(57)【要約】      （修正有）【課題】耐熱性に優れるβ−ホスホグルコムターゼとその製造方法並びに用途を提供する。【解決手段】耐熱性に優れる嫌気性好熱菌であるサーモアナエロバクター・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ）ＡＴＣＣ３５０４７に由来するβ−ホスホグルコムターゼ組換え酵素を精製し性質を調べたところ、６５℃においても酵素反応が可能な優れた耐熱性を有することを見出した。従来の酵素と比べて、より高い温度で利用できるので、少ない酵素量で長時間の反応が可能となり、反応液の雑菌汚染の懸念も少ない。当該酵素をコードするＤＮＡ、当該酵素の製造方法とこれを用いたオリゴ糖の製造方法を提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するβ−ホスホグルコムターゼ。
（１）作用
Ｄ−グルコース−６−リン酸をβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸に変換し、β−Ｄ−グルコース−１−リン酸をＤ−グルコース−６−リン酸に変換する；
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、２５，０００±５，０００ダルトン；
（３）至適温度
１０ｍＭのＭｇ２＋イオン存在下、ｐＨ６．５、３０分間反応の条件下で６５℃；
（４）至適ｐＨ
１０ｍＭのＭｇ２＋イオン存在下、５５℃、３０分間反応の条件下でｐＨ６．５；
（４）温度安定性
１０ｍＭのＭｇ２＋イオン存在下、ｐＨ６．５、３０分間保持する条件下で６０℃まで安定；
（５）ｐＨ安定性
１０ｍＭのＭｇ２＋イオン存在下、３７℃、２４時間保持する条件下でｐＨ４．５乃至９．０の範囲で安定；及び
（６）金属イオンによる活性化
Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋イオンにより活性化される；
【請求項２】
配列表における配列番号１に記載のアミノ酸配列か、当該アミノ酸配列において１個以上１０個未満のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する請求項１記載のβ−ホスホグルコムターゼ。
【請求項３】
請求項２記載のβ−ホスホグルコムターゼをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
ＤＮＡが、配列表における配列番号２に記載の塩基配列か、遺伝暗号の縮重に基づきコードするアミノ酸配列を変えることなく配列表における配列番号２に記載の塩基配列における塩基の１個又は２個以上が他の塩基に置換した塩基配列、又は、それらの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡである請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は４記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターＤＮＡとを含んでなる組換えＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５記載の組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項７】
請求項１又は２記載のβ−ホスホグルコムターゼ産生能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物から産生したβ−ホスホグルコムターゼを採取することを特徴とするβ−ホスホグルコムターゼの製造方法。
【請求項８】
微生物が、請求項６記載の形質転換体である請求項７記載のβ−ホスホグルコムターゼの製造方法。
【請求項９】
下記の工程を含んでなるオリゴ糖の製造方法。
（１）請求項１又は２記載のβ−ホスホグルコムターゼをＤ−グルコース−６−リン酸に作用させてβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸に変換する工程；
（２）得られるβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸を二糖類ホスホリラーゼの共存下でグルコースと反応させオリゴ糖を生成させる工程；及び
（３）得られるオリゴ糖を採取する工程；
【請求項１０】
二糖類ホスホリラーゼが、トレハロースホスホリラーゼ又はコージビオースホスホリラーゼである請求項９記載のオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−ホスホグルコムターゼ、当該酵素をコードするＤＮＡ、当該酵素の製造方法及び当該酵素を用いたオリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マルトース、トレハロース、コージビオースなどのオリゴ糖とその機能が注目され、これらオリゴ糖の多様な製造方法が各方面から広く検討されている。これらオリゴ糖を製造する方法として、従来、マルトースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ（例えば、特許文献１を参照）、スクロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼ、コージビオースホスホリラーゼ（例えば、特許文献２を参照）など種々の二糖類ホスホリラーゼの合成反応を利用する方法が知られている。しかしながら、二糖類ホスホリラーゼを利用するオリゴ糖の合成において、基質となるα−Ｄ−グルコース−１−リン酸又はβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸（以下、本明細書では「β−Ｄ−グルコース−１−リン酸」を「β−Ｇ１Ｐ」と略称する。）をどのように供給するかその手段が課題となっている。
【０００３】
一方、Ｄ−グルコース−６−リン酸（以下、本明細書では「Ｇ６Ｐ」と略称する。）をβ−Ｇ１Ｐに変換する酵素としてβ−ホスホグルコムターゼ（ＥＣ  ５．４．２．６、以下、本明細書では「β−ＰＧＭ」と略称する。）が知られている。β−ＰＧＭの給源としてはラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）などの微生物が知られている（非特許文献１を参照）ものの、β−ＰＧＭの酵素的特性は詳細に調べられておらず、また、耐熱性が低いという問題点がある。例えば、ラクトコッカス・ラクチス由来のβ−ＰＧＭの反応至適温度は４５℃、温度安定性は４０℃までである。酵素の耐熱性は、酵素反応を実用化する際、極めて重要な因子であり、耐熱性に優れる酵素は、少量の酵素量で長時間反応できるため、酵素反応における酵素量が低減でき経済的に有利である。また、工業的な利用を考慮すると、雑菌汚染を防止するため５５℃以上、望ましくは、６０℃以上で反応を行うことが好ましい。このような観点から、耐熱性に優れるβ−ＰＧＭが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−３０４８８１号公報
【特許文献２】特開平１０−３０４８８２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】キアン（Ｑｉａｎ）ら、ミクロバイオロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），１４３巻、８５５乃至８６５頁（１９９７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、耐熱性に優れるβ−ＰＧＭとその製造方法並びに用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決するために耐熱性に優れるβ−ＰＧＭを求めて、その酵素を産生する微生物を広く検索した。その過程において、嫌気性好熱菌であるサーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物サーモアナエロバクター・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ）  ＡＴＣＣ３５０４７の菌体破砕抽出液にβ−ＰＧＭ活性の存在を認めたものの、当該酵素活性は非常に微弱であり、単離・精製するに十分な酵素量は得られなかった。そこで、サーモアナエロバクター属微生物のゲノムＤＮＡに認められたβ−ＰＧＭ遺伝子と推定されるＤＮＡに相当するＤＮＡをサーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７よりクローニングし、これを含む組換えＤＮＡで大腸菌を形質転換し、培養して組換え酵素を調製した。この組換え酵素を精製し性質を調べたところ、６５℃においても酵素反応が可能な優れた耐熱性を有するβ−ＰＧＭであることを見出した。このβ−ＰＧＭは従来のβ−ＰＧＭと比べて、より高い温度で利用できるので、少ない酵素量で長時間の反応が可能で反応液の雑菌汚染の懸念も少ないと考えられた。さらに、本β−ＰＧＭをサーモアナエロバクター属由来のトレハロースホスホリラーゼ又はコージビオースホスホリラーゼと組み合わせれば、Ｇ６Ｐとグルコースとを基質としてトレハロースやコージオリゴ糖などのオリゴ糖が効率よく製造できることを見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、耐熱性に優れるβ−ＰＧＭと、当該酵素コードするＤＮＡ、当該酵素の製造方法とこれを用いたオリゴ糖の製造方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のβ−ＰＧＭは、組換え微生物における大量発現が可能で、耐熱性が高く精製も容易である。また、本発明のβ−ＰＧＭは、耐熱性が高いためβ−Ｇ１ＰとＧ６Ｐの変換反応を工業的レベルで利用する上で有利に用いることができる。さらには、同等の耐熱性を有するトレハロースホスホリラーゼやコージビオースホスホリラーゼなどの二糖類ホスホリラーゼと組み合わせることにより、グルコースとＧ６Ｐとを基質としてトレハロースやコージオリゴ糖などのオリゴ糖を効率よく製造することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
β−ＰＧＭは、β−Ｇ１ＰとＧ６Ｐの相互変換を触媒する酵素である。本発明のβ−ＰＧＭとは、具体的には下記の理化学的性質を有する酵素を意味する。
（１）作用
Ｇ６Ｐをβ−Ｇ１Ｐに変換し、β−Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換する；
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、２５，０００±５，０００ダルトン；
（３）至適温度
１０ｍＭのＭｇ２＋イオン存在下、ｐＨ６．５、３０分間反応の条件下で６５℃；
（４）至適ｐＨ
１０ｍＭのＭｇ２＋イオン存在下、５５℃、３０分間反応の条件下でｐＨ６．５；
（４）温度安定性
１０ｍＭのＭｇ２＋イオン存在下、ｐＨ６．５、３０分間保持する条件下で６０℃まで安定；
（５）ｐＨ安定性
１０ｍＭのＭｇ２＋イオン存在下、３７℃、２４時間保持する条件下でｐＨ４．５乃至９．０の範囲で安定；
（６）金属イオンによる活性化
Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋イオンにより活性化される；
【００１１】
本発明のβ−ＰＧＭの活性は、本明細書を通じて以下のようにして測定した。反応液における終濃度としてβ−Ｇ１Ｐを２ｍＭ、ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を３０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１０ｍＭとなるよう調製した基質溶液７５０μｌに酵素液５０μｌを加えて８００μｌの反応液とし、５５℃で３０分間反応を行った後、沸騰湯浴中で１０分間加熱し反応を停止させる。この反応停止液に含まれるＧ６Ｐを定量するため、２ｍＭのＮＡＤＰ（ロシュ社販売）と１．２５単位のＧ６Ｐデヒドロゲナーゼ（ロシュ社販売）とを含む０．５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２００μｌ加えて、３０℃で３０分間反応を行う。この反応液の３４０ｎｍの吸光度を測定し、生じたＮＡＤＰＨを定量することにより反応停止液中のＧ６Ｐを定量する。本β−ＰＧＭの活性１単位は、上記条件下で１分間に１μｍｏｌのβ−Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換する酵素量と定義する。
【００１２】
本発明のβ−ＰＧＭは、通常、特定のアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列としては、β−Ｇ１ＰとＧ６Ｐの相互変換を触媒するという酵素活性を変えることなく、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列において１個以上１０個未満のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列が挙げられる。
【００１３】
本発明のＤＮＡとは、上記の配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列を有するβ−ＰＧＭをコードするものを意味する。本発明のＤＮＡは、当該β−ＰＧＭをコードするものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７を含むサーモアナエロバクター属の微生物が挙げられ、これらの菌体から本発明のＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、嫌気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的のゲノムＤＮＡが得られる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
【００１４】
本発明のＤＮＡは、通常、特定の塩基配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号２で示される塩基配列又はそれに相同的な塩基配列、又はそれらの塩基配列に相補的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号２で示される塩基配列に相同的な塩基配列としては、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列番号３で示される塩基配列において１個以上３０個未満の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列、さらには、配列表における配列番号２で示される塩基配列において、遺伝暗号の縮重に基づき、コードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換した塩基配列が挙げられる。
【００１５】
本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜のベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ  ＳＫ＋、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ  ＳＫ＋、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子ＤＮＡ及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ  ３ＡＩ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｂａｍ  ＨＩ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００１６】
このようにして得られる組換えＤＮＡを、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などの適宜の宿主微生物に導入することにより形質転換体を得ることができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養して粗酵素を調製し、β−Ｇ１ＰとＧ６Ｐの相互変換を触媒するものを選択すればよい。
【００１７】
本発明のβ−ＰＧＭ産生能を有する微生物（形質転換体を含む）の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、β−ＰＧＭを産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、澱粉の部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
【００１８】
培養には、本発明のβ−ＰＧＭ産生能を有する微生物が良好に生育する条件を適宜選択して用いればよい。例えば、サーモアナエロバクター属の微生物を用いる場合、培養は、通常、温度５０乃至８０℃、好ましくは、６０乃至７０℃、ｐＨ５乃至８、好ましくは、ｐＨ６．５乃至７．５の範囲から選ばれる条件で嫌気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０乃至６０時間である。また、微生物が形質転換体である場合、培養条件はその宿主微生物の種類によって異なるものの、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至５０℃、ｐＨ２乃至９の範囲から選ばれる条件で、通気攪拌する好気的な条件下で１０時間乃至１５０時間とすればよい。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【００１９】
このようにして微生物を培養した後、本発明の酵素を含む培養物を回収する。本発明のβ−ＰＧＭ活性は、主に菌体内に認められ、菌体を粗酵素として採取することも、菌体破砕抽出液を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を回収するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。菌体破砕抽出液は、そのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
【００２０】
本発明のβ−ＰＧＭが組換え酵素である場合には、宿主の種類によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又は菌体破砕物から分離して用いることも有利に実施できる。
【００２１】
上記のように本発明のβ−ＰＧＭは、菌体破砕抽出液などの粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、公知の方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。また、本発明のβ−ＰＧＭが形質転換体を培養して得た組換え型酵素の場合、宿主由来の蛋白質よりも耐熱性に優れる点を利用して、菌体破砕抽出液を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を、約６０℃で一定時間熱処理することにより夾雑する他の蛋白質を熱変性させ、変性により沈澱する蛋白質を遠心分離などで除去することにより精製することができる。さらに、熱処理して得られる部分精製酵素標品を透析後、『リソース（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）  Ｑ』カラムなどを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、『スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５』カラムなどを用いたゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明のβ−ＰＧＭを電気泳動的に単一な酵素として得ることができる。
【００２２】
更に、β−ＰＧＭ活性を有する菌体破砕抽出液、濃縮液又は精製した酵素液を用いて、本発明のβ−ＰＧＭを公知の方法により固定化酵素とすることもできる。酵素の固定化方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
【００２３】
本発明のβ−ＰＧＭの基質としてはＧ６Ｐ又はβ−Ｇ１Ｐが用いられる。本酵素はＧ６Ｐとβ−Ｇ１Ｐの相互変換を触媒する酵素であるため、Ｇ６Ｐを基質とした場合にはβ−Ｇ１Ｐを、β−Ｇ１Ｐを基質とした場合にはＧ６Ｐをそれぞれ生成する。本発明のβ−ＰＧＭを基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．１％（ｗ／ｖ）の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明のβ−ＰＧＭの反応は進行してＧ６Ｐからはβ−Ｇ１Ｐを、また、β−Ｇ１ＰからＧ６Ｐを生成する。工業的には、基質濃度１％（ｗ／ｖ）以上が好適であり、この条件下で、Ｇ６Ｐ又はβ−Ｇ１Ｐを有利に生成できる。反応温度は反応が進行する温度、即ち７０℃付近までで行えばよい。好ましくは５０乃至６５℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、５．０乃至８．０の範囲、好ましくはｐＨ６．０乃至７．０の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、酵素の使用量と反応時間は目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。
【００２４】
本発明のβ−ＰＧＭは、β−Ｇ１Ｐを基質として消費する他の酵素、例えば、トレハロースホスホリラーゼ、コージビオースホスホリラーゼなどの二糖類ホスホリラーゼと組み合わせて作用させると、Ｇ６Ｐが効率よくβ−Ｇ１Ｐに変換されるので、Ｇ６Ｐとグルコースとから効率良くトレハロース又はコージオリゴ糖などのオリゴ糖を製造することができる。また、この反応系に、さらに、ＡＴＰとグルコースとからＧ６Ｐを生成するＡＴＰグルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．２）やポリリン酸とグルコースとからＧ６Ｐを生成するポリリン酸グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．６３）などのグルコキナーゼを組み合わせれば、グルコースを原料として上記のオリゴ糖を製造することが可能となる。
【００２５】
上記の反応系によって得られたオリゴ糖含有糖液は、必要に応じて、目的のオリゴ糖が非還元性である場合には、水素添加して反応液中に残存する還元性糖質を糖アルコールに変換して還元力を消滅せしめるなどの更なる加工処理を施すことも随意である。オリゴ糖の精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、目的のオリゴ糖を利用せず夾雑糖質を資化、分解する微生物、例えば酵母などによる発酵処理や、目的のオリゴ糖が非還元性である場合には、アルカリ処理などにより残存している還元性糖質を分解除去するなどの１種または２種以上の精製方法が適宜採用できる。
【００２６】
とりわけ、オリゴ糖の工業的な精製方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去し、目的オリゴ糖含量を向上させた糖組成物を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００２７】
以下、実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００２８】
＜実験１：β−ＰＧＭをコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製＞
β−ＰＧＭをコードするＤＮＡをサーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定及び形質転換体の調製を行った。
【００２９】
＜実験１−１：ゲノムＤＮＡの調製＞
本願と同じ出願人による特開平１０−３０４８８２号公報の実施例Ａ−２に記載の方法に従い、サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７株のゲノムＤＮＡを調製した。
【００３０】
＜実験１−２：β−ＰＧＭをコードするＤＮＡのクローニング及び塩基配列の決定＞
非特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス由来β−ＰＧＭのアミノ酸配列に基づき、サーモアナエロバクター属微生物に由来し、且つ、同アミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有する蛋白質を、データベース『ＧｅｎＢａｎｋ』を対象に検索したところ、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）  ＭＢ４のゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＣ  ００３８６９）において、推定ホスホヘキソムターゼをコードするＤＮＡが認められた。なお、当該推定ホスホヘキソムターゼは配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列を有しており、配列表における配列番号４で示される塩基配列を有するＤＮＡにコードされていた。サーモアナエロバクター・ブロッキイＡＴＣＣ３５０４７のβ−ＰＧＭのアミノ酸配列は、上記サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス  ＭＢ４の推定ホスホヘキソムターゼのアミノ酸配列と全域にわたって相同性が高いと仮定し、サーモアナエロバクター・ブロッキイＡＴＣＣ３５０４７由来のβ−ＰＧＭをコードするＤＮＡのクローニングを試みた。
【００３１】
配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列（サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス  ＭＢ４由来推定ホスホヘキソムターゼ）の第１２乃至第１８番目のアミノ酸配列に基づき、センスプライマーとして配列表における配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、同第１８３乃至第１８９番目のアミノ酸配列に基づき、アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。これらのプライマーを用い、実験１−１で得たゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ−プラス−ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社販売）をＰＣＲ酵素として、ＤＮＡ  サーマルサイクラー  ＰＪ２０００（パーキン・エルマー社製造）を用いて常法によりＰＣＲ増幅を行ったところ、約５００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ  ＳＫ＋（ストラタジーン社製）の制限酵素Ｓｒｆ  Ｉサイトにクローニングし、得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄを形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製して調べたところ、目的とする約５００ｂｐのＤＮＡ断片を有していた。その組換えプラスミドを「ｐＣＲ−ｉｎｔｅｒＰＧＭ」と命名した。
【００３２】
組換えプラスミドｐＣＲ−ｉｎｔｅｒＰＧＭが有する約５００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を、通常のジデオキシ法により解読したところ、鎖長５０７ｂｐであり、当該ＤＮＡ断片の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、前記サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス  ＭＢ４の推定ホスホヘキソムターゼの部分アミノ酸配列（配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列）と約９５％の高い相同性を有していた。この結果から、得られたＤＮＡ断片はβ−ＰＧＭをコードするＤＮＡの一部と推察された。
【００３３】
上記のβ−ＰＧＭをコードするＤＮＡの一部と推察されたＤＮＡ断片が制限酵素Ｍｓｐ  Ｉにて切断されないことを予め確認した後、実験１−１で得たゲノムＤＮＡを制限酵素Ｍｓｐ  Ｉにて消化し、消化物をセルフライゲーションさせて環状化ゲノムを得た。β−ＰＧＭをコードするＤＮＡの一部と推定されたＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列表における配列番号７及び８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして合成し、上記環状化ゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、約４，５００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が得られた。
【００３４】
得られた約４，５００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を、直接、常法のジデオキシ法により解読したところ、目的遺伝子の５'末端側は解読できたものの３'末端側が解読できなかった。そこで、ゲノムＤＮＡを、解読できたβ−ＰＧＭ遺伝子領域内に認識部位が１箇所存在する制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断した後、セルフライゲーションさせて得た環状化ゲノムを鋳型として、再度、配列表における配列番号７及び８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしてＰＣＲ増幅を行い約１５００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡの塩基配列を、常法のジデオキシ法により解読し、上記で解読したものと合わせてサーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７のβ−ＰＧＭをコードするＤＮＡの塩基配列及びこれにコードされるβ−ＰＧＭのアミノ酸配列を決定した。その結果、サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７のβ−ＰＧＭは、配列表における配列番号１で示される２１５残基のアミノ酸配列からなり、且つ、当該酵素をコードするＤＮＡは、配列表における配列番号２で示される鎖長６４５ｂｐの塩基配列を有することが判明した。なお、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列から算出される分子量は２４，３６３ダルトンであった。
【００３５】
＜実験１−３：β−ＰＧＭをコードするＤＮＡの再クローニングと塩基配列の再確認＞
実験１−２で決定したβ−ＰＧＭをコードするＤＮＡの塩基配列を確定させる目的で、当該塩基配列における翻訳開始コドン及び終始コドンを含むプライマー、すなわち、配列表における配列番号９及び１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それぞれをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いて、実験１−１で得たゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、β−ＰＧＭの全域をコードするＤＮＡの再クローニングを行い、組換えＤＮＡ、ｐＣＲ−ＰＧＭを得た。ｐＣＲ−ＰＧＭに含まれるＤＮＡの塩基配列を常法のジデオキシ法により決定したところ、実験１−２で決定した配列表における配列番号２で示される塩基配列と全く同一の塩基配列を含んでいた。
【００３６】
次いで、上記で再クローン化したβ−ＰＧＭの全域をコードするＤＮＡを発現用ベクターに組込む目的で、当該ＤＮＡの上流に制限酵素Ｎｄｅ  Ｉ認識部位を導入し、下流に制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ認識部位を導入し、また、終止コドンが本来のＴＡＧからＴＡＡに変わるよう設計したプライマー、すなわち、配列表における配列番号１１及び１２でそれぞれ示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それぞれをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用い、実験１−１で得たゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ  ＳＫ＋（ストラタジーン社製）の制限酵素Ｎｄｅ  Ｉ−Ｅｃｏ  ＲＩサイトにクローニングし、得られた組換えＤＮＡをｐＣＲ−ＴｂＰＧＭと命名した。
【００３７】
＜実験２：発現用組換えＤＮＡ、ｐＲＳＥＴ−ＴｂＰＧＭ−２と形質転換体の調製＞
組換えＤＮＡ、ｐＣＲ−ＴｂＰＧＭ中のβ−ＰＧＭをコードするＤＮＡを発現用ベクターに挿入し、得られた発現用組換えＤＮＡを大腸菌に導入し形質転換体を調製した。
【００３８】
実験１−３で得たβ−ＰＧＭをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ、ｐＣＲ−ＴｂＰＧＭを制限酵素Ｎｄｅ  Ｉ及びＥｃｏ  ＲＩにより消化し、７０℃で３０分間熱処理して制限酵素を失活させた。この消化物を用いて、予め制限酵素Ｎｄｅ  Ｉ及びＥｃｏ  ＲＩで消化した発現ベクター、ｐＲＳＥＴ  Ａ（インビトロジェン株式会社販売）に市販のキット（商品名「Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１、宝酒造製）を用いて挿入した。この反応物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（東洋紡製）を形質転換し、目的とする組換えＤＮＡを保持する形質転換体を選択し、この形質転換体から組換えＤＮＡを単離して『ｐＲＳＥＴ−ＴｂＰＧＭ−２』と命名した。次いで、ｐＲＳＥＴ−ＴｂＰＧＭ−２を用いて宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換して形質転換体『ＲＳＥＴ−ＴｂＰＧＭ−２』を調製した。
【００３９】
＜実験３：形質転換体の培養と組換え型β−ＰＧＭの精製＞
実験２で得た形質転換体ＲＳＥＴ−ＴｂＰＧＭ−２を、５００ｍｌ容の三角フラスコに入った１００ｍｌのＬＢ培地（トリプトン  １％、酵母エキス  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．２％、ｐＨ７．５、アンピシリン  ７０μｇ／ｍｌ含有）に植菌し、２７℃で２４時間培養した。合計３Ｌの培養液から遠心分離により、湿菌体３５．９ｇを回収し、この菌体を３００ｍｌの２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．５、ＮａＣｌを２０ｍＭ、ＤＴＴを１ｍＭ含有）に懸濁し、超音波処理して菌体を破砕し、さらに遠心分離により不溶物を除去し、菌体破砕抽出液３４０ｍｌを採取した。この菌体破砕抽出液の３３％〜８０％硫安飽和塩析画分を回収し、２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対して透析した後、６０℃で１５分間熱処理を行い、生じた変性蛋白質を遠心分離で除き、熱処理液上清を回収した。
【００４０】
得られた熱処理液上清を用いて各種クロマトグラフィーにより精製を行った。まず、陰イオン交換カラム（商品名「リソース  Ｑ」、６ｍｌ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。熱処理液上清８ｍｌを３０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したカラムにチャージし、０Ｍから０．５ＭまでのＮａＣｌリニアグラジエントにより溶出させたところ、酵素活性画分はＮａＣｌ濃度約０．０１〜０．０５Ｍで溶出した。クロマトグラムを図１に示す。次いで、回収した活性画分を限外濾過膜（商品名「アミコンウルトラ」、分画分子量５，０００ダルトン、ミリポア社販売）にて膜濃縮し、スーパーデックス７５カラム（２６ｍｍ×６０ｃｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供した。膜濃縮酵素液４ｍｌを０．２ＭのＮａＣｌを含有する３０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したカラムにチャージして同緩衝液で溶出を行った。このゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、酵素活性は分子量２５，０００ダルトンと５１，０００ダルトンに相当する位置に溶出し、両画分を精製酵素標品としてそれぞれ回収した。組換え型β−ＰＧＭの精製のまとめを表１に示す。
【００４１】
【表１】
2010148502.tif 000002
【００４２】
ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて分子量２５，０００ダルトンを示す酵素画分と５１，０００ダルトンを示す酵素画分は、いずれも電気泳動的に単一にまで精製されており、後述するように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいていずれも２５，０００±５，０００ダルトンの分子量を示した。また、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて分子量２５，０００ダルトンを示す酵素画分を再度ゲル濾過クロマトグラフィーに供したところ、再度、分子量２５，０００ダルトンを示すピークと５１，０００ダルトンを示すピークとに分離した（図２を参照）ことから、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて分子量２５，０００ダルトンを示す酵素画分は単量体酵素、５１，０００ダルトンを示す酵素画分は二量体酵素と考えられた。比活性において両酵素画分に差はほとんどなく、それぞれ１５９単位／ｍｇ−蛋白及び１５６単位／ｍｇ−蛋白であった。両酵素画分をβ−ＰＧＭ精製標品として別々に回収した。精製における収率は両画分合わせて７９％であった。
【００４３】
＜実験４：サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来β−ＰＧＭの諸性質＞
【００４４】
＜実験４−１：分子量＞
実験３の方法で得た単量体酵素及び二量体酵素と考えられるβ−ＰＧＭ精製標品をそれぞれ５乃至２０％（ｗ／ｖ）グラジエントゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、いずれも分子量は２５，０００±５，０００ダルトンであった。この値は当該酵素のアミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）から算出される分子量２４，３６３とよく一致するものであった。
【００４５】
＜実験４−２：至適温度及び至適ｐＨ＞
実験３の方法で得たβ−ＰＧＭ精製標品のうち、単量体酵素を用いて、β−ＰＧＭ活性に及ぼす温度及びｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図３（至適温度）及び図４（至適ｐＨ）に示した。β−ＰＧＭの至適温度はｐＨ６．５、３０分間反応、１０ｍＭ  Ｍｇ２＋イオン存在下で６５℃であった。至適ｐＨは、４５℃、３０分間反応、１０ｍＭ  Ｍｇ２＋イオン存在下でｐＨ６．５であった。なお、二量体酵素についても同様に調べたところ、単量体酵素と同じであった。
【００４６】
＜実験４−３：温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験３の方法で得たβ−ＰＧＭ精製標品のうち、単量体酵素を用いて、β−ＰＧＭの温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する３０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、酵素溶液を各温度に３０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、酵素を１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する各ｐＨの２５ｍＭ緩衝液中で３７℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．５に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図５（温度安定性）及び図６（ｐＨ安定性）に示した。図５から明らかなように、本酵素は６０℃まで安定であった。また、図６から明らかなように、本酵素は、少なくともｐＨ４．５乃至９．０の範囲で安定であった。なお、二量体酵素についても同様に調べたところ、単量体酵素と同じであった。
【００４７】
＜実験４−４：酵素活性に及ぼす金属イオンの影響＞
実験３の方法で得たβ−ＰＧＭ精製標品のうち、単量体酵素を用いて、酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を調べた。活性測定に用いる基質溶液から１０ｍＭのＭｇＣｌ２を除いた基質溶液を用い、濃度を変えた各種金属塩存在下で活性測定した結果を表２に示す。なお、β−ＰＧＭの活性は活性測定条件と同じ１０ｍＭ  Ｍｇ２＋イオン存在下での活性を１００とした場合の相対活性で表した。
【００４８】
【表２】
2010148502.tif 000003
【００４９】
表２に示すように、本β−ＰＧＭはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋又はＣｏ２＋イオンによって活性化されることが判明した。なお、二量体酵素についても同様に調べたところ、単量体酵素と同じであった。
【００５０】
＜実験５：β−ＰＧＭ反応の平衡点＞
β−ＰＧＭが触媒するβ−Ｇ１ＰとＧ６Ｐの相互変換反応の平衡点を調べる実験を以下のとおり行った。５．３ｍＭ  β−Ｇ１Ｐ（オリエンタル酵母社販売）、２６．３ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、４．２７ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む基質溶液９５０μｌに実験３の方法で得たβ−ＰＧＭの単量体酵素５０μｌ（１．９５単位）を加えて５５℃で反応を行い、反応液を経時的にサンプリングし、沸騰湯浴中で１０分間加熱し反応停止した後、分析に供した。また、β−Ｇ１Ｐに変えてＧ６Ｐ（オリエンタル酵母社販売）を用いた以外は同様に処理して分析を行った。なお、反応液中のβ−Ｇ１Ｐ及びＧ６Ｐの定量は、ＨＰＡＥ−ＰＡＤ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ−Ｐｕｌｓｅｄ  Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法により下記の測定条件にて行った。
＜ＨＰＡＥ−ＰＡＤ条件＞
カラム：ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１（４ｘ２５０ｍｍ、日本ダイオネクス社販売）
カラム温度：４０℃
溶離液Ａ：１００ｍＭ  水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１１．６）
溶離液Ｂ：１Ｍ  酢酸ナトリウムを含有する１００ｍＭ  水酸化ナトリウム水溶液
溶離液の容量比：溶離液Ａ  ９：溶離液Ｂ  １（０〜２０分）
溶離液Ａ  ８：溶離液Ｂ  ２（２０〜３０分）
溶離液Ａ  ５：溶離液Ｂ  ５（３０〜４０分）
流  速：１ｍｌ／分
検  出：パルスドアンペロメトリー検出器  ＥＤ４０（日本ダイオネクス社製）
【００５１】
図７にβ−Ｇ１Ｐを基質にしたときのＧ６Ｐ生成の経時変化を、図８にＧ６Ｐを基質にしたときのβ−Ｇ１Ｐ生成の経時変化を示す。図７及び図８において、符号●はＧ６Ｐを、符号□はβ−Ｇ１Ｐをそれぞれ示している。図７から明らかなように、本β−ＰＧＭはβ−Ｇ１Ｐに作用させると速やかにＧ６Ｐに変換した（図７における符号●）。一方、図８から明らかなように、本β−ＰＧＭはＧ６Ｐに作用させるとわずかにβ−Ｇ１Ｐに変換した（図８における符号□）。いずれの反応の場合にも、反応約２時間でβ−Ｇ１ＰとＧ６Ｐの比率は約５：９５でほぼ平衡となった。本β−ＰＧＭは、５５℃と高い反応温度においてもβ−Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換し、Ｇ６Ｐをβ−Ｇ１Ｐに変換する可逆反応を触媒することが確認された。
【００５２】
ここまでの実験で得られたサーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来β−ＰＧＭの理化学的性質を、公知のラクトコッカス・ラクチス由来のβ−ＰＧＭ（非特許文献１より抜粋）の理化学的性質とともに表３にまとめた。
【００５３】
【表３】
2010148502.tif 000004
【００５４】
表３から明らかなように、サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来β−ＰＧＭは、公知のラクトコッカス・ラクチス由来のβ−ＰＧＭと比較して、至適温度及び温度安定性が２０℃程度高く、耐熱性に優れる酵素であった。
【００５５】
＜実験６：β−ＰＧＭとトレハロースホスホリラーゼを組み合わせたグルコースとＧ６Ｐとからのトレハロースの調製＞
β−ＰＧＭと、同じくサーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来のトレハロースホスホリラーゼとを組み合わせて、グルコースとＧ６Ｐとを基質としてトレハロースを酵素合成する系の構築を試みた。なお、β−ＰＧＭは実験３の方法で得た単量体酵素を、サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来のトレハロースホスホリラーゼは、本願と同じ出願人による特開平１０−３０４８８１号公報の実施例Ａ−４に記載された方法で調製し、同公報記載の方法で活性測定した組換え型トレハロースホスホリラーゼの精製標品を用いた。
【００５６】
反応液の終濃度でＧ６Ｐ（オリエンタル酵母社販売）を１０ｍＭ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１０ｍＭとし、グルコースの濃度を２，４，８，１４及び３０ｍＭと変えて調製した基質溶液８００μｌに、０．１３単位のトレハロースホスホリラーゼと４．２８単位のβ−ＰＧＭを加えて１ｍｌとし、ｐＨ６．２、５５℃で反応を行った。反応時間は反応が平衡に達するに十分な２４時間とした。反応を停止させた後、実験５で用いたＨＰＡＥ−ＰＡＤ法により反応液中のグルコース、Ｇ６Ｐ、β−Ｇ１Ｐ、及びトレハロースの定量を行った。結果を表４に示す。
【００５７】
【表４】
2010148502.tif 000005
【００５８】
表４から明らかなように、Ｇ６Ｐの濃度を１０ｍＭに固定し、グルコース濃度を変化させた場合、グルコース濃度が高いほどトレハロースの生成量は増加した。一方、反応液中のトレハロースの割合が最大に達したのは、１４ｍＭのグルコースと１０ｍＭのＧ６Ｐに酵素を作用させた場合であり、そのときのトレハロース濃度は５．５ｍＭ（固形物当たり４０．２質量％）であった。Ｇ６Ｐからβ−ＰＧＭにより生成するβ−Ｇ１Ｐは速やかにトレハロースホスホリラーゼによってグルコースとβ−Ｇ１Ｐからのトレハロース合成に利用されるため、反応液のβ−Ｇ１Ｐ濃度は低い値を維持した。
【００５９】
＜実験７：β−ＰＧＭとコージビオースホスホリラーゼを組み合わせたグルコースとＧ６Ｐとからのコージオリゴ糖の調製＞
β−ＰＧＭと、同じくサーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来のコージビオースホスホリラーゼとを組み合わせて、グルコースとＧ６Ｐとを基質としてコージオリゴ糖を酵素合成する系の構築を試みた。なお、β−ＰＧＭは実験３で得た単量体酵素を、サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来のコージビオースホスホリラーゼは本願と同じ出願人による特開平１０−３０４８８２号公報の実施例Ａ−４に記載された方法で調製し、同公報記載の方法で活性測定した組換え型コージビオースホスホリラーゼの精製標品を用いた。
【００６０】
反応液の終濃度でＧ６Ｐ（オリエンタル酵母社販売）を４０ｍＭ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）を１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１０ｍＭとし、グルコースの濃度を８，１６，３２，４８及び１２０ｍＭと変えて調製した基質溶液に、１グラムのＧ６Ｐ当たり６５．５単位のコージビオースホスホリラーゼと６００単位のβ−ＰＧＭを加えて、ｐＨ６．０、５５℃で反応を行った。反応時間は反応が平衡に達するに十分な７２時間とした。反応を停止させた後、実験５で用いたＨＰＡＥ−ＰＡＤ法によりグルコース、β−Ｇ１Ｐ及びＧ６Ｐ定量を行った。また、コージオリゴ糖とグルコースの定量は下記ＨＰＬＣ条件にて行い、ＨＰＬＣ法で求めたグルコース濃度とＨＰＡＥ−ＰＡＤ法により求めたグルコース濃度をもとに、ＨＰＬＣ法におけるコージオリゴ糖量を計算した。結果を表５に示す。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＭＣＩｇｅｌ  ＣＫ０４ＳＳ（株式会社三菱化学製造）  ２本
（カラム２本を直列に連結）
溶離液：精製水
流速：０．４ｍｌ／分
カラム温度：８０℃
検出：示差屈折計
【００６１】
【表５】
2010148502.tif 000006
【００６２】
表５から明らかなように、Ｇ６Ｐの濃度を４０ｍＭに固定し、グルコース濃度を変化させた場合、グルコース濃度が高いほどコージビオース、コージトリオースなどコージオリゴ糖の総生成量は増加した。一方、反応液中のコージオリゴ糖の割合が最大に達したのは、４８ｍＭのグルコースと４０ｍＭのＧ６Ｐに酵素を作用させた場合であり、そのときのコージビオース、コージトリオース、コージテトラオース及びコージペンタオースの濃度はそれぞれ１１．０ｍＭ、５．７ｍＭ、１．０ｍＭ及び０．３ｍＭとなり、コージオリゴ糖は固形物当たり４４．６質量％に達した。実験６の場合と同様に、Ｇ６Ｐからβ−ＰＧＭにより生成するβ−Ｇ１Ｐは速やかにコージビオースホスホリラーゼによってグルコースとβ−Ｇ１Ｐからのコージオリゴ糖の合成に利用されるため、反応液のβ−Ｇ１Ｐ濃度は低い値を維持した。
【００６３】
以上の実験結果は、β−ＰＧＭ産生能を有する好熱性微生物から当該酵素をコードするＤＮＡをクローニングし、組換えＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換体とし、その形質転換体を培養し、酵素を生産させ採取することによって得たβ−ＰＧＭは耐熱性に優れており、このβ−ＰＧＭを他の二糖類ホスホリラーゼと組み合わせて用いれば、グルコースとＧ６Ｐとから各種のオリゴ糖を調製できることを示している。
【００６４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００６５】
＜β−ＰＧＭの調製＞
サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７を、特開平１０−３０４８８２号公報の実験１に記載された培地に接種し、嫌気ファーメンターにて温度６５℃で約５０時間培養した。培養液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕し、破砕液上清のβ−ＰＧＭ活性を測定した。この活性を培養液１ｍｌ当たりに換算すると、０．０３単位であった。破砕液上清を限外濾過膜にて濃縮し、得られた濃縮液を透析してβ−ＰＧＭ活性を約４単位／ｍｌ有する粗酵素液をもとの培養液の総活性に対して約６５％の収率で得た。
【実施例２】
【００６６】
＜組換え型β−ＰＧＭの調製＞
実験２で得た形質転換体ＲＳＥＴ−ＴｂＰＧＭ−２を３ＬのＴ培地（培地１Ｌ当たり、バクト−トリプトン１２ｇ、バクト−イーストエキストラクト２４ｇ、グリセロール４ｍｌ、１７ｍＭ  リン酸一カリウム、７２ｍＭ  リン酸二カリウムを含有）を用いて３７℃で２４時間好気的に培養した。培養液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕し、破砕液上清を５５℃で３０分間熱処理し、宿主由来の非耐熱性蛋白質を変性、失活させた。熱処理液をさらに遠心分離して得た部分精製酵素液のβ−ＰＧＭ活性を測定し、培養液１ｍｌ当たりに換算すると約３８単位であった。
【実施例３】
【００６７】
＜グルコースとＧ６Ｐとからのトレハロースの調製＞
実験３で得た単量体酵素をβ−ＰＧＭとして用い、本願と同じ出願人による特開平１０−３０４８８１号公報の実施例Ａ−４に記載された方法で調製した組換え型トレハロースホスホリラーゼの精製標品を用いてグルコースとＧ６Ｐを基質としてトレハロースを調製した。反応液の終濃度でグルコースを１２ｍＭ、Ｇ６Ｐ（オリエンタル酵母社販売）を１０ｍＭ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１０ｍＭとなるように調製した基質溶液に、１グラムのＧ６Ｐ当たり１，６５０単位のβ−ＰＧＭと５０単位のトレハロースホスホリラーゼを加えて５５℃で２５時間反応させたところ、５．８ｍＭのトレハロースを含む反応液が得られた。反応停止後、反応液に終濃度０．１ｍＭのＣａＣｌ２を添加し、反応液中のリン酸をリン酸カルシウムとして沈澱させ遠心分離により除去した。得られたリン酸除去液に再度β−ＰＧＭとトレハロースホスホリラーゼを添加し、５５℃で１３時間反応させたところ反応液中のトレハロース濃度は７．７ｍＭに達した。反応停止の後、反応液を電気透析し、反応液中に含まれるＧ６Ｐとβ−Ｇ１Ｐを除去したところ、固形物換算でトレハロースを６２質量％、グルコースを３８質量％含有する糖液が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明のβ−ＰＧＭは、従来公知のβ−ＰＧＭに比べ耐熱性に優れるので、β−Ｇ１ＰとＧ６Ｐの相互変換反応を工業的レベルで利用する上で有利に用いることができる。また、本発明のβ−ＰＧＭを二糖類ホスホリラーゼやグルコキナーゼなどと組み合わせることにより、グルコースからより付加価値の高いオリゴ糖を酵素合成する系を構築することができる。本発明は、かくも顕著な作用効果を奏する発明であり、産業上の貢献度が誠に多大な意義ある発明である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明のβ−ＰＧＭを陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した場合のクロマトグラムである。
【図２】本発明のβ−ＰＧＭの単量体酵素をゲル濾過クロマトグラフィーに供した場合のクロマトグラムである。
【図３】本発明のβ−ＰＧＭの酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明のβ−ＰＧＭの酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図５】本発明のβ−ＰＧＭの安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図６】本発明のβ−ＰＧＭの安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図７】本発明のβ−ＰＧＭをβ−Ｇ１Ｐに作用させた場合のＧ６Ｐ生成の経時変化を示す図である。
【図８】本発明のβ−ＰＧＭをＧ６Ｐに作用させた場合のβ−Ｇ１Ｐ生成の経時変化を示す図である。
【符号の説明】
【００７０】
図１及び２において、
○：β−ＰＧＭ活性
図２において、
ａ：分子量５１，０００ダルトンを示すβ−ＰＧＭ
ｂ：分子量２５，０００ダルトンを示すβ−ＰＧＭ
図７及び８において、
□：β−Ｇ１Ｐ
●：Ｇ６Ｐ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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