(57)【要約】【課題】タンパク質間相互作用における責任部位の同定方法、タンパク質間相互作用における責任部位として用いられるポリペプチドおよびタンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法の提供。【解決手段】任意のタンパク質を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド群を用いることにより、任意のタンパク質における責任部位を同定する。この同定方法により、タンパク質間相互作用における責任部位として用いられるポリペプチドを特定し、このポリペプチドを用いて被験物質によるタンパク質間相互作用の阻害の有無を調べることで、タンパク質間相互作用阻害剤をスクリーニングする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）のうち、タンパク質間相互作用の責任部位として用いられる次の１）〜４）のいずれかに記載のポリペプチド、
１）ＮＳ３のＮ末端側１番から１８９番のアミノ酸からなるポリペプチド、
２）ＮＳ３のＮ末端側１番から９４番のアミノ酸からなるポリペプチド、
３）ＮＳ４ＢのＮ末端側５０番から７４番のアミノ酸からなるポリペプチド、
４）ＮＳ４ＢのＮ末端側４０番から６３番のアミノ酸からなるポリペプチド。
【請求項２】
標識タンパク質と融合させた請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
標識タンパク質がＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇ
ＦＰ）、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ＲＦＰ、ｍＷａｓａｂｉ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍまたはｍＯｒａｎｇｅから選ばれるいずれか１つ以上である請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを発現させるためのプラスミド。
【請求項５】
請求項４に記載のプラスミドを大腸菌に導入した形質転換体。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを用いる、次の１）〜３）の工程を含むタンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法、
１）被験物質を添加した状態で、請求項１〜３のいずれかから選ばれる１つのポリペプチドと、請求項１〜３のいずれかから選ばれる１つのポリペプチドとのタンパク質間相互作用をアッセイする工程、
２）上記１）において、被験物質の添加によって、請求項１〜３のいずれかから選ばれる１つのポリペプチドと、それ以外の請求項１〜３のいずれかから選ばれる１つのポリペプチドとのタンパク質間相互作用が阻害されるか否かを調べる工程、
３）上記２）において、タンパク質間相互作用が阻害されている揚合に被験物質をタンパ
ク質聞相互作用阻害剤とする工程。
【請求項７】
「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」
を用い、「他のタンパク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化
して得たポリペプチド（Ｅ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化
して得たポリペプチドの群（Ｆ）」とのタンパク質間相互作用をアッセイすることにより、「任意のタンパク質（Ａ）」における責任部位を同定する方法。
【請求項８】
「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」
または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ
）」が、「任意のタンパク質（Ａ）」または「他のタンパク質（Ｄ）」を３残基以上４０
残基以下から成るアミノ酸領域に細分化して得たポリペプチドの群である請求項７に記載
の方法。
【請求項９】
「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」
または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ
）」が、標識タンパク質と融合された融合ポリペプチドの群である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標識タンパク質がＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇ
ＦＰ）、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ＲＦＰ、ｍＷａｓａｂｉ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍまたはｍＯｒａｎｇｅから選ばれるいずれか１つ以上である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
エピトープのマッピングに用いる請求項７〜１０のいずれかに証載の方法。
【請求項１２】
「任意のタンパク質（Ａ）」および／または「他のタンパク質（Ｄ）」がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタンパク質である請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
「任意のタンパク質（Ａ）」および／または「他のタンパク質（Ｄ）」がＣ型肝炎ウイル
ス（ＨＣＶ）の非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）がＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂのいずれかである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
「任意のタンパク質（Ａ）」がＮＳ４Ｂである、「他のタンパク質（Ｄ）」のＮＳ４Ｂに
おける責任部位を同定するための請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」
が、ＮＳ４Ｂの配列を１１の領域に細分化し、ＧＳＴと融合させた融合ポリペプチド（Ｇ
ＳＴ−４Ｂ１〜ＧＳＴ４Ｂ１１）をいずれか二つ以上含むポリペプチドの群である請求項
１５に記載の方法。
【請求項１７】
「他のタンパク質（Ｄ）」がＮＳ３である請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）」がＮＳ
３Ｎ，ＮＳ３Ｃ，ＮＳ３ＮＮ、ＮＳ３ＮＣのいずれかであり、「他のタンパク質（Ｄ）を
二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ）」がこれらのいずれか二つ以上
を含むものである請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＮＳ４ＢまたはＮＳ３Ｎを二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド。
【請求項２０】
標識タンパク質と融合させた請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ＧＳＴ−４Ｂｌ〜ＧＳＴ４Ｂｌ１のいずれかである請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ＧＳＴ−４Ｂｌ〜ＧＳＴ４Ｂ１１のいずれか二つ以上を含むポリペプチド群。
【請求項２３】
ＮＳ３Ｎ，ＮＳ３Ｃ，ＮＳ３ＮＮまたはＮＳ３ＮＣのいずれかである請求項１９に記載の
ポリペプチド。
【請求項２４】
ＮＳ３Ｎ，ＮＳ３Ｃ，ＮＳ３ＮＮまたはＮＳ３Ｎのいずれか二つ以上を含むポリペプチド
群。
【請求項２５】
次の１）〜３）の工程を含むタンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法、
１）被験物質を添加した状態で、「任意のタンパク質（Ａ）」、「任意のタンパク質（Ａ
）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」または「任意のタンパク質（
Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」を用い、「他のタンパ
ク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド
（Ｅ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド
の群（Ｆ）」とのタンパク質間相互作用をアッセイする工程、
２）上記１）において、被験物質の添加によって、「任意のタンパク質（Ａ）」、「任意
のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」または「任
意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」と、
「他のタンパク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得た
ポリペプチド（Ｅ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得た
ポリペプチドの群（Ｆ）」とのタンパク質間相互作用が阻害されるか否かを調べる工程、
３）上記２）において、タンパク質間相互作用が阻害されている揚合に被験物質をタンパ
ク質聞相互作用阻害剤とする工程。
【請求項２６】
「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」また
は「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）
」が、「任意のタンパク質（Ａ）」を３残基以上４０残基以下から成るアミノ酸領域に細
分化して得たポリペプチドまたはそのポリペプチドの群である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」また
は「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）
」が、細分化されたそれぞれの領域に標識タンパク質を融合させた融合ポリペプチドまた
はそのポリペプチドの群である請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
標識タンパク質がＧＳＴ、ＭＢＰまたはＧＦＰから選ばれるいずれか１つ以上である請求
項２７に記載の方法。
【請求項２９】
「任意のタンパク質（Ａ）」および／または「他のタンパク質（Ｄ）」がＣ型肝炎ウイル
ス（ＨＣＶ）のタンパク質である請求項２５〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
「任意のタンパク質（Ａ）」および／または「他のタンパク質（Ｄ）」がＣ型肝炎ウイル
ス（ＨＣＶ）の非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）がＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂのいずれかである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
「任意のタンパク質（Ａ）」がＮＳ４Ｂであって、「他のタンパク質（Ｄ）」がＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂのいずれかである請求項３０または３１に記載の
方法。
【請求項３３】
「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」また
は「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）
」が、ＮＳ４Ｂの配列をｌｌの領域に細分化し、ＧＳＴと融合させた融合ポリペプチド（
ＧＳＴ−４Ｂ１〜ＧＳＴ４Ｂ１１）またはそのポリペプチドをいずれか二つ以上含むポリ
ペプチドの群である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
「他のタンパク質（Ｄ）」がＮＳ３である請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）」がＮＳ
３Ｎ，ＮＳ３Ｃ，ＮＳ３ＮＮ、ＮＳ３ＮＣのいずれかであり、「他のタンパク質（Ｄ）を
二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ）」がこれらのいずれか二つ以上
を含むものである請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶとする）等のタンパク質における、タンパ
ク質間相互作用における責任部位の同定方法に関する。また、この方法によって同定された、タンパク質間相互作用における責任部位として用いられるポリペプチドに関する。さらに、このポリペプチドを用いるタンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、ＨＣＶ等のタンパク質について、タンパク質間相互作用における責任部位の
同定方法、この方法によって同定された、タンパク質間相互作用における責任部位として用いられるポリペプチド、およびタンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法に関する発明である。
ＨＣＶは、Ｃ型肝炎の病因とされるウイルスであり、ＨＣＶに感染するとＣ型肝炎から
肝硬変、肝癌へと進展することがある。わが国では肝癌の約８割がＨＣＶによるものとさ
れている。そのため、これらの疾病の治療や予防に有効な物質として、ＨＣＶの細胞への
感染やＨＣＶタンパク質の機能・他のタンパク質等への結合を阻害する方法等により、ＨＣＶの活動を阻害する物質のスクリーニングが行われている（例えば、特許文献１〜３、非特許文献１参照）。
【０００３】
ＨＣＶはＮ末端側からコア、エンベロープ１（Ｅｌ），エンベロープ２（Ｅ２），ｐ７，ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂと呼ばれる１０種類のタン
パク質をコードしている（図１）。これらは、ゲノムから翻訳される際にひとつづきのポ
リプロテインとして生成され、翻訳と同時進行的（ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａ１）に
切断がおこり、各々のタンパク質となる。コア、Ｅ１，Ｅ２はＨＣＶ粒子を構成する構造
タンパク質に分類され、その他のタンパク質はＨＣＶ粒子に含まれない非構造タンパク質
（以下、ＮＳタンパク質とする）と呼ばれる。一般的にＮＳタンパク質はウイルスゲノム
の複製や、宿主細胞の機能の阻害・撹乱などに関与するとされ、ＨＣＶにおいても、ＮＳ
２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５ＢのＮＳタンパク質が非共有結合に
よって互いに密接に相互作用し、各タンパク質が共同的に機能しながらゲノムの複製を行うと考えられている。ＨＣＶのタンパク質の機能やビリオン複製の機構については例えば、非特許文献２，３の総説にこれまで明らかになった知見が概説されている（非特許文献２，３参照）。
【０００４】
個々のＨＣＶタンパク質が持つ機能（例えばＮＳ３の持つプロテアーゼ活性やＮＳ５Ｂの持つＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成活性）のみならず、ＮＳタンパク質同士の相互作用もＨＣＶの複製に重要な役割を果たすと考えられることから（非特許文献４，５参照）、このＮＳタンパク質同士の相互作用を阻害することで、ＨＣＶの病原性の発揮を抑制できると考えられる。しかし、このような発想のもとにＮＳタンパク質同士の相互作用を阻害する物質が探索された例は知られておらず、新たなスクリーニング方法の提供が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ０１／０５８４５９
【特許文献２】特開２００６−７５０３８号公報
【特許文献３】特開平８−２０５８９３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｗｏｎｇ  Ａ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００８，  ８，  ５２２−５３１
【非特許文献２】Ｍｏｒａｄｐｏｕｒ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００７，  ５，  ４５３−４６３
【非特許文献３】Ｋａｔｏ  Ｎ．  Ａｃｔａ  Ｍｅｄ．  Ｏｋａｙａｍａ，  ２００１，  ５５，  １３３−１５９
【非特許文献４】Ｐａｒｅｄｅｓ  Ａ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２００８，  ８２，  １０６７１−１０６８３
【非特許文献５】Ｗoｒｋ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２００８，  ８２，  １０５１９−１０５３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＨＣＶ等のタンパク質について、タンパク質間相互作用における責任部位の
同定方法の提供を課題とする。また、この方法によって同定された、タンパク質間相互作用における責任部位として用いられるポリペプチドの提供を課題とする。さらに、このポリペプチドを用いるタンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＨＣＶ等のタンパク質
について、タンパク質間相互作用における責任部位の同定方法として、「任意のタンパク
質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」を用い、「他のタ
ンパク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプ
チド（Ｅ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプ
チドの群（Ｆ）」とのタンパク質間相互作用をアッセイすることによって、「他のタンパ
ク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド
（Ｅ）」等が特異的に作用し得る、「任意のタンパク質（Ａ）」における責任部位が同定
できることを見出した。
また、タンパク質問相互作用阻害剤のスクリーニング方法として、被験物質を添加した
状態で、「任意のタンパク質（Ａ）」、「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細
分化して得たポリペプチド（Ｂ）」または「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に
細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」を用い、「他のタンパク質（Ｄ）」、「他のタ
ンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）」または「他のタ
ンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ）」とのタンパ
ク質間相互作用をアッセイし、被験物質の添加によって、該タンパク質間相互作用が阻害
されるか否かを調べることにより、タンパク質間相互作用阻害剤をスクリーニングできる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（３５）の責任部位を同定する方法、タンパク質間相互作用における責任部位として用いられるポリペプチドおよびスクリーニング方法等に関する。
（１）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）のうち、タンパク質間相互作用の責任部位として用いられる次の１）〜４）のいずれかに記載のポリペプチド、
１）ＮＳ３のＮ末端側１番から１８９番のアミノ酸からなるポリペプチド、
２）ＮＳ３のＮ末端側１番から９４番のアミノ酸からなるポリペプチド）、
３）ＮＳ４ＢのＮ末端側５０番から７４番のアミノ酸からなるポリペプチド、
４）ＮＳ４ＢのＮ末端側４０番から６３番のアミノ酸からなるポリペプチド。
（２）標識タンパク質と融合させた請求項１に記載のポリペプチド。
（３）標識タンパク質がＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ＲＦＰ、ｍＷａｓａｂｉ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍまたはｍＯｒａｎｇｅから選ばれるいずれか１つ以上である請求項２にポリペプチド。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプチドを発現させるためのプラスミド。
（５）上記（４）に記載のプラスミドを大腸菌に導入した形質転換体。
（６）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプチドを用いる、次の１）〜３）の工程を含むタンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法、
１）被験物質を添加した状態で、上記（１）〜（３）のいずれかから選ばれる１つのポリペプチドと、上記（１）〜（３）のいずれかから選ばれる１つのポリペプチドとのタンパク質間相互作用をアッセイする工程、
２）上記１）において、被験物質の添加によって、上記（１）〜（３）のいずれかから選ばれる１つのポリペプチドと、上記（１）〜（３）のいずれかから選ばれる１つのポリペプチドとのタンパク質間相互作用が阻害されるか否かを調べる工程、
３）上記２）において、タンパク質間相互作用が阻害されている揚合に被験物質をタンパ
ク質聞相互作用阻害剤とする工程。
（７）「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（
Ｃ）」を用い、「他のタンパク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に
細分化して得たポリペプチド（Ｅ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に
細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ）」とのタンパク質間相互作用をアッセイすること
により、「任意のタンパク質（Ａ）」における責任部位を同定する方法。
（８）「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（
Ｃ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの
群（Ｆ）」が、「任意のタンパク質（Ａ）」または「他のタンパク質（Ｄ）」を３残基以
上４０残基以下から成るアミノ酸領域に細分化して得たポリペプチドの群である上記（７
）に記載の方法。
（９）「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（
Ｃ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの
群（Ｆ）」が、標識タンパク質と融合された融合ポリペプチドの群である上記（８）に記
載の方法。
（１０）標識タンパク質がＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ＲＦＰ、ｍＷａｓａｂｉ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍまたはｍＯｒａｎｇｅから選ばれるいずれか１つ以上である上記（９）に記載の方法。
（１１）エピトープのマッピングに用いる上記（７）〜（１０）のいずれかに証載の方法。
（１２）「任意のタンパク質（Ａ）」および／または「他のタンパク質（Ｄ）」がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタンパク質である上記（７）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）「任意のタンパク質（Ａ）」および／または「他のタンパク質（Ｄ）」がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）である上記（１２）に記載の方法。
（１４）非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）がＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂのいずれかである上記（１３）に記載の方法。
（１５）「任意のタンパク質（Ａ）」がＮＳ４Ｂである、「他のタンパク質（Ｄ）」のＮＳ４Ｂにおける責任部位を同定するための上記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群
（Ｃ）」が、ＮＳ４Ｂの配列を１１の領域に細分化し、ＧＳＴと融合させた融合ポリペプ
チド（ＧＳＴ−４Ｂ１〜ＧＳＴ４Ｂ１１）をいずれか二つ以上含むポリペプチドの群であ
る上記（１５）に記載の方法。
（１７）「他のタンパク質（Ｄ）」がＮＳ３である上記（１５）または（１６）に記載の方法。
（１８）「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）
」がＮＳ３Ｎ，ＮＳ３Ｃ，ＮＳ３ＮＮ、ＮＳ３ＮＣのいずれかであり、「他のタンパク質
（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ）」がこれらのいずれか
二つ以上を含むものである上記（１５）または（１６）に記載の方法。
（１９）ＮＳ４ＢまたはＮＳ３Ｎを二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド。
（２０）標識タンパク質と融合させた上記（１９）に記載のポリペプチド。
（２１）ＧＳＴ−４Ｂｌ〜ＧＳＴ４Ｂｌ１のいずれかである上記（２０）に記載のポリペ
プチド。
（２２）ＧＳＴ−４Ｂｌ〜ＧＳＴ４Ｂ１１のいずれか二つ以上を含むポリペプチド群。
（２３）ＮＳ３Ｎ，ＮＳ３Ｃ，ＮＳ３ＮＮまたはＮＳ３ＮＣのいずれかである上記（１９
）に記載のポリペプチド。
（２４）ＮＳ３Ｎ，ＮＳ３Ｃ，ＮＳ３ＮＮまたはＮＳ３ＮＣのいずれか二つ以上を含むポ
リペプチド群。
（２５）次の１）〜３）の工程を含むタンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法、
１）被験物質を添加した状態で、「任意のタンパク質（Ａ）」、「任意のタンパク質（Ａ
）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」または「任意のタンパク質（
Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」を用い、「他のタンパ
ク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド
（Ｅ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド
の群（Ｆ）」とのタンパク質間相互作用をアッセイする工程、
２）上記１）において、被験物質の添加によって、「任意のタンパク質（Ａ）」、「任意
のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」または「任
意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」と、
「他のタンパク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得た
ポリペプチド（Ｅ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得た
ポリペプチドの群（Ｆ）」とのタンパク質間相互作用が阻害されるか否かを調べる工程、
３）上記２）において、タンパク質間相互作用が阻害されている揚合に被験物質をタンパ
ク質聞相互作用阻害剤とする工程。
（２６）「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ
）」または「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの
群（Ｃ）」が、「任意のタンパク質（Ａ）」を３残基以上４０残基以下から成るアミノ酸
領域に細分化して得たポリペプチドまたはそのポリペプチドの群である上記（２５）に記
載の方法。
（２７）「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ
）」または「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの
群（Ｃ）」が、細分化されたそれぞれの領域に標識タンパク質を融合させた融合ポリペプ
チドまたはそのポリペプチドの群である上記（２５）または（２６）に記載の方法。
（２８）標識タンパク質がＧＳＴ、ＭＢＰまたはＧＦＰから選ばれるいずれか１つ以上で
ある上記（２７）に記載の方法。
（２９）「任意のタンパク質（Ａ）」および／または「他のタンパク質（Ｄ）」がＣ型肝
炎ウイルス（ＨＣＶ）のタンパク質である上記（２５）〜（２８）のいずれかに記載の方
法。
（３０）「任意のタンパク質（Ａ）」および／または「他のタンパク質（Ｄ）」がＣ型肝
炎ウイルス（ＨＣＶ）の非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）である上記（２９）に記載
の方法。
（３１）非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）がＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，
ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂのいずれかである上記（３０）に記載の方法。
（３２）「任意のタンパク質（Ａ）」がＮＳ４Ｂであって、「他のタンパク質（Ｄ）」が
ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂのいずれかである上記（３０）または（
３１）に記載の方法。
（３３）「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ
）」または「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの
群（Ｃ）」が、ＮＳ４Ｂの配列をｌｌの領域に細分化し、ＧＳＴと融合させた融合ポリペ
プチド（ＧＳＴ−４Ｂ１〜ＧＳＴ４Ｂ１１）またはそのポリペプチドをいずれか二つ以上
含むポリペプチドの群である上記（３２）に記載の方法。
（３４）「他のタンパク質（Ｄ）」がＮＳ３である上記（３２）または（３３）に記載の
方法。
（３５）「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）
」がＮＳ３Ｎ，ＮＳ３Ｃ，ＮＳ３ＮＮ、ＮＳ３ＮＣのいずれかであり、「他のタンパク質
（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ）」がこれらのいずれか
二つ以上を含むものである上記（３４）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の責任部位の同定方法によって、「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に
細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」を用いてアッセイを行うことで、「他のタンパ
ク質（Ｄ）」等が特異的に作用し得る、任意のタンパク質における責任部位が同定できる。
また、本発明のスクリーニング方法によって、Ｃ型肝炎等の疾病の治療のための阻害剤
をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法において、スクリーニ
ングされた阻害剤と、「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリ
ペプチド（Ｂ）」または「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポ
リペプチドの群（Ｃ）」を用いてアッセイを行うことで、スクリーニングされた阻害剤の
結合部位を同定することもできる。
そして、これらの方法を用いることにより、阻害剤スクリーニングキット等の実験用の
キットを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＨＣＶの遺伝子構造を示した図である。
【図２】タンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法の原理を示した図である。
【図３】ＮＳタンパク質の発現を示した図である（実施例３）。
【図４】ＮＳタンパク質の発現を示した図である（実施例３）。
【図５】精製した各ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（以下、ＧＳＴとする）融合ポリペプチドを示した図である（実施例３）。
【図６】ＮＳ４Ｂ全長と他のＮＳタンパク質の相互作用を示した図である（実施例３）。
【図７】ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂｌ〜ＧＳＴ−ＮＳ４ＢｌｌとＮＳ３Ｎとの相互作用を示した図である（実施例３）。
【図８】ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂｌ〜ＧＳＴ−ＮＳ４ＢｌｌとＮＳ３ＮＮおよびＮＳ３ＮＣとの相互作用を示した図である（実施例３）。
【図９】ＮＳ４Ｂ△３の反応性を示した図である（実施例３）。
【図１０】ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂｌ．５、ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ２．５およびＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ３．５とＮＳ３Ｎとの相互作用を示した図である（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「責任部位を同定する方法」は、「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」を用い、「他のタンパク質（Ｄ）」、「他の
タンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）」または「他の
タンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ）」とのタン
パク質間相互作用をアッセイすることにより、「他のタンパク質（Ｄ）」、「他のタンパ
ク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）」または「他のタンパ
ク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ）」が特異的に作用
し得る、「任意のタンパク質（Ａ）」における責任部位を同定する方法のことをいう。こ
の方法は、責任部位を同定するための他の工程を含むこともできる。
【００１３】
ここで「責任部位」とは、「任意のタンパク質（Ａ）」と「他のタンパク質（Ｄ）」、
「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）」または
「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ）」と
が相互作用する部位のことをいう。本発明の「責任部位を同定する方法」においては、「
任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」の
うち、いずれのポリペプチドに「他のタンパク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二
つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二
つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ）」が強く作用するかを調べること
で、任意のタンパク質における「責任部位」を同定することができる。本発明の「責任部
位を同定する方法」は責任部位を抗体等のエピトープとする、エピトープのマッピングに
も用いることができる。
【００１４】
本発明の「責任部位を同定する方法」の原理は次のように示すこともできる。
［発明の原理］
以下の工程１、２によって「任意のタンパク質（Ａ）」における、「他のタンパク質（
Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）
」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（
Ｆ）」が特異的に作用し得る責任部位を同定する。
工程１：タンパク質融合ポリペプチド群の作成
「任意のタンパク質（Ａ）」をアミノ酸３残基以上、任意の残基数からなる任意の領域
に分割する。分割したそれぞれのポリペプチドについて検出のための標識タンパク質を融
合し、「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（
Ｃ）」を作製する（Ａ１〜Ａｎ）。
工程２：責任部位の同定
「他のタンパク質（Ｄ）」を固定し、工程１で作成したＡ１〜Ａｎの「任意のタンパク
質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」を反応させ、結合
量を定量することにより、「任意のタンパク質（Ａ）」における責任部位を同定する。
【００１５】
本発明の「任意のタンパク質（Ａ）」または「他のタンパク質（Ｄ）」は、タンパク質
間相互作用をするタンパク質であればいずれのタンパク質でも良いが、例えば、ＨＣＶの
タンパク質であるＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂ等を挙げる
ことができる。
例えば、ＮＳ４Ｂを「任意のタンパク質（Ａ）」とする場合には、ＮＳ４Ｂとタンパク
質間相互作用をするＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂ等が「他のタンパク
質（Ｄ）」として挙げられる。
ＨＣＶのタンパク質は、遺伝子型１〜６（ｇｅｎｏｔｙｐｅ１〜６）のいずれにコード
されるタンパク質であってもよく、これらの遺伝子型におけるいずれのサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ（例えばｓｕｂｔｙｐｅ  １ｂ型等））にコードされるタンパク質であってもよい。さらに、同一サブタイプにおいても株（ｉｓｏｌａｔｅ）の違いによって生じる１０％近く相補性が異なる遺伝子や、感染者の体内に存在する微妙に配列の異なる無数の変異株（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）の遺伝子がコードするタンパク質であってもよい。インターフェロンの効きが悪く、また、日本で７０％を占める１ｂ型のＨＣＶ遺伝子がコードするタンパク質であることが特に好ましい。
【００１６】
本発明の「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（
Ｂ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（
Ｅ）」には、「任意のタンパク質（Ａ）」または「他のタンパク質（Ｄ）」を二つ以上の
領域に細分化して得たポリペプチドであれば、いずれのものも含まれる。この「任意のタ
ンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」または「他のタ
ンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）」を二つ以上含む
ものを、本発明においては「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得た
ポリペプチドの群（Ｃ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して
得たポリペプチドの群（Ｆ）」とする。これらのポリペプチド群は全体として、「任意の
タンパク質（Ａ）」または「他のタンパク質（Ｄ）」の全長をカバーしていることが好ましい。
【００１７】
ポリペプチドは、三つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドであれば、何残基からなってもよいが、例えば、任意のタンパク質を３残基以上４０残基以下のアミノ酸残基から
成る領域に細分化して得たポリペプチドであるが好ましく、特に１０残基以上ないし３０
残基程度のアミノ酸残基から成る領域に細分化して得たポリペプチドであることが好まし
い。また、細分化して得た各ポリペプチドのアミノ酸残基数は、それぞれ同じであっても、また異なっていても良い。
「二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」における各ポリペプチドは、
重なり合う領域を含んでいてもよい。例えば、ポリペプチド（１）は、任意のタンパク質
（Ａ）のＮ末端側１番から２０番のアミノ酸からなり、ポリペプチド（２）は、任意のタンパク質（Ａ）のＮ末端側１０番から３０番のアミノ酸からなり、ポリペプチド（３）は、任意のタンパク質（Ａ）のＮ末端側２０番から４０番のアミノ酸からなる、というものであってもよい。
【００１８】
このようなポリペプチドとして、例えば、ＨＣＶにおける責任部位を同定するためには、非共有結合による複合体の形成に関わる、ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのいずれかに含まれるポリペプチドが挙げられる。ＨＣＶは遺伝子配列の違いによって遺伝子型１〜６（ｇｅｎｏｔｙｐｅ１〜６）および各遺伝子型内でさらに細分される５０種類以上のサブタイプがあり、また同一サブタイプにおいても株（ｉｓｏｌａｔｅ）の違いによって遺伝子の配列が異なるというように、ゲノムの変異が大きいことが知られている。本発明で提供するポリペプチドは、ＨＣＶのどの遺伝子型またはサブタイプ（例えばｓｕｂｔｙｐｅ  １ｂ型等）にコードされるＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂを対象としてもよく、これらに含まれるいずれのポリペプチドであってもよい。前述（段落番号０００３）のように各ＮＳタンパク質はポリプロテインが切断されて産生されるが、たとえばサブタイプ１ｂＨＣＶにおいては非特許文献３に記載されているように、ＮＳ２はポリプロテインのアミノ酸８１０番−１０２６番、同様にＮＳ３は１０２７番―１６５７番、ＮＳ４Ａは１６５８番−１７１１番、ＮＳ４Ｂは１７１２番−１９７２番、ＮＳ５Ａは１９７３番−２４１９番、ＮＳ５Ｂは２４２０番−３０１０番からなる（図１参照）。
【００１９】
本発明のポリペプチドの特定においては、例えば、ＮＳ３のＮ末端側１番から２０番のアミノ酸からなるポリペプチド、ＮＳ３のＮ末端側１０番から３０番アミノ酸からなるポリペプチド等とアミノ酸の番号でポリペプチドを特定すれば、全ての遺伝子型に適用できる。なお、一部の遺伝子型においてＮＳ５Ａなど一部のＮＳタンパク質のアミノ酸数が若干異なることが知られており、もし該当する場合は特記する。
【００２０】
このような本発明のポリペプチドとして、例えば、ＨＣＶ（１ｂ型）における責任部位を同定するためのポリペプチドの場合、例えばＨＣＶ（１ｂ型）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列を１１の領域に細分化し、各領域をＧＳＴと融合させた融合ポリペプチド（ＧＳＴ−４Ｂ１〜ＧＳＴ４Ｂｌ１）等が挙げられる。このＧＳＴ−４Ｂ１〜ＧＳＴ４Ｂ１１の各ポリペプチドは、ＮＳ４Ｂのアミノ酸配列のうち、ＮＳ４Ｂ１はＮＳ４ＢのＮ末端側１番から２５番のアミノ酸、ＮＳ４Ｂ２は２６番から４９番のアミノ酸、ＮＳ４Ｂ３は５０番から７３番のアミノ酸、ＮＳ４Ｂ４は７４番から９９番のアミノ酸、ＮＳ４Ｂ５は１００番から１２４番のアミノ酸、ＮＳ４Ｂ６は１２５番から１４７番のアミノ酸、ＮＳ４Ｂ７は１４８番から１６９番のアミノ酸、ＮＳ４Ｂ８は１７０番から１９１番のアミノ酸、ＮＳ４Ｂ９は１９２番から２１７番のアミノ酸、ＮＳ４Ｂ１０は２１８番から２３９番のアミノ酸およびＮＳ４Ｂ１１は２４０番から２６１番のアミノ酸にそれぞれＧＳＴを融合したポリペプチドとして特定することができる。
また、ＨＣＶ（１ｂ型）のＮＳ４Ｂの一部を上記とは異なる位置で細分化し，各領域をＧＳＴと融合させた融合ポリペプチド（ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ１．５、ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ２．５およびＧＳＴ−Ｓ４Ｂ３．５）等も挙げることができ、このＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ１．５はＮＳ４ＢのＮ末端側１５番から３９番のアミノ酸、ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ２．５は４０番から６３番のアミノ酸およびＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ３．５は５９番から８２番のアミノ酸にそれぞれＧＳＴを融合したポリペプチドとして特定することができる。
さらに、ＨＣＶ（１ｂ型）のＮＳ３をＮ末端側とＣ末端側の２つの領域に細分化したポリペプチド（ＮＳ３Ｎ，ＮＳ３Ｃ）や、このうちのＮＳ３Ｎのアミノ酸配列をＮ末端側とＣ末端側にさらに細分化したポリペプチド（ＮＳ３ＮＮ，ＮＳ３ＮＣ）等も挙げることができ、このＮＳ３ＮはＮＳ３のＮ末端側１番から１８９番のアミノ酸、ＮＳ３Ｃは１９０番から６３１番のアミノ酸、ＮＳ３ＮＮは１番から９４番のアミノ酸およびＮＳ３ＮＣは９５番から１８９番のアミノ酸からなるポリペプチドとして特定することができる。
これらのポリペプチドは、ＧＳＴ以外にも、ＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＢＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）、ＥＹＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｍＷａｓａｂｉ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍまたはｍＯｒａｎｇｅなどを標識タンパク質として融合したポリペプチドであってもよい。
本発明においては、これらのポリペプチドを二つ以上組合せ、「任意のタンパク質（Ａ
）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」として用いることができ
る。
【００２１】
本発明の「責任部位を同定する方法」によって同定された、ＨＣＶのＮＳタンパク質のうち、タンパク質間相互作用の責任部位として用いられるポリペプチドとしては、例えば、次の１）〜４）のポリペプチドが挙がられる。
１）ＮＳ３のＮ末端側１番から１８９番のアミノ酸からなるポリペプチド、
２）ＮＳ３のＮ末端側１番から９４番のアミノ酸からなるポリペプチド、
３）ＮＳ４ＢのＮ末端側５０番から７４番のアミノ酸からなるポリペプチド、
４）ＮＳ４ＢのＮ末端側４０番から６３番のアミノ酸からなるポリペプチド。
ここで、「タンパク質間相互作用における責任部位として用いられるポリペプチド」とは  タンパク質間における相互作用において、責任部位となる部位を示すポリペプチドのことをいい、このような責任部位となる部位を示すポリペプチドであれば、上記１）〜４）のポリペプチドには限られない。
【００２２】
本発明における「プラスミド」には、本発明においてタンパク質間相互作用の責任部位の同定のために用いるポリペプチドやタンパク質を発現するためのプラスミドであればいずれのものも含まれる。例えば、ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５ＡまたはＮＳ５ＢをコードするＤＮＡ配列を、ｐＥＴ２１ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などに組み込んだものや、ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのいずれかに含まれるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ｐＥＴ２１ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などに組み込んだものなどが挙げられる。
また、本発明における「形質転換体」には、これらのポリペプチドやタンパク質を発現するためのプラスミドを宿主に組み込んだものであればいずれのものも含まれる。例えば、ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５ＡまたはＮＳ５ＢをコードするＤＮＡ配列を、ｐＥＴ２１ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に組み込んだものを、大腸菌ＫＲＸ株（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に導入したものなどが挙げられる。
【００２３】
本発明においては、これらのポリペプチドを用い、「タンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法」を行うこともできる。
本発明の「タンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法」は、次の１）〜３）の
工程を含む、タンパク質間相互作用阻害剤をスクリーニングするための方法のことをいい、これらの工程を含んでいれば、タンパク質間相互作用阻害剤をスクリーニングするため
の他の工程をさらに追加することができる。
１）被験物質を添加した状態で、「任意のタンパク質（Ａ）」、「任意のタンパク質（Ａ
）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」または「任意のタンパク質（
Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」を用い、「他のタンパ
ク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド
（Ｅ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド
の群（Ｆ）」とのタンパク質間相互作用をアッセイする工程、
２）上記１）において、被験物質の添加によって、「任意のタンパク質（Ａ）」、「任意
のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」または「任
意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」と、
「他のタンパク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得た
ポリペプチド（Ｅ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域に細分化して得た
ポリペプチドの群（Ｆ）」とのタンパク質間相互作用が阻害されるか否かを調べる工程、
３）上記２）において、タンパク質間相互作用が阻害されている場合に被験物質をタンパ
ク質聞相互作用阻害剤とする工程。
【００２４】
本発明の「タンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法」の原理を図２および次のように示すこともできる。
［発明の原理］
上記の「責任部位を同定する方法」の原理における工程１、２に、さらに次の３．の工
程を加え、責任部位特異的なタンパク質間相互作用阻害剤をスクリーニングする。
工程３：責任部位に特異的なタンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング
「他のタンパク質（Ｄ）」を固定し、工程２で同定した責任部位を含む「任意のタンパ
ク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」（仮にＡｘとする）
との相互作用を定量するアッセイ系において、タンパク質間相互作用阻害剤の候補とされる被験物質を加え、タンパク質間相互作用に対する阻害効果を解析する。
【００２５】
本発明の「タンパク質間相互作用阻害剤」とは、結合や複合体の形成等のタンパク質同
士の相互作用を阻害する物質や、その阻害に有効な成分を含む物質のことをいう。タンパ
ク質間の相互作用によって、ウイルスゲノムの複製等の人体等に悪影響を及ぼすタンパク
質間相互作用を抑制する剤であることが好ましい。このような「タンパク質間相互作用阻
害剤」として、例えば、ＨＣＶのＮＳタンパク質同士の相互作用を抑制する剤が挙げられ
る。
【００２６】
本発明の「被験物質」とは、タンパク質問相互作用阻害剤の候補として考えられる物質
のことをいい、医薬品として用いる可能性のある物質ならばいかなる物質でもよい。合成
化合物およびタンパク質などの生体分子、たとえば任意のタンパク質に特異的に結合して、他のタンパク質との結合を阻害し得る抗体等が挙げられる。
【００２７】
本発明の「タンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法」における「任意のタン
パク質（Ａ）」、「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプ
チド（Ｂ）」、「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチ
ドの群（Ｃ）」、「他のタンパク質（Ｄ）」、「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域
に細分化して得たポリペプチド（Ｅ）」または「他のタンパク質（Ｄ）を二つ以上の領域
に細分化して得たポリペプチドの群（Ｆ）」等は、上記の同定方法に記載されたものと同
じものを指す。
【００２８】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。
【実施例１】
【００２９】
＜責任部位を同定する方法＞
「任意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）
」を用い、「他のタンパク質（Ｄ）」とのタンパク質間相互作用をアッセイすることによ
り、「他のタンパク質（Ｄ）」が特異的に作用し得る、「任意のタンパク質（Ａ）」にお
ける責任部位を同定した。
【実施例２】
【００３０】
＜タンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニング方法＞
次の１）〜３）の工程を経ることで、タンパク質間相互作用阻害剤をスクリーニングし
た。
１）被験物質を添加した状態で、「任意のタンパク質（Ａ）」、「任意のタンパク質（Ａ
）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」または「任意のタンパク質（
Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」を用い、「他のタンパ
ク質（Ｄ）」とのタンパク質間相互作用をアッセイする工程、
２）上記１）において、被験物質の添加によって、「任意のタンパク質（Ａ）」、「任意
のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチド（Ｂ）」または「任
意のタンパク質（Ａ）を二つ以上の領域に細分化して得たポリペプチドの群（Ｃ）」と、
「他のタンパク質（Ｄ）」とのタンパク質間相互作用が阻害されるか否かを調べる工程、
３）上記２）において、タンパク質間相互作用が阻害されている揚合に被験物質をタンパ
ク質間相互作用阻害剤とする工程。
【実施例３】
【００３１】
実施例１に記載の責任部位を同定する方法を用いて責任部位の同定を行った。また、実
施例２に記載のスクリーニング方法を用いて阻害剤のスクリーニングを行った。
【００３２】
１．試料の調製
ＨＣＶのＮＳタンパク質の発現・精製
１）ＮＳ３（ＮＳ３Ｎ、ＮＳ３Ｃ、ＮＳ３ＮＮ，ＮＳ３ＮＣ），ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ｂ（Ｎ
Ｓ５ＢΔ）の作製
ＨＣＶ−Ｏ株（ＨＣＶ：１ｂ型）の全長の塩基配列（ＤＤＢＪ，ＥＭＢＬ，ａｎｄ  Ｇ
ｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ．ＡＢ１９１３３３）を含むプラスミ
ドｐＯＮ／Ｃ−５Ｂ／ＫＥ（Ｉｋｅｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２９（２００５）１３５０−１３５９）を用い、ＮＳタ
ンパク質を作製した。まずＮＳ３，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５ＢをコードするＤＮＡ配列を、ｐＯＮ／Ｃ−５Ｂ／ＫＥを鋳型としたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって増幅した。このとき、ＰＣＲプライマーにヒスチジン６残基から成るタグ（Ｈｉｓタグ）配列をコードする配列を含ませておき、作製するタンパク質のＮ末端ないしはＣ末端にＨｉｓタグが付加されるように設計した。ＮＳ３（配列表配列番号１），ＮＳ４Ｂ（配列表配列番号２）をコードするＤＮＡ配列をｐＥＴ３ａプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に組み込み、ＮＳ５Ｂ（配列表配列番号３）をコードするＤＮＡ配列をｐＥＴ２１ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に組み込んだ。できたプラスミドを大腸菌ＫＲＸ株（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に導入し、ラムノースを添加することによって、ＮＳ３，ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ｂをそれぞれ発現させた。各タンパク質はニッケルアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて公知の手法により精製した。
ＮＳ３およびＮＳ５Ｂについては、全長の発現産物が可溶化できなかったため、Ｎ末端
ドメイン（ＮＳ３のＮ末端側１番から１８９番のアミノ酸；配列表配列番号４、以下、ＮＳ３Ｎと示す，プロテアーゼドメイン）、Ｃ末端ドメイン（ＮＳ３のＮ末端側１９０番から６３１番のアミノ酸；配列表配列番号５、以下、ＮＳ３Ｃと示す、ヘリカーゼドメイン）に分割した。さらに、このＮＳ３ＮをＮ末端ドメイン（ＮＳ３のＮ末端側１番から９４番のアミノ酸；配列表配列番号６、以下、ＮＳ３ＮＮと示す）、Ｃ末端ドメイン（ＮＳ３のＮ末端側９５番から１８９番のアミノ酸；配列表配列番号７、以下、ＮＳ３ＮＣと示す）に分割した。
また、ＮＳ５Ｂについても、可溶性のタンパク質を作製するために、Ｃ末端部位に存在
する２１アミノ酸の疎水性領域（ＮＳ５ＢのＮ末端側５７１番から５９１番のアミノ酸）を欠失させたＮＳ５ＢΔ（配列表配列番号８）を作製した。得られたＮＳタンパク質の精製標品を図３、４に示した。
【００３３】
２）ＮＳ４Ｂ△３の作製
ＮＳ４ＢからＮＳ４Ｂ３部位のアミノ酸配列（ＮＳ４ＢのＮ末端側５０番から７３番のアミノ酸）を欠失させたＮＳ４Ｂ△３（ＮＳ４ＢのＮ末端側１番から４９番のアミノ酸配列および７４番から２６１番のアミノ酸配列を連結したもの；配列表配列番号９）をコードするＤＮＡ配列をｐＥＴ３ａプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に組み込みＮＳ４Ｂ△３を大腸菌（ＫＲＸ株（Ｐｒｏｍｅｇａ社））において発現させ、精製した。
【００３４】
２．１１領域に分割したＮＳ４Ｂ融合ポリペプチドの作製
ＮＳ４Ｂを１１領域に分割したものをそれぞれｐＧＥＸ−２Ｔベクター（ＧＥ社）に組み込み大腸菌（ＴＧ１株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社））において発現させ、精製することで１１個のＧＳＴ融合ポリペプチドを得た。
ＮＳ４Ｂの分割はＮ末端ドメインを３領域、中央ドメインを５領域、Ｃ末端ドメインを
３領域にそれぞれ分けることで行った。１１領域に分割した各ポリペプチドは２２〜２６
アミノ酸より成るポリペプチドであり、それぞれＮＳ４Ｂ１（ＮＳ４ＢのＮ末端側１番から２５番のアミノ酸；配列表配列番号１０）、ＮＳ４Ｂ２（同２６番から４９番のアミノ酸；配列表配列番号１１）、ＮＳ４Ｂ３（同５０番から７３番のアミノ酸；配列表配列番号１２）、ＮＳ４Ｂ４（同７４番から９９番のアミノ酸；配列表配列番号１３）、ＮＳ４Ｂ５（同１００番から１２４番のアミノ酸；配列表配列番号１４）、ＮＳ４Ｂ６（同１２５番から１４７番のアミノ酸；配列表配列番号１５）、ＮＳ４Ｂ７（同１４８番から１６９番のアミノ酸；配列表配列番号１６）、ＮＳ４Ｂ８（同１７０番から１９１番のアミノ酸；配列表配列番号１７）、ＮＳ４Ｂ９（同１９２番から２１７番のアミノ酸；配列表配列番号１８）、ＮＳ４Ｂ１０（同２１８番から２３９番のアミノ酸；配列表配列番号１９）およびＮＳ４Ｂ１１（同２４０番から２６１番のアミノ酸；配列表配列番号２０）であった。得られた各ＧＳＴ融合ポリペプチド（ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ１〜ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂｌ１、配列表配列番号２１〜３１）を図５に示した。
また、ＮＳ４Ｂの一部を分割したＮＳ４Ｂ１．５（ＮＳ４ＢのＮ末端側１５番から３９番のアミノ酸）、ＮＳ４Ｂ２．５（同４０番から６３番のアミノ酸）およびＮＳ４Ｂ３．５（ＮＳ４ＢのＮ末端側５９番から８２番のアミノ酸）についても同様に、大腸菌に発現させることで３個のＧＳＴ融合ポリペプチド（ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ１．５、ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ２．５およびＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ３．５）を得た。
【００３５】
３．ＥＬＩＳＡ法によるタンパク質間相互作用の測定
１）ＮＳ４Ｂ（全長）のタンパク質間相互作用の測定
上記１で作製したＮＳ３Ｎ，ＮＳ３ＣまたはＮＳ５Ｂ△をＥＬＩＳＡプレートに固定し、ＮＳ４Ｂ（全長）とのタンパク質間相互作用を調べた。
ＥＬＩＳＡプレート１ウェルあたり１μｇのＮＳ３Ｎ，ＮＳ３ＣまたはＮＳ５Ｂ△をそれぞれＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）５０μｌに溶解して加え、４℃で十二時間以上静置することにより固定した。
ＮＳ４Ｂ（全長）はｍｙｃタグ（配列表配列番号３２）を付加したものを用いた。その
結果、図６に示したように、ＮＳ４Ｂ（全長）は、ＮＳ３ＮおよびＮＳ５Ｂ△に強く作用
することが示された。
【００３６】
２）ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ１〜ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂｌ１を用いた責任部位の同定（１）
上記１．１）で作製したＮＳ３Ｎを上記３．１）と同様の方法によってＥＬＩＳＡプレートに固定し、上記２で作製したＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ１〜ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂｌ１およびコン
トロールとしてポリペプチドを付加していないＧＳＴをそれぞれ反応させ、抗ＧＳＴ抗体
（ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体（ＧＥ社））および抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰ
（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅを反応させた後、ペルオキシダーゼ発色反応により定量した。
その結果、図７に示したように、ＮＳ３Ｎに対してＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ３が最も強く相互作用し、もっとも重要な責任部位であることが示された。
【００３７】
３）ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ１〜ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂｌ１を用いた責任部位の同定（２）
上記１．１）で作製したＮＳ３ＮＮおよびＮＳ３ＮＣを上記３．１）と同様の方法によってそれぞれＥＬＩＳＡプレートに固定し、上記２で作製したＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ１〜ＧＳ
Ｔ−ＮＳ４Ｂｌ１およびＧＳＴをそれぞれ反応させ、上記３．２）と同様の方法によって
責任部位の同定を行った。
その結果、図８に示したように、ＮＳ３ＮＮおよびＮＳ３ＮＣのいずれにおいてもＧＳ
Ｔ−ＮＳ４Ｂ３が最も強く相互作用し、特にＮＳ３ＮＮにおいて重要な責任部位であることが示された。
【００３８】
４）ＮＳ４Ｂ△３のタンパク質間相互作用の測定
上記１．２）で作製したＮＳ４Ｂ△３にｍｙｃタグを付加したＮＳ４Ｂ△３を用いて、
上記１．１）で作製したＮＳ３ＮをＥＬＩＳＡプレートに固定し、相互作用させた。その
結果、図９に示したように、野生型ＮＳ４Ｂより相互作用が弱いことが示された。
【００３９】
５）ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ１．５、ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ２．５およびＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ３．５を用いた責任部位の同定（３）
上記１．１）で作製したＮＳ３Ｎを上記３．１）と同様の方法によってＥＬＩＳＡプレートに固定し、上記２で作製したＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ１．５、ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ２．５、ＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ３．５、比較としてＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ３および陰性対照としてポリペプチドを付加していないＧＳＴをそれぞれ反応させ、抗ＧＳＴ抗体（ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体（ＧＥ社））および抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅを反応させた後、ペルオキシダーゼ発色反応により定量した。
その結果、図１０に示したように、ＮＳ３Ｎに対してＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ２．５がＧＳＴ−ＮＳ４Ｂ３よりも強く相互作用し、もっとも重要な責任部位であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の責任部位の同定方法によって、タンパク質間相互作用における任意のタンパク
質における責任部位を同定することができる。この責任部位の同定によって、責任部位を
対象とする医薬品の開発などに役立てることができる。
また、本発明のスクリーニング方法によって、Ｃ型肝炎等の疾病の治療のための阻害剤
をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法によって得られた阻害
剤は、Ｃ型肝炎等の疾病の治療薬に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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