(57)【要約】【課題】分子生物学研究等の分野において実施される核酸の増幅、特にサイズの大きなターゲット遺伝子において有用性の高い、新規な核酸合成方法ならびに組成物を提供する。【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸合成用組成物であって、該ＤＮＡポリメラーゼに加えて、ベタイン（トリメチルグリシン）およびｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドを有することを特徴とする核酸合成用組成物および、これらの存在下で核酸合成反応を行う核酸の合成方法、に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アーキア由来のＤＮＡポリメラーゼ、ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド、及びベタイン（トリメチルグリシン）を含有することを特徴とする、核酸合成用組成物。
【請求項２】
ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の核酸合成用組成物。
【請求項３】
ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼである請求項２に記載の核酸合成用組成物。
【請求項４】
ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドがアーキア由来のｄＵＴＰアーゼ活性を有すポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸合成用組成物。
【請求項５】
ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドがＳＩＲＶ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ  ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）由来、もしくはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項４に記載の核酸合成用組成物。
【請求項６】
ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドが以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである、請求項５に記載の核酸合成用組成物。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列において、１ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド
【請求項７】
アーキア由来のＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸合成方法であって、ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド及びベタイン（トリメチルグリシン）の存在下で行うことを特徴とする、核酸合成方法。
【請求項８】
ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである、請求項７に記載の核酸合成方法。
【請求項９】
ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項８に記載の核酸合成方法。
【請求項１０】
ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドがアーキア由来のｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の核酸合成方法。
【請求項１１】
ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドが、ＳＩＲＶ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ  ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）由来、もしくはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項１０に記載の核酸合成方法。
【請求項１２】
ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドが以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかである、請求項１１に記載の核酸合成方法。
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｆ）配列番号１又は２のアミノ酸配列において、１ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に分子生物学の分野において、ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸からＤＮＡの合成を行う際に有用な新規組成物及び方法に関するものであり、特にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に有用な核酸合成用組成物及び核酸合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸を用いたＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。中でも、ＰＣＲ法に代表される核酸増幅法は、研究分野のみならず、遺伝子診断、親子鑑定といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。
【０００３】
ＰＣＲ法による遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長からなるサイクルを２５〜４０サイクル繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。
【０００４】
ここで、ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、真正細菌由来のＰｏｌＩ型酵素（「ファミリーＡ」に属する。）とアーキア（超高熱始原菌）由来のα型酵素（「ファミリーＢ」に属する。）がある。一般的に、ＴａｑやＴｔｈに代表されるＰｏｌＩ型酵素は、ＤＮＡ合成速度が比較的速く、プロセッシビティ（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ；ＤＮＡポリメラーゼが基質ＤＮＡに結合してから離れるまでに合成されるヌクレオチドの数である）に優れる反面、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が無いことからＤＮＡ合成時の正確性が低く、熱安定性が低いという特徴がある。また、誤って取り込んだ塩基を取り除くことができないため、一般的にＰＣＲ反応における増幅効率が低く、増幅可能なターゲットの長さも５ｋｂ程度が限界となっている。
【０００５】
一方、ＰｏｌＩ型酵素におけるこれらの短所を補う方法として、ＰｏｌＩ型酵素に微量のα型酵素を添加する技術が知れられている（特許文献１）。この方法により、ＰＣＲ反応における増幅効率が向上し、かつ比較的長いターゲットの増幅が可能になったものの、ターゲットの配列を正確に増幅する「正確性」の点においては、ＰｏｌＩ型酵素単独の場合とほとんど大差はなく、正確性を要するクローニング等の用途には使用できないといった問題点が依然として存在している。これに対し、ＫＯＤやＰｆｕに代表されるα型酵素は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つことからＤＮＡ合成時の正確性が高く、さらに、熱安定性に優れるという特徴がある。さらに、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼはα型酵素でありながら、ＤＮＡ合成速度が速く、プロセッシビティにも優れるため、高正確性ＰＣＲ酵素として、現在広く利用されている。
【０００６】
しかしながら、その一方で、特にα型酵素の場合は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有することから非特異的増幅が生じやすく、またｄＣＴＰ（２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の脱アミノ化によって生じるｄＵＴＰ（２’−Ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ，５’−Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を取り込むとそこで反応が停止してしまうことから、ターゲットＤＮＡの増幅量が低下したり、長いターゲットＤＮＡの増幅ができなくなったりする等の問題があった。
【０００７】
これらの短所に対して、これまでに、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する抗体を用いたホットスタート法（特許文献２）や、非特異的増幅を抑える効果のあるバッファー組成への改良（特許文献３）にて非特異増幅が抑制できることが報告されている。さらに、ｄＵＴＰ取り込みによる合成反応停止については、特許文献４や非特許文献１に示されるように、ＰＣＲ反応中にｄＵＴＰａｓｅ（ｄＵＴＰ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を添加することにより、ｄＵＴＰを分解し、合成反応停止を抑制することによって、増幅効率を高め、あるいは増幅可能なターゲット長を向上させることができることが知られている。
【０００８】
さらに、α型酵素に限らず、ＰＣＲパフォーマンスの向上を目指して、様々な添加剤が検討され、有効であることが報告されている。例えば、化学物質性の添加剤としては、ＤＭＳＯ、ベタイン（トリメチルグリシン）等のＴｍ降下剤や、タンパク性の添加剤として、ＳＳＢ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＦＣＳ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ）、ＲＦＣＬ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ）等が知られている。これらの添加剤は、鋳型ＤＮＡとＰＣＲプライマー、あるいは、鋳型ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼの結合を促進させることによって、ポリメラーゼ反応を亢進させるものである
【０００９】
しかしながら、これらの添加剤を加えても、ターゲットＤＮＡの長さやサンプルの形態によっては、ターゲットＤＮＡの増幅ができない、あるいは、十分量の増幅産物が得られない場合がある。例えば、ヒトのゲノムＤＮＡを鋳型に、３０ｋｂを超える長さのターゲットを正確に増幅することは、これまでの技術では不可能であり、特にファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いる場合に、汎用的に核酸増幅に関して優れた系の確立が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，４３６，１４９号公報
【特許文献２】特許第３９６８６０６号公報
【特許文献３】特許公開２００３−１４４１６９公報
【特許文献４】特表２００２−５０５５７２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，５９６−６０１（２００２）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，６０２４−６０２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように、核酸の増幅に関しては様々な関連技術が報告されているものの、ＤＮＡ増幅効率及び増幅可能なターゲットＤＮＡ長には限界があり、更なるＤＮＡ合成活性の向上、すなわちＰＣＲパフォーマンスの向上が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼ、特にＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼをはじめとする、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成活性を更に改良するため、その組成の改良に関して鋭意検討を行った結果、ベタイン（トリメチルグリシン）存在下に、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｄｉｃｕｓ  ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＳＩＲＶ）やＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株等のアーキア由来のｄＵＴＰａｓｅを添加することにより、ＰＣＲパフォーマンスを飛躍的に向上させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち本発明によれば、以下が提供される。
（１）アーキア由来のＤＮＡポリメラーゼ、ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド、及びベタイン（トリメチルグリシン）を含有することを特徴とする、核酸合成用組成物。
（２）ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである、（１）に記載の核酸合成用組成物。
（３）ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼである（２）に記載の核酸合成用組成物。
（４）ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドがアーキア由来のｄＵＴＰアーゼ活性を有すポリペプチドである、（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸合成用組成物。
（５）ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドがＳＩＲＶ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ  ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）由来、もしくはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドである、（４）に記載の核酸合成用組成物。
（６）ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドが以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである、（５）に記載の核酸合成用組成物。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列において、１ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド
（７）アーキア由来のＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸合成方法であって、ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド及びベタイン（トリメチルグリシン）の存在下で行うことを特徴とする、核酸合成方法。
（８）ＤＮＡポリメラーゼがファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである、（７）に記載の核酸合成方法。
（９）ＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼである、（８）に記載の核酸合成方法。
（１０）ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドがアーキア由来のｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドである、（７）〜（９）のいずれかに記載の核酸合成方法。
（１１）ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドが、ＳＩＲＶ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ  ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）由来、もしくはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドである、（１０）に記載の核酸合成方法。
（１２）ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドが以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかである、（１０）に記載の核酸合成方法。
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｆ）配列番号１又は２のアミノ酸配列において、１ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の合成方法、特にＰＣＲ方法において、ＰＣＲパフォーマンスを飛躍的に向上させることができる。すなわち、本発明によって、ＰＣＲ増幅量の増大、あるいは、従来のＤＮＡポリメラーゼ組成物では難しいとされてきたＤＮＡの長断片の増幅が可能になる。
【００１６】
特に、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼに代表されるようなファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いる場合においては、ＤＮＡ増幅の高い正確性、つまり極めて低い誤塩基取り込み（エラー）率を保ちながら、ＰＣＲ産物量を増大させ、あるいは増幅可能なターゲット遺伝子の鎖長を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例３におけるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【図２】実施例４におけるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の第一の側面は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド及びベタインを含有する核酸合成用組成物である。
【００１９】
本発明において用いられるＤＮＡポリメラーゼの種類は、いずれのＤＮＡポリメラーゼであっても本発明の効果を奏し、特に限定されるものではないが、アーキア（始原菌）由来であることが好ましい。アーキアの種類としては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ａｅｒｏｐｙｒｕｓ属、などが例示される。アーキア由来のＤＮＡポリメラーゼには、ＤＮＡの３’端から５’端方向にＤＮＡ鎖を端から消化し、削る活性（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（ＤＮＡ校正活性））を有するものがあり、高い正確性をもってＤＮＡ合成を行うため、これらを用いるのが好ましい。これらのＤＮＡポリメラーゼは、さらに、ｄＵＴＰの取り込みを検知して、そこでポリメラーゼ反応によるＤＮＡ鎖の伸長を停止させる機構を備えている。
【００２０】
アーキア由来のＤＮＡポリメラーゼにおいて、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することがより好ましい。ファミリーＢ(α型)のＤＮＡポリメラーゼとして、現在の市場にて購入できるものは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーンなど）、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・アプライド・サイエンス）、Ｕｌｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）などが例示される。なかでも、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼがより好ましいものであるが、本発明で使用するＤＮＡポリメラーゼは、ｄＵＴＰの取り込みを検知して、そこでポリメラーゼ反応によるＤＮＡ鎖の伸長を停止させる機構を持つＤＮＡポリメラーゼであれば、それらのいずれにおいても適用することが可能であり、特に限定されるものではない。
【００２１】
本発明は、ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドを含有することを特徴とする。ｄＵＴＰアーゼ活性とは、ｄＵＴＰにおけるリン酸結合を加水分解する酵素活性を指す。ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドの存在により、核酸合成反応中にｄＵＴＰが取り込まれることにより生じる合成反応停止を阻止することが可能となる。
【００２２】
ｄＵＴＰアーゼの活性測定法としては、ｄＵＴＰアーゼが触媒するｄＵＴＰ→ｄＵＭＰ＋ＰＰｉ（ピロリン酸）の反応において、その単位時間あたりに減少するｄＵＴＰの量を測定する方法や、あるいは生成されるピロリン酸を測定する方法が挙げられる。
本明細書では、後者（ピロリン酸の定量）を具体的に以下のとおり行った。
活性測定したいｄＵＴＰアーゼをｄＵＴＰ溶液（１０ｍＭ  ｄＵＴＰ、５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に添加し、８０℃で１時間反応させた後、生成されたピロリン酸量をピロリン酸定量試薬（Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｒｅａｇｅｎｔ：Ｓｉｇｍａ社）を用いて定量する。活性は、「８０℃、１時間の反応で、０．１μｍｏｌのピロリン酸を生成する酵素量を１ｕｎｉｔ」と定義する。
【００２３】
ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドであれば、いずれの由来のものであっても使用することができるが、アーキア由来のｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドを好適に用いることができる。具体的には、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｄｉｃｕｓ  ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＳＩＲＶ）等のアーキアウイルス由来のｄＵＴＰａｓｅや、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株やＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ等のアーキア由来のｄＵＴＰａｓｅが挙げられる。
【００２４】
より具体的には、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｄｉｃｕｓ  ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ由来のｄＵＴＰａｓｅ（ＳＩＲＶ-ｄＵＴＰａｓｅ）としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。あるいは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつｄＵＴＰアーゼ活性を有するものが好ましい。即ち該ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、公知の技術方法による特定部位への変異導入により改変されたものであってもよい。別の側面から見ると、配列番号１に記載のアミノ酸配列と７０％以上のホモロジーを有するものであることが好ましい。また、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するもの、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のホモロジーを有するものが挙げられる。
【００２５】
また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来のｄＵＴＰａｓｅ（ＫＯＤ-ｄＵＴＰａｓｅ）としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。あるいは、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつｄＵＴＰアーゼ活性を有するものが好ましい。即ち該ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、公知の技術方法による特定部位への変異導入により改変されたものであってもよい。別の側面から見ると、配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上のホモロジーを有するものであることが好ましい。また、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するもの、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のホモロジーを有するものである。
【００２６】
添加するｄＵＴＰアーゼの量は、核酸合成反応組成液中の終濃度にして、下限として好ましい濃度は０．００１ｎｇ／μｌ、さらに好ましくは０．００５ｎｇ／μｌ、より好ましくは０．０１ｎｇ／μｌである。上限として好ましい濃度は１０ｎｇ／μｌ、さらに好ましくは６ｎｇ／μｌ、より好ましくは４ｎｇ／μｌである。下限以下であれば、核酸合成のパフォーマンスの向上の効果があまり見られず、上限以上であってもそれ以上の際立った核酸合成のパフォーマンスの向上の効果が見られなくなる。
【００２７】
本発明ではさらにベタインが用いられる。本発明において用いられるベタインとは、アミノ酸のアミノ基に ３つのメチル基が付いた化合物の総称であるが、本発明においては、トリメチルグリシン（分子式：Ｃ５Ｈ１１ＮＯ２）を指す名称として用いられる。ベタインは、アカザ科フダンソウ属の植物、テンサイ、その他にもキノコやサトウダイコン、エビ、カニなどに含まれている。添加するベタイン（トリメチルグリシン）の量は、核酸合成反応組成液中の終濃度にして、下限として好ましい濃度は０．１Ｍ、さらに好ましくは０．５Ｍ，より好ましくは１Ｍである。上限として好ましい濃度は５Ｍ、さらに好ましくは３Ｍ，より好ましくは２Ｍである。下限以下であれば、核酸合成反応のパフォーマンスの向上の効果が見られず、上限以上であってもそれ以上の際立った核酸合成のパフォーマンスの向上の効果が見られなくなる。加えて、５Ｍ以上ではベタインが溶解しにくくなる。
【００２８】
ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド及びベタインの両者を組み合わせて用いることにより、その相乗効果によって、ＤＮＡの増幅効率、及び増幅可能なターゲットのサイズが飛躍的に向上する。特にｄＵＴＰアーゼおよびベタインをそれぞれ上記好ましい範囲の比率で組み合わせて用いることが好ましい。
【００２９】
本発明における核酸合成用組成物は、少なくとも以下の構成を含む。
（１）ＤＮＡポリメラーゼ
（２）ベタイン
（３）ＳＩＲＶ−ｄＵＴＰａｓｅもしくはＫＯＤ−ｄＵＴＰａｓｅ
あるいは、以下の構成を少なくとも含む。
（４）ＤＮＡポリメラーゼ
（５）ベタイン
（６）ＳＩＲＶ−ｄＵＴＰａｓｅ及びＫＯＤ−ｄＵＴＰａｓｅ
さらには以下の構成を含むこともある。
（７）ＤＮＡポリメラーゼ
（８）ベタイン
（９）配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド
さらに、以下の構成を少なくとも含む核酸合成用組成物であってもよい。
（１０）ＤＮＡポリメラーゼ
（１１）ベタイン
（１２）配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド
【００３０】
本発明における核酸合成用組成物とは、ＤＮＡポリメラーゼを含むストック液（ＤＮＡポリメラーゼ保存溶液）を指す場合と、核酸合成反応のための反応溶液を指す場合とがある。
【００３１】
核酸合成用組成物がＤＮＡポリメラーゼを含むストック液である場合は、さらにバッファーを加えることができる。反応バッファーを含む構成である場合、２倍から２０倍程度の濃度、好ましくは２倍から１０倍程度の濃度に濃縮されたストック液として含まれることが好ましい。この核酸合成用組成物を核酸合成反応に用いる場合は、核酸合成反応前に必要に応じて、反応バッファーや４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの混合物）溶液、さらには金属イオンや無機塩等を加えて、核酸合成反応を行うことができる。また、予めこれらの任意の構成要素を混合しておいて、核酸合成反応前にさらに必要な構成要素を加えて反応溶液を調製することもできる。これらの種類や濃度は当業者であれば適宜設定しうるものである。
【００３２】
核酸合成用組成物を核酸合成反応のための反応溶液を指すものとして用いる場合、核酸合成用組成物は、さらに必要により、ＤＮＡポリメラーゼ用の反応バッファー、基質である４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの混合物）溶液などを含む。反応バッファーとしては、トリス−塩酸緩衝液、トリス−硫酸緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられるが、トリス−硫酸緩衝液が特に好ましい。濃度としては、１０〜２００ｍＭが好ましく、２０〜１００ｍＭがより好ましい。ｐＨとしては、７．０〜９．５の範囲が好ましく、７．５〜９．０の範囲がより好ましい。また、反応バッファー中には、１．０〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭの濃度でＭｇ２＋を含むことが好ましい。更には、ＫＣｌ等の塩を含んでいてもよい。また、必要に応じて、界面活性剤その他の安定化剤を含んでいてもよい。
【００３３】
核酸合成用組成物が核酸合成反応のための反応溶液である場合、ＤＮＡポリメラーゼ、ベタイン、ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドは、予め混合された形状にて構成されていてもよいし、あるいは各々が別チューブに入っていて、反応を行う前に混合し核酸合成用組成物を作製する態様をとってもよい。
【００３４】
本発明における核酸合成反応とは、鋳型となる核酸に対し、相補的な配列を持つ核酸を配列依存的に合成する反応を指す。具体的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＴＲＣ）法、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）法、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮ）法などが例示される。これらのなかで、ＰＣＲ法が好適に用いられる。
【００３５】
本発明の核酸合成用組成物は、これまで合成・増幅することのできなかったＤＮＡの長い領域を、極めて正確に合成する点で顕著な効果を有する。例えば、ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド及びベタインを有さない、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸合成用組成物でＰＣＲ反応を行った場合、ＤＮＡを増幅できる断片長は６〜７ｋｂｐが限界である。また、ベタインのみを添加して、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸合成用組成物でＰＣＲ反応を行った場合、約８．５ｋｂｐ以上のＤＮＡの合成は難しい。他方、ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドのみを添加する場合、特許文献４によれば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌｉｏｓｕｓ由来のｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドのみを用いて、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼやＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ）により増幅が確認されているＤＮＡの断片長は６．２ｋｂｐ前後であった。本発明者らがｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドを添加してＰＣＲ反応を行った結果、６．２ｋｂｐ以上を増幅することはできたが、１０ｋｂｐ以上のＤＮＡ断片を確実に増幅することはできなかった。ＤＮＡの合成の難しさは、増幅したい領域の鎖長が長くなるにしたがって、指数関数的に難しくなる。
【００３６】
しかしながら、本発明を用いた場合、３２ｋｂｐ前後であっても増幅することができる。しかも、アーキア由来のＤＮＡポリメラーゼ、とりわけファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは校正活性を有するため、誤塩基の取り込みによるエラー率は、０．００１〜０．０１％であり、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼに比べ、高い正確性を示す。したがって、本発明は、ＤＮＡの長断片を正確に増幅できるようになった点で極めて顕著な効果を奏するものである。
【００３７】
本発明の第二の側面は、ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチド及びベタイン（トリメチルグリシン）の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸合成を行うことを特徴とする核酸合成方法である。
【００３８】
ｄＵＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドの濃度の好ましい範囲は、核酸合成反応溶液において、下限として好ましくは０．００１ｎｇ／μｌであり、より好ましくは０．００５ｎｇ／μｌ、さらに好ましくは０．０１ｎｇ／μｌである。上限としては好ましくは１０ｎｇ／μｌであり、より好ましくは６ｎｇ／μｌ、さらに好ましくは４ｎｇ／μｌである。下限以下であれば、核酸合成のパフォーマンスの向上の効果があまり見られず、上限以上であってもそれ以上の際立った核酸合成のパフォーマンスの向上の効果が見られなくなる。
【００３９】
ベタインの濃度の好ましい範囲は、核酸合成反応溶液において、下限として好ましくは０．１Ｍ、より好ましくは０．５Ｍ、さらに好ましくは１Ｍである。上限として好ましくは５Ｍ、より好ましくは３Ｍ、さらに好ましくは２Ｍである。下限以下であれば、核酸合成のパフォーマンスの向上の効果があまり見られず、上限以上であってもそれ以上の際立った核酸合成のパフォーマンスの向上の効果が見られなくなる。
【００４０】
本核酸合成方法は、さらに必要により、ＤＮＡポリメラーゼ用の反応バッファー、基質である４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの混合物）溶液などの存在下で行われる。反応バッファーとしては、トリス−塩酸緩衝液、トリス−硫酸緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられるが、トリス−硫酸緩衝液が特に好ましい。濃度としては、１０〜２００ｍＭが好ましく、２０〜１００ｍＭがより好ましい。ｐＨとしては、７．０〜９．５の範囲が好ましく、７．５〜９．０の範囲がより好ましい。また、反応バッファー中には、１．０〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭの濃度でＭｇ２＋を含むことが好ましい。更には、ＫＣｌ等の塩を含んでいてもよい。また、必要に応じて、界面活性剤やその他の安定化剤を添加して行うことができる。
【００４１】
核酸合成方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法、ＩＣＡＮ法などが挙げられるが、ＰＣＲ法による核酸合成方法が好ましい。
【００４２】
ＰＣＲ法における、変性反応、アニーリング反応、伸長反応の各段階の温度及び時間、並びに反応サイクル数は当業者であれば適宜設定しうるものである。また、ＰＣＲ法を利用した、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲについても本発明は有効である。
【実施例１】
【００４３】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。
【００４４】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｄｉｃｕｓ  ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＳＩＲＶ）由来のｄＵＴＰａｓｅ（ＳＩＲＶ−ｄＵＴＰａｓｅ）のクローニングと該ｄＵＴＰａｓｅの取得
本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼ関連因子の１つであるＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ  ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ由来のｄＵＴＰａｓｅをコードする遺伝子（ＳＩＲＶ−ｄｕｔ）を以下の方法によってクローニングした。ＳＩＲＶ−ｄｕｔの塩基配列は４７４塩基対のオープンリィーディングフレームから構成されていることが報告されていた（非特許文献２）。そこで、我々は、１６組の人工合成プライマーを用いたＰＣＲ法にて目的配列を含むＤＮＡ断片の合成を行い、このＤＮＡ断片を鋳型にしたｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法にてＤＮＡ断片の連結を行い、目的のＤＮＡ鎖長を取得するに至った。
【００４５】
具体的には、ＳＩＲＶ−ｄｕｔ遺伝子のクローニングは３２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号３〜３４）とＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いたｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにて行った。まず、はじめに、［１］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１とｒ１６（配列番号３と３４）、［２］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ２とｒ１５（配列番号４と３３）、［３］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ３と  ｒ１４（配列番号５と３２）、［４］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ４とｒ１３（配列番号６と３１）、［５］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ５とｒ１２（配列番号７と３０）、［６］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ６と  ｒ１１（配列番号８と２９）、［７］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ７とｒ１０（配列番号９と２８）、［８］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ８とｒ９（配列番号１０と２７）、［９］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ９と  ｒ８（配列番号１１と２６）、［１０］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１０とｒ７（配列番号１２と２５）、［１１］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１１とｒ６（配列番号１３と２４）、［１２］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１２と  ｒ５（配列番号１４と２３）、［１３］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１３とｒ４（配列番号１５と２２）、［１４］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１４とｒ３（配列番号１６と２１）、［１５］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１５と  ｒ２（配列番号１７と２０）、［１６］ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１６とｒ１（配列番号１８と１９）の１６組のプライマーセットをアニーリングさせた後、伸長反応を行い、４５塩基対の２本鎖ＤＮＡ１６本を形成した（ＤＮＡ断片［１］〜［１６］、［１６］のみ３４塩基対）。
【００４６】
次に、（ａ）プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１とｒ１５，鋳型：ＤＮＡ断片［１］と［２］，（ｂ）プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ３とｒ１３，鋳型：ＤＮＡ断片［３］と［４］，（ｃ）プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ５とｒ１１，ＤＮＡ断片［５］と［６］，（ｄ）プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ７とｒ９，鋳型：ＤＮＡ断片［７］と［８］，（ｅ）プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ９とｒ７，鋳型：ＤＮＡ断片［９］と［１０］，（ｆ）プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１１とｒ５，ＤＮＡ断片［１１］と［１２］，（ｇ）プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１３とｒ３，  鋳型：ＤＮＡ断片［１３］と［１４］，（ｈ）プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１５とｒ１，鋳型：ＤＮＡ断片［１５］と［１６］、この８組のプライマー，ＤＮＡ断片を用いてＰＣＲを行い、７５塩基対の２本鎖ＤＮＡ８本を形成した（ＤＮＡ断片（ａ）〜（ｈ）、（ｈ）のみ６４塩基対）。
【００４７】
引続き、［１７］プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１とｒ１３，鋳型：ＤＮＡ断片（ａ）と（ｂ），［１８］プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ５とｒ９，鋳型：ＤＮＡ断片（ｃ）と（ｄ），［１９］プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ９とｒ５，鋳型：ＤＮＡ断片（ｅ）と（ｆ），［２０］プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１３とｒ１，鋳型：ＤＮＡ断片（ｇ）と（ｈ）、この４組のプライマー，ＤＮＡ断片を用いてＰＣＲを行い、１３５塩基対の２本鎖ＤＮＡ４本を形成した（ＤＮＡ断片（ａ）〜（ｈ）、（ｈ）のみ１２４塩基対）。さらに引続き、（ｉ）プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１とｒ９，鋳型：ＤＮＡ断片［１７］と［１８］，（ｊ）プライマー：ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ９とｒ１，鋳型：ＤＮＡ断片［１９］と［２０］、この２組のプライマー，ＤＮＡ断片を用いてＰＣＲを行い、２５５塩基対と２４４塩基対の２本鎖ＤＮＡ２本を形成した（ＤＮＡ断片（ｉ）と（ｊ））。最後に、ＳＩＲＶｄｕｔ  ｆ１とｒ１をプライマー，ＤＮＡ断片（ｉ）と（ｊ）を鋳型としてＰＣＲを行い、４７８塩基対の２本鎖ＤＮＡを形成した。
【００４８】
次に、発現プラスミドベクターを作製するために、ＳＩＲＶｄｕｔ  Ｎｄｅ１とＳＩＲＶｄｕｔ  Ｘｂａ１（配列番号３６と３７）をプライマー，先の４７８塩基対の２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅI，ＸｂａIで切断した後、予めＮｄｅI／ＮｈｅIにて切断したｐＥＴ１１ｃプラスミド（ノバジェン社製）に連結した。このクローニングしたプラスミドは、ＤＮＡシーケンシング解析にてＳＩＲＶ−ｄｕｔ遺伝子の塩基配列に変異が導入されていないことを確認した。このプラスミドをｐＤＵＴ（ＳＩＲＶ）と命名した。
【００４９】
ｐＤＵＴ（ＳＩＲＶ）を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ストラタジーン社製）を形質転換した後、ＬＢ培地にて３７℃で約２時間培養した。菌体の生育状態を確認するため、ＯＤ６６０が０．５〜１．０になっていることを確認した後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して、３７℃で更に約５時間発現誘導を行った。得られた培養液から菌体を回収し、菌体破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ｐＨ８、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁して超音波破砕した。この破砕懸濁液を加温処理（８０℃，３０分間）して、遠心分離により菌体破砕片を分離した後、終濃度で５０ｍＭ ＫＣｌと０．２％ポリエチレンイミンを添加して、室温で３０分間攪拌しながら除核酸処理を行った。この除核酸処理液に０．５飽和となるように硫安を添加して目的蛋白質を沈殿させた後、精製緩衝液１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ｐＨ８、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％ グリセロール）に再溶解した。この塩析再溶解液をＧ−２５カラムにて脱塩した後、へパリンクロマトに吸着して、精製緩衝液１をベースに２００〜１０００ｍＭのグラジエントにて目的蛋白質を溶出分画した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてＳＩＲＶ−ｄＵＴＰａｓｅの予想分子量（１８ｋＤ）付近に溶出されている画分をプールして、まず、緩衝液２（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ｐＨ８、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％ グリセロール、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、０．００１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）で透析した。次に、十分量の最終形状緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ｐＨ８、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ グリセロール、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、０．００１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）により数回透析して、評価用のＳＩＲＶ−ｄＵＴＰａｓｅ精製標品を取得した。
【実施例２】
【００５０】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来のｄＵＴＰａｓｅ（ＫＯＤ−ｄＵＴＰａｓｅ）のクローニングと該ｄＵＴＰａｓｅの取得
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来のｄＵＴＰａｓｅについては、コードする遺伝子（ＫＯＤ−ｄｕｔ）を以下の方法によってクローニングした。すなわち、公共データベースに公開されているＫＯＤ−ｄｕｔの塩基配列（データベース名：ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッションＮｏ.  ＮＣ＿００６６２４）を参考に、クローニング用のＰＣＲプライマー：ＫＯＤｄｕｔ  ｆ１とｒ１（配列番号３８と３９）を合成した。なお、ＫＯＤｄｕｔ  ｆ１には、増幅断片の移し変えを容易にするために、その５’端にＮｄｅＩの制限酵素サイトを付加した。ＰＣＲは、これらのプライマーとＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いて、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来のゲノミックＤＮＡを鋳型にして実施した。次に、得られた増幅産物を、ＴＡｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてベクターｐＴＡ２（東洋紡績社製）にＴＡクローニングを行った。得られたプラスミド（ｐＴＡ２−ＫＯＤ−ｄｕｔ）は、ＤＮＡシーケンシングにより、塩基配列の確認を行い、目的のＫＯＤ−ｄｕｔ遺伝子がクローニングされていることを確認した。
【００５１】
次に、発現プラスミドベクターを作製するために、ＫＯＤ−ｄｕｔ遺伝子をｐＴＡ２−ＫＯＤ−ｄｕｔから、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩにて切り出し、予めＮｄｅI／ＢａｍＨＩにて切断したｐＥＴ１４ｂプラスミド（ノバジェン社製）にサブクローニングした。このプラスミドをｐＤＵＴ（ＫＯＤ）と命名した。このｐＤＵＴ（ＫＯＤ）を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した後、実施例１と同様の精製方法にて酵素の精製を行い、ＫＯＤ−ｄＵＴＰａｓｅの精製標品を取得した。
【実施例３】
【００５２】
ｄＵＴＰａｓｅ及びベタインによる核酸増幅効果
実施例１で得られたＳＩＲＶ−ｄＵＴＰａｓｅおよび実施例２で得られたＫＯＤ−ｄＵＴＰａｓｅを用いて、ヒトゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ／５０μｌ）を鋳型とした様々な鎖長の遺伝子領域をターゲットとしたＰＣＲを行い、ｄＵＴＰａｓｅとベタインのＰＣＲ反応への添加効果の評価を行った。ターゲットとしては、ＨＢｇ（ヒトβ-グロビン）遺伝子領域の３．６ｋｂｐ、８．５ｋｂｐ、１７．５ｋｂｐ、３２ｋｂｐおよびｔＰＡ（ヒトティッシュープラスミノーゲンアクチベーター）遺伝子領域の２４ｋｂｐを用いた。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｖｅｒ.２（東洋紡績社製）を用いて、表１に示すような反応組成にて、表２に示すプライマーセットとＰＣＲサイクル条件によりＰＣＲを行った。
【００５３】
比較例として、添加剤なし、ＳＩＲＶ−ｄＵＴＰａｓｅのみを添加した場合、ＫＯＤ−ｄＵＴＰａｓｅのみを添加した場合、及び１．５Ｍベタインのみを添加した場合についても、同様に試験を行った。
【００５４】
ＰＣＲは、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００；アプライドバイオシステムズ）を用いて行い、ＰＣＲ反応終了後４℃で保持した。その後、ＰＣＲ産物５μｌを１％アガロース電気泳動に供して、目的のターゲットが増幅されているかの確認を行った。これらの結果を表３、及び図１に示す。
【００５５】
【表１】
2010213689.tif 000002
【００５６】
【表２】
2010213689.tif 000003
【００５７】
【表３】
2010213689.tif 000004
【００５８】
表３及び図１から分かる通り、添加剤なしの組成物では、８．５ｋｂｐの核酸の増幅ができなかった。さらに、ｄＵＴＰａｓｅあるいはベタインを各々単独で添加した条件では、８．５ｋｂｐを確実に増幅できるようになるものの、１７．５ｋｂｐや２４ｋｂｐのようなさらに長いターゲットでは、全く増幅できないか、あるいは、微弱な増幅のみが見られた。
【００５９】
これに対し、ｄＵＴＰａｓｅ及びベタインを同時に添加した条件では、１７．５ｋｂｐ及び２４ｋｂｐの増幅に加え、３２ｋｂｐの増幅産物までもが得られるようになることが確認された。また、８．５ｋｂｐの増幅からわかるように、ｄＵＴＰａｓｅとベタインを共存させた場合、各々単独で添加した場合と比較して、増幅産物のバンドが非常に強くなっており、増幅効率が大きく向上していることが示された。このように、ｄＵＴＰａｓｅ及びベタインを同時に作用させることで、ＤＮＡの増幅効率、及び増幅可能なターゲットのサイズが飛躍的に向上することが確認できた。アーキア由来のＤＮＡポリメラーゼ、特にファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、３’−５' エキソヌクレアーゼ活性を示し校正活性を有することから、ＤＮＡ合成における極めて高い正確性を示す。本発明が、ＤＮＡの長断片を正確に合成する点で、従来にはない効果を奏することが示された。
【実施例４】
【００６０】
ＳＩＲＶ−ｄＵＴＰａｓｅ及びＫＯＤ−ｄＵＴＰａｓｅによる長核酸断片の核酸増幅効果の再確認
実施例２で得られたＫＯＤ−ｄＵＴＰａｓｅ、及び実施例１で得られたＳＩＲＶ−ｄＵＴＰａｓｅを用いて、再度実施例３と同様の条件にてヒトゲノムＤＮＡを鋳型にＨＢｇ遺伝子（３２ｋｂｐ）をターゲットとするＰＣＲを行なった。
【００６１】
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ産物５μｌを１％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図２に示した。ＫＯＤ−ｄＵＴＰａｓｅを用いた場合でも、ＳＩＲＶ−ｄＵＴＰａｓｅを用いた場合と同様に、ベタイン単独では増幅が見られない３２ｋｂｐの増幅が可能となり、ｄＵＴＰａｓｅとベタインとを共存させることにより確実に増幅可能サイズを向上させうることが確認できる。また、ＫＯＤ−ｄＵＴＰａｓｅとＳＩＲＶ−ｄＵＴＰａｓｅで、その効果に殆ど差は見られないことから、ｄＵＴＰａｓｅとベタインとの共存によるＰＣＲパフォーマンスを格段に向上させる本効果は、これら２種類のｄＵＴＰａｓｅに限らず、他のｄＵＴＰａｓｅ、なかでも、特にアーキア由来の耐熱性を有するｄＵＴＰａｓｅであれば、同様な効果を得ることができると推測される。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、従来から知られている核酸合成方法と比べて、増幅効率に優れ、長いサイズのターゲットＤＮＡの増幅に関しても良好な増幅を示すことから、分子生物学の研究分野はもとより、遺伝子診断、法医学、食品や環境中の微生物検査等の幅広い分野において利用されることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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