(57)【要約】【課題】高い測定精度とカラム耐久性とを有し、特に臨床検査に好適な液体クロマトグラフィー用のカラム充填剤を提供する。【解決手段】液体クロマトグラフィー用のカラム充填剤であって、架橋重合体からなるコア粒子と、前記コア粒子の表面に重合された非イオン性親水性重合体層と、前記非イオン性親水性重合体層に結合したイオン交換基を有する化合物とからなるカラム充填剤。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィー用のカラム充填剤であって、架橋重合体からなるコア粒子と、前記コア粒子の表面に重合された非イオン性親水性重合体層と、前記非イオン性親水性重合体層に結合したイオン交換基を有する化合物とからなることを特徴とするカラム充填剤。
【請求項２】
架橋性単量体及び／又は非イオン性親水性重合体が、（メタ）アクリル酸エステルを含む単量体を重合してなるものであることを特徴とする請求項１記載のカラム充填剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のカラム充填剤を製造する方法であって、
架橋重合体からなるコア粒子の表面で非イオン性親水性単量体を重合させて非イオン性親水性重合体層を形成する工程と、
前記非イオン性親水性重合体層にイオン交換基を有する化合物を反応させる工程とを有する
ことを特徴とするカラム充填剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載のカラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載のカラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い測定精度とカラム耐久性とを有し、特に臨床検査に好適な液体クロマトグラフィー用のカラム充填剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ法）を用いた検査方法が広く利用されつつある。例えば、ヘモグロビン（Ｈｂともいう）類、なかでも糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃともいう）は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。このヘモグロビンＡ１ｃの測定方法として、精度が良く、短時間に測定できることから、ＨＰＬＣ法が用いられるようになってきている。
【０００３】
臨床検査の分野においては、短時間にかつ高精度に測定できることが要求される。例えば、糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられるためには、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、かつ、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％以下程度であることが必要とされる。更に、低コストでの測定を可能とするためには、カラム耐久性（カラム寿命）が高いことも要求される。
このような高精度と高カラム耐久性とを達成するためには、測定対象試料中の成分の非特異吸着を抑制したカラム充填剤が必要である。カラム充填剤への非特異吸着は、クロマトグラムを変形させることにより測定精度を低下させ、カラム耐久性を短縮化させる。
【０００４】
特許文献１には、グリコヘモグロビンの分離定量法に用いるカラム充填剤として、架橋重合体にイオン交換基が導入されたカラム充填剤が開示されている。特許文献１においては、架橋重合体が有する水酸基をエポキシ化した後、硫酸ナトリウムでスルホン酸基を導入する方法によりカラム充填剤を製造している。
しかしながら、特許文献１に記載されたカラム充填剤は、イオン交換基が存在しない表面部分が疎水性であり、該疎水性部分へ非特異吸着が起こることから、測定精度、カラム耐久性に劣るという問題があった。
【０００５】
一般に、カラム充填剤の非特異吸着を抑制するためには、カラム充填剤の表面を親水性とすることが考えられる。しかしながら、カラム充填剤の親水性を高くしようとすると、耐圧性、耐膨潤性が低下して、迅速な分析ができないという問題がある。
特許文献２には、架橋重合体からなるコア粒子の表面を、親水性高分子であるポリビニルアルコールで被覆し、更にイオン交換基を導入したカラム充填剤が開示されている。特許文献２に記載されたカラム充填剤は、耐圧性等を低下させることなく親水性を付与することにより、非特異吸着を抑制したものである。
しかしながら、特許文献２に記載されたカラム充填剤は、ポリビニルアルコールからなる被覆層が剥離しやすく、耐久性が低いという問題があった。
【０００６】
特許文献３には、架橋重合体からなるコア粒子の表面を、カチオン交換性基を有する単量体を重合して被覆する方法が開示されている。親水性重合体として、カチオン交換性基を有するものを用いることにより、ヘモグロビンＡ１ｃを高精度に分離できるとしている。
しかしながら、特許文献３に記載されたカラム充填剤は、その親水性がカチオン交換性基に由来するものであり、カチオン交換性基以外の表面部分が疎水性である場合には、非特異吸着を抑制することができない。
【０００７】
特許文献４には、架橋重合体からなるコア粒子の表面に、加水分解によりカルボキシル基を生成し得る官能基を有する単量体を重合して被覆し、その後該加水分解によりカルボキシル基を生成し得る官能基を加水分解してカルボキシル基を生成させたカラム充填剤が開示されている。
しかしながら、特許文献４に記載されたカラム充填剤は、製造時に加水分解反応を行う際、表面の被覆層だけではなく、架橋重合体の主鎖まで切断してしまう。そのため、カラム充填剤の形状が変形し、測定ピークがブロード化して、分離性能の低下を引き起してしまう。また、切断部分から疎水面が露出して、該疎水面に非特異吸着が起こるという問題もあった。
【特許文献１】特開平０３−２５５３６０公報
【特許文献２】特開平１１−１８３４６０公報
【特許文献３】特開平０３−７３８４８号公報
【特許文献４】特開平０３−１７９２５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、高い測定精度とカラム耐久性とを有し、特に臨床検査に好適な液体クロマトグラフィー用のカラム充填剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、液体クロマトグラフィー用のカラム充填剤であって、架橋重合体からなるコア粒子と、前記コア粒子の表面に重合された非イオン性親水性重合体層と、前記非イオン性親水性重合体層に結合したイオン交換基を有する化合物とからなるカラム充填剤である。
以下に本発明を詳述する。
【００１０】
本発明者は、架橋重合体からなるコア粒子の表面に、非イオン性親水性重合体層を重合し、更に上記非イオン性親水性重合体にイオン交換基を導入して得られたカラム充填剤を用いれば、非特異吸着を抑制し、高い測定精度とカラム耐久性とを発揮できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明のカラム充填剤は、架橋重合体からなるコア粒子と、上記コア粒子の表面に重合された非イオン性親水性重合体層と、上記非イオン性親水性重合体層に結合したイオン交換基を有する化合物とからなる。
上記コア粒子が架橋重合体からなることにより、本発明のカラム充填剤の耐圧性や耐膨潤性を確保することができる。
【００１２】
上記コア粒子の形状は特に限定されないが、真球状であることが好ましい。
上記コア粒子の粒径の好ましい下限は０．５μｍ、好ましい上限は５０μｍである。上記コア粒子の粒径が０．５μｍ未満であると、カラムの圧力損失が増大することがあり、５０μｍを超えると、カラム内の空隙率が増加して試料が拡散しやすくなり、ピークがブロード化することがある。
【００１３】
上記コア粒子を構成する架橋重合体は、少なくとも架橋性重合性単量体を含む単量体を重合してなるものである。なお、上記重合体は、イオン交換基を有しない単量体が好ましい。
上記架橋性重合性単量体は特に限定されないが、（メタ）アクリル酸エステルが好適である。
なお、本明細書において（メタ）アクリル酸エステルとは、アクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルを意味する。
【００１４】
上記架橋性重合性単量体である（メタ）アクリル酸エステルは特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等のポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレートや、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレートや、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等のアルキレングリコールジ（メタ）アクリレートや、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレー、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等のヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレートや、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等のｘアルカロールアルカンｙ（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらの架橋性重合性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１５】
上記架橋重合体は、必要に応じて、上記架橋性重合性単量体に加えて、非架橋性重合性単量体との共重合体としてもよい。
上記非架橋性重合性単量体は特に限定されないが、（メタ）アクリル酸エステルが好適である。
【００１６】
上記非架橋性重合性単量体である（メタ）アクリル酸エステルは、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル等の（メタ）アクリル酸アルキルや、（メタ）アクリル酸−２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸−２−エチルヘキシル等のアクリル酸誘導体や、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等のポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートや、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等のポリプロピレングリコール（メタ）アクリレートや、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等のアルキレングリコールモノ（メタ）アクリレートや、グリシジル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等の水酸基またはグリシジル基を有する（メタ）アクリレートが挙げられる。これらの非架橋性重合性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１７】
上記の非架橋性重合性単量体を用いる場合、上記非架橋性重合性単量体の配合量は、上記架橋性重合性単量体１００重量部に対する好ましい上限が５０重量部である。上記非架橋性重合性単量体の配合量が５０重量部を超えると、得られるカラム充填剤の耐圧性や耐膨潤性が劣ることがある。上記非架橋性重合性単量体の配合量のより好ましい上限は２０重量部である。
【００１８】
上記コア粒子を製造する方法は特に限定されず、例えば、上記架橋性重合性単量体、又は上記架橋性重合性単量体と非架橋性重合性単量体の混合物（以下、単に「単量体混合物」ともいう。）を重合開始剤の存在下において、乳化重合法、ソープフリー重合法、分散重合法、懸濁重合法、シード重合法等の従来公知の重合方法で重合させる方法等が挙げられる。なかでも、分散重合法、懸濁重合法、シード重合法が好適である。
【００１９】
例えば、懸濁重合法により上記コア粒子を製造する場合、上記単量体混合物に重合開始剤を溶解し、適当な分散媒中に分散させた後、必要に応じて窒素ガス等の不活性ガス雰囲気下にて攪拌しながら加温することにより、真球状のコア粒子を得ることができる。
【００２０】
上記重合開始剤は特に限定されず、水溶性又は油溶性の従来公知のラジカル重合開始剤を用いることができる。
上記重合性開始剤としては、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物や、２，２−アゾビスイソブヒロニトリル、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等のアゾ化合物等が挙げられる。
【００２１】
上記重合開始剤の配合量は、上記単量体混合物１００重量部に対して好ましい下限が０．０５重量部、好ましい上限が５重量部である。上記重合開始剤の配合量が０．０５重量部未満であると、重合反応が不充分となったり、重合反応に長時間要したりすることがあり、５重量部を超えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生することがある。
なお、上記重合開始剤は、上記単量体混合物に溶解させて用いることが好ましい。
【００２２】
上記重合に際しては、公知の重合方法において用いられる各種の添加剤等を添加してもよい。添加剤としては、例えば、重合体にマクロポアを形成するための多孔質化剤、重合反応を制御するための各種連鎖移動剤、懸濁粒子を安定化されるための分散剤等が挙げられる。
【００２３】
上記多孔質化剤は、例えば、上記単量体混合物を溶解するが、得られる重合体は溶解しない有機溶媒が挙げられる。このような多孔質化剤を添加して重合反応を行い、重合反応後に多孔質化剤を除去することにより、得られる重合体にマクロポアを形成することができる。
このような有機溶媒は、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類や、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等の飽和炭化水素や、イソアミルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール等が挙げられる。
上記多孔質化剤を用いる場合、その配合量は上記単量体混合物１００重量部に対して好ましい上限が１００重量部である。
【００２４】
上記非イオン性親水性重合体層は、上記コア粒子の表面に形成されたものである。
上記非イオン性親水性重合体層を有することにより、本発明のカラム充填剤は、非特異吸着が抑制され、高い測定精度とカラム耐久性とを発揮することができる。
【００２５】
上記非イオン性親水性重合体層は、上記コア粒子の存在下で非イオン性親水性単量体を重合することにより形成されるものである。
上記非イオン性親水性単量体は、非イオン性の親水性基を有する単量体であって、イオン性の官能基の有しないものである。
上記非イオン性の親水性基は、例えば、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられる。なかでも、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基が好ましく、水酸基、エポキシ基、グリシジル基がより好ましい。
【００２６】
上記非イオン性親水性単量体は特に限定されないが、（メタ）アクリル酸エステルが好適である。
上記非イオン性親水性単量体である（メタ）アクリル酸エステルは、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等のポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートや、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等のポリプロピレングリコール（メタ）アクリレートや、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等のアルキレングリコールモノ（メタ）アクリレートや、グリシジル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等のエポキシ化又はヒドロキシル化（メタ）アクリレートや、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等のアミノ化（メタ）アクリレートや、（メタ）アクロレイン、シアノ（メタ）アクリレート、エチル−２−アクリレート等のアルデヒド化又はシアノ化（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらの非イオン性親水性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２７】
上記非イオン性親水性重合体層は、上記架橋重合体からなるコア粒子の表面で上記非イオン性親水性単量体を重合させることにより形成することができる。具体的には、例えば、上記コア粒子と重合開始剤との存在下で、上記非イオン性親水性単量体を重合させる方法が挙げられる。
なお、上記コア粒子の表面以外でも重合反応は起こり得るが、このような反応による重合体は、重合反応後に洗浄することにより除去できる。
なお、上記非イオン性親水性単量体を重合させる重合開始剤は、上記コア粒子を製造する際に用いる重合開始剤と同様のものを用いることができる。
【００２８】
上記コア粒子の表面で効率よく上記非イオン性親水性単量体を重合させるには、予め上記コア粒子内に重合開始剤を含有させた状態で、上記非イオン性親水性単量体を重合する方法が好適である。
上記コア粒子内に重合開始剤を含有させる方法は、例えば、上記コア粒子を構成する架橋重合体を膨潤させ、かつ、重合開始剤を溶解できる有機溶媒に重合開始剤を溶解し、該重合開始剤の溶液中に上記コア粒子を浸漬する方法等が挙げられる。
【００２９】
また、上記コア粒子を構成する架橋重合体を調製する際の重合反応において、この重合反応が完了する前、即ち、重合開始剤が完全に消費される前に、非イオン性親水性単量体を反応系に添加することで、最初に添加した重合開始剤を利用して、架橋重合体の表面に効率よく非イオン性親水性単量体を重合させることができる。
【００３０】
上記イオン交換基を有する化合物は、上記非イオン性親水性重合体層に結合している。
本明細書においてイオン交換基とは、イオン交換性を有する官能基を意味する。上記イオン交換基は、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等のカチオン交換基や、３級アミノ基、４級アンモニウム基等のアニオン交換基等が挙げられる。本発明のカラム充填剤をヘモグロビンＡ１ｃの測定に用いる場合には、カチオン交換基が好ましく、スルホン酸基がより好ましい。
なお、上記イオン交換基は、上記イオン交換基を末端に有する全ての官能基を含み、付随する構造は問わない。例えば、「カルボキシル基」には、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基等のカルボキシル基が結合する官能基を全てを含む。
【００３１】
上記非イオン性親水性重合体層に上記イオン交換基を有する化合物を結合させる方法は、
例えば、上記非イオン性親水性重合体の非イオン性親水性基に、上記イオン交換基を有する化合物を反応させる方法が挙げられる。
上記非イオン性親水性重合体の非イオン性親水性基に、上記イオン交換基を有する化合物を反応させる方法は、公知の化学反応による技術を用いることができる。下記に例示する方法は全て公知の化学反応であり、上記コア粒子を構成する架橋重合体の分解等の反応を伴わない条件であれば、公知の反応を限定なく用いることができる。
【００３２】
上記非イオン性親水性重合体の非イオン性親水性基が水酸基である場合、例えば、ブロムエタンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン酸や、クロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸等を上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、これらの化合物を水酸化アルカリ水溶液中で反応させることにより、上記非イオン性親水性重合体層に上記イオン交換基を有する化合物を結合させることができる。
【００３３】
上記非イオン性親水性重合体の非イオン性親水性基が水酸基である場合、例えば、イオン交換基を有するアルデヒド化合物を上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、酸触媒下にてアセタール反応をさせることにより、上記非イオン性親水性重合体層に上記イオン交換基を有する化合物を結合させることができる。
【００３４】
上記非イオン性親水性重合体の非イオン性親水性基が水酸基である場合、例えば、トリカルバニル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン化合物を上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、水酸基の脱水反応によるエステル化反応をさせることにより、上記非イオン性親水性重合体層に上記イオン交換基を有する化合物を結合させることができる。
【００３５】
上記非イオン性親水性重合体の非イオン性親水性基が水酸基である場合、例えば、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等を上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、これらの化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させることにより、上記非イオン性親水性重合体層に上記イオン交換基を有する化合物を結合させることができる。
【００３６】
上記非イオン性親水性重合体の非イオン性親水性基がエポキシ基、グリシジル基又はアミノ基である場合、例えば、非イオン性親水性重合体に、エピクロルヒドリンやトリグリシジルエーテル等のエポキシ化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させてエポキシ化した後、硫酸ナトリウムやタウリン、グリコール酸等のカチオン交換基を有する化合物を反応させる方法や、三フッ化ホウ素エーテラートを結合した後、亜硫酸ナトリウム水溶液中で加熱処理する方法等により上記非イオン性親水性重合体層に上記イオン交換基を有する化合物を結合させることができる。同様に、水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中に塩酸２−クロロトリエチルアミン水溶液を添加することにより、３級アミノ基を導入することができる。
上記非イオン性親水性重合体の非イオン性親水性基がエポキシ基やグリシジル基である場合には、そのまま上記処理に供してもよい。
【００３７】
本発明のカラム充填剤を製造する方法であって、架橋重合体からなるコア粒子の表面で非イオン性親水性単量体を重合させて非イオン性親水性重合体層を形成する工程と、上記非イオン性親水性重合体層にイオン交換基を有する化合物を反応させる工程とを有するカラム充填剤の製造方法もまた、本発明の１つである。
【００３８】
本発明のカラム充填剤は、タンパク質等をＨＰＬＣ法で測定する際の課題である試料中の成分のカラム充填剤への非特異吸着を低減し、従来のカラム充填剤を用いた場合よりも測定精度を向上させることができる。本発明のカラム充填剤を用いたＨＰＬＣ法は、ヘモグロビンＡ１ｃや異常ヘモグロビン等をはじめとする種々のタンパク質等を測定に好適である。このような測定方法もまた、本発明の１つである。
本発明の測定方法により測定できる異常ヘモグロビン類としては、例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）、ヘモグロビンＡ２等が挙げられる。
【００３９】
本発明のカラム充填剤を用いてＨＰＬＣ法によりタンパク質の測定を行なう場合、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えた従来公知のＨＰＬＣシステムを用いることができる。このようなシステムに、本発明のカラム充填剤を充填したカラムを接続し、血液試料を測定する。
【００４０】
上記ＨＰＬＣ法による測定に用いられる溶離液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類が挙げられる。例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸及びその塩類や、グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類や、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸及びその塩類、グッドの緩衝液類等が挙げられる。
上記緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
【００４１】
ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行う際には、上記緩衝液として１０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩濃度を有する緩衝液を用いる必要がある。緩衝液の塩濃度が１０ｍＭ未満であると、イオン交換反応が行なわれず、ヘモグロビンを分離することができない。緩衝液の塩濃度が１０００ｍＭを超えると、塩が析出してシステムに悪影響を及ぼす。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、高い測定精度とカラム耐久性とを有し、特に臨床検査に好適な液体クロマトグラフィー用のカラム充填剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００４４】
（実施例１）
トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性重合性単量体、新中村化学社製）３００ｇとトリメチロールエタントリアクリレート（架橋性重合性単量体、新中村化学社製）５０ｇとの混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解して単量体混合物を得た。得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（ゴーセノールＧＨ−２０、日本合成化学社製）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、グリセリンメタクリレート（非イオン性親水性単量体、日本油脂社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、架橋重合体からなるコア粒子が非イオン性親水性重合体で被覆された被覆コア粒子を得た。
【００４５】
得られた被覆コア粒子５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、４０ｇのエピクロルヒドリンを添加した後、室温で５時間反応させた。得られたエポキシ化重合体４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。
【００４６】
得られたカラム充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製し、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製、ＬＣ−１０Ａ）に接続した。
測定試料として、フッ化ナトリウム採血したヒト健常人血液を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により２００倍に溶血希釈したものを用いた。溶離液として、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）（溶離液Ａ）及び４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（溶離液Ｂ）の２種を用い、流速１．０ｍＬで送液して溶離液Ａから溶離液Ｂへのステップワイズグラジエント法により分離し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
上記試料を測定した結果、図１のクロマトグラムを得た。図１中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡｏである。ヘモグロビンＡ１ｃが他のヘモグロビン分画と短時間内に良好に分離された。
【００４７】
（実施例２）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（架橋性重合性単量体、新中村化学社製）３５０ｇと２−ヒドロキシエチルメタクリレート（非架橋性重合性単量体、日本油脂社製）５０ｇとの混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解して単量体混合物を得た。得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（ゴーセノールＧＨ−２０、日本合成化学社製）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、グリシジルメタクリレート（非イオン性親水性単量体、日本油脂社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、架橋重合体からなるコア粒子が非イオン性親水性重合体で被覆された被覆コア粒子を得た。
得られた被覆コア粒子５０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。
【００４８】
得られたカラム充填剤を用いた以外は実施例１と同様の方法によりカラムを調製し、ＨＰＬＣシステムに接続した。実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００４９】
（比較例１）
本比較例では、非イオン性親水性重合体によるコア粒子の被覆を行わずにイオン交換基を導入した例を示す。
テトラエチレングリコールジメタクリレート（架橋性重合性単量体、新中村化学社製）３００ｇ、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（非架橋性重合性単量体、和光純薬社製）５０ｇ、グリシジルメタクリレート（非イオン性親水性単量体、和光純薬社製）５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解して単量体混合物を得た。得られた単量体混合物を、４％のポリビニルアルコール（ゴーセノールＧＨ−２０、日本合成化学社製）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１２時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、架橋重合体粒子を得た。
得られた架橋重合体粒子５０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。
【００５０】
得られたカラム充填剤を用いた以外は実施例１と同様の方法によりカラムを調製し、ＨＰＬＣシステムに接続した。実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図２のクロマトグラムを得た。図２中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡｏである。実施例２のカラム充填剤により得られたクロマトグラム（図１）よりも測定時間を延長したにも関わらず、ヘモグロビンＡ１ｃの分離が不良であった。
【００５１】
（比較例２）
本比較例では、非イオン性親水性重合体層を形成せずに、イオン性重合体層を形成した例を示す。
トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学社製）３００ｇとトリメチロールエタントリアクリレート（架橋性単量体、新中村化学社製）５０ｇとの混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解して単量体混合物を得た。得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（ゴーセノールＧＨ−２０、日本合成化学社製）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（イオン性単量体、東亞合成化学社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、イオン交換基が導入されたカラム充填剤を得た。
【００５２】
得られたカラム充填剤を用いた以外は実施例１と同様の方法によりカラムを調製し、ＨＰＬＣシステムに接続した。実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５３】
（評価）
実施例及び比較例で得られたカラム充填剤について、以下の方法により評価を行った。結果を評価に示した。
【００５４】
（１）回収率試験
得られたカラム充填剤を用いて、回収率試験を実施した。回収率試験は、カラムの代わりに内径０．２５ｍｍ、長さ１０００ｍｍのＰＥＥＫ製配管をＨＰＬＣに取り付け、上記試料を測定した場合のピーク総面積を１００％とし、上記カラム充填剤を充填したカラムを取り付けて測定した場合のピーク総面積の上記ＰＥＥＫ配管時に対する比率により求めた。
【００５５】
表１より、実施例のカラム充填率を用いた場合には、ほぼ１００％の回収率が得られた。一方、比較例のカラム充填剤では回収率が７０％以下と低かった。これは、測定対象であるヘモグロビンがカラム充填剤に非特異的に吸着して溶出してこなかったためと考えられる。
【００５６】
（２）修飾ヘモグロビン類の分離性能評価
得られたカラム充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製し、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製、ＬＣ−１０Ａ）に接続した。
【００５７】
修飾ヘモグロビン類としては、レイバイルヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
即ち、試料Ｌは、健常人全血に、グルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人全血に、アセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
【００５８】
修飾ヘモグロビン試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）及び修飾ヘモグロビンの調製に用いた健常人血（非修飾品）を、溶離液として、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）（溶離液Ａ）及び４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（溶離液Ｂ）の２種を用い、流速１．０ｍＬで送液して溶離液Ａから溶離液Ｂへのステップワイズグラジエント法により分離し、４１５ｎｍの吸光度を測定し、得られたヘモグロビンＡ１ｃの測定値を比較した。
分離性能は、修飾ヘモグロビン試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から非修飾品のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより行なった。
【００５９】
表１より、実施例のΔ値は０．２％以下であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが測定できたことが判った。一方、比較例のカラム充填剤を用いた場合では、修飾ヘモグロビンが存在すると、ヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく変動し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を正確に測定できなかった。
【００６０】
（３）異常ヘモグロビン類の分離性能評価
得られたカラム充填剤を用いて、異常ヘモグロビンとしてヘモグロビンＳおよびヘモグロビンＣを含む試料（ＡＦＳＣヘモコントロール：ヘレナ研究所社製）の測定を行った。
実施例１のカラム充填剤を用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図３に示す。図３中、ピーク１はヘモグロビンＨｂＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡｏ、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク４はヘモグロビンＳ、ピーク５はヘモグロビンＣを示す。他の実施例のカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離することはできなかった。
【００６１】
（４）ヘモグロビンＡ２の分離性能評価
得られたカラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料として、Ａ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を測定した。
実施例１のカラム充填剤を用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図４に示す。図４中、ピーク１はヘモグロビンＨｂＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡｏ、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク６はヘモグロビンＡ２を示す。ヘモグロビンＡ２を良好に分離することができた。一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、ヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。
【００６２】
（５）カラム耐久性の評価
得られたカラム充填剤を用いて、同一のヒト血液試料を連続測定し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の推移を確認した。結果を図５に示した。
本発明のカラム充填剤では、３０００回測定においても測定値が変化しなかったが、比較例のカラム充填剤を用いた場合は、測定値が低下し、カラム寿命が短いことが確認された。
【００６３】
（６）ヘモグロビン以外の試料の測定例
実施例１のカラム充填剤を用いて、ヘモグロビン以外のタンパク質標準液試料を測定した。
溶離液として、溶離液Ｃ：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）および溶離液Ｄ：溶離液Ｃと５００ｍＭＮａＣｌ水溶液の等量混合物の２種を用い、流速１．０ｍＬで送液して、溶離液Ｃ１００％から溶離液Ｄ１００％へのリニアグラジエント法により分離し、２８０ｎｍの吸光度を測定した。
得られたクロマトグラムを図６に示した。図６中、ピーク１１はミオグロビン、ピーク１２はα−キモトリプシノーゲン、ピーク１３はリボヌクレアーゼＡ、ピーク１４はリゾチームを示す。いずれのたんぱく質試料も短時間内に良好に分離できた。
【００６４】
【表１】
2010112794.tif 000002
【００６５】
（実施例３）
実施例２で得られた被覆コア粒子５０ｇを、７重量％水酸化ナトリウム水溶液３００ｍＬに分散させ、５０重量％塩酸２−クロロトリエチルアミン水溶液４００ｍＬを添加して、５０℃で１６時間攪拌しながら反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、ジエチルアミノ基（アニオン交換基）が導入されたカラム充填剤を得た。
【００６６】
得られたカラム充填剤を用いた以外は実施例１と同様の方法によりカラムを調製し、ＨＰＬＣシステムに接続した。これを用いてタンパク質標準液試料を測定した。溶離液として、２００ｍＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）（溶離液Ｅ）及び溶離液Ｅと５００ｍＭＮａＣｌ水溶液との等量混合物（溶離液Ｆ）の２種を用い、流速１．０ｍＬで送液して、溶離液Ｅ１００％から溶離液Ｆ１００％へのリニアグラジエント法により分離し、２８０ｎｍの吸光度を測定した。
得られたクロマトグラムを図７に示した。図７中、ピーク２１はオボアルブミン、ピーク２２はトリプシンインヒビターを示す。いずれのたんぱく質試料も短時間内に良好に分離できた。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によれば、高い測定精度とカラム耐久性とを有し、特に臨床検査に好適な液体クロマトグラフィー用のカラム充填剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図２】比較例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図３】実施例１のカラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図５】実施例及び比較例のカラム充填剤の耐久性評価の結果である。
【図６】実施例１のカラム充填剤を用いてたんぱく質標準液の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。
【図７】実施例３のカラム充填剤を用いてたんぱく質標準液の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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