(57)【要約】【課題】新規リボスイッチ、その使用方法、ならびにリボスイッチとともに用いるための組成物の提供。【解決手段】ある種の天然ｍＲＮＡは代謝産物感受性遺伝子スイッチとして役立つ、ということが発見されたが、この場合、ＲＮＡは小有機分子と直接結合する。この結合過程はｍＲＮＡの立体配座を変え、これが種々の異なるメカニズムにより遺伝子発現の変化を引き起こす。これらの天然「リボスイッチ」の修飾バージョン（種々の核酸工学処理戦略を用いて作製される）は、特定のエフェクター化合物により制御されるデザイナー遺伝子スイッチとして用いられ得る。リボスイッチを活性化するこのようなエフェクター化合物は、本明細書中ではトリガー分子と呼ばれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料およびリボスイッチを接触させることを包含する当該化合物の検出方法であって、当該化合物により活性化されるとリボスイッチがシグナルを生じ、試料が当該化合物を含有する場合にリボスイッチがシグナルを生じる前記方法。
【請求項２】
前記化合物により活性化されるとリボスイッチが立体配座を変え、立体配座の変化が立体配座依存性標識によりシグナルを生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物により活性化されるとリボスイッチが立体配座を変え、立体配座の変化がリボスイッチに連結されたＲＮＡの発現の変化を引き起こし、発現の変化がシグナルを生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リボスイッチに連結されたＲＮＡから発現されるレポータータンパク質によりシグナルが生成される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子発現の抑制方法であって、化合物および細胞を接触させる方法であり、この場合、当該化合物が以下の構造：
【化１】
2010213712.tif 000012
｛式中、化合物がグアニン応答リボスイッチに結合される場合、Ｒ7は水素結合受容体として役立ち、Ｒ10は水素結合供与体として役立ち、Ｒ11は水素結合受容体として役立ち、Ｒ12は水素結合供与体として役立ち、
Ｒ13はＨ、Ｈ2であるかまたは存在せず、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、Ｃ、Ｎ、ＯまたはＳであり、
【化２】
2010213712.tif 000013
は、各々独立して、一重または二重結合を表す。｝
を有し、
当該化合物はグアニン、ヒポキサンチンまたはキサンチンではなく、
当該細胞がグアニン応答リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、当該化合物がグアニン応答リボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。
【請求項６】
遺伝子発現の抑制方法であって、化合物および細胞を接触させる方法であり、この場合、当該化合物が以下の構造：
【化３】
2010213712.tif 000014
｛式中、化合物がアデニン応答リボスイッチに結合される場合、Ｒ1、Ｒ3およびＲ7は水素結合受容体として役立ち、そしてＲ10およびＲ11は水素結合供与体として役立ち、
Ｒ13はＨ、Ｈ2であるかまたは存在せず、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、Ｃ、Ｎ、ＯまたはＳであり、
【化４】
2010213712.tif 000015
は、各々独立して、一重または二重結合を表す。｝
を有し、
当該化合物はアデニン、２，６−ジアミノプリンまたは２−アミノプリンではなく、
当該細胞がアデニン応答リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、当該化合物がアデニン応答リボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。
【請求項７】
遺伝子発現の抑制方法であって、化合物および細胞を接触させる方法であり、この場合、当該化合物が以下の構造：
【化５】
2010213712.tif 000016
｛式中、Ｒ2およびＲ3は各々正に荷電され、
Ｒ1は負に荷電され、
Ｒ4はＣ、Ｎ、ＯまたはＳであり、
【化６】
2010213712.tif 000017
は、各々独立して、一重または二重結合を表す。｝
を有し、
当該化合物がリジンではなく、
当該細胞がリジン応答リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、当該化合物がリジン応答リボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。
【請求項８】
Ｒ2およびＲ3が各々ＮＨ3+であり、そしてＲ1がＯ-である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子発現の抑制方法であって、化合物および細胞を接触させる方法であり、この場合、当該化合物が以下の構造：
【化７】
2010213712.tif 000018
｛式中、Ｒ1は正に荷電され、
Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、Ｃ、ＯまたはＳであり、
Ｒ4はＣＨ3、ＮＨ2、ＯＨ、ＳＨ、Ｈであるかまたは存在せず、
Ｒ5はＣＨ3、ＮＨ2、ＯＨ、ＳＨまたはＨであり、
Ｒ6はＣまたはＮであり、
【化８】
2010213712.tif 000019
は、各々独立して、一重または二重結合を表す。｝
を有し、
当該化合物がＴＰＰ、ＴＰまたはチアミンではなく、
当該細胞がチアミンピロリン酸応答リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、当該化合物がチアミンピロリン酸応答リボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。
【請求項１０】
Ｒ1がホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
以下のステップ：
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現を抑制するための化合物を試験し、この場合、抑制はリボスイッチにより、
（ｂ）細胞と、過程（ａ）における遺伝子発現を抑制した化合物とを接触させることにより遺伝子発現を抑制する
を含む方法であって、上記細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、上記化合物がリボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する前記方法。
【請求項１２】
リボスイッチの同定方法であって、以下のステップ：
化合物の存在および不存在下でＲＮＡ分子の直列自発的切断を査定する
を含み、
上記ＲＮＡ分子が当該化合物により調節された遺伝子によりコードされ、
上記ＲＮＡ分子の直列自発的切断のパターンの変化がリボスイッチを示す前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する引照
本出願は、米国特許仮出願第60/412,468号（2002年9月20日提出）の利益を主張する。米国特許仮出願第60/412,468号（2002年9月20日提出）は、その記載内容が参照により本明細書中で援用される。
【０００２】
連邦政府支援研究に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所National Institutes of Healthにより授与される補助金NIH GM48858およびNIH GM559343ならびに米国国立科学財団National Science Foundationにより授与される補助金NSF EIA-0129939下での政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
産業上の利用分野
本発明は一般的に、遺伝子発現の分野に、特に遺伝子発現の調節の領域にある。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
細胞は、種々の遺伝子発現パターンによる多数の生化学的シグナルおよび環境的合図に応答しなければならないので、精確な遺伝子制御は生体系の不可欠な特徴である。遺伝子制御のほとんどの既知のメカニズムは、化学的または物理的刺激を感知し、そして次に関連ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ配列との選択的相互作用により遺伝子発現を変調するタンパク質因子の使用を包含する。タンパク質は、複雑な形状をとり、生体系にそれらの化学的および物理的環境を精確に感知させる種々の機能を実行し得る。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には、転写開始を変調するためにＤＮＡを結合することにより（例えばｌａｃリプレッサータンパク質；Matthews, K.S., and Nichols, J.C., 1998, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 58, 127-164）、あるいは転写終結（例えばＰｙｒＲタンパク質；Switzer, R.L., et al., 1999, Progl. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 62, 329-367）または翻訳（例えばＴＲＡＰタンパク質；Babitzke, P., and Gollnick, P., 2001, J. Bacteriol. 183, 5795-5802）を制御するためにＲＮＡを結合することにより作用する。タンパク質因子は、種々のメカニズム、例えばアロステリック変調または翻訳後修飾により環境刺激に応答し、そしてこれらのメカニズムの採用時に、高応答性遺伝子スイッチとして役立つよう適合される（例えばPtashne, M., and Gann, A. (2002). Genes and Signals. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY参照）。
【０００５】
遺伝子制御におけるタンパク質因子の広範囲に及ぶ関与のほかに、ＲＮＡが遺伝子調節において活発な役割を受け持ち得る、ということも既知である。近年の研究は、小非コードＲＮＡが破壊のためのｍＲＮＡの選択的ターゲッティングに働いて、これが遺伝子発現の下向き調節を生じる、という実質的役割を明らかにし始めている（例えばHannon, G.J. 2002, Nature 418, 244-251およびその中の参考文献参照）。ＲＮＡ干渉のこの方法は、ワトソン−クリック塩基相補性により選択的に意図されたｍＲＮＡ標的を認識し、その後、結合ｍＲＮＡがタンパク質の作用により破壊される短ＲＮＡの能力を利用する。新規のしかし高度に特異的なＲＮＡ結合部位を有するタンパク質因子を生成することよりも、進化過程により新しい標的特異的ＲＮＡ因子を生成することの方がはるかに容易であるため、ＲＮＡはこの系における分子認識のための理想的作用物質である。
【０００６】
タンパク質は、生物学が酵素、受容体および構造的機能に関して有するほとんどの要件を満たすが、しかしＲＮＡもこれらの能力に役立ち得る。例えばＲＮＡは、かなりの酵素力および精確な分子認識を示す多数のリボザイムドメイン（Cech & Golden, Building a catalytic active site using only RNA. In: The RNA World R.F. Gesteland, T.R. Cech, J.F. Atkins, eds., pp. 321-350 (1998); Breaker, In vitro selection of catalytic polynucleotides. Chem. Rev. 97, 371-390 (1997)）および受容体ドメイン（Osborne & Ellington, Nucleic acid selection and the challenge of combinatorial chemistry. Chem. Rev. 97, 349-370 (1997); Hermann & Patel, Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science 287, 820-825 (2000)）を形成するのに十分な構造的可塑性を有する。さらにこれらの活性は、エフェクター分子により選択的に変調されるアロステリックリボザイム（Soukup & Breaker, Engineering precision RNA molecular switches. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3584-3589 (1999); Seetharaman et al., Immobilized riboswitches for the analysis of complex chemical and biological mixtures. Nature Biotechnol. 19, 336-341 (2001)）を作製するために組合され得る。
【０００７】
ＲＮＡのこれらの特性は、ある種のｍＲＮＡがアロステリックメカニズムを用いて特定の代謝産物の存在に対する遺伝子調節性応答を提供し得る、という見解（Gold et al., From oligonucleotide shapes to genomic SELEX: novel biological regulatory loops. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 59-64 (1997); Gold et al., SELEX and the evolution of genomes. Curr. Opin. Gen. Dev. 7, 848-851 (1997); Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000); Gelfand et al., A conserved RNA structure element involved in the regulation of bacterial riboflavin synthsis genes. Trends Gen. 15, 439-442 (1999); Miranda-Rios et al., A conserved RNA structure (thi box) is involved in regulation of thiamin biosynthetic gene expression in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9736-9741 (2001); Stormo & Ji, Do mRNAs act as direct sensors of small molecules to control their expression? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9465-9467 (2001)）と一致する。チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）依存性センサー／調節タンパク質はチアミン生合成遺伝子の制御に関与すると提唱されている（Webb & Downs, Characterization of thiL, encoding thiamin-monophosphate kinase, in Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem. 272, 15702-15707 (1997)）が、しかしこのようなタンパク質因子は存在することが示されていない。
【０００８】
枯草菌B. subtilusのｌｙｓＣ遺伝子の転写は高濃度のリジンにより抑制される（Kochhar, S., and Paulus, H. 1996, Microbiol. 142: 1635-1639; Mader, U., et al., 2002, J. Bacteriol. 184: 4288-4295; Patte, J.C. 1996. Biosynthesis of lysine and threonine. In: Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, F.C. Neidhardt, et al., eds., Vol. 1, pp. 528-541. ASM Press, Washington, DC; Patte, J.-C., et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 169: 165-170）が、しかし遺伝子調節物質として役立つタンパク質因子は同定されていない（Liao, H.-H., and Hseu, T.-H. 1998, FEMS Microbiol. Lett. 168: 31-36）。ｌｙｓＣ遺伝子は、Ｌ−アスパラギン酸をＬ−リジンに転換する代謝経路における第一段階を触媒するアスパルトキナーゼＩＩをコードする（Belitsky, B.R. 2002. Biosynthesis of amino acids of the glutamate and aspartate families, alanine, and polyamines. In: Bacillus subtilis and its Closest Relatives: form Genes to Cells. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch, and R. Losick, eds., ASM Press, Washington, D.C.）。
【発明の概要】
【０００９】
発明の要約
ある種の天然ｍＲＮＡは代謝産物感受性遺伝子スイッチとして役立つ、ということが発見されたが、この場合、ＲＮＡは小有機分子を直接結合する。この結合過程はｍＲＮＡの立体配座を変え、これが種々の異なるメカニズムにより遺伝子発現の変化を引き起こす。これらの天然「リボスイッチ」の修飾バージョン（種々の核酸工学処理戦略を用いて作製される）は、特定のエフェクター化合物により制御されるデザイナー遺伝子スイッチとして用いられ得る。リボスイッチを活性化するこのようなエフェクター化合物は、本明細書中ではトリガー分子と呼ばれる。天然スイッチは、抗生物質およびその他の小分子療法のための標的である。さらにリボスイッチの構成は、天然スイッチの実際の小片を新規の非免疫原性遺伝子制御素子を構築するために用いさせ、例えばアプタマー（分子認識）ドメインは、新規の認識ドメインがユーザー定義エフェクター化合物による遺伝子変調を引き起こすよう、他の非天然アプタマーと交換され得る（またはそうでなければ修飾される）。変更スイッチは、治療レジメンの一部となる（タンパク質合成を開始させるかまたは停止し、あるいは調節する）。新規構築遺伝子調節ネットワークは、生体バイオセンサー、生物体の代謝工学処理のような領域に、ならびに改良型の遺伝子療法治療に適用され得る。
【００１０】
単離および組換えリボスイッチ、このようなリボスイッチを含有する組換え構築物、このようなリボスイッチと操作可能的に連結される非相同配列、ならびにこのようなリボスイッチ、リボスイッチ組換え構築物および非相同配列と操作可能的に連結されるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物が開示される。非相同配列は、例えば当該タンパク質またはペプチド、例えばレポータータンパク質またはペプチドをコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然リボスイッチであるかまたはそれらに由来する。
【００１１】
非相同アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含有するキメラリボスイッチも開示される。即ちキメラリボスイッチは、ある供給源からのアプタマードメインおよび別の供給源からの発現プラットフォームドメインから成る。非相同供給源は、例えば異なる特定のリボスイッチまたは異なる種類のリボスイッチからである。非相同発現プラットフォームドメインは、非リボスイッチ供給源からも生じ得る。
【００１２】
リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断し得る化合物を選択または同定するための組成物および方法も開示される。リボスイッチの活性化は、トリガー分子の結合時のリボスイッチの状態の変化を指す。リボスイッチは、トリガー分子以外の化合物により、そしてトリガー分子の結合以外の方法で活性化され得る。トリガー分子という用語は、本明細書中では、リボスイッチを活性化し得る分子および化合物を指すために用いられる。これは、リボスイッチおよびリボスイッチを活性化しうるその他の化合物のための天然または正常トリガー分子を含む。天然または正常トリガー分子は、事実上、またはいくつかの非天然リボスイッチの場合における所定のリボスイッチのためのトリガー分子、リボスイッチが意図されるかまたはリボスイッチが選択されたトリガー分子（例えばin vitro選択でまたはin vitro進化技術で）である。非天然トリガー分子は、非天然トリガー分子として言及され得る。
【００１３】
リボスイッチの非活性化は、トリガー分子が結合されない場合のリボスイッチの状態の変化を指す。リボスイッチは、トリガー分子以外の化合物の結合により、そしてトリガー分子の除去以外の方法で非活性化され得る。リボスイッチの遮断は、トリガー分子の存在がリボスイッチを活性化しないリボスイッチの条件または状態を指す。
【００１４】
リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断し得る化合物およびこのような化合物を含有する組成物も開示される。リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断するための組成物および方法も開示される。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去により遺伝子発現を制御するよう機能する。化合物は、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断するために用いられ得る。リボスイッチのためのトリガー分子（ならびにその他の活性化化合物）は、リボスイッチを活性化するために用いられ得る。トリガー分子以外の化合物は一般に、リボスイッチを非活性するかまたは遮断するために用いられ得る。リボスイッチは、例えばリボスイッチの存在からトリガー分子を除去することによっても非活性化され得る。リボスイッチは、例えばリボスイッチを活性化しないトリガー分子の類似体の結合により遮断され得る。
【００１５】
化合物をＲＮＡ分子と接触させることにより、ＲＮＡ分子（この場合、ＲＮＡ分子はリボスイッチを含む）の、またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変更するための組成物および方法も開示される。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去により遺伝子発現を制御するよう機能する。したがってリボスイッチを含む当該ＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する条件に付すことは、ＲＮＡの発現を変更するために用いられ得る。発現は、例えば転写の終結の、またはＲＮＡと結合するリボソームの遮断の結果として変更され得る。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質によって、ＲＮＡ分子の発現を低減するか又は防止し、あるいはＲＮＡ分子の発現を促進するかまたは増大し得る。
【００１６】
リボスイッチをＲＮＡ分子と操作可能的に連結することにより、ＲＮＡ分子の、またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を調節するための組成物および方法も開示される。リボスイッチは、適切な方法で、例えばリボスイッチをＲＮＡ分子と物理的につなぐことにより、あるいは工学処理核酸から産生されるＲＮＡがＲＮＡ分子に操作可能的に連結されたリボスイッチを有するようＲＮＡ分子をコードする核酸を工学処理することにより、ＲＮＡ分子と操作可能的に連結され得る。当該ＲＮＡ分子と操作可能的に連結されたリボスイッチを、リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断する条件に付すことは、ＲＮＡの発現を変更するために用いられ得る。
【００１７】
リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断することにより、リボスイッチを含有する天然遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための組成物および方法も開示される。遺伝子がそれを保有する細胞または生物体の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化または遮断は、細胞または生物体の死、静止、衰弱において存在する。例えば微生物の生存に不可欠な天然遺伝子中の天然リボスイッチの活性化は、微生物の死を引き起こし得る（リボスイッチの活性化が発現を止めるかまたは抑制する場合）。これは、抗菌および抗生物質作用のための開示化合物および方法の使用の一基礎である。
【００１８】
リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断することにより、リボスイッチを含有する単離、工学処理または組換え遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための組成物および方法も開示される。遺伝子またはＲＮＡは、任意の方法で工学処理されるか、あるいは組換え体であり得る。例えばＲＮＡのリボスイッチおよびコード領域は非相同であり、リボスイッチは組換え体またはキメラまたはその両方であり得る。遺伝子が所望の発現産物をコードする場合、リボスイッチの活性化または不活性化は、遺伝子の発現を誘導し、したがって発現産物の産生を生じるために用いられ得る。遺伝子が遺伝子発現のまたは別の細胞過程の誘導物質またはリプレッサーをコードする場合、リボスイッチの活性化、非活性化または遮断は、他の調節された遺伝子または細胞過程の誘導、抑制または脱抑制を生じ得る。多数のこのような二次調節作用は既知であり、そしてリボスイッチとともに用いるために適合され得る。このような調節のための一次制御としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小非抗原性分子であり得る点である。
【００１９】
アプタマードメインをリボスイッチ（キメラリボスイッチである）の発現プラットフォームドメインと操作可能的に連結することによりリボスイッチの調節を変更するための組成物および方法も開示される。アプタマードメインは次に、例えばアプタマードメインのためのトリガー分子の作用により、リボスイッチの調節を媒介する。アプタマードメインは、任意の適切な方法で、例えばリボスイッチの正常または天然アプタマードメインを新規のアプタマードメインで置換することにより、リボスイッチの発現プラットフォームドメインに操作可能的に連結され得る。一般に、アプタマードメインが得られるリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断し得る任意の化合物または条件を用いて、キメラリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断し得る。
【００２０】
リボスイッチを共有的に変更することにより（例えばリボスイッチの一部を架橋するかまたは化合物をリボスイッチとカップリングすることにより）リボスイッチを不活性化するための組成物および方法も開示される。この方法におけるリボスイッチの不活性化は、例えばリボスイッチのためのトリガー分子が結合するのを防止する、トリガー分子の結合時のリボスイッチの状態の変化を防止する、あるいはトリガー分子の結合時にリボスイッチの発現プラットフォームドメインが発現に影響を及ぼさないようにする変更に起因し得る。
【００２１】
リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する化合物の同定方法も開示される。例えばリボスイッチを活性化する化合物は、試験化合物およびリボスイッチを接触させ、そしてリボスイッチの活性化を査定することにより同定され得る。リボスイッチが活性化された場合、試験化合物は、リボスイッチを活性化する化合物として同定される。リボスイッチの活性化は、任意の適切な方法で査定され得る。例えばリボスイッチは、レポーターＲＮＡに連結され、そしてレポーターＲＮＡの発現、発現レベルまたは発現レベルの変化が、試験化合物の存在下および非存在下で査定され得る。別の例として、リボスイッチは立体配座依存性標識を含み、それからのシグナルはリボスイッチの活性状態によって変化する。このようなリボスイッチは、好ましくは天然リボスイッチからのまたはそれに由来するアプタマードメインを用いる。観察され得るように、リボスイッチの活性化の査定は、制御検定または測定の使用により、あるいは制御検定または測定を用いずに実施され得る。リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法は、類似の方法で実施され得る。
【００２２】
リボスイッチを遮断する化合物の同定は、任意の適切な方法で成し遂げられ得る。例えば検定は、リボスイッチを活性化するかまたは非活性化することが既知の化合物の存在下で、そして試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を査定するために実施され得る。試験化合物の非存在下で観察されるのと同様に活性化または非活性化が観察されない場合には、試験化合物はリボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定される。
【００２３】
バイオセンサーリボスイッチも開示される。バイオセンサーリボスイッチは、それらのコグネイトトリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを生成する工学処理リボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値レベルまたはそれより上で誘発され得る。バイオセンサーリボスイッチは、in vivoまたはin vitroでの使用のために意図され得る。例えばシグナルとして役立つかまたはシグナル生成に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡと操作可能的に連結されるバイオセンサーリボスイッチは、リボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有するよう細胞または生物体を工学処理することにより、in vivoで用いられ得る。in vitroで用いるためのバイオセンサーリボスイッチの一例は、それからのシグナルがリボスイッチの活性化状態によって変化する立体配座依存性標識を含むリボスイッチである。このようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは天然リボスイッチからのまたはそれに由来するアプタマーを用いる。バイオセンサーリボスイッチを用いた化合物の検出方法も開示される。当該方法は、試験試料およびバイオセンサーリボスイッチを接触させ、そしてバイオセンサーリボスイッチの活性化を査定することを包含し得る。バイオセンサーリボスイッチの活性化は、試験試料中のバイオセンサーリボスイッチのためのトリガー分子の存在を示す。
【００２４】
リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する化合物を同定し、同定化合物を製造することにより作られる化合物も開示される。これは、例えば本明細書中の別の箇所に開示されたような化合物同定方法を、同定化合物の製造方法と組合せることにより成し遂げられ得る。例えば化合物は、試験化合物およびリボスイッチを接触させ、リボスイッチの活性化を査定し、そしてリボスイッチが試験化合物により活性化される場合には、化合物としてリボスイッチを活性化する試験化合物を製造することにより作られ得る。
【００２５】
化合物によりリボスイッチの活性化、非活性化または遮断を点検し、点検化合物を製造することにより作られる化合物も開示される。これは、例えば本明細書中の別の箇所に開示されたような化合物活性化、非活性化または遮断査定方法を、点検化合物の製造方法と組合せることにより成し遂げられ得る。例えば化合物は、試験化合物およびリボスイッチを接触させ、リボスイッチの活性化を査定し、そしてリボスイッチが試験化合物により活性化される場合には、化合物としてリボスイッチを活性化する試験化合物を製造することにより作られ得る。リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断するそれらの能力に関する化合物の点検は、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断することが前に既知でない化合物の同定を、そして化合物がリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断することがすでに既知であった場合のリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する化合物の能力を査定することの両方を指す。
【００２６】
新規のトリガー分子を認識する新規のリボスイッチおよび／または新規のアプタマーを選択し、設計し、または誘導するための方法も開示される。このような方法は、リボスイッチ中の一組のアプタマー変異体の産生、当該化合物の存在下での変異体リボスイッチの活性化の査定、活性化された変異体リボスイッチ（あるいは例えば最も高度にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ）の選択、ならびに所望の活性、特異性、活性および特異性の組合せ、あるいはその他の特性の組合せを有する変異体リボスイッチが生じるまでこれらの過程を反復することを包含する。これらの方法により産生されるリボスイッチおよびアプタマードメインも開示される。
【００２７】
開示リボスイッチ、例えばその誘導体および組換え形態は一般に、任意の供給源、例えば天然リボスイッチおよびde novoで設計されたリボスイッチからであり得る。任意のこのようなリボスイッチは、開示方法においてまたは開示方法とともに用いられ得る。しかしながら異なる型のリボスイッチが定義され、そしていくつかのこのような亜型は特定の方法（一般に本明細書中の別の箇所に記載されているような）において、または特定の方法を伴って有用であり得る。リボスイッチの型としては、例えば天然リボスイッチ、天然リボスイッチの誘導体および修飾形態、キメラリボスイッチおよび組換えリボスイッチが挙げられる。天然リボスイッチは、現実に見出されるようなリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。このような天然リボスイッチは、それが現実に生じるような、単離または組換え形態の天然リボスイッチであり得る。即ちリボスイッチは同一一次構造を有するが、しかし新規の遺伝子または核酸情況において単離されたかまたは工学処理されている。キメラリボスイッチは、例えばリボスイッチの任意のまたは特定のクラスまたは型のリボスイッチの一部、ならびにリボスイッチの同一のまたは任意の異なるクラスまたは型の異なるリボスイッチの一部、任意のまたは特定のクラスまたは型のリボスイッチの一部、ならびに任意の非リボスイッチ配列または構成成分から作製され得る。組換えリボスイッチは、新規の遺伝子または核酸情況で単離されたかまたは工学処理されたリボスイッチである。
【００２８】
異なるクラスのリボスイッチは、同一または類似のトリガー分子を有するリボスイッチ、あるいは同一または類似の全体構造（予測、確定または組合せ）を有するリボスイッチを指す。同一クラスのリボスイッチは一般に同一または類似トリガー分子、ならびに同一または類似全体構造の両方を有するが、しかしそうである必要はない。
【００２９】
開示された方法および組成物の付加的利点は、一部は以下の説明に記述されており、そして一部はその説明から理解され、あるいは開示された方法および組成物の実行により学習され得る。開示された方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲に特定的に指摘された素子および組合せにより実現され、獲得される。上記の一般的説明および火気の詳細な説明はともに本発明の例示および解説に過ぎず、特許請求されたように本発明を限定するものではない、と理解されるべきである。
【００３０】
本明細書に組入れられそしてその一部を構成する添付の図面は、開示された方法および組成物のいくつかの実施形態を説明と一緒に示しており、開示された方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡの２０２−ヌクレオチドリーダー配列における代謝産物依存性立体配座変化を示す。図１Ａは、変性10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いたｂｔｕＢリーダーの自発的ＲＮＡ切断産物の分離を示す。５’−３２ｐ標識ｍＲＮＡリーダー分子（矢印）を、20 μMのＡｄｏＣｂ１の存在下（＋）または非存在下（−）で、20 mMのＭｇＣｌ2、50 mMのトリス−ＨＣｌ（25℃でｐＨ8.3）中で25℃で41時間インキュベートした。無反応、アルカリによる部分消化およびＲＮアーゼＴ１による部分消化を受けた（Ｇ特異的切断）ＲＮＡを含有するレーンは、それぞれＮＲ、-ＯＨおよびＴ１により同定される。選定グアノシン残基後の切断を表す生成物帯域の位置を、中黒矢頭により同定する。明青色矢頭標識１〜８は、自発的ＲＮＡ切断の割合の増大または低減を経験するエフェクター誘導性構造変調を示す9つの位置のうちの8つを同定する。リン光画像解析装置（Molecular Dynamics）を用いて画像を生成し、そしてImageQuantソフトウェアを用いることにより切断収量を定量した。図１Ｂは、ＡｄｏＣｂ１の存在下でのｂｔｕＢ  ｍＲＮＡの２０２−ヌクレオチドリーダー配列に関する配列および二次構造モデルを示す。推定塩基対合素子をＰ１〜Ｐ９と呼ぶ。偽結び目を形成する能力を有するＰ４およびＰ９のループ中の相補的ヌクレオチドを並置する。明青色矢頭により、構造変調の9つの特定部位を同定する。星印は、Ｂ12ボックス（ヌクレオチド１４１〜１６２）の境界を定める。開始コドン（ヌクレオチド２４１〜２４３）の５’にじかに接して存在するコード領域および38ヌクレオチドは、２０２−ヌクレオチド断片中に含まれなかった。３１５−ヌクレオチド断片は、２０２−ヌクレオチド断片、リーダー配列の残りの38ヌクレオチド、ならびにコード領域の最初の75ヌクレオチドを含む。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡリーダーがＡｄｏＣｂ１に関する飽和性結合部位を形成することを示す。図２Ａは、部位１（Ｇ２３）および部位２（Ｕ６８）により表されるようなＡｄｏＣｂ１エフェクターの濃度へのｂｔｕＢ  ｍＲＮＡリーダーの自発的切断の依存度を示す。図１の短い説明に記載したように、５’−32Ｐ標識ｍＲＮＡリーダー分子をインキュベートし、分離し、分析した。当該分子は示したような同一対照およびマーカーレーンを含む。インキュベーションは、10 nM〜100 μMの範囲のＡｄｏＣｂ１の濃度を含有する（レーン１〜８）か、またはＡｄｏＣｂ１を含まなかった（−）。図２Ｂは、ＡｄｏＣｂ１の濃度（ｃ）の対数に対するｍＲＮＡリーダーに沿った6つの位置で切断されたＲＮＡの分画の複合プロットを示す。ＡｄｏＣｂ１の非存在下でのインキュベーション時に得られた値を含めて各位置に関して測定された最高および最低切断値と比較して、分画切断値を正規化した。差込図は6つの部位の各々に関して用いられる記号を明示するが、一方、残り3つの部位は、弱いかまたは不明瞭な切断帯域のため、分析から排除した。中黒および中白記号は、ＡｄｏＣｂ１の濃度の増大時の、それぞれ増大および低減切断収量を表す。破線は、半最大構造的変調を生成するために必要な濃度により予測した場合の、〜300 ｎMのＫDを示す。プロットされたデータは、単一ＰＡＧＥ分析から得られたが、このうち、2つの代表的切片は図１Ａに図示されている。
【図３】図３は、２０２−ヌクレオチドｍＲＮＡリーダーが平衡透析装置中のＡｄｏＣｂ１の不均等分布を生じることを示す。Ｉ：ＲＮＡの不存在下でトリチウム化エフェクターの平衡を実行した。ＩＩ：（過程１）Ｉの場合と同様に平衡を実行したが、しかし小室ｂに付加したｍＲＮＡリーダー200 pmolを用いた；（過程２）5,000 pmolの非標識化ＡｄｏＣｂ１を小室ｂに付加した。ＩＩＩ：ＩＩに記載したように平衡を実行したが、しかし5,000 pmolのシアノコバラミンを小室ｂに付加した。ＩＶ：（過程１）ＩＩの過程１に記載したように平衡を開始した；（過程２および３）小室ａ中の溶液を25 μＬの新鮮な平衡緩衝液に置き換えた；（過程４）5,000 pmolの非標識化ＡｄｏＣｂ１を小室ｂに付加した。ｃｐｍ比は、ａの係数に対する小室ｂ中で検出される計数の割合である。破線は、ｃｐｍ比１を表し、これはトリチウムの均等分布が確立された場合に予測される値である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡリーダーによるエフェクターの選択分子認識を示す。図４Ａは、ＡｄｏＣｂ１（１）および種々のエフェクター類似体（２〜１１、（30参照））の化学構造を示す。図４Ｂは、２０２−ヌクレオチドｂｔｕＢ  ＲＮＡリーダーの自発的切断の変調をモニタリングすることによる類似体結合の確定を示す。５’−32Ｐ標識化ｍＲＮＡリーダー分子を、図１Ａに対する凡例に記載したようにインキュベートし、分離して、分析したが、これらは、指示されたように同一の対照およびマーカーレーンを含む。部位２（Ｕ６８）を包含する３つのＰＡＧＥ分析物の切片を示す。各画像の下に、指示されたような各エフェクターに関する、あるいは無エフェクター（−）に関する切断されたＲＮＡの量（各ゲル中のＵ６８での切断の最低および最高レベルに関して正規化）をプロットする。化合物１１（１３−ｅｐｉ−ＡｄｏＣｂ１）はＡｄｏＣｂ１のエピマーであって、この場合、プロピオンアミド側鎖がコリン環の平面上に存在するよう、Ｃ１３の立体配座が転化される（Brown et al., Conformational studies of 5’-deoxyadenosyl-13-epicobalamin, a coenzymatically active structural analog of coenzyme B12. Polyhedron 17, 2213 (1998)参照）。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆは、ｍＲＮＡリーダーにおける突然変異、ならびにＡｄｏＣｂ１結合および遺伝子制御に及ぼすそれらの作用を示す。図５Ａは、野生型２０２−ヌクレオチドｂｔｕＢリーダーの推定Ｐ５素子の配列が、位置Ｕ６８での自発的ＲＮＡ切断において観察される増大により示されるように、ＡｄｏＣｂ１依存性変調を表示することを示す（10％変性ＰＡＧＡゲル）。5 μMＡｄｏＣｂ１の非存在下（−）または存在下（＋）で、検定を実行した。残りのレーンは図１Ａに対する凡例に記載したのと同様である。合成棒グラフは、平衡透析装置におけるＡｄｏＣｂ１の平衡をシフトするＲＮＡの能力、ならびに細菌培養へのＡｄｏＣｂ１付加により調節されるレポーター遺伝子（実験手順参照）の能力を示す。（左）平衡透析により得られるｃｐｍ比をプロットするが、この場合、小室ｂはＲＮＡを含有する。平衡透析実験の詳細は、図３の短い説明に記載されている。（右）5 μMＡｄｏＣｂ１の非存在下（−）または存在下（＋）での細胞増殖から確定した場合のβ−ガラクトシダーゼの発現レベルをプロットする。左右の囲み数字はそれぞれ、およそのＫD、ならびにＡｄｏＣｂ１の存在下でのβ−ガラクトシダーゼ活性のフォールド抑制を示す。Ｎ．Ｄ．は、測定されなかったことを意味する。図５Ｂ〜５Ｆは、指示したような種々の突然変異体リーダー配列の配列および性能特徴を示す。実験手順の節に記載したように、構築物を作製した。
【図６】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄは、ｍＲＮＡによる代謝産物結合を示す。図６Ａは、１６５ｔｈｉＭ  ＲＮＡの自発的切断のＴＰＰ依存性変調がポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により可視化されたことを示す。100 μMＴＰＰの存在下（＋）または不存在下（−）で、20 mMのＭｇＣｌ2、50 mMのトリス−ＨＣｌ（25℃でｐＨ8.3）中で25℃で約40時間、５’Ｐ標識ＲＮＡ（矢印、20 nM）をインキュベートした。ＮＲ、-ＯＨおよびＴ１はそれぞれ、無反応、アルカリによる部分消化またはＲＮアーゼＴ１による部分消化（Ｇ特異的切断）を受けたＲＮＡを示す。選定Ｇ残基後の切断を表す生成物帯域に番号を付けて、中黒矢頭により同定する。星印は、シネ−ダルガルノ（ＳＤ）配列を包含するＲＮＡ構造の変調を同定する。リン光画像解析装置（Molecular Dynamics）を用いてゲル分離物を分析し、そしてImageQuantソフトウェアを用いて定量した。図６Ｂは、コンピューターモデリング（Zuker et al., Algorithms and thermodynamics for RNA secondary structure prediction: a practical guide. In RNA Biochemistry and Biotechnology (eds. Barciszewski J. & Clark, B.F.C.) 11-43 (NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, 1999); Mathews et al., Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999)）により、ならびに図６Ａに示した構造プロービングデータにより予測した場合の１６５ｔｈｉＭの二次構造モデルを示す。自発的切断特徴は、差込図に示したとおりである。無印ヌクレオチドは、一定のしかし低レベルの分解を示す。切頭化９１ｔｈｉＭ  ＲＮＡを矩形で囲み、そしてｔｈｉボックス素子（Miranda-Rios et al., A conserved RNA structure (thi box)is involved in regulation of thiamin biosynthetic gene expression in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9736-9741 (2001)）に明青色陰影を付ける。橙色で目立たせたヌクレオチドは、Ｐ８*と呼ばれる代替的対合を同定する。当該ＲＮＡは、野生型と比較して、構築物の非必須部分に導入されてクローニングのための制限部位を形成する2つの突然変異（Ｇ１６５ＡおよびＵ１５７Ｃ）を保有するが、一方、全てのＲＮＡは、in vitro転写を促すために2つの５’−末端Ｇ残基９を保有する。図６Ｃは、２４０ｔｈｉＣ  ＲＮＡの自発的切断のＴＰＰ依存性変調を示す。図６Ａに関して上記したとおりに反応を実行し、分析した。図６Ｄは、２４０ｔｈｉＣの二次構造モデルを示す．ｔｈｉＭと同様である塩基対合素子は、標識化Ｐ１〜Ｐ５である。切頭化ＲＮＡ１１１ｔｈｉＣを矩形で囲む。橙色で目立たせたヌクレオチドは、代替的対合を同定する。
【図７】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、高親和性代謝産物受容体として役立つｔｈｉＭおよびｔｈｉＣ  ｍＲＮＡリーダーを示す。図７Ａは、ＴＰＰの異なる濃度（ｃ）に関してプロットした１６５ｔｈｉＭ（左）および２４０ｔｈｉＣ（右）内のいくつかの部位でのＲＮＡ切断の自発的変調の程度を示す。赤色矢印は、ＲＮＡの半最大変調（見掛けのＫD）を得るために必要なＴＰＰの概算濃度を示す。図７Ｂは、指示したようにＴＰＰ、ＴＰおよびチアミンを用いて両ＲＮＡに関してプロットした見掛けのＫD値の対数を示す。矩形データは、切頭化ＲＮＡ９１ｔｈｉＭおよび１１１ｔｈｉＣとともにＴＰＰを用いて生成した。図７Ｃは、１６５ｔｈｉＭの自発的切断のパターンが、ＰＡＧＥ分析（左）により示されるような、そして指示したような3つのレーンに関する相対的リン光画像解析装置計数を表すグラフ（右）により示されるようなチアミンとＴＰＰリガンドとの間で異なる、ということを示す。ＲＮＡプロービング分析に関する詳細は、図６Ａと関連して上記したものと同様である。グラフは、ImageQuantソフトウェアにより作成した。
【図８】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、代謝産物結合に関するｍＲＮＡの高感受性および選択性を示す。図８Ａは、チアミンのいくつかの類似体の化学構造を示す。ＴＤはチアミンジスルフィドであり、ＴＨＺは4−メチル−5−β−ヒドロキシエチルチアゾールである。図８Ｂは、指示したようにＴＰＰおよび種々の化学類似体（各々40 μM）を用いた１６５ｔｈｉＭ  ＲＮＡ構造プロービングのＰＡＧＥ分析を示す。ＲＮＡスパニングヌクレオチド〜１１３−〜１５０内の有意の構造変調の位置を、中白矢頭により示す。星印は、特定の化合物の存在下で切断される（底部）ＲＮＡの正規化分画を比較するために用いられる部位（Ｃ１４４）を同定する。ＲＮＡプロービング分析に関する詳細は、図６ａに関連して上記したものと同様である。図８Ｃは、分子認識のために重要であるＴＰＰの特徴の要約を示す。図８Ｄは、トレーサーとして3Ｈ−チアミンを用いた平衡透析を示す。指示どおりに小室ｂ中のＲＮＡ構築物の存在下での平衡時に確立された２−小室系（ａおよびｂ）中のトリチウム分布に関する比率をプロットする（非ＴＰＰ結合突然変異体Ｍ３の説明に関しては下記参照）。平衡の開始時に、表示したように、100 μMのＴＰＰまたはオキシチアミンを小室ａに付加した。
【図９】図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、ｔｈｉＭリボスイッチの構造および機能の突然変異分析を示す。図９Ａは、構築物Ｍ１〜Ｍ８中に存在する突然変異を１６５ｔｈｉＭ  ＲＮＡと比較して示す。Ｐ８*は、Ｐ１およびＰ８ステムの部分（橙色）間の推定塩基対合素子である。図９Ｂ（上部）は、直列プロービング実験（10 μMのＴＰＰ）のＰＡＧＥ分析により、ならびにβ−ガラクトシダーゼ発現検定により示した場合の、野生型（ＷＴ）、Ｍ１およびＭ２  ＲＮＡのin vitro結合および遺伝子制御機能を示す。ＰＡＧＥゲル上での標識は、図６Ａに関連して上記したのと同様である。バーは、培地中のＴＰＰの存在下（＋）および非存在下（−）での遺伝子発現のレベルを表す。図９Ｃは、表形態で示したＷＴ〜Ｍ９の類似分析の要約である。ＳＤ状態「ｎ．ｄ．」（測定せず）は、ＴＰＰの不存在下および存在下で検出された自発的切断のレベルが検出の限界に近い（Ｍ６、Ｍ７およびＭ８）か、あるいはその領域がＷＴと比較して非定型構造（Ｍ９）を取ることを示す。
【図１０】図１０は、ＳＡＭ応答リボザイムの選択のための構築物を示す。ハンマーヘッドセルフクリーニングリボザイムおよびＳＡＭアプタマーはともに、機能を示すために架橋ドメインの適正な生成を要する。したがって選択は、ＳＡＭまたは別の結合構成成分類似体が存在する場合のみ、リボザイム饑機能を可能にすると予測される。
【図１１】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆおよび１１Ｇはコンセンサス配列を示し、そして推定二次構造は、各リボスイッチに関して記載されたような系統発生学的および生化学的分析により得られた（参考文献参照）。赤色のヌクレオチドは、代表的配列の90％より多くで保存され、中白丸は可変配列のヌクレオチド位置を同定し、そして腺は配列および長さにおいて可変性である素子を同定する。モデルを以下に説明する：６Ａ）コエンザイムＢ１２アプタマー（実施例１）；６Ｂ）ＴＰＰアプタマー（実施例２）；６Ｃ）ＦＭＮアプタマー（実施例３）；６Ｄ）ＳＡＭアプタマー（実施例７）；６Ｅ）グアニンアプタマー（実施例６）；６Ｆ）アデニンアプタマー（実施例８）；および６Ｇ）リシンアプタマー（実施例５）。文字ＲおよびＹは、それぞれプリンおよびピリミジン塩基を表す；ＫはＧまたはＵを意味する；ＷはＡまたはＵを意味する；ＨはＡ、ＣまたはＵを意味する；ＤはＧ、ＡまたはＵを意味する；Ｎは4つの塩基のいずれかを表す。
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、ＦＭＮによる枯草菌B. subtilusｒｉｂＤ  ｍＲＮＡの調節を示す。図１２Ａは、直列プロービング検定の結果を示す。赤色丸で同定されるヌクレオチド間連結は、ＦＭＮの不存在下でのインキュベーションと比較して、ＦＭＮの存在下でｒｉｂＤがインキュベートされる場合の自発的切断量の低減を示す（これらのヌクレオチドに関して適切な増大を示す）。黄色丸は、一貫して高レベルの分割を示す連結を同定し、このことは、それらがＦＭＮの存在により変調されないことを示す。図１２Ｂは、ｒｉｂＤ調節のメカニズムに関するモデルを示す。ｒｉｂＤ  ｍＲＮＡは、ＦＭＮの非存在下でアンチ終止立体配座を取る。ＦＭＮのレベル増大は、ターミネーター構造の形成を可能にするＲＦＮ−ＦＭＮ複合体を安定化する。図１２Ｃは、リボフラビンおよびＦＭＮに関する化学構造および見掛けの解離定数を示す。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃは、ＴＰＰによる大腸菌ｔｈｉＭ  ｍＲＮＡの調節を示す。図１３Ａは、直列プロービングの結果を示す。赤色丸で同定されるヌクレオチド間連結は、リガンドの不存在下でのインキュベーションと比較して、ＴＰＰの存在下でｔｈｉＭがインキュベートされる場合の自発的切断量の低減を示す。それに反して、緑色丸で同定される連結は、リガンドの非存在下でのインキュベーションと比較して、ｔｈｉＭがＴＰＰとともにインキュベートされる場合の切断量の増大を示す。青色陰影矩形は、ピロリン酸認識領域（本文中に記載）を示す。図１３Ｂは、ｔｈｉＭ調節のメカニズムに関するモデルを示す。ＴＰＰの不存在下では、アンチ−ＳＤ配列はアプタマードメインの一部と相互作用して、アンチ−アンチ−ＳＤを生成する。ＴＰＰが増大されると、アプタマー−ＴＰＰ複合体が形成され、アンチ−ＳＤはＳＤとの対合の方を選択する。図１３Ｃは、チアミンおよびＴＰＰに関する化学構造および見掛けの解離定数を示す。
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、推定真核生物リボスイッチを示す。図１４Ａは、100個の細菌および古細菌ＲＮＡを基礎にしたコンセンサスＴＰＰ結合ドメインを示す。赤色のヌクレオチドは、ほとんど保存される（＞90％）。中白丸はヌクレオチド位置を表し、そして配列および長さが変わるドメインはｖａｒと呼ばれる。コンセンサスモデルは、近年報告されたもの（Rodionov et al., 2002）と類似する。図１４Ｂは、シロイヌナズナArabidopsis thalianaのＴＰＰ結合ドメインを示す。イネOryza sativa（橙色）およびヒメマキバサワゴケPhilonotis secunda（緑色）における変異を示す。図１４Ｃは、アカパンカビNeurospora crassaのイントロン中の推定ＴＰＰ結合ドメインを示す。
【図１５】図１５は、細菌ＴＰＰ依存性リボスイッチに関連した真核生物ドメインの配列アラインメントを示す。塩基対号ステムを黒色で陰影を付け、そして実施例２で明示されるように標識する。真核生物においては塩基対の長さおよび数を有意に拡張されるＰ３配列を、ステム−ループ構造として表す。真核生物ドメインに関して検索するために用いられた細菌における高度保存ヌクレオチド位置を、灰色で陰影をつける。各道程（ＩＤ）配列に関して、所定のGenBank登録内の保存ＣＵＧＡＧＡ配列の位置を、寄託番号、配列名および遺伝子同定とともに示す。配列類似性に基づいた付加的タンパク質注釈を、括弧内に示す。方法：デフォルトパラメーターを用いてGenBankのblastn検索により、細菌配列（ＥｃｏおよびＣａｃ）との配列類似性により、リボスイッチ様ドメインを最初に同定した。これらのヒットを立証し、パターン（ＣＴＧＡＧＡ［200］ＡＣＹＴＧＡ［5］＜＜＜ＧＮＴＮＮＮＮＣ＞＞＞［5］ＣＧＮＲＧＧＲＡ）との縮重適正に関して検索することにより拡張した。ギュメは塩基対合を示し、そして括弧内数字は強制最大長を有する可変ギャップである。真核生物配列は全て、このパターンに対して1または0個の不適正を有するが、但し、最終検索素子における単一Ａ挿入のために最初に3つの不適正を有したもの（Ａまたは）は除く。アラインメントを簡素化するために、この突然変異を除去した。ｍＲＮＡ（Ｍ33643.1）およびゲノム（ＡＢ033416.1）配列の比較は、フザリウム・オキシスポルムF. oxysporum素子がｓｔｉ３５遺伝子の５’ＵＴＲにおけるイントロン中に存在する、ということを実証した。その他の真菌配列（Ｎｃｒ、ＡｏｒおよびＦｓｏ）には、コンセンサススプライシング配列が側面を接する。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、シロイヌナズナからの推定ＴＰＰ−リボスイッチの構造プロービングを示す。図１６Ａは、100 μMＴＰＰの不存在下（−）または存在下（＋）でのインキュベーションにより生成されたシロイヌナズナArabidopsis thaliana（図１４Ｂ）の１２８−ヌクレオチドＲＮＡの断片化パターン（矢印）を示す。Ｔ１、-ＯＨおよびＮＲは、それぞれＲＮアーゼＴ１（Ｇ残基に対して３’切断）で、アルカリで部分的に消化された、または反応しなかったＲＮＡを同定する。実施例２に記載したのと同様に反応を実行した。図１６Ｂは、シロイヌナズナＲＮＡによるＴＰＰ結合に関する見掛けのＫDを示す。実施例１〜３に記載したのと同様に直列プロービングにより、結合された分画を確定する。
【図１７】図１７は、遺伝子構造チアミン生合成遺伝子およびリボスイッチ制御の考え得るメカニズムを示す。大腸菌および枯草菌リボスイッチの位置およびメカニズムは、実施例２および６に詳述される。ヒメマキバサワゴケからの推定ＴＰＰリボスイッチは、ＴＨＩＣ遺伝子のｃＤＮＡクローン中のポリＡ尾から直ぐ上流に存在する。フザリウム・オキシスポルムにおける推定ＴＰＰリボスイッチドメインは、ゲノム配列にしたがってＳＴＩ３５遺伝子の５’−ＵＴＲイントロン中に位置するが、しかしｃＤＮＡクローン中には存在しない。
【図１８】図１８は、Ｌボックス高度保存配列および構造ドメインが、リシン代謝に関連するグラム陽性およびグラム陰性細菌ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ中に存在することを示す。Ｌボックス配列の保存部分および二次構造は、特に言及されるような28の代表的ｍＲＮＡのアラインメントにより同定した。Ｐ１〜Ｐ５を表す塩基対合能力を、独立して色分けする。赤色のヌクレオチドは、80％より多い実例で保存される。星印は、この試験で検査された代表（枯草菌ｌｙｓＣ５’−ＵＴＲ）を同定する。遺伝子名は、GenBankで注釈されるようなものであるか、あるいはタンパク質配列類似性により得られた。生物略称を以下に示す：炭疽菌Bacillus anthracis（ＢＡ）、バシラス・ハロデュランスBacillus halodurans（ＢＨ）、枯草菌Bacillus subtilus（ＢＳ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（ＣＡ）、ウェルチ菌Clostridium perfringens（ＣＰ）、大腸菌Escherichia coli（ＥＣ）、インフルエンザ菌Haemophilus influenzae（ＨＩ）、オセアノバシラス・イヘエンシス（ＯＩ）、パスツレラ・マルトシダ（ＰＭ）、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus（ＳＡ）、表皮ブドウ球菌Staphylococcus epidermidis（ＳＥ）、フレクスナー赤痢菌Shigella flexneri（ＳＦ）、シュワネラ・オネイデンシスShewanella oneidensis（ＳＯ）、サーマトガ・マリチマThermatoga maritima（ＴＭ）、サーモアネロバクター・テングコンゲンシス（ＴＴ）、コレラ菌Vibrio choleraVibrio cholerae（ＶＣ）、ビブリオ・ブルニフィクスVibrio vulnificus（ＶＶ）、Thermoanaerobacter tengcongensis（ＴＥ）。
【図１９】図１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃは、枯草菌のｌｙｓＣ５’−ＵＴＲからのコンセンサスＬボックスモチーフがＬ−リシンの存在下でアロステリック再配列を受ける、ということを示す。（Ａ）原核生物および古細菌生物からの31の代表的配列（図１８）の系統発生学を用いて得られるようなＬボックスドメインのコンセンサス配列および構造。赤色で示したヌクレオチドは、代表物の少なくとも80％に存在し、中白丸は可変同一性のヌクレオチド位置を同定し、そして褐色線は可変ヌクレオチド同一性および鎖長を意味する。図１９Ｂは、枯草菌のｌｙｓＣ５’−ＵＴＲの配列、二次構造モデルおよびリシン誘導性構造変調を示す。付加的94ヌクレオチド（図示されていない）は、ヌクレオチド２３７およびＡＵＧ開始コドン間に存在する。Ｃに図示したような自発的ＲＮＡ切断をモニタリングすることにより、２３７ｌｙｓＣ  ＲＮＡを用いて、構造変調部位（赤色で丸く囲んだヌクレオチド）を確定した。図１９Ｃは、２３７ｌｙｓＣ  ＲＮＡの直列プロービングがＲＮＡ構造のリジン誘導性変調を明示することを示す。変性10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて生成物分離により明示される自発的切断のパターンは、リジンの非存在下（−）で観察されるものと比較して、10 μMのＬ−リシン（Ｌ）の存在下で4つの主要部位（１〜４で示す）で変化する。Ｔ１、-ＯＨおよびＮＲは、それぞれＲＮアーゼＴ１での部分消化物、アルカリでの部分消化物および無反応を示す。Ｔ１レーンにおける選定帯域（Ｇ特異的切断）は、ヌクレオチド位置により同定される（実験詳細に関する方法を参照）。
【図２０】図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄおよび２０Ｅは、リジンアプタマーの分子認識特徴、ならびにケージ化リジンの使用を示す。図２０Ａは、Ｌ−リジン、Ｄ−リジンおよび9つの密接に関連した類似体の化学構造を示す。小丸はキラル炭素中心を表すが、この場合、エナンチオマー立体配置は各化合物に関して定義される。陰影付腕は、図示したＬ−リジンおよび類似体間の化学的差を同定する。図２０Ｂは、リガンドの不存在下（−）での、あるいは各レーンに示したように10 μMのＬ−リジンまたは100 μMの種々の類似体の存在下での１７９ｌｙｓＣ  ＲＮＡの直列プロービング分析を示す。各レーンに関しては、部位３での自発的切断の相対程度を、この部位の直ぐ下の一定切断のゾーンのものと比較するが、この場合、〜1.5より有意に低い切断比は変調を示す。図２０Ｃは、塩酸によるジペプチド消化の模式図である。ジペプチド形態は全て、リジンアプタマー（不活性）を結合できないと予測されるが、一方、リジン含有ジペプチドは、酸消化時にアプタマー（活性）における立体配座変化を誘導するはずである。図２０Ｄは、リジンの非存在下（−）での、または種々のアミノ酸およびジペプチドの存在下での１７９ｌｙｓＣ  ＲＮＡの直列プロービング分析を示す。下線を付したレーンは、ａに図示したようにＨＣｌで前処理したジペプチド調製物を保有する。図２０Ｅは、付加リガンドの非存在下でのプロセシングの程度への正規化後に、ｄにおける部位３での自発的切断の分画をプロットすることを示す。
【図２１】図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃおよび２１Ｄは、１７９  ｌｙｓＣ  ＲＮＡと結合するＬ−リジンに関する解離定数および化学量論の確定を示す。図２１Ａは、3 nMから3 mMまでの範囲のＬ−リジンの濃度増大に伴う直列プロービングを示す。詳細は、図１９Ｃに関して明示されたのと同様である。図２０Ｂは、自発的切断を受けているＲＮＡの正規化分画対部位１〜３に関するアミノ酸の濃度を図示するプロットを示す。破線は、リガンド結合に関する見掛けのＫDを示す半最大構造変調を引き起こすのに必要なＬ−リジンの濃度を同定する。図２０Ｃは、１７９ｌｙｓＣＲＮＡ（10 μM）が平衡透析小室中でトリチウム化Ｌ−リジン（50 ｎM）の平衡を変える。競合的結合を調べるために、非標識化Ｌ−（Ｌ）およびＤ−リジン（Ｄ）、またはＬ−オルニチン（５）を、指示通りに、前平衡化検定の一小室に付加し、各々採集濃度を50 μMとした。図２１Ｄは、１７９ｌｙｓＣＲＮＡにより結合するＬ−リシンのスキャッチャード解析を示す。変数ｒは、結合リガンド濃度対総ＲＮＡ濃度の比を表し、そして変数［ＬF］は遊離リガンドの濃度を表す。
【図２２】図２２Ａ、２２Ｂおよび２２Ｃは、枯草菌ｌｙｓＣリボスイッチ、ならびに代謝産物誘導性転写終結のためのそのメカニズムを示す。図２２Ａは、ｌｙｓＣリボスイッチ二次構造に関する配列および抑制状態モデルを示す。橙色で目立たせたヌクレオチドは、Ｌ−リジンの不存在下で形成され得る推定抗ターミネーター相互作用を同定する。矩形で囲んだヌクレオチドは、崩壊の部位（Ｍ１）、ならびにターミネーターステム（Ｍ２）に関する、そしてターミネーターおよび抗ターミネーターステム（Ｍ３）に関する代償性突然変異を同定する。明青色で陰影を付けたヌクレオチドは、突然変異が以前に報告された（Vold et al. 1975; Lu et al. 1992）ｌｙｓＣ抑制解除を示す位置のいくつかを同定する。図２２Ｂは、指示されたように、10 mMＬ−リジンまたはその他の類似体の不存在下（−）または存在下（＋）で実行されるin vitro転写検定を示す。ＦＬおよびＴは、それぞれ全長および有限転写体を同定する。総有限および全長転写体と比較した場合の有限ＲＮＡのパーセントを、各レーンに関して提供する（％有限）。図２２Ｃは、野生型（ＷＴ）、Ｇ３９ＡおよびＧ４０Ａ突然変異体ｌｙｓＣ５’−ＵＴＲ断片と融合されたβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子のin vivo発現を示す。培地条件を以下に示す：Ｉ、正常培地（0.27 mMリシン）；ＩＩ、最少培地（0.012 mM）；ＩＩＩ、リジン補足最小培地（1 mM）；ＩＶ、ヒドロキサム酸リジン補足（培地ＩＩ＋1 mMヒドロキサム酸リジン）最少培地；Ｖ、チオシン補足（培地ＩＩ＋1 mMチオシン）最小培地。
【図２３】図２３は、高度保存ドメインがある種のグラム陽性およびグラム陰性細菌ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ中に存在することを示す。Ｇボックスコンセンサス配列と一致する細菌からの32の代表的ｍＲＮＡドメインのアラインメントを表す。橙色、青色および紫色の陰影を付けた領域は、それぞれステムＰ１、Ｐ２およびＰ３の塩基対合能力を同定する。赤色のヌクレオチドは、90％より多い実例で保存される。星印は、この試験で検査された代表（ｘｐｔ−ｐｂｕＸ５’−ＵＴＲ）を同定する。保存コア中（Ｐ３−Ｐ１接合部に）にＣ→Ｕ突然変異を保有する3つの代表（ＢＳ５、ＣＰ４およびＶＶ１）はアデニン特異的リボスイッチであると思われる（未発表観察）、ということに留意することは重要である。遺伝子名は、GenBank、ＳｕｂｔｉＬｉｓｔデータベースで注釈されるようなものであるか、あるいはタンパク質配列類似性検索（括弧内）に基づいている。生物略称を以下に示す：バシラス・ハロデュランスBacillus halodurans（ＢＨ）、枯草菌Bacillus subtilus（ＢＳ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（ＣＡ）、ウェルチ菌Clostridium perfringens（ＣＰ）、フゾバクテリウム・ヌクレタムFusobacterium nucleatum（ＦＮ）、乳酸菌Lactococcus lactis（ＬＬ）、リステリア菌Listeria monocytogenes（ＬＭ）、オセアノバシラス・イヘエンシス（ＯＩ）、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus（ＳＡ）、表皮ブドウ球菌Staphylococcus epidermidis（ＳＥ）、Ｂ群溶連菌Streptococcus agalactiae（ＳＴＡ）、Ａ群溶連菌Streptococcus pyogenes（ＳＴＰＹ）、肺炎連鎖球菌Streptococcus pneumoniae（ＳＴＰＮ）、サーモアネロバクター・テングコンゲンシス（ＴＥ）およびビブリオ・ブルニフィクスVibrio vulnificus（ＶＶ）。
【図２４】図２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃは、枯草菌におけるｘｐｔ−ｐｂｕＸｍＲＮＡのＧボックスＲＮＡがグアニンにアロステリックに応答することを示す。図２４Ａは、プリン代謝に大いに関与する遺伝子の５’ＵＴＲ中に存在するＧボックスＲＮＡドメインに関するコンセンサス配列および二次モデルを示す。系統発生学的分析は、３−ステム（Ｐ１〜Ｐ３）接合部の形成と一致する。赤色および黒色で描いたヌクレオチドは、検査した代表物の90％および80％より多くにおいて存在する（図２３）。丸で囲んだヌクレオチドは塩基相補性を示し、このことは偽結び目の形成を示す。図２４Ｂは、ｘｐｔ−ｐｂｕＸ転写単位の５’−ＵＴＲの配列およびリガンド誘導性構造変化を示す。推定抗ターミネーター相互作用を、橙色で目立たせている。直列プロービング（Ｃから）により確定されるような構造変化を受けるヌクレオチドは、赤色丸で同定する。２０１ｘｐｔＲＮＡの９３ｘｐｔ断片（矩形内）は、グアニン結合機能を保持する。星印は、in vitro転写を促す（５’末端）か、または制限部位を生成する（３’末端）ＲＮＡ配列への変化を意味する。ヌクレオチド数は天然転写開始部位の最初のヌクレオチドで開始する。翻訳開始コドンは、位置１８６で開始する。図２４Ｃは、グアニンおよび関連プリンが９３ｘｐｔ  ｍＲＮＡ断片の構造的変調を選択的に誘導することを示す。前駆体ＲＮＡ（Ｐｒｅ；５’32Ｐ標識）を、それぞれＧ、Ｈ、ＸおよびＡで示されるようなグアニン、ヒポキサンチン、キサンチンおよびアデニンの不存在下（−）または存在下で40時間のインキュベーションにより、直列プロービングに付した。ＮＲ、Ｔ１および-ＯＨと呼ばれるレーンは、それぞれ、反応しなかった、ＲＮアーゼＴ１による部分消化（Ｇ特異的切断）に付された、あるいは部分アルカリ消化に付されたＲＮＡを含有する。Ｇ特異的切断を表す選定帯域を同定する。領域１〜４は、自発的ＲＮＡ切断のリガンド誘導性変調の主要部位を同定する。
【００３２】
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、２０１ｘｐｔ  ｍＲＮＡリーダーが高親和性でグアニンを結合することを示す。図２５Ａは、4つの領域での２０１ｘｐｔ  ＲＮＡの自発的ＲＮＡ切断がグアニン濃度の増大に伴って低減することを示す。図２５Ｃに示したような変調の4つの領域に対応するＰＡＧＥ画像のそれらの位置を示す。その他の詳細および表記は、図２５Ｃに対する凡例に記載したものと同様である。図２５Ｂは、図２５Ａにおける変調化領域１〜４に関するグアニンの濃度に対して自発的切断を経たＲＮＡの正規化分画を描いたプロットを示す。グアニンの不存在下で測定される最大切断に対して、そして10 μMグアニンの存在下で測定される最小切断に対して、分画切断値を正規化した。見掛けのＫD値（5 nM以下）は、これらの検定条件に関する検出の限界を示す。
【図２６】図２６Ａ、２６Ｂおよび２６Ｃは、ｘｐｔ−ｐｂｕＸ  ｍＲＮＡのグアニン結合アプタマーによる分子識別を示す。図２６Ａは、グアニン、ヒポキサンチンおよびキサンチン（枯草菌におけるｘｐｔ−ｐｂｕＸ遺伝子発現の活性天然レギュレーター）に関する化学構造および見掛けのＫD値をアデニン（不活性）と比較して示す。グアニンと比較した場合の化学構造の差を桃色陰影で示す。２０１ｘｐｔＲＮＡに関して図２６に示すように、ＫD値を確定した。グアニンに関する数字は、環窒素原子の位置を表す。図２６Ｂは、グアニンの種々の類似体に関する化学構造およびＫD値が、このプリンの全変化が結合親和性の損失を引き起こすことを明示する、ということを示す。500 μMより高い類似体の濃度はこの分析においては検査されなかったので、中白丸は、指示されたよりほとんど有意に高いと思われるＫD値を同定する。指示されたようなＧ、Ｈ、ＸおよびＡの見掛けのＫD値を比較のために赤色三角形としてプロットする。図２６Ｃは、２０１ｘｐｔにおけるグアニンアプタマーの分子認識特徴の模式図を示す。それぞれグアニンおよびヒポキサンチンの９−リボシル誘導体であるグアノシン（ＫD＞100 μM）およびイノシン（ＫD＞100 μM）は測定可能な結合を示さないため（図２７参照）、グアニンの位置９での水素結合形成が予測される。
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂは、平衡透析によるグアニン結合特異性の確証を示す。図２７Ａは、平衡透析戦略を用いて、in vitro転写９３ｘｐｔＲＮＡがグアニンと結合し、種々の類似体を弁別し得ることを確証するために平衡透析戦略を用いたことを示す。5,000ダルトンの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する透析膜により有るなおよびその他の類似体から分離される小室ａに3Ｈ−グアニンを付加することにより、各データ点を生成した。左：グアニン結合部位が小室ｂ中に存在しないか、または余分量の非標識化競合物が存在する場合には、トリチウムの分布におけるシフトは予測されない。右：余分量のグアニン結合ＲＮＡが小室ｂ中に存在し、そして競合物が存在しない場合には、小室ｂに向かうトリチウムの分布における実質的シフトが予測される。図２７Ｂは、９３ｘｐｔＲＮＡは平衡透析装置中の3Ｈ−グアニンの分布をシフトし得るが、一方、グアニンの類似体は貧競合物である、ということを示す。プロットは、両小室から計数されたｃｐｍの総量と比較した場合の小室ｂ中のトリチウムの計数／分（ｃｐｍ）の分画を示す。ＲＮＡが存在しない（ｎｏｎ）場合、あるいは余分量の非標識化競合物（Ｇ）の存在下と同様に、シフトが起きない場合、〜0.5の値が予測される。大多数のＨ−グアニンが、検定条件下（100 nM3Ｈ−グアニン、300 nMＲＮＡ、500ｎM類似体）で有効な競合物として役立たない非標識化類似体の非存在下（−）で、または非標識化類似体の存在下で、小室ｂ中でＲＮＡにより結合される場合、約1の値が予測される。ＩｎｏおよびＧｕａは、それぞれイノシンおよびグアノシンを表す。
【図２８】図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃおよび２８Ｄは、変異体グアニンリボスイッチの結合および遺伝子制御機能を示す。図２８Ａは、グアニンアプタマードメインの種々の構造的特徴の重要性を調べるために用いられる突然変異を示す。図２８Ｂは、平衡透析によるアプタマー変異体の結合機能の検査を示す。ＷＴは、野生型９３ｘｐｔ構築物を意味する。詳細は、図２７に関して記載されたのと同様である。図２８Ｃは、指示されたような種々のプリンの導入時のβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の遺伝子変調を示す。図２８Ｄは、ＷＴおよび突然変異体Ｍ１〜Ｍ７によるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子発現の調節を示す。中白および中黒棒は、それぞれグアニンの不存在下および存在下で細胞を増殖させた場合に生成される酵素活性を表す。
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂは、リボスイッチが基礎遺伝子制御に関与することを示す。図２９Ａは、7つの既知のリボスイッチおよびそれらが感知する代謝産物の模式図である。以下のような二次構造モデルを得た：補酵素Ｂ12（実施例１参照）；ＴＰＰ（実施例２参照）；ＦＭＮ（実施例３参照）；ＳＡＭ（実施例７参照）；グアニン（実施例６参照）；リシン（実施例５参照）；アデニン（実施例８参照）。補酵素Ｂ12を立体分解形態で示すが、この場合、ａ、ｂおよびｃは断片間の共有結合部位を意味する。図２９Ｂは、枯草菌リボスイッチレギュロンの遺伝子地図、ならびに細菌染色体上のそれらの位置を示す。色を調和させることにより同定されるように、リボスイッチにより遺伝子を制御する。命名法は全て、ＳｕｂｔｉＬｉｓｔデータベース放出Ｒ16.1（Moszer, I., et al., 1995, Microbiol. 141, 261-268）から得られるが、但し、近年の命名であるｍｅｔＩおよびｍｅｔＣを除く（Auger, S., et al., 2002, Microbiol. 148, 507-518）。
【図３０】図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃは、ＳボックスがＳＡＭを結合する構造化ＲＮＡドメインであることを示す。（Ａ）１０７細菌代表物由来のＳボックスドメインのコンセンサス配列および二次構造モデル。赤色および黒色位置は、図示したようなその分子の同一物が、それぞれ代表的ＳボックスＲＮＡの90％または80％より多くで保存される。Ｒ、ＹおよびＮは、それぞれプリン、ピリミジンおよび任意のヌクレオチドを表す。Ｐ１〜Ｐ４は、保存塩基対合を同定する。丸で囲んだヌクレオチドは推定偽結び目相互作用を同定する。図３０Ｂは、２５１ｙｉｔＪ  ｍＲＮＡ断片に関する配列および二次構造モデルを示す。ＳＡＭの導入時の構造変調の部位を、上記と同様に示す。ヌクレオチド１は、推定転写開始出発部位に対応する。星印は、in vitroでの効率的転写を可能にするために構築物に付加されたヌクレオチドを同定する。ＡＵＧ開始コドンの最初のヌクレオチドは２１２である（示されていない）。その他の表記は、ａに記載されたのと同様である。図３０Ｃは、50 mMトリス−ＨＣｌ（25℃でｐＨ8.3）、20 mMＭｇＣｌ2、100 mMＫＣｌ中で、各レーンに関して指示されたようにメチオニンまたはＳＡＭを用いず（−）にまたは用いて、25℃で〜40時間インキュベートされた２５１ｙｉｔＪ（〜1 nM５’32Ｐ−標識化）ＲＮＡの自発的切断パターンを示す。ＮＲ、Ｔ１および-ＯＨはそれぞれ、無反応、ＲＮアーゼＴ１による部分消化ならびにアルカリによる部分消化を表す。Ｔ１消化（Ｇ残基後で切断）に対応するある種の断片帯域を示す。青色矢頭は自発的切断の有意の変調の位置を同定し、そして番号の付いた部位を定量のために用いた（図３１ｂ参照）。実験手順は、実施例１〜３に記載されたものと同様である。
【図３１】図３１Ａ、３１Ｂおよび３１Ｃは、ＳＡＭ結合ＲＮＡによる結合親和性および分子弁別を示す。図３１Ａは、ＳＡＭｙｉｔＪリボスイッチの結合特性をプローブするために用いられる種々の化合物の化学構造を示す。メチオニン以外で、図示したような各化合物を、５’炭素（Ｒにより示されるような）を介して結合されるアデノシル部分（［Ａ］；差込物）に結合する。図３１Ｂ左：領域１〜６（図３０ｃ参照）で切断されたＲＮＡの正規化分画対モル単位でのＳＡＭの濃度の対数をプロットすることにより、ＳＡＭに関する２５１ｙｉｔＪのＫDを確定した。破線は、切断活性の半最大変調を誘導するために必要とされる濃度を示す。右：この方法により確定した場合のＳＡＭおよび種々の類似体に関するＫD値。図３１Ｃは、平衡透析により確定される分子弁別を示す。検定は、平衡透析小室（１、２）のサイドＡに付加された100 nMのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン−メチル−3Ｈ（3Ｈ−ＳＡＭ；14.5 μCimmol-1；〜7,000 cpm）を用い、そして指示されたように小室のＢサイド上の3 μMＲＮＡの不存在下（無）または存在下で実行した。非標識化類似体の非存在下（−）で〜10時間、平衡を実行し、次にその後、指示されたように25 μMの非標識化化合物（サイドＢに付加）の存在下でインキュベートした。Ｍ１は、ステムＰ１およびＰ２間の接合部に破壊的突然変異を保有する１２４ｙｉｔＪの変異体である（図３２ａ）。ｃｐｍ比１での線は、3Ｈ−ＳＡＭにおけるシフトが起きなかった場合に予測される棒の高さを同定する。付加的実験詳細は、実施例１および２に記載されたものと同様である。
【図３２】図３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃは、ＳＡＭ結合および遺伝子制御に及ぼすＲＮＡ突然変異の作用を示す。図３２Ａは、１２４ｙｉｔＪ  ＲＮＡに関する配列および二次構造モデルを示す。ｌａｃＺレポーター遺伝子から上流のｙｉｔＪ５’−ＵＴＲの融合を含有するプラスミド中に突然変異Ｍ１〜Ｍ９を生成した。次にin vitro試験のための突然変異体ＲＮＡの調製のための鋳型をＰＣＲにより作製し、突然変異体ＤＮＡ構築物をin vivo試験のために染色体中に組み込んだ。実験の詳細に関しては、方法の項を参照されたい。図３２Ｂは、指示されたように野生型（ＷＴ）および突然変異体ＲＮＡの存在下での平衡透析によるＳＡＭ結合機能の分析を示す。詳細は図３１ｃに対する凡例に記載されているが、但し、300 nMＲＮＡを用い、そして全検定を、非標識化類似体の付加なしに実行した。図３２Ｃは、指示されたような種々のリボスイッチ構築物でトランスフェクトされた枯草菌細胞中でのβ−ガラクトシダーゼ発現のin vivo制御を示す。β−ガラクトシダーゼ活性を、実施例２に記載されたように測定した。0.75 μg/mLのメチオニン（−）50 μg/mLのメチオニン（＋）中のグルコース最少培地中で、細胞を増殖させた。Ｍ６〜Ｍ９をin vivoで検査した。
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂは、ＳＡＭリボスイッチを保有するいくつかのｍＲＮＡの代謝産物誘導性転写終結を示す。図３３Ａは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたin vitro転写が4つのｍＲＮＡリーダー配列の終結増大を生じる、ということを示す。各レーンに関して指示されたように50 μMのエフェクターの不存在下（−）または存在下（＋）で、反応を実行した。例えばｍｅｔＩ鋳型は、ｍＲＮＡ位置２４２を介して５’ＵＴＲおよびコード配列を含むが、一方、終結部位は位置１８９に生じると予測される。各ゲルの下に、予測終結＋全長ＲＮＡ（ＦＬ）の全体量と比較した予測位置での転写終結（Ｔ）のパーセンテージを示す。図３３Ｂは、2つの構造状態でのｍｅｔＩリボスイッチに関する配列および構造モデルを示す。緑色および桃色残基は、それぞれＰ１（アンチ−アンチ−ターミネーター）およびターミネーターステムに対応する。橙色残基は、アンチターミネーターステムに対応する。赤色で囲まれた配列は、遺伝子制御の提唱メカニズムを調べるために用いられる突然変異の位置および同一性を明示する。ゲル：破壊的（Ｍａ、ＭａｂおよびＭｃ）または対応する代償的突然変異（Ｍａｂｃ）が挿入された突然変異体ｍｅｔＩリボスイッチの分析。ｍｅｔＩ突然変異体鋳型および野生型対照鋳型（ＷＴ）はＡにおいて用いられた鋳型と同一であるが、但し、ＦＬ産物は２２０ヌクレオチドである。その他の表記は、Ａの記載と同様である。
【図３４】図３４Ａおよび３４Ｂは、バシラス属の枯草菌Bacillus subtilusおよび炭疽菌Bacillus anthracisが異なる親和性でＳＡＭと結合することを示す。図３４Ａは、直列プロービングにより確定した場合の枯草菌ｃｙｓＨアプタマーの構造的変調を示す。差込物：一連のＳＡＭまたはＳＡＭ類似体濃度全体の構造的変調をモニタリングすることにより確定される見掛けのＫD値。2つのＧ残基（星印）をＲＮＡ構築物の５’末端に含んで、in vitro転写を促した。ヌクレオチド番号は、推定転写開始部位に対応して与えられる。ヌクレオチド１１７に延びるＲＮＡを用いて直列プロービングを実行したが、一方、残りのＲＮＡは、推定転写ターミネーターステムを表現するために示される。実験は、図３０ｂおよび図３１ｂに記載されたものと同様であった。詳細に関しては、図３０ｂに対する凡例を参照されたい。図３４Ｂは、直列プロービングにより確定した場合の枯草菌の構造変調を示す。炭疽菌ｃｙｓＨ  ｍＲＮＡの転写開始点は確定されておらず、そこでヌクレオチドの番号付けは2つの挿入Ｇ残基（星印）直後で開始する。ヌクレオチド１１２に延びるＲＮＡを用いて、直列プロービングを実行した。
【図３５】図３５Ａ、３５Ｂおよび３５Ｃは、グアニン−およびアデニン特異的リボスイッチを示す。図３５ａは、この試験において検査される2つのグアニン特異的（ｐｕｒＥおよびｘｐｔ）および3つのアデニン特異的アプタマードメインの配列および構造特徴を示す。Ｐ１〜Ｐ３は、アプタマードメインの二次構造を含む3つの塩基対化ステムを同定する。赤色ヌクレオチドは、その塩基同一性が系統発生学において90％より多くの代表物に保存される。矢印は、リガンド特異性の決定因子であるアプタマーの保存コア内の一ヌクレオチドを同定する。ＢＳ、ＣＰおよびＶＶは、それぞれ枯草菌Bacillus subtilus、ウェルチ菌Clostridium perfringensおよびビブリオ・ブルニフィクスVibrio vulnificusを意味する。図３５ｂは、ｘｐｔおよびｙｄｈＬアプタマーの配列および二次構造を示す。緑色ヌクレオチドは、ｘｐｔアプタマーの場合とは異なるｙｄｈＬアプタマー内の位置を同定する。ｘｐｔ中のヌクレオチドを、実施例６に記載されているように番号付けする。その他の表示は、Ａで記載したのと同様である。
【図３６】図３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃ、３６Ｄおよび３６Ｅは、5つのＧボックスＲＮＡ（ａ〜ｅ）のリガンド特異性を示す。直列プロービングは、標識した場合の保存アプタマードメインに関して検定する。ＮＲ、Ｔ１および-ＯＨは、それぞれ前駆体ＲＮＡ（Ｐｒｅ）がインキュベートされなかったか、あるいはＲＮアーゼＴ１またはアルカリで部分消化されたマーカーレーンを同定する。ＲＮアーゼＴ１消化（グアニジル残基に関して３’を切断する）に対応する選定帯域を、各ＲＮＡに関して標識する。リガンドの不存在下（−）で、または1 μMグアニン（Ｇ）またはアデニン（Ａ）の存在下で、40時間、ＲＮＡをインキュベートした。大きい矢頭は、特定のリガンドの付加のためである切断パターンにおける実質的変化の部位を同定する。付加的詳細に関しては方法の項を参照されたい。
【図３７】図３７Ａおよび３７Ｂは、アデニンに対するｙｄｈＬアプタマーの結合親和性を示す。図３７ａは、アデニンの種々の濃度での８０ｙｄｈＬ  ＲＮＡに関する直列プロービング検定を示す。各レーンに関して、部位１〜４を定量し、切断されたＲＮＡの分画を用いて、見掛けのＫDを確定した。図３７ｂは、部位１〜４での自発的切断を受けたＲＮＡの正規化分画の、アデニンの濃度に対するプロットを示す。付加的詳細に関しては実施例８を参照されたい。
【図３８】図３８Ａおよび３８Ｂは、ｙｄｈＬからのアデニンアプタマーによる分子認識の特異性を示す。図３８ａ上部：８０ｙｄｈＬ  ＲＮＡとの測定可能な結合を示すアデニン、グアニンおよびその他のプリン類似体の化学構造。最も密接に結合する化合物である２，６−ＤＡＰに関する化学的変化を、桃色で強調する。底部左：種々のプリンに関する見掛けのＫD値。底部右：ｙｄｈＬのための分子認識接触子として役立つアデニンにおける化学的特徴に関するモデル。Ｎ７およびＮ９の重要性は確定されていない、ということに留意。丸で囲んだ矢印は、水素結合供与体がＣ２に付加される場合、接触が存在する、ということを示す。図３８ｂは、８０ｙｄｈＬ  ＲＮＡにより結合されない種々のプリンの化学構造を示す（ＫD値は300 μMより少ない）。
【図３９】図３９Ａ、３９Ｂ、３９Ｃおよび３９Ｄは、グアニン−およびアデニン特異的アプタマーの相互変換を示す。図３９ａ左：所定部位に関する野生型９３ｘｐｔＲＮＡ切断産物の正規化分画の、直列プロービング検定におけるインキュベーション中に存在するリガンドの濃度の対数に対するプロット。変調に関してモニタリングされる切断産物は、部位３に対応する（図３７ａ）。右：小室Ｂ中に存在する総計数／分（ｃｐｍ）の分画の、平衡透析小室のサイドＡおよびＢからの総計数／分に対するプロット。〜0.5の値はリガンドの等分布（結合なし）を示すが、一方、〜１の値は、ほとんどのリガンドが小室のサイドＢ内でＲＮＡに結合される（ｂ、ｃ、ｄ）、ということを示す。直列プロービングおよび平衡透析は、それぞれ９３ｘｐｔ（ＣからＵへの突然変異）、８０ｙｄｈＬおよび８０ｙｄｈＬ（ＵからＣへの突然変異）に関してプロットする。
【図４０】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄおよび４０Ｅは、アデニンリボスイッチならびに遺伝子活性化素子としてのその機能によるｙｄｈＬの遺伝子制御に関するモデルを示す。図４０ａは、遺伝子調節のための「オン」および「オフ」状態に関する枯草菌ｙｄｈＬからのアデニンリボスイッチの配列および二次構造モデルを示す。図４０ｂは、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子との融合により確定した場合の、野生型ｙｄｈＬリボスイッチの、ならびに変異体形態のin vivo機能を示す。
【図４１−１】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−２】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−３】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−４】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−５】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−６】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−７】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−８】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−９】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−１０】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−１１】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−１２】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−１３】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−１４】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−１５】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−１６】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−１７】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−１８】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−１９】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−２０】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−２１】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−２２】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−２３】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−２４】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−２５】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−２６】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−２７】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−２８】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−２９】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−３０】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−３１】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−３２】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−３３】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−３４】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−３５】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−３６】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−３７】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−３８】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−３９】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−４０】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−４１】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−４２】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−４３】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−４４】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−４５】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−４６】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−４７】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−４８】リボスイッチの配列および型を示す。
【図４１−４９】リボスイッチの配列および型を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の詳細な説明
開示された方法および組成物は、特定の実施形態およびそこに含まれる実施例の下記の詳細な説明に対する、そして図面ならびにそれらの上記のおよび下記の説明に対する参照により、より容易に理解され得る。
【００３４】
ある種の天然ｍＲＮＡは代謝産物感受性遺伝子スイッチとして役立つが、この場合、ＲＮＡは小有機分子と直接結合する。この結合過程はｍＲＮＡの立体配座を変え、このことが、種々の異なるメカニズムにより遺伝子発現に変化を引き起こす。これらの天然「リボスイッチ」の修飾バージョン（種々の核酸工学処理戦略を用いることにより作製される）は、特定のエフェクター化合物（本明細書中ではトリガー分子と呼ばれる）により制御されるデザイナー遺伝子スイッチとして用いられ得る。天然スイッチは、抗生物質およびその他の小分子療法のための標的である。さらにリボスイッチの構成は、天然スイッチの実際の小片を新規の非免疫原性遺伝子制御素子を構築するために用いさせ、例えばアプタマー（分子認識）ドメインは、新規の認識ドメインがユーザー定義エフェクター化合物による遺伝子変調を引き起こすよう、他の非天然アプタマーと交換され得る（またはそうでなければ修飾される）。変更スイッチは、治療レジメンの一部となる（タンパク質合成を開始させるかまたは停止し、あるいは調節する）。新規構築遺伝子調節ネットワークは、生体バイオセンサー、生物体の代謝工学処理のような領域に、ならびに改良型の遺伝子療法治療に適用され得る。
【００３５】
メッセンジャーＲＮＡは典型的には、タンパク質−または小ＲＮＡ−調節因子により、ならびに翻訳の過程中のリボソームにより影響を及ぼされる遺伝子情報の受動的担体として考慮される。ある種のｍＲＮＡは天然アプタマードメインを保有し、そしてこれらのＲＮＡドメインとの直接的な特定代謝物質の結合が遺伝子発現の変調をもたらす、ということが発見された。天然リボスイッチは、典型的には天然ＲＮＡと関係がない2つの意外な機能を示す。第一に、ｍＲＮＡ素子は、ある構造がその標的代謝産物のための精確な結合ポケットとして役立つ別個の構造上体を取り得る。第二に、構造状態間の代謝産物誘導性アロステリック相互変換は、いくつかの別個のメカニズムのうちの１つにより遺伝子発現のレベルにおける変化を引き起こす。リボスイッチは典型的には、2つの別々のドメインに切断され得る：即ち、一方は標的（アプタマードメイン）と選択的に結合し、もう一つは遺伝子制御（発現プラットフォーム）に影響を及ぼす。それは、遺伝子発現の代謝産物依存性アロステリック制御を生じるこれら2つのドメイン間の動的相互作用である。
【００３６】
本明細書中に開示されるように、別個のクラスのリボスイッチが同定されており、そして活性化化合物（本明細書中ではトリガー分子と呼ばれる）を選択的に認識することが示されている。例えば補酵素Ｂ12、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）およびフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）は、これらの化合物の代謝または輸送経路における重要な酵素をコードする遺伝子中に存在するリボスイッチを活性化する。各リボスイッチクラスのアプタマードメインは、高度保存コンセンサス配列および構造に従う。したがって配列相同性検索を用いて、関連リボスイッチドメインを同定し得る。リボスイッチドメインは、細菌、古細菌および真核生物からの種々の生物において発見されている。
【００３７】
グアニンを認識し、そしてほとんどの他のプリン類似体を弁別するリボスイッチの一クラスが発見された。グアニンリボスイッチのコンセンサス配列および構造特徴を保有する代表的ＲＮＡは、原核生物の多数の遺伝子の５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）に置かれるが、この場合、それらはプリンサルベージおよび生合成に関与するタンパク質の発現を制御する。この系統発生学的収集物の3つの代表物は、グアニンに関するよりも数等級良好な大きさである見掛けの解離定数（見掛けのＫD）に関する値を有するアデニンと結合する。アデニンに対する選択は、リボスイッチのコア中の単一ヌクレオチド置換のためであり、この場合、各代表物はほとんど、ワトソン／クリック塩基対を形成することによりその対応するリガンドを認識すると思われる。さらに枯草菌のｙｄｈＬ遺伝子に関連したアデニン特異的リボスイッチは、遺伝子「オン」スイッチとして機能し、この場合、アデニン結合は、内在的転写ターミネーターステムの形成を妨げる構造的再配列を引き起こす。グアニン感知リボスイッチは、この化合物の濃度変化に応答して遺伝子発現を変調するＲＮＡ遺伝子制御素子の一クラスである。
【００３８】
大腸菌ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡの５’−非翻訳化配列は、代謝モニタリングおよび遺伝子制御におけるより予防的な役割を負う、ということが発見された。ｍＲＮＡは、タンパク質を必要とせずに補酵素Ｂ12を選択的に結合するにより代謝産物感知性遺伝子スイッチとして役立つ。この結合事象は、リボソーム結合の抑制と、その結果として起こるコバラミン輸送タンパク質ＢｔｕＢの合成の低減に関与すると思われる別個のＲＮＡ構造を確立する。この発見は、本明細書中に記載された関連観察とともに、ＲＮＡ−代謝産物相互作用による代謝モニタリングが遺伝子制御の広範なメカニズムである、という仮説を支持する。
【００３９】
ＲＮＡ構造プロービングデータは、チアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）リボスイッチがその標的化合物のアロステリックセンサーとして働く、ということを示し、この場合、アプタマードメインによるＴＰＰの結合はアプタマー内の、ならびに翻訳を妨げる隣接発現プラットフォーム内の立体配座状態を安定化する。発現プラットフォームの多様性は、広範囲であると思われる。ｔｈｉＭ  ＲＮＡは、翻訳を制御するためにシネ−ダルカルノ（ＳＤ）遮断メカニズムを用いる。それに反して、ｔｈｉＣ  ＲＮＡは転写と翻訳の両方で遺伝子発現を制御し、したがってＴＰＰ結合事象を転写終結事象に、そして完成ｍＲＮＡの翻訳の抑制に変換するある程度より複雑な発現プラットフォームを使用し得る。
【００４０】
１．リボスイッチＲＮＡの一般的構築
細菌リボスイッチＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの主コード領域の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に主として置かれる遺伝子制御素子である。構造的プロービング試験（さらに下記で考察される）は、リボスイッチ素子が一般的に2つのドメイン：リガンド結合ドメインとして役立つ天然アプタマー（T. Hermann, D.J. Patel, Science 2000, 287, 820; L. Gold, et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763）、ならびに遺伝子発現に関与するＲＮＡ素子（例えばシネ−ダルガルノ（ＳＤ）素子；転写ターミネーターステム）と連係する「発現プラットフォーム」からなる、ということを明示する。これらの結論は、in vitroで合成されたアプタマードメインが発現プラットフォームの非存在下で適切なリガンドと結合する、という観察から引き出される（実施例２、３および６参照）。さらに構造的プロービング研究は、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインが、独立して検査した場合に特定の二次−および三次−構造フォールドを取る、即ち完全５’リーダーＲＮＡの情況で検査した場合のアプタマー構造と本質的に同一である、ということを示唆する。これは、多くの場合、アプタマードメインが発現プラットフォームと関係なくフォールドするモジュラー単位である、ということを意味する（実施例２、３および６参照）。
【００４１】
最後に、アプタマードメインのリガンド結合または非結合状態は、遺伝子発現時に影響を及ぼすのに関与する発現プラットフォームにより説明される。モジュラー素子としてのリボスイッチの見込みは、アプタマードメインが種々の生物の間で（そしてＴＰＰリボスイッチに関して観察されたような界間でさえ）高度に保存されている（N. Sudarsan, et al., RNA 2003, 9, 644）が、一方、発現プラットフォームは、配列、構造において、ならびに添付のオープンリーディングフレームの発現が制御されるメカニズムにおいて変化する、という事実によりさらに支持される。例えば枯草菌のｔｅｎＡ  ｍＲＮＡのＴＰＰリボスイッチと結合するリガンドは、転写終結を引き起こす（A.S. Mironov, et al., Cell 2002, 111, 747）。この発現プラットフォームは、ＴＰＰ結合がＳＤ遮断メカニズムにより翻訳の抑制を引き起こす大腸菌からのｔｈｉＭ  ｍＲＮＡにおけるＴＰＰリボスイッチの発現プラットフォームと比較して、配列および構造において異なる（実施例２参照）。ＴＰＰアプタマードメインは容易に認識可能であり、そしてこれら2つの転写単位間でほぼ同一の機能的特性を有するが、しかし遺伝子制御メカニズムおよびそれらを実行する発現プラットフォームは非常に異なる。
【００４２】
リボスイッチＲＮＡに関するアプタマードメインは、典型的には〜70〜170 nt長の範囲である（図１１）。この観察は、in vitro進化実験が、長さがかなり短くそして構造的に複雑である広範な種々の小分子結合アプタマーを同定したと仮定すると、ちょっと予測されなかった（T.Hermann, D.J. Patel, Science 2000, 287, 820; L. Gold, et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763; M. Famulok, Current Opinion in Structural Biology 1999, 9, 324）。人工アプタマーと比較した場合の天然アプタマー配列の複雑さおよび情報含量の実質的増大に関する理由は依然として立証されていないが、しかしこの複雑さは高親和性および選択性を伴って機能するＲＮＡ受容体を生成する必要が最もあると考えられる。リガンド−リボスイッチ複合体に関する見掛けのＫD値は、低ナノモルから低マイクロモルの範囲である。いくつかのアダプタードメインは、添付の発現プラットフォームから単離される場合、無傷リボスイッチの場合を上回る標的リガンドに対する親和性改善（〜10〜100倍）を示す、ということに留意するのも有益である（実施例２参照）。おそらく、リガンド親和性の損失により示される完全無傷リボスイッチＲＮＡにより必要とされる多数の異なるＲＮＡ立体配座のサンプリングにおいて、エネルギー消費が認められる。アプタマードメインは分子スイッチとして役立たねばならないため、これは、それらのより洗練された構造を合理化するのを助け得る天然アプタマーにおける機能的要求にも付加し得る。
【００４３】
２．細菌における転写終結のリボスイッチ調節
細菌は、転写の終結のために主に2つの方法を用いる。ある種の遺伝子は、Ｒｈｏタンパク質に依存性である終結シグナルを組み入れる（J.P. Richardson, Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1577, 251）が、一方、他のものはＲｈｏ−非依存性ターミネーター（内在性ターミネーター）を用いて、転写延長複合体を非安定化する（I. Gusarov, E. Nudler, Molecular Cell 1999, 3, 495; E. Nudler, M.E. Gottesman, Genes to Cells 2002, 7, 755）。後者のＲＮＡ素子は、富ＧＣステム−ループとその後の6〜9個のウリジル残基の鎖から成る。内在性ターミネーターは細菌ゲノム全体に広く行き渡っており（F. Lillo, et al., 2002, 18, 971）、そして典型的には遺伝子またはオペロンの３’末端に位置する。興味深いことに、５’−ＵＴＲ内に位置する内在性ターミネーターに関して漸増数の例が観察されつつある。
【００４４】
細菌により用いられる広範な種々の遺伝子調節戦略の中で、ＲＮＡポリメラーゼが調節方式で５’−ＵＴＲ内の終結シグナルに応答する例が増大しつつある（T.M. Henkin, Current Opinion in Microbiology 2000, 3, 149）。ある種の条件中は、ＲＮＡポリメラーゼ複合体は外部シグナルにより指図されて、終結シグナルを感知するかまたは無視する。転写開始は調節なしで起こり得るが、しかしｍＲＮＡ合成の全部の（そして遺伝子発現の）制御は、最後に内在性ターミネーターの調節により指図される。おそらくは、少なくとも2つの相容れないｍＲＮＡ立体配座のうちの1つは、転写終結を合図するＲＮＡ構造の形成または崩壊を生じる。いくつかの場合に、ＲＮＡである（F.J. Grundy, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2002, 99, 11121; T.M. Henkin, C. Yanofsky, Bioassays 2002, 24, 700）そして他の場合にはタンパク質である（J. Stulke, Archives of Microbiology 2002, 177, 433）トランス作用因子は一般に、特定の細胞内シグナルを受容し、そしてその後にＲＮＡ立体配座の1つを安定化するために必要とされる。リボスイッチはＲＮＡ構造変調と遺伝子制御機構により解釈される代謝産物シグナルとの間の直接連結を提供する。枯草菌ｍＲＮＡからのＦＭＮリボスイッチの簡潔な態様が、このメカニズムを例証するために以下で提示される。
【００４５】
チアミン生合成に関与するある種のｍＲＮＡは、タンパク質因子の参加を伴わずにチアミン（ビタミンＢ1）またはその生物活性ピロリン酸誘導体（ＴＰＰ）と結合する、ということが発見された。ｍＲＮＡ−エフェクター複合体は、リボソーム結合部位を封鎖し、そして遺伝子発現の低減をもたらす別個の構造をとる。この代謝産物感知ｍＲＮＡ系は、その起源がタンパク質の進化的出現に先行し得る遺伝子「リボスイッチ」（本明細書中ではリボスイッチと呼ばれる）の一例を提供する。大腸菌のｂｔｕＢ遺伝子のｍＲＮＡリーダー配列は補酵素Ｂ12と選択的に結合し得るし、そしてこの結合事象は遺伝子制御のために重要であるＲＮＡにおける構造変化を引き起こす、ということが発見された（実施例１参照）。
【００４６】
枯草菌のｌｙｓＣ遺伝子の５’−ＵＴＲは、リジン応答性リボスイッチとして役立つ保存ＲＮＡ素子を保有する、ということも発見された。リボスイッチのリガンド結合ドメインは約1 μMの見掛けの解離定数（ＫD）でＬ−リジンと結合し、そして密接に関連する類似体、例えばＤ−リシンおよびオルニチンに対して高レベルの分子識別を示す。この広範なクラスのリボスイッチは、抗微生物剤チオシンのための標的として役立つ。
【００４７】
ｘｐｔ−ｐｂｕＸオペロン（Christiansen, L.C., et al., 1997, J. Bacteriol. 179, 2540-2550）は、グアニンに対する高親和性および高選択性を示すリボスイッチにより制御される、ということも発見された。このクラスのリボスイッチは、枯草菌における5つの転写単位の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、例えば１２−遺伝子ｐｕｒオペロンのものに存在する。ｍＲＮＡによるグアニンの直接結合は、ある種の細菌におけるプリン代謝のための代謝恒常性の重要な決定因子として役立つ。さらに7つの別個の標的分子に応答する発見されたクラスのリボスイッチは、中心代謝経路にとって基本的重要性を有する枯草菌における少なくとも68の遺伝子を制御する。
【００４８】
Ｓボックスと呼ばれる高度保存ＲＮＡドメインは、ＳＡＭのための選択的アプタマーとして役立つ、ということが発見された。二次および三次構造のアロステリック変調は、アプタマードメインとのＳＡＭ結合時に誘導され、そしてこれらの構造的変化はｍＲＮＡ転写の終結を誘導するのに関与する。
【００４９】
アデニンに応答する変異体クラスのリボスイッチも開示される。これらのリボスイッチは、グアニンアプタマーに配列および二次構造が密接に対応するアプタマードメインを保有する。しかしながらアデニンサブクラスのリボスイッチの各代表物は、アプタマーの保存コア中にＣ→Ｕ突然変異を保有し、このことは、この残基が代謝産物認識に関与することを示す。この単一ヌクレオチドの同定は、グアニンおよびアデニン間の結合特異性を確定し、これが、複雑なリボスイッチ構造が新規の代謝産物標的を認識する方法の一例を提供する。
【００５０】
本明細書中に開示された特定の天然リボスイッチは代謝産物結合により遺伝子発現を制御するｍＲＮＡ素子の最初の例であるが、しかしこの遺伝子制御戦略は生物学において広範囲に及ぶ、と予測される。ＴＰＰ、補酵素Ｂ12およびＦＭＮは、ＲＮＡワールド（Joyce, The antiquity of RNA-based evolution. Nature 418, 214-221 (2002)）中の生物学的補因子として出現した、ということが示唆されている（White III, Coenzymes as fossils of an earlier metabolic state. J. Mol. Evol. 7, 101-104 (1976); White III, In: The Pyridine Nucleotide Coenzymes. Acad. Press, NY pp. 1-17 (1982); Benner et al., Modern metabolism as a palimpsest of the RNA world. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7054-7058 (1989)）。これらの代謝産物が生合成されたものであり、そしてタンパク質の出現の前に用いられる場合には、ある種のリボスイッチは最も古い形態の遺伝子制御の現代の実例であり得る。ゲノム配列データベースの検索は、ＴＰＰアプタマーに対応する配列が、大きな変化を大々的に伴わずに、細菌、古細菌および真核生物からの生物体中に存在する、ということを明示した。新規の代謝産物結合ｍＲＮＡは進化が進行すると出現すると思われるが、しかし既知のリボスイッチはＲＮＡワールドからの分子化石である、と考えられる。
【００５１】
真菌および植物において同定されている、そして原核生物のチアミンピロリン酸結合ドメインのコンセンサス配列および構造を一致させるｍＲＮＡ素子が開示される。シロイヌナズナでは、コンセンサスモチーフはチアミン生合成遺伝子の３’−ＵＴＲ中に存在し、そして単離ＲＮＡドメインはin vitroで対応する補酵素と結合する。これらの結果は、代謝産物結合ｍＲＮＡが真核生物遺伝子調節に関与し、そしていくつかのリボスイッチが古い形態の遺伝子制御を代表し得る、ということを示す。
【００５２】
開示された方法および組成物は、別記しない限り、特定の合成方法、特定の分析技法に、または特定の試薬に限定されない、と理解されるべきであり、このようなものとして変化し得る。さらにまた本明細書中で用いられる用語は特定の実施形態を説明するだけの目的のためであり、限定されるよう意図されない、と理解されるべきである。
【００５３】
材料
開示された方法および組成物のために用いられ得る、ともに用いられ得る、そのための調製に用いられ得る、あるいはその生成物である材料、組成物および構成成分が開示される。これらのおよびその他の材料が本明細書中で開示され、そして、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物の種々の個々のおよび集合的組合せおよび置換の各々に対する特定の参照は明瞭には開示され得ないが、しかし各々は特に意図され、本明細書中に記載される、と理解される。例えばリボスイッチまたはアプタマードメインが開示され、考察され、そして多数の分子、例えばリボスイッチまたはアプタマードメインに対してなされ得る多数の修飾が考察される場合、リボスイッチまたはアプタマードメインの各々のおよび全ての組合せおよび置換、ならびに可能である修飾は、特に別記されない限り、特定的に意図される。したがって分子Ａ、ＢおよびＣの一クラスが、分子Ｄ、ＥおよびＦの一クラスと同様に開示され、そして組合せ分子の一例Ａ−Ｄが開示される場合には、各々が独立して列挙されない場合でも、各々は独立して、そして集合的に意図される。したがってこの例では、組合せＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが特に意図され、そしてＡ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；ならびに実例組合せＡ−Ｄの開示から開示されると考えられるはずである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも特に意図され、開示される。したがって例えばＡ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅの亜群が特に意図され、そしてＡ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；ならびに実例組合せＡ−Ｄの開示から開示されると考えられるべきである。この概念は、この適用の全ての態様に当てはまり、例としては、開示組成物の製造および使用方法における過程が挙げられるが、これらに限定されない。したがって実施され得る種々の付加的過程が存在する場合、これらの付加的過程の各々は、開示された方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組合せを用いて実施され、そしてこのような組合せの各々は特に意図され、開示されると考えられるべきである、と理解される。
【００５４】
Ａ．リボスイッチ
リボスイッチは、発現されるＲＮＡ分子の一部であり、そしてトリガー分子により結合される場合、状態を変える発現制御素子である。リボスイッチは、典型的には2つの別個のドメインに切断され得る：1つは標的（アプタマードメイン）を選択的に結合するもの、そしてもう1つは遺伝子制御に影響を及ぼすもの（発現プラットフォームドメイン）である。それは、遺伝子発現の代謝産物依存性アロステリック制御を生じるこれら2つのドメイン間の動的相互作用である。単離および組換えリボスイッチ、このようなリボスイッチを含有する組換え構築物、このようなリボスイッチと操作可能的に連結される非相同配列、ならびにこのようなリボスイッチ、リボスイッチ組換え構築物および非相同配列と操作可能的に連結されるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物が開示される。非相同配列は、例えば当該タンパク質またはペプチド、例えばレポータータンパク質またはペプチドをコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは天然リボスイッチであり、あるいはそれらに由来する。
【００５５】
開示されたリボスイッチ、例えばその誘導体および組換え形態は一般に、任意の供給源からであり、例えば天然リボスイッチおよびde novoで意図されたリボスイッチであり得る。任意のこのようなリボスイッチは、開示された方法に、またはそれとともに用いられ得る。しかしながら異なる型のリボスイッチが限定され、そしていくつかのこのようなサブタイプは、特定の方法（一般に本明細書中の他の箇所に記載されているような）に、またはそれとともに有用であり得る。リボスイッチの種類としては、例えば天然リボスイッチ、誘導体および修飾形態の天然リボスイッチ、キメラリボスイッチ、ならびに組換えリボスイッチが挙げられる。天然リボスイッチは、実際に見出されるようなリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。このような天然リボスイッチは、それが現実に起きるような単離または組換え形態の天然リボスイッチであり得る。即ちリボスイッチは同一の一次構造を有するが、しかし新規の遺伝子または核酸情況で単離または工学処理されている。キメラリボスイッチは、例えばリボスイッチの任意のまたは特定のクラスまたは型のリボスイッチの一部、ならびにリボスイッチの同一のまたは任意の異なるクラスまたは型のリボスイッチの一部、リボスイッチの任意のまたは特定のクラスまたは型のリボスイッチの一部、ならびに任意の非リボスイッチ配列または構成成分で構成され得る。組換えリボスイッチは、新規の遺伝子または核酸情況で単離または工学処理されたリボスイッチである。
【００５６】
異なるクラスのリボスイッチは、同一または類似のトリガー分子を有するリボスイッチ、あるいは同一または類似の全体構造（予測された、確定されたまたは組合せ）を有するリボスイッチを指す。同一クラスのリボスイッチは一般に同一または類似のトリガー分子、ならびに同一または類似の全体構造の両方を有するが、しかしそうである必要はない。
【００５７】
非相同アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含有するキメラリボスイッチも開示される。即ちキメラリボスイッチは、一供給源からのアプタマードメインおよび別の供給源からの発現プラットフォームドメインで構成される。非相同供給源は、例えば異なる特定のリボスイッチ、異なる型のリボスイッチ、または異なるクラスのリボスイッチからであり得る。非相同アプタマーは、非リボスイッチアプタマーからも生じ得る。非相同発現プラットフォームドメインは、非リボスイッチ供給源からも生じ得る。
【００５８】
リボスイッチは、その他の既知の開発されたまたは天然のリボスイッチから修飾され得る。例えばスイッチドメイン部分は、リボスイッチの既知のまたは予測される二次、三次または二次および三次の両方の構造を保存しながら、１つまたは複数のヌクレオチドを変えることにより修飾され得る。例えば塩基対中の両ヌクレオチドは、これも塩基対であり得るヌクレオチドに変えられうる。塩基対合の保持を可能にする変化は、塩基対保存的変化として本明細書中で言及される。
【００５９】
修飾または誘導体リボスイッチは、in vitro選択および進化技法を用いても製造され得る。概してin vitro進化技法は、リボスイッチに適用される場合、リボスイッチ配列の一部（単数または複数）は変更されるが、しかしリボスイッチの他の部分は一定に保持される一組の変異体リボスイッチを生成することを包含する。変異体リボスイッチ組の活性化、非活性化または遮断（あるいはその他の機能的または構造的判定基準）が次に査定され、そして当該判定基準を満たす変異体リボスイッチが、使用のためにまたはさらなる進化課程のために選択される。変異体の生成のための有用な塩基リボスイッチは、本明細書中で開示される特定およびコンセンサスリボスイッチである。コンセンサスリボスイッチは、in vitro選択および進化のためにリボスイッチのどの部分（単数または複数）を変えるのかを知らせるために用いられ得る。
【００６０】
調節変更による修飾リボスイッチも開示される。リボスイッチの調節は、リボスイッチ（キメラリボスイッチである）の発現プラットフォームドメインにアプタマードメインを操作可能的に連結することにより変更され得る。次にアプタマードメインは、例えばアプタマードメインに対するトリガー分子の作用によりリボスイッチの調節を媒介し得る。アプタマードメインは、任意の適切な方法で、例えばリボスイッチの正常または天然アプタマードメインを新規のアプタマードメインに置き換えることにより、リボスイッチの発現プラットフォームドメインに操作可能的に連結され得る。一般にアプタマードメインが得られるリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断し得る任意の化合物または条件を用いて、キメラリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断し得る。
【００６１】
不活性化リボスイッチも開示される。リボスイッチは、リボスイッチを共有的に変えることにより（例えばリボスイッチの部分を架橋するかまたは化合物をリボスイッチと結合することにより）不活性化され得る。この方法でのリボスイッチの不活性化は、例えばリボスイッチのためのトリガー分子が結合しないようにする、トリガー分子の結合時にリボスイッチの状態における変化を防止する、あるいはリボスイッチの発現プラットフォームドメインがトリガー分子の結合時に発現に影響を及ぼさないようにする変更に起因し得る。
【００６２】
バイオセンサーリボスイッチも開示される。バイオセンサーリボスイッチは、それらのコグネイトトリガー分子の存在下で検出可能シグナルを生成する工学処理リボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値でまたはそれより高いレベルで誘発され得る。バイオセンサーリボスイッチは、in vivoまたはin vitroでの使用のために意図され得る。例えばシグナルとして役立つかまたはシグナルの生成に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに操作可能的に連結されるバイオセンサーリボスイッチは、リボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有するよう細胞または生物を工学処理することにより、in vivoで用いられ得る。in vitroで用いるためのバイオセンサーリボスイッチの一例は、立体配座依存性標識を含むリボスイッチであり、それからのシグナルはリボスイッチの活性化状態によって変化する。このようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは天然リボスイッチからのまたは由来のアプタマーを用いる。バイオセンサーリボスイッチは、種々の状態およびプラットフォームで用いられ得る。例えばバイオセンサーリボスイッチは、固体支持体、例えばプレート、チップ、ストリップおよびウエルとともに用いられ得る。
【００６３】
新規のトリガー分子を認識する修飾または誘導体リボスイッチも開示される。新規のトリガー分子を認識する新規のリボスイッチおよび／または新規のアプタマーは、既知のリボスイッチに関して選択され、それらから設計されまたは誘導され得る。これは、例えばリボスイッチ中に一組のアプタマー変異体を生成し、当該化合物の存在下で変異体リボスイッチの活性化を査定し、活性化された変異体リボスイッチ（または例えば最も高度にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ）を選択し、そして、所望の活性、特異性、活性および特異性の組合せまたは特性のその他の組合せを有する変異体リボスイッチが生じるまで、これらの過程を反復することにより成し遂げられ得る。
【００６４】
特に有用なアプタマードメインは、Ｐ１ステム構造（または単にＰ１）として本明細書中で言及されるステム構造を形成し得る。種々のリボスイッチのＰ１ステムは、図１１（および他の図）に示されている。Ｐ１ステム構造中のハイブリダイズ鎖は、アプタマー鎖（Ｐ１ａ鎖とも呼ばれる）および制御鎖（Ｐ１ｂ鎖とも呼ばれる）と呼ばれる。制御鎖は、アプタマー鎖、ならびに調節鎖と呼ばれる（Ｐ１ｃ鎖とも呼ばれる）連結発現プラットフォーム中の配列の両方を伴うステム構造を形成し得る。したがって制御鎖（Ｐ１ｂ）は、アプタマー鎖（Ｐ１ａ）および調節鎖（Ｐ１ｃ）を有する代替的ステム構造を形成し得る。リボスイッチの活性化および非活性化は、あるステム構造から他のステム構造へのシフトを生じる（Ｐ１ａ／Ｐ１ｂからＰ１ｂ／Ｐ１ｃへ、またはその逆）。Ｐ１ｂ／Ｐ１ｃステム構造の形成は、リボスイッチを含有するＲＮＡ分子の発現に影響を及ぼす。この制御メカニズムを介して働くリボスイッチは、本明細書中では代替的ステム構造リボスイッチと（または代替的ステムリボスイッチと）呼ばれる。
【００６５】
概して任意のアプタマードメインは、アプタマードメインの制御鎖と相補的であるよう発現プラットフォームドメイン中の調節化鎖を設計するかまたは適合することにより、任意の発現プラットフォームドメインとともに用いるために適合され得る。あるいはアプタマードメインのアプタマーおよび制御鎖の配列は、制御鎖が発現プラットフォーム中の機能的に有意の配列と相補的であるよう、適合され得る。例えば制御鎖は、制御鎖とＳＤ配列との間のステム構造の形成時に、ＳＤ配列がリボソームに接近不可能になり、したがって翻訳開始を低減するかまたは防止するよう、ＲＮＡのシネ−ダルガルノ配列と相補的であるよう適合され得る。アプタマー鎖はアプタマードメイン中のＰ１ステムの形成を可能にするために配列中に対応する変化を有する、ということに留意されたい。
【００６６】
別の例として、転写ターミネーターがＲＮＡ分子（最も便利であるのはＲＮＡの非翻訳領域）に付加され得るが、この場合、転写ターミネーターの配列の一部はアプタマードメインの制御鎖（配列は調節化配列である）と相補的である。これは、アプタマー鎖および調節化鎖を有する代替的ステム構造をアプタマードメインの制御配列に形成させ、したがってリボスイッチの活性化または非活性化時に転写ターミネーターステムを形成するかまたは崩壊させる。任意のその他の発現素子は、代替的ステム構造の類似の設計によりリボスイッチの制御下に置かれ得る。
【００６７】
リボスイッチにより制御される転写ターミネーターに関しては、転写の速度、ならびにリボスイッチおよび発現プラットフォーム素子の感覚は、適正制御のために重要であり得る。転写速度は、例えば転写を中断し、リボスイッチにトリガー分子を生成させ、感知させるためのポリメラーゼ中断素子（例えば一連のウリジン残基）により、調整され得る。例えばＦＭＮリボスイッチに関しては、ＦＭＮがそのアプタマードメインに結合される場合には、アンチターミネーター配列が封鎖され、そしてアンチターミネーター構造の形成のために利用不可能である（図１２）。しかしながらＦＭＮが存在しない場合、アンチターミネーターは、そのヌクレオチドがポリメラーゼから一旦出現すると、生成し得る。次にＲＮＡＰは別のＵストレッチに達して、再び中断するためにのみ、中断部位なしで遮断する。転写ターミネーターは次に、ターミネーターヌクレオチドがアンチターミネーターにより連結されない場合にのみ生成する。
【００６８】
コード領域と操作可能的に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む調節可能遺伝子発現構築物が開示されるが、この場合、リボスイッチはＲＮＡの発現を調節し、リボスイッチおよびコード領域は非相同性で洗う。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み得るが、この場合、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同性である。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み得るが、この場合、アプタマードメインはＰ１ステムを含み、Ｐ１ステムはアプタマー鎖および制御鎖を含み、発現プラットフォームドメインは調節化鎖を含み、調節化鎖、制御鎖またはその両方がステム構造を形成するよう意図されている。
【００６９】
リボスイッチが天然リボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチが開示される。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み得るが、この場合、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同性である。リボスイッチは、天然グアニン応答性リボスイッチ、アデニン応答性リボスイッチ、リシン応答性リボスイッチ、チアミンピロリン酸応答性リボスイッチ、アデノシルコバラミン応答性リボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド応答性リボスイッチまたはＳ−アデノシルメチオニン応答性リボスイッチから誘導され得る。リボスイッチはトリガー分子により活性化され得るが、この場合、リボスイッチは、トリガー分子により活性化されるとシグナルを生成する。
【００７０】
多数のリボスイッチおよびリボスイッチ構築物が本明細書中に記載され、言及されている。任意の特定のリボスイッチまたはリボスイッチ構築物、あるいはリボスイッチまたはリボスイッチ構築物の群が、本明細書中に開示された本発明のいくつかの態様から排除され得る、ということが特に意図される。例えばｘｐｔ−ｐｂｕＸリボスイッチとレポーター遺伝子との融合は、レポーター遺伝子に融合された一組のリボスイッチから排除され得る。
【００７１】
１．アプタマードメイン
アプタマーは、特定の化合物および化合物のクラスと選択的に結合し得る核酸セグメントおよび構造物である。リボスイッチは、トリガー分子の結合時に、リボスイッチの状態または構造の変化を生じるアプタマードメインを有する。機能的リボスイッチにおいて、アプタマードメインに連結された発現プラットフォームドメインの状態または構造は、トリガー分子がアプタマードメインと結合すると、変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、任意の供給源に由来し、例えばリボスイッチの天然アプタマードメイン、人工アプタマー、工学処理、選定、進化または誘導アプタマー（単数または複数）ドメインであり得る。リボスイッチ中のアプタマーは一般に、例えばステム構造により、連結発現プラットフォームドメインの一部と相互作用し得る少なくとも1つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合時に、生成するかまたは崩壊される。
【００７２】
種々の天然リボスイッチのコンセンサスアプタマードメインは、図１１に示されている。これらのアプタマードメイン（例えばそこに例示される直接変異体の全て）は、リボスイッチ中に用いられ得る。コンセンサス配列および構造は、配列および構造中の変異を示す。指示変異内に存在するアプタマードメインは、本明細書中では、直接変異体と呼ばれる。これらのアプタマードメインは、修飾または変異体アプタマードメインを生成するよう修飾され得る。保存的修飾としては、対中のヌクレオチドが相補性を保持するよう塩基対合ヌクレオチド中に任意の変化が挙げられる。中等度の修飾としては、指示された長さ範囲の20％以下のステムまたはループ（これに関する長さまたは長さ範囲が指示されている）の長さの変化が挙げられる。ループおよびステム長は、「指示される」べきものであると考えられ、この場合、コンセンサス構造は特定長のステムまたはループを示し、あるいは一連の長さが列挙されるかまたは表示される。中等度の修飾としては、指示された長さ範囲の40％以下のステムまたはループ（これに関する長さまたは長さ範囲が指示されない）の長さの変化が挙げられる。中等度修飾は、アプタマードメインの非特定部分の機能的変異対も含む。アプタマードメインの非特異的部分は、図１１に実線で示されている。
Ｐ１ステムおよびその構成鎖は、発現プラットフォームおよびＲＮＡ分子とともに用いるためにアプタマードメインを適合する再に修飾され得る。広範囲におよび得るこのような修飾は、本明細書中ではＰ１修飾と呼ばれる。Ｐ１修飾は、アプタマードメインのＰ１修飾の配列および／または長さに対する変化を含む。
【００７３】
図１１に示したアプタマードメイン（任意の直接変異体を含む）は、in vitro選択またはin vitro進化技法により誘導化アプタマードメインを生成するための最初の配列として特に有用である。
【００７４】
開示リボスイッチのアプタマードメインは、任意のその他の目的のためにも、そして任意のその他の情況において、アプタマーとして用いられ得る。例えばアプタマーは、リボザイム、その他の分子スイッチ、ならびに構造における変化がＲＮＡの機能に影響を及ぼし得る任意のＲＮＡ分子を制御するために用いられ得る。
【００７５】
２．発現プラットフォームドメイン
発現プラットフォームドメインは、リボスイッチを含有するＲＮＡ分子の発現に影響を及ぼすリボスイッチの一部である。発現プラットフォームドメインは一般に、例えばステム構造を形成することにより、連結アプタマードメインの一部と相互作用し得る少なくとも1つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合時に生成するかまたは崩壊され得る。ステム構造は一般に、発現調節構造であるか、またはその形成を防止する。発現調節構造は、その構造を含有するＲＮＡ分子の発現を可能にし、防止し、増強しまたは抑制する構造である。例としては、シネ−ダルガルノ配列、開始コドン、転写ターミネーター、ならびに安定およびプロセシングシグナルが挙げられる。
【００７６】
Ｂ．トリガー分子
トリガー分子は、リボスイッチを活性化し得る分子および化合物である。これは、リボスイッチを活性化し得るリボスイッチおよびその他の化合物のための天然または正常トリガー分子を包含する。天然または正常トリガー分子は、現実に所定のリボスイッチのためのトリガー分子、またはいくつかの非天然リボスイッチの場合には、そのためにリボスイッチが設計されるかまたはそれを用いてリボスイッチが選択されるトリガー分子である（例えばin vitro選択またはin vitro進化技法のように）。非天然トリガー分子は、非天然トリガー分子と呼ばれ得る。
【００７７】
Ｃ．化合物
リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断し得る化合物、およびこのような化合物を含有する組成物も開示される。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去により、遺伝子発現を制御するよう機能する。化合物は、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断するために用いられ得る。リボスイッチのためのトリガー分子（ならびにその他の活性化化合物）は、リボスイッチを活性化するために用いられ得る。トリガー分子以外の化合物は一般に、リボスイッチを非活性化するかまたは遮断するために用いられ得る。リボスイッチは、例えばリボスイッチの存在からトリガー分子を除去することによっても、非活性化され得る。リボスイッチは、例えばリボスイッチを活性化しないトリガー分子の類似体の結合により遮断され得る。
【００７８】
化合物をＲＮＡ分子と接触させることにより、ＲＮＡ分子の、またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変更するための化合物も開示される（この場合、ＲＮＡ分子はリボスイッチを含む）。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去により遺伝子発現を制御するよう機能する。したがってリボスイッチを含む当該ＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する条件に付すことは、ＲＮＡの発現を変更するために用いられ得る。発現は、例えば転写の終結またはＲＮＡと結合するリボスイッチの遮断の結果として変更され得る。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質によって、ＲＮＡ分子の発現を低減または防止し、あるいはＲＮＡ分子の発現を促進または増大し得る。
【００７９】
ＲＮＡ分子の、またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を調節するための化合物も開示される。リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断することによりリボスイッチを含有する天然遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物も開示される。遺伝子がそれを保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化または遮断は、細胞または生物の死、静止または衰弱において存在し得る。
【００８０】
リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断することにより、リボスイッチを含有する単離、工学処理または組換え遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物も開示される。遺伝子が所望の発現産物をコードする場合、リボスイッチの活性化または非活性化は、遺伝子の発現を誘導し、したがって発現産物の産生を生じるために用いられ得る。遺伝子が遺伝子発現のまたは別の細胞過程の誘導物質またはリプレッサーをコードする場合、リボスイッチの活性化、非活性化または遮断は、他の調節された遺伝子または細胞過程の誘導、抑制または脱抑制を生じ得る。多数のこのような二次調節作用は既知であり、そしてリボスイッチとともに用いるために適合され得る。このような調節のための一次制御としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小非抗原性分子であり得る点である。
【００８１】
リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する化合物の同定方法も開示される。例えばリボスイッチを活性化する化合物は、試験化合物およびリボスイッチを接触させ、そしてリボスイッチの活性化を査定することにより同定され得る。リボスイッチが活性化された場合、試験化合物は、リボスイッチを活性化する化合物として同定される。リボスイッチの活性化は、任意の適切な方法で査定され得る。例えばリボスイッチは、レポーターＲＮＡに連結され、そしてレポーターＲＮＡの発現、発現レベルまたは発現レベルの変化が、試験化合物の存在下および非存在下で査定され得る。別の例として、リボスイッチは立体配座依存性標識を含み、それからのシグナルはリボスイッチの活性状態によって変化する。このようなリボスイッチは、好ましくは天然リボスイッチからのまたはそれに由来するアプタマードメインを用いる。観察され得るように、リボスイッチの活性化の査定は、制御検定または測定の使用により、あるいは制御検定または測定を用いずに実施され得る。リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法は、類似の方法で実施され得る。
リボスイッチを遮断する化合物の同定は、任意の適切な方法で成し遂げられ得る。例えば検定は、リボスイッチを活性化するかまたは非活性化することが既知の化合物の存在下で、そして試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を査定するために実施され得る。試験化合物の非存在下で観察されるのと同様に活性化または非活性化が観察されない場合には、試験化合物はリボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定される。
【００８２】
リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する化合物を同定し、同定化合物を製造することにより作られる化合物も開示される。これは、例えば本明細書中の別の箇所に開示されたような化合物同定方法を、同定化合物の製造方法と組合せることにより成し遂げられ得る。例えば化合物は、試験化合物およびリボスイッチを接触させ、リボスイッチの活性化を査定し、そしてリボスイッチが試験化合物により活性化される場合には、化合物としてリボスイッチを活性化する試験化合物を製造することにより作られ得る。
【００８３】
化合物によりリボスイッチの活性化、非活性化または遮断を点検し、点検化合物を製造することにより作られる化合物も開示される。これは、例えば本明細書中の別の箇所に開示されたような化合物活性化、非活性化または遮断査定方法を、点検化合物の製造方法と組合せることにより成し遂げられ得る。例えば化合物は、試験化合物およびリボスイッチを接触させ、リボスイッチの活性化を査定し、そしてリボスイッチが試験化合物により活性化される場合には、化合物としてリボスイッチを活性化する試験化合物を製造することにより作られ得る。リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断するそれらの能力に関する化合物の点検は、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断することが前に既知でない化合物の同定を、そして化合物がリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断することがすでに既知であった場合のリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する化合物の能力を査定することの両方を指す。
【００８４】
リボスイッチを活性化するために用いられ得る特定の化合物も開示される。グアニン応答性リボスイッチ（およびグアニン応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ）に関して有用な化合物としては、次式：
【化１】
2010213712.tif 000002
（ここで、化合物はグアニン応答性リボスイッチまたはその誘導体と結合し、化合物がグアニン応答リボスイッチまたは誘導体に結合される場合、Ｒ7は水素結合受容体として役立ち、Ｒ10は水素結合供与体として役立ち、Ｒ11は水素結合受容体として役立ち、Ｒ12は水素結合供与体として役立ち、Ｒ13はＨ、Ｈ2であるかまたは存在せず、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、Ｃ、Ｎ、ＯまたはＳであり、そして
【化２】
2010213712.tif 000003
は、各々独立して、一重または二重結合を表す）
を有する化合物が挙げられる。
【００８５】
上記定義内の化合物は全て、本明細書中で特に開示されるよう意図され、そして特に開示されると考えられるべきである。さらに上記の定義内で同定され得る全ての亜群は、本明細書中で特に開示されるよう意図され、そして特に開示されると考えられるべきである。その結果、任意の化合物または化合物の亜群は、使用のために特に含まれるかまたは使用から排除され、あるいは化合物のリストに含まれるかまたはリストから排除され得る、ということが特に意図される。例えば一見解として、各化合物が上記のようであるが、しかしグアニン、ヒポキサンチン、キサンチンまたはＮ2−メチルグアニンでない化合物の一群が意図される。別の例として、各化合物が上記と同様であり、そしてグアニン応答性リボスイッチを活性化し得る化合物の一群が意図される。
【００８６】
アデニン応答性リボスイッチ（およびアデニン応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ）に関して有用な化合物としては、次式：
【化３】
2010213712.tif 000004
（ここで、化合物はアデニン応答性リボスイッチまたはその誘導体と結合し、化合物がアデニン応答リボスイッチまたは誘導体に結合される場合、Ｒ1、Ｒ3およびＲ7は水素結合受容体として役立ち、そしてＲ10およびＲ11は水素結合供与体として役立ち、Ｒ12はＨ、Ｈ2であるかまたは存在せず、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、Ｃ、Ｎ、ＯまたはＳであり、そして
【化４】
2010213712.tif 000005
は、各々独立して、一重または二重結合を表す）
を有する化合物が挙げられる。
【００８７】
上記定義内の化合物は全て、本明細書中で特に開示されるよう意図され、そして特に開示されると考えられるべきである。さらに上記の定義内で同定され得る全ての亜群は、本明細書中で特に開示されるよう意図され、そして特に開示されると考えられるべきである。その結果、任意の化合物または化合物の亜群は、使用のために特に含まれるかまたは使用から排除され、あるいは化合物のリストに含まれるかまたはリストから排除され得る、ということが特に意図される。例えば一見解として、各化合物が上記のようであるが、しかしアデニン、２，６−ジアミノプリンまたは２−アミノプリンでない化合物の一群が意図される。別の例として、各化合物が上記と同様であり、そしてアデニン応答性リボスイッチを活性化し得る化合物の一群が意図される。
【００８８】
リシン応答性リボスイッチ（およびリシン応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ）に関して有用な化合物としては、次式：
【化５】
2010213712.tif 000006
（ここで、化合物はリシン応答性リボスイッチまたはその誘導体と結合し、式中、Ｒ2およびＲ3は各々正に荷電され、Ｒ1は負に荷電され、Ｒ4はＣ、Ｎ、ＯまたはＳであり、そして
【化６】
2010213712.tif 000007
は、各々独立して、一重または二重結合を表す）
を有する化合物が挙げられる。Ｒ2およびＲ3が各々ＮＨ3+であり、そしてＲ1がＯ-である上記のような化合物も意図される。
【００８９】
上記定義内の化合物は全て、本明細書中で特に開示されるよう意図され、そして特に開示されると考えられるべきである。さらに上記の定義内で同定され得る全ての亜群は、本明細書中で特に開示されるよう意図され、そして特に開示されると考えられるべきである。その結果、任意の化合物または化合物の亜群は、使用のために特に含まれるかまたは使用から排除され、あるいは化合物のリストに含まれるかまたはリストから排除され得る、ということが特に意図される。例えば一見解として、各化合物が上記のようであるが、しかしリシンでない化合物の一群が意図される。別の例として、各化合物が上記と同様であり、そしてリシン応答性リボスイッチを活性化し得る化合物の一群が意図される。
【００９０】
ＴＰＰ応答性リボスイッチ（およびリシン応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ）に関して有用な化合物としては、次式：
【化７】
2010213712.tif 000008
（ここで、化合物はＴＰＰ応答性リボスイッチまたはその誘導体と結合し、式中、Ｒ1は正に荷電され、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、Ｃ、ＯまたはＳであり、Ｒ4はＣＨ3、ＮＨ2、ＯＨ、ＳＨ、Ｈであるかまたは存在せず、Ｒ5はＣＨ3、ＮＨ2、ＯＨ、ＳＨまたはＨであり、Ｒ6はＣまたはＮであり、そして
【化８】
2010213712.tif 000009
は、各々独立して、一重または二重結合を表す）
を有する化合物が挙げられる。Ｒ1がホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートである上記のような化合物も意図される。
【００９１】
上記定義内の化合物は全て、本明細書中で特に開示されるよう意図され、そして特に開示されると考えられるべきである。さらに上記の定義内で同定され得る全ての亜群は、本明細書中で特に開示されるよう意図され、そして特に開示されると考えられるべきである。その結果、任意の化合物または化合物の亜群は、使用のために特に含まれるかまたは使用から排除され、あるいは化合物のリストに含まれるかまたはリストから排除され得る、ということが特に意図される。例えば一見解として、各化合物が上記のようであるが、しかしＴＰＰ、ＴＰまたはチアミンでない化合物の一群が意図される。別の例として、各化合物が上記と同様であり、そしてＴＰＰ応答性リボスイッチを活性化し得る化合物の一群が意図される。
【００９２】
Ｄ．構築物、ベクターおよび発現系
開示リボスイッチは、任意の適切な発現系中で用いられ得る。組換え発現は、ベクター、例えばプラスミドを用いて有用に成し遂げられ得る。ベクターは、リボスイッチコード配列に操作可能的に連結されたプロモーター、ならびに発現されるＲＮＡ（例えばタンパク質をコードするＲＮＡ）を含み得る。ベクターは、転写および翻訳に必要とされるその他の素子も含み得る。本明細書中で用いる場合、ベクターは、外因性ＤＮＡを含有する任意のキャリアを指す。したがってベクターは、分解を伴わずに外因性核酸を細胞に輸送する作用物質であり、それが送達される細胞中の核酸の発現を生じるプロモーターを含む。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミドおよび人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。リボスイッチ調節構築物を保有するのに適した種々の原核生物および真核生物発現ベクターが産生され得る。このような発現ベクターとしては、例えばｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣおよび酵母ベクターが挙げられる。ベクターは、例えば種々のin vivoおよびin vitro情況で用いられ得る。
【００９３】
ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養性ウイルス、シンドビスおよびその他のＲＮＡウイルス、例えばＨＩＶ主鎖を伴うこれらのウイルスが挙げられる。それらをベクターとして用いるのに適するようにするこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーも有用である。Verma (1985)に記載されているレトロウイルスベクターとしては、ネズミマロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）およびベクターとしてＭＭＬＶの望ましい特性を発現するレトロウイルスが挙げられる。典型的にはウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写体、複製およびキャプシド封入に必要な逆方向末端反復、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するためのプロモーターを含有する。ベクターとして工学処理された場合、ウイルスは典型的には除去される１つまたは複数の初期遺伝子を有し、そして遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットが除去ウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム中に挿入される。
【００９４】
「プロモーター」は一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの単数または複数の配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの基本的相互作用に必要とされるコア素子ならびに転写因子を含有し、そして上流素子および応答素子を含有し得る。
【００９５】
「エンハンサー」は一般に、転写開始部位から非固定距離で機能し、そして転写単位に対して５’（Laimins, 1981）または３’（Lusky et al., 1983）であり得るＤＮＡの配列を指す。さらにエンハンサーは、イントロン内（Banerji et al., 1983）、ならびにコード配列それ自体内（Osborne et al., 1984）であり得る。それらは通常は10〜300 bp長であり、そしてそれらはシスで機能する。エンハンサーは、直ぐ近くのプロモーターから転写を増大するよう機能する。エンハンサーも、プロモーターと同様に、転写の調節を媒介する応答素子をしばしば含有する。エンハンサーはしばしば、発現の調節を確定する。
【００９６】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）中で用いられる発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写の終結に必要な配列も含有し得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳化部分中のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位はポリアデニル化領域も含有する、というのが好ましい。この領域の一利点は、それが転写単位がプロセシングされ、ｍＲＮＡと同様に輸送される見込みを増大する点である。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルは導入遺伝子構築物中で用いられるのが好ましい。
【００９７】
ベクターは、マーカー生成物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー生成物は、遺伝子が細胞に送達され、そして一旦送達されれば、発現されるか否かを確定するために用いられる。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質をコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能マーカーであり得る。このような選択可能マーカーが宿主細胞中に首尾よくトランスフェクトされると、形質転換化宿主細胞は、選定圧力下に置かれた場合、存在し続け得る。選定レジメンの2つの広範に用いられる別個の部類が存在する。第一の部類は、細胞の代謝、ならびに補足培地と関係なく増殖する能力を欠く突然変異体細胞株の使用に基づく。第二の部類は、任意の細胞型に用いられる選択スキームを示し、そして突然変異体細胞株の使用を要しない優勢選択である。これらのスキームは典型的には、宿主細胞の増殖を阻止するために薬剤を用いる。新規の遺伝子を有する細胞は、タンパク質運搬薬剤体制を発現し、選択を生き残る。このような優勢選択の例は、薬剤ネオマイシン（Southern and Berg, 1982）、ミコフェノール酸（Mulligan and Berg, 1980）またはヒグロマイシン（Sugden et al., 1985）を用いる。
【００９９】
遺伝子移入は、遺伝物質、例えばプラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドおよび人工染色体（これらに限定されない）の直接移入を用いて、あるいは細胞中の遺伝武士地またはキャリア、例えば陽イオン性リポソームの移入により得られる。このような方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書中に記載された方法に用いるために容易に適合可能である。移入ベクターは、細胞中に遺伝子を送達するために用いられる（例えばプラスミド）、あるいは遺伝子を送達するための一般的戦略の一部としての、例えば組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部としての任意のヌクレオチド構築であり得る（Ram et al. Cancer Res. 53: 83-88, (1993)）。トランスフェクションのための適切な手段、例えばウイルスベクター、化学的形質移入体、または物理機械的方法、例えば電気穿孔およびＤＮＡの直接核酸は、例えばWolff, J.A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990); およびWolff, J.A. Nature, 352, 815-818, (1991)により記載されている。
【０１００】
１．ウイルスベクター
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養性ウイルス、シンドビスおよびその他のＲＮＡウイルス、例えばＨＩＶ主鎖を伴うこれらのウイルスが挙げられる。それらをベクターとして用いるのに適するようにするこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。好ましいレトロウイルスとしては、ネズミマロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）およびベクターとしてＭＭＬＶの望ましい特性を発現するレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスより大きな遺伝子有効搭載量、即ち導入遺伝子またはマーカー遺伝子を保有し、この理由のために、一般的に用いられるベクターである。しかしながらそれらは非増殖細胞では有用でない。アデノウイルスベクターは助けて働くのが相対的に安定且つ容易であり、高力価を有し、エーロゾル処方物中で送達され、そして非分裂細胞をトランスフェクトし得る。ポックスウイルスベクターは大型であり、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、それらは熱安定性であり、そして室温で保存され得る。好ましい実施形態は、ウイルス抗原により引き出される宿主生物の免疫応答を抑制するよう工学処理されたウイルスベクターである。この型の好ましいベクターは、インターロイキン８または１０に関するコード領域を保有する。
【０１０１】
ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入するために、ほとんどの化学的または物理的方法より高い相互作用（遺伝子を導入する能力）能力を有する。典型的にはウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写体、複製およびキャプシド封入に必要な逆方向末端反復、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するためのプロモーターを含有する。ベクターとして工学処理された場合、ウイルスは典型的には除去される１つまたは複数の初期遺伝子を有し、そして遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットが除去ウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム中に挿入される。この型の構築物は、約8 kbまでの外来遺伝子物質を保有し得る。除去初期遺伝子の必要機能は、典型的には、初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するよう工学処理された細胞株により供給される。
【０１０２】
ｉ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、任意の型、亜科、属または親和性を含めたレトロウイルス科のウイルス科に属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、概して、Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985)（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）により記載されている。遺伝子療法のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許第4,868,116号および第4,980,286号；ＰＣＴ出願WO 90/02806およびWO 89/07136；ならびにMulligan（Science 260: 926-932 (1993)）に記載されている（これらの記載内容は、参照により本明細書中で援用される）。
【０１０３】
レトロウイルスは本質的には、核酸積荷をその中に詰め込んだパッケージである。核酸積荷は、それとともに、複製娘分子がパッケージ被膜内に効率的に包装されることを保証するパッケージングシグナルを保有する。パッケージシグナルのほかに、複製ならびに複製ウイルスのパッケージングのために、シスで必要とされる多数の分子が存在する。典型的にはレトロウイルスゲノムは、タンパク質被膜の作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有する。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は典型的には、標的細胞に移入されるものである外来ＤＮＡにより置き換えられる。レトロウイルスベクターは典型的には、パッケージ被膜中への組入れのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始を知らせる配列、逆転写に必要な阻止、例えば逆転写のｔＲＮＡプライマーを結合するためのプライマー結合部位、ＤＮＡ合成中のＲＮＡ鎖のスイッチを導く末端反復配列、ＤＮＡ合成の二次鎖の合成のためのプライミング部位として役立つ富プリン配列５’−３’ＬＴＲ、ならびに宿主ゲノム中に挿入するためのレトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能にするＬＴＲの末端知覚の特定配列を含有する。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の除去は、約8 kbの外来配列をウイルスゲノム中に挿入させ、逆転写させて、そして複製時に新規レトロウイルス粒子中にパッケージさせる。この量の核酸は、各転写体のサイズによって1〜多数の遺伝子の送達のために十分である。正または負の選択可能マーカーを、他の遺伝子と一緒に挿入物中に含むことが好ましい。
【０１０４】
ほとんどのレトロウイルスベクター中の複製機構およびパッケージングタンパク質は除去されているため（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）、ベクターは典型的には、パッケージング細胞株中にそれらを入れることにより生成される。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージング機構を含有駿河、しかし任意のパッケージングシグナルを欠くレトロウイルスでトランスフェクトされるかまたは形質転換された細胞株である。選択のＤＮＡを保有するベクターがこれらの細胞株中にトランスフェクトされると、当該遺伝子を含有するベクターは、ヘルパー細胞によりシスで提供される機構により複製され、新規のレトロウイルス粒子中にパッケージされる。機構のためのゲノムは、それらが必要なシグナルを欠くため、パッケージされない。
【０１０５】
ｉｉ．アデノウイルスベクター
複製欠陥アデノウイルスの構築が記載されている（Berkner et al., J. Virology 61: 1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6: 2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57: 267-274 (1986); Davidson et al., J. Virology 61: 1226-1239 (1987); Zhang “Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis” BioTechniques 15: 868-872 (1993)）。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、それらが初期感染細胞内で複製され得るが、しかし新規の感染性ウイルス粒子を生成できないため、それらが他の細胞型に蔓延し得る程度にそれらが限定される点である。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮細胞、ＣＮＳ実質細胞および多数のその他の組織部位への直接in vivo送達後に高効率遺伝子移入を達成することが示された（Morsy, J. Clin. Invest. 92: 1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92: 381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92: 1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4: 154-159 (1993); La Salle, Science 259: 988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267: 25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4: 461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6: 75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73: 1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994); Zabner, Cell 75: 207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5: 1287-1291 (1993);およびRagot, J. Gen. Virology 74: 501-507 (1993)）。組換えアデノウイルスは、特定の細胞表面受容体に結合することにより遺伝子形質導入を達成し、その後、野生型または複製欠陥アデノウイルスと同一方法で、受容体媒介性エンドサイトーシスによりウイルスがインターナライズされる（Chardonnet and Dales, Virology 40: 462-477 (1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12: 386-396 (1973); Svensson and Persson, J. Virology 55: 442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51: 650-655 (1984); Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65: 6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73: 309-319 (1993)）。
【０１０６】
好ましいウイルスベクターは、除去されたＥ１遺伝子を有したアデノウイルスに基づいたものであり、これらのビリオンはヒト２９３細胞株のような細胞株中で生成される。別の好ましい実施形態では、Ｅ１およびＥ３遺伝子はともに、アデノウイルスゲノムから除去される。
【０１０７】
別の型のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を基礎にする。この欠陥パルボウイルスは、それが多数の細胞型に感染し得るし、ヒトに対して非病原性であるため、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは約4〜5 kbを輸送し、野生型ＡＡＶは染色体１９中に安定的に挿入することが既知である。この部位特異的組込み特性を含有するベクターが好ましい。この型のベクターの特に好ましい実施形態は、Avigen, San Francisco, CAにより製造されるＰ４．１Ｃベクターであり、これは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋおよび／またはマーカー遺伝子、例えばグリーン蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子を含有し得る。
【０１０８】
ウイルスおよびレトロウイルス中の挿入遺伝子は通常は、望ましい遺伝子産物の発現を制御するのを助けるために、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの単数または複数の配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの基本的相互作用に必要とされるコア素子ならびに転写因子を含有し、そして上流素子および応答素子を含有し得る。
【０１０９】
２．ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳類宿主細胞中のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源、例えばウイルス、例えばポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスのゲノムから、あるいは非相同哺乳類プロモーター、例えばβアクチンプロモーターから得られる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として得られるのが便利である（Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)）。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として得られるのが便利である（Greenway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982)）。もちろん、宿主細胞または関連種からのプロモーターも本明細書中で有用である。
【０１１０】
エンハンサーは一般に、転写開始部位から非固定距離で機能し、そして転写単位に対して５’（Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)）または３’（Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)）であり得るＤＮＡの配列を指す。さらにエンハンサーは、イントロン内（Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983)）、ならびにコード配列それ自体内（Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)）であり得る。それらは通常は10〜300 bp長であり、そしてそれらはシスで機能する。エンハンサーは、直ぐ近くのプロモーターから転写を増大するよう機能する。エンハンサーも、転写の調節を媒介する応答素子をしばしば含有する。プロモーターも、転写の調節を媒介する応答素子を含有し得る。エンハンサーはしばしば、遺伝子の発現の調節を確定する。多数のエンハンサー配列は目下、哺乳類遺伝子から既知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン）が、しかし典型的には真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを用いる。好ましい例は、複製の起点の後期サイド上のＳＶ４０エンハンサー（bp 100〜270）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期サイド上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１１１】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を誘発する光または特定の化学事象により、特定的に活性化され得る。システムは、テトラサイクリンおよびデキサメタソンのような試薬により調節され得る。放射線照射、例えばガンマ線照射への曝露、あるいはアルキル化化学療法薬によりウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法もある。
【０１１２】
プロモーターおよび／またはエンハンサー領域が全ての真核生物細胞型において活性であるのが好ましい。この型の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（650塩基）である。その他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１１３】
全ての特定の調節素子はクローン化され、そして黒色腫細胞のような特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために用いられ得る、ということが示されている。グリア原繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞中で遺伝子を選択的に発現するために用いられてきた。
【０１１４】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）中で用いられる発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写の終結に必要な配列も含有し得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳化部分中のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位はポリアデニル化領域も含有する、というのが好ましい。この領域の一利点は、それが転写単位がプロセシングされ、ｍＲＮＡと同様に輸送される見込みを増大する点である。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルは導入遺伝子構築物中で用いられるのが好ましい。転写単位の好ましい実施形態では、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルから得られ、約400塩基から成る。転写単位がその他の標準配列を、単独でまたは上記配列と組合せて含有し、構築物からの発現をまたはその安定性を改善するのが好ましい。
【０１１５】
３．マーカー
ベクターは、マーカー生成物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー生成物は、遺伝子が細胞に送達され、そして一旦送達されれば、発現されるか否かを確定するために用いられる。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質をコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能マーカーであり得る。哺乳類細胞のための適切な選択可能マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシンおよびプロマイシンでアル。このような選択可能マーカーが宿主細胞中に首尾よくトランスフェクトされると、形質転換化宿主細胞は、選定圧力下に置かれた場合、存在し続け得る。選定レジメンの2つの広範に用いられる別個の部類が存在する。第一の部類は、細胞の代謝、ならびに補足培地と関係なく増殖する能力を欠く突然変異体細胞株の使用に基づく。2つの例は、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ-細胞およびマウスＬＴＫ-細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素の付加を伴わずに増殖する能力を欠く。これらの細胞は、完全ヌクレオチド合成経路に必要なある種の遺伝子を欠くため、それらは失われたヌクレオチドが補足培地中に提供されない限り、それらは生き残れない。培地を補足するのに代わるのは、無傷ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠き、したがってそれらの増殖要件を変えている細胞中に導入することである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補足培地中で生き残ることができない。
【０１１７】
第二の部類は、任意の細胞型に用いられる選択スキームを示し、そして突然変異体細胞株の使用を要しない優勢選択である。これらのスキームは典型的には、宿主細胞の増殖を阻止するために薬剤を用いる。それらの細胞は、タンパク質運搬薬剤体制を発現し、選択を生き残る。このような優勢選択の例は、薬剤ネオマイシン（Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)）、ミコフェノール酸（Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980)）またはヒグロマイシン（Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biiol. 5: 410-413 (1985)）を用いる。3つの例は、真核生物制御下で細菌遺伝子を用いて、適切な薬剤、それぞれＧ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはヒグロマイシンに対する耐性を運搬する。その他の例としては、ネオマイシン類似体Ｇ４１８およびプラマイシンが挙げられる。
【０１１８】
Ｅ．バイオセンサーリボスイッチ
バイオセンサーリボスイッチも開示される。バイオセンサーリボスイッチは、それらのコグネイトトリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを生成する工学処理リボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値レベルまたはそれより上で誘発され得る。バイオセンサーリボスイッチは、in vivoまたはin vitroでの使用のために意図され得る。例えばシグナルとして役立つかまたはシグナル生成に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡと操作可能的に連結されるバイオセンサーリボスイッチは、リボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有するよう細胞または生物体を工学処理することにより、in vivoで用いられ得る。in vitroで用いるためのバイオセンサーリボスイッチの一例は、それからのシグナルがリボスイッチの活性化状態によって変化する立体配座依存性標識を含むリボスイッチである。このようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは天然リボスイッチからのまたはそれに由来するアプタマーを用いる。
【０１１９】
Ｆ．レポータータンパク質およびペプチド
リボスイッチの活性化を査定するために、またはバイオセンサーリボスイッチのために、レポータータンパク質またはペプチドが用いられ得る。レポータータンパク質またはペプチドは、その発現がリボスイッチにより調節されるＲＮＡによりコードされ得る。実例は、いくつかの特定のレポータータンパク質の使用を記載する。レポータータンパク質およびペプチドの使用は周知であり、リボスイッチとともに用いるために容易に適合され得る。レポータータンパク質は、検出され得るかまたは検出可能なシグナルを生成し得る任意のタンパク質またはペプチドであり得る。好ましくはタンパク質またはペプチドの存在は、標準技法（例えばラジオイムノアッセイ、放射能標識、イムノアッセイ、酵素活性に関する検定、吸光度、蛍光、発光およびウエスタンブロット）を用いて検出可能であり得る。さらに好ましくはレポータータンパク質のレベルは、低レベルでも、標準技法を用いて容易に定量可能である。有用なレポータータンパク質としては、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質およびそれらの誘導体、例えばホタルPhotinus pyralisからのホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）、ならびにウミシイタケRenilla reniformisからのウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）が挙げられる。
【０１２０】
Ｇ．立体配座依存性標識
立体配座依存性標識は、標識が会合される分子または化合物（例えばリボスイッチ）の形態または立体配座における変化に基づいた蛍光強度または波長における変化を生じる全ての標識を指す。プローブおよびプライマーの情況において用いられる立体配座依存性標識の例としては、分子ビーコン、Amplifluor、ＦＲＥＴプローブ、切断ＦＲＥＴプローブ、TaqManプローブ、スコルピオンプライマー、蛍光三重鎖オリゴ、例えば三重鎖分子ビーコンまたは三重鎖ＦＲＥＴプローブ、蛍光水溶性共役ポリマー、ＰＮＡプローブおよびＱＰＮＡプローブがあげられるが、これらに限定されない。このような標識、特にそれらの機能の原理は、リボスイッチとともに用いるために適合され得る。いくつかの型の立体配座依存性標識は、Schweitzer and Kingsmore, Curr. Opin. Biotech. 12: 21-27 (2001)に再検討されている。
【０１２１】
立体配座依存性標識の一形態であるステム消光標識は、ステム構造が生じると、標識からの蛍光が消光されるよう、消光部分が近接されるように核酸上に配置される蛍光標識である。ステムが崩壊されると（例えば標識を含有するリボスイッチが活性化されると）、消光部分はもはや蛍光標識に近接しておらず、蛍光は増大する。この作用の例は、分子ビーコン、蛍光三重鎖オリゴ、三重鎖分子ビーコン、三重鎖ＦＲＥＴプローブおよびＱＰＮＡプローブに見出され、その作用原理はリボスイッチとともに用いるために適合され得る。
【０１２２】
立体依存性標識の一形態であるステム活性化標識は、ステム構造の形成により蛍光が増大されるかまたは変更される標識または標識対である。ステム活性化標識は、受容体および供与体が近接する場合（標識を含有する核酸鎖がステム構造を形成する場合）、供与体から受容体への蛍光共鳴エネルギーシフトが受容体を蛍光発光させるよう、受容体蛍光標識および供与体部分を含み得る。ステム活性化標識は典型的には、ステム構造が核酸分子中に形成されると受容体および供与体が近接されるよう、核酸分子（例えばリボスイッチ）上に置かれる標識対である。ステム活性化標識の供与体部分がそれ自体蛍光標識である場合、受容体に近接しない場合（即ちステム構造が形成されない場合）、それは蛍光として（典型的には受容体の蛍光とは異なる波長で）エネルギーを放出し得る。ステム構造が形成される場合には、全体的作用は、供与体蛍光の低減ならびに受容体蛍光の増大である。ＦＲＥＴプローブは、ステム活性化標識の使用の一例であり、その作用原理は、リボスイッチとともに用いるために適合され得る。
【０１２３】
Ｈ．検出標識
リボスイッチ活性化、非活性化または遮断の検出および定量を、あるいはリボスイッチの活性化、非活性化または遮断時に産生される核酸またはタンパク質の発現を助けるために、検出標識が検出プローブまたは検出分子中に組入れられるか、あるいは発現核酸またはタンパク質中に直接組入れられ得る。本明細書中で用いる場合、検出標識は、直接または間接的に、核酸またはタンパク質と会合され、そして直接または間接的に、測定可能、検出可能なシグナルを生じる任意の分子である。多数のこのような標識は、当業者に既知である。開示された方法に用いるのに適した検出標識の例は、放射性同位元素、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体およびリガンドである。
【０１２４】
適切な蛍光標識の例としては、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、BODIPY（商標）、カスケードブルー（商標）、オレゴングリーン（商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、ランタニドイオンの大環状キレート化合物、例えばquantum dyeTM、蛍光エネルギーシフト染料、例えばチアゾールオレンジ−エチジウムへテロ二量体、ならびにシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が挙げられる。その他の特定の蛍光標識の例としては、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリン・コンプレキソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル、アストラゾン・ブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾン・オレンジＲ、アストラゾン・レッド６Ｂ、アストラゾン・イエロー７  ＧＬＬ、アタブリン、アウラミン、アウロホスフィン、アウロホスフィンＧ、ＢＡＯ  ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、ベルベリンスルフェート、ビスベンズアミド、ブランコフォルＦＦＧ溶液、ブランコフォルＳＶ、ボディピＦ１、ブリリアント・スルホフラビンＦＦ、カルセインブルー、カルシウムグリーン、カルコフルオルＲＷ溶液、カルコフルオル・ホワイト、カルコフォア・ホワイトＡＢＴ溶液、カルコフォア・ホワイト標準溶液、カルボスチリル、カスケード・イエロー、カテコールアミン、シナクリン、コリホスフィンＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１８、ＣＹ５．１８、ＣＹ７、ダンス（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、ダンサ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、二フッ化ジピロメテンホウ素、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリスロシンＩＴＣ、ユークリスチン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導性蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレスカミン、フラ−２、ゲナクリル・ブリリアントレッドＢ、ゲナクリル・ブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリル・ピンク３Ｇ、ゲナクリル・イエロー５ＧＦ、Gloxalic Acid、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、インド−１、イントラホワイトＣｆリキッド、ロイコフォアＰＡＦ、ロイコフォアＳＦ、ロイコフォアＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシファー・イエローＣＨ、ルシファー・イエローＶＳ、マグダラ・レッド、マリナ・ブルー、マキシロン・ブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロン・ブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤアミン、ニトロベンズオキサジドール、ノルアドレナリン、ニュークレア・ファーストレッド、ニュークレア・イエロー、ナイロサン・ブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラロサニリン（フェウルゲン）、フォルワイトＡＲ溶液、フォルワイトＢＫＬ、フォルワイトＲｅｖ、フォルワイトＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインダセン・ポントクロム・ブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオン・イエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザール・ブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエキストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベン・イソチオスルホン酸）、スチルベン、スナルフ１、スルホ・ローダミンＢＣａｎＣ、スルホ・ローダミンＧエキストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ウビテックスＳＦＣ、キシレンオレンジおよびＸＲＩＴＣが挙げられる。
【０１２５】
有用な蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、ならびにシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光に関するそれぞれ吸光度および最大発光は：ＦＩＴＣ（490 nm；520 nm）、Ｃｙ３（554 nm；568 nm）、Ｃｙ３．５（581 nm；588 nm）、Ｃｙ５（652 nm；672 nm）、Ｃｙ５．５（682 nm；703 nm）およびＣｙ７（755 nm；778 nm）であり、したがってそれらの同時検出を可能にする。フルオレセイン染料のその他の例としては、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン（ＶＩＣ）が挙げられる。蛍光標識は、種々の商業的供給元から、例えばAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ；Molecular Probes, Eugene, OR；Research Organics, Cleveland, Ohioおよびから入手可能である。
【０１２６】
付加的当該標識としては、それらが会合されるプローブが標的分子と特異的に結合される場合にのみ、シグナルを提供するものが挙げられ、この場合、このような標識は、Tyagi & Kramer, Nature Biotechnology (1996) 14: 303およびEP 0 070 685 B1に記載されるような「分子ビーコン」を含む。その他の当該標識としては、米国特許第5,563,037号；WO 97/17471およびWO 97/17076に記載されたものが挙げられる。
【０１２７】
標識化ヌクレオチドは、合成中の発現核酸への直接組入れのための検出標識の有用形態である。核酸に組入れられ得る検出標識の例としては、ヌクレオチド類似体、例えばＢｒｄＵｒｄ（５−ブロモデオキシウリジン、Hoy and Schimke, Mutation Research 290: 217-230 (1993)）、アミノアリルデオキシウリジン（Henegaru et al., Nature Biotechnology 18: 345-348 (2000)）、５−メチルシトシン（Sano et al., Biochim. Biophys. Acta 951: 157-165 (1988)）、ブロモウリジン（Wansick et al., J. Cell Biology 122: 283-293 (1993)）およびビオチンで（Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633 (1981)）または適切なハプテン、例えばジゴキシゲニンで（Kerkhof, Anal. Biochem. 205: 359-364 (1992)）修飾されたヌクレオチドが挙げられる。適切な蛍光標識化ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである（Yu et al., Nucleic Acids Res., 22: 3226-3232 (1994)）。ＤＮＡのための好ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ブロモデオキシウリジン、ＢｒｄＵｒｄ、ＢｒｄＵ、ＢＵｄＲ、Sigma-Aldrich Co）である。ＤＮＡ中への検出標識の組入れのためのその他の有用なヌクレオチド類似体は、ＡＡ−ｄＵＴＰ（アミノアリル−デオキシウリジントリホスフェート、Sigma-Aldrich Co）および５−メチル−ｄＣＴＰ（Roche Molecular Biochemicals）である。ＲＮＡ中への検出標識の組入れのための有用なヌクレオチド類似体は、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ビオチン−１６−ウリジン−５’−トリホスフェート、Roche Molecular Biochemicals）である。フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５は、直接ラベリングのためにｄＵＴＰに連結され得る。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチン−またはジゴキシゲニン−標識化プローブの二次検出のためのアビジンまたは抗ジゴキシゲニン共役体として利用可能である。
【０１２８】
核酸中に組入れられた検出標識、例えばビオチンは、その後。当該技術分野で周知の感知方法を用いて検出され得る。例えばビオチンは、ビオチンと結合され、その後適切な基質（例えば化学発光基質ＣＳＰＤ：二ナトリウム，３−（４−メトキシスピロ−［１，２−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート；Tropix, Inc.）の化学発光により検出されるストレプタビジン−アルカリホスファターゼ共役体（Tropix, Inc.）を用いて検出され得る。標識は、例えば化学シグナル増幅を用いて、あるいは光を生じる酵素に対する基質（例えば化学発光１，２−ジオキセタン基質）または蛍光シグナルを用いることにより検出され得る酵素、例えばアルカリホスファターゼ、ダイズペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびポリメラーゼでもあり得る。
【０１２９】
2またはそれ以上のこれらの検出標識を併合する分子も、検出標識と考えられる。既知の検出標識のいずれかを、開示されたプローブ、タグ、分子および方法とともに用いて、活性化または非活性化リボスイッチ、あるいは開示された方法において生成される核酸またはタンパク質を標識し、検出し得る。検出標識により生成されるシグナルを検出し、測定するための方法も、当業者に既知である。例えば放射性同位元素は、シンチレーション計数または直接的可視化により検出され得る。蛍光分子は、蛍光分光光度計により検出され得る。リン光分子は、分光光度計により検出され得るし、あるいはカメラで直接可視化され得る。酵素は、酵素により触媒される反応の生成物の検出または可視化により検出され得る。抗体は、抗体と結合された二次検出標識を検出することにより検出され得る。本明細書中で用いる場合、検出分子は、検出されるべき化合物または組成物と相互作用し、そして１つまたは複数の検出標識が結合される分子である。
【０１３０】
Ｉ．配列類似性
本明細書中で考察されるように、相同性および同一性という用語は、類似性と同一の事柄を意味する、と理解される。したがって例えば相同性という語の使用が2つの配列（例えば非天然配列）間で用いられる場合、これは必ずしも、これら2つの配列間の進化関係を示すわけではないが、しかしむしろそれらの核酸配列間の類似性または関連性に注目している、と理解される。2つの進化的に関連する分子間の相同性を確定するための方法の多くは、それらが進化的に関連するか否かにかかわらず、配列類似性を測定する目的のために、任意の2つまたはそれ以上の核酸またはタンパク質にルーチンに適用される。
【０１３１】
概して、本明細書中の開示されたリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子およびタンパク質の任意の既知の変異体および誘導体、または生じ得るものを明示するための一方法は、特定の既知の配列との相同性に関して変異体および誘導体を明示することによる、と理解される。本明細書中に開示された特定の配列の同一性は、本明細書中の別の箇所でも考察される。概して、本明細書中に定義されたリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子およびタンパク質の変異体は、典型的には、記述された配列またはネイティブ配列と少なくとも約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99％の相同性を有する。2つのタンパク質または核酸、例えば遺伝子の相同性の確定方法を、当業者は容易に理解する。例えば相同性は、相同性がその最高レベルであるよう、2つの配列を整列後に算定され得る。
【０１３２】
相同性を算定する別の方法は、公表されたアルゴリズムにより実施され得る。比較のための配列の最適アラインメントは、Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lepman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)の類似性方法のための検索により、これらのアルゴリズムのコンピューター化手段（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ；Wesconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）により、あるいは点検により、実行され得る。
【０１３３】
同一の種類の相同性は、例えばZuker, M. Science 244: 48-52, 1989、Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7706-7710, 1989、Jaeger et al. Methods Enzymol. 183: 281-306, 1989に開示されたアルゴリズムにより、核酸から得られる（少なくとも核酸アラインメントに関連した物質に関して、これらの記載内容は、参照により本明細書中で援用される）。任意の方法が典型的には用いられ、そしてある場合には、これらの種々の方法の結果は異なり得るが、しかし同一性がこれらの方法のうちの少なくとも1つを用いて見出される場合、配列は記述された同一性を有すると言われると当業者は理解する、と理解される。
【０１３４】
例えば本明細書中で用いる場合、別の配列との特定の相同性％を有するとして挙げられる配列は、任意の１つまたは複数の上記の算定方法により算定されるような列挙された相同性を有する配列を指す。例えば第一配列が任意のその他の計算方法により算定した場合に第二配列と80％の相同性を有さない場合でも、Zuker計算法を用いて第一配列が第二配列と80％の相同性を有すると算定された場合、第一配列は、本明細書中に限定されるように、第二配列と80％の相同性を有する。別の例として、SmithおよびWatermanの計算方法、NeedlemanおよびWunschの計算方法、Jaeger計算方法、あるいは任意のその他の計算方法により算定した場合に第一配列が第二配列と80％の相同性を有さない場合でも、Zuker計算方法ならびにPearsonおよびLipman計算方法の両方を用いて第一配列が第二配列と80％の相同性を有すると算定されれば、第一配列は、本明細書中で限定されるように、第二配列と80％の相同性を有する。さらに別の例として、各計算方法を用いて第一配列が第二配列と80％の相同性を有すると算定される場合（しかし、実際には、異なる計算方法はしばしば、異なる算定相同性パーセンテージを生じる）、第一配列は、本明細書中で限定されるように、第二配列と80％の相同性を有する。
【０１３５】
Ｊ．ハイブリダイゼーションおよび選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、少なくとも2つの核酸分子間の、例えばプライマーまたはプローブとリボスイッチまたは遺伝子間の配列駆動性相互作用を意味する。配列駆動性相互作用は、ヌクレオチド特異的方法での2つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド誘導体間に起こる相互作用を意味する。例えばＣと相互作用するＧ、またはＴと相互作用するＡは、配列駆動性相互作用である。典型的には配列駆動性相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン面で生じる。2つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に既知の多数の条件およびパラメーターにより影響を及ぼされる。例えば反応の塩濃度、ｐＨおよび温度は全て、2つの核酸分子がハイブリダイズするか否かに影響を及ぼす。
【０１３６】
2つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションに関するパラメーターは、当業者に周知である。例えばいくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、緊縮ハイブリダイゼーション条件と定義され得る。例えばハイブリダイゼーションの緊縮性は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄課程のいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方により制御される。例えば選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分がそれらのハイブリダイゼーション相手から解離する融解温度）より低い約12〜25℃である温度で高いオン強度溶液（6×ＳＳＣまたは6×ＳＳＰＥ）中でのハイブリダイゼーションと、洗浄温度がＴｍより低い5℃〜20℃であるよう選択される温度および塩濃度の組合せでのその後の洗浄を包含し得る。温度および塩濃度は、フィルター上に固定された参照ＤＮＡの試料が当該標識化核酸とハイブリダイズされ、そして次に異なる緊縮条件下で洗浄される予備実験において経験的に容易に確定される。ハイブリダイゼーション温度は、典型的にはＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに関してはより高い。条件は、緊縮を達成するために上記のように、あるいは当該技術分野で既知であるように用いられ得る（Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York, 1989; Kunkel et al. Methods Enzymol. 1987: 154: 367, 1987）（少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関連する物質に関して、これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのための好ましい緊縮ハイブリダイゼーション条件は、6×ＳＳＣまたは6×ＳＳＰＥ中で約68℃（水溶液中）で、その後68℃での洗浄である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緊縮は所望により、したがって所望される相補性の程度が低減されると、そしてさらに変異性が探索される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔ濃厚性によって、低減され得る。同様にハイブリダイゼーションおよび洗浄の緊縮性は、所望により、したがって、全て当該技術分野で既知のように、所望される相同性が増大すると、そしてさらに高相同性が所望される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔ濃厚性によって、増大され得る。
【０１３７】
選択的ハイブリダイゼーションを限定する別の方法は、その他の核酸に結合される核酸のうちの1つの量（パーセンテージ）に注目することによる。例えばいくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％の限定核酸が非限定核酸に結合される場合である。典型的には非限定核酸は、例えば10または100または1000倍よりも多い。この種類の検定は、限定および非限定核酸の両方が、例えばそれらのｋdより10倍または100倍または1000倍低いか、あるいは核酸分子の一方のみが10倍または100倍または1000倍であるか、あるいは核酸分子の一方または両方がそれらのｋdより高い条件下で実施され得る。
【０１３８】
選択的ハイブリダイゼーションを限定する別の方法は、所望の酵素作用を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で酵素的に働かせる核酸のパーセンテージに注目することによる。例えばいくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％の核酸が、例えば酵素作用がＤＮＡ延長である酵素作用を促進する条件下で酵素的に作用され、その場合、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％の核酸分子が延長される場合である。好ましい条件は、操作を実施する酵素に関して適切である場合、メーカーにより示唆されるもの、または当該技術分野で指示されるものも包含する。
【０１３９】
まさに相同性に関する場合と同様に、2つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを確定するためには、本明細書中に開示された種々の方法がある、と理解される。これらの方法および条件は、2つの核酸分子間の異なるパーセンテージのハイブリダイゼーションを提供し得るが、しかし別記しない限り、任意の方法のパラメーターを満たすに足りる、と理解される。例えば80％のハイブリダイゼーションが必要とされた場合、ハイブリダイゼーションがこれらの方法のいずれかにおいて必要パラメーター内で起こる限り、それは本明細書中に開示されるとみなされる。
【０１４０】
組成物および方法が集合的にまたは単一でハイブリダイゼーションを確定するためのこれらの判定基準のいずれかを満たす場合、それは本明細書中に開示される組成物または方法である、と当業者は理解する、と理解される。
【０１４１】
Ｋ．核酸
核酸ベースのものである本明細書中に開示される種々の分子、例えばリボスイッチ、アプタマー，ならびにリボスイッチおよびアプタマーをコードする核酸が存在する。開示核酸は、例えばヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド置換物から作製され得る。これらのおよびその他の分子は本明細書中で考察されるが、これらに限定されない。例えばベクターが細胞中で発現される場合、発現ｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、ＧおよびＵから作製される、と理解される。同様に、例えば外因性送達により核酸分子が細胞または細胞環境中に導入される場合、核酸分子は細胞環境中の核酸分子の分解を低減するヌクレオチド類似体から作製されるのが有益である、と理解される。
【０１４２】
それらの関連機能が保持される限り、リボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォームならびに任意のその他のオリゴヌクレオチドおよび核酸は、修飾ヌクレオチド（ヌクレオチド類似体）から作製されるかまたはそれを含み得る。多数の修飾ヌクレオチドが既知であり、オリゴヌクレオチドおよび核酸に用いられ得る。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖またはリン酸部分のいずれかに対するいくつかの型の修飾を含有するヌクレオチドである。塩基部分に対する修飾は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕの天然および合成修飾、ならびに異なるプリンまたはピリミジン塩基、例えばウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、および2−アミノアデニン−９−イルを含む。修飾塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシおよびその他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。付加的塩基修飾は、例えば米国特許第3,687,808号、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613およびSanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993に見出され得る。ある種のヌクレオチド類似体、例えば５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、５−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を増大し得る。その他の修飾塩基は、普遍塩基として機能するものである。普遍塩基としては、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールが挙げられる。普遍塩基は標準塩基に取って代るが、しかし塩基対合における偏りを有さない。即ち普遍塩基は、任意のその他の塩基と塩基対合し得る。塩基修飾はしばしば、二重鎖安定性増大といった独特の特性を達成するために、例えば糖修飾、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルと組合され得る。一連の塩基修飾を詳述し、記載する多数の米国特許、例えば米国特許第4,845,205号、第5,130,302号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,594,121号、第5,596,091号、第5,614,617号および第5,681,941号が存在する。これらの特許は各々、それらの記載内容が、特に塩基修飾、それらの合成、それらの使用、ならびにオリゴヌクレオチドおよび核酸中へのそれらの組入れに関して、参照により本明細書中で援用される。
【０１４３】
ヌクレオチド類似体は、糖部分の修飾も含み得る。糖部分への修飾は、リボースおよびデオキシリボースの天然修飾、ならびに合成修飾を含む。糖修飾としては、２’位置での以下の修飾：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；あるいはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る）が挙げられるが、これらに限定されない。２’糖修飾としては、−Ｏ［（ＣＨ2）ｎＯ］ｍＣＨ3、−Ｏ（ＣＨ2）ｎＯＣＨ3、−Ｏ（ＣＨ2）ｎＮＨ2、−Ｏ（ＣＨ2）ｎＣＨ3、−Ｏ（ＣＨ2）ｎＯＮＨ2および−Ｏ（ＣＨ2）ｎＯＮ［（ＣＨ2）ｎＣＨ3］2（ここで、ｎおよびｍは1〜約10である）も挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
２’位置のその他の修飾としては、以下の：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ3、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＳＯＣＨ3、ＳＯ2、ＣＨ3、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態を改善するための基、あるいはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、ならびに同様の特性を有するその他の置換基が挙げられるが、これらに限定されない。同様の修飾は、糖上の他の位置でも、特に３’末端ヌクレオチド上のまたは２’−５’連結オリゴヌクレオチド中の３’位置、ならびに５’末端ヌクレオチドの５’位置でもなされ得る。修飾糖としては、架橋環酸素での修飾、例えばＣＨ2およびＳを含むものも挙げられる。
【０１４５】
ヌクレオチド糖類似体は、糖模倣物、例えばペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分も有し得る。このような修飾糖構造の調製を教示する多数の米国特許、例えば米国特許第4,981,957号、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号および第5,700,920号が存在する。これらの特許は各々、それらの記載内容が、特に修飾糖構造、それらの合成、それらの使用、ならびにヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸中へのそれらの組入れの説明に関して、参照により本明細書中で援用される。
【０１４６】
核酸類似体は、リン酸部分でも修飾され得る。修飾リン酸部分としては、2つのヌクレオチド間のリンケージがホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよびその他のあるきるホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、例えば３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートが挙げられるが、これらに限定されない。2つのヌクレオチド間のこれらのホスフェートまたは修飾ホスフェートリンケージが３’−５’リンケージまたは２’−５’リンケージによるものであり、そしてリンケージは逆極性、例えば３’−５’→５’−３’または２’−５’→５’−２’を含有し得る、と理解される。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。多数の米国特許が修飾ホスフェートを含有するヌクレオチドの製造および使用方法を教示しており、それらの例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,196号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号および第5,625,050号が存在する。これらの特許は各々、それらの記載内容が、特に修飾ホスフェート、それらの合成、それらの使用、ならびにヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸中へのそれらの組入れの説明に関して、参照により本明細書中で援用される。
【０１４７】
ヌクレオチド類似体は単一修飾を含有することのみを必要とするが、しかしさらにまたその部分の1つの中に、または異なる部分間に多数の修飾を含有し得る、と理解される。
ヌクレオチド置換基は、ヌクレオチドと類似の機能特性を有するが、しかしホスフェート部分を含有しない分子、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ヌクレオチド置換基は、ワトソン−クリックまたはフーグスティーン方式で相補的核酸を認識し、そしてハイブリダイズ（して塩基対合）するが、しかしリン酸部分以外の部分により一緒に連結される分子である。ヌクレオチド置換基は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に従い得る。
【０１４８】
ヌクレオチド置換基は、置き換えられたリン酸部分および／または糖部分を有したヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。ヌクレオチド置換基は、標準リン原子を含有しない。リン酸に関する置換基は、例えば短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間リンケージ、混合異種原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間リンケージ、あるいは１つまたは複数の短鎖異種原子または複素環式ヌクレオシド間リンケージであり得る。これらの例としては、モルホリノリンケージ（一部はヌクレオシドの糖部分から生成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成成分部分を有するその他のものを有するものが挙げられる。多数の米国特許がこれらの型のホスフェート置換の製造および使用方法を開示しており、それらの例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,264,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,610,289号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号および第5,677,439号が存在する。これらの特許は各々、それらの記載内容が、特にホスフェート置換、それらの合成、それらの使用、ならびにヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸中へのそれらの組入れの説明に関して、参照により本明細書中で援用される。
【０１４９】
ヌクレオチドの糖およびリン酸部分は、例えばアミド基リンケージ（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）により置き換えられ得る、ともヌクレオチド置換基において理解される。米国特許第5,539,082号、第5,714,331号および第5,719,262号は、ＰＮＡ分子の製造および使用方法を教示する（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）（Nielsen et al., Science 254: 1497-1500 (1991)も参照）。
【０１５０】
オリゴヌクレオチドおよび核酸はヌクレオチドで構成され、異なる型のヌクレオチドまたは同一型のヌクレオチドから作製され得る。例えばオリゴヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得る。ヌクレオチドの約10％〜約50％は、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得る。ヌクレオチドの約50％またはそれ以上は、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得る。あるいはヌクレオチドの全てが、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得る。このようなオリゴヌクレオチドおよび核酸は、キメラオリゴヌクレオチドおよびキメラ核酸と呼ばれ得る。
【０１５１】
Ｌ．固体支持体
固体支持体は、分子（例えばトリガー分子）およびリボスイッチ（あるいは開示された方法で用いられるかまたはそれにより生成されるその他の構成成分）が会合され得る固体状態基板または支持体である。リボスイッチおよびその他の分子は、直接または間接的に固体支持体と会合され得る。例えば分析物（例えばトリガー分子、試験化合物）は、固体支持体の表面に結合されるか、または固体支持体上に固定された捕捉剤（例えば分析物を結合する化合物または分子）と会合され得る。別の例として、リボスイッチは固体支持体の表面に結合されるか、または固体支持体上に固定されたプローブと会合され得る。アレイは、多数のリボスイッチ、プローブまたはその他の分子が、アレイ、格子またはその他の組織化パターンで会合された支持体である。
【０１５２】
固体支持体に用いるための固体状態基板としては、構成成分が直接または間接的に会合され得る任意の固体物質が挙げられ得る。この例としては、例えばアクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカルボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびポリアミノ酸が挙げられる。固体状態基板は、任意の有用な形態、例えば薄膜、膜、ボトル、皿、繊維、織布、造形ポリマー、粒子、ビーズ、微小粒子またはそれらの組合せを有し得る。固体状態基板および固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得る。チップは、物質の長方形または正方形小片である。固体状態基板のための好ましい形態は、薄膜、ビーズまたはチップである。固体状態基板のための有用な形態は、微小滴定皿である。いくつかの実施形態では、多ウエルガラススライドが用いられ得る。
【０１５３】
アレイは、固体支持体上の同定されたまたは予め決定された位置に固定された複数のリボスイッチ、トリガー分子、その他の分子、化合物またはプローブを包含し得る。固体支持体上の各予定位置は一般に、ある型の構成成分（即ちその位置の構成成分は全て同一である）を有する。あるいは多数の種類の構成成分が、固体支持体上の同一予定位置に固定され得る。各位置は、所定の構成成分の多数のコピーを有する。固体支持体上の異なる構成成分の空間的分離は、別個の検出および同定を可能にする。
【０１５４】
有用ではあるが、しかし固体支持体が単一単位または構造であるという必要はない。一組のリボスイッチ、トリガー分子、その他の分子、化合物および／またはプローブが、任意数の固体支持体全体に分布され得る。例えば一方では、各構成成分は別個の試験管または容器中に、あるいは別個のビーズまたは微小粒子上に固定され得る。
【０１５５】
固体状態基板へのオリゴヌクレオチドの固定化方法は、十分に確立されている。オリゴヌクレオチド、例えばアドレスプローブおよび検出プローブは、確立されたカップリング方法を用いて、基板に結合され得る。例えば適切な結合方法は、Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (11): 5022-5026 (1994)およびKhrapko et al., Mol Biol (Mosk)(USSR) 25: 718-730 (1991)により記載されている。カゼイン被覆スライド上の３’−アミンオリゴヌクレオチドの固定化方法は、Stimpson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6379-6383 (1995)により記載されている。固体状態基盤にオリゴヌクレオチドを結合する有用な方法は、Guo et al., Nucleic Acids Res. 22: 5456-5465 (1994)により記載されている。
【０１５６】
固体支持体上に固定される構成成分（例えばリボスイッチ、トリガー分子またはその他の分子）は各々、固体支持体の異なる予定領域に置かれ得る。異なる位置は、異なる反応小室であり得る。異なる予定領域は各々、他の各々の異なる領域から物理的に分離され得る。固体支持体の異なる予定領域間の距離は、固定されるかまたは可変的であり得る。例えば一アレイでは、各構成成分は互いに固定距離で整列され得るが、一方、ビーズと会合された構成成分は固定空間関係で存在しない。特に多数の固体支持体（例えば多数のビーズ）の使用は、可変的距離を生じる。
【０１５７】
構成成分は、任意の密度で固体支持体上に会合されるかまたは固定され得る。構成成分は、400を超える異なる構成成分／cm3の密度で、固体支持体に固定され得る。構成成分のアレイは、任意数の構成成分を有し得る。例えばアレイは、固体支持体上に固定された少なくとも1,000個の異なる構成成分を、固体支持体上に固定された少なくとも10,000個の異なる構成成分を、固体支持体上に固定された少なくとも100,000個の異なる構成成分を、または固体支持体上に固定された少なくとも1,000,000個の異なる構成成分を有し得る。
【０１５８】
Ｍ．キット
上記の物質ならびにその他の物質は、開示された方法を実施し、あるいは開示方法の実施を手助けするために有用なキットとして、任意の適切な組合せで一緒に包装され得る。所定のキット中のキット構成成分が意図され、開示方法において一緒に用いるために適合されるならば有用である。例えば、化合物を検出するためのキットであって、１つまたは複数のバイオセンサーリボスイッチを含むキットが開示される。キットは、リボスイッチの活性化を検出するための試薬および標識も含有し得る。
【０１５９】
Ｎ．混合物
開示方法を実施するために実施し、または調製することにより生成される混合物が開示される。例えばリボスイッチおよびトリガー分子を含む混合物が開示される。
【０１６０】
方法が組成物または構成成分または試薬を混合するかまたは接触させることを包含するときはいつも、本方法の実施は多数の異なる混合物を作製する．例えば方法が3混合課程を包含する場合、これらの課程の各々の後に、過程が別個に実施される場合には、独自の混合物が生成される。さらに混合物は、過程の実施方法にかかわらず、全ての過程の完了時に生成される。本発明の開示は、開示方法の実施ならびに本明細書中に開示された例えば任意の開示試薬、組成物または構成成分を含有する混合物により得られるこれらの混合物を意図する。
【０１６１】
Ｏ．系
開示方法を実施するために、あるいは方法の実施を手助けするために有用な系が開示される。系は一般に、製造物品、例えば構造物、機械、装置等の組合せを含む。開示されるまたは開示から明らかであるこのような組合せが意図される。例えばバイオセンサーリボスイッチ、固体支持体およびシグナル読取装置を含む系が開示され、意図される。
【０１６２】
Ｐ．データ構造およびコンピューター制御
開示方法でもちいられる、開示方法により生成される、あるいは開示方法から生成されるデータ構造が開示される。データ構造は一般に、組成物または媒質中で収集され、組織化されおよび／または具体化される任意の形態のデータ、情報および／または対象である。電子形態で、例えばＲＡＭ形態でまたは保存ディスク上に保存されるリボスイッチ構造および活性化測定値は、データ構造の一型である。
【０１６３】
開示方法またはその任意の部分またはその調製物は、コンピューター制御により制御され、管理されまたは別の方法で手助けされ得る．このようなコンピューター制御、コンピューター制御法、データ構造およびコンピュータープログラムが意図されるし、そして本明細書中に開示されると理解されるべきである。
【０１６４】
方法
リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断するための方法が開示される。このような方法は、例えばリボスイッチならびにリボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断し得る化合物またはトリガー分子を接触させることを包含し得る。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去により、遺伝子発現を制御するよう機能する。化合物は、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断するために用いられ得る。リボスイッチのためのトリガー分子（ならびにその他の活性化化合物）は、リボスイッチを活性化するために用いられ得る。トリガー分子以外の化合物は一般に、リボスイッチを非活性化するかまたは遮断するために用いられ得る。リボスイッチは、例えばリボスイッチの存在からトリガー分子を除去することによっても、非活性化され得る。したがってリボスイッチの非活性化の開示方法は、例えばリボスイッチの存在またはリボスイッチとの接触からトリガー分子（またはその他の活性化化合物）を除去することを包含し得る。リボスイッチは、例えばリボスイッチを活性化しないトリガー分子の類似体の結合により遮断され得る。
【０１６５】
化合物をＲＮＡ分子と接触させることにより、ＲＮＡ分子の、またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変更するための方法も開示される（この場合、ＲＮＡ分子はリボスイッチを含む）。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去により遺伝子発現を制御するよう機能する。したがってリボスイッチを含む当該ＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する条件に付すことは、ＲＮＡの発現を変更するために用いられ得る。発現は、例えば転写の終結またはＲＮＡと結合するリボスイッチの遮断の結果として変更され得る。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質によって、ＲＮＡ分子の発現を低減または防止し、あるいはＲＮＡ分子の発現を促進または増大し得る。
【０１６６】
リボスイッチをＲＮＡ分子と操作可能的に連結することにより、ＲＮＡ分子の、またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を調節するための方法も開示される。リボスイッチは、任意の適切な方法で、例えばリボスイッチをＲＮＡ分子に物理的に連結することにより、あるいは工学処理核酸から産生されるＲＮＡがＲＮＡ分子と操作可能的に連結されるリボスイッチを有するよう、リボスイッチを含みそしてリボスイッチをコードするためにＲＮＡ分子をコードする核酸を工学処理することにより、ＲＮＡ分子と操作可能的に連結され得る。当該ＲＮＡ分子と操作可能的に連結されたリボスイッチを、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する条件に付すことは、ＲＮＡの発現を変更するために用いられ得る。
【０１６７】
リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断することにより、リボスイッチを含有する天然遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための方法も開示される。遺伝子がそれを保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化または遮断は、細胞または生物の死、静止または衰弱において存在し得る。例えば微生物の生存に不可欠である天然遺伝子中の天然リボスイッチの活性化は、微生物の死を引き起こし得る（リボスイッチの活性化が発現を止めるかまたは抑制する場合）。これは、抗菌剤および抗生物質作用のための開示化合物および方法の使用のための一基礎である。
【０１６８】
リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断することにより、リボスイッチを含有する単離、工学処理または組換え遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための方法も開示される。遺伝子またはＲＮＡは、任意の方法で工学処理され得るし、あるいは組換え体であり得る。例えばＲＮＡのリボスイッチおよびコード領域は非相同性であり、リボスイッチは組換え体またはキメラまたはその両方であり得る。遺伝子が所望の発現産物をコードする場合、リボスイッチの活性化または非活性化は、遺伝子の発現を誘導し、したがって発現産物の産生を生じるために用いられ得る。遺伝子が遺伝子発現のまたは別の細胞過程の誘導物質またはリプレッサーをコードする場合、リボスイッチの活性化、非活性化または遮断は、他の調節された遺伝子または細胞過程の誘導、抑制または脱抑制を生じ得る。多数のこのような二次調節作用は既知であり、そしてリボスイッチとともに用いるために適合され得る。このような調節のための一次制御としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小非抗原性分子であり得る点である。
【０１６９】
アプタマードメインをリボスイッチ（キメラリボスイッチである）の発現プラットフォームドメインと操作可能的に連結することによりリボスイッチの調節を変更するための方法も開示される。アプタマードメインは次に、例えばアプタマードメインのためのトリガー分子の作用により、リボスイッチの調節を媒介し得る。アプタマードメインは、任意の適切な方法で、例えばリボスイッチの正常または天然アプタマードメインを新規のアプタマードメインで置換することにより、リボスイッチの発現プラットフォームドメインに操作可能的に連結され得る。一般に、アプタマードメインが得られるリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断し得る任意の化合物または条件を用いて、キメラリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断し得る。
【０１７０】
リボスイッチを共有的に変更することにより（例えばリボスイッチの一部を架橋するかまたは化合物をリボスイッチとカップリングすることにより）リボスイッチを不活性化するための方法も開示される。この方法におけるリボスイッチの不活性化は、例えばリボスイッチのためのトリガー分子が結合するのを防止する、トリガー分子の結合時のリボスイッチの状態の変化を防止する、あるいはトリガー分子の結合時にリボスイッチの発現プラットフォームドメインが発現に影響を及ぼさないようにする変更に起因し得る。
【０１７１】
新規のトリガー分子を認識する新規のリボスイッチおよび／または新規のアプタマーを選択し、設計し、または誘導するための方法も開示される。このような方法は、リボスイッチ中の一組のアプタマー変異体の産生、当該化合物の存在下での変異体リボスイッチの活性化の査定、活性化された変異体リボスイッチ（あるいは例えば最も高度にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ）の選択、ならびに所望の活性、特異性、活性および特異性の組合せ、あるいはその他の特性の組合せを有する変異体リボスイッチが生じるまでこれらの過程を反復することを包含する。これらの方法により産生されるリボスイッチおよびアプタマードメインも開示される。
【０１７２】
機能性核酸分子のin vitro選択およびin vitro進化のための技法は既知であり、リボスイッチおよびそれらの構成成分とともに用いるために適合され得る。有用な技法は、例えばA. Roth and R.R. Breaker (2003) Selection in vitro of allosteric ribozymes. In: Methods in Molecular Biology Series - Catalytic Nucleic Acid Protocols (Sioud, M., ed.), Humana, Totowa, NJ; R.R. Breaker (2002) Engineered Allosteric Ribozymes as Biosensor Components. Curr. Opin. Biotechnol. 13: 31-39; G.M. Emilsson and
R.R. Breaker (2002) Deoxyribozymes: New Activities and New Applications. Cell. Mol. Life Sci. 59: 596-607; Y. Li,  R.R. Breaker (2001) In vitro Selection of Kinase and Ligase Deoxyribozymes. Methods 23: 179-190; G.A. Soukup, R.R. Breaker (2000) Allosteric Ribozymes. In: Ribozymes: Biology and Biotechnology. R.K. Gaur and G. Krupp eds., Eaton Publishing; G.A. Soukup, R.R. Breaker (2000) Allosteric Nucleic Acid Catalysts. Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 318-325; G.A. Soukup, R.R. Breaker (1999) Nucleic Acid Molecular Switches. Trends Biotechnol. 17: 469-476; R.R. Breaker (1999) In vitro Selection of Self-cleaving Ribozymes and Deoxyribozymes. In: Intracellular Ribozyme Applications: Principles and Protocols. L. Couture, J. Rossi eds. Horison Scientific Press, Norfolk, England; R.R. Breaker (1997) In vitro Selection of Catalytic Polynucleotides. Chem. Rev. 97: 371-390；およびそれらの中で引用された参考文献に記載されている（これらの記載内容は各々、in vitro選択および進化技法のそれらの説明に関して参照により本明細書中で特に援用される）。
【０１７３】
リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断し得る化合物を選択または同定するための方法も開示される。リボスイッチの活性化は、トリガー分子の結合時のリボスイッチの状態の変化を指す。リボスイッチは、トリガー分子以外の化合物により、そしてトリガー分子の結合以外の方法で活性化され得る。トリガー分子という用語は、本明細書中では、リボスイッチを活性化し得る分子および化合物を指すために用いられる。これは、リボスイッチおよびリボスイッチを活性化しうるその他の化合物のための天然または正常トリガー分子を含む。天然または正常トリガー分子は、事実上、またはいくつかの非天然リボスイッチの場合における所定のリボスイッチのためのトリガー分子、リボスイッチが意図されるかまたはリボスイッチが選択されたトリガー分子（例えばin vitro選択でまたはin vitro進化技術で）である。非天然トリガー分子は、非天然トリガー分子として言及され得る。
【０１７４】
リボスイッチの非活性化は、トリガー分子が結合されない場合のリボスイッチの状態の変化を指す。リボスイッチは、トリガー分子以外の化合物の結合により、そしてトリガー分子の除去以外の方法で非活性化され得る。リボスイッチの遮断は、トリガー分子の存在がリボスイッチを活性化しないリボスイッチの条件または状態を指す。
【０１７５】
リボスイッチを活性化し、非活性化しまたは遮断し得る化合物の同定方法も開示される。例えばリボスイッチを活性化する化合物は、試験化合物およびリボスイッチを接触させ、そしてリボスイッチの活性化を査定することにより同定され得る。リボスイッチが活性化された場合、試験化合物は、リボスイッチを活性化する化合物として同定される。リボスイッチの活性化は、任意の適切な方法で査定され得る。例えばリボスイッチは、レポーターＲＮＡに連結され、そしてレポーターＲＮＡの発現、発現レベルまたは発現レベルの変化が、試験化合物の存在下および非存在下で測定され得る。別の例として、リボスイッチは立体配座依存性標識を含み、それからのシグナルはリボスイッチの活性状態によって変化する。このようなリボスイッチは、好ましくは天然リボスイッチからのまたはそれに由来するアプタマードメインを用いる。観察され得るように、リボスイッチの活性化の査定は、制御検定または測定の使用により、あるいは制御検定または測定を用いずに実施され得る。リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法は、類似の方法で実施され得る。
【０１７６】
リボスイッチを遮断する化合物の同定は、任意の適切な方法で成し遂げられ得る。例えば検定は、リボスイッチを活性化するかまたは非活性化することが既知の化合物の存在下で、そして試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を査定するために実施され得る。試験化合物の非存在下で観察されるのと同様に活性化または非活性化が観察されない場合には、試験化合物はリボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定される。
【０１７７】
バイオセンサーリボスイッチを用いた化合物の検出方法も開示される。当該方法は、試験試料およびバイオセンサーリボスイッチを接触させ、そしてバイオセンサーリボスイッチの活性化を査定することを包含し得る。バイオセンサーリボスイッチの活性化は、試験試料中のバイオセンサーリボスイッチのためのトリガー分子の存在を示す。バイオセンサーリボスイッチは、それらのコグネイトトリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを生成する工学処理リボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値レベルまたはそれより上で誘発され得る。バイオセンサーリボスイッチは、in vivoまたはin vitroでの使用のために意図され得る。例えばシグナルとして役立つかまたはシグナル生成に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡと操作可能的に連結されるバイオセンサーリボスイッチは、リボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有するよう細胞または生物体を工学処理することにより、in vivoで用いられ得る。in vitroで用いるためのバイオセンサーリボスイッチの一例は、それからのシグナルがリボスイッチの活性化状態によって変化する立体配座依存性標識を含むリボスイッチである。このようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは天然リボスイッチからのまたはそれに由来するアプタマーを用いる。
【０１７８】
トリガー分子の濃度が低下し、そこでトリガー濃度が変わるとシグナルが変化し得る場合、リボスイッチ活性化が可逆的であるため、バイオセンサーリボスイッチは条件変化をモニタリングするために用いられ得る。検出され得るトリガー分子の濃度の範囲は、トリガー分子に関して異なる解離定数を有するリボスイッチを工学処理することにより変更され得る。これは、例えばトリガー分子に対して高親和性を有するリボスイッチの感受性を「下げる」ことにより成し遂げられ得る。一連の濃度は、同一センサーまたは検定における異なる感受性の多数のバイオセンサーリボスイッチを用いることにより、モニタリングされ得る。
【０１７９】
リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する化合物を同定し、同定化合物を製造することにより作られる化合物も開示される。これは、例えば本明細書中の別の箇所に開示されたような化合物同定方法を、同定化合物の製造方法と組合せることにより成し遂げられ得る。例えば化合物は、試験化合物およびリボスイッチを接触させ、リボスイッチの活性化を査定し、そしてリボスイッチが試験化合物により活性化される場合には、化合物としてリボスイッチを活性化する試験化合物を製造することにより作られ得る。
【０１８０】
化合物によりリボスイッチの活性化、非活性化または遮断を点検し、点検化合物を製造することにより作られる化合物も開示される。これは、例えば本明細書中の別の箇所に開示されたような化合物活性化、非活性化または遮断査定方法を、点検化合物の製造方法と組合せることにより成し遂げられ得る。例えば化合物は、試験化合物およびリボスイッチを接触させ、リボスイッチの活性化を査定し、そしてリボスイッチが試験化合物により活性化される場合には、化合物としてリボスイッチを活性化する試験化合物を製造することにより作られ得る。リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断するそれらの能力に関する化合物の点検は、リボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断することが前に既知でない化合物の同定を、そして化合物がリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断することがすでに既知であった場合のリボスイッチを活性化し、非活性化し、または遮断する化合物の能力を査定することの両方を指す。
【０１８１】
試料およびリボスイッチを接触させることを包含する当該化合物の検出方法であって、当該化合物により活性化されるとリボスイッチはシグナルを生じ、試料が当該化合物を含有する場合にリボスイッチがシグナルを生じる方法が開示される。当該化合物により活性化されるとリボスイッチは立体配座を変え、この場合、立体配座の変化は立体配座依存性標識によりシグナルを生じる。当該化合物により活性化されるとリボスイッチは立体配座を変え、この場合、立体配座の変化がリボスイッチに連結されたＲＮＡの発現の変化を引き起こし、発現の変化がシグナルを生じる。シグナルは、リボスイッチに連結されたＲＮＡから発現されるレポータータンパク質により生成され得る。
【０１８２】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現を抑制するための化合物を試験し（この場合、抑制はリボスイッチによる）、そして（ｂ）細胞と、過程（ａ）における遺伝子発現を抑制した化合物とを接触させることにより遺伝子発現を抑制することを包含する方法であって、細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチと結合することにより遺伝子の発現を抑制する方法が開示される。
【０１８３】
リボスイッチの同定方法であって、化合物の存在および非存在下でＲＮＡ分子の直列自発的切断を査定することを包含する方法であり、この場合、ＲＮＡ分子は化合物により調節された遺伝子によりコードされ、ＲＮＡ分子の直列自発的切断のパターンの変化はリボスイッチを示す方法も開示される。
【０１８４】
Ａ．抗菌化合物の同定
リボスイッチは、小有機分子を結合する目的のために進化してきた新規の種類の構造化ＲＮＡである。リボスイッチの天然結合ポケットは、代謝類似体で、または天然代謝産物の形状−空間を模倣する化合物により標的化され得る．リボスイッチは、（１）多数のグラム陽性およびグラム陰性細菌、例えば炭疽菌Bacillus anthracis中に見出され、（２）これらの細菌における遺伝子発現の基本的調節物質であり、（３）同時的耐性を進化させるとは思われない多重コピー中に存在し、そして（４）ヒトに存在することがいまだ立証されていない。特徴のこの組合せは、新規の抗菌化合物に関してリボスイッチを興味深い標的にする。さらにリボスイッチの小分子リガンドは、薬剤候補を製造するための誘導体化のための有用な部位を提供する。
【０１８５】
あるクラスのリボスイッチが一旦同定され、薬剤標的としてのその能力が査定されれば（例えば標的生物中の多数の遺伝子がそのクラスのリボスイッチにより調節される方法を確定することにより）、候補分子が同定され得る。以下に、ＳＡＭリボスイッチを用いたこの例証を提示する（実施例７参照）。
【０１８６】
反応性メチルおよびスルホニウムイオン中心を安定イオウベースのリンケージで置換するＳＡＭ類似体（ＹＢＤ−２およびＹＢＤ３）は、適切な親和性（低〜中ナノモル範囲）でリボスイッチにより認識され、付加的ＳＡＭ類似体の合成のためのプラットフォームとして役立つ。さらにより広い範囲のリンケージ類似体（Ｎ−およびＣ−ベースのリンケージ）が合成され、試験されて、最適プラットフォームを提供し、その時点でアミノ酸およびヌクレオシド誘導を引き起こす。
【０１８７】
ＳＡＭのスルホキシドおよびスルホン誘導体を用いて、類似体を生成し得る。例えばRonald T. Borchardt and Yih Shiong Wu, Potential inhibitor of S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase. 1. Modification of the amino acid portion of S-adenosylhomocysteine. J. Med. Chem. 17, 862-868, 1974に記載された確立合成プロトコールが用いられ得る。これらのおよびその他の類似体が合成され、逐次的にまたは同一群中で結合に関して検定され得る。付加的ＳＡＭ類似体は、毎回確立される認識決定因子に基づいた化合物同定の進行中に設計される。簡易結合検定が、本明細書の別の箇所に記載されたように、枯草菌および炭疽菌リボスイッチＲＮＡに関して実行され得る。
【０１８８】
最も見込みのあるＳＡＭ類似体リード化合物は、代謝的に不活性のままで、細菌細胞中に進入し、そしてリボスイッチと結合しなければならない。さらに、有用なＳＡＭ類似体はリボスイッチによりしっかり結合されなければならないが、しかしタンパク質酵素の活性部位においてＳＡＭを競合可能であってもならず、あるいは患者の細胞中で望ましくない毒性作用を生じる危険性が存在する。これらの組織の予備査定として、化合物は、枯草菌増殖を中断させるが、しかし大腸菌培養に影響を及ぼし得ないそれらの能力に関して試験され得る（ＳＭＡを用いるが、しかしＳＡＭリボスイッチを欠く）。リード化合物候補に関してスクリーニングするために、平行細菌培養を、以下のように増殖させ得る：
１．枯草菌は、外因的供給ＳＡＭ類似体の非存在下で、グルコース最少培地中で培養され得る。
２．枯草菌は、外因的供給ＳＡＭ類似体の存在下で、グルコース最少培地中で培養され得る（高用量が選択され、その後、推定薬剤化合物の濃度範囲を試験するよう意図された実験が反復され得る）。
３．大腸菌は、外因的供給ＳＡＭ類似体の存在下で、グルコース最少培地中で培養され得る（高用量が選択され、その後、推定薬剤化合物の濃度範囲を試験するよう意図された実験が反復され得る）。
【０１８９】
細胞倍加時間の測定により、種々の培養の適性が比較され得る。微小滴定プレート中で増殖される培養を用いて薬剤化合物に関する一連の濃度が試験され、別の実験室からの微小プレート読取り基を用いて分析され得る。培養１は、良好に増殖すると予測される。培養２を抑制する薬剤は、培養３の増殖を抑制することもあり、抑制しないこともあり得る。広範囲の薬剤濃度への曝露時に培養２と培養３の両方を同時に抑制する薬剤は、外因性化合物により誘導された一般的毒性を反映し得る（即ちリボスイッチ抑制のほかのまたはそれに代わる、多数の異なる細胞過程の抑制）。このスクリーンにおいて同定される上首尾の薬剤候補は、ともかく極高用量でのみ大腸菌を抑制し、甚だ（＞10倍）低い濃度で枯草菌を抑制する。
【０１９０】
ＳＡＭに関する誘導体化点が同定される場合、リード薬剤化合物の効率的同定は適切なＳＡＭ類似体または一般的化学ライブラリーのより大規模なスクリーニングを要する。高処理量スクリーンは、核酸工学処理原理を用いて、1または2つの異なる方法により作製され得る。高処理量スクリーニング検定に適合性であるフォーマットへの下記の両蛍光センサーの適合は、固定化方法または溶液ベースの方法を用いることにより調整され得る。
レポーターを作製するための一方法は、リボスイッチドメインへのＳＡＭ結合時の蛍光タグの放出を触媒するドメインを付加することにより、リボスイッチに第三機能を付加することである。最終レポーター構築物では、この触媒ドメインは、蛍光シグナルを生成するための触媒ドメインの正確なフォールディングを可能にすることにより、リガンド結合事象を中継する連絡モジュールによりｖｉｔＪ  ＳＡＭリボスイッチに連結され得る。これは、下記のように成し遂げられ得る。
【０１９１】
ＳＡＭリボレポータープール設計：適切なＤＮＡ鋳型およびプライマー配列を用いたＰＣＲ増幅により、ＲＮＡへのin vitro転写のためのＤＮＡ鋳型（１０図）が構築された。この構築物において、ハンマーヘッドのステムＩＩ（ＳＡＭアプタマーのステムＰ１）が無作為化されて、2億5000万より多くの考え得る配列組合せを示したが、この場合、アプタマーがＳＡＭまたは関連高親和性類似体により占められる場合にのみ、いくつかは不可避的にリボザイムの機能を可能にする。構築物の集団中の各分子は配列が同一であるが、但し、無作為ドメインでは配列の全ての考え得る組合せの多コピーが集団中に示される。
【０１９２】
ＳＡＭリボレポーター選択：in vitro選択プロトコールは、以下の過程の反復的繰り返しであり得る：
１．標準方法によりin vitroでＲＮＡを転写する。ＲＮＡ全体に亘って放射能を組み入れるために［α−32Ｐ］ＵＴＰを含む。
２．標準方法により変性ＰＡＧＥ上で全長ＲＮＡを精製する。
３．触媒活性のための十分なマグネシウム（20 mM）を含有するが、しかしＳＡＭを含有しないネガティブ選択緩衝液中で全長ＲＮＡ（〜100 pmol）をインキュベートする。室温（〜23℃）で4時間、利己的分子の出現を阻止するために必要な場合には、温度周期またはアルカリ変性を用いて、インキュベートする。
４．変性ＰＡＧＥ上で全長ＲＮＡを精製し、ＳＡＭの非存在下で反応するＲＮＡを廃棄する。
５．20 mMＭｇおよびＳＡＭを含有するポジティブ選択緩衝液中でインキュベートする（23℃でｐＨ7.5）。室温で20分間インキュベートする。
６．変性ＰＡＧＥ上で切断ＲＮＡを精製して、ＳＡＭを結合し、ＲＮＡの自己切断を可能にしたスイッチを回収する。
７．ＲＮＡをＤＮＡに逆転写する。
８．ＲＮＡの切断部分を再導入したプライマーを用いてＤＮＡをＰＣＲ増幅する。
【０１９３】
過程４におけるＳＡＭの濃度は、最初は100 μMであり、そして選択が進行すると低減される。上首尾の伝達モジュールを回収する進行経過は、過程６における精製ゲル上に観察される切断の量により査定され得る。選択終点は、集団が10 nMＳＡＭ中で100％切断に近づく場合（親リボザイムおよびリボスイッチの最大活性のための条件）、あるいは集団が多数回にわたって改善しない活性のプラトーに近づく場合である。最終集団は次に、シーケンシングされ得る。個々の伝達モジュールクローンは、ＳＡＭの存在下で、スクリーニング構築物中の蛍光シグナルの生成に関して検定され得る。
【０１９４】
蛍光シグナルは、分子ビーコンのリボスイッチ媒介性トリガリングによっても生成され得る。この設計において、リボスイッチ立体配座変化は、蛍光および消光剤の両方でタグされた折畳み分子ビーコンを非折畳みにさせて、そしてリボスイッチとらせんを形成することにより消光剤から蛍光を強制的に離す。このメカニズムは、この方法が転写制御に関与するターミネーターおよびアンチターミネーター系のリガンド媒介性形成を利用し得る場合、既存のリボスイッチに容易に適合させ得る。
【０１９５】
分子ビーコンを結合することによりリガンド結合を報告するためにリボスイッチを用いることは、経験的に確定されねばならない。分子ビーコンの最適長およびヌクレオチド組成、ならびにリボスイッチ上のその結合部位は、最高信号−ノイズ比を生じるよう、系統的に試験され得る。検定の妥当性は、分子ビーコン結合リボスイッチに対する異なるＳＡＭ類似体の見掛けの相対結合親和性（蛍光シグナル発生速度により確定）を、標準直列プロービングにより確定された結合定数と比較することにより、確定され得る。
【実施例】
【０１９６】
実施例
Ａ．実施例１：補酵素Ｂ12（ＡｄｏＣｂｌ）リボスイッチ
本実施例は、補酵素Ｂ12を結合することにより遺伝子発現を制御するリボスイッチの試験および分析を記載した。
【０１９７】
１．方法
ｉ．化学物質およびオリゴヌクレオチド
補酵素Ｂ12（５’−デオキシ−５’−アデノシルコバラミンまたは「ＡｄｏＣｂｌ」）およびその類似体メチルコバラミン、二シアン化コビンアミドおよびシアノコバラミンをSigmaから購入した。トリチウム化ＡｄｏＣｂｌを、前に記載されたように調製した（Brown and Zou, Thermolysis of coenzymes B12 at physiological temperatures: activation parameters for cobalt-carbon bond homolysis and a quantitative analysis of the perturbation of the homolysis equibrium by the ribonucleoside triphosphate Reductase from Lactobacillus leichmannii. J. Inorg. Biochem. 77, 185-195 (1999)）。ＡｄｏＣｂｌ類似体Ｂ6、Ｎ6−ジメチル−ＡｄｏＣｂｌ、Ｎ6−メチル−ＡｄｏＣｂｌ、Ｎ1−メチル−ＡｄｏＣｂｌ、３−デアザ−ＡｄｏＣｂｌ、ＰｕｒＣｂｌ、２’−デオキシ−ＡｄｏＣｂｌおよび１３−エピ−ＡｄｏＣｂｌに関する情報に関しては、Toraya, In: Chemistry and Biochemistry of B12. Banerjee, R. Ed. (Wiley, New York) pp. 783-809 (1999)を参照されたい。
【０１９８】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Yale UniversityのKeck Foundation Biotechnology Resource Centerにより合成された。ＤＮＡを変性（8 M尿素）ＰＡＧＥにより精製し、そして10 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5, 23℃）、200 mMＮａＣｌおよび1 mMＥＤＴＡ中での粉砕／浸漬により、ゲルから単離した。エタノールを用いた沈降により溶液からＤＮＡを回収し、水中に再懸濁して、使用するまで−20℃で保存した。
【０１９９】
ｉｉ．直列プロービングによるＲＮＡ構造分析
ＰＣＲにより生成された鋳型からin vitro転写により前駆体ｍＲＮＡリーダー分子を調製し（下記のin vivo発現構築物および検定の節参照）、そして前に記載された方法を用いて５’32Ｐ標識した（Soukup and Breaker, Allosteric nucleic acid catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 3t8-325 (2000)）。約20 nMの標識ＲＮＡ前駆体を、図１の簡単な説明に記載したようにインキュベートした。前に記載されたものと同様の反応条件を用いて、随伴消化を実行した（Soukup and Breaker, Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of P,-NA. RNA 5, 1308-1325 (1999)）。リガンドの光誘導性分解を防止するために、アルミ箔で各試験管を包むことにより、光への曝露からインキュベーションを保護した。
【０２００】
ｉｉｉ．平衡透析検定
Dispo平衡透析機（ＥＤ−１、 Harvard Bioscience）装置を用いて、各平衡透析実験を実行した。この場合、2つの小室（ａおよびｂ）は各々、25 μLの平衡緩衝液（50 mMトリス−ＨＣｌ［ｐＨ8.3, 25℃］、20 mMＭｇＣｌ2）を含入した。5,000ダルトン分子量カットオフを有する透析膜により、小室を分離した。各実験（Ｉ〜ＩＶ、囲み）において、100 pmolの3Ｈ−ＡｄｏＣｂｌを小室ａに包含し、そして他の添加剤は各小室に関して（＋）と記した場合には含入された。各過程において、平衡を25℃で10時間進行させた後、試料を定量するか、あるいはその後の操作を実行した。各小室からの5または10 μLの溶液を用いて、液体シンチレーション計数により定量を達成した。
アルミ箔で各装置を包むことにより、光への曝露から透析試料を保護した。
【０２０１】
ｉｖ．in vivo発現構築物および検定
大腸菌Ｋ−１２菌株を全てのｂｔｕＢ−ｌａｃＺ発現検定のために用い、そしてＴｏｐ１０細胞（Invitrogen）をプラスミド調製のために用いた。大腸菌ＭＣ４１００菌株（S. Gottesman, NIHから寄贈）からのコロニーＰＣＲにより、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片として、ｂｔｕＢリーダー配列を包含するＤＮＡ（ヌクレオチド−７０〜４５０）を増幅した。野生型構築物および突然変異体構築物を、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）の第９コドンを有するフレーム中で、プラスミドｐＲＳ４１４（R. Simons, ＵＣＬＡから寄贈；Simons et al., Improved single and multicopy lac-based cloning vectors for protein and operon fusions. Gene 53, 85-96 (1987)）中に挿入した。所望の配列変化を導入した適切なＤＮＡプライマーを用いて、突然変異部位の領域上流および下流を別々に増幅した。その結果生じた断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、次に併合して、全長構築物の末端に対応するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。その結果生じた構築物をクローン化し、シーケンシングした。その配列が確証された構築物を発現分析のために用い、そして、in vitro転写のためのＰＣＲ由来ＤＮＡのその後の調製のための鋳型として用いた。
【０２０２】
上記のように生成された種々のｂｔｕＢリーダー配列およびｌａｃＺ間のインフレーム融合を用いて、Miller, In: A Short Course in Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY), p.72 (1992)により記載されたものから適合されたａ／３−ガラクトシダーゼ検定を用いることにより、発現のレベルを確定した。
【０２０３】
２．結果
ｂｔｕＢリーダーｍＲＮＡの２０２−ヌクレオチドリーダー配列における代謝産物依存性立体配座。図１Ａ：変性10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いたｂｔｕＢリーダーの自発的ＲＮＡ切断産物の分離。５’−32Ｐ−標識ｍＲＮＡリーダー分子（矢印）を、20 μMのＡｄｏＣｂｌの存在下（＋）または非存在下（−）で、20 mMＭｇＣｌ2、50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.3, 25℃）中で25℃で41時間インキュベートした。反応を受けていないＲＮＡ、アルカリによる部分消化物およびＲＮアーゼＴ１（Ｇ特異的切断）による部分消化物を含有するレーンを、それぞれＮＲ、ＯＨおよびＴ１により同定する。選択グアノシン残基後の切断に対応する生成物帯域の位置を、中黒矢頭により同定する。明青色矢頭標識１〜８は、自発的ＲＮＡ切断の速度の増大または低減を経験するエフェクター誘導性構造変調を示す9つの位置のうちの8つを同定する。リン光画像解析装置（Molecular Dynamics）を用いて画像を生成し、そしてImageQuantソフトウェアを用いることにより切断収量を定量した。図１Ｂ：ＡｄｏＣｂ１の存在下でのｂｔｕＢ  ｍＲＮＡの２０２−ヌクレオチドリーダー配列に関する配列および二次構造モデル。推定塩基対合素子をＰ１〜Ｐ９と呼ぶ。偽結び目を形成する能力を有するＰ４およびＰ９のループ中の相補的ヌクレオチドを並置する。明青色矢頭により、構造変調の9つの特定部位を同定する。星印は、Ｂ12ボックス（ヌクレオチド１４１〜１６２）の境界を定める。開始コドン（ヌクレオチド２４１〜２４３）の５’にじかに接して存在するコード領域および38ヌクレオチドは、２０２−ヌクレオチド断片中に含まれなかった。３１５−ヌクレオチド断片は、２０２−ヌクレオチド断片、リーダー配列の残りの38ヌクレオチド、ならびにコード領域の最初の75ヌクレオチドを含む。
【０２０４】
ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡリーダーは、ＡｄｏＣｂｌに関する飽和性結合部位を形成する。図２Ａ：部位１（Ｇ２３）および部位２（Ｕ６８）により表されるようなＡｄｏＣｂ１エフェクターの濃度へのｂｔｕＢ  ｍＲＮＡリーダーの自発的切断の依存度。図１Ａに対する凡例に記載したように、５’−32Ｐ標識ｍＲＮＡリーダー分子をインキュベートし、分離し、分析した。当該分子は示したような同一対照およびマーカーレーンを含む。インキュベーションは、10 nM〜100 μMの範囲のＡｄｏＣｂ１の濃度を含有する（レーン１〜８）か、またはＡｄｏＣｂ１を含まなかった（−）。図２Ｂ：ＡｄｏＣｂ１の濃度（ｃ）の対数に対するｍＲＮＡリーダーに沿った6つの位置で切断されたＲＮＡの分画の複合プロット。ＡｄｏＣｂ１の非存在下でのインキュベーション時に得られた値を含めて各位置に関して測定された最高および最低切断値と比較して、分画切断値を正規化した。差込図は6つの部位の各々に関して用いられる記号を明示するが、一方、残り3つの部位は、弱いかまたは不明瞭な切断帯域のため、分析から排除した。中黒および中白記号は、ＡｄｏＣｂ１の濃度の増大時の、それぞれ増大および低減切断収量を表す。破線は、半最大構造的変調を生成するために必要な濃度により予測した場合の、〜300 ｎMのＫDを示す。プロットされたデータは、単一ＰＡＧＥ分析から得られたが、このうち、2つの代表的切片は図１Ａに図示されている。
【０２０５】
２０２−ヌクレオチドｍＲＮＡリーダーは、平衡透析装置中のＡｄｏＣｂ１の不均等分布を生じる。図３（Ｉ）：ＲＮＡの非存在下でトリチウム化エフェクターの平衡を実行した。図３（ＩＩ）：（過程１）Ｉの場合と同様に平衡を実行したが、しかし小室ｂに付加したｍＲＮＡリーダー200 pmolを用いた；（過程２）5,000 pmolの非標識化ＡｄｏＣｂｌを小室ｂに付加した。図３（ＩＩＩ）：ＩＩに記載したように平衡を実行したが、しかし5,000 pmolのシアノコバラミンを小室ｂに付加した。ＩＶ：（過程１）ＩＩの過程１に記載したように平衡を開始した；（過程２および３）小室ａ中の溶液を25 μＬの新鮮な平衡緩衝液に置き換えた；（過程４）5,000 pmolの非標識化ＡｄｏＣｂ１を小室ｂに付加した。ｃｐｍ比は、ａの係数に対する小室ｂ中で検出される計数の割合である。破線はｃｐｍ比１を表し、これはトリチウムの均等分布が確立された場合に予測される値である。
【０２０６】
ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡリーダーによるエフェクターの選択分子認識。図４Ａは、ＡｄｏＣｂ１（１）および種々のエフェクター類似体（２〜１１）の化学構造を示す。図４Ｂ：２０２−ヌクレオチドｂｔｕＢ  ＲＮＡリーダーの自発的切断の変調をモニタリングすることによる類似体結合の確定。５’−32Ｐ標識化ｍＲＮＡリーダー分子を、図１Ａに対する凡例に記載したようにインキュベートし、分離して、分析したが、これらは、指示されたように同一の対照およびマーカーレーンを含む。部位２（Ｕ６８）を包含する３つのＰＡＧＥ分析物の切片を示す。各画像の下に、指示されたような各エフェクターに関する、あるいは無エフェクター（−）に関する切断されたＲＮＡの量（各ゲル中のＵ６８での切断の最低および最高レベルに関して正規化）をプロットする。化合物１１（１３−ｅｐｉ−ＡｄｏＣｂ１）はＡｄｏＣｂ１のエピマーであって、この場合、プロピオンアミド側鎖がコリン環の平面上に存在するよう、Ｃ１３の立体配座が転化される（Brown et al., Conformational studies of 5’-deoxyadenosyl-13-epicobalamin, a coenzymatically active structural analog of coenzyme B12. Polyhedron 17, 2213 (1998)参照）。
【０２０７】
ｍＲＮＡリーダーにおける突然変異、ならびにＡｄｏＣｂ１結合および遺伝子制御に及ぼすそれらの作用。図５Ａ：野生型２０２−ヌクレオチドｂｔｕＢリーダーの推定Ｐ５素子の配列は、位置Ｕ６８での自発的ＲＮＡ切断において観察される増大により示されるように、ＡｄｏＣｂｌ依存性変調を表示する（10％変性ＰＡＧＡゲル）。5 μMＡｄｏＣｂｌの非存在下（−）または存在下（＋）で、検定を実行した。残りのレーンは図１Ａに対する凡例に記載したのと同様である。合成棒グラフは、平衡透析装置におけるＡｄｏＣｂ１の平衡をシフトするＲＮＡの能力、ならびに細菌培養へのＡｄｏＣｂ１付加により調節されるレポーター遺伝子（実験手順参照）の能力を示す。（左）平衡透析により得られるｃｐｍ比をプロットするが、この場合、小室ｂはＲＮＡを含有する。平衡透析実験の詳細は、図３の短い説明に記載されている。（右）5 μMＡｄｏＣｂ１の非存在下（−）または存在下（＋）での細胞増殖から確定した場合のβ−ガラクトシダーゼの発現レベルをプロットする。左右の囲み数字はそれぞれ、およそのＫD、ならびにＡｄｏＣｂ１の存在下でのβ−ガラクトシダーゼ活性のフォールド抑制を示す。Ｎ．Ｄ．は、測定されなかったことを意味する。図５Ｂ〜５Ｆ：指示したような種々の突然変異体リーダー配列の配列および性能特徴。実験手順の節に記載したように、構築物を作製した。
【０２０８】
ｉ．メッセンジャーＲＮＡの代謝産物誘導性構造変調
ｂｔｕＢリーダー配列単独が代謝産物を感知し、そしてそれに応答するために十分であるか否かを査定するために、ＲＮＡの構造依存性自発的切断に頼る分子プロービング戦略を用いた（Soukup and Breaker, Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of P,-NA. RNA 5, 1308-1325 (1999); Soukup et al., Generating new ligand-binding RNAs by affinity maturation and disintegration of allosteric ribozymes. RNA 7, 524-536 (2001)）。ＲＮＡホスホジエステルリンケージが自発的に切断される主要メカニズムは、隣接リン中心上の２’−酸素による内部求核攻撃を包含する。所定のＲＮＡリンケージのＵ−酸素、リンおよび５’−酸素原子の精確な「直列」位置決定は、生産的求核攻撃が起こるには不可欠であるため（Soukup and Breaker, Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of P,-NA. RNA 5, 1308-1325 (1999); Soukup et al., Generating new ligand-binding RNAs by affinity maturation and disintegration of allosteric ribozymes. RNA 7, 524-536 (2001); Westheimer, Pseudo-rotation in the hydrolysis of phosphate esters. Acc. Chem. Res. 1, 70-78 (1968); Usher, On the mechanism of ribonuclease action. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 661-667 (1969); Usher and McHale, Hydrolytic stability of helical RNA: a selective advantage for the natural 3’,5’-bond. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1149-1153 (1976); Dock-Bregeon and Moras, Conformational changes and dynamics of tRNAs: evidence from hydrolysis patterns. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 113-121 (1987)）、所定のリンケージで自発的切断が起こる比率はＲＮＡの二次および三次構造に大いによっている。特に安定塩基対合構造に関与するヌクレオチドにより形成されるＲＮＡリンケージは、それらが直列立体配座にめったに適合しないため、自発的切断を受けることはめったにないが、一方、相対的非構造化領域にまたは三次構造化領域におかれるヌクレオチドは、はるかに高レベルの自発的切断を経験する。したがってそのリガンドの非存在下および存在下でのＲＮＡ受容体のプロービングは、ＲＮＡ構造モデルに関する証拠を提供するために、そして所定のＲＮＡリガンド相互作用に関する解離定数を確定するためにさえ、用いられ得る（Soukup and Breaker, Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of P,-NA. RNA 5, 1308-1325 (1999); Soukup et al., Generating new ligand-binding RNAs by affinity maturation and disintegration of allosteric ribozymes. RNA 7, 524-536 (2001)）。
【０２０９】
ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡの５’−非翻訳領域のヌクレオチド１〜２０２を包含するＲＮＡの調製（Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000); Lundrigan et al., Transcribed sequences of the Escherichia coli btuB gene control its expression and regulation by vitamin B12 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1479-1483 (1991)）を、直列プロービングに付した（図１）。推定ＡｄｏＣｂｌエフェクターの非存在下で、ＲＮＡは、大部分は非構造化される領域に差し込まれる安定構造素子の混合物を有する十分に秩序正しい立体配座状態を示す切断性生物の別個のパターンを示す（図１Ａ）。ＡｄｏＣｂｌの存在下では、切断のパターンは8つの位置で変わり、一方、構造変調の９番目の位置（図１Ｂ）は、ｍＲＮＡの長い方の部分が用いられる場合に観察される。特にヌクレオチド２０２での代謝産物誘導性構造変調（図１Ｂ、位置９）は、ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡのヌクレオチド１〜３１５を包含する断片の直列プロービングを用いることにより観察された（Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000)）。位置１、３、４、８および９は、自発的切断のエフェクター依存性減衰を受け、一方、残りの部位は逆作用を経験する。類似のパターンの代謝産物変調ＲＮＡ切断は、ネズミチフス菌Salmonella typhimuriumの類似２０６−ヌクレオチドｂｔｕＢリーダーＲＮＡを用いて観察された（Wei et al., Res. Microbiol. 143, 459 (1992)）。
【０２１０】
これらのエフェクター変調部位を、コンピューターおよびＲＮＡプロービングデータの組合せを用いることにより生成される二次構造モデル上にマッピングする。ＲＮＡにジ構造予測アルゴリズム（Zuker et al., Algorithms and thermodynamics for RNA secondary structure prediction: a practical guie. In RNA Biochemistry and Biotechnology (eds. Barciszewski, J., and Clark, B.F.C.) pp. 11-43 (NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers (1999)）は、9つの塩基対合素子が形成されるモデルを支持する。直列プロービングデータおよび予備突然変異分析は、これらの対合相互作用のうちの8つ（Ｐ１〜Ｐ４およびＰ６〜Ｐ９）と一致するが、一方、代替的対合相互作用（Ｐ５）は支持される（下記参照）。これらの推定塩基対合素子の大多数は、Ｐ９の顕著な例を除いて、エフェクター誘導性変調時に無傷のままであると思われる。リボソーム結合および翻訳の変調におけるこの構造素子の重要性は、突然変異分析により以前に確立されている（Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000)）。Ｐ９ステム−ループ構造の代謝産物依存性形成は、ｍＲＮＡ翻訳の下向き調節に関して重要であると思われる。この仮説と一致するのは、ＡｄｏＣｂｌの付加時にこの位置における構造形成において観察される増大である（図１Ｂ、位置８および９での切断低減）。
【０２１１】
ｉｉ．飽和性代謝産物結合部位がメッセンジャーＲＮＡにより形成される
ｍＲＮＡリーダーの構造的変更がＡｄｏＣｂｌにより選択的に誘導される場合（非特異的作用による変調とは対照的に）には、ＲＮＡは典型的受容体−リガンド相互作用の特性を示すに違いない。したがって各部位での相対程度の構造変調のプロットは、エフェクターに関する見掛けの解離定数（見掛けのＫＤ）を生じると予測され、これは、ＲＮＡの半分をそれらの変更構造状態に変換するために必要とされるエフェクターの濃度を反映する。さらに単一結合事象は観察される全体的構造変化をもたらし、次に各変調部位に関して算定される個々の（Ｋｒ）値は単一値に集中するはずであり、一方、これらの値は、構造変調が非特異的作用に起因する場合には、変化すると思われる。
【０２１２】
実際、自発的ＲＮＡ切断のレベルは、直列プロービング混合物に付加されるＡｄｏＣｂｌの濃度と相関することが判明した（図２Ａ）。エフェクター濃度に及ぼす変調の6つの最も顕著な部位の依存性の試験は、25℃で約300 nMという同様の見掛けのＫD値を明示する（図２Ｂ）。この値は、ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡとのリボソームのＡｄｏＣｂｌ依存性結合を調べた以前の検定から得られた見掛けのＫD値に匹敵する（Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000)）。さらに構造変調が広範囲の濃度に亘って生じるという事実は、このＲＮＡが、エフェクター濃度の小変化に対するより実質的な応答性を生じる多数エフェクターの協同結合を利用するとは思われない、ということを示唆する。同時にこれらの観察は、ｍＲＮＡリーダーが立体配座の実質的変化を受け、そしてＡｄｏＣｂｌに対する高親和性結合ポケットを形成する、ということを示す。
【０２１３】
この結論に対するさらなる支持を提供するために、平衡透析を用いて、2小室透析系においてインキュベートされた場合に、ＲＮＡがトリチウム化ＡｄｏＣｂｌ（３Ｈ−ＡｄｏＣｂｌ）の不均一分布を選択に生じ得るか否かを確定した。予測どおり、平衡透析アセンブリーの小室への３Ｈ−ＡｄｏＣｂｌの付加は、インキュベーション時の小室ａおよびｂ間のトリチウムのほぼ等しい分布（ｃｐｍ比〜1）を生じる（図３、実験Ｉ）。しかしながら小室ｂへの２０２−ヌクレオチドｍＲＮＡリーダーの付加は、小室ｂに有利になるように３Ｈ−ＡｄｏＣｂｌの平衡におけるシフト（ｃｐｍ比〜1）を引き起こす（図３、実験ＩＩおよびＩＩＩ）。余分量の非標識ＡｄｏＣｂｌのその後の付加は、2つの小室間のトリチウムの均等分布を取り戻し、一方、余分量のシアノコバラミン（ビタミンＢ12、ＡｄｏＣｂｌの類似体）の付加はトリチウム比を均一性に戻さないことが重要である。余分な非標識ＡｄｏＣｂｌは、ｂｔｕＢ  ＲＮＡにより形成される極めて大多数の結合部位を占めるのに役立つことにより、均等分布を取り戻す、と予測される。それに反して、シアノコバラミンは大腸菌におけるｂｔｕＢ発現のための調節エフェクターとして役立ち得ないことが既知であり（Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000); Lundrigan and Kadner, Altered cobalamin metabolism in Escherichia coli btuR mutants affects btuB gene regulation. J. Bacteriol. 171, 154-161 (1989)）、したがってＲＮＡによりエフェクターとして無視されるに違いない。これらの知見は、ＲＮＡがＡｄｏＣｂｌと直接結合するという結論と一致し、そしてＲＮＡがある種の類似体化合物を排除する選択的結合ポケットを形成する、ということを示す。
【０２１４】
1:1複合体がエフェクターおよびＲＮＡ間に形成されると仮定すると、平衡透析は検定条件下で2よりはるかに大きいｃｐｍ比を生じる、と予測される（３Ｈ−ＡｄｏＣｂｌより２倍多いＲＮＡ、ならびに見掛けのＤＤより高いＲＮＡおよびエフェクターの濃度）。余分の結合部位が存在するため、大多数のトリチウムは平衡時に小室ｂにシフトされるに違いない。しかしながらデータは、用いられる試料中のトリチウムの〜70％が３Ｈ−ＡｄｏＣｂｌの形態でない、ということを示唆する。例えば小室ａ中の緩衝液の上首尾の置換（平衡透析系から非シフトトリチウムを除去する）は、ｃｐｍ比に関する値の漸増を生じる（図３；実験ＩＶ）。さらに小室ｂ中のＲＮＡとの平衡時の小室ａ中に残留するトリチウムは、その後の平衡透析実験においてｂｔｕＢ  ＲＮＡによりトリチウムの不均一分布を生じるよう誘導され得ない（データは示されていない）。この非結合とリチウムの供給源はほとんどが、ＡｄｏＣｂｌの光媒介性分解からであると思われ、これは周囲光条件下で非常に不安定である。3Ｈ−ＡｄｏＣｂｌの質量スペクトル分析は、資料は光曝露の非存在下でほぼ完全に無傷であるが、しかし平衡透析実験を確立する場合に、典型的には試料により経験される約20秒の時間の間の光への曝露時に〜70％分解を生じる、ということを明示する。
【０２１５】
ｉｉｉ．ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡリーダーはＡｄｏＣｂｌを選択的に結合する
遺伝子応答に対する選択性を提供するためには、他の代謝産物により誘発されることから遺伝子スイッチを排除するために、ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡリーダーはＡｄｏＣｂｌに関する明確な結合ポケットを形成しなければならない。このＲＮＡの分子認識能力を探求するために、10の類似体に関するＡｄｏＣｂｌの結合親和性を間接的に確定した（図４Ａ）。これを、ＡｄｏＣｂｌまたは種々の類似体の存在下でのインキュベーション時の部位２（ヌクレオチドＵ６８）での自発的切断の程度をかくていすることにより達成した（図４Ｂ）。コバラミン化合物が５’−デオキシ−５’−アデノシル部分を欠く場合、ＲＮＡは構造的変調を受けることができない、ということが判明した。この部分上の個々の官能基の重要性は、他の類似体の機能により明示される。要するに、アデニン環のＮ１、Ｎ３およびＮ６位置での修飾は結合の有意の崩壊を引き起こすが、一方、近接リボース部分の２“−ヒドロキシル基は重要な分子認識素子ではない。面白いことに、コリン環（化合物１１）の位置１３での化学量論の変化は、このin vitro検定における、そして細胞の内側でも、調節エフェクターとして分子を不活性にさせる。これらの知見は、ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡリーダーがＡｄｏＣｂｌに関する結合ポケットを形成し、そしてＲＮＡがエフェクターと多数の接触をなして、高度の分子特異性を保証する、ということを示す。
【０２１６】
ｉｖ．代謝産物−ＲＮＡ結合の崩壊は遺伝子制御に関する帰結を有する
ＡｄｏＣｂｌの存在は、ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡのリボソーム結合および翻訳効率の低減を引き起こす（Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000)）。結果は、この遺伝子制御過程がｂｔｕＢ  ｍＲＮＡとのＡｄｏＣｂｌの選択的結合により媒介される、ということを示す。突然変異体ＲＮＡリーダーのin vitroでのエフェクター結合機能を、細胞内側のエフェクター誘導性遺伝子制御を支持するそれらの能力と比較した。予測どおり、野生型ｍＲＮＡリーダーはエフェクター誘導性構造変調を示し、平衡透析系における3Ｈ−ＡｄｏＣｂｌの不均等分布を誘導し、そしてＡｄｏＣｂｌで処理され、適切なレポーター構築物を保有する大腸菌の下向き調節を可能にする（図５Ａに要約）。しかしながら進化的に保存された「Ｂ12ボックス」中の単一突然変異（Ａ１５０Ｔ）の導入（Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000)）は、「ｍｌ」と呼ばれるこの構築物のin vivoエフェクター結合およびin vivo遺伝子制御機能を完全に排除し（図５Ｂ）、このことは、遺伝子制御に対するエフェクター結合の必要性と一致する。
【０２１７】
予測Ｐ５ステム素子を破壊し（Ｕ７３Ｇ、Ｇ７４Ｕ）、そしてその後回復する（Ｕ７３Ｇ、Ｇ７４Ｕ、Ｃ１１４Ａ、Ａ１１５Ｃ）突然変異を検査した。構築物ｍ２中の破壊ステムは、in vitroでのＡｄｏＣｂｌ結合親和性の低減ならびに細胞検定における遺伝子制御の対応する低減を引き起こし（図５Ｃ）、一方、Ｐ５ステム素子（構築物ｍ３）の回復は、結合および遺伝子制御に関するよく似た野生型機能を生じる。これは、Ｐ５ステムがＲＮＡの機能のための重要な構造素子である、ということを示す。面白いことに、Ｐ４およびＰ９ループ間の考え得る偽結び目構造における潜在的破壊的（ｍ４）および回復的（ｍ５）突然変異（図１Ｂ）はともに、結合親和性の低減を生じる（ＫD〜5 μM）。偽結び目が形成されつつある場合、この構造は適正機能のための特定の配列を要し得る。これらのＤＮＡは縮小されたがしかし検出可能なレベルのエフェクター結合を保持するが、しかしどちらも、対応するレポーター構築物を保有する細菌培養へのＡｄｏＣｂｌの付加時に遺伝子制御を示さない。その調節系がＡｄｏＣｂｌの移入を制御し続けるそれらの天然ｂｔｕＢ遺伝子を細胞が保持する場合、結合親和性の損失は、エフェクター濃度に関する物理的範囲外にこれらの突然変異体ＲＮＡを置くために十分であると思われる。本知見は、ｍＲＮＡが、タンパク質調節素子の非存在下で精確遺伝子制御を実施するために必要とされる構造的および機能的精巧さを有する、という仮説を支持する。
【０２１８】
ｖ．分析
代謝産物の濃度を直接感知するｍＲＮＡによる遺伝子制御は、細胞代謝の状態をモニタリングするための新規の確立されたパラダイムである。原核生物におけるアミノアシルｔＲＮＡの感知もそれらの対応するアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼの５’−非翻訳領域とのｔＲＮＡの直接結合により達成されると考えられる（Henkin, tRNA-directed transcription antitermination. Mol. Microbiol. 3, 381-387 (1994)）が、しかし結合はワトソン／クリック塩基対合により媒介されると思われる。ｂｔｕＢの場合、ｍＲＮＡはＡｄｏＣｂｌエフェクターを直接結合し、そしておそらくはリボソーム結合を防止することにより、翻訳開始に対して抵抗性になる（Nou & Kadner, Adenosylcobalamin inhibits ribosome biding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000)）。タンパク質受容体が分子認識にまたは遺伝子発現を変調するために必要とされない場合には、この簡単な「リボスイッチ」メカニズムはその建築において最も経済的である。タンパク質を包含する類似の系と比較したｂｔｕＢ遺伝子制御構成成分の組織化的簡易性を考えると、ｍＲＮＡは、天然および非生物学的調節エフェクターに対して直接応答するようより容易に工学処理されと思われる。
【０２１９】
代謝産物およびｍＲＮＡ間の直接接触を包含するこのメカニズムの変異は、遺伝子回路中ではるかに広範囲に及ぶ、という可能性がある。例えばＡｄｏＣｂｌ補酵素に関する生合成経路におけるタンパク質をコードするネズミチフス菌ｃｏｂオペロンは、そのリーダードメイン中にＢ12ボックスおよびその他の調節構造を保有する（Ravnum and Andersson, An adenosyl-cobalamin (coenzyme-B12)-repressed translational enhancer in the cob mRNA of Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol. 39, 1585-1594 (2001)）。別の考え得るリボスイッチエフェクターであるこれら2つの補酵素およびＦＭＮ（Gelfand et al., A conserved RNA structure element involved in the regulation of bacterial riboflavin synthesis genes. Trends Genetics 15, 439-442 (1999)）はおそらくは、ＲＮＡにより完全に作動される古い代謝状態の分子化石である、ということが注目されている（White III, Coenzymes as fossils of an earlier metabolic state. J. Mol. Evol. 7, 101-104 (1976)）。その通りである場合には、ｍＲＮＡによる代謝産物感知を包含するメカニズムは、生物における遺伝子制御の最も古い形態のうちの1つであり得る。
【０２２０】
Ｂ．実施例２：チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）リボスイッチ
本実施例は、チアミンピロリン酸を結合することにより遺伝子発現を制御するリボスイッチの試験および分析を記載した。
１．化学物質およびオリゴヌクレオチド
ＴＰＰ、チアミン一リン酸（ＴＰ）、チアミン、オキシチアミン、アンプロリウムおよびベンフォチアミンは、Sigmaから購入した。チアミンジスルフィドおよび４−メチル−５−β−ヒドロキシエチルチアゾール（ＴＨＺ）は、TCI Americaから購入した。3Ｈ−標識チアミンは、American Radiolabeled Chemicals, Inc. (10 Ci mmol-1)から購入した。合成ＤＮＡは、Yale UniversityのKeck Foundation Biotechnology Resource Centerにより合成された。ＤＮＡを変性（8 M尿素）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製し、そして10 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5, 23℃）、200 mMＮａＣｌおよび1 mMＥＤＴＡ中での粉砕−浸漬により、ゲルから単離した。エタノールを用いた沈降によりＤＮＡを回収した。
【０２２１】
２．大腸菌ｔｈｉＭ−および大腸菌ｔｈｉＣ−ｌａｃＺ融合体の構築
大腸菌ｔｈｉＣＥＦＧＨオペロン（Vander Horn et al., Structural genes for thiamine biosynthetic enzymes (thiCEFGH) in Echerichia coli K-12. J. Bacteriology 175, 982-992 (1993)）のヌクレオチド−８３〜２３８を、ＥｃｏＲ１−ＢｇｌＩＩ断片として大腸菌ＭＣ４１００菌株（S. Gottesman, NIHから入手）からＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡを、ｌａｃＺのプロモーターレスコピーを含有するＥｃｏＲ１−およびＢａｍＨ１−消化ｐＲＳ４１４プラスミドＤＮＡ（R. Simons, UCLAから入手；Simons et al., Improved single and multicopy lac-based cloning vectors for protein and operon fusions Gene 53, 85-96 (1987)）に結繋し、ｌａｃＺの第９コドンとｔｈｉＣの第９コドンとのインフレーム融合を生じた。同様にｔｈｉＭの調節領域（ヌクレオチド−６７〜１６３）を、ＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１断片としてＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＲＳ４１４中に挿入したが、この場合、ｔｈｉＭの第６コドンはｌａｃＺの第９コドンとともにインフレームで存在する。全てのその後の操作のために、Ｔｏｐ１０細胞（Invitrogen）中でプラスミドを形質転換した。部位特異的突然変異誘発は全て、QuikChange部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）および適切な変異原性ＤＮＡプライマーを用いて、ｔｈｉＣおよびｔｈｉＭ調節領域中に導入した。突然変異は全て、ＤＮＡシーケンシング（USB Thermosequenase）により確証した。
【０２２２】
３．チアミン抑制β−ガラクトシダーゼ検定
ｔｈｉＣまたはｔｈｉＭ  ｍＲＮＡリーダー配列とのインフレームｌａｃＺ融合を含有する大腸菌細胞（Ｔｏｐ１０；Invitrogen）を、Ｍ９グルコース最少培地（＋50 μg/mlビタミン検定カザミノ酸；Difco）中で中期対数期に増殖させた。付加チアミン（100 μM）を用いて、または用いずに、培養を増殖させた。アリコート（1 mL）をβ−ガラクトシダーゼ酵素検定のために取り出し、これをMiller (Miller, In: A Short Course in Bacterial Genetics Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, p.72. (1992)により記載されたのと同様の方法で実行した。全ての検定を2回反復して、二重反復試験し、Miller単位値はこれらの分析の平均を示した。
【０２２３】
４．in vitro転写
適切なＤＮＡプライマーおよびプラスミドｐＲＳ４１４ｔｈｉＣまたはｐＲＳ４１４ｔｈｉＭをそれぞれ用いて、ＰＣＲにより，ｔｈｉＣおよびｔｈｉＭ  ｍＲＮＡリーダーの断片のin vitro転写のための鋳型を生成した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写を促すために、この段階で、ジヌクレオチド配列ＧＧをＤＮＡ構築物中に導入した（各ＲＮＡ構築物の５’末端に対応する）。ＲＮＡをin vitro転写により調製し、前に記載されたように５’32Ｐ標識した（Seetharaman et al., Immobilized riboswitches for the analysis of complex chemical and biological mixtures. Nature Biotechnol. 19, 336-341 (2001)）。
【０２２４】
５．ＲＮＡの直列プロービング
ＲＮＡ構築物の直列プロービングを実行することにより、各構築物に関する見掛けのＫD値の確定を達成したが、この場合、リガンドの濃度は、弱結合リガンドに関して、10 nM〜100 nM、または10 mMまで変化した。特にＲＮＡ構築物の自発的切断のＴＰＰ依存性変調を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により可視化した。５’−32Ｐ−標識ＲＮＡ（20 nM）を、100 μMのＴＰＰの存在下（＋）または不存在下（−）で、20 mMＭｇＣｌ2、50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.3, 25℃）中で25℃で約40時間インキュベートした。いくつかのＲＮＡは、反応を受けていないか、アルカリによる部分消化物を受けたか、あるいはＲＮアーゼＴ１（Ｇ特異的切断）による部分消化物を受けた（図６ａ参照）。特定部位で切断されたＲＮＡの分画対リガンドの対数濃度の複合プロット（例えば図７ａ）を生成して、見掛けのＫDの概算値を提供した。分画切断値を、各部位に関して測定された最高および最低切断値に対して正規化した。
【０２２５】
６．平衡透析
Dispo平衡透析機（ＥＤ−１、 Harvard Bioscience）を用いて、平衡透析検定を実行した。この場合、5,000ダルトン分子量カットオフ膜により、小室ａおよびｂを分離した。小室ｂへの、指示されたような100 nM3Ｈ−チアミンを含有する25 μLの平衡緩衝液［50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.3, 25℃）、20 mMＭｇＣｌ2、100 mMＫＣｌ］の付加により、ならびに20 μMＲＮＡを含有しないかまたは含入する等容積の平衡緩衝液の付加により、平衡を開始した。平衡を23℃で10時間進行させた、アリコートを各小室から取り出して、液体シンチレーション計数により定量した。
【０２２６】
７．結果
ｉ．ｍＲＮＡによる代謝産物結合
図６Ａは、１６５ｔｈｉＭ  ＲＮＡの自発的切断のＴＰＰ依存性変調がポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により可視化されたことを示す。100 μMＴＰＰの存在下（＋）または非存在下（−）で、20 mMのＭｇＣｌ2、50 mMのトリス−ＨＣｌ（25℃でｐＨ8.3）中で25℃で約40時間、５’Ｐ標識ＲＮＡ（矢印、20 nM）をインキュベートした。ＮＲ、-ＯＨおよびＴ１はそれぞれ、無反応、アルカリによる部分消化またはＲＮアーゼＴ１による部分消化（Ｇ特異的切断）を受けたＲＮＡを示す。選定Ｇ残基後の切断を表す生成物帯域に番号を付けて、中黒矢頭により同定する。星印は、シネ−ダルガルノ（ＳＤ）配列を包含するＲＮＡ構造の変調を同定する。リン光画像解析装置（Molecular Dynamics）を用いてゲル分離物を分析し、そしてImageQuantソフトウェアを用いて定量した。
【０２２７】
図６Ｂは、コンピューターモデリング（Zuker et al., Algorithms and thermodynamics for RNA secondary structure prediction: a practical guide. In RNA Biochemistry and Biotechnology (eds. Barciszewski J. & Clark, B.F.C.) 11-43 (NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, 1999); Mathews et al., Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999)）により、ならびに図６Ａに示した構造プロービングデータにより予測した場合の１６５ｔｈｉＭの二次構造モデルを示す。自発的切断特徴は、差込図に示したとおりである。無印ヌクレオチドは、一定のしかし低レベルの分解を示す。切頭化９１ｔｈｉＭ  ＲＮＡを矩形で囲み、そしてｔｈｉボックス素子（Miranda-Rios et al., A conserved RNA structure (thi box)is involved in regulation of thiamin biosynthetic gene expression in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9736-9741 (2001)）に明青色陰影を付ける。橙色で目立たせたヌクレオチドは、Ｐ８*と呼ばれる代替的対合を同定する。当該ＲＮＡは、野生型と比較して、構築物の非必須部分に導入されてクローニングのための制限部位を形成する2つの突然変異（Ｇ１６５ＡおよびＵ１５７Ｃ）を保有するが、一方、全てのＲＮＡは、in vitro転写を促すために2つの５’−末端Ｇ残基９を保有する。
【０２２８】
図６Ｃは、２４０ｔｈｉＣ  ＲＮＡの自発的切断のＴＰＰ依存性変調を示す。図６Ａに関して上記したとおりに反応を実行し、分析した。図６Ｄは、２４０ｔｈｉＣの二次構造モデルを示す．ｔｈｉＭと同様である塩基対合素子は、標識化Ｐ１〜Ｐ５である。切頭化ＲＮＡ１１１ｔｈｉＣを矩形で囲む。橙色で目立たせたヌクレオチドは、代替的対合を同定する。
【０２２９】
ｉｉ．ｔｈｉＭおよびｔｈｉＣ  ｍＲＮＡリーダーは抗親和性代謝産物受容体として役立つ
図７Ａは、ＴＰＰの異なる濃度（ｃ）に関してプロットした１６５ｔｈｉＭ（左）および２４０ｔｈｉＣ（右）内のいくつかの部位でのＲＮＡ切断の自発的変調の程度を示す。赤色矢印は、ＲＮＡの半最大変調（見掛けのＫD）を得るために必要なＴＰＰの概算濃度を示す。図７Ｂは、指示したようにＴＰＰ、ＴＰおよびチアミンを用いて両ＲＮＡに関してプロットした見掛けのＫD値の対数を示す。矩形データは、切頭化ＲＮＡ９１ｔｈｉＭおよび１１１ｔｈｉＣとともにＴＰＰを用いて生成した。図７Ｃは、１６５ｔｈｉＭの自発的切断のパターンが、ＰＡＧＥ分析（左）により示されるような、そして指示したような3つのレーンに関する相対的リン光画像解析装置計数を表すグラフ（右）により示されるようなチアミンとＴＰＰリガンドとの間で異なる、ということを示す。ＲＮＡプロービング分析に関する詳細は、図６Ａと関連して上記したものと同様である。グラフは、ImageQuantソフトウェアにより作成した。
【０２３０】
ｉｉｉ．代謝産物結合に関するｍＲＮＡリーダーの高感受性および選択性
図８Ａは、チアミンのいくつかの類似体の化学構造を示す。ＴＤはチアミンジスルフィドであり、ＴＨＺは4−メチル−5−β−ヒドロキシエチルチアゾールである。図８Ｂは、指示したようにＴＰＰおよび種々の化学類似体（各々40 μM）を用いた１６５ｔｈｉＭ  ＲＮＡ構造プロービングのＰＡＧＥ分析を示す。ＲＮＡスパニングヌクレオチド〜１１３−〜１５０内の有意の構造変調の位置を、中白矢頭により示す。星印は、特定の化合物の存在下で切断される（底部）ＲＮＡの正規化分画を比較するために用いられる部位（Ｃ１４４）を同定する。ＲＮＡプロービング分析に関する詳細は、図６Ａに関連して上記したものと同様である。図８Ｃは、分子認識のために重要であるＴＰＰの特徴の要約を示す。図８Ｄは、トレーサーとして3Ｈ−チアミンを用いた平衡透析を示す。指示どおりに小室ｂ中のＲＮＡ構築物の存在下での平衡時に確立された２−小室系（ａおよびｂ）中のトリチウム分布に関する比率をプロットする（非ＴＰＰ結合突然変異体Ｍ３の説明に関しては下記参照）。平衡の開始時に、表示したように、100 μMのＴＰＰまたはオキシチアミンを小室ａに付加した。
【０２３１】
ｉｖ．ｔｈｉＭリボスイッチの構造および機能の突然変異分析
図９Ａは、構築物Ｍ１〜Ｍ８中に存在する突然変異を１６５ｔｈｉＭ  ＲＮＡと比較して示す。Ｐ８*は、Ｐ１およびＰ８ステムの部分（橙色）間の推定塩基対合素子である。図９Ｂ（上部）は、直列プロービング実験（10 μMのＴＰＰ）のＰＡＧＥ分析により、ならびにβ−ガラクトシダーゼ発現検定により示した場合の、野生型（ＷＴ）、Ｍ１およびＭ２  ＲＮＡのin vitro結合および遺伝子制御機能を示す。ＰＡＧＥゲル上での標識は、図６Ａに関連して上記したのと同様である。バーは、培地中のＴＰＰの存在下（＋）および非存在下（−）での遺伝子発現のレベルを表す。図９Ｃは、表形態で示したＷＴ〜Ｍ９の類似分析の要約である。ＳＤ状態「ｎ．ｄ．」（測定せず）は、ＴＰＰの非存在下および存在下で検出された自発的切断のレベルが検出の限界に近い（Ｍ６、Ｍ７およびＭ８）か、あるいはその領域がＷＴと比較して非定型構造（Ｍ９）を取ることを示す。
【０２３２】
８．考察
その配列および考え得る二次構造が細菌および古細菌のいくつかの種において保存されている前に同定された（Miranda-Rios et al., A conserved RNA structure (thi box)is involved in regulation of thiamin biosynthetic gene expression in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9736-9741 (2001)）「ｔｈｉボックス」ドメインを含む大腸菌のｔｈｉＭおよびｔｈｉＣ  ｍＲＮＡの５’−非翻訳領域を包含するβ−ガラクトシダーゼ融合構築物を調製した。ｔｈｉＭおよびｔｈｉＣ翻訳融合構築物は、そうでなければチアミンの供給源を欠く最少培地中で宿主細胞が増殖される場合、それぞれ18−110倍のβ−ガラクトシダーゼ活性のチアミン依存性抑制を示す。ｔｈｉＭリーダーを含有する転写融合物はチアミンによる抑制を受けないが、しかしｔｈｉＣリーダーを含有する同様の融合物はチアミンによる16倍変調を生じ、このことは、ｔｈｉＣを用いて観察された遺伝子制御の有意部分が転写のレベルで起きることを示唆する。
【０２３３】
これらの構築物を用いて、ＲＮＡ断片のin vitro転写のためにＰＣＲによりＤＮＡ鋳型を調製した。その結果生じたＤＮＡを構造プロービング過程に付して（実施例１参照）、ＲＮＡがリガンドの結合時に構造変調を受けるか否かを明示した。非構造化領域中のヌクレオチド間リンケージは、ＲＮＡの高度構造化領域に存在するリンケージと比較して、より大きく自発的切断を受けると思われる（Soukup and Breaker, Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of P,-NA. RNA 5, 1308-1325 (1999)）。１６５−ヌクレオチドｔｈｉＭ  ＲＮＡ断片（１６５ｔｈｉＭ）は、ＴＰＰの非存在下で長時間ＲＮＡがインキュベートされる場合に生成される異なるパターンの切断産物を有する（図６Ａ）。100 μMのＴＰＰの付加時に、位置３９〜８０に亘る領域中の多数のヌクレオチド間リンケージが自発的切断の低減を示す場合、１６５ｔｈｉＭは実質的構造変化を受ける。これは、ＴＰＰがＲＮＡと結合し、この領域内の限定構造を安定化して、より低率の断片化を生じる、ということを示す。
【０２３４】
断片化パターンは、二次構造予測アルゴリズムにより同定される潜在的塩基対合および突出構造と大いに一致する（Zuker et al., Algorithms and thermodynamics for RNA secondary structure prediction: a practical guide. In RNA Biochemistry and Biotechnology (eds. Barciszewski J. & Clark, B.F.C.) 11-43 (NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, 1999); Mathews et al., Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999)）。切断のリガンド誘導性低減を経験するほとんどのリンケージは、ｔｈｉボックスおよびこのドメインに対して５’にじかに接して存在するヌクレオチドにより包含される（図６Ｂ）。切断を受けるがしかしＴＰＰにより変調されないその他のリンケージは、突出部またはヘアピンのループに存在すると予測される。Ｐ２〜Ｐ７と標識された予測塩基対合構造は、最低レベルの自発的切断示すリンケージを包含し、このことは、ＴＰＰの存在下および非存在下の両方でそれらが構造化されたままであることを暗示する。興味深いことに、ヌクレオチド１２６〜１３０は、ＴＴ付加時により構造化されるようになる上記のものとは離れた唯一の領域を包含する．これらのヌクレオチドは、原核生物におけるｍＲＮＡの効率的翻訳のために必要とされるシネ−ダルガルノ（ＳＤ）配列に対応する。これらの知見は、ｔｈｉＭ  ＲＮＡがＴＰＰと結合して複合体を形成し、リボソームがＳＤ配列に到達できない遺伝子制御メカニズムと一致する。
【０２３５】
同様に構造プロービングを用いて、ｔｈｉＣのためのｍＲＮＡリーダーを検査し得る。２４０ｔｈｉＣ  ＲＮＡも、ジは圧的切断のそのパターンの広範な変調を示し、さらにまた変化パターンの大多数がｔｈｉボックス二、ならびにこのドメインの直ぐ上流に位置する領域に置かれる（図６Ｃ）。ｔｈｉＭおよびｔｈｉＣにおける最高構造変調のこれらの領域は、類似の二次構造中にフォールディングされ（図６Ｄ）、そしてｔｈｉボックスドメイン内におよびそれに隣接していくつかの共通配列素子を保有する。したがってｔｈｉＭおよびｔｈｉＣスパニングステムＰ１〜Ｐ５の構造は、工学処理リガンド結合ＲＮＡであるアプタマーと類似するＴＰＰ結合モチーフを含む（Osborne & Ellington, Nucleic acid selection and the challenge of combinatorial chemistry. Chem. Rev. 97, 349-370 (1997); Hermann & Patel, Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science 287, 820-825 (2000); Gold et al., Diversity of oligonucleotide functions. Annu. Rev. Biochem. 64, 763-797 (1995)）。この天然ＴＰＰアプタマーに対して３’にあるヌクレオチドは、代謝産物結合事象を遺伝子応答に転換することに関与する。
【０２３６】
ＴＰＰ、チアミンおよびチアミン一リン酸（ＴＰ）に関する見掛けの解離定数（見掛けのＫD）を確定することにより、これらのｍＲＮＡによる代謝産物検出の感受性を査定した。一連のリガンド濃度下で、ＲＮＡ内のいくつかのリガンド感受性部位での自発的切断の程度をモニタリングすることにより、値を出した。例えばゼロ〜100 μMの範囲（またはある種の類似体に関しては10 mMまで）のＴＰＰ濃度下での微量の１６５ｔｈｉＭ  ＲＮＡのプロービングは、ＲＮＡ構造の半最大変調は、約600 nMのＴＰＰが存在する場合（図７Ａ）に起こり、これは600 nMの見掛けのＫDを示す、ということを明示する。同様に２４０ｔｈｉＣのプロービングは100 nMの見掛けのＫDを明示する。165ｔｈｉＭおよび２４０ｔｈｉＣ  ＲＮＡはともに、ＴＰまたはチアミンよりしっかりＴＰＰを結合すると思われ、ｔｈｉＣはＴＰおよびチアミンに対して1,000倍より大きい弁別を示す（図７Ｂ）。ＴＰＰがＲＮＡ構造の最強モジュレーターであるという事実は、ＴＰＰ合成がチアミン生合成遺伝子の発現の調節のために必要とされるというネズミチフス菌における遺伝子観察と一致する（Webb et al., Thiamine pyrophosphate (TPP) negatively regulates transcription of some thi genes of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 178, 2533-2538 (1996)）。タンパク質から作られる受容体−リガンド系に関して一般的に観察される現象であるＲＮＡにより達成される示差的特異性はこれらのリガンド結合ＲＮＡが特異性変化を受容する(例えば天然または人工的進化力による)、ということを示す。
【０２３７】
ＲＮＡ−リガンド相互作用に関する実ＫD値は、ＲＮＡ構造に影響を及ぼし得るＭｇ2+およびその他の作用物質の生理学的条件がin vitro検定の条件に釣り合わない細胞内部では異なる。さらにまた、ＲＮＡ構築物の性質は、変更ＫDの供給源であり得る。例えば推定天然アプタマーのみを多量に包含する最小化９１ｔｈｉＭ構築物（図６Ａ）は、ＴＰＰを結合する能力を保持し、そしてより長い構築物と比較して約20倍改善される見掛けのＫDを示す（図７Ｂ）。したがってＴＰＰに対する親和性は、発生期ＲＮＡ転写体がＲＮＡポリメラーゼまたはリボソームの活性部位から出現する場合に変わり得る。さらにこの結果は、９１ｔｈｉＭアプタマードメインが、遺伝子発現を直接制御しているＲＮＡ構成成分（集合的に「発現プラットフォーム」と呼ばれる）から分離され得る、ということを実証する。アプタマーおよび発現プラットフォームドメインの物理的および機能的分離を含むこのモジュール式構築は、合理的ＲＮＡ工学処理戦略による（または進化過程を通しての）ＴＰＰ制御ＲＮＡの生成を可能にする。
【０２３８】
１６５ｔｈｉＭのｔｈｉボックスドメイン内のいくつかのリンケージでの自発的切断は、用いられる種類のリガンドと特に相関する。ＴＰＰは、ヌクレオチドＡ６１、Ｕ６２、そして小程度にＵ７９での１６５ｔｈｉＭの自発的切断を低減するが、しかしこれら同一部位は、チアミンがその飽和濃度近くで存在する場合、高レベルの切断を保持する（図７Ｃ）。これらのヌクレオチドは、ｔｈｉボックスドメイン内の内部突出で一塊になり、そしてＴＰＰのリン酸基のための結合部位に寄与すると思われる。
【０２３９】
チアミンのある種の構造的特徴を保有するいくつかの類似体の存在下で、１６５ｔｈｉＭの構造的変調をさらに調べた（図８Ａ）。チアミンおよびそのリン酸化誘導体ＴＰおよびＴＰＰは、予測どおり変調を誘導する（図８Ｂ）。しかしながらＴＰＰと低類似性を有するオキシチアミンおよびその他のチアミン類似体は、構造的変調を誘導できない。類似体のこのサンプリングの性能は、ＲＮＡがそのリガンドの遠位部分と特異的に接触し、そしてプリンおよびリン酸基がともに分子認識のための重要な素子を保有する、ということを示す（図８Ｃ）。同様の結果は、平衡透析検定を用いて得られる（図８Ｄ）。例えば平衡透析アセンブリーの小室ｂへの９１ｔｈｉＭ  ＲＮＡの付加は、余分量の非標識ＴＰＰも含まれない限り、小室ｂに好都合に3Ｈ−チアミンの分布のシフトを引き起こす。しかしながらオキシチアミンの存在は、トリチウム分布を均一性に有意に戻さず、これは、プロービングデータが、ＲＮＡと結合し得ない、ということを示すために予測される。これらの知見は、ＴＰＰリボスイッチのアプタマードメインがその標的リガンドに対して高選択性である、ということを示す。
【０２４０】
一連の変異体構築物を生成し、試験することにより、１６５ｔｈｉＭ  ＲＮＡに関する二次構造モデルをより詳細に検査した（図９Ａ）。例えば変異体Ｍ１は、予測Ｐ３対合素子を破壊する突然変異を保有する。この突然変異は、ＴＰＰ結合の損失（図９Ｂ、例えば位置Ｃ７７参照）、ならびに対応するβ−ガラクトシダーゼ融合構築物の遺伝子制御の損失（図９Ｂ、グラフ）を引き起こす。二重突然変異体構築物Ｍ２における塩基対合の再確立は、ＴＰＰ結合および遺伝子制御の両方を回復する。同様に構築物Ｍ３〜Ｍ６により包含される破壊的および回復的突然変異は、ステムＰ５およびＰ８の形成と一致する。ＴＰＰの付加時に、ＷＴおよびＭ２構築物の両方のＳＤ素子は、高レベルの自発的切断を排除する構造中で封鎖されるようになる。それに反してＭ１構築物は、ＳＤ変調を示さない（図９Ｂ、ヌクレオチド１２６〜１３０）。これらの結果は、リボソームによりＳＤへの接近を低減するＰ８の安定形成をＴＰＰ結合が最終的に促すメカニズムにより遺伝子スイッチが切られるのと一致する。
【０２４１】
Ｐ８（ヌクレオチド１０８〜１１１）中のＳＤ配列の相手は、ＴＰＰの存在下および非存在下の両方において、自発的切断に抵抗性のままである（図６Ａ）。これは、そうでなければこのアンチ−ＳＤ素子がＰ８を形成するのを防止する代替的構造の置換のため、ＴＰＰの付加時の、Ｐ８の形成と一致する。さらにヌクレオチド８３〜８６は、アンチ−ＳＤ素子と相補的であり、そしてこの領域はＴＰＰの存在下および非存在下で自発的切断も妨げる。下記のように試験される遺伝子制御が生じるメカニズムは、「オン」状態でのＰ８*の相互排他的形成対代謝産物結合「オフ」状態でのＰ１およびＰ８の同時形成によるものである（図９Ｃ）。
【０２４２】
このメカニズムの査定において、構築物Ｍ７〜Ｍ９を試験した。構築物Ｍ７は、Ｐ８*相互作用を同時に不安定化しながら、Ｐ８相互作用を不安定化するよう意図されるアンチ−ＳＤ配列中にＵ１０９Ｃ突然変異を保有する。Ｍ７はＴＰＰ結合機能を保持し、そして有意レベルの遺伝子変調を示す（図９Ｂ、ボックス）が、これは、突然変異が「オン」および「オフ」状態間のｍＲＮＡの相対分布を崩壊しない場合に予測される。比較に際して、Ｍ８（Ｕ１１０Ｃ）はＴＰＰ結合を保持し、レポーター発現における劇的低減を示し、そしてほとんど全ての遺伝子変調を失う。さらにＭ８はもはやＳＤ配列における検出可能な自発的切断を示さず、これは、このＲＮＡ変異体に有利に明確にシフトされているＰ８およびＰ８*構成体間の熱力学的平衡と一致する。アンチ−ＳＤ素子中に4つの突然変異を保有する構築物Ｍ９は、ＳＤ領域中に有意に異なるパターンの自発的切断を有する。Ｍ９は、構築物がin vitroでのＴＰＰ結合を保持するという事実にもかかわらず、細胞へのチアミン付加時に遺伝子発現を低減できない。ＴＰＰ結合は適切なＲＮＡ変異体中のＳＤ素子の構造的自由を制限し、そしてこれは遺伝子制御と相関する、ということはこれらのデータから明白である。
【０２４３】
Ｃ．実施例３：代謝産物結合リボスイッチ
１．序論
現代生物は、代謝要求および環境変化に応答する数百の遺伝子の発現を調整しなければならない。各遺伝子産物は、時間的に、定量的にそしてしばしば空間的に調節されねばならない。さらに遺伝子制御過程は、動的、迅速で、そして変化を受ける特定条件に選択的に応答性でなければならない。したがって生物は、多数の環境シグナルを継続的に定量する遺伝子調節因子の見張り番を要する。多数の考え得る生化学的または物理的合図のうちの1つであり得る特定のシグナルの測定時に、これらの調節因子は生物の遺伝子の特定のサブセットの発現を変調しなければならない。
【０２４４】
タンパク質は高応答性センサーを生成するための立証済み媒体であるため、タンパク質はこれらのシグナルの必須のセンサーである、と一般的に考えられてきた。しかしながらｍＲＮＡは遺伝子制御の目的のための化学的および物理的条件の直接センサーとしても作用し得る、ということが発見された。集合的に「リボスイッチ」と呼ばれるｍＲＮＡドメインのクラスは、標的化合物を直接的に結合することにより、特定代謝産物の濃度を感知するＲＮＡ遺伝子制御素子として役立つ。発見されたリボスイッチは、基本的生化学過程に重要である代謝産物、例えばアデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）（実施例１参照）、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）（実施例２参照）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）（実施例７参照）、リジン（実施例５参照）、グアニン（実施例６参照）およびアデニン（実施例８参照）を感知するのに関与する。適切な小分子リガンドとの相互作用時に、リボスイッチｍＲＮＡは、それらがコードする遺伝子の変調を生じる構造的再組織化を受ける。今日まで、詳細に検査されてきたリボスイッチは全て、それらの標的リガンドを結合するに際して遺伝子抑制を引き起こすが、しかしリガンド結合時に遺伝子発現を活性化するリボスイッチは産生され得ない（そして事実上見出されると思われる）。
【０２４５】
各々の場合、小有機代謝産物とｍＲＮＡ受容体との直接的相互作用が遺伝子発現において対応する変化をもたらすために、リボスイッチドメインは、一連の生化学的および遺伝子的分析に付されてきた。本実施例は、これらの努力の、そしてリボスイッチにより示される一般的特性のうちのいくつかの簡単な要約を提供する。これらの発見ならびに本実施例および本明細書中の他の箇所に記載されたリボスイッチ操作の原理を用いて、当業者は、遺伝子ツールとして、および抗菌剤の開発のための標的として用いることを含めた多数の目的のためにリボスイッチを使用し、適合し得る。
【０２４６】
２．リボスイッチＲＮＡの一般的組織化
細菌リボスイッチＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの主コード領域の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に主に置かれる遺伝子制御素子である。構造的プロービング試験（以下でさらに考察）は、リボスイッチ素子は一般に2つのドメイン：即ちリガンド結合ドメイン（本明細書中ではアプタマードメインと呼ばれる）として役立つ天然アプタマー（T. Hermann, D.J. Patel, Science 2000, 287, 820; L. Gold, et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763）、ならびに遺伝子発現に関与するＲＮＡ素子（例えばシネ−ダルガルノ（ＳＤ）素子；転写ターミネーターステム）と連動する「発現プラットフォーム」から成る、ということを明示した。これらの結論は、in vitroで合成されたアプタマードメインが発現プラットフォームの非存在下で適切なリガンドを結合する、という観察から引き出される（実施例２および６参照）。さらに構造的プロービング研究は、独立して試験した場合、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインが特定の二次および三次構造襞を採用し、全５’リーダーＲＮＡの情況で試験した場合のアプタマー構と本質的に同一である、ということを示唆する。これは、多くの場合、アプタマードメインが発現プラットフォームとは無関係にフォールディングするモジュラー単位であることを意味する（実施例２および６参照）。
【０２４７】
最後に、アプタマードメインのリガンド結合または非結合状態は、遺伝子発現時に作用を発揮するのに関与する発現プラットフォームにより解釈される。モジュラー素子としてのリボスイッチの見地は、アプタマードメインが種々の生物の間で（そしてＴＰＰリボスイッチに関して観察されるような区分間でさえ）高度に保存される、という事実によりさらに支持されるが、一方、発現プラットフォームは、配列、構造において、ならびに添付のオープンリーディングフレームの発現が制御されるメカニズムにおいて変わる。例えば枯草菌のｔｅｎＡ  ｍＲＮＡのＴＰＰリボスイッチと結合するリガンドは、転写終結を生じる。この発現プラットフォームは、大腸菌からのｔｈｉＭ  ｍＲＮＡにおけるＴＰＰリボスイッチの発現プラットフォームと比較した場合、配列および構造が異なり、この場合、ＴＰＰ結合はＳＤ遮断メカニズムによる翻訳の抑制を生じる（実施例２参照）。ＴＰＰアプタマードメインは容易に認識可能であり、そしてこれら2つの転写単位間のほぼ同一の機能的特徴を有するが、しかしそれらを実行する遺伝子制御メカニズムおよび発現プラットフォームは非常に異なる。
【０２４８】
リボスイッチＲＮＡに関するアプタマードメインは、典型的には〜70〜170 nt長の範囲である（図１１）。この観察は、長さがかなり短く、そして構造的に複雑であるin vitro進化実験が広範な種々の小分子結合アプタマーを同定したとすると、多少予測されなかった（T.Hermann, D.J. Patel, Science 2000, 287, 820; L. Gold, et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763; M. Famulok, Current Opinion in Structural Biology 1999, 9, 324）。人工アプタマーと比較した場合の天然アプタマー配列の複雑さおよび情報含量の実質的増大は、高親和性および選択性を伴って機能するＲＮＡ受容体を生成する必要が最もあると考えられる。リガンド−リボスイッチ複合体に関する見掛けのＫD値は、低ナノモルから低マイクロモルの範囲である。いくつかのアダプタードメインは、添付の発現プラットフォームから単離される場合、無傷リボスイッチの場合を上回る標的リガンドに対する親和性改善（〜10〜100倍）を示す、ということに留意するのも有益である（実施例２参照）。これはおそらく、リガンド親和性の損失により示される完全無傷リボスイッチＲＮＡにより必要とされる多数の異なるＲＮＡ立体配座のサンプリングにおけるエネルギー消費を表す。アプタマードメインは分子スイッチとして役立たねばならないため、これは、それらのより洗練された構造を合理化するのを助け得る天然アプタマーにおける機能的要求にも付加し得る。
【０２４９】
３．細菌における転写終結のリボスイッチ調節
細菌は主に、転写の終結のために2つの方法を用いる。ある種の遺伝子は、Ｒｈｏタンパク質に依存性である終結シグナルを組み入れる（J.P. Richardson, Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1577, 251）が、一方、他のものはＲｈｏ−非依存性ターミネーター（内在性ターミネーター）を用いて、転写延長複合体を非安定化する（I. Gusarov, E. Nudler, Molecular Cell 1999, 3, 495; E. Nudler, M.E. Gottesman, Genes to Cells 2002, 7, 755）。後者のＲＮＡ素子は、富ＧＣステム−ループとその後の6〜9個のウリジル残基の鎖から成る。内在性ターミネーターは細菌ゲノム全体に広く行き渡っており（F. Lillo, et al., 2002, 18, 971）、そして典型的には遺伝子またはオペロンの３’末端に位置する。興味深いことに、５’−ＵＴＲ内に位置する内在性ターミネーターに関して漸増数の例が観察されつつある。
【０２５０】
細菌により用いられる広範な種々の遺伝子調節戦略の中で、ＲＮＡポリメラーゼが調節方式で５’−ＵＴＲ内の終結シグナルに応答する例のクラスが増大しつつある（T.M. Henkin, Current Opinion in Microbiology 2000, 3, 149）。ある種の条件中は、ＲＮＡポリメラーゼ複合体は外部シグナルにより指図されて、終結シグナルを感知するかまたは無視する。転写開始は調節なしで起こり得るが、しかしｍＲＮＡ合成の全部の（そして遺伝子発現の）制御は、最後に内在性ターミネーターの調節により指図される。一般に、少なくとも2つの相容れないｍＲＮＡ立体配座のうちの1つは、転写終結を合図するＲＮＡ構造の形成または崩壊を生じる。いくつかの場合に、ＲＮＡである（F.J. Grundy, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2002, 99, 11121; T.M. Henkin, C. Yanofsky, Bioassays 2002, 24, 700）そして他の場合にはタンパク質である（J. Stulke, Archives of Microbiology 2002, 177, 433）トランス作用因子は一般に、特定の細胞内シグナルを受容し、そしてその後にＲＮＡ立体配座の1つを安定化するために必要とされる。リボスイッチはＲＮＡ構造変調と遺伝子制御機構により解釈される代謝産物シグナルとの間の直接連結を提供する。枯草菌ｍＲＮＡからのＦＭＮリボスイッチの簡潔な態様が、このメカニズムを例証するために以下で提示される。
【０２５１】
ｉ．ＦＭＮに関する天然アプタマー
ＲＦＮ素子と呼ばれる高度保存ＲＮＡドメインは、リボフラビンおよびＦＭＮの生合成および輸送に関与する細菌遺伝子において同定された（M.S. Gelfand, et al., Trends in Genetics 1999, 15, 439; A.G. Vitreschak, et al., Nucleic Acids Research 2002, 30, 3141）。この素子は、突然変異がＦＭＮ媒介性調節の損失を生じた場合、枯草菌のｒｉｂＤＥＡＨＴオペロン（以後「ｒｉｂＤ」）の遺伝子操作のために必要とされる（Y.V. Kil, et al., Moleclar & General Genetics 1992, 233, 483; V.N. Mironov, et al., Molecular & General Genetics 1994, 242, 201）。これらのデータは、タンパク質ベースのＦＭＮセンサーまたはＦＭＮそれ自体（G.D. Stormo, Y. Ji, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98, 9465）が、ｒｉｂＤ遺伝子発現を抑制するためにＲＦＮ素子と相互作用する、ということを提唱した。しかしながらこのような相互作用がどのように起こるか、あるいは発現が作用を及ぼされるメカニズムについては分からなかった。ＦＭＮを特異的に結合するＲＮＡ配列は定方向進化実験により同定された（C.T. Lauhon, J.W. Szostak, Jouornal of the American Chemical Society 1995, 117, 1246, M. Roychowdhury-Saha, et al., Biochemistry 2002, 41, 2492）が、しかしそれらはＲＦＮ素子に対する明白な類似点を示さなかった。
【０２５２】
ａ．構造的プロービングはＦＭＮ媒介性ＲＮＡ構造変調を明示する
ＲＮＡポリマー中の各ヌクレオチド間リンケージは、ＳN２−様メカニズムにより自発的加水分解を受け易く、この場合、２’酸素が隣接リン中心を攻撃して、鎖切断を引き起こす。この反応は、攻撃求核性分子、リン中心および５’−酸素脱離基（直列立体配座）間の180°配向を要する（G.A. Soukup, R.R. Breaker, RNA 1999, 5, 1308; V. Tereshko, et al., RNA 2001, 7, 405）。塩基対合されるかまたは別の方法で構造的に束縛されるヌクレオチドは、典型的にはこれらの立体配置をとることができず、したがって低比率の自発的切断を示す。これに反して、構造的に束縛されないヌクレオチドは、非常に高い比率の自発的切断を示す。これらの観察は、所定のあるなポリマーに関して関連した比率の自発的切断を確立し、そしてこれを二次−および三次構造モデルと相関させる「直列プロービング」と呼ばれる構造的プロービング方法に利用されてきた（V. Tereshko, et al., RNA 2001, 7, 405）。
【０２５３】
ｒｉｂＤのＲＦＮ素子がＦＭＮに対して応答性であったか否かを査定するために、対応する５’−ＵＴＲの断片を５’−32Ｐ標識し、ＦＭＮの非存在下および存在下でインキュベートして、その結果生じた断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。興味深いことに、パターンは、ＦＭＮを用いた反応と用いない反応との間で異なり、これは、ｒｉｂＤとのＦＭＮ結合時に、ＲＮＡの構造的再配列が認められることを意味する。ＲＦＮ素子のらせん間領域内に置かれたある種のヌクレオチド位置の自発的切断はＦＭＮの存在下で有意に低減されるようになり、このことは、これらのヌクレオチドが、ＲＮＡに構造的束縛を強いるＦＭＮ−ＲＮＡ複合体の形成に関与する、ということを示唆する（図１２）。それは、遺伝子発現のアロステリック変調のために発現プラットフォームにより利用され得るこの種類の構造的変調である。
【０２５４】
酵素プロービングにより、ｒｉｂＤ  ＲＦＮ素子によるＦＭＮの直接結合に関する付加的証拠を生成した。ＲＦＮ素子とアニーリングすると予測されたオリゴヌクレオチドをＦＭＮの存在下および非存在下でｒｉｂＤ転写体に付加し、そしてその結果生じた混合物をＲＮアーゼＨ（ＲＮＡ：ＤＮＡへテロ二重鎖を特異的に切断する）で消化し、そしてＰＡＧＥにより分析した（A.S. Mironov, et al., Cell 2002, 111, 747）。転写体の有意部分は、ＦＭＮの非存在下である種のオリゴヌクレオチドと結合するが、しかしＦＭＮの存在下では結合せず、このことは、ＦＭＮがｒｉｂＤ転写体の構造的再配列を安定化し、これが次にオリゴヌクレオチドのアニーリングを防止する、ということを示す。
【０２５５】
ｂ．ＦＭＮ−ｒｉｂＤ複合体の親和性および特異性
ＲＦＮ素子がＦＭＮのためのアプタマーとして役立つ場合、それは、関連リガンドを弁別する何らかの能力を有する飽和性受容体の特徴を示すべきである。ＦＭＮに関する見掛けの解離定数（見掛けのＫD）に関する値を得るために、微量のｒｉｂＤ  ＲＮＡおよび漸増濃度のＦＭＮを用いて、直列プロービング検定を反復した；ＲＮＡ構造の半最大変調と相関するリガンド濃度は、見掛けのＫDを反映すべきである。これらの実験は、ｒｉｂＤ  ＲＮＡが、〜5 nMの見掛けのＫDを示す飽和性リガンド結合部位を含有する、ということを示す。さらにＲＮＡは、およそ3のオーダーの大きさにより、脱リン酸化形態のＦＭＮ（リボフラビン）を弁別する。アプタマーは、リン酸基との生産的相互作用を成すＦＭＮのための結合ポケットを生成しなければならないため、ｒｉｂＤ  ｍＲＮＡのこの例外的リガンド特異性は意外である。
【０２５６】
ｉｉ．ＦＭＮ誘導性転写終結
ａ．ＦＭＮリボスイッチにより媒介されるin vitro転写終結
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたは枯草菌ＲＮＡポリメラーゼを用いて、in vitro転写により、ｒｉｂＤリーダー領域に関する主要転写産物の相対量を調べた。ｒｉｂＤリーダー領域は、ｒｉｂＤコード領域の直ぐ上流に古典的内在性ターミネーターを含有する。興味深いことに、内在性ターミネーターで終結した転写体は、付加的タンパク質因子の非存在下で、ＦＭＮにより特定的に誘導される。さらにＲＦＮ素子における突然変異は、この現象を阻害する。ターミネーターの左半分は、ＲＦＮ素子の一部との代替的塩基対合相互作用を形成し、それによりアンチターミネーター素子を形成する。内在性ターミネーターの配列変化はＦＭＮ誘導性終結を排除し、一方、アンチターミネーターの変化は構成的終結を生じる。合わせて考えると、これらの観察は、余分量のＦＭＮの条件中にＦＭＮがｒｉｂＤ転写体と直接相互作用する機械的モデルと一致する。複合物形成はその後、５’−ＵＴＲ内の転写終結を誘導し（図１２）、これが、ＯＲＦが転写されるのを防止することにより遺伝子発現を妨げる。ＦＭＮ制限の条件中、アンチターミネーター構造はｒｉｂＤ発生期転写体内に形成され、これが下流遺伝子の合成を可能にする。
【０２５７】
ｂ．in vivoでの転写終結のＦＭＮ媒介性制御
リボスイッチ媒介性転写終結の分子的詳細は、このどちらかといえば極度に簡素化されたモデルが意味するより複雑であると思われる．例えばターミネーターまたはアンチターミネーター立体配座を形成するための「決定」が転写中に1回だけ起きるとすると、調節メカニズムは精確な転写動力学、ならびに適切なＲＮＡフォールディング経路に頼ると思われる。さらにＲＮＡ受容体と相互作用するＦＭＮの動力学は、重要な因子であると思われる。ＲＮＡがＦＭＮに対して有する親和性は工学処理アプタマーと比較して例外的に強いが、しかし、リガンド会合の動力学は遺伝子調節のより重要な決定因子であり得る。実際、これらのパラメーターはすべて、内在性ターミネーター全体に適切な制御を発揮するために、協力すると思われる。本明細書中に記載されたように用いるためにリボスイッチを適合し、設計するに際しては、転写速度の影響が考慮されるべきである。
【０２５８】
ｉｉｉ．その他のリボスイッチによる転写終結の制御
内在性ターミネーターは、コンピューター援用検索アルゴリズムにより同定され得る（F. Lillo, et al., 2002, 18, 971）。このようなバイオインフォーマティック分析を用いて、内在性ターミネーターおよび代替的アンチターミネーター構造素子を含有すると予測されるリボスイッチＲＮＡのサブセットが同定され得る（M. Mandal, et al., Cell 2003, 113; A.G. Vitreschak, et al., Nucleic Acids Research 2002, 30, 3141; F.J. Grundy, T.M. Henkin, Molecular Microbiology 1998, 30, 737; S. Kochhar, H. Paulus, Microbiology 1996, 142, 1635; D.A. Rodionov, et al., Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 48949）。したがってＦＭＮリボスイッチに関して上記した結果は、多数のその他のリボスイッチＲＮＡにより用いられるメカニズムを示す。実際ＳＡＭ−およびＴＰＰ−依存性リボスイッチは、相互排他的内在性ターミネーターおよびアンチターミネーター構造の形成により、終結全体に制御を発揮することが実証されている（例えば実施例７参照）。さらにＳＡＭリボスイッチアプタマー内のらせんを崩壊し、その後回復する突然変異は、それぞれＳＡＭ結合の損失および回復を生じる。併発的にこれらの突然変異は、リガンド結合機能にしたがって、ＳＡＭ誘導性転写終結の崩壊または回復も生じる。リボスイッチは、本明細書中に記載された原理に従って、古典的内在性ターミネーターとはかなりの程度異なる転写終結シグナル全体に制御を発揮するよう適合され、設計され得る。本明細書中の他の箇所に記載したように、発現制御ステム構造を有する発現プラットフォームドメインは、アプタマーの制御鎖（Ｐ１ｂ）が発現プラットフォームの調節鎖（Ｐ１ｃ）とともにステム構造を形成し得るよう、アプタマードメインのＰ１ステムを設計することにより、アプタマードメインに釣り合わされ得る。
【０２５９】
４．細菌における翻訳開始のリボスイッチ調節
リボスイッチによる遺伝子制御の代替的メカニズムは、翻訳開始の変調である。転写終結と違って、ＲＮＡポリメラーゼにより完全ｍＲＮＡが合成されるが、しかし発現は、代謝産物濃度があるレベルに達するまで、リボスイッチにより防止される。ほとんどの場合、リボスイッチは高濃度の標的代謝産物の存在下で翻訳開始を妨げる、ということが観察された。しかしながらリボスイッチは、リボスイッチ構造のアロステリック変調が翻訳活性化を引き起こすよう、設計され、適合され得る。翻訳制御の調節メカニズムを、大腸菌からのＴＰＰリボスイッチに関していかに簡単に説明する。
【０２６０】
ｉ．ＴＰＰに関する天然アプタマー
ｔｈｉボックスと呼ばれる保存ＲＮＡ素子は、チアミンの生合成および輸送に関与するｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ内で同定された（D.A. Rodionov, et al., Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 48949; J. Miranda-Rios, M. Navarro, M. Soberon, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98, 9736）。遺伝子実験は、この構造素子が、リゾビウム属のリゾビウムメリロチRhizobium melilotiチアミン生合成遺伝子のチアミン依存性調節に必要とされるということを確証した（J. Miranda-Rios, M. Navarro, M. Soberon, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98, 9736）が、古典的遺伝子実験により調節因子は未だ同定されていなかった。したがってｔｈｉボックスは、チアミンまたはその誘導体に応答するリボスイッチの一部として役立ち得ると考えられる。
【０２６１】
大腸菌では、チアミン生合成および輸送遺伝子は、主に3つのオペロンおよび4つの単一遺伝子内に位置する（T.P. Begley, et al., Archives of Microbiology 1999, 171, 293）が、この場合、各オペロンにはｔｈｉ素子が先行する。これらの配列の調節特性を査定し始めるために，ｔｈｉＭＤおよびｔｈｉＣＥＦＳＧＨオペロンに関するリーダー領域を利用して、ｌａｃＺレポーター遺伝子との転写および翻訳融合物を構築した（実施例２参照）。外因性チアミンの付加は、大腸菌におけるｌａｃＺレポーターの抑制を生じる。これらのデータからの結果は、ｔｈｉＭ遺伝子が主に翻訳のレベルで調節され、一方、ｔｈｉＣリーダー領域はｌａｃＺレポーターに転写および翻訳調節の両方を付与する、ということを実証する。
【０２６２】
ａ．大腸菌ｍＲＮＡによるチアミンピロリン酸の直接結合
ＦＭＮアプタマーに関して上記したように，ｔｈｉＭおよびｔｈｉＣリーダーへのＴＰＰの直接結合を、直列プロービング検定により実証した（実施例２参照）。チアミン、チアミン一リン酸（ＴＰ）またはピロリン酸誘導体（ＴＰＰ）の付加は、ｔｈｉ素子を包含する領域において特に，ｔｈｉＭ  ＲＮＡの構造的再配列を引き起こす（図１３）。生物活性形態のチアミンであるＴＰＰが500 nMの見掛けのＫDでリガンド間の最良の親和性を示し、一方、ＴＰおよびチアミンがそれぞれ3 μMおよび40 μMの見掛けのＫDでｔｈｉＭと会合することは有意である。ｔｈｉＣリーダー領域に類似するＲＮＡの直列プロービング検定は、チアミンおよびそのリン酸化形態間のより劇的な弁別をさえ明示し、チアミンおよびＴＰＰの結合間の1,000倍より大きい差を示す。これらのデータは、ＴＰＰ合成が調節のために必要であるということを示唆した遺伝子実験と一致する（E. Webb, et al., Journal of Bacteriology 1996, 178, 2533; E. Webb, D. Downs, Journal of Biological Chemistry 1997, 272, 15702）。さらにまたこの計は、リン酸基との生産的接触を成す天然ＲＮＡアプタマーの別の例を提供する。
【０２６３】
ｂ．平衡透析によるＴＰＰ結合の確証
ｔｈｉＭリーダー領域に類似するＲＮＡを合成し、区画が3000ダルトン分子量カットオフ透析膜により分離される2小室平衡透析装置の片側に入れた。小室間が平衡されたら、ｔｈｉＭ含有小室内に3Ｈ−チアミンを選択的に保持した（実施例２参照）。この作用は、余分量の非標識チアミンを提供することにより排除され得たが、しかしチアミンの近似化学類似体であるオキシチアミンを補足した場合には逆転され得なかった。さらにｔｈｉＭの突然変異バージョンは、ＲＮＡ含有小室に3Ｈ−チアミンをシフトできなかった。総合して、これらのデータは安定ｔｈｉＭ：チアミン複合体の生成を示すが、この場合、ＲＮＡの配列およびリガンドの化学的形態は最大結合親和性のために重要である。
【０２６４】
ｉｉ．チアミン誘導体の結合は構造変調と相関する
ｔｈｉＭに関する直列プロービングデータの精査は、構造変調の2つの意外なパターンを明示する。第一に、チアミンまたはＴＰＰを含有する反応間の自発的断片化の相対比率は、ｔｈｉ素子の内部ループ内で異なる（図１３）。この領域におけるヌクレオチドは、ＴＰＰの存在下で、しかしチアミンを用いずに構造次元の増大を選び、このことは、この領域がともかくもピロリン酸認識ポケットの形成に関与することを意味する。第二に、ＳＤ配列の領域は、ＴＰＰの存在下で構造的に変調されるようになるｔｈｉ素子の外側の唯一の部分である。
【０２６５】
特にＳＤ配列は、ＴＰＰを欠く反応に比して、自発的切断における有意の低減を示し、これは、ＳＤが、ＴＰＰの結合時に、より構造的に束縛された形態に転換されることを示唆する。この考えは、ＴＰＰの非存在下でＳＤが有意程度の一本鎖特徴を有し、そして翻訳開始のために利用可能であるメカニズム（図１３）と一致する。アンチＳＤ配列は、これらの条件下でＴＰＰアプタマー内のアンチ−アンチＳＤ配列と相互作用するよう提唱される.これに反して、余分量のＴＰＰの条件中は、アンチＳＤ配列の塩基対合を分断するＴＰＰ−ＲＮＡ複合体が形成され、これは次にＳＤと自由に直接相互作用し、その領域の一本鎖特徴を低減し、それゆえ翻訳開始の有効性を低減する。ｔｈｉＭ  ｍＲＮＡの予備的部位特異的突然変異誘発は、この全体モデルを支持する（実施例２参照）。特にＴＰＰ結合を分断する突然変異はｔｈｉＭ−ｌａｃＺ融合のための翻訳の調節も破壊するが、一方、アンチＳＤ配列を変更する突然変異は、調節に影響を及ぼすが、しかしＴＰＰ結合には影響しない。したがってチアミンの結合は、ＳＤの構造的利用可能性およびin vivoでの翻訳有効性の両方と相関する。
【０２６６】
ｉｉｉ．その他のリボスイッチによる翻訳開始の制御
バイオインフォーマティックス分析は、リボスイッチＲＮＡの間で頻発するｔｈｉＭのものと類似の分子メカニズムと一致する。特にアンチＳＤおよびアンチ−アンチＳＤ構造は、いくつかのリボスイッチクラス、例えばＦＭＮ（A.G. Vitreschak, et al., Nucleic Acids Research 2002, 30, 3141）、リシン、ＴＰＰ（D.A. Rodionov, et al., Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 48949）、補酵素Ｂ12（実施例１参照）およびＳＡＭに関して提唱されている.概してグラム陰性生物からのリボスイッチは、翻訳全体に制御を発揮する発現プラットフォームのほうを選ぶようであり、一方、グラム陽性細菌からのリボスイッチは、転写終結を制御する発現プラットフォームを優先的に用いると思われる。後者は、グラム陽性生物における多重遺伝子転写単位により大きく依存することを示し、これは、遺伝子産物が不必要である場合、長いオペロンの転写を妨げるためにより効率的であり得る。
【０２６７】
翻訳開始全体にわたるリボスイッチ媒介性制御の生化学的証拠は、ＦＭＮおよびＡｄｏＣｂｌリボスイッチに関しても得られる（実施例１参照）。枯草菌ｙｐａＡ遺伝子を調節するリボスイッチと結合するＦＭＮは、ｔｈｉＭに関して観察されたものと同様の、ＳＤ構造情況の変更を生じる。興味深いことに、この遺伝子制御素子は、ｙｐａ転写を調節することも提唱されている（J.M. Lee, et al., Journal of Bacteriology 2001, 183, 7371）が、しかしリーダー領域は明白な内在性ターミネーター構造を含有しない。ＡｄｏＣｂｌと大腸菌ｂｔｕＢリボスイッチとの結合も、in vivoでの翻訳の調節と相関すると実証されている。
【０２６８】
ある種のリボスイッチＲＮＡは、同一のＲＮＡ配列を用いて、転写および翻訳の全体の制御を発揮する。このクラスのリボスイッチに関しては、ＳＤ配列は、内在性ターミネーター内に含入される。したがってターミネーター構造の形成は、ＳＤ−封鎖構造の形成を規定する。全体として、これらの観察は全て、ｔｈｉＭおよびｒｉｂＤリボスイッチはそれぞれ翻訳および転写のリボスイッチ媒介性制御のための有用なパラダイムを示すが、しかし遺伝子発現の制御のためのリボスイッチＲＮＡにより利用される広範な種々の分子メカニズムが存在すると思われる、ということを示唆する。実際、制御の異なるメカニズムを用いることでなければならないＴＰＰリボスイッチが、いくつかの植物および真菌種で同定されている（実施例４参照）。いくつかの場合のスプライス部位近くの、そして他の場合の３’−ＵＴＲにおけるこれらのＲＮＡの設置は、それぞれスプライシング、ならびにｍＲＮＡ安定性または発現の全体に亘るＴＰＰ応答性制御を示す。
【０２６９】
５．初期起源？
ＦＭＮ、ＴＰＰ、リシンおよびＡｄｏＣｂｌリボスイッチＲＮＡは、進化的に隔たった微生物の間に広く行き渡っており、このことは、これらのＲＮＡ遺伝子素子に関する古い起源を意味する（A.G. Vitreschak, et al., Nucleic Acids Research 2002, 30, 3141; D.A. Rodionov, et al., Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 48949; D.A. Rodionov, et al., Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 48949）。ＳＡＭ、グアニンおよびアデニンリボスイッチは、多数の異なる属においても表示されるが、しかしそれらは、2〜3のグラム陰性細菌を除いて、主にグラム陽性細菌に限定されると思われる（実施例６参照）。全ての場合に、リボスイッチクラスの構造および配列保存は、アプタマードメインに限定される（図１１）。これは、進化により有意に修飾されなかったアプタマーＲＮＡが標的化学物質を結合するその能力を保存しなければならないと仮定すると、予測されない。これに反して、発現プラットフォーム間には、同一クラスのリボスイッチ間でも、そして同一生物内でも、少なからぬ配列および構造多様性が存在する。合わせて考えると、これらのデータは、リボスイッチアプタマードメインのリガンド結合特性が広範囲の進化という時間の物差しを通して保持されてきた、ということを暗示する。
【０２７０】
さらにリボスイッチＲＮＡに関するリガンドは、仮説的ＲＮＡベースの世界からの機能的遺物であると提唱されてきたが、この場合、ＲＮＡポリメラーゼは、最初期自己複製生物のうちのいくつかに関する必要な触媒およびゲノム内容を提供した（H.B. White, 3rd, Journal of Molecular Evolution 1976, 7, 101; G.F. Joyce, Nature 2002, 418, 214）。したがって補因子結合ＲＮＡとして、リボスイッチからのアプタマードメインは、リボスイッチのアロステリック変調のために、あるいは触媒補因子としてリガンドを利用したリボザイムの一部として、遺伝子制御の最初期形態のうちのいくつかに関するＲＮＡベースワールドの情況において有用であった、と推測することは魅力的である。
【０２７１】
６．薬剤標的および遺伝子ツールとしてのリボスイッチ
リボスイッチは、原核生物酵素補因子の生合成および輸送に関与する多数の遺伝子の制御に利用される。枯草菌総ゲノム含量のほぼ２％を表す少なくとも６９の遺伝子はリボスイッチＲＮＡの制御下にあり（表１）、これは原核生物における遺伝子制御のためのリボスイッチＲＮＡの広範囲の使用を例示する（M. Mandal, et al., Cell 2003, 113）。多数のリボスイッチ媒介性遺伝子は、ほとんどの増殖条件下で不可欠である、と予測される。リボスイッチ機能による妨害は、次に、生命代謝経路の劇的不安定化をそしておそらくは増殖の停止を生じる、と予測される。したがって標的代謝産物に非常によく似た化合物はリボスイッチＲＮＡと結合し、遺伝子発現の低減を引き起こす、と思われる。遺伝子発現のこの類似体誘導性崩壊が十分である場合には、このような化合物は抗菌的用途の候補であり得る。
【０２７２】
【表１】
2010213712.tif 000010
【０２７３】
【表２】
2010213712.tif 000011
【０２７４】
表１．枯草菌における既知のリボスイッチクラスの分布。遺伝子名は、細菌の呼称であるｍｅｔＩおよびｍｅｔＣを除いて、SubtiListデータベースに由来する（S. Auger, et al., Microbiology 2002, 148, 507）。ｙｐａＡ（R.A. Kreneva, et al., Genetika 2000, 36, 1166）、ｙｕａＪ（D.A. Rodionov, et al., Journal of Biological Chemisty 2002, 277, 48949）、ｙｋｒＴＳ（B.A. Murphy, et al., Journal of Bacteriology 2002, 184, 2314）およびｙｋｒＷＸＹＺ（B.A. Murphy, et al., Journal of Bacteriology 2002, 184, 2314）に関する基本的役割は、近年提示された。
【０２７５】
小分子薬剤によるＲＮＡのターゲッティングには明らかな優位が認められ（G.J. Zaman, et al., Nucleic Acids Research 2002, 30, 62）、最も明白な例は、リボソームＲＮＡの例である。いくつかのその他の細菌特異性ＲＮＡが小分子薬剤相互作用のための候補として単球されてきた；しかしながらそのアプローチは、たとえＲＮＡそれ自体が小有機分子のための結合ポケットを天然に形成しなくても、当該ＲＮＡと偶発的に相互作用する化学物質に関して大型化学物質ライブラリをスクリーニングすることに頼っている。したがってリボスイッチＲＮＡは、それらが、それらのタンパク質受容体等価物と非常によく似た小分子リガンドのための受容体として役立つとすると、抗菌剤開発において利点を示す。
【０２７６】
化学物質抑制のための標的としてのそれらの使用のほかに、天然リボスイッチＲＮＡにより利用されるメカニズムの理解は、新規の遺伝子抑制素子としてのリボスイッチの適合ならびに新規リボスイッチの開発を可能にする。広範な種々の小有機分子と相互作用する多数のアプタマーＲＮＡ配列が同定されてきた（M. Famulok, Current Opinion in Structural Biology 1999, 9, 324）。非生物学的なあるいはそうでなければ代謝的に不活性な化合物に応答する工学処理リボスイッチが生成され得る。このような遺伝子制御素子は、種々の発現制御および分子検出用途に用いられ得る。
【０２７７】
Ｄ．実施例４：真核生物リボスイッチ
１．要約
代謝産物結合ｍＲＮＡによる遺伝子制御は、原核生物においては広範囲に及んでいる。これらの「リボスイッチ」は、典型的にはｍＲＮＡの非コード領域に位置し、そこでそれらはそれらの標的化合物を選択的に結合し、そしてその後、遺伝子発現を変調する。原核生物のチアミンピロリン酸結合ドメインのコンセンサス配列および構造と調和する真菌および植物において同定されたｍＲＮＡ素子が開示される。シロイヌナズナでは、チアミン生合成遺伝子の３’−ＵＴＲ中のコンセンサスモチーフ残基および単離ＲＮＡドメインは、in vitroで対応する補酵素と結合する。これらの結果は、代謝産物結合ｍＲＮＡはおそらくは真核生物遺伝子調節に関与し、そしていくつかのリボスイッチは古い形態の遺伝子制御を代表するものであり得る、ということを示唆する。
【０２７８】
２．序論
リボスイッチは、原核生物のある種のメッセンジャーＲＮＡの５’−非翻訳領域に見出され得る遺伝子制御素子である（実施例１〜３参照）。これらの遺伝子スイッチは、2つの意外な特性を示す。第一に、ｍＲＮＡはタンパク質の助けを借りずに、標的代謝産物に関する高選択性結合部位を形成し得る。第二に、代謝産物結合は、遺伝子発現の変更をもたらすＲＮＡ構造のアロステリック再組織化を引き起こす。多数の他の遺伝子制御系と違って、リボスイッチは、代謝産物結合タンパク質を必要とせずにセンサーとして役立ち、したがってｍＲＮＡによりコードされる遺伝子情報とその化学的環境との間の直接的連結を提供する。
【０２７９】
生化学的および遺伝子分析により、多数の異なる型のリボスイッチが確証されている。例えば補酵素Ｂ12結合ＲＮＡは、コバラミン輸送タンパク質をコードする大腸菌ｂｔｕＢ遺伝子の発現を制御することが示された（実施例１）。チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）が引き金となるリボスイッチは、この補酵素の生合成に関与する大腸菌（実施例３）および枯草菌（実施例６）におけるオペロンを制御することが示された。さらにリボフラビンおよびＦＭＮの生合成または移入に関与する遺伝子の５’−非翻訳領域にしばしば見出されるＲＦＮ素子は、枯草菌におけるＦＭＮ依存性リボスイッチの受容体部分として役立つ（実施例３および６参照）。近年、枯草菌における多数の遺伝子の５’−ＵＴＲ中に位置するある種のＳ−ボックスモチーフが、高親和度および精度で補酵素Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を結合する、ということが確定された。これらの知見は、代謝産物の多様なコレクションを認識するためにリボスイッチが用いられ、そしてｍＲＮＡによる小分子の直接感知がある種の生物に関する遺伝子制御の重要な形態である、ということを示す。本明細書中に開示されているのは、代謝産物結合ドメインが真核生物のある種のｍＲＮＡ中に埋め込まれる、という証拠であり、このことは、高等生物も遺伝子制御のためにリボスイッチを利用する、というを示す。
【０２８０】
３．結果
Ｂ12−およびＳＡＭ依存性リボスイッチとの配列類似性を示す原核生物において同定された多数のＲＮＡ素子が開示される。これらのＲＮＡモチーフが相対的にサイズが大きくそして配列が複雑であると仮定すると、同一素子の多数の進化的再発明が起きたとは考えられない。さらにこれらの遺伝子スイッチの代謝産物トリガーは、タンパク質の出現前の時点に存在したと予測される（White, 1976; Benner et al., 1989; Jeffares et al., 1998）。これは、タンパク質の出現前の、そして代謝がＲＮＡにより完全に誘導された時代であると考えられる古代ＲＮＡワールドにおいて生じた既知のクラスの代謝産物感知ＲＮＡと一致する（Joyce, 2002）。
【０２８１】
今日のリボスイッチが古い起源を有する場合には、真核生物は、現代細胞の最後の共通の先祖から派生したＲＮＡ遺伝子スイッチを保有し得る。本明細書中に開示されたいくつかの真核生物は、ＴＰＰリボスイッチクラスの代謝産物結合ドメインのコンセンサス配列および構造に従うＲＮＡドメインを保有する（図１４Ａ）（ＴＰＰ結合ドメインを保有するｍＲＮＡは大腸菌のｔｈｉＣタンパク質と相同であるタンパク質をコードする。このタンパク質酵素は、ヒドロキシメチルピリミジンホスフェート（ＨＭＰ−Ｐ）への５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）の転換を触媒し、これはチアミンの、そして最終的にはＴＰＰの合成における重要な生合成過程である（Vander Horn et al., 1993; Begley et al., 1999））。例えばシロイヌナズナの推定チアミン生合成遺伝子は、コンセンサスＴＰＰ結合ドメインに従うその３’−ＵＴＲ中にＲＮＡ素子（図１４）を保有する。同様のＲＮＡ素子は、イネ（Oriza sativa）およびブルーグラス（Poa secunda）に見出される。ＴＰＰ結合配列および構造に従うＲＮＡ素子は、真菌、例えばアカパンカビNeurospora crassa（図１４Ｃ）およびフザリウムオキシプロラムFusarium oxysporumにも存在する。植物を用いた場合と同様に、真菌におけるリボスイッチ相同体は、チアミンの生合成に関連づけられてきた遺伝子中に位置し、このことは、各々の場合、それらの役割は適切な生合成遺伝子の発現を変調することにより必要な補酵素レベルを保持することである、ということを示唆する。グラム陰性細菌である大腸菌（ｔｈｉＣおよびｔｈｉＭ）およびグラム陽性細菌であるクロストリジウムアセトブチリクム（ｔｈｉＣ）のものと比較して、真核生物に見出される相同ドメインの配列アラインメントを、図１５に示す。
【０２８２】
合成ＤＮＡ鋳型のin vitro転写によりシロイヌナズナのコンセンサスＴＰＰ結合ドメイン（図１４Ａ）に対応するＲＮＡ素子を生成し、ＲＮＡを「直列プロービング」に付した（図１６Ａ）。この方法はＲＮＡホスホジエステルリンケージの自発的破壊に頼っており、その切断パターンを用いて、リガンド結合ＲＮＡの構造的および機能的特徴を明示し得る（実施例１〜３参照）。実際、リボスイッチ様素子はＴＰＰ依存性構造変調を示し、そして細菌からのＴＰＰリボスイッチの予測二次構造と一致する断片化パターンを有する（実施例２および３参照）。さらにこの構造プロービング方法は、本明細書中では、大腸菌リボスイッチ変異体に関して前に確定されたものと同様である〜50 nMの見かけの解離定数（ＫD）でＲＮＡがＴＰＰと結合する（図１６Ｂ）、ということを確立するために用いられた。同様に、ＴＰＰリボスイッチコンセンサスに対応する真菌の配列素子は、高親和度でＴＰＰと結合する、ということが実証された。
【０２８３】
リボソーム結合部位の封鎖および転写終結は、大腸菌におけるＴＰＰリボスイッチに関して実証されたメカニズムである（図１７）。植物におけるＴＰＰ結合素子はポリＡ尾から直ぐ上流に位置するため、代謝産物結合はＲＮＡプロセシングおよび安定性を調節し得ると考えられる。あるいはアカパンカビの真菌ゲノム中に同定されたコンセンサスＴＰＰ結合配列（図１４Ｃ）はイントロン中に存在し、これは、代謝産物結合プレｍＲＮＡによりＲＮＡスプライシングが誘導され得る、ということを示唆する。原核生物では、リガンド結合は、典型的には遺伝子制御素子、例えば転写ターミネーターおよびリボソーム結合部位近くのワトソン−クリック塩基対合配列中のアロステリック変化をもたらす。同様に、代謝産物結合リボスイッチによる二次構造再配列を用いて、真核生物におけるより多くの種類のＲＮＡプロセシング、輸送および発現経路を変調し得る。
【０２８４】
ＴＰＰ結合ドメイン、ならびに補酵素Ｂ12、ＦＭＮおよびＳＡＭに関するものは古い起源を有すると思われるが、しかし代謝産物結合ｍＲＮＡの他の例は進化におけるより近年に出現したと考えられる。これらのより新しいリボスイッチは、系統発生学的状況全体でより狭く分布され、したがって古くなくそして普遍的に分布される化合物により誘導される新規のリボスイッチに関して検索する努力は、困難である。現代生物におけるリボスイッチ使用の範囲に関係なく、天然および工学処理リボスイッチはともに、有意の実用性を有する。既知のリボスイッチが重要な補酵素の濃度を変調する場合に役立つ中心的役割を考えると、これらのＲＮＡは薬剤発見作業のための新規の標的として役立ち得る。したがって天然リボスイッチの逆工学処理を用いて、真核生物遺伝子の目的を持った制御のためにデザイナーリボスイッチを作製するための概念的基礎を確立し得る。
【０２８５】
Ｅ．実施例５：リジンリボスイッチ
細胞の化学的および物理的環境における変化に応答する遺伝子発現の精確な制御は、生化学的センサー素子と遺伝子情報を保有するかまたは解釈する分子との間の選択的相互作用を要する。このような環境変化に応答するほとんどの既知の遺伝子因子は、タンパク質である（Ptashne and Gann 2002）。しかしながら多数の試験（例えば実施例１〜３および６〜８参照）は、天然ＲＮＡ分子も小有機化合物を認識し、隣接遺伝子の発現を制御するためにアロステリック変化を利用する、ということを実証した。リボスイッチと呼ばれるこれらの代謝産物結合ＲＮＡドメインは、典型的にはｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ内に埋め込まれ、そして標的化合物の生合成または移入に関与するタンパク質の発現を制御する。リボスイッチは、イオウ代謝に関与する細菌における基本的代謝経路を制御するに際して、そして種々の補酵素およびプリンの生合成に際しても重要な役割を演じ得る（実施例６参照）。さらにリボスイッチは、系統発生学的に真正細菌生物の間に広く行き渡り、そして生化学的データは、リボスイッチが真核生物の遺伝市中にも存在する、ということを示唆する（実施例４参照）。
【０２８６】
これらの観察は、リボスイッチが生体系における遺伝子制御の広範に用いられるメカニズムを含むと思われる、ということを示す。枯草菌のｌｙｓＣ遺伝子の転写は、高濃度のリシンにより示される（Kochhar, S., and Paulus, H. 1996, Microbiol. 142: 1635-1639; Mader, U., et al., 2002, J. Bacteriol. 184: 4288-4295; Patte, J.C. 1996. Biosynthesis of lysine and threonine. In: Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, F.C. Neidhardt, et al., eds., Vol.1, pp. 528-541. ASM Press, Washington, DC; Patte, J.-C., et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 169: 165-170）が、しかし遺伝子調節物質として役立つタンパク質因子は同定されたことがない（Liao, H.-H., and Hseu, T.-H. 1998, FEMS Microbiol. Lett. 168: 31-36）。ｌｙｓＣ遺伝子は、Ｌ−アスパラギン酸をＬ−リシンに転化する代謝経路の第一段階を食倍するアスパルトキナーゼＩＩをコードする（Belitsky, B.R. 2002. Biosynthesis of amino acids of the glutamate and aspartate families, alanine, and polyamines. In: Bacillus subtilis and its Closest Relatives: from Genes to Cells. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch, and R. Losick, eds., ASM Press, Washington, D.C.）。興味深いことに、アスパルトキナーゼＩＩ酵素の構成性発現を示す突然変異体ならびにｌｙｓＣ  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲに対する全ての突然変異地図の作成に際して、いくつかの努力が首尾よく行った（Boy, E., et al., 1979. Biochimie 61: 1151-1160; Lu, Y., et al., 1991, J. Gen. Microbiol. 137: 1135-1141; Lu, Y., et al., 1992, FEMS Microbiol. Lett. 92: 23-27）。さらに枯草菌および大腸菌ｌｙｓＣ５’−ＵＴＲ間で、有意レベルの配列類似性が同定された（Patte, J.-C., et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 169: 165-170）。これらの特質は、この遺伝子に関する遺伝子制御素子として役立つリシン応答性リボスイッチと一致する。
【０２８７】
１．材料および方法
ｉ．化学物質およびオリゴヌクレオチド
Ｌ−リジン、全ての類似体（但しＬ−α−ホモリシン（化合物６、図２０Ａ）、トリチウム化リジン（Ｌ−リジン−［４，５−3Ｈ（Ｎ）］）を除く）および4つのジペプチドを、Sigmaから購入した。前に報告されたもの（Dong, Z. 1992, Tetrahedron Lett. 33: 7725-7726）から改作したプロトコールを用いて、Ｌ−α−ホモリシンを合成した。ＴＬＣおよびＮＭＲにより、合成Ｌ−α−ホモリシンの純度および完全性を確証した。
【０２８８】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、エール大学のHHMI Keck Foundation Biotechnology Resource Centerが合成し、変性ＰＡＧＥにより精製し、そして10 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5, 23℃）、200 mMＮａＣｌおよび1 mMＥＤＴＡ中での粉砕／浸漬により、ゲルから溶離した。エタノールを用いた沈降により溶液からオリゴヌクレオチドを回収した。
【０２８９】
ｉｉ．系統発生学的分析
枯草菌ｌｙｓＣ５’−ＵＴＲとの配列類似性により、Ｌボックスドメインを同定した。最終的には、パターン（WAGAGGNGC[10]A[3]RKTA[50]RRGR[10]CCGARR[40]GG[13]VAA[13]YTGTCA[36]TGRWG[2]CTWY）との縮重マッチに関して検索するためにプログラムを用いたが、しかしながらこのパターンの低完全バージョンを反復細分とともに用いて、Ｌボックスモチーフのコンセンサス配列および構造を同定した。括弧内の数字は可変ギャップであり、強制最大長を示す。ヌクレオチド表記法を以下に示す：Ｙ＝ピリミジン；Ｒ＝プリン；Ｗ＝ＡまたはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣ。図１８に示した系統発生を生じる場合、このパターンの6までの違反は許される。
【０２９０】
ｉｉｉ．ＲＮＡ構築物の直列プロービング
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよび適切なＰＣＲ  ＤＮＡ鋳型を用いて、in vitro転写により、枯草菌３１５  ｌｙｓＣ、２３７  ｌｙｓＣおよび１７９  ｌｙｓＣ  ＲＮＡを調製した。前記（Seetharaman et al., 2001, Nature Biotechnol. 19, 336-341）と同様のプロトコールを用いて、ＲＮＡ転写体を脱リン酸化し、その後、５’32Ｐ標識した。標識前駆体ＲＮＡ（〜2 nM）を、実施例１および２に記載したのと同様の条件を用いて直列プロービングに付した。反応物（10 μL）を、Ｌ−リジンまたは各実験に関して示したような種々の類似体の存在下または非存在下で、50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.5, 25℃）、20 mMＭｇＣｌ2および100 mMＫＣｌを含有する緩衝液中で25℃で40時間インキュベートした。変性10％ＰＡＧＥを用いて、自発的切断産物を分離し、これを、Molecular Dynamicsリン光画像解析装置およびImageQuantソフトウェアを用いることにより、検出し、定量した。
【０２９１】
ｉｖ．平衡透析およびスキャッチャード分析
Dispo平衡透析機（ＥＤ−１、 Harvard Bioscience）を用いて、平衡透析検定を実行した。この場合、5,000ＭＷＣＯ膜により、2つの小室ａおよびｂを分離した。緩衝液の最終組成は、50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.5, 25℃）、20 mMＭｇＣｌ2および100 mMＫＣｌを含有した（各小室に30 μL送達）。3Ｈ−リシン（平衡前50 nM初期濃度；40 Ci/mmol; 15,000 cpm）を小室ａに付加することにより、検定を開始した。存在する場合、ＲＮＡ（１７９  ｌｙｓＣ）を小室ｂに導入して、濃度を10 μMとした。25℃で10時間平衡後、各小室からの3 μl  アリコートを、液体シンチレーション計数器による定量のために取り出した。さらに3 μLの緩衝液をａに送達し、そして指示通りに50 μM非標識Ｌ−リジン、Ｄ−リジン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−リジンヒドロキサメートを含有する等容量の緩衝液をｂに送達することにより、競合検定を確立した。25℃でさらに10時間インキュベーション後、トリチウム分布の定量のために、3 μlのアリコートを再び取り出した。
【０２９２】
以下を除いて上記のように、スキャッチャードデータ点を生成した。ＲＮＡを小室ｂに付加して、1 μＭRNAの濃度を生じて、透析混合物の平衡を20時間進行した。さらに3Ｈ−リシン濃度を50 nMから2.5 μMに変更した。平衡透析データからのスキャッチャードプロット上のｔｅｎの算定を、本明細書中の他の箇所に記載したように実行した。
【０２９３】
ｖ．in vitro転写終結検定
前に記載したもの（Landick, R., et al., 1996, Methods Enzymol. 274: 334-353）から適合された1回転写の方法を用いて、転写終結検定を実行した。発生期ＲＮＡの最初のＣ残基が位置１７まで遭遇されないよう、ｌｙｓＣ５’−ＵＴＲ転写のための鋳型を変更した。ＡｐＡジヌクレオチド（1.35 μM）、ＧＴＰおよびＵＴＰ（各々2.5 μM）＋非標識ＡＴＰ（1 μM）および［α−32Ｐ］−ＡＴＰ（4 μCi）の混合物の付加により重合を開始し、これを10分間インキュベートした。各々150 μMの4つのＮＴＰの付加により休止複合体を再開させ、そしてヘパリン（0.1 mg/mL）を同時に付加して、新規鋳型上でポリメラーゼが転写を開始するのを防止する。転写混合物は、20 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.0, 23℃）、20 mM ＮａＣｌ、14 mMＭｇＣｌ2、0.1 mMＥＤＴＡ、0.01 mg/mLＢＳＡ、1％ v/vグリセロール、4 pmolＤＮＡ鋳型、0.045 U/μL 大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ（Epicenter, Madison, WI）および10 mMのＬ−リジンまたは各実験に関して指示されたようなリジン類似体も含有した。反応物を37℃でさらに20分間インキュベートし、生成物を、変性6％ＰＡＧＥとその後のリン光画像解析装置を用いた分析により検査した。
【０２９４】
ｖｉ．ｌｙｓＣ遺伝子変異体のin vivo分析
本明細書中の他の箇所に記載したものと同様の方法を用いてin vivoでリジンリボスイッチの機能を査定するために、ｌｙｓＣ５’−ＵＴＲとｌａｃＺレポーター遺伝子の融合体を用いた。要するにプロモーターおよび転写鋳型の最初の315個のヌクレオチドを含むｌｙｓＣ５’−ＵＴＲを、ＰＣＲによりＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片として調製した。所望の突然変異を保有するプライマーを用いて、野生型構築物のＰＣＲ増幅により、配列変異体Ｍ１〜Ｍ３、Ｇ３９ＡおよびＧ４０Ａを生成した。ＰＣＲ産物を、ｌａｃＺレポーター遺伝子の直ぐ上流のｐＤＧ１６６１中でクローン化し、その結果生じたクローンの完全性をシーケンシングにより確証した。枯草菌１Ａ４０菌株（Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OHから入手）中でのｐＤＧ１６６１変異体の形質転換を実施し、クロラムフェニコール耐性に関して選択し、スペクチノマイシン感受性に関してスクリーニングすることにより、正確な形質転換体を同定した。
【０２９５】
濃化培地（２ＸＹＴブロスまたはトリプトース血液寒天ベース）または限定培地（0.5％ w/vグルコース、2 g/L（ＮＨ4）2ＳＯ4、18.3 g/LＫ2ＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏ、6 g/LＫＨ2ＰＯ4、1 g/Lクエン酸ナトリウム、0.2 g/LＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、5 μMＭｎＣｌ2および5 μMＣａＣｌ2）中で、37℃で振盪しながら細胞を増殖させた。メチオニン、リジンおよびトリプトファンを、ルーチン増殖のために50 μg/Lに付加した。0.1のＡ595への限定培地中のルーチン増殖条件下でのインキュベーションによりリシン限定条件下での増殖を確立し、この時点で、遠心分離により細胞をペレット化し、最少培地中に再懸濁して、5つのアリコートに分割し、図２２Ｃに対する凡例に限定されたような5つの異なる培地型で補足した。培養をさらに3時間インキュベートした後、β−ガラクトシダーゼ検定を実施した。
【０２９６】
２．結果
ｉ．Ｌボックス：遺伝子制御に重要である保存ｍＲＮＡ素子
リボスイッチは典型的には、代謝産物結合「アプタマー」ドメインならびに遺伝子発現に必要なｍＲＮＡ素子をつなぎ合わせる「発現プラットフォーム」の密接な並置により形成される。発現プラットフォームとして役立つＲＮＡ配列および構造構成成分は、進化を通して有意に変化するが、しかしアプタマードメインはそのリガンド結合コアの配列組成を主要二次構造特徴とともに大いに保持する。これは、関連ＲＮＡドメインを同定するための、そして所定クラスのリボスイッチに関するコンセンサス配列および構造を確立するための系統発生学的分析の使用を可能にする。
【０２９７】
3つの細菌種のｌｙｓＣ５’−ＵＴＲ間に存在することが報告された配列相同性から始めて（Patte, J.-C., et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 169: 165-170）、関連配列および二次構造に関して検索するアルゴリズムを用いて、代表物の数が拡大した（例えば実施例４および６参照）。ｌｙｓＣ相同体ならびに多数のグラム陽性およびグラム陰性生物からのリシン生合成に関連するその他の遺伝子の５’−ＵＴＲ中の「Ｌボックス」と呼ばれるこのＲＮＡドメインの31の代表物を同定した（図１８）。配列アラインメントは、ＲＮＡが、主要塩基対合ドメインが56の高度保存ヌクレオチドを差し込まれる５−ステム接合部を形成する、ということを明示する（図１９Ａ）。さらに塩基対合素子Ｐ２、Ｐ２ａ、Ｐ２ｂ、Ｐ３およびＰ４は各々、特定長の制限に従うと思われ、このことは、それらが高度構造化ＲＮＡの形成における不可欠な関係物である、ということを示唆する。ステムＰ２およびＰ２ａ間の接合部における保存配列は、他の高度構造化ＲＮＡ中にしばしば生じるＲＮＡ素子である「ループＥ」モチーフに従う、ということも注目された（例えばL eonitis, N.B., and Westhof, E. 1998, J. Mol. Biol. 283: 571-583参照）。
【０２９８】
枯草菌ｌｙｓＣ  ｍＲＮＡのＬボックスドメインは、推定転写ターミネーターステムから直ぐ上流に存在する（Kochhar, S., and Paulus, H. 1996, Microbiol. 142: 1635-1639; Patte, J.-C., et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 169: 165-170）。類似の配列を有するいくつかのその他のリボスイッチ（例えば実施例３および６）では、５’−ＵＴＲは隣接発現プラットフォームからの最小アプタマードメインを分離するよう整えられ得る。ｌｙｓＣ５’−ＵＴＲのヌクレオチド１〜２３７を包含するＲＮＡ断片（２３７ｌｙｓＣ、図１９Ｂ）を生成し、アロステリック機能に関して検査した。推定転写ターミネーターステムを除くこの構築物を、直列プロービングによる構造分析に付して（Soukup, G.A. and Breaker, R.R., 1999, RNA 5: 1308-1325）、リシンの存在がＲＮＡ構造を変えるか否かを確定した。２３７ｌｙｓＣは、系統発生学的配列で得たから構築されるＬボックスモチーフの二次構造モデルと一致する自発的ＲＮＡ切断の一パターンを示す（図１９Ｃ）、ということが観察された。さらに、10 μMＬ−リシンの付加はＲＮＡ鎖に沿った4つの位置で切断パターンの有意の変化を引き起こし、これは５’−ＵＴＲ断片のアロステリック変調が起きていることを示す、ということが判明した。さらに、Ｌ−ボックスモチーフの最も高度に保存された部分のみを包含する１７９ｌｙｓＣ  ＲＮＡ構築物（ｌｙｓＣ５’−ＵＴＲのヌクレオチド２７〜２０５）を用いた場合、同一パターンの自発的切断およびアミノ酸依存性構造変調を観察した。
【０２９９】
自発的切断の低減は、代謝産物誘導性構造変調の4つの部位の各々において観察される。ほとんどの場合、自発的切断の低減は、ＲＮＡおよびそのリガンド間に形成される複合体中でより規制されるようになるヌクレオチドのためである（Soukup, G.A. and Breaker, R.R., 1999, RNA 5: 1308-1325）。興味深いことに、ヌクレオチドのこれら4つの群は、Ｌボックス二次構造モデルの５−ステム接合部の中心に位置し（図１９Ｂ）、これは、これらのヌクレオチドがアミノ酸標的の認識に直接関与する、ということを意味する。他のリボスイッチのアプタマードメインに関して、同様のパターンのリガンド誘導性構造変調が観察された（実施例２、３および６参照）。
【０３００】
ｉｉ．リジンアプタマーはＬ−リシンに関する高特異性を示し、密接に関連する類似体を弁別する
リボスイッチは、タンパク質から作製されるそれらの等価物遺伝因子と同様に、精確遺伝子制御を達成するために、それらの標的代謝産物に対する十分な特異性および親和性を示さねばならない。ｌｙｓＣ  Ｌボックスドメインの分子認識特質を調べるために、100 μMでリシンの種々の類似体を用いて、一連の直列プロービング検定を実施した。リジン類似体コレクションの特性を検査したが、この場合、各化合物はＬ−リジンと比較して、最小化学的変化を保有する（図２０Ａ）。アミノ酸に対するほぼ全ての化学的変化は、化合物が１７９ｌｙｓＣ  ＲＮＡの構造変調を引き起こすことができないようにさせる（図２０Ｂ）。おそらく最も顕著なのは、単一炭素中心での立体化学的立体配置によりＬ−リジンとは異なるＤ−リシンの存在下では、ＲＮＡは構造変調を受けない、ということである。
【０３０１】
Ｄ−リジンのならびにその他の類似体の存在下での有意の構造変調の非存在は、少なくとも3つの接触点がＲＮＡとそのアミノ酸標的との間に作られている、ということを示す。特に、類似体１、３および４は構造変調を誘導できないという観察は、それぞれ鎖原子のアミノおよびカルボキシ基に対して、ならびに側鎖のアミノ基に対してなされている接触と一致する。さらに化合物２、５、６、７および８がＲＮＡにおける立体配座変化を誘導できないことは、アルキル側鎖の長さおよび完全性を測定し得る高度弁別結合ポケットをアプタマーが形成する、ということを示す。この高レベルの分子弁別は、リシンに関する遺伝子スイッチがほとんど、Ｌ−リジンと専ら応答しなければならず、そして密接に関連する天然化合物とは応答してはならないので、特別な生物学的意義を有する。
【０３０２】
同様に種々のジペプチドおよび酸加水分解ジペプチドに対する１７９ｌｙｓＣ  ＲＮＡのアロステリック応答を調べた。ジペプチドはＲＮＡ構造のアロステリック変調を誘発すべきでないが、しかし少なくとも１つのｌｙｓｙｌ残基を保有するジペプチド（図２０Ｃ）の酸媒介性加水分解は活性になるに違いない、と仮定された。予測どおり、１７９ｌｙｓＣは、ジペプチドｌｙｓ−ｌｙｓ、ｌｙｓ−ａｌａ、ａｌａ−ｌｙｓまたはａｌａ−ａｌａの付加時にアロステリック変調を受けない（図２０Ｄ）。しかしながら少なくとも１つのｌｙｓｙｌ残基を保有する3つのジペプチドは、115℃で23時間の6 ＮHCLによるジペプチドの前処理と、その後の蒸発および中和の時点で、ＲＮＡの構造変調を誘導する。構造変調の程度は（図２０Ｅ）、加水分解リシン含有ジペプチドを含有する試料がｌｙｓＣアプタマーを完全に飽和し、これは飽和量（1 μMより大；下記参照）のＬ−リジンの酸媒介性放出に従う、ということを示す。
【０３０３】
Ｄ−リジンをＨＣｌで前処理すると、中間レベルの構造変調が起こる、ということも観察された。興味深いことに、Ｄ−およびＬ−リジン間のエピマー化の発表された比率（Engel, M.H., and Hare, P.E. 1982. Racemization rates of the basic amino acids. Year Book Carnegie Inst. Washington 81: 422-425）は、半最大構造変調を生じるために必要とされる約1 μMのＬ−リジンを説明するのに十分である（図２０Ｅ）。これらの結果は、ｌｙｓＣアプタマーに関する分子リガンドとして作用するリジンと、そしてＲＮＡ立体配座変化が市販のＬ−リシン調製物の未知の夾雑物によるものでないことと一致する。
【０３０４】
ｉｉｉ．枯草菌Ｌ−リジンアプタマーの結合親和性および化学量論
種々の濃度のＬ−リジンを用いて１７９ｌｙｓＣに関する直列プロービング検定を実行することにより、解離定数（ＫD）の概算を行なった（図２１Ａ）。構造変調の部位は、リガンドの漸増濃度に応答した漸進的低レベルの自発的切断を示す。ＲＮＡ切断程度対Ｌ−リジン濃度のプロット（図２１Ｂ）は、約1 μMアミノ酸が混合物中に存在する場合に、半最大構造変調が起こる、ということを示し、したがってその標的リガンドに関する１７９ｌｙｓＣの見掛けのＫDを反映する。
【０３０５】
転写終結に関与することが予測される構造素子を包含するより長い構築物に関する見掛けのＫD値は、Ｌ−リジンに対する有意に弱い親和性を示す.特にｌｙｓＣ５’−ＵＴＲのヌクレオチド１〜３１５を包含するＲＮＡ構築物は、直列プロービングにより、〜500 μMの見掛けのＫDを示すことが判明した。その他のリボスイッチに関するリガンド親和性において同様の差が観察されているが、この場合、完全リボスイッチの状況における同一アプタマー（アプタマー＋隣接発現プラットフォーム）と比較して、最小化アプタマーはそのコグネイトリガンドとより密接に結合する。これはほとんど、遺伝子制御素子としてのリボスイッチの機能に重要であり得るが、しかしアプタマードメインの前組織化を低減することによりリガンド結合を低減する競合する二次または三次構造の存在のためであると思われる。
【０３０６】
平衡透析も、その標的に対する１７９ｌｙｓＣアプタマーの親和性および特異性を調べるために用いた（図２１Ｃ）。ＲＮＡの不存在下では、トリチウム化Ｌ−リジンは、平衡透析装置の2つの小室（ａおよびｂ）間に等しく分布する、と予測される。しかしながら系の一小室への余分量のアプタマーの付加は、複合体形成の結果として、この小室に向けてトリチウムの分布をシフトするはずである。トリチウムのこの不斉分布は、ＲＮＡからトリチウム化リジンの大部分を追い出す大余分量の非標識競合体リガンドの付加により均一性に回復される、と予測される。予測どおり、平衡透析装置の小室ｂ中のトリチウム化Ｌ−リジンの分画は、10時間インキュベーション後にＲＮＡの非存在下で〜0.5である（図２１Ｃ）。この分画は、200倍余分量の１７９  ｌｙｓＣ（10 μM）が小室ｂに付加されると、インキュベーション後に〜0.8に変更され、一方、トリチウムのこの対照的分布は、余分量（50 μM）の非標識Ｌ−リジンの導入後にさらに10時間インキュベートすると回復される。さらにＤ−リジンおよびＬ−オルニチンはトリチウムの等分布を回復せず、これは、直列プロービングにより確定した場合に素あれらがＲＮＡ構造を変調できないことと一致する。
【０３０７】
種々の濃度のトリチウム化Ｌリジン下で実行した一連の平衡透析実験を用いて、スキャッチャードプロットも作製した（図２１Ｄ）。その結果生じた線の勾配は、１７９  ｌｙｓＣ  ＲＮＡが〜1 μMの見掛けのＫDでＬ−リジンと結合する、ということを示し、これは直列プロービングを用いて観察されたものと一致する。さらに線分のｘ遮断は、1のｒ値近くで起こり、これはＲＮＡがそのリガンドと1:1複合体を形成することを実証する。
【０３０８】
ｉｖ．リジンアプタマーおよび隣接配列は、アミノ酸依存性リボスイッチとして機能する
今日までに検査された多数のリボスイッチに関しては、リガンド結合に応答して遺伝子発現を制御するのに役立つアプタマードメインの直ぐ下流に存在する識別可能組の構造が認められる。典型的には、この「発現プラットフォーム」の構造は、アプタマードメインに結合する代謝産物により変調される。代替的構造はその後、転写または翻訳過程の変調をもたらす。例えば大腸菌のｔｈｉＭ  ｍＲＮＡ上のＴＰＰリボスイッチは、隣接コード領域のシネ−ダルガルノ配列と結合するリボソームを妨害すると思われる発現プラットフォームを保有する（実施例２参照）。同様に枯草菌からの種々のリボスイッチの発現プラットフォームは、転写終結を誘導するステム−ループ構造のリガンド誘導性形成を受ける（例えば実施例３、６および７）。
【０３０９】
ｌｙｓＣ  ｍＲＮＡは、余分量のＬ−リジンの存在下で増殖させた培養枯草菌細胞中で転写終結を受ける、ということが報告されている（Kochhar, S., and Paulus, H. 1996, Microbiol. 142: 1635-1636）。ｌｙｓＣアプタマーのＰ１ステムの形成に関与する配列ドメインは、〜30ヌクレオチド下流に存在する推定ターミネーターヘアピンの一部と相補的である、ということが本明細書中で観察された（図２２Ａ）。この構成はいくつかのその他のリボスイッチと類似し、そのうちのいくつかは、上記のように対応するリガンドの付加時にin vitroでの転写の終結を示す。したがってｌｙｓＣリーダー配列は、ターミネーターステムの形成を変調することにより転写終結を誘導するＬ−リジン特異的リボスイッチとして役立つと思われる。
【０３１０】
Ｌ−リジンおよびいくつかの類似体の不存在下および存在下で、in vitro転写検定を実行した（図２２Ｂ、左）。付加リガンドの不存在下では、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを用いたin vitroでの1回転写は、総転写収量の〜36％に対応する終結産物を産生する。これに反して、10 mMのＬ−リジンがin vitro転写中に存在する場合、終結産物の量は〜76％に増大する。Ｄ−リシンまたはＬ−オルニチンは終結を誘導せず、これは、これらの化合物がリシンアプタマードメインにより認識されず、したがって転写終結の引き金となるとは予測されない、という事実と一致する。
【０３１１】
枯草菌におけるｌｙｓＣ遺伝子に関する発現プラットフォームの立体配置は、転写終結メカニズムと密接に関連づけられるが、この場合、Ｌ−リジンの結合はＰ１ステムを安定化し、したがってターミネーターヘアピンの形成を可能にすると予測される（図２２Ａ）。重要な対合阻止内に突然変異を入れることにより、そしてリジン誘導性転写終結を査定することにより、この提唱されたメカニズムを検査した（図２２Ｂ、中央）。特に変異体Ｍ１は、ターミネーターステムの形成を破壊する2つの突然変異を保有する。この変異体は転写終結のリシン依存性変調を失い、そして野生型構築物に比してより大きい転写的読み過ごしを生じる。Ｍ２は、ターミネーターステムの崩壊を補償するが、しかしアンチターミネーターステムの崩壊を引き起こす4つの突然変異の全体を保有する。この構築物もリシン依存性変調を失い、一方、終結産物の量は予測どおりより大きくなる。最後に、アンチターミネーター塩基対合能力を回復するためにＭ２プラス２つの付加的突然変異と同一と経を保有する6−ヌクレオチド変異体Ｍ3は、転写終結のリジン媒介性変調に関してほぼ野生型性能を生じる。これらの知見は、リジン結合がアンチターミネーターステムの形成を妨害し、したがって内在性ターミネーター構造の形成により転写終結を増大するリボスイッチメカニズムと一致する。
【０３１２】
ｖ．リボスイッチが抗生物質標的として役立つという証拠
他のリシン類似体とは違って、Ｌ−リジンヒドロキシメートおよび抗菌化合物チオシン（Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン；図２２Ａ、差込図）は、転写終結の増大を生じる（図２２Ｂ、左）。これら２つの化合物は、試験した類似体のいずれかの最良の見掛けのＫD値を示し、Ｌ−リジンヒドロキシメートおよびチオシンに関する値はそれぞれ、〜100 μMおよび〜30 μMである（データは示されていない）。先行試験において、枯草菌（Vold, B., et al., 1975, J. Bacteriol. 121: 970-974; Lu, Y., et al., 1992, FEMS Microbiol. Lett. 92: 23-27）および大腸菌（Patte, J.-C., et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 169: 165-170）において、チオシンに対する耐性を生じ、そしてｌｙｓＣ発現の低下を生じる一連の突然変異体が同定された。これらの突然変異は全て、リジンアプタマードメインにマッピングされ（選定枯草菌突然変異体に関しては図２２Ａ参照）、そして全て、構造の保存素子または塩基対合完全性の崩壊を引き起こすと思われる。
【０３１３】
平衡透析により、ならびに直列プロービングにより、2つのチオシン耐性突然変異体（Ｇ３９ＡおよびＧ４０Ａ）の機能的完全性を調べた。両突然変異体はリジン結合活性を示し得ない。さらに、そうでなければ保存されるＰ１〜Ｐ２接合部中に突然変異を保有するＲＮＡ構築物は、in vitroでのリシン依存性転写終結を受け得ない（図２２Ｂ、右）。これらの知見は、チオシンの抗菌作用が少なくとも部分的には類似体とリジンリボスイッチとの直接結合のためであり、細胞増殖に有害であるレベルにアスパルトキナーゼ発現を抑制させる、ということを示唆する。
【０３１４】
ｌａｃＺレポーター遺伝子との融合により、ｌｙｓＣの野生型５’−ＵＴＲの、そして２つのチオシン耐性突然変異体の機能もin vivoで調べた。野生型リボスイッチドメインはＬ−リジンの付加時にリガンド依存性変調を示し、一方、Ｇ３９ＡおよびＧ４０Ａ突然変異体はβ−ガラクトシダーゼ発現を調節できない（図２２Ｃ、培地ＩＩ対ＩＩＩ）。これに反して、リジンヒドロキシメートはin vivoでレポーター遺伝子の発現を抑制できず（培地ＩＶ）、これは、この化合物が転写終結を誘発するために十分に高い濃度を細胞の内側で獲得し得なかった、ということを示す。リジンの場合と同様に、チオシンも野生型構築物に関してβ−ガラクトシダーゼ発現を抑制するが、しかし2つの抑制突然変異体ではそうでない（培地Ｖ）。この後者の観察は、リジンリボスイッチのためのエフェクターとしてのその機能に大いによっているチオシンの抗菌作用と一致する。
【０３１５】
３．結論
枯草菌におけるリシン生合成の調節解除を生じる第一の突然変異体は、ほぼ30年前に同定された（Vold, B., et al., 1975, J. Bacteriol. 121: 970-974）が、しかしながら遺伝子調節のメカニズムは依然として解決されていない。枯草菌からのｌｙｓＣ  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲは、アミノ酸リジンに応答するリボスイッチとして役立つ、ということが実証されたことを、本明細書中に開示した。最初の試験で単離された抑制突然変異体は、リガンドがもはやＲＮＡに結合されないよう、リボスイッチのアプタマードメインの崩壊を生じる。さらに、突然変異体ｌｙｓＣ断片レポーター遺伝子融合体を用いたin vivo発現試験は、これらのリボスイッチ突然変異がほとんど、リジンおよびいくつかのその他のアミノ酸に対する生合成経路における第一段階を触媒するアスパルトキナーゼの非調節化過剰発現を引き起こすようである、ということを示す。2つのより顕著なメカニズム、即ち翻訳媒介性転写減衰およびＴボックス依存性メカニズム（Henkin, T.M., and Yanofsky, C. 2002, BioEssayts 24: 700-707）はともに、非アミノアシル化ｔＲＮＡの存在を感知する。実際、枯草菌における20の共通アミノ酸のうちの18は、Ｔボックス素子の使用により間接的に検出されると思われる。興味深いことに、任意の生物中に既知のｔＲＮＡlys依存性Ｔ−ボックスは認められず、そしておそらくは本明細書中に記載したリジンリボスイッチは、対応するＴボックスの不存在下で、このアミノ酸に関する遺伝子センサーとして役立つ。さらに、いくつかの生物からのｎｈａＣ遺伝子と結び付けられるリジンリボスイッチの遺伝子分布は、このＲＮＡ遺伝子素子が細胞ｐＨの重要な調節物質であり得る、ということを示す。
【０３１６】
ｌｙｓＣ  ｍＲＮＡはＬ−リジンのための受容体として機能するため、Ｌｙｓリボスイッチは薬剤標的として役立つ（その他の例を参照。Hesselberth, J.R., and Ellington, A.D. 2002, Nature Struct. Biol. 9: 891-893; Sudarsan, N., et al., 2003, RNA 9: 644-647）。リジンリボスイッチ、そしておそらくはその他のクラスのリボスイッチも同様に、リボスイッチと選択的に結合し、遺伝子変調を誘導する類似体により標的化され得る。枯草菌では、リボスイッチの引き金を引くリジンの類似体は、アスパルトキナーゼ発現の低減がリジンおよびその他の重要な代謝産物の飢餓状態を誘導するはずであるため、抗菌剤として機能すると予測される。チオシンがin vitroでリジンアプタマーと結合し、そして野生型リボスイッチに融合されたレポーター構築物の下向き調節を引き起こすという知見は、リボスイッチが薬剤発見のための標的の新規に認知されたクラスであるという見地に対する支持を提供する。
【０３１７】
近年の発見は、広範囲の生物における遺伝子発現を導く場合の小ＲＮＡの役割を明らかにしてきた（再検討のためには、Gottesman, S. 2002, Genes Dev. 16: 2829-2842参照）。小ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ内に埋め込まれたリボスイッチドメインは、広範囲のメカニズムにより遺伝子発現を制御し得る、ということは明白である。他のＲＮＡ遺伝子制御素子と違って、リボスイッチは代謝産物と直接結合し、そして多数の基礎代謝産物の移入および生合成に関与する遺伝子の発現を制御する。前に検査されたリボスイッチは、ヌクレオチドと化学的に関連する化合物に応答する。しかしながら高選択性で小アミノ酸に応答するリボスイッチの一クラスの存在は、天然ＲＮＡスイッチがより大きい範囲の代謝産物種を検出し、応答し得るという証拠として役立つ。
【０３１８】
Ｆ．実施例６：枯草菌およびその他の細菌におけるグアニンおよびその他のリボスイッチ
１．要約
リボスイッチは、それらの対応する標的に関する精密センサーとして役立つある種のメッセンジャーＲＮＡ内の代謝産物結合ドメインである。ｍＲＮＡ構造のアロステリック再配列はリガンド結合により媒介され、そしてこれが遺伝子発現の変調を引き起こす。グアニンを選択的に認識し、そして5 nMという低い濃度で飽和されるようになるリボスイッチの一クラスを、本明細書中に開示する。枯草菌では、このｍＲＮＡモチーフは、ほとんどプリン輸送およびプリンヌクレオチド生合成に関与する17の遺伝子を一緒にコードする少なくとも5つの別個の転写単位上に位置する。これらの知見は、代謝産物を感知し、そしてタンパク質因子を必要とせずに遺伝子発現を制御するｍＲＮＡのさらなる例を提供する。さらに、リボスイッチはある種の細菌における多数の基礎代謝経路の調節に寄与する、ということがここに明らかになる。
【０３１９】
２．序論
タンパク質因子および核酸の相互作用が、現代細胞における遺伝子発現のための複雑な調節ネットワークを導く、ということは広範に理解されている。ほとんどの場合、タンパク質因子は遺伝子発現ネットワークを保持するのにぴったりの作用物質であると思われる。タンパク質は複雑な形状をとり、生体系にそれらの化学的および物理的環境を精確に感知させる種々の機能を実行する。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には転写開始を変調するためにＤＮＡを結合することにより（例えばｌａｃリプレッサータンパク質；Matthews, K.S., and Nichols, J.C., 1998, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 58, 127-164）、あるいは転写終結（例えばＰｙｒＲタンパク質；Switzer, R.L., et al., 1999, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 62, 329-367）または翻訳（例えばＴＲＡＰタンパク質；Babitzke, P., and Gollnick, P., 2001, J. Bacteriol. 183, 5795-5802）を制御するためにＲＮＡを結合することにより作用する。タンパク質因子は、種々のメカニズムにより、例えばアロステリック変調または翻訳後修飾により環境刺激に応答し、そして高応答性遺伝子スイッチとして役立てるためにこれらのメカニズムを利用するのに熟達している（例えばPtashne, M., and Gann, A. (2002). Genes and Signals. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY参照）。
【０３２０】
遺伝子制御におけるタンパク質因子の広範な関与のほかに、ＲＮＡは遺伝子調節に際して能動的役割を引受け得る、ということも既知である。近年の研究は、遺伝子発現の下向き調節を生じる破壊のために小非コードＲＮＡがｍＲＮＡを選択的にターゲッティングする場合に演じる実質的役割を明らかにし始めた（例えばHannon, G.J. 2002, Nature 418, 244-251およびその中の参考文献参照）。ＲＮＡ妨害のこの過程は、ワトソン−クリック塩基相補性により選択的に意図されたｍＲＮＡ標的を認識する短ＲＮＡの能力を利用し、この後に、結合ｍＲＮＡがタンパク質の作用により破壊される。新規のしかし高度に特異的なＲＮＡ結合部位を有するタンパク質因子を生成することよりも進化過程により新規の標的特異的ＲＮＡ因子を生成することの方がはるかに容易であるため、ＲＮＡはこの系における分子認識のための理想的作用物質である。
【０３２１】
タンパク質をまたは小分子をさえ選択的に結合するそれらの能力においてタンパク質受容体および抗体をいくつかのＲＮＡ分子が模倣し得る複雑な三次元形状を多数の研究が目下確証している（Gold, L., et al., 1995, Annu. Rev. Biochem. 64, 763-797; Hermann, T., and Patel, D., 2000, Science 287, 820-825）。さらにＲＮＡは、リガンド結合時に構造的および機能的変調を受けるアロステリックドメインの形成を可能にするのに十分な構造複雑性を示す（Soukup G.A., and Breaker, R.R., 1999a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3584-3589 ; Seetharaman, S. et al., 2001, Nature Biotechnol. 19, 336-341）。天然ＲＮＡも、グアノシンまたはそのリン酸化誘導体を結合するグループＩ自己スプライシングＲＮＡにより実証されるように、ヌクレオチドを結合し得る（McConnell, T.S., et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8362-8366）。さらに近年、ＲＮＡによるＡＴＰの直接結合がウイルスキャプシド中にＤＮＡをパッケージするために不可欠である、ということを示す証拠が提供されている（Shu, D., and Guo, P., 2003, J. Biol. Chem. 278, 7119-7125）。
【０３２２】
既知のリボスイッチは、高親和性および精確性でそれらの標的代謝産物を結合し、これは、精確な且つ高感度の遺伝子制御を可能にし得る任意の型の分子スイッチに不可欠な特質である。例えば補酵素Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に応答する近年同定されたリボスイッチは、〜4 nMの解離定数（ＫD）でそれを標的と結合する（実施例７参照）。さらにリボスイッチは、単一メチル基および会合正電荷によりＳＡＭと異なる天然代謝産物であるＳ−アデノシルホモシステインに対して〜100倍弁別し得る。本明細書中で開示された（実施例１）リボスイッチを含む遺伝子制御は、その生物学的分泌ならびにモニタリングされている標的分子に関して広範に及ぶ現象である。始原菌生物からのある種のｍＲＮＡがリボスイッチ様ドメインを保有し（Stormo, G.D., and Jil., Y., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9465-9467; Rodionov, D.A., et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, 48949-48959）、そして真菌および植物からのいくつかのｍＲＮＡがチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）（Sudarsan, N., et al., 2003, RNA 9: 644-647）と結合することが観察されている。
【０３２３】
ヌクレオチドおよび核酸の代謝的保持の基礎を成す細菌におけるプリン輸送およびプリン生合成経路の遺伝子調節（Switzer, R.L., et al., 2002, A.L. Sonenshein, et al., eds., ASM Press, Washington, pp. 255-269）を、リボスイッチの存在に関して分析した。枯草菌では、多数の遺伝子がプリンの生合成に（12遺伝子を伴うｐｕｒオペロン；Ebbole, D.J., and Zalkin, H. 1987, J. Biol. Chem. 262, 8274-8287）、そして分解核酸からのプリン塩基の回収に関与する。調節タンパク質因子の関与は、キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびキサンチン特異的プリンペルメアーゼをそれぞれコードするｘｐｔ−ｐｂｕＸオペロンの制御に参加することが提唱されてきた（Christiansen, L.C., et al., 1997, J. Bacteriol. 179, 2540-2550）。タンパク質因子ＰｕｒＲは高アデニン濃度の存在下で転写のリプレッサーとして役立つことが既知であり（Weng, M., et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7455-7459）、対応する機能を有するタンパク質は、グアニンに応答する枯草菌においては同定されていない。
【０３２４】
本明細書中で開示されたｘｐｔ−ｐｂｕＸオペロンは、グアニンに対する高親和性および選択性を示すリボスイッチにより制御される。この新たに発見されたクラスのリボスイッチは、12−遺伝子ｐｕｒオペロンのものを含めて、枯草菌における5つの転写単位の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）中に存在する。したがってｍＲＮＡによるグアニンの直接結合は、ある種の細菌におけるプリン代謝のための代謝恒常性の重要な決定因子として役立つ。さらに、7つの異なる標的分子に応答する既知のクラスのリボスイッチは、中心代謝経路に対する基本的重要性を有する枯草菌における少なくとも68の遺伝子を制御すると思われる、ということが確定された。これらの知見は、小退社産物およびＲＮＡ間の直接的相互作用が細菌における遺伝子調節の有意の且つ広範な形態である生体系の代謝調節においてリボスイッチが実質的役割を演じる、ということを示す。
【０３２５】
３．実験手順
ｉ．化学物質およびオリゴヌクレオチド
グアニンおよびその類似体キサンチン、ヒポキサンチン、アデニン、グアノシン、７−メチルグアニン、Ｎ2−メチルグアニン、１−メチルキサンチン、３−メチルキサンチン、８−メチルキサンチン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、アロプリノール、２−アミノ−６−メルカプトプリン、ルマジンおよびグアニン−８−3Ｈ塩酸塩を、Sigmaから購入した。イノシン、尿酸、２−アミノ−６−ブロモプリン、Ｏ−メチルグアニンおよびプテリンを、Aldrichから購入した。
【０３２６】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、エール大学のKeck Foundation Biotechnology Resource Centerが合成し、変性ＰＡＧＥにより精製し、そして10 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5, 23℃）、200 mMＮａＣｌおよび1 mMＥＤＴＡ中での粉砕／浸漬により、ゲルから溶離した。エタノールを用いた沈降により溶液からオリゴヌクレオチドを回収した。
【０３２７】
ｉｉ．系統発生学的分析
デフォルトパラメーターを用いたGenBankのＢＬＡＳＴＮ検索を実行することにより、ｘｐｔ−ｐｂｕＸ５’−ＵＴＲとの配列類似性によりＧボックスドメインを同定した。パターン（<<<<[2]TA[6]<<<[2]ATNNGG[2]>>>[5]GTNTCTAC[3]<<<<<[3]CCNNNAA[3]>>>>>[5]>>>>）との縮重マッチに関して検索することにより、これらのヒットを拡大した。急角度括弧は塩基対合を示す。括弧内の数字は可変ギャップであり、強制最大長を示す。図２３に示した系統発生を生じる場合、このパターンの合計4つまでの違反は許された。ＢＳ３−ｘｐｔドメイン（ｘｐｔ−ｐｂｕＸリーダーのドメイン）のみがグアニンと結合することが示された、ということに留意することは、この場合に重要である。ＶＶ１代表物の分子特異性がアデニンに対してであり、グアニンではない、ということが実証された（未発表データ）。グアニン結合ＲＮＡアプタマーがアデニンと結合するよう変更され得る（例えばグアニンとのワトソン−クリック対合相互作用を成すためにＣ残基がアプタマーにより用いられる場合、ＣからＵへの変化）考え得る自明の手段を仮定すると、その他の代表物も分子認識を変更した、ということは除外され得ない。
【０３２８】
ｉｉｉ．ＲＮＡ構築物の直列プロービング
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよび適切なＰＣＲ  ＤＮＡ鋳型を用いて、in vitro転写により、枯草菌２０１ｘｐｔリーダーおよび切頭化９３ｘｐｔアプタマーＲＮＡを調製し、その後、前記（Seetharaman, S. et al., 2001, Nature Biotechnol. 19, 336-341）と同様のプロトコールを用いて、５’32Ｐ標識した。標識前駆体ＲＮＡ（〜2 nM）を、実施例２に記載したのと同様の条件を用いて直列プロービングに付した。反応物（10 μL）を、各実験に関して示したようにプリンの存在下または不存在下で、50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.5, 25℃）、20 mMＭｇＣｌ2および100 mMＫＣｌを含有する緩衝液中で25℃で40時間インキュベートした。1 nM〜10 μMの範囲のプリン濃度を典型的には用いたが、しかし貧結合リガンドに関しては300 μMという高い範囲であった。変性10％ＰＡＧＥを用いて、自発的切断産物を分離し、Molecular Dynamicsリン光画像解析装置を用いてその結果を調べた。ImageQuantソフトウェアを用いることにより、自発的切断収量の定量を達成した。直列プロービングに関する2 nMより低いＲＮＡの濃度はシグナルレベルが不十分なために容易に使用できないため、この濃度に近い見掛けのＫD値は最大可能値を示す。
【０３２９】
ｉｖ．平衡透析
Dispo平衡透析機（ＥＤ−１、 Harvard Bioscience）を用いて、平衡透析検定を実行した。この場合、5,000ＭＷＣＯ膜により、2つの小室ａおよびｂを分離した。緩衝液の最終組成は、50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.5, 25℃）、20 mMＭｇＣｌ2および100 mMＫＣｌを含有した（各小室に30 μL送達）。小室ａは3Ｈ−グアニンも含有したが、一方、小室ｂも各実験に関して指示したような300 nMのｘｐｔＲＮＡ構築物を含有した。25℃で10時間平衡後、各小室からの5 μl  アリコートを、液体シンチレーション計数器による定量のために取り出した。適切な場合には、さらに5 μLの緩衝液をａに送達し、そして500 nM非標識プリンを含有する等容量の緩衝液をｂに付加した。25℃でさらに10時間インキュベーション後、トリチウム分布の定量のために、5 μlのアリコートを再び取り出した。
【０３３０】
ｖ．ｘｐｔ−ｌａｃＺ融合物の構築
本明細書中の他の箇所に記載したのと同様のアプローチを用いて、遺伝子操作を実行した。要するに、枯草菌１Ａ４０菌株（Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH）からのｘｐｔ−ｐｂｕＸオペロンの転写開始部位に関してｎｔ−１２１〜＋１９７を包含するＤＮＡ構築物を、ＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１断片としてＰＣＲ増幅した。生成物を、ｌａｃＺレポーター遺伝子の直ぐ上流の部位でｐＤＧ１６６１中にクローン化した。適切なプライマーおよびQuickChange部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を用いることにより、工学処理ｐＤ１６６１内に突然変異体を作製した。プラスミド突然変異体を、菌株１Ａ４０のａｍｙＥ遺伝子座に組み込んだ。形質転換体を、クロラムフェニコール（5 μg/ml）耐性に関して選択し、スペクチノマイシン（100 μg/ml）に対する感受性に関してスクリーニングした。シーケンシングにより、各構築物の完全性を確証した。
【０３３１】
ｖｉ．β−ガラクトシダーゼ発現のグアニン媒介性変調
0.4％ w/vグルコース、20 g/L（ＮＨ4）2ＳＯ4、25 g/LＫ2ＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏ、6 g/LＫＨ2ＰＯ4、1 g/Lクエン酸ナトリウム、0.2 g/LＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、0.2％グルタミン酸塩、5 μg/mlクロラムフェニコール、50 μg/mlＬ−トリプトファン、50 μg/mlＬ−リシンおよび50 μg/mlＬ−メチオニンを含有する最少培地中で、37℃で振盪しながら枯草菌細胞を増殖させた。プリンを付加し、最終濃度を0.5 mg/mlとした。中期対数期の細胞(〜0.1のＡ595)を遠心分離により収穫し、各実験に関する指示通りに、プリン（0.5 mg/mL）の非存在下または存在下で最小倍地中に再懸濁した。グアニンの貧溶解性は、この濃度での検出可能レベルの沈殿生成を生じるが、しかし細胞増殖の悪影響は観察されなかった。別記しない限り、細胞をさらに3時間インキュベートしたの地、β−ガラクトシダーゼ検定を実施する。図２８Ｃに示したデータを、上記と同様に生成したが、但し、β−ガラクトシダーゼ検定は、指示された時間で実施した。
【０３３２】
４．結果および考察
ｉ．いくつかの枯草菌ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ中の保存ドメイン
ｘｐｔ−ｐｂｕＸオペロンは、グアニン、ヒポキサンチンおよびキサンチンにより調節される。これらのプリン化合物は化学的類似性を共有し、そしてプリン回収の経路において互いに隣接する。プリンオペロンと対比して、ｘｐｔ−ｐｂｕＸオペロンの調節は、アデニンデアミナーゼが不活性である菌株中では、依然としてアデニンの影響を受けない（Christiansen, L.C., et al., 1997, J. Bacteriol. 179, 2540-2550）。これらの観察は、非同定タンパク質因子がグアニン認識に関与し得る、という推測を促した（Ebbole, D.J., and Zalkin, H. 1987, J. Biol. Chem. 262, 8274-8287）が、しかしながらこのような遺伝因子は同定されていない。さらにｘｐｔ−ｐｂｕＸ  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲはかなり大きく（185ヌクレオチド）、これはリボスイッチドメインを収容するには十分である。
【０３３３】
リボスイッチは典型的には、2つの機能性ドメインからなる：即ち、その標的代謝産物と選択的に結合するアプタマー、ならびに代謝産物結合に応答し、アロステリック的手段による遺伝子発現を制御する発現プラットフォームである。既知のリボスイッチのほとんどの保存部分はアプタマードメインであり、一方、隣接発現プラットフォームは、配列中でおよび二次構造中で広範に変わり得る.アプタマーの高度配列保存は、進化を通して変化しない化学物質に対して受容体を形成するその能力をＲＮＡが保持しなければならない、という事実のためである。これに反して、発現プラットフォームは、アプタマードメインによりリガンド結合に応答する遺伝子制御を可能にする構造の多大な多様性のうちの1つを生成し得る。その他の枯草菌遺伝子中に、そしてその他の細菌種中に存在するｘｐｔ−ｐｂｕＸ５’−ＵＴＲ配列に関するデータベース検索を実行するために、この進化的保存を利用した。ｘｐｔ−ｐｂｕＸ５’−ＵＴＲのヌクレオチド１４〜８２（図２３）を有する配列および予測二次構造に密接に対応する枯草菌内の5つの転写単位を同定した。このドメインの合計32の代表物を、いくつかのグラム陽性およびグラム陰性細菌の間で同定した。その他の成員も同様に存在し得る。
【０３３４】
ＲＮＡのこの代表物組から、「Ｇボックス」（図２４Ａ）と呼ばれる保存ＲＮＡモチーフに関するコンセンサス配列および二次構造を同定した。Ｇボックスの二次構造は３−ステム（Ｐ１〜Ｐ３）接合部から成り、この場合、有意配列保存はＰ１内および非対合領域中で生じる。さらに、ステムＰ２およびＰ３はともに、７塩基対長に許された1−または2−塩基不適正を与える、ということが判明した。ステム長のこの普通でない保存は、これらの構造素子が、３−ステム接合部に関してそれらのステム−ループ配列の距離および配向束縛を確立する、ということを意味する。なんらかの塩基対合能力が2つのステム−ループ配列間に存在し、これが偽結び目の形成を可能にする。これらの特質は、Ｇ−ボックスドメインがほとんど、精確な三次元フォールドを採用するために保存二次−および三次構造素子を用いると思われる、ということを示す。
【０３３５】
ｉｉ．枯草菌のｘｐｔ−ｐｂｕＸ５’−ＵＴＲからのＧボックスＤＮＡはグアニンを結合する
枯草菌のｘｐｔ−ｐｂｕＸ５’−ＵＴＲを基礎にした2つのＲＮＡ構築物を調製して、ｍＲＮＡがグアニンまたはその最も近似の類似体を選択的に結合するか否かを調べた。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに関するプロモーター配列ならびにさらなる操作を可能にするいくつかのヌクレオチド付加および突然変異を導入されたプライマーを用いて、ＰＣＲにより、ｘｐｔ−ｐｂｕＸｍＲＮＡの完全５’ＵＴＲならびに最初の４つのコドンに対応する二本鎖ＤＮＡ鋳型を生成した（図２４Ｂ；実験手順も参照）。ＵＴＲの５’半分を包含する切頭形態のこの構築物も、ＰＣＲにより作製した。転写時に、短い方のＤＮＡ鋳型は９３ｘｐｔと呼ばれる９３−ヌクレオチド転写体を生成し、一方、長い方の鋳型は２０１ｘｐｔと呼ばれる２０１−ヌクレオチド転写体を産生する。
【０３３６】
これらの前駆体ＲＮＡを５’32Ｐ標識し、直列プロービングに付した（例えば実施例１参照）が、この場合、アプタマー内のＲＮＡリンケージの自発的切断は、その対応するリガンドの存在下および非存在下でモニタリングされる。９３ｘｐｔ（図２４Ｃ）および２０１ｘｐｔ（図２５Ａ）ＲＮＡの自発的切断のパターンは、1 μMの濃度のグアニンの付加時に有意の変化を受ける、ということが判明した。ヒポキサンチンおよびキサンチンもともに、この濃度で自発的切断の変調を誘導する。特に、4つの主要領域は、自発的切断におけるリガンド媒介性低減を示す（図２４Ｂおよび２４Ｃ）。しかしながら1 μMのアデニン（そして1 mMという高さでも）存在は、ＲＮＡ切断産物のパターンを変更しない。これらの結果は、枯草菌ｘｐｔ−ｐｂｕＸｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ中のＧボックスドメインがグアニンおよび関連プリンに関するアプタマーとして役立ち、そしてこのアプタマーは、リガンド結合時に有意の構造変調を受ける、ということを示す。リボスイッチの情況では、このアロステリック機能は、遺伝子発現を調節する構造素子を変調するためにｍＲＮＡにより利用され得る。
【０３３７】
グアニンアプタマーがその標的に対して有する親和性の予備査定に際して、種々の濃度のグアニンの存在下で２０１ｘｐｔを用いた直列プロービングを実行した。予測どおり、漸増濃度は、構造変調の4つの主要部位での自発的切断量の漸進的低減を提供した（図２５Ａ）。直列プロービングのために〜5 nMグアニンの濃度を用いると、変調の半最大レベルは、直列プロービングのために〜5 nMグアニンの濃度を用いる場合に観察された（図２５Ｂ）。これは、これらの条件下での２０１ｘｐｔに関するＫDが〜5 nMであるということを意味するが、しかし、直列プロービング検定の制限のために、実際の値は多少低いことがある、ということに注目することは重要である（実験手順参照）。さらに非生理学的条件下（例えば高Ｍｇ2+および高ｐＨ）でＫDを確定したが、そうすると結合親和性はin vivoで多少異なり得る。しかしながら比較のためにこの数値を用いると、グアニンに対する２０１ｘｐｔＲＮＡの親和性は、そのグアノシン一リン酸塩基質に対するテトラヒメナＩ群リボザイムの場合より10,000倍大きい（McConnell, T.S. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8362-8366）。この差はほとんど、ＲＮＡがそれらのそれぞれの細胞環境内で経験する2つの化合物の濃度の相対的差を反映すると思われる。
【０３３８】
ｉｉｉ．グアニンアプタマーは多数のプリン類似体を弁別する
精確な代謝恒常性を保持するために、細胞はその標的代謝産物の濃度を感知できなければならないが、しかしそうでなければ遺伝子変調を不注意に誘発し得る他の化合物との調節的掛け合いの防止もしなければならない。実際、他のリボスイッチの特質は、密接に関連する代謝産物間を弁別する能力である。例えばＦＭＮおよびＴＰＰリボスイッチは、非リン酸化補酵素前駆体チアミンおよびリボフラビンを〜1,000倍弁別する（実施例２および３参照）。
【０３３９】
関連代謝産物の分子弁別を強いるためのこの要件は、細胞中に存在する多数のプリンヌクレオシドおよびヌクレオチド、プリン塩基およびプリン様化合物が認められる場合、グアニンリボスイッチに関しては極端であると予測される。図２５に記載した直列プロービング戦略を用いて、種々のプリンおよびプリン類似体に関して、９３ｘｐｔＲＮＡの見掛けのＫD値を確立した。ヒポキサンチンおよびキサンチンはグアニンに関して確定された値に最も近いＫD値を示し、一方、アデニンは300 μMという過剰量のＫD値を有する（図２６Ａ）。これらの結果は、アデニンが他のプリンの場合のようにｘｐｔ−ｐｂｕＸオペロンの発現を有意に抑制することはない、という観察と一致する（Christiansen, L.C., et al., 1997, J. Bacteriol. 179, 2540-2550）。しかしながらヒポキサンチンおよびキサンチンがグアニンリボスイッチを直接結合することにより遺伝子発現を抑制し得るか、あるいはそれらが先ずグアニンに転換された後、遺伝子制御に影響を及ぼすかは明らかでない。
【０３４０】
グアニン複素環上の全ての官能化位置の変更が結合親和性の実質的損失を引き起こす、ということが判明した（図２６Ｂ、図２７）。例えばグアニンの位置６の酸素原子は、２−アミノプリン（>10,000倍損失）、２−アミノ−６−ブロモプリン（〜1,000倍）およびＯ6−メチルグアニン（>100倍）に関する見掛けのＤの損失により実証されるように、分子認識の有意の決定因子である。ほとんどの分子相互作用は、Ｃ８での分子相互作用以外は、ＲＮＡおよびグアニン間の水素結合接触の発生により説明され得る。ここで、おそらくはＲＮＡ構造は、８−メチルキサンチン（>10,000）および尿酸（>10,000）のように、付加的容積を保有する類似体と立体的衝突を生じる。
【０３４１】
グアニンアプタマーが最大親和性を要する有望な分子認識特徴の要約を、図２６Ｃに示す。しかしながら有意の結合親和性が塩基スタッキングにより得られる有望な可能性は、検査されなかった。ＲＮＡおよび全ての面構造間のそのように多くの生産的接触の存在は、リガンドがほとんど完全にアプタマー構造に飲み込まれると思われる、ということを示唆する。これは、尿酸のようなより嵩のある化合物の立体吸蔵によりＲＮＡが認識を生じ得る方法も説明する.ある種の生物学的環境では、例えば尿酸は結晶化を可能にする高濃度に集結し得る。このような環境では、細菌は、グアニン調節性遺伝子の望ましくない抑制を防止するためには、高レベルの弁別を要する。このような分子認識試験にかんがみて、ＲＮＡ遺伝子スイッチがその標的化合物との広範な分子接触を進化させる、ということは意外でない。
【０３４２】
ｉｖ．平衡透析によるグアニンアプタマー機能の確証
平衡透析を用いて、ｘｐｔ−ｐｂｕＸオペロンからのＧボックスＲＮＡは、その他のプリンおよびプリン類似体全体で選択的にグアニンを結合する、というさらなる証拠を提供した。トリチウム化グアニンにおける実質的シフトは、余分量の機能性ＲＮＡが一方の消失に付加された場合に、２−小室透析装置において起きると予測される（図２７Ａ）。さらにこのシフト平衡は、余分量の非標識競合体リガンドの付加時に単一体に戻る必要がある。予測どおり、90％より多いとリチウム化グアニンが９３ｘｐｔＲＮＡと共局在化され、その後、余分量の非標識グアニンが導入されると、再分布する、ということが観察された。これに反して、過剰非標識類似体の存在は、3Ｈ−グアニンおよびＲＮＡの共局在化に影響を及ぼさない（図２７Ｂ）。ヌクレオシドグアノシン（９−リボシルグアノシン）でさえ２つの小室間のグアノシンの等分布を回復できないが、これは、塩基単独のためのぴったりとしたポケットを形成するためのＲＮＡフォールディングと一致する。
【０３４３】
直列プロービングおよび平衡透析データはともに、この天然アプタマーが高親和性および特異性でグアニンを結合する、ということを示す。従来の一研究では、in vitro進化を用いて、無作為配列ＲＮＡのプールからプリン結合アプタマーを単離した（Kiga, D., et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26, 1755-1760）。この工学処理アプタマーはグアニンに関して1.3 μMのＫDを示し、そしてヒポキサンチンおよびキサンチンに対しては2〜3倍の弁別を示すだけである。選定プリンに対するこのアプタマーのより低い特異性および親和性は、Ｎ１、Ｎ７およびＯ６位置のみが分子認識のために重要である、という事実のためである。これに反して、ＧボックスＲＮＡは、おそらくは水素結合により、グアニン上の全ての利用可能な官能基との生産的接触を成すと思われる（図２６Ｃ）。
【０３４４】
ｖ．アプタマー突然変異はグアニン結合および遺伝子制御に影響を及ぼす
種々の突然変異をＧボックスドメインに導入して、いくつかの構造阻止および保存ヌクレオチドの重要性を調べた（図２８Ａ）。平衡透析を用いることにより、９３ｘｐｔＲＮＡの情況で、グアニン結合に及ぼすこれらの突然変異の影響を確定した。3つのステムを独立して崩壊させる突然変異（Ｍ１、Ｍ４およびＭ６）は、中心接合部に2つの突然変異を保有する変異体ＲＮＡ（Ｍ３）の場合と同様に、結合機能の損失を引き起こす（図２８Ｂ）。これに反して、塩基対合を回復する補償的突然変異を作ることにより（Ｍ２、Ｍ５およびＭ７）、破壊的ステム突然変異の作用は大いに逆転される。これらの結果は、ステム構造は重要であるが、しかしこれらの素子の精確な配列組成はあまり重要性を有さないということを示す系統発生学的分析と一致する（図２３）。
【０３４５】
in vitroでの変異体アプタマーの結合機能は、in vivoでの遺伝子制御とも相関する。本明細書中に開示された結果は、ｘｐｔ−ｐｂｕＸｍＲＮＡの５’−ＵＴＲを保有するレポーター遺伝子がグアニンにより、そしてヒポキサンチンおよびキサンチンより少ない程度、抑制される、という初期の知見を確証する（Christiansen, L.C., et al., 1997, J. Bacteriol. 179, 2540-2550）。特に転写融合物をβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子と、図２８Ａに記載した突然変異を保有する変異体ｘｐｔ−ｐｂｕＸ５’−ＵＴＲ配列との間に作製した。野生型配列を用いた枯草菌染色体形質転換体は、予測レベルの遺伝子変調を示す（図２８Ｃ）。ｘｐｔアプタマーはin vitroで本質的に同一であるキサンチンおよびヒポキサンチンに関する解離定数を示すが、しかしin vivoでのこれらの化合物による遺伝子変調における差は、それらの細胞濃度の差のためであり得る。
【０３４６】
グアニン結合損傷をin vitroで有するアプタマー変異体は、β−ガラクトシダーゼ抑制の損失も示す（図２８Ｄ）。さらにステムＰ１〜Ｐ３における塩基対合の回復は、遺伝子制御回復を生じる。Ｍ２変異体は、それが遺伝子制御回復を示すだけでなく、グアニンの非存在下でβ−ガラクトシダーゼの適度の発現も提供するため、特別な関心を有する。リボスイッチ機能は、分子感知のためのアプタマーの作用、ならびにＲＮＡ−リガンド複合体形成を遺伝子応答に変換する発現プラットフォームを要する。ＴＰＰおよびＦＭＮリボスイッチの例（実施例２および３参照）は、ターミネーターおよびアンチターミネーター構造の示差的形成により機能すると思われる。転写抗終結構造のこのようなリガンド誘導性形成も、多数のＳＡＭリボスイッチにより用いられる発現プラットフォームメカニズムの基礎であると思われる（実施例７参照）。構築物Ｍ２はｘｐｔ−ｐｂｕＸリーダーの推定アンチターミネーター構造内に3つの突然変異を保有し、したがって、これらの突然変異はターミネーターステム形成に向けて構造フォールディングを偏らせる必要があるため、レポーター遺伝子発現の全体的低減を示すと予測される。
【０３４７】
これらの突然変異的および帰納的分析の結果は、二次構造モデルの主な特徴を確証し（Ｐ１〜Ｐ３）、そしてそれらが代謝産物結合にとって重要である、ということを実証する。さらにリガンド結合および遺伝子制御間の相関は、ｘｐｔ−ｐｂｕＸリーダー配列のＧボックスおよび隣接ヌクレオチドがほとんどが転写終結のアロステリック制御により作動することにより、グアニン依存性リボスイッチとして機能するよう協力して働く、ということを示す。
【０３４８】
ｖｉ．リボスイッチは基本的生化学的経路を制御する
ｘｐｔ−ｐｂｕＸオペロンのＧボックスＲＮＡはその標的に対して並外れた親和性および選択性を示すグアニン感知リボスイッチの重要な構造素子である、ということをわれわれの知見は示す。枯草菌では、この一般的リボスイッチモチーフは、少なくとも5つの転写単位を制御すると思われる（図２３）。この新規同定レギュロンにおける遺伝子産物のいくつかの精確な機能は明白に限定されてはいないが、しかし枯草菌からの、ならびにその他の生物からの既知の遺伝子は大部分がプリン代謝に関連する。本明細書中に開示された結果に基づいて、この大型ｐｕｒオペロンの５’−ＵＴＲ内のＧボックスドメインがグアニン依存性リボスイッチ調節に関与しており、そして遺伝子調節メカニズムは、ｘｐｔ−ｐｂｕＸオペロンに関して本明細書中に提唱されたのと同様であり得ると思われる。
【０３４９】
枯草菌およびその他の細菌におけるＧボックスドメインの分布は、このクラスの代謝産物結合ＲＮＡが、細胞生存に不可欠であるレギュロンを制御する、ということを示唆する。枯草菌では、グアニンリボスイッチ（または関連アデニン依存性リボスイッチ−図２３の凡例参照）は、１７の遺伝子の遺伝子調節への少なくとも何らかの寄与を提供すると思われる。グアニン依存性リボスイッチの発見は、同様の代謝産物感知ＲＮＡの増殖リストに加わる。例えばＳＡＭに応答するリボスイッチの一クラス（McDaniel, B.A.M., et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 3083-3088;Epshtein, V., et al., 2003Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 5052-5056）は、補酵素生合成、アミノ酸代謝およびイオウ代謝に関与する26という多数の遺伝子のレギュロンを制御する。その他のリボスイッチクラスにより制御される遺伝子とともに含入される場合、少なくとも68の遺伝子（その総遺伝子補体のほぼ2％）はリボスイッチ制御下にある（図２９）。
【０３５０】
グアニンおよびＳＡＭのようなリガンドに関するリボスイッチは明らかに、その濃度が非常に広範な代謝経路組の恒常性を保証するためにモニタリングされる主制御分子として役立っている。リボスイッチは、タンパク質因子により示されるのと同一レベルの精度および効率で代謝産物監視および遺伝子制御を可能にするようでもある。したがってこれらのＲＮＡスイッチは、それらがタンパク質から作られる遺伝子スイッチに機能的に匹敵するため、現代生化学構築物の進化において後期に出現し得た。しかしながらある種のリボスイッチの代謝保持および広範な系統発生学的分布におけるそれらの基本的役割を考えると、これらに類似するアプタマードメインが、タンパク質の出現前にＲＮＡワールド生物が代謝産物を検出し、生化学経路を制御した原初のメカニズムであり得た、ということは首尾一貫している。
【０３５１】
５．結論
グアニンが代謝産物結合ｍＲＮＡにより感知されるというこの論証は、リボスイッチの既知のクラスを拡大し、そしてある種の細菌ＲＮＡが全ての生体系の基本である重要な補酵素およびその他の化合物の濃度のモニタリングに関与する、という付加的証拠を提供する。
【０３５２】
系統発生学的分析および生化学的データは、多数の細菌が、そしていくつかの場合には、真核生物（Sudarsan, N., et al., 2003, RNA 9: 644-647）が、不可欠な代謝産物を感知し、そして遺伝子制御を媒介することをリボスイッチに委ねる、ということを示す。タンパク質因子は、これらの重要な調節作業を実行するために疑問の余地なく用いられ得るが、しかし本明細書の開示に基づいて、高度構造化ＲＮＡはこの役割に良好に適合される。ＲＮＡポリマーが、高親和性および精度で代謝産物受容体を生成するための貧適合媒体である場合には、進化が遠い昔にタンパク質因子をそれらの代わりに置き換えた、と予測する。
【０３５３】
リボスイッチは、タンパク質の進化的出現前に代謝的および環境的シグナルをモニタリングした古代の遺伝子制御系の誘導体である、ということは首尾一貫している（例えば実施例１および２参照）、と本明細書中に開示する（White, H.B.III., 1976, J. Mol. Evol. 7, 101-104; Benner, S.A., et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7054-7058; Jeffares, D.C., et al., 1998, J. Mol. Evol. 46, 18-36; Jadhav, V.R., and Yarus, M., 2002, Biochimie 84, 877-888）。リボスイッチのためのトリガーとしてのグアニンの同定は、進化の極初期に生じている代謝産物感知ＲＮＡと一致する。アミノ酸リシンに応答する別のクラスのリボスイッチも、本明細書中に開示される（図２９）。リボスイッチは全てより近年の進化的発明であり得るが、しかしリジンリボスイッチの起源でさえ最後の共通の先祖の前から始まり、そして生体系が純ＲＮＡワールドから、コードタンパク質合成を用いるより現代の代謝状態に移り変わっていた時期に遡り得る。
【０３５４】
Ｇ．実施例７：Ｓ−アデノシルメチオニンリボスイッチ
リボスイッチは、ある種のメッセンジャーＲＮＡに関する遺伝子制御素子として役立つ代謝産物結合ＲＮＡ構造である。これらのＲＮＡスイッチは、3つの生物界の全てにおいて同定されており、そして典型的にはそのタンパク質産物が標的代謝産物の生合成、輸送または利用に関与する遺伝子の制御に責任を負う。本明細書中に開示したように、細菌に見出される高度保存ＲＮＡドメインは、顕著に高い親和性および特異性で、補酵素Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に応答するリボスイッチとして役立つ。ＳＡＭリボスイッチはＳＡＭの導入時に構造的再組織化を受け、そしてこれらのアロステリック変化が枯草菌における26の遺伝子の発現を調節する。このそして関連する知見は、小代謝産物およびアロステリックｍＲＮＡ間の直接相互作用は、細菌における遺伝子調節の有意の且つ広範な形態である、ということを示す。
【０３５５】
１．結果
ｉ．ＳＡＭ応答性リボスイッチの同定
過去に同定されたリボスイッチにより感知される化合物の各々（補酵素Ｂ12、ＴＰＰ、ＦＭＮ）は、現代タンパク質酵素により補酵素として用いられる。興味深いことに、これらの補酵素は、ＲＮＡワールドにおいて古代リボザイムにより補酵素としてもそれらが用いられ得たという推測を支持するために用いられてきたＲＮＡと有意の構造類似性を有する（S.A. Benner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7054(1989); H.B. White III, J. Mol. Evol. 7, 101(1976); D.C. Jeffares, et al., J. Mol. Evol. 46, 18(1998)）。現代リボスイッチが、ＲＮＡワールドにおいて生じたＲＮＡ制御系の直接の子孫である場合には、それれは代謝産物を感知し、そしてそれらが制御する代謝経路は現代生化学過程に対する基本的重要性を有する。この仮説をさらに査定するために、それらの生化学的特質を確定するために、そしてゲノムワイドのレベルでの遺伝子制御におけるそれらの役割を確立するために、付加的リボスイッチに関する検索を実施した。
【０３５６】
この骨折り仕事に際して、Ｓボックスを検査した（F.J. Grundy, T.M. Henkin, Mol. Microbiol. 30, 737 (1998)）が、これは、グラム陽性細菌中のある種のメッセンジャーＲＮＡの５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に位置する高度保存配列ドメイン（図３０Ａ）である。遺伝子および配列分析はともに、Ｓボックスドメインが11の転写単位から成るレギュロンに関する遺伝子制御素子として役立つ、ということを示唆する。これらのｍＲＮＡは、イオウ代謝、メチオニン生合成、システイン生合成およびＳＡＭ生合成に関与する枯草菌中の26という多数の異なる遺伝子をコードする。しかしながら推定調節因子の性質ならびにそれが応答する代謝産物は確定されなかった（T.M. Henkin, Curr. Opin. Microbiol. 3, 149(2000); F.J. Grundy, T.M. Henkin, Frontiers Biosci. 8, D20 (2003)）。枯草菌のｙｉｔＪ  ｍＲＮＡの最初の251個のヌクレオチドに対応するＲＮＡ構築物（図３０ｂ）をin vitro転写により調製した（G.A. Soukup, R.R. Breaker, RNA 5, 1308 (1999)）。ｙｉｔＪ遺伝子産物は、メチオニン生合成に関与すると提唱された酵素である推定メチレンテロラヒドロフォレートレダクターゼである（F.J. Grundy, T.M. Henkin, Mol. Microbiol. 30, 737 (1998)）。２５１ｙｉｔＪＲＮＡを「直列プロービング」に付したが、これは、構造的情況の差により引き起こされる自発的ＲＮＡホスホジエステル切断の比率の変異性に頼ることにより、ＲＮＡポリマーの構造化および非構造化部分の位置を明示する。直列プロービングは、代謝産物誘導性構造変調に関与するヌクレオチドも明示する（実施例１〜３参照）。
【０３５７】
２５１ｙｉｔＪＲＮＡがＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を結合し得るか否かを分析した。実際,ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による分離時に、自発的ＲＮＡ切断産物のパターン（図３０ｃ）は、最終濃度0.1 mMまたは1 mMのＳＡＭの導入時に立体配座変調を受ける高度構造化ＲＮＡ素子を示した。これに反して、同一濃度でのメチオニンの導入時には構造変調は明らかでなかったが、これは、構造的再組織化を誘導するためには、ＲＮＡはＳＡＭのメチオニンおよび５’−デオキシアデノシル部分の両方を要する、ということを示唆する。リガンド誘導性変調の位置（図３０ｂ）は、ＳボックスＲＮＡの保存コアがＳＡＭのための天然アプタマーとして役立つ、ということを示した（L. Gold, et al., Annu. Rev. Biochem. 64, 763 (1995)）。ｍＲＮＡリーダーのヌクレオチド２８〜１４９＋５’末端の２つのＧ残基を包含する１２４ｙｉｔＪを用いて、同様の結果を得た。
【０３５８】
ｉｉ．ＳＡＭ依存性リボスイッチによる分子認識
代謝産物に応答する遺伝子スイッチは、生理学的濃度に関連した解離定数（ＫD）でその標的を結合できなければならない。さらに代謝産物受容体は、同一環境中で生じると思われる密生津に関連した化合物を精確に弁別するか、または遺伝子発現の望ましくない変調を合えて行なうことができなければならない。したがってＳＡＭに対するｙｉｔＪＲＮＡの親和性を、ならびにこの標的と構造的に類似する生物学的関連化合物を弁別するＲＮＡの能力を査定した（図３０ａ）。
【０３５９】
一連のリガンド濃度全体の構造変調の程度をモニタリングするため二、直列プロービングを用いて、ＳＡＭに関する２５１ｙｉｔＪのＫDを確定した（図３０ｂ、左）。ＳＡＭに関する２５１ｙｉｔＪのＫDは〜200 nMであるが、１２４ｙｉｔＪにより代表される最小化アプタマードメインは、開示検定条件下で〜4 nMのＫDを示す。最小化アプタマードメインによる結合親和性のこのような改善が観察されている（実施例２参照）。これはほとんどが、そうでなければ代替的フォールディングを起こさせる隣接発現プラットフォームの排除のためのアプタマードメインのリガンド結合形態のより大きい構造的再組織化を反映すると思われる。トリチウム化ＳＡＭを用いたスカッチャード分析を用いて１２４ｙｉｔＪが尋問された場合には、密接な結合も観察された。結合親和性の査定は、１２４ｙｉｔＪアプタマーに関するＫDが、関連ＲＮＡに関して近年報告されたものと比較して、1000倍より大きく改善される、ということを示した（McDaniel, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 3083-3088 (2003)）。細菌中のＳＡＭの正常濃度は、典型的には低マイクロモル範囲である（McDaniel, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 3083-3088 (2003)）が、しかしながらこの補酵素プールのほとんどがおそらくは酵素により結合される。したがってこのリボスイッチにより示される低ＫDは、遊離ＳＡＭの濃度を感知するために必要とされ得る。
【０３６０】
予測どおり、１２４ｙｉｔＪＲＮＡは、ＳＡＭの類似体に対する高レベルの分子弁別を達成する。例えばＲＮＡは、メチル化反応のための補酵素としてのＳＡＭの利用時に産生されるＳＡＨ（図３１ｂ、右）に対して〜100倍の弁別を示す（F. Takusagawa, et al., In: Comprehensive Biological Catalysis, M. Sinnott, ed., Academic Press, Vol. 1, pp. 1-30 (1998)）。したがってアプタマーは、単一メチル基の非存在および正電荷の解離損失を感知し得るＳＡＭに関する結合ポケットを形成しなければならない。同様に、ＲＮＡは、単一メチレン基の非存在により、ＳＡＨとは異なる別の生物学的化合物であるＳＡＣに対してほぼ10,000倍弁別する。平衡透析を用いて、このパターンの分子弁別を確証した（図３１ｃ）。
【０３６１】
ｉｉｉ．ｍＲＮＡによるＳＡＭ結合は遺伝子調節に必要である
系統発生学的で得たを用いて、ＳＡＭ結合アプタマードメインに関する二次構造モデルを確立した（F.J. Grundy, T.M. Henkin, Mol. Microbiol. 30, 737 (1998)）。このモデルに関するさらなる支持を提供するために、これらの突然変異体アプタマーを基礎にした変異体リボスイッチと融合した場合の、１２４ｙｉｔＪＲＮＡの結合機能に及ぼす、そしてｌａｃＺレポーター遺伝子のＳＡＭ媒介性遺伝子制御に及ぼす破壊的および補償的突然変異（図３２ａ）の影響を調べた。アプタマーの保存コア（Ｍ１）を変更する、あるいは4つの主要塩基対合領域（Ｍ２、Ｍ４、Ｍ６およびＭ８）の各々における塩基対合を崩壊する突然変異は、平衡透析により確定した場合、ＳＡＭ結合機能の損失を大々的に生じる（図３２ｂ）。これらのステムにおける塩基対合を回復する補償的突然変異（Ｍ３、Ｍ５、Ｍ７、Ｍ９）は、少なくとも一部の結合活性を回復する。
【０３６２】
メチオニンが豊富な増殖培地は、Ｓボックスドメインを保有する枯草菌遺伝子の抑制をもたらす、ということが示されている（F.J. Grundy, T.M. Henkin, Mol. Microbiol. 30, 737 (1998)）。これはほとんど、メチオニンを十分量のＳＡＭ供給に転換する細胞の能力のためであると思われる。試験した全ての場合に本明細書中に開示されているように、突然変異体の結合機能は、そうでなければ最少増殖培地中に余分量のメチオニンとともに存在した場合、添付レポーター遺伝子を下向き調節するそれらの能力と相関する（図３２ｃ）。これらの知見は、ＳボックスｍＲＮＡの遺伝子調節に必要であるｍＲＮＡとのＳＡＭ結合と一致する。
【０３６３】
ｉｖ．ＳＡＭリボスイッチは枯草菌における転写終結による遺伝子発現を制御する
本明細書中に開示した細菌リボスイッチは、転写終結または翻訳開始を変調することにより遺伝子発現を制御し得る（実施例２および３参照）が、一方、真核生物におけるいくつかの推定リボスイッチは、いくつかの異なるメカニズムのうちの1つを用い得る。枯草菌では、ＳＡＭ結合アプタマードメインは、典型的には推定転写ターミネーターヘアピンから直ぐ上流に存在し（F.J. Grundy, T.M. Henkin, Mol. Microbiol. 30, 737 (1998)）、これは、ＳＡＭ結合がほとんど、ＦＭＮ−およびＴＰＰ依存性リボスイッチに関して前に記載されたように、転写終結を誘導すると思われる、ということを意味する（実施例３参照）。
【０３６４】
ＳボックスレギュロンのｍＲＮＡリーダー配列に対応する11個のＤＮＡ鋳型を用いたＳＡＭの非存在下または存在下でのin vitro転写を実施した。ネイティブ枯草菌ＲＮＡポリメラーゼの代わりにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、これらの検定を簡易化した。細菌ポリメラーゼの代理としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが用いられる場合でも、ＦＭＮ依存性リボスイッチは、転写終結を誘導する、ということが観察された（実施例３参照）。この試験では、ｙｉｔＪ、ｙｏａＤおよびｍｅｔＫリーダー構築物は、ＳＡＭの付加時に適度の転写終結を示す、ということが判明した。さらに劇的には、ｍｅｔＩリーダー構築物からの終結産物は、ＳＡＭの導入時に〜12％からほぼ75％に増大する（図３３ａ）。全ての場合に、類似体ＳＡＨまたはＳＡＣが反応に付加されると、転写終結の変調はほとんどまたは全く起きない。残りの7つのＳボックス代表物は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる有意の変調を示さないが、おそらくはそれがネイティブポリメラーゼの不完全置換物として役立つ。実際、ＳＡＭ依存性転写終結は、大腸菌または枯草菌ポリメラーゼを検定に用いる場合、これらのｍＲＮＡリーダー配列の多くに関して観察される（McDaniel, B.A.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 3083-3088(2003)）。
【０３６５】
ＳＡＭ誘導性終結のメカニズム（図３３ｂ）はほとんど、転写的読み過ごしを可能にする（ＳＡＭを用いないアンチターミネーター形成）か、または終結を引き起こす（ＳＡＭを用いたターミネーター形成）代替的ヘアピン構造のリガンド媒介性形成を包含する、と思われる。発現プラットフォーム中に破壊的または補償的変化を保有する幾つかの突然変異体ｍｅｔＩ構築物を生成することにより、このメカニズムを調べた（図３３ｂ）。ＳＡＭは、適正なターミネーターおよびアンチターミネーター塩基相補性を保持する野生型ｍｅｔＩリボスイッチに比して6つの突然変異を保有する突然変異体（Ｍａｂｃ）における転写終結の付加的〜20％収量を生じる。しかしながら相互作用に正常対合を起こさせないこれら6つの突然変異の不完全表現は、ＳＡＭ媒介性転写変調をほとんどまたは全く可能にしない。さらにターミネーターステム形成を崩壊する突然変異（Ｍａ）は低レベルの終結を生じ、一方、アンチターミネーターステム形成を崩壊する突然変異（Ｍａｂ、Ｍｃ）は高レベルの終結を生じる（図３３ｂ）。これらの知見は、ＳＡＭ結合により誘導されるＲＮＡ構造変調が、アンチターミネーター配列を封鎖することにより遺伝子制御を媒介し、したがって転写ターミネーターヘアピンの形成を促進する、ということを示す。
【０３６６】
ｖ．リボスイッチは基本的生化学的経路に関与する多重遺伝子を制御する
ＳＡＭリボスイッチにより制御されるレギュロンを含む11の転写単位（F.J. Grundy, T.M. Henkin, Mol. Microbiol. 30, 737 (1998)）は、イオウ代謝、アミノ酸代謝およびＳＡＭ生合成に対して中心部にある少なくとも26個の遺伝子を包含すると思われる。枯草菌からの11の転写単位は全てコンセンサスＳボックス素子を保有するが、しかしこれらのうちの1つ（ｃｙｓＨ）からの遺伝子発現は、その他のＳボックスＲＮＡの場合のように、培地へのメチオニンの付加により変調されない、ということを近年の報告は示す（M.C. Mansilla, et al., J. Bacteriol. 182, 5885 (2000)）。枯草菌ｃｙｓＨからのアプタマードメインは、同一生物からのｙｉｔＪの場合より2等級以上低い大きさである親和性でＳＡＭと結合する（図３４ａ）。しかしながら炭疽菌からのｃｙｓＨ相同体は、ｙｉｔＪの場合に釣り合うＫDを示し（図３４ｂ）、このことは、枯草菌ｃｙｓＨアプタマーが枯草菌ｃｙｓＨアプタマーが、多少劣化された結合親和性を有する１つまたは複数の突然変異を蒙ったことを意味する。
【０３６７】
２．結論
最新の生化学的およびバイオインフォーマティックスデータは、枯草菌がリボスイッチ制御下の少なくとも68個の遺伝子（その総遺伝子補体のほぼ2％）を有する、ということを示す。さらにこれらのｍＲＮＡの各々は、生物学において普遍的である生物学的化合物に応答している。基本的代謝過程に関する遺伝子制御素子がＲＮＡにより形成される、という事実は、このポリマーが化学的環境を精確にモニタリングするために必要とされる構造的精巧さを有し、そして代謝産物結合事象を遺伝子応答に変換する、ということを示す。原子レベルでのリボスイッチ構造のさらに詳細な分析は、代謝産物結合がアロステリック再組織化ＲＮＡ遺伝子スイッチをいかに促すかを確定するに際して多大な有用性を有する。
【０３６８】
ＳＡＭおよびグアニンのようなリガンドに関するリボスイッチは、その濃度が非常に広範な代謝経路組の恒常性を保証するためにモニタリングされる主制御分子として役立っていると思われる。リボスイッチは、タンパク質因子により示されるのと同一レベルの精度および効率で代謝産物監視および遺伝子制御を可能にするようでもあり、したがって現代生化学構築物の進化において後期に出現し得た。
【０３６９】
３．方法
ｉ．ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび化学物質
合成ＤＮＡは、エール大学のKeck Foundation Biotechnology Resource Centerから購入した。in vitro転写によるＲＮＡの調製を実行した（Seetharaman, S. et al., Nat. Biotechnol. 19, 336-341 (2001)）し、生成物を実施例２に記載したように精製した。ＳＡＭ、ＳＡＭの種々の類似体およびＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン−メチル−3Ｈ（3Ｈ−ＳＡＭ）は、Sigmaから購入した。
【０３７０】
ｉｉ．ＤＮＡ構築物
転写開始部位に関してヌクレオチド−３８０〜＋１５を包含するｙｉｔＪＤＮＡ構築物を、枯草菌染色体ＤＮＡ（菌株１６８）のＰＣＲ増幅時にＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１制限部位を精製したプライマーを用いて調製した。生成物を、ｌａｃＺレポーター遺伝子の直ぐ上流にリボスイッチを置くこれらの制限部位を用いて、ｐＤＧ１６６１（２６参照；Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH）中にクローン化した。適切な突然変異原性プライマーおよびQuickChange部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を用いることにより、突然変異体を作製した。シーケンシングにより、全配列を確証した。
【０３７１】
ｉｉｉ．リボスイッチ機能のin vivo分析
枯草菌１Ａ２３４菌株を、Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OHから入手した。濃化培地（２ＸＹＴブロスまたはトリプトース血液寒天ベース）または限定培地（0.5％ w/vグルコース、20 g/L（ＮＨ4）2ＳＯ4、183 g/LＫ2ＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏ、60 g/LＫＨ2ＰＯ4、10 g/Lクエン酸ナトリウム、2 g/LＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、5 μMＭｎＣｌ2、50 μg/Lトリプトファンおよび50 μg/Lグルタミン酸塩）中で、37℃で振盪しながら細胞を増殖させた。メチオニンを、ルーチン増殖のために50 μg/Lに付加した。0.1のＡ595へのルーチン増殖条件下でのインキュベーションによりメチオニン限定条件下での増殖を確立し、この時点で、遠心分離により細胞をペレット化し、最小培地中に再懸濁して、2つのアリコートに分割し、50 μg/L（＋メチオニン）または0.75 μg/L（−メチオニン）を補足した。培養をさらに3時間インキュベートした後、β−ガラクトシダーゼ検定を実施した。枯草菌中でのｐＤＧ１６６１変異体（ＤＮＡ構築物参照）の形質転換を、他の箇所に記載したように実施した（H. Jarmer, et al., FEMS Microbiol. Lett. 206, 197 (2002)）。クロラムフェニコール（5 μg/mL）耐性に関して選択し、スペクチノマイシン（100 μg/mL）感受性に関してスクリーニングすることにより、正確な形質転換体を同定した。ａｍｙＥ特異的プライマーを用いて、ＰＣＲにより、二重交差組換えによる適正な部位特異的ゲノム挿入を確証した。
【０３７２】
ｉｖ．in vitro転写終結検定
50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5, 23℃）、15 mMＭｇＣｌ2、2 mMスペルミジン、5 mMＤＴＴの存在下で37℃で2時間、〜3 pmolの特定鋳型ＤＮＡ、200 μＭの各ＮＴＰ、5 μCi［α−32Ｐ］ＵＴＰ（1 Ci＝37 GBq）および50単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）を含有する転写反応物（10 μL）をインキュベートした。ＳＡＭおよびその類似体を付加して、最終濃度を50 μMとした。各々の場合に、ＧＧで開始し、推定天然転写開始を包含し（F.J. Grundy, T.M. Henkin, Mol. Microbiol. 30, 737 (1998)）、そして隣接オープンリーディングフレームの最初の13コドンを含む転写体を産生した対応するプライマーを用いて、ＰＣＲにより、枯草菌のＳボックスレギュロン中の11のリボスイッチドメインの全てに関して転写鋳型を生成した。変性6％ＰＡＧＥにより転写産物を分離し、リン光画像解析装置により可視化した。併合終結および全長ＲＮＡと比較した終結帯域中のＲＮＡの比率を確定することにより、終結収量を概算した。
【０３７３】
Ｈ．実施例８：アデニンリボスイッチ
グアニンを認識し、そしてほとんどの他のプリン類似体を弁別するリボスイッチの一クラスが、近年同定された（実施例６参照）。グアニンリボスイッチのコンセンサス配列および構造特徴を保有する代表的ＲＮＡは、原核生物の多数の遺伝子の５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）に置かれるが、この場合、それらはプリンサルベージおよび生合成に関与するタンパク質の発現を制御する。本実施例は、この系統発生学的収集物の3つの代表物が、グアニンに関するよりも数等級良好な大きさである見掛けの解離定数（見掛けのＫD）に関する値を有するアデニンと結合することを示す。アデニンに対する選択は、リボスイッチのコア中の単一ヌクレオチド置換のためであり、この場合、各代表物はほとんど、ワトソン／クリック塩基対を形成することによりその対応するリガンドを認識すると思われる。さらに枯草菌のｙｄｈＬ遺伝子に関連したアデニン特異的リボスイッチは、遺伝子「オン」スイッチとして機能し、この場合、アデニン結合は、内在的転写ターミネーターステムの形成を妨げる構造的再配列を引き起こす。
【０３７４】
グアニン感知リボスイッチは、この化合物の濃度変化に応答して遺伝子発現を変調するＲＮＡ遺伝子制御素子の一クラスである（実施例６参照）。これは、種々の基本的化合物、例えばリシン、ならびに補酵素ＦＭＮ、ＳＡＭ、Ｂ12およびＴＰＰ（チアミンピロリン酸）に応答する遺伝子発現を調節する代謝産物結合リボスイッチの多数のクラスのうちの1つである（実施例６参照）。典型的には各リボスイッチは、遺伝子発現の変更パターンへの化学シグナルの変換器として一緒に機能する2つの機能性ドメイン、即ちアプタマーおよび発現プラットフォームから成る。アプタマーは標的代謝産物のための特定受容体として役立ち、この場合、リガンド結合は、アプタマーおよび発現プラットフォームドメインの両方におけるアロステリック変化を生じる。
【０３７５】
グアニン−およびリシン特異的リボスイッチからの天然アプタマーに関するリガンド特異性の詳細な検査を実行し（実施例６参照）、そしてＦＭＮ、ＳＡＭ、Ｂ12およびＴＰＰアプタマーの低包括的検査を実行した（実施例１〜３参照）。各々の場合、密接に関連する代謝産物類似体の結合さえも退けることにより、ＲＮＡは高レベルの分子弁別を示す。高度分子弁別のこの特質は、複合化学混合物の存在下で高度の精確さで生物学的過程を実行するために必要な、遺伝子調節因子を含めた酵素および受容体の特質である。
【０３７６】
グアニンリボスイッチの分子認識特質は、プリン複素環周囲のほぼ全ての位置がアプタマーによる高親和性結合のために重要であると思われる、という事実により区別される。したがって結合ポケットの配列は、グアニン濃度の変化に応答して遺伝子発現をリボスイッチに制御させが、しかしアデニンの漸増濃度に応答して遺伝子発現の変調を防止する（実施例６参照；Cristiansen, L.C., et al., J. Bacteriol. 179, 2540-1550 (1997)）。しかしながらＲＮＡから作られた受容体は、それらのタンパク質等価物と同様に、天然選択の結果として変更分子認識特性を獲得し得る、と思われる。これは、代謝経路に近接する代謝産物を選択的に感知し、それに応答する進化によりリボスイッチを出現させる。
【０３７７】
本実施例は、アデニンに応答するリボスイッチの変異体クラスの存在を確証する。これらのリボスイッチは、近年記載されたグアニンアプタマーに配列および二次構造が密接に対応するアプタマードメインを保有する（実施例６参照）。しかしながらリボスイッチのアデニンサブクラスの代表物はアプタマーの保存コア中にＣからＵへの突然変異を保有し、このことは、この残基が代謝産物認識に関与することを示す。結果は、この単一ヌクレオチドの同一性がグアニンおよびアデニン間の結合特異性を確定することを示し、このことが、複合リボスイッチ構造が新規代謝産物標的を認識するよう突然変異し得る方法の一例を提供する。
【０３７８】
１．結果
ｉ．リボスイッチドメイン間の系統発生学的比較
比較配列戦略を用いて、「Ｇボックス」と呼ばれる保存配列素子を保有する多数の原核生物種からの一連の遺伝子間領域を同定した（実施例６参照）。枯草菌は少なくとも5つのこれらのモチーフを保有するが、これも、遺伝学技法を用いて同定された（Johansen, L.E., et al., J. Bacteriol. 185, 5200-5209）。系統発生学の各代表物は、3つの潜在的塩基対合素子（Ｐ１〜Ｐ３）、ならびに今日までに同定された例の90％より多くに保存されている24という多数のヌクレオチドを有する。強調されたＧボックスモチーフに共通の特徴を有するこの系統発生学のサブセットを、本明細書中に提示する（図３５Ａ）。選定代表物をより詳細に試験すると、それらは直ぐ下流の遺伝子のｍＲＮＡ転写体により包含され、したがってあるｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ中に位置するＲＮＡ素子として存在する。
【０３７９】
ｙｄｈＬからのＲＮＡ（図３５Ｃ）に比してｘｐｔのグアニン結合ドメイン（図３５Ｂ）中に存在するいくつかの顕著な差を同定した。第一に、ｘｐｔと比較した場合のｙｄｈＬ中の23の配列変異の間で、20は塩基対合素子内に存在し、そしてこれらの変化のほとんどが塩基対合が保持されるのを可能にする。これは、2つのＲＮＡ間の全体的二次構造が類似する、ということを強く示す。第二に、残りの3つの突然変異は、2つ（ｘｐｔに関して位置３１および４８に対応する）が可変性であることが既知である位置に存在するよう、非対合領域に存在する。これらの突然変異は、ＲＮＡの構造および機能に有意に影響を及ぼさない。第三に、残りの突然変異は、そうでなければ３−ステム接合部の厳格に保存されたヌクレオチドに対応するｘｐｔに関して位置７４でのＣからＵへの変化である。この突然変異の位置を考えると、この変化はｙｄｈＬアプタマーの分子認識特質を変更し得る。
【０３８０】
ｉｉ．変異体ＧボックスＲＮＡは選択的にアデニンを結合する
ｘｐｔアプタマーはそのリガンドと多数の接触を成し、そして7つという多数の水素結合がＲＮＡ−リガンド複合体の形成に関与する、ということが確立された（実施例６参照）。さらに立体的衝突も、ＲＮＡにより結合され得る代謝産物の範囲を制限するのを手助けすると思われる、という証拠が存在する。この接触アレイは、グアニンの種々の側とＲＮＡの遠位部分との間に多数の相互作用を生成することにより確立され得るに過ぎない。
興味をそそる仮説は、ｘｐｔの位置７４のＣ残基がグアニンとワトソン／クリック塩基対を形成しており、したがってこれらの水素結合のうちの3つを形成すると考えられるという可能性である。Ｕ突然変異は、枯草菌ｙｄｈＬならびにウエルシュ菌C. perfringensおよびビブリオブルニフィカスV. vulnificusからの2つのＲＮＡにおける対応する位置に存在するため、これらのＲＮＡはアデニン応答性リボスイッチとして役立ち得る、とわれわれは考える。この仮説は、後者2つの遺伝子（ａｄｄ）がアデニンデアミナーゼ酵素をコードする、という認識によりさらに支持された。アデニンは、アデニンデアミナーゼの発現レベルを確定するためにその濃度がモニタリングされている代謝産物であるに違いない、ということは理にかなっていると思われる。
【０３８１】
直列プロービングを用いて、5つのＧボックスＲＮＡのリガンド特異性を調べた（Soukup, G.A. & Breaker, R.R., RNA 5, 1308-1325 (1999); Soukup, G.A., DeRose, E.C., RNA 7, 524-536 (2001)）。この検定では、ＲＮＡの自発的切断を、リガンドの非存在下で、あるいはグアニンまたはアデニンの存在下でモニタリングする。前に予測されたように（実施例６参照）、ｐｕｒＥ  ＲＮＡ（図３６Ａ）は、ｘｐｔＲＮＡに関して観察されたものに対応するグアニンの存在下での自発的切断産物のパターンの変化を示す（図３６Ｂ）。これらの結果は、試験したリガンドの濃度の存在下でインキュベートした場合、ｐｕｒＥ  ＲＮＡが、ｘｐｔＲＮＡと同様に、グアニンにアロステリックに応答し、アデニンには応答しない、ということを確証する。
【０３８２】
それに反して、Ｐ１およびＰ３間の接合部（ｘｐｔのＣ７４に対応する）におけるＣからＵへの突然変異を保有する3つのＲＮＡは全て、グアニンと応答するが、しかしアデニンの存在下でインキュベートした場合のみ、構造変調を示す。さらにアデニン特異的アプタマーに関する自発的切断のパターンは、ＧボックスＲＮＡに関して提唱された二次構造モデルと一致する（図３５）。これらの結果は、ＲＮＡのＧボックスクラスのある種の変異体がアデニンのセンサーとして役立つ、ということを示す。
【０３８３】
さらにこれらの知見は、それらの天然環境におかれた場合、枯草菌からのｙｄｈＬ  ＲＮＡならびにウエルシュ菌C. perfringensおよびビブリオブルニフィカスV. vulnificusからの2つのａｄｄＲＮＡはアデニン特異的リボスイッチとして役立つ、という仮説と一致する。
【０３８４】
ｉｉｉ．ｙｄｈＬアプタマーは高親和性および選択性でアデニンを結合する
リボスイッチの別の特質は、アプタマードメインがそれらの対応する標的化合物に対する緊密な結合を示し、そしてそれらが、いくつかの場合には、見掛けのＫDにおける大きさのオーダーで類似体を弁別する、というものである。例えば枯草菌ｘｐｔからのグアニンリボスイッチは、〜5 nMのグアニンに関する見掛けのＫDを示すが、しかし少なくとも100,000分の1の見掛けのＫDでアデニンを結合する。直列プロービング検定を用いて、これら2つのプリンに関する枯草菌８０ｙｄｈＬ  ＲＮＡの結合親和性を確定した。予測どおり、ＲＮＡは、漸増濃度のアデニンの存在下で自発的ＲＮＡ切断断片のパターンの漸進的変化を示す（図３７Ａ）が、しかし10 μMという高い漸増グアニン濃度を用いた場合はパターンは変わらないままである（下記参照）。
【０３８５】
漸増アデニン濃度により変化を受ける自発的切断断片に対応する帯域を4つの部位に分類し、存在する全ＲＮＡと比較した切断の程度を定量した。このデータを用いて、リガンド結合に関する見掛けのＫDの概算値を提供するプロットを作製した（図３７Ｂ）。この場合、部位１、２および４での自発的切断における半最大減少、ならびに部位３での自発的切断における対応する半最大増大は、約300 nMアデニンが直列プロービング検定に存在する場合に生じた。したがってｙｄｈＬアプタマーは、リボスイッチの他のクラスにより示されたものと類似する見掛けのＫDでアデニンを結合する。
【０３８６】
種々の類似体を用いた同一直列プロービング戦略を用いることにより、８０ｙｄｈＬの分子認識特質を調べた。例えばアデニンに類似の化学変異体である一連のプリン類似体は、ＲＮＡとの測定可能な結合を示す（図３８Ａ）。測定可能な結合を有するリガンド２，６−ＤＡＰ、Ａおよび２−ＡＰ、Ｐ、ＭＡ（親和性の低い順に列挙）は全て、アデニンの近似類似体である。さらに種々のリガンドに対するＲＮＡの相対親和性は、分子認識を確立するためにアプタマーが用いると思われる接点の何らかの指示を提供する（図３８Ａ、底部右）。このモデルは、一連のプリン類似体が８０ｙｄｈＬ  ＲＮＡとの測定可能な結合を示すことができない、という知見と一致する（図３８Ｂ）。
【０３８７】
８０ｙｄｈＬにより認識されるプリンのコレクションは、ｘｐｔアプタマーと比較して、ｙｄｈＬアプタマーによりプリンリガンドのワトソン／クリック塩基対合面のみが示差的に認識される、ということを示す。例えばＣ８位置での修飾（８−クロロアデニン）はリガンド結合を防止し、これは、ある種のプリント８０ｙｄｈＬとの間の立体的衝突が、ｘｐｔアプタマーの場合と同様に観察された、ということを意味する（実施例６参照）。興味深いことに、２，６−ＤＡＰは最もぴったり結合するリガンドであるが、アデニンはそうではないという事実は、ｙｄｈＬおよびｘｐｔアプタマー間の類似性を洞察する。この観察は、ｘｐｔアプタマー中に存在することが提唱された2つの水素結合受容体接触のうちの少なくとも1つを８０ｙｄｈＬ  ＲＮＡが保持する、ということを示唆する。したがってこれらのＲＮＡの分子認識特質は、ｘｐｔにおけるワトソン／クリックグアニン−Ｃ塩基対からｙｄｈＬにおけるワトソン／クリックアデニン−Ｕ塩基対への変化により説明され得るパターンを有するｘｐｔと分子認識において異なるｙｄｈＬ  ＲＮＡと一致する。
【０３８８】
ｉｖ．分子工学処理によるＧボックスＲＮＡの交換リガンド特異性
ｘｐｔおよびｙｄｈＬ  ＲＮＡはワトソン／クリック塩基対合相互作用によりグアニンまたはアデニンに対するそれらの特異性を引き出しているという考えを、分子工学処理アプローチを用いてより詳細に調べた。同様のアプローチは、グアニンからアデニンへの脱塩基ハンマーヘッド形リボザイム構築物のリガンド奪回特異性を変えるために、以前用いられた（Wilson, K.S. & Hippel, P.H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8793-8797）。Ｇボックスアプタマーの野生型（９３ｘｐｔおよび８０ｙｄｈＬ）および突然変異体（９３ｘｐｔＣからＵへおよび８０ｙｄｈＬ  ＵからＣへ）形態をともに生成し、グアニンおよびアデニンとの結合親和性に関して試験した（図３９）。突然変異は、ｘｐｔ配列に関してヌクレオチド位置７４に対応し（図３５Ｂ）、これはグアニンおよびアデニン間の分子弁別の決定因子であると推測される。
【０３８９】
前に観察されたように（実施例６参照）、ｘｐｔを基礎にしたアプタマーは、グアニンの存在下でインキュベートした場合にのみ、構造変調を示し、そして平衡透析検定においてトリチウム化グアニンの分布をシフトし得る（アデニンではできない）（図３９Ａ）。しかしながら位置７４にＣからＵへの単一突然変異を保有する９３ｘｐｔＲＮＡはもはやグアニンに応答しないが、しかしアデニンの存在下でのみ、平衡透析中に構造変調および結合活性を示す（図３９Ｂ）。これに反して、野生型８０ｙｄｈＬ  ＲＮＡはアデニンに対して特異的であり（図３９Ｃ）、一方、この重要なヌクレオチド位置での対応するＵからＣへの突然変異はグアニンに結合特異性を変更する（図３９Ｄ）。したがってＧボックスアプタマーの塩基特異性の主要決定因子は、ステムＰ１およびＰ３間の接合部に存在し、そしてこの塩基がほとんど、その標的リガンドを用いて慣用的ワトソン／クリック塩基対を形成すると思われるＣまたはＵ残基である。
【０３９０】
ｖ．枯草菌からのｙｄｈＬアデニンリボスイッチによる遺伝子制御のメカニズム
ほとんどの場合、リボスイッチは、交互塩基対構造間のアロステリック相互転換により、原核生物における遺伝子発現を制御する。例えば大腸菌のｔｈｉＭ遺伝子からのＴＰＰリボスイッチは、リガンドの存在下でｍＲＮＡのシネ−ダルガルノ配列を封鎖するために交互塩基対合を用いて、おそらくは、翻訳開始低減を生じる（実施例２参照）。これに反して、枯草菌からのＴＰＰリボスイッチは、リガンド結合事象を利用して、塩基対合パターンを変更し、そして転写延長を中止させる内在性ターミネーターステムを形成する（Gusarov, I & Nudler, E. Mol. Cell. 4, 495-504 (1999); Mironov, A.S. et al. Cell 111, 747-756 (2002)）。同様に、転写ターミネーターの代謝産物媒介性形成は、ＦＭＮ（実施例３および６参照）、ＳＡＭ（実施例７参照）、グアニン（実施例６参照）およびリシン（実施例５参照）に応答するリボスイッチのある種の例により用いられるメカニズムである。
【０３９１】
転写終結メカニズムの証拠が存在するか否かを査定するために、ｙｄｈＬリボスイッチのＵＴＲ配列を調べた。この可能性と一致するのは、ｙｄｈＬ  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲが、22という多数の塩基対、その後の一連の8つのウリジル残基から成る大型ヘアピンを形成し得る、という事実である（図４０Ａ）。近年、他でも特筆された（Johansen, L.E., et al., J. Bacteriol. 185, 5200-5209）この構造特徴は、内在性ターミネーターステムに特徴的である。アデニンの不存在下では、リボスイッチはこの内在性ターミネーターを形成し得る、と考えられた。真実である場合には、このリボスイッチに関する遺伝子制御状態はこの予測「オフ」状態に関与せず、これが転写終結を油どうすることによる遺伝子発現を防止する。アデニンの存在下では、遺伝子発現は、ターミネーターステムの左肩の実質部分がアプタマードメインのステムＰ１およびＰ３を形成するために必要であるために進行すると予測される。ステムＰ１およびＰ２はアデニンアプタマーの一部分を成す構成成分であるため、リガンド結合は、ターミネーターステムの形成を妨げる構造を確立する。
【０３９２】
レポーター構築物を生成することにより、ｙｄｈＬリボスイッチに関するこのメカニズムをin vivoで査定したが、この場合、種々の形態のグアニン−およびアデニン特異的リボスイッチを枯草菌ゲノム中に組入れた。対照として、野生型ｘｐｔリボスイッチ、あるいは位置７４にＣからＵへの突然変異を有するｘｐｔ突然変異体を用いて、2つのレポーター構築物を調製した。予測どおり、野生型ｘｐｔ構築物は、培地中に余分量のグアニンを与えられた場合、β−ガラクトシダーゼ発現の抑制を引き起こす（図４０ｂ）。この知見は、ｘｐｔからのグアニンリボスイッチの機能に関して前に報告されたものと同様である（実施例６参照）。アデニンも、6時間インキュベーション後に、レポーター発現の適度の（〜4倍）抑制を示す。この後者の作用はほとんど、この構築物に用いられるｘｐｔ−ｐｂｕＸプロモーターでアデニンに応答する転写開始の適度の下向き調節を提供することが既知である（Cristiansen, L.C., et al., J. Bacteriol. 179, 2540-1550 (1997)）ＰｕｒＲタンパク質の機能のためであると思われる。
【０３９３】
ＣからＵへの突然変異を保有するほぼ同一のｘｐｔ構築物はグアニン付加時に調節の損失を生じるが、しかしアデニンのための推定タンパク質依存性制御における変化を示さない（図４０Ｃ）。この結果は、この突然変異が成される場合にin vitroでの観察されたグアニン結合の損失と一致するが、しかしその結果生じるin vitroでのアデニンに対する特異性変化はin vivoでの活発なアデニン依存性遺伝子制御を可能にしない、ということを示唆する。ほぼ間違いなく、アデニン付加時の発現減少もまた、ＰｕｒＲタンパク質によるものである。
【０３９４】
ｘｐｔリボスイッチと対照をなして、対応する野生型および突然変異ｙｄｈＬレポーター構築物の性能は、後者が、リガンドレベルの上昇に対して逆に応答するアデニン依存性リボスイッチである、ということを示す。特に、野生型ｙｄｈＬ構築物は、リガンドの非存在下で、またはグアニンの存在下で検定した場合、非常に低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示す（図４０Ｄ）。しかしながら遺伝子発現における10倍より大きい増大が、付加アデニンに応答して起こる。さらに、アプタマーのＰ１〜Ｐ３接合部におけるＵからＣへの単一突然変異は、どのリガンドが用いられるかにかかわらず、実質的（〜100倍）抑制を引き起こす（図４０ｅ）。これはｙｄｈＬリボスイッチ機能に関して提唱されたモデルに反すると思われるが、しかしこの突然変異は実際にアデニン結合を崩壊するが、しかしそれはターミネーターステムにおいてミスマッチを起こさせもする、ということに留意することは重要である。このミスマッチがターミネーターステムに対して十分に不安定化しているか、あるいはこの突然変異がリボスイッチに関するフォールディング経路に悪影響を及ぼす場合には、遺伝子制御素子に関するデフォルト「オフ」状態はデフォルト「オン」に変わると予測される。したがって遺伝子発現の観察されたレベルは、その遺伝子制御素子が細胞中のプリンの濃度にとって問題にならない場合、ｙｄｈＬ遺伝子の完全活性化を示し得る。
【０３９５】
２．考察
ｉ．アデニンリボスイッチの構造および進化
グアニン−およびアデニン特異性ＧボックスＲＮＡ間の配列および生化学的類似性は、それらが二次および三次構造全体において類似している、ということを示す。ｘｐｔおよびｙｄｈＬアプタマーに単一突然変異を作ることによりこれらのアプタマーのリガンド特異性を容易に交換し得ることは、このような変化が天然集団において高頻度で起こり得る、ということを示唆する。しかしながら、ｘｐｔまたはｙｄｈＬリボスイッチの単一塩基変異体はどちらも、in vivoでの遺伝子制御における対応する特異性変化を示さないという事実は、リボスイッチ特異性における有用な交換を成すためには多数の突然変異が必要であり得る、ということを示唆する。
【０３９６】
結果的に生じる単一塩基ｘｐｔ変異体の結合親和性がその新規のリガンドに関して同じくらい強いというわけではない、ということに留意することは重要である。特に野生型ｘｐｔＲＮＡは5 nMより弱くないグアニンに関する見掛けのＫDを有する（図３９ａ）が、一方、このＲＮＡのＣからＵへの変異体は、〜100nMのアデニンに関する見掛けのＫDを示す（図３９ｂ）。この場合、突然変異はグアニンおよびアデニン間の塩基弁別の実質的変化を生じるが、しかしマッチトリガンドに関する結合親和性は多少劣化された。それに反して、野生型および突然変異ｙｄｈＬ  ＲＮＡは、マッチトリガンドに対する特異性変化および結合親和性の保持の両方を示す（図３９Ｃおよび３９Ｄ）。しかしながらグアニンに対する８０ｙｄｈＬのＵからＣへの変異体に関する親和性は、９３ｘｐｔの場合の少なくとも10分の1であると思われる。
【０３９７】
したがってリガンド特異性を直接限定しないが、しかし結合親和性をさらに調整する随伴突然変異は、生物学的環境においてグアニンおよびアデニンリガンド間で相互交換するためにＧボックスＲＮＡにとって必要であり得る。この点で、ｙｄｈＬおよびｘｐｔアプタマーが23の位置で互いに異なり、明らかに重要な位置（ｘｐｔのＣ７４）内には1つだけ存在する、ということは興味深い。これらの突然変異のいくつかはアプタマーの結合親和性を調整するのに役立ち得るが、しかし多くは、それらが不可欠な二次構造素子を保持するために可能にされるＲＮＡ配列における中立的変化の結果であり得る。
【０３９８】
ｉｉ．ｙｄｈＬ  ｍＲＮＡの遺伝子制御および機能
２−フルオロアデニンの毒性作用に耐える枯草菌の突然変異体株が、近年報告された（Johansen, L.E., et al., J. Bacteriol. 185, 5200-5209）。ｙｄｈＬ遺伝子産物の過剰発現を引き起こすこれらの突然変異を、アデニンリボスイッチドメインにマッピングした。いずれの場合も、変化（欠失）は、ターミネーターステムの一部を排除することにより、あるいはターミネーターステムとそしてアデニンアプタマードメインの一部をともに排除することにより、リボスイッチ機能を破壊する、と予測される。両方の場合に、変異体は、リボスイッチがそのデフォルト状態を取るのを妨げ（転写終結）、これが遺伝子発現の非変調活性化を引き起こす。
【０３９９】
ｙｄｈＬ遺伝子（ｐｂｕＥとも呼ばれる）のタンパク質産物は、プリン流出ポンプであると提唱されている（Johansen, L.E., et al., J. Bacteriol. 185, 5200-5209）。したがってｙｄｈＬからのアデニンリボスイッチの崩壊により細胞に付与される２−フルオロアデニンに対する耐性は、この毒性化合物の分泌のためであり得る。天然遺伝子背景では、細胞内の過剰アデニンの存在はほとんど、ｙｄｈＬ遺伝子の発現増大を誘導して、プリン流出タンパク質を産生すると思われる。次に高レベルのこのタンパク質が、１つまたは複数の形態のこの化合物クラスを細胞から押出すことにより、プリンの濃度を正常化するよう働く。
【０４００】
ｉｉｉ．リボスイッチメカニズム−代謝産物濃度上昇による遺伝子活性化および非活性化
枯草菌からのアデニンリボスイッチは、その作用メカニズムに関しても注目に値する。今日までに調べられたリボスイッチの大多数において、代謝産物結合は遺伝子発現の低下を引き起こす。これは、完全ｍＲＮＡの転写を防止するためのターミネーターステムのリガンド媒介性形成により、あるいはシネ−ダルガルノ配列を封鎖し、そして翻訳開始を妨げることにより生じる。ほとんどの場合、十分レベルの特定の代謝産物の蓄積は理論的に、化合物の生合成または移入に関与する遺伝子を止めるためのシグナルを提供るはずあるので、遺伝子発現の下向き調節が予測される（Grundy, F.J. & Henkin, T.M. et al., Frontiers Biosci. 8, D20-31 (2003)。）
【０４０１】
ｙｄｈＬからのアデニンリボスイッチ（そしておそらくはａｄｄリボスイッチに関しても同様に）は、その機能が、高濃度の標的化合物の存在下でのリボスイッチ活性化のための必要性をほのめかす遺伝子の一群に属する。ｙｄｈＬの場合、ある種のプリン、例えばグアニンが適度の濃度で不溶性であると考えると、過剰プリンの廃棄は重要な能力であると思われる。あるいはアデニン濃度が例外的に低い場合、アデニンデアミナーゼを発現する明白な必要性はなく、したがってウエルシュ菌C. perfringensおよびビブリオブルニフィカスV. vulnificusのａｄｄ遺伝子からのリボスイッチは、同様にリガンド結合により活性化され得る、とわれわれは予測する。興味深いことに、枯草菌およびその他のグラム陽性生物における多数のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの発現を制御する５’−ＵＴＲであるＴボックスドメイン（Grundy, F.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11121-11126）も、それらが感知する標的の濃度上昇に応答して遺伝子発現を誘導する。しかしながら既知の代謝産物結合ドメインとは違って、Ｔボックスドメインは、その発現をそれらが制御する酵素の生成物に対する生化学的前駆体を感知する（Miller, J.H. A Short Course in Bacterial Genetics.  Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992)）。
【０４０２】
代謝産物増大に応答して遺伝子活性化を誘導するリボスイッチは、遺伝的必要性のために低頻度で起こるとわれわれは予測するが、しかし遺伝子活性化および遺伝子非活性化リボスイッチ間のこの分布をゆがめるＲＮＡフォールディングにおける固有の構造的欠陥は認められない。リボスイッチが、遺伝子発現を活性化するかまたは抑制することによりリガンド結合に応答するが、いずれにせよ、ＲＮＡは、ＲＮＡフォールディングの同一原理に基づいている二次および／または三次構造におけるアロステリック変化を利用する。活性化および抑制リボスイッチ間の唯一の絶対的差異は発現プラットフォームの微細構造であり、一方、アプタマードメインは依然として大きく変化しないままであり得る。
【０４０３】
３．方法
ｉ．プリン類似体
グアニン、アデニン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、ヒポキサンチン、キサンチン、１−メチルアデニン、プリン、６−メチルアミノプリン、Ｎ6−Ｎ6ジメチルアデニン、６−メルカプトプリン、３−メチルアデニン、グアニン−８−3Ｈおよびアデニン−２，８−3Ｈを、Sigmaから購入した。６−シアノプリンおよび８−アザアデニンを、Aldrichから購入し、２−クロロアデニン、８−クロロアデニンをBiolog Life Science Institute, Germanyから購入した。
【０４０４】
ｉｉ．ＤＮＡオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、エール大学のHHMI Keck Foundation Biotechnology Resource Centerが合成し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、そして10 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5, 23℃）、200 mMＮａＣｌおよび1 ｍＭEDTAを含有する緩衝液中での粉砕／浸漬により、ゲルから溶離した。エタノールを用いてＤＮＡを沈降させ、脱イオン水中に再懸濁し、使用するまで−20℃で保存した。
【０４０５】
ｉｉｉ．ＲＮＡ構築物の直列プロービング
実施例６に記載したように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてin vitro転写し、脱リン酸化し、そして32Ｐで５’末端標識することにより、対応するＰＣＲ  ＤＮＡ鋳型から、ＲＮＡ構築物を合成した。典型的直列プロービング検定では、2 nMの標識ＲＮＡを、各実験に関して示したのと同じプリン化合物の不存在下または存在下で、20 mMＭｇＣｌ2、50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.5, 25℃）および100 mMＫＣｌを含有する緩衝液中で25℃で40時間インキュベートした。別記しない限り、1 nM〜10 μMの範囲のプリン濃度を用いた。各インキュベーションの終了時に、変性（8 M尿素）10％ＰＡＧＥ上で自発的切断産物を分離し、リン光画像解析装置を用いて可視化し、そしてImageQuaNTソフトウェア（Molecular Dynamics）を用いて定量した。
【０４０６】
ｉｖ．平衡透析
Dispo平衡透析機（Harvard Bioscience）を用いて、平衡透析検定を実行した。この場合、5,000ＭＷＣＯ膜により、小室ＡおよびＢを分離した。小室Ａは、50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.5, 25℃）、20 mMＭｇＣｌ2および100 mMＫＣｌを含有する緩衝液中に100 nMの濃度で30 μlの3Ｈ−グアニンまたは3Ｈ−アデニンを含有した。3 μMの濃度でＲＮＡを含有する上記の緩衝液の30 μlアリコートを、小室Ｂに送達した。25℃で10時間平衡を進行させた。その後、5 μlを各小室から取り出し、液体シンチレーション計数により定量した。
【０４０７】
ｖ．ｘｐｔ−およびｙｄｈＬ−ｌａｃＺ融合物の構築
ｙｄｈＬの翻訳開始部位に関してヌクレオチド−４６８〜＋９を包含するＤＮＡ構築物を、ＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１制限部位を導入されたプライマーを用いて、枯草菌１Ａ４０菌株（Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH）からＰＣＲ増幅した。野生型構築物を、ｌａｃＺレポーター遺伝子の直ぐ上流のＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１制限部位でｐＤＧ１６６１中にクローン化し、シーケンシングして、その完全性を確証した。その結果生じたプラスミドを、適切なプライマーを用いたQuickChange部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）による部位特異的突然変異誘発のための鋳型として用いた。プラスミド突然変異体を、枯草菌１Ａ４０菌株のａｍｙＥ遺伝子座に組み込んで、形質転換体を、実施例６に記載したのと同様に確証した。
【０４０８】
ｖｉ．リボスイッチ機能のin vivo分析
0.4％ w/vグルコース、20 g/L（ＮＨ4）2ＳＯ4、25 g/LＫ2ＨＰＯ4、6 g/LＫＨ2ＰＯ4、1 g/Lクエン酸ナトリウム、0.2 g/LＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、0.2％グルタミン酸塩、5 μg/mlクロラムフェニコール、50 μg/mLＬ−トリプトファン、50 μg/mLＬ−リシンおよび50 μg/LＬ−メチオニンを含有する最少培地中で、37℃で絶えず振盪しながら、形質転換枯草菌細胞を中期対数期に増殖させた。グアニンまたはアデニンを付加して、最終濃度を0.1 mg/mlとした。中期対数期の細胞を収穫し、プリンの存在下または非存在下で最少培地中に再懸濁し、各実験に関して指示したようなさらなる時間の間増殖させ、この時点で、1 mlの細胞を、Miller (Miller, In: A Short Course in Bacterial Genetics Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, p.72. (1992)により記載された方法の変法を用いて、β−ガラクトシダーゼ酵素検定に付した。
【０４０９】
Ｉ．実施例９：本明細書中で考察したＳＡＭ、コバラミン、グアニン、アデニンおよびリシンリボスイッチに関する配列比較表
図４１は、リボスイッチの配列および型を示す。これらの配列のアラインメントは、本明細書中に開示されたものと同様であり、他の図面に開示された領域は、図４１における同一領域に対応する。
【０４１０】
SequenceSnifferプログラムを用いて、公表済みアラインメントおよび二次構造に基づいて、付加的リボスイッチが見出された（Grundy, F.J. & Henkin, T.M. The S box regulon: a new global transcription termination control system for methionine and cysteine biosynthesis genes in Gram-positive bacterial. Mol. Microbiol. 30, 737-749 (1998)）。このプログラムは、連結配列モチーフおよび塩基対合束縛により限定されるＲＮＡパターンとの縮重マッチを見出す。アラインメント中では、塩基対合領域は同一色のバックグラウンドを有し、そして実施例１〜８で考察した対応する図面におけると同様に標識する。推定偽結び目の付加をＰＳで印を付ける。いくつかの配列に関して、予測ターミネーター（黄色）および開始コドン（緑色）に印を付ける。指示GenBank記録または未完成ゲノム整列群中の各配列に関する位置は、丸（●）で印を付けた配列カラムに関するものである−アプタマーの５’であるステムＰ１中の第５塩基。開始は、星印（＊）で印を付けたカラム−アプタマーの３’であるステムＰ１中の第６塩基−からオペロン中の最初の遺伝子の開始コドンまでのオフセットである。ＣＯＧＮＩＴＯＲ（Tatusov, R.L. et al., The COG database: new developments in phylogenetic classification of proteins from complete genomes. Nucleic Acids Res. 29, 22-28 (2001)）およびＰＦＡＭ（Bateman, A., et al., The Pfam Protein Families Database. Nucleic Acids Res. 30, 276-280 (2002)）データベースマッチから同定された遺伝子は、GenBank記録中に注釈されたタンパク質配列とマッチする。可能な場合は、これらのデータベースからの標準名を用いる（2011＝ＣＯＧ２０１１；????＝無マッチ）。枯草菌に関する従来のオペロン名を括弧内に示す（Grundy, F.J. & Henkin, T.M. The S box regulon: a new global transcription termination control system for methionine and cysteine biosynthesis genes in Gram-positive bacterial. Mol. Microbiol. 30, 737-749 (1998)）。ステムＰ１に包含される塩基間の＜90％対毎同一性を有する配列のサブセットを、コンセンサス配列を確定するために選択した。コンセンサス配列では、小文字および大文字塩基は、それぞれある位置での＞80％および＞90％保存を示す。単一塩基が＞80％保存を示さなかった場合、プリン（Ｒ）およびピリミジン（Ｙ）塩基を割り当てた。
【０４１１】
（＊）配列は別の配列と＞90％同一性を共有し、コンセンサスを確定する場合には除外した。
（１）誤って注釈されたＯＲＦであり得る非常に短い仮説的遺伝子。
（２）考え得るＳボックス「偽遺伝子」。Ｓボックスは指示オペロンの反対鎖５’上にある。
【０４１２】
開示された方法および組成物は、これらは変化し得るので、記載された特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されない、と理解される。本明細書中に用いられた用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではない、ということも理解される。
【０４１３】
本明細書中で用いる場合、そして添付の特許請求の範囲においては、単数形態「a」、「an」および「the」は、明確に別記しない限り、複数の言及を含む、ということに留意しなければならない。したがって例えば「1つの（a）リボスイッチ」に対する言及は、複数のこのようなリボスイッチを含み、「その（the）リボスイッチ」に対する言及は、１つまたは複数のリボスイッチならびに当業者に既知のその等価物への言及である、といった具合である。
【０４１４】
「任意の」または「任意に」とは、次に記載される事象、環境または物質が起こり得るかまたは存在し得る、あるいは起こり得ないかまたは存在し得ないということを、そしてその説明が、事象、環境または物質が起こるかまたは存在する場合、ならびにそれが起きないかまたは存在しない場合を含むということを意味する。
【０４１５】
範囲は、「およそ」のある特定の値から、および／または「およそ」の別の特定の値までとして、本明細書中では表され得る。このような範囲が表される場合、特に意図され、よく考えた上で開示されるのは、特に別記しない限り、ある特定の値からおよび／または他の特定の値までの範囲である。同様に、値が近似値として表される場合、先行する「およそ」の使用により、特定の値は、特に別記しない限り、別の、特に、よく考えた上で開示されるべきである特に意図された実施形態を生じる、と理解される。さらに、範囲の各々の端点は、特に別記しない限り、他の端点に関してそして他の端点と独立して、有意である、と理解される。最後に、明瞭に開示された範囲内に含入される個々の値および値の亜範囲も全て、特定的に意図された、と理解されるべきであり、そして特に別記しない限り、よく考えた上で開示されるべきである。上記は、特定の例において、これらの実施形態のいくつかまたは全てが明瞭に開示されるか否かにかかわらず、適用する。
【０４１６】
別記しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術的および科学的用語は、開示された方法および組成物が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと類似のまたは等価の任意の方法および物質が本発明の方法および組成物の実施または試験に用いられ得るが、しかし特に有用な方法、装置および物質は記載されたものと同一である。本明細書中で引用された出版物、ならびにそれらが引用されるための物質は、参照により本明細書中で特に援用される。本発明は、従来の発明に基づいてこのような開示に先行する資格を与えられていない、ということの承認と解釈されるべきものは、本明細書中にはない。任意の参考文献は従来技術を構成する、という承認は成されない。参考文献の考察は、それらの著者等が力説し、そして出願人等が引用文書の正確さおよび妥当性に挑戦する権利を保持することを記述する。多数の出版物が本明細書中で言及されているが、しかしこのような参考文献は、これらの文書のいずれかが当該技術分野における共通の一般的知識の一部を構成するという承認を与えない、ということは明らかに理解されるべきである。
【０４１７】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、「〜を含む」という語、ならびにその後の変形、例えば「〜から成る」および「〜を含む（単数）」は、「〜を包含するが、それに限定されない」ことを意味し、例えば他の添加物、構成成分、完全体または段階を除外するよう意図されない。
【０４１８】
ルーチンに過ぎない実験、本明細書中に記載された方法および組成物の特定の実施形態の多数の等価物を用いて、当業者は認識し、あるいは確認し得る。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４１−４】
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【図４１−５】
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【図４１−６】
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【図４１−７】
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【図４１−８】
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【図４１−９】
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【図４１−１０】
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【図４１−１１】
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【図４１−１２】
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【図４１−１３】
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【図４１−３１】
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【図４１−４２】
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【図４１−４３】
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【図４１−４４】
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【図４１−４５】
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【図４１−４６】
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【図４１−４７】
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【図４１−４８】
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【図４１−４９】
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