(57)【要約】【課題】種々のタンパク質結晶の徐放性組成物を開発すること。【解決手段】本発明は、タンパク質結晶とイオンポリマーとの複合体、およびそのような複合体を含んで成る組成物に関する。本発明はさらに、これらの複合体および組成物を製造する方法も提供する。本発明はさらに、タンパク質に基づく療法の持続放出を必要とするかまたはそれによって改善される疾患を有する個体の治療法も提供する。種々のタンパク質結晶の徐放性組成物を開発するために、本発明は、タンパク質の両性性質を利用する。また、本発明は、薬物療法の持続放出を必要とするかまたはそれによって改善される疾患状態の治療法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、タンパク質結晶とイオンポリマーとの複合体、ならびにそれを含んで成る組
成物であって、徐放性組成物を包含する組成物に関する。さらに、本発明は、これらの複
合体および組成物を製造する方法も提供する。本発明の複合体および組成物は、タンパク
質に基づく療法の持続放出による治療に敏感に反応する疾患状態の治療に特に有効である
。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
種々の疾患状態を標的とするタンパク質療法の開発において、大きな障害がある。その
ような障害のいくつかの例は、商業的に実現性のない処方物、短い生体内半減期および極
僅かな経口生物学的利用能である。これまで、短い生体内半減期は、静脈内または皮下投
与によって一般に輸送される徐放性タンパク質処方物の開発を制限してきた。
【０００３】
例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の徐放性処方物を提供するために、ヒドロゲル［非特許文献１］、リポソーム、油エマルジョン、生分解性ポリマーミクロスフェア、ならびにポリエチレングリコール修飾［非特許文献２］を組み込む技術が開発された。しかし、それによって得られる処方物は、薬剤のバースト放出を示し、厳しい製造条件を使用し、そして／または製造を複雑にしうる。これは、ＤＬ−乳酸コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア技術に基づくｈＧＨ処方物に特に当てはまり、なぜなら、該ミクロスフェアの製造に使用される方法は、高温、界面活性剤、有機溶媒および水性／有機溶媒界面のような条件を使用する傾向があるからであり、それらは全てタンパク質の変性を生じる［非特許文献３；非特許文献４］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＫａｔａｋａｍらＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，４９（１）、２１−２６（１９９７）
【非特許文献２】ＲｏｓｓらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（３６），２１６９６−２１９７７（１９９６）
【非特許文献３】ＨｅｒｂｅｒｇｅｒらＰｒｏｃ．Ｉｎｔｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２３，８３５−８３６（１９９６）
【非特許文献４】ＫｉｍらＩｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２２９（１−２），１０７−１１６（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
徐放性タンパク質処方物を開発する代替法は、処方物の一部として結晶化したタンパク
質を使用することを含む。例えば、亜鉛およびプロタミンと複合体化させた結晶化インス
リンは、長時間放出挙動を示す［Ｋｒａｙｅｎｂｕｈｌ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，
Ｒｅｐ．Ｓｔｅｎｏ．Ｍｅｍ．Ｈｏｓｐ．Ｎｏｒｄ．Ｉｎｓｕｌｉｎｌａｂ．１：６０−
７３（１９４６）］。種々の結晶は、所定のタンパク質結晶の溶解度および溶解速度を調
節しうるので、種々の溶解プロフィールを有する種々の結晶に基づく徐放性処方物を開発
することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
種々のタンパク質結晶の徐放性組成物を開発するために、本発明は、タンパク質の両性
性質を利用する。例えば、タンパク質鎖上の利用可能な塩基性および酸性残基の数、なら
びにｐＨ環境が、タンパク質の全体的正味電荷を決定する。従って、等電ｐＨ値（ｐＩ）
、またはタンパク質の正味電荷が０である場合の特定ｐＨ（タンパク質の水への溶解度が
最も低く、結晶化が最も起こりやすいｐＨ）は、全てのタンパク質に固有である。低ｐＩ
を有するタンパク質（タンパク質中の酸性基の数が、塩基性基の数より多い）へのポリカ
チオンの複合体、または、高ｐＩを有するタンパク質（タンパク質中の塩基性基の数が、
酸性基の数より多い）へのポリアニオンの複合体は、有利な溶解挙動を包含する有利な物
理的性質を有するタンパク質を生じうる。タンパク質は、ほぼそれらのｐＩか、またはそ
のｐＩ値の極めて近くで結晶化することができる。しかし、タンパク質の等電点に近い溶
液のｐＨにおける、タンパク質結晶へのポリアニオンまたはポリカチオンの付加は、低複
合を生じうる。
【０００７】
一般的な複合法のそのような欠点は、本発明の方法を使用することによって回避しうる
。タンパク質結晶およびイオンポリマーの生理学的適合性徐放性複合体、およびそれを含
んで成る組成物を得ることが好都合である。その目的のために、本発明は、そのような複
合体および組成物を準備する方法、および薬物療法の持続放出を必要とするかまたはそれ
によって改善される疾患状態の治療法を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
タンパク質結晶およびイオン性化合物を含む、複合体。
（項目２）
前記タンパク質が、以下：治療タンパク質、融合タンパク質、糖タンパク質、レセプター、合成抗原、組換え抗原、ウイルス表面タンパク質、ホルモン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドからなる群より選択される、項目１に記載の複合体。
（項目３）
前記治療タンパク質が、以下：グルカゴン様ペプチド１、抗体、組織適合性抗原、インテ
グリン、セレクチン、インヒビター、成長因子、ポストリディカルホルモン、神経成長ホ
ルモン、血液凝固因子、接着分子、骨形態形成タンパク質、レクチン、栄養因子、サイト
カイン（例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、α−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ、γ−ＩＦ
Ｎ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、リンホトキシン、ＩＬ−５、遊走阻止因子、ＧＭＣＳ
Ｆ、ＩＬ−７、ＩＬ−３、単球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激
因子、多剤耐性タンパク質、他のリンホカイン）、トキソイド、エリスロポエチン、第Ｖ
ＩＩＩ因子、アミリン、ＴＰＡ、ドルナーゼ−α、α−１−アンチトリプシン、ヒト成長
ホルモン、神経成長ホルモン、骨形態形成タンパク質、成長分化因子、ニューレグリン、
ウレアーゼおよびトキソイドからなる群より選択される、項目２に記載の複合体。
（項目４）
前記ホルモンが、以下：ヒト成長ホルモン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、排卵誘導ホ
ルモン、黄体化ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンからなる群より選択される、項目２に
記載の複合体。
（項目５）
前記抗体が、以下：インフリキシマブ、エタネルセプト、リタキシマブ、トラスツズマブ
、アブシキシマブ、パリビズマブ、ムルモナブ−ＣＤ３、ゲムツズマブ、バシリキシマブ
、ダクリズマブ、ゼバリンおよびミロタルグからなる群より選択される、項目２に記載
の複合体。
（項目６）
前記酵素が、以下：ラスブリカーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ヒドロラーゼ、オキシダー
ゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、アデニレートシクラーゼ、トランスフェラーゼ
、オキシドレダクターゼ、ニトリラーゼ、ラッカーゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダ
ーゼおよびヒダントイナーゼからなる群より選択される、項目２に記載の複合体。
（項目７）
前記イオン性化合物が、以下：ポリマー、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質お
よびデンドリマーからなる群より選択される、項目１に記載の複合体。
（項目８）
前記イオン性化合物の前記ポリペプチドまたはタンパク質成分が、約２ｋＤより大きい分
子量を有する、項目７に記載の複合体。
（項目９）
前記イオン性化合物の前記ポリペプチドまたは前記タンパク質成分が、ポリカチオンおよ
びポリアニオンからなる群より選択される、項目７に記載の複合体。
（項目１０）
前記ポリカチオンが、以下：プロタミン、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン
、ヒストン、ミエリン塩基性タンパク質、硫酸ポリミキシンＢ、臭化ドデシルトリメチル
アンモニウム、ブラジキニン、スペルミン、プトレシン、オクチルアルギニンおよび合成
ペプチドおよびデンドリマーからなる群より選択される、項目９に記載の複合体。
（項目１１）
前記ポリアニオンが、以下：ポリグルタメート、ポリアスパルテート、ポリアクリレート
、ポリシアノアクリレート、ポリラクテート、ポリ−Ｂ−ヒドロキシブチレート、ポリビ
ニルピロリドン、ヒアルロン酸、ヘパリン、硫酸化ポリサッカリド、硫酸デキストラン、
硫酸ヘパリンおよびデンドリマーからなる群より選択される、項目９に記載の複合体。
（項目１２）
溶液相に懸濁した不溶相を含有する組成物であって、該不溶相が、タンパク質結晶、イオ
ン性化合物および賦形剤を含む複合体であり、該溶液相が、以下：水、緩衝剤、防腐剤、
等張剤、安定剤およびこれらの組合せからなる群より選択される、組成物。
（項目１３）
前記タンパク質が、以下：治療タンパク質、融合タンパク質、糖タンパク質、レセプター
、合成抗原、組換え抗原、ウイルス表面タンパク質、ホルモン、抗体、酵素、Ｆａｂフラ
グメント、環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドからなる群より選択される、項目１２に
記載の組成物。
（項目１４）
前記治療タンパク質が、以下：グルカゴン様ペプチド１、抗体、組織適合性抗原、インテ
グリン、セレクチン、インヒビター、成長因子、ポストリディカルホルモン、神経成長ホ
ルモン、血液凝固因子、接着分子、骨形態形成タンパク質およびレクチン、栄養因子、サ
イトカイン（例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、α−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ、γ−
ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、リンホトキシン、ＩＬ−５、遊走阻止因子、ＧＭ
ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−３、単球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー
刺激因子、多剤耐性タンパク質、他のリンホカイン）、トキソイド、エリスロポエチン、
第ＶＩＩＩ因子、アミリン、ＴＰＡ、ドルナーゼ−α、α−１−アンチトリプシン、ヒト
成長ホルモン、神経成長ホルモン、骨形態形成タンパク質、ウレアーゼおよびトキソイド
からなる群より選択される、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
前記ホルモンが、以下：ヒト成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、グルカゴン、副甲状腺ホ
ルモン、排卵誘導ホルモン、黄体化ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンからなる群より選択
される、項目１３に記載の組成物。
（項目１６）
前記抗体が、以下：インフリキシマブ、エタネルセプト、リタキシマブ、トラスツズマブ
、アブシキシマブ、パリビズマブ、ムルモナブ−ＣＤ３、ゲムツズマブ、バシリキシマブ
、ダクリズマブ、ゼバリンおよびミロタルグからなる群より選択される、項目１３に記
載の組成物。
（項目１７）
前記酵素が、以下：ラスブリカーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ヒドロラーゼ、オキシダー
ゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、アデニレートシクラーゼ、トランスフェラーゼ
、オキシドレダクターゼ、ニトリラーゼ、ラッカーゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダ
ーゼおよびヒダントイナーゼからなる群より選択される、項目１３に記載の組成物。
（項目１８）
前記イオン性化合物が、以下：ポリマー、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質お
よびデンドリマーからなる群より選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目１９）
前記イオン性化合物の前記オリゴペチド成分が、約２ｋＤより小さい分子量を有する、請
求項１８に記載の組成物。
（項目２０）
前記イオン性化合物の前記ポリペチドまたはタンパク質成分が、約２ｋＤより大きい分子
量を有する、項目１８に記載の組成物。
（項目２１）
前記イオン性化合物の前記ポリペプチドまたは前記タンパク質成分が、ポリカチオンおよ
びポリアニオンからなる群より選択される、項目１８に記載の組成物。
（項目２２）
前記ポリカチオンが、以下：プロタミン、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン
、ヒストン、ミエリン塩基性タンパク質、硫酸ポリミキシンＢ、臭化ドデシルトリメチル
アンモニウム、ブラジキニン、スペルミン、プトレシン、オクチルアルギニン、および合
成ペプチドおよびデンドリマーからなる群より選択される、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記ポリアニオンが、以下：ポリグルタメート、ポリアスパルテート、ポリアクリレート
、ポリシアノアクリレート、ポリラクテート、ポリ−Ｂ−ヒドロキシブチレート、ポリビ
ニルピロリドン、ヒアルロン酸、ヘパリン、硫酸化ポリサッカリド、硫酸デキストラン、
硫酸ヘパリンおよびデンドリマーからなる群より選択される、項目２１に記載の組成物
。
（項目２４）
前記賦形剤が、以下：界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリオール、グリコアミノ
グリカン、アミノ酸、デンプン、グリセロール、糖類、セルロース、ポビドンデキストリ
ン、ポリソルベート、ヒドロキシプロピルセルロースおよびアスコルビン酸からなる群よ
り選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目２５）
前記安定剤が、以下：糖類、ポリオール、アミノ酸、可溶性タンパク質および界面活性剤
からなる群より選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目２６）
哺乳動物における疾患状態を処置するための方法であって、項目１〜１１のいずれか１
項に記載の複合体の治療有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目２７）
哺乳動物における疾患状態を処置するための方法であって、項目１２〜２５のいずれか
１項に記載の組成物の治療有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目２８）
前記複合体または組成物が、経口経路または非経口経路によって前記哺乳動物に投与され
る、項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９）
前記複合体または組成物が、皮下または筋肉内経路によって前記哺乳動物に投与される、
項目２８に記載の治療法。
（項目３０）
前記複合体または組成物が、２７より大きいゲージを有する針を使用して、皮下経路によ
って前記哺乳動物に投与される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記複合体または組成物が、無針注射によるかまたは経皮的手段によって、前記哺乳動物
に投与される、項目２６または２７に記載の方法。
（項目３２）
前記複合体または組成物が、前記哺乳動物に１週間に１回投与される、項目２６または
２７に記載の方法。
（項目３３）
前記複合体または組成物が、前記哺乳動物に２週間に１回投与される、項目２６または
２７に記載の方法。
（項目３４）
前記複合体または組成物が、前記哺乳動物に１ヶ月に１回投与される、項目２６または
２７に記載の方法。
（項目３５）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目２６または２７に記載の方法。
（項目３６）
タンパク質複合体を生成するための方法であって、以下の工程：
（ａ）タンパク質の溶液と結晶化試薬混合物とを混合して溶液を生成する工程；
（ｂ）脱イオン水を該溶液に添加する工程；
（ｃ）タンパク質結晶が形成されるまで、該溶液を約４℃と約４０℃との間の温度で約
２時間と約４８時間との間の時間インキュベートする工程；および、
（ｄ）イオン性化合物を該溶液に添加する工程、
を包含する、方法。
（項目３７）
タンパク質複合体を生成するための方法であって、以下の工程：
（ａ）タンパク質の溶液と結晶化緩衝剤とを混合して溶液を生成する工程；
（ｂ）脱イオン水を該溶液に添加する工程；
（ｃ）イオン性化合物を該溶液に添加する工程；および、
（ｄ）タンパク質結晶が形成されるまで、該溶液を約４℃と約４０℃との間の温度で、
約２時間と約４８時間との間の時間インキュベートする工程、
を包含する、方法。
（項目３８）
工程（ｂ）と（ｃ）との間で、賦形剤を前記溶液に添加する工程をさらに包含する、請求
項３５または３６に記載の方法。
（項目３９）
溶液相に懸濁したタンパク質複合体を含有する組成物を生成するための方法であって、以
下：水、緩衝剤、防腐剤、等張剤、安定剤およびこれらの組合せからなる群より選択され
る溶液相において、項目３５または３６に従って調製した前記複合体を混合する工程を
包含する、方法。
（項目４０）
工程（ａ）において、前記タンパク質が、前記溶液中に約０．５ｍｇ／ｍｌと約２００ｍ
ｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する、項目３５または３６に記載の方法。
（項目４１）
工程（ａ）において、前記結晶化試薬混合物が、以下：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、
酢酸塩、リン酸塩、クエン酸ホウ酸塩、イミダゾール、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ、重炭酸塩、炭
酸塩、Ｎ−（２−アセトアミド）−イミノジ酢酸およびＭＥＳからなる群より選択される
、項目３５または３６に記載の方法。
（項目４２）
前記結晶化試薬混合物が、前記溶液中に、約０．５ｍＭと約５００ｍＭとの間の濃度で存
在する、項目３５または３６に記載の方法。
（項目４３）
前記結晶化試薬混合物が、約２と約１０との間のｐＨを有する、項目３５または３６に
記載の方法。
（項目４４）
工程（ｄ）において、前記溶液のｐＨが、前記結晶化試薬混合物のｐＨと同じである、請
求項３５または３６に記載の方法。
（項目４５）
項目３５の工程（ｃ）および項目３６の工程（ｄ）において、前記溶液が、約４℃と
約３７℃との間の温度で、約１日と約２日との間の時間インキュべートされる、項目３
５または３６に記載の方法。
（項目４６）
前記イオン性化合物が、以下：ポリマー、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質お
よびデンドリマーからなる群より選択される、項目３５または３６に記載の方法。
（項目４７）
前記イオン性化合物の前記オリゴペプチド成分が、約２ｋＤより小さい分子量を有する、
項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記イオン性化合物の前記ポリペプチドまたはタンパク質成分が、約２ｋＤより大きい分
子量を有する、項目４５に記載の方法。
（項目４９）
前記イオン性化合物の前記ポリペプチドまたは前記タンパク質成分が、ポリカチオンおよ
びポリアニオンからなる群より選択される、項目４５に記載の方法。
（項目５０）
前記ポリカチオンが、以下：プロタミン、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン
、ヒストン、ミエリン塩基性タンパク質、硫酸ポリミキシンＢ、臭化ドデシルトリメチル
アンモニウム、ブラジキニン、スペルミン、プトレシン、オクチルアルギニンおよび合成
ペプチドおよびデンドリマーからなる群より選択される、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記ポリアニオンが、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、ポリアクリレート、ポリ
シアノアクリレート、ポリラクテート、ポリ−Ｂ−ヒドロキシブチレート、ポリビニルピ
ロリドン、ヒアルロン酸、ヘパリン、硫酸化ポリサッカリド、硫酸デキストラン、硫酸ヘ
パリンおよびデンドリマーポリグルタメートおよびポリアスパルテートから選択される、
項目４８に記載の方法。
（項目５２）
前記賦形剤が、以下：界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリオール、グリコアミノ
グリカン、アミノ酸、デンプン、グリセロール、糖類、セルロース、ポビドンデキストリ
ン、ポリソルベート、ヒドロキシプロピルセルロースおよびアスコルビン酸からなる群よ
り選択される、項目３７に記載の方法。
（項目５３）
前記安定剤が、以下：糖類、ポリオール、アミノ酸、可溶性タンパク質、界面活性剤およ
びこれらの組合せからなる群より選択される、項目３８に記載の方法。
（項目５４）
前記タンパク質が以下：治療タンパク質、融合タンパク質、糖タンパク質、レセプター、
合成抗原、組換え抗原、ウイルス表面タンパク質、ホルモン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグ
メント、環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドからなる群より選択される、項目３５また
は３６に記載の方法。
（項目５５）
前記治療タンパク質が、以下：グルカゴン様ペプチド１、抗体、組織適合性抗原、インテ
グリン、セレクチン、インヒビター、成長因子、ポストリディカルホルモン、神経成長ホ
ルモン、血液凝固因子、接着分子、骨形態形成タンパク質、レクチン、栄養因子、サイト
カイン（例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、α−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ、γ−ＩＦ
Ｎ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、リンホトキシン、ＩＬ−５、遊走阻止因子、ＧＭＣＳ
Ｆ、ＩＬ−７、ＩＬ−３、単球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激
因子、多剤耐性タンパク質、他のリンホカイン）、トキソイド、エリスロポエチン、第Ｖ
ＩＩＩ因子、アミリン、ＴＰＡ、ドルナーゼ−α、α−１−アンチトリプシン、ヒト成長
ホルモン、神経成長ホルモン、骨形態形成タンパク質、成長分化因子、ニューレグリン、
ウレアーゼおよびトキソイドからなる群より選択される、項目３５または３６に記載の
方法。
（項目５６）
前記ホルモンが、以下：ヒト成長ホルモン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、排卵誘導ホルモン、黄体化ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンからなる群より選択される、項目３５または３６に記載の方法。
（項目５７）
前記抗体が、以下：インフリキシマブ、エタネルセプト、リタキシマブ、トラスツズマブ、アブシキシマブ、パリビズマブ、ムルモナブ−ＣＤ３、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ゼバリンおよびミロタルグからなる群より選択される、項目３５または３６に記載の方法。
（項目５８）
前記酵素が、以下：ラスブリカーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ヒドロラーゼ、オキシダーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、アデニレートシクラーゼ、トランスフェラーゼ、オキシドレダクターゼ、ニトリラーゼ、ラッカーゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼおよびヒダントイナーゼからなる群より選択される、項目３５または３６に記載の方法。
（項目５９）
前記酵素が、以下：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアミラーゼ、Ｂｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａリパーゼ、シュウ酸オキシダーゼおよび尿酸オキシダーゼか
らなる群より選択される、項目３５または３６に記載の方法。
（項目６０）
前記タンパク質結晶が、インスリンタンパク質結晶でない、項目１または２に記載の複合体。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、光学顕微鏡によって画像化した、８５ｍＭ酢酸カルシムおよび１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）および硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下のｈＧＨ結晶生長を示す。実施例４参照。
【図２】図２は、２８０ｎｍにおいて監視した、リン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウムおよび酢酸カルシウム／プロタミン塩へのｈＧＨの溶解度を、時間の関数として示す。実施例５参照。
【図３】図３は、光学顕微鏡によって画像化した、８５ｍＭ酢酸カルシム、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）および硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下のｈＧＨ結晶生長を示す。実施例９参照。
【図４】図４は、２８０ｎｍにおいて監視した、実施例６〜１０によって生長させたｈＧＨ結晶の溶解度を、時間（分）の関数として示す。実施例１１参照。
【図５】図５は、種々の量の硫酸プロタミンを添加した際の、ｈＧＨ結晶（８５ｍＭ酢酸カルシム、２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００および１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の存在下に形成）の溶解特性を示す。硫酸プロタミンをｈＧＨ結晶に添加し、そして、上澄みにおける可溶性ｈＧＨ濃度を１時間静置し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（面積（Ａｒｅａ））によって測定した。実施例１２参照。
【図６】図６は、光学顕微鏡によって画像化した、５％エタノールおよび１５％ＰＥＧ−６０００（ｐＨ８．５）の存在下に生長したラスブリカーゼ（ｒａｓｂｕｒｉｃａｓｅ）結晶を示す。実施例１４参照。
【図７】図７は、単独か、またはイオンポリマー、例えば、ポリアルギニン、ポリリシン、プロタミンおよびポリオルチニンと複合体化させた、ラスブリカーゼの累積溶解％を示す。実施例１８参照。
【図８】図８は、光学顕微鏡によって画像化した、１００ｍＭリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）中の４０％ＰＥＧ−６００の存在下に生長した蓚酸オキシダーゼ結晶を示す。実施例１９参照。
【図９Ａ】図９Ａは、表６に従って、可溶性ｈＧＨ（群１）、ポリアルギニンと複合体化させたｈＧＨのナトリウム結晶（群２）およびプロタミンと複合体化させたｈＧＨのナトリウム結晶（群３）を毎日皮下投与された幼若雌カニクイザルの血清中のｈＧＨ濃度を、時間の関数として示す。実施例２６参照。
【図９Ｂ】図９Ｂは、表８に従って、可溶性ｈＧＨ（群１）、ポリアルギニンと複合体化させたｈＧＨのナトリウム結晶（群２）およびプロタミンと複合体化させたｈＧＨのナトリウム結晶（群３）を毎日皮下投与された幼若雌カニクイザルについての血清中のＩＧＦ−１濃度を、時間の関数として示す。実施例２６参照。
【図１０Ａ】図１０Ａは、表１０に従って、対照（群１；７日間にわたって１日１回）、可溶性ｈＧＨ（群４および５；７日間にわたって１日１回）および結晶ｈＧＨ（群６、７、９および１０；７日間に１回）を皮下投与された雄ウィスターラットの７日間の成長を示す。実施例２７参照。注：サル用量は、高用量、即ち５．６ｍｇ／ｋｇ／週を意味する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、表１１に従って、対照（群１；７日間にわたって１日１回）、可溶性ｈＧＨ（群４および５；７日間にわたって１日１回）および結晶ｈＧＨ（群６、７、９および１０；７日間に１回）を皮下投与された雄ウィスターラットについての、７日間にわたる毎日の誘導体重増加（ｇ）を示す。実施例２７参照。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書において特に記載しなければならない限り、本発明に関して使用される科学お
よび技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によってそうで
ないことが必要とされなければ、単数形用語は複数形を含み、複数形用語は単数形を含む
。概して、本明細書に記載されるカラムクロマトグラフィー、光学顕微鏡検査法、ＵＶ−
ＶＩＳ分光学、薬物動態分析、組換えＤＮＡ法、ペプチドおよびタンパク質化学、核酸化
学および分子生物学に関して使用される命名法および技術は、当業者によく知られており
、当分野で一般に使用されるものである。
【００１０】
以下の用語は、他に指示しなければならない限り、下記の意味を有するものと理解され
る。
【００１１】
「複合体」という用語は、タンパク質の結晶およびイオン化合物を意味する。または、
該用語は、タンパク質の結晶、イオン化合物および賦形剤を意味しうる。
【００１２】
「タンパク質結晶」という用語は、三次元結晶格子を有する結晶固体状態の一つの状態
を意味する。タンパク質が結晶状態であるかどうかは、当分野で既知の任意の方法、例え
ば、Ｘ線回折または粉末Ｘ線回折によって決定しうる。
【００１３】
「非晶質固形物」または「非晶質沈殿物」という用語は、結晶固体状態に特徴的な三次
元結晶格子構造を有さないタンパク質の非結晶固体形態である。
【００１４】
「球状タンパク質粒子（ＳＰＰ）」という用語は、ナノメートルのオーダーの球半径を
有するタンパク質複合体を意味する。該複合体は、１つまたはそれ以上の医薬的または診
断的に許容される成分または賦形剤と組み合わした結晶タンパク質を含有する。
【００１５】
「イオン化合物」という用語は、所定のｐＨ環境下に、少なくとも２個の荷電基および
少なくとも２の正味電荷を有するペプチドを包含するあらゆるポリマー（ホモポリマーま
たはヘテロポリマー）または小分子を意味する。イオン化合物という用語は、高分子電解
質も包含する。
【００１６】
「治療タンパク質」という用語は、処方物または組成物、または医薬処方物または組成
物において、生体に投与されるタンパク質を意味する。治療タンパク質または予防用タン
パク質の例は、ホルモングルカゴン、例えばグルカゴン様ペプチド１および副甲状腺ホル
モン、抗体、融合タンパク質、エンブレル（エタネルセプト）を包含する（注：エンブレ
ルは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連鎖したヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子
レセプター（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分から成るダイマー融合タンパク質であ
る）。エタネルセプトのＦｃ成分は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび
ちょうつがい部位（ＣＨ１ドメインは含まない）、インヒビター、増殖因子、神経成長ホ
ルモン、血液凝固因子（例えば、第ＩＸ因子）、接着分子、骨形態形成タンパク質および
レクチン栄養因子、サイトカイン、例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、α−ＩＦ
Ｎ、β−ＩＦＮ、γ−ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、リンホトキシン、ＩＬ−５
、遊走阻止因子、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−３、単球−マクロファージコロニー刺激
因子、顆粒球コロニー刺激因子（例えば、ＣＳＦ−３）、多剤耐性タンパク質、他のリン
ホカイン、トキソイド、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、アミリン、ＴＰＡ、ドルナ
ーゼ−α、α−１−アンチトリプシン、ヒト成長ホルモン、神経成長ホルモン、骨形態形
成タンパク質、ウレアーゼ、トキソイド、排卵誘導ホルモン、ＦＳＨ、ＬＳＨ、アルテプ
ラーゼ（Ａｌｔｅｐｌａｓｅ）および組織プラスミノゲンアクチベータ（ＴＰＡ）を含む
。
【００１７】
下記のような治療タンパク質も包含する：
白血球マーカー、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８
、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、Ｃ
Ｅ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７およびそのリガンド、ＣＤ２８およびそのリガン
ド、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７．３、ＣＤ２９およびそのリガンド、ＣＤ３０およびその
リガンド、ＣＤ４０およびそのリガンドｇｐ３９、ＣＤ４４、ＣＤ４５およびアイソフォ
ーム、Ｃｄｗ５２（Ｃａｍｐａｔｈ抗原）、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７２、
ＣＴＬＡ−４，ＬＦＡ−１およびＴＣＲ；
組織適合性抗原、例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ抗原、ルイスＹ抗原、ＳＬｅｘ、
ＳＬｅｙ、ＳＬｅａおよびＳＬｅｂ；
インテグリン、例えば、ＶＬＡ−１、αＩＩβ、βＩＩＩα  ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３
、ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＶＬＡ−６およびＬＦＡ−１；
接着分子、例えば、Ｍａｃ−１およびｐ１５０、９５；
セレクチン、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンならびに
それらのカウンターレセプターＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＬＦＡ
−３；
インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、Ｉ
Ｌ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ
−１４およびＩＬ−１５；
インターロイキンレセプター、例えば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−
５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１１Ｒ、ＩＬ−１２
Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１４Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１  ｔｒａｐ、ＩＬ−４  ｔｒ
ａｐ、ＩＬ−６  ｔｒａｐおよびＩＬ−１３  ｔｒａｐ；
ケモカイン、例えば、ＰＦ４、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＣＰ１、ＮＡＰ−２、Ｇ
ｒｏα、ＧｒｏβおよびＩＬ−８；
増殖因子、例えば、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＢＭＰｓ、ＧＤＦｓ、ニューレグリン、ＴＳ
Ｈ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＰＴＨｒＰ、ＥＧＦファミリー、ＥＧＦ、ＰＤＧＦファミリ−、
エンドセリン、ペグビソマントおよびガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）；
増殖因子レセプター、例えば、ＴＮＦαＲ、ＲＧＦβＲ、ＴＳＨＲ、ＶＥＧＦＲ／ＶＰ
ＦＲ、ＶＥＧＦ  ｔｒａｐ、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰＨＴｒＰＲ、ＰＤＧＦＲファミリー
、ＥＰＯ−Ｒ、ＧＣＳＦ−Ｒ、組換えヒト可溶性ｐ５５ＴＮＦレセプター（ＴＢＰ−１タ
ンパク質）および他の造血因子レセプター；
インターフェロンレセプター、例えば、ＩＦＮαＲ、ＩＦＮβＲおよびＩＦＮγＲ；
融合タンパク質；
Ｉｇおよびそれらのレセプター、例えば、ＩｇＥ、ＦｃｅＲＩおよびＦｃｅＲＩＩ；お
よび
血液因子、例えば、補体Ｃ３ｂ、補体Ｃ５ａ、補体Ｃ５ｂ−９、Ｒｈ因子、フィブリノ
ーゲン、フィブリンおよびミエリン関連増殖因子。
【００１８】
「糖タンパク質」という用語は、糖鎖およびタンパク質様成分を含んで成る分子として
定義される。
【００１９】
本発明の複合体および組成物のタンパク質成分は、任意の天然、合成または組換えタン
パク質抗原であってよく、例えば下記のものである：破傷風トキソイド、ジフテリアトキ
ソイド、ウイルス表面タンパク質、例えば、ＣＭＶ糖タンパク質Ｂ、ＨおよびｇＣＩＩＩ
、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質、ＲＳＶエンベロープ糖タンパク質、ＨＳＶエン
ベロープ糖タンパク質、ＥＢＶエンベロープ糖タンパク質、ＶＺＶエンベロープ糖タンパ
ク質、ＨＰＶエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザウイルス糖タンパク質、肝炎フ
ァミリー表面抗原；ウイルス構造タンパク質、ウイルス酵素、寄生生物タンパク質、寄生
生物糖タンパク質、寄生生物酵素および細菌タンパク質を包含する。
【００２０】
腫瘍抗原、例えば、ｈｅｒ２−ｎｅｕ、ムチン、ＣＥＡおよびエンドシアリンも包含さ
れる。アレルゲン、例えば、ハウスダウトダニ抗原、ｌｏｌ  ｐ１（草）抗原、およびウ
ルシオールが包含される。
【００２１】
毒素、例えば、プソイドモナスエンドトキシンおよびオステオポンチン／ウロポンチン
、蛇毒液および蜂毒液が包含される。
【００２２】
糖タンパク質腫瘍関連抗原、例えば、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ヒトムチン、ｈｅｒ−２
／ｎｅｕおよび前立腺特異抗原（ＰＳＡ）も包含される［Ｒ．Ａ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  
ａｎｄ  Ｏ．Ｊ．Ｆｉｎｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６２，ｐ
ｐ．２７１−５６（１９９６）］。
【００２３】
ポリマーという用語は、分子量約５，０００またはそれ以上を有する分子であって、共
有結合した分子量５，０００未満のモノマー単位２個またはそれ以上から成る分子を意味
する。本発明の選択的実施形態によれば、ポリマーは、２個またはそれ以上のモノマーか
ら成ることができ、ダイマー、トリマー、テトラマー等を包含する。ポリマーは、ホモポ
リマーまたはヘテロポリマーであってよく、コポリマーを包含する。
【００２４】
コポリマーという用語は、１つの鎖につき２種またはそれ以上のモノマー単位を有する
ポリマーを意味する。コポリマーの全組成中のモノマー単位の配列は、交互、ブロックま
たは統計的であってよい［Ｏｄｉａｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ，第３版、１４２−１４９（１９９１）］。
【００２５】
ポリペプチドは、互いに連結した５０個より多いアミノ酸および／またはイミノ酸の連
鎖として定義される。オリゴペプチドは、互いに連結した２〜５０個のアミノ酸および／
またはイミノ酸として定義される。
【００２６】
タンパク質は、２，０００より大きい分子量を有する巨大分子であり、１個またはそれ
以上のポリペプチド鎖から成る。
【００２７】
「デントリマー」という用語は、高分子を意味し、簡単な分岐モノマー単位から段階的
に生成される合成三元巨大分子であり、その性質および機能性は容易に調節することがで
き、変化させることができる。デンドリマーの独特の構造および単分散構造は、一般的な
直鎖状ポリマーと比較した場合に、有意に向上した物理的および化学的性質を生じること
が示されている。その結果、現在、デンドリマーは、進歩した薬剤輸送システム用の主要
なナノメートル規模の構成単位の１つであると考えられている。
【００２８】
デンドリマーは、最初の３世代において、一般的な有機分子に類似している。それらは
、小さく、一貫したまたは特定の三次元構造を有していない。第４世代までに、デンドリ
マーは球状になり始め、好ましい三次元構造をとり始める。第５世代までに、デンドリマ
ーは、一貫した特定の三次元構造を有し、第５世代を超えると、デンドリマーは高度に構
造化された球形になる。本発明の１つの実施形態は、少なくとも２世代のデンドリマーに
関する。本発明の他の実施形態において、デンドリマーは、陽荷電または陰荷電すること
ができる。
【００２９】
「ポリカチオン」という用語は、適切なｐＨ環境下に正味陽電荷を有するオリゴマー鎖
（少なくとも２個のモノマー単位）またはポリマー鎖を意味する。ポリカチオンの例は、
プロタミン、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン、ヒストン、ミエリン塩基性
タンパク質、硫酸ポリミキシンＢ、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、ブラジキニン
、スペルミン、プトレシン、オクチルアルギニンおよび合成ペプチドおよびデンドリマー
である。
【００３０】
「ポリアニオン」という用語は、適切なｐＨ環境下に正味陰電荷を有するオリゴマー鎖
（少なくとも２個のモノマー単位）またはポリマー鎖を意味する。ポリアニオンの例は、
ポリグルタメート、ポリアスパルテート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、
ポリラクテート、ポリ−Ｂ−ヒドロキシブチレート、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン
酸、ヘパリン、硫酸化ポリサッカリド、硫酸デキストラン、硫酸ヘパリン、ポリホスフェ
ートおよびデンドリマーである。
【００３１】
「懸濁液」という用語は、可溶相に分散した不溶相を意味する。
【００３２】
等張溶液は、ヒト生理液と同じ浸透圧を有する。「等張剤」は、所定液における浸透圧
を調節するために使用することができるあらゆる分子または化合物である。
【００３３】
本発明の複合体および組成物は、あらゆる医薬的に許容される賦形剤と組み合わすこと
ができる。本発明によれば、「医薬的に許容される賦形剤」は、医薬組成物に使用される
充填剤または充填剤組合せとして作用する賦形剤である。好ましい賦形剤は、下記のもの
を包含する：１）アミノ酸、例えば、グリシン、アルギニン、アルパラギン酸、グルタミ
ン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、プロリン；２）炭水化物、例えば、単糖類、
例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロ
ース、リボース；二糖類、例えば、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロース
；多糖類、例えば、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲン；アル
ジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、ラクチトール、ソルビトール；ならび
に３）グルクロン酸およびガラクツロン酸。他の賦形剤は、下記のものを包含する：シク
ロデキストリン、例えば、メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロ
デキストリン等；無機塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、
ナトリウムおよびカリウムのリン酸塩、硼酸、炭酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウ
ム；有機塩、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩；乳化または可溶
化／安定化剤、例えば、アラビアゴム、ジエタノールアミン、グリセリルモノステアレー
ト、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー
、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、ソルビタンモノラウレート
、ソルビタンモノステアレートおよびソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ワックス
、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン誘導体；および粘度上昇剤、例えば、寒天、ア
ルギン酸およびその塩、グアールゴム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレン
オキシド、セルロースおよびその誘導体、プロピレンカーボネート、ポリエチレングリコ
ール、ヘキシレングリコール、チロキサポール。任意の前記化合物の塩も使用しうる。他
の好ましい賦形剤群は、下記のものを包含する：スクロース、トレハロース、ラクトース
、ソルビトール、ラクチトール、イノシトール、ナトリウムおよびカリウムの塩、例えば
、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、硼酸塩、グリシン、アルギニン、ポリエチレンオキシ
ド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、メトキシ
ポリエチレングリコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ポ
リリシン、ポリアルギニン。
【００３４】
本発明の１つの実施形態において、賦形剤は、下記から成る群から選択される：塩、ア
ルコール、炭水化物、タンパク質、脂質、界面活性剤、ポリマーおよびポリアミノ酸。他
の実施形態において、賦形剤は、下記から成る群から選択される：界面活性剤、プルロニ
ックポリオール、ポリオール、グリコアミノグリカン、アミノ酸、デンプン、グリセロー
ル、単糖類、二糖類、セルロース、プロビドンデキストリン、ポリソルベート、ヒドロキ
シプロピルセルロースおよびアスコルビン酸。
【００３５】
本発明の複合体および組成物は、担体または補助剤、治療薬に添加した場合にその作用
を加速するかまたは向上させる物質と組み合わすこともできる。補助剤の例は、フロイト
補助剤、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、緩衝物質、例
えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸およびソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部
分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナト
リウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、マグネシウム、ケイ酸塩、セルロー
スに基づく物質およびポリエチレングリコール。ゲルベース形態用の補助剤は、例えば、
ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリ
オキシプロピレン−ブロックコポリマー、ポリエチレングリコールおよびウッドワックス
（ｗｏｏｄ  ｗａｘ）アルコールである。
【００３６】
本発明の複合体および組成物は、安定剤と組み合わすこともできる。本発明の１つの実
施形態において、安定剤は、下記から成る群から選択される：糖類、ポリオール、アミノ
酸、可溶性タンパク質および界面活性剤。
【００３７】
「結晶化試薬混合物」という用語は、塩、ＰＥＧ、緩衝剤、およびタンパク質またはポ
リマーの結晶化に必要とされる他の成分を含有する組成物として定義される。
【００３８】
本発明の１つの実施形態は、タンパク質結晶およびイオン化合物を含んで成る複合体に
関する。他の実施形態は、複合体、および医薬的に許容される賦形剤または担体を含んで
成る組成物に関する。本発明の他の実施形態は、溶液相に懸濁した不溶相を含んで成る組
成物であって、該不溶相が、タンパク質結晶、イオン化合物および賦形剤を含んで成る複
合体であり、該溶液相が、水、緩衝剤、防腐剤、等張剤、安定剤およびそれらの組合せか
ら成る群から選択される組成物に関する。さらに、本発明は、これらの複合体および組成
物を製造する方法も提供する。
【００３９】
本発明は、タンパク質結晶対応物または従来処方のタンパク質対応物と比較して、長時
間溶解特性を有する複合体および組成物を示す。その溶解挙動は、結晶化工程の前または
後に、タンパク質結晶にポリカチオンまたはポリアニオン化合物を付加することによって
得られる。ポリカチオン化合物またはポリアニオン化合物の使用の選択は、タンパク質の
ＰＩおよび結晶化環境のｐＨに依存する。
【００４０】
イオン化合物をタンパク質結晶に複合体化させることに加えて、ポリカチオンおよびポ
リアニオンを使用して、非晶質タンパク質沈殿物および球状タンパク質粒子の複合体およ
び組成物を準備することもできる。
【００４１】
本発明によれば、徐放性組成物用のタンパク質の種々の結晶の発生は、タンパク質の両
性性質に依存する。例えば、タンパク質鎖上の利用可能な塩基性および酸性残基の数、な
らびにｐＨ環境が、タンパク質の全体的正味電荷を決定する。従って、等電ｐＨ値（ｐＩ
）、またはタンパク質の正味電荷が０である場合の特定ｐＨは、全てのタンパク質に固有
である。ポリカチオンまたはポリアニオンを、それぞれ、低ｐＩまたは高ｐＩを有するタ
ンパク質に複合体化させることは、好ましい溶解挙動を包含する有利な物理的性質を有す
るタンパク質を生じうる。
【００４２】
例えば、ヒト成長ホルモン（ｐＩ＝５．２）を、ｐＨ７において緩衝液中で結晶化させ
るかまたは沈殿させる場合、タンパク質は陰に荷電され、従って、ポリカチオンと相互作
用するかまたは複合体化しうる。同様に、９より高いｐＩを有するモノクローナル抗体、
例えばリタキサンおよびハーセプチンは、中性緩衝液中でポリアニオンと複合体化しうる
。
【００４３】
一旦アミノ酸配列が確認されると、タンパク質正味電荷の推定値を算出することができ
る。公的に得られるプログラムにアクセスして、これを行なうことができる（参照：  ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｏｌ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｄ  ａｂｉｍ／ｃｏｍｐｏ−
ｐ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／ｓｅｒｖｉｃ
ｅ／ｄｅａｍｂｕｌｕｍ）。酸性タンパク質、アスパラギン酸（ｐＫａ４．５）およびグ
ルタミン酸（ｐＫａ４．５）の高含有量を有するタンパク質は、一般に６〜６．４未満の
ｐＩを有する。一方、塩基性タンパク質、ヒスチジン（ｐＫａ６．２）、リシン（ｐＫａ
１０．４）およびアルギニン（ｐＫａ１２）の高含有量を有するタンパク質は、約７．５
〜８より高いｐＩを有する。それらの両方に対して、中性タンパク質、同量の酸残基およ
び塩基性アミノ酸残基を一般に有するタンパク質は、中性ｐＩを有する（ｐＩは一般に約
６．５〜７．４である）。
【００４４】
包括的ではないが、種々の治療タンパク質のｐＩの例は以下の通りである：組換えヒト
エリスロポエチン（ｐＩ＝４）；エタネルセプト（エンブレル）（ｐＩ＝５．１）；イン
スリン（ｐＩ＝５．４）；顆粒球コロニー刺激因子（ｐＩ＝５．５〜５．９）；ＴＮＦ−
α（ｐＩ＝５．６）；フィブロラーゼ（ｐＩ＝６．７）；ＩＬ−１β（ｐＩ＝６．９）；
組換え組織プラスミノゲン活性化因子（ｐＩ＝６．５〜８．５）；オルトクロン  ＯＫＴ
３（ｐＩ＝６．７〜７．２）；第ＶＩＩＩ因子（ｐＩ＝７〜７．６）；ウシソムトトロピ
ン（ｐＩ＝７．４）；インターロイキン２（ｐＩ＝７．４４）；インスリン様成長因子−
１（ｐＩ＝８．４）およびアプロチニン（ｐＩ＝１０．５）。
【００４５】
本発明の１つの実施形態は、タンパク質結晶およびイオン化合物を含んで成る複合体に
関する。本発明の実施形態によれば、タンパク質結晶およびイオン化合物は、約１：２５
０〜約１：２０のタンパク質／イオン化合物のモル比で存在する。他の実施形態において
、タンパク質結晶およびイオン化合物は、約５：１〜約４０：１（ｗ／ｗ）のタンパク質
／イオン化合物比率で存在する。他の実施形態において、タンパク質結晶およびイオン化
合物は、約１０：１〜約２０：１（ｗ／ｗ）のタンパク質／イオン化合物比率で存在する
。他の実施形態において、タンパク質結晶およびイオン化合物は、約１２：１〜約１５：
１（ｗ／ｗ）のタンパク質／イオン化合物比率で存在する。選択的実施形態によれば、そ
の比率は５：１（ｗ／ｗ）である。
【００４６】
好ましい実施形態において、タンパク質結晶は、下記から成る群から選択される：治療
タンパク質、融合タンパク質、糖タンパク質、レセプター、合成抗原、組換え抗原、ウイ
ルス表面タンパク質、ホルモン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、環状ペプチドおよび
直鎖状ペプチド。
【００４７】
より好ましい実施形態において、治療タンパク質は、下記から成る群から選択される：
グルカゴン様ペプチド１、抗体、組織適合性抗原、インテグリン、セレクチン、インヒビ
ター、成長因子、ポストリディカル（ｐｏｓｔｒｉｄｉｃａｌ）ホルモン、神経成長ホル
モン、血液凝固因子（例えば、第ＩＸ因子）、接着分子、骨形態形成タンパク質およびレ
クチン、栄養因子、サイトカイン、例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、α−ＩＦ
Ｎ、β−ＩＦＮ、γ−ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、リンホトキシン、ＩＬ−５
、遊走阻止因子、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−３、単球−マクロファージコロニー刺激
因子、顆粒球コロニー刺激因子（例えば、ＣＳＦ−３）、多剤耐性タンパク質、他のリン
ホカイン、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、アミリン、ＴＰＡ、ドルナーゼ−α、α
−１−アンチトリプシン、ヒト成長ホルモン、神経成長ホルモン、骨形態形成タンパク質
、ウレアーゼおよびトキソイド。
【００４８】
他のより好ましい実施形態において、治療タンパク質は、下記から成る群から選択され
る：グルカゴン様ペプチド１、抗体、組織適合性抗原、インテグリン、セレクチン、イン
ヒビター、成長因子、ポストリディカルホルモン、神経成長ホルモン、血液凝固因子（例
えば、第ＩＸ因子）、接着分子、骨形態形成タンパク質およびレクチン、栄養因子、サイ
トカイン、例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、リ
ンホトキシン、ＩＬ−５、遊走阻止因子、ＩＬ−７、ＩＬ−３、単球−マクロファージコ
ロニー刺激因子、多剤耐性タンパク質、他のリンホカイン、第ＶＩＩＩ因子、アミリン、
ＴＰＡ、ドルナーゼ−α、α−１−アンチトリプシン、ヒト成長ホルモン、神経成長ホル
モン、骨形態形成タンパク質、ウレアーゼおよびトキソイド。
【００４９】
他の好ましい実施形態において、ホルモンは、下記から成る群から選択される：ヒト成
長ホルモン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、排卵誘導ホルモン（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  
ｈｏｒｍｏｎｅ）、黄体化ホルモンおよび卵胞刺激ホルモン。
【００５０】
さらに他の好ましい実施形態において、抗体は、下記から成る群から選択される：イン
フリキシマブ、エンタネルセプト（エンブレル）、リタキシマブ、トラスツズマブ、アブ
シキシマブ、パリビズマブ、ムルモナブ−ＣＤ３、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダク
リズマブ、ゼバリンおよびミロタルグ。
【００５１】
さらに他の好ましい実施形態において、酵素は、下記から成る群から選択される：ラス
ブリカーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ヒドロラーゼ、オキシダーゼ、イソメラーゼ、リア
ーゼ、リガーゼ、アデニレートシクラーゼ、トランスフェラーゼ、オキシドレダクターゼ
、ニトリラーゼ、ラッカーゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼおよびヒダントイナ
ーゼ。
【００５２】
より好ましい実施形態において、アミラーゼは、鞠菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒ
ｙｚａｅ）に由来する。他の好ましい実施形態において、リパーゼは、セパシア菌（Ｂｕ
ｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）に由来する。さらに他の好ましい実施形態にお
いて、オキシダーゼは、蓚酸オキシダーゼおよび尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）から成
る群から選択される。
【００５３】
１つの実施形態において、リアーゼはヒスチダーゼであり、ヒドロラーゼはＬ−アスパ
ラギナーゼＩＩである。他の実施形態において、酵素はアデノシンデアミナーゼまたはセ
レダーゼである。
【００５４】
１つの実施形態によれば、本発明のタンパク質結晶およびイオンポリマーの複合体は、
順次に吸収され反対に荷電された高分子電解質の多層被膜を有するタンパク質結晶（ＥＰ
１１９０１２３  Ｂ１）ではない。
【００５５】
複合体のイオン化合物成分は、下記から成る群から選択される：ポリマー、ポリペプチ
ド、オリゴペプチド、タンパク質およびデンドリマー。好ましい実施形態において、オリ
ゴペプチドは、約２ｋＤ未満の分子量を有し、ポリペプチドまたはタンパク質は、約２ｋ
Ｄより高い分子量を有する。さらに、本発明のイオン化合物のオリゴペプチドまたはポリ
ペプチドまたはタンパク質成分は、ポリカチオンおよびポリアニオンから成る群から選択
することができる。
【００５６】
より好ましい実施形態において、ポリカチオンは、下記から成る群から選択される：プ
ロタミン、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン、ヒストン、ミエリン塩基性タ
ンパク質、硫酸ポリミキシンＢ、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、ブラジキニン、
スペルミン、プトレシン、オクチルアルギニンおよび合成ペプチドおよびデンドリマー。
他のより好ましい実施形態において、ポリアニオンは、下記から成る群から選択される：
ポリグルタメート、ポリアスパルテート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、
ポリラクテート、ポリ−Ｂ−ヒドロキシブチレート、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン
酸、ヘパリン、硫酸化ポリサッカリド、硫酸デキストラン、硫酸ヘパリンおよびデンドリ
マー。
【００５７】
本発明の他の実施形態は、溶液相に懸濁した不溶相を含んで成る組成物であって、該不
溶相が、タンパク質結晶、イオン化合物および賦形剤を含んで成る複合体であり、前記溶
液相が、水、緩衝剤、防腐剤、等張剤、安定剤およびそれらの組合せから成る群から選択
される組成物に関する。または、そのような組成物は、賦形剤を使用せずに準備すること
もできる。
【００５８】
さらに、本発明の好ましい実施形態は、賦形剤が下記から成る群から選択される組成物
も包含する：界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリオール、グリコアミノグリカン
、アミノ酸、デンプン、グリセロール、糖類、セルロース、ポビドンデキストリン、ポリ
ソルベート、ヒドロキシプロピルセルロースおよびアスコルビン酸。
【００５９】
他の好ましい実施形態は、安定剤が下記から成る群から選択される組成物を包含する：
糖類、ポリオール、アミノ酸、可溶性タンパク質および界面活性剤。
【００６０】
本発明は、タンパク質に基づく療法の持続放出を必要とするかまたはそれによって改善
される疾患状態を有する哺乳動物に、複合体または組成物を投与する方法も提供する。該
方法は、タンパク質結晶およびイオン化合物を含んで成る本発明の複合体の治療有効量を
哺乳動物に投与する工程を含んで成る。または、該方法は、イオン化合物に複合体化させ
たタンパク質結晶および賦形剤を含んで成る組成物の有効量を哺乳動物に投与する工程を
含んで成る。
【００６１】
本発明の１つの実施形態において、タンパク質結晶およびイオン化合物の複合体、なら
びにそれらを含んで成る賦形剤含有または不含有組成物を、単独か、または医薬的、獣医
学的または予防的調製物の一部として、投与する。それらは、非経口、経口、肺、鼻、耳
、肛門、膣、皮膚、眼、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、粘膜、舌下、皮下、経皮、局
所、口腔または頭蓋内経路で投与しうる。
【００６２】
本発明の１つの実施形態において、タンパク質結晶およびイオン化合物、ならびにそれ
らを含んで成る組成物を、賦形剤を添加するかまたは添加せずに、経口経路または非経口
経路によって投与する。好ましい実施形態において、タンパク質結晶およびイオン化合物
を含んで成る複合体、およびそれらを含んで成る組成物を、賦形剤を添加するかまたは添
加せずに、皮下または筋肉内経路によって投与する。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明の複合体または組成物を、２７かまたはそれより大
きいゲージの針を使用して皮下経路によって投与する。または、複合体または組成物を、
無針注射器または経皮的手段によって投与しうる。
【００６４】
本発明は、好都合にも、本発明の複合体または組成物の哺乳動物への持続放出を可能に
する。１つの実施形態において、本発明の複合体または組成物を１週間に１回投与する。
他の実施形態において、本発明の複合体または組成物を２週間ごとに投与する。さらに他
の実施形態において、本発明の複合体または組成物を１ヶ月ごとに投与する。特定の治療
計画は、複合体の薬物動態特性、治療される疾患、治療される患者の年齢および体重、患
者の総合的健康状態および主治医の判断のような要因に依存することは当業者に理解され
る。
【００６５】
本発明は、タンパク質結晶とイオン化合物との複合体を準備する方法も提供する。１つ
のそのような方法は、下記の工程を含んで成る：（ａ）タンパク質の溶液と結晶化試薬混
合物とを混合して溶液を調製し；（ｂ）脱イオン水を前記溶液に添加し；（ｃ）タンパク
質結晶が形成されるまで、前記溶液を約４℃〜約４０℃の温度で約２時間〜約４８時間イ
ンキュベーションし；（ｄ）イオン化合物を前記溶液に添加して、前記タンパク質結晶と
前記イオン化合物との複合体を形成する。
【００６６】
代表的に、タンパク質の結晶化は、タンパク質の全電荷が０であるタンパク質ｐＩに近
い溶液のｐＨにおいて生じる可能性が高い。しかし、ポリアニオンまたはポリカチオンの
タンパク質結晶への、それらのｐＩ値における付加は、そのｐＨにおいて低複合を生じう
る。その結果、タンパク質結晶およびイオンポリマーの複合体は、弱く、哺乳動物への投
与に有用でない場合がある。このような理由から、上記の方法におけるそれぞれ工程（ｃ
）および（ｄ）である結晶化工程と複合体化工程の間に、付加的任意工程を含むことが好
都合である。その付加的任意工程において、付加的賦形剤を、工程（ｃ）で形成されたタ
ンパク質結晶の懸濁液に添加して、結晶化のｐＨと異なるｐＨにおいてタンパク質結晶の
溶解度を減少させ、それと同時に、結晶の電荷を変化させ、それによって、次の工程（ｄ
）における高分子イオンとの複合体化を促進する。次に、得られた複合体を非経口投与用
に処方することができ、その場合、ｐＨは生理的ｐＨ、例えば、ｐＨ６．５〜７．５、ま
たは経口投与に好適な他の任意のｐＨにすべきである。選択的実施形態によれば、上記の
任意工程は、賦形剤を前記溶液に添加して、タンパク質結晶の結晶度は維持するが、工程
（ｃ）と（ｄ）の間のタンパク質結晶のｐＨは変化させることを含む。
【００６７】
本発明は、タンパク質結晶とイオン化合物との複合体を準備する選択的方法も提供する
。この方法は、下記の工程を含んで成る：（ａ）タンパク質の溶液と結晶化試薬混合物と
を混合して溶液を調製し；（ｂ）脱イオン水を前記溶液に添加し；（ｃ）イオン化合物を
前記溶液に添加し；そして（ｄ）タンパク質結晶が形成されるまで、前記溶液を約４℃〜
約４０℃の温度で約２時間〜約４８時間インキュベーションする。いずれかの本発明の方
法によって準備される複合体は、タンパク質およびイオン化合物の共結晶であってもよく
、または単に、タンパク質結晶とイオン化合物との物理的会合（即ち、静電相互作用）で
あってもよい。
【００６８】
タンパク質結晶とイオン化合物との複合体を製造する上記の方法の他の実施形態におい
て、賦形剤または塩を工程（ｂ）と（ｃ）の間の溶液に添加することができる。
【００６９】
他の好ましい実施形態において、上記の方法におけるイオン化合物を添加する工程にお
いて、ポリカチオンおよびポリアニオンを、タンパク質／ポリアニオンまたはポリカチオ
ン（ｍｇ：ｍｇ）の比率約１：５〜約１：２５で添加する。
【００７０】
上記の方法の工程（ｂ）と（ｃ）の間で賦形剤を添加する場合、好ましい賦形剤は、界
面活性剤、プルロニックポリオール、ポリオール、グリコアミノグリカン、アミノ酸、デ
ンプン、グリセロール、糖類、セルロース、ポビドンデキストリン、ポリソルベート、ヒ
ドロキシプロピルセルロースおよびアスコルビン酸を包含する。
【００７１】
好ましい実施形態において、上記の方法の工程（ａ）におけるタンパク質は、前記溶液
に約０．５ｍｇ／ｍｌおよび約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００７２】
他の好ましい実施形態において、上記の方法の工程（ａ）における結晶化試薬混合物は
、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸ホウ酸塩、イミダゾール
、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ、重炭酸塩、炭酸塩、Ｎ−（２−アセトアミド）−イミノジ酢酸およ
びＭＥＳから成る群から選択される。さらに他の好ましい実施形態において、結晶化試薬
混合物は、約０．５ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度で溶液に存在する。他の好ましい実施形態
において、結晶化試薬混合物は、約２〜約１０のｐＨを有する。
【００７３】
他の好ましい実施形態において、上記方法の工程（ｄ）における溶液のｐＨは、前記結
晶化試薬混合物と同じである。
【００７４】
上記の方法の他の実施形態において、溶液を約４℃〜約３７℃の温度で約１日〜約２日
間インキュベーションする。
【００７５】
本発明は、溶液相に懸濁したタンパク質複合体を含んで成る組成物を製造する方法も提
供し、上記方法は、下記の工程を含んで成る：水、緩衝液、防腐剤、等張剤、安定剤およ
びそれらの組合せから成る群から選択される溶液相に、上記の方法によって製造した前記
複合体を混合する工程を含んで成る方法である。
【００７６】
好ましい実施形態において、安定剤を下記から成る群から選択する：糖類、ポリオール
、アミノ酸、可溶性タンパク質、界面活性剤およびそれらの組合せ。
【００７７】
本発明をより深く理解しうるように、下記実施例を示す。これらの実施例は、例示目的
にすぎず、本発明の範囲をいかなる方法においても限定するものではないと理解すべきで
ある。
【実施例】
【００７８】
下記の物質を下記実施例において使用した。
【００７９】
（材料）
商業的に入手可能な組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を、ＢｒｅｓａＧｅｎ  Ｌｔ
ｄ．（Ｔｈｅｂａｒｔｏｎ、オーストラリア）から得、平均分子量６０００（ＰＥＧ−６
０００）のポリエチレングリコールをＨａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｇｕｎａ
Ｎｉｇｕｅｌ，カリフォルニア）から得、硫酸プロタミンをＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃ
ａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）からＦｉｓｈｅｒを通じて購入した。
リン酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、
酢酸カルシウム、塩化カルシウム、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよびナ
トリウムアジドモノメチルエーテルを、Ｆｉｓｈｅｒ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）か
ら得た。ポリアルギニンをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【００８０】
（分析技術およびアッセイ）
逆相高性能液体クロマトグラフィー。  逆相高性能液体クロマトグラム（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ）を、Ｃ５、５ｃｍ  ｘ  ４．６ｍｍ、３μｍカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆ
ｏｎｔｅ，ＰＡ）を取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ（Ｐａｌｏ  
Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって得た。サンプルを溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７
．２、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌおよび０．０２％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３）
に溶解し、注入の前に濾過した（０．２μｍ）。溶媒ＡおよびＢの勾配法を使用して２１
４および２８０ｎｍにおいて溶離プロフィールを監視した。溶媒Ａは、９９．９％ｄＨ２
Ｏ／０．１％ＴＦＡから成っていた。溶媒Ｂは、９９．９％アセトニトリル／０．１％Ｔ
ＦＡから成っていた。全ての化学物質は、Ｆｉｓｈｅｒから入手したＨＰＬＣグレードで
あった。溶離は、０〜２分  ４０〜５０％Ｂ、２〜１２分  ５０〜６０％Ｂ、および１２
〜１５分  ６０〜８５％Ｂの勾配デザインを使用して、１５分間にわたって行なった。流
量１ｍｌ／分およびカラム温度２０℃の操作を通して維持した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅ
ｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用してデータを分析し
た。
【００８１】
サイズ排除クロマトグラフィー。  高性能サイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ−ＨＰＬ
Ｃ）を、ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム（ｐａｒｔ＃  ０８４５０、Ｔｏｓ
ｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＬＬＣ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）（７．８ｍｍ  
ｘ  ３０ｃｍ、５μｍ）を取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ（Ｐａ
ｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、およびＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＭＷＤ（ＵＶ）によ
って得た。サンプルを溶解緩衝液０．２ｍｌに溶解し、注入の前に０．２μｍ濾過して、
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ温度制御オートサンプラーに取った。５０ｍＭ  Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ７．５の移動相を使
用して、２１４および２８０ｎｍにおいて溶離プロフィールを監視した。カラム温度を２
５℃に維持し、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ脱ガス剤を使用して脱気した。
【００８２】
ＵＶ−ＶＩＳ吸収および光学顕微鏡検査法。  ＵＶ−ＶＩＳ分光写真を、Ｂｅｃｋｍａ
ｎ  ＤＵ  ７４００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌ
ｅｒｔｏｎ，ＣＡ）によって得た。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−５１顕微鏡を使用する明視野
画像化によって光学顕微鏡写真を得、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｉａ
Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ  Ｌ．Ｐ．，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ）を使用して４０ｘ〜４００ｘの倍率で、Ｓｏｎｙ  ＤＸＣ−９７０ＭＤ  ３ＣＣＤカ
ラーデジタルビデオカメラによって保存した。
【００８３】
（実施例１）
リン酸アンモニウムを使用するｈＧＨの結晶化。  商業的に入手可能なｈＧＨ（５０ｍ
ｇ）を、１５ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）に先ず溶解し、１０，０
００の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＰｉｅｒｃｅ透析器を使用して２ｘ４００
０ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）に対して透析した。Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ  １０，０００）を４０００ｒｐｍにおいて２０〜３０分間にわた
って使用して、タンパク質濃度を遠心分離によって調節した。ｈＧＨの濃度は、２８０ｎ
ｍ／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨ  Ａ２８０＝０．８１３吸収単位）での吸収によ
って測定して３０〜４５ｍｇ／ｍｌであった。脱イオン水をその溶液に添加して、最終タ
ンパク質濃度１０〜２０ｍｇ／ｍｌを得た。最終濃度８６０ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４が得
られるようにリン酸アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４）（２．５Ｍ）を溶液に添加するこ
とによって、ｈＧＨの結晶を生長させた。次に、溶液を２５℃で１６時間インキュベーシ
ョンした。針状結晶を得、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さ約８〜１５μ
ｍであり、結晶収量は９０％より大であった。
【００８４】
（実施例２）
クエン酸ナトリウムを使用するｈＧＨの結晶化。  実施例１に記載のように、商業的に
入手可能なｈＧＨを、精製し、そして／または透析し、そして濃縮した。脱イオン水をｈ
ＧＨの濃縮溶液に添加して、最終タンパク質濃度１７．５ｍｇ／ｍｌを得た。最終濃度３
９０ｍＭ  Ｎａ−シトレートが得られるようにクエン酸ナトリウム（Ｎａ−シトレート）
（１．５Ｍ）をその溶液に添加することによって、ｈＧＨの結晶を生長させた。次に、溶
液を２５℃で１６時間にわたってインキュベーションした。針状結晶を得、光学顕微鏡で
画像化した。得られた結晶は、長さ約８μｍ未満であり、結晶収量は８５％より大であっ
た。
【００８５】
（実施例３）
リン酸ナトリウムを使用するｈＧＨの結晶化。  実施例１に記載のように、商業的に入
手可能なｈＧＨを、精製し、そして／または透析し、そして濃縮した。脱イオン水を濃縮
ｈＧＨ溶液に添加して、最終タンパク質濃度１２．５〜１７．５ｍｇ／ｍｌを得た。Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ８．６）を添加して、最終濃度１００ｍＭとした。最終濃度６
００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４が得られるように第二リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）（
１Ｍ）をその溶液に添加することによって、ｈＧＨの結晶を生長させた。次に、溶液を２
５℃で１６時間にわたってインキュベーションした。針状結晶を得、光学顕微鏡で画像化
した。得られた結晶は、長さ５〜２５μｍであり、結晶収量は７５％より大であった。
【００８６】
（実施例４）
酢酸カルシウムおよび硫酸プロタミンを使用するｈＧＨの結晶化。  実施例１に記載の
ように、商業的に入手可能なｈＧＨを、精製し、そして／または透析し、そして濃縮した
。脱イオン水を濃縮ｈＧＨ溶液に添加して、最終タンパク質濃度１５ｍｇ／ｍｌを得た。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ８．６）を添加して、最終濃度１００ｍＭとした。この溶
液に硫酸プロタミンを添加して、最終濃度２ｍｇ／ｍｌとした。最終濃度８５ｍＭ  Ｃａ
−アセテートが得られるように酢酸カルシウム（Ｃａ−アセテート）（１Ｍ）を溶液に添
加することによって、ｈＧＨの結晶を生長させた。次に、溶液を３７℃で８時間インキュ
ベーションした。針状結晶を得、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さ２０μ
ｍ未満であり、結晶収量は７０％より大であった。図１参照。
【００８７】
（実施例５）
塩誘導結晶化によって製造されたｈＧＨ結晶の溶解プロフィール。  実施例１〜４の結
晶化溶液のインキュベーション後に、結晶をペレット化し、残る上澄みを除去した。ピペ
ッティングまたはボルテックスによって、０．２００ｍｌ溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ７．２）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌおよび０．０２％（ｖ／
ｖ）ＮａＮ３）に結晶ペレットを再懸濁し、次に、３７℃で約１５分間平衡させた。ペレ
ット再懸濁後のタンパク質濃度は、約２ｍｇ／ｍｌであった。次に、サンプルを１０，０
００  ｘ  ｇで２分間遠心分離し、上澄みを完全に除去して、２８０ｎｍにおいて、ＲＰ
−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＵＶ−ＶＩＳによってタンパク質濃度を測定した。
結晶ペレットを、溶解緩衝液０．２００ｍｌにさらに再懸濁し、該方法を、検出しうるタ
ンパク質が上澄み中に測定されなくなるまで繰り返した。この方法は連続的溶解と呼ばれ
る。
【００８８】
図２は、上記実施例１〜４において、一価（ＮａまたはＮＨ４）または二価（Ｃａ）の
塩を使用して製造した種々のｈＧＨ結晶の溶解挙動を、時間（分）の関数として示す。ｈ
ＧＨ溶解を、蓄積率として測定し、ＡＵＣ値またはＵＶ−ＶＩＳ  ｍｇ／ｍｌ測定値から
導いた。結果は、ｈＧＨの二価カルシウム結晶が、ｈＧＨの一価ナトリウムまたはアンモ
ニウム結晶より有意に遅い速度で溶解することを示す。データは、３９０ｍＭ  Ｎａ−シ
トレートを添加して製造したｈＧＨ結晶が、６０分後に完全に溶解されていることを示す
。さらに、６００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４または８６０ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４の添加によ
って製造したｈＧＨ結晶は、それぞれ６０分後または７５分後に完全に溶解されている。
一方、８５ｍＭ  Ｃａ−アセテートおよび硫酸プロタミンを添加して製造したｈＧＨ結晶
は、３９０分後に完全に溶解されている（下記の表１参照）。
【００８９】
（表１．溶解緩衝液中のｈＧＨの塩についての、２８０ｎｍで測定した連続的溶解試験
）
【００９０】
【表１−１】
2010174036.tif 000002
【００９１】
【表１−２】
2010174036.tif 000003
（実施例６）
酢酸カルシウムおよび２％ＰＥＧ−６０００を使用するｈＧＨの結晶化。  実施例１に
記載のように、商業的に入手可能なｈＧＨを、精製し、そして／または透析し、そして濃
縮した。脱イオン水を濃縮ｈＧＨ溶液に添加して、最終タンパク質濃度１５ｍｇ／ｍｌを
得た。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ８．６）を添加して、最終濃度１００ｍＭとした。
この溶液に２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００を添加した。最終濃度８５ｍＭ  Ｃａ−アセ
テートが得られるようにＣａ−アセテート（１Ｍ）をその溶液に添加することによって、
ｈＧＨの結晶を生長させた。次に、溶液を２５℃で１６時間インキュベーションした。針
状結晶を得、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さ約２５〜約７５μｍであり
、結晶収量は８５％より大であった。
【００９２】
（実施例７）
酢酸ナトリウムおよび６％ＰＥＧ−６０００を使用するｈＧＨの結晶化。  実施例１に
記載のように、商業的に入手可能なｈＧＨを、精製し、そして／または透析し、そして濃
縮した。脱イオン水を濃縮ｈＧＨ溶液に添加して、最終タンパク質濃度１５ｍｇ／ｍｌを
得た。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ８．６）を添加して、最終濃度１００ｍＭとした。
この溶液に６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００を添加した。最終濃度５００ｍＭ  Ｎａ−ア
セテートが得られるように酢酸ナトリウム（Ｎａ−アセテート）（２Ｍ）をその溶液に添
加することによって、ｈＧＨの結晶を生長させた。次に、溶液を２５℃で１６時間インキ
ュベーションした。針状結晶を得、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さ約２
５〜約７５μｍであり、結晶収量は８５％より大であった。
【００９３】
（実施例８）
塩化カルシウムおよび６％ＰＥＧ−６０００を使用するｈＧＨの結晶化。  実施例１に
記載のように、商業的に入手可能なｈＧＨを、精製し、そして／または透析し、そして濃
縮した。脱イオン水を濃縮ｈＧＨ溶液に添加して、最終タンパク質濃度１５ｍｇ／ｍｌを
得た。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ８．６）を添加して、最終濃度１００ｍＭとした。
この溶液に６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００を添加した。最終濃度８５ｍＭ  ＣａＣｌ２
が得られるようにＣａＣｌ２（１Ｍ）をその溶液に添加することによって、ｈＧＨの結晶
を生長させた。次に、溶液を２５℃で１６時間インキュベーションした。針状結晶を得、
光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さ約１００μｍより大であり、結晶収量は
９０％より大であった。
【００９４】
（実施例９）
酢酸カルシウム、６％ＰＥＧ−６０００および硫酸プロタミンを使用するｈＧＨの結晶
化。  実施例１に記載のように、商業的に入手可能なｈＧＨを、精製し、そして／または
透析し、そして濃縮した。脱イオン水を濃縮ｈＧＨ溶液に添加して、最終タンパク質濃度
１５ｍｇ／ｍｌを得た。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ８．６）を添加して、最終濃度１
００ｍＭとした。この溶液に、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）および６％ＰＥＧ−６０
００（ｖ／ｖ）を添加した。最終濃度８５ｍＭ  Ｃａ−アセテートが得られるようにＣａ
−アセテート（１Ｍ）をその溶液に添加することによって、ｈＧＨの結晶を生長させた。
次に、溶液を３７℃で１６時間インキュベーションした。針状結晶を得、光学顕微鏡で画
像化した。得られた結晶は、長さ２５μｍ未満であり、結晶収量は７０％より大であった
。図３参照。
【００９５】
（実施例１０）
酢酸カルシウムおよび６％  ＰＥＧ−ＭＭＥ−５０００を使用するｈＧＨの結晶化。  
実施例１に記載のように、商業的に入手可能なｈＧＨを、精製し、そして／または透析し
、そして濃縮した。脱イオン水を濃縮ｈＧＨ溶液に添加して、最終タンパク質濃度１５ｍ
ｇ／ｍｌを得た。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ８．６）を添加して、最終濃度１００ｍ
Ｍとした。この溶液に、６％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコールモノメチルエーテル−５
０００（ＰＥＧ−ＭＭＥ−５０００）を添加した。最終濃度１２５ｍＭ  Ｃａ−アセテー
トが得られるようにＣａ−アセテート（１Ｍ）をその溶液に添加することによって、ｈＧ
Ｈの結晶を生長させた。次に、溶液を２５℃で１６時間インキュベーションした。針状結
晶を得、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶は、長さ５０μｍ未満であり、結晶収量
は９０％より大であった。
【００９６】
（実施例１１）
ポリエチレングリコールを使用して製造したｈＧＨ結晶の溶解プロフィール。  実施例
６〜１０で製造した結晶化溶液のインキュベーション後に、結晶をペレット化し、残る上
澄みを除去した。ピペッティングまたはボルテックスによって、溶解緩衝液（実施例５参
照）０．２ｍｌに結晶ペレットを再懸濁し、次に、３７℃で約１５分間平衡させた。次に
、サンプルを１０，０００  ｘ  ｇで２分間遠心分離し、上澄みを除去して、２８０ｎｍ
において、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＵＶ−ＶＩＳによってタンパク質濃
度を測定した。結晶ペレットを、溶解緩衝液にさらに再懸濁し、該方法を、検出しうるタ
ンパク質が上澄み中に測定されなくなるまで繰り返した。
【００９７】
図４および表２は、２％  ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ  Ｃａ−アセテート、６％ＰＥ
Ｇ−６０００／５００ｍＭ  Ｎａ−アセテート、６％ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ  Ｃａ
Ｃｌ２、６％ＰＥＧ−６０００／８５ｍＭ  Ｃａ−アセテート／プロタミンおよび６％Ｐ
ＥＧ−ＭＭＥ−５０００／１２５ｍＭ  Ｃａ−アセテートを使用して製造したｈＧＨ結晶
の溶解挙動を、時間（分）の関数として示す。ｈＧＨ溶解を、蓄積率として測定し、ＡＵ
Ｃ値またはＵＶ−ＶＩＳ  ｍｇ／ｍｌ測定値から導いた。結果は、６％ＰＥＧ−６０００
／８５ｍＭ  Ｃａ−アセテート／プロタミンを添加して製造したｈＧＨ結晶が、最も遅く
溶解し、４９５分後に完全に溶解したことを示している。他の結晶は、２％ＰＥＧ−６０
００／８５ｍＭ  Ｃａ−アセテート結晶については３００分で溶解し、他のｈＧＨ結晶に
ついてはそれより短い時間で溶解した。
【００９８】
（表２．溶解緩衝液中のＰＥＧおよびｈＧＨの塩についての、２８０ｎｍで測定した連
続的溶解試験）
【００９９】
【表２−１】
2010174036.tif 000004
【０１００】
【表２−２】
2010174036.tif 000005
（実施例１２）
ｈＧＨ結晶の溶解特性における硫酸プロタミンの作用。  図５は、先に存在するカルシ
ウムｈＧＨ結晶溶液にある量の硫酸プロタミンを添加した後に、３７℃で１時間にわたっ
て溶解緩衝液中でインキュベーションした後に溶解した、ｈＧＨ結晶（８５ｍＭ酢酸カル
シウム、２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００および１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８
．６））の量を示す。ｈＧＨ／プロタミン（ｍｇ：ｍｇ）の比率を図５に示す。グラフは
、プロタミンがｈＧＨ結晶の溶解に有意に作用することを示す。
【０１０１】
（実施例１３）
グルコースオキシダーゼの結晶化および複合体化。  グルコースオキシダーゼ（ｐＩ４
．６）は、ポリカチオンおよびポリアニオンの両方に結合することができる。グルコース
オキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を、フィルターに通して水に入れ、１５ｍｇ／ｍｌに濃縮し
た。次に、酵素（１０ｍｌ）を、ｐＨ５．０における０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中に
１８％  ＰＥＧ−６０００、３２％イソプロパノールを含有する結晶化試薬と混合した（
１：１）。混合した後、溶液を４℃にし、１００ｒｐｍで攪拌しながら２４時間にわたっ
て結晶化を進ませた。
【０１０２】
グルコースオキシダーゼ結晶を、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって収集す
る。次に、これらの結晶を１０％ＰＥＧ−６０００および１６％イソプロパノールに再懸
濁させて、懸濁液中のタンパク質濃度を１５ｍｇ／ｍｌとする。次に、結晶を４ｘ１ｍｌ
量および１００μｌにする。グリシン（ｐＨ２．５）、アセテート（ｐＨ４．６）、ＭＥ
Ｓ（ｐＨ６．５）またはＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）の１Ｍ緩衝剤保存溶液を、４つの量の
１つに添加する。結晶が溶解していないことを確認するために、上澄み中のタンパク質の
濃度をＡ２８０ｎｍにおいて測定する。タンパク質の結晶度のどのような減少も、顕微鏡
で測定する。必要であれば、ＰＥＧまたはイソプロパノールの濃度を増加させて、結晶度
を維持する。
【０１０３】
ｐＨ２．５、４．６、６．５および７．５の結晶懸濁液に、ポリアニオン、例えばポリ
アスパルテートまたはポリグルタメートを添加する。各ｐＨについて、下記のタンパク質
／ポリアニオン（ｗ／ｗ）比率を試験する：０．１：１、１：１、５：１および１０：１
。次に、タンパク質／ポリアニオンの溶液を、４℃で一晩平衡させる。次に、サンプルを
１００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次に、上澄みを除去する。得られたペレットを、溶
解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）１０ｍｌに３７℃で再懸濁する。ポリアニ
オンを添加せずに、タンパク質結晶１ｍｌを取り、上澄みを除去し、溶解緩衝液（１０ｍ
Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）１０ｍｌにペレットを３７℃で再懸濁することによって、対
照サンプルを調製する。複合体および非複合体化タンパク質の両方を、新しい溶解緩衝液
に４時間ごとに再懸濁する。複合体化および非複合体化タンパク質のタンパク質濃度を、
完全な溶解が得られるまでの時間にわたって測定する。
【０１０４】
（実施例１４）
ポリアルギニンを使用するラスブリカーゼの結晶化および複合体化。  ５％エタノール
および１５％ＰＥＧ−６０００を使用して、最終タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌにおいて
ｐＨ８．５で、ラスブリカーゼ（ビオチーム）を結晶化した。次に、結晶を２０００ｒｐ
ｍで５分間にわたって遠心分離して、可溶性タンパク質を取り、次に、新しい母液に再懸
濁する。得られた結晶を光学顕微鏡で画像化した（図６参照）。
【０１０５】
５ｍｇ／ｍｌの結晶の懸濁液１ｍｌに、ポリアルギニンを、タンパク質／ポリマー比率
（ｗ／ｗ）１：０、０．０５：１、１：１、５：１で添加し、６時間にわたって平衡させ
る。次に、サンプルを遠心分離して上澄みを除去し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１
０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液に３７℃で溶解させる。次に、ＵＶ−ＶＩＳまたはＲＰ  ＨＰＬ
Ｃによって完全溶解時間を測定する。その比率を超えると溶解が生じないタンパク質／ポ
リマー比率の飽和点も測定しうる。
【０１０６】
５ｍｇ／ｍｌの結晶の懸濁液１ｍｌに、ポリアルギニンを、タンパク質／ポリマー比率
（ｗ／ｗ）４：１で添加し、６時間にわたって平衡させる。次に、サンプルを遠心分離し
て上澄みを除去し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８
．５）に３７℃で溶解させる。次に、ＵＶ−ＶＩＳまたはＲＰ  ＨＰＬＣによって完全溶
解時間を測定した。
【０１０７】
（実施例１５）
ポリリシンを使用するラスブリカーゼの結晶化および複合体化。  ５％エタノールおよ
び１５％  ＰＥＧ−６０００を使用して、最終タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌにおいてｐ
Ｈ８．５で、ラスブリカーゼ（ビオチーム）を結晶化した。次に、結晶を２０００ｒｐｍ
で５分間にわたって遠心分離して、可溶性タンパク質を取り、次に、新しい母液に再懸濁
する。
【０１０８】
５ｍｇ／ｍｌの結晶の懸濁液１ｍｌに、ポリリシンを、タンパク質／ポリマー比率（ｗ
／ｗ）１：０、０．０５：１、１：１、５：１で添加し、６時間にわたって平衡させる。
次に、サンプルを遠心分離して上澄みを除去し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍ
Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液に３７℃で溶解させる。次に、ＵＶ−ＶＩＳまたはＲＰ  ＨＰＬＣに
よって完全溶解時間を測定する。その比率を超えると溶解が生じないタンパク質／ポリマ
ー比率の飽和点も測定しうる。
【０１０９】
（実施例１６）
ポリアスパルテートおよびポリグルタメートを使用するリタキシマブの結晶化および複
合体化。  リタキシマブ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、該抗体１ｍｌと、０．２Ｍ  酢酸カルシ
ウム、０．１Ｍ  イミダゾール（ｐＨ８．０）、１０％  ＰＥＧ−８０００を含有する溶
液１ｍｌとの混合によって結晶化した。混合物を、血液学／化学ミキサー（モデル３４６
、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって室温で２２５ｒｐｍでタンブルした。
室温で２４時間後に、針状クラスターを有するリタキシマブ結晶が形成された。
【０１１０】
５ｍｇ／ｍｌの結晶の懸濁液０．５ｍｌに、ポリグルタメートを、タンパク質／ポリマ
ー比率（ｗ／ｗ）１：０、０．０５：１、１：１、５：１で添加し、６時間にわたって平
衡させる。次に、サンプルを遠心分離し、上澄みを除去する。次に、結晶複合体を、１５
０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液に３７℃で溶解させる。次に、Ｕ
Ｖ−ＶＩＳまたはＲＰ  ＨＰＬＣによって完全溶解時間を測定する。その比率を超えると
溶解が生じないタンパク質／ポリマー比率の飽和点も測定しうる。他のポリアニオンを使
用して類似調製物を形成しうる。
【０１１１】
（実施例１７）
ヒスチジン、トレハロースおよびポリソルベートを使用するトラスツズマブの結晶化お
よび複合体化。  緩衝溶液（０．４９５ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、０．３２ｍ
ｇ／ｍｌ  Ｌ−ヒスチジン、２０ｍｇ／ｍｌ  トレハロース、０．０９ｍｇ／ｍｌ  ポリ
ソルベート２０）中の１０ｍｌのトラスツズマブ（２２ｍｇ／ｍｌ）を、１０ｍｌの結晶
化緩衝液（２５％ＰＥＧ−４００、１０％ポリプロピレングリコール、０．１Ｍ  Ｔｒｉ
ｓ（ｐＨ８．５）および５％ＰＥＧ−８０００）と混合し、室温で一晩インキュベーショ
ンした。混合物を、血液学ミキサーでタンブルし、プロピレングリコール１ｍｌをさらに
補足した。トラスツズマブ結晶を翌日に得た。
【０１１２】
５ｍｇ／ｍｌの結晶の懸濁液０．５ｍｌに、ポリグルタメートを、タンパク質／ポリマ
ー比率（ｗ／ｗ）１：０、０．０５：１、１：１、５：１で添加し、６時間にわたって平
衡させる。次に、サンプルを遠心分離し、上澄みを除去する。次に、結晶複合体を、１５
０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液に３７℃で溶解させる。次に、Ｕ
Ｖ−ＶＩＳまたはＲＰ  ＨＰＬＣによって完全溶解時間を測定する。その比率を超えると
溶解が生じないタンパク質／ポリマー比率の飽和点も測定しうる。
【０１１３】
（実施例１８）
イオンポリマーを使用するラスブリカーゼの結晶化および複合体化。  ５％エタノール
および１５％ＰＥＧ−６０００を使用して、最終タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌで、ｐＨ
８．５においてラスブリカーゼ（ビオチーム）を結晶化した。次に、結晶を２０００ｒｐ
ｍで５分間にわたって遠心分離して、可溶性タンパク質を取り、次に、新しい母液に再懸
濁した。
【０１１４】
ウリカーゼ（上記のラスブリカーゼより）を、３２ｍｇ／ｍｌ精製ウリカーゼ、１０％
ＰＥＧ−６０００および２５ｍＭグリシン（ｐＨ９．０）を含有するバッチ１ｍｌ中で結
晶化した。４℃で４８時間インキュベーションした後に、１５％ＰＥＧ−６０００、１０
％エタノールおよび２５ｍＭグリシン（ｐＨ９．０）を含有する修飾母液を使用して、結
晶を洗浄した。結晶吸収を２８０ｎｍで測定し、結晶の濃度は３８．８ｍｇ／ｍｌであっ
た。次に、結晶を、各２０μｌの５つの量に分け、各量は、ラスブリカーゼ結晶の総重量
０．７８ｍｇ／試験管を含有していた。対照試験管（非複合（ｂａｒｅ）ラスブリカーゼ
結晶）に母液１０μｌを添加した。残りの各試験管に、０．２ｍｇ（２０ｍｇ／ｍｌ溶液
１０μｌ）の下記複合体化成分の１つを添加した：ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポ
リリシンまたはプロタミン。次に、各試験管を４℃で一晩インキュベーションした。
【０１１５】
種々のイオンポリマーと複合体化させたラスブリカーゼの溶解挙動を試験するために、
下記の試験をデザインした。上記の各試験管中の結晶を、下記の順序で、ウリカーゼ溶解
緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５））で洗浄した：１）
溶解緩衝液５０μｌを各試験管に添加し；２）再懸濁した結晶を室温で２分間インキュベ
ーションし：３）次に、試験管を７０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離し；４）
上澄みを除去し、分析用に取り；５）結晶が完全に溶解するまで、工程１〜４を繰り返し
た。各洗浄サイクルからの上澄みを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析し（約６．７分にお
いて溶離した１３０ｋＤのタンパク質ピーク）、各群の累積溶解％を表３に示し、図７に
グラフで示す。
【０１１６】
（表３．イオンポリマーと複合体化させたラスブリカーゼの累積溶解％）
【０１１７】
【表３−１】
2010174036.tif 000006
【０１１８】
【表３−２】
2010174036.tif 000007
各サンプルは、非複合体化または複合ラスブリカーゼ結晶を完全に溶解させるために異
なる洗浄サイクル数を必要とした。非処理対照または非複合体化結晶は、１０回以内の洗
浄で溶解した。ラスブリカーゼのポリアルギニン、ポリオルニチンおよびプロタミン−複
合体化結晶は、複合体化結晶の完全溶解のために３０回の洗浄を必要とした。これに対し
て、ラスブリカーゼのポリリシン複合体化結晶は、複合体化結晶の完全溶解のために１５
回の洗浄を必要とした。さらに、ポリアルギニン複合体化ラスブリカーゼは、最良の溶解
プロフィールを示し、結晶が長時間にわたって極めて緩やかに放出された。ポリオルニチ
ン−複合体化ラスブリカーゼは、溶解するのにほぼ同じ洗浄回数を要するが、突然のバー
ストの後に遅い溶解が生じた。ポリリシン複合体化ラスブリカーゼは、対照非複合体化結
晶と比較して、極めて少ない向上を示し、ほとんどすぐに溶解した。
【０１１９】
（実施例１９）
蓚酸オキシダーゼの結晶化および複合体化。  酵母に極僅かに発現される蓚酸オキシダ
ーゼを、１２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次に、酵素１ｍｌの１つの部分を、ｐＨ４．２のリ
ン酸クエン酸緩衝剤１００ｍＭ中の４０％ＰＥＧ−６００を含有する結晶化試薬の２つの
部分と混合した。混合した後、結晶が１時間後に現れた。得られた結晶を光学顕微鏡で画
像化した（図８参照）。
【０１２０】
４時間後、蓚酸オキシダーゼ結晶を、２５％ＰＥＧ−６０００および１００ｍＭ  Ｔｒ
ｉｓ緩衝剤（ｐＨ８．５）で洗浄し、次に、２５％ＰＥＧ−６０００および１００ｍＭ  
Ｔｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ８．５）に再懸濁させて、２０ｍｇ／ｍｌ結晶懸濁液を得た。結晶
懸濁液の２０μｌ量を除去し、２０ｍｇ／ｍｌポリアルギニン（ＭＷ＝７．５ｋＤ）１０
μｌをそれに添加した。混合物を１７時間インキュベーションした。次に、複合体を５分
間にわたって微量遠心分離し、上澄みを除去した。得られたペレットを２００μｌの溶解
緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．２
）に再懸濁させた。
【０１２１】
（実施例２０）
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａリパーゼの結晶化および複合体化。  Ｂｕ
ｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａリパーゼをダイアフィルトラーションを行い、４
４ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中の酵素１ｍ
ｌの１つの部分を、５０％ｔ−ブタノールを含有する結晶化試薬の１つの部分と混合した
。混合した後、結晶が１時間以内に現れた。
【０１２２】
３時間後、リパーゼ結晶を、３５％ｔ−ブタノールおよび１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ８．５）で洗浄し、次に、３５％ｔ−ブタノールおよび１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ８．５）に再懸濁させて、２２ｍｇ／ｍｌ結晶懸濁液を得た。結晶懸濁液の２０μｌ量を除去し、２０ｍｇ／ｍｌポリアルギニン（ＭＷ＝７．５ｋＤ）１０μｌをそれに添加した。混合物を１７時間インキュベーションした。次に、複合体を５分間にわたって遠心分離し、上澄みを除去した。得られたペレットを２００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．２）に再懸濁させた。
【０１２３】
（実施例２１）
アミラーゼの結晶化および複合体化。  アミラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙ
ｚａｅ）を、８０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次に、酵素１ｍｌの１つの部分を、ｐＨ６．０
の３００ｍＭ酢酸カルシウム中の４２％ＰＥＧ−８０００を含有する結晶化試薬の１つの
部分と混合した。２時間後、結晶化が終了し、結晶を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）中の２５％ＰＥＧ−８０００で洗浄し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ８
．５）中の２５％ＰＥＧ−８０００に懸濁させて、４０ｍｇ／ｍｌ結晶懸濁液を得た。
【０１２４】
２時間後、４０ｍｇ／ｍｌ結晶懸濁液量１０μｌを取り、４０ｍｇ／ｍｌポリアルギニ
ン（ＭＷ＝９．５ｋＤ）１０μｌをそれに添加した。混合物を１７時間インキュベーショ
ンした。次に、複合体を５分間にわたって遠心分離し、上澄みを除去した。得られたペレ
ットを２００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．２）に再懸濁させた。
【０１２５】
（実施例２２）
トラスツズマブの結晶化および複合体化。  トラスツズマブ（抗体ＣＨＯ細胞由来）を
、水２２ｍｇ／ｍｌにおいて再形成する。次に、抗体１ｍｌの１つの部分を、５０％ＰＥ
Ｇ−４００、１０％ＰＥＧ−８０００、２０％プロピレングリコール、０．２％Ｔｗｅｅ
ｎ−８０、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．６を含有する結晶化試薬の２つの部分と混合す
る。混合物を室温で一晩インキュベーションする。トラスツズマブ結晶を翌日に得る。結
晶化が終了した後に、結晶を、結晶化緩衝液（３０％ＰＥＧ−４００、７％ＰＥＧ−８０
００、３０％プロピレングリコール、０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０、０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐ
Ｈ５．５）で洗浄する。結晶の２００μｌ量を取り、緩衝液（ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．５
）で洗浄する。
【０１２６】
２０ｍｇ／ｍｌ結晶懸濁液２０μｌに、ポリグルタミン酸（１０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌ
、ＭＷ９０ｋＤ）またはアスパラギン酸（１０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、ＭＷ９０ｋＤ）を
添加する。混合物を室温で１７時間インキュベーションする。次に、複合体を５分間にわ
たって微量遠心分離し、上澄みを除去する。得られたペレットを２００μｌの溶解緩衝液
（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．２）に再
懸濁させる。
【０１２７】
（実施例２３）
エタネルセプト（エンブレル）の結晶化および複合体化。  エンタネルセプト（エンブ
レル）（ヒト組換えＣＨＯ細胞由来）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ８．０）にお
いて脱塩し、３０ｍｇ／ｍｌに濃縮する。次に、抗体０．５ｍｌの１つの部分を、１６％
ＰＥＧ−４０００、２００ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝剤  ｐ
Ｈ８．６を含有する結晶化試薬の３つの部分と混合する。混合物を室温で一晩インキュベ
ーションする。エンタネルセプト（エンブレル）結晶を翌日に得る。結晶化が終了した後
に、結晶を、緩衝液（２０％ＰＥＧ−６０００、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．６）で洗
浄する。結晶の２００μｌ量を取り、緩衝液（２０％ＰＥＧ−６０００および１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．６）で洗浄する。
【０１２８】
３０ｍｇ／ｍｌ結晶懸濁液１３μｌに、ポリアルギニン（１０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、
ＭＷ９０ｋＤ）またはポリリシン（１０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、ＭＷ９０ｋＤ）を添加す
る。混合物を室温で１７時間インキュベーションする。次に、複合体を５分間にわたって
微量遠心分離し、上澄みを除去する。得られたペレットを２００μｌの溶解緩衝液（５０
ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．２）に再懸濁さ
せる。
【０１２９】
（実施例２４）
酢酸ナトリウムおよび６％ＰＥＧ−６０００を使用するｈＧＨの結晶化。  実施例１に
記載のように、商業的に入手可能なｈＧＨを、精製し、そして／または透析し、そして濃
縮した。脱イオン水を濃縮ｈＧＨ溶液に添加して、最終タンパク質濃度１５ｍｇ／ｍｌを
得た。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ８．６）を添加して、最終濃度１００ｍＭとした。
この溶液に、６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００を添加した。最終濃度５００ｍＭ  Ｎａ−
アセテートが得られるように酢酸ナトリウム（Ｎａ−アセテート）（２Ｍ）をその溶液に
添加することによって、ｈＧＨの結晶を生長させた。次に、溶液を２５℃で１６時間にわ
たってインキュベーションした。針状結晶を得、光学顕微鏡で画像化した。得られた結晶
は、長さ約２５〜約７５μｍであり、結晶収量は８５％より大であった。
【０１３０】
（実施例２５）
酢酸ナトリウムを使用するｈＧＨの結晶化。  この場合、可溶性組換え産生ｈＧＨ（ｒ
ｈＧＨ）の凍結バルクフィード溶液を、下記の２つの株から得た：１つはＥ．コリ（Ｎｏ
ｖａｒｔｉｓ）由来、もう１つは酵母（Ｌｕｃｋｙ  Ｇｏｌｄ）由来である。Ｅ．コリお
よび酵母保存溶液に由来するｒｈＧＨの分離分析は、その生物源に関係なく、同じ結晶化
特性および溶解特性を有するｒｈＧＨであることを示した。約３．３ｍｌの解凍ｒｈＧＨ
供給溶液（未知緩衝剤中に供給された１０〜２０ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＧＨ）を、ＢｉｏＲａ
ｄによって供給される１０ＤＧ−脱塩カラムを使用して精製した。サンプルを充填する前
に、３０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）でカラムを洗浄することによ
ってカラムを馴化した。次に、ｒｈＧＨサンプルを充填し、重力によってカラムに入れた
。最初の３ｍｌの溶離剤を捨てた後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐ
Ｈ８．０を添加した。脱塩ｒｈＧＨ４．５ｍｌを溶離し、収集した。次に、３５００ｒｐ
ｍで２０〜３０分間にわたってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ  １０，０００）を
使用して、遠心分離による濃縮を行なった。ｈＧＨの濃度は、２８０ｎｍ／０．８１３で
の吸収によって測定して３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった（１ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨ  Ａ２８
０  ＝  ０．８１３吸収単位）。最終タンパク質濃度１５ｍｇ／ｍｌを有する全溶液にお
いて、それぞれ、最終濃度１００ｍＭ、６％（ｖ／ｖ）および５００ｍＭになるように、
脱イオン水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−６０００およびＮａ−アセテー
トを添加することによって、結晶を生長させた。次に、溶液をゆっくり混合し、３３℃で
１２〜１６時間インキュベーションした。針状または棒状結晶を得、ＴＥＭで画像化した
（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。結晶の長さは、約２〜２５μｍであった。結晶を遠心分離
し、ペレット化した後に、上澄みを抽出し、結晶収量は８５％より大であった。結晶は３
３℃〜１５℃の温度においても形成しうるが、長い結晶化時間を必要とし、おそらくは収
量の減少を生じる。
【０１３１】
イオンポリマー添加剤を使用するナトリウムｈＧＨ結晶の複合体化。  一旦、結晶収量
が求められると、ナトリウムｒｈＧＨ結晶を、母液（２５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、６％ＰＥＧ−６０００、および７ｍｇ／ｍｌ硫酸プ
ロタミンまたは４．２ｍｇ／ｍｌポリアルギニン）に再懸濁して、ナトリウムｒｈＧＨ結
晶の最終濃度２１ｍｇ／ｍｌを得た。ｒｈＧＨ／硫酸プロタミンについてのタンパク質／
添加剤の比率は約３：１（ｍｇ：ｍｇ）であり、ｒｈＧＨ／ポリアルギニンについては５
：１（ｍｇ：ｍｇ）であった。これらの比率から算出されるモル比は、ｒｈＧＨ／プロタ
ミンにつては約１：１．７１５であり、ｒｈＧＨ／ポリアルギニンについては約１：０．
５８７である。上記のｒｈＧＨペレットを、適切な母液に均質に再懸濁し、２〜８℃で一
晩インキュベーションし、次に、遠心分離して、圧縮ぺレットを得た。上澄みを除去し、
同じ母液（イオンポリマー添加剤不含）にペレットを再懸濁し、４℃で保存した。
【０１３２】
２１ｍｇ／ｍｌのｒｈＧＨに再懸濁しながら、母液の添加剤濃度（ｍｇ／ｍｌ）を変化
させることによって、付加的ｒｈＧＨ／イオンポリマー添加剤の比率が得られる。例えば
、母液における硫酸プロタミンの増加した濃度（１０．５ｍｇ／ｍｌ）を使用して、再懸
濁の際のｒｈＧＨ／添加剤の比率２：１が得られる。
【０１３３】
（実施例２６）
幼若雌のカニクイザルの比較薬理学試験。  この試験の目的は、雌カニクイザルに皮下
投与した場合の、結晶組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）の生体内薬物動態プロフィー
ルを評価することであった。これらのデータは、血清中の結晶ｒｈＧＨの制御放出、およ
び結晶ｒｈＧＨ放出の関数としての体重増加のモデルを確立するために得た。
【０１３４】
（表４．霊長類試験Ｉの試験デザイン）
【０１３５】
【表４】
2010174036.tif 000008
ａ商業的に入手可能なｈＧＨ（可溶性、非結晶化形態）をＮｏｖａｒｔｉｓから入手し、
フィルターに通してＷＦＩに入れた。群１（正の対照）は各投与日に可溶性ｈＧＨを投与
された。
ｂ製造については実施例２５を参照。
ｃ全ての用量は、毎日の採血後に投与された。
【０１３６】
１２匹の幼若雌のカニクイザルを、各群に４頭の３つの群に分け、可溶性ｒｈＧＨ（群
１）、ＰＥＧおよびポリアルギニンを使用したｒｈＧＨのナトリウム結晶（群２、実施例
２５による）、またはＰＥＧおよびプロタミンを使用したｒｈＧＨのナトリウム結晶（群
３、実施例２５による）を投与した。処置の開始時に体重２〜６ｋｇ、年齢４〜７のサル
を、自動給水装置または水ボトルを備えたステンレス鋼ケージに一匹ずつ入れた。動物の
室内環境を調節し（約２１±３℃；湿度３０〜７０％；各２４時間のうち１２時間は明所
および１２時間は暗所；１時間につき１２〜２０回の換気）、１日２回サルに標準保証市
販霊長類固形試料（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｅ
Ｄｉｅｔ  ＃２０５５Ｃ）を与えた。
【０１３７】
この霊長類試験は、可溶性ｒｈＧＨ（群１）、ＰＥＧおよびポリアルギニンを使用した
ｒｈＧＨのナトリウム結晶（群２）ならびにＰＥＧおよびプロタミンを使用したｒｈＧＨ
のナトリウム結晶（群３）の投与後の、ｈＧＨおよびインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１
）の血清濃度を測定し比較するために行なわれた。上記の表５に示した時点における投与
に移行する際および投与の前に、全ての動物の体重を記録した。各動物の血液サンプル（
約１ｍｌ）を、−２１６、−１２０、０、２、４、６、８、１０、２４、４８、７２、９
６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４、２８８および３１２時
間における朝に、大腿静脈、上腕静脈または伏在静脈から採取した。血液を、血清分離試
験管に採取し、室温に３０〜４５分間置いて凝固させ、２〜８℃において３０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離した。各血清サンプルを、１００μｌ量および残りの量に分け、両方
の量を分析前に−７０±１０℃で保存した。一般に、より小さい１００μｌ量をｒｈＧＨ
測定に使用し、より大きい残りの量をＩＧＦ−１測定に使用した。必要とされる複製の容
量により、いくつかの例外があった。
【０１３８】
次に、収集した血清サンプルを、ｈＧＨ濃度について分析した（表５参照）。注：標準
値範囲を超えたｒｈＧＨ濃度については、適切な希釈を行なった。全ての数値を使用して
、霊長類ｈＧＨの個々の各動物平均バックグラウンドレベルを得た。この各動物平均値を
、その試験対象に関して各時点で測定した血清レベルから引いた。次に、各時点について
の補正値を平均して、血清中のｒｈＧＨの補正平均値を得た。次に、補正平均値の標準偏
差を使用して標準誤差を計算し、Ｎ＝４の平方根で割った。
【０１３９】
（表５．群１（毎日可溶性）、群２（ナトリウム  ｒｈＧＨ／ポリアルギニン）および
群３（ナトリウム  ｒｈＧＨ／プロタミン）についてのｒｈＧＨレベル）
【０１４０】
【表５】
2010174036.tif 000009
注：  ｒｈＧＨ値は、ベースラインを調整した動物４頭の平均値、即ちベースラインを引
いた数値である。ベースラインは、−２１６、−１２０および０時間における数値の平均
である。
【０１４１】
図９Ａは、群１、２および３に関する、時間（時）の関数としての、ベースライン調節
後の血清中ｒｈＧＨレベルを示す。
【０１４２】
（表６．表５のデータに基づく薬物動態パラメーターの概要）
【０１４３】
【表６】
2010174036.tif 000010
ａ  商業的に入手可能なｈＧＨ（可溶性、非結晶化形態）をフィルターに通してＷＦＩに
入れた。群１（正の対照）は可溶性ｈＧＨを７日間毎日投与された。
【０１４４】
上記のデータは、血清中に最大ｈＧＨが現れた時間（Ｔｍａｘ）が、ポリアルギニン複
合ナトリウム結晶ｈＧＨについては１０時間、プロタミン複合ナトリウム結晶ｈＧＨにつ
いては１０時間、可溶性ｈＧＨについては２時間であったことを示す。可溶性ｈＧＨは結
晶投与用量の１／７で輸送されたが、上記表６に示したＣｍａｘ値は、いずれかの複合体
化結晶形態で投与されたｈＧＨが、初期血清濃度上昇を有意に減少させることを示す。さ
らに、可溶性および結晶群について、Ｔ９０％値も算出した。群１（可溶性形態）のＴ９
０％は２０時間であり、群２および３（複合体化結晶形態）のＴ９０％はそれぞれ７４お
よび７７時間であった。これらの結果は、複合体化結晶形態が、可溶性形態よりかなり長
い時間にわたって、高いｈＧＨレベルを生じることを明らかに示している。
【０１４５】
ｈＧＨの血清濃度の測定に加えて、ＩＧＦ−１のレベルも時間の関数ととして測定した
。ＩＧＦ−１の産生を測定することによって、ｒｈＧＨの有効性を確かめた。下記の表７
は、群１〜３の動物についてのＩＧＦ−１濃度を示す。図９Ｂは、内因性ＩＧＦ−１レベ
ルのベースライン控除後に、複合体化結晶処方物が、毎日の可溶性投与と比較しうるＩＧ
Ｆ−１放出刺激能力を有することを示している。非ヒト霊長類におけるこれらの結果は、
本発明の処方物を使用して、好都合にもヒトにおいて同様の効果が得られることを示唆し
ている。
【０１４６】
（表７．毎日可溶性、ナトリウムｒｈＧＨ／ポリアルギニン、およびナトリウムｒｈＧ
Ｈ／プロタミンの群についてのＩＧＦ−１レベル）
【０１４７】
【表７】
2010174036.tif 000011
注：  ＩＧＦ−１値は、動物４頭のベースラインを調整した平均値、即ちベースラインを
引いた数値である。ベースラインは、−２１６、−１２０および０時間における数値の平
均である。
【０１４８】
（実施例２７）
下垂体を切除した雄ラットに、単回または毎日の皮下注射によって投与したヒト成長ホ
ルモンの薬力学試験。  この試験の目的は、下垂体を切除した雄ウィスターラットに、１
回または７日連続で毎日投与した場合の、種々のｈＧＨ処方物の有効性を比較することで
あった。試験デザインは以下の通りであった：
（表８．試験デザイン−サンプルの説明）
【０１４９】
【表８−１】
2010174036.tif 000012
【０１５０】
【表８−２】
2010174036.tif 000013
ａ  滅菌条件下にＷＦＩを使用して、全てのサンプルを調整した。賦形剤および可溶性ｈ
ＧＨサンプルを、それらの各最終容量にした後に０．２２μｍフィルターで濾過した。
【０１５１】
（表９．試験デザイン−投与）
【０１５２】
【表９−１】
2010174036.tif 000014
【０１５３】
【表９−２】
2010174036.tif 000015
体重約９０〜１００ｇ、日齢約２５〜３０の雄ウィスターラット１３８匹の到着後、制
御条件（約２３±３℃；相対湿度３０〜７０％；各２４時間のうち１２時間は明所および
１２時間は暗所；１時間につき１０〜１５回の換気）下に群で飼育し、試験中、精製水お
よび実験室用餌を適宜、摂取しうるようにした。ラットを、試験前２週間にわたって、環
境に順応させた。
【０１５４】
表９の濃度、容量および投与計画によって、１３８匹のラットにサンプルを投与した。
被験物質を、１回、または１日１回で７日連続で、単回ボーラス注射として背領域に皮下
投与した。投与の３日前まで、およびその後、必要に応じて、注射部位を剃り、印をつけ
て、注射を容易にした。３００μｌのシリンジに取り付けた３０ゲージｘ８ｍｍの針を使
用して、被験物質を投与した。シリンジに吸引する前、および投与の前に、被験物質を注
意深く逆さにして、泡立たせずに懸濁液または溶液の均質性を確実にした。
【０１５５】
−３および−２週において週２回、そして−７〜１４日において毎日、体重増加を測定
し、記録した。ラット体重は、投与時において約１００ｇ±１０％であった。誘導成長％
の結果を、図１０Ａおよび１０Ｂに示し、表１０および１１に示す。表１０において、「
高用量」は５．６ｍｇ／ｋｇ／週である。データは、ｒｈＧＨ：ポリアルギニン（群７、
実施例２５）、またはｒｈＧＨ：プロタミン（群９および１０、実施例２５）結晶の単回
注射を受けたラットの７日間の体重増加と、対照（群１、無ｈＧＨ）または可溶性ｈＧＨ
サンプル（群４および５）の注射を毎日受けたラットの同じ７日間の体重増加との比較を
示す。群１、偽下垂体切除ラットは、７日間にわたって正常な成長を示す。さらに、７日
間で１回の注射によってｒｈＧＨ：ポリアルギニンを投与されたラット（群７）は、可溶
性ｈＧＨ（群５）を７日間毎日投与されたラットより高い％の誘導成長を示した。毎日の
可溶性注射と、ポリアルギニン複合体化結晶ｒｈＧＨの単回注射との、観測差異は、統計
的に立証できない。これらの結果は、本発明のｈＧＨ結晶および処方物が、１週間にわた
って毎日投与された可溶性ｒｈＧＨと同じ有効性であることを示す。
【０１５６】
（表１０．下垂体切除ラットにおける８日目の誘導体重増加）
【０１５７】
【表１０】
2010174036.tif 000016
（表１１．下垂体切除ラットにおける毎日の誘導体重増加（ｇ））
【０１５８】
【表１１−１】
2010174036.tif 000017
【０１５９】
【表１１−２】
2010174036.tif 000018
（実施例２８）
酢酸ナトリウムおよび硫酸プロタミンを使用するｈＧＨの結晶化。  この場合、可溶性
組換え産生ｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の凍結バルクフィード溶液を、下記の２つの株から得た：
１つはＥ．コリ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）由来、もう１つは酵母（Ｌｕｃｋｙ  Ｇｏｌｄ）由
来である。Ｅ．コリおよび酵母保存溶液に由来するｒｈＧＨの分離分析は、その生物源に
関係なく、同じ結晶化特性および溶解特性を有するｒｈＧＨであることを示した。約３．
３ｍｌ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）の解凍ｒｈＧＨ供給溶液を、ＢｉｏＲａｄによって供給
されている１０ＤＧ−脱塩カラムを使用して精製した。サンプルを充填する前に、３０ｍ
ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）でカラムを洗浄することによってカラム
を馴化した。次に、ｒｈＧＨサンプルを充填し、重力によってカラムに入れた。最初の３
ｍｌの溶離剤を捨てた後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を
添加した。脱塩ｒｈＧＨ４．５ｍｌを溶離し、収集した。次に、３５００ｒｐｍで２０〜
３０分間にわたってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ  １０，０００）を使用して、
遠心分離による濃縮を行なった。ｈＧＨの濃度は、２８０ｎｍ／０．８１３での吸収によ
って測定して３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった（１ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨ  Ａ２８０  ＝  ０
．８１３吸収単位）。最終タンパク質濃度１５ｍｇ／ｍｌを有する全溶液において、それ
ぞれ、最終濃度１００ｍＭ、６％（ｖ／ｖ）、２ｍｇ／ｍｌおよび５００ｍＭになるよう
に、脱イオン水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−４０００、硫酸プロタミン
およびＮａ−アセテートを添加することによって、結晶を生長させた。次に、溶液をゆっ
くり混合し、３３℃で１２〜１６時間インキュベーションした。長さ約２〜２５μｍの針
状結晶を得た。結晶を遠心分離し、ペレット化した後に、上澄みを抽出し、結晶収量は９
０％より大であった。
【０１６０】
（実施例２９）
酢酸ナトリウムおよびポリアルギニンＨＣｌを使用するｈＧＨの結晶化。  この場合、
可溶性組換え産生ｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の凍結バルクフィード溶液を、下記の２つの株から
得た：１つはＥ．コリ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）由来、もう１つは酵母（Ｌｕｃｋｙ  Ｇｏｌ
ｄ）由来である。Ｅ．コリおよび酵母保存溶液に由来するｒｈＧＨの分離分析は、その生
物源に関係なく、同じ結晶化特性および溶解特性を有するｒｈＧＨであることを示した。
約３．３ｍｌ（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）の解凍ｒｈＧＨ供給溶液を、ＢｉｏＲａｄによっ
て供給される１０ＤＧ−脱塩カラムを使用して精製した。サンプルを充填する前に、３０
ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）でカラムを洗浄することによってカラ
ムを馴化した。次に、ｒｈＧＨサンプルを充填し、重力によってカラムに入れた。最初の
３ｍｌの溶離剤を捨てた後、別の５．０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０
を添加した。脱塩ｒｈＧＨ４．５ｍｌを溶離し、収集した。次に、３５００ｒｐｍで２０
〜３０分間にわたってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ  １０，０００）を使用して
、遠心分離による濃縮を行なった。ｈＧＨの濃度は、２８０ｎｍ／０．８１３での吸収に
よって測定して３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった（１ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨ  Ａ２８０  ＝  
０．８１３吸収単位）。最終タンパク質濃度１５ｍｇ／ｍｌを有する全溶液において、そ
れぞれ、最終濃度１００ｍＭ、２％（ｖ／ｖ）、２ｍｇ／ｍｌおよび５００ｍＭになるよ
うに、脱イオン水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、ＰＥＧ−４０００、ポリアルギニ
ンＨＣｌおよびＮａ−アセテートを添加することによって、結晶を生長させた。次に、溶
液をゆっくり混合し、３３℃で１２〜１６時間インキュベーションした。長さ約２〜２５
μｍの針状結晶を得た。結晶を遠心分離し、ペレット化した後に、上澄みを抽出し、結晶
収量は９０％より大であった。
【０１６１】
明確な理解のために、図表および実施例によって本発明を幾分詳しく説明したが、記載
した実施形態を含む本明細書の開示の真意または範囲を逸脱せずに、本発明に変更または
改変を加えうることは、本発明の開示に照らして当業者に極めて明らかである。
【図１】
2010174036.tif 000019
【図２】
2010174036.tif 000020
【図３】
2010174036.tif 000021
【図４】
2010174036.tif 000022
【図５】
2010174036.tif 000023
【図６】
2010174036.tif 000024
【図７】
2010174036.tif 000025
【図８】
2010174036.tif 000026
【図９Ａ】
2010174036.tif 000027
【図９Ｂ】
2010174036.tif 000028
【図１０Ａ】
2010174036.tif 000029
【図１０Ｂ】
2010174036.tif 000030