(57)【要約】【課題】  保持カラムからの試料の溶出時間に影響を与えないように保持カラムを洗浄する液体クロマトグラフを提供する。【解決手段】  試料を保持する保持カラム９と、移動相溶媒２を用いて試料を保持カラム９へ送液する第１ポンプ１と、試料分離用溶媒１１を用いて保持カラム９に保持した試料を溶出する第２ポンプ１０と、保持カラム９から溶出した試料を分離する分離カラム１２と、オートサンプラ４とを備えた液体クロマトグラフであって、分離カラム１２にて試料を分離した後に、第１ポンプ１から送液する液体を移動相溶媒３から洗浄用溶媒３へ切換えて、保持カラム９を洗浄するように制御する制御部を備えている。【選択図】図１
2010139448.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を保持する保持カラムと、
第１溶媒を用いて試料を前記保持カラムへ送液する第１ポンプと、
第２溶媒を用いて保持カラムに保持した試料を溶出する第２ポンプと、
保持カラムから溶出した試料を分離する分離カラムと、
試料注入部とを備えた液体クロマトグラフであって、
分離カラムにて試料を分離した後に、第１ポンプから送液する液体を第１溶媒から洗浄用溶媒へ切換えて、保持カラムを洗浄するように制御する制御部を備えていることを特徴とする液体クロマトグラフ。
【請求項２】
請求項１において、
制御部は、第１ポンプから送液する液体を第１溶媒から洗浄用溶媒へ変更した後に、第１ポンプと保持カラムとの間の流路を試料注入部にて一時的に短絡させて第１ポンプからの単位時間当たりの送液流量を高くし、その後流路および送液流量を元に戻してから洗浄用溶媒を保持カラムへ送液するように制御することを特徴とする液体クロマトグラフ。
【請求項３】
請求項１において、
制御部は、第１ポンプから送液する液体を洗浄用溶媒から第１溶媒へ戻した後に、第１ポンプと保持カラムとの間の流路を試料注入部にて一時的に短絡させて第１ポンプからの単位時間当たりの送液流量を高くし、その後流路および送液流量を元に戻してから第１溶媒を保持カラムへ送液するように制御することを特徴とする液体クロマトグラフ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかにおいて、
第１ポンプからの第１溶媒または洗浄用溶媒を保持カラムへ送液する流路と、第２ポンプからの第２溶媒を保持カラムへ送液する流路とを互いに切換える切換えバルブを備えていることを特徴とする液体クロマトグラフ。
【請求項５】
試料を保持する保持カラムと、
第１溶媒を用いて試料を前記保持カラムへ送液する第１ポンプと、
第２溶媒を用いて保持カラムに保持した試料を溶出する第２ポンプと、
保持カラムから溶出した試料を分離する分離カラムと、
試料注入部とを備えた液体クロマトグラフであって、
前記第１ポンプは洗浄用溶媒を用いて保持カラムを洗浄することを特徴とする液体クロマトグラフ。
【請求項６】
溶媒を用いて試料を保持カラムへ送液する液体クロマトグラフ用の送液ポンプであって、
前記溶媒とは別の洗浄用溶媒を用いて保持カラムを洗浄することを特徴とする送液ポンプ。
【請求項７】
試料を保持する保持カラムと、
第１溶媒を用いて試料を前記保持カラムへ送液する第１ポンプと、
第２溶媒を用いて保持カラムに保持した試料を溶出する第２ポンプと、
保持カラムから溶出した試料を分離する分離カラムとを備えた液体クロマトグラフの洗浄方法であって、
分離カラムにて試料を分離した後に、第１ポンプから送液する液体を第１溶媒から洗浄用溶媒へ切換えて、保持カラムを洗浄することを特徴とする液体クロマトグラフの洗浄方法。
【請求項８】
請求項７において、
制御部は、第１ポンプから送液する液体を第１溶媒から洗浄用溶媒へ変更した後に、第１ポンプと保持カラムとの間の流路を試料注入部にて一時的に短絡させて第１ポンプからの単位時間当たりの送液流量を高くし、その後流路および送液流量を元に戻してから洗浄用溶媒を保持カラムへ送液する液体クロマトグラフの洗浄方法。
【請求項９】
請求項７において、
第１ポンプから送液する液体を洗浄用溶媒から第１溶媒へ戻した後に、第１ポンプと保持カラムとの間の流路を試料注入部にて一時的に短絡させて第１ポンプからの単位時間当たりの送液流量を高くし、その後流路および送液流量を元に戻してから第１溶媒を保持カラムへ送液する液体クロマトグラフの洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質やペプチド，核酸など、混合試料の分離分析のための液体クロマトグラフ，液体クロマトグラフ用送液ポンプおよび液体クロマトグラフの洗浄方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフによるタンパク質やペプチド，核酸などの分離分析は、それぞれの試料に適切な分離カラムを用いることで、試料の保持時間の違いを利用し検出を行う。
【０００３】
近年、プロテオミクス研究の分野においても、１分あたりマイクロリットル〜ナノリットル流量の液体クロマトグラフ装置（ＬＣ）と、質量分析計（ＭＳ）を接続した分析システムが頻繁に利用されている。
【０００４】
上記のような試料を分析する場合、より高感度での検出を行うために、試料を一旦、前段に置いた濃縮用の保持カラム（トラップカラム）へ保持し、次に流路を切換えた後、後段の分析カラムへ試料を送る方式が取られることがある。
【０００５】
トラップカラムを接続した流路切換バルブが流路を切換え、試料の分離分析用の溶媒を送液するポンプ（グラジエントポンプ）からの流路を用いる側が接続されると、グラジエント送液によりトラップカラムからは徐々に試料が溶出される。溶出された試料は後段の分離カラムへと送られ、さらに後段に置かれた検出器により検出し、分離分析を行う。
【０００６】
保持カラムを利用した液体クロマトグラフによる分析を行う際、試料の送液される保持カラムには試料が残留することもあり、次回以降の分析におけるコンタミネーションや、試料同士の吸着が起こるなど、正確に行うことが困難になる問題があった。
【０００７】
液体クロマトグラフ装置における洗浄機能については、ＷＯ２００４−１０２１８２号公報（特許文献１）において試料用ニードルから試料と同様に洗浄液を吸引し、移動相として吐出することでニードルの洗浄を実行している技術があるが、保持カラムを有した液体クロマトグラフでは、洗浄する部位が異なるため適用できない。
【０００８】
また、特開２００１−１９４３５５号公報（特許文献２）においては、特定の組成の洗浄液を分離カラムの洗浄に用いている。
【０００９】
特開２００３−１９４７９１号公報（特許文献３）では液体クロマトグラフより分離した試料の検出器セルを洗浄するものであるが、
液体クロマトグラフ装置を用いた解析において、分析する試料を一時保持カラムへ保持させる、またはサンプルループなどに試料を一定量導入し、流路切換えの後、後段の分析カラムへ試料を送る方式で行われることなどが多いが、保持カラムへ試料が残留し、次回以降の分析へコンタミネーションを起こし、正確な分析ができなくなるという問題があった。
【００１０】
また、上記のように試料が残留した場合は、前後の測定間に試料を含まない溶液（例えば、純水など）を、１回、または複数回分析試料と同様の方法・条件で測定し（ブランク測定）、残留試料を溶出させる必要が生じる。
【００１１】
もしくは一分析ごとに溶媒を洗浄用の溶媒に変更し、手動で流速を設定するなどして保持カラムを洗浄するなどの方法を取る必要がある。
【００１２】
本発明の目的とするのは保持カラムの洗浄であり、保持カラムの後段に検出器を置かない液体クロマトグラフでは構成が異なるため適当ではなかった。
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ２００４−１０２１８２号公報
【特許文献２】特開２００１−１９４３５５号公報
【特許文献３】特開２００３−１９４７９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら保持カラムの洗浄を手動で行うと、分析時間にバラツキが生じてしまい、測定回数毎に試料が保持カラムから溶出する時間にバラツキが生じてしまうという問題がある。そのため正確なデータの評価が困難になる場合がある。
【００１５】
本発明は、上記の問題を解決するためになされたものであり、その目的は保持カラムからの試料の溶出時間に影響を与えないように保持カラムを洗浄する液体クロマトグラフおよび液体クロマトグラフの洗浄方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の課題を解決するために本発明の液体クロマトグラフは、試料を保持する保持カラムと、
第１溶媒を用いて試料を前記保持カラムへ送液する第１ポンプと、
第２溶媒を用いて保持カラムに保持した試料を溶出する第２ポンプと、
保持カラムから溶出した試料を分離する分離カラムと、
試料注入部とを備えた液体クロマトグラフであって、
分離カラムにて試料を分離した後に、第１ポンプから送液する液体を第１溶媒から洗浄用溶媒へ切換えて、保持カラムを洗浄するように制御する制御部を備えていることを特徴としている。
【００１７】
上記構成によれば、試料を保持カラムへ送液していた第１ポンプを用いて洗浄用溶媒を保持カラムへ送液する制御部を備えているため、洗浄用溶媒の保持カラムへの送液を自動化することができる。このように洗浄用溶媒の保持カラムへの送液を自動化すれば、毎回の保持カラムの洗浄時間のバラツキを無くすことができる。そのため、正確なデータの評価を行うことができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、毎回の保持カラムの洗浄時間のバラツキを無くすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
図１は本発明の液体クロマトグラフの概略構成図である。
【００２０】
〔液体クロマトグラフの構成〕
液体クロマトグラフは、同図に示すように、試料を保持するための保持カラム（トラップカラム）９と、保持カラム９が接続された流路切換え用６方バルブ８と、試料を保持カラム９へ送液する第１送液ポンプ（第１ポンプ）１と、オートサンプラ４と、保持カラム９に保持した試料を溶出する試料分離用溶媒１１を送液する第２送液ポンプ（第２ポンプ）１０と、保持カラムから溶出した試料を分離する分離カラム１２と、分離カラム１２にて分離した試料を検出する検出部１３と、を備えている。なお、図１に示すように、廃液を蓄える廃液瓶１４を液体クロマトグラフと共に用いることができる。
【００２１】
第１ポンプ１は、移動相溶媒２と洗浄用溶媒３との２つの溶媒を切換えて送液することができる。移動相溶媒２は試料を保持カラム９へ移動させるものであり、洗浄用溶媒３は保持カラム９を洗浄するための溶媒である。なお、これらの溶媒２，３を加えたものを液体クロマトグラフと称してもよい。
【００２２】
オートサンプラ４は、第１ポンプ１と６方バルブ８との間に位置しており、ニードル５，サンプルインジェクションポート６，洗浄部７を備えている。ニードル５は、試料を吸引しサンプルインジェクションポート６に接続され、吸い込んだ試料を流路に注入するためのものであり、洗浄部７にて洗浄できる。つまり、ニードル５は、サンプルインジェクションポート６−洗浄部７間を移動可能な構成となっている。
【００２３】
６方バルブ８は、次の２つの流路を切換えるものである。第１の流路は６方バルブ８のポジションがバルブ位置Ａ（図１）のときに形成される流路であり、第２の流路は６方バルブ８のポジションがバルブ位置Ｂ（図２）のときに形成される流路である。
（第１の流路）第１ポンプ１→オートサンプラ４→保持カラム９→廃液瓶１４
第２ポンプ１０→分離カラム１２→検出部１３
（第２の流路）第１ポンプ→オートサンプラ４→廃液瓶１４
第２ポンプ１０→保持カラム９→分離カラム１２→検出部１３
なお、図示しないが、上記の各部材を以下に示す通りに制御するための制御部を備えている。また、洗浄用溶媒３としては、保持カラム９の性能を著しく劣化させない溶液であれば、特に限定されるものではない。
【００２４】
次に液体クロマトグラフの動作の一例を説明する。
【００２５】
〔液体クロマトグラフの動作〕
（保持ステップ）
まず、６方バルブ８のポジションがバルブ位置Ａのとき、第１ポンプ１から移動相溶媒２がオートサンプラ４経由で保持カラム９へ送液される。ここで例えば、移動相溶媒２としては、０.１％ギ酸水溶液溶媒を用いることができ、移動相溶媒２を１０μＬ／minで送液させることができる。サンプルインジェクションポート６と接続されたニードル５は試料を採取し、採取された試料は移動相溶媒２により保持カラム９へ送液される。このように保持カラム９へ試料が送液される場合、保持カラム９へ保持されない塩などの物質は移動相溶媒２と共に廃液瓶１４へ送られる。
【００２６】
なお、第２ポンプ１０からは、試料分離用溶媒１１が保持カラム９を通過しない流路を通って分離カラム１２へ送液される。ここで例えば、試料分離用溶媒１１としては、０.１％ギ酸を含む５０％アセトニトリル水溶液を用いることができる。
【００２７】
（分析ステップ）
６方バルブ８のポジションがバルブ位置Ａからバルブ位置Ｂへ切換えられると、第２ポンプ１０から試料分離用溶媒１１が保持カラム９およびさらに後段の分離カラム１２へ送液される。これにより、保持カラム９に保持された試料は第２ポンプ１０により溶出され、分離カラム１２にて分離され、検出部１３にて検出される。第１ポンプ１は６方バルブ８のポジションがバルブ位置Ａからバルブ位置Ｂへ切換えられても送液を続け、送液される移動相溶媒２は廃液瓶１４へ流れる。ニードル５は保持ステップにおけるサンプルの注入後、流路から切り離され、アイドル位置（不図示）に戻る。
【００２８】
（保持カラム洗浄ステップ）
検出部１３による検出終了後、６方バルブ８のポジションをバルブ位置Ｂからバルブ位置Ａへ切換える。その後、第１ポンプ１により送液する溶媒を、移動相溶媒２から洗浄用溶媒３に変更し、オートサンプラ４のニードル５をサンプルインジェクションポート６から洗浄部７へ移動させる。移動後に、第１ポンプ１の流量を上記の１０μＬ／minから１ｍＬ／minへ変更し、高流量により第１ポンプ１〜ニードル５までの流路内の溶液を置換する。流路内の溶液を置換することをパージと呼ぶ。パージの時間は例えば５分とすることができる。パージ終了後、第１ポンプ１の流量を１０μＬ／minへ戻し、ニードル５をサンプルインジェクションポート６へ移動させる。これにより、第１ポンプ１から洗浄用溶媒３がオートサンプラ４を経由して保持カラム９へ送液され、保持カラム９の洗浄が可能である。なお、保持カラム９を洗浄した後の洗浄用溶媒３は廃液瓶１４へ蓄えられる。
【００２９】
例えば、第１ポンプ１による洗浄用溶媒３の送液を１０分間行い、保持カラム９を洗浄する。
【００３０】
（保持カラム内の置換ステップ）
その後、第１ポンプ１から送液される溶媒を洗浄用溶媒３から移動相溶媒２へ変更する。さらに、オートサンプラ４のニードル５をサンプルインジェクションポート６から洗浄部７へ移動させる。ニードル５移動後、第１ポンプ１の流量を１０μＬ／minから１ｍＬ／minへ変更し、高流量により第１ポンプ１〜ニードル５までの流路内の溶液を洗浄用溶媒３から移動相溶媒２へ置換する（パージする）。パージ時間は例えば５分とすることができる。パージ終了後、第１ポンプ１の流量を１ｍＬ／minから１０μＬ／minへ戻し、ニードル５を洗浄部７からサンプルインジェクションポート６へ移動させる。第１ポンプ１から移動相用溶媒２がオートサンプラ４を経由して保持カラム９へ送液される。この状態で例えば２０分間送液を行うことにより保持カラム９内の溶媒は、洗浄用溶媒３から移動相溶媒へ置換され、平衡化され、次の分析が可能な初期状態となる。
【００３１】
なお、上記の６方バルブ８は、代わりに流路の切換えが可能であれば１０方バルブを用いてもよい。または、後述する図３のように、試料分離用溶媒１１として０.１％ギ酸を含む２％アセトニトリル水溶液とし、この他に例えば０.１％ギ酸を含む９８％アセトニトリル水溶液を用いて第２ポンプ１０をグラジエント送液可能なポンプとして用いてグラジエント分析を行ってもよい。さらに、上記の液体クロマトグラフではオートサンプラ４を用いたがマニュアルインジェクタなどで試料の注入を行ってもよい。
【００３２】
上記では、洗浄液を一種追加した構成としたが、使用した送液ポンプは標準で四種までの溶媒を送液することが可能であるため、保持カラムを効率よく洗浄できるように二種以上の溶液を追加してもよい。また、試料導入用の送液ポンプを、複数の溶液を決められた組成で混合し送液するポンプに変更して、制御部から徐々に洗浄効率が上昇するような溶液の組成で送液する制御を行い、より効率良く保持カラムの洗浄を行ってもよい。
【００３３】
また、本実施の形態の液体クロマトグラフは、上記で説明したものに限らず、上記の保持カラムの洗浄機能を備えたナノ流量の液体クロマトグラフでもよい。このナノ流量の液体クロマトグラフについて図３を用いて説明する。
【００３４】
図３では、図１と異なる構成のみ説明し、同一の構成については説明を省略する。ナノ流量の液体クロマトグラフは、図１に示す液体クロマトグラフの６方バルブ８の代わりに１０方バルブ１５を用いており、さらに、複数の溶媒の組成比を決めて混合し送液する第３ポンプ２０と、ナノ流量送液ポンプ（ナノフローポンプ）１７と、第３ポンプ２０およびナノフローポンプ１７に接続されグラジエント溶液を作成するための１０方バルブ１９を備えている。さらに、第３ポンプ２０は、保持カラム９から試料を溶出させるための試料分離用溶媒（試料溶出用溶媒）１１，１６を決められた混合比で送液する。ナノフローポンプ１７は純水１８を送液する。
【００３５】
次に動作について説明する。まず、１０方バルブ１５が図３に示すバルブ位置Ｃにおいて、試料を保持カラム９へ保持させる。次に、１０方バルブ１５の流路を切換え、図４に示すバルブ位置Ｄとする。
【００３６】
その後、第３ポンプ２０から決められた混合比で混合された試料分離用溶媒１１，１６が送液される。１０方バルブ１９は一定時間ごと（例えば１分）にバルブ位置が変更する。１０方バルブ１９には２つのループが備えられており、一定時間ごとに各々のループに流入する試料分離用溶媒１１，１６の混合比が異なる溶液が溜められる。ループに溜められた溶液はナノフローポンプ１７から流入するナノ流量の水の分だけ１０方バルブ１５側への流路に押し出される。第３ポンプ２０、ナノフローポンプ１７、および１０方バルブ１９によって作成されたナノ流量の溶媒は保持カラム９へ送液され、保持カラム９から試料が溶出される。
【００３７】
溶出された試料は、分離カラム１２にて徐々に分離され、検出部１３にて検出される。検出後、１０方バルブ１５のバルブ位置は、バルブ位置Ｄからバルブ位置Ｃへ戻され、第１ポンプ１から送液する溶媒を移動相溶媒２から洗浄用溶媒３へ切換え、上述と同様の洗浄動作が行う。
【００３８】
さらに、図３に示すナノ流量の液体クロマトグラフに図５に示すような２つの６方バルブ２１，２２を追加してもよい。
【００３９】
図６は本発明の保持カラム洗浄ステップにおける第１ポンプ１（上段）とオートサンプラ４（下段）の動作のタイムチャートを示したものである。洗浄ステップにおいて、
（ａ）オートサンプラ４のニードル５は洗浄部７パージ位置に移動する。
（ｂ）第１ポンプ１の移動相溶媒２が洗浄用溶媒３に切換えられ、流速が１０μＬ／minから１ｍＬ／minへ変更される。例えば５分経過後、送液は一時停止する。
（ｃ）オートサンプラ４のニードル５はサンプルインジェクションポート６の位置に戻る。
（ｄ）洗浄用溶媒３が第１ポンプ１→オートサンプラ４→保持カラム９→廃液瓶１４と流れることで、保持カラム９が洗浄される。流速は１０μＬ／min。例えば２０経過後、送液は一時停止する。
（ｅ）オートサンプラ４のニードル５は洗浄部７パージ位置に移動する。
（ｆ）第１ポンプ１の洗浄用溶媒３が移動相溶媒２に切換えられ、流速が１０μＬ／minから１ｍＬ／minへ変更される。例えば５分経過後、送液は一時停止する。
（ｇ）オートサンプラ４のニードル５はサンプルインジェクションポート６の位置に戻る。
（ｈ）移動相溶媒２が第１ポンプ１→オートサンプラ４→保持カラム９→廃液瓶１４と流れることで、保持カラム９内の溶媒が移動相溶媒２に置換される。流速は１０μＬ／minである。
（ｉ）例えば２０分間送液を行うことで、保持カラム９内の溶媒置換、及び平衡化が完了する。
【００４０】
洗浄用溶媒３は本発明においては０.１％ギ酸を含む９８％アセトニトリル溶液を用いた。このほかに１００％アセトニトリル溶液や５０％メタノール溶液など、保持カラム９からサンプルの残留物を十分に溶出させる組成の溶液であれば良い。また保持カラム９の性質によっては純水や０.１％ギ酸水溶液が強溶媒として機能するのであれば、これらのような溶液でもよい。
【００４１】
本発明によれば、試料を保持するための保持カラムと、試料を前記保持カラムへ送液する第１送液ポンプと、保持カラムに保持した試料を溶出する第２送液ポンプと、保持カラムから溶出した試料を分離する分離カラムと、前記第１のポンプから送液される、洗浄用の溶媒を備えていることを特徴とする液体クロマトグラフにおいて、分析後に保持カラムを自動洗浄することができる液体クロマトグラフを提供する。
【００４２】
保持カラムの洗浄が可能であり、試料を保持カラムに送液するためのポンプに、洗浄溶媒を一種、または複数種追加することで、保持カラムを強力に効率よく洗浄することが可能であり、その結果分析間のブランク測定を行わなくてよくなるため、総分析時間を短縮することができる。さらに、総分析時間の短縮により、データ精度の向上，試料劣化の低減，使用する試薬量の低減も可能である。
【００４３】
また、試料を送液するポンプに別途バルブと洗浄用溶媒を送液可能な流路を追加すれば、パージによる洗浄動作は可能であるが、大幅にコストが上昇するため、本発明は低コストで利用可能な技術である。
【００４４】
本実施例では、洗浄液を一種追加した構成としたが、実施例にて使用した送液ポンプは標準で四種までの溶媒を送液することが可能であるため、保持カラムを効率よく洗浄できるように二種以上の溶液を追加してもよい。
【００４５】
また、試料導入用の送液ポンプを、複数の溶液を決められた組成で混合し送液するポンプに変更して、制御部から徐々に洗浄効率の上昇するような溶液の組成で送液する制御を行い、より効率良く保持カラムの洗浄を行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明を示すものであり、一実施形態の液体クロマトグラフの概略構成を示す図である。
【図２】図１に示す液体クロマトグラフの６方バルブのバルブ位置を切換えた状態を示す図である。
【図３】本発明を示すものであり、一実施形態のナノ流量の液体クロマトグラフの概略構成を示す図である。
【図４】図３に示す液体クロマトグラフの１０方バルブのバルブ位置を切換えた状態を示す図である。
【図５】図３に示す液体クロマトグラフに２つの６方バルブを追加した概略構成を示す図である。
【図６】本発明の保持カラム洗浄ステップにおける第１ポンプとオートサンプラの動作のタイムチャートを示したものである。
【符号の説明】
【００４７】
１  第１ポンプ
２  移動相溶媒（第１溶媒）
３  洗浄用溶媒
４  オートサンプラ（試料注入部）
８  ６方バルブ（切換えバルブ）
９  保持カラム
１０  第２ポンプ
１１，１６  試料分離用溶媒（第２溶媒）
１２  分離カラム
１５  １０方バルブ（切換えバルブ）
【図１】
2010139448.tif 000003
【図２】
2010139448.tif 000004
【図３】
2010139448.tif 000005
【図４】
2010139448.tif 000006
【図５】
2010139448.tif 000007
【図６】
2010139448.tif 000008