(57)【要約】【課題】内因性サイトカイニン濃度の減少を介する、オーキシン効果の閉じ込め、根の成長の維持、ならびに増加した種子、胚および子葉の大きさおよび／または重量の促進に関する問題を克服すること。【解決手段】根の成長を刺激するか、または側根もしくは不定根の形成を増強するか、または根の横地重力屈性を変更するための方法であって、該方法は、植物または植物の一部において活性なサイトカイニンのレベルを低減させる、植物サイトカイニンオキシダーゼまたは他のタンパク質のレベルを、植物または植物の一部において増加させる工程を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、植物の形態学的、生化学的、および生理学的な、特性または特徴を改変するための方法（例えば、１つ以上の発生プロセスおよび／または環境適合プロセス（根の成長、および／または不定根形成および／もしくは側根形成、および／または根屈地性、および／または根の成長、および／または頂芽優性、および／または分枝、および／または老衰の時期、および／または開花の時期、および／または花形成、および／または種子発生、および／または種子生成の、開始もしくは刺激もしくは増強の改変を含むが、これらに限定されない））に関する。種子の大きさおよび／または重量を増加するための方法、胚の大きさおよび／または重量を増加するための方法、ならびに子葉の大きさおよび／または重量を増加する方法もまた、提供される。これらの方法は、植物において、調節可能なプロモーター配列（例えば、細胞特異的プロモーター配列、組織特異的プロモーター配列、または器官特異的プロモーター配列）の制御下で作動可能である、サイトカイニン分解制御タンパク質（特に、サイトカイニンオキシダーゼ）を発現する工程を包含する。好ましくは、本発明により改変される特徴は、サイトカイニン媒介性特徴および／またはオーキシン媒介性特徴である。本発明は、本方法を実施するために有用である遺伝子構築物、およびその遺伝子構築物により生成された、他の同系対応物と比較して変化した形態学的特性および／または生化学的特性および／または生理学的特性を有するトランスジェニック植物に及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
根は、高等植物の重要な器官である。その主要な機能は、土壌における植物の固定、ならびに水および栄養素（Ｎ栄養、無機質など）の取り込みである。従って、根の成長は、特に栄養素制限条件下で、空気中にある器官の成長および収穫量に対して直接的または間接的な影響を有する。根はまた、二次植物産物（例えば、防御化合物および植物ホルモン）の生成に関係する。
【０００３】
根はまた、多数の重要な主要穀物における貯蔵器官である。甜菜は、ヨーロッパにおける糖生成のための最も重要な植物である（２６０Ｍｉｌｌ  ｔ／年；世界生産の３８％）。カサバ（Ｍａｎｉｏｃ（ｃａｓｓａｖａ））、ヤムおよびサツマイモ（ｓｗｅｅｔ  ｐｏｔａｔｏ（ｂａｔａｔｅ））は、重要なデンプン生成体である（約１５０  Ｍｉｌｌ  ｔ／各年）。そのデンプン含量は、ジャガイモの二倍であり得る。根はまた、多数の野菜（例えば、ニンジン、ラディッシュ）、ハーブ（例えば、ショウガ、ククマ（ｋｕｋｕｍａ））および医療植物（例えば、チョウセンニンジン）における消費関連器官である。さらに、根において見出される二次植物産物のうちのいくつかは、化学産業および薬学産業において経済的に重要である。例は、ヤムであり、これは、ステロイドホルモンの合成のための基礎分子を含む。別の例は、シコニンであり、これは、毛根培養物においてＬｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎの根により生成される。シコニンは、その抗炎症特性、抗腫瘍特性および創傷治癒特性のために使用される。
【０００４】
さらに、穀物植物の改善された根の成長はまた、雑草植物との競争を増強し、そして水の接近性および取り込みを増加することによって、乾燥領域における成長を改善する。
【０００５】
改善された根の成長はまた、経済的目的（例えば、バイオレメディエーションおよび土壌侵食の予防／阻止）のために適切である。
【０００６】
根の構造は、古典的育種を通してはほぼ未開のたままである領域であり、それは、この分野においてこの形質を評価することが困難であることに起因する。従って、バイオテクノロジーは、この形質の改善に対して有意な影響を有し得る。なぜなら、バイオテクノローは、この分野において大規模スクリーニングに依存しないからである。むしろ、バイオテクノロジーアプローチは、その植物の特定の特徴を決定する分子成分の基礎的理解を必要とする。今日、この知見は、単に断片的に過ぎず、結果として、バイオテクノロジーは、この領域における躍進をこれまで実現できなかった。
【０００７】
根の成長についての十分に確立された調節因子は、オーキシンである。成長中の植物に対するインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）の適用は、側根成長および側根伸長を刺激する（Ｔｏｒｒｅｙ，Ａｍ  Ｊ  Ｂｏｔ  ３７：２５７〜２６４，１９５０；Ｂｌａｋｅｌｙら、Ｂｏｔ  Ｇａｚ  １４３：３４１〜３５２，１９８２；ＭｕｄａｙおよびＨａｗｏｒｔｈ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２：１９３〜２０３，１９９４）。広範囲の濃度のＩＡＡに曝露された根は、側根数の増加を開始した（Ｋｅｒｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１２２：９２５〜９３２，２０００）。さらに、特定の濃度の外因性オーキシンに応答して生じた側根を有する根が後により高濃度のＩＡＡに暴露された場合、既存の側根の間に間隔を空けた多数の過剰な側根が形成された（Ｋｅｒｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１２２：９２５〜９３２，２０００）。逆に、オーキシン輸送インヒビター（ＮＰＡを含む）を含む寒天における根の成長は、側根数を減少する（ＭｕｄａｙおよびＨａｗｏｒｔｈ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２：１９３〜２０３，１９９４）。
【０００８】
増加したレベルの内因性ＩＡＡを含むアラビドプシス変異体が、単離された（Ｂｏｅｒｊａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１４０５〜１４１，１９９５；Ｃｅｌｅｎｚａら、Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ  ９：２１３１〜２１４２，１９９５；Ｋｉｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：２０２３〜２９３７，１９９５；Ｌｅｈｍａｎら、Ｃｅｌｌ  ８５：１８３〜１９４，１９９６）。これらの変異体は、第２染色体上に位置する単一遺伝子座の対立遺伝子であることが現在公知である。これらの変異体の種子は、過剰な不定側根を有し、このことは、上記の外部オーキシン適用の効果と一致する。
【０００９】
不定側根形成に対するオーキシンの刺激効果は、トランスジェニック植物のおけるオーキシンの過剰生成が、根の成長を増加するための有効なストラテジーであることを示唆する。しかし、このことがまた、改善された特徴を有する商業製品を生じるか否かは疑問である。不定側根形成に対するその刺激効果とは別に、オーキシン過剰生成は、他の効果（例えば、葉数の減少、異常な葉形態（狭い、巻いた葉）、開花の中止、頂芽優性の増加、幹における不定根形成）を誘発し、これらの効果のうちのほとんどは、農業的検知からは望ましくない（Ｋｌｅｅら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ  １：８６〜９６，１９８７；Ｋａｒｅｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５：２２５〜２３６，１９９０）。従って、オーキシン合成の増加に依存するアプローチに関する主要な問題は、閉じ込めの問題、すなわち、オーキシンの効果を根に閉じ込めることである。この閉じ込めの問題は、組織特異的プロモーターを使用することによっては克服されないであろう。オーキシンは、植物において輸送され、その作用は、結果的には、合成部位に限定されない。別の問題は、オーキシンが常に根の全バイオマスを増加するか否かである。寒天で成長させた根について、濃度の増加により徐々に側根形成が刺激されたが、結果的に、これらの根の成長は阻害された（Ｋｅｒｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２２：９２５〜９３２，２０００）。
【００１０】
種子は、高等植物の生殖単位である。植物種子は、発芽後の胚の栄養を確保するために貯蔵化合物を含む。これらの貯蔵器官は、ヒトの栄養および家畜の給餌に有意に寄与する。種子は、３つの主要部分（すなわち、胚、内乳および種皮）からなる。貯蔵化合物は、内乳（例えば、すべての穀物において、二重受精から生じる）、いわゆる外乳（珠心組織に由来する）または子葉（例えば、マメ変種）のいずれかである貯蔵器官中に貯蔵される。貯蔵化合物は、脂質（脂肪種子セイヨウアブラナ）、タンパク質（例えば、穀物のアリュ−ロン中）、または炭水化物（デンプン、ラフィノース様オリゴ糖）である。
【００１１】
デンプンは、穀物の種子における貯蔵化合物である。最も重要な種は、トウモロコシ（ＦＡＯ  １９９５によると、毎年生産約５７０ｍｉｏ  ｔ）、コメ（毎年５４０ｍｉｏ  ｔ）、およびコムギ（毎年５３０ｍｉｏ  ｔ）である。タンパク質が豊富な種子は、種々の種類のマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｓｐｅｃ．，Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ，Ｖｉｇｎａ  Ｓｐｅｃ．；毎年約２０ｍｉｏ  ｔ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ；毎年１４ｍｉｏ  ｔ）およびダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ；毎年１３６ｍｉｏ  ｔ）である。ダイズ種子はまた、脂質の重要な供給源でもある。脂質が豊富な種子は、種々のＢｒａｓｓｉｃａ種（毎年約３０ｍｉｏ  ｔ）、ワタ、東洋ゴマ、アマ、ポピー、ヒマの実、ヒマワリ、ラッカセイ、ココナッツ、アブラヤシ、およびこれらより経済的に重要ではない他のいくつかの植物である。
【００１２】
受精の後、発生中の種子は、植物の供給源器官から栄養化合物を誘引しそれを使用して、貯蔵器官において貯蔵化合物を生成する、溜め込み（ｓｉｎｋ）器官になる。種子の大きさおよび重量の増加は、種々の多くの穀物種にとって望ましい。増加したデンプン蓄積、タンパク質蓄積および脂質蓄積、従って、摂取の際の栄養増加に加えて、種子の大きさおよび／または重量の増加ならびに子葉の大きさおよび／または重量の増加は、発芽の際のより速い成長（早期強勢）およびストレス寛容の増加に関連付けられる。サイトカイニンは、溜め込み（ｓｉｎｋ）強度を決定する際の重要な因子である。一般的概念は、サイトカイニンが溜め込み（ｓｉｎｋ）強度の正の調節因子であると予測する。
【００１３】
多数の報告が、種々の発生プロセス（例えば、根の成長および分枝、苗条における頂芽優性の制御、葉緑体の発生、および葉の老衰）におけるサイトカイニンの刺激機能または阻害機能を記載する（Ｍｏｋ  Ｍ．Ｃ．（１９９４）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｍｏｔ，Ｄ．Ｗ．Ｓ．およびＭｏｋ，Ｍ．Ｃ．編（ＣＲＣ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＩ）、ｐｐ．１５５〜１６６）。サイロカイニンの生物学的機能についての結論は、主に、外因性サイトカイニン適用の結果または内因的に増加したサイトカイニンレベルの結果に関する研究に由来する（Ｋｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．およびＬａｎｅｈｏｎ，Ｍ．Ｂ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｅｓ，Ｐ．Ｊ．編（Ｋｌｕｗｅｒ，Ｄｏｒｄｒｄｒｏｃｈｔ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ），ｐｐ．３４０〜３５３，Ｓｍｕｌｌｉｎｇ，Ｔ．，Ｒｕｐｐ．，Ｈ．Ｍ．Ｆｒａｎｋ，ＭおよびＳｃｈａｆｅｒｍ，Ｓ．（１９９９）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｓｕｒｎａｄ，Ｍ．，Ｐａｃ  Ｐ．およびＢｅｃｋ，Ｅ．編（Ｐｅｒｅｓ，Ｐｒａｇｕｅ）ｐｐ．８５〜９６）。現在まで、逆の問題：内因性サイトカイニン濃度が減少した場合、何が植物成長および発達についての結果であるのか？に取り組むことは可能ではなかった。サイトカイニン含量が減少した植物は、サイロカイニンが制限し従って調節し得るプロセスについてのより正確な情報をもたらすと予期される。他の植物ホルモン（例えば、アブシジン酸、ジベレリン、およびエチレン）とは異なり、サイトカイニン生合成変異体は単離されていない（Ｈｏｏｙｋｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．Ｊ．，Ｈａｌｌ，Ｍ．Ａ．およびＬｉｂｂｅｕｇａ，Ｋ．Ｒ．編（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。
【００１４】
異化酵素サイトカイニンオキシダーゼ（ＣＫＸ）は、植物組織におけるサイトカイニンレベルを制御する際に中心的役割を果す。ＣＫＸ活性は、多数の高等植物および種々の植物組織において見出されている。この酵素は、不飽和のイソプレノイド側鎖を保有するサイロカイニンの分解を触媒する、ＦＡＤ含有オキシドレダクターゼである。遊離塩基ｉＰおよびＺならびにその個々のリボシドが、好ましい基質である。ｉＰ異化の反応生成物は、アデニンおよび不飽和アルデヒド３−メチル−２−ブトナールである（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｊ．（１９９４）Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｍｏｋ．Ｄ．Ｗ．Ｓ．およびＭｏｋ，Ｍ．Ｃ．編（ＣＲＣ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）ｐｐ．１３９〜１５４）。最近、Ｚｅａ  ｍａｙｓ由来のサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子が、単離された（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｂｉｌｙｅｕ，Ｋ．Ｄ．，Ｌａｓｋｅｙ，Ｊ．Ｇ．およびＣｈｅｒｉｃｈ，Ｎ．Ｎ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５，３２８〜３３３，Ｈｏｕｂａ−Ｈｅｒｉａ，Ｎ．，Ｐｅｔｈｅ，Ｃ．ｄ’Ａｌａｙｅｒ，ＪおよびＬｅｌｏｕｃ，Ｍ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１７：６１５〜６２６）。ＣＫＸ遺伝子発現の操作は、サイトカイニン生合成変異体の欠損を部分的に克服し得、高等植物の全生活環の間のｉＰ型サイトカイニンおよびＺ型サイトカイニンの関連性を研究するための強力な道具として使用され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、内因性サイトカイニン濃度の減少を介する、オーキシン効果の閉じ込め、根の成長の維持、ならびに増加した種子、胚および子葉の大きさおよび／または重量の促進に関する問題を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、植物サイトカイニンオキシダーゼタンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸配列、およびベクター、宿主細胞、ならびにそのタンパク質、核酸配列およびベクターを含む、トランスジェニック植物細胞、植物、および植物部分を提供する。例えば、本発明は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のサイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物に関する。この遺伝子は、調節性プロモーターの制御下で発現され得る。このプロモーターは、内因性組織特異的因子もしくは環境特異的因子によって調節され得るか、あるいは、特定の化学物質の適用により誘導され得る。
【００１７】
本発明はまた、サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の発現、または植物もしくは植物部分における活性サイトカイニンレベルを減少するタンパク質をコードする核酸の発現によって、根の構造およびバイオマスを改変するための方法に関する。好ましくは、発現は、根または特定の組織または根の特定の細胞型に特異的なプロモーターの制御下である。
【００１８】
さらに、本発明は、種子の大きさおよび／もしくは重量、胚の大きさおよび／もしくは重量、ならびに子葉の大きさおよび／もしくは重量を増加する方法に関する。この方法は、サイトカイニン遺伝子の発現、または植物もしくは植物部分における活性サイトカイニンレベルを減少するタンパク質をコードする核酸の発現を包含する。好ましくは、発現は、種子、胚、または子葉において優先的に発現を指向するプロモーターの制御下である。
・本願は、以下を提供し得る：
・（項目１）
根の成長を刺激するか、または側根もしくは不定根の形成を増強するか、または根の横地重力屈性を変更するための方法であって、該方法は、植物または植物の一部において活性サイトカイニンのレベルを低減させる、植物サイトカイニンオキシダーゼまたは他のタンパク質のレベルを、植物または植物の一部において増加させる工程を包含する、方法。
・（項目２）
根の成長を刺激するか、または側根もしくは不定根の形成を増強するか、または根の横地重力屈性を変更するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）配列番号２７、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８〜３１、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかに示されるＤＮＡ配列またはこれらの相補体を含む、核酸；
（ｂ）配列番号２７、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８〜３１、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかに示されるＲＮＡ配列またはこれらの相補体を含む、核酸；
（ｃ）配列番号２７、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８〜３１、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかに特異的にハイブリダイズする核酸、またはこれらの相補体；
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号３２もしくは配列番号３５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、またはその相補体；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかにおいて規定される核酸であって、該核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＲＮＡであるという点で特徴付けられ、該ＲＮＡにおいて、ＴはＵで置換されている、核酸；
（ｆ）遺伝子コードの結果として、配列番号２７、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８〜３１、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかに示される核酸に対して縮重しているか、または（ａ）〜（ｅ）のいずれかにおいて規定される核酸に対して縮重している、核酸；
（ｇ）種間のコドン用法の差異に起因して、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２もしくは配列番号３５のいずれかに示されるタンパク質をコードする核酸に由来する核酸、または（ａ）〜（ｅ）のいずれかにおいて規定される核酸に由来する核酸；
（ｈ）対立遺伝子間の差異に起因して、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２もしくは配列番号３５のいずれかに示されるタンパク質をコードする核酸または（ａ）〜（ｅ）のいずれかにおいて規定される核酸と異なる（ｄｉｖｅｒｇｅ）、核酸；
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２もしくは配列番号３５のいずれかに示されるタンパク質をコードする核酸；
（ｊ）サイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｉ）のいずれかにおいて規定される核酸の機能的フラグメント；ならびに
（ｋ）植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸、または植物もしくは植物の一部における活性サイトカイニンレベルを低減するタンパク質をコードする核酸の、好ましくは根における発現を構成する核酸、
からなる群より選択される、植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸の発現を包含する、方法。
・（項目３）
単離された核酸であって、以下：
（ａ）配列番号２９、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかに示されるＤＮＡ配列を含む、核酸、またはこれらの相補体；
（ｂ）配列番号２９、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかに示されるＲＮＡ配列を含む、核酸、またはこれらの相補体；
（ｃ）配列番号２９、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかに示される核酸に特異的にハイブリダイズする核酸、またはこれらの相補体；
（ｄ）配列番号３２に示されるポリペプチドを含み、そして配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％類似するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、核酸；
（ｅ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも４７％類似するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、核酸；
（ｆ）配列番号１０もしくは配列番号３５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも４７％類似するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、核酸；
（ｇ）配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３２もしくは配列番号３５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、核酸；
（ｈ）遺伝子コードの結果として、配列番号２９、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかに示される核酸配列に対して縮重しているか、または（ａ）〜（ｇ）のいずれかにおいて規定される核酸に対して縮重している、核酸；
（ｉ）生物間のコドン用法の差異に起因して、配列番号４、配列番号６、配列番号１０もしくは配列番号３５のいずれかに示されるタンパク質をコードする核酸または（ａ）〜（ｇ）のいずれかにおいて規定される核酸と異なる（ｄｉｖｅｒｇｅ）、核酸；
（ｊ）対立遺伝子間の差異に起因して、配列番号４、配列番号６、配列番号１０もしくは配列番号３５のいずれかに示されるタンパク質をコードする核酸または（ａ）〜（ｇ）のいずれかにおいて規定される核酸と異なる（ｄｉｖｅｒｇｅ）、核酸；
（ｋ）配列番号２９、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかに示される核酸によってコードされるサイトカイニンオキシダーゼの免疫学的に活性なフラグメントをコードするか、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかにおいて規定される核酸の免疫学的に活性なフラグメントをコードする核酸、
（ｌ）配列番号２９、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかに示される核酸によってコードされるサイトカイニンオキシダーゼの機能的フラグメントをコードするか、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかにおいて規定される核酸の機能的フラグメントをコードする核酸であって、該フラグメントは、サイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する、核酸；ならびに
（ｍ）配列番号４、配列番号６、配列番号１０もしくは配列番号３５に規定されるタンパク質をコードする核酸であって、但し、該核酸は、以下のＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＣ００５９１７、ＡＢ０２４０３５およびＡＣ０２３７５４のいずれかのもとで登録された核酸ではない、核酸、
からなる群より選択される、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有する植物タンパク質をコードする、核酸。
・（項目４）
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡもしくは合成ＲＮＡであって、該ＲＮＡにおいて、ＴはＵで置換されている、項目３に記載の単離された核酸。
・（項目５）
項目３または４に記載の核酸と特異的にハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸分子。
・（項目６）
項目３または４に記載の核酸を特異的に増幅する、少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸分子。
・（項目７）
項目３または４に記載の核酸を含む、ベクター。
・（項目８）
発現ベクターである、項目７に記載のベクターであって、前記核酸は、原核生物宿主細胞における該核酸の発現を可能にする１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている、ベクター。
・（項目９）
発現ベクターである、項目７に記載のベクターであって、前記核酸は、真核生物宿主細胞における該核酸の発現を可能にする１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている、ベクター。
・（項目１０）
項目３または４に記載の核酸を含む、宿主細胞。
・（項目１１）
項目７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
・（項目１２）
項目８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
・（項目１３）
項目９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
・（項目１４）
細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞または動物細胞である、項目１０に記載の宿主細胞。
・（項目１５）
細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞または動物細胞である、項目１１に記載の宿主細胞。
・（項目１６）
細菌細胞である、項目１２に記載の宿主細胞。
・（項目１７）
昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞または動物細胞である、項目１３に記載の宿主細胞。
・（項目１８）
項目３もしくは４に記載の核酸によってコードされる単離されたポリペプチド、またはそのホモログもしくは誘導体、またはその免疫学的に活性なフラグメントもしくは機能的フラグメント。
・（項目１９）
配列番号４、配列番号６、配列番号１０もしくは配列番号３５のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそのホモログもしくは誘導体、またはその免疫学的に活性なフラグメントもしくは機能的フラグメントを含む、項目１８に記載のポリペプチド。
・（項目２０）
サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法であって、該方法は、
項目１１に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程、および
該培養物から生成されたポリペプチドを回収する工程、
を包含する、方法。
・（項目２１）
サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法であって、該方法は、
項目１２に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程、および
該培養物から生成されたポリペプチドを回収する工程、
を包含する、方法。
・（項目２２）
サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法であって、該方法は、
項目１３に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程、および
該培養物から生成されたポリペプチドを回収する工程、
を包含する、方法。
・（項目２３）
項目１８に記載のポリペプチドまたはその特異的エピトープを特異的に認識する、抗体。
・（項目２４）
項目１９に記載のポリペプチドまたはその特異的エピトープを特異的に認識する、抗体。
・（項目２５）
トランスジェニックの植物、植物細胞または植物組織の生成のための方法であって、
発現可能な形式またはベクター中の項目３または４に記載の核酸の、該植物、植物細胞また
は植物組織への導入
を包含する、方法。
・（項目２６）
変更された植物、植物細胞または植物組織の生成のための方法であって、
該植物の細胞、組織または器官への、項目１８に記載のポリペプチドの直接的導入
を包含する、方法。
・（項目２７）
変更された植物、植物細胞または植物組織の生成のための方法であって、
該植物の細胞、組織または器官への、項目１９に記載のポリペプチドの直接的導入
を包含する、方法。
・（項目２８）
項目１８に記載のポリペプチドの発現をもたらす方法であって、該方法は、
１つ以上の制御配列に作動可能に連結された、該ポリペプチドをコードする核酸、または１つ以上の制御配列に作動可能に連結された、該ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターの、植物細胞のゲノムへの安定な導入
を包含する、方法。
・（項目２９）
項目１９に記載のポリペプチドの発現をもたらす方法であって、該方法は、
１つ以上の
制御配列に作動可能に連結された、該ポリペプチドをコードする核酸、または１つ以上の制御配列に作動可能に連結された、該ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターの、植物細胞のゲノムへの安定な導入
を包含する、方法。
・（項目３０）
前記植物細胞から植物を再生する工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
・（項目３１）
前記植物細胞から植物を再生する工程をさらに包含する、項目２８に記載の方法。
・（項目３２）
前記植物細胞から植物を再生する工程をさらに包含する、項目２９に記載の方法。
・（項目３３）
項目３または４に記載の核酸を含むトランスジェニック植物細胞であって、該核酸は、植物細胞またはトランスジェニック植物細胞における該核酸の転写および／または発現を可能にする調節エレメントに、作動可能に連結されている、トランスジェニック植物細胞。
・（項目３４）
項目３３に記載のトランスジェニック植物細胞であって、前記核酸は、該植物細胞のゲノムに安定に組み込まれている、トランスジェニック植物細胞。
・（項目３５）
項目３３に記載の植物細胞を含む、トランスジェニックの植物、植物の一部または植物組織。
・（項目３６）
項目３４に記載の植物細胞を含む、トランスジェニックの植物、植物の一部または植物組織。
・（項目３７）
項目３５に記載の植物の、収穫可能な部分。
・（項目３８）
項目３６に記載の植物の、収穫可能な部分。
・（項目３９）
種子、葉、果実、幹培養物、根茎、根、塊茎および球茎からなる群より選択される、項目３７に記載の植物の収穫可能な部分。
・（項目４０）
種子、葉、果実、幹培養物、根茎、根、塊茎および球茎からなる群より選択される、項目３８に記載の植物の収穫可能な部分。
・（項目４１）
項目３５に記載の植物または植物の一部由来の子孫。
・（項目４２）
項目３６に記載の植物または植物の一部由来の子孫。
・（項目４３）
根の成長を刺激するための方法であって、該方法は、項目３もしくは４に記載の核酸の発現を包含するか、または植物もしくは植物の一部において活性サイトカイニンのレベルを低減する別のタンパク質の発現を包含する、方法。
・（項目４４）
側根または不定根の形成を増強するための方法であって、該方法は、項目３もしくは４に記載の核酸の発現を包含するか、または植物もしくは植物の一部において活性サイトカイニンのレベルを低減する別のタンパク質の発現を包含する、方法。
・（項目４５）
根の横地重力屈性を変更するための方法であって、該方法は、項目３もしくは４に記載の核酸の発現の変更を包含するか、または植物もしくは植物の一部において活性サイトカイニンのレベルを低減する別のタンパク質の発現を包含する、方法。
・（項目４６）
収穫量の増加をもたらす、項目４３に記載の方法。
・（項目４７）
収穫量の増加をもたらす、項目４４に記載の方法。
・（項目４８）
収穫量の増加をもたらす、項目４５に記載の方法。
・（項目４９）
前記核酸の発現が、強力な構成的プロモーターの制御下で生じる、項目４３に記載の方法。
・（項目５０）
前記核酸の発現が、強力な構成的プロモーターの制御下で生じる、項目４４に記載の方法。
・（項目５１）
前記核酸の発現が、強力な構成的プロモーターの制御下で生じる、項目４５に記載の方法。
・（項目５２）
前記核酸の発現が、根において優先的に発現されるプロモーターの制御下で生じる、項目４３に記載の方法。
・（項目５３）
前記核酸の発現が、根において優先的に発現されるプロモーターの制御下で生じる、項目４４に記載の方法。
・（項目５４）
前記核酸の発現が、根において優先的に発現されるプロモーターの制御下で生じる、項目４５に記載の方法。
・（項目５５）
項目１８に記載のポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定および獲得するための方法であって、
項目１８に記載のポリペプチドが使用されるスクリーニングアッセイ
を包含する、方法。
・（項目５６）
項目１９に記載のポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定および獲得するための方法であって、
項目１９に記載のポリペプチドが使用されるスクリーニングアッセイ
を包含する、方法。
・（項目５７）
ツーハイブリッドスクリーニングアッセイを包含する、項目５５に記載の方法であって、ここで、項目１８に記載のポリペプチドはベイトとして、そしてｃＤＮＡライブラリーはプレイとして使用される、方法。
・（項目５８）
ツーハイブリッドスクリーニングアッセイを包含する、項目５６に記載の方法であって、ここで、項目１９に記載のポリペプチドはベイトとして、そしてｃＤＮＡライブラリーはプレイとして使用される、方法。
・（項目５９）
項目１８に記載のポリペプチドと、該ポリペプチドが使用されるスクリーニングアッセイによって獲得可能な、相互作用するタンパク質パートナーとの間の相互作用を、調節するための方法。
・（項目６０）
項目１９に記載のポリペプチドと、該ポリペプチドが使用されるスクリーニングアッセイによって獲得可能な、相互作用するタンパク質パートナーとの間の相互作用を、調節するための方法。
・（項目６１）
項目１８に記載のポリペプチドと相互作用する化合物を同定および獲得するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）項目１８に記載のポリペプチドと、項目５５に記載の方法によって獲得可能な、相互作用するタンパク質パートナーとが発現される、ツーハイブリッドシステムを提供する工程、
ｂ）（ａ）に規定されるように発現されたポリペプチドによって形成される複合体と、該化合物とを相互作用させる工程、ならびに
ｃ）該化合物と該ポリペプチドとの相互作用、または（ａ）に規定されるように発現されたポリペプチドによって形成される該複合体の測定を実施する工程、
を包含する、方法。
・（項目６２）
項目１９に記載のポリペプチドと相互作用する化合物を同定および獲得する方法であって：
ａ）ツーハイブリッドシステムを提供する工程であって、ここで、項目１９に記載のポリペプチドおよび項目５６に記載の方法によって獲得可能な相互作用するタンパク質パートナーが発現される、工程、
ｂ）該化合物と、（ａ）において規定される該発現されたポリペプチドにより形成される複合体とを相互作用させる工程、および
ｃ）該化合物と、該ポリペプチドまたは（ａ）において規定される該発現されたポリペプチドにより形成される複合体との相互作用の測定を実施する工程、
を包含する、方法。
・（項目６３）
項目１８に記載のポリペプチドに特異的に結合する化合物または化合物の混合物を同定する方法であって、
ａ）項目１８に記載のポリペプチドと、該化合物または化合物の混合物を、複合体の形成を可能にするのに適した条件下で合わせる工程、および
ｂ）複合体の形成を検出する工程であって、ここで、複合体の存在は、該ポリペプチドに特異的に結合する化合物または混合物を同定する、工程、
を包含する、方法。
・（項目６４）
項目１９に記載のポリペプチドに特異的に結合する化合物または化合物の混合物を同定する方法であって、
ａ）項目１９に記載のポリペプチドと、該化合物または化合物の混合物を、複合体の形成を可能にするのに適した条件下で合わせる工程、および
ｂ）複合体の形成を検出する工程であって、ここで、複合体の存在は、該ポリペプチドに特異的に結合する化合物または混合物を同定する、工程、
を包含する、方法。
・（項目６５）
前記化合物が、前記ポリペプチドの活性を阻害し、そして合理的な化学物質設計のために使用され得る、項目６１に記載の方法。
・（項目６６）
前記化合物が、前記ポリペプチドの活性を阻害し、そして合理的な化学物質設計のために使用され得る、項目６２に記載の方法。
・（項目６７）
前記化合物または化合物の混合物が、前記ポリペプチドの活性を阻害し、そして合理的な化学物質設計のために使用され得る、項目６３に記載の方法。
・（項目６８）
前記化合物または化合物の混合物が、前記ポリペプチドの活性を阻害し、そして合理的な化学物質設計のために使用され得る、項目６４に記載の方法。
・（項目６９）
植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、
項目５５に記載の方法の工程、および
農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、
を包含する、方法。
・（項目７０）
植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、
項目５６に記載の方法の工程、および
農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、
を包含する、方法。
・（項目７１）
植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、
項目５７に記載の方法の工程、および
農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、
を包含する、方法。
・（項目７２）
植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、
項目５８に記載の方法の工程、および
農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、
を包含する、方法。
・（項目７３）
植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、
項目５９に記載の方法の工程、および
農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、
を包含する、方法。
・（項目７４）
植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、
項目６０に記載の方法の工程、および
農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、
を包含する、方法。
・（項目７５）
植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、
項目６１に記載の方法の工程、および
農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、
を包含する、方法。
・（項目７６）
植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、
項目６２に記載の方法の工程、および
農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、
を包含する、方法。
・（項目７７）
植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、
項目６３に記載の方法の工程、および
農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、
を包含する、方法。
・（項目７８）
植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、
項目６４に記載の方法の工程、および
農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、
を包含する、方法。
・（項目７９）
項目３または４に記載の核酸分子を含む、診断組成物。
・（項目８０）
項目７に記載のベクターを含む、診断組成物。
・（項目８１）
項目８に記載のベクターを含む、診断組成物。
・（項目８２）
項目１８に記載のポリペプチドを含む、診断組成物。
・（項目８３）
項目１９に記載のポリペプチドを含む、診断組成物。
・（項目８４）
項目２３に記載の抗体を含む、診断組成物。
・（項目８５）
項目２４に記載の抗体を含む、診断組成物。
・（項目８６）
根の成長点の大きさを増大する方法であって、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部、好ましくは根において活性サイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の発現を含む、方法。
・（項目８７）
根の大きさを増大する方法であって、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部、好ましくは根において活性サイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする別の核酸の発現を含む、方法。
・（項目８８）
根の成長点の大きさを増大する方法であって、好ましくは苗条における、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現のダウンレギュレーションを含む、方法。
・（項目８９）
葉の老化を遅らせる方法であって、好ましくは、葉の老化における、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現のダウンレギュレーションを含む、方法。
・（項目９０）
葉の老化を変化させる方法であって、葉の老化における、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含む、方法。
・（項目９１）
葉の厚みを増大する方法であって、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部において活性サイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の発現を含む、方法。
・（項目９２）
道管の大きさを減少させる方法であって、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部において活性サイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の発現を含む、方法。
・（項目９３）
道管の大きさを増大する方法であって、植物または植物の一部における、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現のダウンレギュレーションを含む、方法。
・（項目９４）
単為結実を誘導する方法であって、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部において、好ましくは胎座、胚珠、およびそれら由来の組織において活性サイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の発現を含む、方法。
・（項目９５）
実生の直立性を改善する方法であって、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含むか、または実生、好ましくは実生の根において活性サイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の発現を含む、方法。
・（項目９６）
植物または植物の一部における、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含む、枝分かれを増大する方法。
・（項目９７）
植物または植物の一部、好ましくは幹または腋芽における、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含む、倒伏耐性を改善する方法。
・（項目９８）
植物サイトカイニンオキシダーゼを過剰発現するトランスジェニック台木を含む、トランスジェニック植物。
・（項目９９）
接ぎ穂をさらに含む、項目９８に記載のトランスジェニック植物。
・（項目１００）
項目９８または９９に記載の植物の収穫可能な一部分。
・（項目１０１）
根の成長および発達を刺激する方法であって、トランスジェニックの植物細胞または組織培養物における植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸の発現を含む、方法。
・（項目１０２）
前記核酸が、項目３に記載の核酸または項目２に規定される核酸のうちの少なくとも１つである、項目６１に記載の方法。
・（項目１０３）
種子の大きさまたは重量を増大する方法であって、
植物におけるサイトカイニンオキシダーゼのレベルまたは活性を増大する工程、または
植物または植物の一部、好ましくは種子における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質のレベルまたは活性を増大する工程
を包含する、方法。
・（項目１０４）
胚の大きさまたは重量を増大する方法であって、
植物におけるサイトカイニンオキシダーゼのレベルまたは活性を増大する工程、または
植物または植物の一部、好ましくは胚における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質のレベルまたは活性を増大する工程
を包含する、方法。
・（項目１０５）
子葉の大きさを増大する方法であって、
植物におけるサイトカイニンオキシダーゼのレベルまたは活性を増大する工程、または
植物または植物の一部、好ましくは子葉における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質のレベルまたは活性を増大する工程
を包含する、方法。
・（項目１０６）
種子の大きさまたは重量を増大する方法であって、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部、好ましくは種子における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質をコードする核酸の発現を包含する、方法。
・（項目１０７）
胚の大きさまたは重量を増大する方法であって、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部、好ましくは胚における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質をコードする核酸の発現を包含する、方法。
・（項目１０８）
子葉の大きさを増大する方法であって、項目３もしくは４に記載の核酸または項目２において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部、好ましくは子葉における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質をコードする核酸の発現を包含する、方法。
・（項目１０９）
前記核酸が、種子において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、項目１０６に記載の方法。
・（項目１１０）
前記核酸が、胚において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、項目１０７に記載の方法。
・（項目１１１）
前記核酸が、子葉において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、項目１０８に記載の方法。
・（項目１１２）
前記プロモーターがさらに、内乳またはアリューロンに対して特異的である、項目１０９に記載の方法。
・（項目１１３）
前記方法が、収穫量の増加を導く、項目１０６に記載の方法。
・（項目１１４）
前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、項目１０６に記載の方法。
・（項目１１５）
前記方法が、収穫量の増加を導く、項目１０７に記載の方法。
・（項目１１６）
前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、項目１０７に記載の方法。
・（項目１１７）
前記方法が、収穫量の増加を導く、項目１０８に記載の方法。
・（項目１１８）
前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、項目１０８に記載の方法。
・（項目１１９）
実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、項目１１４に記載の方法。
・（項目１２０）
実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、項目１１６に記載の方法。
・（項目１２１）
実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、項目１１８に記載の方法。
・（項目１２２）
植物において種子の大きさまたは重量を増大する方法であって、配列番号１、５、２５、もしくは２７のいずれかに示される核酸または該核酸のオルソログの発現を含み、該オルソログが、該植物の種に特異的である、方法。
・（項目１２３）
植物において胚の大きさまたは重量を増大する方法であって、配列番号１、５、２５、もしくは２７のいずれかに示される核酸または該核酸のオルソログの発現を含み、該オルソログが、該植物の種に特異的である、方法。
・（項目１２４）
植物において子葉の大きさを増大する方法であって、配列番号１、５、２５、もしくは２７のいずれかに示される核酸または該核酸のオルソログの発現を含み、該オルソログが、該植物の種に特異的である、方法。
・（項目１２５）
前記核酸が、種子において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、項目１２２に記載の方法。
・（項目１２６）
前記核酸が、胚において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、項目１２３に記載の方法。
・（項目１２７）
前記核酸が、子葉において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、項目１２４に記載の方法。
・（項目１２８）
前記プロモーターがさらに、内乳またはアリューロンに対して特異的である、項目１２５に記載の方法。
・（項目１２９）
前記方法が、収穫量の増加を導く、項目１２２に記載の方法。
・（項目１３０）
前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、項目１２２に記載の方法。
・（項目１３１）
前記方法が、収穫量の増加を導く、項目１２３に記載の方法。
・（項目１３２）
前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、項目１２３に記載の方法。
・（項目１３３）
前記方法が、収穫量の増加を導く、項目１２４に記載の方法。
・（項目１３４）
前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、項目１２４に記載の方法。
・（項目１３５）
実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、項目１３０に記載の方法。
・（項目１３６）
実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、項目１３２に記載の方法。
・（項目１３７）
実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、項目１３４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、植物サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の模式図を示す。トウモロコシから単離された種々のサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子（ＺｍＣＫＸ１、登録番号ＡＦ０４４６０３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２５５：３２８〜３３３，１９９９）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから単離された種々のサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子（ＡｔＣＫＸ１〜ＡｔＣＫＸ４）の構造が、示される。エキソンは、「Ｅ」と称され、影付き四角により示される。イントロンは、白四角により示される。遺伝子のサイズ（ｋｂ、各構造の上部）、遺伝子登録番号（名前の下）、および０．５ｋｂを示すサイズ棒が、さらに示される。
【図２】図２は、植物サイトカイニンオキシダーゼアミノ酸配列のアライメントを示す。トウモロコシ由来のサイトカイニンオキシダーゼ（ＺｍＣＫＸ１）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のサイトカイニンオキシダーゼ（ＡｔＣＫＸ１〜ＡｔＣＫＸ４）からのアミノ酸配列が、整列される。同一のアミノ酸残基は、黒四角により示され、類似するアミノ酸が、灰色の四角中にある。アミノ酸類似性のグループ：（Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）、（Ｆ、Ｗ、Ｙ）、（Ｇ、Ａ）、（Ｓ、Ｔ）、（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、（Ｅ、Ｄ）、（Ｎ、Ｑ）。
【図３】図３は、ＡｔＣＫＸ１を発現するタバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のノーザンブロット分析を示す。（Ａ）野生型ＳＮＮタバコ（レーン９）と比較した構成的に発現するタバコ植物（レーン１〜８）のノーザンブロット分析。（Ｂ）１２時間誘導後の葉におけるテトラサイクリン誘導遺伝子発現と、構成的に発現するクローンとの比較。レーン２〜９は、４つの異なるＡｔＣＫＸ１〜Ｗ３８ＴｅｔＲクローン（＋、−、テトラサイクリン処理ありまたはテトラサイクリン処理なし）であり、レーン１は、構成的に発現する３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１クローンである。（Ｃ）ＡｔＣＫＸ１遺伝子を構成的に発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のノーザンブロット分析。レーン２〜４は、野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物（レーン１）と比較した３つの異なる構成的に発現する３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１クローンである。
【図４】図４は、３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の成長特徴を示す。（Ａ）２つの３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１発現実生（右）と比較した２つの野生型実生（左）。トランスジェニック実生における不定根の形成の増加および分枝している根の増加に注意のこと。写真は、発芽１４日後に撮影した。植物は、垂直位置のペトリ皿においてＭＳ培地上でインビトロで成長した。（Ｂ）Ａと同様であるが、根を、トルイジンブルーで染色した。（Ｃ）発芽３週間後の３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック実生を含むペトリ皿の平面図である。（Ｄ）液体培地中で成長した３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック植物を示す。野生型実生の根は、これらの条件下で不十分にしか成長しない（示さず）。（Ｅ）３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１遺伝子を発現する形質転換体（Ｔ０）を示し（右の３つの植物）、野生型植物が左に示される。（Ｆ）土壌中で成長したＴ１植物の表現型を示す。２つの３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック植物と比較した野生型植物（左）。
【図５】図５は、ＡｔＣＫＸ２を過剰発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の表現型を示す。野生型（左の植物）と比較した、３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ２を発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のＴ１世代（右の２つの植物）。
【図６】図６は、ＡｔＣＫＸ２を発現するタバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のノーザンブロット分析を示す。（Ａ）野生型ＳＮＮタバコ（レーン８）と比較した構成的に発現するタバコ植物（レーン１〜７）のノーザンブロット分析。（Ｂ）ＡｔＣＫＸ２遺伝子を構成的に発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のノーザンブロット分析。レーン２〜８は、野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物（レーン１）と比較した７つの異なる構成的に発現する３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ２クローン。
【図７】ＡｔＣＫＸ１発現するタバコ植物およびＡｔＣＫＸ２を発現するタバコ植物の苗条表現型を示す。（Ａ）６週齢植物の平面図。（Ｂ）開花段階でのタバコ植物。（Ｃ）幹伸長の速度論。矢印は、開花の開始を標識する。植物の齢（発芽後の日数）およびその段階での葉数が、矢印の上に示される。棒は、ＳＤ（標準偏差）を示す；ｎ＝１２。（Ｄ）発芽後６８日目と１００日目との間に形成される葉の数（ｎ＝１２）およびこれらの葉の最終表面積（野生型１００％は、３６４６±１４４ｃｍ２；ｎ＝３）。（Ｅ）葉の大きさおよび老衰の比較。葉は、上から、節数４、９、１２、１６および２０（左から右へ）である。
【図８】図８は、ＡｔＣＫＸを発現するトランスジェニックタバコ植物の根の表現型を示す。（Ａ）発芽１７日後の実生。（Ｂ）開花段階の土壌で成長した植物の根系。（Ｃ）発芽１０日後の根の長さ、側根（ＬＲ）の数、および不定根（ＡＲ）の数。（Ｄ）内因性サイトカイニンによる根の成長阻害の用量応答曲線。棒は、±ＳＤ（標準偏差）を示す。；ｎ＝３０．
【図９】図９は、３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１発現タバコ植物における腋生苗条分裂組織の成長を示す。
【図１０】図１０は、ＡｔＣＫＸ１過剰発現タバコ植物  対  野生型（ＷＴ）タバコの、苗条分裂組織、葉および根分裂組織の組織学を示す。・（Ａ）植物性苗条先端部の分裂組織を通る縦の中央断面。Ｐ＝葉原基。・（Ｂ）葉の二次整列葉脈における維管組織。Ｘ＝木質部、ＰＨ＝篩部束。・（Ｃ）完全に成長した葉の断面。・（Ｄ）上部の葉表皮の走査型電子顕微鏡。・（Ｅ）ＤＡＰＩで染色した根先端部。ＲＭ＝根分裂組織。・（Ｆ）発芽から１０日後の、根分裂組織の縦の中央断面。ＲＣ＝根冠；ＰＭ＝前分裂組織。・（Ｇ）先端部から１０ｍｍの横根断面。Ｅ＝表皮、Ｃ１〜Ｃ４＝皮層細胞層、Ｘ＝木質部、ＰＨ＝篩部束。棒線は、１００μｍである。
【図１１】図１１は、ＡｔＣＫＸ３発現タバコ植物およびＡｔＣＫＸ４発現タバコ植物のノーザンブロット分析を示す。・（Ａ）構成的発現ＡｔＣＫＸ３タバコ植物のノーザンブロット分析。レーン指定は、個々のトランスジェニック植物番号を示し、ＷＴは、野生型ＳＮＮタバコである。上のブロットは、ＡｔＣＫＸ３特異的プローブで探査され、下のブロットは、２５Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプローブ（これは、ＲＮＳローディングのためのコントロールとして作用する）で探査された。・（Ｂ）構成的発現ＡｔＣＫＸ４タバコ植物のノーザンブロット分析。レーン指定は、個々のトランスジェニック植物番号を示し、ＷＴは、野生型ＳＮＮタバコである。上のブロットは、ＡｔＣＫＸ４特異的プローブで探査され、下のブロットは、２５Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプローブ（これは、ＲＮＳローディングのためのコントロールとして作用する）で探査された。
【図１２】図１２は、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックタバコ植物および野生型植物の相互移植を示す。・（Ａ）左側の２種の植物：コントロール（ＷＴ根茎上に移植されたＷＴ接ぎ穂）。右側の２種の植物：ＡｔＣＫＸ２−３８トランスジェニック根茎上に移植されたＷＴ接ぎ穂。・（Ｂ）左：コントロール（ＷＴ根茎上に移植されたＷＴ接ぎ穂）。右：ＷＴ根茎上に移植されたＡｔＣＫＸ２−３８植物の接ぎ穂。・（Ｃ）根領域の拡大図。左：コントロール（ＷＴ根茎上に移植されたＷＴ接ぎ穂）。右：ＡｔＣＫＸ２−３８トランスジェニック根茎上に移植されたＷＴ接ぎ穂。・（Ｄ）不定根の形成。左：コントロール（ＷＴ根茎上に移植されたＷＴ接ぎ穂）。右：ＡｔＣＫＸ２−３８トランスジェニック根茎上に移植されたＷＴ接ぎ穂。
【図１３Ａ】図１３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子、胚および実生の表現型を示す。・（Ａ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック株の種子および野生型種子。棒線サイズ＝１ｍｍ。・（Ｂ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック株、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック株、ＡｔＣＫＸ３トランスジェニック株およびＡｔＣＫＸ４トランスジェニック株の種子、ならびに野生型種子。棒線サイズ＝１ｍｍ。・（Ｃ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの成熟胚および野生型植物の成熟胚。棒線サイズ＝２００μｍ。胚を、２０％のＥｔＯＨ中で１２時間吸収させた成熟種子から得、その種皮から搾り取り、抱水クロラールで洗浄し、そしてＮｏｍａｒｓｋｉ光学を使用して撮影した。・（Ｄ）発芽から４日後の、野生型（上）およびＡｔＣＫＸ１発現Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子。・（Ｅ）Ｄのクローズアップ。
【図１３Ｂ】図１３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子、胚および実生の表現型を示す。・（Ａ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック株の種子および野生型種子。棒線サイズ＝１ｍｍ。・（Ｂ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック株、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック株、ＡｔＣＫＸ３トランスジェニック株およびＡｔＣＫＸ４トランスジェニック株の種子、ならびに野生型種子。棒線サイズ＝１ｍｍ。・（Ｃ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの成熟胚および野生型植物の成熟胚。棒線サイズ＝２００μｍ。胚を、２０％のＥｔＯＨ中で１２時間吸収させた成熟種子から得、その種皮から搾り取り、抱水クロラールで洗浄し、そしてＮｏｍａｒｓｋｉ光学を使用して撮影した。・（Ｄ）発芽から４日後の、野生型（上）およびＡｔＣＫＸ１発現Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子。・（Ｅ）Ｄのクローズアップ。
【図１３Ｃ】図１３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子、胚および実生の表現型を示す。・（Ａ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック株の種子および野生型種子。棒線サイズ＝１ｍｍ。・（Ｂ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック株、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック株、ＡｔＣＫＸ３トランスジェニック株およびＡｔＣＫＸ４トランスジェニック株の種子、ならびに野生型種子。棒線サイズ＝１ｍｍ。・（Ｃ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの成熟胚および野生型植物の成熟胚。棒線サイズ＝２００μｍ。胚を、２０％のＥｔＯＨ中で１２時間吸収させた成熟種子から得、その種皮から搾り取り、抱水クロラールで洗浄し、そしてＮｏｍａｒｓｋｉ光学を使用して撮影した。・（Ｄ）発芽から４日後の、野生型（上）およびＡｔＣＫＸ１発現Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子。・（Ｅ）Ｄのクローズアップ。
【図１３Ｄ】図１３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子、胚および実生の表現型を示す。・（Ａ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック株の種子および野生型種子。棒線サイズ＝１ｍｍ。・（Ｂ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック株、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック株、ＡｔＣＫＸ３トランスジェニック株およびＡｔＣＫＸ４トランスジェニック株の種子、ならびに野生型種子。棒線サイズ＝１ｍｍ。・（Ｃ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの成熟胚および野生型植物の成熟胚。棒線サイズ＝２００μｍ。胚を、２０％のＥｔＯＨ中で１２時間吸収させた成熟種子から得、その種皮から搾り取り、抱水クロラールで洗浄し、そしてＮｏｍａｒｓｋｉ光学を使用して撮影した。・（Ｄ）発芽から４日後の、野生型（上）およびＡｔＣＫＸ１発現Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子。・（Ｅ）Ｄのクローズアップ。
【図１３Ｅ】図１３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子、胚および実生の表現型を示す。・（Ａ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック株の種子および野生型種子。棒線サイズ＝１ｍｍ。・（Ｂ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック株、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック株、ＡｔＣＫＸ３トランスジェニック株およびＡｔＣＫＸ４トランスジェニック株の種子、ならびに野生型種子。棒線サイズ＝１ｍｍ。・（Ｃ）ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの成熟胚および野生型植物の成熟胚。棒線サイズ＝２００μｍ。胚を、２０％のＥｔＯＨ中で１２時間吸収させた成熟種子から得、その種皮から搾り取り、抱水クロラールで洗浄し、そしてＮｏｍａｒｓｋｉ光学を使用して撮影した。・（Ｄ）発芽から４日後の、野生型（上）およびＡｔＣＫＸ１発現Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子。・（Ｅ）Ｄのクローズアップ。
【図１４】図１４は、野生型および、４つの研究したＡｔＣＫＸ遺伝子の各々とは無関係の２つのクローンの種子重量を示す。各クローンについて２００個の種子の５つの異なるバッチを分析することによって、平均重量を得た。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
オーキシン生合成の増加に関連する上で言及した問題を回避するために、代替のアプローチに従うことに議論の余地はなった。本発明者らは、オーキシンの生物学的アンタゴニストのダウンレギュレートが、オーキシンレベルの増加と比較して、根の成長に対して類似の効果またはより優れた効果を誘発し得ることを理論付けた。ホルモン作用および相互作用は、非常に複雑であるが、本発明者らは、サイトカイニンが根の成長に対してオーキシンアンタゴニストとして機能し得ると仮定した。植物組織培養についてのホルモン研究は、サイトカイニンに対するオーキシンの割合が、これらホルモンの各々の絶対レベルよりも器官形成のために重要であることを示しており、このことは、実際に、これらのホルモンが、少なくとも特定の生物学的プロセスにおいてアンタゴニストとして機能することを示している。さらに、側根形成は、サイトカイニンの外因性適用によって阻害される。興味深いことに、根伸長は、サイトカイニン処理によってネガティブの影響を受け、このことは、サイトカイニンが根分枝形成と根の成長との両方を制御することを示唆している。
・同時に、現在の文献データは、サイトカイニンレベルの増加が根の成長にネガティブの影響を与えることを示しているが、このプロセスの基礎となる機構は、理解されていない。植物におけるサイトカイニンの合成部位は、根先端部および苗条の若組織である。サイトカイニンの内因性濃度は、ｎＭ範囲である。しかし、これらの定量は困難であるので、かなり多量の組織を抽出する必要があり、実際の局所濃度は知られていない。また、サイトカイニンの亜細胞区画化も知られていない。一般的に、遊離塩基およびリボシドは、細胞質および核に局在化されており、一方グルコシドは、小胞に局在化されていると考えられている。わずかに異なる化学構造を有する種々のサイトカイニンもまた、存在している。結果として、外因性サイトカイニンの効果が、総サイトカイニン濃度の上昇に起因するはずであるか、またはむしろ、レセプター、トランスロケーター（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ）、トランスポーター、および改変酵素に対する他の形態の植物保有（ｐｌａｎｔ−ｂｏｒｎｅ）サイトカイニン（これは、構造、細胞位置または亜細胞位置のいずれかが異なる）からの競合に起因するはずであるかは、知られていない。
【００２１】
根におけるサイトカイニンレベルが、実際に根の成長に最適なレベルを超えるという仮定を試験するために、新規の遺伝子コードサイトカイニンオキシダーゼ（これは、サイトカイニン代謝酵素である）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ＡｔＣＫＸと称される）からクローニングし、そしてその後、トランスジェニックタバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ中、強力な構成的プロモーターの下で発現させた。ＡｔＣＫＸ  ｍＲＮＡ発現を示しかつサイトカイニンオキシダーゼ活性を増加させる形質転換株はまた、根の形成および成長の促進を明示した。苗条成長に対するネガティブの影響もまた、観察された。後者は、これらの植物におけるサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の構成的発現に従う。これは、一般的な植物成長特性に対するこのサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の制限された発現の重要性を示す。サイトカイニンオキシダーゼ活性の閉じ込めは、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは器官特異的プロモーターを使用することによって達成され得る。なぜなら、サイトカイニン分解は、上で説明されるように、ホルモン合成に頼るアプローチとは対照的に、ＣＫＸタンパク質を発現する組織または細胞に制限されるプロセスだからである。
【００２２】
苗条成長に対するサイトカイニンオキシダーゼの観察されたネガティブ効果は、サイトカイニンオキシダーゼが、成長を促進する化学物質を設計するためまたは成長を促進する化学物質についてスクリーニングするための、興味深い標的であることを示している。このような化学物質は、これらの化学物質の適用が根の成長を阻害しないように、サイトカイニンオキシダーゼ活性を阻害するべきであり、好ましくは、根に輸送されるべきではなく、かつ土に迅速に分解されるべきである。サイトカイニンはまた、葉の老化期を遅滞させ、このことは、ポジティブ効果が光合成組織の成長と維持との両方を含むことを意味する。さらに、サイトカイニンが老化期を遅滞させ、葉の緑化（葉緑素含量）を増加させ、苗条先端の優占度を低下させるという観察は、植物の気性部分におけるＣＫＸ活性の抑制に基づくストラテジー（例えば、アンチセンス技術、リボサイム技術、および相互抑制技術）が、結果として老化期を遅滞させ得、葉の緑化を増加させ得、そして分枝形成を増加させ得ることを示す。
【００２３】
同様に、根の成長に対するサイトカイニンオキシダーゼ発現の観察されたポジティブ効果は、サイトカイニンオキシダーゼが、除草薬を設計するためまたは除草薬についてスクリーニングするための、興味深い標的であることを示している。このような除草薬は、サイトカイニンオキシダーゼ活性を阻害するべきであり、好ましくは、苗条に輸送されるべきではなく、かつ土を通して根に投与され得る溶媒中に溶解しかつこの溶媒中で比較的安定であるべきである。
【００２４】
植物成長および植物構造に対するサイトカイニンオキシダーゼ過剰発現のこれらの効果は、現在までのところ未知であり、結果として、現在までの発明およびその実施形態は、予見することができなかった。
【００２５】
苗条成長に対する観察されたネガティブ効果は、サイトカイニンオキシダーゼの操作がまた、小さい表現型を得るためにも使用され得ることを示す。小さい表現型は、例えば、穀類および果樹のような商業的作物において特に有用である。
【００２６】
本発明に従って、サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物が、サイズおよび／または重量の増加した種子（胚を含む）および子葉を成長させることがまた、驚くべきことに発見された。これらの結果は、驚くべきことである。なぜなら、サイトカイニン含量の減少が、器官成長の低下に関連して予測されたからである。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態は、植物成長および植物構造に対するサイトカイニンオキシダーゼ発現のポジティブ効果に関し、特に、根の成長および根構造、種子サイズおよび種子重量、胚サイズおよび胚重量、ならびに子葉サイズおよび子葉重量に対するサイトカイニンオキシダーゼ発現のポジティブ効果に関する。サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子ファミリーは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの少なくとも６つのメンバーからなる（以下の実施例を参照のこと）。本発明者らは、トランスジェニック植物において、これらの遺伝子のうちのいくつかを用いて達成される効果の定量的相違が存在することを示している。記載されているＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓサイトカイニンオキシダーゼの機能的ホモログは、多くの緑色植物（Ｈａｒｅおよびｖａｎ  Ｓｔａｄｅｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  ９１：１２８−１３６，１９９４；ＪｏｎｅｓおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｐｌａｎｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇ  ２３：１２３−１３４，１９９７）、および他の生物（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｅｄｓ  Ｍｏｋ  ａｎｄ  Ｍｏｋ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ１３９−１５４，１９９４）においてサイトカイニンオキシダーゼ活性の存在についての証拠を与える他の生物から単離され得ることが予測される。従って、本発明において機能的なサイトカイニンオキシダーゼの配列は、本明細書中に記載される配列と同一である必要はない。本発明は、一般的な穀類作物および単子葉作物のために特に有用であり、例えば、小麦またはトウモロコシ由来のサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子も同様に使用され得る（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９９；Ｒｉｎａｌｄｉ  ａｎｄ  Ｃｏｍａｎｄｉｎｉ，１９９９）。サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するかまたは任意の他のサイトカイニン代謝活性を有する他の遺伝子（Ｚａｚｉｍａｌｏｖａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，Ｈｏｏｙｋａａｓ，ＨａｌｌおよびＬｉｂｂｅｎｇａ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｐｐ  １４１−１６０，１９９７）もまた、本発明の目的のために使用され得ると考えられる。同様に、内因性サイトカイニン代謝活性を増加させる遺伝子コードタンパク質もまた、本発明の目的のために使用され得る。原則として、類似の表現型はまた、サイトカイニンの下流で機能する遺伝子（例えば、サイトカイニンのシグナル伝達経路に関与するレセプターまたはタンパク質）を妨害することによって得られ得る。
【００２８】
本発明の目的のために、用語「根の成長」は、単子葉植物と双子葉植物との両方における、根の成長の種々の段階にて根系を作製する種々の部分の成長の全ての局面を包含することが理解されるべきである。この根の成長の促進は、根の１つ以上の部分（主根、側根、不定根などを含む）（これらの全ては、本発明の範囲内に含まれる）の成長の促進をもたらし得ることが理解されるべきである。
【００２９】
本発明の目的のために、種子重量または種子サイズの増加は、胚、内乳、アリューロン、および種皮の１つ以上のサイズの増加を含み得ることもまた、理解されるべきである。さらに、胚サイズおよび／または胚重量の増加は、胚に関連する種々の器官（例えば、子葉、胚軸、および根）の増加を含み得る。
【００３０】
第一の実施形態に従って、本発明は、根の成長を刺激するための方法、ならびに／あるいは側根および／または不定根の形成を促進するための方法、ならびに／あるいは植物サイトカイニンオキシダーゼの発現を含むかまたは植物もしくは植物の一部における活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現を含む根の向地性を変更するための方法に関する。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、植物におけるサイトカイニンオキシダーゼのレベルもしくは活性を増加させることによってか、または植物もしくは植物の一部における活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現によって、植物種子のサイズおよび／または重量を増加させるための方法に関する。好ましくは、サイトカイニンオキシダーゼのレベルもしくは活性の増加、または植物もしくは植物の一部における活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現は、種々の組織を含む種子またはこの種子の細胞型に局在化される。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、植物におけるサイトカイニンオキシダーゼのレベルもしくは活性を増加させることによってか、または植物もしくは植物の一部における活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現によって、植物胚のサイズおよび／または重量を増加させるための方法に関する。好ましくは、サイトカイニンオキシダーゼのレベルもしくは活性の増加、または植物もしくは植物の一部における活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現は、種子に局在化される。なおより好ましくは、サイトカイニンオキシダーゼのレベルもしくは活性の増加、または植物もしくは植物の一部における活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現は、胚に局在化される。
【００３３】
なお別の実施形態において、本発明は、植物におけるサイトカイニンオキシダーゼのレベルもしくは活性を増加させることによってか、または植物もしくは植物の一部における活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現によって、植物子葉のサイズおよび／または重量を増加させるための方法に関する。好ましくは、サイトカイニンオキシダーゼのレベルもしくは活性の増加、または植物もしくは植物の一部における活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現は、子葉に局在化される。
【００３４】
本発明の文脈において、用語「発現」および／または「過剰発現」は、相互交換可能に使用され、かつこれら両方が、植物サイトカイニンオキシダーゼまたは植物における活性サイトカイニンのレベルを低下させる任意の他のタンパク質の「増強された発現および／または異所性発現」に関することが理解されるべきである。これとともに、植物サイトカイニンオキシダーゼの増強された発現、および植物サイトカイニンオキシダーゼまたは上記の他のタンパク質の「デノボ」発現が意味されることが、明確であるべきである。あるいは、上記の他のタンパク質は、植物サイトカイニンオキシダーゼのサイトカイニン代謝活性を増強する。
【００３５】
本発明の文脈において、語句「側根および／または不定根」は、「側根および不定根」を意味し得るが、「側根または不定根」を意味し得ないことが、さらに理解されるべきである。この増強は、側根の形成においてまたは不定根の形成において、および非主根の両方の型において存在し得るが、必ずしも必要ではない。
【００３６】
さらに、本明細書中で使用される場合、「種子のサイズ（大きさ）および／または重量の増加」は、種子のサイズおよび重量の増加を意味し得、種子のサイズまたは重量の増加もまた意味し得る。従って、この増強は、種子のサイズの増加においてもしくは種子の重量の増加において、またはその両方において存在し得る。類似の解釈が、「胚のサイズおよび／または重量の増加」ならびに「子葉のサイズおよび／または重量の増加」に適用されるべきである。
【００３７】
用語「植物（単数）」および「植物の一部（単数）」は、用語「植物（複数）」および「植物の一部（複数）」と相互交換可能に使用される。
【００３８】
さらなる実施形態に従って、本発明は、根の成長を刺激するための方法、および／または側根もしくは不定根の形成を促進するための方法、および／または根の向地性を変更するための方法、および／または収穫量を増加させるための方法、および／または初期生長力を増強させるための方法、および／または根／苗条比を改変するための方法、および／または倒伏（ｌｏｄｇｉｎｇ）に対する耐性を改善するための方法、および／または渇水耐性を増加させるための方法、および／またはインビトロでの外植片の伝播（植物サイトカイニンオキシダーゼの発現、または植物もしくは植物の一部における活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現を含む）を促進するための方法に関する。
【００３９】
好ましい実施形態に従って、本発明は、根の成長を刺激するための方法に関し、この方法は、サイトカイニンオキシダーゼ（好ましくは、本発明に従うサイトカイニンオキシダーゼ）、または植物もしくは植物の一部（好ましくは、根）における活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の過剰発現によって、根質量の増加をもたらす。
【００４０】
成長促進配列の過剰発現に起因する、より高度な根バイオマス生成は、その収穫量に対する直接的な効果を有し、かつ根細胞もしくはトランスジェニック根細胞またはこのトランスジェニック根細胞の細胞培養物によって生成される化合物の生成に対する間接的な効果を有する。根培養物中で生成される興味深い化合物の１つの例は、シコニン（ｓｈｉｋｏｎｉｎ）であり、この収穫量は、上記方法によって有利に増強され得る。
【００４１】
より特定の実施形態に従って、本発明は、根の成長を刺激するための方法、または側根および／もしくは不定根の形成を促進するための方法、または根の向地性を変更するための方法、または種子のサイズおよび／もしくは重量を増加させるための方法、または胚のサイズおよび／もしくは重量を増加させるための方法、または子葉のサイズおよび／もしくは重量を増加させるための方法に関する。この方法は、以下からなる群より選択される植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸の発現、または好ましくは、植物もしくは植物の一部における活性サイトカイニンのレベルを低下させるタンパク質をコードする核酸の、根もしくは種子（胚、内乳、種皮、またはアリューロンのような種子の一部を含む）、もしくは子葉における発現を含む：
（ａ）配列番号２７、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８〜３１、配列番号３３もしくは配列番号３４、またはそれらの相補体のいずれかで与えられるＤＮＡ配列を含む核酸：
（ｂ）配列番号２７、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８〜３１、配列番号３３もしくは配列番号３４、またはそれらの相補体のいずれかに対応するＲＮＡ配列を含む核酸；
（ｃ）配列番号２７、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８〜３１、配列番号３３もしくは配列番号３４、またはそれらの相補体のいずれかに特異的にハイブリダイズする核酸；
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号３２もしくは配列番号３５、またはそれらの相補体のいずれかで与えられるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；
（ｅ）上記核酸が、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＲＮＡであることによって特徴付けられる、（ａ）〜（ｄ）のいずれかにおいて定義される核酸（ここで、Ｔは、Ｕで置き換えられている）；
（ｆ）遺伝暗号の結果として、配列番号２７、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８〜３１、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかで与えられる核酸または（ａ）〜（ｅ）のいずれかにおいて定義される核酸に縮重する、核酸；
（ｇ）生物間でのコドン用法における差異に起因して、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２もしくは配列番号３５のいずれかで与えられるタンパク質をコードする核酸または（ａ）〜（ｅ）のいずれかにおいて定義される核酸と異なる（ｄｉｖｅｒｇｅ）、核酸；
（ｈ）対立遺伝子間の差異に起因して、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２もしくは配列番号３５で与えられるタンパク質をコードする核酸または（ａ）〜（ｅ）に定義される核酸と異なる（ｄｉｖｅｒｇｅ）、核酸；
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号３５のいずれかで与えられるタンパク質をコードする核酸；
（ｊ）サイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｉ）のいずれかにおいて定義される核酸の機能的フラグメント；ならびに、
（ｋ）植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸。
【００４２】
本発明において、新規なＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸が単離され、そして初めて、本発明者らは、驚くべきことに、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物部分におけるサイトカイニンオキシダーゼの発現が、上記した根および種子に関連した特徴を生じたことを示した。根に関連した特徴が発揮されるためには、サイトカイニンオキシダーゼの発現は、根において、好ましくは、根特異的プロモーターの制御下で、生じるべきである。種子に関連した特徴（胚を含む）が発揮されるためには、サイトカイニンオキシダーゼの発現は、種子において、好ましくは種子特異的プロモーターの制御下で、生じるべきである。このような根特異的プロモーターの一例は、配列番号３６において提供される。種子特異的プロモーターの例は、表４中に列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
子葉に関連した特徴が発揮されるためには、サイトカイニンオキシダーゼの発現が、子葉において、好ましくは、子葉で優先的に発現するプロモーターの制御下で、生じるべきである。
【００４４】
本発明は、いくつかの新規なＡｔＣＫＸ遺伝子およびタンパク質によって実施例の節において支持されるが、本発明の概念はまた、実施例の節において記載されるように、植物において同様の効果を得るために、他の植物（好ましくは、当該他の植物の根および／または種子および／または子葉）から単離され、そして発現される他のサイトカイニンオキシダーゼの使用にも関することが明らかであるべきである。
【００４５】
従って、本発明は、より一般的には、根成長を刺激するため、または側根または不定根の形成を増強するため、または根の重力屈性を変化させるための、植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸、または植物または植物部分において活性サイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の使用に関する。本発明はまた、種子サイズおよび／もしくは重量の増大のため、または胚サイズおよび／もしくは重量の増大のため、または植物子葉サイズおよび／もしくは重量の増大のための、植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸の使用、または植物または植物部分において活性サイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の使用に関する。使用されるべき好ましいサイトカイニンオキシダーゼは、上記で規定したようなサイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸によってコードされ、そして以下に規定されるような本発明の新規な核酸によってコードされる。
【００４６】
本発明は、以下からなる群から選択される、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有する新規な植物タンパク質をコードする単離された核酸に関する：
（ａ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３または３４のいずれかに示されるようなＤＮＡ配列を含む核酸、またはそれらの相補体、
（ｂ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３または３４のいずれかに示されるようなＲＮＡ配列を含む核酸、またはそれらの相補体、
（ｃ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３または３４のいずれかに示されるような核酸に特異的にハイブリダイズする核酸、またはそれらの相補体、
（ｄ）配列番号３２に示されているようなポリペプチドを含み、そして配列番号４に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも７０％類似の、好ましくは、少なくとも７５％、８０％または８５％、より好ましくは、少なくとも９０％または９５％、最も好ましくは、少なくとも９９％類似のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｅ）配列番号６に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも３５％類似の、好ましくは、３７％、４０％、４５％、４７％または５０％類似の、より好ましくは、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％類似の、最も好ましくは、８５％、９０％または９５％類似のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、  （ｆ）配列番号１０または３５に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも３５％類似の、好ましくは、３７％、４０％、４５％、４７％または５０％類似の、より好ましくは、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％類似の、最も好ましくは、８５％、９０％または９５％類似のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｇ）配列番号４、６、１０、３２または３５のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、
（ｈ）遺伝コードの結果として、配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３３または３４のいずれかに示されるような核酸または（ａ）から（ｇ）のいずれかで規定されたような核酸に対して縮重している、核酸、
（ｉ）生物間でのコドン用法の差異に起因して、配列番号４、６、１０または３５のいずれかに示されるようなタンパク質をコードする核酸または（ａ）から（ｇ）のいずれかに規定されるような核酸と異なる（ｄｉｖｅｒｇｅ）、核酸、
（ｊ）対立遺伝子間の差異に起因して、配列番号４、６、１０または３５に示されるようなタンパク質をコードする核酸または（ａ）から（ｇ）に規定されるような核酸と異なる（ｄｉｖｅｒｇｅ）、
（ｋ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３または３４のいずれかに示されるような核酸によってコードされるサイトカイニンオキシダーゼの免疫学的活性フラグメントをコードする核酸、または（ａ）から（ｊ）のいずれかに規定されるような核酸の免疫学的活性フラグメントコードする核酸、
（ｌ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３または３４のいずれかにおいて示されるような核酸によってコードされるサイトカイニンオキシダーゼの機能的フラグメントをコードする核酸、または（ａ）から（ｊ）のいずれかにおいて規定されるような核酸の機能的フラグメントコードする核酸であって、ここで当該フラグメントは、サイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する、核酸、および
（ｍ）配列番号４、６、１０または３５に規定されるようなタンパク質をコードする核酸であって、ここで、当該核酸は、以下のＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＣ００５９１７、ＡＢ０２４０３５、およびＡＣ０２３７５４のいずれかの下で登録された核酸ではない、核酸。
【００４７】
本発明はまた、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡもしくはＲＮＡであり、ここでＴがＵに置換されている、本発明の単離された核酸に関する。
【００４８】
本発明はまた、本発明の核酸と特異的にハイブリダイズするか、または特異的に増幅する、少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸分子に関する。
【００４９】
異なるサイトカイニン形態は、種々の発達プロセスにおいて果たす、異なる役割を有し得る。従って、ＣＫＸ１、ＣＫＸ２、ＣＫＸ３およびＣＫＸ４の示差的な効果は、異なるサイトカイニンのプールに対する明確な効果に関連し得る。例えば、ＣＫＸ１およびＣＫＸ３は、主に、根伸長および分枝を促進するが、ＣＫＸ２およびＣＫＸ４は、主として、不定根の形成を刺激する。さらに、ＣＫＸ１およびＣＫＸ３は、種子サイズおよび重量を、ＣＫＸ２およびＣＫＸ４よりも大きな程度に増大する。特定の作用形態に束縛されることなく、サイトカイニンプールに対するこの示差的な効果は、基質特異性におけるいくらかの差異、または細胞におけるサイトカイニンオキシダーゼの示差的な区画化（ＣＫＸ１およびＣＫＸ３についてミトコンドリアであり、ＣＫＸ２、ＣＫＸ４、ＣＫＸ５、およびＣＫＸ６について細胞外であると推定される）から生じ得る。
【００５０】
別の実施形態に従って、本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターに関する。好ましい実施形態では、当該ベクターは、この核酸が１つ以上の制御配列に作動可能に連結されており、原核生物宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において当該配列の発現を可能にする発現ベクターである。
【００５１】
単子葉植物における本発明のサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の発現について、ｃＤＮＡ配列に対応する核酸配列が、単子葉植物におけるイントロンの誤スプライシングを回避するために使用されるべきであることが理解されるべきである。単子葉植物において発現されるべき好ましいｃＤＮＡ配列は、配列番号２５から３０および３４のいずれかに示されるような核酸配列を有する。
【００５２】
本発明はまた、本発明の核酸分子またはベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。当該宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物または動物細胞を含む群から選択される。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、本発明の核酸によってコード可能な単離されたポリペプチド、またはそれらのホモログまたは誘導体、またはそれらの免疫学的活性フラグメントまたは機能的フラグメントに関する。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、３２および３５のいずれかに示されるようなアミノ酸配列、またはそれらのホモログもしくは誘導体、またはそれらの免疫学的活性フラグメントおよび／もしくは機能的フラグメントを含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２または３５に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれらのホモログもしくは誘導体、またはそれらの免疫学的活性フラグメントおよび／もしくは機能的フラグメントに関する。それらの好ましい機能的フラグメントは、それらのシグナルペプチドを欠くフラグメントである。
【００５４】
なお別の実施形態に従って、本発明は、本発明のポリペプチドを生成するための方法であって、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、およびこの培養物から生成されたポリペプチドを回収する工程を包含する、方法に関する。
【００５５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはそれらの特異的エピトープを特異的に認識する抗体に関する。
【００５６】
本発明はさらに、トランスジェニック植物、植物細胞、または植物組織の生成のための方法であって、当該植物、植物細胞、または植物組織において、発現可能な様式で本発明の核酸分子を、または本発明のベクターを導入する工程を包含する、方法に関する。
【００５７】
本発明はまた、変化した植物、植物細胞、または植物組織の生成のための方法であって、当該植物の細胞、組織、または器官に直接的に、本発明のポリペプチドを導入する工程を包含する、方法に関する。
【００５８】
別の実施形態に従って、本発明は、本発明のポリペプチドの発現を行うための方法であって、１つ以上の制御配列に作動可能に連結された本発明の核酸分子、または本発明のベクターを植物細胞のゲノムに安定に導入する工程を包含する、方法に関する。本発明はさらに、当該植物細胞から植物を再生する工程をさらに包含する、上記の方法に関する。
【００５９】
本発明はまた、本発明の核酸配列を含むトランスジェニック植物細胞であって、当該核酸配列が、調節エレメントに作動可能に連結されて、植物細胞における当該核酸の転写および／または発現を可能にする、植物細胞、または上述した方法によって得られ得るトランスジェニック植物細胞に関する。
【００６０】
別の好ましい実施形態に従って、本発明は、本明細書中上述したようなトランスジェニック植物細胞であって、ここで本発明の核酸が当該植物細胞のゲノムに安定して組み込まれている、トランスジェニック植物細胞に関する。
【００６１】
本発明はさらに、本明細書中に記載されるような植物細胞を含むトランスジェニック植物または植物組織、およびまた、当該トランスジェニック植物の収穫可能な部分、好ましくは、種子、葉、果実、茎培養物、根、塊茎、根茎、および鱗茎からなる群から選択される部分に関する。本発明はまた、当該トランスジェニック植物または植物部分のいずれかに由来する子孫に関する。
【００６２】
別の実施形態に従って、本発明は、根成長を刺激するための方法であって、本発明の核酸を発現する工程を包含するか、または植物もしくは植物部分において活性サイトカイニンのレベルを減少させる別のタンパク質を発現させる工程を包含する、方法に関する。
【００６３】
本発明の別の局面において、種子のサイズおよび／または重量を増大させる方法が提供される。この方法は、植物においてサイトカイニンオキシダーゼのレベルまたは活性を増大させる工程、植物または植物部分（好ましくは、種子）において活性サイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質のレベルまたは活性を増大させる工程を包含する。
【００６４】
種子の種々の部分（器官）もまた、サイズおよび／または重量が増大され得る（例えば、胚、胚乳、種皮、またはアリューロン）。例えば、本発明に従って、胚の大きさおよび／または重量を増大させる方法が提供される。この方法は、植物においてサイトカイニンオキシダーゼのレベルまたは活性を増大させる工程、または植物または植物部分（好ましくは、胚）において活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質のレベルまたは活性を増大させる工程を包含する。
【００６５】
本発明のさらに別の局面では、子葉の大きさおよび／または重量を増大させる方法が提供される。この方法は、植物においてサイトカイニンオキシダーゼのレベルまたは活性を増大させる工程、または植物または植物部分（好ましくは、子葉）において活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質のレベルまたは活性を増大させる工程を包含する。
【００６６】
種子サイズおよび／または重量を増大する方法に従って、実生の成長速度の増大または
早期強勢における増大が得られる。収穫量の増大もまた得られる。同様に、胚のサイズおよび／もしくは重量、または子葉の大きさおよび／もしくは重量を増大させる方法に従って、実生の成長速度の増大または早期強勢の増大が得られる。多くの場合、収穫量の増大もまた得られる。実生成長または早期強勢の増大は、しばしば、ストレス耐性の増大と関連する。例えば、実生（発芽の際の実生の根系を含む）のより速い発達は、生存（特に悪条件（例えば、乾燥）下での）にとって重要である。
【００６７】
サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列が、本発明の方法において使用され得る。例えば、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本明細書中で提供される種々の配列のいずれかが、種子、胚、または子葉のサイズおよび／もしくは重量を増大させる方法において使用され得る。
【００６８】
好ましくは、配列番号１、５、２５、または２７のいずれかに記載のような核酸、または当該核酸のオルソログを発現するトランスジェニック植物が生成される。好ましくは、このオルソログは、トランスジェニック植物の関連した種に由来する。さらにより好ましくは、このオルソログは、トランスジェニック植物の種に対して特異的（ネイティブまたは内因性）である。
【００６９】
上記のように、発現を特異的に、または優先的に制御するプロモーターが、本発明の方法において使用され得る。従って、種子のサイズまたは重量における増大が望ましい場合、種子特異的プロモーターが使用され得る。胚のサイズまたは重量における増大が望ましい場合、胚特異的プロモーターが使用され得る。子葉のサイズまたは重量における増大が望ましい場合、子葉において発現を制御するプロモーターが好ましい。このようなプロモーターは周知であり、広範に入手可能であり、そして本明細書中に、例えば、表４において、列挙されている。
【００７０】
別の実施形態では、本発明は、種子の大きさまたは種子の重量、またはその両方を増大させるための方法であって、この方法は、本発明の核酸を発現させる工程を包含するか、または植物または植物部分において活性サイトカイニンのレベルを減少する別のタンパク質を発現させる工程を包含する、方法に関する。
【００７１】
なお別の実施形態では、本発明は、胚の大きさまたは胚の重量、またはその両方を増大させるための方法であって、この方法は、本発明の核酸を発現させる工程を包含するか、または植物または植物部分において活性サイトカイニンのレベルを減少する別のタンパク質を発現させる工程を包含する、方法に関する。
【００７２】
さらに別の実施形態では、本発明は、子葉の大きさを増大させるための方法であって、この方法は、本発明の核酸を発現させる工程を包含するか、または植物または植物部分において活性サイトカイニンのレベルを減少する別のタンパク質を発現させる工程を包含する、方法に関する。植物または植物部分において、係るサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子またはそれらの部分の、あるいは活性サイトカイニンのレベルを減少する別のタンパク質の局在化された発現は、子葉の成長の増強に至る。貯蔵器官として子葉を有する種においては、このような子葉の成長の増強は、収穫量の増強および／または実生の成長効率の増強に至る。さらにこの点において、炭水化物、脂質およびタンパク質は全て種子内に貯蔵され、植物の早期成長の間にエネルギーおよび代謝物を提供するために、発芽の間に代謝される。種子の大きさは、しばしば、早期強勢と関連している。なぜなら、より大きな種子は、より多くの炭水化物、脂質およびタンパク質を含み、従って、より速い成長を与えるからである。従って、本発明の方法は、実生のより早い成長に至る。このような早期強勢はストレス耐性の増強と関連している。例えば、植物の根系のより速い発達は、生存（特に悪条件（例えば、乾燥）下で）にとって重要である。早期強勢はまた、収穫量の増大および開花までの時間の短縮に関連している。
【００７３】
植物の細胞または組織培養物は、これらの植物細胞または組織に、成長および／または特定の化合物の生成に必要な全ての要件を提供する特別な培地（液体または固体のいずれかの）において増殖される、植物細胞または植物組織の人工的に生成される培養物である。植物の細胞および／または組織培養物は、数例を挙げると、植物の迅速な繁殖のため、およびトランスジェニック植物の生成のために使用され得る。根形成は、いくつかの移植片にとって、または当該培養物におけるいくらかの条件においては困難であり得、当該培養された植物細胞または組織におけるサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の発現は、根形成を増強するために使用され得る。植物細胞および／または組織培養物はまた、有益な化合物の工業的生成のために使用され得る。可能な生成化合物は、医薬品、殺虫剤、色素、化粧品、香水、食物添加剤などである。このような生成物の例は、シコニン（ｓｈｉｋｏｎｉｎ）（これは、植物Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎの根によって生成される）である。植物組織培養物の例は、毛状根培養物であり、これは、毛状根の人工的に生成された塊である。Ｌ．ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎの根は、多数に採集することが困難であり、毛状根培養物を調製することにより、最終産物のシコニンは、通常存在するよりも速い速度で工業的に調製され得る。本明細書中で開示されるように、サイトカイニンオキシダーゼの発現は、根成長および発達を増強し、従って、当該植物細胞および組織培養手順において有利に使用され得る。従って、本発明の別の実施形態に従って、根成長および発達を刺激するための方法が提供され、この方法は、トランスジェニック植物細胞または当該トランスジェニック植物細胞を含む組織培養物において、植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸、好ましくは、本発明のサイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸を発現させる工程を包含する。
【００７４】
本発明はさらに、側根または不定根の形成を増強するための方法であって、本発明の核酸を発現させる工程を包含するか、または植物または植物部分において活性サイトカイニンのレベルを減少する別のタンパク質を発現させる工程を包含する、方法に関する。
【００７５】
本発明はまた、根の横地重力屈性を変更する方法に関し、この方法は、本発明の核酸の発現の変更を含むかまたは、植物中もしくは植物の一部中の活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現を含む。
【００７６】
本発明はまた、初期生長力（ｖｉｇｏｒ）を増強する方法、および／または根／苗条比を改変する方法、および／または倒伏に対する抵抗を向上する方法、および／または乾燥耐性を増大する方法、および／または外植体のインビトロにおける繁殖を促進する方法であって、植物もしくは植物の一部中の活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現を含む本発明の核酸の発現を含む方法に関する。
【００７７】
本発明はさらに、根の大きさを増大する方法あるいは根成長点の大きさを増大する方法に関し、この方法は、本発明の核酸の発現を含むかまたは植物もしくは植物の一部（好ましくは、根）中の活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現を含む。
【００７８】
さらに別の実施形態に従って、本発明は、苗条成長点の大きさを増大する方法に関し、この方法は、（好ましくは、苗条中の）本発明の核酸の発現のダウンレギュレーションを含む。
【００７９】
好ましい実施形態に従って、本発明は、葉老化を遅延させる方法に関し、この方法は、葉（好ましくは、老化した葉）中の本発明の任意のサイトカイニンオキシダーゼの発現のダウンレギュレーションを含む。本発明はまた、葉老化を変更する方法に関し、この方法は、老化した葉中のサイトカイニンオキシダーゼのうちの１つの発現を含む。
【００８０】
本発明はまた、葉の厚さを増大させる方法に関し、この方法は、本発明の核酸の発現を含むかまたは植物もしくは植物の一部（好ましくは、葉）中の活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現を含む。
【００８１】
本発明はまた、導管の大きさを低下させる方法に関し、この方法は、本発明の核酸の発現を含むかまたは植物もしくは植物の一部（好ましくは、導管）中の活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現を含む。
【００８２】
本発明はさらに、導管の大きさを増大させる方法に関し、この方法は、植物もしくは植物の一部中の本発明の核酸の発現のダウンレギュレーションを含む。
【００８３】
別の実施形態に従って、本発明は、実生の直立性を改良する方法に関し、この方法は、本発明の核酸の発現を含むかまたは実生中の活性サイトカイニンのレベルを低下する別のタンパク質の発現を含む。
【００８４】
さらに、本発明は、上記の任意の方法に関し、この方法は、結果として収穫量の増加につながる。
【００８５】
本発明はさらに、本発明の任意の方法に関し、ここで、この核酸の発現は、強力な構成的プロモーターの制御下で起こる。植物根への効果を有する本発明の局面（例えば、好ましくは、根の成長を刺激する方法、側根または不定根の形成を向上させる方法、あるいは根の横地重力屈性を変更する方法）について、本発明の核酸の発現は、好ましくは根中において優先的に発現されるプロモーターの制御下で起こる。表５ａにおいて、根特異的プロモーターの不完全な表が含まれる。本発明の方法に使用される好ましいプロモーターは、クラバータ（ｃｌａｖａｔａ）ホモログプロモーターであり、配列番号３６に公表されるような配列を有する。
【００８６】
植物種子への効果を有する本発明の局面（例えば、種の大きさまたは重量を増大する方法、胚芽の大きさまたは重量を増大する方法）、あるいは植物子葉への効果を有する本発明の局面（例えば、子葉の大きさまたは重量を増大する方法）について、本発明の核酸の発現は、種中において優先的に発現されるプロモーターの制御下で起こる。種子特異的プロモーターは、全ての種子器官において発現されるプロモーターであり得るか、あるいは１つ以上の器官または組織（例えば、胚芽、胚乳、もしくはアリューロン）に対して、発現における優先傾向を示すプロモーターであり得る。このようなプロモーターの例を、本明細書の表４に示す。
【００８７】
さらに別の実施形態に従って、本発明は、細胞運命を改変する方法、および／または植物成長を改変する方法、および／または植物形態を改変する方法、および／または植物生化学を改変する方法、および／または植物生理学を改変する方法、および／または細胞周期進行速度を改変する方法であって、植物の特定の細胞、組織もしくは器官における本発明の核酸の発現の改変を含む方法に関する。
【００８８】
本発明はまた、成長の促進、ならびに／または収穫量の増加、ならびに／または植物細胞、組織および／もしくは器官の老化の変更、ならびに／または植物の側器官の形成の頻度の増大、を達成する方法であって、本発明の核酸の異所的発現を含む方法に関する。
【００８９】
本発明はまた、不利な生育条件および／またはストレス条件における細胞の細胞分裂活性を促進および拡大する方法に関し、この方法は、本発明の核酸配列の異所的発現を含む。
【００９０】
さらに別の実施形態に従って、本発明は、本発明のポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定および獲得する方法に関し、この方法は、本発明のポリペプチドを使用したスクリーニングアッセイを含む。
【００９１】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定および獲得する方法に関し、この方法は、本発明のポリペプチドをバイト（ｂａｉｔ）として使用し、そしてｃＤＮＡライブラリーをプレイ（ｐｒｅｙ）として使用する、ツーハイブリッドスクリーニングアッセイを含む。
【００９２】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドと、上記の方法によって得られ得る相互作用タンパク質パートナーとの間の相互作用を調節する方法に関する。
【００９３】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドと相互作用する化合物を同定および獲得する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ツーハイブリッド系を提供する工程であって、本発明のポリペプチドおよび相互作用タンパク質パートナーが上記の方法によって得られる、工程；
（ｂ）この化合物を、ａ）に記載の発現されたポリペプチドによって形成された複合体と相互作用させる工程；ならびに
（ｃ）この化合物の、ポリペプチドまたはａ）に記載の発現されたポリペプチドによって形成された複合体との相互作用の（リアルタイムの）測定を実行する工程。
【００９４】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する化合物または化合物の混合物を同定する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）複合体形成を可能にするのに適切な条件下で、本発明のポリペプチドをこの化合物または化合物の混合物と結合する工程；および
（ｂ）複合体形成を検出する工程であって、この複合体の存在が、このポリペプチドを特異的に結合する化合物または混合物を同定する、工程。
【００９５】
本発明はまた、上記の方法に関し、ここで、この化合物または混合物は、本発明のこのポリペプチドの活性を阻害し、そして化学物質の合理的な設計に使用され得る。
【００９６】
別の実施形態に従って、本発明は、植物成長調節因子または除草剤として、上記の方法によって同定される化合物または混合物の使用に関する。
【００９７】
本発明はまた、植物成長調節因子または除草剤組成物の生成についての方法に関し、この方法は、上記の化合物スクリーニング方法の工程およびこの工程から得られる化合物を、農業または植物の細胞培養または組織培養における適用に適切な形態で処方する工程を包含する。
【００９８】
本発明はまた、分枝形成を増大する方法に関し、この方法は、植物または植物部分（好ましくは、茎または腋芽）中の本発明の核酸の発現を含む。
【００９９】
本発明はまた、倒伏耐性を改善する方法に関し、この方法は、植物または植物部分（好ましくは、茎または腋芽）中の本発明の核酸の発現を含む。
【０１００】
本発明はまた、成長促進化学物質もしくは除草剤についての設計またはスクリーニングの方法に関し、この方法は、本発明の核酸または本発明のベクターの使用を含む。
【０１０１】
別の実施形態に従って、本発明は、収穫量の増大のための本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０１０２】
本発明はまた、根の成長を刺激するための本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０１０３】
本発明はまた、側根または附属根の形成を増大するための本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０１０４】
本発明はまた、根の横地重力屈性の変更のための本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０１０５】
本発明はまた、種子の大きさ、種子の重量、胚芽の大きさ、胚芽の重量、子葉の大きさ、および子葉の重量のうちの少なくとも１つを増大するための本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０１０６】
本発明はさらに、初期生長力の増進、および／または根／苗条比の改変、および／または倒伏に対する抵抗の改善、および／または乾燥耐性の増大、および／または外植体のインビトロにおける増殖の促進のための、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０１０７】
本発明はまた、本発明の核酸分子、本発明の組換えベクターまたは本発明のポリペプチドの使用に関し、この使用によって、植物成長を改変し、および／または植物形態を改変し、および／または植物生化学を改変し、および／または植物生理学を改変する。
【０１０８】
さらに別の実施形態に従って、本発明は、診断（ｄｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）組成物に関し、この組成物は、少なくとも本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を含む。
【０１０９】
本発明の別の実施形態は、トランスジェニック台木の使用に関し、この使用によって、接ぎ穂（ｓｃｉｏｎ）を用いた接木手順において、サイトカイニンオキシダーゼの発現によって根の成長および発育が向上し、農業上の特性または園芸上の特性が改良された植物または木が生産される。接ぎ穂は、トランスジェニックまたは非トランスジェニックであり得る。この実施形態によって認識される特定の特性は、根系によって授与された特性であり、そして土壌における植物／木の係留の改善、ならびに／あるいは例えば結果として乾燥耐性の改善をもたらす水の取り込みの改善ならびに／あるいは土壌からの栄養の取り込みの改善ならびに／あるいは植物全体にわたる有機物質の輸送の改善ならびに／あるいは土壌中への物質（例えば、植物ヘモジデリン貪食細胞（ｐｈｙｔｏｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ））の分泌の向上ならびに／あるいは呼吸の改善ならびに／あるいは対病性の改善ならびに／あるいは収穫量の改善を含む特性が挙げられる。接木のためにＡｔＣＫＸ形質転換台木を使用する利点は、根系の向上に加えて、本明細書中に記載されるように、接木上の葉の老化の遅延である（図１２Ａを参照）。この特定の実施形態のための好ましい植物または木としては、自己の根において良好に生育しない植物または木が挙げられ、そして栽培環境（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｓｅｔｔｉｎｇ）（例えば、市販の収穫が期待できる品種のブドウ、柑橘類、アプリコット、アーモンド、プラム、モモ、リンゴ、ナシ、サクランボ、クルミ、イチジク、ヘイゼルおよびビワ）において接木される。
【０１１０】
上述のように、オーキシンおよびサイトカイニンは、ある生物学的プロセスにおいて、アンタゴニストとして作用する。例えば、サイトカイニン／オーキシン比は、結果的に根の組織化をもたらす高濃度のオーキシンおよび結果的に苗条の生成をもたらす高濃度のサイトカイニンを用いて、根および苗条の生成を調節する。本発明に開示されるように、タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるサイトカイニンオキシダーゼの発現は、結果的に、オーキシン効果の向上と一致して、根の発育の向上をもたらす。オーキシンはまた、果実の発育にも関係する。雌花の部分のオーキシンでの処理は、結果的に、いくつかの植物種において単為結実果実の発育をもたらす。単為結実果実の発育は、いくつかの園芸作物において、雌性生殖器におけるオーキシンの生合成の増大を介して、遺伝学的に操作される（ＷＯ０１０５９８５）。
【０１１１】
従って、別の実施形態に従って、本発明は、植物に単為結実形質を誘導する方法に関し、この方法は、１つ以上のサイトカイニンオキシダーゼまたは別のタンパク質（植物または植物の一部、好ましくは、雌性生殖器（例えば、胎座、胚珠およびそれらに由来する組織）において活性サイトカイニンのレベルを低下させる）の発現をダウンレギュレートする工程から構成される。Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓに由来するＤｅｆＨ９プロモーター領域またはその相同体の１つ（胎座および胚珠中の高い発現特異性を授与する）が、この目的に使用され得る。
【０１１２】
当業者は、本明細書中に記載される発明が、具体的に記載される発明以外のバリエーションおよび改変を前提とすることを認識する。本明細書中に記載される発明が、このようなバリエーションおよび改変の全てを含むことが理解される。本発明はまた、本明細書中で参照されるかまたは示されるような工程、特性、組成物および化合物の全てを、個別にかまたは集合的に含み、そして、任意あるいはそれ以上のこれらの工程または特性のありとあらゆる組み合わせを含む。
【０１１３】
本発明は、任意の植物、特に、飼い葉または飼料マメ科植物、観賞植物、食用作物、木、または以下を含む表から選択された低木：
【０１１４】
【化１】
2010213715.tif 000002
アマランス、朝鮮アザミ、アスパラガス、ブロッコリー、ブリュッセルスプラウト（ｂｒｕｓｓｅｌ  ｓｐｒｏｕｔ）、キャベツ、アブラナ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードの若葉、アマ、ケール、レンズマメ、菜種、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、ストロー、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、カボチャ、および茶、または中でも、上に具体的に名を挙げた任意の植物の種子、または上記の任意の種の組織培養、細胞培養もしくは器官培養を含む、単子葉植物および双子葉植物に適用される。
【０１１５】
本明細書にわたって、その文脈が他に要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびにそのバリエーション（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、他の任意の整数または工程あるいは整数または工程の群の除外ではなく、規定された整数または工程あるいは整数または工程の包含を意味することが理解される。
【０１１６】
本明細書中に使用されるように、用語「に由来する」は、特定の整数または整数の群が特定の種類に起源を有するが、特定の源から直接得られることを必要としないことを示すと解釈される。
【０１１７】
用語「タンパク質」、「ペプチド」または「オリゴペプチド」は、本明細書中に使用される場合、任意の長さの重合体形態のアミノ酸をいう。これらの用語はまた、公知のアミノ酸修飾（例えば、ジスルフィド結合形成、システイニル化、酸化、グルタチオニル化（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化、アセチル化、ファルネシル化、ビオチン化、ステアロイル化、ホルミル化、リポ酸付加、リン酸化、硫酸化、ユビキチン化、ミリストイル化、パルミトイル化、ゲラニルゲラニル化、環化（例えば、ピログルタミン酸生成）、酸化、脱アミド、脱水、グリコシル化（例えば、ペントース、ヘキソサミン、Ｎ−アセチルヘキソサミン、デオキシヘキソース、ヘキソース、シアル酸など）およびアシル化、ならびに天然には存在しないアミノ酸残基、Ｌ−アミノ酸残基およびＤ−アミノ酸残基）を含む。
【０１１８】
本発明のタンパク質の「ホモログ」とは、ホモログであるタンパク質に対して、その機能的特性の１つ以上を変化させることなく、特に、得られるものの活性を低下させることなく、アミノ酸の置換、欠失、および／または付加を含む、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素である。例えば、このタンパク質のホモログは、このタンパク質の生物活性アミノ酸配列改変体からなる。このようなホモログを生成するためには、そのタンパク質中に存在するアミノ酸が、類似の特性（例えば、疎水性、親水性、疎水性モーメント（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｍｅｎｔ）、抗原性、αヘリックス構造またはβシート構造を形成または破壊する性質など）を有する他のアミノ酸で置き換えられ得る。アミノ酸の物理的特性および化学的特性の概説が、表１に与えられる。
【０１１９】
本発明のタンパク質の置換変異体は、このアミノ酸配列における少なくとも１つのアミノ酸が除去され、そしてその代わりに異なる残基が挿入されている、変異体である。アミノ酸置換は、代表的に、単一の残基の置換であるが、ポリペプチドに課される機能的制約に依存して、群がり得る；挿入は、通常、約１〜１０アミノ酸残基のオーダーであり、そして欠失は、約１〜２０残基の範囲である。好ましくは、アミノ酸置換は、上記のもののような保存的アミノ酸置換を含む。
【０１２０】
【表１】
2010213715.tif 000003
本発明の挿入アミノ酸配列改変体は、１つ以上のアミノ酸残基が、そのタンパク質において予め決定された部位に導入されている、変異体である。挿入は、アミノ末端融合および／またはカルボキシ末端融合、ならびに単一のアミノ酸もしくは複数のアミノ酸の配列ない挿入を包含し得る。一般に、アミノ酸配列における挿入は、アミノ末端融合またはカルボキシル末端融合より小さく、そして約１〜１０残基のオーダーである。アミノ末端またはカルボキシ末端の融合タンパク質または融合ペプチドの例としては、２つのハイブリッド系において使用されるような、転写活性化剤の結合ドメインまたは活性化ドメイン、ファージコートタンパク質、（ヒスチジン）６−タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質、ジヒドロフォレートレダクターゼ、Ｔａｇ・１００エピトープ（ＥＥＴＡＲＦＱＰＧＹＲＳ）、ｃ−ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ＦＬＡＧ（登録商標）−エピトープ（ＤＹＫＤＤＤＫ）、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＨＡエピトープ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、プロテインＣエピトープ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ）およびＶＳＶエピトープ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）が挙げられる。
【０１２１】
本発明のタンパク質の欠失改変体は、１つ以上のアミノ酸の、このタンパク質のアミノ酸配列からの除去によって特徴付けられる。
【０１２２】
本発明のタンパク質のアミノ酸改変体は、当該分野において周知のペプチド合成技術（例えば、固相ペプチド合成など）を使用して、または組換えＤＮＡ操作によって、容易に作製され得る。置換変異体、挿入変異体、または欠失変異体を表す改変体タンパク質を産生するための、ＤＮＡ配列の操作は、当該分野において周知である。例えば、既知の配列を有するＤＮＡにおいて、予め決定された部位に置換変異を作製するための技術は、当業者に周知であり、例えば、Ｍ１３変異誘発、Ｔ７−Ｇｅｎインビトロ変異誘発キット（ＵＳＢ、Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＰＣＲ媒介部位特異的変異誘発、または他の部位特異的変異誘発プロトコルによる。
【０１２３】
本発明において、ＤＮＡ配列間および／またはタンパク質間での「同一性」パーセントおよび／または「類似性」パーセントは、当該分野において公知のコンピュータプログラム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ法と組み合わせたＤＮＡｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎプログラム）を使用して、計算される。
【０１２４】
本発明のタンパク質の「誘導体」は、そのポリペプチドの少なくとも５つの連続したアミノ酸残基を含むがそのタンパク質の生物学的活性を維持している、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素である。「誘導体」は、そのポリペプチドの天然に存在する形態のアミノ酸配列と比較して、さらなる天然に存在するアミノ酸残基、変更してグリコシル化されたアミノ酸残基、アシル化アミノ酸残基、または天然には存在しないアミノ酸残基をさらに含み得る。あるいは、またはさらに、誘導体は、そのポリペプチドの天然に存在するアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列に共有結合または非共有結合した、２つ以上の非アミノ酸置換基（例えば、レポーター分子または他のリガンド）を含み得る（例えば、検出を容易にするために結合された、レポーター分子）。
【０１２５】
「免疫学的活性」とは、特異的エピトープまたはハプテンのような分子またはその特異的フラグメントが、例えば、抗体に結合することによって認識されることを意味する。特異的エピトープは、例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９９６）（Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｒｏｄｄａ，Ｓ．Ｊ．およびＭａｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９８６）．Ａ  ｐｒｉｏｒｉ  ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｈｉｃｈ  ｍｉｍｉｃｓ  ａ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，７０９−７１５）に記載されるような、ペプチド走査技術を使用して決定され得る。
【０１２６】
用語「配列のフラグメント」または「配列の一部」とは、言及される元の配列の短縮型配列を意味する。短縮型配列（核酸配列またはタンパク質配列）は、長さが広範に変動し得る；最小サイズは、配列に、言及される元の配列の、少なくとも匹敵する機能および／または活性を提供するために十分な大きさの配列（例えば、「機能的フラグメント」）であり、一方で最大のサイズは、重要ではない。いくつかの適用において、最大のサイズは、通常、元の配列の所望の活性および／または機能を提供するために必要とされるより実質的に大きくない。代表的に、短縮型アミノ酸配列は、約５〜約６０アミノ酸長の範囲である。しかし、より代表的には、配列は、最大約５０アミノ酸長であり、好ましくは、最大約６０アミノ酸長である。少なくとも約１０、１２、または１５アミノ酸であり、最大約２０または２５アミノ酸までの配列を選択することが、通常望ましい。
【０１２７】
機能的フラグメントはまた、本発明によるタンパク質に特異的なエピトープを含むフラグメントを含み得る。好ましい機能的フラグメントは、例えば、少なくとも５、１０、２５、１００、１５０、または２００アミノ酸の長さを有する。
【０１２８】
従って、機能的フラグメントはまた、免疫学的に活性なフラグメントであってもそうでなくてもよいことが、理解されるべきである。
【０１２９】
本発明の文脈において、上記で定義されたような、サイトカイニンオキシダーゼのホモログ、誘導体ならびに／あるいは免疫学的に活性なフラグメントおよび／または免疫学的に機能的なフラグメントが実施される。本発明において使用されることが企図される、特に好ましい、サイトカイニンオキシダーゼタンパク質のホモログ、誘導体ならびに／あるいは免疫学的に活性なフラグメントおよび／または免疫学的に機能的なフラグメントは、植物体から、より具体的には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａから誘導され、なおより具体的には、このサイトカイニンオキシダーゼは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＫＸであるか、またはその中で発現され得る。本発明は、ＡｔＣＫＸタンパク質の機能的ホモログまたは誘導体、および／あるいは免疫学的に活性なフラグメントの使用を明らかに企図し、そしてこのＡｔＣＫＸタンパク質の１つをコードするヌクレオチド配列の使用に対する適用に限定されるべきではない。
【０１３０】
任意の上記タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよびそのフラグメントは、生物学的系（例えば、細胞培養）において産生され得る。あるいは、任意の上記タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよびそのフラグメントは、化学的に操作され得る（例えば、固相ポリペプチド合成によって）。上記タンパク質またはそのフラグメントは、例えば、ツーハイブリッドアッセイ（これは、例えば、本発明によるサイトカイニンオキシダーゼと相互作用するタンパク質の同定を可能にする）における場合と同様に、融合タンパク質の一部であり得る。
【０１３１】
タンパク質またはそのフラグメントは、例えば、本発明によるサイトカイニンオキシダーゼと、本発明の方法によって得られる相互作用タンパク質パートナーとの間の、相互作用を調節するために、さらに有用である。化学合成されたペプチドは、例えば、抗血清および／または抗体の産生のための抗原の供給源として、特に有用である。
【０１３２】
「抗体」としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体または重鎖ラクダ抗体、ならびに抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、ＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメント）が挙げられる。
【０１３３】
モノクローナル抗体は、例えば、ＬｉｄｄｌｅおよびＣｒｙｅｒ（１９９１）に記載されるような技術によって調製され得、この技術は、マウス骨髄腫細胞の、免疫動物由来の脾臓細胞への融合を包含する。さらに、分子またはそのフラグメントに対する、抗体またはそのフラグメントは、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）に記載されるような方法を使用することによって、得られ得る。小ペプチド（例えば、本発明のタンパク質のフラグメント）に対する抗体の場合、このペプチドは、一般に、動物の免疫の前に、キャリアタンパク質に結合される。このようなタンパク質キャリアとしては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミンおよび破傷風トキソイドが挙げられる。キャリアタンパク質は、動物の免疫応答を増強し、そしてＴ細胞レセプター結合部位に対するエピトープを提供する。用語「抗体」は、その誘導体（例えば、標識された抗体）をさらに含む。抗体標識としては、アルカリホスファターゼ、ＰＫＨ２、ＰＫＨ２６、ＰＫＨ６７、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、ビオチン、アガロース、ペルオキシダーゼおよび金粒子が挙げられる。タンパク質に対する抗体に依存する分子生物学におけるツールとしては、タンパク質ゲルブロット分析、遺伝子の同定を可能にする発現ライブラリーのスクリーニング、タンパク質定量方法（ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡが挙げられる）、タンパク質の免疫親和性精製、タンパク質の免疫沈降（例えば、実施例６を参照のこと）、および免疫学的局在決定が挙げられる。抗体および特にペプチド抗体の他の使用としては、タンパク質分解プロセシングの研究（Ｌｏｆｆｌｅｒら、１９９４、Ｗｏｕｌｆｅら、１９９４）、タンパク質活性部位の決定（Ｌｅｒｎｅｒ  １９８２）、前駆体および翻訳後プロセシングの研究（ＢａｒｏｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ  １９８２、Ｌｅｒｎｅｒら、１９８１、Ｓｅｍｉｅｒら、１９８２）、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインの同定（Ｍｕｒａｋａｍｉら、１９９２）、ならびに遺伝子発現におけるエキソン利用の研究（Ｔａｍｕｒａら、１９９１）が挙げられる。
【０１３４】
上で定義されたような、サイトカイニンオキシダーゼ、またはそのホモログ、誘導体もしくはフラグメントを特異的に認識する抗体が、本発明において実施される。好ましくは、このサイトカイニンオキシダーゼは、植物サイトカイニンオキシダーゼであり、より具体的には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ（ＡｔＣＫＸ）の１つである。
【０１３５】
用語「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸分子」とは、本明細書中において使用される場合、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、あるいは両方の組み合わせ）をいう。この用語はさらに、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。この用語はまた、メチル化、環化のような公知のヌクレオチド改変、ならびに１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの、イノシンのようなアナログでの「キャップ」および置換を包含する。核酸の改変としては、アクリジン、アミン、ビオチン、カスケードブルー、コレステロール、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｄａｂｃｙｌ、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、Ｅｄａｎｓ、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、３’−グリセリル、ＨＥＸ、ＩＲＤ−７００、ＩＲＤ−８００、ＪＯＥ、ホスフェートソラレン、ローダミン、ＲＯＸ、チオール（ＳＨ）、スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＡＭＣＡ−Ｓ（登録商標）、ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）の付加が挙げられる。ポリヌクレオチド骨格改変としては、メチルホスホネート、２’−ＯＭｅ−メチルホスホネートＲＮＡ、ホスホロチオレート、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅＲＮＡが挙げられる。塩基改変としては、２−アミド−ｄＡ、２−アミノプリン、３’−（ｄｄＡ）、３’ｄＡ（コルジセピン）、７−デアザ−ｄＡ、８−Ｂｒ−ｄＡ、８−オキソ−ｄＡ、Ｎ６−Ｍｅ−ｄＡ、無塩基部位（ｄＳｐａｃｅｒ）、ビオチンｄＴ、２’−ＯＭｅ−５Ｍｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｃ、３’−（５−Ｍｅ−ｄＣ）、３’−（ｄｄＣ）、５−Ｂｒ−ｄＣ、５−Ｉ−ｄＣ、５−Ｍｅ−ｄＣ、５−Ｆ−ｄＣ、カルボキシ−ｄＴ、交換可能なｄＡ、交換可能なｄＣ、交換可能なｄＧ、交換可能なｄＴ、交換可能なｄＵ、７−デアザ−ｄＧ、８−Ｂｒ−ｄＧ、８−オキソ−ｄＧ、Ｏ６−Ｍｅ−ｄＧ、Ｓ６−ＤＮＰ−ｄＧ、４−メチル−インドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−イノシン、２’−ｄＩ、Ｏ６−フェニル−ｄＩ、４−メチル−インドール、２’−デオキシネブラリン、５−ニトロインドール、２−アミノプリン、ｄＰ（プリンアナログ）、ｄＫ（ピリミジンアナログ）、３−ニトロピロール、２−チオ−ｄＴ、４−チオ−ｄＴ、ビオチン−ｄＴ、カルボキシ−ｄＴ、Ｏ４−Ｍｅ−ｄＴ、Ｏ４−トリアゾールｄＴ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｕ、５−Ｂｒ−ｄＵ、２’−ｄＵ、５−Ｆ−ｄＵ、５−Ｉ−ｄＵ、Ｏ４−トリアゾールｄＵが挙げられる。これらの用語はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（骨格が糖ではなくＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位を含む偽ペプチドである、ＤＮＡアナログ）を包含する。ＰＮＡは、ＤＮＡの挙動を模倣し、そして核酸鎖に相補的に結合する。ＰＮＡの天然の骨格は、通常活性化されるより強い結合およ���より大きい特異性を生じる。さらに、ＰＮＡの独特の化学的特性、物理的特性および生物学的特性は、強力な生体分子ツール、アンチセンスおよび抗原薬剤、分子プローブおよびバイオセンサを生成するために利用されている。
【０１３６】
本発明はまた、本発明による核酸の少なくとも約１５の連続するヌクレオチド、そして好ましくは、１５〜５０ヌクレオチドの核酸配列を、有利に提供する。これらの配列は、上で定義されたような本発明の配列に特異的にハイブリダイズするためのプローブとして、または上で定義されたような本発明の配列の特異的な増幅もしくは複製を開始するためのプライマーとして、などで有利に使用され得る。このような核酸配列は、当該分野において周知の技術に従って、例えば、組換え手段または合成手段によって、産生され得る。これらはまた、本発明による核酸の存在を検出するための診断キットなどにおいて使用され得る。これらの試験は、一般に、プローブを、サンプルと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程、およびプローブとサンプル中の任意の核酸との間での任意の二重鎖または三重鎖の存在を検出する工程を包含する。
【０１３７】
有利には、本発明による核酸配列は、組換え手段または合成手段を使用して（例えば、ＰＣＲクローニング機構を使用して）産生され得る。ＰＣＲクローニングは、一般に、プタイマーの対（これらは、約１５〜５０ヌクレオチドであり得る）を、クローニングされることが望まれる遺伝子の領域に作製する工程、これらのプライマーを、細胞由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと接触させる工程、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程、増幅された領域またはフラグメントを単離する工程、および増幅されたＤＮＡを回収する工程を包含する。一般に、本明細書中に記載されるような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９）に記載されるように、当該分野において周知である。
【０１３８】
「コード配列」または「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、適切な制御配列または調節配列の制御下に置かれる場合（すなわち、このクローニング配列またはＯＲＦが発現可能な形式で存在する場合）、ｍＲＮＡに転写され得、そして／またはポリペプチドに翻訳され得る、ヌクレオチド配列であると定義される。ＯＲＦのクローニング配列は、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳終止コドンと境界を接する。コード配列またはＯＲＦとしては、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えヌクレオチド配列、合成により製造されたヌクレオチド配列またはゲノムＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。このコード配列またはＯＲＦは、核酸配列に介在することによって、中断され得る。
【０１３９】
実質的に同じタンパク質をコードするが異なる供給源から単離された、遺伝子およびコード配列は、実質的に分岐した（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）核酸配列からなり得る。逆向きの、実質的に分岐する（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）核酸配列は、本質的に同じタンパク質の発現をもたらすように設計され得る。これらの核酸配列は、例えば、所定の遺伝子の異なる対立遺伝子、遺伝コードの縮重、またはコドン利用の差異の結果である。従って、表２に示されるように、メチオニンおよびトリプトファンのようなアミノ酸は、単一のコドンによってコードされるが、一方でアルギニン、ロイシン、およびセリンのようなアミノ酸は、おのおの、６つまでの異なるコドンから翻訳され得る。好ましいコドン利用の差異が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（細菌）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ、Ｍ．ｓａｔｉｖａ（２つの双子葉植物）およびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（単子葉植物）に対して表３に示される。１例を抜き出すと、コドンＧＧＣ（グリシンを表す）が、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおいて最も頻繁に使用されるコドンであり（３６．２‰）、Ｏ．ｓａｔｉｖａにおいて２番目に頻繁に使用されるコドンであるが、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａおよびＭ．ｓａｔｉｖａにおいてはずっと低い頻度で使用される（それぞれ９‰および８．４‰）。グリシンをコードし得る４つの可能なコドンのうちで（表２を参照のこと）、ＧＧＣコドンが、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＯ．ｓａｔｉｖａにおいて最も頻繁に使用される。しかし、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおいては、これはＧＧＡ（およびＧＧＵ）コドンであり、一方でＭ．ｓａｔｉｖａにおいては、これはＧＧＵ（およびＧＧＡ）コドンである。
【０１４０】
本発明において規定されるＤＮＡ配列は、介在配列によって中断され得る。「介在配列」とは、本発明のＤＮＡ配列を含むコード配列を破壊するか、または本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列の発現可能な形式を破壊する、任意の核酸配列を意味する。介在配列の除去は、このコード配列またはその発現形式を回復させる。
【０１４１】
介在配列の例としては、イントロンおよび可動性ＤＮＡ配列（例えば、トランスポゾン）が挙げられる。「可動性ＤＮＡ配列」とは、組換え事象の結果として可動になり得る任意のＤＮＡ配列を意味する。
【０１４２】
【表２】
2010213715.tif 000004
【０１４３】
【表３】
2010213715.tif 000005
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「ハイブリダイゼーション」とは、実質的に相同な相補ヌクレオチド配列が互いにアニールするプロセスである。ハイブリダイゼーションプロセスは、溶液中で全体で起こり得る。すなわち、両方の相補核酸が溶液中にある。このようなプロセスに依存する分子生物学のツールとしては、ＰＣＲ、差引きハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ配列決定が挙げられる。ハイブリダイゼーションプロセスはまた、さらに、相補核酸の一方がマトリックス（例えば、磁気ビーズ、セファロースビーズまたは任意の他の樹脂）に固定された状態で起こり得る。このようなプロセスに依存する分子生物学的ツールとしては、ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡの単離が挙げられる。ハイブリダイゼーションプロセスは、さらに、相補核酸の一方が固体支持体（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜）に固定された状態で、または例えば、フォトリソグラフィーによって、例えば、ケイ酸含有ガラス支持体に固定された状態（後者は、核酸アレイまたはマイクロアレイとして、あるいは核酸チップとして公知である）で、起こり得る。このようなプロセスに依存する分子生物学ツールとしては、ＲＮＡおよびＤＮＡのベルブロット分析、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションならびにマイクロアレイハイブリダイゼーションが挙げられる。ハイブリダイゼーションを起こすためには、核酸分子は、一般に、熱的にかまたは化学的に（例えば、ＮａＯＨによって）、二本鎖を２つの一本鎖に融解するため、および／またはヘアピンもしくは他の二次構造を一本鎖核酸から除くために、変性される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度およびハイブリダイゼーション緩衝液の組成のような条件によって、影響を受ける。ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件としては、高温および／または低塩濃度（塩としては、ＮａＣｌおよびクエン酸Ｎａ３が挙げられる）ならびに／あるいはハイブリダイゼーション緩衝溶液へのホルムアミドの含有および／またはハイブリダイゼーション溶液中のＳＤＳ（界面活性剤）のような化合物の濃度の低下および／またはハイブリダイゼーション緩衝液からの硫酸デキストランもしくはポリエチレングリコール（分子の集合を促進する）のような化合物の排除が挙げられる。従来のハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されているが、当業者は、多くの異なるハイブリダイゼーション条件が、公知または期待される相同性および／もしくは核酸配列の長さの様式で設計され得ることを理解する。十分に低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、上記で定義された本発明のＤＮＡ配列に相同な核酸を単離するために、特に好ましい。上記異常発生に寄与する要素としては、対立性、遺伝コードの縮重および上記のような好ましいコドン利用の差異が挙げられる。
【０１４４】
用語「特異的にハイブリダイズする（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」または「特異的にハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」とは、配列が複合混合物（例えば、全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ）中に示される場合、中程度のストリンジェントな条件下での、特定のヌクレオチド配列への分子の結合、複合またはハイブリダイズをいう。
【０１４５】
核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション）の文脈において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメーター下で異なる。例えば、より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。Ｔｍは、５０％の標的配列が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする、規定されたイオン強度およびｐＨ下の温度である。特異性は、代表的にハイブリダイゼーション後の洗浄機能である。このような洗浄の重大な因子としてはイオン強度および最終洗浄溶液の温度が挙げられる。
【０１４６】
一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特定の配列について融点（Ｔｍ）よりも約５０℃低い温度から選択される。Ｔｍは、５０％の標的配列が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨ下での）である。Ｔｍは、溶液条件およびプローブの塩基組成に依存し、そして以下の式を使用して計算され得る：
Ｔｍ＝７９．８℃＋（１８．５×Ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋（５８．４℃×％［Ｇ＋Ｃ］）−（８２０／＃二重鎖中のｂｐ）−（０．５％×ホルムアミド）。
【０１４７】
より好ましいストリンジェント条件は、温度がＴｍより２０℃低い場合、および最も好ましいストリンジェント条件は、Ｔｍより１０℃低い場合である。非特異的結合はまた、多数の公知の技術（例えば、タンパク質含有溶液による膜のブロッキング、ハイブリダイゼーション緩衝液への異種のＲＮＡ、ＤＮＡおよびＳＤＳの添加およびＲＮａｓｅでの処理）のうちの任意の１つを使用して制御され得る。
【０１４８】
洗浄条件は、代表的にストリンジェンシー以下で行われる。一般的に、核酸ハイブリダイゼーションアッセイまたは遺伝子増幅検出手順についての適切なストリンジェント条件は、上記される。よりストリンジェントな条件または低いストリンジェントな条件がまた、選択され得る。
【０１４９】
ストリンジェンシーレベルを規定する目的のために、参照は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈら１９８９「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ａｔ  １１．４５に簡便になされ得る。低いストリンジェンシー条件の例は、３７〜４５℃で、２〜３時間、４〜６×ＳＳＣ／０．１−０．５％  ｗ／ｖ  ＳＤＳである。ハイブリダイゼーションに関する核酸の供給原または濃度に依存して、ストリンジェンシーの代替条件が、中程度のストリンジェント条件のように使用され得る。中程度のストリンジェント条件の例としては、４５℃以上で２〜３時間、１〜４×ＳＳＣ／０．２５％  ｗ／ｖ  ＳＤＳが挙げられる。高いストリンジェント条件の例としては、６０℃で１〜３時間、０．１−１Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ｗ／ｖ  ＳＤＳが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の間変化し得、そしてストリンジェンシー条件を維持するかまたは変化する種々のパラメーターを承知する。例えば、別のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６５℃で４×ＳＳＣでのハイブリダイゼーション、次いで約１時間６５℃で０．１×ＳＳＣでの洗浄である。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド中、４×ＳＳＣ、４２℃である。ストリンジェント条件のなお別の例としては、６２℃で、６×ＳＳＣ、０．０５×ＢＬＯＴＴＯでのハイブリダイゼーションおよび６２℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられる。
【０１５０】
明らかに、本発明は、サイトカインオキシダーゼ、ホモログ、誘導体あるいはハイブリダイゼーションの任意の方法においてより高く規定された場合、その免疫学的に活性なおよび／または機能的フラグメントをコードする本発明のＤＮＡ配列の使用を具体化する。さらに、本発明はまた、前記本発明のＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列に関する。好ましい前記サイトカインオキシダーゼは、植物サイトカインオキシダーゼ、より詳細にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＫＸである。
【０１５１】
細胞、組織または器官（好ましくは植物器官）中のタンパク質の発現に影響するために、タンパク質は、例えば、マイクロインジェクションまたは弾道手段によって前記細胞へと直接的に導入され得るか、あるいは、前記タンパク質をコードする単離された核酸分子は、発現可能な形式において、前記細胞、組織または器官へと導入され得る。
【０１５２】
好ましくは、本発明のＤＮＡ配列は、コード配列またはサイトカインオキシダーゼタンパク質またはホモログあるいはその誘導体または前記で規定されるようなその免疫学的に活性なおよび／または機能的フラグメントをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＰ）を含む。本発明の好ましいタンパク質は、前記のサイトカインオキシダーゼのアミノ酸配列を含む。好ましい前記サイトカインオキシダーゼは、植物サイトカインオキシダーゼおよびより詳細にはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＫＸである。
【０１５３】
「ベクター」または「ベクター配列」は、形質転換によって生物に導入され得、そして前記生物中で安定に維持され得るＤＮＡ配列を意味する。ベクター維持は、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ培地中で可能である。他のベクター（例えば、ファージミドベクターおよびコスミドベクター）は、細菌および／またはウイルス中で維持され得るか、または複合され得る。ベクター配列は、一般的に、制限酵素、複合クローニング部位（ＭＣＳ）によって認識される独特な部位のセットを含み、ここで、１つ以上の非ベクター配列は、挿入され得る。
【０１５４】
「非ベクター配列」は、ベクター内に含まれたＭＣＳの１つ以上の部位に組み込まれるＤＮＡ配列をさらに意味する。
【０１５５】
「発現ベクター」は、挿入された非ベクター配列についての発現可能形式の作製を可能にする適切な調節配列または制御配列を含むことによってベクターのサブセットを形成し、従って、前記非ベクター配列によってコードされたタンパク質の発現を可能にする。発現ベクターは、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、真菌（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクター）、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）および植物細胞（例えば、ジャガイモウイルスのＸベースの発現ベクター）を含む生物におけるタンパク質発現を可能にすることが当業者に公知である。
【０１５６】
本発明は、明らかに、任意のサイトカインオキシダーゼ、ホモログ、誘導体および／あるいは前記で規定されるようなその免疫学的に活性なおよび／または機能的フラグメントを含む。好ましい前記サイトカインオキシオダーゼは、植物サイトカインオキシダーゼであり、より詳細にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＫＸである。
【０１５７】
生物学的系におけるベクター媒介タンパク質生産を発現するための代替として、化学タンパク質合成が適用され得る。合成ペプチドは、溶液相または固相において製造され得る。しかし、固相ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  １９６３）が、最も一般的な方法であり、そして直線ペプチド鎖を製造するためのアミノ酸の連続的な添加を含む。固相ペプチド合成は、３つの工程からなるサイクルを包含する：（ｉ）固体支持体または樹脂への成長ペプチド鎖のカルボキシ末端アミノ酸の固定化；（ｉｉ）鎖アセンブリ、成長ペプチド鎖に添加されるアミノ酸の活性化、カップリングおよび脱保護からなるプロセス；および（ｉｉｉ）樹脂からの完全なペプチドの除去およびアミノ酸側鎖からの保護基の除去を含む切断。固相ペプチド合成における一般的なアプローチとしては、アミノ酸のアミノ末端保護基として、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル／ｔ−ブチル）およびＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）が挙げられる。アミノ酸側鎖の保護基としては、以下が挙げられる：メチル（Ｍｅ）、ホルミル（ＣＨＯ）、エチル（Ｅｔ）、アセチル（Ａｃ）、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、アニシル、ベンジル（Ｂｚｌ）、トリフルオロアセチル（Ｔｆａ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＮＳｕ、ＯＳｕ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、４−メチルベンジル（Ｍｅｂ）、チオアニジル、チオクレシル（ｔｈｉｏｃｒｅｓｙｌ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、４−ニトロフェニル（ＯＮｐ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２−ニトロベンゾイル（ＮＢｚ）、２−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）、４−トルエンスルフォニル（Ｔｏｓｙｌ、Ｔｏｓ）、ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）、ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、２，４，５−トリクロロフェニル，２−ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）、トリフェニルメチル（Ｔｒｉｔｙｌ、Ｔｒｔ）および２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）。鎖アセンブリの間、ＦｍｏｃまたはＢｏｃは、除去され、成長鎖に結合したアミノ酸残基の活性化アミノ末端を生じる。次のアミノ酸のカルボキシ末端は、例えば、ＨＢＴＵによって高反応性エステルへの変換によって活性化され得る。現在の技術（例えば、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ９０５０  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて、５０残基までの直線ペプチドが、製造され得る。多数のガイドラインは、以下を含む生物学的系における使用に適切なペプチドを生産するのに役立つ：（ｉ）異なるアミノ酸（例えば、ｃｙｓ、ｍｅｔ、ｔｒｐ（ペプチド合成の間に、容易に酸化されそして／または分解される）またはａｒｇ）の使用の限定；（ｉｉ）疎水性アミノ酸（ペプチドの可溶性を減じる）を最小化；および（ｉｉｉ）アミノ末端のグルタミン酸（ピログルタミメートに環化し得る）を防止。
【０１５８】
「発現可能形式」は、単離された核酸分子が、構成的に、あるいは、細胞内シグナルもしくは細胞外シグナル（例えば、環境刺激もしくは環境ストレス（マイトジェン、無酸素（ａｎｏｘｉａ）、低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）、温度、塩、光、脱水など）または化合物（ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドまたは抗生物質（テトラサイクリン、アンピシリン、リファンピシン、カナマイシン））、ホルモン（例えば、ジベレリン、オーキシン、サイトカイニン、グルココルチコイド、ブラシノステロイド、エチレン、アブシジン酸など）、ホルモンアナログ（インドール酢酸（ＩＡＡ）、２，４−Ｄなど）、金属（亜鉛、銅、鉄など）、またはとりわけ、デキサメタゾンによる誘導に従って、ｍＲＮＡに転写され、そして／または翻訳されてタンパク質を産生するのに適切な形態にあることを意味する。当業者に既知であるように、機能タンパク質の発現はまた、１以上の翻訳後修飾（グリコシル化、リン酸化、脱リン酸化）または、特に、１以上のタンパク質−タンパク質相互作用を必要とし得る。このような他の全てのプロセスは、「発現可能形式」との用語の範囲に含まれる。
【０１５９】
好ましくは、特定の細胞、組織または器官（好ましくは、植物起源）におけるタンパク質の発現は、その細胞、組織、または器官に対して上記のタンパク質をコードする単離された核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子、ゲノム遺伝子、合成オリゴヌクレオチド分子、ｍＲＮＡ分子またはオープンリーディングフレーム）を誘導するかまたはそれらを発現することによって与えられ、ここで、上記の核酸分子は、適切な調節配列または制御配列と作動可能に連結して配置されており、この適切な調節配列または制御配列としては、プロモーター、好ましくは植物発現可能プロモーター、およびターミネーター配列を含む。
【０１６０】
「プロモーター」に対する本明細書中での参照は、その最も広い程度のうちに入り、そして、従来の真核生物ゲノム遺伝子から由来される転写調節配列を含み、この配列は、正確な転写開始のために必要であるＴＡＴＡボックスを含み、ＣＣＡＡＴボックス配列はあってもなくともよく、そして発生的な刺激および／または外的な刺激に応答してかまたは組織特異的様式で遺伝子発現を変更するさらなる調節エレメントまたは制御エレメント（すなわち、上流の活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）があってもなくともよい。
【０１６１】
「プロモーター」との用語はまた、標準的な原核生物遺伝子の転写調節配列を含み、この場合、−３５ボックス配列および／または−１０ボックス転写調節配列を含み得る。
【０１６２】
「プロモーター」との用語はまた、細胞、組織または器官の中の核酸分子の発現を与え、活性化し、また増強する合成分子または融合分子あるいは誘導体を記述するのに使用される。
【０１６３】
プロモーターはまた、１以上の特異的な調節エレメントのさらなるコピーを含み、プロモーターが作動可能に連結する核酸分子の発現をさらに増強するか、および／または空間的発現および／または一過性の発現を変更する。このような調節エレメントは、異種プロモーター配列に隣接して位置し得、例えば、銅、糖コルチコイド、デキサメタゾン、テトラサイクリン、ジベレリン、ｃＡＭＰ、アブシジン酸、オーキシン、創傷、エチレン、ジャスモネート（ｊａｓｍｏｎａｔｅ）、またはサリチル酸に応答して核酸分子の発現を駆動するか、または特定の細胞、組織または器官（例えば、分裂組織、葉、根、胚、花、種、または果実）に核酸分子の発現を与え得る。
【０１６４】
本発明の状況において、そのプロモーターは、好ましくは、植物発現可能プロモーター配列である。細菌、酵母細胞、昆虫細胞、および動物細胞のような非植物細胞において機能するかまたは単独で機能するプロモーターは、本発明から除外されない。「植物発現可能」とは、プロモーター配列（それに添加されたか、またはそれに含まれる任意のさらなる調節エレメントを含む）は、少なくとも、植物細胞、組織または器官（好ましくは、単子葉植物または双子葉植物の植物細胞、組織または器官）における発現を誘導するか、それの発現を与えるか、その発現を活性化するか、またはその発現を増強することができる。
【０１６５】
「植物作動可能」および「植物において作動可能」との用語は、本明細書中で使用される場合に、プロモーター配列に関して、植物発現可能プロモーター配列と等価であるとされる。
【０１６６】
バイナリーウイルス植物発現系の一部分として調節可能なプロモーターはまた、当業者にとって公知である（Ｙａｄａｖ  １９９９−ＷＯ９９２２００３；Ｙａｄａｖ  ２０００−ＷＯ００１７３６５）。
【０１６７】
本発明の文脈において、「調節可能プロモーター配列」は、必要に応じて、特定の条件下で、植物の、特定の細胞、組織、器官または、細胞、組織、もしくは器官の群における構造遺伝子上で発現を与えることのできるが、一般的に全ての条件下でその植物全体に亘って発現を与えない、プロモーターである。従って、調節可能プロモーター配列は、そのプロモーターがその植物中あるいは特定の条件のセット（例えば、化合物または他の誘導因子による遺伝子発現の誘導に従う）の下でその植物全体に亘って特定の位置に作動可能に結合している遺伝子上での発現を与える、プロモーター配列である。
【０１６８】
好ましくは、本発明の実施において使用される調節可能プロモーターは、その植物中における特定の位置で発現を、構成的に与えるかまたは誘導に従って与えるが、しかし、任意の環境の植物全体において発現を与えない。このようなプロモーターの範囲のうちに含まれるのは、細胞特異的プロモーター配列、組織特異的プロモーター配列、器官特異的プロモーター配列、細胞周期特異的遺伝子プロモーター配列、誘導性プロモーター配列、および構成性プロモーター配列であり、これらの配列は、任意の時間においてその植物の特定部位に発現を与えるように改変される（例えば、転移性遺伝エレメント（Ａｃ、Ｄｓ、Ｓｐｍ、Ｅｎまたは他のトランスポゾン）中の上記の構成性プロモーターの組み込みによる）。
【０１６９】
同様に、「組織特異的」との用語は、発現が、好ましくは、植物起源の特定の組織または組織型（これらの、組織または組織型に必ずしも限定されない）において、優勢であることを示す。
【０１７０】
同様に、「器官特異的」との用語は、発現が、好ましくは、植物起源の特定の器官（これらの、器官に必ずしも限定されない）において、優勢であることを示す。
【０１７１】
同様に、「細胞周期特異的」との用語は、発現が、支配的に周期的であって、かつ好ましくは、植物起源の１以上の必ずしも構成的段階でない細胞周期において生じる（必ずしも細胞は排他的に細胞周期になくてもよいにもかかわらず）ことを示している。
【０１７２】
当業者は、「誘導性プロモーター」が、その転写活性が、発生学的刺激、化学的刺激、環境的刺激、または物理的刺激に応答して増大されそして誘導されるプロモーターであることを理解する。同様に、「構成性プロモーター」が、生物体（好ましくは、植物）の殆どの部分（必ずしも全ての部分でなくともよい）にわたって、その成長および発生の大半期間（必ずしも全ての部分でなくともよい）にて、転写的に活性なプロモーターであることを、当業者は理解する。
【０１７３】
当業者は、過度の実験をすることなく、公的に利用可能な供給源または容易に利用可能な供給源からサイトカイニンオキシダーゼタンパク質の適切な発現を調節する用途のために、適切なプロモーター配列を選択することが容易にできる。
【０１７４】
核酸分子をプロモーター配列の調節制御下におくか、またはプロモーター配列と作動可能に連結しておくことは、発現がそのプロモーター配列によって制御されるように核酸分子を位置付けることを意味する。プロモーターは、（必ずというわけでないが）通常、そのプロモーターが調節する核酸分子の上流または５’末端側、およびその転写開始部位から２ｋｂ以内に、位置付けられる。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築において、一般的に、そのプロモーターをその遺伝子転写開始部位から距離をとって位置付けることが好ましく、その距離は、そのプロモーターと天然の状態でそのプロモーターが制御する遺伝子（すなわち、そのプロモーターが駆動される遺伝子）との間の距離とほぼ同じである。当該分野で公知であるように、この距離おける幾つかのバリエーションは、プロモーター機能を喪失することなしに、適応され得る。同様に、その制御下におかれた異種遺伝子に関する調節配列エレメントの好ましい位置づけは、天然状態におけるそのエレメント（すなわち、それが駆動される遺伝子）の位置づけによって規定される。その上、当該分野で知られるように、その距離のバリエーションンがまた、生じ得る。
【０１７５】
本発明の遺伝子構築物における用途に適切なプロモーターの例としては、特に、表４に列挙されるプロモーターが挙げられる。表４に列挙されたプロモーターは、例証目的のみで提供され、かつ本発明は、表４によって提供されたリストによって限定されない。当業者は、容易に、本発明を実施するのに有用なさらなるプロモーターを提供する立場にある。
【０１７６】
構成性プロモーターまたは植物全体に亘って発現を誘導するプロモーターの場合、このような配列は、表４に列挙される１以上の組織特異的なプロモーターに由来するヌクレオチド配列、あるいは、１以上の上記の組織特異的誘導性プロモーターに由来するヌクレオチド配列を付加して、その植物における組織特異性を与えることよって改変されることが好ましい。例えば、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターは、上述した（Ｅｌｌｉｓら，１９８７）ように、トウモロコシＡｄｈ１プロモーター配列を付加し、その上での嫌気的に調節される根特異的発現を与えることによって改変され得る。別の例は、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターをトウモロコシのグリシンリッチプロテインＧＲＰ３遺伝子のエレメントに融合することによって根特異的遺伝子または根多量性遺伝子の発現を与えることを記載している（ＦｅｉｘおよびＷｕｌｆｆ  ２０００−ＷＯ００１５６６２）。このような改変は、当業者によって慣用的な実験によって達成され得る。
【０１７７】
「ターミネーター」との用語は、転写の終止のシグナルとなる転写単位の末端のＤＮＡ配列をいう。ターミネーターは、ポリアデニル化シグナルを含む３’側の非翻訳ＤＮＡ配列であり、この配列は、ポリアデニレート配列を一次転写物の３’末端側に付加することを容易にする。ウイルス、酵母、コケ類、細菌、昆虫、鳥類、哺乳類ならびに植物に由来する細胞において活性なターミネーターは、公知であり、刊行物において記載されている。これらは、細菌、真菌、ウイルス、動物および／または植物から単離され得る。
【０１７８】
【表４】
2010213715.tif 000007
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本発明の遺伝子構築物における使用に特に適切なターミネーターの例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネーター、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）遺伝子ターミネーター配列、Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子ターミネーター配列、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼターミネーター配列（ｔ３’Ｂｔ２）、Ｚｅａ  ｍａｙｓゼイン遺伝子ターミネーター配列、ｒｂｃｓ−１Ａ遺伝子ターミネーター、およびｒｂｃｓ−３Ａ遺伝子ターミネーター配列などが挙げられる。
【０１７９】
本発明の好ましいプロモーター配列としては、根特異的プロモーターおよび種子特異的プロモーター（表５、表４、ならびに実施例において概略されているものが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。
【０１８０】
表５．本発明の実施における使用のための例示的な根部特異的プロモーター
【０１８１】
【表５】
2010213715.tif 000016
当業者は、本発明の実施における使用について適切であり得るさらなるプロモーター配列およびターミネーター配列を理解する。このような配列は、過度の実験なしに容易に使用され得る。
【０１８２】
本発明の文脈において、遺伝子またはタンパク質の「異所性発現」または「異所性過剰発現」は、天然の条件下では通常存在しない遺伝子またはタンパク質の発現パターンおよび／または発現レベルをいい、より具体的には、増加した発現および／または増加した発現レベルを意味する。異所性発現は、そのタンパク質をコードするコード配列と単離された相同性プロモーターまたは異種プロモーターとを作動可能に連結して、キメラ遺伝子を生成する工程、および／またはそのコード配列とそれ自体の単離されたプロモーター（すなわちそのタンパク質の発現を天然に駆動する非単離のプロモーター）とを作動可能に連結して、組換え遺伝子複製または遺伝子倍加効果を生成する工程を含む多数の方法で達成され得る。「異所性同時発現」は、２つ以上の遺伝子またはタンパク質の異所性発現または異所性過剰発現を意味する。同じの、より好ましくは、異なるプロモーターは、その遺伝子またはタンパク質の異所性発現をいうのに使用される。
【０１８３】
好ましくは、本発明の文脈において使用されるプロモーター配列は、サイトカイニンオキシダーゼタンパク質もしくはホモログ、誘導体または前出で規定されるその免疫学的に活性なフラグメントおよび／あるいは機能的フラグメントをコードするコード配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結される。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、「発現のダウンレギュレーション」とは、より低い遺伝子発現のレベルおよび／またはより低い活性な遺伝子産物のレベルおよび／またはより低い遺伝子産物活性のレベルを意味する。発現の減少は、例えば、プロモーター配列に対するセンス方向（同時発現が生じる場合）か、またはアンチセンス方向における、コード配列またはその部分の添加によって、さらに、例えば、挿入変異誘発（例えば、Ｔ−ＤＮＡ挿入もしくはトランスポゾン挿入）によって、または例えば、ＡｎｇｅｌｌおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ（１９８８−ＷＯ９８３６０８３）、Ｌｏｗｅら（１９９９−ＷＯ９８５３０８３）、Ｌｅｄｅｒｅｒら（１９９９−ＷＯ９９１５６８２）あるいはＷａｎｇら（１９９９−ＷＯ９９５３０５０）により記載される遺伝子サイレンシングストラテジーによって達成され得る。サイレンシング遺伝子発現が目的の遺伝的構築物は、プロモーター配列に対してセンス方向および／またはアンチセンス方向において、そこに含まれる遺伝子（または、その１つ以上の部分）のヌクレオチド配列を有し得る。遺伝子発現をダウンレギュレートするための別の方法は、リボザイムの使用を含む。
【０１８５】
活性な遺伝子産物のレベルまたは遺伝子産物活性のレベルの調節（低下を含む）は、細胞、組織、器官または生物を、その遺伝子産物、ホモログ、誘導体および／もしくはその免疫学的に活性なフラグメントに投与するか、または曝露することによって達成され得る。免疫調節は、活性な遺伝子産物のレベルおよび／または遺伝子産物活性のレベルをダウンレギュレートし得る技術の別の例であり、細胞、組織、器官または生物にか、またはそれらの中における、その遺伝子産物に対する抗体の投与、または曝露、または発現を包含し、ここで、遺伝子産物および／または遺伝子産物活性のレベルは、調節されるべきである。このような抗体は、「植物抗体（ｐｌａｎｔｉｂｏｄｙ）」、一本鎖抗体、ＩｇＧ抗体および重鎖ラクダ抗体ならびにそのフラグメントを含む。
【０１８６】
活性な遺伝子産物または遺伝子産物活性のレベルを調節（低下させることを含む）することは、さらに、細胞、組織、器官または生物を、その遺伝子産物のアゴニストまたはその活性に投与または曝露することによって達成され得る。このようなアゴニストとしては、タンパク質（例えば、キナーゼおよびプロテイナーゼを含む）ならびに前記のように本発明に従って同定される化学的化合物が挙げられる。
【０１８７】
本発明の文脈において、より以前に規定されるようなサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の発現のダウンレギュレーションは、想像される。好ましくは、このサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子は、植物サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子であり、より好ましくはＡｔＣＫＸである。本発明はさらに、サイトカイニンオキシダーゼタンパク質またはサイトカイニンオキシダーゼ活性のレベルのダウンレギュレーションを包含し、それによって、このサイトカイニンオキシダーゼタンパク質は、前記に規定される。好ましくは、このサイトカイニンオキシダーゼタンパク質は、植物サイトカイニンオキシダーゼであり、より特にはＡｔＣＫＸである。
【０１８８】
「細胞発生運命および／または植物発生および／または植物形態学および／または生化学および／または生理学を改変する」とは、植物の１つ以上の発生特性および／または形態学的特性および／または生化学的特性および／または生理学的特性が、本明細書に記載される本発明に関与する１つ以上の工程の実施によって変更されることを意味する。
【０１８９】
「細胞運命」とは、植物発生もしくはそのための細胞プロセスの間に産生される特定の細胞の、または特に細胞周期の間についての細胞プロセスの、または細胞周期プロセスの結果としての細胞型もしくは細胞特性をいう。
【０１９０】
「植物発生」または用語「植物発生特性」または類似の用語は、本明細書で使用される場合、植物細胞、特に、先祖細胞が発生する特定の組織型または器官型の発生運命を決定する際に関与する植物の任意の細胞プロセスを意味すると見なされる。植物発生に関連する細胞プロセスは、当業者に公知である。このようなプロセスとしては、例えば、形態発生、光形態発生、苗条発生、根部発生、栄養体発生、再生発生、幹伸長、開花、ならびに細胞運命の決定の際に関与する調節機構、特に、細胞周期に関与するプロセスまたは調節プロセスが挙げられる。
【０１９１】
「植物形態学」または用語「植物形態学特性」または類似の用語は、本明細書で使用される場合、植物の外観（１つ以上の構造的特徴またはその構造的特徴の組み合わせを含む）をいうことは、当業者によって理解される。このような構造的特徴としては、植物の任意の細胞、細胞の組織もしくは器官または細胞、細胞の組織もしくは器官の群（根、幹、葉、苗条、茎、毛、花、花弁、気孔、花柱、おしべ、花粉、胚珠、種子、胚子、胚乳、種皮、アリューロン、繊維、果実、形成層、木質、心材、実質組織、通気組織、篩要素、師部または脈管組織など）の形状、サイズ、数、位置、色、組織、配置、ならびに模様が挙げられる。
【０１９２】
「植物生化学」または用語「植物性化学的特性」または類似の用語は、本明細書で使用される場合、植物の代謝プロセスまたは触媒プロセス（１次代謝および２次代謝ならびにその産物（植物によって産生される、任意の低分子、高分子または化学的化合物（例えば、デンプン、糖、タンパク質、ペプチド、酵素、ホルモン、成長因子、核酸分子、セルロース、ヘミセルロース、カロース、レクチン、繊維、色素（例えば、アントシアニン）、ビタミン、ミネラル、微量栄養素または多量栄養素が挙げられるが、これらに限定されない）を含む））をいうことは、当業者によって理解される。
【０１９３】
「植物生理学」または用語「植物生理学的特性」または類似の用語は、本明細書で使用される場合、植物の機能的プロセス（発生プロセス（例えば、成長、展開および分化、性発生、性生殖、種子設定、種子発生、穀粒充填、無性生殖、細胞分裂、休止状態、光順応、発芽光合成、葉拡大、繊維生成、２次成長または木質生成など）を含む；外部から適用される因子（例えば、金属、化学物質、ホルモン、成長因子）および環境ならびに環境ストレス因子（例えば、無酸素、低酸素、高温、低温、脱水、光、光周期、冠水、塩、重金属など）に対する植物の応答（この外部から適用される因子に対する植物の順応応答を含む））をいうと理解される。
【０１９４】
組換えＤＮＡを植物組織または植物細胞に導入するための手段としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣａＣｌ２およびそのバリエーションを用いる形質転換（特に、Ｈａｎａｈａｎ（１９８３）により記載される方法）、プロトプラストへのＤＮＡの直接取り込み（Ｋｒｅｎｓら、１９８２；Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、１９８４）、プロトプラストへのＰＥＧ媒介取り込み（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９０）、微粒子衝撃、エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍら、１９８５）、ＤＮＡのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら、１９８６）、組織外植片または組織細胞の微粒子衝撃（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、１９８８；Ｓａｎｆｏｒｄ、１９８８）、核酸を有する組織の真空浸潤、または植物の場合、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから植物組織へのＴ−ＤＮＡ媒介輸送（Ａｎら（１９８５）Ｄｏｄｄｓら（１９８５）、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８３ａ、１９８３ｂ、１９８５）によって本質的に記載される）。単子葉植物の形質転換のための方法は、当該分野で周知であり、以下が挙げられる：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（Ｃｈｅｎｇら１９９７−ＷＯ９７４８８１４；Ｈａｎｓｅｎ  １９９８−ＷＯ９８５４９６１；Ｈｉｅｉら、１９９４−ＷＯ９４００９７７；Ｈｉｅｉら、１９９８−ＷＯ９８１７８１３；Ｒｉｋｉｉｓｈｉら、１９９９−ＷＯ９９０４６１８；Ｓａｉｔｏら、１９９５−ＷＯ９５０６７２２）、微粒子銃（Ａｄａｍｓら、１９９９−米国特許第５，９６９，２１３号；Ｂｏｗｅｎら、１９９８−米国特許第５，７３６，３６９号；Ｃｈａｎｇら、１９９４−ＷＯ９４１３８２２；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、１９９９−米国特許第５，８７４，２６５号／米国特許第５，９９０，３９０号；ＶａｓｉｌおよびＶａｓｉｌ、１９９５−米国特許第５，４０５，７６５号；Ｗａｌｋｅｒら、１９９９−米国特許第５，９５５，３６２号）、ＤＮＡ取り込み（Ｅｙａｌら、１９９３−ＷＯ９３１８１６８）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞のマイクロインジェクション（ｖｏｎ  Ｈｏｌｔ、１９９４−ＤＥ４３０９２０３）ならびに超音波処理（Ｆｉｎｅｒら、１９９７−米国特許第５，６９３，５１２号）。
【０１９５】
細胞の微粒子銃については、微粒子が、細胞中へと推進され、形質転換された細胞を生成する。任意の適切な衝撃細胞形質転換方法論および装置は、本発明の実施の際に使用され得る。例示的な装置および手順は、Ｓｔｏｍｐら（米国特許第５，１２２，４６６号）ならびにＳａｎｆｏｒｄおよびＷｏｌｆ（米国特許第４，９４５，０５０号）によって開示される。衝撃形質転換手順を使用する場合、遺伝子構築物は、形質転換されるべき細胞において複製し得るプラスミドを組み込み得る。このようなシステムにおける使用に適切な微粒子の例としては、１〜５μｍの金粒子が挙げられる。ＤＮＡ構築物は、任意の適切な技術（例えば、沈殿）によって微粒子上に堆積し得る。
【０１９６】
完全植物は、当該分野で周知の手順に従って、形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞から再生成され得る。続くクローン増殖し得る（器官形成または胚形成のいずれかによる）植物組織は、本発明の遺伝子構築物により形質転換され、それから完全植物が再生成され得る。選択された特定の組織は、形質転換される特定の種に対して利用可能であり、最も適するクローン増殖系に依存する。例示的な組織標的としては、葉横紋、花粉、胚、子葉、胚軸、大型配偶体、カルス組織、存在する分裂組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、および根分裂組織）、ならびに誘導された分裂組織（例えば、子葉分裂組織および胚軸分裂組織）が挙げられる。
【０１９７】
用語「器官形成」は、本明細書で使用される場合、苗条および根が、分裂組織中心から連続的に発生するプロセスを意味する。
【０１９８】
用語「胚形成」は、本明細書で使用される場合、苗条および根が、体細胞または配偶子のいずれかから、協同した様式（連続的でない）で一緒に発生するプロセスを意味する。
【０１９９】
好ましくは、植物は、本発明の方法に従って生成され、任意の当該分野で認識される手段（例えば、微粒子銃、マイクロインジェクション、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（ｐｌａｎｔａ形質転換を含む）、プロトプラスト融合、またはエレクトロポレーションなど）によって、トランスフェクトされるか、または遺伝子配列により形質転換されるか、またはタンパク質の導入に寛容である。最も好ましくは、その植物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって生成される。
【０２００】
植物、酵母、カビまたは糸状菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換あるいはアグロリスティック（ａｇｒｏｌｉｓｔｉｃ）は、Ｔ−ＤＮＡと呼ばれる形質転換ベクター配列の部分の核への輸送、および真核生物のゲノムにおけるこのＴ−ＤＮＡの組み込みに基づく。
【０２０１】
「Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ」は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのメンバー、より好ましくは、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＲｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよび最も好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを意味する。
【０２０２】
「Ｔ−ＤＮＡ」、または輸送されたＤＮＡは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｒ遺伝子の活性化後に、Ｔ−ＤＮＡ境界においてニック形成され、そして真核生物細胞の核に対する一本鎖ＤＮＡとしてトランスフェクトされるＴ−ＤＮＡと隣接する形質転換ベクターの部分を意味する。
【０２０３】
本明細書で使用される場合、「Ｔ−ＤＮＡ境界」、「Ｔ−ＤＮＡ境界領域」、または「境界領域」は、右Ｔ−ＤＮＡ境界（ＲＢ）または左Ｔ−ＤＮＡ境界（ＬＢ）のいずれかを意味する。このような境界は、Ｔ−ＤＮＡ隣接境界の部分としての境界内部領域および／またはベクター骨格隣接境界の部分としての境界外部領域によって隣接されるコア配列を含む。コア配列は、オクトピン型ベクターの場合には２２ｂｐを含み、そしてノパリン型ベクターの場合には２５ｂｐを含む。右境界領域および左境界領域におけるコア配列は、不完全な反復を形成する。境界コア配列は、少なくともＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２からなるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍニック形成複合体による認識および処理について必要不可欠である。Ｔ−ＤＮＡに隣接するコア配列は、そのＴ−ＤＮＡの輸送を促進するのに十分である。しかし、そのコア配列にのみ隣接されるＴ−ＤＮＡを保有する形質転換ベクターを用いる形質転換の効率は、低い。境界内部領域および境界外部領域は、Ｔ−ＤＮＡ輸送の有効性を調節することが知られている（Ｗａｎｇら、１９８７）。Ｔ−ＤＮＡ輸送を増強させる１つの要素は、右境界外部領域において特徴付けおよび存在し、そしてｏｖｅｒｄｒｉｖｅと呼ばれる（Ｐａｒａｌｔａら、１９８６、ｖａｎ  Ｈａａｒｅｎら、１９８７）。
【０２０４】
「Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクター」または「Ｔ−ＤＮＡベクター」は、少なくともそれぞれ右および左の境界コア配列からなる右および左のＴ−ＤＮＡ境界に隣接するＴ−ＤＮＡ配列を包含する任意のベクターを意味し、そして任意の真核生物細胞の形質転換に使用される。
【０２０５】
「Ｔ−ＤＮＡベクター骨格配列」は、Ｔ−ＤＮＡ境界の外側、そしてより具体的には、境界コア不完全反復のニック形成部位の外側に存在するベクターを含むＴ−ＤＮＡの全てのＤＮＡを意味する。
【０２０６】
本発明は、最適化されたＴ−ＤＮＡを含み、その結果、真核生物細胞のゲノムにおけるベクター骨格統合は、最小限にされるか、または存在しない。「最適化されたＴ−ＤＮＡベクター」とは、ベクター骨格配列の真核生物細胞のゲノムへの輸送を減少または廃止のいずれかするように設計されたＴ−ＤＮＡベクターを意味する。このようなＴ−ＤＮＡベクターは、当業者に公知であり、Ｈａｎｓｏｎら（１９９９）およびＳｔｕｉｖｅｒら（１９９９−ＷＯ９９０１５６３）に記載のものを含む。
【０２０７】
バイナリー形質転換ベクター、超バイナリー形質転換ベクター、同時組み込み形質転換ベクター、Ｒｉ誘導型形質転換ベクターを含む任意のＴ−ＤＮＡにおいて、ならびに、アグロリスティック（ａｇｒｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換に使用されるＴ−ＤＮＡ保有ベクターにおいて、本発明は、サイトカイニンオキシダーゼ、ホモログ、誘導体もしくは前出のようなその免疫学的に活性なおよび／または機能的フラグメントをコードするＤＮＡ配列の封入を明確に考慮する。好ましくは、このサイトカイニンオキシダーゼは、植物サイトカイニンオキシダーゼであり、より好ましくは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＫＸである。
【０２０８】
「バイナリー形質転換ベクター」とは、以下：
（ａ）形質転換されるべき真核生物細胞において活性な目的の少なくとも１つの遺伝子および／または少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むＴ−ＤＮＡ領域；ならびに
（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて活性な少なくとも１つの複製の起源ならびにＥ．ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける選択についてのマーカーを含むベクター骨格領域、
を含む、ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクターを意味する。
【０２０９】
バイナリー形質転換ベクターのＴ−ＤＮＡ境界は、オクトピン型またはノパリン型のＴｉプラスミド由来もしくはその両方由来であり得る。バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡは、ヘルパープラスミドと組み合わせて、真核生物細胞にのみ輸送される。
【０２１０】
「ヘルパープラスミド」は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて安定に維持され、Ｔ−ＤＮＡの輸送を可能にするのに必要なｖｉｒ遺伝子のセットを少なくとも保有するプラスミドを意味する。このｖｉｒ遺伝子のセットは、オクトピン型またはノパリン型のＴｉプラスミド由来もしくはその両方由来であり得る。
【０２１１】
「超バイナリー形質転換ベクター」は、ベクター骨格領域において、極めて有毒なＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ系統Ａ２８１（ＥＰ０６０４６６２、ＥＰ０６８７７３０）のＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒ領域をさらに保有するバイナリー形質転換ベクターを意味する。超バイナリー形質転換ベクターは、ヘルパープラスミドと組み合わせて使用される。
【０２１２】
「同時組み込み形質転換ベクター」は、以下：
（ａ）植物において活性な、少なくとも１つの目的遺伝子および／または少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むＴ−ＤＮＡ領域；ならびに
（ｂ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて活性な少なくとも１つの複製の起源ならびにＥ．ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける選択についてのマーカー、ならびにＴ−ＤＮＡの輸送を可能にするのに必要なｖｉｒ遺伝子セットを含むベクター骨格領域、
を少なくとも含む、ｔ−ＤＮＡベクターを意味する。
【０２１３】
Ｔ−ＤＮＡ境界および上記Ｔ−ＤＮＡベクターのｖｉｒ遺伝子の上記セットが、オクトピン型もしくはノパリン型のＴｉプラスミドのいずれか、またはその両方から得られ得る。
【０２１４】
「Ｒｉ由来植物形質転換ベクター」は、そのＴ−ＤＮＡ境界が、Ｔｉプラスミドから由来するバイナリ形質転換ベクターを意味し、このバイナリ形質転換ベクターは、ｖｉｒ遺伝子の必要なセットを有する「ヘルパー」Ｒｉプラスミドとともに使用される。
【０２１５】
本明細書中で使用される場合、用語「選択マーカー遺伝子」または「選択マーカー」または「選択用マーカー」は、発現されて、細胞の同定および／または選択を容易にする、細胞に表現型を付与する任意の遺伝子（これは、本発明の遺伝子構築物またはその誘導体にトランスフェクトまたは形質転換される）を含む。本明細書中で企図される適切な選択マーカー遺伝子としては、とりわけ、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）、細菌カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ホスフィノスリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔｌｌ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子（Ｈａｓｅｌｏｆｆら，１９９７）、およびルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【０２１６】
「農業科学的導入（ａｇｒｏｌｉｓｔｉｃｓ）」、「農業科学的形質転換」または「農業科学的移入」によって、ここでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換の特徴と微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）ＤＮＡ送達の特徴とを組み合わせた形質転換方法を意味する。このように、Ｔ−ＤＮＡ含有標的プラスミドは、ＶｉｒＥ２ありまたはなしでＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２の植物生成において可能なＤＮＡ／ＲＮＡを用いて同時に送達される（ＨａｎｓｅｎおよびＣｈｉｌｔｏｎ  １９９６；Ｈａｎｓｅｎら，１９９７；ＨａｎｓｅｎおよびＣｈｉｌｔｏｎ  １９９７−ＷＯ９７１２０４６）。
【０２１７】
「外来ＤＮＡ」によって、組換え技術によって宿主のゲノムに導入される任意のＤＮＡ配列を意味する。上記の外来ＤＮＡは、例えば、Ｔ−ＤＮＡ配列またはその一部（例えば、発現可能な様式において選択マーカーを含むＴ−ＤＮＡ配列）を含む。外来ＤＮＡは、さらに、上記で規定される介在ＤＮＡ配列を含む。
【０２１８】
「組換え事象」によって、部位特異的組換え事象またはトランスポゾン「移動（ジャンピング）（ｊｕｍｐｉｎｇ）」によってもたらされる組換え事象のいずれかを意味する。
【０２１９】
「リコンビナーゼ」によって、部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼのいずれかを意味する。
【０２２０】
「組換え部位」によって、部位特異的組換え部位またはトランスポゾン境界配列のいずれかを意味する。
【０２２１】
「部位特異的組換え事象」によって、一般に、以下の３つのエレメントからなるシステムによって触媒される事象を意味する：一対のＤＮＡ配列（部位特異的組換え配列または部位）および特定の酵素（部位特異的リコンビナーゼ）。部位特異的リコンビナーゼは、部位特異的組換え配列の配向に依存して、２つの部位特異的組換え配列の間でのみ、組換え反応を触媒する。２つの部位特異的組換え部位の間に介在する配列は、部位特異的組換え配列が、互いに対して反対の方向に配向されている場合（すなわち、逆反復）に、部位特異的リコンビナーゼの存在下で逆にされる。部位特異的組換え配列が、互いに対して同じ方向（すなわち、直接反復（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔｓ））に配向される場合、任意の介在配列は、部位特異的リコンビナーゼとの相互作用の際に欠失される。従って、部位特異的組換え配列が、真核生物ゲノムに組み込まれた外来ＤＮＡ配列の両端にて直接反復として存在する場合、上記配列のこのような組み込みは、その後、部位特異的組換え配列の、対応する部位特異的リコンビナーゼとの相互作用によって逆にされ得る。
【０２２２】
多くの異なる部位特異的リコンビナーゼ系が使用され得、これらの系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージμのＧｉｎリコンビナーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉのＰｉｎリコンビナーゼ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ由来のＰｉｎＢ、ＰｉｎＤおよびＰｉｎＦ、ならびにｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系。リコンビナーゼは、一般に、インテグラーゼ、レゾルバーゼ、またはフリッパーゼである。また二重特異的（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）リコンビナーゼは、二重特異的リコンビナーゼに対応する２つの異なる部位特異的組換え部位の直接反復または関節反復とともに使用され得る（Ｗ０９９／２５８４０）。この２つの好ましい部位特異的リコンビナーゼ系は、バクテリオファージＰ１  Ｃｒｅ／ｌｏｘおよび酵母ＦＬＰ／ＦＲＴ系である。これらの系において、リコンビナーゼ（ＣｒｅまたはＦＬＰ）は、そのそれぞれの部位特異的組換え配列（それぞれ、ｌｏｘまたはＦＲＴ）と特異的に相互作用し、その介在配列を逆にするかまたは切り出す。これら２つの系の各々についての部位特異的組換え配列は、比較的短い（ｌｏｘについては３４ｂｐおよびＦＲＴについては４７ｂｐ）。これらの系のいくつかは、タバコ（Ｄａｌｅら．１９９０）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｏｓｂｏｒｎｅら．１９９５）のような植物において高効率により、既に使用されている。部位特異的組換え系は、相同組換えの制御のため（例えば、ＵＳ５５２７６９５）、標的化された導入のため、遺伝子スタッキングなどのため（ＷＯ９９／２５８２１）および複雑なＴ−ＤＮＡ組み込みパターンの解明または選択マーカーの切り出しのため（ＷＯ９９／２３２０２）の方法を含め、植物分子生物学において多くの適用を有する。
【０２２３】
その部位特異的組換え配列は、ＤＮＡの末端に連結されて、切り出されるかまたは逆にされなければならないが、部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子は、何れの場所にも位置し得る。例えば、リコンビナーゼ遺伝子は、既に、真核生物のＤＮＡ中に存在し得るか、あるいは細胞に直接導入されるか、または交配もしくは他家受粉を通じてかのいずれかによって後に導入されるＤＮＡフラグメントにより供給され得る。あるいは、実質的に精製されたリコンビナーゼタンパク質は、例えば、マイクロインジェクションまたは微粒子銃により、真核生物細胞に直接導入され得る。代表的には、その部位特異的リコンビナーゼコード領域は、調節配列に作動可能に連結され、真核生物細胞における部位特異的リコンビナーゼの発現を可能にする。
【０２２４】
「トランスポゾンの移動によってもたらされる組換え事象」または「トランスポザーゼ媒介性組換え」によって、以下の３つのエレメントからなる系によって触媒される組換え事象を意味する：一対のＤＮＡ配列（トランスポゾン境界配列）および特定の酵素（トランスポザーゼ）。そのトランスポザーゼは、逆反復として配置されている２つのトランスポゾン境界配列の間の組換え反応のみを触媒する。
【０２２５】
多くの異なるトランスポゾン／トランスポザーゼ系が使用され得、これらの系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｄｓ／Ａｃ系、Ｓｐｍ系およびμ系。これらの系は、トウモロコシに端を発するが、少なくともＤｓ／ＡｃおよびＳｐｍ系は、他の植物においても機能することが示された（Ｆｅｄｏｒｏｆｆら．１９９３，Ｓｃｈｌａｐｐｉら．１９９３，Ｖａｎ  Ｓｌｕｙｓら．１９８７）。１１ｂｐ境界配列および１３ｂｐ境界配列によって、それぞれ輪郭が示される、Ｄｓ型トランスポゾンおよびＳｐｍ型トランスポゾンが好ましい。
【０２２６】
トランスポゾン境界配列は、ＤＮＡの末端に連結されて、切り出されなければならないが、トランスポザーゼをコードする遺伝子は、何れの場所にも位置され得る。例えば、リコンビナーゼ遺伝子は、真核生物のＤＮＡに既に存在し得るか、あるいは細胞に直接導入されるか、または交配もしくは他家受粉を通じてかのいずれかによって後に導入されるＤＮＡフラグメントにより供給され得る。あるいは、実質的に精製されたトランスポザーゼタンパク質は、例えば、マイクロインジェクションまたは微粒子銃により、細胞に直接導入され得る。
【０２２７】
本発明の一部として、トランスポゾン境界配列は、それらが、上記ＤＮＡ配列の外側に存在し、上記ＤＮＡを、トランスポザーゼの作用によって動き得るトランスポゾン様実体に形質転換するように、外来ＤＮＡ配列に含まれる。
【０２２８】
トランスポゾンは、しばしば、宿主ゲノムの別の遺伝子座に再組み込みされるので、トランスポザーゼが作用可能であった宿主の子孫の分離は、例えば、トランスポゾンフットプリントのみを含む形質転換宿主およびなお外来ＤＮＡを含む形質転換宿主を分離するために必要であり得る。
【０２２９】
本発明を実施するにあたり、その遺伝的エレメントは、好ましくは、例えば、細胞におけるリコンビナーゼタンパク質の発現によって、移動するように誘導され、これは、遺伝的エレメントの組み込み部位を接触させて、そこでの組換え事象を容易にし、遺伝的エレメントを完全に切り出すか、あるいは一般に、本来の組み込み部位に約２０ヌクレオチド以上の長さである「フットプリント」を残す。本発明の方法に従って生成されたそれらの宿主および宿主部分は、同じものを含む移動可能な遺伝的エレメントまたは遺伝子構築物の存在を検出するために、標準的核酸ハイブリダイゼーションおよび／または増幅技術によって同定され得る。あるいは、移動可能な遺伝的エレメントが切り出された形質転換宿主細胞、組織および宿主の場合、このような技術を使用して、宿主のゲノムにおいて、切り出し事象の後に残ったフットプリントを検出することが可能である。
【０２３０】
本明細書中で使用される場合、用語「フットプリント」とは、移動可能な遺伝的エレメントの、上記遺伝子構築物で先に形質転換された細胞のゲノムからの切り出し、欠失または他の除去によって生成される、本明細書中で記載されるものと同じもの含む、移動可能な遺伝的エレメントまたは遺伝子構築物の任意の誘導体をいうものとする。フットプリントは、一般に、切り出しを促進するために使用される組換え遺伝子座またはトランスポゾンの少なくとも１つの単一のコピーを含む。しかし、フットプリントは、遺伝子構築物に由来するさらなる配列（例えば、左側境界配列、右側境界配列、複製起点、使用される場合はリコンビナーゼコード配列もしくはトランスポザーゼコード配列に由来するヌクレオチド配列）、または他のベクターに由来するヌクレオチド配列を含み得る。従って、フットプリントは、使用される遺伝子構築物の組換え遺伝子座もしくはトランスポゾンのヌクレオチド配列（例えば、ｌｏｘ部位またはｆｒｔ部位に対応するか、またはこれらの部位に相補的なヌクレオチド配列）に従って、同定可能である。
【０２３１】
用語「細胞周期」とは、細胞の増殖および分裂と関連する、特にＤＮＡの複製および有糸分裂の調節に関連する、周期的な生化学的かつ構造的事象を意味する。細胞周期は、以下のように呼ばれる相を含む：Ｇ０、Ｇａｐ１（Ｇ１）、ＤＮＡ合成（Ｓ）、Ｇａｐ２（Ｇ２）、および有糸分裂（Ｍ）。通常は、これら４つの相は、連続的に生じるが、細胞周期はまた、改変された周期を含む。ここで、１つ以上の相がなく、改変された細胞周期（例えば、内部倍数性、母性効果変異体、倍数性、ポリテニー、および核内倍加）を生じる。
【０２３２】
用語「細胞周期進行」とは、異なる細胞周期相を通過するプロセスをいう。用語「細胞周期進行速度」とは、従って、上記細胞周期相が通り抜ける速度または上記細胞周期相を完了するために必要な時間範囲をいう。
【０２３３】
「ツーハイブリッドアッセイ」によって、多くの真核生物転写因子が、２つのドメイン、すなわちＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢ）および活性化ドメイン（ＡＤ）を含むという観察に基づくアッセイを意味する。これらのドメインは、物理的に分離している（すなわち、共有結合の破壊）と、標的遺伝子発現をもたらさない。ＤＢに融合される上記タンパク質のうちの一方およびＡＤに融合される上記タンパク質のうちの他方と物理的に相互作用し得る２つのタンパク質は、標的遺伝子発現において生じる転写因子のＤＢドメインおよびＡＤドメインを再結合する。酵母ツーハイブリッドアッセイにおける標的遺伝子は、通常は、ガラクトシダーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子である。酵母ツーハイブリッドアッセイにおけるタンパク質パートナーの間の相互作用は、従って、レポーター遺伝子産物の活性を測定することによって定量され得る（ＢａｒｔｅｌおよびＦｉｅｌｄｓ  １９９７）。あるいは、哺乳動物ツーハイブリッド系が使用され得、例えば、この系は、キメラ緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子を含む（Ｓｈｉｏｄａら，２０００）。
【０２３４】
さらに、本発明のタンパク質の構造モチーフの折りたたみシミュレーションおよびコンピューター再設計は、適切なコンピュータープログラムを使用して行われ得る（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２５（１９９６），２８６−２９９；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１（１９９５），６７５−６７９）。タンパク質折りたたみのコンピュータモデリングは、詳細なペプチドモデルおよびタンパク質モデルの立体配座分析およびエネルギー分析のために使用され得る（Ｍｏｎｇｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７（１９９５），９９５−１０１２；Ｒｅｎｏｕｆ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７６（１９９５），３７−４５）。特に、適切なプログラムは、相補的ペプチド配列についてのコンピューター補助検索により、サイトカイニンオキシダーゼ、そのリガンドまたは他の相互作用タンパク質の相互作用部位の同定のために使用され得る（Ｆａｓｓｉｎａ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ５（１９９４），１１４−１２０）。さらに、タンパク質およびペプチドの設計のための適切なコンピューターシステムは、先行技術において記載される（例えば、Ｂｅｒｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２（１９９４），１０３３−１０３６；Ｗｏｄａｋ，Ａｎｎ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．５０１（１９８７），１−１３；Ｐａｂｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５（１９８６），５９８７−５９９１において）。上記のコンピューター分析から得られた結果は、例えば、本発明のタンパク質のペプチド模倣物またはそのフラグメントの調製のために使用され得る。タンパク質の天然のアミノ酸配列のこのような偽ペプチドアナログは、非常に効率的に親タンパク質を模倣し得る（Ｂｅｎｋｉｒａｎｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１９９６），３３２１８−３３２２４）。例えば、容易に利用可能なアキラルΩ−Ｄアミノ酸残基の、本発明のタンパク質またはそのフラグメントへの組み込みは、脂肪族鎖のポリメチレン単位によるアミノ結合の置換を生じ、それにより、ペプチド模倣物を構築するための都合の良いストラテジーを提供する（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３９（１９９６），７６９−７７７）。他のシステムにおける小ペプチドホルモンの過剰活性（Ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅ）ペプチド模倣アナログは、先行技術において記載される（Ｚｈａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２４（１９９６），３２７−３３１）。本発明のタンパク質の適切なペプチド模倣物はまた、連続的アミンアルキル化を介したペプチド模倣コンビナトリアルライブラリーの合成および得られた化合物を（例えば、それらの結合特性、キナーゼ阻害性特性および／または免疫学的特性について）試験することによって同定され得る。ペプチド模倣コンビナトリアルライブラリーの作製および使用の方法は、先行技術において記載されている（例えば、Ｏｓｔｒｅｓｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６７（１９９６），２２０−２３４およびＤｏｒｎｅｒ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１９９６），７０９−７１５）。
【０２３５】
さらに、本発明のタンパク質の三次元構造および／または結晶構造が、本発明のタンパク質の生物学的活性のペプチド模倣インヒビターの設計のために使用され得る（Ｒｏｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５（１９９６），１２９３３−１２９４４；Ｒｕｔｅｒｂｅｒ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１９９６），１５４５−１５５８）。
【０２３６】
本発明の方法において得られるかまたは同定される化合物は、本発明の核酸、ペプチドまたはタンパク質のいずれかに結合し得る化合物であり得る。同定される他の目的の化合物は、上記遺伝子またはタンパク質のいずれかの発現が、上記化合物の作用によって増強または減少されるような様式において、本発明の遺伝子またはタンパク質の発現を調節する化合物である。あるいは、この化合物は、本発明の任意のタンパク質の活性を増強または減少することによってその作用を発揮し得る。本明細書中で好ましいタンパク質は、新規なサイトカイニンオキシダーゼである。
【０２３７】
上記化合物または複数の化合物は、例えば、サンプル（例えば、植物、動物または微生物からの例えば細胞抽出物）中に含まれ得る。さらに、上記化合物は、当該分野で公知であり得るが、今まで、サイトカイニンオキシダーゼ相互作用タンパク質を抑制または活性化し得ることは知られていない。反応混合物は、細胞または組織培養物の無細胞抽出物であってもよいし、細胞または組織培養物を含んでいてもよい。本発明の方法に従う適切な設定は、当業者に公知であり、例えば、一般に、Ａｌｂｅｒｔｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第３版（１９９４）、特に第１７章において記載される。複数の化合物は、例えば、反応混合物、培養培地に添加され得るか、または細胞に注入され得る。
【０２３８】
化合物を含むサンプルが本発明の方法において同定される場合、アゴニストとして作用し得る化合物を含むと同定される本来のサンプルからその化合物を単離することが可能であり得るか、または例えば、複数の異なる化合物からなる場合、１サンプルにつき異なる物質の数を減少し、本来のサンプルの細分によってこの方法を反復するために、本来のサンプルをさらに細分し得るかのいずれかである。サンプルの複雑性に依存して、上記の工程は、好ましくは、本発明の方法に従って同定されるサンプルが、限定数のまたは唯一の物質を含むのみであるまで数回行われ得る。好ましくは、上記のサンプルは、物質または類似の化学的特性および／もしくは物理的特性を含み、最も好ましくは、上記物質は、同一である。好ましくは、上記の方法に従って同定される化合物またはその誘導体は、植物交配または植物細胞および組織培養物における適用に適切な形態にさらに処方される。
【０２３９】
用語「早期強勢（ｅａｒｌｙ  ｖｉｇｏｒ）」とは、植物が、早期発生の間に迅速に生長する能力をいい、発芽後の、十分に発達した根系および十分に発達した光合成装置の首尾よい確立に関連する。
【０２４０】
用語「倒伏に対する耐性」または「直立性（ｓｔａｎｄａｂｉｌｉｔｙ）」とは、植物が、土壌に対してそれ自体を固定する能力をいう。直立または半直立生長習性を有する植物に関して、この用語はまた、有害な（環境的）条件下で直立性の位置を維持する能力をいう。この形質は、根系の大きさ、深さおよび形態に関連する。
【０２４１】
用語「接ぎ木（ｇｒａｆｔｉｎｇ）」とは、本明細書中で使用される場合、２つの異なる植物の一部を一緒に接ぎ（ｊｏｉｎ）、その結果、それらが一緒に結合して、樹液が流れ得、従って、生長および発達し得る新たな単一の植物を形成することをいう。従って、接ぎ木は、２つの部分からなる：（ｉ）下の部分は、本明細書中でいわれる場合、根茎であり、本質的には、根系および茎部分からなる、ならびに（ｉｉ）上の部分（接ぎ枝（ｓｃｉｏｎ）または接ぎ穂（ｇｒａｆｔ））は、植物の空中部分を生じる。
【０２４２】
本明細書中で使用される場合、ｔｂｌａｓｔｎとは、ＢＬＡＳＴ（基本的局所的アラインメント検索ツール）ファミリーのプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）の一部であるアラインメントツールをいう。ＢＬＡＳＴは、最適な局所的アラインメント（すなわち、類似性の分離された領域のみを共有する配列の中での関係を検出するための２つの核酸配列またはタンパク質配列のある部分のアラインメント）の領域を同定することを目的とする（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０）。本発明において、ＢＬＡＳＴ  ２．０統合ソフト（ｓｕｉｔｅ）のプログラムのｔｂｌａｓｔｎを使用して、トウモロコシサイトカイニンオキシダーゼタンパク質配列を、全てのリーディングフレームにおいて動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して比較する（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２  （１９９７））。
【０２４３】
以下の実施例は、本発明の例示によって提供され、決して限定ではない。本出願中に含められる全ての参考文献の内容は、それらが完全に記載されているかのように、本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【０２４４】
（実施例１：本発明の配列の簡単な説明）
【０２４５】
【表６】
2010213715.tif 000017
【０２４６】
【表７】
2010213715.tif 000018
（実施例２．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の候補サイトカイニンオキシダーゼコード遺伝子の同定）
６個の異なる遺伝子を、トウモロコシ由来のサイトカイニンオキシダーゼに対する配列類似性を保有するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａから同定した（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ２５５：３２８−３３３，１９９９；Ｈｏｕｄａ−Ｈｅｒｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １７：６１５−６２６；ＷＯ９９／０６５７１）。これらの遺伝子を、トウモロコシタンパク質の配列を含む公的なゲノムデータベースからのヌクレオチド配列の６−フレーム翻訳を、ｔｂｌａｓｔｎプログラムを使用して、スクリーニングすることによって見出した。これらの配列を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニン−様遺伝子またはＡｔＣＫＸと指定した。これらは、ＡｔＣＫＸ１〜ＡｔＣＫＸ６として任意に番号を付けた。以下のリストは、これらの遺伝子に対する情報を要約する。予測されたＯＲＦ境界およびタンパク質配列は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓサイトカイニンオキシダーゼとトウモロコシサイトカイニンオキシダーゼとの間および異なるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓサイトカイニンオキシダーゼの間のタンパク質配列相違を近似することによって示すための指標である。示されるＯＲＦ境界およびタンパク質配列は、これらのＡｔＣＫＸ遺伝子の作用の様式に対する決定的な証拠として取られないべきである。ＤＮＡとタンパク質配列との比較に対して、ＤＮＡｓｔａｒ製のプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎを使用した。このプログラムは、アライメントのためにＣｌｕｓｔａｌ法を使用する。タンパク質配列とＤＮＡ配列とのマルチプルアライメントについて、ギャップペナルティーおよびギャップ長を、各１０に設定した。タンパク質のペアワイズアライメントについて、パラメーターは、以下の通りであった：１で保存されたＫｔｕｐｌｅ；３で保存されたギャップペナルティー；５で保存されたウィンドウ；５で保存されたダイアゴナル。ｃＤＮＡのペアワイズアライメントについて、パラメーターは、以下の通りであった：２で保存されたＫｔｕｐｌｅ；５で保存されたギャップペナルティー；４で保存されたウィンドウ；４で保存されたダイアゴナル。タンパク質のアライメントについての類似する群は以下である：（Ｍ，Ｉ，Ｌ，Ｖ）、（Ｆ，Ｗ，Ｙ）、（Ｇ，Ａ）、（Ｓ，Ｔ）、（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、（Ｅ，Ｄ）、（Ｎ，Ｑ）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡ配列およびタンパク質配列の間で示される値は、全ての組み合わせを用いて示される最小値および最大値を示す。
【０２４７】
（Ａ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質１（配列番号１）））
データベース中での位置（登録番号、ｂａｃの位置）：ＡＣ００２５１０、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  第ＩＩ染色体、２５５の完全配列の第２２５節。クローンＴ３２Ｇ６由来の配列。
【０２４８】
データベースにおいて予測されるＯＲＦ：１５５１７．．１６１８３、１６４１５．．１６５４２、１６６３１．．１６８９１、１６９９５．．１７２５７、１７３４４．．１７７５２ＡｔＣＫＸ１  ｃＤＮＡ配列は、配列番号２５として列挙される。
【０２４９】
予測されるタンパク質配列：配列番号２：
相同性
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの％同一性：
３１．５％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓタンパク質との％類似性：
３２．２％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとの％同一性（範囲）：
３８．２％（ＡｔＣＫＸ２）−５４．１％（ＡｔＣＫＸ６）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓタンパク質との％同一性（範囲）：
３７．１％（ＡｔＣＫＸ２）−５８．１％（ＡｔＣＫＸ６）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
（Ｂ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ２（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質２（配列番号３）））
データベース中での位置（登録番号、ｂａｃの位置）：ＡＣ００５９１７、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ第ＩＩ染色体、２５５の完全配列の第１１３節。Ｆ２７Ｆ２３，Ｆ３Ｐ１１クローン由来の配列。
【０２５０】
データベースにおいて予測されるＯＲＦ：
相補体、４０７２１．．４１０１２、４１０５４．．４１３６４、４１５１３．．４１７７０、４２５３５．．４２６６２、４３１５３．．４３７１１
留意してください：遺伝子予測プログラムＮｅｔＰｌａｎｔＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を使用して本発明者らによって同定されたｃＤＮＡ配列は、データベースにおいて注釈をつけられた配列とは異なる。新規のｃＤＮＡ配列に基づいて、データベースにおいて予測されたＯＲＦを改訂した：
相補体、４０７２１．．４１０１２、４１０９５．．４１３６４、４１５１３．．４１７７０、４２５３５．．４２６６２、４３１５３．．４３７１１
このｃＤＮＡによってコードされるタンパク質配列を、配列番号４に列挙する。ＡｔＣＫＸ２のｃＤＮＡを、１工程ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＡｔＣＫＸ２トランスジェニック植物組織の全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによってクローン化し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を使用して配列決定した。これは、本発明者らによって同定され、予想されたｃＤＮＡ配列が正しいことを確認した。新規ＡｔＣＫＸ２  ｃＤＮＡ配列を、配列番号２６として列挙する。ＡｔＣＫＸ２  ｃＤＮＡのヌクレオチド１１７１〜１２５４に対応する８４ｂｐのフラグメントを、配列番号３１として列挙する。この８４ｂｐ  ｃＤＮＡ配列の対応するペプチド配列を、配列番号３２として列挙する。
【０２５１】
相同性
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの％同一性：
３８．４％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓタンパク質との％類似性：
３７．５％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとの％同一性（範囲）：
３４．９％（ＡｔＣＫＸ６）−６４．５％（ＡｔＣＫＸ４）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓタンパク質との％類似性（範囲）：
３６．５％（ＡｔＣＫＸ６）−６６．１％（ＡｔＣＫＸ４）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
（Ｃ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ３（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質３（配列番号５）））
データベース中での位置（登録番号、ｂａｃの位置）：ＡＢ０２４０３５、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａゲノムＤＮＡ、第５染色体、Ｐ１クローン：ＭＨＭ１７、完全配列。
【０２５２】
データベース中にＯＲＦの予測はなし。
【０２５３】
以下の遺伝子を、いくつかの遺伝子予測プログラム（ＧＲＡＩＬ（ｆｔｐ：／／ａｒｔｈｕｒ．ｅｐｍ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ｘｇｒａｉｌ）、Ｇｅｎｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ＣＣＲ−０８１．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮｈｔｍｌ）およびＮｅｔＰｌａｎｔＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を含む）を使用して、本発明者らが同定した：
相補体、２９４１５．．２９７１８、２９８１３．．３００８１、３０１８３．．３０４４３、３０５２９．．３０６５６、３２１０７．．３２７１６
本発明者らによって同定された新規のＡｔＣＫＸ３  ｃＤＮＡ配列を、配列番号２７として列挙する。
【０２５４】
予測されたタンパク質配列、自身のＯＲＦ予測に基づく：配列番号６
相同性
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの％同一性：
３８．７％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓタンパク質との％類似性：
３９．２％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡ％同一性（範囲）：
３８．８％（ＡｔＣＫＸ６）−５１．０％（ＡｔＣＫＸ２）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓタンパク質との類似性（範囲）：
３９．９％（ＡｔＣＫＸ６）−４６．７％（ＡｔＣＫＸ２）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
（Ｄ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ４（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質４（配列番号７）））
データベース中での位置（登録番号、ｂａｃの位置）：
１）ＡＬ０７９３４４、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＮＡ  第４染色体、ＢＡＣクローンＴ１６Ｌ４（ＥＳＳＡプロジェクト）
２）ＡＬ１６１５７５、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＮＡ  第４染色体、コンティグフラグメント第７１番目。
【０２５５】
データベース中に予測されるＯＲＦ：
１）７６１８７．．７６８１４、７７１８９．．７７３１６、７７８２３．．７８０８０、７８３１８．．７８５８６、７８６７７．．７８９６８
２）１０１００２．．１０１６２９、１０２００４．．１０２１３１、１０２６３８．．１０２８９５、１０３１３３．．１０３４０１、１０３４９２．．１０３７８３
ＡｔＣＫＸ４  ｃＤＮＡ配列を、配列番号２８として列挙する。
【０２５６】
予測されたタンパク質配列：配列番号８
相同性
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの％同一性：
４１．０％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓタンパク質との類似性
４１．０％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとの％同一性（範囲）：
３５．２％（ＡｔＣＫＸ６）−６４．５％（ＡｔＣＫＸ２）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓタンパク質との％相同性（範囲）：
３５．１％（ＡｔＣＫＸ６）−６６．１％（ＡｔＣＫＸ２）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
（Ｅ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ５（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質５（配列番号９）））
データベース中での位置（登録番号、ｂａｃの位置）：ＡＣ０２３７５４、Ｆ１Ｂ１６、完全配列、第１染色体
データベース中にＯＲＦの予測はなし。
【０２５７】
以下の遺伝子を、いくつかの遺伝子予測プログラム（ＧＲＡＩＬ（ｆｔｐ：／／ａｒｔｈｕｒ．ｅｐｍ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ｘｇｒａｉｌ）、Ｇｅｎｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ＣＣＲ−０８１．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮｈｔｍｌ）およびＮｅｔＰｌａｎｔＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を含む）を使用して、本発明者らが同定した：
４３７５６．．４４３４７、４４４３５．．４４５６２、４４７００．．４４９６６、４５４９３．．４５７５５、４６２００．．４６５６０
本発明者らによって同定され、予測された新規のＡｔＣＫＸ５  ｃＤＮＡ配列を、配列番号２９として列挙する。このｃＤＮＡについての予測されたタンパク質配列を、配列番号１０として列挙する。第２の潜在的なＡＴＧ開始コドンは、ゲノム配列中に９ヌクレオチドを超えて上流に存在する。これら２つの開始コドンのうちどちらが、タンパク質の第１のアミノ酸をコードするかは不明である。従って、この上流開始コドンで開始する第２の潜在的なＡｔＣＫＸ５  ｃＤＮＡをまた、本発明において配列番号３４として列挙する。対応するゲノム配列を、配列番号３３として列挙し、コードされるタンパク質を配列番号３５として列挙する。
【０２５８】
相同性
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの％同一性：
３９．１％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓタンパク質との％類似性：
３６．６％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとの％同一性（範囲）：
４０．１％（ＡｔＣＫＸ２）−４４．０％（ＡｔＣＫＸ３）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓタンパク質との％類似性（範囲）：
４１．６％（ＡｔＣＫＸ４）−４６．４％（ＡｔＣＫＸ６）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
（Ｆ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ６（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質６（配列番号１１）））
データベース中での位置（登録番号、ｂａｃの位置）：ＡＬ１６３８１８、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＮＡ  第３染色体、Ｐ１クローンＭＡＡ２１（ＥＳＳＡプロジェクト）
データベース中に予測されるＯＲＦ：
４６６３０．．４７２１５、４７３４３．．４７４７０、４７５９１．．４７８０６、４７８９９．．４８１６１、４８２４４．．４８５６５
ＡｔＣＫＸ６  ｃＤＮＡ配列を、配列番号３０として列挙する。
【０２５９】
予測されたタンパク質配列：配列番号１２
相同性
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの％同一性：
３７．３％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓタンパク質との％類似性：
３６．１％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとの％同一性（範囲）：
３４．９％（ＡｔＣＫＸ２）−５４．１％（ＡｔＣＫＸ１）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のタンパク質との％類似性（範囲）：
３５．１％（ＡｔＣＫＸ４）−５８．１％（ＡｔＣＫＸ１）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
遺伝子ＡｔＣＫＸ３およびＡｔＣＫＸ５を、データベース中の推定サイトカイニンオキシダーゼとして注釈を付けず、これらの遺伝子に対するＯＲＦを与えなかった。さらに、ＡｔＣＫＸ２について予測されたＯＲＦ（従って、タンパク質構造）は、本出願人らの独自の予想とは異なり、本出願人らの予測を、ＡｔＣＫＸ２  ｃＤＮＡを配列決定することによって確認した。
【０２６０】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＣＫＸ遺伝子１〜４の遺伝子とトウモロコシＣＫＸ遺伝子との構造の比較を、図１に示す。
【０２６１】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＣＫＸ遺伝子によってコードされる予測タンパク質は、トウモロコシタンパク質と３２％と４１％との間の配列類似性を示す一方、これらは、互いに３５％と６６％との間の配列類似性を示す。この配列保存の低下に起因して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＣＫＸ遺伝子が、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするかどうかは、演繹的に明確というわけではない。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＣＫＸの予測されたタンパク質１〜４およびトウモロコシＣＫＸ遺伝子のアライメントを、図２に示す。
【０２６２】
（実施例３．ＡｔＣＫＸ１を過剰発現するトランスジェニック植物は、サイトカイニンオキシダーゼ活性の増加を示し、植物形態学を変更した）
（１．クローニングプロセスの記載）
以下のプライマーを使用し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（登録Ｃｏｌｕｍｂｉａ）由来のＡｔＣＫＸ−１遺伝子をＰＣＲ増幅した（クローニングのために使用
された非相同配列は、下の場合である）：
５’プライマーの配列：ｃｇｇｔｃｇａｃＡＴＧＧＧＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴＡＣＧ（配列番号１３）
３’プライマーの配列：ｇｃｇｔｃｇａｃＴＴＡＴＡＣＡＧＴＴＣＴＡＧＧＴＴＴＣＧＧＣＡＧＴＡＴ（配列番号１４）。
【０２６３】
これらのプライマーによって増幅された２２３５ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ｐＵＣ１９のＳａｌＩ部位に挿入した。挿入物を配列決定し、ＰＣＲ増幅産物が、どの変異も含まなかったことを確認した。このベクターのＳａｌＩ／ＳａｌＩフラグメントを、二元ベクターｐＢｉｎＨｙｇ−Ｔｘ（Ｇａｔｚら、１９９２）中の改変ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（３つのテトラサイクリンオペレーター配列を保有）の下流のＳａｌＩ部位でサブクローン化した。得られた構築物を、標準的な形質転換プロトコルを使用するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換によって、タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに導入した。
【０２６４】
（２．トランスジェニック株の分子分析）
高いレベルでＡｔＣＫＸ１転写物を合成するいくつかのトランスジェニック株を、同定した（図３）。ＡｔＣＫＸ１転写物を発現するトランスジェニック株はまた、記載されるように（Ｍｏｔｙｋａら、１９９６）、［２−３Ｈ］ｉＰのアデニンへの変換に基づくサイトカイニンオキシダーゼ活性に対する標準的なアッセイによって決定される場合、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。これは、表６の２つのタバコ株および２つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ株について例示される。この結果は、ＡｔＣＫＸ１遺伝子が、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを示す。
【０２６５】
（表６．ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック植物組織におけるサイトカイニンオキシダーゼ活性）
【０２６６】
【表８】
2010213715.tif 000019
（３．トランスジェニック株の表現型の記載）
（３．１  タバコにおいて：）
植物は、低下した頂芽優勢（図７Ａ、ＢおよびＣ）および増加した根生成（図８）を有する小型表現型を有した。
【０２６７】
（表現型の５つの範疇：）
１）強−２クローン
２）中間−３クローン
３）弱−４クローン
４）大きな花部を有する高い植物（ＷＴとして）−５クローン
５）ＷＴに類似、９クローン
（高い（図７ＢおよびＣを参照のこと））
−  ＷＴ：１００〜１５０ｃｍの間
−  弱：約７５ｃｍ
−  中間：約４０〜４５ｃｍ（主幹  約２５ｃｍであるが、側枝がより大きくなる）
−  強：約１０ｃｍ
トランスジェニックＡｔＣＫＸ１−４８およびＡｔＣＫＸ１−５０は、強表現型を示した。以下は、ＷＴ植物と比較される場合の幹伸長についての測定である。
【０２６８】
【表９】
2010213715.tif 000020
（実験）
植物を、温室中、土壌で栽培した。データを、１株あたり少なくとも１０の植物から得た。
【０２６９】
（葉（図７Ｄおよび７Ｅを参照のこと））
ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）の葉の形状は、皮針形（狭く細長い）であり：成葉の幅  対  長さの比は、１：２（野生型植物）から１：３（ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック）まで減少した（図７Ｅ）。葉のおよび葉表面の数は，ＷＴと比較して減少した（図７Ｄを参照のこと）。顕著な差異はまた、葉の老化の進行の間にも観察された。ＷＴタバコにおいて、葉の老化は、最も基本の葉で始まり、そして葉色素の均一な減少を生じる（図７Ｅ）。対照的に、強力に発現するＡｔＣＫＸ１植物の老化している葉は、葉脈に沿って緑色のままであり、そして葉脈間領域において黄色に変わり、このことは変化した葉の老化を示している。より古い葉の手触りは、より堅かった。
【０２７０】
（根）
遺伝子を高度に発現するインビトロで栽培された植物は、より厚い（より強い）より多くの根を形成する能力（図８Ａ）によって、および茎に沿った気根の形成によって、ＷＴから容易に区別可能であった。
【０２７１】
ＡｔＣＫＸ１−５０過剰発現実生について、図８Ｃに示されるように、一次根はより長く、そして側根および不定根の数は、より多かった（実施例９もまた参照のこと）。
【０２７２】
外因性サイトカイニンによる根成長阻害の用量応答曲線は、トランスジェニック実生の根が、ＷＴ根よりもサイトカイニン耐性であることを示した（図８Ｄ）。ｉＰＲに対するＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体の耐性は、ＡｔＣＫＸ２についてほど示されず、このことは、後者のｉＰ型サイトカイニンにおけるより小さな変化と一致する（表１０を参照のこと）。
【０２７３】
気生植物部分の成長は非常に減少されたという事実にもかかわらず、根生物体量の大きな増加が、土壌で栽培した成体植物について観察された（４〜５ヶ月間土壌で栽培した植物について、図８Ｂを参照のこと）。
【０２７４】
（節間距離）
・中間表現型：ＷＴ植物における第５節間および第９節間の、それぞれ、５ｃｍおよび２ｃｍの長さと比較して、花の下から５番目の節間は、約２．５ｃｍの長さであり、そして９番目の節間は、約０．５ｃｍの長さであった。
・強力な表現型：植物ＡｔＣＫＸ１−５０。発芽の１３１日後に測定した根元からの２０番目の節間の長さは、ＷＴの３９．２±３．８ｍｍと比較して、１．３±．０．４であった。
【０２７５】
（頂芽優性および枝分かれ）
より多くの側枝が、形成され、このことは、栄養成長の間の、ＷＴ植物と比較して減少した頂芽優性を示している（図９を参照のこと）。側枝は、主茎を過剰に生長させ、中間ＡｔＣＫＸ１発現体について、４０〜４５ｃｍの高さに達した。さらに二次枝が現れた。しかし、芽は、頂芽優性から完全には解放されなかった（すなわち、側枝は、現実に、伸び続けなかった）。減少した頂芽優性は、より小さな苗条の頂端分裂組織の頂芽成長点による減少したオーキシン産生に起因し得る（実施例１０を参照のこと）。
【０２７６】
（生殖性発生）
ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体における開花の開始は、遅れ、そしてさく果１つあたりから得られる花および種子の数が、減少した。花のサイズは、トランスジェニック植物において変化せず、そして個々の種子の重量は、野生型植物由来の種子の重量に匹敵した。２つの代表的なＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体のデータを、以下にまとめる：
（Ａ．開花の開始）
【０２７７】
【表１０】
2010213715.tif 000021
実験：データを、１株あたり少なくとも１０の植物について収集した。第１の花の完全な伸びを、開花の開始として定義した。ＤＡＧ＝発芽後の日数。
【０２７８】
（Ｂ．１植物あたりの種子さく果の数）
【０２７９】
【表１１】
2010213715.tif 000022
実験：種子さく果の数を、少なくとも５種の異なる植物について決定した。これらの植物は、冬季の間、温室で栽培した。これは、特に、トランスジェニッククローンにおいて、形成される花の数に悪影響を及ぼすことを注記する。しかし、これらの植物が減少した数の花を形成する一般的特徴（ｐｉｃｔｕｒｅ）は、正しい。ｎ．ｄ．決定せず。
【０２８０】
（Ｃ．種子の収穫量／さく果（ｍｇ））
【０２８１】
【表１２】
2010213715.tif 000023
実験：さく果の収穫量を、少なくとも１２個の種子さく果について決定した。種子さく果のサイズは、非常に可変性であり、故に、標準偏差が大きかった。ｎ．ｄ．決定せず。
【０２８２】
（Ｄ．１００個の種子の重量（ｍｇ））
【０２８３】
【表１３】
2010213715.tif 000024
実験：種子生物体量を、少なくとも５種の異なる種子さく果由来の１００個の種子の重量として決定した。ｎ．ｄ．決定せず。
【０２８４】
（３．２  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓについて）
・発芽の開始は、ＷＴについてと同じであった。
・全根系は、伸長し、そして側根および不定根の数が、増大した（図４Ａ〜Ｄを参照のこと）。
・気生器官（ａｅｒｉａｌ  ｏｒｇａｎ）の成長は減少して、縮小した表現型を生じ（図４Ｅおよび４Ｆを参照のこと）、そして葉生物体量は、減少した。葉および花の形成は、遅れる。
・生活環は、ＷＴと比較して長く、そして種子の収穫量は、ＷＴと比較して少なかった。
【０２８５】
以下の形態計測学的データは、これらの表現型を例示する：
（根の発生）
（Ａ．根系の全長）
【０２８６】
【表１４】
2010213715.tif 000025
（Ｂ．一次根の長さ）
【０２８７】
【表１５】
2010213715.tif 000026
（Ｃ．側根（ＬＲ）の長さ）
【０２８８】
【表１６】
2010213715.tif 000027
（Ｄ．不定根の長さ）
【０２８９】
【表１７】
2010213715.tif 000028
（Ｅ．側根（ＬＲ）の数）
【０２９０】
【表１８】
2010213715.tif 000029
（Ｆ．不定根（ＡＲ）の数）
【０２９１】
【表１９】
2010213715.tif 000030
実験：測定を、ＭＳ培地でインビトロで発芽した８日後に、植物に対して実施した。１株あたり少なくとも１７の植物を、スコア付けした。
【０２９２】
（苗条の発生）
（Ａ．葉表面）
【０２９３】
【表２０】
2010213715.tif 000031
実験：発芽の３０日後に形成された主要なロゼット型の葉の葉表面積を、測定した。１クローンあたり３の植物を分析した。
【０２９４】
（生殖性発生）
開花の開始
【０２９５】
【表２１】
2010213715.tif 000032
実験：植物を、温室条件下で栽培した。１クローンあたり少なくとも１３の植物を分析した。ＤＡＧ＝発芽後の日数。
【０２９６】
（結論）
ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の分析は、タバコから得られた結果を大部分確認し、そして減少したサイトカイニン含量の結果の一般的な性質を示す。全根系は、伸長し（根の全長は、ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体において、約１１０〜１４０％増加した）、そして苗条は、よりゆっくりと発生し（開花の遅れ）そして葉生物体量は、減少した。種子の収穫量も同様に、このトランスジェニック体においてより低かった。
【０２９７】
（実施例４．ＡｔＣＫＸ２を過剰発現するトランスジェニック植物は、サイトカイニンオキシダーゼ活性の増加および植物形態の変化を示した）
（１．クローニングプロセスの説明）
以下のプライマーを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（受託  コロンビア）由来のＡｔＣＫＸ２遺伝子をＰＣＲ増幅した（クローニングのために使用される非相同配列は、小文字である）：
５’プライマーの配列：ｇｃｇｇｔａｃｃＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＣＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣ（配列番号１５）
３’プライマーの配列：ｇｃｇｇｔａｃｃＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＴＧＣ（配列番号１６）。
【０２９８】
３１０４ｂｐのＰＣＲフラグメント（これらのプライマーによって増幅した）を、ｐＵＣ１９のＫｐｎｌ部位に挿入した。この挿入物を配列決定して、公開された配列との差異が、このＰＣＲ手順によって導入されていないことを確認した。このベクターのＫｐｎｌ／Ｋｐｎｌフラグメントを、バイナリーベクターｐＢｉｎＨｙｇ−Ｔｘ中の改変ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（３つのテトラサイクリンオペレーター配列を有する）の下流のＫｐｎｌ部位にサブクローニングした（Ｇａｔｚら、１９９２）。得られた構築物を、標準的な形質転換プロトコールを使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換によって、タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに導入した。
【０２９９】
（２．トランスジェニック株の分子分析）
ＡｔＣＫＸ２転写物を高レベルで合成するいくつかのトランスジェニック株を、同定した（図６）。ＡｔＣＫＸ２転写物を発現するトランスジェニック株もまた、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。これは、表７中の２つのタバコ株および３つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ株について例示される。この結果は、ＡｔＣＫＸ２遺伝子が、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを証明する。
【０３００】
（表７．ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック植物組織におけるサイトカイニンオキシダーゼ活性）
【０３０１】
【表２２】
2010213715.tif 000033
（３．トランスジェニック株の表現型の説明）
（３．１  タバコについて（図７〜１０を参照のこと））
表現型の３つのカテゴリー：
１）強い−１５クローン（ＡｔＣＫＸ１の中間表現型と類似）；
２）弱い−６クローン；
３）その他−ＷＴ植物と類似、７クローン。
【０３０２】
（気生植物部分）
植物の高さ、節間距離、枝分かれ、葉の形態および黄変に関する観察は、矮性特徴が、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック体よりもＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体においてより激しいという点で、一般に小さい量的差異を有するＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体についての観察と類似していた（図７Ａおよび７Ｂにおいて、ＡｔＣＫＸ１植物とＡｔＣＫＸ２植物とを比較のこと）。このことは、強力な表現型であるＡｔＣＫＸ２−３８およびＡｔＣＫＸ２−４０を有するクローンの幹伸長および節間距離の測定について、以下に例示される。
【０３０３】
（幹伸長）
【０３０４】
【表２３】
2010213715.tif 000034
実験：植物を、温室中、土壌で栽培した。データを、１株あたり少なくとも１０の植物から収集した。
【０３０５】
（節間距離）
【０３０６】
【表２４】
2010213715.tif 000035
実験：根元から２０番目の節間の長さを、発芽の１３１日後に測定した。
【０３０７】
（根）
遺伝子を高度に発現するインビトロで栽培された植物は、より厚い（より強い）より多くの根を形成する能力によって、および茎に沿った気根の形成によって、ＷＴ植物から容易に区別可能であった。
【０３０８】
ＡｔＣＫＸ２−３８過剰発現実生について、図８Ｃに示されるように、一次根はより長く、そして側根および不定根の数は、より多かった（実施例９もまた参照のこと）。
【０３０９】
外因性サイトカイニンによる根成長阻害の用量応答曲線は、トランスジェニック実生の根が、ＷＴ根よりもサイトカイニン耐性であることを示した（図８Ｄ）。ｉＰＲに対するＡｔＣＫＸ１−２８トランスジェニック体の耐性は、ＡｔＣＫＸ２−３８についてほど示されておらず、このことは、後者のｉＰ型サイトカイニンにおけるより小さな変化と一致する（表１０を参照のこと）。
【０３１０】
ＷＴと比較した、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック植物のＴＯ株の根生物体量の生重量および乾燥重量の増加が、以下の表に示されるように、土壌で栽培した植物について観察された：
【０３１１】
【表２５】
2010213715.tif 000036
実験：３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ２クローンの６種のＷＴ植物および６種の独立したＴ０株を、土壌で栽培した。開花後、根系を、水で洗浄し、そして土を可能な限り除去し、そして生重量および乾燥重量を測定した。以下の表に示されるように、根生物体量の生重量および乾燥重量の増加はまた、ＷＴと比較した場合、水耕栽培したＡｔＣＫＸ２トランスジェニック体のＦ１子孫について観察された。
【０３１２】
【表２６】
2010213715.tif 000037
実験：土壌栽培した植物を、発芽の６０日後に、水耕系（Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液）に移し、そしてさらに６０日間栽培した。水耕溶液を、連続して通気し、そして３日おきに新鮮な溶液と交換した。
【０３１３】
要約すると、水耕溶液中で栽培されたトランスジェニック植物は、野生型植物よりも６５〜１５０％大きな根生物体量（生重量）を形成した。乾燥重量の増分は、１０〜５０％であった。この差異は、おそらく、トランスジェニック体のより大きな細胞容量に一部起因する。これは、細胞壁の相対部分を減少させ、これにより乾物物質の大部分を形成する。苗条生物体量は、野生型苗条の２０％から７０％に減少した。生重量の差異は、苗条根／茎比の変化を生じ、この根／茎比は、野生型において、約８であるが、トランスジェニッククローンにおいて、約１であった。
【０３１４】
（結論）
気生植物部分の成長が減少するという事実にもかかわらず、ＷＴコントロールと比較して、根の成長および生物体量の増加が、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック実生および異なる条件下で栽培した成体植物について観察された。異なるトランスジェニック植物の間の量的差異が観察された：根生物体量のより大きな増加が、最も強力に発現するクローンについて観察された。
【０３１５】
（生殖性発生）
ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック体における開花の開始は、遅れ、そして１さく果あたりの花の数および種子の収穫量が、減少した。これらの効果は、ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック植物において観察された効果と非常に類似していたが、これらは、以下の表に示されるように、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック体においてあまり顕著でなかった。花の大きさは、トランスジェニック植物においては変化せず、そして個々の種子の重量は、野生型植物の種子の重量に匹敵した。
【０３１６】
（Ａ．開花の開始）
【０３１７】
【表２７】
2010213715.tif 000038
実験：データを、１株あたり少なくとも１０の植物について収集した。第１花の全伸長を、開花の開始として定義した。ＤＡＧ＝開花後の日数。
【０３１８】
（Ｂ．１植物あたりの種子さく果の数）
【０３１９】
【表２８】
2010213715.tif 000039
実験：種子さく果の数を、少なくとも５種の異なる植物について決定した。これらの植物は、冬季の間に、温室条件下で栽培されたことに注意のこと。これは、特に、トランスジェニッククローンについて、形成された花の数に悪影響を与える。しかし、これらの植物が減少した数の花を形成する一般的特徴は、正しい。ｎ．ｄ．決定せず。
【０３２０】
（Ｃ．種子の収穫量／さく果（ｍｇ））
【０３２１】
【表２９】
2010213715.tif 000040
実験：種子の収穫量を、少なくとも１２個の種子さく果について決定した。種子さく果のサイズは、非常に可変性であり、故に、標準偏差が大きかった。ｎ．ｄ．決定せず。
【０３２２】
（Ｄ．１００個の種子の重量（ｍｇ））
【０３２３】
【表３０】
2010213715.tif 000041
実験：種子生物体量を、少なくとも５種の異なる種子さく果由来の１００個の種子の重量として決定した。ｎ．ｄ．決定せず。
【０３２４】
（３．２  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて）
以下の形態計測データは、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックスについて得られた：
根発育
（Ａ．根系の全長）
【０３２５】
【表３１】
2010213715.tif 000042
（Ｂ．主根長）
【０３２６】
【表３２】
2010213715.tif 000043
（Ｃ．側根長）
【０３２７】
【表３３】
2010213715.tif 000044
（Ｄ．不定根長）
【０３２８】
【表３４】
2010213715.tif 000045
（Ｅ．側根（ＬＲ）の数）
【０３２９】
【表３５】
2010213715.tif 000046
（Ｆ．不定根（ＡＲ）の数）
【０３３０】
【表３６】
2010213715.tif 000047
（実験：測定を、ＭＳ培地において、植物８ｄ．ａ．ｇインビトロで行った。１株当たり少なくとも１７の植物を評価した。
【０３３１】
（苗条発育）
（葉表面）
【０３３２】
【表３７】
2010213715.tif 000048
（実験：発芽の３０日後に形成された主ロゼット葉の葉表面積を測定した。クローン当たり３つの植物を分析した。
【０３３３】
（繁殖的発育）
（開花の開始）
【０３３４】
【表３８】
2010213715.tif 000049
（実験：植物を温室条件下で生育させた。クローン当たり少なくとも１３の植物を分析した。ＤＡＧ＝発芽後の日数。
【０３３５】
（結論）：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックスは、減少した葉のバイオマスおよびＡｔＣＫＸ１トランスジェニックスと類似した矮化表現型（図５と図４Ｆを比較する）を有した。全根系はまた、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて増大した。全根長は、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックスにおいて約５０％増加した。ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックスは、より長い主根、より多くの側根を有し、そしてより多くの不定根を形成する。ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックスは、主根の増加した増殖を欠いたが、ＷＴよりも、より多くの横根（ｓｉｄｅ  ｒｏｏｔ）および側根（ｌａｔｅｒａｌ  ｒｏｏｔ）を形成する。
【０３３６】
（要旨）：
ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックスについて観測された表現型は、ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックスと非常に類似するが、同一ではなく、これは、タバコトランスジェニックスについて得られた結果と非常に類似するが、同一ではない。これは、これらの２つの植物種における減少したサイトカイニン含有量の結果の一般的な性質を確認し、従って、類似の表現型は、同様に他の植物種において予期され得る。タバコとＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓとの間の主要な違いは、ＡｔＣＫＸ２過剰発現植物における増加した主根増殖の欠如である。
【０３３７】
（実施例５．ＡｔＣＫＸ３を過剰発現するトランスジェニック植物は、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性および変化した植物形態学を示した）
（１．クローニングプロセスの説明）
以下のプライマーを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ許諾）由来のＡｔＣＫＸ３遺伝子をＰＣＲ増幅した（クローニングのための使用した非相同性配列は、小文字である）：
【０３３８】
【表３９】
2010213715.tif 000050
このＰＣＲ増幅によって産生された３３９７−ｂｐ  ＰＣＲフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＫｐｎｌ部位に挿入した。挿入物を配列決定して、ＰＣＲ産物が、遺伝子と比較して配列の変化を有さないことを確認した。このベクターのＫｐｎｌ／Ｋｐｎｌフラグメントを、バイナリーベクターｐＢｉｎＨｙｇ−Ｔｘにおいて、改変ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（３つのテトラサイクリンオペレーター配列を有する）の下流のＫｐｎｌ部位にサブクローニングした（Ｇａｔｚら、１９９２）。得られた構築物を、標準的な形質転換プロトコルを使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって、タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに導入した。
【０３３９】
（２．トランスジェニック株の分子分析）
ＡｔＣＫＸ３転写物を高レベルで合成する、いくつかのトランスジェニックタバコ株を同定した（図１１Ａ）。ＡｔＣＫＸ３転写物を発現するトランスジェニックタバコ株はまた、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。これは、表８において３つの植物で例示される。これは、ＡｔＣＫＸ３遺伝子が、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを証明する。
【０３４０】
（表８．ＡｔＣＫＸ４トランスジェニック植物組織におけるサイトカイニンオキシダーゼ活性）
【０３４１】
【表４０】
2010213715.tif 000051
（３．植物表現型分析）
タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＡｔＣＫＸ３遺伝子の過剰発現によって生成される表現型は、ＡｔＣＫＸ１発現植物およびＡｔＣＫＸ２発現植物の表現型と基本的に類似した（すなわち、増強された根付きおよび矮化）。しかし、タバコにおけるＡｔＣＫＸ３遺伝子の過剰発現は、ＡｔＣＫＸ２と比較してより強力な表現型を生じた。この意味において、ＡｔＣＫＸ３の過剰発現は、ＡｔＣＫＸ１過剰発現とより類似した。
【０３４２】
（実施例６．ＡｔＣＫＸ４を過剰発現するトランスジェニック植物は、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性および変化した植物形態学を示した）
（１．クローニングプロセスの説明）
以下のプライマーを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ許諾）由来のＡｔＣＫＸ４遺伝子をＰＣＲ増幅した（クローニングのための使用した非相同性配列は、小文字である）：
【０３４３】
【表４１】
2010213715.tif 000052
このＰＣＲ増幅によって産生された２８９０−ｂｐ  ＰＣＲフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＫｐｎｌ部位に挿入した。挿入物を配列決定して、ＰＣＲ産物が、この遺伝子と比較して配列の変化を有さないことを確認した。このベクターのＫｐｎｌ／Ｋｐｎｌフラグメントを、バイナリーベクターｐＢｉｎＨｙｇ−Ｔｘにおいて、改変ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（３つのテトラサイクリンオペレーター配列を有する）の下流のＫｐｎｌ部位にサブクローニングした（Ｇａｔｚら、１９９２）。得られた構築物を、標準的な形質転換プロトコルを使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって、タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに導入した。
【０３４４】
（２．トランスジェニック株の分子分析）
いくつかのトランスジェニックタバコ株は、ＡｔＣＫＸ４転写物を高レベルで合成した（図１１Ｂ）。ＡｔＣＫＸ４転写物を発現するトランスジェニック株はまた、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。これは、表９において３つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよび３つのタバコ株で例示される。この結果は、ＡｔＣＫＸ４遺伝子が、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを証明する。
【０３４５】
（表９．ＡｔＣＫＸ４トランスジェニック植物組織におけるサイトカイニンオキシダーゼ活性）
【０３４６】
【表４２】
2010213715.tif 000053
全般的に、このデータは、４つのサイトカイニンオキシダーゼについての見かけのＫｍ値が、基質としてｉＰを用いて０．２〜９．５μＭの範囲であり、これは、さらに、ＡｔＣＫＸ１〜４によってコードされるタンパク質が、実際に、本明細書中において開示されるように、サイトカイニンオキシダーゼ酵素であることを実証する。
【０３４７】
（３．植物表現型分析）
タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＡｔＣＫＸ４遺伝子の過剰発現によって生成される表現型は、ＡｔＣＫＸ１発現植物およびＡｔＣＫＸ２発現植物の表現型と基本的に類似した（すなわち、増強された根付き、減少した頂芽優性、矮化、およびタバコの規則的な葉の葉脈間領域の黄変）。タバコにおけるさらなる表現型は、披針形の葉であった（変化した、長さ対幅の比）。
【０３４８】
（ＡｔＣＫＸを過剰発現するタバコ植物の一般的な観察）
全般的に、表現型分析は、ＡｔＣＫＸ遺伝子過剰発現が、タバコにおける苗条および根系における劇的な発育の変化（増強された根系の発育、および着生植物部分の矮化を含む）を引き起こしたことを実証した。他の効果（例えば、変化した葉の老化、茎における不定根の形成、および他のもの）もまた、本明細書中に記載されるように観察された。異なる遺伝子について、変化は非常に類似するが、同一ではなかった。タバコにおいて、ＡｔＣＫＸ１およびＡｔＣＫＸ３の過剰発現は、ＡｔＣＫＸ２およびＡｔＣＫＸ４とは異なる。一般的に、２つの前者は、特性（特に、苗条）のより高い発現を示した。従って、特定のサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子は、本発明の実施形態に記載される表現型を達成するために好ましくあり得る。
【０３４９】
（実施例７．ＡｔＣＫＸ５遺伝子のクローニング）
以下のプライマーを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ許諾）由来のＡｔＣＫＸ５遺伝子をＰＣＲ増幅した（クローニングのための使用した非相同性配列は、小文字である）：
【０３５０】
【表４３】
2010213715.tif 000054
５’プライマーの配列は、ＡｔＣＫＸ５タンパク質の２つの潜在的開始コドンを含み、この最も５’側の開始コドンには、下線が付され、そして第２のＡＴＧは、イタリックで示される。
【０３５１】
２８４３−ｂｐ  ＰＣＲフラグメント（このＰＣＲ増幅によって産生される）を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に平滑末端産物として挿入した。
【０３５２】
（実施例８．ＡｔＣＫＸ６遺伝子のクローニング）
以下のプライマーを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ許諾）由来のＡｔＣＫＸ６遺伝子をＰＣＲ増幅した（クローニングのための使用した非相同性配列は、小文字である）：
【０３５３】
【表４４】
2010213715.tif 000055
１９４９−ｂｐ  ＰＣＲフラグメント（このＰＣＲ増幅によって産生される）を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に平滑末端産物として挿入した。
【０３５４】
（実施例９．タバコ実生生育試験が、ＡｔＣＫＸトランスジェニックスの早期の生長力を実証した）
ＡｔＣＫＸ１−５０およびＡｔＣＫＸ２−３８を過剰発現トランスジェニックスおよびＷＴタバコの種子を、ＭＳ培地にインビトロで播き、冷却処理の４日後、培養室に持って行き、６日後に、発芽した。実生生育に対する観察を、発芽の１０日後に行い（図８Ｃもまた参照のこと）、以下に要約した。少なくとも２０の個体を、クローン当たりで評価した。類似のデータが、２つの他の実験において得られた。
【０３５５】
（Ａ．根系の全長）
【０３５６】
【表４５】
2010213715.tif 000056
（Ｂ．主根長）
【０３５７】
【表４６】
2010213715.tif 000057
（Ｃ．側根長）
【０３５８】
【表４７】
2010213715.tif 000058
（Ｄ．不定根長）
【０３５９】
【表４８】
2010213715.tif 000059
（Ｅ．側根（ＬＲ）の数）
【０３６０】
【表４９】
2010213715.tif 000060
（Ｆ．不定根（ＡＲ）の数）
【０３６１】
【表５０】
2010213715.tif 000061
（ＡｔＣＫＸ１植物およびＡｔＣＫＸ２植物、一般的観察）：
ＡｔＣＫＸ１過剰発現タバコ植物およびＡｔＣＫＸ２過剰発現タバコ植物の実生は、発芽の１０日後の非形質転換コントロール植物よりも６０％多くの不定根および３倍多くの側根を有した。主根の長さは、約７０％増加した。これは、より多くて長い横根および第２根とともに、全体の根の長さの７０〜１００％の増加を生じた。これらの結果は、サイトカイニンオキシダーゼの過剰発現が、主根および不定根の両方の生育および発育を増強し、早期の生長力を生じることを示した。
【０３６２】
（実施例１０．ＡｔＣＫＸ１過剰発現タバコ植物における変化した植物形態学の組織学的分析）
種々の組織の顕微鏡分析は、ＡｔＣＫＸトランスジェニックスにおける形態学的変化が、細胞数および細胞形成速度における明瞭な変化によって反映されることを明らかにした（図１０を参照のこと）。ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックスの苗条頂端分裂組織（ＳＡＭ）は、野生型より小さく、そして中心区域（ｚｏｎｅ）と側方器官形成の周辺区域との間の空間をより少ない細胞が占めるが、細胞は同じサイズであった（図１０Ａ）。減少したサイトカイニン含有量の結果としての、ＳＡＭの減少した細胞数およびサイズは、サイトカイニンが、ＳＡＭ増殖においてある役割を有することを示す。分化パターンにおける明確な変化は生じず、ＳＡＭにおける分化区域の空間的組織化が、細胞数および局所サイトカイニン濃度から大きく独立することを示唆する。サイトカイニンオキシダーゼ過剰発現における葉の全体的な組織パターンは、変化しなかった。しかし、師部および木部のサイズは、有意に減少した（図１０Ｂ）。対照的に、葉の柔組織および表皮細胞の平均細胞サイズは、４〜５倍増加した（図１０Ｃ、Ｄ）。ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックスの新たな細胞は、野生型の葉の速度の３〜４％で形成され、そして最終的な葉の細胞数は、野生型の５〜６％の範囲であると推定された。これは、葉におけるサイトカイニンが、細胞分裂サイクルを維持するための絶対的な要件であることを示す。花器官の細胞サイズも細胞形態も、変化せず、そしてカプセル当たりの種子収穫量が、野生型およびＡｔＣＫＸトランスジェニック植物において類似した。ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック植物の根分裂組織の細胞集団は、約４倍拡大し、そして中心カラムネラ（ｃｏｌｕｍｎｅｌｌａ）および側方カラムネラの両方における細胞数が増加した（図１０Ｅ、Ｆ）。最終根直径は、全ての型の根細胞の増加した直径に起因して、６０％増加した。半径方向の根のパターンは、しばしば第４層の皮層細胞が、トランスジェニックの根において注目されたことを除いて、野生型およびトランスジェニックスと同一であった（図１０Ｇ）。増加した細胞数およびわずかに減少した細胞長は、増強された根の生育が、増加した細胞の生育よりもむしろ増加した数のサイクリング細胞に起因することを示す。低下したサイトカイニン含有量の存在下において、根の分裂組織細胞は、分裂組織を残し、伸長を開始する前に、さらなる回の有糸分裂を受けなければならない。従って、分裂組織からの出口は、サイトカイニンに感受性の機構によって調節される。明らかに、サイトカイニンは、根の分裂組織においてネガティブな調節の役割を有し、そして野生型サイトカイニン濃度は、最大の根系の発育に対して阻害性である。従って、サイトカイニンオキシダーゼを過剰発現することによる活性サイトカイニンのレベルの減少は、根の発育を刺激しこれは、ＷＴ植物と比較してより多くの側根および不定根を有する根のサイズの増加を生じる。
【０３６３】
（実施例１１．ＡｔＣＫＸ１過剰発現タバコ植物およびＡｔＣＫＸ２植物過剰発現タバコ植物は、減少したサイトカイニン含有量を有した）
測定した１６の異なるサイトカイニン代謝のうち、最も大きな変化は、ＡｔＣＫＸ２過剰発現物のｉＰ型サイトカイニンにおいて生じた（表１０）：ｉＰ型サイトカイニンの含有量の全体的な減少は、ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックスにおけるよりもＡｔＣＫＸ２発現植物においてより明白である。ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックスは、苗条においてより強力な表現型を示した。どのサイトカイニン代謝物が、分析された異なる性質に関連するかは、分からない。それは、異なるサイトカイニンが、種々の発育プロセスにおける異なる役割を演じることであり得る。より小さな変化がＺ型サイトカイニンについて注記され、これは、基質の異なる接近性またはタンパク質のより低い基質特異性に起因し得る。個体トランスジェニッククローンにおけるｉＰおよびＺ代謝物の合計の含有量は、野生型の３１％と６３％との間であった。Ｏ−グルコシドのサイトカイニン保存プールはまた、トランスジェニックスにおいて低下した（表１０）。Ｎ−グルコシドおよびＤＨＺ型サイトカイニンの濃度は、非常に低く、そしてトランスジェニックの実生において変化しないか、またはほんのわずかに変化した（データは示さず）。
【０３６４】
表１０．ＡｔＣＫＸトランスジェニック植物のサイトカイニン含有量。サイトカイニン抽出、免疫精製、ＨＰＬＣ分離およびＥＬＩＳＡ法による定量は、Ｆａｉｓｓら、１９９７により記載されるように実施された。約１００の２週齢の実生の３つの独立してプールされたサンプル（サンプル当たり２．５ｇ）を、各クローンについて分析した。濃度は、ｐｍｏｌ×ｇ新鮮重量−１である。略語：ｉＰ、Ｎ６−（Δ２イソペンテニル）アデニン；ｉＰＲ、Ｎ６−（Δ２イソペンテニル）アデニンリボシド；ｉＰＲＰ、Ｎ６−（Δ２イソペンテニル）アデニンリボシド５’モノホスフェート；Ｚ、ｔｒａｎｓ−ゼアチン；ＺＲ、ゼアチンリボシド；ＺＲＰ、ゼアチンリボシド５’モノホスフェート；ＺＯＧ、ゼアチンＯ−グルコシド；ＺＲＯＧ、ゼアチンリボシドＯ−グルコシド。
【０３６５】
【表５１】
2010213715.tif 000062
（実施例１２．接ぎ木実験は、ＡｔＣＫＸ過剰発現に起因する矮化および増強された根の発育が、トランスジェニック組織に制限されることを示した）  どのサイトカイニンオキシダーゼ過剰発現の表現型の効果が、発現組織に制限されるか（すなわち、細胞自律性または器官自律性の性質）を調査するために、接ぎ木実験を行った。ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックタバコ植物とＷＴタバコとの間で、相互接ぎ木を行った。この実験で使用されたトランスジェニック植物は、ＡｔＣＫＸ２−３８であり、これは、増強された根の生育および着生植物部分の減少した発育によって特徴付けられる強い表現型を示した。実施例３〜６に記載されるように、これらは、タバコおよびａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるサイトカイニンオキシダーゼ過剰発現から生じる２つの重要な表現型であった。
【０３６６】
植物は、接ぎ木したとき約１５ｃｍ長であり、そして接ぎ木接合部は、土壌の約１０ｃｍ上であった。図１２は、接ぎ木の１５週間後の植物を示す。主な結果は以下であった：（ｉ）トランスジェニック台木に接ぎ木したＷＴ接ぎ穂（ｓｃｉｏｎ）の着生表現型（ａｅｒｉａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は、ＷＴコントロールの接ぎ枝（ｇｒａｆｔ）（＝ＷＴ台木上のＷＴ接ぎ穂）に類似した。重要なことに、これは、台木におけるＡｔＣＫＸ２導入遺伝子の過剰発現が、植物の非トランスジェニック着生部分の矮化を誘導しなかったことを示した（図１２Ａを参照のこと）。トランスジェニック台木の改善された根の成長は維持され、このことは、ＡｔＣＫＸトランスジェニックの改善された根の成長が自律的であり、ＡｔｃＫＸトランスジェニック苗条に依存しないことを示した（図１２Ｃ）。興味深いことに、トランスジェニック台木に接ぎ木したＷＴ接ぎ穂はより健全なようであり、より良く発達した。特に、根出葉の老化は、これらの植物において遅延した。（図１２Ａを参照のこと）；（ｉｉ）ＷＴ台木に接ぎ木したトランスジェニック接ぎ穂は、トランスジェニック接ぎ穂が由来するトランスジェニック植物の着生部分に類似するようであった。すなわち、苗条矮化表現型もまた自律的であり、そして改善した根の成長に依存しない（図１２Ｂを参照のこと）。
【０３６７】
上記の、トランスジェニック台木に接ぎ木したＷＴ苗条のより良い外観に加えて、ＷＴ苗条の根部分（ｂａｓａｌ  ｐａｒｔ）での不定根の形成は顕著であった（図１２Ｄ、右の植物）。不定根の形成はまた、ＡｔＣＫＸトランスジェニックの幹に生じたが、ＷＴコントロールの接ぎ枝の幹には生じず（図１２Ｄ、左の植物）、従って非自律的形質であるようである。
【０３６８】
まとめると、ＡｔＣＫＸ過剰発現タバコにおける促進された根形成および苗条の矮化は自律的形質であり、そして接ぎ木手順によって接合し得ないことが、本発明において開示される。驚くべきことに、ＡｔＣＫＸトランスジェニック台木上にＷＴ接ぎ穂を接ぎ木することにより、より活発に育つ植物を得、そして葉の老化は遅延した。
【０３６９】
接ぎ木の代わりとして、組織特異的プロモーターを使用して、サイトカイニン過剰発現の自律的表現型的影響から離し得た。従って、本発明において、組織特異的な様式でのサイトカイニンオキシダーゼの過剰発現を使用して、苗条系または根系のような植物の形態を変更し得ることが開示されている。
【０３７０】
（実施例１３．トランスジェニック植物における根特異的プロモーター下でのＡｔＣＫＸ遺伝子の発現は、根生成の増加を導く）
ＡｔＣＫＸ遺伝子（実施例４を参照のこと）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの根ｃｌａｖａｔａホモログプロモーター（配列番号３６）（これは、根特異的発現を駆動するプロモーターである）の制御下にクローニングする。他の根特異的プロモーターもまた、本発明の目的のために使用され得る。例示的な根特異的プロモーターについては、表５を参照のこと。
【０３７１】
根において特異的にＡｔＣＫＸ遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、植物の着生部分の成長および発達に負に影響することなく、根の生成の増加を示す。葉の老化および着生植物部分の成長に対する正の影響が観察される。
【０３７２】
（実施例１４．トランスジェニック植物における老化誘導性プロモーター下でのＡｔＣＫＸ遺伝子の抑制は、葉の老化の遅延および種子収穫量の増大を導く）
ＡｔＣＫＸ遺伝子に由来し、かつ内因性サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の発現を抑制するように設計したキメラ遺伝子構築物を、老化誘導性プロモーターの制御下にクローニングする。例えば、老化関連遺伝子（ＳＡＧ）由来のプロモーター（例えば、ＳＡＧ１２プロモーター）を使用し得る（Ｑｕｉｒｉｎｏら、２０００）。葉の老化において特異的に内因性サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子を抑制するトランスジェニック植物は、植物の形態および成長および発達に負に影響することなく、葉の老化の遅延ならびにより多い種子収穫量を示す。
【０３７３】
（実施例１５．雌性生殖器官におけるＡｔＣＫＸ遺伝子の過剰発現は、単為結実果実の発達を導く）
ＡｔＣＫＸ遺伝子のオープンリーディングフレームを、雌性生殖器官における過剰発現付与するプロモーター（例えば、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ由来のＤｅｆＨ９プロモーターまたはそのホモログのうちの１つであり、これは、胎座および胚珠における特異的に高発現特異性を有する）の制御下にクローニングする。これらの組織において増強されたサイトカイニンオキシダーゼ活性を有するトランスジェニック植物は、単為結実果実の発達を示す。
【０３７４】
（実施例１６．ＡｔＣＫＸ遺伝子の過剰発現は、種子サイズおよび子葉サイズの増大を生じる）
トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物は、上記のように、３５Ｓプロモーターの制御下で、サイトカイニンオキシダーゼ（ＡｔＣＫＸ）遺伝子を過剰発現する。トランスジェニック植物（特に、ＡｔＣＫＸ１遺伝子およびＡｔＣＫＸ３遺伝子を発現する）は、サイズが大きくなった種子を発達させた。この種子のサイズが大きくなった原因はほとんど完全に、胚が大きくなったことによるものである。種子、胚および初期後胚表現型の詳細は、図１３Ａ〜１３Ｅに示される。表１１は、野生型および４つの調査したＡｔＣＫＸ遺伝子の各２つの独立したクローンの種子重量を示す。平均重量は、各クローンについて２００種子の５つの異なるバッチを分析することによって得た。定量評価は、ＡｔＣＫＸ１発現クローンおよびＡｔＣＫＸ３発現クローンの種子重量が、野生型よりも約１．８〜２．３倍高いことを示した。ＡｔＣＫＸ２発現系統およびＡｔＣＫＸ４の発現系統の種子収穫重量は、１０〜２５％の範囲であった（表１１および図１４）。
【０３７５】
種子、胚、および子葉のサイズおよび重量増加は予測されない。なぜなら、サイトカイニン含有量の減少は、器官成長の減少に関連することが予期されているからである。種子、胚、および子葉のサイズにおける増加についての１つの考えられる理由は、これらの貯蔵器官におけるサイトカイニンの、以前は知られていなかった負の調節機能である。器官成長の制御におけるサイトカイニンの負の調節機能は、根からということのみがこれまで知られていた（Ｗｅｒｎｅｒら、２００１）。従って、本発明者らは、成長がサイトカイニンによって負に調節される組織における、サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の局在化された発現が、この組織の促進した成長を導くことを提唱する。例えば、子葉の発達の間、ＣＫＸ遺伝子の局在された発現は、子葉および貯蔵器官としての子葉を有する種子の成長を促進し、実生の収穫量を増やし、そして実生の成長効率を高めるように導く可能性がある。種子の数は、ＡｔＣＫＸ１発現物およびＡｔＣＫＸ３発現物において少なくなる。しかし、以前には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの種子数の減少が、サイズの増大に関連することを報告するものはなかった。
【０３７６】
（実施例１７）
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮの葉外植片を、ＣａＭＶ３５  Ｓプロモーターの制御下に、ＡｔＣＫＸ１遺伝子またはＡｔＣＫＸ２遺伝子を備えるベクターＢｉｎ−Ｈｙｇ−ＴＸで形質転換した。これらの形質転換した植物に由来するいくつかの系統をさらに培養し、そしてこれらの種子サイズを分析した（表１２）。
【０３７７】
導入遺伝子ＣＫＸ１およびＣＫＸ２を有するタバコ植物は全て、種子サイズについてのパラメータである種子領域において増加を示した。
【０３７８】
【表５２】
2010213715.tif 000063
【０３７９】
【表５３】
2010213715.tif 000064
【０３８０】
【表５４】
2010213715.tif 000065
2010213715.tif 000066
2010213715.tif 000067
2010213715.tif 000068
2010213715.tif 000069
2010213715.tif 000070
（配列表）
【数１】
2010213715.tif 000071
【数２】
2010213715.tif 000072
【数３】
2010213715.tif 000073
【数４】
2010213715.tif 000074
【数５】
2010213715.tif 000075
【数６】
2010213715.tif 000076
【数７】
2010213715.tif 000077
【数８】
2010213715.tif 000078
【数９】
2010213715.tif 000079
【数１０】
2010213715.tif 000080
【数１１】
2010213715.tif 000081
【数１２】
2010213715.tif 000082
【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【数１９】
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【数２０】
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【数２１】
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【数２２】
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【数２３】
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【数２４】
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【数２５】
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【数２６】
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【数２７】
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【数２８】
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【数２９】
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【数３０】
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【数３１】
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【数３２】
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【数３３】
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【数３４】
2010213715.tif 000104
【数３５】
2010213715.tif 000105
【数３６】
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【数３７】
2010213715.tif 000107
【図１】
2010213715.tif 000108
【図２】
2010213715.tif 000109
【図３】
2010213715.tif 000110
【図４】
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【図５】
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【図６】
2010213715.tif 000113
【図７】
2010213715.tif 000114
【図８】
2010213715.tif 000115
【図９】
2010213715.tif 000116
【図１０】
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【図１１】
2010213715.tif 000118
【図１２】
2010213715.tif 000119
【図１３Ａ】
2010213715.tif 000120
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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