(57)【要約】【課題】イオン液体を用いてセルロースをより分解するのにより実用的なセルロース含有材料の処理方法を提供する。【解決手段】前記セルロース含有材料と疎水性イオン液体とを、前記セルロース含有材料中に前記疎水性イオン液体を浸透させるように接触させて、セルロース含有材料を処理する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース含有材料の処理方法であって、
前記セルロース含有材料と疎水性イオン液体とを、前記セルロース含有材料中に前記疎水性イオン液体を浸透させるように接触させる工程、
を備える、処理方法。
【請求項２】
さらに、前記疎水性イオン液体と接触後の前記セルロース含有材料に、親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程、を備える、請求項１に記載の処理方法。
【請求項３】
前記接触工程は、前記セルロース含有材料及び前記疎水性イオン液体を加熱することを含む、請求項１又は２に記載の処理方法。
【請求項４】
前記疎水性イオン液体は、フッ化アルキル基含有アニオン種を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の処理方法。
【請求項５】
前記フッ化アルキル基含有アニオン種は、パーフルオロアルキル基含有フルオロホスフェートアニオン及びパーフルオロアルキル基含有スルホニルイミドアニオンから選択される１種又は２種以上である、請求項４に記載の処理方法。
【請求項６】
セルロース含有材料の分解産物の生産方法であって、
前記セルロース含有材料と疎水性イオン液体とを、前記セルロース含有材料中に前記疎水性イオン液体を浸透させるように接触させる工程と、
前記疎水性イオン液体と接触後の前記セルロース含有材料に親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、
前記親水性溶媒相中のセルラーゼにより前記セルロース含有材料のセルロースを分解する工程と、
を備える、生産方法。
【請求項７】
前記セルロースの分解工程後に、親水性溶媒相を回収する工程を備える、請求項６に記載の生産方法。
【請求項８】
前記セルロースの分解工程後の疎水性イオン液体相の少なくとも一部を回収し、前記接触工程において再利用する、請求項６又は７に記載の生産方法。
【請求項９】
疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料を含有する、セルロース含有材料を含有するセルラーゼの酵素反応用媒体。
【請求項１０】
さらに、親水性溶媒を含み、前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を有する、請求項９に記載の酵素反応用媒体。
【請求項１１】
さらに、前記親水性溶媒相にセルラーゼを含有する、請求項１０に記載の酵素反応用媒体。
【請求項１２】
有用物質の生産方法であって、
疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料とセルラーゼを含有する親水性溶媒とを含み、前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系において前記セルロース含有材料中のセルロースを分解して得られた親水性溶媒相中のセルロース分解産物を炭素源として用いて微生物の発酵によって有用物質を生産する工程、
を備える、生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン液体を利用したセルロース含有材料の処理方法、分解物の生産方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
有限である石油資源を代替するものとして、植物の光合成作用に由来するバイオマスへの期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。また、バイオマスを利用し、化成品やバイオ燃料に利用しようとする試みであるバイオリファイナリーの重要性が指摘され、実用化に向けた技術開発が進められている。バイオマスを、エネルギー源やその他の原料として有効利用するためには、バイオマスを動物や微生物が容易に利用可能な炭素源にまで分解・糖化することが必要である。実用化のために解決すべき課題としては、木質系又は草本系のバイオマスの主成分であるセルロース、なかでも結晶性セルロースの効率的な分解方法の開発が挙げられる。
【０００３】
現状の糖化プロセスでは、バイオマスを高温・高圧処理や酸処理により前処理してセルロースを分離後、セルラーゼを作用させている。しかしながら、前処理に多大なエネルギーがかかるうえに大量のセルラーゼが必要となっているため、実用化において大きな課題となっている。
【０００４】
近年、イオン液体がセルロースを可溶化することが報告されている。例えば、クロライド系のイオン液体に１００℃程度の条件下でセルロースを可溶化させる性質が見出されている（特許文献１、非特許文献１）。また、非クロライド系イオン液体が、よりマイルドな条件でセルロースを可溶化できることもわかってきている（特許文献２、非特許文献２、３、４）。
【０００５】
さらに、イオン液体で可溶化したセルロースをセルラーゼで糖化する試みもなされているが、イオン液体中ではセルラーゼが不活性化されるという報告がなされている（非特許文献２，４）。イオン液体でセルロースを可溶化するという前処理を施した後、可溶化後のセルロースを水などの親水性溶媒で洗浄してイオン液体を取り除き、その後、水に投入することでセルラーゼで分解できることが報告されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００５−５０６４０１号公報
【特許文献２】特開２００６−１３７６７７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】R D. Rogerら、J. Am. Chem. Soc. 124(18),4974-4975, 2002
【非特許文献２】大野ら、Polym. Prep. Jpn., 55(1), 2090, 2006
【非特許文献３】大野ら、Polym. Prep. Jpn., 56(1), 2198-2199, 2007
【非特許文献４】R D. Rogerら、Green Chem., 5, 443-447, 2003
【非特許文献５】C A. Schallら、Biotechnol. Bioeng., 95(5), 904-910,2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献２、４では、イオン液体で可溶化したセルロースをセルラーゼで分解するために、セルラーゼをポリオエチレンオキシド（ＰＥＯ）等で安定化することが有効である可能性が示唆されている。しかしながら、現時点で得られている安定化セルラーゼが十分なセルロース分解活性を有しているわけではない。また、非特許文献５に記載のように、イオン液体でセルロースを可溶化する場合、イオン液体をセルロースから除去するための丹念な洗浄操作を要するとともに、それでもなお相当程度大量のセルラーゼを必要とすることがわかった。また、セルロースの分解・糖化を、イオン液体によってセルロース可溶化したのとは別の反応場で行わなければならないということは、効率的なセルロースの分解・糖化には不都合であった。
【０００９】
以上のように、現状において、イオン液体を用いてセルロースを効率的に分解することは依然として困難であった。加えて、工業プロセスにおけるセルロースの糖化のためには、分解後の糖化物を効率的に回収し、イオン液体を再利用することも要請される。
【００１０】
本発明は、イオン液体を用いてセルロースをより分解するのにより実用的なセルロース含有材料の処理方法、当該処理方法を利用したセルロース含有材料の分解産物の生産方法、有用物質の生産方法等を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記した課題を解決するために鋭意検討したところ、セルロース含有材料を疎水性イオン液体で処理し、その後、この処理液を水などの親水性溶媒と接触させることで、疎水性イオン液体と反溶媒との二相界面に処理物を局在させることができるという知見を得た。さらに、この反溶媒相にセルラーゼを添加することにより、そのセルラーゼによりセルロースを分解できるという知見も得た。本明細書の開示はこれらの知見に基づいて提供される。
【００１２】
本明細書の開示によれば、セルロース含有材料の処理方法であって、前記セルロース含有材料と疎水性イオン液体とを、前記セルロース含有材料中に前記疎水性イオン液体を浸透させるように接触させる工程、を備える、処理方法が提供される。この処理方法は、さらに、前記疎水性イオン液体と接触後の前記セルロース含有材料に、親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程、を備えることもできる。また、前記接触工程は、前記セルロース含有材料及び前記疎水性イオン液体を加熱することを含んでいてもよい。
【００１３】
本処理方法においては、前記疎水性イオン液体は、フッ化アルキル基含有アニオン種を有することが好ましく、より好ましくは、前記フッ化アルキル基含有アニオン種は、パーフルオロアルキル基含有フルオロホスフェートアニオン及びパーフルオロアルキル基含有スルホニルイミドアニオンから選択される１種又は２種以上である。
【００１４】
本明細書の開示によれば、セルロース含有材料の分解産物の生産方法であって、前記セルロース含有材料と疎水性イオン液体とを、前記セルロース含有材料中に前記疎水性イオン液体を浸透させるように接触させる工程と、前記疎水性イオン液体と接触後の前記セルロース含有材料に親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、前記親水性溶媒相中のセルラーゼにより前記セルロース含有材料のセルロースを分解する工程と、を備える、生産方法が提供される。
【００１５】
本生産方法においては、前記セルロースの分解工程後に、親水性溶媒相を回収する工程を備えていてもよい。また、前記セルロースの分解工程後の疎水性イオン液体相の少なくとも一部を回収し、前記接触工程において再利用するようにしてもよい。
【００１６】
本明細書の開示によれば、疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料を含有する、セルロース含有材料を含有するセルラーゼの酵素反応用媒体が提供される。本媒体は、さらに、親水性溶媒を含み、前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を有していてもよい。また、さらに、前記親水性溶媒相にセルラーゼを含有していてもよい。
【００１７】
本明細書の開示によれば、有用物質の生産方法であって、疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料とセルラーゼを含有する親水性溶媒とを含み、前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系において前記セルロース含有材料中のセルロースを分解して得られた親水性溶媒相中のセルロース分解産物を炭素源として用いて微生物の発酵によって有用物質を生産する工程、を備える、生産方法が提供される
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明のセルロースの処理方法及びセルロースの分解産物の生産方法等の一例を示す図である。
【図２】疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との二相系の界面におけるセルロースの分解の一態様を模式的に示す図である。
【図３】実施例１における操作の概要を示す図である。
【図４】疎水性イオン液体と水との二相系における水相中のグルコース濃度の測定結果を示す図である。
【図５】結晶性セルロースを滅菌水を添加したときの状態（左側）と疎水性イオン液体と結晶性セルロースとを接触後クエン酸緩衝液を添加したときの状態(右側)を示す図である。
【図６】二相系におけるグルコースへの変換効率の測定結果を示す図である。
【図７】二相系に用いる疎水性イオン液体の種類とグルコースへの変換効率の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書の開示は、セルロース含有材料の処理方法、セルロース分解産物の生産方法等に関する。本明細書の開示によれば、セルロース含有材料と疎水性イオン液体とを接触させることにより、セルロース含有材料のセルロースを含むマトリックスに疎水性イオン液体が浸透する。この結果、セルロース含有マトリックスの少なくとも一部が崩壊すると考えられる。これにより、セルラーゼがその基質であるセルロース等にアクセスしやすい状態が形成される。さらに、その後、疎水性イオン液体と接触後のセルロース含有材料に水性媒体などの親水性溶媒を供給することにより、疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料を含む疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との二相系が形成される。
【００２０】
上記処理方法で形成された二相系においては、その界面にセルロースを含む画分が局在され濃縮される。界面に局在するセルロースは、その界面において親水性溶媒中のセルラーゼによって分解される。このとき、疎水性イオン液体相により、界面に局在し濃縮されたセルロースはセルラーゼがアクセスしやすい状態が形成されている。一方、親水性溶媒相によりセルラーゼは親水性溶媒中に存在することになる。このため、セルラーゼは界面近傍のセルロースに作用するのにあたり疎水性イオン液体に接触するものの、疎水性イオン液体との接触は抑制されており、その酵素活性は確保されやすくなっている。これらの結果、セルラーゼによりセルロースが効率的に分解される。
【００２１】
疎水性イオン液体によるマトリックスの崩壊によって親水性溶媒に対して親和性が高い部分を有するセルロース又はその一部が生成された場合には、当該親水性部分は親水性溶媒相に移行しセルラーゼにより分解される。このように、親水性溶媒に親和性のあるセルロース又はその一部がマトリックス崩壊により生成されたとしても、親水性溶媒相に移行して確実に分解され回収される。これは、セルラーゼによる分解に先だって疎水性イオン液体を水等による洗浄を伴わないで、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相の二相系を形成した状態でセルロースを分解するためである。この結果、セルロース含有材料中のセルロースを高率にその糖化物に変換することができる。
【００２２】
また、二相系ゆえに、疎水性イオン液体はそれ自体分離回収が容易である。セルロースの分解産物であるグルコース等は親水性溶媒相に移行する。このため、セルロース分解産物は親水性溶媒相としてあるいは当該溶媒相から容易に分離回収される。
【００２３】
本明細書の開示によれば、疎水性イオン液体とセルロース含有材料とを接触させてセルロース含有材料に疎水性イオン液体を浸透させることで、その後親水性溶媒を供給したときに二相系を形成できる。その結果、セルラーゼによるセルロースの効率的な分解とその回収並びに疎水性イオン液体の分離回収及び再利用が可能となる。また、これにより、セルロース含有材料を効率的に有用物質に変換できるようになる。
【００２４】
以下、本明細書に開示される各種の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法、セルロース分解産物の生産方法及び有用物質の生産方法の概要の一例を示す図であり、図２は、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との二相系の界面におけるセルロースの分解の一態様を模式的に示す図である。
【００２５】
（セルロース含有材料）
本明細書において、セルロースとは、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体をいう。セルロースにおけるグルコースの重合度は特に限定しないが、好ましくは２００以上である。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。また、セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースを含んでいてもよい。さらに、セルロースは、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体であってもよい。セルロース は、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよいが、好ましくは結晶性セルロースを含む。さらに、セルロースは、天然由来のものでも、人為的に合成したものでもよい。セルロースの由来も特に限定しない。植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。
【００２６】
セルロースは、天然では植物細胞壁の主たる構成成分として存在し、多糖としては地球上で最も多く生産されている。植物細胞壁において、セルロースは、結晶性セルロース領域と非晶質セルロース領域とを形成している。また、セルロースは、植物細胞壁において、リグニンやヘミセルロースと複合化されたセルロース含有マトリックスを形成している。
【００２７】
本明細書において、セルロース含有材料とは、上記したセルロースを含むものであればよい。したがって、セルロースは結晶性セルロースであっても非結晶性セルロースであってもよく、セルロースのほか、ヘミセルロースやリグニンを含んでいてもよい。セルロース含有材料としては、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲ワラなどの各種ワラ、籾殻、バガス、木材チップなどの農産廃棄物、古紙、建築廃材などの各種廃棄物などを含むバイオマス（木質系及び草本系）が挙げられる。
【００２８】
本明細書に開示される各種実施形態に適用されるセルロース含有材料は特に限定されない。後述する実施例においても開示するように、疎水性イオン液体は、結晶性セルロースであってもその一部を可溶化又は崩壊又は溶解できることがわかっている。すなわち、結晶性セルロースのように、水素結合により強固に相互作用して結晶性の高い領域であっても、疎水性イオン液体は浸透し、その構造を緩和してセルラーゼによる分解を促進できる。このため、疎水性イオン液体にセルロースを含むマトリックスの崩壊・可溶化又は溶解に作用することができれば、本処理方法に適用できると考えられる。また、疎水性イオン液体のセルロースを含むマトリックスへの作用を考慮すると、セルロース含有材料は水に不溶性あるいは難溶解性のものであることが好ましい。かかるセルロース含有材料としては、結晶性セルロースを含有するセルロース含有材料が挙げられ、また、例えば、セルロースのほかリグニン及び／又はヘミセルロースを含有する植物細胞壁由来のセルロース含有マトリックスを含む材料が挙げられる。典型的には、草本系や木質系のバイオマスが挙げられる。
【００２９】
（セルロース含有材料の処理方法）
本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法は、セルロース含有材料と疎水性イオン液体とを、前記セルロース含有材料に前記疎水性イオン液体が浸透するように接触させる工程（以下、接触工程という。）を備えることができる。さらに、本明細書に開示される処理方法は、疎水性イオン液体と接触後のセルロース含有材料に疎水性イオン液体に対する親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程（以下、二相系形成工程という。）を備えることができる。
【００３０】
（接触工程）
本明細書に開示される接触工程は、液相である疎水性イオン液体と固相であるセルロース含有材料とを接触させる工程である。疎水性イオン液体は、セルロース含有材料のセルロースを含むマトリックスに浸透性を有しており、セルロース含有材料の少なくとも一部を崩壊させその構造を緩和することができる。本明細書の開示を拘束するものではないが、セルロースは疎水性領域と親水性領域とを併せ持つ高分子材料であるため、その疎水性領域と疎水性イオン液体との相互作用により疎水性イオン液体がセルロース含有マトリックスに浸透し、その少なくとも一部を破壊するものと考えられる。また、セルロース含有材料が、セルロース以外にヘミセルロースやリグニンを含むセルロース含有マトリックスを備えている場合には、同様に、これらの成分の疎水性領域と相互作用して、セルロース含有マトリックスに浸透し、その一部を崩壊するものと考えられる。
【００３１】
（疎水性イオン液体）
本明細書において、疎水イオン液体は、水と二相分離するイオン液体をいうものとする。なお、温度変化によって水と二相分離するイオン液体であってもよい。接触工程に適用される疎水性イオン液体は、特に限定されない。セルロース含有材料に浸透可能な疎水性イオン液体であればよい。例えば、セルロース含有材料に対して浸透性を有する疎水性イオン液体は、例えば、セルロース含有材料と混合したとき、セルロース含有材料を疎水性イオン液体の下方への集積を抑制して懸濁ないし分散することができる。また、その疎水性イオン液体と接触後に親水性溶媒相中のセルラーゼのアクセスを容易化できる疎水性イオン液体であってもよい。
【００３２】
イオン液体は、その融点が１００℃以下であることが好ましく、より好ましくは８０℃以下である。さらに好ましくは４０℃以下であり、最も好ましくは２０℃以下である。
【００３３】
疎水性イオン液体としては、特に限定されないが、例えば、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、炭化水素基等で置換された置換イミダゾリウム塩、置換ピリジニウム塩、置換ピペリジニウム塩（脂環式第４級アンモニウム塩）、第三級スルホニウム塩等が挙げられ、本発明のイオン液体としては、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、置換イミダゾリウム塩、置換ピリジニウム塩及び置換ピペリジニウム塩が好ましく、なかでも第四級アンモニウム塩及び第四級ホスホニウム塩が好ましい。第４級アンモニウム塩、第４級ホスホニウム塩、置換イミダゾリウム塩、置換ピリジニウム塩及び置換ピペリジニウム塩をそれぞれ一般式(I)〜（V）として表す。
【００３４】
【化１】
2010220490.tif 000002
【００３５】
疎水性イオン液体の構成カチオン種としては、一般式（Ｉ）に示すように、同一または相異なる４つ置換基が窒素原子に結合したアンモニウムカチオン、一般式(II)に示すように、同一または相異なる４つの置換基がリン原子に結合したホスホニウムカチオン、一般式（III）に示すように、イミダゾール環の２つの窒素原子が同一又は相異なる置換基と結合したイミダゾリウムカチオン、一般式（IV）に示すように、ピリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピリジニウムカチオン、一般式(V)に示すように、ピペリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピペリジニウムカチオン、同一または相異なる３つの置換基がイオウ原子に結合したスルホニウムカチオンなどが挙げられる。なお、環状構造を有するカチオン種にあっては、各種環上の炭素原子に低級アルキル等の置換基が結合されていてもよい。
【００３６】
好ましい構成カチオン種としては、イミダゾール環の２つの窒素原子が同一又は相異なる置換基と結合したイミダゾリウムカチオン、ピリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピリジニウムカチオン及びピペリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピペリジニウムカチオンが挙げられる。なお、これらの環状体は、２個が連結されるなどの多環構造を形成していてもよい。
【００３７】
これらのカチオン種における置換基（一般式（I）〜(V)中においてはＲ１〜Ｒ４で表される。）としては、それぞれ独立に炭素数１〜１８であって、直鎖状又は分岐状のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基等であることが好ましい。好ましいアルキル基としては、炭素数１〜１８の直鎖状のアルキル基が挙げられる。具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基などが挙げられる。また、ベンジル基、ベンザル基、ベンジリデン基などの芳香族系炭化水素基であってもよい。好ましいアルケニル基としては、低級アルキル基等で置換されていてもよいアリル基（２−プロペニル基）などがあげられる。また、置換基には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基の炭素数１〜４程度のアルキル基を備えるアルコキシ基を有していてもよい。好ましくは、２−メトキシエチル基のように、アルキル鎖の末端にアルコキシ基を備える。
【００３８】
好ましいカチオン種としては、例えば、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムカチオンなどの非対照イミダゾリウムカチオン、１−（２−メトキシ）エチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンなどの非対照イミダゾリウムカチオン、１−ブチル−１−メチルピロリジウムイオンなどの非対照ピロリジウムカチオン、１，３−ジアリルイミダゾリウムカチオン等が挙げられる。
【００３９】
疎水性イオン液体の構成アニオン種としては、例えば、ビス（トリフルオロメタン）スルホンイミドアニオン（(ＣＦ3ＳＯ2)2Ｎ-）などのビス（パーフルオロアルカン）スルホンイミドアニオン、パーフルオロアルカン基で置換されていてもよいヘキサフルオロアンチモネートアニオン（ＳｂＦ6-）、トリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェートアニオンなどのパーフルオロアルカン基で置換されていてもよいヘキサフルオロホスフェートアニオン（ＰＦ6-）、パーフルオロアルカン基で置換されていてもよいテトラフルオロボレートアニオン（ＢＦ4-）など、塩素アニオン（Ｃｌ-）、臭素アニオン（Ｂｒ-）、ヨウ素アニオン（Ｉ-）などのハロゲンアニオン、アルカンスルホネートアニオン、パーフルオロアルカンスルホネートアニオン（ＣＦ3ＳＯ3-など）、酢酸アニオン（ＣＨ3ＣＯ2-）、パーフルオロ酢酸アニオン（ＣＦ3ＣＯ2-）、硝酸アニオン（ＮＯ3-）などが挙げられる。
【００４０】
好ましいアニオン種としては、フッ化アルキル基含有アニオン種が挙げられる。フッ化アルキル基は、好ましくはパーフルオロアルキル基である。かかるアニオン種としては、例えば、ビス（トリフルオロメタン）スルホンイミドアニオン（(ＣＦ3ＳＯ2)2Ｎ-）などのパーフルオロアルキル基含有スルホニルイミドアニオンやトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロフェートアニオンなどのパーフルオロアルキル基含有フルオロホスフェートアニオンが挙げられる。
【００４１】
イオン液体は、カチオンとアニオンとの組み合わせであり、上述したカチオン種及びアニオン種を含む従来公知のカチオン種及びアニオン種を適宜組み合わせて用いることができる。疎水性イオン液体は、商業的に入手できるものであるほかは、公知の方法で合成することができる。合成方法は特に限定されないで、カチオンを塩化物との塩として合成、精製し、その後、得ようとするイオン液体のアニオンの塩と反応させるなどするか、一旦水酸化物とした上でアニオンを含む酸で中和してもよい。
【００４２】
イオン液体の純度は高いことが好ましい。イオン液体の合成工程の不純物は、イオン液体と親水性溶媒とを混合して得られる媒体のｐＨに大きく影響し、結果として酵素の触媒活性に大きく影響する場合があるからである。本発明者らによれば、例えば、イミダゾリウム系カチオンを用いるイオン液体の場合、純度が低いほど水や緩衝液などの親水性溶媒と混合したときのｐＨがアルカリにシフトしやすく、セルラーゼによるセルロース分解活性が低下する傾向があることがわかっている。
【００４３】
以上の疎水性イオン液体は、単独で用いることができるほか、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。こうした疎水性イオン液体又はその組み合わせは、それ自体、セルロース含有材料の構造緩和、分解・糖化用の媒体として有用である。かかる媒体によれば、セルロースをセルラーゼで効率的に分解し、しかも、当該媒体の回収再利用及び分解産物の回収を容易化することができる。
【００４４】
セルロース含有材料と疎水性イオン液体とを接触させる方法は特に限定されない。セルロース含有材料は疎水性イオン液体が含浸して浸透されていれば足り、必ずしも疎水性イオン液体中にセルロース含有材料が浸漬され、分散され、あるいは懸濁された状態であることを要しない。セルロース含有材料に疎水性イオン液体を浸透させるには、例えば、図１に示すように、十分量の疎水性イオン液体中にセルロース含有材料を供給し浸漬するようにしてもよいし、セルロース含有材料に対して疎水性イオン液体を噴霧等によりセルロース含有材料に浸透させるのに必要量程度供給し、セルロース含有材料に疎水性イオン液体を含浸させるようにしてもよい。
【００４５】
セルロース含有材料中に疎水性イオン液体を浸透させるための処理は適宜設定することができる。適度に、例えば、４０℃以上１５０℃以下程度、好ましくは５０℃以上１５０℃以下程度に加熱してもよい。加熱を行うことで、疎水性イオン液体のセルロース含有材料への浸透を促進することができる。１５０℃を超えると、セルロース含有材料の種類によっては好ましくない反応が生じる可能性があり、４０℃未満では、加熱の効果が得られにくいからである。また、必要に応じて、攪拌を行ってもよい。さらに、超音波処理を行ってもよい。これらの各種処理は、単独で採用してもよいが、適宜組み合わせて採用してもよい。処理の種類は、用いる疎水性イオン液体の種類やセルロース含有材料によっても適宜変更される。
【００４６】
なお、後段の二相系形成工程において、疎水性イオン液体量を低減するには、浸透に必要量程度の疎水性イオン液体をセルロース含有材料に供給してもよいし、十分量の疎水性イオン液体に浸漬したセルロース含有材料を、その後、ろ過や遠心分離等の固液分離手段により疎水性イオン液体から分離してもよい。
【００４７】
このような接触工程の実施により、セルロース含有材料には疎水性イオン液体が浸透され、そのセルロース含有マトリックスの緩んだようになっているものと考えられる。疎水性イオン液体によってセルロース含有材料の構造が緩和されることにより、水性媒体などの親水性溶媒と接触して二相系が形成されたとき、セルロースの親水性領域が親水性溶媒相との界面に露出されやすくなり、界面のセルロースが親水性溶媒相中のセルラーゼによって分解されると考えられる。したがって、こうした接触工程を経て疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料は、その後、セルラーゼ等によるセルロースの分解に供することができる。
【００４８】
（二相系形成工程）
さらに、本明細書に開示される処理方法は、二相系形成工程を備えることもできる。疎水性イオン液体が浸透したセルロース含有材料に親水性溶媒を供給することで二相系を構成できる。これにより、セルロース含有材料を親水性溶媒相との界面に局在・濃縮でき、セルラーゼ等によりセルロースを分解するのに適した環境を形成することができる。
【００４９】
疎水性イオン液体に対して供給する液体は、疎水性イオン液体と二相系を構成できるものであって（疎水性イオン液体と二相系を形成可能な程度に親水性の溶媒であって）、セルロースの分解産物のうち少なくともグルコースの良溶媒となる親水性溶媒であればよい。また、ここで使用する疎水性イオン液体は、異なる２種類以上のものを混合して用いてもよい。かかる液体としては、例えば、水性の液体であって、水又は水と相溶性のある有機溶媒との混液が挙げられる。有機溶媒としては、炭素数が１〜４程度の低級アルコールが挙げられる。また、当該液体には、セルロースの分解産物であるグルコース等の溶解のため、あるいはセルラーゼによる酵素反応に適したｐＨや塩濃度を形成するための酸、アルカリあるいは塩類が含まれていてもよい。典型的には、二相系形成時において親水性溶媒相に酵素反応に適したｐＨを付与できる緩衝液や塩溶液が挙げられる。親水性溶媒には、酵素反応に必要な金属イオンを含めることもできる。さらに、セルラーゼ等に酵素を予め含有していてもよい。酵素反応を考慮した塩類及び酵素は、必ずしも二相系形成工程において親水性溶媒に含まれることを要するものではない。少なくともセルロースの分解時においてこれらを添加するようにしてもよい。
【００５０】
二相系を形成する方法や二相系の形態は特に限定されない。疎水性イオン液体に浸漬、分散又は懸濁されたセルロース含有材料に対して親水性溶媒を供給してもよいし、疎水性イオン液体が含浸されただけのセルロース含有材料に親水性溶媒を供給してもよい。また、セルラーゼがアクセスしやすくなる程度に疎水性イオン液体がセルロース含有材料に浸透されていれば足りる。したがって、疎水性イオン液体にセルロース含有材料を浸漬等した状態の場合には、ことから、過剰量の疎水性イオン液体を分離除去しておくことが好ましい。なお、二相系の形成にあたっては、セルロース含有材料と親水性溶媒とを十分に接触させるために、適宜攪拌してもよい。また、適当な温度での加熱を伴っていてもよい。
【００５１】
形成される二相系は、疎水性イオン液体がセルロース含有材料に浸透し、セルロース含有材料を液相中に浸漬、分散又は懸濁した状態で保持されるときには、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相とで明らかな二相系が形成される。一方、疎水性イオン液体がセルロース含有材料に浸透しているが、セルロース含有材料が浸漬等された状態となるような過剰量では存在しない場合には、親水性溶媒中に疎水性イオン液体が浸透したセルロース含有材料が存在するような二相系が形成される。後者の二相系では、セルロース含有材料自体が実質的な疎水性イオン液体相となっている。なお、このような場合であっても、セルロース含有材料は、親水性溶媒相との界面近傍に局在しているといえる。
【００５２】
こうした二相系の形成工程の実施により、セルロース含有材料は、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との界面に局在、濃縮される。これは、セルロース含有材料に含まれるセルロース等の親水性領域との親水性溶媒相との相互作用によるものと推測される。二相系の界面においては、親水性領域が親水性溶媒相側に露出された状態となっていると推測される。このようなセルロース含有材料の局在・濃縮及び親水性溶媒相への露出は、親水性溶媒相に存在するセルラーゼによるセルロースの分解に適した状態になっている。同時に、二相系は、疎水性イオン液体の回収と分解産物の回収にも好ましい系になっている。
【００５３】
以上説明したように、本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法によれば、セルロース含有材料のセルロースを含有するマトリックスの構造を緩和して、セルラーゼがアクセスしやすい環境を形成することができる。さらに、二相系を形成することでセルラーゼによるセルロースの分解に適し、疎水性イオン液体と分解産物の双方の分離回収に適した環境を形成することができる。
【００５４】
（セルロース含有材料を分解するための酵素反応用媒体）
本明細書の開示によれば、疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料を含有する、セルラーゼの酵素反応用媒体が提供される。かかる酵素反応用媒体によれば、疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料は、それ自体、セルラーゼによるセルロースの分解に適した状態となっている。酵素反応用媒体は、親水性溶媒を含んで疎水性イオン液体との二相系を有していてもよい。かかる二相系は、さらにセルロースの分解に適したものとなっている。
【００５５】
なお、かかる酵素反応用媒体は、基質をセルロース含有材料のセルロースとし、酵素をセルラーゼとするものであるが、疎水性イオン液体による構造緩和作用が発揮される基質含有材料であればほかの物質とその分解酵素にも適用が可能である。すなわち、酵素が作動可能な環境下では難溶性の基質形態を採るものであっても、酵素を作用させて利用しやすくすることができる。
【００５６】
基質としては特に限定しないが、天然多糖や天然樹脂、合成多糖や合成樹脂などを含む高分子が挙げられる。天然多糖としては、例えば、セルロース、キシラン、キチン及びキトサンが挙げられる。また、酵素は基質の種類によるが、セルロースを基質とする場合には、既に説明したセルラーゼであり、キシランにはキシラナーゼ、キチンやキトサンには、キチナーゼ等が挙げられる。
【００５７】
疎水性イオン液体は、特に限定されないが、基質の種類等に応じて決定される。公知のイオン液体から適宜選択して用いることができる。例えば、セルロースを基質とする場合には、既に説明した疎水性イオン液体を好ましく用いることができる。また、セルロースに好ましく用いることのできるイオン液体は、類似した構造を有するキチンやキトサンにも好ましく用いることができる。
【００５８】
なお、疎水性イオン液体の特性の変動によるｐＨシフトやｐＨ変動の酵素活性及び分解効率への悪影響を抑制又は回避可能な反応媒体を調製するには、用いるイオン液体と親水性溶媒が接触したとき生じる可能性のあるｐＨシフトを補正し又はｐＨ変動を緩衝するのに十分な調整能力を有する親水性溶媒を用いることが好ましい。酵素反応用媒体には、さらに、基質に作用させるための酵素を含んでいてもよい。酵素は、予め親水性溶媒に添加してあってもよいし、二相系を形成後に添加されるものであってもよい。
【００５９】
（セルロース含有材料の分解産物の生産方法）
本明細書の開示によれば、図１に示すように、上記接触工程と、上記二相系形成工程と、セルロース分解工程と、を備えるセルロース含有材料の分解産物の生産方法が提供される。本明細書に開示される生産方法によれば、セルロースのセルラーゼによる分解に適しており、しかも、疎水性イオン液体の分離回収及び再利用と、グルコース等の分解産物の回収に適し二相系を備えているため、実用的なレベルでのセルロース含有材料の分解利用が可能となっている。なお、接触工程と二相系形成工程に関しては、上記処理方法において説明した各種の態様をそのまま適用することができる。なお、セルロースの分解産物としては、セルロースの低分子化されたものであればよい。より具体的には、最終分解産物であるグルコースのほか、セロビオース及びセロオリゴ糖が挙げられる。
【００６０】
（セルロース分解工程）
セルロース分解工程は、親水性溶媒相中のセルラーゼによりセルロースを分解する工程である。セルラーゼは、セルロースをグルコースにまで加水分解するのに作用する各種の酵素の総称である。セルラーゼとしては、狭義には、β１，４−エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、グルカン１，４−βグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）、セルロース１，４−βセロビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、βグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）等が挙げられる。また、セルラーゼは、天然由来であっても人工的に改変されたものであってもよい。天然由来のものとしては、特に限定しないが、Trichoderma属又はAspergillus属由来のセルラーゼなどを好ましく用いることができる。また、７０℃以上で高い活性を示し、９０℃から１００℃でも活性を維持する耐熱性セルラーゼを用いることもできる。例えば、Pyrococcus属に代表される超好熱性古細菌由来のセルラーゼであってもよい。本発明においては、上記した狭義のセルラーゼを１種類又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。異種のセルラーゼでなく、同種であっても２種類以上組み合わせてもよい。また、由来の異なるセルラーゼを組み合わせて用いることもできる。また、セルラーゼは、適当な担体に保持された形態であってもよい。
【００６１】
また、セルロース分解工程では、植物細胞壁においてセルロースと複合体を形成しているヘミセルロースを分解する酵素を用いることもできる。ヘミセルロースとしては、キシラン、マンナン、グルコマンナン等が挙げられる。ヘミセルロースの分解酵素としては、キシラナーゼ等が挙げられ、こうした酵素は、上記のTrichoderma属やAspergillus属等のセルロース分解性微生物に由来するものであってもよい。また、Pyrococcus属に代表される超好熱性古細菌由来のセルラーゼなどの耐熱性セルラーゼであってもよい。
【００６２】
セルラーゼは、二相系形成工程において予め親水性溶媒に含めておいてもよいし、セルラーゼ分解工程において、親水性溶媒相に添加してもよい。セルラーゼの添加時においては、親水性溶媒相は、酵素活性の発現に適した環境であることが好ましい。酵素反応の安定性や操作の簡便性を考慮すると、親水性溶媒相は、用いるセルラーゼの至適ｐＨを含む酵素活性に適したｐＨ範囲に一致する範囲に緩衝能を有する緩衝液を用いることが好ましい。一般的なセルラーゼの典型的な好適ｐＨは４〜６程度であるため、例えば、クエン酸緩衝液（クエン酸及びクエン酸ナトリウム）、酢酸緩衝液（酢酸−酢酸ナトリウム）、クエン酸−リン酸緩衝液（クエン酸−リン酸二水素ナトリウム）等が挙げられる。こうした緩衝液の濃度やｐＨを適宜調製して、親水性溶媒相のｐＨを４以上６以下、より確実には、４．０以上６．０以下となるように設定することが好ましい。
【００６３】
セルラーゼによるセルロース分解のための温度や時間は特に限定されない。セルラーゼの種類にもよるが、通常、３０℃〜７０℃程度、好ましくは３５℃〜４５℃程度で、ｐＨ２以上６以下程度とし、数時間から数十時間程度実施する。耐熱性セルラーゼを用いる場合は、７０℃以上１００℃以下であってもよい。
【００６４】
セルロース分解工程によれば、疎水性イオン液体によりセルロースマトリックスの構造が緩和されかつ一部が親水性溶媒相との界面に露出された二相系が形成されているため、親水性溶媒相中のセルラーゼがセルロースを効率的に分解することができる。しかも、グルコースなどセルロースの低分子化物（二糖やオリゴ糖を含む分解産物）は、親水性溶媒相に移行するため、一層セルラーゼにより分解されやすくなる。後述するように、親水性溶媒相からは、分解産物を容易に回収できる。
【００６５】
このようなセルロース分解工程を実施することで、たとえば、図２に示すようにして、セルロースはセルラーゼにより分解され、かかる低分子化によって構造緩和が一層促進され、セルラーゼによる分解も促進される。また、分解産物は、親水性溶媒相に移行し、さらにセルラーゼにより分解されることもある。一方、後述するように、未分解のセルロース、ヘミセルロース、リグニンなどのセルロース含有由来の炭素原は、固液分離手段により固相として分離されるため、再度の分解等の処理が可能であり、炭素原の損失を十分に抑制又は回避できる。また、後述するように、疎水性イオン液体も容易に分離回収され再利用できる。
【００６６】
（分解産物の回収工程）
図１に示すように、セルロース分解工程後、親水性溶媒相を回収することができる。二相系は分解工程後も維持され、親水性溶媒相は容易に回収される。通常、疎水性イオン液体相は親水性溶媒相よりも比重が大きく、親水性溶媒相が上相、疎水性イオン液体相が下相となっている。したがって、通常は、上相を回収すればよい。回収した親水性溶媒相は疎水性イオン液体を実質的に含んでいないため、そのまま、たとえば後段で説明する有用物質の生産方法における発酵工程等に利用できる。また、必要に応じて濃縮されてもよい。なお、親水性溶媒相にはセルラーゼが含まれているが、公知の方法で分離回収も可能である。セルラーゼを固相担体に固定化しておくことで分離回収は容易になる。
【００６７】
（疎水性イオン液体の回収工程）
図１に示すように、セルロース分解工程後、疎水性イオン液体を回収することができる。二相系のため、疎水性イオン液体は容易に回収される。また、図１に示すように、回収された疎水性イオン液体相は、再度、接触工程に供給してセルロース含有材料に浸透させるための疎水性イオン液体として再利用や循環利用が可能である。疎水性イオン液体は、高価であるためかかる循環利用が可能となることでセルロースの糖化がより現実的となる。なお、疎水性イオン液体は、セルロース含有マトリックスの構造緩和作用を有しているが、セルロースを溶解するものではない。また、水可溶性画分は、親水性溶媒相に移行され、未分解の固相（セルロース含有材料の分解残渣）は後述するように固液分離手段で分離される。したがって、疎水性イオン液体相へのセルロース含有材料由来成分の溶解は、回避又は抑制されている。
【００６８】
なお、界面に局在するなどして残存したセルロース含有材料の分解残渣は、固液分離手段によって回収できる。かかる残留物については再度、接触工程〜分解工程を実施することもできる。残留物は、用いたセルロース含有材料の種類やセルラーゼの種類等によるが、ヘミセルロースやリグニン、未分解のセルロース等が含まれていると考えられる。
【００６９】
以上説明したように、本明細書に開示されるセルロース分解産物の生産方法によれば、用いた疎水性イオン液体及びセルロース分解産物の回収等が容易なより実用的なセルロース含有材料の利用が可能となる。
【００７０】
（有用物質の生産方法）
本明細書に開示されるセルロースを利用する有用物質の生産方法は、上記したセルロースの分解産物の生産方法によって得られるセルロース分解産物を炭素源として用いて酵母などの微生物の発酵によって有用物質を生産する工程（以下、単に発酵工程ともいう。）を備えることができる。この生産方法によれば、セルロース含有材料から効率的に分解回収されたセルロース分解産物を用いることで、全体としての製造コストを低減することができる。
【００７１】
炭素源は、疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料とセルラーゼを含有する親水性溶媒とを含み、前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系において前記セルロース含有材料中のセルロースを分解して得られた親水性溶媒相中のセルロース分解産物を用いる。本生産方法において用いるセルロース分解産物は、セルロース分解工程後の親水性溶媒相、その濃縮物、又は親水性溶媒相から分離回収されたものであってもよい。上述したように親水性溶媒相は、疎水性イオン液体を実質的に含んでいないため、そのままであって発酵工程に供することができる。したがって、例えば、セルロース分解工程後の親水性溶媒相等を発酵用の培地の一部として用いることができる。
【００７２】
発酵工程で用いる微生物は、特に限定しないで、セルロースの分解産物を資化可能であって生産しようとする有用物質の種類に応じて適宜選択される。セルロース分解産物は、グルコースが主であるが、ヘミセルロース由来のキシラン等であってもよい。例えば、酵母やカビなどの真菌類や大腸菌等の微生物が挙げられる。微生物は、野生型であってもよいし、遺伝子工学的技術等によって人為的にセルロース分解産物を効率的に資化可能に改変されたり、有用物質を生産可能に改変されたりしたものであってもよい。典型的には、エタノールを生産する酵母などの微生物が挙げられる。また、有機酸を生産する酵母や乳酸菌であってもよい。
【００７３】
発酵工程は、用いる微生物の種類や生産しようとする有用物質に応じて実施すればよい。発酵のための培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、数時間〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。なお、変換工程終了後、培養液から微生物を除去してエタノール等の有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを濃縮する工程を実施してもよい。
【００７４】
有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましい。例えば、エタノールなどの低級アルコール、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。
【００７５】
以上説明したように、本明細書に開示される有用物質の生産方法によれば、従来に比してより効率的に得られたセルロース分解産物を利用するため、有用物質の生産コストを効果的に低減することができる。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７７】
（疎水性イオン液体と水との二相系におけるグルコースの局在性の確認）
本実施例では、疎水性イオン液体を利用した二相系でのセルロースの糖化及び回収にあたり、グルコースなどの可溶性の分解産物が水相に移行するかどうかを確認した。本実施例においては、疎水性イオン液体として、1,3-Diallylimidazolium bis（trifluoromethansulfonyl）imide（Solvent Innovation社製、以下単に、[Dalim][Tf2Ｎ]と省略する。）、１-Ethyl-3-methylimidazolium bis（trifluoromethansulfonyl）imide （Solvent Innovation社製、以下単に、[Emin][ Tf2Ｎ]と省略する。）を用いた。
【００７８】
【化２】
2010220490.tif 000003
【００７９】
図３に示すように、濃度１．０８ｇ／ｍｌに調整したグルコース溶液を調製し、この溶液に上記疎水性イオン液体２種をそれぞれ１．０ｇを加えて（グルコース溶液と疎水性イオン液体の体積比として１：１）、これらを室温にてボルテックス（商標）ミキサーでよく混合後、疎水性イオン液体相と水相との二相系を形成した。その後、上相の水相から２００μｌを採取して、０．２μｍフィルター（Milex-LG、ミリポア社製）でろ過して、ＨＰＬＣ（島津製作所製）を利用してグルコース濃度を測定した。グルコース濃度の測定は、生成したグルコース量をＨＰＬＣ（島津製作所製）でそれぞれ定量した（Katahiraら、Appl. Microbiol. Biotech. Biotechnol'2006, 72: 1136-1143）。なお、ＨＰＬＣの測定条件は以下のとおりとし、詳細は、付属の取扱説明書に従った。結果を図４に示す。
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：Shim-Pack SPR-Pb
移動相：水
検出: RID（Refractive Index Decter）
【００８０】
図４に示すように、グルコース溶液と、２種類の二相系の水相とにおけるグルコース濃度はほぼ同一であった。以上のことから、疎水性イオン液体中には、グルコースは溶解されないことがわかった。
【実施例２】
【００８１】
本実施例では、疎水性イオン液体を利用した二相系でセルロースを分解できるかどうかを確認した。疎水性イオン液体としては、1,3-Diallylimidazolium bis（trifluoromethansulfonyl）imide（関東化学株式会社社製、以下単に、[Dalim][ Tf2Ｎ]と省略する。）を用いた。
【００８２】
結晶性セルロースであるアビセル（Avicel） PH-101(Fluka社製)１０ｍｇを採取し、これに疎水性イオン液体１．０ｇを添加して結晶性セルロースの最終濃度が１．０（wt/vol）％となる試料を調製した。一般的に水溶液中に結晶性セルロースを添加すると、セルロース粒子は下層に集積・沈殿する現象が観察されるが、疎水性イオン液体の場合は異なり、セルロース粒子は下層に集積等されないで、疎水性イオン液体相に均一に分散された。
【００８３】
さらに、これらの試料に対して１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を９００μｌ加えてボルテックス（商標）ミキサーで攪拌し、静置して疎水性イオン液体相とクエン酸緩衝液からなる水相との二相系を形成した。この際、図５に示すように、クエン酸緩衝液の添加前は疎水性イオン液体相に分散されていて結晶性セルロース粒子が疎水性イオン液体相と水相の界面に集積し局在されることがわかった。
【００８４】
この水相に上記クエン酸緩衝液で調製したセルラーゼ混合溶液（Trichoderma reesei ATCC26921由来のNovozyme-Cellclast（Sigma-Aldrich）とAspergillus nigar由来のNovozyme-188（Sigma-Aldrich）を５：１で混合したものである。）を、水相において終濃度１μｌ／ｍｌとなるように加え、４０℃で７２時間、静置条件で酵素反応を行った。酵素反応後に、水相５０μｌを採取し４倍希釈後、水相中のグルコース濃度をBiosensor BF-5（王子計測器）で測定してグルコースへの変換効率を算出した。なお、疎水性イオン液体との二相系を形成しない以外は、同様にして結晶性セルロースを含むクエン酸緩衝液中で酵素反応を行い、対照とした。結果を図６に示す。
【００８５】
図６に示すように、疎水性イオン液体を利用した二相系の水相中のセルラーゼによって疎水性イオン液体中の結晶性セルロースが分解されることがわかった。また、対照とした結晶性セルロース懸濁液よりも、１５％以上グルコースへの変換効率が向上することがわかった。かかる変換効率の向上は疎水性イオン液体によるセルロースの構造緩和作用によるものと考えられる。
【実施例３】
【００８６】
本実施例では、疎水性イオン液体を利用した二相系でのセルロースの糖化に用いる疎水性イオン液体の評価を行った。本実施例においては、以下に示す１９種類の疎水性イオン液体について検討した。
【００８７】
（１）1-Butyl-2,3-dimethylimidazolium hexafluorophosphate([Bdmin][PF6]
（２）1-Hexyl-3-methylimidazolium tris(pentafuluoroethyl)trifluorophaosphate([C6min][ FAP])
（３）1,3-Diallylimidazolium bis（trifluoromethansulfonyl）imide（[Dalim][ Tf2N ]）
（４）1-Allyl-3-butylimidazolium tetrafluorophoborate(Abin][BF4])
（５）1-Hexyl 3-methylimidazolium hexafluorophosphate([C6min][PF6]
（６）1-Butyl-1-methylpyrrolidium tris(pentafuluoroethyl)trifluorophaosphate([BMP][ FAP ])
（７）1-Octyl 3-methylimidazolium hexafluorophosphate([C8min][PF6]
（８）1,10-Bis(3-methlimidazolium-1-yl) decane di-bis（trifluoromethansulfonyl）imide（[minC10min][ Tf2N ]）
（９）1-Allyl- 3-etylimidazolium bis（trifluoromethansulfonyl）imide（[Aeim][Tf2N]）
（１０）1-Ethyl- 3-metylimidazolium bis（trifluoromethansulfonyl）imide（[Emim][ Tf2N ]）
（１１）1-Butyl-3-metylimidazolium bis（trifluoromethansulfonyl）imide（[C4mim][ Tf2N ]）
（１２）1-Allyl-3-metylimidazolium bis（trifluoromethansulfonyl）imide（[Amim][ Tf2N ]）
（１３）1-Butyl-3-metylpyrrolidium bis（trifluoromethansulfonyl）imide（[BMP][ Tf2N ]）
（１４）1-Allyl- 3-butylimidazolium bis（trifluoromethansulfonyl）imide（[Abim][ Tf2N ]）
（１５）[mim(o-xylene)mim]2[Tf2N]（[MOXM]2[Tf2N]）
（１６）[mim(m-xylene)mim]2[Tf2N]（[MMXM]2[Tf2N]）
（１７）[(AcOMe)mim][Tf2N]（[(AcOMe)M][Tf2N]）
（１８）1,1’-[1,2-ethanediylbis(oxy-1,2-ethanediyl)]bis-[3-methyl-1H-imidazolium-1-yl] bis(trifluorosulfonyl)imide（[dM(EG)dM]2[Tf2N]）
（１９）1-(2-methoxy)ethyl-3-methylimidazolium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide（[C2OC1mim][Tf2N] ）
【００８８】
結晶性セルロースであるアビセル（Avicel） PH-101(Fluka社製)１０ｍｇを採取し、これに上記疎水性イオン液体１．０ｇをそれぞれ添加して結晶性セルロースの最終濃度が１．０（wt/vol）％となる１４種類の試料を調製した。これらのすべての疎水性イオン液体において、セルロース粒子は下層に集積等されないで、疎水性イオン液体相に均一に分散された。
【００８９】
さらに、これらの試料に対して１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を９００μｌ加えてボルテックス（商標）ミキサーで攪拌し静置して疎水性イオン液体相とクエン酸緩衝液からなる水相との二相系を形成した。この際、すべての疎水イオン液体に由来する二相系において結晶性セルロース粒子が疎水性イオン液体相と水相の界面に集積し局在された。
【００９０】
各二相試料の水相に上記クエン酸緩衝液で調製した実施例２で用いたセルラーゼ混合溶液を、水相において終濃度１μｌ／ｍｌとなるように加え、４０℃で７２時間、静置条件で酵素反応を行った。酵素反応後に、水相５０μｌを採取し４倍希釈後、当該水相中のグルコース濃度を上記と同様の方法で測定してグルコースへの変換効率を算出した。結果を図７に示す。
【００９１】
図７に示すように、すべての疎水性イオン液体においてグルコースへの変換が可能であった。なかでも、上記（２）、（３）、（６）及び（１９）のイオン液体において良好な結果が得られた。すなわち、72時間の糖化反応後におけるグルコース変換効率が60％程度となり、高い糖化効率を示すことが確認された。上記（２）、（６）及び（１９）の疎水性イオン液体の構造を以下に示す。なお、本実施例の操作条件においては、疎水性イオン液体によりグルコース変換効率に差があった。これは、疎水性イオン液体の種類によっては水相のｐＨ等がセルラーゼの至適ｐＨからずれることになるものがあることなどが想定され、水相の緩衝液の緩衝能やｐＨ調整によって調整可能であると考えられた。
【００９２】
【化３】
2010220490.tif 000004
【図１】
2010220490.tif 000005
【図２】
2010220490.tif 000006
【図３】
2010220490.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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