(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、水産魚介類、特に、特定の産地に由来する水産魚介類、一つまたは複数の優良形質を有する優良水産種苗、または特定の品種の水産魚介類を、標識・識別するための簡易かつ正確な方法を提供することである。【解決手段】  したがって、本発明は、ミトコンドリアＤＮＡ  Ｄ−ループの塩基配列を用いて、一個体または個体群の水産魚介類もしくはその一部またはそれらの加工品の生産履歴を追跡する方法、およびかかる方法に用いられるマーカー遺伝子を決定する方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水産魚介類またはその加工品のミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの塩基配列を決定することにより、該水産魚介類またはその加工品のプロフィールを同定する方法。
【請求項２】
プロフィールが、種、品種、系統、種苗、生産履歴および／または産地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マイクロサテライトにより核型を決定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの種特異的塩基配列が１から２以上のギャップの挿入により整列化できるか否かの判定をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ミトコンドリアＤＮＡのＤループ全長の塩基配列を、ミトコンドリアプロリンｔＲＮＡ特異的プライマーおよびミトコンドリアフェニルアラニンｔＲＮＡ特異的プライマーを用いて増幅し、両鎖シークエンシングにより決定することをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
２または３以上の水産魚介類またはその加工品のミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの塩基配列を比較するための、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの塩基配列の比較が、母系特異的塩基配列が完全に一致するか否かの比較である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
２または３以上の水産魚介類のうちの少なくとも一つは、ミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの塩基配列を予め同定した一個体の雌親または該雌親に由来する受精卵、仔魚、稚魚もしくは成魚である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
雌親に由来する受精卵、仔魚、稚魚もしくは成魚が、同一の養殖場または生簀において産卵および／または孵化されたものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
放流事業または栽培漁業における加入量変動調査または養殖における種苗の同定のための、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
食品としての水産魚介類またはその加工品の種、生産履歴および／または産地を同定するための、請求項６または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然および栽培漁業における水産魚介類の遺伝子識別および標識方法に関する。より具体的には、本発明は、魚介類ミトコンドリアＤＮＡのＤループの塩基配列の相違に基づき、魚介類の品種、産地、系統（種苗）を識別および標識する方法、および養殖事業（栽培漁業）において育種された種苗の稚魚の識別および標識のための方法、ならびにかかる方法に用いるマーカー遺伝子の決定および検出の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本においては海面養殖漁業および栽培漁業の技術開発が従来から進展しているが、特に近年、クロマグロの完全養殖が成功したことを筆頭として、マダイ、ヒラメ、シラスウナギなどにおいて、卵から繁殖可能な成魚を生産し、さらに成魚から次世代を再生産する、天然資源に依存しない完全養殖の技術が確立しつつある。世界的な食糧不足による食糧価格の高騰、日本の食糧自給率の低下、輸入食糧に関する安全性の問題などが火急の懸案である今日、より安全、安価かつ高品質の食糧を提供し得る供給源として、養殖および栽培漁業に対する関心が高まってきている。
【０００３】
養殖および栽培漁業においては、優良系統、例えばウイルスや細菌などの病原に対する耐性の高い系統、成長速度が高い系統、繁殖能力の高い系統などを選択して繁殖させることにより、より高品質の人工種苗の育成が行われる。人工種苗の育成、特に食用とされる魚類を継代で完全養殖する試みには莫大な資本が必要であり、その資本回収は容易ではない。また、水産種苗においては、植物種苗のような遺伝子操作による不稔技術の導入は技術的・倫理的に困難であるため、育種・確立した優良種苗（稚魚）を販売・譲渡する場合、譲受人による増殖（繁殖）と販売が容易であり、種苗育成者の権利の保護が非常に困難であることが問題となっている。また、植物種苗については種苗法により登録された種苗（品種）育成者の権利が保護されるが、動物、特に水産魚介類の種苗に関しては、育成者の権利は法的にも実質的な保護がなされていない。このため、養殖・栽培漁業の分野において優良種苗の育成者および放流事業者の権利を保護し、水産業を活性化するために、水産種苗の登録制度の確立と種苗および成魚の標識および同定方法の開発が望まれる。
【０００４】
また、栽培漁業、特に放流事業の加入量変動調査のために稚魚を標識する方法の開発も望まれている。例えば、近年、ミナミマグロに次いでタイセイヨウクロマグロも絶滅危惧種に指定され、漁獲制限がなされている。このような種について、人工的に育成された稚魚を放流して自然集団を回復させることが可能であると考えられる。一部において、遺伝子的に均一な種苗の大規模な放流が生物学的多様性を低下させ、ひいては水産資源の衰退を導くことが懸念されているが、むしろ、新たな種苗の放流により他系統との交配が進み、生態系における遺伝子の多様性を高めるので、漁場の回復に寄与すると考えられる。種苗の放流による漁場の回復のためには、遺伝子的組成の異なる新たな種苗の放流、および放流の評価を的確に行う加入量変動調査が必要である。加入量変動調査はまた、自然界における水産資源量の変動を把握するためにも重要であり、漁場における特定の種、品種、系統および種苗の正確な加入量変動調査は、放流事業が生態系に与える影響を把握し、かつ持続可能な漁獲計画のために必要である。
【０００５】
放流稚魚を追跡調査するための従来の標識として、例えばサケ稚魚のあぶらびれの切除（北海道札幌市豊平川さけ科学館）、ヒラメ稚魚の無眼側の黒化および焼印（宮津栽培漁業センター）、マダラやトラフグにおける稚魚耳石のＡＬＣ（アリザリンコンプレクソン）色素標識および腹鰭抜去標識（能登栽培漁業センターおよび南伊豆栽培漁業センター）、さらに近年ではＩＣタグと通信衛星を利用する電子標識などが実施されている。いずれも稚魚に対して物理的に標識を行うものであり、鰭の切除や焼印などの手段は、種苗を傷つける危険があり、また市場における商品価値を損なう恐れがある。ＡＬＣ色素標識は、種苗を傷つけずに標識を行うので放流後の成長や生存能に影響を与えないという利点がある一方、調査のためには魚を収集・解体して耳石を採取し、蛍光顕微鏡による確認を行わねばならない。また、これらの方法による標識は、放流する全個体に対して標識をする必要があるのみならず、標識個体一代に限られ、Ｆ１以降の世代にわたって識別可能なものではない。さらに、マグロやトラフグのような高級魚の場合、検査のために魚を購入することは、費用が莫大となるため実質的に不可能であり、また、クロマグロなどの場合、高価であるのみならず魚体が大きいのでサンプル採取や標識自体が困難であるなど、調査の実施には多くの問題が残されている。
【０００６】
水産業における別の懸案事項は、市場に流通する際の水産物の表示に関する問題である。平成１１年のＪＡＳ法改正により、一般消費者向けに販売される生鮮水産物について、名称、原産地（採捕・生産された水域名または輸出国名）、解凍・養殖の表示が義務づけられている。しかしながら、流通の現場においてこれらの表示の真贋を判定することは実質的に困難であるため、販売業者による水産物の産地（漁場・港）の偽装（国産ウナギとの虚偽表示により外国産ウナギを販売するなど）、種または品種の偽装（例えばクロマグロとの虚偽表示によりキハダマグロを販売するなど）が問題となっている。品種や漁場によって食品としての品質や本来の価格は異なるが、偽装の疑いがある場合の検証は容易ではなく、表示に依存せずに生産履歴を正確かつ容易に追跡できるシステムも存在しないため、食品の表示に対する信頼が失われつつある。したがって、水産物の表示をより厳格にし、ひいては産地消費者がより安心して水産物を選択できるように、流通過程において水産物の生産履歴を厳正に表示し、必要に応じて迅速かつ正確に判定できる方法の開発もまた望まれている。
【０００７】
ＤＮＡ塩基配列の相違に基づいて生物種または亜種内の識別を行う手法は、分子遺伝学、系統進化学などの分野において非常に有用であり、特にヒトにおいては医療、法医学などの分野においても利用されている。魚類においては、例えば、特定の遺伝子マーカーを用いて白化しやすいヒラメを判別する方法が開発されている（特許文献１）。しかしながら、特定の形質をもたらす遺伝子多型をマーカーとする方法では、形質毎にマーカーとなる遺伝子型を同定する必要があり、上記のような養殖および栽培漁業の分野における問題を解決するためには有効ではない。
【０００８】
種苗の遺伝子標識を行うために、ＭＨＣマイクロサテライトなどのゲノム多型マーカーを用いることも試みられたが、遺伝子組成の限られた養殖の受精槽においてすらＭＨＣの配列の多様性は極めて高く、個体間においても大きく異なるため、ＭＨＣハプロタイプにより種苗を標識し同定することは困難であった（本発明者らによる実験：データは示さず）。
【０００９】
ミトコンドリアは、核ゲノムとは独立して独自の10数種類の遺伝子群を含む約15,000〜17,000塩基対（ヒトでは16,569塩基対）の環状二本鎖ＤＮＡを有する。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は母性遺伝により子孫に伝えられるので、遺伝学の分野において利用される。また、ｍｔＤＮＡは、塩基置換速度が核ゲノムと比較して５〜１０倍早く、同一種内における変異が多いので、ハプロタイプ識別のために利用されている。例えば、シロザケのｍｔＤＮＡコントロール領域（制御領域、Ｄ−ループ）の多型をハイブリダイゼーションにより検出し、ハプロタイプを判定する方法が開発されている（特許文献２）。
【００１０】
Ｄループは、ｍｔＤＮＡ中の非翻訳高度可変領域であり、同一種内においても多く変異が発生する。非特許文献１には、リュウキュウアユについて、自然集団とこれを起源として異なる環境に導入された導入集団の遺伝的組成を比較する目的で、ｍｔＤＮＡ  Ｄループのマイクロサテライトを制限酵素切断片長多型（ＲＦＬＰ）分析によりハプロタイプ分析を行い、起源となったリュウキュウアユ自然集団と導入集団との間で遺伝的組成が類似していることを確認したことが記載されている。また、非特許文献２は、キンメダイ属３種のミトコンドリア制御領域（Ｄ−ループ）の塩基配列を比較したところ１５．５％の塩基置換率であったこと、および、異なる漁場から採集されたキンメダイの全てがそれぞれ独自のハプロタイプを示し、共通の配列を示すものは見られなかったことを記載している。
【００１１】
非特許文献３は、ミトコンドリア制御領域中の超可変領域の配列を用いて、クロマグロおよびメカジキの地理的亜種間の遺伝的相関関係を調査した結果、大西洋と地中海とで捕獲されたクロマグロの遺伝子構成に分離は見られなかったことを記載している。一方、非特許文献４は、大西洋クロマグロ当歳魚の集団毎の遺伝的構成をマイクロサテライト遺伝子座とミトコンドリア制御領域を用いて調査した結果、ミトコンドリア制御領域の配列類似性と地理的配置との間に有意な関連性を見出したことを記載している。また、非特許文献５は、ミトコンドリア制御領域５’末端のハプロタイプにより分けられる２つのクレイド（clade）を用いた個体群統計学により、メバチマグロの地理的な遺伝子の流出入を調査することを記載している。
【００１２】
これらの文献に開示される方法は、個体のハプロタイプを判定し、特定の地域におけるハプロタイプ頻度を調べることにより、個体群間の関係を調査するためのものである。例えば特許文献２から理解されるように、ある特定のハプロタイプは、複数の個体において観察され、また複数の異なる地域にわたって分布する。したがって、これらの方法によっては、特定の個体または個体群についてハプロタイプまたはハプロタイプ組成を判定することはできるが、その個体が属する母集団（系統または産地）を判定することはできず、またその個体または個体群を遺伝子により標識することも不可能であった。また、例えば非特許文献２から理解されるように、Ｄ−ループの塩基配列は同種の個体間であってもハプロタイプの差異が大きいため、種や系統の識別に用いることは不可能であった。
【００１３】
非特許文献６は、クロマグロの養殖に関して、養殖系統を継代して育種を行う場合の遺伝的多様性のモニタリングのために、生け簀内で天然親魚約20個体から得られた孵化仔魚について、母系の推定のためにミトコンドリアＤＮＡのＤループ前半領域のシークエン20分析を、父系の推定のためにマイクロサテライトマーカー分析を行ったことを記載している。各ロット（同日に回収された受精卵）内で３〜８種類のミトコンドリアＤＮＡハプロタイプが観察され、そのハプロタイプ頻度はロット間で大きく異なり、マイクロサテライトマーカー分析においても、ロット間の遺伝的構成が異なることが明らかとなり、生け簀内の魚群の産卵に関与する親魚が産卵日によって異なることが示唆された。しかしながら、特定の種苗を標識し、放流後および流通の過程においてその履歴を管理・追跡する方法は、未だ見出されていない。
【００１４】
このように、水産魚介類の特定の個体あるいは個体群について、その種、品種、系統または産地を簡易かつ正確に識別し、大量の個体を標識することは、従来のいずれの方法によっても行うことができず、かかる方法の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開2007-312645号公報
【特許文献２】特開2003-180397号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】池田他、「マイクロサテライトＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡ  ＤループのＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析によるリュウキュウアユ導入集団の遺伝的評価」、水産育種、2001年、第31巻、pp.33−37
【非特許文献２】秋本他、「ミトコンドリア制御領域の塩基配列分析による日本周辺漁場におけるキンメダイの集団遺伝構造の解析」、神水研研報第８号、2003年、pp.89-97
【非特許文献３】Carlsson et al., "Microsatellite and mitochondrial DNA analyses of Atlantic bluefin tuna (Thunnus thynnus thynnus) population structure in the Mediterranean Sea", Molecular Ecology, 2004, vol.13, pp.3345-3356
【非特許文献４】Martinez et al., "Genetic diversity and historial demography of Atlantic bigeye tuna (Thunnus obesus)", Molecular Phylogenetics and Evolution, 2006, vol.39, pp.404-416
【非特許文献５】Alvarado Bremer et al., "Comparative phylogeography of Atlantic bluefin tuna and swordfish: the combined population expansion on the regional phylogenies of two highly migratetory pelagic fishes", Molecular Phylogenetics and Evolution, 2005, vol.36, pp.169-187
【非特許文献６】森島他、「養殖クロマグロの遺伝的管理に向けた研究」、平成19年度日本水産学会近畿支部後期例会プログラム、109-D、平成19年12月1日、日本水産学会（http://www.suisan-kinki.org/reikai/h19reikai/h19_kouki/9.pdf）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、本発明は、上記の問題点に鑑み、水産魚介類、特に、特定の産地に由来する水産魚介類、一つまたは複数の優良形質を有する優良水産種苗、または特定の種または品種の水産魚介類の１個体〜大量の個体を、標識・識別するための簡易かつ正確な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、魚類の行動様式、繁殖形態に着目した。例えばクロマグロの産卵においては、一個体の雌親魚が一回に約200万〜1,000万個の卵を産卵、孵化する。その受精には複数の雄親魚が関与していると考えられる。また、養殖の場合は特に、一つの養殖槽において一日に産卵する雌親個体の数は少なく、受精卵は約１日で孵化して水面に浮揚し、産卵日毎に回収することが可能である。本発明者らは、これと併せてミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が母系特異的であることに着目した。ミトコンドリアＤＮＡは一般的にサイズが小さく、組み換えが起こらないため個体間での保存性が高いが、Ｄループの短い領域に変異が集中している。これらのことに焦点を当て鋭意研究を進めた結果、水産魚介類のプロフィールの同定、例えば生産履歴、種、品種、系統または産地などの識別が可能であることを見出し、さらに研究を重ね、発明を完成するに到った。
【００１９】
すなわち、本発明は、水産魚介類またはその加工品のミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの塩基配列を決定することにより、該水産魚介類またはその加工品のプロフィールを同定する方法に関する。
本発明はさらに、プロフィールが、種、品種、系統、種苗、生産履歴および／または産地である、前記方法に関する。
【００２０】
また、本発明は、マイクロサテライトにより核型を決定することをさらに含む、前記方法に関する。
本発明はさらに、ミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの種特異的塩基配列が１から２以上のギャップの挿入により整列化できるか否かの判定をさらに含む、前記方法に関する。
本発明はまた、ミトコンドリアＤＮＡのＤループ全長の塩基配列を、ミトコンドリアプロリンｔＲＮＡ特異的プライマーおよびミトコンドリアフェニルアラニンｔＲＮＡ特異的プライマーを用いて増幅し、両鎖シークエンシングにより決定することをさらに含む、前記方法に関する。
【００２１】
また、本発明は、２または３以上の水産魚介類またはその加工品のミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの塩基配列を比較するための、前記方法に関する。
さらに、本発明は、ミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの塩基配列の比較が、母系特異的塩基配列が完全に一致するか否かの比較である、前記方法に関する。
【００２２】
また、本発明は、２または３以上の水産魚介類のうちの少なくとも一つは、ミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの塩基配列を予め同定した一個体の雌親または該雌親に由来する受精卵、仔魚、稚魚もしくは成魚である、前記方法に関する。
さらに、本発明は、雌親に由来する受精卵、仔魚、稚魚もしくは成魚が、同一の養殖場または生簀において産卵および／または孵化されたものである、前記方法に関する。
【００２３】
さらに、本発明は、放流事業または栽培漁業における加入量変動調査または養殖における種苗の同定のための、前記方法に関する。
また、本発明は、食品としての水産魚介類またはその加工品の種、生産履歴および／または産地を同定するための、前記方法に関する。
【００２４】
本明細書において使用される場合、品種とは、同種内の小分類であって、他の集団とは形態、生理、遺伝的に区別し得るような特徴を有する集団を指し、分類学的に亜種として分けられる場合もある。例えば、クロマグロは、一般に、大西洋、地中海および黒海産（タイセイヨウクロマグロ）と、太平洋産（タイヘイヨウクロマグロ）との２つの亜種に分類され、さらに学説では、大西洋産、地中海産および黒海産は別の遺伝学的特徴を有する群に分けられるとされていたが、本明細書中以下に記載する本発明者らの解析により、タイセイヨウクロマグロとタイヘイヨウクロマグロとは別品種として分類される。
【００２５】
本明細書において用いる場合、種苗（人工種苗）とは、優れた（または生け簀養殖もしくは放流に適した）形質を有する個体を人為的に選抜して交配し、その次代を系統として養成し、さらに個体または系統の選抜を行うことにより、優良形質を有する系統を繁殖のために確立したものを指し、受精卵、稚魚、仔魚および成魚を含み、養殖のためのものであっても、海川に放流されるためのものであってもよい。
【００２６】
本明細書において用いられる場合、生産履歴とは、水産魚介類の個体もしくはその一部またはそれらの加工品が流通の過程にある場合において、生産地（養殖、採取もしくは加工などの場）、生産方法（養殖、採取または加工の方法もしくは条件など）、保存や流通の方法もしくは条件、または加工品である場合原料となる水産魚介類の種、品種もしくは系統などの情報を意味する。また、産地とは、対象となる水産魚介類が由来する水域または施設を意味し、産卵場、餌場、回遊場、漁場、水揚場、孵化および養殖場などを含む。
【００２７】
本明細書において用いる場合、母系特異的配列とは、検体となる個体のミトコンドリアＤＮＡのＤループ塩基配列と、比較対照となる個体のミトコンドリアＤＮＡのＤループ塩基配列とを整列化（アラインメント）して相同性を比較した場合、同一の母系に由来する個体間では完全に一致するが、異母個体との間では、０〜２個程度のギャップの挿入で整列化でき、高度の相同性を示すが完全には一致しない領域の塩基配列を指す。種特異的配列とは、複数の異なる種のＤループ塩基配列が数個以上のギャップの挿入で整列化できる場合において、異種間で相同性が高い塩基配列を指す。さらに、本発明者らは、母系特異的配列中に、同一種間でも異なる母系の間で、特に多くの変異が集中する短い領域が存在することを見出した。この領域を本明細書において母系変異集中領域と称する。同様に、異種間でギャップにより整列化できるが多くのギャップが集中する短い領域が存在することを見出し、この領域を異種変異集中領域と称する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、水産魚介類の種苗、産地および品種を簡便かつ迅速に識別することが可能となり、したがって、該水産魚介類の生産履歴および品種などの表示を厳正に管理することができ、種苗や食品としての水産魚介類を、より安全かつ公正に提供することが可能となる。特に輸入やインターネット販売などにより流通される、従来では生産履歴の追跡が困難であった水産物の生産履歴を管理することが可能となり、偽装表示による水産物販売を防止・摘発することができるようになる。また、本発明により、養殖魚介類の優良種苗、例えば、ＧＴＬ、ウイルス耐性などのの優良種苗を遺伝子識別することが可能となり、種苗のブランド化および育種者の権利の保護がより容易となる。また、本発明により、母系特異的遺伝子配列により標識された種苗を大量生産することができ、これと同時に母系特異的配列のデータベースを構築することにより、放流事業における加入量変動調査が可能となるのみならず、生態系において特定の系統の個体数の増減をモニタリングすることが容易となり、水産魚介類の遺伝的多様性の維持に有用な資料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１−１】マグロ属のミトコンドリアのＤループ塩基配列の比較を示す図である。
【図１−２】マグロ属のミトコンドリアのＤループ塩基配列の比較を示す図である。
【図１−３】マグロ属のミトコンドリアのＤループ塩基配列の比較を示す図である。
【図１−４】マグロ属のミトコンドリアのＤループ塩基配列の比較を示す図である。
【図１−５】マグロ属のミトコンドリアのＤループ塩基配列の比較を示す図である。
【図１−６】マグロ属のミトコンドリアのＤループ塩基配列の比較を示す図である。
【図１−７】マグロ属のミトコンドリアのＤループ塩基配列の比較を示す図である。
【図１−８】マグロ属のミトコンドリアのＤループ塩基配列の比較を示す図である。
【図１−９】マグロ属のミトコンドリアのＤループ塩基配列の比較を示す図である。
【図１−１０】マグロ属のミトコンドリアのＤループ塩基配列の比較を示す図である。
【図１−１１】マグロ属のミトコンドリアのＤループ塩基配列の比較を示す図である。
【００３０】
【図２】ＰＣＲにより増幅されたマグロ属における母系特異的ＤＮＡの電気泳動の結果を示す。
【図３−１】天然および養殖マダイのミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループ塩基配列の多様性を示す図である。
【図３−２】天然および養殖マダイのミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループ塩基配列の多様性を示す図である。
【図３−３】天然および養殖マダイのミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループ塩基配列の多様性を示す図である。
【図３−４】天然および養殖マダイのミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループ塩基配列の多様性を示す図である。
【００３１】
【図４】ＰＣＲにより増幅されたマダイにおける母系特異的ＤＮＡの電気泳動の結果を示す。
【図５−１】マグロ属のミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループ塩基配列の比較を示す図である。
【図５−２】マグロ属のミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループ塩基配列の比較を示す図である。
【図５−３】マグロ属のミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループ塩基配列の比較を示す図である。
【図６】天然および養殖のマグロのミトコンドリアＤＮＡ  Ｄ−ループ配列の比較を示す図である。
【図７】同一の母系に属する養殖クロマグロ稚魚の４種のマイクロサテライト分析の結果を示すゲル電気泳動の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、一態様において、水産魚介類またはその加工品のプロフィールを同定する方法を提供する。該方法において、予め採取された水産魚介類のミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの塩基配列を決定し、該決定された塩基配列と、同定されるべき検体としての水産魚介類またはその加工品のミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの塩基配列とを比較することにより、検体のプロフィールを同定する。プロフィールとは、好ましくは種、品種、系統、生産履歴および／または産地であるが、これらに限定されない。特定の種、品種系統の種苗に特異的な遺伝子マーカーを見つけだすことは容易ではないが、本発明の方法においては、一個体の雌親から多数の次世代の個体が生産される水産魚介類の特徴を利用して、異なる種、系統または母系の間で可変性が特に高いミトコンドリアＤループ領域の塩基配列の相違を、種、系統などのマーカーとして用いる。ミトコンドリアＤＮＡは少量のサンプルから得られるコピー数が多く、核ＤＮＡが劣化するような条件下においても安定性が高いので、魚類のプロフィールの情報源として最も好適である。
【００３３】
一態様において、本発明の方法は、水産魚介類もしくはその一部またはそれらの加工品またはこれらの雌親個体から、ミトコンドリアＤＮＡを含む試料を、生産履歴の初期において予め採取して保存することを含む。生産履歴の初期とは、例えば、採集（漁獲）、生産、卸売、流通、販売などの場を意味し、例えば天然または養殖の魚介類の場合、水揚げした漁業または養殖業の従事者が、鱗、鰭、少量の肉片など該魚介類のミトコンドリアＤＮＡを含むサンプル（試料）を採取し、凍結保存することができる。また、受精卵から養殖した仔魚（稚魚）を販売する場合、同一の雌親が産卵した（同腹の）１以上の受精卵、仔魚もしくは稚魚または雌親の鱗などを採取して凍結保存することができる。本発明の方法により同一母系の稚魚全個体が同一のマーカー（母系特異的配列）により標識されるので、１個体の同腹稚魚のサンプルを保存することにより、放流または販売後の全個体を追跡調査することが可能となる。あるいは、例えばマグロのように解体して流通・販売する場合、卸売場、市場または販売店などにおいて、各個体のサンプルを採取して凍結保存することができる。このようにして、個体の一部をサンプルとして予め採取して保存することにより、特定の個体の全てまたは一部（切り身、加工品など）を販売した後においても、該個体に由来する販売品に含まれるミトコンドリアＤＮＡと、予め採取された同一個体のサンプルに含まれるミトコンドリアＤＮＡとを比較することができる。
【００３４】
本発明の方法は、好ましい態様において、前記水産魚介類またはその加工品、または種苗の場合は雌親個体から採取された試料（第１の試料、標準試料）に含まれるミトコンドリアＤＮＡ制御領域（Ｄ−ループ）の塩基配列中の、母系特異的または種特異的な塩基配列を決定することを含む。例えば、種特異的塩基配列を決定するために、第一に、目的とする種についての指標とする配列を得ることが必要である。具体的には、GeneBankやMitoFish（魚介類ミトコンドリアの公開データベース（http://mitofish.ori.u-tokyo.ac.jp/））などの公共のデータベース（以下dbと略）から、同種または近縁種のｍｔＤＮＡの塩基配列を検索して用いてもよい。養殖稚魚の標識のための母系特異的配列を得るためには、雌親、または該雌親が産卵した少なくとも１の受精卵、仔魚もしくは稚魚からミトコンドリアＤＮＡを得、公知の分子生物学的手法を用いてＤループの塩基配列を決定すればよい。このＤ−ループ塩基配列とデータベースや他の個体のＤ−ループ塩基配列とを比較することにより、母系変異集中領域を決定し、これを母系特異的配列として用いることもできる。同一の雌親が産卵した受精卵およびそれに由来する仔魚もしくは稚魚は、全個体が同一の母系特異的配列を有し、この母系特異的配列は他の雌親に由来する個体とは異なる。したがって、１の受精卵、仔魚もしくは稚魚の母系特異的配列が、同一母系集団中の全個体の母系特異的配列となる。
【００３５】
母系特異的配列または種特異的配列を決定するために、特定の種、品種、系統または産地に由来する水産魚介類のｍｔＤＮＡ  Ｄループ配列と、他の種、品種、系統または産地に由来する個体の対応する配列とを比較し、識別可能なパーセンテージで塩基の置換が生じる領域を決定する。
【００３６】
この領域は、異なる母系の個体間において、例えば800〜1600塩基長の領域中であれば、５〜１０個（１％）、好ましくは１１〜１５個（１．５％）、より好ましくは１６〜３０個（３％）の塩基の置換を有する領域である。同一母系の個体間においては、この領域の塩基配列が完全に一致することが好ましいが、他の母系との識別が可能である限りにおいて、１または２程度の塩基の置換を含んでもよい。より正確な識別のために、同一の母系の個体間における塩基の置換は、０．２％程度以下、好ましくは約０．１％程度以下、さらに好ましくは０％（完全一致）であることが好ましい。
母系特異的配列の典型的な位置は、Ｄループのプロリン側末端の塩基を１番目の塩基として、約１００〜６００番目、好ましくは約１５０〜４５０番目の間の塩基配列中に存在する。例えばクロマグロにおいては母系特異的配列は約１５０〜３５０番目、マダイにおいては約２５０〜４５０番目の間の塩基配列中に存在する。
【００３７】
また、種を識別するための領域は、複数の異なる種間で１から２以上のギャップの挿入によりＤループ配列が整列化できる場合において、異種間で相同性を示す塩基配列である。異種間での相同性は、９０〜９７％、好ましくは９０〜９５％、より好ましくは９０〜９３％である。複数の配列を比較する多重整列化解析（マルチアラインメント）には、例えばMEGA4（登録商標、Molecular Evolutionary Genetic Analysis Software Version 4.0、Tamura et al., Mol. Biol. Evol., 2007, 24(8):1596-1599）、SEQUENCHER（登録商標）（Gene Codes、米国）などのシークエンス解析のための公共または市販のソフトウェアを用いることができる。
種特異的配列の典型的な位置は、母系特異的配列と部分的に重複する場合もある。例えばクロマグロにおいては種特異的配列は約１５０〜７００番目、特に約１５０〜２５０番目および約６００〜７００番目に見出すことができる。
【００３８】
次いで、検体となる水産魚介類から採取された試料（第２の試料、検体）に含まれるミトコンドリアのＤループＤＮＡを、上記の母系特異的配列または種特異的配列と比較することにより、その種、品種、系統、生産履歴および産地の識別を行なうことができる。例えば、上記の母系または異種特異的塩基配列に基づいて設計されたプライマーまたはプローブを用いて、公知の手段により、検体のｍｔＤＮＡ中に母系特異的塩基配列または異種特異的塩基配列と同一の配列が含まれるか否かを容易に検出することができる。かかる目的のための公知の手段として、ＰＣＲ法、ＲＣＡ法、ダイレクトシークエンス法、TaqMan法、ＤＮＡアレイ法、ＦＩＳＨ法などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
本発明の方法において、さらに、ミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの母系または種特異的配列に加えて、他のハプロタイプの比較を組み合わせることにより、識別をより厳密に行ってもよい。通常のハプロタイプ分析では個体間における相違が大きいので、種や種苗の同定には用いることができない。例えば、非特許文献２に示されるとおり、同腹仔のミトコンドリアＤＮＡにおいてすら、マイクロサテライトのハプロタイプは異なる。しかしながら、限られた個体数で繁殖を行う養殖においては、Ｆ１におけるハプロタイプの数が比較的少なく、例えば、同じ雌親から生じた１１個体の稚魚において、４種のマイクロサテライトにより識別されるハプロタイプは４種類であった（参考例１）。このことを利用して、Ｄ−ループによる識別を補強することができる。例えば、放流する人工種苗（稚魚）の標識として、Ｄ−ループ母系または種特異的配列のみならず、マイクロサテライトなどにより核型のハプロタイプも決定しておくことにより、万が一、人工種苗と同一の母系に属する個体が天然に存在する場合であっても、採集（漁獲）されたサンプルが天然のものであるか人工種苗であるかを確実に判断することができる。
【００４０】
本発明の方法は、好ましい態様において、前記母系特異的塩基配列、母系変異集中領域または異種特異的塩基配列に基づくプライマーまたはプローブの作成を含む。プライマーは、Ｄループ全長の増幅のためのプライマー、または、母系特異的塩基配列、母系変異集中領域もしくは種特異的塩基配列の特異的増幅のためのプライマーを含む。プローブは、母系特異的塩基配列、母系変異集中領域または種特異的塩基配列に特異的に結合する核酸、例えばオリゴヌクレオチドを含む。目的とする母系特異的または種特異的塩基配列の一部に対して少なくとも部分的に相補的となるように設計したプライマーまたはプローブを用いて、定法により、検体中に目的の配列を含むｍｔＤＮＡが含まれるか否かを容易に決定することができる。具体的には、例えば、栽培漁業における加入量変動調査において、検体となる魚の個体のｍｔＤＮＡを鋳型として、調査対象の種苗（母系）に特異的な配列に基づいて設計されたプライマーを用いてＰＣＲやダイレクトシークエンスを行うことにより、該個体が目的の種苗であるか否かを容易に判定することができる。あるいは、産地または系統などによりデータベース化した複数〜多数の母系特異的配列と、検体の配列とを、ＤＮＡアレイ法などにより比較し、検体がデータベース中に記載される産地または系統に該当するか否かを容易に判定することができる。
【００４１】
別の態様において、前記水産魚介類もしくはその一部またはそれらの加工品に、これらが前記母系特異的または異種特異的塩基配列により標識されていることを記載する文書またはラベルを添付してもよい。この文書またはラベルはまた、それらが添付されている水産魚介類は、その生産履歴の初期において予めサンプルが採取され保存されているか、および／または既に母系または種特異的配列が決定されており、必要に応じて（例えば該水産魚介類の購入者または使用者の希望により）、該水産魚介類に含まれるミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を母系または種特異的配列と比較することが可能であることを示すことができる。かかる文書またはラベルを添付された水産魚介類やその加工品は、生産者から離れて流通した後においても生産履歴を追跡することが可能であり、また、遺伝子標識により検査を行うため産地や品種の偽装が困難となることから、より安全性の高い食品を提供することが可能となる。
【００４２】
一態様において、同一の種、品種、系統、生産履歴および／または産地に属する複数の雌親に由来する複数の母系特異的または種特異的配列を、産地、品種または系統によりプールしてデータベース化し、検体の同定に役立てることもできる。例えば、養殖場において恒常的に雌個体の母系特異的配列を取得してデータベース化することにより、継代養殖され流通されているブリやマグロなどの水産魚介類が由来する養殖場および出荷時期などを追跡することができる。または、特定の産地について同様のデータベースを構築し、産地表示の真偽を判定するために役立てることもできる。具体的には、目的の水域におけるサンプリングにより得られる対照試料を基に、１または２以上の母系が存在する集団として、産地を識別する。例えば、特定の水域における定着性が強く母系の数が比較的少ない集団であれば、該集団における母系特異的配列をプールしたデータベースを作成することにより、該データベースに含まれる母系特異的配列により産地を特定することができる。
【００４３】
別の態様において、本発明は、上記の方法において、検体となる水産魚介類もしくはその一部またはそれらの加工品から、ミトコンドリアＤＮＡを含む試料を採取して保存することを含む。本発明の方法によって生産履歴を追跡することができる水産魚介類もしくはその一部またはそれらの加工品は、生きている魚介類であっても、または生鮮、加熱調理済み、乾燥もしくは冷凍の魚介類であっても、それらの鱗、鰭、鰓、尾、皮膚、骨、体液、筋肉または内臓組織などであってもよい。一般に、ミトコンドリアは一つの細胞内に多数（数百〜数千個）存在するため、少量のサンプルから充分なｍｔＤＮＡを得ることができ、また核ＤＮＡと比較して構造的に安定であるため、核ＤＮＡが劣化する条件下においても抽出できる。したがって、本発明の方法により、食品もしくは動物飼料またはそれらの原材料として加工された水産魚介類の生産履歴を調査することが可能となる。特に、魚類の種や亜種の判定は、流通の経路の下流、すなわち、対象となる魚介類が既に販売、加工、調理された状況において主として行われることが予測されるが、本発明の方法に従ってミトコンドリアＤＮＡを利用することにより、加工・調理・冷凍・解凍などの処理の後であっても、少量のサンプルが得られれば、魚種を判定することができる。より正確な生産履歴調査のために、組織試料は、非加熱の試料の場合は約０．２ｇ以上（鱗の場合数枚）、加熱された試料の場合は約１ｇ〜５ｇであることが好ましい。採取した試料は、サンプルチューブに密封し、−２０℃〜−８０℃で凍結保存する。ミトコンドリアＤＮＡの抽出・精製は、定法にしたがってアルカリ法などにより行い、ＴＥに溶解する。長期保存する場合は、アルコールで沈殿させて−２０℃〜−８０℃で保存するか、またはポリマー、ビーズもしくは紙などの担体を用いてＤＮＡを室温で長期保存する方法も開発されている（例えば「ＤＮＡブック」：Kawai他、Genome Research，2003，13：1488-1495を参照）。
【００４４】
本発明の一態様において、養殖または栽培漁業において育成された種苗の受精卵、仔魚または稚魚の生産履歴を追跡する方法を提供する。養殖又は栽培漁業においては、親魚の産卵期の観察により、同腹の（雌親が同じ）受精卵および仔魚（稚魚）の群を得ることが可能である。本発明の方法により、同時期に浮遊した個体群を、同一の母系特異的配列により遺伝子標識された種苗とみなすことができる。したがって、継代養殖や優良株との交配によって育成した優良種苗を、雌親によって分けた群として識別することにより、各々の群の雌親のｍｔＤＮＡのＤループ母系特異的塩基配列により標識された母系群とすることができる。例えばマグロなどの場合、一個体の雌魚から生産された数百万〜数千万個体の種苗の全てに、魚体を傷つけることも遺伝子組み替えなどを行うこともなく、均一な標識を行うことができ、放流後の追跡調査、特に母系別の加入量変動調査を容易に行うことができる。また、種苗の近親交配による遺伝的障害を避ける指標を提供することもできる。また、他者が不当に種苗を複製した場合にこれを摘発することが技術的に可能となるので、種苗を育成する業者の保護に役立てることができる。
【００４５】
本発明の方法は、水産魚介類の種類によって限定されるものではないが、特に、広域に流通し、品種、産地または種苗により安全性、栄養価、価格などが変化する水産魚介類の生産履歴の追跡に、特に有用である。具体的には、スズキ目サバ亜目サバ科マグロ属（例えば、クロマグロ、ミナミマグロ、キハダマグロ、メバチマグロ、ビンナガマグロなど）、同サワラ属（サワラなど）および同カツオ属（カツオなど）、スズキ目スズキ亜目アジ科ブリ属（ブリ、カンパチ、ヒラマサなど）および同マアジ属（マアジなど）、スズキ目スズキ亜目スズキ科（スズキなど）、スズキ目スズキ亜目タイ科マダイ亜科（マダイなど）、フグ目フグ科（トラフグ、マフグなど）、カレイ目カレイ亜目（ヒラメ、カレイ）、サケ目サケ科サケ属（ベニザケ、シロザケ、ギンザケ、カラフトマス、マスノスケなど）、ウナギ目ウナギ亜目（ウナギ、アナゴ、ハモ）、貝類（ハマグリ、アサリ、ホタテ、シジミ、およびサザエ）などが挙げられる。
【００４６】
一態様において、本発明の方法は、ミトコンドリアＤＮＡのＤループ全長の塩基配列を、ミトコンドリアプロリンｔＲＮＡ特異的プライマーおよびミトコンドリアフェニルアラニンｔＲＮＡ特異的プライマーを用いて両鎖シークエンシングにより決定することをさらに含む。ミトコンドリアＤＮＡに含まれる遺伝子の配置や塩基配列は、水産魚介類の近縁種の間で、Ｄループを除いて、保存性が高い。Ｄループは０．８〜１．５ｋｂ程度の塩基長を有する高度可変領域であるが、その３’末端側において隣接するプロリンｔＲＮＡ遺伝子および５’末端側において隣接するフェニルアラニンｔＲＮＡ遺伝子の塩基配列は保存性が高い。したがって、Ｄループを挟んでプロリンｔＲＮＡおよびフェニルアラニンｔＲＮＡの配列に対して各々プライマーを設計することにより、Ｄループの全長をＰＣＲで増幅することができる。プロリンｔＲＮＡおよびフェニルラニンｔＲＮＡのプライマーによりＰＣＲでＤループＤＮＡを増幅した後、酵素などによりＰＣＲ産物中のプライマーを消化および未反応ｄＮＴＰを不活性化し、次いで、増幅に使用した２種のＰＣＲプライマーの各々を用いて、それぞれの末端からシークエンスを行なう。配列の信頼性の観点から、両鎖シークエンスを行うことが好ましい。シークエンスの精度をあげるために相補鎖が一致した場合のみＤループの塩基配列とする。両鎖が重複しない領域は得られたＤループ内側から再度シークエンスする。
【実施例】
【００４７】
以下に例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は、これらの例によって何ら限定されるものではない。また、本発明の方法を適宜改変することは、当業者の通常の技術の範囲内である。
【００４８】
材料および方法
１．ミトコンドリアＤＮＡの抽出・精製法
試薬の組成：
（１）Ｐ１溶液（再懸濁試薬：２５０ｍｌ、２〜８℃保存）
０．５Ｍ  ＥＤＴＡ                        ５．０ｍｌ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）  １２．５ｍｌ
滅菌水で２５０ｍｌに増量し、オートクレーブ滅菌する。
（２）Ｐ２溶液（溶菌試薬：２５０ｍｌ、室温保存）
ＳＤＳ      ２．５ｇ
ＮａＯＨ    ２．０ｇ
滅菌水で２５０ｍｌに増量する。
（３）Ｐ３溶液（除蛋白沈殿試薬：５００ｍｌ、４〜８℃保存）
酢酸カリウム  １４７．３ｇ
酢酸          ６０．０ｍｌ
滅菌水で５００ｍｌに増量し、ｐＨ  ５．５に調整し、オートクレーブ滅菌する。
【００４９】
ミトコンドリアＤＮＡの抽出：
（１）水産魚介類の組織約０．２ｇ（鱗の場合数枚）の試料を、サンプルチューブに移し、Ｐ１溶液を０．４ｍｌ添加し、ペスツル棒でサンプルを潰す。
（２）Ｐ２溶液を０．４ｍｌ添加し、ペスツル棒で軽く混合する。
（３）Ｐ３溶液を０．４ｍｌ添加し、チューブの底を指で弾いて攪拌する。
（４）室温で５分間、２０，０００×ｇで遠心分離し、上澄を別のチューブに移す。
（５）フェノール・クロロホルム溶液を０．４ｍｌ添加し、ボルテックスミキサーにかける。
（６）再び遠心分離を行ない、上澄を回収する。
（７）５、６の操作を繰り返す。
（８）得られた上澄の0.6倍容積のイソプロパノールを加える。
（９）２０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上澄を捨て、７０％エタノールで沈殿を洗浄する。
（１０）再び遠心分離した後、上澄を捨て、６５℃で５分間静置して乾燥させる。
（１１）０．１ＭのＴＥ  ３０μｌに溶解させ、ミトコンドリアＤＮＡ溶液とする。
【００５０】
２．ＤループＤＮＡの増幅
例えば以下の手順に従ってミトコンドリアのＤＮＡのＤループ塩基配列を増幅する：
（１）魚介類ミトコンドリアのＤＮＡの塩基配列は、MitoFish（http://mitofish.ori.u-tokyo.ac.jp/）、GeneBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）などの公開データベース（以下dbと略）から得られる、目的の種と同種、あるいは近縁種のｍｔＤＮＡの塩基配列中、Ｄループの両側にあるプロリンｔＲＮＡおよびフェニルラニンｔＲＮＡの遺伝子配列からＰＣＲプライマーを作製する。なお、dbに含まれていない新規の試料の場合は、近縁種のプライマーで代替えする（成功例：ブリ（実施例３を参照））か、あるいはミトコンドリアＤＮＡのショットガンシークエンスなどにより配列を得る。
【００５１】
（２）以下の組成でＰＣＲ反応用カクテルを作成し、試料のミトコンドリアＤＮＡを０．５μｌ添加する：
１０×ＰＣＲバッファー：２μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２：２μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ：２μｌ、５Ｕ／μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ：０．１μｌ、１６．７ｐｍｏｌ／μｌプライマー（フォワード）：１μｌ、１６．７ｐｍｏｌ／μｌプライマー（リバース）：１μｌ、精製水：１１．３μｌ。
【００５２】
（３）熱変性９５℃  １０分、ＤＮＡ増幅（９５℃  １分、６５℃  ３０秒、７２℃  １分）×３４サイクル、７２℃  ５分の反応条件で、ＰＣＲを行う。
（４）ＰＣＲ反応液７．１μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに分注し、Exo SAP IT（USB Co.）を２．９μｌ添加する。
（５）３７℃で１５分間反応後、８０℃で１５分間熱変性する。
【００５３】
３．ＤループＤＮＡ両鎖シークエンス法
ＰＣＲでＤＮＡを増幅した後、Exo SAP IT（USB Co.）などにより、ＰＣＲ産物中のプライマーを消化および未反応ｄＮＴＰを不活性化し、次いで、増幅に使用した２種のＰＣＲプライマーの各々を用いて、それぞれの末端から、例えば以下の手順でシークエンスを行なう。
【００５４】
（１）Exo SAP ITの反応液を２分割し（各５μl）、３８４ウェルＰＣＲプレートの空のウェルに移す。
（２）シークエンス用カクテルをＡＢＩ社マニュアルに従って以下の組成で作製する：
フォワード（またはリバース）プライマー：１６．７ｐｍｏｌ／μｌを１μｌ、５×シークエンスバッファー：２μｌ、Bigdye：２μｌ。
（３）ヒートシールで密封し、熱変性９６℃  １分、伸長（９６℃  １０秒、５０℃  ５秒、６０℃  ４分）×３０サイクルの条件でサイクルシークエンス反応を行う。
（４）ヒートシールをはがし、１２５ｍＭのＥＤＴＡを２．５μｌ、エタノールを２５μｌ添加し、１時間、室温で静置する。
（５）４℃、３，２７３×ｇで３０分間遠心分離する。
（６）ＰＣＲプレートを逆さまにしてエタノールを除去する。
（７）冷却した７０％エタノールを３５μｌ添加し、同条件で遠心分離する。
（８）エタノールを除去し、６５℃に５分間置いて、乾燥させる。
（９）ホルムアミドを５μｌ添加し、熱変性する。
（１０）ABI373型シークエンサーでシークエンスする。
【００５５】
４．多重整列化解析
以下に、「SEQUENCHER（登録商標）」を用いる場合の解析手順を示す。
（１）SEQUENCHER（登録商標）にシークエンスのデータをインポートする。
（２）末端のクオリティーの低い配列を除去する。
（３）データベース、または過去のシークエンスデータをシークエンチャーにインポートする。
（４）例えば以下の条件設定において、複数の配列のコンティグを作成し、相同性に基づいて、母系特異的配列、母系変異集中領域および同属異種特異的配列を決定する：
Assembly  Algorithm       ：Dirty Dataをチェック
Optimize  Gap  placement  ：Use Re Aligner，Prefer 3’ Gap Placementをチェック
Minimum  Match  Percentage：80
Minimum  Overlap          ：20。
【００５６】
実施例１：クロマグロ母系特異的塩基配列の抽出と種苗の遺伝子標識
方法：
１）「MitoFish」（http://mitofish.ori.u-tokyo.ac.jp）から、本まぐろ（太平洋クロマグロ：Thunnus orientalis）のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列（GeneBank登録番号AB185022：配列番号１、以下dbと記載）を検索し、プロリンｔＲＮＡとプェニルアラニンｔＲＮＡの塩基配列からＤループ増幅のためのＰＣＲプライマーを以下の通り作製した。
本まぐろのＤループＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ共通プライマー配列
フォワードプライマー（プロリン側）：
5’-TACCCCTAACTCCCAAAGCTAGG-3’（配列番号２）
リバースプライマー（フェニルアラニン側）：
5’-GCTTTCTAGGGCCCATCTTAAC-3’（配列番号３）
【００５７】
２）境港と福岡で水揚げされた天然本まぐろ（太平洋クロマグロ）成魚と養殖本まぐろ（太平洋クロマグロ）成魚、各１尾ずつ、および同時に採取した浮遊受精卵を孵化した本まぐろ稚魚11尾からミトコンドリアを抽出し、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。
３）上記の方法でＤループＤＮＡを増幅した後に塩基配列決定を行ない、データベースの本まぐろ（db）のＤループの塩基配列（配列番号１）と比較した。
【００５８】
結果：
多重整列化の結果を図１に示す（なお、各々のＤループ塩基配列は、境港：配列番号２０、福岡：配列番号２１、養殖成魚：配列番号２２、養殖稚魚１〜１１：配列番号２３〜３３とする）。図中、下部の配列はデータベース（db）の太平洋クロマグロのミトコンドリアＤループの塩基配列におけるnt（ヌクレオチド）１からnt865までであり、その下部の黒点は、該db太平洋クロマグロと比較した他のマグロとの間で塩基の相違があることを示す。上記プライマーを用いて決定した太平洋クロマグロ14個体のＤループＤＮＡは、dbと同じ865塩基であり、各塩基配列はギャップを加えることなく多重整列化することができた。天然および養殖の各成魚間において、個体間の配列の塩基相同性は高く、わずかに6〜22の異なった塩基相違点が太平洋クロマグロ（db）の前半nt175〜586間の29部位に存在していた（表１）。
【００５９】
【表１】
2010148505.tif 000002
【００６０】
塩基相違点はnt175〜200に７部位、およびnt273〜305に５部位に相違点が集中していたためにその間の配列を母系特異的塩基配列と規定した。一方、養殖稚魚11尾間では、配列は完全に一致しているために、同時に浮遊した受精卵は同一雌親由来であり、雌親が異なる他の成魚との相違点は特定部位に集中していることが明らかとなった。またこの結果から、同一の雌親に由来する受精卵や稚魚は、そのうちの１個体のミトコンドリアＤ−ループの塩基配列を決定することにより、全個体を同じ母系集団として容易に標識できることが示された。
【００６１】
応用例１：クロマグロ母系特異的塩基配列の特定と簡易検出法
母系特異的塩基配列、特に母系変異集中領域の塩基配列を増幅するＰＣＲ用プライマーを作製することにより、検体から簡易かつ迅速な方法により母系特異的シグナルを得、その母系性から検体の生産履歴を追跡することができる。以下に例を示す。
【００６２】
方法：
以下のプライマー対を作製し、天然および養殖の太平洋クロマグロ成魚３尾および稚魚11尾、ならびにミナミマグロおよびビンナガマグロ１尾ずつから抽出したミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、タッチダウンＰＣＲにより増幅を行なった。
母系特異的ＰＣＲフォワードプライマー（図１、同一母系太平洋クロマグロnt.175〜200：母系特異的変異点７ヶ所）：
5’-CTTTCAACATCTTACTTACATCACG-3’（配列番号４）
母系特異的ＰＣＲリバースプライマー（図１、同一母系太平洋クロマグロnt.273〜305：母系特異的変異点５カ所）：
5’-TTCTTACTGCGTTTAAGTTTACCAG-3（配列番号５）
【００６３】
結果：
図２に、ＰＣＲ増幅産物のアガロース電気泳動の結果を示す。母系が異なる天然太平洋クロマグロおよび養殖太平洋クロマグロからはシグナルは検出されなかったが、同一母系の養殖稚魚11尾から135塩基対の母系特異的ＤＮＡが増幅された。したがって、同一母系の養殖稚魚（種苗）が、母系特異的塩基配列によって遺伝子標識されており、該母系特異的塩基配列に特異的に設計されたプライマーを用いたＰＣＲにより容易に検出し得ることを確認した。本明細書において示した系統または産地以外の種苗においても、同様に母系特異的なプライマーを設計し、検体のリアルタイムＰＣＲを行なえば、シグナルの有無によって簡便かつ迅速に母系識別を行うことができる。
【００６４】
実施例２：マダイ母系特異的塩基配列と種苗の遺伝子標識
方法：
１）「MitoFish」からマダイ（Pagrus major）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列（GeneBank登録番号AP002949：配列番号６）を入手し、プロリンｔＲＮＡおよびフェニルアラニンｔＲＮＡの塩基配列から以下のＰＣＲプライマーを設計して、マダイＤループ増幅と塩基配列決定に使用した：
フォワードプライマー(クロマグロ（db）フェニルアラニンｔＲＮＡ塩基配列から代用)：
5’-GCTTTCTAGGGCCCATCTTAAC-3’（配列番号７）
リバースプライマーＩ(マダイdbプロリンｔＲＮＡから設計)：
5’-TTTAACCCCCACCATTGGCTCCC-3’（配列番号８）
リバースプライマーＩＩ(マダイＤループ内塩基配列より再設計)：
5’-AGAGGGGGGTAACAATGAGATC-3’（配列番号９）
【００６５】
２）マダイのプロリンｔＲＮＡおよびフェニルアラニンｔＲＮＡの塩基配列はいずれもクロマグロの対応する配列に一致していたが、リバース側において１塩基が異なっていたため、マダイdbのフェニルアラニンｔＲＮＡ塩基配列を利用した（リバースプライマーＩ）。塩基配列に関しては、最初に読めたＤループ３’末端側の塩基配列から第２のリバースプライマーＩＩを作製し、完全に両鎖の塩基配列を読み取った。
【００６６】
３）ＰＣＲの鋳型ＤＮＡには、福岡玄海の養殖成魚と山口、福岡の天然成魚各１尾ずつ、および同日浮遊しに採取された受精卵を孵化成長させた養殖種苗10尾からミトコンドリアを抽出し、ＰＣＲ鋳型ＤＮＡとした。上記の方法でＤループＤＮＡ増幅および塩基配列決定を行ない、データベースのマダイの塩基配列（以下dbと記載）を基準に多重整列化を行なった（図３）。
【００６７】
結果：
マダイのＤループはいずれも約1054塩基対からなり、太平洋クロマグロ（db）Ｄループ（869塩基対）より189塩基対長い。４箇所にギャップを挿入することにより多重整列化が可能となった（図３）。特に養殖稚魚10尾間ではＤループの配列は全て同一であった。同時に浮遊し採取された受精卵から生じる稚魚のミトコンドリアＤループは同じ塩基配列を有することから、これらの稚魚が同一雌親に由来することが明らかとなり、また、同一の雌親に由来する受精卵や稚魚は、そのうちの１個体のミトコンドリアＤ−ループの塩基配列を決定することにより、全個体を同じ母系集団として容易に標識できることが示された。一方、産地の異なる各個体間では、約1054塩基対中、9〜24塩基の相違点が見られた（表２）。これらの変異のうち、マダイdbのＤループnt.273〜311間に９カ所、nt370〜416間に９箇所が集中していたことから、この間を母系特異的領域とした。
【００６８】
【表２】
2010148505.tif 000003
【００６９】
応用例２：マダイ母系特異的塩基配列の特定と簡易検出法
方法：
実施例２において決定した母系特異的領域の塩基配列に基づいて以下のプライマーを設計し、天然および養殖のマダイ異母系成魚３尾および同一母系稚魚5尾から抽出したミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、タッチダウンＰＣＲにより増幅を行なった：
マダイ母系特異的ＰＣＲフォワードプライマー（図３、マダイ稚魚nt.273〜308：母系特異的変異点8ヶ所）：
5’-AGAAATAGCAAGTGTTCAAGTATTTATCCCCAAAAC-3’（配列番号１０）
マダイ母系特異的ＰＣＲリバースプライマー（図３、マダイ稚魚nt.402〜375：母系特異的変異点５カ所）：
5’-GTGTTGGTACTTGGTAGACATTTGTCG -3‘（配列番号１１）
【００７０】
結果：
図４に、ＰＣＲ増幅産物のアガロース電気泳動の結果を示す。母系が異なる天然および養殖成魚からはシグナルは検出されなかったが、同一母系の養殖稚魚5尾から129塩基対の母系特異的ＤＮＡが増幅された。したがって、同一母系の養殖稚魚（種苗）が、母系特異的塩基配列によって遺伝子標識されており、該母系特異的塩基配列に特異的に設計されたプライマーを用いたＰＣＲにより容易に検出し得ることを確認した。
【００７１】
実施例３：ブリのＤループ解析例とクロマグロ、マダイとの比較
マダイ、ブリ、クロマグロは養殖魚売上げの90％を占め、いずれもスズキ目に属するがマダイはスズキ亜目タイ科，マグロはサバ亜目サバ科、ブリはスズキ亜目アジ科に属する。スズキ目はその他カツオ、マアジなど重要な回遊水産魚を数多く含む。これらの遺伝的類縁性を知るためにＤループを比較した。ただし、ブリのミトコンドリアＤＮＡ塩基配列はデータベースに登録されていないため、クロマグロのｔＲＮＡプライマーで代用した。
【００７２】
方法：
鳥取、福岡で水揚げされた天然ブリのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、実施例１において使用したクロマグロのＤループ両端プライマー（配列番号２および３）を用いて、約900塩基対のＤＮＡを増幅した。両端プライマーの各々を用いて両鎖シークエンスを行なったところ、フェニルアラニン側では一度で全長を読み取ることができなかったため、第一のプライマーにより得た部分配列から次のプライマーを設計し、全長の塩基配列を決定した。
ブリ逆方向プライマー：  5’-GGTTTAACGCGCAAAAGCCGAG-3’（配列番号１２）
【００７３】
結果：
鳥取ブリ（配列番号１３）と福岡ブリ（配列番号１４）とのＤループ塩基配列を整列化させるために、配列中１カ所にギャップを必要とした。699塩基中の690塩基配列が相同であり、相違塩基は８塩基であった。さらに試料を増やすことにより、ブリのミトコンドリアＤＮＡ  Ｄループの塩基配列で品種（亜種）識別ができる。
なお、同じスズキ目間では、マダイ、マグロおよびブリの間では、随所に短い（最長33個）相同塩基はあるが、ギャップ挿入数が多く、多重整列化ができない状態であった。
【００７４】
実施例４：マグロの種、品種および産地の識別と生産履歴管理（トレーサビリテイー）
MitoFishデータベースから入手した本まぐろ（太平洋クロマグロ：Thunnus orientalis）のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列（GeneBank登録番号AB185022：配列番号１）を標準材料として、以下の一般に市販されているマグロ属の種および亜種との間でＤループの塩基配列の比較解析を行った：
【００７５】
大西洋クロマグロ（Thunnus thynnus)：ミトコンドリアＤＮＡ塩基配列（GeneBank登録番号AY302574：配列番号１５）
ビンナガマグロ（Thunnus alalunga）：ミトコンドリアＤＮＡ塩基配列（GeneBank登録番号AB101291：配列番号１６）
メバチマグロ（インド洋産：Thunnus obesus：配列番号１７）
キハダマグロ（宮城沖産：Thunnus albacares：配列番号１８）
ミナミマグロ（オーストラリア産：Thunnus maccoyii：配列番号１９）
【００７６】
結果：
上記マグロ６種のＤループ塩基配列は869塩基前後であったが、１種あたり10部位前後のギャップを挿入することにより、多重整列化を行うことができた。ただし、ギャップ挿入は22部位あり、特に母系特異的配列前半のnt172〜232に９部位が集中していた。各品種間では869塩基中39〜77塩基の違いがあったが（表３）、その他の領域では相同性を保っていた。特に、nt173〜215にギャップ12部位を含む35部位とnt628〜672にギャップ３部位を含む20部位に相違塩基が集中していた（図５−１〜３）。いずれも部分的に太平洋クロマグロ母系特異的配列と重複するが、ギャップの位置および変異の数が前記母系特異的配列とは明確に異なるので、種識別領域（同属異種識別領域）として特定することができる。
【００７７】
【表３】
2010148505.tif 000004
【００７８】
常法に従い、残る相同領域から遺伝的類似性を求めた結果、大西洋クロマグロ/太平洋クロマグロ、ミナミマグロ/太平洋クロマグロ、大西洋クロマグロ/ミナミマグロ間の相違塩基数とギャップ挿入数はそれぞれ６９（＋８）、７７（＋５）、４９（＋２）であった。いずれも「トロ」の材料とされるこれらの種が、遺伝的には互いに遠位にあることが明らかとなった。
【００７９】
この結果により、ミトコンドリアＤループの塩基配列の相違により、マグロ属およびその種間の識別が可能であり、食品表示の偽装の防止および摘発などに有用であることが示唆される。ただし、同じ太平洋クロマグロ間でも最大２２個の相違点があるが（表１）、マグロ属の種間識別はギャップ数を加味した相違塩基数で判断できる。
【００８０】
実施例５：マグロの産地識別
方法：
図１および図３に示すように、マグロおよびマダイのＤループ塩基配列を母系により識別することが可能となったが、母系は産卵場所や魚群，あるいは棲息海域で規定される可能性があるので、産地識別に利用できる可能性を調べた。棲息海域が広い回遊魚であるマグロのＤループ塩基配列が産地によってどの程度異なるか、メバチマグロ、キハダマグロにおいて比較した。
【００８１】
結果：
下記の産地が異なる個体のＤループ塩基配列の比較では、ギャップを加えることなしに配列を整列化できた。以下に、同種のマグロでの産地による塩基配列の変異数を示す（括弧内の数値＝相違塩基部位数/比較塩基部位数）：
メバチマグロ  ：パラオ/インド洋（18/569）
大西洋/パラオ（28/569）
大西洋/インド洋（35/569）
キハダマグロ  ：インド洋/宮城沖（12/756）
太平洋クロマグロ：（6〜22/869）
【００８２】
同種間の多重整列化ではギャップの挿入は必要なかったが、産地が異なる場合、太平洋クロマグロの母系特異的塩基配列に相当する領域に相違が見られた。すなわち、この領域の多型を用いて産地を識別し得ることが示唆される。
【００８３】
本発明の方法により、産地の異なるマダイ、マグロのＤループの塩基配列の相違で母系を識別することができるが、逆に塩基配列の相違から該当する産地を推定する場合、商品の生産履歴管理と同様に、比較対照となる試料を必要とする。好ましくは、産地または棲息海域に存在する魚群のＤループ塩基配列データベースを作成し、データベース中の全配列と比較する。データベース作成と並行して産地識別を行ってもよい。
【００８４】
実施例６：天然および養殖のマグロのＤ−ループ配列の比較
天然のマグロ集団と養殖稚魚との遺伝的相違を調べるために、築地市場に集積される天然のクロマグロと、近畿大学水産研究所から供与されたクロマグロ受精卵および稚魚のＤ−ループ塩基配列を、上記の方法により決定して比較した。
結果
漁場や水揚場の異なる535尾の太平洋クロマグロのうち、養殖稚魚と同じＤループ配列を有する個体は存在しなかった（図６）。この結果から、本発明の方法を実際に用いて、例えば、漁獲された集団中の人工種苗を同定することができ、放流事業における加入量変動調査や、漁獲高に対する放流事業の貢献度を判定することや、育成・販売した種苗が他者により複製された場合に追跡を行うことなどが可能であることの裏付けがなされた。
【００８５】
参考例１：マイクロサテライトによるハプロタイプ分析
同一母系の養殖クロマグロ稚魚１１尾について、公知のマイクロサテライトマーカーTth208、Tth217、Tth4およびTth7-16（Clark et al., 2004, Mol. Ecol. Notes, 4:70-73）を用いてハプロタイプ分析を行った。少なくとも４パターンのハプロタイプが観察された（図７）ことから、少なくとも３個体の雄親と雌親（１個体）が産卵時に存在したことが示唆される。一方、天然のクロマグロについて同様の分析を行ったところ、分析を行った全個体間でマイクロサテライトパターンが異なり、同一のハプロタイプを示す個体は存在しなかった（データは示さず）。これらの結果から、遺伝的多様性が小さい養殖魚の場合は産卵時に存在する親魚の個体数が少ないので、受精卵全てのマイクロサテライトによるハプロタイプを決定することが可能であり、したがって、ｍｔＤＮＡ  Ｄループによる母系識別にマイクロサテライト分析による雄系識別を組み合わせることにより、より精度が高い系統標識が可能になることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明は、水産資源保護として有用な魚介類のトレーサビリティーの提供を可能とするものであり、このトレーサビリティの提供により、食品としての魚介類の生産履歴または養殖もしくは栽培漁業のための稚魚の追跡（調査）を可能にすることにより、魚介類の品質および産地を保証し、生産履歴表示の偽装を摘発、防止し、また優良種苗の遺伝子標識による識別および養殖・育種者の権利の確立に寄与するものである。本発明はさらに、放流事業に用いる大量の稚魚の標識と洋上での追跡調査および加入量変動調査を可能にすることにより、水産資源の遺伝的多様性の維持および排他的経済区域内での栽培漁業の発展に寄与するものである。
【図１−１】
2010148505.tif 000005
【図１−２】
2010148505.tif 000006
【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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