(57)【要約】【課題】遺伝子診断、分子生物学研究等の分野において実施される核酸の特異的増幅法において、低コストで、簡便な、新規な核酸合成方法ならびに組成物を提供する。【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成方法であって、該ＤＮＡポリメラーゼが、該ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体として供給されることを特徴とする核酸の合成方法および核酸合成用組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成方法であって、該ＤＮＡポリメラーゼが、該ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体として供給されることを特徴とする核酸の合成方法。
【請求項２】
該ＤＮＡポリメラーゼがアーキア（ａｒｃｈａｅ）由来のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の核酸の合成方法。
【請求項３】
該ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２に記載の核酸の合成方法。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の合成方法。
【請求項５】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成用組成物であって、該ＤＮＡポリメラーゼが、該ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体として供給されていることを特徴とする核酸合成用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に分子生物学の分野において、ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸からＤＮＡの合成を行う際に有用な新規方法及び組成物に関するものであり、特にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に有用な新規方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸を用いたＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。中でも、ＰＣＲ法に代表される核酸増幅法は、研究分野のみならず、遺伝子診断、親子鑑定といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。
【０００３】
ＰＣＲ法による遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長からなるサイクルを２５〜４０サイクル繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。これにより、微量のサンプルから標的核酸の所望の配列を特異的に増幅できることから、分子生物学の分野においては、遺伝子のクローニングの手段として、また、食品や環境中の微生物検査等においては、増幅産物の有無からサンプル中の特定の微生物等の存在を判定する、いわゆる検出の手段として用いられている。
【０００４】
このＰＣＲ法による遺伝子増幅方法の一つの問題点として、標的ではない核酸の非特異的な増幅がみられることがある。この非特異的な増幅の多くは、反応液を調製し、サーマルサイクラーにセットした後、反応温度がアニーリング温度に達するまでにプライマーの３’末端の一部が、鋳型ＤＮＡにアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅がスタートしてしまうこと（ミスプライミング）が原因である。また、プライマーダイマーあるいはオリゴマーの形成が増幅効率の低下を招くこともある。さらに、アーキア（始原菌）由来の、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性）を有するＤＮＡポリメラーゼ（ファミリーＢに属する）の場合は、その３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によってプライマーが削られることにより、プライマーの特異性が低下し、その結果として、非特異的増幅産物の増加や、増幅効率が低下する現象が知られている。
【０００５】
このような非特異的な増幅などの問題点を解決する方法として、ホットスタート法が開発されている。ホットスタート法は、プライマーが特異的にターゲットにアニーリングできる十分な高温になってはじめてＰＣＲの系が完成するようにする方法であり、高温になって初めて試薬が混合されるように一部の試薬成分を物理的に分離しておく方法や、ＤＮＡポリメラーゼが熱によって活性化されるように予め温度感受性阻害剤にて不活性化させておく方法が知られている。前者の具体的方法としては、（１）高温下で不足しているコンポーネントを追加する方法、（２）常温では固体であるが高温下融解するワックスを利用するワックスバリアー法（特許文献１）や、カプセル化法がある。また、後者の具体的方法としては、（３）ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体を用いる方法（特許文献２）、（４）ジカルボン酸無水物等による化学修飾により可逆的に不活性化されたＤＮＡポリメラーゼを用いる方法（特許文献３）、（５）ＤＮＡポリメラーゼに特異的に結合するアプタマーを用いる方法（特許文献４）などが知られている。
【０００６】
しかしながら、（１）の方法は、反応装置にセットした反応チューブのふたを開け、そこに試薬を加えるという非常に煩わしい操作が必要であり、それが故に、クロスコンタミネーションの原因となるという欠点がある。また、同様に、（２）の方法もワックス層を形成させるために煩雑な操作が必要であり、特にサンプル数が多い場合には不向きである。このような問題から、今日では、（３）あるいは（４）の方法が一般的に広く用いられている。
【０００７】
（３）あるいは（４）の方法は、一旦ＤＮＡポリメラーゼを調製した後は、特に特別な操作をすることなく、ＰＣＲ反応液を調製し、ＰＣＲ反応を実施することができることから、現在、研究用試薬として広く用いられている。しかしながら、一方で、（３）の抗体を用いる方法は、別途、そのＤＮＡポリメラーゼに対する抗体を調製しなければならず、（３）の方法を採用したＤＮＡポリメラーゼを製造するためには、高度な技術、設備が必要である。また、抗体は一般的に高価であるため、試薬の製造コスト高につながっている。また、（４）の方法も、ジカルボン酸無水物等でＤＮＡポリメラーゼを処理する必要があり、高度な技術、設備が必要である。さらに、本方法で製造されたＤＮＡポリメラーゼは、再活性化のために、９２℃〜９５℃で９分〜１２分の熱処理時間を必要とする。一般的に、９０℃以上の高温でＤＮＡを長時間処理すると脱プリンなどの分解が起こるため、特に長いターゲットの場合、増幅効率が充分でないなどの問題もある。さらに、（３）（４）の方法共に、ＤＮＡポリメラーゼ活性を完全にブロックすることができず、熱処理前の段階で一部活性が残っていることから、特異性が低下するという問題も残されている。
【０００８】
そこで、これらの問題を解決するような新規なホットスタート法、あるいはホットスタート対応のＤＮＡポリメラーゼ試薬が待ち望まれていた。すなわち、ＰＣＲ反応液の調製が簡便で、かつ、それに用いる試薬は、特別な技術、設備を用いることなく製造でき、さらに、低コストに製造できる技術の確立が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−３１６５６１
【特許文献２】特開平  ６−２０９７７５号
【特許文献３】特開平  ９−１０３２９２号
【特許文献４】公表平１１−５０７２２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法、特にＰＣＲ法において、ターゲットを特異的に増幅する技術については、様々な方法あるいは組成物が報告されているものの、いずれも一長一短があり、問題点を有していた。また、その組成物を調製するためには、高度な技術が必要であり、その結果として、試薬の製造コスト高につながっていた。そこで、低コストに製造でき、かつ、確実にホットスタート法が実行できる核酸の合成方法及びそのための組成物が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体を直接ＰＣＲ反応用原料として用いることによって、低コストで、簡便に、かつ確実にホットスタート法を実現できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体そのものを、ＤＮＡポリメラーゼがカプセル化された試薬と捉えることにより、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成方法であって、該ＤＮＡポリメラーゼが、該ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体として供給されることを特徴とする核酸の合成方法。
［項２］
該ＤＮＡポリメラーゼがアーキア（ａｒｃｈａｅ）由来のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項１に記載の核酸の合成方法。
［項３］
該ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項２に記載の核酸の合成方法。
［項４］
ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法であることを特徴とする項１〜３のいずれかに記載の核酸の合成方法。
［項５］
ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成用組成物であって、該ＤＮＡポリメラーゼが、該ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体として供給されていることを特徴とする核酸合成用組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに抗体やアプタマーを加えたり、あるいは化学修飾を施したりすることなく、極めて特異性の高いホットスタート法が可能となる。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのタンパク精製自体が不要になるため、抗体等の製造や、化学修飾に掛かる労力や費用のみならず、ＤＮＡポリメラーゼそのものの精製に掛かる労力や費用を省くことができ、核酸の合成試薬（合成用組成物）を簡便に安価に経済的に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１におけるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【図２】実施例２におけるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【図３】実施例３におけるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の実施形態の一つは、ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成方法であって、該ＤＮＡポリメラーゼが、該ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体として供給されることを特徴とする核酸の合成方法である。
【００１６】
本発明における、ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成方法とは、最も代表的なものとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。しかしながら、本発明においては、核酸合成方法はＰＣＲ法に特に限定されるものではなく、既に報告されているような、様々な核酸増幅方法に広く適用することができる。具体的な合成方法としては、例えば、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＮＡＳＢＡ法などが挙げられ、いずれの方法にも応用できる。
【００１７】
本発明においては、該ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成方法において、該ＤＮＡポリメラーゼが、該ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体として供給されることを特徴とするものである。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼが、酵素タンパクとして精製されることなく、微生物菌体中に存在した状態で核酸の合成反応に供されることを特長とする。言い換えれば、ＤＮＡポリメラーゼは、微生物の細胞膜等によりカプセル化された状態にあり、核酸の合成反応時の熱処理等によって始めて菌体より露出され、他の核酸合成用基質と接触することとなる。これにより、極めて特異性の高いホットスタート法を簡便に実施することが可能となる。
【００１８】
上記ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物としては、特に限定されるものではないが、大腸菌、酵母等の組換えＤＮＡ技術によって耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを発現しうる微生物であることが好ましく、中でも大腸菌であることが好ましい。具体的には、分子生物学実験に汎用される大腸菌Ｋ−１２株由来のＪＭ１０９、ＤＨ５、ＤＨ５α、ＨＢ１０１株およびその派生株等や、大腸菌Ｂ株由来のＢＬ２１株およびその派生株等が挙げられる。
【００１９】
また上記ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体は、生菌であっても、不活化された死菌であってもよい。生菌の場合は、核酸合成反応時の熱処理により結果として不活化されることになるが、供給時の形態としては、遺伝子組換え生物の拡散防止の観点から、不活化された死菌の形態が望ましい。不活化は、微生物菌体中のＤＮＡポリメラーゼが露出しない程度に適度な熱処理、あるいは、７０％エタノールに接触させることで可能である。また、該微生物菌体は、微生物培養に用いられた培地を除いた後、滅菌水や適当なバッファーに懸濁されてもいいし、菌体の沈降及び−２０℃保存時の凍結を防ぐために５０％グリセロール等を含んだバッファー等に懸濁されても良い。
【００２０】
本発明において用いられるＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを鋳型にそれと相補的な核酸を合成する活性を有する、いわゆるＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されるものではないが、好熱細菌あるいはアーキア（始原菌）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることが望ましい。好熱細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼなどが例示される。また、アーキア由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼや、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼなどが例示される。
【００２１】
なお、本発明の核酸合成方法の手順は、ＤＮＡポリメラーゼとして、精製されたＤＮＡポリメラーゼの代わりに、ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体を用いる以外、通常の方法と何ら変わらない。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ用の反応バッファー、基質である４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ）、プライマー、鋳型となるＤＮＡ等と、ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体を混和することにより、核酸合成用の組成物を調製した後、プライマーの伸長反応を行う。すなわち、核酸合成方法がＰＣＲ法の場合は、熱サイクルをかけることにより増幅反応を行う。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成用組成物であって、該ＤＮＡポリメラーゼが、該ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体として供給されていることを特徴とする核酸合成用組成物である。
【００２３】
本発明の核酸合成用組成物は、ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体に加え、必要により、ＤＮＡポリメラーゼ用の反応バッファー、基質である４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸などを含んでいてもよい。反応バッファー等は、ＤＮＡポリメラーゼを発現している微生物菌体とプレミックスの形で供給されていても良いし、あるいは、別のチューブにて供給されてもよい。
別の言い方をすれば、本発明は上記組成物を含む核酸合成用キットであっても良い。
【実施例１】
【００２４】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に特に限定されるものではない。
【００２５】
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌の調製
特許公開平７−２９８８７９の実施例３に記載の、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ組換え発現ベクター  （ｐＥＴ−ｐｏｌ）  を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９）を形質転換し、得られた形質転換体をＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｐ．Ａ．２，  １９８９に記載）  にて培養し、集菌１時間前にイソプロピオチ−  β−Ｄ−  ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの誘導処理を行った。培養終了後、培養液を遠心分離することにより菌体を回収した後、適量の滅菌水に菌体を懸濁した。次に、この菌体懸濁液を６０℃、３０分間熱処理を行うことにより菌体を不活化した。不活化された菌体懸濁液を、適宜滅菌水で希釈した後、等量のグリセールを加えて、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌の菌体標品とした。なお、熱処理前の菌体懸濁液から一部をとり、希釈後、ＬＢ寒天培地に撒くことにより、菌体数（菌体濃度）を測定した。
【実施例２】
【００２６】
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌を用いた核酸増幅効果の確認（最適な菌体量の検討）
実施例１で得られたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌の菌体標品を用いて、ヒトゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／５０μｌ）を鋳型として、ＨＢｇ（ヒトβ−グロビン）遺伝子（８．５ｋｂｐ）を増幅ターゲットとするＰＣＲ評価を実施した。ＰＣＲ反応試薬には、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（東洋紡績）を用い、タンパク精製されたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ標品の代わりに、実施例１で得られたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌菌体標品を用いた。添加量は、ＰＣＲ反応液５０μｌあたり、４×１０＾３〜２×１０＾６個を添加した。具体的には、表１に示すような反応組成にて、配列番号１および２に示される塩基配列からなるプライマー（０．３μＭ）を用いてＰＣＲを行った。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
ＰＣＲは、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００；アプライドバイオシステムズ）を用いて、９４℃・２分で保持させた後、９８℃・１０秒、６５℃・３０秒、６８℃・７分の条件で３０サイクルの反応を行った。ＰＣＲ反応終了後、反応液５μｌを１％アガロース電気泳動に供し、増幅産物の解析を行った。その結果を図１に示した。本評価系では、８．５ｋｂｐという比較的長いターゲットを増幅したにも係わらず、ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌菌体標品を用いた場合において、精製されたＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−）１ユニットを用いた場合と同程度の増幅産物が得られた。また、増幅は、ＰＣＲ反応液５０μｌあたり、１×１０＾５〜２×１０＾６個（ここで、＾は累乗を示す。例えば、１０＾５は、１０の５乗を意味する。）の広い菌体量で得られており、なかでも、目的産物の特異的な増幅には、３×１０＾５〜５×１０＾５個程度の菌体量が適当であることが判った。このように、精製されたＤＮＡポリメラーゼでなくとも、ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌菌体をＰＣＲ反応液に加えることによってターゲットＤＮＡが十分に増幅されることが確認できた。
【実施例３】
【００２９】
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌を用いた場合のホットスタート効果の確認
次に、実施例１で得られたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌に、実際にホットスタート効果があるかの評価を行った。
方法としては、実施例２と同様に、実施例１で得られたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌の菌体標品を用いて、ヒトゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／５０μｌ）を鋳型として、ＨＢｇ（ヒトβ−グロビン）遺伝子（３．６ｋｂｐ）を増幅ターゲットとするＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、ＰＣＲ反応試薬として、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（東洋紡績）を用い、ＤＮＡポリメラーゼとしては、（１）タンパク精製されたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット、（２）（１）にさらに抗ＫＯＤ抗体が添加されてホットスタート仕様となっているＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−）１ユニット、及び  （３）実施例１で得られたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌菌体（添加量は、１×１０＾５個）を添加した。具体的には、表２に示すような反応組成にて、配列番号３および４に示される塩基配列からなるプライマー（０．３μＭ）を用いてＰＣＲを行った。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
ＰＣＲは、図２に示すように２通りの反応サイクル条件で行った。すなわち、９４℃・２分→（９８℃・１０秒、６０℃・３０秒、６８℃・４分）×３０サイクルのＡ条件、及び、そのＰＣＲサイクルの前に３７℃・３０分のプレインキュベーションの時間を追加したＢ条件にて行った。このプレインキュベーションの時間は、ホットスタートの効果をより明瞭にするために追加したものである。ＰＣＲ反応終了後は、反応液５μｌを１％アガロース電気泳動に供し、増幅産物の解析を行った。その結果を図２に示した。タンパク精製されたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの場合は、ホットスタートに対応していないため、Ａ条件でもエキストラバンドが見られ、さらに、Ｂ条件では、ターゲットの増幅が弱まると共にスメアリングが酷くなっているのがわかる。これに対し、ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌菌体標品では、Ａ条件、Ｂ条件のいずれにおいても、ターゲットの増幅産物が特異的に増幅されており、抗ＫＯＤ抗体によりホットスタート仕様となっているＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−）と同じ増幅結果が得られていることが判る。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌菌体を用いた場合にも、明らかにホットスタート効果が得られることが確認できた。
【実施例４】
【００３２】
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌と、ホットスタート対応の精製ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合の検出感度の比較
ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌菌体にも、明らかにホットスタート効果が得られることが確認できたことから、次に、ホットスタート対応の精製ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−）との検出感度の比較を行った。鋳型サンプルとしては、ヒトゲノムＤＮＡ  ０．０８〜５０ｎｇ／５０μｌを用い、ターゲットは、実施例２と同様に、ＨＢｇ（ヒトβ−グロビン）遺伝子（３．６ｋｂｐ）を増幅ターゲットとした。具体的には、表３に示すような反応組成にて、配列番号３および４に示される塩基配列からなるプライマー（０．３μＭ）を用いた。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
ＰＣＲは、９４℃・２分→（９８℃・１０秒、６０℃・３０秒、６８℃・４分）×３０サイクルにて行った。ＰＣＲ反応終了後は、反応液５μｌを１％アガロース電気泳動に供し、増幅産物の解析を行った。その結果を図３に示した。ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌菌体を用いた場合も、ホットスタート仕様の精製ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−）を用いた場合も、いずれの場合も、０．４ｎｇの鋳型量まで検出できていることがわかる。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ発現大腸菌菌体を用いた場合でも、ホットスタート仕様の精製ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−）と同じ検出感度が得られることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、従来から知られている特異的核酸合成方法（ホットスタート法）と比べて、より低コストで、簡便に、かつ確実にホットスタート法を実現できることから、分子生物学の研究分野はもとより、遺伝子診断、法医学、食品、生体試料や環境中の微生物検査等の幅広い分野において利用されることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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