(57)【要約】【課題】冠状動脈疾患の間および／または急性心筋梗塞後に、ヒト患者に心臓脈管形成を提供する薬および投与様式を提供すること。【解決手段】  本発明は、０．２μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇの組換えＦＧＦあるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む単位用量に関する。本発明はまた、脈管形成有効用量のＦＧＦあるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテイン、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物に関する。脈管形成有効用量は、配列番号１〜３、５、８〜１０もしくは１２〜１４のいずれか１つの、０．２μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇのＦＧＦ、あるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（Ａ．発明の分野）
本発明は、ヒトにおいて、心臓脈管形成を誘導するためのＦＧＦ、あるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含有する単位用量に関する。本発明はまた、ＦＧＦの単位用量を含有する薬学的組成物、および患者に対する全身性リスクを最小化しつつ心臓脈管形成を誘導するために、ヒトにこの薬学的組成物を投与するための方法に関する。本発明は、有用である。なぜなら、この単位用量、薬学的組成物およびその投与方法は、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の処置に対する外科的介入に対する代替を提供し、そしてさらに、ヒトにおける心筋梗塞（ＭＩ）後の傷害を低減するための補助剤を提供し得る。
【背景技術】
【０００２】
（Ｂ．発明の背景）
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、プロテオグリカン（例えば、ヘパリン）に対する高程度の親和性によって特徴付けられる少なくとも１８個の構造的に関連するポリペプチド（ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−１８と命名）のファミリーである。種々のＦＧＦ分子は、サイズが１５〜２３ｋＤの範囲であり、そして正常な状態および悪性状態において広範な範囲の生物学的活性（神経細胞接着および分化（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：６３５〜６４３（１９８７））；創傷治癒（特許文献１（Ｆｉｄｄｅｓ））；多くの中胚葉細胞型および外胚葉細胞型に対するマイトジェンとして、栄養性因子として、分化誘導因子または分化阻害因子として（Ｃｌｅｍｅｎｔｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１３１１〜１３１６（１９９３））；ならびに脈管形成因子として（Ｈａｒａｄａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９４：６２３〜６３０（１９９４））を含む）を示す。従って、ＦＧＦファミリーは、種々の程度の線維芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞およびニューロン細胞を刺激する多能性増殖因子のファミリーである。
【０００３】
ＦＧＦが正常組織によって放出される場合に（例えば、胎児発生または創傷治癒において）、これは、時間的制御および空間的制御に供される。しかし、ＦＧＦファミリーの多くのメンバーもまた、癌遺伝子である。従って、時間的制御および空間的制御の非存在下で、これらは、脈管形成を提供することによって腫瘍増殖を刺激する能力を有する。
【０００４】
冠状動脈疾患（アテローム性動脈硬化症）は、ヒトにおける進行性の疾患であり、ここでは、１以上の冠状動脈が、班の蓄積を通じて徐々に閉塞性になる。この疾患を有する患者の冠状動脈は、しばしば、バルーン血管形成術または部分的に閉塞した動脈を支えて開かせるステントの挿入によって処置される。究極的には、これらの患者は、高額な費用および高い危険性にて、冠状動脈バイパス手術を受けることが必要とされる。バイパス手術を受ける必要性を除外するように、冠状の血流を増強する薬を、このような患者に提供することが所望される。
【０００５】
さらにより重要な状況は、ヒトにおいて患者が心筋梗塞を被る場合に生じ、ここでは、１以上の冠状動脈または細動脈が、完全に閉塞される（例えば、血餅によって）。閉塞した動脈または細動脈により作用される心筋層の部分への循環を回復することがすぐに必要である。失われた冠状循環が、梗塞の発症の数時間以内に回復される場合、閉塞から下流にある心筋層へのほとんどの損傷は、予防され得る。血餅溶解薬物（例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、およびウロキナーゼ）は、この例において有用であることが証明されている。しかし、血餅溶解剤に対する補助剤として、また、脈管形成によって損傷した心筋層または閉塞した心筋層に対する側副枝循環を得ることもまた、所望される。
【０００６】
従って、本発明の目的は、冠状動脈疾患の間および／または急性心筋梗塞後に、ヒト患者に心臓脈管形成を提供する薬および投与様式を提供することである。さらに詳細には、本発明のさらなる目的は、有害な効果を最小にしつつ、心臓脈管形成の所望の特性を提供する、ヒトに対する治療的用量の哺乳動物ＦＧＦ、および投与様式を提供することである。
【０００７】
多くの種々のＦＧＦ分子が、単離されており、そして変動する心筋虚血の種々の動物モデルに投与されており、かつしばしば反対の結果を与えている。Ｂａｔｔｌｅｒらによると、「心筋虚血のイヌモデルは、天然の側副枝循環が相対的に少なく、かつヒト冠状循環に類似している点において「勝る」ブタモデルとは対照的に、天然に存在する側副枝循環が豊富であるために批判されている」。Ｂａｔｔｌｅｒら、「Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  Ｓｗｉｎｅ  Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ」、ＪＡＣＣ、２２（７）：２００１〜６（１９９３年１２月）２００２頁、１列。しかし、心筋梗塞モデルにおけるブタにウシｂＦＧＦ（すなわち、ＦＧＦ−２）を投与したＢａｔｔｌｅｒらは、１つの動物種から別の動物種で得られる結果が変動することを考慮し、そして多様な結果が、「従って、異なる動物モデルからの結果を外挿する際に留意されなければならない注意を強調する」ことを明示的に開示する。Ｂａｔｔｌｅｒら、２００５頁、１列。さらに、Ｂａｔｔｌｅｒは、「ｂＦＧＦ（すなわち、ウシＦＧＦ−２）の投薬および投与様式が、達成される生物学的効果についての顕著な暗示を有し得る」ことを指摘する。Ｂａｔｔｌｅｒら、２００５頁、１列。従って、本発明のさらなる目的は、ヒト患者におけるＣＡＤおよび／またはＭＩ後の傷害の安全かつ効果的な処置を提供する線維芽細胞増殖因子の投薬および投与様式を発見することである。さらに一般的には、本発明の目的は、ヒト心臓において、脈管形成を誘導するための薬学的組成物および方法を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許５，４３９，８１８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）  本出願人らは、例えば、配列番号１〜３、５、８〜９もしくは１２〜１４の線維芽細胞増殖因子、あるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインが、冠状脈管形成を必要とするヒト患者の１以上の冠状脈管（ＩＣ）中に約０．２μｇ／ｋｇ〜約３６μｇ／ｋｇの単位用量として投与される場合に、手術の介入を回避するに十分な迅速かつ治療的な心臓脈管形成を、ヒト患者に予想外に提供し、そして処置された患者の運動許容時間（ＥＴＴ）において予想外のより優れた増加を生じる。比較のために、血管形成術は、プラセボと比較して３０秒よりも多い、患者のＥＴＴの増加を提供する場合に治療的成功とみなされる。用語「心臓脈管形成」または「冠状脈管形成」とは、本明細書中で使用される場合、毛細管から細動脈（これは、冠状循環における側副枝として作用する）のサイズの範囲である、新しい血管の形成を意味する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）  ＦＧＦの単位用量であって、配列番号１〜３、５、８〜１０、もしくは１２〜１４のいずれか１つのアミノ酸配列を有する哺乳動物ＦＧＦ、あるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを約０．０８ｍｇ〜約６．１ｍｇ含有する、単位用量。
（項目２）  前記ＦＧＦあるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを０．３μｇ／ｋｇ〜３．５ｍｇ含有する、項目１の単位用量。
（項目３）  前記ＦＧＦが配列番号１〜３、５、または８〜９のいずれか１つの配列を有する、項目１に記載の単位用量。
（項目４）  前記ＦＧＦが配列番号１０または１２〜１４のいずれか１つの配列を有する、項目１に記載の単位用量。
（項目５）  前記ＦＧＦが配列番号１の配列を有する、項目３に記載の単位用量。
（項目６）  前記ＦＧＦが配列番号２の配列を有する、項目３に記載の単位用量。
（項目７）  前記ＦＧＦが配列番号３の配列を有する、項目３に記載の単位用量。
（項目８）  前記ＦＧＦが配列番号８の配列を有する、項目３に記載の単位用量。
（項目９）  前記ＦＧＦが配列番号９の配列を有する、項目３に記載の単位用量。
（項目１０）  前記ＦＧＦが配列番号１２の配列を有する、項目４に記載の単位用量。
（項目１１）  前記ＦＧＦが配列番号１３の配列を有する、項目４に記載の単位用量。
（項目１２）  前記ＦＧＦが配列番号１４の配列を有する、項目４に記載の単位用量。
（項目１３）  薬学的組成物であって、（ｉ）配列番号１〜３、５、８〜１０、もしくは１２〜１４のいずれか１つの配列を有する、治療的有効量の、ＦＧＦ、あるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテイン、および（ｉｉ）薬学的に受容可能なキャリアを含有し、該組成物が、ヒト患者への投与に適切な形態およびサイズである、薬学的組成物。
（項目１４）  前記治療的有効量が、前記ＦＧＦあるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを０．２μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇ含有する、項目１３に記載の薬学的組成物。
（項目１５）  前記治療的有効量が、前記ＦＧＦを約０．２μｇ／ｋｇ〜約３６μｇ／ｋｇ含有する、項目１４に記載の薬学的組成物。
（項目１６）  前記治療的有効量が、前記ＦＧＦを約０．２μｇ／ｋｇ〜２．０μｇ／ｋｇ含有する、項目１５に記載の薬学的組成物。
（項目１７）  前記治療的有効量が、前記ＦＧＦあるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを０．００８ｍｇ〜６．１ｍｇ含有する、項目１３に記載の薬学的組成物。
（項目１８）  前記治療的有効量が、前記ＦＧＦあるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを０．３ｍｇ〜３．５ｍｇ含有する、請求項１７に記載の薬学的組成物。
（項目１９）  前記治療的有効量が、前記ＦＧＦの脈管形成的に活性なフラグメントを０．００８ｍｇ〜６．１ｍｇ含有する、項目１７に記載の薬学的組成物。
（項目２０）  前記治療的有効量が、前記ＦＧＦの脈管形成的に活性なムテインを０．００８ｍｇ〜６．１ｍｇ含有する、項目１７に記載の薬学的組成物。
（項目２１）  冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するための方法であって、冠状動脈疾患に対する処置を必要とするヒト患者における１以上の冠状脈管に、配列番号１〜３、５、８〜１０、または１２〜１４のいずれか１つの配列を有する、組換えＦＧＦ、あるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインの治療的有効量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２２）  前記治療的有効量が、約０．００８ｍｇ〜約６．１ｍｇの前記組換えＦＧＦ、あるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）  前記治療的有効量が、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの前記組換えＦＧＦ、あるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）  項目２１に記載の方法であって、前記患者の１以上の冠状脈管に、約０．２μｇ／ｋｇ〜約３６μｇ／ｋｇの、前記組換えＦＧＦ、あるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを投与する工程を包含する、方法。
（項目２５）  項目２２に記載の方法であって、前記患者の１以上の冠状脈管に、０．０２μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇの前記組換えＦＧＦを投与する工程を包含する、方法。
（項目２６）  項目２３に記載の方法であって、前記患者の冠状脈管に、２μｇ/ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇの前記組換えＦＧＦを投与する工程を包含する、方法。
（項目２７）  項目２４に記載の方法であって、前記患者の冠状脈管に、約２０μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇの前記組換えＦＧＦを投与する工程を包含する、方法。
（項目２８）  項目２１に記載の方法であって、前記患者の冠状脈管に、０．００８ｍｇ〜６．１ｍｇの、前記組換えＦＧＦの脈管形成的に活性なフラグメントを投与する工程を包含する、方法。
（項目２９）  項目２１に記載の方法であって、前記患者の冠状脈管に、０．００８ｍｇ〜６．１ｍｇの、前記組換えＦＧＦの前記脈管形成的に活性なムテインを投与する工程を包含する、方法。
（項目３０）  ヒト患者の心臓における脈管形成を誘導するための方法であって、冠状脈管形成を必要とするヒト患者の１以上の冠状脈管中に、配列番号１〜３、５、８〜１０もしくは１２〜１４のいずれか１つの配列を有する組換えＦＧＦ、あるいはその脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインの治療的有効量を、単位用量として投与する工程を包含する、方法。
（項目３１）  前記単位用量が前記患者の２つの冠状脈管に投与される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）  前記組換えＦＧＦの投与が２０分以内であり、有効量のグリコサミノグリカンをさらに投与する、項目３０に記載の方法。
【００１０】
本発明における使用に適切であるＦＧＦは、ヒトＦＧＦ−１（配列番号１）、ウシＦＧＦ−１（配列番号２）、ヒトＦＧＦ−２（配列番号３）、ウシＦＧＦ−２（配列番号５）、ヒトＦＧＦ−４（配列番号８）、ヒトＦＧＦ−５（配列番号９）、ヒトＦＧＦ−６（配列番号１０）、ヒトＦＧＦ−８（配列番号１２）、ヒトＦＧＦ−９（配列番号１３）およびヒトＦＧＦ−９８（配列番号１４）を含む。１つの実施態様において、このＦＧＦ分子は、ヒトＦＧＦ−１（配列番号１）、ウシＦＧＦ−１（配列番号２）、ヒトＦＧＦ−２（配列番号３）、ウシＦＧＦ−２（配列番号５）、ヒトＦＧＦ−４（配列番号８）およびヒトＦＧＦ−５（配列番号９）である。代替の実施態様では、このＦＧＦ分子は、ヒトＦＧＦ−６（配列番号１０）、マウスＦＧＦ−８（配列番号１２）、ヒトＦＧＦ−９（配列番号１３）またはヒトＦＧＦ−９８（配列番号１４）である。
【００１１】
代表的には、本発明の脈管形成的に活性なフラグメントは、成熟ＦＧＦ分子の遠位の２／３（すなわち、細胞結合部位を有するカルボキシ末端でのこの分子の２／３）を保持する。簡便性のために、用語「ヒトＦＧＦ」、「ウシＦＧＦ」およびマウスＦＧＦは、それぞれ、「ｈＦＧＦ」、「ｂＦＧＦ」および「ｍＦＧＦ」として略語形態において本明細書中で使用される。
【００１２】
本出願人らはまた、ＦＧＦまたはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントの単回単位用量が、冠状脈管形成が必要なヒト患者（例えば、任意の医学的管理にもかかわらず任意の冠状動脈疾患を有するヒト患者）の１以上の冠状脈管（ＩＣ）に単位用量として投与される場合に、このヒト患者に、治療学的利益を予想外に提供することを発見し、この治療学的利益は、この単回単位用量が投与された後（症状において反映されるように）２週間ほどの早さで見られ、そしてこの単回単位用量が投与された後（ＥＴＴおよび「Ｓｅａｔｔｌｅ  Ａｎｇｉｎａ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ」（ＳＡＱ）として反映されるように）少なくとも６０日間持続する。例えば、ＣＡＤを有すると診断された２８人のヒト患者が、配列番号５のＦＧＦ−２の０．３３μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇの単位用量をＩＣ投与される前およびその５７日後の両方においてＳＡＱによって評価され、１３〜３６ポイントの範囲で評価された５つの診断基準におけるそれらのスコアの平均的な増加が、処置の代替の様式における「臨床的に重要である」と考えられる８ポイント変化よりも約１．６〜４．５倍大きい。表２を参照のこと。１５人の第１の患者のスコアが、配列番号５のＦＧＦ−２の低用量（２μｇ／ｋｇ未満）を受容する患者と高用量（２μｇ／ｋｇ以上）を受容する患者との間で分析され、そしてＳＡＱによって評価された場合、両方の用量が、それぞれ１２．３〜５８．１および１０．９〜３２．１の範囲の「臨床的に重要な」増加を有するスコアを提供することが見出された。従って、これらの患者が、本発明の低用量または高用量を投与されるかどうかにかかわらず、それらの増加したスコアは、処置の代替の様式において「臨床的に重要である」と考えられる８ポイント変化よりも約１．４〜７．２倍大きかった。表３を参照のこと。
【００１３】
本研究の一部として、ＭＲＩが、駆出率、領域心筋機能および灌流（遅延された到達帯（ｄｅｌａｙｅｄ  ａｒｒｉｖａｌ  ｚｏｎｅ））を評価するために、ＣＡＤであると診断された２３人のヒト患者において実施された。患者らに、配列番号５のＦＧＦ−２の０．３３μｇ／ｋｇ〜１２μｇ／ｋｇの単回単位用量をＩＣ投与した。患者らの心臓機能および冠状機能を、処置の前後に、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって客観的に評価した。ＭＲＩ結果は、収縮の間の領域壁運動（ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｗａｌｌ  ｍｏｔｉｏｎ）（％）および壁厚化（ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ）（％）における有意な改善を実証した。これらの結果はまた、遅延された到達帯（％ＬＶ）の有意な減少を示した。これらの結果は、駆出率（ＥＦ）のいずれの有意な変化を実証しなかった。従って、本出願人らは、本発明に従ってＩＣ投与された場合、ＦＧＦの単回単位用量の、ヒトにおける臨床的効力を実証した。
【００１４】
従って、１つの局面において、本出願人らの発明は、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つの安全かつ治療学的に有効な量のＦＧＦ、あるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む単位用量のＦＧＦに関する。典型的に、この安全かつ治療学的に有効な量は、約０．２μｇ／ｋｇ〜約３６μｇ／ｋｇの、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。他の実施態様において、この単位用量のこの安全かつ治療学的に有効な量は、０．２μｇ／ｋｇ〜２．０μｇ／ｋｇ、２．０μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、または２０μｇ／ｋｇ〜約３６μｇ／ｋｇの、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。多数のヒトＣＡＤ患者について絶対項で表現されると、本発明の単位用量は、０．００８ｍｇ〜６．１ｍｇ、より典型的には０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。
【００１５】
別の局面において、本発明は、安全かつ治療学的に有効な量のＦＧＦまたはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテイン、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物に関する。典型的に、安全かつ治療学的に有効な量のＦＧＦは、約０．２μｇ／ｋｇ〜約３６μｇ／ｋｇの、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテイン、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的組成物の他の実施態様において、安全かつ治療学的に有効な量のＦＧＦは、０．２μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、または２０μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇの、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦのようなＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテイン、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【００１６】
なお別の局面において、本発明は、ＣＡＤについてのヒト患者を処置するため、またはそれにおける冠状脈管形成を誘導するために、上述の単位用量または薬学的組成物を使用する方法に関する。この方法は、冠状動脈疾患についての処置の必要な（または脈管形成の必要な）ヒト患者の１以上の冠状脈管に、安全かつ治療学的に有効な量の組換えＦＧＦまたはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを投与する工程を包含する。典型的に、この安全かつ治療学的に有効な量の一部が、２つの冠状脈管の各々へ投与される。より典型的には、この安全かつ治療学的に有効な量は、薬学的に受容可能なキャリア中に、約０．２μｇ／ｋｇ〜約３６μｇ／ｋｇの、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。他の実施態様において、この安全かつ治療学的に有効な量は、薬学的に受容可能なキャリア中に、０．２μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、または２０μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇの、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。
ＦＧＦは、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｏａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）（例えば、ヘパリン）結合タンパク質であり、そしてグリコサミノグリカン（「プロテオグリカン」または「ムコポリサッカリド」としても公知）の存在が、活性およびＡＵＣを最適化し、本発明のＦＧＦのＩＣ投薬量は、典型的に、ヘパリンのようなグリコサミノグリカンのＩＶ投与の２０分以内に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、２０分間にわたって、ヒトにおいてＩＣ注入によって投与された６つの異なる用量のｒＦＧＦ−２（配列番号５）についての、時間（時間）に対する平均ｒＦＧＦ−２血漿濃度のプロットである。図１における６つの用量のｒＦＧＦ−２は、０．３３μｇ／ｋｇ、０．６５μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇおよび２４μｇ／ｋｇ（除脂肪体重（ＬＢＭ））である。
【図２】図２は、６つの用量のｒＦＧＦ−２についての図１に関しての、ｐｇ・時間／ｍｌでの曲線下の各々の個々の患者のｒＦＧＦ−２領域（ＡＵＣ）のプロットであり、そしてＩＣ注入に続く全身性ｒＦＧＦ−２暴露の用量直線性を示す。
【図３】図３は、「ｒＦＧＦ−２注入前の分」における、ヘパリン投与の時間関数としての、個々のヒト患者のｒＦＧＦ−２用量を正規化したＡＵＣのプロットであり、そしてｒＦＧＦ−２  ＡＵＣにおけるヘパリン投与のタイミングの影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本出願人らは、ＦＧＦまたはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの１用量が、安全かつ治療学的に有効な量で、ＣＡＤと診断されたヒト患者の１以上の冠状脈管へ投与される場合に、この患者に、この患者の冠状動脈疾患についての安全かつ治療学的に有効な処置を提供し、この処置が、さらなる処置が必要とされるより前に少なくとも６ヶ月持続することを発見した。実際、ＣＡＤを処置するための本出願人らの方法は、当該分野で使用される標準的な客観的診断基準（すなわち、ＥＴＴ）によって評価される場合に、処置された患者のＥＴＴにおける１／２〜２分間の予想外の優れた増加を提供した。これは、現在の様式の処置（すなわち、脈管形成術）について臨床的に有意であると考えられる３０秒の増加と比較される場合、例外的に十分に匹敵する。
【００１９】
ＦＧＦに関して本明細書中で使用される句「安全かつ治療学的に有効な量」は、本発明によって投与される場合に、医学的に管理し得ない主要な合併症がなく、かつ最適な医学的管理にもかかわらずＣＡＤの症状を有する患者において客観的な心臓改善を提供する、ＦＧＦまたはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの量を意味する。従って、他の副作用を有さず、流体の投与によって管理され得る急性低血圧は、本発明の目的について「安全」であると考えられる。典型的に、ＦＧＦの安全かつ治療学的に有効な量は、約０．２μｇ／ｋｇ〜約３６μｇ／ｋｇの、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。
【００２０】
従って、本発明は、複数の局面を有する。その第１の局面において、本発明は、脈管形成術と比較した場合、ヒトにおけるＣＡＤを処置する際に予想外に優れた結果を生じた単位用量のＦＧＦ医薬に関する。詳細には、この単位用量は、安全かつ治療学的に有効な量の、ＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。典型的に、この単位用量は、約０．２μｇ／ｋｇ〜約３６μｇ／ｋｇの、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。この単位用量の他の実施態様において、この安全かつ治療学的に有効な量は、約０．２μｇ／ｋｇ〜約２．０μｇ／ｋｇ、約２．０μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇ、または約２０μｇ／ｋｇ〜約３６μｇ／ｋｇの、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。０．００８ｍｇ〜６．１ｍｇの絶対項で、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む処方物で、本発明の単位用量を提供することが、都合がよい。この実施態様において、この単位用量は、多数のＣＡＤ患者の任意の１人へ投薬することに適応するに十分な量のＦＧＦを含み、多数のＣＡＤ患者は、最も低い投薬量（約０．２μｇ／ｋｇ）での最も小さな患者（例えば、４０ｋｇ）から、最も高い投薬量（約３６μｇ／ｋｇ）でのより大きな患者（例えば、１７０ｋｇ）までの範囲に及ぶ。より典型的には、この単位用量は、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。この単位用量は、典型的に、上記で参照される量のＦＧＦ、ならびに有効な量の１以上の薬学的に受容可能な緩衝液、安定化剤および／または本明細書中で後に記載される他の賦形剤を含む、溶液形態または凍結乾燥された形態で提供される。
【００２１】
上述の単位用量の活性薬剤は、組換えＦＧＦあるいはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントまたはムテインである。典型的に、この単位用量の活性薬剤は、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４のいずれか１つのＦＧＦである。より典型的には、この単位用量の活性薬剤は、ｈＦＧＦ−１（配列番号１）、ｂＦＧＦ−１（配列番号２）、ｈＦＧＦ−２（配列番号３）、ｂＦＧＦ−２（配列番号５）、ｈＦＧＦ−４（配列番号８）またはｈＦＧＦ−５（配列番号９）である。代替の実施態様において、この単位用量の活性薬剤は、ｈＦＧＦ−６（配列番号１０）、ｍＦＧＦ−８（配列番号１２）、ｈＦＧＦ−９（配列番号１３）またはｈＦＧＦ−９８（配列番号１４）である。
【００２２】
本発明の単位用量、薬学的組成物および方法において利用される多数の哺乳動物ＦＧＦのアミノ酸配列およびそれを作製するための方法は、当該分野において周知である。詳細には、哺乳動物ＦＧＦ１−９およびＦＧＦ−９８のアミノ酸配列および組換え発現を開示する参照が、以下で連続して議論される。
【００２３】
ＦＧＦ−１：ｈＦＧＦ−１（配列番号１）のアミノ酸配列およびその組換え発現が、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ」という題名の米国特許第５，６０４，２９３号（Ｆｉｄｄｅｓ）（これは、１９９７年２月１８日に発行された）に開示される。’２９３患者の図２ｄを参照のこと。この参考文献および本明細書における他の全ての参考文献は、この文章の前後に引用されるにかかわらず、その全体が本明細書中で参考として明示的に援用される。ｂＦＧＦ−１（配列番号２）のアミノ酸配列および組換え発現がまた、米国特許第５，６０４，２９３号（Ｆｉｄｄｅｓ）に開示され、これは、参考として本明細書中で援用された。’２９３患者の図１ｂを参照のこと。ｈＦＧＦ−１（配列番号１）およびｂＦＧＦ−１（配列番号２）の両方が、１４０個のアミノ酸残基を有する。ｂＦＧＦ−１は、ｈＦＧＦ−１と、１９個の残基位置が異なる：５（Ｐｒｏ→Ｌｅｕ）、２１（Ｈｉｓ→Ｔｙｒ）、３１（Ｔｒｙ→Ｖａｌ）、３５（Ａｒｇ→Ｌｙｓ）、４０（Ｇｌｎ→Ｇｌｙ）、４５（Ｇｌｎ→Ｐｈｅ）、４７（Ｓｅｒ→Ｃｙｓ）、５１（Ｔｒｙ→Ｉｌｅ）、５４（Ｔｒｙ→Ｖａｌ）、６４（Ｔｒｙ→Ｐｈｅ）、８０（Ａｓｎ→Ａｓｐ）、１０６（Ａｓｎ→Ｈｉｓ）、１０９（Ｔｙｒ→Ｖａｌ）、１１６（Ｓｅｒ→Ａｒｇ）、１１７（Ｃｙｓ→Ｓｅｒ）、１１９（Ａｒｇ→Ｌｅｕ）、１２０（Ｇｌｙ→Ｇｌｕ）、１２５（Ｔｙｒ→Ｐｈｅｓ）および１３７（Ｔｒｙ→Ｖａｌ）。ほとんどの場合において、これらの差異が保存される。さらに、残基の１１６位および１１９位のこれらの差異は、Ａｒｇの位置を交換するのみである。
【００２４】
ＦＧＦ−２：ｈＦＧＦ−２（配列番号３）のアミノ酸配列およびその組換え発現のための方法が、「ＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ」との題名の米国特許第５，４３９，８１８号（Ｆｉｄｄｅｓ）（これは、１９９５年８月０８日に発行された）（その中の図４を参照のこと）において、および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ」との題名の米国特許第５，５１４，５６６号（Ｆｉｄｄｅｓ）（これは、１９９６年５月０７日に発行された）（その中の図４を参照のこと）において開示される。ｂＦＧＦ−２のアミノ酸配列（配列番号５）およびその組換え発現のための種々の方法が、「Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ」との題名の米国特許第５，１５５，２１４号（これは、１９９２年１０月１３日に発行された）において開示される。ｈＦＧＦ−２およびｂＦＧＦ−２の１４６個の残基形態が比較される場合、それらのアミノ酸配列は、ほぼ同一であり、２つの残基のみが異なる。詳細には、ｈＦＧＦ−２からｂＦＧＦ−２への変化では、唯一の差異は、残基１１２位（Ｔｈｒ→Ｓｅｒ）および１２８位（Ｓｅｒ→Ｐｒｏ）で生じる。
【００２５】
ＦＧＦ−３：ＦＧＦ−３（配列番号７）は、まず、マウスｉｎｔ−２乳房腫瘍の発現産生物として同定され、そしてそのアミノ酸配列は、Ｄｉｃｋｓｏｎらの「Ｐｏｔｅｎｉｔｉａｌ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：８３３（１９８７年４月３０日）において開示される。Ｎ末端Ｍｅｔが排除される場合に２３４個の残基を有するＦＧＦ−３（配列番号７）は、実質的に、ＦＧＦ−１（ヒトおよびウシ）およびＦＧＦ−２（ヒトおよびウシ）の両方よりも長い。ｂＦＧＦ−１（配列番号２）およびｂＦＧＦ−２（配列番号５）に対するｍＦＧＦ−３（配列番号７）についてアミノ酸残基の比較が、Ｄｉｃｋｓｏｎら（１９８７）の重複様式で示される。ｍＦＧＦ−３（配列番号７）のアミノ酸配列がｂＦＧＦ−１（配列番号２）およびｂＦＧＦ−２（配列番号５）と比較される場合、ＦＧＦ−３は、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の両方に対して５つの残基挿入物を含む５つの位置を有する。これらの挿入物のうちの最も重要なものは、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−１に対するそれぞれ、１２および１４残基の挿入物であり、ＦＧＦ−３の残基１３５位で始まる。これらの挿入物を考慮に入れて、Ｄｉｃｋｓｏｎは、ｍＦＧＦ−３がＦＧＦ−１に対して５３個の残基同一性を有し、そしてＦＧＦ−２に対して６９個の残基同一性を有することを開示する。さらに、ＦＧＦ−３は、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の両方におけるシグナル配列のＮ末端に対して、１０個の残基の疎水性Ｎ末端の伸張を含む。ｂＦＧＦ−１およびｂＦＧＦ−２のＣ末端に対して、ｍＦＧＦ−３は、約６０個の残基伸張を含む。ｍＦＧＦ−３のＣ末端伸張は活性のために必要でなさそうである。よりおそらく、それは、ＦＧＦにレセプター特異性を与えることによる活性のモデレーター（ｍｏｄｅｒａｔｏｒ）である。
【００２６】
ＦＧＦ−４：ｈＦＧＦ−４（配列番号８）として現在公知である、ｈｓｔタンパク質についてのアミノ酸配列が、まず、Ｙｏｓｈｉｄａら「Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｓｔ，ａ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｔ−２−Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８４：７３０５−７３０９（１９８７年１０月）によって開示された。そのリーダー配列を含んで、ｈＦＧＦ−４（配列番号８）は、２０６個のアミノ酸残基を有する。ｈＦＧＦ−４（配列番号７）、ｈＦＧＦ−１（配列番号１）、ｈＦＧＦ−２（配列番号３）およびｍＦＧＦ−３（配列番号５）のアミノ酸配列が比較される場合；ｈＦＧＦ−４の残基７２〜２０４が、ｈＦＧＦ−２（配列番号５）に対して４３％の相同性を有し；残基７９〜２０４が、ｈＦＧＦ−１（配列番号１）に対して３８％相同性を有し；そして残基７２〜１７４が、ｍＦＧＦ−３（配列番号７）に対して４０％の相同性を有する。重複形態でのこれらの４つの配列の比較が、Ｙｏｓｈｉｄａ（１９８７）の図３で示される。さらに、ｈＦＧＦ−４の残基８８位および１５５位でのＣｙｓが、ｈＦＧＦ−１、ｈＦＧＦ−２、ｍＦＧＦ−３およびｈＦＧＦ−４の中で高度に保存され、そして相同領域において見出される。
【００２７】
ｈＦＧＦ−２（配列番号３）の２つの推定細胞結合部位が、その残基３６位〜３９位および７７位〜８１位で生じる。Ｙｏｓｈｉｄａ（１９８７）の図３を参照のこと。ｈＦＧＦ−２の２つの推定ヘパリン結合部位が、その残基１８位〜２２位および１０７位〜１１１位で生じる。Ｙｏｓｈｉｄａ（１９８７）の図３を参照のこと。ヒトおよびウシのＦＧＦ−２についてのアミノ酸配列の間の実質的な類似性を考慮すると、本発明者らは、ｂＦＧＦ−２（配列番号５）についてのこの細胞結合部位がその残基３６位〜３９位および７７位〜８１位にあること、ならびにこのヘパリン結合部位がその残基１８位〜２２位および１０７位〜１１１位にあることを予想する。ｈＦＧＦ−１（配列番号１）に関して、この推定細胞結合部位が、残基２７位〜３０位および６９位〜７２位で生じ、そしてこの推定ヘパリン結合部位が、残基９位〜１３位および９８位〜１０２位で生じる。ｂＦＧＦ−１（配列番号２）が、残基９位〜１３位、２７位〜３０位、６９位〜７２位および９８位〜１０２位において、ｈＦＧＦ−１（配列番号１）が有するのと同一のアミノ酸を有する限り、ｂＦＧＦ−１は、ｈＦＧＦ−１が有するのと同一の細胞およびヘパリン結合部位を有することが予想される。
【００２８】
ＦＧＦ−５：ｈＦＧＦ−５（配列番号１５）をクローニングするためのアミ酸配列および方法が、Ｚｈａｎらの「Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ−５  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ」、Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８（８）：３４８７〜３４９５（１９８８年８月）において開示される。本出願人らはまた、ＦＧＦ−５を配列決定し、そして配列番号９のアミノ酸配列を得た。このアミノ酸配列は、残基２３６位において（ＺｈａｎのＡｓｎの代わりにＬｙｓを有する）および残基２４３位において（ＺｈａｎのＳｅｒの代わりにＰｒｏを有する）、Ｚｈａｎの配列と異なる。ｈＦＧＦ−５（配列番号９）およびｈＦＧＦ−５（配列番号１５）の両方は、配列番号５のＦＧＦ−２の第１残基の上流の６７個の残基のリーダー配列、およびｈＦＧＦ−２のＣ末端を超えて約４７個の残基だけ延びるテイル配列を含む、２６６個のアミノ酸残基を有する。ｈＦＧＦ−１（配列番号１）、ｈＦＧＦ−２（配列番号３）、ｍＦＧＦ−３（配列番号７）、ｈＦＧＦ−４（配列番号８）およびＦＧＦ−５（配列番号９）のアミノ酸配列の間の比較が、Ｚｈａｎ（１９８８）の図２に示される。Ｚｈａｎの図２において、ｈＦＧＦ−１、ｈＦＧＦ−２、ｍＦＧＦ−３およびｈＦＧＦ−４が、それぞれ、ａＦＧＦ（すなわち、酸性ＦＧＦ）、ｂＦＧＦ（すなわち、塩基性ＦＧＦ）、ｉｎｔ−２、およびｈｓｔＫＳ３として、すなわちそれらの本来の名称によって同定される。上記で参照される比較において、ＦＧＦ−５アミノ酸残基の２つのブロック（９０〜１８０および１８７〜２０７）が、ＦＧＦ１−４に対して実質的な相同性、すなわち、ＦＧＦ−４と５０．４％、ＦＧＦ−３と４７．５％、ＦＧＦ−２と４３．３％およびｈＦＧＦ−１と４０．２％を示した。Ｚｈａｎ（１９８８）の図２を参照のこと。米国特許第５，１５５，２１７号（Ｇｏｌｄｆａｒｂ）および同第５，２３８，９１６号（Ｇｏｌｄｆａｒｂ）（こららは、Ｚｈａｎ公開に対応する）は、ＦＧＦ−３としてＺｈａｎのＦＧＦ−５を参照する。しかし、当該分野（Ｃｏｕｌｉｅｒによって以下に実証されるように）は、Ｚｈａｎ（およびＧｏｌｄｆａｒｂ）のｈＦＧＦを、ＦＧＦ−３としてでなく、ＦＧＦ−５として認識するようになった。これらの２つのＧｏｌｄｆａｒｂの特許は、Ｚｈａｎによって上記で報告されたのと同一のｈＦＧＦ−５（配列番号１５）のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
（ＦＧＦ−６：）  ｈＦＧＦ−６（配列番号１０）のアミノ酸配列およびクローニングのための方法は、Ｃｏｕｌｉｅｒら、「Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦＧＦ−６  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ａｎｄ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１４３７〜１４４４（１９９１）に開示される。ｈＦＧＦ−６は、ＦＧＦの中で最も大きなものの一つで、２０８アミノ酸残基を有する。ヒトＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６およびＦＧＦ−７のアミノ酸配列が比較される場合、分子のカルボキシ末端２／３において強い類似性が存在する（例えば、ｈＦＧＦ−６（配列番号１０）の７８〜２０８残基に対応する）。特に、２つのシステインを含む２３残基（配列番号１０のｈＦＧＦ−６の９０〜１５７の位置）は、このファミリーの７つのメンバーの間で同一である。このメンバーは、保存されたアミノ酸残基が考慮される場合、３３残基に増加する。これら７つのヒトＦＧＦの間の全体の類似性は、これらの分子のカルボキシ末端２／３に関して３２％〜７０％の同一残基および４８％〜７９％の保存残基に及ぶ。ＦＧＦ−６と比較したこの配列比較を、本明細書中の表１に示す。
【００３０】
【表１】
2010174017.tif 000002
表１を参照して、ＦＧＦ−６は、ＦＧＦ−４と最も高い一致（９１の同一残基／１０３の保存残基）を有する。これは、合計７０％の同一残基および７９％の保存残基になる。ｈＦＧＦ−６（配列番号１０）は、ｈＦＧＦ−３（配列番号２）、ｈＦＧＦ−２（配列番号３）、ｈＦＧＦ−７（配列番号１１）およびｈＦＧＦ−１（配列番号１）と最も異なり、それぞれに４２、４２、３６および３２の同一残基を有する。
【００３１】
ＦＧＦ１〜７のアミノ酸配列のオーバーレイした比較が、援用されるＣｏｕｌｉｅｒ（１９９１）の図３に示される。Ｃｏｕｌｉｅｒの図３は、ＦＧＦ分子のＣ末端２／３が整列される場合、全ての７つのＦＧＦメンバー由来の残基が同一である２３残基の位置が存在することを示す。全ての７つのＦＧＦメンバー由来の残基が保存された１０残基の位置もまた存在する。Ｃｏｕｌｉｅｒ（１９９１）の図３。組合せて、これら同一残基および保存残基は、ＦＧＦ１〜７の各々の末端２／３上に約６箇所の３〜５残基を形成し、ここで３〜５残基は、ヒトＦＧＦ全ての７つの種（すなわちｈＦＧＦ１〜７）において共にグループ化される。
【００３２】
（ＦＧＦ−７：）
ｈＦＧＦ−７（配列番号１１）のアミノ酸配列は、Ｍｉｙａｍｏｔｏら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎｉｎｔｈ  Ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｆａｍｉｌｙ，Ｗｈｉｃｈ  Ｈａｓ  ａ  Ｕｎｉｑｕｅ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ」、Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３（７）：４２５１〜４２５９（１９９３）に開示される。Ｍｉｙａｍｏｔｏにおいて、このｈＦＧＦ−７は、その昔の名称ＫＧＦによって言及された。配列番号１１に示されるように、ＦＧＦ−７は、１９１アミノ酸残基を有する。ｈＦＧＦ−７（配列番号１１）をｈＦＧＦ１〜６およびｈＦＧＦ−９と比較したＭｉｙａｍｏｔｏは、ＦＧＦ−７のカルボキシ末端２／３がこの群の他のメンバーの末端２／３と比較可能な相同性を有することを示す。Ｍｉｙａｍｏｔｏ（１９９３）の４２５４頁（図２）を参照のこと。
【００３３】
（ＦＧＦ−８：）
ｍＦＧＦ−８（配列番号１２）のアミノ酸配列およびその組換え体発現のための方法は、Ｔａｎａｋａら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ」、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９：８９２８〜８９３２（１９９２）に開示される。ＴａｎａｋａのｍＦＧＦ−８は、２１５アミノ酸残基を有する。ＭａｃＡｒｔｈｕｒら、「ＦＧＦ−８  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｌｉｃｅ  ｆｏｒｍｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２１：３６０３〜３６１３（１９９５）は、ＦＧＦ−８が成熟したＮ末端において異なるがＣ末端領域に渡って同一であるという８つの異なるアイソフォームを有することを開示する。この８つのアイソフォームは、ＦＧＦ−８が、最初の４つ（ほとんどの他のＦＧＦ遺伝子の第一エキソンに対応する）は選択的スプライシングが生じる６つのエキソンを有することに起因して生じる。
【００３４】
（ＦＧＦ−９：）
ｈＦＧＦ−９のアミノ酸配列およびその組換え発現のための方法は、Ｓａｎｔｏｓ−Ｏｃａｍｐｏら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（３）：１７２６〜１７３１（１９９６）に開示される。この表題にもかかわらず、Ｏｃａｍｐｏは、ｈＦＧＦ−９（配列番号１３）およびｍＦＧＦ−９の両方のアミノ酸配列を開示する。ヒトおよびマウスのＦＧＦ−９分子は、わずか２つの残基で異なる２０８アミノ酸残基および配列を有する。特に、ｈＦＧＦ−９は、ＡｓｎおよびＳｅｒを、それぞれ残基９および３４に有し、一方、ｍＦＧＦ−９は、それぞれＳｅｒおよびＡｓｎを有する。ＦＧＦ−９は、ＦＧＦファミリーを定義する保存されたアミノ酸の完全な保存を有する。Ｓａｎｔｏｓ−Ｏｃａｍｐｏ（１９９６）の１７２６頁。ＦＧＦ−９の最大半減活性は、１８５ｎｇ／ｍｌヘパリンにおいて見られ、一方、ＦＧＦ−１の最大半減活性は、６７０ｎｇ／ｍｌヘパリンにおいて見られる。Ｓａｎｔｏｓ−Ｏｃａｍｐｏ（１９９６）の１７３０頁。ＦＧＦ−１と比較する場合、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−９の両方は、最適な活性のためのより低いヘパリン濃度を要求する。
【００３５】
（ＦＧＦ−９８：）
ｈＦＧＦ−９８（配列番号１４）のアミノ酸配列およびその組換え発現のための方法は、ここにおいてその全体を本明細書中に参考として援用する米国特許仮出願番号第６０／０８３，５５３号に開示される。ｈＦＧＦ−１８としても公知のｈＦＧＦ−９８は、２０７アミノ酸残基を有する。従って，ｈＦＧＦ−６（２０７残基）、ｈＦＧＦ−９（２０８残基）およびｈＦＧＦ−９８（２０７残基）は、大きさにおいて類似する。
【００３６】
ＦＧＦは、順々に生物学的な応答を媒介する４つの関連した膜貫通型レセプターの１つ以上と差示的に結合しそしてこれらを活性化する。ＦＧＦレセプター（「ＦＧＦＲ」）は、チロシンキナーゼレセプタースーパーファミリーのメンバーである。ＦＧＦＲの細胞外ドメインは，選択的スプライシングの結果として差示的に発現する２〜３の免疫グロブリン様（「ＩＧ様」）ドメインを含む。別の選択的スプライシング事象はまた，Ｉｇ様ドメインＩＩＩのカルボキシ末端半分の配列をリーディングフレームを変化することなく改変し得る。Ｓａｎｔｏｓ−Ｏｃａｍｐｏ（１９９６）。「ｂ」および「ｃ」として言及される２つのスプライス型は、ＦＧＦＲの１、２、３を生じるが，４を生じない。ＦＧＦＲのより詳細な記述は，Ｍａｔｈｉｅｕら、「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ３」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０（４１）：２４１９７〜２４２０３（１９９５）に見出される。差示的にＦＧＦＲを刺激するＦＧＦ１〜９の能力は、Ｏｒｎｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（２５）：１５２９２〜１５２９７（１９９６）により報告されたようにレセプター依存的であった。Ｏｒｎｉｔｚにおいて、細胞株ＢａＦ３は、画分に分割され，そして各々の画分は，以下のＦＧＦレセプターの１つを発現するようにトランスフェクトされた：ＦＧＦＲ１ｂ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｂ、ＦＧＦＲ３ｃおよび（１つのＩｇ様ドメインを除いた）ＦＧＦ４。その後，形質転換された細胞株は，ＦＧＦ１〜９（５ｎＭ）の１つおよび補因子としてのヘパリン（２μｇ／ｍｌ）に暴露された。次いでマイトジェン応答が、［3Ｈ］チミジンの取りこみによって計測された。ｃｐｍでの結果は，以下の通りである。
【００３７】
１．ＦＧＦＲ１ｂ：類似のマイトジェン応答が、ｈＦＧＦ−１（３２，０００ｃｐｍ）およびｈＦＧＦ−２（２８，０００ｃｐｍ）によって、次に高い応答は、ｍＦＧＦ−３（約１６，０００ｃｐｍ）およびｈＦＧＦ−４（１５，０００ｃｐｍ）により産生された；
２．ＦＧＦＲ１ｃ：類似のマイトジェン応答が、ｈＦＧＦ−１、ｈＦＧＦ−２、ｈＦＧＦ−４、ｈＦＧＦ−５およびｈＦＧＦ−６（約３６，０００ｃｐｍ）によって産生され、ｍＦＧＦ−９は唯一、他の有意な応答（約１９，０００ｃｐｍ）を産生した；
３．ＦＧＦＲ２ｂ：最大のマイトジェン応答は、ｈＦＧＦ−７（１４，０００ｃｐｍ）、ｈＦＧＦ−１（１２，５００ｃｐｍ）およびｍＦＧＦ−３（９，５００ｃｐｍ）によってであった；
４．ＦＧＦＲ２ｃ：最大のマイトジェン応答は、ｈＦＧＦ−４（２１，０００ｃｐｍ）、ｍＦＧＦ−９（２０，０００ｃｐｍ）、ｈＦＧＦ−６（１６，５００ｃｐｍ）、ｈＦＧＦ−１（１６，０００ｃｐｍ）、ｈＦＧＦ−２（１４，５００ｃｐｍ）、ｈＦＧＦ−５（９，５００ｃｐｍ）およびｍＦＧＦ−８（９，０００ｃｐｍ）によってであった；
５．ＦＧＦＲ３ｂ：マイトジェン応答は、ｈＦＧＦ−１（３７，０００ｃｐｍ）およびｍＦＧＦ−９（２６，０００ｃｐｍ）によってのみであった；
６．ＦＧＦＲ３ｃ：最大のマイトジェン応答は、ｈＦＧＦ−１（３９，０００ｃｐｍ）、ｈＦＧＦ−２（３４，０００ｃｐｍ）、ｈＦＧＦ−４（３３，０００ｃｐｍ）、ｍＦＧＦ−８（３２，５００ｃｐｍ）、ｍＦＧＦ−９（３１，０００ｃｐｍ）、ｈＦＧＦ−５（１６，０００ｃｐｍ）およびｈＦＧＦ−６（１３，０００ｃｐｍ）による；
７．ＦＧＦＲ４Δ：最大のマイトジェン応答は、ｈＦＧＦ−２（２９，０００ｃｐｍ）、ｈＦＧＦ−４およびｈＦＧＦ−６（２７，０００ｃｐｍ）、ｍＦＧＦ−８（２５，０００ｃｐｍ）、ｍＦＧＦ−１（２４，０００ｃｐｍ）ならびにｈＦＧＦ−９（２０，０００ｃｐｍ）により、他の全ては６，０００ｃｐｍ以下であった。
【００３８】
上述に示されるように，ＦＧＦ−１のみが、試験されたレセプター全てにおいて有意なマイトジェン応答を誘導する。従って、ＦＧＦ−１は，他のＦＧＦと関連するレセプター特異性を生じさせる分子へのＮ末端付加およびＣ末端付加を伴う万能なリガンド（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｌｉｇａｎｄ）として考えられ得る。全身的に投与されたＦＧＦによるインビボでの多様な応答に関する可能性を考慮すると、局所的な投与によって、そして局所的な投与のために好適な投薬量を発見することによって（すなわち、ＣＡＤに関する処置の必要な患者の少なくとも１つの冠状動脈への哺乳動物ＦＧＦの治療的有効量の投与によって）、本発明は、全身的な応答についての可能性を最小化する。
【００３９】
以下に続く実施例において、ｂＦＧＦ−２（配列番号５）を、ラット、ブタおよびヒトにインビボで投与し、新脈管形成の活性に関して試験した。実施例のｂＦＧＦ−２を、米国特許第５，１５５，２１４号に記載されたように作製した。この‘２１４特許においては、配列番号５のｂＦＧＦ（本明細書中で以降、「ＦＧＦ−２」）をコードする配列番号４のＤＮＡが、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、Ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲＩ、ＲＰ４またはλファージのようなクローニングベクターに挿入され、そしてこのクローニングベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかを形質転換するのに用いられ、この形質転換された細胞は、ＦＧＦ−２を発現する。１つの実施態様において、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母細胞である。結果的に発現した全長ＦＧＦ−２は、配列番号５に従う１４６アミノ酸を有する。配列番号５のＦＧＦ−２は４つのシステイン（すなわち、残基位置２５、６９、８７および９２）を有するが、内部のジスフィルド結合は存在しない［‘２１４  第６欄、５９〜６１行］。しかし、酸化的な条件下で架橋が生じる事象において、それは、残基位置２５および６９でおそらく生じ得る。
【００４０】
ヒトＦＧＦ−２に対応するようなウシ起源の配列番号５の哺乳動物ＦＧＦ−２は、最初インビボで１５５アミノ酸残基を有するポリペプチドとして合成される。Ａｂｒａｈａｍら、「Ｈｕｍａｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ」ＥＭＢＯ  Ｊ．、５（１０）：２５２３〜２５２８（１９８６）。Ａｂｒａｈａｍの全長１５５残基のウシＦＧＦ−２と比較する場合、出願人らの配列番号５のＦＧＦ−２は、対応する全長分子のＮ末端の最初の９つのアミノ酸残基であるＭｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ（配列番号６）を欠く。上で論じたように、配列番号５のＦＧＦ−２は、２つの残基の位置においてヒトＦＧＦ−２とは異なる。特に、配列番号５のｂＦＧＦ−２の残基位置１１２および１２８のアミノ酸は、それぞれＳｅｒおよびＰｒｏであり、一方、ｈＦＧＦ−２においては、それらはそれぞれＴｈｒおよびＳｅｒである。この実質的な構造的同一性を考慮すると、実施例に提供され、そしてｂＦＧＦ−２（配列番号５）について本明細書中の他で論じたインビボの臨床結果は、ｈＦＧＦ−２（配列番号３）に直接適用可能であるはずである。
【００４１】
実施例の組換え体ｂＦＧＦ−２（配列番号５）は、「Ｂｏｖｉｎｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ」と表題付けられた０９／１１／９０に発行され、本明細書中にその全体が参考として援用された米国特許第４，９５６，４５５号に詳細に記載された技術を用いて、製薬品質（９８％以上の純度）に精製された。特に、出願人らの単位用量の組換えｂＦＧＦ−２の精製において利用された最初の２つの工程は、「以前に記載されたような慣習的なイオン交換精製手順および逆相ＨＰＬＣ精製手順」である。［Ｂｏｌｅｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１：５３６４〜５３６８（１９８４）を引用した米国特許第４，９５６，４５５号］。‘４５５特許が「重要な精製工程」と呼ぶ第３の工程［‘４５５  第７欄、５〜６行］は、ｈｅｐａｒｉｎ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）アフィニティクロマトグラフィーであり、ＦＧＦ−２の強力なヘパリン結合親和性は、約１．４Ｍおよび１．９５Ｍ  ＮａＣｌで溶出される場合、数千倍の精製を達成するのに使用される［‘４５５  第９欄、２０〜２５行］。ポリペプチド均一性は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって確認される。緩衝液交換は、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ−２５（Ｍ）ゲル濾過クロマトグラフィーによって達成された。
【００４２】
配列番号１〜３、５，８〜１０または１２〜１４の任意の哺乳動物ＦＧＦに加えて、本発明の単位用量における活性薬剤はまた、「その新脈管形成的に活性なフラグメント」を含む。用語「その新脈管形成的に活性なフラグメント」は、配列番号５の残基配列の約８０％を有し、かつ対応する成熟した哺乳動物ＦＧＦの新脈管形成効果を保持する配列番号１〜３、５，８〜１０または１２〜１４の任意のＦＧＦのフラグメントを意味する。共通の短縮化（ｔｒａｎｃａｔｉｏｎ）は、メチオニンアミノペプチダーゼを用いる処理のような周知の技術を用いたＮ末端のメチオニンの除去である。２番目の所望される短縮化は、そのリーダー配列のない哺乳動物ＦＧＦを含む。当業者は、このリーダー配列を、細胞膜の通過を容易にするが、活性に必須でなくかつ成熟タンパク質においては見出されないタンパク質のＮ末端の一連疎水性残基として認識する。
【００４３】
好ましい短縮化は、ｈＦＧＦ−２（または類似のｂＦＧＦ−２）に関して決定される。一般則として、哺乳動物ＦＧＦのアミノ酸配列は、最大の相同性を得るためにＦＧＦ−２と整列される。整列したＦＧＦ−２（配列番号３または５）の対応するＮ末端を超えて伸長する哺乳動物ＦＧＦの部位はまた、有害な効果を伴わない欠失のために適切である。同様に、整列されたＦＧＦ−２（配列番号３または５）のＣ末端を超えて伸長する哺乳動物ＦＧＦの部分もまた、有害な効果なく欠失され得る。
【００４４】
上記のものよりも短いＦＧＦのフラグメントはまた、ＦＧＦの細胞結合部位およびヘパリン結合セグメントの少なくとも一つが残存する限り、本発明の範囲内である。先に既に議論されたように、ＦＧＦ−２（ヒトまたはウシ）のヘパリン結合セグメントは、残基１８〜２２および１０７〜１１１に生じる。一方、細胞結合部分は、残基３６〜３９および７７〜８１に生じる。例えば、ｂＦＧＦ−２のＮ末端短縮化がウシにおける新脈管形成活性を排除しないということは、当該分野において周知である。特に、この技術は、配列番号５のｂＦＧＦ−２に関してＮ末端短縮化を有する配列番号５のｂＦＧＦ−２のいくつかの天然に生じるフラグメントおよび生物学的に活性なフラグメントを開示する。配列番号５の残基１２〜１４６を有する活性かつ短縮化されたｂＦＧＦ−２は、ウシの肝臓に見出され、そして配列番号５の残基１６〜１４６を有する別の活性かつ短縮化されたｂＦＧＦ−２は、ウシの腎臓、副腎および精巣に見出された。［Ｕｅｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１３８：５８０〜５８８（１９８６）を引用する米国特許第５，１５５，２１４  第６欄、４１〜４６行を参照のこと］。同様に、ＦＧＦ活性を有することが公知の配列番号５のｂＦＧＦ−２の他のフラグメントは、ＦＧＦ−２（２４〜１２０）−ＯＨおよびＦＧＦ−２（３０〜１１０）−ＮＨ2である。［米国特許第５，１５５，２１４  第６欄、４８〜５２行］。これらの後者のフラグメントは、ｂＦＧＦ−２（配列番号５）の細胞結合部位およびヘパリン結合セグメントの一つ（残基１０７〜１１１）の両方が残存する。従って、哺乳動物ＦＧＦの新脈管形成的に活性なフラグメントは、代表的にＦＧＦ−２と相同性を最大にするように整列される場合、少なくとも配列番号５のｂＦＧＦ−２（または配列番号３のｈＦＧＦ−２）の残基３０〜１１０に対応する残基、より代表的に、少なくとも配列番号５のｂＦＧＦ−２の残基１８〜１４６に対応する残基を有するこれらの末端短縮化フラグメントを含む。
【００４５】
本発明の単位用量はまた、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意の哺乳動物ＦＧＦの「新脈管形成的に活性な．．．ムテイン」を含む。用語「新脈管形成的に活性な．．．ムテイン」は、これらの個々の部位において配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意の残基の少なくとも８０％、好ましくは９０％を構造的に残存し、そして配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意のＦＧＦの新脈管形成的な活性を機能的に残存する、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意の哺乳動物ＦＧＦの変異型を意味する。好ましくは、この変異は、Ｌ−アミノ酸を用いる「保存的な置換」であり、１つのアミノ酸が別の生物学的に類似のアミノ酸によって置換される。保存的な置換の例は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＧｌｙのような疎水性の残基の１つの他への置換、もしくはＰｈｅ⇔Ｔｙｒ、Ｓｅｒ⇔Ｔｈｒ、またはＡｒｇとＬｙｓとの間、ＧｌｕとＡｓｐとの間、またはＧｌｎとＡｓｎとの間などのような１つの極性の残基の他への置換を含む。概して、変化されたアミノ酸は、お互いに交換可能とみなされる。しかし、より保存的に置換を作製するために、側鎖についての大きさおよび電荷（もしあれば）の類似の両方を考慮する。他の適切な置換は、ジスフィルド形成に含まれない残基位置のシステイン（ｈＦＧＦ−２（配列番号３）またはｂＦＧＦ−２（配列番号５）中の残基８７および９２のような）の一方または両方へのセリンの置換を含む。好ましくは、置換は、新脈管形成的な活性に関与しないＮ末端に導入される。しかし、上記のように、保存的な置換は、分子を通じて導入されるのに適切である。
【００４６】
当業者は、当該分野に公知の技術を用いて、本発明の単位用量、組成物および方法における使用のための新脈管形成的な活性を有するＦＧＦポリペプチドムテイン（またはフラグメントムテイン）の発現を得るために、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意の哺乳動物ＦＧＦをコードするＤＮＡ中に１つ以上の点変異を作成することが可能である。配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意のＦＧＦの新脈管形成的に活性なムテインを調製するために、当業者は、当該分野において公知のおよび／またはＧｉｌｍａｎら、Ｇｅｎｅ、８：８１（１９７９）またはＲｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：７３１（１９８７）に教示されるような部位特異的変異誘発の標準的技術を、１つ以上の点変異を配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意のＦＧＦをコードするｃＤＮＡに導入するために使用する。
【００４７】
第二の局面において、本発明は、安全性および配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意の哺乳動物ＦＧＦまたは新脈管形成的に活性なそのフラグメントもしくはそのムテインの脈管形成的に有効な用量、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的な組成物に関する。代表的には、本発明の薬学的組成物の安全性かつ新脈管形成的に有効な用量は、形態および大きさにおいてヒト患者への投与に適切であり、以下を含む：（ｉ）０．２μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇの配列番号１〜３、５、８〜１０もしくは１２〜１４の任意のＦＧＦまたは新脈管形成的に活性なそのフラグメントもしくはそのムテイン；（ｉｉ）および薬学的に受容可能なキャリア。他の実施形態において、安全かつ新脈管形成的に効果的な用量は、０．２μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇまたは２０μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇの配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意のＦＧＦあるいは新脈管形成的に活性なそのフラグメントもしくはそのムテイン、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【００４８】
本明細書中で用いられる場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、タンパク質様医薬（例えば、本明細書中に開示された配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意の哺乳動物ＦＧＦ）の安定化および／または投与のために当該分野において公知の任意のキャリアまたは希釈液を意味し、これは、この組成物を受け入れる個体に有害な抗体の産生を自身で誘導せず、そして過度の毒性なしに投与され得る。本発明の他の局面において、薬学的組成物が提供され、これは薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈液の組合せで、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意の組換えＦＧＦあるいは新脈管形成的に活性なそのフラグメントもしくはそのムテインを含む。このような薬学的組成物は、投与の前に溶液に溶解される溶液として、または固形（例えば、凍結乾燥した）としてのいずれかに調製され得る。さらに、この組成物は、適切なキャリアまたは希釈液を用いてＩＣ注射または投与のために調製され得る。薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈液は、利用される用量および濃度においてヒトレシピエントに無毒性である。注射可能または注入可能な溶液のための適切なキャリアまたは希釈液の代表的な例は、滅菌水または等張性生理食塩水溶液を含む。これらは、好ましくは、適切なｐＨで緩衝化され（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）、そして必要に応じてマンニトール、ブドウ糖、グリセリン、エタノール、および／または１つ以上のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））を含む。トレハロース、チオグリセロールおよびジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような安定剤もまた、添加され得る。
【００４９】
代表的な薬学的組成物は、０．００１〜１０ｍｇ／ｍｌ、より代表的には０．０３〜０．５ｍｇ／ｍｌの配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意のｒＦＧＦまたは新脈管形成的に活性なそのフラグメントもしくはそのムテイン、１０ｍＭ  チオグリセロール、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ５）を含む。上記の組成物に適切な希釈液または洗浄（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）薬は、上記の任意のキャリアである。代表的には、この希釈液は、１０ｍＭ  チオグリセロール、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ５）を含むキャリア溶液自身である。配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意のｒＦＧＦまたは新脈管形成的に活性なそのフラグメントもしくはそのムテインは、液状形態で長時間では不安定である。安定性および有効期限を最大限にするために、配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意のｒＦＧＦまたは新脈管形成的に活性なそのフラグメントもしくはそのムテインの有効量を薬学的に受容可能な水性のキャリア中に含む本発明の薬学的な組成物は、−６０℃で冷凍貯蔵されるべきである。融解した場合、この溶液は、冷蔵された条件で６ヶ月間安定である。代表的な単位用量は、１．５〜８ｍｇの配列番号１〜３、５、８〜１０または１２〜１４の任意のＦＧＦを有する上記の組成物の約５〜１０ｍｌを含む。
【００５０】
別の実施態様において、薬学的組成物は、凍結乾燥（フリーズドライ）形態で、配列番号１〜３、５、８〜１０、もしくは１２〜１４の任意の１つのＦＧＦ、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの、単位用量を含む。この形態において、ＦＧＦの単位用量は、治療的効果の損失なく、実質的に６ヶ月より長く、凍結温度で保存され得る。凍結乾燥は、複数のバイアルの、減圧下での急速凍結乾燥により達成される。それぞれのバイアルは、その中に、本発明のＦＧＦの単位用量を含有する。上記の凍結乾燥を実行する凍結乾燥機は、市販されており、そして当業者により容易に操作可能である。患者への投与の前に、この凍結乾燥製品は、好ましくはそれ自身のバイアル中で、適切な滅菌水性希釈液（代表的には、０．９％（または以下）の滅菌生理食塩水、または適合する滅菌緩衝液、または滅菌脱イオン水でさえ）を用いて、既知の濃度に再構成される。患者のＫｇ体重に依存して、配列番号１〜３、５、８〜１０、もしくは１２〜１４のうちのいずれかの１つのＦＧＦまたはそれらの脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの０．２μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇを含む単回用量を、患者への投与のための再構成産物としてバイアルから吸引する。従って、２４μｇ／ｋｇが投与される平均７０ｋｇの男性は、１６８０μｇ（すなわち、１．６８０ｍｇ）（７０ｋｇ×２４μｇ／ｋｇ）のＩＣ注入を受けるに十分な容量の再構成製品をバイアルから吸引される。
【００５１】
その第３の局面において、本発明は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）についてヒト患者を処置するために上記の単位用量または薬学的組成物を用いる、ＣＡＤまたはＭＩについての処置が必要な患者を処置するための方法に関する。特に、本発明は、冠動脈疾患についてヒト患者を処置するための方法に関する。この方法は、配列番号１〜３、５、８〜１０、もしくは１２〜１４の任意の１つの組換えＦＧＦ、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの安全かつ治療上有効な量を、冠動脈疾患の処置の必要なヒト患者の１つ以上（代表的には２つ）の冠状脈管へ投与する工程を包含する。好ましい冠状脈管は冠動脈であるが、冠状血管形成術により提供される場合、移植伏在血管および移植内胸動脈もまた、適切である。
【００５２】
本発明の方法は、硝酸塩により提供されるような単に症状の処置でなく、基礎的条件（すなわち、ＣＡＤまたはＭＩ）の臨床的処置を提供する。代表的に、本発明の方法の安全かつ治療上有効な量は、薬学的に受容可能なキャリア中に配列番号１〜３、５、８〜１０、もしくは１２〜１４の任意の１つのＦＧＦ、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの０．２μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇを含む。他の実施態様において、この安全かつ治療上有効な量は、薬学的に受容可能なキャリア中に、配列番号１〜３、５、８〜１０、もしくは１２〜１４の任意の１つのＦＧＦ、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの０．２μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、または２０μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇを含む。絶対的用語では、この安全かつ治療上有効な量は、配列番号１〜３、５、８〜１０、もしくは１２〜１４の任意の１つのＦＧＦ、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの約０．００８ｍｇ〜約６．１ｍｇ、より代表的には、配列番号１〜３、５、８〜１０、もしくは１２〜１４の任意の１つのＦＧＦ、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの０．３ｍｇ〜３．５ｍｇである。
【００５３】
本発明の治療上有効な量のｒＦＧＦ−２は、最適な医学管理にかかわらず、ＣＡＤ症状と診断されたヒト患者の少なくとも１つの冠状脈管に、医薬（例えば、血栓溶解剤、ストレプトキナーゼ、または冠動脈を可視化するために用いられる放射性不透明性色素もしくは磁気粒子）の冠状脈管内投与のための当該分野で既に公知であり、かつ用いられている標準的心臓カテーテル技術を用いて、投与される。例えば、冠動脈カテーテルは、処置の必要な患者の動脈（例えば、大腿動脈または鎖骨下動脈）に挿入され、そしてこのカテーテルは、処置される患者の適切な冠状脈管に位置するまで、目で見ながら前方に押される。明白なラインを維持するための標準的注意を用いて、１０〜３０分の間隔にわたって、実質的に連続して単位用量を注入することにより、可溶性形態の薬学的組成物が投与される。本発明の薬学的組成物は長時間投与され得るが、そのような投与において利点がなく、そして血栓症の潜在的に増加する危険性があることを本出願人は認識している。  代表的には、単位用量の一部（例えば、１／２）が、第１の冠状脈管に投与される。次いで、このカテーテルは、第２の二次性冠状脈管に再配置され、そして単位用量の残りがカテーテルのフラッシングによって投与される。上記の再配置手順を用いて、単位用量の一部は、単位用量全体が投与されるまで、複数の冠状脈管に投与され得る。投与後、このカテーテルは、従来技術で公知のプロトコールを用いて抜去される。冠状脈管形成の徴候は、単位用量のＩＣ投与後、数日で明白になる。治療上の利点は、ＩＣ  ＦＧＦ投与後、２週間程度のはやさで観察される。臨床的に重大な改善は、単位用量のＩＣ投与後３０日で客観的基準（ＥＴＴおよび／またはＳＡＱ）により容易に実証され得る。進行性ＣＡＤ疾患を有する特定の患者において、単位用量のＦＧＦを、例えば、６ヶ月ごとまたは毎年、投与することが、その期間の間、ＣＡＤの進行を克服するために、必要または適切であり得る。
【００５４】
本発明の方法の１つの利点は、心臓脈管形成である。従って、別の局面において、本発明は、ヒト患者の心臓の脈管形成を誘導する方法に関する。この方法は、配列番号１〜３、５、８〜１０、もしくは１２〜１４の任意の１つの組換え哺乳動物ＦＧＦ、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの約０．２μｇ／ｋｇ〜約３６μｇ／ｋｇ（または絶対的用語では、約０．００８ｍｇ〜約６．１ｍｇ）を、冠状脈管形成の必要なヒト患者の１つ以上の冠状脈管に単位用量として投与する工程を包含する。
【００５５】
本明細書の実施例２の基準を満たす、ＣＡＤと診断された５２例のヒト患者に、配列番号５のＦＧＦ−２の０．３３μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇの単位用量を、約２０分間にわたるＩＣ注入によって投与した。次いで、この５２例の処置患者をＳｅａｔｔｌｅ  Ａｎｇｉｎａ  Ｑｕｅｓｔｉｎｎａｉｒｅにより評価した。これは、客観的基準および主観的基準の組み合わせに基づく評価を提供する。表２を参照のこと。Ｓｅａｔｔｌｅ  Ａｎｇｉｎａ  Ｑｕｅｓｔｉｎｎａｉｒｅは、処置の前および後の両方に評価される以下の５つのサブスケールを有する、確証された、疾患特異的装置である：１）「運動能力（ｅｘｅｒｔｉｏｎａｌ  ｃａｐａｃｉｔｙ）」＝身体活動の限界；２）「疾患の認知」＝ＭＩについて心配する；３）「処置の満足度」；４）「アンギナ頻度」＝発症（エピソード）および舌下ニトログリセリン使用の回数；ならびに５）「アンギナ安定性」＝最も激しい身体的活動での発症（エピソード）の回数。５つのサブスケールの各々の可能性のある範囲は、０〜１００であり、スコアが高いほどより良好なクオリティーオブライフ（生活の質）を示す。さらに、平均ベースラインスコア（処置前）と処置後スコアとの間の８ポイント以上の平均変化が、「臨床的に有意」であると認識される。表２は、事前試験され、次いで配列番号５のＦＧＦ−２の０．３３μｇ／ｋｇ〜２４μｇ／ｋｇの一単位用量を、ＩＣ注入により投与された２８例の患者が、「Ｓｅａｔｔｌｅ  Ａｎｇｉｎａ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ」によって評価された５つの「クオリティーオブライフ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）」の基準について１３から３６ポイントへの平均スコアの上昇を示したことを報告する。本明細書における表２を参照のこと。これらの１３から３６ポイントの平均の上昇は、別の方法の処置において、「臨床的に有意」であると当該分野で認識されている８ポイントの変化よりも約１．６〜４．５倍大きかった。本明細書において、表２を参照のこと。
【００５６】
【表２】
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さらに、表２の最初の１５例の患者についての結果の組み合わせが配列番号５のＦＧＦ−２の低用量（２μｇ／ｋｇ以下）と高用量（２μｇ／ｋｇより多い）との間で分類され、そして「Ｓｅａｔｔｌｅ  Ａｎｇｉｎａ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ」により評価された場合、両方の用量は、それぞれ、約１２．３〜５８．１および約１０．９〜３２．１にわたるスコアの上昇を提供することが見出された。本明細書における表３を参照のこと。このスコアの上昇は、別の様式の処置において「臨床的に有意である」と考えられている８ポイントの変化より、約１．４〜７．２倍大きかった。
【００５７】
同じ第Ｉ相試験において、ＣＡＤと診断され、そして本明細書における実施例２の基準を満たす５２例のヒト患者に、配列番号５のＦＧＦ−２の０．３３μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇの単回単位用量をＩＣ投与した。ヒトにおける最大耐容用量（ＭＴＤ）は、４８μｇ／ｋｇでの２／１０例の患者における重篤だが一過性の低血圧の発症に基づいて、３６μｇ／ｋｇと規定された。（対照的に、ブタにおけるＭＴＤは、６．５μｇ／ｍｌと規定された）。１つの部位で、２３例のヒト患者の心臓を、改善した冠の満足度の客観的徴候について磁気共鳴画像（ＭＲＩ）によって、処置の前（「ベースライン」）ならびに３０日後および６０日後の両方で評価した。ＭＲＩによって評価した客観的基準のうちにあるのは以下である：１）左室（ＬＶ）駆出率（ＥＦ）；２）正常壁厚（ｎｏｒｍａｌ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ：ＮＷＴ）；３）正常壁運動（ｎｏｒｍａｌ  ｗａｌｌ  ｍｏｔｉｏｎ：ＮＷＭ）；４）側副枝程度（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｅｘｔｅｎｔ）；５）虚血領域帯；６）標的化壁厚（ＴＷＴ）；７）標的化壁運動（ＴＷＭ）；および８）灌流帯または遅延到達帯（％ＬＶ）。患者はまた、アンギナ、トレッドミル運動期間、休息／運動  核灌流について評価された。結果を表４にまとめる。表４は、ベースラインのアンギナのクラスが、それぞれＩＣ  ＦＧＦ−２の後３０日目および６０日目に、２．６から１．４および１．２に減少したことを反映する。平均のトレッドミル運動時間は、処置後、それぞれ３０日目および６０日目に、ベースラインの８．５分から９．４分および１０．０分に延長した。左室駆出率（ＬＶＥＦ）には有意な変化は観察されなかった。しかし、標的壁運動は有意に増大し、ＦＧＦ−２処置後、ベースラインの１５．４％から２３．５％（３０日目）および２４．１％（６０日目）に動いた。同様に、標的壁厚は、ＦＧＦ−２処置後、ベースラインの２８．７％から３４．７％（３０日目）および４５．９％（６０日目）へと有意に上昇した。灌流においても、遅延到達帯（％ＬＶ）における減少により測定した場合、有意な増大が存在した。ここで、遅延到達帯はＦＧＦ−２処置後、ベースラインの１８．９％から７．１％（３０日目）および１．８２％（６０日目）に減少した。
【００５８】
【表３】
2010174017.tif 000004
【００５９】
【表４】
2010174017.tif 000005
従って、本発明に従うＦＧＦ−２の単回ＩＣ注入をＣＡＤ患者に提供すれば、ＭＲＩおよび他の従来基準により客観的に測定した場合、患者に有意な身体的改善を提供した。
【００６０】
（薬物動態および代謝）
ＦＧＦ−２の分子構造は、血管系の細胞表面および内皮壁上のプロテオグリカン鎖（ヘパリンおよびヘパリン様構造）に結合することが既知である正に荷電したテイル（ｔａｉｌ）を含む。Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ、ら「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６３８：１７７〜１８１（１９８１）を参照のこと。内皮がＦＧＦ−２結合の原因であり、注射後、受け手（ｓｉｎｋ：流し）として働くので、本発明者らは、ｒＦＧＦ−２が、投与直後に速い生体分布相を受けると考えた。従って、本発明者らは静脈経路の投与と異なって冠状脈管内に標的した。
【００６１】
腎臓および肝臓は、ｒＦＧＦ−２の排泄のための主要な器官である。特に、腎臓は、約６０ｋＤのタンパク質カットオフを有し、これにより血清アルブミン（ＭＷ  ６０ｋＤ）を保持する。しかし、配列番号５のＦＧＦ−２は、約１６ｋＤの分子量を有する。従って、腎排泄が期待される。市販のウシＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ−２）の放射線標識した生体分布研究において、肝臓および腎臓の両方が、ＩＶ注射またはＩＣ注射後１時間で、放射線標識ｂＦＧＦ−２の高いカウントを含むことが示された。同じ研究において、ＦＧＦ−２は、赤血球に結合するようであった、しかし、これらの結果は、全血のインビトロ分析では確認されなかった。発表された研究では、ｂＦＧＦ−２の別の組換えヨウ化形態がラットに与えられた場合、肝臓が、排泄の主要な器官として同定された。Ｗｈａｌｅｎら「Ｔｈｅ  Ｆａｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｂＦＧＦ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒｉｎ」Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、１：１５７〜１６４（１９８９）。より詳細には、ＦＧＦ−２は、全身循環においてα2マクログロブリンに結合すること、およびこの複合体がクッファー細胞上のレセプターによりインターナリゼーションされることが知られている。Ｗｈａｌｅｎら（１９８９）およびＬａＭａｒｒｅら「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ａｌｐｈａ−２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６５：３〜１４（１９９１）。標識したＦＧＦ−２フラグメントは、血漿中には見出されなかったが、それらは尿中に見出され、そしてサイズは細胞内の分解産物に対応した。ＦＧＦ−２がヘパリンと組み合わせて投与された場合、ＦＧＦ−２の腎排泄が増加した。Ｗｈａｌｅｎら（１９８９）。ヘパリンと複合体化されない場合カチオン性であるＦＧＦ−２分子は、糸球体基底膜のカチオン性硫酸ヘパリンにより反発されるようである。ＦＧＦ−２／ヘパリン複合体は、より中性に荷電され、従って腎臓により容易に濾過され、そして排出される。
【００６２】
本発明者らは、家畜のヨークシャー（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ）ブタにおいて静脈内（ＩＶ）および冠状脈管内（ＩＣ）投与後、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（「ＳＤ」）ラットにおけるＩＶ投薬後、およびＣＡＤのヒト患者におけるＩＣ投与後に、ｒＦＧＦ−２（配列番号５）の薬物動態を決定した。全ての種において、ＩＶ注射および／またはＩＣ注射後のｒＦＧＦ−２血漿濃度は、最初の１時間に、初期の急激な勾配およびいくつかの対数目盛にわたるかなりの減少（分布相）その後、より緩やかな低下（排泄相）を有するバイエクスポネンシャル曲線に従った。図１は、以下の用量後の関数として、配列番号５のｒＦＧＦ−２のＩＣ投与後のヒトにおけるこれらの相を示す、血漿濃度対時間の曲線を提供する：除脂肪体重（ＬＢＭ）に対して、０．３３μｇ／ｋｇ、０．６５μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇおよび２４μｇ／ｋｇ。配列番号５のｒＦＧＦ−２の血漿濃度は、ヒトＦＧＦ−２の分析のために上市された市販のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）により決定された。このＥＬＩＳＡアッセイは、配列番号５のｒＦＧＦ−２との１００％の交差反応性を示した。ＦＧＦファミリーの他のメンバーおよび多数の他のサイトカインは、このアッセイにより検出されなかった。さらにヘパリンは、このアッセイを妨害しない。
【００６３】
薬物動態学研究の設計、薬物動態学的パラメータ、および結論が、ブタおよびラットにおける研究についてそれぞれ表５および６に列挙される。読者は、特定の詳細について、これらの表を参照する。しかし、とりわけ注目されるべきポイントは、７０２±３１１〜６０９±３５０ｍｌ／時間／ｋｇのクリアランス（ＣＬ）を有する動物についての単一コンポーネントモデルについての単回ＩＣ注入に続いて、半減期（Ｔ1/2）が２．８±０．８〜３．５時間であったことである。これらの研究の結果は、配列番号５の組換えｂＦＧＦ−２の薬物動態学は、これらの動物がＩＣ経路またはＩＶ経路のいずれを通して投薬されたかにかかわらず、実質的に同一であったことを示す。表５を参照のこと。ブタにおいて、組換えｂＦＧＦ−２の最大耐容用量は、６．５μｇ／ｋｇであった。とりわけこれらの研究の表５および６から引き出されるべき他の薬物動態学的結果は、迅速な分布相それに続く中度の排泄相、およびヒトについて図１で報告されるような用量線形性があることである。また、性別差がなかった。さらに、スリーコンパートメントモデルを、７０Ｕ／ｋｇのヘパリンを約１５分投与され、その後５〜１０分のＩＣ注入によって０．６５〜６．５μｇ／ｋｇを投与されるブタについて分析した。これらのスリーコンパートメントについての半減期
【００６４】
【数１】
2010174017.tif 000006
は、それぞれ、１．５分、１７分、および６．６．時間であった。これらの動物において、初期容量（「Ｖ1」）はおよそ血漿容量であり、そして定常容量（「ＶSS」）は血漿容量の約１０倍であった。表５を参照のこと。ブタにおいて、配列番号５の組換えｂＦＧＦ−２の循環ヘパリンへの結合は、生体分布および排出を減少させるようである。同様に、ラットにおいて、ｒＦＧＦ−２の分布およびクリアランスの両方の容量は、ヘパリンが投与される場合、より少なかった。表６を参照のこと。さらに、ＦＧＦ−２のクリアランスにおける最大かつ最も好ましい変化が、ヘパリンが±１５分以内に、好ましくはｒＦＧＦ−２  ＩＣ注入の直前に投与される場合に、見られた。表６を参照のこと。
【００６５】
【表５】
2010174017.tif 000007
【００６６】
【表６】
2010174017.tif 000008
配列番号５のｒＦＧＦ−２の薬物動態学を、本出願を支持する第Ｉ相臨床研究において最適な医学的管理にもかかららずＣＡＤと診断されたヒトにおいて、研究した。この第Ｉ相研究において利用されるｒＦＧＦ−２の用量は、除脂肪体重（ＬＢＭ）で、０．３３μｇ／ｋｇ、０．６５μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、および２４μｇ／ｋｇであり、そして全ての用量を、４０Ｕ／ｋｇヘパリン（これは、ｒＦＧＦ−２注入（２例の患者の冠状脈管のそれぞれに１０分）の１〜９５分前にＩＶまたはＩＣ投与された）でこの患者を前処置した後、２０分ＩＣ注入によって投与した。本明細書中の図１〜３は、これらの結果を基礎とするデータを要約する。詳細には、図１は、上記のように２０分間にわたってＩＣ注入によって投与されるｒＦＧＦ−２（配列番号５）の６つの異なる用量についての、時間（時間）に対する平均ｒＦＧＦ−２血漿濃度のプロットである。図１は、用量線形性および二相性の血漿レベル減少、すなわち、最初１時間の迅速な分布相、続いて１．９±２．２時間のＴ1/2を有する排出相を示す。用量線形性は、図２においてより容易に見られ、この図２は、投与された６つの用量のｒＦＧＦ−２の各々についての図１に関しての、ｐｇ・時間／ｍｌでの個々の患者のｒＦＧＦ−２の曲線下面積（ＡＵＣ）のプロットである。図３は、「ｒＦＧＦ−２注入前の分」でのヘパリン用量の時間に対しての、個々のヒト患者ｒＦＧＦ−２用量の正規化したＡＵＣプロットであり、そしてｒＦＧＦ−２  ＡＵＣにおけるヘパリン投与のタイミングの影響を示す。図３は、最大のＡＵＣ／用量は、有効量のグルコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）が、ＩＣ  ｒＦＧＦ−２注入の３０分以内で、より好ましくはＩＣ  ｒＦＧＦ−２注入の２０分以内で前投与された場合に、達成されたことを示す。典型的には、有効量のグルコサミノグリカンは、４０〜７０Ｕ／ｋｇヘパリンである。これらの薬物動態学的結果を、本明細書中の表７に要約する。
【００６７】
【表７】
2010174017.tif 000009
ｒＦＧＦ−２分布相は、ヘパリン無しのｒＦＧＦ−２と比較した場合、ヘパリン有りの場合、より急激でなく、分布容量はより少なく、そしてクリアランスはより少なかった。循環ヘパリンとのｒＦＧＦ−２の複合体は、ｒＦＧＦ−２の生体分布および排出を減少させるようである。ＦＧＦ−２のヘパリン様構造への結合は強力である（解離定数約２×１０-9Ｍ）が、ＦＧＦ−２のＦＧＦ−２レセプターへの結合は約２倍のオーダーの大きさだけ高い（解離定数約２×１０-11Ｍ）。Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉら（１９９１）。さらに、配列番号５のｒＦＧＦ−２のグルコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）との複合体化は、シグナル形質導入および有糸分裂誘発を増加し得、そして／または酵素的分解からｒＦＧＦ−２を保護する。
【００６８】
以下に続く例は、選択基準および上記で議論されたデータのもとである第Ｉ相臨床試験に関するより詳細を提供する。
【実施例】
【００６９】
（実施例１）
（第Ｉ相臨床試験において使用される単位用量のｒＦＧＦ−２）
配列番号５のｒＦＧＦ−２を、単位用量および薬学的組成物として処方し、そ
して、本明細書中で参照される第Ｉ相臨床試験において、ラット、ブタおよび最
終的にはヒトへ投与した。種々の処方物を以下に記載する。
【００７０】
（ｒＦＧＦ−２単位用量）を、積層した灰色ブチルゴム栓（ｌａｍｉｎａｔｅ
ｄ  ｇｒａｙ  ｂｕｔｙｌ  ｒｕｂｂｅｒ  ｓｔｏｐｐｅｒ）および赤色フリッ
プオフオーバーシール（ｒｅｄ  ｆｌｉｐ−ｏｆｆ  ｏｖｅｒｓｅａｌ）を備え
る３ｃｃＩ型ガラスバイアル中に、液体として提供した。このｒＦＧＦ−２単位
用量は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、１ｍ
ＭのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭの塩化ナ
トリウム、ｐＨ５．０中に、１．２ｍｌの０．３ｍｇ／ｍｌの配列番号５のｒＦ
ＧＦ−２を含んだ。従って、絶対的条件として、各バイアル（および単位用量）
は、０．３６ｍｇのｒＦＧＦ−２を含んだ。液体形態でこの単位用量を含むバイ
アルを、２℃〜８℃で保存した。
【００７１】
（ｒＦＧＦ希釈剤）を、積層した灰色ブチルゴム栓および赤色フリップオフオ
バーシールを備える５ｃｃＩ型バイアル中に供給した。ｒＦＧＦ−２希釈剤は、
１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、１３５ｍＭの
塩化ナトリウム、ｐＨ５．０中を含んだ。各バイアルは、５．２ｍｌのｒＦＧＦ
−２希釈剤溶液を含み、これを２℃〜８℃で保存した。
【００７２】
注入される（ｒＦＧＦ−２薬学的組成物）を、注入容量が１０ｍｌになるよう
に、ｒＦＧＦ−２単位用量をｒＦＧＦ希釈剤で希釈することによって調製した。
ＥＤＴＡ濃度を１００μｇ／ｍｌの限界未満に保持するために、この全注入容量
を、高体重を有する患者へ比例してより高いＦＧＦ−２の絶対量が投与される場
合には、２０ｍｌに増加させた。
【００７３】
（実施例２）
（ｒＦＧＦ−２での処置に関する、冠状動脈疾患を有する患者についての選択
基準）
以下の選択基準を、冠状動脈疾患を有する第Ｉ相患者へ適用した。これらの患
者の活性は、最適な医学的管理にもかかわらずそれらの活性が冠状虚血によって
制限され、そしてこれらの患者は、承認された脈管再生治療についての候補でな
かった。
【００７４】
（包含基準：）被験体は、以下である場合に適格である：
・１８歳以上の男性または女性
・冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の診断
・承認された脈管再生治療（例えば、脈管形成術、ステント、冠状動脈バイパ
スグラフト（ＣＡＢＧ））についての準最適な候補（またはこれらの処置を拒否
する）
・改変されたＢｒｕｃｅプロトコルを使用して少なくとも３分間運動し、そし
て冠状虚血によって制限され得る
・薬理学的に圧迫されたタリウムセスタミビ（ｓｅｓｔａｍｉｂｉ）スキャン
における少なくとも２０％心筋の誘導性の欠陥および可逆性の欠陥
・必要な心臓カテーテル挿入について臨床的に受容可能である範囲内のＣＢＣ
、血小板、血清化学
・正常ＩＮＲ、またはＣｏｕｍａｄｉｎで抗凝固である場合、ＩＮＲ＜２．０
・全ての必要な研究手順および追跡訪問を含むこの研究に参加するための、意
志および書面でのインフォームドコンセントを提供し得る
（除外基準：）被験体は、以下である場合に適格でない：
・悪性腫瘍：治癒的に処置された基底細胞がんを除く過去十年内の悪性腫瘍の
何らかの病歴、
・眼の状態：増殖性未熟児網膜症、重篤な非増殖性未熟児網膜症、網膜静脈閉
塞、Ｅａｌｅｓ病、または黄斑浮腫、あるいは眼科医による眼底検査：６ヶ月以
内の眼内手術の病歴
・腎臓機能：年齢について適合される正常範囲未満のクレアチンクリアランス
；タンパク質＞２５０ｍｇまたはミクロアルブミン＞３０ｍｇ／２４時間  尿
・ＩＶクラス心不全（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏ
ｎ）
・超音波心臓診断図、タリウムスキャン、ＭＲＩまたはゲートされプールされ
た血液スキャン（ｇａｔｅｄ  ｐｏｏｌｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓｃａｎ）（ＭＵＧ
Ａ）により駆逐率＜２０％
・血流力学的関連不整脈（例えば、心室細動、持続性心室性頻脈）
・重篤な弁狭窄（大動脈領域＜１．０ｃｍ2、僧帽弁領域＜１．２ｃｍ2）、ま
たは重篤な弁不全
・３週間以内のアンギナまたは不安定アンギナの顕著な増加
・３ヶ月以内の心筋梗塞（ＭＩ）の病歴
・６ヶ月以内の一過性虚血発作（ＴＩＡ）または発作（ｓｔｒｏｋｅ）の病歴
・６ヶ月以内のＣＡＢＧ、脈管形成術またはステントの病歴
・６ヶ月以内の経心筋レーザー脈管再生、ｒＦＧＦ−２、または脈管上皮増殖
因子（ＶＥＧＦ）での処置の病歴
・妊娠の可能性または保育中の（ｎｕｒｓｉｎｇ）母の女性
・任意の病理学的線維症、例えば、肺の線維症、強皮症
・公知の脈管奇形、例えば、ＡＶ奇形、血管腫
・ＣＡＤの症状の評価を干渉し得る任意の疾患、例えば、心膜炎、脇軟骨炎、
食道炎症、全身性血管炎、鎌状赤血球症の合併
・改変Ｂｒｕｃｅプロトコル運動ストレス試験の実行を制限する任意の疾患、
例えば、肢の麻痺または切断、重篤な関節炎または肢、重篤な慢性妨害肺性疾患
（ＣＯＰＤ）
・３０日以内（または、研究薬物の６０日以内に計画される）の調査の薬剤、
デバイスまたは手順の臨床試験への参加関与
・ｒＦＧＦ−２または関連化合物に対する公知の過敏症
・調査員の意見において本研究における参加のために不適切な被験体を作る任
意の条件、例えば、精神病、重篤な精神遅滞、研究員とコミュニケーションが取
れないこと、薬物またはアルコール乱用。
【００７５】
（実施例３）
（ヒトへ投与される組換えＦＧＦ−２（配列番号５）についての第Ｉ相臨床試
験）
配列番号５の組換えｂＦＧＦ−２を、重篤なＣＡＤを有する５２人のヒト患者
（これは、最適な医学的管理にもかかわらず症状を残し、そして第Ｉ相オープン
ラベル、単回投与、用量増大、２部位トライアルにおいて外科または経皮的脈管
再生を拒絶するかまたはそののための準最適な候補である）へ投与した。上記薬
物を、患者の冠状動脈へのカテーテル配置のための標準的技法（脈管形成術にお
いて既に利用されたような）を使用して、冠状血液供給の２つの主要な源（ＩＣ
）の間に分割された単回２０分注入として投与した。ｒＦＧＦ−２の用量（μｇ
／ｋｇ）は、配列番号５のｒＦＧＦ−２の、０．３３（ｎ＝４）、０．６５（ｎ
＝４）、２．０（ｎ＝８）、６．０（ｎ＝４）、１２．０（ｎ＝４）、２４（ｎ
＝８）、３６（ｎ＝１０）および４８（ｎ＝１０）であった。アンギナ頻度およ
びクオリティーオブライフを、ベースラインで（ｒＦＧＦ−２投与前）およびｒ
ｆＦＧＦ−２投与後約６０日で、Ｓｅａｔｔｌｌｅ  Ａｎｇｉｎａ  Ｑｕｅｓｔ
ｉｏｎｎａｉｒｅ（ＳＡＱ）によって評価した。運動耐容時間（ＥＴＴ）を、ス
レッドミル試験によって評価した。安静／運動核灌流およびゲートされたセスタ
ミビ−決定される（ｓｅｓｔａｍｉｂｉ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）安静時駆出率
（ＥＦ）、および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を、ベースラインで、およびＦＧＦ
−２投与後３０日および６０日で評価した。評価した他の終点は、ＭＲＩ（駆逐
率（ＥＦ）、正常壁運動（ＮＷＭ）、標的化壁運動（ＴＷＭ）、正常壁厚み（Ｎ
ＷＴ）、標的化壁厚み（ＴＷＴ）、虚血領域帯および側副枝程度を客観的に測定
するため）を含んだ。表２〜４をそれぞれ参照のこと。
【００７６】
予備的安全性結果は、重大な事象は用量関連しなかったことを示す。今までの
ところは、８つの投薬量群の中で、最低の投薬量群、すなわち、０．６５μｇ／
ｋｇ（２３日目）、２．０μｇ／ｋｇ（５７日目）および６．０μｇ／ｋｇ（６
３日目）で、３つの死亡が存在した。３人の患者、すなわち、１群（０．３３μ
ｇ／ｋｇ）、３群（２．０μｇ／ｋｇ）および４群（６．０μｇ／ｋｇ）の各々
から１例における急性心筋梗塞（ＭＩ）についての６つの入院が存在した。これ
らの３人の患者のうちの１人は、急性ＭＩについての６つの入院のうちの４つを
占めた。４群の患者において投薬後３週間で診断された１例の大きなＢ細胞リン
パ腫もまた存在した。この患者は、投薬後２ヶ月で死んだ。注入の間または注入
直後により高い用量でみられる急性低血圧は、昇圧薬の必要がない輸液の投与に
よって管理された。ｒＦＧＦ−２（配列番号５）の最大耐容用量は、３６μｇ／
ｋｇとして定義された。４８μｇ／ｋｇ  ＩＣまでのｒＦＧＦ−２の用量は、積
極的な輸液管理を用いて患者において管理された。しかし、彼らは、１０人の患
者のうちの２人において急性および／または起立性の低血圧に起因して耐容性を
示さなかった。ＩＣ注入されたｒＦＧＦ−２のヒトにおける半減期は、約１時間
であった。
【００７７】
配列番号５のｒＦＧＦ−２の単回ＩＣ注入で処置した、この研究におけるヒト
患者は、１．５〜２分のＥＴＴの平均増加を示した。これは、３０秒を超えるＥ
ＴＴの増加が、重要であり、かつ代替の治療（例えば、脈管形成術）を評価する
ための基準と考えられるので、特に重要である。ＳＡＱによって測定される、ア
ンギナ頻度およびクオリティーオブライフは、試験した２８人の患者（ｎ＝２８
）について５つの全てのサブスケールにおいて５７日で有意な改善を示した。表
２および３を参照のこと。特に、ＳＡＱによって評価される５つの診断基準につ
いてのスコアの平均変化は、１３〜３６であり、「臨床的に重要である」と考え
られる８以上の平均変化を有した。表２を参照のこと。
【００７８】
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、配列番号５のｂＦＧＦ−２の単回単位用量の投
与に従う目的の改善を示し、この改善は、３０日および６０日での増加した標的
化壁運動（ｐ＜０．０５）、および６０日での増加した標的化壁厚化（ｐ＜０．
０１）を含む。ＭＲＩはさらに、改善した領域壁運動、ならびに低用量（０．３
３μｇ／ｋｇおよび０．６５μｇ／ｋｇ）および高用量（２．０μｇ／ｋｇおよ
び１２．０μｇ／ｋｇ）の両方についての標的化領域における増加した心筋灌流
および側副枝発達を示した。
【００７９】
２８人の患者の部位の１つで評価した異常灌流帯は、３０日および６０日で有
意に減少した（ｐ＜０．００１）。
【００８０】
上記の診断基準（すなわち、ＥＴＴ  ＳＡＱ、ＭＲＩ）に加えて、処置は、脈
管形成効果が少なくとも６ヶ月持続する場合に、非常に成功であると考えられる
。本第Ｉ相研究において、予想外に優れた脈管形成効果が、全ての投薬群におい
て５７〜６０日間持続したことが観察された。［表２〜４を参照のこと。］既に
得られた結果に基づいて、脈管形成効果が１２ヶ月以上、しかし少なくとも６ヶ
月（この時点で必要ならば上記手順が繰り返される）持続することが予想される
。
【００８１】
（実施例４）
（冠状動脈疾患を処置するためにヒトに投与される組換えＦＧＦ−２（配列番
号５）に関して提案される第ＩＩ相臨床試験）
冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するためにｒＦＧＦ−２の第ＩＩ相臨床
試験を、以下の４つのアームを有するダブルブラインド／プラシーボ（ｄｏｕｂ
ｌｅ  ｂｌｉｎｄ／ｐｌａｃｅｂｏ）コントロールド研究として実施した：ＩＣ
投与される、プラシーボ、０．３μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇおよび３０μｇ／ｋ
ｇ。
【００８２】
（実施例５）
（第ＩＩ相ヒト臨床試験についてのｒＦＧＦ−２の単位用量および薬学的組成
物）
配列番号５のｒＦＧＦ−２を、本明細書中で参照される第ＩＩ相臨床試験にお
いけるヒトへの投与のための単位用量および薬学的組成物として処方した。種々
の処方物を以下に記載する。
【００８３】
（ｒＦＧＦ−２単位用量）を、積層した灰色ブチルゴム栓および赤色フリップ
オフオバーシールを備える５ｃｃＩ型ガラスバイアル中に、液体として調製した
。このｒＦＧＦ−２処方物は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチ
オグリセロール、０．３ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（分子量３７２．
２）、１３５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．０中に、０．３ｍｇ／ｍｌの配列
番号２のｒＦＧＦ−２を含む。各バイアルは、３．７ｍｌのｒＦＧＦ−２薬物産
物溶液（１バイアル当たり１．１１ｍｇのｒＦＧＦ−２）を含んだ。液体形態の
得られた単位用量を、−６０℃未満で保存した。上述の単位用量を、「ｒＦＧＦ
−２プラシーボ」を用いて希釈する。患者のサイズに依存して、いくつかのバイ
アルの内容物は、第ＩＩ相研究のために３．６μｇ／ｋｇの単位用量を産生する
ように合わせられ得る。
【００８４】
（ｒＦＧＦ−２プラシーボ）を、積層した灰色ブチルゴム栓および赤色フリッ
プオフオーバーシールを備える５ｃｃＩ型ガラスバイアル中に、透明無色液体と
して提供する。このｒＦＧＦ−２プラシーボは、上記薬物製品と、外観において
識別不可能であり、そして以下の処方を有する：１０ｍＭのクエン酸ナトリウム
、１０ｍＭモノチオグリセロール、０．３ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物
（分子量３７２．２）、１３５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．０。各バイアル
は、５．２ｍｌのｒＦＧＦ−２プラシーボ溶液を含む。単位用量と異なり、この
ｒＦＧＦ−２プラシーボを２℃〜８℃で保存する。
【００８５】
注入される（ｒＦＧＦ−２薬学的組成物）を、注入容量が第ＩＩ相について２
０ｍｌになるように、ｒＦＧＦ希釈剤でｒＦＧＦ−２単位用量を希釈することに
よって調製する。
【００８６】
（配列表）
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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