(57)【要約】【課題】  生物学的試料中の特定の生体物質の蛍光ラベリングまたは蛍光イメージングに適する手段の提供【解決手段】  表面の修飾された希土類含有セラミックスナノ粒子（ＲＥＤ−ＣＮＰ）であって、該粒子表面に、式（Ｉ）      ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（ｃａｒｂｏ）              （Ｉ）式中、ＰＥＧはα−末端が修飾されていてもよいポリ（エチレングリコール）鎖を含むセグメントを表し、そしてポリ（ｃａｒｂｏ）は側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントを表す、で示されるブロック共重合体、および任意に特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子特定の生体物質を特異的が該カルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖を介して固定されている、上記表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰ。ＰＥＧ鎖の立体反発により、生理条件下におけるナノ粒子同士の凝集を阻害し、さらに非標的生体物質の吸着も抑制することが可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面の修飾された希土類含有セラミックスナノ粒子（ＲＥＤ−ＣＮＰ）であって、該粒子表面に、式（Ｉ）
ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（ｃａｒｂｏ）              （Ｉ）
式中、ＰＥＧはα−末端が修飾されていてもよいポリ（エチレングリコール）鎖を含むセグメントを表し、そして
ポリ（ｃａｒｂｏ）は側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントを表す、
で示されるブロック共重合体が該カルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖を介して固定されている、上記表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰ。
【請求項２】
表面の修飾された希土類含有セラミックスナノ粒子（ＲＥＤ−ＣＮＰ）であって、該粒子表面に、式（Ｉ）
ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（ｃａｒｂｏ）              （Ｉ）
式中、ＰＥＧはα−末端が修飾されていてもよいポリ（エチレングリコール）鎖を含むセグメントを表し、そして
ポリ（ｃａｒｂｏ）は側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントを表す、
で示されるブロック共重合体が該カルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖を介して固定されており、かつ、
該共重合体の他に、さらに特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子が共固定されている、上記表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰ。
【請求項３】
式（Ｉ）におけるポリ（ｃａｒｂｏ）が、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（リンゴ酸）よりなる群から選ばれるポリマー由来である、請求項１または２記載の表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰ。
【請求項４】
式（Ｉ）で示されるブロック共重合体が、下記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ−ａ）、（ＩＩＩ−ｂ）、（ＩＶ−ａ）
および（ＩＶ−ｂ）で示されるブロック共重合体からなる群より選ばれる、請求項１または２記載の表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰ。
【化１】
2010112861.tif 000003
上記式中、
Ａは水素原子または置換もしくは未置換の炭素原子１２個までのアルキル基を表し、
Ｌは直接結合または二価の連結基を表し、
Ｔは水素原子、ヒドロキシル基または−ＺＲ’であって、ここでＺは単結合、ＣＯ、ＯもしくはＮＨを表し、Ｒ’は水素原子、置換もしくは未置換の炭素原子１２個までの炭化水素基を表し、
Ｒは水素原子またはメチル基を表し、
ｍは４〜２５００の整数であり、
ｎは５〜１００００の整数であり、
Ｘ＋Ｙまたはｚは５〜１０００の整数であり、そして
各式中のカルボキシル基は、独立して３０％までエステルの形態であることができる。
【請求項５】
水性媒体中で、ＲＥＤ−ＣＮＰおよびその表面に結合した側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントが主として内部に存在し、α−末端が修飾されていてもよいポリ（エチレングリコール）鎖を含むセグメントが主として外側に存在するようなコア−シェル構造を有する請求項１記載の表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰ。
【請求項６】
ＲＥＤ−ＣＮＰと
式（Ｉ）
ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（ｃａｒｂｏ）              （Ｉ）
式中、ＰＥＧはα−末端が修飾されていてもよいポリ（エチレングリコール）鎖を含むセグメントを表し、そして
ポリ（ｃａｒｂｏ）は側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントを表す、
で示されるブロック共重合体と
任意に、特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子と
を含む緩衝化された水溶液を攪拌する工程を含んでなる、請求項１または２記載の表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰの製造方法。
【請求項７】
請求項２記載の表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰを含んでなる特定の生体物質を蛍光ラベリングするための試薬。
【請求項８】
請求項２記載の表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰを生物学的試料と接触させ、次いでＲＥＤ−ＣＮＰの近赤外光励起による近赤外発光または可視発光を観察することとを含んでなる該試料中の特定生体物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水性媒体中、特に、高いイオン強度の水性媒体中で分散安定性を示す表面の修飾された希土類含有セラミックナノ粒子（以下、ＲＥＤ−ＣＮＰと略記する場合がある）およびその蛍光ラベリングのための使用に関する。該表面の修飾は特定のブロック共重合体および、任意に、特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子により行われる。
【背景技術】
【０００２】
バイオ研究における発光材料の利用は、生体物質や細胞の蛍光イメージングをはじめとしてその重要性が高まっており、免疫診断等の医療診断への応用も期待されている。現在の蛍光イメージングにおいては、蛍光色素や蛍光タンパク質、半導体量子ドットといった蛍光体を利用するのが一般的であり、それらは励起光源に紫外光や短波長可視光を用いる場合が多い。そしてこれらの発光材料（例えば、超微粒子）を用いる場合に、該微粒子の水溶液での分散安定性や該粒子表面への被検体以外の夾雑タンパク質等の非特異的吸着を抑制するために様々な表面処理が施されている。金もしくは半導体コロイド粒子の表面にポリエチレングリコール−ｂ−ポリ（メタクリル酸ジメチルアミノエチル）のブロック共重合体を結合させることにより該コロイド粒子の分散安定性および該粒子表面への非特異吸着を抑制できること（特許文献１参照）、半導体超微粒子に水溶性および非特異的吸着抑制能を付与するためにω−メルカプト脂肪酸のポリエチレングリコールエステルである配位子でそれらの表面を修飾することも知られている（特許文献２参照）。
【０００３】
しかしながら、紫外光や短波長可視光は短波長であるために光散乱性が高く、生体深部まで透過できないことや、生体へのダメージ（光毒性）、観察対象物の自家蛍光、蛍光体自体の光分解による退色などが懸念されている。
【０００４】
そこで近年、近赤外（ＮＩＲ）光励起により、ＮＩＲ発光やアップコンバージョンによる可視発光を示す希土類含有セラミックスナノ粒子（ＲＥＤ−ＣＮＰ）を用いた蛍光イメージングの研究が盛んに行なわれている。ＮＩＲ発光やアップコンバージョン発光では、ＮＩＲ光励起により、光散乱、光毒性、観察対象物の自家蛍光の全ての問題を軽減できる。また蛍光体そのものはセラミックスであるため、長時間励起しても退色することがない。このような長所からＲＥＤ−ＣＮＰの蛍光バイオイメージングへの応用が期待されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）。これらの文献の前者には、希土類イオンをドープしたナノ結晶ＮａＹＦ４：Ｙｂ，Ｅｒをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）でコーティングすることにより近赤外領域における励起により非常に強いアップコンバージョン発光を生じるナノ粒子が提供できることについて記載されている。後者には、ＮａＹＦ４：Ｙｂ、Ｅｒ（Ｔｍ）／ＮａＹＦ４コア／シェル（Ｃ／Ｓ）型の六方晶ナノ粒子を両親媒性ポリマーの層により親水性にしたところ、粒子が水溶性になり、ｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中やｐＨ９．３ＴＢＥバッファー（Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ）中で安定であることが示されている。この文献において、両親媒性ポリマー（２５％オクチルアミンおよび４０％イソプロピルアミン修飾ポリ（アクリル酸））は該粒子に予め固定されたオレイルアミンのオクタデシル基との疎水性相互作用を介してコーティングされている。さらにまた、本発明者等の一部は、ＥｒでドープしたＹ２Ｏ３ナノ粒子表面にポリ（アクリル酸）とα−アセタール−ポリ（エチレングリコール）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（２−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）の多層を固定した粒子を製造し、これらの粒子が水性溶液中で一定の分散安定性を示すことを報告した（非特許文献３）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−８０９０３公報
【特許文献２】特開２００２−１２１５４８公報
【非特許文献１】Ｄｅｖ  Ｋ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９（２００８）９３７−９４３
【非特許文献２】Ｇｕａｎｇ−Ｓｈｕｎ  Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２００７，１９，３４１−３４３
【非特許文献３】Ｙｕｋｉｏ  Ｎａｇａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００６），１９（２），１４５−１４９
【発明の開示】
【０００６】
ＲＥＤ−ＣＮＰは蛍光バイオイメージングへの応用に適した性質を持つが、生体環境下では極めて高濃度の夾雑タンパク質や高いイオン強度にあるため、このような環境下で分散し、機能する材料設計が必要になる。前記非特許文献１ないし非特許文献３では、一定のポリマーでコートされたナノ粒子が水溶性になり、また、一定のｐＨにおいて安定な分散性を示すことが記載されている。非特許文献１によれば、ＰＥＩに葉酸を共有結合することにより癌細胞のイメージングに使用できることも記載されている。
【０００７】
しかしながら、生体環境下で実用化するには、未だ、必ずしも満足できる分散安定性や夾雑タンパク質等の非特異的吸着を抑制できるものでない。
【０００８】
そこで、本発明者等は、ＲＥＤ−ＣＮＰの表面の修飾について検討してきた結果、非特許文献１および非特許文献２では、それぞれナノ粒子表面へのアミノ基（またはイミノ基）を介するポリマー（ＰＥＩ）および特定の連結基（オクタデシル基）の結合を利用しているのとは対照的に、一定のブロック共重合体の側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントを介してポリ（エチレングリコール）鎖セグメントをＲＥＤ−ＣＮＰ表面に担持させたところ、該ブロック共重合体がＲＥＤ−ＣＮＰ表面へ安定に固定化されることのみならず、高いイオン強度下の水性溶液中でも安定にＲＥＤ−ＣＮＰを分散させることができることを見出した。さらに、上記のブロック共重合体をＲＥＤ−ＣＮＰ表面へ固定する際に該共重合体に加えて、特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子を共存させて処理すると、該生体分子がＲＥＤ−ＣＮＰ表面へ効率よく共固定されることも確認された。しかも、こうして固定された生体分子はそれらが本来有していた特定の生体物質に対する標的指向性を保持していることも確認された。
【０００９】
したがって、本発明によれば、表面の修飾された希土類含有セラミックスナノ粒子（ＲＥＤ−ＣＮＰ）であって、該粒子表面に、式（Ｉ）
ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（ｃａｒｂｏ）              （Ｉ）
式中、ＰＥＧはα−末端が修飾されていてもよいポリ（エチレングリコール）鎖を含むセグメントを表し、そして
ポリ（ｃａｒｂｏ）は側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントを表す、
で示されるブロック共重合体が該カルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖を介して固定されている、上記表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰ、が提供される。
【００１０】
また、別の態様の発明として、該粒子表面に、該共重合体の他に、さらに特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子が共固定されている、上記表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰも、提供される。
【００１１】
前者では、それ自体蛍光イメージングツールとして使用できることのみならず、例えば、後述するようなＰＥＧのα−末端の官能基を介して該生体分子または非特許文献１に記
載されているような葉酸の如きリガンドを共有結合し、標的指向性を付与することもできる。一方、後者では、該生体分子の特定の生体物質に対する標的指向性を利用して、組織学的な標識として、また、各種のバインディングアッセイ等に使用できる。
【００１２】
＜発明の詳細な記述＞
本発明にいう、希土類含有セラミックナノ粒子（ＲＥＤ−ＣＮＰ）は、本発明の目的に沿うものである限り、それらの構成元素種、調製方法の如何を問うことなく、近赤外光励起によるアップコンバージョンを伴う如何なる発光ナノ粒子であってもよい。また、ナノ粒子と称するのは、主として数ナノ（ｎｍ）ないし数１００ナノ（ｎｍ）サイズにある粒子を意図しているが、数μｍにある微粒子を排除することまで意図するものではない。このような、ＲＥＤ−ＣＮＰには、上記非特許文献１〜３、またはそこで引用された文献に記載されたナノ粒子も包含される。限定されるものでないが、元素組成で表すと、ドープする（または含有せしめる）希土類元素または希土類元素の組み合わせをＸとしてＹ２Ｏ３：Ｘ，Ｌａ２Ｏ３：Ｘ，Ｇｄ２Ｏ３：Ｘ，Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｘ，Ｇｄ２Ｏ２Ｓ：Ｘ，Ｌａ２Ｏ２Ｓ：Ｘ，ＹＯＦ：Ｘ，Ｙ３ＯＣｌ７：Ｘ，ＹＦ３：Ｘ，ＧｄＦ３：Ｘ，ＬａＦ３：Ｘ，ＬｉＹＦ３：Ｘ，ＮａＹＦ４：Ｘ，ＢａＹＦ５：Ｘ，ＢａＹ２Ｆ５：Ｘ，ＹＧａＯ３：Ｘ，Ｙ３Ｇａ５Ｏ１２：Ｘ，ＹＳｉＯ５：Ｘ，ＹＳｉ３Ｏ７：Ｘ，ＬａＯＣｌ：Ｘ，ＬａＯＢｒ：Ｘ，ＹＯＣｌ：Ｘ，ＹＯＢｒ：Ｘ，ＬａＰＯ４：Ｘ，ＹＰＯ４：Ｘ，ＬａＶＯ４：Ｘ，ＹＶＯ４：Ｘ，Ａｌ２Ｙ４Ｏ９：Ｘ，ＡｌＹＯ３：Ｘ，Ｙ３Ａｌ５Ｏ１２：Ｘをあげることができる。単独でドープする希土類元素Ｘとしては、Ｃｅ，Ｐｒ，Ｎｄ，Ｓｍ，Ｅｕ，Ｔｂ，Ｄｙ，Ｈｏ，Ｅｒ，Ｔｍ，Ｙｂをあげることができる。ドープする希土類元素の組み合わせはＣｅ，Ｐｒ，Ｎｄ，Ｓｍ，Ｅｕ，Ｔｂ，Ｄｙ，Ｈｏ，Ｅｒ，Ｔｍ，Ｙｂの中から複数の組み合わせをあげることができるが、好ましくはＹｂとＰｒ，Ｅｕ，Ｈｏ，ＥｒまたはＴｍの組み合わせをあげることができる。
【００１３】
本発明で用いる式（Ｉ）で示されるブロック共重合体におけるポリ（ｃａｒｂｏ）は、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（リンゴ酸）よりなる群から選ばれるポリマー由来であることができる。また、式（Ｉ）において、ＰＥＧのα−末端が修飾されている場合の例は、置換もしくは未置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、ヒドロキシ、等であることができる。置換されたアルコキシにいう、置換基は、限定されるものでないが、アミノ、モノ−もしくはジＣ１−Ｃ３アミノ、Ｒ１Ｒ２ＣＨ−（ここで、Ｒ１およびＲ２は独立してＣ１−Ｃ６アルコキシ、アリール−Ｃ１−Ｃ３アルコキシおよび−Ｏ−ＣＨ（Ｒ’）−ＣＨ２−Ｏ−から選ばれるアセタールもしくはケタール残基であることができ、Ｒ’は水素原子もしくはＣ１−Ｃ３アルキルであることができる）、マレイミド基およびヒドラジド基であることができる。これらの基は、必要により、特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子やその他のリガンド等を共有結合させるのに利用できる。
【００１４】
式（Ｉ）で示されるブロック共重合体でより具体的なものとしては、下記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ−ａ）、（ＩＩＩ−ｂ）、（ＩＶ−ａ）および（ＩＶ−ｂ）で示されるブロック共重合体を挙げることができる。
【００１５】
【化１】
2010112861.tif 000002
【００１６】
上記式中、
Ａは水素原子または置換もしくは未置換の炭素原子１２個までのアルキル基を表し、
Ｌは直接結合または二価の連結基を表し、
Ｔは水素原子、ヒドロキシル基または−ＺＲ”であって、ここでＺは単結合、ＣＯ、ＯもしくはＮＨを表し、Ｒ”は水素原子、置換もしくは未置換の炭素原子１２個までの炭化水素基を表し、
Ｒは水素原子またはメチル基を表し、
ｍは４〜２５００、好ましくは、１０〜１０００、より好ましくは１００〜２５０の整数であり、
ｎは５〜１０００、好ましくは、１０〜１０００、より好ましくは３０〜５０の整数であり、
ｘ＋ｙまたはｚは５〜１０００、好ましくは、１０〜５００、より好ましくは２０〜７０の整数であり、
そして各式中のカルボキシル基は、独立して３０％までエステル（例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ベンジル、フェネチル、等のアルコール成分との）の形態にあることができる。Ｌは直接結合または二価の連結基、例えば、Ｏ、ＮＨ、ＣＯまたはＸ（ＣＨ２）ｐＹであ
って、ここでＸはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨもしくはＣＯＯを表し、ＹはＮＨもしくはＣＯを表し、ｐは１〜６の整数を表す。
【００１７】
上式中の各基または各部分の定義は、より具体的には、次のごとき意味を有する。「炭素原子１２個（以下、Ｃ１２のように略記する場合あり。このような記載様式は、他の炭素原子を有する基を表示する場合にも同様に用いられる。）までのアルキル基」とは、直鎖もしくは分岐鎖であってもよいアルキル基であって、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよびｎ−もしくはｉｓｏ−ドデシルを表す。このようなアルキル基の置換基としては、本発明の目的に沿う限り、どのような基であってもよいが、好ましくは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−（ここで、Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシ、アリールオキシもしくはアリール−Ｃ１−３アルキルオキシを表すか、一緒になってＣ１−Ｃ６アルキルで置換されていてもよいエチレンジオキシ（−Ｏ−ＣＨ（Ｒ′）−ＣＨ−Ｏ−、ここで、Ｒ′は水素原子またはＣ１−Ｃ３アルキル基である）を表わす）の基、式Ｒ１′Ｒ２′ＮＣＨ２−（ここで、Ｒ１′およびＲ２′は独立して、有機シリル型のアミノ保護基、例えばトリアルキルシリル基またはＲ１′およびＲ２′はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜７員環のジシラ−アザシクロヘテロ環式環を形成しうる原子団である）の基を挙げることができる。例えば、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ−の基は、所謂、アセタール部分を示し、緩和な加水分解によって、容易にＯＣＨ−（アルデヒド基）に転化できる。他方、式Ｒ１′Ｒ２′ＮＣＨ２−の基は、例えば、テトラアルキルアンモニウムフロリドを含む溶液中で容易にＨ２Ｎ−に転化できる。
【００１８】
したがって、このような置換基を有する式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ−ａ）、（ＩＩＩ−ｂ）、（ＩＶ−ａ）または（ＩＶ−ｂ）で表されるブロック共重合体は、それらを用いて、本発明に従う表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰを形成した後、通常、主として該粒子のシェルまたは表面に存在する上記の置換基をアルデヒド基またはアミノ基に転化し、こうして得られた官能基を介して、特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子やその他のリガンド等を共有結合させることができる。このような置換基を有するポリエチレンセグメントの取得方法は既知であり、例えば、Ｒ１Ｒ２ＣＨ−基の場合は、ＷＯ９６／３３２３３（または対応するＵＳ−Ａ−５，９２５，７２０）を参考にすることができる。また、上記各式で示されるブロック共重合体の一部は市販されており、また多くは公知であり、かりに文献未載のものは公知のものの製造方法に準じて容易に製造できる。
【００１９】
特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子にいう、特定の生体物質としては、例えば、腫瘍細胞または組織において特異的に発現されているような物質、ＣＤ２０抗原やＨＥＲ２等を意味し、このような物質に対する標的指向性を有する生体分子としては、これらの物質に対して特的に結合するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体等の受容体の可溶性分子等であることができる。
【００２０】
上記の式（Ｉ）で示されるブロック共重合体は、本発明の目的上、ＲＥＤ−ＣＮＰ表面へ該ＲＥＤ−ＣＮＰが水性媒体、例えばリン酸緩衝化生理食塩水中で安定に分散できる程度に固定されていなければならない。使用するブロック共重合体の種類（各セグメントの分子量の変動を含む）等により最適値を特定することができないが、当業者であれば、後述する具体例を参照に、小実験を行うことでかような程度を容易に決定できるであろう。限定されるものでないが、熱重量分析（ＴＧＡ）により吸着ポリマー量を定量し、該表面のＰＥＧ密度を算出した場合に、０．００５１〜０．０３鎖／ｎｍ２、このましくは０．０１〜０．０３鎖／ｎｍ２の値をとることができる。また、ＲＥＤ−ＣＮＰ表面に、該共重合体の他に、さらに特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子が共固定されている場合、該生体分子は、それが該生体物質に対して指向性（または選択的な結合性）を示す限り、少なくとも粒子あたり、１分子存在すればよい。
【００２１】
このような表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰは、水性媒体中では、ＲＥＤ−ＣＮＰおよびその表面に結合した側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントが主として内部に存在し、α−末端が修飾されていてもよいポリ（エチレングリコール）鎖を含むセグメントが主として外側に存在するようなコア−シェル構造をとるものと確認している。
【００２２】
上記の表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰは、室温または必要により数度℃まで冷却した温度下、６〜２４時間ＲＥＤ−ＣＮＰと式（Ｉ）で示されるブロック共重合体を適当な緩衝水溶液（ｐＨ６．８〜８．０）中で混合攪拌することにより製造できる。ＲＥＤ−ＣＮＰとブロック共重合体の割合は、通常、上記のＲＥＤ−ＣＮＰの単位表面積あたりＰＥＧの密度を考慮し、ＲＥＤ−ＣＮＰに対してブロック共重合体が大過剰になるように用いる。例えば、重量比で、ＲＥＤ−ＣＮＰに対してブロック共重合体を１対１〜１０となるように混合すればよい。混合攪拌後、遠心（例えば、９００００Ｇ、１５分間）精製を数度繰返すことにより目的の生成物を取得できる。こうして取得した生成物である表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰは、如何なる機序によりブロック共重合体が表面に固定されているか定かでないが、高イオン強度（例えば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）下で攪拌しても表面から脱着もしくは放出されない。
【００２３】
本発明によれば、特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子は、上記製造方法においてＲＥＤ−ＣＮＰとブロック共重合体の混合攪拌時に生体分子も一緒に混合攪拌することにより、容易にＲＥＤ−ＣＮＰの表面に固定できる。理論により拘束されるものでないが、ブロック共重合体分子がその中の複数の側鎖カルボキシル基を介してＲＥＤ−ＣＮＰの表面へ固定される時にポリ（ｃａｒｂｏ）鎖マトリックスが該生体分子を上記表面固定してしまうのかも知れない。こうして固定された生体分子は、該分子が表面に固定されたＲＥＤ−ＣＮＰを用いて生体分子が標的とする生体物質を水性媒体中で蛍光ラベリング処理する間、該ＲＥＤ−ＣＮＰ表面から実質的に放出されない。
【００２４】
したがって、本発明によれば、上記の表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰを含んでなる特定の生体物質の蛍光ラベリングするための試薬が提供される。また、上記の表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰを生物学的試料と接触させ、次いでＲＥＤ−ＣＮＰの近赤外光励起による近赤外発光または可視発光を観察することとを含んでなる該試料中の特定生体物質の検出方法も提供される。上記接触は、生物学的試料、例えば、血液、尿等の体液、または特定の器官の細胞もしくは組織と室温または、必要により数度℃に冷却した温度下で直接行うことができる。こうして試料中の特定の分子または領域に結合したＲＥＤ−ＣＮＰに励起光として近赤外線を照射することにより該分子または領域を発光させ観察可能にする。
【００２５】
以上に説明したとおり、生体条件下において高い分散安定性を持ち、さらに特異吸着性、非特異吸着抑制能をも併せ持つ上記の表面の修飾されたＲＥＤ−ＣＮＰは、これまで報告されてきた蛍光イメージング用のＲＥＤ−ＣＮＰと比較し、より生理条件下で高い機能性を持つ材料である。そのため、これまでの蛍光イメージングの欠点の多くが解決でき、これまでに観察が困難であった生体内外の現象を可視化できることで、本発明は、生命科学の発展や新たな医療技術の開拓をもたらすことが期待される。
【００２６】
以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明する。
【００２７】
＜実施例１＞  希土類含有セラミックスナノ粒子（ＲＥＤ−ＣＮＰ）の合成
硝酸イットリウム・６水和物（４．０ｍｍｏｌ）、硝酸エルビウム・６水和物（０．３ｍｍｏｌ）、尿素（０．４ｍｏｌ）を加えた水溶液２００ｍｌを１００℃に加熱し、２時間
反応を行なった。得られた試料を遠心精製（２００００ｇ，１５ｍｉｎ，×３回）、溶媒置換（水）を行い、乾燥後に９００℃で１時間熱処理することで、エルビウム含有イットリアナノ粒子（ＵＮＰ１）を得た。
また、同様の方法で、硝酸イットリウム・６水和物（４ｍｍｏｌ）、硝酸エルビウム・６水和物（０．３ｍｍｏｌ）、硝酸イッテルビウム（０．３ｍｍｏｌ）、尿素（０．４ｍｏｌ）を加えた水溶液２００ｍｌを１００℃に加熱し、２時間反応させ、得られた試料を上記同様に遠心精製、溶媒置換を３回行い、乾燥後に９００℃で１時間熱処理することで、イッテルビウム、エルビウム含有イットリアナノ粒子（ＵＮＰ２）を得た。
【００２８】
＜実施例２＞  ＲＥＤ−ＣＮＰ表面のＰＥＧ修飾
ＵＮＰ２  １．０ｍｇとＰＥＧ−ｂ−ＰＡＡｃ（ポリ（アクリル酸））（Ｍｎ＝５０００／３２００、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｃｅ  社、カナダから入手）５．０ｍｇをＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ，ｐＨ７．０）１０ｍＬ中で攪拌（２４時間，４℃）、遠心精製（９００００Ｇ，１５ｍｉｎ，×３）し、ＰＥＧ化ＵＮＰ１（ＰＥＧ−ＵＮＰ１）を調製した。この調製したＰＥＧ−ＵＮＰ１のＦＴ−ＩＲ測定より、ＰＥＧ−ｂ−ＰＡＡｃ由来と考えられるカルボニル基の存在を確認した。このＰＥＧ−ＵＮＰ１のζ電位を測定したところ、ほぼ０ｍＶ付近を示しており、粒子表面にＰＥＧ−ｂ−ＰＡＡｃが吸着し、電位が遮蔽されているものと考察した。さらに熱重量分析（ＴＧＡ）により吸着ポリマー量を定量し、ＰＥＧ−ＵＮＰ１表面のＰＥＧ密度を算出した結果、０．０１９ｃｈａｉｎｓ／ｎｍ２となった。これらの結果より、ＰＥＧ−ｂ−ＰＡＡｃによってＵＮＰ１が効果的に修飾されていることが確認された。
【００２９】
＜実施例３＞  ＰＥＧ修飾ＲＥＤ−ＣＮＰの生理条件下における分散安定性評価
調製したＰＥＧ−ＵＮＰ１の分散安定性をＤＬＳ測定によって検討した、この結果、ＰＥＧ−ＵＮＰ１（１．０ｍｇ）は生理条件下（１０ｍＭ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１０ｍＬ中において１週間以上安定し、粒径分布にほとんど変化がないことが確認された。
【００３０】
＜実施例４＞  ＰＥＧ／ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ共固定ＲＥＤ−ＣＮＰの調製と特異的分子認識能の評価
ＵＮＰ２  １．０ｍｇとＰＥＧ−ｂ−ＰＡＡｃ（Ｍｎ＝５０００／３２００）５．０ｍｇ、ストレプトアビジン（ＳＡ）０．６ｍｇをＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ，ｐＨ７．０）１０ｍＬ中で攪拌（２４ｈ，４℃）、遠心精製（５００００Ｇ，１５ｍｉｎ，×３）し、ＰＥＧ／ＳＡ共固定ＵＮＰ２（ＰＥＧ／ＳＡ−ＵＮＰ２）を調製した。この調製したＰＥＧ／ＳＡ−ＵＮＰ２をビオチン標識抗体プレートに加えて蒸留水で洗浄した後、近赤外（ＮＩＲ）励起光（９８０ｎｍ）を照射して観察したところ、近赤外光励起型発光の一種であるアップコンバージョン発光（５５０ｎｍ，６６０ｎｍ）、さらに近赤外領域の発光（１５００ｎｍ）が見られた。
この抗体プレートの発光の明るさは、プレート上のビオチン標識抗体量に依存して増加することも確認され、ＰＥＧ／ＳＡ−ＵＮＰ２が特異的認識可能であることが示された。同様の手順でビオチン未標識抗体プレートにＰＥＧ／ＳＡ−ＵＮＰ２を加えた際には、アップコンバージョン発光および近赤外発光は観察されず、非特異吸着が起きていないことも確認された。
【００３１】
＜実施例５＞  ＰＥＧ／ＢＳＡ共固定ＲＥＤ−ＣＮＰの調製と特異的分子認識能の評価
ＵＮＰ１  １．０ｍｇとＰＥＧ−ｂ−ＰＡＡｃ（Ｍｎ＝５０００／３２００）５．０ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）５．０ｍｇをＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ，ｐＨ７．０）１０ｍＬ中で攪拌（２４ｈ，４℃）、遠心精製（９００００Ｇ，１５ｍｉｎ，×３）し、ＰＥＧ／ＢＳＡ共固定ＵＮＰ１（ＰＥＧ／ＢＳＡ−ＵＮＰ１）を調製した。この調製したＰＥＧ／ＢＳＡ−ＵＮＰ１を抗ＢＳＡ抗体プレートに加えて蒸留水で洗
浄した後、近赤外（ＮＩＲ）励起光（９８０ｎｍ）を照射して観察したところ、近赤外光励起型発光の一種であるアップコンバージョン発光（５５０ｎｍ，６６０ｎｍ）が見られた。この抗体プレートの発光の明るさは、プレート上の抗ＢＳＡ抗体量に依存して増加することも確認され、ＰＥＧ／ＢＳＡ−ＵＮＰ１が特異的認識可能であることが示された。同様の手順で抗マウスＩｇＧ抗体プレートにＰＥＧ／ＢＳＡ−ＵＮＰ１を加えた際には、アップコンバージョン発光は観察されず、非特異吸着が起きていないことも確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＰＥＧとＳＡを表層に共固定したＲＥＤ−ＣＮＰの概略図と、アップコンバージョンによる可視発光、近赤外発光の画像である。
【図２】ＰＥＧ／ＳＡ共固定ＲＥＤ−ＣＮＰがビオチン化標識抗体プレート上において、抗体量依存的に発光の明るさが増加することを観察した画像である。
【図１】
2010112861.tif 000004
【図２】
2010112861.tif 000005