(57)【要約】【課題】従来よりもさらに改良された、エタノールまたは脂肪酸を含む基質を用いた発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供する。【解決手段】腸内細菌科に属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌であって、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された細菌を、エタノールまたは脂肪酸を炭素源として含む培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌を、エタノールまたは脂肪酸を炭素源として含む培地に培養し、培養物中にＬ-アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ-アミノ酸を採取することを特徴とするＬ-アミノ酸の製造法であって、前記細菌が、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された細菌である方法。
【請求項２】
リボヌクレアーゼGをコードするrng遺伝子が不活化されたことにより、リボヌクレアーゼGの活性が低下した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記rng遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアント
である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌が、好気的にエタノールまたは脂肪酸を資化できるように改変された、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するように改変
されたadh遺伝子を保持し、それによって好気的にエタノールまたは脂肪酸を資化できる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、変異型adhE遺伝子を保持するように改変され、それによって好気的にエタ
ノールを資化できる、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記変異型adhE遺伝子が、568位のグルタミン酸残基が他のアミノ酸残基に置換された
以外は配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその保存的バリアントをコード
する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｌ-アミノ酸がＬ-リジン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-スレオニン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-
ヒスチジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-チ
ロシン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-プロリン、及びＬ-システインからなる群から選択され
る一種または二種以上のＬ-アミノ酸である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｌ-アミノ酸がＬ-リジンであり、前記細菌がジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォス
フォエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、
ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テ
トラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラ
ーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、及び
／または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｌ-アミノ酸がＬ-スレオニンであり、前記細菌がアスパルテートセミアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼＩ、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノト
ランスフェラーゼ、及び、スレオニンシンターゼからなる群より選択される１種または２
種以上の酵素の活性が増強されている請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌または
パントエア属細菌である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌が、エシェリヒア・コリである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
エタノールが培地中に0.001w/v%以上含まれる請求項１〜１２のいずれか一項に記載の
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、調味料、
食品添加物、飼料添加物、化学製品、医薬品などの様々な分野に利用される。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に
属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの製造法においては、自
然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えDNA技術により塩
基性Ｌ−アミノ酸生合成酵素の活性が増大するように改変された微生物などが用いられて
いる。(特許文献１〜９）
【０００３】
一般的に、微生物を用いてアミノ酸生産を行う際には、炭素源に糖質を主成分として用
いているが、エタノールまたは脂肪酸も糖質と同様に炭素源として用いることが可能である（特許文献１０）。
【０００４】
リボヌクレアーゼGは、16SrRNAの5'末端の成熟に関わるリボヌクレアーゼとして見出された（非特許文献１、２）。また、リボヌクレアーゼGは一本鎖RNAのAUリッチな領域を切断するといわれているが、切断配列等の詳細に関しては解明されていない（非特許文献３〜５）。
【０００５】
リボヌクレアーゼGの生理学的役割に関する知見は乏しいが、リボヌクレアーゼGがeno 
mRNAやアルコールデヒドロゲナーゼをコードするadhE mRNAの分解に関与していること、及び、マイクロアレイ解析の結果から、いくつかの解糖系酵素をコードする遺伝子をはじめ、複数の遺伝子のmRNAの特異的な分解に関与することが報告されている（非特許文献６〜８）。また、16S rRNAとadhE mRNAに対する分解活性を比較すると、rng:catでは両方が分解されなくなるのに対し、rng430 (G341S)ではadhE mRNAのみが分解されることが報告されている（非特許文献９）。
【０００６】
また、rng遺伝子とcra遺伝子の両方を欠損した株では、グルコースを炭素源として培養
した際にピルピン酸が蓄積するという報告がなされている（非特許文献１０）。
【０００７】
しかしながら、リボヌクレアーゼGの活性を変えることがエタノールまたは脂肪酸からのＬ−アミノ酸生産に効果があることは、全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許公開EP0643135B
【特許文献２】欧州特許公開EP0733712B
【特許文献３】欧州特許公開EP1477565A
【特許文献４】欧州特許公開EP0796912A
【特許文献５】欧州特許公開EP0837134A
【特許文献６】国際公開WO01/53459
【特許文献７】欧州特許公開EP1170376A
【特許文献８】国際公開WO2005/010175
【特許文献９】国際公開WO96/17930
【特許文献１０】WO2008/010565
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】EMBO J., 18 (1999) 2878-2885
【非特許文献２】Biochem. Biophys. Res. Commun., 259 (1999) 483-488
【非特許文献３】J. Biol. Chem., 269 (1994) 10797-10803
【非特許文献４】J. Biol. Chem., 269 (1994) 10790-10796
【非特許文献５】J. Biol. Chem., 275 (2000) 8726-8732
【非特許文献６】Mol. Microbiol., 43 (2002) 1445-1456
【非特許文献７】Genes Cell., 6 (2001) 403-410
【非特許文献８】Biosci. Biotechnol. Biochem., 66 (2002) 2216-2220
【非特許文献９】Biochem. Bioph. Res. Commun., 289 (2001) 1301-1306
【非特許文献１０】Appl. Microbiol. Biotechnol., 76 (2007) 183-192
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来よりもさらに改良された、エタノールまたは脂肪酸を含む基質を用いた発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、リボヌクレアーゼG
の活性を低下させることによって、腸内細菌のエタノールまたは脂肪酸からのＬ−アミノ酸生産能が大幅に向上することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌を、エタノールまたは脂肪酸を炭素源として含む培地に培養し、培養物中にＬ-アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ-アミノ酸を採取することを特徴とするＬ-アミノ酸の製造法であって、前記細菌が、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された細菌である方法。
（２）リボヌクレアーゼGをコードするrng遺伝子が不活化されたことにより、リボヌクレアーゼGの活性が低下した、前記方法。
（３）前記rng遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリア
ントである、前記方法。
（４）前記細菌が、好気的にエタノールを資化できるように改変された、前記方法。
（５）前記細菌が、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するように
改変されたadh遺伝子を保持し、それによって好気的にエタノールを資化できる、前記方
法。
（６）前記細菌が、変異型adhE遺伝子を保持するように改変され、それによって好気的に
エタノールを資化できる、前記方法。
（７）前記変異型adhE遺伝子が、568位のグルタミン酸残基が他のアミノ酸残基に置換さ
れた以外は配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその保存的バリアントをコ
ードする、前記方法。
（８）前記Ｌ-アミノ酸がＬ-リジン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-スレオニン、Ｌ-アルギニン
、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-フェニルアラニン、
Ｌ-チロシン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-プロリン、及びＬ-システインからなる群から選択
される一種または二種以上のＬ-アミノ酸である前記方法。
（９）前記Ｌ-アミノ酸がＬ-リジンであり、前記細菌がジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フ
ォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラー
ゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ
、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デア
シラーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、
及び／または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている前記方法。
（１０）前記Ｌ-アミノ酸がＬ-スレオニンであり、前記細菌がアスパルテートセミアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼＩ、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートア
ミノトランスフェラーゼ、及び、スレオニンシンターゼからなる群より選択される１種ま
たは２種以上の酵素の活性が増強されている前記方法。
（１１）前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌
またはパントエア属細菌である前記方法。
（１２）前記細菌が、エシェリヒア・コリである、前記方法。
（１３）エタノールが培地中に0.001w/v%以上含まれる前記方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、エタノールまたは脂肪酸を炭素源として、効率よくＬ−アミノ酸を製造することが
できる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜１＞本発明で使用される腸内細菌科に属する細菌
本発明で使用される細菌は、腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌であ
り、かつリボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された細菌である。本発明の細
菌は、腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌を、リボヌクレアーゼGの活性
が低下するように改変することによって取得することができる。以下に、リボヌクレアー
ゼGの活性が低下するように改変される、本発明の細菌の親株として使用される細菌、及
びＬ-アミノ酸生産能の付与又は増強の方法を以下に例示する。尚、本発明の細菌は、リ
ボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌にＬ-アミノ
酸生産能を付与するか、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された腸内細菌
科に属する細菌のＬ-アミノ酸生産能を増強することによっても、取得することができる。
【００１５】
＜１−１＞本発明の親株として使用される細菌
本発明の細菌は、腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌である。
腸内細菌科は、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パント
エア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネ
ラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotec
hnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/
wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が
好ましい。
【００１６】
エシェリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家
に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されていることを意味する。本発明に
おいて使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ（E.co
li）が挙げられるが、これに限定されない。
【００１７】
本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されな
いが、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli 
and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Tab
le 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されてい
る系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒ
ア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００１８】
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O. 
Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出
来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分
譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションのカタログに記載されている。
【００１９】
パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類によ
り、パントエア属に分類されていることを意味する。エンテロバクター・アグロメランス
のある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメラ
ンス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイその他に再分類された(I
nt. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993))。本発明において、パントエア属に属す
る細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００２０】
本発明に用いる細菌は、エタノールまたは脂肪酸の資化性を有する細菌であり、元来エタノールまたは脂肪酸の資化性を有する細菌、エタノールまたは脂肪酸の資化性を付与された組換え株、又はエタノールまたは脂肪酸の資化性が高まった変異株でもよい。
エシェリヒア・コリに関しては、嫌気条件でエタノールを生成する酵素として、以下の反応を可逆的に触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼとアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するAdhEの存在が知られている。エシェリヒア・コリのAdhEをコードするadhE遺伝子の配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。
アセチル-CoA + NADH + H+ → アセトアルデヒド + NAD+ + CoA
アセトアルデヒド + NADH + H+ → エタノールまたは脂肪酸 + NAD+
【００２１】
本発明においては、好気的にエタノールを資化できる細菌を用いることが好ましい。エシェリヒア・コリは、好気条件ではエタノールは資化できないが、好気的にエタノールを資化できるように改変された株を用いてもよい。元来好気的にエタノールを資化できない細菌を、好気的にエタノールを資化できるように改変するには、例えば、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するように改変されたadh遺伝子を保持させること、又は、好気的にエタノールを資化できることを可能にする変異をコード領域内に有
する変異型adhE遺伝子を保持させることが挙げられる。さらに、この変異型adhE遺伝子は、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するものであってもよい。
【００２２】
エシェリヒア・コリは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の上流のプロ
モーターを好気的に機能するプロモーターに置換することによって、好気条件でアルコー
ルデヒドロゲナーゼが発現し、好気的にエタノールを資化できるようになる（WO2008/010565号パンフレット）。好気条件で機能する非天然型プロモーターとして、好気条件で或る特定レベルを超えてａｄｈＥ遺伝子を発現することができる任意のプロモーターを用いることができる。好気条件は、振盪、通気及び撹拌等の方法によって酸素が供給される細菌の培養に通常用いられるものであり得る。具体的には、好気条件で遺伝子を発現することが知られている任意のプロモーターを用いることができる。例えば、解糖、ペントースリン酸経路、ＴＣＡサイクル、アミノ酸生合成経路等に関与する遺伝子のプロモーターを用いることができる。さらに、λファージのＰtacプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ＰRプロモーター、又はＰLプロモーターは全て、好気条件で機能する強いプロモーターであることが知られており、これらを用いることが好ましい。
【００２３】
また、前記したようにエシェリヒア・コリは好気条件ではエタノールは資化できないが、AdhEの変異によっても、好気的にエタノールを資化出来るようになることが知られている（Clark D. P., and Cronan, J. E. Jr. 1980. J. Bacteriol. 144: 179-184; Membrillo-Hernandez, J. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275: 33869-33875）。このような変異を有するAdhE変異体として具体的には、エシェリヒア・コリのAdhEの568位のグルタミン酸残基がグルタミン酸及びアスパラギン酸以外のアミノ酸残基、例えばリジンで置換された変異体（Glu568Lys、E568K）がある（国際公開パンフレットWO2008/010565号公報）。
【００２４】
さらに、前記AdhE変異体は、以下の追加的変異を含んでいてもよい。
Ａ）560位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基、例えばリジン残基への置換
Ｂ）566位のフェニルアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばバリン残基への置換、
Ｃ）22位のグルタミン酸残基、236位のメチオニン残基、461位のチロシン残基、554位のイソロイシン残基、及び786位のアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばそれぞれグリシン残基、バリン残基、システイン残基、セリン残基、及びバリン残基への置換、又は
Ｄ）上記変異の組合わせ。
【００２５】
「好気的にエタノールを資化できる」とは、エタノールを単一炭素源とする最少液体培地もしくは固体培地にて、好気条件で生育可能であることを意味する。「好気条件」は前記と同様に、振盪、通気及び撹拌等の方法によって酸素が供給される細菌の培養に通常用いられるものであり得る。また、「好気的にエタノールを資化できる」とは、ＡｄｈＥタンパク質のレベルに関して、Clark及びCronan（J. Bacteriol., 141, 177-183 (1980））の方法によって測定された無細胞抽出物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１．５ユニット以上、好ましくは５ユニット以上、及びより好ましくは１０ユニット以上であることを意味する。
【００２６】
本発明におけるＬ-アミノ酸生産菌は、油脂の加水分解物や脂肪酸のの資化能力を高めるように改変されていても構わない。例えば、腸内細菌群に見出される脂肪酸代謝を調節するDNA結合能を有する転写因子FadRをコードする遺伝子の欠損などが挙げられる（DiRusso, C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267: 8685-8691; DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7: 311-322）。具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のfadR遺伝子は、Genbank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号1,234,161〜1,234,880に位置し、GenBank accession No. AAC74271にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２７】
また、本発明の細菌は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキ
シドレダクターゼの活性が増大するように改変された菌株であってもよい。ピルビン酸シ
ンターゼの、あるいは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が増大するよ
うに改変するには、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレ
ダクターゼ活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変すること
が好ましい。尚、微生物が元来ピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合、同酵素活
性を有するように改変された微生物は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：Ｎ
ＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が、非改変株に比べて増大している。
【００２８】
本発明における「ピルビン酸シンターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばフェレドキシンあるいはフラボドキシン存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.7.1）を意味する。ピルビン酸シンターゼは、
ＰＳと略称されることもあり、ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキ
シンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、または、
ピルビン酸オキシドレダクターゼと命名されている場合もある。電子供与体としては、フ
ェレドキシンまたはフラボドキシンを用いることが出来る。
【００２９】
還元型フェレドキシン + アセチル-CoA + CO2 → 酸化型フェレドキシン + ピルビン酸 + ＣｏＡ
【００３０】
ピルビン酸シンターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の
微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸シンターゼ活性を比較することにより達成
される。ピルビン酸シンターゼの活性は、例えば、Yoonらの方法（Yoon, K. S. et al. 1
997. Arch. Microbiol. 167: 275-279）に従って測定できる。例えば、電子受容体として
の酸化型メチルビオロゲンとＣｏＡと粗酵素液を含む反応液にピルビン酸を添加した際に
、ピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測
定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmol
のメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸シンターゼ活性を有している
場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましく
は3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸シンターゼ活
性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビ
ン酸シンターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されている
ことが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/
mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸シンターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Buckel, W.and Go
lding, B. T. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60: 27-49）。したがって、酵素活性の測定に際しては、反応容器中の酸素濃度を低下させて酵素反応を行うことが好ましい。
【００３１】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、クロロビウム・テピダム(Chlorobium te
pidum)、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）
等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可
能である。また、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）をはじめとする、腸内細菌群
に属する細菌由来のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することも可能である。さらに、
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、メタノコッカス・マリパルディス（Methan
ococcus maripaludis）、メタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldococcus jann
aschii）、メタノサーモバクター・サーマトトロフィカス（Methanothermobacter therma
utotrophicus）などの独立栄養性メタン生成古細菌（autotrophic methanogens）のピル
ビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。
【００３２】
具体的には、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）のピルビン酸シンターゼ
遺伝子として、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_00293
2）の塩基番号1534432〜1537989に位置する、配列番号９に示す塩基配列を有する遺伝子
を例示することができる。配列番号１０には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示し
た（GenBank Accession No. AAC76906）。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイ
ラスのピルビン酸シンターゼは、δサブユニット（GenBank Accession No. BAA95604）、
αサブユニット（GenBank Accession No. BAA95605）、βサブユニット（GenBank Access
ion No. BAA95606）、γサブユニット（GenBank Accession No. BAA95607）の４つのサブユニットによる複合体を形成していることが知られている（Ikeda, T. et al. 2006. Bio
chem. Biophys. Res. Commun. 340: 76-82）。さらに、ヘリコバクター・ピロリ（Helico
bacter pylori）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 000915）の塩基番号1170138
〜1173296番に位置するHP1108、HP1109、HP1110、HP1111の4つの遺伝子からなるピルビン酸シンターゼ遺伝子、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）
のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 002754）の塩基番号1047593〜1044711番で示されるSSO1208、SSO7412、SSO1207、SSO1206の4つの遺伝子でコードされるピルビン酸シンターゼ遺伝子を例示することができる。さらに、ピルビン酸シンターゼ遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【００３３】
エシェリヒア・コリにおいては、K-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096
）の塩基番号1435284〜1438808に位置する、配列番号１１に示す塩基配列を有するydbK遺伝子（b1378）が、配列上の相同性からピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ
、すなわちピルビン酸シンターゼをコードしていると予想されている。配列番号１２には
、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. AAC76906）。さ
らに、ピルビン酸シンターゼ遺伝子は、エシェリヒア・コリのピルビン酸シンターゼ遺伝
子（ydbK）と高い相同性を有する、エシェリヒア属、サルモネラ属（Salmonella）、セラ
チア属（Serratia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、シゲラ属（Shigella）、サ
イトロバクター属（Citrobacter）などの腸内細菌群に属するピルビン酸シンターゼ遺伝
子であってもよい。
【００３４】
メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）のピルビン酸シンタ
ーゼは、メタノコッカス・マリパルディスのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_005
791）（Hendrickson, E. L. et al. 2004. J. Bacteriol. 186: 6956-6969）の塩基番号1
462535〜1466397に位置するporCDABEFオペロンにコードされている（Lin, W. C. et al. 
2003. Arch. Microbiol. 179: 444-456）。このピルビン酸シンターゼは、γ、α、β、
及びδの４つのサブユニットを含んでおり、これらのサブユニットに加えて、PorE及びPorFもピルビン酸シンターゼの活性に重要であることが知られている（Lin, W. and Whitman, W. B. 2004. Arch. Microbiol. 181: 68-73）。γサブユニットは、ゲノム配列の塩基番号1465867〜1466397（相補鎖）のporA遺伝子にコードされており、配列番号13にその塩基配列を、配列番号14に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988626）。δサブユニットは、ゲノム配列の塩基番号1465595〜1465852（相補鎖）porB遺伝子にコードされており、配列番号15にその塩基配列を、配列番号16に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988627）。αサブユニットは、ゲノム配列の塩基番号1464410〜1465573（相補鎖）のporC遺伝子にコードされており、配列番号17にはその塩基配列を、配列番号18に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988625）。βサブユニットは、ゲノム配列の塩基番号1463497〜1464393（相補鎖）のporD遺伝子にコードされており、配列番号19にはその塩基配列を、配列番号20に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988624）。PorEは、ゲノム配列の塩基番号1462970〜1463473（相補鎖）のporE遺伝子にコードされており、配列番号21にはその塩基配列を、配列番号22に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988623）。PorFは、ゲノム配列の塩基番号1462535〜1462951（相補鎖）のporF遺伝子にコードされており、配列番号23にはその塩基配列を、配列番号24に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988622）。
独立栄養性のメタン生成古細菌のメタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldoco
ccus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーマトトロフィカス（Methanothermobact
er thermautotrophicus）なども同じ遺伝子構造のピルビン酸シンターゼ遺伝子を有して
いることが知られており、これらを利用することが可能である。
【００３５】
本発明における「ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ」とは、アセチル-CoA
とCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばＮＡＤＰＨあ
るいはＮＡＤＨ存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.1.15）を意味する。ピルビン酸
：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、ＰＮＯと略称されることもあり、ピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼと命名されている場合もある。しかしながら、本発明において「ピルビン酸
デヒドロゲナーゼ活性」というときは、後述するように、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し
、アセチル-CoAを生成する反応を触媒する活性であり、この反応を触媒するピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ（PDH）は、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼとは別の酵素で
ある。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、電子供与体としては、ＮＡＤＰ
ＨあるいはＮＡＤＨを用いることが出来る。
【００３６】
ＮＡＤＰＨ + アセチル-CoA + CO2 → ＮＡＤＰ+ + ピルビン酸 + CoA
【００３７】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増強されたことの確認は、増強
前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキ
シドレダクターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシ
ドレダクターゼの活性は、例えば、Inuiらの方法（Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Che
m. 262: 9130-9135）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビ
オロゲンとCoAと粗酵素液を含む反応液に、ピルビン酸を添加した際にピルビン酸の脱炭
酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって
、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲン
の還元量で表される。親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有して
いる場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ま
しくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸：ＮＡＤ
Ｐ+オキシドレダクターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を
導入することにより、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼが生成されていれば
よいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U
/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg
以上が望ましい。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、酸素に対して感受性
であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Inui, H. et al. 1987. J. B
iol. Chem. 262: 9130-9135; Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）。
【００３８】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、光合成真核微生
物で原生動物にも分類されるユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸
：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Nakazawa, M. et al. 2000. FEBS Lett. 479:
155-156）、原生生物クリプトスポルジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）のピ
ルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol.
Evol. 18: 710-720）の他、珪藻タラシオシラ・スードナナ（Tharassiosira pseudonana
）にも相同な遺伝子が存在することが知られている（Ctrnacta, V. et al. 2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53: 225-231）。
【００３９】
具体的には、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+
オキシドレダクターゼ遺伝子として、配列番号25に示す塩基配列を有する遺伝子を例示す
ることができる（GenBank Accession No. AB021127）。配列番号26には、同遺伝子がコー
ドするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. BAB12024）。
【００４０】
本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼの活性に必要な電子供与体の酸化型を還元型
にリサイクルする活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変す
ることによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよ
い。電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性としては、フェレドキシン-ＮＡ
ＤＰ+レダクターゼ活性を挙げることができる。また、電子供与体のリサイクル活性の増
強に加えて、ピルビン酸シンターゼ活性が増大するように改変することによって、ピルビ
ン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。なお、上記親株は、
本来内在的に電子供与体のリサイクル活性をコードする遺伝子を有しているものであって
もよいし、本来は電子供与体のリサイクル活性を有さないが、当該活性をコードする遺伝
子を導入することにより活性が付与され、Ｌ-アミノ酸生産能が向上するものであっても
よい。
【００４１】
「フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ」とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素
（EC 1.18.1.2）をいう。
【００４２】
還元型フェレドキシン + NADP+ → 酸化型フェレドキシン + NADPH + H+
【００４３】
本反応は、可逆反応であり、ＮＡＤＰＨと酸化型フェレドキシン存在下で、還元型フェ
レドキシンを産生することが可能である。フェレドキシンはフラボドキシンと代替可能で
ありフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼと命名されているものも同等の機能を有する
。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼは微生物から高等生物まで幅広く存在が確認さ
れており（Carrillo, N. and Ceccarelli, E. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270: 1900-19
15; Ceccarelli, E. A. et al. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698: 155-165参照）、
フェレドキシン-ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ-フェレドキシンオキシド
レダクターゼと命名されているものもある。
【００４４】
フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性が増強されたことの確認は、改変前の微
生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクタ
ーゼ活性を比較することにより達成される。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼの活
性は、例えば、Blaschkowskiらの方法（Blaschkowski, H. P. et al. 1982. Eur. J. Bio
chem. 123: 563-569）に従って測定できる。例えば、基質としてフェレドキシンを用い、
減少するNADPH量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのNADPHの酸化
量で表される。親株がフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を有している場合、親
株の活性が十分高ければ、増強する必要はないが、親株と比較して、好ましくは1.5倍以
上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。
【００４５】
フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼをコードする遺伝子は、多くの生物種で見出さ
れており、目的のＬ-アミノ酸生産株中で活性を有するものであれば使用することが可能
である。エシェリヒア・コリではフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼとしてfpr遺伝
子が同定されている（Bianchi, V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175:1590-1595）。また
、シュードモナス・プチダ(Psuedomonas putida)には、ＮＡＤＰＨ-プチダレドキシンレ
ダクターゼ（Putidaredoxin reductase）遺伝子とプチダレドキシン（Putidaredoxin）遺
伝子がオペロンとして存在することが知られている(Koga, H. et al. 1989. J. Biochem.
(Tokyo) 106: 831-836）。
【００４６】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼとしては、エシェリヒア
・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4111749〜41124
95（相補鎖）に位置する、配列番号27に示す塩基配列を有するfpr遺伝子を例示すること
ができる。配列番号28にはFprのアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. AAC76906）。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）の塩基番号2526234〜2527211にフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子が見出されている（GenBank Accession No. BAB99777）。
【００４７】
ピルビン酸シンターゼの活性には、フェレドキシン又はフラボドキシンが電子供与体と
して存在することが必要である。従って、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が
向上するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改
変された微生物であってもよい。
また、ピルビン酸シンターゼ活性、又は、フラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ及び
ピルビン酸シンターゼ活性が増強するように改変することに加えて、フェレドキシン又は
フラボドキシンの産生能が向上するように改変してもよい。
【００４８】
本発明における「フェレドキシン」とは、非ヘム鉄原子（Fe）と、硫黄原子を含み、4F
e-4S、3Fe-4S、あるいは、2Fe-2Sクラスターと呼ばれる鉄-硫黄クラスターを結合したタ
ンパク質で1電子の伝達体として機能するものを指す。「フラボドキシン」とはFMN（Flav
in-mononucleotide）を補欠分子属として含む1あるいは2電子の伝達体として機能するも
のタンパク質を指す。フェレドキシンとフラボドキシンについては、McLeanらの文献に記
載されている（McLean, K. J. et al. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33: 796-801）。
【００４９】
なお、改変に用いる親株は、本来内在的にフェレドキシン又はフラボドキシンをコード
する遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はフェレドキシン又はフラボドキシ
ン遺伝子を有さないが、フェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を導入することにより
活性が付与され、Ｌ-アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【００５０】
フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて
向上していることの確認は、フェレドキシン又はフラボドキシンのmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認できる。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Sambrook, J. et al. 1989. Molecula
r CloningA Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
, New York）。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していれば
いずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上
、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【００５１】
また、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と
比べて向上していることの確認は、SDS-PAGEや二次元電気泳動あるいは、抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J. et al. 1989. Molecula
r Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, New York）。生産量については、野生株あるいは非改変株と比較して、向上していれ
ばいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以
上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【００５２】
フェレドキシン及びフラボドキシンの活性は、適切な酸化還元反応系に加えることで測
定することが可能である。例えば、Boyerらにより、産生されたフェレドキシンをフェレ
ドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼにより還元し、生じた還元型フェレドキシンによるチト
クロームCの還元を定量する方法が開示されている（Boyer, M. E. et al. 2006. Biotech
nol. Bioeng. 94: 128-138）。また、フラボドキシンの活性は、フラボドキシン-ＮＡＤ
Ｐ+レダクターゼを用いることで、同じ方法で測定が可能である。
【００５３】
フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードする遺伝子は、広く分布しており、コー
ドされるフェレドキシン又はフラボドキシンがピルビン酸シンターゼと電子供与体再生系
が利用可能なものであれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、エシェリ
ヒア・コリには、2Fe-2Sクラスターを有するフェレドキシンをコードする遺伝子としてfd
x遺伝子が存在し（Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-111
25）、4Fe-4Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてyfhL遺伝子が予想されてい
る。また、フラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子（Osborne, C. et al. 1991. J. 
Bacteriol. 173: 1729-1737）とfldB遺伝子（Gaudu, P. and Weiss, B. 2000. J. Bacter
iol. 182:1788-1793）の存在が知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノ
ム配列（GenBank Accession No. BA00036）においては、塩基番号562643〜562963番に複数のフェレドキシン遺伝子fdx（GenBank Accession No. BAB97942）及び塩基番号1148953〜1149270番にfer（GenBank Accession No. BAB98495）が見出されている。また、クロロビウム・テピダムにおいては、多くのフェレドキシン遺伝子が存在するが、ピルビン酸シンターゼの電子受容体となる4Fe-4S型のフェレドキシン遺伝子としてフェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIが同定されている（Yoon, K. S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276: 44027-44036）。ハイドロジェノバクター・サーモファイラス等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌由来のフェレドキシン遺伝子あるいはフラボドキシン遺伝子を用いることもできる。
【００５４】
具体的には、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子として、エシェリヒア・コリ
K-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号2654770〜2655105番（相補鎖）に位置する配列番号29に示すfdx遺伝子、及び塩基番号2697685〜2697945番に位置する配列番号31に示すyfhL遺伝子を例示することができる。配列番号30及び配列番号32には、Fdx及びYfhLのアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAC75578及びAAC75615）。エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子としては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号710688〜710158番（相補鎖）に位置する配列番号33に示すfldA遺伝子、及び塩基番号3037877〜3038398 番に位置する配列番号35に示すfldB遺伝子を例示することができる。配列番号34及び配列番号36には、fldA遺伝子及びfldB遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAC73778及びAAC75933）。
【００５５】
クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のフェレドキシン遺伝子としては、クロ
ロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号11840
78〜1184266番に位置する配列番号37に示すフェレドキシンＩ遺伝子、及び塩基番号1184476〜1184664番に位置する配列番号39に示すフェレドキシンII遺伝子を例示することができる。配列番号38及び配列番号40には、フェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIがコードするアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAM72491及びAAM72490）
。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）
のフェレドキシン遺伝子（GenBank Accession No. BAE02673）やスルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列中の塩基番号2345414〜2345728番
で示されるスルフォロバス・ソルファタリカスのフェレドキシン遺伝子を例示することが
できる。さらに、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chloro
bium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイ
ドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよく、
さらにはエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア
属等のγ-プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュ
ードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌
等からクローニングされるものであってもよい。
【００５６】
上述のような本発明の遺伝子の発現を増強するための改変は、Ｌ-アミノ酸生産能の付
与について記載した目的遺伝子の発現を増強する方法と同様にして行うことができる。本
発明の遺伝子は、それらを保持する微生物の染色体DNAを鋳型にして、PCR法により取得することができる。
【００５７】
例えば、クロロビウム・テピダムのピルビン酸シンターゼ遺伝子は、配列番号９の塩基
配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号41、42に示すプライマーを用いて
、クロロビウム・テピダムの染色体DNAを鋳型とするPCR法（polymerase chain reaction
）法（White, T. J. et al. 1989. Trends Genet. 5: 185-189参照）によって、取得する
ことができる。
エシェリヒア・コリのピルビン酸シンターゼ遺伝子は、配列番号11の塩基配列に基づい
て作製したプライマー、例えば、配列番号43、44に示すプライマーを用いて、エシェリヒ
ア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCRによって、取得することができる。
【００５８】
ユーグレナ・グラシリスのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子は、配
列番号13に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号45、46に示すプライマーを用いて、ユーグレナ・グラシリスの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【００５９】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子は、配列番号27の
塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号47、48に示すプライマーを用
いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【００６０】
エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子fdxは、配列番号29の塩基配列に基づいて
作製したプライマー、例えば、配列番号49、50に示すプライマーを用いて、エシェリヒア
・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【００６１】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子fldAは、配列番号33の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、フラボドキシン遺伝子fldBは、配列番号35の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、各々取得することができる。
【００６２】
また、クロロビウム・テピダムのフェレドキシンＩ遺伝子は、配列番号37の塩基配列に
基づいて作製したプライマーを用いて、フェレドキシンII遺伝子は、配列番号39の塩基配
列に基づいて作製したプライマーを用いて、クロロビウム・テピダムの染色体DNAを鋳型
とするPCR法によって、各々取得することができる。
【００６３】
他の微生物に由来する本発明の遺伝子も、上記の各遺伝子の配列情報、又は、その微生
物において公知の遺伝子又はタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとするPCR法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチ
ドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体DNA又は染色体DNAライブラリーから、取得することができる。なお、染色体DNAは、DNA供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（Saito, H. and Miura, K. I. 1963. Biochem. Biop
hys. Acta, 72, 619-629; 生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。
【００６４】
また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、又はピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシ
ドレダクターゼの活性の増強に加えて、マリックエンザイムの活性が低下していることが
好ましい。本発明の微生物がエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレ
ブシエラ属、又はセラチア属に属する細菌である場合は、特にマリックエンザイムの活性
を低下させることが好ましい。
【００６５】
本発明において、マリックエンザイムの活性とは、リンゴ酸を酸化的に脱炭酸し、ピル
ビン酸を生成する反応を可逆的触媒する活性を意味する。上記反応は、ＮＡＤＰを電子受
容体とするＮＡＤＰ型マリックエンザイム（malate dehydrogenase (oxaloacetate-decar
boxylating) (NADP+)とも表記される）（EC:1.1.1.40 b2463遺伝子（maeB遺伝子とも表記
される）配列番号５１）、あるいは、ＮＡＤを電子受容体とするＮＡＤ型マリックエンザ
イム（malate dehydrogenase (oxaloacetate-decarboxylating) (NAD+) とも表記される
）（EC:1.1.1.38 sfcA遺伝子（maeA遺伝子とも表記される）配列番号５３）の２種の酵素
によって触媒される。マリックエンザイム活性の確認は、Bolognaらの方法（Bologna, F.
P. et al. 2007. J. Bacteriol. 2007 189: 5937-5946）に従って測定することができる。
【００６６】
NADP-dependent malic enzyme : NADP+ + malate → NADPH + CO2 + pyruvate
NAD-dependent malic enzyme：NAD+ + malate → NADH + CO2 + pyruvate
【００６７】
酵素活性の低下は、後述のリボヌクレアーゼG活性の低下と同様にして行うことができ
る。
【００６８】
本発明においては、ＮＡＤＰ型マリックエンザイムとＮＡＤ型マリックエンザイムの両
方の活性を低下させることがより好ましく、特に、本発明の微生物がエシェリヒア属、エ
ンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、又はセラチア属に属する細菌である
場合に、両方の型のマリックエンザイムの活性を低下させることが好ましい。
【００６９】
また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、又はピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシ
ドレダクターゼの活性の増強に加えて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下している
ことが好ましい。
【００７０】
本発明において、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＰＤＨ」ということがある）
活性とは、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoA(acetyl-CoA)を生成する反応を
触媒する活性を意味する。上記反応は、PDH（E1p：pyruvate dehydrogenase, EC:1.2.4.1
aceE遺伝子  配列番号55）、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ（E2p：dihydrolip
oyltransacetylase, EC:2.3.1.12  aceF遺伝子  配列番号57）、ジヒドロリポアミドデヒ
ドロゲナーゼ（E3：dihydrolipoamide dehydrogenase; EC:1.8.1.4  lpdA遺伝子  配列番
号59）の３種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの３種類のサブユニットはそ
れぞれ以下の反応を触媒し、これら３つの反応を合わせた反応を触媒する活性をPDH活性
という。PDH活性の確認は、VisserとStratingの方法（Visser, J. and Strating, M. 198
2. Methods Enzymol. 89: 391-399）に従って測定することができる。
【００７１】
E1p: pyruvate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine
→ [dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase] S-acetyldihydrolipoyllysine 
+ CO2
E2p：CoA + enzyme N6-(S-acetyldihydrolipoyl)lysine → acetyl-CoA + enzyme N6-(
dihydrolipoyl)lysine
E3: protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ → protein N6-(lipoyl)lysine + NAD
H + H+
【００７２】
酵素活性の低下は、後述のリボヌクレアーゼG活性の低下と同様にして行うことができ
る。
【００７３】
また、本発明の細菌は、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレー
トデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（ａｃｅオペロン）が構成的に
発現するか、又は同オペロンの発現が強化されるように改変された菌株であってもよい。
マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナー
ゼ／フォスファターゼオペロン（ａｃｅオペロン）が構成的に発現するとは、ａｃｅオペ
ロンのプロモーターが、リプレッサータンパク質であるiclＲにより抑制を受けないこと
、抑制が解除されていることを意味する。
【００７４】
ａｃｅオペロンを構成的に発現していること、また同オペロンの発現が強化しているこ
とは、aceオペロンがコードするタンパク質であるマレートシンターゼ(aceB)、イソシト
レートリアーゼ(aceA)、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（
aceK）の酵素活性が非改変株、あるいは野生株と比べて増大していることによって確認出
来る。
【００７５】
酵素活性の測定は、マレートシンターゼに関してはグリオキシル酸に依存するアセチル
CoAのチオエステル結合の分解をA232の減少で測定する方法(Dixon,G.H.,Kornberg,H.L., 
1960, Biochem.J, 1;41:p217-233）、イソシトレートリアーゼに関してはイソシトレート
から生じるグリオキシル酸を２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体として測定する
方法(Roche,T.E..Williams J.O., 1970, Biochim.Biophys.Acta, 22;206(1):p193-195)、
イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼに関してはイソシトレートデヒドロゲナーゼに
対するリン酸の脱着を32Pを使用して測定する方法（Wang, J.Y.J. and Koshland, D.E., 
Jr., 1982, Arch  Biochem. Biophys., 218, p59-67）などで確認出来る。
【００７６】
抑制を解除するためには、例えば、ａｃｅオペロン上のリプレッサー（iclR）の結合部
位を、iclRが結合できないように改変すればよい。また、同オペロンのプロモーターを、
iclRによって発現抑制を受けない強力なプロモーター（lacプロモーターなど）に置換す
ることによって、抑制を解除することもできる。
【００７７】
また、iclR遺伝子の発現が低下又は欠失するように細菌を改変することによって、ａｃ
ｅオペロンの発現を構成的にすることもできる。具体的には、iclRをコードする遺伝子の
発現調節配列を同遺伝子が発現しないように改変するか、同リプレッサーの機能が失われ
るようにコード領域を改変することによって、ａｃｅオペロンの発現の抑制を解除するこ
とができる。
【００７８】
本発明に用いる細菌の好ましい形態は、上記のｉ）好気的にエタノールまたは脂肪酸を資化できる性質、ii）ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの増大した活性、iii）ａｃｅオペロンの構成的な発現又は強化された発現、iv) ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の低下のいずれかを有するものであるが、ｉ）及びii）の性質を有することが好ましく、これら４つの性質を有することがより好ましい。
【００７９】
本発明において、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、Ｌ-アミ
ノ酸を生産し、培地中に分泌する能力を有する細菌をいう。また、好ましくは、目的とす
るＬ-アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量を培地に蓄積さ
せることができる細菌をいう。Ｌ-アミノ酸は、Ｌ-アラニン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-アスパ
ラギン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-システイン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-グルタミン、グリシ
ン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-リジン、Ｌ-メチオニン、Ｌ-フ
ェニルアラニン、Ｌ-プロリン、Ｌ-セリン、Ｌ-スレオニン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-チ
ロシン及びＬ-バリンを含む。これらの中では、Ｌ-リジン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-スレオ
ニン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-
フェニルアラニン、Ｌ-チロシン、Ｌ-トリプトファン、及びＬ-システインが好ましく、
特に、Ｌ-スレオニン、Ｌ-リジン及びＬ-グルタミン酸が好ましい。
なお、本発明において、L-アミノ酸とは、フリー体のＬ-アミノ酸のみならず、硫酸塩
、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む塩も含む。
【００８０】
以下、前記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌
Ｌ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
【００８１】
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性
株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え
株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採
用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、19
86年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種に
おいて、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく
、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素
も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ
耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００８２】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株
を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、また
はＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理
し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、か
つＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００８３】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強
することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合
成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げ
ることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片
を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少な
くとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これ
らの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子の
プロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレ
ットWO95/34672号参照）。
【００８４】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発
現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロ
モーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変した
ものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロ
モーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量
の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００８５】
以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する具体的方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付
与された細菌について例示する。
【００８６】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系
酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系
酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ（asd）、アスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレ
オニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテート
トランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以
下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトラ
ンスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺
伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン
分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活
性が欠損したTDH6株（特開2001−346578号）等が挙げられる。
【００８７】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制さ
れる。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィー
ドバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい
。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、
培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑
制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエー
ターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., 
Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987);
国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
【００８８】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモー
ターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝
子の発現がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなス
レオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−ス
レオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-
β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【００８９】
このようにＬ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレ
オニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに
連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増
幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させる
ことによっても達成出来る。
【００９０】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺
伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これら
のＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺
伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（
pepC）(国際公開95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子
（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸
カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００９１】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝
子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与する
ことも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:1
23−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧
州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００９２】
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pV
IC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T2
3/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939
,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika 
(in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などの
エシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたは
ホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００９４】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するた
めの親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC
40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。
【００９５】
Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするth
rA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【００９６】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロ
ゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００９７】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺
伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA
遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、A
TG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation wit
h Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００９８】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, G
enBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製さ
れたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet
., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００９９】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜9849
32, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の
微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【０１００】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を
有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を
阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解
除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、
Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプ
ロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対し
て耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すこと
によって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escher
ichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リ
ジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【０１０１】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵
素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては
、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコ
リン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピ
メリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、
ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dap
D)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1
253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジ
ピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸
デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートア
ミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジ
アミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与す
る遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【０１０２】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経
路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下また
は欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の
化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジ
ンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【０１０３】
好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196株は、E.coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換することによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本
国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027
が付与されている。
【０１０４】
pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる（国際公開第WO95/16042、WO01/53459号パンフレット）。
【０１０５】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻
害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換さ
れたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒
性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli 
W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. co
li株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写
制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する
株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. c
oil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニル
アラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンな
どのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大
されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ
−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコ
ードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【０１０８】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VK
PM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-121
16 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FE
RM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、
E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げ
られるが、これらに限定されない。
【０１０９】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生
合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝
子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォ
リボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフ
ォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾール
カルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子
(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチ
ジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)
などが挙げられる。
【０１１０】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【０１１１】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコ
ードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【０１１２】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334t
hrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定され
ない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−
イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子
の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファー
ジP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性の
Ｌ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【０１１３】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン
酸生合成系酵素１種又は２種以上の活性が増強された株が挙げられるが、これらに限定さ
れない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミ
ンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲ
ナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メ
チルクエン酸シンターゼ（prpC）、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)
、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォ
スフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロム
ターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フ
ォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、
フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfk
A, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵
素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノール
ピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼが好ましい。
【０１１４】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝
子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変され
た株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる
。
【０１１５】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン
酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性
が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレー
トリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランス
アセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、
アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、
ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げ
られる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタ
レートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取
得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【０１１６】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【０１１７】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ
遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この
株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【０１１８】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代
謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒ
ドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特
許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【０１１９】
パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナ
ナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所  〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時は
エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロ
バクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【０１２０】
また、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレ
ートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【０１２１】
さらに、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCP
G+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入し
て得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されて
いる。
【０１２２】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸
ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE.coli A
J12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除さ
れたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さら
に、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1、WO03/044192)。
【０１２３】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝
子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)
などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子ま
たはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【０１２４】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレ
ートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３−デオキシ
−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシン
ターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５−エノー
ル酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレ
フェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)
から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸
デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（CM-PD）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻
害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を
含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質
転換株が挙げられる。
【０１２５】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型ア
ントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入され
た株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝
子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプト
ファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を
増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【０１２６】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し
、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェ
リヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大
することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ
−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするpr
oB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌
の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増
大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683
遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【０１２８】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403
及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【０１２９】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (V
KPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生
合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝
子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オル
ニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝
子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイ
ルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アル
ギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(c
arAB)が挙げられる。
【０１３１】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定
されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシ
ンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソ
ロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使
用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・
オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Mosc
ow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO
96/06926)を親株として用いることができる。
【０１３２】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルア
ミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシン
ヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオ
ニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号)
.が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒ
ドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする
遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 03567
39, 及び米国特許第5,998,178号)。
【０１３３】
Ｌ−チロシン生産菌
チロシン生産菌としては、チロシンによる阻害を受けない脱感作型のプレフェン酸デヒ
ドラターゼ遺伝子(tyrA)を有するエシェリヒア属細菌（欧州特許出願公開1616940号公報
）が挙げられる。
【０１３４】
遺伝子組換えにより本発明に用いる細菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した
遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、それらの遺伝子のバ
リアント、すなわち、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、それらの遺伝
子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。
すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若し
くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子であってもよい。
【０１３５】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置
やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好まし
くは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは
、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe
、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性
アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように公知の遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。
【０１３６】
さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に
対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
また、遺伝子の配列におけるそれぞれのコドンは、遺伝子が導入される宿主で使用しや
すいコドンに置換したものでもよい。
【０１３７】
保存的変異を有する遺伝子は、変異剤処理等、通常変異処理に用いられる方法によって
取得されたものであってもよい。
【０１３８】
また、遺伝子は、公知の遺伝子配列の相補配列又はその相補配列から調製され得るプロ
ーブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、公知の遺伝子産物と同等の機能を
有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件
」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成され
ない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【０１３９】
プローブとしては、遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプロー
ブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これ
らの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【０１４０】
上記した遺伝子のバリアントに関する記載は、下記のrng遺伝子及び本明細書に記載し
た他の遺伝子についても同様に適用される。
【０１４１】
＜１−２＞リボヌクレアーゼG活性の低下
次に、腸内細菌科の属する細菌のリボヌクレアーゼGの活性を低下させる改変について
説明する。
【０１４２】
本発明において「リボヌクレアーゼG（RNaseG）活性」とは、RNaseGの基質となるRNAを分解する活性をいう。
RNaseGの基質となるRNAとしては、例えば、エノラーゼをコードする遺伝子en（GenBank Accession No.X82400）やアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子adhE（GenBank Accession No.M33504）から転写されたRNAなどを挙げることができる。活性測定は、例えば、リファンピシンによりRNA合成を抑制した菌株よりRNAを抽出し、eno遺伝子又はadhE遺伝子のmRNAの分解半減期を測定することで、その活性を間接的に知ることができる。また、RNaseGを単離精製し、RNaseG切断部位を含むオリゴリボヌクレオチドのような人工基質の切断反応を測定することにより、その活性を知ることもできる。このような活性測定方法は既に開示されている（J. Biol. Chem., 275, 8726-8732, 2000）。
【０１４３】
「RNaseG活性が低下するように改変された」とは、細菌の細胞あたりのRNaseG活性が、非改変株、例えば野生型の腸内細菌科に属する菌株よりも低くなったことをいう。例えば、細胞あたりのRNaseGの分子数が低下した場合や、分子あたりのRNaseG活性が低下した場合等が該当する。細胞あたりのRNaseG活性の比較は、例えば、同じ条件で培養した細菌の細胞抽出液に含まれるRNaseG活性を比較することによって、行うことができる。尚、活性の「低下」には、活性が完全に消失した場合も含まれる。比較の対照となる野生型のエシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリMG1655株などが挙げられる。
【０１４４】
RNaseGの活性の低下は、RNaseGをコードする遺伝子（rng）を不活化することによって達成される。rng遺伝子の「不活化」とは、同遺伝子によってコードされるRNaseGの活性が低下又は消失するように、同遺伝子を遺伝子組換えにより改変するか、又は、同遺伝子に変異を導入することをいう。
【０１４５】
rng遺伝子としては、GenBankに登録されているエシェリヒア・コリのrng遺伝子（GenBank Accession No. NC_000913.2の塩基番号3394348〜3395817の相補鎖：配列番号１）が挙げられる。このrng遺伝子がコードするRNaseGのアミノ酸配列を配列番号２に示す。rng遺伝子は、これらの配列に基づき、合成オリゴヌクレオチドを合成し、エシェリヒア・コリの染色体を鋳型としてＰＣＲ反応を行うことによってクローニングすることができる。ま
た、相同組換えによってrng遺伝子を欠損させる場合には、染色体上のrng遺伝子と一定以上の相同性、例えば、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の相同性を有する遺伝子を用いることもできる。また、染色体上のrng遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いることもできる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【０１４６】
rng遺伝子の不活化は、具体的には例えば、染色体上のrng遺伝子のコード領域の一部又
は全部を欠損させたり、コード領域中に他の配列を挿入することによって達成される。こ
れらの手法は、遺伝子破壊とも呼ばれる。
また、rng遺伝子のプロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を
改変することなどによって、rng遺伝子の発現を低下させることによっても、rng遺伝子を
不活化することができる。発現の低下には、転写の低下と翻訳の低下が含まれる。また、
発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現を低下させることができ
る。
【０１４７】
さらには、染色体上の標的遺伝子の前後の配列を含めて、標的遺伝子全体を欠失させて
もよい。また、rng遺伝子の不活化は、染色体上のrng遺伝子のコード領域にアミノ酸置換
（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）
、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成
出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the
National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chem
istry 266, 20833-20839(1991)）。
【０１４８】
各遺伝子の改変は、遺伝子組換えにより行われることが好ましい。遺伝子組換えによる
方法として具体的には、相同組換えを利用して、染色体上の標的遺伝子の発現調節配列、
例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損
させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入することが挙げられる。
【０１４９】
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ま
しくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、各遺伝子が産生するタ
ンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領
域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠
失させる領域は長い方が確実に標的遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる
領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【０１５０】
コード領域に他の配列を挿入する場合も、挿入する位置は標的遺伝子のいずれに領域で
あってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に標的遺伝子を不活化することができる
。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配
列としては、標的遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれ
ば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ-グルタミン酸生産に有用な遺
伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【０１５１】
染色体上の標的遺伝子を上記のように改変するには、例えば、標的遺伝子の部分配列を
欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、
該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の標的遺伝子とで
相同組換えを起こさせることにより、染色体上の標的遺伝子を欠失型遺伝子に置換するこ
とによって達成できる。欠失型標的遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成した
としても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。この
ような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redド
リブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A
, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、又は、R
edドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gu
mport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた
方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を
含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たない
スイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特
開平05-007491号公報）。
【０１５２】
標的遺伝子の転写量が低下したことの確認は、標的遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。
転写量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して低下していれば、いずれでもよいが
、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％
以下に低下していることが望ましく、全く発現していないことが特に好ましい。
【０１５３】
標的遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、同タンパク質に結合
する抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（C
old spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク
質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、
例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも75%以下
、50％以下、25％以下、又は10％以下以下に減少していることが望ましく、全くタンパク
質を産生していない（完全に活性が消失している）ことが特に好ましい。
【０１５４】
また、rng遺伝子を変異処理して、低活性のRNaseGをコードする遺伝子を取得することもできる。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子adhEの発現はrng遺伝子の機能に依存するため（Biochem. Biophys. Res. Commun., 295 (2002) 92-97）、ad
hEとβガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を結合した融合タンパク質を発現する
プラスミドを細胞内で変異型rng遺伝子と共存させ、βガラクトシダーゼ活性を測定する
ことにより、活性低下型のrng遺伝子をスクリーニングすることもできる。
【０１５５】
RNaseGの活性を低下させるには、上述の遺伝子操作法以外に、例えば、エシェリヒア属細菌を紫外線照射または、Ｎ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）もしく
は亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、RNaseGの活性が低下した菌株を選択する方法が挙げられる。RNaseG活性が低下した変異株としては、16S rRNAの5'末端の成熟活性は残存しながらmRNAの分解活性のみが低下したような株、例えば、変異株DC430株やGM1430株など（Biochem. Biophys. Res. Commun., 289(5),1301-1306, 201） が挙げられる。
【０１５６】
＜２＞本発明のＬ-アミノ酸の製造法
本発明のＬ-アミノ酸の製造法においては、エタノールまたは脂肪酸を炭素源として含む培地で、腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有し、かつ、RNaseGの活性が低下するように改変された細菌を培養して、培養物中にＬ-アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ-アミノ酸を採取する。
【０１５７】
使用するエタノールは、Ｌ-アミノ酸を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の単独の炭素源として用いる場合、エタノールまたは脂肪酸は培地中に炭素源として資化できるだけ含まれていればいずれでもよいが、0.001w/v%以上、好ましくは0.05w/v％以上、さらに好ましくは0.1w/v%以上含まれていることが望ましい。また、培地中のエタノールは、20w/V％以下、好ましくは10w/ｖ％以下、さらに好ましくは2w/v%以下であることが好ましい。
【０１５８】
また流加培地として使用する場合は、エタノールは培地中に0.001w/v%以上、好ましくは0.05w/v％以上、さらに好ましくは0.1w/v%以上含まれていることが望ましく、10w/v%以下、好ましくは5w/v%以下、さらに好ましくは1w/v%以下含むことが好ましい。
なお、エタノールの濃度は、様々な方法で測定することが可能であるが、酵素法による
測定が、簡便かつ一般的である（Swift, R. 2003. Addiction 98: 73-80）。脂肪酸の濃
度は、ガスクロマトグラフィやHPLCなどの一般的な方法で測定することが可能である（Le
hotay, S. J. and Hajslova, J. TrAC Trends Anal. Chem. 2002. 21: 686-697; Lin, J.
T. et al. 1998. J. Chromatogr. A. 808: 43-49）。
【０１５９】
さらに、本発明の方法に使用する培地には、エタノールに加え、他の炭素源を添加してもよい。好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの糖類、グリセロールなどの多価アルコール類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸類を用いることが出来る。炭素源は1種でもよく、2種以上の混合物であってもよい。
【０１６０】
エタノールと他の炭素源は任意の比率で混合することが可能であるが、炭素源中のエタ
ノールの比率は、２０重量％以上、より好ましくは３０重量％以上、より好ましくは３７
重量％であることが望ましい。特に、ピルビン酸シンターゼ活性、または、ピルビン酸：
ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が強化されていない細菌を用いる場合は、生産され
るアミノ酸の収率の観点から、エタノールまたは脂肪酸の割合は上記範囲が好ましい。
【０１６１】
脂肪酸とは、一般式 CnHmCOOH（n+1、m+1は、それぞれ、脂肪酸に含まれる炭素数、水素数を表す）で表わすことができる長鎖炭化水素の1価のカルボン酸を指す。一般的に炭素数が12 以上のものを長鎖脂肪酸と呼ぶことが多い。脂肪酸は、その炭素数と不飽和度
によって様々な種類が存在する。また、脂肪酸は、油脂の構成成分であり、油脂の種類に
よって脂肪酸の組成も異なることが知られている。ミリスチン酸（C13H27COOH）は炭素数14の飽和脂肪酸であり、ヤシ油、パーム油に含まれる。パルミチン酸（C15H31COOH）は炭素数16の飽和脂肪酸であり、植物油脂一般に多く含まれる。ステアリン酸（C17H35COOH）は、炭素数18の飽和脂肪酸であり、動物性脂肪・植物性油に多く含まれる。オレイン酸（C17H33COOH）は、炭素数18の一価の不飽和脂肪酸であり、動物性脂肪や植物油に多く含まれる。リノール酸（C17H31COOH）は炭素数18で9位と12位にシス型二重結合を2つ持っている多価不飽和脂肪酸である。脂肪酸としては、上記の長鎖脂肪酸の混合物を用いることも出来る。脂肪酸の混合物を炭素源として用いる場合、脂肪酸の混合比率は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる濃度比率であればいずれでもかまわない。油脂の加水分解物から、グリセロールを除いた脂肪酸の混合物を利用することも可能である。
【０１６２】
本発明の方法においては、油脂の加水分解物を用いることもできる。
油脂は、脂肪酸とグリセロールのエステルであり、トリグリセリド（triglyceride）と
も呼ばれる。油脂としては、加水分解反応が可能であれば、常温で液体のものを指す脂肪
油（oil）、固体のものを指す脂肪（fat）など、どのようなものも使用することが出来る
。また、動物由来（魚類を含む）油脂と植物由来油脂のすべてが使用可能であり、１種ま
たは２種以上を組み合わせて使用することも出来る。原料として用いる油脂は、純粋な油
脂であってもよいし、油脂以外の物質を含む混合物であってもよい。例えば、油脂が植物
由来のものである場合は、油脂を含む植物抽出物又はその分画物が挙げられる。
動物油脂として、バター、豚脂、牛脂、羊脂等、クジラ油、イワシ油、ニシン油等をあ
げることができる。植物油脂としては、パーム油、オリーブ油、菜種油、大豆油、米糠油
、クルミ油、ゴマ油、ピーナッツ油等が挙げられるが、これらに限定されるものではない
。パーム油はアブラヤシの果実からとれる油脂であり、近年バイオディーセル（biodiese
l）燃料としての利用が盛んになり、生産量が高まっている。アブラヤシ（oil palm）は
、ヤシ科アブラヤシ属（Elaeis）に分類される植物の総称である。粗パーム油（crude pa
lm oil）は、一般的に搾油工場で生産される未精製のパーム油を指し、粗パーム油として
取引が行われている。また、微細藻類にも油脂を蓄積するものが知られており（Chisti, 
Y. 2007. Biotechnol Adv. 25: 294-306）、藻体から抽出することも可能である。藻体内
には油脂以外にも糖類、タンパク質、アミノ酸などの有機物が含まれているが、これらを
含む混合物を加水分解して炭素源として用いても構わない。
油脂としては、加水分解により生じる脂肪酸種が、本発明の方法に使用する細菌が炭素
源として資化できるものであり、それらの含量がより高い油脂が望ましい。L-アミノ酸生
産能を有する細菌が資化できる長鎖の脂肪酸種としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パ
ルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などが挙げられる。
【０１６３】
本発明における油脂の加水分解物とは、上記油脂を化学的あるいは酵素により加水分解
したものを指し、脂肪酸とグリセロールの混合物を指す。工業的な加水分解法としては、
高温（250-260℃）、高圧（5-6MPa）下で油脂と水を交流接触させる連続高温加水分解法
が一般的に行われている。また、酵素を用いて低温（30℃前後）で反応を行うことも工業
的に行われている（Jaeger, K. E. et al. 1994. FEMS Microbiol. Rev. 15: 29-63）。
前記酵素としては、油脂の加水分解反応を触媒する酵素リパーゼを用いることが出来る。
リパーゼは工業的に重要な酵素であり、様々な産業的利用がなされている（Hasan, F. et
al. 2006. Enzyme and Microbiol. Technol. 39: 235-251）。油脂の加水分解物は、脂
肪酸とグリセロールの混合物であり、パーム油等の一般的な油脂の加水分解物に含まれる
脂肪酸に対するグリセロールの重量比は10%程度であることが知られている。油脂の加水
分解物としては、脂肪酸を含む限り特に制限されない。例えば、油脂の加水分解物をその
まま用いることも出来るが、脂肪酸、グリセロールの一部を除いて使うことも可能である
し、脂肪酸やグリセロールを加えて使用することも出来る。この時のグリセロールの脂肪
酸に対する重量比は、好ましくは５〜２０：１００、より好ましくは７．５〜１５：１０
０である。
【０１６４】
本発明の方法で使用する培地に含まれる、脂肪酸、または、油脂の加水分解物の量は、
本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる限り幾らでもよいが、培地中に単
独の炭素源として添加する場合、１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、さらに好ましく
は２w/v%以下含まれることが好ましい。また、培地中に単独の炭素源として添加する場合
、０．２w/v%以上、好ましくは０．５w/v%以上、さらに好ましくは１．０w/v%以上含まれていることが望ましい。
また、流加培地として使用する場合は、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、
流加後の培地中の濃度が５w/v%以下、好ましくは２w/v%以下、さらに好ましくは１w/v%以下で含まれることが好ましい。また、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、０．
０１w/v%以上、好ましくは０．０２w/v%以上、さらに好ましくは０．０５w/v%以上の量にて制御することが好ましい。
なお、脂肪酸の濃度は、ガスクロマトグラフィ（Hashimoto, K. et al. 1996. Biosci.
Biotechnol. Biochem. 70:22-30）やHPLC（Lin, J. T. et al. 1998. J. Chromatogr. A
. 808: 43-49）により測定することが可能である。
【０１６５】
培地に加える脂肪酸、または油脂の加水分解物に含まれる脂肪酸は、水にミセル化する
ナトリウムやカリウムなどとのアルカリ金属塩として用いることが望ましい。しかしなが
ら、脂肪酸のナトリウム塩やカリウム塩の溶解度も発酵原料として用いるのには十分では
ない場合がある。そこで、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌が炭素源として脂肪酸をより
効率よく資化できるようにするために、乳化を行う等、均一化を促進する工程を加えるこ
とが好ましい。例えば乳化方法として、乳化促進剤や界面活性剤を加える等が考えられる
。ここで乳化促進剤としては、リン脂質やステロールが挙げられる。また界面活性剤とし
ては、非イオン界面活性剤では、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エス
テル（Tween 80）などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、n-オクチルβ-D
-グルコシドなどのアルキルグルコシド、ショ糖ステアリン酸エステルなどのショ糖脂肪
酸エステル、ポリグリセリンステアリン酸エステルなどのポリグリセリン脂肪酸エステル
等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、アルキルベタインであるN,N-ジメチル
-N-ドデシルグリシンベタインなどが挙げられる。これ以外にも、トライトンX-100（Trit
on X-100）、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル（Brij-58）やノニルフェノールエ
トキシレート（Tergitol NP-40）等の一般的に生物学の分野で用いられる界面活性剤が利
用可能である。
さらに、脂肪酸の乳化や均一化を促進するための操作も有効である。この操作は、脂肪
酸の乳化や均一化を促進する操作であれば、どのような操作でも構わない。具体的には、
ホモジナイザー処理、ホモミキサー処理、超音波処理、高圧処理、高温処理などが挙げら
れるが、ホモジナイザー処理、超音波処理およびこれらの組合せがより好ましい。
上記界面活性剤による処理と、ホモジナイザー処理及び／または超音波処理を組み合わ
せることが特に好ましく、これらの処理は、脂肪酸がより安定なアルカリ条件下で行われ
ることが望ましい。アルカリ条件としては、pH9以上が望ましく、より望ましくはpH10以上である。
【０１６６】
さらに、本発明の方法に使用する培地には、脂肪酸、または、油脂の加水分解物に加え
、他の炭素源を添加してもよい。好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース
、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物やバイオマスの加水分解により得
られた糖液などの糖類、エタノールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク
酸等の有機酸類である。なお他の炭素源を用いる場合には、炭素源中の脂肪酸、または、
油脂の加水分解物の比率が１０重量％以上、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは
５０重量％以上であることが好ましい。
【０１６７】
本発明において、ピルビン酸シンターゼ活性、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシ
ドレダクターゼ活性を強化した細菌を用いる場合には、エタノールと他の炭素源との混合比率は、エタノールまたは脂肪酸濃度が高いほうが好ましく、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは100％である。
【０１６８】
なお、本発明において、エタノールまたは脂肪酸は、培養の全工程において一定濃度含まれてもよいし、流加培地のみあるいは初発培地のみに添加されていてもよく、その他の炭素源が充足していれば、一定時間エタノールまたは脂肪酸が不足している期間があってもよい。一時的とは、例えば発酵全体の時間のうち１０％以下、又は２０％以下、最大で３０％の時間でエタノールまたは脂肪酸が不足していてもよい。
【０１６９】
培地中に添加するその他の成分としては、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必
要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。本発明の培地中
に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または
硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒
素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンス
ティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源を１種のみ含
まれていてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加
培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよ
いし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。
【０１７０】
本発明の培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ま
しい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸な
どのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであ
ればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチ
ン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【０１７１】
また、培地には、炭素源、窒素源、硫黄源の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ
栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、
核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解
物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が
挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【０１７２】
また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には
要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ-リジ
ン生産菌は、後述のようにＬ-リジン生合成経路が強化されており、Ｌ-リジン分解能が弱
化されているものが多いので、Ｌ-スレオニン、Ｌ-ホモセリン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-メ
チオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地
は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は
、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多
段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１７３】
培養は、発酵温度２０〜４５℃、特に好ましくは３３〜４２℃で通気培養を行うことが
好ましい。ここで酸素濃度は、５〜５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行う。ま
た、ｐＨを５〜９に制御し、通気培養を行うことが好ましい。培養中にｐＨが下がる場合
には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリ
で中和することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培
養することにより、培養液中に著量のＬ-アミノ酸が蓄積される。蓄積されるＬ-アミノ酸
の濃度は野生株より高く、培地中から採取・回収できる濃度であればいずれでもよいが、
50g/L以上、望ましくは75g/L以上、さらに望ましくは100g/L以上である。
【０１７４】
目的アミノ酸が塩基性アミノ酸である場合は、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終
了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正とな
るように制御する、あるいは又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供
給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在す
る培養期があるようにし、前期重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を
主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収す
る方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照）。
【０１７５】
本発明においては、Ｌ-アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、微生物の培養を種培養
と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分
培養で行い、本培養を流加培養、又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回
分培養で行ってもよい。
【０１７６】
本発明において、流加培養、あるいは連続培養を行う際には、一時的にエタノールまたは脂肪酸あるいは脂肪酸またはその他の炭素源の流加が停止するように間欠的に流加培地を流加してもよい。また、流加を行う時間の最大で30％以下、望ましくは20％以下、特に望ましくは10％以下で流加培地の供給を停止することが好ましい。流加培養液を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇するときのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピューターで検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい（米国特許5,912,113号明細書）。
【０１７７】
流加培養に用いられる流加培地は、エタノールまたは脂肪酸またその他の炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素（増殖促進因子）を含む培地が好ましく、発酵培地中の脂肪酸濃度が一定以下になるように制御してもよい。ここで一定濃度以下とは、１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、さらに好ましくは１w/v%以下になるように添加する培地を調製することを意味する。
【０１７８】
培養液からのＬ-アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法
を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ-アミノ酸が蓄積する場合には
、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清
からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ-アミノ酸を回収することができる。回収される
Ｌ-アミノ酸は、フリー体のＬ-アミノ酸であっても、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニ
ウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む塩であってもよい。
【０１７９】
また、本発明において採取されるL-アミノ酸は、目的とするL-アミノ酸以外に微生物菌
体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたL-アミノ
酸の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (US5,431,9
33, JP1214636B, US4,956,471, US4,777,051, US4946654, US5,840358, US6,238,714, US2005/0025878)。
【０１８０】
また、Ｌ−アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収するこ
とができる。また、培地中に析出したＬ−アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ−アミノ
酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【実施例】
【０１８１】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【０１８２】
〔実施例１〕リボヌクレアーゼG活性が低下したＬ−リジン生産菌の構築
＜１−１＞WC196ΔcadAΔldcC株へのエタノール資化性の付与
L-リジン生産菌にエタノール資化性を付与するため、変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhE*）の導入を行った。変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子として、MG1655::PL-tacadhE*（WO2008/010565）由来の遺伝子を用いた。MG1655::PL-tacadhE*株は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）と、PL-tacプロモーターにより制御される変異型adhE遺伝子が連結したＤＮＡ断片を、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムに挿入して得た株である。cat遺伝子をゲノムから除去できるようにするため、cat遺伝子を、ラムダファージのアタッチメントサイトとテトラサイクリン耐性遺伝子を連結したＤＮＡ断片（att-tet）へ置き換えた。
【０１８３】
cat遺伝子のatt-tet遺伝子への置き換えは、WO2005/010175に記載の、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）によって行った。「Red-driven i
ntegration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側
に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することがで
きる。さらにλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5
200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisi
ve nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.）を組み合わせることに
より、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。cat遺伝
子をatt-tet遺伝子で置換えるためのプライマーとして、配列番号５及び６のプライマー
を使用して行った。こうして、MG1655::PL-tacadhE*のcat遺伝子がatt-tet遺伝子に置き
換えられたMG1655-att-tet-PL-tacadhE*株を得た。
【０１８４】
L-リジン生産菌にエタノール資化性を付与するため、MG1655-att-tet-PL-tacadhE*をドナーとして、L-リジン生産菌WC196ΔcadAΔldcC株にP1トランスダクションを行い、WC196ΔcadAΔldcC-att-tet-PL-tacadhE*株を得た。
【０１８５】
次に、PL-tacプロモーター上流に導入されたatt-tet遺伝子を除去するために、ヘルパ
ープラスミドpMW-intxis-ts（米国特許出願公開20060141586）を使用した。pMW-intxis-t
sは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)
をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。
【０１８６】
上記で得られたWC196ΔcadAΔldcC-att-tet-PL-tacadhE*株のコンピテントセルを常法
に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で50 mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、LB寒天培地上、42℃で培養し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びテトラサイクリン耐性を試験し、att-tet及びpMW-intxis-tsが脱落しているPL-tacadhE*導入株であるテトラサイクリン、アンピシリン感受性株を取得した。この株をWC196ΔcadAΔldcC PL-tacadhE*株と名づけた。
【０１８７】
＜１−２＞WC196ΔcadAΔldcC PL-tacadhE*株からのリボヌクレアーゼG非産生株（rng遺
伝子欠損株WC196ΔcadAΔldcΔrng PL-tacadhE*株）の構築
MG1655株に対して、「Red-driven integration」方法により、rng遺伝子の欠失を行っ
た。ｒｎｇ遺伝子の欠失用プライマーとして、配列番号７及び８のプライマーを使用して
行うことができる。これによって、MG1655Δrng::Cm株を得た。MG1655Δrng::Cm株をドナーとして、L-リジン生産菌WC196ΔcadAΔldcC PL-tacadhE*株にP1トランスダクションを行い、リボヌクレアーゼG非産生株WC196ΔcadAΔldcC PL-tacadhE*Δrng::Cm株を得た。
【０１８８】
WC196ΔcadAΔldcC PL-tacadhE*株、WC196ΔcadAΔldcC PL-tacadhE*Δrng::Cm株を、dapA、dapB及びlysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、WC196ΔcadAΔldcC PL-tacadhE*/pCABD2株、及び、WC196ΔcadAΔldcC PL-tacadhE*Δrng::Cm/pCABD2を得た。これらの株を20mg/Lのストレプトマイシンを含むＬ培地にて終ＯＤ600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
【０１８９】
〔実施例２〕リボヌクレアーゼG非産生株のエタノールからのＬ−リジン生産能の評価
前記の株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、20mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて15時間培養した。得られた菌体を0.85%の食塩水に懸濁し、初発OD=0.25となるように、太試験管(内径18 mm)の、20mg/Lのストレプトマイシンを含む発酵培地の5 mLに接種し、往復振とう培養装置で、攪拌120rpmの条件下、37℃において16時間培養した。培養後、培地中に蓄積したリジンの量を公知の方法（サクラ精機  バイオテックアナライザーAS210）により測定した。
発酵培地の組成を以下に示す。
【０１９０】
［Ｌ−リジン発酵培地組成］
エタノール                         10 ml/L
(NH4)2SO4                           24 g/L
K2HPO4                             1.0 g/L
MgSO4・7H2O                        1.0 g/L
FeSO4・7H2O                       0.01 g/L
MnSO4・5H2O                       0.01 g/L
イーストエキストラクト              2.0 g/L
CaCO3（日本薬局方）                  30 g/L
蒸留水                             最終量1L
KOHでpH5.7に調整し、115℃で10分オートクレーブを行った。但しMgSO4・7H2Oは別に殺菌し、エタノールはフィルターろ過により滅菌した。CaCO3は、180℃で２時間乾熱滅菌したものを入れた。  抗生物質として、20mg/Lのストレプトマイシンを添加した。
【０１９１】
結果を表１に示す。収率(%)は、エタノールからのＬ−リジン収率(w/w)を示す。表１から分かるように、WC196ΔcadAΔldcC PL-tacadhE*Δrng::Cm/pCABD2株は、rng遺伝子を欠損していないWC196ΔcadAΔldcC PL-tacadhE*/pCABD2株と比較して多量のＬ−リジンを蓄積した。
〔実施例３〕リボヌクレアーゼG活性が低下したＬ−リジン生産菌の構築
＜３−１＞WC196ΔcadAΔldcC株からのリボヌクレアーゼG非産生株（rng遺伝子欠損株WC196ΔcadAΔldcΔrng株)の構築
【０１９２】
Ｌ−リジン生産菌として、WC196ΔcadAΔldcC株を用いた。WC196ΔcadAΔldcC株におけるrng遺伝子の欠失は、WO2005/010175に記載の、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2
002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the 
phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.）に
よって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合
成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３’側にデザインした合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺
伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組合わ
せることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。
rng遺伝子の欠失用プライマーとして、配列番号７及び８のプライマーを使用して行う
ことができる。これによって、リボヌクレアーゼG非産生株WC196ΔcadAΔldcCΔrng::Cm株を得た。尚、WC196ΔcadAΔldcC株も、同様にしてcadA遺伝子及びldcC遺伝子を欠失させることにより得られた株である。
【０１９３】
WC196ΔcadAΔldcC株、WC196ΔcadAΔldcCΔrng::Cm株を、dapA、dapB及びLysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、WC196ΔcadAΔldcC /pCABD2株、WC196ΔcadAΔldcCΔrng::Cm/pCABD2を得た。また、これらの株を20mg/Lのストレプトマイシンを含むＬ培地にて終ＯＤ600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
〔実施例４〕リボヌクレアーゼG非産生株の脂肪酸からのＬ−リジン生産能の評価
WC196ΔcadAΔldcCΔrng::Cm/pCABD2株と対照株WC196LC/pCABD2株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、25 mg/Lのストレプトマイシンを含むLB寒天培地プレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養する。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500 mL容坂口フラスコの、25 mg/Lのストレプトマイシンを含む以下に記載の発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において48時間培養する。本培養における炭素源としては、グルコースまたは、オレイン酸ナトリウムを用いる。オレイン酸ナトリウムに対しては、乳化促進剤としてポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80：ナカライテスク社製）を終濃度0.5%（w/v）となるように添加したものを用いた。総炭素源量は、グルコースは40g/L、オレイン酸ナトリウムは20g/Lとした。これらの株がTween80を資化できないことは、別途確認する。培養に用いた培地組成を以下に示す。
【０１９４】
［エシェリヒア属細菌  Ｌ-リジン生産培地］
炭素源
オレイン酸ナトリウム         20 g/L
Tween 80                      5 g/L
その他の成分
(NH4)2SO4                    24 g/L
KH2PO4                        1 g/L
MgSO4・7H2O                   1 g/L
FeSO4・7H2O                0.01 g/L
MnSO4・7H2O                0.01 g/L
Yeast Extract                 2 g/L
CaCO3（日本薬局方）          30 g/L
KOHでpH7.0に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なう。但し、炭素源とMgSO4・7H2Oは別殺菌した後、混合した。CaCO3は乾熱滅菌後に添加する。
【０１９５】
48時間後に、培養上清のＬ-リジンの量をバイオセンサーBF-5（王子計測機器）により
測定する。生育度は、グルコース培養では濁度（OD）にて測定し、脂肪酸を炭素源とした
場合には、適当な希釈を行った培養液をLBプレートに塗布して生菌数を測定する。フ
オレイン酸ナトリウムを炭素源にした場合には、rng欠損株（WC196ΔcadAΔldcCΔrng::Cm/pCABD2）は、親株（WC196LC/pCABD2）に対して、有意に高い生育の向上とＬ-リジン生産を示しす。
【０１９６】
〔配列表の説明〕
配列番号１：Escherichia coiのリボヌクレアーゼG遺伝子(rng)の塩基配列
配列番号２：Escherichia coiのリボヌクレアーゼGのアミノ酸配列
配列番号３：Escherichia coliのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhE)の塩基配列
配列番号４：Escherichia coliのアルコールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列
配列番号５：cat遺伝子をatt-tet遺伝子で置換えるためのプライマー
配列番号６：cat遺伝子をatt-tet遺伝子で置換えるためのプライマー
配列番号７：rng遺伝子の欠失用プライマー
配列番号８：rng遺伝子の欠失用プライマー
配列番号９：Chlorobium tepidumのピルビン酸シンターゼ遺伝子の塩基配列
配列番号10：Chlorobium tepidumのピルビン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号11：Escherichia coliのピルビン酸シンターゼ遺伝子(ydbK)の塩基配列
配列番号12：Escherichia coliのピルビン酸シンターゼ(YdbK)のアミノ酸配列
配列番号13：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼγサブユニット遺伝子
（porA）の塩基配列
配列番号14：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼγサブユニットのアミ
ノ酸配列
配列番号15：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼδサブユニット遺伝子
（porB）の塩基配列
配列番号16：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼδサブユニットのアミ
ノ酸配列
配列番号17：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼαサブユニット遺伝子
（porC）の塩基配列
配列番号18：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼαサブユニットのアミ
ノ酸配列
配列番号19：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼβサブユニット遺伝子
（porD）の塩基配列
配列番号20：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼβサブユニットのアミ
ノ酸配列
配列番号21：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼporE遺伝子の塩基配列
配列番号22：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼPorEのアミノ酸配列
配列番号23：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼporF遺伝子の塩基配列
配列番号24：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼPorFのアミノ酸配列
配列番号25：Euglena gracilisのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子の
塩基配列
配列番号26：Euglena gracilisのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼのアミノ
酸配列
配列番号27：Escherichia coliのフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子(fpr)の
塩基配列
配列番号28：Escherichia coliのフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子(fpr)が
コードするアミノ酸配列
配列番号29：Escherichia coliのフェレドキシン遺伝子(fdx)の塩基配列
配列番号30：Escherichia coliのフェレドキシン遺伝子(fdx)がコードするアミノ酸配列
配列番号31：Escherichia coliのフェレドキシン遺伝子(yfhL)の塩基配列
配列番号32：Escherichia coliのフェレドキシン遺伝子(yhfL)がコードするアミノ酸配列
配列番号33：Escherichia coliのフラボドキシン遺伝子(fldA)の塩基配列
配列番号34：Escherichia coliのフラボドキシン遺伝子(fldA)がコードするアミノ酸配列
配列番号35：Escherichia coliのフラボドキシン遺伝子(fldB)の塩基配列
配列番号36：Escherichia coliのフラボドキシン遺伝子(fldB)がコードするアミノ酸配列
配列番号37：Chlorobium tepidumのフェレドキシンＩ遺伝子の塩基配列
配列番号38：Chlorobium tepidumのフェレドキシンＩ遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号39：Chlorobium tepidumのフェレドキシンII遺伝子の塩基配列
配列番号40：Chlorobium tepidumのフェレドキシンII遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号41：Chlorobium tepidumのピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号42：Chlorobium tepidumのピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号43：Escherichia coliのピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号44：Escherichia coliのピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号45：Euglena gracilisのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子増
幅プライマー１
配列番号46：Euglena gracilisのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子増
幅プライマー２
配列番号47：Escherichia coliのフラボドキシン-ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅用プ
ライマー１
配列番号48：Escherichia coliのフラボドキシン-ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅用プ
ライマー２
配列番号49：Escherichia coliのfdx遺伝子増幅用プライマー１
配列番号50：Escherichia coliのfdx遺伝子増幅用プライマー２
配列番号51：Escherichia coliのＮＡＤＰ型マリックエンザイムをコードする遺伝子（b2
463）の塩基配列
配列番号53：Escherichia coliのＮＡＤ型マリックエンザイムをコードする遺伝子（sfcA
）の塩基配列
配列番号55：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼEp1サブユニット遺伝子（a
ceE）の塩基配列
配列番号56：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼEp1サブユニットのアミノ
酸配列
配列番号57：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼE2サブユニット遺伝子（ac
eF）の塩基配列
配列番号58：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼE2サブユニットのアミノ酸
配列
配列番号59：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼE3サブユニット遺伝子（lp
dA）の塩基配列
配列番号60：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼE3サブユニットのアミノ酸
配列
【配列表】
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