(57)【要約】【課題】測定された核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、被検試料間の初期鋳型量の関係を正確に決定することを課題とする。【解決手段】本発明は、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめることにより、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を算出し、被検試料間の初期鋳型量の関係を算出する場合に、理論式は、指数パラメータである環境係数、および、初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含むこと、を特徴とする。【選択図】図１
2010227061.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめることにより、前記被検試料中の初期鋳型量に相当する量を算出し、前記複数の前記被検試料ごとに算出した前記初期鋳型量に相当する量を比較することにより、前記被検試料間の前記初期鋳型量の関係を算出する標的核酸測定方法であって、
前記理論式は、
指数パラメータである環境係数、および、前記初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含むこと、
を特徴とする標的核酸測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の標的核酸測定方法において、
前記理論式における、前記標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、前記反応促進係数、および、前記反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータ、および、前記環境係数により、前記核酸増幅反応の増幅効率を定義すること、
を特徴とする標的核酸測定方法。
【請求項３】
請求項２に記載の標的核酸測定方法において、
前記理論式は、前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記初期鋳型量に相当する量に対する、前記熱サイクル数ごとの前記増幅効率に１を加えた数の総乗で表すこと、
を特徴とする標的核酸測定方法。
【請求項４】
請求項３に記載の標的核酸測定方法において、
前記理論式は、以下に示す式であること、
を特徴とする標的核酸測定方法。
【数１】
2010227061.tif 000026
（ここで、Ｎｎは、前記熱サイクル数ｎにおける前記標的核酸の増幅量に相当する量、Ｎ０は、前記初期鋳型量に相当する量、ｊは、前記熱サイクル数、Ｎｊは、前記熱サイクル数ｊにおける標的核酸の増幅量に相当する量、Ｎｍａｘは、前記標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、ρは、前記反応促進係数、μは、前記反応阻害係数、Ｋは、前記環境係数である。）
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の標的核酸測定方法において、
最小二乗法を用いて前記理論式にあてはめること、
を特徴とする標的核酸測定方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の標的核酸測定方法において、
前記理論式の前記パラメータのうち、少なくとも１つを固定値とすること、
を特徴とする標的核酸測定方法。
【請求項７】
請求項６に記載の標的核酸測定方法において、
以下の式で表される増加率が、０以上１以下である領域において測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を前記理論式にあてはめることにより、前記反応促進係数および／または前記反応阻害係数を求め固定化すること、
を特徴とする標的核酸測定方法。
【数２】
2010227061.tif 000027
（ここで、Δｎは、前記増加率であり、Ｎｎは、前記熱サイクル数ｎにおける前記標的核酸の増幅量に相当する量である。）
【請求項８】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の標的核酸測定方法において、
前記複数の前記被検試料のうち少なくとも一つは、前記初期鋳型量が既知の標準試料であり、
前記被検試料間の前記初期鋳型量の前記関係として、前記各被検試料の前記標準試料に対する、前記初期鋳型量に相当する量の比率を算出し、
算出した前記比率に前記標準試料の前記初期鋳型量を乗じて、前記各被検試料の前記初期鋳型量を更に算出すること、
を特徴とする標的核酸測定方法。
【請求項９】
請求項８に記載の標的核酸測定方法において、
前記標準試料に対して実施された前記核酸増幅反応における前記熱サイクル数、および、当該熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめることにより、前記理論式の前記パラメータのうちの少なくとも一つを求めて固定値とし、前記各被検試料の前記初期鋳型量を算出すること、
を特徴とする標的核酸測定方法。
【請求項１０】
記憶部と制御部を少なくとも備えた標的核酸測定装置であって、
前記記憶部は、
同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、
指数パラメータである環境係数、および、前記被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、
を備え、
前記制御部は、
前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティング手段と、
前記理論式フィッティング手段によりフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出手段と、
前記初期鋳型量相当量算出手段により前記複数の前記被検試料ごとに算出された前記初期鋳型量に相当する量を比較することにより、前記被検試料間の前記初期鋳型量の関係を算出する初期鋳型量関係算出手段と、
を備えたことを特徴とする標的核酸測定装置。
【請求項１１】
同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記標的核酸の増幅量に相当する量を前記熱サイクル数ごとに測定する測定部を備えた測定装置と、記憶部と制御部を少なくとも備えた情報処理装置と、を備えた標的核酸測定システムであって、
前記記憶部は、
前記測定部により測定された、前記熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとの前記標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、
指数パラメータである環境係数、および、前記被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、
を備え、
前記制御部は、
前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティング手段と、
前記理論式フィッティング手段によりフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出手段と、
前記初期鋳型量相当量算出手段により前記複数の前記被検試料ごとに算出された前記初期鋳型量に相当する量を比較することにより、前記被検試料間の前記初期鋳型量の関係を算出する初期鋳型量関係算出手段と、
を備えたことを特徴とする標的核酸測定システム。
【請求項１２】
記憶部と制御部を少なくとも備えた情報処理装置に実行させるための標的核酸測定プログラムであって、
前記記憶部は、
同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、
指数パラメータである環境係数、および、前記被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、
を備えており、
前記制御部において、
前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティングステップと、
前記理論式フィッティングステップにおいてフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出ステップと、
前記初期鋳型量相当量算出ステップにおいて前記複数の前記被検試料ごとに算出された前記初期鋳型量に相当する量を比較することにより、前記被検試料間の前記初期鋳型量の関係を算出する初期鋳型量関係算出ステップと、
を実行させるための標的核酸測定プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以後、「ＰＣＲ」と記す。）と呼ばれる核酸増幅反応が報告されている。ＰＣＲは、核酸分子中の特定核酸領域を容器内で約１００万倍にも増幅するものである。ＰＣＲを利用することにより、標的核酸の特定核酸領域を、増幅された状態で検出することが可能となり、感度的には１分子の核酸から病原体を検出することも可能となっている。
【０００３】
この増幅された特定核酸領域の一般的な検出方法としては、ＰＣＲ終了後の反応溶液をアガロース電気泳動により分離した後に染色し、バンドの移動度（分子量）で判別する方法や、この反応溶液をドットハイブリダイゼーション法により検出する方法が行われている。
【０００４】
ここで、従来のＰＣＲを利用した核酸検出方法においては、一旦、ＰＣＲ終了後の反応溶液を反応容器から取り出して処理するものであるため、増幅された特定核酸領域が環境中に飛散する場合がある。飛散した特定核酸領域が実験室内の他の検体に混入すると、この核酸が次のＰＣＲの鋳型核酸となってしまい、他の検体の検査において偽陽性の要因となるおそれがある。
【０００５】
そのため、近年、試料中の核酸増幅量に相当する蛍光強度を、熱サイクル毎に測定するリアルタイムＰＣＲという方法が提案されているが、依然として、試料中の標的核酸の初期鋳型量を分析することが難しいという欠点がある。すなわち、増幅量が少ない場合は蛍光強度が微弱なため測定ができず、そのため増幅反応混合物中の初期鋳型量に相当するサイクル数０における蛍光強度を正確に算出することは困難である。
【０００６】
そこで、初期鋳型量の測定方法として、特許文献１が開示されている。この測定方法では、まず、一つの被検試料は、未知濃度の特異的核酸配列を有し、他の被検試料は、同じ特異的核酸配列を異なる既知濃度で含む複数の被検試料を準備する。そして、既知濃度および未知濃度の被検試料を、複数のサイクルについて並行して熱サイクルに供する。つづいて、被検試料から輻射される蛍光を測定し、実時間で各反応混合物がある強度（例えば、検出レベル以上の所定の強度）をもって蛍光を発するための必要なサイクル数（以後、「ＣＴ値」と記す。）を決定する。そして、既知濃度の被検試料における、特異的核酸配列の濃度対ＣＴ値を示す検量線を作成し、未知核酸濃度の被検試料のＣＴ値を作成した検量線にあてはめ、未知濃度の被検試料中の特異的核酸配列の初期鋳型量を決定する。
【０００７】
また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（製品名）の製品説明資料には、基準とした試料のＣＴ値の差から相対値を求める相対定量法である比較ＣＴ法が示されている（非特許文献１参照）。この方法では、基準とした試料のＣＴ値の差から相対値を求め、ＰＣＲ増幅効率を１００％と仮定して、初期鋳型量を決定する。
【０００８】
また、特許文献２には、以下の初期鋳型量の測定方法が開示されている。この測定方法では、まず、被検試料を、複数のサイクルについて熱サイクルに供する。この時、被検試料から核酸が増幅された量に相当する蛍光が輻射されるので、この輻射された蛍光を測定する。そして、測定した値を、ｄｓＤＮＡのモル濃度に変換し、ｄｓＤＮＡのモル濃度対サイクル数の測定曲線を得る。そして、出発プライマーモル濃度をパラメータの一つとする理論曲線にこの測定曲線をあてはめ、サイクル数０におけるｄｓＤＮＡのモル濃度つまり被検試料中の初期鋳型量を決定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平７−１６３３９７号公報
【特許文献２】特開平８−６６１９９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】“今だからこそリアルタイムＰＣＲ〜検量線を引かなくても定量できる？”、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００９年、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ、［平成２１年２月２４日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｗｅｂｓｉｔｅ／ｊｐ／ｂｉｏｂｅａｔ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｊｓｐ？ＣＯＬＵＭＮＰＧＣＤ＝７８９７３＆ＣＯＬＵＭＮＣＤ＝７６４４８＆ＴＹＰＥ＝Ｃ＆ＢＩＯＣＡＴＥＧＯＲＹＣＤ＝７＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、従来の測定方法においては、検量線を必要とする場合には、多数の既知濃度の被検試料を準備しなければならず未知濃度の被検試料の処理数が少なくなり、一方、検量線を必要としない場合には、実際のＰＣＲ増幅効率が必ずしも正確に反映されず、得られた初期鋳型量の正確性が低いという問題点を有していた。
【００１２】
例えば、特許文献１に記載の測定方法では、毎回ＰＣＲ増幅効率が反映された検量線を作成するため、得られる初期鋳型量の正確性が高いものの、毎回の実験毎に検量線を作成する必要があり、既知濃度の被検試料を多量に用意しなければならないという問題がある。また、複数の既知濃度の被検試料のＰＣＲを行う必要があるため、未知濃度の被検試料の処理数が減ってしまうという問題がある。
【００１３】
また、従来の比較ＣＴ法による測定方法（非特許文献１参照）では、検量線作成用の複数の既知濃度の被検試料を必要とせず、多量の未知濃度の被検試料を処理できるものの、ＰＣＲ増幅効率を１００％と仮定しているため、実際のＰＣＲ増幅効率（多くの場合、１００％とならない。）が結果に反映されず、得られた初期鋳型量の正確性が低くなってしまうという問題がある。
【００１４】
また、特許文献２に記載の方法では、検量線を必要とせず、同時に実際のＰＣＲ増幅効率を結果に反映するので、得られる初期鋳型量の正確性が高く、多量の未知濃度の被検試料を処理できるとも考えられる。しかしながら、蛍光測定値をｄｓＤＮＡのモル濃度に変換するには、事前に用意された蛍光測定値とｄｓＤＮＡモル濃度との関係を用いるため、この時の蛍光測定条件と、ＰＣＲにより測定曲線を得る時の測定条件が異なると、理論式のパラメータである出発プライマー濃度と被検試料における増幅核酸のモル濃度との関係が不正確となってしまい、理論式が成立しなくなるという問題がある。また、特許文献２に記載の理論式では、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映できるものではないため、測定曲線を理論式にあてはめた結果得られた初期鋳型量の正確性が低くなるという問題もあった。
【００１５】
本発明は、上記問題点に鑑みて創案されたものであり、測定された核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、複数の被検試料間の初期鋳型量の関係を正確に決定することができる、標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
このような目的を達成するため、本発明の標的核酸測定方法は、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめることにより、前記被検試料中の初期鋳型量に相当する量を算出し、前記複数の前記被検試料ごとに算出した前記初期鋳型量に相当する量を比較することにより、前記被検試料間の前記初期鋳型量の関係を算出する標的核酸測定方法であって、前記理論式は、指数パラメータである環境係数、および、前記初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含むこと、を特徴とする。
【００１７】
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記理論式における、前記標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、前記反応促進係数、および、前記反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータ、および、前記環境係数により、前記核酸増幅反応の増幅効率を定義すること、を特徴とする。
【００１８】
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記理論式は、前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記初期鋳型量に相当する量に対する、前記熱サイクル数ごとの前記増幅効率に１を加えた数の総乗で表すこと、を特徴とする。
【００１９】
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記理論式は、以下に示す式であること、を特徴とする。
【数１】
2010227061.tif 000003
（ここで、Ｎｎは、前記熱サイクル数ｎにおける前記標的核酸の増幅量に相当する量、Ｎ０は、前記初期鋳型量に相当する量、ｊは、前記熱サイクル数、Ｎｊは、前記熱サイクル数ｊにおける標的核酸の増幅量に相当する量、Ｎｍａｘは、前記標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、ρは、前記反応促進係数、μは、前記反応阻害係数、Ｋは、前記環境係数である。）
【００２０】
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、最小二乗法を用いて前記理論式にあてはめること、を特徴とする
【００２１】
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記理論式の前記パラメータのうち、少なくとも１つを固定値とすること、を特徴とする。
【００２２】
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、以下の式で表される増加率が、０以上１以下である領域において測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を前記理論式にあてはめることにより、前記反応促進係数および／または前記反応阻害係数を求め固定化すること、を特徴とする。
【数２】
2010227061.tif 000004
（ここで、Δｎは、前記増加率であり、Ｎｎは、前記熱サイクル数ｎにおける前記標的核酸の増幅量に相当する量である。）
【００２３】
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記複数の前記被検試料のうち少なくとも一つは、前記初期鋳型量が既知の標準試料であり、前記被検試料間の前記初期鋳型量の前記関係として、前記各被検試料の前記標準試料に対する、前記初期鋳型量に相当する量の比率を算出し、算出した前記比率に前記標準試料の前記初期鋳型量を乗じて、前記各被検試料の前記初期鋳型量を更に算出すること、を特徴とする。
【００２４】
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記標準試料に対して実施された前記核酸増幅反応における前記熱サイクル数、および、当該熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめることにより、前記理論式の前記パラメータのうちの少なくとも一つを求めて固定値とし、前記各被検試料の前記初期鋳型量を算出すること、を特徴とする。
【００２５】
また、本発明は、標的核酸測定装置に関するものであり、本発明の標的核酸測定装置は、記憶部と制御部を少なくとも備え、前記記憶部は、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、指数パラメータである環境係数、および、前記被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、を備え、前記制御部は、前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティング手段と、前記理論式フィッティング手段によりフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出手段と、前記初期鋳型量相当量算出手段により前記複数の前記被検試料ごとに算出された前記初期鋳型量に相当する量を比較することにより、前記被検試料間の前記初期鋳型量の関係を算出する初期鋳型量関係算出手段と、を備えたことを特徴とする。
【００２６】
また、本発明は、標的核酸測定システムに関するものであり、本発明の標的核酸測定システムは、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記標的核酸の増幅量に相当する量を前記熱サイクル数ごとに測定する測定部を備えた測定装置と、記憶部と制御部を少なくとも備えた情報処理装置と、を備えた標的核酸測定システムであって、前記記憶部は、前記測定部により測定された、前記熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとの前記標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、指数パラメータである環境係数、および、前記被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、を備え、前記制御部は、前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティング手段と、前記理論式フィッティング手段によりフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出手段と、前記初期鋳型量相当量算出手段により前記複数の前記被検試料ごとに算出された前記初期鋳型量に相当する量を比較することにより、前記被検試料間の前記初期鋳型量の関係を算出する初期鋳型量関係算出手段と、を備えたことを特徴とする。
【００２７】
また、本発明は、標的核酸測定プログラムに関するものであり、本発明の標的核酸測定プログラムは、記憶部と制御部を少なくとも備えた情報処理装置に実行させるための標的核酸測定プログラムであって、前記記憶部は、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、指数パラメータである環境係数、および、前記被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、を備えており、前記制御部において、前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティングステップと、前記理論式フィッティングステップにおいてフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出ステップと、前記初期鋳型量相当量算出ステップにおいて前記複数の前記被検試料ごとに算出された前記初期鋳型量に相当する量を比較することにより、前記被検試料間の前記初期鋳型量の関係を算出する初期鋳型量関係算出ステップと、を実行させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２８】
この発明の標的核酸測定方法によれば、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめることにより、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を算出し、複数の被検試料ごとに算出した初期鋳型量に相当する量を比較することにより、被検試料間の初期鋳型量の関係を算出する方法において、理論式は、指数パラメータである環境係数、および、初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む。これにより、測定された核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、複数の被検試料間の初期鋳型量の関係を正確に決定することができるという効果を奏する。
【００２９】
また、本発明の標的核酸測定装置によれば、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を記憶し、指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶し、記憶した熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行い、フィッティングされた理論式から、初期鋳型量に相当する量を算出し、複数の被検試料ごとに算出した初期鋳型量に相当する量を比較することにより、被検試料間の初期鋳型量の関係を算出する。これにより、測定された核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、複数の被検試料間の初期鋳型量の関係を正確に決定することができるという効果を奏する。
【００３０】
また、本発明の標的核酸測定システムによれば、測定装置は、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、標的核酸の増幅量に相当する量を熱サイクル数ごとに測定し、情報処理装置は、測定された、熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとの標的核酸の増幅量に相当する量を記憶し、指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶し、記憶した熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行い、フィッティングされた理論式から、初期鋳型量に相当する量を算出し、複数の被検試料ごとに算出した初期鋳型量に相当する量を比較することにより、被検試料間の初期鋳型量の関係を算出する。これにより、測定した核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、複数の被検試料間の初期鋳型量の関係を正確に決定することができるという効果を奏する。
【００３１】
また、本発明の標的核酸測定プログラムによれば、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を記憶し、指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する情報処理装置において、記憶された熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行い、フィッティングされた理論式から、初期鋳型量に相当する量を算出し、複数の被検試料ごとに算出した初期鋳型量に相当する量を比較することにより、被検試料間の初期鋳型量の関係を算出する方法を実行させる。これにより、測定した核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、複数の被検試料間の初期鋳型量の関係を正確に決定することができるプログラムを提供することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、本発明の概要を示すフローチャートである。
【図２】図２は、本発明が適用される標的核酸測定装置１００の構成の一例を示すブロック図である。
【図３】図３は、本実施の形態における標的核酸測定装置１００の処理の一例を示すフローチャートである。
【図４】図４は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ７９００（商品名）の測定装置により得られた測定データの一例を示す図である。
【図５】図５は、横軸を熱サイクル数ｎとして、縦軸に増加率Δｎを示した図である。
【図６】図６は、図５において、関係式（０≦Δｎ≦ρ≦１）を満たすフィッティング領域を切り出して実測値と理論値を比較した図である。
【図７】図７は、本実施例２の標的核酸測定方法を示すフローチャートである。
【図８】図８は、Ｃｔ値対初期鋳型量を示す検量線を示す図である。
【図９】図９は、検量線法と比較Ｃｔ法により算出した従来例の算出結果を示す図である。
【図１０】図１０は、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２のそれぞれについて、条件１と条件２の２通りでフィッティングを行い、各パラメータを算出した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、従来例と本実施例２−２において算出した初期鋳型量（相当量）および初期鋳型量比を示す図である。
【図１２】図１２は、算出した各パラメータの値を示す図である。
【図１３】図１３は、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２について算出した初期鋳型量を示す図である。
【図１４】図１４は、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２について、本実施例２−２と従来法（検量線法）により算出された初期鋳型量の比較結果を示す図である。
【図１５】図１５は、環境係数Ｋの値をＫ＝１．０〜１．７の範囲で決定し、既知鋳型量の標準サンプルをフィッティングさせ、得られたρおよびμの値を用いて他の測定データをフィッティングさせた結果を示す図である。
【図１６】図１６は、環境係数Ｋの値をＫ＝１．０〜１．７の範囲で決定し、既知鋳型量の標準サンプルをフィッティングさせ、得られたρおよびμの値を用いて他の測定データをフィッティングさせた結果を示す図である。
【図１７】図１７は、環境係数Ｋの値をＫ＝１．０〜１．７の範囲で決定し、既知鋳型量の標準サンプルをフィッティングさせ、得られたρおよびμの値を用いて他の測定データをフィッティングさせた結果を示す図である。
【図１８】図１８は、環境係数Ｋの値をＫ＝１．０〜１．７の範囲で決定し、既知鋳型量の標準サンプルをフィッティングさせ、得られたρおよびμの値を用いて他の測定データをフィッティングさせた結果を示す図である。
【図１９】図１９は、初期ＤＮＡ鋳型量を２０００ｐｇ／μｌと５００ｐｇ／μｌで調製した実験１の測定データを用いて算出した初期鋳型量相当量Ｎ０の比を表す図である。
【図２０】図２０は、初期ＤＮＡ鋳型量を２０００ｐｇ／μｌと５００ｐｇ／μｌで調製した実験２の測定データを用いて算出した初期鋳型量相当量Ｎ０の比を表す図である。
【図２１】図２１は、初期ＤＮＡ鋳型量を２０００ｐｇ／μｌと５００ｐｇ／μｌで調製した実験３の測定データを用いて算出した初期鋳型量相当量Ｎ０の比を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下に、本発明にかかる標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラムの実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
【００３４】
［本発明の概要］
以下、本発明の概要について図１を参照して説明し、その後、本発明の構成および処理等について詳細に説明する。ここで、図１は、本発明の概要を示すフローチャートである。
【００３５】
図１に示すように、まず、本発明は、核酸増幅反応における熱サイクル数（ｎ）を設定する（ステップＳＡ−１）。すなわち、核酸増幅反応を繰り返し行うための熱サイクルの回数（ｎ）が設定される。
【００３６】
そして、本発明は、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対し核酸増幅反応を行い、標的核酸を増幅させる（ステップＳＡ−２）。ここで、本発明は、複数の被検試料のうち少なくとも一つを、初期鋳型量が既知の標準試料としてもよい。
【００３７】
そして、本発明は、熱サイクル数（ｎ）と対応付けて、標的核酸の増幅量に相当する量（以下、「増幅量相当量」と呼ぶ。）を測定する（ステップＳＡ−３）。ここで、「増幅量」とは、熱サイクル数１から当該サイクル数までに増幅された標的核酸の総量を意味する。また、「増幅量相当量」とは、任意の指標によって得られる標的核酸の増幅量に相当する量であり、例えば、２本鎖ＤＮＡの存在時に信号を発するインターカーレーターからの信号強度や、増幅反応時の伸張反応により信号を発生させるレポーター分子からの信号強度等である。
【００３８】
そして、本発明は、当該熱サイクル数が熱サイクル数（ｎ）に到達したか否かを判断し（ステップＳＡ−４）、熱サイクル数（ｎ）に到達していない場合（ステップＳＡ−４、Ｎｏ）、ステップＳＡ−２に戻る。一方、熱サイクル数（ｎ）に到達した場合（ステップＳＡ−４、Ｙｅｓ）、核酸増幅反応と、それに伴う増幅量相当量の測定を終了する。
【００３９】
そして、本発明は、熱サイクルごとに測定された増幅量相当量を理論式にあてはめる（ステップＳＡ−５）。ここで、本発明の理論式は、指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量（以下、「初期鋳型量相当量」と呼ぶ。）を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含んで構成される。すなわち、本発明は、このステップＳＡ−５において、熱サイクルごとに測定された増幅量相当量に理論式が適合（フィッティング）するように理論式のパラメータを決定する。
【００４０】
ここで、理論式において、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータおよび環境係数により、核酸増幅反応の増幅効率を定義してもよい。また、理論式は、増幅量相当量を、初期鋳型量相当量に対する、熱サイクル数ごとの増幅効率に１を加えた数の総乗で表してもよい。また、本発明は、理論式のパラメータのうち、少なくとも１つを固定値としてもよい。また、複数の被検試料のうち少なくとも一つに初期鋳型量が既知の標準試料を用いた場合、本発明は、標準試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、当該熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量相当量を、理論式にあてはめることにより、理論式のパラメータのうちの少なくとも一つを求め、各被検試料の初期鋳型量を算出するために、当該求めたパラメータを固定値としてもよい。
【００４１】
そして、本発明は、増幅量相当量があてはめられた理論式から、初期鋳型量相当量（すなわち、増幅反応混合物中のサイクル数０における初期鋳型量に相当する量）を算出する（ステップＳＡ−６）。例えば、本発明は、フィッティングによりパラメータが決定された理論式に基づいて、初期鋳型量相当量の算出を行う。
【００４２】
そして、本発明は、複数の被検試料ごとに算出した初期鋳型量相当量を比較することにより、被検試料間の初期鋳型量の関係（比率、割合、大小関係など）を算出する（ステップＳＡ−７）。ここで、複数の被検試料のうち少なくとも一つに初期鋳型量が既知の標準試料を用いた場合、本発明は、被検試料間の初期鋳型量の関係として、各被検試料の標準試料に対する、初期鋳型量相当量の比率を算出し、算出した比率に標準試料の初期鋳型量を乗じて、各被検試料の初期鋳型量を更に算出してもよい。
【００４３】
以上が本発明の概要である。このように、本発明は、測定された増幅量相当量をそのまま当てはめることができ、実際の増幅効率を正確に反映させることができる理論式を用いて、被検試料間の初期鋳型量の関係を正確に決定することができる。
【００４４】
［標的核酸測定装置の構成］
次に、本発明にかかる標的核酸測定装置の構成について図２を参照して説明する。図２は、本発明が適用される標的核酸測定装置１００の構成の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
【００４５】
図２において標的核酸測定装置１００は、概略的に、制御部１０２と通信制御インターフェース部１０４と入出力制御インターフェース部１０８と記憶部１０６を備えて構成される。ここで、制御部１０２は、標的核酸測定装置１００の全体を統括的に制御するＣＰＵ等である。また、入出力制御インターフェース部１０８は、入力部１１２や出力部１１４や測定部１１６に接続されるインターフェースである。また、記憶部１０６は、各種のデータベースやテーブルなどを格納する装置である。これら標的核酸測定装置１００の各部は任意の通信路を介して通信可能に接続されている。
【００４６】
記憶部１０６に格納される各種のデータベースやファイル（測定データファイル１０６ａ、理論式ファイル１０６ｂ等）は、固定ディスク装置等のストレージ手段である。例えば、記憶部１０６は、各種処理に用いる各種のプログラムやテーブルやファイルやデータベース等を格納する。
【００４７】
これら記憶部１０６の各構成要素のうち、測定データファイル１０６ａは、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ等）における熱サイクル数に対応付けて、熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量相当量を記憶する増幅量相当量記憶手段である。ここで、測定データファイル１０６ａは、複数の被検試料の一つとして初期鋳型量が既知の標準試料に関する測定データを記憶してもよく、すなわち、当該初期鋳型量が既知の標準試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとに測定された増幅量相当量を記憶してもよい。
【００４８】
また、理論式ファイル１０６ｂは、理論式を記憶する理論式記憶手段である。ここで、理論式ファイル１０６ｂに記憶される理論式は、指数パラメータである環境係数Ｋ、および、初期鋳型量相当量Ｎ０を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量（以下、「飽和量相当量」と呼ぶ。）Ｎｍａｘ、反応促進係数ρ、および、反応阻害係数μのうち少なくとも一つのパラメータを含んで構成される。
【００４９】
ここで、理論式ファイル１０６ｂに記憶される理論式は、飽和量相当量Ｎｍａｘ、反応促進係数ρ、および、反応阻害係数μのうち少なくとも一つのパラメータ、および、環境係数により、核酸増幅反応の増幅効率を定義してもよい。更に、理論式は、増幅量相当量Ｎｎを、初期鋳型量相当量Ｎ０に対する、熱サイクル数ごとの増幅効率に１を加えた数の総乗で表してもよい。例えば、理論式は、以下に示す式でもよい。
【数３】
2010227061.tif 000005
（ここで、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量、Ｎ０は、初期鋳型量相当量、ｊは、熱サイクル数、Ｎｊは、熱サイクル数ｊにおける増幅量相当量、Ｎｍａｘは、飽和量相当量、ρは、反応促進係数、μは、反応阻害係数、Ｋは、環境係数である。）
【００５０】
また、理論式ファイル１０６ｂは、理論式のパラメータの値を記憶してもよく、例えば、反応促進係数ρ、反応阻害係数μ、環境係数Ｋ、および、飽和量相当量Ｎｍａｘの少なくとも１つを固定値として記憶してもよい。
【００５１】
また、図２において、入出力制御インターフェース部１０８は、入力部１１２や出力部１１４や測定部１１６の制御を行う。ここで、出力部１１４としては、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカを用いることができる（なお、以下においては出力部１１４をモニタとして記載する場合がある）。また、入力部１１２としては、キーボードや、マウス、マイク等を用いることができる。
【００５２】
また、測定部１１６は、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、増幅量相当量を熱サイクル数ごとに測定する測定手段である。一例として、測定部１１６は、リアルタイムＰＣＲ装置等における測定手段として構成される。なお、測定部１１６により測定された熱サイクルごとの増幅量相当量は、制御部１０２の制御により、測定データとして測定データファイル１０６ａに格納される。
【００５３】
また、図２において、制御部１０２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや、各種の処理手順等を規定したプログラム、および、所要データを格納するための内部メモリを有する。そして、制御部１０２は、これらのプログラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行う。制御部１０２は、機能概念的に、理論式フィッティング部１０２ａ、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂ、初期鋳型量関係算出部１０２ｃを備えて構成されている。
【００５４】
このうち、理論式フィッティング部１０２ａは、測定データファイル１０６ａに記憶された熱サイクル数ごとの増幅量相当量を、理論式ファイル１０６ｂに記憶された理論式にあてはめて、当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティング手段である。すなわち、理論式フィッティング部１０２ａは、熱サイクルごとに測定された増幅量相当量に理論式が最も適合（フィッティング）するように理論式のパラメータを決定する。
【００５５】
ここで、理論式フィッティング部１０２ａは、最小二乗法を用いて理論式へのあてはめを行ってもよい。また、理論式フィッティング部１０２ａは、理論式ファイル１０６ｂに記憶された、反応促進係数ρ、反応阻害係数μ、環境係数Ｋ、飽和量相当量Ｎｍａｘ等のパラメータの値を読み出し、このうち少なくとも一つのパラメータを固定値として理論式のフィッティングを行ってもよい。例えば、理論式フィッティング部１０２ａは、測定データファイル１０６ａに記憶された、標準試料に関する熱サイクル数ごとの増幅量相当量を、理論式ファイル１０６ｂに記憶された理論式にあてはめ、当該理論式のパラメータの値を決定し、決定したパラメータのうち少なくとも一つの値を固定値として理論式ファイル１０６ｂに格納してもよい。すなわち、この理論式ファイル１０６ｂに格納されたパラメータの値は、各被検試料についての測定データを理論式にあてはめてフィッティングを行う場合に、理論式のパラメータを固定化するために読み出される。また、理論式フィッティング部１０２ａは、測定データファイル１０６ａに記憶された増幅量相当量のうち最大値を、飽和量相当量Ｎｍａｘとして理論式のフィッティングを行ってもよい。また、理論式フィッティング部１０２ａは、以下の式で表される増加率Δｎが、０以上１以下である領域において測定された増幅量相当量のみを理論式にあてはめることにより、反応促進係数ρや反応阻害係数μ等のパラメータを固定化してもよい。すなわち、理論式フィッティング部１０２ａは、増加率Δｎが、０以上１以下である熱サイクル数の範囲において測定された増幅量相当量のみを理論式にあてはめてフィッティングを行い、求めた反応促進係数ρや反応阻害係数μ等のパラメータの値を固定値として理論式ファイル１０６ｂに格納してもよい。
【数４】
2010227061.tif 000006
（ここで、Δｎは、増加率であり、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量である。）
【００５６】
また、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂは、理論式フィッティング部１０２ａによりフィッティングされた理論式から、初期鋳型量相当量を算出する初期鋳型量相当量算出手段である。例えば、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂは、理論式フィッティング部１０２ａによるフィッティング結果である理論式のパラメータの値に基づいて、複数の被検試料ごとに初期鋳型量相当量Ｎ０を算出する。
【００５７】
また、初期鋳型量関係算出部１０２ｃは、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂにより複数の被検試料ごとに算出された初期鋳型量相当量を比較することにより、被検試料間の初期鋳型量の関係を算出する。例えば、初期鋳型量関係算出部１０２ｃは、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂにより複数の被検試料ごとに算出された初期鋳型量相当量に基づいて、被検試料間の初期鋳型量相当量の比や比率や割合や大小関係等を算出することにより、被検試料間の初期鋳型量の関係を算出して出力部１１４に出力する。ここで、初期鋳型量関係算出部１０２ｃは、被検試料間の初期鋳型量の関係として、被検試料の初期鋳型量相当量の、標準試料の初期鋳型量相当量に対する比率を算出し、算出した比率に標準試料の初期鋳型量（既知量）を乗じて、各被検試料の初期鋳型量を更に算出してもよい。
【００５８】
以上が、本標的核酸測定装置１００の構成の一例である。ここで、標的核酸測定装置１００は、ルータ等の通信装置および専用線等の有線または無線の通信回線を介して、ネットワーク３００に通信可能に接続されてもよい。この場合、通信制御インターフェース部１０４は、通信回線等に接続されるルータ等の通信装置（図示せず）に接続されるインターフェースであり、標的核酸測定装置１００とネットワーク３００（またはルータ等の通信装置）との間における通信制御を行う。すなわち、通信制御インターフェース部１０４は、他の端末と通信回線を介してデータを通信する機能を有する。図２において、ネットワーク３００は、標的核酸測定装置１００と外部システム２００とを相互に接続する機能を有し、例えば、インターネット等である。
【００５９】
また、標的核酸測定装置１００は、測定データやパラメータ等に関する外部データベースや、標的核酸測定装置として機能させるための外部プログラム等を提供する外部システム２００に、ネットワーク３００を介して通信可能に接続されてもよい。
【００６０】
図２において、外部システム２００は、ネットワーク３００を介して、標的核酸測定装置１００と相互に接続され、利用者に対して測定データや理論式やパラメータの値等に関する外部データベースや、情報処理装置を標的核酸測定装置として機能させるための標的核酸測定プログラム等の外部プログラム等を提供する機能を有する。ここで、外部システム２００は、ＷＥＢサーバやＡＳＰサーバ等として構成してもよい。また、外部システム２００のハードウェア構成は、一般に市販されるワークステーション、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置およびその付属装置により構成してもよい。また、外部システム２００の各機能は、外部システム２００のハードウェア構成中のＣＰＵ、ディスク装置、メモリ装置、入力装置、出力装置、通信制御装置等およびそれらを制御するプログラム等により実現される。
【００６１】
［標的核酸測定装置１００の処理］
次に、このように構成された本実施の形態における本標的核酸測定装置１００の処理の一例について、以下に図３を参照して詳細に説明する。ここで、図３は、本実施の形態における標的核酸測定装置１００の処理の一例を示すフローチャートである。
【００６２】
図３に示すように、リアルタイムＰＣＲ装置等の測定部１１６が、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数に対応付けて、増幅量相当量を熱サイクル数ごとに測定すると、標的核酸測定装置１００の制御部１０２は、熱サイクル数および熱サイクル数ごとに測定された増幅量相当量に関する測定データを、測定部１１６を介して取得し、測定データファイル１０６ａに格納する（ステップＳＢ−１）。ここで、複数の被検試料のうち少なくとも一つは、初期鋳型量が既知の標準試料であってもよい。
【００６３】
そして、理論式フィッティング部１０２ａは、測定データファイル１０６ａに記憶された熱サイクル数ごとの増幅量相当量を、理論式ファイル１０６ｂに記憶された理論式にあてはめて、理論式のフィッティングを行う（ステップＳＢ−２）。すなわち、理論式フィッティング部１０２ａは、熱サイクル数ごとの増幅量相当量に理論式が最も適合（フィッティング）するように、最小二乗法等を用いて理論式のパラメータの値を調整して決定する。ここで、理論式フィッティング部１０２ａにより用いられる理論式は、指数パラメータである環境係数Ｋの他、反応促進係数ρや、反応阻害係数μ、飽和量相当量Ｎｍａｘ等のパラメータにより、核酸増幅反応の増幅効率が定義されていてもよい。また、理論式は、一例として、増幅量相当量を、初期鋳型量相当量に対する、熱サイクル数ごとの増幅効率に１を加えた数の総乗で表し、好適には、理論式は以下の式で表される。
【数５】
2010227061.tif 000007
（ここで、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量、Ｎ０は、初期鋳型量相当量、ｊは、熱サイクル数、Ｎｊは、熱サイクル数ｊにおける増幅量相当量、Ｎｍａｘは、飽和量相当量、ρは、反応促進係数、μは、反応阻害係数、Ｋは、環境係数である。）
【００６４】
ここで、ステップＳＢ−２において、理論式フィッティング部１０２ａは、反応促進係数ρ、反応阻害係数μ、環境係数Ｋ、飽和量相当量Ｎｍａｘ等のパラメータの値を理論式ファイル１０６ｂから読み出し、パラメータのいずれかを、複数の被検試料間で共通の固定値としてもよい。例えば、理論式フィッティング部１０２ａは、測定データファイル１０６ａに記憶された、標準試料に関する熱サイクル数ごとの増幅量相当量を理論式にあてはめ、当該理論式のパラメータの値を決定し、決定したパラメータのうち少なくとも一つの値を固定化した理論式に、被検試料に関する熱サイクル数ごとの増幅量相当量をあてはめて、当該理論式のフィッティングを行ってもよい。
【００６５】
そして、理論式フィッティング部１０２ａは、フィッティング結果である理論式の各パラメータの値を理論式ファイル１０６ｂに格納する（ステップＳＢ−３）。例えば、理論式フィッティング部１０２ａは、最小二乗法等を用いて理論式が増幅量相当量に最も適合（フィッティング）するように最適化したパラメータの値を、フィッティング結果として理論式ファイル１０６ｂに格納する。
【００６６】
そして、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂは、理論式ファイル１０６ｂに記憶された理論式のパラメータの値に基づいて、複数の被検試料ごとに初期鋳型量相当量Ｎ０を算出する（ステップＳＢ−４）。
【００６７】
そして、初期鋳型量関係算出部１０２ｃは、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂにより複数の被検試料ごとに算出された初期鋳型量相当量を比較することにより、被検試料間の初期鋳型量の関係（比や比率や割合や大小関係等の相対定量値）を算出し、入出力制御インターフェース部１０８を介して出力部１１４に出力する（ステップＳＢ−５）。ここで、初期鋳型量関係算出部１０２ｃは、被検試料間の初期鋳型量の関係として、標準試料に対する被検試料の、初期鋳型量相当量の比率を算出し、算出した比率に標準試料の初期鋳型量（既知量）を乗じて、各被検試料の初期鋳型量を更に算出してもよい。以上が標的核酸測定装置１００の処理の一例である。
【００６８】
以上、本実施の形態によれば、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数ごとに測定された増幅量相当量を、理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行い、フィッティングされた理論式から、初期鋳型量相当量Ｎ０を算出し、複数の被検試料ごとに算出した初期鋳型量相当量Ｎ０を比較することにより、被検試料間の初期鋳型量の関係を算出する場合において、理論式は、指数パラメータである環境係数Ｋ、および、初期鋳型量相当量Ｎ０を含み、かつ、飽和量相当量Ｎｍａｘ、反応促進係数ρ、および、反応阻害係数μのうち少なくとも一つのパラメータを含むので、測定された増幅量相当量をそのまま当てはめることができ、実際の増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、被検試料間の初期鋳型量の関係を正確に決定することができる。
【００６９】
また、本実施の形態によれば、理論式において、飽和量相当量Ｎｍａｘ、反応促進係数ρ、および、反応阻害係数μのうち少なくとも一つのパラメータ、および、環境係数Ｋにより、核酸増幅反応の増幅効率を定義するので、実際の増幅効率を更に正確に反映することができる理論式を用いて、被検試料間の初期鋳型量の関係をより正確に決定することができる。
【００７０】
また、本実施の形態によれば、理論式は、増幅量相当量を、初期鋳型量相当量Ｎ０に対する、熱サイクル数ごとの増幅効率に１を加えた数の総乗で表すので、測定された増幅量相当量をそのまま当てはめることができ、実際の増幅効率をより正確に反映することができる理論式を用いて、被検試料間の初期鋳型量の関係をより正確に決定することができる。
【００７１】
また、本実施の形態によれば、理論式は、以下に示す式であるので、実際の増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、被検試料間の初期鋳型量の関係をより正確に決定することができる。
【数６】
2010227061.tif 000008
（ここで、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量、Ｎ０は、初期鋳型量相当量、ｊは、熱サイクル数、Ｎｊは、熱サイクル数ｊにおける増幅量相当量、Ｎｍａｘは、飽和量相当量、ρは、反応促進係数、μは、反応阻害係数、Ｋは、環境係数である。）
【００７２】
また、本実施の形態によれば、最小二乗法を用いて理論式にあてはめるので、より正確にフィッティングを行うことができ、被検試料間の初期鋳型量の関係をより正確に決定することができる。
【００７３】
また、本実施の形態によれば、理論式のパラメータのうち、少なくとも１つを固定値とするので、得られたパラメータ値を固定化して、より短時間で正確に被検試料間の初期鋳型量の関係を決定することができる。
【００７４】
また、本実施の形態によれば、以下の式で表される増加率が、０以上１以下である領域において測定された増幅量相当量を理論式にあてはめることにより、反応促進係数ρおよび／または反応阻害係数μを求め固定化するので、測定された増幅量相当量のうち適切な領域のみを用いて、より正確に被検試料間の初期鋳型量の関係を決定することができる。
【数７】
2010227061.tif 000009
（ここで、Δｎは、増加率であり、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量である。）
【００７５】
また、本実施の形態によれば、複数の被検試料のうち少なくとも一つは、初期鋳型量が既知の標準試料であり、被検試料間の初期鋳型量の関係として、各被検試料の標準試料に対する、初期鋳型量相当量Ｎ０の比率を算出し、算出した比率に標準試料の初期鋳型量を乗じて、各被検試料の初期鋳型量を更に算出するので、正確に算出された被検試料間の初期鋳型量の関係を利用して、各被検試料の初期鋳型量を正確に決定することができる。
【００７６】
また、本実施の形態によれば、標準試料に対して実施された核酸増幅反応における熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量相当量を、理論式にあてはめることにより、理論式のパラメータのうちの少なくとも一つを求めて固定値とし、各被検試料の初期鋳型量を算出するので、標準試料と共通の固定値を用いて被検試料間の初期鋳型量の関係を正確に算出して、各被検試料の初期鋳型量をより正確に決定することができる。これにて、本実施の形態の一例の説明を終える。
【実施例１】
【００７７】
つづいて、本実施の形態にかかる実施例１について、以下に図４〜図６を参照して説明する。
【００７８】
［理論式］
まず、本実施例１で用いる理論式について、以下に説明する。
【００７９】
本実施例１にかかるリアルタイムＰＣＲシステムにおいて、ＰＣＲに必要な溶液は、適切な緩衝液や、２種の相補的オリゴヌクレオチドプライマー、過剰量の４種のヌクレオチドトリホスファート、ＤＮＡポリメラーゼ、未知量のターゲット核酸分子等により構成される。このような構成において、ＰＣＲ反応におけるＰＣＲ産物の量Ｎｎは、次式で表される。
【数８】
2010227061.tif 000010
（ここで、ρは増幅係数であり理想的には１であるが、実際には、システムの条件（実験条件）により０〜１の値となる（ρ＝０の場合は、増幅なし）。μは、阻害係数であり理想的には０であるが、ピロリン酸などによる増幅阻害物質の影響により０〜∞の値となる（μ＝∞の場合は、増幅なし）。また、ｐ（Ｎｚｎ−１，Ａｚｎ−１，Ｔｘ，Ｌｔ，Ｌｐ）は、ポリメラーゼの作用特性関数であり、その値は、ＰＣＲの熱サイクル回数ｎ−１における、ポリメラーゼの数Ｎｚｎ−１、ポリメラーゼの比活性Ａｚｎ−１、伸長時間Ｔｘ（秒）、鋳型の塩基長Ｌｔ、プライマーの塩基長Ｌｐに依存する。）
【００８０】
ポリメラーゼが完全に機能するときには、ｐ（Ｎｚｎ−１，Ａｚｎ−１，Ｔｘ，Ｌｔ，Ｌｐ）＝１であるので、（１）式は、次式となる。
【数９】
2010227061.tif 000011
【００８１】
しかし、実際の条件下では、ポリメラーゼは完全には機能していないと考えられる。また、ポリメラーゼの作用特性関数ｐ（Ｎｚｎ−１，Ａｚｎ−１，Ｔｘ，Ｌｔ，Ｌｐ）の具体的な数式は明らかでないため、本実施例１では、これに替えて変数Ｋを導入して、式（２）を次式のように変更する。
【数１０】
2010227061.tif 000012
【００８２】
ここで、（１）式、（２）式および（３）式におけるＮｍａｘは、ＤＮＡの飽和量（ＰＣＲの熱サイクルを繰り返した場合のＤＮＡの飽和量）であり、次式で与えられる。
Ｎｍａｘ＝Ｎｐ０＋Ｎ０                                （４）
（ここで、Ｎｐ０は初期のプライマーの数、Ｎ０は、鋳型ＤＮＡの数である。）
【００８３】
そして、（３）式により、ＰＣＲの熱サイクル回数ｎにおけるＤＮＡの数は、次式で表される。
【数１１】
2010227061.tif 000013
【００８４】
さらに、ＰＣＲの熱サイクル回数ｎにおけるＤＮＡの増加率（増幅効率）Δｎは、（３）式により、次式で表される。
【数１２】
2010227061.tif 000014
【００８５】
そして、（６）式から明らかなように、増加率Δｎおよび増幅係数ρは、理論上、以下の関係式となる。
【数１３】
2010227061.tif 000015
【００８６】
本実施例１では、以上の理論式（具体的には、（５）式）に基づいて、最小二乗フィッティングを行う。具体的には、増幅量相当量Ｎｎが高精度に検出できる複数のＮｎを、（５）式を用いて最小二乗フィッティングすることにより、ρ、μ、Ｎ０およびＮｍａｘを得る。そして、このようにして求められたＮ０を鋳型ＤＮＡの推定数量（初期鋳型量相当量）とする。ここで、ρ、μおよびＮｍａｘの全てがシステム条件で共通の定数（固定値）であれば、フィッティングは、求めるべきパラメータが少なくなり、計算は容易となる。なお、ρは、システム条件により、Ｎｍａｘは溶液の量により変化することが考えられるので、固定値とせず変数のままでもよい。
【００８７】
ここで、以上のように構成された本実施例１の理論式と、従来の理論式の差異について説明する。
【００８８】
例えば、特許文献２において開示されている式には、前述のプライマーとポリメラーゼの量が導入されている。ここで、特許文献２の式において、濃度をＤＮＡ数とし、さらに阻害係数を用いて書き換えると、次式が得られる。
【数１４】
2010227061.tif 000016
（ここで、Ｎｎ−１およびＮｎは、それぞれ、ＰＣＲの熱サイクル回数ｎ−１およびｎにおけるＤＮＡの数である。また、ｅＶはＤＮＡの残存確率、ρは増幅係数、μは阻害係数、Ｎ０は鋳型ＤＮＡの数、Ｎｐ０は初期のプライマーの数である。また、Ｎｚｎ−１およびＡｚｎ−１は、それぞれ、ＰＣＲの熱サイクル回数ｎ−１におけるポリメラーゼの数および比活性であり、Ｔｘは伸長時間（秒）、Ｌｔは鋳型の塩基長、Ｌｐはプライマーの塩基長である。また、ＤＮＡの飽和量Ｎｍａｘは次式で与えられる。）
Ｎｍａｘ＝Ｎｐ０＋Ｎ０                        （９）
【００８９】
ここで、ポリメラーゼが十分に機能し、さらに、ｅＶ＝１である場合は、（９）式により、次式が得られる。
【数１５】
2010227061.tif 000017
【００９０】
したがって、（１０）式は、次式と表すことができる。
【数１６】
2010227061.tif 000018
【００９１】
次に、特許文献２では、Ｎｎがポリメラーゼの機能不全に支配される場合の（１）式は次式で表わされるとしている。
【数１７】
2010227061.tif 000019
【００９２】
このように、特許文献２から導かれる（１２）式の第２項では、Ｎｎ−１が含まれておらず理解できない。また、初期のポリメラーゼの数Ｎｚ０および比活性Ａｚ０についての説明がなく実施できない。さらに、（８）式は、第２項のいずれか最小の値を採用するものであり、現実にどちらの式でもフィッティングできることになり、どちらを採用すべきかが分からず、フィッティングに利用できない。本来、フィッティングを行うにあたって、これらの２つの式は１つにまとめられるべきであり、１つにまとめられた場合に現実に近いシステム構造ができるものと考えられる。
【００９３】
この特許文献２に記載の式に比較して、本実施例１で用いられる理論式（５）は、ＰＣＲの熱サイクル全てにわたって統一した式で表現され、フィッティングに利用可能となるものである。
【００９４】
また、ＰＣＲの熱サイクルに従って変動するポリメラーゼの作用特性関数に替えて、一つの指数パラメータ（環境係数Ｋ）を導入することにより、様々なパラメータ（例えば、ポリメラーゼの数、ポリメラーゼの比活性、伸長時間、鋳型の塩基長、プライマーの塩基長等）を省略することができ、理論式のフィッティングを容易にすることができる。
【００９５】
なお、上記の説明においては、ポリメラーゼの作用特性関数に代替するものとして、指数パラメータ（環境係数Ｋ）を導入するよう説明を行ったが、この指数パラメータ（環境係数Ｋ）が代替するパラメータは、ポリメラーゼに関するパラメータのみに限られない。
【００９６】
すなわち、実際のＰＣＲによる核酸増幅反応とその測定において、測定される増幅量相当量に基づく実際の増幅効率は、ポリメラーゼの作用特性のみならず、様々な既知の因子や未知の因子からの影響を受ける。本実施例１において、理論式における増幅効率に、指数パラメータ（環境係数Ｋ）を導入することにより、それらの多様な因子によるパラメータを一つのパラメータで代替することができ、かつ、実際の増幅効率によく一致させることができることが分かった。
【００９７】
なお、一例として、環境係数Ｋに影響を与える既知の因子としては、以下のものがある。すなわち、測定装置関係の因子としては、サーマルサイクラーによる、設定温度との誤差や、昇温速度、降温速度等の他、測光部による、感度（ＣＣＤと光源）や画像濃度変換処理等の因子がある。また、アプリケーション関係の因子としては、酵素（ポリメラーゼ等）の耐熱性や、プライマー配列による増幅効率の違い、酵素（ポリメラーゼ等）の種類による増幅効率の違い等の因子がある。このように、理論式の増幅効率に導入される指数パラメータの環境係数Ｋは、これらの既知因子によるパラメータや、現在知られていない未知因子によるパラメータに代替することができるものである。
【００９８】
［フィッティング方法］
次に、本実施例１における、具体的なフィッティングの方法について図４〜図６を参照して説明する。
【００９９】
フィッティング時に考慮すべき点は、できるだけ多くの有効データを参照することである。ここで、図４は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ７９００（商品名）の測定装置により得られた測定データの一例を示す図である。図４において、実線は、測定データの実測値（増幅量相当量）による測定曲線を表し、破線は、フィッティングされた理論式の理論曲線を示している。また、横軸は、熱サイクル数ｎを表し、縦軸は、増幅量相当量Ｎを表している。
【０１００】
図４において、理論値は、上述した（５）式を用いて計算した。ただし、データが飽和点まで測定されているものとして、飽和量相当量Ｎｍａｘは、測定された増幅量相当量の最大値（ここでは、３．２７４４９９）とした。なお、簡易的に、増加率Δｎが負の値が出現するまでの測定データであれば、飽和点までのデータと認定した。ただし、厳密には、データは飽和点まで至っていないので、シミュレーションで得られる有限Ｎｍａｘと、生データ（測定データ）の有限Ｎｍａｘが等しくなるように、更にフィッティングの繰り返し計算を行うべきである。なお、ここでは、Ｋ＝１として（例えば、ポリメラーゼが完全に機能する場合を想定して）計算している。
【０１０１】
この測定データについて、上述した式（６）により増加率Δｎ特性を描くと、図５に示すように表現できる。図５は、横軸を熱サイクル数ｎとして、縦軸に増加率Δｎを示した図であり、実線は、測定データの実測値による増加率Δｎのグラフ線を表し、破線は、フィッティングされた理論式による増加率Δｎの理論曲線を示している。
【０１０２】
図５に示すように、理論値は、上述した（７）式の関係式（０≦Δｎ≦ρ≦１）を満たしているが、測定誤差（主にバックグラウンドノイズ）のために実測値は、この関係式を満たさない場合がある。そのため、好適には、関係式（０≦Δｎ≦ρ≦１）を満たさないデータ区間を外し、それ以外の増加率Δｎの単純減少区間をフィッティング領域とすることが望ましい。ここで、図６は、図５において、関係式（０≦Δｎ≦ρ≦１）を満たすフィッティング領域を切り出して実測値と理論値を比較した図である。
【０１０３】
図６に示すように、この測定データにおいて、フィッティング領域は、熱サイクル数ｎ＝２７〜３３における７点のデータであった。次に、この７点の測定データのうちの２点（ｎ＝２７およびｎ＝３３）の増幅量相当量Ｎを用いて、フィッティングを行い、反応促進係数ρおよび反応阻害係数μを求めた。
【０１０４】
上述した（６）式において、Ｋ＝１とすると次式が得られる。
【数１８】
2010227061.tif 000020
【０１０５】
そして、（１３）式および（１４）式から、次式のようにρおよびμが得られる。
【数１９】
2010227061.tif 000021
【０１０６】
そして、（１５）式および（１６）式に、実測データ（ｎ＝２７および３３の増幅量相当量）を代入することにより、ρ＝１．０６、μ＝３．５８が得られた。さらに、２点のΔ値に一致するように、初期鋳型量相当量Ｎ０を決定すると、Ｎ０＝５ｘ１０−９が得られた。以上、本実施例１では、理解の容易のため、２点フィッティング（連立方程式を解くことにより係数を求める方法）を行う例について説明したが、これに限られず、最小二乗法による多点フィッティング（より好適には、７点フィッティング）を行ってもよい。また、本実施例１においては、もともと反応系での理論式なので検出輝度が式中に登場しないが、この関係を正確に記述するために、輝度ベースの理論式を用いてもよい。
【実施例２】
【０１０７】
つづいて、本実施の形態にかかる実施例２について、以下に図７〜図１４を参照して説明する。
【０１０８】
ここで、まず、本実施例２の概要を以下に示す。本実施例２では、以下に示すように、初期鋳型量相当量の比を求め、初期鋳型量の算出を行った。ここで、図７は、本実施例２の標的核酸測定方法を示すフローチャートである。
【０１０９】
図７に示すように、まず、本実施例２では、同一の標的核酸を有する複数の被検試料に対し核酸増幅反応を行い、標的核酸を増幅させる（ステップＳＣ−１´）。ここで、本実施例２では、最終的に初期鋳型量相当量の比から初期鋳型量を算出するため、初期鋳型量が既知の標準試料についても、並行して核酸増幅反応を行い、標的核酸を増幅させる（ステップＳＣ−１）。
【０１１０】
そして、本実施例２では、核酸増幅反応における熱サイクルと対応付けて、被検試料および標準試料の増幅量相当量（この実施例２では、蛍光強度）を熱サイクル数ごとに測定する（ステップＳＣ−２，ＳＣ−２´）。
【０１１１】
そして、本実施例２では、標準試料についての測定データ（熱サイクルごとに測定した増幅量相当量）を理論式にあてはめて、データ解析（すなわち、理論式のフィッティング：ｆｉｔｔｉｎｇ）を行う（ステップＳＣ−３）。なお、本実施例２では、本願発明者により開発された以下の理論式を用いる。
【数２０】
2010227061.tif 000022
（ここで、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量、Ｎ０は、初期鋳型量相当量、ｊは、熱サイクル数、Ｎｊは、熱サイクル数ｊにおける増幅量相当量、Ｎｍａｘは、飽和量相当量、ρは、反応促進係数、μは、反応阻害係数、Ｋは、環境係数である。）
【０１１２】
そして、本実施例２では、標準試料の測定データについてのデータ解析結果（フィッティング結果）として、反応促進係数ρ、反応阻害係数μ、および、飽和量相当量Ｎｍａｘのパラメータを算出する（ステップＳＣ−４）。
【０１１３】
そして、本実施例２では、標準試料のデータ解析結果として算出されたパラメータを固定値として用いて、各被検試料の測定データを理論式にあてはめ、データ解析（フィッティング）を行う（ステップＳＣ−５）。このように、本実施例２では、初期鋳型量相当量の比較結果における誤差量を最小限に抑えるために、理論式のパラメータを、標準試料と被検試料間で共通の固定値とする。
【０１１４】
そして、本実施例２では、データ解析結果（フィッティング結果）に基づいて、標準試料および被検試料のそれぞれについて、初期鋳型量相当量を算出する（ステップＳＣ−６，ＳＣ−６´）。
【０１１５】
そして、本実施例２では、標準試料および被検試料間で、初期鋳型量相当量の比較を行って初期鋳型量の比を算出し、算出した初期鋳型量の比に標準試料の初期鋳型量を乗じて、各被検試料の初期鋳型量を算出する（ステップＳＣ−７）。以上が、本実施例２の概要である。
【０１１６】
ここで、本実施例２における測定条件を以下に示す。本実施例２において、以下に示すように、プライマー、鋳型ＤＮＡおよび試薬を用意し、核酸増幅であるＰＣＲを行う被検試料を調製した。
・プライマー：ヒトβ―グロビン（最終濃度０．３μＭ）
・試薬：２×ＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  （商品名）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、最終濃度１×）
・鋳型ＤＮＡ：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ，Ｍａｌｅ  （商品名）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｃａｔ＃Ｇ１４７１）
【０１１７】
そして、以下に示す条件にてＰＣＲを行い、サイクル数対蛍光強度の測定データを取得した。
・リアルタイムＰＣＲ装置：ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ  （商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・ＰＣＲサイクル条件：９５℃／１０分→（９５℃／３０秒→６０℃／１分）×４０サイクル
【０１１８】
ここで、本実施例２による算出結果と対比を行うため、従来法として、Ｃｔ値を用いて、以下の検量線法および比較Ｃｔ法により、濃度の異なる被検試料の初期鋳型量の比を算出した。
【０１１９】
（検量線法）
上記実施例２の被検試料と同じ試薬を用いて、初期鋳型量の最終濃度が２０００ｐｇ／μｌ、５００ｐｇ／μｌ、１２５ｐｇ／μｌ、３１．２５ｐｇ／μｌとなるように標準試料を調製し、ＰＣＲを行い、リアルタイムＰＣＲ装置に搭載されているソフトウエアからＣｔ値を求め、Ｃｔ値対初期鋳型量を示す検量線を作成した。ここで、図８は、Ｃｔ値対初期鋳型量を示す検量線を表した図である。
【０１２０】
そして、初期鋳型量を８００ｐｇ／μｌ、２５０ｐｇ／μｌに調製した被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２のＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求めた。求めたＣｔ値から図８に示す検量線を用いてそれぞれの初期鋳型量を算出した。
【０１２１】
（比較Ｃｔ法）
初期鋳型量２０００ｐｇ／μｌのＣｔ値２４．６を基準として、以下の式を用いて被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２の初期鋳型量を算出した。
Ｎｓ＝２０００×２（２４．６−Ｃｔｓ）
（ここで、Ｎｓは、被検試料の初期鋳型量（ｐｇ／μｌ）であり、Ｃｔｓは、被検試料のＣｔ値である。）
【０１２２】
以上のように、従来法であるＣｔ値を用いて、検量線法および比較Ｃｔ法による被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２の初期鋳型量を算出した。ここで、図９は、検量線法と比較Ｃｔ法により算出した従来例の算出結果を示す図である。
【０１２３】
（実施例２−１）
つづいて、実施例２−１として、従来例で用いた測定データと同じ被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２の増幅曲線を、以下の式にあてはめ各パラメータの値を算出した。
【数２１】
2010227061.tif 000023
（ここで、Ｎｏは、初期鋳型量相当量であり、Ｎｎは、サイクル数ｎにおける増幅量相当量である蛍光強度であり、Ｎｍａｘは、飽和量相当量であり、ρは、反応促進係数であり、μは、反応阻害係数であり、Ｋは、環境係数である。）
【０１２４】
本実施例２−１では、条件１として、全てのパラメータを固定しない場合と、条件２として、環境係数Ｋを固定した場合の２通りでフィッティングを行った。ここで、図１０は、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２のそれぞれについて、条件１と条件２の２通りでフィッティングを行い、各パラメータを算出した結果を示す図である。この図１０に示すフィッティング結果から、被検試料（Ｎｏ．１、Ｎｏ．２）間で初期鋳型量相当量Ｎ０の比を（初期鋳型量比）を算出した。
【０１２５】
以上のように、実施例２−１および従来例において、初期鋳型量（相当量）および初期鋳型量比を算出した。ここで、図１１は、従来例と本実施例２−１において算出した初期鋳型量（相当量）および初期鋳型量比を示す図である。
【０１２６】
図１１に示すように、実施例２−１では、検量線法のように多量の標準試料によるＰＣＲを必要とすることなく、かつ、検量線を用いずに、初期鋳型量の比を算出することができることが分かった。また、増幅率を２の固定値とする比較Ｃｔ法よりも実際の増幅率を正確に反映させることができるので、調製時の初期鋳型量の比（＝３．２）に極めて近い値を算出することができ、従来法と同等かそれ以上の精度で、初期鋳型量の比を算出できることが確認された。また、測定結果（測定データ）を、検量線により初期鋳型量に変換することなく、そのまま理論式にあてはめられることも確認された。
【０１２７】
（実施例２−２）
つづいて、実施例２−２として、実施例２−１で測定した初期鋳型量２０００ｐｇ／μｌの標準試料を、以下の理論式にあてはめ、各パラメータの値を算出した。ここで、図１２は、算出した各パラメータの値を示す図である。
【数２２】
2010227061.tif 000024
（ここで、Ｎｏは、初期鋳型量相当量であり、Ｎｎは、サイクル数ｎにおける増幅量相当量である蛍光強度であり、Ｎｍａｘは、飽和量相当量であり、ρは、反応促進係数であり、μは、反応阻害係数であり、Ｋは、環境係数である。）
【０１２８】
そして、図１２に示す算出結果から、ρ、μ、Ｋの値をそれぞれ０．９、０．８、１．５に固定し、上記理論式を用いて、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２の各値を算出した。そして、算出した初期鋳型量相当量Ｎ０における標準試料に対する比率（相対比）を求め、それぞれ標準試料の初期鋳型量である２０００ｐｇ／μｌを乗じて、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２のそれぞれの初期鋳型量を算出した。ここで、図１３は、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２について算出した初期鋳型量を示す図である。
【０１２９】
また、実施例２−１で示した従来法との対比を行った。ここで、図１４は、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２について、本実施例２−２と従来法（検量線法）により算出された初期鋳型量の比較結果を示す図である。
【０１３０】
図１４に示すように、本実施例２−２により算出された初期鋳型量は、従来法と同等以上の精度で、調製時の値をほぼ正確に示していることが確認された。これにより、実施例２によれば、従来法のような多量の標準試料によるＰＣＲを必要とせず、かつ、検量線を用いずに、一つの標準試料のみをＰＣＲに用いるだけで、被検試料の初期鋳型量を精度良く算出できることが確認された。また、検量線により初期鋳型量に変換することなく、測定結果（測定データ）を、そのまま理論式にあてはめられることも確認された。
【０１３１】
このように、本実施例２によれば、鋳型の増幅量に相当する蛍光強度をｄｓＤＮＡのモル濃度に変換することなく、かつ、複数の濃度既知の標準サンプルを用いた検量線を用いずに、多量の未知濃度の被検試料における初期鋳型量の関係を精度良く算出することが可能となった。また、少なくとも１つの初期鋳型濃度既知の標準試料を用いることで、多量の未知濃度の被検試料における初期鋳型量を正確に算出することが可能となった。
【実施例３】
【０１３２】
つづいて、本実施の形態にかかる実施例３について、以下に図１５〜図２１を参照して説明する。本実施例３では、以下の理論式のパラメータの値の取りうる範囲について検討を行った。
【数２３】
2010227061.tif 000025
（ここで、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量、Ｎ０は、初期鋳型量相当量、ｊは、熱サイクル数、Ｎｊは、熱サイクル数ｊにおける増幅量相当量、Ｎｍａｘは、飽和量相当量、ρは、反応促進係数、μは、反応阻害係数、Ｋは、環境係数である。）
【０１３３】
ここで、図１５〜図１８は、各測定データ（異なる日に実施された独立した実験の測定データ“０７１０１０”、“０７１１０８”、“０８０１１６”、“０８０８２８”）において、環境係数Ｋの値をＫ＝１．０〜１．７の範囲で決定し、既知鋳型量の標準サンプルをフィッティングさせ、得られたρおよびμの値を用いて他の測定データをフィッティングさせた結果を示す図である。すなわち、一つを基準サンプルとしてＫ固定で理論式にフィッティングし、算出されたρ、μを用いて２つのサンプル間の初期鋳型量相当量Ｎ０値の比を取った。各図において、Ｎ０は、２つのサンプル間の初期鋳型量相当量Ｎ０値の比に基づいて算出された初期鋳型量の値であり、Ｎｍａｘは、計算で算出されたＮｍａｘの値であり、Ｒは、式の相関係数を示している。
【０１３４】
その結果、図１５〜図１８の各測定データにおいて、調製した既知量の初期鋳型量と、算出した初期鋳型量とを比較すると、図１５の測定データでは、Ｋ＝１．５の場合で両者の一致度が最も高く最適であり、そのほか、図１６の測定データではＫ＝１．２、図１７の測定データではＫ＝１．２、図１８の測定データではＫ＝１．４の場合が、最も正確に初期鋳型量を算出することができ最適であった。
【０１３５】
この結果から、理論式の増幅効率に指数パラメータである環境係数Ｋを導入しない従来例（すなわち、Ｋ＝１．０）と比較して、本実施例３によれば、より正確に初期鋳型量を算出できることが分かった。また、図１８の最右欄に示すように、Ｃｔ値を用いる従来例との比較のために、検量線より増幅効率を加味して、Ｃｔ値より初期鋳型量を算出した。このように、本実施例２では、検量線を作成する必要がないため被検試料の処理数を多くすることができ、Ｃｔ値を用いる従来の手法と比較して同等かそれ以上の精度で初期鋳型量を正確に算出できることが分かった。
【０１３６】
理論式のパラメータの値の取りうる範囲について考察すると、反応促進係数ρは、理想的には、０＜ρ＜１であるが（実施例１の（７）式参照）、アプリケーションや装置によってはこの限りではない。また、反応阻害係数μは、理論的には０〜∞であり（実施例１参照）、環境係数Ｋは、実質的には、１〜２付近となることが分かった（ここで、上記に加え、さらにＫ値の検討を行った結果を以下に示す）。
【０１３７】
環境係数Ｋのパラメータの値の取りうる範囲について更に詳細に検討するために、以下の実験１〜３を行った。本方法では、鋳型量が既知のサンプル２つ（量比１：４）を用意し、そのうちの一つを基準サンプルとしてＫ固定で理論式にフィッティングし、算出されたρ、μを用いて２つのサンプルの初期鋳型量相当量Ｎ０値の比を取った。なお、Ｋは、０〜２．０までの範囲で固定値の値を０．１刻みで振っている。なお、以下の実験１〜３は、独立した実験結果である。
【０１３８】
ここで、実験１および２の実験条件を示す（なお、実施例１，２において、実験条件は同じであるが実験日が異なっている）。ＰＣＲ反応液組成（ｆ．ｃ．）は、以下のように調製した。
・２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（商品名）：１×（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・ｐｒｉｍｅｒ  （ヒトβ−ｇｌｏｂｉｎ）：０．３ｕＭ  ｅａｃｈ
・ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ（商品名）：０．２ｕＭ
・Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ：２０００ｐｇ，  ５００ｐｇ／μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  Ｃａｔ＃  Ｇ１４７１）
・Ｔｏｔａｌ：２０μｌ
【０１３９】
また、実験１および２のＰＣＲ条件は、リアルタイムＰＣＲ装置として、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９５℃／１０分→（９５℃／１５秒→６０℃／１分）×４０サイクルのＰＣＲサイクル条件で行った。
【０１４０】
また、実験３の実験条件を示す。ＰＣＲ反応液組成（ｆ．ｃ．）は、以下のように調製した。
・２×ＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（商品名）：１×（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）
・ｐｒｉｍｅｒ  （ヒトβ−ｇｌｏｂｉｎ）：０．３ｕＭ  ｅａｃｈ
・Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（商品名）：２０００ｐｇ，  ５００ｐｇ／μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  Ｃａｔ＃  Ｇ１４７１）
・Ｔｏｔａｌ：２０μｌ
【０１４１】
また、実験３のＰＣＲ条件は、リアルタイムＰＣＲ装置として、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９５℃／１０分→（９５℃／３０秒→６０℃／１分）×４０サイクルのＰＣＲサイクル条件で実験を行った。
【０１４２】
ここで、図１９〜図２１は、それぞれ、初期ＤＮＡ鋳型量を２０００ｐｇ／μｌと５００ｐｇ／μｌで調製した実験１〜３の測定データを用いて算出した初期鋳型量相当量Ｎ０の比を表す図である。各図の両サイドを破線で囲んだ領域は、調製した初期量の比（１：４）に対して、算出した比が４付近となり、好ましい結果が得られたＫ値の範囲を示している。このように、実験１では、Ｋ＝１．４〜１．６の場合が好適であり、実験２では、Ｋ＝１．１〜１．３の場合が好適であり、実験３では、Ｋ＝１．４〜１．６の場合が好適であった。以上で、本実施例３の説明を終える。
【０１４３】
［他の実施の形態］
さて、これまで本発明の実施の形態について説明したが、本発明は、上述した実施の形態以外にも、特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてよいものである。
【０１４４】
例えば、標的核酸測定装置１００がスタンドアローンの形態で処理を行う場合を一例に説明したが、標的核酸測定装置１００とは別筐体で構成されるクライアント端末からの要求に応じて処理を行い、その処理結果を当該クライアント端末に返却するように構成してもよい。
【０１４５】
また、実施の形態において説明した各処理のうち、自動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を手動的に行うこともでき、あるいは、手動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を公知の方法で自動的に行うこともできる。
【０１４６】
このほか、上記文献中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各処理の登録データや検索条件等のパラメータを含む情報、画面例、データベース構成については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
【０１４７】
また、標的核酸測定装置１００に関して、図示の各構成要素は機能概念的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。
【０１４８】
例えば、上述の実施形態においては、測定部１１６は、標的核酸測定装置１００が備える一手段として構成したが、本発明はこれに限られず、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、標的核酸の増幅量に相当する量を熱サイクル数ごとに測定する測定部を備えたリアルタイムＰＣＲ装置等の測定装置として構成してもよい。すなわち、上記測定部を備えた測定装置と、記憶部と制御部を少なくとも備えた情報処理装置と、を備えた標的核酸測定システムとして、本発明を構成してもよいものである。そして、本標的核酸測定システムにおいて、測定装置の測定部は、上記実施の形態における測定部１１６の機能を有し、情報処理装置の記憶部と制御部は、上記実施の形態における標的核酸測定装置１００の記憶部１０６と制御部１０２の機能を有し、同様の効果を奏するよう構成される。
【０１４９】
また、標的核酸測定装置１００の各装置が備える処理機能、特に制御部１０２にて行われる各処理機能については、その全部または任意の一部を、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）および当該ＣＰＵにて解釈実行されるプログラム（例えば、標的核酸測定プログラム）にて実現してもよく、また、ワイヤードロジックによるハードウェアとして実現してもよい。尚、プログラムは、後述する記録媒体に記録されており、必要に応じて標的核酸測定装置１００に機械的に読み取られる。すなわち、ＲＯＭまたはＨＤなどの記憶部１０６などは、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）として協働してＣＰＵに命令を与え、各種処理を行うためのコンピュータプログラムが記録されている。このコンピュータプログラムは、ＲＡＭにロードされることによって実行され、ＣＰＵと協働して制御部を構成する。
【０１５０】
また、このコンピュータプログラムは、標的核酸測定装置１００に対して任意のネットワーク３００を介して接続されたアプリケーションプログラムサーバに記憶されていてもよく、必要に応じてその全部または一部をダウンロードすることも可能である。
【０１５１】
また、本発明に係るプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納することもできる。ここで、この「記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ等の任意の「可搬用の物理媒体」、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。
【０１５２】
また、「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
【０１５３】
記憶部１０６に格納される各種のデータベース等（測定データファイル１０６ａ、理論式ファイル１０６ｂ）は、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスク等の固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等のストレージ手段であり、各種処理やウェブサイト提供に用いる各種のプログラムやテーブルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。
【０１５４】
また、標的核酸測定装置１００は、既知のパーソナルコンピュータ、ワークステーション等の情報処理装置を接続し、該情報処理装置に本発明の方法を実現させるソフトウェア（プログラム、データ等を含む）を実装することにより実現してもよい。
【０１５５】
更に、装置の分散・統合の具体的形態は図示するものに限られず、その全部または一部を、各種の付加等に応じて、または、機能負荷に応じて、任意の単位で機能的または物理的に分散・統合して構成することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１５６】
以上、詳細に説明したように、本発明にかかる標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラム並びに記録媒体によれば、測定された核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、複数の被検試料間の初期鋳型量の関係を正確に決定することができ、医療や製薬や創薬や生物学研究や臨床検査などの様々な分野において極めて有用である。
【符号の説明】
【０１５７】
１００  標的核酸測定装置
１０２  制御部
１０２ａ  理論式フィッティング部
１０２ｂ  初期鋳型量相当量算出部
１０２ｃ  初期鋳型量関係算出部
１０４  通信制御インターフェース部
１０６  記憶部
１０６ａ  測定データファイル
１０６ｂ  理論式ファイル
１０８  入出力制御インターフェース部
１１２  入力部
１１４  出力部
１１６  測定部
２００  外部システム
３００  ネットワーク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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