(57)【要約】【課題】高い収率で幹細胞を分離する。【解決手段】容器４と、該容器４の内部空間Ａ１，Ａ２を区画し、幹細胞を通過可能な口径の多数の透孔を有する第１のフィルタ５と、該第１のフィルタ５によって区画された一方の空間Ａ２に開口する開閉可能な液体排出口３と、該液体排出口３を覆う位置に配置され、幹細胞の通過を禁止し液体の通過を許容する口径の多数の透孔を有する第２のフィルタ６とを備え、前記第１および第２のフィルタ５，６に挟まれた空間Ａ２に、血管形成を誘導する誘導因子を含む誘導培地１１が充填されている幹細胞分離装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器と、
該容器の内部空間を区画し、幹細胞を通過可能な口径の多数の透孔を有する第１のフィルタと、
該第１のフィルタによって区画された一方の空間に開口する開閉可能な液体排出口と、
該液体排出口を覆う位置に配置され、幹細胞の通過を禁止し液体の通過を許容する口径の多数の透孔を有する第２のフィルタとを備え、
前記第１および第２のフィルタに挟まれた空間に、血管形成を誘導する誘導因子を含む誘導培地が充填されている幹細胞分離装置。
【請求項２】
前記誘導因子が、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦまたはＨＧＦの少なくとも１つである請求項１に記載の幹細胞分離装置。
【請求項３】
容器内に設けられた幹細胞を通過可能な口径の多数の透孔を有する第１のフィルタと、幹細胞の通過を禁止し液体の通過を許容する口径の多数の透孔を有する第２のフィルタとの間に挟まれる培地空間に、血管形成を誘導する誘導因子を含む誘導培地を充填し、
前記培地空間に前記第１のフィルタを挟んで隣接する空間に、幹細胞を含む細胞懸濁液を収容して培養し、
その後に、前記培地空間に開口し前記第２のフィルタによって覆われる液体排出口から容器の外部に誘導培地を排出する幹細胞分離方法。
【請求項４】
前記誘導因子が、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦまたはＨＧＦの少なくとも１つである請求項３に記載の幹細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞分離装置および幹細胞分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、骨髄などの幹細胞を有する組織から幹細胞を含む細胞群または幹細胞を抽出し、様々な疾患に対して細胞を投与、または患部に注入する細胞治療が行われている。このような幹細胞を抽出するための技術として、ＣＤ３４抗体で分離する技術が知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５５３６４７５号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】臨床病理レビュー  特集第１２２号  「最新  造血細胞移植とその実際手技」、ｐ１４６−１５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＣＤ３４抗体による分離は、収率が低いという問題がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、高い収率で幹細胞を分離することができる幹細胞分離装置および幹細胞分離方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、容器と、該容器の内部空間を区画し、幹細胞を通過可能な口径の多数の透孔を有する第１のフィルタと、該第１のフィルタによって区画された一方の空間に開口する開閉可能な液体排出口と、該液体排出口を覆う位置に配置され、幹細胞の通過を禁止し液体の通過を許容する口径の多数の透孔を有する第２のフィルタとを備え、前記第１および第２のフィルタに挟まれた空間に、血管形成を誘導する誘導因子を含む誘導培地が充填されている幹細胞分離装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、幹細胞を含む細胞懸濁液が容器内の第１のフィルタによって区画された空間に収容されると、細胞懸濁液が第１のフィルタを挟んで誘導培地に隣接する。誘導培地内に含まれている血管形成を誘導する誘導因子が、第１のフィルタを越えて細胞懸濁液に作用し、細胞懸濁液内に含まれている幹細胞が誘導培地の収容されている空間の方向に誘導される。
【０００８】
第１のフィルタは幹細胞を通過させることができる口径の多数の透孔を有しているので、誘導された幹細胞は第１のフィルタの透孔を通過して誘導培地の空間内に入る。この状態で、残った細胞懸濁液を排出し、また、液体排出口を開放して第２のフィルタを介して誘導培地を排出することにより、誘導培地内に誘導されていた幹細胞を中央空間に残した状態で回収することができる。これにより、ＣＤ３４抗体によることなく、高い収率で幹細胞を分離することができる。
上記発明においては、前記誘導因子が、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦまたはＨＧＦの少なくとも１つであることが好ましい。
【０００９】
また、本発明は、容器内に設けられた幹細胞を通過可能な口径の多数の透孔を有する第１のフィルタと、幹細胞の通過を禁止し液体の通過を許容する口径の多数の透孔を有する第２のフィルタとの間に挟まれる培地空間に、血管形成を誘導する誘導因子を含む誘導培地を充填しておき、前記培地空間に前記第１のフィルタを挟んで隣接する空間に、幹細胞を含む細胞懸濁液を収容して培養し、その後に、前記培地空間に開口し前記第２のフィルタによって覆われる液体排出口から容器の外部に誘導培地を排出する幹細胞分離方法を提供する。
上記発明においては、前記誘導因子が、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦまたはＨＧＦの少なくとも１つであってもよい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、高い収率で幹細胞を分離することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置を示す模式的な縦断面図である。
【図２】図１の細胞分離装置による細胞分離方法を説明するフローチャートである。
【図３】図１の細胞分離装置の上部空間に細胞懸濁液を導入した状態を示す模式的な縦断面図である。
【図４】図３の細胞分離装置により培養した後の状態を示す模式的な縦断面図である。
【図５】図４の状態から上部空間の細胞懸濁液を排出した状態を示す模式的な縦断面図である。
【図６】図５の状態から誘導培地を排出した状態を示す模式的な縦断面図である。
【図７】図６の状態から中央空間に洗浄液を供給した状態を示す模式的な縦断面図である。
【図８】図７の状態から洗浄液を排出した状態を示す模式的な縦断面図である。
【図９】図８の状態から中央空間に乳酸リンゲル液を供給した状態を示す模式的な縦断面図である。
【図１０】図９の状態から中央空間から幹細胞を含む乳酸リンゲル液を吸引して回収する状態を説明する模式的な縦断面図である。
【図１１】図１の細胞分離装置において、誘導培地内のＳＤＦ−１の濃度と回収される細胞数との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の一実施形態に係る細胞分離装置１および細胞分離方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１は、図１に示されるように、上端に細胞懸濁液の導入口２を有し、下端に液体の第１の排出口３を有する筒状の容器４と、容器４の内部に上下方向に間隔をあけて配置され、容器４内部を上部空間Ａ１、中央空間Ａ２および下部空間Ａ３に区画する第１，第２のフィルタ５，６とを備えている。
【００１３】
第１のフィルタ５は、幹細胞の通過を許容し、それよりも大きな細胞等の通過を禁止する程度の口径約８μｍの複数の透孔（図示略）を有している。
第２のフィルタ６は、幹細胞の通過を禁止し、液体の通過を許容する程度の口径約４μｍの複数の透孔（図示略）を有している。
【００１４】
上部空間Ａ１には、さらに、外気の流通を可能にしつつ、塵埃やウィルス等の容器４内への浸入を禁止するフィルタ７と、該上部空間Ａ１内の液体を排出するための開閉可能な第２の排出口８が設けられている。
また、中央空間Ａ２には、該中央空間Ａ２内に液体を供給するための液体供給口９と、最終的に中央空間Ａ２内に残留した幹細胞Ｂを回収するための回収口１０とが設けられている。
【００１５】
容器４内の中央空間Ａ２および下部空間Ａ３には、誘導培地１１が収容されている。誘導培地１１は、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％血清および１００ｎｇ／ｍＬの血管形成を誘導する因子、例えば、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦまたはＨＧＦの少なくとも１つを含んだものである。誘導培地１１は、第１のフィルタ５に接触する位置まで中央空間Ａ２および下部空間Ａ３内に満たされている。
【００１６】
このように構成された本実施形態に係る細胞分離装置１を用いた細胞分離方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１を用いて細胞懸濁液Ｃから幹細胞Ｂを分離するには、容器４の全ての排出口３，８、回収口１０および供給口９を閉じた状態で、図１および図２に示されるように、中央空間Ａ２および下部空間Ａ３内に誘導培地１１を貯留する（ステップＳ１）。
【００１７】
この状態で、容器４の上部の導入口２を開放し、図３に示されるように、導入口２から細胞懸濁液Ｃを容器４の上部空間Ａ１内に導入する（ステップＳ２）。
細胞懸濁液Ｃは、例えば、骨髄液を乳酸リンゲル液等によって希釈したもので、幹細胞Ｂの他、種々の細胞を含んでいる。
【００１８】
上部空間Ａ１内に導入された細胞懸濁液Ｃは、第１のフィルタ５を挟んで中央空間Ａ２内の誘導培地１１に隣接させられる。
この状態で、図４に示されるように、所定の培養条件、例えば、３７℃の環境下に容器４ごと配置して、静置することにより、細胞懸濁液Ｃ内の幹細胞Ｂを培養する（ステップＳ３）。
【００１９】
誘導培地１１には、血管形成を誘導する因子が含まれているので、この因子の作用によって、細胞懸濁液Ｃ内の幹細胞Ｂが細胞懸濁液Ｃ内を遊走して中央空間Ａ２の方向に引き寄せられる。他の細胞にはこの因子はほぼ作用しない。
【００２０】
そして、中央空間Ａ２の方向に引き寄せられた幹細胞Ｂは、時間の経過によって、第１のフィルタ５の透孔を通過して中央空間Ａ２の誘導培地１１内に入る。
所定時間、例えば、２２時間経過した後に、図５に示されるように、上部空間Ａ１に設けられた第２の排出口８を開放して、細胞懸濁液Ｃを排出する（ステップＳ４）。次いで、図６に示されるように、容器４の下部の第１の排出口３を開放して、中央空間Ａ２および下部空間Ａ３に貯留されている誘導培地１１を排出する（ステップＳ５）。
【００２１】
第２のフィルタ６は、幹細胞Ｂの通過を禁止する口径の透孔を有しているので、中央空間Ａ２内に誘導されてきていた幹細胞Ｂは、第２のフィルタ６によって捕捉され、誘導培地１１のみが第１の排出口３から排出される。
そして、誘導培地１１が排出され終わったら、第１の排出口３を閉じて、図７に示されるように、中央空間Ａ２に設けられた液体供給口９から中央空間Ａ２内に洗浄液Ｄを供給し（ステップＳ６）、第２のフィルタ６に捕捉されていた幹細胞Ｂを再懸濁する。そして、図８に示されるように、第１の排出口３を開放して、洗浄液Ｄを排出する（ステップＳ７）。
【００２２】
必要により、ステップＳ６およびステップＳ７を繰り返すことにより、第２のフィルタ６に捕捉された幹細胞Ｂを洗浄する（ステップＳ８）。この後に、図９に示されるように、液体供給口９から乳酸リンゲル液のような回収用の液体Ｅを中央空間Ａ２内に供給して幹細胞Ｂを再懸濁し（ステップＳ９）、図１０に示されるように、回収口１０に接続したシリンジ１２等によって幹細胞Ｂを含む液体Ｅを回収する（ステップＳ１０）。
【００２３】
このように、本実施形態に係る細胞分離装置１および細胞分離方法によれば、上部空間Ａ１に幹細胞Ｂを含む細胞懸濁液Ｃを貯留して、所定の時間にわたって培養するだけで、細胞懸濁液Ｃ内の幹細胞Ｂを中央空間Ａ２に遊走させて分離することができる。したがって、ＣＤ３４抗体を用いることなく、高い収率で、幹細胞Ｂを回収することができるという利点がある。
【００２４】
なお、本実施形態においては、ＳＤＦ−１の濃度として、１００ｎｇ／ｍＬを例示したが、これに限定されるものではない。図１１に示されるように、ＳＤＦ−１の濃度と回収される細胞数との関係を示す。図１１によれば、ＳＤＦ−１を含まない場合と比較して、５０ｎｇ／ｍＬ以上のＳＤＦ−１が含有されていれば、いずれの場合も細胞回収率が増大していることがわかる。
【符号の説明】
【００２５】
１  幹細胞分離装置
３  第１の排出口（液体排出口）
４  容器
５  第１のフィルタ
６  第２のフィルタ
１１  誘導培地
Ａ１  上部空間（内部空間）
Ａ２  中央空間（空間）
Ｂ  幹細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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