(57)【要約】【課題】タンパク質−タンパク質結合に接近可能な形態でポリペプチドを酵母細胞壁につなぐ（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）ための遺伝子方法【解決手段】酵母細胞表面上で野生型タンパク質を越える増強した提示可能性についてタンパク質を選択するための方法であって、以下：酵母細胞壁タンパク質に融合された、試験されるタンパク質を発現するベクターを用いて酵母細胞を形質転換する工程であって、ここで変異誘発が、該試験されるタンパク質の変異体の変化に富む集団を生成するために使用される、工程；該酵母細胞を、該酵母細胞表面上に提示されるタンパク質に結合し、そして該酵母細胞表面上に提示されないタンパク質と結合しない標識と接触させる工程；該標識が結合する該酵母細胞を単離する工程であって、ここで試験されるタンパク質に結合した該標識の増強した存在が、該試験されるタンパク質が該酵母細胞表面上に提示可能であることを示す、工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、免疫学およびタンパク質化学の分野に関する。より具体的には、本発明は、コンビナトリアルライブラリーからの所望の結合特性を有する配列の選択のための酵母細胞表面上のペプチドおよびタンパク質のディスプレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連する技術分野の記載）
抗体が結合する部位の構造は、ペプチド配列データから合理的な精度で推定され得るが、結合親和性および結合特異性における改良を合理的に操作する能力は、いくつかの成功にもかかわらずより理解しにくいことが証明されている（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、８７年；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、９２年）。結果として、ライブラリーの変異誘発およびスクリーニングは、現在のところ、抗体の指向性の親和性成熟への最も有益なアプローチを示す。コンビナトリアルライブラリースクリーニングおよび選択方法は、タンパク質の認識特性を変化させるための共通の道具となった（Ｅｌｌｍａｎら、１９９７、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ  ＆  Ｆｉｅｌｄｓ、１９９５）。特に、インビトロでの抗体免疫レパートリーの構築およびスクリーニングは、抗体−抗原相互作用の強度および特異性に対して改良された制御を約束する。
【０００３】
最も広範な技術は、ファージディスプレイであり、ここで目的のタンパク質は、バクテリオファージ被膜タンパク質へのポリペプチド融合体として発現され、そして固定化されたかまたは可溶性のビオチン化されたリガンドに結合することによって引き続きスクリーニングされる（例えば、Ｈｕｓｅら、８９年；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、９１年；Ｍａｒｋｓら、９２年）。融合体は、最も一般的にはマイナーな被膜タンパク質（遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）と呼ばれる）に対して作製され、このタンパク質は、ファージのチップで３〜５コピー中に存在する。この方法で構築されるファージは、１つのパッケージ中で表現型（表示された抗体の結合活性）および遺伝子型（その抗体をコードする遺伝子）の両方を有する、コンパクトな遺伝子「単位」とみなされ得る。ファージディスプレイは、抗体、ＤＮＡ結合タンパク質、プロテアーゼインヒビター、短いペプチド、および酵素に首尾よく適用されている。
【０００４】
所望の結合特性を有する抗体は、「パンニング」と呼ばれるプロセスにおいて固定化された抗原に結合することによって選択される。ファージ保有非特異的抗体を、洗浄することによって取り除き、次いで、結合したファージを溶出し、そしてＥ．ｃｏｌｉの感染により増幅する。このアプローチは、以下を含む多数の抗原に対する抗体を生成するために適用されている：Ｂ型肝炎表面抗原（Ｚｅｂｅｄｅｅら、９２年）；多糖類（Ｄｅｎｇら、９４年）、インスリン様増殖因子１（ＧａｒｒａｒｄおよびＨｅｎｎｅｒ、９３年）、２−フェニルオキサゾール−５−オン（ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＷｅｉｌｌ、９３年）、ならびに４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロ−フェナセチル−（ＮＩＰ）−カプロン酸（Ｈａｗｋｉｎｓら、９２年）。
【０００５】
それにもかかわらず、ファージディスプレイは、いくつかの弱点を有する。抗体ファージディスプレイライブラリーのパンニングは、強力な技術であるが、それは、その広範な成功した適用を制限するいくつかの本質的な困難性を有する。例えば、いくつかの真核生物の分泌型タンパク質および細胞表面タンパク質は、細菌細胞中では利用不可能な、グリコシル化または大規模なジスルフィド異性化のような翻訳後修飾を必要とする。さらに、ファージディスプレイの性質は、リガンド結合パラメーターの定量的な識別および直接的な識別を不可能にする。例えば、非常に高度な親和性抗体（ＫD≦１ｎＭ）は、パンニングにより単離することが困難である。なぜなら、この非常に強い抗体−抗原相互作用を破壊するために必要とされる溶出条件は、一般に、それを十分に非感染性にするためにファージ粒子を十分に変性させるのに十分に過酷である（例えば、低いｐＨ、高い塩）。さらに、固体表面への抗原の物理的な固定化についての必要性は、多数の人工的な困難性を生じる。例えば、高い抗原表面密度は、真の親和性を隠すアビディティー効果を導入する。また、物理的なつなぎとめ（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）は、抗原の並進エントロピーおよび回転エントロピーを減少し、可溶性抗原についてのものと比較して、抗体結合に対してより小さいＤＳおよび結果として生じる結合親和性の過大評価を生じ、そして混合手順および洗浄手順の際の可変性からの大きな効果は、再現性の困難性を導く。さらに、１ファージ粒子当たり１から数個の抗体のみの存在は、実質的に確率論的な変動を誘導し、そして類似の親和性の抗体の間での識別が不可能になる。例えば、６倍以上の親和性の差異は、しばしば、効率的な識別のために必要とされる（ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＷｅｉｌ、９３年）。最終的に、集団は、より急速に増殖する野生型ファージにより追い越され得る。特に、ｐＩＩＩは、ファージの生活環に直接的に関与するので、いくつかの抗体または結合抗原の存在は、会合したファージの増殖を妨げるかまたは遅らせる。
【０００６】
いくつかの細菌細胞表面ディスプレイ方法が、開発されている。しかし、原核生物発現系の使用は、時折、予測し得ない発現の偏りを誘導し、そして細菌莢膜多糖層は、低分子リガンドに対してこのような系を制限する拡散障壁を提示する（Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９６）。Ｅ．ｃｏｌｉは、高分子結合反応を立体的に妨害し得る、リポ多糖類層または莢膜を有する。実際、細菌莢膜の推定される生理学的機能は、免疫系から細胞を保護するために、細胞膜に対する高分子の拡散の制限である（ＤｉＲｉｅｎｚｏら、７８年）。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムは、抗体フラグメントの折り畳みおよびアセンブリのための区画として進化していないので、Ｅ．ｃｏｌｉ中の抗体の発現は、代表的には、非常にクローン依存性である（いくつかのクローンは、よく発現し、そして他のクローンは、全く発現しない）。このような可変性は、Ｅ．ｃｏｌｉの表面上に発現される抗体ライブラリーにおける全ての可能な配列の等価な提示に対する懸念を誘導する。
【０００７】
新規な治療剤の発見は、酵母選択系の開発により促進される。Ｂ細胞ディスプレイ抗体と酵母細胞ディスプレイ抗体との間の構造類似性は、糸状ファージで入手可能であるよりも、インビボでの親和性成熟に対してより近い類似性を提供する。さらに、酵母で利用可能な増殖培養の容易さおよび遺伝子操作のたやすさは、大きな集団を急速に変異誘発し、そしてスクリーニングさせることを可能にする。哺乳動物の身体における状態と対比させることにより、結合および選択の生理化学的条件を、ｐＨ、温度、およびイオン強度の広範な範囲内で酵母培養物について変化させ、抗体操作実験においてさらなる自由度を提供し得る。コンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング、および抗体−抗原の解離速度に基づくスクリーニングのための酵母表面ディスプレイ系の開発は、本明細書中に記載されている。
【０００８】
ヒト疾患の診断および処置のための、モノクローナル抗体を操作することの可能性のある適用は、遠い道のりである。特に、癌治療および腫瘍画像化に対する適用は、活動的に追求されている。グラム陰性敗血症についての抗体治療はなお、落胆させる予備的な結果にもかかわらず見込みを有している。免疫組織化学、免疫アッセイ、および免疫親和性クロマトグラフィーへのインビトロでの適用は、既によく開発されている。これらの適用の各々について、高親和性（すなわち、ＫD≦１０ｎＭ）および高い特異性を有する抗体が望ましい。事例証拠は、ファージディスプレイ系および細菌ディスプレイ系がｎＭより小さい親和性の抗体を一貫して産生していないようであることを示唆する。現在までに、酵母ディスプレイは、このギャップを満たし、そしてこのようなものは、巨大な商業的な重要性および医学的な重要性の鍵となる技術であるはずである。
【０００９】
細胞媒介性免疫に対するＴ細胞レセプターの重要性は、１９８０年代から公知であったが、より高い親和性のＴ細胞レセプターを操作するための方法は、開発されていなかった。いくつかのグループが、単鎖Ｔ細胞レセプター構築物を産生したが、これらの発現系は、Ｔ細胞レセプター結合の生化学的分析を可能にしたが、指向性の様式でこれらの結合特性を変化させるためのライブラリー方法を可能にしなかった。このＴ細胞レセプターを、可溶性型で産生することは特に困難であった。その内因性型において、Ｔリンパ球の表面上のＣＤ３複合体のサブユニットと非共有結合的に会合するのは、ヘテロ二量体（αβ）膜タンパク質である。この細胞外αおよびβドメインは、定常領域（ＣαおよびＣβ）、ならびにペプチド／ＭＨＣ抗原の結合の際に直接的に機能する可変領域（ＶαおよびＶβ）の両方から構成される。産生のためのいくつかの困難な方法が開発されている：Ｅ．ｃｏｌｉからのＶαＶβの分泌、免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域に融合されたＶαＣα  ＶβＣβからなるミエローマ細胞中でのキメラ分子の産生、胸腺腫中での細胞表面脂質との融合からの切断によるＶαＣα  ＶβＣβの産生（Ｓｌａｎｅｔｚら、１９９１）、トロンビン消化での膜貫通領域の前のラット好塩基球性白血病細胞株産生ＶαＣα  ＶβＣβ−ｚ複合体の切断、ロイシンジッパー会合を有するまたは有さないバキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＶαＣα  ＶβＣβの産生、ならびにＣＯＳ細胞からの免疫グロブリンＣＨ−ｇｄ  ＴＣＲキメラの分泌（Ｅｉｌａｔら、１９９２）。完全ＴＣＲの最小結合サブユニットを含む単鎖抗体フラグメントに類似する、より小さい単鎖ＴＣＲフラグメント（ｓｃＴＣＲ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で構築され、そして産生されており、０．５〜１．０ｍｇ／Ｌのレベルで封入体から再び折り畳まれるかまたはペリプラズム中で折り畳まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
先行技術は、所望の結合特性を有する配列の選択のために細胞表面ペプチドおよびタンパク質を表示する効果的な手段を欠くという点で不十分である。先行技術はまた、改良された結合特性のためのＴ細胞レセプターを操作する効果的な手段を欠くという点で不十分である。より具体的には、細胞媒介性免疫の治療介入を生じるために可溶性Ｔ細胞レセプターを操作するための技術は、利用可能ではない。本発明は、当該分野における長年の必要性および願望を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明によって、以下が提供される。
【００１２】
（項目１）  野生型タンパク質の表現型特性と比較して増強した表現型特性を有するタンパク質を選択するための方法であって、以下：
酵母細胞壁タンパク質に融合される、試験されるタンパク質を発現するベクターを用いて酵母細胞を形質転換する工程であって、ここで変異誘発を使用し、該試験されるタンパク質の変異体の変化に富む集団を生成する、工程；
該酵母細胞を第１の標識で標識する工程であって、ここで該第１の標識が該試験されるタンパク質を発現する酵母と結合し、そして該試験されるタンパク質を発現しない酵母と結合しない、工程；
該第１の標識が結合する該酵母細胞を単離する、工程；ならびに
酵母により発現される該変異タンパク質の該特性を分析し、そして該野生型タンパク質の特性と比較する工程であって、ここで野生型タンパク質に対して増強した特性を有する変異タンパク質を提示する酵母細胞が選択される、工程、
を含む、方法。
【００１３】
（項目２）  前記表現型特性が、表面発現レベル、安定性、結合定数、および解離定数からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
【００１４】
（項目３）  前記試験されるタンパク質が、抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ抗体フラグメントである、項目１に記載の方法。
【００１５】
（項目４）  前記試験されるタンパク質が細胞表面レセプターのリガンド結合ドメインである、項目１に記載の方法。
【００１６】
（項目５）  前記細胞表面レセプターがＴ細胞レセプターである、項目４に記載の方法。
【００１７】
（項目６）  前記試験されるタンパク質が、そのＮ末端により前記酵母細胞壁タンパク質のＣ末端に融合される、項目１に記載の方法。
【００１８】
（項目７）  前記酵母細胞壁タンパク質がアグルチニンである、項目１に記載の方法。
【００１９】
（項目８）  項目１に記載の方法であって、ここで前記酵母株がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、およびＣａｎｄｉｄａからなる群から選択される属である、方法。
【００２０】
（項目９）  前記試験されるタンパク質の前記変異体が、単一の変異体および複数の変異体からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
【００２１】
（項目１０）  前記第１の標識が、前記試験されるタンパク質に対するリガンドに付着された磁性粒子および蛍光標識からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
【００２２】
（項目１１）  増強した表現型特性を有する目的の変異したタンパク質の選択が、前記富化および標識する工程の反復サイクルを含む、項目１に記載の方法。
【００２３】
（項目１２）  項目１に記載の方法であって、さらに以下：
前記酵母細胞を第２の標識で標識する工程であって、ここで該酵母細胞を形質転換するために使用される前記ベクターが、融合ポリペプチドを産生するために前記試験されるタンパク質に融合されるポリペプチド配列を発現するための手段を含み、そして該第２の標識が、該融合ポリペプチドを発現する酵母細胞と結合し、そして該融合ポリペプチドを発現しない酵母細胞と結合しない、工程；
該第２の標識を定量することによって形質転換された酵母集団を富化する工程であって、ここで該第２の標識の出現が、細胞表面上に発現される該融合ポリペプチドの量に正比例する、工程；ならびに
前記試験されるタンパク質の表面発現レベルを決定するために、該第２の標識の前記定量と前記第１の標識の該定量とを比較する、工程、
を含む、方法。
【００２４】
（項目１３）  項目１２に記載の方法であって、ここで試験される野生型タンパク質の表面発現レベルと比較して前記試験される変異タンパク質の該表面発現レベルにおける増加が、該変異タンパク質の所望の表現型特性について選択するために使用され得る、方法。
【００２５】
（項目１４）  前記表現型特性が、細胞内発現レベル、安定性、結合定数、解離定数、分泌のレベル、および可溶性からなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
【００２６】
（項目１５）  前記第２の標識により認識される前記融合ポリペプチドの前記ポリペプチド部分がエピトープタグである、項目１２に記載の方法。
【００２７】
（項目１６）  前記第１の標識および前記第２の標識が蛍光標識である、項目１２に記載の方法。
【００２８】
（項目１７）  項目１に記載の方法であって、さらに以下の工程：
真核生物中での発現に適合したベクター中に前記選択された変異タンパク質をコードする遺伝子をクローニングする、工程；および
該真核生物中で該変異タンパク質を発現させる工程であって、ここで該変異タンパク質の前記増強した特性が、前記野生型タンパク質の特性と該変異タンパク質の該増強した特性の特性とを比較することによって確認される、工程、
を含む、方法。
【００２９】
（項目１８）  前記真核生物が、哺乳動物、昆虫および酵母からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
【００３０】
（項目１９）  項目１に記載の方法であって、さらに以下：
原核生物中での発現に適合したベクター中に前記選択された変異タンパク質をコードする遺伝子をクローニングする、工程；および
該原核生物中に該変異体タンパク質を発現させる工程であって、ここで該変異タンパク質の前記増強した特性が、前記野生型タンパク質の特性と該変異タンパク質の該増強した特性の特性とを比較することによって確認される、工程、
を含む、方法。
【００３１】
（項目２０）  酵母細胞表面上の表示可能性についてタンパク質を選択するための方法であって、以下：
酵母細胞壁タンパク質に融合された試験されるタンパク質を発現するベクターを用いて、酵母細胞を形質転換する工程であって、ここで変異誘発を用いて、該試験されるタンパク質の変異体の変化に富んだ集団を生成する、工程；
第１の標識を用いて該酵母細胞を標識する工程であって、ここで該第１の標識は、該試験されるタンパク質を発現する酵母と結合し、そして該試験されるタンパク質を発現しない酵母と結合しない、工程；
該第１の標識を定量することによって該第１の標識が結合する該酵母細胞を単離する工程であって、ここで該第１の標識の高い出現は、該試験されるタンパク質が所望のディスプレイ特性を有することを示し、そして該第１の標識の低い出現は、該試験されるタンパク質が所望のディスプレイ特性を有さないことを示す、工程、
を含む、方法。
【００３２】
（項目２１）  前記試験されるタンパク質が、抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ抗体フラグメントである、項目２０に記載の方法。
【００３３】
（項目２２）  前記試験されるタンパク質が細胞表面レセプターのリガンド結合ドメインである、項目２０に記載の方法。
【００３４】
（項目２３）  前記細胞表面レセプターがＴ細胞レセプターである、項目２２に記載の方法。
【００３５】
本発明の１つの実施態様において、タンパク質−タンパク質結合に接近可能な形態でポリペプチドを酵母細胞壁につなぐ（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）ための遺伝子方法が提供される。この方法を蛍光活性化セルソーティングと組合わせることは、別の分子に対する増加または減少した親和性、変化した特異性、あるいは条件的な結合を有するタンパク質を選択する手段を提供する。
【００３６】
本発明の別の実施態様において、酵母Ａｇａ２ｐ細胞壁タンパク質のＣ末端に目的のポリペプチドを遺伝的に融合する方法が提供される。接合の条件下で、各酵母細胞の外壁は、アグルチニンと呼ばれる約１０4タンパク質分子を含む。このアグルチニンは、接合中に反対の接合型の酵母細胞の接着を媒介するために特定の接触として働く。実際には、酵母は、細胞壁成分からの立体障害なしにタンパク質−タンパク質結合のためのプラットフォームを進化した。アグルチニンに抗体を付着することによって、免疫系におけるＢ細胞による、抗体の細胞表面ディスプレイを効果的に模倣し得る。
【００３７】
別の実施態様において、９残基エピトープ（ＨＡ）タグをＡＧＡ２タンパク質のＣ末端に融合する方法が提供される。この短いペプチドは、細胞の固定または消化なしに溶液中の抗体に対する細胞表面上での接近可能であり、そしてフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡により検出され得る。従って、酵母は、ペプチドを表示するために使用され得る。
【００３８】
さらに別の実施態様において、４−４−２０モノクローナル抗体のｓｃＦｖフラグメントをＡＧＡ２タンパク質のＣ末端に融合する方法が提供され、このフラグメントは、細胞表面上で接近可能であり、そして細胞の任意の固定または消化なしに蛍光抗原を結合し、そしてフローサイトメトリまたは蛍光顕微鏡により検出され得る。従って、酵母を使用し、抗体フラグメントを表示し得る。
【００３９】
本発明の１つの局面において、以下の工程を含む所望の結合特性を有するタンパク質を選択するための方法を提供する：酵母細胞壁結合タンパク質にＮ末端で融合された、試験されるタンパク質を発現するベクターを用いて酵母細胞を形質転換する工程；酵母細胞を第１の標識で標識する工程、ここで第１の標識が上記の試験されるタンパク質を発現する酵母と結合し、そして上記の試験されるタンパク質を発現しない酵母と結合しない、工程；この第１の標識と結合する酵母細胞について選択する工程；ならびに第１の標識を定量する工程、ここで第１の標識の高い出現は、試験されるタンパク質が所望の結合特性を有することを示し、ここで第１の標識の低い出現は、試験されるタンパク質が所望の結合特性を有さないことを示す、工程。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様はさらに、以下の工程を含む：酵母細胞を第２の標識で標識する工程、ここで第２の標識が、この試験されかつベクターによりコードされたタンパク質に融合されたエピトープタグを発現する酵母と結合し、そしてベクターによりコードされるエピトープタグを発現しない酵母と結合しない、工程；第２の標識を定量する工程、ここで上記第２の標識の出現は、酵母細胞表面上の試験されるエピトープタグ化タンパク質の発現コピー数を示す、工程、ならびに第２の標識の出現に対して基準化された第１の標識の出現を決定するために第２の標識の定量と第１の標識の定量を比較する工程、ここで第２の標識の出現と比較して高い第１の標識の出現は、試験されるタンパク質が所望の結合特性を有することを示す、工程。
【００４１】
本発明の別の好ましい実施態様は、以下の工程を含む：試験されるタンパク質への結合について第１の標識と競合する第３の標識を用いて酵母細胞を標識する工程；第１の標識で酵母細胞を標識する工程；第１の標識を定量する工程；第２の標識で酵母細胞を標識する工程；第２の標識を定量する工程；ならびに第２の標識の出現に対して基準化された第１の標識の出現を決定するために、第２の標識の定量と第１の標識の定量を比較する工程、ここで第２の標識の出現と比較して低い第１の標識の出現は、試験されるタンパク質が所望の結合特性を有することを示す、工程。
【００４２】
本発明の１つの実施態様において、第１の標識は、リガンドに付着された蛍光標識であり、そして第２の標識は、抗体に付着された蛍光標識である。この標識が蛍光である場合、この定量工程を、フローサイトメトリーまたは共焦点蛍光顕微鏡によって実行する。
【００４３】
本発明の別の局面は、本発明の方法を実行するためのベクターを提供し、ベクターは、目的のタンパク質のＮ末端に融合された細胞壁結合タンパク質を含む。本発明のこの局面の好ましい実施態様は、酵母細胞中で目的のタンパク質に融合されたポリペプチドエピトープタグを発現するための手段を含む。より好ましい実施態様は、この細胞壁結合タンパク質が酵母アグルチニンタンパク質の結合サブユニットであり、さらにより好ましくは、酵母アグルチニン結合サブユニットがＡｇａ２ｐであることを提供する。
【００４４】
本発明の本局面の別の好ましい実施態様は、エピトープタグアミノ酸配列が、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（ＨＡ）（配列番号１）、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（ｃ−ｍｙｃ）（配列番号２）、ＤＴＹＲＹＩ（配列番号３）、ＴＤＦＹＬＫ（配列番号４）、ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ（配列番号５）、ＫＰＰＴＰＰＰＥＰＥＴ（配列番号６）、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号７）、ＲＹＩＲＳ（配列番号８）、またはＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号９）の群から選択されること、ならびに目的のタンパク質のＮ末端が、細胞壁結合タンパク質のＣ末端に融合されることを提供する。
【００４５】
本発明のなお別の好ましい実施態様において、野生型タンパク質の表現型特性と比較して増強した表現型特性を有するタンパク質を選択するための方法が提供され、この方法は、以下の工程を含む：酵母細胞壁タンパク質に融合された試験されるタンパク質を発現するベクターを用いて酵母細胞を形質転換する工程であって、ここで変異誘発を使用し、試験されるタンパク質の変異体の変化に富んだ集団を生成する、工程；第１の標識で酵母細胞を標識する工程であって、ここで第１の標識が、試験されるタンパク質を発現する酵母と結合し、そして試験されるタンパク質を発現しない酵母と結合しない、工程；第１の標識と結合する酵母細胞を単離する工程；ならびに野生型タンパク質の特性を有する酵母細胞により発現される変異タンパク質の特性を分析かつ比較する工程であって、ここで野生型タンパク質に対して増強した特性を有する変異タンパク質を提示する酵母細胞が選択される、工程。上記のように、第２および／または第３の標識を本実施態様に用い得、そして増強した表現型特性を有する目的の変異タンパク質の選択が、富化工程および標識する工程の反復サイクルを含み得る。
【００４６】
好ましい実施態様において、酵母細胞壁タンパク質がアグルチニンであり；試験されるタンパク質が結合サブユニットアグルチニンのＣ末端にそのＮ末端により融合され；酵母株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、およびＣａｎｄｉｄａからなる群から選択される属であり；試験されるタンパク質が、抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ抗体フラグメントであり、より好ましくは、試験されるタンパク質が細胞表面レセプターのリガンド結合ドメインであり、さらにより好ましくは、細胞表面レセプターは、Ｔ細胞レセプターである。
【００４７】
本発明の目的は、表面発現、安定性、結合定数、解離定数、分泌のレベル、および可溶性からなる群から選択される増強した表現型特性を示す変異タンパク質を選択するための方法を提供することであり、ここで試験されるタンパク質の変異体は、単一の変異または複数の変異を含み得る。
【００４８】
さらに別の実施態様において、第２の標識を使用し、細胞表面発現レベルを定量的に決定し得、これは、他の所望の表現型特性（例えば、細胞内発現、安定性、結合定数、解離定数、分泌のレベル、および可溶性）について選択するためのアッセイとして使用され得る。
【００４９】
別の実施態様において、本発明の方法により選択される変異体タンパク質は、この選択される変異体タンパク質をコードする遺伝子を真核生物における発現のために適合されたベクターにクローニングすることにより；およびその真核生物においてこの変異体タンパク質を発現することにより、さらに特徴付けられ得る。ここで、この変異体タンパク質の増強された特性は、この変異体タンパク質の増強された特性の表現型特性を、野生型タンパク質の特性と比較することにより確認される。好ましくは、この真核生物は、哺乳動物、昆虫、または酵母からなる群から選択される。選択される変異体の表現型は、「新しい」（すなわち、変異型の）タンパク質の遺伝的特性であるので、このアプローチはまた、他の非真核生物発現系におけるこの変異体の発現に適用可能である。
【００５０】
酵母表面提示、およびフローサイトメトリーよる選別が、Ｔ細胞レセプターのＶｂ８領域に特異的なｓｃＦｖ変異体を単離するために使用されてきた。選択は、２つの蛍光標識プローブ（可溶性Ｖｂ８ドメイン、およびｓｃＦｖのカルボキシ末端に存在するｃ−ｍｙｃエピトープタグに対する抗体）による平衡結合に基づいた。このスクリーニングで選択された変異体は、Ｖｂ８に関する３倍増加された親和性を有するｓｃＦｖ、および抗ｃ−ｍｙｃ抗体により減少した親和性で結合されたｓｃＦｖクローンを含んだ。後者の発見は、酵母提示系が、立体配置的なエピトープ（標準的ペプチドスクリーニングにより明らかにされ得ない）のマッピングに使用され得ることを示す。平衡抗原結合定数は、表面提示形式内で評価され得、このことにより、サブクローニングおよび可溶性発現を必要とすることなく、単離された変異体のスクリーニングが可能になる。ランダムに突然変異されたｓｃＦｖを提示する酵母細胞の比較的小さいライブラリー（３×１０5）のみをスクリーニングして、これらの変異体を同定した。このことは、この系が、真核生物分泌タンパク質および細胞表面タンパク質の結合特性を操作するための強力な手段を提供することを示した。
【００５１】
本発明のこの局面の別の好ましい実施態様は、その通常の（「野生型」）配列として提示されないタンパク質を提示する方法を提供する。示される実施例において、抗原に対するＴ細胞レセプターは、その「野生型」配列として発現されなかった。しかし、ランダム突然変異、適切な立体配置特異的抗体を用いるフローサイトメトリーによる選択の後、この変異体レセプターを酵母細胞表面上に発現した。このストラテジーにより、新規なＴ細胞レセプターの発見が可能になり、そしてこのストラテジーは、事実上、任意のポリペプチドの提示のための方法を提供する。従って、本発明はまた、酵母細胞表面上での提示可能性についてタンパク質を選択するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：酵母細胞を、試験されるタンパク質を酵母細胞壁タンパク質と融合して発現するベクターで形質転換する工程であって、試験されるタンパク質の変異体のまだらな集団を生成するために突然変異を使用する、工程；酵母細胞を第１の標識で標識する工程であって、第１の標識が、試験されるタンパク質を発現する酵母と結合し、かつ試験されるタンパク質を発現しない酵母と結合しない、工程；第１の標識が結合する酵母細胞を、第１の標識を定量することにより単離する工程であって、第１の標識の高い存在は、試験されるタンパク質が所望の提示特性を有することを示し、そしてここで、第１の標識の低い存在は、試験されるタンパク質が所望の提示特性を有さないことを示す、工程を包含する。好ましくは、試験されるタンパク質は、抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント、またはｓｃＦｖ抗体フラグメント、あるいは、細胞表面レセプターのリガンド結合ドメインである。細胞表面レセプターの代表的な例は、Ｔ細胞レセプターである。
本発明の他の、そしてさらなる局面、特徴、および利点は、以下の、開示の目的のために提供される本発明の現在の好ましい実施態様の記載から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、模式図であり、酵母提示によるインビトロ親和性成熟を示す。
【図２】図２は、酵母上での表面提示の模式図を示す。赤血球凝集素抗原（ＨＡ）由来の９アミノ酸ペプチドのエピトープが、ａ−アグルチニンのＡｇａ２ｐサブユニットのＣ末端、続いて、４−４−２０抗フルオレセインｓｃＦｖ配列と融合された。さらなる１０残基エピトープタグ（ｃ−ｍｙｃ）が、ｓｃＦｖのＣ末端で融合され、これにより、ＨＡタグかｃ−ｍｙｃタグのいずれかにより、抗原結合から独立している融合提示の定量が可能になった。ＨＡタグまたはｃ−ｍｙｃタグを使用して、二重標識フローサイトメトリーにおける提示された融合タンパク質の数の変動を正規化し得る。
【図３】図３は、酵母表面提示のためのベクターを示す。図３Ａは、ベクターｐＣＴ２０２の構造を示す。図３Ｂは、特異的制限部位およびガラクトースによる転写調節、Ｎ末端ＨＡタグおよびＣ末端ｃ−ｍｙｃエピトープタグ、ならびにＦａｃｔｏｒ  ＸＡプロテアーゼ切断部位を示す。
【図４】図４は、提示された融合物が、蛍光技術により検出され得ることを実証し、ａ−ｃ−ｍｙｃ／ａ−ｍｏｕｓｅ−ＰＥで標識された酵母のフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。
【図５】図５は、４−４−２０  ｓｃＦｖによる抗原結合が、蛍光により検出され得ることを示し、ＦＩＴＣ−デキストラン（２×１０6Ｄａ）で標識された酵母のフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。
【図６】図６は、４−４−２０活性およびｃ−ｍｙｃが、同時に検出され得ることを示し、そして蛍光シグナルの１：１の相関を実証する；従って、強度シグナル１（ＦＩＴＣ）における変動は、シグナル２（ＰＥ）の強度により、目的のタンパク質の発現における細胞間の変動を正規化し得る。
【図７】図７は、ＡＧＡ２−ＨＡ−４−４−２０−ｃ−ｍｙｃ遺伝子カセットの配列を示す。
【図８】図８は、ｓｃＦｖを提示する酵母の共焦点顕微鏡画像を示す。ＨＡペプチド（図８Ａ）またはｓｃＦｖ融合物（図８Ｂ）の表面発現を指向するプラスミドを含む酵母が、ｍＡｂ  ９Ｅ１０、続いて２次抗マウスＩｇＧ−Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）結合体およびＦＩＴＣ−デキストランで標識された。ＤＩＣ（上のパネル）、赤色ＰＥ蛍光（中のパネル）、および緑色ＦＩＴＣ蛍光（下のパネル）画像を収集した。
【図９Ａ】図９は、ｓｃＦｖを提示する酵母のフローサイトメトリー分析を示す。図９Ａは、無関係のペプチド（図９Ａ）かまたは４−４−２０  ｓｃＦｖ（図９Ｂ）を提示する酵母株を、ｍＡｂ  ９Ｅ１０およびＦＩＴＣ−デキストランで標識した。また、ｓｃＦｖを提示する細胞を、標識前に５ｍＭ  ＤＴＴで処置した（図９Ｃ）。（ｉ）９Ｅ１０による標識化と結合したＰＥ蛍光の１変量ヒストグラム；（ｉｉ）ＦＩＴＣ蛍光の１変量ヒストグラム；（ｉｉｉ）ＰＥとＦＩＴＣ蛍光との間の相関を示す２変量ヒストグラム。
【図９Ｂ】図９は、ｓｃＦｖを提示する酵母のフローサイトメトリー分析を示す。図９Ａは、無関係のペプチド（図９Ａ）かまたは４−４−２０  ｓｃＦｖ（図９Ｂ）を提示する酵母株を、ｍＡｂ  ９Ｅ１０およびＦＩＴＣ−デキストランで標識した。また、ｓｃＦｖを提示する細胞を、標識前に５ｍＭ  ＤＴＴで処置した（図９Ｃ）。（ｉ）９Ｅ１０による標識化と結合したＰＥ蛍光の１変量ヒストグラム；（ｉｉ）ＦＩＴＣ蛍光の１変量ヒストグラム；（ｉｉｉ）ＰＥとＦＩＴＣ蛍光との間の関連を示す２変量ヒストグラム。
【図９Ｃ】図９は、ｓｃＦｖを提示する酵母のフローサイトメトリー分析を示す。図９Ａは、無関係のペプチド（図９Ａ）かまたは４−４−２０  ｓｃＦｖ（図９Ｂ）を提示する酵母株を、ｍＡｂ  ９Ｅ１０およびＦＩＴＣ−デキストランで標識した。また、ｓｃＦｖを提示する細胞を、標識前に５ｍＭ  ＤＴＴで処置した（図９Ｃ）。（ｉ）９Ｅ１０による標識化と結合したＰＥ蛍光の１変量ヒストグラム；（ｉｉ）ＦＩＴＣ蛍光の１変量ヒストグラム；（ｉｉｉ）ＰＥとＦＩＴＣ蛍光との間の関連を示す２変量ヒストグラム。
【図１０Ａ】図１０は、動態力学的選択およびフローサイトメトリーセル選別による、改良されたｓｃＦｖ改変体を提示する酵母の濃縮を実証する。突然変異された４−４−２０  ｓｃＦｖを発現する酵母ライブラリー（図１０Ａ）、ならびに３回の動態力学的選択および増殖から生じる酵母のプール（図１０Ｂ）が、５−アミノフルオレセインを有する蛍光抗原の競合解離に供され、ＦＩＴＣ強度／ＰＥ強度の最も高い割合で、最も強固に結合する変異体を提示する細胞を残した。
【図１０Ｂ】図１０は、動態力学的選択およびフローサイトメトリーセル選別による、改良されたｓｃＦｖ改変体を提示する酵母の濃縮を実証する。突然変異された４−４−２０  ｓｃＦｖを発現する酵母ライブラリー（図１０Ａ）、ならびに３回の動態力学的選択および増殖から生じる酵母のプール（図１０Ｂ）が、５−アミノフルオレセインを有する蛍光抗原の競合解離に供され、ＦＩＴＣ強度／ＰＥ強度の最も高い割合で、最も強固に結合する変異体を提示する細胞を残した。
【図１１】図１１は、フルオレセインと表面提示されたｓｃＦｖとの間の相互作用の解離動態力学を示す。４−４−２０  ｓｃＦｖを提示する酵母（丸）、ライブラリーから単離された変異体４Ｍ１．１（四角）、および変異体４Ｍ１．２（三角）は、ｍＡｂ  ９Ｅ１０およびＦＩＴＣ−デキストランで標識された。５−アミノフルオレセインが、競合剤として添加された。細胞の９Ｅ１０陽性集団のＦＩＴＣ蛍光の平均強度は、時間の関数に従った。この直線の傾きは、動態力学的解離速度に等しく、そして時間ｔ＝０での外挿値は、相互作用の結合価に等しい。ＭＦＩi＝時間ｔ＝ｉでの酵母の相対的平均蛍光強度。
【図１２】図１２は、酵母表面に提示されたｓｃＦｖ−ＫＪ１６（影をつけた）およびコントロールＡｇａ２ｐ／ＨＡ（影をつけていない）の、発現レベルおよび抗原結合特性を示す。酵母ＥＢＹ１００株は、酵母提示ベクターｐＣＴ２０２にクローン化されたｓｃＦｖ−ＫＪ１６またはｐＣＴ２０２ベクター単独で形質転換された。２０℃で一晩のガラクトース培地での誘導の後、細胞を蛍光抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。（図１２Ａ）マウス抗ＨＡ  Ｍａｂ（１２ＣＡ５）に続いてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで染色された、ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母またはＡｇａ２ｐ／ＨＡ／酵母、（図１２Ｂ）マウス抗ｃ−ｍｙｃ  Ｍａｂ（９Ｅ１０）に続いてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで染色された、ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母またはＡｇａ２ｐ／ＨＡ／酵母、（図１２Ｃ）約１０ｎＭのビオチン化ｓｃＴＣＲに続いてストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体で染色された、ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母またはＡｇａ２ｐ／ＨＡ／酵母、および（図１２Ｄ）ビオチン化ｓｃＴＣＲに続いて、１００ｍｇ／ｍｌのインタクトなＩｇＧ  ＫＪ１６の存在下（影をつけた）または非存在下（影をつけていない）でストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体で染色されたｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母。
【図１３】図１３は、フローサイトメトリーにより決定された、ｓｃＦｖ−ＫＪ１６を提示した細胞壁の平衡抗原結合等温式を示す。表面ｓｃＦｖ−ＫＪ１６を提示する酵母ＥＢＹ１００株を、ビオチン化ｓｃＴＣＲの濃度を変化させてインキュベートし、ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体で標識し、そしてフローサイトメトリーにより検出した。データを、スキャッチャード図として、または力価として（挿入図）プロットし、そして約５００ｎＭの有効ＫDを決定した。ＭＦＵは、平均蛍光単位をいう。
【図１４Ａ】図１４は、二次元蛍光ヒストグラムおよびｓｃＦｖ−ＫＪ１６変異体を選択するために使用される選別ウィンドウを示す。提示ベクターｐＣＴ２０２にクローン化されたｓｃＦｖ−ＫＪ１６は、Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異誘発遺伝子株ＸＬ１−Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換され、そして６晩の増殖周期の間増殖された。変異体ライブラリーのプラスミドは、精製され、そしてＥＢＹ１００酵母のＬｉＡｃ形質転換（Ｇｉｅｔｚら、１９９５）に使用された。３０℃での導入後、酵母は、蛍光活性化セルソーターを使用して選別された。（図１４Ａ）第１回のセル選別からの代表的ヒストグラム（選別ウィンドウが示される）、および（図１４Ｂ）第４（最終）回の選別からの代表的ヒストグラム（選別ウィンドウに集団の濃縮を示す）。
【図１４Ｂ】図１４は、二次元蛍光ヒストグラムおよびｓｃＦｖ−ＫＪ１６変異体を選択するために使用される選別ウィンドウを示す。提示ベクターｐＣＴ２０２にクローン化されたｓｃＦｖ−ＫＪ１６は、Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異誘発遺伝子株ＸＬ１−Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換され、そして６晩の増殖周期の間増殖された。変異体ライブラリーのプラスミドは、精製され、そしてＥＢＹ１００酵母のＬｉＡｃ形質転換（Ｇｉｅｔｚら、１９９５）に使用された。３０℃での導入後、酵母は、蛍光活性化セルソーターを使用して選別された。（図１４Ａ）第１回のセル選別からの代表的ヒストグラム（選別ウィンドウが示される）、および（図１４Ｂ）第４（最終）回の選別からの代表的ヒストグラム（選別ウィンドウに集団の濃縮を示す）。
【図１５】図１５は、図１４Ｂに示される最終選別由来の１０個のランダムに選択されたクローンについて、抗ＨＡ  Ｍａｂ、抗ｃ−ｍｙｃ  Ｍａｂ、またはビオチン化ｓｃＴＣＲに対する結合の平均レベルを示す。１０個の変異体および野生型ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母は、ガラクトース培地中で３０℃で一晩誘導された。細胞は、マウス抗ＨＡ  Ｍａｂに続くＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧでの染色後（白色棒）、マウス抗ｃ−ｍｙｃに続くＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧでの染色後（灰色棒）、またはビオチン化ｓｃＴＣＲ（約４０ｎＭ）に続くストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体での染色後（黒色棒）、フローサイトメトリーにより分析された。
【図１６】図１６は、図４に示される３つの選択された変異体の、抗ｃ−ｍｙｃ結合またはｓｃＴＣＲ結合に関する蛍光標識分布を示す。３つのクラスのｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母変異体は、抗ｃ−ｍｙｃおよびビオチン化ｓｃＴＣＲに続き、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧおよびストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体で二重染色され、次いで、図４に記載されるようにフローサイトメトリーにより分析された。各ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母変異体（影をつけた）および野生型ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母（影をつけない）についての蛍光分布が示される。図１６Ａおよび１６Ｂ（ｍｕｔ４）；図１６Ｃおよび１６Ｄ（ｍｕｔ７）；図１６Ｅおよび１６Ｆ（ｍｕｔ１０）。
【図１７】図１７は、図１６に示される３つの変異体についての平衡抗原結合等温式を示す。Ａｇａ２ｐ／ＨＡ／酵母、野生型ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母、および図１６で特徴付けられる３つの変異体ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母が、種々の希釈度のビオチン化ｓｃＴＣＲに続きストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体で染色された。フローサイトメトリーによる分析の後、結合等温式が、ＭＦＵをｓｃＴＣＲ希釈度の関数として、グラフ化された。
【図１８】図１８は、野生型ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母、ｍｕｔ４およびｍｕｔ７の配列分析を示す。野生型ｓｃＦｖ−ＫＪ１６および２つの変異体由来のプラスミド（ｍｕｔ４およびｍｕｔ７）が、下記のように、プラスミドレスキューにより回収され、そして、配列決定のためのプラスミドを生成するために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換された。配列決定分析は、提示ベクターのｓｃＦｖに隣接するプライマーを使用して実行された。変異が、太字で示される。
【図１９】図１９は、Ｔ細胞レセプター単鎖（ＶαＶβ）遺伝子を含むプラスミドで形質転換された酵母に結合する抗体のフローサイトメトリープロフィールを示す。通常の、すなわち野生型（ｗｔ）の配列が、ｓｃＴＣＲプラスミドのランダム突然変異後に選択されたいくつかの変異体（ｍＴＣＲ７、ｍＴＣＲ１５、ｍＴＣＲ１６）と比較された。選択は、抗体１Ｂ２（Ｔ細胞レセプター上の高次構造エピトープを認識する）の結合に続き、数回の蛍光活性化セル選別を含んだ。第１のパネルにおいて、酵母細胞は、ＨＡタグに対する抗体（１２ＣＡ５）で染色された。第２のパネルにおいて、酵母細胞は、Ｔ細胞レセプターに対する抗体（１Ｂ２）で染色された。ＨＡエピトープは、各々の場合、表面上に発現されるが、変異型プラスミドを発現する細胞のみが、ネイティブのＴ細胞レセプター（１Ｂ２ポジティブ）を発現し得る。
【図２０】図２０は、図１９に示される選択由来の二重変異体で形質転換された酵母に結合する抗体のフローサイトメトリープロフィールを示す。細胞は、図１９に示されるように、フローサイトメトリーのために染色された。二重変異体は、Ｔ細胞レセプターのレベル（すなわち、１Ｂ２反応物質）において増加を示した。この結果は、単一の変異と組合せることにより、Ｔ細胞レセプターの細胞表面発現のレベルを増強することが可能であることを示す。
【図２１】図２１は、細胞表面Ｔ細胞レセプターの増強された発現を導く変異の配列を示す。これらは、Ｖβの残基１７、Ｖαの残基４３、およびＶαの残基１０４を含んだ。
【図２２】図２２は、ｓｃＴＣＲの相対的分泌レベルを示す。低コピー酵母発現系を使用して産生されたｓｃＴＣＲの可溶性発現レベル（自由裁量単位）。独立したクローン由来の３通りの培養物を、１Ｂ２  ＥＬＩＳＡ活性について分析した。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ｓｃＴＣＲを提示する酵母のフローヒストグラムを示す。野生型、ならびに代表的単一変異体、二重変異体、および三重変異体についてのセル選別された集団を表す。平均蛍光単位（ＦＩＴＣ蛍光：抗ＨＡ、ＰＥ蛍光：１Ｂ２）が、各ヒストグラム上に示される。抗ＨＡは、表面融合物の数を示し、そして１Ｂ２は、適切に折り畳まれたｓｃＴＣＲを提示する細胞の数を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、表面発現と可溶性分泌との間の相関関係を示す。フローにより決定された１Ｂ２活性表面ｓｃＴＣＲが、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定された可溶性分泌物質の１Ｂ２活性と比較される。最低限の、二連のフロー実験が行われ、特定のクローンの平均蛍光単位が決定された。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ｓｃＴＣＲの温度安定性を示す。ｓｃＴＣＲを含む酵母上清サンプルが、示される温度に１時間供された。３連のサンプルが、ＥＬＩＳＡによる１Ｂ２活性画分について分析された。画分は、全く活性の損失を有さない最も高い強度のＥＬＩＳＡシグナルにより、個々に正規化されて統一された。図２４Ａおよび図２４Ｂの両方において、比較は、野生型ｓｃＴＣＲよりもＴＲＸ−ＴＣＲに対してなされた。なぜなら、野生型ｓｃＴＣＲは、酵母上清中で検出されなかったからである。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ｓｃＴＣＲの温度変性の動態力学を示す。上清サンプルの１Ｂ２  ＥＬＩＳＡ活性が、各サンプルが４６℃でインキュベートされた時間の関数としてモニターされた。４６℃での観察された動態力学的熱変性速度（ｋobs）が示される。図２４Ａおよび図２４Ｂの両方において、比較は、野生型ｓｃＴＣＲよりもＴＲＸ−ＴＣＲに対してなされた。なぜなら、野生型ｓｃＴＣＲは、酵母上清中で検出されなかったからである。
【図２５】図２５は、熱安定性発現と可溶性発現との間の相関関係を示す。４８℃で１時間のインキュベートの後に残存するｓｃＴＣＲ  １Ｂ２  ＥＬＩＳＡ活性が、相対的分泌レベル（１Ｂ２  ＥＬＩＳＡ）と比較される。３連のサンプルが、分泌レベルおよび熱安定性分析について分析された。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される場合、用語「アフィニティー成熟」とは、より高い親和性の抗体が選択される、連続する変異および選択のプロセスをいう。本明細書中で使用される場合、用語「アグルチニン」とは、接合の間に、２つの酵母細胞を一緒に結合する酵母表面接着タンパク質をいう。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、特定の分子に強固かつ特異的に結合する哺乳動物免疫系により産生されるタンパク質をいう。本明細書中で使用される場合、用語「リガンド」とは、特定のタンパク質により特異的に結合される分子をいう。本明細書中で使用される場合、用語「抗原」とは、抗体により特異的に結合されるリガンドをいう。本明細書中で使用される場合、用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、結合された抗原に直接接触する抗体の一部をいう。本明細書中で使用される場合、用語「蛍光活性化セルソーティング」または「フローサイトメトリー」とは、差示的な蛍光標識に基づいて細胞集団を選別する方法をいう。本明細書中で使用される場合、用語「ハプテン」とは、キャリアに結合化されることなく免疫応答を刺激し得ない小さい抗原をいう。本明細書中で使用される場合、用語「単鎖抗体」または「ＳＣＡ」とは、単一の活性結合部位を保持する抗体の、重鎖と軽鎖の一部の融合物をいう。用語ｓｃＦｖは、互換可能に使用され単鎖抗体をいう。本明細書中で使用される場合、用語「エピトープタグ」とは、別のタンパク質に融合される場合に、抗体に特異的に結合されるアミノ酸の一連の配列をいう。本明細書中で使用される場合、用語「ＨＡ」とは、エピトープタグ配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１）をいう。本明細書中で使用される場合、用語「ｃ−ｍｙｃ」とは、エピトープタグ配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２）をいう。本明細書中で使用される場合、用語「ｓｃＦｖ４−４−２０」とは、フルオレセインおよび他の分子（例えば、ビオチンまたはデキストラン）に結合体化されたフルオレセインに特異的に結合するｓｃＦｖをいう。本明細書中で使用される場合、用語「ＡＧＡ２ｐ」とは、酵母ＡＧＡ２接合型のａアグルチニン遺伝子のタンパク質産物をいう。用語「表示可能性」とは、タンパク質が、誤って折り畳まれたタンパク質を保持し分解する分泌の「品質維持」装置から免れることを可能にする生物物理学的特徴の組合せを記載するために使用される（ＨａｍｍｏｎｄおよびＨｅｌｅｎｉｕｓ、１９９５）。酵母細胞表面上で提示されるタンパク質は、最初に、この品質維持ステップを首尾良く通過しなければならない。タンパク質折り畳みの動態力学および熱力学的安定性はともに、品質維持装置から免れる効率を決定すると考えられる。
【００５４】
本発明に従って、従来の分子生物学、微生物学、および当業者の範囲内の組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は、文献中に完全に説明される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＦｒｉｔｓｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、（１９８５））；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、（１９８４））；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、（１９８６））；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照のこと。
【００５５】
「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントが、付加されたセグメントの複製が起こるように付加され得るレプリコン（例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド）である。
【００５６】
ＤＮＡ「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に配置される場合に、インビボでポリペプチドに転写および翻訳される二重鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含み得る。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置する。
【００５７】
転写制御配列および翻訳調節配列は、宿主細胞においてコード配列の発現を提供するＤＮＡ調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなど）である。
【００５８】
「プロモーター配列」とは、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そして下流（３’方向）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を規定する目的のために、プロモーター配列は、その３’末端に転写開始部位を結合され、そして上流（５’方向）を伸長して、上記の背景で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小の数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列中に、転写開始部位（ヌクレアーゼＳＩを用いるマッピングにより都合良く規定された）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合の原因であるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核生物のプロモーターは、しばしば（但し、常にではない）、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物のプロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えて、シャイン−ダルガーノ配列を含む。
【００５９】
「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を、制御および調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがこのコード配列をｍＲＮＡ（次いで、このコード配列にコードされるタンパク質に翻訳される）に転写する場合には、細胞において、転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」である。
【００６０】
「選択遺伝子」とは、特定の条件の実行の際に、必要とされる表現型を提示する細胞の区別を可能にする遺伝子をいう。例えば、抗生物質耐性遺伝子を含む細菌細胞を選択ための抗生物質を含む培地における細菌の増殖。
【００６１】
用語「プライマー」とは、本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチド（精製された制限消化などで天然に生じるか、または合成により生成されるか）をいい、このオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長産物（これは核酸の鎖に相補的である）の合成が誘導される条件下に配置された場合（すなわち、ヌクレオチドおよび誘導物質（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下で、かつ適切な温度およびｐＨで、合成の開始点として作用し得る。プライマーは、一本鎖かまたは二本鎖のいずれかであり得、そして誘導物質の存在下で所望の伸長産物の合成をプライムするのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの因子（温度、プライマーの供給源、および使用される方法を含む）に依存する。例えば、診断的適用のためには、標的配列の複雑性に依存し、そのオリゴヌクレオチドプライマーは、代表的には、１５〜２５以上のヌクレオチドを含むが、それは、より少ないヌクレオチドを含み得る。
【００６２】
本明細書中のプライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の別々の鎖に「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、これらのプライマーが、その各自の鎖とハイブリダイズするように実質的に相補的でなければならないことを意味する。従って、このプライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントが、プライマーの５’末端に付加され得、残りのプライマー配列は、鎖に相補的であり得る。あるいは、プライマー配列が配列との十分な相補性を有するか、または標的配列とハイブリダイズし、それにより、伸長産物の合成のための鋳型を形成すると仮定すると、非相補的塩基またはより長い配列が、プライマー中に点在し得る。
【００６３】
細胞は、このようなＤＮＡがその細胞内部に導入された場合、外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡにより、「形質転換され」てきた。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムに、組み込まれて（共有結合されて）もよいし、組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞において、形質転換するＤＮＡは、エピソームエレメント（例えば、プラスミド）上に維持され得る。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれ、その結果、形質転換ＤＮＡが、染色体の複製を通じて娘細胞に遺伝される細胞である。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを樹立する、真核生物細胞の能力により実証される。「クローン」は、有糸分裂により単一細胞または共通の祖先から誘導された細胞の集団である。「細胞株」は、インビトロで何世代でも安定に増殖し得る初代細胞のクローンである。
【００６４】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然では、より大きい分子と関連して見出されない、より大きいＤＮＡ分子中の同定可能なＤＮＡセグメントである。従って、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、この遺伝子は、通常、供給源の生物のゲノムにおける哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡにより隣接される。別の例では、コード配列は、コード配列自体が天然には見出されない構築物である（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、または天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子改変体または天然に存在する変異事象は、本明細書において規定されるようなＤＮＡの異種領域を生じない。
【００６５】
タンパク質に融合され得、そして抗体により特異的に結合され得る多数のポリペプチド配列は、公知であり、そしてエピトープタグとして利用され得る。これらとしては、例えば、ＨＡ（配列番号１）、ｃ−ｍｙｃ（配列番号２）、ＤＴＹＲＹＩ（配列番号３）、ＴＤＦＹＬＫ（配列番号４）、ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ（配列番号５）、ＫＰＰＴＰＰＰＥＰＥＴ（配列番号６）、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号７）、ＲＹＩＲＳ（配列番号８）およびＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号９）が挙げられる。
【００６６】
抗体は、ヒトの免疫系により産生されるタンパク質分子であり、外来物質の認識をし、外来物質へ結合し、そして身体からの外来物質の排除の媒介をする。高度に特異的な、癌の診断および治療のための抗体を利用するために技術が開発された。例えば、腫瘍細胞に結合する抗体に対して放射性同位体または毒素を係留することにより、周辺組織を比較的無傷のままにしながら、罹病組織に対して、そのような細胞傷害性薬剤の集中させた投薬を送達することは可能である。抗体はまた、生物工学において重要なツールであり、そして分析目的のため（例えば、微量の物質および分離物を定量するため）、ならびに複合混合物から所望の生物学的産物を精製するために広範に用いられる。
【００６７】
これらの適用において、抗体のその標的との結合の強度（親和性）、および抗体がその特定の標的のみに結合する選択性（特異性）の両方が重大である。この理由のため、タンパク質技術者は、特定の抗体の結合特性の変化および改善を求める。抗体の構造的設計への合理的なアプローチは、限定的な成功しか満たさなかった。そしてランダムなスクリーニングのために利用可能な方法は、重大な限界を有する。
【００６８】
抗体親和性を微調整する問題に対する哺乳動物の免疫系のアプローチは、「親和性成熟」と呼ばれるプロセスによる。ここで、変異および進化的な選択のサイクルは、それらの標的にさらに強固に結合する抗体を産生する。本発明は、哺乳動物の免疫系のＢ細胞のレパートリーの微生物性のアナログを構築することにより、抗体親和性および抗体特異性を操作するための強力な新しいシステムを開示する。抗体は、細胞壁タンパク質との遺伝的融合により酵母細胞の表面に提示された。変異後、改変体は、蛍光的に標識された標的との結合特性の改善に基づいて選択された。
【００６９】
酵母の抗体の提示方法は、物理的特性および化学的特性がすでに十分特徴付けられているモデル抗体を研究することにより試験された。次いで、これらの方法は、実際の目的の抗体にそのまま適用される。酵母の遺伝的順応、この微生物の増殖の容易さ、および試験管内の抗体結合条件を変更する能力は、組み合わせられて、抗体親和性および抗体特異性の操作に対する今までにない制御を生じる。
【００７０】
本発明のライブラリー方法の利点は、これが抗体のようなタンパク質に特に適していることである。最も広範に用いられる方法は、現在、バクテリオファージの表面上で提示される抗体の「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」からなる。酵母の提示は、ファージの提示を超えるいくつかの利点を有する。第１に、抗体−抗原結合は、密接に結合した改変体を回収するために壊される必要はない。先行技術の方法における、この結合を切断するために必要な過酷な条件は、ファージの感染性を低下させ得る。第２に、クローンの欠失の低下によるライブラリーの多様性の増加は、利点である。多くの抗体構造が、細菌の分泌装置によって、正確にプロセシングされ得ないことは、周知である。酵母細胞は、真核生物であり、そして哺乳動物細胞と非常に類似の分泌経路を有する。第３に、本発明は、抗体−抗原親和性のより正確かつ緻密な決定を提供する。１細胞あたり１０4個の分子の存在は、１ファージあたりわずか数分子については生じる確率的な変動を排除する。最後に、フローサイトメトリーによる蛍光の定量は、ファージのパニングでの２つの結合／遊離二分法との比較によって、論理に基づいた親和性の知識がなくても、表面結合抗原の持続的な測定を提供する。また、細菌は、提示された分子に抗体またはタンパク質が接近することを妨げる高分子透過性障壁として作用するリポ多糖層を有する。
【００７１】
本発明は、酵母上でのペプチドおよびタンパク質ライブラリーのインビトロにおける発現および選択のための表面提示系を開示する。９残基のペプチドエピトープ（ＨＡ）は、酵母細胞壁タンパク質（ＡＧＡ２）の結合サブユニットに、次いで４−４−２０抗フルオレセイン単鎖Ｆｖに融合された。選択は、提示された融合物を有する細胞および有さない細胞の混合物についてフローサイトメトリーにより実行された。６００倍の富化が、分別（ｓｏｒｔ）の１回通過で達成された。本発明のこの系は、抗体のインビトロ親和性成熟のためのプロセスならびに他のタンパク質およびペプチドの方向付けられた進化のためのプロセスを例証し、これは、以下の利点を有する：（ｉ）パニングより微細な親和性識別を可能にする２重標識フローサイトメトリー選択計画；（ｉｉ）選択における確率的な変動を排除する、１細胞あたり１０4コピーもの多くの提示配列、および（ｉｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されるライブラリーから欠失されたクローンを産生し得る発現の偏り（ｂｉａｓ）を改変した、または潜在的に改善した酵母におけるライブラリー発現。
【００７２】
本発明の１つの目的は、親和性および特異性の改善のための抗体の操作である。この目的に向かって、抗体−ハプテン結合は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの外部細胞壁上で発現される抗体の変異誘発およびスクリーニングを介して研究された。実験的に容易な、そして遺伝的に柔軟な真核生物であるので、酵母は、抗体発現および操作のためのプラットフォームとして、線維状ファージ提示を超える有意な利点を示す。本質的に、哺乳動物の免疫系Ｂ細胞レパートリーの微生物性のアナログは、インビトロで構築され、変異誘発および選択の厳密に制御された条件下で実行されるべき抗体の親和性成熟を可能にした。結果として、親和性および特異性が有意に改善された抗体を達成できた。
【００７３】
本発明の１つの局面は、以下の工程を含む、所望の結合特性を有するタンパク質を選択するための方法を提供する：そのＮ末端で酵母細胞壁結合タンパク質と融合された試験されるべきタンパク質を発現するベクターで酵母細胞を形質転換する工程；第１標識で酵母細胞を標識する工程であって、ここでこの第１標識は、試験されるべきタンパク質を発現する酵母と会合し、そして試験されるべきタンパク質を発現しない酵母と会合しない、工程；第１標識が会合している酵母細胞を選択する工程；第１標識を定量する工程であって、ここで第１標識の高頻度の出現は、試験されるべきタンパク質が所望の結合特性を有することを示し、そして第１標識の低度の出現は、試験されるべきタンパク質が所望の結合特性を有さないことを示す、工程。
【００７４】
本発明の好ましい実施態様は、さらに以下の工程を包含する：第２標識で酵母細胞を標識する工程であって、ここで第２標識は、試験されるべきであって、かつベクターによってコードされるタンパク質と融合されたエピトープタグを発現する酵母と会合し、そしてベクターによってコードされるエピトープタグを発現しない酵母と会合しない、工程；第２標識を定量する工程であって、第２標識の出現は、酵母細胞表面上の試験されるべきエピトープタグ化タンパク質の多数の発現コピーを示す、工程；ならびに第１標識の定量を第２標識の定量に対して比較して、第２標識の出現に対して正規化された第１標識の出現を決定する工程であって、ここで第２標識の出現に比較して高い第１標識の出現は、試験されるべきタンパク質が所望の結合特性を有することを示す、工程。
【００７５】
本発明の別の好ましい実施態様は、以下の工程を包含する：試験されるべきタンパク質に対する結合について第１標識と競合する第３標識で酵母細胞を標識する工程；第１標識で酵母細胞を標識する工程；第１標識を定量する工程；第２標識で酵母細胞を標識する工程；第２標識を定量する工程；および第１標識の定量を第２標識の定量に対して比較して、第２標識の出現に対して正規化された第１標識の出現を決定する工程であって、ここで第２標識の出現に比較して低い第１標識の出現は、試験されるべきタンパク質が所望の結合特性を有することを示す、工程。
【００７６】
本発明の別の局面は、本発明の方法を実施するためのベクターを提供し、これには目的のタンパク質のＮ末端に融合された細胞壁結合タンパク質を含む。本発明のこの局面の好ましい実施態様は、酵母細胞において、ポリペプチドエピトープタグを発現するための手段を含む。より好ましい実施態様は、細胞壁結合タンパク質が、酵母アグルチニンタンパク質結合サブユニットであり、なおより好ましくは、酵母アグルチニンタンパク質が、Ａｇａ２ｐであることを提供する。
【００７７】
本発明の別の局面は、野生型タンパク質の特性と比較して増強された表現型特性を有するタンパク質を選択する方法を提供し、この方法には以下の工程を包含する：酵母細胞壁タンパク質と融合した試験されるべきタンパク質を発現するベクターで酵母細胞を形質転換する工程であって、ここで変異誘発が試験されるべきタンパク質の改変体の種々の集団を作成するために用いられる、工程；第１標識で酵母細胞を標識する工程であって、ここで第１標識は、試験されるべきタンパク質を発現する酵母と会合し、そして試験されるべきタンパク質を発現しない酵母と会合しない、工程；第１標識が会合している酵母細胞を単離する工程；ならびに酵母によって発現される変異体タンパク質の特性を分析し、そして野生型タンパク質の特性と比較する工程であって、ここで野生型のタンパク質を超える増強された特性を有する変異体タンパク質を提示する酵母細胞が選択される、工程。上記のように、第２標識および／または第３標識がこの実施態様において用いられ得、そして増強された表現型特性を有する目的の変異タンパク質の選択は、濃縮工程および標識化工程の反復サイクルを包含し得る。
【００７８】
好ましい実施態様では、酵母細胞壁タンパク質は、アグルチニンである；試験されるべきタンパク質は、そのＮ末端によってアグルチニンの結合サブユニットのＣ末端に融合される；酵母株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、ＹａｒｒｏｗｉａおよびＣａｎｄｉｄａからなる群から選択される属の酵母株である；この試験されるべきタンパク質は、抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ抗体フラグメントであり、より好ましくはこの試験されるべきタンパク質は、細胞表面レセプターのリガンド結合ドメインであり、なおより好ましくは、この細胞表面レセプターは、Ｔ細胞レセプターである。
【００７９】
本発明の目的は、表面発現、安定性、結合定数、解離定数、分泌レベルおよび溶解度からなる群から選択される増強された表現型特性を示す変異体タンパク質を選択するための方法を提供することであり、ここで、試験されるべきタンパク質の変異体は、単一変異または多重変異を含み得る。
【００８０】
本発明のさらに別の局面では、第２標識は、細胞表面の発現レベルを定量的に決定するために用いられ得る。これは、細胞内発現、安定性、結合定数、解離定数、分泌レベルおよび溶解度のような他の所望の表現型特性を選択するためのアッセイとして用いられ得る。
【００８１】
本発明の方法により選択される変異体タンパク質は、真核生物における発現に適応したベクターに、選択された変異体タンパク質をコードする遺伝子をクローニングすること；および真核生物において変異体タンパク質を発現することによりさらに特徴付けられ得る。ここで変異体タンパク質の増強された特性は、変異体タンパク質の増強された特性の表現型の特性を野生型タンパク質の特性と比較することによって確認される。好ましくは、真核生物は、哺乳動物、昆虫、または酵母からなる群から選択される。選択される変異体の表現型は、「新しい」（すなわち、変異された）タンパク質の固有の特性であるので、このアプローチはまた、他の非真核生物発現系において変異体を発現するために適用可能である。
【００８２】
本発明の別の好ましい局面は、それらの正常な（「野生型」）配列として提示されないタンパク質を提示するための方法を提供する。示した実施例において、抗原に対するＴ細胞レセプターは、その「野生型」配列のようには発現されなかった。しかし、ランダムな変異誘発、および適切な立体配置上特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーによる選択の後、変異体レセプターは、酵母細胞表面上で発現された。この戦略は、新規のＴ細胞レセプターの発見を可能にし、そして実質的に任意のポリペプチドの提示の方法を提供する。従って、本発明はまた、以下の工程を含む、酵母細胞表面上での表示可能性についてタンパク質を選択するための方法を提供する：酵母細胞壁タンパク質と融合した試験されるべきタンパク質を発現するベクターで酵母細胞を形質転換する工程であって、ここで変異誘発が、試験されるべきタンパク質の変異体の種々の集団を生成するために用いられる、工程；第１標識で酵母細胞を標識する工程であって、ここでこの第１標識は、試験されるべきタンパク質を発現する酵母と会合し、そして試験されるべきタンパク質を発現しない酵母と会合しない、工程；第１標識が会合している酵母細胞を、第１標識を定量することによって単離する工程であって、ここで第１標識の高頻度の出現は、試験されるべきタンパク質が所望の提示特性を有することを示し、そして第１標識の低頻度の出現は、試験されるべきタンパク質が所望の提示特性を有さないことを示す、工程。好ましくは、試験されるタンパク質は、抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、もしくはｓｃＦｖ抗体フラグメント、または細胞表面レセプターのリガンド結合ドメインである。細胞表面レセプターの代表的な例は、Ｔ細胞レセプターである。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、本発明の種々の実施態様を例証する目的のために与えられ、そして、いずれの様式でも本発明を限定する意味はない。
【００８４】
（実施例１）
（培地／緩衝液）
本明細書において、以下の培地／緩衝液を用いた。
【００８５】
（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＬＢ  培地（１×）：Ｂａｃｔｏ  トリプトン（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）：１０．０ｇ；Ｂａｃｔｏ  酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）：５．０ｇ；ＮａＣｌ：１０．０ｇ。１Ｌに作成し、オートクレーブする。プレートについては、１５ｇ／Ｌの寒天を添加し、そしてオートクレーブする。
【００８６】
アンピシリンの貯蔵物：水中のアンピシリンのナトリウム塩２５ｍｇ／ｍｌ。濾過滅菌し、そして−２０℃で４ｍｌのアリコートで保管する。作業時は［  ］＝３５〜５０ｍｇ／ｍｌ；１Ｌ中に４ｍｌのアリコート→１００ｍｇ／ｍｌ；１Ｌ中に２ｍｌのアリコート→５０ｍｇ／ｍｌ。オートクレーブしたＬＢが約５５℃まで冷却した後にＬＢに添加する。
【００８７】
ＳＯＣ培地（１００ｍＬ）：２％のＢａｃｔｏ  トリプトン：２．０ｇ；０．５％の酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）：０．５ｇ；１０ｍＭのＮａＣｌ：０．２ｍｌ  ５Ｍ；１０ｍＭのＭｇＣｌ2：１．０ｍｌ  １Ｍ；１０ｍＭのＭｇＳＯ4：１．０ｍｌ  １Ｍ；２０ｍＭのブドウ糖：０．３６ｇ。オートクレーブするまたは濾過滅菌する。
【００８８】
（酵母）
（合成最小＋カザミノ酸（ＳＤ−ＣＡＡ）５００ｍＬ）
ブドウ糖（グルコース）                                    １０．００ｇ
アミノ酸非含有  酵素窒素塩基（Ｄｉｆｃｏ）                  ３．３５ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ                                      ５．１ｇ
ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ                                        ４．２８ｇ
カザミノ酸（Ｔｒｐ−、Ｕｒａ−）（Ｄｉｆｃｏ）              ２．５ｇ
蒸留水を加えて最終容量にする。濾過滅菌し、そして冷蔵する。プレートについては、リン酸ナトリウムおよびソルビトールを溶解して、４００ｍｌの蒸留水中で最終濃度１Ｍにする。７．５ｇの寒天を添加し、そしてオートクレーブする。ブドウ糖、Ｎ2塩基およびアミノ酸を蒸留水１００ｍｌに溶解し、そして濾過滅菌する。オートクレーブした塩が触れるのに十分なまで冷めた後、濾過した試薬を添加する。
【００８９】
（ＳＧ−ＣＡＡ（誘導培地）５００ｍＬ）
ガラクトース                                              １０．００ｇ
アミノ酸非含有  酵母窒素塩基（Ｄｉｆｃｏ）                  ３．３５ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ                                      ５．１ｇ
ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ                                        ４．２８ｇ
カザミノ酸（Ｔｒｐ−、Ｕｒａ−）（Ｄｉｆｃｏ）              ２．５ｇ
蒸留水を添加し、最終容量にする。濾過滅菌し、そして冷蔵する。
【００９０】
（濃厚（ＹＰＤ）（１０００ｍＬ）；酵母抽出液：１０ｇ；ペプトン（Ｄｉｆｃｏ）：２０ｇ；デキストロース：２０ｇ。蒸留水を添加し、１Ｌにする。オートクレーブする。
【００９１】
ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−酢酸）：作業溶液：０．０４ＭのＴｒｉｓ−酢酸および０．００１ＭのＥＤＴＡ
保存溶液（５０×）                          １Ｌ中
Ｔｒｉｓ塩基                                ２４２ｇ
氷酢酸                                      ５７．１ｍｌ
０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）              １００ｍｌ
ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩）：作業溶液：０．０９ＭのＴｒｉｓ−ホウ酸塩および０．００１ＭのＥＤＴＡ
保存溶液（５×）                            １Ｌ中
Ｔｒｉｓ塩基                                ５４ｇ
ホウ酸                                      ２７．５ｇ
０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）            ２０．０ｍｌ
停止緩衝液１０×（制限）：５０％  ｖ／ｖグリセロール；０．１ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）；１％  ｗ／ｖのＳＤＳ；０．１％  ｗ／ｖ  ブロモフェノールブルー。色素を除くすべての成分を組み合わせ、そして色素の添加前にｐＨを７．５にする。
【００９２】
染色−臭化エチジウム：水中で０．５ｍｇ／ｍｌ；貯蔵溶液：１０ｍｇ／ｍｌ。貯蔵溶液の希釈：ＴＢＥ中で１／１０。１００ｍｌの緩衝液に１００ｍｌの希釈液を添加する。
【００９３】
ＴＢＳ  作業溶液：１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＥＤＴＡ。濾過滅菌する。
【００９４】
（実施例２）
（プロトコル：レプリカプレート法）
１．コロニーリフトのために適切な材料を選択する（その材料が洗浄、乾燥および滅菌されることを確認する）。
２．それぞれの新鮮なレプリカプレートの底を矢印でマークし、プレートを１列に並べる。また、出発プレートをマークする。
３．出発プレートのフタを取り、プレートを裏返し、そしてコロニーリフト材料上のマークと底の矢印を一列に並べる。プレートを材料の表面に下ろし、そして穏やかにプレート全体に押し付ける。プレートが材料に接触した後、それがまわりに動いていないことを確認する。プレートを取り除き、そしてフタを再度置く。材料に転写されたコロニーの部分が見られ得る。
４．この手順を１枚の新鮮なレプリカプレートを用いて繰り返す。矢印がマークと一列に並び、また正確なレプリカを作成することを確認する。転写された小さいコロニーを見るため光にかかげる。
５．作成されるべきそれぞれのレプリカプレートについて全手順を繰り返す。
６．選択増殖のために適切な条件でレプリカプレートをインキュベートする。コロニーは、通常、１日かそのぐらいで増殖する。
【００９５】
（実施例３）
（プロトコル：酵母の電気的形質転換）
細胞の調製：
１．５０ｍｌのＹＰＤをＯＤが０．１になるように終夜培養物で接種する。
２．激しく振盪しながら３０℃で細胞を増殖させ、１．３〜１．５のＯＤ600にする（約６時間）。
３．４℃で５分間、３５００ｒｐｍにて冷却したローターで回収する。上清を廃棄する。
４．細胞を、５０ｍｌの冷滅菌水に再懸濁することにより徹底的に洗浄する。上記のように遠心分離し、そして上清を廃棄する。
５．２５ｍｌの冷水を用いて４の工程を繰り返す。
６．２ｍｌの氷冷滅菌１Ｍ  ソルビトールに再懸濁する。上記のように遠心分離し、そして上清を廃棄する。
７．５０ｍｌの氷冷１Ｍ  ソルビトールに再懸濁する。細胞の最終容量は、約１５０ｍｌ（３回の形質転換に十分）である。
【００９６】
電気的形質転換：
１．氷上に０．２ｃｍのキュベットおよび白色スライドチャンバーを置く。
２．エッペンドルフチューブ中に、５０ｍｌの酵母懸濁液を添加し、そしてＴＥ中の＜５ｍｌ（０．１ｍｇ）のプラスミドＤＮＡに穏やかに混合する。すでにエッペンドルフチューブ中の酵母にＤＮＡを添加することを確認する。５分間氷上に置く（この時間枠は、かなり重要である）。
３．ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲを１．５ｋＶおよび２５ｍＦに設定する。パルスコントローラーを２００Ｗに設定する。このパルスについての時定数は、４．５〜５．０ｍｓｅｃであるべきである。
４．４０ｍｌの細胞／ＤＮＡ混合物を、事前冷却したエレクトロポレーションキュベットに移す。内容物を底まで取り、サンプルがキュベットの両方のアルミニウム側面と接触することを確認する。このキュベットを冷却された安全チャンバースライド内に置く。キュベットがチャンバーの基部にある電極と接触するまでチャンバー内にスライドを押し込む。
５．上記の設定で１パルスを適用する。
６．キュベットとスライドを離し、そして直ちに、１ｍｌの冷たい１Ｍのソルビトールをキュベットに添加する。混合し、そしてキュベットを氷に戻す。１Ｍのソルビトールを含有する選択プレート上に２００ｍｌを塗りひろげる。
【００９７】
（実施例４）
（プロトコル：Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換）
１．コンピテントサブクローニングが効率的なＨＢ１０１（−７０℃保管）のアリコートを氷上で融解し、すべての試薬を氷上に維持する。ｌａｃ  ｚ相補性についてはＤＨ５α細胞を；非メチル化についてはＤＭ−１を用いる。
２．それぞれのＤＮＡサンプルのために１、ｐＢＲ３２２（陽性コントロール）（ＤＨ５αおよびＤＭ−１についてはｐＵＣ１９）のために１、ＤＮＡなし（陰性コントロール）のために１の、必要な数のエッペンドルフチューブに５０ｍｌのＨＢ１０１を分配する。
３．未使用の細胞を５０ｍＬの部分に等分し、そしてドライアイス／エタノール浴中で再凍結する；−７０℃で貯蔵する。
【００９８】
４．１ｍｌのＤＮＡ（１ｍｇ）をエッペンドルフ（１ｍｌのｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣ１９）に加え、チューブを叩き混合する。次いで氷上で３０分間インキュベートする。連結のために、１〜２ｍｌの連結混合溶液（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）を使用する（過剰量は形質転換を困難にする）。
【００９９】
５．３７℃で２０秒間、熱ショックを与える（ＤＭ−１細胞については４２℃で４５秒間）。
【０１００】
６．氷上に２分間配置し、次いで０．９５ｍｌの室温のＳＯＣ培地を加える。浴槽（随意に振盪する）中で、あるいは３７℃の室温下で振盪機において、３７℃で１時間インキュベートする。。
【０１０１】
７．１００〜２００ｍＬの細胞をＬＢ（１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン）に播種し、そして３７℃で一晩インキュベートする。
【０１０２】
（実施例５）
（プロトコル：ＧＥＬａｓｅ（商標登録）ＤＮＡ精製）
Ｗｉｚａｒｄ（商標登録）ＰＣＲ  ｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、ゲルからのＤＮＡ精製のための代替のプロトコルである。Ｗｉｚａｒｄ（商標登録）ｐｒｅｐの収量が低い場合、ＧＥＬａｓｅ（商標登録）が推奨される。所望のフラグメントが２００ｋｂ長未満もしくは５ｋｂ長より長い場合、収量は低い。
【０１０３】
１．新鮮な１×ＴＡＥ緩衝液中で、１％低融点アガロースゲルにてＤＮＡフラグメントを分離する。
【０１０４】
２．エチジウムブロマイドを含む水中で、このゲルを染色する。携帯型のＵＶランプを使用して、新しい剃刀の刃で目的のフラグメントを切り出す。
【０１０５】
３．このゲル切片を、予め重量測定しておいたエッペンドルフチューブ中に配置する。ゲル切片の重量を決定するために、両方の重量を再度測定する。ゲル切片の重量が３００ｍｇを超える場合、工程６の後に、サンプルを２つのチューブに分割する。
【０１０６】
４．ゲル切片１００ｍｇあたり、２ｍｌの５０×ＧＥＬａｓｅ（商標登録）緩衝液を加える。
【０１０７】
５．このゲル切片を含むチューブを、ゲルが完全に融解されるまで、７０℃でインキュベートする。これには少なくとも２０分を要する。望ましい技術としては、３０分間保持し、ピペットで混合物を数回上げ下げし、次いでさらに１０分間保持することである。ゲルが完全に融解するのを確認すること。
【０１０８】
６．融解したゲルを、４５℃で少なくとも３０分間平衡化する。
【０１０９】
７．融解したゲル１５０ｍｇあたり、１ＵのＧＥＬａｓｅ（商標登録）を加える。４時間インキュベートする。６００ｍｇより多い場合は、２ＵのＧＥＬａｓｅ（商標登録）を加える。
【０１１０】
８．１容積（１容積＝ゲル切片のｍｇ）の５Ｍ酢酸アンモニウムをこの溶液に加える。３００ｍｇより重いゲルを使用する場合、エタノール沈殿のために、より大きなチューブを必要とする。
【０１１１】
９．２容積（１容積＝ゲル切片＋酢酸アンモニウムのｍｇ）に室温の１００％エタノールを加え、そして数回反転する。
【０１１２】
１０．１９ＲＡＬにて、室温下で少なくとも３０分間遠心分離することによってＤＮＡをペレット化する。ＤＮＡ濃度が非常に低い場合、エタノールを加えてから３０分間保持し、次いで３０分間遠心する。
【０１１３】
１１．ピペットで上清を除き、処分する。
【０１１４】
１２．ペレットを、室温の７０％アルコールで洗浄する。
【０１１５】
１３．ＤＮＡを、水もしくはＴＥに溶解する。次いで、ＤＮＡを−２０℃で保存し得る。
【０１１６】
（実施例６）
（プロトコル：連結）
材料：Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよび２×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液
ホスファターゼ処理：仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）および緩衝液（必要である場合）。平滑末端化処理：ｄＮＴＰ混合物（０．５ｍＭ）。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩもしくはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント。連結処理：オリゴヌクレオチドリンカー−０．２ｍＭ  ＤＴＴ。
【０１１７】
１．２０ｍｌの反応溶液中で、個々のＤＮＡ成分を適切な制限エンドヌクレアーゼで切断する。この反応が完了した後、６５℃まで１５分間加熱することによって酵素を不活性化する。さらなる酵素的な処置を必要としない場合、工程６へ進む。
【０１１８】
２．ＤＮＡのうち１つの５’リン酸が除去されるべき場合、２ｍｌの１０×ＣＩＰ緩衝液および１ＵのＣＩＰを加え、３０〜６０分間、３７℃でインキュベートする。この反応が完了した後、７５℃まで１５分間加熱することによってＣＩＰを不活性化する。さらなる酵素的な処理を必要としない場合、工程６へ進む。
【０１１９】
３．平滑末端化処理のために、１ｍｌの溶液（４つ全てのｄＮＴＰ（各０．５ｍＭ）および適切量のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩもしくはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを含む）を加え、充填反応もしくはトリミング反応を行う。完了した後、７５℃まで１５分間加熱することによって酵素を不活性化する。オリゴヌクレオチドリンカーを加えるべき場合、工程４へ進む。１つの平滑断端のみを含むＤＮＡフラグメントを所望する場合、反応産物を適切な制限エンドヌクレアーゼで切断する。さらなる酵素的な処理を必要としない場合、工程６へ進む。
【０１２０】
４．０．１〜１．０ｍｇの適切なオリゴヌクレオチドリンカー、１ｍｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍｌの０．２Ｍ  ＤＴＴ、および２０〜１００付着末端単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを加え、１５℃で一晩インキュベートする。７５℃まで１５分間加熱することによってリガーゼを不活性化する。
【０１２１】
５．工程４の産物を、オリゴヌクレオチドリンカーを認識する制限酵素で切断する（必要ならば、緩衝液条件を調整する）。２つの末端の１つのみがリンカーを含むべき場合、この産物をさらなる制限酵素で切断する。
【０１２２】
６．必要ならば、所望のＤＮＡセグメントをゲル電気泳動によって単離する。次いで、精製する（ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（商標登録）またはＧＥＬａｓｅ（商標登録））。
【０１２３】
７．連結：２０ｍｌの水に対して、９ｍｌのＤＮＡ成分（０．１〜５ｍｇ）、４ｍｌの５×リガーゼ緩衝液、１ｍＬ（付着末端）のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ：１単位＝３００付着末端単位、２０〜５００の付着末端単位が必要）。１〜２４時間、１６℃でインキュベートする。
【０１２４】
８．１ｍｌの連結された産物を形質転換受容性Ｅ．ｃｏｌｉ細胞へ導入し、そして形質変換体を選択する。次いで、ミニプレップおよび制限酵素マッピングを行い、所望の産物についてスクリーニングする。
【０１２５】
（実施例７）
（クローニング：）
全ての形質転換体は、下記の製造者プロトコルに従い、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α中に存在した。
【０１２６】
ＰＣＲ
・Ａｍｐｌｉｗａｘ  ＰＣＲ−ｇｅｍ媒介性ホットスタートＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）−シンウォールチューブのための製造者プロトコル
・ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ中心試薬（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）
・ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）
ＡＧＡ２
ＰＣＲによってクローン化する。
・ＰＣＲのためのテンプレートは、ＣＥＮ  ＢＡＮＫ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムライブラリー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）であった。
・プライマー：５’−ＡＴＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴＡＣＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡ−３’（配列番号１０）
および
５’−ＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＧａｇｃｇｔａｇｔｃｔｇｇａａｃｇｔｃｇｔａｔｇｇｇｔａＡＡＡＡＡＣＡＴＡＣＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＧＧＧ−３’（配列番号１１）。
・サーマルプロフィール：
変性  ９４℃で１分間
アニール化  ４１℃で２分間（初めの５サイクル）、４５℃で２分間（さらなる２５サイクル）
伸長  ７２℃で２５秒間
最後のポリッシング工程  ７２℃１０秒間
ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）クローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、製造者プロトコルに従い、プラスミドｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔにクローン化した。３４２ｂｐ  ＡＧＡ２フラグメントをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切除し、１％アガロースゲル上で精製し（プロトコル６．１．７．２）、そしてＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてＣＵＰ１プロモーターを含む、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔにサブクローン化した。
【０１２７】
ＨＡペプチド
ＨＡペプチドを、カセット式変異誘発によって挿入した。Ｘａ因子認識配列およびＨＡエピトープをコードする相補的なオリゴヌクレオチド鎖を、ＡＧＡ２クローンの３’ＸｈｏＩ部位への連結を可能にする付着突出で合成する一方で、同時にこの部位を破壊した；ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ内の下流のＳａｃＩ部位をアニール化し、そしてｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ内のＣＵＰ１−ＡＧＡ２構築物に連結した。この挿入は、ＨＡ配列の３’末端で新規のＸｈｏＩ部位を含む。ＣＵＰ１−ＡＧＡ２−ＨＡを、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして切り出し、１％アガロースゲル上で精製し、そしてすでにα因子終結配列を含む酵母のシャトルベクターｐＲＳ３１４（１）内にサブクローンし、表面提示ベクターｐＣＴ１０１を形成した。オリゴ配列：
５’−ＴＣＧＡＣＧＡＴＴＧＡＡＧＧＴＡＧＡＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴＣＴＧＣＡＧＴＡＡＴＡＧＡＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴ−３’（配列番号１２）および
５’−ＣＧＡＧＧＡＴＡＡＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＧ−３’（配列番号１３）。
【０１２８】
ＧＡＬプロモーターをベクターＹＣｐｌａｃ２２−ＧＡＬから切り出した。適切な付着突出を有する１２ｂｐのパリンドロームリンカーを、まずこのベクターにクローン化し、両方の末端で制限部位を変えた：ＥｃｏＲＩ→ＫｐｎＩ（Ｅ／ＫＬＩＮＫ）およびＢａｍＨＩ→ＥｃｏＲＩ（Ｂ／ＥＬＩＮＫ）。得られたＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＣＴ１０１にクローン化し、ベクターｐＣＴ２０１を形成した。オリゴヌクレオチド配列：Ｅ／ＬＬＩＮＫ  ５’−ＡＡＴＴＧＧＴＡＣＣ−３’（配列番号１４）；Ｂ／ＥＬＩＮＫ  ５’−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号１５）。
【０１２９】
４−４−２０ｓｃＦｖを、上記のようにＰＣＲによって増幅した：
・テンプレート：ＧｅｎｅＸベクター内の４−４−２０（Ｄ．Ｋｒａｎｚ（ＵＩＵＣ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）から得た）
・プライマー：５’−ｇｇｔｔｇｇｃｃａａｇｃｔａｇｃＧＡＣＧＴＣＧＴＴＡＴＧＡＣＴＣＡＡ−３’（配列番号１６）および
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃａａｃｔｃｇａｇｃｔａｔｔａｃａａｇｔｃｔｔｃｔｔｃａｇａａａｔａａｇｃｔｔｔｔｇｔｔｃＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡ−３’（配列番号１７）。
・サーマルプロフィール：
変性  ９４℃で１分間
アニール化  ４０℃で２分間（初めの５サイクル）、４８℃で２分間（さらなる３０サイクル）
伸張  ７２℃で５０秒間
最後のポリッシュ工程  ７２℃で１０分間。
【０１３０】
ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ内にクローン化し、上記の方法を使用して、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして、ｐＣＴ２０１内にサブクローン化し、ベクターｐＣＴ２０２を作製した。ベクターｐＣＴ３０２を、（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）3リンカーをコードする合成オリゴヌクレオチド（ＵＩＵＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）を挿入することによって、ＡＧＡ２とｐＣＴ２０２の４−４−２０オープンリーディングフレームとの間にフレーム内に作成した。
【０１３１】
ＡＧＡ１
上記のようにＰＣＲで増幅した：
・テンプレート：ＣＥＮ  ＢＡＮＫ
・プライマー：５’−ＡＴＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴ−３’（配列番号１８）および
５’−ＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧｃｔａＴＴＡＡＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＣＡＴＴＧＣ−３’（配列番号１９）
・サーマルプロフィール：
変性  ９４℃で１分間
アニール化  ４１℃で２分間（初めの５サイクル）、４５℃で２分間（さらなる２５サイクル）
伸張  ７２℃で２分２０秒間
最後のポリッシュ工程  ７２℃で１０分間
ＰＣＲ産物を、ＧＥＬａｓｅ（商標登録）キットを使用してゲル精製した。ｐＣＴ２０１のＫｐｎＩ／ＳｓｔＩフラグメントをベクターｐＲＳ３１６内にクローン化した。次いで、これをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、切り出されたＡＧＡ２フラグメントを、残存するベクターフラグメントをゲル精製することによって除去し、そして精製したＡＧＡ１  ＰＣＲ産物に連結し、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した。得られたクローンはｐＣＴ２１１であった。ｐＣＴ２１１のＫｐｎＩ／ＳｓｔＩフラグメントを、実質的に、ベクターＹＩｐｌａｃ２１１内でクローン化し、ベクターｐＩＵ２１１を形成した。
【０１３２】
（実施例８）
（酵母における発現）
酵母株、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ５４６５（ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１  ｌｅｕ２Ｄ１  ｈｉｓ３Ｄ２００  ｐｅｐ４：ＨＩＳ２  ｐｒｂ１Ｄ１．６Ｒ  ｃａｎ１  ＧＡＬ）。この株は、ｐｅｐ４およびｐｒｂ１変異体であり、プロテアーゼを欠く変異体を作製する。３つの栄養マーカーを除去し、そしてプラスミド選択のために使用し得た：ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＥＵ２。ＨＩＳ３を除去したが、ＰＥＰ４除去は、ＨＩＳマーカーで補われる。
【０１３３】
形質転換：
ベクターｐＩＵ２１１を、ＡＧＡ１配列において独自に存在するＢｓｉＷＩで切断した。約１００ｎｇのこの直鎖化されたベクターおよび２００ｎｇのｐＣＴ２０２を、エレクトロポレーション（プロトコル２．６．１）によって、酵母株ＢＪ５４６５に同時に形質転換した。形質転換体をＳＤ−ＣＡＡプレート上で選択した。
【０１３４】
実験的な誘導条件：
ｐＩＵ２１１およびｐＣＴ２０２で形質転換された酵母の単一コロニーを、３ｍｌのＳＤ−ＣＡＡに接種し、そして約２４時間、３０℃で増殖させた。この時点では、細胞密度は、１ｍあたり約１０7〜１０8細胞（すなわち、ＯＤ600は約１〜３）であった。遠心分離によって十分な量の細胞を回収し、開始ＯＤ600が〜０．５になるように、３ｍｌのＳＧ−ＣＡＡに接種した。この培養物を、約２０時間、３０℃で増殖させた。
【０１３５】
（実施例９）
（酵母細胞の蛍光標識化）
以下の方法を使用して、酵母細胞の蛍光標識化を行った：
１．ＳＧ−ＣＡＡ中で２０時間培養した後、０．２  ＯＤ−ｍｌ（６００ｎｍ）の細胞を、約１０〜３０秒間、１４，０００ｇで遠心分離することによって回収する。
【０１３６】
２．細胞ペレットを、ＴＢＳ中に再懸濁して、そして遠心沈殿することによって洗浄する。
【０１３７】
３．ペレットを、適切な容積のＴＢＳ中に再懸濁して、インキュベーションのために最終容積を１００ｍｌにする。以下の量の標識化試薬を、適切な量として加える：１ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ−デキストラン（ＭＷ  ２，０００，０００）（Ｓｉｇｍａ）；１ｍｌの９Ｅ１０  Ｍａｂ腹水（Ｂａｂｃｏ）または１００ｍｇ／ｍｌでの１０ｍｌの９Ｅ１０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ＴＢＳ中で１０ｍｇ／ｍｌの１００ｍｌの１２ＣＡ５  Ｍａｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。ボルテックスまたは上下のピペッティングによって混合する。
【０１３８】
４．室温で１時間インキュベートし、チューブを指で軽くはじくか、ボルテックスするか、またはピペッティングすることによって、約２０分毎に細胞を混合する。
【０１３９】
５．この細胞を遠心沈殿し、そして適切な量のＴＢＳ中に再懸濁し、最終容積を１００ｍｌにする。以下の量の第２の試薬を、適切な量として加える：４ｍｌのマウス−ＰＥ（Ｓｉｇｍａ）；２ｍｌのマウス−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）；１ｍｌのＦＩＴＣ−デキストラン。
【０１４０】
６．室温で３０分間インキュベートする。
【０１４１】
７．遠心沈殿し、そして工程２のように洗浄する。
【０１４２】
８．ペレットを、約１００ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基，ｐＨ８．３（ＦＩＴＣで標識化した任意のものについて）またはＴＢＳ（顕微鏡のため）に再懸濁する。フローサイトメトリーのために、５００ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓに懸濁する（最終細胞密度約１０6／ｍｌあるいはそれ以上）。サンプルは、フローサイトメトリーのために、０．５ｍｌ微量遠心チューブ中にある必要がある。ビオチン−フルオレセインを使用する実験のために、細胞を増殖し、誘導し、回収し、そして記載されるように、１次標識として、ＦＩＴＣ−デキストランの代用として１０ｍＭのビオチン−フルオレセインで標識し、そして二次標識試薬として、３ｍｇのストレプトアビジン−ＰＥおよび１ｍｇのＲＥＤ６１３結合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）2（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）の混合物で標識した。
【０１４３】
（実施例１０）
（共焦点蛍光顕微鏡）
ＨＡペプチド（ｐＣＴ２０１）もしくはｓｃＦＶ融合（ｐＣＴ２０２）のプラスミド指向表面発現を含む酵母を、唯一の炭素源として２％ガラクトースを含む培地中で２０時間増殖させ、そして実質的に、ｍＡｂ  ９Ｅ１０で標識し、次いで、記載されるように、二次抗マウスＩｇＧ−Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）結合体およびＦＩＴＣ−デキストランによって標識した。標識された細胞を、抗退色試薬として１ｍｇ／ｍｌのｐ−フェニレンジアミンを含む９０％グリセロールマウント媒体中で、ポリリジン被覆スライド上にマウントし、そしてレーザー共焦点蛍光顕微鏡（ＵＩＵＣ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｕｉｔｅ）を用いて、６３×の対物レンズの倍率で８秒間の速度で分析した。ＤＩＣ、赤色ＰＥ蛍光、および緑色ＦＩＴＣ蛍光からのイメージを収集した。
【０１４４】
（実施例１１）
（フローサイトメトリー分析および分類）
標識された酵母細胞懸濁液を、ＵＩＵＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒのフローサイトメトリーセンターで、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーターで分析した。事象速度を、ほぼ５００細胞／秒で維持した。集団を光散乱によってゲートし、凝集細胞の検査を避け、そして１００，０００事象に関するデータを収集した。初期細胞分類実験については、ｐＣＴ２０２ベクターを保有する酵母を、非形質転換の親株ＢＪ５４６５と混合し、そしてＦＩＴＣシグナルに基づいて、ＣＩＣＥＲＯ分類エレクトロニクスで改変されたＣｏｕｌｔｅｒ  ７５３細胞分類ベンチ（ＵＩＵＣフローサイトメトリーセンター）にて分類した。分類前のサンプルおよび分類後のサンプルを非選択培地上に播種し、次いで、レプリカをｐＣＴ２０２ベクターに選択的な培地上に播種した。選択的なプレート上で生存可能な非選択的なコロニー画分として、純度を決定した。
【０１４５】
（実施例１２）
（表面抗体発現レベルの定量化）
ベクターｐＣＴ２０２を保有する細胞およびＱｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ細胞ビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、記載されるように、ＦＩＴＣ結合ｍＡｂ  １２ＣＡ５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）（ＴＢＳ中に１０ｇ／ｍｌ）で標識し、そしてＣｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーターにて分析した。酵母サンプルの、標準ビーズとの蛍光強度の比較は、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ（Ｓｉｇｍａ）のＱｕｉｃｋＣａｌを使用する直線回帰によって、提示している酵母細胞の抗体結合能力の決定を可能にした。
【０１４６】
（実施例１３）
（ｓｃＦｖを提示する細胞からの抗原解離の動力学的分析）
プラスミドｐＣＴ２０２保有する酵母細胞を増殖し、そして記載されるように、抗ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂ  ９Ｅ１０およびＦＩＴＣ−デキストランまたはビオチン−フルオレセインで標識した。標識された集団の画分をフローサイトメトリー分析し、蛍光の初期レベルを測定した。非蛍光競合剤（５−アミノフルオレセイン）を約１０ｍＭ（約１０００倍過剰）の最終濃度で加え、ｃ−ｍｙｃ陽性細胞集団のＦＩＴＣもしくはＰＥ蛍光を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬにて室温（２１−２３℃）で、時間の関数として追跡した。データを、指数関数的な減衰として当てはめた。多価抗原が時間の関数として細胞に結合するという可能性は、Ｐ＝１−（１−ｅ-kt）N（Ｎは結合価であり、Ｋは解離に動力学的速度定数であり、そしてｔは時間である）によって与えられる。長時間のｔについては、これは、Ｐ＝Ｎｅ-ktまで減少する。従って、長時間のｔ〜０時間のデータの推定は、Ｐ＝Ｎ、またはＦext＝ＮＦ0の蛍光強度を産する。ここでＦextは、競合剤添加時で推定された蛍光であり、そしてＦ0は実際の初期蛍光である。従って、表面提示ｓｃＦｖ  ４−４−２０と多価のＦＩＴＣ−デキストランとの相互作用の結合価は、図１１における曲線のｙ切片として決定した。
【０１４７】
可溶性フルオレセイン（ＦＤＳ）への結合を、ｓｃＦｖを提示する細胞全体の近傍の蛍光消光作用を観察することによってアッセイした。細胞を、２３℃で温度自動調節された石英キュベットにおいて、ＴＢＳ＋０．１％ＢＳＡに２×１０7細胞／ｍｌで懸濁し、そして０〜７．５ｎＭの範囲にわたるＦＤＳで滴定する。５２０ｎｍでの蛍光を、４８８ｎｍの励起波長を使用して、ＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ  ＳＰＦ−５００分光蛍光光度計で観察した。不適切なｓｃＦｖを提示するコントロール細胞を滴定し、平衡結合型データモデルに対する２つのパラメータ適合について勾配を得、平衡定数および有効ｓｃＦＶ濃度を得た。平衡滴定に続いて、５−アミノフルオレセインを１ｍＭまで加え、そしてサンプルの蛍光の変化を、ＦＤＳに対するｋoffを決定するために経時的に追跡した。
【０１４８】
（実施例１４）
（ｓｃＦｖ遺伝子の変異原性）
約１００ｎｇのｐＣＴ３０２を、製造者プロトコルに従い、２連でＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換した。ＳＯＣ培地中での１時間の誘導の後、２つの形質転換体群をプールし、そしてそのプールの１／２０００を、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地上に播種し、形質転換効率を決定した。５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む５ｍｌの液体ＬＢ培地（ＬＢ−ＡＭＰ５０−ＣＡＲＢ１００）を、残余の形質転換体と共に接種し、そして一晩３７℃で増殖させた（ＯＤ600約１．０）。この培養物の十分な量を収集し、バッフル振盪フラスコ中で、この培養物を５０ｍｌのＬＢ−ＡＭＰ５０−ＣＡＲＢ１００にＯＤ600＝０．０１になるまで接種し、そしてＯＤ600約１．０〜１．１まで３７℃で増殖させた。細胞を遠心分離によって収集し、そして２００ｍｌのＬＢ−ＡＭＰ５０−ＣＡＲＢ１００にＯＤ600＝０．００１まで接種するために使用し、そしてこの培養物を、３７℃でＯＤ600約１．０まで増殖させた。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（商標登録）Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ（商標登録），Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）によって単離した。回収したＤＮＡをＸＬ１−Ｒｅｄに再び形質転換し、そして成長周期を３回繰り返し、得られる最終産物を突然変異誘発遺伝子株における増殖の約９０世代に供した。
【０１４９】
（実施例１５）
（ライブラリーの発現および動力学的スクリーニング）
５０ｍｇの突然変異を誘発されたｐＣＴ３０２  ＤＮＡを、１０の分離した反応におけるＧｉｅｔｚおよびＳｃｈｉｅｓｔｌの方法により、酵母株ＥＢＹ１００に形質転換した。その生成物をプールし、そして全体の１／２０００を選択培地上にプレートして、形質転換体の総数を決定した。その残余物を５０ｍｌの選択グルコース培地中で接種し、３０℃で一晩増殖し、ＯＤ600＝０．１まで継代し、そして１０倍に拡大させた。選択ガラクトース培地（５ｍｌ）をＯＤ600＝０．５に接種し、そしてＯＤ600＝１．０−２．０まで３０℃で一晩増殖させた。１０7細胞のサンプル（１  ＯＤ600ｍｌ）を、記載されるようにＦＩＴＣ−デキストランで標識した。標識に続いて、細胞を、１０ｍＭの５−アミノフルオレセインおよび９Ｅ１０ｍＡｂ中に室温で２０分間再懸濁し、同時にサンプルを氷冷緩衝液でリンスしてＦＩＴＣ−デキストランの競合的解離を停止し、そして記載されるように抗マウスＰＥ二次抗体で標識した。サンプルを、図４に示されるような選別ウインドウと４０００／秒の事象速度（ｅｖｅｎｔ  ｒａｔｅ）を有するクールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）７５３ベンチ（ｂｅｎｃｈ）上で選別した。選別第１回の間に６×１０7細胞を試験し、そしてウインドウを、集団の０．２％を回収するようにセットした。回収された細胞をグルコース培地中で再増殖し、そして競合および選別の繰り返しの前に、記載されるようにガラクトースに切り替えた。合計４回の選別および増幅を実施した。４×１０7細胞を第２回で試験し、そして２×１０7細胞を、各第３回および第４回において試験した。第１および第２回を、全ての陽性クローンの高回収率を提供するために濃縮様式において実施し、そして第３および第４回は、同時に発生した陰性細胞を拒絶し、かつより多量の濃縮要因を達成するために精製様式において実施した。第４回の生成物を、個々のコロニーを単離するためにプレートした。
【０１５０】
（実施例１６）
（融合ディスプレイ系の確立）
酵母細胞壁タンパク質を有するペプチドエピトープタグ融合物をコードする遺伝子を構築し、そしてそのエピトープの表面発現を改変した。この細胞壁タンパク質であるａ−アグルチニンは、酵母の接合の間の細胞と細胞の接着に関与する。従って対向する接合型の細胞上のアグルチニンに対するレセプターとして、外部細胞表面上に曝露される。試験的な混合および選別実験を実施して、フローサイトメトリーによる親和性スクリーニングについて、一回通過および二回通過の精製収量ならびに純度を決定した。
【０１５１】
（実施例１７）
（酵母接合のアグルチニン）
酵母の生活環において、一倍体細胞は、２つの可能な接合型（ａまたはα）ののうちの１つとして生じる。ａ一倍体細胞およびα一倍体細胞が物理的接触する場合、それらは、「アグルチニン」と呼ばれる細胞表面接着タンパク質の間の強力で特異的な相互作用を通して互いに接着する。いったんこの様式において結合すると、その細胞は融合して二倍体細胞を形成する。酵母細胞壁上における抗体提示についてのプラットホーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）として、ａ−アグルチニンのサブユニットに対するポリペプチドの融合物を構築した。アグルチニンの生理学的役割は、他のタンパク質との特異的で高親和性の相互作用のために、細胞の外側にタンパク質結合部位を提示することであるので、酵母細胞壁成分からの人工的な立体障害を最小限であった。
【０１５２】
真核生物として、酵母は、抗体分泌Ｂリンパ球の分泌装置と非常に相同性の高い分泌装置を保有する。結果として、人工的クローン依存性の非効率的な分泌は、この宿主によって最小化されるべきである。多数の研究は、特定分子がインビトロおよびインビボの両方において、機能の有意な損失を伴わずに変換され得るというように、酵母と哺乳動物の分泌経路の間に著しい相同性を明らかにした。マウスＢｉＰの発現は、その発現が増殖に対して必須である酵母のＢｉＰと機能的に置換される（Ｎｏｒｍｉｎｇｔｏｎ、１９８９）。哺乳動物のＰＤＩの発現は、別の必須な酵母のＥＲ管腔タンパク質である酵母のＰＤＩと機能的に置換される（Ｇｕｎｔｈｅｒら、１９９３）。酵母の分泌と哺乳動物の分泌との間に広範な類似性が与えられれば、誤った折りたたみに起因する抗体発現におけるクローンの変異性は、細菌性宿主と比較して、酵母において実質的に減じられるべきである。実際、酵母における活性な抗体の折りたたみ、アセンブリ、および分泌は、以前に実証されている（Ｗｏｏｄら、’８５；Ｈｏｒｗｉｔｚら、’８８）。
【０１５３】
酵母のａ−アグルチニンを以下の２つのサブユニットとして合成する；Ａｇａ１ｐ（これは、細胞壁への固定のためにホスファチジル−イノシトール−グリカンテイルを保有する）およびＡｇａ２ｐ（これは、高親和性（ＫD≒１ｎＭ）でα−アグルチニンに結合する）（ＬｉｐｋｅおよびＫｕｒｊａｎ、１９９２）。Ａｇａ１ｐおよびＡｇａ２ｐは、サブユニット間ジスルフィド結合によって連結され、そしてＡｇａ２ｐは、ＤＴＴのような還元剤とのインキュベーションの後に、増殖培地に放出される。ホスファチジル−イノシトール−グリカンテイルは、一般的に膜に局在化されるが、Ａｇａ１ｐは、グリコシル転移によって細胞壁中の線維状グルカンに連結されるという実質的な証拠が集積されている（ｄｅ  ＮｏｂｅｌおよびＬｉｐｋｅ、１９９４）。
【０１５４】
（実施例１８）
（融合構築物）
酵母細胞表面上でポリペプチドを提示するためにアグルチニン融合を使用することの可能性を確立するために、「エピトープタグ」ペプチドをＡｇａ２ｐに最初に遺伝的に融合した。このアプローチを抗体の融合に拡張することは簡単である。酵母の分泌経路を通したｓｃＦｖ分子の継代は、効率的である。なぜなら、活性化ＩｇＧおよびＦａｂの折りたたみ、アセンブリ、および分泌が酵母において実証されているからである（Ｈｏｒｗｉｔｚら、１９８８；Ｗｏｏｄら、１９８５）。
【０１５５】
ＡＧＡ２遺伝子を酵母のゲノムライブラリーからＰＣＲによってクローン化し、そして発現レベルの２５倍の改変を可能にする強力な銅誘導性ＣＵＰ１プロモーターを含む発現ベクター中にサブクローニングした。インフルエンザＨＡエピトープタグについてのコード配列（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）（配列番号１）を、ＡＧＡ２オープンリーディングフレームの３’末端に融合し、その前にはＸａ因子の部位特異的プロテアーゼ切断部位（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ’）（配列番号２６）が存在する。この構築物のＤＮＡ配列を、図７において示す。利便性のよい制限部位を、単鎖抗体の遺伝子のインフレーム融合物に対して含んでいる。
【０１５６】
Ａｇａ２ｐ−ＨＡ融合物は、単に、最終的なＡｇａ２ｐ−ＨＡ−抗体融合物に対する構築物の中間体であるが、これは融合ペプチドが、この系において細胞表面上に固定され、そして接近可能であることを確認するための手段を提供する。融合による外部細胞壁へのＨＡペプチドの固定化を、１２ＣＡ５  ｍＡｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いる全ての固定されていない細胞の免疫蛍光染色によって確証し、フローサイトメトリーおよび蛍光鏡検によって検出した（図９）。全体の１２ＣＡ５抗体分子は、いかなる破壊的な細胞壁の生化学的処理も伴わずにＨＡエピトープに結合するので、Ａｇａ２ｐは、高分子認識のために、細胞外部に接近可能である。
【０１５７】
前記したように、Ａｇａ２ｐ結合サブユニットは、Ａｇａ１ｐへのジスルフィド結合を通して細胞壁に接着され、これは他の細胞壁成分と共有結合的に固定される。ＤＴＴでの処理は１２ＣＡ５での標識を無効にした。このことは、Ａｇａ２ｐ−ＨＡ融合がジスルフィド結合によって細胞表面に付着されることを示す。ＡＧＡ１遺伝子を、ＰＣＲによってクローン化し、そしてＧＡＬ１プロモーターの下流にサブクローニングした。ＡＧＡ１の発現を、ガラクトース増殖培地に切り替えることによって誘導した。
【０１５８】
ＨＡエピトープタグを、表面抗体レベルおよび蛍光的に標識された抗原結合の両方について二重蛍光標識することを可能にするように、抗体融合物中に含有する。このアプローチは、抗体発現レベルにおける細胞と細胞の変動を、抗原親和性の単一細胞の測定値から切り離す。例えば、ａ−ＨＡモノクローナル抗体に対するフィコエリトリン標識された二次ＩｇＧでの間接的な免疫蛍光は、表面抗体数の測定を提供し、一方、抗体に結合するフルオレセイン標識された抗原は、結合親和性の測定を提供する。１細胞あたり約１０4コピーのａ−アグルチニンが提示されるため、結合測定値における確率的影響は、最小限である。市販のフローサイトメーターは１０3の発蛍光団分子の下で検出し得るので、シグナル対ノイズの比率は問題とならないはずである。緑色蛍光（フルオレセイン、すなわち、抗原結合）の赤色蛍光（フィコエリトリン、すなわち、抗体数）に対する比率は、抗原による抗体結合画分に比例する。
【０１５９】
本方法によって可能な分離因子を試験するために、ＨＡエピトープタグを発現する細胞を、規定された比率で野生型の細胞と混合した。この細胞の混合物を、フルオレセイン標識されたａ−ＨＡ  ＩｇＧで標識し、そして最も高い蛍光の亜集団をフローサイトメトリーによって選別した。選別した画分を再培養し、そしてＡｇａ２ｐ−ＨＡ融合を保有する細胞の画分を、発現ベクターに関連する遺伝的マーカーについてのレプリカ平板法によって決定した。この情報から、本方法によって可能な一回通過精製を推定した。
【０１６０】
（実施例１９）
（ａ−アグルチニンに対する単鎖の抗フルオレセイン抗体の融合）
モノクローナル抗体４−４−２０に基づく抗フルオレセイン単鎖抗体が構築され、そして特徴付けられている（Ｂｉｒｄ、’８８；Ｄａｖｉｄら、１９９１）。この単鎖抗体は、安定的に折りたたまれ、そしてＦａｂフラグメントに匹敵する親和性を保持することが公知である。モノクローナル抗体４−４−２０についての遺伝子を、酵母細胞表面上での発現のために、現存のＡＧＡ２−ＨＡ融合遺伝子に融合した。
【０１６１】
フルオレセインに対するモノクローナル抗体は、抗体−ハプテンの相互作用についての物理化学的研究のために有用なモデル系である。抗体−抗原結合の動力学（Ｋｒａｎｚら、１９８２）、錯体化の熱力学解析（Ｈｅｒｒｏｎら、１９８６）、静電相互作用の役割（Ｏｍｅｌｙａｎｅｎｋｏら、１９９３）、および抗体結合部位の部位指定突然変異誘発（Ｄｅｎｚｉｎら、１９９３）は、この系を使用して研究されている。
【０１６２】
提示された４−４−２０融合の機能性を、多様なフルオレセイン標識デキストラン（Ｓｉｇｍａ）に結合することによって決定した。抗体結合がフルオレセイン発光を消光するので、検出されたフルオレセインは、４−４−２０結合フルオレセインを通して酵母に結合されるデキストランにつながれた部分を表す。
【０１６３】
（実施例２０）
（提示骨格の発達）
酵母は、ａ−アグルチニンおよびα−アグルチニンとして公知の２つの関連した細胞表面レセプターを保有する。これら２つのアグルチニンは、二倍体を形成するための融合に先立つように、ａ一倍体細胞とα一倍体細胞との間の細胞−細胞接着を媒介するように機能する（Ｌｕ、１９９５）。α−アグルチニンは、Ｃ末端で細胞壁グルカンに共有結合的に連結されることが示されており（Ｌｕ、１９９５；Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ、１９９３）、そしてａ−アグルチニンは類似の結合によって固定されると考えられる（Ｌｕ、１９９５）。ａ−アグルチニンのＣ末端部分への融合は、酵母表面上で酵素およびウイルス抗原を固定するために、以前に使用されている（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ、１９９３）。
【０１６４】
酵母表面提示ライブラリースクリーニング方法の開発のためのモデル系として、本発明者らは、ａ−アグルチニン（これは、α−アグルチニンと異なり、２つのサブユニットの糖タンパク質である）への融合によって酵母の細胞壁上に機能的な抗フルオレセインｓｃＦｖおよびｃ−ｍｙｃエピトープタグを提示している（図２）。７２５残基のＡｇａ１ｐサブユニットは、β−グルカン共有結合を通して（Ｌｕ、１９９５）アセンブリを細胞壁に固定し（Ｒｏｙ、１９９１）；６９のアミノ酸の結合サブユニットＡｇａ２ｐは、２つのジスルフィド結合によってＡｇａ１ｐに連結される（Ｃａｐｐｅｌｌａｒｏ、１９９４）。天然のａ−アグルチニン結合活性はＡｇａ２ｐのｃ−末端に局在化され（Ｃａｐｐｅｌｌａｒｏ、１９９４）；従って、これは、細胞外高分子への接近性を有する分子ドメイン、および提示のためのつなぎのタンパク質について有用な部位を表す。Ａｇａ２ｐへのＣ−末端融合として、提示タンパク質についてのベクターを構築した（図３）。
【０１６５】
（実施例２１）
（ｓｃＦｖの発現および表面局在化の確認）
Ａｇａ２ｐ−ｓｃＦｖ融合物の発現は、誘導性ＧＡＬ１プロモーターによって指示される（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、１９８４）。グルコース培地における酵母の増殖は、ＧＡＬ１プロモーター由来の転写物の本質的に完全な抑制を可能にし、宿主増殖に負に影響する配列に対して対抗選択回避するための重要な考察を可能にする。ガラクトースを含む培地への細胞の切り替えは、分泌経路内で関連しそして細胞表面に曝露される、Ａｇａ１ｐおよびＡｇａ２ｐ融合遺伝子産物の生成を誘導する。Ａｇａ２ｐ−ｓｃＦｖ融合物の表面局在化を、共焦点の蛍光鏡検およびフローサイトメトリーによって確認している。抗ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂおよびフルオレセイン結合デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン）で同時に標識された細胞を、レーザー走査共焦点鏡検によって試験した（図８）。関連のないペプチド（すなわち、血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ単独）の提示に指向するベクターを保有するコントロール細胞は、ｃ−ｍｙｃエピトープまたはＦＩＴＣ−デキストランについて特異的なｍＡｂによって標識されない（図８Ａ）。
【０１６６】
対照的に、Ａｇａ２ｐ−ｓｃＦｖ−ｃ−ｍｙｃ融合物を発現する表面提示ベクターｐＣＴ２０２を保有する細胞を、抗ｃ−ｍｙｃ抗体およびＦＩＴＣ−デキストランの両方で同時標識し（図８Ｂ）、抗原結合部位が非常に大きな高分子に接近可能であることを実証する。これらの菌株の両方を、ＨＡエピトープタグに対して指向されたｍＡｂ  １２ＣＡ５によって陽性に染色した。インタクトなＩｇＧ（１５０ｋＤａ）および２×１０6Ｄａのデキストランポリマーの両方に対する結合についての融合の接近性は、細胞壁成分からの有意な立体障害が存在しないことを示し、このことは、Ｅ．ｃｏｌｉ表面が、高分子拡散に対する障壁を形成するリポ多糖層内に埋め込まれたタンパク質を提示したことに関連して重要な利点である。
【０１６７】
これらの酵母株の二色フローサイトメトリー分析は、同様に、細胞表面上に接近しやすく提示されたｓｃＦｖを実証する。陰性コントロールおよびｓｃＦｖ提示菌株を、抗ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂ  ９Ｅ１０およびＦＩＴＣ−デキストランで同時に標識した。二変数ヒストグラムは、４−４−２０提示プラスミドを保有する細胞集団についてのフィコエリトリン蛍光（ｍＡｂ  ９Ｅ１０結合のレベル）の強度とＦＩＴＣ蛍光（抗原結合）の強度との間における直線的な関係を実証し、一方、コントロール集団はバックグラウンド蛍光を示す（図９ＡおよびＢ）。陽性画分内での蛍光強度の分布は、エピトープタグ標識によって決定されるように、提示された融合物の数における細胞と細胞の変動性について、抗原結合シグナルを補正することの重要性を例示する。
【０１６８】
ｓｃＦｖ提示細胞集団の公知の抗体結合能力の校正標準との比較による提示効率の定量化は、１細胞あたり３×１０4融合より大きな平均値を生じる。Ａｇａ２ｐ−ｓｃＦｖ融合を提示する細胞の、標識前のジチオトレイトールでの処理は、ＦＩＴＣ−デキストランおよびｍＡｂ  ９Ｅ１０の両方による細胞表面の染色を排除し（図９Ｃ）、これは組換えＡｇａ２ｐサブユニットとＡｇａ１ｐとの間の特異的ジスルフィド結合相互作用による、細胞表面への融合タンパク質の付着と一致する。この特徴は、酵母の提示系の別の重要な特徴、すなわち、タンパク質は、単純に、さらなる特徴付けのために還元によって細胞表面から放出され得ることを例示する。
【０１６９】
４−４−２０／フルオレセイン相互作用の特異性をさらに試験するために、フルオレセインの非蛍光アナログ（５−アミノフルオレセイン）を使用して、競合的解離アッセイを実施した。これらのデータの解析から、ＦＩＴＣ−デキストランについては２１℃で３.７×１０-3／秒の一価の解離速度定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ｋoff）、およびフルオレセイン−ビオチンについては３.９×１０-3／秒の一価の解離速度定数を得る。ｔ＝０秒に対する指数適合の外挿は、ＦＩＴＣ−デキストラン分子のｓｃＦｖとの相互作用の平均価が１.５より少ないことを示す。同様の結果は、競合物として、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅ）されたイヌリン、フルオレセイン結合ウシ血清アルブミン、およびフルオレセイン−ビオチンを使用して得られ、このことはＦＩＴＣ−デキストランまたはフルオレセイン−ビオチンによる細胞の標識が、提示された融合とフルオレセイン部分との間の特異的な相互作用に起因することを示した。さらに、表面提示された４−４−２０  ｓｃＦｖ由来のフルオレセイン二ナトリウム塩（ＦＤＳ）の解離動力学は、分光蛍光計によって観察されるように、酵母が産生する可溶性４−４−２０  ｓｃＦｖ由来のＦＤＳの解離動力学と整合した。
【０１７０】
（実施例２２）
（フローサイトメトリーでの細胞選別による提示細胞の濃縮）
酵母表面提示を用いたフローサイトメトリー選別の有効性を試験するために、表面提示ベクターを保有する酵母と関連する選択マーカーを欠損した酵母の混合物を選別し、そして純度をレプリカ平板法によって独立して決定した。重要な濃縮因子（６００倍まで）を得た（表Ｉ）。従って、稀なクローンは、より小さな集団を提供するために、緩和されたストリンジェンシーかつ高収量で、最初に陽性細胞を濃縮することにより、酵母提示ライブラリーから選択され得、次いで、稀なクローンを単離するための数回通過のよりストリンジェントな選別に供され得る。
【０１７１】
【表１】
2010213725.tif 000002
【０１７２】
（実施例２３）
（酵母提示の突然変異誘発ライブラリーからの、より低いｋoffを有するｓｃＦｖ変異体の単離）
Ｅ．ｃｏｌｉの「突然変異誘発遺伝子」株における増殖によって無作為に突然変異誘発されたｓｃＦｖ遺伝子の選抜が、記載されている（Ｌｏｗ、１９９６）。そのような株中の酵母表面提示ベクターの増殖によって作製された、約５×１０5の４−４−２０  ｓｃＦｖ変異体のライブラリーを、酵母中で発現した。ｓｃＦｖライブラリーを提示する細胞のプールを、ＦＩＴＣ−デキストラン標識した細胞の５−アミノフルオレセインとの競合による動力学的選別に供した。ＰＥフルオレセインに対して最も高い割合のＦＩＴＣを示すｃ−ｍｙｃ陽性細胞を、フローサイトメトリー選別によって回収し（図１０Ａ）、融合抑制条件下（グルコース炭素供給源）での再増殖によって増幅し、表面融合提示について誘導し、そして再選別した。ＦＩＴＣ−デキストランによる標識の持続時間の実質的な増加を実証する細胞は、３回の選別および増幅の後に劇的に濃縮された（図１０）。
【０１７３】
ｓｃＦｖライブラリーから選択された２つの個々のクローンについてのＦＩＴＣ−デキストラン解離動力学は、野生型４−４−２０  ｓｃＦｖと比較して２．９倍異なった（図１１）。変異体の速度定数は、野生型の５．６×１０-3／秒と比較して、２３℃で１．９×１０-3／秒（変異体４Ｍ１．１）および２．０×１０-3／秒（４Ｍ１．２）であり；類似の実験から、それぞれ、５．０×１０-3／秒、２．４×１１０-3／秒、２．８×１０-3／秒のフルオレセイン−ビオチンについてのｋoff値を得た。さらに、分光蛍光計によって決定された可溶性フルオレセイン解離動力学は、野生型と比較して両方の変異体について２．２倍の改善を示し、そして初期の平衡した蛍光消光実験は、結合反応の親和性定数において類似の改善を示唆する。わずか３倍減少したｏｆｆ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）でのクローンの単離は、このスクリーニング方法の、正確な定量的識別を達成する能力を実証する。
【０１７４】
個々に分析される選択された２６のクローンのうち、２つはｋoffにおいて等しく改善され (上記の４Ｍ１.１および４Ｍ１.２)；２つは、直線的発現レベル／活性関係をゆがめるｃ−ｍｙｃ標識における減少を伴う野生型ｋoffを実証し；１つは野生型ｋoffおよびｃ−ｍｙｃ標識を実証し；そして２１個は、野生型より約１０倍低い明らかなｋoffで、一価のＦＩＴＣ−デキストランまたはフルオレセイン−ビオチンではなく、多価の２×１０6Ｄａ  ＦＩＴＣ−デキストランにのみ結合した。アビディティの増加を伴うクローンの濃縮は、多価抗原の使用により生じ（１デキストランあたり約９０フルオレセイン）；アビディティ効果は、一価抗原結合を保証するスクリーニング条件の適切な設計によって、効率的に回避され得る。さらに、エピトープタグ変異体の選択は、連続した選別回においてｃ−ｍｙｃおよびＨＡタグ標識による発現レベルを交互に検出することによって、またはｓｃＦｖ遺伝子に対してのみの変化を標的化する二者択一的な突然変異誘発ストラテジーによって排除され得る。
【０１７５】
これらの結果は、ｓｃＦｖフラグメントが、高分子認識に対して接近可能な様式、および組み合わせのライブラリーの構築およびスクリーニングに受け入れられやすい様式で酵母の表面上に提示され得ることを示す。提示されたｓｃＦｖは、抗原に特異的に結合する−酵母細胞表面上に提示された機能的抗体フラグメントの第１の証明。インビトロ抗体親和性成熟のためのライブラリー方法、および他の哺乳動物タンパク質の提示のためのライブラリー方法に対してのこの提示系の適用は、ファージディスプレイ、細菌性表面ディスプレイ、および酵母ツーハイブリッド方法のような現存の技術に対して重要な補完的代替法である。実際、最適化されていないスクリーニング条件下での比較的小さなライブラリーからの改善されたフルオレセイン結合ｓｃＦｖ変異体の回収においての、酵母ディスプレイ系の全くの最初の試みの成功は、この技術の頑健性を明らかに実証する。表面につながれたｓｃＦｖの実証された高度に定量的な動力学的解析および類似した結合特性を有するクローンの良好な識別は、タンパク質の組み合わせ最適化についての酵母ディスプレイの重要な潜在性をさらに証明する。
【０１７６】
（実施例２４）
（酵母提示系におけるＴ細胞レセプターへの抗体の提示）
本明細書において、Ｔ細胞レセプターのＶｂ８領域について特異的なｓｃＦｖ（ＫＬ１６）（Ｒｏｅｈｍら、１９８５）を、酵母提示系において発現した。このｓｃＦｖ−ＫＪ１６は、ＴＣＲリガンド（例えば、スーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Ｃｈｏら、１９９５））の認識を競合的にブロックすることによって、Ｔ細胞の活性を阻害する。このｓｃＦＶの親和性改変体は、増強したＴ細胞阻害を示し得るため、ｓｃＦｖ−ＫＪ１６のより高い親和性形態を操作する際の、この酵母提示系の使用を試験した。
【０１７７】
蛍光的に標識された抗原である、Ｖｂ８単鎖ＴＣＲ（Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒら、１９９６）への細胞表面ｓｃＦｖの平衡結合に基づくスクリーニングを開発した。２チャネルのフロー選別を使用し、選択はまた、ｓｃＦｖのカルボキシ末端にある１０残基のｃ−ｍｙｃタグへの蛍光的に標識された抗ｃ−ｍｙｃ抗体の結合に基づいた。ＴＣＲに対してより高親和性を有するｓｃＦｖ改変体または抗ｃ−ｍｙｃ抗体についてより低い親和性を有するｓｃＦｖ改変体を単離した。期待通り、前者はＣＤＲにおける変異を有し（ＶL  ＣＤＲ１）、そして後者はｃ−ｍｙｃエピトープにおいて変異を有した。従って、これらの発見は、酵母の提示アプローチが、より高い親和性のｓｃＦｖを単離することか、または特定のＭａｂによって認識される提示タンパク質のエピトープを同定することのいずれかのために使用され得ることを実証する。
【０１７８】
（プラスミドおよび菌株）
改変された２０５リンカー（Ｃｈｏら、１９９５）によって結合されたｓｃＦｖ−ＫＪ１６  ＶLおよびｓｃＦｖ−ＫＪ１６  ＶH遺伝子を、製造者のプロトコルに従って、ベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に、ＰＣＲによってサブクローニングした。ｃ−ｍｙｃエピト-プタグを、ｓｃＦｖのカルボキシ末端に含ませた。ｓｃＦｖを含む約８００ｂｐのＮｈｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔから切り出し、そして９残基のエピトープタグ（ＨＡ）を含む酵母表面表示ベクターｐＣＴ２０２および誘導性ＧＡＬ１プロモーターの下流のＡＧＡ２オープンリーディングフレーム中に連結した。得られた構築物を、ＧＡＬ１プロモーターによって制御された、染色体に組み込まれたＡＧＡ１を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＢＪ５４６５（ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１  ｌｅｕ２Ｄ１  ｈｉｓ３Ｄ２００  ｐｅｐ４：：ＨＩＳ２  ｐｒｂＤ１．６  ｃａｎ１  ＧＡＬ；Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）中に、ＧｉｅｔｚおよびＳｃｈｉｅｓｔｌの酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）形質転換法（Ｇｉｅｔｚら、１９９５）によって形質転換した（菌株ＥＢＹ１００）。
【０１７９】
（実施例２５）
（酵母表面上のｓｃＦｖ−ＫＪ１６の誘導および検出）
ｐＣＴ２０２／ｓｃＦｖ−ＫＪ１６で形質転換された酵母細胞を、３ｍｌの選択的グルコース培地ＳＤ−ＣＡＡ（グルコース  ２ｗｔ％、Ｄｉｆｃｏ酵母窒素塩基  ０．６７ｗｔ％、カサミノ酸  ０．５ｗｔ％）中で振盪しながら、３０℃で一晩増殖させた。約１８〜２０時間後、組換えＡＧＡ１＋ＡＧＡ２−ｓｃＦｖ発現を、５ｍｌの選択的ガラクトース培地（ＳＧ−ＣＡＡ、ここで２％のガラクトースは、ＳＤ−ＣＡＡ中のグルコースと置換する）中で振盪しながら、２０℃で誘導した。培養物を、約２０〜２４時間（１〜２培増）後に、遠心分離によって収集し、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％アジドを含むＰＢＳ（１０ｍＭ  ＮａＰＯ4、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）で洗浄し、そして２５ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ抗−ＨＡ  Ｍａｂ  １２ＣＡ５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、抗ｃ−ｍｙｃ  Ｍａｂ  ９Ｅ１０（原腹水の１：１００希釈；Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）、またはＥ．ｃｏｌｉで発現される封入体から調製されるビオチン化ｓｃ−ＴＣＲ（Ｓｃｈｏｄｉｎら、１９９６）[約３６０ｎＭ]とともに、氷上で４５分インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＦＩＴＣ標識化Ｆ（ａｂ’）2ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）またはストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）結合体（１：１００；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のいずれかとともに、氷上で３０分インキュベートした。標識化酵母細胞を、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＩＵＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーターで分析した。イベント速度は、約２５０細胞／秒であった。１０，０００イベントについてのデータを収集し、そしてこの集団を、光散乱（サイズ）に従って制御（ｇａｔｅ）して、細胞塊の分析を阻止した。これらの条件をまた使用して、ｓｃＴＣＲの種々の希釈液でｓｃＦｖ−ＫＪ１６酵母をインキュベーション後に、等温で結合する平衡な抗原を産生した。散乱分析を行い、ビオチン化ｓｃＴＣＲの推定濃度およびフローデータから直接得られた平均蛍光単位を使用して、ＫD値を決定した。
【０１８０】
（実施例２６）
（ｓｃＦｖ−ＫＪ１６ランダム変異ライブラリーの生成）
およそ５０ｎｇのｐＣＴ２０２／ｓｃＦｖ−ＫＪ１６を、製造者のプロトコルに従って、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に形質転換した。ＳＯＣ培地中での１時間の誘導に続いて、この回収物を、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして５００ｍｌの液体ＬＢ培地（１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０ｍｌ／ｍｌのカルベニシリンを含む）（ＬＢ−ＡＭＰ１００−ＣＡＲＢ５０）中で再懸濁した。この再懸濁液を、５０ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で、１５ｍｌのＬＢ−ＡＭＰ１００−ＣＡＲＢ５０に添加し、そして振盪しながら３７℃で増殖した。この培養物を、中間対数期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）（ＯＤ600  約０．２〜０．４）において、新鮮な１５ｍｌのＬＢ−ＡＭＰ１００−ＣＡＲＢ５０を補充し、次いで、飽和まで増殖させた（ＯＤ600  約１．０〜１．１；これを、変異の１「サイクル」または一回とみなした）。この培養物の小画分（０．７５ｍｌ）を、次のサイクル（１５ｍｌのＬＢ−ＡＭＰ１００−ＣＡＲＢ５０）に添加した。６サイクルの増殖後、Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ＤＮＡプラスミドの調製を、１５ｍｌの培養物で実施した。ＬｉＡｃ法（Ｇｉｅｔｚら、１９９５）を使用して、６サイクル目からのおよそ４．５ｍｌのｐＣＴ２０２／ｓｃＦｖ−ＫＪ１６  ＤＮＡを、酵母株ＥＢＹ１００の３つの管の各々の中で形質転換した。この３つの反応物をプールし、そして１ｍｌのｄｄＨ2Ｏ中に再懸濁後、１／２０００のプールを選択プレート上に置き、形質転換効率を決定した。５０ｍｌのＳＤ−ＣＡＡに、この培養物の残留物を播種し、振盪させながら３０℃で一晩増殖させ、ＯＤ600＝０．０５まで継代し、そしてＯＤ600＞１．０まで３０℃で一晩増殖させた。次いで、５ｍｌのＳＧ−ＣＡＡをＯＤ600  約０．５に対して播種し、そしてＯＤ600＝１．０〜２．０まで振盪させながら３０℃で一晩増殖させた。
【０１８１】
（実施例２７）
（ＦＡＣＳによるｓｃＦｖ−ＫＪ１６変異ライブラリーの選択）
細胞を、上記のように、抗ｃ−ｍｙｃ  Ｍａｂおよびビオチン化ｓｃＴＣＲ（約１０ｎＭの濃度で使用される）で二重標識した。この反応容量を調整し、表面のｓｃＦｖに対して約１０倍モル濃度過剰の抗原（ｓｃＴＣＲ）を維持した。サンプルを、図３に示されるような分離窓（ｓｏｒｔ  ｗｉｎｄｏｗ）を備えたＣｏｕｌｔｅｒ  ７５３ベンチ上で、そして４，０００細胞／秒のイベント速度で分離した。総数８×１０7細胞を、収集された集団の０．１〜０．４％を有する、最初の分離回の間に調べた。収集された細胞をＳＤ−ＣＡＡ中で３０℃で再増殖させ、そして次の分離する回の前に、ＳＧ−ＣＡＡに切り替えた。４回の分離の総量を、最初の２回の分離を富化様式（全てのポジティブクローンの高回収率）で行い、そして最後の２回の分離を精製様式（同時発生的なネガティブ細胞の拒絶）で行った。最後の分離の直後に、収集された細胞を再分離し、そして選択プレート上に置いて、個々のクローンを単離した。
【０１８２】
（実施例２８）
（変異ｓｃＦｖ−ＫＪ１６遺伝子のレスキューおよび配列決定）
ｓｃＦｖ−ＫＪ１６酵母由来のプラスミド（野生型および２つの変異体）を、細胞をボルテックスの代わりに２分間ビーズビーター（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）を用いて破壊したこと以外は、Ｗａｒｄ（Ｗａｒｄ、１９９１）に記載されたプロトコルに従ってレスキューした。細胞を１分間遠心分離し、そして上相（水相）を収集した。Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ミニプレップキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してプラスミドＤＮＡを調製し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテント細胞（ＧｉｂｒｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｇｕｒｇ，ＭＤ）を、ＣａＣｌ2法を使用して、１ｍｌのＤＮＡ調製物で形質転換した。形質転換物を、ＬＢ−ＡＭＰ５０上にプレートした。野生型ｓｃＦｖ−ＫＪ１６および２つの変異体（ｍｕｔ４およびｍｕｔ７）の配列決定を、表示ベクターのｓｃＦｖに隣接するプライマーおよび蛍光自動化配列決定装置（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＩＵＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）を使用して行った。
【０１８３】
（実施例２９）
（酵母細胞表面ｓｃＦｖによるＴＣＲ結合）
モノクローナル抗ＴＣＲ抗体ＫＪ１６は、ＴＣＲのＶｂ８鎖上の立体構造的エピトープを認識する（Ｂｒｏｄｎｉｃｋｉら、１９９６）。ＫＪ１６は、Ｔ細胞のＶｂ８集団を標的および欠失するための試みを含む、マウスにおける多くのインビボの研究に使用されてきた（Ｂｏｒｎら、１９８７、ＭｃＤｕｆｆｉｅら、１９８６、Ｒｏｅｈｍら、１９８５）。これらの効果を媒介上で、抗体親和性を変化させる可能な効果を評価するために、ＴＣＲについて増加する親和性を有するＫＪ１６改変体を同定するための酵母ディスプレイシステムの使用を試験した。この抗ＴＣＲ抗体ＫＪ１６由来のｓｃＦｖ遺伝子は、以前にクローニングされ、そしてこのｓｃＦｖタンパク質は、ＫＪ１６Ｆａｂフラグメントとほぼ同じ親和性（ＫD  約１２０ｎＭ）を示した（Ｃｈｏら、１９９５）。
【０１８４】
酵母細胞表面上で発現されるＡｇａ２ｐアグルチニンサブユニットを有する融合ポリペプチドとして発現されるために、ｓｃＦｖ−ＫＪ１６コード配列をサブクローン化した。この融合ポリペプチドは、ｓｃＦｖのＮ末端に血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを含み、そしてカルボキシ末端にｃ−ｍｙｃエピトープタグを含む。これらのエピトープの含有は、モノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）抗体および抗ｃ−ｍｙｃ(９Ｅ１０)抗体を、抗原結合活性と無関係に、全長ｓｃＦｖの表面発現を定量するためにフローサイトメトリーで使用することを可能にする。このような規格化は、融合ポリペプチドの表面レベルにおいて、細胞から細胞（ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ）の可変性の効果を明らかにすることを助ける。以下に議論されるように、２つの独立エピトープタグの有用性はまた、変異体に結合するリガンドについてスクリーニングすることを所望されなくてもよい、個々のエピトープ変異体の選択について制御し得る。細胞表面ｓｃＦｖの結合特性を評価するために、可溶性単鎖Ｖｂ８−Ｖａ３  ＴＣＲ（Ｓｃｈｏｄｉｎら、１９９６）をビオチン化し、そして結合されたリガンドを、フィコエリトリン−ストレプトアビジン結合体を用いて検出した。
【０１８５】
図１２は、ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／Ａｇａ２プラスミドで形質転換された酵母が、ＨＡエピトープ（図１２Ａ）およびｃ−ｍｙｃエピトープ（図１２Ｂ）を発現したことを示す。Ａｇａ２ｐ／ＨＡ発現ベクターのみでトランスフェクトされたコントロール酵母は、抗ＨＡ  Ｍａｂについてポジティブであったが、抗ｃ−ｍｙｃ抗体についてはポジティブでなかった。非蛍光集団における細胞の画分は、プラスミドの安定性および培養増殖期に依存することが見出されたが、関係する生理学的なプロセスは未知である。それにも関わらず、２０℃まで誘導温度が減少して、そして２つの培養物が倍増する時間未満まで誘導時間が減少して、ｓｃＦｖ−ＫＪ１６を表示する細胞の７５％より多くを有する集団を産生する。ｓｃＦｖ−４−４−２０は、ほぼ同じポジティブ細胞の比率を有するこの系を用いて表示された。
【０１８６】
細胞表面ｓｃＦｖに対するビオチン化ｓｃＴＣＲの結合はまた、フローサイトメトリーによって検出された（図１２Ｃ）。発現された活性ｓｃＦｖが抗ＨＡ抗体およびｃ−ｍｙｃ抗体を用いて検出されるものと同様であった細胞の画分は、全長の発現、正しく折り畳まれたｓｃＦｖと一致した。さらに、２色のヒストグラムは、ＨＡエピトープ表示およびｃ−ｍｙｃエピトープ表示の両方と結合するｓｃＴＣＲの強固な相関を実証した。ビオチン化ｓｃＴＣＲ結合は、ｓｃＦｖ−ＫＪ１６を表示する酵母に対して特異的であり、そして過剰な可溶性ＫＪ１６ＩｇＧによって完全に阻害された(図１２Ｄ）。
【０１８７】
表面に表示されたｓｃＦｖ−ＫＪ１６のおよその親和性を、ビオチン化ｓｃＴＣＲの変化した濃度を有する全細胞の滴定によって、細胞壁上でインサイチュにおいて決定した。平衡結合を、フローサイトメトリーにより細胞に結合したｓｃＴＣＲを分析することによって測定した。結合データのスキャッチャード分析（図１３）によって５００ｎＭのＫDを得、これは可溶性ｓｃＦｖ−ＫＪ１６について観察されたＫDの５倍以内であった。ＫDは、過大評価でありそうな、１００％のｓｃＴＣＲが活性であったという仮定の下で計算されたので、このような一致は妥当である（すなわち、２０％のみが正確に折り畳まれた場合、表面ｓｃＦｖは約１００ｎＭのＫDを有する）。以前に、可溶化Ｅ．ｃｏｌｉ封入体から精製されたｓｃＴＣＲの実質的な画分は不正確に折り畳まれることが、見出された（Ｓｃｈｏｄｉｎら、１９９６）。
【０１８８】
（実施例３０）
（蛍光活性化細胞選別による、変異されたｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母の選択）
Ｅ．ｃｏｌｉ変異株を使用して、ファージディスプレイによる親和性成熟についてｓｃＦｖを変異誘発した（Ｌｏｗら、１９９６）。このアプローチは、酵母ディスプレイを使用するフルオレセインについての高い親和性を用いて、ｓｃＦｖ−４−４−２０の変異体を同定することにおいて首尾良いものであった。この変異誘発アプローチの長所は、その単純性、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換および細胞増殖のみを必要とすることである。さらに、このＥ．ｃｏｌｉ変異誘発遺伝子系統は、発現プラスミドを介して変異を導入し、そして従って、結合の特徴を決定するために重要であると考えられる、ｓｃＦｖの一部に対して偏って変化しない。変異誘発遺伝子系統の変異誘発のこの局面が都合良いかどうかは、利用可能な構造情報に基づいて、抗原結合に影響を与え得る重要な残基を同定する能力に依存する。公表された親和性変異研究の試験は、このような残基の位置が（一般に非接触残基において）、まだ演繹的に予測可能でないことを示唆する（Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９３、Ｐａｔｔｅｎら、１９９６、Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９６、Ｙａｎｇら、１９９５、Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５）。
【０１８９】
ｓｃＦｖ−ＫＪ１６に対するこのストラテジーを適用するために、ｓｃＦｖ−ＫＪ１６/Ａｇａ２プラスミドを、６サイクルの増殖について、Ｅ．ｃｏｌｉ変異誘発遺伝子系統ＸＬ１−Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において増殖させた。この手順が、２０００ｂｐにおける１サイクルあたりの変異速度に基づいて、ｓｃＦｖコード配列において平均２〜３点の変異を導入することを予測した。得られたプラスミド調製物で、およそ３×１０5の形質転換体のライブラリーサイズを産生する酵母を形質転換した。他の研究において、より大きなライブラリー（１０7）は、さらなる形質転換手順の最適化によって、および独立した形質転換体をプールすることによって得られた。この数は、ライブラリー構築物についてサイズの上限を示すのではなく、さらなる最適化の試みとして、スケールアップが直接適用され得る。
【０１９０】
変異誘発された酵母ライブラリーを、抗ｃ−ｍｙｃ抗体結合（ＦＩＴＣ）およびビオチン化ｓｃＴＣＲ結合（ＰＥ）について２重染色を使用して、４回の首尾良い分離のサイクルおよび増幅に供した。ビオチン化ＴＣＲを、野生型ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母による結合の検出可能なしきい値を少し下まわって産生される１：５０００希釈液（約１０ｎＭ）で使用した（図１３）。１回の分離サイクル後（図１４Ａ）および４回の分離サイクル後（図１４Ｂ）の変異されたｓｃＦｖ−ＫＪ１６サンプルの２つのチャネル蛍光プロフィールを示す。図１４に示された対角窓上に蛍光を示す細胞を、再増殖のために収集した。この対角窓の原理は、任意の所定の回において、分離基準が表示されたポリペプチドの融合あたりの抗原結合に基づくことにあった。例えば、より高いＰＥ蛍光レベル（すなわち、ｓｃＴＣＲ結合）のみに基づく選択は、より高い親和性ｓｃＦｖを有するこれらの変異体のみならず、酵母細胞あたりのｓｃＦｖのより高い密度を表示する変異体を含んだ。後者の変異体は、原理的に、表面発現可変性について規格化するために２つのパラメーターの１つとして抗ｃ−ｍｙｃ抗体を誘導することによって除去される。最初の２つの分離回を、富化様式において実施し、最も高い蛍光を有する約０．５％の細胞集団を単離し、そして一致（同時に分離された液滴における２つの細胞）を避けるために分離ソフトウェアを設定しなかった。この最後の２回の分離回を、高い一致を避けるために、精製のために実施した。４サイクルの後、細胞を直ちに再分離し、そしてプレートした。１０のコロニー（ｍｕｔ１〜１０）を、さらなる分析のために選択した。
【０１９１】
（実施例３１）
（変異ｓｃＦｖ-酵母の特徴付け）
１０の選択された変異体の各々を、抗ＨＡ抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体、およびビオチン化ＴＣＲで標識し、そしてフローサイトメトリーによって分析した（図１５）。予測され得るように、１つのクローン（ｍｕｔ６）は、野生型ｓｃＦｖ−ＫＪ１６／酵母に表現型的に類似して現れた。別のクローン（ｍｕｔ７）を、より高いＴＣＲ結合レベルを示すために見出し、結果を、いくつかの独立した滴定によって確認した。最終的に、多くの変異体（ｍｕｔ１〜５、８、９）は、抗ＨＡ抗体またはビオチン化ｓｃＴＣＲの結合と比較された抗ｃ−ｍｙｃ抗体に対する減少された結合を一貫して示した。このクラスの変異体の存在は、図１４に示されるように、対角線上の分離窓の詳細によって説明され得る。細胞は、定常ｃ−ｍｙｃ（ＦＩＴＣ）シグナルで結合するｓｃＴＣＲ（ＰＥ）を増加させることによってか、または代わりに定常ｓｃＴＣＲ（ＰＥ）シグナルで結合するｃ−ｍｙｃ（ＦＩＴＣ）を減少させることによってのいずれかによって分離窓に「移動」し得る。これらの変異体の選択は、融合物中のエピトープタグである、ＨＡおよびｃ−ｍｙｃの両方を使用することによって容易に回避され得る。従って、各回の分離におけるこれらの各々のエピトープタグの標識を代替することによって、エピトープタグの１つへの減少された結合は、この場合におけるように、連続した分離回において富化されない。
【０１９２】
推定的なｃ−ｍｙｃエピトープ変異体（ｍｕｔ４）、ｓｃＴＣＲ結合変異体（ｍｕｔ７）および別の変異体（ｍｕｔ１０）の蛍光のヒストグラムを、野生型ｓｃＦｖと比較した（図１６）。ｍｕｔ４（図１６Ａおよび１６Ｂ）は、抗ｃ−ｍｙｃ標識における減少を示し、ｍｕｔ７は、ｓｃＴＣＲ結合の増強を示し（図１６Ｃおよび１６Ｄ）、そしてｍｕｔ１０は、どちらにおいても変化を示さなかったが、ポジティブであった細胞の画分は、野生型ｓｃＦｖに対して、より高かった（図１６Ｅおよび１６Ｆ）。図１６Ｅおよび１６Ｆにおいて示されるように、ほぼ１００％のｍｕｔ１０細胞は、試験された各々の薬剤についてポジティブであった。これは、細胞表面ｓｃＦｖのレベルを減少させる、２つの別個の細胞集団を示す野生型ｓｃＦｖ−ＫＪ１６酵母と似ている各々の他の変異体（例えば、ｍｕｔ４およびｍｕｔ７を参照のこと）と対比する。ｍｕｔ１０の増強されたプラスミド安定性およびｍｕｔ１０からＥ．ｃｏｌｉへの発現プラスミドをレスキューするために繰り返される失敗は、染色体の組込みがこの変異体プラスミドで起こったことを示唆する。従って、ｍｕｔ１０の変化された表面発現の特徴付けは、発現プラスミドの組込みの結果であると思われる。
【０１９３】
ｓｃＴＣＲに対する結合親和性を、可溶性ビオチン化ｓｃＴＣＲを用いる滴定によって、図１６に示される変異体について評価した（図１７）。このデータの非直線の曲線適合性は、ｍｕｔ４およびｍｕｔ１０について変化していないＫDを示すが、ｍｕｔ７については親和性が３倍増加することを示す。ｍｕｔ１０の平均蛍光における増大は、図１６Ｅおよび１６Ｆにおいて明らかなように、増大するｓｃＴＣＲ結合よりむしろ、この分布における非蛍光端部の非存在のためである。
【０１９４】
（実施例３２）
（変異体ｓｃＦｖの配列決定）
酵母ディスプレイプラスミドにクローニングされたｗｔ−ｓｃＦｖ−ＫＪ１６ならびに酵母由来のプラスミドのレスキューに従うｍｕｔ４およびｍｕｔ７のヌクレオチド配列を、決定した（図１８）。野生型ｓｃＦｖ−ＫＪ１６は、当初公表されたｓｃＦｖ配列（Ｃｈｏら、１９９５）から、２つのサイレント変化を含んだ。これらは、酵母ディスプレイプラスミドへのｓｃＦｖのクローニングの前に、ＰＣＲによって導入され得た。ｍｕｔ４配列は１つの変異を含み、そしてｍｕｔ７は２つの変異を含んだ。ｍｕｔ４における唯一の変異は、上記のように抗ｃ−ｍｙｃ抗体による結合の減少と一致する、ｃ−ｍｙｃエピトープに存在した（ＬｙｓからＧｌｕ）。ｍｕｔ７は、ＶL領域のフレームワーク領域におけるＡｒｇからＬｙｓへの変化およびＶL鎖のＣＤＲ１におけるＳｅｒからＡｒｇへの変化を含んだ。後者の変異は、ｍｕｔ７について観察される、より高い結合親和性に一致した。
【０１９５】
ファージディスプレイは、より高い抗原結合親和性を有するｓｃＦｖの選択ならびに未処置のライブラリー由来の新規なｓｃＦｖの単離のため使用された（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、１９９７）。しかし、部分的には、毒性、コドンの偏り、または折り畳みの問題のために、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるいくつかの哺乳動物タンパク質の発現において差異が存在した（例えば、ＫｎａｐｐｉｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｍ、１９９５、Ｕｌｒｉｃｈら、１９９５、ＷａｌｋｅｒおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９９４）。酵母の発現は、タンパク質が真核生物の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および効率的なジスルフィド異性化）を伴って発現され得ることの利点を提案することによって、潜在的に、いくつかのこれらの問題を未然に防ぎ得る。さらに、ファージディスプレイは、一般に、５倍未満で異なる結合親和性を有する変異体間を識別するための、定量的な精度を有さない（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒら、１９９５）。対照的に、蛍光標識および分離は、３倍のみ増大した親和性を有する４−４−２０ｓｃＦｖクローンの単離を可能にした。抗原結合親和性の最大変化が、より小さな効果を各々有する点変異の指向された組合せによって生じる（Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９３、Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６、Ｙａｎｇら、１９９５）ので、親和性におけるわずかな改良を同定するための能力は、有意な値であり得る。これらの利点を考慮して、抗Ｔ細胞レセプターｓｃＦｖの親和性の成熟についての酵母ディスプレイシステムの使用が、開発された。
【０１９６】
マウスＴＣＲのＶｂ８領域に対して特異的であるｓｃＦｖを、インビボでＴ細胞標的特性を究極的に増強し得た抗ＴＣＲ試薬を生成するために使用した（Ｃｈｏら、１９９７、Ｃｈｏら、１９９５）。活性なｓｃＦｖを、ネイティブｓｃＦｖに類似する親和性を有する、酵母の表面上のＡｇａ２ｐ融合タンパク質として発現させた（ｓｃＦｖについての１２０ｎＭと比較して、約５００ｎＭ）。より高い親和性ｓｃＦｖを選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡ修復欠乏性菌株を用いるランダム変異誘発は、６回の増殖サイクル後に、１０００塩基対あたり約２〜３の頻度で変異を生じた。蛍光性標識化ｓｃＴＣＲおよび抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いるフローサイトメトリーを使用して、増大されたｓｃＴＣＲ親和性を有する細胞ディスプレイｓｃＦｖを分離した。抗ｃ−ｍｙｃ抗体は、より高い親和性のためではなく、ｓｃＦｖ−ｃ−ｍｙｃ融合物のより高い細胞表面発現のために増大されたＴＣＲ結合を有する変異体の制御する、選択のための第２の基準として含まれた。複数回の選択後、３つの変異表現型クラスを観察した：１）ｃ−ｍｙｃ抗体に対する結合を減少したが、ｓｃＴＣＲ結合は変化しない（ｍｕｔ１〜５、８、９）；２）ｃ−ｍｙｃ標識を変化せずにｓｃＴＣＲに対する結合を増強した（ｍｕｔ７）；および３）染色体ベクター組込みによる、より高効率の表面発現（ｍｕｔ１０）。
【０１９７】
ｍｕｔ４およびｍｕｔ７によって示される変異体のクラスの単離は、図１４に例示される選択基準から予測され得る。すなわち、ｓｃＴＣＲ（ＰＥ）シグナルの増加またはｃ−ｍｙｃ（ＦＩＴＣ）シグナルの減少のいずれかが細胞を分離窓中に置くので、対角線上の分離窓の境界上で同定された任意の変異細胞は、ｍｕｔ４およびｍｕｔ７について記載されたいずれかの特性によって説明され得る。このことは、２つの独立したエピトープタグの利用性のためであるが、しかし、このアプローチについて実質的な問題を示していない。変化する分離サイクルにおいてＨＡおよびｃ−ｍｙｃタグを利用することによって、１つのエピトープタグの減少された標識についての進行性の富化は、起こるべきではない。
【０１９８】
エピトープタグ変異体の単離は、酵母表面ディスプレイについてさらなる適用を強調する：モノクローナル抗体によって認識されるエピトープのマッピング。ペプチドライブラリーを使用する代替的なストラテジーが、この点における直鎖状エピトープについて首尾良いが、本明細書に記載されるアプローチは、立体配座的なエピトープに対して伸長され得る。従って、正しく折り畳まれたタンパク質は、酵母細胞上に表示され得、そして本明細書で記載されるような直接のランダム変異誘発は、隣接していないポリペプチド配列からエピトープ残基を同定するために適用され得る。非折り畳みタンパク質が保持され、そして真核生物分泌特性制御装置によって分解され、そして種々の発現レベルがＨＡ標識またはｃ−ｍｙｃ標識によって同定されるので、エピトープ残基の誤った同定は、この手順によって最小化されるべきである。この記載されたアプローチは、アラニンスキャン変異誘発よりも実質的に容易である。
【０１９９】
ｃ−ｍｙｃ標識あたりのｍｕｔ１０の平均単鎖Ｔ細胞レセプター標識が変化されなかったので、ｍｕｔ１０がこのスクリーンにおいて富化された理由は、明らかでない。明確に標識化された細胞のより高い画分が、分離窓へのランダムな過剰のために、富化についてこのクローンを偏らせることは可能である。いかなる場合においても、ｓｃＴＣＲ標識またはｃ−ｍｙｃ標識のいずれもが、このクローンについて異なず、そしてこの発現プラスミドの構造的再配列は、この発現プラスミドが染色体への組込みを有することを示す。
【０２００】
ｍｕｔ７における唯一の独特なＣＤＲ変異の同定は、この変異体ｓｃＦｖがＴ細胞レセプターに対する結合を増強したという知見と一致する。Ｔ細胞レセプターに対する、より高い親和性を有するｓｃＦｖのみ（そしてｃ−ｍｙｃ変異体ではない）を得るための将来の試みは、ｓｃＦｖの細胞表面レベルについて制御するために抗ＨＡ抗体および抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いる、代替の選択を含む。このストラテジーは、選択された変異体間のＤＮＡシャッフリング技術（Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４）と組合わせて、野生型ｓｃＦｖ（ＫD  約１２０ｎＭ）よりも、著しく高い親和性を有するｓｃＦｖ−ＫＪ１６の単離を可能にすべきである。このような変異体ＫＪ１６のｓｃＦｖを使用して、Ｔ細胞シグナル伝達の反応速度論的な現象ならびに二抗原特異的抗体を介するＴ細胞媒介性殺傷の標的化を試験し得る（Ｃｈｏら、１９９７）。
【０２０１】
本発明は、細胞表面ディスプレイを介してアフィニティー成熟させた抗体の意図的な単離を実証する。上記のように、オフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）選択を用いて、解離速度が減少した変異体を同定し、それゆえ、ｓｃＦｖ−ＫＪ１６の発現において、平衡化した抗原結合を用いた。これらの２つのアプローチは相補的であり、そして出発ｓｃＦｖのアフィニティーに依存する。１ｎＭを超えるＫDについては、反応速度の変動の有効な識別を可能にするには解離速度が迅速すぎるので、可溶性標識抗原を用いての平衡化のストラテジーを遂行することが合理的である。さらに、これらのより低いアフィニティーでは、大量の可溶性抗原は、もし、提示されたｓｃＦｖが、約１〜１０ｎＭの有効濃度で存在するならば、標識反応混合物から実質的に欠乏していない。対照的に、強く結合している抗体（例えば、４−４−２０（ＫD＝０．４ｎＭ））は、不便な大きな標識容量を用いない限り、可溶性の標識抗原をＫD未満の濃度で欠乏する。しかし、このような強く結合している抗体についての解離反応速度は、手動での混合手順を介しての、クエンチング、選別、および分析を可能にするのに十分にゆっくりである。従って、ストラテジーを用い得、それによってｓｃＦｖは、約１ｎＭのＫDになるまで、平衡化に基づくスクリーニングおよび変異誘発の繰り返しを介して、続いて、オフ速度スクリーニングおよび変異誘発の繰り返しにより、アフィニティー成熟させて、なおさらなる改良を入手し得る。
【０２０２】
細胞表面ディスプレイおよびフローサイトメトリースクリーニングは、反応速度結合パラメーター（例えば、ＫDおよび解離速度定数（ｋdiss））に基づくライブラリー由来のクローンの選択を可能にする。次いで、選択された変異体の結合パラメーターは、図１７に示すように、サブクローニングまたは可溶性発現の必要性を伴わずに、ディスプレイ形式において、インサイチュで定量的に見積もられ得る。対照的に、ファージディスプレイされた抗体の選択は、しばしば、ｐＨ２および８Ｍ  ＧｕＨＣｌという程度までですらある、漸増的なストリンジェントの洗浄条件および溶出条件を含む。このようなストリンジェンシー選択は、定量的な精度が乏しく、そして結合パラメーター（例えば、ＫDまたはｋdiss）と環境条件または生理学的条件下で常に直接的に関連するとは限らない。
【０２０３】
細菌細胞表面ディスプレイ系は、抗体および他のタンパク質の操作について記載された（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら，１９９６）。これらの系は、本発明の酵母ディスプレイ系のいくつかの利点を保有するが、これらは、真核生物分泌経路の翻訳後プロセシング能力を提供しない。細菌上にディスプレイしたタンパク質への巨大分子の接近はまた、リポ多糖層により提示される拡散障壁により制限され得る（Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９６）。この理由のために、モノクローナル抗体で標識した可溶性タンパク質抗原またはエピトープタグに対する結合は可能ではない。培養した哺乳動物細胞における表面ディスプレイ系もまた利用可能であるが、これらの系についてのコンビナトリアルライブラリーの構築およびスクリーニングは、酵母についてのように迅速でないかまたは用途が広いわけではない。
【０２０４】
かなり小さなライブラリー（３×１０5）をスクリーニングして、本明細書中に記載した変異体を単離した。これは、酵母のライブラリーサイズについての上限を表さない。１０7クローンを有する酵母ライブラリーが構築されており、そして必要な場合には、さらにライブラリーサイズにおける増加が達成できる。本発明は、酵母表面ディスプレイを用いて、増加したアフィニティーを有する変異ｓｃＦｖを単離し得ること、および変化したｍＡｂエピトープを有する変異体が所望により富化または排除され得ることを示す。さらに、ＫDは、サブクローニングおよび可溶性発現を必要とすることなく、ディスプレイ形式においてインサイチュで見積もられ得る。スクリーニング条件の定量的最適化は、本方法におけるさらなる改良を可能にする。酵母表面ディスプレイの適用は、抗体アフィニティー成熟を超えて、反応速度および平衡結合パラメーターに直接基づく、ｃＤＮＡ発現ライブラリーからの結合ドメインの単離、または変異レセプターもしくはリガンドの単離にまで広がる。
【０２０５】
（実施例３３：酵母ディスプレイ系におけるＴ細胞レセプターのディスプレイ可能性および発現）
本発明はまた、例えば、ペプチド−ＭＨＣ複合体またはスーパー抗原に対する改良された結合特性に関して、Ｔ細胞レセプターを操作するための新規なプロセスに関する。本発明は、酵母表面ディスプレイライブラリー形式においてＴ細胞レセプターを提示するための方法を確立する。この方法は、以下のために用いられ得る：１）一般に、表面または酵母において通常発現されないポリペプチドを発現するため、および２）より詳細には、選り抜きのリガンドについて、より高いアフィニティーのＴ細胞レセプターを操作するため。
【０２０６】
タンパク質操作は、増加したアフィニティー結合の合理的かつ指向的な操作を可能にする開発のレベルには到達していない。結果として、大きな変異集団から改良された変異体を同定するアプローチが開発された。最も広範に用いられるアプローチは、「ファージディスプレイ」であり、これは、抗体を、特に、連結した「単鎖」抗体の形態で操作するために使用されてきた。しかし、ファージディスプレイ方法論は、単鎖Ｔ細胞レセプター（ｓｃＴＣＲｓ）を好首尾に提示できなかった。これは、単離された単鎖Ｔ細胞レセプターの折畳みが、ＣＤ３複合体の他の成分および真核生物小胞体のタンパク質折畳み機構の非存在下では、非常に非効率的であることによる可能性が最も高い；細菌のペリプラズムは、これらのフラグメントを効果的に折り畳むことができない。
【０２０７】
酵母表面に提示されたＴ細胞レセプターの確立を、図１９〜２１に図示する。重要な改良は、この系において提示され得る変異Ｔ細胞レセプターを単離するために行われた。野生型Ｔ細胞レセプターは、Ｔ細胞レセプターの天然のコンホメーションに特異的である抗体（１Ｂ２）による結合が存在しないことによって示されたように、機能的に提示されない（図１９）。Ｔ細胞レセプターを変異させることおよび１Ｂ２結合についてライブラリーをスクリーニングすることにより、酵母において提示された変異単鎖Ｔ細胞レセプターが同定された。これは、改良された結合特性を有する変異単鎖Ｔ細胞レセプターを単離するために現在用いられ得る系を確立する。
【０２０８】
本発明は、Ｔ細胞レセプターを発現するのに好首尾な酵母細胞−表面ディスプレイ系を提供する。第２に、全長Ｔ細胞レセプターの発現は、Ｔ細胞レセプター遺伝子をランダムに変異誘発し、次いで表面発現についてフローサイトメトリーによって選択した後にのみ達成され得る。この方法は、Ｔ細胞レセプター中の発現欠損を「訂正」する進化的アプローチを利用した。
【０２０９】
この同じアプローチは、その野生型形態では効率的に提示されない任意のポリペプチドに適用され得る。「表示可能性」についての選択は、実施例３３〜３７に記載されるように、Ｔ細胞レセプターについての実施を減少させた。一旦提示可能な変異バージョンのポリペプチドが得られたら、次いで、これらのバージョンは、実施例１〜３２に記載される改良された結合特性についてのスクリーニングプロセスに供され得る。
【０２１０】
改良されたＴ細胞レセプター分子は、癌、敗血症、および自己免疫疾患（例えば、関節炎、糖尿病、または多発性硬化症）の治療において有用である。例えば、可溶性形態の高アフィニティーＴ細胞レセプターは、有害なＴ細胞媒介自己免疫疾患のアンタゴニストとして作用し、それにより、これらの疾患のための潜在的な処置を提供する。類似のストラテジーが、可溶性腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）について好首尾で用いられた。そしてこのレセプターの形態は、臨床試験においては、敗血症性ショックおよび慢性関節リウマチについてである（Ｍｏｏｓｍａｙｅｒら，１９９５）。
【０２１１】
本発明の方法では、酵母表面ディスプレイは、単鎖Ｔ細胞レセプターがＭＨＣペプチド複合体またはスーパー抗原に対して高アフィニティーで結合するように操作されることを可能にする。このような分子は、種々の医学的用途を見出す。例としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：１）自己免疫疾患（例えば、関節炎、糖尿病、および多発性硬化症）における健常組織に対する不適切なＴ細胞攻撃を妨害すること；２）Ｔ細胞と相互作用して大量の炎症性反応を導く細菌性スーパー抗原に起因する敗血症性ショックを妨害すること；および３）高アフィニティーＴ細胞レセプターを抗ＣＤ３二重特異性薬剤とともに用いてＴ細胞を再度癌性細胞に攻撃させることによる、Ｔ細胞レセプターリガンド（例えば、特異的腫瘍ペプチド／ＭＨＣ複合体）を保有する腫瘍細胞の破壊。
【０２１２】
（プラスミドおよび株）
単鎖ＴＣＲ遺伝子（修飾された２０５リンカーにより連結されたＶ（８．２−リンカー−Ｖ（３．１）遺伝子（Ｃｈｏら，１９９５））を、製造業者のプロトコルに従って、ＰＣＲによってベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にサブクローニングした。６−Ｈｉｓエピトープタグを、精製目的のためにｓｃＴＣＲのカルボキシ末端に含めた。ｓｃＴＣＲを含有する約８００−ｂｐのＮｈｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔから切り出し、そして９残基のエピトープタグ（ＨＡ）および誘導性ＧＡＬ１プロモーターの下流にＡＧＡ２オープンリーディングフレームを含む酵母表面ディスプレイベクターｐＣＴ２０２に連結した。得られた構築物を、ＧｉｅｔｚおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ（Ｇｉｅｔｚら，１９９５）の酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）形質転換方法により、ＧＡＬ１プロモーター（株ＥＢＹ１００）により制御される、染色体に組み込まれたＡＧＡ１を含有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ５４６５株（ａｕｒａ３−５２  ｔｒｐｌ  ｌｅｕ２Ｄ１  ｈｉｓ３Ｄ２００  ｐｅｐ４：：ＨＩＳ２  ｐｒｂＤ１．６  ｃａｎｌ  ＧＡＬ；Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）に形質転換した。
【０２１３】
（実施例３４：ｓｃＴＣＲランダム変異体ライブラリーの生成）
約５０ｎｇのｐＣＴ２０２／ｓｃＴＣＲを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に製造業者のプロトコルに従って形質転換した。ＳＯＣ培地における１時間の誘導後、回復物を、２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、そして１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する５００ｍｌの液体ＬＢ培地（ＬＢ−ＡＭＰ１００−ＣＡＲＢ５０）に再懸濁した。再懸濁物を、５０−ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中の１５−ｍｌのＬＢ−ＡＭＰ１００−ＣＡＲＢ５０に添加し、そして３７℃にて振盪しながら増殖させた。培養物に新鮮な１５−ｍｌのＬＢ−ＡＭＰ１００−ＣＡＲＢ５０を、対数中期（ＯＤ600（０．２〜０．４））にて補充し、次いで飽和になるまで増殖させた（ＯＤ600約１．０〜１．１；これは、１「サイクル」または１回の変異とみなされた）。わずかな部分のこの培養物（０．７５ｍｌ）を次のサイクルに添加した（１５−ｍｌ  ＬＢ−ＡＭＰ１００−ＣＡＲＢ５０）。６サイクルの増殖後、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ＤＮＡプラスミド調製を、１５−ｍｌ培養物について行った。第６サイクルからの約１０ｍｇのｐＣＴ２０２／ｓｃＴＣＲ  ＤＮＡを、１０チューブの酵母ＥＢＹ１００株の各々にＬｉＡｃ法を用いて形質転換した。１−ｍｌ  ｄｄＨ2Ｏ／チューブ中に再懸濁した後に１０反応物をプールし、１／１０，０００のプールを選択プレート上にプレーティングして形質転換効率を決定した。ライブラリーサイズは約７×１０6であった。５０ｍｌ容量のＳＤ−ＣＡＡ（グルコース２ｗｔ％，Ｄｉｆｃｏ酵母窒素ベース０．６７ｗｔ％，カザミノ酸０．５ｗｔ％）に、残りの培養物を接種し、３０℃にて振盪しながら一晩培養し、ＯＤ600＝０．０５になるように継代し、そして３０℃にてＯＤ600＞１．０になるように一晩増殖させた。次いで、５ｍｌの選択的ガラクトース培地ＳＧ−ＣＡＡ（ここで、２％ガラクトースがＳＤ−ＣＡＡ中のグルコースを置換する）を、ＯＤ600＝０．５になるように接種し、そして２０℃にて約２０〜２４時間（１〜２回の倍加）振盪しながら一晩増殖させた。
【０２１４】
（実施例３５：蛍光活性化細胞選別によるｓｃＴＣＲ変異体ライブラリーの選択）
細胞を、２５ｍＬ  Ｍａｂ  １Ｂ２（抗Ｖｂ８．２Ｖａ３．ｌ；腹水液から調製し、そしてビオチン結合体化した）を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で用いて標識した。サンプルを、約４，０００細胞／秒の事象速度（ｅｖｅｎｔ  ｒａｔｅ）でＣｏｕｌｔｅｒ  ７５３ベンチ（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＵＩＵＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）で選別した。合計６×１０7細胞を、最初の選別の回の間に調べ、この集団のうちの約５％を収集した。収集した細胞を、４ｍｌの選択的グルコース培地ＳＤ−ＣＡＡ中で３０℃にて選別の間に再度増殖させた。約１８〜２０時間後、組換えＡＧＡ１＋ＡＧＡ２−ｓｃＦｖ発現を、５ｍｌ  ＳＧ−ＣＡＡ中で振盪しながら２０℃にて誘導した。合計３回の選別を行い、最初の選別では、富化態様であり（高回収率の全てのポジティブクローン）そして最後の２回の選別では精製態様であった（同時ネガティブ細胞を拒否した）。最後の選別の直後に、収集した細胞を２つの別々の集団（「高発現」および「低発現」）として再度選別、収集し、そして選択プレートにプレーティングして個々のクローンを単離した。２０個のクローンを、フローサイトメトリーによって調べた。
【０２１５】
（実施例３６：酵母表面上での変異ｓｃＴＣＲの誘導および検出）
ｐＣＴ２０２／ｓｃＴＣＲライブラリー選別由来の個々のクローンを、３０℃にて振盪しながら３ｍｌのＳＤ−ＣＡＡ中で一晩増殖させ、続いてＳＧ−ＣＡＡ中で上記の通りに誘導した。培養物を、２０〜２４時間（１〜２回の倍加）後に遠心分離によって収集し、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％アジドを含有するＰＢＳ（１０ｍＭ  ＮａＰＯ4、１５０ｍＭ  ＮａＣＩ、ｐＨ７．３）を用いて洗浄し、そして氷上にて２５Ｌの１０ｍｇ／ｍｌ抗ＨＡ  Ｍａｂ  １２ＣＡ５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、または腹水から調製したビオチン化１Ｂ２  Ｍａｂ（２０ｍｇ／ｍｌ）を用いて４５分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳを用いて洗浄し、そしてＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）2ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）またはストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）結合体（１：１００；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のいずれかを用いて３０分間、氷上にてインキュベートした。標識した酵母細胞を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーターで分析した。事象速度は、約２５０細胞／秒であった。１０，０００事象についてのデータを収集し、そして集団を光散乱（サイズ）に従ってゲートに通して細胞凝集の分析を防止した。野生型（ｗｔ）ＴＣＲおよびいくつかの代表的なＴＣＲ変異体からの結果を図１９に示す。いくつかのこれらの単離体由来の組み合わされた変異を含む二重変異体をまた構築し、そしてこれらのフローサイトメトリーの結果を図２０に示す。
【０２１６】
（実施例３７：変異ｓｃＴＣＲ遺伝子のレスキューおよび配列決定）
ｓｃＴＣＲ酵母（ｗｔおよび２０個の変異体）からのプラスミドを、細胞をボルテックスする代わりにビーズビーター（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）を２分間用いて破砕した以外は、Ｗａｒｄ（Ｗａｒｄ，１９９１）により記載されるプロトコルに従ってレスキューした。細胞を１分間遠心分離し、そして上層（水層）を収集した。Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（登録商標）コンピテント細胞（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を１ｍｌのＤＮＡ調製物を用いるエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換物を、ＬＢ−ＡＭＰ５０上にプレーティングした。ｗｔ  ｓｃＴＣＲおよび２０個の変異体（ｍＴＣＲ１−ｍＴＣＲ２０）の配列決定を、ディスプレイベクターのｓｃＴＣＲに隣接するプライマー、および蛍光自動化配列決定（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＩＵＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて行った。単一変異を、（図２１）に示した単離物の各々についてのＴＣＲにおいて見出した。
【０２１７】
（実施例３８：一重ＴＣＲ変異体、二重ＴＣＲ変異体、および三重ＴＣＲ変異体の表面ディスプレイおよび可溶性発現）
単一部位変異体は、以下の残基を含んでいた：ＶａＬ４３Ｐ（ｍＴＣＲ７）、ＶａＬ１０４Ｐ（ｍＴＣＲ１６）、およびＶｂＧ１７Ｅ（ｍＴＣＲ１５）。二重変異体または三重変異体におけるこれらの変異の組合せは、さらに高いレベルでさえｓｃＴＣＲの表面ディスプレイを生じた。
【０２１８】
酵母表面ディスプレイにより選択された変異ｓｃＴＣＲをより詳細に調べるために、一重変異体（ｍＴＣＲ７、ｍＴＣＲ１５、ｍＴＣＲ１６）、二重変異体（ｍＴＣＲ７／１５、ｍＴＣＲ７／１６、ｍＴＣＲ１５／１６）、ならびに三重変異体（ｍＴＣＲ７／１５／１６）を、コンセンサスシグナル配列（Ｃｌｅｍｅｎｔｓら，１９９１）に基づく合成プレプロ領域とともに、誘導性ＧＡＬ  １〜１０プロモーターの制御下で酵母分泌プラスミド中にクローニングした。構築物を、酵母において発現させ、そして得られた上清を、正しく折り畳まれたＴＣＲタンパク質の尺度として定量的１Ｂ２結合アッセイにおいてモニタリングした。１Ｂ２活性ｓｃＴＣＲ変異体の発現レベルは、野生型ｓｃＴＣＲについての検出できないレベルから、最大レベルを発現した三重変異体まで変化した（図２２）。分泌レベルの順番は、以下の通りであった：三重変異体＞二重変異体＞一重変異体＞野生型。選択されたｓｃＴＣＲ二重変異体を、抗ＴＣＲ抗体カラム（ＫＪ１６−Ａｆｆｉｇｅｌ）を用いてアフィニティー精製し、そして低コピー発現系を用いる絶対分泌レベルは、約１００ｍｇ／Ｌであることが見出された。
【０２１９】
（実施例３９：ＴＣＲ分泌レベルと表面ディスプレイレベルとの比較）
この系におけるｓｃＴＣＲの分泌レベルを、表面ディスプレイ系において発現されたＴＣＲのレベルと直接比較するために、同じ変異体を、フローサイトメトリーを用いて酵母におけるＡｇａ−２融合体として調べた。酵母の表面上に提示されたｓｃＴＣＲを、抗ＨＡ抗体を用いて、続いてフルオレセイン標識二次抗体およびビオチン化１Ｂ２を用いて、続いてストレプトアビジン−フィコエリトリンを用いて標識した。酵母集団の得られた蛍光強度をフローサイトメトリーによりモニタリングし、そして平均蛍光単位として決定した（図２３Ａ）。蛍光のレベルは、一重変異体、二重変異体、および三重変異体の間で変動したが、相対レベルは、酵母分泌系と正確に同じであった（図２３Ｂ）（すなわち、三重変異体＞二重変異体＞一重変異体＞野生型）。従って、この酵母ディスプレイ系は、酵母表面において、より高いレベルで発現されるものを単に選択することにより、分泌可能な発現系において高レベルで生成されるこれらのＴＣＲ変異体を同定し得た。
【０２２０】
（実施例４０：可溶性ＴＣＲの温度安定性）
変異ｓｃＴＣＲについて分泌（および提示）レベルを支配し得るタンパク質の特性を探求するために、変異ｓｃＴＣＲの安定性を、熱変性を行うことにより調査した。酵母ｓｃＴＣＲ上清を、種々の温度で１時間インキュベートし、そしてタンパク質活性を残存した１Ｂ２活性のパーセントとしてモニタリングした。野生型ｓｃＴＣＲが酵母系においては発現されないので、Ｅ．ｃｏｌｉ封入体から再折畳みした野生型ｓｃＴＣＲを比較のために使用した。このｓｃＴＣＲを、チオレドキシン融合タンパク質（ＴＲＸ−ＴＣＲ）として用いた。この融合タンパク質は、タンパク質の安定性および可溶性を増加させることが予測される。結果は、ＴＲＸ−ＴＣＲよりも一重変異体の方が高い熱変性温度を有することを示した（図２４Ａ）。さらに、二重変異体および三重変異体はさらに安定であり、野生型ＴＣＲまたは一重変異体のいずれよりもさらに高い変性温度を有した（図２４Ａ）。
【０２２１】
変異ｓｃＴＣＲについての熱変性の反応速度を、各変異体についての変性速度を比較するために４６℃にて決定した（図２４Ｂ）。さらに、酵母ｓｃＴＣＲ上清およびそれらの１Ｂ２結合活性を、種々の時間の間のインキュベーション後に残存したＴＣＲ活性についてモニタリングした。熱変性速度は、ＴＲＸ−ＴＣＲについて最も高く、そして三重変異体について最も低く、単一変異体および二重変異体は中間の範囲にあった（図２４Ｂ）。アフィニティー精製したｍＴＣＲ１５／１６は、酵母培養上清において直接測定されたｍＴＣＲ１５／１６について決定された類似の熱変性反応速度を有した。このことは、上清中の内因性酵母タンパク質の存在が、測定された変性反応速度に影響を与えないことを示す。
【０２２２】
４８℃にて１時間の後に残存したネイティブなＴＣＲの量を、変異ｓｃＴＣＲについての分泌レベルに対してプロットした場合に直接的な相関が、観察された（Ｓｈｕｓｔａらからの図４＝図２５を必要とする）。従って、ＴＣＲの場合、安定性の固有特性は、分泌効率の信頼性のある予測物であり、ＴＣＲの酵母細胞表面レベルと直接相関した。この相関によって、増加した安定性を示す変異タンパク質を単離するためにより高い表面レベルのタンパク質について選択することにより、このディスプレイ系が用いられ得る。
【０２２３】
（実施例４１：翻訳後修飾および酵母ディスプレイ）
本発明の方法は、酵母において容易に発現され、そして有意に増強された熱安定性を提示する２Ｃ  ｓｃＴＣＲの改変体を同定した。事実、同定した単一部位変異体は、通常不安定であるｓｃＴＣＲを、共有結合的にジスルフィドで「安定化」されたかまたは化学的に架橋された単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と同等に安定であるようであるｓｃＴＣＲへと変換した。ＴＣＲについてはこれは特に重要であり、ＴＣＲは、自己免疫疾患の処置においてアンタゴニストとしての可能性を有する。異種発現された野生型ＴＣＲは、以前は非常に不安定であり、生理学的温度での薬物動態が重要である。
【０２２４】
グリコシル化が、タンパク質の増加した分泌および熱安定性をもたらし得ることが示された。例えば、グルコアミラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成された非グリコシル化形態では、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて生成されたグリコシル形態よりも安定性が低かった。それゆえ、Ｖα領域中に１つのＮ結合型グリコシル化部位を有する、酵母において生成されるｓｃＴＣＲｓの安定性は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成される非グリコシル化ＴＲＸ−ＴＣＲの安定性よりも大きいことが可能であった。しかし、これは、二重変異体および三重変異体が、一重変異体を超える増加した安定性を有し、かつ両方の種がグリコシル化されるので、唯一の説明ではないようである。さらに、野生型ｓｃＴＣＲはまたグリコシル化されることが期待されるとはいえ、酵母における野生型ｓｃＴＣＲの発現は検出されなかった。
【０２２５】
分泌系における種々の変異ｓｃＴＣＲの発現レベルは、酵母ディスプレイ系における表面上でのＴＣＲのレベルと完全に相関した。この関係は、両方の系が同じ分泌装置を必要とするという事実から生じ得る。従って、タンパク質の折畳みおよび安定性に影響を与える変異は、外側（すなわち、細胞表面または分泌される）へのタンパク質輸送の同じ工程に影響を与え得る。これは、酵母において真核生物タンパク質を発現することの（バクテリオファージまたは細菌と比較して）明確な利点である。なぜなら、正しく折り畳まれたタンパク質のみをエキソサイトーシス経路全体を横断させることを確実にする質的な制御機構が存在するからである。
【０２２６】
変異ｓｃＴＣＲ発現レベルはまた、熱変性速度と相関した。この効果は、ウシ膵臓トリプシンインヒビターについて見られた効果と類似している。この効果においては、増加した安定性をもたらした変異がまた、酵母における分泌レベルの増加を導いた。この相関は、折り畳まれた形態における増加した安定性を有するタンパク質が、真核生物の質制御機構により保持および分解されるよりも、適切にパッケージングされ、そして細胞から輸送される可能性の方がより高いという理論を支持する。もちろん、多くの他の因子（例えば、正方向折畳み速度（ｆｏｒｗａｒｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｒａｔｅ）、ジスルフィド結合形成、および小胞体タンパク質折畳み補助物との会合）はまた、重要な役割を果たす。しかし、本発明が実証するように、熱安定性は、以前に不安定でかつほとんど分泌されなかった分子（例えば、ＴＣＲ）についての分泌能力の良好な尺度であるようである。
【０２２７】
本明細書中に提示した知見に基づいて、ほとんど発現されないおよび／または不安定なタンパク質が、より高いレベルで、および／またはより安定な分子として発現されるために系統的に進化され得る方法論を想像し得る。このタンパク質をコードする遺伝子は、ランダムに変異され得、そしてこのライブラリーは、酵母の表面において発現され得る。一旦提示されると、この集団は、高い表面濃度（特異的プローブに起因する高い平均蛍光）を示すクローンについてスクリーニングされ得る。ｓｃＴＣＲについて実証したように、表面発現が改善された改変体は、高いレベルで発現する、より安定な分子であるという可能性を有する。従って、酵母表面ディスプレイは、結晶化、工業的適用、および医学的適用のためにタンパク質の安定性を増加させるための強力な道具であり得る。
【０２２８】
以下の参考文献は、本明細書中で引用された：
【０２２９】
【表２−１】
2010213725.tif 000003
【０２３０】
【表２−２】
2010213725.tif 000004
【０２３１】
【表２−３】
2010213725.tif 000005
【０２３２】
【表２−４】
2010213725.tif 000006
【０２３３】
【表２−５】
2010213725.tif 000007
【０２３４】
本明細書中で言及される任意の特許または刊行物は、本発明が属する当業者のレベルを示す。これらの参考文献は、各々の個々の刊行物が、参考として具体的かつ個別に援用されるのと同じ程度に参考として援用される。
【０２３５】
当業者は、本発明が、目的を実行し、そして言及した目的および利点、ならびにそれに固有の目的および利点を得るようによく適合されることを容易に理解する。本明細書中に記載される、方法、手順、分子、および特定の化合物を伴う本実施例は、現在のところ、好ましい実施態様の代表的なものであり、例示であり、そして本発明の範囲に対する限定ではない。特許請求の範囲により規定される本発明の精神内に含まれるその変更および他の使用を、当業者は、想起する。
【０２３６】
本発明の上記に引用された特徴、利点および目的が達成される主題が、詳細に理解され得るように、添付の図面に図示されるその特定の実施態様を参照することにより、本発明のより特定の記載が理解され得る。これらの図面は、本明細書の一部を形成する。添付の図面は、本発明の好ましい実施態様を図示し、従って、それらの実施態様の範囲の制限を考慮されるべきではないことが、注意されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【配列表】
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