(57)【要約】【解決課題】バキュロウイルスを用いて目的蛋白質を昆虫細胞により発現させる発現系において、昆虫細胞の培養を、発現された目的蛋白質の分解を回避しつつ継続すること。【解決手段】目的蛋白質をコードする遺伝子を導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を培養して当該蛋白質を発現させる方法であって、蛋白質分解酵素阻害剤を添加した培地中で昆虫細胞を培養する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的蛋白質をコードする遺伝子を導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を培養して当該蛋白質を発現させる方法であって、蛋白質分解酵素阻害剤を添加した培地中で昆虫細胞を培養する方法。
【請求項２】
蛋白質分解酵素阻害剤がセリン・システインプロテアーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤及びシステインプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される１種以上の阻害剤であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
セリン・システインプロテアーゼ阻害剤がロイペプチン又はフッ化フェニルメチルスルホニルであることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
セリンプロテアーゼ阻害剤が４−（2−アミノエチル）−ベンゼンスルフォニルフルオライド又はベンズアミジンであることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項５】
システインプロテアーゼ阻害剤がＥ−６４であることを特徴とする請求項２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質分解酵素阻害剤を添加した培地中で昆虫細胞を培養することによる、目的蛋白質をコードする遺伝子を導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を培養して当該蛋白質を発現させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト由来の蛋白質等を、大腸菌等の微生物、植物細胞そして昆虫細胞を宿主として用いて製造することが一般に行われている。中でも昆虫細胞に目的蛋白質をコードする遺伝子を導入したバキュロウイルスを感染させ、当該蛋白質を発現させて取得する方法（以下、バキュロウイルス発現系等と表現することがある）は、発現蛋白質の立体構造を保持すると共に糖鎖付加を伴った生体内蛋白質と極めて近い性質を有した蛋白質を高発現できることから広く一般に利用されている技術である。
【０００３】
上記のようにして目的蛋白質を発現させた場合、発現した目的蛋白質が宿主由来の蛋白質分解酵素により分解されてしまうと、回収される蛋白質量が減少してしまう。そこで従来は、十分な目的蛋白質を発現させた後に培養操作を終了し、培養液にベンズアミジン等の蛋白質分解酵素阻害剤を添加した上で、目的蛋白質の回収操作を低温下で実施して発現した目的蛋白質を回収することが提案されている（例えば特許文献１の実施例７及び非特許文献１）。しかし、これら方法では培養中の発現蛋白質の分解を回避することは不可能であり、発現蛋白質の減少や分解物の混合が問題となっている。
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−１７４５９１号公報
【非特許文献１】Ｃｏｌｉｎ  Ｈ．Ｍａｃｐｈｅｅ１ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９８年、１６１：６２７３−６２７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
バキュロウイルス−昆虫細胞発現系での蛋白質発現は、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母菌等での蛋白質発現とは異なり、バキュロウイルスの感染から数日間で目的蛋白質を発現した後、昆虫細胞は死に至る。培養下の昆虫細胞の状態や感染に使用するバキュロウイルスの濃度（Ｔｉｔｅｒ）に依存し目的蛋白質の発現量は変動し、目的蛋白質の最適回収時期は操作を行うごとに異なるといっても過言ではないが、一般的には、早い時期では目的蛋白質の発現は少ない。従って、感染後の早い時期に培養を止めてしまうと、目的蛋白質を十分に回収することが困難となる。反対に、十分な量の目的蛋白質が発現することを期待して、回収時期を遅らせると、目的蛋白質の発現に伴って死滅した昆虫細胞から大量の蛋白質分解酵素が培養液中に遊離してしまい、結果的に分解によって消失する目的蛋白質の量の増加により回収量が減少し、更に、その後の目的蛋白質の精製の段階で混入した分解物の除去のために多くの労力を要することになる。
【０００６】
上記の通り、バキュロウイルス発現系では昆虫細胞の培養を終了するタイミングを図ることが極めて重要であるにもかかわらず非常に困難であるため、培養を継続している段階で死滅細胞から遊離する蛋白質分解酵素の影響を排除する必要がある。しかし、非特許文献１では、宿主細胞と培養上清分離後に蛋白質分解酵素阻害剤を添加する手法を示したものであり、蛋白質分解酵素阻害剤共存下で宿主細胞の培養が可能であるか否かについては記載していない。また、昆虫細胞の培養は通常２７℃付近で実施されるが、蛋白質分解酵素阻害剤を添加した後に低温条件とはいえない２７℃付近での培養を継続した場合、目的蛋白質の分解を抑制し得るのか否かについても、非特許文献１は記載していない。そこで本発明の目的は、バキュロウイルス発現系において、宿主細胞の培養を発現された目的蛋白質の分解を回避しつつ継続することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的に鑑みてなされた本発明は、発現された目的蛋白質の分解を回避しつつ宿主細胞の培養を継続するものであり、目的蛋白質をコードする遺伝子を導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を培養して当該蛋白質を発現させる方法であって、蛋白質分解酵素阻害剤を添加した培地中で昆虫細胞を培養する方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
バキュロウイルスで感染した昆虫細胞の培養中に、培養液に添加することが可能な蛋白質分解酵素阻害剤として、ロイペプチン、Ｅ−６４、４−（2−アミノエチル）−ベンゼンスルフォニルフルオライド、フッ化フェニルメチルスルホニル等を例示することができる。本発明の対象となり得るバキュロウイルス発現系は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈｆｉｖｅ、ｍｉｍｉｃＳｆ９等といった、従来公地の昆虫細胞を宿主細胞とする系であれば制限はない。かかる宿主細胞を培養する培地に関しても、Ｇｒａｃｅ’ｓ培地、Ｓｆ９００培地、ＥｘｐｒｅｓｓＦｉｖｅ培地、ＥＸ−Ｃｅｌｌ培地等、昆虫細胞が培養できる培地として知られているものであれば制限はない。
【０００９】
バキュロウイルスによる昆虫細胞の感染は、対数増殖期（ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）に維持した昆虫細胞に対して目的蛋白質をコードする遺伝子（以下目的遺伝子という）を組み込んだバキュロウイルスを添加することにより実施することができる。添加する際の細胞濃度は通常５×１０５から１×１０6程度が好ましいが、この範囲に限定されるものではない。なおバキュロウイルスへの目的遺伝子の導入は、市販の試薬キットにより実施することができる。
【００１０】
蛋白質分解酵素阻害剤の培地への添加は、培地中でバキュロウイルスによる宿主細胞の感染を行う段階から行うことが例示できる。かかる好ましい態様では、感染後に発現される目的蛋白質の分解を効果的に抑制することが可能だからである。培地へ添加する蛋白質分解酵素阻害剤の最適濃度は、その種類により異なり、本発明の実施例等を参考に、事前に予備的実験をして決定することが好ましい。本発明者の知見によれば、蛋白質分解酵素阻害剤がフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）であれば１mＭ程度、ロイペプチンであれば２０μＭ程度、Ｅ−６４であれば１μＭ程度である。
【００１１】
蛋白質分解酵素阻害剤を添加した培地中で培養を継続し、好ましくは３から７日経過した後、培地又は細胞を回収し、発現した目的蛋白質を回収するが、回収のための操作は、従来公知の方法を使用することができる。
【発明の効果】
【００１２】
後述する実施例からも明らかなように、蛋白質分解酵素阻害剤は、バキュロウイルスによる宿主細胞の感染時から培地に添加しても、過剰な添加を行わない限り感染した昆虫細胞の生育や目的蛋白質の発現自体には何ら影響を与えることがない。従って本発明によれば、バキュロウイルス発現系において発現した目的蛋白質が昆虫細胞の死滅に伴って遊離する蛋白質分解酵素によって分解されることを防止し、結果的に、目的蛋白質の分解が原因の収量の低下、分解物が混入することによる精製操作の複雑化を回避することが可能となる。特に、目的蛋白質の分解を抑制しつつ宿主細胞の培養を継続し得るので、十分な量の目的蛋白質の発現を期待して培養操作を継続し、回収時期を遅らせることが可能である。
【００１３】
本発明は、フッ化フェニルメチルスルホニル等といった入手が用意で、しかも安価な蛋白質分解酵素阻害剤を利用して実施することができる。従って、バキュロウイルス発現系を利用した商業ベースでの目的蛋白質の製造に利用することが可能である。
【実施例】
【００１４】
以下実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するが、実施例は本発明の一例であって、本発明を限定するものではない。
【００１５】
実施例１
目的蛋白質としてヒト  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １（以下「ＳＮＤ１」とする）を選択し、そのバキュロウイルス発現系を調製した。まず、ＲＴ−ＰＣＲを用い、常法に従ってＳＮＤ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０１４３９０．２）のｃＤＮＡをヒト前立腺癌細胞ＬｎＣａｐからクローニングした。クローニングしたｃＤＮＡから終止コドンを除去した後、ヒスチジン６残基をコードするコドンを追加して調製したポリヒスチジン−タッグＳＮＤ１をバキュロウイルス用トランスファーベクターｐＦａｓｔＢａｃ−１（インビトロジェン社製）に導入し、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社製）を用いてプロトコールに従いバキュロウイルスを調製し、感染実験を実施した。また、本品を常法に従ってＳｆ２１に感染させて培養を行い、ポリヒスチジン−タッグＳＮＤ１含む発現培養上清を調製した後、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で透析し、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ金属キレートカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）製、Ｃａｔ．ＮＯ．１７−５２４８−０１）を用いてプロトコールに従い精製操作を行った。
【００１６】
上記精製抗原を用いモノクローナル抗体を調製した。まず、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（７週令のメス）に対し、ＳＮＤ１（５０μｇ）をフロイントの完全アジュバントと共に腹腔に免疫した。次に、当該マウスから得たＢ細胞とマウスミエローマ細胞株ＰＡＩとを常法に従って融合し、モノクローナル抗体産生株ＥＢＭ２６５を取得した。ＥＢＭ２６５産生ハイブリドーマより培養上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧカラムによりＩｇＧとして精製後、アルカリ性ホスファターゼ標識キット（同仁化学研究所製、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２）を用い標識を施しウエスタンブロッティングに使用した。
【００１７】
実施例２
昆虫細胞Ｓｆ９を培養し感染前日に５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬになるように調整した。５０ｍＬのＳｆ９を２本準備し、ウイルス液を加えＳＮＤ１の発現を実施した。その際、２００ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）からなるエタノール溶液を、一方のＳｆ９細胞に最終濃度１ｍＭになるよう加え発現実験を実施した。感染５日後に培養上清を回収し、実施例１同様金属キレートカラムにてＳＮＤ１を精製した。精製品の電気泳動後のクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による蛋白質染色像を図１左に示す。感染５日後のサンプルおいてＰＭＳＦ未添加ではＳＮＤ１の分解により１０５ｋＤａ付近のバンドが認められない。電気泳動後、ポリフッ化ビニリデン膜に蛋白質をトランスファー後、３％スキムミルクを含むＴＢＳにて２時間ブロッキング後、１μｇ／ｍＬのアルカリ性ホスファターゼ標識ＥＢＭ２６５、および１％ブロックエース（大日本住友製薬）を含むＴＢＳと反応後、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳにて充分洗浄後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｔｈｅｒｍｏ社、ＣａｔＮｏ．３４０４２）により、ＳＮＤ１を検出した結果を図１右に示す。ＣＢＢ染色と同様にＰＭＳＦ未添加では１０５ｋＤａ付近にＳＮＤ１は検出されなかった。
【００１８】
実施例３
実施例２によりＰＭＳＦの効果が確認できたため、実施例２同様にＰＭＳＦ添加、未添加による感染後３，４，５日後の培養上清よりＳＮＤ１を金属キレートカラムで精製しＳＮＤ１の回収量を検証した。精製品を電気泳動しＣＢＢにて染色後、デンシトメーターにより１０５ｋＤａの未分解ＳＮＤ１のバンド強度を測定した。その結果、図２左に示す通りＰＭＳＦ未添加では感染５日後（Ｄａｙ５）で分解による１０５ｋＤａ未分解ＳＮＤ１は消失していた。一方、１ｍＭ  ＰＭＳＦ添加により、Ｄａｙ５まで発現の上昇が確認された。
【００１９】
実施例４
実施例２、３によりＰＭＳＦの効果が確認できたため、ＰＭＳＦ濃度ならびに経日変化を検討した。Ｓｆ９細胞、ウイルス添加、培養上清回収は実施例２に従い実施した。実施例２のウエスタンブロッティングの結果より、ＳＮＤ１の検出が可能であることが明らかになったため金属キレートカラムによる精製をすることなしに培養上清中のＳＮＤ１をウエスタンブロッティングにより検出した。その結果を図３に示す。感染後４日目（Ｄａｙ４）では０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ以上の添加で分解産物の低減、１０５ｋＤａ未分解ＳＮＤ１の強いバンドが検出された。また、ＰＭＳＦ  ２ｍＭ添加では、１０５ｋＤａ未分解ＳＮＤ１以外の分解ＳＮＤ１もほとんど生じていないことが確認できる。感染後５日目（Ｄａｙ５）、６日目（Ｄａｙ６）においては０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ  ＰＭＳＦ添加群においても７０ｋＤａ付近の分解ＳＮＤ１が検出され、感染後７日目（Ｄａｙ７）までにＰＭＳＦ添加濃度依存的に１０５ｋＤａ未分解ＳＮＤ１の減少が認められる。２ｍＭ  ＰＭＳＦ添加ではＤａｙ７にて初めて分解物が多く生じていた。図４に経過ごとの生細胞数の結果を示す。２ｍＭ  ＰＭＳＦ添加以外のＳｆ９感染細胞はＤａｙ６までにほぼ全ての細胞が死滅している。一方、２ｍＭ  ＰＭＳＦでは約３０％の生細胞が存在し、死細胞数と分解産物生成に関連があることを示唆する結果である。
【００２０】
実施例５
実施例２、３、４ではＰＭＳＦをウイルス感染時に一過的に添加し、その後の添加を実施することなくＰＭＳＦの効果を検証した。ＰＭＳＦは水溶液中での半減期が数時間と短いため数日後のＰＭＳＦによる蛋白質分解酵素活性の阻害効果は弱まることが推察される。そこで、感染後、毎日０．１ｍＭ  ＰＭＳＦを添加し、一過性の添加に対して効果の比較実験を実施した結果を図５に示す。感染後３日目（Ｄａｙ３）まではＳＮＤ１分解物は認められないがＤａｙ４以降、ＳＮＤ１顕著な分解が認められ、Ｄａｙ５以降は１０５ｋＤａ未分解ＳＮＤ１が検出できず、ＰＭＳＦ未添加との明らかな差は認められない。また、Ｄａｙ５では最終的に０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ添加したことになるが、一過性で０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ添加に比べ優位性はなく低濃度で順次加えることの効果は認められなかった。図６に経過ごとの生細胞数の結果を示すが、実施４同様感染６日目にはほぼ全ての細胞が死滅していた。また、図には示さないが５ｍＭ以上のＰＭＳＦ添加はＰＭＳＦの細胞毒性により感染後２日目の時点で大半の細胞が死滅し、蛋白質の発現には至らない。
【００２１】
実施例６
実施例２に従い、各種蛋白質分解酵素阻害剤の効果を検証した。使用した蛋白質分解酵素阻害剤は、１ｍＭ  ＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルフォニルフロライド）、５０μｇ／ｍＬ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（アプロチニン）、５μＭ  Ｂｅｓｔａｔｉｎ（ベスタチン）、５μＭ  Ｅ−６４（Ｎ−［Ｎ−（Ｌ−３−トランスカルボキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシル］−アグマチン），２０μＭ  Ｌｅｕｔｅｐｔｉｎ（ロイペプチン）、１ｍＭ  ＰＭＳＦである。ＳＮＤ１の検出は実施例３同様ウエスタンブロッティングにより実施した。図７に示す通り、蛋白質分解酵素阻害剤未添加に比較し、ＡＥＢＳＦ、Ｅ−６４、Ｌｕｅｐｅｐｔｉｎ、ＰＭＳＦの４種の阻害剤が効果を示した。Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｂｅｓｔａｔｉｎは効果が認められなかった。効果が認められた４種の蛋白質分解酵素阻害剤では、感染４日目（Ｄａｙ４）では効果の差が大きくないものの日を重ねるに従い、ＡＥＢＳＦならびにＰＭＳＦは分解物が生成していることが明らかである。一方、Ｅ−６４およびＬｅｕｔｅｐｔｉｎはＤａｙ７においても分解物の産生が増えることのない極めて有効な蛋白質分解酵素阻害剤であることが明らかである。図８に経過ごとの生細胞数の結果を示すが、ＡＥＢＳＦは細胞死の遅延が認められるものの、Ｄａｙ６ではいずれの蛋白質分解酵素阻害剤添加群でも大半の細胞が死滅していた。結果は示さないが金属プロテアーゼ阻害剤であるＥＤＴA（エチレンジアミン四酢酸）はウイルス感染を妨害し、ウイルス添加後もＬｏｇ Ｐｈａｓｅでの細胞増殖が継続し、発現蛋白質の回収率が極めて低い。
【００２２】
実施例７
実施例６で最も効果の認められた蛋白質分解酵素阻害剤の一つであるＥ−６４に関し、使用濃度ならびにＳＮＤ１の発現の経過日数ごとの変化を検討した。図９に示す通り、１〜１０μＭの濃度範囲において、ＳＮＤ１の十分な発現、分解抑制が認められ、感染７日目（Ｄａｙ７）までその効果を維持していた。図１０に経過ごとの生細胞数の結果を示すが、Ｅ−６４未添加群に対しても細胞死プロファイルの差は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ウイルス感染５日後のＳｆ９培養上清より金属キレートカラムにより精製したＳＮＤ１のＣＢＢ染色像と、ウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図２】ウイルス感染３，４，５日後のＳｆ９培養上清より金属キレートカラムにより精製したＳＮＤ１のＣＢＢ染色像を左図に示す。右図は、ＣＢＢ染色像をデンシトメーターによりスキャンした際の強度（ＯＤ）を示す。図中（−）は、蛋白質分解酵素未添加を示す。
【図３】ＰＭＳＦ添加濃度変動によるＳｆ９培養上清中のＳＮＤ１の発現の経過日数ごとの変化をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。
【図４】ＰＭＳＦ添加濃度変動によるＳｆ９生細胞の経過日数ごとの変化を示す。
【図５】ＰＭＳＦ添加を毎日実施した際のＳｆ９培養上清中のＳＮＤ１の発現の経過日数ごとの変化をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。
【図６】ＰＭＳＦ添加を毎日実施した際のＳｆ９生細胞の経過日数ごとの変化を示す。
【図７】各種蛋白質分解酵素阻害剤添加によるＳｆ９培養上清中のＳＮＤ１の発現の経過日数ごとの変化をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。
【図８】各種蛋白質分解酵素阻害剤添加によるＳｆ９生細胞の経過日数ごとの変化を示す。
【図９】Ｅ−６４添加濃度変動によるＳｆ９培養上清中のＳＮＤ１の発現の経過日数ごとの変化をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。
【図１０】Ｅ−６４添加濃度変動によるＳｆ９生細胞の経過日数ごとの変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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