(57)【要約】【目的】  多糖類の陽イオン性誘導体を使用し水中下オレフィン化合物を重合させて無界面活性剤のラテックス溶液を調整し、デオキシリボ核酸ＤＮＡ，リボ核酸ＲＮＡを細胞に送り込む非ウイルス性ベクタ−を得る。【構成】  多糖類の陽イオン性誘導体に水中下オレフィン化合物を重合させてなる重合体から成るラテックス溶液。  またこれに各種のデオキシリボ核酸ＤＮＡ，リボ核酸ＲＮＡを反応させて得られる複合体。【効果】  このような非ウイルス性ベクタ−を用いると危険性のあるウイルス類のベクタ−と異なり安全にかつ人工物である事から安定して使用される事になる。ベクタ−としての形質変換効率を高める為に細胞膜の選択性は重要である。  さらに形質変換効率を高める為には疎水親水ドメインを有する事が必要であり、具体的には陽イオン性多糖類とビニル単量体の共重合体材料からなるラテックスを形成さす事が重要である事が解った。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
2010246563.tif 000007
において、水可溶性リニア多糖類陽イオン性誘導体の単位の式が、
【化２】
2010246563.tif 000008
で表され、式中オレフィン化合物の二重結合より出発する重合体の単位の式が、
【化３】
2010246563.tif 000009
で表され、水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体を幹ポリマ−とし、オレフィンを有する化合物がグラフト鎖として成る、グラフト率が２％から５０００％の範囲の（化２）とこの（化３）よりなる、上記（化１）で表わされる、水可溶性リニア多糖類を母体とする多糖類の陽イオン性部分置換体にオレフィンを有する単量体をグラフト重合して得られる共重合体よりなる、遺伝子ベクタ−。
【請求項２】
一般式
【化１】
2010246563.tif 000010
において、水可溶性リニア多糖類陽イオン性誘導体の単位の式が、
【化２】
2010246563.tif 000011
で表され、式中オレフィン化合物の二重結合より出発する重合体の単位の式が、
【化３】
2010246563.tif 000012
で表され、水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体を幹ポリマ−とし、オレフィンを有する化合物がグラフト鎖として成る、グラフト率が２％から５０００％の範囲の（化２）とこの（化３）よりなる、上記（化１）で表わされる、水可溶性リニア多糖類を母体とする多糖類の陽イオン性部分置換体にオレフィンを有する単量体をグラフト重合して得られる共重合体よりなる、遺伝子ベクタ−の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明の水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体−オレフィンを有する単量体グラフト共重合体は水酸基を有する水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体に水中下オレフィンを有する単量体をグラフト重合させ、遺伝子組み替えベクタ−材料として有用なラテックス重合生成物を製造するものである。  本発明は水酸基を有するリニア多糖類の陽イオン性誘導体で水可溶性であれば、統べて水中下オレフィンを有する単量体をグラフト重合させ、遺伝子組み替えベクタ−材料として有用なラテックス重合生成物を製造出来る事を示唆するものである。  
【背景技術】
【０００２】
ある遺伝子(DNA、RNA)を他の生物へ移植する際にその遺伝子を運ぶ、いわば運びやが必要でありこれをベクタ−と称している。  現在ベクタ−として使用されている物は各種のウイルスであり、細菌に寄生するプラスミドや細菌に感染するファ−ジである。  これらに移植する遺伝子をつけて感染させれば細菌に遺伝子を送りこめ。  現在実用化されているベクタ−はこれらウイルスベクタ−であるが、使用するウイルス自体の形質が細胞に移植する際に組み込まれる恐れがあり、安全性に疑問が指摘されている。  一方従来イムノアッセイ材料としてラテックス重合生成物を製造されていたが、製造する方法は界面活性剤存在下水溶液中で乳化重合して成された物が大部分であり、界面活性剤の存在しないソ−プレスの物が望まれている。  これは水溶液中に存在する界面活性剤がラテックス診断薬としての作用に影響するからである。  この為に問題点を解決するための手段として水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体−オレフィンを有する単量体グラフト共重合体は水酸基を有する水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体に水中下オレフィンを有する単量体をレドックス開始剤などでグラフト重合させ、イムノアッセイ材料として有用なソ−プレスのラテックス重合生成物として製造される。  すでにこのソ−プレスの水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体−オレフィンを有する単量体グラフト共重合体ラテックスおよびラテックス診断薬の特許が成立している。  これは抗体吸着ラテックス診断薬に使用されている。  乳化重合とは水溶液中にオレフィン単量体を懸濁し通常は界面活性剤などを用いて乳化される重合法で、詳細に述べれば単量体あるいは成長鎖と水素結合、ク−ロン力、電荷移動相互作用、ファンデルワ−ルス力などによって水溶媒界面で相互作用して高分子鎖が重合成長して水溶液中に微粒子を形成さす重合方法である。  通常重合生成物は重合させた単量体と界面活性剤との混合物として存在する。  この不純物として考えられる界面活性剤はラテックス診断薬に使用される時に妨害する事があり問題と成っていた。  今回、おもいもかけずソ−プレスのラテックスを製造するこの技術を用いて遺伝子組み替えベクタ−材料として有用なラテックス重合生成物を製造出来る事をみいだした。
【特許文献１】昭和５９年特許願第２４８４７６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在実用化されている遺伝子ベクタ−は大部分がウイルスベクタ−であるが、使用するウイルス自体の形質が細胞に移植する際に組み込まれる恐れがあり、安全性に問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
遺伝子工学で、ある遺伝子を他の生物へ移植する際にその遺伝子を運ぶ、いわば運びやが必要でありこれをベクタ−と称している。
現在ベクタ−として使用されているものは各種のウイルスであり、細菌に寄生するプラスミドや細菌に感染するファ−ジである。  これらに移植する遺伝子をつけて感染させれば細菌に遺伝子を送りこめる。  このプラスミドやファ−ジの替りに陽イオン性高分子体と核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）との複合体をもちいると複合体のＲＮＡ、ＤＮＡ（遺伝子）が直接にあらかじめ準備された細胞に送りこめる事に成る。  この非ウイルス性ベクタ−を用いると危険性のあるウイルス類のベクタ−と異なり安全にかつ人工物である事から安定して使用される事になる。  更に重要な事は癌治療にこの遺伝子治療を用いる場合、現在マクロファ−ジへの遺伝子ＤＮＡ導入がこのＤＥＡＥ−デキストランなどの陽イオン性高分子体のみが有効である事である。  しかしリボ核酸ＲＮＡ、デオキシリボ核酸ＤＮＡ導入率はいまだかなり低く、実用にはさらなるハ−ドルを越えねばならい。  この遺伝子治療は個々のマクロファ−ジを用いるテイラ−メイド治療法であり癌治療に安全かつもつとも有効な治療法と考えられる。  陽イオン性高分子体としては陽イオン性多糖類が有望であるが、それは複合体が細胞膜をとうり抜ける事が必要であるからであり、この可能性は陽イオン性多糖類に起因する複合体の陽電荷と細胞膜表面の陰電荷との反応及び細胞膜表面の多糖類と複合体との相互作用にかかつているからである。  ベクタ−としての細胞膜の透過選択性にかんして高分子生体親和性は重要である。  さらに生体親和性を付与するには、用いる陽イオン性高分子体のベクタ−は疎水親水ドメインを有する事が必要であり、具体的にはＤＥＡＥ−デキストランなどの陽イオン性多糖類とビニル単量体の共重合体からなるラテックスを形成し、ビニル単量体の重合部分による疎水部分と陽イオン性多糖類による親水部分をあわせ持たす事が重要である。  即ちこの生じる疎水親水ドメインを有する複合体ラテックスの生体適合性が重要であり、さらに陽イオン性多糖類とビニル単量体の共重合体にする事で核酸との反応を高め、陽イオン性多糖類のベクタ−としての低ＤＮＡ、低ＲＮＡ導入率を改善できる事を発見した。
【発明の効果】
【０００５】
本願発明は水酸基を有する水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体に水中下オレフィンを有する単量体をグラフト重合させた物である。対するオレフィンを有する単量体成長鎖や生じた共重合体鎖の構造はそれぞれ化学構造式（化２）、（化１）として記載されている。それぞれの結合関係は、水可溶性リニア多糖類陽イオン性誘導体の水酸基の水素原子（開始剤の酸化によりプロトンとして）の引き抜きによるラジカル発生に起因するオレフィン単量体二重結合の連鎖移動による共有結合であることは明白である。  これは４価のセリウムイオンなどを開始剤として用いて行い、一切の界面活性剤を使用しない事から抗体吸着ラテックス診断薬などに使用される時に妨害される事が無く大変有用であった。  本願発明の水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体−オレフィンを有する単量体グラフト共重合体ラテックスが抗体吸着ラテックス診断薬に使用されることを目的としている事は昭和５９年特許願第２４８４７６号の特許請求の範囲の記載形式より明白であった。  即ち水酸基を有する水可溶性高分子体に水中でオレフィンを有する単量体をグラフト重合させ、イムノアッセイ診断材料として有用なラテックス重合生成物を製造する事を発明の構成に欠く事ができない事項の主要部としており、多糖類等のオレフィンを有する単量体グラフト共重合体も同一の目的を達成出来る。  このようなソ−プフリ−と言われる溶媒と溶質との界面で成長するグラフト共重合体は種々用途の広い有用な物質である。  特にイムノアッセイ材料以外にも濾過膜やバイオマテリアルとして注目されている。  又その親水性に注目して、人口腎臓膜、コンポ−ネント、代用血管、コンタクトレンズへの応用が考えられてきたが、このラテックス重合生成物が生じる疎水親水ドメインの界面活生性が細胞膜表面の親和性・透過性に特に重要であり又核酸との反応を高め、思いもかけず新たに非ウイルス性ベクタ−として極めて有望な事が解った。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、この発明のリニア多糖類の陽イオン性誘導体−オレフィンを有する単量体グラフト共重合体について、詳細に説明する。  リニア多糖類の陽イオン性誘導体−オレフィンを有する単量体グラフト共重合体は、次の（３）のステップを経て得る。  この重合体は核酸と複合体を形成して、細胞内の核に取りこまれ細胞の形質変換を生じるものである。
（１）リニア多糖類の陽イオン性誘導体の調整
固体で存在する場合、リニア多糖類陽イオン性誘導体の単位の式が、
【化４】
2010246563.tif 000002
で示される。  このリニア多糖類の陽イオン性誘導体の水酸基が一部エ−テル結合でカルボキシメチル基、硫酸エステル基など酸性基で置換されたもの、あるいはアルキル基で一部置換されたものに上記（化４）中のＸに表示されるカチオン官能基が入ったものでもよい。  通常これらのリニア多糖類の陽イオン性誘導体はリニア多糖類の水酸基とＸＣｌで表される上記陽イオン置換基の塩素化合物とのアルカリ溶液中のショツテンバウマン反応で得られる。  ここで言うリニア多糖類とはデキストラン、プルラン等発酵法により工業生産可能なものが考えられる。  対するグラフト重合させられるオレフィンを有する単量体としては、一般式が下記式の繰り返し単位で示されるものが考えられる。
【化３】
2010246563.tif 000003
具体的に言うと、アクリル酸、メタクリル酸のごときα、β−不飽和酸のアルキルエステル、シクロヘキシルエステルのごとき低級アルキル置換シクロヘキシルエステル、２−ヒドロキシエチルエステル、２−ヒドロキシプロピルエステル、２−ヒドロキシブチルエステル；アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリルアミド、アクリル−もしくはメタクリル−ジメチルアミド、上記α、β−不飽和酸のＣ1 〜Ｃ3 のアミノアルキルエステル、Ｃ1 〜Ｃ3 のジアルキルアミノアルキルエステル、グリシジルエステル、テトラヒドロフルフリルエステル、ベンジルエステル、ポリエチレングリコ−ルモノエステル類；アクリロニトリル、メタアクリロニトリルのごときα、β−不飽和酸のニトリル基；ビニルアルコ−ル、メチルビニルアルコ−ル、ジメチルビニルアルコ−ル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルブチレ−トのごときビニルアルコ−ル及びそのメチル置換ビニルアルコ−ルのＣ1
〜Ｃ3 アルキルエステル；スチレン、ビニルトルエン；ビニルピロリドン；ビニルメチルピロリドンなどが考えられる。
（２）グラフト共重合体の調整
反応は通常水溶液中で行われる。  すなわちリニア多糖類の陽イオン性誘導体の水溶液中、上記オレフィンを有する単量体を加え、開始剤を添加して反応する。  開始剤としては４価のセリウム塩、４価のマンガン塩、第二鉄塩−過酸化水素が通常用いられるが、他に過硫酸カリウム（ＫＰＳ）、アゾビスイソブチルニトリル（ＡＩＢＮ）、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）等ラジカル開始剤も用いられる。反応温度は常温より８０℃まで幅広く選択出来る。必要なら窒素置換して反応を続行させる事も行われる。  それぞれの結合関係は、水可溶性リニア多糖類陽イオン性誘導体のプロトンの引き抜きによるラジカル発生によるオレフィンを有する単量体二重結合の連鎖移動による共有結合である。この反応では生成物はラテックスで生じる。  このラテックス重合体は一般的には水、アルコ−ル、又はアセトン、テトラヒドロフラン等有機溶媒に不溶であるがキヤステイング法などにより、容易に成膜出来る。  あるいはアルコ−ルなど不溶溶媒を過剰に加え沈殿として得た後、熱プレス法などにより容易に成型品を作る事が出来る。
上記目的の為に、グラフト重合体中、幹ポリマ−とグラフトポリマ−の比率あるいはその重合度比率は目的に合わせて種々選択出来る。  グラフト重合はその重合率をグラフト率（％）で定められる。  これはグラフト率（％）＝（グラフト重合した単量体量／グラフト共重合体中の幹ポリマ−量）×１００で定義される。  本発明においてはオレフィン化合物がグラフト鎖として成り、グラフト率が２％から５０００％の範囲が適当と考えられる。  本願発明は水酸基を有する水可溶性リニア多糖類の陽イオン性誘導体に水中下オレフィンを有する単量体をグラフト重合させた物である事は繰り返し述べているが、生じた共重合体鎖の構造は特許請求の範囲に化学構造式として記載されている様に（化２）式と（化３）式よりなる、
【化１】
2010246563.tif 000004
式で表わされる。
それぞれの結合関係は、水可溶性リニア多糖類陽イオン性誘導体の水酸基のプロトンの引き抜きによるラジカル発生によるオレフィンを有する単量体二重結合の連鎖移動による共有結合である。        
（３）陽イオン性多糖類共重合体と核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）との複合体
本発明の陽イオン性多糖類共重合体をベクターとする遺伝子デリバリーシステムではその最初のステップは本発明の陽イオン性多糖類共重合体と核酸よりなる複合体の形成より始まる。  詳細にはリニア多糖類を母体とする多糖類の陽イオン性部分置換体にオレフィンを有する単量体をグラフト重合して得られる共重合体と、核酸よりなる複合体の形成が遺伝子デリバリーシステムの重要な最初のステップである。
具体的にはその複合体は
【化５】
2010246563.tif 000005
で示されるデオキシリボヌクレオチドを繰り返し単位とする、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を反応させ生じることを特徴とする、リニア多糖類を母体とする多糖類の陽イオン性部分置換体にオレフィンを有する単量体をグラフト重合して得られる共重合体と、核酸よりなる複合体であり、
【化６】
2010246563.tif 000006
で示されるリボヌクレオチドを繰り返し単位とする、リボ核酸（ＲＮＡ）を反応させ生じることを特徴とする、リニア多糖類を母体とする多糖類の陽イオン性部分置換体にオレフィンを有する単量体をグラフト重合して得られる共重合体と、核酸よりなる複合体である。
（化５）、（化６）式はヌクレオチドの構成を示し、式中Ｂでしめされるプリンまたはピリミジン塩基と糖およびリン酸からなっている。  また式中Ｂで、具体的にはプリン塩基としてはアデニン、グアニンの２種であり、ピリミジン塩基としてはシトシン、ウラシル、チミンの３種であるが、ＤＮＡの繰り返し単位であるデオキシリボヌクレオチドではアデニン、グアニンの２種と、ピリミジン塩基としてはシトシン、チミンが選択され、ＲＮＡの繰り返し単位であるリボヌクレオチドではアデニン、グアニンの２種と、ピリミジン塩基としてはシトシン、ウラシルが選択される。  構成される糖はそれぞれデオキシリボヌクレオチドではデオキシリボースであり、リボヌクレオチドではリボースである。
本発明の陽イオン性多糖類共重合体と（化５）、（化６）式中に示されるヌクレオチドを繰り返し単位とする、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）のリン酸部分は静電的ク−ロン力により容易に結合してポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）の陽イオン性多糖類共重合体−核酸複合体を生じる。  この複合体形成が遺伝子デリバリーシステムの重要な最初のステップである。  その為、用いる陽イオン性高分子体のベクタ−は疎水親水ドメインを有する事が必要であると思われ、具体的にはＤＥＡＥ−デキストランなどの陽イオン性多糖類とビニル単量体の共重合体からなるラテックスを形成し、ビニル単量体の重合部分による疎水部分と陽イオン性多糖類による親水部分をあわせ持たす事が重要であると考えられる。  これが核酸との反応を高め、かつエンドサイト−シスで細胞内に容易に導入されエンドソ−ム（輸送小胞体）に取り込まれる確率を高めると考えられるから、ＤＥＡＥデキストランなどの陽イオン性多糖類ベクタ−の細胞や細胞核への低ＤＮＡ、低ＲＮＡ導入率を改善できる。
すなわち実施例１のＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＭＡ共重合体の塩酸塩の場合の手順で、３種類のＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＭＡ共重合体例１、例２、例３を作製した即ち平均分子量Ｍｗ５０万のデキストランを母体とした窒素含量３％のＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン塩酸塩２ｇを水５０ｍｌに溶解し、ついで例１、例２、例３にたいして、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）３ｍｌ、４ｍｌ、６ｍｌをそれぞれ加え、十分に反応溶液、反応容器中の空気を窒素ガスで置換した後よく攪拌しながら、溶存空気を窒素ガスで置換した０．１Ｎ硝酸１５ｍｌに溶かした硝酸  第二セリウムアンモニウムニトレイト１００ｍｇを加え反応を開始する。  反応は３０℃で２時間行いラテックスが生成する。  反応終了は停止剤としてハイドロキノン１％溶液３ｍｌを使用した後、水中で透折を行い未反応物及び開始剤を除去して、ＤＥＡＥ−デキストラン−ＭＭＡ共重合体ラテックスを得た。  
このものは遺伝子組み替えベクタ−として極めて有用でありテスト結果を示す。
テスト方法は（発明を実施するための最良の形態）の欄の（４）―プロトコールＢの手順に従って行った。  pCMV-β-Galプラスミド(Invitrogen)を使用し形質変換した被形質変換細胞の２９３細胞（ヒト胎児腎細胞）を３７℃で５０時間インキュベイトした後、発現効率を調べた。β−ガラクトシタ−ゼ染色（Ｘ−ｇａｌ染色）により遺伝子の発現を確認した。
染色部分の面積よりトランスフェクションを評価すると出発ＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩を１とすると例１の重量増加率１５０％のＤＥＡＥ−デキストラン−ＭＭＡ共重合体は３，例２の重量増加率２００％のＤＥＡＥ−デキストラン−ＭＭＡ共重合体は３を示した。
ここで重量増加率は加えたＭＭＡの重量にたいする使用したＤＥＡＥ−デキストランの重量との比である。
即ち，重量増加率＝加えたＭＭＡの重量／使用したＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩の重量。
実施例３のごとく、陽イオン性多糖類共重合体の溶液を鮭の精子由来のＤＮＡ溶液に加えたところ、完全に沈澱して陽イオン性多糖類共重合体とＤＮＡの複合体が得られた。
同様な操作を陽イオン性多糖類で行なうと陽イオン性多糖類共重合体と比較して完全に沈澱するのにははるかに長時間を要した。
すなわち、ＤＥＡＥ−デキストラン−ＭＭＡ共重合体／ＤＮＡの複合体の沈殿時間は重量増加率３００％で０．５時間、重量増加率２００％で１時間、重量増加率１５０％で２時間であつた。  一方その同様な操作を実施例１の原料ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストランの塩酸塩で行なうと完全に沈澱するのに９６時間を要した。
同様に実施例のごとく、陽イオン性多糖類共重合体の溶液を酵母由来のＲＮＡ溶液に加えたところ、完全に沈澱して陽イオン性多糖類共重合体とＲＮＡの複合体が得られた。
この場合も同様な操作を陽イオン性多糖類で行なうと陽イオン性多糖類共重合体と比較して、完全に沈澱するのにはるかに長時間をようした。  
これらの事は陽イオン性多糖類共重合体が陽イオン性多糖類と比較して核酸との高い反応性を有する事を示している。
この複合体は細胞膜を透過し、エンドサイト−シスで細胞内に容易に導入され、エンドソ−ム（輸送小胞体）に取り込まれる。  複合体はさらにエンドソ−ムから細胞室内へ放出され、ＲＮＡ干渉作用を生じたり（ＲＮＡ）、転写・遺伝子発現するが、真核細胞の場合は最終的には核膜を透過して核に至り、複合体として核内へ集積する。  核内で複合体から核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）が分離され、転写・遺伝子発現を容易にする。
（４）陽イオン性多糖類共重合体ベクタ−によるトランスフェクション
プロトコールA
１。トランスフェクションの１日前より被形質変換細胞を１００ｍｍシャ−レ中で培養する。  被形質変換細胞の１００ｍｍ培養シャ−レ中細胞密度は８×１０5 個を目安にする。今回はＣＯＳ−１細胞（ＳＶ４０で形質転換されたアフリカ緑ザル腎細胞）をＤＭＥＭ培地（牛胎児血清を１０％含む）を用い３７℃、５％ＣＯ２下で培養を行った。
２。洗液の１×ＰＢＳ（リン酸緩衝塩剤、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  (Dulbecco & Vogt(1954))）を準備する。  この洗液の１×ＰＢＳ液とＤＥＡＥ−デキストラン共重合体液等の陽イオン性多糖類共重合体液を３７℃に加温する。
３。１０×ＰＢＳ液を使用して、１×ＰＢＳ液に希釈する。  トランスフェクション液を次のような手順で準備する。
１００ｍｍ培養シャ−レを用いて、滅菌チュ−ブ中に組み替えＤＮＡとしてルシフェラ−ゼをコ−ドしたプラスミド（ｐＧＬ３−コントロール、ＣｏｎｔｒｏｌｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（プロメガPromega Madison WI））２０μｇを１×ＰＢＳ液で５４０μｌに希釈する。    そして陽イオン性多糖類共重合体液（陽イオン性多糖類として１０ｍｇ／ｍｌ）の２８μｌを加える。  よく混ざるように滅菌チュ−ブを指でたたくようにする。
４。被形質変換細胞のＣＯＳ−１細胞が存在する培養シャ−レから培養液を除く、  １００ｍｍ培養シャ−レでは被形質変換細胞を洗液の１×ＰＢＳの１０ｍｌで２回洗浄する。  
５。  ３。で調整されたＤＮＡ−陽イオン性多糖類共重合体複合体液をこの被形質変換細胞に加える。  よく行き渡るように培養シャ−レでは被形質変換細胞をかきまぜる。
６。培養シャ−レを３７℃で３０分間インキュベイトする。  ときどき培養シャ−レをゆらしてみる。
７。１００ｍｍ培養シャ−レでは成長培地（ＤＭＥＭ培地）６ｍｌを培養シャ−レに加える。  培養シャ−レを３７℃で２時間３０分間インキュベイトして、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を発現させる。  成長培地を取換え、さらに３７℃で４８−７２時間インキュベイトする。
８。発現効率
ＣＯＳ−１細胞の形質変換の発現効率は組み込まれている発現ルシフェラ−ゼ活性によった。  すなわちルシフェラ−ゼ  アッセイ  キット（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ））を使用し、ルミノメ−タ（Ｔｕｒｎｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ＴＤ−２０ｅ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ  ））により、  ＴＬＵ値（Ｔｕｒｎｅｒ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ（ＴＬＵ））を求め、ＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩（Ｍｗ５０万、窒素含量５％）のその値を１として各サンプルを比較した。
プロトコールB
１。トランスフェクションの１日前より被形質変換細胞を３５ｍｍシャ−レ中で培養する
被形質変換細胞の３５ｍｍ培養シャ−レ中細胞密度は８×１０5 個を目安にする。    ２９３細胞（ヒト胎児腎細胞）をＤＭＥＭ培地（牛胎児血清を１０％含む）を用い、５％ＣＯ２下で３７℃下で培養を行う。
２。洗液の１×ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  (Dulbecco & Vogt(1954))）を準備する。  この洗液の１×ＰＢＳ液と塩基性多糖類共重合体液を３７℃に加温する。
３。１０×ＰＢＳ液を使用して、１×ＰＢＳ液に希釈する。  トランスフェクション液を次のような手順で準備する。
３５ｍｍ培養シャ−レを用いて、滅菌チュ−ブ中に組み替えＤＮＡとしてpCMV-β-Galプラスミド(Invitrogen)1０μｇを１×ＰＢＳ液で２７０μｌに希釈する。    そして各塩基性多糖類共重合体液（塩基性多糖類として１０ｍｇ／ｍｌ）の１４μｌを加える。
よく混ざるように滅菌チュ−ブを指でたたくようにする。
４。被形質変換細胞の２９３細胞（ヒト胎児腎細胞）が存在する培養シャ−レから培養液を除く、３５ｍｍ培養シャ−レでは被形質変換細胞を洗液の１×ＰＢＳの２ｍｌで２回洗浄する。  
５。３。で調整されたＤＮＡ−塩基性多糖類共重合体液をこの被形質変換細胞に加える。  よく行き渡るように培養シャ−レ−では被形質変換細胞をかきまぜる。
６。培養シャ−レを３７℃で３０分間インキュベイトする。  ときどき培養シャ−レをゆらしてみる。
７。３５ｍｍ培養シャ−レでは成長培地（ＤＭＥＭ培地）３ｍｌを培養シャ−レに加える。  培養シャ−レを３７℃で２時間３０分間インキュベイトして、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙを発現させる。  成長培地を取換え、さらに３７℃で４８−７２時間インキュベイトする。
８。発現効率
β−ガラクトシタ−ゼ染色（Ｘ−ｇａｌ染色）により遺伝子の発現を確認する。
ＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩を１として染色部分の面積よりトランスフェクションを評価する。
【実施例】
【０００７】
実施例１
平均分子量Ｍｗ５０万のデキストランを母体とした窒素含量５％のＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン塩酸塩２ｇを水５０ｍｌに溶解し、ついでメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）８ｍｌを加え、十分に反応溶液、反応容器中の空気を窒素ガスで置換した後よく攪拌しながら、溶存空気を窒素ガスで置換した０．１Ｎ硝酸１５ｍｌに溶かした硝酸第二セリウムアンモニウムニトレイト１００ｍｇを加え反応を開始する。  反応は３０℃で２時間行いラテックスが生成する。  反応終了は停止剤としてハイドロキノン１％溶液３ｍｌを使用した。後、反応溶液を３倍量のメタノ−ル中に注入し沈殿を得た。  この沈殿を熱水で十分に洗浄し遠心分離後５０℃で減圧乾燥し、ついで乾燥物をソックスレ−抽出器に入れて２４時間アセトン抽出を行い、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＭＡ共重合体の塩酸塩１．５ｇを得た。
窒素含量１．７％  グラフト率２００％
対ＤＥＡＥ−デキストラン収率２５％
このものは、ＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩の良溶媒である水にもポリメタクリル酸メチルの良溶媒であるアセトンにも溶けない。  この物の赤外吸収スペクトルをみると、  ＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩には見られないカルボニル基の吸収が波数１７３０ｃｍ−1付近にみられる。  
実施例２
実施例１と同様な反応を行った後、ラテックスの反応終了溶液をメタノ−ル中に注入せず、水中で透折を行い未反応物及び開始剤を除去して、ＤＥＡＥ−デキストラン−ＭＭＡ共重合体ラテックスを得た。  
このものは遺伝子組み替えベクタ−として有用でありテスト結果を示す。
テスト方法は（発明を実施するための最良の形態）の欄の（４）―プロトコールＡの手順に従って行った。  被形質変換細胞のＣＯＳ−１細胞を３７℃で５０時間インキュベイトした後、発現効率を調べた。
即ちベクタ−の効果をみる形質変換の発現効率はＣＯＳ−１細胞に組み込まれている発現ルシフェラ−ゼ活性によった。平均分子量Ｍｗ５０万のデキストランを母体とした窒素含量５％のＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩の値を１として実施例２のサンプルを比較したところ、５倍の発現ルシフェラ−ゼ活性が得られた。
実施例３
実施例２で得られたＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＭＡ共重合体のラテックスをＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の２mlを鮭の精子由来のＤＮＡ溶液（2０mｇ/ml）1mlに加えたところ、０．４時間で完全に沈澱して、20mgのＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＭＡ共重合体とＤＮＡの複合体が得られた。
同様な操作を原料ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストランの塩酸塩で行なうと完全に沈澱するのに９６時間を要した。
図１はそのものの赤外吸収スペクトルである。  波数1000cm−１から1100cm−１にかけてＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン由来のピラノーズ環の吸収がみられ、1220cm−１付近にはＤＮＡ由来のP−Oの伸縮振動による吸収がみられ、1730cm−１付近にはMMA由来によるカルボニル基C=Oの吸収が見られる。
実施例４
実施例２で得られたＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＭＡ共重合体のラテックスをＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の２mlを酵母由来のＲＮＡ溶液（2０mｇ/ml）1mlに加えたところ、４時間で完全に沈澱して、10mgのＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＭＡ共重合体とRＮＡの複合体が得られた。  同様な操作を原料ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストランの塩酸塩で行なうと完全に沈澱するのに１４４時間を要した。                              
図2はそのものの赤外吸収スペクトルである。波数1000cm−１から1100cm−１にかけてＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン由来のピラノーズ環の吸収がみられ、1230cm−１付近にはRＮＡ由来のP−Oの伸縮振動による吸収がみられ、1730cm−１付近にはMMA由来によるカルボニル基C=Oの吸収が見られる。
実施例５
平均分子量Ｍｗ２０万のプルランを母体とした窒素含量４％のＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−プルラン塩酸塩４ｇを水８０ｍｌに溶解し、ついでメタノ−ル１０ｍｌ、スチレン単量体３５ｍｌを加え、十分に反応溶液、反応容器中の空気を窒素ガスで置換した後よく攪拌しながら、溶存空気を窒素ガスで置換した０．１Ｎ硝酸３０ｍｌに溶かした硝酸第二セリウムアンモニウムニトレイト２００ｍｇを加え反応を開始する。反応は室温で１時間行いラテックスが生成する。  反応終了は停止剤としてハイドロキノン１％溶液３ｍｌを使用した。
後の精製及び乾燥工程は実施例１と同様に行い、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−プルラン−スチレン共重合体の塩酸塩７ｇを得た。
窒素含量０．９２％  グラフト率３５０％
対ＤＥＡＥ−プルラン収率３８％
実施例６
実施例５と同様な反応を行った後、ラテックスの反応終了溶液をメタノ−ル中に注入せず、水中で透折を行い未反応物及び開始剤を除去して、ＤＥＡＥ−プルラン−スチレン共重合体ラテックスを得た。  このものは遺伝子組み替えベクタ−として有用であった。  実施例２と同様な手順に従い、このもののラテックス溶液の発現ルシフェラ−ゼ活性は実施例２のＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩の値を１として１．５倍の発現ルシフェラ−ゼ活性が得られた。
実施例７
実施例６で得られたＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−プルラン−スチレン共重合体のラテックスをＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−プルラン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の２mlを鮭の精子由来のＤＮＡ溶液（2０mｇ/ml）1mlに加えたところ、２.５時間で完全に沈澱して、12mgのＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−プルラン−スチレン共重合体とＤＮＡの複合体が得られた。
実施例８
実施例６で得られたＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−プルラン−スチレン共重合体のラテックスをＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−プルラン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の２mlを酵母由来のＲＮＡ溶液（2０mｇ/ml）1mlに加えたところ、５時間で完全に沈澱して、9mgのＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−プルラン−スチレン共重合体とRＮＡの複合体が得られた。
実施例９
平均分子量Ｍｗ４万のデキストランを母体とした窒素含量５％のＡＥ（アミノエチル）−デキストラン塩酸塩４ｇを水９０ｍｌに溶解し、ついでメタノ−ル５ｍｌ、メタクリル酸ブチル２０ｍｌを加え、十分に反応溶液、反応容器中の空気を窒素ガスで置換した後よく攪拌しながら、溶存空気を窒素ガスで置換した０．１Ｎ硝酸１５ｍｌに溶かした硝酸第二セリウムアンモニウムニトレイト５０ｍｇを加え反応を開始する。  反応は室温で３０分間行いラテックスが生成する。  反応終了は停止剤としてハイドロキノン１％溶液３ｍｌを使用した。  後の精製及び乾燥工程は実施例１と同様に行い、ＡＥ（アミノエチル）−デキストラン−メタクリル酸ブチル共重合体の塩酸塩６ｇを得た。
窒素含量１．３％  グラフト率３００％  対ＡＥ−デキストラン収率３８％
このものは、ＡＥ−デキストラン塩酸塩の良溶媒である水にもポリメタクリル酸ブチルの良溶媒であるアセトンにも溶けない。  
実施例１０
実施例９と同様な反応を行った後、ラテックスの反応終了溶液をメタノ−ル中に注入せず、水中で透折を行い未反応物及び開始剤を除去して、ＡＥ（アミノエチル）−デキストラン−メタクリル酸ブチル共重合体ラテックスを得た。  このものは遺伝子組み替えベクタ−として有用であった。
実施例２と同様な手順に従い、このもののラテックス溶液の発現ルシフェラ−ゼ活性は実施例２のＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩の値を１として１．５倍の発現ルシフェラ−ゼ活性が得られた。
実施例１１
実施例１０で得られたＡＥ（アミノエチル）−デキストラン−メタクリル酸ブチル共重合体のラテックスをＡＥ（アミノエチル）−デキストラン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の２mlを鮭の精子由来のＤＮＡ溶液（2０mｇ/ml）1mlに加えたところ、３時間で完全に沈澱して、12mgのＡＥ（アミノエチル）−デキストラン−メタクリル酸ブチル共重合体とＤＮＡの複合体が得られた。
実施例１２
実施例１０で得られたＡＥ（アミノエチル）−デキストラン−メタクリル酸ブチル共重合体のラテックスをＡＥ（アミノエチル）−デキストラン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の２mlを酵母由来のＲＮＡ溶液（2０mｇ/ml）1mlに加えたところ、５時間で完全に沈澱して、10mgのＡＥ（アミノエチル）−デキストラン−メタクリル酸ブチル共重合体とRＮＡの複合体が得られた。
実施例１３
平均分子量Ｍｗ３万のプルランを母体とした窒素含量３％のＨＰＴＭＡ（２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム）−プルラン塩酸塩４ｇを水１００ｍｌに溶解し、ついでアクリル酸メチル単量体３０ｍｌを加え、十分に反応溶液、反応容器中の空気を窒素ガスで置換した後よく攪拌しながら、溶存空気を窒素ガスで置換した０．１Ｎ硝酸２０ｍｌに溶かした硝酸第二セリウムアンモニウムニトレイト２００ｍｇを加え反応を開始する。  反応は室温で１時間行いラテックスが生成する。  反応終了は停止剤としてハイドロキノン１％溶液４ｍｌを使用した。
後の精製及び乾燥工程は実施例１と同様に行い、ＨＰＴＭＡ（２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム）−プルラン−アクリル酸メチル共重合体の塩酸塩２ｇを得た。
窒素含量１．２％  グラフト率１５０％
対ＨＰＴＭＡ−プルラン収率２０％
実施例１４
実施例１３と同様な反応を行った後、水中で透折を行い未反応物及び開始剤を除去して、ＨＰＴＭＡ（２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム）−プルラン−アクリル酸メチル共重合体ラテックスを得た。  このものは遺伝子組み替えベクタ−として有用であった。実施例２と同様な手順に従い、このもののラテックス溶液の発現ルシフェラ−ゼ活性は実施例２のＤＥＡＥ-デキストラン塩酸塩の値を１として１．１倍の発現ルシフェラ−ゼ活性が得られた。
実施例１５
実施例１４で得られたＨＰＴＭＡ（２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム）−プルラン−アクリル酸メチル共重合体のラテックスをＨＰＴＭＡ（２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム）−プルラン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の２mlを鮭の精子由来のＤＮＡ溶液（2０mｇ/ml）1mlに加えたところ、５時間で完全に沈澱して、10mgのＨＰＴＭＡ（２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム）−プルラン−アクリル酸メチル共重合体とＤＮＡの複合体が得られた。
実施例１６
実施例１４で得られたＨＰＴＭＡ（２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム）−プルラン−アクリル酸メチル共重合体のラテックスをＨＰＴＭＡ（２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム）−プルラン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の２mlを酵母由来のＲＮＡ溶液（2０mｇ/ml）1mlに加えたところ、６時間で完全に沈澱して、9mgのＨＰＴＭＡ（２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム）−プルラン−アクリル酸メチル共重合体とRＮＡの複合体が得られた。
実施例１７
平均分子量Ｍｗ３０万のデキストランを母体とした窒素含量２％のＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−デキストラン塩酸塩２ｇを水５０ｍｌに溶解し、アクリル酸メチル（ＭＡ）１５ｍｌを加え、十分に反応溶液、反応容器中の空気を窒素ガスで置換した後よく攪拌しながら、溶存空気を窒素ガスで置換した０．１Ｎ硝酸１５ｍｌに溶かした硝酸第二セリウムアンモニウムニトレイト２５０ｍｇを加え反応を開始する。  反応は３０℃で２時間行いラテックスが生成する。  反応終了は停止剤としてハイドロキノン１％溶液３ｍｌを使用した。後、反応溶液を３倍量のメタノ−ル中に注入し沈殿を得た。  この沈殿を熱水で十分に洗浄し遠心分離後５０℃で減圧乾燥し、ついで乾燥物をソックスレ−抽出器に入れて２４時間アセトン抽出を行い、ＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＡ共重合体の塩酸塩２ｇを得た。
窒素含量０．７％  グラフト率１８５％
対ＴＥＡＥ−デキストラン収率３５％
このものは、ＴＥＡＥ−デキストラン塩酸塩の良溶媒である水にもアクリル酸メチルの良溶媒であるアセトンにも溶けない。  
実施例１８
実施例１７と同様な反応を行った後、ラテックスの反応終了溶液をメタノ−ル中に注入せず、水中で透折を行い未反応物及び開始剤を除去して、ＴＥＡＥ−デキストラン−ＭＭＡ共重合体ラテックスを得た。  
このものは遺伝子組み替えベクタ−として有用でありテスト結果を示す。
テスト方法は（発明を実施するための最良の形態）の欄の（４）の手順に従って行った。  即ちベクタ−の効果をみる形質変換の発現効率はＣＯＳ−１細胞に組み込まれている発現ルシフェラ−ゼ活性によった。平均分子量Ｍｗ５０万のデキストランを母体とした窒素含量５％のＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩の値を１として実施例１８のサンプルを比較したところ、３倍の発現ルシフェラ−ゼ活性が得られた。
実施例１９
実施例１８で得られたＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＡ共重合体のラテックスをＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−デキストラン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の２mlを鮭の精子由来のＤＮＡ溶液（2０mｇ/ml）1mlに加えたところ、３時間で完全に沈澱して、１５mgのＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＡ共重合体とＤＮＡの複合体が得られた。
実施例２０
実施例１８で得られたＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＡ共重合体のラテックスをＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−デキストラン換算で１０mｇ/mlの溶液に調整する。
この溶液の２mlを酵母由来のＲＮＡ溶液（2０mｇ/ml）1mlに加えたところ、５時間で完全に沈澱して、８mgのＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−デキストラン−ＭＡ共重合体とRＮＡの複合体が得られた。  
【産業上の利用可能性】
【０００８】
現在実用化されている遺伝子ベクタ−は大部分がウイルスベクタ−であるが、使用するウイルス自体の形質が細胞に移植する際に組み込まれる恐れがあり、安全性に問題がある。
本発明の陽イオン性多糖類共重合体のような非ウイルス性ベクタ−を用いると危険性のあるウイルス類のベクタ−と異なり安全にかつ人工物である事から安定して使用される事になる。  本発明の陽イオン性多糖類共重合体は核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）のリン酸部分と静電的ク−ロン力により容易に結合してポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）の陽イオン性多糖類共重合体−核酸複合体を生じる。  この複合体形成が遺伝子デリバリーシステムの重要な最初のステップであり、疎水親水ドメインを有している事からこれが核酸との反応を高め、かつエンドサイト−シスで細胞内に容易に導入され、エンドソ−ム（輸送小胞体）に取り込まれる確率を高め、ＤＥＡＥデキストランなどの既存の陽イオン性多糖類ベクタ−の細胞や細胞核への低ＤＮＡ、低ＲＮＡ導入率を改善できるが、なによりも本発明の陽イオン性多糖類共重合体は化学的に安定である。  たとえばその溶液は１２０℃、１５分のオートクレーブ処理に十分に耐える。  遺伝子組み替えベクタ−を産業化のレベルまで高めるには細胞やバクテリアを大量に培養し、それに効率よく遺伝子導入する技術が必要である事から再現性が優れている事やコストの安い事,  特に化学的に安定している事は重要である。
これらの重要な特性を本発明の陽イオン性多糖類共重合体は具備しており産業上有望である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例３で得られたＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン−      ＭＭＡ共重合体とＤＮＡの複合体の赤外吸収スペクトルを示すグラフである。
【図２】実施例４で得られたＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストラン−      ＭＭＡ共重合体とＲＮＡの複合体の赤外吸収スペクトルを示すグラフである。
【図１】
2010246563.tif 000013
【図２】
2010246563.tif 000014