(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質のグリコシル化を制御するための新規な方法、およびそれによって産生させたタンパク質の提供。【解決手段】グリコシル化阻害剤の存在下で宿主細胞を培養することによって、グリコシル化部位を含むタンパク質を産生させるステップを含み、生成したタンパク質はグリコシル化部位において、より少ないグリカンまたはより少ない糖を含む、タンパク質の製造方法。タンパク質の生物学的特徴がグリコシル化レベルの減少によって変化し、例えばタンパク質とその標的リガンドとの結合が改変される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質のグリコシル化レベルを減少させるための方法であって、グリコシル化阻害量のグリコシル化阻害剤の存在下、培地中で増殖させる宿主細胞中で、少なくとも１つのグリコシル化部位を含むタンパク質を発現させるステップを含み、前記阻害剤が存在しない点以外は同一の条件下で増殖させた、それ以外は同一の宿主細胞中で産生させた、それ以外は同一のタンパク質と比較して、前記タンパク質は、より低いレベルのグリコシル化を含み、それによって、前記タンパク質のグリコシル化レベルを制御する方法。
【請求項２】
前記グリコシル化部位が、リガンド結合部位中または抗原結合部位中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グリコシル化レベルが、前記グリコシル化部位におけるグリカン部位の占有および前記グリコシル化部位におけるグリコシル化の程度からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記グリコシル化部位が、Ｏ−連結性グリコシル化部位およびＮ−連結性グリコシル化部位からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記グリコシル化部位が、Ｎ−連結性グリコシル化部位であり、さらに、前記グリコシル化部位は、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシル化阻害剤は、ツニカマイシン、ツニカマイシン相同体、ストレプトビルジン、マイコスポシジン、アンフォマイシン、ツシマイシン、抗生物質２４０１０、抗生物質ＭＭ１９２９０、バシトラシン、コリネトキシン、ショードマイシン、ジュイマイシン、１−デオキシマンノノジリマイシン、デオキシノジリマイシン、Ｎ−メチル−１−デオキシマンノノジリマイシン、ブレフェルジンＡ、グルコース類似体、マンノース類似体、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシグルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（＋）ガラクトース、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース、１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−マンニトール（ＤＩＭ）、フルオログルコース、フルオロマンノース、ＵＤＰ−２−デオキシグルコース、ＧＤＰ−２−デオキシグルコース、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、２５−ヒドロキシコレステロール、ヒドロキシコレステロール、スウェインソニン、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、アクチノマイシンＤ、モネンシン、ｍ−クロロカルボニル−シアニドフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、コンパクチン、ドリチル−ホスホリル−２−デオキシグルコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ヒポキサンチン、チミジン、コレステロール、グルコサミン、マンノサミン、カスタノスペルミン、グルタミン、ブロモコンズリトール、コンズリトールエポキシド、コンズリトール誘導体、グリコシルメチル−ｐ−ニトロフェニルトリアゼン、β−ヒドロキシノルバリン、スレオ−β−フルオロアスパラギン、Ｄ−（＋）−グルコン酸δ−ラクトン、リン酸ジ（２−エチルヘキシル）、リン酸トリブチル、リン酸ドデシル、（ジフェニルメチル）−リン酸の２−ジメチルアミノエチルエステル、ヨウ化［２−（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ヨード酢酸、およびフルオロアセテートからなる群から選択される少なくとも１つの阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記グリコシル化阻害剤が、２−デオキシ−Ｄ−グルコースである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グリコシル化阻害量が、約０．５ｇ／Ｌ〜３ｇ／Ｌの範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培地中のグルコース濃度を約０．０５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの範囲の量に維持するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
宿主細胞が、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物の宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＮＳ０／１、Ｓｐ２／０、ヒト細胞、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＯＳ−７、ＴＭ４、ＣＶ１、ＶＥＲＯ−７６、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ  ３Ａ、Ｗ１３８、ＭＭＴ０６０５６２、ＴＲ１、ＭＲＣ５、およびＦＳ４からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グリコシル化部位が、アスパラギン−イソロイシン−スレオニン（ＮＩＴ）、アスパラギン−グリシン−セリン（ＮＧＳ）、アスパラギン−セリン−スレオニン（ＮＳＴ）、およびアスパラギン−スレオニン−セリン（ＮＴＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのグリコシル化部位である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法に従って産生させたタンパク質。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法に従って産生させたタンパク質。
【請求項１６】
抗体またはその抗原結合部分であり、さらに、前記抗体は抗ヒトＩｇＥ抗体である、請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒト抗体である、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記抗体が、占有されておらず、かつ／または前記グリコシル化阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一の前記抗体よりも少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む、少なくとも１つのＮ−連結性グリコシル化部位を含み、前記部位は、配列番号８のアミノ酸配列に関する重鎖のアスパラギン７３（Ｎ７３）におけるグリコシル化部位およびアスパラギン３０１（Ｎ３０１）におけるグリコシル化部位からなる群から選択される、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記抗体が、占有されていない、アスパラギン７３におけるＮ−連結性グリコシル化部位を含む、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記タンパク質が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）のリガンド結合部位（ＬＢＳ）を含む、請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項２１】
アミノ酸残基１からアミノ酸残基番号２３までを含むシグナル配列を有さない配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＡＧＥ融合タンパク質であり、前記融合タンパク質は、末端のリシン残基（Ｌｙｓ４３８）を欠く、請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記ＲＡＧＥ融合タンパク質が、占有されておらず、かつ／または前記グリコシル化阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一のＲＡＧＥ融合タンパク質よりも少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む、少なくとも１つのＮ−連結性グリコシル化部位を含み、前記部位は、いずれもシグナル配列（アミノ酸１から２３まで）を有しない配列番号１のアミノ酸配列に関する、アミノ酸残基番号２におけるアスパラギン（Ｎ２）、アミノ酸残基番号５８におけるアスパラギン（Ｎ５８）、およびアミノ酸残基番号２８８におけるアスパラギン（Ｎ２８８）からなる群から選択される少なくとも１つの部位である、請求項２１に記載のタンパク質。
【請求項２３】
占有されておらず、かつ／または少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む、少なくとも２つのＮ−連結性グリコシル化部位を含む、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
３つのＮ−連結性グリコシル化部位を含み、それらのうちの少なくとも１つが、占有されておらず、かつ／または少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２５】
前記阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一の前記タンパク質と比較して、抗原との結合の増加を示す、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一の前記タンパク質と比較して、ＲＡＧＥリガンドとの結合の増加を示す、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２７】
約３４℃〜３９℃の範囲の温度から、約２８℃〜３３℃の範囲の温度への温度シフトをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
約３４℃〜３７℃の範囲の温度から、約３０．５℃〜３１．５℃の範囲の温度への温度シフトを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１４に記載のタンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１５に記載のタンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
ある量の融合タンパク質を含む組成物であって、前記融合タンパク質は、免疫グロブリンポリペプチドに連結しているＲＡＧＥポリペプチドを含み、
ａ）前記ＲＡＧＥポリペプチドは、ヒトＲＡＧＥ（配列番号３）の断片を含み、ヒトＲＡＧＥの前記断片は、リガンド結合部位、およびグリコシル化され得る少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
ｂ）前記免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインまたはＣＨ２ドメインの一部、および免疫グロブリンのＣＨ３ドメインを含み、
ｃ）前記免疫グロブリンポリペプチドのＮ末端残基が、前記ＲＡＧＥポリペプチドのＣ末端残基に連結しており、
前記融合タンパク質の前記量の少なくとも０．５％がアグリコシル化されている組成物。
【請求項３２】
前記融合タンパク質の総量の少なくとも３０％がアグリコシル化されている、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
完全グリコシル化形態の前記融合タンパク質の量のパーセントが、非完全グリコシル化形態全ての前記融合タンパク質の量のパーセントよりも少ない、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記融合タンパク質が、グリコシル化され得る少なくとも３つのアミノ酸残基を含み、グリコシル化の第１の潜在的な部位が前記ＲＡＧＥのリガンド結合部位のアミノ酸残基であり、グリコシル化の第２の潜在的な部位が前記ＲＡＧＥポリペプチドのアミノ酸残基であり、グリコシル化の第３の潜在的な部位が前記免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸残基である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
少なくとも１つの潜在的なグリコシル化部位を含むタンパク質を含む組成物であって、完全グリコシル化タンパク質の量が、完全にはグリコシル化されていないタンパク質の量よりも少なく、薬学的に許容できる担体をさらに含む組成物。
【請求項３６】
前記タンパク質が、２つの潜在的なグリコシル化部位を含み、完全グリコシル化タンパク質の量が、グリコシル化されていない１つの部位および／またはより低いレベルのグリコシル化を含む１つの部位を含むタンパク質の量と、グリコシル化されていない２つの部位および／またはより低いレベルのグリコシル化を含む２つの部位を含むタンパク質の量とを組み合わせた量よりも少ない、請求項３５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年４月２０日出願の米国特許仮出願第６１／１７０，８９７号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、タンパク質のグリコシル化を制御するための方法、ならびにそれに関する組成物および方法に関する。さらに、本発明は、糖タンパク質のグリコシル化および／またはグリカン部位の占有を減少させ、それによって、それらの生物学的な特徴および／または機能に影響を及ぼす方法にも関する。また、本発明は、本発明の方法を使用して生成した、グリコシル化を制御するための組成物、およびそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質およびポリペプチドはますます重要な治療剤になっている。ほとんどの場合、これらのタンパク質およびポリペプチドは、細胞培養において、対象とする特定のタンパク質またはポリペプチドを著しく高いレベルで産生させるために操作および／または選択されている細胞から産生される。細胞培養条件の制御および最適化が、タンパク質およびポリペプチドの商業生産を成功させるためには決定的に重要である。
【０００４】
細胞培養において産生された、多くのタンパク質およびポリペプチドは、オリゴ糖鎖を含めた、共有結合によって連結している炭水化物構造を含有する糖タンパク質である。これらのオリゴ糖鎖は、小胞体およびゴルジ体において、Ｎ−連結またはＯ−連結のいずれかを介してタンパク質に連結される。オリゴ糖鎖は、糖タンパク質の質量の顕著な部分を構成する場合がある。オリゴ糖鎖は、糖タンパク質の正確な折り畳みの促進、タンパク質間の相互作用の媒介、安定性の付与、好都合な薬動力学的および／または薬物動態学的な特性の付与、タンパク質分解性消化の阻害、糖タンパク質の適切な分泌経路に対する標的化、ならびに糖タンパク質の特定の１つもしくは複数の器官に対する標的化を含めた、糖タンパク質の機能において重要な役割を果たすと考えられている。
【０００５】
一般に、Ｎ−連結性オリゴ糖鎖は、小胞体内腔において、新生のトランスロケーションするタンパク質に付加される（参照により本明細書に組み込まれているＡｌｂｅｒｔｓら、１９９４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌを参照されたい）。オリゴ糖は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸であってよい）の標的コンセンサス配列内部に含有されるアスパラギン残基の側鎖上のアミノ基に付加される。最初のオリゴ糖鎖は通常、小胞体において、特異的なグリコシダーゼ酵素によって切り取られ、その結果、２つのＮ−アセチルグルコサミン残基および３つのマンノース残基でできている、短い分枝したコアのオリゴ糖が生じる。
【０００６】
小胞体における最初のプロセシングの後、糖タンパク質は小型のベシクルを介してゴルジ体へ運ばれ、そこで、オリゴ糖鎖はさらなるプロセシングを受けてから、細胞表面に分泌される。切り取られたＮ−連結性オリゴ糖鎖は、いくつかのマンノース残基の付加によって改変され、その結果、高マンノースオリゴ糖が生じる場合がある。あるいは、Ｎ−アセチルグルコサミンの単糖単位の１つまたは複数がコアのマンノースサブユニットに付加して、複雑なオリゴ糖を形成する場合もある。ガラクトースがＮ−アセチルグルコサミンサブユニットに付加する場合もあり、シアル酸サブユニットがガラクトースサブユニットに付加する場合もあり、その結果、シアル酸、ガラクトースまたはＮ−アセチルグルコサミン残基のいずれかを有する末端をもつ鎖が生じる。さらに、フコース残基がコアのオリゴ糖のＮ−アセチルグルコサミン残基に付加する場合もある。これらの付加のそれぞれが、特異的なグリコシルトランスフェラーゼによる触媒作用を受ける。
【０００７】
Ｎ−連結性グリコシル化経路による改変に加え、また、糖タンパク質は、ゴルジ体においてプロセシングされる際に、Ｏ−連結性オリゴ糖鎖の、特異的なセリン残基またはスレオニン残基への付加によって改変される場合もある。Ｏ−連結性オリゴ糖の残基は１つずつ付加され、各残基の付加は特異的な酵素による触媒作用を受ける。Ｎ−連結性グリコシル化とは対照的に、Ｏ−連結性グリコシル化についてのコンセンサスアミノ酸配列は、それほど十分には定義されていない。
【０００８】
タンパク質、具体的には免疫グロブリンのグリコシル化が、それらの生物学的機能に対して顕著な作用をもたらすことが示されている。例えば、免疫グロブリンについては、グリコシル化が、エフェクター機能、構造的な安定性および抗体産生細胞からの分泌速度に影響を及ぼすことが実証されている（Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：４０７）。これらの特性に関与する炭水化物基は一般に、抗体の定常（Ｃ）領域につながっている。例えば、ＣＨ２ドメイン中のアスパラギン２９７におけるＩｇＧのグリコシル化が、補体依存性細胞溶解の古典経路を活性化するＩｇＧの完全な能力には必要である（ＴａｏおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２５９５）。ＣＨ３ドメイン中のアスパラギン４０２におけるＩｇＭのグリコシル化が、抗体の適切な集合および細胞溶解活性のためには必要である（ＭｕｒａｏｋａおよびＳｈｕｌｍａｎ、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：６９５）。ＩｇＡ抗体のＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン中の１６２位および４１９位のようなグリコシル化部位の除去によって、細胞内分解および少なくとも９０％の分泌阻害が生じた（ＴａｙｌｏｒおよびＷａｌｌ、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４１９７）。
【０００９】
また、抗原結合部位を含む可変（Ｖ）領域における免疫グロブリンのグリコシル化も観察されている。ＳｏｘおよびＨｏｏｄ（１９７０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６６：９７５）は、ヒト抗体の約２０％がＶ領域においてグリコシル化されていることを報告した。Ｖドメインのグリコシル化は、Ｖ領域配列中のＮ−連結性グリコシル化のシグナルＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの偶発的な発生から生じると考えられており、当技術分野では、免疫グロブリンの機能において重要な役割を果たすとの認識には至っていない。
【００１０】
ごく最近になって、アルファ−（１−６）デキストランに対して特異的なマウス抗体の重鎖ＣＤＲ２における、抗原結合部位中のグリコシル化によって、デキストランに対する抗体の親和性が増加することが実証されている（Ｗａｌｌｉｃｋら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１０９９；およびＷｒｉｇｈｔら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２７１７）。また、抗ＣＤ３３抗体の抗原結合部位内部のグリコシル化部位を除去する突然変異、より具体的には、抗体Ｍ１９５のＶドメインのフレームワーク領域内部のＮ−連結性グリコシル化部位の除去によって、抗原との抗体の結合が増強されることも実証されている（Ｃｏらに対する米国特許第６，３５０，８６１号）。しかし、抗体のＦｃ部分中に存在するＮ−連結性グリコシル化部位は除去されず、好ましくは、グリコシル化されて分子のエフェクター機能を維持した。
【００１１】
さらに、解糖阻害性物質を細胞培養の培地に添加して、代謝老廃物である乳酸の蓄積を低下させ、それによって、細胞生存率および抗体タンパク質産生を増加させている。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８３４７３号、現在では、２００８年５月８日に公開のＷＯ２００８／０５５２６０を参照されたい（解糖阻害性化合物の細胞培養物への添加によって、乳酸濃度が低下し、増殖分化因子８（ＧＤＦ−８）に対して特異的な抗体の産生が増加した）。また、解糖阻害はタンパク質のグリコシル化レベルにも影響を及ぼしている可能性もあるが、阻害剤の、タンパク質のグリコシル化に対する作用は判定されておらず、論じられることさえなかった。さらに、細胞培養において産生された抗ＧＤＦ−８抗体は、抗原結合部位中に、潜在的なグリコシル化部位を何ら含まなかった（抗ＧＤＦ−８抗体であるＭｙｏ２２、Ｍｙｏ２８およびＭｙｏ２９を記載している、Ｖｅｌｄｍａｎら、米国特許公開第２００４／０１４２３８２号を引用しているＷＯ２００８／０５５２６０、４９頁、１７０段を参照されたい）。したがって、抗ＧＤＦ−８抗体の重鎖定常ドメインにおけるグリコシル化が、開示されている培養条件下で影響を受けることを想定したとしても、抗原結合部位のグリコシル化の変化の効果は判定し得なかったであろう。これは、産生された抗体が、抗原結合領域（例えば、Ｖドメイン）中の潜在的なグリコシル化部位を欠いたと思われるからである。
【００１２】
タンパク質治療剤に関しては、リガンドまたは抗原に対する低下したまたは低い親和性が主要な問題であった。親和性の喪失または減少は、非常に望ましくなく、より多くの治療用タンパク質を患者に注入しなければならず、これには、コストの上昇、および有害作用のより大きなリスクが伴う。さらにより決定的には、親和性が低下したタンパク質は、補体溶解、抗体依存性の細胞傷害性、およびウイルスの中和等の生物学的機能の減少を示している恐れがある。さらに、その相互作用の阻害が探求されている内因性のリガンドまたは結合パートナーと比較して、抗原または結合パートナーと、治療用タンパク質との間の競合が減少することによって、タンパク質がアンタゴニスト機能の減少を示している恐れもある。例えば、部分ヒト化抗体であるＨＵＶＨＣＡＭＰにおける親和性の喪失の結果、この抗体の補体溶解を媒介する全ての能力の喪失が生じている恐れがある（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２７、表１を参照されたい）。
【００１３】
さらに、タンパク質の立体構造の予測が不可能であることを考えると、わずか単一のアミノ酸の、特にタンパク質の抗原結合部位またはリガンド結合部位における突然変異が、潜在的な治療用タンパク質の生物学的活性に対して強烈な作用を示す場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許仮出願第６１／１７０，８９７号
【特許文献２】米国特許第６，３５０，８６１号
【特許文献３】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８３４７３号
【特許文献４】ＷＯ２００８／０５５２６０
【特許文献５】米国特許公開第２００４／０１４２３８２号
【特許文献６】米国特許第５，５００，３６２号
【特許文献７】米国特許第５，８２１，３３７号
【特許文献８】米国特許第６，１６５，４７６号
【特許文献９】米国特許公開第２００７／００９２５２１号
【特許文献１０】国際特許出願公開第ＷＯ９９／２２７６４号
【特許文献１１】国際特許公開第ＷＯ９８／５８９６４号
【特許文献１２】米国特許出願公開第ＵＳ２００９／００４２２５３号
【特許文献１３】ＷＯ２００４／０９９２３１
【特許文献１４】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１４９４号
【特許文献１５】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７６９４号
【特許文献１６】ＷＯ２００６／０１７６４３
【特許文献１７】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７７０５号
【特許文献１８】ＷＯ２００６／０１７６４７
【特許文献１９】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００１６８６号
【特許文献２０】ＷＯ２００７／０９４９２６
【特許文献２１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１０１２５号
【特許文献２２】ＷＯ２００７／１３０３０２
【特許文献２３】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１７８６号
【特許文献２４】ＷＯ２００８／１００６７０
【特許文献２５】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２５９９６号
【特許文献２６】ＷＯ２００４／０１６２２９
【特許文献２７】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６９５６号
【特許文献２８】ＷＯ２００８／１００４７０
【特許文献２９】ＥＰ４１７，５６３
【特許文献３０】ＥＰ４１７，０１４
【特許文献３１】米国特許第４，８１６，５６７号
【特許文献３２】米国特許第４，８１６，３９７号
【特許文献３３】欧州特許公開第ＥＰ１７１４９６号
【特許文献３４】欧州特許公開０１７３４９４号
【特許文献３５】英国特許第ＧＢ２１７７０９６Ｂ号
【特許文献３６】ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１９３号
【特許文献３７】ＥＰ０２３９４００
【特許文献３８】米国特許第５，５４５，８０６号
【特許文献３９】米国特許第５，５６９，８２５号
【特許文献４０】米国特許第５，６２５，１２６号
【特許文献４１】米国特許第５，６３３，４２５号
【特許文献４２】米国特許第５，７８９，６５０号
【特許文献４３】米国特許第５，８７７，３９７号
【特許文献４４】米国特許第５，６６１，０１６号
【特許文献４５】米国特許第５，８１４，３１８号
【特許文献４６】米国特許第５，８７４，２９９号
【特許文献４７】米国特許第５，７７０，４２９号
【特許文献４８】米国特許第５，５４５，８０７号
【特許文献４９】ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０３９１８号
【特許文献５０】ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１２２２７号
【特許文献５１】ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２５５８５号
【特許文献５２】ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／１３８５２号
【特許文献５３】ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／２４８８４号
【特許文献５４】ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／４５９６２号
【特許文献５５】ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号
【特許文献５６】ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／４３４７８号
【特許文献５７】米国特許第５，９３９，５９８号
【特許文献５８】米国特許第６，０７５，１８１号
【特許文献５９】米国特許第６，１１４，５９８号
【特許文献６０】米国特許第６，１５０，５８４号
【特許文献６１】米国特許第６，１６２，９６３号
【特許文献６２】米国特許第５，４７６，９９６号
【特許文献６３】米国特許第５，６９８，７６７号
【特許文献６４】米国特許第５，２２３，４０９号
【特許文献６５】米国特許第５，４０３，４８４号
【特許文献６６】米国特許第５，５７１，６９８号
【特許文献６７】米国特許第５，４２７，９０８号
【特許文献６８】米国特許第５，５８０，７１７号
【特許文献６９】米国特許第５，９６９，１０８号
【特許文献７０】米国特許第６，１７２，１９７号
【特許文献７１】米国特許第５，８８５，７９３号
【特許文献７２】米国特許第６，５２１，４０４号
【特許文献７３】米国特許第６，５４４，７３１号
【特許文献７４】米国特許第６，５５５，３１３号
【特許文献７５】米国特許第６，５８２，９１５号
【特許文献７６】米国特許第６，５９３，０８１号
【特許文献７７】国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４２８６号
【特許文献７８】ＷＯ２００８／１２３９９９
【特許文献７９】米国特許第５，７１４，３５０号
【特許文献８０】米国特許第５，６７７，４２５号
【特許文献８１】米国特許第６，１６５，７４５号
【特許文献８２】米国特許第６，２７７，３７５号
【特許文献８３】米国特許第５，８６９，０４６号
【特許文献８４】米国特許第６，１２１，０２２号
【特許文献８５】米国特許第５，６２４，８２１号
【特許文献８６】米国特許第５，６４８，２６０号
【特許文献８７】米国特許第６，１９４，５５１号
【特許文献８８】ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９３５１号
【特許文献８９】ＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号
【特許文献９０】米国特許第５，５４９，８９２号
【特許文献９１】ＥＰ１１７，０６０
【特許文献９２】ＥＰ１１７，０５８
【特許文献９３】米国特許第４，３９９，２１６号
【特許文献９４】米国特許第５，１６６，３２０号
【特許文献９５】ＷＯ１９９０／１３６４６
【特許文献９６】米国特許第４，２５６，１０８号
【特許文献９７】米国特許第４，１６０，４５２号
【特許文献９８】米国特許第４，２６５，８７４号
【特許文献９９】米国特許第４，７３７，４５６号
【特許文献１００】米国特許第４，３７６，１１０号
【特許文献１０１】ＷＯ９４／０４１８８
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ａｌｂｅｒｔｓら、１９９４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ
【非特許文献２】Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：４０７
【非特許文献３】ＴａｏおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２５９５
【非特許文献４】ＭｕｒａｏｋａおよびＳｈｕｌｍａｎ、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：６９５
【非特許文献５】ＴａｙｌｏｒおよびＷａｌｌ、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４１９７
【非特許文献６】ＳｏｘおよびＨｏｏｄ（１９７０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６６：９７５
【非特許文献７】Ｗａｌｌｉｃｋら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１０９９
【非特許文献８】Ｗｒｉｇｈｔら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２７１７
【非特許文献９】Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２７、表１
【非特許文献１０】ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ
【非特許文献１１】Ａｕｓｕｂｅｌら、２００２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ
【非特許文献１２】ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９９０、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ
【非特許文献１３】Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９１））
【非特許文献１４】Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７〜３１
【非特許文献１５】Ｇｏｎｎｅｔら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３〜１４４５
【非特許文献１６】Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））
【非特許文献１７】Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１））
【非特許文献１８】Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５）
【非特許文献１９】Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３〜９８
【非特許文献２０】Ｐｅａｒｓｏｎ、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５〜２１９
【非特許文献２１】Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０
【非特許文献２２】Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜４０２
【非特許文献２３】Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．、１９８９、編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．
【非特許文献２４】Ｋａｂａｔ、１９８７および１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）
【非特許文献２５】ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７
【非特許文献２６】Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８〜８８３
【非特許文献２７】Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６
【非特許文献２８】Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６
【非特許文献２９】Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３
【非特許文献３０】Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８
【非特許文献３１】Ｐｏｌｊａｋら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３
【非特許文献３２】Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９５、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３〜１０１
【非特許文献３３】Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７〜１０５８
【非特許文献３４】ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜９２（１９９１）
【非特許文献３５】Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２〜６５６（１９９８）
【非特許文献３６】Ｄａｅｒｏｎ、１９９７、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３〜２３４
【非特許文献３７】Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４
【非特許文献３８】ｄｅ  Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜３４１
【非特許文献３９】Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７
【非特許文献４０】Ｋｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９
【非特許文献４１】Ｗｉｎｅｓら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５３１３〜５３１８
【非特許文献４２】ＨｕｂｂａｒｄおよびＩｖａｔｔ（１９８１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：５５５〜５８３
【非特許文献４３】ＩＵＢ−ＩＵＰＡＣ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、１９８２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３３４７〜３３５１
【非特許文献４４】（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３３５２
【非特許文献４５】Ｗｏｒｍｌａｎｄら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１３７０〜１３８０
【非特許文献４６】ＢｅａｌｅおよびＦｅｉｎｓｔｅｉｎ、１９７６、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９：２５３〜２５９
【非特許文献４７】Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｓ．４４：１１１〜１１７
【非特許文献４８】ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９〜４１６
【非特許文献４９】Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖａｒｋｉら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９９９）
【非特許文献５０】Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ  ５３７：３０５３
【非特許文献５１】Ｃｒｕｚら、１９９９、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６６：１０４〜１１３
【非特許文献５２】Ｅｌｂｅｉｎ、１９８５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９８：１３５〜１５４
【非特許文献５３】Ｅｌｂｅｉｎ、１９８７、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：４９７〜５３４
【非特許文献５４】Ｇｒａｈａｍら、１９７７、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９
【非特許文献５５】Ｍａｔｈｅｒ、１９８０、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１
【非特許文献５６】Ｍａｔｈｅｒら、１９８２、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８
【非特許文献５７】Ｐｅｔｅｒ−Ｋａｔａｌｉｎｉｃ、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４０５：１３９〜１７１
【非特許文献５８】Ｍｅｄｚｉｈｒａｄｓｚｋｙ、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４０５：１１６〜１３８
【非特許文献５９】Ｎｅｅｐｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４９９８〜１５００４
【非特許文献６０】Ｐａｒｋら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：１０２５〜１０３１
【非特許文献６１】ＮａｉｓｍｉｔｈおよびＳｐｒａｎｇ、１９９５〜９６、Ｊ．Ｉｎｆｌａｍｍ．４７：１〜７
【非特許文献６２】ＹａｒｄｅｎおよびＵｌｌｒｉｃｈ、１９８８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：４３３〜４７８
【非特許文献６３】ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、１９９０、Ｃｅｌｌ  ６１：２４３〜２５４
【非特許文献６４】Ｓａｔｏら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：７０〜７４
【非特許文献６５】ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９５、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２９：８９５〜８９８
【非特許文献６６】Ｔｅｒｍａｎら、１９９１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１６７７〜８３
【非特許文献６７】ＤｅＶｒｉｅｓら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５；９８９〜９９１
【非特許文献６８】Ｓｈｉｂｕｙａら、１９９０、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：５１９〜５２４
【非特許文献６９】Ｄｒｅｗｓ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：１５１６
【非特許文献７０】Ｍｉｌｌｉｇａｎ，ＧおよびＲｅｅｓ，Ｓ．、ＴＩＰＳ、２０：１１８〜１２４、１９９９
【非特許文献７１】Ｗａｔｓｏｎ，ＳおよびＳ．Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ、Ｔｈｅ  Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．、１３０〜１３２頁、１９９４
【非特許文献７２】Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１
【非特許文献７３】Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２
【非特許文献７４】Ｔｅｎｇら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：７３０８〜７３１２
【非特許文献７５】Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２７９
【非特許文献７６】Ｏｌｓｓｏｎら、１９８２、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：３〜１６
【非特許文献７７】Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９
【非特許文献７８】Ｌｏｎｂｅｒｇ、１９９４、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９〜１０１
【非特許文献７９】ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３
【非特許文献８０】ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ、１９９５、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６〜５４６
【非特許文献８１】Ｔａｙｌｏｒら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７〜６２９５
【非特許文献８２】Ｃｈｅｎら、１９９３、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：６４７〜６５６
【非特許文献８３】Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０〜３７２４
【非特許文献８４】Ｃｈｏｉら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７〜１２３
【非特許文献８５】Ｃｈｅｎら、１９９３、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１〜８３０
【非特許文献８６】Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２〜２９２０
【非特許文献８７】Ｔａｙｌｏｒら、１９９４、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９〜５９１
【非特許文献８８】Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜８５１
【非特許文献８９】Ｔｏｍｉｚｕｋａら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２〜７２７
【非特許文献９０】Ｋｕｒｏｉｗａら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９〜８９４
【非特許文献９１】Ｃｈａｐｌｉｎら、１９９１、ＧＢＨ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  １５（Ｐｒｏｔｅｉｎ）：２７９〜２８２
【非特許文献９２】Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１〜６６０４
【非特許文献９３】Ａｎｇｏｖら（２００８、ＰｌｏＳ  ＯＮＥ  ３：ｅ２１８９［ｗｗｗ．ｐｌｏｓｏｎｅ．ｏｒｇ］）
【非特許文献９４】ＨａｔｆｉｅｌｄおよびＲｏｔｈ（２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．１３：２７〜４２）
【非特許文献９５】Ｇｅｔｈｉｎｇら、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：６２０〜６２５
【非特許文献９６】Ｍａｎｔｅｉら、１９７９、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０〜４６
【非特許文献９７】Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｒｂ、１９７８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６〜４５７
【非特許文献９８】Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ、１９９３、Ｆｏｃｕｓ  １５：７３
【非特許文献９９】Ｋｅｏｗｎら、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５２７〜５３７
【非特許文献１００】Ｍａｎｓｏｕｒら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８〜３５２
【非特許文献１０１】Ｏｋａｙａｍａら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１１３６〜１１４２
【非特許文献１０２】Ｔｈｏｍａｓら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３〜５１２
【非特許文献１０３】Ｓｅｅｄ、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０
【非特許文献１０４】Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７〜１９５
【非特許文献１０５】ＷｕおよびＷｕ、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１
【非特許文献１０６】Ｗｉｌｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７
【非特許文献１０７】Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１、１９９０
【非特許文献１０８】Ｂｅｒｋｎｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６、１９８８
【非特許文献１０９】Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４、１９９１
【非特許文献１１０】Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３〜１５５、１９９２
【非特許文献１１１】Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４８２〜６４８６、１９９２
【非特許文献１１２】ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８１２〜２８１６、１９９３
【非特許文献１１３】Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２５８１〜２５８４、１９９２
【非特許文献１１４】Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ５７：２６７、１９８６
【非特許文献１１５】Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９、１９９２
【非特許文献１１６】Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９〜３５６、１９９２
【非特許文献１１７】Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８、１９８９
【非特許文献１１８】ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３〜１９７３、１９８９
【非特許文献１１９】Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０、１９８５）
【非特許文献１２０】Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６〜６４７０、１９８４
【非特許文献１２１】Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１、１９８５
【非特許文献１２２】Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２〜３９、１９８８
【非特許文献１２３】Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１〜６１９、１９８４
【非特許文献１２４】Ｆｌｏｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１〜３７９０、１９９３
【非特許文献１２５】Ｃｓｏｎｋａら、２０００、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１３：３２０７〜３２１６
【非特許文献１２６】Ｈａｄｌａｃｚｋｙ、２００１、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：１２５〜１３２
【非特許文献１２７】Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍら、２００４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：２１
【非特許文献１２８】Ｐｅｒｅｚら、２００４、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ．Ｊｕｌｙ／Ａｕｇｕｓｔ  ２００４：６１〜６８
【非特許文献１２９】Ｓｔｅｗａｒｔら、２００２、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７１９〜７２３
【非特許文献１３０】Ｖａｎｄｅｒｂｙｌら、２００５、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３３：１４７０〜１４７６５
【非特許文献１３１】Ｍａｄｅｒ，ＳおよびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３〜５６０７、１９９３
【非特許文献１３２】Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９〜１０２４、１９９３
【非特許文献１３３】Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１０６０７〜１０６１３、１９９３
【非特許文献１３４】Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０１４９〜１０１５３、１９９２
【非特許文献１３５】Ｃａｒｔｅｒら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７
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【非特許文献１６７】Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４７：４〜１１
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【非特許文献１７０】Ｈｅｒｚら、１９９０、ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１７６９〜１７７６
【非特許文献１７１】Ｙｏｎｅｋｕｒａら、２００３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７０：１０９７〜１１０９
【非特許文献１７２】Ｈａｎａｆｏｒｄら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５００１９〜５００２４
【非特許文献１７３】Ｄａｔｔｉｌｏら（２００７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４６：６９５７〜６９７０）
【非特許文献１７４】Ｓｒｉｋｒｉｓｈｎａら（２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８０：９９８〜１００８）
【非特許文献１７５】Ｏｓａｗａら（２００７、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７０：１４６８〜１４７４）
【非特許文献１７６】Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐら（２００７、ＥＭＢＯ  Ｊ．２６：３８６８〜３８７８）
【非特許文献１７７】Ｄａｔｉｌｌｏら、２００７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４６：６９５７〜６９７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、当技術分野では、リガンドに対する、または抗体の場合には抗原に対する親和性が変化している治療用タンパク質、具体的には、抗原またはリガンドに対する親和性および／または特異性が増加しており、望ましくは免疫原性が低下している可能性があり、天然に存在する定常領域のグリコシル化によって付与されたエフェクター機能が改善されている治療用タンパク質が求められている。あるいは、抗原またはリガンドに対する結合の親和性および／または特異性が改善されているが、抗体の重鎖定常領域中に存在するグリコシル化部位のグリコシル化によって媒介されるエフェクター機能が低下しているまたは全くない治療用タンパク質、具体的には、抗体、または免疫グロブリンの定常領域もしくはその一部を含むＦｃ融合タンパク質も求められている。さらに、抗原またはリガンドの結合部位のアミノ酸配列中に何らかの突然変異を導入することを必要としない、治療用タンパク質の抗原またはリガンドの結合部位のグリコシル化の阻害または除去も求められている。したがって、当技術分野では、免疫グロブリンおよびその他の治療上重要なタンパク質の効能を向上させ、必要な用量を低下させるための方法、ならびにそのような方法によって得られた治療用タンパク質が求められており、本発明は、抗体の抗原結合部位中または治療用タンパク質のリガンド結合部位中に何らかの突然変異を導入することを必要とせずに、これらの必要性を満たす。
【００１７】
治療用糖タンパク質の重要性および細胞培養プロセスの進歩にもかかわらず、リガンド結合部位のグリコシル化を、タンパク質のそのような決定的に重大な部分中にアミノ酸突然変異を導入することを必要とせずに制御することができる条件下で、そのようなタンパク質を産生させるための新規なプロセスに対する必要性が満たされていない。本発明は、この必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、タンパク質のグリコシル化レベルを減少させるための方法を含む。この方法は、グリコシル化阻害量のグリコシル化阻害剤の存在下、培地中で増殖させる宿主細胞中で、少なくとも１つのグリコシル化部位を含むタンパク質を発現させるステップを含み、この阻害剤が存在しない点以外は同一の条件下で増殖させた、それ以外は同一の宿主細胞中で産生させた、それ以外は同一のタンパク質と比較して、当該タンパク質は、より低いレベルのグリコシル化を含み、それによって、タンパク質のグリコシル化レベルを制御する。
【００１９】
１つの態様では、グリコシル化部位は、リガンド結合部位中または抗原結合部位中にある。
【００２０】
別の態様では、グリコシル化レベルは、グリコシル化部位におけるグリカン部位の占有およびグリコシル化部位におけるグリコシル化の程度からなる群から選択される。
【００２１】
さらに別の態様では、グリコシル化部位は、Ｏ−連結性グリコシル化部位およびＮ−連結性グリコシル化部位からなる群から選択される。
【００２２】
さらなる態様では、グリコシル化部位は、Ｎ−連結性グリコシル化部位であり、さらに、グリコシル化部位は、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
別の態様では、グリコシル化阻害剤は、ツニカマイシン、ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｙｍｙｃｉｎ）相同体、ストレプトビルジン（ｓｔｒｅｐｔｏｖｉｒｕｄｉｎ）、マイコスポシジン（ｍｙｃｏｓｐｏｃｉｄｉｎ）、アンフォマイシン（ａｍｐｈｏｍｙｃｉｎ）、ツシマイシン（ｔｓｕｓｈｉｍｙｃｉｎ）、抗生物質２４０１０、抗生物質ＭＭ１９２９０、バシトラシン、コリネトキシン（ｃｏｒｙｎｅｔｏｘｉｎ）、ショードマイシン、ジュイマイシン（ｄｕｉｍｙｃｉｎ）、１−デオキシマンノノジリマイシン（１−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）、デオキシノジリマイシン（ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）、Ｎ−メチル−１−デオキシマンノノジリマイシン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｄｅｘｏｙｍａｎｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）、ブレフェルジンＡ、グルコース類似体、マンノース類似体、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシグルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（＋）ガラクトース、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース、１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−マンニトール（ＤＩＭ）、フルオログルコース、フルオロマンノース、ＵＤＰ−２−デオキシグルコース、ＧＤＰ−２−デオキシグルコース、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、２５−ヒドロキシコレステロール、ヒドロキシコレステロール、スウェインソニン、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、アクチノマイシンＤ、モネンシン、ｍ−クロロカルボニル−シアニドフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、コンパクチン、ドリチル−ホスホリル−２−デオキシグルコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ヒポキサンチン（ｈｙｇｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、チミジン、コレステロール、グルコサミン、マンノサミン、カスタノスペルミン、グルタミン、ブロモコンズリトール（ｂｒｏｍｏｃｏｎｄｕｒｉｔｏｌ）、コンズリトールエポキシド（ｃｏｎｄｕｒｉｔｏｌ  ｅｐｏｘｉｄｅ）、コンズリトール（ｃｏｎｄｕｒｉｔｏｌ）誘導体、アグリコシルメチル−ｐ−ニトロフェニルトリアゼン、β−ヒドロキシノルバリン、スレオ−β−フルオロアスパラギン、Ｄ−（＋）−グルコン酸δ−ラクトン、リン酸ジ（２−エチルヘキシル）、リン酸トリブチル、リン酸ドデシル、（ジフェニルメチル）−リン酸の２−ジメチルアミノエチルエステル、ヨウ化［２−（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ヨード酢酸、およびフルオロアセテートからなる群から選択される少なくとも１つの阻害剤である。
【００２４】
別の態様では、グリコシル化阻害剤は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースである。
【００２５】
さらに別の態様では、グリコシル化阻害量は、約０．５ｇ／Ｌ〜３ｇ／Ｌの範囲である。
【００２６】
さらなる態様では、この方法は、培地中のグルコース濃度を約０．０５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの範囲の量に維持するステップをさらに含む。
【００２７】
別の態様では、宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される。
【００２８】
さらに別の態様では、哺乳動物の宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＮＳ０／１、Ｓｐ２／０、ヒト細胞、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＯＳ−７、ＴＭ４、ＣＶ１、ＶＥＲＯ−７６、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ  ３Ａ、Ｗ１３８、ＭＭＴ０６０５６２、ＴＲ１、ＭＲＣ５、およびＦＳ４からなる群から選択される。
【００２９】
その上さらなる態様では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００３０】
別の態様では、グリコシル化部位は、アスパラギン−イソロイシン−スレオニン（ＮＩＴ）、アスパラギン−グリシン−セリン（ＮＧＳ）、アスパラギン−セリン−スレオニン（ＮＳＴ）、およびアスパラギン−スレオニン−セリン（ＮＴＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのグリコシル化部位である。
【００３１】
本発明は、タンパク質のグリコシル化レベルを減少させるための方法に従って産生させたタンパク質を包含し、この方法は、グリコシル化阻害量のグリコシル化阻害剤の存在下、培地中で増殖させる宿主細胞中で、少なくとも１つのグリコシル化部位を含むタンパク質を発現させるステップを含み、この阻害剤が存在しない点以外は同一の条件下で増殖させた、それ以外は同一の宿主細胞中で産生させた、それ以外は同一のタンパク質と比較して、当該タンパク質は、より低いレベルのグリコシル化を含み、それによって、タンパク質のグリコシル化レベルを制御し、グリコシル化部位は、リガンド結合部位または抗原結合部位であり、グリコシル化レベルは、グリコシル化部位におけるグリカンの占有およびグリコシル化部位におけるグリコシル化の程度からなる群から選択され、グリコシル化部位は、Ｏ−連結性グリコシル化部位およびＮ−連結性グリコシル化部位からなる群から選択され、グリコシル化部位は、アスパラギン−イソロイシン−スレオニン（ＮＩＴ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのグリコシル化部位であり、グリコシル化阻害剤は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースであり、グリコシル化阻害量は、約０．５ｇ／Ｌ〜３ｇ／Ｌの範囲であり、この方法は、培地中のグルコース濃度を、約０．０５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの範囲の量に維持するステップを含み、宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される。
【００３２】
１つの態様では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞であり、アスパラギン−グリシン−セリン（ＮＧＳ）、アスパラギン−セリン−スレオニン（ＮＳＴ）、およびアスパラギン−スレオニン−セリン（ＮＴＳ）である。
【００３３】
別の態様では、このタンパク質は抗体またはその抗原結合部分であり、さらに、抗体は抗ヒトＩｇＥ抗体である。
【００３４】
別の態様では、抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒト抗体である。
【００３５】
さらに別の態様では、抗体は、占有されておらず、かつ／またはグリコシル化阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一の抗体よりも少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む、少なくとも１つのＮ−連結性グリコシル化部位を含み、当該部位は、配列番号８のアミノ酸配列に関する重鎖のアスパラギン７３（Ｎ７３）におけるグリコシル化部位およびアスパラギン３０１（Ｎ３０１）におけるグリコシル化部位からなる群から選択される。
【００３６】
さらなる態様では、抗体は、占有されていない、アスパラギン７３におけるＮ−連結性グリコシル化部位を含む。
【００３７】
別の態様では、タンパク質は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）のリガンド結合部位（ＬＢＳ）を含む。
【００３８】
さらに別の態様では、タンパク質は、アミノ酸残基１からアミノ酸残基番号２３までを含むシグナル配列を有さない配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＡＧＥ融合タンパク質であり、前記融合タンパク質は、末端のリシン残基（Ｌｙｓ４３８）を欠く。
【００３９】
さらなる態様では、ＲＡＧＥ融合タンパク質は、占有されておらず、かつ／またはグリコシル化阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一のＲＡＧＥ融合タンパク質よりも少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む、少なくとも１つのＮ−連結性グリコシル化部位を含み、当該部位は、いずれもシグナル配列（アミノ酸１から２３まで）を有しない配列番号１のアミノ酸配列に関する、アミノ酸残基番号２におけるアスパラギン（Ｎ２）、アミノ酸残基番号５８におけるアスパラギン（Ｎ５８）、およびアミノ酸残基番号２８８におけるアスパラギン（Ｎ２８８）からなる群から選択される少なくとも１つの部位である。
【００４０】
１つの態様では、タンパク質は、占有されておらず、かつ／または少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む、少なくとも２つのＮ−連結性グリコシル化部位を含む。
【００４１】
別の態様では、タンパク質は、３つのＮ−連結性グリコシル化部位を含み、それらのうちの少なくとも１つは、占有されておらず、かつ／または少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む。
【００４２】
さらに別の態様では、タンパク質は、阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一のタンパク質と比較して、抗原との結合の増加を示す。
【００４３】
さらなる態様では、タンパク質は、阻害剤の非存在下で産生させた点以外は同一のタンパク質と比較して、ＲＡＧＥリガンドとの結合の増加を示す。
【００４４】
１つの態様では、方法は、約３４℃〜３９℃の範囲の温度から、約２８℃〜３３℃の範囲の温度への温度シフトをさらに含む。
【００４５】
さらに別の態様では、方法は、約３４℃〜３７℃の範囲の温度から、約３０．５℃〜３１．５℃の範囲の温度への温度シフトを含む。
【００４６】
本発明は、タンパク質のグリコシル化レベルを減少させるための方法に従って産生させたタンパク質を含む医薬組成物を包含し、この方法は、グリコシル化阻害量のグリコシル化阻害剤の存在下、培地中で増殖させる宿主細胞中で、少なくとも１つのグリコシル化部位を含むタンパク質を発現させるステップを含み、この阻害剤が存在しない点以外は同一の条件下で増殖させた、それ以外は同一の宿主細胞中で産生させた、それ以外は同一のタンパク質と比較して、当該タンパク質は、より低いレベルのグリコシル化を含み、それによって、タンパク質のグリコシル化レベルを制御し、グリコシル化部位は、リガンド結合部位または抗原結合部位であり、グリコシル化レベルは、グリコシル化部位におけるグリカン部位の占有およびグリコシル化部位におけるグリコシル化の程度からなる群から選択され、グリコシル化部位は、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）のアミノ酸配列を含むＮ−連結性グリコシル化部位であり、グリコシル化阻害剤は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースであり、グリコシル化阻害量は、約０．５ｇ／Ｌ〜３ｇ／Ｌの範囲であり、この方法は、培地中のグルコース濃度を、約０．０５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの範囲の量に維持するステップをさらに含み、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００４７】
別の態様では、グリコシル化部位は、アスパラギン−イソロイシン−スレオニン（ＮＩＴ）、アスパラギン−グリシン−セリン（ＮＧＳ）、アスパラギン−セリン−スレオニン（ＮＳＴ）、およびアスパラギン−スレオニン−セリン（ＮＴＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのグリコシル化部位である。
【００４８】
本発明は、ある量の融合タンパク質を含む組成物を包含し、当該融合タンパク質は、免疫グロブリンポリペプチドに連結しているＲＡＧＥポリペプチドを含み、当該ＲＡＧＥポリペプチドは、ヒトＲＡＧＥ（配列番号３）の断片を含み、ヒトＲＡＧＥの当該断片は、リガンド結合部位、およびグリコシル化され得る少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、当該免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインまたはＣＨ２ドメインの一部、および免疫グロブリンのＣＨ３ドメインを含み、当該免疫グロブリンポリペプチドのＮ末端残基が、当該ＲＡＧＥポリペプチドのＣ末端残基に連結しており、当該融合タンパク質の当該量の少なくとも０．５％がアグリコシル化されている。
【００４９】
１つの態様では、融合タンパク質の総量の少なくとも３０％がアグリコシル化されている。
【００５０】
別の態様では、完全グリコシル化形態の融合タンパク質の量のパーセントが、非完全グリコシル化形態全ての融合タンパク質の量のパーセントよりも少ない。
【００５１】
さらに別の態様では、融合タンパク質は、グリコシル化され得る少なくとも３つのアミノ酸残基を含み、グリコシル化の第１の潜在的な部位がＲＡＧＥのリガンド結合部位のアミノ酸残基であり、グリコシル化の第２の潜在的な部位がＲＡＧＥポリペプチドのアミノ酸残基であり、グリコシル化の第３の潜在的な部位が免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸残基である。
【００５２】
本発明は、少なくとも１つの潜在的なグリコシル化部位を含むタンパク質を含み、薬学的に許容できる担体をさらに含む組成物を包含し、完全グリコシル化タンパク質の量が、完全にはグリコシル化されていないタンパク質の量よりも少ない。
【００５３】
１つの態様では、タンパク質は、２つの潜在的なグリコシル化部位を含み、完全グリコシル化タンパク質の量が、グリコシル化されていない１つの部位および／またはより低いレベルのグリコシル化を含む１つの部位を含むタンパク質の量と、グリコシル化されていない２つの部位および／またはより低いレベルのグリコシル化を含む２つの部位を含むタンパク質の量とを組み合わせた量よりも少ない。
【００５４】
種々の培養条件、糖タンパク質を利用し、異なるグリコシル化阻害剤が関与する実施形態等、本発明の代替の実施形態を以下に記載する。
【００５５】
上記の概要、および下記の発明の詳細な説明は、添付の図面と共に読むとより理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、図面において現在好ましい（１つまたは複数の）実施形態を示す。本発明は示される正確な構成および手段に限定されないことは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の構成を示す図である。終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）を、ＲＡＧＥシグナル伝達に関与すると考えられているその３つの細胞外ドメイン（Ｖ、Ｃ１およびＣ２）、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと共に示す。「可溶性ＲＡＧＥ」および「ｓＲＡＧＥ」という用語に包含されるＲＡＧＥの可溶性または分泌された形態は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを欠いているように示される。ｓＲＡＧＥは、おとり受容体の役を務めることがあり、ＲＡＧＥ細胞外ドメインとしてのみ図において示される。完全長ヒト重鎖ＩｇＧ１分子が示され、第１の定常ドメインＣＨ１と一緒になって、抗原結合性断片（Ｆａｂ）を形成する可変結合ドメイン（ＶＨ）を示し、これは柔軟なヒンジ領域を介してＩｇＧ１分子の第２および第３の定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）に結合している。図はさらに、免疫グロブリンヒンジ領域を伴うまたは伴わない（図示）、ヒトＲＡＧＥのＶおよびＣ１ドメインをＩｇＧ１分子のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結することによって構成されるｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を示す。
【図２Ａ】本発明のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。本発明のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号１）。ｓＲＡＧＥ−Ｉｇタンパク質配列は、４６１個のアミノ酸を含み、それには２３個のアミノ酸のシグナルペプチド／リーダー配列（ある特定の状況では２２個のアミノ酸であり得る）が含まれ、発現の間に切断され４３８個のアミノ酸成熟タンパク質（または、Ｎ末端リシンが切り出されている場合は４３７個のアミノ酸）が生じる。この例のために、アミノ酸残基の番号付けは２３個のアミノ酸のリーダー配列を含まず、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質配列はアミノ酸１（Ｑ１）においてグルタミンであり、それが環化し、アミノ酸１（ｐＥ１）においてピログルタミン酸（ｐＥ）を形成することができる。ヒトＲＡＧＥ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１３６から得た。位置Ｎ２、Ｎ５８およびＮ２８８の３つの下線を引いたアスパラギン（Ｎ）は、Ｎ−連結性グリコシル化の潜在的部位を示す。ＲＡＧＥのＶドメインは、アミノ酸残基番号１からアミノ酸残基Ｅ１０９までにまたがる。ＲＡＧＥのＣ１ドメインは、ＶドメインのＣ末端配列と約１０個のアミノ酸が重複し、およそアミノ酸Ｇ９９からＥ２２０までにまたがる。アミノ酸残基１９５からアミノ酸残基１９８までの下線を引いたアミノ酸ＲＡＬＲは、フューリン切断のコンセンサス配列を示す。ｓＲＡＧＥのＣ２ドメインのＮ末端における概ね８個のアミノ酸残基（ＰＥＧＧＡＶＡＰ）は、Ｃ１ドメインのＣ末端配列と重複し、Ｃ１／Ｃ２接合部は、およそアミノ酸Ｌ２１２からＰ２２８にまたがる。ＩｇＧ１  ＦｃのＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、末端リシン（Ｋ）が切り出されていない場合、およそＰ２２９からＫ４３８まで包含するように示される。示されている実施形態では、融合タンパク質は、ＩｇＧ１の完全ヒトヒンジドメインを含まない。別の実施形態では、融合タンパク質は、ヒンジまたはその任意の部分を含むことができ、ヒンジは存在する場合、改変されて、例えば未改変ヒンジ領域と別の状況では関連する任意のエフェクター機能を変化させ得ることを含む。
【図２Ｂ】本発明のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の核酸配列を示す図である。配列番号１のアミノ酸配列を含む、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質をコードする核酸配列を示す（配列番号２）。ボールド体で強調したコード配列１〜７５３は、ＲＡＧＥ  Ｎ末端タンパク質配列をコードし、一方配列７５４〜１３８６は、ヒンジ領域を含まないヒトＩｇＧ  Ｆｃ（γ１）タンパク質配列をコードする。
【図３】ＰＮＧａｓｅＦおよびフューリンによる消化の作用を示す、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の画像である。振とうフラスコ培養物中で増殖した細胞中に発現しているｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を、ｍａｂｓｅｌｅｃｔによって精製し、ＰＮＧａｓｅＦまたはフューリンによる消化に供し、続いて４〜１２％勾配の還元Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分析した。各レーンは、２．７μｇのタンパク質を含有する。分子量（Ｋｄ）を左に示す。レーン１および６は、未処理融合タンパク質を含有する。レーン２は、ＰＮＧａｓｅＦ消化緩衝液のみでインキュベートした融合タンパク質を含有する。レーン３は、ＰＮＧａｓｅＦで消化された融合タンパク質を含有する。レーン４は、フューリン消化緩衝液のみでインキュベートした融合タンパク質を含有する。レーン５は、フューリンで消化された融合タンパク質を含有する。ＦＬＭ＝完全長単量体。
【図４】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質分析の結果を示す。精製したｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を、移動相（３５０ｍＭのシトレート、ｐＨ６．０）中で３ｍｇ／ｍｌに希釈し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００  １０／３００ＧＬカラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した（周囲温度、０．７５ｍＬ／分流量、注入量２０μＬ、操作時間４０分、２８０ｎｍでモニター）。ＳＥＣは、ホモ二量体、ヘテロ二量体、Ｆｃ二量体および高分子量種の相対的定量化を可能にし、そのピーク結果を左上隅の挿入図に示す。
【図５】ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のグリカン部位の占有プロファイルを示す逆相−ＨＰＬＣの結果を示す。重ね合わせたクロマトグラムは、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質（Ｓ１）および分画した試料（Ｓ１Ｆ１、Ｓ１Ｆ２、およびＳ１Ｆ３）のＦＬＭである。画分Ｓ１Ｆ３の濃度は著しく低く、したがって、それに続くＥＬＩＳＡ結合アッセイにそれは含めなかった。右上隅の挿入図は、各試料／画分の割合としての各グリカンの概ねの内容を示す。
【図６】図５に示すピークＳ１Ｆ１およびＳ１Ｆ２についての質量分析法によるピーク同一性の確認を示す図である。質量スペクトルデータは、ピークＳ１Ｆ１を３−グリカン種として、Ｓ１Ｆ２を２−グリカン種として同定する。
【図７】ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合からの放出されたＮ−連結性グリカンの順相ＨＰＬＣ分析を示す図であり、ピーク同一性をクロマトグラムに示す。種の相対存在量を表１に示す。
【図８】ｓＲＡＧＥ−Ｉｇのトリプシン消化物の逆相分離の結果を示す図である。挿入図は、Ｎ−連結性トリプシンペプチドが溶出する領域を示す。
【図９】理論的モノアイソトピック分子量と共に、コンセンサスＮ−連結性グリコシル化部位を含有するトリプシンペプチドの同一性を示す。図は、トリプシンによって消化されたｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質からの３つの予想されるトリプシン糖ペプチドのアミノ酸配列を示し、各トリプシン消化物の理論的モノアイソトピック分子量を示す。トリプシン糖ペプチドは、以下の通りである。質量が約６３８．３６ＤａのＴ１ｐＥ（ｐＥＮＩＴＡＲ）；分子量が約２２４１．２２ＤａのＴ１０（ＶＬＰＮＧＳＬＦＬＰＡＶＧＩＱＤＥＧＩＦＲ）；および分子量が約１１８８．５０ＤａのＴ３１（ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）。
【図１０】ツニカマイシンの存在下で発現しているｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のグリカン部位の占有プロファイルを示す逆相−ＨＰＬＣを示す図である。重ね合わせたクロマトグラムは、ツニカマイシン処理細胞（Ｓ２）および３種の画分試料（Ｓ２Ｆ１、Ｓ２Ｆ１、およびＳ２Ｆ３）からのｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質である。右上隅の挿入図は、各試料またはその画分中の各グリカンの相対割合を示す。
【図１１】図１０に示すピークＳ２Ｆ１、Ｓ２Ｆ２およびＳ２Ｆ３についての、質量分析法によるピーク同一性の確認を示す図である。質量スペクトルデータによって、ピークＳ２Ｆ１を３−グリカン種と、Ｓ２Ｆ２を２−グリカン種と、およびＳ２Ｆ３を０−グリカン種と同定する。
【図１２】免疫グロブリン重鎖定常領域中に典型的に存在する例示的な二分岐グリコフォームを示す図である。本発明によれば、「Ｇ０」は、末端シアル酸（ＮｅｕＡｃｓ）またはＧａｌが存在しない二分岐構造を意味し、「Ｇ１」は、１つのＧａｌを有し、ＮｅｕＡｃｓを有さない二分岐構造を意味し、「Ｇ２」は、２つの末端Ｇａｌを有し、ＮｅｕＡｃｓを有さない二分岐構造を意味する。
【図１３Ａ】抗ＩｇＥ抗体５．９４８．１の重鎖の配列を示す図である。ｍＡｂ５．９４８．１重鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号８）。可変ドメインを小文字で示し、定常ドメインを大文字で示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は下線を引く、重鎖可変領域中の潜在的なＮ−連結性グリコシル化部位（フレームワーク３のアスパラギン７３）は大文字（「ＮＴＳ」）で示す。重鎖定常ドメイン中のＮ−連結性グリコシル化部位（「ＮＳＴ」）であるＡｓｎ３０１に下線を引く。
【図１３Ｂ】抗ＩｇＥ抗体５．９４８．１の重鎖の配列を示す図である。ｍＡｂ５．９４８．１の重鎖をコードする核酸配列を示す（配列番号９）。
【図１３Ｃ】抗ＩｇＥ抗体５．９４８．１の軽鎖の配列を示す図である。ｍＡｂ５．９４８．１軽鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号１０）。可変ドメインを小文字で示し、定常ドメインを大文字で示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線をする。
【図１３Ｄ】抗ＩｇＥ抗体５．９４８．１の軽鎖の配列を示す図である。ｍＡｂ５．９４８．１の軽鎖をコードする核酸配列を示す（配列番号１１）。
【図１４】抗体５．９４８．１の重鎖についての４つの可能性のあるグリカン部位占有変異体を示す図である。図は、左から右へ、Ａｓｎ７３またはＡｓｎ３０１にグリカンを含まない０−グリカン占有変異体、Ａｓｎ３０１のみにグリカンを含む１−グリカン占有変異体、Ａｓｎ７３のみにグリカンを含む１−グリカン占有変異体、ならびにＡｓｎ７３およびＡｓｎ３０１の両方にグリカンを含む完全に占有された２−グリカン占有部位変異体を示す。
【図１５】抗体５．９４８のグリカンプロファイルを示す図である。重鎖は、２−グリカンおよび１−グリカン変異体を示す３つのピークに分解された。０−グリカン占有変異体は検出されなかった。１−グリカン占有ピークは、さらに分解されて、抗体重鎖のＦｃ領域においてグリコシル化された変異体（より優勢である）およびＦａｂ領域においてグリコシル化された変異体を同定することができた。対照培養条件下で生成された全重鎖に、完全グリコシル化２−グリカン占有重鎖は概ね９８％含まれ、１−グリカン占有重鎖は約２％含まれることをデータは示す。
【図１６】グリコール−Ｎ−グリカナーゼによって脱グリコシル化された５．９４８．１抗体の試料、ならびにＳＤＳおよびＢＭＥを使用して変性させた試料と共に、モノクローナル抗体５．９４８．１（ｍＡｂ５．９４８．１）のグリカンプロファイルを示す図である。未変性５．９４８．１抗体の重鎖は、２−グリカンおよび１−グリカン変異体を示す３つの主要なピークに上記で見られたように分解された（図１５、上記）。０−グリカン占有変異体は検出されなかった。１−グリカン占有ピークはさらに分解され、抗体重鎖のＦｃ領域においてグリコシル化された変異体およびＦａｂ領域においてグリコシル化された変異体を同定することができた。未変性脱グリコシル化５．９４８．１抗体の重鎖は、主として１−グリカン種と、いくらかの０−グリカン種を含有するプロファイルを示す。変性脱グリコシル化５．９４８．１抗体の重鎖は、主として０−グリカン種を含有するプロファイルを示す。
【図１７】対照条件下（すなわち、グリコシル化阻害剤の非存在下）で産生された抗体５．９４８．１のグリカンプロファイルを示す図である。試料は培養物から１４日目に採取された（試料７、Ｓ７）。重鎖は、２−グリカンおよび１−グリカン変異体を示す３つのピークに分解された。０−グリカン占有変異体は検出されなかった。１−グリカン占有ピークはさらに分解されて、抗体重鎖のＦｃ領域においてグリコシル化された変異体（より優勢である）およびＦａｂ領域においてグリコシル化された変異体を同定することができた。対照培養条件下で生成された全重鎖に、完全グリコシル化２−グリカン占有重鎖は概ね９８％含まれ、１−グリカン占有重鎖は約２％含まれることをデータは示す。
【図１８】グリコシル化阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースの存在下で産生された抗体５．９４８．１のグリカンプロファイルを示す図であり、試料は培養物から１４日目に採取された（試料１１、Ｓ１１）。重鎖は、２−グリカンおよび１−グリカン変異体を示す３つのピークに分解された。０−グリカン占有変異体は容易に検出された。１−グリカン占有ピークは、さらに分解されて、抗体重鎖のＦｃ領域においてグリコシル化された変異体（より優勢である）およびＦａｂ領域においてグリコシル化された変異体を同定することができた。
【図１９】対照条件下（グリコシル化阻害剤の非存在下）で産生されたｍＡｂ５．９４８．１のグリカンプロファイル、およびグリコシル化対照条件下（すなわち、グリコシル化阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースの存在下）で産生されたｍＡｂ５．９４８．１のグリカンプロファイルを比較したプロファイルの重ね合わせの図であり、試料は各培養物から１４日目に採取された（各々、Ｓ７およびＳ１１）。重鎖は２−グリカン、１−グリカンおよび０−グリカン変異体を示す４つのピークに分解された。Ｓ１１にのみ０−グリカン占有変異体が容易に検出された。１−グリカン占有ピークは、さらに分解されて、抗体重鎖のＦｃ領域においてグリコシル化された変異体（より優勢である）およびＦａｂ領域においてグリコシル化された変異体を同定することができた。対照試料（Ｓ７）（１−グリカン変異体は、大部分はＦｃ変異体から構成される）と比べて、１−グリカンＦａｂ変異体の重鎖が、２−デオキシ−Ｄ−グルコース試料（Ｓ１１）中で１−グリカンＦｃ変異体と比べて大幅に増加していることをデータは示す。
【図２０】図２０Ａと図２０Ｂを含み、グリコシル化阻害剤の非存在下と存在下で産生された抗体５．９４８．１のグリカンプロファイルを比較する詳細なプロファイル比較の図である。図２０Ａは、対照条件下（グリコシル化阻害剤の非存在下）で産生されたｍＡｂ５．９４８．１のグリカンプロファイルを示す図であり、試料は培養物から１４日目に採取された（Ｓ７）。図２０Ｂは、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの存在下で産生されたｍＡｂ５．９４８．１のグリカンプロファイルを示す図であり、試料は培養物から１４日目に採取された（Ｓ１１）。図２０Ａと図２０Ｂの比較は、０−グリカン占有変異体がＳ１１のみにおいて容易に検出されることを示す。１−グリカン占有ピークはさらに分解されて、抗体重鎖のＦｃ領域においてグリコシル化された変異体（より優勢である）およびＦａｂ領域においてグリコシル化された変異体を同定することができた。対照試料（Ｓ７、図２０Ａ）（１−グリカン変異体は、大部分はＦｃ変異体から構成される）と比べて、１−グリカンＦａｂ変異体の重鎖が、２−デオキシ−Ｄ−グルコース試料（Ｓ１１、図２０Ｂ）中で１−グリカンＦｃ変異体と比べて大幅に増加していることをデータは示す。
【図２１】プロセスの時間経過にわたる、対照条件下（すなわち、グリコシル化阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースの非存在下）で産生されたｍＡｂ５．９４８．１のグリカンプロファイルを示す図である。図は、培養の７日目（Ｓ５）、１２日目（Ｓ６）および１４日目（Ｓ７）に採取された試料のグリカンプロファイルを示す３つの曲線を示す。タンパク質のＦｃ領域（Ａｓｎ３０１）でグリコシル化された１−グリカンの重鎖の相対量は、Ｆａｂ部位（Ａｓｎ７３）でグリコシル化された１−グリカンの重鎖の量と比較して時間の経過に伴い増加することをデータは示す。試料採取した任意の時間に採取した試料中に０−グリカンの重鎖は検出されないことをデータはさらに示す。
【図２２】プロセスの時間経過にわたる、グリコシル化阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースの存在下で産生されたｍＡｂ５．９４８．１のグリカンプロファイルを示す図である。図は、培養の７日目（Ｓ９）、１２日目（Ｓ１０）および１４日目（Ｓ１１）に採取した試料のグリカンプロファイルを示す３つの曲線を示す。１−グリカンの重鎖タンパク質の相対量は、２−グリカンの重鎖タンパク質の量と比較して時間の経過に伴い増加することをデータは示す。さらに、タンパク質のＦａｂ領域（Ａｓｎ７３）でグリコシル化された１−グリカンの重鎖タンパク質は、Ｆｃ部位（Ａｓｎ３０１）でグリコシル化された１−グリカンの重鎖の量と比較して時間の経過に伴い増加することをデータは示す。これは、対照試料（培養の間にＦｃ１−グリカンがＦａｂ１−グリカンと比べて増加する）において見られるのと反対である。０−グリカンの重鎖の生成は、グリコシル化阻害条件下で時間の経過に伴い増加することをデータはさらに示す。
【図２３】グリコール−Ｎ−グリカナーゼによって脱グリコシル化された５．９４８．１抗体の同等の試料、ならびにＳＤＳおよびＢＭＥを使用して変性された試料と共に、対照条件下（すなわち、グリコシル化阻害剤の非存在下）で産生された未変性抗体５．９４８．１（ｍＡｂ５．９４８．１）のグリカンプロファイルを示す図であり、試料は培養の１４日目に採取した（Ｓ７）。未変性５．９４８．１抗体の重鎖は、２−グリカンおよび１−グリカン変異体を示す３つの主要なピークに上記で見られたように分解された。この試料について、グリコシル化阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースの非存在下で０−グリカン占有変異体は検出されなかった。
【図２４】グリコール−Ｎ−グリカナーゼによって脱グリコシル化された５．９４８．１抗体の同等の試料（−・−）、ならびにＳＤＳおよびＢＭＥを使用して変性された試料（−−−）と比較した、グリコシル化阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースの存在下で産生された未変性抗体５．９４８．１（ｍＡｂ５．９４８．１）のグリカンプロファイルを示す図であり、試料は培養の１４日目に採取した（Ｓ７）（実線）。未変性５．９４８．１抗体の重鎖は、２−グリカン、１−グリカンおよび０−グリカン変異体を示す４つのピークに分解された。この試料について、０−グリカン占有変異体は容易に検出されたが、グリコシル化阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースの存在下で０−グリカンの重鎖の生成をさらに示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
別途本明細書において定義しない限り、本発明に関連して使用する科学技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。さらに、文脈からそうでないとする必要がない限り、単数の用語は複数も含み、複数の用語は単数も含むものとする。一般に、本明細書に記載する細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用する命名法や、それらの技法は、当技術分野ではよく知られており、通常使用するものである。
【００５８】
本発明の方法および技法は一般に、別段の記載がない限り、当技術分野でよく知られている方法、ならびに本明細書全体を通して引用し、論じる種々の一般的およびより具体的な参照文献の記載に従って実施する。そのような参照文献として、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら、２００２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９９０、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹが挙げられ、これらは、参照により本明細書に組み込まれている。酵素の反応および精製の技法は、製造元の詳述、当技術分野の通常の達成方法または本明細書の記載に従って実施する。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、細胞および分子の生物学、免疫学、ならびに薬用のおよび薬学的な化学に関連して使用する命名法、それらの実験室手順および技法は、当技術分野ではよく知られており、通常使用するものである。化学合成、化学的な分析、薬学的調製物、製剤化および送達、ならびに患者の治療については、標準的な技法を使用する。
【００５９】
定義
本明細書で使用する場合、以下の各用語は、このセクションにおけるそれに関連する意味を有する。
【００６０】
冠詞「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」が、当該冠詞の文法上の対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために、本明細書では使用される。例えば、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（１つの要素）」は、１つの要素または複数の要素を指す。
【００６１】
本明細書で使用する場合、２０個の従来のアミノ酸およびそれらの略語は、従来の使用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。これは、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６２】
本明細書で使用する場合、アミノ酸は、以下の表に示すように、それらの正式名称、それらに対応する三文字表記、またはそれらに対応する一文字表記によって示す。
正式名称          三文字表記    一文字表記
アスパラギン酸    Ａｓｐ          Ｄ
グルタミン酸      Ｇｌｕ          Ｅ
リシン            Ｌｙｓ          Ｋ
アルギニン        Ａｒｇ          Ｒ
ヒスチジン        Ｈｉｓ          Ｈ
チロシン          Ｔｙｒ          Ｙ
システイン        Ｃｙｓ          Ｃ
アスパラギン      Ａｓｎ          Ｎ
グルタミン        Ｇｌｎ          Ｑ
セリン            Ｓｅｒ          Ｓ
スレオニン        Ｔｈｒ          Ｔ
グリシン          Ｇｌｙ          Ｇ
アラニン          Ａｌａ          Ａ
バリン            Ｖａｌ          Ｖ
ロイシン          Ｌｅｕ          Ｌ
イソロイシン      Ｉｌｅ          Ｉ
メチオニン        Ｍｅｔ          Ｍ
プロリン          Ｐｒｏ          Ｐ
フェニルアラニン  Ｐｈｅ          Ｆ
トリプトファン    Ｔｒｐ          Ｗ
【００６３】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を示す側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって相互に異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度を上方に加減して、保存的性質を示す置換について修正することができる。このように加減するための手段が、当業者にはよく知られている。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７〜３１）を参照されたい。
【００６４】
類似の化学的特性を示す側鎖を有するアミノ酸の群の例として、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸の置換の群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００６５】
あるいは、保存的な置き換えは、参照により本明細書に組み込まれているＧｏｎｎｅｔら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３〜１４４５に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中等度に保存的な」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有する任意の変化である。
【００６６】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる置換、（２）酸化に対する感受性を低下させる置換、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる置換、および（４）そのような類似体のその他の物理化学的または機能的な特性を付与または改変する置換である。置換、欠失および／または挿入を含む類似体は、特定したペプチド配列以外の配列の種々の異質タンパク質を含むことができる。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）を、特定した配列（好ましくは、分子間接触を形成する（１つまたは複数の）ドメインの外側、例えば、ＣＤＲの外側のポリペプチドの部分）中に作製することができる。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させることがあってはならない（例えば、置き換えたアミノ酸に親配列中に生じるヘリックスを壊す傾向があってはならないし、親配列を特徴付けるその他の型の二次構造を乱すことがあってもいけない）。当技術分野で認識されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１））；ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５）に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６７】
ポリペプチドについての配列類似性は典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定する。タンパク質解析ソフトウェアが、保存的アミノ酸置換を含めた、種々の置換、欠失およびその他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して、類似の配列を一致させる。例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．から入手可能なＧＣＧ）は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅとも呼ばれるが、これは、ヌクレオチド配列およびタンパク質配列を判定、解析および操作するための１３０超のプログラムの統合ソフトウェアパッケージである。デフォルトパラメータを用いて、生物体の異なる種由来の相同ポリペプチド等の近縁関係にあるポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその異質タンパク質との間の配列の類似性、相同性および／または配列同一性を決定するために使用することができる、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」等のプログラムを、ＧＣＧは含有する。例えば、ＧＣＧバージョン６．１、バージョン７．０、バージョン９．１、およびバージョン１０．０を参照されたい。
【００６８】
また、ポリペプチド配列を、ＧＣＧ中のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して、デフォルトまたは推奨のパラメータを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）によって、問合わせ配列と検索配列との間の最も良好なオーバーラップの領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性が得られる（Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３〜９８；Ｐｅａｒｓｏｎ、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５〜２１９）。本発明の配列を異なる生物体由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、具体的には、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜４０２を参照されたい。これらは、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６９】
従来の表記法が、ポリペプチド配列を表現するために、本明細書では使用される。すなわち、ポリペプチド配列の左手側の端が、アミノ末端であり、ポリペプチド配列の右手側の端が、カルボキシル末端である。
【００７０】
完全なままの「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続している少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．、１９８９、編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）を参照されたい（その全体が、全ての目的のために参照により組み込まれている）。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲまたはＶＬ）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれている超可変性の領域にさらに再分割することができ、これらは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれているより保存されている領域の間に散在している。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲでできており、アミノ末端からカルボキシル末端へ、以下の順番で並ぶ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。各ドメインに対するアミノ酸の割当ては、Ｋａｂａｔ、１９８７および１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ中（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８〜８８３の定義に従う。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典補体系の第１構成成分（Ｃｌｑ）を含めた、宿主の組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。軽鎖および重鎖の内部では、可変領域と定常領域とは、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結ばれており、また、重鎖の場合には、さらに約１０個のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
【００７１】
本明細書で使用する「リガンド結合部位」という用語は、ポリペプチドもしくはタンパク質の一部、またはそれらの断片を指し、これは、結合パートナーまたは同族リガンドとも呼ばれている別の分子と特異的に結合する。好ましくは、リガンド結合部位（「ＬＢＳ」）は、少なくとも１つのグリカン部位（本明細書では、「潜在的なグリコシル化部位」とも呼ぶ）を含むことができるが、そうである必要はない。この部位を、炭水化物部分が占有することができるが、そうである必要はない。リガンド結合部位の例には、アミノ酸残基番号２のアスパラギン（Ａｓｎ２またはＮ２）においてグリカン部位を含み、Ｎ５８において第２のグリカン部位をさらに含むＲＡＧＥのリガンド結合部位があり、このＬＢＳは、これらに限定されないが、アミロイドベータ（Ａβ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｓ１００、カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）、アンフォテリンおよびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を含めた、ＲＡＧＥのリガンドと特異的に結合する。
【００７２】
本明細書では互換的に使用する「抗原結合部位」または「抗原結合部分」という用語は、抗原（例えば、ＩｇＥ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長の抗体の断片によってもたらすことができることが示されている。抗体の「抗原結合部位」という用語内に包含される結合断片の例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結している２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法を使用して、これらから単一のタンパク質の鎖を作製することができる合成リンカーによって、これらを結ぶことができ、この場合、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対形成して、（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）一価の分子を形成する。例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；およびＨｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３を参照されたい。また、そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されることを意図する。また、ダイアボディ等の、その他の形態の一本鎖抗体も包含される。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であり、この場合、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現するが、短過ぎて同一の鎖上の２つのドメイン間での対形成させることができないリンカーを使用し、それによって、これらのドメインを、別の鎖の相補性を示すドメインと対形成させて、２つの抗原結合部位を生み出す（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３を参照されたい）。
【００７３】
その上さらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分の、１つまたは複数のその他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成されたより大きな免疫接着分子の部分であってもよい。そのような免疫接着分子の例として、ストレプトアビジンコア領域を使用して、四量体ｓｃＦｖ分子を作製すること（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９５、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３〜１０１）、ならびにシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端のポリヒスチジンタグを使用して、二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製すること（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７〜１０５８）が挙げられる。その他の例として、抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲを、分子中に共有結合または非共有結合のいずれかで組み込んで、対象とする抗原、例として、ＩｇＥに特異的に結合する免疫接着分子を作製する場合が挙げられる。そのような実施形態では、（１つまたは複数の）ＣＤＲを、より大きなポリペプチド鎖の部分として組み込んでもよく、別のポリペプチド鎖に共有結合によって連結してもよく、または非共有結合によって組み込んでもよい。Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片等の抗体部分は、全抗体のパパインまたはペプシンそれぞれによる消化等、全抗体から従来の技法を使用して調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書に記載するように、標準的な組換えＤＮＡの技法を使用して得ることもできる。
【００７４】
本発明に関して「抗体」について本明細書で言及する場合には、その抗原結合部分もまた使用することができることを理解されたい。抗原結合部分は、完全なままの抗体と、特異的な結合について競合する。一般に、Ｐａｕｌ．Ｗ．編、１９８９、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章中（第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）を参照されたい（その全体が、全ての目的のために参照により組み込まれている）。抗原結合部分は、組換えＤＮＡの技法によってか、または完全なままの抗体の酵素によるもしくは化学的な切断によって産生することができる。いくつかの実施形態では、「抗原結合部分」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、ならびに特異的な抗原結合をポリペプチドに付与するのに十分である抗体の少なくとも一部を含有するポリペプチドを含む。１つまたは複数の結合部位を有する実施形態では、結合部位は、相互に同一であってもよく、または異なってもよい。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合の特異性および親和性を示す。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合には、定常領域もまたヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。開示のヒト抗体またはそれらの抗原結合部分は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダムなもしくは部位特異的な変異誘発によってか、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞の突然変異によって導入された突然変異）を含むことができる。しかし、本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列中に移植されている抗体を含むことを意図しない。
【００７７】
「ヒトモノクローナル抗体」または「完全ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。１つの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入非ヒト動物、例えば、遺伝子導入マウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され、Ｂ細胞は、不死化細胞に融合している。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、創出または単離した全てのヒト抗体、例として、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についての遺伝子導入もしくは染色体導入動物（例えば、マウス）、またはそれから調製したハイブリドーマから単離した抗体（以下にさらに記載する）、（ｂ）ヒト抗体を発現させるために形質転換した宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離した抗体、（ｃ）組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングが関与する任意のその他の手段によって調製、発現、創出または単離した抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体に対して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける変異誘発（またはヒトＩｇ配列の遺伝子が導入されている動物を使用する場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける変異誘発）を行うことができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、関係があるが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然には存在しない場合がある配列となる。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「アイソタイプ」または「クラス」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体のクラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ）を指す。抗体の定常ドメインは、抗原に対する結合には関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に依存して、所与のヒトの抗体または免疫グロブリンを、免疫グロブリンの５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭのうちの１つに割り当てることができる。異なるクラスの免疫グロブリンの構造および三次元の立体配置はよく知られている。種々のヒト免疫グロブリンのクラスのうち、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭのみが補体を活性化することが知られている。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトにおいてＡＤＣＣを媒介することが知られている。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「サブクラス」は、重鎖定常領域遺伝子のアイソタイプ内におけるさらなる特定化、例えば、ＩｇＧアイソタイプ内のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のサブクラス等を指す。
【００８１】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用する。「抗体依存性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」という用語は、非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ＮＫ細胞、好中球、マクロファージ等）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、それに続いて、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介型反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するそのような細胞傷害性細胞は一般に、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞（ＮＫ細胞）は、ＦｃγＲＩＩＩ発現し、一方、単核球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよび／またはＦｃγＲＩＶを発現する。造血細胞上におけるＦｃＲの発現が、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜９２（１９９１）に要約されている。分子のＡＤＣＣ活性を判定するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているもの等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイのために有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞がある。それに代わってまたはそれに加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２〜６５６（１９９８）に開示されているもの等の動物モデル中で判定することもできる。
【００８２】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語を使用して、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載し、Ｆｃ領域は、重鎖のヒンジ領域ならびにＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。例えば、ＦｃＲは、未変性配列のヒトＦｃＲであってよい。ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲ（ガンマ受容体）であってよく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶのサブクラスの受容体を含み、これらには、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的にスプライシングされた形態も含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、これらは、主としてそれらの細胞質ドメイン中において異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ、１９９７、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３〜２３４を参照されたい）。ＦｃＲについては、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４；ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜３４１に総説されている。今後同定されるものも含めて、その他のＦｃＲが、本明細書では用語「ＦｃＲ」によって包含される。また、この用語は、新生仔の受容体ＦｃＲｎも含み、これは、母親のＩｇＧの胎仔への移動に関与する（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７、およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９）。免疫グロブリンＦｃ断片上の主要なＦｃＲ結合部位は、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域中に存在する。このヒンジ領域が、種々の白血球上のＦｃＲ１〜３と相互作用し、これらによる細胞の標的の攻撃を引き起こす（Ｗｉｎｅｓら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５３１３〜５３１８）。ヒンジ領域は、これに限定されないが、米国特許第６，１６５，４７６号に記載されている配列を包含する。
【００８３】
「抗体依存性細胞傷害性を誘発することができる」という用語は、当業者に知られている（１つまたは複数の）アッセイによって測定した場合の、抗体等の物質のＡＤＣＣを示す能力を指す。そのような活性は典型的には、Ｆｃ領域の、種々のＦｃＲとの結合によって特徴付けられる。いずれかの特定の機構に限定されることなく、当業者であれば、抗体のＡＤＣＣを示す能力は、例えば、そのサブクラス（ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３等）に基づいたもの、Ｆｃ領域中に導入した突然変異によるもの、または抗体のＦｃ領域中の炭水化物パターンに対する改変に基づいたものであってよいことを認識するであろう。そのような改変は、例えば、米国特許公開第２００７／００９２５２１号に記載されている。
【００８４】
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の改変された形態、例えば、抗体のコンジュゲート、および別の物質または抗体を指す。
【００８５】
「ヒト化抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体を指すことを意図する。追加のフレームワーク領域の改変を、ヒトフレームワーク配列内部に作製することもできる。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」という句によって、試料中で、特異的な分子を認識し、それに結合するが、その他の分子に対する認識および結合は実質的に起こさない化合物、例えば、タンパク質、核酸および抗体等を意味する。例えば、試料中の同族リガンドを認識し、それに結合する抗体またはペプチド阻害剤（例えば、その同族抗原であるＩｇＥと結合する抗ＩｇＥ抗体）は、試料中のその他の分子に対する認識および結合は実質的に起こさない。したがって、指定したアッセイ条件下では、特定した結合部分（例えば、抗体またはその抗原結合部分）は、特定の標的分子、例えば、ＩｇＥに優先的に結合するが、試験試料中に存在するその他の構成成分とは顕著な量では結合しない。多様なアッセイフォーマットを使用して、対象とする分子に特異的に結合する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＦＡＣＳおよびウエスタンブロット解析が、ＩｇＥと特異的に反応する抗体を同定するために使用することができる多くのアッセイに属する。典型的には、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドのシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的には、バックグラウンドの１０倍超であり、さらにより具体的には、平衡解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、好ましくは、≦１００ｎＭ、最も好ましくは、≦１０ｎＭである場合に、抗体が抗原に「特異的に結合する」といわれている。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「ｋｏｎ」という用語は、特定の抗体−抗原または受容体−リガンドの相互作用のオン速度または会合速度を指すことを意図し、一方、本明細書で使用する場合、「ｋｏｆｆ」という用語は、特定の抗体−抗原／受容体−リガンドの相互作用のオフ速度または解離速度を指すことを意図する。本明細書で使用する場合、「ＫＤ」という用語は、解離定数を指すことを意図し、これは、ｋｏｆｆのｋｏｎに対する比（すなわち、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表す。抗体またはその他の結合パートナーについてのＫＤ値を、当技術分野で十分に確立されている方法を使用して決定することができる。ＫＤを決定するための１つの方法は、表面プラズモン共鳴の使用、典型的には、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム等のバイオセンサーシステムの使用による方法である。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、２つ以上の異なる抗体由来の領域を含む抗体を意味する。特定の実施形態では、「キメラ抗体」は、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体等、１つの種に由来する可変領域配列および別の種に由来する定常領域配列を含む。１つの実施形態では、１つまたは複数のＣＤＲが、マウス抗ヒトＩｇＥ抗体に由来する。別の実施形態では、全てのＣＤＲが、マウス抗ヒトＩｇＥ抗体に由来する。別の実施形態では、２つ以上のマウス抗ヒトＩｇＥ抗体由来のＣＤＲが、キメラヒト抗体中で組み合わさっている。例えば、キメラ抗体は、第１のマウス抗ＩｇＥ抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１、第２のマウス抗ヒトＩｇＥ抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２、ならびにＣＤＲ３および第３のマウス抗ヒトＩｇＥ抗体の軽鎖由来のＣＤＲ３を含むことができ、重鎖由来のＣＤＲは、１つまたは複数のその他の抗ＩｇＥ抗体に由来することができる。さらに、フレームワーク領域は、同じマウス抗ヒトＩｇＥ抗体のうちの１つ、または１つもしくは複数の異なるマウスに由来することができる。
【００８９】
さらに、本明細書で先に論じたように、キメラ抗体は、２つ以上の種の生殖系列配列に由来する部分を含む抗体も含む。
【００９０】
本発明の炭水化物部分について、オリゴ糖を記載するために通常使用される命名法を参照して記載する。この命名法を使用する炭水化物化学の総説が、ＨｕｂｂａｒｄおよびＩｖａｔｔ（１９８１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：５５５〜５８３に見い出される。例えば、この命名法は、マンノースを示すＭａｎ；２−Ｎ−アセチルグルコサミンを示すＧｌｃＮＡｃ；ガラクトースを示すＧａｌ；フコースを示すＦｕｃ；およびグルコースを示すＧｌｃを含む。シアル酸は、簡単な表記法によって、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、ＮｅｕＮＡｃ、および５−グリコールイルノイラミン酸は、ＮｅｕＮＧｃと記載する（ＩＵＢ−ＩＵＰＡＣ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、１９８２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３３４７〜３３５１；（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３３５２）。
【００９１】
本発明の炭水化物構造が、Ｎ−連結性オリゴ糖として発現するタンパク質上に生じる。「Ｎ−連結性グリコシル化」は、炭水化物部分がＧｌｃＮＡｃを介してポリペプチド鎖中のアスパラギン残基につながっていることを指す。Ｎ−連結性炭水化物は全て、共通のＭａｎ１−６（Ｍａｎ１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒコア構造を含有する。したがって、記載したコア構造中、Ｒは、産生した糖タンパク質のアスパラギン残基を示す。産生したタンパク質の配列は、アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含有する。対照的に、「Ｏ−連結性」炭水化物は、共通のコア構造によって特徴付けられ、これは、スレオニンまたはセリンのヒドロキシル基につながっているＧａｌＮＡｃであるが、コンセンサス配列は必要でない。Ｎ−連結性炭水化物のうち、最も重要なのは、本明細書に記載する「二分岐（ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）」構造等の「複雑な」Ｎ−連結性炭水化物である。
【００９２】
当業者であれば、糖タンパク質である免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）には、ゼロ、１または２つのガラクトース残基を含有する３つの型の複雑な二分岐構造が伴い（Ｗｏｒｍｌａｎｄら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１３７０〜１３８０）、これらはそれぞれ通常、Ｇ０、Ｇ１およびＧ２として知られていることを認識するであろう。ＩｇＧクラスのヒト抗体分子に関しては、それぞれが、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインの内面のβ−４ターン（β−４  ｂｅｎｄ）のＡｓｎ２９７のアミド側鎖においてつながっているＮ−連結性オリゴ糖を有する（ＢｅａｌｅおよびＦｅｉｎｓｔｅｉｎ、１９７６、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９：２５３〜２５９；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｓ．４４：１１１〜１１７）。ＩｇＧのＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７においてつながっているオリゴ糖部分は、六糖コア構造が同定されており、外側糖残基が可変である複雑な二分岐型である（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら１９９７、上記；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９〜４１６を参照されたい）。コア構造（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ）は、二分岐オリゴ糖の典型例であり、模式的に、
【００９３】
【化１】
2010246541.tif 000002
と示すことができる。
【００９４】
各コア構造が、バイセクティングＮ−アセチルグルコースアミン、コアのフコース、およびガラクトースまたはシアル酸のいずれかの外側の糖を有し得ることから、Ａｓｎ２９７部位を占有することができる、総数３６種の構造的に独特のオリゴ糖がある（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記）。また、特定のＣＨ２ドメイン内部においては、Ａｓｎ２９７におけるグリコシル化が、二本鎖Ｆｃドメイン内部の各々のＡｓｎ２９７残基につながっている異なるオリゴ糖鎖に起因して非対照となる場合があることも認識されるであろう。例えば、単一の抗体分泌細胞内部で合成された重鎖は、そのアミノ酸配列に関しては均一であり得るが、一般に、示差的にグリコシル化され、その結果、多数の構造的に独特のＩｇのグリコフォームを生じる。
【００９５】
ＩｇＧのＣＨ２ドメイン中に見い出される複雑なオリゴ糖構造の大多数の型が、国際特許出願公開第ＷＯ９９／２２７６４号、７頁に描写されている。
【００９６】
本発明によれば、Ｇ０は、末端にシアル酸（ＮｅｕＡｃ）もＧａｌも存在しない二分岐構造を指し、Ｇ１は、１つのＧａｌを有し、ＮｅｕＡｃが存在しない二分岐構造を指し、Ｇ２は、２つの末端のＧａｌを有し、ＮｅｕＡｃが存在しない二分岐構造を指す。例えば、Ｇ０、Ｇ１、Ｇ−１およびＧ２の例示的な構造を描写する図１２を参照されたい。
【００９７】
「グリコフォーム」は、種々の炭水化物単位の連結を含む複雑なオリゴ糖構造を指す。そのような構造が、例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖａｒｋｉら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９９９）に記載されており、これもまた、標準的な糖類生物学の命名法の総説を提供している。そのようなグリコフォームとして、これらに限定されないが、Ｇ２、Ｇ１、Ｇ０、Ｇ−１およびＧ−２が挙げられる（例えば、国際特許公開第ＷＯ９８／５８９６４号および第ＷＯ９９／２２７６４号を参照されたい）。
【００９８】
「グリカン部位の占有」または「グリカンの占有」という用語は、タンパク質中の潜在的なＮ−連結性またはＯ−連結性のグリコシル化部位が、共有結合によって連結している炭水化物部分を含んでも（すなわち、グリカン部位が占有されている）、または含まなくても（すなわち、グリカン部位が占有されていない）よい場所を包含する。ポリペプチド上に、少なくとも２つの潜在的なグリコシル化部位がある場合、ゼロ（０グリカン部位の占有）、一方（１グリカン部位の占有）、または両方（２グリカン部位の占有）のうちのいずれかが、炭水化物部分によって占有され得る。
【００９９】
「グリコシル化のパターン」は、タンパク質に共有結合している炭水化物単位のパターン（例えば、グリコフォーム）、および（１つまたは複数の）グリコフォームが、タンパク質のペプチド骨格、より具体的には免疫グロブリンタンパク質に共有結合している（１つまたは複数の）部位のパターンと定義する。
【０１００】
異なる細胞系によってか、またはトランスジェニック動物中で発現させた、抗体を含めて、タンパク質が、相互に比較した場合、異なるグリカン部位の占有、グリコフォーム、および／またはグリコシル化のパターンを示す可能性がある。しかし、本明細書が提供する核酸分子によってコードされる、または本明細書が提供するアミノ酸配列を含む、抗体を含めて、全ての糖タンパク質が、糖タンパク質のグリコシル化、グリカンの占有またはグリコフォームのパターンに関わらず、本発明の一部である。
【０１０１】
本明細書で使用する「グリコシル化阻害剤」または「グリコシル化阻害性化合物」という用語は、物質または化合物であって、当該物質または化合物の存在下で産生させたポリペプチドまたはタンパク質が、少なくとも１つの非グリコシル化部位を含むか、または当該物質もしくは化合物が存在しない点以外は同一の条件下の、それ以外は同一の細胞が産生する、それ以外は同一のポリペプチドもしくはタンパク質よりも少なくとも１つ少ない炭水化物部分を同じ部位に含むかのいずれかである物質または化合物を指す。グリコシル化阻害剤として、これらに限定されないが、ツニカマイシン、ツニカマイシン相同体、ストレプトビルジン、マイコスポシジン、アンフォマイシン、ツシマイシン、抗生物質２４０１０、抗生物質ＭＭ１９２９０、バシトラシン、コリネトキシン、ショードマイシン、ジュイマイシン、１−デオキシマンノノジリマイシン、デオキシノジリマイシン、Ｎ−メチル−１−デオキシマンノノジリマイシン、ブレフェルジンＡ、グルコースおよびマンノースの類似体、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシグルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（＋）ガラクトース、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース、１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−マンニトール（ＤＩＭ）、フルオログルコース、フルオロマンノース、ＵＤＰ−２−デオキシグルコース、ＧＤＰ−２−デオキシグルコース、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、２５−ヒドロキシコレステロール、ヒドロキシコレステロール、スウェインソニン、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、アクチノマイシンＤ、モネンシン、ｍ−クロロカルボニル−シアニドフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、コンパクチン、ドリチル−ホスホリル−２−デオキシグルコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ヒポキサンチン、チミジン、コレステロール、グルコサミン、マンノサミン、カスタノスペルミン、グルタミン、ブロモコンズリトール、コンズリトールエポキシドおよびコンズリトール誘導体、グリコシルメチル−ｐ−ニトロフェニルトリアゼン、β−ヒドロキシノルバリン、スレオ−β−フルオロアスパラギン、Ｄ−（＋）−グルコン酸δ−ラクトン、リン酸ジ（２−エチルヘキシル）、リン酸トリブチル、リン酸ドデシル、（ジフェニルメチル）−リン酸の２−ジメチルアミノエチルエステル、ヨウ化［２−（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ヨード酢酸、ならびに／またはフルオロアセテートが挙げられる。当業者であれば、過度の実験をせずとも、本発明の方法および組成物に従って使用することができるグリコシル化阻害性物質を容易に認識する、またはそれらを決定することができるであろう。
【０１０２】
本明細書で使用する「グリコシル化阻害量」という用語によって、物質または化合物の量であって、当該物質または化合物の存在下で産生させたポリペプチドまたはタンパク質が、当該物質または化合物の非存在下で産生させた、それ以外は同一のポリペプチドまたはタンパク質と比較して、グリコシル化の検出可能な減少を含む物質または化合物の量を意味する。したがって、ポリペプチドまたはタンパク質のいずれかは、当該物質または化合物が存在しない点以外は同一の条件下の細胞が産生する、それ以外は同一のポリペプチドまたはタンパク質よりも、同じ潜在的なグリコシル化部位において、少なくとも１つ多い非グリコシル化部位（占有されていないグリカン部位）を含むか、または少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む。
【０１０３】
「グリコシル化の減少」、「より少ないグリコシル化」または「グリコシル化の阻害」は、本明細書では互換的に使用し、これらは、ポリペプチドまたはタンパク質が、グリコシル化阻害性の物質または化合物が存在しない点以外は同一の条件下の細胞が産生する、それ以外は同一のポリペプチドもしくはタンパク質よりも、同じ潜在的なグリコシル化部位において、少なくとも１つ多い非グリコシル化（すなわち、アグリコシル化）部位、すなわち、全く占有されておらず、それには炭水化物部分が全くつながっていないグリカン部位を含む、または少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む場合を包含する。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語によって、細胞に投与した場合、対象とする物質または化合物が存在しない点以外は同一の条件下の、それ以外は同一の細胞が産生する、それ以外は同一のポリペプチドまたはタンパク質のグリコシル化と比較して、細胞が産生した当該ポリペプチドまたはタンパク質のグリコシル化の検出可能な減少を媒介する量を意味する。ポリペプチドまたはタンパク質のグリコシル化は、例えば、本明細書に開示する方法等を含めて、当技術分野でよく知られている多数の方法によって判定することができる。
【０１０５】
当業者であれば、本明細書において投与する化合物または組成物の有効量は変化し、細胞型、ポリペプチドまたはタンパク質の中の潜在的なグリコシル化部位の数、使用する細胞培養条件等のいくつかの要因に基づいて容易に決定することができることを理解するであろう。
【０１０６】
抗体、またはリガンド：受容体の結合対に関して本明細書で使用する場合、「競合する」という用語によって、第１の抗体もしくはその抗原結合部分、または受容体タンパク質が、第２の抗体もしくはその抗原結合部分、または受容体タンパク質の同族リガンドと、結合について競合し、第１の抗体の、その同族エピトープとの結合が、第２の抗体の非存在下における第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下において検出可能に減少することを意味する。それに代わって、第２の抗体のそのエピトープに対する結合も、第１の抗体の存在下において検出可能に減少することは必要とされなくてもよい。したがって、第２の抗体が、第１の抗体のそのそれぞれのエピトープに対する結合を阻害することなく、第１の抗体は、第２の抗体のそのエピトープに対する結合を阻害することができる。しかし、各抗体が、他方の抗体の、その同族エピトープまたはリガンドとの結合を、同じ、より多くまたはより少なくのいずれの程度にしろ、検出可能に阻害する場合、抗体は、それらのそれぞれの（１つまたは複数の）エピトープの結合について相互に「クロス競合する（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）」といわれる。例えば、クロス競合する抗体は、エピトープまたはエピトープの一部に結合することができ、それらに対して、本発明の抗体が結合する。競合する抗体およびクロス競合する抗体の両方が、本発明によって包含される。そのような競合またはクロス競合が生じる機構（例えば、立体障害、立体構造の変化、または共通のエピトープもしくはその一部に対する結合等）に関わらず、当業者であれば、本明細書に提供する教示に基づいて、そのような競合する抗体および／またはクロス競合する抗体は、包含され、本明細書に開示する方法のために有用である場合があることを理解するであろう。
【０１０７】
本明細書で使用する「指示材料」という用語は、本明細書に列挙する種々の疾患もしくは障害に影響を及ぼす、それらを軽減もしくは治療するため、または本明細書に開示する新規な方法を使用するためのキット中の本発明の方法、化合物、組合せおよび／または組成物の有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、図表または任意のその他の表現媒体を含む。場合によりまたはそれに代わって、指示材料は、本発明のタンパク質を使用する本明細書において他の箇所で開示するものを含めて、治療用タンパク質を産生するおよび／または細胞、組織もしくは哺乳動物における疾患もしくは障害を軽減する、１つまたは複数の方法を記載することもできる。
【０１０８】
キットの指示材料は、例えば、本発明の化合物および／もしくは組成物を含有する容器に添付しても、または化合物および／もしくは組成物を含有する容器と一緒に出荷してもよい。あるいは、指示材料は、レシピエントが指示材料と化合物とを協同させて使用することを意図して、容器と別々に出荷してもよい。
【０１０９】
別段の記載がない限り、「患者」または「対象」という用語は、互換的に使用し、ヒト患者および非ヒト霊長類等の哺乳動物や、ウサギ、ラットおよびマウスならびにその他の動物等の動物対象を指す。好ましくは、患者はヒトを指す。
【０１１０】
従来の表記法が、ポリペプチド配列を表現するために、本明細書では使用される。すなわち、ポリペプチド配列の左手側の端が、アミノ末端であり、ポリペプチド配列の右手側の端が、カルボキシル末端である。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」という句によって、化合物、例えば、タンパク質、核酸、抗体等を意味し、これらは、試料中で、特異的な分子を認識し、それに結合するが、その他の分子に対する認識および結合は実質的に起こさない。例えば、試料中の同族リガンドまたは結合パートナーを認識し、それに結合する抗体またはペプチド受容体（例えば、その同族抗原であるＩｇＥと結合する抗ＩｇＥ抗体、または終末糖化産物受容体［ＲＡＧＥ］とアミロイドベータペプチドもしくはＳ１００等のそのリガンドのうちの１つ）は、しかし、試料中のその他の分子に対する認識および結合は実質的に起こさない。したがって、指定したアッセイ条件下では、特定した結合部分（例えば、抗体もしくはその抗原結合部分、または受容体もしくはそのリガンド結合部分）は、特定の標的分子に優先的に結合するが、試験試料中に存在するその他の構成成分とは顕著な量では結合しない。多様なアッセイフォーマットを使用して、対象とする分子に特異的に結合する抗体またはペプチドを選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＦＡＣＳ、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）、およびウエスタンブロット解析が、抗原と特異的に反応する抗体、または同族リガンドもしくは結合パートナーと特異的に結合する受容体もしくはそのリガンド結合部分を同定するために使用することができる多くのアッセイに属する。典型的には、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドのシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的には、バックグラウンドの１０倍超であり、さらにより具体的には、平衡解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、好ましくは、≦１００ｎＭ、最も好ましくは、≦１０ｎＭである場合に、抗体が抗原に「特異的に結合する」といわれている。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋な」は、対象の種が、最も多く存在する種である（すなわち、組成中の任意のその他の個々の種よりもモル単位で多い）ことを意味し、好ましくは、実質的に精製された画分は、対象の種（例えば、抗体または受容体を含めた、糖タンパク質）が、存在する全ての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モル単位）を含む組成である。一般に、実質的に純粋な組成は、組成中に存在する全ての巨大分子種の約８０パーセント超、より好ましくは、約８５％、９０％、９５％および９９％超を含む。最も好ましくは、対象の種は、本質的な均一性（混入物質の種を、従来の検出方法によっては組成中に検出することができない）まで精製されており、組成は、単一の巨大分子種から本質的になる。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、「治療する」は、患者が経験する疾患の症状（すなわち、腫瘍の増殖および／もしくは転移、または免疫細胞の数および／もしくは活性によって媒介されるその他の作用等）の頻度を低下させることを意味する。この用語は、本発明の化合物または物質を投与して、疾患の症状、合併症または生化学的な徴候の発症を予防するかまたは遅延させて、症状を軽減すること、または疾患、状態もしくは障害のさらなる発展を停止させるもしくは阻害することを含む。治療は、予防（疾患の発症を予防するもしくは遅延させること、またはその臨床的もしくは亜臨床的な症状の顕在化を予防すること）であっても、または疾患が顕在化した後に、症状を抑制するもしくは軽減させる療法であってもよい。
【０１１４】
「併用療法」は、第１の治療剤および別の治療剤の投与であって、これらの治療剤の共同作用から有益な効果をもたらすことを意図する、維持相を場合により含む特異的な治療計画の部分としての投与を包括する。併用の有益な効果として、これに限定されないが、治療剤を組み合わせた結果生じる薬物動態学的または薬動力学的な共同作用が挙げられる。これらの治療剤を組み合わせた投与は典型的には、定義した期間（選択された組合せに依存して、通常、数分、数時間、数日または数週）にわたって実施される。「併用療法」は一般に、これらの治療剤のうちの２つ以上を、結果として、本発明の組合せを偶然かつ独断的に生じる別々の単独療法投与計画の部分として投与することを包含することは意図しない。
【０１１５】
「併用療法」は、これらの治療剤を順次に投与すること、すなわち、各治療剤を、異なる時期に投与すること、およびこれらの治療剤または治療剤のうちの少なくとも２つを実質的に同時に投与することを包括する。各治療剤の順次投与または実質的に同時の投与は、これらに限定されないが、経口経路、静脈内経路、筋肉内、皮下経路、および粘膜組織を通しての直接的な吸収を含めた、任意の適切な経路によってもたらすことができる。治療剤は、同じ経路または異なる経路によって投与することができる。例えば、第１の治療剤（例えば、化学療法剤）は経口投与することができ、第２の物質（例えば、抗体またはその他の糖タンパク質）は、静脈内投与することができる。さらに、選択された組合せの第１の治療剤は、静脈内注射によって投与することができ、一方、組合せの他方の治療剤は、経口投与することもできる。あるいは、例えば、治療剤の両方を、静脈内または皮下からの注射によって投与することもできる。
【０１１６】
本明細書では、「順次」という用語は、別段の記載がない限り、規則的な配列または順番によって特徴付けられることを意味する。例えば、投与計画が、治療用タンパク質（例えば、抗体、糖タンパク質等）および化学療法剤の投与を含む場合には、順次の投与計画は、化学療法剤の投与の前、同時に、実質的に同時または後に治療用タンパク質を投与することを含むことができるであろうが、両方の物質が、規則的な配列または順番で投与される。「別々の」という用語は、別段の記載がない限り、相互に間隔を置くことを意味する。「同時」という用語は、別段の記載がない限り、同じ時期に生じるまたは行われること、すなわち、本発明の化合物を同じ時期に投与することを意味する。「実質的に同時」という用語は、化合物を相互に数分以内（例えば、相互に１０分以内）に投与することを意味し、一緒に投与することおよび連続的に投与することを包括することを意図するが、投与が連続的な場合には、投与の間隔は、ごく短い期間（例えば、医師が、２つの化合物を別々に投与するために要する時間）に限られる。本明細書で使用する場合、同時的な投与と実質的に同時の投与とは互換的に使用する。順次投与は、治療用タンパク質と化学療法剤とを時間的に別々に投与することを指す。
【０１１７】
また、「併用療法」は、上記の治療剤を、その他の生物学的に活性な成分（これらに限定されないが、第２のかつ異なる治療用タンパク質、ワクチン等）、および非薬物療法（これらに限定されないが、手術または放射線治療等）とさらに組み合わせて投与することも包括することができる。併用療法が放射線治療をさらに含む場合、治療剤と放射線治療との併用の共同作用から有益な効果が達成される限り、放射線治療は、任意の適切な時期に実施してよい。例えば、適切な場合には、放射線治療を治療剤の投与から一時的に、おそらく数日または数週間もの間除去しても、有益な効果が依然として達成される。
【０１１８】
本明細書で使用する「回分培養」という用語は、培地を含めた、細胞を培養する場合に最終的に使用する全ての構成成分、および細胞自体を、培養プロセスの始めに提供する細胞培養の方法を指す。典型的には、回分培養を何らかの時点で停止し、培地中の細胞および／または構成成分を収集し、場合により精製する。
【０１１９】
「バイオリアクター」は、細胞培養物の増殖のために有用な任意の槽を包含する。バイオリアクターは、細胞の培養のために有用である限り、いずれのサイズであってもよい。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上、またはそれらの間の任意の容積であってよい。これらに限定されないが、ｐＨおよび温度を含めた、バイオリアクターの内部条件を、培養期間の間、場合により制御する。バイオリアクターは、ガラス、プラスチックまたは金属を含めて、本発明の培養条件下の培地中に懸濁させた細胞培養物を保持するために適している任意の材料でできていてよい。本明細書で使用する場合、「生産用バイオリアクター」という用語は、対象とするポリペプチドまたはタンパク質を生産する場合に使用する最終のバイオリアクターを指す。生産用バイオリアクターの容積は典型的には、少なくとも５００リットルであり、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上、またはそれらの間の任意の容積であってよい。当業者であれば、本発明を実行する場合に使用するための適切なバイオリアクターが分かり、それらを選ぶことができるであろう。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、「細胞密度」という用語によって、所与の容積の培地中に存在する細胞の数を意味する。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、「細胞生存率」は、培地中の細胞が所与の一連の培養条件または実験的な変動の下で生存する能力を指す。また、本明細書で使用する場合、この用語は、特定の時期における培地中の生存細胞および死滅細胞の総数に対する、その時期において生存する細胞の部分も指す。
【０１２２】
本明細書で使用する「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「細胞培養の培地（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」および「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」というこれらの用語は、増殖細胞に栄養を与える栄養素を含有する溶液を指す。特定の実施形態では、培地は、哺乳動物細胞を増殖するために有用である。典型的には培地は、最低限の増殖および／または生存のために細胞が必要とする必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質ならびに微量元素を提供する。また、培地は、最低速度を上回る増殖および／または生存を増強する補助的な構成成分も含有してよく、それらとして、これらに限定されないが、ホルモンおよび／もしくはその他の増殖因子、（ナトリウム、塩素、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸等の）特定のイオン、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、ならびに／またはグルコースもしくはその他のエネルギー源が挙げられる。特定の実施形態では、培地を好都合に処方して、細胞の生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度とする。特定の実施形態では、培地は、細胞培養開始後に添加する補給培地である。特定の実施形態では、細胞培養の培地は、出発栄養溶液と、細胞培養開始後に添加する任意の補給培地との混合物となる。
【０１２３】
本明細書で使用する「複合培地」という用語は、その身元または分量が、分かっていないかまたは制御されていないかのいずれかである少なくとも１つの構成成分を含有する培地を指す。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、「培養物」および「細胞培養物」という用語は、細胞集団であって、その生存および／または増殖に適している条件下の（本明細書の他の箇所で定義する）培地中に懸濁させた細胞集団を指す。当業者であれば明らかとなるであろうが、また、本明細書で使用する場合、これらの用語は、細胞集団と細胞集団を懸濁させた培地とを含む組合せも指す。特定の実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物の細胞培養物である。
【０１２５】
本明細書で使用する「既知組成培地」という用語は、培地の組成が、分かっておりかつ制御されている培地を指す。
【０１２６】
本明細書で使用する場合、「流加培養」という用語によって、培養プロセスを開始した後に、追加の構成成分を培養物に１または複数回提供する、細胞を培養する方法を包含することを意味する。提供する構成成分は典型的には、培養プロセスの間に枯渇してしまった、細胞にとっての栄養補給物質を含む。それに加えてまたはそれに代わって、追加の構成成分は、（本明細書の他の箇所で定義する）補助的な構成成分を含むこともできる。特定の実施形態では、追加の構成成分を、補給培地として提供することができる。典型的には、流加培養を何らかの時点で停止し、培地中の細胞および／または構成成分を収集し、場合により精製する。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「改変した流加培養プロセス」または「混合モードの培養プロセス」という用語によって、接種段階および／または最終のバイオリアクターにおける生産段階の間に灌流プロセスおよび／または回分プロセスおよび／または流加プロセスの組合せを使用する、細胞を培養する方法を包含することを意味する。論じられている例示的な改変した流加プロセスが、これに限定されないが、米国特許出願公開第ＵＳ２００９／００４２２５３号（２００９年２月１２日公開）中のプロセスであり、この全体が、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「補給培地」は、細胞培養開始後に添加する、増殖哺乳動物細胞に栄養を与える栄養素を含有する溶液を指す。補給培地は、最初の細胞培養の培地中に提供したものと同一の構成成分を含有することができる。あるいは、補給培地は、最初の細胞培養の培地中に提供したもの以外の１つまたは複数の追加の構成成分を含有してもよい。それに加えてまたはそれに代わって、補給培地は、最初の細胞培養の培地中に提供した１つまたは複数の構成成分を欠いてもよい。特定の実施形態では、補給培地の１つまたは複数の構成成分を、それらの構成成分を最初の細胞培養の培地中に提供した濃度またはレベルと同一またはそれらに類似の濃度またはレベルで提供する。特定の実施形態では、補給培地の１つまたは複数の構成成分を、それらの構成成分を最初の細胞培養の培地中に提供した構成成分の濃度またはレベルとは異なる濃度またはレベルで提供する。特定の実施形態では、補給培地は、補助的な構成成分を含有する。
【０１２９】
本明細書で使用する「補助的な構成成分」という用語によって、最低速度を上回る増殖および／または生存を増強する構成成分を包含し、それらとして、これらに限定されないが、ホルモンおよび／もしくはその他の増殖因子、（ナトリウム、塩素、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸等の）特定のイオン、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、ならびに／またはグルコースもしくはその他のエネルギー源が挙げられる。特定の実施形態では、補助的な構成成分を最初の細胞培養物に添加する。特定の実施形態では、補助的な構成成分を細胞培養開始後に添加する。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、「断片」という用語によって、ポリペプチドについて言及し、これを、そのポリペプチドに独特または特徴的である、所与のポリペプチドの任意の個別の部分と定義する。また、本明細書で使用する場合、この用語は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持する、所与のポリペプチドの任意の個別の部分も指す。特定の実施形態では、保持される活性の一部は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。特定の実施形態では、保持される活性の一部は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。特定の実施形態では、保持される活性の一部は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。特定の実施形態では、保持される活性の一部は、完全長ポリペプチドの活性の１００％以上である。それに代わってまたはそれに加えて、また、本明細書で使用する場合、この用語は、完全長ポリペプチド中に見い出される確立された配列エレメントを少なくとも含む、所与のポリペプチドの任意の部分も指す。いくつかの実施形態では、配列エレメントは、完全長ポリペプチドの少なくとも約４〜５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個以上のアミノ酸にわたる。
【０１３１】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、任意のヌクレオチド配列、ＤＮＡまたはＲＮＡを指し、それらの少なくとも何らかの部分が、個別の最終産物、典型的には、これに限定されないが、ポリペプチドをコードする。場合により、この用語は、ポリペプチドまたはその他の個別の最終産物をコードするコード配列を指すのみならず、また、発現の基礎レベルを調節する、コード配列に先行するおよび／もしくは続く領域（以下の「遺伝子調節エレメント」の定義を参照されたい）、ならびに個々のコードセグメント（「エクソン」）間の介在配列（「イントロン」）を包含することもできる。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、「遺伝子調節エレメント」という用語によって、遺伝子産物の発現を調節する、遺伝子に動作可能に連結している任意の配列エレメントを指す。遺伝子調節エレメントは、遺伝子産物の発現レベルを増加させるかまたは減少させるかのいずれかによって機能することができ、コード配列の前、内部また後に位置することができる。遺伝子調節エレメントは、遺伝子発現の任意の段階において、例えば、転写の開始、伸長もしくは終結、ｍＲＮＡのスプライシング、ｍＲＮＡの編集、ｍＲＮＡの安定性、ｍＲＮＡの細胞内部における局在化、翻訳の開始、伸長もしくは終結、または遺伝子発現の任意のその他の段階を調整することによって作用することができる。遺伝子調節エレメントは、個々または相互に組み合わさって機能することができる。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、本発明に従って培地中で増殖させて、対象とするタンパク質またはポリペプチドを産生させる細胞を指す。特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。
【０１３４】
本明細書で使用する「ハイブリドーマ」という用語によって、不死化細胞と抗体産生細胞とを融合させた結果生じる細胞または細胞の子孫を包含することを意味する。得られたハイブリドーマは、抗体を産生する不死化細胞である。ハイブリドーマを生み出すために使用する個々の細胞は、任意の哺乳動物源に由来することができ、それらとして、これらに限定されないが、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ヤギおよびヒトが挙げられる。また、この用語は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）細胞系も包含し、これは、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞系との間の融合産物であるヘテロハイブリッド骨髄腫融合体の子孫を、続いて、血漿細胞と融合させた結果生じる。さらに、この用語は、抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞系、例えば、クアドローマ等を含むことも意味する（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ  ５３７：３０５３を参照されたい）。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して一緒になって連結しているアミノ酸の連続した鎖を指す。この用語を使用して、任意の長さのアミノ酸を指すが、当業者であれば、この用語は、長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して一緒になって連結している２つのアミノ酸を含む最短の鎖を指すこともできることを理解するであろう。当業者に知られているように、ポリペプチドは、処理および／改変され得る。例えば、ポリペプチドは、グリコシル化され得る。本発明に従って発現させようとするポリペプチドは、治療用ポリペプチドとなり得る。治療用ポリペプチドは、身体内の領域または身体の領域に対して生物学的な作用を示すポリペプチドであり、そうした領域に対して作用するか、またはそうした領域に対して中間体を介して遠く離れて作用する。治療用ポリペプチドの例について、以下により詳細に論じる。
【０１３６】
本明細書で使用する「タンパク質」という用語は、個別の単位として機能する１つまたは複数のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが、個別の機能単位であり、個別の機能単位を形成するために、その他のポリペプチドとの持続性のまたは一時的な物理的な関わりを必要としない場合には、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に使用することができる。個別の機能単位が、相互に物理的に関わる複数のポリペプチドで構成される場合には、本明細書で使用する場合、「タンパク質」という用語は、物理的にカップルし、個別の単位として一緒になって機能する複数のポリペプチドを指す。本発明に従って発現させようとするタンパク質は、タンパク質治療剤となり得る。タンパク質治療剤は、身体内の領域または身体の領域に対して生物学的な作用を示すタンパク質であり、そうした領域に対して作用するか、またはそうした領域に対して中間体を介して遠く離れて作用する。タンパク質治療剤の例について、以下により詳細に論じる。
【０１３７】
本明細書で使用する場合、「組換えによって発現させたポリペプチド」および「組換えポリペプチド」は、そうしたポリペプチドを発現させるために操作されている宿主細胞から発現したポリペプチドを指す。特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、この操作は、１つまたは複数の遺伝子の改変を含むことができる。例えば、発現させようとするポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種の遺伝子を導入することによって、宿主細胞の遺伝子を改変することができる。異種の組換えによって発現させたポリペプチドは、宿主細胞中で通常発現するポリペプチドと同一であっても、またはそれに類似してもよい。また、異種の組換えによって発現させたポリペプチドは、宿主細胞にとって外来性であってもよく、例えば、宿主細胞中で通常発現するポリペプチドとは異種である。特定の実施形態では、異種の組換えによって発現させたポリペプチドは、キメラである。例えば、ポリペプチドの一部が、宿主細胞中で通常発現するポリペプチドと同一であるまたはそれに類似するアミノ酸配列を含有してよく、一方、その他の部分は、宿主細胞にとって外来性であるアミノ酸配列を含有する。それに加えてまたはそれに代わって、ポリペプチドは、いずれもが宿主細胞中で通常発現する、２つ以上の異なるポリペプチド由来のアミノ酸配列を含有してもよい。さらに、ポリペプチドは、いずれもが宿主細胞にとって外来性である、２つ以上のポリペプチド由来のアミノ酸配列を含有してもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞の遺伝子を、１つまたは複数の内因性の遺伝子の活性化または上方制御によって改変する。
【０１３８】
本明細書で使用する「タイター」という用語によって、所与の量の培地容積中の細胞培養物が産生した、組換えによって発現させたポリペプチドまたはタンパク質の総量を意味する。タイターは典型的には、培地１ミリリットル当たりのポリペプチドまたはタンパク質のミリグラムまたはマイクログラムの単位で表す。
【０１３９】
グリコシル化の制御プロセス
本発明は、グリコシル化タンパク質および／またはグリコシル化ポリペプチドを細胞培養によって産生させるための方法および培地処方の改善を提供し、タンパク質またはポリペプチドは、グリコシル化の減少を含む。特定の実施形態では、本発明は、細胞培養物中のタンパク質のグリコシル化を低下させる方法を提供する。
【０１４０】
以前の研究から、代謝老廃物である乳酸が、細胞の増殖、生存率、および／またはタンパク質の産生もしくは質に対して有害であることが実証されている。また、以前の研究から、培養期間全体を通して低いグルコースレベルを維持することによって、細胞培養物中の乳酸レベルを低く保って、解糖を低下させることができることも実証されている。（Ｃｒｕｚら、１９９９、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６６：１０４〜１１３）。しかし、グルコースレベルを連続的にモニターし、加減することは、タンパク質またはポリペプチドの大規模生産の場合には実用的ではないことから、以前の研究から、解糖阻害性物質を細胞培養の培地に添加することによって、解糖を低下させて、タンパク質の産生を改善することができることが実証されている（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８３４７３号、２００８年５月８日にＷＯ２００８／０５５２６０として公開）。より具体的には、解糖阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースを添加することによって、細胞培養の培地中の乳酸レベルが減少し、また、特定の濃度の場合には、細胞による対象とするタンパク質の産生も増加したことが示されている。
【０１４１】
本発明は、細胞培養によってグリコシル化を減少させることを含む、糖タンパク質および／またはポリペプチドを産生させるための方法および培地処方の改善を提供し、これによって、培地中のグルコースレベルを連続的にモニターし、加減する必要性が不要になる。本発明は、グリコシル化の減少を含む、糖タンパク質またはポリペプチドを産生させるための方法および培地処方の改善を提供し、糖タンパク質またはポリペプチドは、リガンド結合部位または抗原結合部位の中に潜在的なグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、グリコシル化の減少を含む糖タンパク質またはポリペプチドは、これに限定されないが、同族リガンドまたは結合パートナーとの結合の改善（例えば、特異性および／またはアビディティーの増加）を含めて、生物学的特徴の改善を示す。特定の実施形態では、細胞培養は、回分培養または流加培養である。
【０１４２】
本発明の特定の組成物は、グリコシル化阻害性物質を含む細胞培養の培地を含む。特定の実施形態では、そのようなグリコシル化阻害性物質は、ツニカマイシン、ツニカマイシン相同体、ストレプトビルジン、マイコスポシジン、アンフォマイシン、ツシマイシン、抗生物質２４０１０、抗生物質ＭＭ１９２９０、バシトラシン、コリネトキシン、ショードマイシン、ジュイマイシン、１−デオキシマンノノジリマイシン、デオキシノジリマイシン、Ｎ−メチル−１−デオキシマンノノジリマイシン、ブレフェルジンＡ、グルコースおよびマンノースの類似体、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシグルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（＋）ガラクトース、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース、１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−マンニトール（ＤＩＭ）、フルオログルコース、フルオロマンノース、ＵＤＰ−２−デオキシグルコース、ＧＤＰ−２−デオキシグルコース、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、２５−ヒドロキシコレステロール、ヒドロキシコレステロール、スウェインソニン、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、アクチノマイシンＤ、モネンシン、ｍ−クロロカルボニル−シアニドフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、コンパクチン、ドリチル−ホスホリル−２−デオキシグルコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ヒポキサンチン、チミジン、コレステロール、グルコサミン、マンノサミン、カスタノスペルミン、グルタミン、ブロモコンズリトール、コンズリトールエポキシドおよびコンズリトール誘導体、グリコシルメチル−ｐ−ニトロフェニルトリアゼン、β−ヒドロキシノルバリン、スレオ−β−フルオロアスパラギン、Ｄ−（＋）−グルコン酸δ−ラクトン、リン酸ジ（２−エチルヘキシル）、リン酸トリブチル、リン酸ドデシル、（ジフェニルメチル）−リン酸の２−ジメチルアミノエチルエステル、ヨウ化［２−（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ヨード酢酸、ならびに／またはフルオロアセテートを含む。当業者であれば、本明細書に提供する教示を頼りに、Ｎ−連結性グリコシル化、Ｏ−連結性グリコシル化または両方のいずれかを阻害する、多数の有用である可能性があるグリコシル化阻害剤が当技術分野では知られており、本発明の新規な方法においてそれらの用途についてアッセイすることができることを理解するであろう。例えば、Ｅｌｂｅｉｎ、１９８５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９８：１３５〜１５４；Ｅｌｂｅｉｎ、１９８７、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：４９７〜５３４を参照されたい。
【０１４３】
いくつかの実施形態によれば、細胞培養によって産生させた組換えタンパク質のグリコシル化レベル（例えば、タンパク質上またはペプチド上の占有されているグリカン部位の数、当該部位におけるグリコフォームのサイズおよび／または複雑さ等）は、そのような解糖阻害性物質を欠く点以外は同一の培地中で、それ以外は同一の条件下で産生させたタンパク質のグリコシル化レベルよりも低い。いくつかの実施形態によれば、培養物のグリコシル化レベルは、そのようなグリコシル化阻害性物質を欠く点以外は同一の培地中で、それ以外は同一の条件下で産生させたグリコシル化レベルよりも低い。
【０１４４】
本発明のその他の実施形態について、以下に詳細に論じる。しかし、当業者であれば、これらの実施形態の種々の改変形態が、添付の特許請求の範囲に属することを理解するであろう。本発明の範囲を定義するのは、特許請求の範囲およびその等価物であり、本発明の範囲は、特定の実施形態にも、特定の実施形態のこの説明によっても限定されてはならない。
【０１４５】
細胞
細胞培養に、かつタンパク質またはポリペプチドの発現に感受性である任意の宿主細胞を、本発明に従って活用することができる。特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物である。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系が、当技術分野ではよく知られており、それらには、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系が含まれ、それらとして、これらに限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、およびヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。本発明に従って使用することができる哺乳動物細胞のその他の非限定的な例として、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ））；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；浮遊培養増殖用のヒト胚性腎臓系の２９３細胞または２９３細胞のサブクローン（Ｇｒａｈａｍら、１９７７、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、１９８０、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒら、１９８２、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝細胞腫系（Ｈｅｐ  Ｇ２）；ならびにこれらに限定されないが、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（ＮＳ０／１、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）、ＮＳ０細胞およびＳｐ２／０細胞を含めた、多数の骨髄腫細胞系が挙げられる。
【０１４６】
さらに、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する、多数の市販されているおよび市販されていないハイブリドーマ細胞系を本発明に従って活用することができる。当業者であれば、ハイブリドーマ細胞系は、異なる栄養必要量を有する場合があり、かつ／または最適な増殖およびポリペプチドもしくはタンパク質の発現のためには、異なる培養条件を必要とする場合があろうことを理解し、必要に応じて条件を改変することができるであろう。
【０１４７】
本発明は、対象とするタンパク質を産生するための、当技術分野で知られているまたは本明細書に開示する任意の真核生物の発現系、例として、昆虫細胞系における発現、酵母発現系、またはこれに限定されないが、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞系を含む。すなわち、通常であれば産生するタンパク質がグリコシル化され、（Ｎ−連結性および／またはＯ−連結性の）グリコシル化の減少が望まれる任意の細胞培養系を、本発明の新規な方法において使用することができる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、酵母発現系を使用し、グリコシル化阻害剤を使用するグリコシル化の制御によって、Ｎ−連結性、Ｏ−連結性または両方の型のグリコシル化を減少させるかまたは排除する。これは、酵母系が望まれないＮ−連結性グリコシル化、およびより特定するとＯ−連結性グリコシル化を媒介することができることから、特に有用である。したがって、本明細書に開示する新規な方法は、酵母中で、Ｎ−連結性グリコシル化および／またはＯ−連結性グリコシル化のレベルが減少したタンパク質を産生させるための有用な方法を提供する。これによって産生したグリコシル化が少ないまたはアグリコシル化されたタンパク質は、これらに限定されないが、不均一性の低下、改善されたバッチ／ロットの結果のより標準化されたプロファイル、結合の特徴の改善等の有用な特徴を示すことができる。
【０１４９】
使用することができるその他の細胞系は、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞系である。植物の宿主細胞として、例えば、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ等が挙げられる。細菌の宿主細胞には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種がある。酵母の宿主細胞には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）がある。
【０１５０】
対象とするタンパク質をコードする核酸分子の発現ベクターは、これらの核酸分子を含み、適切な哺乳動物、植物、細菌または酵母の宿主細胞にトランスフェクトするために使用することができる。任意の既知の方法により形質転換して、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することができる。異種のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入するための方法は、当技術分野ではよく知られており、それらには、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈殿法、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソーム中における（１つまたは複数の）ポリヌクレオチドの被包、およびＤＮＡの核内への直接的なマイクロインジェクションがある。さらに、核酸分子を、哺乳動物細胞内にウイルスベクターによって導入することもできる。植物細胞を形質転換する方法は、当技術分野ではよく知られており、例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、微粒子銃形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、およびウイルスによる形質転換が挙げられる。また、細菌細胞および酵母細胞を形質転換する方法も当技術分野ではよく知られている。
【０１５１】
また、発現ベクターを、発現系にＤＮＡ微粒子銃を使用して送達することもでき、プラスミドを、微細粒子、好ましくは金上に沈殿させ、これらの粒子を飛ばして標的の細胞内または発現系内に入れる。ＤＮＡ微粒子銃の技法は、当技術分野ではよく知られており、装置、例えば、「遺伝子銃」が、微小粒子を細胞内（例えば、Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）および皮膚内（ＰＭＥＤ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＰｏｗｄｅｒＭｅｄ  Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）に送達するために市販されている。
【０１５２】
産生細胞系からのタンパク質の発現を、いくつかの既知の技法を使用して増強することができる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）およびプラズマコードネオマイシン耐性系は、特定の条件下における発現を増強するための通常のアプローチである。
【０１５３】
上記で言及したように、多くの場合、対象とするタンパク質またはポリペプチドを高いレベルで産生させるために、細胞を選択または操作する。しばしば、例えば、対象とするタンパク質もしくはポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、かつ／または対象とするポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子（内因性のものでも、導入されたものでも）の発現を調整する調節エレメントを導入することによって細胞を操作して、高いレベルのタンパク質を産生させる。
【０１５４】
特定のポリペプチドが、細胞増殖、細胞生存率、または対象とするポリペプチドもしくはタンパク質の最終的な産生を何らかの形で制限する細胞のいくつかのその他の特徴に対して有害な作用を示す恐れがある。特異的なポリペプチドを発現させるために操作した１つの特定の型の細胞集団の間でさえ、細胞集団内における変動が存在する場合があり、その結果、特定の個々の細胞がより良好に増殖し、かつ／または対象とするポリペプチドをより多く産生する。特定の実施形態では、実行者が、細胞を培養するために選ばれた特定の条件下におけるロバストな増殖について細胞系を経験的に選択する。特定の実施形態では、特定のポリペプチドを発現させるために操作した個々の細胞が、大規模生産のために、細胞増殖、最終的な細胞密度、パーセント細胞生存率、発現したポリペプチドのタイター、またはこれらの任意の組合せ、または実行者が重要であるとみなす任意のその他の条件に基づいて選ばれる。
【０１５５】
細胞の培養
本発明は、ポリペプチドの発現に適している任意の細胞培養の方法または系と共に使用することができる。例えば、細胞を回分培養または流加培養において増殖させることができ、培養を、ポリペプチドを十分発現させた後で終了し、その後、発現したポリペプチドを収集し、場合により精製する。あるいは、細胞を灌流培養において増殖させることができ、培養を終了せず、新しい栄養素およびその他の構成成分を培地に定期的または連続的に添加し、その間に発現したポリペプチドを定期的または連続的に収集する。その他の実施形態では、細胞を米国特許出願公開第ＵＳ２００９／００４２２５３号に記載されているもの等の改変した流加培養のプロセスにおいて増殖させる。
【０１５６】
細胞は、実行者が選ぶ任意の都合のよい容積で増殖させることができる。例えば、細胞は、数ミリリットルから数リットルまでの容積範囲の小規模な反応槽中で増殖させることができる。あるいは、細胞は、およそ少なくとも１リットルから１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００もしくは１２，０００リットル以上、またはそれらの間の任意の容積までの容積範囲の大規模な業務用のバイオリアクター中で増殖させることができる。
【０１５７】
細胞培養の温度が、細胞培養物が生存可能な状態に維持される温度範囲、高いレベルのポリペプチドが産生される温度範囲、代謝老廃物の産生もしくは蓄積が最低限に留まる温度、および／またはこれらの任意の組合せ、または実行者が重要であるとみなすその他の要因に主として基づいて選択される。１つの非限定的な例として、およそ３７℃において、ＣＨＯ細胞が、良好に増殖し、高いレベルのタンパク質またはポリペプチドを産生する。一般に、約２５℃〜４２℃の範囲内で、ほとんどの哺乳動物細胞が、良好に増殖し、かつ／または高いレベルのタンパク質もしくはポリペプチドを産生することができるが、本開示が教示する方法は、これらの温度に限定されない。約３５℃〜４０℃の範囲内で、特定の哺乳動物細胞が、良好に増殖し、かつ／または高いレベルのタンパク質もしくはポリペプチドを産生することができる。特定の実施形態では、細胞培養物を、細胞培養プロセスの間に、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５℃の温度で、１または複数回増殖させる。当業者であれば、細胞の必要性および実行者の産生要件に依存して、細胞を増殖させるための適切な１つまたは複数の温度を選択することができるであろう。
【０１５８】
さらに、培養は、培養過程の間に１つまたは複数の温度シフトを経ることができる。培養温度をシフトさせる場合、温度シフトは、比較的徐々であってよい。例えば、温度変化を完了するために数時間または数日を要する場合がある。あるいは、温度シフトは、比較的急激であってもよい。温度を、培養プロセスの間に着実に増加または減少させることができる。あるいは、温度を、培養プロセスの間に種々の時期において個別の量だけ増加または減少させることもできる。それに続く（１つもしくは複数の）温度または（１つもしくは複数の）温度範囲が、最初または以前の（１つもしくは複数の）温度または（１つもしくは複数の）温度範囲よりも、低くてもまたは高くてもよい。当業者であれば、これらの実施形態では、複数の個別の温度シフトが包含されることを理解するであろう。例えば、温度を（より高いまたはより低い温度または温度範囲のいずれかまで）１回シフトさせ、細胞を特定の期間にわたってこの温度または温度範囲において維持することができ、この後、温度を新しい温度または温度範囲まで再度シフトさせることができ、この温度は、以前の温度または温度範囲の温度または温度範囲よりも低いかまたは高いかのいずれかであってよい。それぞれの個別のシフトの後の培養温度は、一定であってもよく、または特定の範囲の温度内に維持してもよい。
【０１５９】
初期の温度または温度範囲に関しては、（１つまたは複数の）温度シフト後の細胞培養の温度または温度範囲が、細胞培養物が生存可能な状態に維持される（１つもしくは複数の）温度、高いレベルのポリペプチドもしくはタンパク質が産生される範囲、代謝老廃物の産生もしくは蓄積が最低限に留まる範囲、および／またはこれらの任意の組合せ、または実行者が重要であるとみなすその他の要因に主として基づいて選択される。一般に、約２５℃〜４２℃の範囲内で、ほとんどの哺乳動物細胞が、生存可能な状態に維持され、高いレベルのタンパク質またはポリペプチドを産生するが、本開示が教示する方法は、これらの温度に限定されない。特定の実施形態では、約２５℃〜３５℃の範囲内で、哺乳動物細胞が、生存可能な状態に維持され、高いレベルのタンパク質またはポリペプチドを産生する。特定の実施形態では、細胞培養物を、（１つまたは複数の）温度シフト後に、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５℃の温度で、１または複数回増殖させる。当業者であれば、細胞の特定の必要性および実行者の特定の産生要件に依存して、（１つまたは複数の）温度シフト後に細胞を増殖させるための適切な（１つもしくは複数の）温度または（１つもしくは複数の）温度範囲を選択することができるであろう。実行者の必要性および細胞自体の要件に依存して、細胞を任意の量の時間にわたって増殖させることができる。当業者であれば、使用する細胞系の特長、産生させようとするタンパク質もしくはポリペプチドの特長、培地中のその他の構成成分の有無、または実験および／もしくはその他の必要性から望まれる任意のその他の要因に基づいて、培養をより低い温度までシストさせる的確な時点を選択することができるであろう。
【０１６０】
特定の実施形態では、細胞培養物を約３２℃〜約４２℃の範囲の温度で増殖させ、温度を約２５℃〜約３１℃までシストさせ、より好ましくは、細胞培養物を約３３℃〜約３７℃の範囲の温度で増殖させ、温度を約２８℃〜約３１℃までシフトさせ、その上より好ましくは、細胞培養物を約３４℃〜３７℃の範囲の温度で増殖させ、温度を約２９℃〜約３１℃までシフトさせ、より好ましくは、細胞培養物を約３４℃の温度で増殖させ、温度を約３１℃までシフトさせる。
【０１６１】
特定の実施形態では、回分反応および流加反応を、発現したポリペプチドが、実行者の必要性によって決定された十分に高いタイターに達した時点で終了する。非限定的な例として、細胞培養は、ポリペプチドのタイターが１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００または２０００ｍｇ／Ｌ以上である場合に終了することができる。当業者であれば、回分培養および／または流加培養を収集することができる１つまたは複数の適切なタイターを選択することができるであろう。それに加えてまたはそれに代わって、回分反応および流加反応を、細胞が、実行者の必要性によって決定された十分に高い密度に達した時点で終了する。例えば、培養は、細胞が最大生存細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントに達した時点で終了することができる。
【０１６２】
特定の実施形態では、回分細胞培養および／または流加細胞培養を終了して、乳酸およびアンモニウム等の代謝老廃物の望ましくない産生または蓄積を予防する。特定の実施形態では、細胞培養を、培地中に乳酸が望ましくないレベルまで蓄積する前に終了する。非限定的な例として、細胞培養を、乳酸が８、７、６、５、４、３、２または１ｇ／Ｌに達する前に終了することができる。
【０１６３】
特定の実施形態では、回分反応および流加反応を、細胞密度が、実行者の必要性によって決定された十分に高いレベルに達した時点で終了する。例えば、細胞培養を、細胞密度が１ｍＬ当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２×１０６細胞以上に達した時点で終了することができる。特定の実施形態では、回分反応および流加反応を、細胞密度が１ｍＬ当たり１×１０６細胞に達する前に終了する。
【０１６４】
特定の場合には、その後の産生相の間に、枯渇してしまったまたは細胞によって代謝されてしまった栄養素またはその他の培地の構成成分を、細胞培養物に補うことが有益または必要である場合がある。非限定的な例として、ホルモンおよび／もしくはその他の増殖因子、（ナトリウム、塩素、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸等の）特定のイオン、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、またはグルコースもしくはその他のエネルギー源を、細胞培養物に補うことが有益または必要である場合がある。これらの補助的な構成成分全てを細胞培養物に１回で添加してもよく、または細胞培養物に数回に分けて添加してもよい。
【０１６５】
当業者であれば、細胞培養の特定の特徴を最適化するために、特異的な細胞培養条件を手直しすることができるであろう。それらの特徴として、これらに限定されないが、対象とするタンパク質のグリコシル化の程度、細胞増殖速度、細胞生存率、細胞培養物の最終的な細胞密度、乳酸およびアンモニウム等の有害な代謝副産物の最終濃度、発現したポリペプチドの最終的なタイター、またはこれらのいずれかの組合せ、または実行者が重要であるとみなすその他の条件が挙げられる。
【０１６６】
培地組成物
多種多様な増殖培地のうちのいずれかを、本発明に従って使用することができる。特定の実施形態では、細胞を多様な合成培地のうちのいずれか中で増殖させ、こうした培地の構成成分は、分かっておりかつ制御されている。特定の実施形態では、細胞を多様な複合培地のうちのいずれかの中で増殖させ、この場合、培地の全ての構成成分が、分かっているかつ／または制御されているわけではない。
【０１６７】
哺乳動物細胞の培養ための合成増殖培地を含めて、細胞培養のための合成増殖培地が、過去数十年にわたって広範に開発され、公開されている。既知組成培地の全ての構成成分が十分に特徴付けられており、したがって、既知組成培地は、血清または加水分解産物等の複雑な添加剤を含有しない。早期の培地処方は、細胞増殖および生存率の維持を可能にするために開発され、タンパク質の産生についてはほとんどまたは全く配慮されていない。ごく最近になって、組換えのタンパク質および／またはポリペプチドを産生する生産性の高い細胞培養物を支援するという発現を目的とする培地処方が開発されるようになった。
【０１６８】
既知組成培地は典型的には、水中における、既知濃度のおよそ５０個の化学的実体からなる。また、大部分の既知組成培地は、１つまたは複数の十分に特徴付けられたタンパク質、例として、インスリン、ＩＧＦ−１、トランスフェリンまたはＢＳＡ等も含有するが、その他の既知組成培地は、タンパク質構成成分を必要とせず、したがって、無タンパク質既知組成培地と呼ばれている。既知組成培地の化学的構成成分は一般に、５つの広いカテゴリー、すなわち、アミノ酸、ビタミン、無機塩、微量元素、および整ったカテゴリー化が可能でない種々雑多カテゴリーに属する。
【０１６９】
全ての培地は、既知組成培地であってもまたは複合培地であっても、増殖細胞のためのエネルギー源を含む。しばしば、エネルギー源は、グルコース、すなわち、化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６を有する単純な単糖類の糖である。市販されている培地、例として、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ変法イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）を含めた、従来の培地処方は、比較的高いレベルのグルコースを含有している。グルコースは従来、豊富に必要であると考えられている。これは、グルコースが、細胞にとって主要な代謝エネルギー源であるからである。しかし、グルコースの迅速な消費によって、グリコシル化の増加が生じる。本明細書で実証するように、グリコシル化の減少によって、糖タンパク質の生物学的な機能および特徴の改善をもたらすことができることから、細胞培養物中のグルコースレベルの減少および／または制御が望まれる場合がある。したがって、本発明は、細胞培養の培地中のグルコースの量を減少させることおよび／または制御することを包含する。１つの実施形態では、グルコース濃度を、約１００μｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、より好ましくは、約５００μｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、その上より好ましくは、約５００μｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは、約５００μｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは、約１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、より好ましくは、約１ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、その上より好ましくは、約０．０５ｇ／Ｌ〜０．５ｇ／Ｌの範囲に維持する。最も好ましくは、グルコース濃度を、約１．５ｇ／Ｌに維持する。
【０１７０】
本発明は、特定の細胞培養の方法および培地処方によって、糖タンパク質のグリコシル化が最小限に留まり、完全に阻害されさえするという発見を包含する。ツニカマイシンは、グリコシル化阻害剤である抗生物質であり、ウリジンジリン酸（ＵＤＰ）−ＧｌｃＮＡｃから、ホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｐ−ＧｌｃＮＡｃ）を移動させて、ドリコールリン酸（Ｄｏｌ−Ｐ）−ＧｌｃＮＡｃを形成するグリコシルトランスフェラーゼを阻害する。２−デオキシ−Ｄ−グルコースは、グルコースの構造類似体であり、この場合、糖の２’位のヒドロキシル基が水素部分で置き換わっている。したがって、いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、いずれかの阻害剤を使用してタンパク質のグリコシル化を低下させた場合、より少ないグリコシル化レベルを有する糖タンパク質を生じるという点から、グリコシル化阻害のこの機構は、決定的なものではないようである。さらに驚くべきことには、細胞培養物中のグリコシル化を阻害するために使用したグリコシル化阻害剤に関わらず、リガンド結合部位内部に位置するグリコシル化部位を含むタンパク質のグリコシル化の減少によって、タンパク質による同族リガンドの結合の改善が媒介された。
【０１７１】
この開示は、これらに限定されないが、２−デオキシ−Ｄ−グルコースおよびツニカマイシンを含めた、グリコシル化阻害性物質を含有する培地処方から、それらを細胞培養において細胞を増殖させるために使用した場合、糖タンパク質のグリコシル化の減少を生じることを実証する。さらに、本明細書に提供する開示は、驚くべきことに、グリコシル化部位が、糖タンパク質のリガンド結合部位または抗体の抗原結合部位の内部に位置する場合、その部位におけるグリコシル化の低下が、より高いレベルのグリコシル化を含む同一の糖タンパク質であって、グリコシル化阻害性物質が存在しない点以外は同一の細胞培養条件下で産生させた同一の糖タンパク質と比較して、糖タンパク質による生物学的機能の改善（例えば、リガンドまたは抗原の結合の改善）を媒介したことを実証する。いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、そのようなグリコシル化阻害性物質を細胞培養の培地に提供することによって、グリコシル化を低下させ、それによって、結合部位の、その同族リガンドに結合する能力に影響を及ぼし、したがって、タンパク質の結合の親和性または特異性を増加させることが可能である。
【０１７２】
さらに、本明細書に提供する開示は、驚くべきことに、グリコシル化部位が抗体の抗原結合部位内部に位置する場合、本明細書に開示する新規なプロセスによって、抗体のグリコシル化レベルを、抗体の重鎖の抗原結合部位内部に位置するグリコシル化部位および定常領域中に位置するグリコシル化部位の両方において低下させることができることを実証する。さらに、その部位において媒介されたグリコシル化の低下は、より高いレベルのグリコシル化を含む同一の抗体であって、グリコシル化阻害性物質が存在しない点以外は同一の細胞培養条件下で産生させた同一の抗体と比較して、抗体による生物学的機能を改善すること（例えば、抗原結合の改善）ができる。
【０１７３】
したがって、本発明は、糖タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、抗体を含めた、糖タンパク質のグリコシル化レベルおよび／または結合の特徴に影響を及ぼすための方法を提供する。
【０１７４】
特定の実施形態では、本発明に従って使用しようとするグリコシル化阻害性物質は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含む。特定の実施形態では、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを、１リットル当たり０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０グラム以上の濃度で提供する。特定の実施形態では、細胞培養物中の２−デオキシ−Ｄ−グルコースのグルコースに対する比が、１／５０、１／４５、１／４０、１／３９、１／３８、１／３７、１／３６、１／３５、１／３４、１／３３、１／３２、１／３１、１／３０、１／２９、１／２８、１／２７、１／２６、１／２５、１／２４、１／２３、１／２２、１／２１、１／２０、１／１９、１／１８、１／１７、１／１６、１／１５、１／１４、１／１３、１／１２、１／１１、１／１０、１／９、１／８、１／７、１／６、１／５、１／４、１／３、１／２もしくは１／１、またはこれらより高いもしくは低い任意の比である。当業者であれば、細胞培養の培地中の２−デオキシ−Ｄ−グルコースの前述の濃度および比を、回分培養、流加培養、灌流培養および／または改変した流加培養を使用して達成することができることを理解するであろう。
【０１７５】
また、本発明は、グルコース濃度が制限されている培地処方も包含する。特定の実施形態では、グルコース濃度を、約１００μｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、より好ましくは、より好ましくは、約１００μｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは、約１００μｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、その上より好ましくは、約１００μｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、より好ましくは、約１００μｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌ、最も好ましくは、約５０μｇ／Ｌ〜０．５ｇ／Ｌの範囲に維持する。
【０１７６】
本開示は、いくつかの要因が、対象とするタンパク質のグリコシル化の減少において重要である場合があり、それによって、同族リガンドへの結合の改善を含めて、タンパク質の生物学的特徴の改善をもたらすことを教示する。そのような要因として、これらに限定されないが、グリコシル化阻害剤の細胞培養物への添加、培養物中のグルコースレベル、これに限定されないが、細胞培養物が経る温度シフトを含めた、培養温度、および細胞を培養するために使用する培地が挙げられる。
【０１７７】
特定の細胞系は、異なるレベルのグリコシル化および／またはグリコシル化部位に存在する（１つもしくは複数の）グリコフォームをもたらす場合がある。にもかかわらず、本発明の方法および本明細書に記載する培地組成物の活用によって、所与の細胞培養物中において、グリコシル化阻害剤が存在しない点以外は同一の条件下で産生させたタンパク質のグリコシル化レベルと比較して、糖タンパク質の全体的なグリコシル化の低下が得られる。
【０１７８】
本明細書に開示する本発明の培地処方に、必要に応じてまたは所望により、ホルモンおよび／もしくはその他の増殖因子、（ナトリウム、塩素、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸等の）特定のイオン、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、タンパク質加水分解産物、またはグルコースもしくはその他のエネルギー源を場合により補うことができる。本発明の特定の実施形態では、ヘキサメチレン−ビス（アセトアミド）（「ＨＭＢＡ」）および／または酪酸ナトリウム（「ＮａＢ」）等の化学誘発剤（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｃｔａｎｔ）を培地に補うことが有益である場合がある。これらの任意の補充物質は、培養の開始時に添加してもよく、または枯渇した栄養素を補充するため、もしくは別の理由で後の時点で添加してもよい。当業者であれば、本発明の培地処方中に含ませることができる任意の望ましいまたは必要な補充物質が分かるであろうし、実験および／またはその他の必要性に基づいて、添加すべき特定の補充物質を選択することができるであろう。
【０１７９】
ポリペプチド
宿主細胞中において発現可能である、潜在的なグリコシル化部位を含む任意のポリペプチドを、本明細書に開示する方法および組成物に従って産生させることができる。さらにより好ましくは、ポリペプチドは、ポリペプチドのリガンド結合部位中の潜在的なグリコシル化部位、例として、これらに限定されないが、抗体の抗原結合部位、受容体のリガンド結合部位等を含む。
【０１８０】
ポリペプチドを、宿主細胞にとって内因性である遺伝子からかまたは宿主細胞内に導入する異種の遺伝子から発現させることができる。ポリペプチドは、天然に存在するものであってもよく、またはそれに代わって、操作または選択されている配列を有してもよい。産生させようとするポリペプチドは、天然に個々に存在するポリペプチド断片から集合させることができる。それに加えてまたはそれに代わって、操作したポリペプチドが、天然には存在しない１つまたは複数の断片を含むこともできる。
【０１８１】
本明細書に提供する新規な方法に従って産生させることができる例示的な糖タンパク質は、当技術分野ではよく知られており、それらとして、これに限定されないが、２００４年１１月１８日にＷＯ２００４／０９９２３１として公開された、２００４年４月９日に出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１４９４号に提供されている広範なリストが挙げられる（例えば、図２８Ａ〜２８ＣＣを参照されたい）。
【０１８２】
本発明の実行者が、対象とするポリペプチドを選択し、その正確なアミノ酸配列を知る。本発明に従って発現させようとする任意の所与のタンパク質は、それ自体の特定の特徴を示し、培養細胞によるグリコシル化レベルに影響を及ぼす場合があり、同一の培養条件下で増殖させた別のポリペプチドまたはタンパク質よりも低いレベルで発現する場合がある。当業者であれば、任意の所与の発現させたポリペプチドまたはタンパク質のグリコシル化レベルを制御するために、本発明の培地および本明細書に記載する方法を適切に改変することができるであろう。
【０１８３】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、潜在的なグリコシル化部位を含む。すなわち、当業者であれば、ポリペプチドは、特定のアミノ酸配列を含めて、細胞によってタンパク質をグリコシル化させることができることを示す特徴を含むことを理解するであろう。いくつかの実施形態では、潜在的なグリコシル化部位は、セリンまたはスレオニンのいずれかを含む、Ｏ−連結性グリコシル化部位である。Ｐｅｔｅｒ−Ｋａｔａｌｉｎｉｃ、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４０５：１３９〜１７１を参照されたい。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つのＮ−連結性グリコシル化部位を含む。Ｍｅｄｚｉｈｒａｄｓｚｋｙ、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４０５：１１６〜１３８を参照されたい。当業者であれば、特定のアミノ酸配列が、細胞によってグリコシル化シグナルとして認識され、その結果、グリカンが特定のアスパラギン残基においてつながることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、Ｎ−連結性グリコシル化部位は、アスパラギン−Ｘ−セリン（Ｎ−Ｘ−Ｓ）またはアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸であってよい）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ−連結性グリコシル化部位は、これらに限定されないが、アスパラギン−イソロイシン−スレオニン（ＮＩＴ）、アスパラギン−グリシン−セリン（ＮＧＳ）、アスパラギン−セリン−スレオニン（ＮＳＴ）、およびアスパラギン−スレオニン−セリン（ＮＴＳ）を含めた、アミノ酸配列を含む。潜在的なおよび実際のタンパク質グリコシル化部位を同定するための方法が当技術分野では知られており、それらとして、これに限定されないが、ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／におけるＳｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのＥｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍのプロテオミクスサーバから無料で利用可能である翻訳後修飾予測ソフトウェアが挙げられる。これらの種々のプログラムとして、これらに限定されないが、ＤｉｃｔｙＯＧｌｙｃ（ＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍにおけるＧｌｃＮＡｃ  Ｏ−グリコシル化部位の予測；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＤｉｃｔｙＯＧｌｙｃ／から無料で利用可能である）；ＮｅｔＯＧｌｙｃ（哺乳動物のタンパク質におけるＣ−マンノシル化部位の予測；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＣＧｌｙｃ／から無料で利用可能である）；ＮｅｔＯＧｌｙｃ（哺乳動物のタンパク質におけるＯ−ＧａｌＮＡｃ、ムチン型グリコシル化部位の予測；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／から無料で利用可能である）；ＮｅｔＧｌｙｃａｔｅ（ヒトタンパク質におけるリシンのイプシロンアミノ基の糖化の予測；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／から無料で利用可能である）；ＯＧＰＥＴ（真核生物（非原生動物）のタンパク質におけるＯ−ＧａｌＮＡｃ、ムチン型グリコシル化部位の予測；ｈｔｔｐ：／／ｏｇｐｅｔ．ｕｔｅｐ．ｅｄｕ／ＯＧＰＥＴ／から無料で利用可能である）；およびＹｉｎＯＹａｎｇ（真核生物のタンパク質配列においてＯ−ベータ−ＧｌｃＮＡｃがつながる部位の予測；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＹｉｎＯＹａｎｇ／から無料で利用可能である）が挙げられる。特定の実施形態では、タンパク質は、Ｏ−連結性グリコシル化部位およびＮ−連結性グリコシル化部位の両方を含む場合があり、そのようなタンパク質は、当技術分野ではよく知られており、当業者によって容易に同定することができる。
【０１８４】
本発明に従って望ましく発現させることができるポリペプチドはしばしば、興味深いまたは有用な生物学的または化学的な活性に基づいて選択される。特定の実施形態では、本発明の方法および／または組成物を利用して、タンパク質治療剤またはポリペプチド治療剤を発現させる。例えば、本発明を利用して、任意の薬学的または商業的に意味のある受容体、抗体、酵素、ホルモン、調節因子、抗原、結合物質等を発現させることができる。本発明に従って産生させることができるポリペプチドおよびタンパク質の以下のリストは、例示的な性質のものに過ぎず、限定的な列挙であることを意図しない。当業者であれば、任意のポリペプチドまたはタンパク質を、本発明に従って発現させることができ、特定の必要性に基づいて、産生させようとする特定のポリペプチドを選択することができることを理解するであろう。
【０１８５】
受容体
薬学的および／または商業的な物質として有効であることが示されており、本発明の教示に従って望ましく産生させることができるクラスのポリペプチドには、受容体を含む。受容体の生物学的な重要性および潜在的な治療剤としてのそれらの重要性を考えると、これらの分子の、本発明の方法および組成物に従う産生は、特に興味深い。受容体は典型的には、細胞外のシグナル伝達リガンドを認識することによって機能する、膜貫通型の糖タンパク質である。受容体はしばしば、リガンド認識ドメインに加えて、タンパク質キナーゼドメインを有する。このタンパク質キナーゼドメインは、リガンドへの結合時に、標的細胞内の分子をリン酸化することによってシグナル伝達経路を開始し、細胞内部における発生または代謝の変化をもたらす。
【０１８６】
特定の実施形態では、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）を、本発明の系および方法に従って発現させる。発現させることができる例示的なＲＡＧＥタンパク質が、とりわけ、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７６９４号（２００５年８月３日出願）、現在では、ＷＯ２００６／０１７６４３として（２００６年２月１６日）公開；第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７７０５号（２００５年８月３日出願）、現在では、ＷＯ２００６／０１７６４７として（２００６年２月１６日）公開；第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００１６８６号（２００７年１月２３日出願）、現在では、ＷＯ２００７／０９４９２６として（２００７年８月２３日）公開；第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１０１２５号（２００７年４月２５日出願）、現在では、ＷＯ２００７／１３０３０２として（２００７年１１月１５日）公開；および第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００１７８６号（２００８年２月１１日出願）、現在では、ＷＯ２００８／１００６７０として（２００８年８月２１日）公開に提供されている（これらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている）。１つの実施形態では、ＲＡＧＥのリガンド結合部位は、シグナル配列を含めた、完全長ヒトＲＡＧＥのアミノ酸配列（配列番号３）に関するおよそアミノ酸２４（Ｇｌｎ２４；Ｑ２４）からアミノ酸残基番号５２（Ｌｙｓ５２；Ｋ５２）までを含む。その他の実施形態では、リガンド結合部位は、ＲＡＧＥのＶ−ドメイン、すなわち、シグナル配列を含めた、完全長ヒトＲＡＧＥのアミノ酸配列（配列番号３）に関するおよそアミノ酸２４（Ｇｌｎ２４；Ｑ２４）からアミノ酸残基番号１１６（Ａｒｇ１１６；Ｒ１１６）までを含む。ヒトＲＡＧＥの完全長のアミノ酸配列を、シグナル配列は小文字で示し、２つの潜在的なＮ−連結性グリコシル化部位には下線を施して以下に記載する。
【０１８７】
【化２】
2010246541.tif 000003
【０１８８】
ヒトＲＡＧＥのアミノ酸１〜２５１をコードする核酸配列（配列番号４）を、以下に示す。
【０１８９】
【化３】
2010246541.tif 000004
【０１９０】
典型的には、（小文字で示した）最初の２２または２３個のアミノ酸が、シグナル配列を含み、哺乳動物細胞中で発現させた成熟したＲＡＧＥ中には存在しない。さらに、最初の２３個のアミノ酸が、シグナル配列を含み、成熟したＲＡＧＥが、１位においてグルタミンのアミノ酸残基（Ｑ）を含む場合には、このグルタミン（Ｑ）は典型的には、ピログルタミン酸（「ｐＥ」として示す）に環化し、したがって、ヒトＲＡＧＥのリガンド結合部位は、以下の配列を含む。
【０１９１】
【化４】
2010246541.tif 000005
【０１９２】
いくつかの実施形態では、ＲＡＧＥポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む、ＲＡＧＥのＶ様ドメインを含む。
【０１９３】
【化５】
2010246541.tif 000006
【０１９４】
当業者であれば、本明細書に提供する開示を頼りに、ヒトＲＡＧＥのリガンド結合部位は、配列番号１４の配列から配列番号１６のアミノ酸配列までの範囲の任意の長さのアミノ酸を含むことができることを理解するであろう。それぞれの場合に、ＲＡＧＥのリガンド結合部位は、配列番号１３および１６の配列のＡｓｎ３および５９（シグナル配列が、２２アミノ酸長である場合）、または配列番号１４、１５、１７および１８のＡｓｎ２および／もしくはＡｓｎ５８（シグナル配列が、２３アミノ酸長である場合）に位置する少なくとも１つのＮ−連結性グリコシル化部位を含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態によれば、終末糖化産物受容体は、可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）を含む。すなわち、ｓＲＡＧＥは、ＲＡＧＥの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含まない。Ｎｅｅｐｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４９９８〜１５００４；Ｐａｒｋら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：１０２５〜１０３１を参照されたい。特定の実施形態では、ＲＡＧＥは、可溶性ＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質、例えば、ＲＡＧＥ−Ｆｃを含み、これは、免疫グロブリン（「Ｉｇ」）の一部と共有結合によって連結しているリガンド結合部位を含むＲＡＧＥの一部を含む。特定の実施形態では、ｓＲＡＧＥ融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃを含む（この場合、Ｆｃは典型的には、例えば、ＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む）。特定の実施形態では、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇは、ヒトＩｇのヒンジ部分を含み、ヒンジドメインは、第１の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）の末端から、第２の重鎖定常ドメイン（ＣＨ２）の始めまでのアミノ酸配列にわたる。例えば、ＳｔｒｏｍおよびＺｈｅｎに対する米国特許第６，１６５，４７６号（ヒトおよびマウスの免疫グロブリンのヒンジドメインのアミノ酸配列が、４段の末端から５段の先端にわたる表に提示されている）を参照されたい。特定の実施形態では、ヒンジ領域を含むヒトｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質は、図３Ａに示す、２００３年８月１８日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２５９９６号、現在では、２００４年２月２６日に公開のＷＯ２００４／０１６２２９に記載されているヒトｓＲＡＧＥ−Ｆｃを包含する。さらなる実施形態では、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ定常ドメイン（ヒトＩｇＧ１のアミノ酸Ｐｒｏ１００からＬｙｓ３３０まで）と６個のアミノ酸リンカー（すなわち、ＩＥＧＲＭＤ）を介して融合しているヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン（配列番号３のアミノ酸残基番号１から３４４まで）を含む。カタログ番号１１４５−ＲＧ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮを参照されたい。さらに、ヒンジ領域を含むｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合体は、ＷＯ２００４／０１６２２９、図１Ｂに記載されているマウスｓＲＡＧＥ−Ｆｃ、ならびにＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から市販されている、それぞれカタログ番号１１７９−ＲＧ、１６１６−ＲＧに記載されているマウスおよびラットのｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質も包含する。その他の実施形態では、ＲＡＧＥ融合タンパク質は、ヒトＩｇドメインと融合しているマウスＲＡＧＥの可溶性ドメインを含む。追加の実施形態では、ＲＡＧＥ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ４免疫グロブリン由来の定常重鎖ドメインと融合しているヒトＲＡＧＥのｓＲＡＧＥ部分を含む。例えば、出願されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６９５６号（１２頁、段落０５５、表２に示されている、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を含むヒトｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列；１３頁、段落００５９、表４に示されているｓＲＡＧＥ部分を、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ部分と連結している７個のアミノ酸リンカー配列、すなわち、ＧＳＧＳＧＳＧを含むｓＲＡＧＥ−Ｆｃ  ＩｇＧ４融合タンパク質、ヒトＲＡＧＥの推定上のフューリン切断部位におけるまたはその付近の２つの点突然変異をさらに含む、１５頁、段落００６３、表６に示されているヒトＩｇＧ４のＦｃ領域に連結しているヒトｓＲＡＧＥのアミノ酸配列を含むｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；および１７頁、段落００６７、表８に示されている、ヒトＲＡＧＥの推定上のフューリン切断部位におけるまたはその付近の２つの点突然変異をさらに含む、ｓＲＡＧＥ部分をヒトＩｇＧ４  Ｆｃ部分と連結している７個のアミノ酸リンカー配列、すなわち、ＧＳＧＳＧＳＧを含むｓＲＡＧＥ−Ｆｃ  ＩｇＧ４融合タンパク質を提示している）を参照されたい。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇは、ヒンジ部分を欠く免疫グロブリン部分を含み、ＣＨ２の最初のアミノ酸が存在せず、ヒンジ領域が、ＲＡＧＥのドメイン内リンカー配列、またはそれに対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの同一性を示す配列で置き換えられている。
【０１９７】
特定の実施形態では、ＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質は、ヒンジ領域を欠くＩｇの一部と融合しているＲＡＧＥの細胞外部分を含む。１つの実施形態では、ＲＡＧＥのＶ−ドメインを含むヒトＲＡＧＥの細胞外部分が、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインの一部およびＣＨ３ドメイン全体を含み、ヒンジ領域を欠くヒトＩｇＧ１の一部と融合している。例えば、ＷＯ２００６／０１７６４３およびＷＯ２００６／０１７６４７を参照されたい（その全体が、参照により本明細書に組み込まれており、例えば、図４に示すように、３つのドメインを含むｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を提供している）。別の実施形態では、ＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質は、４つのドメイン、すなわち、ＲＡＧＥのＶ−ドメイン、ＲＡＧＥのＣ１ドメイン、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインの一部、およびヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン全体、およびヒンジ領域を含む。例えば、全てがヒンジ領域を欠くＷＯ２００６／０１７６４３およびＷＯ２００６／０１７６４７、図５；ならびにＷＯ２００８／１００４７０（図４Ｂおよび４Ｄに、３つのドメインのｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を提供しており、図４Ａおよび４Ｃに、４つのドメインのｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を提供している）を参照されたい（これらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている）。さらに、特定の実施形態では、ｓＲＡＧＥ融合タンパク質は、カルボキシル末端において６個のヒスチジンタグと融合しているイヌＲＡＧＥの細胞外、すなわち、可溶性のドメインを含む融合タンパク質を含む（カタログ番号４７５０−ＲＧ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。
【０１９８】
特定のＲＡＧＥ融合タンパク質を、本明細書において例示する。しかし、本発明は、いかなる場合であっても、これらにも、その他のＲＡＧＥポリペプチドのいずれにも限定されないが、リガンド結合部位またはそれに対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８もしくは９９パーセントの同一性を示す配列を含む任意のＲＡＧＥタンパク質またはその断片を包含し、好ましくは、リガンド結合部位は、潜在的なグリコシル化部位を含む。
【０１９９】
特定の実施形態では、ＲＡＧＥ−融合タンパク質は、配列番号３のアラニン２３（成熟したペプチド中には２２個のアミノ酸のシグナル配列はない）、または残基２４におけるグルタミン（Ｑ）もしくはピログルタミン酸（ｐＥ）（成熟したペプチド中には２３個のアミノ酸のシグナル配列およびｐＥに環化したグルタミンはない）のいずれかから始まり、それぞれ、アミノ酸残基のＬｙｓ３０またはＬｙｓ２９において終わるＲＡＧＥのリガンド結合部位を含む。その他の実施形態では、融合タンパク質のＲＡＧＥ部分は、配列番号３のおよそアミノ酸アラニン２３（成熟したペプチド中には２２個のアミノ酸のシグナル配列はない）、または残基２４におけるグルタミン（Ｑ）もしくはピログルタミン酸（成熟したペプチド中には２３個のアミノ酸のシグナル配列およびｐＥに環化したグルタミンはない）から、アミノ酸残基Ａｒｇ１１６において終わる（リーダーペプチドを含む）ＲＡＧＥのＶ−ドメインを含む。ＷＯ２００７／０９４９２６、例えば、図１Ｄを参照されたい。
【０２００】
その他の実施形態では、ＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質が、Ｃ末端のリシン（Ｋ）のアミノ酸残基を含む場合、当業者であれば、このリシン残基を切り出すことができ、その結果、Ｃ末端のリシン残基を欠く融合タンパク質が生じることを理解するであろう。
【０２０１】
別の態様では、本発明は、本明細書における実施形態のうちのいずれか１つに記載するタンパク質のある量を含む組成物を提供し、タンパク質の少なくとも０．５％が、アグリコシル化されている。タンパク質の量のパーセントは、とりわけ、試料中のタンパク質分子の数に関係し、適切な場合には、グリコシル化の、タンパク質の分子量に対する作用に左右される。別の実施形態では、完全グリコシル化形態のタンパク質のパーセントは、タンパク質の総量の６７％未満、または６５％未満、または６０％未満、または５５％未満、または５０％未満、または４５％未満である。別の実施形態では、完全グリコシル化形態のタンパク質の量のパーセントは、非完全グリコシル化形態全てを組み合わせた場合のタンパク質の量のパーセントよりも少ない。例えば、グリコシル化の２つの潜在的な部位を有するタンパク質の場合、完全グリコシル化形態（すなわち、二重グリコシル化）のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の量のパーセントは、モノグリコシル化形態とアグリコシル化形態とを組み合わせた場合に存在するタンパク質の量のパーセントよりも少ない。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書における実施形態のうちのいずれか１つに記載するｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のある量を含む組成物を提供し、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の少なくとも０．５％が、アグリコシル化されている。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。
【０２０２】
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のある量を含む組成物という文脈内で使用する場合、「ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の量」は、典型的なタンパク質の解析検出方法によって検出可能な量である。ある実施形態では、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の量は、０．０１ｍｇ超である。別の実施形態では、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の量は、０．１ｍｇ超である。別の実施形態では、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の量は、１．０ｍｇ超である。
【０２０３】
別の実施形態では、アグリコシル化形態のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の量のパーセントは、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の総量の少なくとも１％、または少なくとも２％、または少なくとも３％、または少なくとも４％、または少なくとも５％、または少なくとも６％、または少なくとも７％、少なくとも８％、または少なくとも９％、または少なくとも１０％、または少なくとも１２％、または少なくとも１４％、または少なくとも１６％、または少なくとも１８％、または少なくとも２０％、または少なくとも２２％、または少なくとも２４％、または少なくとも２６％、または少なくとも２８％、または少なくとも３０％である。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。
【０２０４】
別の実施形態では、完全グリコシル化形態のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のパーセントは、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の総量の６７％未満、または６５％未満、または６０％未満、または５５％未満、または５０％未満、または４５％未満である。別の実施形態では、完全グリコシル化形態のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の量のパーセントは、非完全グリコシル化形態全てを組み合わせた場合のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の量のパーセントよりも少ない。例えば、グリコシル化の３つの潜在的な部位を有するｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の場合、完全グリコシル化形態（すなわち、三重グリコシル化）のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の量のパーセントは、二重グリコシル化形態と、モノグリコシル化形態とアグリコシル化形態とを組み合わせた場合に存在するｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の量のパーセントよりも少ない。したがって、潜在的なグリコシル化部位の数がｎであり、ｎは１以上の整数である場合、ｎ個のグリコシル化部位を含むｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の量は、ｎ−１個以下のグリコシル化部位を有する形態全てとして存在するｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の総量よりも少ない。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。
【０２０５】
本発明の別の態様では、融合タンパク質のある量を含む組成物を提供し、当該融合タンパク質は、免疫グロブリンポリペプチドに連結しているＲＡＧＥポリペプチドを含み、
ａ）当該ＲＡＧＥポリペプチドは、ヒトＲＡＧＥ（配列番号３）の断片を含み、当該ヒトＲＡＧＥの断片は、リガンド結合部位およびグリコシル化され得る少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
ｂ）当該免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインまたはＣＨ２ドメインの一部、および免疫グロブリンのＣＨ３ドメインを含み、
ｃ）当該免疫グロブリンポリペプチドのＮ末端残基は、当該ＲＡＧＥポリペプチドのＣ末端残基に連結しており、
融合タンパク質の量の少なくとも０．５％がアグリコシル化されている。ある実施形態では、融合タンパク質は、ＲＡＧＥポリペプチドのシグナル配列を含まない。シグナル配列は、配列番号４のアミノ酸残基１〜１８、１〜２２または１〜２３であってよい。別の実施形態では、ＲＡＧＥポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、ＲＡＧＥポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、融合タンパク質のＮ末端配列は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択される。別の実施形態では、ＲＡＧＥポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸残基２３〜１１６、２３〜１１８、２３〜１３６、２３〜２３０、２３〜２５６、２３〜３０５、２３〜３２１、２３〜３３０または２３〜３４４を含む。
【０２０６】
免疫グロブリンポリペプチドに連結しているＲＡＧＥポリペプチドを含む融合タンパク質のある量を含む組成物という文脈内で使用する場合、「融合タンパク質の量」は、典型的なタンパク質の解析検出方法によって検出可能な量である。ある実施形態では、融合タンパク質の量は、０．０１ｍｇ超である。別の実施形態では、融合タンパク質の量は、０．１ｍｇ超である。別の実施形態では、融合タンパク質の量は、１．０ｍｇ超である。
【０２０７】
別の実施形態では、アグリコシル化形態の融合タンパク質の量のパーセントは、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の総量の少なくとも１％、または少なくとも２％、または少なくとも３％、または少なくとも４％、または少なくとも５％、または少なくとも６％、または少なくとも７％、少なくとも８％、または少なくとも９％、または少なくとも１０％、または少なくとも１２％、または少なくとも１４％、または少なくとも１６％、または少なくとも１８％、または少なくとも２０％、または少なくとも２２％、または少なくとも２４％、または少なくとも２６％、または少なくとも２８％、または少なくとも３０％である。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。
【０２０８】
別の実施形態では、完全グリコシル化形態の融合タンパク質の量のパーセントは、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の総量の６７％未満、または６５％未満、または６０％未満、または５５％未満、または５０％未満、または４５％未満である。別の実施形態では、完全グリコシル化形態の融合タンパク質の量のパーセントは、非完全グリコシル化形態全ての融合タンパク質の量のパーセントよりも少ない。例えば、グリコシル化の３つの潜在的な部位を有する融合タンパク質の場合、完全グリコシル化形態（すなわち、三重グリコシル化）の融合タンパク質の量のパーセントは、二重グリコシル化形態と、モノグリコシル化形態とアグリコシル化形態とを組み合わせた場合の融合タンパク質の量のパーセントよりも少ない。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。
【０２０９】
別の実施形態では、融合タンパク質は、グリコシル化され得る少なくとも２つのアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、グリコシル化され得る少なくとも３つのアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、融合タンパク質中のグリコシル化の潜在的な部位の数は２である。別の実施形態では、融合タンパク質中のグリコシル化の潜在的な部位の数は３である。別の実施形態では、ＲＡＧＥのリガンド結合部位は、グリコシル化され得るアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、融合タンパク質が、グリコシル化され得る少なくとも２つのアミノ酸残基を含む場合、第１のグリコシル化の潜在的な部位は、ＲＡＧＥのリガンド結合部位のアミノ酸残基であり、第２のグリコシル化の潜在的な部位は、免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸残基である。別の実施形態では、融合タンパク質が、グリコシル化され得る少なくとも３つのアミノ酸残基を含む場合、第１のグリコシル化の潜在的な部位は、ＲＡＧＥのリガンド結合部位のアミノ酸残基であり、第２のグリコシル化の潜在的な部位は、ＲＡＧＥポリペプチドのアミノ酸残基であり、第３のグリコシル化の潜在的な部位は、免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸残基である。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。
【０２１０】
免疫グロブリンポリペプチドに連結しているＲＡＧＥポリペプチドを含む融合タンパク質のある量を含む組成物という文脈内で使用する場合、「免疫グロブリンポリペプチド」は、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの接合部における保存されているＦｃＲｎスカベンジャー受容体結合部位含む。免疫グロブリンポリペプチドは、既知の重鎖アイソタイプ、すなわち、ＩｇＧ（γ）、ＩｇＭ（μ）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＥ（ε）またはＩｇＡ（α）のうちのいずれか１つ由来の重鎖の断片または全体であってよい。さらに、重鎖（またはその一部）は、既知の重鎖のサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１（γ１）、ＩｇＧ２（γ２）、ＩｇＧ３（γ３）、ＩｇＧ４（γ４）、ＩｇＡ１（α１）、ＩｇＡ２（α２）、または生物学的活性を変化させる、これらのアイソタイプもしくはサブタイプの突然変異体のうちのいずれか１つに由来することができる。ある実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドは、異なる免疫グロブリンのアイソタイプおよび／または重鎖のサブタイプの一部またはドメインを含有することができる。ある実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドは、ＩｇＧ１サブタイプである。別の実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドは、ＩｇＧ２サブタイプである。さらなる別の実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドは、ＩｇＧ３サブタイプである。別の実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドは、ＩｇＧ４サブタイプである。別の実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ断片の重鎖断片のうちの１つの断片を含む。別の実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンの重鎖を含む。別の実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫グロブリンのヒンジ領域を含まない。
【０２１１】
特定の実施形態では、腫瘍壊死因子アルファ受容体および腫瘍壊死因子ベータ受容体の形態（ＴＮＦＲ−１；１９９１年３月２０日公開のＥＰ４１７，５６３；およびＴＮＦＲ−２、１９９１年３月２０日公開のＥＰ４１７，０１４。これらの文献のそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている）をとる腫瘍壊死因子阻害剤を、本発明の系および方法に従って発現させる（総説として、その全体が、参照により本明細書に組み込まれているＮａｉｓｍｉｔｈおよびＳｐｒａｎｇ、１９９５〜９６、Ｊ．Ｉｎｆｌａｍｍ．４７：１〜７を参照されたい）。いくつかの実施形態によれば、腫瘍壊死因子阻害剤は、可溶性ＴＮＦ受容体を含む。特定の実施形態では、腫瘍壊死因子阻害剤は、可溶性ＴＮＦＲ−Ｉｇを含む。特定の実施形態では、本発明のＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲＩＩの可溶性の形態である。さらなる実施形態では、ＴＮＦ阻害剤は、マウス可溶性ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含む。例えば、ＷＯ２００４／０１６２２９、図２Ｂを参照されたい。特定の実施形態では、本発明のＴＮＦ阻害剤は、可溶性のＴＮＦ結合性タンパク質である。特定の実施形態では、本発明のＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質、例えば、ＴＮＦＲ−Ｆｃまたはエタネルセプトである。本明細書で使用する場合、「エタネルセプト」は、ＴＮＦＲ−Ｆｃを指し、これは、ｐ７５ＴＮＦ−α受容体の細胞外部分の２分子の二量体であり、各分子は、ヒトＩｇＧ１の２３５個のアミノ酸のＦｃ部分からなる。
【０２１２】
特定の実施形態では、本発明に従って産生させようとする受容体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＲＴＫファミリーは、多数の細胞型の多様な機能のために決定的である受容体を含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれているＹａｒｄｅｎおよびＵｌｌｒｉｃｈ、１９８８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：４３３〜４７８；ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、１９９０、Ｃｅｌｌ  ６１：２４３〜２５４を参照されたい。）。ＲＴＫの非限定的な例として、腫瘍壊死因子アルファ受容体および腫瘍壊死因子ベータ受容体（ＴＮＦＲ−１；１９９１年３月２０日公開のＥＰ４１７，５６３；およびＴＮＦＲ−２、１９９１年３月２０日公開のＥＰ４１７，０１４；総説として、参照により本明細書に組み込まれているＮａｉｓｍｉｔｈおよびＳｐｒａｎｇ、上記を参照されたい）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体ファミリーのメンバー、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ）ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、免疫グロブリンならびにＥＧＦ相同ドメインＩ（ＴＩＥ−１）およびＴＩＥ−２を有するチロシンキナーゼ受容体（参照により本明細書に組み込まれているＳａｔｏら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：７０〜７４）やｃ−Ｍｅｔ受容体が挙げられ、これらのうちのいくつかは、血管新生を直接的または間接的に促すことが示唆されている（ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９５、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２９：８９５〜８９８）。ＲＴＫのその他の非限定的な例として、胎仔肝臓キナーゼ１（ＦＬＫ−１）（時にはキナーゼ挿入ドメイン含有受容体（ＫＤＲ）（Ｔｅｒｍａｎら、１９９１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１６７７〜８３）または血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）と呼ばれている）、時には血管内皮細胞増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ−１）と呼ばれている、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１（Ｆｌｔ−１）（ＤｅＶｒｉｅｓら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５；９８９〜９９１；Ｓｈｉｂｕｙａら、１９９０、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：５１９〜５２４）、ニューロピリン−１、エンドグリン、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）およびＡｘ１が挙げられる。当業者であれば、本発明の特定の方法および組成物に従って発現させることができるその他の受容体が分かるであろう。
【０２１３】
特定の実施形態では、本発明に従って産生させようとする受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。ＧＰＣＲは、薬物の作用および開発についての主要な標的であり、その結果として、現在までに知られている薬物の半分以上が誕生しており（Ｄｒｅｗｓ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：１５１６）、ＧＰＣＲは、治療的介入のための最も重要な標的であり、臨床で処方されている薬物の３０％が、ＧＰＣＲに拮抗するかまたはそれを刺激するかのいずれかである（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，ＧおよびＲｅｅｓ，Ｓ．、ＴＩＰＳ、２０：１１８〜１２４、１９９９）。また、これらの受容体は、治療のための標的としての歴史が確立され証明されていることから、本発明に従うＧＰＣＲの産生も、特に興味深い。
【０２１４】
グルタミン酸受容体は、神経伝達において重要であるＧＰＣＲの群を形成する。グルタミン酸は、ＣＮＳにおける主要な神経伝達物質であり、神経細胞の可塑性、認知、記憶、学習、ならびにてんかん、脳卒中および神経変性等のいくつかの神経学的障害において重要な役割を果たすと考えられている（Ｗａｔｓｏｎ，ＳおよびＳ．Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ、Ｔｈｅ  Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．、１３０〜１３２頁、１９９４）。また、血管作動性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）ファミリーも、それらの作用がＧＰＣＲによって媒介される関連ポリペプチドの群である。このファミリーの重要なメンバーは、ＶＩＰ自体、セクレチンおよび成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）である。ＶＩＰは、平滑筋弛緩、種々の組織における分泌の刺激または阻害、種々の免疫細胞の活性の調節、ならびにＣＮＳにおける種々の興奮性および阻害性の活性を含めた、広いプロファイルの生理学的作用を示す。セクレチンは、膵臓および腸において酵素およびイオンの分泌を刺激し、また、脳においても少量存在する。
【０２１５】
抗体
抗体は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質である。多数の抗体が現在、薬学的またはその他の商業的な物質として使用されているまたは検討下にあることを考えると、本発明の方法および組成物に従う抗体の産生は、特に興味深い。
【０２１６】
宿主細胞中で発現させることができる任意の抗体を、本発明に従って使用することができる。より好ましくは、抗体は、潜在的なグリコシル化部位を、抗体の抗原結合部位の中または付近に含む。１つの実施形態では、抗体は、グリコシル化部位を可変ドメイン中に含む。さらなる実施形態では、グリコシル化部位は、ＣＤＲまたはＦＲの中に位置してよく、さらにより好ましくは、グリコシル化部位の部位の占有が、抗体の、その抗原に対する結合に影響を及ぼす。
【０２１７】
特定の実施形態では、発現させようとする抗体は、モノクローナル抗体である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、キメラ抗体である。当技術分野では知られているように、キメラ抗体は、２つ以上の生物体に由来するアミノ酸断片を含有する。キメラ抗体分子は、例えば、マウス、ラットまたはその他の種の抗体由来の抗原結合ドメインを、ヒト定常領域と共に含むことができる。キメラ抗体を作製するための多様なアプローチが記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１；Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許公開第ＥＰ１７１４９６号；欧州特許公開第０１７３４９４号、英国特許第ＧＢ２１７７０９６Ｂ号を参照されたい。これらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１８】
特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、キメラ抗体であり、大半のアミノ酸残基がヒト抗体に由来し、したがって、ヒト対象へ送達された場合、何らかの起こり得る免疫反応が最小限に留まる。ヒト化抗体の場合、超可変領域中のアミノ酸残基が、抗原に対する所望の特異性または親和性を付与する非ヒト種由来の残基で置き換えられている。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト抗体に対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセント以上の同一性を示すアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ヒト化抗体を、保存的置換、コンセンサス配列の置換、生殖系列の置換および／または逆突然変異の導入によって最適化する。そのような変化させた免疫グロブリン分子は、当技術分野で知られているいくつかの技法のうちのいずれかによって作製することができ（例えば、Ｔｅｎｇら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：７３０８〜７３１２；Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２７９；Ｏｌｓｓｏｎら、１９８２、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：３〜１６）、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１９３号またはＥＰ０２３９４００の教示に従って作製することもできる。これらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１９】
場合によっては、本開示の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を担持する遺伝子導入マウスまたは染色体導入マウスを使用して生成することができる。これらの遺伝子導入マウスおよび染色体導入マウスは、本明細書ではそれぞれＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）と呼ばれているマウスを含み、これらを、本明細書では集合的に「ヒトＩｇマウス」と呼ぶ。
【０２２０】
ＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ（登録商標），Ｉｎｃ．）は、再配列されていないヒトの重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子小座を、内因性のμ鎖およびκ鎖の座位を不活性化する、標的突然変異と一緒に含有する（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９を参照されたい）。したがって、マウスは、マウスのＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫化に応答して、導入したヒトの重鎖および軽鎖の導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高い親和性のヒトＩｇＧκモノクローナルを生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４、上記；総説、Ｌｏｎｂｅｒｇ、１９９４、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９〜１０１中；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３、ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ、１９９５、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６〜５４６）。さらに、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７〜６２９５；Ｃｈｅｎら、１９９３、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：６４７〜６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０〜３７２４；Ｃｈｏｉら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７〜１２３；Ｃｈｅｎら、１９９３、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１〜８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２〜２９２０；Ｔａｙｌｏｒら、１９９４、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９〜５９１；ならびにＦｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜８５１；全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，７８９，６５０号；第５，８７７，３９７号；第５，６６１，０１６号；第５，８１４，３１８号；第５，８７４，２９９号；および第５，７７０，４２９号；Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号；全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに対するＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０３９１８号、第ＷＯ９３／１２２２７号、第ＷＯ９４／２５５８５号、第ＷＯ９７／１３８５２号、第ＷＯ９８／２４８８４号および第ＷＯ９９／４５９６２号；ならびにＫｏｒｍａｎらに対するＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号も参照されたい。
【０２２１】
別の場合には、本開示のヒト抗体は、導入遺伝子および導入染色体の上にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウス、例として、ヒト重鎖の導入遺伝子およびヒト軽鎖の導入染色体を担持するマウスを使用して産生させることができる。そのようなマウスは、本明細書では「ＫＭ  ｍｉｃｅ（商標）」と呼ばれ、Ｉｓｈｉｄａらに対するＰＣＴ公開第ＷＯ０２／４３４７８号に詳細に記載されている。
【０２２２】
その上さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系も、当技術分野では利用可能であり、本開示の抗体を産生させるために使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれている代替のトランスジェニック系を使用することができ、そのようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに対する米国特許第５，９３９，５９８号；第６，０７５，１８１号；第６，１１４，５９８号；第６，１５０，５８４号および第６，１６２，９６３号に記載されている。
【０２２３】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替の染色体導入動物系も、当技術分野では利用可能であり、本開示の抗体を産生させるために使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれている、ヒト重鎖の導入染色体およびヒト軽鎖の導入染色体の両方を担持するマウスを使用することができ、そのようなマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２〜７２７に記載されている。さらに、ヒトの重鎖および軽鎖の導入染色体を担持するウシが、当技術分野では記載されており（Ｋｕｒｏｉｗａら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９〜８９４）、本開示の抗体を産生させるために使用することができる。
【０２２４】
また、本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫細胞が再構成されており、その結果、ヒト抗体の応答を免疫化時に生じさせることができるＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。そのようなマウスが、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらに対する米国特許第５，４７６，９９６号および第５，６９８，７６７号に記載されている。
【０２２５】
また、本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、当技術分野では確立されている。例えば、Ｌａｄｎｅｒらに対する米国特許第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；および第５，５７１，６９８号；Ｄｏｗｅｒらに対する米国特許第５，４２７，９０８号および第５，５８０，７１７号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらに対する米国特許第５，９６９，１０８号および第６，１７２，１９７号；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらに対する米国特許第５，８８５，７９３号；第６，５２１，４０４号；第６，５４４，７３１号；第６，５５５，３１３号；第６，５８２，９１５号および第６，５９３，０８１号を参照されたい。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体の可変ドメイン中に、少なくとも１つの潜在的なグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、グリコシル化部位は、ＣＤＲ中に位置し、その他の実施形態では、グリコシル化部位は、ＦＲまたは両方の中に位置する。その他の実施形態では、抗体は、定常ドメイン中に、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む。好ましくは、抗体は、重鎖定常ドメイン中に、グリコシル化部位を含む。
【０２２７】
別の態様では、本発明は、本明細書の実施形態のうちのいずれか１つに記載するタンパク質のある量を含む組成物を提供し、タンパク質の少なくとも０．５％が、アグリコシル化されている。タンパク質の量のパーセントは、とりわけ、試料中のタンパク質分子の数に関係し、適切な場合には、グリコシル化の、タンパク質の分子量に対する作用に左右される。別の実施形態では、完全グリコシル化形態のタンパク質のパーセントは、タンパク質の総量の９８％未満、または９７％未満、または９６％未満、または９５％未満、または９４％未満、または９３％未満、または９２％未満、または９１％未満、または９０％未満、または８７％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６７％未満、または６５％未満、または６０％未満、または５５％未満、または５０％未満、または４５％未満である。別の実施形態では、完全グリコシル化形態のタンパク質の量のパーセントは、非完全グリコシル化形態全てを組み合わせた場合のタンパク質の量のパーセントよりも少ない。例えば、グリコシル化の２つの潜在的な部位を有するタンパク質の場合、完全グリコシル化形態（すなわち、両方の部位が完全にグリコシル化されており、完全なグリコフォームが存在する）のタンパク質の量のパーセントは、モノグリコシル化形態（１つの部位がアグリコシル化されている）と完全アグリコシル化形態（両方の部位がアグリコシル化されている）とを組み合わせた場合に存在するタンパク質の量のパーセントよりも少なく、「アグリコシル化状態」は、ある部位に存在するグリコフォームが、タンパク質が完全にグリコシル化されている場合の当該部位に存在する完全なグリコフォームよりも、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ少ない炭水化物部分を含む場合を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書の実施形態のうちのいずれか１つに記載するタンパク質のある量を含む組成物を提供し、タンパク質の少なくとも０．５％が、アグリコシル化されている。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。
【０２２８】
タンパク質のある量を含む組成物という文脈内で使用する場合、「タンパク質の量」は、典型的なタンパク質の解析検出方法によって検出可能な量である。ある実施形態では、タンパク質の量は、０．０１ｍｇ超である。別の実施形態では、タンパク質の量は、０．１ｍｇ超である。別の実施形態では、タンパク質の量は、１．０ｍｇ超である。
【０２２９】
別の実施形態では、アグリコシル化形態のタンパク質の量のパーセントは、タンパク質の総量の少なくとも１％、または少なくとも２％、または少なくとも３％、または少なくとも４％、または少なくとも５％、または少なくとも６％、または少なくとも７％、少なくとも８％、または少なくとも９％、または少なくとも１０％、または少なくとも１２％、または少なくとも１４％、または少なくとも１６％、または少なくとも１８％、または少なくとも２０％、または少なくとも２２％、または少なくとも２４％、または少なくとも２６％、または少なくとも２８％、または少なくとも３０％である。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。
【０２３０】
別の実施形態では、完全グリコシル化形態のタンパク質のパーセントは、タンパク質の総量の９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、および６７％未満、または６５％未満、または６０％未満、または５５％未満、または５０％未満、または４５％未満である。別の実施形態では、完全グリコシル化形態のタンパク質の量のパーセントは、非完全グリコシル化形態全てを組み合わせた場合のタンパク質の量のパーセントよりも少ない。例えば、グリコシル化の３つの潜在的な部位を有するタンパク質の場合、完全グリコシル化形態（すなわち、３つの部位が完全にグリコシル化されている）のタンパク質の量のパーセントは、二重グリコシル化形態（２つの部位が完全にグリコシル化されている）と、モノグリコシル化形態（１つの部位が完全にグリコシル化されている）とアグリコシル化形態（３つの部位全てがアグリコシル化されている）とを組み合わせた場合に存在するタンパク質の量のパーセントよりも少ない。したがって、潜在的なグリコシル化部位の数がｎであり、ｎは１以上の整数である場合、ｎ個のグリコシル化部位を含むタンパク質の量は、ｎ−１個以下のグリコシル化部位を有する形態全てとして存在するタンパク質の総量よりも少ない。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。
【０２３１】
別の態様では、本発明は、タンパク質を含む組成物を包含し、当該タンパク質は、２つの潜在的なグリコシル化部位を含むポリペプチド鎖を含む抗体であり、完全グリコシル化形態（すなわち、両方の部位が占有されており、完全なグリコフォームが各部位に存在する）の抗体の量は、抗体の非完全グリコシル化形態全てを組み合わせた量よりも少ない。当業者であれば理解するであろうが、正規の抗体は典型的には、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。重鎖が、２つのグリコシル化部位を含む場合（図１４に、可変ドメイン中のグリコシル化部位および定常ドメイン中のグリコシル化部位を含む抗体を図式的に描写する）、または重鎖および軽鎖の両方のそれぞれが、１つのグリコシル化部位を含む場合、または各軽鎖が、２つのグリコシル化部位を含む場合には、完全にグリコシル化された抗体は、４つのグリコシル化部位を含むことができる。したがって、正規の抗体の場合、抗体は、グリコシル化の４つの潜在的な部位を、各重鎖上に２つ、または重鎖および軽鎖のそれぞれの上に１つ、または軽鎖上に２つ含むことができ、本発明は、完全グリコシル化形態の（すなわち、４つの部位が完全にグリコシル化されている）抗体の量のパーセントが、モノアグリコシル化形態（一方の鎖中の１つの部位および他方の鎖上の２つの部位が完全にグリコシル化されている）と、二重アグリコシル化形態（１つの鎖中の２つの部位または各鎖上の１つの部位が完全にグリコシル化されている）と、三重アグリコシル化形態（１つの鎖中の１つの部位のみが完全にグリコシル化されている）と、完全アグリコシル化形態（４つの部位全てがアグリコシル化されている）とを組み合わせた場合に存在する抗体の量のパーセントよりも少ない組成物を包含する。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているかまたは完全にはグリコシル化されていないとみなすことができる。
【０２３２】
別の態様では、本発明は、抗体を含めた、タンパク質のある量を含む組成物を提供し、タンパク質の少なくとも０．５％が、アグリコシル化されている。
【０２３３】
抗体を含めた、タンパク質のある量を含む組成物という文脈内で使用する場合、「タンパク質の量」は、典型的なタンパク質の解析検出方法によって検出可能な量である。ある実施形態では、タンパク質の量は、０．０１ｍｇ超である。別の実施形態では、タンパク質の量は、０．１ｍｇ超である。別の実施形態では、タンパク質の量は、１．０ｍｇ超である。
【０２３４】
別の実施形態では、アグリコシル化形態のタンパク質の量のパーセントは、タンパク質の総量の少なくとも１％、または少なくとも２％、または少なくとも３％、または少なくとも４％、または少なくとも５％、または少なくとも６％、または少なくとも７％、少なくとも８％、または少なくとも９％、または少なくとも１０％、または少なくとも１２％、または少なくとも１４％、または少なくとも１６％、または少なくとも１８％、または少なくとも２０％、または少なくとも２２％、または少なくとも２４％、または少なくとも２６％、または少なくとも２８％、または少なくとも３０％である。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。
【０２３５】
別の実施形態では、組成物中、完全グリコシル化形態のタンパク質の量のパーセントは、タンパク質の総量の９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６７％未満、または６５％未満、または６０％未満、または５５％未満、または５０％未満、または４５％未満である。別の実施形態では、試料中、完全グリコシル化形態のタンパク質の量のパーセントは、非完全グリコシル化形態全てのタンパク質の量のパーセントよりも少ない。例えば、グリコシル化の３つの潜在的な部位を有するタンパク質の場合、試料中、完全グリコシル化形態（すなわち、三重グリコシル化）のタンパク質の量のパーセントは、二重グリコシル化形態と、モノグリコシル化形態と、アグリコシル化形態とを組み合わせた場合のタンパク質の量のパーセントよりも少ない。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。
【０２３６】
別の実施形態では、タンパク質は、グリコシル化され得る少なくとも２つのアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、タンパク質は、グリコシル化され得る少なくとも３つのアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、タンパク質中のグリコシル化の潜在的な部位の数は２である。別の実施形態では、タンパク質中のグリコシル化の潜在的な部位の数は３である。別の実施形態では、タンパク質は、グリコシル化され得るアミノ酸残基を含むリガンド結合部位を含む。別の実施形態では、タンパク質が、グリコシル化され得る少なくとも２つのアミノ酸残基を含む場合、第１のグリコシル化の潜在的な部位は、リガンド結合部位のアミノ酸残基であり、第２のグリコシル化の潜在的な部位は、タンパク質の非リガンド結合部位中のアミノ酸残基である。別の実施形態では、タンパク質が、グリコシル化され得る少なくとも３つのアミノ酸残基を含む場合、第１のグリコシル化の潜在的な部位は、リガンド結合部位中のアミノ酸残基であり、第２のグリコシル化の潜在的な部位もまた、タンパク質のリガンド結合部位中のアミノ酸残基であり、第３のグリコシル化の潜在的な部位は、タンパク質のリガンド結合部位中にはないアミノ酸残基である。この段落の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、ある部位につながっている炭水化物残基の数が、３個以下または２個以下または１個以下である場合、この部位をアグリコシル化されているとみなすことができる。この段落の実施形態のうちのいずれかのその上さらなる実施形態では、タンパク質は、抗体のポリペプチド鎖を包含し、リガンド結合部位は、抗体の抗原結合部位を含む。
【０２３７】
非限定的な１つの例に過ぎないが、本教示に従って産生させることができる抗体は、抗ヒトＩｇＥ抗体である。抗ＩｇＥ抗体は、喘息、ならびにその他のＩｇＥ媒介性疾患、例として、これらに限定されないが、アレルギー性鼻炎および食物アレルギーの治療における療法の特に見込みのある潜在的な道である。
【０２３８】
抗ＩｇＥ抗体は、喘息治療の潜在的に見込みのある経路である。これは、抗ＩｇＥ抗体が、ＩｇＥのＦｃεＲＩに対する結合を阻止し、それによって、ＩｇＥ抗体の抗原結合後のＦｃεＲＩ受容体の架橋結合を阻止することができるからである。ＦｃεＲＩ受容体に結合しているＩｇＥ抗体の架橋結合を阻止することによって、アナフィラキシー性反応を起こす恐れがあるヒスタミンの放出の開始を阻害する。したがって、例えば、喘息を治療するために有用である抗ＩｇＥ抗体は、理想的には、ＩｇＥに結合し、そのＦｃεＲＩ受容体との相互作用を阻害するが、受容体に結合しているＩｇＥには結合せず、それによって、確実に、抗体が受容体と架橋結合してアナフィラキシー性反応を引き起こすことができないようにする（「非アナフィラキシー性抗体」と呼ばれている）。
【０２３９】
本発明において利用可能な抗体、およびそれらを産生させる方法の例が、参照により本明細書に組み込まれている、２００８年４月１日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４２８６号、２００８年１０月１６日公開のＷＯ２００８／１２３９９９に記載されている。この抗体に関するアミノ酸配列についての情報を本明細書に提供するが、さらなる情報を、ＷＯ２００８／１２３９９９に見い出すことができ、それらの出願に記載されている配列は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４０】
これらに限定されないが、喘息、アレルギー性鼻炎および食物アレルギーを含めた、種々のＩｇＥ媒介性疾患を治療するためのこれらの抗体の特定の使用については、ＷＯ２００８／１２３９９９に論じられており、その全体が、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、抗ＩｇＥ抗体またはその抗原結合部分は、潜在的なグリコシル化部位を含む。グリコシル化部位は、抗体のＣＤＲ、ＦＲもしくは両方の中にあっても、またはその抗原結合部分であってもよい。
【０２４２】
特定の実施形態では、ヒトＩｇＥに対して作られた抗ＩｇＥ抗体またはその一部は、ヒトＦｃεＲ１をトランスフェクトしたＲＢＬ−２Ｈ３細胞系を用いる細胞結合アッセイにおいて、ＩｇＥの結合を低下させるその能力によって測定した場合、０．５μｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０を有する。
【０２４３】
さらなる実施形態では抗ＩｇＥ抗体またはその一部は、ヒトＦｃεＲ１をトランスフェクトしたＲＢＬ−２Ｈ３細胞系のＩｇＥ媒介性脱顆粒を阻害するその能力によって測定した場合、０．５μｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０を有し、この場合、ＲＢＬ−２Ｈ３（ＦｃεＲ１）細胞を、抗ＩｇＥ抗体およびヒトＩｇＥと共に４８時間培養し、洗浄して抗ＩｇＥ：ＩｇＥ複合体を除去し、ＦｃεＲ１に結合しているＩｇＥを残し、次いで、結合しているＩｇＥと架橋するポリクローナル抗ＩｇＥ抗体を用いて刺激し、その結果、ＩｇＥ媒介性脱顆粒を生じさせる。さらなる実施形態では、前記ＩＣ５０は、０．２μｇ／ｍＬ未満、０．１μｇ／ｍＬ未満、０．０８μｇ／ｍＬ未満、または０．０２μｇ／ｍＬ未満である。
【０２４４】
別の実施形態では、ヒトＩｇＥに対して作られた抗体またはその抗原結合部分は、受容体と結合しているＩｇＥと架橋結合せず、ヒトＩｇＥと共に４８時間培養し、次いで、洗浄して未結合のＩｇＥを除去したＲＢＬ−２Ｈ３（ＦｃεＲ１）細胞のＩｇＥ依存性脱顆粒を刺激しない。本発明の、ヒトＩｇＥに対して作られた抗体またはその抗原結合部分は、単離ＲＢＬ−２Ｈ３（ＦｃεＲ１）に対するアゴニスト活性を示さない。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＥに対して作られた抗体またはその抗原結合部分は、受容体と結合しているＩｇＥと架橋結合せず、ヒトＩｇＥと共に一晩培養したヒト血液好塩基球のＩｇＥ依存性脱顆粒を刺激しない。本発明の、ヒトＩｇＥに対して作られた抗体またはその抗原結合部分は、単離ヒト血液好塩基球に対するアゴニスト活性を示さない。
【０２４６】
その他の実施形態では、ヒトＩｇＥに対して作られた抗体またはその抗原結合部分は、ヒトのＩｇＡ、ＩｇＧＩおよびＩｇＧ３と比べて、ＩｇＥに対して非常に選択的である。
【０２４７】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって測定した場合、完全長のヒトＩｇＥに１５ｎＭ以下の親和性定数Ｋ０で結合する。
【０２４８】
特定の実施形態では、非アナフィラキシー性抗ＩｇＥ抗体は、ＷＯ２００８／１２３９９９に開示されているｍＡｂ５．９４８．１である。５．９４８．１抗体は、潜在的なＮ−連結性グリコシル化部位を、重鎖可変ドメインのアミノ酸残基番号７３において含む。より具体的には、グリコシル化部位は、可変ドメインの第３フレームワーク領域（ＦＲ３）中に位置する。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、抗ＩｇＥ抗体またはその一部は、潜在的なグリコシル化部位を、抗原結合ドメイン中に含む。特定の実施形態では、抗体は、潜在的なグリコシル化部位を、可変ドメインのＣＤＲまたはＦＲの中に含む。
【０２５０】
別の実施形態では、抗ＩｇＥ抗体またはその一部は、抗体５．９４８．１の場合と同一のヒトＩｇＥのエピトープに結合する。
【０２５１】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号８に対して少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、さらにより好ましくは、少なくとも９８％、その上より好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を示す重鎖可変ドメインのアミノ酸配列、および配列番号１０に対して少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、さらにより好ましくは、少なくとも９８％、その上より好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を示す軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号８と同一の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列および配列番号１０と同一の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含み、配列番号１０のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインをさらに含む。
【０２５３】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、共にＣｏらに対する米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号（それらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている）に開示されている抗ＣＤ３３抗体Ｍ１９５を含む。Ｍ１９５は、グリコシル化部位を、抗体の抗原結合部分内部に含み、より具体的には、Ｍ１９５は、Ｎ−連結性グリコシル化部位を、重鎖可変ドメインの第３フレームワーク領域内部に含む。すなわち、マウス親抗体のヒト化プロセスの間に、グリコシル化部位が、重鎖可変ドメイン内にＦＲ３において導入された。グリコシル化部位を変異誘発によって除去すると、抗体のＣＤ３３への結合が増加した。およそ２０％の抗体が、グリコシル化部位を可変ドメイン内部に含むことは知られていたが、抗体の抗原結合断片中のグリコシル化が抗原結合に対して作用を示すとは考えられていなかった。ＳｏｘおよびＨｏｏｄ、１９７０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６６：９７５を参照されたい。実際には、ＣＤＲ２におけるグリコシル化が実は、抗体のその抗原α−（１，６）−デキストランへの結合を増加させると報告されていた（Ｗａｌｌｉｃｋら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１０９９；Ｗｒｉｇｈｔら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２７１７）。したがって、当業者であれば、本明細書が提供する開示を頼りに、対象とする抗体は、潜在的なグリコシル化部位の存在について判定しなければならないことを理解するであろう。この判定は、これらに限定されないが、本明細書に提供するもの、例として、タンパク質中のグリコシル化の存在を同定することができるアミノ酸配列解析および／またはクロマトグラフィーの技法を含めて、当技術分野で周知の多様な方法を使用して実施することができる。
【０２５４】
当業者であれば、抗体が潜在的なグリコシル化部位を可変ドメインまたは抗原結合部分に含むことを決定した後に、抗体のアミノ酸配列を変化させることを必要としない、本明細書に提供する新規な方法に従って、抗体のグリコシル化レベルを低下させることを、本発明が包含することを理解するであろう。当業者であれば、本明細書に提供する教示を頼りに、可変領域のアミノ酸配列を変化させることなく、本明細書に提供する新規な方法によって、抗体のグリコシル化レベルの低下が可能となることをさらに理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗体の可変ドメイン中の単一のアミノ酸の変化でさえ、抗原結合に対して劇的に有害な作用を示す場合があることを理解するであろう。したがって、本明細書が提供する新規な方法によって、抗体のグリコシル化の低下が可能となり、これによって、抗体の結合の特徴を、可変ドメインのアミノ酸配列を変化させることなく改善することができる。
【０２５５】
特定の実施形態では、タンパク質のグリコシル化を減少させるまたは無効にすることによって、タンパク質の、受容体または抗体それぞれの少なくとも１つのリガンドまたは抗原に対する結合が、完全にグリコシル化されている点以外は同一のタンパク質の、同一のリガンドまたは抗原に対する結合と比較して増加する。
【０２５６】
その他の実施形態では、グリコシル化の少ないタンパク質の生物学的活性に対して、より多くまたは完全にグリコシル化されている点以外は同一のタンパク質と比較して、何ら作用が示されない場合でさえも、当業者であれば、アグリコシル化されているタンパク質の産生によって、実質的な製造上の利点を得る場合があることを理解するであろう。すなわち、具体的には、これらに限定されないが、少なくとも２つのグリカンを含むタンパク質を産生するため、ならびに／または各部位に存在するグリカンの占有レベルおよび／もしくはグリコフォームの産生の制御が困難である場合に、新規な方法は、制御されたグリカンを産生させて、仕様（例えば、グリコシル化がないこと）を満たすこと、ならびに／またはロットおよび／もしくはバッチの不出来の減少のいずれかのための有用な方法を提供する。したがって、当業者であれば、本明細書が提供する教示を頼りに、本発明は、グリコシル化が減少している／アグリコシル化されているタンパク質については、生物学的活性の検出可能な差が達成されない場合であってさえ、糖タンパク質のための細胞培養製造プロセスのロバストさを改善するための新規な方法を提供することを理解するであろう。
【０２５７】
別の実施形態では、より低いレベルのグリコシル化を含む本発明のタンパク質は、Ｘ線結晶解析研究およびトリプシン消化研究のために有用である場合がある（例えば、Ｃｈａｐｌｉｎら、１９９１、ＧＢＨ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  １５（Ｐｒｏｔｅｉｎ）：２７９〜２８２を参照されたい）。
【０２５８】
それに代わってまたはそれに加えて、本発明のタンパク質が免疫グロブリンドメインを含む場合、例えば、タンパク質が、Ｉｇの一部（例えば、Ｆｃ部分）を含む抗体または融合タンパク質である場合、アミノ酸の改変を、タンパク質の生物学的特徴を変化させる１つまたは複数のさらなるアミノ酸の改変と組み合わせることが有用である場合もある。
【０２５９】
フレームワーク領域またはＣＤＲ領域の内部に作製した改変に加えてまたはそれに代わって、開示の糖タンパク質を操作してＦｃ領域内部に改変を含ませて、典型的には、抗体の１つまたは複数の機能的特性、例として、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞傷害性を変化させることもできる。さらに、開示の抗体は、化学的に改変してもよく（例えば、１つもしくは複数の化学的部分を抗体につなげることができる）、または改変してそのグリコシル化を変化させて、ここでも、抗体の１つもしくは複数の機能的特性を変化させてもよい。これらの態様のそれぞれを、以下にさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵ指数の番号付けである。
【０２６０】
ある場合には、ＣＨ１のヒンジ領域を、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変化する、例えば、増加または減少するように改変する。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を変化させて、例えば、軽鎖と重鎖との集合を促進するか、または抗体の安定性を増加もしくは減少させる。
【０２６１】
別の場合には、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、１つまたは複数のアミノ酸の突然変異を、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインの界面領域内に導入し、その結果、抗体は、未変性のＦｃ−ヒンジドメインのブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）への結合と比べて、損なわれたＳｐＡへの結合を示す。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
【０２６２】
別の場合には、抗体を改変して、その生物学的半減期を増加させる。種々のアプローチが可能である。例えば、以下の突然変異のうちの１つまたは複数を導入することができる：Ｗａｒｄに対する米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載されているように、生物学的半減期を増加させるために、抗体を、ＣＨ１領域またはＣＬ領域の内部で変化させて、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループからとったサルベージ受容体結合エピトープを含有させる。
【０２６３】
さらにその他の場合には、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基で置き換えることによって、Ｆｃ領域を変化させて、抗体の（１つまたは複数の）エフェクター機能を変化させる。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置き換えることができ、その結果、抗体は、エフェクターリガンドに対する親和性の変化を示すが、親抗体の抗原結合能力は保持する。それに対する親和性を変化させるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１構成成分であってよい。このアプローチは、共にＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
【０２６４】
別の場合には、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置き換えることができ、その結果、抗体はＣ１ｑ結合の変化および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の低下もしくは無効化を示す。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【０２６５】
別の例では、２３１位と２３９位との内部のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を変化させて、それによって、抗体の補体と結合する能力を変化させる。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９３５１号にさらに記載されている。
【０２６６】
さらに別の例では、以下の位置における１つまたは複数のアミノ酸を改変することによって、Ｆｃ領域を改変して、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増加させ、かつ／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性を増加させる：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位が位置付けられており、結合の改善を示す変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１〜６６０４を参照されたい）。２５６位、２９０位、２９８位、３３３位、３３４位および３３９位における特異的な突然変異が、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の組合せの突然変異体も、ＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。例えば、本明細書に記載する２２Ｂ５／ＤＬＥ抗体は、ＩｇＧアイソタイプのＩｇＧ１サブクラスを使用するが、部位特異的変異誘発を通して、（野生型ＩｇＧ１サブクラスと比較して）以下の突然変異が組み込まれている：Ｓ２４７Ｄ；Ａ３３８Ｌ；およびＩ３４０Ｅ。同様に以下に、より詳細に記載するように、そのようなＳ２４７Ｄ、Ａ３３８ＬおよびＩ３４０Ｅの突然変異は、２４Ｃ７モノクローナル抗体、１Ｄ９モノクローナル抗体および２Ｄ２モノクローナル抗体の中にも導入されている。実施例においてさらに記載するように、そのような突然変異によって、抗体のＦｃγ受容体に対する親和性を増加させ、したがって、そのエフェクター機能を増加させることができる。したがって、本発明は、少なくとも１つの突然変異をＦｃ領域中に含み、突然変異を含まない点以外は同一の抗体よりも、検出可能に向上したＡＤＣＣ応答を示す抗体を包含する。
【０２６７】
特定の実施形態では、上記のモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体またはヒト化抗体は、天然の任意の種におけるいずれの抗体中にも天然には存在しないアミノ酸残基を含有することができる。これらの外来の残基を活用して、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体またはヒト化抗体に対して、新規なまたは改変された特異性、親和性またはエフェクター機能を付与することができる。
【０２６８】
凝固因子
凝固因子が、薬学的および／または商業的な物質として有効であることが示されている。血友病等の疾患の治療における組換え凝固因子の重要性を考えると、本発明の方法および組成物に従って、組換えによって産生させる凝固因子の発現を最適化することは、特に興味深い。本発明に従って産生させることができる凝固因子の１つの非限定的な例が、凝固第ＩＸ因子（第ＩＸ因子または「ＦＩＸ」）である。ＦＩＸは、一本鎖の糖タンパク質であり、これが欠乏すると血友病Ｂを発症し、これに罹患すると血液が凝固することができなくなる障害である。したがって、出血に至る小さな創傷はいずれも、生命を危うくする事象となる恐れがある。
【０２６９】
ＦＩＸは、複数のグリコシル化部位を有し、Ｎ−連結性炭水化物およびＯ−連結性炭水化物の両方を含む。細胞培養物中のチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞によって産生させたＦＩＸは、セリン６１のオリゴ糖鎖に関して変動をいくらか示す。これらの異なるグリコフォーム、およびその他の潜在的なグリコフォームは、ヒトまたは動物に投与した場合、凝固を引き起こす能力が異なる場合があり、かつ／または血中安定性が異なり、凝固の有効性が低下する場合がある。
【０２７０】
血友病Ａは、臨床的には血友病Ｂとは区別できないが、これは、ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子、すなわち、一本鎖チモーゲンとして合成され、次いで、二本鎖の活性な形態にプロセシングされる、別の糖タンパク質の欠損によって引き起こされる。凝固第ＶＩＩＩ因子の凝固活性を調節するためにもまた、本発明を利用して、そのグリコシル化パターンを制御し、または変化させることができる。本発明に従って、産生させることができ、そのグリコシル化パターンを制御し、または変化させることができるその他の糖タンパク質凝固因子として、例えば、これらに限定されないが、組織因子およびフォン−ヴィルブランド因子が挙げられる。
【０２７１】
酵素
薬学的および／または商業的な物質として有効であることが示されており、本発明の教示に従って産生することができることが望まれる別のクラスのポリペプチドには、酵素がある。疾患の治療、ならびにその他の商業的および薬学的な使用における組換え酵素の重要性を考えると、本発明に従う酵素の産生は、特に興味深い。
【０２７２】
非限定的な１つの例に過ぎないが、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＲ）の欠乏の結果、ゴーシェ病として知られている状態を発症し、これは、特定の細胞のリソソーム中におけるグルコセレブロシダーゼの蓄積によって引き起こされる。ゴーシェ病を有する対象は、脾腫大、肝腫大、骨格障害、血小板減少および貧血を含めた、様々な症状を示す。ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＨａｙｅｓは、一次アミノ酸配列中の単一の置換を含有する組換えＧＣＲ（ｒＧＣＲ）によって、天然に存在するＧＣＲと比較して、グリコシル化パターンが変化する、具体的には、フコース残基およびＮ−アセチルグルコサミン残基が増加することを示した（その全体が、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，５４９，８９２号を参照されたい）。したがって、本発明の方法に従うＧＣＲの産生が企図される。当業者であれば、本発明の方法に従って産生させることができる、その他の望ましい酵素が分かるであろう。
【０２７３】
増殖因子およびその他のシグナル伝達分子
薬学的および／または商業的な物質として有効であることが示されており、本発明の教示に従って産生することができることが望まれる別のクラスのポリペプチドには、増殖因子およびその他のシグナル伝達分子がある。増殖因子およびその他のシグナル伝達分子の生物学的重要性、ならびに潜在的な治療剤としてのそれらの重要性を考えると、本発明の方法および組成物に従うこれらの分子の産生は、特に興味深い。増殖因子は典型的には、細胞によって分泌され、その他の細胞上の受容体に結合し、それらを活性化して、受容体細胞中の代謝および発生の変化を開始する糖タンパク質である。
【０２７４】
哺乳動物の増殖因子およびその他のシグナル伝達分子の非限定的な例として、サイトカイン；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ等；形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−アルファ、およびＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４もしくはＴＧＦ−ベータ５を含めた、ＴＧＦ−ベータ等；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合性タンパク質；ＣＤタンパク質、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９等；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、インターフェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマ等；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＴＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファおよびベータ；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびフォン−ヴィルブランド因子等、抗凝固因子、プロテインＣ等；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化物、ウロキナーゼ、またはヒトの尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化物（ｔ−ＰＡ）等；ボンベシン；トロンビン、造血性増殖因子；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；神経栄養因子、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５もしくはＮＴ−６）等、または神経成長因子、ＮＧＦ−ベータ等が挙げられる。当業者であれば、本発明に従って発現させることができるその他の増殖因子またはシグナル伝達分子が分かるであろう。
【０２７５】
ポリペプチドの発現のための、核酸の宿主細胞内への導入
特定の実施形態では、細胞内へ導入する核酸分子が、本発明に従って発現させることが望まれるポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、核酸分子は、所望のポリペプチドの細胞による発現を引き起こす遺伝子産物をコードすることができる。例えば、導入する遺伝子材料が、内因性または異種のポリペプチドの転写を活性化する転写因子をコードすることができる。それに代わってまたはそれに加えて、導入する核酸分子が、細胞によって発現するポリペプチドの翻訳または安定性を増加させることができる。
【０２７６】
核酸は、Ｎ−連結性またはＯ−連結性の少なくとも１つの潜在的なグリコシル化部位を含むタンパク質をコードする任意の核酸であってよい。その他の実施形態では、核酸は、少なくとも、１つのＮ−連結性の潜在的なグリコシル化部位および１つのＯ−連結性の潜在的なグリコシル化部位を含むタンパク質をコードする。潜在的なグリコシル化部位の存在は、特定のタンパク質について知ることができるか、またはこれに限定されないが、タンパク質のアミノ酸配列中の正規のグリコシル化部位の存在を含めた、当技術分野でよく知られている要因や、グリコシル化部位を予測するための、多数の無料で利用可能なコンピュータソフトウェアプログラム等に基づいて予測することができる。その他の実施形態では、タンパク質が、グリコシル化されることが知られており、そのようなタンパク質として、これらに限定されないが、抗体および沢山の糖タンパク質、例えば、ＷＯ２００４／０９９２３１に記載されているものが挙げられる。好ましくは、グリコシル化部位は、タンパク質の生物学的機能に関係するまたは関与する、タンパク質の一部、例として、これに限定されないが、タンパク質の別のタンパク質との相互作用を媒介する部位の内部にあることが知られている。さらにより好ましくは、タンパク質のグリコシル化は、タンパク質の生物学的機能に影響を及ぼすことが知られている。しかし、潜在的なグリコシル化部位を含む任意のタンパク質を、本明細書に提供する新規な方法を使用して産生させることができ、対象とする機能に対する任意の作用、例えば、別のタンパク質との相互作用を判定することができる。すなわち、本発明の方法に従ってグリコシル化阻害剤の存在下でもたらされるタンパク質の対象とする機能を、グリコシル化阻害剤が存在しない点以外は同一の条件下で産生させた、それ以外は同一のタンパク質の機能と比較し、それによって、グリコシル化が対象とする機能に影響を及ぼすかどうかを判定することができる。グリコシル化が、タンパク質の対象とする機能に影響を及ぼす場合、タンパク質は、本発明の方法に従って産生させようとする候補となる。したがって、グリコシル化が、タンパク質の治療的機能に影響を及ぼす、それを媒介する、またはそれに関係する場合には、任意の対象とする治療用タンパク質を、本発明の新規な方法によって産生させることができる。
【０２７７】
対象とするタンパク質をコードする核酸配列は、当技術分野で周知の方法によって得ることができ、多くは、いくつかのデータベースから容易に入手可能である。特定の実施形態では、配列は、当技術分野で知られている。例えば、ヒトＲＡＧＥ配列は、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり（アクセッション番号：ＮＭ＿００１１３６）、これを参照されたい。種々のＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の配列は、対象とする、抗体を含めた、多くのその他のタンパク質の配列と同様、当技術分野で入手可能である。その他の実施形態では、対象とするタンパク質をコードする核酸配列が知られていない場合には、配列を、当技術分野でよく知られている標準的な方法を使用して得ることができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用する宿主細胞中でのタンパク質の発現を増加させるために、核酸配列のコドンの最適化を行うことができるが、それを必要とするわけではない。対象とする核酸の宿主細胞における発現を増加させるためのコドンの最適化のための技法は、当技術分野ではよく知られており、それらとして、これらに限定されないが、Ａｎｇｏｖら（２００８、ＰｌｏＳ  ＯＮＥ  ３：ｅ２１８９［ｗｗｗ．ｐｌｏｓｏｎｅ．ｏｒｇにおいて利用可能］）、ならびにＨａｔｆｉｅｌｄおよびＲｏｔｈ（２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．１３：２７〜４２）に記載されているものが挙げられ、また、タンパク質発現最適化サービスも、例えば、ＣＯＤＡ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）およびＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）から市販されている。
【０２７８】
本発明の治療用タンパク質をコードする核酸は、入手後には、次いで、宿主細胞内に導入する。対象とするポリペプチドの発現を達成するのに十分な核酸を、宿主細胞内に導入するための適切な方法が、当技術分野では知られている。例えば、Ｇｅｔｈｉｎｇら、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：６２０〜６２５；Ｍａｎｔｅｉら、１９７９、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０〜４６；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、ＥＰ１１７，０６０；およびＥＰ１１７，０５８を参照されたい。これらのそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれている。哺乳動物細胞の場合、遺伝子材料を細胞内に導入する通常の方法には、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｒｂ、１９７８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６〜４５７のリン酸カルシウム共沈殿法、またはＨａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ、１９９３、Ｆｏｃｕｓ  １５：７３のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）法がある。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的な態様が、Ａｘｅｌによって米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。遺伝子材料を哺乳動物細胞中に導入するための種々の技法については、Ｋｅｏｗｎら、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５２７〜５３７；Ｍａｎｓｏｕｒら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８〜３５２；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、２００２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹを参照されたい。
【０２７９】
特定の実施形態では、導入すべき核酸は、裸の核酸分子の形態をとる。これらの実施形態のいくつかの態様では、細胞内に導入する核酸分子は、ポリペプチドをコードする核酸および必要な遺伝子調節エレメントのみからなる。これらの実施形態のいくつかの態様では、ポリペプチドをコードする核酸（必要な調節エレメントを含む）は、プラスミドベクター内部に含有される。哺乳動物細胞中でポリペプチドを発現させるための適切なベクターの非限定的な代表例として、ｐｃＤＮＡ１；ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１１３６〜１１４２を参照されたい）；ｐＭＣｌｎｅｏ  Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３〜５１２を参照されたい）；バキュロウイルスベクター、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０等；ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７〜１９５）が挙げられる。特定の実施形態では、細胞内に導入すべき核酸分子は、ウイルスベクター内部に含有される。例えば、ポリペプチドをコードする核酸を、ウイルスゲノム（または部分的なウイルスゲノム）内に挿入することができる。ポリペプチドの発現を指示する調節エレメントを、ウイルスゲノム内に、挿入する核酸と共に含ませてもよく（すなわち、ウイルスゲノム内に挿入する遺伝子に連結する）、またはウイルスゲノム自体によって提供させてもよい。
【０２８０】
ＤＮＡおよびリン酸カルシウムを含有する沈殿物を形成することによって、裸のＤＮＡを細胞中に導入することができる。それに加えてまたはそれに代わって、また、ＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストランとの混合物を形成し、この混合物を細胞と共にインキュベートすることによってか、または細胞とＤＮＡとを一緒に適切な緩衝液中でインキュベートし、細胞に高電圧電気パルスを与えること（すなわち、エレクトロポレーション）によって、裸のＤＮＡを細胞内に導入することもできる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡを、カチオン性脂質を含有するリポソーム懸濁液と混合することによって、裸のＤＮＡを細胞内に導入する。次いで、ＤＮＡ／リポソームの複合体を、細胞と共にインキュベートする。また、例えば、マイクロインジェクションによって、裸のＤＮＡを細胞内に直接注入することもできる。
【０２８１】
それに加えてまたはそれに代わって、ＤＮＡとポリリシン等のカチオンとの複合体を形成することによって、裸のＤＮＡを細胞内に導入することもできる。この複合体は、細胞表面受容体のリガンドにカップルする（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７；および米国特許第５，１６６，３２０号を参照されたい）。ＤＮＡ−リガンドの複合体の受容体への結合によって、ＤＮＡの受容体媒介性エンドサイトーシスによる取り込みが促進される。
【０２８２】
特定の核酸配列、例えば、ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含有するウイルスベクターの使用が、核酸配列を細胞内に導入するための通常のアプローチである。細胞のウイルスベクターによる感染は、多くの細胞が核酸を受け取り、これによって、核酸を受け取った細胞の選択の必要性を不要にすることができるという利点を有する。さらに、ウイルスベクター内部でコードされる分子、例えば、ウイルスベクター中に含有されているｃＤＮＡは一般に、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞中で効率的に発現する。
【０２８３】
不完全レトロウイルスが、遺伝子治療目的での遺伝子導入において使用するために十分に特徴付けられている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１、１９９０を参照されたい）。組換えレトロウイルスを構築して、対象とするポリペプチドをコードする核酸を、レトロウイルスゲノム内に挿入することができる。さらに、レトロウイルスゲノムの一部を除去して、レトロウイルスを複製欠損とすることもできる。次いで、複製欠損レトロウイルスを、ウイルス粒子にパッケージし、これを使用して、標準的な技法によって、ヘルパーウイルスの使用を通して標的細胞を感染させることができる。
【０２８４】
アデノウイルスのゲノムを、対象とするポリペプチドをコードし、発現するが、正常な溶解性ウイルスの生活環におけるその複製能力の観点では不活性化されているように操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４、１９９１；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３〜１５５、１９９２を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ｄｌ３２４またはアデノウイルスのその他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）に由来する適切なアデノウイルスベクターが、当技術分野では知られている。組換えアデノウイルスは、遺伝子送達ビヒクルが有効であるために、細胞が分裂していることを必要とせず、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、上記）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４８２〜６４８６、１９９２）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８１２〜２８１６、１９９３）、ならびに筋肉細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２５８１〜２５８４、１９９２）を含めた、多種多様な細胞型に感染させるために使用することができる点で好都合である。さらに、導入したアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含有されている外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノム内には一体化されないが、エピソーム性に留まり、したがって、導入したＤＮＡが宿主ゲノム内に一体化されてしまう状況（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）下における挿入変異誘発の結果として生じる恐れがある潜在的な問題が回避される。さらに、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡを運搬する能力も、その他の遺伝子送達ベクターと比べると大きい（最大８キロベース）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、上記で引用；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ５７：２６７、１９８６）。現在最も使用されている複製欠損アデノウイルスベクターの場合、ウイルスのＥ１遺伝子およびＥ３遺伝子は全てまたは部分的に欠失しているが、アデノウイルス遺伝子材料の８０％相当は保持されている。
【０２８５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、別のウイルス、例として、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスを、効率的な複製および生産的な生活環のためのヘルパーウイルスとして必要とする天然に存在する不完全ウイルスである。（総説として、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９、１９９２を参照されたい。）。また、これは、そのＤＮＡを非分裂細胞内に一体化することができる数少ないウイルスうちの１つでもあり、安定な一体化を高い頻度で示す（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９〜３５６、１９９２；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８、１９８９；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３〜１９７３、１９８９を参照されたい）。ＡＡＶの、わずか３００塩基対を含有するベクターは、パッケージすることができ、一体化することもできる。外因性ＤＮＡのための空間は、約４．５ｋｂまでに限られる。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０、１９８５）に記載されているもの等のＡＡＶベクターを使用して、ＤＮＡを細胞内に導入することができる。多様な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型内に導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６〜６４７０、１９８４；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１、１９８５；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２〜３９、１９８８；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１〜６１９、１９８４；およびＦｌｏｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１〜３７９０、１９９３を参照されたい）。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、対象とするＤＮＡまたは遺伝子を宿主細胞内に導入して、組換えタンパク質を発現する細胞系を産生するためのＡｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＡＣＥ）技術を使用する、哺乳動物の人口染色体の使用を包含する。従来技法と比較して、これらの哺乳動物の人工染色体によって、宿主ゲノム内への一体化に依存しないそれらの高い運搬能力および自己複製能による、細胞タンパク質の産生についての利点が得られる。これまでに、ＡＣＥ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）と呼ばれている大型のサテライトＤＮＡに基づいた人工染色体を、多様な宿主細胞のバックグラウンド中で新規に容易に生成することができることが実証されている（Ｃｓｏｎｋａら、２０００、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１３：３２０７〜３２１６；Ｈａｄｌａｃｚｋｙ、２００１、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：１２５〜１３２；Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍら、２００４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：２１；Ｐｅｒｅｚら、２００４、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ．Ｊｕｌｙ／Ａｕｇｕｓｔ  ２００４：６１〜６８；Ｓｔｅｗａｒｔら、２００２、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７１９〜７２３；Ｖａｎｄｅｒｂｙｌら、２００５、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３３：１４７０〜１４７６５）。
【０２８７】
核酸分子を細胞集団内に導入するために使用する方法によって、細胞の大部分が改変され、ポリペプチドが細胞によって効率的に発現するようになる場合、改変された細胞集団を、さらなる単離および集団内部の個々の細胞のサブクローニングなしで使用することができる。すなわち、ポリペプチドの細胞集団による産生が十分にある場合には、さらなる細胞の単離は必要とされず、集団をそのまま使用して、細胞培養に播種して、ポリペプチドを産生させることができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを効率的に産生する単一細胞を単離し、それから均一な細胞集団を拡大することが望ましい場合がある。
【０２８８】
対象とするポリペプチドをコードする核酸分子を細胞内に導入する代わりに、導入する核酸が、細胞によって内因性に産生されるタンパク質またはポリペプチドの発現を引き起こす、またはそれらの発現レベルを増加させる別のポリペプチド、タンパク質または調節エレメントをコードすることもできる。例えば、細胞は、特定のポリペプチドを発現することができるが、細胞の追加の処理がなければ、発現には至らない可能性がある。同様に、細胞は、所望の目的には不十分な量のポリペプチドしか発現することができない。したがって、対象とするポリペプチドの発現を刺激する物質を使用して、ポリペプチドの細胞による発現を引き起こすまたは増加させることができる。例えば、導入する核酸分子は、対象とするポリペプチドの転写を活性化または上方制御する転写因子をコードすることができる。そのような転写因子の発現に続いて、対象とするポリペプチドの発現、またはよりロバストな発現が生じる。同様に、導入する核酸分子は、対象とするポリペプチドの調節領域から１つまたは複数の転写リプレッサーを漸減させる１つまたは複数の調節エレメントを含有することもできる。
【０２８９】
特定の実施形態では、ポリペプチドの発現を指示する核酸は、宿主細胞内に安定に導入される。特定の実施形態では、ポリペプチドの発現を指示する核酸は、宿主細胞内に一過性に導入される。当業者であれば、実験の必要性に基づいて、核酸を細胞内に安定に導入すべきか、または一過性に導入すべきかを選ぶことができるであろう。
【０２９０】
対象とするポリペプチドをコードする遺伝子を、１つまたは複数の調節のための遺伝子調節エレメントに場合により連結することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子調節エレメントは、ポリペプチドの構成的発現を指示する。いくつかの実施形態では、対象とするポリペプチドをコードする遺伝子の誘導的発現をもたらす遺伝子調節エレメントを使用することができる。誘導性遺伝子調節エレメント（例えば、誘導性プロモーター）の使用によって、ポリペプチドの細胞中での産生の調節が可能となる。真核生物細胞中で使用するために有用である可能性がある誘導性遺伝子調節エレメントの非限定的な例として、ホルモン調節エレメント（例えば、Ｍａｄｅｒ，ＳおよびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３〜５６０７、１９９３を参照されたい）、合成リガンド調節エレメント（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９〜１０２４、１９９３を参照されたい）、ならびに電離放射線調節エレメント（例えば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１０６０７〜１０６１３、１９９３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０１４９〜１０１５３、１９９２を参照されたい）が挙げられる。当技術分野で知られている追加の細胞特異的調節系またはその他の調節系も、本明細書に記載する方法および組成物に従って使用することができる。
【０２９１】
特定の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸配列のコドンを最適化して、任意の特定の細胞中における発現レベルを増加させる。コドン最適化の方法は、当技術分野ではよく知られており、それらとして、例えば、Ａｎｇｏｖら（２００８、ＰｌｏＳ  ＯＮＥ  ３：ｅ２１８９［ｗｗｗ．ｐｌｏｓｏｎｅ．ｏｒｇにおいて利用可能］）、ならびにＨａｔｆｉｅｌｄおよびＲｏｔｈ（２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．１３：２７〜４２）に記載されているものが挙げられる。さらに、コドン最適化サービスも、例えば、ＣＯＤＡ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）およびＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）から市販されている。
【０２９２】
その他の実施形態では、ポリペプチドがシグナル配列を含む場合、天然ではポリペプチドと結合している内因性シグナル配列を、通常はポリペプチドと結合していないシグナル配列で置き換えて、培養細胞中におけるポリペプチドの発現レベルを改善することができる。すなわち、本発明のポリペプチドを、異種のペプチドと融合している融合タンパク質ポリペプチドとして発現させることができる。この異種のペプチドは、好ましくは、成熟したタンパク質またはポリペプチドのＮ末端（例えば、ヒトＲＡＧＥのＡｌａ２２またはＧｌｕ２３）において特異的な切断部位を有するシグナル配列またはその他のポリペプチドである。選択された異種の配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列である。未変性のシグナル配列を認識もプロセシングもしない原核生物の宿主細胞の場合、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩのリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列によって置換することがきる。酵母分泌の場合、未変性のシグナル配列を、例えば、酵母のインベルターゼのリーダー、α−因子のリーダー（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のα−因子のリーダーを含む）、もしくは酸性ホスファターゼのリーダー、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のグルコアミラーゼのリーダー、または例えば、ＷＯ１９９０／１３６４６に記載されているシグナルによって置換することができる。哺乳動物細胞における発現の場合、哺乳動物のシグナル配列およびウイルスの分泌リーダー、例えば、ヒトインターロイキン−３シグナル配列（アミノ酸配列ＭＳＲＬＰＶＬＬＬＬＱＬＬＶＲＰＡＭＡ［配列番号１９］；核酸配列ＡＴＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴ［配列番号２０］によってコードされる）、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域についての核酸を、読み枠中で、対象とするタンパク質をコードする核酸にライゲーションする。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、タンパク質が内因性シグナル配列を含む場合、シグナル配列をコードする核酸配列のコドンを最適化して、宿主細胞中におけるタンパク質の発現レベルを増加させることができる。
【０２９４】
当業者であれば、本発明の教示に従って、細胞に対象とするポリペプチド発現させる遺伝子を導入する方法を選び、場合により適切に改変することができるであろう。
【０２９５】
発現させたポリペプチドの単離
特定の実施形態では、本発明に従って発現させたタンパク質またはポリペプチドを単離および／または精製することが望ましい。特定の実施形態では、発現させたポリペプチドまたはタンパク質を培地中に分泌させ、したがって、細胞およびその他の固体を、精製プロセス中の第１のステップとして、例えば、遠心分離またはろ過によって除去することができる。
【０２９６】
組換え技法を使用する場合、タンパク質を、細胞内に産生させる、周辺質空間中に産生させる、または直接培地中に分泌させることができる。抗体の変異体を細胞内に産生させる場合、第１のステップとして、宿主細胞または溶解断片のいずれかである粒子性デブリを、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去することができる。Ｃａｒｔｅｒら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の周辺質空間中に分泌させた抗体を単離するための手順を記載している。手短に述べると、細胞のペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＢＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍する。細胞デブリは、遠心分離によって除去することができる。
【０２９７】
タンパク質を培地中に分泌させる場合、一般に、そのような発現系からの上清を、市販のタンパク質濃縮用フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ製またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ製の限外ろ過ユニットを使用して濃縮する。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤を、前述のステップのうちのいずれかに含ませて、タンパク質の分解を阻害することができ、抗生物質を含ませて、付随的混入物の増殖を阻止することもできる。
【０２９８】
ポリペプチドまたはタンパク質を、これらに限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲルろ過、遠心分離もしくは溶解性の差、エタノール沈殿、またはタンパク質の精製のための任意のその他の利用可能な技法（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版中、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＨａｍｅｓ（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９；ならびにＤｅｕｔｓｃｈｅｒら（編）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｖｏｌ  １８２中、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照されたい。これらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれている）を含めた、標準的な方法によって単離および精製することができる。
【０２９９】
特に免疫親和性クロマトグラフィーの場合、タンパク質を、そのタンパク質に対して産生させ、不動の支持体に固定した抗体を含む親和性カラムに結合させることによって、タンパク質を単離することができる。あるいは、親和性タグ、例として、インフルエンザ外被配列、ポリ−ヒスチジン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを、タンパク質に、標準的な組換え技法によってつなげて、適切な親和性カラム上に通すことによって簡単な精製を可能とすることができる。当業者であれば、発現させたポリペプチドを単離するために有用なその他の既知の親和性タグが分かるであろう。精製プロセスの間のポリペプチドまたはタンパク質の分解を低下させるまたは排除するために、プロテアーゼ阻害剤、例として、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンをいずれかまたは全ての段階において添加することができる。発現させたポリペプチドまたはタンパク質を単離および精製するために、細胞を溶解させなければならない場合に、プロテアーゼ阻害剤の使用は好都合であることが多い。
【０３００】
抗体、または免疫グロブリンＦｃドメインを含むタンパク質の場合、細胞から調製したタンパク質組成物を、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーが、好ましい精製技法である。プロテインＡの親和性リガンドとしての適切性は、抗体中またはＦｃ融合タンパク質中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖に基づいている抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、１９８３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３）。プロテインＧが、全てのマウスアイソタイプ、およびヒトＩｇＧ３に対して推奨されている（Ｇｕｓｓら、１９８６、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７〜１５７５）。親和性リガンドがつながっているマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、その他のマトリックスも利用可能である。制御多孔性ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスによって、アガロースを用いた場合に達成することができる流速および処理時間よりも、速い流速および短い処理時間が可能になる。抗体の変異体がＣＨ３ドメインを含む場合には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が、精製のために有用である。また、タンパク質の精製のためのその他の技法、例として、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオン性またはカチオン性の交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）上でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿も、回収しようとする抗体の変異体に依存して利用可能である。
【０３０１】
予備的な精製の（１つまたは複数の）ステップに続いて、対象とするタンパク質または抗体、および混入物を含む混合物を、約２．５〜４．５の間のｐＨの溶出用緩衝液を使用して低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけることができ、好ましくは、低い塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施する。
【０３０２】
当業者であれば、的確な精製の技法は、精製しようとするポリペプチドまたはタンパク質の特長、ポリペプチドまたはタンパク質を発現させる細胞の特長、および細胞を増殖させた培地の組成に依存して異なる場合があることを理解するであろう。
【０３０３】
医薬組成物
本発明は、活性成分としての本発明のポリペプチドまたはタンパク質を含む調製物および医薬組成物の使用を包含する。本発明は、活性成分としての本発明のポリペプチドまたはタンパク質を、第２の治療剤、例えば、化学療法剤、別の抗体またはタンパク質、免疫賦活性物質等と組み合わせて含む調製物および医薬組成物の使用もさらに包含する。そのような医薬組成物は、対象への投与のために適した形態で、各活性成分単独から、もしくは少なくとも１つの活性成分（例えば、有効用量の治療用タンパク質、有効用量の治療剤）との組合せからなってもよく、別の場合には、医薬組成物は、活性成分、ならびに１つもしくは複数の薬学的に許容できる担体、１つもしくは複数の追加の（活性および／もしくは不活性な）成分、またはこれらの何らかの組合せを含んでもよい。
【０３０４】
１つの実施形態では、タンパク質を、水溶液中で非経口（例えば、静脈内）投与し、一方、第２の治療剤（例えば、化学療法剤、第２の治療用タンパク質、第２の抗体等）を、丸剤／カプセル剤の形態で経口投与する。しかし、当業者であれば、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明は、これら、または任意のその他の製剤、用量、投与経路等に制限されないことを理解するであろう。むしろ、本発明は、タンパク質を、第２の治療剤と組み合わせて投与する任意の製剤または方法を包含し、それらとして、これらに限定されないが、多くの中でもとりわけ、各物質を異なる製剤中で異なる投与経路を介して別々に投与する場合、ならびに水性組成物中のタンパク質および治療剤を単一の組成物（例えば、第２の治療剤がタンパク質、例として、別の抗体、第２の治療用タンパク質等である場合）として投与する場合、とりわけ、静脈内投与する場合が挙げられる。したがって、以下の論述において、任意の治療用タンパク質を、任意のその他の治療用タンパク質または化合物と組み合わせて投与するステップを含む本発明の方法を実行するための種々の製剤を記載するが、本発明は、これらの製剤に制限されず、当業者であれば、本発明の方法において使用するために本明細書に提供する教示を頼りにすれば、容易に決定することができる任意の製剤を含む。
【０３０５】
本発明の方法において使用する治療用タンパク質は、対象への投与のために適した医薬組成物中に組み込むことができる。典型的には、医薬組成物は、タンパク質および薬学的に許容できる担体を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合性であるありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。薬学的に許容できる担体の例として、水、食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうちの１つまたは複数、およびそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、または塩化ナトリウムを含ませることが好ましい。薬学的に許容できる物質、例として、湿潤量または少量の補助的な物質、具体的には、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤。これらは、タンパク質またはその一部の有効期間または有効性を増強する。
【０３０６】
本発明において使用する治療用タンパク質は、多様な形態をとることができる。これらとして、例えば、液体、半固体および固体の投与剤型、例として、液体の液剤（例えば、注射用および注入用の液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム剤、ならびに坐剤が挙げられる。好ましい形態は、治療剤、意図する投与様式および治療的適応に依存する。典型的な好ましい組成物は、注射用または注入用の液剤、例として、ヒトをその他の抗体を用いて受動免疫するために使用するものに類似する組成物の形態をとる。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態では、タンパク質を、静脈内への注入または注射によって投与する。別の好ましい実施形態では、タンパク質を、筋肉内または皮下への注射によって投与する。
【０３０７】
治療用組成物は典型的には、製造および保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、液剤、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソーム剤、または高い薬物濃度に適したその他の規則正しい構造として製剤化することができる。必要量のタンパク質を適切な溶媒中に、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つまたは組合せと共に組み込み、続いて、ろ過滅菌することによって、無菌の注射用液剤を調製することができる。一般に、分散剤の基剤および上記に列挙したものからの必要なその他の成分を含有する無菌のビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって、分散剤を調製する。無菌の注射用液剤を調製するための無菌の散剤の場合には、調製の好ましい方法は、活性成分に任意の追加の所望の成分を加え、あらかじめろ過滅菌した溶液からの活性成分および追加の成分の散剤をもたらす真空乾燥および凍結乾燥である。
【０３０８】
注射に用いるために適している医薬組成物は典型的には、無菌の液剤（水溶性の場合）または分散剤、および無菌の注射用の液剤または分散剤の用時調製のための無菌の散剤を含む。静脈内投与の場合には、適切な担体は、生理食塩水、静菌的な水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を含む。全ての場合に、組成物は無菌でなければならず、シリンジへの充填が簡単に行われる程度まで流動性を示さなければならない。好都合には、特定の薬学的製剤は、製造および保管の条件下で安定であり、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。一般に、関連する担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）を含有する溶媒または分散媒体、ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってよい。例えば、レシチン等の被覆を使用する、分散剤の場合には必要な粒子サイズを維持する、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。特定の場合には、組成物中に、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、または塩化ナトリウムを含ませることが有用である。注射用組成物の長期の吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０３０９】
治療用タンパク質は、当技術分野で知られている多様な方法によって投与することができ、それらとして、経口投与、非経口投与、粘膜投与、吸入による投与、外用投与、頬側投与、経鼻投与および直腸投与が挙げられるが、これらに限定されない。多くの治療的適応について、好ましい投与の経路／様式は、皮下、筋肉内、静脈内または注入である。無針注射を、所望により利用することができる。当業者であれば理解するであろうが、投与の経路および／または様式は、望まれる結果に依存して変化する。
【０３１０】
特定の実施形態では、タンパク質は、化合物を迅速な放出から保護する担体と共に、インプラント、経皮パッチ、マイクロカプセル化送達システムを含めた、制御性放出性製剤等として調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が、特許を取得しているか、または一般的に当業者に知られている。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）中を参照されたい。
【０３１１】
投与計画を加減して、最適の所望の応答をもたらすことができる。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、いくつかに分割した用量を、長期にわたり投与してもよく、または治療の状況の要求に従って、用量を比例的に減量もしくは増量してもよい。投与を簡単にし、投与量を一様にするために、非経口組成物を投与単位剤型に製剤化することは、特に好都合である。本明細書で使用する場合、投与単位剤型は、治療すべき哺乳動物対象のための統一された投与量として適切な、物理的な個別の単位を指し、各単位は、所望の治療効果を必要な薬学的担体と共同してもたらすための計算された、活性化合物のあらかじめ決定された分量を含有する。本発明の投与単位剤型についての仕様は、（ａ）タンパク質の独特の特徴および達成しようとする特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個人の感受性を治療するためのそのような活性化合物を作り上げる分野に内在する限界によって決まり、それらに直接依存する。
【０３１２】
投与量の値は、軽減すべき状態の型および重症度によって変化する場合があり、単一または複数の用量を含む場合があることに留意されたい。任意の特定の対象について、特異的な投与計画は、個人の必要性および組成物を投与するまたは組成物の投与を監督する者の専門家としての判断に従って時間と共に加減すべきであり、本明細書に記載する投与量の範囲は、例示的なものに過ぎず、それには、請求する組成物の範囲および実行を制限する意図はないこともさらに理解されたい。
【０３１３】
１つの実施形態では、約５〜６の範囲のｐＨにおいて約１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５ｍｇ／ｍｌ、またはより好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ、またはその上より好ましくは約１５ｍｇ／ｍｌ、またはさらにより好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を、酢酸ナトリウム、ポリソルベート８０および塩化ナトリウムと共に含有する無菌の水溶液としての静脈内製剤中で投与する。好ましくは、静脈内製剤は、ｐＨ５．５において５または１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０および１４０ｍＭ塩化ナトリウムと共に含有する無菌の水溶液である。さらに、タンパク質を含む溶液は、多くのその他の化合物のうち、ヒスチジン、マンニトール、スクロース、トレハロース、グリシン、ポリ（エチレン）グリコール、ＥＤＴＡ、メチオニン、および任意のそれらの組合せ、さらに関連の分野で知られている多くのその他の化合物も含むことができる。
【０３１４】
１つの実施形態では、用量の一部を静脈内ボーラスによって、かつタンパク質製剤の残りを注入によって投与する。例えば、タンパク質をボーラスとして０．０１ｍｇ／ｋｇで静脈内注入することができ、かつあらかじめ決定されたタンパク質の用量の残りを静脈内注射によって投与することができる。タンパク質のあらかじめ決定された用量を、例えば、１時間半から２時間〜５時間までの期間にわたって投与することができる。
【０３１５】
第２の治療剤に関しては、治療剤が、例えば、小型分子である場合、当技術分野でよく知られているように、医薬組成物中に、生理学的に許容できるエステルまたは塩の形態で、例として、生理学的に許容できるカチオンまたはアニオンと組み合わせて提示することができる。
【０３１６】
本明細書に記載する医薬組成物の製剤は、薬学の分野で知られているまたは今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を担体または１つもしくは複数のその他の付属の成分と合わせ、次いで、必要であればまたは所望により、製品を所望の単回または複数回の投与単位に形作るかまたは包装するステップを含む。
【０３１７】
本発明の方法において有用である医薬組成物は、経口投与、直腸投与、膣投与、非経口投与、外用投与、肺投与、鼻腔内投与、頬側投与、眼投与、または別の投与経路に適した製剤として調製、包装または販売することができる。その他の企図する製剤には、突出型ナノ粒子（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、リポソーム調製物、活性成分を含有する再接合赤血球（ｒｅｓｅａｌｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、および免疫学に基づいた製剤がある。
【０３１８】
本発明の医薬組成物は、バルクとして、単回単位用量として、または複数の単回単位用量として調製、包装または販売することができる。本明細書で使用する場合、「単位用量」は、活性成分のあらかじめ決定された量を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は一般に、対象に投与する活性成分の投与量に、またはそのような投与量の好都合な一部、例えば、そのような投与量の２分の１または３分の１等に等しい。
【０３１９】
本発明の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容できる担体、および任意の追加の成分の相対的な量は、治療する対象の身元、サイズおよび状態に依存して、かつ組成物を投与しようとする経路にさらに依存して変化する。例えば、組成物は、０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含むことができる。
【０３２０】
活性成分に加えて、本発明の医薬組成物は、１つまたは複数の追加の薬学的に活性な治療剤もさらに含むことができる。具体的に企図する追加の薬剤には、制吐剤、止痢薬、化学療法剤、サイトカイン等がある。
【０３２１】
本発明の医薬組成物の制御性放出性製剤または持続性放出性製剤は、従来の技術を使用して作製することができる。
【０３２２】
経口投与のために適している本発明の医薬組成物の製剤は、これらに限定されないが、錠剤、硬質もしくは軟質のカプセル剤、カシェ剤、トローチ剤、またはドロップ剤を含めた、個別の固体の投与単位の形態として調製、包装または販売することができ、それぞれが、あらかじめ決定された量の活性成分を含有する。経口投与のために適しているその他の製剤として、これらに限定されないが、粉末もしくは顆粒の製剤、水性もしくは油性の懸濁剤、水性もしくは油性の液剤、または乳剤が挙げられる。
【０３２３】
本明細書で使用する場合、「油性の」液体は、炭素含有液体分子を含み、水よりも極性が低い特長を示す液体である。
【０３２４】
活性成分を含む錠剤は、例えば、活性成分を、場合により１つまたは複数の追加の成分と共に圧縮または成型することによって作製することができる。圧縮錠剤は、適切な装置中で、粉末または顆粒の調製物等の自由に流動する形態の活性成分を、結合剤、滑沢剤、賦形剤、表面活性剤および分散剤のうちの１つまたは複数と場合により混合して圧縮することによって調製することができる。成型錠剤は、適切な装置中で、活性成分と、薬学的に許容できる担体と、混合物を湿潤させるのに少なくとも十分な液体との混合物とを成型することによって作製することができる。
【０３２５】
錠剤を製造する場合に使用する薬学的に許容できる賦形剤として、これらに限定されないが、不活性な希釈剤、顆粒化剤および崩壊剤、結合剤、ならびに滑沢剤が挙げられる。既知の分散剤として、これらに限定されないが、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムが挙げられる。既知の表面活性剤として、これに限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。既知の希釈剤として、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、結晶セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムが挙げられる。既知の顆粒化剤および崩壊剤として、これらに限定されないが、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸が挙げられる。既知の結合剤として、これらに限定されないが、ゼラチン、アカシア、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。既知の滑沢剤として、これらに限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクが挙げられる。
【０３２６】
錠剤は、被覆されていなくてもよく、または対象の消化管内における崩壊を遅延させ、それによって、活性成分の持続性の放出および吸収をもたらすために、既知の方法によって被覆されていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリン等の材料を使用して、錠剤を被覆することができる。さらに、例えば、錠剤は、米国特許第４，２５６，１０８号；第４，１６０，４５２号；および第４，２６５，８７４号に記載されている方法を使用して被覆して、浸透圧制御型放出性錠剤を形成することもできる。錠剤は、薬学的に洗練された口当たりがよい調製物を提供するために、甘味剤、矯味剤、着色剤、保存剤、またはこれらの何らかの組合せもさらに含むこともできる。
【０３２７】
活性成分を含む硬質カプセル剤は、ゼラチン等の生理的に分解性の組成を使用して作製することができる。そのような硬質カプセル剤は、活性成分を含み、例えば、不活性な固体の希釈剤、例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンを含めた、追加の成分もさらに含むことができる。
【０３２８】
活性成分を含む軟質ゼラチンカプセル剤は、ゼラチン等の生理的に分解性の組成を使用して作製することができる。そのような軟質カプセル剤は活性成分を含み、これは、水、または落花生油、液体パラフィンもしくはオリーブ油等の油性の媒体と混合することができる。
【０３２９】
経口投与のために適している本発明の医薬組成物の液体製剤は、液体の形態または使用前の水もしくは別の適切なビヒクルを用いる再構成を意図する乾燥製品の形態のいずれかとして調製、包装および販売することができる。
【０３３０】
液体の懸濁剤は、活性成分を、水性または油性のビヒクル中に懸濁させるための従来の方法を使用して調製することができる。水性ビヒクルとして、例えば、水および等張食塩水を挙げることができる。油性ビヒクルとして、例えば、扁桃油、油のエステル、エチルアルコール、アラキス（ａｒａｃｈｉｓ）油、オリーブ油、ゴマ油、ヤシ油等の植物油、分画植物油、および液体パラフィン等の鉱油が挙げられる。液体の懸濁剤は、これらに限定されないが、懸濁化剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、矯味剤、着色剤および甘味剤を含めた、１つまたは複数の追加の成分をさらに含むことができる。油性の懸濁剤は、増粘剤をさらに含むことができる。既知の懸濁化剤として、これらに限定されないが、ソルビトールシロップ、水素添加食用脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、アカシアガム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース誘導体が挙げられる。既知の分散剤または湿潤剤として、これらに限定されないが、レシチン等の天然に存在するホスファチド；アルキレンオキシドの、脂肪酸と、長鎖脂肪族アルコールと、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルと、または脂肪酸およびヘキシトールの無水物に由来する部分エステルとの縮合産物（例えば、それぞれ、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、およびモノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）が挙げられる。既知の乳化剤として、これらに限定されないが、レシチンおよびアカシアが挙げられる。既知の保存剤として、これらに限定されないが、メチル、エチルまたはｎ−プロピル−パラ−ヒドロキシ安息香酸、アスコルビン酸およびソルビン酸が挙げられる。既知の甘味剤として、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロースおよびサッカリンが挙げられる。油性懸濁剤のための既知の増粘剤として、例えば、蜜ろう、固形パラフィンおよびセチルアルコールが挙げられる。
【０３３１】
水性または油性の溶媒中の活性成分の液体の液剤は、液体の懸濁剤と実質的に同様に調製することができ、主要な差は、活性成分を溶媒中に懸濁させるのではなく、溶解させる点である。本発明の医薬組成物の液体の液剤は、液体の懸濁剤に関して記載した構成成分のうちのいずれをも含むことができるが、懸濁化剤が活性成分の溶媒中への溶解を必ずしも補助するとは限らないことを理解されたい。水性溶媒として、例えば、水および等張食塩水が挙げられる。油性溶媒として、例えば、扁桃油、油のエステル、エチルアルコール、アラキス油、オリーブ油、ゴマ油、ヤシ油等の植物油、分画植物油、および液体パラフィン等の鉱油が挙げられる。
【０３３２】
本発明の薬学的調製物の粉末および顆粒の製剤は、既知の方法を使用して調製することができる。そのような製剤を対象に直接投与してもよく、またはそれらを使用して、例えば、錠剤を形成しても、カプセル剤を充填しても、もしくは水性や油性のビヒクルを添加することによって水性や油性の懸濁剤や液剤を調製してもよい。これらの製剤のそれぞれは、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、および保存剤のうちの１つまたは複数もさらに含むことができる。また、充填剤等の追加の賦形剤、および甘味剤、矯味剤または着色剤もこれらの製剤中に含ませることができる。
【０３３３】
また、本発明の医薬組成物を、水中油型の乳剤または油中水型の乳剤の形態として調製、包装または販売することもできる。油相は、オリーブ油もしくはアラキス油等の植物油、液体パラフィン等の鉱油、またはこれらの組合せであってよい。そのような組成物は、１つまたは複数の乳化剤、例として、アカシアガムまたはトラガントガム等の天然に存在するガム、大豆またはレシチンのホスファチド等の天然に存在するホスファチド、モノオレイン酸ソルビタン等の脂肪酸とヘキシトールの無水物との組合せに由来するエステルもしくは部分エステル、およびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等、そのような部分エステルのエチレンオキシドとの縮合産物もさらに含むことができる。また、これらの乳剤は、例えば、甘味剤または矯味剤を含めた、追加の成分も含有することができる。
【０３３４】
本発明の医薬組成物は、直腸投与のために適している製剤として調製、包装または販売することができる。そのような組成物は、例えば、坐剤、滞留浣腸調製物、および直腸または結腸の灌注のための溶液の形態をとることができる。
【０３３５】
坐剤製剤は、活性成分を、通常の室温（すなわち、約２０℃）においては固体であり、対象の直腸温度（すなわち、健常なヒトの場合、約３７℃）においては液体となる、非刺激性の薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせることによって作製することができる。適切な薬学的に許容できる賦形剤として、これらに限定されないが、カカオバター、ポリエチレングリコール、および種々のグリセリドが挙げられる。坐剤製剤は、これらに限定されないが、抗酸化剤および保存剤を含めた、種々の追加の成分もさらに含むことができる。
【０３３６】
滞留浣腸調製物、または直腸もしくは結腸の灌注のための溶液は、活性成分を、薬学的に許容できる液体の担体と組み合わせることによって作製することができる。当技術分野ではよく知られているように、浣腸調製物は、対象の直腸の解剖学的形態に適合されている送達装置を使用して投与することができ、その内部に包装することもできる。浣腸調製物は、これらに限定されないが、抗酸化剤および保存剤を含めた、種々の追加の成分もさらに含むことができる。
【０３３７】
本発明の医薬組成物は、膣投与のために適している製剤として調製、包装または販売することができる。そのような組成物は、例えば、坐剤、タンポン等の含浸型もしくは被覆型の膣挿入材料、圧注調製物、または膣灌注のためのジェル剤もしくはクリーム剤もしくは液剤の形態をとることができる。
【０３３８】
化学組成物を用いて、材料に対して含浸または被覆を行う方法は当技術分野ではよく知られており、それらとして、これらに限定されないが、化学組成物を表面上に堆積または結合させる方法、化学組成物を材料の合成の間に材料の構造内に（すなわち、生理的に分解性の材料と共に等）組み込む方法、および水性または油性の溶液または懸濁液を吸収性の材料内にそれに続く乾燥の有無に関わらず吸収させる方法が挙げられる。
【０３３９】
圧注調製物、または膣灌注のための液剤は、活性成分を、薬学的に許容できる液体の担体と組み合わせることによって作製することができる。当技術分野でよく知られているように、圧注調製物は、対象の膣の解剖学的形態に適合されている送達装置を使用して投与することができ、その内部に包装することもできる。圧注調製物は、これらに限定されないが、抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤および保存剤を含めた、種々の追加の成分もさらに含むことができる。
【０３４０】
本明細書で使用する場合、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織を物理的に破り、医薬組成物を組織の裂け目を通して投与することによって特徴付けられる任意の投与経路を含む。したがって、非経口投与として、これらに限定されないが、医薬組成物を、組成物の注射、外科的切開を通して組成物を適用すること、組織貫通性の非外科的創傷を通して組成物を適用すること等による、医薬組成物の投与が挙げられる。具体的には、非経口投与は、これらに限定されないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内への注射、および腎臓透析注入の技法を含むことを企図する。
【０３４１】
非経口投与に適している医薬組成物の製剤は、無菌水または無菌の等張食塩水等の薬学的に許容できる担体と組み合わせた活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与または連続的な投与のために適した形態として調製、包装または販売することができる。注射用製剤は、アンプル中または保存剤を含有する複数回用量容器中等の単位投与剤型として調製、包装または販売することができる。非経口投与のための製剤として、これらに限定されないが、懸濁剤、液剤、油性または水性のビヒクル中の乳剤、ペースト剤、および以下に論じる埋込み型の持続性放出性または生分解性の製剤が挙げられる。そのような製剤は、これらに限定されないが、懸濁化剤、安定化剤または分散剤を含めた、１つまたは複数の成分もさらに含むことができる。非経口投与のための製剤の１つの実施形態では、活性成分を適切なビヒクル（例えば、無菌の発熱性物質を有しない水）を用いる再構成のための乾燥（すなわち、散剤または顆粒の）形態で提供し、組成物は再構成してから非経口投与される。
【０３４２】
本発明の組成物は、当技術分野で既知の多様な方法によって投与することができる。投与の経路および／または様式は、望まれる結果に依存して変化する。活性化合物は、化合物を迅速な放出から保護する担体と共に、インプラント、経皮パッチ、マイクロカプセル化送達システムを含めた、制御性放出性製剤等として調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）に記載されている。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。
【０３４３】
医薬組成物は、無菌の注射用の水性または油性の懸濁剤または液剤の形態として調製、包装または販売することができる。この懸濁剤または液剤は、既知の技術に従って製剤化することができ、活性成分に加えて、本明細書に記載する分散剤、湿潤剤または懸濁化剤等の追加の成分も含むことができる。そのような無菌の注射用製剤は、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒、例えば、水または１，３−ブタンジオール等を使用して調製することができる。その他の許容できる希釈剤および溶媒として、これらに限定されないが、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成モノまたはジ−グリセリド等の固定油が挙げられる。有用であるその他の非経口的に投与可能な製剤には、活性成分を、微結晶性の形態として、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の構成成分として含むものがある。持続性放出または埋込みのための組成物は、薬学的に許容できるポリマー性または疎水性の材料、例として、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーまたは難溶性塩を含むことができる。
【０３４４】
外用投与のために適している製剤として、これらに限定されないが、液体または半液体の調製物、例として、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤またはペースト剤等の水中油型または油中水型の乳剤、および液剤または懸濁剤が上げられる。外用投与可能な製剤は、例えば、約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含むことができるが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解性の限界まで高くてもよい。外用投与のための製剤は、本明細書に記載する追加の成分のうちの１つまたは複数もさらに含むことができる。
【０３４５】
本発明の医薬組成物は、頬側の空洞を介する肺投与のために適している製剤として調製、包装または販売することができる。そのような製剤は、活性成分を含み、約０．５〜約７ナノメートル、好ましくは約１〜約６ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含むことができる。そのような組成物は、好都合には、乾燥散剤のリザーバを含む、噴霧剤の流れをリザーバに導いて散剤を分散させることができる装置を使用してか、または自己噴霧型の溶媒／散剤を分散させる容器、例として、密閉容器中の低沸点噴霧剤中に溶解もしくは懸濁させた活性成分を含む装置を使用して投与するための乾燥散剤の形態をとる。好ましくは、そのような散剤は、重量に関して少なくとも９８％の粒子が０．５ナノメートル超の直径を有し、数に関して少なくとも９５％の粒が７ナノメートル未満の直径を有する粒子を含む。より好ましくは、重量に関して少なくとも９５％の粒子が１ナノメートル超の直径を有し、数に関して少なくとも９０％の粒子が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥散剤組成物は、好ましくは、糖等の固体の微細な粉末希釈剤を含み、好都合には、単位用量剤型で提供される。
【０３４６】
低沸点噴霧剤は一般に、大気圧において６５°Ｆ未満の沸点を有する液体の噴霧剤を含む。一般に、噴霧剤は、組成物の５０〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成することができ、活性成分は、組成物の０．１〜２０％（ｗ／ｗ）を構成することができる。噴霧剤は、追加の成分、例として、液体の非イオン性もしくは固体のアニオン性の界面活性剤、または固体の希釈剤（好ましくは、活性成分を含む粒子と同じ等級の粒子サイズを有する）もさらに含むことができる。
【０３４７】
また、肺送達のために製剤化した本発明の医薬組成物は、活性成分を、溶液または懸濁液の液滴の形態として提供することもできる。そのような製剤は、活性成分を含む、場合により無菌の水性または希釈アルコールの液剤または懸濁剤として調製、包装または販売することができ、好都合には、任意の噴霧または微粒化の装置を使用して投与することができる。そのような製剤は、これらに限定されないが、サッカリンナトリウム等の矯味剤、揮発油、緩衝化剤、表面活性剤、またはメチルヒドロキシ安息香酸等の保存剤を含めた、１つまたは複数の追加の成分もさらに含むことができる。この投与経路によって提供する液滴は、好ましくは、約０．１〜約２００ナノメートルの範囲の平均直径を有する。
【０３４８】
また、肺送達のために有用であるとして本明細書に記載する製剤は、本発明の医薬組成物の鼻腔内送達のためにも有用である。
【０３４９】
鼻腔内投与のために適している別の製剤は、活性成分を含み、約０．２〜５００マイクロメートルの平均粒子を有する粗い散剤である。そのような製剤は、鼻から吸い込む様式、すなわち、鼻孔に近付けて保持した散剤の容器から鼻道を通して迅速に吸入させることによって投与する。
【０３５０】
経鼻投与のために適している製剤は、例えば、わずか約０．１％（ｗ／ｗ）から、多くは１００％（ｗ／ｗ）までの活性成分を含むことができ、本明細書に記載する追加の成分のうちの１つまたは複数もさらに含むことができる。
【０３５１】
本発明の医薬組成物は、頬側投与のために適している製剤として調製、包装または販売することができる。そのような製剤は、例えば、従来の方法を使用して作製した錠剤またはドロップ剤の形態をとることができ、例えば、０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含むことができ、残りは、経口的に溶解可能なまたは分解性の組成、および場合により本明細書に記載する追加の成分うちの１つまたは複数を含む。あるいは、頬側投与のために適している製剤は、活性成分を含む散剤またはエアロゾル化もしくは微粒化した液剤もしくは懸濁剤を含むことができる。そのような粉末の、エアロゾル化またはエアロゾル化した製剤は、分散時には、好ましくは、約０．１〜約２００ナノメートルの範囲の粒子または液滴の平均サイズを有し、本明細書に記載する追加の成分うちの１つまたは複数もさらに含むことができる。
【０３５２】
本発明の医薬組成物は、眼投与のために適している製剤として調製、包装または販売することができる。そのような製剤は、例えば、水性または油性の液体の担体中の、例えば、０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）の活性成分の液剤または懸濁剤を含めた、点眼薬の形態をとることができる。そのような点眼薬は、緩衝化剤、塩、または本明細書に記載する追加の成分のうちの１つもしくは複数もさらに含むことができる。有用であるその他の、眼から投与可能な製剤には、活性成分を微結晶性の形態としてまたはリポソーム調製物中に含むものがある。
【０３５３】
本明細書で使用する場合、「追加の成分」として、これらに限定されないが、以下のうちの１つまたは複数が挙げられる：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性な希釈剤；顆粒化剤および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；矯味剤；着色剤；保存剤；生理的に分解性の組成、ゼラチン等；水性のビヒクルおよび溶媒；油性のビヒクルおよび溶媒；懸濁化剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；ならびに薬学的に許容できるポリマー性または疎水性の材料。本発明の医薬組成物中に含ませることができるその他の「追加の成分」が、当技術分野では知られており、例えば、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８５）に記載されている。
【０３５４】
本発明の１つの実施形態では、治療用タンパク質を含む組成物は、２０ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ５．５、８４ｍｇ／ｍｌトレハロース脱水物、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および０．１ｍｇ／ｍｌＥＤＴＡ二ナトリウム水和物を含む無菌の溶液を含む。１つの態様では、タンパク質を、透明なガラス製バイアル中に、ゴム栓およびアルミニウムのシールを用いて包装する。別の態様では、バイアル１個当たり約４００ｍｇの名目充填量を有するバイアルに、約２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含有させる。
【０３５５】
本発明の治療用タンパク質組成物は、動物、好ましくはヒトに投与することができる。組成物が、治療用タンパク質と第２の治療剤との組合せを含む場合、各活性成分の投与する正確な投与量は、これらに限定されないが、動物の型、および治療する疾患状況の型、動物の年齢、および投与経路を含めた、任意の数の要因に依存して変化する。
【０３５６】
治療用タンパク質は、多くは１日数回の頻度で動物に投与してもよく、またはそれより低頻度で、例として、１日１回、週１回、２週に１回、月１回、もしくはさらにより低頻度で、例として、数カ月に１回、もしくは年１回未満もの低頻度で投与してもよい。投与頻度は、当業者には容易に明らかとなり、任意の数の要因、例として、これらに限定されないが、治療する疾患の型および重症度、動物の型および年齢等に依存する。
【０３５７】
治療用タンパク質は、多くは１日数回の頻度で動物に投与してもよく、またはそれより低頻度で、例として、１日１回、週１回、２週に１回、月１回、もしくはさらにより低頻度で、例として、数カ月に１回、もしくは年１回未満もの低頻度で投与してもよい。投与頻度は、当業者には容易に明らかとなり、任意の数の要因、例として、これらに限定されないが、治療する疾患の型および重症度、動物の型および年齢等に依存する。
【０３５８】
治療用タンパク質および第２の治療剤（例えば、第２のタンパク質）は、別々に、異なる日に、または１日の異なる時間に、および同時に、または同じ日に投与することができるという意味で同時投与することができる。したがって、同時投与は、タンパク質と第２の治療剤との投与が一方の物質を他方の非存在下で投与した場合よりも検出可能に向上する、患者に対する治療の利益を媒介するような、２つの物質の投与の任意の時間的な組合せを包含する。
【０３５９】
本発明の治療用タンパク質と第２の治療剤の組合せは、多数のその他の化合物（多くの中でもとりわけ、その他の抗ホルモン性の療法剤、サイトカイン、化学療法剤および／または抗ウイルス薬）と共に同時投与することができる。あるいは、（１つまたは複数の）化合物を、タンパク質と治療剤との組合せ、またはそれらの任意の順列の１時間、１日、１週、１カ月またはそれよりも前に投与することができる。さらに、（１つまたは複数の）化合物を、放射線の投与、幹細胞移植、もしくは任意の治療剤（例えば、サイトカイン、化学療法化合物等）の投与、またはそれらの任意の順列の１時間、１日、１週またはそれよりも後に投与することもできる。頻度および投与計画は、当業者には容易に明らかとなり、任意の数の要因、例として、これらに限定されないが、治療する疾患の型および重症度、動物の年齢および健康状況、投与する１つまたは複数の化合物の身元、種々の化合物の投与経路等に依存する。
【０３６０】
投与計画
投与計画を加減して、最適の所望の応答をもたらすことができる。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、いくつかに分割した用量を、長期にわたり投与してもよく、または治療の状況の要求に従って、用量を比例的に減量もしくは増量してもよい。投与を簡単にし、投与量を一様にするために、非経口組成物を投与単位剤型に製剤化することは、特に好都合である。本明細書で使用する場合、投与単位剤型は、治療すべき哺乳動物対象のための統一された投与量として適切な、物理的な個別の単位を指し、各単位は、所望の治療効果を必要な薬学的担体と共同してもたらすための計算された、活性化合物のあらかじめ決定された分量を含有する。本発明の投与単位剤型についての仕様は、（ａ）治療用タンパク質の独特の特徴および達成しようとする特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個人の感受性を治療するためのそのような活性化合物を作り上げる分野に内在する限界によって決まり、それらに直接依存する。
【０３６１】
本発明に従って投与する治療用タンパク質の治療有効量についての例示的、非限定的な範囲は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ超、または少なくとも約１５ｍｇ／ｋｇ、例えば約１〜３０ｍｇ／ｋｇ、または例えば約１〜２５ｍｇ／ｋｇ、または例えば約１〜２０ｍｇ／ｋｇ、または例えば約５〜２０ｍｇ／ｋｇ、または例えば約１０〜２０ｍｇ／ｋｇ、または例えば約１５〜２０ｍｇ／ｋｇ、または例えば約１５ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、軽減すべき状態の型および重症度によって変化する場合があり、単一または複数の用量を含む場合があることに留意されたい。任意の特定の対象について、特異的な投与計画は、個人の必要性および組成物を投与するまたは組成物の投与を監督する者の専門家としての判断に従って時間と共に加減すべきであり、本明細書に記載する投与量の範囲は、例示的なものに過ぎず、それには、請求する組成物の範囲および実行を制限する意図はないこともさらに理解されたい。治療用タンパク質を投与するための適切な投与量および投与計画の決定は、関連分野ではよく知られており、当業者には、本明細書に開示する教示に従って、それが包含されることを理解されたい。
【０３６２】
１つの実施形態では、本発明の抗ＩｇＥ抗体またはその抗原結合部分を、静脈内製剤中で、適切な緩衝系中の約５〜２０ｍｇ／ｍｌの抗体を含有する無菌の水溶液として投与する。
【０３６３】
１つの実施形態では、低い用量を投与するために、用量の一部を静脈内ボーラスによって、かつ抗体製剤の残りを注入によって投与する。例えば、抗体をボーラスとして０．０１ｍｇ／ｋｇで静脈内注入することができ、かつあらかじめ決定された抗体の用量の残りを静脈内注射によって投与することができる。別の実施形態では、低い用量全体を、単一のボーラス注入として投与する。より高い用量、例えば、３ｍｇ／ｋｇの場合、抗体をボーラスとしては投与しないが、全体量を注入によって投与する。抗体のあらかじめ決定された用量を、例えば、約１時間半から約５時間までの期間にわたって投与することができる。
【０３６４】
本発明の１つの実施形態では、治療用タンパク質（例えば、ｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＩｇＥ抗体等の抗体等）を、およそ３週に１回、より好ましくは約４サイクルにわたり投与し、その後は、３カ月に１回投与する。この実施形態１つの態様では、タンパク質を、約１０ｍｇ／ｋｇで投与する。
【０３６５】
当業者であれば、本発明の治療用タンパク質と第２の治療用のタンパク質もしくは薬剤との組合せを同時に投与してもよく、または本発明のタンパク質と第２の治療用のタンパク質もしくは薬剤とは、異なる時期に投与してもよいことを理解するであろう。例えば、１つの実施形態では、治療用タンパク質を単一の注射および／または注入として投与し、第２の治療剤（例えば、非タンパク質性化合物）を、タンパク質の投与の開始前、間または後に１日１回投与する。しかし、本発明は、治療剤についての任意の特定の投与量にも投与計画にも限定されない。むしろ、抗体および治療剤を投与するための最適な用量、経路および投与計画は、関連分野の当業者であれば、周知の方法を使用して容易に決定することができる。
【０３６６】
例えば、治療用タンパク質の単回用量または複数回用量を投与することができる。あるいは、少なくとも１回用量、または少なくとも３、６もしくは１２回の用量を投与することができる。これらの用量は、例えば、２週に１回、３週に１回、月１回、２０日に１回、２５日に１回、２８日に１回、３０日に１回、４０日に１回、６週に１回、５０日に１回、２カ月に１回、７０日に１回、８０日に１回、３カ月に１回、６カ月に１回、または年１回投与することができる。１つの態様では、治療用タンパク質を、３週に１回、より好ましくは約４サイクルにわたり投与し、次いで、３カ月に１回投与する。さらに、第２の治療剤またはタンパク質を、１日１回、１日に数回もしくは１回、週１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月１回、３カ月に１回、６カ月に１回、年１回、または当業者が決定する、治療の利益を患者にもたらす任意のその他の期間投与することができる。
【０３６７】
タンパク質の用途
本発明の治療用タンパク質は、親和性精製物質として使用することができる。このプロセスの場合、タンパク質をＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）樹脂またはろ紙等の固相上に、当技術分野でよく知られている方法を使用して固定化する。固定化されたタンパク質を、精製しようとする結合パートナーを含有する試料と接触させ、その後、支持体を、精製しようとする結合パートナーを除く、試料中の実質的に全ての材料を除去する適切な溶媒を用いて洗浄する。こうした結合パートナーは、固定化されたタンパク質に結合している。最後に、固定化されたタンパク質から結合パートナーを放出させる、グリシン緩衝液等の別の適切な溶媒を用いて、支持体を洗浄する。
【０３６８】
また、タンパク質は、診断アッセイにおいて、例えば、特異的な細胞、組織または血清中の、対象とする結合パートナーの発現を検出するために有用である場合もある。診断適用の場合、典型的には、本発明のタンパク質を検出可能な部分を用いて標識する。多数の標識が利用可能であり、それらには、蛍光変化を定量化する技法があり、この場合、タンパク質を、フルオロフォアを用いて標識する。化学発光基質は、化学反応によって電気的に励起され、次いで、（例えば、化学発光計を使用して）測定することができる光を放射する場合もあり、または蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識の例として、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が挙げられる。酵素を、抗体またはそれらの断片を含めて、タンパク質にコンジュゲートさせる技法が、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７３：１４７〜１６６（１９８１）に記載されている。
【０３６９】
時には、標識を、タンパク質と間接的にコンジュゲートさせる。当業者であれば、これを達成するための種々の技法が分かるであろう。例えば、タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合部分をビオチンとコンジュゲートさせることができ、上記で言及した３つの広いカテゴリーの標識のうちのいずれかを、アビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆でもよい。ビオチンは、アビジンに選択的に結合し、したがって、この間接的な様式で、標識をタンパク質とコンジュゲートさせることができる。あるいは、標識のタンパク質との間接的なコンジュゲーションを達成するために、タンパク質を、小型のハプテン（例えば、ジグロキシン（ｄｉｇｌｏｘｉｎ））とコンジュゲートさせ、上記で言及した異なる型の標識のうちの１つを、抗ハプテン抗体（例えば、抗ジグロキシン抗体）とコンジュゲートさせる。こうして、標識のタンパク質との間接的なコンジュゲーションを達成することができる。
【０３７０】
本発明の別の実施形態では、タンパク質を標識する必要ななく、その存在は、タンパク質に結合する標識された抗体を使用して検出することができる。
【０３７１】
本発明のタンパク質は、抗体を含めて、任意の既知のアッセイの方法、例として、競合結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイにおいて利用することができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。
【０３７２】
競合結合アッセイは、限られた量のタンパク質との結合について、試験試料と競合する、標識された標準の能力を利用する。試験試料中の標的の量は、タンパク質に結合するようになる標準の量に反比例する。結合するようになる標準の量の決定を促進するために、タンパク質は一般に、競合の前および後に不溶化させる。その結果、タンパク質に結合している標準および試験試料は、好都合に、未結合のままの標準および試験試料から分離することができる。
【０３７３】
サンドイッチアッセイには、２つの結合性タンパク質の使用が関与し、それぞれが、検出しようとするタンパク質の異なる結合ドメイン、または抗体の場合にはエピトープに結合することができる。サンドイッチアッセイの場合、解析しようとする試験試料に、固相上に固定化されている第１の抗体が結合し、その後、第２の抗体を含めて、第２の結合性タンパク質が、試験試料に結合し、こうして、不溶性の３部複合体が形成される。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。第２の抗体は、それ自体を検出可能な部分を用いて標識してもよく（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分を用いて標識されている抗免疫グロブリン抗体を使用して測定してもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、１つの型のサンドイッチアッセイが、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
【０３７４】
免疫組織化学検査のためには、生物学的試料は、新鮮であっても、もしくは凍結してもよく、または、例えば、パラフィン中に包埋し、ホルマリン等の保存剤を用いて固定してもよい。
【０３７５】
また、タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイのために使用することもできる。一般に、タンパク質を放射ヌクレオチド（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ等）を用いて標識し、したがって、タンパク質が結合パートナーと結合する、または抗体の場合には、抗体がその抗原と結合する組織を、免疫シンチグラフィーを使用して局在化することができる。例えば、本発明の抗ＩｇＥ抗体を使用して、例えば、喘息患者の肺中に存在するＩｇＥの量を検出することができる。または、本発明のＲＡＧＥ融合タンパク質を使用して、患者中に存在するリガンドの量を検出することができる。
【０３７６】
本発明のタンパク質は、キットとして提供する、すなわち、あらかじめ決定された量の試薬を、診断アッセイを実施するための指示と組み合わせて包装することができる。タンパク質を、酵素を用いて標識する場合、キットは、酵素が必要とする基質および補助因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含むことができる。さらに、その他の添加剤、例として、安定化剤、緩衝剤（例えば、ブロッキング緩衝剤または溶解用緩衝剤）等も含ませることができる。種々の試薬の相対的な量を大きく変化させて、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度をもたらすことができる。具体的には、試薬を、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液をもたらす、賦形剤を含む乾燥粉末、通常、凍結乾燥粉末として提供することができる。
【０３７７】
抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける用途
本発明のタンパク質を使用して、哺乳動物を治療することができることを企図する。１つの実施形態では、タンパク質を、例えば、前臨床データを得る目的で非ヒト哺乳動物に投与する。治療すべき例示的な非ヒト哺乳動物として、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、および前臨床研究が行われるその他の哺乳動物が挙げられる。そのような哺乳動物は、タンパク質を用いて治療すべき疾患についての確立された動物モデルであってもよく、またはそれらを使用して、対象とするタンパク質の毒性もしくは薬物動態を研究してもよい。これらの実施形態のそれぞれにおいて、用量漸増研究を哺乳動物に対して実施することができる。
【０３７８】
タンパク質を、非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内を含めた、任意の適切な手段によって投与し、所望により、局所的な免疫抑制治療のために病変内に投与する。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下への投与がある。さらに、タンパク質を、パルス注入によっても、具体的には、タンパク質の用量を減少させて適切に投与する。好ましくは、投与が短期または長期のいずれであるかに一部依存して、注射、最も好ましくは、静脈内または皮下への注射によって投与する。
【０３７９】
疾患を予防または治療する場合、抗体またはタンパク質の適切な投与量は、治療すべき疾患の型、疾患の重症度および経過、抗体の変異体を投与する目的が予防または治療のいずれであるか、以前の療法、患者の病歴および抗体の変異体に対する患者の応答、ならびに主治医の裁量に依存する。特定の実施形態では、本発明の抗ヒトＩｇＥ抗体を、１回または治療の間数回にわたり患者に適切に投与することができる。同様に、その他の実施形態では、本発明のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質も、１回または治療の間数回にわたり患者に投与される。
【０３８０】
疾患の型および重症度に依存して、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）のタンパク質が、例えば、１回でまたは複数回に分けて投与するにしても、連続的に注入するにしても、患者に投与するための最初の候補投与量となる。典型的な１日の投与量は、上記で言及した要因に依存して、約１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってよいであろう。数日以上にわたる反復投与の場合、状態に依存して、治療を疾患の症状の所望の抑制が生じるまで維持する。しかし、その他の投与計画が有用である場合がある。この療法の進展は、従来の技法およびアッセイによって容易にモニターされる。抗ＬＦＡ−１抗体または抗ＩＣＡＭ−１抗体のための例示的な投与計画が、ＷＯ９４／０４１８８に開示されている。
【０３８１】
種々の疾患または障害を治療するための、本発明のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の使用が、例えば、ＷＯ２００４／０１６２２９；ＷＯ２００６／０１７６４３；ＷＯ２００６／０１７６４７；ＷＯ２００７／０９４９２６；ＷＯ２００７／１３０３０２；およびＷＯ２００８／１００６７０に開示されている。
【０３８２】
タンパク質組成物は、良質の医療のための原則（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）と一致する様式で、製剤化、服用および投与される。この状況において考慮する要因には、治療する特定の障害、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、当該物質の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療担当者が知っているその他の要因がある。投与すべきタンパク質の「治療有効量」は、そのような考慮によって決まり、疾患または障害の予防、寛解または治療のために必要な最低量である。タンパク質は、問題になっている障害を予防または治療するために現在使用されている１つまたは複数の薬剤と共に、場合により製剤化されるが、そうである必要はない。そのようなその他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、障害または治療の型、および上記で論じたその他の要因に依存する。これらは一般に、以前に使用された場合と同じ投与量および投与経路を用いてか、またはこれまでに利用された投与量の約１〜９９％で使用される。
【０３８３】
ＩｇＥを標的として認識する本発明の抗ＩｇＥ抗体を使用して、「ＩｇＥ媒介性障害」を治療することができる。これらには、喘息、アレルギー性鼻炎および結膜炎（季節性鼻アレルギー）、湿疹、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、ならびに食物アレルギー等の疾患がある。また、例えば、ハチにさされること、ヘビにかまれること、食物または医薬品が引き起こすアナフィラキシー性ショックの重大な生理学的状態も、本発明の範囲の下に包含される。
【０３８４】
終末糖化産物（ＡＧＥ）、アミロイドベータ（Ａβ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｓ１００、カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）、アンフォテリンおよびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を標的として認識する本発明のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を使用して、ＲＡＧＥが媒介するまたはＲＡＧＥのそのリガンドへの結合に関係する任意の疾患、状態または障害、すなわち、「ＲＡＧＥ媒介性障害」を治療することができる。ＲＡＧＥは、多様な疾患状況に関係しているとみなされており、そのようなＲＡＧＥ媒介性障害として、これらに限定されないが、とりわけ、糖尿病の症状もしくは糖尿病後期合併症の症状、例えば、糖尿病性腎障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性足部潰瘍、心血管系の合併症もしくは糖尿病性ニューロパシー；アミロイドーシス、アルツハイマー病、癌、腎不全、または自己免疫に関係する炎症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、低酸素、脳卒中、心臓発作、出血性ショック、敗血症、臓器移植、もしくは損なわれた創傷治癒；骨粗鬆症、腎不全、移植片拒絶、移植術に伴う炎症および／もしくは拒絶が挙げられる。
【０３８５】
以下の実験的な実施例を参照することによって、本発明を詳細にさらに記載する。これらの実施例を提供する目的は例示のために限られ、これらには、別段の記載がない限り制限する意図はない。したがって、いかなる場合であっても、本発明が以下の実施例に限定されると解釈してはならず、むしろ、本発明は、本明細書が提供する教示の結果として明らかになるありとあらゆる変更形態を包含すると解釈すべきである。
【実施例１】
【０３８６】
グリコシル化の制御：グリコシル化阻害剤であるツニカマイシンを使用したグリカン部位の占有の減少は、ＲＡＧＥリガンド結合に影響を及ぼす
終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）は、いくつかの慢性障害の病態に関連付けられてきており、その結果として治療的介入の標的として積極的に追求されている。ＲＡＧＥは、そのグリコシル化状態がそのリガンドへ結合に影響を及ぼすことがある糖タンパク質であることが最近の研究によって示されてきた。この研究において、本発明者らは、組換えヒトｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を発現させ、そのグリコシル化状態およびタンパク質分解処理を調査した。ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質は、３つのＮ−連結性グリコシル化部位を有し（２つはｓＲＡＧＥドメインにあり、１つはＦｃ領域にある）、それはＣＨＯ細胞中で発現するとき、概ね７０％が完全に占有されている。
【０３８７】
ツニカマイシン処理した細胞培養物を使用して、このタンパク質の部位占有変異体を発現させた。部位占有変異体を単離し、ＲＡＧＥリガンドであるＳ１００ｂへの結合に対するグリカン占有の影響を評価した。アグリコシル化変異体は、完全に占有されたバージョンと比較してＳ１００ｂへの結合において１０倍の増加を示し、一方二重占有された変異体は、２つの間の中間の結合を示した。さらに、ＣＨＯが発現するｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の概ね２０％は、サブチリシン様プロテアーゼであるフューリンによって切断され、ＲＡＧＥドメインの損失がもたらされることを本発明者らは見出した。これらの研究は、最適なリガンド結合活性のための組換えＲＡＧＥ分子の翻訳後の必要条件への識見を提供し、ＣＨＯ細胞中の完全長タンパク質の発現に関連する潜在的な課題を強調した。
【０３８８】
糖化終末産物受容体（ＲＡＧＥ）は、その発現が糖尿病、慢性炎症およびアルツハイマー病を含めたいくつかのヒト疾患において上方制御される、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである（Ｒａｍａｓａｍｙら、２００５、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１５：１６Ｒ〜２８Ｒ）。ＲＡＧＥのリガンドには、還元糖への脂質およびタンパク質の曝露、ならびにそれに続く不可逆的な複雑な分子の再構成からもたらされる不均一な構造である終末糖化産物（ＡＧＥ）が含まれる（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら、１９８８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８：１３１５〜１３２０；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９４、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１４：１５２１〜１５２８）。ＡＧＥ以外に、ＲＡＧＥは、アミロイドベータ（Ａβ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｓ１００（カルグラニュリンファミリーの炎症誘発性メンバー）、カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）、アンフォテリンおよびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を含めた多数の機能的および構造的に多様なリガンドに結合する（Ｂｕｃｃｉａｒｅｌｌｉら、２００２、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５９：１１１７〜１２８；Ｃｈａｖａｋｉｓら、２００４、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．６：１２１９〜１２２５；Ｋｏｋｋｏｌａら、２００５、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：１〜９；Ｓｃｈｍｉｄｔら、２００１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：９４９〜９５５；Ｒｏｃｋｅｎら、２００３、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６２：１２１３〜１２２０）。
【０３８９】
様々な組織におけるそのリガンドへの結合によるＲＡＧＥの活性化は、アルツハイマー病（Ｙａｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ３８２：６８５〜６９１）、ならびに癌細胞浸潤および転移（Ｔａｇｕｃｈｉら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ４０５：３５４〜３５７）を含めて、種々の状態に関連付けられてきた（Ｈｏｆｍａｎｎら、１９９９、Ｃｅｌｌ９７：８８９〜９０１；Ｗａｕｔｉｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２３８〜２４３；Ｔｅｉｌｌｅｔら、２０００、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１１：１４８８〜１４９７；Ｖｌａｓｓａｒａら、１９９６、Ｆｉｎｎｉｓｈ  Ｍｅｄ．Ｓｏｃ．ＤＵＯＤＥＣＩＭ、Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２８：４１９〜４２６；Ｈａｍｍｅｓら、１９９９、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ４２：６０３〜６０７）。
【０３９０】
ＲＡＧＥ受容体へのリガンドの結合は、その上方制御に関与する（Ｓｃｈｍｉｄｔら、２０００、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１４９８：９９〜１１１）。受容体の発現の増加は、細胞シグナル伝達および活性化をもたらし、それが慢性疾患の病態の原因となる（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９９、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８４：４８９〜４９７）。ＲＡＧＥを下方制御し、リガンド関与のサイクルを妨げる１つの方法は、膜貫通ドメインを欠いている「おとり」または可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）を生じさせることである。外来性ｓＲＡＧＥによる処理は、糖尿病マウスモデルにおいて糖尿病性アテローム性動脈硬化の促進を抑制することが示されてきており（Ｐａｒｋら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４：１０２５〜１０３１）、ＲＡＧＥが治療的介入のための有用な標的であり得るという考えを支援する（ＨｕｄｓｏｎおよびＳｃｈｍｉｄｔ、２００４、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ２１：１０７９〜１０８６、ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｔｅｒｎ、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１１：３６８〜３７５、Ｈｕｄｓｏｎら、２００３、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４１９：８０〜８８）。
【０３９１】
この研究において記載されたｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質は、有望な治療上のおとりとして設計された組換え分子である。このタンパク質は、ヒトＩｇＧ１重鎖分子のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結したヒトＲＡＧＥのリガンド結合Ｖ様ドメインおよび定常型様Ｃ１ドメインを含有する（図１）。ｓＲＡＧＥは、単量体としてマウスから単離されてきており（Ｈａｎｆｏｒｄら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５００１９〜５００２４）、また大腸菌（Ｗｉｌｔｏｎら、２００６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆ．４７：２５〜３５）および酵母（Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４７：４〜１１）中に単量体として発現されてきたが、ここでは二量体としてのヒトｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の発現を本発明者らは報告する。本発明者らは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に発現したときのｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のタンパク質分解的切断およびグリコシル化パターンについて記載する。そのリガンドへの結合に対するヒトＲＡＧＥのＮ−連結性グリコシル化の機能的役割を評価するために、本発明者らはツニカマイシンを使用して、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のＮ−連結性部位占有変異体を産生し、ＲＡＧＥリガンドであるＳ１００ｂへのグリコシル化変異体の結合を測定した。
【０３９２】
実験手順
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を発現している宿主細胞系の産生：
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を発現しているＣＨＯ細胞系は、図２に示すアミノ酸配列（配列番号１）をコードするｓＲＡＧＥ−Ｉｇ  ｃＤＮＡを含有する線状化発現プラスミドによるエレクトロポレーションを介してトランスフェクションによって産生した。ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質をコードする核酸は、ヒトＲＡＧＥシグナル配列（配列番号１の最初の２３個のアミノ酸）をコードする配列を含む。トランスフェクション後に、細胞をメチルスルホキシミン（ＭＳＸ）中で選択し、生存プールからの馴化培地（「ＣＭ」）を、タンパク質産生のためにＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。融合タンパク質を産生する細胞を、静置培養から懸濁培養に移し、非クローンプールとしてスケールアップした。振とうフラスコアッセイにおいて許容できる増殖速度およびタイターを有したプールを、キャピラリークローニングした。クローンを懸濁培養にスケールアップし、振とうフラスコアッセイにおいてそれらの増殖および発現レベルに基づいて進行させた。馴化培地を、振とうフラスコ中で増殖させた非クローンプールおよびクローン候補の両方から集め、製品品質分析のために小さなＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって精製した。この研究のために使用されるｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を発現しているクローンＣＨＯ細胞系を、増殖、タイターおよび製品品質の特徴に基づいて選択し、これが評価した細胞系の総数を代表する。
【０３９３】
ツニカマイシン処理：
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を発現しているクローンＣＨＯ細胞系を、振とうフラスコにおいて５０ｍＬの培地中で対数増殖期中期まで培養した。細胞をＤＭＳＯに溶解した５μｇ／ｍＬのツニカマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、振とう培養器中で３７℃で３日間インキュベートした。３日間の終わりに馴化培地を集め、ろ過し、精製した。精製したタンパク質を、グリカン部位の占有についてＲＰ−ＨＰＬＣによって分析し、Ｓ１００ｂ結合アッセイのためにピーク画分を集めた。
【０３９４】
馴化培地からのｓＲＡＧＥ−Ｉｇタンパク質の精製：
タンパク質の実験室規模の精製を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）からのＡＫＴＡ  ＦＰＬＣクロマトグラフィーを使用して、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからの５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム上で行った。カラムを、５カラム容量（ＣＶ）のホスフェート（５０ｍＭ）、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化した。次いで、浄化したＣＭをカラムに加え、１０ＣＶのホスフェート（５０ｍＭ）、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）によって洗浄し、続いて５ＣＶのアセテート（２５ｍＭ）（ｐＨ５．５）で洗浄した。次いで、タンパク質を、２５ｍＭのアセテート（ｐＨ３．５）を使用してカラムから溶出させ、溶出プールを２８０ｎｍの吸光度に基づいて単一の画分として集めた。操作の間ずっとカラムを５ｍＬ／分で操作した。次いで、精製したタンパク質プールを、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）からの１０Ｋ透析カセットを使用して安定化緩衝液中に透析した。精製したタンパク質の濃度を、２８０ｎｍの吸光度を使用して分光光度計で決定した。
【０３９５】
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ、ＰＮＧａｓｅＦおよびフューリン消化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：
精製したｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質（１７８μｇ）を、総容量２５０μＬの緩衝液中で７．５ｍＵのペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）（カタログ番号ＧＫＥ−５００６、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）で３７℃で３０時間消化した。３２μｇの精製したｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を、総容量１００μＬの緩衝液中で２４Ｕのフューリンプロテアーゼ（カタログ番号Ｐ８０７７Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で３７℃で１５時間消化した。未消化および消化融合タンパク質試料を、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で調製し、２．７μｇの総タンパク質をレーン毎に処理し、４〜１２％勾配のＮｕＰａｇｅ  ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（カタログ番号ＮＰ０３２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上で操作した。
【０３９６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるｓＲＡＧＥ−Ｉｇの分析：
精製したｓＲＡＧＥ−Ｉｇを、移動相（３５０ｍＭのシトレート、ｐＨ６．０）中で３ｍｇ／ｍｌに希釈し、Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５液体クロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用してＳＥＣによって分析した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬカラムを、０．７５ｍＬ／分の流量で周囲温度にて４０分間分離のために使用した（カタログ番号１７−５１７５−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。検出は２８０ｎｍの吸光度であった。
【０３９７】
ＲＰ−ＨＰＬＣによるグリコシル化部位の占有の決定および液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によるピークの同定：
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のグリコシル化部位の占有を、逆相ＨＰＬＣ条件下で決定した。クォータナリポンプおよび紫外吸光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、ＨＰＬＣ分離のために使用した。データ収集および統合は、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）またはＥｍｐｏｗｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ）ソフトウェアパッケージによって行った。手短に述べると、１．０ｍｇ／ｍｌの２０μＬのタンパク質溶液を、０．３ｍＬ／分の流量で浅い勾配のＨＰＬＣグレードの水およびアセトニトリル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によってＺｏｒｂａｘ３００ＳＢ−Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で分離した。０時間における当初の勾配を、６７％の移動相Ａ（０．１％のトリフルオロ酢酸（ＡＣＳグレード、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬを含有する水））および３３％の移動相Ｂ（０．０８５％のトリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル）に設定した。ｔ＝０分から２分まで、移動相Ｂを３４％に増加させ、これをｔ＝２分から１０分までに３６％にさらに増加させ、それに続いて６７％の移動相Ａおよび３３％の移動相Ｂで１０分間平衡させた。検出は２１４ｎｍの吸光度であった。
【０３９８】
グリコシル化部位占有変異体のマスプロファイルを特性決定するために、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）にカップリングしたＡｇｉｌｅｎｔ１１００液体クロマトグラフを使用してＬＣ／ＭＳによって試料を分析した。逆相分離からの溶離液を、１：１分割して質量分析計の源中に導いた。質量スペクトルを各クロマトグラフピークにわたり平均化し、Ｍａｓｓｌｙｎｘソフトウェアによって供給されたＭａｘＥｎｔアルゴリズムを使用して逆重畳積分した。
【０３９９】
蛍光検出を備えた順相ＨＰＬＣ（ＮＰＬＣ）による放出されたグリカンの分析：
試料を０．２５ｍｇに希釈し、１０キロダルトンの分画分子量（ＭＷＣＯ１０Ｋ）を有するＮａｎｏｓｅｐ（Ｐ／Ｎ  ＯＤ０１０Ｃ３４、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）メンブレンフィルターを使用して脱塩した。Ｎ−グリカンを、３７℃で一晩ＰＮＧａｓｅＦ（カタログ番号ＧＫＥ−５００６、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）とのインキュベーションによって糖タンパク質から放出させた。酵素反応を、β−メルカプトエタノール（ＧＫＥ−５００６、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）およびＳＤＳ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）の存在下で行った。放出後、タンパク質を、Ｎａｎｏｓｅｐメンブレンフィルター（ＭＷＣＯ１０Ｋ）を使用して放出されたグリカンから除去した。グリカン部分を含有する試料を、標識反応の前に蒸発乾固した。次いで、グリカンを、６５℃で３〜４時間、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）（ＧＫＫ−４０４、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）で標識した。過剰な標識試薬を、ＧｌｙｃｏＣｌｅａｎ  Ｓカートリッジ（ＧＫＫ−４７２６、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を使用して除去した。最後に、標識されたグリカンの混合物を、蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００液体クロマトグラフで（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）ＮＰＬＣによって分析した。励起（Ｅｘ）波長は３３０ｎｍであり、発光（Ｅｍ）波長は４２０ｎｍであった。３０℃に保持したＴＳＫ−ＧＥＬアミド−８０カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒径５μｍ）を分離のために使用した（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）。０．４ｍＬ／分の流量で勾配分離を使用し、７０％のＡおよび３０％のＢで開始し、９０分間にわたり４０％のＢに増加させた。次いで、移動相Ｂを５０分間にわたり９５％に、および５分間にわたり１００％に増加させ、次いで再平衡のために３０％に減少させた。使用した移動相は下記の通りであった。移動相Ａは、アセトニトリルであり、移動相Ｂは、２５０ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４）であった。１０μＬの注入量を分析のために使用した。
【０４００】
アニオン交換クロマトグラフィーによる電荷プロファイリング：
試料を０．５ｍｇに希釈し、順相液体クロマトグラフィー（ＮＰＬＣ）のために上記のように調製した。放出および標識されたグリカンの混合物を、蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）上でアニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。励起波長は３３０ｎｍであり、発光波長は４２０ｎｍであった。周囲温度でＧｌｙｃｏＳｅｐＣカラム（１００ｍｍ×７．５ｍｍ、１０μｍ粒径）（ＧＫＩ−４７２１、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を、分離のために使用した。０．５ｍＬ／分の流量で勾配分離を使用し、５分間１００％Ａおよび０％Ｂで開始し、４５分間にわたり５０％Ｂに増加させた。次いで、移動相Ｂを５分にわたり１００％に増加させ、５分間保持し、再平衡のために０％に戻した。使用した移動相は下記の通りであった。移動相Ａは、２０％のアセトニトリル、８０％の水（ｖ／ｖ）であり、移動相Ｂは、２０％のアセトニトリル、８０％の酢酸アンモニウム（２５０ｍＭ）（ｖ／ｖ）（ｐＨ４．５）であった。１００μＬの注入量を分析のために使用した。
【０４０１】
トリプシンマッピングＬＣ／ＭＳによる部位特異的分析：
融合タンパク質を、概ね１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）および２５％アセトニトリル中で４ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μＬの最終容量とした。溶液を４０μｇのトリプシン（Ｖ５１１Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に加え、３７℃で一晩インキュベートした。消化物を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による１：１０希釈によってクエンチした。消化物を、０．１％ＴＦＡを含む０％から５０％のアセトニトリル：水の直線勾配を使用して、Ｑ−Ｔｏｆ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｌｆｏｒｄ、ＭＡ）にカップリングしたＡｇｉｌｅｎｔ１１００液体クロマトグラフ上で５０分にわたりＬＣ／ＭＳによって分析した。Ｚｏｒｂａｘ３００−ＳＢカラム（４．６×１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、分離および質量分析のために使用した。ＬＣからの流れを、質量分析計の源への導入の前に約１：２に分割した。
【０４０２】
Ｓ１００ｂ結合アッセイのためのピーク画分収集：
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質試料を、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ限外ろ過カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して４．０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、次いで、上記のようにグリカン部位の占有について逆相条件下で分離した。ｓＲＡＧＥ−Ｉｇの部位占有変異体を表す３つの画分を、三重グリコシル化（画分１、Ｆ１）、二重グリコシル化（画分２、Ｆ２）、およびアグリコシル化（画分３、Ｆ３）として集めた。集めた試料を濃縮し、安定化緩衝液中に移した。画分試料のタンパク質濃度を、ＤＵ６５０分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）で２８０ｎｍの吸光度によって決定し、続いてタンパク質をＳ１００ｂ  ＥＬＩＳＡ結合アッセイに供した。
【０４０３】
Ｓ１００ｂ結合ＥＬＩＳＡ：
ＥＬＩＳＡアッセイプレートを、コーティング緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ２を含むトリス緩衝溶液［ＴＢＳ］、ｐＨ８．０）中で一晩４℃で、１００μＬ／ウェルのＳ１００ｂタンパク質（２０μｇ／ｍＬ）（カタログ番号５５９２９０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）でコーティングした。次いで、プレートをブロッキング緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ２を含むＴＢＳ、ｐＨ８．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、および１％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］）で３度洗浄し、１〜１．５時間ブロッキング緩衝液でブロックした。ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合試料を、個別の希釈プレート中で調製した。最高濃度は、ブロッキング緩衝液中１０μｇ／ｍＬであり、ブロッキング緩衝液中２．４ｎｇ／ｍＬまで１：４段階希釈した。ブロックした後、アッセイプレートをブロッキング緩衝液で洗浄し、１００μＬの試料を希釈プレートからアッセイプレートに移した。アッセイプレートを室温で２．５時間インキュベートした。次いで、アッセイプレートをブロッキング緩衝液で３度洗浄し、１分の浸漬時間を洗浄の間に設けた。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（カタログ番号Ａ２２９０、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、ブロッキング緩衝液中１：２５００希釈で１００μＬ／ウェルでプレートに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、アッセイプレートを再びブロッキング緩衝液で３度洗浄し、１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；カタログ番号３４０２２、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を各ウェルに加え、プレートを室温で８分間インキュベートした。次いで、１ＭのＨ２ＳＯ４（１００μＬ）を各ウェルに加え、プレートを振とうし、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにて読み取った。
【０４０４】
結果
宿主細胞中のｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の発現：
非還元および還元ゲルの両方中のＣＨＯ細胞馴化培地からの精製した融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、単量体として移動する融合タンパク質を示した。これは、二量体が非共有結合的会合によって会合することを示唆する。融合タンパク質の精製はプロテインＡを用いるため、プロテインＡと結合する部分を保持するＦｃ含有断片のみが観察されることが予想されることにも留意すべきである。図３は還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示し、完全長単量体（ＦＬＭ）が、概ね５５ｋＤａで移動する融合タンパク質の主な形態であることを示す（レーン１および６）。断片ＡおよびＢ両方（図３、レーン１および６）の同一性を、個別の分析で質量分析法によって確認した。断片Ａは、約４６ｋＤａで移動するＦＬＭのアミノ酸５５〜４３８を表し（図２を参照されたい）、断片Ｂは、約３０ｋＤａで移動する概ねＦＬＭのアミノ酸１９９〜４３８を表す。アミノ酸の番号付けは、図２に示す配列（配列番号１）に基づく。融合タンパク質のＰＮＧａｓｅＦによる処理（図３、レーン３）は、３つのバンド全ての移動のシフトを示し、これはＦＬＭならびに断片ＡおよびＢはＮ−グリコシル化されていることを示す。フューリンによる融合タンパク質の完全な消化（図３、レーン５）は、示されている２つの主要なバンドをもたらす。レーン５の上部のバンドは、レーン６に見られる断片ＢのＮ−グリコシル化形態と共に移動する。レーン５の下部のバンドは、レーン３に見られる断片Ｂのアグリコシル化形態と共に移動する。断片Ｂはフューリンコンセンサス切断部位（アミノ酸１９９〜４３８）に直接続く配列を含有することを示す質量分析法データに加えて、この結果は、断片ＢがＦＬＭのフューリン切断（または断片Ａのフューリン切断）によって生じることを示唆する。
【０４０５】
サイズ排除クロマトグラフィーによる完全長ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合の分析：
ＣＨＯ馴化培地からの精製した融合タンパク質のＳＥＣ分析の結果を図４において示すが、３つの主なピークを示す。１６．９４分でピーク１；１８．６４分でピーク２；および２１．６３分でピーク３。ＳＥＣと併せてレーザー光散乱を使用して、ピーク１と関連する概ねの分子量は約９６ｋＤａ（±１０％の誤差）であることが決定された。ホモ二量体について計算した質量がグリコシル化に応じて約９７〜１０７ｋＤａの範囲であるため、この結果は、ピーク１のｓＲＡＧＥ−Ｉｇホモ二量体としての割当てと一致する。この結果に基づいて、図４に示すＳＥＣプロファイルのピーク２は、ヘテロ二量体（フューリン切断されたＦｃ断片と関連する１つの完全長分子）を表し、ピーク３は、Ｆｃ二量体またはおそらく完全長単量体を表し得ると思われる。また図４に示すこれらのピークについての成分概略は、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質が、少量のＦｃ二量体または単量体（概ね３％）および高分子量種（ＨＭＭＳ２）／凝集体（１％未満）と共に、主にホモ二量体（概ね７８％）およびヘテロ二量体（概ね１９％）から構成されることを示す。
【０４０６】
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のグリコシル化部位の占有、および部位占有変異体の分画：
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のＦＬＭについてのグリコシル化部位の占有プロファイルを、図５において示すデータにおいて試料１（Ｓ１）として示す。試料１は、主に試料１画分１（Ｓ１Ｆ１）と称される３−グリカン種（６７％）、試料１画分２（Ｓ１Ｆ２）と称される２−グリカン種（２２％）、および非常に少量の１−グリカンおよび０−グリカン種（試料１画分３［Ｓ１Ｆ３］と称される）を含有することをプロファイルは示す。画分の純度を、逆相分離を使用した再注入によって確認した。図５に示すＳ１試料の結果についての３−グリカンおよび２−グリカンピーク両方の同一性を、下記に記載するＬＣ／ＭＳを使用して確認した。
【０４０７】
ＬＣ／ＭＳによるグリコシル化部位占有変異体の分析：
図５に示すようなＳ１Ｆ１およびＳ１Ｆ２と称されるピークについての質量スペクトルを生成した。その結果を、上（図６Ａ）および下のパネル（図６Ｂ）を含む図６に示す。スペクトルは、各試料１の画分内のいくつかの種の存在が、分子中に存在する３つの潜在的なＮ−連結性グリカン部位から予期されるグリコシル化の不均一性と一致することを示す。図６（上のパネル、図６Ａ）は、最も早い溶出ピークであるＳ１Ｆ１が、３つの部位全てがＮ−連結性グリカン（５２，９９９〜５４，１０５Ｄａ）によって占有されている種と一致することを示す。アミノ酸配列に基づいた非占有（０−グリカン部位の占有）種の予測分子量は４８，５９４Ｄａであり、約４０００〜６０００Ｄａの質量の差異がある。図６（下のパネル、図６Ｂ）は、ピークＳ１Ｆ２についての逆重畳積分質量スペクトルを示す。質量スペクトルは、二重占有された（２−グリカン部位の占有）種（５１，７８５〜５２，４００Ｄａ）と一致する質量を示す。全体で、ＬＣ／ＭＳ分析は、Ｓ１中に存在する種の様々な量のグリコシル化を伴う不均一な集団を示す。相対ＵＶ吸光度によって示されているように、主な種は、完全に占有された糖タンパク質であり、より低いレベルの二重グリコシル化、およびおそらく単独グリコシル化、およびアグリコシル化種がある。３つのＮ−連結性部位の相対占有を、タンパク質分解マッピングを使用して評価し、各部位において存在するグリカンのタイプのより詳細な分析を、下記で説明するように行った。
【０４０８】
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合から放出されたＮ−グリカンのサイズおよび電荷プロファイリング分析：
ＰＮＧａｓｅＦとのインキュベーションによって融合タンパク質から放出されたＮ−連結性グリカンについての順相ＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフを、図７に示す。市販のグリカン標準物質と比較することによってピークを同定した。データは、有意なシアル酸付加が存在するグリカン構造、ならびにＩｇＧ分子に特有であるコアフコシル化された二分岐グリカンを示す。また観察されるのはオリゴマンノース構造（Ｍａｎ５、Ｍａｎ６）である。グリカンの各々の相対量を、表１に示し、相当する提案する構造を示す。
【０４０９】
【表１】
2010246541.tif 000007
【０４１０】
「Ｇ０」という用語は、末端シアル酸（ＮｅｕＡｃｓ）またはＧａｌが存在しない二分岐構造を意味し、「Ｇ１」は、１つのＧａｌを有しＮｅｕＡｃｓを有さない二分岐構造を意味し、「Ｇ２」は、２つの末端Ｇａｌを有し、ＮｅｕＡｃｓを有さない二分岐構造を意味する。
【０４１１】
アニオン交換クロマトグラフィーによる放出されたグリカンの分析を使用して、存在する中性、一重、および二重荷電種の相対量を定量化した。表２において要約した結果は、グリカンプロファイリングデータと相当一致し、これは存在する種の概ね２５％がシアル酸付加されていることを示す。
【０４１２】
【表２】
2010246541.tif 000008
【０４１３】
シアル酸付加グリカンは、クロマトグラムにおいて特に同定されなかった。図７において「シアル酸付加」と標識されたピークは、シアリダーゼによる処理および保持時間におけるそれらの相当するシフトによって、そのように同定された。分子上に存在するシアル酸のタイプは、酸加水分解、続いて標識化および逆相分離についてのシアル酸参照パネルとの保持時間の比較を使用して、Ｎ−アセチルノイラミン酸であることが示された。トリプシン消化物の質量分析法によって、これらの割当てを確認した。
【０４１４】
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のトリプシンマッピング分析：
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のトリプシン消化物のＵＶクロマトグラムを、図８に示す。コンセンサスＮ−連結性部位を含有するトリプシンペプチドを、質量に基づいて同定した。クロマトグラムにおいてＴ１、Ｔ１０、およびＴ３１と標識する。これらのトリプシンペプチドのアミノ酸配列は、以下の通りである。Ｔ１は、ｐＥＮＩＴＡＲ（配列番号５）を含み、Ｔ１０は、ＶＬＰＮＧＳＦＬＰＡＶＧＩＱＤＥＧＩＦＲ（配列番号６）を含み、Ｔ３１はＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号７）を含む。Ｔ１は、ＲＡＧＥドメインにおいてＡｓｎ２（Ｎ２）で第１のＮ−連結性部位を含有し、Ｔ１０は、Ａｓｎ５８（Ｎ５８）において第２の部位を含有し、Ｔ３１は、融合タンパク質のＡｓｎ２８８（Ｎ２８８）に生じるＦｃドメインのＮ−連結性グリコシル化部位を含有する（しかし、それ以外ではヒトＩｇＧ１のＡｓｎ２９７である）。グリコシル化部位を含有する予測されるトリプシンペプチドを、図９に示す。Ｔ１ペプチドは、Ｎ末端グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）を有し、これが環化を受けて、Ｔ１ｐＥと示されるピログルタミン酸（ｐＥ）種を形成する。これらのペプチドについての相当する糖ペプチドを同様に検出した。図８における挿入図は、Ｔ１およびＴ３１糖ペプチドの両方が溶出する領域の拡大図を示す。共溶出するピークがなかったため、部位の占有のレベルについて非常に正確な定量的データを得ることは可能でなかった。しかし、各部位におけるレベルの推定を行うことができた。すなわち、第１のＲＡＧＥグリコシル化部位をＡｓｎ２において含有するＴ１ペプチドは、グリカンが存在する、および存在しないトリプシンペプチドのＵＶ吸光度に基づいて概ね９０％占有されている。Ｔ１の糖ペプチドは、Ｔ３１ペプチドからの糖ペプチドと共溶出し、そのためにこれが推定される。同じことがＡｓｎ２８８においてＩｇＧグリコシル化部位を含有するＴ３１ペプチドにも当てはまる。しかし、非占有ペプチドはほとんど観察されなかったため、この部位は少なくとも９５％占有されていると推定することができる。最後に、第２のＲＡＧＥグリコシル化部位をＡｓｎ５８において含有するＴ１０ペプチドは、約８５％占有されていると推定される。全体で、これらの測定は、本明細書において上記で記載されたように完全なままの種の逆相分析によって得られた値と十分一致する。
【０４１５】
各部位において存在するグリカンの同一性を決定するために、糖ペプチドのクロマトグラフピークの質量スペクトルを生成した。表１において要約した放出されたグリカンの順相クロマトグラフ分析から決定された同一性と組み合わせて、質量スペクトルからの糖ペプチドの測定した質量に基づいて、グリカンの同一性を与えた。一緒に、３つのグリコシル化部位の各々に存在するグリカンの同一性を決定した。シアル酸付加の大部分はＡｓｎ２部位において存在し、Ｇ１＋ＮＡＮＡグリカンと共に、１つおよび２つの末端Ｎ−アセチルノイラミン酸を有するＧ２グリカン（各々、Ｇ２＋２ＮＡＮＡおよびＧ２＋ＮＡＮＡ）として存在することをデータは示す。Ａｓｎ５８部位は、大部分がオリゴマンノース構造から構成され、Ｍａｎ５が優勢である。この部位において存在するいくつかの微量な構造がまたある。Ａｓｎ２８８部位は主として、ヒトＩｇＧグリカンに特有であるＧ０およびＧ１構造の存在を示す。各部位において存在するグリカンの概要を、それらの相対存在量の推定と共に表３に示す。
【０４１６】
【表３】
2010246541.tif 000009
【０４１７】
ツニカマイシン処理
抗生物質ツニカマイシンは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−ＧｌｃＮＡｃからホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｐ−ＧｌｃＮＡｃ）を移動させてドリコールリン酸（Ｄｏｌ−Ｐ）−ＧｌｃＮＡｃを形成するグリコシルトランスフェラーゼを阻害するグリコシル化阻害剤である。ツニカマイシンをここで使用して、グリコシル化の阻害は、タンパク質のグリカン部位の占有を減少させることができ、より好ましくは、タンパク質の同族リガンドとの結合におけるタンパク質の結合の特徴に影響を及ぼすことができることを示した。
【０４１８】
ツニカマイシン処理試料の部位占有
ツニカマイシンで処理したＣＨＯ細胞から発現した完全長ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質についてのグリコシル化部位の占有プロファイルを、試料２（Ｓ２）として図１０において示す。試料は、主に３−グリカン種（４２％）、２−グリカン種（１６％）および０−グリカン種（３１％）を含有することをプロファイルは示し、１−グリカン種は検出されない。結合分析のためのＳ２画分１（Ｓ２Ｆ１）（３−グリカン）、Ｓ２Ｆ２（２−グリカン）およびＳ２Ｆ３（０−グリカン）ピークの分画および収集の前に、図１０におけるＳ２試料についての３−グリカン、２−グリカンおよび０−グリカンピークの同一性を、質量分析法（図１１）を使用して確認した。０−グリカン種は、Ｎ末端においてピログルタミン酸（ｐＥ）を有するｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質、およびＣ末端リシンを有するまたは有さない変異体の混合物（発現の間の部分的タンパク質分解処理（すなわち、リシン切出し）による不均一なＣ末端を示すＩｇＧ重鎖分子の特色をよく示している）の理論的な質量と一致する。
【０４１９】
Ｓ１００ｂへの部位占有変異体の結合の決定
Ｓ１００ｂは、そのＲＡＧＥとの相互作用がＶＣ１ドメインに位置付けられてきた公知のＲＡＧＥリガンドである。ＲＡＧＥへのＳ１００ｂの細胞外結合は、ＲＡＧＥレベルの増加を刺激し、これは細胞応答の増加ならびに慢性炎症および疾患の確立をもたらす。したがって、上記のようなｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質から単離された部位占有変異体の混合物および画分を、Ｓ１００ｂに結合するそれらの能力について試験し、その結果を表４に示す。結果は、ＩＣ５０値、およびＳ１対照（ツニカマイシンを伴わずに増殖させたＣＨＯ細胞によって産生された未処理ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ）と比較したＳ１００ｂへの相対結合（％）の両方として示す。
【０４２０】
【表４】
2010246541.tif 000010
【０４２１】
ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質がツニカマイシン（試料Ｓ２）で処理したＣＨＯ細胞中に発現したとき、グリカン占有プロファイルは、６７％の３−グリカン＋２２％の２−グリカンの混合物（未処理／対照試料Ｓ１）から４２％の３−グリカン＋１６％の２−グリカン＋３１％の０−グリカン（ツニカマイシンで処理／試料Ｓ２）にシフトする。Ｓ１００ｂへの試料Ｓ２の相対結合（２９５％）は、試料Ｓ１のそれ（１００％）の概ね３倍であり、これは、混合物のより低いグリカン占有がｓＲＡＧＥ−ＩｇのＳ１００ｂへのより良好な結合をもたらすことを示唆する。単離したグリカン画分のさらなる結合研究によって、この知見が確認された。Ｓ１対照から単離された２−グリカン画分（Ｓ１Ｆ２）は、またＳ１対照から単離された３−グリカン画分（４６％）（Ｓ１Ｆ１）と比較して、Ｓ１００ｂ（１７３％）への改良された結合を示した。Ｓ１００ｂへの最大の結合は、ツニカマイシン処理試料Ｓ２から単離された０−グリカン画分（Ｓ２Ｆ３）で観察された。Ｓ１００ｂへの結合においてアグリコシル化変異体（Ｓ２Ｆ３）は、試料Ｓ１Ｆ１についての完全に占有された３−グリカンバージョン（４６％）と比較して１０倍の増加（５２９％）、および未分画の未処理Ｓ１対照（１００％）と比較して５倍の増加を示した。
【０４２２】
考察
この研究において、ヒトｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質を発現させ、特性決定した。さらに、ＲＡＧＥリガンドであるＳ１００ｂへのこのタンパク質の結合に対するグリコシル化の影響を調査した。融合パートナーの血清半減期を改善するために融合タンパク質が従来生成されてきたが、免疫グロブリンドメインへのＲＡＧＥの部分もしくはｓＲＡＧＥの部分の連結が、または二量体化が、どのようにｓＲＡＧＥの折り畳みおよびグリコシル化、またはリガンドに結合するその能力に影響を与え得るかについてはほとんど知られていない。
【０４２３】
本明細書に開示するデータは、ＣＨＯ細胞中で発現しているｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質が、主に非共有結合ホモ二量体として存在し、残りのタンパク質は、単一のＲＡＧＥ  Ｖ様ドメインが損失した、ホモ二量体のフューリン切断によって形成されたヘテロ二量体として存在することを示唆する。ＲＡＧＥのＣ１ドメイン中にフューリンコンセンサス配列が存在するため、なぜホモ二量体の集団がより効率的に切断されないのかは明らかでない。いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、切断されたおよび切断されていない二量体の不均一な集団をもたらすフューリンによるＦＬＭの不完全な切断は、一般にＣＨＯ細胞、および哺乳動物細胞が、非常に少ない量の内因性フューリンを産生するという事実による可能性がある（Ａｙｏｕｂｉら、１９９６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２３：８７〜９５）。
【０４２４】
ＲＡＧＥ分子におけるフューリン切断部位の生物学的目的が何であり、フューリン切断が内因性ＲＡＧＥ分子の生物学的機能に対して何らかの機能的意義を有しているかどうかはまた興味深い。フューリンによる切断は、アポリポタンパク質Ｅ受容体２（ＡｐｏＥＲ２）の可溶性形態（Ｋｏｃｈら、２００２、ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：５９９６〜６００４）および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）（Ｈｅｒｚら、１９９０、ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１７６９〜１７７６）を放出させることが示されてきた。したがって、いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、フューリンは、使用してそれらの細胞標的と相互作用するリガンドを調節もしくは阻害することができる、またはＲＡＧＥシグナル伝達を制御することができる、可溶性ＲＡＧＥ受容体断片のｉｎ  ｖｉｖｏでの産生に関与し得る。ヒトＲＡＧＥ  ｍＲＮＡの新規なスプライス変異体は、ＲＡＧＥ受容体の可溶性形態の産生に関与する１つの機構であると示されてきたが（Ｙｏｎｅｋｕｒａら、２００３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７０：１０９７〜１１０９）、内因性可溶性ＲＡＧＥを産生することができるタンパク質分解プロセスについて知られていることはより少ない。興味深いことに、マウスにおける可溶性ＲＡＧＥは、ヒトにおいて報告されている選択的スプライシング機構と対照的に、カルボキシ末端の切断によって産生される（Ｈａｎａｆｏｒｄら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５００１９〜５００２４）。したがって、いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質において観察されるフューリン切断は、ＲＡＧＥの内因性切断を示すことができ、分子の生物学的機能においてｉｎ  ｖｉｖｏで役割を果たし得る。
【０４２５】
未変性ＲＡＧＥは、Ｖ様ドメインにおいて２つの潜在的部位Ｎ２およびＮ５８でＮ−グリコシル化される。いくつかの研究は、ＲＡＧＥのグリコシル化によって、ＲＡＧＥリガンドについてその親和性および／または特異性に影響を与えることができ、結合が問題のリガンドに応じて変化し得ることを示してきた。Ｗｉｌｔｏｎら（２００６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆ．４７：２５〜３５）は、細菌中で発現された可溶性ＲＡＧＥ（単量体、アグリコシル化）が、終末糖化産物（ＡＧＥ）−ＢＳＡ、免疫グロブリン軽鎖のアミロイド線維およびグリコサミノグリカンを含めたいくつかのＲＡＧＥリガンドに結合することを報告した。しかし、融合タンパク質ではなかった大腸菌由来のｓＲＡＧＥは、ＡＧＥであるカルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）−ＢＳＡを結合しなかった。Ｄａｔｔｉｌｏら（２００７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４６：６９５７〜６９７０）はまた、細菌的に発現した可溶性ＲＡＧＥが、Ｓ１００ｂおよびアンフォテリンを結合することに加えて、ＡＧＥ−ＢＳＡに結合することを示した。対照的に、Ｓｒｉｋｒｉｓｈｎａら（２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８０：９９８〜１００８）は、ウシ肺から単離された未変性完全長グリコシル化ＲＡＧＥ受容体が、受容体が脱グリコシル化されたときにアンフォテリンへの結合において有意な減少を示したことを報告した。Ｏｓａｗａら（２００７、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７０：１４６８〜１４７４）はまた、哺乳動物細胞中で発現している可溶性ＲＡＧＥの脱グリコシル化変異が、グリコシル化野生型と比較してＡＧＥへの結合において減少を示したことを示した。したがって、ＲＡＧＥ、またはｓＲＡＧＥリガンド結合に対するグリコシル化、またはその欠如の作用が何かについては明らかでなかった。さらに、従来の研究はどれも、そのリガンドに結合するｓＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥはＩｇドメインに縮合していた）に対するグリコシル化の作用を調査してこなかった。
【０４２６】
発現した融合タンパク質が、融合タンパク質中でＡｓｎ２およびＡｓｎ５８において各々概ね９０％および８５％占有されている両方のＮ−連結性部位を示しているため、免疫グロブリン領域のｓＲＡＧＥへの連結が、ＲＡＧＥのＶ様ドメインのグリコシル化を妨げているように思われないことを本明細書に開示するデータは初めて示す。いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、この融合タンパク質は二量体として存在するため、ｓＲＡＧＥの二量体化は、リガンドへのその親和性に対して影響を有し得るかもしれない。リガンド結合において役割を果たすその二量体化は、Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐら（２００７、ＥＭＢＯ  Ｊ．２６：３８６８〜３８７８）の研究によって示唆されており、四量体のＳ１００ｂが二量体のｓＲＡＧＥに最適に結合することを示した。３つの部位全てにおいてＮ−グリコシル化（３−グリカン種）（２つはＶ様ドメイン中、１つはＩｇ領域中）を伴うｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質は、アグリコシル化形態（例えば、２つ以下の占有されたＮ−連結性グリコシル化部位を有する形態）と比較して乏しいＳ１００ｂへの結合を示すことを本研究は示す。タンパク質中の１つのＮ−連結性部位が占有されていないとき（２−グリカン種）、Ｓ１００ｂへのｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の結合は増加し、タンパク質中の３つの部位全てが占有されていないとき（０−グリカン種）、最も高いＳ１００ｂへの結合を示す。ＲＡＧＥ  Ｖ様ドメイン中の占有されたＮ−連結性部位とＩｇ領域中の占有された部位とを区別することができないため、２−グリカン種は、ＲＡＧＥ  Ｖ様ドメイン（Ｎ２およびＮ５８）において占有されている両方の部位（Ｎ２８８においてグリカンがない）を表すことがあり、または２−グリカン種は、Ｎ２およびＮ２８８における、またはＮ５８およびＮ２８８におけるグリカン占有を表し得る。しかし、トリプシンマッピングデータは、Ｉｇ領域（Ａｓｎ２８８）におけるＮ−グリカン部位が３つの中で最も高度に占有されている（Ａｓｎ２について９０％およびＡｓｎ５８について８５％と比較して９５％）ことを示すため、２−グリカン種の少なくとも３分の２はＡｓｎ２８８において占有された部位を含有し、したがって２−グリカン種の３分の２は、ＲＡＧＥ  Ｖ様ドメイン中でＡｓｎ２またはＡｓｎ５８において占有されている単一のＮ−連結性部位のみを有するはずであることをデータは示唆する。本明細書に開示するデータは、３−グリカン種と比較して、２−グリカン種についてのＳ１００ｂへのｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の結合の増加を示し、したがって、いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、この結合の増加は、ＲＡＧＥ  Ｖ様ドメインにおけるグリコシル化の損失の結果であり得る。この傾向は、２−グリカンまたは３−グリカン種と比較して、Ｓ１００ｂへのｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の０−グリカン種の最も高い結合を示す本明細書に開示するデータによって確認される。リガンド結合の増加が、ＲＡＧＥ  Ｖ様ドメインにおけるグリコシル化の減少の結果であることをこれらのデータはさらに示し、これはＲＡＧＥ  Ｖ様ドメインにおいてグリコシル化を完全に欠いている０−グリカン種によって最も明白である。
【０４２７】
要約すれば、本明細書に開示するデータは、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のアグリコシル化変異体がＲＡＧＥリガンドであるＳ１００ｂへの最適な結合をもたらすことを初めて示す。Ｓ１００ｂのためのＲＡＧＥ上の結合部位はＶＣ１ドメインとして同定されてきたため（Ｄａｔｉｌｌｏら、２００７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４６：６９５７〜６９７０）、いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、可溶性ＲＡＧＥ中のＡｓｎ２およびＡｓｎ５８位置におけるＮ−グリコシル化は、Ｓ１００ｂ結合を物理的に阻害することがあり、またはリガンド結合部位の認識を変化させ得ることをこれらのデータは示唆する。ＲＡＧＥリガンドであるＳ１００ｂの結合の研究に加えて、ＡβペプチドへのｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質およびそのグリコシル化変異体の結合を調査し、下記で示すように同様の結果が見出されたことを見出した。
【実施例２】
【０４２８】
減少したグリカン部位の占有を含むＲＡＧＥによるＡβ結合の増加
本明細書において他の箇所ですでに記載したように、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇを、未処理ＣＨＯ細胞（対照；試料１＝Ｓ１）およびツニカマイシン（ＴＭＹＣＮ）処理ＣＨＯ細胞（試料２＝Ｓ２）において発現させた。次いで試料を、上記に記載したように分画し、下記のグリカン部位の占有を有する融合タンパク質を含む画分を得た。試料１−画分１（Ｓ１Ｆ１）＝未処理細胞、３−グリカン占有；試料１−画分２（Ｓ１Ｆ２）＝未処理細胞、２−グリカン占有；試料２−画分１（Ｓ２Ｆ１）＝ＴＭＹＣＮ処理細胞、３−グリカン占有；試料２−画分２（Ｓ２Ｆ２）＝ＴＭＣＹＮ処理細胞、２−グリカン占有；試料２−画分３（Ｓ２Ｆ３）＝ＴＭＹＣＮ処理細胞、０−グリカン占有。Ａβへの各画分の結合を、Ｓ１（対照、未処理細胞）の結合と比較した。結果を下記の表５に要約する。
【０４２９】
Ａβペプチド結合活性のためのアッセイ：
手短に述べると、２種のヒトＡβペプチドを試験した。Ａβ１−４０（カタログ＃Ａ−１１５３−２、Ｒｐｅｐｔｉｄｅ）、およびＡβ１−２８（カタログ＃２４２３２、ＡｎａＳｐｅｃ）。プレートを、一晩４℃で１％ＮＨ４ＯＨ中の２０μｇ／ｍＬのペプチドによってコーティングした。次いで、プレートをブロッキング緩衝液（ＴＢＳ、ｐＨ８．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、および１％ＢＳＡ）で洗浄し、室温で１時間ブロックした。全ての他のステップは本質的に、上記のＳ１００ｂ結合アッセイについて本明細書において上記に記載した通りに行った。
【０４３０】
【表５】
2010246541.tif 000011
【０４３１】
Ｓ１００ｂとの融合タンパク質結合に関して本明細書において上記で開示したように、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質がツニカマイシンで処理したＣＨＯ細胞（試料Ｓ２）中で発現したとき、グリカン占有プロファイルは、概ね６７％の３−グリカン＋２２％の２−グリカンを含む混合物（未処理／対照試料Ｓ１）から約４２％の３−グリカン＋１６％の２−グリカン＋３１％の０−グリカンを含む混合物（ツニカマイシンで処理／試料Ｓ２）へシフトした。
【０４３２】
試料Ｓ２のＡβ（１５１％）への相対結合は、試料Ｓ１（１００％）のそれより概ね１．５倍大きく、これはＳ２混合物のより低いグリカン占有が、よりグリコシル化されたＳ１試料と比較してｓＲＡＧＥ−ＩｇのＡβへのより良好な結合をもたらすことを示唆する。単離したグリカン画分のさらなる結合研究によって、この知見が確認された。Ｓ１００ｂ結合に関して上記で開示した結果と同様に、Ｓ１対照から単離された２−グリカン画分（Ｓ１Ｆ２）は、またＳ１対照から単離された３−グリカン画分（１０２％）（Ｓ１Ｆ１）と比較して、Ｓ１００ｂへの改良された結合を示した（１７０％）。Ａβへの最も高い結合は、ツニカマイシン処理試料Ｓ２から単離された０−グリカン画分（Ｓ２Ｆ３）で観察された。アグリコシル化変異体（Ｓ２Ｆ３）は、試料Ｓ２Ｆ１について完全に占有された３−グリカンバージョン（４９％）と比較してＡβへの結合において６倍の増加（２９５％）、および未分画の未処理Ｓ１対照（１００％）と比較して３倍の増加を示した。
【０４３３】
要するに、グリカン部位の占有の減少は、ＡβへのｓＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の結合の増加を媒介した。したがって、本明細書に開示するデータは、グリコシル化の制御を使用して、そのリガンドへのタンパク質の結合の特徴を改良することができることを示す。
【実施例３】
【０４３４】
２−デオキシ−Ｄ−グルコースを使用したグリコシル化の制御：グリカン部位の占有の減少は、ＲＡＧＥリガンド結合に影響を及ぼす
この研究において使用されるＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの部分に連結しているヒトＲＡＧＥのＶ様およびＣ様Ｃ１ドメインを含むＲＡＧＥのリガンド結合部位を含有する。融合タンパク質は、３つのＮ−連結性グリコシル化部位を含み、２つはＲＡＧＥドメイン中のＮ２およびＮ５８にあり、１つはＦｃ領域（融合ペプチドのアミノ酸残基番号２８８）中にあり、これはＣＨＯ細胞において発現しているとき概ね７０％が完全に占有されている。本明細書において他の箇所ですでに開示したように、細胞培養物中でツニカマイシンを使用して、融合タンパク質を発現させ、部位占有変異体を産生した。グリコシル化変異体を単離し、ＲＡＧＥリガンドへの結合に対するグリカン占有の影響を決定した。上記で開示したように、アグリコシル化０−グリカン部位占有変異体は、完全に占有された３−グリカンバージョン（４６％）と比較してＳ１００ｂへの結合（５２９％）において１０倍の増加を示し、一方では二重占有された２−グリカン変異体は、２つの間の中間の結合（１８０％）を示した。同様に、Ａβへの結合に関して、アグリコシル化０−グリカン変異体は、完全に占有された３−グリカンバージョン（未分画の対照混合物と比較して４９％）と比べて、Ａβへの結合において６倍の増加を示し（未分画の対照グリカン混合物と比較して２９５％）、２−グリカン部位占有変異体（未分画の混合物と比べて２３８％）は、０−グリカン変異体のそれと非常に同様な、結合において中間の増加を示した（未分画の対照混合物と比較して２３８％）。要するに、ツニカマイシンをグリカン部位占有阻害剤として使用した本明細書において他の箇所ですでに開示したデータは、部位の占有の減少がそのリガンドに結合するＲＡＧＥの親和性を増加させ、さらに具体的には、ＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質の結合親和性はグリカン部位の占有を阻害することによって制御することができたことを初めて示した。したがって、組換えタンパク質のグリコシル化パターンを細胞内で操作し、そのリガンドへのタンパク質の結合を改善することができることをこれらのデータは示す。増加した結合活性を有する分子の製造のためのＮ−グリカン部位占有阻害剤を使用したバイオプロセスを開発することが有用であることをこれらのデータは示唆する。
【０４３５】
より高価ではなく無毒性のＮ−連結性グリカン部位占有阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースを使用して、このような新規なバイオプロセスを開発した。２−デオキシ−Ｄ−グルコースは、ヘキソキナーゼおよびグルコースホスホイソメラーゼを競合的に阻害することによって解糖アンタゴニストの役割を果たし、Ｎ−連結性グリコシル化の間にドリコール−ピロリン酸連結オリゴ糖中に組み込まれることによってマンノースと競合する。制御された流加バイオリアクタープロセスを使用して、上記に記載したｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を発現している細胞培養物上での２−デオキシ−Ｄ−グルコースを使用する作用を評価した。本明細書に開示するデータは、Ｎ−連結性部位の占有に対する、および融合タンパク質のＳ１００ｂリガンドへのその後の結合活性に対するこの阻害剤の影響を示す。本明細書に開示する結果は、阻害剤の使用によるよりグリコシル化された変異体と比べて、融合タンパク質のアグリコシル化変異体の産生増加を示す。さらに重要なことに、本明細書に開示するデータは、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含有するバイオプロセスを使用して産生した融合タンパク質が、Ｓ１００ｂリガンドへの親和性の増加を示したことを示す。
【０４３６】
したがって、本明細書に開示するデータは、２−デオキシ−Ｄ−グルコースをバイオリアクタープロセスにおいて効率的に使用して、哺乳動物細胞中に発現している組換え分子のＮ−連結性グリカン部位の占有を制御することができることを示す。したがって、この阻害剤を製造工程の間に使用して、とりわけ最適な標的／リガンド／組織結合活性、溶解度、血清からの半減期／クリアランス等の分子の好ましい特性を操作することができる。
【０４３７】
材料および方法
細胞系の維持およびバイオリアクター接種材料
ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を発現しているＣＨＯ細胞を、シェーカープラットフォームインキュベーター（Ｋｕｈｎｅｒ、モデル番号ＩＳＦ−１−Ｗ）上で撹拌（１４０ｒｐｍ、１インチ行程、３６．５℃）した１２５ｍｌ、２５０ｍｌ、５００ｍｌ、１０００ｍｌ、または２０００ｍｌの通気シェーカーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で懸濁培養物として維持し増殖させた。
【０４３８】
０．５Ｌのバイオリアクター操作−ＤＡＳＧＩＰ細胞培養システム
哺乳動物細胞の平行培養のためのモジュラーシステムであるＤＡＳＧＩＰ  Ｃｅｌｌｆｅｒｍ−ｐｒｏ培養システム（Ｊｕｌｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（最高ｐＨ８およびＯ２制御設定）を、メーカーの説明書に従って０．５Ｌのバイオリアクター操作のために使用した。
【０４３９】
１Ｌのバイオリアクターシステム
１Ｌのバイオリアクター操作のための、１Ｌの操作用容量の撹拌ガラス製容器のＡｐｐｌｉｋｏｎ培養システム（カタログ番号Ｖ３ＭＢ０１００１２、Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｆｌｏｗ  ＣｏｎｓｏｌｅとカップリングしたＡｐｐｌｉｋｏｎ１０３０ＡＤＩコントローラおよびＰ１００ＡＤＩ１０３２撹拌機コントローラによって制御される水中でのＯ２／ＣＯ２ガス処理およびヘッドスペースを常時の空気で覆うことを伴う）。
【０４４０】
基質投与のために、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ１０１Ｕ／Ｒポンプ（カタログ番号０１０．４２０２．００Ａ、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ  Ｂｒｅｄｅｌ  Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用した。
【０４４１】
対照培地
市販の産生培地であるＣＤ  ＣＨＯ培地は、ＣＨＯ増殖およびモノクローナル抗体産生のための無タンパク質合成培地である（カタログ番号１０７４３．０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。接種材料培地に、２５０μｌ（２５μＭ）のＬ−メチオニンスルホキシイミン（１００ｍＭ）（カタログ番号ＧＳＳ−１０１５−Ｆ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充した。産生培地を、さらなるアミノ酸である０．７７ｇ／Ｌのイソロイシン、１．０８ｇ／Ｌのロイシン、０．９１ｇ／Ｌのチロシン２Ｎａ、０．３８ｇ／Ｌのバリン、０．４０５ｇ／Ｌのシステイン、および０．０７ｇ／Ｌのトリプトファンで前処理した。
【０４４２】
実験培地
市販のＣＤ  Ｏｐｔｉ−ＣＨＯ培地は、無タンパク質合成培地（参照番号１２６８１〜０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。接種材料培地に、２５０μｌ（２５μＭ）のＬ−メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）（１００ｍＭ）（カタログ番号ＧＳＳ−１０１５−Ｆ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を補充した。
【０４４３】
無脂質のＯｐｔｉ−ＣＨＯは、無タンパク質で市販の既知組成培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｋｕ．ＭＥ０８００１６）である。接種材料培地に、２５０μｌ（２５μＭ）のＬ−メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）（１００ｍＭ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＧＳＳ−１０１５−Ｆ）を補充した。
【０４４４】
Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３２５培地は、無タンパク質で市販の培地（カタログ番号１４３４０Ｃ、Ｓｉｇｍａ）である。接種材料培地に、２５０μｌ（２５μＭ）のＬ−メチオニンスルホキシイミン（１００ｍＭ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＧＳＳ−１０１５−Ｆ）を補充した。
【０４４５】
栄養素補給液および供給物
独自の補給液であるＣＤＦｖ６．２栄養素補給溶液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって製造された粉末配合物の既知組成粉末である。ＣＤＦｖ６．２無脂質栄養素補給溶液を、脂肪酸前駆体サブグループなしに配合した。これらの補給液の再構成は、補給液のＷＦＩへの溶解およびｐＨの７．０への調節を伴った。
【０４４６】
グルコース補給溶液：
補給液は、３００ｇ／Ｌ（３０％）グルコース（カタログ番号Ｇ−８９２０、Ｓｉｇｍａ）溶液であった。
【０４４７】
２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理：
２−デオキシ−Ｄ−グルコース（カタログ番号Ｄ８３７５−１００Ｇまたはカタログ番号Ｄ３１７９、Ｓｉｇｍａ）を、注入のために概ね４０ｍｌの水に溶解し（ＷＦＩ）、下記の表６に見られるように各リアクターについて投与戦略に基づいてボーラス注入した。
【０４４８】
【表６】
2010246541.tif 000012
【０４４９】
ＶｉＣｅｌｌ細胞計算器：
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒによって製造された自動化細胞生存率分析器（モデル番号ＶｉＣｅｌｌ  ＸＲ）は、貫流セルのビデオ画像を介してトリパンブルー排除法を行う。
【０４５０】
Ｃｅｄｅｘ細胞計算器：
血球計と匹敵するように設計された、Ｃｅｄｅｘ  Ｆｌｏｗ  Ｃｅｌｌの顕微鏡画像の画像分析を介したトリパンブルー排除法によって生細胞および死細胞を検出および区別する自動化細胞計数器（モデル番号ＣＥＤＥＸ  ＡＳ２０、ｉｎｎｏｖａｔｉｓ  ＡＧ、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０４５１】
ＮＯＶＡ  ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ４００およびＦｌｅｘ分析器：
哺乳動物細胞懸濁液についての自動化代謝物分析器（モデル番号ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ４００およびモデル番号ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  Ｆｌｅｘ、ＮＯＶＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用した。ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ４００は、特定の酵素または非酵素センサーによって栄養素／代謝物（グルタミン、グルコース、ラクテート、グルタメート）、酸／塩基状態（ｐＨ、ＰＣＯ２、ＰＯ２）、電解質（ナトリウム、カリウム）、ならびに計算したパラメータ（重量オスモル濃度、空気およびＣＯ２飽和、ＨＣＯ３）について細胞懸濁液を分析する。ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  Ｆｌｅｘは、多数の分析器を単一のモジュラー装置（細胞懸濁液を、モジュール１において、電気化学によってＧｌｕｃ、Ｌａｃ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＮＨ４＋、ｐＨ、ＰＣＯ２、ＰＯ２、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋を、モジュール２において、凝固点降下によって重量オスモル濃度を、モジュール３において、デジタル画像によって細胞密度／細胞生存率を分析する）に統合した。
【０４５２】
浸透圧計：
２０μｌの試料を処理するために設計された自動化単一試料浸透圧計であるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏ−浸透圧計（モデル番号３３２０）を使用した（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ）。モデル３３２０は、試料を重量オスモル濃度について分析する前に、試料を冷却することによって凝固点降下法を用いる。
【０４５３】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ分析：
未精製の細胞培養ブロス試料を、抗体親和性方法プロトコルＰＯＲＯＳ６Ｂ．Ｍ（Ｌｉｎｃｏｌｎ  ＰＧＭ  ＳＯＰ「プロテインＡ  ＨＰＬＣ、ＨＢ−０００４−０１」）およびＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ装置（モデル番号Ｇ１３１６Ａ、ＳＮ  ＤＥ１１１２２１１６およびモデル番号Ｇ１３２９Ａ、ＳＮ  ＤＥ９１６０３８００）を使用して、ｓＲＡＧＥ−Ｉｇ  Ｆｃ融合タンパク質産生タイターについて分析した。プロトコルは、下記のクロマトグラフィー条件を伴う。平衡移動相：１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含有しない）；溶出移動相：１２ｍＭのＨＣｌ、１５０ｍｌのＮａＣｌ、ｐＨ２．２５；洗浄緩衝液：ＷＦＩ水；洗浄緩衝液：６Ｍのグアニジンおよび７０％エタノール；カラム：Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓプロテインＡ免疫検出センサーカートリッジ（カタログ番号２−１００１−００、ＳＮ６９４０、７３１８）；注入量：２０μＬ；ならびに検出器：紫外線吸光度λ＝２８０ｎｍ。
【０４５４】
結果および考察
ツニカマイシン処理−Ｓ１００ｂへの部位占有変異体の結合の決定
抗生物質ツニカマイシンは、ホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｐ−ＧｌｃＮＡｃ）をウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−ＧｌｃＮＡｃから移動させてドリコールリン酸（Ｄｏｌ−Ｐ）−ＧｌｃＮＡｃを形成するグリコシルトランスフェラーゼを阻害するグリコシル化阻害剤である。ツニカマイシンは、タンパク質のグリカン部位の占有を減少させ、より好ましくは、そのリガンドへのタンパク質の結合に影響を及ぼすために使用することができることを、本明細書において他の箇所ですでに開示したデータは示す。しかし、ツニカマイシンは、有毒および高価であるためバイオリアクタープロセスのために望ましい阻害剤ではない。したがって、ＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質アッセイにおいて別のグリカン部位占有阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコースを使用して、グリカン部位の占有を制御した。
【０４５５】
本明細書において他の箇所ですでに指摘したように、Ｓ１００ｂは、そのＲＡＧＥとの相互作用がＶ／Ｃ１ドメイン内のリガンド結合部位に位置付けられてきた公知のＲＡＧＥリガンドである。上記のようにツニカマイシン処理したＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質から単離された部位占有変異体の混合物および画分を、Ｓ１００ｂへ結合するそれらの能力について試験した。その結果を上記の表５に示す。結果を、ＩＣ５０値、およびＳ１対照（未処理細胞によって産生された未分画のＲＡＧＥ−Ｆｃ）と比較したＳ１００ｂへの相対結合（％）の両方として報告する。ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質がツニカマイシンで処理したＣＨＯ細胞中で発現したとき（試料Ｓ２）、グリカン占有プロファイルは、約６７％の３−グリカン＋２２％の２−グリカンの混合物（未処理／対照試料Ｓ１）から約４２％の３−グリカン＋１６％の２−グリカン＋３１％の０−グリカンを含む混合物（ツニカマイシンで処理／試料Ｓ２）にシフトした。試料Ｓ２のＳ１００ｂへの相対結合（２９５％）は、試料Ｓ１のそれ（１００％）の概ね３倍であり、これは混合物のより低いグリカン占有が、Ｓ１００ｂへのＲＡＧＥ−Ｆｃのより良好な結合をもたらすことを示唆する。単離したグリカン画分のさらなる結合研究により、この知見が確認された。Ｓ１対照から単離された２−グリカン画分（Ｓ１Ｆ２）は、またＳ１対照から単離された３−グリカン画分（４６％）（Ｓ１Ｆ１）と比較して、Ｓ１００ｂへの改良された結合（１７３％）を示した。最も高いＳ１００ｂへの結合は、ツニカマイシン処理試料Ｓ２から単離された０−グリカン画分（Ｓ２Ｆ３）で観察された。アグリコシル化変異体（Ｓ２Ｆ３）は、試料Ｓ１Ｆ１について完全に占有された３−グリカンバージョン（４６％）と比較して、Ｓ１００ｂへの結合において１０倍の増加（５２９％）、および未処理Ｓ１対照（１００％）と比較して５倍の増加を示した。
【０４５６】
２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理−Ｓ１００ｂへの部位占有変異体の結合の決定
２−デオキシ−ｄ−グルコースによる培養物の処理は、Ｎ−連結性グリコシル化経路における特定のステップを妨げ、または基質アンタゴニストとして機能することが報告されてきた。２−デオキシ−Ｄ−グルコースは、ヘキソキナーゼおよびグルコースホスホイソメラーゼを競合的に阻害することによって解糖アンタゴニストとして機能する。さらに、この糖類似体は、Ｎ−連結性グリコシル化の間にドリコール−ピロリン酸連結オリゴ糖中に組み込まれることによってマンノースと競合することが報告されてきた。
【０４５７】
表６において一覧表示されているように１０日目に試料採取されたリアクター操作３９（Ｒ３９）は、０．５ＬのＤＡＳＧＩＰバイオリアクターにおいてＣＨＯ対照プロセスを使用した、１０日目に回収された馴化培地から精製されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のベースラインのグリカン部位の占有プロファイルおよびＳ１００ｂ結合活性を表す。ＣＨＯ対照プロセスには、７日目に３４℃から３１℃への温度シフトが含まれる。結果は、表７において示されている通り、このリアクターについて１０日目および１２日目に本質的に同一である。ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、この対照プロセスにおいて主に過グリコシル化され、分子の大部分は３−グリカン（約４６％）および２グリカン（約２８％）形態である。これらの試料は、最小のＳ１００ｂへの結合を示す。
【０４５８】
【表７】
2010246541.tif 000013
【０４５９】
その結果を表７において示すリアクターＲ５３は、同じプロセスを伴うＲ３９操作と同一のリアクターであるが、プロセスの９日目および１１日目に投与する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの２回の１ｍｇ／ｍｌ（リアクター容量に基づいて６ｍＭ）のボーラス注入の添加を伴う。このリアクターの１０日目および１２日目に回収された馴化培地から精製されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の、グリカン部位の占有プロファイルおよびＳ１００ｂ結合活性をまた、表２および図１において示す。本明細書に開示するデータは、ベースラインのバイオリアクターＲ３９の結合活性と比較して、このリアクターにおいて１２日目に１００〜１５２１％の結合活性の増加を示す。結合活性のこの増加は、より高度なグリコシル化形態の減少に加えてアグリコシル化種の増加と相関している。
【０４６０】
結合活性と部位の占有との間の相互性が、異なる培地配合物および投与戦略において観察された
市販のＣＨＯ培地（すなわち、Ｅｘ  Ｃｅｌｌ３２５ＰＦ  ＣＨＯおよびＯｐｔｉＣＨＯ）は、アミノ酸、グルコース、ビタミン、塩、および微量元素等の独自の濃度の培地成分で配合される。バイオリアクターにおけるグリコシル化分布パターンに対する２−デオキシ−Ｄ−グルコース添加と併せた培地の影響を示すために、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を発現しているＣＨＯ細胞を、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地およびＥｘ  Ｃｅｌｌ３２５ＰＦ  ＣＨＯ（Ｓｉｇｍａ）中に直接順応させた。動物成分およびタンパク質を含有しない既知組成培地であるＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯを、異なる回分（脂質を含まないカタログ配合物およびカスタム配合物）に配合したが、それはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣＤ  ＣＨＯカタログ培地の無脂質配合物に相当した。バイオリアクターＲ６６は、１ＬのＣＨＯ  Ａｐｐｌｉｋｏｎ対照プロセス（アミノ酸の前処理を伴わない）、脂質前駆体を含有しないＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地、および脂肪酸前駆体サブグループを含有しないＣＤＦｖ６．２栄養素補給液を利用した。２−デオキシ−ｄ−グルコースの単一の１ｍｇ／ｍｌ（１Ｌのリアクター容量に基づいて６ｍＭ）のボーラス注入を、９日目にバイオリアクターに投与した。培地試料を１２日目および１４日目に回収し、馴化培地試料を精製し、グリカン部位の占有およびＳ１００ｂ結合活性についてアッセイした（結果を表７および図１２において一覧表にする）。結果は、ベースラインの「対照」バイオリアクターであるＲ３９と比べて回収時に、完全グリコシル化種の減少およびアグリコシル化種の増加を示す（３−グリカン：Ｒ６６について１２日目に３２．９％に対して、Ｒ３９について１２日目に４５．８％；０−グリカン：Ｒ６６について１２日目に１２．２％に対して、Ｒ３９について１２日目に０．３％）。グリコフォーム分布におけるこのシフトは、１２日目のベースラインのバイオリアクターであるＲ３９試料と比較したときに、Ｓ１００ｂ結合活性における３２倍の増加と相関している（Ｒ６６について１２日目に３２４６％に対して、Ｒ３９について１０日目に比較した１００％のベースライン）。さらに、表６および図１２に示される結果は、連続培養によるグリカン占有プロファイルおよびＳ１００ｂ結合活性における改善を示唆する。
【０４６１】
グルタミンを含有せずに配合した無タンパク質培地であるＥｘ−Ｃｅｌｌ３２５ＰＦ  ＣＨＯ培地は、ＣＨＯ対照プロセス（６種のアミノ酸の培地前処理を伴わない）を利用する１ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター操作であるＲ７９において調査した。２−デオキシ−ｄ−グルコースの２回の１ｍｇ／ｍｌ（１Ｌのバイオリアクター容量に基づいて６ｍＭ）のボーラス注入を、７日目および９日目にバイオリアクターに投与した。培地試料を１２日目および１４日目に回収し、馴化培地を精製し、グリカン部位の占有およびＳ１００ｂ結合活性についてアッセイした。これらのバイオリアクター条件についてのデータを、表７および図１２においてＲ７９として示す。本明細書に開示するデータは、完全グリコシル化種の増加（３−グリカン：Ｒ３９について１２日目に４５．８％に対して、Ｒ７９について１２日目６８．０％）および０−グリカン形態の増加（Ｒ３９、１２日目に０．３％に対して、Ｒ７９、１２日目に０．８％）を示す。グリコフォーム分布におけるこの変化は、ベースラインのバイオリアクターＲ３９（１０日目）と比較して、１２日目のＳ１００ｂ結合活性において５倍の増加と相関している（Ｒ７９についてベースラインに対して５２７％と比較した、Ｒ３９について１００％のベースライン、ベースラインは１０日目の対照Ｒ３９の結合である）。さらに、本明細書に開示するデータ、例えば、表７および図１２は、連続培養によるグリカン占有プロファイルおよびＳ１００ｂ結合活性における改善を示唆する。
【０４６２】
アグリコシル化変異体およびＳ１００ｂ結合における同様の増加は、ＣＤ  ＣＨＯ培地を使用した２−デオキシ−ｄ−グルコースのボーラス投与を行うときに得た
表７におけるリアクターＲ８０は、同じプロセスを伴うリアクターＲ７９操作と同一であるが、Ｅｘ  Ｃｅｌｌ３２５ＰＦ  ＣＨＯ培地の代わりにＣＤ−ＣＨＯを使用する。このバイオリアクターについてのデータを、表７および図１２においてＲ８０として示す。本明細書に開示するデータは、Ｒ７９と同様に、２−デオキシ−Ｄ−グルコースによる処理が完全グリコシル化種の全体的な減少をもたらし、また０−グリカン形態の増加を媒介したことを示す。特に、ベースラインのバイオリアクター（Ｒ３９、１０日目）に比べて、完全グリコシル化種は減少し（４５．７〜２１．７％）、アグリコシル化は増加した（０．３〜３１．８％）。グリカン占有のシフトは、１２日目に得た各バイオリアクター操作の馴化培地について、Ｓ１００ｂ結合活性を劇的に増加させた（１００〜１６３２％）。Ｒ８０リアクターの１４日目の試料からのＳ１００ｂ結合活性は得られた中で最も高く、ベースラインのリアクターＲ３９からの試料と関連する結合活性より有意に高かった。驚いたことに、バイオリアクター操作Ｒ８０は、１０日目に対照バイオリアクターＲ３９の約８０７７％または概ね８０倍より高かった。
【０４６３】
要約すれば、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの補充は、ＲＡＧＥ−Ｉｇアグリコシル化（０−グリカン部位の占有）変異体（これもまたＳ１００ｂリガンドへの改良された結合を示した）の増加をもたらした。改良された結合親和性を有するアグリコシル化変異体の驚くべき増加は、２−デオキシ−Ｄ−グルコース投与戦略の後のグリコシル化分布パターンにおけるシフトの結果であった。２回の２−デオキシ−Ｄ−グルコースの１ｇ／Ｌの投与と組み合わせたＣＨＯ対照プロセスを使用して、バイオリアクターにおいてＲＡＧＥ−Ｉｇ融合タンパク質のアグリコシル化変異体の産生の増加が示された。アグリコシル化変異体の産生の増加は次には、より多くの量の完全グリコシル化（３−グリカン部位が占有されている）変異体を有する未処理の参照バイオリアクターと比較して、Ｓ１００ｂ結合活性における驚くべき増加を媒介した。グリコシル化によって影響を与えられるタンパク質の好ましい特性（数ある中でも、最適の標的／リガンド／組織結合活性、溶解性、半減期、血清からのクリアランス等）を操作するために、これらに限定されないが２−デオキシ−Ｄ−グルコース等のグリカン部位占有阻害剤を製造工程において使用して、組換えタンパク質のＮ−連結性部位の占有を制御することができることを、本明細書に開示するデータは示す。当業者であれば、本明細書において提供する開示を提供されると、グリコシル化部位を除去するために、アミノ酸変異を導入する必要なしに、グリカン部位占有阻害剤を使用した組換えタンパク質におけるグリカン部位の占有を制御することによって、急速に、このような変異と潜在的に関連するタンパク質高次構造に対する作用、活性の喪失、免疫原性の増加等なしに、タンパク質特性を制御する重要で新規な方法を提供することを理解するであろう。
【実施例４】
【０４６４】
２−デオキシ−Ｄ−グルコースを使用したグリコシル化の制御：抗体についてのグリカン部位の占有の減少
ヒト免疫グロブリンＥに特異的に結合する抗体を使用することによって、本発明の新規な細胞培養方法を使用して、グリコシル化阻害剤が存在しない点以外は同一の細胞培養条件下で産生させた同一のタンパク質のグリコシル化レベルと比較して、減少したグリコシル化を含む糖タンパク質を産生することができることを決定した。
【０４６５】
図１３Ａ〜１３Ｄに示されているように、完全ヒト抗ＩｇＥ抗体は、抗体５．９４８．１と称される（本明細書においてまた「ＩｇＥ  ｍＡｂ」または「ｍＡｂ５．９４８．１」とも呼ばれる）。抗体５．９４８．１は、潜在的なＮ−連結性グリコシル化部位、すなわち、重鎖ポリペプチドＶドメインのアミノ酸残基７３〜７５における［ｎｔｓ］、および定常ドメインのアミノ酸残基３０１〜３０３、すなわち［ＮＳＴ］を含む（図１３Ａを参照されたい）。また今や２００８年１０月１６日にＷＯ２００８／１２３９９９として公表された２００８年４月１日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４２８６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。図１３Ａは、重鎖のアミノ酸配列（配列番号８）を示し、可変ドメイン残基は小文字であり、ＣＤＲは下線で示す。Ｖドメインのグリコシル化部位（Ｎ２）を大文字で示し、定常ドメインのグリコシル化部位（Ｎ３０１）を下線で示す。図１３Ｂは、重鎖のアミノ酸配列（配列番号８）をコードする核酸配列（配列番号９）を示す。図１３Ｃは、軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）を示し、可変ドメイン残基は小文字であり、ＣＤＲは下線で示す。図１３Ｄは、軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）をコードする核酸配列（配列番号１１）を示す。
【０４６６】
したがって、ｍＡｂ５．９４８．１は、２つのグリコシル化部位（Ｖドメインのフレームワーク領域３（ＦＲ３）におけるＡｓｎ７３、および標準的なＦｃ重鎖グリコシル化部位のＡｓｎ３０１）を含む重鎖を含む完全ヒトＩｇＧ２である。図１４は、抗体５．９４８．１についての４つの可能性のあるグリカン占有部位変異体を示した図を提供する。すなわち、グリカンを含まない０−グリカン占有部位変異体、Ａｓｎ３０１においてグリカンを含む１−グリカン占有部位変異体、Ａｓｎ７３においてグリカンを含む１−グリカン占有部位変異体、ならびにＡｓｎ７３およびＡｓｎ３０１においてグリカンを含む２−グリカン占有変異体である。各抗体は２つの重鎖を含むため、２つの軽鎖と共に上述のグリカン占有変異体の各々の様々な組合せを含む様々な並べ換えが可能である。
【０４６７】
ｍＡｂ５．９４８．１を発現している細胞培養物を、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの存在下および非存在下で増殖させた。手短に述べると、ｍＡｂ５．９４８．１を発現しているＣＨＯ細胞のクローン集団を、６×５００ｍＬの通気振とうフラスコ中に、フラスコ毎に１００ｍＬの培地中で０．３×１０６細胞／ｍＬで播種した。細胞を含有する振とうフラスコ（Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、表９を参照されたい）を、非加湿振とう培養器中に置いた（３６．５℃、５％ＣＯ２、１４０ｒｐｍの撹拌、１インチ行程）。細胞数および生存率を培養の１４日間にわたり毎日取得した。培養の３日目から開始して、全ての振とうフラスコに、栄養素（１６ｍＬ／Ｌ／日）およびグルコースのボーラス（２．５ｍＬ／日で１００ｇ／Ｌグルコースストック）を供給した。培養の７日目および９日目に、１ｇ／Ｌの２−デオキシ−ｄ−グルコースを、試験振とうフラスコ（各々、Ｓ１０およびＳ１１）に加え、一方対照振とうフラスコ（Ｓ６およびＳ７）には２−デオキシ−ｄ−グルコース阻害剤を加えなかった。培養の７日目に、振とうフラスコＳ５およびＳ９を、ＨＰＬＣおよびグリカン部位の占有分析によるタイター決定のために回収した。２−デオキシ−ｄ−グルコースの添加前にＳ９を回収した。培養の１２日目に、振とうフラスコＳ６（阻害剤を含有しない）およびＳ１０（阻害剤を含有）を、タイター決定およびグリカン部位の占有分析のために回収した。培養の１４日目に、振とうフラスコＳ７（阻害剤を含有しない）およびＳ１１（阻害剤を含有）を、タイター決定およびグリカン部位の占有分析のために回収した。
【０４６８】
各試料についてタンパク質タイターを測定した。結果を表８に示す。タンパク質タイターは培養物中で時間と共に増加し、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含有しない培養物とグリコシル化阻害剤を含む培養物との間のタンパク質タイターに有意差はなかった。したがって、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの存在は、阻害剤の存在下の細胞増殖によってタンパク質発現に影響を及ぼすように思われなかった。
【０４６９】
【表８】
2010246541.tif 000014
【０４７０】
グリカン部位の占有に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコース添加の作用を、阻害剤の非存在下で細胞によって産生されたｍＡｂ５．９４８．１のグリカン部位の占有と比較した。各試料についてのグリカンプロファイルを決定し、クロマトグラムを図１６〜２４に示す。各試料中の各グリカン部位占有変異体の量を決定した。結果を下記の表９に示す。
【０４７１】
【表９】
2010246541.tif 000015
【０４７２】
さらに具体的には、最大グリコシル化を実現するための条件下で産生されたｍＡｂ５．９４８．１の対照試料のグリカンプロファイルを図１５に示す。さらに、対照は、約９８％の２−グリカン、および概ね２％の１−グリカンを示し、存在する０−グリカンは検出されなかった。興味深いことに、存在する１−グリカン変異体では、大部分（概ね７５％）は、定常領域中に存在するＦｃグリコシル化部位であるＡｓｎ３０１において糖類を含むグリカンであり、１−グリカン画分の残りの２５％は、可変領域（抗原結合性断片；Ｆａｂ）においてＮ−連結性グリカンを含むＡｓｎ７３グリカンを含んだ。
【０４７３】
両方とも阻害剤を含有しない７日目に取得した両方の培養試料（Ｓ５およびＳ９）のグリカンプロファイルは、対照と同様であった。すなわち、７日目に、グリカンは、約９８％の２−グリカンおよび約２％の１−グリカンを含み、０−グリカン変異体は検出されなかった。さらに、１−グリカン形態の大部分は、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ３０１）でグリコシル化され、残りの１−グリカンは、可変領域でグリコシル化された。
【０４７４】
阻害剤の非存在下で増殖した対照培養物中で産生した抗体のグリカンプロファイルは、時間の経過に伴い存在する２−グリカンの割合の減少を示し、２−グリカンの割合は１４日目までに約９８％から約９５．５％に減少した。さらに、Ｆｃ領域においてグリコシル化された１−グリカンの割合は、約１．２％から約４．１％に増加した。しかし、対照培養物中でいつでも０−グリカンは検出されず、Ｆａｂにおいてグリコシル化された１−グリカンの量は、時間の経過に伴い変化しなかった。
【０４７５】
１２日目までに、阻害剤の存在下で増殖した培養物（Ｓ１０）中で産生された抗体は、グリカンプロファイルのシフトを示した。さらに具体的には、２−グリカンの割合は約９４％に減少し、１−グリカンの割合は劇的に増加し、Ｆａｂ領域においてグリコシル化された１−グリカン（１．６％）およびＦｃ領域においてグリコシル化された１−グリカン（３．５％）両方のレベルが増加した。よりさらに驚いたことに、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの存在下で増殖した細胞は、検出可能な量（０．９％）の０−グリカン変異体を産生した。２日後１４日目に、１−グリカンおよび０−グリカン変異体の増加は、よりさらに劇的であり、２−グリカン画分の減少は、より明白であった。すなわち、Ｓ１１において、２−グリカン変異体は、産生された抗体の約９０％を構成し、１−グリカン変異体は、Ｆａｂ領域においてグリコシル化の２．３％、Ｆｃ領域においてグリコシル化の５．２％を構成した。グリコシル化を有さない抗体（０−グリカン）の割合は、産生された抗体５．９４８．１の約１．７％を構成した。
【０４７６】
哺乳動物細胞培養物中で産生された糖タンパク質のグリコシル化は、グリコシル化阻害剤を使用して制御することができることをこれらの結果は示す。さらに具体的には、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの存在下にて細胞培養物中で産生された重鎖中に２つのグリコシル化部位を含む抗体は、減少する量の２−グリカン変異体ならびに増加する量の１−グリカンおよび０−グリカン形態を含んだ。いずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、抗体のＦｃドメインにおけるグリコシル化は、抗体のＦａｂ領域におけるグリコシル化と比較して優先的に起こるようである。またいずれの特定の理論にも縛られる意図はないが、阻害剤が培地に加えられる前に産生された２−グリカン抗体は、培養物中に存在し続けるかもしれない。したがって、時間の経過に伴い存在する２−グリカン変異体の相対的減少、および１−グリカン、最終的に０−グリカン変異体の同時に起きる増加は、阻害剤が加えられると、たとえあったにしてもさらなるほんの少しの２−グリカン変異体しか産生されないことをおそらく示す。いくらかのさらなる１−グリカンＦｃ変異体が産生され続ける一方、阻害剤が加えられると１−グリカンＦａｂ形態が産生されることをそれはまた示す。結果はまた、阻害剤の添加が０−グリカンアグリコシル化変異体の産生を媒介することを示唆する。したがって、本明細書に開示するデータは、糖タンパク質のグリコシル化は制御することができ、よりさらに好ましくは、タンパク質タイターの有意な減少なしに制御することができることを初めて示す。結果は、それだけに限らないが、培養期間の延長を含めた培養条件のさらなる変更が、産生される糖タンパク質の約３０％または３０％超まで０−および１−グリカン形態の産生の増加を実現し得ることをさらに示唆する。
【実施例５】
【０４７７】
２−デオキシ−Ｄ−グルコースを使用した抗ＩｇＥ抗体のグリコシル化の減少：グリカン部位の占有の減少およびＩｇＥへの抗体結合に対する作用
グリカン部位の占有の減少によって媒介されるｍＡｂ５．９４８．１による抗原結合に対する任意の作用を、これらに限定されないが、ＷＯ２００８／１２３９９９で開示されているもの（例えば、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を使用するＩｇＥ細胞結合アッセイ、脱顆粒阻害アッセイ、血清からの遊離ＩｇＥの枯渇、ＥＬＩＳＡ  ＩｇＥ結合アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）アッセイ等）、および抗体結合の特徴を評価するための当技術分野で周知の他のアッセイ等の標準的な方法を用いて評価する。
【０４７８】
さらに具体的には、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの非存在下（Ｓ５、Ｓ６、およびＳ７）および存在下（Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１）で培養された細胞によって産生されたｍＡｂ５．９４８．１の結合の特徴を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析によって評価する。手短に述べると、各試料からの抗体を、標準的なＥＤＣ−ＮＨＳカップリング化学および１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐｈ５．０）の固定化緩衝液を使用してＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標））上で共有結合的に固定化する。参照フローセルを、ＥＤＣ−ＮＨＳによって活性化し、エタノールアミンでブロックするが、タンパク質はその上に固定化されない。
【０４７９】
動力学的測定を、約０．０９から６００ｎＭの範囲の濃度でＩｇＥ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、カタログ番号ＰＨＰ００８Ｘ２またはＥｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＣＰ１０３５Ｋ）を使用して、５０または１００μＬ／分の流量でＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０（ｐＨ７．４）、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）により供給）を使用して得る。各濃度での注入時間は、概ね３．２５分であり、それに続いて２０分の解離相がある。再生溶液（１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７）を使用した再生ステップを、解離相の後に含める。ＢＩＡ評価ソフトウェア４．１（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標））およびＳｃｒｕｂｂｅｒソフトウェアバージョン２．０（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、センサーグラムを局所的にフィットさせる。
【０４８０】
阻害剤の非存在下で生成された各試料（Ｓ５、Ｓ６およびＳ７）についての親和性（ＫＤ）、オンレート（ｋａ、Ｍ−１ｓ−１）およびオフレート（ｋｄ）を、阻害剤の存在下で生成された試料（Ｓ９、Ｓ１０およびＳ１１）と比較して、（１つまたは複数の）ｍＡｂ５．９４８．１のその抗原であるヒトＩｇＥとの抗体結合に対する減少したグリコシル化の作用を評価する。
【０４８１】
本明細書に記載する核酸配列およびアミノ酸配列を、それらの配列識別番号と共に下記の表１０において一覧表示する。
【０４８２】
【表１０】
2010246541.tif 000016
【０４８３】
本明細書において引用した１つ１つの特許、特許出願、および公開資料の開示は、これによって全内容が参照により本明細書に組み込まれている。
【０４８４】
本発明を特定の実施形態に関連して開示してきたが、本発明の他の実施形態および変形形態は、当業者によって本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく考案し得ることは明白である。添付の特許請求は、全てのこのような実施形態および同等の変形形態を含むと解釈されることを意図する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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