(57)【要約】【課題】他の細胞から象牙芽細胞へ効率的に細胞分化させる細胞分化装置を提供する。【解決手段】細胞分化装置１００は、筒状のチャンバ１３０と、加圧部１１０とを有する。チャンバ１３０は、多数の凹部からなる多凹面部１３２を有する天井膜１３１を、凹部開口がチャンバ内側に向けて配置される。多凹面部１３２には幹細胞が付着される。圧力部１１０は、多凹面部１３２に周期的に圧力をかける。刺激を与えられた幹細胞は、細胞突起を凹部１３２ａ内に伸ばした状態で象牙芽細胞に分化する。幹細胞は、例えば歯髄幹細胞である。加圧部からの圧力は、機械加圧又は静水圧加圧である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の凹部からなり幹細胞が付着される多凹面部を有する天井膜を、凹部開口がチャンバ内側に向けて有する筒状のチャンバと、前記多凹面部に周期的に圧力をかけることにより前記幹細胞に刺激を与え、幹細胞の細胞突起を前記凹部内に伸ばした状態で前記幹細胞を象牙芽細胞に分化させる加圧部とを有することを特徴とする細胞分化装置。
【請求項２】
前記幹細胞は、歯髄幹細胞、骨髄幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、及びｉＰＳ細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求項１記載の細胞分化装置。
【請求項３】
前記加圧部に印加するパルス電気信号の波形は、正弦波、余弦波、矩形波、台形波、鋸波、三角波、又はこれらの合成波の何れか一つであることを特徴とする請求項１又は２項に記載の細胞分化装置。
【請求項４】
前記加圧部における加圧は、前記チャンバの天井膜側から軸方向に周期的にかかる機械加圧であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の細胞分化装置。
【請求項５】
前記加圧部における加圧は、前記チャンバを耐圧容器内の媒体中に浸漬し、前記チャンバの外面に一様な等方圧を作用させる静水圧加圧であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の細胞分化装置。
【請求項６】
前記機械加圧による圧力は、０．７５Ｎ／ｍ２以上１．５Ｎ／ｍ２以下であることを特徴とする請求項４記載の細胞分化装置。
【請求項７】
前記静水圧加圧による圧力は、０．５ＭＰａ以上１．０ＭＰａ以下であることを特徴とする請求項５記載の細胞分化装置。
【請求項８】
前記凹部の内部の形状は、深さが１μｍ以上２０μｍ以下であり、直径が１μｍ以上１２μｍ以下である略円柱形状であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の細胞分化装置。
【請求項９】
前記天井膜は、表面にＩ型コラーゲンがコートされたシリコン膜であることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の細胞分化装置。
【請求項１０】
前記チャンバ内に細胞分化を促進する分化培地が含有され、前記分化培地中及び前記天井膜の少なくとも何れか一方に、骨形成因子（Bone Morphogenetic Proteins）又はｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）が含有されることを特徴とする請求項１乃至９の何れか１項に記載の細胞分化装置。
【請求項１１】
前記骨形成因子は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＢＭＰ１１、ＧＤＦ５及びＧＤＦ６のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求項１０記載の細胞分化装置。
【請求項１２】
前記チャンバの内部空間の形状は、歯牙う触により生じる象牙質の空隙形状であることを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１項に記載の細胞分化装置。
【請求項１３】
前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることを特徴とする請求項２記載の細胞分化装置。
【請求項１４】
多数の凹部からなる多凹面部を有する天井膜を、凹部開口がチャンバ内側に向けて有する筒状のチャンバの前記多凹面部に幹細胞を付着させる工程と、前記チャンバの天井膜側から軸方向に周期的に圧力をかけることにより前記幹細胞に刺激を与え、幹細胞の細胞突起を前記凹部内に伸ばした状態で前記幹細胞を象牙芽細胞に分化させる工程とを有することを特徴とする細胞分化方法。
【請求項１５】
多数の凹部からなる多凹面部を有する天井膜を、凹部開口がチャンバ内側に向けて有する筒状のチャンバの前記多凹面部に幹細胞を付着させる工程と、前記チャンバの天井膜側から軸方向に周期的に圧力をかけることにより前記幹細胞に刺激を与え、幹細胞の細胞突起を前記凹部内に伸ばした状態で前記幹細胞を象牙芽細胞に分化させる工程とを有する細胞分化方法により得られる分化誘導された象牙芽細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞を象牙芽細胞に分化させるための細胞分化装置、幹細胞を象牙芽細胞に分化させる細胞分化方法、及びその細胞分化方法を使用して分化誘導された象牙芽細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、う蝕歯等の治療方法において、う蝕が深くて歯髄にまで達している場合、歯髄全部を除去して空隙に根管充填材（剤）を充填して封鎖する処置（抜髄処置）が採られることが多かった。
【０００３】
しかしながら、歯髄除去後は、血管による歯（象牙質・歯髄）の物質代謝が絶たれるため象牙質が脆弱化し割れやすくなる。また、痛みを伝える神経が無くなるので、再びう蝕が進行した場合に自覚症状が得られず、さらに感染抵抗力もなくなるので、予期せぬ間にう蝕が悪化するという問題点がある。従って、近年では、歯の健康状態を維持し長持ちさせるためにはむしろ歯髄を保存するのが好ましいと考えられている。
【０００４】
歯髄を保存するには、露出した歯髄表面（露髄面）を覆髄剤で覆う直接覆髄法と、歯髄の一部のみを除去し、根部歯髄を覆髄剤で覆う生活歯髄切断法とがあり、いずれも歯髄を感染から保護するために用いられる。歯髄の保存を考慮した場合、歯髄の外側（冠部側）に象牙質が形成されることが重要であり、特許文献１〜２には、歯髄露出部に注射等により適用する覆髄剤が記載されている。
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の覆髄剤は血液抽出物を有効成分として用いるものであるが、象牙質形成促進能及び安全性の観点から問題点がある。また、特許文献２に記載の覆髄剤はＮ−アセチルグルコサミンを有効成分とするものであるが、細胞表層や細胞間物質であって象牙芽細胞分化誘導のために必須の形態形成因子・細胞増殖分化因子・細胞遊走因子が含まれず、間接的に局所で遊離した因子を吸着するにすぎないため、象牙質形成促進及び象牙質・歯髄複合体の再生には不十分であるという問題点がある。
【０００６】
そこで、試験管内で歯髄又は他組織の幹細胞から象牙芽細胞を細胞分化させ、細胞分化により得られた象牙芽細胞から象牙質を形成し、形成した象牙質をう触により失われた歯髄露出部に移植するという手法が考えられる。
【０００７】
例えば、非特許文献１には、ヒト歯髄細胞を燐酸三カルシウムとハイドロキシアパタイトとの複合体粉体に播種した試料をヌードマウス皮下へ移植して摘出することが開示されている。摘出後のヘマトキシリン／エオシン染色像から硬組織の形成が確認され、さらにこの試料から抽出したRNAを、RT-PCRを用いて評価したところ、硬組織が象牙質様組織であったことが記載されている。しかしながら形成された硬組織の量は非常に少なく、臨床応用の見地からは効率的な象牙芽細胞への効率的な分化手法が求められる。
【０００８】
また、非特許文献２には、生体外で歯髄幹細胞を抽出し、その歯髄幹細胞に骨形成因子（Bone Morphogenetic Proteins：ＢＭＰ）蛋白質の投与又はＢＭＰ遺伝子を導入し、三次元培養を行い分化した象牙芽細胞を露出歯髄面上に移植する象牙質の再生が記載されている。しかしながら、再生される象牙質は細管構造を持たない骨様象牙質であり、方向性を規定できず物理学的性質が細管象牙質に比べて劣る。
【０００９】
また、特許文献３には、MIP-3α（Macrophage inflammatory protein-3alpha）受容体の発現を誘導する分化因子及びMIP-3αの存在下にて、間葉系幹細胞から象牙芽細胞を製造する方法が記載されているが、特許文献３に記載されている方法では細胞分化効率は十分なものとはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００２−３６３０８４号公報
【特許文献２】特開平６−２５６１３２号公報
【特許文献３】再表２００６−００９２９１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】S.Gronthosら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,5;97(25)：13625-30
【非特許文献２】Nakashima and Reddi, 2003;Nakashima and Akamine, 2006（PMID 12949568 doi 10.1038/nbt864;PMID:16186748）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、歯髄又は他組織の幹細胞から象牙芽細胞へ効率的に細胞分化させる装置、歯髄又は他組織の幹細胞から象牙芽細胞へ効率的に細胞分化させる方法、及び、その方法を使用して得られる象牙芽細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係る細胞分化装置は、多数の凹部からなり幹細胞が付着される多凹面部を有する天井膜を、凹部開口がチャンバ内側に向けて有する筒状のチャンバと、前記多凹面部に周期的に圧力をかけることにより前記幹細胞に刺激を与え、幹細胞の細胞突起を前記凹部内に伸ばした状態で前記幹細胞を象牙芽細胞に分化させる加圧部とを有することを特徴とする。
【００１４】
前記幹細胞は、歯髄幹細胞、骨髄幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、及びｉＰＳ細胞のうち少なくとも何れか一つを含むものであることが好ましい。
【００１５】
また、前記加圧部に印加する駆動波形が、正弦波、余弦波、矩形波、台形波、鋸波、三角波、又はこれらの合成波の何れか一つであることが好ましい。
【００１６】
また、前記加圧部における加圧は、前記チャンバの天井膜側から軸方向に周期的にかかる機械加圧であることが可能である。
【００１７】
また、前記加圧部における加圧は、前記チャンバを耐圧容器内の媒体中に浸漬し、前記チャンバの外面に一様な等方圧を作用させる静水圧加圧であることが可能である。
【００１８】
前記機械加圧による圧力は、０．７５Ｎ／ｍ２以上１．５Ｎ／ｍ２以下であることが好ましい。
【００１９】
前記静水圧加圧による圧力は、０．５ＭＰａ以上１．０ＭＰａ以下であることが好ましい。
【００２０】
また、前記凹部の内部の形状は、深さが１μｍ以上２０μｍ以下であり、直径が１μｍ以上１２μｍ以下である略円柱形状であることが好ましい。
【００２１】
また、前記天井膜は、表面にプラズマ処理された酸素透過性のシリコン膜であることが好ましい。
【００２２】
更に、前記チャンバ内に細胞分化を促進する分化培地が含有され、前記分化培地中及び前記天井膜の少なくとも何れか一方に、骨形成因子（Bone Morphogenetic Proteins）又はｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）が含有されることが好ましい。
【００２３】
前記骨形成因子は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＢＭＰ１１、ＧＤＦ（Growth Differentiation Factor）５及びＧＤＦ６のうち少なくとも何れか一つを含むものであることが好ましい。
【００２４】
前記チャンバは、歯牙う触により生じる象牙質の空隙形状であることが好ましい。
【００２５】
前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることが好ましい。
【００２６】
また、本発明に係る細胞分化方法は、多数の凹部からなる多凹面部を有する天井膜を、凹部開口がチャンバ内側に向けて有する筒状のチャンバの前記多凹面部に幹細胞を付着させる工程と、前記チャンバの天井膜側から軸方向に周期的に圧力をかけることにより前記幹細胞に刺激を与え、幹細胞の細胞突起を前記凹部内に伸ばした状態で前記幹細胞を象牙芽細胞に分化させる工程とを有することを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る象牙芽細胞は、多数の凹部からなる多凹面部を有する天井膜を、凹部開口がチャンバ内側に向けて有する筒状のチャンバの前記多凹面部に幹細胞を付着させる工程と、前記チャンバの天井膜側から軸方向に周期的に圧力をかけることにより前記幹細胞に刺激を与え、幹細胞の細胞突起を前記凹部内に伸ばした状態で前記幹細胞を象牙芽細胞に分化させる工程とを有する細胞分化方法により得られる分化誘導された象牙芽細胞である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、歯髄幹細胞等の幹細胞から短時間で安全にしかも大量に象牙芽細胞を分化させることができる。分化させた象牙芽細胞からは象牙質を得ることができ、これを患者のう触により生じた空隙に移植することで適切なう触治療ができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】（ａ）,（ｂ）は、機械加圧による加圧部を有する第１実施形態に係る細胞分化装置を示した展開図であり、そのうち（ａ）は全体を説明するものであり、（ｂ）は内側に複数個の凹部を有する天井膜を説明する断面図である。
【図２】（ａ）,（ｂ）は、機械加圧による加圧部を有する第１実施形態に係る細胞分化装置を示した展開図であり、そのうち（ａ）は組み立て途中を説明するものであり、（ｂ）は装置の概観図である。
【図３】第１実施形態に係る細胞分化装置の加圧部の断面図である。
【図４】（ａ）,（ｂ）は、天井膜の複数個の凹部を説明する説明図であり、そのうち（ａ）は複数個の凹部の平面図であり、（ｂ）は複数個の凹部の断面図である。
【図５】パルス電気信号の波形を説明する説明図であり、（ａ）は正弦波若しくは余弦波であり、（ｂ）は矩形波であり、（ｃ）は台形波であり、（ｄ）は鋸波であり、（ｅ）は三角波である。
【図６】台形波の波形の変形例を示す説明図である
【図７】（ａ）〜（ｄ）は幹細胞が象牙芽細胞に分化して基質を形成することを説明する図であり、そのうち（ａ）は、最初、幹細胞が複数個の凹部に付着する状態を説明する断面図であり、（ｂ）は加圧により細胞が突起を伸ばして象牙芽細胞に分化する状態を説明する断面図であり、（ｃ）は象牙芽細胞が象牙質基質を形成しながら後退する状態を説明する断面図であり、（ｄ）はスキャフォールドとともに注入された歯髄幹細胞が歯髄細胞を含む歯髄組織として三次元構築（バイオ歯が形成）される状態を説明する断面図である。
【図８】チャンバ内部の空間が歯牙う触により生じる象牙質の空隙形状である他の実施形態に係る細胞分化装置の展開図である。
【図９】静水圧加圧による加圧部を有する第２実施形態に係る細胞分化装置の断面図である。
【図１０】第３実施形態に係る細胞分化装置の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（第１実施形態）
以下、添付の図面を参照して本発明の第１実施形態について具体的に説明する。図１（ａ）は、機械加圧による加圧部を有する第１実施形態に係る細胞分化装置全体を説明するものであり、図１（ｂ）は内側に複数個の凹部を有する天井膜を説明する断面図である。図２（ａ）は、第１実施形態に係る細胞分化装置の組み立て途中を説明するものであり、図２（ｂ）は第１実施形態に係る細胞分化装置の概観図である。図３は、第１実施形態に係る細胞分化装置の加圧部の断面図である。図４（ａ）は天井膜の複数個の凹部の平面図であり、図４（ｂ）は天井膜の複数個の凹部の断面図である。
【００３１】
本実施形態に係る細胞分化装置１００は、図１（ａ）に示すように、筒状のチャンバ１３０と、加圧部１１０とを有する。
【００３２】
筒状のチャンバ１３０は、筒体１３３と、筒体１３３の上部に載置される天井膜１３１とを有する。天井膜１３１の厚みは、例えば２００μｍ〜１０００μｍである。筒体１３３の内部空間１３４は、上下面が解放するように形成されている。筒体１３３は円筒形状であるが、このような形状に限定されることはなく角筒体等の種々の形状を採用することができる。筒体１３３の高さは例えば５ｍｍ〜１０ｍｍであり、直径は例えば２５ｍｍ〜３０ｍｍである。内部空間１３４の内径は例えば２ｍｍ〜１２ｍｍである。内部空間１３４の容積は、例えば３００ｍｍ３〜１３００ｍｍ３、好ましくは３９０ｍｍ３〜１１３０ｍｍ３である。図１（ｂ）に示すように、天井膜１３１には、多数の凹部１３２ａからなる多凹面部１３２が形成されている。凹部１３２ａは、深さ方向が一定方向を指向して配列されている。なお、内部空間１３４内に、幹細胞の分化のための小型のアダプタチャンバを配置することも可能である。
【００３３】
天井膜１３１は、その多数の凹部１３２ａの開口がチャンバ１３０の内側に向くように配置して、筒体１３３の上部に載置される。天井膜１３１は、生体親和性及びガス透過性を有する材質から形成される。細胞へ酸素を供給し且つ細胞から不要な二酸化炭素及び代謝産物を排出することによりチャンバ１３０内の環境を生体環境に近づけるためである。
【００３４】
天井膜１３１は、例えばシリコンハイドロゲルで形成される。シリコンハイドロゲルを用いることにより、レーザー等により凹部１３２ａを形成することなく、天井膜１３１を成形すると同時に凹部１３２ａも形成できる。例えば、窩洞修復形態に準じたキャビティを有する鋳型に、象牙細管様の凹部１３２ａを形成可能な成形部位（具体的には凸状部）を備えさせることで、成形と同時に凹部１３２ａを形成できる。シリコンハイドロゲルは、ポリシロキサン骨格とポリカーボネート骨格を含むコポリマーと、親水性モノマーを重合した親水性ポリマーからなり、該コポリマーと親水性ポリマーの相互網目構造を有する透明ゲルを用いることができる。シリコンハイドロゲル以外にもポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ジメチルシロキサングリセロールメタアクリレート、ヒドロキシエチルメタアクリレート等のエラストマーで天井膜１３１を形成することも可能である。なお、外部観察を容易にするため、透明な材料で天井膜１３１を形成することが好ましい。
【００３５】
天井膜１３１の表面には、幹細胞が付着しやすいように、膜表面をプラズマ処理した後にコラーゲンコート処理がなされる。コラーゲンコートに使用されるコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンを用いることが好ましい。Ｉ型コラーゲンとは、基本的コラーゲンであり、繊維性コラーゲンである。
【００３６】
蓋体１２０は、外部の物理的衝撃等から天井膜１３１を保護するためのものである。蓋体１２０は柔軟性を有するとともに物理的衝撃にも耐性を有する材料から形成される。更には蓋体１２０もガス透過性を有する材料で形成されることが好ましい。蓋体１２０も天井膜１３１と同様の材質で形成することができる。蓋体１２０の中央部には穴１２１が設けられている。
【００３７】
加圧部１１０は、チャンバ１３０の天井膜１３１側から、穴１２１を介して、チャンバ１３０の軸方向に矢印Ｓで示すように周期的に加圧板１１９にて天井膜１３１に対して圧力をかける。
【００３８】
図２（ａ）に示すように、チャンバ１３０は、カップ１４０内部に載置され、天井膜１３１の上に蓋体１２０が載置される。そして、図２（ｂ）に示すように、加圧板１１９が穴１２１に入り込み、天井膜１３１の上に加圧板１１９が置かれる。筒体１３３の内部空間１３４の上部は、天井膜１３１で蓋される。筒体１３３の内部空間１３４の下部は、カップ１４０の下面１４１で蓋される。
【００３９】
加圧部１１０は、多凹面部１３２に周期的に圧力をかけることができるものであれば、任意の機構を使用することができる。本実施形態では、図３に示すように、加圧部１１０は、アクチュエータ２５０と、天井膜１３１を加圧する加圧板１１９と、アクチュエータ２５０の振動を加圧板１１９に伝達する振動棒１１８とを有する。
【００４０】
アクチュエータ２５０は、制御回路１１１と、円盤状の第１ヨーク１１２と、第２ヨーク１１３と、マグネット１１４と、コイル１１５と、コイルボビン１１６とを有する。アクチュエータ２５０はケース１１７に収納されている。
【００４１】
第２ヨーク１１３の内側には、振動棒１１８の振動方向Ｓに着磁されたマグネット１１４が内蔵されている。マグネット１１４には、円板状の第１ヨーク１１２が取り付けられている。マグネット１１４、第１ヨーク１１２及び第２ヨーク１１３により磁気回路が構成される。
【００４２】
マグネット１１４と第２ヨーク１１３との間の隙間空間には、コイル１１５が巻回されたコイルボビン１１６が出入りする。コイル１１５には、給電線が接続されており、その給電線は駆動用のＩＣ等の制御回路１１１に電気的に接続されている。この制御回路１１１からパルス電気信号がアクチュエータ２５０に供給される。加圧板１１９には圧力状況を検知する圧力センサが配置され、多凹面部１３２にかかる圧力をモニタして、振動棒１１８の変位量を制御する制御手段が設けられることが好ましい。振動棒１１８の変位量制御は、加圧板１１９にかかる圧力に基づくフィードバック制御により、振動棒１１８の変位量を制御することが好ましい。
【００４３】
多凹面部１３２に設けられている凹部１３２ａは、例えば３千個／ｍｍ２〜５万個／ｍｍ２形成されることが好ましい。また、凹部１３２ａの形状は特に限定されるものではないが、例えば図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、非貫通型の略円柱形状の空隙である。凹部１３２ａのサイズは、後述するように、分化した象牙芽細胞の細胞突起が凹部１３２ａ内部に入り込みやすいように象牙質の象牙細管の態様に類似する態様で形成される。凹部１３２ａの直径１３１ｄは、例えば１μｍ以上１２μｍ以下であり、好ましくは１μｍ以上１０μｍ以下であり、より好ましくは２μｍ以上８μｍ以下である。凹部１３２ａ同士のピッチ１３１ｐは例えば２μｍ以上３０μｍ以下であり、好ましくは３μｍ以上２８μｍ以下であり、より好ましくは４μｍ以上２６μｍ以下である。また、凹部１３２ａの深さ１３２ｈは、例えば１μｍ以上２０μｍ以下であり、好ましくは１μｍ以上１５μｍ以下であり、より好ましくは２μｍ以上１０μｍ以下である。なお、凹部１３２ａは開口部を有する面の反対側まで到達する貫通状の形状でもよい。
【００４４】
次に、上述した細胞分化装置１００の使用態様、及び、本実施形態に係る細胞分化方法を説明する。図５は、パルス電気信号の波形を説明する説明図であり、（ａ）は正弦波若しくは余弦波であり、（ｂ）は矩形波であり、（ｃ）は台形波であり、（ｄ）は鋸波であり、（ｅ）は三角波である。図６は、より好ましい台形波の波形を示す説明図である。図７は、幹細胞が象牙芽細胞に分化して基質を形成することを説明する説明図であり、（ａ）は、最初、幹細胞が複数個の凹部に付着する状態であり、（ｂ）は加圧により細胞が突起を伸ばして象牙芽細胞に分化する状態であり、（ｃ）は象牙芽細胞が象牙質基質を形成しながら後退する状態であり、（ｄ）はスキャフォールドに歯髄幹細胞を混合して筒体内に注入し、さらに培養して歯髄細胞を含む歯髄組織が三次元構築される状態である。スキャフォールドは、例えば、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲン、グリコサミノグリカン、ゼラチン、ヒアルロン酸、キチン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヘパラン硫酸、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト等の天然材料及びその誘導体のほか、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸グリコール酸共重合体、ポリエチレングリコール、ポリシリコン、ポリカプロラクトン等の合成高分子材料が挙げられる。Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンは、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを混合させたものであり、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの重量比は例えば２：３〜３：２であり、好ましくは１：１である。また、スキャフォールドは、熱可塑性高分子等の高分子体で作製された数平均直径が１ｎｍ〜１０００ｎｍのナノファイバーからなるスポンジ状の三次元構造体も使用できる。そのような三次元構造体の空隙率は８０％〜９９．９９％とすることが好ましい。
【００４５】
まず、図７（ａ）に示すように、天井膜１３１の多凹面部１３２に幹細胞３００を付着させる。幹細胞３００は特に限定されるものではないが、象牙芽細胞に分化しやすい幹細胞３００が選択され、例えば歯髄幹細胞、骨髄幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells,人工多能性幹細胞）又はこれらの混合を使用することができる。多凹面部１３２に付着させる幹細胞３００の密度は、例えば１×１０４個／ｃｍ３〜１×１０７個／ｃｍ３、好ましくは５×１０４個／ｃｍ３〜５×１０６個／ｃｍ３、より好ましくは１×１０５個／ｃｍ３〜１×１０６個／ｃｍ３の範囲とすることができる。
【００４６】
歯髄幹細胞は、例えば、ヒトの抜去歯（永久歯若しくは乳歯由来）等から採取することができる。歯髄幹細胞は、ＣＤ３１陰性且つＣＤ１４６陰性ＳＰ（Side Population)細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＭＨＣ(major histocompatibility complex) class Ｉ陰性、ＭＨＣ class ＩＩ陰性細胞等に多く含まれる。なお、ヒトについてのＭＨＣ class ＩがＨＬＡ（human leukocyte antigen）class Ｉであり、ＭＨＣ class ＩにはＨＬＡ class Ｉも含まれる。ヒト歯髄幹細胞は、例えばNakashima M. Archs oral Biol. 36(9), 655-663, 1991に記載の方法に従って採取することができる。例えば埋伏歯を無菌的に取り出し、Phosphate Buffered Saline（ＰＢＳ）溶液等の適当な保存液で保存する。歯牙の中の石灰化した部分を取り除き、歯髄組織を細切して、ＰＢＳ溶液等を用いて組織を洗浄する。次いで、コラゲナーゼやディスパーゼを用いて組織を酵素処理する。酵素処理後、ピペッティング操作と遠心操作により細胞を回収する。特に乳歯の中には歯髄幹細胞が高密度に含有されているので、ヒトの乳歯は歯髄幹細胞を採取するのに好適である。
【００４７】
次に筒体１３３をカップ１４０内部に入れて、筒体１３３の内部空間１３４に細胞分化を促進する分化培地（又はスキャフォールド）を入れることができる。分化培地は種々のものを使用することができ、例えば、ＧＩＢＣＯ社のＤＭＥＭ、メディカルト社のＩＶＣ、アーバイン社のＨＴＦ、等を用いることができる。分化培地には骨形成因子（Bone Morphogenetic Proteins）が含有されることが好ましい。より好ましくはプラズマコートした多凹面部１３２にI型コラーゲンとともに骨形成因子をコートする。骨形成因子は特に限定されるものではないが、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ１１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６等を使用することができる。また分化培地には１０％ウシ胎児血清もしくは１０％仔ウシ血清、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、４ｍＭのＰｉ（リン酸）を含有しても良い。
【００４８】
また分化培地（又はスキャフォールド）には、マトリックスメタロプロテアーゼ３（ＭＭＰ３）活性を有するタンパク質を含有させることも可能である。ＭＭＰ３は、ＭＭＰファミリーに属するタンパク質の一種であり、ストロムライシン１とも呼称されている。ＭＭＰ３は、各種の生物種から取得されており、例えば、ヒトのＭＭＰ３のアミノ酸配列及び塩基配列は、GenBankにてアクセッション番号NP_002413.1にて取得することができ、特異的に象牙質形成促進作用を有する。
【００４９】
更に、分化培地（又はスキャフォールド）には、象牙芽細胞への分化誘導を促進するとされる公知の形態形成因子を含むことができる。このような形態形成因子としては、例えばサイトカイン類、ケモカイン類、ビタミン類、抗生物質、ホルモン生理活性物質が挙げられ、好ましくは、デキサメタゾン、ＭＩＰ−３α、ＭＣＰ−１、ＴＧＦ−β、β−グリセロリン酸、アスコルビン酸、タクロリムス、シクロスポリン、スタチン、ビタミンＤ、グルココルチコイド、Insulin-like growth factors (ＩＧＦｓ)、Fibroblast growth factors (ＦＧＦｓ)等が挙げられる。これらの因子は、単一の添加でもよいし、複数の因子を組み合わせて添加してもよい。
【００５０】
次に、幹細胞を付着させた凹部１３２ａを内部空間１３４側に向けて、天井膜１３１を筒体１３３の上部に載置する。次に図２（ａ）で示すように天井膜１３１の上に蓋体１２０を被せ、図２（ｂ）で示すように天井膜１３１の上に加圧板１１９が置かれる。加圧部１１０は固定部材にて固定されることが好ましい。なお、チャンバ１３０内部は、細胞分化が促進されやすいように３７℃〜３８℃程度に保つことが好ましい。
【００５１】
次に、加圧部１１０の図示されていない電源をオンにして、制御回路１１１からアクチュエータ２５０に対してパルス電気信号を供給して、加圧板１１９を上下に振動させて、チャンバ１３０の軸方向に周期的に圧力をかける。パルス電気信号の波形は、特に限定されるものではないが、例えば図５（ａ）に示すように正弦波若しくは余弦波、図５（ｂ）に示すように矩形波、図５（ｃ）に示すように台形波、図５（ｄ）に示すように鋸波、図５（ｅ）に示すように三角波、又はこれらの合成波を使用することができる。
【００５２】
矩形波は、簡単なデジタル回路を用いることで容易に生成可能であるうえ、応答が速いので効率良く微振動させることができる。しかし、圧力変動が大きくなり、幹細胞又は象牙芽細胞にダメージを与える可能性があるので、電圧の立ち上がりと立ち下がりが傾斜している台形波が好適である。台形波は、図５（ｃ）に示すように、上端部の時間ｔｕと下端部の時間ｔｄとが同一であり、また上端部から下端部への移動時間ｔ１と下端部から上端部への移動時間ｔ２とも同一である。なお、例えば時間ｔｕの場合は加圧板１１９が最上部にあり、時間ｔｄの場合は加圧板１１９が最下部にあると考えることができる。
【００５３】
図６に示すように、台形波は、上端部の時間ｔｕと下端部の時間ｔｄとが同一であるが、上端部から下端部への移動時間ｔ１よりも下端部から上端部への移動時間ｔ２が短いほうが好適である。即ち、加圧板１１９が最上部から最下部へ移動（押し動作）する時間よりも、最下部から最上部へ移動（引く動作）する時間のほうが短いほうが好適である。なお、台形波以外の正弦波、余弦波、矩形波、鋸波、三角波においても、加圧板１１９の押し動作時間より引き動作時間が短くなるような変形波形が好適である。
【００５４】
パルス電気信号の波形が正弦波又は余弦波の場合は、その周波数ｆは特に限定されるものではないが、あまりにも高周波数となると幹細胞又は歯髄幹細胞にダメージを与える可能性がある。そこで、周波数ｆは低周波数とすることが好ましく、例えば０．１〜１．５Ｈｚ、より好ましくは０．２〜１．０Ｈｚ、更に好ましくは０．３〜０．５Ｈｚである。また、パルス電気信号の波形が矩形波又は台形波の場合は、波形が最上部又は最下部に位置するタイミングが単位時間あたりに余りに多いと細胞にダメージを与える可能性がある。そこで、波形が最上部又は最下部に位置するタイミングは単位時間あたり所定回数に抑制することが好ましく、例えば１分間あたり、２〜１２回、より好ましくは３〜８回、更に好ましくは４〜６回である。
【００５５】
加圧板１１９の上下振動により、チャンバ１３０の軸方向に周期的に圧力がかかる。機械圧力は特に限定されるものではないが、あまりに高い圧力がかかると幹細胞又は象牙芽細胞にダメージが与えられる可能性があるから、例えば０．７５Ｎ／ｍ２以上１．５Ｎ／ｍ２以下、好ましくは例えば０．８５Ｎ／ｍ２以上１．２５Ｎ／ｍ２以下、より好ましくは０．９５Ｎ／ｍ２以上１．０Ｎ／ｍ２以下である。
【００５６】
そして、チャンバ１３０の軸方向に周期的にかかる圧力は、口腔内で歯髄幹細胞に日常的に加わる生体物理刺激に類似する圧力である。このように、凹部１３２ａに付着している幹細胞３００にチャンバ１３０の軸方向に生体内と同じような周期的圧力が与えられ、幹細胞３００は象牙芽細胞３１０に分化する。象牙芽細胞３１０は、象牙質の外側端部に整列した偏心的な核と、長い細胞突起３１１とを有する円柱状の一方向に並んだ細胞であり、この象牙芽細胞３１０は図７（ｂ）に示すように、その細胞突起３１１を凹部１３２ａ内に伸ばした状態で、幹細胞から分化する。そして、図７（ｃ）に示すように象牙芽細胞は象牙質基質３６０を形成し、図７（ｄ）に示すようにスキャフォールド３７０内に歯髄細胞からの基質が三次元構築される。
【００５７】
本実施形態に係る発明によれば、簡易な手法又は装置にて、短時間で効率よく幹細胞から象牙芽細胞を分化させることができる。更に、図８に示すように、チャンバ１３０の筒体１３３の内部空間１３３を歯牙う触により生じる象牙質の空隙形状に形成しておけば、患者に移植するのに好ましい形状にて象牙質の三次元構造体（バイオ歯）を得ることができ、これを患者のう触により生じた空隙に移植することにより、移植したバイオ歯が削って残った象牙質と完全に接着する。移植物と残存象牙質とでは熱膨張率、収縮率及び力学的性質がほぼ同じであるため、鋳型で作った人工材料の充填修復物又は補綴物を装着する従来の治療法と比較して、隙間から再度う蝕になることを防ぐことができる。また、象牙質切削を従来よりも大幅に削減し、さらに再生された象牙質は種々の細胞増殖因子及び形態形成因子を含むため、う蝕予防・自然修復効果が高く、歯の寿命を著しく増大させることができる。
【００５８】
（第２実施形態）
本実施形態に係る細胞分化装置１００は、第１実施形態と異なり、加圧部１１０における加圧が静水圧加圧である。図９は本実施形態に係る細胞分化装置の断面図である。
【００５９】
図９に示すように、加圧部１１０は、アクチュエータ筐体２３０と、アクチュエータ２５０と、振動板２２１とを有する。振動板２２１は薄厚みの板体であり、例えば樹脂、金属等で形成される。樹脂にて振動板２２１を形成する場合は例えばポリエチレン等を使用することできる。金属にて振動板２２１を形成する場合は例えば銅、アルミニウム、マグネシウム、ステンレス等で形成できる。アクチュエータ筐体２３０内部には流体が充填されており、流体は特に限定されるものではないが例えば水である。アクチュエータ筐体２３０の右側端部には流路孔２３０ａ，２３０ｂが形成されている。振動板２２１はその両端部にてゴム等の弾性支持部材２２２により支持されており、アクチュエータ筐体２３０内部の空間を上部空間２８１と下部空間２８２とで分割している。アクチュエータ筐体２３０は耐圧容器である。
【００６０】
アクチュエータ２５０の構成は第１実施形態と同様であり、下部空間２８２に配置されている。アクチュエータ２５０は、アクチュエータケース２１４内に収納されており、これによりアクチュエータ２５０が流体に曝されることが防止される。アクチュエータケース２１４は、上ケース２１２と、下ケース２１１と、これらを接続するゴム部材２１３とで構成される。下ケース２１１は下部空間２８２の任意の箇所に固定されており、コイルボビン１１６と上ケース２１２とは接着剤等により固着されている。
【００６１】
チャンバ１３０は、カップ１４０内部に入れられ、接着剤等を介して蓋体１２０にてシールされる。チャンバ１３０は、チャンバ筐体２７０内に収納される。チャンバ容器２７０は耐圧容器である。接着剤等を使用して蓋体１２０でシールするのは、流体が内部に浸透して幹細胞又は歯髄幹細胞に付着しないようにするためである。チャンバ筐体２７０内部には、アクチュエータ筐体２３０内部と同様に流体が充填されている。チャンバ筐体２７０の両端部には流路孔２７０ａ，２７０ｂが形成されている。流路孔２３０ａと流路孔２７０ａとは流体が流れる管路２４１で接続されている。また、流路孔２３０ｂと流路孔２７０ｂとは流体が流れる管路２４２で接続されている。
【００６２】
次に、本実施形態に係る細胞分化装置１００の使用態様を説明する。天井膜１３１の多凹面部１３２に歯髄幹細胞等の幹細胞を付着させ、筒体１３３をカップ１４０内部に入れ、内部空間１３４に分化培地を入れ、天井膜１３１を筒体１３３の上部に載置し、天井膜１３１の上に蓋体１２０を被せる（ただし本実施形態では蓋体１２０に穴１２１はない）ところまでは、上述した第１実施形態と共通である。
【００６３】
アクチュエータ筐体２３０及びチャンバ筐体２７０内部を水で充填し、加圧部１１０の図示されていない電源をオンにして、制御回路１１１からアクチュエータ２５０に対して台形波等のパルス電気信号を供給する。これにより、振動板２２１は台形波振動を行い、上部空間２８１及び下部空間２８２の容積が増減する。上部空間２８１及び下部空間２８２の容積変化に伴い、上部空間２８１及び下部空間２８２の圧力が交互に増減し、夫々管路２４１及び管路２４２を介して交互に流体の脈流として吐出される。即ち、コイルボビン１１６が上方向に移動すると、振動板２２１も上方向に移動し、上部空間２８１の容積が減少し、上部空間２８１内から流体が吐出され、管路２４１を通じて流体がチャンバ筐体２７０内に流入してチャンバ筐体２７０内の圧力が上昇する。一方、コイルボビン１１６が下方向に移動すると、振動板２２１も下方向に移動し、下部空間２８２の容積が減少し、下部空間２８２内から流体が吐出され、管路２４２を通じて流体がチャンバ筐体２７０内に流入してチャンバ筐体２７０内の圧力が上昇する。
【００６４】
静水圧加圧は、特に限定されるものではないが、あまりに高い圧力がかかると幹細胞又は象牙芽細胞にダメージが与えられる可能性があるから、例えば０．５ＭＰａ以上１．０ＭＰａ以下、好ましくは０．７ＭＰａ以上０．９ＭＰａ以下、より好ましくは０．８ＭＰａ以上０．８５ＭＰａ以下である。
【００６５】
このようにして、チャンバ１３０の多凹面部１３２に周期的に圧力がかかり、凹部１３２ａに付着している幹細胞３００に刺激が与えられ、細胞突起３１１を凹部１３２ａ内に伸ばした状態で象牙芽細胞３１０に分化する。静水圧加圧によれば多凹面部１３２に対して鉛直方向に精度良く圧力を与えることができる。
【００６６】
（第３実施形態）
図１０は本実施形態に係る細胞分化装置の概観図である。本実施形態に係る細胞分化装置１００は、第１実施形態と異なり、天井膜１３１と筒体１３３とが一体となっており、部品点数削減により細胞分化装置１００の製造コストを低減させることができる。
【００６７】
図１０に示すように、本実施形態に係る細胞分化装置１００は蓋体１２０を使用しないので、天井膜１３１は外部からの物理的衝撃に対して耐性を有する程度の強度を有する材質で形成される。筒体１３３の内部空間１３４は下面のみが解放されており、ここから幹細胞を多凹面部１３２に付着させる。多凹面部１３２に幹細胞を付着させた後、チャンバ１３０をカップ１４０内に載置して、天井膜１３１の上に加圧部１１０を載置して、加圧板１１９の上下振動により、チャンバ１３０の軸方向に周期的に圧力がかかる。本実施形態によれば簡易な構造により装置を構成できる。
【符号の説明】
【００６８】
１００  ：細胞分化装置
１１０  ：加圧部
１１１  ：制御回路
１１２  ：第１ヨーク
１１３  ：第２ヨーク
１１４  ：マグネット
１１５  ：コイル
１１６  ：コイルボビン
１１７  ：ケース
１１８  ：振動棒
１１９  ：加圧板
１２０  ：蓋体
１３０  ：チャンバ
１３１  ：天井膜
１３２  ：多凹面部
１３２ａ：凹部
１３３  ：筒体
１３４  ：内部空間
１４０  ：カップ
２１１  ：下ケース
２１２  ：上ケース
２１３  ：ゴム部材
２１４  ：アクチュエータケース
２２１  ：振動板
２２２  ：弾性支持部材
２３０  ：アクチュエータ筐体
２４１  ：管路
２４２  ：管路
２５０  ：アクチュエータ
２７０  ：チャンバ筐体
２８１  ：上部空間
２８２  ：下部空間
３００  ：幹細胞
３１１  ：歯髄幹細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010213631.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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