(57)【要約】【課題】細胞サイズを抑制しながら骨髄間質細胞（ＢＭＳＣｓ）あるいは間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を未分化の状態で増殖培養する。【解決手段】本発明の培養方法は、多軸回転によって生成した模擬微小重力環境下で骨髄間質細胞又は間葉系幹細胞を培養して培養前よりも平均の細胞サイズが小さい骨髄間質細胞又は間葉系幹細胞を得ることを特徴とする。このような培養方法で培養した骨髄間質細胞又は間葉系幹細胞は、中枢神経疾患治療用の移植細胞として好適である。【選択図】図１
2010246434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多軸回転によって生成した模擬微小重力環境下で骨髄間質細胞を培養して培養前よりも平均の細胞サイズが小さい骨髄間質細胞を得ることを特徴とする
骨髄間質細胞の培養方法。
【請求項２】
請求項１に記載の骨髄間質細胞の培養方法であって、
前記骨髄間質細胞がマウス骨髄間質細胞である
骨髄間質細胞の培養方法。
【請求項３】
請求項１に記載の骨髄間質細胞の培養方法であって、
前記骨髄間質細胞がラット骨髄間質細胞である
骨髄間質細胞の培養方法。
【請求項４】
多軸回転によって生成した模擬微小重力環境下でヒト間葉系幹細胞を培養して培養前よりも平均の細胞サイズが小さいヒト間葉系幹細胞を得ることを特徴とする
ヒト間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項５】
多軸回転によって生成した模擬微小重力環境下で骨髄間質細胞を培養して培養前よりも平均の細胞サイズが小さい骨髄間質細胞を移植細胞として得ることを特徴とする
中枢神経疾患治療用の移植細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄間質細胞の培養方法、間葉系幹細胞の培養方法、中枢神経系疾患治療用の移植細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで中枢神経系疾患は、神経再生ができず治療が困難とされてきたが、近年、新しい治療法としての再生医療に期待が寄せられている。この再生医療としては、従来、胚性幹細胞や胎児脳から得られた神経幹細胞を脳内に移植する方法が検討されてきたが、免疫拒絶、細胞供給の限界、倫理上の問題などが取り上げられている。
【０００３】
このような問題を解決する治療法の一つとして、骨髄間質細胞（bone marrow stromal cells：ＢＭＳＣｓ）、或いは、骨髄間質細胞を精製して得られる間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells; ＭＳＣｓ）を移植することが提案されている。例えば、ラット脳梗塞モデルに対し、ＢＭＳＣｓの脳内移植治療が有効であったことが２０００年にChenらにより報告され（非特許文献１）、以来、ＢＭＳＣｓは、中枢神経系疾患における細胞治療の候補の一つと挙げられるようになった。ＢＭＳＣｓは採取が容易で、自家移植が可能であるため免疫拒絶の危険性が低く、倫理的問題が少ない。
【０００４】
更に、ＢＭＳＣｓを静脈経由で細胞移植することも検討されている。薬剤投与と同様な点滴静脈注射により行われる静脈経由での細胞移植は、非浸襲的で安全性が高いと考えられている。静脈経由での細胞移植による治療効果は、例えば、下記の非特許文献２〜６に報告されており、実用化に近いと考えられている。Bang et al.によれば、既に、中大脳動脈閉塞患者にＢＭＳＣｓを静脈内自家移植した臨床治験が行われ、脳萎縮を減少させ、機能的な改善効果が見られたと報告されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Chen et al, "Intracerebraltransplantation of bone marrow with BDNF after MCAo in rat", Neuropharmacology,39, (2000) pp. 711-716.
【非特許文献２】O. Y. Bang et al. "Autologous mesenchymalstem cell transplantation in stroke patients", Ann. Neurol., 57, (2005)pp. 874-882.
【非特許文献３】J. Chen et al., "Therapeutic Benefit ofIntravenous Administration of Bone Marrow Stromal Cells After Cerebral Ischemiain Rats", Stroke, 32, (2001) pp. 1005-1011.
【非特許文献４】T. Honma et al. "Intravenous infusion ofimmortalized human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebralischemia model in adult rat", Exp. Neurol., 199, (2006) pp. 56-66.
【非特許文献５】D. Lu et al. "Adult bone marrow stromalcells administered intravenously to rats after traumatic brain injury migrateinto brain and improve neurological outcome", Neuroreport, 12, (2001) pp.559-563.
【非特許文献６】T. Okazaki et al. "Intravenousadministration of bone marrow stromal cells increases survivin and Bcl-2protein expression and improves sensorimotor function following ischemia inrats", Neurosci. Lett., 430, (2008) pp. 109-114.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＢＭＳＣｓ又はＭＳＣｓを静脈経由で細胞移植する場合、まず、ＢＭＳＣｓ又はＭＳＣｓを体外で未分化の状態で増殖培養する必要がある。本願の発明者は、増殖培養の際に培養細胞のサイズを小さくすることができれば、血流により末梢血管まで移植細胞が行き渡らせることができるのではないかと考えた。末梢血管まで移植細胞が行き渡らせることができれば、静脈経由での細胞移植の際に生着率を向上させることができ、治療効果が増大すると考えられる。
【０００７】
そして、発明者は、試行錯誤により、ＢＭＳＣｓ或いはＭＳＣｓを、細胞のサイズを抑制しながら体外で未分化の状態で増殖培養する方法を見出した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣｓ）あるいは間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を細胞のサイズを抑制しながら体外で未分化の状態で増殖培養する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一の観点において、本発明の骨髄間質細胞の培養方法は、多軸回転によって生成した模擬微小重力環境下で骨髄間質細胞を培養して培養前よりも平均の細胞サイズが小さい骨髄間質細胞を得ることを特徴とする。
【００１０】
一実施形態では、前記骨髄間質細胞がマウス骨髄間質細胞であることが可能であり、他の実施形態では、前記骨髄間質細胞がラット骨髄間質細胞であることが可能である。
【００１１】
他の観点において、本発明のヒト間葉系幹細胞の培養方法は、多軸回転によって生成した模擬微小重力環境下でヒト間葉系幹細胞を培養して培養前よりも平均の細胞サイズが小さいヒト間葉系幹細胞を得ることを特徴とする。
【００１２】
本発明の更に他の観点において、本発明の中枢神経疾患治療用の移植細胞の製造方法は、多軸回転によって生成した模擬微小重力環境下で骨髄間質細胞を培養して培養前よりも平均の細胞サイズが小さい骨髄間質細胞を移植細胞として得ることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、細胞サイズを抑制しながら骨髄間質細胞（ＢＭＳＣｓ）あるいは間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を未分化の状態で増殖培養することができる。また、本発明によれば、中枢神経疾患治療用に適した移植細胞を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態における３Ｄ−クリノスタットの構成の一例を示す図である。
【図２】ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列とＰＣＲ条件を示す表である。
【図３】Day 0、Day 7、Day 14におけるマウスＢＭＳＣｓの位相差顕微鏡像である。
【図４】培養されたマウスＢＭＳＣｓの細胞サイズの変化を示すグラフである。
【図５Ａ】Day 0、Day 7、Day 14におけるマウスＢＭＳＣｓのｍＲＮＡの発現を示す像である。
【図５Ｂ】Day 0、Day 7、Day 14におけるマウスＢＭＳＣｓの免疫染色像である。
【図６Ａ】ＢＭＳＣｓを移植したマウスのBeam Walking試験の結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】ＢＭＳＣｓを移植したマウスのRotarod試験の結果を示すグラフである。
【図７Ａ】マウスＢＭＳＣｓを移植したときのＮＦ−Ｈで染色した脳組織の免疫染色像である。
【図７Ｂ】マウスＢＭＳＣｓを移植したときのＭＡＰ２で染色した脳組織の免疫染色像である。
【図８Ａ】マウスＢＭＳＣｓを移植したときの単位面積当たりの移植細胞存在率を示すグラフである。
【図８Ｂ】マウスＢＭＳＣｓを移植したときの脳挫傷部位における移植細胞の生着率と細胞サイズを示す表である。
【図９】マウスＢＭＳＣｓを移植したときの移植細胞のＣＸＣＲ４の発現を示す染色像である。
【図１０】ラットＢＭＳＣｓを培養したときのｍＲＮＡの発現を示す像である。
【図１１】ラットＢＭＳＣｓを培養したときのＣＸＣＲ４のよう成立を示すグラフである。
【図１２】ラットＢＭＳＣｓを培養したときの細胞１個当たりの細胞接着面積を示すグラフである。
【図１３Ａ】ＢＭＳＣｓを移植したラットのBBB scoreを示すグラフである。
【図１３Ｂ】ＢＭＳＣｓを移植したラットのInclined plane scoreを示すグラフである。
【図１４】ＢＭＳＣｓを移植したラットの脊髄組織における移植細胞の分布と存在率を示す像である。
【図１５Ａ】ＢＭＳＣｓを移植したラットの脊髄組織のＨ＆Ｅ染色像である。
【図１５Ｂ】ＢＭＳＣｓを移植したラットの損傷部脊髄における空洞率を示すグラフである。
【図１６】脊髄損傷部位における移植細胞の生着率と培養細胞接着面積との関係を示す表である。
【図１７Ａ】ヒトＭＳＣｓを培養したときの培養細胞の細胞直径の変化を示すグラフである。
【図１７Ｂ】ヒトＭＳＣｓを培養したときの培養細胞の細胞直径の数値を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施形態では、骨髄間質細胞（bone marrow stromal cells：ＢＭＳＣｓ）、又は、骨髄間質細胞を精製して得られる間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells; ＭＳＣｓ）が多軸回転によって形成された模擬微小重力環境下で培養される。ここで、模擬微小重力環境下とは、時間軸で積分された重力ベクトルが宇宙環境と同じく微小であるような環境のことをいう。
【００１６】
模擬微小重力環境は、例えば、３Ｄ−クリノスタットを用いて作り出すことができる。３Ｄ−クリノスタットとは、直交する２軸の周りに試料を３６０°回転させる装置である。３Ｄ−クリノスタットを用いれば、時間軸で積分された重力ベクトルが宇宙環境と同じく微小であるような（例えば１０−３Ｇであるような）環境を作り出すことができる。
【００１７】
図１は、３Ｄ−クリノスタットの構成の一例を示す図である。図１の３次元クリノスタット１は、本体３、モータ４、外側フレーム５、モータ６、及び内側フレーム７を含む。本体３は、静止系に設置される。本体３は、基部３ａと脚３ｂ、３ｃを含む。基部３ａには、脚３ｂ、３ｃが接続されている。脚３ｂには、モータ４が設けられている。モータ４は、外側フレーム５に接続され、回転軸４ａの回りに外側フレーム５を回転する。外側フレーム５には、モータ６が設けられている。モータ６は、内側フレーム７に接続され、回転軸６ａの回りに内側フレーム７を回転する。回転軸６ａは、回転軸４ａと概ね直交する。内側フレーム７には、既述の培養容器２が接続される。培養容器２は、回転軸４ａと回転軸６ａとの交点の近傍にある。培養容器２は、内側フレーム７と同体に回転する。外側フレーム５と内側フレーム７とがそれぞれ回転されると、培養容器２は、２軸回転する。培養容器２が２軸回転されると、培養容器２に封入された培養細胞に働く重力の方向が分散され、模擬微小重力環境を作り出すことができる。
【００１８】
模擬微小重力環境下でＢＭＳＣｓ又はＭＳＣｓを培養する手法は、中枢神経系疾患を治療するための移植細胞の製造方法として有用である。実験結果として後に詳細に記載されているように、ＢＭＳＣｓ又はＭＳＣｓを模擬微小重力環境下で培養することにより、ＢＭＳＣｓ又はＭＳＣｓの分化を抑制することができる。加えて、ＢＭＳＣｓ又はＭＳＣｓを模擬微小重力環境下で培養することにより、培養後のＢＭＳＣｓ又はＭＳＣｓの細胞のサイズを小さくすることができる。より厳密に言えば、模擬微小重力環境下で培養することにより、培養後のＢＭＳＣｓ又はＭＳＣｓの平均サイズ（細胞面積又は細胞直径）を、培養前よりも小さくすることができる。これらのことは、模擬微小重力環境下で培養したＢＭＳＣｓ又はＭＳＣｓを移植細胞として使用した場合の生着率を向上させ、中枢神経系疾患に対する治療効果を増大させる。
【００１９】
以下では、本発明の実施例について詳細に説明する。
【実施例１】
【００２０】
実施例１では、静置環境下（１Ｇ環境）下又は３Ｄ−クリノスタットによる模擬微小重力環境下でマウス骨髄間質細胞（ｍＢＭＳＣｓ）を培養し、細胞形態、神経分化マーカーの発現解析から、模擬微小重力環境下でのｍＢＭＳＣｓの動態を検討した。模擬微小重力発生には、三菱重工業製の３Ｄ−クリノスタットを用いた。更に、臨床応用の観点から、マウス脳挫傷モデルを作製し、模擬微小重力環境下で培養したｍＢＭＳＣｓの移植効果を検討した。
【００２１】
１．実験手順
（マウス骨髄間質細胞の培養）
ｍＢＭＳＣｓは、５−８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨と脛骨より採取した。１．０×１０８個の骨髄細胞を直径９０ｍｍの培養皿（Thermo Fisher Scientific Nunc A/S brand, Roskilde, Denmark）に播種し、４８時間後、培地交換により浮遊細胞を除去し、培養皿底面に接着したｍＢＭＳＣｓを培養細胞として得た。増殖用培地は、10% fetal bovine serum (Thermo Fisher Scientific HyClone brand,  South Logan, UT)、100 units/ml penicillin、及び、100μｇ/ml streptomycin（いずれも、Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO）を添加したDullbecco's  modified Eagle's medium(Sigma Aldrich Co.)を使用した。なお、細胞移植実験で使用したマウス骨髄細胞は、ドナー細胞を判別するため、ＧＦＰトランスジェニックマウス（GFP-tg mouse）の大腿骨と脛骨より同様に採取し、培養した。
【００２２】
実験に必要な細胞数を確保するまで２回の継代を行ってｍＢＭＳＣｓを増殖させ、OptiCellTM (Thermo  Fisher Scientific Nunc brand, Rochester, NY)に２．０×１０４個/cm2の密度で播種した。70%コンフルーエントになった時点で、増殖を完了した。この時点のｍＢＭＳＣｓを、Day 0のｍＢＭＳＣｓと呼ぶ。増殖したｍＢＭＳＣｓを、異なる二つの培養環境、即ち、通常の１Ｇ環境（group  1G）の群と、３Ｄ−クリノスタットを使用して生成した微小重力環境（group CL）の群の２群に分けて培養した。このとき、各群とも、引き続き増殖用培地で培養する群（group GM）と、神経分化誘導培地に切り換えて分化誘導を行う群（group ND）の２群に分けた。したがって、実験群は、group 1G-GM、group CL-GM、group 1G-ND、group CL-NDの４群である。神経細胞への分化誘導培地としては、Dulbecco's  modified Eagle's medium/F-12
(Invitrogen Co., Carlsbad, CA)に、20ng/ml human
fibroblast growth factor basic、10ng/ml human β  neural growth factor、10ng/ml human brain
derived neurotrophic factor（いずれも、PeproTech Inc., Rocky
Hill, NJ）、B27  supplement（Invitrogen Co.）、100  units/ml
penicillin、及び100μｇ/ml  streptomycinを添加して調製した。
【００２３】
培養７日後のｍＢＭＣＳ（Day 7のｍＢＭＳＣｓ）を、形態変化の観察、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）及び免疫染色による解析、及び静脈経由での細胞移植に使用した。
【００２４】
加えて、７日間の培養の後に、追加的に７日間の１Ｇ環境下での培養を行った試料（Day 14のｍＢＭＳＣｓ）も作製した。追加的に行われる７日間の培養は、全ての群について（即ち、group CLについても）１Ｇ環境下で行われていることに留意されたい。
【００２５】
（形態観察）
培養したｍＢＭＣＳの形態変化は、倒立型位相差顕微鏡（Eclipse TE300; Nikon Co., Tokyo,  Japan）を用いて観察し、無作為に写真撮影を行った。細胞のサイズは、次のようにして測定した。0.1%  tripsinで処理して回収したｍＢＭＳＣｓを無作為に写真撮影し、パーソナルコンピュータに取り込んだ。撮影した写真から、各群１５０個の細胞を無作為に抽出し、画像処理ソフトウェア（ImageJ; National Institutes of Health, Bethesda, MD）を用いて細胞サイズ（直径）を算出した。
【００２６】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲのためのサンプリングは、ISOGEN (NIPON GENE Co., Ltd.,  Toyama, Japan)を用いて行い、付属のプロトコールに従ってＲＮＡを単離した。SuperScriptTMII  (Invitrogen Co.)を用いて逆転写反応を行い、作製したｃＤＮＡを鋳型として、BD  AdvantageTM 2 PCR Kits (BD Biosciences Clontech, Palo
Alto, CA)を使用してＰＣＲ反応を行った。未分化の細胞のマーカーにＯｃｔ−４を用い、神経細胞の分化マーカーにはneurofilament heavy chain (ＮＦ−Ｈ)を用いた。内部標準遺伝子には、β-actinを用いた。作製したプライマー（いずれも、Sigma-Aldrich  Japan K.K., Sigma Genosys, Hokkaido, Japan）の塩基配列とＰＣＲ条件は、図２の通りである。
【００２７】
（神経分化マーカーの免疫染色）
ｍＢＭＳＣｓを固定し、免疫染色を行った。観察には、多機能顕微鏡（BZ-9000; KEYENCE Co.,  Osaka, Japan）を使用した。神経分化マーカーであるＮＦ−Ｈ，microtuble
associated protein 2（ＭＡＰ２）に対する一次抗体には、monoclonal
anti-neurofilament  200, monoclonal anti-MAP2（いずれも、Sigma-Aldrich Co.）を用い、希釈倍率は１：２００とした。二次抗体には、Alexa
Flour（登録商標）488 goat anti-mouse IgG  (H+L) (Invitrogen Co.)を用い、希釈倍率は１：１００とした。核染色には、4', 6-diamidine-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI; Kirkegaard
& Perry  Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD)を用い、希釈倍率は１：１００とした。染色後の細胞を撮影して、その画像をパーソナルコンピュータに取り込み、それぞれの一次抗体について、陽性細胞数を全細胞数で除して陽性率を算出した。
【００２８】
（脳挫傷モデルマウスの作製と細胞移植）
レシピエントマウス（脳挫傷モデルマウス）の作製には、８週齢Ｃ５７ＢＬ／６を用い、極低温を利用して脳挫傷マウスを作製した。詳細な手順は、下記の通りである：麻酔下で頭皮を頭尾軸方向に１５ｍｍ切開した後、冠状縫合とラムダ縫合の中間で、矢状縫合の左外側３．０ｍｍの部位（運動野皮質部位）に頭蓋骨の上から、液体窒素を用いて冷却した金属プローブを３０秒間、４回、３０秒間隔で当て、直径４．０ｍｍの脳挫傷を作製した。
細胞移植は、脳挫傷７日後に行った。具体的には、１匹あたり３．０×１０５個の培養細胞を１００μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁して、後眼窩静脈叢に注射した。細胞移植を脳挫傷７日後に行うのは、損傷直後の脳細胞において発生する炎症の影響を排除するためである。炎症性細胞の浸潤は、移植細胞の生着の障害になることが考えられる。対照群であるGroup Cのマウスには、100μｌのＰＢＳを注射した。また、Group Sのマウスには頭部の皮膚切開のみを行った。即ち、Group Sは、シャムオペレーション群である。
【００２９】
（運動機能評価）
運動機能検査として、Beam-Walking試験とRotarod試験を行った。
Beam-walking試験では、木製の四角柱（幅6mm、長さ120mm）の上でマウスを歩かせ、５０歩中に、麻痺側である右側の後肢が踏み外した歩数を記録した。全てのマウスを、脳挫傷モデル作製前に、３日間、踏み外しが５歩以下になるよう訓練した。
Rotarod試験では、rotarod装置（KN-75; NATSUME SEISAKUSHO Co., Ltd., Tokyo Japan）を用い、２０ｒｐｍで回転するロッド上でマウスを走らせ、ロッドから落ちるまでの時間を計測した。全てのマウスを、脳挫傷モデル作製前に、３日間、１０ｒｐｍで回転するロッド上に１００秒以上留まれるよう訓練した。
【００３０】
（組織学的解析）
脳損傷２８日後（細胞移植２１日後）、麻酔下でマウスを灌流固定し、脳組織を摘出した。脳組織をTissu-Tek（登録商標） O.C.TTM Compound (Sakura Finetechnical Co., Ltd., Tokyo  Japan)で包埋し、液体窒素で瞬間凍結した。凍結した試料は、クリオスタット（Leica
Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany）にて厚さ１０μｍに薄切りした。薄切した脳組織は、ヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ染色）と神経分化マーカーであるＮＦ−ＨとＭＡＰ２、アストロサイト分化マーカーであるglial fibrillary acidic protein（ＧＦＡＰ）に対する免疫染色に使用した。免疫染色の一次抗体には、ＮＦ−ＨとＭＡＰ２については、monoclonal anti-neurofilament 200, monoclonal anti-MAP2（いずれも、Sigma-Aldrich Co.）を用い、希釈倍率は１：２００とし、ＧＦＡＰについては、mouse monoclonal GFAP (Abcam plc., Cambridge, UK)を用い、希釈倍率は１：２００とした。二次抗体には、Alexa Flour (登録商標) 594 goat anti-mouse IgG  (H+L)(Invitrogen Co.)を用い、希釈倍率は１：１００とした。染色後の脳組織の観察には、多機能顕微鏡（BZ-9000: KEYENCE Co.）を使用した。
【００３１】
（ケモカインレセプターの免疫染色）
ケモカインレセプターの免疫染色は、前述の神経分化マーカーの免疫染色と同様の方法で行った。ケモカインレセプターであるＣＸＣＲ４に対する一次抗体には、anti CXCR4 (fusin (H-118); Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa  Cruz, CA)を用い、希釈倍率は１：１００とした。
【００３２】
２．実験結果
（模擬微小重力環境の細胞形態に対する影響）
図３は、Day 0（培養前）、Day 7（７日間の培養後）、Day 14（７日間の追加培養後）のｍＢＭＳＣｓの細胞形態を示す画像であり、図４は、このような培養による細胞サイズの変化を示すグラフである。ここで、７日間の培養後（Day 7）に行われる７日間の追加培養は、いずれの群についても１Ｇ環境下で行われることに留意されたい。
【００３３】
図３に示されているように、培養前（Day 0）では、紡錘形の細胞や卵円形の細胞が観察された。
【００３４】
一方、７日間の培養後（Day 7）の細胞形態は、次の通りである：増殖培地で培養し続けた群であるgroup 1G-GM及びgroup CL-GMについては、細胞形態としては著明な変化は見られなかった。即ち、分化に伴う突起や、細胞同士の接合は観察されなかった。一方、１Ｇ環境下で、且つ、神経へ分化誘導した群であるgroup 1G-NDについては、神経様の突起を長く伸ばした細胞が多く、細胞同士が接合している様子が観察された。これは、培養細胞が神経細胞に分化していることを示している。一方、模擬微小重力環境下では、神経へ分化誘導した群であるgroup CL-NDについては、神経へ分化誘導したにも関らず、細胞形態の著明な変化は見られなかった。即ち、group CL-NDについては、突起を長く伸ばした細胞は観察されなかった。これは、模擬微小重力環境下では、ｍＢＭＳＣｓの神経への分化が抑制された可能性を示唆するものである。
【００３５】
模擬微小重力環境下で培養することによる作用を確かめる為に、７日間、模擬微小重力環境下で培養した後、追加的に、７日間、１Ｇ環境下で培養を行った（Day 14）。その結果、group CL-NDについても、group 1G-ND（１Ｇ環境下で、且つ、神経へ分化誘導して培養した群）と同様に神経様の長い突起が発現した。即ち、模擬微小重力環境下での培養では分化が抑制されたgroup CL-NDについても、その後に１Ｇ環境下で培養を行うことにより分化が発現した。この結果は、模擬微小重力環境下での培養がｍＢＭＳＣｓの神経への分化を抑制する作用がある可能性を一層に強く示唆するものである。
【００３６】
加えて、模擬微小重力環境下で培養した群（group CL-GM及びgroup CL-ND）については、細胞サイズが小さくなるという特性が現れた。図４は、group  1G-GM、group 1G-ND 、group
CL-GM、及びgroup CL-NDのそれぞれの細胞サイズの変化を示すグラフである。図４において、マークは、各群の細胞サイズの平均値を示している。７日間、模擬微小重力環境下で培養した群（group CL-GM及びgroup CL-ND）では、細胞サイズの平均値が、減少していた。この作用は、特に、神経へ分化誘導した群（group CL-ND）において顕著に見られた。
【００３７】
その後、模擬微小重力環境下で７日間培養した群（group CL-GM及びgroup CL-ND）について、７日間、追加的に１Ｇ環境下で培養を行ったところ、細胞サイズが元に戻る減少が現れた。このことは、模擬微小重力環境下での培養が細胞サイズを小さくする作用を有することを一層に強く示唆するものである。
【００３８】
（模擬微小重力環境の細胞分化に対する影響）
細胞分化に対する影響を更に検討する為に、未分化マーカーと細胞分化マーカーの発現について検討した。未分化マーカーとしてＯｃｔ−４、神経分化マーカーとしてneurofilament heavy chain (NF-H)とmicrotuble  associated protein 2 (MAP2)を使用した。
【００３９】
図５Ａは、各群のｍＲＮＡの発現を示す像であり、図５Ｂは、各群のＮＦ−Ｈ及びＭＡＰ２のタンパク質発現を示す免疫染色像である。図５Ｂの免疫染色像のそれぞれにおける数値は、ＮＦ−Ｈ、ＭＡＰ２のタンパク質発現の検出反応の陽性細胞数を全細胞数で除した数値を示す表である。図５Ａに図示されているように、Day 0では、いずれの群についても、Ｏｃｔ−４  ｍＲＮＡ発現が見られ、ＮＦ−Ｈ  ｍＲＮＡ発現は見られなかった。
【００４０】
一方、Day 7では、Ｏｃｔ−４  ｍＲＮＡ発現とＮＦ−Ｈ  ｍＲＮＡ発現において群によって違いが見られた。
まず、１Ｇ環境で培養した場合には、増殖培地と分化培地で差異が見られた。詳細には、group 1G-GMについてはＯｃｔ−４  ｍＲＮＡ発現が維持され、神経分化マーカーであるＮＦ−ＨやＭＡＰ２のタンパク質を発現している細胞は少なかった。一方、分化誘導が行われたgroup 1G-NDは、Ｏｃｔ−４  ｍＲＮＡ発現が弱く、ＮＦ−Ｈ  ｍＲＮＡが発現しており、神経に分化していることが確認された。また、図５Ｂに示されているように、group 1G-NDについては、ＮＦ−Ｈ及びＭＡＰ２のタンパク質発現も観察され、その陽性率には差が見られなかった。
【００４１】
一方、模擬微小重力環境下で培養した場合には、増殖培地と分化培地で差異は見られなかった。即ち、増殖培地で培養されたgroup CL-GMは、group 1G-GMと同様に未分化マーカーの発現が見られ、分化マーカーの発現は見られなかった。加えて、分化誘導が行われたgroup CL-NDについても、Ｏｃｔ−４  ｍＲＮＡが発現し、神経分化マーカーの発現は見られなかった。
【００４２】
その後、group CL-GMを含む全ての群について、１Ｇ環境で７日間の追加培養を行ったところ(Day 14)、図５Ａに示されているように、group CL-GMについてもＯｃｔ−４  ｍＲＮＡ発現が弱くなる一方で、ＮＦ−Ｈ  ｍＲＮＡの発現が強くなった。更に、図５Ｂに示されているように、group 1G-NDに加え、group CL-NDについてもＮＦ−Ｈ及びＭＡＰ２のタンパク質発現も観察された。
【００４３】
このことは、模擬微小重力環境下の培養では、ｍＢＭＳＣｓに神経分化誘導を行ってもなお分化が抑制されること、及び、未分化性と分化能とを維持できることを示している。
【００４４】
（移植による運動機能の回復と神経再生）
上述のように、模擬微小重力環境下の培養では、ｍＢＭＳＣｓの分化が抑制されると共に、細胞サイズが小さくなった。以下では、模擬微小重力環境下で培養されたｍＢＭＳＣｓを移植したときの運動機能の回復と神経再生の効果について検討する。
【００４５】
培養したｍＢＭＳＣｓの生体内の機能を評価するために、中枢神経系疾患モデルとしてマウス脳挫傷モデルを作製し、そのマウス脳挫傷モデルにｍＢＭＳＣｓを静脈経由で移植した。移植は、脳挫傷７日後に行った。その後、ｍＢＭＳＣｓ移植による運動機能の回復と神経再生の効果を確認するために、Beam-walking試験とRotarod試験を行った。実験手順は、上述の通りである。更に、組織学的解析により、移植細胞の生着について評価した。
【００４６】
図６Ａは、Beam-Walking試験の結果を示すグラフである。図６Ａに示されているように、Beam-Walking試験において、group CL-NDのｍＢＭＳＣｓが移植されたマウスは、脳挫傷１１日以降にＰＢＳのみを静注したgroup  Cと比較して、１４日以降にはgroup
1G-NDと比較して有意に運動機能が改善し、実験群の中で最も運動機能が回復した。また、group 1G-GM,
group CL-GM, group 1G-NDは、group Cと比較して脳挫傷１４日以降に有意な改善が見られた。Group 1G-NDの回復が鈍く、group CL-GMとgroup 1G-GMは同程度の回復であった。
【００４７】
図６Ｂは、Rotarod試験の結果を示すグラフである。Rotarod試験においても、Beam-Walking試験と同様の結果が得られた。詳細には、group CL-NDの細胞を移植したマウスは、脳挫傷１４日後にはgroup Cと比較して、脳挫傷２１日後にはgroup  1G-NDと比較して、また、脳挫傷28日後にはgroup CL-GM及びgroup 1G-GMと比較してもウ有為に運動機能が改善した。
【００４８】
図７Ａは、ＮＦ−Ｈで染色した組織像であり、図７Ｂは、ＭＡＰ２で染色した組織像である。group 1G-GM,  group CL-GM, group 1G-ND, 及びgroup CL-NDのいずれについても、脳挫傷２８日後（移植２１日後）の脳損傷部にＧＦＰの緑色蛍光を発する移植細胞が観察された。これは、いずれの群の移植細胞についても、マウス脳挫傷モデルに細胞移植したｍＧＭＳＣｓが脳損傷部に到達していることを意味している。
【００４９】
図７Ａ、図７Ｂの組織像から、単位面積当たりのＧＦＰ陽性細胞の面積の割合を算出した。図８Ａは、その結果を示すグラフであり、図８Ｂは、各群のＧＦＰ陽性細胞の面積の割合、及び、各群の培養細胞の直径の平均値を示す表である。１Ｇ環境で培養した細胞については、単位面積当たりのＧＦＰ陽性細胞の面積の割合は、group 1G-GMでは１．２％、group 1G-ＮＤでは４．２％であった。一方、模擬微小重力環境で培養した細胞については、単位面積当たりのＧＦＰ陽性細胞の面積の割合は、group CL-GMでは７．３％、group CL-ＮＤでは１１．３％であった。この結果は、模擬微小重力環境で培養した細胞を移植したマウスでは、１Ｇ環境下で培養した細胞を移植したマウスと比較して（即ち、group CL-GMはgroup 1G-GMと比較して、また、group CL-NDはgroup 1G-NDと比較して）、脳挫傷部に移植細胞が多く到達したことを示している。そして、上述の細胞サイズの実験結果を考慮すると、細胞サイズの低減が、脳挫傷部に移植細胞が多く到達した要因と考えられる。
【００５０】
図７Ａ、図７Ｂを再度に参照して、移植細胞の一部には、ＮＦ−ＨやＭＡＰ２の発現が観察された。模擬微小重力環境で培養した細胞を移植したマウスでは、１Ｇ環境下で培養した細胞を移植したマウスと比較して（即ち、group CL-GMはgroup 1G-GMと比較して、また、group CL-NDはgroup 1G-NDと比較して）、ＮＦ−ＨやＭＡＰ２を発現している移植細胞も多く観察された。さらに、group CL-GMと比較してgroup CL-NDの方がＮＦ−ＨやＭＡＰ２を発現している移植細胞が多く観察された。
【００５１】
（微小重力環境で培養した移植細胞のＣＸＣＲ４発現）
移植細胞の損傷領域への遊走に関するメカニズムは解明されていないが、静脈内移植したＢＭＳＣｓは、梗塞部から発せられるシグナルや細胞表面接着因子により血液脳関門を通過し、障害部位に集積すると考えられている。特に、損傷領域において損傷後産生が上昇するstromal cell derived factor 1 （ＳＤＦ−１）が選択的移行に関与する可能性が示唆されている。ＳＤＦ−１は、濃度勾配の方向にリンパ球を遊走させることで知られるケモカインの一つで、ＣＸＣ型ケモカイン受容体の一つであるＣＸＣＲ４と結合する。近年、ＢＭＳＣｓに含まれるＭＳＣｓもＣＸＣＲ４を発現しており、脳挫傷領域におけるＳＤＦ−１の発現が、静注したＭＳＣｓの遊走を促進するとして注目されている。そこで、培養した移植細胞のＣＸＣＲ４発現を解析した。
【００５２】
図９は、ＣＸＣＲ４の免疫染色を行った組織像である。図９の組織像における数値は、移植細胞のＣＸＣＲ４陽性率を示している。増殖培地で培養したgroup 1G-GMとgroup CL-GMのＣＸＣＲ４陽性率は、ほぼ同等であった。一方、神経への分化誘導培地で培養したgroup 1G-NDでは、ＣＸＣＲ４を発現している細胞が少なかった。一方、group  CL-NDでは、ＣＸＣＲ４を細胞膜上に発現している細胞が多く、増殖培地で培養した細胞と比較しても、陽性細胞が多く観察された。
【００５３】
増殖培地で培養したｍＢＭＳＣｓは、ＭＳＣｓのような未分化性を維持し、ＣＸＣＲ４を発現している細胞も存在する為、移植後に脳損傷部に移行したことが考えられる。一方、神経へ分化したgroup 1G-NDではＣＸＣＲ４を発現している細胞が少なかったため、損傷部に到達した移植細胞が少なかったことが考えられる。また、group CL-NDの培養細胞では、神経に分化誘導を行っても未分化性が維持されており、ＣＸＣＲ４を発現している細胞も多いという結果が得られた。このことが、group CL-NDの細胞を移植したマウスにおいて、より多くの移植細胞が損傷部に生着し、運動機能を改善させた理由の一つと考えられる。
【００５４】
以上の実験結果は、未分化性維持を可能とし、また、細胞のサイズを縮小させる模擬微小重力環境下での培養は、移植治療に用いる移植細胞の培養法として有用であることを示している。特に、神経への分化を誘導しながらも未分化性を維持して模擬微小重力環境下での培養を行うことにより、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を増加させ、運動機能を顕著に改善させることができる。
【実施例２】
【００５５】
実施例２では、模擬微小重力環境下で培養した骨髄間質細胞（ＢＭＳＣｓ）の脊髄損傷に対する移植効果を検討した。より具体的には、静置環境下（１Ｇ環境）下、及び、３Ｄ−クリノスタットによる模擬微小重力環境下でラットＢＭＳＣｓの増殖培養を行い、細胞遊走因子受容体のｍＲＮＡやタンパク質の発現解析を行い、移植治療における移植細胞としての適性を検討した。また、脊髄損傷モデルラットを作製し、１Ｇ環境下、及び模擬微小重力環境下で培養したラットＢＭＳＣｓを静脈経由で移植し、組織学的解析や運動機能評価により、細胞移植効果の検討を行った。
【００５６】
１．実験方法
５週齢ラットの大腿骨と脛骨より骨髄細胞を採取し、直径９０ｍｍの培養皿（Thermo Fisher  Scientific Nunc A/S brand）にて培養した。４８時間後、培地交換により浮遊細胞を除去し、培養皿底面に接着した細胞を培養細胞（ラットＢＭＳＣｓ）として採取した。増殖用培地は、10% fetal bovine serum（Thermo Fisher  Scientific HyClone brand）、100 units/ml penicillin、100μg/ml streptomycin (いずれも、Sigma-Aldrich Co.)を添加したDullbecco's modified  Eagle's medium-low glucose (Sigma-Aldrich Co.)を使用した。培養液は、３〜４日に１回交換した。実験に必要な細胞数を確保するまで２回の継代を行った。増殖させたラットＢＭＳＣｓは、細胞培養器OptiCellTM (Thermo Fisher Scientific Nunc brand)に播種した。播種後、ラットＢＭＳＣｓが培養器底面に接着するよう１Ｇ環境下で１日培養を行った。この状態のラットＢＭＳＣｓをDay 0のラットＢＭＳＣｓと呼ぶ。実験群は、１Ｇ環境下にて培養を行った群（group
1G）と模擬微小重力環境下にて培養を行った群（group  CL）の２つの群である。いずれの群の培養細胞も、７日間、増殖培地にて培養した。
【００５７】
脊髄損傷モデルラットは、１５０−２００ｇの成体雌ラットに対し、Weight Drop methodにより第１０〜１１胸椎レベルで脊髄損傷を形成することによって作製された。このようにして作製された脊髄損傷モデルラットに、上記の手順で培養したgroup 1G、group CLのラットＢＭＳＣｓを移植した。移植されるラットＢＭＳＣｓには、移植前に、PKH２６（Sigma-Aldrich Co.)で赤色蛍光標識を付した。脊髄損傷直後に、ラットＢＭＳＣｓを含む細胞懸濁液をラットの尾静脈へ注射し、１匹あたり３．０×１０６個の細胞を移植した。実験群は、脊髄損傷直後に生理食塩水の静脈注射を行ったラット（group C）、１Ｇ環境下で７日間培養を行ったＢＭＳＣｓを移植したラット（group  1G）、模擬微小重力環境下で７日間培養を行ったＢＭＳＣｓを移植したラット（group
CL）の３群である。
【００５８】
ラットの運動機能評価は、脊髄損傷前（Day 0）、脊髄損傷１〜７日後（Day 1-7）、１４日後（Day 14）、２１日後（Day 21）に行った。運動機能評価として、Basso-Beatle-Bresnahan  locomotor rating scale (BBB score)と、Inclined
plane  method (Inclined plane score)を行った。ここで、Inclined plane  methodとは、ラットを角度可変式の板上に乗せ、姿勢保持が可能な最大角度を測定する方法である。
【００５９】
２．実験結果
図１０は、７日間の培養後のgroup 1Gとgroup CLのそれぞれにおけるＯｃｔ−４及びＣＸＣＲ４のｍＲＮＡの発現を示す図である。ここで、Ｏｃｔ−４は未分化細胞マーカーであり、ＣＸＣＲ４は細胞遊走因子受容体である。未分化マーカーであるＯｃｔ−４のｍＲＮＡの発現は、group 1Gよりgroup CLで強かった。また、細胞遊走因子受容体であるＣＸＣＲ４のｍＲＮＡについては、group 1Gでは殆ど発現が見られず、group CLでは発現が見られた。内部標準遺伝子であるＧ３ＰＤＨの発現は、group 1Gとgroup CLとで同様であった。
【００６０】
図１１は、７日間の培養後のgroup 1Gとgroup CLにおけるＣＸＣＲ４の免疫染色陽性率を示すグラフである。陽性率は、各群について無作為に撮影された写真から得られたＣＸＣＲ４陽性細胞数を全細胞数で除して算出した。図１１に図示されているように、ＣＸＣＲ４の免疫染色の結果では、両群ともに、ＣＸＣＲ４を発現している細胞が見られた。算出したＣＸＣＲ４陽性率は、group CLがgroup 1Gよりも有意に高かった。
【００６１】
図１２は、培養した細胞のサイズ、具体的には、細胞１個当たりの細胞接着面積を示すグラフである。細胞１個当たりの細胞接着面積は、単位面積当たりの細胞接着面積を細胞数で除して算出した。細胞１個当たりの細胞接着面積は、group CLの方がgroup 1Gより少なかった。位相差顕微鏡像でも、group CLの細胞は、group 1Gの細胞と比較して小さく見えた。
【００６２】
図１３Ａ、図１３Ｂは、group 1Gとgroup CLのＢＭＳＣｓを移植したラットの運動機能評価の結果を示す図である。詳細には、図１３Ａは、group 1Gとgroup CLのＢＭＳＣｓを移植したラットのＢＢＢ scoreを示すグラフであり、図１３Ｂは、Inclined plane scoreを示すグラフである。図１３Ａ、図１３Ｂに示されているように、ＢＢＢ score、Inclined plane scoreのいずれについても、group CLは、脊髄損傷３日後以降に、他の２群（group C、group 1G）と比較して有意な改善が見られた。
【００６３】
また、group 1Gとgroup CLの両方について、脊髄損傷２１日後の脊髄組織の組織像を観察した。図１４は、脊髄損傷２１日後の脊髄組織の移植細胞分布を示す像である。group 1G、group CLのいずれについても、脊髄組織の損小領域にＰＫＨ２６の赤色蛍光を発する移植細胞が観察された。group 1Gと比較してgroup CLでは、移植細胞が多く観察された。
【００６４】
更に、脊髄損傷２１日後の損傷部脊髄のＨ＆Ｅ染色像の観察が行われた。図１５Ａは、脊髄組織のＨ＆Ｅ染色像であり、図１５Ｂは、空洞率を示すグラフである。図１５Ａの脊髄損傷２１日後のＨ＆Ｅ染色像から理解されるように、３つの群のいずれについても、脊髄後索から中心部の損傷と組織の空洞化が観察された。図１５Ｂに示されているように、脊髄損傷後２１日において、損傷部脊髄の空洞率は、group Cが最も高く、group CLでは有意に低かった。
【００６５】
以上に説明されているように、模擬微小重力環境下でラットＢＭＳＣｓを培養すると、Ｏｃｔ−４のｍＲＮＡ発現がみられた。これは、模擬微小重力環境下での培養により、ＢＭＳＣｓの未分化性が維持されることを示唆している。更に、group CLでは細胞遊走因子受容体の発現も増加した。
【００６６】
ＰＫＨ２６で標識された移植細胞は、静脈内移植から２１日後のラット脊髄の損傷領域に固定された。図１６の表に示されているように、group CLでは、培養細胞接着面積がgroup 1Gと比較して約４３％減少し、生着率は約２８倍に増加した。模擬微小重力環境下で培養したＢＭＳＣｓは、より多くの細胞が損小領域に生着し、移植を受けたラットの損傷部空洞率は有意に低下し、運動機能も有意に改善した。
【００６７】
以上の結果は、模擬微小重力環境下で培養したラットＢＭＳＣｓの中枢神経系疾患への移植細胞としての有用性を示している。
【実施例３】
【００６８】
実施例３では、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）を模擬微小重力環境下で培養することによる効果を検討した。
具体的には、ヒト間葉系幹細胞（Lonza Walkersville,  Inc., Walkersville, MD）を細胞培養器OptiCellTM（Thermo  Fisher Scientific Nunc brand,
Rochester, NY）に播種し（Day 0）、通常の１Ｇ環境下又は３Ｄ−クリノスタットで作り出した模擬微小重力環境下で７日間培養した。即ち、実験群は、１Ｇ環境下で培養したｈＭＳＣｓの群（group 1G）と、模擬微小重力環境下で培養したｈＭＳＣｓの群（group CL）の２つである。
【００６９】
培養には増殖培地が使用された。増殖培地としては、10% fetal bovine serum (Thermo
Fisher Scientific HyClone brand, South Logan, UT)、25  units/ml penicillin、25μg/ml streptomycin  (いずれも、Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO)を添加したDullbecco's
modified Eagle's medium (Sigma-Aldrich Co.)を使用した。
【００７０】
図１７Ａは、７日間の培養前、及び培養後の培養細胞の細胞直径を示すグラフであり、図１７Ｂは、平均の細胞直径の具体的数値を示す表である。培養７日後、通常の１Ｇ環境で培養したｈＭＳＣｓ（group 1G）と比較して、模擬微小重力環境下で培養したｈＭＳＣｓ（group CL）では、細胞直径が有意に小さくなった。模擬微小重力環境下で培養したｈＭＳＣｓ（group CL）は、更に、７日間の培養後において培養前より細胞直径が小さくなっていた。また、模擬微小重力環境下で培養することにより、未分化性が維持され、また、細胞移植後に分化して損傷部の再生に寄与することは確認されている。このことは、模擬微小重力環境下で培養したｈＭＳＣｓの再生医療における移植細胞としての優位性を示している。
【符号の説明】
【００７１】
１：３次元クリノスタット
２：培養容器
３：本体
３ａ：基部
３ｂ、３ｃ：脚
４：モータ
５：外側フレーム
６：モータ
７：内側フレーム
【図１】
2010246434.tif 000003
【図２】
2010246434.tif 000004
【図４】
2010246434.tif 000005
【図６Ａ】
2010246434.tif 000006
【図６Ｂ】
2010246434.tif 000007
【図８Ａ】
2010246434.tif 000008
【図８Ｂ】
2010246434.tif 000009
【図１１】
2010246434.tif 000010
【図１２】
2010246434.tif 000011
【図１３Ａ】
2010246434.tif 000012
【図１３Ｂ】
2010246434.tif 000013
【図１５Ｂ】
2010246434.tif 000014
【図１６】
2010246434.tif 000015
【図１７Ａ】
2010246434.tif 000016
【図１７Ｂ】
2010246434.tif 000017
【図３】
2010246434.tif 000018
【図５Ａ】
2010246434.tif 000019
【図５Ｂ】
2010246434.tif 000020
【図７Ａ】
2010246434.tif 000021
【図７Ｂ】
2010246434.tif 000022
【図９】
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【図１０】
2010246434.tif 000024
【図１４】
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【図１５Ａ】
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