(57)【要約】【課題】本発明は、組換えタンパク質を植物細胞内のゴルジ装置へ局在させる方法を提供する。【解決手段】上記課題は、ａ）Ｔｏｘ１ドメイン及びシグナルペプチドを含む組換えタンパク質を作製する工程；及びｂ）前記組換えタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を植物細胞に導入する工程；を含む方法により解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質を植物細胞内のゴルジ装置へ局在させる方法であって、以下の：
ａ）Ｔｏｘ１ドメイン及びシグナルペプチドを含む組換えタンパク質を作製する工程；及び
ｂ）前記組換えタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を植物細胞に導入する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２】
Ｔｏｘ１ドメインが、以下の：
a）配列番号２２、２４、２６、２８、３０及び３６〜２６６で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
ｂ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０及び３６〜２６６で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｔｏｘ１活性を有するタンパク質；
をコードする塩基配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｔｏｘ１ドメインが、配列番号２１若しくは２３、配列番号２５若しくは２７又は配列番号２９若しくは３１を含む塩基配列でコードされる、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物由来のＴｏｘ１ドメインを用いて、任意のタンパク質をこのドメインとの融合体の形で植物細胞内のゴルジ装置へ局在させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴルジ装置は、細胞内から細胞外へとタンパク質等を輸送する経路である分泌系において、真核生物に共通な機能として、タンパク質の仕分け、タンパク質に付加された糖鎖の改変、スフィンゴ脂質等の糖脂質の構造変換を行っている細胞小器官である。また、植物においてゴルジ装置は、細胞外多糖であるヘミセルロースやペクチンの合成も行っている。ゴルジ装置で行われるタンパク質の仕分けや修飾などには、ゴルジ装置に局在するタンパク質がその機能を担っている。
【０００３】
近年、ヒト有用タンパク質など有用物質の生産が動物培養細胞などを用いて行われている。ヒトの医療用タンパク質などの機能性タンパク質はゴルジ装置を経由して糖鎖付加等の修飾を受けるものが多く、また、糖鎖付加のメカニズムは生物間でかなり異なる。すなわち、動物の有用タンパク質を植物や酵母等の異種生物で合成させても、ゴルジ装置における糖鎖修飾が動物のものと異なるため、合成されたポリペプチドに機能発現に必要な糖鎖が付加されず、結果的に目的とする機能や安定性が付与されたタンパク質を発現できない場合、不要な糖鎖が付加されるために所望の機能が発現されない場合、又は目的とするものではない性質が付与されてしまう場合がある（非特許文献１）。
【０００４】
一方で、植物を用いた有用物質生産は、そのコストが動物、微生物に比べて安価であること、植物は移動せず収穫も容易であること、そして動物細胞に感染する病原菌やウイルスに関する問題を考慮する必要がない等の多くの利点があり、注目されている。また、近年の再生医療技術の発達により、今後、ヒト組織の再生に用いられるサイトカイン／増殖因子や抗体等のヒトや動物由来の有用タンパク質の安価な供給が求められるであろう。さらに、近年、生理活性が注目されているスフィンゴ脂質に関しては、動物では多様な構造を有するものが報告されているが、植物ではグルコシルセラミドが唯一の成分である。そこで、動物のゴルジ装置に存在するスフィンゴ脂質修飾酵素を植物ゴルジ装置に局在させることにより、植物において動物型のスフィンゴ脂質の合成が可能となる。実際に、動物型スフィンゴ脂質のコア部分を植物に作らせるモデル実験も行われている（特許文献１）。
【０００５】
このようにゴルジ装置におけるタンパク質や脂質修飾の機構は動物・植物間で極めて異なり、植物を用いてヒト有用タンパク質や生理活性を有する脂質を合成させるには、ゴルジ装置におけるタンパク質や脂質修飾の機能を動物型に大きく改変する必要がある。植物ゴルジ装置の機能を動物型に改変させるためには、植物のゴルジ装置に、動物型の修飾を行わせる動物由来の多数の酵素タンパク質群を局在させる必要がある。たとえば、ゴルジ装置に、動物型の糖鎖修飾に関連する酵素タンパク質を局在させることにより、植物を用いて動物型糖鎖を有するタンパク質を合成させる。このようにして植物ゴルジ装置の人工的改変が達成できれば、植物を用いた機能性ヒト有用タンパク質や生理活性物質生産が可能となり、今後の植物バイオ産業へ幅広く応用することができる。また、ヒト有用タンパク質の生産に加え、新規の構造を有する細胞外多糖類を合成することも、植物ゴルジ装置の機能を改変することで可能になる。
【０００６】
糖鎖構造の形成には、１種類の糖鎖間の結合に少なくとも１種類の酵素が必要である。従って、植物に動物型の糖鎖を合成させるためには、複雑な動物型糖鎖に対応した、多数の酵素をゴルジ装置へ導入しなければならない。そのためには、所望の複数の酵素タンパク質をゴルジ装置に局在させる技術が必要である。ゴルジ装置へ異種タンパク質を局在させるには、通常、膜貫通領域（膜貫通タンパク質）を用いた方法が用いられる（非特許文献２）。しかし、膜貫通タンパク質を用いてゴルジ装置へ異種タンパク質を局在させる方法により多数のタンパク質を局在させようとしても、局在機構の飽和等によりゴルジ装置にタンパク質を効率良く局在させることはできない。従って、植物型のゴルジ装置を動物型の複雑な機能に改変するには、種々のタンパク質を効率よくゴルジ装置に局在させる必要があり、そのためのタンパク質局在機構は、複数存在するのが望ましい。また、発現産物の活性を解析する場合、細胞を破砕したり、精製後に解析したりするが、膜貫通タンパク質の場合は界面活性剤を用いて膜からの可溶化を行うステップが必要であり、そのためには通常多数の界面活性剤の中から適したものを選択しなければならず、かなり煩雑である（特許文献２）。一方、膜貫通領域を用いずに多数のタンパク質を局在させた場合は、上記のような可溶化ステップがなくても解析や精製ができるし、しかも手順も容易である。しかしながら、膜貫通領域を用いずにタンパク質をゴルジ装置へ局在させる方法についての報告は未だない。
【０００７】
植物の細胞壁や、分泌系のオルガネラに存在するタンパク質には、その中のプロリン残基がヒドロキシプロリンに変換され、またその一部が糖鎖付加を受けているものが多数存在する（非特許文献３）。この際のプロリン残基のヒドロキシプロリンへの変換に関わるのが、プロリン水酸化酵素（Ｐ４Ｈ）である。この酵素はその構造から１型と２型に大別される（非特許文献３）。このうち２型の酵素タンパク質は、Ｎ−末端領域中に存在する小胞体への移行に関わるシグナルペプチド、次いで活性ドメイン、そしてＣ末端に存在するＴｏｘ１ドメインという領域からなる。
【０００８】
Ｔｏｘ１ドメインは、バクテリアや線虫の一部のタンパク質にみられるＳｈｋＴドメインと類似の配列を持ち、４１のアミノ酸残基からなり、その中に６個のシステイン残基が存在している（非特許文献４）。この２型のＰ４Ｈの細胞内局在やＴｏｘ１ドメインの機能については、未だに報告されていない（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２８８２１０号公報
【特許文献２】特許４１８６０９８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Doran, P.M. Current Opinion in Biotechnology 11, 199-204 (2000)
【非特許文献２】Czlapinski and Bertozzi, Curr. Opi. Chem. Biol., 10, 645-651 (2006)
【非特許文献３】森口亮ら  月刊バイオインダストリー、２００９年１月号
【非特許文献４】Tiainen et al., J. Biol. Chem., 280, 1142-1148 (2005)
【非特許文献５】Sheen J et al., Plant J. 8:777-784 (1995)
【非特許文献６】Shimizu M et al., Plant J. 42:877-789 (2005)
【非特許文献７】Hood EE et al., J Bacteriol. 168:1291-1301 (1986)
【非特許文献８】Yuasa, K., et al.,  Plant J. 41:81-94. (2005)
【非特許文献９】Marion et al. Plant J., 56. 169-179 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、植物由来のＴｏｘ１ドメインを用いて、任意のタンパク質をこのドメインとの融合体の形で植物細胞内のゴルジ装置へ局在させる方法を提供することを目的とする。
上記のように、膜貫通領域を用いずに、植物細胞の分泌系において、タンパク質をゴルジ装置に局在させる技術の開発が望まれていた。現在、ゴルジ装置へ異種タンパク質を局在させるためには、膜タンパク質の膜貫通ドメインを用いた方法が用いられているが、ゴルジ装置の機能を複雑に改変させるためには、複数のタンパク質をゴルジ装置に局在させる必要がある。そこで、導入物間での予想外の相互作用や、局在ドメインの過剰発現による目的外部位への発現物の輸送を避けるために、複数の異なる局在機構を用いて各種タンパク質をゴルジ装置に局在させることが望ましい。しかしながら、現在までにゴルジ装置へとタンパク質を局在させる為に用いられている機構は、膜貫通ドメインを用いる一種類の機構だけである。そのため、植物ゴルジ装置の機能改良により有用物質生産等を行う場合には、従来とは異なる機構によるゴルジ装置局在法を開発しなければならないという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、植物のプロリン水酸化酵素タンパク質のＣ末端に存在する、Ｔｏｘ１ドメインを異種タンパク質に連結することにより、従来の膜貫通ドメインを用いた手法とは異なる機構でタンパク質をゴルジ装置へと局在させることにより、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  組換えタンパク質を植物細胞内のゴルジ装置へ局在させる方法であって、以下の：
ａ）Ｔｏｘ１ドメイン及びシグナルペプチドを含む組換えタンパク質を作製する工程；及び
ｂ）前記組換えタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を植物細胞に導入する工程；
を含む、前記方法、
（２）  Ｔｏｘ１ドメインが、以下の：
a）配列番号２２、２４、２６、２８、３０及び３６〜２６６で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
ｂ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０及び３６〜２６６で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｔｏｘ１活性を有するタンパク質；
をコードする塩基配列を含む、（１）記載の方法、
（３）  Ｔｏｘ１ドメインが、配列番号２１若しくは２３、配列番号２５若しくは２７又は配列番号２９若しくは３１を含む塩基配列でコードされる、（１）記載の方法、
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法は、従来の膜貫通ドメインとは異なる機構でタンパク質をゴルジ装置に局在させることができることから、膜貫通ドメインという単一の機構を用いることにより生じる問題を回避できる。
【００１５】
本発明に関するＴｏｘ１ドメインは、希望するタンパク質をゴルジ装置へと局在させることに活用できる。当該Ｔｏｘ１ドメインは、例えば、動物型糖鎖修飾に関わる糖転移酵素群をゴルジ装置に局在させて、植物において本来合成されない動物型糖鎖を有するタンパク質を、植物で合成させることも可能であり、植物の分泌系の改良に用いることができる。これにより、植物を用いたヒト有用物質などの生産に応用ができる技術が提供されるため、好ましい。すなわち、本発明は、植物機能の改良という幅広い分野に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａは、タバコの２型プロリン水酸化酵素であるＮｔＰ４Ｈ２．１とＮｔＰ４Ｈ２．２のアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、タバコ（ＮｔＰ４Ｈ２．１、ＮｔＰ４Ｈ２．２）、イネ（ＡＫ０５９７５９、ＡＫ１０３７３９）、シロイヌナズナ（ＡＴ３Ｇ０６３００、ＡＴ３Ｇ２８４８０）における２型プロリン水酸化酵素ホモログのＴｏｘ１ドメインのアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図２】図２は、コンストラクションに用いたベクターｐＭＡＴ３２８の構造を示す図である。
【図３】図３は、ＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰを発現するタバコＢＹ−２細胞を用いたｓｐＧＦＰ−２型Ｐ４Ｈの局在解析を示す図である。
【図４】図４は、シロイヌナズナ子葉を用いたｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１とＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰの一過性発現の解析を示す図である。
【図５】図５は、ＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰを発現するタバコＢＹ−２細胞を用いた、イネ（Ａ）及びシロイヌナズナ（Ｂ）由来のＴｏｘ１ドメインを連結したｓｐＧＦＰの一過性発現の解析を示す図である。
【図６】図６は、スクロース密度勾配遠心を用いたタバコＢＹ−２細胞内在性のＮｔＰ４Ｈ２．２の局在解析を示す図である。
【図７】図７は、タバコＢＹ−２細胞から単離したミクロソームを用いたトリプシン処理による、内在性ＮｔＰ４Ｈ２．２の存在形態の解析を示す図である。
【図８】図８は、ｍＳＰＯ及びｍＳＰＯ−Ｔｏｘ１融合タンパク質を発現するＢＹ−２の細胞（Ｃ）及び培地（Ｍ）におけるｍＳＰＯ及びｍＳＰＯ−Ｔｏｘ１融合タンパク質の解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の概要
本発明は、Ｔｏｘ１ドメインを含む組換えタンパク質を植物細胞内のゴルジ装置へ局在させる方法に関する。
【００１８】
本発明者は、Ｔｏｘ１ドメインの解析を行い、その結果、Ｔｏｘ１ドメインがタンパク質をゴルジ装置へと局在させる、「局在ドメイン」であることを見出した。本発明は、Ｔｏｘ１ドメインという新規局在ドメインを利用して、異種タンパク質をゴルジ装置へ局在させる方法に関する。当該方法は、Ｔｏｘ１ドメインを含む組換えタンパク質を、対象植物において発現させることにより達成される。
【００１９】
本発明は、具体的には、ａ）Ｔｏｘ１ドメイン及びシグナルペプチドを含む組換えタンパク質を作製する工程；及びｂ）前記組換えタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を植物細胞に導入する工程を含む方法に関する。以下に、本発明の方法を具体的に説明する。
【００２０】
本発明のＴｏｘ１ドメイン
植物の細胞壁や、分泌系のオルガネラに存在するタンパク質には、その中のプロリン残基がヒドロキシプロリンに変換され、またその一部が糖鎖付加を受けているものが多数存在する（非特許文献３）。この際のプロリン残基のヒドロキシプロリンへの変換に関わるのが、プロリン水酸化酵素（Ｐ４Ｈ）であり、その構造から１型と２型に大別される（非特許文献３）。このうち２型の酵素タンパク質はＮ−末端領域に小胞体への移行に関わるシグナルペプチド、次いで活性ドメイン、そしてＣ末端にＴｏｘ１ドメインという領域からなる。
【００２１】
Ｔｏｘ１ドメインは、バクテリアや線虫の一部のタンパク質にみられるＳｈｋＴドメインと類似の配列を持ち、４１のアミノ酸残基からなり、その中に６個のシステイン残基が存在する（非特許文献４）。本発明におけるタンパク質のゴルジ装置への局在化には、当該Ｔｏｘ１ドメインを目的タンパク質のＣ末端に連結し、それを植物細胞中で発現させることによって達成される。したがって、遺伝子組み換え技術を用いて、目的タンパク質とＴｏｘ１ドメインの融合タンパク質を設計する必要がある。
【００２２】
本発明に用いるＴｏｘ１ドメインが含まれるプロリン水酸化酵素タンパク質はいずれの植物由来でもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡのほか、合成によって得ることもできる。好ましいプロリン水酸化酵素タンパク質としては、タバコ、イネ、シロイズナズナ等に由来するものがあげられるが、これらに限定されない。例えば、タバコ由来の２型プロリン水酸化酵素であるＮｔＰ４Ｈ２．１とＮｔＰ４Ｈ２．２は、これまでに本発明者らが完全長ｃＤＮＡのクローニングと配列解析を行い、そのｃＤＮＡ配列は公共データーベースであるＤＤＢＪにａｃｃｅｓｓｉｏｎＮＯ．ＡＢ４７１９２６及びＡＢ４７１９２７として登録されている。図１Ａに、ＮｔＰ４Ｈ２．１のアミノ酸配列（配列番号３４）とＮｔＰ４Ｈ２．２のアミノ酸配列（配列番号３５）の比較を示した。図１では、Ｔｏｘ１ドメインを四角で囲み、共通するアミノ酸残基に網掛けをして示している。
【００２３】
また、本発明に用いるＴｏｘ１ドメイン領域としては、以下の実施例２の表１に示すような９０種類の植物由来の２６７種類のドメイン領域（配列番号３６〜２６６）、さらに、表２に記載されるようなタバコ（アミノ酸配列：配列番号２２及び２４；塩基配列：配列番号２１及び２３）、イネ（アミノ酸配列：配列番号２６及び２８；塩基配列：配列番号２５及び２７）、シロイズナズナ（アミノ酸配列：配列番号３０及び３２；塩基配列：配列番号２９及び３１）等に由来するものがあげられるが、これらに限定されない。本発明のＴｏｘ１ドメインをコードする塩基配列としては、表４に記載の配列番号２１、２３、２５、２９及び３１のほか、配列番号３６〜２６６で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。
【００２４】
さらに、本発明のＴｏｘ１ドメイン領域を示すアミノ酸配列としては、以下の実施例２の表１に記載した様々な植物のＴｏｘ１ドメインの配列を比較することにより、コンセンサス配列である、
Ｃ［ＳＴＶ］ＤＥ［ＮＤ］［ＥＤ］［ＳＮ］Ｃ［ＥＰ］ＲＷＡ［ＡＶ］［ＬＭＡ］ＧＥＣ［ＴＡ］ＫＮＰＥＹＭ［ＶＩ］Ｇ［ＳＴ］［ＰＡＳ］［ＥＤＧ］ＬＰＧ［ＹＦ］ＣＲ［ＫＲ］ＳＣ［ＫＮ］［ＶＡ］Ｃ
というアミノ酸配列（配列番号３３）もあげられる。上記アミノ酸残基は一文字標記であり、［  ］内は取り得るいずれかのアミノ酸残基を示す。このうち、第１，８，１７，３４，３８及び４１残基目の全てのシステイン残基、第３及び２０残基目のアスパラギン酸残基、第１０残基目のトリプトファン残基、第１１残基目のアラニン残基、第１５，２６，３２残基目のグリシン残基、第１６残基目のグルタミン酸残基、第２４残基目のメチオニン残基、第３５残基目のアルギニン残基、第３７残基目のセリン残基は、今回見出したＴｏｘ１配列の中で９８％以上保存されており、非常に保存性の高い残基である。また第２１残基目のプロリン残基は８８％、第２３残基目のチロシン残基は９７％とこれらも高度に保存されており、さらに、第２７番目の残基は水酸基を持つ小さな側鎖からなるセリンとスレオニンの両残基の何れかを持つものが９２％、第３６番目の残基は塩基性側鎖からなるリジンとアルギニンの両残基の何れかを持つもので９８％、第４０番目の残基は小さな疎水性側鎖からなるアラニンとバリンの両残基の何れかを持つもので９０％と、これらの部位についても特定の性質のアミノ酸残基から構成されている。なお、第２９残基目が欠失しているもの、この残基の後ろにプロリン残基の挿入を持つもの、第３３残基目が欠失しているもの等もある。従って、本発明のＴｏｘ１ドメインを示すアミノ酸配列には上記コンセンサス配列（配列番号３３）を含むアミノ酸配列も含まれる。
【００２５】
さらに、本発明のＴｏｘ１ドメインを示すアミノ酸配列には、配列番号２２、２４、２６、２８、３０及び３６〜２６６で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列も含まれる。
【００２６】
具体的には、配列番号２２、２４、２６、２８、３０及び３６〜２６６に示すアミノ酸配列のうち1個又は数個（好ましくは５、４、３、２又は１個）のアミノ酸残基が欠失するか、他のアミノ酸残基で置換されるか、他のアミノ酸残基が付加されるか、又はこれらを組合わせたアミノ酸配列をいう。
【００２７】
上記したように、配列番号２２、２４、２６、２８、３０及び３６〜２６６で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。なお、タンパク質のアミノ酸配列に、そのＴｏｘ１の活性を保持しつつ１又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
【００２８】
また、本発明のＴｏｘ１ドメインは、配列番号２２、２４、２６、２８、３０及び３６〜２６６で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｔｏｘ１活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。本発明のＴｏｘ１活性とは、本発明のＴｏｘ１ドメインを目的タンパク質のＣ末端に連結して植物細胞中で発現させると、当該目的タンパク質をゴルジ装置へ局在化することができるような活性をいう。上記本発明に関するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列には、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列も含まれる。
【００２９】
本発明の組換えタンパク質の作製
本発明で用いる組換えタンパク質には、Ｔｏｘ１ドメイン及びシグナルペプチドが含まれる。
【００３０】
ゴルジ装置は分泌系に存在するために、合成されたＴｏｘ１融合タンパク質は小胞体から始まる細胞内輸送系である分泌系に移行する必要がある。そのため小胞体への移行に関わるシグナルペプチド領域が、タンパク質のＮ末端に必要である。それゆえ、シグナルペプチドがないタンパク質をゴルジ装置へと移行させる場合には、遺伝子組換え技術を用いてＮ末端領域にシグナルペプチドを連結させる必要がある。この場合、本発明の方法で用いる植物細胞において効率よく機能するシグナルぺプチドであれば、植物由来のシグナルペプチドに限定されるものではなく、動物や微生物由来のシグナルペプチドであってもよい。動物や微生物等の植物以外のタンパク質を用いる場合、当該動物や微生物に固有のシグナルペプチドが存在している場合があるが、そのシグナルペプチドが植物で機能する場合とともに、当該シグナルペプチドが本発明で用いる植物細胞で実際に機能しない場合もある。従って、このような場合は予め、当該シグナルペプチドが本発明で用いる植物細胞中で機能するかを確認するのが望ましい。もしくは、植物において効率良く機能することがよく知られたシグナルペプチドで置き換えることも有効である。シグナルペプチドとしては、例えば、サツマイモスポラミン由来のシグナルペプチドを用いることができる。サツマイモスポラミンはゴルジ装置を経由して液胞に運ばれるタンパク質であるが、シグナルペプチドの後ろに存在するプロ領域中の、液胞輸送シグナルとして働く配列中に存在する第２８番目のイソロイシンがグリシンに変換（Ｉ２８Ｇ）すると、液胞には運ばれずに分泌されることを特徴とする。さらに、本来サツマイモスポラミンの第３６番目のプロリンにＯ−結合型糖鎖が付加されるが、このプロリンがグルタミンに変換（Ｐ３６Ｑ）されていると、糖鎖付加が起こらない（非特許文献６）ことも特徴とする。
【００３１】
本発明の組換えタンパク質にはプロモーターが含まれてもよい。この場合、用いるプロモーターとしては、植物中で遺伝子を発現することができるプロモーターであれば、Ｔｏｘ１ドメインを融合させてゴルジ装置に局在させるタンパク質に応じて適宜選択できる。例えば、植物で遺伝子を恒常的に発現させるのに用いられるカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓプロモーターがあげられるが、これに限定されない。器官特異的プロモーター又は誘導型プロモーターを用いてもよい。また、Ｔｏｘ１ドメイン融合タンパク質の過剰発現により、植物の生育に影響が生じる場合は、器官特異的もしくは誘導型プロモーターを用いるのが望ましい。その他、本発明の組換えタンパク質には導入遺伝子のタンパク質翻訳効率を高めるために、エンハンサー等を含めることができる。適当なエンハンサーの例としては、タバコモザイクウィルス由来の翻訳エンハンサーがあげられるが、これに限定されない。
【００３２】
本発明で用いるシグナルペプチド、プロモーター及びエンハンサー等をコードするポリヌクレオチドは、植物由来であっても動物由来であってもよく、合成により作製されてもよい。また用いるシグナルペプチド、プロモーター及びエンハンサー等は、本発明で用いる形質導入や発現方法に応じて適宜選択できる。
【００３３】
組換えに用いるタンパク質とＴｏｘ１ドメインの連結については、本発明のＴｏｘ１ドメインを目的とするタンパク質のＣ末端で連結する。その連結部において、両者間にスペーサーを挿入してもよく、又は、数アミノ酸残基からなるスペーサーを挿入するのが望ましい。このような手法は当業者には公知であるが、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質を作製する際に用いられる方法と同等な方法があげられる。挿入するスペーサーは、作製するコンストラクトに応じて、適宜選択することができる。スペーサーの例としては、免疫グロブリンのヒンジ領域や、グリシンが３〜６残基繋がったもの等が上げられるがこれらに限定されない。
【００３４】
組換えタンパク質の作製は、例えば、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))』等に従い、当業者であれば容易に行うことができる。
【００３５】
本発明の組換えタンパク質をコードする核酸の植物への導入
本発明の方法は、植物中で組換え遺伝子を発現させることにより、Ｔｏｘ１融合タンパク質をゴルジ装置へ局在させることを特徴とする。
【００３６】
本発明の組換えタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸とは、上記『本発明の組換えタンパク質の作製』の項で記載した本発明の組換えタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を意味する。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。さらに上記本発明の組換えタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは修飾されたヌクレオチドを含有するものも含まれる。
【００３７】
本発明の組換えタンパク質をコードする核酸の植物への導入方法としては、当該核酸を適当な発現ベクターに挿入したものを植物細胞に導入する方法等があげられる。
当該核酸は公知の手段を用いて発現ベクターに挿入することができる。具体的には、本発明の組換えタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を有するプラスミドを制限酵素を用いて消化する。用いる制限酵素としては、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ等があげられるが、これらに限定されない。なお、末端をＴ４ポリメラーゼ処理することにより平滑化してもよい。消化後の塩基配列断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。この塩基配列断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込むことにより、発現用ベクターを得ることができる。本発明で用いる植物細胞用の発現ベクターとしては、アグロバクテリウムを介した形質転換の際に用いられるバイナリーベクター等があげられるが、宿主細胞において複製可能かつ生存可能である限り他のいかなるベクターをも用いることができ、宿主との関係において適宜選択することができる。この発現ベクターまたは目的とする組換えタンパク質の発現カセットを宿主である植物細胞に導入して形質転換体を作製し、目的とする組換えタンパク質を発現させて、すなわち、ゴルジ体に局在させることができる。
【００３８】
本発明の方法で用いられる核酸を植物細胞に導入する方法としては、例えば、アグロバクテリウム法を利用する方法、エレクトロポレーションによる方法、パーテイクルガンを用いる方法等があげられるがこれらに限定されない。植物への遺伝子導入に一般に良く使われるアグロバクテリウム法は、適当なアグロバクテリウム株に本発明の方法に用いる核酸を導入した後、所望の植物細胞に感染させることにより当該核酸を植物細胞に導入する方法である。具体的には、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡという領域が、植物の遺伝子に挿入されることになるため、このＴ−ＤＮＡ領域を構築する必要がある。アグリバクテリウム法を用いた遺伝子導入に関しては、現在、様々なメーカーより、植物遺伝子発現用のベクターが販売されており、当該ベクターを利用することもできる。
【００３９】
本発明の方法で用いられる植物については、Ｔｏｘ１ドメインが種々の植物において局在ドメインとして用いることができるため、特に限定されず、いかなる植物にも適用することができる。本発明の方法で用いられる植物細胞についても特に限定されない。好ましくは、タバコＢＹ−２細胞等である。タバコＢＹ−２細胞とはタバコの胚軸由来の培養細胞であり、増殖が速く、アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入が容易で、また切片をつくらなくても蛍光タンパク質の細胞内局在を解析できるなど、多くの利点がある。
【００４０】
組換えタンパク質の局在を検出する方法
上記のように、本発明の方法により、組換えタンパク質を植物細胞内のゴルジ装置へ局在させたことは、以下の方法によって確認することができる。まず、組換えタンパク質を作製する場合に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）や赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）等の蛍光タンパク質も組換えておき、本発明の方法により作製した核酸が導入された細胞を顕微鏡で観察する方法があげられる。例えば、１型プロリン水酸化酵素であるＮｔＰ４Ｈ１．１（以前にはＮｔＰＨと標記）と単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）との融合タンパク質を用いることができる。ＮｔＰ４Ｈ１．１は、小胞体とゴルジ装置の間を行き来し、主にシスゴルジ領域に局在している膜タンパク質であり、Ｎ末端領域に膜貫通ドメインがあり（非特許文献８）、当該融合タンパク質は主にシスゴルジ領域に局在し、ドット状の蛍光として観察することができる。
【００４１】
また、細胞から分離したミクロソーム画分をスクロース密度勾配により分離し、その密度勾配中での分布を検討することにより、局在する細胞内器官を同定することができる。
さらに、Ｔｏｘ１ドメインに対する抗体を作製する方法もあげられる。具体的には、本発明の方法により作製した核酸が導入された細胞の膜画分抽出物に当該抗体を接触させて、免疫学的方法により確認する方法である。当該免疫学的方法としては、多くの手法が一般に普及しており、とくに特定の方法に限定されるものではなく、イムノブロッティング法、競合法、イムノメトリック法、ネフェロメトリー（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｙ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）又は  ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等のサンドイッチ法などがあげられる。抗体の作製方法としては、公知のいかなる方法もあげられる。
【００４２】
そして、本発明の方法により作製された組換えタンパク質が植物細胞内のゴルジ装置の内外のどちらに局在しているのかを確認することもできる。具体的には、トリプシン処理による存在形態の解析により、膜で囲まれた細胞小器官や小胞の外側・内側のどちらにタンパク質が存在しているのかを解析することができる。タンパク質の大部分の領域が膜小胞の内側に存在している場合は、プロテアーゼで処理しても膜で守られているため、膜小胞の内側に存在する領域は切断を受けない。したがって、タンパク質全体としてはほとんど切断を受けないことになる。この際、界面活性剤を加えて膜構造を破壊することにより、タンパク質全体がプロテアーゼによる切断を受けるようになる。一方、タンパク質の大部分の領域が外側（細胞質側）に突き出ているタンパク質は、界面活性剤で処理をしなくても、プロテアーゼによってタンパク質の大部分の領域が切断をうける。本発明では、膜の内側に存在するタンパク質の指標及び細胞質側に大部分が突出しているタンパク質の指標を用いて、これらとの比較を行うことにより、本発明の方法により作製された組換えタンパク質が植物細胞内のゴルジ装置の内側に局在しているのかを確認することができる。
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕
Ｔｏｘ１ドメインを連結した分泌型ＧＦＰのタバコＢＹ−２細胞における局在解析
本実施例では、Ｔｏｘ１ドメインを連結した分泌型ＧＦＰのタバコＢＹ−２細胞における局在解析を行った。具体的には、タバコＢＹ−２細胞を用い、Ｔｏｘ１ドメインを連結した分泌型ＧＦＰの局在解析を行った。
【００４４】
まず、ＢＹ−２細胞の培養には改良ＬＳ培地を用い、３００ｍｌ三角フラスコに９５ｍｌの培地を入れ、２６℃、暗所で１３０ｒｐｍの旋回培養を行った。培養７日後に細胞は定常期に達するため、７日毎に細胞１．５ｍｌを新しい培地に継代することにより、細胞の維持を行った。
【００４５】
タバコ由来の２型プロリン水酸化酵素であるＮｔＰ４Ｈ２．１とＮｔＰ４Ｈ２．２の完全長ｃＤＮＡ配列中に存在するシグナルペプチド領域を除いたＮｔＰ４Ｈ２．１とＮｔＰ４Ｈ２．２及びＮｔＰ４Ｈ２．１とＮｔＰ４Ｈ２．２のＴｏｘ１ドメインをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅してそれぞれを分泌型ＧＦＰのＣ末端に連結させ、これをＲＦＰと融合させたシスゴルジマーカーを発現するタバコ培養細胞ＢＹ−２への導入に用いた。
【００４６】
シグナルペプチドのコード領域を除いたＮｔＰ４Ｈ２．１のＰＣＲによる増幅には、ＮｔＰ４Ｈ２．１の完全長ｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを用いて以下のプライマー
６−ｏＭＯＲ１：ＣＧＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＴＣ
（配列番号１）及び
６−ｏＭＯＲ３：ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣ
（配列番号２）を用いた。また、ＮｔＰ４Ｈ２．１のＴｏｘ１ドメインをコードする領域の増幅には、ＮｔＰ４Ｈ２．１完全長ｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを用いて以下のプライマー
６−ｏＭＯＲ２：ＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＧＴＧＡＴＣＧＴＧＡＴＧ
（配列番号３）及び６−ｏＭＯＲ３を（配列番号２）を用いた。一方、シグナルペプチドのコード領域を除いたＮｔＰ４Ｈ２．２の増幅には、ＮｔＰ４Ｈ２．２の完全長ｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを用いて以下のプライマー
６−ｏＭＯＲ４：ＴＡＣＧＧＴＡＣＣＣＧＴＴＣＧＡＣＴＴＣＴＣＴＴＣＧＡＴＴＣＴＣ（配列番号４）及び
６−ｏＭＯＲ６：ＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣＣＴＴＧＣＡＧ
（配列番号５）を用いた。また、ＮｔＰ４Ｈ２．２のＴｏｘ１ドメインをコードする領域の増幅には、ＮｔＰ４Ｈ２．２の完全長ｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを用いて以下のプライマー
６−ｏＭＯＲ５：ＴＡＣＧＧＴＡＣＣＡＧＴＧＴＴＴＧＴＡＡＧＧＡＴＣＡＧＡＡＴＣ
（配列番号６）及び６−ｏＭＯＲ６を（配列番号５）を用いた。上記プライマー等を用いて、９４℃  ２分；１サイクルの後、
９４℃  ３０秒；
５５℃  ３０秒；
７２℃  １分；３５サイクル
７２℃  ７分；１サイクル
の条件でＰＣＲ反応を行った。なお、ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  (ＴａＫａＲａ)を用い、メーカーのマニュアルに従って反応液の調製を行った。また、サーマルサイクラーにはＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００（ＢｉｏＲａｄ）を用いた。
【００４７】
得られた４種類のＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで切断した後に、プラスミドｐＭＡＴ３２８（図２）のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ。ｐＭＡＴ３２８ベクターにＴ−ＤＮＡのボーダー領域を含ませ、３５Ｓプロモーターの制御化でＧＦＰ融合タンパク質を発現させるコンストラクトを挿入した。当該ＧＦＰは本来のＧＦＰの改良型であり、蛍光を強めるために６５番目のセリンをスレオニンに置換した（非特許文献５）。ｐＭＡＴ３２８ベクター内のＧＦＰのＮ末端に、第２８番目のイソロイシンがグリシンに変換（Ｉ２８Ｇ）し、第３６番目のＯ−結合型糖鎖が付加されるプロリンがグルタミンに変換（Ｐ３６Ｑ）するという変異を導入したサツマイモスポラミンのシグナルペプチドを含む、１−４１番目のアミノ酸を連結した。このサツマイモスポラミン［１−４１（Ｉ２８Ｇ，Ｐ３６Ｑ）］＋ＧＦＰを、分泌型ＧＦＰ（ｓｐＧＦＰ）とする。
またｐＭＡＴ３２８のｓｐＧＦＰのＣ末端には小胞体残留シグナルであるＫＤＥＬモチーフが連結されており、このシグナルの両端に、ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩの制限酵素部位がある配列が挿入されている。本実験において、ｐＭＡＴ３２８のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩサイトにＰＣＲ産物を組み込んだため、ＫＤＥＬモチーフをコードする領域は失われ、結果として翻訳されない。このようにして作製した計４種のｓｐＧＦＰ−２型Ｐ４Ｈコンストラクトを、ｓｐＧＦＰ−ＮｔＰ４Ｈ２．１、ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．１）、ｓｐＧＦＰ−ＮｔＰ４Ｈ２．２、ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．２）とする。
【００４８】
次に、これらプラスミドＤＮＡにハイグロマイシン耐性遺伝子の導入を行った。形質転換に用いるＢＹ−２細胞由来の形質転換株にはシスゴルジのマーカータンパク質を発現させており、そのコンストラクトの導入のためにカナマイシン耐性遺伝子が組み込まれているため、別の抗生物質で形質転換体の選抜を行う必要があるからである。
【００４９】
続いてハイグロマイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡを、エッペンドルフ社製エレクトロポレーション装置エレクトロポレーター２５１０を用い、１８００Ｖの設定電圧でアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株（非特許文献７）に電気パルスを加えてエレクトロポレーションを行った。その後、アグロバクテリウムをＳＯＣ液体培地で縣濁して３０℃で３時間保温した後に、２０ｍｇ／ｌカナマイシンを、及び２０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含むＬＢプレートに塗布し、２８℃で２日間培養して形質転換コロニーを得た。
【００５０】
アグロバクテリウムの感染に用いるタバコ細胞は、１型プロリン水酸化酵素であるＮｔＰ４Ｈ１．１（以前にはＮｔＰＨと標記）と単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）との融合タンパク質を発現するコンストラクトであるＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰ発現形質転換ＢＹ−２株を用いた。
【００５１】
タバコ培養細胞へのアグロバクテリウムの感染は、以下のように行った。まず、感染に用いるアグロバクテリウムのコロニーをＹＥＢ液体培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養を行ってタバコ培養細胞への感染に用いた。継代３日目のＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰ発現ＢＹ−２細胞４ｍｌを滅菌シャーレにとり、ここにアグロバクテリウム培養液を１００μｌ加え、２６℃、暗所で４８時間共存培養を行った。
遺伝子導入がされた細胞の選抜には、抗生物質であるハイグロマイシンを５０ｍｇ／ｌ、カナマイシンを２００ｍｇ／ｌ、及びアグロバクテリウム除菌用抗生物質であるセフォタキシムを５００ｍｇ／ｌ含む改良ＬＳ固形培地を用いて行った。培養２〜３週間後に、生じた細胞のコロニーを同じ組成の新しい選抜培地に移し、さらに２〜３週間培養を行った。ある程度コロニーが大きくなったら、コロニーを掻きとってハイグロマイシンとセフォタキシムを含む改良ＬＳ液体培地に移し、２８℃、暗所条件下で振とう培養（１３０ｒｐｍ）を行った。細胞が増殖した後に、細胞の一部をサンプリングし、ＧＦＰ及びＲＦＰ蛍光の観察に用いた。ＧＦＰ及びＲＦＰ蛍光の観察には、ＩＸ２−ＤＳＵ装置（ＩＸ２−ＤＳＵ）を組み込んだＩＸ８１倒立型電動顕微鏡（ＩＸ８１：オリンパス）を用い、ＣｏｏｌＳＮＡＰ  ＨＱ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて画像の取り込みを行い、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて画像解析を行った。
【００５２】
その結果、ＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰは主にシスゴルジ領域に局在し、ドット状の蛍光シグナルとして観察された。このＲＦＰ蛍光との比較により、導入したｓｐＧＦＰ−ＮｔＰ４Ｈ２．１、ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．１）、ｓｐＧＦＰ−ＮｔＰ４Ｈ２．２、ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．２）の局在を解析したところ、図３に示すように、これら全てのコンストラクト由来の蛍光は主にドット状のシグナルとして観察された。ＲＦＰ蛍光とＧＦＰ蛍光はよく一致し、両者の画像を重ね合わせると共局在をしめす黄色のシグナルが観察された。この結果より、これらのＧＦＰ融合タンパク質はシスゴルジ領域に局在していることが示された。図３中、ｍｅｒｇｅとは、ＧＦＰ蛍光とＲＦＰ蛍光を重ね合わせた画像であり、両者の蛍光が一致する箇所は黄色で示す。
【００５３】
〔実施例２〕
Ｔｏｘ１ドメインを連結した分泌型ＧＦＰのシロイヌナズナにおける局在解析
本実施例では、ＮｔＰ４Ｈ２．１及びＮｔＰ４Ｈ２．２のＴｏｘ１ドメインを分泌型ＧＦＰのＣ末端に連結させたコンストラクトであるｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．１）とｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．２）、及びシスゴルジマーカーとして利用するＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰコンストラクトを有するアグロバクテリウムをシロイヌナズナの芽生えに感染させ、ＧＦＰ及びＲＦＰの一過性蛍光の観察を行った。
【００５４】
ＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰコンストラクトのアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株への導入には、上記〔実施例１〕と同様に行った。
シロイヌナズナへのアグロバクテリウムの感染は（非特許文献９）を参考にして以下のように行った。
【００５５】
シロイヌナズナ（ｅｃｏｔｙｐｅ  Ｃｏｌｏｍｂｉａ）種子を２％スクロースを含むＭＳ培地に播種し、４℃・暗所で３日間処理した後に、２２℃・２４時間日長で３日間培養し、アグロバクテリウムの感染に用いた。
【００５６】
用いたアグロバクテリウムは、ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．１）、ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．２）及びＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰの各プラスミドを有する３種類のアグロバクテリウムである。各アグロバクテリウムのコロニーを、２×ＹＴ培地に植菌して２８℃で２４時間振とう培養を行った。培養液を遠心することによってアグロバクテリウムを集菌し、Ｏ．Ｄ６００＝２．０となるように縣濁バッファー［５ｍＭ  Ｍｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ５．６、５％スクロース、２００ｕｍアセトシリンゴン］で縣濁した。
【００５７】
ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．１）を有するアグロバクテリウムとＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰを有するアグロバクテリウムを等量ずつ混合し、感染液Ａを調製した。また、ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．２）を有するアグロバクテリウムとＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰを有するアグロバクテリウムを等量ずつ混合し、感染液Ｂを調製した。それぞれの感染液にＭＳ固形培地上で発芽させたシロイヌナズナ芽生えを浸し、−０．０６ｋＰａ、１分間の減圧を３ないし４回繰り返した。シロイヌナズナ芽生えに付着した余分なアグロバクテリウム液をペーパータオルで吸い取った後に、芽生えを０．５ｍｍメッシュのナイロンフィルターを敷いたＭＳ固形培地に移し、２２℃、２４時間日長で３〜４日間培養を行った後に、子葉を切り取り、ＧＦＰ及びＲＦＰ蛍光の解析を実施例１と同様に行った。
【００５８】
感染液Ａ及び感染液Ｂを感染させたシロイヌナズナの子葉を観察した結果、いずれもｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１融合タンパク質の蛍光はドット状のシグナルとして観察され、ＢＹ−２細胞を用いた解析と同様に、シスゴルジマーカーであるＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰとの局在はよく一致した（図４）。この結果より、Ｔｏｘ１ドメインはタバコだけでなく、他の植物でもゴルジ装置への局在ドメインとして機能を発揮したことが示された。なお、図４のｍｅｒｇｅとは、ＧＦＰ蛍光とＲＦＰ蛍光を重ね合わせた画像であり、両者の蛍光が一致する箇所は黄色で示し、また、ＧＦＰおよびＲＦＰ蛍光が共に観察された細胞を、矢印で示した。
【００５９】
〔実施例３〕
イネ及びシロイヌナズナ由来のＴｏｘ１ドメインを連結した分泌型ＧＦＰの、タバコ培養細胞における局在解析
本実施例では、他の植物のＴｏｘ１ドメインがゴルジ装置への局在ドメインとして機能するかどうかを調べるために、イネ及びシロイヌナズナの２型プロリン水酸化酵素ホモログ由来のＴｏｘ１ドメインをｓｐＧＦＰに連結し、これらをタバコＢＹ−２細胞で一過的に発現させ、それらの局在を解析した。
【００６０】
ＤＤＢＪ公開データーベースにおいて、タバコ２型プロリン水酸化酵素の配列を元に植物におけるＴｏｘ１ドメインの検索を、ｂｌａｓｔ  及びｔｂｌａｓｔｎのアルゴリズムを用いて行った。その結果、シロイヌナズナ、イネ、タバコ、トマト、スイカ、コムギ、グレープフルーツ等の被子植物のみならず、スギ、マツ、イチョウ等の裸子植物、イヌカタヒバやＡｄｉａｎｔｕｍ属のシダ、コケ植物であるヒメツリガネゴケ、単細胞藻類であるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  やＯｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ  ＣＣＥ９９０１等の合計９０種の植物において、合計９０種の植物において、Ｔｏｘ１ドメインを有するタンパク質が存在することが見出された（表１）。
【００６１】
【表１−１】
2010213583.tif 000002
【００６２】
【表１−２】
2010213583.tif 000003
【００６３】
【表１−３】
2010213583.tif 000004
【００６４】
【表１−４】
2010213583.tif 000005
【００６５】
【表１−５】
2010213583.tif 000006
【００６６】
【表１−６】
2010213583.tif 000007
【００６７】
すなわち、Ｔｏｘ１ドメインがあるタンパク質は、広く植物界に存在していることが明らかになった。なお、このホモロジー検索の結果において、動物由来の配列は、相同性が植物由来のものよりかなり低いことが明らかになった。
【００６８】
これらの植物のＴｏｘ１ドメインの配列を比較すると、コンセンサス配列として、Ｃ［ＳＴＶ］ＤＥ［ＮＤ］［ＥＤ］［ＳＮ］Ｃ［ＥＰ］ＲＷＡ［ＡＶ］［ＬＭＡ］ＧＥＣ［ＴＡ］ＫＮＰＥＹＭ［ＶＩ］Ｇ［ＳＴ］［ＰＡＳ］［ＥＤＧ］ＬＰＧ［ＹＦ］ＣＲ［ＫＲ］ＳＣ［ＫＮ］［ＶＡ］Ｃ（一文字標記、［  ］内は何れかのアミノ酸）という配列（配列番号３３）が得られた。このうち、第１，８，１７，３４，３８及び４１残基目の全てのシステイン残基、第３及び２０残基目のアスパラギン酸残基、第１０残基目のトリプトファン残基、第１１残基目のアラニン残基、第１５，２６，３２残基目のグリシン残基、第１６残基目のグルタミン酸残基、第２４残基目のメチオニン残基、第３５残基目のアルギニン残基、第３７残基目のセリン残基は、今回見出したＴｏｘ１配列の中で９８％以上保存されており、非常に保存性の高い残基であることが見出された。また第２１残基目のプロリン残基は８８％、第２３残基目のチロシン残基は９７％とこれらも高度に保存されており、さらに、第２７番目の残基は水酸基を持つ小さな側鎖からなるセリンとスレオニンの両残基の何れかを持つものが９２％、第３６番目の残基は塩基性側鎖からなるリジンとアルギニンの両残基の何れかを持つもので９８％、第４０番目の残基は小さな疎水性側鎖からなるアラニンとバリンの両残基の何れかを持つもので９０％と、これらの部位についても特定の性質のアミノ酸残基から構成されていることが明らかとなった。これら以外の残基については、ある程度アミノ酸の側鎖の性質に傾向が認められる残基もあるが、全体として保存性は高くない。なお、第２９残基目が欠失しているもの、この残基の後ろにプロリン残基の挿入を持つもの、第３３残基目が欠失しているもの等も認められた。
【００６９】
そこで、イネ及びシロイヌナズナにおける２型プロリン水酸化酵素ホモログ、それぞれ、イネのＡＫ０５９７５９及びＡＫ１０３７３９、シロイヌナズナのＡｔ３ｇ０６３００及びＡｔ３ｇ２８４８０のＴｏｘ１領域をタバコ以外の植物由来ものの代表として用い（表２）、これらＴｏｘ１ドメインの細胞内でのタンパク質局在に果たす役割について、上記と同様の方法で解析を進めることとした。
【００７０】
【表２】
2010213583.tif 000008
【００７１】
そこで、これらのドメインに対するｃＤＮＡの塩基配列番号から、Ｔｏｘ１ドメインをコードする領域に対応し、目的のドメインのコード領域の５’側と３’側にそれぞれＫｐｎＩとＥｃｏＲＩの制限酵素認識部位を有するプライマーを作製し、イネｃＤＮＡライブラリー及びシロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーを基にしてＰＣＲを行い、各Ｔｏｘ１ドメインをコードするＤＮＡの増幅を行った。ＡＫ０５９７５９のＴｏｘ１ドメインをコードする配列の増幅にはプライマー
４４５−ｏＭＯＲ１：ＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＧＣＣＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＧＡＡ
（配列番号７）及び
４４５−ｏＭＯＲ２：ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＡＧＣＡＴＣＧＣＡＡＡＣ
（配列番号８）を用いた。
ＡＫ１０３７３９のＴｏｘ１ドメインをコードする配列の増幅にはプライマー
４４５−ｏＭＯＲ３：ＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＣＡＡＴＴＧＣＡＣＴＧＡＣＧＡＣ
（配列番号９）及び
４４５−ｏＭＯＲ４：ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＡＴＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＣ
（配列番号１０）を用いた。
ＡＴ３Ｇ０６３００のＴｏｘ１ドメインをコードする配列の増幅にはプライマー
４４５−ｏＭＯＲ５：ＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＣＴＧＴＡＣＴＧＡＣＧＴＡ
（配列番号１１）及び
４４５−ｏＭＯＲ６：ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＡＣＡＧＣＴ
（配列番号１２）を用いた。
ＡＴ３Ｇ２８４８０のＴｏｘ１ドメインをコードする配列の増幅にはプライマー
４４５−ｏＭＯＲ７：ＣＧＧＧＴＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＧＴＡＴＧＧＡＣＧＡＧ
（配列番号１３）及び
４４５−ｏＭＯＲ８：ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧ（配列番号１４）を用いた。上記プライマー等を用いて、９４℃  ２分；１サイクルの後、
９４℃  ３０秒；
５５℃  ３０秒；
７２℃  １５秒；３５サイクル
７２℃  ２分；１サイクル
の条件でＰＣＲ反応を行った。なお、ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、メーカーのマニュアルに従って反応液の調整を行った。また、サーマルサイクラーにはＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００を用いた。
【００７２】
得られたＰＣＲ産物をいずれもＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断し、プラスミドｐＭＡＴ３２８のＫｐｎＩ−ＥｃｐＲＩサイトに導入した。このようにしてｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＡＫ０５９７５９）、ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＡＫ１０３７３９）、ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＡＴ３Ｇ０６３００）、ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１（ＡＴ３Ｇ２８４８０）の計４種類のプラスミドＤＮＡを作製した。作製したプラスミドＤＮＡを〔実施例１〕と同様な方法でアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株に導入した。ＢＹ−２細胞へのアグロバクテリウムの感染は、〔実施例１〕と同様な方法で行った。アグロバクテリウムとの共存培養を２６℃、暗所で４８時間行った後に、各種ＧＦＰの一過性蛍光及びＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰの蛍光の解析を〔実施例１〕と同様に行った。
【００７３】
その結果、各種ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１融合タンパク質の蛍光は、いずれもドット状の蛍光シグナルとして観察され、シスゴルジマーカーであるＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰとの局在はよく一致した（図５）。このことから、各種ｓｐＧＦＰ−Ｔｏｘ１融合タンパク質の局在部位は主にシスゴルジであり、イネ、シロイヌナズナ由来のＴｏｘ１ドメインも、タバコ由来のＴｏｘ１ドメインと同様に、ゴルジ装置への局在ドメインとして機能することが示された。よって、〔実施例２〕の結果と併せると、Ｔｏｘ１ドメインは幅広い植物で局在ドメインとして機能することが明らかになった。図５中、ｍｅｒｇｅとは、ＧＦＰ蛍光とＲＦＰ蛍光を重ね合わせた画像であり、両者の蛍光が一致する箇所は黄色で示した。
【００７４】
〔実施例４〕
タバコ内在性の２型プロリン水酸化酵素の局在解析のための特異抗体の作製
〔実施例１−３〕のＧＦＰ融合タンパク質を用いた解析の結果、Ｔｏｘ１ドメインがゴルジ装置への局在ドメインとして機能していると考えられた。そこで本実施例では。タバコＢＹ−２細胞を用い、内在性の２型プロリン水酸化酵素の局在解析や存在形態を、ＮｔＰ４Ｈ２．２特異抗体を用いて解析した。
【００７５】
ＮｔＰ４Ｈ２．２抗体については、ＮｔＰ４Ｈ２．２配列中に特異的に存在する２種類のペプチド断片ＮＳＥＡＫＫＴＱＡＫＧＤＤＷＳＤＣ（配列番号１５）及びＣＳＧＷＨＮＤＫＫＴＫＳＳＶＬＫＬ（配列番号１６）を合成して、それらを混合してＫＬＨに結合させたものを抗原としてウサギを免疫することにより、このタンパク質に対するポリクロナール抗体を作製し、抗原として用いたペプチドを固定化したカラムを用いてアフィニティー精製をしたものを用いた。
【００７６】
〔実施例５〕
細胞分画とスクロース密度勾配遠心によるＮｔＰ４Ｈ２．２の局在解析
本実施例では、顕微鏡観察法以外の方法で、ＮｔＰ４Ｈ２．２の局在部位を検討する為に、タバコ培養細胞ＢＹ−２株から分離したミクロソーム画分をスクロース密度勾配により分離し、その密度勾配中での分布を検討することにより、ＮｔＰ４Ｈ２．２の局在する細胞内器官を検討した。解析を容易にする為に、シスゴルジと小胞体の間を行き来しており主にシスゴルジに局在しているタンパク質であるＮｔＰ４Ｈ１．１とｍＲＦＰの融合蛋白質と、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）を経て分泌される膜タンパク質であるＳＣＡＭＰ２とＹＦＰとの融合蛋白質を共に発現するＢＹ−２細胞を材料として用いた。
【００７７】
継代３日目のＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰ１とＳＣＡＭＰ２−ＹＦＰをともに発現するＢＹ−２細胞を、ろ紙を敷いたブフナーロートを用いて吸引濾過により回収し、細胞２０ｇに対し２０ｍｌの抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｍｅｓ  ｐＨ７．２，０．４５Ｍスクロース，２ｍＭ  ＤＴＴ）を加えてホモジナイズし、１，０００×ｇで１０分間遠心し、さらにその上澄みを１，０００×ｇで１０分間遠心した。得られた上澄みを１０，０００×ｇで１０分間遠心し、得られた上澄みをスクロースクッション（２０％／４５％）に重層し、１００，０００×ｇで６０分間、超遠心分離を行った。２０％／４５％の界面に集まった膜画分を回収し、スクロース濃度２０％になるように調製したあと、２０〜４５％の連続スクロース勾配に重層し、１００，０００×ｇで１６時間、超遠心分離を行った後に、サンプルを分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いたサンプルは熱処理をせずに泳動を行い、泳動後に画像解析装置Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いてＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰとＳＣＡＭＰ２−ＹＦＰの検出を行った。次にゲル中のタンパク質をトランスブロットＳＤセル（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてＰＶＤＦメンブレンにブロッティングを行い、引き続きブロッキング液中で室温、６０分間処理した。１次抗体にはＮｔＰ４Ｈ２．２抗体をブロッキングバッファーで１０００倍に希釈して用いた。抗体液中で室温、１６時間反応させた後に、ブロッキングバッファーで２５００倍に希釈したＥＣＬ  Ｐｌｅｘ  ｇｏａｔ−α−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−Ｃｙ５（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス）を二次抗体として室温で１時間反応させた。ＮｔＰ４Ｈ２．２の検出にはＴｙｐｈｏｏｎ９４００を用いた。
【００７８】
その結果、図６に示すように、ＮｔＰ４Ｈ２．２の回収された画分と、ＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰの回収された画分はよく一致した。従って、この結果もＮｔＰ４Ｈ２．２は主にシスゴルジに局在していることを示している。図６中、上段の内在性ＮｔＰ４Ｈ２．２は、ＮｔＰ４Ｈ２．２特異抗体で検出を行ったもので、下段のＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰおよびＳＣＡＭＰ２−ｍＲＦＰの蛍光は画像解析装置を検出したものである。写真の右側の画分（ｂｏｔｔｏｍ）ほど、スクロース濃度が高い画分となることを示す。
【００７９】
一方、ＳＣＡＭＰ２−ＹＦＰはトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）を経て分泌されるタンパク質であり、ＴＧＮや細胞膜などに局在している膜タンパク質である（非特許文献５）が、ＳＣＡＭＰ２−ＹＦＰの分布とＮｔＰ４Ｈ２．２は違う傾向を示した。これらのことから、ＮｔＰ４Ｈ２．２もＮｔＰ４Ｈ１．１と同様に、主にシスゴルジに局在していることが示された。この結果は（実施例１−３）のＧＦＰ融合タンパク質を用いた結果とよく一致しており、Ｔｏｘ１ドメインによるゴルジ装置への局在機能を示す。
【００８０】
〔実施例６〕
トリプシン処理によるＮｔＰ４Ｈ２．２の解析に使用する、ＢＹ−２細胞のミクロソームの単離
継代５日目のＢＹ−２細胞を回収し、細胞１０ｇに対し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）を含む１０ｍｌのミクロソーム単離バッファー（４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４，２％ＢＳＡ，０．４Ｍソルビトール，０．１Ｍ  ＫＯＡｃ，６ｍＭＥＧＴＡ，４ｍＭＥＤＴＡ）を加えてホモジナイズし、１，０００×ｇで１０分間遠心し、さらにその上澄みを１０，０００×ｇで１０分間遠心して得られた上澄みを１００，０００×ｇで６０分間、超遠心分離を行った。得られた沈殿に５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ６．８，１ｍＭ  ＤＴＴを７２０μｌ加えてミクロソームサンプルとした。このミクロソームサンプルを用いて、トリプシン処理を行い、ＮｔＰ４Ｈ２．２の存在形態についての解析に供した。
【００８１】
〔実施例７〕
トリプシン処理によるＮｔＰ４Ｈ２．２の存在形態の解析
本実施例は、膜で囲まれた細胞小器官や小胞の外側・内側のどちらにタンパク質が存在しているのかを解析することができることを示す。タンパク質の大部分の領域が膜小胞の内側に存在している場合は、プロテアーゼで処理しても膜で守られているため、膜小胞の内側に存在する領域は切断を受けない。したがって、タンパク質全体としてはほとんど切断を受けないことになる。この際、界面活性剤を加えて膜構造を破壊することにより、タンパク質全体がプロテアーゼによる切断を受けるようになる。一方、タンパク質の大部分の領域が外側（細胞質側）に突き出ているタンパク質は、界面活性剤で処理をしなくても、プロテアーゼによってタンパク質の大部分の領域が切断をうける。本解析はこのような仕組みに基づいて実施している。
【００８２】
本解析では、１型プロリン水酸化酵素であるＮｔＰ４Ｈ１．１とＲＦＰとの融合タンパク質であるＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰを発現するＢＹ−２細胞を材料に用いた。ＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰはタンパク質の大部分の領域が膜の内側に存在しているため、膜の内側に存在するタンパク質の指標として用いることができる。また細胞質側に大部分が突出しているタンパク質の指標として、Ｓｅｃ２２の検出を特異抗体を用いて行った。これらとの比較を行うことにより、ＮｔＰ４Ｈ２．２が膜の外側・内側どちらに存在しているのかを解析した。
【００８３】
単離したミクロソーム６．５μｌにつき、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を１μｌ、２０％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．５μｌ、８ｕｇ／ｍｌトリプシンを２μｌ加えて３７℃で６０分間反応を行った。なお、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００やトリプシンを水で置き換えた対照反応も同時に行った。反応後、１０ｍｇ／ｍｌダイズトリプシンインヒビターを２μｌ加えて室温で２分以上保温した後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質を分離した。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた各サンプルは熱処理をせずに泳動を行い、泳動後にＴｙｐｈｏｏｎ９４００を用いてＮｔＰ４Ｈ１．１−ｍＲＦＰ由来の蛍光の検出を行った。検出後、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、引き続きブロッキング液中で室温、６０分間処理した。１次抗体にはＮｔＰ４Ｈ２．２抗体、及びＳｅｃ２２抗体をブロッキングバッファーでいずれも１０００倍に希釈して用いた。各抗体液で室温、１６時間反応させた後に、ブロッキングバッファーで２５００倍に希釈したＥＣＬ  Ｐｌｅｘ  ｇｏａｔ−α−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−Ｃｙ５を二次抗体として室温で１時間反応させた。次いで、二次抗体に付加されているＣｙ５の蛍光を、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００により検出することにより、各タンパク質を検出した。
【００８４】
Ｓｅｃ２２はＮ末端領域の大部分の領域が細胞質側に存在するため、界面活性剤で処理を行わなくてもトリプシンによる切断を受ける（非特許文献８）。そのため図７に示したように、トリプシンを加えることによりＳｅｃ２２のシグナルが減少する。一方、１型Ｐ４ＨであるＮｔＰ４Ｈ１．１は、タンパク質の大部分の領域が膜内部に存在するタンパク質であり、界面活性剤により膜構造を破壊する処理によって、トリプシンによる切断を受けるようになる。そのため、図７に示すように、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下においてトリプシンによる切断を受け、シグナルが消失する。ＮｔＰ４Ｈ２．２は、界面活性剤処理によってトリプシンによる切断を受けているが、界面活性剤非存在下では切断を受けない（図７）ことから、ＮｔＰ４Ｈ２．１と同様に膜内部に存在するタンパク質であることが明らかとなった。
【００８５】
〔実施例８〕
異種タンパク質のＣ末端にＴｏｘ１ドメインを連結した場合の効果
本実施例では、Ｔｏｘ１ドメインを異種タンパク質のＣ末端に連結させることによって、そのタンパク質の局在がどのようになるかについて解析を行った。
【００８６】
Ｔｏｘ１ドメインを連結するタンパク質として、分泌型スポラミン（△２５−３０・Ｅ３５Ａスポラミン）（非特許文献６）を用い、このＣ末端に、Ｔｏｘ１ドメインを連結させたコンストラクトをタバコＢＹ−２細胞で発現させ、解析を行った。
【００８７】
＜分泌型スポラミン−Ｔｏｘ１コンストラクトを発現させるコンストラクトの作製＞
導入遺伝子のタンパク質翻訳効率を高めるために、タバコモザイクウィルス由来の翻訳エンハンサーであるΩ配列を、プラスミドｐＭＡＴ１３７（文献１０）の３５Ｓプロモーターの下流に連結させた。Ω配列の増幅には、プラスミドｐＥＵ３−ＮＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ）を鋳型として用い、プライマー
６２７−ｏＭＯＲ５：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡ
（配列番号１７）及び
６２７−ｏＭＯＲ６：ＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＧＡＡＴＧＴ
（配列番号１８）を用いた。上記プライマー等を用いて、９４℃  ２分；１サイクルの後、
９４℃  ３０秒；
５５℃  ３０秒；
７２℃  １０秒；３０サイクル
７２℃  ２分；１サイクル
の条件でＰＣＲ反応を行った。なお、ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、メーカーのマニュアルに従って反応液の調整を行った。また、サーマルサイクラーにはＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００を用いた。
得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、プラスミドｐＭＡＴ１３７のＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入した。作製したプラスミドをｐＭＡＴ１３７Ωとする。
【００８８】
続いて、ｐＭＡＴ１３７ΩにＮｔＰ４Ｈ２．１及びＮｔＰ４Ｈ２．２のＴｏｘ１ドメインの挿入を行った。〔実施例１〕において、ＮｔＰ４Ｈ２．１の完全長ｃＤＮＡが組み込まれたプラスミドを鋳型にして、プライマー６−ｏＭＯＲ２（配列番号３）と６−ｏＭＯＲ３を（配列番号２）により増幅されたＰＣＲ産物（ＮｔＰ４Ｈ２．１のＴｏｘ１ドメイン）、ならびにＮｔＰ４Ｈ２．２の完全長ｃＤＮＡが組み込まれたプラスミドを鋳型にしてプライマー６−ｏＭＯＲ５（配列番号６）と６−ｏＭＯＲ６を（配列番号５）により増幅されたＰＣＲ産物（ＮｔＰ４Ｈ２．２のＴｏｘ１ドメイン）をそれぞれＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断し、ｐＭＡＴ１３７ΩのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入した。このようにしてプラスミドｐＭＡＴ１３７Ω−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．１）及びｐＭＡＴ１３７Ω−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．２）を作製した。
【００８９】
続いて、△２５−３０・Ｅ３５Ａスポラミンがクローニングされたプラスミドを鋳型として、プライマー
６５８−ｏＭＯＲ１：ＣＴＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＡＣＴＣ
（配列番号１９）及び
６５８−ｏＭＯＲ２：ＡＴＣＡＡＡＣＣＴＡＣＣＧＡＴＧＴＧＧＧＴＧＧＴＡＣＣＴＣＡ
（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行った。上記プライマー等を用いて、９４℃  ２分；１サイクルの後、
９４℃  ３０秒；
５５℃  １０秒；
７２℃  １分；３０サイクル
７２℃  ２分；１サイクル
の条件でＰＣＲ反応を行った。なお、ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＨＳ ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  (ＴａＫａＲａ)を用い、メーカーのマニュアルに従って反応液の調整を行った。また、サーマルサイクラーにはＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００を用いた。
【００９０】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで切断し、プラスミドｐＭＡＴ１３７Ω−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．１）及びｐＭＡＴ１３７Ω−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．２）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩサイトに導入した。完成したプラスミドを、それぞれｍＳＰＯ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．１）及びｍＳＰＯ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．２）とする。なお、コントロールとしてはｐＭＡＴ１３７ΩのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩサイトに△２５−３０・Ｅ３５Ａスポラミンを挿入したプラスミドを用い、これをｍＳＰＯとする。
【００９１】
完成した３種類のプラスミドＤＮＡ［ｍＳＰＯ，ｍＳＰＯ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．１）及びｍＳＰＯ−Ｔｏｘ１（ＮｔＰ４Ｈ２．２）］を、〔実施例１〕と同様にアグロバクテリウムＥＨＡ１０１株にエレクトロポレーションし、〔実施例１〕と同様な手法を用いて野生型ＢＹ−２細胞への導入を行った。但し、形質転換したＢＹ−２細胞の選抜に用いた培地にはハイグロマイシンは含まれていない。
【００９２】
継代７日目の形質転換ＢＹ−２細胞の培養液から、吸引ろ過により細胞と培地サンプリングし、細胞重と培地量を記録した。細胞については、等量の抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２，０．４５Ｍスクロース，１０ｍＭ  ＤＴＴ）を加えてペッスルで細胞を軽く潰し、超音波破砕を５分間行った後に、１０，０００×ｇの遠心を１０分間行い、上澄みをタンパク質サンプルとした。培地１０μｌと、培地１０μｌ分に相当する細胞から得られたタンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、スポラミンタンパク質の検出には〔実施例４〕と同様なウエスタン解析によって行ったが、１次抗体にはブロッキングバッファーで１０００倍に希釈した坑スポラミン抗体を用いた。検出はＴｙｐｈｏｏｎ９４００を用いて行い、細胞内及び培地中に分泌されたスポラミンバンドのシグナル強度の定量を行った。
【００９３】
細胞内と培地におけるｍＳＰＯ及びｍＳＰＯ−Ｔｏｘ１融合タンパク質の量を解析した結果、図８に示すようにｍＳＰＯ−Ｔｏｘ１を導入したＢＹ−２細胞において細胞内に留まるスポラミンの量がｍＳＰＯを導入した細胞に比べ多く、スポラミンを細胞内に留める機能は、ＮｔＰ４Ｈ２．１とＮｔＰ４Ｈ２．２由来のＴｏｘ１ドメインで共に認められた。表３に細胞と培地におけるｍＳＰＯおよびｍＳＰＯ−Ｔｏｘ１融合タンパク質の量を画像解析装置で計算し、細胞内に留まる割合を示した。
【００９４】
【表３】
2010213583.tif 000009
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号１９：プライマー
配列番号２０：プライマー
【図１Ａ】
2010213583.tif 000010
【図１Ｂ】
2010213583.tif 000011
【図２】
2010213583.tif 000012
【図３】
2010213583.tif 000013
【図４】
2010213583.tif 000014
【図５】
2010213583.tif 000015
【図６】
2010213583.tif 000016
【図７】
2010213583.tif 000017
【図８】
2010213583.tif 000018
【配列表】
2010213583000001.app