(57)【要約】【課題】Ｐ１９ＣＬ６は心筋細胞に分化しやすいＥＣ細胞として知られているが、実際は心筋細胞への分化は容易ではない。そこでＰ１９ＣＬ６から、心筋細胞へ、より確実性の高い分化方法が望まれた。【解決手段】Ｐ１９ＣＬ６から３層以上の積層構造に増殖するクローン細胞を選別する。このクローン細胞をコラーゲンをコートしたウェルで、ＤＭＥＭの下で増殖させ、メチル化阻害剤である５‐Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅで４８時間以上刺激することで、拍動心筋細胞を高い確立で得ることができた。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ１９ＣＬ６由来のクローン細胞であって、少なくとも３層以上に増殖する細胞。
【請求項２】
Ｐ１９ＣＬ６から少なくとも３層以上に積層して増殖するクローン細胞を選別する工程と、
前記選別したクローン細胞を増殖させる工程と、
前記増殖させたクローン細胞をメチル化阻害剤で刺激する工程と、
前記刺激されたクローン細胞を培養する工程を有するＰ１９ＣＬ６を心筋細胞に分化誘導する方法。
【請求項３】
前記増殖させる工程は、コラーゲン（Ｔｙｐｅ  Ｉ）でコーティング処理を行った培養皿で前記クローン細胞を増殖させる請求項１に記載されたＰ１９ＣＬ６を心筋細胞に分化誘導する方法。
【請求項４】
前記培養する工程では、培養液としてＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を用いる請求項１または２のいずれかの請求項に記載されたＰ１９ＣＬ６を心筋細胞に分化誘導する方法。
【請求項５】
前記メチル化阻害剤は５−Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅである請求項１乃至３のいずれかの請求項に記載されたＰ１９ＣＬ６を心筋細胞に分化誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞に分化しやすいＥＣ細胞として知られているＰ１９ＣＬ６細胞の分化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）は、発生初期の胚の内部細胞塊から樹立された幹細胞株である。未分化であるので、多種類の細胞に分化することができる多分化能を有する。多分化能という特性は、分化させた細胞を用いて損傷した細胞や組織を修復することに用いることができる可能性があり、注目されている。
【０００３】
実際、ＥＳ細胞からは運動神経細胞、心筋細胞、造血幹細胞への分化誘導が報告されており、さまざまな治療への応用が検討されているだけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬効のスクリーニングへの利用も考えられている。
【０００４】
ところで、心筋細胞は増殖能力を持たないため、最終分化状態の細胞であると考えられている。つまり、心筋梗塞などで損傷を受けてしまった心筋は再生することがない。従って、心筋組織が広範囲に損傷を受けた場合、従来は心臓移植が唯一の根治治療であった。
【０００５】
しかし、ＥＳ細胞を心筋細胞に分化させ、損傷を受けた組織を再生することができれば、心臓疾患の治療法として新たな根治治療を提供することができる。そのため、心筋細胞に分化するＥＳ細胞およびその誘導因子について数多くの研究がなされている。
【０００６】
特許文献１では、ヒトのＥＳ細胞を心筋細胞へ分化させる方法として、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）がない、つまり無血清条件下でインキュベートすることで、高い確率で心筋細胞に分化させることができることを示している。
【０００７】
さらに、特許文献２では、アスコルビン酸またはその誘導体の存在下でヒトのＥＳ細胞を心筋細胞へ分化させることができることを示している。
【０００８】
また、特許文献３では、脂肪組織由来幹細胞、特に脂肪組織由来多系統前駆細胞（ＡＤＭＰＣ）をＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）またはＯＰ９培養上清の存在下で培養させることで、心筋細胞へ分化する心筋芽細胞および心筋芽細胞シートを得ることができることを示している。
【０００９】
また、特許文献４では、ＥＳ細胞をポリアミンの存在下で培養することで、心筋細胞へ分化させることができることを開示している。
【００１０】
再生医療には上記のように安全なＥＳ細胞が必要であるが、心筋細胞への分化および発生のメカニズムや、薬効のスクリーニングとしては、より手軽に入手できてＥＳ細胞と同様の多分化能を有する未分化幹細胞があれば、大変有用である。
【００１１】
このような細胞には、胚性癌腫細胞株（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ：ＥＣ細胞株）があり、いくつかのマウス系統で発見された悪性奇形腫から得た腫瘍細胞から樹立されている。
【００１２】
１９９６年にＡｋｅｍｉ  Ｈａｂａｒａ−Ｏｈｋｕｂｏによって胚性癌腫細胞株Ｐ１９から単離されたＣＬ６という細胞（以後「Ｐ１９ＣＬ６」と呼ぶ。）（非特許文献１参照）は、ＤＭＳＯの存在下で培養すると自律的に拍動する心筋細胞に分化し、心筋特異的遺伝子を発現する。従って、薬効のスクリーニング用としては大変注目されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表２００８−５００８２１号公報
【特許文献２】特表２００８−５２３８２３号公報
【特許文献３】特開２００８−３０７２０５号公報
【特許文献４】特開２００６−２１８０３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
Ｐ１９ＣＬ６は、ＤＭＳＯの存在下で高い確率で自律的に拍動する心筋細胞に分化するとされているが、実際にＰ１９ＣＬ６を心筋細胞に分化させるのは容易ではなく、高い確率で心筋細胞を得ることはできなかった。本発明は、このような課題に鑑みＰ１９ＣＬ６を高い確率で心筋細胞へ分化させる方法を提供するものである。また、本発明者は、Ｐ１９ＣＬ６の中でも、特定の性質を有するクローンが、高い確率で心筋細胞に分化することを見出し、そのクローン細胞をも提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
より具体的には、本発明の細胞は
Ｐ１９ＣＬ６由来のクローン細胞であって、少なくとも３層以上に積層して増殖する細胞である。
【００１６】
また、本発明の分化誘導方法は、
Ｐ１９ＣＬ６から少なくとも３層以上に積層して増殖するクローン細胞を選別する工程と、
前記選別したクローン細胞を増殖させる工程と、
前記増殖させたクローン細胞をメチル化阻害剤で刺激する工程と、
前記刺激されたクローン細胞を培養する工程を有するＰ１９ＣＬ６を心筋細胞に分化誘導する方法である。
【発明の効果】
【００１７】
Ｐ１９ＣＬ６から得た、３次元的に積層しながら増殖するクローン細胞は、メチル化阻害剤による刺激を経て、培養されることで、高い確率で心筋細胞に分化する。そして、１０倍の対物レンズと１０倍の接眼レンズで得られる顕微鏡の視野で、半分以上の領域を占める拍動する心筋細胞（塊あるいはシート）を得ることができるので、薬品などのスクリーニングに適した心筋細胞を高い確率で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の細胞Ａ１から分化した心筋細胞と親株（Ｐ１９ＣＬ６）から分化した心筋細胞の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、Ｐ１９ＣＬ６を高い確率で心筋細胞に分化させるためには、Ｐ１９ＣＬ６由来のクローン細胞のうち、高さ方向に少なくとも３層以上積層して増殖するクローン細胞を用いるのがよいという点を見出してなされたものである。
【００２０】
Ｐ１９ＣＬ６は、Ｐ１９という胚性癌腫細胞株から特に心筋細胞へ容易に分化するものとして得られた細胞である。しかし、Ｐ１９ＣＬ６の中にも、増殖の仕方が異なる細胞があり、平面的若しくは部分的に２層になった状態で増殖するものと、３層以上に積層しながら立体的に増殖するものがあった。
【００２１】
本発明は、Ｐ１９ＣＬ６から得た、少なくとも３層以上に積層しながら増殖するクローン細胞と、そのクローン細胞を所定の条件で刺激し、培養することで心筋細胞に分化させる方法を提供するものである。
【００２２】
Ｐ１９ＣＬ６は、すでに公的に分譲されており、低温で保存されている。従って、この状態から常温に戻す（起こす）工程が必要である。起こす工程は、特に限定されるものではなく、ウォーターバス中で３７℃のお湯をつくり、凍結した細胞が入っている容器をウォーターバス中ですばやく解凍するという常法でよい。次に細胞を増殖させる。増殖させる工程も、常法に従ってよい。増殖させる培地は特に限定されないが、αＭＥＭ（アルファ改変イーグル培地）とＤＭＥＭが好適に用いられる。培地には、ＦＢＳの他、適宜栄養成分を追加してもよい。
【００２３】
次にＰ１９ＣＬ６から３層以上に積層しながら増殖するクローン株を選択する。クローンの選択の仕方も特に限定されるものではなく、ペニシリンカップ（クローニングリング（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｒｉｎｇ）とも呼ばれている。）法などの常法を用いることができる。ここで抽出するクローン株は、３層以上に積層しながら増殖するクローン株である。単層状態で広がりながら増殖するクローン株は、心筋細胞に分化しても出現頻度が低く、また心筋細胞塊が小さいため拍動領域が狭く分化効率が悪い。増殖の結果、３層以上に積層したか否かは顕微鏡観察で容易に判断できる。
【００２４】
次に選択したＰ１９ＣＬ６由来のクローン細胞を増殖させる。増殖させる工程も、常法に従ってよい。増殖させる培地も特に限定されないが、αＭＥＭとＤＭＥＭが好適に用いられる。培地には、ＦＢＳの他、適宜栄養成分を追加してもよい。
【００２５】
次にＰ１９ＣＬ６をメチル化阻害剤で刺激する。メチル化阻害剤として、５−Ａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅやＺｅｂｕｌａｒｉｎｅなども利用できるが、５−Ａ
ｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ（以下「Ａｚａ」と記載する。）が好適に利用できる。刺激時間は４２時間以上７８時間以下がよく、より好ましくは６６時間以上７８時間以下がよい。メチル化阻害剤での刺激時間が短いと、選択したクローン株であっても、心筋細胞に分化しない場合が頻繁に生じる。一方、刺激時間が長すぎると細胞が死滅してしまう。
【００２６】
Ｐ１９ＣＬ６を心筋細胞に分化させた先行例では、メチル化阻害剤での刺激を２４時間行うことで、心筋細胞に分化させた点の開示があるが、実際には心筋細胞に分化する確立は低かった。本発明の発明者は、Ｐ１９ＣＬ６から得たクローン細胞を、より長い時間でのメチル化阻害剤での刺激によって、高い確率で心筋細胞に分化することを見出した。
【００２７】
なお、クローン細胞を増殖させる際に、コラーゲンで培養皿（以下「ウェル」という。）をコーティングしてもよい。ウェルをコラーゲンで培養することで、より安定してクローン細胞を得ることができる。また、この時に使用するコラーゲンは（Ｔｙｐｅ  Ｉ）が好適であった。
【００２８】
メチル化阻害剤での刺激の後に、ＤＭＳＯを加えた培養液を用いて、常法の培養環境にて細胞を培養する。刺激後の細胞はその後の培養で高い確率で（効率良く）心筋細胞へ分化して大きな心筋細胞塊を形成し、広い範囲で拍動が同期する。
【００２９】
以下、本発明の実施例を比較例と共に説明する。
【実施例】
【００３０】
［クローン細胞の選択］
Ｐ１９ＣＬ６は、理化学研究所より分譲を受けた。
【００３１】
まず、直径１０ｃｍのウェルに５０個、１００個、２００個のＰ１９ＣＬ６細胞を播種し、コロニー形成率を調べた。求めたコロニー形成率から直径１０ｃｍのウェルに２０〜３０個程度のコロニーが形成されるように細胞を播種して、ＣＯ2インキュベータで１〜２週間培養した。
【００３２】
１〜２週間の培養で直径が２〜３(数)ｍｍ程のコロニーが形成された。１つの細胞が増殖して形成されたコロニーは、単一のクローン細胞から形成されている。他のコロニーと十分に距離が離れたコロニーを（倒立型）顕微鏡下で選別し、ウェルの裏底にマジックで印を付けた。培養液を（アスピレーターで）除きハンクス液で２回ほど洗浄し、ウェルの底全体が少量のハンクス液で湿っている状態にした。
【００３３】
片面全体にグリースを塗布したペニシリンカップ（クローニングリング）をマジックの印に合わせ中央にコロニーが位置するように置き、グリースで封されたウェルを作った。
【００３４】
ペニシリンカップ内に５０μＬの０．２５％トリプシン溶液を加え、コロニーを形成する細胞の一部が丸くなりウェルから剥がれるまで室温ないし３７℃で数分間静置した。直ちに、ピベットで１００μＬの培養液を加え、数回のピペッティングで細胞を十分に剥がした後、細胞液を回収した。１ｍＬの培養液を加えた２４ウェルプレートの個々のウェルに回収した細胞液を入れ、培養した。
【００３５】
細胞が増殖し、７０〜８０％コンフルエントになったら、直径３．５ｃｍ、６ｃｍ、１０ｃｍのウェルに順次移し替えて培養した。１０ｃｍウェルで増殖した細胞は数個の細胞凍結用チューブに分けて−８０℃ないし液体窒素温度で実験に供するまで保存した。
【００３６】
コロニーには、ウェル上で３層以上に積層しながら立体的に増殖するものと、平面的若しくは部分的に２層になった状態で増殖するものが存在し、前者のコロニーから得られたクローン細胞（Ａ１、Ａ２、Ａ３）と後者のコロニーから得られたクローン細胞（Ｓ６ａ）を実験に供した。
【００３７】
［単層細胞と多層細胞の比較］
以下の［親株との比較］以外の実施を含め−８０℃で保存しておいた細胞は、３７℃のウォーターバスで解凍させ、５．５％ないし７．５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れた１０ｃｍウェルにて培養し、７０〜８０％コンフルエントになった細胞を使用する。ここでは、クローン細胞Ａ１とＳ６ａを上記の方法により用意した。クローン細胞Ａ１は、多層に増殖するクローン細胞であり、Ｓ６ａは、単層で増殖するクローン細胞である。
【００３８】
まず、１２ウェルプレートに、それぞれ２０００００個／ウェルになるようにクローン細胞を入れ、７．５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭで２０−２８時間後に９０−１００％コンフルエントな時状態になるまで増殖させた。次に１０、１５、２０μＭの濃度のＡｚａを２４時間および４８時間作用させた。その後は、１．５％ＤＭＳＯで培養を継続した。
【００３９】
Ａｚａを作用させた当日を０日とした場合、（約）１６日目に拍動心筋細胞の出現頻度を調べた。なお、以下の実施を含め、拍動心筋細胞の出現頻度は以下のように評価した。
【００４０】
対物レンズ１０倍、接眼１０倍の倒立顕微鏡で細胞の位相差像を観察する。出現頻度を以下のようにＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄで評価した。
Ａ：２視野を見れば少なくとも１つの拍動細胞塊が出現した。
Ｂ：４−５視野内に少なくとも１つの拍動細胞塊が出現した。
Ｃ：８−１０視野内に少なくとも１つの拍動細胞塊が出現した。
Ｄ：ウェル内での拍動細胞塊は数個以下だった。
【００４１】
なお、１２ウェルプレートの各ウェルの底面積は３．８ｃｍ2だがウェルの辺縁は界面張力により培養液がウェルの壁へ引っ張られ明瞭な位相差像が得られなかった。これは液−気相の界面はウェル全体では平面とならず，辺縁近くでカーブするので光の屈折に影響をおよぼすためと考えられた。有効視野が得られる（位相差像が明瞭な）ウェルの面積は、底面積より一回り小さいが，さらにそれよりも一回り小さいウェルの円（円の中心から８割程度の径の円）で判定した。
【００４２】
結果を表１に示す。多層増殖クローン細胞Ａ１は、出現頻度でＢ乃至Ｃの場合があったが、単層増殖クローン細胞Ｓ６ａは、出現頻度Ｃの場合が、１度だけ（１０μＭのＡｚａを４８時間作用させた場合）であり、Ａ１より出現頻度が低かった。また、Ａｚａの濃度を２０μＭとした場合は、どちらのクローン細胞も出現頻度がＤであった。これらの結果より、多層増殖クローン細胞Ａ１は単層増殖クローン細胞Ｓ６ａより心筋細胞への分化が起こりやすいことがわかった。またメチル化阻害剤であるＡｚａの濃度は２０μＭでは高すぎると考えられた。
【００４３】
【表１】
2010213576.tif 000002
【００４４】
［コートの効果］
細胞の接着状態は細胞の分化に影響を及ぼすと考えられる。また、細胞が積層状態で増殖するのは、単層で増殖する場合と比べ、接着状態に差があることが考えられた。細胞の最初の接着はウェルであるので、ウェルにコートを行った場合の効果を調べた。
【００４５】
１２ウェルプレートに３．０μｇ／ｃｍ2の濃度でコラーゲン（Ｔｙｐｅ  Ｉ）のコーティング処理を２時間以上行った。また、同様にＭａｔｒｉｇｅｌ（いか「マトリゲル」という。）をコーティング処理したウェルを用意した。クローン細胞Ａ１、Ａ２、Ａ３を２０００００個／ウェルになるようにそれぞれのウェルに入れた。
【００４６】
コラーゲンでコートしたウェルには５．５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れ、マトリゲルでコートしたウェルには７．５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れ、２０−２８時間後に９０−１００％コンフルエントな時状態になるまで増殖させた。
【００４７】
次に１０μＭの濃度のＡｚａを、２４、４８、７２、９６時間作用させた。その後は、１．０％ＤＭＳＯで培養を継続した。結果を表２に示す。
【００４８】
クローン細胞Ａ１、Ａ２、Ａ３はいずれも多層増殖クローン細胞である。拍動心筋細胞の出現頻度でみると、クローン細胞Ａ２では、コラーゲンとマトリゲルとの差はほとんど無かった。しかし、クローン細胞Ａ１では、若干出現頻度は増えており、クローン細胞Ａ３では、出現頻度で「Ａ」評価の場合も観測された。
【００４９】
このことから、コラーゲンによるウェルのコートはマトリゲルによるコートよりも心筋細胞への分化の頻度を高めた。また、１０μＭの濃度とはいえ、Ａｚａを９６時間作用させると、心筋細胞への分化の頻度は低下することが分かった。
【００５０】
【表２】
2010213576.tif 000003
【００５１】
［分化条件の絞込み］
ここで再度多層増殖クローン細胞について、より高い確率で心筋細胞に分化する条件を詰める確認を行った。用いた細胞はクローン細胞Ａ１およびＡ３であり、調べた条件は、培養時のＦＢＳの濃度、Ａｚａの作用時間、ウェルのコートの有無および種類である。今回は６ウェルプレートを用い、それぞれ５０００００個／ウェルになるようにクローン細胞を入れて実験した。
【００５２】
ウェルへのコートは「コートの効果」（表２）で行ったのと同じように、コラーゲンとマトリゲルをウェルにコートした。それぞれの細胞には、５．５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭと７．５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭの２種類のウェルを用意した。そして、それぞれ９０−１００％コンフルエントな状態まで増殖させ、１０μＭのＡｚａを４８時間および７２時間作用させた。Ａｚａでの作用の後は、１％のＤＭＳＯで培養を継続した。
【００５３】
この実験では、拍動心筋細胞の出現頻度だけでなく、細胞塊の大きさも評価した。細胞塊の大きさは次のような尺度で行った。用いた倒立顕微鏡や観察視野に関しては、これまでの実施例と同じである。
◎：１視野の面積で７５％以上が拍動する大きな拍動心筋細胞塊を観測した。
○：１視野の面積で２５−５０％が拍動する拍動心筋細胞塊を観測した。
△：１視野の面積で５−２０％程度が拍動する拍動心筋細胞塊を観測した。
×：１視野の面積で２−３％程度以下が拍動する拍動心筋細胞塊を観測した。
結果を表３に示す。
【００５４】
マトリゲルとコートなしの場合は、判断が容易ではない。しかし、コラーゲンでコートしたウェルを用いた場合は、出現頻度が高くなり、大きな拍動心筋細胞塊を得ることができた。特にクローン細胞Ａ１をコラーゲンコートのウェルで培養し、Ａｚａで７２時間処理したものは、出現頻度も高く（Ａ）、また観察された拍動心筋細胞塊も大きかった（◎）。クローン細胞Ａ１に対するこの条件は、その後５回繰り返し実験を行い、同様に再現されていることを確認している。
【００５５】
【表３】
2010213576.tif 000004
【００５６】
［親株との比較］
クローン細胞Ａ１は、親株であるＰ１９ＣＬ６のクローン細胞である。しかし、拍動心筋細胞への分化の頻度は違いそうである。そこで親株との比較を行った。−８０℃で保存しておいた細胞は、３７℃のウォーターバスで解凍させ、６．５％ＦＢＳを添加したαＭＥＭないし７．５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れた１０ｃｍウェルにて培養し、７０〜８０％コンフルエントになった細胞を使用した。
【００５７】
実験には６ウェルプレートを用い、それぞれ５０００００個／ウェルになるようにクローン細胞を入れて実験した。ウェルは、コラーゲンでコートしたウェルとコートしていないウェルを用意した。αＭＥＭを用いたのは、Ｐ１９ＣＬ６の既報のプロトコルではαＭＥＭが用いられているからである。
【００５８】
また、Ａｚａの濃度は１０μＭ一定とし、作用時間は２４、４８、７２時間と変化させた。評価は、拍動心筋細胞塊の大きさと出現頻度で評価した。結果を表４に示す。
【００５９】
親株では細胞塊の大きさは△以上は無かったが、クローン細胞Ａ１では○や◎も確認でき、安定して拍動心筋細胞に分化することがわかった。
【００６０】
図１に、この時の顕微鏡写真を示す。図１（ａ）は、Ｐ１９ＣＬ６（親株）をαＭＥＭで培養し、分化させた場合である。また、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）はそれぞれ親株をＤＭＥＭで培養させた場合、クローン細胞Ａ１をαＭＥＭで培養した場合、クローン細胞Ａ１をＤＥＭで培養した場合である。図中白矢印は２００μｍを示す。また、白で囲った領域が拍動心筋細胞塊（の領域）である。
【００６１】
図１（ａ）では、小さな心筋細胞塊が散見されるだけである。（ｂ）では、視野中央付近に比較的大きな心筋細胞塊が観測できる。一方、クローン細胞Ａ１では、（ｃ）で視野の半分以上を占め、（ｄ）ではほぼ視野一杯の拍動心筋細胞塊を観測できた。
【００６２】
【表４】
2010213576.tif 000005
【図１】
2010213576.tif 000006