(57)【要約】【課題】抗ウイルス活性または抗腫瘍活性を有する所望の組織を選択的に標的化するプロドラッグを同定するために、メトキシホスホネートヌクレオチドアナログのプロドラッグをスクリーニングするための新規の方法が提供される。【解決手段】本発明の方法は、レトロウイルス治療またはヘパドナウイルス治療のためのＰＭＰＡの新規の混合エステルアミデートの同定を導き、このＰＭＰＡのエステルアミデートは、本明細書中で規定されるような置換基を有する構造（５ａ）の化合物を含む。薬学的に受容可能な賦形剤中のこれらの新規の化合物の組成、ならびに治療および予防におけるそれらの使用が提供される。本明細書中の用途のための出発物質および化合物を調製するためにマグネシウムアルコキシドを使用するための改良された方法もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、メトキシホスホネートヌクレオチドアナログのプロドラッグに関する。詳細には、本願は、このようなプロドラッグを作製および同定するための改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのメトキシホスホネートヌクレオチドアナログは公知である。一般に、このような化合物は、構造Ａ−ＯＣＨ２Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）２を有し、ここで、Ａは、ヌクレオシドアナログの残基であり、そしてＲは、独立して、水素または様々な保護基、あるいはプロドラッグ官能基である。米国特許第５，６６３，１５９号、同第５，９７７，０６１号および同第５，７９８，３４０号、Ｏｌｉｙａｉら「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」１６（１１）：１６８７−１６９３（１９９９）、Ｓｔｅｌｌａら、「Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．」２３（１２）：１２７５−１２８２（１９８０）、Ａａｒｏｎｓ，Ｌ．，Ｂｏｄｄｙ，Ａ．およびＰｅｔｒａｋ，Ｋ．（１９８９）Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｌ．Ｆ．およびＮｉｍｍｏ，Ｗ．Ｓ．編），ｐｐ．１２１−１２６；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．（１９８５）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．編）ｐｐ．７０−７４および７９−９２；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｐ．Ｋ．およびＡｍｉｄｏｎ，Ｇ．Ｌ．（１９８５）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．編）ｐｐ．１１８−１２１；Ｎｏｔａｒｉ，Ｒ．Ｅ．（１９８５）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．編）ｐｐ．１３５−１５６；Ｓｔｅｌｌａ，Ｖ．Ｊ．およびＨｉｍｍｅｌｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｊ．（１９８５）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．編）ｐｐ．１７７−１９８）；Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．（１９８５）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．編）ｐｐ．１９９−２４１；Ｃｏｎｎｏｒｓ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．編）ｐｐ．２９１−３１６を参照のこと。本明細書中の全ての文献および特許引用文献は、参考として明確に援用される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
抗ウイルス治療または抗腫瘍治療を意図したメトキシホスホネートヌクレオチドアナログのプロドラッグは、公知であるものの、それらの全身的な効果のために従来的に選択された。例えば、このようなプロドラッグは、親薬物が全ての組織に利用可能であることを保証する増大したバイオアベイラビリティ（すなわち、胃腸管から吸収されて親化合物に迅速に変換される能力）のために選択された。しかし、出願人らは、ここで、アナログがＨＩＶ感染の局在した病巣部位で富化される本明細書中で記載される研究によって示されるように、治療的部位で富化される薬物を選択することが可能であることを見出した。本発明の目的は、他の利点の中でもとりわけ、親メトキシホスホネートヌクレオチドアナログを用いる治療の標的である組織における親薬物の、バイスタンダー組織に対するより小さな毒性およびより大きな効力を生じることである。したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）  標的組織において増大した活性を与えるメトキシホスホネートヌクレオチドアナログプロドラッグを同定するためのスクリーニング方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つの該プロドラッグを提供する工程；
（ｂ）少なくとも１つの治療標的組織および少なくとも１つの非標的組織を選択する工程；
（ｃ）該プロドラッグを、該標的組織および該少なくとも１つの非標的組織に投与する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）において、該組織中の該プロドラッグによって与えられた相対活性を決定する工程、
を包含する、方法。
（２）  前記活性が、抗ウイルス活性または抗腫瘍活性である、項目１に記載の方法。
（３）  前記活性が、抗ウイルス活性である、項目２に記載の方法。
（４）  前記活性が、抗ＨＩＶ活性または抗ＨＢＶ活性である、項目３に記載の方法。
（５）  前記プロドラッグが、ＰＭＰＡまたはＰＭＥＡのプロドラッグである、項目１に記載の方法。
（６）  前記プロドラッグが、ホスホノアミデート、ホスホノエステルまたは混合ホスホノアミデート／ホスホノエステルである、項目５に記載の方法。
（７）  前記アミデートが、アミノ酸アミデートである、項目６に記載の方法。
（８）  前記エステルが、アリールエステルである、項目６に記載の方法。
（９）  前記標的組織において、前記非標的組織の活性の１０倍より大きい相対活性を有するプロドラッグを選択する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（１０）  項目１に記載の方法であって、前記標的組織および非標的組織が動物中に存在し、前記プロドラッグが該動物に投与され、そして前記相対活性が、該プロドラッグの投与後に、該動物の組織の分析によって決定される、方法。
（１１）  項目１に記載の方法であって、前記標的組織および非標的組織における活性が、組織中の前記プロドラッグの少なくとも１つの代謝産物の量をアッセイすることによって決定される、方法。
（１２）  前記代謝産物が、親薬物である、項目１２に記載の方法。
（１３）  前記代謝産物が、前記親薬物のジホスフェートである、項目１２に記載の方法。
（１４）  前記標的組織がウイルス感染した組織であり、そして前記非標的組織が、ウイルス感染していない同じ組織である、項目１に記載の方法。
（１５）  前記標的組織がリンパ組織であり、そして前記活性が抗ＨＩＶ活性である、項目１に記載の方法。
（１６）  前記標的組織が肝臓であり、そして前記活性が抗ＨＢＶ活性である、項目１に記載の方法。
（１７）  前記標的組織が血液学的であり、そして前記活性が抗腫瘍活性である、項目１に記載の方法。
（１８）  前記標的組織が悪性であり、そして前記非標的組織が、悪性ではない同じ組織である、項目１に記載の方法。
（１９）  以下の構造（１）を有する化合物、ならびにそのキラル富化組成物、その塩、それらの遊離塩基および溶媒和物であって：
【化１】
2010174033.tif 000002
ここで、Ｒａは、Ｈまたはメチルである、化合物。
（２０）  以下の構造（２）を有する化合物、ならびにその富化されたジアステレオマー、塩、遊離塩基および溶媒和物：
【化２】
2010174033.tif 000003
（２１）  以下の構造（３）を有するジアステレオマー富化化合物、ならびにそれらの塩、遊離塩基および溶媒和物であって：
【化３】
2010174033.tif 000004
該化合物は、実質的に以下のジアステレオマー（４）を含まず：
【化４】
2010174033.tif 000005
ここで、
Ｒ１は、インビボで加水分解可能なオキシエステル、またはヒドロキシルであり；
Ｂは、複素環塩基であり；
Ｒ２は、ヒドロキシル、またはアミノ酸の残基であり、該アミノ酸の残基は、該アミノ酸のアミノ基を介してＰ原子に結合され、そしてそれぞれが、必要に応じてエステル化された該アミノ酸のカルボキシ置換基を有し、
ただし、Ｒ１およびＲ２の両方が、ヒドロキシルではなく；
Ｅは、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ２Ｆ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ＝ＣＨ２）ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｃ≡ＣＨ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ２Ｎ３）ＣＨ２−、
【化５】
2010174033.tif 000006
−ＣＨ（Ｒ６）ＯＣＨ（Ｒ６’）−、−ＣＨ（Ｒ９）ＣＨ２Ｏ−、またはＣＨ（Ｒ８）Ｏ−であり、ここで右側の結合は、該複素環塩基に結合され；
点線は、任意の二重結合を表し；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、またはアシルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルアミノおよびジアルキルアミノから選択される１〜５個の炭素原子を有する置換基であり；
Ｒ６およびＲ６’は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、またはＣ２〜Ｃ７アルカノイルであり；
Ｒ７は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、または一緒になって−Ｏ−もしくは−ＣＨ２−を形成し；
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、またはＣ１〜Ｃ６ハロアルキルであり；そして
Ｒ９は、Ｈ、ヒドロキシメチル、またはアシルオキシメチルである、
化合物。
（２２）  以下の構造（５ａ）を有するジアステレオマー富化化合物、ならびにその塩、互変異性体、遊離塩基および溶媒和物であって：
【化６】
2010174033.tif 000007
該化合物は、実質的に以下のジアステレオマー（５ｂ）を含まず：
【化７】
2010174033.tif 000008
ここで、
Ｒ５は、メチルまたは水素であり；
Ｒ６は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアリールアルキルであるか、Ｒ６は、独立して、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、オキソ、ハロ、アミノ、アルキルチオ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、アリールアルコキシ、アリールアルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、ニトロアルキル、アジド、アジドアルキル、アルキルアシル、アルキルアシルアルキル、カルボキシルまたはアルキルアシルアミノから選択される１〜３個の置換基で置換された、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアリールアルキルであり；
Ｒ７は、任意の天然に存在するアミノ酸または薬学的受容可能なアミノ酸の側鎖であり、該側鎖がカルボキシルを含む場合、該カルボキシル基は、アルキル基またはアリール基で必要に応じてエステル化され；
Ｒ１１は、アミノ、アルキルアミノ、オキソまたはジアルキルアミノであり；そして
Ｒ１２は、アミノまたはＨである、
化合物。
（２３）  以下の構造（６）の化合物、ならびにその塩および溶媒和物：
【化８】
2010174033.tif 000009
（２４）  以下の構造（７）の化合物：
【化９】
2010174033.tif 000010
（２５）  項目１９〜２４のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に有効な賦形剤を含む、組成物。
（２６）  前記賦形剤がゲルである、項目２５に記載の組成物。
（２７）  局所投与に適切である、項目２５に記載の組成物。
（２８）  抗ウイルス治療または予防のための方法であって、該方法は、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の化合物を、治療的または薬学的に有効な量で、このような治療または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
（２９）  マグネシウムアルコキシドを使用するための方法であって、該方法は、９−（２−ヒドロキシプロピル）アデニン（ＨＰＡ）または９−（２−ヒドロキシエチル）アデニン（ＨＥＡ）、マグネシウムアルコキシド、および保護したｐ−トルエンスルホニルオキシメチルホスホネートを反応させる工程を包含する、方法。
（３０）  ＰＭＰＡまたはＰＭＥＡをそれぞれ回収する工程をさらに包含する、項目２９に記載の方法。
（３１）  前記ｐ−トルエンスルホニルオキシメチルホスホネートのホスホネートが、エチルエステルによって保護される、項目２９に記載の方法。
（３２）  前記アルコキシドが、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシドである、項目２９に記載の方法。
（３３）  前記アルコキシドが、ｔ−ブチルオキシドまたはイソプロピルオキシドである、項目３２に記載の方法。
【０００４】
従って、これらの観察によって、標的組織において増大した活性を与えるメトキシホスホネートヌクレオチドアナログのプロドラッグを同定するためのスクリーニング方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）少なくとも１つのプロドラッグを提供する工程；
（ｂ）少なくとも１つの治療標的組織および少なくとも１つの非標的組織を選択する工程；
（ｃ）このプロドラッグを、この標的組織および少なくとも１つの非標的組織に投与する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）において、この組織中のプロドラッグによって与えられた相対的な抗ウイルス活性を決定する工程。
【０００５】
好ましい実施形態において、標的組織は、ＨＩＶがアクティブに複製される部位および／またはＨＩＶレザバとして働く部位であり、非標的組織はインタクトな動物である。予想外にも、本発明者らは、この方法をＨＩＶについて実施するための標的組織としてリンパ組織を選択することによって、活性薬物のこのような組織への送達を促進するプロドラッグを同定した。
【０００６】
この方法によって同定された、本発明の好ましい化合物、ならびにそのキラル富化組成物、その塩、その遊離塩基および溶媒和物は、以下の構造（１）を有する：
【０００７】
【化１０】
2010174033.tif 000011
ここで、Ｒａは、Ｈまたはメチルである。
【０００８】
本発明の好ましい化合物、ならびにその富化ジアステレオマー、塩、遊離塩基および溶媒和物は、以下の構造（２）を有する：
【０００９】
【化１１】
2010174033.tif 000012
さらに、本発明者らは、予想外にも、リン原子および／またはアミデート置換基上の置換基のキラリティーは、本発明の実施において観察された富化に影響を及ぼすことを見出した。従って、本発明の別の実施形態において、本発明者らは、以下の構造（３）を有する本発明のジアステレオマー富化化合物、ならびにその塩、遊離塩基および溶媒和物を提供し：
【００１０】
【化１２】
2010174033.tif 000013
この富化化合物は、実質的に以下のジアステレオマー（４）を含まず：
【００１１】
【化１３】
2010174033.tif 000014
ここで、
Ｒ１は、インビボで加水分解可能なオキシエステル、またはヒドロキシルであり；
Ｂは、複素環塩基であり；
Ｒ２は、ヒドロキシル、またはアミノ酸の残基であり、このアミノ酸の残基は、このアミノ酸のアミノ基を介してＰ原子に結合され、そしてそれぞれが、必要に応じてエステル化されたこのアミノ酸のカルボキシ置換基を有し、
ただし、Ｒ１およびＲ２の両方が、ヒドロキシルではなく；
Ｅは、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ２Ｆ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ＝ＣＨ２）ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｃ≡ＣＨ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ２Ｎ３）ＣＨ２−、
【００１２】
【化１４】
2010174033.tif 000015
−ＣＨ（Ｒ６）ＯＣＨ（Ｒ６’）−、−ＣＨ（Ｒ９）ＣＨ２Ｏ−、またはＣＨ（Ｒ８）Ｏ−であり、ここで右側の結合は、この複素環塩基に結合され；
点線は、任意の二重結合を表し；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、またはアシルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルアミノおよびジアルキルアミノから選択される１〜５個の炭素原子を有する置換基であり；
Ｒ６およびＲ６’は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、またはＣ２〜Ｃ７アルカノイルであり；
Ｒ７は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、または一緒になって−Ｏ−もしくは−ＣＨ２−を形成し；
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル、またはＣ１〜Ｃ６ハロアルキルであり；そして
Ｒ９は、Ｈ、ヒドロキシメチル、またはアシルオキシメチルである。
【００１３】
構造（３）のジアステレオマーは、リンキラル中心において、（Ｓ）異性体であるように設計される。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態は、以下の構造（５ａ）を有するジアステレオマー富化化合物、ならびにその塩、互変異性体、遊離塩基および溶媒和物であり：
【００１５】
【化１５】
2010174033.tif 000016
この富化化合物は、以下のジアステレオマー（５ｂ）を実質的に含まない：
【００１６】
【化１６】
2010174033.tif 000017
ここで、
Ｒ５は、メチルまたは水素であり；
Ｒ６は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアリールアルキルであるか、Ｒ６は、独立して、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、オキソ、ハロ、アミノ、アルキルチオ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、アリールアルコキシ、アリールアルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、ニトロアルキル、アジド、アジドアルキル、アルキルアシル、アルキルアシルアルキル、カルボキシルまたはアルキルアシルアミノから選択される１〜３個の置換基で置換された、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアリールアルキルであり；
Ｒ７は、任意の天然に存在するアミノ酸または薬学的受容可能なアミノ酸の側鎖であり、この側鎖がカルボキシルを含む場合、このカルボキシル基は、アルキル基またはアリール基で必要に応じてエステル化され；
Ｒ１１は、アミノ、アルキルアミノ、オキソまたはジアルキルアミノであり；そして
Ｒ１２は、アミノまたはＨである。
【００１７】
本発明の好ましい化合物は、構造（６）の化合物、９−［（Ｒ）−２−［［（Ｓ）−［［（Ｓ）−１−（イソプロポキシカルボニル）エチル］アミノ］フェノキシホスフィニル］メトキシ］プロピル］アデニン（本明細書中でＧＳ−７３４０とも呼ばれる）である：
【００１８】
【化１７】
2010174033.tif 000018
本発明の別の好ましい実施形態は、構造（５）（構造（７））のフマル酸塩、９−［（Ｒ）−２−［［（Ｓ）−［［（Ｓ）−１−（イソプロポキシカルボニル）エチル］アミノ］フェノキシホスフィニル］メトキシ］プロピル］アデニンフマル酸塩（１：１）（本明細書中で、ＧＳ−７３４０−２とも呼ばれる）である：
【００１９】
【化１８】
2010174033.tif 000019
構造（１）〜（７）の化合物は、必要に応じて、薬学的に受容可能な賦形剤を含む組成物に処方される。このような組成物は、ウイルス（特に、ＨＩＶまたはヘパドナウイルス）感染の治療または予防において、有効用量で使用される。
【００２０】
さらなる実施形態において、９−［２−（ホスホノメトキシ）プロピル］アデニン（本明細書以下、「ＰＭＥＡ」と呼ぶ）または９−［２−（ホスホノメトキシ）エチル］アデニン（本明細書以下、「ＰＭＥＡ」と呼ぶ）を、マグネシウムアルコキシドを使用して容易に製造するための方法が提供され、ここでこの方法は、９−（２−ヒドロキシプロピル）アデニンまたは９−（２−ヒドロキシエチル）アデニン、保護したｐ−トルエンスルホニルオキシメチルホスホネートおよびマグネシウムアルコキシドを合わせ、それぞれＰＭＰＡまたはＰＭＥＡを回収する工程を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
このスクリーニング方法において使用するためのメトキシホスホネートヌクレオチドア
ナログ親薬物は、構造Ａ−ＯＨ２Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を有する化合物であり、ここで、Ａは、ヌクレオシドアナログの残基である。これらの化合物はそれ自体公知であり、そして本発明の部分ではない。より詳細には、親化合物は、複素環の塩基ＢおよびアグリコンＥを含み、一般的に以下の構造を有する：
【００２２】
【化１９】
2010174033.tif 000020
ここで、Ｂ基は以下で定義去れ、そしてＥ基は上で定義される。例は、以下に記載される：米国特許第４，６５９，８２５号、同第４，８０８，７１６号、同第４，７２４，２３３号、同第５，１４２，０５１号、同第５，１３０，４２７号、同第５，６５０，５１０号、同第５，６６３，１５９号、同第５，３０２，５８５号、同第５，４７６，９３８号、同第５，６９６，２６３号、同第５，７４４，６００号、同第５，６８８，７７８号、同第５，３８６，０３０号、同第５，７３３，８９６号、同第５，３５２，７８６号、および同第５，７９８，３４０号、ならびにＥＰ  ８２１，６９０およびＥＰ  ６５４，０３７。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法において使用するためのプロドラッグは、前述のパラグラフに記載される親メトキシホスホネートヌクレオチドアナログの共有結合的に修飾されたアナログである。一般的に、親薬物のリン原子は、プロドラッグの修飾に好ましい部位であるが、他の部位は複素環の塩基ＢまたはアグリコンＥ上に見出される。多くのこのようなプロドラッグは、すでに公知である。主に、これらは、リン原子のエステルまたはアミデートであるが、塩基およびアグリコン上の置換基もまた含む。これらの修飾自体のいずれも、本発明の部分でもなく、本発明の範囲を限定するともみなされない。
【００２４】
メトキシホスホネートヌクレオチドアナログのリン原子は、アミド化またはエステル化のような共有結合的修飾のための２の原子価を含む（ただし、ただ１つのリンの原子価が自由に置換されると、１つのホスホリルのヒドロキシルがエステル化されて、アグリコンＥのヒドロキシル置換基になる場合は除く）。このエステルは、代表的には、アリールオキシである。このアミデートは、通常、アルキル基またはアリール基（通常は、フェニル基、シクロアルキル基、またはｔ−アルキル基、ｎ−アルキル基もしくはｓ−アルキル基）でエステル化された遊離カルボキシル基を有する天然に存在するモノアミノ酸である。本発明のスクリーニング方法において使用するために適切なプロドラッグは、米国特許第５，７９８，３４０号の実施例に開示される。しかし、おそらく標的組織細胞内において、例えば、加水分解、酸化または生物学的組織への暴露から生じる他の共有結合の転移によって、インビボで遊離メトキシホスホネートヌクレオチドアナログ親薬物に変換され得ると考えられる任意のプロドラッグは、本発明の方法における使用のために適切である。このようなプロドラッグは、現時点で公知ではないかもしれないが、将来的に同定され、従って、本発明の方法における試験のために利用可能な適切な候補物となる。プロドラッグは、この方法におけるスクリーニングのための候補物にすぎないため、それらの構造は、スクリーニング方法を実施することまたは可能にすることに関係しないが、もちろん、それらの構造は結局、プロドラッグがこのアッセイにおいて選択的であると示されるか否かを決定する。
【００２５】
親薬物に結合したプロ部分（ｐｒｏ−ｍｏｉｅｔｙ）は、同じであっても異なっていてもよい。しかし、スクリーニングアッセイに使用される各プロドラッグは、試験される他のプロドラッグとは構造的に異なる。別個の、すなわち構造的に異なるプロドラッグは、一般に、それらの立体化学または共有結合構造のいずれかに基づいて選択されるか、あるいはそれらの特徴は組み合わせで変更される。しかし、試験される各プロドラッグは、望ましくは構造的かつ立体化学的に実質的に純粋であり、そうでなければ、スクリーニングアッセイの結果はそれほど有用ではなくなる。もちろん、本発明の方法の個々の実施形態で、単一のプロドラッグのみを試験することは、本発明の範囲内であるが、代表的には、次いで、従来の研究の結果と他のプロドラッグを比較する。
【００２６】
本発明者らは、プロドラッグの立体化学は、標的組織中の富化に影響を与え得ることを見出した。キラルな部位は、リン原子に存在し、そしてまた、その置換基において見出される。例えば、アミデートの調製に使用されるアミノ酸は、Ｄ型またはＬ型であり得、そしてリン酸エステルまたはアミノ酸エステルも同様に、キラル中心を含み得る。キラルな部位はまた、この分子のヌクレオシドアナログ部分上に見出されるが、これらは代表的には、親薬物の立体化学によってすでに規定され、そしてスクリーンの一部として変更されない。例えば、ＰＭＰＡのＲ異性体は、これが対応するＳ異性体よりも活性であるために好ましい。代表的に、これらのジアステレオマーまたはエナントマーは、純粋ではない場合、各部位でキラル富化され、その結果、スクリーンの結果は、より意味のあるものとなる。記載されるように、立体異性体の差示性は、問題のキラル中心において他の立体異性体を含まない立体異性体（代表的には、これは、ほとんどのメトキシホスホネートヌクレオチドアナログの場合、エナンチオマーよりむしろジアステレオマーである）を富化または精製することによって与えられ、その結果、各試験化合物は、実質的に均質である。実質的に均質またはキラル富化されたとは、所望の立体異性体が、約６０重量％の化合物、通常約８０重量％より多くの化合物、好ましくは約９５重量％より多くの化合物を含むことを意味する。
【００２７】
（新規なスクリーニング方法）
一旦、少なくとも１つの候補プロドラッグが選択されると、本発明のスクリーニング方法の残りの工程を使用して、標的組織に必要とされる選択性を有するプロドラッグを同定する。最も簡便には、プロドラッグは、組織または細胞における後の検出を容易にするために、検出可能な基で標識される（例えば、放射性標識される）。しかし、標識は、必要とされない。なぜなら、プロドラッグまたはその代謝産物（親化合物を含む）についての他の適切なアッセイがまた、使用され得るためである。これらのアッセイとしては、例えば、質量分析法、ＨＰＬＣ、生物検定またはイムノアッセイが挙げられ得る。このアッセイは、プロドラッグおよびその代謝産物のいずれか１つ以上を検出し得るが、好ましくは、このアッセイは、親薬物の生成をのみを検出するために行われる。これは、プロドラッグの抗菌的に活性な親二リン酸塩への変換の程度および速度が試験される全ての組織中で同じであるという仮定（これは、全ての場合において保証され得ない）に基づく。そうでなければ、二リン酸塩について試験し得る。
【００２８】
標的組織は、好ましくは、ＨＩＶ感染の処置において有用であるプロドラッグをスクリーニングする場合、リンパ様組織である。リンパ様組織は、当業者に周知であり、これらとしては、ＣＤ４細胞、リンパ球、リンパ節、マクロファージおよびマクロファージ様細胞（末梢血液単球細胞（ＰＢＭＣ）のような単球を含む）ならびにグリア細胞が挙げられる。リンパ様組織はまた、リンパ様組織または細胞（例えば、肺、皮膚および脾臓）において豊富である非リンパ組織を含む。もちろん、他の抗ウイルス薬物の経路についての他の標的は、特定のウイルスが関係する複製または潜伏の最初の部位（例えば、肝炎についての肝臓およびＨＳＶについての末梢神経）である。同様に、腫瘍についての標的組織は、実際に、腫瘍自体である。これらの組織は、当業者に周知であり、そして選択するために過度の実験を必要としない。抗ウイルス化合物についてスクリーニングする場合、標的組織は、ウイルスによって感染され得る。
【００２９】
非標的組織または細胞はまた、本明細書中の方法の一部としてスクリーニングされる。任意の数または身元のこのような組織または細胞が、この点で使用され得る。一般に、親薬物が毒性であると予想される組織は、非標的組織として使用される。非標的組織の選択は、全体的に、プロドラッグの性質および親の活性に依存している。例えば、非肝炎組織は、肝炎に対するプロドラッグについて選択され、そして腫瘍と同じ組織の非形質転換細胞は、抗腫瘍選択的プロドラッグスクリーニングについて十分である。
【００３０】
本発明の方法は、プロドラッグの経口的バイオアベイラビリティーを決定するために代表的に行なわれる研究とは別であることに注意するべきである。経口的バイオアベイラビリティー研究において、目的は、親薬物に実質的に変換された、全身的循環に入るプロドラッグを同定することである。本発明において、目的は、胃腸管または循環において代謝されないプロドラッグを見出することである。従って、本発明の方法において評価される標的組織は、一般に、小腸を含まないか、または小腸が含まれる場合、組織は、小腸以外のさらなる組織を含み得る。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法において使用される標的組織および非標的組織は、代表的に、インタクトな生きている動物における組織である。エステルを含むプロドラッグは、より望ましくは、イヌ、サルまたはげっ歯類以外の他の動物において試験される；マウスおよびラットの血漿は、所望な治療被験体がヒトまたは高等動物である場合、誤解されやすい結果を生じ得る高い循環レベルのエステラーゼを含む。
【００３２】
インタクトな動物でこの方法を実施することが必要である。灌流された器官、インビトロ器官培養物（例えば、皮膚移植片）または細胞培養の種々の形態において維持された細胞株（例えば、回転ビンまたは無重力懸濁系）を使用することもまた、本発明の範囲内である。例えば、ＭＴ−２細胞は、ＨＩＶプロドラッグを選択するための標的組織として使用され得る。従って、用語「組織」は、組織化された細胞構造、または天然で見出され得るような組織構造を必要とするように解釈されるべきではないが、このような組織構造は好ましい。むしろ、用語「組織」は、特定の供給源、起源または分化段階の細胞と同義であると解釈されるべきである。
【００３３】
標的組織および非標的組織は、実際、同じ細胞であり得るが、組織はまた、異なる生物学的状態で存在し得る。例えば、本明細書中の方法は、ウイルス未感染細胞（非標的組織に対応する）において実質的に不活性のままであるが、ウイルス感染した組織（標的組織）において活性を付与するプロドラッグを選択するために使用される。同じ手法が、予防的プロドラッグ（すなわち、非感染細胞において実質的に代謝されないままであるが、ウイルス感染に付随する抗ウイルス的活性形態に代謝されるプロドラッグ）を選択するために使用され得る。同様に、プロドラッグは、形質転換細胞および非形質転換の対応する組織においてスクリーニングされ得る。これは、血液学的悪性腫瘍（例えば、白血病）の治療のためのプロドラッグを選択する比較試験において特に有用である。
【００３４】
操作のいずれの特定の理論によって限定されることなく、組織選択的プロドラッグは、他の組織または細胞と比較して、標的細胞によって選択的に取り込まれ、そして／または細胞内で選択的に代謝されると考えられている。本明細書中のメトキシホスホネートプロドラッグの固有の利点は、生理学的ｐＨにおけるジアニオンへのこれらの代謝が、これらが細胞から拡散し得ないことを保証するということである。従って、これらは、長い期間効果的であり、そして上昇した細胞内濃度で維持され、それにより、増加した効力を示す。標的組織における増強された活性についての機構は、標的細胞による増強された取り込み、増強された細胞内保持、または両方の機構が共に作用することを含むと考えられる。しかし、選択性または増強された送達が標的組織中で生じる様式は、重要ではない。プロドラッグの親化合物への代謝変換のすべてが、標的組織中で生じることはまた、重要ではない。最終的な薬物活性を付与する変換のみが、標的組織中で生じる必要がある；他の組織における代謝は、標的組織における抗ウイルス形態に最終的に変換される中間体を提供し得る。
【００３５】
所望である選択性の程度または増強された送達は、親化合物およびこれが測定される様式（％用量分布または親化合物濃度）と共に変化する。一般的に、親薬物が、すでに大きな治療ウインドウを有する場合、低い程度の選択性が、所望のプロドラッグに十分であり得る。他方、毒性化合物は、選択的プロドラッグを同定するためのより広範なスクリーニングを必要とし得る。本発明の方法の相対的な費用は、標的組織、および親化合物が相対的に毒性であることが知られている組織のみにおけるスクリーニングによって減少され得る（例えば、より高い用量で腎毒性であるＰＭＥＡについては、主に腎臓およびリンパ様組織に集中する）。
【００３６】
選択された組織におけるプロドラッグの相対的な抗ウイルス活性を決定する工程は、通常、プロドラッグの代謝産物の相対的な存在または活性について標的組織および非標的組織をアッセイすることによって達成される。このプロドラッグの代謝産物は、抗ウイルス活性または抗腫瘍活性を有する代謝産物を有するかまたはこれに変換されることが知られている。従って、代表的に、標的組織において最終的に活性代謝産物を生成する抗ウイルス活性なもしくは抗腫瘍活性な代謝産物またはその前駆体に標的細胞において優先的に代謝されるプロドラッグを同定するために、実質的に同じ時間経過にわたって組織中の親薬物の相対量を決定する。抗ウイルス化合物の場合において、活性な代謝産物は、ホスホネート親化合物の二リン酸塩である。ウイルス核酸に組み込まれるのはこの代謝産物であり、それにより、伸長する核酸鎖を短縮させ、そしてウイルス複製を停止させる。プロドラッグの代謝産物は、タンパク質同化性代謝産物、異化性代謝産物、または同化作用および異化作用の両方の産物であり得る。代謝産物が生成される様式は、本発明の方法の実施において重要ではない。
【００３７】
本発明の方法は、抗ウイルス活性または抗腫瘍活性を実質上有する代謝産物をアッセイすることに限定されない。確かに、活性な代謝産物の不活性な前駆体をアッセイし得る。抗ウイルス的に活性な二リン酸塩代謝産物の前駆体としては、親薬物の一リン酸塩、親薬物の他の代謝産物の一リン酸塩（例えば、ヘテロ環状塩基上の置換基の中間体改変）、親自体、およびリン酸化の前のプロドラッグの親への変換において細胞によって生成された代謝産物が挙げられる。前駆体構造は、これらが細胞性代謝産物の結果であるので、かなり変化し得る。しかし、この情報は、すでに公知であるか、または当業者によって容易に決定され得る。
【００３８】
アッセイされるプロドラッグが、それ自体抗腫瘍活性または抗ウイルス活性を示さない場合、生のアッセイに対する調整が必要とされ得る。例えば、不活性な代謝産物の活性な代謝産物への細胞内プロセシングは、試験される組織中で異なる速度で生じ、不活性な代謝産物を用いる生のアッセイは、細胞型中の差異を考慮して調整される必要がある。なぜなら、相対的なパラメーターは、不活性な代謝産物の蓄積ではなく、標的組織における活性の生成であるためである。しかし、適切な調整を決定することは、当業者の範囲内である。従って、本明細書中の本発明の工程（ｄ）は、活性を決定する工程を必要とし、活性は、直接的に測定されるかまたは推定され得るかのいずれかである。これは、本明細書中の方法が、それ自体活性である中間体をアッセイすることのみに限定されることを意味するのではない。例えば、試験組織におけるプロドラッグの非存在または減少はまた、アッセイされ得る。工程（ｄ）は、それが関係する組織と相互作用する場合、プロドラッグによって付与される活性の評価のみを必要とし、そしてこのことは、推定または他の非間接的な測定に基づき得る。
【００３９】
本発明の方法の工程（ｄ）は、プロドラッグの「相対的」活性を決定する工程を必要とする。これは、各アッセイおよび全てのアッセイまたは一連のアッセイが、必ずしも選択された非標的組織を含む必要はないと理解される。対照的に、基準となる非標的活性を提供するために、非標的組織もしくは組織の組織学的制御、またはこのような非標的組織から予想される結果を示すアルゴリズムを使用することは、本発明の範囲内である。
【００４０】
次いで、工程（ｄ）において得られる結果は、非標的組織よりも標的組織においてより大きい抗ウイルス活性を生成するプロドラッグを最適に選択または同定するために使用される。さらなる開発のために選択されるのはこのプロドラッグである。
【００４１】
プロドラッグ候補物のいくつかの前評価は、本発明の方法の実施の前に、行なわれ得ることが理解される。例えば、プロドラッグは、大部分が代謝されないで胃腸管を通過し得る必要があり、血液中で実質的に安定である必要があり、そして少なくともある程度細胞を浸透し得なければならない。ほとんどの場合において、このプロドラッグはまた、実質的な代謝なしで肝臓循環の初回通過を完了する必要がある。このような前研究は任意であり、そして当業者に周知である。
【００４２】
抗ウイルス活性について上記のような同じ推定は、メトキシホスホネートヌクレオチドアナログの抗腫瘍プロドラッグについても同様に適用可能である。これらとしては、例えば、ＰＭＥＧのプロドラッグ、ＰＭＥＡのグアニルアナログが挙げられる。この場合において、ＰＭＥＧのような細胞障害性ホスホネートは、これらの細胞障害性が実際にこれらの抗腫瘍活性を付与するので、探求する価値のある化合物である。
【００４３】
次いで、この新規なスクリーニング方法によって同定された化合物を、所望の目的が満たされていることを確認するために、伝統的な臨床前プログラムまたは臨床プログラムに入れ得る。代表的に、プロドラッグは、標的組織における親薬物の活性または濃度（％用量分布）が、非標的組織における親化合物の活性または濃度の２倍より大きく、そして好ましくは５倍より大きい場合、選択的であると考えられる。あるいは、プロドラッグ候補物は、基準プロドラッグと比較され得る。この場合、選択性は、絶対的ではなく、相対的である。選択的プロドラッグは、原型と比較して標的組織において約１０倍よりも大きい濃度または活性を生じるプロドラッグであるが、選択性の程度は任意である。
【００４４】
（開始物質または中間体の調製のための新規な方法）
本発明の好ましい出発物質（親薬物）（ＰＭＥＡおよび（Ｒ）−ＰＭＰＡ）の製造のための改善された方法もまた、本明細書中に含まれる。代表的には、この方法は、９−（２−ヒドロキシプロピル）アデニン（ＨＰＡ）または９−（２−ヒドロキシエチル）アデニン（ＨＥＡ）をマグネシウムアルコキシドと反応させ、その後、保護されたアグリコンシントンｐ−トルエン−スルホニルオキシメチルホスホネート（トシレート）を反応混合物に添加し、そしてそれぞれＰＭＰＡまたはＰＭＥＡを回収する工程を包含する。
【００４５】
好ましくは、ＨＰＡは、濃縮されたかまたは単離されたＲエナンチオマーである。キラルＨＰＡ混合物が使用される場合、Ｒ−ＰＭＰＡは、合成が完了した後、キラルＰＭＰＡ混合物から単離され得る。
【００４６】
代表的には、トシレートは、低級アルキル基によって保護されるが、他の適切な基が、当業者に明らかである。トシル化反応において保護基として作用し得るプロドラッグホスホネート置換基であらかじめ置換されたトシレートを使用することは便利であり、それに
より、脱保護工程を回避しそしてそこからプロドラッグまたは中間体を直接回収し得る。
【００４７】
マグネシウムアルコキシドのアルキル基は重要ではなく、そして任意のＣ１〜Ｃ６の分枝または直鎖状のアルキルであり得るが、好ましくは、ｔ−ブチル（ＰＭＰＡについて）またはイソブチル（ＰＭＥＡについて）である。反応条件はまた、重要ではないが、好ましくは、撹拌しながらかまたは他に中程度に撹拌しながら、約７０〜７５℃で反応混合物を加熱する工程を包含する。
【００４８】
ホスホネート置換基を保持する利益がない場合、生成物は、脱保護され（通常、トシレート保護基がアルキルであるブロモトリメチルシランを用いて）、次いで、この生成物は、結晶化または当業者に明らかな他の簡便な方法によって回収される。
【００４９】
（複素環式塩基）
構造（３）および（４）に記載される本発明の化合物において、複素環式塩基Ｂは、以下の構造；
【００５０】
【化２０】
2010174033.tif 000021
から選択され、ここで、
Ｒ１５は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ１６、ＳＨ、ＳＲ１６、ＮＨ２、またはＮＨＲ１７であり；
Ｒ１６は、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＣＨ、ＣＨ２ＣＨＣＨ２およびＣ３Ｈ７を含む、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ２〜Ｃ６アルケニルであり；
Ｒ１７は、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＣＨ、ＣＨ２ＣＨＣＨ２およびＣ３Ｈ７を含む、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ２〜Ｃ６アルケニルであり；
Ｒ１８は、Ｎ、ＣＦ、ＣＣｌ、ＣＢｒ、ＣＩ、ＣＲ１９、ＣＳＲ１９、またはＣＯＲ１９であり；
Ｒ１９は、Ｈ、置換されていないかまたはＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩによって置換されたＣ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ２〜Ｃ９アルケニル、Ｃ２〜Ｃ９アルキニル、Ｃ１〜Ｃ９アルキル−Ｃ１〜Ｃ９アルコキシ、またはＣ７〜Ｃ９アリール−アルキルであり、従ってＲ１９は、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨＣＨ２、−ＣＨＣＨＢｒ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２ＣＣＨ、−ＣＨ２ＣＨＣＨ２、−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２ＯＣＣＨ、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＣＨ２Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＣＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、および−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣ３Ｈ７を含み；
Ｒ２０は、ＮまたはＣＨであり；
Ｒ２１は、Ｎ、ＣＨ、ＣＣＮ、ＣＣＦ３、ＣＣ≡ＣＨまたはＣＣ（Ｏ）ＮＨ２であり；
Ｒ２２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＳＣＨ２ＣＨ３、ＳＣＨ２ＣＣＨ、ＳＣＨ２ＣＨＣＨ２、ＳＣ３Ｈ７、ＮＨ（ＣＨ３）、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）、Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、ＮＨ（ＣＨ２ＣＣＨ）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨＣＨ２）、ＮＨ（Ｃ３Ｈ７）、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、またはＸであり、ここで、Ｘは、−（ＣＨ２）ｍ（Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｒ１０）２であり、ここで、各ｍは独立して０〜２であり、ｎは０〜１であり、そしてＲ１０は、独立して、
Ｈ、
Ｃ１〜Ｃ１５アルキル、Ｃ２〜Ｃ１５アルケニル、Ｃ６〜Ｃ１５アリールアルケニル、Ｃ６〜Ｃ１５アリールアルキニル、Ｃ２〜Ｃ１５アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１５アラルキル、Ｃ６〜Ｃ１５ヘテロアラルキル、Ｃ５〜Ｃ６アリール、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、
Ｃ２〜Ｃ１５アルキル、Ｃ３〜Ｃ１５アルケニル、Ｃ６〜Ｃ１５アリールアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１５アルキニル、Ｃ７〜Ｃ１５アリールアルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１５アラルキル、Ｃ６〜Ｃ１５へテロアルキル、またはＣ３〜Ｃ６へテロシクロアルキルであり、ここで、アルキル部分におけるメチレンは、−Ｏ−によって置換されたＮ６に隣接せず、
必要に応じて、両方のＲ１０は一緒に、Ｎに結合して１個または２個のＮヘテロ原子および必要に応じてさらなるＯまたはＳヘテロ原子を含む、飽和または不飽和のＣ２〜Ｃ５複素環を形成し、
あるいは、前述のＲ１０基の１つは、１〜３個のハロ、ＣＮまたはＮ３で置換される；しかし、必要に応じて、少なくとも１つのＲ１０基はＨではなく；
Ｒ２８は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＣＨ３、ＳＣＨ２ＣＨ３、ＳＣＨ２ＣＣＨ、ＳＣＨ２ＣＨＣＨ２、ＳＣ３Ｈ７、ＯＲ１６、ＮＨ２、ＮＨＲ１７またはＲ２２であり；そして
Ｒ２４は、Ｏ、ＳまたはＳｅである。
【００５１】
Ｂはまた、保護された複素環式塩基および保護されていないヘテロ環式塩基の両方（特にプリン塩基およびピリミジン塩基）を含む。環外アミンおよび他の不安定な基のための保護基が公知であり（Ｇｒｅｅｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」）、そしてＮ−ベンゾイル、イソブチリル、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）などが挙げられる。保護基の選択は、当業者に明らかであり、そして不安定な基の性質および保護基が遭遇すると予想される化学（例えば、酸性、塩基性、酸化的、還元的または他の条件）に依存する。例示的な保護種は、Ｎ４−ベンゾイルシトシン、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ２−イソブチリルグアニンなどである。
【００５２】
保護塩基は、式Ｘａ．１、ＸＩａ．１、ＸＩｂ．１、ＸＩＩａ．１またはＸＩＩＩａ．１
【００５３】
【化２１】
2010174033.tif 000022
を有し、ここで、Ｒ１８、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２４は、以前に定義された意味を有し；Ｒ２２Ａは、Ｒ２２がＮＨ２ではない条件で、Ｒ３９またはＲ２２であり；Ｒ２３Ａは、Ｒ２３がＮＨ２ではない条件で、Ｒ３９またはＲ２３であり；Ｒ３９は、ＮＨＲ４０、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ３６またはＣＲ４１Ｎ（Ｒ３８）２であり、ここで、Ｒ３６は、１個もしくは２個の原子またはハロゲン、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、ヒドロキシおよびシアノから選択される基で置換された、Ｃ１〜Ｃ１９アルキル、Ｃ１〜Ｃ１９アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０アリール、アダマントイル（ａｄａｍａｎｔｏｙｌ）、アルキルアニル、またはＣ３〜Ｃ１０アリールであり；Ｒ３８は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであるか、または両方のＲ３８は共に、１−モルホリノ、１−ピペリジン、または１−ピロリジンであり；Ｒ４０は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチルおよびデカニルを含む、Ｃ１〜Ｃ１ａアルキルであり；そしてＲ４１は、水素またはＣＨ３である。
【００５４】
構造ＸＩａ．１およびＸＩｂ．１の塩基について、Ｒ３９がＲ２２ＡまたはＲ２３Ａに存在する場合、同じ塩基上の両方のＲ３９基は、一般に同じである。例示的なＲ３６は、フェニル、前述のＲ３６アリール置換基の１つで置換されたフェニル、−Ｃ１０Ｈ１５（ここで、Ｃ１０Ｈ１５は、２−アダマントイルである）、−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ３、メチル、ブチル、ｔ−ブチル、へプタニル、ノナニル、ウンデカニル、またはウンデセニルである。
【００５５】
特定の塩基としては、ヒポキサンチン、グアニン、アデニン、シトシン、イノシン、チミン、ウラシル、キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの１−デアザ誘導体；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの７−デアザ誘導体；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの３−デアザ誘導体；６−アザシトシン；５−フルオロシトシン；５−クロロシトシン；５−ヨードシトシン；５−ブロモシトシン；５−メチルシトシン；５−ブロモビニルウラシル；５−フルオロウラシル；５−クロロウラシル；５−ヨードウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル；５−メトキシメチルウラシル；５−エチニルウラシルおよび５−プロピニルウラシルが挙げられる。
【００５６】
好ましくは、Ｂは、グアニル、３−デアザグアニル、１−デアザグアニル、８−アザグアニル、７−デアザグアニル、アデニル、３−デアザアデニル、１−デアザアデニル、８−アザアデニル、７−デアザアデニル、２，６−ジアミノプリニル、２−アミノプリニル、６−クロロ−２−アミノプリニルおよび６−チオ−２−アミノプリニルから選択される９−プリニル残基であり、またはＢ’は、シトシニル、５−ハロシトシニル、および５−（Ｃ１〜Ｃ３−アルキル）シトシニルから選択される１−ピリミジニル残基である。
【００５７】
このましいＢ基は、式
【００５８】
【化２２】
2010174033.tif 000023
を有し、ここで、
Ｒ２２は、独立して、ハロ、酸素、ＮＨ２、ＸまたはＨであるが、必要に応じて、少なくとも１つのＲ２２は、Ｘであり；
Ｘは、−（ＣＨ２）ｍ（Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｒ１０）２であり、ここで、ｍは、０〜２であり、ｎは０〜１であり、そして
Ｒ１０は、独立して、
Ｈ、
Ｃ１〜Ｃ１５アルキル、Ｃ２〜Ｃ１５アルケニル、Ｃ６〜Ｃ１５アリールアルケニル、Ｃ６〜Ｃ１５アリールアルキニル、Ｃ２〜Ｃ１５アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１５アラルキル、Ｃ６〜Ｃ１５ヘテロアラルキル、Ｃ５〜Ｃ６アリール、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、
Ｃ２〜Ｃ１５アルキル、Ｃ３〜Ｃ１５アルケニル、Ｃ６〜Ｃ１５アリールアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１５アルキニル、Ｃ７〜Ｃ１５アリールアルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１５アラルキル、Ｃ６〜Ｃ１５へテロアルキル、またはＣ３〜Ｃ６へテロシクロアルキルであり、ここで、アルキル部分におけるメチレンは、−Ｏ−によって置換されたＮ６に隣接せず、
必要に応じて、両方のＲ１０は一緒に、Ｎに結合して１個または２個のＮヘテロ原子および必要に応じてさらなるＯまたはＳヘテロ原子を含む、飽和または不飽和のＣ２〜Ｃ５複素環を形成し、
あるいは、前述のＲ１０基の１つは、１〜３個のハロ、ＣＮまたはＮ３で置換される；しかし、必要に応じて、少なくとも１つのＲ１０基はＨではなく；そして
Ｚは、複素環式核がたった１個のＺだけプリンとは異なる条件で、ＮまたはＣＨである。
【００５９】
Ｅ基は、メトキシホスホネートヌクレオチドアナログにおいて使用されるアグリコンを示す。好ましくは、Ｅ基は、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２−である。また、アグリコンにおけるキラル中心の側鎖は、（濃縮された（Ｓ）エナンチオマーであるヒドロキシメチルを除いて）実質的に（Ｒ）構造のみであることが好ましい。
【００６０】
Ｒ１は、構造−ＯＲ３５または−ＯＲ６を有するインビボ加水分解性オキシエステルであり、ここで、Ｒ３５は、本明細書中に参考として援用される米国特許第５，７９８，３４０号の６４段落４９行目において定義され、そしてＲ６は、上に定義される。好ましくは、Ｒ１は、アリールオキシ、通常、非置換かまたはパラ置換の（Ｒ６において定義されるような）フェノキシである。
【００６１】
Ｒ２は、必要に応じて約５未満の原子によってアミデートＮに結合された任意のカルボキシ基がエステル化されている条件で、アミノ酸残基である。Ｒ２は、代表的に、構造
【００６２】
【化２３】
2010174033.tif 000024
を有し、ここで、
ｎは、１または２であり；
Ｒ１１は、Ｒ６またはＨであり；好ましくは、Ｒ６＝Ｃ３〜Ｃ９アルキル；ＯＨ、ハロゲン、ＯまたはＮで独立して置換されたＣ３〜Ｃ９アルキル；Ｃ３〜Ｃ６アリール；ＯＨ、ハロゲン、ＯまたはＮで独立して置換されたＣ３〜Ｃ６アリール；あるいはＯＨ、ハロゲン、ＯまたはＮで独立して置換されたＣ３〜Ｃ６アリールアルキルであり；
Ｒ１２は、独立して、Ｈまたは非置換であるかもしくはＯＨ、Ｏ、Ｎ、ＣＯＯＲ１１およびハロゲンからなる群より独立して選択される置換基によって置換されたＣ１〜Ｃ９アルキル；非置換であるかもしくはＯＨ、Ｏ、Ｎ、ＣＯＯＲ１１およびハロゲンからなる群より独立して選択される置換基によって置換されたＣ３〜Ｃ６アリール；あるいは非置換であるかもしくはＯＨ、Ｏ、Ｎ、ＣＯＯＲ１１およびハロゲンからなる群より独立して選択される置換基によって置換されたＣ３〜Ｃ９アリール−アルキルであり；
Ｒ１３は、独立して、Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１１；アミノ；アミド；グアニジニル；イミダゾリル；インドリル；スルホキシド；ホスホリル；Ｃ１〜Ｃ３アルキルアミノ；Ｃ１〜Ｃ３アルキルジアミノ；Ｃ１〜Ｃ６アルケニルアミノ；ヒドロキシ；チオール；Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ；Ｃ１〜Ｃ３アルキルチオール（ａｌｋｔｈｉｏｌ）；（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ１１；非置換かまたはＯＨ、ハロゲン、ＳＨ、ＮＨ２、フェニル、ヒドロキシフェニルもしくはＣ７〜Ｃ１０アルコキシフェニルで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル；非置換かまたはＯＨ、ハロゲン、ＳＨ、ＮＨ２、フェニル、ヒドロキシフェニルもしくはＣ７〜Ｃ１０アルコキシフェニルで置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル；および非置換かまたはＯＨ、ハロゲン、ＳＨ、ＮＨ２、フェニル、ヒドロキシフェニルもしくはＣ７〜Ｃ１０アルコキシフェニルで置換されたＣ６〜Ｃ１２アリールであり；そして
Ｒ１４は、ＨあるいはＣ１〜Ｃ９アルキル、またはＯＨ、ハロゲン、ＣＯＯＲ１１、ＯもしくはＮで独立して置換されたＣ１〜Ｃ９アルキル；Ｃ３〜Ｃ６アリール；ＯＨ、ハロゲン、ＣＯＯＲ１１、ＯもしくはＮで独立して置換されたＣ３〜Ｃ６アリール；またはＯＨ、ハロゲン、ＣＯＯＲ１１、ＯもしくはＮで独立して置換されたＣ３〜Ｃ６アリールアルキルである。
【００６３】
好ましくは、Ｒ１１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、最も好ましくはイソプロピルであり、Ｒ１３は、天然に存在するアミノ酸の側鎖であり、ｎ＝１であり、Ｒ１２はＨであり、そしてＲ１４はＨである。構造（２）の化合物において、本発明は、へノキシおよびイソプロピルエステルが−ＯＨに加水分解された代謝産物を含む。同様に、化合物（５ａ）、５（ｂ）および（６）の脱エステル化された濃縮ホスホノアミデート代謝産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００６４】
アリールおよび「Ｏ」または「Ｎ」置換は、米国特許第５，７９８，３４０号の１６列目、４２〜５８行に規定されている。
【００６５】
代表的には、アミノ酸は、天然アミノ酸またはｌアミノ酸である。適切な特異的な実施例は、米国特許第５，７９８，３４０号において、例えばその表４および８〜１０列に記載されている。
【００６６】
本明細書において用いる場合、アルキルは、反対に言及しない限り、正常な、第二級、第三級、または環状の炭化水素である。反対に言及しない限り、アルキルは、Ｃ１−Ｃ１２である。例えば、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２、および−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３である。アルケニルおよびアルキニルは、同じ様式で規定されるが、それぞれ少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む。
【００６７】
ここでエノール基またはケト基が開示されており、対応する互変異性体も同様に教示されていると解釈される。
【００６８】
本発明のプロドラッグ化合物は、米国特許第５，７９８，３４０号に列挙される遊離塩基または種々の塩の形態で提供されており、そしてまた米国特許第５，７９８，３４０号に記載されるような薬学的産物としての使用のために薬学的に受容可能な賦形剤または溶媒和希釈剤とともに処方される。これらのプロドラッグは、親薬物について既に確立された抗ウイルスおよび有用性を有する（米国特許第５，７９８，３４０号およびメトキシホスホネートヌクレオチドアナログに関する他の引用文献を参照のこと）。構造（４）のジアステレオマーは少なくとも、本明細書における研究において表されたような比較的無差別の特徴にかかわらず、インビトロにおける加水分解によって親薬物の化学的生成における中間産物として有用であることが理解される。
【実施例】
【００６９】
本発明は以下の実施例を参考としてさらに完全に理解される。
【００７０】
【化２４】
2010174033.tif 000025
（マグネシウムイソプロポキシドを用いるＰＭＥＡへのアデニン）アデニン（１６．８ｇ、０．１２４ｍｏｌ）を含有するＤＭＦ（４１．９ｍｌ）の懸濁液へ、エチレンカルボネート（１２．１ｇ、０．１３７ｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（０．１００ｇ、０．００２５ｍｏｌ）を添加した。この混合物を１３０℃で一晩加熱した。反応物を５０℃より下に冷却し、そしてトルエン（６２．１ｍｌ）を添加した。このスラリーを２時間５℃にさらに冷却し、濾過し、そしてトルエンでリンスした（２×）。湿潤固体を６５℃減圧下で乾燥し２０．０ｇ（９０％）の９−（２−ヒドロキシエチル）アデニンをオフホワイトの固体として得た。Ｍｐ：２３８〜２４０℃。
【００７１】
【化２５】
2010174033.tif 000026
９−（２−ヒドロキシエチル）アデニン（ＨＥＡ）（２０．０ｇ、０．１１２ｍｏｌ）をＤＭＦ（１２５ｍｌ）中に懸濁し、そして８０℃に加熱した。マグネシウムイソプロポキシド（１１．２ｇ、０．０７８４ｍｏｌ）、または代わりにマグネシウムｔ−ブトキシドをこの混合物に添加し、続いてジエチルｐ−トルエンスルホニルオキシメチルホスホネート（６６．０ｇ、０．１６２ｍｏｌ）を１時間にわたって添加した。この混合物を８０℃で７時間攪拌した。３０ｍｌの揮発物を減圧蒸留によって除去し、そして反応物に３０ｍｌの新鮮ＤＭＦを再チャージした。室温への冷却後、ブロモトリメチルシラン（６９．６ｇ、０．４５０ｍｏｌ）を添加し、そしてこの混合物を６時間８０℃に加熱した。反応物を濃縮し高粘度の粘性物質（ｔｈｉｃｋ  ｇｕｍ）を得た。この粘性物質を３６０ｍｌの水に溶解し、１２０ｍｌのジクロロメタンで抽出し、水酸化ナトリウムでｐＨ３．２に調節し、そして得られたスラリーを一晩室温で攪拌した。このスラリーを１時間４℃に冷却した。この固体を濾過によって分離し、水で洗浄し（２×）、そして５６℃減圧下で乾燥して、白色固体として２０ｇ（６５．４％）の９−［２−（ホスホノメトキシ）エチル］アデニン（ＰＭＥＡ）を得た。Ｍｐ：＞２００℃（分解）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）・３．４９（ｔ，２Ｈ）；３．９４（ｔ，２Ｈ）；４．３９（ｔ，２Ｈ）；８．１３（ｓ，１Ｈ）；８．２２（ｓ，１Ｈ）。
【００７２】
【化２６】
2010174033.tif 000027
（マグネシウムｔ−ブトキシドを用いるＰＭＰＡへのアデニン）アデニン（４０ｇ、０．２９６ｍｏｌ）を含有するＤＭＦ（４１．９ｍｌ）の懸濁液へ、（Ｒ）−プロピレンカーボネイト（３４．５ｇ、０．３３８ｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（０．４８０ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を添加した。この混合物を１３０℃で一晩加熱した。反応物を１００℃より下に冷却し、そして反応温度を１００〜１１０℃の間に維持したまま、トルエン（１３８ｍｌ）を、続いてメタンスルホン酸（４．７ｇ、０．０４９ｍｏｌ）添加した。追加のトルエン（１１４ｍｌ）を添加して均一な溶液を作成した。この溶液を７時間にわたって３℃に冷却し、次いで１時間３℃で保持した。得られた固体を濾過して分離し、そしてアセトンでリンスした（２×）。湿潤固体を８０℃減圧下で乾燥し、オフホワイトの固体として、４２．６ｇ（７５％）の（Ｒ）−９−［２−（ヒドロキシ）プロピル］アデニン（ＨＰＡ）エチル）アデニンを得た。Ｍｐ：１８８〜１９０℃。
【００７３】
【化２７】
2010174033.tif 000028
（Ｒ）−９−［２−（ヒドロキシ）プロピル］アデニン（ＨＰＡ）（２０．０ｇ、−。１０４ｍｏｌ）をＤＭＦ（４４．５ｍｌ）中に懸濁し、そして６５℃に加熱した。マグネシウムｔ−ブトキシド（１４．２ｇ、０．０８３ｍｏｌ）、または代わりにマグネシウムイソプロポキシドを、温度を７８℃に保持したまま、１時間にわたってこの混合物に添加し、続いてジエチルｐ−トルエンスルホニルオキシメチルホスホネート（６６．０ｇ、０．２０５ｍｏｌ）を２時間にわたって添加した。この混合物を７５℃で４時間攪拌した。５０℃より下への冷却後、ブロモトリメチルシラン（７３．９ｇ、０．４７８ｍｏｌ）を添加し、そしてこの混合物を３時間７７℃に加熱した。完了したとき、この反応物を８０℃に加熱し、そして揮発物を常圧蒸留によって取り出した。残滓を５０℃で水（１２０ｍｌ）に溶解し、次いで酢酸エチルで抽出した（１０１ｍｌ）。水酸化ナトリウムを用いて水相のｐＨをｐＨ１．１に調節し、標準（Ｒ）−ＰＭＰＡをシードし、そして水相のｐＨを水酸化ナトリウムでｐＨ２．１に再調節した。得られたスラリーを室温で一晩攪拌した。このスラリーを３時間４℃に冷却した。この固体を濾過して分離し、水（６０ｍｌ）で洗浄し、そして５０℃減圧下で乾燥し、オフホワイトの固体として、１８．９ｇ（６３．５％）の粗（Ｒ）−９−［２−（ホスホノメトキシ）プロピル］アデニン（ＰＭＰＡ）を得た。
【００７４】
全ての固体が溶解するまで、粗（Ｒ）−９−［２−（ホスホノメトキシ）プロピル］アデニンを水（２５５ｍｌ）中で加熱還流した。この溶液を４時間にわたって室温まで冷却した。得られたスラリーを３時間４℃に冷却した。この固体を濾過によって分離し、水（５６ｍｌ）およびアセトン（５６ｍｌ）で洗浄し、そして５０℃減圧下で乾燥して、白色固体として１５．０ｇ（５０．４％）の（Ｒ）−９−［２−（ホスホノメトキシ）プロピル］アデニン（ＰＭＰＡ）を得た。Ｍｐ：２７８〜２８０℃。
【００７５】
【化２８】
2010174033.tif 000029
ガラスで裏打ちした（ｇｌａｓｓ−ｌｉｎｅｄ）リアクターに、無水ＰＭＰＡ、（Ｉ）（１４．６ｋｇ、５０．８ｍｏｌ）、フェノール（９．６ｋｇ、１０２ｍｏｌ）、および１−メチル−２−ピロリジノン（３９ｋｇ）を充填した。この混合物を８５℃に加熱し、そしてトリエチルアミン（６．３ｋｇ、６２．３ｍｏｌ）を添加した。次いで、１，３−ジクロヘキシルカルボジイミド（１７．１ｋｇ、８２．９ｍｏｌ）を含有する１−メチル−２−ピロリジノン（１．６ｋｇ）の溶液を、１００℃で６時間にわたって添加した。加熱を１６時間続けた。反応物を４５℃に冷却して、水（２９ｋｇ）を添加し、そして２５℃に冷却した。濾過して反応物から固体を除き、そして水（１５．３ｋｇ）でリンスした。合わせた濾過液およびリンスを減圧下で褐色の（ｔａｎ）スラリーに濃縮して、水（２４．６ｋｇ）を添加し、そしてＮａＯＨ（水に２５％含有）でｐＨ＝１１に調節した。珪藻土を通した濾過、続いて水（４．４ｋｇ）でのリンスによって細粒を取り除いた。合わせた濾過液およびリンスを酢酸エチル（２８ｋｇ）で抽出した。ＨＣｌ（水に３７％含有）（４ｋｇ）を用いて水溶液をｐＨ＝３．１に調節した。粗ＩＩを濾過で分離し、そしてメタノール（１２．７ｋｇ）で洗浄した。粗ＩＩの湿潤ケーキをメタノール（５８ｋｇ）中に懸濁（スラリー）した。固体を濾過によって分離し、メタノール（８．５ｋｇ）で洗浄し、そして減圧下で乾燥して、白色粉末として９．３３ｋｇのＩＩを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ１．２（ｄ，３Ｈ）、３．４５（ｑ，２Ｈ）、３．７（ｑ，２Ｈ）、４（ｍ，２Ｈ）、４．２（ｑ，２Ｈ）、４．３５（ｄｄ，２Ｈ）、６．６（ｄ，２Ｈ）、７（ｔ，１Ｈ）、７．１５（ｔ，２Ｈ）、８．１５（ｓ，１Ｈ）、８．２（ｓ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ１５．０（デカップリング）。
【００７６】
（ＧＳ−７１７１（ＩＩＩ））（スキーム１）ガラスで裏打ちしたリアクターに、モノフェニルＰＭＰＡ、（ＩＩ）、（９．１２ｋｇ、２５．１ｍｏｌ）およびアセトニトリル（３０．７ｋｇ）を充填した。塩化チオニル（６．５７ｋｇ、５６．７ｍｏｌ）を５０℃より下で添加した。固体が溶解するまで、この混合物を７５℃で加熱した。反応温度を８０℃に上昇させ、そして窒素下での常圧蒸留によって揮発物（１１．４ｋｇ）を収集した。ポット残滓を２５℃に冷却し、ジクロロメタン（４１ｋｇ）を添加し、そして−２９℃に冷却した。（Ｌ）−アラニンイソプロピルエステル（７．１ｋｇ、５４．４ｍｏｌ）を含有するジクロロメタン（３６ｋｇ）の溶液を、−１８℃で６０分にわたって添加し、続いて−１８〜−１１℃で３０分にわたってトリエチルアミン（７．６６ｋｇ、７５．７ｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温まで暖め、そして二水素リン酸ナトリウム溶液（水中に１０％含有、各洗浄に１５．７ｋｇ）を用いて５回洗浄した。有機溶液を無水硫酸ナトリウム（１８．２ｋｇ）で乾燥し、濾過し、ジクロロメタン（２８ｋｇ）でリンスし、そして減圧下で油状物に濃縮した。アセトン（２０ｋｇ）をこの油状物にチャージし、そしてこの混合物を減圧下で濃縮した。アセトン（１８．８ｋｇ）を得られた油状物にチャージした。３８×３８ｃｍベッドの２２ｋｇシリカゲル６０、２３０〜４００メッシュを通したクロマトグラフィーによって生成溶液の半分を精製した。このカラムを４８０ｋｇのアセトンで溶出した。新鮮なシリカゲルおよびアセトンを用いてこの油状物の半分で精製を繰り返した。清浄な生成物を有する画分を減圧下で油状物に濃縮した。アセトニトリル（１９．６ｋｇ）をこの油状物にチャージし、そしてこの混合物を減圧下で濃縮した。アセトニトリル（６６．４ｋｇ）をチャージし、そしてこの溶液を１６時間０〜−５℃に冷却した。固体を濾過によって取り出し、そして濾過物を減圧下で濃縮して、黒い油状物として５．６ｋｇのＩＩＩを得た：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．１（ｍ  １２Ｈ）、３．７（ｍ，１Ｈ）、４．０（ｍ、５Ｈ）、５．０（ｍ，１Ｈ）、６．２（ｓ，２Ｈ）、７．０５（ｍ，５Ｈ）、８．０（ｓ，１Ｈ）、８．２５（ｄ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２１．０、２２．５（デカップリング）。
【００７７】
【化２９】
2010174033.tif 000030
（モノフェニル  ＰＭＰＡ（ＩＩ）。還流冷却器および窒素入口を備える丸底フラスコを、７０℃の油槽に入れた。このフラスコに無水ＰＭＰＡ（Ｉ）（１９．２ｇ、６７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．２９ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、およびテトラメチレンスルホン（４０ｍＬ）を充填した。塩化チオニル（１４．２ｇ、１１９ｍｍｏｌ）を４時間にわたって添加した。加熱を同じ時間にわたって１００℃まで上昇させた。均一な溶液を得た。フェノキシトリメチルシラン（１１．７ｇ、７０ｍｍｏｌ）を５分間にわたってこの溶液に添加した。１００℃油槽中での加熱をさらに２時間続けた。反応物を０℃に冷却しながら、迅速に攪拌するアセトン（４００ｍＬ）中に注いだ。固体を濾過によって分離して、減圧下で乾燥して、メタノール（７５ｍＬ）に溶解した。氷／水中で冷却しながら、水酸化カリウム溶液（４５％水）を用いて、溶液のｐＨを３．０に調節した。得られた固体を濾過して分離し、メタノールでリンスし、そして減圧下で白色粉末として２０．４ｇのＩＩ（スキーム２）に乾燥した。
【００７８】
（ＧＳ−７１７１（ＩＩＩ））。モノフェニル  ＰＭＰＡ（ＩＩ）（３ｇ、８．３ｍｍｏｌ）、テトラメチレンスルホン（５ｍＬ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ドロップ）を、４０℃の油槽中の丸底フラスコに合わせた。塩化チオニル（１．９６ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）を添加した。２０分後、この清明な溶液を熱から取り出し、ジクロロメタン（１０ｍｌ）で希釈し、そして（Ｌ）−アラニンイソプロピルエステル（５ｇ、３３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（５．３３ｇ、４１ｍｍｏｌ）を含有する−１０℃のジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に添加した。反応混合物を室温まで暖め、二水素リン酸ナトリウム（１０％水、各洗浄１０ｍＬ）で３回洗浄した。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下で油状物に濃縮した。この油状物をフマル酸（０．７７ｇ、６．６ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（４０ｍＬ）とあわせ、そして加熱し還流して均一な溶液を得た。この溶液を氷槽中で冷却し、そして濾過によって固体を分離した。固体ＧＳ−７１７１フマル酸塩を減圧下で３．７ｇに乾燥した。この塩（３．１６ｇ、５．３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍＬ）に懸濁し、そして炭酸カリウム溶液（５ｍＬ、水中に２．５Ｍ）とともにこの固体が溶解するまで攪拌した。有機相を分離し、次いで水（５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下で乾燥して褐色の泡状物として２．４ｇのＩＩＩを得た。
【００７９】
（実施例３）
（Ａ．バッチ溶出クロマトグラフィーによるジアステレオマー分離）
Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＳ，２０μｍ、２１×５０ｍｍガードカラムを備える市販のＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＳ，２０μｍ、２１×２５０ｍｍ半−分離用ＨＰＬＣカラムを用いて、ＧＳ−７１７１（ＩＩＩ）のジアステレオマーをバッチ溶出クロマトグラフィーによって分離した。Ｃｈｉｒａｌｐａｋ（登録商標）ＡＳは、Ｄｉａｃｅｌが製造し、Ｃｈｉｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって北アメリカで販売されている独自のパッキング材である（米国特許第５，２０２，４３３号、ＲＥ３５，９１９号、５，４３４，２９８号、５，４３４，２９９号、および５，４９８，７５２号）。Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＳは、シリカゲル支持体上にコーティングされたアミロセトリス［（Ｓ）−α−メチルベンジルカルバメート］から構成される鏡像異性体（キラル）固定相（ｃｈｉｒａｌ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ）（ＣＳＰ）である。
【００８０】
ＧＳ−７１７１ジアステレオマー混合物を、移動相中で溶解させ、そしてＧＳ−７１７１の約１ｇのアリコートをクロマトグラフィーシステムにポンピングした。望ましくないジアステレオマー（ＧＳ−７３３９と名付けられた）は、このカラムから溶出する最初の主要な広い（約１５分、期間）のピークであった。ＧＳ−７３３９ピークを最終溶出した場合、この移動相は、直ちに１００％メチルアルコールにスイッチし、ここで所望のジアステレオマー（ＧＳ−７３４０（ＩＶ）と名付けられた）が、メチルアルコール溶媒先端を用いてこのカラムから先鋭なピークで溶出するようにさせた。このメチルアルコールを用いて全体にわたるサイクル時間を短くさせた。注入の最初の組み合わせ後、精製したジアステレオマーの１つを含有する単一の大きな画分（＞９９．０％単一ジアステレオマー）として、両方のジアステレオマーを収集した。この移動相溶媒を減圧下で取り出して、砕けやすい泡状物として精製したジアステレオマーを得た。
【００８１】
出発ＧＳ−７１７１量の約９５％を２つのジアステレオマー画分中で回収した。このＧＳ−７３４０画分は、総回収量の約５０％を構成した。
【００８２】
クロマトグラフィー条件は、以下の通りであった：
移動相（最初）      ：ＧＳ−７１７１−アセトニトリル：イソプロピルアルコール（９０：１０）
（最後）      ：１００％メチルアルコール
流れ                ：１０ｍＬ／分
実行時間            ：約４５分
検出                ：ＵＶ（２７５ｎｍ）
温度                ：環境
溶出プローブフィール：ＧＳ−７３３９（ジアステレオマーＢ）
：ＧＳ−７３４０（ジアステレオマーＡ；（ＩＶ））。
【００８３】
（Ｂ．ＳＭＢクロマトグラフィーによるＧＳ−７１７１のジアステレオマーの分離）
擬似移動床式（ＳＭＢ）クロマトグラフィーの一般的な説明については、Ｓｔｒｕｂｅら、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」２：３０５−３１９（１９９８）を参照のこと。
【００８４】
ＧＳ−７３４０（ＩＶ）。ＧＳ−７１７１（ＩＩＩ）（２．８ｋｇ）を、１０ｃｍ×５ｃｍの充填床（Ｃｈｉｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，シリカゲル上にコーティングした２０ミクロンのＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＳ）（１．２ｋｇ）上での擬似移
動床式クロマトグラフィーによって精製した。このカラムを、アセトニトリル中３０％メタノールで溶出した。生成物含有画分を、アセトニトリル中、ＩＶ溶液まで濃縮した（２．４８ｋｇ）。この溶液を放置して、アセトニトリルを用いて湿った結晶性塊まで凝固させた。この結晶性塊を、黄褐色の結晶性粉末まで減圧下で乾燥した。１．３０１ｋｇ  ＩＶ，９８．７％のジアステレオマー純度：ｍｐ  １１７〜１２０℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  １．１５（ｍ，１２Ｈ），３．７（ｔ，１Ｈ），４．０（ｍ，５Ｈ），４．２（ｄｄ，１Ｈ），５．０（ｍ，１Ｈ），６．０５（ｓ，２Ｈ），７．１（ｍ，５Ｈ），８．０（ｓ，１Ｈ），８．２（ｓ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ２１．０（デカップリングした）。
【００８５】
（Ｃ．Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣによるジアステレオマーの分離）
ＧＳ−７１７１（ＩＩＩ）を、ジアステレオマーを分離するために、以下に要約するプロトコルを使用して、逆相ＨＰＬＣによるクロマトグラフィーにかけた。
【００８６】
クロマトグラフィーカラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＬｕｎａＴＭ  Ｃ１８（２），５μｍ，１００Åの細孔サイズ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）、またはその等価物
ガードカラム：Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒ  Ｃ１８（Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、またはその等価物
移動相：Ａ−水中０．０２％（８５％）Ｈ３ＰＯ４：アセトニトリル（９５：５）
Ｂ−水中０．０２％（８５％）Ｈ３ＰＯ４：アセトニトリル（５０：５０）
移動相の勾配
【００８７】
【表１】
2010174033.tif 000031
実行時間：５０分
平衡化猶予：１００％移動相Ａで１０分
流速：１．２ｍＬ／分
温度：環境
検出：ＵＶ（２６０ｎｍ）
サンプル溶液：２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）
保持時間：ＧＳ−７３３９、約２５分
ＧＳ−７３４０、約２７分。
【００８８】
（Ｄ．結晶化によるジアステレオマーの分離）
ＧＳ−７３４０（ＩＶ）。アセトニトリル中のＧＳ−７１７１（ＩＩＩ）の溶液を、減圧下で、琥珀色泡状物まで濃縮した（１４．９ｇ）。この泡状物を、アセトニトリル（２０ｍＬ）中に溶解し、そしてＩＶの結晶で播種した。この混合物を一晩攪拌し、５℃まで冷却し、そして濾過によって固体を単離した。この固体を乾燥して、２．３ｇのＩＶを白色結晶として得た。９８％のジアステレオマー純度（３１Ｐ  ＮＭＲ）：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  １．１５（ｍ，１２Ｈ），３．７（ｔ，１Ｈ），３．９５（ｍ，２Ｈ），４．０５（ｍ，２Ｈ），４．２（ｍ，２Ｈ），５．０（ｍ，１Ｈ），６．４（ｓ，２Ｈ），７．１（ｍ，５Ｈ），８．０（ｓ，１Ｈ），８．２（ｓ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  １９．５（デカップリングした）。この生成物から選択した単結晶のＸ線結晶分析により、以下のデータを得た：
結晶の色、晶相      無色、カラム
結晶寸法            ０．２５×０．１２×０．０８ｍｍ
結晶系              斜方晶系
格子型              単純
格子パラメーター    ａ＝８．３５２（１）Å
ｂ＝１５．５７４（２）Å
ｃ＝１８．２５３（２）Å
Ｖ＝２３７４．２（５）Å
空間群              Ｐ２１２１２１（＃１９）
Ｚ値                ４
Ｄｃａｌｃ              １．３３３ｇ／ｃｍ３
Ｆ０００                １００８．００
μ（ＭｏＫα）      １．６０ｃｍ−１。
【００８９】
（実施例４）
（ＧＳ−７３４０のフマル酸塩の調製）
ＧＳ−７３４０−０２（Ｖ）。（スキーム１）ガラス管付き反応器に、ＧＳ−７３４０（ＩＶ）（１．２９４ｋｇ，２．７１ｍｏｌ）、フマル酸（２８４ｇ，２．４４ｍｏｌ）、およびアセトニトリル（２４．６ｋｇ）を充填した。この混合物を加熱還流して固体を溶解し、熱いまま濾過し、そして１６時間かけて５℃まで冷却した。この生成物を濾過によって単離し、アセトニトリル（９．２ｋｇ）でリンスし、そして乾燥して１３２９ｇ（Ｖ）を白色粉末として得た：ｍｐ  １１９．７〜１２１．１℃；［α］Ｄ２０−４１．７°（ｃ  １．０，酢酸）。
【００９０】
（実施例５）
（ＧＳ−７１２０（ＶＩ）の調製）
スキーム３
【００９１】
【化３０】
2010174033.tif 000032
５Ｌの丸底フラスコに、モノフェニルＰＭＰＡ、（ＩＩ）（２００ｇ，０．５５ｍｏｌ）およびアセトニトリル（０．６２９ｋｇ）を充填した。塩化チオニル（０．１４４ｋｇ，１．２１ｍｏｌ）を２７℃未満で添加した。この混合物を、固体が溶解するまで７０℃で加熱した。揮発性物質（０．４５Ｌ）を、窒素下での大気圧蒸留によって除去した。このポットの残渣を２５℃に冷却し、ジクロロメタン（１．６ｋｇ）を添加し、そしてこの混合物を−２０℃に冷却した。ジクロロメタン（１．３３ｋｇ）中の（Ｌ）−αアミノ酪酸エチルエステル（０．１４４ｋｇ，１．１ｍｏｌ）の溶液を、−２０〜−１０℃で１８分かけて添加し、続いてトリエチルアミン（０．１７ｋｇ，１．６５ｍｏｌ）を−８〜−１５℃で１５分かけて添加した。この反応混合物を室温まで暖め、そしてリン酸二水素ナトリウム溶液（１０％ａｑ．，各洗浄０．３Ｌ）で４回洗浄した。有機溶液を無水硫酸ナトリウム（０．５ｋｇ）で乾燥させ、そして濾過した。この固体をジクロロメタン（０．６ｋｇ）でリンスし、そして合わせた濾液およびリンスを減圧下で油状物まで濃縮した。この油状物を、１．２ｋｇのシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）の１５×１３ｃｍのベッド上でのクロマトグラフィーによって精製した。このカラムを、ジクロロメタンおよびメタノールの勾配で溶出した。生成物含有画分を減圧下で濃縮して、２１１ｇのＶＩ（スキーム３）を黄褐色の泡状物として得た。
【００９２】
（実施例５ａ）
（バッチ溶出クロマトグラフィーによるＧＳ−７１２０のジアステレオマーの分離）
ジアステレオマー混合物を、以下を除いて、実施例３ＡにおいてＧＳ−７１７１について記載された条件を使用して精製した：
移動相（最初）    ：ＧＳ−７１２０−アセトニトリル：イソプロピルアルコール（９８：２）
（最後）    ：１００％メチルアルコール
溶出プロフィール  ：ＧＳ−７３４１（ジアステレオマーＢ）
：ＧＳ−７３４２（ジアステレオマーＡ）。
【００９３】
（実施例６）
（結晶化によるＧＳ−７１２０のジアステレオマーの分離）
１Ｌの丸底フラスコに、モノフェニルＰＭＰＡ，（ＩＩ），（５０ｇ，０．１３７ｍｏｌ）およびアセトニトリル（０．２Ｌ）を充填した。塩化チオニル（０．０３６ｋｇ，０．３０３ｍｏｌ）を添加し、１０℃発熱した。この混合物を、固体が溶解するまで加熱還流した。揮発性物質（０．１Ｌ）を、窒素下での大気圧蒸留によって除去した。このポットの残渣を２５℃に冷却し、ジクロロメタン（０．２ｋｇ）を添加し、そしてこの混合物を−２０℃に冷却した。ジクロロメタン（０．６７ｋｇ）中の（Ｌ）−αアミノ酪酸エチルエステル（０．０３６ｋｇ，０．２７５ｍｏｌ）の溶液を、−２０〜−８℃で３０分かけて添加し、続いてトリエチルアミン（０．０４２ｋｇ，０．４１ｍｏｌ）を−６℃まで１０分かけて添加した。この反応混合物を室温まで暖め、そしてリン酸二水素ナトリウム溶液（１０％ａｑ．，各洗浄０．０７５Ｌ）で４回洗浄した。この有機溶液を無水硫酸ナトリウム（０．１ｋｇ）で乾燥させ、そして濾過した。この固体を酢酸エチル（０．２５Ｌ）でリンスし、そして合わせた濾液およびリンスを減圧下で油状物まで濃縮した。この油状物を、酢酸エチル（０．２５Ｌ）で希釈し、播種し、一晩攪拌し、そして−１５℃に冷却した。この固体を濾過によって単離し、そして減圧下で乾燥して、１７．７ｇのＧＳ−７３４２（表５）を黄褐色粉末として得た：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ０．９５（ｔ，３Ｈ），１．３（ｍ，６Ｈ），１．７（ｍ，２Ｈ），３．７（ｍ，２Ｈ），４．１（ｍ，６Ｈ），４．４（ｄｄ，１Ｈ），５．８（ｓ，２Ｈ），７．１（ｍ，５Ｈ），８．０（ｓ，１Ｈ），８．４（ｓ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ２１（デカップリングした）。
【００９４】
（実施例７）
（ＧＳ−７０９７のジアステレオマーの分離）
このジアステレオマー混合物を、以下を除いて、ＧＳ−７１７１について記載された条件（実施例３Ａ）を使用して精製した：
移動相（最初）    ：ＧＳ−７１２０−アセトニトリル：イソプロピルアルコール（９５：５）
（最後）    ：１００％メチルアルコール
溶出プロフィール  ：ＧＳ−７１１５（ジアステレオマーＢ）
：ＧＳ−７１１４（ジアステレオマーＡ）。
【００９５】
（実施例８）
（ＧＳ−７０９７の調製のための代替的手順）
ＧＳ−７０９７：フェニルＰＭＰＡ，エチルＬ−アラニルアミデート。フェニルＰＭＰＡ（１５．０ｇ，４１．３ｍｍｏｌ）、Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩（１２．６ｇ，８３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１１．５ｍＬ，８３ｍｍｏｌ）を、乾燥Ｎ２下、５００ｍＬのピリジン中で一緒にスラリーにした。この懸濁液を、トリフェニルホスフィン（３７．９ｇ，１４５ｍｍｏｌ）、アルドリチオール２（Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ  ２）（２，２’−ジピリジルジスルフィド）（３１．８ｇ，１４５ｍｍｏｌ）、および１２０ｍＬのピリジンの溶液と合わせた。この混合物を５７℃の内部温度で１５時間加熱した。完全な反応物を、減圧下で黄色ペースト（１００ｇ）まで濃縮した。このペーストを、１．１ｋｇのシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）の２５×１１ｃｍのベッド上でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。このカラムを、ジクロロメタン中２％メタノール（８リットル）、続いて最終組成１３％メタノールまでの２６リットルの溶出剤の過程の直線勾配で溶出した。きれいな生成物を含有する画分を濃縮して、１２．４ｇの粗性（５）（理論値の６５％）を得た。この物質は、１Ｈ  ＮＭＲによって、約１５％（重量）のトリエチルアミン塩酸塩が混入していた。この生成物を３５０ｍＬの酢酸エチルに溶解し、２０ｍＬの水で抽出し、有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして濃縮して１１．１ｇの純粋なＧＳ−７０９７を白色固体として得ることによって、この混入物を除去した（収率５８％）。この手順をまた、ＧＳ−７００３ａとＧＳ−７００３ｂ（フェニルアラニルアミデート）とのジアステレオマー混合物、およびＧＳ−７１１９とＧＳ−７３３５（グリシルアミデート）との混合物を合成するために使用した。これらのジアステレオマーを、実施例３Ａ、６および７に示されるようなバッチ溶出手順を使用して分離した。
【００９６】
（実施例９）
（プロドラッグジアステレオマーのインビトロ研究）
ＭＴ−２細胞におけるインビトロでの抗ＨＩＶ−１活性および細胞傷害性、ならびにヒト血漿およびＭＴ−２細胞抽出物（遊離塩基）におけるＧＳ−７３４０およびテノフォビルジスオプロキシルフマレート（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ  ｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ）（ＴＤＦ）の安定性を、表１に示す。ＧＳ−７３４０は、ＴＤＦと比較して１０倍増加した抗ウイルス活性を示し、そして血漿安定性において２００倍の増加を示す。このより大きな血漿安定性は、経口投与後の、ＴＤＦより高いＧＳ−７３４０の循環レベルを生じると予想される。
【００９７】
（表１．インビトロ活性および安定性）
【００９８】
【表２】
2010174033.tif 000033
ＴＤＦの細胞内代謝から生じる、ＧＳ−７３４０と比較した相対的細胞内ＰＭＰＡを推定するために、プロドラッグおよびＰＭＰＡの両方を放射標識し、そして等モル濃度でインタクトなヒト全血へとスパイクした。１時間後、血漿、赤血球（ＲＢＣ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、そして放射測定検出を用いるＨＰＬＣによって分析した。この結果を、表２に示す。
【００９９】
１時間後、ＧＳ−７３４０は、ＴＤＦおよびＰＭＰＡと比較して、それぞれ１０×および３０×の、ＰＢＭＣにおけるＰＭＰＡの総細胞内濃度を生じる。１時間後の血漿において、放射能の８４％が、インタクトなＧＳ−７３４０に起因するが、一方、１時間ではＴＤＦは検出されない。血漿においてインタクトなＴＤＦが検出されないので、１時間でのＴＤＦとＧＳ−７３４０との間の１０×の差は、インビボで予期される最小限の差異である。ＰＢＭＣにおける３つ全ての化合物についてのＨＰＬＣクロマトグラムを、図１に示す。
【０１００】
（表２．ヒト血液におけるＰＭＰＡプロドラッグまたはＰＭＰＡの１時間のインキュベーション後の、血漿、ＰＢＭＣおよびＲＢＣにおけるＰＭＰＡ代謝産物）
【０１０１】
【表３】
2010174033.tif 000034
（図１．３７℃でＴＤＦ、ＧＳ−７３４０またはＰＭＰＡと１時間インキュベートしたヒト血液からのＰＢＭＣ抽出物の、ＨＰＬＣ／Ｃ−１４追跡）
【０１０２】
【表４】
2010174033.tif 000035
Ｍｅｔ．ＸおよびＭｅｔ  Ｙ（代謝産物ＸおよびＹ）を、表５に示す。小文字の「ｐ」は、リン酸化を表す。これらの結果を、ヒト血液において１時間後に得た。時間の増加に伴って、インビトロの差異は増加すると予想される。なぜなら、ＧＳ−７３４０の８４％は、１時間後でも血漿中で依然としてインタクトであるためである。インタクトなＧＳ−７３４０は、経口投与後の血漿中に存在するので、相対的な臨床的有効性は、インビトロで見られるＩＣ５０値に関連するはずである。
【０１０３】
以下の表３において、テノフォビル、ＴＤＦ、ＧＳ−７３４０、いくつかのヌクレオシドおよびプロテアーゼインヒビターネルフィニビル（ｎｅｌｆｉｎｉｖｉｒ）のＩＣ５０を列挙する。示されるように、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）およびＧＳ−７３４０は、他の全てのヌクレオチドまたはヌクレオシドよりも２〜３桁強力である。
【０１０４】
（表３．抗レトロウイルス化合物のインビトロでの抗ＨＩＶ−１活性）
【０１０５】
【表５】
2010174033.tif 000036
１．Ａ．Ｓ．ＭｕｌａｔｏおよびＪ．Ｍ．Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６，９１（１９９７）。
【０１０６】
本発明の分離したジアステレオマーのインビトロでの細胞培養抗ＨＩＶ−１活性およびＣＣ５０のさらなる研究を行い、そして結果を以下の表にする。
【０１０７】
（表４．ジアステレオマーの効果）
【０１０８】
【表６】
2010174033.tif 000037
アッセイ参照：Ａｒｉｍｉｌｌｉ，ＭＮら，（１９９７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ９−［２−（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｒｏｐｌｙｌ］ａｄｅｎｉｎｅ（ＰＭＰＡ）ｐｒｏｄｒｕｇｓ。Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ８（６）：５５７−５６４。
【０１０９】
「Ｐｈｅ−メチルエステル」は、メチルフェニルアラニルモノアミデート、テノフォビルのフェニルモノエステルである；「ｇｌｙメチルエステル」は、メチルグリシルモノアミデート、テノフォビルのフェニルモノエステルである。
【０１１０】
上記の各場合において、異性体Ａは、ＧＳ−７３４０（Ｓ）と同じ絶対立体化学を有すると考えられ、そして異性体Ｂは、ＧＳ−７３３９と同じ絶対立体化学を有すると考えられる。
【０１１１】
分離されたジアステレオマーのインビトロでの代謝および安定性を、ＰＬＣＥ、ＭＴ−２抽出物およびヒト血漿において決定した。以下に列挙した生物学的サンプル（８０μＬ）を、ネジ蓋付き遠心管に移し、３７℃で５分間インキュベートした。適切な緩衝液（２０μＬ）中に０．２ｍｇ／ｍＬの試験化合物を含む溶液を、その生物学的サンプルに添加し、そして混合した。この反応混合物（２０μＬ）を即座にサンプリングし、そしてＨＰＬＣ分析のための内部標準として０．０１５ｍｇ／ｍＬの２−ヒドロキシメチレンナフタレンを含む、６０μＬのメタノールと混合した。このサンプルを、０時間のサンプルとして用いた。次いで、特定の時点で、反応混合物（２０μＬ）をサンプリングし、そして内部標準を含む６０μＬのメタノールと混合した。このようにして得られた混合物を、１５，０００Ｇで５分間遠心分離し、そして上清を、以下に記載の条件下でのＨＰＬＣで分析した。
【０１１２】
評価した生物学的サンプルは、以下のとおりである：
（１）ＰＬＣＥ（ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）に２０倍希釈した、Ｓｉｇｍａ製のブタ肝臓カルボキシエステラーゼ（１６０ｕ／ｍｇタンパク質、２１ｍｇタンパク質／ｍＬ））。
（２）ＭＴ−２細胞抽出物（公開された手順［Ａ．Ｐｏｍｐｏｎ、Ｉ．Ｌｅｆｅｂｖｒｅ、Ｊ．−Ｌ．Ｉｍｂａｃｈ、Ｓ．Ｋａｈｎ、およびＤ．Ｆａｒｑｕｈａｒ、「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」、５：９１−９８（１９９４）］に従って（媒体として以下に記載のＨＥＰＥＳ緩衝液を使用することを除く）ＭＴ−２細胞から調製した）。
（３）ヒト血清（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製のプールした正常ヒト血漿）。
【０１１３】
本研究で使用した緩衝系は、以下のとおりである：
ＰＬＣＥの研究において、試験化合物をＰＢＳ中に溶解した。ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、Ｓｉｇｍａ）は、０．０１Ｍ  リン酸、０．００２７Ｍ  リン酸カリウム、および０．１３７Ｍ  塩化ナトリウムを含む。３７℃にてｐＨ７．４。
【０１１４】
ＭＴ−２細胞抽出物の研究において、試験化合物をＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した。ＨＥＰＥＳ緩衝液は、０．０１０Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．０５Ｍ  塩化カリウム、０．００５Ｍ
塩化マグネシウム、および０．００５Ｍ  ｄｌ−ジチオトレイトールを含む。３７℃にてｐＨ７．４。
【０１１５】
ヒト血漿の研究において、試験化合物をＴＢＳ中に溶解した。ＴＢＳ（トリス緩衝化生理食塩水（Ｓｉｇｍａ））は、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．００２７Ｍ
塩化カリウム、および０．１３８Ｍ  塩化ナトリウムを含む。３７℃にてｐＨ７．５。
【０１１６】
ＨＰＬＣ分析を、以下の条件下で行った。
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  Ｒｘ−Ｃ８、４．６×２５０ｍｍ、５μ
（ＭＡＣ−ＭＯＤ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．Ｃｈａｄｄｓ  Ｆ
ｏｒｄ，ＰＡ）
検出：２６０ｎｍのＵＶ
流速：１．０ｍＬ／分
実行時間：３０分
注入用量：２０μＬ
カラム温度：周囲温度
移動相Ａ：５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ６．０）／ＣＨ３ＣＮ＝９５／５  
（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ６．０）／ＣＨ３ＣＮ＝５０／５０
（ｖ／ｖ）
勾配泳動：０分      １００％  移動相Ａ
２５分    １００％  移動相Ｂ
３０分    １００％  移動相Ｂ
結果を以下の表５に示す（これはまた、表４からの選択されたＩＣ５０データを含む）。
【０１１７】
（表５．３７℃でのＰＭＰＡモノアミデートの異性体ＡおよびＢのインビトロ代謝）
【０１１８】
【表７】
2010174033.tif 000038
（実施例１０）
（ビーグル犬へのプロドラッグジアステレオマーの経口投与後の血漿曝露およびＰＢＭＣ曝露）
ＧＳ７３４０の薬物動態学を、１０ｍｇ当量／ｋｇ用量の経口投与後のイヌにおいて研究した。
【０１１９】
（処方物）プロドラックを、投薬前０．５時間以内に、５０ｍＭのクエン酸中の溶液として調製した。本研究で使用した全ての化合物は、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成された。以下のロットを使用した：
【０１２０】
【表８】
2010174033.tif 000039
（用量投与およびサンプル収集）本研究の生物相（ｉｎ−ｌｉｆｅ  ｐｈａｓｅ）は、「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ刊行物８６−２３）の推奨に従って行い、そしてこれは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。絶食させた雄性ビーグル犬（１０±２ｋｇ）を、本研究に使用した。各薬物を、経口栄養法によって単回用量として投与した（１．５〜２ｍｌ／ｋｇ）。用量は、１０ｍｇ当量ＰＭＰＡ／ｋｇであった。ＰＢＭＣについて、血液サンプルを、投薬後０時間（投薬前）、２時間、８時間および２４時間で収集した。血漿について、血液サンプルを、投薬後０時間（投薬前）、５分、１５分および３０分、ならびに１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間および２４時間で収集した。血液（１．０ｍｌ）を、２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって血漿用に即座に処理した。血漿サンプルを凍結させ、分析までに−７０℃で維持した。
【０１２１】
（末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製）  特定の時点で採取した全血（８ｍｌ）を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）と等しい割合で混合し、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上に重層し、そして４００×ｇで４０分間遠心分離した。ＰＢＭＣ層を取り出し、そしてＰＢＳで１回洗浄した。形成されたＰＢＭＣペレットを、０．５ｍｌのＰＢＳ中で再構成し、細胞を再懸濁し、血球計数器を使用してカウントし、分析までに−７０℃で維持した。平均一細胞容積を乗算した細胞数を、細胞内濃度の計算に使用した。２００フェムトリットル／細胞の報告された値を、休止ＰＢＭＣ容積として使用した（Ｂ．Ｌ．Ｒｏｂｉｎｓ、Ｒ．Ｖ．Ｓｒｉｎｉｖａｓ、Ｃ．Ｋｉｍ、Ｎ．Ｂｉｓｃｈｏｆｂｅｒｇｅｒ、およびＡ．Ｆｒｉｄｌａｎｄ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２、６１２（１９９８））。
【０１２２】
（血漿およびＰＢＭＣ中のＰＭＰＡおよびプロドラッグの測定）イヌ血漿サンプル中のＰＭＰＡの濃度を、ＰＭＰＡをクロロアセトアルデヒドで誘導体化して高い蛍光性のＮ１，Ｎ６−エテノアデニン誘導体を生成することによって決定した（Ｌ．Ｎａｅｓｅｎｓ、Ｊ．Ｂａｌｚａｒｉｎｉ、およびＥ．Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３８、４８０（１９９２））。手短には、血漿（１００μｌ）を、２００μｌのアセトニトリルと混合して、タンパク質を沈殿させた。次いで、サンプルを、室温にて減圧下で、乾燥するまでエバポレートした。乾燥されたサンプルを、２００μｌの誘導体化混液（１００ｍＭ  酢酸ナトリウム中の０．３４％  クロロアセトアルデヒド（ｐＨ４．５））中で再構成し、ボルテックスし、そして遠心分離した。次いで、上清を新しいネジ蓋付きチューブに移し、９５℃で４０分間インキュベートした。次いで、誘導体化されたサンプルを、乾燥するまでエバポレートし、ＨＰＬＣ分析のために１００μｌの水中で再構成した。
【０１２３】
細胞内ＰＭＰＡをＨＰＬＣによって測定し得る前に、ＰＢＭＣ抽出物中に存在する多量のアデニン関連リボヌクレオチドを、選択的な酸化によって除去しなければならなかった。本発明者らは、Ｔａｎａｋａら（Ｋ．Ｔａｎａｋａ、Ａ．Ｙｏｓｈｉｏｋａ、Ｓ．Ｔａｎａｋａ、およびＹ．Ｗａｔａｙａ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３９、３５（１９８４））の改変した手順を使用した。手短には、ＰＢＭＣサンプルを、メタノールと１：２で混合し、そして減圧下で乾燥するまでエバポレートした。乾燥されたサンプルを、血漿アッセイ中に記載のように誘導体化した。誘導体化されたサンプルを、２０μＬの１Ｍ  ラムノースおよび３０μＬの０．１Ｍ  過ヨウ素酸ナトリウムと混合し、そして３７℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、４０μＬの４Ｍ  メチルアミンおよび２０μＬの０．５Ｍ  イノシンを添加した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、サンプルを、減圧下でエバポレートして乾燥し、そしてＨＰＬＣ分析のために水で再構成した。
【０１２４】
インタクトなプロドラッグは、いずれのＰＢＭＣサンプル中にも検出されなかった。インタクトなプロドラッグを含む可能性のある血漿サンプルについては、ＰＭＰＡへのさらなる変換が誘導体化中に生じないことを確かめるために、実験を行った。プロドラッグ標準を、薬物を含まないの血漿に添加し、そして記載のように誘導体化した。これらの血漿サンプルのいずれにおいても検出可能なレベルのＰＭＰＡは存在せず、変換の推定％は、１％未満であった。
【０１２５】
ＨＰＬＣシステムは、ＡＳ３０００自動注入器およびＦ２０００蛍光検出器を備えるＰ４０００溶媒送達系から構成された（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）。カラムは、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２カラム（４．６×１５０ｍｍ）であった。使用した移動相は、以下であった：Ａ、５ｍＭ  テトラブチルアンモニウムブロミド（ＴＢＡＢｒ）を含む２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中の５％アセトニトリル（ｐＨ６．０）；Ｂ、５ｍＭ  ＴＢＡＢｒを含む２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中の６０％アセトニトリル（ｐＨ６．０）。流速は、２ｍｌ／分であり、そしてカラム温度を、カラムオーブンによって３５℃に維持した。勾配プロフィールは、ＰＭＰＡについては、１０分間の９０％  Ａ／１０％  Ｂ、そしてプロドラックについては、１０分間の６５％
Ａ／３５％  Ｂであった。検出は、２３６ｎｍでの励起および４２０ｎｍでの発光による、蛍光によるものであり、そして注入容量は、１０μｌであった。データを、実験データ獲得系（ＰｅａｋＰｒｏ、Ｂｅｃｋｍａｎ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）によって獲得および保存した。
【０１２６】
（薬物動態学計算）ＰＭＰＡおよびプロドラッグの曝露を、０時間〜２４時間の血漿またはＰＢＭＣにおける濃度曲線下の面積（ＡＵＣ）として表した。このＡＵＣ値は、台形法則を使用して計算した。
【０１２７】
（血漿濃度およびＰＢＭＣ濃度）本研究の結果を、図２および図３に示す。図２は、ＰＭＰＡプロドラッグの純粋なジアステレオアイソマーの経口投与後の、血漿曝露およびＰＢＭＣ曝露のＧＳ７３４０−２代謝概要の時間経過を示す。
【０１２８】
（図２．１０ｍｇ当量／ｋｇでのイヌへのＧＳ７３４０−２の経口投与後の血漿およびＰＢＭＣ中のＰＭＰＡおよびプロドラッグの濃度）
【０１２９】
【表９】
2010174033.tif 000040
図２の棒グラフは、ＰＭＰＡ  ｓ．ｃ．、ＴＤＦおよびアミデートエステルプロドラッグの投与後のイヌのＰＢＭＣ中および血漿中のテノフォビル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）についてのＡＵＣ（０〜２４時間）を示す。全てのアミデートプロドラッグは、ＰＢＭＣ曝露における増加を示した。例えば、ＧＳ７３４０は、ＰＭＰＡ  ｓ．ｃ．およびＴＤＦと比較して、ＰＢＭＣ曝露における約２１倍の増加を生じ；そして血漿曝露における、それぞれ、６．２５倍および１．２９倍の減少を生じた。
【０１３０】
（図３．イヌにおける１０ｍｇ当量／ｋｇの投与におけるＰＢＭＣ中および血漿中のテノフォビル曝露を示す）
イヌへの１０ｍｇ当量／ｋｇのＰＭＰＡプロドラッグの経口投薬後のＰＢＭＣ中および血漿中のＰＭＰＡについてのＡＵＣ（０〜２４時間）
【０１３１】
【表１０】
2010174033.tif 000041
これらのデータは、インビボにて、ＧＳ７３４０が、経口的に送達され得、ＰＭＰＡへの全身曝露を最小化し、そしてＨＩＶ複製を主に担う細胞中のＰＭＰＡの細胞内濃度を大いに増強することを説明する。
【０１３２】
（表６）
（イヌにおけるＰＭＰＡの経口プロドラッグからのＰＢＭＣ中および血漿中のＰＭＰＡ曝露）
【０１３３】
【表１１】
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（実施例１１）
（ＧＳ−７３４０の体内分布）
ＧＳ−７３４０の臨床前特徴付けの一部として、イヌにおけるその体内分布を測定した。ＧＳ−７３４０（イソプロピルアラニニル（ａｌａｎｉｎｙｌ）モノアミデート、テノフォビルのフェニルモノエステル）の組織分布を、ビーグル犬への経口投与後に試験した。２匹の雄の動物に、水性溶液（５０ｍＭ  クエン酸、ｐＨ２．２）中の１４Ｃ＝ＧＳ−７３４０（８．８５ｍｇ当量ＰＭＰＡ／ｋｇ、３３．２μＣｉ／ｋｇ；アデニンの８位の炭素が標識されている）を経口投薬した。血漿および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２４時間の期間にわたって得た。尿および糞便を、２４時間にわたってケージ収集した。投薬後２４時間で、動物を屠殺し、そして組織を分析のために取り出した。組織中の総放射活性を、酸化および液体シンチレーションカウンティングによって決定した。
【０１３４】
放射標識したＧＳ７３４０の単回経口投薬後２４時間でのＰＭＰＡの体内分布を、ＴＤＦ（ＧＳ−４３３１）を用いた先の研究からのデータと共に、表４に示す。ＴＤＦの場合、血漿中のプロドラッグ濃度は、アッセイ検出レベル未満であり、そして血漿中に観察された主要な種は、この親薬物である。リンパ組織、骨髄および骨格筋中のＰＭＰＡのレベルは、ＧＳ−７３４０の投与後に１０倍増加した。
【０１３５】
リンパ組織における蓄積は、ＰＢＭＣ分析から観察されたデータと一致する。なぜなら、これらの組織は、主にリンパ球から構成されるからである。同様に、骨髄における蓄積は、おそらく、この組織中のリンパ球の高い割合（７０％）に起因する。
【０１３６】
（表７．１０ｍｇ当量ＰＭＰＡ／ｋｇでの経口投薬後のイヌ（平均、Ｎ＝２）における放射標識したＧＳ−７３４０の排出および組織分布）
【０１３７】
【表１２】
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＊１５×１０６個の総細胞の典型的回収率および０．２ピコリットル／細胞平均ＰＢＭＣ容積を使用して計算した。ｎ．ｓ．＝サンプルなし、ｎ．ａ．＝適用せず、ｎ．ｄ．＝決定せず。