(57)【要約】【課題】本発明は、例えば、標的細胞へのウイルス介在遺伝子送達のための、ウイルスベクターの適用の改善を提供することを目的とする。本発明はまた、目的の核酸または他の治療的分子を送達できるウイルスベクターと、ウイルスベクターの標的細胞への結合または親和性をもたらすか、または促進することができるリガンドの混合物を含む組成物を提供することを目的とする。【解決手段】ウイルスに非共有結合的に結合している細胞ターゲティングリガンドを含む、宿主動物内の標的細胞にウイルスを送達するためのベクターを提供することにより上記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスに非共有結合的に結合している細胞ターゲティングリガンドを含む、宿主動物内の標的細胞にウイルスを送達するためのベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の背景)
１．技術分野
本発明は遺伝子移入および遺伝子治療法に関する。より具体的に、本発明は、核酸のヒトおよび他の動物の特異的臓器、組織または腫瘍へのインビトロおよびインビボウイルス送達を標的化するための組成物および方法を提供する。治療的遺伝子、例えば、ｗｔｐ５３を送達するための本発明の使用は、慣用の放射線および化学療法に増加した感受性をもたらすことができる。
【背景技術】
【０００２】
２．背景技術の記載
ウイルスベクターを使用した遺伝子送達および遺伝子治療は、かなり研究の対象となっている。癌の遺伝子治療の長年にわたる目的は、転移を含む腫瘍細胞を選択的に標的とする全身性送達システムである。核酸を、細胞内にウイルスベクターを介して挿入し、これらの細胞内で所望の治療的作用を産生するようにできる。例えば、遺伝子を細胞機能を干渉する欠損遺伝子、例えばｐ５３を置換するように挿入できる。核酸はまた細胞内に宿主動物に所望の治療的効果を産生するために、例えば、予防接種、免疫治療、またはアンチセンス発現のために細胞内に挿入できる。
【０００３】
ウイルスベクターは、核酸を宿主細胞に移入するためのウイルスにより使用されている細胞侵入機構を利用して開発されている。組換えレトロウイルスおよびアデノウイルスベクターは、インビトロおよびインビボ遺伝子移入を達成するためのストラテギーを使用して構築されている。治験のために認可されている遺伝子治療プロトコールの約８０％がウイルスベクターを使用する(Wivel and Wilson, 1998)。アデノウイルスベクターは、非分割細胞に挿入し、外因性遺伝子の相対的に大きな(＞８ｋｂ)ペイロードを運搬できるため、遺伝子治療のある形で利点を提供する(Berkner, 1998)。更に、アデノウイルス粒子は精製でき、１０１１ＰＦＵ／ｍＬより大きいタイターを産生できる(Wivel and Wilson, 1998)。これらのシステムの一つの欠点は、しかし、ウイルスの限定された細胞親和性であり、標的化ウイルス粒子の問題がまだ現在癌の治験で使用されている治療的ウイルスで解決されていない。したがって、細胞親和性を変える方法が開発されており、探求されている。
【０００４】
二機能性接合体の手段によるレトロウイルスの親和性を変えるシステムが記載されている(Roux et al., 1989)。二機能性接合体は、ウイルスコートに対する抗体、および、他方に、標的細胞の特異的細胞膜マーカーに方向付けされた抗体を含む。
【０００５】
Goud et al. (1988)は、二つのモノクローナル抗体(Ｍａｂ)を含む二機能性抗体を記載する。Ｍａｂは、モロニーレトロウイルスのｇｂ７０コートタンパク質およびヒトトランスフェリンレセプターに方向付けされた。これらの接合体は、レトロウイルスが、そうでなければ非浸透性の標的細胞に浸透することを可能にした。
【０００６】
ＷＯ９２／０６１８０(Wu et al., 1992)は、ウイルスの表面に標的細胞表面レセプターを結合した分子を提供し、細胞表面レセプターに特性のウイルスを作ることによる、親和性を変える方法を記載している。その明細書中では、レトロウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスを、アシアログリコプロテインレセプターに結合する炭水化物分子で化学的に修飾する。Wu et al.は外因性遺伝子を細胞に挿入するためのインビトロ法のみ記載している。
【０００７】
アデノウイルスベクターは、非分割細胞に入ることができ、約８ｋｂの外因性ＤＮＡ配列を運搬できるため、遺伝子治療のある形で利点を提供する。アデノウイルス粒子は精製でき、１０１１ＰＦＵ／ｍＬより大きいタイターを産生できる。
【０００８】
組換えアデノウイルスの使用の一つの制限は、標的特異的細胞タイプへの限定した能力である。多くの実験が、レセプター介在エンドサイトーシスを介したＤＮＡ複合体を有する非組換えアデノウイルスを使用した遺伝子移入が報告されており、アデノウイルスにエンドソームの中身の放出をさせる能力を提供する(Cotton et al., 1992; Wagner et al., 1992)。これらの方法は、トランスフェリン−ポリリジン／ＤＮＡ複合体を使用し、結合または非結合アデノウイルスを内面化する。Wagner et al. (1992)は、ポリリジンに接合することによりアデノウイルスベクターを修飾し、これをトランスフェリン−ポリリジン／ＤＮＡの接合体と複合体化させ、３重トランスフェリン−ポリリジン／アデノウイルス−ポリリジン／ＤＮＡ複合体を作る。標的化のための類似の試みは、トランスフェリン(Ｔｆ)のアデノウイルス粒子への結合であり、トランスフェリンレセプター(ＴｆＲ)が多くの腫瘍タイプで上昇するという事実の利点を使用する(Miyamoto et al., 1994; Baselga and Mendelsohn, 1994)。Schwarzenberger et al. (1997)は、分子接合体ベクター(ＭＣＶ)を記載する。ＭＣＶは、目的の遺伝子をを含むプラスミドをポリリジン(ＰＬ)と縮合させ、ＰＬは複製インコンピテントアデノウイルス(エンドソーム融解剤(endosomolytic agent))に結合し、ＰＬはビオチニル化リガンドを標的化するためにストレプトアビジンに結合している。しかし、Ｔｆのアデノウイルスへの共有結合、またはＴｆ−ポリリジン−アデノウイルス接合体の産生の現在の方法は、恐らく、Ｔｆ−修飾ウイルスを作るために必要な過酷な条件のために、減少した感染性をしばしばもたらすことが報告されている(Cotton et al., 1992; Wagner et al., 1992; Schwarzenberger et al., 1997)。
【０００９】
他の試みは、中和抗繊維または抗ｋｎｏｂモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの、フォレートまたはＦＧＦ２のようなリガンドへの架橋を必要とする(Rogers et al., 1997; Douglas et al., 1996)。キメラＦａｂリガンドと複合体化したアデノウイルスベクターは、腫瘍局在化にある約束を示し、天然アデノウイルスと比較してインビボで減少した肝臓毒性を示す。
【００１０】
Curiel et al., (米国特許第５,５２１,２９１号および５,５４７,９３２号)は、核酸を真核生物細胞に内在化させるための、複数アデノウイルスポリカチオン接合体を記載する。これらの接合体のいくつかは、内在化因子としての核酸に親和性を有する物質に結合したトランスフェリンを使用する。
【００１１】
Cotton et al. (米国特許第５,６９３,５０９号)は、通常浸透できない細胞に効率的に浸透するが、遺伝子発現および／またはそのエンドソーム融解特性を残したままの、報告された能力を有するアデノウイルスを記載する。トランスフェリンはアデノウイルス粒子に共有結合的に結合し、それらはレセプター介在エンドサイトーシスを受けることができる。この方法は、トランスフェリンを、アルデヒド基を炭水化物部分に含む形に酸化し、酸化トランスフェリンを還元条件下でアデノウイルスに結合させる。また、感染性が修飾後維持されているか、予期できないと記載されている。
【００１２】
Low et al. (米国特許第５,１０８,９２１号；第５,４１６,０１６号；および第５,６３５,３８２号)は、フォレート、ビオチン、チアミンおよびそれらのアナログのようなリガンドを使用した外因性分子の経膜輸送の促進のための方法を記載する。この方法はまた抗イディオタイプ抗体または、リガンドのレセプターと結合できる他の分子も使用し得る。記載された他のリガンドは、ナイアシン、パントテン酸、リボフラビン、ピリドキサールおよびアスコルビン酸を含む。
【００１３】
Xu et al. (1997)およびXu et al. (1999)は、Ｔｆのカチオン性リポソームへの添加が、リポソームの、正常ｐ５３遺伝子を含む外因性遺伝子の送達の能力を、インビトロおよびインビボの両方で有意に増加させることを発見した。最も顕著には、彼らは、ヌードマウスで異種移植片として生育している広範囲のヒト腫瘍細胞への非常に選択的なターゲティングを達成した。
【００１４】
本発明の背景を明らかにするため、または実施に関する更なる詳細を提供するための文献および本明細書で使用する他の材料は、引用して本明細書に包含させ、簡便のために添付の引用文献のリストに各々グループ化している。
【発明の概要】
【００１５】
(発明の要約)
本発明は、例えば、標的細胞へのウイルス介在遺伝子送達のための、ウイルスベクターの適用の改善を提供する。
【００１６】
一つの態様において、本発明は、目的の核酸または他の治療的分子を送達できるウイルスベクターと、ウイルスベクターの標的細胞への結合または親和性をもたらすまたは促進することができるリガンドの混合物を含む、組成物を提供する。混合物を産生するための記載の方法は、過酷な化学的処理によりもたらされ得るウイルス粒子の不活性化を避ける。混合物は単純な方法で調製し、ヒト患者への全身性(例えば、非経口)投与に適している。
【００１７】
他の態様において、本発明は、ウイルス粒子の中身の標的化送達を達成するため、前記混合物を、ヒトまたは他の動物にインビボで全身的に投与する方法を提供する。
【００１８】
他の態様において、本発明の治療的遺伝子である野生型ｐ５３の送達のための使用は、放射線および化学療法剤への増感を導く。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ｌａｃＺ遺伝子を担持するＴｆ標的化アデノウイルスベクターで感染させた後の、ＪＳＱ−３細胞で発現したβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子。５×１０４ＪＳＱ−３細胞／ウェルを２４ウェルプレートで培養した。２４時間後、細胞を１度血清無しのＥＭＥＭで洗浄し、血清無しの０.３ｍＬ  ＥＭＥＭまたは抗生物質を各ウェルに添加した。２００μＬ  ＥＭＥＭ中のトランスフェリン対ウイルスの異なる比率のＡｄ５ＬａｃＺまたはＴｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ複合体を、二つのウェルに添加した。５×１０２から５×１０５Ｔｆ分子／ビリオンの比率を使用した。ウイルス対細胞比は５００および１０００ウイルス粒子／細胞(ｐｔ／細胞)であった。３７℃、５％ＣＯ２で、２分に１回試験管を回転により混合しながら４時間インキュベーション後、０.５ｍＬの２０％血清添加ＥＭＥＭをウェルに添加した。培養２日後、細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、１×レポーター融解緩衝液(Promega)で融解させた。細胞融解物を、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および４５０μＭ  β−メルカプトエタノール含有２０ｍＭ  トリス(ｐＨ７.５)中の１００μＬの１５０μＭ  Ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシドで３７℃で３０分処理した。反応を１５０μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３の添加により停止させ、吸光度を４０５ｎｍで測定した。精製β−ガラクトシダーゼを標準曲線作成に使用した。結果を、β−ガラクトシダーゼ等量／総タンパク質ｍｇのミリ単位(ｍＵ)で示した。
【図２】Ｔｆ標的化アデノウイルス、マウス異種移植片モデルにおけるβ−ガラクトシダーゼレポーターの全身的送達の組織化学的分析。ＤＵ１４５異種移植片腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスに、１回、Ｔｆ−ＡｄＬａｃＺをｉ.ｖ.注射した。注射３日後、動物を殺し、腫瘍および正常組織を摘出してＸ−ｇａｌで染色した。図２Ａは、１.５×１０５Ｔｆ分子／ビリオンの比率でＴｆ−Ａｄｐ５３で全身的処置した動物由来の腫瘍を示す。図２Ｂは、図２Ａに対応する肝臓を示す。図２Ｃは、２.９×１０５Ｔｆ分子／ビリオンの比率でＴｆ−Ａｄｐ５３で全身的処置した動物由来の腫瘍を示す。図２Ｄは、図２Ｃに対応する肝臓を示す。図２Ｅは、５.８×１０５Ｔｆ分子／ビリオンの比率でＴｆ−Ａｄｐ５３で全身的処置した動物由来の腫瘍を示す。図２Ｆは、図２Ｅに対応する肝臓を示す。棒＝５０μｍ。
【図３】Ｔｆ−Ａｄｐ５３のｉ.ｖ.注射後のＤＵ１４５異種移植片腫瘍における外因性ｗｔｐ５３発現。ＤＵ１４５異種移植片を担持する無胸腺ヌードマウスに、Ｔｆ−Ａｄｐ５３または非標的化Ａｄｐ５３のいずれかをｉ.ｖ.注射した。４８時間後、動物を殺し、腫瘍および正常組織を摘出し、タンパク質をウェスタンブロット分析のために単離した。非処理マウスの腫瘍および臓器、ならびに親ＤＵ１４５細胞から単離したタンパク質をコントロールとして含んだ。これらの各々のサンプルの１００μｇの総タンパク質をレーン当たりに充填させた。インビトロでＡｄｐ５３に感染させたＤＵ１４５細胞の２.５μｇの総タンパク質も含んだ。ｐ５３タンパク質バンドを、モノクローナル抗ｐ５３抗体Ａｂ−２およびＥＣＬウェスタンブロットキットを使用して検出した。バンド１＝外因性ヒトｗｔｐ５３；バンド２＝外因性ヒトＤＵ１４５  ｐ５３；バンド３＝内因性マウスｐ５３。
【図４】インビボのＪＳＱ−３異種移植片腫瘍における全身性送達した腫瘍標的化アデノウイルスｐ５３と放射線治療の組合わせの効果。Ｔｆ−Ａｄｐ５３を１×１０５Ｔｆ分子／ビリオンの比率で作った。１×１０１０ウイルス粒子／マウス／注射(３×１０８ｐｆｕと等量)のＴｆ−Ａｄｐ５３または非標的化Ａｄｐ５３を、１００−２００ｍｍ３のＪＳＱ−３異種移植片腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスの尾静脈に注射した。最初のｉ.ｖ.注射の翌日から開始して、３０Ｇｙのイオン化放射線を、一日２Ｇｙの分割容量で動物の腫瘍の部位に適用した。組合わせ処置を受けた動物で、腫瘍の再生育は処置停止後８ヶ月後に観察されなかった。見えるようにするには誤差が小さすぎるため、Ｔｆ−Ａｄｐ(＋)放射線グループでエラーバーはない。棒は処置の期間を示す(約３週間)。全ての動物実験は、実験動物の世話および使用のための、Georgetown University Institutional Guidelinesにしたがって行った。
【図５】全身性送達した、腫瘍標的化アデノウイルス−ｐ５３によるＢ１６マウス肺転移癌のシスプラチン(ＣＤＤＰ)への化学感作。転移癌を、正常、同系Ｃ５７／ＢＩ／６マウスに、１×１０５細胞の静脈注射により誘発した。４日後に処置を開始した。Ｔｆ−Ａｄｐ５３およびコントロールＴｆ−ＡｄＬａｃＺを１.５×１０５Ｔｆ分子／ビリオンの比率で作った。１×１０１０ウイルス粒子／マウス／注射(３×１０８ｐｆｕと等量)のＡｄｐ５３、Ｔｆ−Ａｄｐ５３またはＴｆ−ＡｄＬａｃＺを、１週間に３回、合計１２−１３投与でｉ.ｖ.投与した。ＣＤＤＰを２−４日毎に３−５ｍｇ／ｋｇ、合計８−１３投与で腹腔内注射した。肺を処置が一巡した後に動物から摘出した。処置なし(図５Ａおよび５Ｅ)；ＣＤＤＰ単独(図５Ｂ)；非標的化Ａｄ−ｐ５３＋ＣＤＤＰ(図５Ｃ)；Ｔｆ−ＬａｃＺ＋ＣＤＤＰ(図５Ｆ)；Ｔｆ−Ａｄｐ５３単独(図５Ｇ)；Ｔｆ−Ａｄｐ５３＋ＣＤＤＰ(図５Ｄおよび５Ｈ)で処置した動物からの肺。
【図６】インビボＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片腫瘍における全身性送達した、腫瘍標的化アデノウイルス−ｐ５３と化学療法の組合わせの効果。
【図７】ＬａｃＺを有する非標的化アデノウイルスと、またはＬａｃＺを有するトランスフェリン標的化アデノウイルスと腫瘍内注射したＤＵ１４５細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの発現。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
(発明の詳細な説明)
ｗｔｐ５３を欠くマウスの正常な発育およびｐ５３発現細胞における照射後Ｇ１ブロックの観察は、ｗｔｐ５３が、増殖および発育中よりむしろＤＮＡ損傷後またはストレス後に、細胞の調節において機能することを示す。多くの慣用の抗癌治療(化学療法および放射線)はＤＮＡ損傷を誘導し、アポトーシスの誘導により作用するように見えるため、ｐ５３経路の変更は治療レジメの失敗を導くことが考えられる。
【００２１】
ｗｔｐ５３機能の欠失はまた放射線耐性の増加に関連する。ｗｔｐ５３の存在および続くＧ１遮断の欠失はまたある種のヒト腫瘍および細胞経における増加した放射線耐性と相関することが発見されている。これらは、頭頸部癌、リンパ腫、膀胱癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌および脳腫瘍に代表されるヒト細胞系を含む。
【００２２】
これらの考えを基に、ｗｔｐ５３機能を腫瘍細胞内で回復させる遺伝子治療が、ｐ５３依存的細胞周期チェックポイントおよびアポトーシス経路を回復させ、したがって化学物質／放射線耐性表現型の逆転を導くはずである。このモデルと矛盾せず、化学感受性が、アポトーシスに加えて、ｗｔｐ５３を担持する非小細胞肺癌マウス異種移植片におけるｗｔｐ５３の発現により回復した。ｐ５３−ヌル肺腫瘍細胞系Ｈ１２９９およびＴ９８Ｇ膠芽細胞腫細胞を含む異種移植片の化学感受性およびＷｉＤｒ大腸癌異種移植片のシスプラチンに対する感受性が証明されている。ドキソルビシンまたはマイトマイシンＣによる増加した細胞死も、ｗｔｐ５３のアデノウイルス形質導入によりＳＫ−Ｂｒ−３乳腫瘍細胞で示された。しかし、ある矛盾する報告が、ｐ５３発現と化学耐性の間の関係は、組織または細胞タイプ特異的成分を有し得ると示している。ｗｔｐ５３のアデノウイルスベクターによるトランスフェクションはまた卵巣および大腸−直腸腫瘍細胞を放射線に対して感受性にすることも示されている。アデノウイルス介在ｗｔｐ５３送達は、頭頸部腫瘍系の放射線耐性扁平上皮細胞癌(ＳＣＣＨＮ)における機能的アポトーシスを回復させ、これらの細胞をインビトロで放射線感受性にする。より顕著には、腫瘍内注射したアデノ−ｗｔｐ５３と放射線の組合わせが、確立したＳＣＣＨＮ異種移植片腫瘍の完全なそして長期の腫瘍退行を導いた。
【００２３】
本発明は、非標的化ウイルスベクターの腫瘍内注射の慣用的使用、または非標的化ベクターの全身性送達からさえ出発して、例えば、Roth et al.(米国特許第５,７４７,４６９号)に記載のような、遺伝子治療のための治療的分子の送達に向かう。
【００２４】
本明細書に示すデータは、このような複合体が、インビトロおよびインビボの両方で、一次および転移腫瘍の両方の腫瘍細胞を標的化し、放射線および／または化学療法に感受性にする(ｗｔｐ５３の発現により)優れた能力を証明する。
【００２５】
本発明は、高い程度の標的細胞特性および高い効率を伴う、治療的分子を全身性に送達する必要性に取り組み、全身性に投与したとき、この送達システムは、標的細胞がヒト癌細胞であるとき、転移癌および一次腫瘍に到達し、そして特異的にターゲティングできる。このシステムの手段による、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の正常の野生型バージョンの送達の結果、本発明者らは、腫瘍が放射線治療および／または化学療法に感受性になることを証明した。このシステムの高いトランスフェクション効率は、癌の生育の阻害だけでなく、先在する腫瘍および転移癌を完全に長期間除去する程の高い程度の感作をもたらす。
【００２６】
本発明の具体的態様は、トランスフェリンリガンドと、核酸を標的宿主細胞に送達できるウイルスベクター粒子の混合物を含む、薬学的に許容される組成物を提供する。ウイルスベクター(例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルスベクター)と細胞ターゲティングリガンドの、注射用滅菌水のような適当な媒体中での単純な混合が、ウイルスベクター単独で得られるものよりもトランスフェクション効率を上昇させる。ウイルスベクターとトランスフェリンの単純な混合物は、例えば、トランスフェリンレセプターを発現する細胞、例えば、ヒト癌細胞のトランスフェクションを増加させる。
【００２７】
トランスフェリンの使用は、広範囲のヒト癌に遺伝子を移入すること、または広範囲のヒト癌のための遺伝子治療に関連して特に有利である。広範囲のヒト癌細胞がトランスフェリンレセプターを含む。本発明の混合物中のトランスフェリンの存在は、ウイルスベクターが、これらの癌細胞を、効率的にそして特異的に標的とすることを可能にする。
【００２８】
タンパク質、ペプチド、ホルモン、抗体および抗体フラグメントのような他のリガンドが、このようなリガンドのレセプターを含む、またはレセプター介在エンドサイトーシスによりリガンドを内在化できる細胞にウイルスベクターを特異的にターゲティングするために有用である。リガンドは、例えば、ウイルスベクターの標的細胞への結合を促進するために機能する、天然のまたは組換えタンパク質である。リガンドの例は、インシュリン、毒素、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ヘレグリン、他のウイルス性または細菌性タンパク質、エストロゲンおよびプロゲステロンを含む。
【００２９】
本発明は、細胞ターゲティングリガンドの使用に関し、これは、このリガンドを第２のタイプのウイルスと混合したときに第１のタイプのウイルスで自然に発生し、本発明は、本リガンドをコードするウイルスに関連して天然に存在する細胞ターゲティングリガンドの使用は含まない。本発明は、リガンドが通常天然に存在するウイルスに関連して見られるよりも高い量で存在するとき、リガンドをコードするウイルスタイプに関連して、ウイルスによりコードされる細胞ターゲティングリガンドの混合物を含まない。
【００３０】
リガンドとウイルス粒子の間で複合体が形成される方法は、大量のリガンド分子がウイルス粒子の表面をコートし、それが血流を通って移動するとき、安定性を増加するものである。更に、表面上の多くの数のリガンド分子がまたウイルス抗原の遮断により免疫原性の減少に働き得る。
【００３１】
本発明は、組換え発現ウイルスの使用を含む。組換えアデノウイルス、ＡＡＶベクター(米国特許第５,１３９,９４１号)、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス(米国特許第５,２８８,６４１号)、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、ワクシニアウイルス、家禽ポックスウイルス(ＦＰＶ)、カナリアポックスウイルス(ＣＰＶ)(米国特許第５,９３３,９７５号；第５,７６２,９３８号；および第５,３７８,４５７号)、シンドビスウイルス、キメラまたはハイブリッドウイルス等のウイルスベクターを、本発明に関連して使用し得る。複製コンピテントまたは腫瘍細胞崩壊性ウイルスも本発明に関連して使用できる。
【００３２】
本発明はまたＭａｂ、リンカー、ポリリジン等を使用して、ウイルスベクターにトランスフェリンを結合させる、先に使用の方法に関連して記載されている苛酷な化学物質および複雑な処理工程を有利に回避する、ウイルスベクター−トランスフェリン混合物の製造法を提供する。
本発明により、リガンド−ウイルス混合物を、任意の担体または媒体(典型的に、水性担体)中で調製でき、インビトロまたはインビボ投与に薬学的に適した組成物を提供する。本組成物は、典型的に適当なｐＨに緩衝化され、浸透圧調節剤、抗生物質等のような適当な補助成分を含み得る。
【００３３】
混合物に使用するウイルス粒子の量および最終的に宿主動物に投与する(またはインビトロで細胞に投与する)量は、科学文献に記載の遺伝子移入および遺伝子治療の既知の原則に基づいて、当業者により決定される。本発明の混合物は、ウイルスベクターの投与に関して先に記載のものと類似の方法を介して投与され、インビトロまたはインビボ遺伝子移入または遺伝子治療をする。本発明は、ウイルスベクターの全身投与のための組成物および方法の提供により、現存する方法を改善する。本混合物の非経口投与(特に、静脈内または動脈内投与)が好ましい。ある場合、ウイルス粒子の実質的に(例えば、３０倍)少ない投与量を、本発明によりもたらされる改善された効率により、投与できることが予測される。あるいは、他の場合、既知の投与量を使用でき、増加した遺伝子の移入をもたらす。本発明の組成物中のウイルス粒子、リガンドおよび補助剤の濃度も、適当に選択する。
【００３４】
本発明の具体的態様は、本発明の組成物を、放射線治療および／または化学療法と共に使用するために提供される。
本発明は、特定のウイルスベクターに、またはリガンド−ウイルスベクター混合組成物の投与の特定の経路または形態に限定されない。所望の総量は実験的に決定でき、１回または複数回投与で、遺伝子治療を必要とする患者に提供できる。
【００３５】
実施例に示すデータは、Ｔｆ−アデノウイルス複合体が、腫瘍における、非標的化アデノウイルスベクターで見られるよりも著しく高いレベルの遺伝子発現の産生ができることを示す。本明細書で記載の遺伝子送達法は、Ｔｆ標的化ウイルスを作るための相対的に単純な方法に基づく。結合は非共有結合的であり、ＭＡｂ、リンカー、ポリリジン等を使用して、Ｔｆをウイルスベクターに結合するのに使用されていた先に使用の方法に関連して記載されている望ましくなく、恐らく毒性である副産物を作ることができる化学反応を含まず、過酷な化学的接合および複雑な加工段階を避ける。ウイルスのこれらの化学的修飾は、ウイルスの感染性を確実に低下させ、腫瘍毛細管に浸透するには恐らく大きすぎる凝集体を産生し得る。腫瘍内注射された、腫瘍細胞崩壊性ウイルスを含むウイルス遺伝子治療ベクターは治験中であるが、共有結合的修飾なしの標的化ウイルスで現在臨床研究下のものはない。
【００３６】
一つの薬剤ｐ５３遺伝子治療が長期間腫瘍を完全に除去するのに十分でないということは明らかになってきているが、Ｔｆ標的化アデノウイルスと慣用の放射線／化学療法の現在記載の組合わせは、生育阻害だけでなく、腫瘍退行を達成することができ、相乗作用を証明する。
【００３７】
本明細書に記載のインビボ研究は、全身性Ｔｆ−Ａｄｐ５３遺伝子治療と、慣用の放射線治療および／または化学療法の組合わせが、いずれかの処置単独よりも明らかにより有効であることを証明する。臨床的設定において、明白な腫瘍には６５から７５Ｇｙの、微細な疾患には４５から５０Ｇｙの放射線用量が頭頸部癌の処置に一般に用いられる。高用量の放射線または化学療法剤に付随する既知の有害な副作用を仮定すれば、低投与量の慣用の処置を可能にするための腫瘍の増感は、大きな臨床的利点である。さらに、放射線の場合、ｗｔｐ５３機能の全身性回復が、有効であると判明する放射線処置用量の減少をもたらし、再発した腫瘍の更なる治療的介入を可能にする。
【００３８】
化学療法および放射線に対する腫瘍の増感は、現在の治療モダリティーの効果の増加をもたらす。更に、その可能性は、この慣用の抗癌モダリティーの両方のタイプの必要な用量を減少し、それによりこれらの処置にしばしば関連するひどい副作用を減らすための腫瘍特異的組合わせ処置に存在する。実施例に記載のインビボ実験において、放射線と組合わせたＴｆ−Ａｄｐ５３の全身性投与は、完全なそして長期間の腫瘍退行を、腫瘍ターゲティングウイルスの３×１０８ｐｆｕほど少ない用量を使用してもたらした。この投与量は、Kataoka et al. (1998)により、非標的化Ａｄｐ５３と２−Ｍｅを使用して用いられたものと同様であった。本実験において、部分的腫瘍生育阻害(肺コロニー計数の３分の２減少)が観察された。
【００３９】
このシステムは遺伝子治療ベクターの腫瘍内注射の必要性を除き得るが、非常に攻撃的な癌の場合、また全身性および腫瘍内処置の両方を使用することが有益でもあり得る。このシステムはまた他のウイルス性癌処置の送達を助けるためにも適合し得る。例えば、爪の腫瘍細胞崩壊性ウイルスの現在の試験は全身性送達をサポートしていない。ＯＮＹＸ−０１５は、ｗｔｐ５３腫瘍抑制活性を欠く腫瘍細胞(“ｐ５３−欠失”細胞)中で効率的に複製し、殺し、正常細胞ではしない遺伝子的に修飾されたアデノウイルスである。このウイルスの特異的修飾は、正常細胞中で効率的に複製することを防止する。ＯＮＹＸ−０１５での臨床実験は、現在、頭頸部癌、膵臓癌および卵巣癌のため進行中である(Heise et al., 1997; Hall et al., 1998; Linke, 1998; Krin et al., 1998)。ウイルスが腫瘍を標的とする我々の能力は、ＯＮＹＸ−０１５のような他のウイルスをベースにした癌処置の効率を有意に改善し得る。
【００４０】
最も顕著には、全身性投与は、一次腫瘍および離れた転移癌に治療的遺伝子が到達できることを意味する。これは、腫瘍内注射で達成されるものと、明確に対照をなす。本明細書に記載の方法は、現存する組換えウイルスをターゲティングするために適合できる。送達する遺伝子にも無関係である。加えて、このシステムは、上記のように、腫瘍細胞崩壊性ウイルスでも使用できる。ターゲティングのためのＴｆの使用は、広範囲のスペクトルの癌が上昇したレベルのＴｆＲを発現し、５０％を超える癌で、ｐ５３遺伝子が関与するため、ヒト癌のｐ５３遺伝子治療に関連して特に魅力的である。したがって、これらの発見は、このＴｆ標的化アデノウイルス送達システムの、この疾病に対する戦いにおいて、遺伝子治療の最初の約束を果たすことを助ける、新規な、より優れたそして有効な形の癌の遺伝子治療としての臨床的な可能性を証明する。
【００４１】
具体的に、本発明の説明的態様を以下の実施例に提供する。
【実施例】
【００４２】
実施例１
トランスフェリン促進アデノウイルス形質導入効率
Ａ．トランスフェリン−アデノウイルス混合物の調製
ホロ−トランスフェリン(Ｔｆ、鉄飽和、Sigma)を滅菌水に５ｍｇ／ｍＬで溶解した。Ｅ.  ｃｏｌｉ  ＬａｃＺ遺伝子をＣＭＶプロモーターの制御下に含む、Ａｄ５ＬａｃＺと命名した、非増殖性(replication deficient)アデノウイルス抗原型５(AdcCMVntbeta-gal, Gene Transfer Vector Core, Unicersity of Iowa)を、ＰＢＳ＋３％スクロース中、１.１×１０１２粒子(ｐｔ)／ｍＬ(５.５×１０９プラーク形成単位、ｐｆｕ／ｍＬ)の濃度で、本研究に使用した。Ｔｆを最初に０.５ｍｇ／ｍＬに１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７.４で希釈し、次いでＴｆを５０μＬ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に、１０倍連続希釈で添加した。Ａｄ５ＬａｃＺを次いで試験管に添加し、Ｔｆ対ウイルス比率を１×１０２から１×１０６Ｔｆ分子／ビリオンまでの範囲とした。試験管を室温で揺すりながら(試験管を２分毎に一度回転させる)１０−１５分インキュベートし、次いで血清なしの１５０μＬ  ＥＭＥＭを各試験管に添加した。
【００４３】
Ｂ．アデノウイルス／Ｔｆ混合物を使用したインビトロ形質導入
我々は、ＡｄＬａｃＺ(Ｅ.  ｃｏｌｉ  ＬａｃＺ遺伝子をＣＭＶプロモーターの制御下に含む)と名付けた非増殖性アデノウイルス抗原型５、およびそのウイルスのＴｆ−修飾形(Ｔｆ−ＡｄＬａｃＺ)を使用した。Ｔｆ−ＡｄＬａｃＺがレポーター遺伝子を送達する能力を最適化するために、頭頸部のヒト扁平上皮細胞癌腫(ＳＣＣＨＮ)由来の細胞系ＪＳＱ−３(Weichselbaum et al., 1988)の培養を、異なる比率のＴｆ対ウイルスおよびウイルス粒子対細胞を使用して産生したＡｄＬａｃＺまたはＴｆ−ＡｄＬａｃＺで感染させた。
【００４４】
５×１０４  ＪＳＱ−３細胞／ウェルを２４ウェルプレートで培養した。２４時間後、細胞を一度血清なしのＥＭＥＭで洗浄し、０.３ｍＬの血清なしのＥＭＥＭまたは抗生物質を各ウェルに添加した。２００μＬ  ＥＭＥＭ中のトランスフェリン対ウイルスの異なる比率のＡｄ５ＬａｃＺまたはＴｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ複合体をウェルにデュプリケートで添加した。ウイルス対細胞比率は２０から２０００ウイルス粒子／細胞(ｐｔ／細胞)までであった。４時間、３７℃で５％ＣＯ２中で時々揺すりながらインキュベーションした後、０.５ｍＬの２０％血清含有ＥＭＥＭをウェルに添加した。２日の培養後、細胞を一度ＰＢＳで洗浄し、１×レポーター融解緩衝液(Promega)に融解した。細胞融解物を１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および４５０μＭ  β−メルカプトエタノール含有２０ｍＭ  トリス(ｐＨ７.５)中、１００μＬの１５０μＭ  Ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシドで３７℃で３０分処理した。反応を１５０μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３の添加により停止させた。吸光度４０５ｎｍで測定した。精製β−ガラクトシダーゼ(Boehringer)を使用して標準曲線を作成した。結果は、全タンパク質のｍｇ当たりのβ−ガラクトシダーゼ等量のミリ単位(ｍＵ)として示した。
【００４５】
Ｃ．組織化学的染色
Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ形質導入の組織化学的研究のために、２４ウェルプレート中の６０％コンフルエント細胞を、５時間上記のトランスフェクション溶液でトランスフェクトした。更に２日の培養後、細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌ(Xu et al., 1997)で染色した。トランスフェクション効率を青色染色細胞の割合として計算した。
【００４６】
Ｄ．結果および考察
Ｔｆ対ウイルスまたはウイルス対細胞の一定の比率で、Ｔｆ−ＡｄＬａｃＺでの発現は、非標的化ＡｄＬａｃＺで見られるよりも３倍から４倍の間高かった(図１参照)。５００ｐｔ／細胞または２.５ＭＯＩ(感染効率、またはｐｆｕ／ウェル)、レポーター遺伝子産物のβ−ガラクトシダーゼの１０ｍＵ／ｍｇタンパク質が、ＡｄＬａｖＺ単独で発現された。トランスフェリン−ウイルス混合物Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５００Ｔｆ分子／ｐｔ)での形質導入は、レポーター遺伝子発現の２５ｍＵ／ｍｇタンパク質を産生し、Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５,０００Ｔｆ分子／ｐｔ)は３０ｍＵ／ｍｇ発現を産生し、そしてＴｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５０,０００Ｔｆ分子／ｐｔ)は３８.８ｍＵ／ｍｇ発現を産生し、これはＡｄ５ＬａｃＺ単独よりも各々２.５倍、３倍および３.８倍より遺伝子導入が達成されたことを示す。１,０００ｐｔ／細胞または５ＭＯＩで、Ａｄ５ＬａＺ単独よりも、Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５００Ｔｆ分子／ｐｔ)は２.４倍多いレポーター遺伝子発現を、Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５０００Ｔｆ分子／ｐｔ)は３.３倍多い遺伝子発現を提供した。Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５０,０００Ｔｆ分子／ｐｔ)は、見かけ上の飽和である、２.６倍多い発現をした。したがって、Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ複合体の最適比は、約５００−５０,０００Ｔｆ分子／ｐｔ、好ましくは約５０００Ｔｆ分子／ｐｔであるように見える。ウイルス粒子の表面をコートするのに使用する大量のトランスフェリン分子は、血流を移動するとき、その安定性を増加させると考えられる。ビリオン表面上の大量のトランスフェリン粒子は、またウイルスの免疫原性のウイルス抗原曝露の遮断による減少のために働き得る。
【００４７】
組織化学的染色は、Ａｄ５ＬａｃＺ単独が２０−３０％形質導入効率を与えるが、トランスフェリン複合アデノウイルスＴｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５０００Ｔｆ分子／ｐｔ)は、７０−９０％効率を与えることが示された。
上記結果は、アデノウイルス−トランスフェリン混合物がアデノウイルス遺伝子形質導入を実質的に促進できることを証明する。
【００４８】
実施例２
ヌードマウスＪＳＱ−３異種移植片モデルにおけるトランスフェリン標的化全身性アデノウイルス遺伝子送達
Ａ．トランスフェリン−アデノウイルス複合体の製造
トランスフェリン−Ａｄ５ＬａｃＺ複合体を、実施例１に記載の製造に使用したものと類似の方法で製造した。１×１０９−１×１０１０ｐｔ  Ａｄ５ＬａｃＺ(ＰＢＳ＋３％スクロース中１×１０１２ｐｔ／ｍＬ)を異なる量のＴｆ(水中４から５ｍｇ／ｍＬ)と、１μｇから１ｍｇ  Ｔｆ／１×１０１０ｐｔ、または７.５×１０２−７.５×１０５Ｔｆ分子／ビリオンの範囲で混合した。混合物を室温で５−１０分揺すりながら(２分に１回の試験管の回転)インキュベートし、Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ複合体を形成させた。ＰＢＳ(ｐＨ７.４)を各試験管に添加し、１×１０９−１×１０１０ｐｔ／０.２−０.３ｍＬ／マウス注射に希釈した。
【００４９】
二つのタイプのヒト腫瘍を、上記培養実験で使用したＳＣＣＨＮ細胞系(ＪＳＱ−３)またはヒト前立腺癌細胞系ＤＵ１４５(Isaacs et al., 1991; Asgari et al., 1997)のいずれかの皮下注射によりヌードマウスに異種移植片として確立させた。ヌードマウス腫瘍モデルを、４−６週齢雌ヌードマウスの脇腹にＪＳＱ−３細胞またはＤＵ１４５細胞を皮下注射することにより確立させた(Xu et al., 1997)。腫瘍を１−２ｃｍ３のサイズまで生育させた。１×１０９−１×１０１０ｐｔ  Ａｄ５ＬａｃＺ複合体と異なる量の２００−３００μＬのＴｆを各マウスに、１ｃｃシリンジで３０Ｇ針で尾静脈から注射した。コントロールグループにおいて、Ａｄ５ＬａｃＺを注射した。注射３日後、腫瘍ならびにマウス組織を摘出し、１ｍｍ切片に切断し、ＰＢＳで１回洗浄し、２％ホルムアルデヒド／０.２％グルタールアルデヒドで４時間室温で固定した。固定した腫瘍切片を４回、各１時間洗浄し、Ｘ−Ｇａｌ溶液＋０.１％ＮＰ−４０(ｐＨ８.５)で一晩３７℃で染色した。染色した腫瘍切片を、通常の組織学的方法を使用して包埋させて薄片化にし、nuclear fast redで対比染色した。腫瘍当たり４個の切片を試験し、青色染色細胞で示される、β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現を評価した。
【００５０】
他の腫瘍切片を定量的β−ガラクトシダーゼアッセイのために使用した。組織を均質化し、１×レポーター融解緩衝液(Promega)に融解した。融解物を９６ウェルプレートに添加し、定量的β−ガラクトシダーゼアッセイを実施例１に記載のように行った。ある実験においては、定量的β−ガラクトシダーゼアッセイをまたLuminescent β-galactosidase Detection Kit II(Clontech)を使用して行った。
【００５１】
Ｂ．結果および考察
全身性、標的化ウイルス遺伝子送達を試験するために、ウイルスベクターを十分確立された固体腫瘍モデルにｉ.ｖ.注射した。二つの固体腫瘍異種移植片モデルを使用して、標的化ウイルス遺伝子送達システムを試験した。１×１０１０ｐｔのＡｄ５ＬａｃＺを、単独または異なる量のＴｆと複合体で、ＪＳＱ−３およびＤＵ１４５細胞の１−２ｃｍ３のサイズのヒト腫瘍異種移植片を担持するヌードマウスにｉ.ｖ.注射した。３日後、Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺを注射した腫瘍は、Ａｄ５ＬａｃＺ単独(＜１％)と比較して、増加したＸ−Ｇａｌ染色青色を示した。効果は、増加したＴｆ／ｐｔ比の結果、５％から３５％まで(０.０１ｍｇ−０.６ｍｇ／１０６ｐｔ)に増加した。効果は、Ｔｆ／ｐｔ比＞０.６−１ｍｇ／１０１０ｐｔ(約４.５から６×１０５Ｔｆ分子／ビリオン)で減少し始めた。これは図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅに示し、それらではβ−ガラクトシダーゼ発現細胞(Ｘ−ｇａｌ染色により示される)の割合が２.９×１０５Ｔｆ／ビリオンから５.８×１０５Ｔｆ／ビリオンにＴｆ−分子／ビリオン比を増加させるにつれて、実際に減少する(図２Ｃおよび２Ｅ)。更に、１.５×１０５Ｔｆ／ビリオンで、β−ガラクトシダーゼ発現は肝臓、および脾臓および肺を含む他の臓器で明らかでないが(図２Ｂ)、肝臓での少ないが、明らかに検出可能なβ−ガラクトシダーゼ発現が２.９×１０５Ｔｆ分子／ビリオンであった(図２Ｄ)。対照的に、高い比率のＴｆ／ビリオンで作ったＴｆ−Ａｄ５ＬａｃＺの注射は、顕著な肝臓染色をもたらした(図２Ｆ)。したがって、これらの発見に基づいて、顕著な腫瘍トランスフェクション効率を示すが、腫瘍特異性の最高の程度を維持する１.５×１０５Ｔｆ分子／ビリオンの比率が、本実験に最適であると決定した。最適条件は、ＪＳＱ−３で約０.０１−０.２ｍｇ／１０１０ｐｔ(７.５×１０３−１.５×１０５Ｔｆ分子／ビリオン)、およびＤＵ１４５で約０.０３−０.５ｍｇ／１０１０ｐｔであると考えられた。したがって、Ｔｆ／ｐｔ比率は、異なる腫瘍モデルでインビボで最適化できた。インビトロ最適Ｔｆ／ｐｔ比率は、より多くのトランスフェリンがターゲティングを改善するためのウイルスの安定化にインビボで必要であり得るように、インビボよりも小さいことは注意すべきである。０.２ｍｇ  Ｔｆ／１０１０ｐｔ(１.５×１０５Ｔｆ分子／ビリオン)比率を、続くＪＳＱ−３腫瘍のインビボ遺伝子治療実験に使用した。
【００５２】
定量的β−ガラクトシダーゼアッセイも、トランスフェリン標的化アデノウイルスをｉ.ｖ.注射されたマウスの腫瘍における遺伝子の発現の、アデノウイルス単独と比較した実質的増加を確認した。
【００５３】
ウイルスの標的化臓器送達は、またＴｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ複合体をｉ.ｖ.注射したマウスの肝臓でも観察されたが、肝臓送達は異なる好ましいＴｆ／ｐｔ比率を有し、例えば、０.５ｍｇ−１.３ｍｇＴｆ／１０１０ｐｔ(３.７５×１０５−９.７５×１０５Ｔｆ分子／ビリオン)である。Ａｄ５ＬａｃＺ単独をｉ.ｖ.注射したマウスにおいて、限られた数のみの肝臓細胞が青色に染色されていたが(＜１−５％)、Ｔｆ＋Ａｄ５ＬａｃＺをｉ.ｖ.注射したマウスは、増加した青色肝臓細胞を示した(１０％−４０％)。腫瘍標的化および肝臓標的化の間の好ましいＴｆ／ｐｔ比率の差は、本発明の全身性ウイルス送達システムが、異なる標的に選択的であるように最適化できることを説明する。
【００５４】
実施例３
ＤＵ１４５異種移植片ヌードマウスモデルにおけるインビボのｐ５３のトランスフェリン標的化アデノウイルス介在遺伝子送達およびタンパク質発現
トランスフェリン標的化アデノウイルスベクターがｐ５３遺伝子を腫瘍細胞に選択的に送達する能力を試験した。正常ヒトｐ５３遺伝子を担持する非増殖性アデノウイルス抗原型５を本実験に使用した。Ａｄｐ５３と名付けたこのウイルスをＴｆ−Ａｄｐ５３の製造に使用した。Ｔｆ−Ａｄｐ５３を、ホロ−トランスフェリンとＡｄｐ５３の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４中で１.５×１０５Ｔｆ分子／ビリオンの比率での混合により、製造した。１０分、４℃でインキュベーション後、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)、ｐＨ７.４を添加して最終容量３００μＬ／マウスとし、５％デキストロースの最終濃度にした。皮下ＤＵ１４５腫瘍担持ヌードマウスへのこれらのウイルスのｉ.ｖ.注射３日後、マウスを殺し、腫瘍および臓器を摘出し、ｐ５３タンパク質発現のウェスタンブロット分析を行った(図３)。この実験に使用した抗体は、ヒトｐ５３の正常および変異形の両方と反応し、マウスｐ５３と交差反応する。ｐ５３バンドはウイルス性に形質導入された野生型ｐ５３が、ＤＵ１４５細胞において見られるｐ５３の変異形の上に、ゲル中で移動することを示す。これは、図３の左の二つのレーンで見られ、ＤＵ１４５細胞を、Ａｄｐ５３との培養で感染させたＤＵ１４５細胞と比較する。ウイルス性にコードしたｗｔｐ５３を示す上部のバンドは、ＤＵ１４５細胞がインビトロでＡｄｐ５３に感染することを明らかにした。第１レーン(ＤＵ１４５＋Ａｄｐ５３)は、２.５μｇのタンパク質しか含まず、他方、図３の他の全てのレーンは１００μｇの総タンパク質を含むことは注意すべきである。
【００５５】
標的化Ａｄｐ５３(即ち、Ｔｆ−Ａｄｐ５３)を投与されたマウスからの腫瘍のウェスタンブロット分析は、一つの大きなバンドのように見えるように合わさった上部バンド(外来生ｐ５３)および下部バンド(内因性ＤＵ１４５  ｐ５３)を確認する。Ｔｆ−Ａｄｐ５３を投与されたマウスの腫瘍において、非標的化Ａｄｐ５３で処理したマウスからの腫瘍よりも、有意に多くの外来生ｐ５３があることは明白である。標的化Ｔｆ−Ａｄｐ５３で処理したマウスからの肝臓および他の主用臓器は、ｗｔｐ５３を僅かに示すか、示さない。対照的に、非標的化Ａｄｐ５３での処理は、肝臓における高いレベルの外来生ｐ５３をもたらした。予測されるように、非処理マウスの腫瘍は内因性ＤＵ１４５  ｐ５３しか含まず、これらの動物からの臓器は内因性マウスｐ５３しか含まなかった。これらの結果は、更に、非標的化Ａｄｐ５３でなくＴｆ−Ａｄｐ５３が、腫瘍をインビボで選択的に標的とでき、ｐ５３がｉ.ｖ.投与に続いて腫瘍組織内で効率的に発現させることを確認する。
【００５６】
実施例４
ＳＣＣＨＮ異種移植片ヌードマウスモデルにおける、放射線処置と組合わせたインビボトランスフェリン標的化全身性アデノウイルス介在遺伝子送達
遺伝子治療における標的化アデノウイルス送達システムの有用性の最終的な試験は、全身性に投与したときの腫瘍の処置におけるその効果である。機能的ｐ５３の損失が、放射線−耐性表現型に寄与し得ることは確立されている(Bristow et al., 1996)。我々は、先に、ｗｔｐ５３と慣用の放射線処置の組合わせが、確立された異種移植片を長期間にわたり除去することを証明した(Xu et al., 1999; Pirollo et al., 1997)。この実験の結果は、Ｔｆ−Ａｄｐ５３がヒト腫瘍細胞の異種移植片を放射線治療に対して増感する能力を示す。
【００５７】
異種移植片を、４−６週齢雌無胸腺ヌード(Ncr nu-nu)マウスに、各動物の尾の上の背中の下の方への４×１０６  ＪＳＱ−３細胞(コラーゲンマトリックスであるMatrigel(登録商標)中)の皮下注射により誘導させた。ＪＳＱ−３細胞系は再発性ＳＣＣＨＮ由来であり、非常に放射線耐性であることが既知である。腫瘍を１００−２００ｍｍ３のサイズまで発育させた。標的化Ａｄ−ｐ５３と名付けた標的化アデノウイルスを、実施例１のように、トランスフェリンと、ｗｔｐ５３をコードするＤＮＡを担持するアデノウイルスの混合により製造した。アデノウイルス粒子(ｐｔ)／プラーク形成単位(ｐｆｕ)を、この実験のために計算した。動物を４つのグループに分けた：(ｉ)非処理(−)照射；(ii)非標的化Ａｄ−ｐ５３(＋)照射；(iii)標的化Ａｄ−ｐ５３(−)照射；(iv)標的化Ａｄ−ｐ５３(＋)照射。１×１０１０ｐｔ／マウス／注射(約３×１０８ｐｆｕと等量)の標的化(Ｔｆリガンドとウイルスの混合物を注射)または非標的化(リガンドなし)Ａｄ−ｐ５３を、マウス(グループii、iiiおよびiv)に、尾静脈から、３から４日毎に注射した。合計６回の注射を行った。最初のｉ.ｖ.注射後、動物(グループiiおよびivの)を、腫瘍領域のみへの照射を可能にするリードホルダーに固定し、２.０Ｇｙの１３７Ｃｓ電離放射線の最初の分割用量を、J.L. Shepard and Associates Mark I照射器を使用して投与した。その後、動物は２.０Ｇｙ／日を５日連続で投与され、続く２日は照射処置なしであった。このサイクルを、合計３０Ｇｙが投与されるまで続けた。腫瘍サイズを、毎週、盲験法(blinded manner)で測定した。
【００５８】
非処置動物および放射線なしで標的化Ａｄ−ｐ５３を投与された動物は、５２日までに腫瘍による苦痛のために殺した(図４参照)。非標的化Ａｄ−ｐ５３＋放射線での処置は、一連の処置の間、腫瘍生育を遅らせた。しかし、処置を止めると、これらの動物の腫瘍は大きくなり始め、１２１日までにまた腫瘍による苦痛のために殺すようなサイズとなった。対照的に、Ｔｆ標的化Ａｄ−ｐ５３を放射線と組合わせて投与された動物の腫瘍は、処置の間または処置を停止した後でさえ、完全に退行し処置後８ヶ月以上、これらの動物における腫瘍の再発はなかった。
【００５９】
これらの結果と図３を一緒にして、Ｔｆ標的化アデノウイルスの全身性投与は、ｗｔ−ｐ５３を選択的に腫瘍に送達でき、慣用の放射線治療におけるその増感をもたらす。最も重要なことに、Ｔｆ−Ａｄｐ５３＋放射線の組合わせ処置は、長期間の腫瘍の根絶をもたらす。近年、Kataoka et al., (1998)は、Ａ５４９細胞を使用したマウスモデルにおける２−メトキシエストラジオール(２−Ｍｅ)と、非標的化Ａｄｐ５３の全身性送達の組合わせが、転移肺腫瘍生育を部分的に阻害することを報告している。この組合わせ処置は、肺コロニー数の３分の２の減少をもたらす。確かに将来有望であるが、この処置後に残っている腫瘍細胞は、最も確実に生育し、最終的に動物を殺す。対照的に、我々の結果は、Ｔｆ標的化Ａｄｐ５３が、明らかに完全な、長期(現在８ヶ月までの)皮下ＳＣＣＨＮ腫瘍の抑制をする。
【００６０】
実施例５
放射線処置と組合わせた、ＳＣＣＨＮ異種移植片ヌードマウスモデルにおけるインビボトランスフェリン標的化全身性アデノウイルス−介在遺伝子送達
ＪＳＱ−３異種移植片を、実施例４のようにNCr nu nuマウスに誘導させた。腫瘍を５０−６０ｍｍ３に発育させた。ヒトｗｔｐ５３をコードするＤＮＡあり(標的化Ａｄ−ｐ５３)またはなし(標的化Ａｄ)の標的化アデノウイルスを、トランスフェリンとアデノウイルスを実施例１に記載のように混合して製造した。アデノウイルス粒子(ｐｔ)／プラーク形成単位(ｐｆｕ)を計算した。動物を５つのグループに分けた：(ｉ)非処置(−)照射；(ii)非標的化Ａｄ−ｐ５３(＋)照射；(iii)標的化Ａｄ(＋)照射；(iv)標的化Ａｄ−ｐ５３(−)照射；(ｖ)標的化Ａｄ−ｐ５３(＋)照射。マウスに尾静脈から３から４日毎に３×１０９ｐｔ／マウス／注射をした。合計５回の注射をした。最初のｉ.ｖ.注射３日後、動物を、腫瘍領域のみへの照射を可能にするリードホルダーに固定し、２.０Ｇｙの１３７Ｃｓ電離放射線の最初の分割用量を、J.L. Shepard and Associates Mark I照射器を使用して投与した。その後、動物は２.０Ｇｙ／日を５日連続で投与され、続いて２日照射処置なしであった。このサイクルを、合計２６Ｇｙが投与されるまで続けた。腫瘍サイズを、毎週、盲験法で測定した。実施例４のように、非処置動物の腫瘍および照射なしで標的化Ａｄ−ｐ５３を投与された動物の腫瘍は、５０日までに動物を腫瘍による苦痛のために殺すほどの連続生育を証明した。照射およびｗｔｐ５３なしの標的化Ａｄで処置したグループにおける腫瘍は、処置中は、腫瘍のある最小の照射阻害を証明したが、処置を終了すると、腫瘍は容量が増加した。同様であるが、より劇的な再生育が、標的化Ａｄ−ｐ−５３を投与されたが、照射なしの動物のグループで処置後に起こった。これは、標的化Ａｄ−ｐ５３を照射と組合わせて受けたマウスと鋭い対比である。実施例４で観察されるように、これらの動物で続く腫瘍退行は、全ての処置の終了後８ヶ月まで続いた。マウスの寿命における８ヶ月は、人間の寿命の３０年に相当する。
【００６１】
実施例６
トランスフェリン標的化レトロウイルス遺伝子形質導入
レトロウイルスベクターは、治験において最も広範囲に使用されている遺伝子治療ベクターの一つである。アデノウイルスベクターと同様に、レトロウイルスベクターは欠しい特異性および有意な免疫原性を示す。
【００６２】
Ｅ.  ｃｏｌｉ  ＬａｃＺ遺伝子、ＲｖＬａｖＺ(A Lac Z, Gene Transfer Vector Gore, University of Iowa)を含む非増殖性レトロウイルスを、３×１０７形質転換単位(ＴＵ)／ｍＬを含む１×１０１０粒子(ｐｔ)／ｍＬで本実験に使用した。トランスフェリンとＴｆ−ＲｖＬａｖＺ複合体を、実施例１の記載と同様に製造した。簡単に、Ｔｆを０.５ｍｇ／ｍＬに１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７.４中で希釈し、異なる量のＴｆを５０μＬ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に連続希釈で添加した。ＲｖＬａｃＺを次いで試験管に添加し、Ｔｆ対ウイルス比が１×１０２から１×１０６Ｔｆ分子／ビリオンまでの範囲となるようにした。試験管を室温で１０−１５分、２分に１回揺すりながらインキュベートし、次いで血清なしの１５０μＬ  ＥＭＥＭを各試験管に添加した。インビトロレトロウイルス形質導入を、実施例１に記載のように行った。ウイルス対細胞比は１００から２０００ウイルスｐｔ／細胞であった。
【００６３】
５００ｐｔ／細胞または１.５ＭＯＩ(またはＴＵ／細胞)のウイルス用量で、３.４ｍＵ／ｍｇタンパク質のβ−ガラクトシダーゼがレトロウイルスＲｖＬａｃＺ単独で発現された。トランスフェリン−複合体化ウイルスでは、Ｔｆ−ＲｖＬａｃＺ(５００Ｔｆ分子／ｐｔ)の投与は６.８ｍＵ／タンパク質のβ−ガラクトシダーゼ発現をもたらし、一方Ｔｆ−ＲｖＬａｃＺ(５０００Ｔｆ分子／ｐｔ)の投与は９ｍＵ／ｍｇの発現をもたらし、これはＲｖＬａｃＺ単独の投与により産生されるよりも２倍および３倍高い遺伝子形質導入を示す。遺伝子形質導入は５００００Ｔｆ分子／ｐｔでプラトーに達する。１０００ｐｔ／細胞または３ＭＯＩの投与量で、Ｔｆ−ＲｖＬａｃＺ(５０００Ｔｆ分子／ｐｔ)はＲｖＬａｃＺ単独よりも２.１倍のより多いレポーター遺伝子発現を産生し、Ｔｆ−ＲｖＬａｃＺ(５００００Ｔｆ分子／ｐｔ)は３倍のより多いレポーター遺伝子発現を産生した。組織化学的染色は、ＲｖＬａｃＺ単独が２０−３０％形質導入効率であり、一方トランスフェリン−複合化レトロウイルスＴｆ−ＲｖＬａｃＺ(５０００Ｔｆ分子／ｐｔ)は６０−８０％形質導入効率であることを示した。この結果は、トランスフェリンとレトロウイルスの混合物が実質的にレトロウイルス遺伝子形質導入を促進できることを証明する。
【００６４】
実施例７
化学療法と組合わせた、同系マウスモデルにおけるインビボトランスフェリン標的化全身性アデノウイルス−介在遺伝子送達
免疫コンピテント動物モデルにおけるリガンド標的化、ウイルスｐ５３送達システムが腫瘍細胞を化学療法に対して増感させる能力を試験した。これらの実験のために選択したモデルは、Ｂ１６マウスメラノーマ肺転移癌モデルであった。複数の実験において、Ｂ１６細胞を、尾静脈から、免疫−コンピテントＣ５７／ＢＬ／６マウスに注射した。このモデルにおいて、肺の腫瘍コロニーは、腫瘍細胞によるメラニンの発現のために２−３週間で容易に目に見える。Ｂ１６細胞注射４日後、Ａｄｐ５３、Ｔｆ−Ａｄｐ５３および／またはシスプラチン(ＣＤＤＰ)の組合わせの処置を開始した。１×１０１０ウイルスｐｔ／マウス／注射(３×１０８ｐｆｕと同等)を、１.５×１０５Ｔｆ分子／ビリオンの比率で、全身性にｉ.ｖ.尾静脈注射により、１週間に３回、合計１２−１３ウイルス処置まで投与した。腹腔内ＣＤＤＰ(３−５ｍｇ／ｋｇ)を２−４日毎に投与し、合計８−１３投与量のＣＤＤＰを投与した。全ての処置１日後(Ｂ１６細胞の最初の注射の５週間後)、肺を動物から摘出し、１０％ホルムアルデヒドで潅流した。
【００６５】
図５Ａ−Ｈに示されるように、二つの別々の実験で、組合わせ処置を受けた動物から得た肺と、他のグループから得たものでは、劇的な差がある。ＣＤＤＰ単独およびＴｆ−Ａｄｐ５３単独は、非処置動物からの肺と比較したときにある効果が証明されるが、顕著な数の腫瘍コロニーがまだ明白である。同様に、コントロールウイルスＴｆ−ＡｄＬａｃＺ＋ＣＤＤＰで処置した動物の肺は、医薬の効果のみであることが明白である。より著しくは、非標的化Ａｄｐ５３をＣＤＤｐとともに投与された動物はまた複数の大腫瘍コロニーが存在し、全身性に送達された非処置Ａｄｐ５３の極小の作用を示す。しかし、対照的に、トランスフェリン標的化アデノウイルスｐ５３(Ｔｆ−Ａｄｐ５３)をＣＤＤＰと組合わせて投与された動物からの肺は、明白な腫瘍転移は目では見えない。これらの発見は、全身性に送達されたＴｆ標的化、Ａｄｐ５３が、腫瘍細胞を、慣用の放射線療法に加えて慣用の化学療法に増感できることを証明する。更に、Ｔｆ−Ａｄｐ５３はまた先に使用したヌードマウスモデルに加えて、同系マウスモデルでも有効に機能できる。
【００６６】
我々の全ての実験で用いるＴｆ分子はヒトＴｆである。ある種からのＴｆＲは、一定範囲の他の種からのＴｆに結合できることが知られている(Aisen, 1998)。それにもかかわらず、我々は、最初に、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍において見られる選択性は、我々が使用した、宿主の正常組織においてマウスＴｆＲに優先して腫瘍ＴｆＲにより認識されるヒトＴｆに起因すると考えた。Ｃ５７／ＢＬ／６マウスで生育しているＢ１６マウスメラノーマ細胞を含む全身性モデルシステムは、この点を再保証する。このモデルにおいて、腫瘍におけるＴｆＲおよび正常組織におけるＴｆＲは両方ともマウスＴｆＲである。それでもなお、我々は、ヒトＴｆと複合体化したアデノウイルスが、上昇したレベルのマウスＴｆＲを有する腫瘍に帰ることを証明できた。この発見は、上記のヌードマウスモデルにおいてヒト異種移植片にターゲティングをもたらすのは、種関連現象よりもむしろＴｆＲ発現のレベルであることを示し、我々がヒトにおけるヒト腫瘍生育の処置の最終的な目的を達成できる可能性を後押しする。
【００６７】
実施例８
トランスフェリン標的化単純ヘルペスウイルス形質導入
単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)は、複製コンピテントウイルスベクターであり、遺伝子治療で、特に、中枢神経系で広く使用されている(Walker, 1999)。アデノウイルスまたはレトロウイルスベクターと同様に、ＨＳＶは欠しい全身性および明白な免疫原性を示す。
【００６８】
複製コンピテントウイルスベクター、Ｇ２０７を標的化するためのトランスフェリンターゲティングストラテギーを使用する可能性を研究するために、レポーター遺伝子ＬａｃＺを伴うＨＳＶ(Walker, 1999)をヒトトランスフェリンと複合体化した。実施例１に記載のようなＴｆ−ＡｄＬａｃＺと同様な方法で、Ｇ２０７(１.１×１０９ｐｆｕ／ｍＬ, Nwuro Vir, Inc., ＰＢＳ中)をホロ−トランスフェリン(Sigma, ５ｍｇ／ｍＬ水溶液)と、異なる比率で混合した。実験の一つのセットにおいて、ＨＳＶを、Ｔｆと混合する前に３７℃で１０分インキュベートすることにより熱処理した。熱処理は、ＨＳＶを不活性化できるとの報告がある。
【００６９】
形質導入実験において、８×１０４  ＪＳＱ−３細胞／ウェルを２４ウェルプレートに培養した。２４時間後、細胞を１回、血清なしのＥＭＥＭで洗浄し、次いで０.３ｍＬの血清なしのＥＭＥＭまたは抗生物質を各ウェルに添加した。２００μＬ  ＥＭＥＭ中の異なる比率のトランスフェリン対ウイルスのＨＳＶまたはＴｆ−ＨＳＶ複合体を各ウェルに、ＭＯＩ＝１で添加した。４時間、３７℃、５％ＣＯ２で、試験管を２分毎に回転させることにより混合しながらインキュベーションした後、０.５ｍＬの２０％血清添加ＥＭＥＭを各ウェルに添加した。培養２日後、細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、１×レポーター融解緩衝液(Promega)に融解した。細胞融解物を１００μＬの、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および４５０ｍＭ  β−メルカプトエタノール含有２０ｍＭトリス(ｐＨ７.５)中の１５０μＭ  Ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシドで、３７℃で３０分処理した。反応を１５０μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３の添加により停止させた。吸光度を４０５ｎｍで測定した。精製β−ガラクトシダーゼ(Boehringer)を使用して標準曲線を作った。結果を、β−ガラクトシダーゼ等量／総タンパク質ｍｇのミリ単位(ｍＵ)で示した。結果を表１に示す。
【００７０】
表１
トランスフェリンはＨＳＶ形質導入効率を促進する
【表１】
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＊β−ガラクトシダーゼ活性、ｍＵ／ｍｇタンパク質
【００７１】
トランスフェリンは、複製コンピテントウイルスベクターであるＨＳＶの形質導入効率を促進する。ＨＳＶを熱不活性化したとき、Ｔｆとの複合体化はまだ促進された形質導入効率を示した。５００００のＴｆ／ビリオン比率およびＭＯＩ＝１で、ＴｆＨＳＶはＴｆターゲティングなしのＨＳＶよりも２倍以上大きいレポーター遺伝子発現をした。結果は、トランスフェリンターゲティングストラテギーが、ＨＳＶのような複製コンピテントウイルスベクターで使用できることを証明する。
【００７２】
実施例９
化学療法剤ドセタキセル(タキソテール)と組合わせたＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片ヌードマウスモデルにおけるインビボトランスフェリン標的化全身性アデノウイルス介在遺伝子送達
この標的化アデノウイルス送達システムの有用性を更に証明するために、第２の腫瘍モデルであるヒト乳癌由来細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を使用した。更に、化学療法がしばしば選り抜きの乳癌の処置であるため、この実験は、本発明の送達システムが、確立されたヒト乳癌異種移植片の慣用的に使用されている化学療法剤ドセタキセル(タキソテール)に対する増感をする能力を試験した。異種移植片を４−６週齢雌無胸腺ヌード(NCr nu-nu)マウスに、２.５×１０６  ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を各動物の乳房脂肪パッドに皮下注射することにより誘導させた。腫瘍を４０−５０ｍｍ３のサイズに発育させた。Ｔｆ−Ａｄｐ５３と名付けた標的化アデノウイルスを、実施例１に記載のように、トランスフェリンと、ｗｔｐ５３をコードするＤＮＡを担持するアデノウイルスの混合により製造した。動物を５つのグループに分けた：(ｉ)非処置(−)タキソテール；(ii)タキソテール単独；(iii)非標的化Ａｄｐ５３(＋)タキソテール；(iv)標的化Ａｄ−ｐ５３(−)タキソテール；(ｖ)標的化Ａｄｐ５３(＋)タキソテール。マウスに、３から４日毎に、標的化(Ｔｆリガンドとウイルスの混合物を注射した)または非標的化(リガンドなし)Ａｄｐ５３を、５×１０１０ｐｔ／マウス／注射で、尾静脈から、ｉ.ｖ.注射した。合計１２回の注射をした。最初の静脈注射の翌日、薬剤処置を開始した。動物は、タキソテールを７.５ｍｇ／ｋｇ、３から４日毎にｉ.ｖ.投与され、合計１１回注射した。腫瘍サイズを毎週盲験法で、合計６−８腫瘍／グループで測定した。腫瘍容量の平均サイズ／グループ(ｍｍ３)±標準誤差対時間(日)をプロットした(図６)。Ｔｆ−Ａｄｐ５３単独での処置は効果がなかったが、タキソテール単独または非標的化Ａｄｐ５３＋タキソテールでの処置はある生育阻害を誘導し、薬の効果を示す。しかし、より劇的なレベルの生育阻害が、Ｔｆ標的化Ａｄ−ｐ５３をタキソテールと組み合わせて投与された動物の腫瘍から観察された。これらの発見は、組合わせ処置の相乗作用を示し、本発明のトランスフェリン標的化Ａｄｐ５３複合体が多くのヒト腫瘍モデルで有効なだけでなく、腫瘍の化学療法剤への増感に使用できることを証明する。
【００７３】
実施例１０
ＤＵ１４５異種移植片ヌードマウスモデルにおけるインビボトランスフェリン標的化アデノウイルス介在遺伝子発現
前立腺癌由来細胞系ＤＵ１４５は、腫瘍内注射における改善された発現を証明する。ＬａｃＺ遺伝子を担持する非増殖性アデノウイルス抗原型５を本実験に使用した。無胸腺ヌード(nu/nu)マウスに、皮下的にMatrigel(登録商標)を使用して注射し腫瘍を作らせた。Ｔｆ−Ａｄ−ＬａｃＺを実施例１のように製造した。Ｔｆ／ｐｔの比率は、実施例２に記載のように０.１−０.２ｍｇ／１０１０ｐｔであった。マウスは二つの腫瘍を有したが、一つのみに注射した。
【００７４】
３×１０１０粒子／腫瘍の腫瘍内注射２４時間後、腫瘍を摘出し、切片に切り、液体窒素中で急速凍結させ、Bessamin組織粉砕機で粉砕した。β−ガラクトシダーゼ酵素活性を、Tropix, Inc.のGlacto-Star(登録商標)化学ルミネッセントβ−ガラクトシダーゼアッセイシステムを使用して、製造者のプロトコールにしたがって測定した。結果を図７に示す。Ｔｆ−Ａｄ−ＬａｃＺは、Ａｄ−ＬａｃＺと比較して、β−ガラクトシダーゼ発現の３.４倍より大きい増加をもたらした。結果は、トランスフェリンターゲティングストラテギーが腫瘍内注射における発現の増加に使用できることを証明する。
【００７５】
本発明は、本明細書中で、本発明の好ましい態様の詳細を引用して記載しているが、この記載は、本発明の精神および特許請求の範囲の範囲内で、修飾が当業者には容易になされるということが考えられるため、限定的意図よりむしろ説明的であることを意図することは理解されるべきである。
【００７６】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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