(57)【要約】【課題】内分泌障害、例えばゴナドトロピン関連疾患を治療するための方法を提供する。【解決手段】本発明は、神経毒を含んでなる薬剤、該薬剤の製造方法、ならびに、該薬剤により、内分泌障害、例えばゴナドトロピン関連疾患を治療するための方法に関する。この薬剤は、ボツリヌス毒素の少なくとも一部を含んでなるのが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の成分：
（ａ）ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはその機能的変異体の軽鎖またはその機能的フラグメントを含んでなる軽鎖成分；
（ｂ）ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはその機能的変異体の重鎖または改変重鎖を含んでなる移行成分；および
（ｃ）ＧｎＲＨ受容体に選択的に結合する標的化成分；
を含んでなる薬剤。
【請求項２】
軽鎖成分が、細胞からのホルモンの放出を減少させる請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
軽鎖成分が、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型またはその機能的変異体の軽鎖またはその機能的フラグメントを含んでなる請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
軽鎖成分が、ボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖またはその機能的フラグメントを含んでなる請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
移行成分が、細胞質への少なくとも軽鎖成分の移行を促進する請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
移行成分が、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型またはその機能的変異体の重鎖または改変重鎖を含んでなる請求項１に記載の薬剤。
【請求項７】
移行成分が、ボツリヌス毒素Ａ型の重鎖または改変重鎖を含んでなる請求項１に記載の薬剤。
【請求項８】
改変重鎖が、重鎖の少なくともアミノ末端フラグメントを含んでなる請求項１に記載の薬剤。
【請求項９】
標的化成分が、アミノ酸成分を含んでなる請求項１に記載の薬剤。
【請求項１０】
アミノ酸成分が、ＧｎＲＨ受容体に選択的に結合する抗体の可変領域を含んでなる請求項９に記載の薬剤。
【請求項１１】
アミノ酸成分が、ペプチドを含んでなる請求項９に記載の薬剤。
【請求項１２】
ペプチドが、配列：
【化１】
2010174037.tif 000013
[配列中、Ｘは、グリシン、リシン、Ｄ-リシン、オルニチン、Ｄ-オルニチン、グルタミン酸、Ｄ-グルタミン酸、アスパラギン酸、Ｄ-アスパラギン酸、システイン、Ｄ-システイン、チロシンおよびＤ-チロシンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｚは、Gly-NH2、エチルアミドおよびAza-Gly-NH2からなる群から選択される置換基である]
を含んでなる請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
ＸがＤ-Ｌｙｓであり、Ｚがエチルアミドである請求項１２に記載の薬剤。
【請求項１４】
ペプチドが、アミノ酸配列：
【化２】
2010174037.tif 000014
[配列中、Ｘは、グリシン、リシン、Ｄ-リシン、オルニチン、Ｄ-オルニチン、グルタミン酸、Ｄ-グルタミン酸、アスパラギン酸、Ｄ-アスパラギン酸、システイン、Ｄ-システイン、チロシンおよびＤ-チロシンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｚは、Gly-NH2、エチルアミドおよびAza-Gly-NH2からなる群から選択される置換基である]
の少なくとも５個の連続アミノ酸を含んでなる請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１５】
ペプチドが、アミノ酸配列の少なくとも６個の連続アミノ酸を含んでなる請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１６】
ペプチドが、アミノ酸配列の少なくとも７個の連続アミノ酸を含んでなる請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１７】
ペプチドが、アミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸を含んでなる請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１８】
軽鎖成分、移行成分および標的化成分が、リンカーによって互いに結合している請求項１に記載の薬剤。
【請求項１９】
軽鎖成分が、ボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖であり、移行成分が、細胞質への少なくとも軽鎖の移行を促進しうるボツリヌス毒素Ａ型の重鎖のアミノ末端フラグメントであり、標的化成分が、PyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-エチルアミドである請求項１２に記載の薬剤。
【請求項２０】
血液脳関門を越える薬剤の移行を促進するのに有効な促進剤成分が結合している請求項１に記載の薬剤。
【請求項２１】
ヒトを含む哺乳動物のゴナドトロピン関連疾患を治療するのに有用な請求項１に記載の薬剤。
【請求項２２】
ヒトを含む哺乳動物のゴナドトロピン関連疾患を治療するための、請求項１〜２１のいずれかに記載の薬剤を含有する医薬組成物。
【請求項２３】
ゴナドトロピン関連疾患が、子宮内膜症および性的早熟からなる群から選択される請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ゴナドトロピン関連疾患が性的早熟である請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ゴナドトロピン関連疾患が子宮内膜症である請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
以下の成分を含んでなる組換え改変毒素：
（ａ）ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはその機能的変異体の軽鎖またはその機能的フラグメントを含んでなる軽鎖成分；
（ｂ）ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはその機能的変異体の重鎖または改変重鎖を含んでなる移行成分；
（ｃ）ＧｎＲＨ受容体に選択的に結合する標的化成分；および
（ｄ）外因性プロテアーゼ切断部位(この外因性プロテアーゼ切断部位は、軽鎖成分と移行成分の間に位置する)。
【請求項２７】
外因性プロテアーゼ切断部位が、Bacillus amyliquifaciens由来のGenenaseプロテアーゼまたはヒトライノウイルス３C由来のPrescissionプロテアーゼによって切断される請求項２６に記載の改変毒素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０００年１０月２０日付けの同時継続出願Ｎｏ.０９／６９２,８１１の一部継続出願である。前者出願の開示は、その全体が本明細書の一部を構成する。
本発明は、ゴナドトロピン関連疾患を治療するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Andrew Schallyは、精力的な研究の数年後の１９７１年に最終的に、下垂体からの黄体形成ホルモン(ＬＨ)および卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)の分泌を刺激する原因を為す放出ホルモンの構造を同定することができた。この放出ホルモンは、視床下部によって産生され、神経体液経路によって下垂体に到達する。
【０００３】
現在では、この放出ホルモンの重要性は、ヒト発生および成長におけるその調節的役割について、広く認識されている。さらに、この放出ホルモンは、種々の身体障害疾患のベースになりうる。一般に、この特別の放出ホルモンは、ゴナドトロピン放出ホルモン(ＧｎＲＨ)と称される。
【０００４】
ＧｎＲＨの正常な産生は、ＬＨおよびＦＳＨ(ゴナドトロピンとしても知られる)の身体レベルを有益に調節する。ＬＨは、ＦＳＨと共に、卵巣における成熟中の卵胞からのエストロゲンの放出を刺激し、女性における排卵の過程を誘導する。男性において、ＬＨは間質細胞を刺激し、この理由から、間質細胞刺激ホルモン(ＩＣＳＨ)とも称される。ＦＳＨは、卵巣における卵胞の成熟を誘導し、ＬＨと共に、女性における周期現象において重要な役割を果たす。ＦＳＨは、男性の精巣における胚芽細胞の発生を促進する。
【０００５】
しかし、視床下部によるＧｎＲＨの異常に高い産生は、ゴナドトロピン分泌の増大を引き起こすことがあり、これが身体に有害作用を及ぼすことがある。高レベルの循環ゴナドトロピンは、例えば、性的早熟、子宮内膜症、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、および子宮内膜癌を引き起こすことが知られている。これらの疾患は、ゴナドトロピン分泌のレベルを低下させることによって処置することができる。
【０００６】
ＧｎＲＨアゴニストおよびアンタゴニストは、ゴナドトロピン分泌を減少させるように作用する既存の薬物である。ＧｎＲＨアゴニストは、下垂体によって分泌されるゴナドトロピンの量を初めに増大させることによって作用する。しかし、一定期間にわたりこのアゴニストで処置すると、ゴナドトロピン分泌が減少する(現在のところ、このアゴニストがゴナドトロピン分泌を如何に減少させるかについてのメカニズムは、完全には理解されていない)。
【０００７】
ＧｎＲＨアンタゴニストは、下垂体上のＧｎＲＨ受容体に競合的に結合し、これにより、ＧｎＲＨが下垂体細胞においてその刺激作用を発揮するのを妨げることによって作用する。
【０００８】
ＧｎＲＨアンタゴニストおよびアゴニストは、ゴナドトロピン放出の減少を必要とするある種の状態の処置に有効であることがわかっている。例えば、これらは、子宮内膜症、子宮類線維腫、多嚢胞卵巣疾患、性的早熟およびいくつかの性腺ステロイド依存性の新形成、最も注目すべきは前立腺癌、乳癌および卵巣癌の処置に有効であることがわかっている。
【０００９】
また、ＧｎＲＨアゴニストおよびアンタゴニストは、男性および女性の両方における可能性ある避妊薬としても研究されている。さらに、これらは、下垂体性腺刺激細胞腺腫、睡眠障害(睡眠無呼吸など)、過敏腸症候群、月経前症候群、良性前立腺過形成、多毛症の処置において、成長ホルモン欠損の子供における成長ホルモン療法を助けるものとして、および狼瘡のネズミモデルにおいて、可能性ある有用性を示した。
【００１０】
ＧｎＲＨアゴニストおよびアンタゴニストは有用ではあるが、これらの継続投与は問題となりうる。例えば、ＧｎＲＨアゴニストを用いる処置は、６ヶ月間に制限されるのが普通である。これは、ＧｎＲＨアゴニスト療法が骨無機物密度(ＢＭＤ)に影響を及ぼしうるという負の作用のためである。ＧｎＲＨアゴニスト療法を受けた生殖年齢の女性は、閉経の最初の数年間に女性が普通に経験する損失と比較して、２.３％程度のＢＭＤの損失を示すことが多い。生殖年齢の女性におけるこの損失は、この年齢群の女性の骨密度がなお増大していることが多いので、特に注目すべきである。臨床的環境におけるＧｎＲＨアンタゴニストの使用は、比較的新しいことである。
【００１１】
さらに、Nettら(米国特許Ｎｏ.５,６３１,２２９)は、患者に細胞毒コンジュゲート(例えば、ジフテリア毒素-ＧｎＲＨ)を投与することによる、ＧｎＲＨ分泌を減少させる可能性ある方法を開示している(Nettらの開示は、その全体が本明細書の一部を構成する)。このようなコンジュゲートはＧｎＲＨ分泌を減少させることができるが、その長期投与は、脳中の細胞の連続的な破壊につながることがあり、これは有害でありうる。
【００１２】
ボツリヌス毒素
細菌属であるクロストリジウム属は、１２７を越える種を包含し、形態および機能によって分類される。嫌気性のグラム陽性細菌であるボツリヌス菌(Clostridium botulinum)は、強力なポリペプチド神経毒、ボツリヌス毒素を産生し、該毒素は、ヒトおよび動物において、ボツリヌス中毒と称される神経麻痺性疾患の原因となる。ボツリヌス菌の胞子は、土壌中に見い出され、原産地の缶詰工場で不適切に滅菌され密閉された食品容器において増殖することができ、これが多くのボツリヌス中毒の原因となる。通常、ボツリヌス中毒の作用は、ボツリヌス菌培養物または胞子に感染した食品を食べて１８〜３６時間後に現れる。ボツリヌス毒素は、明らかに弱毒化せずに腸の内層を通過し、末梢運動神経を攻撃することができる。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行困難、嚥下困難および会話困難から、呼吸筋の麻痺および死へと進行することができる。
【００１３】
ボツリヌス毒素Ａ型は、ヒトに対して知られている最も致死性の高い天然の生物学的物質である。約５０ｐｇ(ピコグラム)の市販のボツリヌス毒素Ａ型[精製された神経毒複合体であり、Allergan Inc.，Irvine，カリフォルニアからＢＯＴＯＸＲの商品名で１００単位バイアルで入手可能]が、マウスにおけるＬＤ50である(即ち１単位)。１単位のＢＯＴＯＸＲは、約５０ピコグラム(約５６attomole)のボツリヌス毒素Ａ型複合体を含有する。興味深いことに、モルに基づいて、ボツリヌス毒素Ａ型は、ジフテリアより約１８億倍高い致死性であり、シアン化ナトリウムより約６億倍高い致死性であり、コブラ毒より約３０００万倍高い致死性であり、コレラより約１２００万倍高い致死性である[Singh，"Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins"，B.R.Singhら編の"Natural Toxins II"の第63-84頁(第4章)、Plenum Press，New York (1976)](該文献におけるボツリヌス毒素Ａ型０.３ｎｇのＬＤ50が１Ｕに等しいという記載は、ＢＯＴＯＸＲ約０.０５ｎｇが１単位に等しいと校正される)。ボツリヌス毒素の１単位(Ｕ)は、それぞれ体重１８〜２０ｇの雌性Swiss Websterマウスに腹腔内注射したときのＬＤ50として定義される。
【００１４】
一般的に免疫学的に異なる７種類のボツリヌス神経毒が特性付けされている。これらは、それぞれボツリヌス神経毒血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧであり、そのそれぞれは型特異的抗体による中和によって識別される。ボツリヌス毒素の異なる血清型は、それらが作用する動物種において、およびそれらが誘発する麻痺の重度および期間において異なる。例えば、ボツリヌス毒素Ａ型は、ラットにおいて生じる麻痺の等級によって評価したときに、ボツリヌス毒素Ｂ型より５００倍強力である。さらに、ボツリヌス毒素Ｂ型は、ボツリヌス毒素Ａ型の霊長類ＬＤ50の約１２倍である４８０Ｕ／ｋｇの投与量において、霊長類に非毒性であることが測定されている[Moyer Eら、"Botulinum Toxin Type B：Experimental and Clinical Experience"、Jankovic,J.ら編(1994)の"Therapy With Botulinum Toxin"の第71-85頁、第6章，Marcel Dekker, Inc.]。ボツリヌス毒素は、明らかに高親和力でコリン作動性運動ニューロンと結合し、ニューロン中に転位し、アセチルコリンの放出をブロックする。
【００１５】
血清型に関係なく、毒素中毒の分子メカニズムは類似し、少なくとも３つの工程または段階を含むようである。過程の第１工程において、毒素は、ボツリヌス毒素の重鎖(またはＨ鎖)と神経細胞表面受容体との特異的相互作用によって、運動ニューロンのシナプス前膜に結合する。受容体は、ボツリヌス毒素の各型および破傷風毒素で異なると考えられる。Ｈ鎖のカルボキシル末端セグメント(ＨＣ)は、毒素を運動ニューロン表面に指向させるのに重要であるようである。
【００１６】
第２工程において、毒素は、運動ニューロンの形質膜を横切る。毒素は、初めに、受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞によって包み込まれ、毒素を含有するエンドソームが形成される。次に、毒素は、エンドソームから細胞形質中に逃れ出る。この工程は、約５.５またはそれ以下のｐＨに反応して毒素のコンフォメーション変化を誘発するＨ鎖のアミノ末端セグメント(ＨＮ)によって媒介されると考えられる。エンドソームは、エンドソーム内ｐＨを低下させるプロトンポンプを有することが既知である。コンフォメーションのシフトは毒素中の疎水性残基を露出させ、これが、毒素をエンドソーム膜内に埋込むことを可能にする。次に、毒素(または、少なくともその軽鎖)が、エンドソーム膜を通って細胞形質に転位する。
【００１７】
ボツリヌス毒素活性のメカニズムの最終工程は、毒素の重鎖(Ｈ鎖)および軽鎖(Ｌ鎖)を結合するジスルフィド結合の減少を包含するようである。ボツリヌス毒素および破傷風毒素の全毒素活性は、ホロトキシン(holotoxin)のＬ鎖に含まれる。Ｌ鎖は亜鉛(Ｚｎ++)エンドペプチダーゼであり、これは、神経伝達物質を含有する小胞の認識および形質膜の細胞質表面とのドッキングならびに小胞と形質膜との融合に必須であるタンパク質を選択的に開裂する。破傷風神経毒、ボツリヌス毒素Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧ型は、シナプトソーム膜タンパク質であるシナプトブレビン[小胞関連膜タンパク質(ＶＡＭＰ)とも称される]の分解を引き起こす。シナプス小胞の細胞質表面に存在する大部分のＶＡＭＰは、これらの開裂現象のいずれかの結果として除去される。ボツリヌス毒素の血清型ＡおよびＥは、ＳＮＡＰ-２５を開裂する。ボツリヌス毒素の血清型Ｃは、シンタキシンおよびＳＮＡＰ-２５を開裂する。同じ結合を開裂するボツリヌス毒素Ｂ型および破傷風毒素を除いて、各ボツリヌス毒素は異なる結合を特異的に開裂する。
【００１８】
ボツリヌス毒素は、臨床的環境において、過活動骨格筋を特徴とする神経筋障害の治療に使用されている。ボツリヌス毒素Ａ型複合体は、眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣の治療のために、米国食品医薬局(U.S. Food and Drug Administration)によって承認されている。非Ａ型ボツリヌス毒素血清型は、ボツリヌス毒素Ａ型と比較して、より低い効力および／またはより短い活性期間を有することが明らかである。全てではないにしても、大部分のボツリヌス毒素は、筋肉内注射したときに、例えばマウスDigit Abduction Score (ＤＡＳ)によって測定したときに、注射から１日以内に有意の筋肉麻痺を生じる[Aoki K.R.，"Preclinical Update on BOTOX (Botulinum Toxin Type A)-Purified Neurotoxin Complex Relative to Other Botulinum Toxin Preparations"，Eur J.Neur 1999，6 (suppl 4)：S3-S10]。最大の臨床効果は、数日間は得られないであろう。ボツリヌス毒素Ａ型の１回の筋肉内注射による症状軽減の通常の期間は、平均で約３ヶ月である。明らかに、ボツリヌス毒素の基質は、種々の異なる細胞型に見い出すことができる。例えば、Biochem,J 1：339 (pt 1)：159-65：1999、および、Mov Disord，10(3)：376：1995を参照(ランゲルハンス島Ｂ細胞は、少なくともＳＮＡＰ-２５およびシナプトブレビンを含有する)。
【００１９】
ボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は、７種類の全ての既知ボツリヌス毒素血清型について、約１５０ｋＤである。興味深いことに、ボツリヌス毒素は、１５０ｋＤのボツリヌス毒素タンパク質分子を関連の非毒素タンパク質と共に含んでなる複合体として、クロストリジウム属細菌によって放出される。即ち、ボツリヌス毒素Ａ型複合体は、９００ｋＤ、５００ｋＤおよび３００ｋＤの形態で、クロストリジウム属細菌によって産生されうる。ボツリヌス毒素ＢおよびＣ1型は、７００ｋＤまたは５００ｋＤ複合体としてのみ産生されるようである。ボツリヌス毒素Ｄ型は、３００ｋＤおよび５００ｋＤ複合体として産生される。最後に、ボツリヌス毒素ＥおよびＦ型は、約３００ｋＤ複合体としてのみ産生される。複合体(即ち、約１５０ｋＤより大きい分子量)は、非毒素の血球凝集素タンパク質および非毒素および非毒性の非血球凝集素タンパク質を含有すると考えられる。これらの２つの非毒素タンパク質(ボツリヌス毒素分子と共に、関連の神経毒複合体を構成する)は、変性に対する安定性をボツリヌス毒素分子に与え、毒素が摂取されたときに消化酸(digestive acid)に対する保護を与えるように作用することができる。さらに、より大きい(約１５０ｋＤ分子量より大きい)ボツリヌス毒素複合体は、ボツリヌス毒素複合体の筋肉内注射部位からの、ボツリヌス毒素の比較的遅い拡散速度を与えることができる。
【００２０】
インビトロでの研究は、ボツリヌス毒素が、脳幹組織の一次細胞培養物からのアセチルコリンおよびノルエピネフリンの両方のカリウム陽イオン誘発放出を阻害することを示した。さらに、ボツリヌス毒素が、脊髄ニューロンの一次培養物におけるグリシンおよびグルタメートの両方の誘発放出を阻害すること、ならびに、脳シナプトソーム調製物において、ボツリヌス毒素が、神経伝達物質アセチルコリン、ドパミン、ノルエピネフリン[Habermann E.ら、"Tetanus Toxin and Botulinum A and C Neurotoxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse Brain"，J Neurochem 51(2)；522-527：1988]、ＣＧＲＰ、サブスタンスＰおよびグルタメート[Sanchez-Preito,J.ら、"Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig Cerebral Cortical Synaptosomes"，Eur J.Biochem 165；675-681：1897]のそれぞれの放出を阻害することも報告されている。このように、適切な濃度を使用したときに、大部分の神経伝達物質の刺激誘発放出がボツリヌス毒素によってブロックされる。例えば、Pearce,L.B.，"Pharmacologic Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science and Medicine"，Toxicon 35(9), 1373-1412，1393；Bigalke H.ら、"Botulinum A Neurotoxin Inhibits Non-Cholinergic Synaptic Transmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture"，Brain Research 360, 318-324, 1985；Habemann E.，"Inhibition by Tetanus and Botulinum A Toxin of the release of [3H]Noradrenaline and [3H]GABA From Rat Brain Homogenate"，Experientia 44, 224-226, 1988；Bigalke H.ら、"Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of Various Transmitters，as Studied with Particulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord"，Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 316, 244-251, 1981；および、Jankovic J.ら、"Therapy With Botulinum Toxin"，Marcel Dekker,Inc.(1994)，p.5を参照。
【００２１】
ボツリヌス毒素Ａ型は、既知の方法に従って、発酵槽においてボツリヌス菌の培養物を確立し、増殖させ、次に発酵混合物を採取し、精製することによって得ることができる。全てのボツリヌス毒素血清型は、初めに不活性な一本鎖タンパク質として合成され、これがプロテアーゼによって開裂されるかまたはニックが入って神経活性にならなければならない。ボツリヌス毒素の血清型ＡおよびＧを作る細菌株は内因性プロテアーゼを有しており、従って、血清型ＡおよびＧは、主としてその活性形態で細菌培養物から回収することができる。対照的に、ボツリヌス毒素の血清型Ｃ1、ＤおよびＥは、非タンパク質分解性の菌株によって合成され、従って、培養物から回収したときには活性化されていないのが普通である。血清型ＢおよびＦは、タンパク質分解性および非タンパク質分解性の両菌株によって産生され、従って、活性または不活性の形態のどちらかで回収することができる。しかし、例えばボツリヌス毒素の血清型Ｂを産生するタンパク質分解性の菌株であっても、該菌株は、産生された毒素の一部を開裂するにすぎない。ニック入り分子と非ニック入り分子の正確な比率は、培養時間、培養温度に依存する。従って、例えばボツリヌス毒素Ｂ型のいずれかの調製物のある一定割合は不活性である可能性があり、これが、恐らくはボツリヌス毒素Ａ型と比較したときのボツリヌス毒素Ｂ型の既知の有意に低い効力を説明するものと考えられる。臨床調製物における不活性なボツリヌス毒素分子の存在は、調製物の全体のタンパク質負荷に寄与し、これが、その臨床効果に寄与せずに抗原性の増加につながる。さらに、ボツリヌス毒素Ｂ型は、筋肉内注射したときに、同じ用量レベルのボツリヌス毒素Ａ型よりも、短い活性期間を有し、また低い効力を有することが既知である。
【００２２】
高品質の結晶性ボツリヌス毒素Ａ型は、ボツリヌス菌のＨall Ａ菌株から、≧３×１０7Ｕ／ｍｇ、０.６０未満のＡ260／Ａ278、およびゲル電気泳動での明瞭なバンドパターンの特性を伴って得ることができる。Shantz E.J.ら、"Properties and Use of Botulinum Toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine"，Microbiol Rev. 56, 80-99, 1992に記載されているように、既知のShantz法を使用して結晶性ボツリヌス毒素Ａ型を得ることができる。一般に、ボツリヌス毒素Ａ型複合体は、好適な培地においてボツリヌス菌Ａ型を培養することによって、嫌気性発酵から単離および精製することができる。非毒素タンパク質からの分離の際に、既知の方法を使用して、下記のような純粋なボツリヌス毒素を得ることもできる：分子量約１５０ｋＤおよび比効力(specific potency)１〜２×１０8ＬＤ50Ｕ／ｍｇまたはそれ以上を有する精製ボツリヌス毒素Ａ型；分子量約１５６ｋＤおよび比効力１〜２×１０8ＬＤ50Ｕ／ｍｇまたはそれ以上を有する精製ボツリヌス毒素Ｂ型；および、分子量約１５５ｋＤおよび比効力１〜２×１０7ＬＤ50Ｕ／ｍｇまたはそれ以上を有する精製ボツリヌス毒素Ｆ型。
【００２３】
ボツリヌス毒素および／またはボツリヌス毒素複合体は、List Biological Laboratories，Inc.(Campbell，カリフォルニア)；the Centre for Appliced Microbiology and Research(Porton Down，英国)；和光(大阪，日本)；Metabiologics(Madison，ウイスコンシン)；および、Sigma Chemicals(St.Louis，ミズーリ)から得ることができる。
【００２４】
純粋なボツリヌス毒素およびボツリヌス毒素複合体の両方を使用して、医薬組成物を製造することができる。純粋なボツリヌス毒素およびボツリヌス毒素複合体(毒素Ａ型複合体など)の両方は、表面変性、熱およびアルカリ条件による変性を受けやすい。不活性化した毒素は、免疫原性になりうるトキソイドタンパク質を形成する。生じた抗体は、毒素注射に対して患者を抵抗性にすることができる。
【００２５】
一般に酵素と同様に、ボツリヌス毒素(これは細胞内ペプチダーゼである)の生物学的活性は、その三次元コンフォメーションに少なくとも部分的に依存する。即ち、ボツリヌス毒素Ａ型は、熱、種々の化学物質表面伸張および表面乾燥によって無毒化される。さらに、既知の培養、発酵および精製によって得た毒素複合体を、医薬組成物に使用されるかなり低い毒素濃度まで希釈する際に、好適な安定剤が存在しなければ、毒素が急速に無毒化される結果になることが知られている。毒素をミリグラム量からナノグラム／ミリリットル含有溶液に希釈すると、そのような高希釈の際の比毒性の急速な損失のゆえに、重大な問題を生じる。毒素は、毒素含有の医薬組成物を配合して数ヶ月後または数年後に使用されることもあるので、アルブミンやゼラチンのような安定剤を使用して毒素を安定化してよい。
【００２６】
商業的に入手可能なボツリヌス毒素含有の医薬組成物は、商標ＢＯＴＯＸＲのもとで市販されている(Allergan，Inc.，Irvine，カリフォルニアから入手可能)。ＢＯＴＯＸＲは、滅菌真空乾燥形態で充填された精製ボツリヌス毒素Ａ型複合体、アルブミンおよび塩化ナトリウムからなる。ボツリヌス毒素Ａ型は、Ｎ-Ｚアミンおよび酵母抽出物を含有する培地で増殖させたボツリヌス菌のＨall菌株の培養物から調製される。ボツリヌス毒素Ａ型複合体は、培養液から、一連の酸析出によって、活性な高分子量毒素タンパク質および関連の血球凝集素タンパク質からなる結晶性複合体まで精製される。結晶性複合体を、食塩水およびアルブミンを含有する溶液に再溶解し、滅菌濾過し(０.２ミクロン)、真空乾燥する。真空乾燥した生成物は、−５℃またはそれ以下で冷凍庫中に貯蔵する。ＢＯＴＯＸＲを、筋肉内注射の前に、滅菌した非防腐食塩水を使用して再構成することができる。ＢＯＴＯＸＲの各バイアルは、防腐剤を含有しない滅菌真空乾燥形態において、約１００単位(Ｕ)のボツリヌス毒素Ａ型の精製神経毒複合体、０.５ｍｇのヒト血清アルブミンおよび０.９ｍｇの塩化ナトリウムを含有する。
【００２７】
真空乾燥ＢＯＴＯＸＲを再構成するために、防腐剤を含有しない滅菌規定食塩水(０.９％塩化ナトリウム注射剤)を、適切なサイズの注射器に適切な量の希釈剤を吸引することによって使用する。ＢＯＴＯＸＲは、泡立ちまたは同様の激しい撹拌によって変性することがあるので、希釈剤をバイアルにゆっくり注入する。滅菌上の理由により、ＢＯＴＯＸＲは、バイアルを冷凍庫から取り出して再構成して４時間以内に投与するのが好ましい。この４時間中は、再構成ＢＯＴＯＸＲを、約２℃〜約８℃で冷蔵庫に貯蔵することができる。再構成され、冷蔵貯蔵されたＢＯＴＯＸＲは、その効力を少なくとも約２週間にわたって維持することが報告されている[Neurology 48, 249-53, 1997]。
【００２８】
ボツリヌス毒素Ａ型は、下記の臨床的環境において使用されることが報告されている：
(１)頸部ジストニーの治療のために、筋肉内注射(複数筋肉)あたり、約７５〜１２５単位のＢＯＴＯＸＲ；
(２)眉間線(前頭溝)の治療のために、筋肉内注射あたり、５〜１０単位のＢＯＴＯＸＲ(５単位を鼻根筋に注射し、１０単位を各皺眉筋に注射する)；
(３)恥骨直腸筋の括約筋注射による便秘の治療のために、約３０〜８０単位のＢＯＴＯＸＲ；
(４)上眼瞼の外側瞼板前部の眼輪筋および下眼瞼の外側瞼板前部の眼輪筋への注射による眼瞼痙攣の治療のために、筋肉あたり約１〜５単位のＢＯＴＯＸＲの筋肉内注射；
(５)斜視の治療のために、約１〜５単位のＢＯＴＯＸＲを外眼筋に注射する：注射される量は、注射される筋肉の大きさおよび所望される筋肉麻痺の程度(即ち、所望されるジオプトリ矯正量)に依存して変化する；
(６)脳卒中後の上肢痙性の治療のために、下記の５種類の異なる上肢屈筋にＢＯＴＯＸＲを筋肉内注射する：
(ａ)深指屈筋：７.５〜３０Ｕ
(ｂ)浅指屈筋：７.５〜３０Ｕ
(ｃ)尺側手根屈筋：１０〜４０Ｕ
(ｄ)橈側手根屈筋：１５〜６０Ｕ
(ｅ)上腕二頭筋：５０〜２００Ｕ
上記の５種類の筋肉のそれぞれに同じ治療期間において注射し、それにより、各治療期間において９０〜３６０Ｕの上肢屈筋ＢＯＴＯＸＲを患者に筋肉内注射投与する；
(７)偏頭痛を治療するために、２５ＵのＢＯＴＯＸＲを頭蓋周囲に注射する(眉間、前頭および側頭筋に対称的に注射する)：該注射は、２５Ｕ注射後の３ヶ月間にわたり、偏頭痛頻度、最大重症度、付随嘔吐および急性薬剤使用の減少によって測定したときに、ビヒクルと比較して、偏頭痛の予防処置として有意な利益を示した。
【００２９】
さらに、筋肉内ボツリヌス毒素は、パーキンソン病の患者の振せんの治療にも使用されているが、結果は顕著でないことが報告されている[Marjama-Jyons,J.ら、"Tremor-Predominant Parkinson's Disease"，Drugs & Aging 16(4), 273-278, 2000]。
【００３０】
ボツリヌス毒素Ａ型は、最大１２ヶ月の有効性を有し[European J.Neurology 6(Supp 4), S111-S1150, 1999]、ある場合には２７ヶ月間にもわたる有効性を有しうることが既知である[Laryngoscope 109, 1344-1346, 1999]。しかし、ＢＯＴＯＸＲ筋肉内注射の通常の持続期間は一般に約３〜４ヶ月間である。
【００３１】
種々の臨床状態の治療におけるボツリヌス毒素Ａ型の成功は、他のボツリヌス毒素血清型への関心に導いた。商業的に入手可能な２種類のボツリヌス毒素Ａ型調製物[ＢＯＴＯＸＲおよびＤysportＲ]、ならびに、ボツリヌス毒素Ｂ型およびＦ型の調製物(両方とも和光化学、日本から得られる)について研究を行って、局所筋肉弱化効力、安全性および抗原潜在性を評価した。ボツリヌス毒素調製物を右腓腹筋の上部に注射し(０.５〜２００.０単位／ｋｇ)、マウス指外転採点アッセイ(ＤＡＳ)を使用して筋肉虚弱を分析した。ＥＤ50値を用量反応曲線から計算した。他のマウスに筋肉注射を行って、ＬＤ50用量を求めた。治療指数を、ＬＤ50／ＥＤ50として計算した。マウスの別グループに、ＢＯＴＯＸＲ(５.０〜１０.０単位／ｋｇ)またはボツリヌス毒素Ｂ型(５０.０〜４００.０単位／ｋｇ)を後脚に注射し、筋肉虚弱および増加した水消費について試験した(この後者は乾燥した口の推定モデルである)。１ヶ月に１回ウサギに筋肉内注射することによって[１.５または６.５ｎｇ／ｋｇのボツリヌス毒素Ｂ型または０.１５ｎｇ／ｋｇのＢＯＴＯＸＲ]、抗原潜在性を評価した。ピーク筋肉虚弱および期間は、全ての血清型において用量に相関していた。ＤＡＳ ＥＤ50値(単位／ｋｇ)は次の通りであった：ＢＯＴＯＸＲ：６.７、ＤysportＲ：２４.７、ボツリヌス毒素Ｂ型：２７.０〜２４４.０、ボツリヌス毒素Ｆ型：４.３。ＢＯＴＯＸＲは、ボツリヌス毒素Ｂ型またはボツリヌス毒素Ｆ型より長い作用期間を有していた。治療指数値は以下の通りであった：ＢＯＴＯＸＲ：１０.５、ＤysportＲ：６.３、ボツリヌス毒素Ｂ型：３.２。水消費は、ボツリヌス毒素Ｂ型を注射したマウスの方が、ＢＯＴＯＸＲを注射したマウスより多かったが、ボツリヌス毒素Ｂ型は、筋肉の弱化の有効性が低かった。注射から４ヶ月後、４匹中２匹のウサギ(１.５ｎｇ／ｋｇで処置)および４匹中４匹のウサギ(６.５ｎｇ／ｋｇで処置)は、ボツリヌス毒素Ｂ型に対して抗体を発生させた。別の試験において、ＢＯＴＯＸＲで処置したウサギ９匹中０匹が、ボツリヌス毒素Ａ型に対して抗体を示した。ＤＡＳの結果は、ボツリヌス毒素Ａ型の相対ピーク効力は、ボツリヌス毒素Ｆ型に等しく、ボツリヌス毒素Ｆ型は、ボツリヌス毒素Ｂ型より高いことを示している。作用期間について、ボツリヌス毒素Ａ型はボツリヌス毒素Ｂ型より長く、ボツリヌス毒素Ｂ型の作用期間はボツリヌス毒素Ｆ型より長かった。治療指数値によって示されるように、ボツリヌス毒素Ａ型の２種類の市販調製物[ＢＯＴＯＸＲおよびＤysportＲ]は異なっている。ボツリヌス毒素Ｂ型の後脚注射後に観察される水消費挙動の増加は、臨床的に有意な量のこの血清型がネズミの全身循環に入ったことを示している。また、これらの結果は、ボツリヌス毒素Ａ型と同等の有効性を達成するためには、試験した他の血清型の用量を増加させる必要があることをも示している。用量の増加は、安全性を損なうことがある。さらに、ウサギにおいてＢ型はＢＯＴＯＸＲより高い抗原性であり、その理由は、恐らくはボツリヌス毒素Ｂ型の有効用量を達成するために、より高いタンパク質負荷量が注射されたためであろう[Eur J Neurol 1999 Nov, 6(Suppl 4), S3-S10]。
【００３２】
末梢位置において薬理作用を有することに加えて、ボツリヌス毒素は、中枢神経系において阻害作用を有することもできる。Weigandら[Nauny-Schmiedeberg's Arch.Pharmacol. 1976, 292，161-165]、およびHabermann[Nauny-Schmiedeberg's Arch.Pharmacol. 1974, 281，47-56]の研究は、ボツリヌス毒素が逆行性輸送によって脊髄領域へ上行しうることを示した。このように、末梢位置(例えば筋肉内)に注射されたボツリヌス毒素は、脊髄に逆行輸送されうる。
【００３３】
アセチルコリン
一般に、単一型の小分子神経伝達物質だけが、哺乳動物神経系の各型のニューロンによって放出される。神経伝達物質アセチルコリンは、脳の多くの領域のニューロンによって分泌されるが、特に、運動皮質の大錐体細胞によって、脳幹神経節のいくつかの異なるニューロンによって、骨格筋を神経支配する運動ニューロンによって、自律神経系(交感神経および副交感神経の両方)の節前ニューロンによって、副交感神経系の節後ニューロンによって、および交感神経系の節後ニューロンの一部によって分泌される。本質的に、汗腺、立毛筋および少数の血管への節後交感神経線維だけがコリン作動性であり、交感神経系の大部分の節後ニューロンは、神経伝達物質ノルエピネフィンを分泌する。ほとんどの場合、アセチルコリンは興奮作用を有する。しかし、アセチルコリンは、末梢副交感神経終末の一部において、阻害作用(例えば、迷走神経による心拍数の阻害)を有することが既知である。
【００３４】
自律神経系の遠心性信号は、交感神経系または副交感神経系によって身体に伝達される。交感神経系の節前ニューロンは、脊髄の中間外側角に位置する節前交感神経ニューロン細胞体から伸びる。細胞体から伸びる節前交感神経線維は、脊椎傍交感神経節または脊椎前神経節に位置する節後ニューロンとシナプスを形成する。交感神経系および副交感神経系の両方の節前ニューロンは、コリン作動性であるので、神経節へのアセチルコリンの適用は、交感神経および副交感神経の節後ニューロンの両方を興奮させるであろう。
【００３５】
アセチルコリンは、２種類の受容体、ムスカリン性およびニコチン性受容体を活性化させる。ムスカリン性受容体は、副交換神経系の節後ニューロンによって刺激される全ての効果細胞、ならびに、交感神経系の節後コリン作動性ニューロンによって刺激される効果細胞において見い出される。ニコチン性受容体は、副腎随質、ならびに自律神経節内、即ち、交感神経系および副交感神経系の両方の節前ニューロンと節後ニューロンの間のシナプスにおける節後ニューロンの細胞表面において見い出される。ニコチン性受容体は、多くの非自律神経終末においても、例えば、神経筋接合部における骨格筋線維の膜においても見い出される。
【００３６】
アセチルコリンは、小さい透明な細胞内小胞が、シナプス前ニューロン細胞膜と融合する際に、コリン作動性ニューロンから放出される。多種多様の非ニューロン性の分泌細胞、例えば、副腎随質(ならびにＰＣ１２セルライン)およびランゲルハンス島細胞が、それぞれカテコールアミンおよび副甲状腺ホルモンを、大きい濃染芯小胞(large dense-core vesicle)から放出する。ＰＣ１２セルラインは、交感神経副腎発生の研究用の組織培養モデルとして広く使用されているラット褐色細胞腫細胞のクローンである。ボツリヌス毒素は、インビトロにおいて、脱神経細胞に毒素を透過させるか(エレクトロポレーションによるなど)または直接注射によって、両方の種類の細胞からの両方の種類の化合物の放出を阻害する。ボツリヌス毒素は、皮質シナプトソーム細胞培養物からの神経伝達物質グルタメートの放出をブロックすることも既知である。
【００３７】
神経筋接合部は、筋肉細胞への軸索の近接によって、骨格筋において形成される。神経系を介して伝達される信号は、末端軸索における活動電位を生じ、イオンチャンネルを活性化し、ニューロン内シナプス小胞からの神経伝達物質アセチルコリンの放出を生じる(例えば、神経筋接合部の運動終板において)。アセチルコリンは、細胞外空間を通って、筋肉終板表面のアセチルコリン受容体タンパク質と結合する。一旦、十分な結合が生じると、筋肉細胞の活動電位は、特異的な膜イオンチャンネル変化を引き起こし、筋肉細胞収縮を生じる。次に、アセチルコリンが筋肉細胞から放出され、細胞外空間においてコリンエステラーゼによって代謝される。代謝産物は、さらなるアセチルコリンに再処理するために末端軸索に再循環される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
上記のように、ゴナドトロピンに関連する疾患を治療するために現在使用されている薬物は、有害な副作用を伴っていることが多い。ゴナドトロピン関連疾患を治療するための改善された薬剤および方法が必要とされ続けている。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
本明細書において下記の定義を適用する。
「約」は、「およそ」または「ほぼ」を意味し、本明細書に開示されている数値または数値範囲に関して、開示されているかまたは特許請求の範囲に記載されている数値または数値範囲の±１０％を意味する。
「局所投与」は、薬剤の生物学的作用が望まれている動物の身体上または身体内の部位またはその付近における、薬剤の直接投与を意味する。局所投与は、静脈内または経口投与のような全身性の投与経路を除外する。
【００４０】
「頭蓋内」は、脊髄の背側末端またはその付近の頭蓋の内部を意味し、髄質、脳幹、脳橋、小脳および大脳を包含する。神経体液経路および下垂体は、両方とも頭蓋内とみなされる。
「クロストリジウム毒素」は、ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素および破傷風毒素を包含する。
【００４１】
「軽鎖成分」は、クロストリジウム毒素の軽鎖および／またはそのフラグメントを含む。軽鎖は、約５０ｋＤａの分子量を有し、Ｌ鎖またはＬと称することもある。軽鎖またはそのフラグメントは、タンパク質分解活性を有することができる。
「重鎖成分」は、クロストリジウム毒素の重鎖および／または改変重鎖を含む。全長重鎖は、約１００ｋＤａの分子量を有し、Ｈ鎖またはＨと称することもある。重鎖は、ＨＣおよびＨＮを含む。改変重鎖は、重鎖のフラグメント、例えばＨＮであってよい。
【００４２】
「ＨＣ」は、Ｈ鎖のカルボキシル末端フラグメント、または細胞表面への結合に関与する無傷Ｈ鎖中の該フラグメントに対応する部分にほぼ等価(例えば、機能的に等価)であるクロストリジウム毒素のＨ鎖由来のフラグメントを意味する。
「ＨＮ」は、Ｈ鎖のアミノ末端セグメント、または細胞内エンドソーム膜を通過して細胞質への少なくともＬ鎖の移行に関与する無傷Ｈ鎖中の該フラグメントに対応する部分にほぼ等価(例えば、機能的に等価)であるクロストリジウム毒素のＨ鎖由来のフラグメントを意味する。ＨＮは、Ｈ鎖からＨＣが除去されたものに由来することができる。また、ＨＮは、ＨＣがもはやコリン作動性細胞表面に結合しないように改変されたＨ鎖に由来することもできる。
【００４３】
「ＬＨＮ」は、ＨＮフラグメントに結合したＬ鎖またはその機能的フラグメントを含むクロストリジウム毒素由来のフラグメントを意味する。ＬＨＮは、当業者に既知の方法によりＨＣドメインを除去または化学改変することによって、無傷クロストリジウム毒素から得ることができる。
「標的化成分」は、生理学的条件下で細胞表面受容体(例えば、ＧｎＲＨ受容体)に優先的に結合することができる化学的部分を意味する。
「ＧｎＲＨ」は、ゴナドトロピン放出ホルモンを意味する。
「ＧｎＲＨ-Ａ」は、ＧｎＲＨの類似体を意味する。
【００４４】
「可変領域」は、選択的なサブユニット配列の結果として、１つの抗体から別の抗体へと大きく変化する抗体部分を意味する。この可変領域は、抗原(例えば、ＧｎＲＨ受容体)に特異的に結合することができる。
「スペーサー」は、複数の成分間を物理的に隔離し、距離を付加する分子または分子組を意味する。スペーサーの１つの機能は、成分間の立体障害を妨げることである。例えば、本発明の薬剤は、Ｌ-リンカー-スペーサー-リンカー-ＨＮ-リンカー-ＧｎＲＨであってよい。
【００４５】
「リンカー」は、２またはそれ以上の他の分子または成分を一緒に結合する分子を意味する。
「変異体」は、参照される分子またはペプチドとその実体および機能が実質的に同一である分子またはペプチドを意味する。例えば、参照される軽鎖の変異体は、該参照される軽鎖からのわずかな重要ではない配列変異を有する。１つの態様において、変異体は、開示された配列と等価であるとみなされ、従って本発明の範囲内にある。
【００４６】
本発明によれば、薬剤は、(１)ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはその変異体の軽鎖またはそのフラグメントを含んでなる軽鎖成分；(２)ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはその変異体の重鎖または改変重鎖を含んでなる移行成分；および(３)ＧｎＲＨ受容体に選択的に結合する標的化成分；を含んでなることを特徴とする。
【００４７】
また、本発明によれば、この薬剤は、哺乳動物(例えばヒト)においてゴナドトロピン分泌を減少させるのに有用でありうる。１つの態様において、本発明の薬剤を用いて、下垂体ホルモン関連疾患、特にゴナドトロピン関連疾患、例えば乳癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮内膜症、子宮内膜癌または性的早熟の症状を処置する。
【００４８】
さらに、本発明によれば、軽鎖成分は、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型またはその変異体の軽鎖またはそのフラグメントである。この軽鎖成分は、細胞からのホルモンの放出を減少させる。好ましくは、この軽鎖成分の効果は可逆的である。
【００４９】
さらに、本発明によれば、移行成分は、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型またはその変異体の重鎖または改変重鎖を含んでなる。この移行成分は、軽鎖成分の細胞質への移行を促進する。
【００５０】
さらに、本発明によれば、標的化成分は、生理学的条件下でＧｎＲＨ受容体に選択的に結合することができるアミノ酸成分である。１つの態様において、このアミノ酸成分は、抗体の可変領域である。好ましい態様において、このアミノ酸成分はペプチドである。１つの態様において、このペプチドは、ＧｎＲＨまたは下記のアミノ酸配列で示されるＧｎＲＨの類似体(以下において「ＧｎＲＨ-Ａ」)であってよい：
【化１】
2010174037.tif 000002
[配列中、Ｘは、グリシン、リシン、Ｄ-リシン、オルニチン、Ｄ-オルニチン、グルタミン酸、Ｄ-グルタミン酸、アスパラギン酸、Ｄ-アスパラギン酸、システイン、Ｄ-システイン、チロシンおよびＤ-チロシンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｚは、Gly-NH2、エチルアミドおよびAza-Gly-NH2からなる群から選択される置換基である]。
【００５１】
さらに、本発明によれば、薬剤は、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ-Ａの一部だけを含んでなることができる。例えば、本発明の薬剤は、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ-Ａの８連続アミノ酸、７連続アミノ酸、６連続アミノ酸または５連続アミノ酸を有するポリペプチドを含んでなることができる。
【００５２】
さらに、本発明によれば、薬剤は、促進剤成分に連結されている。この促進剤成分は、血液脳関門を越える薬剤の移行を促進することができる。
【００５３】
本明細書中に記載したあらゆる特徴または特徴の組合せは、これら任意の組合せに含まれる特徴が、その文脈、本明細書および当業者の知識からわかるように相互に矛盾しないものであるならば、本発明の範囲内に含まれる。
本発明のさらなる利点および態様は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】軽鎖およびマルトース結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質(本明細書中ではＭＢＰ-Ｌ鎖融合タンパク質と称する)の発現に使用した破傷風毒素(「ＴｅＴｘ」)およびＤＮＡ構築物(ｐＭＡＬ-Ｌ)を示す図である。図の第１部分の１文字コードは、Ｎ末端ミクロ配列決定によって決定した精製組換えＬ鎖の最初の数個の残基のアミノ酸配列を示す。図の第２部分は、Ｌ鎖にジスルフィド結合したＨ鎖を示す。亜鉛結合ドメインの位置も図に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、性ホルモン関連疾患、例えばゴナドトロピン関連疾患を治療するための薬剤および方法に関する。本発明をいずれかの理論または作用メカニズムに限定することを望むものではないが、本発明の薬剤は、哺乳動物におけるゴナドトロピン分泌レベルを低下させるために有効に使用され、それにより、高レベルのゴナドトロピンに関連する疾患が治療または軽減されるものと考えられる。
【００５６】
広い態様において、本発明の薬剤は、軽鎖成分、移行成分、および標的化成分を含んでなる。
【００５７】
軽鎖成分は、ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはこれら毒素の生物学的に活性な変異体の軽鎖を含むことができる。また、この軽鎖成分は、軽鎖のフラグメントが生理学的環境において生物学的に活性であるならば、このようなフラグメントを含むことができる。即ち、これらのフラグメントは、細胞からのホルモンの放出に実質的に干渉することができる。好ましい態様において、軽鎖成分は、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型またはこれら血清型の生物学的活性な変異体の軽鎖を含有する。別の好ましい態様において、軽鎖成分は、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型またはこれら血清型の生物学的活性な変異体のフラグメントであることもできる(フラグメントそれ自体が生物学的に活性であるとき、例えば、フラグメントが細胞からのホルモンの放出に干渉することができるとき)。１つの好ましい態様において、本発明の軽鎖成分は細胞毒性ではない。即ち、その作用は可逆的である。
【００５８】
１つの態様において、軽鎖成分は、その作用を細胞の内側から、例えば下垂体の性腺刺激細胞の内側から発揮することができる。１つの態様において、細胞の内側から作用を発揮する軽鎖を含む薬剤は、さらに移行成分を含んでなる。この移行成分は、標的細胞の細胞質への薬剤の少なくとも一部の移行を促進することができる。
【００５９】
広い態様において、移行成分は重鎖を含んでなる。１つの態様において、この移行成分は改変重鎖を含んでなる。この改変重鎖はＨＮ成分を含んでなることができる。例えば、改変重鎖は、ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはこれらの変異体のアミノ末端を含むことができる。好ましくは、改変重鎖は、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型またはこれらの変異体のアミノ末端を含有する。より好ましくは、改変重鎖は、ボツリヌス毒素Ａ型のアミノ末端を含んでなる。さらに好ましくは、改変重鎖は、小胞の内側から細胞質への、薬剤の少なくとも一部(例えば、治療成分)の移行を促進しうるボツリヌス毒素Ａ型の重鎖のアミノ末端フラグメントを含んでなる。
【００６０】
好ましい態様において、本発明の薬剤は、ボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖を含む軽鎖成分、およびボツリヌス毒素Ａ型のＨＮを含む移行成分を含んでなる(ここで、このＨＮは、少なくとも治療成分の細胞質への移行を助けることができる)。
【００６１】
別の態様において、本発明の薬剤は、ボツリヌス毒素の１つの型の軽鎖を含む治療成分および別のボツリヌス毒素のＨＮまたはＨＮフラグメントを含む移行成分を含んでなる(これはキメラタンパク質を構成する)。例えば、１つの好ましい態様において、本発明の薬剤は、ＬＨＮ(ここで、Ｌ鎖はボツリヌス毒素Ｂ型から誘導され、ＨＮはボツリヌス毒素Ａ型から誘導される)を含んでなる。この例において、ボツリヌス毒素Ａ型のＨＮフラグメントは、Shoneら[Eur.J.Biochem. 167, 1987, 175-180]の方法に従って得られる。ボツリヌス毒素Ｂ型のＬ鎖は、SathyamoorthyおよびDasGupta[J.Biol.Chem. 260, 1985, 10461-10466]の方法に従って得られる。次いで、ボツリヌス毒素Ａ型のＨ鎖フラグメントのアミン末端セグメント上の遊離システインを、１０倍モル過剰のジピリジルジスルフィドの添加と、その後の４℃で一晩のインキュベートによって誘導化する。次いで、過剰のジピリジルジスルフィドおよびチオピリドン副生物を、ＰＤＩＯカラム(Pharmacia)でタンパク質をＰＢＳに脱塩することによって除去する。次いで、この誘導化したＨＮを、１ｍｇ／ｍｌ以上のタンパク質濃度まで濃縮し、次いで、ボツリヌス毒素Ｂ型に由来するＬ鎖の等モル部分(ＰＢＳ中で＞１ｍｇ／ｍｌ)と混合する。室温で一晩インキュベートした後、混合物を、Superose 6(Pharmacia)のサイズ排除クロマトグラフィーによって分離し、分画をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析する。次いで、このキメラＬＨＮを、標的化コンジュゲートを得るための脚色に利用することができる。
【００６２】
１つの態様において、軽鎖成分および移行成分は、ボツリヌス毒素(好ましくはボツリヌス毒素Ａ型)から誘導される。例えば、ＬＨＮを、組換え法によって、または二鎖ボツリヌス毒素の重鎖を化学的に改変してＨＣ部分を削除することによって得ることができる。神経毒分子(例えばボツリヌス毒素Ａ型)のＨＣを、Ｈ鎖の他のセグメント(ＨＮ)から除去して、ＨＮフラグメントが神経毒分子のＬ鎖にジスルフィド結合したまま残存してＬＨＮフラグメントを与えるようにしうることが当分野でよく知られている。このフラグメントを、標的化成分に共有結合させて、本発明の薬剤を得ることができる。
【００６３】
広い態様において、本発明の標的化成分は、特異的な標的細胞受容体(例えばＧｎＲＨ受容体、好ましくは下垂体ＧｎＲＨ受容体)に結合することができる。
【００６４】
広い態様において、標的化成分はアミノ酸成分を含んでなる。１つの態様において、このアミノ酸成分は、ＧｎＲＨ受容体(好ましくは下垂体ＧｎＲＨ受容体)に特異的に結合する抗体を含んでなる。好ましい態様において、標的化成分は、ＧｎＲＨ受容体に結合する抗体のＦａｂ部分を含んでなる。さらに好ましい態様において、標的化成分は、抗体の可変領域を含んでなる。この可変領域は、当分野で周知の方法に従って組換えにより得ることができる。
【００６５】
１つの態様において、アミノ酸成分はペプチドを含んでなる。このペプチドは、例えばＧｎＲＨを含有することができる。ＧｎＲＨはデカペプチドであり、下記の化学構造を有する：
【化２】
2010174037.tif 000003
【００６６】
１つの態様において、ペプチドは、ＧｎＲＨの類似体(ＧｎＲＨ-Ａ)を含有することもできる。好ましい態様において、ＧｎＲＨ-Ａの一般式は次の通りである：
【化３】
2010174037.tif 000004
[配列中、Ｘは、任意のアミノ酸であり、好ましくはアミノ酸グリシン、リシン、Ｄ-リシン、オルニチン、Ｄ-オルニチン、グルタミン酸、Ｄ-グルタミン酸、アスパラギン酸、Ｄ-アスパラギン酸、システイン、Ｄ-システイン、チロシンまたはＤ-チロシンであり；
Ｚは、Gly-NH2、エチルアミド、およびAza-Gly-NH2からなる群から選択される置換基である]。
【００６７】
この一般構造の可能性の範囲内で、特に好ましいＧｎＲＨは次の通りである：
【化４】
2010174037.tif 000005
【００６８】
表１に、限定のためのものではない種々のＧｎＲＨ-Ａの例を挙げる。
【表１】
2010174037.tif 000006
【００６９】
１つの態様において、標的化成分を、ボツリヌス毒素(好ましくはＨＣを含まないボツリヌス毒素、例えばＬＨＮ)に結合させて、本発明の薬剤を得ることができる。
【００７０】
好ましい態様において、標的化成分はＧｎＲＨ-Ａである。例えば、ＧｎＲＨ-Ａをボツリヌス毒素またはＬＨＮに結合させて、本発明の薬剤を得ることができる。好ましくは、Ｌの治療機能およびＨＮの移行機能を実質的に損なわないようにして、ＧｎＲＨ-Ａ分子をＬＨＮに結合させる。１つの態様において、ＬＨＮをＧｎＲＨ-Ａの６位に結合させて、本発明の薬剤を得る。本発明をいずれかの特定の理論または作用メカニズムに限定することを望むものではないが、ＧｎＲＨ-Ａの６位への結合は、ＧｎＲＨ-ＡがＧｎＲＨ受容体(好ましくは、下垂体ＧｎＲＨ受容体)に効果的に結合するのを可能にするものと考えられる。
【００７１】
広い態様において、スペーサーを用いて、本発明の成分を物理的にさらに隔離することができる。例えば、本発明の薬剤は、スペーサーを介してＧｎＲＨに結合したＬＨＮを含んでなることができる。好ましくは、スペーサーは、成分間の距離を創製して、成分に対する立体障害を最少化または排除するように機能する。さらに好ましくは、この立体障害の最少化または排除は、それぞれの成分がより効率的に機能することを可能にする。
【００７２】
１つの態様において、スペーサーは、ヒト免疫グロブリンのヒンジ領域に類似するかまたはそれと同一であるプロリン、セリン、トレオニンおよび／またはシステインに富むアミノ酸配列を含んでなる。好ましい態様において、スペーサーは、免疫グロブリンｇ１ヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでなる。このような配列は、下記の配列を有する：
【化５】
2010174037.tif 000007
【００７３】
また、スペーサーは、炭化水素部分を含んでなることもできる。例えば、このような炭化水素部分は、下記の化学式で示される：
【化６】
2010174037.tif 000008
【００７４】
広い態様において、リンカー(以下において、「リンカーＹ」または「Ｙ」)を用いて、２またはそれ以上の分子、成分および／またはスペーサーを共に結合することができる。例えば、リンカーＹを用いてＧｎＲＨ-ＡをＬＨＮに結合することができる。別の態様において、リンカーＹを用いてＬＨＮをスペーサーに結合することができ、次いで、このスペーサーを別のリンカーＹによってＧｎＲＨに結合して、下記の構造を含んでなる薬剤を得ることができる：
【化７】
2010174037.tif 000009
【００７５】
リンカーＹは、２-イミノチオラン、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、４-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-(２-ピリジルジチオ)トルエン(ＳＭＰＴ)、ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＭＢＳ)、Ｎ-スクシンイミジル (４-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(ＳＩＡＢ)、スクシンイミジル ４-(ｐ-マレイミドフェニル)ブチレート(ＳＭＰＢ)、１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)、ビス-ジアゾベンジジンおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択することができる。
【００７６】
１つの態様において、リンカーＹは、成分のアミノ酸基のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基またはヒドロキシル基に結合することができる。例えば、リンカーＹは、ＧｎＲＨ-Ａのアミノ酸、好ましくは６位のアミノ酸のカルボキシル基に結合することができる。
【００７７】
記載した化学を用いて、記載した本発明の成分を結合することができるが、本発明の薬剤の標的化成分を別の成分に化学的に結合することができる当業者に既知の任意の他の結合化学が、本発明の範囲内に含まれる。
【００７８】
広い態様において、本発明の薬剤は、さらに促進剤成分にコンジュゲート化されていてよい。促進剤成分は、少なくとも、血液脳関門を越える薬剤の輸送を助けるのに有効である。
【００７９】
１つの態様において、促進剤成分は陽イオン性の脂質分子を含む。陽イオン性の脂質分子を、本発明の薬剤(例えば、ＬＨＮ-ＧｎＲＨ分子)に、当業者に既知の方法(リンカーＹの使用を含む)を用いて共有結合によって結合させることができる。これら陽イオン性脂質の例は、米国特許Ｎo.５,４５９,１２７に開示されている(該特許の開示は、その全体が本明細書の一部を構成する)。
【００８０】
１つの態様において、促進剤成分には、血液脳関門において受容体媒介のトランスサイトーシスを経ることができる分子が含まれる。これら分子の例には、限定するものではないが、インスリン、ＩＧＦ-IIおよびトランスフェリンが含まれる[ShoichetおよびWinn (2000), Advanced Drug Delivery Reviews 42, 81-102; Laszloら (2000), Targeting Drugs to the Brain by Redox Chemical Delivery Systems, 377-416]。
【００８１】
好ましい態様において、促進剤成分は、血液脳関門を越える本発明の薬剤の輸送を容易にすることができるキャリアーペプチドである。このようなキャリアーペプチドには、例えば、下記の式によって示されるペネトラチン(penetratin)ペプチドが含まれる：
【化８】
2010174037.tif 000010
【００８２】
本発明の薬剤は、ヒト医薬において利用される可能性を有する。例えば、前立腺癌は癌死の重大な原因のままであり、男性において第２に多い癌である。現在の前立腺癌の治療方法は、患者の去勢を行って、癌を増殖させると考えられる循環テストステロン／ＤＨＴのレベルを減少させることである。しかし、このような手術介入は過激すぎるであろう。この代わりに、本発明の薬剤を投与して前立腺癌を治療することができる。例えば、有効量のＬＨＮ-ＧｎＲＨ-インスリンを患者に全身投与して、血清テストステロン／ＤＨＴレベルを低下させ、この疾患を適切に治療することができる。
【００８３】
また、本発明の薬剤を投与して子宮内膜症を治療することもできる。子宮内膜症は、女性の腹膜および骨盤において、子宮が痛みを伴う子宮内膜組織の増殖を生じる状態である。この状態を、患者の循環ゴナドトロピンのレベルを低下させることによって治療することができる。このように、有効量の本発明の薬剤を投与して、ゴナドトロピンのレベルを低下させ、子宮内膜症を治療することができる。
【００８４】
また、当業者なら、本発明の薬剤を投与して、身体のゴナドトロピンレベルの低下によって利益を受けるであろう医学的状態を治療しうることを理解するであろう。限定のためのものではない追加の例をさらに下記に示す。
【００８５】
投与すべき薬剤の量は多くの因子に依存する。例えば、各成分がそのそれぞれの機能をより良好に発揮することができるほど、所望の治療効果を得るために要する薬剤の量が少なくなる。当業者なら、それぞれの特定薬剤について特定用量を容易に決定することができる。治療成分、移行成分および標的化成分を含んでなる天然、突然変異または組換えボツリヌス毒素Ａ型を用いる薬剤については、投与すべき薬剤の有効量は、約１〜５００Ｕのボツリヌス毒素であろう。
【００８６】
さらに、薬剤の投与量は、治療される特定の疾患、その重篤度および他の種々の患者の変数(大きさ、体重、年齢、および治療に対する反応性を含む)に応じて広く変化することができる。このような決定は、当業者にとって普通のことである[例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), Anthony Fauciら編, 第14版, McGraw Hill刊行を参照]。１つの態様において、この薬剤投与量は、下垂体からのゴナドトロピンの分泌を、約５〜８０％、好ましくは約３０〜５０％低下させることができる。別の態様において、この薬剤投与量は、循環ゴナドトロピンレベルを、約５〜８０％、好ましくは約３０〜５０％低下させることができる。
【００８７】
本発明の投与の経路には、限定はされないが、中枢神経系への直接注射が含まれる。このような注射には、直接的な脊髄内注射および頭蓋内注射が含まれる。治療を行っている医師が、薬剤(例えば、ＬＨＮ-ＧｎＲＨ-Ａ)を下垂体(好ましくは、下垂体前葉)に直接的に頭蓋内投与するのが好ましい。頭蓋内注射法は、当分野で広く知られている。例えば、米国特許出願Ｎo.０９／６９２,８１１(2000年11月20日出願)は、薬物の種々の頭蓋内投与法を開示しており、これらを本発明の薬剤の頭蓋内投与に容易に採用することができる[薬物の長期頭蓋内供給に有用なデバイスを開示する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７８８０(ＷＯ００／０７６５２)をも参照]。
【００８８】
他の投与経路には、限定するものではないが、経皮、腹膜、皮下、筋肉内、静脈内および直腸内が含まれる。本発明の薬剤それ自体が、血液脳関門を通過してその標的部位(好ましくは、下垂体前葉)に到達しえないことがわかったときには、これらの薬剤を、投与前に促進剤成分にコンジュゲート化するのが好ましい。
【００８９】
本発明の広い態様によれば、組換え技術を使用して、少なくとも１つの薬剤成分を製造する。例えば、国際特許出願公開ＷＯ９５／３２７３８(この開示の全体が本明細書の一部を構成する)を参照。この技術は、いずれかの成分(例えば、治療、移行、および／または標的化成分)のコードを有する、合成オリゴヌクレオチド配列または天然供給源からクローン化したＤＮＡから遺伝物質を得る工程を包含する。初めに、この遺伝子構築物をクローニングベクター(例えば、ファージ、プラスミド、ファージミドまたは他の遺伝子発現ベクター)と融合させることによって、遺伝子構築物を、増幅のための宿主細胞に導入する。この組換えクローニングベクターを、哺乳動物、酵母または細菌宿主中に導入する。好ましい宿主は大腸菌である。宿主細胞中での組換え遺伝子の発現の後、得られたタンパク質を、通常の方法を使用して単離することができる。発現させたタンパク質は、薬剤の３つ全ての成分を含むことができる。例えば、発現させたタンパク質は、ボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖(治療成分)、ボツリヌス毒素Ａ型のＨＮ(移行成分)、ならびに、生理学的条件下でＧｎＲＨ受容体(好ましくは、下垂体前葉ＧｎＲＨ受容体)に結合するＧｎＲＨ-Ａ(標的化成分)を含むことができる。１つの態様において、発現させたタンパク質は、薬剤の３つ全てより少ない成分を含むことができる。このような場合、成分を、好ましくはリンカーＹを介して化学的に連結することができる。
【００９０】
これらの薬剤を組換えによって製造することには多数の利点が存在する。例えば、嫌気性クロストリジウム培養物からの毒素の製造は、面倒かつ時間のかかる方法であり、いくつかのタンパク質沈殿工程ならびに長時間および反復の毒素結晶化または数段階のカラムクロマトグラフィーのいずれかを必要とする多工程の精製プロトコールを包含する。特に、生成物の高毒性は、操作を厳格な封じ込め(ＢＬ３)のもとで行わなければならないことを強制する。発酵過程中に、折り畳まれた一本鎖神経毒が、ニッキングと称される過程により、内因性クロストリジウムプロテアーゼによって活性化される。これには、一本鎖から約１０個のアミノ酸残基を除去して、二鎖形態(２つの鎖が鎖内ジスルフィド結合によって共有結合したままである)を創製することが含まれる。
【００９１】
ニッキングされた毒素は、ニッキングされていない形態よりも活性が高い。ニッキングの量および正確な位置は、毒素を産生する細菌の血清型または外側ループで行われる修飾によって変化する。一本鎖毒素の活性化、即ち、ニッキングされた毒素の収率の相違は、所与の菌株によって産生されるタンパク質分解活性の種類および量の変動による。例えば、ボツリヌス菌Ａ型の一本鎖毒素の９９％以上は、ボツリヌス菌Ｈall Ａ菌株によって活性化されるが、Ｂ型およびＥ型菌株は、より低い活性化量で毒素を産生する(発酵時間に依存して０〜７５％)。即ち、成熟毒素の高い毒性が、治療薬剤としての毒素の商業生産において重要な部分を占める。
【００９２】
従って、操作されたクロストリジウム毒素の活性化の程度は、これらの物質の製造のための重要な検討項目である。毒素(例えば、ボツリヌス毒素および破傷風毒素)を、安全であり、単離が容易であり、かつ完全活性形態への変換が簡単である、比較的非毒性の一本鎖(または毒活性を減少させた一本鎖)として、迅速に増殖する細菌(例えば、大腸菌細胞)において高収率で組換えにより発現させることができるなら、これは大きな利点となるであろう。
【００９３】
安全を第一に考慮して、従来の研究は、破傷風毒素およびボツリヌス毒素の個々のＨ鎖およびＬ鎖の大腸菌での発現および精製に集中していた[これらの単離した鎖自体は非毒性である；Liら (1994)、Biochemistry、33、7014〜7020、およびZhouら (1995)、Biochemistry、34、15175〜15181を参照(これらは、本明細書の一部を構成する)]。これらペプチド鎖の個別の製造の後、厳格に制御された条件下で、Ｈ鎖およびＬ鎖のサブユニットを、酸化的ジスルフィド結合によって結合させて、神経麻痺性の二鎖を得ることができる。
【００９４】
１つの態様において、治療成分および移行成分を含んでなる薬剤を、ニッキングされていない一本鎖として組換えによって製造する。Dollyらの米国特許出願Ｎo.０９／６４８,６９２(この開示は、その全体が本明細書の一部を構成する)を参照。好ましい態様において、薬剤は、一本鎖として発現された後にインビトロでの特異的切断に感受性であるアミノ酸配列を含む。このようなタンパク質には、クロストリジウム毒素およびその誘導体、例えば米国特許Ｎo.５,９８９,５４５および国際特許出願ＷＯ９５／３２７３８(これらは、その全体が本明細書の一部を構成する)に開示されたタンパク質が含まれる。
【００９５】
神経毒、本発明の薬剤または毒素の取扱いに付随する安全性リスクを最小にするために、薬剤の前駆体を、低活性(または不活性)の一本鎖プロ形態として発現させ、次いで、インビトロでの注意深く制御されたタンパク質分解反応によって、好ましくは元の天然神経毒と同レベルの効力に活性化する。タンパク質分解切断の効率および速度を改善するために、操作したタンパク質分解切断部位を、ホロトキシン基質へのプロテアーゼの接近性を促進する一本鎖アミノ酸鎖のＨ部分とＬ部分の間の特別に設計されたループ中に存在するように設計することができる。
【００９６】
ヒトまたは通常のプロテアーゼによる毒素の意図しない活性化のリスクを減少させるために、切断部位のアミノ酸配列を、好ましくは、ヒトにおいて通常は存在しないタンパク質分解酵素に対して高い特異性を有するように設計する(ヒトプロテアーゼとして、または予知可能なヒト動物相および植物相の一部において存在するものとして)。このようなプロテアーゼの非限定的な例には、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫを切断するウシエンテロキナーゼ；配列ＥＸＸＹＸＱＳ／Ｇを切断するタバコetchウイルス(ＴＥＶ)プロテアーゼ；配列ＨＹまたはＹＨを切断するBacillus amyliquifaciens由来のGENENASEＲ；およびアミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰを切断するヒトライノウイルス３Ｃ由来のPRESCISSIONＲプロテアーゼが含まれる。上記で使用する文字Ｘは、任意のアミノ酸を示す。特記しない限り、本明細書中に示した全アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への方向であり、全ヌクレオチド配列は、５'から３'への方向(左から右)である。
【００９７】
１つの態様において、ボツリヌス菌サブタイプＥ毒素の鎖間ループ領域(通常、これは細菌および哺乳動物におけるタンパク質分解ニッキングに耐性である)を修飾して、挿入タンパク質分解切断部位を含有させ、このループ領域を、本発明の一本鎖毒素または改変毒素分子中の鎖間ループ領域として使用する。ボツリヌス菌サブタイプＥ由来のループの使用により、ニッキングされていない毒素分子がインビボで安定化され、選択したプロテアーゼの使用によって活性化されるまで、望ましくない切断に対してそれを耐性にするものと考えられる。
【００９８】
１つの態様において、ＨＣをコードするＤＮＡ配列を、異種遺伝子発現系に含まれるクロストリジウム毒素をコードする組換えＤＮＡ配列中に含有させる。従って、Ｈ鎖の対応するＨＣ部分は、産生されないであろう。これも、クロストリジウム毒素製造に付随する安全性の危険を低下させるであろう。
【００９９】
１つの態様において、ＧｎＲＨを、当業者には周知である系と同様の異種組換えＤＮＡ発現系によって製造することができる。別の態様において、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ-Ａを、当業者には既知であるように、溶液または固相における通常のｔ-Ｂｏｃ／Ｆｍｏｃ法によって製造することができる。また、同様の合成方法が本発明の範囲内に含まれる。これらは、例えば、Miltonら[1992, Biochemistry 31, 8799-8809]およびSwainら[1993, Peptide Research 6, 147-154]が使用した方法論である。
【実施例】
【０１００】
下記の限定のためのものではない実施例は、当業者に、ゴナドトロピン分泌に関連する医学的状態を治療するための特に好ましい方法および本発明の薬剤の製造方法を提供するものである。これらの方法は、本発明の範囲内に含まれる例であり、本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【０１０１】
実施例１：子宮内膜症の治療
３４歳の女性は、自然流産を経た後に医学的手当てを求めた。この患者は、妊娠の２年ほど前から、性交疼痛症(痛みを伴う性交)、月経困難症(痛みを伴う月経)、および排便障害(痛みを伴う腸排便)に苦しんでいたと報告した。身体検査により、直腸子宮ひだ上に複数の痛みを感じる節および子宮腔内層の外側に子宮内膜組織が存在することがわかった。子宮内膜症の予備診断は、腹腔鏡検査(腹膜の検査)中に確認された。この子宮内膜症は、この疾患の重篤なケースを示す段階IIIの子宮内膜症と診断された(段階Ｉは穏やかなケースであり、段階IVは甚だしいケースである)。
【０１０２】
この患者は出産年齢にあり、将来の出産を望んでいたので、手術は除外された。この患者を、ＧｎＲＨアゴニストであるDanazolTMで処置した。DanazolTM処置の４日後に、患者は、重篤な水腫および無能力化の点にまで至る筋肉弱化を訴えた。患者は薬物を中止し、子宮内膜症に苦しみ続けた。
【０１０３】
次いで、医師は、有効量の本発明の薬剤(例えば、ＬＨＮ-ＧｎＲＨ)を投与した。この薬剤を、下垂体前葉に頭蓋内投与した。頭蓋内投与するための方法は、同時継続の特許出願Ｎo.０９／６９２８１１[2000年10月20日出願、"Method for Treating Endocrine Disorders"；この全体が本明細書の一部を構成する]に記載されている。
【０１０４】
投与の数日後に、患者は、生活の質の実質的な改善に気付いた。排便障害は止まった。２〜３週間にわたり、患者は、月経困難症および性交疼痛症の症状の軽減に気付いた。２ヶ月後に、身体検査により、子宮内膜症の重篤度が全体的に低下し、その時点では段階IIに分類されることがわかった。１２ヶ月目に、子宮内膜症は段階Ｉに分類された。１８ヶ月目に、身体検査により、子宮内膜症の徴候がないこと、および患者の症状がないことがわかった。
【０１０５】
実施例２：前立腺癌の治療
５４歳の男性の試験結果は、ＰＳＡ(前立腺特異的な抗原)に対して陽性であった。ＰＳＡ試験は、通常の身体検査中に行った。この患者は、前立腺癌の症状を示していなかった。微細針の吸引生検をこの患者に対して行い、初期段階の前立腺癌を確認した。下垂体前葉に直接投与するＬＨＮ-ＧｎＲＨの頭蓋内注射によって、この患者を治療した。ＬＨＮ-ＧｎＲＨの用量は、患者の循環ゴナドトロピンレベルを８０〜３０％、好ましくは５０％低下させるのに十分な量であった。
【０１０６】
この患者を、癌の進行について密接にモニターした。その後の２４ヶ月間にわたり、癌の広がりはなかった。また、検出しうる前立腺のさらなる肥大はなかった。治療を２７ヶ月目まで繰り返した。最初の診断から３６ヶ月目に、患者はもはやＰＳＡに対して陽性ではなかった。
【０１０７】
実施例３：性的早熟の治療
５歳の女性は、性的早熟と診断された。この患者の身体的症状は、乳房の発達および陰毛の成長であった。また、患者はこの１ヶ月中に月経が始まっていた。膣スミアは、患者の年齢に対しては異常に高いエストロゲンレベルを検出した。また、尿試験も、異常に高いゴナドトロピンレベルを示した。この子供の手、ひざ、手首および臀部のＸ線は、骨端閉鎖が始まる徴候を示した。患者の身長は、５歳の子供の正常な範囲内であった。しかし、この状態を治療せずに放置すると、骨端閉鎖が子供の成長を完全に阻害するであろう。
【０１０８】
この患者にＬＨＮ-ＧｎＲＨを注射した。ＬＨＮ-ＧｎＲＨの用量は、患者の循環ゴナドトロピンレベルを８０〜３０％、好ましくは５０％低下させるのに十分な量であった。注射は頭蓋内であり、薬物を下垂体前葉に投与した。２週間以内に、乳房の大きさの減少が患者において見られた。３ヶ月の経過後に、患者の月経は止まり、青春期に到達するどのような徴候をも示さなくなった。１年後に、この患者は、その年齢の正常な子供の約８０％の身長まで成長した。
【０１０９】
実施例４：子宮内膜癌の治療
５５歳の女性は、身体検査中に閉経後出血を訴えた。初期段階の子宮内膜癌(子宮癌)の陽性の診断が、臨床試験(例えば、子宮内膜生検およびシラー試験)に基づいて為された。
この患者に部分的子宮摘出術を行って癌を除去した。さらに、患者にＬＨＮ-ＧｎＲＨを頭蓋内注射した。ＬＨＮ-ＧｎＲＨの用量は、患者の循環ゴナドトロピンレベルを８０〜３０％、好ましくは５０％低下させるのに十分な量であった。２４ヵ月後に、癌は再発しなかった。注射を２７ヵ月後に繰り返した。
【０１１０】
実施例５：乳癌の治療
４２歳の女性は、通常の自己乳房検査中に左側乳房において塊を発見した後に、医師の医学的検査を求めた。この患者は乳癌の家族歴を有しており、これまで子供を宿したことがなかった。これら２つの因子により、この患者は乳癌の高危険度の群に入った。臨床評価中に、乳癌の存在が確認された。この医学的診断は、乳房撮影および針生検からなっていた。
【０１１１】
癌は、管中に含まれる小節内に限定されているようであった。これと乳房切除術に対する患者の耐性とを組合せると、この患者は、腫瘤摘出術と術後薬物治療の組合せの優れた候補であった。塊を手術によって除去し、患者をＬＨＮ-ＧｎＲＨの頭蓋内注射によって治療した。ＬＨＮ-ＧｎＲＨの用量は、患者の下垂体分泌ゴナドトロピンを約８０〜３０％、好ましくは５０％低下させるのに十分な量であった。手術後の最初の６ヶ月間は毎月毎に、その後は２ヶ月毎に、患者の癌の広がりをチェックした。手術後の２年間、癌の徴候はなかった。
【０１１２】
実施例６：ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖遺伝子のサブクローニング
この実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチド配列をクローン化する方法を記載する。ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖をコードするＤＮＡ配列を、配列：
【化９】
2010174037.tif 000011
を有する合成オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲプロトコールによって増幅することができる。これらプライマーの使用により、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖遺伝子フラグメントの５'および３'末端に、それぞれＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を導入することができる。次いで、これらの制限部位を使用して、増幅生成物の一定方向のサブクローニングを容易にすることができる。さらに、これらのプライマーは、Ｌ鎖コード配列のＣ末端に終止コドンを導入する。ボツリヌス菌(６３Ａ株)由来の染色体ＤＮＡを、増幅反応における鋳型として使用することができる。
【０１１３】
ＰＣＲ増幅を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.３)、５０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸(ｄＮＴＰ)、５０ｐモルの各プライマー、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、および２.５単位のＴａｑポリメラーゼ(Promega)を含む０.１ｍｌの体積中で行う。反応混合物を、３５サイクルの変性(９４℃で１分間)、アニーリング(３７℃で２分間)、および重合(７２℃で２分間)に供した。最後に、反応物を７２℃でさらに５分間伸長する。
【０１１４】
ＰＣＲ増幅生成物を、ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ*にライゲートして、プラスミドｐＳＡＬを得ることができる。このプラスミドを保有する細菌形質転換体を、常法によって単離することができる。クローン化Ｌ鎖ポリヌクレオチドの同一性を、製造元の指示書に従ってSEQUENASE(United States Biochemicals)を使用する二本鎖プラスミド配列決定によって確認する。必要に応じて、重複配列決定を行うために合成オリゴヌクレオチド配列決定プライマーを調製する。クローン化配列は、Binzら[J.Biol.Chem.、265、9153 (1990)]およびThompsonら[Eur.J.Biochem.、189、73 (1990)]によって開示された配列と同一であることが見い出される。
また、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の酵素活性を落とすように設計された部位指向性の突然変異体を創製することもできる。
【０１１５】
実施例７：ボツリヌス毒素Ａ型-Ｌ(ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ)鎖融合タンパク質の発現
この実施例は、ｐＣＡ-Ｌプラスミドを保有する細菌中での野生型Ｌ鎖(これは治療成分として働くことができる)の発現を確認する方法を記載する。ｐＣＡＬを保有する十分に単離した細菌コロニーを使用して、０.１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％(w／v)グルコースを含むＬ-ブロスに接種し、震盪しながら３０℃で一晩増殖させる。この一晩培養物を、０.１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む新鮮なＬ-ブロス中に１：１０希釈し、２時間インキュベートする。融合タンパク質の発現を、最終濃度０.１ｍＭへのＩＰＴＧの添加によって誘導する。３０℃でさらに４時間のインキュベートの後、細菌を、６,０００ｘｇで１０分間の遠心によって集める。
【０１１６】
小規模ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により、ＩＰＴＧ誘導した細菌由来のサンプルにおいて、９０ｋＤａのタンパク質バンドの存在を確認した。このＭｒは、ＭＢＰ(約４０ｋＤａ)成分およびＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖(約５０ｋＤａ)成分を有する融合タンパク質の推定サイズと一致する。さらに、対照培養物から単離したサンプルと比較すると、ＩＰＴＧ誘導したクローンは、実質的により大量の融合タンパク質を含んでいた。
【０１１７】
また、ＩＰＴＧ誘導した細菌抽出物中の所望の融合タンパク質の存在も、Cenci di Belloら[Eur.J.Biochem.、219、161 (1993)]により記載されたポリクローナル抗Ｌ鎖プローブを使用するウェスタンブロットによって確認される。ＰＶＤＦメンブラン(Pharmacia、Milton Keynes、英国)上の反応性バンドを、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗ウサギ免疫グロブリン(Bio-Rad、Hemel Hempstead、英国)およびＥＣＬ検出システム(Amersham、英国)を使用して視覚化する。ウェスタンブロットの結果により、支配的な融合タンパク質の存在が、完全サイズの融合タンパク質よりも低いＭｒのタンパク質に対応するいくつかのかすかなバンドと共に確認された。この観察により、融合タンパク質の限定的な分解が、細菌中または単離操作中に起こることが示唆された。単離操作中の１ｍＭおよび１０ｍＭのベンズアミジン(Sigma、Poole、英国)のいずれの使用によっても、このタンパク質分解は排除されなかった。
【０１１８】
上記操作によって単離された無傷の融合タンパク質の収率は、本明細書中に記載した全ての操作に対して完全に当てはまった。染色されたＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルからの概算に基づくと、ＩＰＴＧで誘導された細菌クローンは、１リットルの培養物あたり５〜１０ｍｇの全ＭＢＰ野生型または突然変異Ｌ鎖融合タンパク質を産生した。即ち、本明細書中に開示したＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖融合タンパク質の製造方法は、限定的なタンパク質分解が起こるにもかかわらず、効率が高い。
【０１１９】
ｐＣＡＬおよびｐＣＡＬ-ＴｙｒＵ７発現プラスミドによってコードされるＭＢＰ-Ｌ鎖融合タンパク質を、アミロースアフィニティークロマトグラフィーによって細菌から精製する。次いで、組換え野生型または突然変異のＬ鎖を、Ｘ2因子による部位特異的な切断によって、融合タンパク質の糖結合ドメインから分離する。この切断操作により、遊離ＭＢＰ、遊離Ｌ鎖、および少量の未切断融合タンパク質が得られた。このような混合物中に存在する得られたＬ鎖は、所望の活性を有することを示すが、本発明者は追加の精製工程を使用した。即ち、切断生成物の混合物を、第２のアミロースアフィニティーカラムに供する(このカラムはＭＢＰおよび未切断融合タンパク質の両方を結合した)。遊離Ｌ鎖はアフィニティーカラムに保持されず、これを下記の実験において使用するために単離する。
【０１２０】
実施例８：融合タンパク質の精製および組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の単離
この実施例は、細菌クローンから野生型組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖を製造および精製する方法を記載する。野生型ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖タンパク質を発現する細菌の１リットル培養物からのペレットを、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフロオリド(ＰＭＳＦ)および１０ｍＭベンズアミジンを含むカラム緩衝液[１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴ]に再懸濁し、超音波処理によって溶解する。この溶解物を、４℃における１５,０００ｘｇで１５分間の遠心によって透明にする。この上清を、アミロースアフィニティーカラム[２×１０ｃｍ、樹脂３０ｍｌ](New England BioLabs、Hitchin、英国)に適用する。２８０ｎｍでの安定な吸光度の読み値によって判定したときに溶出液がタンパク質を含まなくなるまで、未結合タンパク質を、カラム緩衝液により樹脂から洗浄する。次いで、結合したＭＢＰ-Ｌ鎖融合タンパク質を、１０ｍＭマルトースを含むカラム緩衝液によって溶出させる。融合タンパク質を含む分画をプールし、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、および１ｍＭ ＤＴＴを補足した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)に対して４℃で７２時間透析する。
【０１２１】
融合タンパク質を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、および１ｍＭ ＤＴＴを補足した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)緩衝液に対して透析しながら、酵素：基質＝１：１００の比のＸ2因子(Promega、Southampton、英国)で切断することができる。透析を４℃で２４時間行う。この切断工程で得られたＭＢＰおよび野生型または突然変異Ｌ鎖のいずれかの混合物を、カラム緩衝液で平衡化した１０ｍｌのアミロースカラムにかける。通過した分画の一部を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析用に調製し、Ｌ鎖を含むサンプルを同定する。通過した分画の残りの部分を、−２０℃で保存する。全大腸菌抽出物または精製タンパク質を、ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解し、常法に従ってＰＡＧＥに供する。この操作の結果は、組換え毒素フラグメントがサンプルのタンパク質含量の約９０％であることを示した。
【０１２２】
上記の結果は、本明細書中に記載したＭＢＰ-Ｌ鎖融合タンパク質の創製アプローチを使用して、野生型および突然変異の組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖を効率的に製造しうることを示す。さらに、これらの結果は、組換えＬ鎖を、融合タンパク質のマルトース結合ドメインから分離し、その後に精製しうることを示す。
【０１２３】
組換えＬ鎖生成物およびその天然の対応物の酵素活性を比較するために、高感度の抗体に基づくアッセイを開発する。このアッセイは、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位に対応するＳＮＡＰ-２５の無傷のＣ末端領域に特異性を有する抗体を使用する。ＳＮＡＰ-２５のＢｏＮＴ／Ａ切断の反応生成物のウェスタンブロットは、抗体がＳＮＡＰ-２５サブフラグメントに結合しえないことを示した。従って、以下の実施例において使用した抗体試薬は、無傷のＳＮＡＰ-２５のみを検出した。抗体結合がないことを、添加したＢｏＮＴ／Ａ軽鎖またはその組換え誘導体によって媒介されるＳＮＡＰ-２５タンパク質分解の指標として使用した。
【０１２４】
実施例９：ＳＮＡＰ-２５基質に対する組換えＬ鎖のタンパク質分解活性の評価
天然および組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の両方は、ＳＮＡＰ-２５基質をタンパク質分解することができる。定量アッセイを使用して、野生型およびその組換え類似体のＳＮＡＰ-２５基質切断能力を比較することができる。このアッセイに使用する基質を、トロンビンの切断部位を含むグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)-ＳＮＡＰ-２５融合タンパク質を調製することによって獲得し、ｐＧＥＸ−２Ｔベクターを使用して発現させ、グルタチオンアガロースにおけるアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。次いで、ＳＮＡＰ-２５を、酵素：基質の比＝１：１００において、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２.５ｍＭ ＣａＣｌ2を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.５)中のトロンビン[Smithら、Gene、67、31 (1988)]を使用して、融合タンパク質から切断した。未切断融合タンパク質および切断グルタチオン結合ドメインは、ゲルに結合した。組換えＳＮＡＰ-２５タンパク質を、後者の緩衝液で溶出させ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.５)に対して４℃で２４時間透析する。総タンパク質濃度を、常法によって測定する。
【０１２５】
ＳＮＡＰ-２５のＣ末端領域に特異的なウサギポリクローナル抗体を、アミノ酸配列：
【化１０】
2010174037.tif 000012
を有する合成ペプチドに対して惹起する。このペプチドは、シナプス原形質膜タンパク質の残基１９５〜２０６および天然ＳＮＡＰ-２５において見い出されないＮ末端システイン残基に対応する。合成ペプチドを、架橋剤としてマレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＭＢＳ)(Sigma、Poole、英国)を使用してウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)(Sigma、Poole、英国)に結合させて、抗原性を改善する[Liuら、Biochemistry、18、690 (1979)]。抗ペプチド抗体のアフィニティー精製を、架橋剤エチル３-(３-ジメチルプロピル)カルボジイミドを使用してヨード酢酸で活性化した、アミノアルキルアガロース樹脂(Bio-Rad、Hemel Hempstead、英国)にＮ末端システイン残基を介してコンジュゲート化した抗原ペプチドを有するカラムを使用して行う。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.４)および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液でカラムを連続洗浄した後、ペプチド特異的な抗体を、１００ｍＭグリシン(ｐＨ２.５)および２００ｍＭ ＮａＣｌの溶液を使用して溶出させ、０.２ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)中和緩衝液を含む試験管に集める。
【０１２６】
野生型Ｌ鎖を含む全ての組換え調製物を、０.０２％ Lubrolおよび１０μＭ酢酸亜鉛を含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.５)中に４℃で一晩透析し、次いで、その酵素活性を評価する。３７℃で３０分間、２０ｍＭ ＤＴＴで予め還元したＢｏＮＴ／Ａならびにこれらの透析サンプルを、１ｍＭ ＤＴＴを補足した後者のＨＥＰＥＳ緩衝液で異なる濃度に希釈する。
【０１２７】
反応混合物は、５μｌの組換えＳＮＡＰ-２５基質(最終濃度８.５μＭ)および２０μｌの還元ＢｏＮＴ／Ａまたは組換え野生型Ｌ鎖のいずれかを含む。全サンプルを、３７℃で１時間インキュベートし、次いで２５μｌの２％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)および５ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液により反応を停止させる[Foranら、Biochemistry、33、15365 (1994)]。各サンプルの一部を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥサンプル緩衝液の添加および煮沸によってＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびポリクローナルＳＮＡＰ-２５抗体を用いるウェスタンブロットのために調製する。抗ＳＮＡＰ-２５抗体の反応性を、ＥＣＬ検出システムを使用してモニターし、デンシトメトリースキャニングによって定量する。
【０１２８】
ウェスタンブロットの結果は、精製した突然変異Ｌ鎖および天然または組換えの野生型ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖のいずれかのタンパク質分解活性の間の明らかな相違を示す。具体的には、組換え野生型Ｌ鎖は、ＳＮＡＰ-２５基質を切断するが、還元ＢｏＮＴ／Ａ天然Ｌ鎖(この操作において陽性対照として働く)よりも効率が若干低い。従って、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の酵素活性形態を、組換え法によって製造し、次いで単離する。さらに、Ｌ鎖タンパク質中の１個のアミノ酸の置換により、シナプス終末タンパク質を分解する組換えタンパク質の能力がなくなる。
【０１２９】
野生型組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の生物学的活性の予備試験として、ジギトニン透過性にしたウシアドレノクロマフィン細胞からのＣａ2+誘発カテコールアミン放出を減少させるＭＢＰ-Ｌ鎖融合タンパク質の能力を調べる。一致して、野生型組換えＬ鎖融合タンパク質(無傷であるか、または、Ｘ2因子で切断されて遊離ＭＢＰおよび組換えＬ鎖を含む混合物を生成させたかのいずれか)は、天然ＢｏＮＴ／Ａによって引き起こされる阻害と等価なＣａ2+刺激放出の用量依存的阻害を誘導した。
【０１３０】
実施例１０：天然Ｌ鎖、組換え野生型Ｌ鎖と精製Ｈ鎖との再構成
天然のＨ鎖およびＬ鎖を、２Ｍ尿素を使用してＢｏＮＴ／Ａ(List Biologicals Inc.、Campbell、米国)から解離させ、１００ｍＭ ＤＴＴで還元し、次いで、確立されたクロマトグラフィー法に従って精製する[Kozakiら、Japan.J.Med.Sci.Biol.、34、61 (1981)；Maiseyら、Eur.J.Biochem.、177、683 (1988)]。Ｈ鎖を、等モル量の天然Ｌ鎖または組換え野生型Ｌ鎖のいずれかと組合せる。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、５０μＭ酢酸亜鉛、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液に対してサンプルを４℃で４日間にわたり透析することによって再構成を行う。透析の後、ジスルフィド結合した１５０ｋＤａの二鎖を形成させるための組換えＬ鎖および天然Ｈ鎖の会合を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによってモニターし、デンシトメトリースキャニングによって定量する。組換えＬ鎖を使用して形成された二鎖分子の比率は、天然Ｌ鎖を使用したときに得られる分子よりも低い。実際のところ、約３０％の組換え野生型または突然変異Ｌ鎖のみが再構成され、一方、＞９０％の天然Ｌ鎖がＨ鎖と再会合した。この低い再構成効率にもかかわらず、組換えＬ鎖を一体化した十分な材料が、その後の機能試験で使用するために容易に製造される。
【０１３１】
実施例１１：ＴｅＴｘ融合タンパク質の発現および野生型Ｌ鎖タンパク質の精製
この実施例は、先の実施例Ｂに記載したプラスミド構築物によってコードされる組換えＬ鎖融合タンパク質を産生および精製するための方法を記載する。プラスミドｐＭＡＬ-Ｌを保有する大腸菌クローンを、１０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２ｍｇ／ｍｌグルコースにしたＬブロス中、３７℃で約２×１０8細胞／ｍｌ(Ａ500nmが約０.５)の密度になるまで増殖させる。誘導を、最終濃度０.３ｍＭまでＩＰＴＧを添加することによって開始させる。細胞を、２時間後に６０００ｘｇで３０分間の遠心によって回収する。次いで、得られたペレットを、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)を含むカラム緩衝液[１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、1ｍＭエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-四酢酸、および１ｍＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)(ｐＨ７.４)]中に再懸濁し、超音波処理によって溶解する。遠心の後、粗抽出物をアミロースアフィニティーカラム(２.５×１０ｃｍ、樹脂４０ｍｌ)に適用する。
【０１３２】
緩衝液での洗浄によって未結合タンパク質を除去した後、結合したＭＢＰ-Ｌ融合タンパク質を、Mainaら[Gene、74、365 (1998)]が記載した方法に従って、１０ｍＭマルトースを含むカラム緩衝液で溶出させる。単離した融合タンパク質を、AmiconのCENTRICONを使用して０.５〜１ｍｇ／ｍｌに濃縮する。次いで、タンパク質サンプルを、抗ＭＢＰポリクローナル抗体および抗Ｌ鎖モノクローナル抗体を使用して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)およびウェスタンブロットによって分析する。両細胞抽出物のＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、未誘導培養物のクーマシー染色パターンでは存在しない誘導タンパク質バンド(Ｍｒは約９０,０００)の存在が示された。タンパク質バンドの分子量は、ＭＢＰとＬ鎖(Ｍｒがそれぞれ約４０,０００および５０,０００)の融合物から予想される分子量に一致する。ｐＭＡＬ-ｃ２ベクター系を使用した組換えＬ鎖の発現用に確立された最適条件は、ＩＰＴＧとの３７℃で２時間の誘導である。誘導時間をより長くしてもプロテアーゼインヒビターを含有させても、生成物収率は増加しなかった。両融合タンパク質は、水性緩衝液に可溶性(０.５ｍｇ／ｍｌまで)であり、−２０℃で保存したときに８ヶ月間まで安定である。
【０１３３】
この最初の精製工程の後、両ＭＢＰ-Ｌ鎖調製物を、酵素：タンパク質の比＝０.５〜１：１００(w／w)で、Ｘ因子により２３℃で２４時間切断する。ＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認したところ、この切断により、融合タンパク質がそれぞれの野生型Ｌ鎖に、ＭＢＰの遊離を伴って完全に変換された。カラム緩衝液に対して徹底的に透析を行ってマルトースを除去した後、Ｌ鎖を、新しいアフィニティーカラムでの再吸着によってさらに精製する。この精製工程からの所望の生成物は、カラム洗浄分画において見い出される。カラム洗浄分画を、Ａ280nmでモニターし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより再度チェックする。
【０１３４】
アミノ酸配列決定のために、Tonsら[Anal.Biochem.、179、50 (1989)]の記載のように、組換え野生型をＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけ、ポリ(ビニリデンジフルオリド)メンブランに移し、モデル４０００タンパク質シークエンサー(Chelsea Instruments、ロンドン)で自動化エドマン分解を行う。２つの生成物の微量配列決定により、図１Ａに示すように、ベクターの多クローニング部位によってコードされる１１個のアミノ酸によって先行される天然Ｌ鎖のＮ末端の残基と同一の４個の残基が明らかになった。この所望の構造を有する組換えＬ鎖タンパク質の産生に成功して、次にこれら組成物の酵素活性を試験した。
【０１３５】
天然Ｌ鎖の亜鉛依存性プロテアーゼ活性の測定を、組換えＬ鎖タンパク質の活性のためのアッセイとして使用する。２つの異なるタンパク質基質をこのアッセイにおいて使用する。第１の場合、ウシシナプス小胞(ＳＳＶ)を使用する。基質のタンパク質分解切断のためのアッセイは、タンパク質ゲルのクーマシー染色およびウェスタンブロットに基づく。
組換えＬ鎖タンパク質のタンパク質分解活性の評価方法および天然および組換えＬ鎖のインビトロ活性の定量方法は既知であり、これらを使用して組換えＬ鎖を評価および定量することができる。
【０１３６】
実施例１２：天然Ｈ鎖および組換えＬ鎖からのＴｅＴｘの再会合
この実施例は、天然Ｌ鎖または組換え野生型Ｌ鎖のいずれかを一体化したＴｅＴｘ二鎖の製造方法を記載する。Wellerら[Eur.J.Biochem.、182、649 (1989)]の記載のようにＴｅＴｘから精製した天然Ｈ鎖を、等モル量の天然Ｌ鎖または組換え野生型Ｌ鎖のいずれかと組合せる。この混合物を、２Ｍ尿素、２０ｍＭ ＤＴＴ、１Ｍ ＮａＣｌ、および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.４)に対して撹拌しながら１８時間透析し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌおよび６００ｍＭグリシン(ｐＨ８.４)に対して撹拌せずに７２時間さらに透析する。その一部(３００μｇ)を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８.４)中でＨＰＬＣ ＤＥＡＥカラムにかけ、同一緩衝液中のＮａＣｌ勾配(０〜１Ｍ)で溶出させる。共有結合再構成の程度を、非還元性ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよび銀染色によってチェックする。
【０１３７】
二鎖種の再会合を、天然ＴｅＴｘと同時移動する染色された高Ｍｒタンパク質バンドの存在によって確認する。組換え野生型および突然変異Ｌ鎖について、二鎖種の相対量は、銀染色ゲルのデンシトメトリースキャニングで測定したときに、それぞれ５５.１％および５６.８％である。天然のＨ鎖およびＬ鎖は、同等の再構成レベルを与えた。毒素として鎖間ジスルフィド形成に関与する後者は、ＤＴＴによる還元によって遊離のＨ鎖およびＬ鎖に元のように変換される。
【０１３８】
本発明を、種々の具体的な例および態様に関連して記載したが、本発明はこれらに限定されず、特許請求の範囲の範囲内で様々に実施しうることを理解すべきである。
【図１】
2010174037.tif 000015
【配列表】
2010174037000001.app