(57)【要約】【課題】乳癌に関連する疾患の診断、病期分類、予後予測、モニタリングおよび処置のための特定の方法および試薬を提供すること、またはそのような予防方法についての素因を示すこと。【解決手段】本発明は、乳癌に関連する核酸分子およびタンパク質に関する。ヒト乳癌を検出、特徴付け、予防および処置するための組成物、キットおよび方法が提供される。本発明はまた、乳癌を診断、病期分類、予後予測、モニタリングおよび処置するための種々の方法、試薬およびキットに関する。１実施形態では、本発明は、患者が乳癌を有するか、乳癌を発症するリスクが正常よりも高いかを評価する診断方法を提供するが、この方法は、患者サンプルにおける本発明の少なくとも１つのマーカーの発現のレベルを、コントロール、例えば、乳癌のない患者由来のサンプルにおけるマーカー（単数または複数）の発現の正常なレベルと比較する工程を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００３年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／４７４，２８１号および２００４年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／５５５，５５７号の利益を請求する。これらの内容は、本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明の分野は、乳癌の診断、特徴付け、管理および治療を含む、乳癌である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
米国、そして実際には世界中で報告されたガンの症例数の増大は大きな問題である。現在、特定のタイプのガンに利用可能な処置はごく一握りしかなく、それらが絶対的に成功するという保証はない。最も有効であるには、これらの処置には、この悪性腫瘍の早期の検出が必要なだけではなく、この悪性腫瘍の重篤度の確実な評価も必要である。
【０００３】
女性の主な死亡原因である乳癌の頻度は、過去３０年間にわたって米国で徐々に増大している。１９９７年には、１８１，０００例の新規な症例が米国で報告され、乳癌のうち４４，０００人が死亡したと見積もられた（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．４７：５〜２７；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８８：１５７１〜１５７９）。乳癌の病原性は未知であるが、正常な乳房上皮の悪性の表現型へのトランスフォーメーションは、特に３０歳未満の女性では、遺伝因子の結果であり得る（Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：６６〜７１）。ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の発見および特徴付けによって近年、家族性乳癌に寄与し得る遺伝因子についての本発明者らの知識が拡がっている。これらの２つの遺伝子座における生殖細胞系の変異は、乳癌および／または卵巣癌の生涯リスク５０〜８５％を伴っている（Ｃａｓｅｙ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．９：８８〜９３；Ｍａｒｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ
７７：６９７〜７０９）。しかし、他の非遺伝的要因も、この疾患の病因論に重大な影響を有する可能性が高い。その起源にかかわらず、乳癌の罹患率および死亡率は、それが進行の早期に検出されない場合、有意に増大する。従って、乳房組織における細胞のトランスフォーメーションおよび腫瘍形成の早期検出にかなりの労力が集中されてきた。
【０００４】
現在、乳癌を同定する主な方法は、密な腫瘍組織の存在の検出による。これは、乳房の外側の直接の検査によって、または乳房Ｘ線撮影もしくは他のＸ線画像化法によって、種々の程度の有効性まで達成され得る（非特許文献１）。しかし、後者のアプローチは、かなりの費用となる。乳房Ｘ線撮影が行なわれるたびに、この患者は試験中に用いられる放射線の照射特性によって乳房腫瘍を誘発されるというわずかな危険性にさらされる。さらに、このプロセスは費用がかさみ、技術者の主観的解釈によって不正確さが生じ得、例えばある研究では、放射線技師の調査した群で個々に解釈された１セットの乳房Ｘ線撮影のうち約三分の一について大きな臨床的不一致が示された。さらに、多くの女性では、乳房Ｘ線撮影を受けることは疼痛性の経験であることが見出されている。従って、国立ガン研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、５０歳未満の女性には乳房Ｘ線撮影を推奨していない。なぜならこの群では、それより高齢の女性ほど乳癌を発症する可能性が高くないからである。しかし、５０歳未満の女性では乳癌の約２２％しか生じないという徴候には引き付けられるが、このデータは乳癌が閉経前の女性ではより悪性であることを示唆する。
【０００５】
従って、乳癌に関連する疾患の診断、病期分類、予後予測、モニタリングおよび処置のための特定の方法および試薬を提供すること、またはそのような予防方法についての素因を示すことが有利である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊａｔｏｉ，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１７７：５１８〜５２４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、表１および表２に列挙される、ガンマーカー（本明細書において以降は、「マーカー（ｍａｒｋｅｒｓ）」または「本発明のマーカー（ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎｓ）」）に関する。本発明は、このマーカーによってコードされるか、またはこのマーカーに相当する核酸およびタンパク質を提供する（本明細書において以降では、それぞれ「マーカー核酸（ｍａｅｋｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」および「マーカータンパク質（ｍａｒｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」）。本発明はさらに、このようなマーカータンパク質、および／またはマーカータンパク質のフラグメントと特異的に結合する、抗体、抗体誘導体および抗体フラグメントを提供する。
【０００８】
本発明はまた、乳癌を診断、病期分類、予後予測、モニタリングおよび処置するための種々の方法、試薬およびキットに関する。１実施形態では、本発明は、患者が乳癌を有するか、乳癌を発症するリスクが正常よりも高いかを評価する診断方法を提供するが、この方法は、患者サンプルにおける本発明の少なくとも１つのマーカーの発現のレベルを、コントロール、例えば、乳癌のない患者由来のサンプルにおけるマーカー（単数または複数）の発現の正常なレベルと比較する工程を包含する。患者サンプルにおけるマーカー（単数または複数）の発現の上昇は、乳癌を有するか、または乳癌を発症するリスクのある患者の指標であり得る。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、患者が悪性の乳房腫瘍を有するか、進行性の乳房腫瘍を発症する可能性が高いかを評価する診断方法を提供するが、この方法は、患者サンプルにおける本発明の少なくとも１つのマーカーの発現のレベルと、無痛性の乳房腫瘍を有するかまたは乳房腫瘍を有さないコントロール被験体由来のサンプルにおけるマーカーの発現のレベルとを比較する工程を包含する。このマーカーの発現の上昇は、悪性の乳癌の指標であり得る。
【００１０】
従って、本発明の方法は、乳癌を発症するリスクが上昇している患者（例えば、乳癌の家族歴を有する患者、変異発癌遺伝子を有すると同定された患者）を同定するのにおいて有用であり得る。この方法はまた、患者が進行性の乳癌を有するか、進行性の乳房腫瘍を発症する可能性が高いかを評価するために有用な診断である。
【００１１】
本発明の方法は、乳癌の特定の段階を予測するのにおいて、そしてこの癌が転移している（例えば、リンパ節への転移）であるか否かを評価するのにおいて、有用であり得る。さらに、本発明の方法はまた、乳癌を有する患者の、または乳癌を根治する治療を受けている患者の臨床転帰を予測するのにおいて有用である。さらに、本発明の方法はまた、乳癌患者の処置の有効性（例えば、化学療法の有効性）を評価するのにおいても有用である。
【００１２】
本発明によれば、このマーカーは、本発明の方法の陽性的中率（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）が少なくとも約１０％、好ましくは約２５％、より好ましくは約５０％、そして最も好ましくは約９０％であるように選択される。また、マーカーが乳癌患者（例えば、病期０乳癌患者、病期Ｉ乳癌患者、病期ＩＩＡ乳癌患者、病期ＩＩＢ乳癌患者、病期ＩＩＩＡ乳癌患者、病期ＩＩＩＢ乳癌患者、病期ＩＶ乳癌患者、病期Ｉ乳癌患者、病期ＩＩ乳癌患者、病期ＩＩＩ乳癌患者、悪性乳癌患者、腺管癌の乳癌患者、および小葉癌の乳癌患者、ならびに乳房に関連する任意の他のタイプのガン、悪性疾患およびトランスフォーメーションを含む）の少なくとも約１５％において、正常な非乳癌患者に比較して、少なくとも５倍まで過剰発現される方法の実施形態が好ましい。
【００１３】
１局面では、患者が乳癌に罹患しているか否かを評価する診断方法（例えば、新規の検出「スクリーニング」、再発の検出、反射性試験）が提供される。このような方法は、患者由来のサンプルにおける表１に列挙された少なくとも１つのマーカーの発現のレベルと、乳癌を有さないコントロール被験体におけるマーカー（単数または複数）の発現のレベルとを比較する工程を包含する。コントロール被験体におけるレベルと比較した、患者サンプルにおけるマーカーの発現の有意に高いレベルは、患者が乳癌に罹患していることの指標である。
【００１４】
本発明はさらに、患者が進行性の乳癌に罹患しているか否かを評価するための診断方法を提供するが、この方法は：
表２に列挙されるマーカーからなる群より選択されるマーカーの少なくとも１つの患者サンプルにおける発現のレベルを決定する工程と；
無痛性の乳房腫瘍を有するかまたは乳房腫瘍を有さないコントロール被験体由来のサンプルにおけるマーカー（単数または複数）の発現のレベルを決定する工程と；
この患者サンプル中のマーカーの発現レベルと、コントロール被験体由来のサンプル中のマーカーの発現のレベルを比較する工程、という工程を包含する。コントロール被験体由来のサンプルにおけるレベルと比較して、患者サンプルにおけるマーカー（単数または複数）の発現の有意に高いレベルは、この患者が進行性の乳癌を有するかまたは進行性の乳房腫瘍を発症する可能性が高いということの指標である。患者サンプルとコントロールサンプルとの間の発現の相違がないか、または、コントロールレベルに比較した場合、患者サンプルにおける発現の有意に低いレベルは、この患者が無痛性の乳癌を有することを示す。
【００１５】
本発明はさらに、転移しているかまたは転移する可能性が高い乳癌に患者が罹患しているか否かを評価する診断方法を提供するが、この方法は、この患者由来のサンプルにおける表２に列挙された少なくとも１つのマーカーの発現のレベルと、非転移性乳房腫瘍を有するかまたは乳房腫瘍を有さないコントロール被験体由来のサンプルにおけるマーカー（単数または複数）の発現のレベルとを比較する工程を包含する。コントロール被験体由来のサンプルにおけるレベルに比較して、患者サンプルにおける有意に高レベルの発現は、この乳癌が転移しているかまたは転移する可能性が高いという指標である。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、患者がリンパ節に転移しているか、またはリンパ節に転移する可能性が高い乳癌を有するかを決定するための方法を包含するが、この方法は、患者由来のサンプルにおいて表２に列挙されたマーカーの発現のレベルと、非転移性乳房腫瘍を有するかまたは乳房腫瘍を有さないコントロール被験体由来のサンプルにおける発現のレベルとを比較する工程を包含する。コントロール被験体由来のサンプルにおけるレベルに比較して、患者サンプルにおける発現の有意に高いレベルは、その患者がリンパ節に転移しているか、またはリンパ節に対して転移する可能性が高い転移性乳癌に罹患していることの指標である。
【００１７】
本発明はまた、乳癌患者の臨床的転帰を予想するための方法を提供するが、この方法は、この患者由来のサンプルにおける表２に列挙された少なくとも１つのマーカーの発現のレベルと、良好な臨床転帰を有するコントロール被験体（例えば、５年を超える無病生存率（ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）レベルを有する前者の乳癌患者）のサンプル中のマーカー（単数または複数）の発現のレベルとを比較する工程を包含する。コントロール被験体由来のサンプルにおける発現レベルに比較した、患者サンプル中の発現の有意に高いレベルは、この患者の転帰が劣っている（例えば、３年未満の無病生存率）ことの指標である。
【００１８】
本発明はまた、患者における乳癌を阻害する治療の有効性を評価するための方法を提供
する。このような方法は、患者に対して治療の少なくとも一部を提供する前に患者から得られた第一のサンプルにおける本発明の少なくとも１つのマーカーの発現と、この治療の一部の提供後に患者から得られた第二のサンプルにおけるマーカー（単数または複数）の発現とを比較する工程を包含する。第二のサンプルにおけるマーカー（単数または複数）の発現の、第一のサンプルにおけるものに対して有意に低いレベルは、患者の乳癌を阻害するためにこの治療が有効であるということの指標である。
【００１９】
これらの方法では、「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、化学療法、放射線療法、腫瘍組織の外科的切除、遺伝子療法、ならびに生物学的治療、例えば、抗体およびケモカインの投与を含むがこれに限定されない、乳癌を処置するための任意の治療であってもよいことが理解される。従って、本発明の方法は、例えば、腫瘍負荷の低下を評価するための治療の前、間および後に患者を評価するために用いられ得る。
【００２０】
好ましい実施形態では、この方法は、化学的因子または生物学的因子を用いる治療に関する。これらの方法は、患者から得られ、化学因子または生物学的因子の存在下で維持された第一のサンプルにおける本発明の少なくとも１つのマーカーの発現と、患者から得られ、この因子の非存在下で維持された第二のサンプルにおけるマーカーの発現とを比較する工程を包含する。第二のサンプルにおけるマーカー（単数または複数）の発現の、第一のサンプルにおけるマーカー発現に比較して有意に低いレベルは、患者における乳癌を阻害するためにこの因子が有効であるということの指標である。特定の実施形態では、第一および第二のサンプルは、患者から得られた単独のサンプルの一部であってもよいし、または患者から得られたプールされたサンプルの一部であってもよい。
【００２１】
本発明はさらに、患者における乳癌の進行を評価するためのモニタリング方法を提供し、この方法は：
第一の時間ポイントで患者由来のサンプルにおいて、本発明の少なくとも１つのマーカーの発現を検出する工程と；
時間内のその後の時間ポイントで発現工程の検出を繰り返す工程と；
第一と第二の検出工程において検出された発現のレベルを比較して、これによって、この患者における乳癌の進行をモニタリングする工程とを包含する。このその後の時間ポイントでのサンプルにおけるマーカー発現の、第一の時間ポイントでこのサンプルのマーカー発現から有意に高いレベルは、この乳癌が患者において進行しているということの指標であるが、有意に低いレベルの発現は、乳癌が後退していることの指標である。１実施形態では、この患者は、時間内の第一のポイントと時間内のその後のポイントとの間で腫瘍を除去する手術を受けている。
【００２２】
本発明はさらに、患者において乳癌を阻害するための候補組成物を選択するための試験方法を提供する。この方法は：
患者からガン細胞を含むサンプルを得る工程と；
少なくとも１つの試験組成物の存在下において患者由来のガン細胞を含む少なくとも１つのサンプルを別々に維持する工程と；
アリコートの各々において本発明の少なくとも１つのマーカーの発現を比較する工程と；
試験組成物を乳癌の阻害のための候補組成物として選択する工程であって、この組成物は、その試験組成物を含むアリコートにおける本発明の少なくとも１つのマーカーの発現のレベルを、他の試験組成物の存在下でのこのマーカーの発現のレベルに対して有意に低下する工程と、を包含する。
【００２３】
本発明はさらに、化合物の乳癌発癌能力を評価する試験方法を提供する。この方法は、化合物の有無において乳房細胞の別々のアリコートを維持する工程と；各々のアリコートにおける本発明のマーカーの発現を比較する工程と；を包含する。化合物の存在下で維持されるアリコートにおけるマーカーの、化合物の非存在下で維持されるアリコートのものに対して有意に高いレベルの発現は、この化合物が乳房発癌能力を有することの指標である。
【００２４】
さらに、本発明は、患者における乳癌を阻害する方法をさらに提供する。この方法は以下の工程：
患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と；
試験組成物の存在下で患者由来の癌細胞を含む少なくとも１つのサンプルを別々に維持する工程と；
各々のアリコートにおいて本発明のマーカーの発現を比較する工程と；
乳癌のインヒビターとして組成物を同定する工程であって、この組成物が、この組成物を含むアリコートにおける本発明のマーカーの発現のレベルを、他の組成物の存在下でこのマーカーの発現のレベルに対して、有意に低くする、工程と；
乳癌のインヒビターとして同定される組成物の少なくとも１つを患者に投与する工程とを包含する。
【００２５】
本発明によれば、サンプル中の本発明のマーカーの発現のレベルは、以下のサンプルの存在を検出することによって、例えば評価され得る：
対応するマーカータンパク質（例えば、
【００２６】
【化４】
2010246558.tif 000002
2010246558.tif 000003
の配列のうちのいずれか１つを有するタンパク質）、またはそのタンパク質のフラグメント（例えば、試薬、例えば、このタンパク質またはタンパク質フラグメントと特異的に結合する、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメントまたは単鎖抗体を用いることによって）；
対応するマーカー核酸（例えば、配列番号（例えば、
【００２７】
【化５】
2010246558.tif 000004
）の配列のうちの１つを有するヌクレオチド転写物）、またはその相補体）、またはその核酸のフラグメント（例えば、このサンプルから得られた転写されたポリヌクレオチドと、配列番号（例えば、
【００２８】
【化６】
2010246558.tif 000005
）のうちのいずれかの配列の全体またはセグメントを有する１つ以上の核酸に対して固定された基質とを接触させる工程による）、またはその相補体、あるいは対応するマーカータンパク質によって直接（すなわち、触媒される）かまたは間接的に生成される代謝物。
【００２９】
本発明によれば、前述の方法のいずれかを、複数（例えば、２、３、５または１０以上）の乳癌マーカーを用いるかまたは検出して行なってもよく、このマーカーには当該分野で公知のさらなる乳癌マーカーとの本発明の提供されたマーカーの組み合わせを含む。このような方法では、その少なくとも１つが本発明のマーカーである、複数のマーカーの各々のサンプル中での発現レベルを、乳癌に罹患していないコントロールのヒトから得た同じタイプのサンプルにおける複数のマーカーの各々の正常な発現レベルと比較する。そのマーカーの対応する正常なまたはコントロールのレベルに対して、本発明の１つ以上のマーカー、またはそれらのいくつかの組み合わせの、サンプル中における、有意に変化した（すなわち、単独のマーカーを用いて、記載された方法において特定されたように増大するかまたは低下された）発現のレベルは、その患者が乳癌に罹患しているということの指標である。前述の方法の全てについて、マーカー（単数または複数）は好ましくは、この方法の陽性的中率（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）が少なくとも約１０％であるように選択される。
【００３０】
さらなる局面では、本発明は、マーカータンパク質（例えば、
【００３１】
【化７】
2010246558.tif 000006
のいずれかの配列を有するタンパク質）、またはそのタンパク質のフラグメントと特異的に結合する、抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントを提供する。本発明はまた、このような抗体、抗体誘導体、および抗体フラグメントを作製するための方法を提供する。このような方法は、マーカータンパク質（例えば、
【００３２】
【化８】
2010246558.tif 000007
2010246558.tif 000008
のうちのいずれかの配列を有するタンパク質）の全体または１０個以上のアミノ酸のセグメントを含むタンパク質またはペプチドを用いて哺乳動物を免疫する工程を含んでもよく、ここで、このタンパク質またはペプチドは、細胞から、または化学的合成によって得ることができる。本発明の方法はまた、モノクローナル抗体および単鎖抗体を生成する工程を包含し、この工程はさらに、免疫された哺乳動物から脾細胞を単離する工程と、単離された脾細胞と不死化細胞株とを融合してハイブリドーマを形成する工程と、マーカータンパク質またはこのタンパク質のフラグメントと特異的に結合する抗体を生成するハイブリドーマについて個々のハイブリドーマをスクリーニングする工程とを包含する。
【００３３】
別の局面では、本発明は、種々の診断キットおよび試験キットに関する。１実施形態では、本発明は、患者が乳房腫瘍に罹患しているか否かを評価するためのキットを提供する。別の局面では、このキットは、患者が乳房腫瘍を発症するリスクにあるか否かを評価するために用いられ得る。このキットは、本発明の少なくとも１つのマーカーの発現を評価するための試薬を含む。さらに別の実施形態によって、患者が進行性の乳房腫瘍に罹患しているか否かを評価するために用いられ得るキットが提供される。このキットは、本発明の少なくとも１つのマーカーの発現を評価するための試薬を含む。別の実施形態では、本発明は、患者における乳癌を阻害するための化学的または生物学的な因子の適切性を評価するためのキットを提供する。このようなキットは、本発明の少なくとも１つのマーカーの発現を評価するための試薬を含み、そしてまたこのような因子の１つ以上を含んでもよい。さらなる実施形態では、本発明は、乳癌細胞の存在を評価するかまたは乳癌を処置するためのキットを提供する。このようなキットは、マーカータンパク質またはそのタンパク質のフラグメントに特異的に結合する抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントを含んでもよい。このようなキットはまた、複数の抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントを含んでもよく、このような複数の抗体因子は、マーカータンパク質、またはそのタンパク質のフラグメントと特異的に結合する。
【００３４】
さらなる実施形態では、本発明は、乳癌細胞の存在を評価するためのキットを提供するが、このキットは、少なくとも１つのマーカー核酸またはその核酸のフラグメントと特異的に結合する少なくとも１つの核酸プローブを含む。このキットはさらに複数のプローブを備え、そのプローブの各々がマーカー核酸、またはその核酸のフラグメントと特異的に結合する。
【００３５】
さらなる局面では、本発明は、乳癌に罹患しているか、または乳癌を発症するリスクの患者を処置するための方法に関する。このような方法は、本発明の少なくとも１つのマーカーの発現を減少するか、および／またはそのマーカーの生物学的機能と干渉する工程を包含し得る。１実施形態では、この方法は、マーカー核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはそのセグメントを患者に提供する工程を包含する。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドは、マーカー核酸のアンチセンスポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを発現するベクターの送達を通じて患者に提供されてもよい。別の実施形態では、この方法は、マーカータンパク質、またはそのタンパク質のフラグメントに特異的に結合する、抗体、抗体誘導体または抗体フラグメントを患者に提供する工程を包含する。好ましい実施形態では、この抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントは、
【００３６】
【化９】
2010246558.tif 000009
の配列を有するタンパク質、またはそのフラグメントと特異的に結合する。
【００３７】
本発明の方法およびキットはまた、公知の乳癌マーカーを含む公知のガンマーカーを備えてもよいということが理解される。この方法およびキットは、乳癌以外を同定するために用いられ得るということがさらに理解される。
【００３８】
別の局面では、本発明は、マーカータンパク質またはマーカーポリペプチド、例えば、マーカータンパク質の生物学的に活性な部分をコードする核酸分子を特徴とする。好ましい実施形態では、単離された核酸分子は、
【００３９】
【化１０】
2010246558.tif 000010
のアミノ酸配列を有するマーカーポリペプチドをコードする。他の実施形態では、本発明は、
【００４０】
【化１１】
2010246558.tif 000011
から選択されるいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有する単離されたマーカー核酸分子を提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、
【００４１】
【化１２】
2010246558.tif 000012
2010246558.tif 000013
に示されるヌクレオチド配列に対して実質的に同一である核酸分子（例えば、天然に存在する対立遺伝子改変体）を提供する。他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、
【００４２】
【化１３】
2010246558.tif 000014
のヌクレオチド配列を含む核酸分子に対してハイブリダイズする核酸分子を提供するが、この核酸は全長のマーカータンパク質またはその活性フラグメントをコードする。
【００４３】
関連の局面では、本発明は本明細書に記載されるマーカー核酸分子を含む核酸構築物をさらに提供する。特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、ネイティブまたは異種の制御配列に対して作動可能に連結される。また、本発明のマーカー核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、例えば、ポリペプチドを作成するのに適切なベクターおよび宿主細胞も含まれる。
【００４４】
別の関連の局面では、本発明は、マーカーをコードする核酸の検出のためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適切な核酸フラグメントを提供する。
【００４５】
さらに別の関連の局面では、マーカーをコードする核酸分子に対してアンチセンスである単離された核酸分子が提供される。
【００４６】
他の実施形態では、本発明は、マーカーポリペプチド、例えば、
【００４７】
【化１４】
2010246558.tif 000015
2010246558.tif 000016
に示されるアミノ酸配列；
【００４８】
【化１５】
2010246558.tif 000017
に示されるアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列；または
【００４９】
【化１６】
2010246558.tif 000018
のヌクレオチド配列を含む核酸分子に対して、本明細書に記載されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、この核酸が全長マーカータンパク質またはその活性なフラグメントをコードするアミノ酸配列、を有するマーカーポリペプチドを提供する。
【００５０】
関連の局面では、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド分子を含むタンパク質またはペプチド構築物をさらに提供する。特定の実施形態では、本発明のマーカーポリペプチドまたはフラグメントは、融合タンパク質配列を形成するために、ネイティブまたは異種の非マーカーポリペプチド配列に対して作動可能に連結される。
【００５１】
さらに別の局面では、本発明は、マーカーポリペプチドと反応するか、またはより好ましくは特異的にもしくは選択的に結合する、抗体およびその抗原結合フラグメントを特徴とする。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
患者が乳癌に罹患しているか否かを評価する方法であって：
ａ）患者サンプル中のマーカーの発現のレベルを決定する工程であって、該マーカーが表１に列挙されるマーカー、および表２に列挙されるマーカーからなる群より選択される工程と；
ｂ）無痛性の乳房腫瘍を有するかまたは乳房腫瘍を有さないコントロール被験体由来のサンプル中の該マーカーの発現のレベルを決定する工程と；
ｃ）患者サンプル中、およびコントロール被験体由来のサンプル中の該マーカーの発現のレベルを比較する工程と、を包含し、
ここで患者サンプルと、コントロール被験体由来のサンプルとの間における該マーカーの発現のレベル有意な相違は、該患者が乳癌に罹患していることの指標である、方法。
（項目２）
コントロール被験体からの発現のレベルが、ガンでない患者由来の乳房細胞から決定される、項目１に記載の方法。
（項目３）
コントロール被験体からの発現のレベルが、無痛性の乳房腫瘍を有するかまたは乳房腫瘍を有さない被験体の集団からの発現の平均レベルを用いて予め決定される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記マーカーが分泌されたタンパク質に相当する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記マーカーが、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記サンプルが、患者から得られたサンプルを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記サンプルが、血液、リンパ液、嚢胞液、乳首吸引液、および腫瘤生検から収集した液体からなる群より選択される液体を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記サンプル中のマーカーの発現のレベルが、該サンプル中のマーカータンパク質の存在を検出することによって評価される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記マーカータンパク質の存在が、タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体フラグメントからなる群より選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記サンプル中の前記マーカーの発現のレベルが、核酸マーカーに相当する、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の該サンプル中での存在を検出することによって評価される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記転写されたポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
転写されたポリヌクレオチドを検出する工程が、転写されたポリヌクレオチドを増幅する工程を包含する、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記サンプル中の前記マーカーの発現のレベルが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸マーカーまたはその一部とアニーリングする、転写されたポリヌクレオチドの該サンプル中での存在を検出することによって評価される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記サンプル中の前記マーカーの発現のレベルが、乳癌に罹患していない患者における該マーカーの発現の正常なレベルから、少なくとも約２または少なくとも約５という因数だけ異なる、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記マーカーが、表１に列挙されるマーカーから選択される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
患者が乳癌に罹患しているか否かを評価する方法であって：
ａ）表１および表２に列挙されるマーカーから独立して選択される少なくとも２つのマーカーのサンプル中での発現のレベルを決定する工程と；
ｂ）無痛性の乳房腫瘍を有するかまたは乳房腫瘍を有さないコントロール被験体由来のサンプル中の該マーカーの各々の発現のレベルを決定する工程と；
ｃ）患者サンプル中、およびコントロール被験体由来のサンプル中の該マーカーの発現のレベルを比較する工程と、を包含し、
ここでマーカーの発現の相当するコントロールレベルに対する、該マーカーのうち２つ以上の発現のレベルにおける有意な相違は、該患者が乳癌に罹患していることの指標である、方法。
（項目１８）
コントロール被験体からの発現のレベルが、ガンでない患者由来の乳房細胞から決定される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
コントロール被験体からの発現のレベルが、無痛性の乳房腫瘍を有するかまたは乳房腫瘍を有さない被験体の集団からの発現の平均レベルを用いて予め決定される、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
少なくとも３つのマーカーの発現が決定される、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
少なくとも５つのマーカーの発現が決定される、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
患者が、転移しているか、または転移する可能性が高い乳癌を有するかを評価するための方法であって：
ａ）表２に列挙されるマーカーから選択されるマーカーの患者における発現のレベルを決定する工程と；
ｂ）非転移性の乳房腫瘍を有するかまたは乳房腫瘍を有さないコントロール被験体由来のサンプル中における該マーカーの発現のレベルを決定する工程と；
ｃ）患者サンプル中、およびコントロール被験体由来のサンプル中の該マーカーの発現のレベルを比較する工程と、を包含し、
ここでコントロール被験体由来のサンプル中のこのレベルに対して比較した場合、該患者サンプル中の発現の有意に高いレベルは、この乳癌が転移しているか、または転移する可能性が高いことの指標である、方法。
（項目２３）
前記評価は、前記患者がリンパ節に転移している転移性乳癌に罹患しているか、またはリンパ節に転移する可能性が高い転移性乳癌に罹患しているかということの指標である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
乳癌の臨床的転帰を予測するための方法であって：
ａ）表２に列挙されるマーカーから選択されるマーカーの患者における発現のレベルを決定する工程と；
ｂ）良好な臨床転帰を有するコントロール被験体由来のサンプル中における該マーカーの発現のレベルを決定する工程と；
ｃ）患者サンプル中、およびコントロール被験体由来のサンプル中の該マーカーの発現のレベルを比較する工程と、を包含し、
ここでコントロール被験体由来のサンプル中の発現レベルに対して比較した場合、該患者サンプル中の発現の有意に高いレベルは、該患者の臨床的転帰が劣るという指標である、方法。
（項目２５）
患者における乳癌の進行をモニタリングするための方法であって：
ａ）時間内の第一ポイント由来の患者サンプルにおけるマーカーの発現レベルを決定する工程であって、該マーカーが表１に列挙されるマーカー、および表２に列挙されるマーカーからなる群より選択される工程と；
ｂ）時間内のその後の時点で該患者由来のサンプル中における該マーカーの発現のレベルを決定する工程と；
ｃ）工程ａ）および工程ｂ）において検出された発現のレベルを比較して、これによって、患者における乳癌の進行をモニタリングする工程と、を包含し、
ここで該マーカーの発現の変化が、乳癌の進行または後退のいずれかの指標である方法。
（項目２６）
前記マーカーが分泌されたタンパク質に相当する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記マーカーが転写されたポリヌクレオチドまたはその一部を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記サンプルが、患者から得た細胞、または血液、リンパ液、嚢胞液、乳首吸引液、および腫瘤生検から収集した液体からなる群より選択される液体を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記患者が、時間内の第一のポイントと、時間内のその後のポイントとの間で腫瘍を除去するように手術を受けている、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
患者における乳癌を阻害するための試験化合物の有効性を評価する方法であって：
ａ）患者から得られて、試験化合物に曝露された第一のサンプル中のマーカーの発現を決定する工程であって、該マーカーが表１に列挙されるマーカー、および表２に列挙されるマーカーからなる群より選択される工程と、
ｂ）該試験化合物に暴露されていない、患者から得られた第二のサンプルにおける該マーカーの発現を決定する工程と、
ｃ）該試験化合物に暴露されたサンプルと、該試験化合物に暴露されていないサンプルにおける該マーカーの発現を比較する工程と、
を包含し、該試験化合物に対して曝露されたサンプル中のマーカーの発現のレベルが該第二のサンプルに対して有意に低いことは、該試験化合物が該患者における乳癌を阻害するために有効であることの指標である、方法。
（項目３１）
前記第一および第二のサンプルが、前記患者から得られた単独のサンプルの一部である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第一および第二のサンプルが、前記患者から得られたプールされたサンプルの一部である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
患者における乳癌を阻害するための治療の有効性を評価する方法であって：
ａ）該患者に対して該治療の少なくとも一部を投与する前に該患者から得られた第一のサンプル中のマーカーの発現を決定する工程であって、該マーカーが表１に列挙されるマーカー、および表２に列挙されるマーカーからなる群より選択される工程と；
ｂ）該治療の一部を投与した後に該患者から得られた第二のサンプルにおける該マーカーの発現を決定する工程と；
ｃ）該第一および第二のサンプルにおけるマーカーの発現を比較する工程と；
ｄ）該第二のサンプルにおける該マーカーの発現のレベルが該第一のサンプルに対して有意に低い場合、該患者における乳癌を阻害するために該治療が有効であると決定する工程とを包含する、方法。
（項目３４）
患者における乳癌を阻害するための組成物を選択する方法であって：
ａ）該患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と；
ｂ）該サンプルのアリコートを複数の試験組成物に対して別々に曝露する工程と；
ｃ）該アリコートの各々におけるマーカーの発現を比較する工程であって、該マーカーが、表１に列挙されるマーカーおよび表２に列挙されるマーカーからなる群より選択される工程と；
ｄ）該試験組成物のうちの少なくとも１つを選択する工程であって、その試験組成物に曝露されたアリコートにおけるマーカーの、他の試験組成物に対して低レベルの発現を誘導する試験組成物を選択する工程と；
を包含する、方法。
（項目３５）
患者における乳癌の転移を阻害するための組成物を選択する方法であって：
ａ）該患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と；
ｂ）該サンプルのアリコートを複数の試験組成物に対して別々に曝露する工程と；
ｃ）該アリコートの各々におけるマーカーの発現を比較する工程であって、該マーカーが、表２に列挙されるマーカーからなる群より選択される工程と；
ｄ）該試験組成物のうちの少なくとも１つを選択する工程であって、その試験組成物に曝露されたアリコートにおけるマーカーの、他の試験組成物に対して低レベルの発現を誘導する試験組成物を選択する工程と；
を包含する、方法。
（項目３６）
試験組成物の乳房細胞発癌能力を評価するための方法であって：
ａ）試験組成物の有無のもとで乳房細胞の別々のアリコートを維持する工程と；
ｂ）該アリコートの各々において、表１に列挙されるマーカー、および表２に列挙されるマーカーからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーの発現を比較する工程と、を包含し；
ｃ）該試験組成物の存在下で維持した該アリコートにおけるマーカーの発現のレベルが有意に大きいことは、該試験組成物がヒト乳房細胞発癌能力を保有するということの指標である、方法。
（項目３７）
患者が乳癌に罹患しているか否かを評価するためのキットであって、表１に列挙されるマーカー、および表２に列挙されるマーカーからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーの発現を評価するための試薬を備えるキット。
（項目３８）
乳癌細胞の存在を評価するためのキットであって、少なくとも１つの核酸プローブを備え、該プローブが、表１に列挙されるマーカー、および表２に列挙されるマーカーからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーに相当する転写されたポリヌクレオチドに特異的に結合する、キット。
（項目３９）
乳癌細胞の存在を評価するためのキットであって、少なくとも１つの抗体を備え、該抗体が、表１に列挙されるマーカー、および表２に列挙されるマーカーからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーに相当するタンパク質に特異的に結合する、キット。
（項目４０）
患者における乳癌を阻害するための１つ以上の試験化合物の適合性を評価するためのキットであって：
ａ）１つ以上の試験化合物と；
ｂ）表１に列挙されるマーカー、および表２に列挙されるマーカーからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーの発現を評価するための試薬と；
を備えるキット。
（項目４１）
【化１】
2010246558.tif 000019
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
（項目４２）
【化２】
2010246558.tif 000020
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目４３）
【化３】
2010246558.tif 000021
2010246558.tif 000022
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに選択的に結合する、抗体。
（項目４４）
配列番号７７、配列番号７９および配列番号８９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
（項目４５）
配列番号７８のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目４６）
配列番号７８のアミノ酸配列を含むポリペプチドに選択的に結合する、抗体。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、乳房細胞のガン状態と関連する、表１に示される、新規に開発された乳癌マーカーに関する。任意のこれらのマーカーまたはこれらのマーカーの組み合わせの発現が正常なレベルよりも高ければ、患者の乳癌と相関するということが発見されている。さらに、本発明は、乳房細胞のガン状態と関連する、表２に示される新規に発見された乳癌マーカーに関する。任意のこれらのマーカーまたはこれらのマーカーの組み合わせの発現が正常なレベルよりも高ければ、患者の進行性の乳癌と相関するということが発見されている。サンプル中の乳癌の存在、サンプル中の乳癌の非存在、乳癌の病期を検出するため、乳癌が転移しているか否かを評価するため、乳癌患者のありそうな臨床的転帰を推測するため、そして患者における乳癌の予防、診断、特徴付けおよび治療に関する乳癌の他の特徴を用いる方法が提供される。乳癌を処置する方法もまた提供される。
【００５３】
表１は、非乳癌患者サンプル（例えば、非乳癌患者サンプル、非癌性の乳房細胞、他の非乳癌患者サンプル）に比べて、乳癌患者サンプルにおいて過剰に発現される、本発明のマーカーを列挙している。表１は、乳癌の存在についてスクリーニングするのに特に有用なマーカー（「スクリーニングマーカー（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒｓ）」）を列挙している。表２は、正常なサンプル（例えば、良好な転帰の乳癌患者サンプル、非乳癌患者サンプル、非癌性乳房細胞）に比べて、転帰の劣る乳癌患者サンプルにおいて過剰発現される、本発明のマーカーを列挙している。表２は、乳癌の病期を評価するのにおいて特に有用なマーカー（「病期分類マーカー（ｓｔａｇｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒｓ）」）を列挙している。表１および表２は、ヌクレオチド転写物のｃＤＮＡ配列の配列表識別子、および各々のマーカーによってコードされるかまたは各々のマーカーに相当するタンパク質のアミノ酸配列、ならびにｃＤＮＡ配列内のタンパク質コード配列の位置を示している。表１は、本発明のマーカーを同定し（配列番号１〜６６）、そして表２は、本発明のマーカーを同定しており（配列番号６７〜９６）、これは（「マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）」）という名称で指定されており、この名称は、遺伝子は、通常、あてはまる場合（「遺伝子名（Ｇｅｎｅ  Ｎａｍｅ）」）として、このマーカーによってコードされるかまたはこのマーカーに相当するヌクレオチド転写物のｃＤＮＡ配列の配列表識別子（「配列番号（ヌクレオチド）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ（ｎｔｓ））」）、ヌクレオチド転写物によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の配列表識別子（「配列番号（アミノ酸）（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ（ＡＡｓ））」）、およびこのｃＤＮＡ配列内のタンパク質コード配列の位置（「ＣＤＳ」）として知られる。
【００５４】
表１．乳癌スクリーニングマーカー
【００５５】
【表１】
2010246558.tif 000023
2010246558.tif 000024
表２．乳癌病期分類マーカー
【００５６】
【表２】
2010246558.tif 000025
定義
本明細書において用いる場合、以下の用語の各々は、この節においてそれと関連している意味を有する。
【００５７】
本明細書において用いられる「１つの（「ａ」および「ａｎ」）」という項目は、この項目の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）をいう。例えば、「１つのエレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つのエレメントまたは２つ以上のエレメントを意味する。
【００５８】
「マーカー（ｍａｒｋｅｒ）」とは、組織または細胞におけるその遺伝子の発現のレベルの、正常なまたは健常な組織もしくは細胞におけるその発現レベルからの変更が、癌のような疾患状態と関連している遺伝子である。「マーカー核酸（ｍａｒｋｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」とは、本発明のマーカーによってコードされるか、またはそのマーカーに相当する核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）である。このようなマーカー核酸としては、
【００５９】
【化１７】
2010246558.tif 000026
のいずれかの全体もしくは部分的配列、またはこのような配列の相補体を含むＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）が挙げられる。このマーカー核酸としてはまた、
【００６０】
【化１８】
2010246558.tif 000027
のいずれかの全体もしくは部分的配列、またはこのような配列の相補体を含むＲＮＡが挙げられ、ここでは全てのチミジン残基がウリジン残基で置換されている。マーカータンパク質は、
【００６１】
【化１９】
2010246558.tif 000028
のいずれかの全体または部分的配列を含む。「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」および「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、交換可能に用いられる。
【００６２】
「マーカーセット（ｍａｒｋｅｒ  ｓｅｔ）」とは、２つ以上のマーカーの群である。
【００６３】
「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」という用語は、特に意図される標的分子、例えば、マーカーによってコードされるかまたはマーカーに相当するヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合し得る任意の分子をいう。プローブは、当業者によって合成されてもよいし、または適切な生物学的調製に由来してもよい。標的分子の検出の目的のために、プローブは、本明細書に記載されるとおり、標識されるように特別に設計されてもよい。プローブとして利用可能な分子の例としては、限定はしないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子が挙げられる。
【００６４】
本明細書において用いる場合「乳癌（Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）」としては、癌腫（例えば、上皮内癌、浸潤癌、転移性癌）および前癌状態が挙げられる。
【００６５】
「乳房に関連する、乳房関連性（ｂｒｅａｓｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」体液とは、患者の身体内にある場合、乳房細胞に接触するかまたはそれを通過するか、または乳房細胞から脱落した核酸またはタンパク質が通過し得る細胞へ通過する液である。例示的な乳房関連性の体液としては、血液、リンパ液、嚢胞液および乳首吸引液が挙げられる。
【００６６】
「サンプル（ｓａｍｐｌｅ）」または「患者サンプル（ｐａｔｉｅｎｔ  ｓａｍｐｌｅ）」は、患者から得られた細胞、例えば、腫瘤生検、血液、リンパ液および嚢胞液を含む体液、ならびに乳首吸引液を含む。さらなる実施形態では、患者サンプルはインビボである。
【００６７】
マーカーの「正常な（ｎｏｒｍａｌ）」発現レベルは乳癌に罹患していないヒト被験体または患者の乳房細胞におけるマーカーの発現のレベルである。
【００６８】
マーカーの「過剰発現（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」または「有意に高レベルの発現（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｈｉｇｈｅｒ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、発現を評価するために使用されるアッセイの標準誤差よりも大きい、そして好ましくは、コントロールサンプル（例えば、疾患に関連するマーカーを有さない健常被験体由来のサンプル）中のマーカーの発現レベルの少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍または１０倍の試験サンプル中での発現レベル、そして好ましくはいくつかのコントロールサンプルにおけるマーカーの平均発現レベルをいう。
【００６９】
マーカーの「有意に低いレベルの発現（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｌｏｗｅｒ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、コントロールサンプル（例えば、疾患に関連するマーカーを有さない健常被験体由来のサンプル）中のマーカーの発現レベルの少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍または１０倍小さい試験サンプルの発現レベル、そして好ましくはいくつかのコントロールサンプルにおけるマーカーの平均発現レベルをいう。
【００７０】
本明細書において用いる場合、「プロモーター／制御配列（ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、このプロモーター／制御配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要である核酸配列を意味する。ある場合には、この配列は、コアプロモーター配列であってもよく、そして他の場合には、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要である、エンハンサー配列および他の制御エレメントを含んでもよい。このプロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的様式において遺伝子産物を発現するものであってもよい。
【００７１】
「構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、この遺伝子産物が、細胞のほとんどのまたは全ての生理学的条件下において生きたヒト細胞中で生成されるようにするヌクレオチド配列である。
【００７２】
「誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、このプロモーターに対応するインデューサーが細胞中に存在する場合にのみ実質的に、この遺伝子産物が、生きたヒト細胞中で生成されるようにするヌクレオチド配列である。
【００７３】
「組織特異的（ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、この細胞がこのプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ実質的に、この遺伝子産物が生きたヒト細胞中で生成されるようにするヌクレオチド配列である。
【００７４】
「転写されたポリヌクレオチド（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「ヌクレオチド転写物（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）」とは、本発明のマーカーの転写、およびもしあればＲＮＡ転写物の正常な転写後プロセシング（例えば、スプライシング）、およびＲＮＡ転写物の逆転写によって作製された成熟ｍＲＮＡの全てもしくは一部に対して相補的であるか、または相同であるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡもしくはｃＤＮＡのようなアナログ）である。
【００７５】
「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、２つの核酸鎖の領域の間、または同じ核酸鎖の２つの領域の間の配列相補性の広範な概念をいう。第一の核酸領域のアデニン残基は、その第一の領域に対して逆平行である第二の核酸領域の残基と、その残基がチミンまたはウラシルである場合に、特定の水素結合（「塩基対合（ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ）」）を形成し得るということが公知である。同様に、第一の核酸鎖のシステイン残基は、その第一の鎖に対して逆平行である第二の核酸鎖の残基と、その残基がグアニンである場合に、塩基対合し得るということが公知である。核酸の第一の領域は、同じまたは異なる核酸の第二の領域に対してこの２つの領域が逆平行様式で整列されるとき、この第一の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第二の領域の残基と塩基対合し得る場合に、相補的である。好ましくは、この第一の領域は、第一部分を含み、そして第二の領域は、第二部分を含み、それによって、この第一および第二の部分が逆平行方式で整列される場合、この第一の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、そして好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、この第二の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対合され得る。さらに好ましくは、この第一の部分の全てのヌクレオチド残基は、この第二の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対合し得る。
【００７６】
本明細書において用いる場合、「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」とは、同じ核酸鎖の２つの領域の間、または２つの異なる核酸鎖の領域の間のヌクレオチド配列類似性をいう。両方の領域におけるヌクレオチド残基の位置が、同じヌクレオチド残基で占有されれば、この領域はその位置でホモログである。第一の領域は、各々の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占有される場合、第二の領域に対して相同である。２つの領域の間の相同性は、同じヌクレオチド残基によって占有される２つの領域のヌクレオチド残基位置の割合として表される。例えば、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域、およびヌクレオチド５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域は５０％の相同性を共有する。好ましくは、この第一の領域は、第一部分を含み、そして第二の領域は、第二部分を含み、それによって、この各々の部分のヌクレオチド残基位置のうち少なくとも約５０％、そして好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、同じヌクレオチド残基によって占有される。さらに好ましくは、この部分の各々のうち全てのヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基によって占有される。
【００７７】
分子は、基質からの分子解離の実質的な画分なしに、液体（例えば、標準的な生理食塩水  クエン酸、ｐＨ７．４）でリンスされ得るように、分子がこの基質と共有結合的にまたは非共有結合的に結合される場合、このような基質に「固定される（ｆｉｘｅｄ）」かまたは「付加される（ａｆｆｉｘｅｄ）」。
【００７８】
本明細書において用いる場合、「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」核酸分子とは、天然に見出される有機物に存在するヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。
【００７９】
ガンは、このガンの少なくとも１つの症状が、緩和されるか、終結されるか、遅らせられるか、または防止される場合に、「阻害される（ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）」。本明細書において用いる場合、乳癌はまた、このガンの再発または転移が、軽減されるか、遅らせられるか、または防止される場合にも「阻害される（ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）」。
【００８０】
キットとは、少なくとも１つの試薬、例えば、本発明のマーカーの発現を特異的に検出するための、プローブを含む任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）である。このキットは、本発明の方法を行なうためのユニットとして宣伝、配布または販売され得る。
【００８１】
「本発明のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、マーカータンパク質およびそのフラグメント；改変体マーカータンパク質およびそれらのフラグメント；マーカーまたは改変体マーカータンパク質の少なくとも１５アミノ酸セグメントを含むペプチドおよびポリペプチド；ならびにマーカーもしくは改変マーカータンパク質を含む融合タンパク質、またはマーカーもしくは改変マーカータンパク質の少なくとも１５個のアミノ酸のセグメントを包含する。
【００８２】
本明細書において他に特定されない限り、「抗体（単数および複数）」という用語は広義には、抗体の天然に存在する形態（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）、および組み換え抗体、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、および多価抗体、ならびに前述の全てのフラグメントおよび誘導体であって、少なくとも抗原結合部位を有するフラグメントおよび誘導体を包含する。抗体誘導体は、抗体に結合体化されたタンパク質または化学部分を含んでもよい。
【００８３】
本発明は部分的には、正常な（すなわち、非癌性）乳房細胞における発現に比較して、乳癌細胞において過剰発現される、新規に同定されたマーカーに基づく。乳房細胞におけるこれらのマーカーの１つ以上の発現の増大は本明細書において、組織の癌性状態と相関している。本発明は、乳房細胞（例えば、ヒトから得た細胞、培養されたヒト細胞、保管されるかまたは保存されたヒト細胞、およびインビボ細胞）の癌性状態を評価するため、ならびに乳癌に罹患している患者を処置するための組成物、キットおよび方法を提供する。
【００８４】
本発明の組成物、キットおよび方法は、とりわけ以下の用法を有する：
ヒト患者における乳癌の状態を評価する工程；
ヒト患者における乳癌の病期を評価する工程；
患者における乳癌のグレードを評価する工程；
患者における乳癌の良性または悪性の性質を評価する工程；
患者における乳癌の転移能力を評価する工程；
リンパ節に乳癌が転移しているか否かを決定する工程；
乳癌患者の臨床的転帰を予測する工程；
患者が乳癌に罹患しているか否かを評価する工程；
患者における乳癌に罹患している新生物の組織学的タイプを評価する工程；
乳癌を処置するために有用な抗体、抗体フラグメントまたは抗体誘導体を作製する工程、および／または患者が乳癌に罹患しているか否かを評価する工程；
乳癌細胞の存在を評価する工程；
患者における乳癌を阻害するための１つ以上の試験化合物の有効性を評価する工程；
患者における乳癌を阻害するための治療の有効性を評価する工程；
患者における乳癌の進行をモニタリングする工程；
患者における乳癌を阻害するための組成物または治療を選択する工程；
乳癌に罹患している患者を処置する工程；
患者における乳癌を阻害する工程；
試験化合物の乳癌発癌能力を評価する工程；および
乳癌を発症するリスクを有する患者における乳癌の発現を防止する工程。
【００８５】
従って、本発明は、乳癌に罹患している患者の乳癌細胞を評価する方法を包含する。この方法は、患者サンプルにおける本発明のマーカー（表１に列挙される）の発現のレベルと、コントロール、例えば、非乳癌サンプルまたは非癌正常サンプルにおけるマーカーの発現の正常レベルとを比較する工程を包含する。正常なレベルの発現と比較した、患者サンプル中のマーカーの有意に高レベルの発現は、患者が乳房腫瘍に罹患しているということの指標である。
【００８６】
乳癌に罹患している患者における乳癌細胞の進行性を評価する方法がさらに提供される。この方法は、患者サンプルにおける本発明のマーカー（表２に列挙される）の発現のレベルと、コントロール、例えば、非乳癌サンプルまたは無痛性乳癌サンプルにおけるマーカーの発現の正常レベルとを比較する工程を包含する。正常なレベルの発現と比較した、患者サンプル中のマーカーの有意に高レベルの発現は、患者が進行性の乳房腫瘍に罹患しているということの指標である。
【００８７】
本発明の配列（例えば、
【００８８】
【化２０】
2010246558.tif 000029
）またはこのような配列の相補体のいずれかのうちの全体、または１５個以上のヌクレオチドのセグメントを含む核酸、ならびに
【００８９】
【化２１】
2010246558.tif 000030
2010246558.tif 000031
の配列のいずれかのうちの全体または１０個以上のアミノ酸を含むポリペプチドを含む、遺伝子送達ビヒクル、宿主細胞および組成物（全て本明細書に記載される）もまた、本発明によって提供される。
【００９０】
本明細書において用いる場合、患者における乳癌は、本発明の１つ以上のマーカーの発現のレベルの増大を伴っている。しかし、上記で考察されるように、発現レベルにおけるこれらの変化のいくつかは、乳癌の発生から生じ、これらの変化のうちの他のものは、乳癌細胞の癌性状態を誘導、維持および促進する。従って、本発明の１つ以上のマーカーの発現のレベルにおける増大によって特徴付けられる乳癌は、マーカーの発現、および／またはこれらのマーカーによってコードされるタンパク質の機能を軽減するか、および／または妨害することによって阻害され得る。
【００９１】
本発明のマーカーの発現は、当該分野で一般に公知である多数の方法において阻害され得る。例えば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、マーカー（単数または複数）の転写、翻訳またはその両方を阻害するために乳癌細胞に提供され得る。あるいは、マーカータンパク質に特異的に結合し、そして適切なプロモーター／調節性領域と作動可能に連結される、抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドが、このタンパク質の機能または活性を阻害する細胞内抗体を生成するために細胞に提供され得る。マーカーの発現および／または機能はまた、マーカータンパク質に特異的に結合するペプチドまたは抗体、抗体誘導体または抗体フラグメントを用いて乳癌細胞を処置することによって阻害され得る。本明細書に記載の方法を用いて、種々の分子、特に細胞膜を横切ることが可能な十分に小さい分子を含む分子をスクリーニングして、マーカーの発現を阻害するか、またはマーカータンパク質の機能を阻害する分子を同定することができる。このように同定された化合物は、患者の乳癌細胞を阻害するために患者に提供され得る。
【００９２】
本発明の任意のマーカーまたはマーカーの組み合わせ、ならびに本発明のマーカーと組み合わせた任意の公知のマーカーが、本発明の組成物、キットおよび方法において用いられ得る。一般に、乳癌細胞におけるマーカーの発現のレベルと、正常な乳房細胞における同じマーカーの発現のレベルとの間の相違ができるだけ大きいマーカーを用いることが好ましい。この相違は、マーカーの発現を評価するための方法の検出限界と同じ程度に小さくでもよいが、その相違は、評価方法の標準誤差よりも少なくとも大きく、そして好ましくは正常な乳房組織における同じマーカーの発現のレベルよりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、１００倍、５００倍、１０００倍またはそれ以上の相違であることが好ましい。
【００９３】
特定のマーカータンパク質が、乳房細胞（すなわち、正常および癌性細胞の一方または両方）から細胞を囲む細胞外腔へ分泌されることが理解される。これらのマーカーは好ましくは、このようなマーカータンパク質が、組織生検サンプルよりもヒト患者から容易に収集され得る乳房関連性体液サンプルにおいて検出され得るという事実に起因して、本発明の組成物、キットおよび方法の特定の実施形態において用いられる。さらに、マーカータンパク質の検出のための好ましいインビボ技術は、このタンパク質に対する標識された抗体を被験体中に導入する工程を包含する。例えば、被験体中の存在および位置が標準的な画像化技術によって検出され得る放射性マーカーを用いて抗体は標識されてもよい。
【００９４】
任意の特定のマーカータンパク質が分泌タンパク質であるか否かを決定することは当業者には簡単な問題である。この決定を行なうために、マーカータンパク質は、例えば、哺乳動物細胞、好ましくはヒト乳癌細胞株において発現される、細胞外液が収集され、そして細胞外液中のタンパク質の有無が評価される（例えば、タンパク質に特異的に結合する標識された抗体を用いて）。
【００９５】
以下は、タンパク質の分泌を検出するために用いられ得る方法の１例である：約８×１０５個の２９３Ｔ細胞を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、９５％空気雰囲気下で約６０〜７０％コンフルエンスまで、増殖培地（１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地｛ＤＭＥＭ｝）を含むウェル中において３７℃でインキュベートする。次いで、１ウェルあたり、タンパク質をコードする発現ベクターを含む２μｇのＤＮＡおよび１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬカタログ番号１８３４２−０１２）を含む標準トランスフェクション混合物を用いてこの細胞をトランスフェクトする。このトランスフェクション混合物を約５分間維持し、次いで新鮮増殖培地で置換し、空気雰囲気中で維持する。各々のウェルを、メチオニンもシステイン（ＤＭＥＭ−ＭＣ；ＩＣＮカタログ番号１６−４２４−５４）も含まないＤＭＥＭで穏やかに２回リンスする。約１ｍｌのＤＭＥＭ−ＭＣおよび約５０μｌのＴｒａｎｓ−３５Ｓ（商標）試薬（ＩＣＮカタログ番号５１００６）を、各々のウェルに添加する。このウェルを上記の５％ＣＯ２雰囲気下で維持して、３７℃で選択した期間インキュベートする。インキュベーション後、１５０μｌの馴化培地を取り出し、遠心分離して、流動している細胞および砕片を除去する。上清中のタンパク質の存在は、タンパク質が分泌されるということの指標である。分泌されたタンパク質の検出のためのさらなる方法および代替的方法が、当該分野で公知であり、そしてこの方法に加えて、またはこの方法の代わりに用いられてもよい。
【００９６】
乳房細胞を含む患者サンプルは、本発明の方法において用いられ得ることが理解される。これらの実施形態では、マーカーの発現レベルは、乳房細胞サンプル、例えば患者から得られた乳房生検中のマーカーの量（例えば、絶対的な量または濃度）を評価することによって決定され得る。細胞サンプルは、当然ながら、サンプル中でのマーカーの量を評価する前に、種々の周知の収集後調製技術および貯蔵技術（例えば、核酸および／またはタンパク質抽出、固定、貯蔵、凍結、超遠心、濃縮、エバポレーション、遠心分離、など）に供され得る。同様に、乳房生検はまた、収集後の調製および貯蔵技術、例えば固定に供されてもよい。
【００９７】
本発明の組成物、キットおよび方法は、マーカータンパク質を発現する細胞の表面上に提示される、そのマーカータンパク質の少なくとも一部を発現を検出するために用いてもよい。マーカータンパク質、またはその一部が細胞表面に曝露されるかを決定することは当業者には簡単な問題である。例えば、全細胞上でこのようなタンパク質を検出するために、免疫学的方法を用いてもよいし、または少なくとも１つの細胞外ドメイン（すなわち、分泌タンパク質および少なくとも１つの細胞表面ドメインを有するタンパク質の両方を含む）の存在を予測するために周知のコンピューターベースの配列分析方法を用いてもよい。マーカータンパク質を発現する細胞の表面上に提示される少なくとも１部を有するこのマーカータンパク質の発現は、この細胞を溶解する必要なしに検出され得る（例えば、タンパク質の細胞表面ドメインと特異的に結合する標識された抗体を用いて）。
【００９８】
本発明のマーカーの発現は、転写された核酸またはタンパク質の発現を検出するための任意の広範な種々の周知の方法によって評価され得る。このような方法の非限定的な例としては、分泌された、細胞表面、細胞質の、または核タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製方法、タンパク質機能または活性のアッセイ、核酸ハイブリダイゼーション方法、核酸逆転写方法、および核酸増幅方法が挙げられる。
【００９９】
好ましい実施形態では、マーカーの発現は、その正常な翻訳後改変の全てまたは一部を受けているマーカータンパク質を含む、マーカータンパク質またはそのフラグメントと特異的に結合する、抗体（例えば、放射線標識抗体、発色団標識抗体、発蛍光団標識抗体、または酵素標識抗体）、抗体誘導体（例えば、基質とのまたはタンパク質−リガンド対｛例えば、ビオチン−ストレプトアビジン｝のタンパク質もしくはリガンドとの結合体化された抗体）、または抗体フラグメント（例えば、単鎖抗体、単離された抗体超可変ドメイン、など）を用いて評価される。
【０１００】
別の好ましい実施形態では、マーカーの発現は、患者サンプルにおける細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写されたポリヌクレオチド）を調製することによって、そしてマーカー核酸の相補体またはそのフラグメントである参照ポリヌクレオチドとこのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをハイブリダイズすることによって、評価される。ｃＤＮＡは必要に応じて、この参照ポリヌクレオチド（好ましくは、これは増幅されない）とのハイブリダイゼーションの前に任意の種々のポリメラーゼ連鎖反応方法を用いて増幅され得る。１つ以上のマーカーの発現は同様に、マーカー（単数または複数）の発現のレベルを評価するために定量的ＰＣＲを用いて検出され得る。あるいは、本発明のマーカーの変異または改変体（例えば、一塩基多型、欠失、など）を検出する任意の多くの公知の方法が、患者におけるマーカーの出現を検出するために用いられ得る。
【０１０１】
関連の実施形態では、サンプルから得られた転写ポリヌクレオチドの混合物を、マーカー核酸の少なくとも一部（例えば、少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、５００またはそれ以上のヌクレオチド残基）に対して相補的であるかまたはそれと相同であるポリヌクレオチドを固定している基板と接触させる。相補的であるか相同なポリヌクレオチドが基板上で示差的に検出可能（例えば、異なる発色団もしくは発蛍光団を用いて検出可能であるか、または異なる選択された位置に固定される）であれば、複数のマーカーの発現のレベルは、単独の基板（例えば、選択された位置に固定されたポリヌクレオチドの「遺伝子チップ（ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐ）」マイクロアレイ）を用いて同時に評価可能である。１つの核酸と別の核酸とのハイブリダイゼーションを包含する、マーカー発現を評価する方法が用いられる場合、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行なうことが好ましい。
【０１０２】
本発明の組成物、キットおよび方法は、本発明の１つ以上のマーカーの発現レベルの相違の検出に基づくので、マーカーの発現のレベルは、正常な乳房細胞および癌性の乳房細胞のうちの少なくとも１つにおける発現を評価するために用いられる方法の最小検出限界よりも有意に大きいことが好ましい。
【０１０３】
本発明のマーカーの１つ以上を用いてさらなる患者サンプルの慣用的スクリーニングをすることによって、特定のマーカーが、特定の乳癌を含む種々のタイプのガン、ならびに肺癌、卵巣癌などの他のガンで過剰発現されるということが理解される。例えば、本発明のマーカーのいくつかは、乳癌のほとんど（すなわち、５０％以上）または実質的に全て（すなわち、８０％以上）で過剰発現されることが確認される。従って、本発明の組成物、キットおよび方法は、患者における乳房腫瘍の良性または悪性の性質を特徴付けるのに有用である。
【０１０４】
さらに、本発明の特定のマーカーは、乳癌の種々の病期（すなわち、病期０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩおよびＩＶの乳癌、ならびに小分類ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよびＩＩＩＢ、乳癌の原発性癌腫についてのＦＩＧＯ  Ｓｔａｇｅ  Ｇｒｏｕｐｉｎｇシステムを用いて；（Ｂｒｅａｓｔ，Ｉｎ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ：ＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，第５版、１９９７、ｐｐ１７１〜１８０を参照のこと）、乳癌の種々の組織学的サブタイプ（例えば、悪性乳房腫瘍の分類についてのＷＨＯ／ＦＩＧＯシステム；Ｓｃｕｌｌｙ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第３シリーズ、Ｗａｓｈｉｇｔｏｎ  ＤＣを用いる、漿液、粘液、類内膜および明細胞サブタイプ、ならびに小分類および別の分類の腺癌、乳頭腺癌、乳頭嚢胞腺癌、表在性乳頭状癌、悪性腺線維腫、嚢胞線維腫、腺癌、嚢胞腺癌、腺棘細胞腫、類内膜間質肉腫、中胚葉性（ミュラー型）混合腫瘍、中腎性腫瘍、悪性癌腫、ブレンナー腫瘍、混合上皮腫瘍および未分化癌）、および種々のグレード（すなわち、グレードＩ｛十分分化した｝、グレードＩＩ｛中程度によく分化した｝、そしてグレードＩＩＩ｛周囲の正常組織からの分化が乏しい｝））に関連していることが確認される。さらに、多数の患者サンプルが本発明のマーカーの発現について評価されており、そのサンプルが得られた個々の患者の転帰が相関されているので、本発明の特定のマーカーの発現の変化が悪性の癌と強力に相関していること、および本発明の他のマーカーの発現の変化が良性腫瘍と強力に相関していることが確認される。従って、本発明の組成物、キットおよび方法は、患者における乳癌の病期（ｓｔａｇｅ）、グレード（ｇｒａｄｅ）、組織学的タイプ、および良性／悪性の性質のうちの１つ以上を特徴付けるために有用である。
【０１０５】
本発明の組成物、キットおよび方法が、患者における乳房腫瘍の病期（ｓｔａｇｅ）、グレード（ｇｒａｄｅ）、組織学的タイプ、および良性または悪性の性質のうちの１つ以上を特徴付けるために有用である場合、本発明のマーカーまたはマーカーのパネルは、少なくとも約２０％、そして好ましくは少なくとも約４０％、６０％もしくは８０％、そしてさらに好ましくは、相当する病期、グレード、組織学的タイプ、または良性もしくは悪性の性質の乳房腫瘍に罹患している実質的に全ての患者において、陽性の結果が得られるように選択されることが好ましい。好ましくは、本発明のマーカーまたはマーカーのパネルは、一般的集団について約１０％を超える陽性的中率（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）（ＰＰＶ）が得られる（より好ましくは８０％を超えるアッセイ特異性を加えて）ように選択される。
【０１０６】
本発明の複数のマーカーが本発明の組成物、キットおよび方法において用いられる場合、患者サンプル中の各々のマーカーの発現のレベルは、同じタイプの非癌性のサンプル中の複数のマーカーの各々の発現の正常なレベルと、単独の反応混合物中で（すなわち、各々のマーカーについて、異なる蛍光プローブのような試薬を用いて）、または１つ以上のマーカーに相当する個々の反応混合物中のいずれかで比較され得る。１実施形態では、相当する正常なレベルに対する、サンプル中の複数のマーカーの２つ以上の発現のレベルの有意な増大は、この患者が乳癌に罹患しているということの指標である。複数のマーカーを用いる場合、２、３、４、５、８、１０、１２または１５以上の個々のマーカーを用いることが好ましい。少なくとも２０、２５、３０、４０、５０またはそれ以上の個々のマーカーが用いられるマーカーセットを含むようにさらにマーカーが用いられ得る。
【０１０７】
本発明の組成物、キットおよび方法の感度（すなわち、患者サンプル中の非乳房由来の細胞に起因し得る妨害による）を最大化するために、本明細書において用いられる本発明のマーカーは組織分布が限定されている、例えば、通常は非乳房組織では発現されないマーカーであることが好ましい。
【０１０８】
乳癌に関連していることが公知のマーカーはごく少数である（例えば、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２）。これらのマーカーは、当然ながら、本発明のマーカー内に含まれるが、それらは、本発明の１つ以上のマーカーと一緒に、例えばマーカーのパネル内で用いられ得る。特定のタイプの遺伝子、例えば、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、成長因子様遺伝子、プロテアーゼ様遺伝子、およびタンパク質キナーゼ様遺伝子がしばしば種々のタイプの癌の発症と関係していることは周知である。従って、本発明のマーカーのうち、公知の癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子によってコードされる公知のタンパク質に似ているタンパク質に対応するマーカー、ならびに成長因子、プロテアーゼおよびプロテインキナーゼを模倣するタンパク質に対応するマーカーの使用が好ましい。
【０１０９】
本発明の組成物、キットおよび方法は、乳癌を発症するリスクが増大している患者および彼らの医学的顧問に対して特に有用であることが理解される。乳癌を発症するリスクが増大していると認識される患者としては、例えば、乳癌の家族歴を有する患者、変異癌遺伝子（すなわち、少なくとも１つの対立遺伝子）を有することが特定された患者、および高齢の患者（すなわち、約５０歳または６０歳を超える女性）が挙げられる。
【０１１０】
正常な（すなわち、非癌性）乳房組織におけるマーカーの発現のレベルは種々の方法で評価され得る。１実施形態では、この正常なレベルの発現は、非癌性であると思われる乳房細胞の一部におけるマーカーの発現レベルを評価することによって、およびこの正常なレベルの発現と、癌性であると疑われる乳房細胞の一部における発現のレベルとを比較することによって決定される。あるいは、そして詳細には、本明細書に記載される方法の慣用的な能力の結果としてさらなる情報が利用可能であるので、本発明のマーカーの正常な発現の集団平均値が用いられ得る。他の実施形態では、マーカーの「正常な（ｎｏｒｍａｌ）」発現レベルは、ガンに罹患していない患者から得られた患者サンプル、患者中の乳癌の発現が疑われる前にその患者から得られた患者サンプル、保管された患者サンプル由来などの患者サンプル中のマーカーの発現を評価することによって決定され得る。
【０１１１】
本発明はサンプル（例えば、保管された組織サンプルまたは患者から得られたサンプル）中の乳癌細胞の存在を評価するための組成物、キットおよび方法を包含する。この組成物、キットおよび方法は、組成物、キットおよび方法が患者サンプル以外のサンプルとの使用に適合されることが必要な場合を除いて、上記のものと実質的に同じである。例えば、用いられるサンプルがパラフィン処理された、保管されたヒト組織サンプルである場合、本発明のキットにおける本発明の組成物中での化合物の比を、本発明のキット、またはサンプル中のマーカー発現のレベルを評価するために用いられる方法において調節することが必要であり得る。このような方法は、当該分野で周知であり、当業者の技術の範囲内である。
【０１１２】
本発明は、乳癌細胞の存在を（例えば、患者サンプルのようなサンプル中で）評価するためのキットを包含する。このキットは、複数の試薬を含み、その各々が、マーカーの核酸またはタンパク質と特異的に結合し得る。マーカータンパク質との結合のために適切な試薬としては、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメントなどが挙げられる。マーカー核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライシングｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）との結合のために適切な試薬としては、相補的な核酸が挙げられる。例えば、核酸試薬としては、基質に固定されたオリゴヌクレオチド（標識または非標識）、基質と結合されていない標識オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマーの対、分子ビーコンプローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ）などが挙げられる。
【０１１３】
本発明のキットは必要に応じて、本発明の方法を行なうために有用なさらなる組成物を含む。例えば、このキットは、相補的な核酸をアニーリングするため、または抗体とそれが特異的に結合するタンパク質とを結合するために適切な液体（例えば、ＳＳＣ緩衝液）、１つ以上のサンプル区画、本発明の方法の実施を記載する説明書、正常な乳房細胞のサンプル、乳癌細胞のサンプルなどを備えてもよい。
【０１１４】
本発明はまた、患者が乳癌に罹患しているか否かを評価するために有用な抗体を生成する単離されたハイブリドーマを作製する方法を包含する。この方法では、マーカータンパク質の全体またはセグメントを含むタンパク質またはペプチドが合成されて単離される（例えば、そのタンパク質が発現される細胞からの精製によって、または公知の方法を用いる、インビボまたはインビトロでのタンパク質またはペプチドをコードする核酸の転写および翻訳によって）。脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギまたはヒツジは、タンパク質またはペプチドを用いて免疫される。脊椎動物は必要に応じて（そして好ましくは）、タンパク質またはペプチドを用いて少なくともさらに１回免疫され得、その結果この脊椎動物はタンパク質またはペプチドに対する強固な免疫応答を示すようになる。当該分野で周知の任意の種々の方法を用いて、この免疫された脊椎動物から脾細胞を単離して、不死化細胞株と融合してハイブリドーマを形成する。次いで、この方式で形成されたハイブリドーマを標準的な方法を用いてスクリーニングして、マーカータンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体を生成する１つ以上のハイブリドーマを同定する。本発明はまた、この方法によって作製されたハイブリドーマ、およびこのようなハイブリドーマを用いて作製された抗体を包含する。
【０１１５】
本発明はまた、乳癌細胞を阻害するための試験化合物の有効性を評価する方法を包含する。上記のように、本発明のマーカーの発現のレベルにおける相違は、乳房細胞の癌性状態と相関する。本発明の特定のマーカーの発現のレベルにおける変化は、乳房細胞の癌性状態から生じる可能性が高いということが認識されるが、本発明の他のマーカーの発現のレベルの変化は、それらの細胞の癌性の状態を誘導、維持および促進することが同様に理解される。従って、患者の乳癌を阻害する化合物は、本発明のマーカーの１つ以上の発現のレベルを、そのマーカーの正常な発現レベルに近いレベル（すなわち、非癌性乳房細胞におけるマーカーの発現のレベル）まで変化させる。
【０１１６】
従って、この方法は、第一の乳房細胞サンプルにおけるそして試験化合物の存在下で維持されたマーカーの発現と、第二の乳房細胞サンプルにおけるそして試験化合物の存在下で維持されたマーカーの発現とを比較する工程を包含する。試験化合物の存在下での本発明のマーカーの発現の有意な低下は、この試験化合物が乳癌を阻害するということの指標である。乳房細胞サンプルは、例えば、患者から得られた正常な乳房細胞の単独細胞のアリコート、患者から得られた正常な乳房細胞のプールされたサンプル、正常な乳房細胞株の細胞、患者から得られた乳癌細胞の単独のサンプルのアリコート、患者から得られた乳癌細胞のプールされたサンプル、乳癌細胞株の細胞などであってもよい。１実施形態では、サンプルは、患者から得られた乳癌細胞であり、そして種々の乳癌を阻害するために有効であることが公知の複数の化合物のうちの１つ以上が試験されて、患者の乳癌を最もよく阻害する可能性が高い化合物が同定される。
【０１１７】
本方法は、患者の乳癌を阻害するための治療の有効性を評価するために同様に用いられ得る。この方法では、対のサンプル（１つを治療に供し、もう一方は治療に供さない）において本発明の１つ以上のマーカーの発現のレベルを評価する。試験化合物の有効性を評価する方法と同様に、本発明のマーカーの有意に低レベルの発現が治療によって誘導されるならば、この治療は、乳癌を阻害するために有効である。このように、選択された患者由来のサンプルをこの方法に用いるならば、患者の乳癌を阻害するために最も有効であると思われる治療を選択するためにインビトロで別の治療が評価され得る。
【０１１８】
上記のように、ヒト乳房細胞の癌性状態は、本発明のマーカーの発現のレベルの変化と相関している。本発明は、試験化合物のヒト乳房細胞発癌性能力を評価するための方法を包含する。この方法は、試験化合物の有無においてヒト乳房細胞の別々のアリコートを維持する工程を包含する。アリコートの各々において本発明のマーカーの発現を比較する。試験化合物の存在下で維持したアリコートにおける本発明のマーカーの有意に高レベルの発現（試験化合物の非存在下で維持したアリコートに対して）は、この試験化合物がヒト乳癌細胞発癌性能力を有するということの指標である。種々の試験化合物の相対的な発癌性能力は、関連のマーカーの発現のレベルの増強もしくは阻害の程度を比較することによって、発現のレベルが増強されるかもしくは阻害されるマーカーの数を比較することによって、またはその両方を比較することによって、評価され得る。
【０１１９】
本発明の種々の局面は、以下の小節においてさらに詳細に記載される。
【０１２０】
単離された核酸分子
本発明の１局面は、マーカータンパク質またはその一部をコードする核酸分子を含む、単離された核酸分子に関している。本発明の単離された核酸はまた、マーカー核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸分子、およびマーカー核酸分子のフラグメント、例えば、マーカー核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用のために適切な核酸を含む。本明細書において用いる場合、「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）およびヌクレオチドアナログを用いて生成される、ＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことを意図する。核酸分子は、単鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１２１】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」核酸分子とは、核酸分子の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子である。好ましくは「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」核酸分子とは、その核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡにおいてその核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）（好ましくはタンパク質コード配列）を有さない。例えば、種々の実施形態では、単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてその核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋＢ、４ｋＢ、３ｋＢ、２ｋＢ、１ｋＢ、０．５ｋＢまたは０．１ｋＢ未満を含んでもよい。さらに、「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組み換え技術によって生成される場合、他の細胞物質も培養培地も実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学的前駆体も他の化合物も実質的に含まないことができる。
【０１２２】
本発明の核酸分子は、本明細書に記載される標準的な分子生物学的技術およびデータベース記録の配列情報を用いて単離され得る。このような核酸配列の全てまたは一部を用いて、本発明の核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニングの技術を用いて単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されるように）。
【０１２３】
本発明の核酸分子は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを用いて増幅され得る。そのように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローニングされ、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴付けられてもよい。さらに、本発明の核酸分子の一部または全てに対応するヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて、標準的な合成技術によって調製され得る。
【０１２４】
別の好ましい実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、マーカー核酸のヌクレオチド配列に対して、またはマーカータンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む。所定のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子とは、この所定のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、これによって安定な二重鎖を形成し得る、この所定のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的な核酸分子である。
【０１２５】
さらに、本発明の核酸分子は、その全長核酸配列がマーカー核酸を含むか、またはマーカータンパク質をコードする核酸配列のごく一部を含んでもよい。このような核酸は、例えば、プローブまたはプライマーとして用いられ得る。プローブ／プライマーは代表的には、１つ以上の実質的に精製されたオリゴヌクレオチドとして用いられる。このオリゴヌクレオチドは代表的には、本発明の核酸の少なくとも約７、好ましくは約１５、さらに好ましくは約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０もしくは４００またはそれ以上連続するヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０１２６】
本発明の核酸分子の配列の基づくプローブは、本発明の１つ以上のマーカーに対応する転写物またはゲノム配列を検出するために用いられ得る。このプローブは、それに結合された標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含む。このようなプローブは、被験体由来の細胞のサンプル中でこのタンパク質をコードする核酸分子のレベルを測定すること、例えば、ｍＲＮＡレベルを決定すること、またはタンパク質をコードする遺伝子が変異されているかまたは欠失されているかを決定することなどによって、タンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として用いられ得る。
【０１２７】
本発明は、遺伝子コードの縮重に起因して、マーカータンパク質（例えば、
【０１２８】
【化２２】
2010246558.tif 000032
の配列を有するタンパク質）をコードする核酸のヌクレオチド配列とは異なり、これによって同じタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。
【０１２９】
アミノ酸配列における変化を誘導するＤＮＡ配列多形性が集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得るということが当業者によって理解される。このような遺伝子多形性は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して集団内の個体間に存在し得る。対立遺伝子とは、所定の遺伝子座で代替的に存在する遺伝子の群の１つである。さらに、ＲＮＡ発現レベルに影響するＤＮＡ多形性がまた存在し得、これがその遺伝子の全体的発現レベルに影響し得る（例えば、調節または分解に影響することによって）ということが理解される。
【０１３０】
本明細書において用いる場合、「対立遺伝子改変体（ａｌｌｅｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）」という句は、所定の遺伝子座に存在するヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドをいう。
【０１３１】
本明細書において用いる場合、「遺伝子（ｇｅｎｅ）」および「組み換え遺伝子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅ）」という用語は、本発明のマーカーに相当するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは代表的には、所定の遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の相違を生じ得る。別の対立遺伝子は、多数の異なる個体において目的の遺伝子を配列決定することによって同定され得る。これは、種々の個体において同じ遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを用いることによって容易に行なうことができる。天然の対立遺伝子改変体の結果であり、機能的活性を変更しない、ありとあらゆるこのようなヌクレオチドのバリエーションおよび得られたアミノ酸の多形性または改変体は、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１３２】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも７、１５、２０、２５、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３５００、４０００、４５００またはそれ以上のヌクレオチド長であり、そしてマーカー核酸にまたはマーカータンパク質をコードする核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本明細書において用いる場合、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」という用語は、お互いに対して少なくとも６０％（６５％、７０％、好ましくは７５％）同一であるヌクレオチド配列が代表的には、お互いに対してハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載するものである。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ，（１９８９）の６．３．１−６．３．６の節に見出すことができる。好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃でのハイブリダイゼーション、その後の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での５０〜６５℃における１回以上の洗浄である。
【０１３３】
集団に存在し得る本発明の核酸分子の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者はさらに、配列変化が変異によって導入され得、これによってコードされたタンパク質の生物学的活性が変化することなく、このコードされたタンパク質のアミノ酸配列における変化がもたらされることを理解する。例えば、「非必須（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）」アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を作製することができる。「非必須」アミノ酸残基とは、生物学的活性の変化なしに野生型配列から変化し得る残基であるが、「必須（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。例えば、種々の種のホモログの間で保存されていないかまたは半分だけ保存されているアミノ酸残基は、活性について必須ではないかもしれず、従っておそらく変更のための標的である。あるいは、種々の種（例えば、マウスおよびヒト）のホモログの間で保存されるアミノ酸残基は、活性に必須であるかもしれず、従っておそらく変更の標的ではないと思われる。
【０１３４】
従って、本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含む改変体マーカータンパク質をコードする核酸分子に関する。このような改変体マーカータンパク質は、天然に存在するマーカータンパク質とはアミノ酸配列が異なるが、依然として生物学的活性を保持する。１実施形態では、このような改変体マーカータンパク質は、マーカータンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％同一、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１３５】
改変体マーカータンパク質をコードする単離された核酸分子は、１つ以上のアミノ酸残基の置換、添加または欠失がコードされたタンパク質中に導入されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失をマーカー核酸のヌクレオチド配列に導入することによって作製され得る。変異は、部位指向性変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発のような標準的な技術によって、導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の予想される非必須アミノ酸残基で行なわれる。「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。あるいは、変異は、コード配列の全てまたは一部にそって、例えば、飽和変異誘発によって、無作為に導入され得、そして得られた変異体は、活性を保持する変異体を同定する生物学的活性についてスクリーニングされ得る。変異誘発後、コードされたタンパク質は、組み換え的に発現され得、そしてタンパク質の活性が決定され得る。
【０１３６】
本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち、本発明のセンス核酸に相補的であり、例えば、二本鎖マーカーｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはマーカーｍＲＮＡ配列に対して相補的である分子を包含する。従って、本発明のアンチセンス核酸は、本発明のセンス核酸に対して水素結合（すなわち、アニーリング）し得る。アンチセンス核酸は、全体的コード鎖に対して、またはその一部のみに対して、例えば、タンパク質コード領域（またはオープンリーディングフレーム）の全てまたは一部に対して相補的であり得る。アンチセンス核酸分子はまた、マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全てまたは一部に対してアンチセンスであり得る。非コード領域（「５’および３’非翻訳領域（５’ａｎｄ３’  ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ）」）は、コード領域に隣接してアミノ酸に翻訳されない５’および３’配列である。
【０１３７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０、またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用い、化学合成および酵素連結反応を用いて、構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大するように、もしくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成された二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成されてもよく、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられてもよい。アンチセンス核酸を生成するために用いられ得る改変ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウチジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の節にさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０１３８】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には、被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果それらは細胞のｍＲＮＡおよび／またはマーカータンパク質をコードするゲノムＤＮＡとハイブリダイズするかまたはそれに対して結合して、それにより、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによってマーカーの発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によるものであってもよく、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主要な溝における特異的な相互作用によるものであってもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与の経路の例としては、組織部位への直接注射、またはアンチセンス核酸分子の乳房関連体液への注入が挙げられる。あるいは、アンチエンス核酸分子は、選択された細胞を標的するように改変され、次いで全身に投与されてもよい。例えば、全身投与のためには、アンチセンス分子は、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に対してこのアンチセンス核酸分子を結合することによって、それらのアンチセンス分子が、選択された細胞表面で発現されるレセプターまたは抗原と特異的に結合するように改変されてもよい。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下におかれるベクター構築物が好ましい。
【０１３９】
本発明のアンチセンス核酸分子は、αアノマー核酸分子であってもよい。αアノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成するが、ここでは通常のαユニットとは対照的に、この鎖はお互いに並行になっている（Ｇａｕｌｔｉｅｒら，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら．，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０）を含んでもよい。
【０１４０】
本発明はまた、リボザイムを含む。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような単鎖核酸を切断できる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５〜５９１に記載されるようなハンマーヘッドのリボザイム）は、触媒性にｍＲＮＡ転写物を切断して、それによってこのｍＲＮＡにコードされるタンパク質の翻訳を阻害するために用いられ得る。マーカータンパク質をコードする核酸分子に特異性を有するリボザイムは、このマーカーに相当するｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、切断されるヌクレオチド配列に対して相補的であるＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体が構築され得る（Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと）。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択するために用いられ得る（例えば、ＢａｒｔｅｌおよびＳｚｏｓｔａｋ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと）。
【０１４１】
本発明はまた、三重らせん構造を形成する核酸分子を包含する。例えば、本発明のマーカーの発現は、標的細胞において遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成するマーカー核酸またはタンパク質をコードする遺伝子の制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に対して相補的なヌクレオチド配列を標的することによって阻害され得る。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６（６）５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅ（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２）：８０７〜１５を参照のこと。
【０１４２】
種々の実施形態では、本発明の核酸分子は、例えば、この分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善するように、塩基部、糖部分またはリン酸骨格で改変されてもよい。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生成するために改変されてもよい（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１）：５〜２３を参照のこと）。本明細書において用いる場合、「ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」または「ＰＮＡｓ」という用語とは、核酸模倣物、例えば、ＤＮＡ模倣物であって、デオキシリボースリン酸骨格がシュードペプチド（ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ）骨格によって置換されており、４つの天然の核酸塩基のみが保持されている模倣物をいう。ＰＮＡの天然の骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的なハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら（１９９６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０〜６７５に記載されるような標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて行なわれ得る。
【０１４３】
ＰＮＡは、治療および診断の適用において用いられ得る。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写もしくは翻訳の停止を誘導すること、または複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的改変のためのアンチセンスまたはアンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）因子として用いられ得る。ＰＮＡはまた、例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲクランプによる遺伝子の一塩基対変異の分析において用いられ得る；他の酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼと組み合わせて用いる場合人工的制限酵素として（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）、前出；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ，１９９６，前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０〜６７５）用いられ得る。
【０１４４】
別の実施形態では、ＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞取り込みを増強するために、ＰＮＡに対して脂肪親和性または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野で公知の薬物送達の他の技術の使用によって、改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性をあわせ得る、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。このようなキメラによってＤＮＡ認識酵素、例えばＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ部分と相互作用することが可能になるが、一方ＰＮＡ部分は、高い結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基の間の結合数および方向に関して選択された適切な長さのリンカーを用いて連結され得る（Ｈｙｒｕｐ，１９９６、前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６）前出、およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１７）３３５７〜６３に記載されるように行なわれ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホラミダイトカップリング化学および改変されたヌクレオシドアナログを用いて固体支持体上で合成され得る。５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイトのような化合物が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間の連結として用いられ得る（Ｍａｇら１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的な方式でカップリングさせて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７〜６３）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて合成され得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｒら，１９７５，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４）。
【０１４５】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、他の付加基、例えば、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的するため）、または細胞膜を横切る輸送を促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を含んでもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断因子（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、Ｋｒｏｌら，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８〜９７６を参照のこと）またはインターキレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８,Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと
）を用いて改変され得る。このために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋因子、輸送因子、ハイブリダイゼーション誘発切断因子などに対して結合体化され得る。
【０１４６】
本発明はまた、分子ビーコン核酸を含むが、この核酸は、分子ビーコンがサンプル中の本発明の核酸の存在を定量するために有用であるように、本発明の核酸に対して相補的である少なくとも１つの領域を有する。「分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）」核酸は、相補的領域の対を含み、かつそれに会合する発蛍光団および蛍光性クエンチャーを有する核酸である。発蛍光団およびクエンチャーは、相補的領域がお互いにアニーリングする場合に発蛍光団の蛍光がクエンチャーによってクエンチされるような方向で、核酸の異なる部分と会合される。核酸の相補的な領域がお互いとアニーリングしない場合、発蛍光団の蛍光は、低い程度までクエンチされる。分子ビーコン核酸は、例えば、米国特許第５，８７６，９３０号に記載される。
【０１４７】
単離されたタンパク質および抗体
本発明の１局面は、単離されたマーカータンパク質およびその生物学的に活性な部分、ならびにマーカータンパク質またはそのフラグメントに対する抗体を惹起する免疫原としての使用に適切なポリペプチドフラグメントに関する。１実施形態では、ネイティブなマーカータンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いて適切な精製スキームによって細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態では、マーカータンパク質の全体またはセグメントを含むタンパク質またはペプチドが、組み換えＤＮＡ技術によって生成される。組み換え発現に代わって、このようなタンパク質またはペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成されてもよい。
【０１４８】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」または「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、そのタンパク質が由来する細胞もしくは組織供給源由来の細胞性物質もしくは他の混入するタンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成された場合、化学的な前駆体もしくは他の化合物を実質的に含まない。「実質的に細胞物質を含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」という用語は、タンパク質が、そのタンパク質が単離されるかもしくは組み換え生成される細胞の細胞成分から分離されている、タンパク質の調製物を包含する。従って、細胞性物質を実質的に含まないタンパク質としては、異種タンパク質（本明細書においては「混入するタンパク質（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」としても言及される）の約３０％、２０％、１０％または５％未満（乾燥重量として）を有するタンパク質の調製物が挙げられる。タンパク質またはその生物学的に活性な部分が組み換え生成される場合、これはまた、培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地がタンパク質調製の容積の約２０％、１０％または５％未満であることが好ましい。タンパク質が化学合成によって生成される場合、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されていることが好ましい。従って、このタンパク質のこのような調製物は、目的のポリペプチド以外の化学的前駆体または化合物の約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量として）未満を有する。
【０１４９】
マーカータンパク質の生物学的に活性な部分は、全長タンパク質よりも含むアミノ酸が少なく、かつ対応する全長タンパク質の活性の少なくとも１つを示す、マーカータンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一であるかまたはそのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明のマーカータンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであってもよい。さらに、他の生物学的に活性な部分であって、マーカータンパク質の他の領域を欠く部分は、組み換え技術によって調製されて、そのマーカータンパク質のネイティブ型の機能的活性の１つ以上について評価され得る。
【０１５０】
好ましいマーカータンパク質は：
【０１５１】
【化２３】
2010246558.tif 000033
2010246558.tif 000034
のいずれか１つの配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。他の有用なタンパク質は、これらの配列のうちの１つに対して実質的に同一（例えば、少なくとも約４０％、好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％）であり、そして対応する天然に存在するマーカータンパク質の機能的活性を保持するが、天然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なる。
【０１５２】
２つのアミノ酸配列のまたは２つの核酸の同一性パーセントを決定するためには、配列は最適比較目的（ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ）について整列される（例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適アラインメントのために、第一のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップが導入されてもよい）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一の配列における位置が第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されるならば、この分子はその位置で同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、この配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）×１００）。１実施形態では、この２つの配列は同じ長さである。
【０１５３】
２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７のように改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜２２６８のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行なって、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行なって、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップアラインメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴと呼ばれるＢＬＡＳＴアルゴリズムの新規なバージョンは、プログラムＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸのギャップの局所アルゴリズムを行なうことができるＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子の間の遠い関係を検出する繰り返し検索（ｉｔｅｒａｔｅｄ  ｓｅａｒｃｈ）を行なってもよい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォールトパラメーターを用いてもよい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０ウェイト残余表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを用いてもよい。局所配列類似性の領域およびアラインメントを同定するためのさらに別の有用なアルゴリズムは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４〜２４４８に記載されるようなＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するためのＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いる場合、ＰＡＭ１２０ウェイト残余表は例えば、２のｋ−ｔｕｐｌｅ値で用いられ得る。
【０１５４】
２つの配列の間の同一性パーセントは、ギャップを可能にするか否かの、上記の技術と同様の技術を用いて決定され得る。同一性パーセントを算出するのにおいては、正確なマッチングのみをカウントする。
【０１５５】
本発明はまた、マーカータンパク質またはそのセグメントを含むキメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書において用いる場合、「キメラタンパク質（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、異種ポリペプチド（すなわち、マーカータンパク質以外のポリペプチド）に作動可能に連結されたマーカータンパク質の全てまたは一部（好ましくは生物学的に活性な部分）を含む。融合タンパク質内では、「ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ（作動可能に連結された）」という用語とは、マーカータンパク質またはそのセグメントおよび異種ポリペプチドがお互いにインフレームで融合されることを示すこととする。異種ポリペプチドは、マーカータンパク質またはセグメントのアミノ末端またはカルボキシル末端に融合され得る。
【０１５６】
１つの有用な融合タンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質であり、マーカータンパク質またはセグメントが、ＧＳＴ配列のカルボキシル末端に融合される。このような融合タンパク質は、本発明の組み換えポリペプチドの生成を促進し得る。
【０１５７】
別の実施形態では、この融合タンパク質は、そのアミノ末端に異種シグナル配列を含む。例えば、マーカータンパク質のネイティブなシグナル配列が取り除かれて、別のタンパク質由来のシグナル配列で置換されてもよい。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のｇｐ６７分泌性配列は、異種シグナル配列として用いられ得る（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９２）。真核生物異種シグナル配列の他の例としては、メチリンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列が挙げられる（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。さらに別の例では、有用な原核生物異種シグナル配列としては、ｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前出）およびプロテインＡ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）が挙げられる。
【０１５８】
さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、マーカータンパク質の全てまたは一部が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合されている免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、リガンド（可溶性または膜結合性）と細胞表面のタンパク質（レセプター）との間の相互作用を阻害し、それによってインビボにおけるシグナル伝達を抑制するために、薬学的組成物中に組み込まれて、被験体に投与されてもよい。免疫グロブリン融合タンパク質は、マーカータンパク質の同族のリガンドのバイオアベイラビリティーに影響するように用いられ得る。リガンド／レセプター相互作用の阻害は、増殖性および分化上の障害を処置するために、そして細胞生存を調節する（例えば、促進するかまたは阻害する）ための両方のために、治療上有用であり得る。さらに、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中でマーカータンパク質に対する抗体を生成するための免疫原として、リガンドを精製するために、そしてスクリーニングアッセイにおいては、マーカータンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するために、用いられ得る。
【０１５９】
本発明のキメラおよび融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって生成され得る。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡシンセサイザーを含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメントの間の相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行なわれ得、これがキメラ遺伝子配列を生成するために引き続いてアニーリングされ、そして再増幅され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，前出を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードする多くの発現ベクターが市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、融合部分が本発明のポリペプチドに対してインフレームで連結されるように、このような発現ベクター中にクローニングされてもよい。
【０１６０】
シグナル配列を用いて、マーカータンパク質の分泌および単離を容易にし得る。シグナル配列は代表的には、一般的に１つ以上の切断事象において分泌の間に成熟タンパク質から切断される、疎水性アミノ酸のコアによって特徴付けられる。このようなシグナルペプチドは、成熟タンパク質が分泌経路を通過する際、その成熟タンパク質からのシグナル配列の切断を可能にするプロセシング部位を含む。従って、本発明は、マーカータンパク質、融合タンパク質またはシグナル配列を有するそのセグメントに、そしてシグナル配列がタンパク質分解性に切断されているこのようなタンパク質（すなわち、切断産物）に関する。１実施形態では、シグナル配列をコードする核酸配列は、目的のタンパク質、例えばマーカータンパク質またはそのセグメントに対して発現ベクター中で作動可能に連結され得る。このシグナル配列は、発現ベクターがその中に形質転換されている真核生物宿主などからのタンパク質の分泌に関連し、そしてこのシグナル配列は引き続きまたは同時発生的に切断される。次いで、このタンパク質は、当該分野で認識された方法によって細胞外培地から容易に精製され得る。あるいは、シグナル配列は、ＧＳＴドメインなどを用いる精製を容易にする配列を用いて目的のタンパク質に対して連結され得る。
【０１６１】
本発明はまた、マーカータンパク質の改変体に関与する。このような改変体は、アゴニスト（模倣物）またはアンタゴニストのいずれかとして機能し得る変更されたアミノ酸配列を有する。バリアントは、変異誘発、例えば、別個の点突然変異（ポイントミューテーション）または切断によって生成され得る。アゴニストは、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性が実質的に同じのままであるか、またはサブセットであり得る。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的のタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに対して競合的に結合することによって、タンパク質の天然に存在する形態の活性の１つ以上を阻害し得る。従って特定の生物学的効果は、種々の限定機能での処置によって誘発され得る。このタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体を用いる被験体の処置は、このタンパク質の天然に存在する形態での処置に対して被験体において副作用が少なくなり得る。
【０１６２】
アゴニスト（模倣物）として、またはアンタゴニストとして機能するマーカータンパク質の改変体は、アゴニストまたはアンタゴニスト活性について本発明のタンパク質の変異体、例えば、短縮変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。１実施形態では、改変体の変化に富んだライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって生成され、そして変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされる。改変体の変化に富んだライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することによって生成され得、その結果可能性のあるタンパク質配列の変性セットは、個々のポリペプチドとして、あるいはより大きい融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイについて）発現可能である。変性オリゴヌクレオチド配列由来のマーカータンパク質の潜在的な改変体のライブラリーを生成するために用いることができる種々の方法が存在する。変性オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，１９８３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【０１６３】
さらに、マーカータンパク質のセグメントのライブラリーを用いて、改変体マーカータンパク質またはそのセグメントのスクリーニングおよび引き続く選択のためのポリペプチドの変化に富んだ集団を生成することができる。例えば、コード配列フラグメントのライブラリーは、１分子あたり約１回だけのニックが生じる条件下でヌクレアーゼを用いて、目的のコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを処置すること、二本鎖ＤＮＡを変性すること、異なるニック産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するＤＮＡを復元すること、Ｓ１ヌクレアーゼでの処置によって再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することによって生成され得る。この方法によれば、目的のタンパク質の種々のサイズのアミノ末端フラグメントおよび内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが誘導され得る。
【０１６４】
点変異または短縮（切断）によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためには、いくつかの技術が当該分野で公知である。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析になじみ易い、最も広範に用いられる技術は代表的には、複製可能な発現ベクターへ遺伝子ライブラリーをクローニングする工程、得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換する工程、およびその遺伝子産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が所望の活性の検出によって容易になる条件下で、このコンビナトリアル遺伝子を発現する工程を包含する。ライブラリーにおける機能的変異の頻度を増強する技術である、再帰的アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）をスクリーニングアッセイと組み合わせて用いて、本発明のタンパク質の改変体を同定することができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１〜７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７〜３３１）。
【０１６５】
本発明の別の局面は、本発明のタンパク質に対する抗体に関係する。好ましい実施形態では、この抗体は、マーカータンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する。本明細書において互換可能に用いる場合、「抗体（単数または複数）」という用語は、免疫グロブリン分子、ならびに免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を含むそのフラグメントおよび誘導体をいう（すなわち、このような部分は、マーカータンパク質、例えばマーカータンパク質のエピトープのような抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む）。本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体は、このタンパク質に結合するが、通常このタンパク質を含むサンプル、例えば生物学的サンプル中の他の分子には実質的に結合しない抗体である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、限定はしないが単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。
【０１６６】
本発明の単離されたタンパク質またはそのフラグメントは、抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。全長タンパク質が用いられてもよく、あるいは本発明は免疫原としての使用のための抗原性ペプチドフラグメントを提供する。本発明のタンパク質の抗原性ペプチドは、本発明のタンパク質のうちの１つのアミノ酸配列の少なくとも８つ（好ましくは１０、１５、２０または３０以上）のアミノ酸残基を含み、そしてこのタンパク質の少なくとも１つのエピトープを包含し、その結果このペプチドに対して惹起された抗体は、このタンパク質と特異的な免疫複合体を形成する。抗原性ペプチドによって包含される好ましいエピトープは、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば親水性領域である。疎水性配列分析、親水性配列分析、または同様の分析を用いて親水性領域を同定することができる。好ましい実施形態では、単離されたマーカータンパク質またはそのフラグメントは、免疫原として用いられる。
【０１６７】
免疫原は代表的には、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物もしくは脊椎動物のような適切な（すなわち、イムノコンピテント（免疫応答性））被験体を免疫することによって抗体を調製するために用いられる。適切な免疫原性調製物は、例えば、組み換え発現されるかまたは化学的に合成されたタンパク質またはペプチドを含んでもよい。この調製物はさらに、アジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント、または同様の免疫刺激因子をさらに含んでもよい。好ましい免疫原組成物は、例えば、本発明のタンパク質の組み換え発現のために非ヒト宿主細胞を用いて作製された免疫原組成物のような他のヒトタンパク質を含まない組成物である。このような方式では、得られた抗体組成物は、本発明のタンパク質以外のヒトタンパク質の結合が少ないかまたは結合しない。
【０１６８】
本発明は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。本明細書において用いる場合、「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「モノクローナル抗体組成物（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という用語は、特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位のうち１種のみを含む抗体分子の集団をいう。好ましいポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体組成物とは、本発明のタンパク質に対する抗体を選択しているものである。特に好ましいポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製物とは、マーカータンパク質またはそのフラグメントに対する抗体のみを含むものである。
【０１６９】
ポリクローナル抗体は、免疫原として本発明のタンパク質を用いて適切な被験体を免疫することによって調製され得る。免疫された被験体における抗体力価は、免疫されたポリペプチドを用いる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いるような標準的な技術によって経時的にモニターされ得る。免疫後適切な時点で、例えば、特定の抗体力価が最高であるとき、抗体産生細胞は、被験体から得て、標準的な技術、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７にもともと記載されるハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，１９８５のｐｐ７７〜９６を参照のこと）またはトリオーマ技術によってモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製するために用いられ得る。ハイブリドーマ産生のための技術は周知である（一般には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４を参照のこと）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、目的のポリペプチドに結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出され得る。
【０１７０】
ハイブリドーマを分泌するモノクローナル抗体を調製する代わりに、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体を、目的のポリペプチドを有する組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって同定および単離してもよい。ファージディスプレイライブラリーを生成して、スクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒＺＡＰ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを生成しスクリーニングするのにおける使用に特に受け入れられる方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６７９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０〜１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１〜８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ：７２５〜７３４に見出され得る。
【０１７１】
本発明はまた、本発明のタンパク質に特異的に結合する組み換え抗体を提供する。好ましい実施形態では、この組み換え抗体は、マーカータンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する。組み換え抗体としては、限定はしないが、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体、単鎖抗体および多価特異的抗体が挙げられる。キメラ抗体とは、異なる部分が種々の動物種に由来する分子、例えば、マウスｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。（例えば、その全体が参考として本明細書に援用される、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号を参照のこと）。単鎖抗体は、抗原結合部位を有し、単独のポリペプチドからなる。それらは、当該分野で公知の技術によって、例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号（その全体が参考として本明細書に援用される）；Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；Ｗｈｉｔｌｏｗら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１〜９；Ｗｈｉｔｌｏｗら（１９９１）Ｍｅｙｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７〜１０５；およびＨｕｓｔｏｎら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０３：４６〜８８に記載の方法を用いて生成され得る。多価特異的抗体は、種々の抗原に特異的に結合する少なくとも２つの抗原結合部位を有する抗体分子である。このような分子は、当該分野で公知の技術によって、例えば、Ｓｅｇａｌ、米国特許第４，６７６，９８０号（その開示は全体が参考として本明細書に援用される）；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８；Ｗｈｉｔｌｏｗら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．７：１０１７〜１０２６および米国特許第６，１２１，４２４号に記載の方法を用いて生成され得る。
【０１７２】
ヒト化抗体とは、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、その全体が参考として援用される、Ｑｕｅｅｎ，米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。ヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組み換えＤＮＡ技術によって、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願第１８４，１８７号；欧州特許出願第１７１，４９６号；欧州特許出願第１７３，４９４号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１〜１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６〜４４９；およびＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１９８６）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４1：４０５３〜４０６０に記載の方法を用いて、生成され得
る。
【０１７３】
さらに詳細には、ヒト化抗体は、例えば、内因性の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子を発現できるが、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて生成され得る。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば、本発明のマーカーに相当するポリペプチドの全てまたは一部を用いて正常な様式で免疫される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスによって保持されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配列して、引き続きクラス切り替えおよび体細胞変異を受ける。従ってこのような技術を用いて、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を生成することが可能である。ヒト抗体を生成するためのこの技術の概説については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術の、そしてこのような抗体を生成するためのプロトコールの詳細な考察については、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；および米国特許第５，５４５，８０６号を参照のこと。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のような会社は、上記の技術と同様の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに関与し得る。
【０１７４】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を用いて生成され得る。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓら，１９９４，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９〜９０３）。
【０１７５】
本発明の抗体は、産生（例えば、被験体の血液または血清からの）または合成後に単離されて、そして周知の技術によってさらに精製され得る。例えば、ＩｇＧ抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製され得る。本発明のタンパク質に特異的な抗体は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによって選択、または（例えば、部分的に精製され）または精製され得る。例えば、本発明の組み換え発現された、そして精製された（または特に精製された）タンパク質は、本明細書に記載のように生成され、そして例えば、クロマトグラフィーカラムのような固体支持体に対して共有結合されるかまたは非共有結合される。次いで、このカラムは、多数の異なるエピトープに対する抗体を含むサンプルから本発明のタンパク質に特異的な抗体をアフィニティー精製して、これによって実質的に精製された抗体組成物、すなわち、混入した抗体を実質的に含まない抗体組成物を生成するために用いられ得る。実質的に精製された抗体組成物とは、この文脈では、この抗体サンプルが、本発明の所望のタンパク質のエピトープ以外のエピトープに対する抗体の混入が多くとも３０％（乾燥重量による）を含み、そして好ましくはこのサンプルの多くとも２０％、さらに好ましくは多くとも１０％、そして最も好ましくは多くとも５％（乾燥重量による）が混入している抗体である。精製された抗体組成物とは。この組成物における抗体の少なくとも９９％が本発明の所望のタンパク質に対するものであるということを意味する。
【０１７６】
好ましい実施形態では、本発明の実質的に精製された抗体は、本発明のタンパク質のシグナルペプチド、分泌された配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインまたは細胞膜に特異的に結合し得る。特に好ましい実施形態では、本発明の実質的に精製された抗体は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列の選択された配列または細胞外ドメインに特異的に結合する。さらに好ましい実施形態では、本発明の実質的に精製された抗体は、マーカータンパク質のアミノ酸配列の分泌された配列または細胞外ドメインに特異的に結合する。
【０１７７】
本発明のタンパク質に対する抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術によってタンパク質を単離するために用いられ得る。さらに、このような抗体は、マーカータンパク質またはそのフラグメント（例えば、細胞溶解液または細胞上清において）を検出して、マーカーの発現のレベルおよびパターンを評価するために用いられ得る。抗体はまた、例えば、所定の処置レジメンの有効性を評価するために、臨床試験手順の一部として、組織または体液中（例えば、乳房関連性体液中）のタンパク質レベルをモニターするために診断的に用いられ得る。検出は、検出可能な物質に結合された本発明の抗体を含む、抗体誘導体の使用によって容易にできる。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、蛍光体、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコトリエンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生体発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、そして適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１７８】
本発明の抗体はまた、ガンを処置するのにおいて治療剤として有用であり得る。好ましい実施形態では、本発明の完全ヒト抗体は、ヒトガン患者、特に乳癌を有する患者の治療的な処置のために用いられる。別の好ましい実施形態では、マーカータンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体は、治療上の処置に用いられる。さらに、このような治療抗体は、細胞毒、治療剤または放射性金属イオンのような治療部分に結合された抗体を含む抗体誘導体または免疫毒素であってもよい。細胞毒素または細胞毒性剤としては、細胞に有害である任意の因子が挙げられる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては限定はしないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【０１７９】
本発明の結合体化した抗体は、所定の生物学的応答を改変するために用いられ得、薬物部分については、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであってもよい。このようなタンパク質としては、例えば、毒素、例えば、リボソーム阻害タンパク質（その開示が全体として本明細書に援用される、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，１４６，６３１号を参照のこと）、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素；タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター；または生物学的応答改変剤、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子などが挙げられる。
【０１８０】
抗体に対してこのような治療部分を結合体化するための技術は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）ｐｐ２４３〜５６（Ａｌａｎ  Ｒ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版），Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、ｐｐ６２３〜５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、ｐｐ３０３〜１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８（１９８２）を参照のこと。
【０１８１】
従って、１局面では、本発明は、その全てが本発明のタンパク質、そして好ましくはマーカータンパク質に特異的に結合する、実質的に精製された抗体、抗体フラグメントおよび誘導体を提供する。種々の実施形態では、本発明の実質的に精製された抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体は、ヒト抗体であっても、非ヒト抗体であっても、キメラ抗体であっても、および／またはヒト化抗体であってもよい。別の局面では、本発明は、その全てが本発明のタンパク質、そして好ましくはマーカータンパク質に特異的に結合する、非ヒト抗体、抗体フラグメントおよび誘導体を提供する。このような非ヒト抗体は、ヤギ、マウス、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ウサギまたはラットの抗体であってもよい。あるいは、本発明の非ヒト抗体は、キメラおよび／またはヒト化抗体であってもよい。さらに、本発明の非ヒト抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。さらなる局面では、本発明は、その全てが本発明のタンパク質、そして好ましくはマーカータンパク質に特異的に結合する、モノクローナル抗体、抗体フラグメントおよび誘導体を提供する。モノクローナル抗体は、ヒト抗体であっても、ヒト化抗体であっても、キメラ抗体であっても、および／または非ヒト抗体であってもよい。
【０１８２】
本発明はまた、検出可能物質に結合体化された本発明の抗体および使用説明書を備えるキットを提供する。本発明のなお別の局面は、本発明の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物である。１実施形態では、この薬学的組成物は、本発明の抗体、治療部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【０１８３】
組み換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の局面は、マーカータンパク質（またはそのようなタンパク質の一部）をコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において用いる場合、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、それに結合している別の核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが結合し得る環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、ここではさらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌のベクターおよび哺乳動物のエピゾームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピゾームベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターいわゆる発現ベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形態である（ベクター）。しかし、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターを含むこととする。
【０１８４】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含む。これは組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され、発現すべき核酸配列に対して作動可能に連結されている、一つ以上の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、目的のヌクレオチド配列がこのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で）制御配列（単数または複数）に結合されていることを意味するものとする。「制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような制御配列は、例えば、ＧｏｅｄｄｅｌのＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９１）に記載されている。制御配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列および特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的制御配列）が挙げられる。発現ベクターのデザインが、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明されるように、核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを産生し得る。
【０１８５】
本発明の組換え発現ベクターを、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物の細胞（例えば、昆虫細胞｛バキュロウイルス発現ベクターを用いる｝、酵母細胞または哺乳動物細胞）中に、マーカータンパク質またはそのセグメントの発現のために設計し得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、前出、にさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳してもよい。
【０１８６】
真核細胞中におけるタンパク質の発現はほとんどの場合、Ｅ．ｃｏｌｉ中で、融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは代表的には三つの目的に役立つ：１）組換えタンパク質の発現を増大するため；２）組換えタンパク質の溶解度を増大するため；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいては、タンパク質分解性の切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、第Ｘａ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ）、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的の組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ  ６７：３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０１８７】
適切な誘導性非融合Ｅ．  ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１〜３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｐ６０−８９，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．１９９１）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）によって媒介される、Ｔ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって、Ｔ７  ｇｎ１遺伝子を保持する常在性プロファージから、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で供給される。
【０１８８】
Ｅ．  ｃｏｌｉにおける組み換えタンパク質発現を最大にする一つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中でタンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ｐ１１９−１２８，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０を参照のこと。別のストラテジーとは、各々のアミノ酸についての個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉで優先的に使用されるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１〜２１１８）。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技法によって行なうことができる。
【０１８９】
別の実施形態では、この発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母であるＳ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ中の発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびｐＰｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。
【０１９０】
あるいは、この発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ
Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０１９１】
別の実施形態では、本発明の核酸を、哺乳動物の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現する。哺乳動物の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で用いる場合、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、通常用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物のおよび真核生物の細胞の両方にとって適切な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．前出の第１６章および１７章を参照のこと。
【０１９２】
別の実施形態では、組換え哺乳動物表現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある（例えば、組織特異的調節エレメントは核酸を発現するために用いられる）。組織特異的調節エレメントは当該分野において公知である。適切な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、詳細には、Ｔ細胞レセプター（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。例えば、マウスのｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｒ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）の発生上調節されるプロモーターも包含される。
【０１９３】
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にするような様式で、制御配列に対して作動可能に連結される。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示する、アンチセンスの配向にクローニングされた核酸に作動可能に連結された制御配列が選択され得、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、またはアンチセンスＲＮＡの構成的な、組織特異的もしくは細胞タイプ特異的な発現を指示する制御配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプによって活性が決定され得る高効率調節領域の制御下でアンチセンス核酸を生産する、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であってもよい。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）を参照のこと。
【０１９４】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」および「組換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」は、本明細書において互換的に使用される。そのような用語は、特定の対象の細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をも指すことが理解される。突然変異または環境の影響のいずれかに起因して後の世代に特定の改変が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお包含される。
【０１９５】
宿主細胞は任意の原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞（例えば、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞）であってもよい。
【０１９６】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞の中に導入してもよい。本明細書において用いる場合、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」および「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む、外来の核酸を宿主細胞に導入するために当該分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換するか、またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（前出）および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０１９７】
哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションのためには、使用される発現ベクターおよびトランスフェクションの技法に依存して、細胞のごく小さい画分が外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得ることが公知である。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する抵抗性）をコードする遺伝子が一般的に、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する抵抗性を付与するマーカーが挙げられる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択マーカーを組み込んでいる細胞は生き残るが、一方他の細胞は死滅する）。
【０１９８】
培地中で、原核生物細胞または真核生物細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、マーカータンパク質またはそのセグメントを生産することができる。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるマーカータンパク質またはそのセグメントの産生の方法をさらに提供する。一実施形態では、その方法は、本発明の宿主細胞（その中にマーカータンパク質またはそのセグメントをコードする組換え発現ベクターを導入されている）を、そのマーカータンパク質を生産するのに適切な培地中で培養する工程を包含する。別の実施形態では、その方法はさらに、培地または宿主細胞からマーカータンパク質またはそのセグメントを単離する工程をさらに包含する。
【０１９９】
本発明の宿主細胞を用いてまた、非ヒトトランスジェニック動物を産生してもよい。例えば、一実施形態では、本発明の宿主細胞は、その中にマーカータンパク質またはそのセグメントをコードする配列が導入されている受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を用いて、その中に本発明のマーカータンパク質をコードする外因性の配列がそのゲノムの中に導入されている非ヒトトランスジェニック動物、またはマーカータンパク質をコードする内因性の遺伝子（単数または複数）が変更されている相同組換え動物を創成することができる。そのような動物は、マーカータンパク質の機能および／または活性の研究に、そしてマーカータンパク質の修飾因子の同定および／または評価に有用である。本明細書において用いる場合「トランスジェニック動物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ）」とは、動物の一つ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類などが挙げられる。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによってトランスジェニック動物の１つ以上の細胞タイプまたは組織中においてコードされた遺伝子産物の発現を指令する外来性のＤＮＡである。本明細書において用いる場合、「相同組換え動物（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｉｍａｌ）」とは、内因性の遺伝子が内因性の遺伝子と、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外因性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更されている非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０２００】
本発明のトランスジェニック動物は、受精した卵母細胞の雄性前核の中に、マーカータンパク質をコードする核酸を例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって導入して、卵母細胞が偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含まれてもよい。組織特異的制御配列（単数または複数）をこの導入遺伝子に対して作動可能に結合させて、特定の細胞に対して本発明のポリペプチドの発現を指示することができる。胚の操作およびマイクロインジェクションを介した、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当該分野において従来的となっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；および同第４，８７０，００９号、米国特許第４，８７３，１９１号において；そしてＨｏｇａｎ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６において記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用いる。初代のトランスジェニック動物を、ゲノム内の導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞中におけるこの導入遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、この導入遺伝子を担持するさらなる動物の繁殖に用いてもよい。さらに、この導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を担持する他のトランスジェニック動物にさらに繁殖され得る。
【０２０１】
相同組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換が導入されていて、それによって遺伝子を変化させる、例えば、機能的に破壊するマーカータンパク質をコードする、遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。好ましい実施形態では、相同組み換えの際に、内因性遺伝子が機能的に破壊されるように、このベクターをデザインする（すなわち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）。代替的には、相同組換えの際に内因性遺伝子が変異されるかそうでなければ変更されるが、依然として機能性タンパク質をコードしている（例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内因性タンパク質の発現を変更してもよい）ようにベクターを設計してもよい。相同組換えベクターでは、この遺伝子の変更された部分は、この遺伝子のさらなる核酸がその５’および３’末端に隣接しており、ベクターにより担持される外因性遺伝子と胚性幹細胞中の内因性遺伝子との間で相同組換えが起こることが可能になる。さらに別の隣接する核酸配列は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えが起きるように十分な長さである。代表的には、数キロベースの隣接するＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方とも）がベクターに含まれる（相同組換えベクターの記載については、例えば、Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８７．Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと）。ベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションにより）導入され、そしてその中に導入された遺伝子が内因性の遺伝子と相同組み換えされている細胞が選択される（例えば、Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと）。次いで、この選択された細胞を動物（例えば、マウス）の胚盤胞の中に注射して、凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｓｔｏｎ編、ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７，ｐｐ１１３−１５２を参照のこと）。次いで、キメラ胚を適切な偽妊娠の雌性仮親動物に移植して、胚を出産させる。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、動物の全ての細胞が導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えされたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９に；そしてＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号；およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
【０２０２】
別の実施形態では、導入遺伝子の調節発現を可能にする、選択した系を有するトランスジェニック非ヒト動物を生産し得る。そのような系の１例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナー系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を用いて導入遺伝子の発現を調節する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、１つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、もう一方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する２つのトランスジェニック動物を交配させることによる、「ダブル（ｄｏｕｂｌｅ）」トランスジェニック動物の構築によって得ることができる。
【０２０３】
本明細書に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９号に記載された方法に従って生産することができる。
【０２０４】
薬学的組成物
本発明の核酸分子、ポリペプチドおよび抗体（本明細書においては「活性化合物（ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」とも呼ばれる）は、投与に適切な薬学的組成物中に組込みまれてもよい。このような組成物は代表的には、核酸分子、タンパク質または抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書において用いる場合、「薬学的に受容可能なキャリア（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）」という言葉は、薬学的な投与に適合する、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および因子の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または因子がこの活性化合物に不適切である場合を除けば、この組成物におけるそれらの使用が意図される。補助的な活性化合物も、組成物の中に組み込んでもよい。
【０２０５】
本発明は、マーカー核酸またはタンパク質の発現または活性を調節するための薬学的組成物を調製するための方法を包含する。このような方法は、薬学的に受容可能なキャリアと、マーカー核酸またはタンパク質の発現または活性を調節する因子とを処方する工程を包含する。このような組成物はさらに、さらなる活性因子を含んでもよい。従って、本発明はさらに、薬学的に受容可能なキャリアと、マーカー核酸またはタンパク質および１つ以上のさらなる活性化合物の発現または活性を調節する因子とを処方することによって、薬学的組成物を調製するための方法を包含する。
【０２０６】
本発明はまた、（ａ）マーカーに結合するか、または（ｂ）マーカーの活性に対して調節性（例えば、刺激性または阻害性）の効果を有するか、またはさらに詳細には、（ｃ）マーカーとその天然の基質（例えば、ペプチド、タンパク質、ホルモン、補因子または核酸）の１つ以上との相互作用に対して修飾性の影響を有するか、または（ｄ）マーカーの発現に対して修飾性の効果を有する、修飾因子、すなわち、候補物または試験化合物または因子（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書においては、「スクリーニングアッセイ（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ）」とも呼ばれる）を提供する。このようなアッセイは代表的には、マーカーと１つ以上のアッセイ成分との間の反応を包含する。他の成分は、試験化合物自体であっても、または試験化合物とマーカーの天然の結合パートナーの組み合わせであってもよい。
【０２０７】
本発明の試験化合物は、天然の化合物および／または合成の化合物の合成ライブラリーを含む、任意の利用可能な供給源から得ることができる。試験化合物はまた、生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能を有するが、新規な非ペプチド骨格を有しており、酵素的分解に耐性があり、それにもかかわらず生物活性は保持している分子のライブラリー；例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５を参照のこと）；空間的にアドレス可能な平行な固相または溶液相ライブラリー（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）；逆重畳を要する合成ライブラリー方法；「１層１化合物」ライブラリー方法（「ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ」ｌｉｂｒａｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法を含む、当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法において任意の多数のアプローチによって得ることができる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーのアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０２０８】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば、ＤｅＷｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９、Ｅｒｂ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８、Ｃｈｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１において；そしてＧａｌｌｏｐ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３において見出され得る。
【０２０９】
化合物のライブラリーは、溶液中に（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ上に（Ｌａｍ，１９９１．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ上に（Ｆｏｄｏｒ，１９９３．Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌および／または芽胞上に（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上に（Ｃｕｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）またはファージ上で（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６、Ｃｗｉｒｌａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８−６３８２、Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０、Ｌａｄｎｅｒ，前出）提供され得る。
【０２１０】
１実施形態では、本発明は、マーカーまたはその生物学的に活性な部分によってコードされるかまたはそれに対応するタンパク質の基質である、候補物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態では、本発明は、マーカーまたはその生物学的に活性な部分によってコードされるかまたはそれに対応するタンパク質に結合する、候補物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。試験化合物がタンパク質に結合する能力を決定することは、例えば、この化合物と放射性同位元素または酵素標識とをカップリングすることによって達成され得、それによってこのマーカーへのこの化合物の結合が、複合体中の標識されたマーカー化合物を検出することにより達成され得る。例えば、化合物（例えば、マーカー基質）を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出することができる。あるいは、アッセイ成分を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の決定により酵素標識を検出することができる。
【０２１１】
別の実施形態では、本発明は、マーカーの発現、またはマーカーによってコードされるタンパク質の活性、あるいはその生物学的に活性な一部を調節する候補物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。おそらく、このマーカーによってコードされるかこのマーカーに相当するタンパク質は、インビボでは、限定はしないがペプチド、タンパク質、ホルモン、補因子および核酸のような１つ以上の分子と相互作用し得る。この考察の目的については、このような細胞の分子および細胞外分子は、「結合パートナー（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒｓ）」またはマーカー「基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」と呼ばれる。
【０２１２】
このようなスクリーニングを達成するための本発明の１つの必要な実施形態は、マーカーよってコードされるかまたはマーカーに相当するタンパク質の使用により、このタンパク質の天然のインビボの結合パートナーを同定することである。これを達成するための、当業者に公知である多くの方法が存在する。１例は、ツーハイブリッドアッセイ（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ａｓｓａｙ）またはスリーハイブリッドアッセイ（ｔｈｒｅｅ−ｈｙｂｒｉｄ  ａｓｓａｙ）（例えば米国特許第５，２８３，３１７号、Ｚｅｒｖｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２、Ｍａｄｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４、Ｂａｒｔｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４、Ｉｗａｂｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６、および  Ｂｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）において「ベイトタンパク質（ｂａｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」としてマーカータンパク質を使用して、マーカー（結合パートナー）と結合するかまたは相互作用をして、従ってこのマーカーの天然の機能に関与する可能性がある他のタンパク質を同定することである。このようなマーカー結合パートナーはまた、このマーカータンパク質によるシグナルの伝達またはマーカータンパク質媒介性シグナル伝達性経路の下流エレメントに関与する可能性が高い。あるいは、このようなマーカータンパク質結合パートナーはまた、このマーカータンパク質のインヒビターであることが見出され得る。
【０２１３】
このツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインからなるほとんどの転写因子のモジュールの性質に基づく。要するに、このアッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、マーカータンパク質をコードする遺伝子が既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合されている。他の構築物においては、未同定のタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル（ｓａｍｐｌｅ）」）をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡ配列を、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「ベイト（ｂａｉｔ）」および「プレイ（ｐｒｅｙ）」タンパク質がインビボで相互作用してマーカー依存性複合体を形成することが可能である場合、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは近位に引き寄せられる。この近接によって、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されているレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現は容易に検出され得、そして機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離して、そしてこれを用いてマーカータンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得ることができる。
【０２１４】
さらなる実施形態では、マーカータンパク質とその基質および／または結合パートナーとの間の相互作用を調節する（例えば、ポジティブにまたはネガティブに影響する）化合物を同定する目的のために、本発明の使用を通じてアッセイが考案され得る。このような化合物としては、限定はしないが、抗体、ペプチド、ホルモン、オリゴヌクレオチド、核酸およびそのアナログのような分子を挙げることができる。このような化合物はまた、天然および／または合成の化合物の体系的なライブラリーを含む、任意の利用可能な供給源から得ることができる。この実施形態における使用に好ましいアッセイ成分は、本明細書において同定された乳癌マーカータンパク質、公知の結合パートナーおよび／またはこれらの基質、ならびに試験化合物である。試験化合物は、任意の供給源から供給され得る。
【０２１５】
マーカータンパク質とその結合パートナーとの間の相互作用を妨害する化合物を同定するために用いられるアッセイ系の基本原理は、マーカータンパク質およびその結合パートナーを含む反応混合物を、この２つの産物が相互作用して結合して、これによって複合体を形成することを可能にするのに十分な条件および時間のもとで調製する工程に関与する。因子を阻害活性について試験するために、反応混合物は、試験化合物の有無の下で調製する。試験化合物は、反応混合物に最初に含まれてもよいし、またはマーカータンパク質およびその結合パートナーの付加に続く時点で添加されてもよい。コントロール反応混合物は、試験化合物なしか、またはプラシーボとともにインキュベートされる。マーカータンパク質とその結合パートナーとの間の任意の複合体の形成が次に検出される。コントロール反応物において複合体の形成があり、ただし試験化合物を含む反応混合物ではこのような形成が少ないかまたはないことは、この化合物がマーカータンパク質およびその結合パートナーの相互作用を妨害することを示す。逆に、コントロール反応においてではなく化合物の存在下でのさらなる複合体の形成によって、この化合物がマーカータンパク質およびその結合パートナーの相互作用を増強し得ることが示される。
【０２１６】
マーカータンパク質とその結合パートナーとの相互作用を妨害する化合物についてのアッセイは、異種または同種の方式で行なわれ得る。異種アッセイは、マーカータンパク質またはその結合パートナーのいずれかを固相の上に固定する工程と、反応の最後の時点でこの固相に固定された複合体を検出する工程とを包含する。同種アッセイでは、全体的な反応を液相中で行なう。いずれのアプローチでも、反応物の添加の順序は、試験されている化合物についての異なる情報を得るために変化され得る。例えば、マーカータンパク質と結合パートナーとの間の相互作用を妨害する（例えば、競合によって）試験化合物は、試験物質の存在下でこの反応を行なうことによって、すなわち、このマーカーとその相互作用的な結合パートナーとの前にまたは同時にこの反応混合物に対して試験物質を添加することによって、決定され得る。あるいは、事前形成された複合体を破壊する試験化合物、例えば、複合体から１つの成分を取り去る高い結合定数を有する化合物は、複合体が形成された後にこの反応混合物に試験化合物を添加することによって試験され得る。種々の形式が以前に簡単に記載されている。
【０２１７】
異種アッセイ系では、マーカータンパク質またはその結合パートナーのいずれかを固体表面またはマトリックスの上に固定するが、他の対応する非固定成分は、直接または間接的に標識され得る。実際には、マイクロタイタープレートがしばしば、このアプローチに利用される。固定された種は、代表的には当業者に周知である、非共有結合または共有結合のいずれかの、多数の方法によって固定され得る。非共有結合はしばしば、単に、固体表面をマーカータンパク質またはその結合パートナーの溶液でコーティングさせることおよび乾燥することによって、達成され得る。あるいは、固定されるべきアッセイ成分に特異的な固定された抗体がこの目的に用いられ得る。このような表面はしばしば、前もって調製されて貯蔵されてもよい。
【０２１８】
関連の実施形態では、１つまたは両方のアッセイ成分がマトリックスに固定されることを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／マーカー融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／結合パートナーが、グルタチオンセファローズビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着されてもよく、これを次いで試験化合物と、または試験化合物および非吸着標的マーカーまたはその結合パートナーのどちらかと組み合わせ、そしてこの混合物を複合体形成を促進する条件（例えば、生理的な条件）下でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、未結合のアッセイ成分を全て除去し、固定された複合体を、例えば上記のように、直接的にまたは間接的に評価する。あるいは、複合体をマトリックスから解離し、そしてマーカー結合
または活性のレベルを標準的技術を用いて決定してもよい。
【０２１９】
マトリックス上にタンパク質を固定する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに用いることができる。例えば、マーカータンパク質またはマーカータンパク質結合パートナーのいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定することができる。ビオチニル化マーカータンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド）から当該分野で公知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定することができる。特定の実施形態では、このタンパク質固定表面は、前もって調製して保管してもよい。
【０２２０】
このアッセイを行なうために、固定されたアッセイ成分の対応するパートナーを、試験化合物の有無のもとでこのコーティングされた表面に曝す。反応終了後、未反応のアッセイ成分を除去して（例えば、洗浄によって）、形成されたあらゆる複合体を固体表面に結合したままにする。固体表面に固定された複合体の検出は、多数の方法で達成され得る。非固定成分が事前標識されている場合、この表面上に固定された標識の検出によって、複合体が形成されたことが示される。非固定成分が事前に標識されていない場合、間接的な標識を用いて、この表面上に固定された複合体を検出することができる；例えば、最初に非固定種に特異的な標識された抗体を用いて（抗体は、次に、例えば、標識された抗Ｉｇ抗体を用いて直接標識されても、間接的に標識されてもよい）。反応成分の添加の順序次第で、複合体形成を調節する（阻害するかまたは増強する）、または事前形成された複合体を破壊する試験化合物が検出され得る。
【０２２１】
本発明の別の実施形態では、相同なアッセイを用いてもよい。これは代表的には試験化合物の有無において液相で行なわれる上述のアッセイと類似の反応である。この形成された複合体は次いで、未反応の成分から分離され、そして形成された複合体の量が決定される。異種アッセイ系について言及される場合、液相に対する反応物の添加の順序によって、試験化合物が複合体形成を調節（阻害または増強）し、そして事前形成された複合体を破壊する情報を得ることができる。
【０２２２】
このような相同なアッセイにおいて、反応産物は、限定はしないが：分画遠心法、クロマトグラフィー、電気泳動および免疫沈澱分離を含む任意の多数の標準的な技術によって未反応のアッセイ成分から分離され得る。分画遠心法では、分子の複合体は、複合体の種々のサイズおよび密度に基づくその複合体の分画沈殿平衡に起因して、一連の遠心分離工程を通じて複合体になっていない分子から分離され得る（例えば、Ｒｉｖａｓ，Ｇ．およびＭｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９３  Ａｕｇ；１８（８）２８４〜７を参照のこと）。標準的なクロマトグラフィー技術も、複合体化していないものから複合体分子を分離するのに利用され得る。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、サイズに基づいて、そして適切なゲル濾過樹脂をカラムの形態で利用することによって分子を分離する、例えば、比較的大きい複合体ほど、小さい複合体化していない成分から分離され得る。同様に、複合体化していない分子に比べて、この複合体の比較的異なる特性は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー樹脂の使用を通じて、残りの個々の反応物質から複合体を示差的に分離するように開発され得る。このような樹脂およびクロマトグラフィー技術は、当業者に周知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ，１９９８、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１１：１４１〜１４８；Ｈａｇｅ  ａｎｄ  Ｔｗｅｅｄ，１９９７，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．，６９９：４９９〜５２５を参照のこと）。未結合の種から複合体化した分子を分離するにはゲル電気泳動も使用できる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９９９を参照のこと）。この技術では、タンパク質または核酸複合体は、例えば、サイズまたは電荷に基づいて分離される。電気泳動プロセスの間に結合相互作用を維持するため、還元剤の非存在下での非変性ゲルが代表的には好ましいが、特定の相互作用に適切な条件が当業者に周知である。免疫沈降は溶液からのタンパク質−タンパク質複合体の単離のために利用される別の共通の技術である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９９９を参照のこと）。この技術では、結合分子の１つに特異的な抗体への全てのタンパク質の結合は、遠心分離によって容易に収集され得る、ポリマービーズに対する抗体の結合体化によって溶液から沈殿される。結合アッセイ成分は、ビーズから遊離され（特定のタンパク質分解事象または複合体中のタンパク質−タンパク質相互作用を破壊しない、当該分野で周知の他の技術によって）、そして第二の免疫沈澱工程が行なわれ、この時、対応して異なる相互作用アッセイ成分に特異的な抗体を利用する。この方式では、形成された複合体のみが、ビーズに結合されたまま残るはずである。試験化合物の有無の両方における複合体形成の変動を比較し得、これによって、化合物がマーカータンパク質とその結合パートナーとの間の相互作���を調節する能力についての情報が得られる。
【０２２３】
さらなるサンプル操作なしの同種または異種アッセイ系におけるマーカータンパク質とその天然の結合パートナーおよび／または試験化合物との間の相互作用の直接的な検出のための方法もまた本発明の範囲内である。例えば、蛍光エネルギー移動の技術が利用され得る（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）。一般には、この技術は、第一の「ドナー（ｄｏｎｏｒ）」分子に対する蛍光標識（例えば、マーカーまたは試験化合物）の付加を包含し、その結果その放射蛍光エネルギーは、第二の「アクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）」分子（例えば、マーカーまたは試験化合物）上の蛍光標識によって吸着され、これが次に吸収されたエネルギーに起因して蛍光を発し得る。あるいは、「ドナー（ｄｏｎｏｒ）」タンパク質分子は単に、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用し得る。「アクセプター」分子標識が、「ドナー（ｄｏｎｏｒ）」のものとは識別され得るように、異なる波長の光を放射する標識が選択される。標識の間のエネルギー転移の有効性は、分子を隔てる距離に関係するので、分子の間の空間的な関係が評価され得る。分子間で結合が生じる状況では、アッセイ中の「アクセプター」分子標識の蛍光放射は最大であるはずである。ＦＥＴ結合事象は、当該分野で周知の標準的な蛍光検出手段によって従来のように測定され得る（例えば、蛍光計を用いて）。事前形成された複合体における種の１つの関与を増強するかまたは隠す試験物質は、バックグラウンドのシグナルに対してシグナル変異を生じる。この方法では、マーカーとその結合パートナーとの間の相互作用を調節する試験物質は、制御されたアッセイで同定され得る。
【０２２４】
別の実施形態では、マーカー発現の修飾因子は、細胞が候補化合物と接触され、そしてマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の細胞中での発現が決定される方法で同定される。候補化合物の存在下でのマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、候補化合物の非存在下におけるマーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較する。次いでこの候補化合物は、この比較に基づいてマーカー発現の修飾因子として同定され得る。例えば、マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりも存在下において大きい（統計学的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激因子として同定される。逆に、マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも存在下において小さい（統計学的に有意に小さい）場合、この候補化合物は、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現のインヒビターとして同定される。細胞中のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書において記載された方法によって決定され得る。
【０２２５】
別の局面では、本発明は、本明細書に記載される２つ以上のアッセイの組み合わせに関与する。例えば、修飾因子は、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定され得、そしてこの因子がマーカータンパク質の活性を調節する能力は、細胞の形質転換および／または腫瘍形成のための、例えば、動物全体モデルにおいてインビボでさらに確認され得る。
【０２２６】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規な因子に関する。従って、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載のように同定された因子をさらに用いることは本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のように同定された因子（例えば、マーカー修飾因子、アンチセンスマーカー核酸分子、マーカー特異的抗体、またはマーカー結合パートナー）は、このような因子を用いる処置の有効性、毒性または副作用を決定するための動物モデルにおいて用いられ得る。あるいは、本明細書に記載のように同定された因子は、このような因子の作用の機構を決定するために動物モデルにおいて用いられ得る。さらに、本発明は、本明細書に記載のような処置のための上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規な因子の使用に関する。
【０２２７】
低分子因子およびタンパク質またはポリペプチド因子の適切な用量は、習熟した医師、獣医師または研究者の知識の範囲内の多数の要因に依存することが理解される。これらの因子の用量（単数または複数）は、例えば、処置されている被験体またはサンプルの同一性、サイズおよび条件に依存して、さらに妥当な場合、この組成物が投与される経路、ならびにこの因子が本発明の核酸またはポリペプチドに対して有することを実施者が所望する効果に依存して変化する。低分子の例示的な用量は、被験体またはサンプルの重量の１ｋｇあたり１ｍｇまたはμｇである（例えば、１ｋｇあたり約１μｇ〜１ｋｇあたり約５００ｍｇ、１ｋｇあたり約１００μｇ〜１ｋｇあたり約５ｍｇ、または１ｋｇあたり約１μｇ〜１ｋｇあたり約５０ｍｇ）。タンパク質またはポリペプチドの例示的な用量としては、被験体またはサンプルの重量の１ｋｇあたり１ｇ、ｍｇまたはμｇの量が挙げられる（例えば、１ｋｇあたり約１μｇ〜１ｋｇあたり約５ｇ、１ｋｇあたり約１００μｇ〜１ｋｇあたり約５００ｍｇ、または１ｋｇあたり約１ｍｇ〜１ｋｇあたり約５０ｍｇ）。これらの因子の１つの適切な用量は、調節される発現または活性に関するこの因子の能力に依存することがさらに理解される。このような適切な用量は、本明細書に記載のアッセイを用いて決定され得る。これらの因子の１つ以上が本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために動物（例えば、ヒト）に投与される場合、医師、獣医師または研究者は、例えば、最初に比較的低用量を処方し、その後に適切な応答が得られるまでこの用量を漸増することができる。さらに、任意の特定の動物被験体についての特定の用量レベルは、使用される特定の因子の活性、被験体の年齢、体重、全身的健康状態、性別および食餌、投与の時間、投与の経路、排出経路、任意の併用薬、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む種々の要因に基づくことが理解される。
【０２２８】
本発明の薬学的組成物は、投与の意図される経路に適合するように処方される。投与の経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、口腔（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸の投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含んでもよい：滅菌希釈液、例えば、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン−四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および毒性の調節のための因子、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムで調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックからなる、アンプル、ディスポーザブルシリンジまたは複数回投与用バイアルに入れられてもよい。
【０２２９】
注射用に適切な薬学的組成物としては、滅菌注射用水または分散の即時的調製のための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤および滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与のためには、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合に、この組成物は、滅菌でなければならず、そして容易にシリンジに適合する程度まで液体でなければならない。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。このキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物を含む、溶媒であっても分散媒体であってもよい。適切な液体は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そしてサーファクタントの使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、等張性剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムをこの組成物に含むことが好ましい。注射可能組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる因子、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含むことによって達成され得る。
【０２３０】
滅菌注射用液は、活性化合物（例えば、ポリペプチドまたは抗体）を必要な量で適切な溶媒中に、必要に応じて、上に列挙される成分の１つまたは組み合わせとともに組み込むことによって、その後に濾過滅菌によって調製され得る。一般には、分散は、基本的分散培地を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むこと、次いで上に列挙された成分由来の必要な他の成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射用水の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、これによって活性成分に任意のさらなる所望の成分を加えた粉末が、その以前に滅菌濾過された溶液から得られる。
【０２３１】
経口組成物は一般に、不活性希釈液または食用キャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセルに包含されても、または錠剤に圧縮されてもよい。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれて、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いられてもよい。経口成分はまた、液体キャリア中の化合物が経口的に加えられて、濯がれて、吐き出されるかまたは飲み込まれる、口腔洗浄液としての使用のための液体キャリアを用いて調製されてもよい。
【０２３２】
薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント物質は、この組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下のいずれかの成分、または同様の性質の化合物を含んでもよい：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤、例えば、コロイド性二酸化ケイ素；甘味料、例えば、スクロースまたはサッカリン；あるいは芳香剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料。
【０２３３】
吸入による投与のためには、化合物は、適切な噴霧剤、例えば、二酸化炭素のようなガスを含む圧縮容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０２３４】
全身投与はまた、経粘膜または経皮的手段によっても可能である。経粘膜投与または経皮投与のためには、障壁に浸透させるのに適切な浸透剤が処方物中で用いられる。このような浸透剤は一般には、当該分野で公知であるが、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経皮投与は、経鼻噴霧または坐剤の使用を通じて達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、当該分野で一般に公知のような、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ、ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。
【０２３５】
化合物はまた、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む）または直腸送達のための滞留浣腸剤の形態で調製されてもよい。
【０２３６】
１実施形態では、活性化合物を、化合物を身体からの迅速な排泄から防止するキャリア、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤とともに調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液（リポソームであって、その中または上にモノクローナル抗体を組み込まれているリポソームを含む）をまた、薬学的に受容可能なキャリアとして用いてもよい。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０２３７】
経口または非経口組成物を、投与および投与量の均一性の容易さのために投薬単位形態で処方することが特に有利である。本明細書において用いられる投薬単位形態とは、処置されるべき被験体のための単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指す；各々の単位は、必要な薬学的キャリアと組み合わせて、所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の予め決定された量を含む。本発明の投薬単位形態のための仕様は、活性化合物の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個々の処置についてこのような活性化合物からなる当該分野の固有の限界によって示され、そしてそれらに直接依存する。
【０２３８】
抗体については、好ましい投薬量は、体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇ（通常は１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）である。抗体が脳において作用する場合、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投薬量が通常適切である。一般には、部分的ヒト抗体および完全ヒト抗体は、他の抗体よりもヒト身体内で長い半減期を有する。従って、少ない投薬量および少ない投与頻度がしばしば可能である。脂質化のような改変が、抗体を安定化して、取り込みおよび組織浸透を増強するために用いられ得る。抗体の脂質化のための方法は、Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４：１９３によって記載される。
【０２３９】
本発明はまた、乳癌の予防および／または処置のためのワクチン組成物を提供する。本発明は、乳癌に対する免疫応答を刺激するために、表１のマーカーのタンパク質、または表１のマーカーのタンパク質の組み合わせが被験体に導入されている乳癌ワクチン組成物を提供する。本発明はまた、表１に同定されるマーカーまたはマーカーのフラグメントを発現する遺伝子発現構築物が、被験体に導入され、その結果表１のマーカーによってコードされるタンパク質またはタンパク質のフラグメントが被験体のトランスフェクトされた細胞によって正常より高いレベルで生成され、免疫応答を誘発する乳癌ワクチン組成物を提供する。
【０２４０】
１実施形態では、乳癌ワクチンは、乳癌の予防のための免疫治療因子として提供されて使用される。別の実施形態では、乳癌ワクチンは、乳癌の処置のための免疫治療因子として提供されて使用される。
【０２４１】
例えば、表１のマーカーのタンパク質からなる乳癌ワクチンは、種々の経路、例えば、経皮的に、皮下的にまたは筋肉内によってワクチンを投与することによって被験体における乳癌の予防および／または処置のために使用され得る。さらに、乳癌ワクチンは、ワクチンの活性および被験体の応答をブーストするために、アジュバントおよび／または免疫調整剤と一緒に投与され得る。１実施形態では、徐放性放出または間欠放出に適切な、ワクチンを含むデバイスおよび／または組成物は、身体内へのこのような物質の比較的遅い放出のために身体に組み込まれてもよく、またはそこに局所適用されてもよい。ガンを排除するのにおいてさらに有効である応答を生成するために生成された、免疫応答のタイプを変更し得る乳癌ワクチンは、免疫調節化合物とともに導入されてもよい。
【０２４２】
別の実施形態では、表１のマーカーの発現構築物からなる乳癌ワクチンは、筋肉への注射によって、またはマイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）上にコーティングすることおよび高速で皮膚にプロジェクタイル（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）を発射する目的用に設計されたデバイスを用いることによって導入され得る。次いで、本発明の細胞は表１のマーカーのタンパク質（単数または複数）またはタンパク質のフラグメントを発現して、免疫応答を誘導する。さらに、乳癌ワクチンは、免疫応答を増大するか、またはガンを排除するのに有効である応答を生成するために生成されたタイプの免疫応答を調節し得る、サイトカインのような免疫調節分子のための発現構築物とともに導入されてもよい。
【０２４３】
マーカー核酸分子は、ベクターに挿入されてもよく、そして遺伝子治療ベクターとして用いられてもよい。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与によって（米国特許第５，３２８，４７０号）、または定位的注射によって（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈物中に遺伝子治療ベクターを含んでもよいし、またはこの遺伝子送達ビヒクルが包含されている徐放性マトリックスを含んでもよい。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターが、組み換え細胞からインタクトに生成され得る場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を生成する１つ以上の細胞を含んでもよい。
【０２４４】
薬学的組成物は、投与のための説明書とともに容器、パックまたはディスペンサーに含まれ得る。
【０２４５】
予測医学
本発明は、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム学、および臨床試験のモニタリングを予後的（予測的）目的で使用し、これによって個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、個体が乳癌を発症するリスクがあるか否かを決定するために、マーカータンパク質または核酸の１つ以上の発現のレベルを決定するための診断アッセイに関する。このようなアッセイは、それによってガンの発現の前に個体を予防的に処置するための予後または予測の目的のために用いられ得る。
【０２４６】
本発明のさらに別の局面は、薬剤（例えば、乳癌を阻害するために、または任意の他の障害を処置もしくは予防するために投与される、薬物または他の化合物｛すなわち、このような処置が有し得る任意の乳癌発癌性効果を理解するため｝）の臨床トライアルにおける本発明のマーカーの発現または活性に対する影響をモニタリングすることに関する。これらおよび他の薬剤については以下のセクションでさらに詳細に説明する。
【０２４７】
診断的アッセイ
生物学的サンプル中におけるマーカータンパク質または核酸の有無を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプル（例えば、乳房関連体液）を得る工程と、生物学的サンプルをこのポリペプチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡ）を検出する能力のある化合物または薬剤と接触させる工程とを包含する。従って、本発明の検出方法は、インビトロおよびインビボにおいて、例えば、生物学的サンプル中のｍＲＮＡ、タンパク質、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するために用いられ得る。例えば、ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。マーカータンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、マーカータンパク質を検出するためのインビボ技術は、被験体中へこのタンパク質またはそのフラグメントに対する標識抗体を導入する工程を包含する。例えば、抗体を、被験体中のその存在および位置を標準的な造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
【０２４８】
このような診断および予測アッセイの一般的原理は、サンプルまたはマーカーおよびプローブを含み得る反応混合物を、このマーカーおよびプローブが相互作用して結合することを可能にするのに適切な条件および十分な時間のもとで調製して、これによって反応混合物中で除去されるか、および／または検出され得る複合体を形成する工程を包含する。これらのアッセイは、種々の方法で行なうことができる。
【０２４９】
例えば、このようなアッセイを行なうための１方法は、基質とも呼ばれる固相支持体上にマーカーまたはプローブを固定する工程、および反応の終わりの時点で固相上に固定された標的マーカー／プローブ複合体を検出する工程を包含する。このような方法の１実施形態では、マーカーの存在および／または濃度についてアッセイすべき、被験体由来のサンプルを、キャリアまたは固相支持体上に固定してもよい。別の実施形態では、逆の状態が可能であり、ここではプローブが固相に固定されてもよく、そして被験体由来のサンプルはアッセイの未固定成分として反応されてもよい。
【０２５０】
固相に対してアッセイ成分を固定するための多くの方法が確立されている。これらとしては、限定はしないが、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を通じて固定されているマーカーまたはプローブの分子が挙げられる。このようなビオチニル化アッセイ成分は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド）から当該分野内で公知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化することができる。特定の実施形態では、アッセイ成分が固定されている表面は、前もって調製されて保管されてもよい。
【０２５１】
このようなアッセイのための他の適切なキャリアまたは固相支持体としては、マーカーまたはプローブが属する分子のクラスに結合し得る任意の物質が挙げられる。周知の支持体またはキャリアとしては、限定はしないが、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然および改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩（ｇａｂｂｒｏｓ）および磁鉄鉱が挙げられる。
【０２５２】
上記のアプローチを用いてアッセイを行なうために、固定されていない成分を固相に添加して、その際第二の成分を固定する。反応の終了後、複合体化していない成分を、形成されたあらゆる複合体が固相に固定したままであるような条件下で、除去してもよい（例えば、洗浄によって）。固相に固定されたマーカー／プローブ複合体の検出は、本明細書に概説される多数の方法で達成され得る。
【０２５３】
好ましい実施形態では、プローブは、未固定のアッセイ成分である場合、本明細書において考察されており、当業者に周知である検出可能標識を用いて直接または間接的に、アッセイの検出および読み取りの目的のために標識され得る。
【０２５４】
例えば、蛍光エネルギー移動の技術（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）を利用することによって、いずれかの成分（マーカーまたはプローブ）のさらなる操作または標識なしに、マーカー／プローブ複合体の形成を直接検出することも可能である。第一の「ドナー（ｄｏｎｏｒ）」分子上の発蛍光団標識は、適切な波長の入射光線での励起の際に、その発光された蛍光エネルギーが、第二の「アクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）」分子上の蛍光標識によって吸着され、これが次に吸収されたエネルギーに起因して蛍光を発し得るように選択される。あるいは、「ドナー（ｄｏｎｏｒ）」タンパク質分子は単に、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用し得る。「アクセプター」分子標識が、「ドナー（ｄｏｎｏｒ）」のものとは識別され得るように、異なる波長の光を放射する標識が選択される。標識の間のエネルギー転移の有効性は、分子を隔てる距離に関係するので、分子の間の空間的な関係が評価され得る。分子間で結合が生じる状況では、アッセイ中の「アクセプター」分子標識の蛍光放射が最大であるはずである。ＦＥＴ結合事象は、当該分野で周知の標準的な蛍光検出手段によって従来のように測定され得る（例えば、蛍光計を用いて）。
【０２５５】
別の実施形態では、プローブがマーカーを認識する能力を決定することは、リアルタイムＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８〜２３４５およびＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９〜７０５を参照のこと）のような技術を利用することによって、アッセイ成分（プローブまたはマーカー）のいずれかを標識することなく達成できる。本明細書において用いる場合、「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）」は、いかなる反応体（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）も標識することなく、生体特異的相互作用をリアルタイムで研究するための技術である。結合表面の質量の変化（結合事象の指標）によって、表面付近の光の屈折率の変化が生じ（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）、その結果、生物学的分子の間のリアルタイムの反応の指標として用いられ得る検出可能シグナルが得られる。
【０２５６】
あるいは、別の実施形態では、類似の診断および予後予測アッセイが、液相中の溶質としてマーカーおよびプローブを用いて行なわれ得る。このようなアッセイでは、複合体化されたマーカーおよびプローブは、限定はしないが：分画遠心法、クロマトグラフィー、電気泳動および免疫沈澱分離を含む任意の多数の標準的な技術によって、複合体化されていない成分から分離される。分画遠心法では、マーカー／プローブ複合体は、その複合体の種々のサイズおよび密度に基づくその複合体の分画沈殿平衡に起因して、一連の遠心分離工程を通じて複合体になっていないアッセイ成分から分離され得る（例えば、Ｒｉｖａｓ，Ｇ．およびＭｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１８（８）２８４〜７を参照のこと）。標準的なクロマトグラフィー技術も、複合体化していないものから複合体分子を分離するのに利用され得る。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、サイズに基づいて、そして適切なゲル濾過樹脂をカラムの形態で利用することによって分子を分離する、例えば、比較的大きい複合体は、比較的小さい複合体化していない成分から分離され得る。同様に、複合体化していない成分に比べて、このマーカー／プローブ複合体の比較的異なる電荷特性が、例えば、イオン交換クロマトグラフィー樹脂の利用を通じて、複合体化されていない成分から複合体を識別するように開発され得る。このような樹脂およびクロマトグラフィー技術は、当業者に周知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ，Ｎ．Ｈ．１９９８、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．Ｗｉｎｔｅｒ  １１（１−６）：１４１−８；Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ  Ｔｗｅｅｄ，Ｓ．Ａ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ  １９９７  Ｏｃｔ  １０；６９９（１−２）：４９９−５２５を参照のこと）。未結合の成分から複合体化したアッセイ成分を分離するにはゲル電気泳動も使用できる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９８７−１９９９を参照のこと）。この技術では、タンパク質または核酸複合体は、例えば、サイズまたは電荷に基づいて分離される。電気泳動プロセスの間に結合相互作用を維持するためには、還元剤の非存在下での非変性ゲルマトリックス物質および条件が代表的には好ましい。特定のアッセイおよびその成分に対して適切な条件は、当業者に周知である。
【０２５７】
特定の実施形態では、マーカーｍＲＮＡのレベルは、当該分野で公知の方法を用いて生物学的サンプル中で、インサイチュ方式およびインビトロ方式の両方で決定され得る。「生物学的サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅ）」という用語は、被験体、ならびに被験体に存在する組織、細胞および液体から単離された、組織、細胞、生物学的液体およびその単離物を包含するものとする。多くの発現検出方法は、単離されたＲＮＡを用いる。インビトロの方法については、乳房細胞からのＲＮＡの精製のために、ｍＲＮＡの単離に関して選択しない任意のＲＮＡ単離技術を利用し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９８７−１９９９を参照のこと）。さらに、当業者に周知の技術、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（１９８９，米国特許第４，８４３，１５５号）の単一工程ＲＮＡ単離プロセスのような技術を用いて多数の組織サンプルが容易に処理できる。
【０２５８】
単離されたｍＲＮＡは、限定はしないが、サザン分析またはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅のアッセイにおいて用いられ得る。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの好ましい診断方法は、単離されたｍＲＮＡと、検出されている遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズし得る核酸分子（プローブ）とを接触させる工程を包含する。核酸プローブは、例えば全長ｃＤＮＡまたはその一部、例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長であり、かつ本発明のマーカーをコードするｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書に記載されている。プローブとのｍＲＮＡのハイブリダイゼーションによって、該当のマーカーが発現されているということが示される。
【０２５９】
１方式では、ｍＲＮＡは、例えば、アガロースゲル上で単離されたｍＲＮＡを泳動することおよびｍＲＮＡをこのゲルからニトロセルロースのようなメンブレンに転写することによって、固体表面に固定されて、プローブと接触させられる。別の方式では、プローブ（単数または複数）は、固体表面上に固定されて、ｍＲＮＡが、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイ中でプローブ（単数または複数）と接触される。当業者は、本発明のマーカーによってコードされるｍＲＮＡのレベルを検出するのにおいて用いるために公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適合し得る。
【０２６０】
サンプル中のｍＲＮＡマーカーのレベルを決定するための別の方法は、例えば、ｒｔＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号に示される実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−１９３）、自己保存配列複製（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（ｒｏｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号）または任意の他の核酸増幅方法による核酸増幅のプロセス、その後の当該分野で周知の技術を用いるこの増幅された分子の検出を包含する。これらの検出スキームは、核酸分子が極めて少数しか存在しない場合、このような核酸分子の検出のために特に有用である。本明細書において用いる場合、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域にアニーリングされ得る核酸分子の対（それぞれプラス鎖およびマイナス鎖、逆も真）であると規定され、そして間に短い領域を含む。一般に、増幅プライマーは、約１０〜３０ヌクレオチド長であり、約５０〜２００ヌクレオチド長の領域に隣接する。適切な条件下で適切な試薬を用いれば、このようなプライマーは、そのプライマーに隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【０２６１】
インサイチュの方法のためには、ｍＲＮＡは、検出の前に乳房細胞から単離される必要はない。このような方法では、細胞または組織サンプルは、公知の組織学的方法を用いて調製／処理される。次いで、サンプルは支持体、代表的にはガラススライドに固定されて、次いでマーカーをコードするｍＲＮＡに対してハイブリダイズされ得るプローブと接触される。
【０２６２】
マーカーの絶対的発現レベルに基づく決定を行なう代わりに、マーカーの正規化した発現レベルに基いて決定を行なってもよい。発現レベルは、マーカーの発現をマーカーではない遺伝子、例えば恒常的に発現されるハウスキーピング遺伝子の発現に対して比較することによりマーカーの絶対的発現レベルを補正することによって、正規化される。正規化のために適切な遺伝子としては、アクチン遺伝子、または上皮細胞特異的遺伝子のようなハウスキーピング遺伝子が挙げられる。この正規化によって、１サンプル、例えば患者サンプル中の発現レベルと、別のサンプル、例えば、非乳癌サンプルとの比較、または種々の供給源由来のサンプル間の比較が可能になる。
【０２６３】
あるいは、発現レベルは、相対的発現レベルとして提供されてもよい。マーカーの相対的発現レベルを決定するため、マーカーの発現のレベルは、該当のサンプルについての発現レベルの決定の前に、ガン細胞単離物に対して１０個以上の正常のサンプル、好ましくは５０個以上のサンプルについて決定した。多数のサンプルにおいてアッセイされた遺伝子の各々の平均発現レベルを決定して、これをマーカーのベースラインの発現レベルとして用いる。次いで、試験サンプルについて決定されたマーカーの発現レベル（絶対的レベルの発現）を、そのマーカーについて得られた平均発現値で割る。これによって、相対的な発現レベルが得られる。
【０２６４】
好ましくは、ベースライン決定において用いられるサンプルは、乳癌に由来するか、または乳房組織の非乳癌細胞に由来する。細胞供給源の選択は、相対的発現レベルの使用に依存する。平均発現スコアとして正常な組織で見出される発現を用いて、アッセイされたマーカーが（正常な細胞に対して）乳房特異的であるか否かを確証することが補助される。さらに、さらなるデータを蓄積すれば、平均発現値が改訂され得、蓄積されたデータに基いて相対的発現値が改善される。乳房細胞からの発現データによって、乳癌状態の重篤度を分類するための手段が得られる。
【０２６５】
本発明の別の実施形態では、マーカータンパク質が検出される。本発明のマーカータンパク質を検出するための好ましい因子は、このようなタンパク質またはそのフラグメントに結合し得る抗体であって、好ましくは検出可能レベルの抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体であっても、さらに好ましくはモノクローナル抗体であってもよい。インタクトな抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が用いられ得る。プローブまたは抗体に関して「標識された（ｌａｂｅｌｅｄ）」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする（すなわち物理的に連結する）ことによってこのプローブまたは抗体を直接的に標識する工程、ならびに直接標識されている別の試薬との反応性によってプローブまたは抗体を間接的に標識する工程を包含するものとする。間接的な標識の例としては、蛍光標識した二次抗体を用いる一次抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出できるように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識する工程が挙げられる。
【０２６６】
乳房細胞由来のタンパク質は、当業者に周知である技術を用いて単離され得る。使用されるタンパク質単離方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載される方法などであってもよい。
【０２６７】
所定の抗体に結合するタンパク質をサンプルが含むか否かを決定するためには種々の形式が使用され得る。このような形式の例としては、限定はしないが、酵素免疫測定法（エンザイムイムノアッセイ）（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット分析および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。当業者は、乳房細胞が本発明のマーカーを発現するか否かを決定するのにおける使用のために公知のタンパク質／抗体検出方法を容易に適合させることができる。
【０２６８】
１つの形式では、抗体、または抗体フラグメントもしくは誘導体をウエスタンブロットまたは免疫蛍光測定技術のような方法において用いて、発現されたタンパク質を検出することができる。このような用途においては、固体支持体上の抗体またはタンパク質のいずれかを固定することが一般に好ましい。適切な固相支持体またはキャリアとしては、抗原または抗体に結合し得る任意の支持体が挙げられる。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩（ｇａｂｂｒｏｓ）および磁鉄鉱が挙げられる。
【０２６９】
当業者には、抗体または抗原に結合するための多くの他の適切なキャリアが公知であり、そして本発明との使用のためにこのような支持体を適合させることができる。例えば、乳房細胞から単離されたタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で泳動されて、ニトロセルロースのような固相支持体の上に固定され得る。次いで、この支持体を適切な緩衝液で洗浄し、続いて検出可能に標識した抗体で処理してもよい。次いで固相支持体を２回目に緩衝液で洗浄して未結合の抗体を除いてもよい。次いで固体支持体上に結合した標識の量は、従来の手段によって検出され得る。
【０２７０】
本発明はまた、生物学的サンプル（例えば、乳首吸引液のような乳房関連体液）中でマーカータンパク質または核酸の存在を検出するためのキットを包含する。このようなキットは、被験体が乳癌に罹患しているか、または乳癌を発症するリスクが増大しているかを決定するために用いられ得る。例えば、このキットは、生物学的サンプル中でマーカータンパク質または核酸を検出できる標識された化合物または因子、およびサンプル中のタンパク質またはｍＲＮＡの量を決定するための手段を備えてもよい（例えば、タンパク質もしくはそのフラグメントに結合する抗体、またはこのタンパク質をコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）。キットはまた、このキットを用いて得られる結果を解釈するための説明書を備えてもよい。
【０２７１】
抗体ベースのキットについては、このキットは、例えば：（１）マーカータンパク質に結合する第一の抗体（例えば、固体支持体に結合される）；および、必要に応じて（２）このタンパク質または第一の抗体のいずれかに結合して、検出可能な標識に対して結合体化される、第二の異なる抗体、を含んでもよい。
【０２７２】
オリゴヌクレオチドベースのキットについては、このキットは、例えば：（１）マーカータンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）マーカー核酸分子を増幅するために有用なプライマーの対、を含んでもよい。このキットはまた、例えば、緩衝化剤、防腐剤、またはタンパク質安定化剤を含んでもよい。このキットはさらに、検出可能標識（例えば、酵素または基質）を検出するために必要な成分をさらに含んでもよい。このキットはまた、アッセイされて、試験サンプルに比較され得る、コントロールサンプルまたは一連のコントロールサンプルを含んでもよい。キットの各々の成分は、個々の容器内に包含され得、そして種々の容器の全ては、このキットを用いて行なわれるアッセイの結果を解釈するための説明書とともに、単独のパッケージ内であってもよい。
【０２７３】
薬理ゲノム学
本発明のマーカーはまた、薬理ゲノム学のマーカーとしても有用である。本明細書において用いる場合、「薬理ゲノム学マーカー（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ  ｍａｒｋｅｒ）」とは、その発現レベルが患者における特定の臨床薬物応答または感受性と相関している客観的生物化学マーカーである（例えば、ＭｃＬｅｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３５（１２）：１６５０〜１６５２を参照のこと）。薬理ゲノム学マーカーの発現の存在または量は、患者の予想される応答、さらに詳細には特定の薬物または薬物のクラスでの治療に対する患者の腫瘍の予想される応答に関している。患者において１つ以上の薬理ゲノムマーカーの発現の存在または量を評価することによって、その患者に最も適切な、またはさらに大きい程度の成功を有すると推測される薬物療法が選択され得る。例えば、患者における特定の腫瘍マーカーによってコードされるＲＮＡまたはタンパク質の存在または量に基づいて、患者に存在する可能性が高い特定の腫瘍の処置のために適している、薬物または処置のコースが選択され得る。従って、薬理ゲノム学マーカーの使用によって、種々の薬物もレジメンも試みることなく、各々のガン患者について最も適切な処置を選択または設計することが可能になる。
【０２７４】
別の局面の薬理ゲノミクスでは、薬物に対して体が反応する方法を変更する遺伝的状態を取り扱う。これらの薬理ゲノミクス状態は、まれな欠陥として、または多形性として存在し得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤（抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類）の摂取後およびソラマメ摂食後の溶血である。
【０２７５】
例示的実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続期間の両方についての主な決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）ならびにチトクロームＰ４５０酵素であるＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の発見によって、なぜある患者は標準かつ安全な用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過剰な薬物応答および重篤な毒性を示すのかについての説明が得られた。これらの多型性は、人口集団で高代謝群（ＥＭ）および低代謝群（ＰＭ）の２つの表現型で表現される。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性であり、そしていくつかの変異は、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の非存在を全てがもたらすＰＭにおいて同定されている。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分である場合、ＣＹＰ２Ｄ６が形成する代謝物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛作用について実証されるとおり、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。近年では、超高速代謝群の分子的根拠は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因することが確認されている。
【０２７６】
従って、個体における本発明のマーカーの発現のレベルが決定されて、それによってその個体の治療的または予防的な処置のために適切な薬剤（単数または複数）が選択され得る。さらに、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用することができる。この知識を投薬量および薬の選択に適用する場合、本発明のマーカーの発現の調節因子を用いて被験体を処置する際に、有害作用または治療の失敗を避け、これによって治療的または予防的効率を増強することができる。
【０２７７】
臨床試験のモニタリング
本発明のマーカーの発現のレベルに対する因子（例えば、薬物化合物）の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬物スクリーニングに応用できるだけでなく、臨床試験にも応用できる。例えば、マーカー発現に影響する因子の有効性は、乳癌の処置を受けている被験体の臨床試験においてモニターし得る。好ましい実施形態では、本発明は、ある因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬候補物）で被験体を処置することの有効性をモニタリングする方法を提供し、この方法は、（ｉ）この因子の投与前に被験体から投与前サンプルを得る工程と；（ｉｉ）投与前サンプル中において本発明の１つ以上の選択されたマーカーの発現レベルを検出する工程と；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程と；（ｉｖ）この投与後サンプル中のマーカー（単数または複数）の発現のレベルを検出する工程と；（ｖ）投与前サンプル中のマーカー（単数または複数）の発現のレベルを投与後サンプル（単数または複数）中のマーカー（単数または複数）の発現のレベルと比較する工程と；（ｖｉ）この被験体へのこの因子の投与を適宜変更する工程とを包含する。例えば、処置の経過の間のマーカー遺伝子（単数または複数）の発現の増大は、投薬量が無効であること、および投薬量を漸増することが望ましいことを示し得る。逆に、マーカー遺伝子（単数または複数）の発現の減少は、処置が有効であること、および投与量を変化する必要性がないことを示し得る。
【０２７８】
電子装置読み取り可能媒体およびアレイ
本発明のマーカーを含む電子装置読み取り可能な媒体も提供される。本明細書において用いる場合、「電子装置読み取り可能な媒体（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｒｅａｄａｂｌｅ  ｍｅｄｉａ）」とは、電子装置によって直接読んでアクセスすることが可能であるデータまたは情報を記憶、保持、または備えるための任意の適切な媒体をいう。このような媒体としては、限定はしないが：磁気記憶媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ；光学記憶媒体、例えば、コンパクトディスク；電子記憶媒体、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなど；一般的ハードディスクおよびこれらのカテゴリーのハイブリッド、例えば、磁気／光学記憶媒体を挙げることができる。この媒体は、本発明のマーカーをその上に記録するように適合または構成される。
【０２７９】
本明細書において用いる場合、「電子装置（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）」という用語は、データおよび情報を記憶するために構成されるかまたは適合された、任意の適切な計算または処理の装置または他のデバイスを包含するものとする。本発明で利用するのに適切な電子装置の例としては、スタンドアロン（独立型）コンピュータ装置；ローカル・エリア・ネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）インターネット、イントラネットおよびエクストラネットを含むネットワーク；電子器具、例えば、携帯情報端末（ＰＤＡｓ）、携帯電話、ポケベルなど；ならびに局所および分散処理システム、が挙げられる。
【０２８０】
本明細書において用いる場合、「記録された（ｒｅｃｏｒｄｅｄ）」とは、電子装置読み取り可能媒体上に情報を記憶またはコード化するためのプロセスをいう。当業者は、本発明のマーカーを含む製品を生成するために公知の媒体上に情報を記録するために、任意の現在公知の方法を容易に適合させることができる。
【０２８１】
種々のソフトウェアプログラムおよびフォーマットを用いて、本発明のマーカー情報を電子装置読み取り可能媒体上に記憶させることができる。例えば、マーカー核酸配列は、ワードプロセシングのテキストファイルに提示されてもよいし、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏＳｏｆｔ  Ｗｏｒｄのような市販のソフトウェアにフォーマットされてもよいし、またはＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ，Ｏｒａｃｌｅなどのようなデータベースアプリケーションに記憶されたＡＳＣＩＩファイルの形式で、そして他の形式で提示されてもよい。多数のデータープロセッサー構造形式（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を使用して、その上に本発明のマーカーが記録されている媒体を得るかまたは作製することができる。
【０２８２】
本発明のマーカーを読み取り可能形態で提供することによって、種々の目的のためにこのマーカー配列情報に慣用的にアクセスすることができる。例えば、当業者は、本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を、読み取り可能な形態で使用して、標的配列または標的構造モチーフと、このデータ記憶手段に記憶された配列情報とを比較することができる。検索手段を用いて、特定の標的配列または標的モチーフにマッチする、本発明の配列のフラグメントまたは領域を同定する。
【０２８３】
従って、本発明は、被験体が乳癌を有するか、乳癌の前段階の傾向があるかを決定するための方法を行なうための指示を保持するための媒体を提供するが、この方法は、マーカーの有無を決定する工程と、そのマーカーの有無に基づいて、この被験体が乳癌を有するかまたは乳癌に対する前段階の傾向を有するかを決定する工程と、そして／あるいは乳癌または前乳癌状態のための特定の処置を推奨する工程とを包含する。
【０２８４】
本発明はさらに、電子システムおよび／またはネットワークにおいて、被験体が乳癌を有するか、マーカーに関連する乳癌に対する前段階の傾向を有するかを決定するための方法であって、マーカーの有無を決定する工程と、そのマーカーの有無に基づいて、この被験体が乳癌を有するかまたは乳癌に対する前段階の傾向を有するかを決定する工程と、そして／あるいは乳癌または前乳癌状態のための特定の処置を推奨する工程とを包含する方法を提供する。本発明はさらに、被験体に関連する表現型情報を受け取る工程と、そして／または被験体に関連する表現型情報をネットワークから獲得する工程とを包含する。
【０２８５】
本発明はまた、ネットワークにおいて、被験体が乳癌を有するか、マーカーに関連する乳癌に対する前段階の傾向を有するかを決定するための方法であって、マーカーに関連する情報を受け取る工程と、被験体に関連する表現型情報を受け取る工程と、マーカーおよび／もしくは乳癌に対応する情報をこのネットワークから獲得する工程と、そして１つ以上の表現型情報、マーカーおよび獲得された情報に基づいて、この被験体が乳癌を有するかまたは乳癌に対する前段階の傾向を有するかを決定する工程とを包含する方法を提供する。この方法はさらに、乳癌または前乳癌状態の特定の処置を推奨する工程を包含し得る。
【０２８６】
本発明はまた、被験体が乳癌か、進行性の乳房腫瘍かまたは乳癌に対する前段階の傾向を有するかを決定するための職業的方法であって、マーカーに関連する情報を受け取る工程と、被験体に関連する表現型情報を受け取る工程と、マーカーおよび／もしくは乳癌に相当する情報をこのネットワークから獲得する工程と、そして１つ以上の表現型情報、マーカーおよび獲得された情報に基づいて、この被験体が乳癌を有するかまたは乳癌に対する前段階の傾向を有するかを決定する工程とを包含する方法を提供する。この方法はさらに、乳癌または前乳癌状態の特定の処置を推奨する工程を包含し得る。
【０２８７】
本発明はまた、本発明のマーカーを含むアレイを包含する。このアレイは、このアレイにおいて１つ以上の遺伝子の発現をアッセイするために用いられ得る。１実施形態では、このアレイは、組織中の遺伝子発現をアッセイして、このアレイ中の遺伝子の組織特異性を確認するために用いられ得る。この方式では、最大約７６００個の遺伝子が発現について同時にアッセイできる。これによって、１つ以上の組織において特異的に発現される遺伝子の集合を示すプロフィールを発達させることが可能になる。
【０２８８】
このような定量的決定に加えて、本発明は、遺伝子発現の定量を可能にする。従って、組織特異性だけでなく、組織中における遺伝子の集団の発現のレベルも確認可能である。従って遺伝子は、その組織におけるその遺伝子の組織発現自体および発現のレベルに基づいて分類され得る。これは例えば、組織間および組織内の遺伝子発現の関係を確認するのに有用である。従って、１つの組織が混乱され得、そして第二の組織において遺伝子発現の影響が決定され得る。この状況では、生物学的刺激に応答する、１つの細胞タイプの別の細胞タイプに対する効果が決定され得る。このような決定は、例えば、遺伝子発現のレベルにおいて細胞間相互作用の効果を知るために有用である。ある因子が１つの細胞タイプを処置するために治療的に投与されるが、別の細胞タイプに対しては望ましくない効果を有する場合、本発明は、この望ましくない効果の分子的基礎を決定するアッセイを提供し、これによって中和剤（ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を同時投与するか、そうでなければこの望ましくない効果を処置する機会が得られる。同様に、単独の細胞タイプにおいてさえ、望ましくない生物学的効果が分子レベルで決定され得る。これによって、標的遺伝子以外の発現に対する因子の効果が確認されて、相殺され得る。
【０２８９】
別の実施形態では、アレイ中で１つ以上の遺伝子の発現の時間経過をモニターするためにアレイが用いられ得る。これは、本明細書に考察されるような、種々の生物学的状況、例えば、乳癌の発達、乳癌の進行、および乳癌に関連する細胞トランスフォーメーションのような過程で生じ得る。
【０２９０】
このアレイは、同じ細胞または異なる細胞における他の遺伝子の発現に対する遺伝子の発現の効果を確認するためにも有用である。これによって、最終的なまたは下流の標的が調節できない場合、例えば、治療的介入のための別の分子標的の選択が得られる。
このアレイはまた、正常なまたは異常な細胞における１つ以上の遺伝子の種々の発現パターンを確認するためにも有用である。これによって、診断または治療の介入のための分子標的として役立ち得る遺伝子の集団が得られる。
【０２９１】
代用のマーカー
本発明のマーカーは、１つ以上の障害または疾患状態のための、または疾患状態にいたる状態のための、そして詳細には乳癌における代用マーカーとして役立ち得る。本明細書において用いる場合、「代用マーカー（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｍａｒｋｅｒ）」とは、疾患もしくは障害の有無に関連するか、または疾患もしくは障害の進行に（例えば、腫瘍の有無に）関連する客観的生物化学マーカーである。このようなマーカーの存在または量は、疾患とは無関係である。従って、これらのマーカーは、処置の特定の経過が疾患状態または障害を減少させるのに有効であるか否かを示すのに役立ち得る。代用マーカーは、疾患状態または障害の存在または程度が標準的な方法論によって評価するのが困難である場合（例えば、初期段階の腫瘍）、または疾患の進行の評価が潜在的に危険な臨床的終点に達する前に所望される場合に特に有用である（例えば、心筋梗塞または完全に進行したＡＩＤＳの望ましくない臨床転帰に十分先んじて、心血管系の疾患の評価は、代用マーカーとしてコレステロールレベルを用いて行なわれ得、そしてＨＩＶ感染の分析は、代用マーカーとしてＨＩＶ  ＲＮＡレベルを用いて行なわれ得る）。当該分野における代用マーカーの使用の例としては以下が挙げられる：Ｋｏｏｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３５：２５８−２６４；ならびにＪａｍｅｓ（１９９４）ＡＩＤＳ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｎｅｗｓ  Ａｒｃｈｉｖｅ  ２０９。
【０２９２】
本発明のマーカーはまた、薬力学的マーカーとしても有用である。本明細書において用いる場合、「薬力学的マーカー（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｒｋｅｒ）」とは、薬物効果と特異的に相関する客観的な生物化学マーカーである。薬力学的マーカーの存在または量は、薬物が投与されている疾患状態または障害に関係しない；従って、マーカーの存在または量は、被験体における薬物の存在または活性の指標である。例えば、薬力学的マーカーは、そのマーカーが、その薬物のレベルに関係してその組織中で、発現されるかもしくは転写されるか、または発現されないかもしくは転写されないという点で、生物学的組織における薬物の濃度の指標であり得る。この方式では、薬物の分布または取り込みは、薬力学的マーカーによってモニターされ得る。同様に、薬力学的マーカーの存在または量は、薬物の代謝産物の存在または量に関連し得、その結果そのマーカーの存在または量は、インビボにおけるその薬物の相対的分解速度の指標である。薬力学的マーカーは、特に薬物が低用量で投与される場合、薬物効果の検出の感度を増大するのにおいて特に有用である。少量の薬物でさえ複数回のマーカーの転写または発現を活性化するのに十分であり得るので、増幅されたマーカーは、その薬物自体よりも容易に検出可能な量であり得る。また、このマーカーはマーカー自体の性質に起因して容易に検出され得る；例えば、本明細書に記載される方法を用いて、抗体はタンパク質マーカーの免疫ベースの検出システムにおいて使用されてもよく、またはマーカー特異的な放射性標識プローブは、ｍＲＮＡマーカーを検出するために用いられてもよい。さらに、薬力学的マーカーの使用によって、潜在的な直接の観察の範囲を越えて、薬物処置に起因する機序に基づく危険性予測を得ることができる。当該分野における薬力学的マーカーの使用の例としては、Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０３３，８６２号；Ｈａｔｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｅｎｖ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．９０：２２９〜２３８；Ｓｃｈｅｎｔａｇ（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５６  Ｓｕｐｐｌ．３：Ｓ２１−Ｓ２４；およびＮｉｃｏｌａｕ（１９９９）Ａｍ，Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５６  Ｓｕｐｐｌ．３：Ｓ１６−Ｓ２０：が挙げられる。
【実施例】
【０２９３】
実施例１：ｃＤＮＡおよび組織マイクロアレイによる乳癌マーカーの同定
Ｉ．材料および方法
（サンプルの収集およびＲＮＡ調製）
乳房組織を収集して、液体窒素中で急速凍結させた。組織の組織学および細胞組成物は、ＲＮＡ抽出を行なう前に確認した。Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてこの凍結組織から全ＲＮＡを抽出し、続いてＱｉａｇｅｎ’ｓ  ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を用いて二次浄化工程を行って、ＲＮＡプローブ標識有効性を増大させた。アガロースゲルでの電気泳動後にＲＮＡのエチジウム染色から算出して、２８Ｓ／１８Ｓ  リボソームＲＮＡ比が少なくとも１．０であるＲＮＡのみをこの研究に用いた。
（ｃＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション）
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｓｔｖｉｌｌｅ，ＡＬ）由来の３０，７３２個のＵｎｉｇｅｎｅクローンを含むｃＤＮＡマイクロアレイをナイロンフィルターから生成した。３３Ｐ−ｄＣＴＰ、オリゴｄＴ−３０プライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた逆転写による、放射性標識したｃＤＮＡを生成するためのテンプレートとして、全部で４−６μｇの全ＲＮＡを用いた。３３Ｐ標識した第一鎖のｃＤＮＡを、ｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびｐｏｌｙ−ｄＡ  ４０−６０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）を用いてプレアニーリングして、非特異的ハイブリダイゼーションを低下させた。７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２５０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  Ｃａｓｅｉｎ−Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎおよび０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で、各々のフィルターを、約６×１０６カウントの標識プローブと６５℃で１６時間ハイブリダイズさせた。４％および１％のＳＤＳ洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  および４％または１％  ＳＤＳ）を用いてフィルターを洗浄した後、それらをＦｕｊｉ  Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒスクリーンに曝して、ＦｕｊｉスキャナーＢＡＳ  ２５００を用いてスキャンした。Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．で開発された自動アレイ分析プログラム、Ｇｒｉｄ  Ｇｕｒｕ  ｖ１．０を用いてスポットを定量した。
（マーカースコアリングアルゴリズムおよびデータ分析）
ハイブリダイゼーション有効性の相違について補正するために、各々のマイクロアレイフィルター由来のデジタル化データを、そのフィルター上の全てのスポットの中央強度によって正規化した。アレイベースのおよび遺伝子ベースの両方の階層的クラスタ分析を行なって、Ｓｔａｎｆｏｒｄ’ｓ  Ｇｅｎｅ  ＣｌｕｓｔｅｒおよびＴｒｅｅ  Ｖｉｅｗソフトウェアを用いて可視化した。各々の遺伝子についてのマーカースコア（Ｍａｒｋｅｒ  Ｓｃｏｒｅ）を算出することによって示差的に発現された遺伝子をランク付けした。
【０２９４】
マーカースコアの計算のために、サンプルをコントロール群およびテスター群に分けた。マーカースコアについての開始点は、コントロールサンプルを上回るテスターサンプルの平均倍数変化（比）である。示差的な発現を示す変化の程度（発現比）およびテスターサンプルの数の両方を反映するが、極めて高い値を有する小画分のテスターサンプルによっては占有されないようにスコアを設計した。この「異常値（ｏｕｔｌｉｅｒ）」の影響を軽減するために、遺伝子は、１０を超える発現比で、１０の比を有するものと意味があるほど異なることはないとして処理した。マーカースコアに由来するこの所望の能力は、テスターサンプルにまたがる平均倍数変化をとる前に、漸近的圧縮関数を用いてテスター：コントロール発現比を変換することによって達成した。マーカースコアは、テスターがコントロールよりも高度に発現されるとは思われない場合に１の値であり、そうでなければ１より大きい値である。マーカースコアは、いずれの遺伝子についても１０の値を超えることはできない。
【０２９５】
従って、遺伝子についてのマーカースコアＳｇは以下に従って、個々のテスターおよびコントロールレベルの重み付け強度の比の平均として算出される：
Ｓｇ＝（Σ  Ｓｇｓ）／Ｎｔｅｓｔｅｒ
Ｓｇｓ＝Ｃ（ｘｇｓ／（ｋ＋ｘｇＱ））、ここでＳｇｓは遺伝子ｇおよびサンプルｓについてのマーカースコアであり、Ｃ（ｒ）は、ｒ≧１、については、圧縮関数Ｃ（ｒ）＝Ａ（１−ｅ−ｒ／Ａ）であり、そしてｒ＜１についてはＣ（ｒ）＝１であり、Ａは、変化倍数値（本発明者らは、１０を用いた）の上の漸近線であり、
ｘｇｓは、サンプルｓ上の遺伝子ｇの発現値であり、
ｘｇＱは、コントロールサンプルの発現値のＱ番目の百分率であり；代表的にはＱ＝５０であり、
ｋは、データ中の付加ノイズを反映する定数、すなわり、繰り返し測定での変動の固定成分である。０．２５という値は、マイクロアレイ技術を用いて較正実験からこのパートナーについて誘導された。
Ｎｔｅｓｔｅｒはテスターサンプルの数である
（組織マイクロアレイのインサイチュハイブリダイゼーション）
ホルマリン固定された、パラフィン包埋した乳房組織マイクロアレイが提供された。プレハイブリダイゼーション処理は、以前に記載されたプロトコール（Ｄｕｎｃａｎ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９（２）：５６８〜５７６）を用い、自動Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＤＲＳ  ２０００  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｔａｉｎｅｒ（Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を用いて行なった。乳房組織を脱パラフィン処理し、再水和して、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で１５分間、後固定した。ＰＢＳでの洗浄後、組織マイクロアレイを２μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを用いて３７℃で１５分間消化し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて１０分間、再度インキュベートした。組織切片を、引き続いて０．２Ｎ  ＨＣＬを用いて１０分間、０．２５％無水酢酸／０．１ｍｏｌ／Ｌトリエタノールアミンを用いて１０分間インキュベートして、段階的なエタノールで脱水した。インビトロ転写反応（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）において、ＩＭＡＧＥクローン由来の５００ｎｇの直線化プラスミドＤＮＡを用いて、３５Ｓ−ＵＴＰを用いてアンチセンスプローブを標識した。５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、１×デンハート溶液、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５％  ＳＤＳおよび２００μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で５×１０７ｃｐｍ／ｍｌで標識したプローブを用いて、５０℃で１８時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、５×標準クエン酸添加生理食塩水（ＳＳＣ）で１０分間、５０％ホルムアミド／２×  ＳＳＣで５０℃で３０分間、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／５００ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＮＥ）で３７℃で１０分間、スライドを洗浄して、１０μｇ／ｍｌ  ＲｎａｓｅＡを含むＴＮＥ中で３７℃で３０分間インキュベートして、ＴＮＥ中で３７℃で１０分間洗浄して、２×ＳＳＣ中で５０℃２０分間、１回、０．２×ＳＳＣ中で５０℃で２０分間、２回インキュベートし、そして段階的エタノールを用いて脱水した。ｍＲＮＡ転写物の局在化は、Ｋｏｄａｋ  ＮＴＢ２フォトエマルジョン（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中にスライドを浸漬すること、および４℃で１４〜２１日間曝露することによって決定した。スライドは、Ｍｙｅｒｓヘマトキシリンおよびアルコール性エオシンＹを用いて対比染色した。
（定量的ＰＣＲを用いる遺伝子発現分析）
遺伝子発現は、正常および疾患（例えば、癌性）のヒト組織サンプルから調製されたｃＤＮＡ中でＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量的ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。要するに、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従ってＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて単回工程の抽出方法によって患者サンプルから全ＲＮＡを調製した。各々のＲＮＡ調製物をＤＮａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて３７℃で１時間処置した。内部アンプリコン参照としてβ−２ミクログロブリンを用いて、蛍光の閾値レベルに達するのに少なくとも３８回のＰＣＲ増幅サイクル（または１８ｓリボソーム遺伝子については３５回のＰＣＲ増幅）をサンプルが必要とした場合、ＤＮＡｓｅＩ処理は、完全であると確認された。ＤＮａｓｅＩ処理後のＲＮＡサンプルの完全性をアガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって確認した。フェノール抽出後、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）の指示に従ってＴａｑｍａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓを用いてサンプルからｃＤＮＡを調製した。逆転写酵素なしのＲＮＡの陰性コントロールを、各々のＲＮＡサンプルについてニセの（ｍｏｃｋ）逆転写した。
【０２９６】
プローブは、特定の遺伝子およびその関連転写物の配列に基づいてＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって設計した。各々の標的遺伝子プローブは、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）を用いて標識し、そして１８ｓ参照プローブを種々の蛍光色素ＶＩＣで標識した。従って、標的遺伝子および内部参照遺伝子の種々の標識は同じウェル中で測定可能であった。プライマーおよびプローブを、特定の遺伝子の各々の転写物についての感度および特異性についてチエックした。フォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに１８ｓおよび標的遺伝子の両方についてのプローブを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添加した。プライマーおよびプローブの最終濃度は変化してもよいが、各々は所定の実験内において内部で一致していた。代表的な実験では、１８ｓについては、１００ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーに加えて２００ｎＭプローブを、そして標的遺伝子については９００ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーに加えて２５０ｎＭのプローブを含んだ。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）マトリックス実験は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行なった。サーマルサイクラー条件は以下のとおりであった：５０℃で２分間および９５℃で１０分間の保持、その後、９５℃１５秒間、その後６０℃１分間の４０サイクルの２工程ＰＣＲ。
【０２９７】
以下の方法を用いて、同じ組織中の１８ｓ発現に対する種々の組織における遺伝子発現を定量的に算出した。閾値サイクル（Ｃｔ）値は、蛍光中で統計的に有意な増大が検出されるサイクルとして規定する。Ｃｔ値が低いほど、ｍＲＮＡ濃度が高いことを示す。遺伝子のＣｔ値は、以下の式：ΔＣｔ＝Ｃｔ（標的転写物）−Ｃｔ（１８ｓ）を用いてΔＣｔ値を得るために１８ｓリボソーム遺伝子のＣｔ値を差し引きすることによって正規化する。次いで、２−ΔＣｔによって得られる計算式を用いて相対的発現を算出する。
【０２９８】
ＩＩ．結果
（スクリーニングマーカー選択）
「乳房腫瘍プール（ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｐｏｏｌ）」（３つの乳房腫瘍患者サンプル）、「乳房正常プール（ｂｒｅａｓｔ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｏｏｌ）」（３つの正常乳房上皮患者サンプル）、「他の正常なプール（ｏｔｈｅｒ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｏｏｌ）」（正常な心臓、腎臓、小腸、脾臓、白血球、肺、肝臓、脳、骨髄および結腸患者組織サンプル由来の１サンプル）、および「他の腫瘍プール（ｏｔｈｅｒｓ  ｔｕｍｏｒｓ  ｐｏｏｌ）」（４つの子宮癌腫、５つの結腸腫瘍、８つの肺癌腫患者サンプルの種々のタイプ、４つの卵巣腫瘍サンプル、および５つの前立腺腫瘍サンプル）の患者サンプルからなる乳房スクリーニングパネル由来のｍＲＮＡを用いて、上記の物質および方法のセクションにおいて規定されたような転写プロファイリングによって、表１に列挙されるマーカーの全てを同定した。それらの乳房正常、他の正常または他の腫瘍の発現に比較して、少なくとも２５％の乳房腫瘍における少なくとも３倍高い発現を有するクローンを、乳房腫瘍特異的スクリーニングマーカーとして設計した。これらのｃＤＮＡクローンは、決定されたそれらのタンパク質コード転写配列を有するように選択した。
【０２９９】
選択されたｃＤＮＡクローンについて全長タンパク質コード転写物を決定するためには、選択されたクローンの配列（単数または複数）を用いて、有意な重複を有する他のＥＳＴ配列またはクラスターを同定するために、公的な配列および独自の配列データベースを問い合わせた。このように、連続的なＥＳＴ配列および／またはクラスターをタンパク質コード転写物にアセンブルした。特許請求されるマーカーの全てについての別の転写分析は以下のとおり行なった。
【０３００】
ヒトゲノム配列に対して任意の所定のマーカー遺伝子について公知のヌクレオチド配列の既存のマッピングを用い、そしてヒトゲノム配列上の任意の所定のマーカー遺伝子の新規なヌクレオチド配列をさらにマッピングすることによって（例えば、「ＵＣＳＣ」ゲノムブラウザーのようなリソース、または同様の機能の社内リソースを、ゲノム配列上の検索配列の迅速かつ正確なマッピングを可能にするＢＬＡＳＴのようなアルゴリズムと組み合わせて用いて）、マーカー遺伝子のエキソン−イントロン構造を達成して、同じ遺伝子にマッチするＥＳＴ配列にさらに気を配る。
【０３０１】
目的およびコントロールのサンプルの組織からの所定のマーカー遺伝子のコード配列を増幅するために、ＰＣＲプライマーを設計した。コード配列を変更する能力を用いて、この分析から生じるマーカー遺伝子の任意の別の５’または３’によって、この代替の末端に特異的なさらなるプライマーの設計が得られた。
【０３０２】
乳房腫瘍標本に由来するｃＤＮＡテンプレートを用いて得たＰＣＲ産物をプラスミドベクター中にクローニングして、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けた。代表的には、９６個のクローンをＰＣＲ産物の制限消化およびゲル電気泳動によって、またはＤＮＡ配列分析によって分析した。
【０３０３】
２％以上の頻度で生じるオルタナティブ遺伝子転写物の代表的なクローンを配列決定した。全ての利用可能な配列に基づいて手動でキュレートした（ｃｕｒａｔｅｄ）アセンブリ（コンティグ）内に含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定によって、これらのオルタナティブ転写物に相当するタンパク質配列の同定を達成した。この同定された配列は、表１および配列表において命名する。
【０３０４】
同定されたオルタナティブ転写物を有する遺伝子の示差的な遺伝子発現を、患者の組織標本から調製したｃＤＮＡ中のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量的ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって確認した。所定の遺伝子について同定された全ての転写物について鋭敏であった遺伝子特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）試薬を、特定の場合に調製した（例えば、ＢＣＭＰ１１、ＤＮＡＪＣ１およびＮＰＹ１Ｒ）。さらに、スプライシング形態の特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）試薬セットを特定のマーカーの各々の転写物について別々に発色させた（例えば、Ｍ７２５、Ｍ７２６、Ｍ７２７、Ｍ１１１、Ｍ１４９、Ｍ７３０、Ｍ１６５Ａ、Ｍ７３１、Ｍ７３２、Ｍ９６Ａ、Ｍ７３９、Ｍ７４０、Ｍ７４１、Ｍ７１６、Ｍ７１７）。１つだけ例外として、同様の増幅有効性を有する、種々の腫瘍正常発現を実証する、遺伝子特異的および転写物特異的発現プロフィールが見出された。１例では（Ｍ７３１，ＮＰＹ１Ｒ転写物）、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲでは、おそらくこの転写物の量が少ないせいで発現は実証されなかった。
（病期分類マーカーの選択）
５年を超える無病生存率として規定される、転帰が良好な２３個のＩＤＣ節陰性乳房腫瘍、および３年未満の無病生存率として規定される、臨床転帰の劣った１６個のＩＤＣ節陰性乳房腫瘍に由来するｍＲＮＡを用いて、材料および方法のセクションで規定されたような転写プロファイリングによって、表２に列挙される全てのマーカーを同定した。良好な臨床転帰の腫瘍における発現に比較して、劣った臨床転帰の腫瘍の少なくとも２５％において少なくとも３倍高い発現を有するクローンを、劣った臨床転帰の腫瘍特異的マーカーと名付けた。これらのｃＤＮＡクローンは、それらが、決定されたタンパク質コード転写物配列を有するように選択した。
【０３０５】
選択されたｃＤＮＡクローンの転写物をコードする全長タンパク質の決定は、スクリーニングマーカーについて上記されたように行なった。同定された配列は、表２および配列表に命名している。同定されたオルタネイティブ転写物の示差的遺伝子発現は、転帰が良好および転帰が劣る浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）腫瘍由来の患者組織標本から調製されたｃＤＮＡにおいて、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量的ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって確認した。スプライシング形態の特異的ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブ試薬セットを各々の転写物について発色させて、各々の遺伝子について全ての試薬セットを用いて同様の増幅有効性が得られた。（表３を参照のこと）。
【０３０６】
全ての利用可能な配列に基づいて手動でキュレートした（ｃｕｒａｔｅｄ）アセンブリ（コンティグ）内に含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定によって、これらのオルタナティブ転写物に相当するタンパク質配列の同定を達成した。この同定されたタンパク質配列を、表２および配列表において命名する。
【０３０７】
表３．乳癌病期分類マーカーの示差的発現
【０３０８】
【表３】
2010246558.tif 000035
実施例２：エンドポイントＰＣＲによる遺伝子発現分析
Ｉ．材料および方法
要するに、第一鎖ｃＤＮＡを生成するためのテンプレートとして用いられるように種々のサンプル由来の全ＲＮＡをプールした。各々のサンプルの等量がこのプールに含まれた。乳房スクリーニングパネルは、「乳房腫瘍プール」（３つの乳房腫瘍患者サンプル）、「乳房正常プール」（３つの正常乳房上皮患者サンプル）、「他の正常なプール」（正常な心臓、腎臓、小腸、脾臓、白血球、肺、肝臓、脳、骨髄および結腸患者組織サンプル由来の１サンプル）、および「他の腫瘍プール」（４つの子宮癌腫、５つの結腸腫瘍、８つの肺癌腫患者サンプルの種々のタイプ、４つの卵巣腫瘍サンプル、および５つの前立腺腫瘍サンプル）の患者サンプルから構成された（例えば、表２を参照のこと）。乳癌病期分類パネルは、「腫瘍の良好転帰のプール（ｔｕｍｏｒ  ｇｏｏｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｐｏｏｌ）」（４つの腺癌患者サンプル）、「腫瘍の劣った転帰のプール（ｔｕｍｏｒ  ｐｏｏｒ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｐｏｏｌ）」（５つの腺癌患者サンプル）、「乳房正常プール（ｂｒｅａｓｔ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｏｏｌ）」（４つの正常な乳房上皮患者サンプル）、「他の正常プール（ｏｔｈｅｒ  ｎｏｒｍａｌｓ  ｐｏｏｌ）」（正常な心臓、腎臓、小腸、脾臓、白血球、肺、肝臓、脳、骨髄および結腸由来の１患者サンプル）、および「他の腫瘍プール（ｏｔｈｅｒｓ  ｔｕｍｏｒｓ  ｐｏｏｌ）」（子宮頸部、結腸、肺、卵巣および前立腺の腫瘍）の患者サンプルから構成された（例えば、表３を参照のこと）。
【０３０９】
全ＲＮＡは、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従ってＴＲＩＺＯＬ試薬を用いて単一工程抽出方法によって患者サンプルから調製した。各々のＲＮＡ調製物をＤＮａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて３７℃で１時間処理した。各々の患者サンプル由来のＲＮＡを４つの患者プール、例えば、乳房正常プール、乳房腫瘍プール、他の正常なプール、他の腫瘍プールのうちの１つにプールした。ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて５つの患者プールの各々からｃＤＮＡを得た。要するに、製造業者の指示に従って、１μｌの５０μＭオリゴ（ｄＴ）２０プライマーを、１０μｌの容積中において用いて、１μｇ  ＲＮＡを、６５℃で５分間変性した。この反応は、８５℃で５分間のインキュベーションによって終わらせた。最終産物は、水を用いて１００μｌの最終容積まで希釈した。
【０３１０】
遺伝子特異的プライマーは、オープンリーディングフレームのすぐ外側に設計した（表２のカテゴリーに示されるように、「エンドポイント  ＰＣＲプライマー１（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  １）」および「エンドポイント  ＰＣＲプライマー２（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  ２）」）。ＰＣＲ条件は、プライマーおよび予想される産物のサイズについて最適化した。タッチダウンサイクリング条件を用いて２０μｌの反応液中で２μｌのｃＤＮＡを用いた。産物は臭化エチジウム含有アガロースゲルで泳動して、得られたゲルの図は半定量的に分析してスコア付けした。組織パネル上のエンドポイントＰＣＲのゲルの図は、１〜５のスケールでスコア付けした。各々の図は、可視のバンド強度および編集された結果に基づいて３人が独立してスコア付けし、スコアを比較して、３つ全てがバンドの相対強度に一致することを確認し、必要に応じて改変した。次いで、３つのスコアの中央値を最終スコアとして記録した。
【０３１１】
ＩＩ．結果
表４．乳癌スクリーニングエンドポイントＰＣＲデータ
【０３１２】
【表４】
2010246558.tif 000036
マーカーは、他の腫瘍サンプルまたは正常なサンプル群から得たサンプルよりも乳房腫瘍サンプルにおいて高いレベルで発現された（表４）。乳房正常群、他の正常群、または他の腫瘍群から得られた発現に比較した場合、乳房腫瘍群において、Ｍ７２５、Ｍ７２８、Ｍ７２９、Ｍ１５８Ａ、Ｍ２４２、Ｍ１５６、Ｍ４１９およびＭ１４９Ａで特に強力な発現が観察された。
【０３１３】
表５．乳癌病期分類エンドポイントＰＣＲデータ
【０３１４】
【表５】
2010246558.tif 000037
このマーカーは、転帰良好の群から得られた乳房腫瘍サンプルにおけるレベルよりも転帰の劣る群の乳房腫瘍サンプルにおいて高いレベルで発現された（表５）。転帰良好の群から得られた発現に比較した場合、転帰の劣った群では、Ｍ６７２Ａ、Ｍ６７５Ａ、Ｍ５１４、Ｍ７０８、Ｍ７１０、Ｍ６７４、Ｍ２３４Ａ、Ｍ７１１およびＭ４２１Ａで特に強力な発現が観察された。
【０３１５】
実施例３：ＯＳＦ−２スプライシングバリアントの特徴づけ
Ｉ．材料および方法
ｃＤＮＡ合成
実施例１および２において上記された手順と同様に３つの正常な、そして１２の乳房腫瘍組織サンプルから全ＲＮＡを単離した。要するに、製造業者の指示に従ってＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）システムを用い、その後に製造業者の指示に従ってＲＮＡｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）またはＤＮａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ）処置を用いた。各々のサンプル由来の１μｇを正常プールおよび腫瘍プール中に合わせた。ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて上記の実施例２に記載されるようにｃＤＮＡを得た。最終産物は、水で４００〜８００μｌの最終容積まで希釈した。
【０３１６】
スプライスバリエーションに関与する領域をカバーするためにエキソン１６およびエキソン２３に由来するＯＳＦ−２遺伝子特異的プライマーを用いてｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ増幅のプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０ソフトウェアを用いて設計した（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）。ＰＣＲ条件は、プライマーおよび産物の予想されるサイズについて最適化した。０．５μｌの希釈ＲＴ反応物は、最初、２分の９５℃変性工程後、９５℃３０秒、６０℃で３５秒間のアニーリングおよび７２℃の伸長温度の３０秒間および最終の７２℃７分間の伸長工程の５５サイクルから構成されるＰＣＲ条件を用いて、３０μｌの反応物中で用いた。
（コロニーＰＣＲクローニングおよび配列決定）
ＲＴ／ＰＣＲ由来の両方の反応物についてのＰＣＲ産物をゲル精製して、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲ２．１中にクローニングし、製造業者の指示に従ってＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｎｅ−Ｓｈｏｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に形質転換した。得られたコロニーを選択して、テンプレートとして正常プールおよび腫瘍プールに由来するコロニー細胞を用いて上記で記載されたように３０μＬの容積中でコロニーＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ９６マルチウェルキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を用いて精製し、配列決定に供した。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓバージョン１．１を備えるＡＢＩ  ３７００自動シーケンサーを用いて配列決定を行なった。
【０３１７】
プログラムＢＬＡＳＴ［Ｋｅｎｔ，２００２］を用いて、ＯＳＦ−２遺伝子座のゲノム配列に対して全てのクローン配列を整列させた。ＯＳＦ−２の可変領域に適合する配列のみ、すなわち、少なくともエキソン１７からエキソン２２またはエキソン２１からエキソン１６にまたがる配列（「適格配列（ｑｕａｌｉｆｙｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」）を考慮した。次いで、配列を可変性エキソン１７−２１のその有無のパターンに従って分類した。
【０３１８】
ＩＩ．結果
エキソン１７〜２１（全部で２３のエキソンのうち）の種々の組み合わせによって特徴付けられる、８つの転写バリアントを作製する選択的スプライシング事象にＯＳＦ−２発現を供する（表６を参照のこと）。可変性エキソン１７−１９および２１は、コード配列内に配置され、そしてモジュール方式で種々のタンパク質産物をもたらす、転写物のリーディングフレームを変化させることなく、存在することもしないこともできる。
【０３１９】
表６：ＯＳＦ−２選択的スプライシングバリアントのスキーム提示
【０３２０】
【表６】
2010246558.tif 000038
OSF-2の８つの列挙したスプライシングバリアントの相対的発現レベルは、正常な組織
と腫瘍組織との間で異なる。表７は、正常な乳房組織および乳房腫瘍組織由来のクローンの適格配列を分析することによって得られる、正常なおよび乳房腫瘍組織における各々の転写物の相対的頻度を示す。
【０３２１】
表７：組織中のＯＳＦ−２スプライシングバリアント転写物の相対的頻度
【０３２２】
【表７】
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正常な乳房組織において転写物を含むエキソン２１のレベルの増大、および乳房腫瘍組織においてエキソン２１を欠く転写物のレベルの増大がある（例えば、分析されたサンプル中で正常な乳房組織におけるエキソン２１を各全ての転写物のうちのわずか４５％に比較して、エキソン２１を欠く乳房腫瘍組織においては全ての転写物のうち全部で５９％）。
【０３２３】
ＯＳＦ−２のエキソン２１を含むかまたは欠くいずれかの転写物について発現レベルを決定した。２つの試薬セットを用いた：１つはエキソン２１を含む転写物について特異的、そして二番目のものはそれを含まない転写物について特異的。有意な腫瘍／正常の発現増大が観察された。例えば、エキソン２１を欠くＯＳＦ−２転写物について特異的な試薬セットでは、腫瘍サンプルにおいて平均で２．５倍を超える発現が観察される。この増大は、エキソン２１を含むＯＳＦ−２転写物を評価するのにおいては観察されない。これらの結果は、上記のような正常な組織と腫瘍組織との間の相対的転写頻度の相違、および記載されるＯＳＦ−２改変体の間の識別を可能にするプローブを用いる、翻訳プロファイリングマイクロアレイ実験でもともと観察されたような腫瘍組織におけるＯＳＦ−２の一般的な過剰発現の両方を反映する。
【０３２４】
本出願を通じて引用される文献、特許、公開特許出願、ならびにＧｅｎＢａｎｋ、ＩＭＡＧＥコンソーシアムおよびＤｅｒｗｅｎｔを含むデータベース記録を含む、本明細書に引用される参考文献は、本明細書に参考として援用される。
【０３２５】
他の実施形態
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、慣用的な実験のみを用いて認識するか、または確認することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【配列表】
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