(57)【要約】【課題】細胞群を効率的に洗浄して不要成分が除去された細胞群を回収する。【解決手段】底部に対向した洗浄液の吐出口を有する遠心容器に細胞懸濁液を収容し、底部が半径方向外方に向かうように回転させて細胞を底部に遠心分離する遠心分離工程Ｓ１と、該遠心分離工程Ｓ１において遠心分離された上清を排出する上清排出工程Ｓ２と、該上清排出工程Ｓ２において上清を排出した状態で、遠心容器を回転させた状態で、吐出口から洗浄液を吐出する洗浄工程Ｓ３とを含む細胞洗浄方法を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
底部に対向した洗浄液の吐出口を有する遠心容器に細胞懸濁液を収容し、前記底部が半径方向外方に向かうように回転させて細胞を底部に遠心分離する遠心分離工程と、
該遠心分離工程において遠心分離された上清を排出する上清排出工程と、
該上清排出工程において上清を排出した状態で、前記遠心容器を回転させた状態で、前記吐出口から洗浄液を吐出する洗浄工程とを含む細胞洗浄方法。
【請求項２】
前記洗浄工程によって前記細胞が洗浄された後に、前記遠心分離工程および前記上清排出工程を再度行う請求項１に記載の細胞洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞洗浄方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、脂肪組織を分解して脂肪由来細胞を単離させた細胞懸濁液を収容した遠心分離容器を、該遠心分離容器から離れた軸線回りに回転させることにより、細胞懸濁液内に含有されている成分を比重により分離する遠心分離装置が知られている（特許文献１参照。）。
遠心分離容器は、一端を閉塞された略円筒状に形成され、その閉塞端を半径方向外方に向けるように回転させられることにより、閉塞端に向けて比重の大きい成分が移動し、閉塞端側から比重の大きい順に並んで分離されるようになっている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１２４８０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、細胞懸濁液を遠心分離することにより遠心分離容器の底部に分離された細胞群は遠心力によって押し固められた固形のペレット状に形成されてしまうという不都合がある。すなわち、細胞群がペレット状に形成されてしまうと、遠心分離後の細胞群を吸引により遠心分離容器内から取り出すことが困難になる。また、遠心分離時に細胞群の中にタンパク質分解酵素や脂肪分のような不要成分が取り込まれたままペレット状に形成されてしまうことがあり、不要成分を除去することが困難となる。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞群を効率的に洗浄して不要成分が除去された細胞群を回収することができる遠心洗浄方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、底部に対向した洗浄液の吐出口を有する遠心容器に細胞懸濁液を収容し、前記底部が半径方向外方に向かうように回転させて細胞を底部に遠心分離する遠心分離工程と、該遠心分離工程において遠心分離された上清を排出する上清排出工程と、該上清排出工程において上清を排出した状態で、前記遠心容器を回転させた状態で、前記吐出口から洗浄液を吐出する洗浄工程とを含む細胞洗浄方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、遠心分離工程において、細胞懸濁液を収容した遠心容器の底部を半径方向外方に向けて回転させると、細胞懸濁液内に含有されている成分が比重により分離される。この場合に、遠心容器の底部最下層には、比重の大きな細胞群が集められ、その上層には血漿等の上清が集められる。細胞群は遠心力によって押し固められてペレット状に構成される。
【０００８】
この状態で、遠心容器を、底部が下側となるように鉛直方向に沿って配置し、上清排出工程によって上清を吸引することにより遠心容器の底部に細胞群のペレットを残して上清を容器本体外に排出することができる。
この状態で、洗浄工程において、遠心容器を回転させながら遠心容器の底部に配した吐出口から洗浄液を遠心容器内に吐出させることにより、遠心容器の底部に押し固められていたペレット状の細胞群に吐出された洗浄液が吹き付けられ、ペレット状の細胞群が解れて分散させられる。これにより、遠心分離された際に不要成分が取り込まれてしまった細胞群を解して洗浄液内に放出させることができる。
【０００９】
上記発明においては、前記洗浄工程によって前記細胞が洗浄された後に、前記遠心分離工程および前記上清排出工程を再度行うこととしてもよい。
このようにすることで、洗浄工程によって細胞を洗浄して得られた細胞懸濁液が再度遠心分離工程によって遠心分離されてペレット状の細胞群と上清とに分離される。このとき、不要成分が上清内に放出されるので、上清排出工程を再度行うことによって、内部に取り込まれている不要成分の濃度を低減した細胞群を得ることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞群を効率的に洗浄して不要成分が除去された細胞群を回収することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の一実施形態に係る細胞洗浄方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞洗浄方法は、図１に示されるように、先端に向かって先細になる底部を有する容器本体１と、該容器本体１内の底部２近傍に吐出吸引口３ａを配置した吐出吸引管３と、前記吐出吸引口３ａから軸方向に離れた位置に吸引口４ａを配置した上清吸引管４とを備える遠心分離容器５を用いて行われる。
【００１２】
この細胞洗浄方法は、図２に示されるように、容器本体１内に細胞懸濁液を収容した状態で、底部２が半径方向外方に向かうように回転させることにより、細胞懸濁液を比重によって上清と細胞群とに遠心分離する第１の遠心分離工程Ｓ１と、上清吸引管４の吸引口４ａから吸引することにより、第１の遠心分離工程Ｓ１において遠心分離された上清を容器本体１の外部に排出する第１の上清排出工程Ｓ２と、上清が排出された容器本体１を回転させながら吐出吸引口３ａから洗浄液を吐出して再懸濁する洗浄工程Ｓ３と、該洗浄工程Ｓ３において洗浄液を供給することにより再懸濁された細胞懸濁液を遠心分離することにより上清と細胞群とに分離する第２の遠心分離工程Ｓ４と、上清吸引管４の吸引口４ａから吸引することにより、第２の遠心分離工程Ｓ４において遠心分離された上清を容器本体１の外部に排出する第２の上清排出工程Ｓ５とを含んでいる。
【００１３】
第１の遠心分離工程Ｓ１によって細胞懸濁液を上清と細胞群とに遠心分離すると、細胞懸濁液に含まれている消化酵素液や塵埃等の不要成分が細胞間に取り込まれてペレット状に形成される。この状態で上清排出工程Ｓ２により、容器本体１から上清を排出することにより、容器本体１内にペレット状の細胞群を残すことができる。そして、洗浄工程Ｓ３においては、底部２に対向した吐出吸引管３の吐出吸引口３ａからペレット状の細胞群に対し洗浄液を供給することで、細胞群が再懸濁されて洗浄され細胞群に取り込まれていた不要成分が解放される。
【００１４】
この場合において、本実施形態によれば、洗浄工程Ｓ３において、容器本体１を回転させて遠心運動させながら、容器本体１の底部２に向けて洗浄液を吐出することにより、遠心力を受けた細胞群を容器本体１の底部２に集めつつ洗浄液を供給することができる。これにより、吐出される洗浄液によってペレット状の細胞群が舞い上がってしまわないように、底部２に保持しながら洗浄液を供給することができ、より確実に、ペレット状の細胞群を崩壊させて、内部に取り込まれている不要成分を放出させることができる。
【００１５】
そして、この洗浄工程Ｓ３において細胞群を崩壊させて生成された細胞懸濁液を、その後の第２の遠心分離工程Ｓ４によって、上清とペレット状の細胞群とに遠心分離し、第２の上清排出工程Ｓ５によって、上清を排出することにより、再度、ペレット状の細胞群を得ることができる。このようにして得られた細胞群に含有される不要成分の濃度は、最初に得られた細胞群よりも十分に低下させられている。
【００１６】
図３に、容器本体１を２０Ｇおよび１３０Ｇの遠心加速度で遠心運動させながら吐出吸引口３ａから、１００ｍＬ／ｍｉｎの吐出速度で洗浄液を吐出した場合に、得られたペレット状の細胞群内に残留する消化酵素の濃度をそれぞれ示す。図３には、比較のために遠心運動させることなく１００ｍＬ／ｍｉｎの吐出速度で洗浄液を吐出した場合の残留消化酵素の濃度も示している。
【００１７】
図３によれば、遠心加速度の如何に関わらず、容器本体１を遠心運動させながら洗浄液を細胞群に吐出した場合に得られるペレット状の細胞群内の残留消化酵素濃度は、遠心運動させることなく洗浄液を吐出した場合と比較して大幅に低減していることがわかる。
また、このようにして得られたペレット状の細胞群に含まれる生存している細胞数は、図４および図５に示されるように、洗浄工程における遠心加速度および洗浄液の供給速度に依存することなく得ることができることがわかる。図４は、遠心加速度を２０Ｇに固定して、洗浄液の吐出速度を１００〜３００ｍＬ／ｍｉｎに変化させたときの細胞数、図５は、吐出速度を２００ｍＬ／ｍｉｎに固定して、遠心加速度を２０〜１３０Ｇに変化させたときの細胞数をそれぞれ示している。
【００１８】
このように、本実施形態に係る細胞洗浄方法によれば、残留する不要成分の濃度を十分に抑えた細胞群を得ることができ、不要成分としての消化酵素の濃度が低いので、細胞にダメージを与えることが抑制され、また、移植される細胞群から不要成分を除去して、生体親和性の高い細胞群を得ることができるという利点がある。
また、吐出吸引管３の吐出口３ａから若干の洗浄液を供給して再懸濁した後、吐出吸引管３の吐出口３ａから細胞懸濁液を容器本体１の外部に回収することにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞洗浄方法に用いられる遠心分離容器を示す縦断面図である。
【図２】図１の細胞洗浄方法を示すフローチャートである。
【図３】遠心運動をさせずに洗浄した場合との対比において、異なる遠心加速度で遠心運動させた場合の残留酵素濃度を示すグラフである。
【図４】洗浄液の吐出速度を異ならせて測定した、回収されたペレット状の細胞群内の生存している細胞数を示すグラフである。
【図５】遠心加速度を異ならせて測定した、回収されたペレット状の細胞群内の生存している細胞数を示すグラフである。
【符号の説明】
【００２０】
１  容器本体（遠心容器）
２  底部
３ａ  吐出口
Ｓ１，Ｓ４  遠心分離工程
Ｓ２，Ｓ５  上清排出工程
Ｓ３  洗浄工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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