(57)【要約】      （修正有）【課題】全血からのｍＲＮＡの高効率な単離、及び定量するための方法を提供する。【解決手段】オリゴ（ｄＴ）固定化マルチウェルプレートに取り付けられた白血球フィルターの組み合わせを用いて、ｍＲＮＡポリＡテールと、前記固定化オリゴ（ｄＴ）のハイブリダイゼーション中に、特異的アンチセンスプライマーを添加することにより、溶液中においてポリＡ ＲＮＡ上でｃＤＮＡを合成、及び増幅するための方法、及び装置。【選択図】図１
2010220619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中においてポリＡ ＲＮＡ上でｃＤＮＡを合成する方法であって、ＲＮＡポリＡテールと固定化オリゴ（ｄＴ）のハイブリダイゼーション中に特異的アンチセンスプライマーを添加することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全血からのｍＲＮＡの高効率な単離及び定量に関する。より詳しくは、本発明はオリゴ（ｄＴ）固定化マルチウェルプレートに取り付けられた白血球フィルターの組み合わせを用いて、ｍＲＮＡを単離及び増幅するための方法及び装置に関する。
【０００２】
本出願は、２００３年４月２４日付けで英語で出願され、且つ英語で公開されるものと思われる国際出願第ＰＣＴＵＳ０３／１２８９５号の一部継続である、２００３年１０月３０日付けで出願された米国特許出願第１０／６９８，９６７号の一部継続であり、２００２年４月２４日付けで出願された仮出願第６０／３７５，４７２号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
分子生物学の分野の研究により、細胞の遺伝的発生起源及び機能活性が、そのリボ核酸（ＲＮＡ）の研究から推論され得ることが明らかになった。この情報は、感染を診断するため、癌遺伝子発現細胞の存在を検出するため、家族性障害を発見するため、宿主の防御機構の状態をモニターするため、及びＨＬＡ型又は他のマーカーの実体を調べるため、診療上有効に用いられ得る。ＲＮＡは、３種類の機能的に異なる形態：リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）で存在する。安定なｒＲＮＡ及びｔＲＮＡは、翻訳の触媒プロセスに関与し、ｍＲＮＡ分子は遺伝情報を伝達する。全ＲＮＡのわずか約１〜５％がｍＲＮＡで、約１５％がｔＲＮＡで、及び約８０％がｒＲＮＡで構成される。
【０００４】
ｍＲＮＡは、特に遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを定量的に観察するために使用される場合は、重要な診断用ツールとなる。ヒト末梢血は、ｍＲＮＡを解析するための優れた臨床材料である。例えば、血中における特定のキメラｍＲＮＡの検出は、異常細胞が存在することを示し、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の分子診断に使用される（非特許文献１及び２）。癌特異的ｍＲＮＡを測定することにより、微小転移癌細胞も血中において検出することができる。癌特異的ｍＲＮＡとしては、大腸癌に対する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺癌に対する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、甲状腺癌に対するサイログロブリン（非特許文献３)、及び黒色腫に対するチロシナーゼ（非特許文献４）等を挙げることができる。さらに、これらの癌特異的ｍＲＮＡのレベルは治療後に変化し得るため、特異的ｍＲＮＡの定量は治療の追跡調査の際の有用な指標を提供する。
【０００５】
血液は、白血球（およそ５０００白血球／μＬ）に比べて無核赤血球（およそ５００万細胞／μＬ）を大量に含むため、通常はｍＲＮＡ解析の第１段階として、全血からの顆粒球又はリンパ球の単離が行われる。しかし、異なる試料間で白血球の特定のサブセットの回収が一致しないため、単離白血球の数は各試料について測定され、その測定結果は、血液１μＬ当たりのｍＲＮＡ量としてではなく、白血球数当たりのｍＲＮＡ量として表される。さらに、ｍＲＮＡ量は、長い単離プロセスの間に変化し得る。血液から癌細胞を単離するための方法は存在しないが、遺伝子増幅技術により、異なる遺伝子から成るプールからであっても特異的ｍＲＮＡレベルの同定及び定量することが可能であるので、遺伝子特異的プライマー及び遺伝子特異的プローブが入手可能な場合には、全血はｍＲＮＡ解析用の理想的な材料となる。
【０００６】
科学界は、標準化の欠如のため、遺伝子発現分析における研究機関間及び実験間の変動という極めて大きい問題に直面している。近年の遺伝子増幅技術は絶対量の鋳型ＤＮＡを供給しているが、各試料におけるＲＮＡ回収率及びｃＤＮＡ合成効率の情報が欠如してい
るために、これらの値は元の材料中の遺伝子の量に換算することができない。総ＲＮＡはしばしば、ｍＲＮＡ定量のための標準化マーカーとして用いられ、その定量結果は通常総ＲＮＡ量１μｇ当たりの遺伝子の量として表される。しかし、ｍＲＮＡの割合は総ＲＮＡの１〜５％に過ぎず、総ＲＮＡの量が同一である場合であってもｍＲＮＡ容量は変化するので、総ＲＮＡ量はｍＲＮＡ量を表わさない、ということが強調されねばならない。総ＲＮＡ又はｍＲＮＡの収率も、用いられる方法によって大きく変化する。一旦ＲＮＡが抽出されると次の過程はｃＤＮＡの合成であるが、各実験において各々のＲＮＡ鋳型がｃＤＮＡの単一コピーを作製するか否かを現行方法は示唆していないため、この過程自体が不確実性を生じさせる可能性を持つ。このような問題を回避するために、標的遺伝子のデータを、ハウスキーピング遺伝子又はｒＲＮＡのデータと比較することによる相対的定量が広く使われている。しかし対照遺伝子の量は通常一貫せず、実験中に変わる可能性がある。さらに、各臨床検体が通常異なる時点で分析されるため、この変動は臨床的診断に重大な問題を提示する。
【０００７】
全血はＲＮＡ分解酵素（顆粒球由来）及び無核赤血球を大量に含むため、全血から純粋なｍＲＮＡを単離することは非常に困難である。種々のＲＮＡ抽出法を全血に適用することができるが（非特許文献５〜７）、そのアッセイ手順は多大な労力を要し、数回の遠心分離が必要であり、リボヌクレアーゼ活性を失活させるために不可欠な慎重な取り扱いを伴う。
【０００８】
従って、全血から大量のｍＲＮＡを単離及び定量するための、迅速且つ容易な方法及び装置が必要とされている。具体的には、回収の再現性を有し、途切れることなく遺伝子増幅へ移行するプロセスを有する、全血由来のｍＲＮＡを高効率に処理する技術が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kawasaki E.S., Clark S.S., Coyne M.Y., Smith S.D.，Champlin R  ., Witte O.N., 及び McCormick F.P., 1988. ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅された白血病  特異的ｍＲＮＡ配列の検出による慢性骨髄性白血病及び急性リンパ性白血病の診断 Pro  c. Natl. Acad. Sci. USA 85:5698-5702
【非特許文献２】Pachmann K., Zhao S., Schenk T., Kantarjian H., El-Naggar A.K.  , Siciliano M.J., Guo J.Q., Arlinghaus R.B., 及びAndreeff M. 2001. ｉｎ ｓｉ  ｔｕ増幅により測定された個々の慢性骨髄性白血病細胞のｂｃｒ−ａｂｌｅ ｍＲＮＡ  の発現 Br. J. Haematol. 112:749-59
【非特許文献３】Wingo S.T., Ringel M.D., Anderson J.S., Patel A.D., Lukes Y.D.  , Djuh Y.Y., Solomon B., Nicholson D., Balducci-Silano P.L., Levine M.A., Fran  cis G. L. 及びTuttle R.M. 1999. 健常被験体の末梢血中のサイログロブリンｍＲＮＡ  の定量的逆転写ＰＣＲ測定 Clin. Chem. 45:785-89
【非特許文献４】Pelkey T. J., Frierson H.F. Jr. 及びBruns D.E. 1996 固形腫瘍由  来の循環腫瘍細胞及び微小転移の分子的及び免疫学的検出 Clin. Chem. 42:1369-81
【非特許文献５】de Vries T.J., Fourkour A., Punt C.J., Ruiter D.J. 及びvan Mu  ijen G.N. 2000. 細胞調製チューブでの単核細胞回収後のチロシナーゼ及びＭＡＲＴ−  １の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による末梢血中の黒色腫細胞の解析：全血グアニジニ  ウムイソチオシアネートＲＮＡ単離法との比較 Melanoma Research 10:119-26
【非特許文献６】Johansson M., Pisa E.K., Tormanen V., Arstrand K. 及びKagedal Bl. 2000. 血中のチロシナーゼ転写物の定量解析 Clin. Chem. 46:921-27
【非特許文献７】Wingo S.T., Ringel M.D., Anderson J.S., Patel A.D., Lukes Y.D., Djuh Y.Y., Solomon B., Nicholson D., Balducci-Silano P. L., Levine M.A., Francis G.L. 及びTuttle R.M. 1999. 健常被験体の末梢血中のサイログロブリンｍＲＮＡの定量的逆転写ＰＣＲ測定 Clin. Chem. 45:785-89
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、オリゴ（ｄＴ）固定化マルチウェルプレートに取り付けた白血球フィルターの組み合わせを用いて、回収の再現性を有する、全血から直接ｍＲＮＡを単離及び定量するための高効率な方法及び装置を開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様は、（ａ）全血を採取するステップ、（ｂ）赤血球と血液成分とを全血から濾過により除去して、フィルターメンブレン上に白血球を得るステップ、（ｃ）白血球を細胞溶解して、ｍＲＮＡを含有する溶解物を生成させるステップ、（ｄ）溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化プレートに移して、ｍＲＮＡを捕捉するステップ、及び（ｅ）ｍＲＮＡを定量するステップを含む、全血中のｍＲＮＡを高効率に定量する方法を含む。
【００１２】
本方法の好ましい一実施の形態では、白血球を採取する前に全血に抗凝血剤を添加する。捕捉される白血球の収量を増大させるため、複数のフィルターメンブレンを重ね合わせてもよい。フィルターメンブレン上に捕捉された白血球を、溶解緩衝液を用いて溶解し、白血球からｍＲＮＡを遊離させる。溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化プレートへ移すステップは、遠心分離、真空吸引、正圧を加える、又はエタノール洗浄に続く真空吸引により行われ得る。ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡを作製すること、及びこのｃＤＮＡをＰＣＲで増幅することにより定量される。特に好ましい実施の形態では、ｍＲＮＡを定量するのにＴａｑＭａｎ ＰＣＲを用いて行われる。
【００１３】
本発明の別の形態は、普遍的標準としての人工対照ＲＮＡの使用を含む。好ましい実施形態では、各試料中の標準ＲＮＡの回収率の測定することによって、遺伝子増幅の結果から、全血１μＬ当たりに存在するｍＲＮＡの量を確定することが可能になる。本発明の実施形態は、試料間及び実験間の変動係数を低くする。好ましい実施形態では、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成及び定量中の変動は最小限にされ得る。標準化対照ＲＮＡの使用は、より効率的なアッセイ、定量及び比較試験を可能にする。
【００１４】
本発明の別の態様は、全血中のｍＲＮＡの高効率定量を実施するための装置であって、（ａ）複数の試料デリバリーウェル、該ウェルの下部にある白血球捕捉フィルター、及び該フィルターの下部にある、固定化されたオリゴ（ｄＴ）を含むｍＲＮＡ捕捉ゾーンを有するマルチウェルプレート、並びに（ｂ）該フィルタープレートを受容して、プレートとボックスとの間に密閉部を生じるようになっている真空ボックスを備える装置を含む。この装置の好ましい一実施形態では、白血球は、重ね合わせた複数のフィルターメンブレン上に捕捉される。この装置の別の好ましい実施形態では、真空ボックスが真空源を受容するようになっている。この装置の別の好ましい実施形態では、真空ボックスとマルチウェルプレートとの間にマルチウェルサポーターが挿入される。
【００１５】
本発明の別の態様は、全血中のｍＲＮＡを高効率に定量するための装置、ヘパリン、低張緩衝液及び溶解緩衝液を含むキットを含む。
【００１６】
本発明の別の態様は、血液試料、低張緩衝液及び溶解緩衝液を装置に添加するロボット、自動真空吸引装置及び自動遠心分離機、並びに自動ＰＣＲ機を備える、全血中のｍＲＮＡを高効率に定量するための完全に自動化されたシステムを含む。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、オリゴ（ｄＴ）固定化マルチウェルプレートに取り付けた白血球フィ
ルターの組み合わせを用いて、回収の再現性を有する、全血から直接ｍＲＮＡを単離及び定量するための高効率な方法及び装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】高効率ｍＲＮＡ装置の分解図である。
【図２】白血球フィルター及びオリゴ（ｄＴ）固定化フィルターウェルを含む、高効率ｍＲＮＡ装置のマルチウェルプレートを示す図である。
【図３】新鮮血試料及び凍結血試料のフィルタープレート上での白血球捕捉効率を示すグラフである。
【図４】ｍＲＮＡ定量に対する、血液洗浄の回数の効果を示すグラフである。
【図５】ｍＲＮＡ定量に対する、細胞溶解前におけるフィルタープレートの最終処理の効果を示すグラフである。
【図６】溶解緩衝液がＲＮＡ分解酵素を阻害する程度を示すグラフである。
【図７】ｍＲＮＡを定量するための逆転写酵素の最適濃度を示すグラフである。
【図８】ｍＲＮＡを捕捉するためのＰＣＲにおける、最適ｃＤＮＡ値を示すグラフである。
【図９】本発明のハイブリダイゼーションの動態を示すグラフである。
【図１０】１ウェル当たりに使用された全血容量とｍＲＮＡ定量との直線的な関係を示すグラフである。
【図１１】最適グアニジンチオシアネート濃度を示すグラフである。
【図１２】最適プロテイナーゼＫ濃度を示すグラフである。
【図１３】アッセイの妥当性を示すグラフである。
【図１４】合成スパイクＲＮＡの回収率を示すグラフである。
【図１５】特異的アンチセンスプライマー（ＮＮＮ）及び固定化オリゴ（ｄＴ）からのｃＤＮＡ合成を示す図である。
【図１６】変性を伴う場合と伴わない場合の特異的プライム化ＲＮＡの回収率を示すグラフである。
【図１７】特異的プライマーを用いた場合と用いない場合のＲＮＡの増幅を示すグラフである。
【図１８】Ａは本発明の典型的ｍＲＮＡ捕捉スキームを示す図である。Ｂは種々のハイブリダイゼーション性能を示すグラフである。Ｃは総ＲＮＡ及びポリ（Ａ）ＲＮＡの種々の捕捉方法の効率を示すグラフである。Ｄは最適なＰＣＲサイクル数を示すグラフである。ＥはＲＮＡの捕捉のための溶解緩衝液の最適範囲を示すグラフである。
【図１９】ＡはＰＣＲサイクル数対種々の抗血液凝固剤を示すグラフである。ＢはＰＣＲサイクル数対貯蔵時間を示すグラフである。ＣはＰＣＲサイクル数対ハイブリダイゼーション温度を示すグラフである。ＤはＰＣＲサイクル数対ハイブリダイゼーション時間を示すグラフである。ＥはＰＣＲサイクル数対ＭＭＬＶの単位を示すグラフである。ＦはＰＣＲサイクル数対１ウェル当たりのｃＤＮＡのμＬを示すグラフである。
【図２０】Ａはスパイク標準ＲＮＡに関するＣｔ値を示すグラフである。Ｂはスパイク標準ＲＮＡに関する回収率を示すグラフである。Ｃは阻害剤ｄＡ２０に関するＣｔ値を示すグラフである。Ｄは阻害剤ｄＡ２０に関する阻害率を示すグラフである。Ｅは血液１μＬ当たりのＣｔ値を示すグラフである。Ｆは血液１μＬ当たりのｍＲＮＡ回収率を示すグラフである。
【図２１】ｍＲＮＡの回収率対個々の被験者を示す。Ａは種々の被験者間の標準ＲＮＡの回収率を示すグラフである。Ｂは種々の被験者間で回収された血液１μＬ当たりのＣＤ４ｍＲＮＡ量を示すグラフである。Ｃは種々の被験者間で回収された血液１μＬ当たりのｐ２１ｍＲＮＡ量を示すグラフである。Ｄは種々の被験者間で回収された血液１μＬ当たりのＦａｓＬｍＲＮＡ量を示すグラフである。Ｅは種々の被験者間で回収された血液１μＬ当たりのＬＴＣ４ＳｍＲＮＡ量を示すグラフである。
【図２２】ＡはＰＭＡ及びＣａＩで刺激したヘパリン処理全血中のｉｎ ｖｉｔｒｏでのｐ２１及びＦａｓ ＬのｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。ＢはＰＭＡ−ＣａＩ刺激前に４℃で２１時間保存したヘパリン処理全血中のｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。Ｃ及びＤは、基本レベルのｍＲＮＡの量に対する、ＰＭＡ−ＣａＩ刺激後に誘導されるｍＲＮＡの量を表示して、各試料のｉｎ ｖｉｔｒｏ応答性を示すグラフである。Ｅ及びＦはそれぞれＣ及びＤのグラフの回帰線を回転させてＸ軸としたグラフである。ＧはＣと同じデータを、試料の倍増測定で表示したグラフである。ＨはＤと同じデータを、試料の倍増測定で表示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
本発明は、大容量の未調製の全血の解析を可能にし、白血球のみに由来するｍＲＮＡを解析する効率的な手段を提供する。該手段は、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡを除去し、ｍＲＮＡのみを回収することができ、自動化に容易に適合され得る。本発明は、リアルタイムＰＣＲを用いる絶対定量が可能であって、且つ変動係数が２０〜２５％の範囲の優れた再現性を有する感度の高い定量システムを提供する。さらにまた、本発明は種々の疾患標的に適用することができる（表１）。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
本発明は、なんら特定の機械的構造に限定されるものではない。しかし、図１及び図２は、本発明の高効率ｍＲＮＡ定量を実施するための好ましい構造を示す。真空ボックス１０が、この構造の基礎を構成する。真空ボックスは、真空吸引に耐え得る充分強い任意の材料で作られたものであり得るが、その材料は使い捨てプラスチック材料が好ましい。真空ボックスは、真空吸引を行なうための真空源１２を受容するようになっている。フィルタープラグ１４は、真空ボックスの真空吸引装置アダプター内に配置される。真空ボックス１０は、マルチウェルフィルタープレート４０、又は任意選択でマルチウェルサポーター２０とかみ合わせるための縁１６を有することが好ましい。マルチウェルサポーター２０は、任意選択でマルチウェルフィルタープレート４０を支持するように、真空ボックスの上部の内側に設けられる。好ましくはシリコン系ゴム又は他の軟質プラスチックで構成される密封ガスケット３０が、マルチウェルサポーターの上面に配置される。密封ガスケットの上部にマルチウェルフィルタープレート４０が配置され、フィルタープレートは複数の試料ウェル４６、試料デリバリーウェルの下に位置する複数の白血球捕捉フィルター４２、及びフィルターの下にあるｍＲＮＡ捕捉ゾーン４４を備える。固定化オリゴ（ｄＴ）が、ｍＲＮＡ捕捉ゾーンのウェルに含まれている。
【００２２】
好ましい一実施形態は、全血からｍＲＮＡを定量するための、簡単で再現性のある高効率な方法を含む。迅速なプロトコルであるため、採血後のｍＲＮＡの副次的な誘発又は分解が最小限に抑えられ、９６ウェルのフィルタープレート及びマイクロプレートの使用に
より、９６個の試料を同時処理することができる。手順中の操作が最少であることから、定量の手段としてＰＣＲを用いた場合であっても、試料間の変動が非常に少なく、変動係数（ＣＶ）値は３０％未満である。
【００２３】
一実施形態では、本方法は真空ボックスの作製を含む。好ましい一実施形態では、ポリアクリレートポリマーマトリックス（Ｒｅｄ Ｚ、セーフテック社（Safetec））等の血液カプセル封入体を真空ボックスに付加し、血液を固化させる。次いで、マルチウェルサポーターを真空ボックス内に配置する。次いで、シリコン系ゴム又は他の軟質プラスチック製の密封ガスケットをマルチウェルプレートサポーターの上面に配置する。フィルタープラグ（Ｘ−６９５３、６０μ ＦｉｌｔｅｒＰｌｕｇＨＤＰＥ、ポレックスプロダクツグループ（Porex Products Groups））を真空ボックスの真空吸引装置アダプター内に配置する。
【００２４】
この実施形態における方法は、フィルタープレートの作製を含む。白血球を捕捉するために、ガラス繊維膜又は白血球フィルターメンブレンのいずれかを使用することができる。マルチウェルフィルタープレートをガラス繊維膜又は白血球フィルターメンブレンを用いて作製することにより、複数の血液検体を同時に処理することができ、アッセイを簡素化することができる。白血球を捕捉するためのフィルターの例は、米国特許第４，９２５，５７２号及び同第４，８８０，５４８号に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に援用される。一般に、繊維表面上への白血球の吸着は白血球を除去する機構であると考えられている。所与の重量の繊維の表面積は、その繊維の直径に反比例する。したがって、使用される繊維の直径が小さい場合、繊維が細いほど、より大きな吸着容量を有することが期待され、さらに所望の有効性を達成するのに必要な、繊維の重量として測定される量はより少ないことが期待される。ポリエステル、ポリアミド及びアクリル系繊維を含む一般に使用されるいくつかの繊維は、グラフト重合するために必要とされるレベルのγ線による分解に対して充分な耐性を有し、且つ利用可能なモノマーが反応できる構造を有するため、放射線グラフト重合するのに適している。ＰＢＴは、本発明の製造物の開発に使用されてきた主な樹脂であり、本実施例で使用される樹脂である。しかし、繊維化することができ、且つ１．５マイクロメートル以下の細い繊維から成るマット又は織物を形成することができる他の樹脂も存在し得、濡れの臨界表面張力が必要に応じて最適範囲に調整されているような産物は、フィルタープレートの効率的な製造に適しており、さらに小型の白血球除去装置の製造に適している可能性があることに注意されたい。同様にして、適切に処理されたガラス繊維が、効果的な装置を作製するために使用可能であり得る。ＣＤ４ｍＲＮＡの吸着は、ＰＢＴ系フィルターを使用した場合には、ガラス繊維系フィルターを使用した場合とは対照的に４倍まで有効である。フィルタープレートは真空ボックス内に配置される。別の好ましい実施形態では、全血から捕捉される白血球の量を増加させるために、複数のフィルターメンブレンを重ね合わせる。
【００２５】
好ましい一実施形態では、フィルタープレートをプレートサポーター及び密封ガスケット上に配置する。別の好ましい実施形態では、フィルタープレートはプラスチック製粘着テープ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ２２３−９４４４）で密封されており、テープをカットして所望数のウェルを利用可能にすることができる。別の好ましい実施形態では、試料が添加される各ウェルを低張緩衝液（２００μＬの５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）で洗浄する。
【００２６】
本方法は、血液を採取すること、マルチウェルフィルタープレートへ血液を添加すること、並びに赤血球及び他の非白血球成分を除去することを含むことが好ましい。好ましい一実施形態では、抗凝血剤を含む血液採取用チューブ内に全血を吸引し、これにより白血球の濾過効率を増大することができる。抗凝血剤であるヘパリンは、白血球の濾過効率を増大させるのに特に有効である。好ましい一実施形態では、血液試料を凍結してｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ分解酵素を一部除去することができる。ウェルを低張緩衝液で洗浄し得
る。フィルタープレート上の所望数のウェルに血液が添加されると、血液はフィルターメンブレンにより濾過される。濾過は、遠心分離、真空吸引又は正圧等の当業者に知られた任意の技術により行なわれ得る。
【００２７】
特に好ましい一実施形態では、血液試料をフィルタープレートウェルに添加した後、真空吸引を開始する（６ｃｍＨｇ）。各ウェルを、何回か低張緩衝液で洗浄する（２００μＬの５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で１２回）。別の好ましい実施形態では、試料の入った各ウェルをエタノールで洗浄して（２００μＬの１００％エタノールで１回）フィルターメンブレンを乾燥させ、真空吸引する際の白血球捕捉効率を有意に増加させる。別の好ましい実施形態では、次に減圧を行う（２０ｃｍＨｇで＞２分間）。
【００２８】
本方法は、細胞溶解、並びにｍＲＮＡとｍＲＮＡ捕捉ゾーン内に固定されたオリゴ（ｄＴ）とのハイブリダイゼーションを包含する。溶解緩衝液はフィルタープレートウェルに添加され（４０μＬ／ウェル）、そしてインキュベーションを行い（室温で２０分間）、捕捉された白血球からｍＲＮＡを溶出する。好ましい一実施形態では、マルチウェルフィルタープレートを、プラスチック袋中に密封し、遠心分離する（ＩＥＣ ＭｕｌｔｉＲＦ、２，０００ｒｐｍ、４℃で１分間）。次に溶解緩衝液を再び添加し（２０μＬ／ウェル）、その後遠心分離する（ＩＥＣ ＭｕｌｔｉＲＦ、３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間）。次にマルチウェルフィルタープレートを遠心分離機から取り出し、インキュベートする（室温で２時間）。
【００２９】
好ましい実施形態に従うと、溶解緩衝液は、界面活性剤、塩、ｐＨ緩衝剤、グアニジンチオシアネート及びプロテイナーゼＫを含む。
【００３０】
溶解緩衝液の好ましい実施形態は少なくとも１つの界面活性剤を含有するが、１つより多くの界面活性剤を含有してよい。様々なタイプの細胞における異なる膜の種々のレベルの溶解を達成するために、異なる強度を有する界面活性剤濃度の種々の組合せを、当業者は利用し得る。例えばＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０は、Ｎ−ラウロサルコシンより弱い界面活性剤であり、一実施形態では、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０単独で、細胞膜を溶解するのに十分であり得る。他の実施形態では、核膜の溶解を最適化するために、Ｎ−ラウロサルコシンのような強い界面活性剤を、１つ又は複数の弱界面活性剤と組合せて用いられ得る。界面活性剤は、少なくとも細胞の細胞膜を溶解するのに十分であることが好ましい。別の好ましい実施形態は、細胞の核中にかなりの量のｍＲＮＡが存在する場合、細胞の核膜を溶解するのに十分な界面活性剤を含む。状況によっては、細胞質ｍＲＮＡのみを測定するのが望ましいが、他の状況では、細胞質及び核中のｍＲＮＡを測定することが望まれ得る。
【００３１】
溶解緩衝液の強界面活性剤としては、好ましくはＮ−ラウロイルサルコシン、Ｓ．Ｄ．Ｓ．、デオキシコール酸ナトリウム及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
弱界面活性剤としては、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、又は当業者に既知のその他の界面活性剤が挙げられる。０．０５〜２％の界面活性剤が溶解緩衝液中に用いられ得る。溶解緩衝液の特に好ましい一実施形態は、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシンを含む。溶解緩衝液の別の好ましい実施形態は、０．１〜２％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０を含有する。特に好ましい実施形態は、０．１％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０を含有する。
【００３３】
塩及びキレート化剤の組合せも、溶解剤として役立ち得る。例えば７５μＭのＮａＣｌ及び２４μＭのＮａ−ＥＤＴＡは、溶解剤として役立ち得る。溶解剤の実施形態は、当業
者に既知のその他の溶解剤を含み得る。
【００３４】
溶解緩衝液の塩は、ｍＲＮＡ−オリゴ（ｄＴ）ハイブリダイズ剤として作用する。塩は好ましくは、４×ＳＳＣを超えないストリンジェンシー（相補的ＤＮＡ配列がハイブリダイズし合う厳密性）を有するべきであり、当業者により決定される。溶解緩衝液のその他の実施形態は、ＮａＣｌ、又は当業者に既知のその他の塩を含む。
【００３５】
溶解緩衝液ストックのｐＨ緩衝液は、好ましくは７．０〜８．０のｐＨを保持する。一実施形態は、１ｍＭ〜１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４を含む。特に好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４を含む。溶解緩衝液のその他の好ましい実施形態は、ｐＨ５．０の０．１Ｍのクエン酸−リン酸塩を０．０３％のＨ2Ｏ2とともに含有する、当業者に既知のｐＨ緩衝液を含む。
【００３６】
溶解緩衝液の特に好ましい実施形態に従うと、グアニジンチオシアネートはＲＮＡ分解酵素の不活性化剤として役立つ。グアニジンチオシアネートは、通常有効であるのに不十分な濃度で従来技術において用いられてきた、ということを本発明者等は発見した。したがって、グアニジンチオシアネートの濃度は１．４Ｍより高いことが好ましい。高くても１０Ｍというグアニジンチオシアネート濃度、さらに好ましくは２Ｍより高くない濃度を用いることができる。しかし図１１から分かるように、１．７Ｍより高い濃度では、溶解緩衝液の効率は低減される。したがって好ましい実施形態は、約１．４〜約１．７５Ｍのグアニジンチオシアネートを用いる。好ましい一実施形態は、１．７〜１．８Ｍのグアニジンチオシアネートを含む。下記の実施例４で実証されるように、１．７９１Ｍという特定濃度のグアニジンチオシアネートで、作業溶解緩衝液がストックから調製され得る。他の試薬が溶解緩衝液に添加される場合、グアニジンチオシアネートの濃度は希釈される。実施例４におけるように、５５ｍｌの他の試薬が１ｍｌの緩衝液に添加される場合、好ましい溶解緩衝液は約１．６１〜約１．７１Ｍの濃度でグアニジンチオシアネートを含む。したがって好ましい実施形態は、約１．６〜約１．７Ｍの濃度でグアニジンチオシアネートを含む。
【００３７】
特に好ましい実施形態は、ＲＮＡ分解酵素の不活性化剤として２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫをさらに含む。溶解緩衝液の好ましい一実施形態は、２００μｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む。別の好ましい実施形態は、２００μｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む。別の好ましい実施形態は、２００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む。ドデシル硫酸ナトリウムも、ＲＮＡ分解酵素の不活性化剤として役立ち得る。別の実施形態は、ＲＮＡ分解酵素の不活性化剤として０．１〜１０％の２−メルカプトエタノールを含む。特に好ましい一実施形態は、１％の２−メルカプトエタノールを含む。ＲＮＡ分解酵素の不活性化剤の他の実施形態は、好ましくは、ＲＮＡ分解酵素中のジスルフィド結合を低減する、当業者に既知の物質を含み得る。
【００３８】
溶解緩衝液の好ましい実施形態は、Ｍｇ2+及びＣａ2+をキレート化するキレート化剤をさらに含む。好ましい一実施形態は、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＥＤＴＡを含む。特に好ましい実施形態は、１ｍＭのＥＤＴＡを含む。溶解緩衝液ストックの他の好ましい実施形態は、当業者に既知のキレート化剤、例えばＥＤＴＭＰ、２，３−ジメルカプトプロパノール及びＥＧＴＡを含有するが、これらに限定されない。
【００３９】
溶解緩衝液の好ましい実施形態は、ｔＲＮＡを含み得るが、これは種々の供給源から得られ得、フィルタープレートへの血液由来ＤＮＡ及びＲＮＡの非特異的吸収を抑制するために含まれる。さらにｔＲＮＡの存在は、血液由来ＲＮＡの分解を防止する。好ましい一実施形態では、作業溶解緩衝液のｔＲＮＡは、１０ｍｇ／ｍｌの大腸菌ｔＲＮＡを含む。
その他の実施形態は、当業者に既知の任意の供給源からのｔＲＮＡを含有し得る。
【００４０】
溶解緩衝液の好ましい実施形態は、フィルタープレートへの血液由来ＤＮＡ及びＲＮＡの非特異的吸収を抑制するために添加される、多種多様な供給源からのＤＮＡを含み得る。作業溶解緩衝液のＤＮＡは、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌの超音波処理サケ精子ＤＮＡを含む。他の実施形態では、他の生物体からのＤＮＡが用いられ得る。
【００４１】
溶解緩衝液の特に好ましい実施形態は、元の試料中の標的ｍＲＮＡの明確な量を算定するためのスパイク対照ＲＮＡを含み得る。本発明の実施形態前には、研究機関間の変動及び標準化が欠如していたため、一実験における結果を他の実験の結果と比較することは困難であった。しかし本発明の好ましい実施形態では、標的ｍＲＮＡの明確な量は、ＴａｑＭａｎアッセイにより得られた値を各試料中のスパイク対照ＲＮＡの用量の回収率で割ることにより確定され得る。このような最も信頼のある定量は、以下に記載され、実施例５に例示されている。
【００４２】
溶解緩衝液の好ましい実施形態は、１ウェル当たり１０〜１ｅ10コピー、さらに好ましくは１ｅ5〜１ｅ10コピーのスパイクＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、用いられる対照ＲＮＡの量は、少なくとも検出されるのに十分であるが、定量される標的ｍＲＮＡの量を有意に妨害するほど多くはない。好ましい実施形態では、溶解緩衝液に添加される対照ＲＮＡは、ポリ（Ａ）+ＲＮＡである。試験されている試料がヒト血液である特に好ましい実施形態では、対照ＲＮＡはヒト血液中に存在するＲＮＡと相同でない。いくつかの好ましい実施形態では、対照ＲＮＡの配列は、標的ｍＲＮＡと９０％未満の相同性を有するか、又は標的ｍＲＮＡと長さにおいて１０％より大きい差を有する。他の好ましい実施形態では、対照ＲＮＡの配列は、標的ｍＲＮＡと８５％未満の相同性を有するか、又は標的ｍＲＮＡと長さにおいて５％より大きい差を有する。さらなる実施形態では、対照ＲＮＡの配列は、標的ｍＲＮＡと７５％未満の相同性を有するか、又は標的ｍＲＮＡと長さにおいて２％より大きい差を有する。代替的実施形態では、対照ＲＮＡの配列は、標的ｍＲＮＡと６５％未満の相同性を有するか、又は標的ｍＲＮＡと長さにおいて１％より大きい差を有する。一実施形態では、対照ＲＮＡは好ましくは、ＰＣＲにより鋳型オリゴヌクレオチドを増幅することにより作られ得る。したがって正方向プライマー（配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５及び配列番号８）、逆方向プライマー（配列番号９、配列番号１６及び配列番号９）及びＴａｑＭａｎプローブ（ＦＡＭ−配列番号１３−ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ−配列番号１７−ＴＡＭＲＡ、及びＦＡＭ−配列番号１２−ＴＡＭＲＡ）を、種々の対照ＲＮＡオリゴヌクレオチドを増幅するために用いることができる。代替的実施形態は、定量されるべき複数の異なる標的ｍＲＮＡを用いることを包含する。さらなる実施形態は、複数の対照ＲＮＡを用いることを包含する。
【００４３】
本方法はｍＲＮＡを定量することを含むが、これは、好ましい実施形態では、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成及びＰＣＲを用いたｃＤＮＡの増幅を伴う。好ましい一実施形態では、マルチウェルフィルタープレートを、溶解緩衝液（１５０μＬ／ウェルで３回、手動）及び洗浄緩衝液（１５０μＬ／ウェルで３回、手動又はＢｉｏＴｅｋ＃ Ｇ４）で洗浄する。次にｃＤＮＡ合成緩衝液を、マルチウェルフィルタープレートに添加する（４０μＬ／ウェル、手動又はＩ＆Ｊ ＃６）。Ａｘｙｍａｔ（アムジェン株式会社（Amgen）製ＡＭ−96−ＰＣＲ−ＲＤ）を、マルチウェルフィルタープレート上に載せ、次にヒートブロック（３７℃、ＶＷＲ）上に載せ、インキュベートする（＞９０分）。次にマルチウェルフィルタープレートを遠心分離し得る（２，０００ｒｐｍ、４℃で１分間）。ＰＣＲプライマーが３８４ウェルＰＣＲプレートに添加され、ｃＤＮＡがマルチウェルフィルタープレートから３８４ウェルＰＣＲプレートに移される。ＰＣＲプレートを遠心分離し（２，０００ｒｐｍ、４℃で１分間）、リアルタイムＰＣＲを開始する（ＴａｑＭａｎ／ＳＹＢＥＲ）。
【００４４】
別の好ましい実施形態は、下記の実施例６で実証されるように、ｍＲＮＡハイブリダイゼーション中又はｃＤＮＡ合成中に特異的アンチセンスプライマーを添加することを含む。オリゴ（ｄＴ）及び特異的プライマー（ＮＮＮＮ）は、ポリＡ ＲＮＡ上の異なる位置でのｃＤＮＡの伸長を同時に刺激する（図１５）。特異的プライマー（ＮＮＮＮ）及びオリゴ（ｄＴ）は、図１５に示されるように、増幅中のｃＤＮＡの形成を引き起こす。９５℃で２分間各ウェルを加熱することにより、特異的プライマー由来ｃＤＮＡがＧｅｎｅＰｌａｔｅから除去される場合でさえ、加熱変性プロセス（ＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲを用いて）から得られる特異的ＣＤ４ ｃＤＮＡの量は、非加熱のネガティブコントロールから得られる量と同様である（図１６）。いかなる説明又は理論と結びつけずに考えると、このような結果に関して考え得る説明の１つは、オリゴ（ｄＴ）由来ｃＤＮＡは増幅中にプライマー由来ｃＤＮＡを置き換わり得る、というものである（図１５）。加熱変性プロセスが完全に排除されるため、これは特に便利である。さらに、異なる標的のために複数のアンチセンスプライマーを添加することにより、各遺伝子がｃＤＮＡの一定分量から増幅され、そしてＧｅｎｅＰｌａｔｅ中のオリゴ（ｄＴ）由来ｃＤＮＡはその後の使用のために保存され得る。
【００４５】
本発明の別の好ましい実施形態は、全血からのｍＲＮＡを高効率に定量するための装置を含む。該装置は、多数の試料デリバリーウェル、試料デリバリーウェルの下部の白血球捕捉フィルター、及び該フィルターの下部のｍＲＮＡ捕捉ゾーン（ｍＲＮＡ捕捉ゾーンは、ウェル内のｍＲＮＡ捕捉ゾーンに固定化されたオリゴ（ｄＴ）を含む）を備えるマルチウェルフィルタープレートを含む。白血球回収効率を高めるため、いくつかのフィルターメンブレンを重ね合わせることができる。マルチウェルプレートは真空ボックス上に取り付けられるが、真空ボックスはマルチウェルプレートを受容し、マルチウェルプレートと真空ボックスとの間に密封部が形成されるようになっている。該装置の好ましい一実施形態では、真空ボックスは、真空吸引を行なうための真空源を受容するようになっている。別の好ましい実施形態では、マルチウェルサポーターを、真空ボックス内のマルチウェルフィルタープレートの下方に配置する。該装置の別の好ましい実施形態では、シリコン系ゴム等の軟質プラスチック製であり得る密封ガスケットがマルチウェルサポーターとマルチウェルフィルタープレートとの間に挿入される。
【００４６】
多数の慣用的増幅技法が本発明と一緒に用いられ得るが、本発明の特に好ましい一実施形態は、全血由来ＲＮＡ及び対照ＲＮＡを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）を実行することを含む。ホランドらによるPNAS 88: 7276-7280 (1991)は、ＴａｑＭａｎアッセイとして既知のアッセイを記載する。Ｔａｑポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、ポリメラーゼ連鎖反応産物検出系で用いられて、増幅と同時に特異的検出可能シグナルを生じる。３'末端で延長不可能であり、５'末端で標識され、且つ標的配列内でハイブリダイズするよう設計されたオリゴヌクレオチドプローブが、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイに導入される。増幅途中でのポリメラーゼ連鎖反応産物鎖の一方とのプローブのアニーリングは、エキソヌクレアーゼ活性に適した基質を生じる。増幅中、Ｔａｑポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを非分解プローブと識別され得るより小さい断片に分解する。アッセイは高感度且つ特異的であり、そしてより厄介な検出方法を上回る顕著な改良を示す。このアッセイの一バージョンは、米国特許第５，２１０，０１５号（Gelfandら）にも記載されている（米国特許第５，２１０，０１５号（Gelfandら）及びHollandら、PNAS 88: 7276-7280 (1991)）（これらは、参照により本明細書中に援用される）。
【００４７】
さらに、Fisherらに対する米国特許第５，４９１，０６３号は、ＴａｑＭａｎ型アッセイを提供する。フィッシャーらの方法は、発光標識で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの切断を生じる反応を提供し、この場合、反応は、標識と相互作用して標識の
発光を改質するＤＮＡ結合化合物の存在下で実行される。該方法は、プローブの分解に起因する標識プローブの発光の変化を利用する。該方法は、概して、オリゴヌクレオチドプローブの切断を生じる反応を利用するアッセイに、特に、ハイブリダイズしたプローブがプライマー伸長に付随して切断される均一増幅／検出アッセイに適用可能である。増幅標的の蓄積の同時検出と、標的配列の配列特異的検出を可能にする均一増幅／検出アッセイが提供される。米国特許第５，４９１，０６３号（Fisherら）は、参照により本明細書中に援用される。
【００４８】
ＴａｑＭａｎ検出アッセイは、古典的ＰＣＲアッセイを上回るいくつかの利点を提供する。第一に、ＴａｑＭａｎアッセイは、ＰＣＲの感度を、標的配列中に存在する内部オリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションと組合せる。ＰＣＲ後、試料をアガロースゲル上で分離する必要がなく、ＰＣＲ産物の同一性を立証するために必要なその後のサザンブロット及びハイブリダイゼーション過程は排除される。ＰＣＲ後になされるこれらのさらなる検査過程は、精確な同定のために容易に数日間費やし得る。ＴａｑＭａｎ系を用いると、アッセイは２．５時間以内に完了する。さらに、該アッセイプロセスに含まれる方法論は、多数の試料の取扱いを効率的に且つ相互汚染を伴わずに可能にし、したがってロボットによるサンプリングに適合可能である。その結果、多数の試験試料を、ＴａｑＭａｎアッセイを用いて非常に短期間で処理することができる。ＴａｑＭａｎ系の別の利点は、多重化に関する潜在能力である。異なる蛍光レポーター色素を用いてプローブを構築し得るため、いくつかの異なるＨＩＶ系が同一ＰＣＲ反応に併合され、それにより、試験の各々が個別に実施された場合に受ける労働コストを低減し得る。迅速で確実なデータの利点は、労働及びコスト効率と共に、本発明の特異的プライマーを利用するＴａｑＭａｎ検出系を、ＨＩＶの存在をモニタリングするための非常に有益な系にする。
【００４９】
好ましい実施形態では、種々のｍＲＮＡを、各標的に関するプライマー及びプローブを単に変えることにより、定量することができる。最大生理活性を発揮するための重要因子の１つである細胞外Ｃａ++をヘパリンが保持するため、薬剤作用を、白血球を単離することなく全血で分析し得る。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態では、既知量のスパイク標準ＲＮＡを用いることにより所定の試料の総効率を確定する能力は、用量非依存性且つ配列非依存性である実施形態に起因する。既知量の対照ＲＮＡの使用は、ＰＣＲ測定値を、元の試料中の標的ｍＲＮＡの量に変換させる。このような計算は、種々の遺伝子に関する全血１μＬ当たりのｍＲＮＡの存在の正常範囲を確定するために、長時間にわたって個体の大試料に関して用いられ得る。本発明の実施形態が所定時間で個体の全血を試験するために用いられる場合、正常範囲外のレベルを有する、疾患を示すｍＲＮＡの存在を示す結果は、疾患の存在を示唆し得る。本発明の実施形態は、様々な疾患の検出のためのアッセイとして用いられ得る。例えば疾患を示すｍＲＮＡは、多数の試料中のｍＲＮＡを最大所望レベルに誘導して、所定の試料のｍＲＮＡを測定し、そして試料のｍＲＮＡのレベルを検出して、それが最大レベルを下回るか否かを確定することにより検出され得る。同様に、本発明の実施形態は、治療内容の有効性を確定するに際してのアッセイとして用いられ得る。本発明の実施形態は、種々の量の酸化防止剤を用いて人々の試料のｍＲＮＡレベルが互いに比較される酸化ストレス試験においても同様に用いられ得る。
【００５１】
別の好ましい実施形態は、全血からのｍＲＮＡを高効率に定量するためのキットを含む。該キットは、全血からのｍＲＮＡを高効率に定量するための装置、ヘパリン含有血液回収用チューブ、低張緩衝液及び溶解緩衝液を含む。
【００５２】
別の好ましい実施形態は、血液試料、低張緩衝液及び溶解緩衝液を装置に添加するためのロボット、自動真空吸引装置及び遠心分離機、並びに自動ＰＣＲ機を備える、全血中の
ｍＲＮＡを高効率に定量するための完全自動化システムを含む。
【実施例】
【００５３】
＜実施例１＞
本発明の方法の種々のプロトコルを試験し、全血からβ−アクチンｍＲＮＡ及びＣＤ４ｍＲＮＡを定量するために使用した。
【００５４】
３種類の抗凝血剤：ＡＣＤ、ＥＤＴＡ及びヘパリンを試験した結果、ヘパリンが最も高い白血球保持率をもたらした。ＡＣＤ血を移入する際にＬｅｕｋｏｓｏｒｂ膜が使用されているが、４層の膜を同時に使用しても、およそ１５〜４０％の白血球が通り抜けた。ＥＤＴＡ血について試験したが、吸着容量及び白血球保持についてはＡＣＤ血の場合と同様であることがわかった。しかし、もっとも注目すべきは、ヘパリン血中の白血球の１００％がＬｅｕｋｏｓｏｒｂ膜上に捕捉されたことである。ヘパリン血由来の白血球を１００％捕捉したことは、本発明を用いたｍＲＮＡの定量の信頼性を示す。これらのデータは、ｍＲＮＡを正確に定量するにはヘパリン血を使用することが非常に適しているのに対し、大容量の血液を要し、さほど定量的な結果が必要とされない場合にはＡＣＤ血が有用であることを示す。
【００５５】
凍結血試料と新鮮血試料を用いた結果を比較した。図３に示されるように、凍結試料の漏出細胞（leaked cell）からよりも新鮮血の漏出細胞からのほうが、より多くのＣＤ４ｍＲＮＡが回収された。
【００５６】
また、ガラス繊維フィルターの全血保持の有効性を、ＰＢＴ系フィルターメンブレンの保持値と比較して調べた。表ＩＩに示されるように、ガラス繊維膜は、膜を低張緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４）で洗浄して赤血球を破裂させた場合でさえ、４０μＬの全血しか受容しなかった。しかし、Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂフィルターは、表２に示されるように、ガラス繊維フィルターよりも有意に多くの量の全血を受容した。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
低張緩衝液による様々な回数の洗浄を施して、赤血球及び他の血液成分を除去した。図４に示されるように、試料を低張緩衝液で少なくとも３回洗浄すると、洗浄しない場合と比べて、捕捉されたＣＤ４ｍＲＮＡの量が２倍を超えた。また図４は、血液を低張緩衝液で１２回洗浄したときに、最も多くのｍＲＮＡが捕捉されたことを示す。さらに最終ＣＤ４ｍＲＮＡ定量に関して、白血球を回収するための種々の方法、すなわち血液試料の真空吸引による方法、遠心分離による方法、並びにエタノール洗浄に続いて真空吸引による方法を比較した。図５は、真空吸引による方法が遠心分離による方法よりも良好なＣＤ４ｍＲＮＡ定量をもたらすことを示し、且つ真空吸引前にエタノールで血液試料を洗浄する方法にすると、最も多くのｍＲＮＡが得られることを示す。
【００５９】
白血球をガラス繊維膜又はＬｅｕｋｏｓｏｒｂ膜上に捕捉し、低張緩衝液による様々な回数の洗浄を施して、赤血球及び他の血液成分を除去した。捕捉された白血球からｍＲＮＡを遊離させるため、溶解緩衝液（アールエヌエーチャー社（RNAture））をフィルタープレートに添加し（４０μＬ／ウェル）、プレートを室温で２０分間インキュベートした。好ましい実施形態において、溶解緩衝液中に増幅プライマーが含有される。図６は、溶解緩衝液がＲＮＡ分解酵素阻害に重要な役割を果たし、溶解緩衝液により失活したＲＮＡ分解酵素が好酸球中に充満していることを示す。次いで、マルチウェルフィルタープレートをプラスチック製バッグ内に密封し、遠心分離した（ＩＥＣ ＭｕｌｔｉＲＦ、２，０００ｒｐｍ、４℃で１分間）。次いで、溶解緩衝液を再度添加し（２０μＬ／ウェル）、続いて遠心分離した（ＩＥＣ ＭｕｌｔｉＲＦ、３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間）。次いで、マルチウェルフィルタープレートを遠心分離機から取り出し、室温で２時間インキュベートして、ポリ（Ａ）+ＲＮＡテールと固定化オリゴ（ｄＴ）とをハイブリダイズさせた。次いで、マルチウェルフィルタープレートを１５０μＬの溶解緩衝液で３回洗浄して残留リボヌクレアーゼを除去し、続いて１５０μＬの洗浄緩衝液（ＢｉｏＴｅｋ＃Ｇ４）で３回洗浄してｃＤＮＡ合成の阻害因子をいくらか含有する溶解緩衝液を除去した。
【００６０】
前述した最後の洗浄により、洗浄緩衝液はマルチウェルフィルタープレートから完全に除去され、予め混合したｃＤＮＡ緩衝液４０μＬを添加することにより各ウェル内でｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ緩衝液は、５×第１鎖緩衝液（プロメガ社（Promega）製Ｍ５３１Ａ、１０ｍＭのｄＮＴＰ（プロメガ社製ストック、２０×））、プライマー（５μＭ、＃２４）、ＲＮａｓｉｎ（プロメガ社製Ｎ２１１Ａ、４００Ｕ／μＬ）、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（プロメガ社製Ｍ１７０Ａ、２００Ｕ／μＬ）及びＤＥＰＣ水から構成されることが好ましい。図７は、ｍＲＮＡを定量するための最適ＭＭＬＶ濃度が５０単位／ウェルであることを示す。
【００６１】
Ａｘｙｍａｔ（アムジェン社製ＡＭ−９６−ＰＣＲ−ＲＤ）をマルチウェルフィルタープレート上に配置し、次いでこれをヒートブロック（３７℃、ＶＷＲ）上に配置してインキュベートした（＞９０分）。次いで、マルチウェルフィルタープレートを遠心分離した（２，０００ｒｐｍ、４℃で１分間）。ＰＣＲプライマーを３８４ウェルＰＣＲプレートに添加し、ｃＤＮＡをマルチウェルフィルタープレートから３８４ウェルＰＣＲプレートに移した。図８は、ＰＣＲのための最適ｃＤＮＡ値がおよそ２μＬ／ウェルであることを示す。ＰＣＲプレートを遠心分離し（２，０００ｒｐｍ、４℃で１分間）、リアルタイムＰＣＲを開始した（ＴａｑＭａｎ／ＳＹＢＥＲ）。本発明の方法は高いｍＲＮＡ特異性を有し、ＴａｑＭａｎｑＰＣＲでのＣＤ４ｍＲＮＡの増幅では、ＤＮＡコンタミネーションは検出されなかった（＜１０コピー／ウェル）。
【００６２】
図９に示されるように、本発明はｍＲＮＡ定量の変動係数が小さい。２時間のハイブリダイゼーションでは、従来のｍＲＮＡ定量の変動係数がおよそ３００％であるのに対して、該変動係数が１３％未満であった。さらにまた、図１０に示されるように、直線的な結
果は、捕捉されるｍＲＮＡの量が、１ウェル当たりに使用された全血の量に正比例することを示し、本発明が信頼性及び再現性のあるｍＲＮＡの定量法であることを示す。
【００６３】
＜実施例２＞
５０μＬのヘパリンで処理したヒトの凍結血液をＬｅｕｋｏｓｏｒｂフィルタープレートに添加した。各ウェルを真空にし、１５０μＬの５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４及び１５０μＬの１００％エタノールで１２回洗浄した。次に、１．７０７〜１．８５６Ｍのグアニジンチオシアネートを含有する４０μＬの溶解緩衝液をそのウェルに添加した。室温で１５分間インキュベートした後、フィルタープレートをＧｅｎｅＰｌａｔｅ上に配置し、２，０００ｒｐｍで４℃にて１分間遠心分離した。さらに２０μＬの溶解緩衝液を加え、その試料を５分間遠心分離した。ＧｅｎｅＰｌａｔｅを室温で２時間インキュベートした後、各ウェルを１００μＬの溶解緩衝液で３回洗浄し、その後１５０μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ）で３回洗浄した。ｃＤＮＡをＧｅｎｅＰｌａｔｅで合成し、２μＬのｃＤＮＡをＴａｑＭａｎアッセイに用い、ＣＤ４を定量した。結果を図１１に示す。
【００６４】
＜実施例３＞
５０μＬのヘパリンで処理したヒトの凍結血液をＬｅｕｋｏｓｏｒｂフィルタープレートに添加した。各ウェルを真空にし、１５０μＬの５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４及び１５０μＬの１００％エタノールで１２回洗浄した。次に、０〜０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを有する１．７９１Ｍのグアニジンチオシアネートを含有する４０μＬの溶解緩衝液をそのウェルに添加した。室温で１５分間インキュベートした後、フィルタープレートをＧｅｎｅＰｌａｔｅ上に配置し、２，０００ｒｐｍで４℃にて１分間遠心分離した。さらに２０μＬの溶解緩衝液を添加し、５分間再度遠心分離した。ＧｅｎｅＰｌａｔｅを室温で２時間インキュベートした後、各ウェルを１００μＬの溶解緩衝液で３回洗浄し、その後１５０μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ）で３回洗浄した。ｃＤＮＡをＧｅｎｅＰｌａｔｅで合成し、２μＬのｃＤＮＡをＴａｑＭａｎアッセイに用い、ＣＤ４を定量した。結果を図１２に示す。
【００６５】
＜実施例４＞
溶解緩衝液ストック
０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン
４×ＳＳＣ
１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４
１ｍＭＥＤＴＡ
０．１％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０
１．７９１Ｍグアニジンチオシアネート
作用溶解緩衝液
溶解緩衝液ストック １ｍｌ
２−メルカプトエタノール １０μＬ
超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ） １０μＬ
大腸菌ｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ） １０μＬ
プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌストック） ２５μＬ（最終０．５ｍｇ／ｍｌ）
【００６６】
＜実施例５＞
対照ＲＮＡの調製
対照ＲＮＡを合成するために、鋳型オリゴヌクレオチド（配列番号２及び配列番号４）並びにＫ５６２細胞由来のｃＤＮＡ（アールエヌエーチャー社、Irvine, CA）を、Ｔ７−正方向プライマー（配列番号３、配列番号５及び配列番号６）及びｄＴ40逆方向プライマ
ー（Ｔ40−配列番号１及びＴ40−配列番号７）を用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で１０秒間のアニーリング、その後７２℃で２０秒間の伸長をそれぞれ３０サイクルで増幅した。オリゴヌクレオチドはＩＤＴ社(Coralville, IA）又はプロリゴ社（Proligo）（Boulder, CO）から購入した。配列は以下：
配列番号１：５'−ＧＧＧＴＧ ＣＴＧＴＧ ＣＴＴＣＴ ＧＴＧＡＡ Ｃ−３'
配列番号２：５'−ＧＣＣＣＣ ＣＴＣＡＣ ＴＣＣＣＡ ＡＡＴＴＣ ＣＡＡＧＧ ＣＣＣＡＧ ＣＣＣＴＣ ＡＣＡＣＡ ＴＴＧＴＴ ＣＡＣＡＧ ＡＡＧＣＡ ＣＡＧＣＡ
ＣＣＣ−３'
配列番号３：５'−ＧＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣ ＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧ ＧＧＧＡＣ ＡＧＣＣＣ ＣＣＴＣＡ ＣＴＣＣＣ ＡＡＡ−３'
配列番号４：５'−ＧＡＡＧＣ ＧＴＧＴＧ ＴＣＡＣＴ ＧＴＧＴＧ ＴＴＴＣＣ ＡＡＧＧＣ ＣＣＡＧＣ ＣＣＴＣＡ ＣＡＣＡＴ ＴＧＴＴＣ ＡＣＡＧＡ ＡＧＣＡＣ
ＡＧＣＡＣ ＣＣ−３'
配列番号５：５'−ＧＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣ ＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧ ＧＧＧＡＣ ＧＧＡＡＧ ＣＧＴＧＴ ＧＴＣＡＣ ＴＧＴＧＴ ＧＴ−３'
配列番号６：５'−ＧＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣ ＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧ ＧＧＧＡＣ ＧＣＡＴＴ ＣＣＧＣＴ ＧＡＣＣＡ ＴＣＡＡＴ Ａ−３'
配列番号７：５'−ＴＣＣＡＡ ＣＧＡＧＣ ＧＧＣＴＴ ＣＡＣ−３'
の通りである。
【００６７】
ＲＮＡを、３７℃で３０分間ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写システム（Ｔ７ＲｉｂｏＭａｘＥｘｐｒｅｓｓ、プロメガ社）により精製ＰＣＲ産物から合成し、その後１５分間ＤＮアーゼ（１単位）処理を２回行った。精製ＲＮＡ産物をヌクレアーゼ無含有水に懸濁し、その濃度を、標準として、ｒＲＮＡを用いてＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイ（分子プローブ）で測定した。品質をキャピラリー電気泳動チップ（ｉＣｈｉｐ、日立化成工業株式会社（Hitachi Chemical）、東京、日本）で分析した。
【００６８】
白血球の回収
静脈血試料を健常な成人の志願者（volunteer）から集めた。ガラス繊維フィルタープレート（アールエヌエーチャー社）及びＬｅｕｋｏｓｏｒｂ膜（ポールライフサイエンス社（Pall Life Sciences）（Ann Arbor, MI））は、指定業者から入手した。特別注文の９６ウェルＬｅｕｋｏｓｏｒｂフィルタープレートは、ワットマンポリフィルトロニクス社（Whatman-Polyfiltronics）（Clifton, NJ）により製造された。ヒト血液試料は、接触感染性物質と考えられるので、使い捨て真空管が設計され、且つ特別注文の製品は、アンブリットエンジニアリング社（Ambritt Engineering)（Santa Ana, CA）により製造された。フィルタープレートを使い捨て真空管上に配置し、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：インビトロジェン株式会社（Invitrogen）（Carlbad, CA））で２回洗浄した。減圧を止め、次に新鮮血試料又は解凍血試料（最大２００μＬ／ウェル）をフィルタープレートに添加した。試料全てをフィルタープレートに分注した後、減圧濾過を１４ｃｍＨｇで開始し、その後ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１２回洗浄した。最後の洗浄後、減圧をさらに５分間続け、膜を完全に乾燥させ、ＰＢＳの残量を膜から除去した。
【００６９】
細胞溶解及びｍＲＮＡ調製
フィルタープレートをブランクのマイクロプレート上に配置し、その後逆方向プライマー（最終濃度２５ｎＭ）、定量標準として合成ＲＮＡ、１００μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ（エッペンドルフ−５プライム社（Eppendorf-5 Prime）、Westbury, NY）、１００μｇ／ｍＬの大腸菌ｔＲＮＡ（株式会社シグマ（Sigma））、５００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（ピアース社（Pierce）、Rockford, IL）、及び１：１００に希釈された２−メルカプトエタノール（バイオ・ラッド社（BioRad）、Hercules, CA）を含む４０μＬの溶解緩衝液（アールエヌエーチャー社、Irvine, CA）を添加した。試料を室温で１時間イン
キュベートした。いくつかの実験（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）で、様々な濃度のオリゴ−ｄＡ20を溶解緩衝液に添加した。次に、フィルタープレートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、アールエヌエーチャー社）上に配置し、その後６５０×ｇで１分間遠心分離した。次に、２０μＬの溶解緩衝液を添加し、その後１，４５０×ｇで５分間遠心分離した。このプロセスの後、ＧｅｎｅＰｌａｔｅの各ウェルにおける溶解緩衝液量はおよそ５０μＬであった。ＧｅｎｅＰｌａｔｅをインキュベートした後、そのプレートを１００μＬ無処理の溶解緩衝液で３回洗浄し、その後１５０μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣｌ）で３回洗浄した。
【００７０】
ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡを、１×ＲＴ緩衝液、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、１５単位のｒＲＮａｓｉｎ、及び３７．５単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（プロメガ株式会社）を含有する３０μＬのｃＤＮＡ緩衝液を添加することにより、ＧｅｎｅＰｌａｔｅで合成した。試料を３７℃で２時間インキュベートした。逆方向プライマーを溶解緩衝液に添加したため、プライマーをｃＤＮＡ合成反応物には入れなかった。ｃＤＮＡを合成した後、５０μＬのヌクレアーゼ無含有水を各ウェルに添加し、以下に記載するように２μＬをＴａｑＭａｎアッセイに用いた。
【００７１】
ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ
対照ＲＮＡ用のプライマー及びＴａｑＭａｎプローブは、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓバージョン２．０（アプライドバイオシステムズ（ＡＢＩ）社（ABI）、Foster City, CA）により設計された。ｂｃｒ−ａｂｌに、本発明者等は公示の配列を用いた。いくつかの実験では、ＨＹＢシミュレータ（アールエヌエーチャー社）を用いて、逆方向プライマーを設計した。正方向プライマー（配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５及び配列番号８）、逆方向プライマー（配列番号９及び配列番号１６）、並びにＴａｑＭａｎプローブ（ＦＡＭ−配列番号１３−ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ−配列番号１７−ＴＡＭＲＡ及びＦＡＭ−配列番号１２−ＴＡＭＲＡ）を用いて、対照ＲＮＡを増幅した。血液試料中のＣＤ４ｍＲＮＡの量を測定するために、ＣＤ４及び対照ＲＮＡの両方を、単一ウェルのマルチプレックスＰＣＲではなく、ＰＣＲプレートの別個のウェルで分析した。β−アクチンに関しては、市販のプライマー及びプローブが使用された（アプライドバイオシステムズ（ＡＢＩ）社）。３８４ウェルＰＣＲプレート（アプライドバイオシステムズ（ＡＢＩ）社）に、２μＬのｃＤＮＡ、５μＬのＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス（アプライドバイオシステムズ（ＡＢＩ）社）、１μＬの５μＭ正方向プライマー、１μＬの５μＭ逆方向プライマー、及び１μＬの２μＭＴａｑＭａｎプローブを混合した。ＰＣＲを、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で２０秒間、その後５５℃で２０秒間、最後に６０℃で１分間を４５サイクルでＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（アプライドバイオシステムズ（ＡＢＩ）社）を用いて行った。そのデータをＳＤＳバージョン２．０（アプライドバイオシステムズ（ＡＢＩ）社）により解析した。いくつかの実験では、ＴａｑＭａｎアッセイをＧｅｎｅＰｌａｔｅ（オプチコン社（Opticon）、MJ Research）で直接行った。オリゴヌクレオチド（配列番号２、配列番号４及び配列番号１４）、並びにＰＣＲ産物を、対照ＲＮＡ用の定量標準として用いた。配列は以下：
配列番号８：５'−ＡＡＡＴＧ ＣＣＡＣＡ ＣＧＧＣＴ ＣＴＣＡ−３'
配列番号９：５'−ＣＡＡＧＴ ＧＴＣＴＴ ＣＧＴＧＴ ＣＧＴＧＧ Ｇ−３'
配列番号１０：５'−ＡＧＣＣＣ ＣＣＴＣＡ ＣＴＣＣＣ ＡＡＡ−３'
配列番号１１：５'−ＡＧＣＣＣ ＣＣＴＣＡ ＣＴＣＣＣ ＡＡＡ−３'
配列番号１２：５'−ＣＡＧＴＧ ＧＣＴＡＧ ＴＧＧＴＧ ＧＧＴＡＣ ＴＣＡＡＴ ＧＴＧＴＡ ＣＴＴ−３'
配列番号１３：５'−ＣＣＡＡＧ ＧＣＣＣＡ ＧＣＣＣＴ ＣＡＣＡＣ Ａ−３'
配列番号１４：５'−ＣＡＧＧ ＧＡＣＡＡ ＡＴＧＣＣ ＡＣＡＣＧ ＧＣＴＣＴ ＣＡＣＣ
Ａ ＧＴＧＧＣ ＴＡＧＴＧ ＧＴＧＧＧ ＴＡＣＴＣ ＡＡＴＧＴ ＧＴＡＣＴ
ＴＴＴＧＧ ＧＴＴＣＡ ＣＡＧＡＡ ＧＣＡＣＡ ＧＣＡＣＣ ＣＡＧＧＧ−３'
配列番号１５：５'−ＣＣＡＣＴ ＧＧＡＴＴ ＴＡＡＧＣ ＡＧＡＧＴ ＴＣＡＡ−３'
配列番号１６：５'−ＴＣＣＡＡ ＣＧＡＧＣ ＧＧＣＴＴ ＣＡＣ−３'
配列番号１７：５'−ＣＡＧＣＧ ＧＣＣＡＧ ＴＡＧＣＡ ＴＣＴＧＡ ＣＴＴＴＧ Ａ−３'
の通りであった。
【００７２】
データ解析
ＰＣＲ産物の量を、各遺伝子に対する標準曲線を用いて求めた。つまり、ＴａｑＭａｎの結果に、希釈係数（×４０：８０μＬのｃＤＮＡのうち２μＬをＰＣＲに用い、×１．６７：３０μＬのｃＤＮＡを１ウェル当たり５０μＬの溶解緩衝液から合成した）を掛けた。回収されたスパイクＲＮＡをスパイクＲＮＡの所定の量（通常は１つのウェル当たり１０7コピー）で割ることにより、各試料におけるスパイクＲＮＡの回収率をさらに求めた。ＣＤ４ｍＲＮＡに関しては、ＴａｑＭａｎの結果に希釈係数を掛け、血量で割り、同じ試料中のスパイクＲＮＡの回収率で割った。各血液試料をフィルタープレートの３ウェル（３連）に添加し、各遺伝子の１本鎖ｃＤＮＡ及び１本鎖ＰＣＲ産物が各ウェルに生成された。
【００７３】
アッセイの妥当性
ハイブリダイゼーションの動態を図１３Ａに示し、ハイブリダイゼーションは室温で２時間後にプラトーに達した。血液用量の依存性を図１３Ｂに示し、ＣＤ４ｍＲＮＡは０．０５μＬで検出され、対数スケールで最大２００μＬまで直線的に増加した。本発明者等は、ハイブリダイゼーション効率が１５℃と２５℃との間で劇的に変わったことも見出した（図１３Ｃ）。図１３Ｄに示されるように、ＣＤ４ｍＲＮＡはヘパリンで処理された血液中で非常に安定であり、３７℃では７時間まで又は４℃では一晩ほとんど変化しなかった。このことから、ＣＤ４は全血中の遺伝子発現解析に対して優れた対照であり得ることが示唆される。図１３の結果は遺伝子数の平均値±標準偏差として表示された。閾値サイクル（Ｃｔ）のＣＶが１〜２％未満であったが、対数スケールから直線スケールへの変換によって、Ｃｔが遺伝子数に換算された場合にＣＶはかなり増加した。しかし、図１３に示されるように、出発材料が全血であった場合でも、ＣＶは、１０〜３０％と低かった。
【００７４】
定量化
本研究における定量の目的は、スパイク対照ＲＮＡを用いることにより、各試料の総アッセイ効率を求めることであるが、このスパイク対照ＲＮＡは元の試料中の標的ｍＲＮＡの明確な量を計算するための基準としてさらに使用される。この原理は、ＲＮＡの回収が用量非依存的であり、且つその回収は種非依存的であるという２つの前提を含んでいる。つまり、回収率はｍＲＮＡのコピー数の多少にかかわらず一致し、また異なる配列間でも一致していなければならない。このような前提は、ｍＲＮＡ精製過程だけでなく、ｍＲＮＡの定量化、すなわち細胞溶解からＰＣＲまでのプロセス全てに当てはまる。最初の前提を確証するために、５０μＬの血液を添加した場合に様々な量の合成ポリ（Ａ）+対照ＲＮＡを溶解緩衝液に添加し、Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ膜に張り付けた（expose）。対照ＲＮＡがヒト血液だけからは増幅されなかったことを本発明者等が確認した後、対照ＲＮＡの回収率をＴａｑＭａｎアッセイで測定した。図１４Ａに示されるように、対照ＲＮＡの用量依存的回収が１０5〜１０9コピー／ウェルの試験範囲で観察された。同じデータを回収率に換算したところ、これらの値はほぼ２０％と同様になった（図１４Ｂ）。図１４Ａ及び図１４Ｂのデータは、ｍＲＮＡ精製及びｃＤＮＡ合成を含む全プロセスの要約であった。ハイブリダイゼーションの平衡条件のもと、解離定数（Ｋｄ）を以下のように計算した。
【００７５】
Ｋｄ＝［ＲＮＡ］×［オリゴ−ｄＴ］／［ＲＮＡ：オリゴ−ｄＴ］；ここで［ＲＮＡ］及
び［オリゴ−ｄＴ］は、ＲＮＡ及びオリゴ−ｄＴ、それぞれの非結合状態の濃度を表し、且つ［ＲＮＡ：オリゴ−ｄＴ］はオリゴ−ｄＴとハイブリダイズしたＲＮＡの濃度を表す。これは、［ＲＮＡ：オリゴ−ｄＴ］は添加されるＲＮＡの量によって変化することを意味する。実際、ハイブリダイズしたＲＮＡをＹｏｙｏ−１核酸色素で測定した時、［ＲＮＡ：オリゴ−ｄＴ］は添加されたＲＮＡの量に比例して増加した（Miura, Y., Ichikawa,
Y., T., Ogura, M.,deFries, R., Shimada, H., & Mitsuhashi, M. マイクロタイタープレート上での固定化オリゴ（ｄＴ）を用いた全ｍＲＮＡの蛍光光度測定 Clin Chem. 42, 1758-64 (1996)）しかし、図１４Ｂに示される対照ＲＮＡが各ウェルにおいて全ｍＲＮＡの非常に小さな画分であるため、対照ＲＮＡはこの範囲のＫｄ値に事実上影響を与えてはいない。プライマーがｃＤＮＡ合成の過程に含まれた場合、本発明者等は種内及び種間の再現性の問題にぶつかる。しかし、ハイブリダイゼーションの間にプライマーを加えることで再現性が向上し、プライマー配列が異なる場合でもハイブリダイズされる前のプライマーからｃＤＮＡが同様に合成されることが示唆される。回収率それ自体は試料中のｍＲＮＡの量に依存して個体間で変わることもあるが、図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように或る濃度における回収率は同じ試料内での他の濃度に対しても当てはめることができる。
【００７６】
２つ目の前提、すなわち回収率が種非依存的であることを検証するために、３つの合成ポリ（Ａ）+ＲＮＡを入れて、溶解緩衝液のオリゴ−ｄＡによりハイブリダイゼーションを競合阻害させた。図１４Ｂに示されるように、本発明者等は異なる量のＲＮＡを意図的に使用したため、３つのスパイクＲＮＡ間、並びに標的ネイティブＣＤ４ｍＲＮＡ間で回収されたＲＮＡの量が変わった。しかし、ＲＮＡ全てが、３×１０12〜１０15コピー／ウェルでオリゴ−ｄＡにより阻害された（図１４Ｃ）。興味深いことに、同じデータを合計割合に変換した場合、４つのＲＮＡ全てがほぼ３×１０12コピー／ウェルのＩＣ50と非常に類似した阻害曲線を示した（図１４Ｄ）。このことから、本発明者等のシステムによるｍＲＮＡの精製は、ポリ（Ａ）特異的、且つ配列非依存的であることが示唆される。図１４Ｃに示されるように、１０15コピーのオリゴ−ｄＡが添加された後でも、多少の非特異的な活性が残ったままである。しかし、図１４Ｄに示されるように、この非特異的な活性は総活性の５％に過ぎなかった。このように、非ポリ（Ａ）配列はこのアッセイに重要な役割を果たしていないと思われる。図１４Ｂ及び図１４Ｃは、ｍＲＮＡ定量の全プロセスの要約であったため、これらのグラフは、配列が異なっていても標的遺伝子のアッセイ効率がスパイク合成ＲＮＡのアッセイ効率と一致することを示唆する。また、このことから、ＴａｑＭａｎアッセイにより得られた値を各試料のスパイク対照ＲＮＡの単一用量の回収率で割ることにより、明確な量の標的ｍＲＮＡが求められ得ることも示している。
【００７７】
図１３及び図１４に示されるように、アッセイ内変動はおよそ１０〜２０％であった。アッセイ間の変動を査定するために、同じ個体からの新鮮血又は凍結血に加えて、一定分量の同じ凍結血を用いることにより７つの異なる実験を行った。各実験では、異なるフィルタープレート及びＧｅｎｅＰｌａｔｅを用いて、新鮮な材料を、溶解、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ用に調製した。以下の表ＩＩＩに示されるように、対照ＲＮＡの回収率は４〜２９％であった。本発明者らが、対照ＲＮＡ回収率を考慮せずにＣＤ４の量を比較した場合、これらの値は大きく変動した。しかし、各試料の回収率を調整した後、その値はアッセイ間のＣＶの７〜１４％と非常に類似していた。
【００７８】
【表３】
2010220619.tif 000005
【００７９】
図１３Ａ〜図１３Ｄは、アッセイの妥当性を示す。ＴａｑＭａｎアッセイを、ヘパリンで処理した５０μＬのヒト全血由来のｃＤＮＡ（図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｄ）又は合成対照ＲＮＡ（図１３Ｃ）で行った。図１３Ａは、ハイブリダイゼーションの動態を示す。血液一定分量を−８０℃で凍結した。同一の血液一定分量を異なる時間で解凍し、フィルタープレートに添加し、室温で３０〜２７０分間の長さでハイブリダイゼーションを行った。図１３Ｂは用量反応を示す。血液をＰＢＳで１０倍、１００倍及び１，０００倍に希釈し、５０〜２００μＬの試料をフィルタープレートに添加した。図１３Ｃはハイブリダイゼーション温度を示す。ハイブリダイゼーションは、４℃、１５℃、２５℃及び３７℃で２時間行った。図１３Ｄは、ヘパリンで処理した全血の安定性を示す。血液試料を様々な時間長で４℃又は３７℃にて保存した後、各試料を別個に凍結した。試料を同時に解凍し、フィルタープレートに添加した。そのデータを平均値±標準偏差として表示した。
【００８０】
図１４Ａ〜図１４Ｄは、合成スパイクＲＮＡの回収率を表す。図１４Ａ及び図１４Ｂでは、０〜１０10コピーのＲＮＡ３４が各ウェルに添加された。ｍＲＮＡ精製及びｃＤＮＡ合成を行った後、対照ＲＮＡの量をＴａｑＭａｎＰＣＲで測定した。図１４Ａは、回収された対照ＲＮＡの量（コピー数）対添加された対照ＲＮＡの量を示す。図１４Ｂは、回収率を示し、これは以下のように計算された。
【００８１】
回収率＝回収された対照ＲＮＡの量／添加された対照ＲＮＡの量×１００
【００８２】
図１４Ｃ及び図１４Ｄは、オリゴ−ｄＡが存在する中での回収率を示す。５０μＬのヘパリンで処理した血液をＬｅｕｋｏｓｏｒｂフィルタープレートに添加した後、様々な量の対照ＲＮＡ３４（□）、対照ＲＮＡ３６（○）、及び対照ｂｃｒ−ａｂｌ（△）を含有する溶解緩衝液を０〜１０15コピーのオリゴ−ｄＡ20とともに各ウェルに添加した。ｍＲＮＡ精製及びｃＤＮＡ合成の後、対照ＲＮＡの量をＴａｑＭａｎＰＣＲで測定した。図１４Ｃは、回収されたＲＮＡの量（コピー数）対オリゴ−ｄＡ20の量を示す。図１４Ｄでは、合計割合を以下のように計算した。
【００８３】
合計割合＝オリゴ−ｄＡ20存在下での回収されたＲＮＡの量／オリゴ−ｄＡ20非存在下での回収されたＲＮＡの量×１００
【００８４】
＜実施例６＞
５０μＬのヘパリンで処理したヒト血液を、Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ膜の４つの層を取り付けたフィルタープレートに添加した。血液を真空吸引して、１５０μＬの５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４で１２回洗浄した。次にフィルタープレートをＧｅｎｅＰｌａｔｅに配置し、溶解緩衝液（ＣＤ４に関するアンチセンスプライマーありで又はなしで）４０μＬを各ウェルに添加した。遠心分離により、細胞溶解物をフィルタープレートからＧｅｎｅＰｌａｔｅに移した。このプロセスを、溶解緩衝液４０μＬを用いて１回反復した。ＧｅｎｅＰｌａｔｅを室温で２時間インキュベートした後、各ウェルを溶解緩衝液１００μＬで３回洗浄し、その後、洗浄緩衝液１５０μＬを３回添加した。ｃＤＮＡ合成緩衝液及び適切な酵素を添加することにより、ＧｅｎｅＰｌａｔｅの各ウェル中でｃＤＮＡを合成した。３７℃で２時間インキュベーション後、各ウェルを９５℃の水１５０μＬで３回洗浄した。次に、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲにより、ＧｅｎｅＰｌａｔｅ中でＣＤ４ｍＲＮＡを検出した。
【００８５】
オリゴ（ｄＴ）が特異的プライム化（ＮＮＮＮによる）ｃＤＮＡを置換するという仮説を実証するために、特異的プライマーを用いた場合又は用いない場合で、ＧｅｎｅＰｌａｔｅ中でｃＤＮＡを合成した。次にＣＤ４遺伝子を、ＧｅｎｅＰｌａｔｅから直接増幅した。図１７に示されるように、両試料からＣＤ４を増幅した。これは、上流ｃＤＮＡが固
定化オリゴ（ｄＴ）由来ｃＤＮＡから置換される、ということを示唆する。
【００８６】
＜実施例７＞
全体的スキーム
図１８Ａに示されるように、全血をフィルタープレートに添加して、白血球を捕捉した（Ｉ）。フィルタープレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、インビトロジェン株式会社）で洗浄後、赤血球及び血漿構成成分を除去する。このプロセスは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の慣用的密度勾配分離の場合より簡単且つ高効率である。図１８Ｂ（標準ＲＮＡ（○）、ＣＤ４（●）、ｐ２１（黒三角）、ＦａｓＬ（◆）及びロイコトリエンＣ４合成酵素ｍＲＮＡ（ＬＴＣ４Ｓ）（黒四角））に示すように、フィルタープレートのハイブリダイゼーション性能は、密度勾配法の場合よりわずかに良好であった。ロイコトリエンＣ４合成酵素（ＬＴＣ４Ｓ）ｍＲＮＡのレベルは、おそらくは顆粒球集団の排除のため、ＰＢＭＣ中で有意に低かった。しかし、ｐ２１ ｍＲＮＡは、非常に長い分離プロセス中の二次誘導のため、ＰＢＭＣ中では有意により高かった（図２２）。全血を遠心分離し、ペレットを低張溶液（１０ｍＭのＫＨＣＯ3、１５ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、０．１４ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中に懸濁して、赤血球を破裂させて、その後、即時遠心分離して、白血球を沈降させる別の方法を比較した（図１８Ｂ:低張）。しかし、ＣＤ４、ｐ２１、ＦａｓＬ及びＬＴＣ４Ｓのレベルは全て、フィルタープレート法のレベルより低かった。
【００８７】
図１８Ａ（ＩＩ）に示されるように、次の過程は、フィルタープレートに溶解緩衝液を添加すること、及びｍＲＮＡ精製のためにオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートに溶解物を移すことであった。このプロセスを評価するために、３つのその他の方法を比較用に用いた。フェノール／グアニジンイソシアネート（トリゾール、インビトロジェン株式会社）（図１８Ｃ：Ｐ／ＧＩ）又はキット供給溶解緩衝液（ＲＮｅａｓｙ、キアゲン社（Qiagen））（図１８Ｃ：シリカ）をフィルタープレートの各ウェルに添加し、その後、製品の使用説明書に従って、ＲＮＡ（Ｐ／ＧＩ）を沈降させるか、又はスピンカラム（シリカ）からＲＮＡを溶離した。ポリ（Ａ）+ＲＮＡの直接精製のため、溶解緩衝液をフィルタープレートに添加し、そして溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、アールエヌエーチャー社）（図１８Ｃ：ｄＴ ＭＰ）又はオリゴ（ｄＴ）セルロースを含有する真新しいマイクロチューブ（インビトロジェン株式会社）（図１８Ｃ：ｄＴ Ｃ）に移した。Ｐ／ＧＩ、シリカ及びｄＴ Ｃ法は、大量の単離ＰＢＭＣをマイクロチューブ中で用いた場合、十分な性能を示したが、これらの方法は、５０μＬのみの血液を用いたフィルタープレート系に関しては、良好に作用しなかった（図１８Ｃ）。さらに、細胞ペレットを管中で溶解する場合、機械強度（ボルテックス又はピペッティング）の程度はｍＲＮＡを放出するために重要であり、このプロセスが実質的変動を作り出す。しかし、フィルタープレート法を用いた場合、細胞は膜内に分散し、そして溶解緩衝液の添加は、いかなる付加的な機械力を必要とせずに作用するのに十分であった。
【００８８】
溶解緩衝液は好ましくはプライマーの混合物を含有するため、２つの個々のハイブリダイゼーション反応が同時的に起こった（図１８Ａ）。１つは、固定化オリゴ（ｄＴ）及びｍＲＮＡのポリ（Ａ）テール間で起きた。他方のハイブリダイゼーション反応は、特異的プライマーとｍＲＮＡ中の適切な部位との間で起こった（図１８Ａ（ＩＩ））。特異的プライマーの設計は重要であるが、十分なハイブリダイゼーション時間は、ｃＤＮＡ合成中の十分なプライマーハイブリダイゼーションの時間よりもアッセイをより再現可能にした。一見すると固定化オリゴ（ｄＴ）とのハイブリダイゼーションを介して固体表面に留められたｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ二重鎖のように見えた（図１８Ａ（ＩＩ））。したがって９５℃で５分間加熱することにより、ｃＤＮＡを固体表面から除去した。しかし増幅された遺伝子の量は非加熱の対照の遺伝子の量に変化しなかった（図１８Ｄ、挿入図）。ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ二重鎖が固体表面から何らかの形で除去されたか否かを試験するために、マイクロプレートをｃＤＮＡ合成後に何度も水で洗浄し、そのままＰＣＲに用いた。しかし、
ハイブリダイゼーション過程中に特異的プライマーを用いて又は用いずに、マイクロプレートから標的遺伝子を増幅することに成功した（図１８Ｄ）。これらのデータは、特異的プライマー−プライマー化ｃＤＮＡをオリゴ（ｄＴ）−プライマー化ｃＤＮＡで置換し得る、ということを示唆する（図１８Ａ（ＩＩＩ、ＩＶ））。これは、本系にとって好都合であるが、それは、溶液中のｃＤＮＡを遺伝子定量のために用いるからであり、マイクロプレートそれ自体は、検証、貯蔵及び将来の使用のためのｃＤＮＡバンクとして用い得るからである。
【００８９】
溶解中及びその後のハイブリダイゼーションプロセス中のＲＮＡ安定性を確証するために、等量の標準ＲＮＡを含有する種々の濃度の溶解緩衝液を水又は濃縮好酸球抽出物で希釈した。図１８Ｅに示されるように、好酸球抽出物それ自体は、それが洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣｌ）を用いて懸濁された場合、標準ＲＮＡ定量を大幅に無効にしたが、この場合、ハイブリダイゼーションの厳密性は大多数の溶解緩衝液構成成分なしで保持された。しかし好酸球抽出物を溶解緩衝液中に懸濁した場合、ＲＮＡは保持され、そして水希釈液の場合と同様であった（図１８Ｅ）。広範囲の最適溶解緩衝液濃度（７０〜１２０％）は、この系を強固で且つ再現可能にした。１４０％より高い溶解緩衝液濃度は、アッセイ能を有意に低減した。
【００９０】
アッセイ最適化
図１９Ａ〜図１９Ｆに示されるように（標準ＲＮＡ（○）、ＣＤ４（●）、ｐ２１（黒三角）、ＦａｓＬ（◆）及びロイコトリエンＣ４合成酵素ｍＲＮＡ（ＬＴＣ４Ｓ）（黒四角））、５つの異なる標的ＲＮＡの間で等しい実績を示す最適な再現可能条件を同定するために、試験を実行した。再現可能条件は、その後の遺伝子定量の段階にとって重要である。図１９中の各データ点は、一定分量の同一血液三種（各々５０μＬ）について単一の標準的実験を行った結果の平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）である。しかし少なくとも２〜３回、各実験を再現した。まず３つの代表的抗血液凝固剤を試験した。ヘパリンはＡＣＤ及びＥＤＴＡよりわずかに良好な性能を示したが、３つの抗血液凝固剤は全て許容可能である（図１９Ａ）。ＡＣＤ及びＥＤＴＡは、多数の生理活性に関する重要な構成成分であるカルシウムをキレート化するため、全血がｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激のために用いられるこのプロジェクトにおいて、ヘパリンが抗血液凝固剤として選択された（図２２）。
【００９１】
血液採取後の全血の安定性の保持は、最重要関心事である。したがっていくつかの市販されている系（ＰＡＸ遺伝子、プレアナリティックス社（PreAnalytix））は、血液が直ちに溶解され、放出されたＲＮＡが比較的長期間にわたって安定化されるという特別な血液容器を用いる。しかし大容量の溶解物の操作は、系全体を問題の多いものにする。さらに、このプロジェクトの目標の１つがｉｎｖｉｔｒｏでの遺伝子誘導プロセスの前及び後のｍＲＮＡを定量することであるため（図２２Ａ〜図２２Ｈ）、ヘパリン処理全血を４℃で保存し、ｍＲＮＡレベルにおける変化を調べた。４つのネイティブ遺伝子（ＣＤ４、ｐ２１、ＦａｓＬ及びＬＴＣ４Ｓ）のレベルは血液採取後に安定でなかったが、このレベルは、血液を４℃で保存した場合はいつでも、２時間後に安定且つ一定になった（図１９Ｂ）。
【００９２】
オリゴ（ｄＴ）固体表面を用いたポリ（Ａ）+ｍＲＮＡ調製は、通常は室温で実行される。しかし性能は２０〜３０℃の間で変化する（図１９Ｃ）。短い合成ＲＮＡを用いた場合、２０〜２３℃間の差は有意であった（図１９Ｃ）。したがってｍＲＮＡ調製過程を４℃で実行した。ハイブリダイゼーションの長さも重大であった。いくつかのＲＮＡ（標準ＲＮＡ及びＦａｓＬ）は、２時間後にプラトーに達したが、一方、他のものは安定化するのに４〜８時間より長い時間を要した（図１９Ｄ）。その結果、ｍＲＮＡ調製過程を４℃で一晩実行した。この条件に切り替えることにより、アッセイ間の変動を実質的に改良した。
【００９３】
いかなる追加的プライマーも用いずに、ｃＤＮＡを合成した（図１８Ｄ）。短い合成ＲＮＡ及び豊富なＲＮＡ（ＣＤ４）は少量の逆転写酵素しか要しなかったが、その他のＲＮＡ片は、プラトーに達するのに約１００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素を要した（図１９Ｅ）。興味深いことに、ＲＮＡ分解酵素Ｈ-ＭＭＬＶ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ、インビトロジェン株式会社）は、この系におけるネイティブＭＭＬＶと比較して、不十分な性能を示した。３７℃で９０分より長いインキュベーションは、試験した全てのＲＮＡ種に関して十分であった（データは示されていない）。
【００９４】
その後のＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲに、溶液中のｃＤＮＡをそのまま用いた。アッセイは、ＰＣＲに移されるｃＤＮＡの量に比例して鋭敏になる。市販の緩衝液は、ＰＣＲを阻害するジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する。したがって図１９Ｆに示されるように、最大ｃＤＮＡ容積は、ＰＣＲ１０μＬ当たり２μＬであった。緩衝液からＤＴＴを除去することにより、ｃＤＮＡの容積はＰＣＲ１０μＬ当たり４μＬに増大した。
【００９５】
定量
この研究の定量過程における目標は、既知量のスパイク標準ＲＮＡ（これは、ＰＣＲ結果を元の試料中の標的ｍＲＮＡの量に変換するための基準としてさらに用いられる）を用いることにより、各試料における総アッセイ効率を確定することであった。原理は、以下の２つの前提に依存している：効率は、種々の存在量を有する類似するｍＲＮＡの試料間で同一であること（用量非依存性）；及び効率は、異なるｍＲＮＡ配列間で同一であること（配列非依存性）。第一の前提を確証するために、異なる量の合成ＲＮＡ標準を溶解緩衝液に添加し、これを、５０μＬの血液を含有するフィルタープレートにさらした。標準ＲＮＡがヒト血液単独から増幅されなかったことを実証した後に、ＴａｑＭａｎＰＣＲにより標準ＲＮＡの回収率を確定した。図２０Ａに示されるように（標準ＲＮＡ（○）、ＣＤ４（●）、ｐ２１（黒三角）、ＦａｓＬ（◆）及びロイコトリエンＣ４合成酵素ｍＲＮＡ（ＬＴＣ４Ｓ）（黒四角））、標準ＲＮＡの用量依存性回収率を、１０4〜１０9分子ウェルの試験範囲で観察した。この範囲の標準ＲＮＡは５０μＬの血液中に存在する総ｍＲＮＡの量と比較して十分に小さかったため、４つの他のネイティブｍＲＮＡのレベルは変わらないままであった（図２０Ａ）。同一データを回収率に変換した場合、これらの値は全て、約２〜３％で同様になった（図２０Ｂ）。ハイブリダイゼーションの平衡条件下で、解離定数（Ｋｄ）を以下のように算定した：
Ｋｄ＝［ＲＮＡ］×［オリゴ（ｄＴ）］／［ＲＮＡ：オリゴ（ｄＴ）］
（式中、［ＲＮＡ］及び［オリゴ（ｄＴ）］はそれぞれ非結合状態のＲＮＡ及びオリゴ（ｄＴ）の濃度を表し、そして［ＲＮＡ：オリゴ（ｄＴ）］はオリゴ（ｄＴ）とハイブリダイズしたＲＮＡの濃度を表す）。これは、Ｋｄがこの系において一定値として保持され、そして［ＲＮＡ：オリゴ（ｄＴ）］は添加ＲＮＡの量によって変わる、ということを意味する（図２０Ａ）。実際、ハイブリダイズした全ＲＮＡをＹｏｙｏ−１核酸色素により直接測定した場合、［ＲＮＡ：オリゴ（ｄＴ）］は添加ＲＮＡの量に比例して増大した。これらのデータは、標準ＲＮＡの一濃度由来の回収率が、同一試料内のｍＲＮＡの任意の濃度に適用可能であり得る、ということも示唆する。
【００９６】
第二の仮定に関しては、競合的阻害剤としてオリゴ（ｄＡ）を用いて、又は用いずに、ハイブリダイゼーションを実行した。図２０Ｃに示されるように、５つの標的ＲＮＡ全てのＣｔ値は、１ウェル当たり３×１０12分子より多い量でのオリゴ（ｄＡ）により有意に抑制されたが、これらのＲＮＡの発現レベルは全て異なった。興味深いことに、同一データを抑制率に換算した場合、５つのＲＮＡは全て、ほとんど同一の抑制曲線を示し、ＩＣ50は１ウェル当たり約３×１０12〜１０13分子であった（図２０Ｄ）。これは、該系がポリ（Ａ）特異的であり、且つ配列非依存性である、ということを示す。図２０Ｃに示されるように、１０15分子のオリゴ（ｄＡ）を添加した後でさえ、多少の非特異的活性が残存
した（標準ＲＮＡ及びＣＤ４）。しかし、図２０Ｄに示されるように、Ｃｔ値（対数スケール）を分子数（直線スケール）に変換した場合、これらの非特異的活性は極わずかであった。したがって非ポリ（Ａ）配列は、この系において主要な役割を持たないと考えられる。図２０Ａ〜図２０ＤはｍＲＮＡ定量の全プロセスの要約であったため、これらのデータは、任意の標的遺伝子の総アッセイ効率がスパイク標準ＲＮＡの場合と同一である、ということを示唆する。これは、実質的変動は慣用的総ＲＮＡ精製方法において長ＲＮＡと短ＲＮＡとの間に存在するため、ポリ（Ａ）+ＲＮＡに独特である（データは示されていない）。
【００９７】
次の過程は、各ウェル中のＲＮＡの量を血液１μＬ当たりのＲＮＡ量に換算することであった。図２０Ｅに示されるように、４つのネイティブｍＲＮＡのＣｔ値は、添加された血液の容積に応じて、ほぼ直線状に低減した。ＣＤ４のような十分なｍＲＮＡは、０．００１μＬの血液（１：１０5希釈液、１００μＬ／ウェル）からでさえ検出可能であった（図２０Ｅ）。溶解緩衝液中の標準ＲＮＡの量は同一であったため、血液容積が広範に変化した場合でも、標準ＲＮＡの回収率は変わらなかった（図２０Ｅ）。Ｃｔ値は１ウェル当たり１００μＬより多い血液でプラトーに達した（図２０Ｅ）が、これは、フィルタープレートからの白血球の漏出増大を示唆する。一旦同一データが血液１μＬ当たりの量に換算されると、該値は１ウェル当たり３〜５０μＬの血液で一貫しており（図２０Ｆ）、これは４つのネイティブｍＲＮＡ全てに関して言えることであった（図２０Ｆ）。
【００９８】
定量は、２つの個々の絶対値も頼っている：即ち、添加される標準ＲＮＡの量と、ＴａｑＭａｎＰＣＲにおける標準ＤＮＡ鋳型の量である。標準ＲＮＡ産物の純度を保証するために、ＲＮＡオリゴヌクレオチドをこのプロジェクトに用いた。１００塩基長の長さを有するＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成は達成が困難であり得るが、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは２つのプライマー部位、即ちＴａｑＭａｎプローブ部位及びポリ（Ａ）テールを含むことが好ましいため、このような長さが望ましい。本発明の試験における合成ＲＮＡは、ＨＰＬＣ分析により８６％の純度で、ダーマコン社（Dharmacon）により合成された。増幅曲線の勾配（ＰＣＲ効率を示す）はオリゴヌクレオチドとｃＤＮＡとの間で同一であったため、ＨＰＬＣ精製ＤＮＡオリゴヌクレオチドも、ＴａｑＭａｎＰＣＲのための鋳型として用いた。１ウェル当たり１０6〜１０分子のオリゴヌクレオチドを用いて、標準曲線を作成した。ストック溶液のμＭ濃度の１０6〜１０12倍希釈中に、問題が発生した。ＴＥ又は水を希釈液として用いた場合、標準曲線は広範に、特に１ウェル当たり１０3分子未満で変化した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するヌクレアーゼ無含有水に切り替えた後、この問題は完全に排除された。
【００９９】
正常値の確定
健常被験者における血液１μＬ当たりのｍＲＮＡの対照値を確定するために、ＣＤ４、ｐ２１、ＦａｓＬ及びＬＴＣ４Ｓのレベルを、１５の異なる実験により、２ヵ月にわたって５２個体（５４データ点。１個体は３回反復）から測定した。５０μＬの全血の３つの分割単位から、各データ点を得た。図２１Ａに示されるように、標準ＲＮＡの回収率は３．５６±０．４９％（ＣＶ＝１３．７％）であった。このＣＶ値は従来の免疫測定法比べて非常に大きいが、それは、１サイクルの差によって生成物量が２倍（doubling）異なるＰＣＲを用いるため、許容可能である。標準ＲＮＡ回収率の値を用いて、各ｍＲＮＡのデータを、ピコモル又はフェムトモルという分子数ではなく、血液１μＬ当たりの分子数に換算することに成功した。
【０１００】
図２１Ｂ〜図２１Ｅに示されるように（標準ＲＮＡ（○）、ＣＤ４（●）、ｐ２１（黒三角）、ＦａｓＬ（◆）及びロイコトリエンＣ４合成酵素ｍＲＮＡ（ＬＴＣ４Ｓ）（黒四角））、ＣＤ４、ｐ２１、ＦａｓＬ及びＬＴＣ４ＳのｍＲＮＡの対照値は、それぞれ血液１μＬ当たり１００，７７２±５９，１８４（ＣＶ＝５８．７％）、１，６９２±８５８
（ＣＶ＝５０．７％）、１７，８４１±１２，１９０（ＣＶ＝６８．３％）及び４２，０５８±２２，５２１（ＣＶ＝５３．５％）分子であった。５０％ＣＶは、正常値がＴａｑＭａｎＰＣＲにおける１つのＣｔ内に存在する、ということを意味する。興味深いことに、平均±１ｓ．ｄ．値を各図でぼかし模様を入れた場合、いくつかの個体は高い値を表した（図２１Ｂ〜図２１Ｅ）。高いＦａｓＬ ｍＲＮＡレベルを示した一個体を、３回再現した（図２１Ｄ）。低ＣＶ値と組合せたｍＲＮＡの正常値の確定、及び本発明の好ましい実施形態により得られる標準化は、当業者に既知の種々の疾患の検出のためのアッセイに用いられ得る。
【０１０１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ応答性
モデル系としてのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）及びカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（ＣａＩ）（株式会社シグマ）に対する白血球応答性を査定するために、ｐ２１及びＦａｓＬ ｍＲＮＡのレベルを定量した（図２２）。他の好ましい実施形態では、種々の生理活性因子、例えば放射線、紫外線、酸化的ストレス、オゾン、温度、機械的ストレス、化学物質、ペプチド、ホルモン、タンパク質、抗原、抗体、薬剤、小分子化合物、毒性物質、環境性刺激、細胞間連絡、感染性作因及びアレルゲン（これらに限定されない）による刺激に応答して、種々の型のｍＲＮＡを分析し得る。該系は、人工溶液中の単離白血球懸濁液というよりむしろヘパリン処理全血を用いたため、結果は、生理学的に正確な条件を反映した。図２２Ａに示されるように、ｐ２１及びＦａｓＬのｍＲＮＡレベルはともに、ＰＭＡ及びＣａＩの刺激時に急速に増大し、そして約１０倍増を伴って、９０〜１２０分後にプラトーに達した。ｐ２１における増大は、ＦａｓＬの場合よりもはるかに速かった（図２２Ａ）。ｐ２１のレベルはいかなる刺激もなしに３７℃でのインキュベーションによってもわずかに増大されたが、一方、ＦａｓＬは変化しないままであった（図２２Ａ）。興味深いことに、ヘパリン処理全血を４℃で２１時間保存した場合でも、応答性は保存され（図２２Ｂ）、このことは機能的分子分析時に大きな柔軟性を提供する。
【０１０２】
ｍＲＮＡ発現の増加又は低下を分析する際に、倍増は一般的に用いられるパラメーターである。しかし図２２Ｃ〜図２２Ｄに示されるように、ＰＭＡ−ＣａＩ刺激後に誘導されるｐ２１及びＦａｓＬのｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡの基本レベルの量に応じて、直線的に増大した。したがって倍増測定は、試料が正常集団とかけ離れた２つ以上の標準偏差を示した場合（図２２Ｃ）でも、回帰線上に存在する異常試料を同定することはできなかった（図２２Ｇ）。倍増測定は、回帰線（図２２Ｄ）から離れて存在する異常試料を同定した（図２２Ｈ）。図２２Ｃ〜図２２Ｄの二次元グラフは、両方の場合において、通常試料と異常試料を明確に区別した。図２２Ｃ〜図２２Ｈにおいて、各データ点は、三回の測定の平均である。グラフを単純にするために、標準偏差は示さなかった。しかし、Ｘ及びＹ軸の両方における平均±２ｓ．ｄ．を有するぼかし模様域（図２２Ｃ〜図２２Ｄ）が上左及び下右隅にオープンスペースを含有するため、これらの隅に位置する異常試料は同定が困難であった。回帰線に対してＸ軸を回転させることにより（図２２Ｅ〜図２２Ｆ）、ぼかし模様域のサイズを最小化した。これらのグラフ（図２２Ｅ〜図２２Ｆ）は、正常集団外の異常試料を検出するためのより良好な方法を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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