(57)【要約】      （修正有）【課題】妊婦における子癇前症、胎児における１８トリソミーおよび２１トリソミーを診断、モニタリング、または予測するための、および女性における妊娠を検出するための、方法およびキットの提供。【解決手段】１セットの遺伝子座由来の１以上のＲＮＡ種の量を母体血中において定量的に測定すること、および該ＲＮＡ種の量と標準コントロールとを比較することによって、妊婦における子癇前症、胎児における１８トリソミーおよび２１トリソミーを診断、モニタリング、または予測するための、および女性における妊娠を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊婦における子癇前症を診断、モニタリング、または予測するためのキットであって、該キットが、以下：
（ｉ）該妊婦から得られる生物学的サンプル中の１またはそれ以上のＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマー；ここで、該ＲＮＡ種は、ＰＡＰＰＡ２、ＩＧＦＢＰ３、ＡＢＰ１、ＦＮ１、ＳＬＣ２１Ａ２、ＫＩＡＡ０９９２、ＴＩＭＰ３、ＬＰＬ、ＩＮＨＢＡ、ＬＥＰ、ＡＤＡＭ１２、ＰＡＰＰＡ、およびＳＩＧＬＥＣ６からなる遺伝子座由来のＲＮＡから独立して選択され、そしてここで、該生物学的サンプルは、血液、生殖器官からの洗浄物、羊水、尿、唾液、または絨毛膜絨毛である；ならびに、
（ｉｉ）平均的な非子癇前症妊婦由来の対応のサンプル中の該ＲＮＡ種の量を示す標準コントロール
を含む、キット。
【請求項２】
前記ＲＮＡ種がＰＡＰＰＡ２、ＡＤＡＭ１２、ＦＮ１、ＩＮＨＢＡ、ＬＥＰ、またはＳＩＧＬＥＣ６由来であり、そして前記標準コントロールからの該ＲＮＡ種の量の増加が、子癇前症または子癇前症を発症する増加した危険性を示し、あるいはＰＡＰＰＡ由来であり、そして前記標準コントロールからの該ＲＮＡ種の量の減少が、子癇前症または子癇前症を発症する増加した危険性を示す、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記ＲＮＡ種の量の定量的な測定が、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法、またはプライマー伸長反応を使用することを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記ＲＴ−ＰＣＲの後の質量分析に使用する試薬をさらに含む、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記妊婦が妊娠第１、第２または第３期の間にある、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
前記血液が血漿または血清である、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記標準コントロールからのＲＮＡの量の増加が２倍を超えるか、または前記標準コントロールからのＲＮＡの量の減少が５０％を超える、請求項１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００５年３月１８日に出願された米国仮出願第６０／６６３，２９３号に対して優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
出生前診断は、絨毛膜絨毛サンプリング（ＣＶＳ）または羊水穿刺等の手技により胎児から単離された細胞を使用して、ルーチンに行われている。しかし、これらの従来法は、侵襲的であり、そして細心の取扱いにもかかわらず母体および胎児の両方に相当な危険性を与える（Tabor et al, Lancet 1:1287-1293, 1986）。
【０００３】
これらの侵襲的アプローチの代替法が、数種の胎児細胞が母体循環中に見られ得（Johansen et al, Prenat. Diagn. 15:921-931, 1995）、そしてより重要なことには、循環細
胞フリー胎児ＤＮＡが母体血漿および血清中において検出され得る（Lo et al, Lancet 350:485-487, 1997）という発見に従って、例えば、胎児異常を検出するために、出生前スクリーニングについて開発されてきた。母体血中の胎児ＤＮＡの量は、胎児細胞の単離および富化のための必要な工程とは対照的に、血漿または血清の複雑な処理無しに遺伝子分析のために十分であることが示された。胎児アカゲザルＤ（ＲｈＤ）遺伝子型決定（Lo et al, N. Engl. J. Med. 339:1734-1738, 1998）、胎児性別決定（Lo et al, Hum. Genet. 90:483-488, 1993）、およびいくつかの胎児障害の診断（Amicucci et al, Clin. Chem. 46:301-302, 2000; Saito et al, Lancet 356:1170, 2000；およびChiu et al, Lancet
360:998-1000, 2002）が、それ以来、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの技術を
使用して母体血中の胎児ＤＮＡを検出することによって達成されている。
【０００４】
さらに、母体血漿／血清中の胎児ＤＮＡの量的異常もまた、子癇前症（Lo et al, Clin. Chem. 45:184-188, 1999およびZhong et al, Am. J. Obstet. Gynecol. 184:414-419, 2001）、胎児２１トリソミー（Lo et al, Clin. Chem. 45:1747- 1751, 1999およびZhong
et al Prenat. Diagn. 20:795-798, 2000）、ならびに重症妊娠悪阻（Sekizawa et al, Clin. Chem. 47:2164-2165, 2001）において報告されている。出生前遺伝子分析のための母体血中の胎児核酸の検出はまた、米国特許第６，２５８，５４０号に開示されている。
【０００５】
胎児ＤＮＡを分析する際、研究者は、胎児特異的マーカーとして、男の胎児にのみ存在するＹ染色体マーカーをしばしば使用してきた。このアプローチは、この技術の適用を、男の胎児を妊娠している、５０％の妊婦に限定した。さらに、他の遺伝的多型の使用も、胎児ＤＮＡベースの分析の複雑性を増加させた。母体血漿中の胎児ＲＮＡの発見は、これらの限定を回避する可能性のある新規のアプローチを提供する（Poon et al., Clin. Chem. 46:1832-1834, 2000）。
【０００６】
より最近、米国特許出願第０９／８７６，００５号は、母体血中の胎児／胎盤ＲＮＡの検出に基づく非侵襲的技術を開示している。さらに、米国特許出願第１０／７５９，７８３号は、妊娠、ならびに子癇前症、胎児染色体異数性、および早期陣痛等の妊娠関連障害の検出のために使用され得る、特定の胎盤発現ｍＲＮＡマーカー（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット（human chorionic gonadotropinβsubunit）およびヒトコ
ルチコトロピン放出ホルモン（human corticotropin releasing hormone））を開示して
いる。胎盤起源の種々の他のＲＮＡ種もまた、母体血中において検出されている。例えば、Oudejans et al, Clin Chem. 2003, 49(9): 1445-1449, およびGo et al, Clin. Chem.
2004, 50(8):1413-1414を参照のこと。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、表１〜６に示される、さらなる胎児／胎盤由来ＲＮＡ種を開示し、これらは、母体血中に見られ、そして妊娠を検出するため、または胎児の遺伝子型を決定するため、または子癇前症および胎児染色体異数性（例えば、１８トリソミーおよび２１トリソミー）を診断、モニタリング、および予測するためのマーカーとして使用され得る。したがって、本発明は、非侵襲的出生前診断のためのさらなるツールならびに妊娠検出のための代替手段を提供する。
【０００８】
発明の簡単な要旨
第１局面において、本発明は、妊婦における子癇前症を診断、モニタリング、または予測するための方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：第１に、該妊婦から得られる生物学的サンプル中の１またはそれ以上のＲＮＡ種の量を定量的に測定する工程。該ＲＮＡ種は、ＩＧＦＢＰ３、ＡＢＰ１、ＦＮ１、ＳＬＣ２１Ａ２、ＫＩＡＡ０９９２、ＴＩＭＰ３、ＬＰＬ、ＩＮＨＢＡ、ＬＥＰ、ＡＤＡＭ１２、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＰＰＡ２、およびＳＩＧＬＥＣ６からなる遺伝子座由来のＲＮＡから独立して選択され、そして、該生物学的サンプルは、血液、生殖器官からの洗浄物、尿、唾液、羊水、または絨毛膜絨毛である。第２に、第１工程由来のＲＮＡ種の量と、平均的な非子癇前症妊婦由来の対応のサンプル中の該ＲＮＡ種の量を示す標準コントロールとを比較する工程。該標準コントロールからの該ＲＮＡ種の量の増加または減少は、子癇前症または子癇前症を発症する増加した危険性を示す。
【０００９】
ある実施形態において、前記ＲＮＡ種は、ＡＤＡＭ１２、ＰＡＰＰＡ２、ＦＮ１、ＩＮＨＢＡ、ＬＥＰ、またはＳＩＧＬＥＣ６由来であり、そして前記標準コントロールからの該ＲＮＡ種の量の増加は、子癇前症または子癇前症を発症する増加した危険性を示す。他の実施形態において、前記ＲＮＡ種は、ＰＡＰＰＡ由来であり、そして前記標準コントロールからの該ＲＮＡ種の量の減少は、子癇前症または子癇前症を発症する増加した危険性を示す。
【００１０】
ある実施形態において、第１工程は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用することを含む。必要に応じて、この第１工程は、ＲＴ−ＰＣＲの後に質量分析を使用することをさらに含む。他の実施形態において、第１工程は、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法を使用すること、またはプライマー伸長反応を使用することを含む。
【００１１】
ある実施形態において、検査される妊婦は、妊娠第１期(first trimester)の間にある
。他の実施形態において、妊婦は、妊娠第２期(second trimester)または第３期(third trimester)
の間にある。
【００１２】
ある実施形態において、血液は分画され、そして血漿分画が分析される。他の実施形態において、血液は分画され、そして血清分画が分析される。ある実施形態において、標準コントロールからのＲＮＡ量の増加は、２倍を超える。他の実施形態において、標準コントロールからのＲＮＡ量の減少は、５０％を超える。
【００１３】
妊婦における子癇前症を診断、モニタリング、または予測するためのキットもまた、提供される。このキットは、以下を含む：（ｉ）該妊婦から得られる生物学的サンプル中の１またはそれ以上のＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマー；ここで、該ＲＮＡ種は、ＩＧＦＢＰ３、ＡＢＰ１、ＦＮ１、ＳＬＣ２１Ａ２、ＫＩＡＡ０９９２、
ＴＩＭＰ３、ＬＰＬ、ＩＮＨＢＡ、ＬＥＰ、ＡＤＡＭ１２、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＰＰＡ２、およびＳＩＧＬＥＣ６からなる遺伝子座由来のＲＮＡから独立して選択され、そしてここで、該生物学的サンプルは、血液、生殖器官からの洗浄物、羊水、尿、唾液、または絨毛膜絨毛である；ならびに、（ｉｉ）平均的な非子癇前症妊婦由来の対応のサンプル中の該ＲＮＡ種の量を示す標準コントロール。
【００１４】
第２局面において、本発明は、妊婦における１８トリソミーを有する胎児の存在を検出するための方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：第１に、該妊婦から得られる生物学的サンプル中の遺伝子座ＲＰＬ１７由来のＲＮＡ種の量を定量的に測定する工程。該生物学的サンプルは、血液、生殖器官からの洗浄物、羊水、尿、唾液、または絨毛膜絨毛である。第２に、第１工程由来のＲＰＬ１７  ＲＮＡの量と、染色体が正常である胎児を有する平均的な妊婦由来の対応のサンプル中のＲＰＬ１７  ＲＮＡの量を示す標準コントロールとを比較する工程。該標準コントロールからの該ＲＮＡ種の量の逸脱は、１８トリソミーの胎児を有する増加した危険性を示す。
【００１５】
ある実施形態において、標準コントロールからのＲＰＬ１７  ＲＮＡの量の増加は、１８トリソミーの胎児を有する増加した危険性を示し；一方、他のケースにおいて、標準コントロールからのＲＰＬ１７  ＲＮＡの量の減少は、１８トリソミーの胎児を有する増加した危険性を示し得る。
【００１６】
ある実施形態において、第１工程は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用することを含む。必要に応じて、この第１工程は、ＲＴ−ＰＣＲ後に質量分析を使用することをさらに含む。他の実施形態において、第１工程は、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法を使用すること、またはプライマー伸長反応を使用することを含む。
【００１７】
ある実施形態において、検査される妊婦は、妊娠第１期の間にある。他の実施形態において、妊婦は、妊娠第２期または第３期の間にある。
【００１８】
ある実施形態において、血液は分画され、そして血漿分画が分析される。他の実施形態において、血液は分画され、そして血清分画が分析される。ある実施形態において、標準コントロールからのＲＮＡの量の増加は、２倍を超える。他の実施形態において、標準コントロールからのＲＮＡの量の減少は、５０％を超える。
【００１９】
妊婦における１８トリソミーを有する胎児の存在を検出するためのキットもまた、提供される。このキットは、以下を含む：（ｉ）遺伝子座ＲＰＬ１７由来のＲＮＡの量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマー；ここで、該生物学的サンプルは、血液、生殖器官からの洗浄物、羊水、尿、唾液、または絨毛膜絨毛である；ならびに、（ｉｉ）染色体が正常である胎児を有する平均的な妊婦由来の対応のサンプル中のＲＰＬ１７  ＲＮＡの量を示す標準コントロール。
【００２０】
第３局面において、本発明は、妊婦における２１トリソミーを有する胎児の存在を検出するための方法に関する。該方法は、以下の工程を含む：第１に、該妊婦から得られる生物学的サンプル中の１またはそれ以上のＲＮＡ種の量を定量的に測定する工程。該ＲＮＡ種は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＳＯＤ１、ＡＰＰ、ＢＴＧ３、ＡＴＰ５Ｊ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＢＡＣＥ２、ＤＳＣＲ５、ＩＴＳＮ１、ＰＬＡＣ４、ＡＴＰ５Ｏ、ＬＯＣ９０６２５、ＥＦＥＭＰ１、およびＴＦＲＣからなる遺伝子座由来のＲＮＡ種から独立して選択され、ここで、該生物学的サンプルは、血液、生殖器官からの洗浄物、尿、唾液、羊水、または絨毛膜絨毛である。第２に、第１工程由来のＲＮＡ種の量と、染色体が正常である胎児を有する平均的な妊婦由来の対応のサンプル中の該ＲＮＡ種の量を示す標準コント
ロールとを比較する工程。該標準コントロールからのＲＮＡ種の量の増加または減少は、２１トリソミーを有する胎児を有する増加した危険性を示す。
【００２１】
ある実施形態において、ＲＮＡ種は、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｏ、ＥＦＥＭＰ１、またはＴＦＲＣ由来であり、そして前記標準コントロールからのＲＮＡ種の量の増加は、２１トリソミーの胎児を有する増加した危険性を示す。
【００２２】
ある実施形態において、第１工程は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用することを含む。必要に応じて、この第１工程は、ＲＴ−ＰＣＲ後に質量分析を使用することをさらに含む。他の実施形態において、第１工程は、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法を使用すること、またはプライマー伸長反応を使用することを含む。
【００２３】
ある実施形態において、検査される妊婦は、妊娠第１期の間にある。他の実施形態において、妊婦は、妊娠第２期または第３期の間にある。
【００２４】
ある実施形態において、血液は分画され、そして血漿分画が分析される。他の実施形態において、血液は分画され、そして血清分画が分析される。ある実施形態において、標準コントロールからのＲＮＡ量の増加は、２倍を超える。他の実施形態において、標準コントロールからのＲＮＡ量の減少は、５０％を超える。
【００２５】
妊婦における２１トリソミーを有する胎児の存在を検出するためのキットもまた、提供される。このキットは、以下を含む：（ｉ）該妊婦から得られる生物学的サンプル中の１またはそれ以上のＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマー；ここで、該ＲＮＡ種は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＳＯＤ１、ＡＰＰ、ＢＴＧ３、ＡＴＰ５Ｊ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＢＡＣＥ２、ＤＳＣＲ５、ＩＴＳＮ１、ＰＬＡＣ４、ＡＴＰ５Ｏ、ＬＯＣ９０６２５、ＥＦＥＭＰ１、およびＴＦＲＣからなる遺伝子座由来のＲＮＡから独立して選択され、そしてここで、該生物学的サンプルは、血液、生殖器官からの洗浄物、羊水、尿、唾液、または絨毛膜絨毛である；ならびに、（ｉｉ）染色体が正常である胎児を有する平均的な妊婦由来の対応のサンプル中の該ＲＮＡ種の量を示す標準コントロール。
【００２６】
第４局面において、本発明は、女性における妊娠を検出するための方法に関する。該方法は、以下の工程を含む：第１に、該女性から得られる生物学的サンプル中の１またはそれ以上のＲＮＡ種の量を定量的に測定する工程。該ＲＮＡ種は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＳＯＤ１、ＡＴＰ５Ｏ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＤＳＣＲ５、およびＰＬＡＣ４からなる遺伝子座由来のＲＮＡ種から独立して選択され、ここで、該生物学的サンプルは、血液、生殖器官からの洗浄物、羊水、尿、唾液、または絨毛膜絨毛である。第２に、第１工程由来のＲＮＡ種の量と、平均的な非妊娠女性由来の対応のサンプル中の該ＲＮＡ種の量を示す標準コントロールとを比較する工程。該標準コントロールからの該ＲＮＡ種の量の増加または減少は、妊娠を示す。
【００２７】
ある実施形態において、前記ＲＮＡ種は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＴＰ５Ｏ、またはＰＬＡＣ４由来であり、そして前記標準コントロールからの該ＲＮＡ種の量の増加は、妊娠を示す。
【００２８】
ある実施形態において、第１工程は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用することを含む。必要に応じて、この第１工程は、ＲＴ−ＰＣＲ後に質量分析を使用することをさらに含む。他の実施形態において、第１工程は、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法を使用すること、またはプライマー伸長反応を使用することを含む。
【００２９】
ある実施形態において、検査される女性は、妊娠第１期の間にある。他の実施形態において、女性は、妊娠第２期または第３期の間にある。
【００３０】
ある実施形態において、血液は分画され、そして血漿分画が分析される。他の実施形態において、血液は分画され、そして血清分画が分析される。ある実施形態において、標準コントロールからのＲＮＡの量の増加は、２倍を超える。他の実施形態において、標準コントロールからのＲＮＡの量の減少は、５０％を超える。
【００３１】
女性における妊娠を検出するためのキットもまた、提供される。このキットは、以下を含む：（ｉ）該妊婦から得られる生物学的サンプル中の１またはそれ以上のＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマー；ここで、該ＲＮＡ種は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＳＯＤ１、ＡＴＰ５Ｏ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＤＳＣＲ５、およびＰＬＡＣ４からなる遺伝子座由来のＲＮＡから独立して選択され、そしてここで、該生物学的サンプルは、血液、生殖器官からの洗浄物、羊水、尿、唾液、または絨毛膜絨毛である；ならびに、（ｉｉ）平均的な非妊娠女性由来の対応のサンプル中の該ＲＮＡ種の量を示す標準コントロール。
【００３２】
定義
用語「遺伝子座由来のＲＮＡ種」は、本明細書中で使用される場合、ヒトゲノムにおける予め選択された位置の少なくとも一部に対応する配列を有するリボヌクレオチドのポリマーを指す。本願中における「ＲＮＡ種」は、その配列が非コード配列を含んでもよくまたは一部のオープンリーディングフレームのみを含んでもよいので、蛋白質産物をコードするかもしれないしまたはコードしないかもしれない。
【００３３】
用語「胎児の」、「胎盤由来の」および「胎盤発現された」は、本明細書中で使用される場合、妊婦由来の生物学的サンプル（例えば、血液）中において検出可能である特定のＲＮＡ種の起源を示す。換言すれば、胎児ＲＮＡ種は、胎児ＤＮＡ配列から転写されたものである。さらに、胎盤由来または胎盤発現されたＲＮＡ種は、胎盤において見られかつ胎児ＤＮＡ配列から転写されるものである。
【００３４】
用語「生殖器官からの洗浄物」は、本明細書中で使用される場合、妊婦または可能性のある妊娠について検査される女性の生殖器官のリンスまたは洗浄に続いて回収された液体または溶液を指す。
【００３５】
用語「子癇前症」は、本明細書中で使用される場合、妊娠の間に生じる状態を指し、これの主な症状は、浮腫（腫脹）および尿中の蛋白質の存在がしばしば伴う種々の形態の高血圧である。妊娠中毒症（toxemia of pregnancy）と呼ばれることもある、子癇前症（preeclampsia）は、発作を伴う子癇前症である、「子癇」と呼ばれるより重篤な障害に関する。これらの状態は、出産後間もなくまたは妊娠２０週より前に発症し得るが、通常、妊娠後期（２０週より後）の間に発症する。
【００３６】
用語「プライマー伸長反応」は、本明細書中で使用される場合、好適な条件下でテンプレート配列に少なくとも部分的に相補的である所定のポリヌクレオチド配列を伸長することによって、ヌクレオチドポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の作用により媒介されるいかなる重合プロセスをも指す。
【００３７】
用語「染色体異数性」は、本明細書中で使用される場合、染色体の数が通常のハプロイド数の正確な倍数でない染色体異常の状態を指し：しばしば、追加の染色体が存在するか、または１つの染色体が失われている。染色体異数性の最も一般的なケースは、１つのさ
らなる染色体が存在するトリソミーである。例えば、１８トリソミーは、第３の第１８染色体が細胞中に見られる染色体異常であり、一方、２１トリソミーに苦しむ患者の細胞中には、第３の第２１染色体が存在する。
【００３８】
異数性とは対照的に、「染色体が正常である」は、染色体の数がハプロイド数の正確な倍数であり（例えば、ハプロイドにおいて見られる染色体数の２倍）、かつ各々の染色体が同数で存在する（例えば男性の場合における性染色体を除く；ここで、２つの異なる性染色体、ＸおよびＹが、各々、１コピーで存在する）状態をいう。
【００３９】
用語「血液」は、本明細書中で使用される場合、妊婦または可能性のある妊娠について検査される女性由来の血液サンプルまたは調製物を指す。該用語は、母体または胎児起源の造血または任意の他のタイプの細胞または細胞レムナント（cellular remnants）（血
小板を含む）を種々の濃度で有するかまたは全く有さない血液の任意の分画または全血を包含する。「血液」の例としては、血漿および血清が挙げられる。細胞を本質的に含有しない血液サンプルはまた、「無細胞性（acellular）」と呼ばれ、ここで一般的に血小板
は存在しない。
【００４０】
用語「平均」は、子癇前症でないかまたは染色体が正常である胎児を妊娠している妊婦を示す文脈において使用される場合、子癇前症ではないかまたは染色体が正常である胎児を妊娠している女性の無作為に選択されるグループを代表する、特定の特徴（例えば、母体血液中において見られる胎児／胎盤由来ＲＮＡのレベル）を指す。この選択されるグループは、十分な数の女性を含むべきであり、その結果、遺伝子座から転写される胎児／胎盤由来ＲＮＡの平均レベルが、合理的な正確さで、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦の一般的な集団におけるＲＮＡのレベルを反映する。さらに、女性の選択されるグループは、子癇前症あるいは１８トリソミーおよび２１トリソミー等の胎児染色体異数性の表示についてその血液が検査される女性の妊娠期間に類似する妊娠期間を有するべきである。本発明を実施するために好ましい妊娠期間は、スクリーニングされる障害に依存して、異なり得る。例えば、妊婦は、好ましくは妊娠第２期の間に、子癇前症の危険性についてスクリーニングされ、一方、胎児染色体異数性は、好ましくは、可能な限り早くスクリーニングおよび診断される。さらに、検査のために好ましい妊娠期間はまた、検査に使用されるＲＮＡマーカーに依存し得、何故ならば、特定のマーカーは、他の段階においてよりも妊娠のある段階の間により容易に検出可能であるかもしれないためである。
【００４１】
用語「平均」は、同様に、健康な非妊娠女性の無作為に選択されるグループの血液中に見られる量を代表する特定のＲＮＡ種の量を指すために使用され得る。
【００４２】
ＩＧＦＢＰ３、ＡＢＰ１、ＦＮ１、ＳＬＣ２１Ａ２、ＫＩＡＡ０９９２、ＴＩＭＰ３、ＬＰＬ、ＩＮＨＢＡ、ＬＥＰ、ＳＩＧＬＥＣ６、ＲＰＬ１７、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＳＯＤ１、ＡＰＰ、ＢＴＧ３、ＡＴＰ５Ｊ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＢＡＣＥ２、ＤＳＣＲ５、ＩＴＳＮ１、ＰＬＡＣ４、ＬＯＣ９０６２５、ＡＴＰ５Ｏ、ＥＦＥＭＰ１、およびＴＦＲＣは、本明細書中で使用される場合、表２、４および６に提供されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号で記載される配列によって例示される、遺伝子または提案されるオープンリーディングフレーム（それらのバリアントおよびミュータントを含む）ならびにそれらのポリヌクレオチド転写物を指す。ある文脈において、これらの用語はまた、これらの遺伝子またはオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドを指すために使用され得る。
【００４３】
用語「標準コントロール」は、本明細書中で使用される場合、ＲＮＡ転写物（例えば、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｏ、またはＬＥＰ）の量を定量的に測定するための、本発明の方法の使用に好適なサンプルを指す。このようなサンプルは、平均
的な妊婦におけるこのようなＲＮＡの平均レベルを厳密に反映する、既知量の胎児／胎盤由来ＲＮＡ種を含有する。同様に、「標準コントロール」は、平均的な健康な非妊娠女性に由来し得る。
【００４４】
「標準コントロールからのｍＲＮＡの量の増加または減少」は、本明細書中で使用される場合、標準コントロールからの量の正または負の変化を指す。増加は、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、そして最も好ましくは少なくとも１０倍である。同様に、減少は、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％である。
【００４５】
「ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法」は、本明細書中で使用される場合、既知の配列のポリヌクレオチドプローブを用いて、好適なハイブリダイゼーション条件下で、ワトソン・クリック塩基対を形成するその能力に基づいて、ポリヌクレオチドの存在および／または量を検出するための方法を指す。このようなハイブリダイゼーション法の例としては、サザンブロット法およびノーザンブロット法が挙げられる。
【００４６】
「ＰＣＲプライマー」は、本明細書中で使用される場合、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｏ、またはＬＥＰ等の遺伝子座由来のＲＮＡ転写物由来のヌクレオチド配列を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用され得るオリゴヌクレオチドを指す。上記の遺伝子座由来のＲＮＡ配列の増幅のためのＰＣＲプライマーの少なくとも１つは、該遺伝子座に配列特異的であるべきである。
【００４７】
発明の詳細な説明
Ｉ．イントロダクション
本発明は、女性の血液中に存在するいくつかの胎児／胎盤由来ＲＮＡ種（即ち、表１〜６に記載の配列を有するもの）の１またはそれ以上のレベルを分析することによって、妊娠女性における子癇前症および胎児染色体異数性（例えば、１８トリソミーおよび２１トリソミー）を診断、モニタリング、または予測するため、ならびに女性における妊娠を検出するための方法およびキットを初めて提供する。
【００４８】
本発明によれば、母体血サンプル中の胎児／胎盤起源のこれらのＲＮＡ転写物の量が、好ましくは増幅手順（例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））後に、定量的に測定され得る。次いで、これらのＲＮＡ種の１またはそれ以上の量が、類似の妊娠期間にあるこれらの妊娠関連障害を有さない平均的な妊婦を代表する同一種のＲＮＡレベルを有する標準コントロールと比較される。ＲＮＡレベルの増加または減少は、前記障害の存在またはこれを発症する増加した危険性を示す。従って、本発明は、非侵襲的であってかつ性別および多型性に無関係である、子癇前症ならびに１８トリソミーおよび２１トリソミー等の胎児染色体異数性の診断のための新規のアプローチを提供する。
【００４９】
同一の方法論に依存して、女性の血液中のこれらの遺伝子座から転写されるＲＮＡ種の１またはそれ以上のレベルと、平均的な非妊娠女性から得られる確立されたコントロール値と比較することによって、本発明は、妊娠を検出するために使用され得る。
【００５０】
胎児／胎盤発現ＲＮＡは出生前診断およびモニタリングのためのマーカーとして使用されてきたが（例えば、米国特許出願第０９／８７６，００５および第１０／７５９，７８３号を参照のこと）、胎盤において発現されるＲＮＡの全ての種が母体血中で検出可能というわけではないので、この目的のための好適なマーカーとしての任意の特定のＲＮＡ種の同定は、予測不可能な性質の知見である。例えば、本発明者は、母体血中において特定の胎児／胎盤由来ＲＮＡ種を検出することが出来なかった。検出不可能であるいくつかの例示的な種としては、以下が挙げられる：ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキトノン）フ
ラビン蛋白質３，１０ｋＤａ（NADH dehydrogenase (ubiquitnone) flavoprotein 3, 10 kDa）（ＮＤＵＦＶ３）；アルファフェトプロテイン（alpha-fetoprotein）（ＡＦＰ）；ヘモグロビン，イプシロン１（hemoglobin, epsilon 1）（ＨＢＥ１）；およびホスホリ
パーゼＡ２，グループＩＩＡ（血小板，滑液）（phospholipase A2, group IIA (platelets, synovila fluid)）（ＰＬＡ２Ｇ２Ａ）。
【００５１】
ＩＩ．血液サンプルの調製
Ａ．血液サンプルの取得
本発明を実施する第１工程は、本発明の方法を使用する検査に好適な妊娠期間にある妊婦から、あるいは可能性のある妊娠について検査される女性から、生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）を得ることである。好適な妊娠期間は、上述のように、検査される障害および場合によっては使用されるＲＮＡマーカーに依存して変化し得る。女性からの血液の回収は、病院または診療所が一般的に従う標準プロトコルに従って行われる。例えば３〜２０ｍｌの好適な量の末梢血が回収され、そして次の調製より前に標準手順に従って場合によっては貯蔵される。
【００５２】
Ｂ．血漿または血清サンプルの調製
女性の血液の血清または血漿は、本発明に好適であり、そして周知の方法によって得られ得る。例えば、女性の血液は、血液凝固を防止するために、ＥＤＴＡを含有するチューブ中またはＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）等の専用の市販製品中に配置され得、次いで、遠心分離により全血から血漿が得られる。他方では、血清は、血液凝固に続いての遠心分離により得られる。遠心分離は、典型的に、好適な速度（例えば、１，５００〜３，０００×ｇ）で、冷却環境において（例えば、約４〜１０℃の温度で）、行われる。血漿または血清は、ＲＮＡ抽出のための新しいチューブへ移される前に、さらなる遠心分離工程へ供されてもよい。本発明の特定の適用において、血漿または血清が好ましいサンプルタイプであるかもしれない。本発明の他の適用において、全血が好ましいかもしれない。なお別の適応において、血液の他の分画が好ましいかもしれない。
【００５３】
ＩＩＩ．女性の血液中のＲＮＡの量の定量的測定
Ａ．ＲＮＡの抽出
生物学的サンプルからＲＮＡを抽出するための多数の方法が存在する。ＲＮＡ調製の一般的な方法（例えば、SambrookおよびRussell, Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3d ed., 2001によって記載される）に従い得；種々の市販の試薬またはキット、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，バレンシア，ＣＡ）、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）、およびＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ（登録商標）シリーズ９６００ＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ，マディソン，ＷＩ）もまた、女性からの血液サンプルからＲＮＡを得るために使用され得る。これらの方法の２以上の組合せもまた使用され得る。
【００５４】
ある適用においては、混入ＤＮＡの全てまたはほとんどがＲＮＡ調製物から排除されることが好ましい。従って、サンプルの注意深い取り扱い、ＤＮアーゼでの完全な処理、ならびに増幅工程および定量工程における適切な陰性コントロールが、使用されるべきである。
【００５５】
Ｂ．ＲＮＡレベルのＰＣＲに基づく定量的測定
いったんＲＮＡが女性の血液サンプルから抽出されると、問題の遺伝子座（例えば、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｏ、またはＬＥＰ）由来のＲＮＡの量が定量され得る。ＲＮＡレベルを測定するための好ましい方法は、増幅に基づく方法（例えば
、ＰＣＲによる）である。
【００５６】
増幅工程の前に、問題のＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）が合成されなければならない。これは、逆転写（これは、別個の工程として行われ得る）によって、あるいは均一な（homogeneous）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡを増幅するため
のポリメラーゼ連鎖反応の変形において、達成される。リボ核酸のＰＣＲ増幅に好適な方法は、Romero and Rotbart, Diagnostic Molecular Biology: Principles and Applications pp.401-406；Persing et al., eds., Mayo Foundation, Rochester, MN, 1993；Egger et al., J. Clin. Microbiol. 33:1442-1447, 1995；および米国特許第5,075,212号に
おいて記載されている。
【００５７】
ＰＣＲの一般的な方法は、当該分野において周知であり、従って本明細書において詳細には記載しない。ＰＣＲ法、プロトコル、およびプライマー設計における原理のレビューについては、例えば、Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N. Y., 1990を参照のこと。ＰＣＲ試薬およびプロトコル
はまた、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ等の業者から入手可能である。
【００５８】
ＰＣＲは、もっとも通常には、熱安定性酵素を用いての自動プロセスとして行われる。このプロセスにおいて、反応混合物の温度は、典型的に、自動的に変性領域、プライマーアニーリング領域、および伸長反応領域を経由して循環される。あるプロトコルにおいて、アニーリング領域および伸長反応領域は融合される。この目的のために特別に適応された機器が市販されている。
【００５９】
標的ＲＮＡのＰＣＲ増幅が、本発明の実施において典型的に使用される。しかし、当業者は、母体血サンプル中のこれらのＲＮＡ種の増幅は任意の公知の方法［例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（transcription-mediated amplification）、および自己配列複製（self-sustained sequence replication）または核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence-based amplification）（ＮＡＳＢＡ）、これらの各々は十分な増幅を提供する］によって達成され得ることを認識する。より最近開発された分岐ＤＮＡ技術（branched-DNA technology）もまた、母体血中のＲＮＡマーカーの量を定量的に測定
するために使用され得る。臨床サンプル中の核酸配列の直接定量のための分岐ＤＮＡシグナル増幅のレビューについては、Nolte, Adv. Clin. Chem. 33:201-235, 1998を参照のこと。
【００６０】
Ｃ．他の定量法
問題のＲＮＡ種はまた、当業者に周知の他の標準技術を使用して検出され得る。典型的に増幅工程が検出工程に先行するが、増幅は本発明の方法において必須とされない。例えば、問題のＲＮＡ種は、増幅工程が先行するか増幅工程が後に続くかどうかに関わらず、サイズ分画（size fractionation）（例えば、ゲル電気泳動）によって同定され得る。周知の技術（例えば、Sambrook and Russell（前述）を参照のこと）に従ってアガロースまたはポリアクリルアミドゲルにおいてサンプルを泳動しそして臭化エチジウムで標識した後、標準コントロールと同一サイズのバンドの存在は、標的ＲＮＡの存在の指標であり、次いで、その量が、バンドの強度に基づいてコントロールと比較され得る。あるいは、遺伝子座（例えば、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｏ、またはＬＥＰ）から転写されるＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブが使用され得、このようなＲＮＡ種の存在を検出し、そして該プローブによって与えられるシグナルの強度に基づいて、標準コントロールと比較してのＲＮＡ分子の量を示す。
【００６１】
配列特異的プローブハイブリダイゼーションは、他の核酸種を含む特定の核酸を検出す
る周知の方法である。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、プローブは、実質的に相補的な配列にのみ特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、種々の量の配列ミスマッチを許容するために緩和され得る。
【００６２】
液相、固相、または混合相（mixed phase）ハイブリダイゼーションアッセイを含むが
これらに限定されない、当該分野において周知の多数のハイブリダイゼーションフォーマット。以下の文献は、種々のハイブリダイゼーションアッセイフォーマットの概説を提供する：Singer et al., Biotechniques 4:230, 1986；Haase et al., Methods in Virology, pp. 189-226, 1984；Wilkinson, In situ Hybridization, Wilkinson ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford；およびHames and Higgins eds., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, 1987。
【００６３】
ハイブリダイゼーション複合体は、周知の技術に従って検出され、そして該検出は、本発明の重要な局面ではない。標的核酸（即ち、問題のＲＮＡ種または増幅されたＤＮＡ）へ特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブは、ハイブリダイズされた核酸の存在を検出するために典型的に使用されるいくつかの方法のいずれによっても標識され得る。検出の１つの一般的な方法は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ等で標識されたプローブを使用するオートラジオグラフィーの使用である。放射性同位体の選択は、選択される同位体の合成の容易さ、安定性、および半減期に起因する研究の好みに依存する。他の標識としては、フルオロフォア（fluorophores）、化学発光剤、および酵素で標識されたアンチリガンド（antiligands）または抗体へ結合する、化合物（例えば、ビオチ
ンおよびジゴキシゲニン）が挙げられる。あるいは、プローブは、フルオロフォア、化学発光剤または酵素等の標識と直接結合され得る。標識の選択は、要求される感度、プローブとの結合の容易さ、安定性要件、および利用可能な器機類に依存する。
【００６４】
本発明を実施するに必要なプローブおよびプライマーは、周知の技術を使用して合成および標識され得る。プローブおよびプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168, 1984に記載されるよ
うな自動合成器を使用して、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts., 22:1859-1862, 1981によって最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、ネイティブ（native）アクリルアミドゲル電気泳動またはPearson and Regnier, J. Chrom., 255:137-149, 1983に記載されるよう
なアニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のいずれかによる。
【００６５】
ＩＶ．標準コントロールの確立
標準コントロールを確立するために、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦のグループを先ず選択すべきである。これらの女性は、本発明の方法を使用しての子癇前症および胎児染色体異数性（１８トリソミーまたは２１トリソミーを含む）等のコンディションのスクリーニングについて好適な妊娠期間内にある、同様の妊娠期間のものであるべきである。同様に、標準コントロールは、健康な非妊娠女性のグループからのサンプルを使用して確立される。
【００６６】
選択された妊婦および彼女らが妊娠している胎児の健康状態は、妊婦の血圧をモニターすること、陣痛の開始を記録すること、ならびにＣＶＳおよび羊水穿刺を使用して胎児遺伝子分析を行うことを含むがこれらに限定されない、十分に確立されたルーチンに使用される方法によって確認されるべきである。
【００６７】
さらに、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦または健康な非妊娠女性の選択されたグループは、合理的な規模のものでなければならず、その結果、該グループから算出される
本願において名前を挙げた遺伝子座由来のＲＮＡの平均量が、健康な胎児を妊娠している健康な女性または健康な非妊婦女性の一般的な集団の中の通常または平均量を代表すると合理的にみなされ得る。好ましくは、選択されたグループは少なくとも１０人の女性を含む。
【００６８】
選択されるグループの各女性において見られた個々の値に基づく胎児／胎盤由来ＲＮＡの量について、いったん平均値が確立されると、この値は、該ＲＮＡ種の標準と考えられる。従って、類似量の同一種のＲＮＡを含有する任意の血液サンプルが、標準コントロールとして使用され得る。同一種の確立された平均の濃度で問題のＲＮＡ種を含有する溶液もまた、人工的に作製され得、そして標準コントロールとして役立ち得る。
【００６９】
以下の実施例は、例示のためのみに提供され、限定のためではない。当業者は、変化または修飾され本質的に同様の結果を生じ得る種々の重要でないパラメータを容易に認識する。
【実施例】
【００７０】
実施例
以下の実施例は、例示のためのみに提供され、限定のためではない。当業者は、変化または修飾され本質的に同一または同様の結果を生じ得る種々の重要でないパラメータを容易に認識する。
【００７１】
実施例１：胎盤組織における発現を伴う第２１または第１８染色体上の遺伝子座
方法
被験者
胎盤組織および血液サンプルを、香港のプリンス・オブ・ウェールズ病院（the Prince
of Wales Hospital, Hong Kong）にある産婦人科に通院した、第１期の間にある妊婦か
らインフォームドコンセントを得て回収した。研究は、臨床研究倫理委員会（the Clinical Research Ethics Committee）によって承認された。
【００７２】
マイクロアレイ分析のためのサンプル調製
５つの第１期胎盤組織サンプルを、治療終了（therapeutic terminations）の前に絨毛膜絨毛サンプリング（chorionic villlus sampling）（ＣＶＳ）により妊婦から得た。引き続いて、全てのケースの胎児核型は正常であると確認された。胎盤組織サンプルを、回収直後にＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），オースティン，ＴＸ）において保存し、そしてＲＮＡ抽出まで−８０℃で維持した。６ｍｌの母体末梢血を、組織回収時と同時に回収し、そしてＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）において保存した。胎盤組織からのトータルＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）で抽出しそしてＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）で精製した。末梢血からのトータルＲＮＡを、ＤＮアーゼ処理（ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼセット，Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）を含む、製造業者の指示書に従ってＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）によって抽出した。
【００７３】
高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる遺伝子発現分析
各サンプルについて、１０μｇの抽出されたＲＮＡを標識し、そして製造業者の指示書に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３ＡおよびＵ１３３Ｂアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、各アレイを洗浄しそしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）において染色し
た。前記チップをＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）でスキャンし、そしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して分析した。
【００７４】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
ワンステップリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を、胎盤組織および母体血サンプル中のＲＮＡ転写物の定量的測定のために使用した。ハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の検出のためのＱＲＴ−ＰＣＲアッセイは、以前に記載されている（Ｎｇら２００２）。他の研究した遺伝子のプライマー（Ｐｒｏｌｉｇｏ，シンガポール）および蛍光プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ，ＵＳＡ）の配列を、表１Ａに示す。胎盤および母体バフィーコート分析については、相対的定量（relative quantification）を使用し、ここで、研究した転写物レベルは、対応のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベ
ルに対して標準化した。
【００７５】
ＱＲＴ−ＰＣＲ反応を、２５μｌの反応体積において製造業者の指示書（ＥＺ  ｒＴｔｈ  ＲＮＡ  ＰＣＲ試薬セット，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って設定した。ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、組み合わされたサーマルサイクラーおよび蛍光検出器（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行った。全ての転写物について、ＰＣＲプライマーおよび蛍光プローブを、それぞれ、３００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で使用した。ＱＲＴ−ＰＣＲを行う前に、胎盤組織ＲＮＡ抽出物中の混入ＤＮＡを、製造業者の推奨に従って、ＤＮアーゼＩ消化（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）によって除去した。１７ｎｇの抽出した胎盤ＲＮＡを増幅のために使用した。複数のネガティブウォーターブランクを、各分析に含めた。
【００７６】
使用したサーマルプロファイルは、以下の通りであった：含まれたウラシルＮ−グリコシラーゼを作用させるために反応を５０℃で２分間開始させ、続いて６０℃で３０分間逆転写させた。９５℃で５分間変性させた後、９２℃で１５秒間の変性および５８℃で１分間のアニーリング／伸長を使用して、４０サイクルのＰＣＲを行った。
【００７７】
母体血中の胎盤発現転写物の定量的評価
正常な妊婦由来の母体全血サンプルを、ＥＤＴＡチューブへ回収した。４℃で１０分間１，６００ｇで血液サンプルを遠心分離した後、バフィーコートおよび血漿分画を、注意深く別個のポリプロピレンチューブへ移した。血漿サンプルを、４℃で１０分間１６，０００ｇで再遠心分離した。上澄みを新しいポリプロピレンチューブへ回収した。収穫した母体血漿からのＲＮＡ抽出を、前述（Ｎｇら，２００２）のように行った。同様に、ＲＮＡを０．３ｍＬのバフィーコート分画から抽出した。
【００７８】
研究した転写物についてのＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、上述と同一条件で行った。５μｌの抽出された血漿ＲＮＡまたは１０ｎｇのバフィーコートＲＮＡを、各ＱＲＴ−ＰＣＲ反応のために使用した。絶対的定量（absolute quantification）を、血漿サンプル中の
転写物濃度を測定するために使用した。１×１０７コピーから１×１０１コピーまでの範囲に及ぶ濃度での、アンプリコンの全長をスパンする高性能液体クロマトグラフィー精製一本鎖合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｌｉｇｏ，シンガポール）の連続希釈によって、検量線を作製した。血漿中の転写物の絶対濃度を、コピー／血漿ｍｌと表した。合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を表１Ｂに示す。バフィーコート分画についての結果は、ＧＡＰＤＨへの標準化に基づく相対的定量によって表した。
【００７９】
統計解析
統計解析をＳｉｇｍａ  Ｓｔａｔ  ２．０３  ソフトウエア（ＳＰＳＳ）を使用して行
った。
【００８０】
結果
高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる胎盤発現遺伝子の同定
５個の第１期ＣＶＳサンプル遺伝子発現プロフィールを、各個々の組織サンプルの独立したマイクロアレイ分析によって得た。ヒトゲノムＵ１３３ＡおよびＵ１３３Ｂアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって検出可能な約２２，０００の十分に特徴付けられた転写物のうち、合計７２２６個の遺伝子転写物がＣＶＳサンプル中において発現された。本発明者は、以前、通常の個体の血漿中の循環ＤＮＡは造血細胞から主に誘導されることを報告した（Ｌｕｉら，２００２）。したがって、本発明者は、母体血中のバックグラウンド母体核酸の大半も造血コンパートメント（compartment）に由来すると仮定する。本発明
者は母体血漿中の循環ＲＮＡ分子の中で胎盤発現転写物を同定することを目的とするので、本発明者は、さらに、母体全血の遺伝子発現プロフィールを得、そしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用してこれらのプロフィールを対応の胎盤組織のそれと比較した。妊娠初期にある胎盤発現転写物を、それらの発現レベルが５個全てのセットの比較において対応の全血サンプルと比較した場合にＣＶＳ組織において「増加された」転写物を選択することによって、同定した。この手順後、胎盤組織のそれと類似する程度かまたはそれよりも高い程度に母体血液細胞中で発現された転写物を排除した。このように、この分析により、妊娠第１期において相対的胎盤特異性を有する１２４５個の転写物のパネルが同定された。
【００８１】
胎盤組織における発現を伴う第２１または第１８染色体上のコードされる遺伝子座の選択
上述のアプローチによって同定された相対的胎盤特異性（relative placental specificity）を有する転写物のパネルの中で、本発明者は、さらに、第２１染色体上に位置する遺伝子から誘導された転写物を探究した。第２１染色体上に局在される１３個の遺伝子を同定し、そして表２Ａに要約する。この遺伝子選択戦略は、２１トリソミーを有する胎児のゲノムに追加の第２１染色体が存在することの結果として変化された遺伝子量が、第２１染色体上に局在される遺伝子の異常な発現へ導き得るという推論に基づく。胎盤は母体血漿中の循環胎児ＲＮＡの重要な供給源であることを本発明者は以前示しているので（Ｎｇら，２００３）、２１トリソミーの結果としての標的遺伝子の異常な胎盤組織発現は、母体血中の該転写物の異常な濃度によって反映され得る。したがって、循環胎児／胎盤由来ＲＮＡ分析による胎児２１トリソミーの非侵襲的出生前検出のための１つのアプローチは、正常な胎児を妊娠している女性中のそれと比較した場合の、２１トリソミーによって冒された胎児を有する女性中のそれらの選択された転写物の異常な血液濃度の検出に基づく。
【００８２】
同様の戦略を、１８トリソミーの非侵襲的出生前評価のために潜在的に有用な遺伝子マーカーの同定のために適用した。ＣＶＳサンプルおよび母体全血サンプルの両方の遺伝子発現プロフィールを、ヒトゲノムＵ１３３Ｂアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって分析した。母体血に対してＣＶＳにおいて優先的に発現する転写物のパネルを、上述と同一のスクリーニング基準を使用して同定した。第１８染色体上に局在される胎盤発現遺伝子を、相対的胎盤特異性を有する転写物の前記パネルから選択した。該パネル内で、ＣＶＳにおいて最大発現レベルを有する転写物を選択し、そして表２Ｂに示した。
【００８３】
リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲによるマイクロアレイ結果の検証
上述のマイクロアレイに基づく戦略から同定したマーカーの胎盤組織発現を、ワンステップリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲによって検証した。１０個の正常妊娠および３個の２１トリソミー妊娠由来の第１期ＣＶＳ組織を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡならびに表２Ａおよび
２Ｂに列挙される前記選択された転写物について測定した。研究した遺伝子の相対的ｍＲＮＡレベルを、以下の式を使用して対応のＧＡＰＤＨレベルに対して標準化した：
ΔＣｔＸ＝ＣｔＧＡＰＤＨ−ＣｔＸ
式中、Ｃｔは閾値サイクル（threshold cycle）を示し、これは、サンプルのＱＲＴ−Ｐ
ＣＲ反応の集積蛍光が所定の閾値強度に達するために必要とされるＰＣＲサイクル数である。ΔＣｔＸは、研究した転写物Ｘの標準化されたｍＲＮＡレベルであり；ＣｔＧＡＰＤＨは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのＣｔ値であり；そしてＣｔＸは、転写物ＸのＣｔ値である。Ｃｔ値はテンプレートｍＲＮＡの量の対数に反比例するので、より高いΔＣｔＸ値は、より高いｍＲＮＡレベルを示す。研究した転写物は、正常ならびに２１トリソミー胎児を含む妊娠から回収したＣＶＳ組織において発現されかつ検出可能であると確認された。
【００８４】
ＡＤＡＭＴＳ１  ｍＲＮＡ（図１Ａ）（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定，Ｐ＝０．０３６）およびＡＰＰ  ｍＲＮＡ（図１Ｂ）（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定，Ｐ＝０．０３６）の胎盤組織発現の統計的に有意なアップレギュレーションが、正常妊娠と比較して、２１トリソミー妊娠から回収したＣＶＳ組織において見られた。トリソミック染色体上に局在される遺伝子は、胎盤組織発現の量的異常と関連し、そしてしたがって、２１トリソミーの出生前評価のための潜在的に有用なマーカーであるという本発明者の仮定が、これらのデータによって確認された。
【００８５】
母体血中の胎盤発現転写物の検出能
前記転写物のいくつかの検出能（detectability）を、妊娠第３期の女性から回収した
バフィーコートおよび血漿サンプルにおいて評価した。１２個の研究した転写物の全てが、バフィーコート（図２）および血漿サンプル（データは示さず）の両方において検出可能であった。転写物の妊娠特異性を検査するために、分娩前および分娩後２４時間の１０人の妊婦からの血漿サンプルも回収した。図３Ａおよび３Ｂは、Ｃ０Ｌ６Ａ１およびＣＯＬ６Ａ２  ｍＲＮＡの両方が、分娩後に母体血漿から迅速に除去されたことを示し（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、両ケースについてＰ＜０．０５）、一方、対応の血漿ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルは変化しないままであった（データは示さず、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定，Ｐ＝１．０００）。母体血漿由来のＣＯＬ６Ａ１およびＣＯＬ６Ａ２  ｍＲＮＡの分娩後クリアランスは、胎盤がこれらの転写物の主な組織供給源であることを示唆している。
【００８６】
結論
マイクロアレイに基づくアプローチを使用して、第１期胎盤組織において発現される転写物を同定した。２１トリソミーの出生前評価に有用である１３個の転写物を、第２１染色体上に局在される胎盤発現遺伝子の選択に基づいて同定した。同様に、１８トリソミーの出生前評価に有用であるＲＮＡマーカーを、第１８染色体上でコードされる胎盤転写物の選択により同定した。
【００８７】
正常胎盤組織および異数性胎盤組織の両方における前記研究した転写物の検出能を、リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲによって確認した。例として、ＡＤＡＭＴＳ１およびＡＰＰ  ｍＲＮＡは、２１トリソミー妊娠の胎盤組織において異常発現されることが示された。さらに、全ての標的遺伝子のｍＲＮＡが、母体バフィーコートおよび血漿において検出可能であると判った。これらのデータによって、本発明者のマーカー選択戦略が、２１トリソミー胎盤組織において異常発現されかつ母体循環において検出可能であるＲＮＡ種の同定を可能にすることが確認され、これは、胎児２１トリソミーの非侵襲的出生前診断のための戦略の開発を促進する。例えば、２１トリソミーの非侵襲的出生前評価は、正常妊娠のそれと比較した場合の、２１トリソミー妊娠の母体血液におけるＲＮＡマーカーの異常な濃度の検出に基づき得る。あるいは、非侵襲的出生前診断は、母体血漿中の前記転写物の１以上の異なる分子形態の相対的定量比較に基づいて行われ得る。同様の適用がまた、母体血漿中のＲＰＬ１７  ｍＲＮＡの検出を伴って、１８トリソミーに適用され得る。
【００８８】
実施例２：正常妊娠のそれと比較して、２１トリソミー妊娠の胎盤において増加した発現を伴う遺伝子
方法
被験者
この研究における全ての胎盤組織および血液サンプルを、香港のプリンス・オブ・ウェールズ病院にある産婦人科に通院した、妊娠第１期にある女性からインフォームドコンセントを得て回収した。研究は、臨床研究倫理委員会によって承認された。
【００８９】
研究の第１の部分において、正常妊娠および２１トリソミー妊娠の両方の胎盤組織遺伝子発現プロフィールを、オリゴヌクレオチドマイクロアレイによって同定した。第１期胎盤組織サンプルを、絨毛膜絨毛サンプリング（ＣＶＳ）によって妊婦から得た。正常妊娠を伴う５人の女性（妊娠期間範囲：１０〜１２週）および２１トリソミー胎児を妊娠している３人の妊婦（妊娠期間範囲：１２〜１３週）を採用し、引き続いてそれぞれの胎児核型を確認した。研究の第２の部分において、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ実験によって作成された遺伝子発現プロフィールを、ＱＲＴ−ＰＣＲを使用して確認した。３人の２１トリソミー妊婦（妊娠期間：１３〜１４週）および５人の正常な妊婦（妊娠期間：９１３週）由来のＣＶＳを、研究のこの部分のために採用した。
【００９０】
マイクロアレイ分析のためのサンプル調製
ＣＶＳサンプルを、回収直後にＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），オースティン，ＴＸ）に保存し、そしてＲＮＡ抽出まで−８０℃で維持した。正常妊娠を伴う５人の妊婦について、６ｍｌの母体末梢血を、組織回収時と同時に回収し、そしてＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）において保存した。胎盤組織からのトータルＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）で抽出しそしてＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）で精製した。末梢血からのトータルＲＮＡを、ＤＮアーゼ処理（ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼセット，Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）を含む、製造業者の指示書に従ってＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）によって抽出した。
【００９１】
高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる遺伝子発現分析
各サンプルについて、１０μｇの抽出されたＲＮＡを標識し、そして製造業者の指示書に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３ＡおよびＵ１３３Ｂアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、各アレイを洗浄しそしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）において染色した。前記チップをＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）でスキャンし、そしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して分析した。
【００９２】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
ワンステップリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲを、胎盤組織および母体血漿サンプル中のｍＲＮＡ転写物の定量的測定のために使用した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの検出のためのＱＲＴ−ＰＣＲアッセイは、以前に記載されている（Ｎｇら２００２）。他の研究した遺伝子のプライマー配列（Ｐｒｏｌｉｇｏ，シンガポール）およびＴａｑＭａｎマイナーグルーブ結合（minor-groove-binding）（ＭＧＢ）蛍光プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ，ＵＳＡ）を、表３に示す。ｍＲＮＡ量は相対的定量を使用して表現し、ここで、研究した転写物レベルは、対応のＧＡＰＤ
Ｈ  ｍＲＮＡレベルに対して標準化した。
【００９３】
ＱＲＴ−ＰＣＲ反応を、２５μｌの反応体積において製造業者の指示書（ＥＺ  ｒＴｔｈ  ＲＮＡ  ＰＣＲ試薬セット，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って設定した。ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、組み合わされたサーマルサイクラーおよび蛍光検出器（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行った。全ての転写物について、ＰＣＲプライマーおよび蛍光プローブを、それぞれ、３００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で使用した。ＱＲＴ−ＰＣＲを行う前に、抽出した胎盤組織ＲＮＡ中の混入ＤＮＡを、製造業者の推奨に従って、ＤＮアーゼＩ消化（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）によって除去した。１７ｎｇの胎盤ＲＮＡ抽出物を増幅のために使用した。複数のネガティブウォーターブランクを、各分析に含めた。
【００９４】
研究した転写物の全てについて使用したサーマルプロファイルは、以下の通りであった：含まれたウラシルＮ−グリコシラーゼを作用させるために反応を５０℃で２分間開始させ、続いて６０℃で３０分間逆転写させた。９５℃で５分間変性させた後、９２℃で１５秒間の変性および５８℃で１分間のアニーリング／伸長を使用して、４０サイクルのＰＣＲを行った。
【００９５】
母体血中の２１トリソミー関連胎盤転写物の定量的評価
妊婦由来の母体全血サンプルを、ＥＤＴＡチューブへ回収した。４℃で１０分間１，６００ｇで血液サンプルを遠心分離した後、血漿を、注意深くプレイン（plain）ポリプロ
ピレンチューブへ移した。血漿サンプルを、４℃で１０分間１６，０００ｇで再遠心分離した。上澄みを新しいポリプロピレンチューブへ回収した。収穫した母体血漿からのＲＮＡ抽出を、前述（Ｎｇら，２００２）のように行った。研究した転写物についてのＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、上述の条件で行った。５μｌの抽出した血漿ＲＮＡを、各ＱＲＴ−ＰＣＲ反応のために使用した。
【００９６】
統計解析
統計解析をＳｉｇｍａ  Ｓｔａｔ  ２．０３ソフトウエア（ＳＰＳＳ）を使用して行った。
【００９７】
結果
異数性妊娠における異常胎盤組織発現を伴う遺伝子のマイクロアレイに基づく同定
正常妊娠から回収した５個の第１期ＣＶＳサンプルの遺伝子発現プロフィールを、各個々の組織サンプルの独立したマイクロアレイ分析によって得た。本発明者は、以前、通常の個体の血漿中の循環ＤＮＡは造血細胞から主に誘導されることを報告した（Ｌｕｉら，２００２）。したがって、本発明者は、母体血中のバックグラウンド母体核酸の大半も造血コンパートメント（compartment）に由来すると仮定する。研究の最終目的は、母体血
中の循環ＲＮＡ分子のうち胎児特異的である胎盤発現転写物を同定することであるので、本発明者は、さらに、対の母体全血の遺伝子発現プロフィールを得、そして５人の正常妊娠サンプルについてこれらのプロフィールを対応のＣＶＳのそれと比較した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を比較のために使用した。相対的胎盤特異性を有する転写物を、その発現レベルが５個全てのセットの比較において対応の全血サンプルと比較した場合にＣＶＳ組織において「増加された」転写物を選択することによって、同定した。これらの手順後、ＣＶＳ組織のそれと類似する程度かまたはそれよりも高い程度に母体血細胞中で発現された転写物を排除した。この手順によって、胎盤組織において優先的に発現される転写物のパネルが同定された。
【００９８】
次の工程において、異数性妊娠の胎盤組織において異常発現される転写物を同定した。
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、３個の２１トリソミーＣＶＳ組織の発現プロフィールを、上述の５人の妊娠期間が一致する正常妊娠から同定された相対的胎盤特異性を有する遺伝子のパネルと比較した。３個の異数性ＣＶＳサンプルの遺伝子発現シグナルを、ベースラインとして前記正常な胎盤組織発現プロフィールを使用して、前記５個の正常なＣＶＳサンプルの各々のそれと個々に比較した。合計で１５個の比較を行い、そしてインテロゲートした遺伝子の各々について、異数性胎盤においてアップレギュレートされた発現を示した比較の数をカウントした（Ｉカウント）。発現レベルの倍変化（fold- changes）を算出し、そしてｌｏｇ２値へ変換した（シグナルＬｏｇ比（Signal Log Ratio）、
ＳＬＲ）。さらに、以下の場合に、転写物を選択した：（ｉ）転写物が、少なくとも０．４のシグナルＬｏｇ比（発現の１．３倍変化）である程度まで、正常な胎盤と比較して異数性胎盤においてアップレギュレートされた；そして（ｉｉ）該アップレギュレーションが、一貫しており、ここで、半分を超える比較がこのようなアップレギュレーションを示す（Ｉカウント≧８）。表４は、３つの転写物、即ち、ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクス蛋白質１（EGF -containing fibulin-like extracellular matrix protein 1）
（ＥＦＥＭＰ１）、トランスフェリン受容体ｐ９０  ＣＤ７１（transferrin receptor p90 CD71）（ＴＦＲＣ）、およびＡＴＰ５Ｏのマイクロアレイ結果を要約し、これらは、
２１トリソミー妊娠について遺伝子パネルの中で最大限のアップレギュレーションを伴って、胎盤において優先的に発現される。
【００９９】
リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲによるマイクロアレイ結果の検証
上述のマイクロアレイ実験から同定された２１トリソミー妊娠における異常胎盤組織発現を伴う３個の転写物を、ワンステップリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲによって検証した。前記３個の転写物およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを、妊娠期間が一致した３つの２１トリソミー妊娠および５つの正常妊娠から回収したＣＶＳ組織において定量した。研究した遺伝子の相対的ｍＲＮＡレベルを、以下の式を使用して対応のＧＡＰＤＨレベルに対して標準化した：
ΔＣｔＸ＝ＣｔＧＡＰＤＨ−ＣｔＸ
式中、Ｃｔは閾値サイクル（threshold cycle）を示し、これは、サンプルのＱＲＴ−Ｐ
ＣＲ反応の集積蛍光が所定の閾値強度に達するために必要とされるＰＣＲサイクル数である。ΔＣｔＸは、研究した転写物Ｘの標準化されたｍＲＮＡレベルであり；ＣｔＧＡＰＤＨは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのＣｔ値であり；そしてＣｔＸは、転写物ＸのＣｔ値である。Ｃｔ値はテンプレートｍＲＮＡの量の対数に反比例するので、より高いΔＣｔＸ値は、より高いｍＲＮＡレベルを示す。
【０１００】
ＥＦＥＭＰ１  ｍＲＮＡ（図４Ａ）、ＴＦＲＣ  ｍＲＮＡ（図４Ｂ）およびＡＴＰ５Ｏ
ｍＲＮＡ（図４Ｃ）が、正常な妊娠から回収したＣＶＳと比較して２１トリソミーＣＶＳにおいて、実際にアップレギュレートされたことが、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析によって明らかとなった。前記３個の転写物の異常胎盤組織発現が異数性妊娠において存在し、したがって、２１トリソミーの出生前検査のためのＲＮＡマーカーとしてのそれらの有用性を実証する。
【０１０１】
母体血漿中のＲＮＡマーカーの検出能
正常な妊婦由来の血漿サンプルを、ＡＴＰ５Ｏ  ｍＲＮＡについて測定した。ＡＴＰ５Ｏ  ｍＲＮＡは、母体血漿中で検出可能であり（図４Ｄ）、分娩の２４時間後のその濃度の統計的に有意な減少を伴った（図４Ｄ；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ，Ｐ＜０．０５）。これらのデータは、胎盤が母体血漿中のＡＴＰ５Ｏ  ｍＲＮＡの重要な組織供給源であることを示す。
【０１０２】
結論
マイクロアレイに基づくアプローチを使用して、２１トリソミー胎盤組織における異常発現を伴う転写物を同定した。３個の転写物、ＥＦＥＭＰ１、ＴＦＲＣ、およびＡＴＰ５Ｏを、マイクロアレイ実験によって同定し、そして２１トリソミー妊娠の胎盤組織におけるそれらの発現の異常性をＱＲＴ−ＰＣＲによってさらに検証した。したがって、これらのデータは、前記３個の転写物が胎児２１トリソミーの出生前評価のためのＲＮＡマーカーとして有用であることを示す。母体血漿におけるＡＴＰ５Ｏ  ｍＲＮＡの検出能は、胎児２１トリソミーの非侵襲的出生前評価についてのこの転写物の適性を示す。例えば、２１トリソミーの非侵襲的出生前評価は、正常妊娠のそれと比較して、２１トリソミー妊娠の母体血漿中の異常な濃度のＲＮＡマーカー検出に基づき得る。
【０１０３】
実施例３：正常妊娠のそれ比較して子癇前症に冒された妊娠の胎盤における異常発現を伴う遺伝子
方法
被験者
この研究における全ての胎盤組織および血液サンプルを、香港のプリンス・オブ・ウェールズ病院にある産婦人科に通院した、妊娠第３期にある女性からインフォームドコンセントを得て回収した。研究は、臨床研究倫理委員会によって承認された。
【０１０４】
研究の第１の部分において、正常妊娠および子癇前症（preeclamptic）（ＰＥＴ）妊娠の両方の胎盤組織遺伝子発現プロフィールを、オリゴヌクレオチドマイクロアレイによって同定した。５人のＰＥＴ妊婦（妊娠期間範囲：３７〜４０週）および５人の健康な妊婦（妊娠期間範囲：３８〜４０週）の胎盤組織を、帝王切開直後に得た。末梢血を分娩直前に回収した。研究の第２の部分において、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ実験から作成された遺伝子発現プロフィールを、ＱＲＴ−ＰＣＲを使用して確認した。１０人のＰＥＴ（妊娠期間範囲：２５〜４０週）および１０人の健康な妊婦（妊娠期間範囲：３７〜３９週）の胎盤を、帝王切開分娩直後に回収した。子癇前症を、高血圧の病歴を有さない女性における有意な蛋白尿の存在を伴う、１つの場合について＞１１０ｍｍＨｇまたは少なくとも４時間離れた２以上の場合について＞９０ｍｍＨｇの拡張期血圧の持続性上昇（sustained increase）に基づいて規定した。有意な蛋白尿を、少なくとも４時間離れて回収された２つのクリーン−キャッチ中間尿試料中の尿検査において≧２＋または蛋白尿＞０．３ｇ／日と規定した。
【０１０５】
マイクロアレイ分析のためのサンプル調製
胎盤組織サンプルを、回収直後にＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），オースティン，ＴＸ）において保存し、そしてＲＮＡ抽出まで−８０℃で維持した。６ｍｌの母体末梢血を、組織回収時と同時に回収し、そしてＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）において保存した。胎盤組織からのトータルＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）で抽出しそしてＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）で精製した。末梢血からのトータルＲＮＡを、ＤＮアーゼ処理（ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼセット，Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）を含む、製造業者の指示書に従ってＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）によって抽出した。
【０１０６】
高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる遺伝子発現分析
各サンプルについて、１０μｇの抽出されたＲＮＡを標識し、そして製造業者の指示書に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３ＡおよびＵ１３３Ｂアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、各アレイを洗浄しそしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）において染色し
た。前記チップをＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）でスキャンし、そしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して分析した。
【０１０７】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
ワンステップリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲを、胎盤組織および母体血漿サンプル中のｍＲＮＡの定量的測定のために使用した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの検出のためのＱＲＴ−ＰＣＲアッセイは、以前に記載されている（Ｎｇら２００２）。他の研究した遺伝子のプライマー（Ｐｒｏｌｉｇｏ，シンガポール）およびＴａｑＭａｎマイナーグルーブ結合（ＭＧＢ）蛍光プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ，ＵＳＡ）の配列を、表５に示す。ｍＲＮＡ量を、相対的定量を使用して表し、ここで、研究した転写物レベルは、対応のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して標準化した。
【０１０８】
ＱＲＴ−ＰＣＲ反応を、２５μｌの反応体積において製造業者の指示書（ＥＺ  ｒＴｔｈ  ＲＮＡ  ＰＣＲ試薬セット，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って設定した。ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、組み合わされたサーマルサイクラーおよび蛍光検出器（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行った。研究した全ての転写物について、ＰＣＲプライマー（Ｐｒｏｌｉｇｏ）および蛍光プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、それぞれ、３００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で使用した。ＱＲＴ−ＰＣＲを行う前に、胎盤組織ＲＮＡ抽出物中の混入ＤＮＡを、製造業者の推奨に従って、ＤＮアーゼＩ消化（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）によって除去した。１７ｎｇの抽出した胎盤ＲＮＡを増幅のために使用した。複数のネガティブウォーターブランクを、各分析に含めた。
【０１０９】
使用したサーマルプロファイルは、以下の通りであった：含まれたウラシルＮ−グリコシラーゼを作用させるために反応を５０℃で２分間開始させ、続いて６０℃で３０分間逆転写させた。９５℃で５分間変性させた後、９２℃で１５秒間の変性および５６℃で１分間のアニーリング／伸長を使用して、４０サイクルのＰＣＲを行った。
【０１１０】
母体血中の子癇前症関連胎盤転写物の定量的評価
妊婦由来の母体全血サンプルを、ＥＤＴＡチューブへ回収した。４℃で１０分間１，６００ｇで血液サンプルを遠心分離した後、血漿を、注意深くプレイン（plain）ポリプロ
ピレンチューブへ移した。血漿サンプルを、４℃で１０分間１６，０００ｇで再遠心分離した。上澄みを新しいポリプロピレンチューブへ回収した。収穫した母体血漿からのＲＮＡ抽出を、前述（Ｎｇら，２００２）のように行った。研究した転写物についてのＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、上述の条件で行った。５μｌの抽出された血漿ＲＮＡを、各ＱＲＴ−ＰＣＲ反応のために使用した。
【０１１１】
統計解析
統計解析をＳｉｇｍａ  Ｓｔａｔ  ２．０３  ソフトウエア（ＳＰＳＳ）を使用して行った。
【０１１２】
結果
子癇前症妊娠における異常胎盤組織発現を伴う遺伝子のマイクロアレイに基づく同定
本発明者の最終目的は、母体血中のＰＥＴ関連転写物の検出を介してのＰＥＴの研究のためのアプローチを開発することである。したがって、本発明者の遺伝子選択戦略は、先ず、母体末梢血液細胞においてではなくＰＥＴ胎盤において優先的に発現される転写物の同定を必要とする。この戦略は、胎盤が母体血中の循環胎児ＲＮＡの重要な供給源であり、そして造血系が正常な個体における血漿ＤＮＡの主要な供給源であるという本発明者の
以前の知見（Ｌｕｉら，２００２）に基づいて発明された。５個のＰＥＴ胎盤組織サンプルおよびそれらの対応する末梢血サンプルの遺伝子発現プロフィールを、オリゴヌクレオチドマイクロアレイによって測定した。胎盤発現遺伝子を同定するために、５個の分析したＰＥＴ胎盤組織サンプルのうち少なくとも４個において発現された転写物を選択した。次いで、その発現レベルが５個の末梢血サンプルの全てにおいて「存在しなかった」かあるいは対をなす胎盤サンプルおよび母体血液サンプルの５個のセットの全てにおいて対応の全血サンプルと比較した場合に胎盤において「増加された」転写物の正の選択によって、母体血細胞においても発現された遺伝子を排除した。したがって、胎盤組織よりも母体血液細胞においてより高い程度または類似する程度に発現された転写物を排除した。これらの手順によって、胎盤組織において優先的に発現される転写物のパネルが選択された。
【０１１３】
次の工程において、ＰＥＴ胎盤において異常発現される転写物を同定した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、妊娠期間が一致するそれぞれ５個のＰＥＴ妊娠および正常妊娠から回収した胎盤の発現プロフィールを比較した。上述の５個のＰＥＴ妊娠から同定した相対的に胎盤特異的である遺伝子のリストの発現シグナルを、ベースラインとして前記正常な胎盤組織発現プロフィールを使用して、前記５個の正常な胎盤組織サンプルの各々のそれと個々に比較した。合計で２５個の比較を行い、そしてインテロゲートした遺伝子の各々について、ＰＥＴ胎盤においてアップレギュレートされた発現を示した比較の数をカウントした（Ｉカウント）。発現レベルの倍変化（fold-changes）を算出し、そしてｌｏｇ２値へ変換した（シグナルＬｏｇ比（Signal Log Ratio）、ＳＬＲ）。さらに、以下の場合に、転写物を選択した：（ｉ）転写物が、少なくとも０．４のシグナルＬｏｇ比（発現の１．３倍変化）である程度まで、正常な胎盤と比較してＰＥＴ胎盤においてアップレギュレートされた；そして（ｉｉ）該アップレギュレーションが、一貫しており、ここで、半分を超える比較がこのようなアップレギュレーションを示す（Ｉカウント≧１３）。表６は、ＰＥＴ妊娠におけるアップレギュレーションを伴って胎盤において優先的に発現される、１０個の同定された転写物のマイクロアレイ結果を要約する。
【０１１４】
リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲによるマイクロアレイ結果の検証
マイクロアレイ分析から選択したＰＥＴ関連転写物を、ワンステップリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲによって検証した。妊娠期間が一致するそれぞれ１０個のＰＥＴ妊娠および正常妊娠から回収した胎盤組織において、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ濃度を測定した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルを使用して、異なるサンプル間の転写物レベルを標準化した。次いで、マイクロアレイ分析によって同定した１０個の転写物の発現レベルを、両グループの妊娠の胎盤組織サンプルにおいて評価した。研究した遺伝子の相対的ｍＲＮＡレベルを、以下の式を使用して対応のＧＡＰＤＨレベルに対して標準化した：
ΔＣｔＸ＝ＣｔＧＡＰＤＨ−ＣｔＸ
式中、Ｃｔは閾値サイクルを示し、これは、サンプルのＱＲＴ−ＰＣＲ反応の集積蛍光が所定の閾値強度に達するために必要とされるＰＣＲサイクル数である。ΔＣｔＸは、研究した転写物Ｘの標準化されたｍＲＮＡレベルであり；ＣｔＧＡＰＤＨは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのＣｔ値であり；そしてＣｔＸは、転写物ＸのＣｔ値である。Ｃｔ値はテンプレートｍＲＮＡの量の対数に反比例するので、より高いΔＣｔＸ値は、より高いｍＲＮＡレベルを示す。
【０１１５】
レプチン（ＬＥＰ）およびシアル酸結合Ｉｇ様レクチン６（sialic acid binding Ig-like lectin 6）（ＳＩＧＬＥＣ６）ｍＲＮＡは、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析により、正常妊娠のそれと比較してＰＥＴ胎盤において有意にアップレギュレートされると確認された（レプチンおよびＳＩＧＬＥＣ６  ｍＲＮＡについて、それぞれ、図５Ａおよび図５Ｂ）（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、両ケースについてＰ＜０．０５）。これらのデータは、本発明者の転写物選択戦略が、ＰＥＴ胎盤組織において異常発現されるマーカーの同定を可能
にすることを確認する。
【０１１６】
母体血漿中のＰＥＴ関連ＲＮＡマーカーの検出能
第３期にある２５個の健康な妊娠および２６個のＰＥＴに冒された妊娠由来の血漿サンプルを、ＱＲＴ−ＰＣＲによって、ＬＥＰおよびＩＮＨＢＡ  ｍＲＮＡについて測定した。ＬＥＰおよびＩＮＨＢＡについての母体血漿濃度は、合併症を伴わない妊娠と比較した場合、ＰＥＴによって冒された妊娠において、有意に上昇された（ＬＥＰ：図６Ａ、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ，Ｐ＝０．０１７；ＩＮＨＢＡ：図６Ｂ，Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ，Ｐ＝０．００６）。
【０１１７】
結論
マイクロアレイに基づくアプローチを使用して、ＰＥＴ胎盤において異なる発現を伴う転写物を同定し、そしてＰＥＴの研究のための可能性のあるマーカーと考えられた。マイクロアレイ分析によって同定されたＰＥＴ関連転写物のリスト内で、正常妊娠のそれと比較してＰＥＴ胎盤において最も異常発現される１０個の転写物を選択した。ＬＥＰおよびＳＩＧＬＥＣ６発現の両方が、正常胎盤と比べてＰＥＴ胎盤において有意にアップレギュレートされたことが、リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲによって確認された。ＩＮＨＢＡおよびＬＥＰの母体血漿レベルは、合併症を伴わない妊娠よりもＰＥＴにおいて有意により高く、したがって、ＰＥＴの非侵襲的出生前評価のためのマーカーの使用の可能性を示唆する。
【０１１８】
実施例４：２１トリソミーおよび正常妊娠の母体血漿中の胎盤特異的ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡ
ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡの検出能および妊娠特異性の測定
ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡは、リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して母体血漿において検出され得る。さらに、ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡは、子供の誕生後に母体血漿から除去された。したがって、母体血漿中のＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡは、胎児起源のものであり、そして妊娠特異的である。
【０１１９】
サンプル回収および処理
５人の非妊娠女性、５人の第１期妊婦および８人の第３期妊婦由来の末梢血サンプルを回収した。分娩前および分娩後２４時間での６人の第３期妊婦由来の末梢血も得た。血液サンプルをＥＤＴＡチューブ中に回収した。血漿サンプルを、実施例１に記載されるように収穫した。母体血漿サンプルからのＲＮＡ抽出を、実施例１に記載される手順に従って行った。
【０１２０】
リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲアッセイの開発
ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡについてのＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、実施例１に記載されるように開発した。プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，コーラルビレ，ＩＡ）、ＴａｑＭａｎマイナーグルーブ結合（ＭＧＢ）蛍光プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ，ＵＳＡ）およびキャリブレーター（calibrator）（Ｐｒｏｌｉｇｏ，シンガポール）の配列を、表７に示す。
【０１２１】
ＱＲＴ−ＰＣＲ反応を、２５μｌの反応体積において製造業者の指示書（ＥＺ  ｒＴｔｈ  ＲＮＡ  ＰＣＲ試薬セット，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って設定した。ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ，ＵＳＡ）において行った。ＰＣＲプライマーおよび蛍光プローブを、それぞれ、４００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で使用した。５μｌの抽出したＲＮＡを増幅のために使用した。サーマルサイクリン
グプロファイルは、以下であった：反応を５０℃で２分間開始させ、続いて６０℃で３０分間逆転写させた。９５℃で５分間変性させた後、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の変性を使用して、４５サイクルのＰＣＲを行った。
【０１２２】
ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡは、母体血漿中において検出され得、そして妊娠特異的である
ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡは、非妊娠個体のいずれにおいても検出され得ず、しかし第１および第３期妊婦の全てにおいて検出され得た（図７）。第１および第３期妊娠における中央値血漿ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡ濃度は、それぞれ、２９９．６コピー／ｍｌおよび５２９．３コピー／ｍｌであった。循環ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡの妊娠特異性もまた測定した。分娩前の血漿サンプルにおいて、中央値ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡ濃度は５００．０コピー／ｍｌであった。該転写物は、分娩後の血漿サンプルのいずれにおいても検出不可能であった（図８）。
【０１２３】
正倍数性妊娠および２１トリソミー妊娠における循環ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡの比較
循環ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡ濃度を、核型が正常な妊娠と２１トリソミー妊娠との間で比較した。血漿サンプルを、妊娠第１期および第２期にある、正倍数性胎児を妊娠している２９人の妊婦および２１トリソミー胎児を妊娠している５人の妊婦から回収した。血漿サンプルを、上述のように、リアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲによって、ＰＬＡＣ４
ｍＲＮＡ濃度について測定した。ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡは、トリソミック血漿サンプルの全てにおいて検出された。２１トリソミー妊娠および正常妊娠についての中央値は、それぞれ、５５８１コピー／ｍｌおよび４８３６コピー／ｍｌである。サンプルサイズが小さかったために、統計的に有意な差異は、正常妊娠と２１トリソミー妊娠との間で、血漿ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡ濃度について達成されなかった。
【０１２４】
実施例５：正常妊娠のそれと比較して子癇前症によって冒された妊娠の胎盤において異常発現を伴う遺伝子
方法
被験者
この研究における全ての胎盤組織および血液サンプルを、香港のプリンス・オブ・ウェールズ病院にある産婦人科に通院した、妊娠第３期の間にある女性からインフォームドコンセントを得て回収した。研究は、臨床研究倫理委員会によって承認された。
【０１２５】
研究の第１の部分において、正常妊娠および子癇前症（ＰＥＴ）妊娠の両方の胎盤組織遺伝子発現プロフィールを、オリゴヌクレオチドマイクロアレイによって同定した。５人のＰＥＴ妊婦（妊娠期間範囲：３７〜４０週）および５人の健康な妊婦（妊娠期間範囲：３８〜４０週）由来の胎盤組織を、帝王切開直後に得た。末梢血を分娩直前に回収した。研究の第２の部分において、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ実験によって作成された遺伝子発現プロフィールを、ＱＲＴ−ＰＣＲを使用して確認した。６人のＰＥＴ（妊娠期間範囲：３０〜３９週）および６人の健康な妊婦（妊娠期間範囲：３７〜３９週）由来の胎盤を、帝王切開分娩直後に回収した。子癇前症を、高血圧の病歴を有さない女性における有意な蛋白尿の存在を伴う、１つの場合について＞１１０ｍｍＨｇまたは少なくとも４時間離れた２以上の場合について＞９０ｍｍＨｇの拡張期血圧の持続性上昇（sustained increase）に基づいて規定した。有意な蛋白尿を、少なくとも４時間離れて回収された２つのクリーン−キャッチ中間尿試料中の尿検査において≧２＋または蛋白尿＞０．３ｇ／日と規定した。
【０１２６】
マイクロアレイ分析のためのサンプル調製
胎盤組織サンプルを、回収直後にＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），オースティン，ＴＸ）において保存し、そしてＲＮＡ抽出まで−８０℃で維持した。６ｍｌの母体末梢血を、組織回収時と同時に回収し、そしてＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡチ
ューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）において保存した。胎盤組織からのトータルＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）で抽出しそしてＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）で精製した。末梢血からのトータルＲＮＡを、ＤＮアーゼ処理（ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼセット，Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）を含む、製造業者の指示書に従ってＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）によって抽出した。
【０１２７】
高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる遺伝子発現分析
各サンプルについて、１０μｇの抽出されたＲＮＡを標識し、そして製造業者の指示書に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３ＡおよびＵ１３３Ｂアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、各アレイを洗浄しそしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）において染色した。前記チップをＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）でスキャンし、そしてＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｖ  ７．２（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，パロアルト，ＣＡ）を使用して分析した。
【０１２８】
マイクロアレイ遺伝子発現データのマイニング
マイクロアレイデータを．ＣＥＬフォーマットでＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｖ  ７．２（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にインポートした。データマイニング（Data mining）を、正常妊娠およびＰＥＴ妊娠から回収したサンプル（胎盤組織および母体
血液細胞）について独立して行った。各グループの妊娠内で、母体血液細胞よりも胎盤組織サンプルにおいて相対的により高い発現を有した遺伝子を、先ず同定した。５個の胎盤および対の母体血液細胞からのマイクロアレイ生データを、順に以下のステップを使用して一緒に標準化した：（１）ＧＣ−コンテントバックグラウンドコレクション（GC-content background correction）を用いての、Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ｃｈｉｐ  Ａｖｅｒａｇｅによる生データプロセシング（ＧＣ−ＲＭＡ）；（２）０．００１未満の値を有するマイクロアレイデータを０．００１に設定するデータ変換；ならびに（３）各遺伝子についてのシグナル強度を、全サンプルにおけるその測定値の中央値によって割った。胎盤組織または母体血液細胞のいずれかにおける統計的に有意な（Ｐ＜０．０５）発現を伴う遺伝子を、さらに同定した。次いで、これらの遺伝子を、高い倍差異（fold-differences）を伴う転写物を同定する目的で、母体血液細胞のそれと比較しての胎盤組織発現における倍差異に基づく順で分類した。このデータマイニングプロセスにより、母体血液細胞と比較して胎盤組織において相対的により高い発現を伴う遺伝子が同定される。
【０１２９】
他方で、胎盤組織において高絶対発現レベルを有する遺伝子を同定するために、データマイニングを行った。ＧＣ−ＲＭＡプロセッシングと、続いて０．００１未満の値を有するマイクロアレイデータを０．００１に設定するデータ変換によって、胎盤組織についての生マイクロアレイデータを標準化した。次いで、標準化された発現レベルに基づいて、遺伝子をランク付けした。正常および子癇前症妊娠から回収された胎盤組織についてのデータマイニングを独立して行った。
【０１３０】
以下の場合、さらなる研究のために遺伝子を選択した：それらが正常妊娠についてのそれよりも対の母体血に対するＰＥＴ胎盤間の遥かに高い倍差異を実証する場合、あるいは、胎盤組織発現と母体血発現との間で少なくとも２００倍差異を実証しつつ正常胎盤よりもＰＥＴにおいて遥かに高い絶対発現レベルを有するものの場合。
【０１３１】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
ワンステップリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲを、胎盤組織中のｍＲＮＡ転写物の定量的測
定のために使用した。２．５×１０６コピーから２．５コピーまでの範囲に及ぶ濃度での、高性能液体クロマトグラフィー精製一本鎖合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの連続希釈によって、検量線を作製した。研究した遺伝子のプライマー（Ｐｒｏｌｉｇｏ）、蛍光プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ，ＵＳＡ）およびオリゴヌクレオチドキャリブレーターの配列を、表８に示す。
【０１３２】
ＱＲＴ−ＰＣＲ反応を、５０μｌの反応体積において製造業者の指示書（ＥＺ  ｒＴｔｈ  ＲＮＡ  ＰＣＲ試薬セット，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って設定した。ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、組み合わされたサーマルサイクラーおよび蛍光検出器（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行った。研究した転写物の全てについて、蛍光プローブを１００ｎＭの濃度で使用した。各々３００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマーを、妊娠関連血漿プロテインＡ、パパリシン１（pregnancy-associated plasma protein A, pappalysin 1）（ＰＡＰＰ
Ａ）、ＩＮＨＢＡおよびＦＮｌについてのアッセイにおいて各反応のために使用した。各々４００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマーを、ＬＥＰ、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２（メルトリンアルファ）（ADAM metallopeptidase domain 12 (meltrin alpha)）（ＡＤＡＭ１２）、およびパパリシン２（pappalysin 2）（ＰＡＰＰＡ２）
についてのアッセイにおける各反応のために使用した。ＱＲＴ−ＰＣＲを行う前に、胎盤組織ＲＮＡ抽出物中の混入ＤＮＡを、製造業者の推奨に従って、ＤＮアーゼＩ消化（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）によって除去した。１ｎｇの抽出した胎盤ＲＮＡを増幅のために使用した。複数のネガティブウォーターブランクを、各分析に含めた。胎盤組織ＲＮＡ濃度を、コピー／胎盤トータルＲＮＡのｎｇとして表した。
【０１３３】
使用したサーマルプロファイルは、以下の通りであった：含まれたウラシルＮ−グリコシラーゼ(uracil N-glycosylase)を作用させるために反応を５０℃で２分間開始させ、続いて６０℃で３０分間逆転写させた。９５℃で５分間変性させた後、９２℃で１５秒間の変性、ならびにＬＥＰ、ＡＤＡＭ１２、ＰＡＰＰＡおよびＩＮＨＢＡについては５６℃で、しかしＰＡＰＰＡ２およびＦＮ１については５７℃で１分間のアニーリング／伸長を使用して、４０サイクルのＰＣＲを行った。
【０１３４】
統計解析
統計解析をＳｉｇｍａ  Ｓｔａｔ  ３．０  ソフトウエア（ＳＰＳＳ）を使用して行った。
【０１３５】
結果
マイクロアレイ分析から同定された遺伝子は、以下を含んだ：ＬＥＰ、ＡＤＡＭ１２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００３４７４、ＮＭ＿０２１６４１）、ＰＡＰＰＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２５８１）、ＰＡＰＰＡ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２０３１８、ＮＭ＿０２１９３６）、ＩＮＨＢＡおよびＦＮ１。ＰＥＴおよび正常妊娠における選択した転写物の胎盤組織発現レベルを、ワンステップリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲによって評価した。結果を図９に示す。ＬＥＰ、ＡＤＡＭ１２、ＰＡＰＰＡ２、ＩＮＨＢＡおよびＦＮ１の濃度は、正常妊娠よりもＰＥＴから回収した胎盤組織においてより高いことが判り、一方、ＰＡＰＰＡ  ｍＲＮＡについてのそれは、正常妊娠よりもＰＥＴから回収した胎盤組織においてより低いことが判った。
【０１３６】
結論
マイクロアレイに基づくアプローチを使用して、ＰＥＴ胎盤における異常発現プロフィールを伴う転写物を同定し、そしてＰＥＴの研究のための可能性のあるマーカーと考えられた。６個の転写物をマイクロアレイ分析から選択し、そしてＰＥＴ胎盤におけるそれら
の発現プロフィールの異常性を、リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲによって確認する。
【０１３７】
参照文献：
Lui, YYN, Chik, KW, Chiu, RWK, Ho, CY, Lam, CW and Lo, YMD (2002). Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serum after sex-mismatched bone marrow transplantation. Clin Chem 48, 421-427.
Ng, EKO, Tsui, NBY, Lam, NY, Chiu, RWK, Yu, SC, Wong, SC, Lo, ES, Rainer, TH, Johnson, PJ and Lo, YMD (2002). Presence of filterable and nonfilterable mRNA in the plasma of cancer patients and healthy individuals. Clin Chem 48, 1212-1217.
Ng, EKO, Tsui, NBY, Lau, TK, Leung, TN, Chiu, RWK, Panesar, NS, Lit, LCW, Chan, KW and Lo, YMD (2003). mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100, 4748-4753。
【０１３８】
公開されたアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を含めて、本願において引用した全ての特許、特許出願、および他の刊行物は、全ての目的のために全体が参照により組み込まれる。
【０１３９】
【表１Ａ】
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【０１４０】
【表１Ｂ】
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【０１４１】
【表２Ａ】
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【０１４２】
【表２Ｂ】
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【０１４３】
【表３】
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【０１４４】
【表４】
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【０１４５】
【表５】
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【０１４６】
【表６】
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【０１４７】
【表７】
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【０１４８】
【表８】
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【０１４９】
【化１−１】
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【０１５０】
【化１−２】
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【０１５１】
【化１−３】
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【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】第１期２１トリソミー妊娠およびコントロール妊娠におけるＲＮＡ転写物の胎盤組織レベルの比較。（Ａ）ＡＤＡＭＴＳ１  ｍＲＮＡ。（Ｂ）ＡＰＰ  ｍＲＮＡ。各●は１被験者を示す。
【図２】母体バフィーコートにおける胎盤発現転写物の相対濃度。ボックス内の線は中央値を意味する。ボックスは、第２５百分位数と第７５百分位数との間の間隔をマークする。ヒゲ（whiskers）は、第１０百分位数と第９０百分位数との間の間隔を意味する。黒丸は、第１０百分位数および第９０百分位数より外側のデータポイントをマークする。
【図３】分娩後の母体血漿からの胎盤ｍＲＮＡのクリアランス。分娩前および分娩後２４時間の（Ａ）ＣＯＬ６Ａ１  ｍＲＮＡおよび（Ｂ）ＣＯＬ６Ａ２  ｍＲＮＡの母体血漿濃度。各線は、１被験者から得られた対の血漿サンプルを示す。
【図４】第１期２１トリソミー妊娠およびコントロール（正常）妊娠におけるＲＮＡ転写物の胎盤組織レベルの比較。（Ａ）ＥＦＥＭＰ１  ｍＲＮＡ。（Ｂ）ＴＦＲＣ  ｍＲＮＡ。（Ｃ）ＡＴＰ５Ｏ  ｍＲＮＡ。各●は、１被験者を示す。（Ｄ）分娩後２４時間での母体血漿からのＡＴＰ５Ｏ  ｍＲＮＡのクリアランス。各線は、１被験者から得られた対の血漿サンプルを示す。
【図５】第３期子癇前症（ＰＥＴ）妊娠およびコントロール妊娠におけるＲＮＡ転写物の胎盤組織レベルの比較。（Ａ）レプチン（ＬＥＰ）ｍＲＮＡ。（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ６  ｍＲＮＡ。ボックス内の線は中央値を意味する。ボックスは、第２５百分位数と第７５百分位数との間の間隔をマークする。ヒゲは、第１０百分位数と第９０百分位数との間の間隔を意味する。黒丸は、第１０百分位数および第９０百分位数より外側のデータポイントをマークする。
【図６】子癇前症妊娠およびコントロール妊娠の母体血漿中の（Ａ）レプチン（ＬＥＰ）ｍＲＮＡおよび（Ｂ）ＩＮＨＢＡ  ｍＲＮＡの母体血漿濃度の比較。ボックス内の線は中央値を意味する。ボックスは、第２５百分位数と第７５百分位数との間の間隔をマークする。ヒゲは、第１０百分位数と第９０百分位数との間の間隔を意味する。黒丸は、第１０百分位数および第９０百分位数より外側のデータポイントをマークする。
【図７】非妊娠女性ならびに妊娠第１および第３期にある女性の血漿中のＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡ濃度のボックスプロット。ボックス内の線は中央値を意味する。ボックスは、第２５百分位数と第７５百分位数との間の間隔をマークする。ヒゲは、第１０百分位数と第９０百分位数との間の間隔を意味する。黒丸は、第１０百分位数および第９０百分位数より外側のデータポイントをマークする。
【図８】分娩後の母体血漿からのＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡのクリアランス。各線は、分娩前および分娩２４時間後の１被験者から得られた対の血漿サンプルを示す。
【図９】第３期子癇前症（ＰＥＴ）妊娠およびコントロール（正常）妊娠におけるＲＮＡ転写物の胎盤組織レベルの比較。（Ａ）ＬＥＰ  ｍＲＮＡ。（Ｂ）ＡＤＡＭ１２  ｍＲＮＡ。（Ｃ）ＰＡＰＰＡ  ｍＲＮＡ。（Ｄ）ＰＡＰＰＡ２  ｍＲＮＡ。（Ｅ）ＩＮＨＢＡ  ｍＲＮＡ。（Ｆ）ＦＮ１  ｍＲＮＡ。ボックス内の線は中央値を意味する。ボックスは、第２５百分位数と第７５百分位数との間の間隔をマークする。ヒゲは、第１０百分位数と第９０百分位数との間の間隔を意味する。黒丸は、第１０百分位数および第９０百分位数より外側のデータポイントをマークする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
2010213722.tif 000023
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2010213722.tif 000025
【図９Ｄ】
2010213722.tif 000026
【図９Ｅ】
2010213722.tif 000027
【図９Ｆ】
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【配列表】
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