(57)【要約】      （修正有）【課題】質量分析および示差的な標識試薬を用いる、結合特性に基づく分析物の特徴の決定法を提供する。【解決手段】示差的な標識試薬を用いる、結合特性に基づく分析物の特徴の決定に関する。示差的な標識試薬としてアイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬を利用し得、それによって、標識された分析物、または分析物の標識されたフラグメントを生成する。一つ以上のサンプルまたはサンプルの画分は、目的の一つ以上の特徴に基づいて特定のサンプル成分を分離する目的のために、分離され得るか、または固定相（例えば、親和性支持体）へ適用され得る。【選択図】図３ｂ
2010156706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００４年３月１日に出願された米国仮出願第６０／５４９，０４９号の利益を主張し、この出願は、あらゆる目的のために本明細書において参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の実施形態は、質量分析および示差的な標識試薬を用いる、結合特性に基づく分析物の特徴の決定に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（説明）
（１．導入）：
本発明の実施形態は、示差的な標識試薬としてアイソバリック（ｉｓｏｂａｒｉｃ）標識試薬および／またはアイソメリック（ｉｓｏｍｅｒｉｃ）標識試薬を利用し得、それによって、標識された分析物、または分析物の標識されたフラグメントを生成する。一つ以上のサンプルまたはサンプルの画分は、目的の一つ以上の特徴に基づいて特定のサンプル成分を分離する目的のために、分離され得るか、または固定相（例えば、親和性支持体）へ適用され得る。この分離から得られる画分は、考慮の上で選択される様式において、あるセットのアイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬の異なる試薬を用いて標識され得、それによって、その後の分析のためにその画分の一部または全てをコード化（ｅｎｃｏｄｅ）し得る。標識化分析物またはその分析物の標識されたフラグメントを含む一つ以上のサンプルは、各々が個別に分析され得るか、または、いくつかの実施形態においては、二つ以上のサンプルが混合され得、多重様式において分析され得る。標識化分析物を含むサンプルまたは混合物は、必要に応じてさらに分離され得、次いで、質量分析によって分析され得る。分析物の娘フラグメントイオンは、サンプルの各々の分析物を同定するために用いられ得る。標識化分析物の標識の分析またはそのフラグメントイオンの分析は、サンプル混合物をもたらすために用いられるサンプルまたはサンプルフラクションの各々の中の分析物を（相対的または絶対的に）定量するために用いられ得る。このように、一つ以上の目的のサンプル（複合サンプルを含む）の成分についての情報が、目的の特徴（単数または複数）を有する成分に関して求められ得る。この手順は、プロテオームの分析を行う場合に分析されるタンパク質およびペプチドのような、複合サンプル中のタンパク質およびペプチドの翻訳後修飾の分析のために、特に有用であり得る。
【０００４】
（３．定義）：
本明細書の理解を目的として、以下の定義が適用され、適切であるときは常に、単数形で使用される用語はまた複数形を含み、逆もまた然りである。以下に示される定義のいずれかが、本明細書において参考として援用される文書いずれかと矛盾する場合、以下に示される定義が支配する。
【０００５】
ａ．本明細書において用いられる場合、「分析物」とは、決定され得る目的の分子を指す。分析物の非限定的な例として、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡの両方）、炭水化物、脂質、ステロイド、および／または１５００ダルトンより小さい分子量を有する他の低分子が挙げられ得るが、それらに限定されない。この分析物またはこの分析物を含むサンプルのための供給源の非限定的な例として、細胞もしくは組織、またはそれらの培養物（もしくは継代培養物）が挙げられるが、それらに限定されない。細胞分析物の供給源の非限定的な例として、粗製（ｃｒｕｄｅ）または処理された細胞溶解物（全細胞溶解物を含む）、体液、組織抽出物、または細胞抽出物が挙げられるが、それらに限定されない。分析物のための供給源のさらに他の非限定的な例として、クロマトグラフィー分離または電気泳動分離のような分離過程からの画分が挙げられるが、それに限定されない。体液としては、血液、尿、便、脊髄液、脳液（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｆｌｕｉｄ）、羊水、リンパ液、または腺分泌物由来の液が挙げられるが、それらに限定されない。処理された細胞溶解物によって、本発明者らは、細胞を溶解するために必要な処理に加えて、この細胞溶解物が処理され、これによって回収される物質のさらなる処理を行うことを意味する。例えば、サンプルは、一つ以上の分析物を含む細胞溶解物またはその画分であり得、タンパク質分解酵素を用いて粗製細胞溶解物の総タンパク質成分を処理し、これによって、前駆体タンパク質（単数または複数）を分解することによって形成された、ペプチドである。疑問を避けるために、用語分析物は、文脈から明らかに反対の意味が意図されない限り、元の分析物およびそれに由来する複合物を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、用語分析物は、タンパク質、ならびにそのタンパク質の分解によってそのタンパク質から導かれたペプチドに対して、適用され得る。
【０００６】
ｂ．本明細書において用いられる場合、「細胞分析物」は、細胞由来の分析物である。
【０００７】
ｃ．本明細書において用いられる場合、「フラグメント化」とは、共有結合の開裂を指す。
【０００８】
ｄ．本明細書において用いられる場合、「フラグメント」とは、フラグメント化の産物（名詞）、またはフラグメント化を引き起こす操作（動詞）を指す。
【０００９】
ｅ．原子または分子の質量が、しばしば、原子質量単位の最も近い総数、または原子質量単位の最も近い十分の一の位の数（ｔｅｎｔｈ）もしくは百分の一の位の数（ｈｕｎｄｒｅｄｔｈ）に対して概算され得ることはよく認められる。本明細書において用いられる場合、「総質量」とは、異なる原子の型の同位体の使用は質量が非常に近いので、用いられた異なる同位体型の非常に小さい質量の差が検出されようがされまいが、それらの同位体は機能的に同等である範囲内で、絶対質量（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｍａｓｓ）ならびに概算質量（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ  ｍａｓｓ）を指す。
【００１０】
例えば、酸素の一般的な同位体は、１６．０（実際の質量１５．９９４９）および１８．０（実際の質量１７．９９９２）の総質量を有し、炭素の一般的な同位体は、１２．０（実際の質量１２．０００００）および１３．０（実際の質量１３．００３３６）の総質量を有し、窒素の一般的な同位体は、１４．０（実際の質量１４．００３１）および１５．０（実際の質量１５．０００１）の総質量を有する。これらの値は概算であるが、当業者は、あるセットのうちの一種のレポーターの中に１８Ｏ同位体を使用する場合、追加の２質量単位（１６．０の総質量を有する酸素の同位体を超える分）は、例えば、以下において補正し得ることを理解する：このセットの１６Ｏを含む異なるレポーター中で（このレポーターの他の部分に）１８Ｏを補正するために、２個の１２Ｃ原子の代わりに２個の１３Ｃ原子、２個の１４Ｎ原子の代わりに２個の１５Ｎ原子、またはさらに１個の１２Ｃおよび１個の１４Ｎの代わりに１個の１３Ｃ原子および１個の１５Ｎ原子を組み込む。この方法において、このセットのうちの２種の異なるレポーターは、機能的な質量等価物（すなわち、同じ総質量を有する）である。なぜならば、このセットまたはキットの全ての標識物中で２ダルトンの質量の増加を達成するための、２個の１３Ｃ原子（２個の１２Ｃ原子の代わり）の使用、２個の１５Ｎ原子（２個の１４Ｎ原子の代わり）の使用、１個の１３Ｃおよび１個の１５Ｎ（１個の１２Ｃおよび１個の１４Ｎの代わり）の使用、または１個の１８Ｏ原子（１個の１６Ｏ原子の代わり）の使用の間の質量の非常に小さい実際の差は、分析の性質にとって障害ではないからである。
【００１１】
ｆ．本明細書において用いられる場合、「標識試薬」とは、分析物を決定のために印付けするために適切な部分を指す。用語、標識とは、用語、タグ、印付け（ｍａｒｋ）ならびに他の等価の用語および句と類義である。例えば、標識化分析物はまた、タグ付けされた分析物または印付け（ｍａｒｋ）された分析物としても言及され得る。従って、用語「標識」、「タグ」、「印」、およびこれらの用語の派生語は、相互に交換可能であり、分析物を決定のために印付けするために適切な（または印付けしている）部分を指す。
【００１２】
ｇ．本明細書において用いられる場合、「支持体」、「固体支持体」、または「固体キャリア」は、任意の固体物質を意味する。固体支持体は、「樹脂」、「合成支持体」、「固相」、「表面」、「膜」、および／または「支持体」のような用語を含む。固体支持体は、有機重合体（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド）ならびに共重合体およびそのグラフトからなり得る。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）または逆相シリカのような無機のものでもあり得る。固体支持体の構成は、ビーズ、スフェア、粒子、顆粒、ゲル、膜または面の形態であり得る。面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、有孔性または無孔性であり得、膨張性または非膨張性の特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル、凹み（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、または他のコンテナ、容器、外観もしくは配置の形態で構成され得る。複数個の固体支持体は、試薬のロボット利用式送達にアドレス決め可能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）な，多様な位置でのアレイにおいてか、または検出方法および／もしくは検出器具によって、構成され得る。
【００１３】
ｈ．本明細書において用いられる場合、「固定相」とは、サンプルまたはその画分の一つ以上の成分の分析物を示差的に結合させるために用いられる支持体を指す。固定相の一例は、クロマトグラフィー充填物質であるが、それに限定されない。クロマトグラフィー充填物質の供給源は、当該分野において周知である。分離をもたらすためのクロマトグラフィー充填物質の機能および利用方法は、当該分野において周知である。
【００１４】
ｉ．本明細書において用いられる場合、「天然の同位体の量」とは、自然界における同位体（単数または複数）の天然の普及率に基づく、ある化合物中に見出される１種以上の同位体のレベル（または分布）を指す。例えば、生きた植物体から得られる天然化合物は、代表的には、１２Ｃと比較して約１．０８％の１３Ｃを含む。
【００１５】
ｊ．本明細書において用いられる場合、「サンプルまたはその画分」あるいは「サンプル画分」は、サンプルの画分に言及するために用いられ得る。サンプル画分は、あるサンプルの一部を単純に引き出すことによって生成され得るか、さもなければ、二つ以上の画分へ分画されているサンプルを生じる分離過程を行うことによって生成され得る。記載の文脈が反対のことを示さない限り、これらの言及は相互に交換可能であり、サンプルの画分（または一部）の作製のいずれかの型を指す。
【００１６】
ｋ．本明細書において用いられる場合、「サインイオン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｉｏｎ）」とは、アイソメリック標識試薬および／またはアイソバリック標識試薬のセットの各々の特有の標識試薬のフラグメントによってもたらされる特有のイオン（すなわち、レポーター）を指す。サインイオンまたはレポーター（もしくはレポーターイオン）は、特有の標識試薬を同定し、そしてそのピーク強度は、分析されるサンプル中に存在する標識化分析物の量と相関関係がある。サインイオンはまた、レポーターまたはレポーターイオンとして言及されることもあり、逆もまた然りである。
【００１７】
（４．一般）：
（標識試薬）：
本発明の実施形態において使用される標識試薬は、アイソバリック組成物および／または異性体組成物であり得る。代表的には、アイソメリック標識試薬またはアイソバリック標識試薬のセットが使用され得る。あるセットの標識試薬は、特有であるレポーターを含むように選択され得、そして例えば、ＭＳ／ＭＳ分析において独立して決定され得る。アイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬は、ＷＯ２００４／０７０３５２（任意の目的およびあらゆる目的のために参考として援用される）において開示される標識試薬であり得る。アイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬は、同時係属であり共通して所有される米国特許出願第１０／７６５，４５８号、同１０／７６５，２６４号、同１０／７６５，２６７号、または同１０／７６５，４５８号（これらの全てが任意の目的および全ての目的のために本明細書において参考として援用される）において開示される標識試薬であり得る。アイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬は、ＷＯ０２／１４８６７または米国公開特許出願番号ＵＳ２００３−００４５６９４Ａ１（あらゆる目的のために本明細書において参考として援用される）において記載される標識試薬のような、重合体に基づく標識試薬であり得る。標識試薬は、ＷＯ０１／６８６６４（あらゆる目的のために本明細書において参考として援用される）において開示されるアイソバリック標識試薬またはアイソメリック標識試薬であり得る。４種の適切なアイソバリック試薬のセットの例は、図４に示される。アイソバリック試薬のセットは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されており、ｉＴＲＡＱＴＭ標識試薬として販売されている（実施例４を参照のこと）。
【００１８】
アイソバリック標識試薬は、有用であり得る。なぜならば、アイソバリック標識試薬は、ＭＳ／ＭＳ分析で検出可能な差違を除いて、構造的および化学的に識別不可能であり得るからである（総質量と比較した場合に検出可能な絶対質量の差異が存在する場合を除く）。従って、一つのセットの二種の異なるアイソバリック標識試薬を用いて標識された同じ分析物は、構造的および化学的に識別不可能である。従って、各々が特有のアイソバリック標識を持つ二種の同一の分析物の各々は、反応性において識別不可能であるはずであり、ならびに、分離特性においても識別不可能であるはずである。
【００１９】
この標識試薬の特有のレポーターは、サンプルまたはサンプル画分（場合によって）の分析物をコード化するために用いられ得る。コード化は、標識試薬を用いてサンプルまたはサンプル画分を処理し、これによって標識化分析物を生成することによって行われ得、そして最終的にサンプル混合物がサンプルまたはサンプル画分から作製される。このサンプル混合物が分析される場合、サンプル混合物を調合するために用いられる異なるサンプルまたはサンプル画分中の各々の分析物の相対量および／または絶対量（しばしば濃度または分量で報告される）をデコード化（ｄｅｃｏｄｅ）するために、レポーターが使用され得る。これらの分析物自体もまた、娘イオン分析から決定され得る。このように、複合サンプル混合物の成分は、多様な様式において決定され、この分析は、また元のサンプルおよび／またはその画分に関する情報（すなわち、分析物の同一性および量）を提供する。
【００２０】
（サンプルのうちの分析物を標識する）：
標識試薬は、反応基を含む。本発明の実施形態において使用される標識試薬（単数または複数）の反応基は、求電子体または求核体のいずれかであり得、これはサンプルのうちの一つ以上の反応性分析物と反応し得る。この反応基は、もともと存在し（ｐｒｅｅｘｉｓｔ）得るか、またはインサイチュで調製され得る。いくつかの実施形態において、反応基のインサイチュでの調製は、反応性の分析物が存在しない場合に手掛けられ得る。いくつかの実施形態において、インサイチュでの調製は、反応性の分析物が存在する場合に手掛けられ得る。例えば、カルボン酸基は、アミン基（アリールアミン基を含む）のような求核体と反応し得る求電子基を調製するように、インサイチュで水溶性のカルボジイミド（例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル−３−塩酸エチルカルボジイミド；ＥＤＣ）で改変され得る。いくつかの実施形態において、ＥＤＣによる標識試薬のカルボン酸基の活性化は、アミン（求核体）含有分析物の存在下で行われ得る。あるいは、アミン（求核体）含有分析物はまた、ＥＤＣによる最初の反応が行われた後で加えられ得る。他の実施形態において、反応基は、インサイチュでの保護基の除去によってインサイチュで生成され得る。その後、求核体および／または求電子体の反応による分析物の誘導体化をもたらし得る、任意の、存在しているかまたは新たに作製される試薬（単数または複数）は、本発明の方法の実施形態、混合物の実施形態、キットの実施形態、および／または組成物の実施形態によって企図される。
【００２１】
標識試薬の反応基が求電子体である場合、この反応基は、この分析物の適切な求核基と反応し得る。標識試薬の反応基が求核体である場合、この反応基は、分析物の適切な求電子基と反応し得る。適切な求核基と求電子基との多数のペアが公知であり、しばしば化学的分野および生化学的分野において使用される。分析物（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、または１５００ダルトンより小さい他の低分子）と組み合わされ得、それらの分析物の誘導体化をもたらし得る、適切な求核基または求電子基を含む試薬の非限定的な例は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（（Ｐｅｒｓｔｏｒｐ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ），Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ  ６１１０５，ＵＳＡ）に記載される。他の適切な試薬は、当該分野において周知であり、多数の他の販売者（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から市販されている。
【００２２】
標識試薬の反応基は、アミン反応基である得る。例えば、アミン反応基は活性エステルであり得る。活性エステルは、ペプチド合成において周知であり、ペプチド合成において一般的に用いられる条件下でアミノ酸のＮ−αアミンと容易に反応される特定のエステルを指す。アミン反応性の活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、または２，４−ジハロフェニルエステルであり得る。例えば、活性エステルのアルコール基またはチオール基は、式：
【００２３】
【化１】
2010156706.tif 000003
を有し得、ここで、ＸはＯまたはＳであるが、好ましくはＯである。アルコール基またはチオール基である上記のものすべては、活性エステルを形成することがペプチド化学の分野において公知であり、ここで、このアルコール基またはチオール基は、アミノ酸のＮ−α−アミンとエステルのカルボニル炭素との反応によって置換される。本明細書において記載されるいずれかの適切な標識試薬／タグ化試薬の活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）が、周知の手順（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）．「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」中の「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ」（第２章、１３７〜１６５ページ）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい；また：Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｒｏｇｅｒ  Ｅｐｔｏｎ編（ＳＰＣＣ（ＵＫ）Ｌｔｄ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，１９９０）を参照されたい）を用いて調製され得ることは明らかなはずである。一般的式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの標識試薬の代表的な例であるＮ−置換ピペラジン酢酸化合物の活性エステルの形成のための方法は、同時係属であり共通して所有される米国特許出願第１０／７５１，３５４号において記載され、これは、あらゆる目的のために本明細書において参考として援用される。図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、Ｎ−メチルピペラジンの活性エステルを調製するための種々の方法の説明である。慣用的な実験のみを用いて、他の型の活性エステルの調製、ならびに他の標識試薬の活性エステルの調製に、そのような一般的な方法が適用され得る。ペプチド分析物およびタンパク質分析物を標識するための方法は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手し得るｉＴＲＡＱＴＭ試薬について記載されている。
【００２４】
別の実施形態において、標識試薬の反応基は、混合された無水物であり得る。なぜならば、混合された無水物は効率的にアミン基と反応し、それによってアミン結合を生ずることが公知であるからである。
【００２５】
標識試薬の反応基は、チオール反応基であり得る。例えば、チオール反応基は、マレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、またはα−ハロ−アシルであり得る。ハロゲン化（またはハロ）によって、本発明者らは、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素の原子を意味する。
【００２６】
標識試薬の反応基は、ヒドロキシル反応基であり得る。例えば、ヒドロキシル反応基は、ハロゲン化トリチル反応性部分またはハロゲン化シリル反応性部分であり得る。ハロゲン化トリチル反応性部分は、置換され得るか（例えば、Ｙ−メトキシトリチル、Ｙ−ジメトキシトリチル、Ｙ−トリメトキシトリチル、など）、または置換されず、ここでＹは以下に定義される。シリル反応性部分は、アルキル置換されたハロゲン化シリル（例えば、Ｙ−ジメチルシリル、Ｙ−ジトリエチルシリル、Ｙ−ジプロピルシリル、Ｙ−ジイソプロピルシリル、など）であり得、ここでＹは以下に定義される。
【００２７】
標識試薬の反応基は、求核体（例えば、アミン基、ヒドロキシル基、またはチオール基）であり得る。
【００２８】
（質量分析計／質量分析）：
本発明の実施形態は、分子イオンを選択してフラグメント化する能力を有するタンデム質量分析計、および他の質量分析計を用いて実行され得る。タンデム質量分析計（および、より低い程度までの、ポストソース崩解（ｐｏｓｔ  ｓｏｕｒｃｅ  ｄｅｃａｙ）を示す質量分析計のような一段（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔａｇｅ）質量分析計）は、分子イオンをその分子イオンの質量対電荷（ｍ／ｚ）比に従って選択してフラグメント化し、次いで、結果として生じるフラグメント（娘）イオンのスペクトルを記録する能力を有する。さらに具体的には、娘フラグメントイオンのスペクトルは、選択されるイオンを解離エネルギーのレベル（例えば、衝突誘起性解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ））に供することによって生成され得る。例えば、特定のｍ／ｚ比の標識ペプチドに対応するイオンは、第一の質量分析から選択され、第二の（ＭＳ／ＭＳ）質量分析においてフラグメント化されて再分析される。そのようなタンデム質量分析を行い得る代表的な装置として、四扇形磁場型（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｏｕｒ  ｓｅｃｔｏｒ）質量分析計、タンデム飛行時間型質量分析計、三連四重極（ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）質量分析計、イオントラップ質量分析計、ハイブリッド四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２９】
これらの型の質量分析計は、多様なイオン化供給源（エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援式レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）を含むが、それらに限定されない）と共に使用され得る。イオン化供給源は、分析物が固定の電荷を既に所有していない場合に、第一の質量分析のための荷電された化学種を生成するために使用され得る。さらなる質量分析装置およびフラグメント化方法として、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置におけるポストソース崩解、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ）−ＴＯＦ  ＭＳを用いる高エネルギーＣＩＤが挙げられる。タンデム質量分析計の最近の総説に関しては、Ｒ．ＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＤ．Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，「Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．」Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９−２９５（２００１）を参照されたい。また、ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析技術の議論に関しては、米国特許第６，３１９，４７６号（あらゆる目的のために本明細書において参考として援用される）を参照されたい。概して、第一の質量分析を得、第一の質量分析からのイオンを選択してフラグメント化し、次いでこのフラグメント化の結果を分析することが可能である限りは、使用され得る質量分析計の型に制限は存在しない。
【００３０】
（解離エネルギーレベルによるフラグメント化）：
質量分析計内で起こる過程の結果として結合がフラグメント化し得ることはよく認められる。さらに、結合のフラグメント化は、イオンを解離エネルギーレベルに供することによって、質量分析計内で誘導され得る。例えば、解離エネルギーレベルは、衝突誘起性解離（ＣＩＤ）によって、質量分析計内でもたらされ得る。質量分析の分野の当業者は、フラグメント化を引き起こす解離エネルギーレベルを課すための他の例示的技術として、光解離、電子捕獲（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅ）、表面誘導性解離（ｓｕｒｆａｃｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）が挙げられるが、それらに限定されないことを、理解する。
【００３１】
衝突誘起性解離による結合のフラグメント化の過程は、選択されるイオンの運動エネルギー状態を、結合のフラグメント化が起こる点まで上昇させる工程を含む。例えば、運動エネルギーは、衝突セル（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｃｅｌｌ）内での不活性ガス（例えば、窒素、ヘリウム、またはアルゴン）との衝突によって転移され得る。イオンへ転移され得る運動エネルギーの量は、衝突セルに入れられる気体分子の数に比例する。より多くの気体分子が存在する場合、より多くの量の運動エネルギーが選択されたイオンに転移され得、より少ない気体分子が存在する場合、より少ない運動エネルギーが転移される。
【００３２】
従って、質量分析計内の解離エネルギーレベルが制御され得ることは明らかである。また、特定の結合が他の結合より不安定であることもよく認められる。分析物または標識試薬のレポーター中の結合の不安定性は、分析物または標識試薬の性質に依存する。従って、解離エネルギーレベルは、分析物および／または標識物（例えば、レポーター／リンカーの組合せ）がいくらか制御された様式においてフラグメント化し得るように、調整され得る。当業者は、適当なレベルの解離エネルギーを達成し、それによって標識化分析物のイオンの少なくとも一部を、イオン化されたレポーター部分および娘フラグメントイオンへとフラグメント化するように、質量分析計の構成に対して慣用的な調整を行う方法を、理解する。
【００３３】
例えば、解離エネルギーは、第一の質量分析から選択され／単離されるイオンに適用され得る。タンデム質量分析計内で、抽出されたイオンは解離エネルギーレベルに供され得、次いで第二の質量分析計へ移送され得る。選択されたイオンは、選択された質量対電荷比を有し得る。質量対電荷比は、質量分析計の性質に依存して、質量対電荷比の範囲内にあり得る。衝突誘起性解離が使用される場合、イオンを、解離エネルギーがフラグメントイオンを産生するように適用され得る衝突セル内を通すことによって、第一の質量分析装置から第二の質量分析装置へとイオンが移送され得る。例えば、分析のために第二の質量分析装置に送られるイオンは、残りの（フラグメント化されていない）選択されたイオンの全てまたは一部、ならびに、標識化分析物のレポーターイオン（サインイオン）および娘フラグメントイオンを含み得る。
【００３４】
（コンピュータによって補助されるデータベース分析による分析物の決定）
いくつかの実施形態において、分析物は、公知の分析物のスペクトルまたは「理論上の」分析物のスペクトルとのコンピュータに補助される比較によって分析される、娘イオンのフラグメント化のパターンに基づいて決定され得る。例えば、低エネルギーＣＩＤの条件下でフラグメント化されるペプチドイオンの娘フラグメントイオンのスペクトルは、多数の不連続なフラグメント化の現象の合計と見なされる。共通の命名法は、開裂するアミド結合および結合の開裂後に電荷を維持するペプチドフラグメントに従って、娘フラグメントイオンを区別する。この開裂したアミド結合のＮ末端側での電荷保持は、ｂ型イオンの形成をもたらす。この電荷が開裂したアミド結合Ｃ末端側に残る場合、フラグメントイオンはｙ型イオンとして言及される。ｂ型イオンおよびｙ型イオンに加えて、ＣＩＤ質量スペクトルは、他の識別用フラグメントイオン（娘フラグメントイオン）を含み得る。この識別用フラグメントイオンとして、グルタミン、リシン、およびアルギニンからのアンモニアの中性子の損失（−１７ａｍｕ）、またはセリンおよびスレオニンのようなヒドロキシル基含有アミノ酸からの水の損失（−１８ａｍｕ）によって生成されるイオンが挙げられる。特定のアミノ酸は、低エネルギーＣＩＤの条件下で、他のアミノ酸より容易にフラグメント化することが観察されている。このことは、プロリン残基またはアスパラギン酸残基を含むペプチドについて、特に明らかであり、アスパルチル−プロリン結合でさらにより明らかである（Ｍａｋ，Ｍ．ら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１２：８３７−８４２（１９９８））。従って、Ｚ−ｐｒｏダイマーまたはＺ−ａｓｐダイマーのペプチド結合（ここで、Ｚは任意の中性アミノ酸であり、ｐｒｏはプロリンであり、ａｓｐはアスパラギン酸である）は、全ての他のアミノ酸ダイマーの組合せの間のペプチド結合と比較される場合、より不安定である傾向がある。
【００３５】
従って、ペプチドサンプルおよびタンパク質サンプルについて、低エネルギーＣＩＤスペクトルは、重なっているｂ系列イオンおよびｙ系列イオン、同じペプチドからの内部フラグメントイオン、ならびに、アンモニア（ｉｍｍｏｎｉｕｍ）イオンおよび他の中性子損失イオンについての重複する（分子量の）順序に特異的な情報を含む。そのようなＣＩＤスペクトルを解釈して、親ペプチドのアミノ酸配列を新規に構築することは、困難であり時間がかかる。ペプチド配列の同定における最も重要な進展は、ペプチドＣＩＤスペクトルを、タンパク質配列データベースおよびＤＮＡ配列データベース中に既に存在するペプチド配列と関連付ける、コンピューターアルゴリズムの開発であった。そのようなアプローチは、ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｅｎｇ，Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，５：９７６−９８９（１９９４））およびＭＡＳＣＯＴ（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｄ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０：３５５１−３５６７（１９９９））のようなプログラムによって例示される。
【００３６】
簡単に述べると、実験的ペプチドＣＩＤスペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）は、タンパク質配列データベースまたはゲノム配列データベースから得られるペプチド配列から計算的に作成される、「理論上の」娘フラグメントイオンスペクトルと、一致または相関する。この一致または相関関係は、ＭＳ／ＭＳの様式における娘フラグメントイオンの予測質量と実測質量の間の類似性に基づく。潜在的な一致または相関関係は、実験的フラグメントのパターンと「理論上の」フラグメントのパターンとがどの程度よく一致するかに従って、スコア付けされる。所定のペプチドのアミノ酸配列を検索するデータベース上の制約は、非常に識別力があるので、全ゲノムデータベースまたは発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）（ＥＳＴ）データベース中で、単一のペプチドＣＩＤスペクトルがいずれかの所定のタンパク質を同定するために十分であり得る。他の総説については、Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：５−８（２０００）、およびＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９：８９３−９００（１９９８）を参照されたい。
【００３７】
従って、ＭＳ／ＭＳスペクトルの娘フラグメントイオン分析は、標識化分析物のうちの分析物を決定するために用いられるのみならず、決定される分析物が由来する分析物を決定するためにもまた用いられ得る。例えば、ＭＳ／ＭＳ分析におけるペプチドの同定は、このペプチドがタンパク質の酵素的消化の結果として開裂された元のタンパク質を決定するために用いられ得る。同様の分析が他の分析物（例えば、核酸、炭水化物、脂質、およびステロイド）の決定にも適用され得ることが想像される。
【００３８】
（サンプル処理）：
本発明の特定の実施形態において、サンプルは、分析物の標識の前、ならびに分析物の標識の後で、処理され得る。処理はサンプルの全てまたはその一部に対して適用され得る。処理は、サンプル混合物またはその一部に対して適用され得る。処理は、サンプルを複雑でなくするために用いられ得るか、またはサンプルを分析のためにより好ましい形態にするために用いられ得る。この処理は、分析物の標識を容易にし得る。この処理は、サンプル成分の分析を容易にし得る。この処理は、サンプルの取り扱いを簡略化し得る。この処理は、上記のもののうちの二つ以上を容易に進し得る。
【００３９】
例えば、サンプルまたはサンプル混合物は、酵素を用いて処理され得る。この酵素はプロテアーゼ（タンパク質およびペプチドを分解するため）、ヌクレアーゼ（核酸を分解するため）、またはいくつかの他の分解酵素であり得る。この酵素は、きわめて予測可能な分解パターンを有するように選択され得る。二種以上のプロテアーゼおよび／もしくは二種以上のヌクレアーゼ酵素はまた、サンプル成分を分解するように、共にか、または他の酵素と共に使用され得る。
【００４０】
例えば、タンパク質分解酵素であるトリプシンは、セリンプロテアーゼであり、これは、アミン末端（Ｎ末端）およびリシンまたはアルギニンのカルボキシル末端アミノ酸（Ｃ末端）を含むペプチドを生じるように、リシンまたはアルギニンと非特異的なアミノ酸との間のペプチド結合を切断する。このように、タンパク質の切断から得られるペプチドは予測可能であり、トリプシン消化から得られるサンプル中のそれらのペプチドの存在および／または量は、それらのペプチドが由来するタンパク質の存在および／または量を示し得る。さらに、ペプチドの遊離アミン末端は、このペプチドの標識を促進する好ましい求核体であり得る。他の実験的なタンパク分解酵素として、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ），キモトリプシン、およびカルボキシペプチダーゼＣが挙げられる。
【００４１】
例えば、タンパク質（例えば、プロテインＺ）は、トリプシンのようなプロテアーゼを用いて消化される場合、三種のペプチド（例えば、ペプチドＢ、ペプチドＣ、およびペプチドＤ）を生じ得る。従って、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を用いて消化されており、分析される場合にペプチドＢ、ペプチドＣ、およびペプチドＤを含むことが確認されるサンプルは、元はプロテインＺを含んでいたと言える（表題：「コンピュータによって補助されるデータベース分析による分析物の決定」下の上記の議論を参照されたい）。ペプチドＢ、ペプチドＣ、およびペプチドＤの量もまた、消化されたサンプル中のプロテインＺの量と相関する。このように、サンプル（またはその画分）中のペプチドＢ、ペプチドＣ、およびペプチドＤの一種以上の正体および／または量の決定はいずれも、元のサンプル（またはその画分）中のプロテインＺを同定および／または定量するために用いられ得る。
【００４２】
酵素の活性は予測可能であるので、公知の配列のタンパク質の分解から産生されるペプチドの配列は予測可能である。この情報を用いて、「理論上の」ペプチドの情報がもたらされ得る。実際のサンプルの質量スペクトル分析からの娘フラグメントイオンの、コンピュータによって補助される分析（上記のような）における「理論上の」ペプチドのフラグメントの決定は、従って、一種以上の未知のサンプル中の一種以上のペプチドまたはタンパク質を決定するために用いられ得る。同様の分析が、他の分析物（例えば、核酸、炭水化物、脂質、およびステロイド）の決定に対しても適用され得ることが想像される。
【００４３】
いくつかの他の実施形態において、処理は、サンプル成分を分解する酵素以外の酵素を用いる処理を含み得る。例えば、この酵素は、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、または分析物から修飾（例えば、翻訳後修飾によって引き起こされる修飾）を除去する他の酵素であり得る。
【００４４】
いくつかの他の実施形態において、サンプル処理は、化学処理を含む。この化学処理は、上で論議されるような酵素処理の代替として、または上で論議されるような酵素処理と共に用いられ得る。この化学処理は、分析物の修飾を除去するために選択され得る。例えば、この化学処理は、翻訳後修飾によって引き起こされる修飾のような修飾を分析物から除去するために選択され得る。
【００４５】
代表的ではないが、酵素処理および／または化学処理は、修飾を除去する代わりに、一種以上の部分を分析物に付加するために用いられ得る。議論を簡単にするために、全ての本明細書中の引用は、分析物の修飾の除去についてであるが、これらの引用は、一種以上の部分を分析物に付加することが可能であることを含むことを意図されることが理解されるべきである。重要なことは、特有の標識試薬でコード化され得る分析物に、その分析物への変化が処理の間のいつに起こるかに依存して、変化が起こることである。
【００４６】
（分離）：
いくつかの実施形態において、分析物（標識されていようと未標識であろうと）を含むサンプルまたはサンプル混合物の処理は、分離の工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、この分離の工程は、固定相に結合するサンプルの成分と固定相に結合しない成分との間でのサンプル（または、その画分）の分画の工程を包含し得る。そのような処理は、しばしばアフィニティークロマトグラフィーとして言及される。いくつかの実施形態において、この分離の工程は、サンプルもしくはサンプル混合物（またはそれらの一画分または複数の画分）の成分の相対的な親和力に基づいて、サンプルもしくはサンプル混合物の分画の工程を包含し得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、分離の工程は、特定の固定相に結合するサンプルまたはサンプル混合物の成分を、その固定相に結合しない成分から区別するために行われ得る。例えば、リンペプチドは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムに結合することが公知である。この方法において、サンプルのリン酸化ペプチドは、非リン酸化ペプチドから分離され得る。他の型の支持体は、他の型のアフィニティーの特徴に基づいて、複合サンプルからの分析物の分離をもたらすために用いられ得る。
【００４８】
いくつかの実施形態において、同じサンプルまたは異なるサンプルからの示差的に標識化された分析物を含むサンプル混合物が調製され得る。「示差的に標識された」によって、本発明者らは、標識の各々が、同定され得る特有の特性を含む（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析において特有の「サインイオン」を生じる特有のレポーター部分を含む）ことを意味する。サンプル混合物を分析するために、このサンプル混合物の成分は分離され得、このサンプル混合物またはその画分に対して質量分析が行われ得る。この方法において、分離された分析物は個別に質量について分析され得、それによって分析処理の感度を増大させるので、分析の複雑性は実質的に減少し得る。この分析は、サンプル混合物の全ての画分の分析が可能となるように、このサンプル混合物の一つ以上のさらなる画分に対して一回以上繰り返され得る。
【００４９】
示差的に標識された同一の分析物がサンプル混合物中でのこれらの分析物の量に比例する濃度または分量で共溶出する分離条件は、サンプル混合物に加えられる各々のサンプルの量が未知であることを前提として、サンプル混合物を構成するサンプルの各々の中の、各々の標識化分析物の量を決定するために用いられ得る。従って、いくつかの実施例において、サンプル混合物の分離は、質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析）において決定されるシグナルとサンプル混合物中の別々に標識された分析物の量との間の相関関係を維持しつつ、分析を簡略化し得る。
【００５０】
分離は、クロマトグラフィーによって行われ得る。例えば、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）は、そのようなサンプル分離および質量分析をもたらすために用いられ得る。さらに、目的の分析物を分離するために適切な任意のクロマトグラフィー分離処理が用いられ得る。例えば、クロマトグラフィー分離は、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーであり得る。
【００５１】
分離は、電気泳動によって行われる。使用され得る電気泳動分離技術の非限定的な例として、１Ｄ電気泳動分離、２Ｄ電気泳動分離、および／またはキャピラリー電気泳動分離が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５２】
アイソバリック標識試薬または試薬のセットは、サンプルの分析物を標識するために用いられ得る。アイソバリック標識試薬は、分離工程が行われる場合に、特に有用である。何故なら、標識試薬のセットのアイソバリック標識が構造的および化学的に識別不能である（そして、フラグメント化がレポーターを分析物から除去するまで総質量によって識別不能であり得る）からである。従って、同一の組成物の、異なるアイソバリック標識を用いて標識される全ての分析物は、正確に同じ様式（すなわち、共溶出）において、クロマトグラフィーを行うことが出来る。これらの分析物は構造的および化学的に識別不可能であるので、分離過程からの溶出物は、サンプル混合物中の標識化分析物の量に比例する量の、各々がアイソバリック標識された分析物を含み得る。さらに、サンプル混合物が調製される方法についての知見（サンプルの複数部分、サンプル混合物を調製するために加えられる他の任意の成分（例えば、キャリブレーション標準））から、サンプル混合物中の標識化分析物の量を、この分析物が由来する元のサンプル中またはサンプル画分中のその標識化分析物の量に戻して関連付ける（例えば、逆算する）ことが可能である。
【００５３】
標識試薬はまた、異性体であり得る。異性体はクロマトグラフィーによって分離され得る場合もあるが、示差的に標識された全ての同一分析物を共溶出させるために分離過程が行われ得る、条件依存性である状況が存在し、ここで、溶出物中に存在する全ての標識化分析物の量は、サンプル混合物中のそれらの濃度および／または量に比例する。
【００５４】
本明細書において用いられる場合、同重体は構造的および化学的に識別不能な、名目上の同じ総質量の化合物（同位体含量および／または同位体分布を除いて）であるが、異性体は構造的および化学的に識別可能な、名目上の同じ総質量の化合物である点において、同重体は異性体と異なる。
【００５５】
（分析物の相対的および絶対的な定量）：
サンプル混合物の、示差的に標識された同一分析物の相対的な定量は、アイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬のセットを用いて可能となる。示差的に標識された同一分析物の相対的な定量は、第一（ＭＳ）の質量分析において観察される選択されて標識化分析物について、第二（ＭＳ／ＭＳ）の質量分析において決定されるレポーターの相対量（例えば、記録されるピークの面積または高さ）を比較することによって、可能となる。言い換えると、各々のレポーターが、サンプル混合物を生成するために用いられる特定のサンプル（またはサンプル画分）に関する情報と相関し得る場合、第二の質量分析において観察される他のレポーターに対するそのレポーターの相対量は、そのサンプル混合物中のその分析物の相対量である。サンプル混合物を構成するために用いられる各々のサンプルまたはそれらの画分の量が公知である場合、このサンプル混合物を調製するために用いられる各々のサンプル中の分析物の相対量は、第一の質量分析から選択される標識化分析物のイオンについて観察されるレポーターの相対量に基づいて逆算され得る。この過程は、第一の質量分析において観察される異なる標識化分析物の全てについて、繰り返され得る。このように、サンプル混合物を生成するために用いられる異なるサンプル（またはサンプル画分）の各々の中の、各々の反応性分析物の相対量（しばしば濃度および／または分量に換算して表される）が、決定され得ることが可能である。
【００５６】
いくつかの実施形態において、分析物の絶対量が決定され得る。これらの実施形態のために、公知の量の一種以上の示差的に標識された分析物（キャリブレーション標準（単数または複数））がサンプル混合物に加えられ得る。キャリブレーション標準は、キャリブレーション標準のレポーターがサンプル混合物を形成するために用いられるサンプルのいずれと比較しても特有であることを前提として、サンプル混合物の分析物を標識するために用いられる標識のセットのアイソメリック標識またはアイソバリック標識を用いて標識される、予測される分析物であり得る。サンプル混合物の示差的に標識された分析物のレポーターの相対量に対する、キャリブレーション標準のレポーター（すなわち、サインイオン）の相対量が一旦決定されると、サンプル混合物中の示差的に標識された分析物の全ての絶対量（しばしば濃度および／または分量で表される）を計算することが可能となる。このように、示差的に標識された分析物（その各々について、その分析物が由来する元のサンプル中のキャリブレーション標準が存在する）の各々の絶対量はまた、サンプル混合物が調製される方法の既知物に基づいて決定され得る。
【００５７】
上記のことにもかかわらず、適切である場合には、レポーター内での天然に存在する同位体量または人工的に作製された同位体量のいずれについても、レポーター（サインイオン）の強度についての補正が行われ得る。そのような補正方法論の例はまた、２００４年８月１２日に出願され、あらゆる目的のために本明細書において参考として援用される、同時係属であり共有される米国特許出願第１０／９１６，６２９号、表題：「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｆｏｒ  Ｄｅ−Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｎｇ  Ａ  Ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ」においても見出され得る。各々のレポーターの強度を正確に定量するためにさらなる注意が払われると、サンプル混合物を構成するために用いられる元のサンプルまたはサンプル画分の中の分析物の相対的定量および絶対的定量はより正確になる。
【００５８】
簡単に述べると、三種の方法を用いて、特定のサインイオンと関連する最高質量側（ｕｐ  ｍａｓｓ）の同位体ピーク強度および最低質量側（ｄｏｗｎ  ｍａｓｓ）の同位体ピーク強度が、全ての強度の寄与が正しいレポーターに厳密に帰するように、このサインイオン（すなわち、レポーター）と関連する主要な強度ピークに加えられ得る。特定のサインイオンと関連しないピーク強度は、適切に差し引かれる。全てのピーク強度を正しいサインイオンに完全に配置することによって、サインイオンと関連する相対的定量および絶対的定量の情報は非常に正確になり得る。
【００５９】
（プロテオミクス分析）：
サンプルは、多重化され得（すなわち、サンプル混合物を作製することによって）、分析され得、質量分析技術を用いて迅速かつ反復的な様式で再分析され得る。例えば、サンプル混合物は、一つ以上のサンプル中の個々の分析物の量について分析され得る。これらの分析物の量（しばしば濃度および／または分量で表される）は、サンプル混合物が構成された元のサンプル（またはサンプル画分）について決定され得る。サンプル処理および質量分析は迅速に行われ得るので、これらの方法は多数回にわたり繰り返され得、それによって、サンプル混合物の示差的に標識された多数の分析物の量が、これらの分析物が由来する元のサンプル中のこれらの分析物の相対量および／または絶対量に関連して決定され得る。
【００６０】
そのような迅速な多重分析が有用である適用の一つは、プロテオミクス分析の領域にある。プロテオミクスは、生物学的プロセスの構造、機能、および調節に関してのゲノム配列でコード化された情報を説明するための実験的アプローチとして見なされ得る。このことは、細胞または組織によって発現される総タンパク質成分の体系的分析によって達成され得る。本発明の実施形態と組み合わせて用いられる質量分析は、そのような包括的なタンパク質解析のための可能な一つのツールである。包括的なタンパク質解析として、翻訳後修飾の分析、プルダウン法の分析、または他のそのような複合分析が挙げられる。これらの方法はまた、生物マーカー分析のため、または時系列分析のために用いられ得る。
【００６１】
（５．本発明の実施の種々の様式）
本発明の実施形態は、修飾が目的のものであり得る場合の、修飾された分析物または未修飾の分析物の存在および／または非存在について、一つ以上の目的のサンプルの分析を可能にする。クロマトグラフィー技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）は、修飾された分析物を未修飾の分析物から分離するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、修飾の存在は、親和性支持体との特異的な相互作用と非特異的な相互作用とを識別することによって、独立して確認され得る。アイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬のセットは、異なるサンプルまたはサンプル画分の分析物をコード化するために用いられ得る。種々のサンプル中の修飾された分析物および未修飾の分析物の相対量は、種々の標識試薬と結合したレポーター（サインイオン）の比から決定され得、必要であれば、標識された（キャリブレーション）標準が用いられる場合、絶対的定量が可能である。概して、一つ以上のサンプルの修飾された分析物および未修飾の分析物は、以下の一般的な手順に従って決定され得る。
【００６２】
決定されるべきサンプルは、選択され、望ましい場合は必要に応じて処理され得る。サンプル処理の例示的実施形態は、表題：「サンプル処理」において前に論議された。例えば、決定されるべき分析物がタンパク質である場合、一種以上のプロテアーゼ酵素を用いてタンパク質をペプチドに分解することが望ましくあり得る。あるいは、または加えて、サンプルは、さらなる処理に供される前に、特定の成分を分離することによって処理され得る。分離の例示的実施形態は、表題：「分離」において前に論議された。分析物が分析のための適切な形態にある場合、処理は必要でなくてよい。
【００６３】
目的の修飾が、サンプルまたはサンプル画分の分析物と選択される固定相（すなわち、親和性支持体）との特異的な相互作用を引き起こすか否かについて決定がなされる場合、各々のサンプルの画分またはサンプル画分（「特異性コントロール」）は、この修飾を含むサンプルの分析物からこの修飾を除去する酵素および／または化学物質を用いて処理され得る。二つ以上のサンプルが同時に分析されている場合、処理される画分は、全てが混合されて混合物（「特異性コントロール混合物（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）」または「ＳＣＭ」）を形成し得る。上記のことにもかかわらず、少なくとも一つのサンプルまたはその画分は、修飾を除去する酵素および／または化学物質を用いて処理されないままであるか、さもなくば、未修飾の分析物と修飾された分析物をこの方法によって比較することは不可能である。
【００６４】
分析を簡略化するために、複合混合物の分析におけるサインピーク（ｓｉｇｎｉｔｕｒｅ  ｐｅａｋ）の釣り合いが比率情報を分析するのを簡単にするように、試験されるべき各々のサンプルまたはサンプル画分を組み合わせることによって、ＳＣＭが調製され得る。例えば、４個のサンプルが分析される場合、この４個のサンプルの各々の１／５が混合されて酵素または化学物質と反応させられるべきサンプルを形成し得る。従って、残りのサンプルの各々は、元のサンプルの４／５を表し、ＳＣＭはほぼ同等である（１／５＋１／５＋１／５＋１／５＝４／５）。従って、経験則として、ＳＣＭを形成するために各々のサンプルから組み合わされる量は、式：（１／サンプル数（またはサンプル画分数）＋１＝ＳＣＭを調製するために各々のサンプル（またはサンプル画分）から得られる画分）に従って選択され得る。この分析において任意の量がサンプルから回収され得るので、これが制限ではないことに注意されるべきである。しかし、この手順に従うことは、サインイオンについて観察されるピークの相対強度に基づく分析を簡略化する。
【００６５】
分析されるべきサンプルが選択され、所望の場合必要に応じて処理され、必要に応じて分画され（例えば、分離される）、そして必要に応じてアリコートにされて特定の結合分析のために処理された後、各々のサンプルまたはその画分（ＳＣＭを含む）は、親和性支持体に適用され得、この支持体を貫流する（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分析物の画分およびこの親和性支持体に結合する分析物の画分へと分離され得る。各々のサンプルまたはその画分は、異なる親和性支持体に適用される。支持体に結合する分析物は、貫流する分析物の条件と異なる条件下で溶出され得る。親和性支持体を貫流する分析物は、この親和性支持体に結合する画分とは別の画分として回収され得る。修飾された分析物と未修飾の分析物とのそのような分離を行うための方法は、当該分野において周知である。例えば、ＩＭＡＣカラムは、選択的にリンペプチドに結合し、それによって、関連する未修飾バージョンのペプチドからのこのリンペプチドの分離を可能にすることがよく理解される。
【００６６】
この時点で、目的の画分は、各々の画分の分析物とアイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬のセットとの反応によってコード化され得る。分析によっては、特定の画分はコード化される必要がなくてもよく、それらの画分は廃棄され得る。親和性支持体に結合する分析物を含む画分は、代表的には、アイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬のセットの特有の標識試薬を用いてコード化され得る。いくつかの実施形態において、親和性支持体を貫流する分析物を含む画分はコード化され、他の実施形態においては、これらの画分は廃棄され得る。
【００６７】
そのような標識試薬および標識方法の実施形態の議論は、表題：それぞれ「標識試薬」および「サンプルの分析物を標識する」において、前に論議されている。特異性コントロールまたはＳＣＭを除いて、結合サンプル画分およびフロースルー（貫流）サンプル画分の各々は、異なる標識試薬を用いてコード化され得る。特異性コントロールまたはＳＣＭのために、代表的には、親和性支持体に結合する成分を含む画分のみがこのセットからの特有の標識試薬を用いてコード化されるが、望ましい場合は、フロースルー物は特有の標識試薬を用いてコード化され得る。標識が完了した後、各々のサンプル画分（またはその部分画分）は共に混合され得る。全てのサンプル（またはサンプル画分）を共に混合することによって、時間的資材的に効率的な様式において多重分析が行われ得る。この様式によって、サンプル間または実施間での変動性に基づく補正を適用する必要性なしに、異なるサンプル（またはサンプル画分）の組合せの間で直接的な比較がなされ得る。絶対的な定量が望ましい場合、表題：「分析物の相対的および絶対的な定量」において前に論議されるように、目的の分析物についての既知の量のキャリブレーション標準が混合物に加えられ得る。
【００６８】
混合された後、この混合物は、分析物から目的の修飾を除去するために化学処理または酵素処理され得る。従って、この混合物の全ての分析物成分は、未修飾であるが、これらの分析物成分がこの処理の中の先の決定される工程において目的の修飾を含むか否かに関連する結合特性に基づいて、コード化される。従って、この混合物の全ての分析物への修飾が除去されているにもかかわらず、分析物の修飾についての適切な情報は、化学処理または酵素処理の後で混合物中に存在する。言い換えると、この時点での全ての分析物は未修飾であるはずであるが、選択された元のサンプル中の分析物の修飾の存在または非存在を追跡するようにコード化されているはずである。
【００６９】
化学処理または酵素処理の後で、このサンプル混合物は、必要であれば、質量スペクトル分析の前に分離され得る。分離は、混合物を複雑さをなくすために用いられ得る。例えば、分離は、このサンプル混合物の異なる分析物を分離し、それによって、簡略化されたより完全な質量スペクトル分析を容易にするために、用いられ得る。サンプル混合物が複雑であればあるほど、質量スペクトル分析の前の分離の一つ以上の工程の実行がより有益となる。標識試薬の全てがアイソバリックである場合、示差的に標識されているがその他は同一である分析物は、分離技術によっては識別し得ない。そのようにして得られた画分の一部または全ては質量分析計で分析されて、これによって元のサンプルの各々の成分分析物について可能な限り多くの情報を収集し得る。質量分析計による例示的分析は、表題：「質量分析計／質量分析」、「解離エネルギーレベルによるフラグメント化」、および「コンピュータによって補助されるデータベース分析による分析物の決定」において前に論議されている。
【００７０】
例えば、サンプル混合物（またはその画分）は、ＭＳ／ＭＳ分析を含む質量スペクトル分析によって分析され得る。ＭＳ／ＭＳ分析において、サインイオンは、サンプル混合物の異なる標識化分析物について決定され得、ここで、各々のサインイオンは、コード化されたサンプル画分の特有の標識試薬と相関し得、このサインイオンのピーク強度は、サンプル混合物中のその分析物の相対量と相関し得る。各々の分析物のサインイオンの相対強度情報から、元のサンプルの各々の中の修飾された分析物および未修飾の分析物の相対量を決定することが可能であり、必要であれば（特異性コントロールまたはＳＣＭが調製された場合）、この分析物が親和性支持体に対して特異的結合を示すかまたは非特異的結合を示すかを決定することが可能である。娘フラグメントイオン分析は、質量分析において同定される分析物が前駆体分子から得られた場合、この分析物（例えば、ペプチド）ならびに前駆体分子（例えば、タンパク質）を決定するために、さらに用いられ得る。
【００７１】
具体的には、特異性コントロールまたはＳＣＭが親和性支持体に対して個別に適用され、親和性支持体に結合する分析物の少なくとも一部が特有の標識試薬を用いて個別に標識された場合、この修飾を含む分析物が親和性支持体と特異的に相互作用するか否かを決定することが可能である。この情報は、特異性コントロールまたはＳＣＭと結合した特有の標識試薬のサインイオンが観察されるか否かを決定することによって可能である。サインイオンが観察される場合、親和性支持体との相互作用は非特異的である。特異性コントロールまたはＳＣＭのサインイオンが観察されない場合、親和性支持体との相互作用は特異的である。
【００７２】
表題、「コンピュータによって補助されるデータベース分析による分析物の決定」の下で論議されるように、娘イオン分析から、混合物中の分析物の一種以上を同定することが可能である。分析物が前駆体分子から得られる場合、一種以上の前駆体分子の同一性を取得することが可能であり得る。例えば、娘イオン分析がサンプル中の一種以上のペプチド分析物を同定する場合、タンパク質が消化されてこのペプチド分析物を生じたサンプルの中の、一種以上のタンパク質分析物を同定することが可能であり得る。以下の議論および実施例は、この分析が行われ得る方法を示す。
さらに、上記のサンプルおよびサンプル画分はコード化されているので、混合物中のサインイオンの相対強度は、分析される混合物中で同定される修飾されたバージョンの分析物および未修飾のバージョンの分析物の相対量と相関し得る。この情報は、元のサンプルにまた関連するので、元のサンプルの各々の中の、特定の修飾された分析物の相対量および／または絶対量、ならびにその対応する未修飾の分析物の相対量および／または絶対量を決定することが可能である。分析物が前駆体分子から得られる場合、元のサンプルの各々の中の、特定の修飾された前駆体分子（それ自体が分析物である）の相対量および／または絶対量、ならびにその対応する未修飾の前駆体分子（それ自体が分析物である）の相対量および／または絶対量を決定することが可能である。以下の議論および実施例は、この分析が行われ得る方法を示す。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
以下：
ｉ）一つ以上の分析されるべきサンプルを選択する工程であって、該サンプルは、各々が一つ以上の分析物を含み、該分析物の一部は、目的の修飾を含み得る、工程；
ｉｉ）必要に応じて、該サンプルの一つ以上またはその一画分を処理する工程；
ｉｉｉ）必要に応じて、該サンプルの一つ以上またはその一画分を、酵素または化学物質を用いて、目的の修飾をそのように修飾された分析物から取り除く条件下で処理する工程であって、但し、該サンプルまたはその画分の全てが該酵素または化学物質を用いて処理されるわけではない、工程；
ｉｖ）各々のサンプルまたはその一画分を、親和性支持体に適用する工程であって、全ての親和性支持体は同じ固定相を含むが、各々のサンプルまたはその画分は異なる親和性支持体に適用される、工程；
ｖ）必要に応じて、各々の親和性支持体を貫流する分析物を一画分として別々に収集する工程；
ｖｉ）各々の親和性支持体に結合する分析物を、適切な条件下で結合した分析物を溶出させることによって、一画分として別々に収集する工程；
ｖｉｉ）該親和性支持体に結合する一つ以上の分析物を含む各々の画分を、一つのセットのアイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬のうちの、独特のアイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬との反応によってコード化する工程；
ｖｉｉｉ）必要に応じて、該親和性支持体を貫流した一つ以上の分析物を含む各々の画分を、該一つのセットのアイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬のうちの、独特のアイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬との反応によってコード化する工程；
ｉｘ）アイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬を用いてコード化された全ての画分を混合する工程；
ｘ）必要に応じて、既知量の一つ以上のキャリブレーション標準を該混合物に添加する工程；
ｘｉ）該混合物を、酵素または化学物質を用いて、目的の修飾をそのように修飾された分析物から取り除く条件下で処理する工程；
ｘｉｉ）必要に応じて、該混合物を分離する工程；
ならびに、
ｘｉｉｉ）該混合物または一つ以上のその画分を質量分析によって分析し、これによって該混合物の一つ以上の分析物についての娘イオンフラグメントおよび各々の独特の標識試薬と関連するサインイオンを得る工程；
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、以下：
ａ）前記の修飾を含む分析物が、基盤となる親和性支持体と特異的に相互作用するか否かを決定する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目３）
項目１に記載の方法であって、以下：
ａ）前記混合物中の一つ以上の前記分析物を、娘イオンフラグメントの分析によって同定する工程；ならびに／あるいは
ｂ）前記サンプルの各々の中の特定の修飾された分析物および該分析物に対応する未修飾の分析物の、相対量および／または絶対量を決定する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目４）
項目３に記載の方法であって、以下：
ａ）工程ａ）および工程ｂ）を一回以上繰り返して、異なる分析物について、前記サンプルの各々の中の特定の修飾された分析物ならびに該分析物に対応する未修飾の分析物の、相対量および／または絶対量を決定する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目５）
項目１に記載の方法であって、一つ以上のタンパク質および／またはリンタンパク質を分析物として含む一つのサンプルが選択される、方法。
（項目６）
項目５に記載の方法であって、前記サンプルは、前記タンパク質および／またはリンタンパク質をペプチドおよび／またはリンペプチドに消化するために、トリプシンを用いる処理によって処理される、方法。
（項目７）
項目６に記載の方法であって、前記サンプルは、二つの画分に分けられる、方法。
（項目８）
項目７に記載の方法であって、前記サンプルの一つの画分は、一種以上のホスファターゼ酵素を用いて処理され、これによってリンペプチドを脱リン酸化し、もう一方の画分は、そのようには処理されない、方法。
（項目９）
項目８に記載の方法であって、前記の二つの分画の各々は、リンペプチドを未修飾のペプチドから分離し得る親和性支持体に適用される、方法。
（項目１０）
項目９に記載の方法であって、親和性支持体の各々に結合する分析物を含む画分のみが、標識試薬を用いてコード化され、それによって該分析物が単離された親和性支持体を同定する、方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法であって、コード化された画分は混合され、該混合物は、一種以上のホスファターゼ酵素を用いて処理され、これによって前記リンペプチドを脱リン酸化する、方法。
（項目１２）
項目１１に記載の方法であって、前記リン酸修飾を含む分析物が前記親和性支持体と特異的に相互作用するか否かを決定する工程をさらに包含する、方法。
（項目１３）
項目１に記載の方法であって、各々が一種以上のタンパク質および／またはリンタンパク質を分析物として含む二つのサンプルが選択される、方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法であって、各々のサンプルは、トリプシンを用いる処理によって処理され、これによって前記タンパク質および／またはリンタンパク質をペプチドおよび／またはリンペプチドに消化する、方法。
（項目１５）
項目１４に記載の方法であって、各々の処理されたサンプルが、リンペプチドを未修飾のペプチドから分離し得る親和性支持体に適用される、方法。
（項目１６）
項目１５に記載の方法であって、各々の親和性支持体に結合する分析物を含む画分が回収され、各々の異なるカラムから得られる該画分が、前記アイソメリック標識試薬および／またはアイソバリック標識試薬のセットからの、独特の標識試薬を用いてコード化される、方法。
（項目１７）
項目１６に記載の方法であって、親和性支持体の各々を貫流した分析物を含む画分が回収され、各々の異なるカラムから得られる画分は、前記アイソメリック標識試薬および／またはアイソバリック標識試薬のセットからの、特有の標識試薬を用いてコード化される、方法。
（項目１８）
項目１７に記載の方法であって、前記のコード化された画分は混合されて混合物を形成し、該混合物は、一種以上のホスファターゼ酵素を用いて処理され、これによって前記リンペプチドを脱リン酸化する、方法。
（項目１９）
項目１８に記載の方法であって、以下：
ａ）前記混合物中のペプチドの一種以上を、娘イオンフラグメントの分析によって同定する工程；ならびに／あるいは
ｂ）二つ以上の前記サンプルの各々の中の特定のリンペプチドおよび該リンペプチドに対応する未修飾のペプチドの、相対量および／または絶対量を決定する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目２０）
項目１９に記載の方法であって、以下；
ａ）工程ａ）および工程ｂ）を一回以上繰り返し、これによって、異なるペプチドについて、二つ以上の前記サンプルの各々の中の特定のリンペプチドおよび該リンペプチドに対応する未修飾のペプチドの、同一性および／または相対量および／または絶対量を決定する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目２１）
第一サンプルおよび第二サンプルが選択され、各々のサンプルが一種以上のタンパク質および／またはリンタンパク質を分析物として含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記第一サンプルおよび前記第二サンプルは、各々がトリプシンを用いる処理によって処理されて、これによって前記タンパク質および／またはリンタンパク質をペプチドおよび／またはリンペプチドに消化する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
各々の処理されたサンプルの画分は、混合されて特異性コントロール混合物を形成する、項目２２に記載の方法方法。
（項目２４）
前記特異性コントロール混合物は、一種以上のホスファターゼ酵素を用いて処理され、これによって前記リンペプチドを脱リン酸化する、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
項目２４に記載の方法であって、各々の画分は、リンペプチドを未修飾のペプチドから分離し得る親和性支持体に適用され、該画分は：
ａ）前記の第一サンプルの残りの、全てまたは一部；
ｂ）前記の第二サンプルの残りの、全てまたは一部；および
ｃ）前記の特異性コントロール混合物の全てまたは一部
である、方法。
（項目２６）
項目２５に記載の方法であって、各々の親和性支持体に結合する分析物を含む画分が回収され、各々の異なるカラムから得られる各々の画分は、前記アイソメリック標識試薬および／またはアイソバリック標識試薬のセットからの独特の標識試薬を用いてコード化される、方法。
（項目２７）
項目２６に記載の方法であって、各々の親和性支持体を貫流した分析物を含む画分が回収され、前記第一サンプルおよび前記第二サンプルから得られる少なくともフロースルー画分は、前記アイソメリック標識試薬および／またはアイソバリック標識試薬のセットからの独特の標識試薬を用いてコード化される、方法。
（項目２８）
項目２７に記載の方法であって、前記コード化された画分は混合されて混合物を形成し、該混合物は、一種以上のホスファターゼ酵素を用いて処理され、これによって前記リンペプチドを脱リン酸化する、方法。
（項目２９）
前記リン酸修飾を含む一種以上のペプチドが前記親和性支持体と特異的に相互作用するか否かを決定する工程をさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
項目２９に記載の方法であって、以下：
ａ）前記混合物中のペプチドの一種以上を、娘イオンフラグメントの分析によって同定する工程；ならびに／あるいは
ｂ）前記第一サンプルおよび前記第二サンプルの各々の中の、該同定されたペプチドおよび該ペプチドに対応するリンペプチドの、相対量および／または絶対量を決定する工程、
をさらに含む、方法。
（項目３１）
項目３０に記載の方法であって、以下；
ａ）工程ａ）および工程ｂ）を一回以上繰り返し、これによって、異なるペプチドについて、前記第一サンプルならびに前記第二サンプルの中の、特定のリンペプチドおよび該リンペプチドに対応する未修飾のペプチドの、相対量および／または絶対量を決定する工程、
をさらに含む、方法。
（項目３２）
項目３０に記載の方法であって、前記第一サンプルならびに前記第二サンプルの各々の中の、各々が前記の同定されたペプチドおよび関連するリンペプチドに関連するタンパク質およびリンタンパク質の、相対量および／または絶対量を決定する工程をさらに含む、方法。
（項目３３）
前記第一サンプルおよび前記第二サンプルの各々は細胞溶解物である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記分析物（単数または複数）は、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、または、分子量が１５００ダルトンより小さい他の低分子である、項目１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１ａ】図１ａは、理論上のサンプル１およびサンプル２のリンペプチドの存在についての分析の一つの実施形態のワークフローを示す。
【図１ｂ】図１ｂは、図１ａのワークフローによって代表される分析のための（ＭＳ／ＭＳ）質量スペクトル中のサインイオンのピークの理論上の結果を示す。
【図２ａ】図２ａは、リンペプチドの存在についてのサンプルの分析の一つの実施形態のワークフローを示し、ここで、親和性支持体に対する分析物の特異的結合および非特異的結合が決定され得る。
【図２ｂ】図２ｂは、図２ａのワークフローによって代表される分析のための（ＭＳ／ＭＳ）質量スペクトル中のサインイオンピークの理論上の結果を示す。
【図３ａ】図３ａは、サンプル１およびサンプル２のリンペプチドの存在についての分析の一つの実施形態のワークフローを示し、ここで、親和性支持体に対する分析物の特異的結合および非特異的結合が同時に決定され得る。
【図３ｂ】図３ｂは、図３ａのワークフローによって代表される分析のための（ＭＳ／ＭＳ）質量スペクトル中のサインイオンピークの理論上の結果を示す。
【図４】図４は、本発明の実施形態を用いる用途のために適切である４個のアイソバリック標識試薬の可能なセットの一つを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、種々の活性エステルの合成のためのスキームを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、種々の活性エステルの合成のための別のスキームを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、種々の活性エステルの合成のためのなお別のスキームを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、種々の活性エステルの合成のためのさらに別のスキームを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、２重のリンペプチドのスクリーニングおよび一部の関連データを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、モデルリンタンパク質の分析に関連する、実験的データ  対  公開データの表である。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
（６．例示的実施形態）：
以下に示される議論は、一つ以上のサンプルまたはその画分の中のリンペプチドの相対的定量および／または絶対的定量を決定することに焦点を当てる。リンペプチドは、翻訳後修飾（ＰＴＭ）の結果として細胞において生成される。従って、リンペプチドのリン酸基の存在は、本発明の実施形態によって決定され得る、目的の特徴である。しかし、以下に論議される具体的な手順は、分析物の任意の目的の修飾または他の特徴を決定するために採用され得、ここで、この修飾（または修飾に関連する特徴）は、天然の（未修飾）分析物を生成するように、酵素的手段または化学的手段によって除去され得る。以下に論議される手順としてはまた、特異的相互作用を非特異的相互作用から区別するためにコード化が用いられ得る、特定のタンパク質またはタンパク質複合体のアフィニティー（または抗体）プルダウン法が挙げられ得るが、それに限定されない。広範囲に考慮して、タグ付けは、実験的結果とコントロールの結果との間を確実に区別することを望む任意の状況において、サンプルをコード化するために用いられ得る。多重化によって、タグ付けは、実験および複数のコントロールを含み得る。従って、以下の実施例は、本発明を説明することを意図され、決して限定することを意図されない。
【００７５】
複合混合物中の翻訳後に修飾された細胞分析物の同定は、厄介であり得る。このことは特にリンペプチドについて真実である。質量分析におけるリンペプチドについての検出限界は、有意に低下し得る。何故なら、リンペプチドが、対応する天然の（非リン酸化）ペプチドと比較した場合に、しばしば低い（しばしば１０％より低い）モル濃度量において存在するからである。加えて、強い負であるリン酸基は、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量スペクトル分析およびマトリックス支援式レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量スペクトル分析の両方においてイオン抑制を引き起こし得、それによって、観察されるイオン強度を低下させる。従って、相対的に弱いリンペプチドのシグナルがしばしば他のイオンによって隠されるか、または他のサンプル成分によって抑制される、サンプル複雑性の高い多くのプロテオーム−スケールのプロジェクトにおいて、リンペプチドがほとんど首尾よく同定されないことは、驚きではない。サンプル複雑性はアフィニティークロマトグラフィーまたは純粋なＭＳ技術（例えば、前駆体または中性子損失のスキャン様式）の適用によって低下され得るが、リン酸化ペプチドの低いモル濃度量および低いイオン化効率は、複合ペプチドサンプル中で検出されにくくなる。
【００７６】
従って、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞分析物の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の分析のために適切な方法、混合物、および／またはキットに関係する。全ての型の翻訳後修飾が決定され得る。例えば、翻訳後修飾は、細胞分析物のリン酸化、糖化、または金属修飾を含み得る。細胞分析物は、任意の細胞成分（例えば、ペプチド、タンパク質、抗体（抗体フラグメントを含む）、核酸、炭水化物、脂質、またはステロイド）であり得る。
【００７７】
説明的な方法は以下に開示される。混合物の実施形態は、サンプル混合物を含み、このサンプル混合物中で、分析物は、それらの分析物が由来するサンプル画分を同定する標識試薬を用いてコード化される。キットの実施形態は、開示される方法を行うために適切なキット、ならびに、開示されるサンプル混合物をもたらすために用いられ得るキットを含む。キットは、例えば、目的の修飾分析物の未修飾分析物からの分離のために適切な、アイソバリック標識試薬のセットおよび親和性支持体を含み得る。
【００７８】
（特徴的な親和力特性に基づく分析物の修飾の決定）
図１ａ、１ｂ、および実施例１を参照して、翻訳後修飾、または分析物の他の特徴的特性を決定する様式の一つの記載が説明される。図１ａの説明に従って、（例えば、細胞溶解物由来の）タンパク質のような分析物を含む二つのサンプル（すなわち、サンプル１およびサンプル２）が、成分であるタンパク質を消化するために、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を用いる処理によって処理され得る。この消化物は、未修飾ペプチドおよび修飾ペプチド（例えば、リンペプチド、糖ペプチド、または金属ペプチド（ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄｅ））の両方を含み得る。各々の修飾ペプチドについて、相関する天然の（未修飾）ペプチドが、修飾ペプチドと比較した場合に、より多くの量またはより少ない量で存在し得る。
【００７９】
消化された材料の各々のサンプルは、修飾ペプチドを未修飾ペプチドから分離するために、クロマトグラフィーを用いて分離され得る。例えば、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムは、リンペプチドの固定化に適切であり、リンペプチドの固定化を促進することが公知である。固定相およびクロマトグラフィー条件は、他の型の修飾のために最適化され得る。基本的には、分離は、目的の特性（例えば、リンペプチド）を所有する可能性のある結合成分が、そのサンプルの他の成分から分離され得るように行われ得る。結合成分は、固定相を貫流する成分とは別に溶出され得、それによって、各々のサンプルの結合成分および非結合（フロースルー）成分の両方が個別に回収される。従って、二つのサンプルの系について、４つのサンプル画分が回収され得る。この説明に従う画分の数は、比較されるべきサンプルの数の２倍になる。
【００８０】
図１ａにおいて説明されるように、４つのサンプル画分の各々は、一つのセットの標識試薬の異なるアイソバリック標識試薬またはアイソメリック標識試薬と反応させられ得る。例えば、各々の標識試薬は、試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ、および試薬Ｄと称され得、ここで、例えば、これらの試薬は、ＭＳ／ＭＳ分析に供される場合に、各々１１４ａｍｕ、１１５ａｍｕ、１１６ａｍｕ、および１１７ａｍｕのフラグメントイオンを生じる。この時点で、これらの標識試薬は、４つの画分の各々の修飾ペプチドおよび未修飾ペプチド（分析物）と反応し得る。
【００８１】
図１ａにおいて説明されるように、４つの画分の各々が、４つの異なるアイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬のうちの一つを用いて標識されると、これらの４つの画分（またはそれらの一部）は混合されて、サンプル混合物（すなわち、図中の「ＭＩＸ」）を形成し得る。図１ａに従うと、この混合物は、サンプル１およびサンプル２の両方に由来する修飾ペプチドおよび未修飾ペプチドの両方を含み得、ここで、サンプル１由来のペプチドは試薬Ａ（１１４）または試薬Ｃ（１１６）を用いて標識（コード化）され、サンプル２由来のペプチドは試薬Ｂ（１１５）または試薬Ｄ（１１７）を用いて標識（コード化）される。質量／電荷が１１４、１１５、１１６、および１１７のサインイオンを産生するアイソバリック標識試薬の例示的なセットは、図４において説明される。
【００８２】
このサンプル混合物は、次いで、サンプル混合物の分析物から修飾を除去するために、酵素または化学物質を用いて処理され得る。例えば、リンペプチドのリン酸基は、１種以上のホスファターゼ酵素（例えば、セリン（Ｓ）ホスファターゼ、スレオニン（Ｔ）ホスファターゼ、またはチロシン（Ｓ）ホスファターゼ）を用いる処理によって除去され得る。処理の後、同じ分析物の先の修飾されたバージョンまたは未修飾のバージョンは、ここで全てが未修飾となる。しかし、決定されるべきペプチド分析物の全ては、それらの分析物画分が由来するサンプル画分ならびにサンプル（すなわち、サンプル１またはサンプル２）をコード化する標識を含む。この標識がアイソバリックである場合、異なる標識にも関わらず、特に任意の分離過程において、同一の分析物（例えば、ペプチド）は化学的および構造的に（重原子同位体の異なる分布を除いて）識別不能であり得る。従って、多次元の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）のようなその後の分離が、必要であれば行われ得る。サンプル混合物（分離過程によって作製される）の画分は、標識分析物の各々を、そのサンプル混合物中のその標識分析物の分量または濃度に比例して含むので、このことは問題ではない。
【００８３】
修飾（または除去可能な修飾に関連する目的の特徴）を除去するための、化学物質または酵素を用いる処理、および必要であれば分離の後、サンプル混合物またはその画分は、質量分析計で分析され得る。上で論議したように、ＭＳ／ＭＳ様式において、各々の分析物の娘イオンが、サンプルのペプチドおよび／またはタンパク質をＭＳ分析からのイオンの選択によって決定するために用いられ得る。さらに、各々の分析物ペプチドについて、サンプル混合物をもたらすために用いられる４つの画分の各々の中のそのペプチドの相対分量が、各々の標識試薬のレポーターの各々のサインイオンピークに基づいて決定され得る。
【００８４】
図１ｂを参照して、サインイオンについての観察されるパターンが、図１ａによって説明されるワークフロー（ｗｏｒｋｆｌｏｗ）に適用されるサンプルの結果を決定するために用いられ得る。図１ｂの分析によって示され得るように、分析物がＩＭＡＣカラムに対して親和力を示す（すなわち、リンペプチドである）場合、この分析物はカラム上に固定され、試薬Ａまたは試薬Ｂを用いて標識される。従って、分析物が親和性支持体に結合する場合、試薬Ａおよび試薬Ｂのサインイオンが、ＭＳ／ＭＳ分析において観察される。親和性カラムへの結合が起こらない場合、試薬Ｃおよび試薬ＤのみのサインイオンがＭＳ／ＭＳ分析において観察される。各々の標識試薬のサインイオンのピーク強度がサンプル混合物中での分析物の量に比例することが、注意されるべきである。サンプル混合物を形成するために添加される各々のサンプル画分の量（例えば、容積）の知見に基づいて、サンプル画分の各々中、ならびにサンプル１およびサンプル２の各々の中の分析物の量（代表的には、濃度または分量に換算して報告される）を逆算することが可能である。
【００８５】
分析物の絶対的定量が望ましい場合、標識試薬のセットのアイソバリック標識またはアイソメリック標識を用いて示差的に標識された既知の量のキャリブレーション標準分析物を用いて、サンプル混合物をスパイク付け（ｓｐｉｋｅ）することが可能である。この方法において、その分析物のサインイオンの相対量は、既知の量のキャリブレーション標準と相対的に比較され得る。キャリブレーション標準の分量との関係によって、サンプル混合物を形成するために用いられるサンプルの各々の中の分析物の絶対量が、サインイオンの相対強度に基づいて決定され得る。
【００８６】
上記の方法について注意点は、固定相に対する分析物の結合が、決定されることが求められる修飾の存在と関連し得るか否かである。これは、支持体への分析物の結合が、特異的または非特異的のいずれかあり得るからである。以下の実施例は、アイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬を用いて、支持体に対する分析物の観察される親和力が、修飾（または目的の特徴）によって引き起こされる特異的な親和力であるか否かを決定するための方法を説明する。
【００８７】
（親和性結合特性の特異性の決定）
図２ａ、図２ｂ、および実施例２を参照して、分析物の特徴的な特性が固定相への特異的な結合をもたらすか否かを決定する様式の一つの記載が説明される。この方法に従って、分析物（例えば、細胞溶解物由来のタンパク質）を含むサンプルが、サンプルの成分を消化するために、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を用いる処理によって処理され得る。タンパク質について、その消化物は、未修飾ペプチドおよび修飾ぺプチド（例えば、リンペプチド、糖ペプチド、または金属ペプチド）の両方を含み得る。各々の修飾ペプチドについて、関係する天然の（未修飾）ペプチドが、修飾ペプチドと比較した場合により多いまたはより少ない量で存在し得る。
【００８８】
図２ａを参照して、消化されたサンプルまたはその画分は、二つのサンプル画分へと分けられ得る。代表的には二つのサンプル画分は等量であるが、相対量が既知である限りこのことは必要条件ではない。特定の固定相との特異的または非特異的な相互作用について試験されるべき二つのサンプル画分のうち一つは、修飾を除去するために、化学処理または酵素処理され得る。二つのサンプル画分のもう一方は、さらなるサンプル処理なしに用いられ得る。
【００８９】
二つのサンプル画分の各々は、次いで、目的の固定相へ適用される。例えば、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムは、リンペプチドの固定化のために適しており、リンペプチドの固定化を促進することが公知である。固定相およびクロマトグラフィー条件は、他の型の修飾のために最適化され得る。基本的に、分離は、目的の特性を所有する可能性のある結合成分（例えば、リンペプチド）が、サンプルの他の成分から分離され得るように行われ得る。この結合した成分は、固定相を貫流する成分とは別に溶出され得、それによって、結合成分および非結合（フロースルー）成分の両方が個別に回収される。
【００９０】
図２ａにおいて説明されるように、固定相に結合し得た成分を含む画分のみが、一つのセットの標識試薬の異なるアイソバリック標識試薬またはアイソメリック標識試薬と反応される必要がある。「フロースルー」画分は標識され得、分析され得るが、このことは、この成分と固定相との相互作用が特異的であるか非特異的であるかを決定するために必須ではない。
【００９１】
図２ａにおいて説明されるように、標識されるべき画分の各々が、異なるアイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬のうちの一つで実際に標識されると、それらの画分（またはそれらの一部）は、サンプル混合物を形成するために混合され得る。このサンプル混合物は、修飾ペプチドおよび未修飾ペプチドの両方を含み得る。図２ａに従って、このサンプル混合物は、次いで、分析物から修飾を除去するために、酵素または化学物質を用いて処理され得る。例えば、リンペプチドのリン酸基は、一つ以上のホスファターゼ酵素を用いる処理によって除去され得る。処理の後で、同じ分析物の先の修飾されたバージョンおよび未修飾のバージョンは、ここで全てが未修飾となる。
【００９２】
しかし、決定されるべき分析物の全ては、それらの分析物が由来する可能性のあるサンプル画分、およびサンプル（すなわち、サンプル１またはサンプル２）をコード化する標識を含む。この標識がアイソバリックである場合、異なる標識にも関わらず、同一の分析物（例えば、ペプチド）は、特にいずれの分離過程においても、化学的および構造的に（重原子同位体の異なる分布を除いて）識別不可能であり得る。従って、多次元の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）のようなその後の分離が、必要であれば行われ得る。このことは問題ではない。何故なら、サンプル混合物（分離過程によって作製される）の画分は、標識化分析物の各々を、そのサンプル混合物中のその標識化分析物の分量または濃度に比例して含むからである。
【００９３】
修飾（または除去可能な修飾に結合した目的の特徴）を除去するための化学物質または酵素を用いる処理、および必要であれば分離の後で、サンプル混合物またはその画分は、質量分析計で分析され得る。上で論議したように、ＭＳ／ＭＳ様式において、各々の分析物の娘イオンが、サンプルのペプチドおよび／またはタンパク質をＭＳ分析からのイオンの選択によって決定するために用いられ得る。さらに、各々の分析物ペプチドについて、サンプル混合物をもたらすために用いられる画分の各々の中のそのペプチドの相対分量が、各々の標識試薬のレポーターの各々のサインイオンピークに基づいて決定され得る。
【００９４】
図２ｂを参照して、サインイオンについての観察されるパターンが、図２ａによって説明されるワークフローに適用されるサンプルの結果を決定するために用いられ得る。図２ｂの分析によって示され得るように、分析物がＩＭＡＣカラムに対して親和力を示す（すなわち、リンペプチドである）場合、この分析物はカラム上に固定され得、カラムから溶出され得、試薬Ａまたは試薬Ｂを用いて標識され得る。図２ｂを参照して、分析物が固定相に対して特異的に結合する場合、標識試薬Ａについてサインピークはほとんど観察されないか、全く観察されないはずである。何故なら、固定相との接触に先立つ修飾の除去が、固定相への分析物の特異的な結合を取り除くはずだからである。しかし、固定相との相互作用が非特異的である場合、標識試薬Ａについて少なくともいくらかのサインピークが観察される。何故なら、修飾の除去が、修飾と固定相との相互作用に対してほとんど効果を有さないか全く効果を有さないからである。
【００９５】
各々の標識試薬のサインイオンについてのピーク強度がサンプル混合物中の分析物の量に比例することが、注意されるべきである。サンプル混合物を形成するために添加されるサンプル画分の各々の量（例えば、体積または濃度）の知見に基づいて、サンプル画分の各々、および、適切な場合は、アッセイにおいて用いられるサンプルの各々の中の分析物の量（代表的には、濃度または分量に換算して報告される）を逆算することが可能である。
【００９６】
分析物の絶対的定量が望ましい場合、一つのセットの標識試薬のアイソバリック標識またはアイソメリック標識を用いて示差的に標識された既知量のキャリブレーション標準分析物を用いて、サンプル混合物をスパイク付けすることが可能である。このように、その分析物のサインイオンの相対量は、キャリブレーション標準の既知量と相対的に比較され得る。キャリブレーション標準の分量との関係によって、サンプル混合物を形成するために用いられるサンプルの各々の中の分析物の絶対量が、サインイオンの相対強度に基づいて決定され得る。
【００９７】
（分析物の修飾の決定および修飾物の支持体への結合親和性の特異性の決定）
図３ａ、３ｂ、および実施例３を参照して、サンプル成分中の修飾の存在、および、その修飾が固定相への特異的結合をもたらすか否かの両方を決定する様式の一つの記載が説明される。この方法に従って、分析物（例えば、細胞溶解物由来のタンパク質）を含む二つのサンプルが、サンプルの成分を消化するために、タンパク分解酵素（例えば、トリプシン）を用いる処理によって処理され得る。タンパク質について、その消化物は、未修飾ペプチドおよび修飾ぺプチド（例えば、リンペプチド、糖ペプチド、または金属ペプチド）の両方を含み得る。各々の修飾ペプチドについて、関係する天然の（未修飾）ペプチドが、修飾ペプチドと比較した場合により多いまたはより少ない量で存在し得る。
【００９８】
図３ａを参照して、消化されたサンプル（またはそれらの画分）の各々は、二つのサンプル画分へ分けられ得る。説明に従って、各々のサンプルは、２／３のアリコートおよび１／３のアリコートへ分けられ得るが、このことは、相対量が既知である限り必要条件ではない。説明に従って、１／３のサンプル画分の各々は組み合され得（１／３＋１／３＝２／３）、特定の固定相との特異的または非特異的な相互作用について試験されるべき修飾を除去するために、化学処理または酵素処理され得る。二つの１／３の画分を組み合わせることによって、ＩＭＡＣカラムに適用されるサンプルの量は全て同一（すなわち、２／３）である。このアプローチは、レポーターのシグナル分析に基づく相対的定量分析を簡略化し得る。各々のサンプルの残りの２／３は、さらなるサンプル処理なしに用いられ得る。
【００９９】
三つのサンプル画分の各々は、次いで、目的の固定相へ適用され得る。例えば、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムは、リンペプチドの固定化のために適しており、リンペプチドの固定化を促進することが公知である。固定相およびクロマトグラフィー条件は、他の型の修飾にために最適化され得る。基本的に、分離は、目的の特性（例えば、リンペプチド）を所有する可能性のある結合成分が、サンプルの他の成分から分離され得るように行われ得る。この結合成分は、固定相を貫流する成分とは別に溶出され得、それによって、各々のサンプルの結合成分および非結合（フロースルー）成分の両方が個別に回収される。
【０１００】
図３ａにおいて説明されるように、固定相に結合し得た成分を含む画分のみが、目的の修飾を除去するために、酵素処理または化学処理されるサンプルについて、一つのセットの標識試薬のアイソバリック標識試薬またはアイソメリック標識試薬（すなわち、説明における試薬Ｃ）と反応されることを必要とする。修飾を除去するための処理をされないサンプルについては、結合画分およびフロースルー画分の両方が、各々が一つのセットの試薬の異なるアイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬を用いて標識されるべきである。説明されるように、各々の標識試薬は、試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ、試薬Ｄ、および試薬Ｅと称され得、ここで、例えば、これらの試薬は、ＭＳ／ＭＳ分析に供される場合に、各々１１３ａｍｕ、１１４ａｍｕ、１１５ａｍｕ、１１６ａｍｕ、および１１７ａｍｕのフラグメントイオンを生じる。この時点で、これらの標識試薬は、二つまたは四つの画分の各々の修飾ペプチドおよび未修飾のペプチド（分析物）と反応し得、望ましい場合は、それによって各々の画分の成分をコード化し得る。
【０１０１】
図３ａにおいて説明されるように、標識されるべき画分の各々が、異なるアイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬のうちの一つで実際に標識されると、それらの画分（またはそれらの一画分）は、サンプル混合物を形成するために混合され得る。このサンプル混合物は、修飾分析物および未修飾の分析物の両方（例えば、ペプチド）を含み得る。図３ａに従って、このサンプル混合物は、次いで、分析物から修飾を除去するために、酵素または化学物質を用いて処理され得る。例えば、リンペプチドのリン酸基は、一つ以上のホスファターゼ酵素を用いる処理によって脱リン酸化され得る。処理の後、同じ分析物の先の修飾されたバージョンおよび未修飾のバージョンは、ここで全てが未修飾となる。
【０１０２】
しかし、決定されるべき分析物の全ては、サンプル画分、およびそれらの分析物画分が由来する可能性のあるサンプルをコード化する標識を含む。この標識がアイソバリックである場合、異なる標識にも関わらず、同一の分析物（例えば、ペプチド）は、特にいかなる分離過程においても、化学的および構造的に（重原子同位体の異なる分布を除いて）識別不能であり得る。従って、多次元の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）のようなその後の分離が、必要であれば行われ得る。このことは問題ではない。何故なら、サンプル混合物（分離過程によって作製される）の画分は、標識分析物の各々を、そのサンプル混合物中のその標識分析物の分量または濃度に比例して含むからである
修飾（または除去可能な修飾に関連する目的の特徴）を除去するための化学物質または酵素を用いる処理、および必要であれば分離の後、サンプル混合物またはその画分は、質量分析計で分析され得る。上で論議したように、ＭＳ／ＭＳ様式において、各々の分析物の娘イオンが、サンプルのペプチドおよび／またはタンパク質をＭＳ分析からのイオンの選択によって決定するために用いられ得る。さらに、各々の分析物（例えば、ペプチド）について、サンプル混合物をもたらすために用いられる画分の各々の中のそのペプチドの相対量が、各々の標識試薬のレポーターの各々のサインイオンピークに基づいて決定され得る。
【０１０３】
図３ｂを参照して、サインイオンについての観察されるパターンが、図３ａによって説明されるワークフローに適用されるサンプルの結果を決定するために用いられ得る。図３ｂの分析によって示され得るように、ＩＭＡＣカラムに対する親和性を示し、従ってＩＭＡＣカラムに結合する（すなわち、リンペプチドである）分析物について、これらの分析物は試薬Ａおよび試薬Ｂを用いて標識され得る。従って、試薬Ａおよび試薬Ｂについてのピークの強度は、元のサンプル中の修飾分析物（例えば、リンペプチド）の量を示す。同様に、元のサンプル中の未修飾分析物の量は、試薬Ｄおよび試薬Ｅを用いて標識される分画から決定され得る。従って、元のサンプルの各々の中の修飾分析物および未修飾分析物の量についての比が、ＭＳ／ＭＳ分析における試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｄ、および試薬Ｅのレポーターの比に基づいて決定され得る。
【０１０４】
図３ｂを参照して、分析物が固定相に特異的に結合する場合、標識試薬Ｃについてサインピークはほとんど観察されないか、または全く観察されないはずである。何故なら、固定相との接触に先立つ修飾の除去が、固定相への分析物の特異的結合を取り除くはずであるからである。しかし、固定相との相互作用が非特異的である場合、標識試薬Ｃについて少なくともいくらかのサインイオンピークが観察される。何故なら、修飾の除去が、修飾と固定相との相互作用に対してほとんど効果を有さないか全く効果を有さないからである。従って、この修飾が、固定相との特異的相互作用をもたらすか否かの決定もまた、このワークフローによって決定され得る。
【０１０５】
サンプルが処理された方法のに起因して、各々の標識試薬のサインイオンについてのピーク強度がサンプル混合物中の分析物の量に比例するはずであることが、注意されるべきである。サンプル混合物を形成するために添加されるサンプル画分の各々の量（例えば、体積または濃度）の知見に基づいて、サンプル画分の各々、および、適切な場合はアッセイにおいて用いられるサンプルの各々の中の分析物の量（代表的には、濃度または分量に換算されて報告される）を逆算することが可能である。
【０１０６】
分析物の絶対的定量が望ましい場合、アイソバリック標識またはアイソメリック標識の一つのセットの標識試薬を用いて示差的に標識された既知量のキャリブレーション標準分析物を用いて、サンプル混合物をスパイク付けすることが可能である。このように、その分析物のサインイオンの相対量は、キャリブレーション標準の既知量と相対的に比較され得る。キャリブレーション標準の分量に対する関係によって、サンプル混合物を形成するために用いられるサンプルの各々の中の分析物の絶対量が、サインイオンの相対強度に基づいて決定され得る。
【０１０７】
（種々の開示される実施形態に対する一般的な所見）
上記に開示される実施形態の各々において、分析物の絶対的定量は、その分析物についての基準がサンプル混合物に添加される場合、相対的定量に基づいて決定され得る。
【０１０８】
本発明は、上記に示されるように開示されているが、本明細書において、種々の変化、置換、変更がなされ得ることが理解されるべきである。さらに、他の例が、当業者によって容易に確認され得、添付の請求の範囲によって定義されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。
【実施例】
【０１０９】
（発明を実行する様式）
（実施例１：（予測的（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ））
（アフィニティークロマトグラフィーを用いるＰＴＭの簡単な多重分析（図１ａおよび１ｂ））
本実施例を、図１ａおよび図１ｂを参照して説明する。図１ａに関して、サンプル１およびサンプル２は、比較のために選択された細胞または組織に由来する総タンパク質溶解物である。この非限定的な例は、病的な細胞または組織に対する正常な細胞または組織、薬物または他の低分子を用いて処理された（あるいは処理されていない）細胞または組織、および疾患の進行もしくは疾患の処置の経過の間に同じ患者もしくは異なる患者から採取された生物学的体液（血清、尿、脊髄液）の複数のサンプルである。
【０１１０】
このタンパク質溶解物を、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）を用いて個別に消化し、生成されるペプチドを、ＩＭＡＣカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーに供し、それによってリン酸基を含むペプチドを選択的に結合させる。フロースルー画分（例えば、非リン酸化ペプチド）を収集し、次いで、結合した（リン酸化された）ペプチドを選択的に脱着させ、各々のＩＭＡＣカラムから収集する。
【０１１１】
４個のペプチドプール（２個のＩＭＡＣカラムからの結合画分およびフロースルー画分）の各々を、アイソバリック標識試薬の４重のセット（すなわち、試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ、および試薬Ｄ）のメンバーの一つと個別に反応させる。これらの４個のプールを、次いで一緒に混合し、セリン（Ｓ）ホスファターゼ、スレオニン（Ｔ）ホスファターゼ、およびチロシン（Ｙ）ホスファターゼのカクテルを用いて処理し、結合したリン酸基の全てを除去する。このペプチド混合物を、次いで、１Ｄ  ＬＣ、２Ｄ  ＬＣ、または多次元ＬＣによってクロマトグラフィー分離し、このペプチドを、ＭＳによって分析し、解離エネルギーによって断片化し、そして選択したイオンをＭＳ／ＭＳ分析によって分析する。アイソバリック標識試薬は化学的に同一であるので、対応するペプチドのクロマトグラフィー分離は存在せず、上記の４個のプールに由来する同一のペプチドは、質量がアイソバリックである。この時点での戦略は、時間を制限する制約またはサンプルを制限する制約内で可能な限り多くのペプチドについて、可能な限り多くのデータを収集することである。ここで、サンプル１とサンプル２との間での相対的なペプチド（従ってタンパク質）の量を定量するために、収集されたＭＳ／ＭＳ衝突スペクトルの試験を用い得、この試験は、同時に、具体的な同定（娘フラグメントのイオン分析に基づく）、ならびにこの混合物中のリンペプチドの定量（レポーターの相対的なサインイオン分析に基づく）を可能にする。
【０１１２】
図１ｂは、個々のペプチドのＣＩＤの後の、アイソバリック標識試薬の「サイン」イオンピークの理論上のパターンを説明する。この実施例において、サインイオンピーク（すなわち、標識試薬Ａ、標識試薬Ｂ、標識試薬Ｃ、および標識試薬Ｄ）は、１ダルトン離れているが、この間隔は、２ダルトン、３ダルトン、４ダルトンまたはそれ以上離れ得る。任意の所定のペプチドについて、以下の情報を、ＣＩＤスペクトルのサインイオン領域の試験によってもたらし得る：
１）最初のサンプル中でリン酸化されたペプチドのみが、試薬Ａおよび／または試薬Ｂについてのサインイオンを有する。ピークＡおよびピークＢが存在しないことは、このペプチドが元のサンプル中でリン酸化されなかったことを示す。
【０１１３】
２）存在する場合（リンペプチドのみ）、サンプル２と比較して、サンプル１中のペプチドの相対的なリン酸化状態を決定するために、ピークＡのピークＢに対する相対強度比を用い得る（等しい強度は、変化がないことを意味する；この記述は、同様の量のサンプルまたはサンプル画分を含むサンプル１およびサンプル２に対する同様の処理を、ＩＭＡＣカラムに適用したことを前提とする）。
【０１１４】
３）ピークＣおよびピークＤの相対的強度を、サンプル１およびサンプル２中の所定のペプチドの相対的濃度を決定するために用い得る（全てのペプチド；この記述は、同様の量のサンプルまたはサンプル画分を含むサンプル１およびサンプル２に対する同様の処理を、ＩＭＡＣカラムに適用したことを前提とする）。
【０１１５】
４）ピークＡのピークＣに対する相対比、およびピークＢのピークＤに対する相対比（例えば、５％、１０％、２５％）を、サンプル１およびサンプル２中の任意の所定のペプチドのリン酸化の相対的化学量論を決定するために用い得る（この記述は、同様の量のサンプルまたはサンプル画分を含むサンプル１およびサンプル２に対する同様の処理を、ＩＭＡＣカラムに適用したことを前提とする）。
【０１１６】
以下は、この方法の一般的に観察される利点である：
１）この方法は、複雑なサンプル混合物中のリンペプチドを同時に同定および定量することを可能にする。この方法は時間およびサンプル消費に関して非常に効率的である。なぜなら、全ての（非リン酸化）ペプチドの相対的ペプチド濃度に関係するデータと平行して、このデータもまた収集するからである。
【０１１７】
２）上記のホスファターゼを用いる処理は、いくつかの有利な結果を有する。リン酸基の除去は、全てのペプチドが同じネイティブの形態に還元されるので、全体的なサンプルの複雑性を減少させる。このことは、クロマトグラフィーおよびＭＳの両方の分解能のために好ましい。リン酸基の除去は、ペプチドのイオン化効率を（従ってシグナル強度を）上昇させ、検出感度を上げる。実際には、本発明者らは、任意の所与のペプチドの少ない（５〜１０％）リン酸化形態からのシグナルを、ネイティブのペプチドの多量成分からのシグナルに加えた。同定および定量に関する情報は、ここで、同じ単一のＣＩＤスペクトルセット中に存在する。
【０１１８】
３）ＣＩＤならびにＳＥＱＵＥＳＴおよびＭＡＳＣＯＴのようなプログラムを用いる配列データベースの調査によってリンペプチドを同定する能力を、改善する。記載される手順は、低出力のほとんどイオン化し得ないリンペプチドのシグナル全てを、未修飾の親ペプチドの同じ主要なシグナル成分へ加える効果を有する。
【０１１９】
４）ペプチドに基づくプロテオミクスのワークフローを適合させる。少量の付加的なサンプル調製（ＩＭＡＣカラム）のために、単一の多次元ＬＣ実験から収集されたデータを分析して、理論上のサンプル１とサンプル２との間の任意の所定のペプチドを同定して定量し得、存在した任意のリンペプチドを、同時に同定し定量し得る。
【０１２０】
このワークフローアプローチに対する一つの警告は、分析物の固定相への結合が特異的であったかまたは非特異的であったか否かについての決定はなされ得ないことである。言わば、単に分析物がＩＭＡＣカラムに結合したからといって、その分析物はリンペプチドでない可能性がある。なぜならば、一部の非リン酸化ペプチドはＩＭＡＣカラムに結合することが公知であるからである。以下の実施例は、分析物が固定相と特異的な相互作用または非特異的な相互作用を示すか否かを決定する方法を記載する。
【０１２１】
（実施例２：（予測的））
（特異的親和性結合と非特異的親和性結合との間の区別（図２ａ、２ｂ））
リンタンパク質のサンプルをプロテアーゼ（例えば、トリプシン）を用いて消化し、消化されたペプチドのプールを、二つの画分へ分ける（図２ａを参照されたい）。いかなる容積の差も既知でありＭＳ／ＭＳ分析におけるレポーターのピーク強度と相関関係があり得る限り、これらの画分が等しい容積であることは重要でない。一つの画分を、このサンプル画分の成分の全ての共有結合したリン酸を除去するために、ホスファターゼを用いて酵素的に（または化学的に）処理する。従って、この画分がコントロールサンプルとして役立つことを意図する。この二つのサンプルを、次いで、リン酸基を含むペプチドを選択的に結合させるためにＩＭＡＣカラムを用いるクロマトグラフィー分離に各々を供する。フロースルー（非リン酸化）ペプチドを収集し、次いで、結合（潜在的に、リン酸化されているかまたは非特異的に結合する）ペプチドを選択的に脱着し、各々のＩＭＡＣカラムから収集する。このことは潜在的に４個の分離したサンプル画分を生成する（図２ａを参照されたい）。
【０１２２】
これらの選択的に脱着（結合）された画分の各々を、アイソバリック試薬セットのメンバーの一つ（ＡまたはＢ）と個別に反応させる。ただし、特定のＩＭＡＣカラムから得られたサンプル画分の両方を同じアイソバリック標識と反応させる。この標識ペプチドのプールを、次いで混合し、結合したリン酸を除去するために酵素的（例えば、ホスファターゼを用いて）または化学的に処理する。全てのペプチドは、ここで、そのネイティブな非リン酸化形態に変換されている。
【０１２３】
このペプチドの混合物を、次いで、クロマトグラフィー分離（例えば、１Ｄ  ＬＣ、２Ｄ  ＬＣ、または多次元ＬＣ）に供し、これらのペプチドを、ＭＳおよびタンデムＭＳ／ＭＳによって分析する。アイソバリック試薬タグは化学的に同一であるので、タグ化されたペプチドのクロマトグラフィー分離は存在せず、上記の二つのプールからの同一のペプチドは質量がアイソバリックである（ＭＳ）。ＭＳ／ＭＳの後に、アイソバリック標識されたペプチドのＣＩＤから生じるサインイオンピークの試験は、ＩＭＡＣ親和性支持体へのペプチドの特異的結合または非特異的結合の区別を可能にし、従って、非特異的結合と比較した場合の真のリンペプチド結合の区別を可能にする。
【０１２４】
図２ｂを参照して、個々のペプチドのＣＩＤの後のアイソバリック試薬タグからのサインイオンピークの理論的パターンを説明する。この実験において、試薬Ａを、ＩＭＡＣカラムへの固定の前に脱リン酸化されたコントロールサンプルを標識するために用いた。従って、真の結合リンペプチドは、本来はタグＢのみを示すはずである。何故なら、ＩＭＡＣカラムに適用された物質中に残留する修飾された分析物は存在しないはずであるからである。しかし、ＩＭＡＣ支持体に非特異的に結合するペプチドは、試薬Ａおよび試薬Ｂの両方からのシグナルを示すはずである。何故なら、結合はリン酸修飾の存在または非存在に依存はしないからである。標識試薬「Ａ」を、従って、このペプチドが非特異的結合物であり得、かつリンペプチドとみなされるべきでないことを示す、「フラグ（ｆｌａｇ）」シグナルとして用いている。リン酸修飾が固定相に対して親和力を全く有さない場合、標識試薬Ａおよび標識試薬Ｂについてのピークの比は、ＩＭＡＣカラムに適用される二つの画分の量の比に対してほぼ比例するはずであることを注意するべきである。
【０１２５】
（実施例３：（予測的））
（複数の分析物の結合親和力の分析（図３ａおよび図３ｂ））
アイソバリック試薬セットのメンバーの一つを使用して、真のリン酸化を非特異的なリン酸化と区別するための「フラグ」として機能させるこの概念を、上記のように、単一のリンタンパク質分析から完全なプロテオーム分析へと拡張し得る（図３ａ、図３ｂ）。
【０１２６】
細胞溶解物１および細胞溶解物２（図３ａ）は、比較のために選択された細胞または組織に由来する総タンパク質溶解物であり得る。この型の非限定的な例は、病的な組織に対する正常な組織、薬物もしくは他の低分子を用いて処理された（もしくは処理されていない）細胞および／または疾患の進行もしくは疾患の処置の経過の間に同じ患者もしくは異なる患者から採取される生物学的体液（血清、尿、脊髄液）の複数のサンプルであり得るが、これらに限定されない。
【０１２７】
このタンパク質溶解物を、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）を用いて個別に消化する。消化された溶解物を、次いで、図３ａに示す比（各々のサンプル由来の２／３アリコートおよび１／３アリコート）に従って分ける。この２／３アリコートをＩＭＡＣに供し、リン酸基を含むペプチドを選択的に結合させる。フロースルー（推定非リン酸化）ペプチドを回収し、次いで、結合（推定リン酸化または推定非特異的結合）ペプチドを選択的に脱着させ、収集する。細胞溶解物１および細胞溶解物２の各々由来の１／３の画分を混合し、化学処理または酵素処理してリン酸を除去し、再度ＩＭＡＣに供する。これにより、非特異的結合についてのコントロールサンプルを構成する。結合ペプチドを、選択的脱着の後に回収し、そしてこの場合は、フロースルー画分を廃棄し得る。本質的に等量の総タンパク質が各々のＩＭＡＣカラムをフロースルーして落ちるように、ここで示す分割の比（２／３および１／３）を選択する。
【０１２８】
結合画分およびフロースルー画分を、図３ａに示すように、多重のセットのアイソバリック試薬のメンバー（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ：これらは標識のために任意の順番で用いられ得、以下の記載は、説明のみを目的として用いられ、決して限定することを意図されない）と個別に反応させる。全ての標識ペプチドのプールを、次いで組合せて、酵素処理または化学処理して結合したリン酸基を除去する。このプールされる混合物を、次いで、１Ｄ  ＬＣ、２Ｄ  ＬＣ、または多次元ＬＣによって分析し、ペプチドを、ＭＳによって分析し、解離エネルギーに供し、その後、選択されるイオンのＭＳ／ＭＳ分析に供する。収集したＭＳ／ＭＳ衝突スペクトルの試験を、ここで、相対的なペプチドの存在量を定量するために用い得、この試験は、同時に、混合物中のリンペプチドの具体的な同定および定量を可能にし得る。さらなる測定法として、「フラッグ」のピークＣの存在または非存在を、ＩＭＡＣの媒質への真の結合と非特異的結合との間を区別するために（従って、真のリンペプチドを識別するために）用い得る。有意な量のピークＣがＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて存在する場合、このペプチドは非特異的結合物であり、従って、真のリンペプチドではない。
【０１２９】
この論理を適用して、そのような実験から以下の型の情報を得ることが出来る（図３ｂ）。
【０１３０】
１）真のリンペプチドは、ピークＡおよび／またはピークＢを示す。ピークＡおよびピークＢが存在しないことは、このペプチドがリン酸化されていないことを示す。ピークＡおよびピークＢの相対的強度は、各々細胞溶解物１中および細胞溶解物２中のリン酸化形態のこのペプチドの相対的濃度を示す（この記述は、同様の量のサンプルまたはサンプル画分を含むサンプル１およびサンプル２に対する同様の処理を、ＩＭＡＣカラムに適用したことを前提とする）。
【０１３１】
２）ピークＤおよびピークＥの相対的強度を、細胞溶解物１および細胞溶解物２（全てのペプチド）中の任意の所与のペプチド（従って、タンパク質）の相対的濃度を決定するために用い得る。
【０１３２】
３）ピークＤに対するピークＡの相対比、およびピークＥに対するピークＢの相対比（例えば、５％、１０％、２５％）を、細胞溶解物１および細胞溶解物２中の任意の所与のペプチドのリン酸化の相対的化学量論を決定するために用い得る（この記述は、同様の量のサンプルまたはサンプル画分を含むサンプル１およびサンプル２に対する同様の処理を、ＩＭＡＣカラムに適用したことを前提とする）。
【０１３３】
４）ピークＣ由来のシグナルの非存在または実質的な存在を、このペプチドが真の特異的結合物であったか非特異的結合物であったかを決定するために用い得る。ピークＣが存在しないことは、このペプチドが真のリンペプチドであることを示す。ピークＣでのシグナルの実質的な存在は、このペプチドがＩＭＡＣカラムに非特異的に結合し得、リンペプチドではなかったことを示す。
【０１３４】
前述の手順を、アイソバリック標識試薬および／またはアイソメリック標識試薬のより大きなセットを用いるさらなるサンプルの分析へと拡張し得る。従って、この手順を、３個、４個、５個、６個、または６個より多い異なるサンプル（例えば、細胞溶解物）の分析のために用い得る。
【０１３５】
（実施例４：モデルリンタンパク質を用いる分析（図６ａおよび図６ｂ））
モデルリンタンパク質（ウシのａ−カゼイン）を還元し（ＴＣＥＰ、３７℃）、アルキル化し（ＭＭＴＳ、２時間、室温）そしてトリプシン分解した（１：２０  ｗ／ｗ、３７℃、１６時間）。
【０１３６】
（ＩＭＡＣ条件）：ＩＭＡＣクロマトグラフィーを、注射器のポンプに連結した、Ｆｅ３＋によって荷電されたＰｏｒｏｓ  ＭＣ吸着剤で充填した保護カラム（ｇｕａｒｄ  ｃｏｌｕｍｎ）（５ｃｍ×１ｍｍ）を用いて行った。０．１Ｍの酢酸中でサンプルをロードし、そして、２ｍｌの０．１Ｍの酢酸を用いてカラムを洗浄して、非リン酸化ペプチドを溶出させた。結合したリンペプチドを、次いで、１．５ｍｌの重炭酸トリエチルアンモニウム／７５％（ｖ／ｖ）エタノール（ｐＨ  ８．５）中に特異的に溶出させた。
【０１３７】
（ｉＴＲＡＱＴＭ標識）：ＩＭＡＣカラムの別々の結合画分およびフロースルー画分から回収された収集ペプチド画分を、次いで乾燥させ、７５％エタノール／０．２５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムからなるｉＴＲＡＱ標識緩衝液中で再構成した。１ｍｇの各々の試薬（１１４または１１５）を、各々のペプチド混合物に加え、３０分間室温で反応させた。用いたワークフローによっては、標識サンプルを次いでアルカリホスファターゼ（１％  ｗ／ｗ、１時間、室温）を用いて処理してリン酸基を除去し、次いで、ペプチド画分をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために組み合わせた。
【０１３８】
（ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ）：結果として得られたペプチド混合物を、ＬＣ−Ｐａｃｋｉｎｇｓ  ＵｌｔｉＭａｔｅＴＭ系を用いてキャピラリーＲＰ−ＨＰＬＣによって分離し、シアノ−ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを用いてＭＡＬＤＩプレート上にスポットした。このＭＡＬＤＩプレートを、その後、ＡＢＩ  ４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ
Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。ペプチドを、ＧＰＳ  ＥｘｐｌｏｒｅｒＴＭ２ソフトウェアを用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳのデータから同定した。ｉＴＲＡＱＴＭ試薬のサインイオンのピーク領域を、質量分析計のデータベースから直接的に抽出した。
【０１３９】
（図６ａおよび図６ｂ）：２重リンペプチドスクリーニング。図６ａは、このアプローチの最も簡単な実施手段を説明する。これに従うと、タンパク質消化混合物を、リンペプチドおよび非リンペプチドの両方について分析し得る。この実験において、リン酸基の存在を１１５  ｍ／ｚサインイオン（ＩＭＡＣカラムに結合）の出現によって印付けし、一方、非リンペプチドを、ｍ／ｚ  １１４（フロースルー）のレポーター群を用いてコード化した。この方法は、リン酸化の具体的な部位の決定を可能にしないが、本発明者らの結果は、より大量のリン酸化ペプチドを同定し得ることを示唆している。これは、主に、分析前にリン酸を除去し（このことがＭＳの感受性を改善する）、リン酸基の存在または非存在を示す決定的なＭＳ／ＭＳサインを提供するためにアイソバリック標識を用いるからである。本発明者らは、本発明者らの実験において同定されたリンペプチドを、ａ−カゼインについての他の報告と比較した（図６ｂ）。この方法を用いてより一貫して検出される、より長い数個のリンペプチドが、最も注目される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
2010156706.tif 000005
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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