(57)【要約】【課題】従来の動的光散乱法による粒度分布の測定精度の範囲内で小粒子ＬＤＬのサブクラスの粒度分布を測定することができる方法を開発すること。【解決手段】本発明は、リポ蛋白を含む被検試料から小粒子ＬＤＬを含む画分を分離するステップと、分離により得られた小粒子ＬＤＬを含む画分の粒度分布を動的光散乱法で解析するステップとを含む、リポ蛋白サブクラスの測定方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポ蛋白を含む被検試料から小粒子ＬＤＬを含む画分を分離するステップと、分離により得られた小粒子ＬＤＬを含む画分の粒度分布を動的光散乱法で解析するステップとを含むことを特徴とする、リポ蛋白サブクラスの測定方法。
【請求項２】
前記被検試料から小粒子ＬＤＬを含む画分を分離するステップは、ゲルろ過クロマトグラフィー法と、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法と、超遠心法と、２価金属イオン及びポリアニオンを含む試薬を用いる沈降法とからなるグループから選択される手法によって実施されることを特徴とする、請求項１に記載のリポ蛋白サブクラスの測定方法。
【請求項３】
前記動的光散乱法で解析するステップは、粒径粒子の混合比を算出してリポ蛋白サブクラス内の特定成分の割合を求めることを特徴とする、請求項１又は２に記載のリポ蛋白サブクラスの測定方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１つに記載のリポ蛋白サブクラスの測定方法を行うための測定装置であって、動的光散乱法測定部を含むことを特徴とする、測定装置。
【請求項５】
光源としてパルスレーザーを有することを特徴とする、請求項４に記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血清脂質の測定方法及び測定装置を提供する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のリポ蛋白中のコレステロール濃度の亢進は動脈硬化性疾患の原因の１つであることが広く知られている。血液中ではコレステロールや中性脂肪等の脂質は蛋白質と結合したリポ蛋白の形で存在している。リポ蛋白はその構成成分の種類や量、粒径により、複数の分画に分類されている。リポ蛋白は比重ＳＧの小さいものから順に、ＣＭ（カイロミクロン：ＳＧ＜０．９６）、ＶＬＤＬ（超低密度リポ蛋白：０．９６＜ＳＧ＜１．００６）、ＬＤＬ（低密度リポ蛋白：１．００６＜ＳＧ＜１．０６３）、ＨＤＬ（高密度リポ蛋白：１．０６３＜ＳＧ＜１．２１０）の４つの分画に分類されている。ＬＤＬ分画の中でも、比重が１．０４０〜１．０６３のリポ蛋白サブクラスは小粒子ＬＤＬとよばれ、動脈硬化性疾患の危険因子として注目されている。
【０００３】
これらのリポ蛋白と動脈硬化性疾患との相関を調べるために、血液から血清を採取し、血清脂質の成分であるリポ蛋白を分画して単離し、コレステロール量の定量分析を行ったり、粒子径を測定する等の方法で動脈硬化性疾患の発生メカニズムを明らかにする方法等が模索されている。特にＬＤＬ中における小粒子ＬＤＬ量の重要性が指摘されている。
【０００４】
血清中の小粒子ＬＤＬを分離して動脈硬化性疾患の発生メカニズムを調べる方法として、２価金属イオンとポリアニオン等とを含む試薬を用いた沈降法が知られている。この試薬を用いることにより、ＣＭ、ＶＬＤＬ及びＬＤＬ中の大粒子ＬＤＬを沈殿させて小粒子ＬＤＬ及びＨＤＬ以外の成分を除去し、ＨＤＬのコレステロールを消去した上で小粒子ＬＤＬ中のコレステロールを定量することができる（特許文献１）。
【特許文献１】国際公開２００４／０５３５００号パンフレット
【０００５】
動的光散乱法で血清中又は血漿中のＬＤＬの粒度分布を測定する方法が知られている（特許文献２）。血清中又は血漿中ではリポ蛋白はＣＭ、ＨＤＬ、ＬＤＬ等の複数の粒子として存在している。このように被検試料の中に複数の粒子が存在すると、動的光散乱法では十分な分解能が得られず、粒度が理論上の数値とかけ離れた測定値になる傾向があった。そのため、小粒子ＬＤＬのサブクラスの粒度分布情報を正しく得るためには、粒度分布の測定精度向上が必要であるとされてきた。
【特許文献２】特開２００５−１３４２０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし多数の分画が混在する血清試料の粒度分布の測定精度を向上させるのには技術的に困難なうえ、高額の費用を要する。そこで、従来の動的光散乱法による粒度分布の測定精度の範囲内で小粒子ＬＤＬのサブクラスの粒度分布を測定することができる方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、リポ蛋白を含む被検試料から小粒子ＬＤＬを含む画分を分離するステップと、分離により得られた小粒子ＬＤＬを含む画分の粒度分布を動的光散乱法で解析するステップとを含む、リポ蛋白サブクラスの測定方法を提供する。
【０００８】
本発明のリポ蛋白サブクラスの測定方法において、前記被検試料から小粒子ＬＤＬを含む画分を分離するステップは、ゲルろ過クロマトグラフィー法と、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法と、超遠心法と、２価金属イオン及びポリアニオンを含む試薬を用いる沈降法とからなるグループから選択される手法によって実施される場合がある。
【０００９】
本発明のリポ蛋白サブクラスの測定方法において、前記動的光散乱法で解析するステップでは、近似した粒径粒子の混合比を算出してリポ蛋白サブクラス内の特定成分の割合を求める場合がある。
【００１０】
本発明は、本発明のリポ蛋白サブクラスの測定方法を行うための測定装置であって、動的光散乱法測定部を含む測定装置を提供する。
【００１１】
本発明の測定装置は、光源としてパルスレーザーを有する場合がある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の血清脂質の測定方法及び解析方法により、小粒子ＬＤＬの粒度分布測定が可能である。小粒子ＬＤＬの粒度を測定することにより、脂質代謝に変動をきたしうる種々の生理的あるいは病理的な状態を研究あるいは診断に利用可能な指標を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、リポ蛋白を含む被検試料から小粒子ＬＤＬを含む成分を分離するステップと、分離により得られた小粒子ＬＤＬを含む成分の粒度を動的光散乱法で解析するステップとを含む、リポ蛋白サブクラスの測定方法である。本発明の測定方法は、サブクラス内特定性分の割合を求めるステップを含む場合がある。
【００１４】
粒度を測定する方法としては、動的光散乱法、レーザー回折散乱法、デジタルコールター法等がある。小粒子ＬＤＬの粒度はグラジエントゲル電気泳動法による知見から約２２．０〜２５．５ｎｍと推定されており、本発明ではこのような粒度の測定に適した動的光散乱法を用いる。
【００１５】
動的光散乱法による粒度分布算出方法の測定原理はよく知られており、インターネット上で開示されている（例えば、ベックマン・コールター社のホームページ（「動的光散乱法の測定原理」、<URL:http://www.beckmancoulter.co.jp/product/product03/m_principle/>、平成２０年４月１０日現在）。
【００１６】
溶液中の粒子は均一粒子が均一に分散しているという仮定の下、散乱光強度は、粒子が平均的な位置関係にある場合の値（平均散乱強度）を中心にゆらいでいると考えることができる。このゆらぎを、散乱光強度の時系列データとしてとらえ、（１）式のような自己相関関数Ｇ2（τ）を算出する。
【００１７】
【数１】
2010048703.tif 000002
【００１８】
ここでＩ(t)は、時刻ｔでの散乱光強度、τは遅延時間である。この自己相関関数Ｇ2（τ）は、散乱光電場の一次相関関数ｇ1（τ）と、（２）式のように関係づけられる。
【００１９】
【数２】
2010048703.tif 000003
【００２０】
単分散試料（単一粒径の試料）では、一次相関関数ｇ1は、粒子の拡散係数Ｄに依存する単一減衰の指数関数となる。
【００２１】
【数３】
2010048703.tif 000004
【００２２】
ここでＢは、装置に依存する定数である。ｑは散乱ベクトルで、（４）式で表される。ここでｎは溶媒の屈折率、θは散乱角度、λは真空中の光源の波長である。
【００２３】
【数４】
2010048703.tif 000005
【００２４】
粒子の直径（ストークス径）ｄは、Stokes-Einsteinの式より式（５）のように求められる。ここでｋはボルツマン定数、Ｔは絶対温度、ηは溶媒の粘度である。
【００２５】
【数５】
2010048703.tif 000006
【００２６】
単一粒径の試料（単分散系）の場合、上記のようにして粒径を求めることができる。本発明では、粒径が比較的近い小粒子と大粒子がそれぞれ粒径分布を持って混在している試料に対し、その混合比を次のようにして求める。
【００２７】
【数６】
2010048703.tif 000007
【００２８】
【数７】
2010048703.tif 000008
【００２９】
ここで、XW, XI, ws, wl, ms, ml, mm は、それぞれ重量比、散乱光量比、小粒子重量分率、大粒子重量分率、小粒子平均粒径、大粒子平均粒径および動的散乱法で計測した試料の平均粒径である。なおms, ml, mm は、すべて散乱光量に基づく粒径分布の平均値である。
【００３０】
動的光散乱法で正確な平均粒径が得られない場合は、計測した散乱ゆらぎの自己相関関数G2(t)から散乱光量比XIを次式から求めることもできる。
【００３１】
【数８】
2010048703.tif 000009
【００３２】
動的光散乱法によれば、粒子が単分散の粒子群だけでなく、異なる粒度分布をもつ粒子群の測定も可能である。その場合の混合比率(重量比)XWを実測から求める過程は次のとおりである。まず、動的光散乱法により散乱光量に対する粒径分布から、あらかじめ対象とする大粒子と小粒子の平均粒径mlとmsを求めておく。この過程を省略し、文献値や既報告値を用いることも可能である。次に動的光散乱法により、混合比未知の試料の散乱光量に対する平均粒径mmを計測する。これらを用い、式（７）より散乱光量比XIを求めて、式（６）より重量比XWを得る。平均粒径mmが正確に求まらない場合は、式（８）より散乱光量比XIを求めて、式（６）より重量比XWを得ることができる。
【００３３】
リポ蛋白を含む被検試料から小粒子ＬＤＬを含む成分を分画して分離する方法としては、ゲルろ過クロマトグラフィー、岡崎らによって開発された高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法（例えば特開２００２−１３９５０１号公報を参照）、超遠心法、２価金属イオン及びデキストリンを含有する試薬を用いた沈降法が挙げられる。
【００３４】
ゲルろ過クロマトグラフィーは、溶媒で膨潤させたゲル粒子のカラムを用いて行う分離操作である。ゲルろ過クロマトグラフィーに用いるゲルは、例えばセファデックス、バイオゲル、アガロースゲルが挙げられる。
【００３５】
２価金属イオン及びポリアニオンを含有する沈降法用の試薬を用いる方法としては、例えば伊藤らによる国際公開第２００４／０５３５００号パンフレットに記載の試薬を用いる方法が挙げられる。この試薬を用いると、小粒子ＬＤＬの粒度がわずか３０分で測定可能となるため好適に用いられる。
【００３６】
上記２価イオンとしては、例えばマグネシウム、カルシウム、ストロンチウム等のアルカリ土類金属やマンガン、銅、亜鉛、鉄、ニッケル、チタン、コバルト等の遷移金属等の金属の２価イオンが使用可能であり、マグネシウム、カルシウム及びマンガンの２価イオンが好適に用いられる。
【００３７】
ポリアニオンとしては、例えばヘパリン及びその金属塩、リンタングステン酸、及びデキストラン硫酸が使用可能であり、ヘパリンの金属塩が好適に用いられる。
【００３８】
動的光散乱法の光源にはコヒーレンスが良いレーザー光が使用可能である。レーザーには連続光を放出するＣＷレーザーとパルスレーザーがあり、ＣＷレーザーとしてはアルゴンイオンレーザー、半導体レーザー、ヘリウムネオンレーザー等があり、パルスレーザーとしてはＮｄ：ＹＡＧレーザー、エキシマレーザー、炭酸ガスレーザー等が挙げられる。
【００３９】
レーザー光源は、可視光（波長３００〜７００ｎｍ）の範囲で選ぶことが可能であり、ＬＤＬによる光吸収が少ない波長５００〜７００ｎｍが、ＬＤＬの粒子径測定に適しており、感度よく測定できるので、より好ましい。
【００４０】
例えばアルゴンイオンレーザー、半導体レーザー、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーの高調波（ＳＨＧ）のレーザー光のうち、波長５００〜７００ｎｍの光源が好適に用いられる。
【００４１】
本発明は、得られた分画のリポ蛋白の粒度を測定することができる。本発明の測定方法は、リポ蛋白の粒度を測定することにより、脂質代謝に変動をきたしうる種々の生理的あるいは病理的な状態を研究あるいは診断に使用可能な指標を提供することができる。
【００４２】
本発明の実施態様は以下の実施例によって説明されるが、本発明の特許請求の範囲は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
（参考例１）
電気泳動法による小粒子ＬＤＬ粒度の推定値に近い粒度の市販の標準ラテックス（粒径の表示値：２２±１．５ｎｍ）を使用して、単分散ラテックスの粒度を測定した。動的光散乱法測定部を含む測定装置として大塚電子（株）から市販されているＦＤＬＳ−３０００を用いた。
【００４４】
動的光散乱の測定条件は以下のとおりであった。
測定モード：Ｃｏｎｔｉｎ法
測定波長：５３２ｎｍ（出力１００ｍＷ、固体パルスレーザー、Ｎｄ−ＹＡＧのＳＨＧ波使用）
測定散乱角度：９０度
サンプリングタイム：８．０マイクロ秒
積算回数：１００回
コリレーションチャネル数：１２８ｃｈコリーレーション法：タイムインターバル法
試料の物性値：
（血清２５°Ｃ）屈折率  1.3313 粘性1.33
（水、生理食塩液  ２５°Ｃ）屈折率 1.3313 粘性 0.8858
（血清３６．３±２°Ｃ）屈折率  1.3299 粘性1.33
（水、生理食塩液  ３６．３±２°Ｃ）屈折率 1.3299 粘性 0.6922-0.6968
（結果）
図１に示すとおり、上記の標準ラテックスの動的光散乱法による粒度測定の結果、散乱強度約１６の単峰性ピークが得られた。この粒度分布の測定値は、２１．７±２．１ｎｍであった。これは標準サンプルの表示値である２２±１．５ｎｍにきわめて近く、本発明の動的光散乱法による測定の精度が高いことが確認された。
【００４５】
（参考例２）
ヒト血清測定にあたり、多分散ラテックスを混合し、実施例１と同様の測定条件で粒度を測定した。用いた粒子は、市販の平均粒径１００ｎｍ、６０ｎｍ、３０ｎｍ及び２０ｎｍラテックスの混合物（１００，６０，３０，２０ｎｍラテックスの混合比＝２３：２３：１：１）であった。この混合比は正常ヒト血清をゲルろ過して得られたＣＭ及びＬＤＬ分画のコレステロール濃度比に基づいて、ヒト血清中の粒子の粒度を近似するように設定された。
【００４６】
動的光散乱法による粒度分布測定を行い、式（１）〜（８）の数式に基づき計算した結果、図２に示すとおり、約２０−３０ｎｍの散乱強度約２．３の平坦なショルダー部と約１００ｎｍ付近の散乱強度約４のピークとからなる粒度分布が得られた。ショルダー部の粒度分布は２５．３±５．７ｎｍで、ピークの粒度分布は９５．８±４３．７ｎｍであった（図２）。小粒子側の粒度は、２０ｎｍと３０ｎｍのほぼ中央値であった。大粒子側は６０ｎｍと１００ｎｍの混合ピークと推測される。この結果から、動的光散乱法（Ｃｏｎｔｉｎ法）では、多分散粒子集合体のピークを解析により分離するには、粒度で２倍以上の差が必要であることがわかった。また、散乱強度は粒度が大きくなると増大する傾向があることが知られている。このことから、ヒト血清測定にあたって、小粒子ＬＤＬ以外のＬＤＬやＣＭ等の粒度の大きい粒子を除去するステップが必要であることが確認された。
【００４７】
（参考例３）
正常ヒト血清をゲルろ過法で分画し、ＬＤＬ分画とＨＤＬ分画精製後の検体の粒度分布を参考例２と同様の方法で動的散乱法で測定した。
【００４８】
図３に示すとおり、ＬＤＬ分画の粒度分布は２７．３±７．８ｎｍの単峰性ピークを示した。これはＬＤＬ分画の粒度として適切な値であった。図４に示すとおり、ＨＤＬ分画の粒度分布は８．４±０．７ｎｍの単峰性ピークを示した。これもＨＤＬ分画の粒度としては良好な結果であった。これらの結果から、本発明の方法でＬＤＬ及びＨＤＬの粒度分布がともに測定できることが確認された。
【００４９】
本測定条件で、ゲルろ過クロマトグラフィー法で分画後の検体を動的光散乱法で測定を試みた。図５にゲルろ過クロマトグラフィー法での分画を示す。図５に示す２つのグラフの横軸はともに画分番号を表し、図５のグラフＡの縦軸は波長２８０ｎｍの吸光度で、グラフＢの縦軸は各画分について測定された粒度分布の粒径（ｎｍ）である。分画操作を行った後、ＬＤＬ及びＨＤＬの代表的な画分の粒度を動的光散乱法で測定し、代表的な分画を測定した結果がグラフＢである。図５の２つのグラフから、本発明の方法によって隣り合った分画を区別することができることがわかった。
【００５０】
（参考例４）
ＨＤＬと小粒子ＬＤＬとが混在する検体のような、粒度分布の異なる複数の粒子群からなる粒度分布の解析の可否を検討した。これは、（５）式において複数粒子存在下での、粒子混合比を導く手法である。粒子の混合比の実測にあたり、市販の平均粒径２１ｎｍ及び２８ｎｍのラテックスを使用し、参考例２と同様の測定方法で計測した。図７に示すとおり、散乱光の揺らぎから実測された二次自己相関関数は混合比の違いによって明確に異なっていた。
【００５１】
この結果から、ＨＤＬと小粒子ＬＤＬの混在する検体のような、粒径の異なる複数の粒子群からなる検体の粒度を測定することも可能であることがわかった。解析対象となる粒子群数を増やすことで、粒度解析の精度を更に向上させることができる。
【００５２】
（実施例１）
小粒子ＬＤＬの粒度の精度を検討するため、１人の患者から採取した血清を用いて繰り返し測定を行った。血清試料に２価金属イオン及びポリアニオンを含有する市販のｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ測定用試薬（デンカ生研株式会社）を添加して、血清試料から小粒子ＬＤＬよりも大型の粒子、すなわちＬＤＬ分画のうち小粒子ＬＤＬ以外の画分と、ＣＭ及びＶＬＤＬとを除去した。残った小粒子ＬＤＬ画分について動的光散乱法で粒度を測定した。試料１点あたりの前処理時間は約２０分で、容易に測定が可能となった。
【００５３】
（結果）
表１に結果を示すとおり、小粒子ＬＤＬの粒度として１８．９ｎｍ（標準偏差σ＝２．１８７）という値が得られた。
【００５４】
【表１】
2010048703.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の、動的光散乱法を用いた血清脂質の測定方法及び解析方法により、簡便なリポ蛋白の粒度分布測定が可能となった。また、小粒子ＬＤＬの粒度測定ならびにＬＤＬ中の小粒子ＬＤＬの混合比率の測定が可能となった。さらに、２価金属イオン及びポリアニオンを含有する試薬を用いた場合は、迅速かつ簡便な測定が可能となった。本発明の測定方法により、脂質代謝に変動をきたしうる種々の生理的あるいは病理的な状態を研究あるいは診断に使用可能な指標を提供できるため、今後の脂質代謝解析や動脈硬化の発生機序解明や、効率的な治療の確立に貢献すると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】単分散標準ラテックスの粒径測定結果を示す粒度分布図。
【図２】多分散標準ラテックスの粒度分布測定結果を示す粒度分布図。
【図３】ＬＤＬ分画の粒度分布測定結果を示す粒度分布図。
【図４】ＨＤＬ分画の粒度分布測定結果を示す粒度分布図。
【図５】血清のゲルろ過クロマトグラフィー法による分離パターンのプロファイル（Ａ）と、代表的な分画の粒度分布測定結果を示すグラフ（Ｂ）。
【図６】異なる割合で混合された２分散ラテックスによる自己相関係数を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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