(57)【要約】      （修正有）【課題】ヤドリギレクチンまたはヤドリギレクチン一本鎖に対する個体の応答性を判定し、ヤドリギレクチンの膜結合レセプターの発現が，対応する応答性を特徴づける方法を提供する。【解決手段】ヤドリギレクチン又はヤドリギ一本鎖に対する個体の応答性を判定するインビトロ方法のために、ヤドリギレクチンの炭水化物結合サブユニットの膜結合レセプターへの特異結合により媒介され、レセプターはα２−６グルコシド結合によりガラクトースに結合している末端Ｎ−アセチル−ノイラミナーゼにより特徴付ける。判定は、この特定のグルコシル化を量的又は質的に特異的に検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤドリギレクチンまたはヤドリギレクチン一本鎖に対する個体の応答性を判定するためのインビトロ方法であって，膜結合レセプターを量的および／または質的に特異的に検出する工程を含み，レセプターはα２−６グリコシド結合によりガラクトース（Ｇａｌ）に結合した末端Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）により特徴づけられる方法。
【請求項２】
レセプターが，ガラクトースにα２−６結合で結合したＮ−アセチルノイラミン酸の後に少なくともＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含むガングリオシドを含む，請求項１記載の方法。
【請求項３】
レセプターが，Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−Ｇａｌ−［Ｇａｌ／ＧｌｃＮＡｃ］X−Ｃｅｒの
構造のガングリオシドを含む，請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
レセプターが，Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３］XＧａ
ｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒの構造を有するガングリオシドを含む，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
レセプターが，Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒの構造を有するガングリオシド，またはＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒの構造を有するガングリオシドを含む，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
レセプターが細胞膜結合性である，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ヤドリギレクチンが組換えヤドリギレクチン／組換えヴィスクミンである，請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
組換えヤドリギレクチンが，配列番号１，配列番号３または配列番号５に示されるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む，請求項７記載の方法。
【請求項９】
組換えヤドリギレクチンが，配列番号２，配列番号４または配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか，またはその機能的フラグメントを含む，請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
ヤドリギレクチンに対する応答性を判定するためのインビトロ方法であって，少なくとも１つのシアリルトランスフェラーゼを量的および／または質的に判定することを含む方法。
【請求項１１】
請求項１−９において定義されるレセプターを特異的に認識するかまたはこれに結合し，抗体，抗体誘導体，抗体フラグメント，アプタマー，低分子量物質および炭水化物結合性ペプチドの群より選択される物質を含む診断用組成物。
【請求項１２】
物質が検出可能なように標識されている，請求項１１記載の診断用組成物。
【請求項１３】
抗体がモノクローナル抗体である，請求項１１または１２記載の診断用組成物。
【請求項１４】
モノクローナル抗体が，２００２年１２月２０日にＤＳＭＺ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに受託番号ＤＳＭで寄託されたハイブリドーマ細胞株から回収しうる，請求項１３記載の
診断用組成物。
【請求項１５】
請求項１１−１４のいずれかにおいて定義される物質の，機能的ヤドリギレクチンレセプターを検出するための診断剤の製造における使用。
【請求項１６】
診断剤が，請求項１−８のいずれかにおいて定義されるレセプターを細胞で検出するために用いられる，請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
細胞が腫瘍細胞である，請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
細胞が生検材料に由来する，請求項１６または１７記載の使用。
【請求項１９】
細胞が血液サンプルから単離されたものである，請求項１６または１７記載の使用。
【請求項２０】
請求項１−６のいずれかに記載のレセプターに特異的に結合するかまたはこれを認識する物質の，増殖性疾患，ウイルス疾患，自己免疫疾患または神経疾患の治療用の医薬組成物の製造における使用であって，レセプター結合物質またはレセプター認識物質が，抗体，抗体誘導体，抗体フラグメント，アプタマー，低分子量物質および炭水化物結合ペプチドからなる群より選択されることを特徴とする使用。
【請求項２１】
レセプター結合物質および／またはレセプター認識物質が，放射性，細胞毒性または細胞増殖抑制効果を有する化合物に結合している，請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
レセプター結合物質および／またはレセプター認識物質に結合している化合物がペプチドである，請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
抗体がモノクローナル抗体である，請求項２０または２１記載の使用。
【請求項２４】
モノクローナル抗体が，２００２年１２月２０日にＤＳＭＺ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに受託番号ＤＳＭで寄託されたハイブリドーマ細胞株から回収しうる，請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
レセプター結合物質および／またはレセプター認識物質が免疫エフェクター機能を誘導しうるさらに別のドメインを含む，請求項２０−２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
誘導された免疫エフェクター機能が細胞性エフェクター機能である，請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
誘導された免疫エフェクター機能が体液性エフェクター機能である，請求項２６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ヤドリギレクチンまたはヤドリギレクチン一本鎖に対する個体の応答性を判定する方法に関する。本発明の方法においては，ヤドリギレクチンに対する特異的膜結合レセプターの発現が，対応する応答性を特徴づける。
【背景技術】
【０００２】
本明細書においては種々の文献が引用されている。引用されている文献の開示内容（すべての製造元の記述および指針等を含む）を本明細書の一部としてここに引用する。
【０００３】
ヤドリギレクチンは，リシンに関連するタイプＩＩリボソーム不活性化蛋白質（ＲＩＰ）であり，２つの蛋白質鎖から形成される（Ｂａｒｂｉｅｒｉら，１９９３）。ここでは，Ａ鎖は酵素的ｒＲＮＡ−Ｎ−グリコシダーゼ活性を有し，Ｂ鎖は炭水化物結合活性を有する。Ｅ．ｃｏｌｉ中で提供される組換えヴィスクミン（ｒＶｉｓｃｕｍｉｎ）が当業者に知られている（ＥＰ０７５１２２１Ｂ１）。特に，Ｅ．ｃｏｌｉで製造される組換えヴィスクミンは単一物質として臨床的に開発されている。その一次構造に関しては，組換えヴィスクミンはヤドリギ植物に見いだすことができるＭＬ−Ｉ，ＭＬ−ＩＩまたはＭＬ−ＩＩＩには正確に対応していない。記載されている組換えヴィスクミン配列とは別に，元の遺伝子中の点突然変異により改変されたさらに別のヤドリギレクチン変種が存在し，これはその一次構造においてわずかに異なると仮定すべきである。組換えヴィスクミンは，本来のヤドリギレクチンの変種であると考えることができ，ＭＬ−Ｉ，ＭＬ−ＩＩおよびＭＬ−ＩＩＩ配列の混合物として理解することができる。
【０００４】
蛋白質の細胞毒性／細胞増殖抑制性活性には，ヤドリギレクチンの両方の鎖の活性が必要である。ここでは，最初の工程，すなわち細胞の表面への分子の結合が特に重要である。
【０００５】
リシンの場合と同様に，ヤドリギレクチン（およびＥ．ｃｏｌｉにおいて組換え的に製造された組換えヴィスクミン；Ｅｃｋら，１９９９ａ，Ｅｃｋら，１９９９ｂ）もガラクトース／ラクトース特異性を有すると言われている（Ｏｌｓｎｅｓら，１９８２；Ｌｅｅら，１９９２；Ｇｉｌｌｅｒｏｎら，１９９８）。この場合，末端ガラクトースの，および続く糖のグリコシド結合の種類は，これまで，レクチンの特異性には重要ではないと記載されてきた（Ｌｅｅら，１９９４；Ｇｕｐｔａら，１９９６）。
【０００６】
その炭水化物特異性において異なる種々のヤドリギレクチン（ＭＬ−Ｉ，−ＩＩおよび−ＩＩＩ）が文献に記載されている（Ｆｒａｎｚ，１９８６）。ここでは，ガラクトース／ラクトースに対する特異性（ＭＬ−Ｉ）は，ガラクトース／ラクトースおよびＮ−アセチルガラクトサミンの混合された形（ＭＬ−ＩＩ）から，Ｎ−アセチルガラクトサミンにより強く結合する（ＭＬ−ＩＩＩ）ヤドリギレクチンまで様々であることが議論されている。組換えヴィスクミンはガラクトース／ラクトース結合活性を有しており，これは種々のＥＬＩＳＡ様の方法により検出することができる（Ｅｃｋら，１９９９ｂ）。ヤドリギレクチンの他の炭水化物結合活性は，これまでのところ，非常に初歩的なことしか記載されておらず，部分的には非常に相反するものであった。例えば，Ｗｕら（１９９５ａおよび１９９５ｂ）は，ＭＬ−Ｉがヒトα１−酸性糖蛋白質またはフェツインのいずれかに結合する能力は，脱シアリル化された対応物を用いたときに著しく減少することを観察した。これに対し，著者らは，ラットからのシアロ糖蛋白質を脱シアリル化された形で試験に用いたときには，結合が増加し，完全に沈殿することを見いだした。しかし，Ｗｕらにより導き出された結論は，シアル酸を有するかまたは脱シアリル化蛋白質を用いたときの結
果が矛盾するため，解釈することができない。さらに，蛋白質のグリコシル化は均一ではないことに注意すべきである。脱シアリル化のプロセスは化学的プロセスであり，製造元の指針によって様々である。脱シアリル化サンプルにおいては，例えば，末端位置にシアル酸を有する蛋白質の残留物が存在し，これは結果を誤って伝える。いずれにしても，オリゴ糖Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ−β１−４Ｇｌｃを競合剤として用いたときに，蛋白質ヤドリギレクチン相互作用を低下させることができたため，ＭＬ−Ｉのシアル酸に対する特異性が議論された。しかし，沈殿実験の競合の結果をまとめた表においては（マイクロ沈殿手法），同じ設定の試験を用いれば，種々の糖蛋白質（ヒトα−１酸性糖蛋白質；フェツイン，アシアロＲＳＬ）によるＭＬ−Ｉの沈殿は，ラクトースおよびＮｅｕ５Ａｃα２−３／Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ−β１−４ＧｌｃとＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃとの混合物のいずれによっても，ほぼ同じ濃度で妨害することができることが印象的である。ＭＬ−Ｉのシアル酸に対する特異性は，これらのデータからは明確に見ることができない。これはまた，シアル酸を末端位置に有するアシアロＲＳＬおよびフェツインで得られた結果は完全に同一である傾向にあるという理由による。
【０００７】
ほぼ同じ時に，Ｄｅｂｒａｙら（１９９４）は，セファロース４Ｂに固定化したＭＬ−ＩのＯ−３またはＯ−６シアリル化ラクトースまたはシアロ−Ｎ−グリコシルペプチドに対する親和性は，Ｎ−アセチル−ラクトースアミンタイプのオリゴ糖および糖ペプチドと比較してわずかに増加していたことを示すことができた。ここでは，Ｄｅｂｒａｙら（１９９４）は，ヒト起源（例えば，尿，ヒト血清トランスフェリン，ヒトα−１産生糖蛋白質）から部分的に単離したオリゴ糖および糖ペプチドを用いた。Ｄｅｂｒａｙらは，ヤドリギレクチンＩを固定化したカラム（ＭＬ−Ｉセファロース）で実験を行った。彼らは，試験した糖を評価するとき，３つの因子を区別した。画分１（ＦＮＲ）はヤドリギレクチンと相互作用を示さず，ＰＢＳ中でカラムの溶出体積中に溶出された。第２の画分（ＦＲ）は，やはりＰＢＳを用いたがやや遅れて溶出された。したがって，これらの２つの画分の糖は，カラムに固定化されたレクチンと相互作用する能力に関してわずかに異なる。実際に結合した画分（ＦＥ）は，ＰＢＳバッファー中１５０ｍＭガラクトースでのみ溶出することができた。結果は決定的なものではない。著者らは，例えば，シアル酸α２−６を末端ガラクトース残基に結合させているのであれば，ＦＲと比較してＦＮＲの溶出は遅れると議論している（糖１６（ＦＲ）および１７（ＦＮＲ）を参照）。しかし，糖１５（ＦＲ）において見られるように，二重シアル酸標識によっては，カラム上のＭＬ−Ｉにより強く結合する物質を得ることはできなかった。しかし，当業者にとっては，ＦＲと比較したＦＮＲの遅延を明確に議論することは困難である。すなわち，わずかの遅延（ＦＲ）はカラムに結合した蛋白質との非特異的相互作用（例えば疎水性相互作用）に起因し，ヤドリギレクチンの特異性によるものではないようである。カラムをＰＢＳバッファー＋１５０ｍＭＮａＣｌ＋１５０ｍＭガラクトース（ＦＥ）ですすいだ後，試験した構造のうち２つのみが溶出された。これらの２つの構造は，ウシのサイログロブリンまたはキジバトのオボムコイドから単離された。著者らが用いた，主として構造Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−を含む他のすべての構造と異なり，これらの構造は，α１−４またはα１−３のいずれかにより第２のガラクトースに結合した２つのガラクトース残基を末端に有する。
【０００８】
Ｌｅｅら（１９９４）は，ＭＬ−Ｉの認識についての第２の糖残基の関連性を記載した。彼らは，ＭＬ−Ｉによる糖構造の認識を４つのグループに分け，第２の位置にあるＧｌｃＮＡｃ構造が糖の認識を非常に低下させることを示すことができた。彼らは，ＭＬ−Ｉは末端糖残基β−Ｄ−Ｇａｌ−（１−２）−β−Ｄ−Ｇａｌ−を有する糖類に対して最も高い親和性を有することを見いだした。β１−３−結合ガラクトースもまた，同様に優れた特異性を示した。Ｌｅｅら（１９９４）はβ１−４−結合ガラクトースを試験していないが，Ｄｅｂｒａｙら（１９９４）の仕事から，これらもまたＭＬ−Ｉに対して高い特異性を有するはずであると結論づけることができる。
【０００９】
しかし，Ｄｅｂｒａｙら（１９９４）の研究を評価する場合，カラムに固定化されたヤドリギレクチンを用いて実験を行ったことに注意しなければならない。観察された糖と固定化レクチンとの相互作用は，非生理学的実験系である。すなわち，溶液に溶解したヤドリギレクチンまたは組換えヴィスクミンとレセプターとの相互作用に関して，直接結論づけることは不可能である。
【００１０】
Ｌｅｅら（１９９４），Ｄｅｂｒａｙら（１９９４）およびＷｕら（１９９５）によりヤドリギレクチンの特異性に関して提示されるデータは相互に矛盾しており，ヤドリギレクチンのＮｅｕ５Ａｃに対する特異性の決定的な証拠と考えることはできない。データが，規定された試験条件下で得られたものではないことが特に問題である。特に，このことは，用いた蛋白質の質が技術的な理由により均一な炭水化物構造を有することがなかったことと関連する。
【００１１】
Ｌｅｅら（１９９２）による知見に基づいて，Ｇａｌａｎｉｎａら（１９９７）は，ヤドリギレクチンを構造的に明確なネオグリココンジュゲートとカップリングさせる実験系を設計した。この系においては，合成オリゴ糖がヤドリギレクチンの結合を逆転させる競合的効力を試験した。しかし，この系で得られた結果もまた不均一であった。ラクトースの競合的効力は予測されたように示された。Ｎ−アセチル−ラクトースアミンとの競合は，同様の結果をもたらした。さらに，シアリル−ラクトースの天然に生ずる異性体も実験された。しかし，この場合には，α２−３シアリル化異性体はα２−６シアリル化異性体より競合活性が高いが，ラクトースまたはＮ−アセチルラクトースアミンの競合活性より明らかに低かった。さらに，著者らは，Ｎ−アセチル−ノイラミン酸単独では阻害活性を有していなかったと述べている。
【００１２】
競合実験に基づく研究の分析においては，試験された天然に生ずる糖蛋白質が可溶性蛋白質のみを含むことが印象的である。記載される実験においては，膜結合糖蛋白質は試験されなかった。
【００１３】
ヤドリギレクチンのみならず，例えば，他のラクトース／ガラクトース特異的蛋白質，例えば，リシンまたはガレクチンもまた，アシアロフェツイン結合蛋白質として記述される。この特性はまた，定量にも用いることができる（Ｖａｎｇら，１９８６）。Ｇｕｐｔａら（１９９６）は，蛋白質リシン，ガレクチンまたはヤドリギレクチン（ここではＶｉｓｃｕｍ  ａｌｂｕｍアグルチニンと称される）の相互作用をより詳細に記載することができた。彼らは，３つの蛋白質すべてがアシアロフェツインと明確な複合体を形成することを見いだした。ヤドリギレクチンまたはリシンの標的細胞への結合を担うレセプターはまだ知られていない。
【００１４】
１９８２年に，Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞でコレラ毒素のレセプターが同定された（Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙら，１９８２）。これはガングリオシドＧＭ１であった。この仕事に基づいて，この分野では，他のトキシン／レクチンのレセプターの探索も試みられた。ここでは，リシンおよびピーナッツアグルチニンについて，ヒトリンパ球上のレセプターが糖蛋白質であることを示すことができたが，トウゴマアグルチニンおよび大豆アグルチニンは糖蛋白質およびガングリオシドにほぼ同じ程度に結合する（Ｔｕｒｐｉｎら，１９８４）。モノシアロガングリオシドＧＭ１（末端ガラクトースを有する）を挿入したモデル膜を用いる実験において，２つの蛋白質，すなわちリシンおよびヤドリギレクチンとの非常に非特異的な相互作用のみが観察され，加えたタイプＩＩＲＩＰに依存して膜の透過性を明確に区別することはできなかった（Ｐｏｈｌら，１９９８ａ）。さらに，Ｐｏｈｌら（１９９８ｂ）は，リシンおよびヤドリギレクチンの両方ともベヒクルとベヒクルの融合を誘導することができたことを観察した。しかし，膜融合は標的細胞によるこれらの蛋白質の取り込みを担うものではないため，誘導誘導のモデルは，ヤドリギレクチンまたはリシン
のインビボでの取り込みには重要な関連性はない。既に，１９９０年にＴｏｎｅｖｉｔｓｋｙらは，ガングリオシドＧＭ１はレセプターとは考えられないことを示した。Ｕｔｓｕｍｉら（１９８７）は，ＧＭ１含有リポソームへのリシンの結合を報告しており，これは競合物質であるラクトースを加えたときには観察されなかった。
【００１５】
Ｓａｍａｌら（１９９５）は，ヤドリギレクチンは，リシンと同様に，血液血小板と凝集することを観察した。しかし，この分析にしたがえば，ヤドリギレクチンは血液血小板から単離されたリポソームを凝集せず，前記リポソームはリシンにより凝集される。著者らは，これらのレクチンのレセプターの可能性については議論していない。
【００１６】
１９９４年に，変質した細胞の変化した表面構造を利用しうることが見いだされた（Ｇｏｔｔｓｔｅｉｎら，１９９４；Ｕｓｕｉ＆Ｈａｋｏｍｏｒｉ，１９９４）。例えば，イムノトキシンは治療法として示唆され，このイムノトキシンは，特定の糖脂質または糖蛋白質構造に対するモノクローナル抗体からなり，これは好ましくは変質した細胞にのみ存在し，リシンの毒性成分（リシンＡ鎖）である（Ｇｏｔｔｓｔｅｉｎら，１９９４；Ｕｓｕｉ＆Ｈａｋｏｍｏｒｉ，１９９４）。このモデルは，トキシンを標的細胞中に輸送することができる細胞特異的ベヒクルの重要性を強調する。
【００１７】
リシンの場合，炭水化物に結合するＢ鎖は，明確に同定されていないが偏在的に生ずるレセプターとしてのそのようなベヒクルの要件を満たさない。この所見は，患者をリシンで治療したときに記述されている副作用を説明する。
【００１８】
ヤドリギレクチンは，リシンとは異なり，偏在しないレセプターに結合するように見えるため，Ｂ鎖が融合トキシンの輸送用ベヒクルである可能性が示唆された。細胞毒性化合物を有する組換えヴィスクミンのＢ鎖の対応する融合蛋白質は欧州特許出願ＥＰ１０１２２５６Ａ１に記載されている。したがって，対応する治療剤の有効かつ標的化された用途のために，ヤドリギレクチンまたは組換え的に製造された組換えヴィスクミンのＢ鎖が結合するレセプターを同定することが望ましい。
【００１９】
ヤドリギ抽出物（Ｖｉｓｃｕｍ  ａｌｂｕｍの抽出物）を治療薬として用いることは，既に数百年前から知られていた。ここでは，これらの抽出物の活性成分としてレクチンと称される成分が同定されている。これらのレクチンは，脂質または蛋白質が結合した形においても，非常に特異的な炭水化物構造を認識することができ，それに結合することができる蛋白質である。ヤドリギレクチンは，クラスＩＩリボソーム不活性化蛋白質として特徴づけられており，その２つのサブユニットが相互作用する場合にのみ薬理学的に有効である。ここでは，特異的炭水化物結合特性を有する配列モチーフを有するヤドリギレクチンのＢ鎖が，蛋白質の標的細胞内への輸送を担う。標的細胞においては，次にＡサブユニットが細胞においてその酵素的ｒＲＮＡ−Ｎ−グリコシダーゼ活性によりリボソーム代謝をブロックし，このようにして，かかる細胞においてプログラムされた細胞死（アポトーシス）を誘導する。
【００２０】
ヤドリギ植物およびここから得られる抽出物の，疾患を治療するための作用のモードは，欧州特許ＥＰ０６０２６８６Ｂ１に記載されている。今世紀の初めから，ヤドリギ調製物は癌治療において用いられており，成功するか否かはまちまちである（Ｂｏｃｃｉ，１９９３；Ｇａｂｉｕｓら，１９９４；Ｇａｂｉｕｓ＆Ｇａｂｉｕｓ，１９９４；Ｇａｎｇｕｌｙ＆Ｄａｓ，１９９４）。Ｈａｊｔｏら（１９８９，１９９０）はまた，治療効果は特にいわゆるヤドリギレクチン（ヴィスクミン，Ｖｉｓｃｕｍ  ａｌｂｕｍアグルチニン，ＶＡＡ）により媒介されることを示すことができた。細胞毒性効果に加えて，今日では，特に（非特異的）免疫刺激が議論されており，腫瘍患者の併用される療法に，およびフォローアップ治療に，その有効な効果が利用されている。内因性エンドルフィンの放出に
よりそのような患者の生活の質の改善がもたらされる可能性がある（ＨｅｉｎｙａｎｄＢｅｕｔｈ，１９９４）。
【００２１】
多数のインビトロ分析（Ｈａｊｔｏら，１９９０；Ｍａｎｎｅｌら，１９９１；Ｂｅｕｔｈら，１９９３）およびインビボ分析（Ｈａｊｔｏ，１９８６；Ｈａｊｔｏら，１９８９，Ｂｅｕｔｈら，１９９１；Ｂｅｕｔｈら，１９９２）および臨床試験（Ｂｅｕｔｈら，１９９２）は，ヤドリギレクチンにより媒介される炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α，ＩＬ−１，ＩＬ−６）の放出の増加および免疫系の細胞性成分（ＴＨ−細胞，ＮＫ−細胞）の活性化を証明した。
【００２２】
今日では，６０ｋＤａのヤドリギレクチン蛋白質が，ヤドリギ抽出物の活性の本質であると考えられており，蛋白質は生化学的方法により抽出物から得ることができる（Ｆｒａｎｚら，１９７７；Ｇａｂｉｕｓら，１９９２）。ＭＬ蛋白質は２つの共有結合的にＳ−Ｓ結合したサブユニットからなり，ここで，蛋白質のＡ鎖はリボソームの酵素的不活性化を担い（Ｅｎｄｏら，１９８８），この蛋白質のＢ鎖は炭水化物結合を担う。生物学的活性はＢ鎖のレクチン活性を得ることと相関している（Ｈａｊｔｏら，１９９０）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の基礎となる技術的課題は，これまで組換えヴィスクミンまたは類似の化合物の投与を含む治療法が個体の疾患または病気の治療に適しているか否かについて予測することが可能ではなかったことである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
この技術的課題は，本発明の特許請求の範囲に示される態様により解決された。
【００２５】
すなわち，本発明は，ヤドリギレクチンまたはヤドリギレクチン一本鎖に対する個体の応答性を判定するインビトロ方法に関し，この方法は，膜結合レセプターを量的および／または質的に特異的に検出する工程を含み，レセプターは，α２−６グリコシド結合によりガラクトース（Ｇａｌ）に結合している末端Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）により特徴づけられる。
【００２６】
すなわち，本発明にしたがえば，好ましくはヤドリギレクチンまたはヤドリギ一本鎖に対する個体の応答性を判定するインビトロ方法が記載され，この応答性はヤドリギレクチンの炭水化物結合サブユニットの，膜結合レセプターへの特異的結合により媒介され，レセプターは，α２−６グリコシド結合によりガラクトース（Ｇａｌ）に結合している末端Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）により特徴づけられる。判定は，この特定のグリコシル化を量的および／または質的に特異的に検出することを含む。
【００２７】
"ヤドリギレクチン"との用語は，本明細書に記載され当業者に知られる天然のヤドリギレクチンおよび組換えヤドリギレクチンの両方を含み，上述のヤドリギレクチン一本鎖は，好ましくはヤドリギレクチンＢ鎖またはそのフラグメントを含む。
【００２８】
本発明に関して，"応答性"との用語は，単一の細胞，細胞集団，細胞のクラスター，組織，臓器または生物の反応を誘発することを表し，この反応は，疾患または病気の治癒に好都合なものである。さらに，"応答性"との用語はまた，組換えヴィスクミンまたは類似の化合物の予防的な適用における，個体細胞，細胞集団，細胞のクラスター，組織，臓器または生物の感受性を含む。したがって，それぞれの標的細胞の応答性は，有効な治療効果または予防効果と結びつけられる。好ましくは，"応答性"は，ヒト細胞，細胞集団，細胞のクラスター，組織，臓器またはヒト生物の感受性を含む。
【００２９】
"特異的結合"との用語は，例えば，"鍵と鍵穴の原理"により特徴づけられる。リガンド（ヤドリギレクチン）および標的分子（膜結合レセプター）は，互いに特異的に適合する構造ないしモチーフを有する。その一例は，抗体の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基（エピトープ）である。したがって，特異的結合は，より万能の非特異的結合と対照的なものである。互いに特異的に結合する相互作用パートナーの構造が知られている場合，これと相互作用する適当なパートナーの可能な好ましい構造または特定の構造要素についての結論を得ることができる。
【００３０】
本発明は，ヤドリギレクチン，特に組換えヴィスクミンの特異的相互作用のパートナーを提供する。
【００３１】
"ヤドリギレクチンの炭水化物結合サブユニット"との用語は，ヤドリギレクチンの膜結合レセプターに特異的に結合するヤドリギレクチンのＢ鎖の配列モチーフを表す。これらのモチーフはＬａｎｇｅｒら（２０００）に記載されている。リシンの炭水化物結合サブユニットと同様に，ヤドリギレクチンのＢ鎖もまた２つのドメインから形成される。これらのドメインはそれぞれ３つのサブドメインに分けられる。ドメインは１および２と称され，サブドメインはα，βおよびγと称される。リシンについては，すべてのサブドメインはおそらくは細菌の炭水化物結合構造に由来するものであろうと記載されている（Ｒｕｔｅｎｂｅｒら１９８７）。リシンとヤドリギレクチンのＢ鎖の高い構造的同一性のため（６２％の同一性および７０％の相同性，Ｅｃｋら，１９９９），この所見は，ヤドリギレクチンにも適用可能であるように見える。Ｌａｎｇｅｒら（２０００）によれば，リシンとヤドリギレクチンの炭水化物結合サブユニットの異なる特異性は，そのサブドメインにおける相違のためである。特に，１αサブドメインにおいて残基Ｄ２３およびＷ３８，１βにおいて残基Ｙ６８，Ｙ７０，Ｙ７５およびＦ７９，およびサブドメイン２γにおいて残基Ｄ２３５，Ｙ２４９が存在する（番号付けについてはＥｃｋら（１９９９ａ）を参照）。
【００３２】
本発明に関して，"膜結合レセプター"との用語は，α２−６グリコシド結合を介してガラクトース（Ｇａｌ）に結合している末端Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）により特徴づけられる膜結合構造を表す。対応する膜結合構造の例は，細胞の膜にアンカリングされた蛋白質またはペプチドである。この定義は，貫膜蛋白質および膜付随蛋白質およびペプチドの両方を含む。それ自体膜の一部であるか，または膜に付随している脂質もまたそのような構造の例である。本明細書に記載される膜結合構造は，糖蛋白質（グリコシル化された蛋白質）および糖脂質の一部であってもよい。
【００３３】
この点に関して，"膜"との用語は，明示的にすべての膜性の細胞性脂質二重層を含む。したがって，小胞体（ＥＲ），ゴルジ装置の膜，核膜，小胞および空胞の膜および細胞外膜も含まれる。
【００３４】
当該技術分野においては，α２−６グリコシド結合を介してガラクトース（Ｇａｌ）に結合している末端Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）でグリコシル化された蛋白質が記載されている。しかし，これらのグリコシル化された蛋白質は，可溶性蛋白質／血清蛋白質であり（例えば，Ｈａｎａｓａｋｉら，１９９５を参照），これはヤドリギレクチンの薬理学的効果にも作用のモードにも関係ない。本発明は，グリコシル化された膜結合構造を最初に開示するものである。
【００３５】
ヤドリギレクチンの炭水化物結合サブユニットの特異的標的構造として，α２−６グリコシド結合を介してガラクトース（Ｇａｌ）に結合している末端Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を同定することにより，単独で，またはＬａｎｇｅｒら（２０００）
の教示と組合わせて，例えば，当業者が部位特異的突然変異によりリシンの炭水化物結合サブユニットを変化させることを可能とする。このようにして変異させたペプチド／蛋白質は，もはやリシン特異的標的構造には結合しないが，ヤドリギレクチン特異的標的構造には結合する。
【００３６】
かかるグリコシル化の量的および／または質的検出の例は当業者に知られており，例えば，この例を示す本明細書の実施例７および図９に記載されている。そのような方法には，例えば，実施例に示されるような改変したウエスタンブロット分析が含まれる。さらに，そのような方法には，ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ），サンドイッチ（イムノメトリックアッセイ）およびウエスタンブロットアッセイ，ＩＲＭＡ（免疫ラジオイムノメトリックアッセイ），ＥＩＡ（酵素イムノアッセイ），ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ），ＦＩＡ（蛍光イムノアッセイ），ＣＬＩＡ（化学発光イムノアッセイ），アグルチニン化アッセイおよびフローサイトメトリ法等の手法が含まれる。
【００３７】
本発明の方法は，とりわけ，ヤドリギレクチン療法の有効性を予測することを可能とする。この方法は，ヤドリギレクチン，好ましくは組換えヴィスクミンを用いる治療法がある種の細胞，ある種の細胞集団またはある種の組織，臓器または生物にける疾患の治療において原理的に成功すると予測されるか否かについての予見をすることを含む。例えば，本発明の方法を用いて腫瘍細胞において上述のグリコシル化が同定されれば，組換えヴィスクミンは細胞に結合し，細胞に吸収され，細胞毒性効果を発揮することができる。さらに，本発明の方法により，ある個体におけるヤドリギレクチン療法の有効性の予測が可能となる。結論として，患者の群において，個々のレスポンダー（治療法に応答する患者）を非レスポンダーから区別することができる。したがって，そのような予測の方法は，当業者に知られ，ハーセプチンによる乳癌患者の治療の前に行われている試験と同様の目的を達成することができる。抗体調製物ハーセプチンの投与を用いる治療を行う前に，患者がＥＧＦ−レセプターＨｅｒ−２を有しているか否かを試験しなければならない。この点に関して，ＦＤＡ（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は，特に２つの試験方法（免疫組織化学染色（ＩＨＣ）および蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））を認可している（この点については，例えば，Ｔｈｏｍｓｏｎら（２００１）を参照）。同様に，ヤドリギレクチン療法，特に組換えヴィスクミンを用いる治療に対する個々のレスポンダーを認識および／または判定するために，そのような方法および本明細書に記載される他の手法を，本発明の教示にしたがって用いることができる。
【００３８】
本発明の方法を行うためには，液体のサンプル，特に体液のサンプル，細胞，細胞集団または組織を用いることができる。これらのサンプルは血液サンプルまたは体液の他のサンプルに由来するものであってもよく，組織サンプル，個体細胞または播種性の腫瘍細胞であってもよい。そのようなサンプルの例，およびこれらをどのようにして取り出すかの手法は，本明細書においてさらに別の態様に関連してより詳細に記載される。
【００３９】
本発明の方法はまた，患者の群において初期にレスポンダーを認識することを可能とする。このようにして，治療を始める前に大きな遅れを伴わずに容易に実施することができる試験において，治療の成功を評価することが可能である。本発明の方法のこの特徴は，疾患経済学の観点に関して特に意味がある。コストがかかるが個々の患者には有効でないかもしれない治療を回避することができる。このようにして，組換えヴィスクミンを用いる治療の成功が疑わしいように見える個々の患者について，治療が有効な場合には許容される副作用を回避することができる。
【００４０】
実施例に記載されるように，本発明の基礎をなす試験においては，ヤドリギレクチンおよびリシンがスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）に結合することを明確に示すことができた。本
発明は，ヤドリギレクチン（特に組換えヴィスクミン）とリシンの結合特異性の量的および質的相違を示すことを初めて可能としたものである。２つの蛋白質により認識される炭水化物構造の概略図を図１に示す。
【００４１】
実施例に示されるように，特別の試験において，ヤドリギレクチン（特に組換えヴィスクミン）の主たる特異性は末端ガラクトースではないことが示された。図２−５および７は，異なる移動剤中での異なる移動特性によって予め中性および酸性ＧＳＬが分離されているＤＣプレート（ＴＬＣアッセイ）における，結合したリシンまたは組換えヴィスクミンの改変ウエスタンブロット／免疫学的検出を示す。リシンは，末端ガラクトースを有する中性ＧＳＬ（Ｌｃ２，ｎＬｃ４，ｎＬｃ６，Ｇｇ４）（表１；図４Ｂ，レーンｂ）に対して明らかな特異性を示すが，組換えヴィスクミンは驚くべきことにＧａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ（この場合Ｃｅｒはセラミドを意味する）に非常に弱い結合しか示さない（表１；図２Ａ，レーンｂ，一晩インキュベートした後に染色なし）。
【００４２】
しかし，驚くべきことに，この用量は，組換えヴィスクミンにより非常によく認識され，リシンによっては全く認識されないＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）が末端に存在するガングリオシドの群にはあてはまらないことが示された（表１；図２Ｂ，レーンｂ；図５Ｂ，レーンｂ，染色なしを参照）。さらに，驚くべきことに，組換えヴィスクミンによるレセプター構造の認識には，Ｎ−アセチルノイラミン酸が中性の糖構造の末端ガラクトースに，α２−６（認識される）またはα２−３（認識されない）で結合しているかが重要であることが見いだされた（実施例および図を参照）。
【００４３】
本発明の特徴である，Ｎｅｕ５Ａｃ−α２−６−ＧａｌコンフィギュレーションにおけるＮ−アセチルノイラミン酸の特異的認識は，モノクローナル抗体のエピトープ認識における特異性を連想させ，このことはこれまでヤドリギレクチンについては述べられていない。リシンおよび組換えヴィスクミンの全く異なる特異性もまた驚くべきものであり，当業者には予測しえないものであった。試験した２つのタイプＩＩ−リボソーム不活性化蛋白質の異なる認識モチーフは表１にまとめられている。当該技術分野における技術水準から，リシンおよびヤドリギレクチン（特に組換えヴィスクミン）の両方とも，仮に結合するとしてもむしろガラクトースを末端糖残基として有する中性ＧＳＬに結合すると結論づけることができた。
【００４４】
本発明の方法の好ましい態様においては，レセプターは，α２−６−シアリル化ガラクトースの後に少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含むガングリオシド，すなわち，ガラクトースへのα２−６結合Ｎ−アセチルノイラミン酸の後に少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含むガングリオシドを含む。しかし，以下に説明するように，続くＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）はＮｅｕ５Ａｃα２−６−Ｇａｌ構造の後に，直接的および間接的のいずれで存在していてもよい。すなわち，本発明に関して，本発明の方法は，構造Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−Ｇａｌ−Ｙ−［ＧｌｃＮＡｃ］x−Ｃｅｒを含むガングリオシドレセプターの（構造）認識に基
づくことが可能である。Ｙは，例えば，さらに別のガラクトース（Ｇａｌ）を含むことができる。
【００４５】
本発明に関して，"ガングリオシド"との用語は，セラミドオリゴ糖を含む酸性シアル酸を表す。炭水化物成分はＮ−アシルスフィンゴシン（＝セラミド）のＣ１−ＯＨ基に対するグリコシド結合により結合している。ガングリオシドは，長鎖（例えば，ＩＶ3ｎＬｃ
４，ＶＩ3ｎＬｃ６，等）および分枝鎖（ＧＭ１またはＧＭ２）のいずれであってもよい
（Ｖｏｅｔ  ａｎｄ  Ｖｏｅｔ（１９９２），特にこの文献の２７１ページの図）。
【００４６】
本発明の方法のさらに別の好ましい態様においては，レセプターは，構造Ｎｅｕ５Ａｃ
α２−６−Ｇａｌ−［Ｇａｌ／ＧｌｃＮＡｃ］x−Ｃｅｒ（Ｃｅｒはセラミドである）を
有するガングリオシドを含む。本明細書に記載される方法においては，Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３］xＧａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ
が特に好ましい。
【００４７】
ガングリオシドを構造的に特徴付ける一般的方法は，現在のところ，ｘが６以下である場合にのみガングリオシドを正確に分析することができる。ヤドリギレクチンの炭水化物結合サブユニットは末端糖構造を認識する。したがって，変数ｘの値は，原理的には特異的結合には重要ではない。好ましくは，変数は最大で１０の値を有する。さらに，変数は好ましくは６以下の値を有し，より好ましくは５，４，３，２または１の値を有する。さらに，分枝鎖ガングリオシドの場合，ｘの値は個々のまたはすべての鎖で異なっていることが好ましい。
【００４８】
また，本発明の方法の１つの態様において，レセプターは，構造Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３］xＧａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒを有
するガングリオシドを含むことが好ましく，構造Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ，またはガングリオシドＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒが特に好ましい。この好ましい態様もまた，直鎖および分枝鎖のガングリオシドを含む。
【００４９】
さらに別の好ましい態様にしたがえば，レセプターは細胞膜結合性である。
【００５０】
本発明の方法のこの態様は，細胞外膜の一部を形成するかまたはこれに結合している膜結合レセプターの分析を記載する。特に，かかる態様は，糖蛋白質または糖脂質であるレセプターを含む。
【００５１】
さらに別の好ましい態様においては，ヤドリギレクチンは組換えヤドリギレクチン／組換えヴィスクミンである。
【００５２】
上述したように，文献では天然に生ずる種々のヤドリギレクチンを区別している（ＭＬ−Ｉ，−ＩＩおよび−ＩＩＩ）。これらは，その炭水化物特異性において異なる（Ｆｒａｎｚ，１９８６）。ここでは，ガラクトース／ラクトースの特異性（ＭＬ−Ｉ）は，ガラクトース／ラクトースおよびＮ−アセチルガラクトサミンの混合物形（ＭＬ−ＩＩ）から，Ｎ−アセチルガラクトサミンにより強く結合するヤドリギレクチン（ＭＬ−ＩＩＩ）に変化することが議論されている。Ｅ．ｃｏｌｉ中で与えられる組換えヤドリギレクチン／組換えヴィスクミンは当業者に知られている（ＥＰ０７５１２２１Ｂ１；Ｅｃｋら，１９９９ａおよび１９９９ｂ）。組換えヴィスクミンの一次構造は，ヤドリギ植物に見いだすことができるＭＬ−Ｉ，ＭＬ−ＩＩまたはＭＬ−ＩＩＩとは正確には対応していない。記載される組換えヴィスクミンの配列とは別に，元の遺伝子の別の部位の変異により改変されている他のヤドリギレクチン変種が存在し，これはその一次構造においてわずかに異なるかもしれないことが想定される。組換えヴィスクミンは本来のヤドリギレクチンの変種であると考えることができ，ＭＬ−Ｉ，ＭＬ−ＩＩおよびＭＬ−ＩＩＩ配列の混合物であると理解することができる。
【００５３】
さらに，この態様は，欧州特許出願ＥＰ  Ａ  ２１０１２２５６に記載される組換えヴィスクミンに基づく組換え融合蛋白質を含む。
【００５４】
さらに，本発明の１つの態様においては，好ましくは，組換えヤドリギレクチンは配列番号１，配列番号３または配列番号５で示されるポリヌクレオチドによりコードされるア
ミノ酸配列を含む。
【００５５】
さらに別の好ましい態様は，１またはそれ以上のポリヌクレオチドによりコードされる組換えヤドリギレクチンを含む。
【００５６】
本発明の方法の好ましい態様においては，組換えヤドリギレクチンはまた，配列番号２，配列番号４または配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含む。
【００５７】
本発明に関して，"機能的フラグメント"との用語は，アミノ酸配列（配列番号）をもって示されるポリペプチドと同じ生物学的機能を有する，上述のポリペプチドのフラグメントを表す。ヤドリギレクチン，特に組換えヴィスクミン，およびヤドリギレクチンの既知のサブユニットの機能は，本明細書に既に記載した。"機能"には，本明細書に記載されるヤドリギレクチンレセプターに対する，ヤドリギレクチン，特にヤドリギレクチンのＢ鎖の特異的結合特性も含まれる。すなわち，ヤドリギレクチンＢ鎖のフラグメント，特に本明細書に記載されるヤドリギレクチンレセプターとの特異的な相互作用を媒介しうるフラグメントも含まれる。
【００５８】
この点に関して，"同じ生物学的機能"との用語は，例えば，細胞においてポリペプチドのフラグメントまたは誘導体が言及されているペプチドと同じシグナルを誘導することを表す。フラグメントの例は，規定される機能または特定の補欠分子団を有するペプチドドメインである。"同じ生物学的機能"には，細胞毒性，免疫刺激（天然および適応性免疫系の両方），サイトカインの放出の刺激，抗原性，表面マーカー（例えばＮＫ細胞のＣＤ５６）の発現または活性化の誘導，アポトーシスまたはエンドルフィン刺激の誘導も含まれる。
【００５９】
さらに別の好ましい態様においては，組換えヤドリギレクチンはまた，配列番号２，配列番号４または配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはこれらの機能的フラグメントをコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドによりコードされるものから構成される。ただし，遺伝コードを考慮すればその配列は縮重している。
【００６０】
本明細書において初めて記載されるヤドリギレクチンレセプターは，実施例に記載されるように細胞試験においても役割を果たす。細胞が組換えヴィスクミンによる治療に対して異なるように反応することを示すことができた。特に，腫瘍細胞または腫瘍細胞に由来する細胞は，実施例に記載されるように，組換えヴィスクミンによる処理に対して特異的な生化学的反応を示す。
【００６１】
実施例に記載される実験により，本明細書に開示されるレセプターに対する組換えヴィスクミンの特異性を明確に同定することも可能であった。さらに，組換えヴィスクミンがリシンと比較して量的に異なる炭水化物特異性を有することが明確に示された。
【００６２】
本発明の基礎をなし，実施例に記載されている実験においては，腫瘍細胞または腫瘍細胞株が上述のヤドリギレクチン，特に組換えヴィスクミンに対する特異的レセプターを発現することが示された。
【００６３】
本発明の方法の別の態様は，ヤドリギレクチンに対する応答性を判定するためのインビトロ方法であり，この方法は，シアリルトランスフェラーゼを量的および／または質的に決定することを含む。
【００６４】
シアリルトランスフェラーゼは，真核生物細胞においてグリコシル化された構造の末端
グリコシル化を担う。これらの酵素の活性は，ゴルジ装置（トランスゴルジコンパートメント）に見いだされた。酵素はシアル酸残基の転移を触媒する。そのようなシアリルトランスフェラーゼの酵素活性は，例えば変性性細胞（癌細胞）において，ペプチドおよび／または脂質の特異的グリコシル化を触媒する。細胞または組織サンプルにおけるそのようなシアリルトランスフェラーゼの存在は，細胞の変性を示すものと考えることができる。これは，サンプル中のこれらのシアリルトランスフェラーゼの酵素活性を検出する場合にはより当てはまる。
【００６５】
シアリルトランスフェラーゼを量的および／または質的に決定するための分子生物学および蛋白質生化学的方法は，文献から当業者に知られている（例えば，Ｍｕｌｈａｒｄｔ（２０００）およびＲｅｈｍ（２０００）を参照）。分子生物学的方法は，例えばＲＴ−ＰＣＲ手法，ＲＮＡｓｅ保護アッセイ，ノザンブロットまたはサザンブロット分析である。蛋白質生化学的方法は，例えば，トランスフェラーゼ活性を検出するための方法，ならびにウエスタンブロット分析，または"プロテオーム分析"との用語でまとめることができる他の手法等の方法である。
【００６６】
さらに，個々の細胞のシアリルトランスフェラーゼの量的決定は，例えば，播種性の腫瘍細胞を含むことができる。個々の細胞分析は当業者に知られており，ＥＰ  Ａ  １１１００９９３８およびＫｌｅｉｎ（１９９９）に記載されている。
【００６７】
対応するシアリルトランスフェラーゼの例は，β−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．９９．１）（α２−６ＳＴＮ）である。α２−６ＳＴＮは，４７ｋＤａの貫膜蛋白質である。肝細胞はまた４１ｋＤＡ型の前記酵素を分泌する。可溶型α２−６ＳＴＮは血清糖蛋白質であり，これは急性期反応物の群に割り当てられており，病原性プロセスにおいて役割を果たす（多くの癌腫，例えば結腸癌および子宮頸癌において活性が増強されている）。既知の形の酵素のアミノ酸配列およびこれらをコードするヌクレオチド配列は当業者に知られている（受託番号Ｌ２９５５４（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ），Ｘ７５５５８（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ），ＮＭ＿００３０３２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）およびＮＭ＿００９１７５（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）を参照）。
【００６８】
本明細書に記載される，本発明にしたがう方法は，特異的検出試薬を用いて行うことができる。そのような特異的検出試薬は，本明細書に記載されるヤドリギレクチンレセプターと相互作用または結合することができる。かかる相互作用または結合は，直接的であっても間接的であってもよいが，本明細書に記載されるレセプターに特異的でなければならない。本発明の特に好ましい試薬は，特異的抗体，抗体フラグメントまたは抗体誘導体，アプタマー，炭水化物結合分子（例えば，ペプチドおよび／または蛋白質）であり，ここで，試薬は，本明細書に記載されるヤドリギレクチンレセプターまたはその特定の成分（例えば，本明細書において定義され，アルファ２−６グリコシド結合を介してガラクトースに結合している末端Ｎ−アセチルノイラミン酸）を認識および／または結合することができなければならない。好ましくは，これらの検出試薬は標識されており，標識としては，放射性物質，蛍光色素，ビオチン−（ストレプト）アビジン，ルシフェラーゼ，ＣＡＴ，ベータ−ガラクトシダーゼ，アルカリホスファターゼ，ペルオキシダーゼ，さらに別の酵素標識，ジギトニン，一般の染料等が挙げられる。しかし，本発明の方法はまた，本明細書に記載されるレセプターの間接的検出によっても実施することができる。レセプターの検出は実施例に例示されており，上述したように，ＲＩＡ，ＥＬＩＳＡ，ＣＬＩＡ，ＦＩＡ，ＥＬＬＡ，ＴＬＣ試験，組織学的方法，直接および間接（免疫）蛍光法またはフロースルー法（例えば，ＦＡＣＳ分析，フローサイトメトリ，ＢＩＡｃｏｒｅ）等の方法も含むことができる。
【００６９】
別の態様においては，本発明は，上述のレセプターを特異的に認識または結合する物質，好ましくは，抗体，抗体誘導体，抗体フラグメント，アプタマーおよび炭水化物結合ペプチドまたは蛋白質からなる群より選択される物質を含む診断用組成物に関する。しかし，本発明にしたがって，レクチン，例えば標識したレクチンを診断目的に用いることもできる。この場合には，特に，本明細書に記載されるレセプターに特異的に結合しうる標識したレクチンを用いる。
【００７０】
特定の標的構造を認識するかまたは結合する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を製造する方法は当業者に知られている。神経性疾患において役割を果たすガングリオシドＧＤ１およびＧＤ２に対するモノクローナル抗体の製造は，Ｍａｇｎａｎｉら（１９８２），Ｔｕｒら（２００１）およびＰａｎら（２００１）に記載されている。そのような抗体の特異性の検出は，例えば，薄層クロマトグラフィー後の免疫染色に基づく重層アッセイにより行うことができる（Ｍｕｔｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｕｈｌｒａｄｔ（１９８８），Ｍｕｔｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｅｍｍｉｎｅｒ（１９９６），Ｍｕｔｈｉｎｇ（１９９８））。かかる方法は，任意にＥＬＩＳＡと組み合わせてもよい。
【００７１】
本明細書に記載される方法において用いるべき抗体は，好ましくは，本明細書に開示される膜結合レセプター構造に特異的に結合するモノクローナル抗体（またはそのフラグメントまたは誘導体）である。実施例においてはそのような抗体を得る方法が示される。例えば，実施例において５９．３３．３，５９．３３．５および５９．３３．６と表される抗体は，本明細書に記載されるα２−６シアリル化ネオラクト系ガングリオシド，すなわち，本明細書に記載される（組換え）ヤドリギレクチンのレセプターに対する抗体である。
【００７２】
抗体は，例えば，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＭのタイプの抗体でありうる。特に好ましい抗体は，ブダペスト条約にしたがって２００２年１２月２０日に名称５９．３３．３としてＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ），Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋに寄託された受託番号のハイブリドーマ／ハイブリドーマ細胞株から得ることができる。
【００７３】
本明細書に記載される診断用組成物および医薬組成物（下記参照）はまた，本明細書に記載される抗体からこれを修飾することにより得られる抗体を含んでいてもよい。このようにして，当業者に知られる手法を用いて，本明細書に記載される抗体のＣＤＲ（相補性決定領域；３つの相補性決定領域ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は抗体またはＴ−細胞レセプターのＶ−ドメインの末端のループである。これらは抗原またはペプチド：ＭＨＣ複合体と直接接触する）を単離し，かかるＣＤＲを異なる構造を有する抗体に挿入することができる。すなわち，５９．３３．３抗体（ＩｇＭ）からＣＤＲを単離して，このＣＤＲを他のイムノグロブリン，例えばＩｇＧ，好ましくはＩｇＧ１構造中に組み込むことが可能である。これらの方法（例えば，ＣＤＲグラフティング）は当業者によく知られている。したがって，本明細書に記載される抗体はまた，キメラ抗体，ヒト化抗体または一本鎖抗体または一本鎖抗体フラグメント，例えばｓｃＦｖコンストラクトを含む。しかし，そのような抗体の修飾は，本明細書に詳細に記載される抗体５９．３３．３，５９．３３．５または５９．３３．６の修飾に限定されない。用いるべき抗体は，本明細書に記載される（組換え）ヤドリギレクチン（（組換え）ヴィスクミン）のレセプターに特異的に結合する全ての抗体／抗体分子，抗体フラグメントまたは抗体誘導体でありうる。
【００７４】
抗体フラグメント，例えば，Ｆｖ，Ｆ（ａｂ’）2およびＦａｂは，無傷の蛋白質（抗
体）を，例えばプロテアーゼによりまたは化学的切断により切断することにより生成することができる。また，切断型の遺伝子を設計してもよい。例えば，Ｆ（ａｂ’）2フラグ
メントの一部をコードするキメラ遺伝子は，Ｈ−鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域を
コードするＤＮＡ配列，およびその後に翻訳停止コドンを含み，このことにより切断型の分子が得られる。
【００７５】
"抗体誘導体"との用語は，上述の抗体の修飾された形を記述する。これらの修飾には，抗体またはそのフラグメントの化学的修飾，特に生化学的修飾，好ましくは蛋白質生化学的修飾が含まれる。ここでは，抗体，抗体フラグメントおよびそれらの誘導体を特徴づける共通の特徴は，特定の標的構造の認識および／または結合である。本発明にしたがえば，前記標的構造は，本明細書に記載されるヤドリギレクチンの膜結合レセプターである。
【００７６】
アプタマーおよびその特定の特性は，例えば，Ｈｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ（２０００）に概説されている。アプタマーを単離する方法もまた，当該技術分野の技術水準から当業者に知られている。
【００７７】
本明細書においては，"炭水化物結合ペプチド"との用語は，医薬組成物を製造するための使用に関連する本発明の態様におけるものと同様に定義される。
【００７８】
診断用組成物のさらに別の好ましい態様においては，物質を検出可能なように標識する。物質の検出可能な標識の例は当業者に知られている。これには，例えば，放射性標識，酵素標識または蛍光標識が含まれる。ビオチニル化およびアビジンまたはストレプトアビジンを用いる検出も，対応する好ましい態様の一例である。
【００７９】
本発明の１つの態様は，本発明にしたがう診断用組成物を用いて，個体細胞，細胞集団または細胞の集合，組織，臓器または生物中の細胞が，ヤドリギレクチンの機能的レセプターを有するか否かを分析することを含む。
【００８０】
さらに別の態様においては，本発明はまた，上述の物質を用いて，機能的ヤドリギレクチンレセプターを検出するための診断剤を製造することに関する。
【００８１】
本明細書に記載され，実施例で実験されたレセプターの検出における本発明の診断剤の使用は，細胞について行うことがさらに好ましい。
【００８２】
実施例に示されるように，α２−６グリコシド結合を介してガラクトース（Ｇａｌ）に結合している末端Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を発現する腫瘍細胞は，ヤドリギレクチン，特に組換え的に製造したヤドリギレクチン（組換えヴィスクミン）に対するレスポンダーとして特に適している。
【００８３】
好ましい態様においては，調べる細胞は腫瘍細胞である。これらの腫瘍細胞のより好ましいものは，動物細胞，好ましくは哺乳動物に由来する腫瘍細胞であり，さらに好ましくはヒトに由来する腫瘍細胞である。さらに好ましくは，これらの細胞は，白血病細胞，小細胞または非小細胞肺癌，結腸癌，ＣＮＳ癌腫，黒色腫，卵巣癌，腎臓癌，前立腺癌，乳癌，膀胱癌，胃癌，膵臓癌または精巣の癌腫である。
【００８４】
本発明のさらに別の好ましい態様においては，細胞は生検材料に由来するものである。生検材料を回収する方法は当業者に知られている。この記述は，細胞を個人または患者から取り出す種々のタイプの回収方法を含む。生きた細胞である細胞が好ましい。これらには，例えば，細い針を用いて行う生検（細針吸引），パンチ生検，固体組織部分の除去（例えば外科手術法により）または組織全体（例えば副腎）のサンプルがある。種々の回収手法は，例えば，Ｋｒｅｍｅｒら（１９９９），Ｐｉｃｈｌｍａｙｒ  ａｎｄ  Ｌｏｈｌｅｉｎ（１９９１），Ｎｉｅｔｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｆｅｉｌ（１９９７），Ｍａｌｔｅ（１９９８）およびＢｏｎｋに記載されている。
【００８５】
また好ましい態様においては，細胞は血液サンプルから単離される。血液サンプルからの細胞の単離に加えて，本発明のまた好ましい態様においては，胸水，腹水サンプル，洗浄水，尿サンプル，精液サンプルまたは脊髄液および脳液からのサンプルから細胞を単離する。
【００８６】
治療計画を立てる前に，または治療の経過中に，例えば癌患者の組換えヴィスクミンに対する応答性を判定するために，患者から組織を取り出す。また，特定の適応症に関して堅実な統計学的基礎を有する陳述をすることができるように，（異なる）患者の回収されたサンプル／保存されたサンプル（多くの病院でパラフィンブロックバンクとして保存され，適応症にしたがって分類されている）に頼ることも可能である。
【００８７】
これらの組織は，例えば，凍結乾燥されるか，ホルムアルデヒド溶液中に保存されるか，または低温保存により得ることができ（意図的な凍結，例えば，糖溶液等の低温保護溶液で潅流した後），次に当業者に知られる方法にしたがってさらに加工し，例えば，パラフィンブロック中に保存することができる。サンプルから出発して，顕微鏡で調べるのに適した切片を調製する。次に，特定の抗原，すなわち，本明細書で定義される（組換え）ヤドリギレクチンのレセプターの存在について，これらの切片を当業者によく知られる方法で調べる（例えば，ＬＳＡＰ法（ＥＬＩＳＡに類似する方法），またはＤＡＫＯ（Ｈａｍｂｕｒｇ）のＥＮＶＩＳＩＯＮ法を用いることにより）。これを実施するためには，本明細書に記載されるレセプターのエピトープ"ＣＤ７５ｓ"を特異的に認識する抗体，例えば，ｍＡｂ５９．３３．３または他の２つのｍＡｂｓ５９．３３．５または５９．３３．６を用いることにより，患者からのサンプルを用いて行うことができる。抗体は，例えば５００ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの濃度で用いることができ，次に結合した抗体を二次抗体または他の検出方法を用いて検出することができる。例えば，アルカリホスファターゼとともに提供されるポリデキストラン結合抗マウスＩｇＭ抗体を用いることができる。すなわち，健康な組織と変性性組織とを比較することが可能であり，また，患者または特定の腫瘍適応症の場合には，組換えヴィスクミンを用いる治療が有望であるか否かを区別することが可能である。さらに，（組換え）ヤドリギレクチン（（組換え）ヴィスクミン）を用いる治療が成功したか否かを検出することができ，すなわち，治療の経過をモニターすることができる。
【００８８】
さらに，本明細書に記載される発明は，他の診断方法，例えば，とりわけ，細針生検材料および異種移植細胞株または他の細胞株の試験を可能とする。
【００８９】
細胞は，例えば，９６ウエルプレート中で固定し，実施例８に記載されるように，ＥＬＩＳＡと類似する方法において，膜結合／膜安定性ＣＤ７５ｓモチーフ（組換えヴィスクミン結合モチーフ，すなわち，本明細書に記載される膜結合レセプター構造のモチーフ）の存在について調べることができる。試験に用いることができる別の方法はＦＡＣＳ分析である。この方法では，細胞のプールからある種の表面抗原を有する細胞を取り出すことができる（細針生検の場合には特に興味深い）。すなわち，特異的抗体または抗体誘導体，例えば，本明細書に記載されるｍＡｂｓ５９．３３．３，５９．３３．５または５９．３３．６を用いることにより最初に細胞を用いる。次に，結合した抗体（これは，好ましくは，限定されないが，５００ｎｇ／ｍｌ−１０μｇ／ｍｌの濃度で用いることができる）を，ＦＩＴＣまたは他の方法により（蛍光）標識した二次抗体，例えば抗マウスＩｇＭ抗体とともに，自動化セルソーター（例えば，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に入れる。この方法においては，特定の細胞集団を分離するために，標的細胞上に存在する第２のエピトープを（蛍光）標識抗マウスＩｇＭ抗体とは異なる抗体で標識する。したがって，この場合には２回標識された細胞のみを特異的に選択することができる。このことにより，組換えヴィスクミンによる治療に関して患者を予測する別の可能性が提供され
る。
【００９０】
さらに，対応する細胞集団の何パーセント（２回染色した細胞対第２抗体でのみ染色された細胞）が所望のＣＤ７５ｓエピトープを有するかについての情報を得ることができる。そのような分析から，疾患の微量残留物が存在するか否かを評価するかまたは調べることができる。さらに，他の抗腫瘍剤と組換えヴィスクミンとの組み合わせ療法をインビトロで試験して，患者に適用する準備をすることができる。
【００９１】
本明細書に記載される診断方法はまた，溶解した膜構造の分析を含む。とりわけ，例えば，新鮮な固定していない生検材料を界面活性剤（例えば，ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標），ＴｒｉｔｏｎＸ−１１２（登録商標），Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標），Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標），オクチルグリコシド等）で処理し，例えば，ウエスタンブロッティングにより，またはＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ試験の形で，溶解物を分析することが可能である。このことは，界面活性剤による溶解物を，本明細書に記載される（組換え）ヤドリギレクチン（（組換え）ヴィスクミン）の膜結合レセプターが元々存在していたかについて試験しうることを意味する。対応する分析のための十分な方法は当業者に知られている。
【００９２】
さらに別の態様においては，本発明は，上で定義したレセプターの１つに特異的に結合するかまたは認識する物質を，増殖性疾患（例えば癌），ウイルス疾患（例えば，ヘルペス，ＨＩＶ），自己免疫疾患または神経性疾患を治療するための医薬組成物の製造のために用いることに関し，ここで，レセプター結合物質またはレセプター認識物質は，抗体，抗体誘導体，抗体フラグメント，アプタマー，低分子量物質および炭水化物結合ペプチドからなる群より選択される。好ましくは，レセプター結合物質またはレセプター認識物質は，ヤドリギレクチンおよび／または組換えヴィスクミンのＢ鎖のそのレセプターへの結合を阻害するかまたは弱めることができる。
【００９３】
本発明の文脈においては，"阻害する"との用語は，完全な阻害ならびに部分的な阻害を記述する。すなわち，この用語は，ヤドリギレクチンおよび／または組換えヴィスクミンが，特異的レセプターとして同定された炭水化物構造に結合することを完全に妨害することを含む。さらに，ヤドリギレクチンおよび／または組換えヴィスクミンのレセプターへの結合を弱める能力もまた含まれる。
【００９４】
医薬組成物を製造するための上述の物質は，ヤドリギレクチンではなく，特にヤドリギレクチンのＢ鎖ではない。
【００９５】
本発明のこの態様は，さらに好ましくは，"薬学的に許容しうる担体"および／または希釈剤との組み合わせでもよい医薬組成物の処方に関する。特に適した薬学的に許容しうる担体の例は当業者に知られており，緩衝化食塩水，水，エマルジョン，例えば，水中油エマルジョン，各種の界面活性剤，滅菌溶液等が含まれる。そのような担体を含む医薬組成物は，既知の慣用の方法を用いて製剤することができる。これらの医薬組成物は，適当な投与量で個体に投与することができる。投与は，経口または非経口的に行うことができ，例えば，静脈内，腹腔内，皮下，筋肉内，局所，鼻腔内，気管支内または皮膚内に，またはカテーテルを用いて動脈内に投与することができる。投与の種類は臨床的因子に応じて担当医師が決定することができる。投与の種類は種々の因子，例えば，患者の身長または体重，体表面積，年齢，性別または一般的状態により異なり，また，投与される特定の物質，投与の持続時間および種類，および同時に投与される可能性のある他の医薬品等によっても異なることは当業者に知られている。典型的な投与量は，例えば，０．００１−１，０００μｇの範囲内であり，特に上述の因子を考慮する場合にはこの例示的範囲より高いかまたは低い範囲も考えられる。一般に，本発明の組成物を規則的に投与する場合，投与量は１日または１回投与間隔あたり１０ｎｇ−１０ｍｇユニットの範囲内であるべきで
ある。組成物を静脈内投与する場合には，投与量は１ｎｇ−０．１ｍｇユニット／ｋｇ体重／分の範囲内であるべきである。
【００９６】
組成物は，局所的に投与しても全身的に投与してもよい。非経口投与用の製剤は，滅菌した水性のまたは非水性の溶液，懸濁液および乳濁液を含む。非水性希釈剤の例は，プロピレングリコール，ポリエチレングリコール，植物油，例えば，オリーブ油，および有機エステル組成物，例えば，エチルオレエートであり，これらは注射用に適している。水性担体には，水，アルコール性水性溶液，乳濁液，懸濁液，食塩水および緩衝化媒体が含まれる。非経口的担体には，塩化ナトリウム溶液，リンゲルデキストロース，デキストロースおよび塩化ナトリウム，リンゲル乳酸および結合油が含まれる。静脈内担体には，例えば，液体用補充物，栄養および電解質（例えば，リンゲルデキストロースに基づくもの）が含まれる。本発明の組成物はさらに，保存剤および他の添加剤，例えば，抗微生物化合物，抗酸化剤，キレート剤および不活性ガスを含むことができる。さらに，意図される用途により，インターロイキン，成長因子，分化因子，インターフェロン，走化性蛋白質または非特異的免疫調節剤等の化合物を含んでいてもよい。特に好ましくは，細胞増殖抑制剤，抗生物質およびこれらの組み合わせを含むことができる。製造される医薬組成物または医療用製品は，上述の病気の１つまたは疾患の１つの予防または治療に用いることができる。
【００９７】
抗体，抗体フラグメント，抗体誘導体およびアプタマーの製造および単離の方法は，上述した従来技術から当業者には知られており，上記でより詳細に説明されている。
【００９８】
本発明にしたがえば，ヤドリギレクチンまたは組換えヴィスクミンのＢ鎖に対応する物質またはこれらの誘導体は，レクチンおよび炭水化物結合ペプチドの群には含まれない。しかし，この態様は，とりわけ，生化学的修飾および／または分子生物学的修飾（例えば特異的突然変異誘発）により，その結合特性に関して，本明細書に記載されるレセプターに対するＢ鎖の結合特性に適合するよう改変されている他のレクチンを含む。
【００９９】
さらに，別の好ましい態様においては，レセプター結合物質および／またはレセプター認識物質を，放射性，細胞毒性または細胞増殖抑制性効果を有する化合物と結合させる。
【０１００】
この態様においては，放射性，細胞毒性または細胞増殖抑制性効果を有する化合物への物質の結合の種類は，その物質および化合物によって異なる。好ましくは，両方とも，例えば，ペプチドまたは蛋白質である。この場合には，結合は，好ましくは，１またはそれ以上のペプチド結合および／またはジスルフィド結合により行う。
【０１０１】
放射性物質で標識したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはサイトカインは，放射性免疫物質の例である。さらに好ましい態様においては，対応する物質を，レクチン，トキシンまたはトキソイド，好ましくは細菌由来のもの（例えば，破傷風トキソイド，破傷風毒素，ジフテリア毒素，コレラ毒素，シュードモナスエキソトキシン，シュードモナストキソイド，百日咳毒素，百日咳トキソイド，クロストリジウムエキソトキシンまたはクロストリジウムトキソイド），または植物由来のもの（タイプＩＲＩＰ，例えば，サポリンまたはゲロニン，またはタイプＩＩＲＩＰ，例えば，リシンまたはタイプＩＩＲＩＰのＡ鎖またはタイプＩＲＩＰのＡ鎖，これはタイプＩＩＲＩＰと相同である）と結合させる。さらに，放射性，細胞毒性または細胞増殖抑制性効果を有する他の低分子量分子（小分子），および上述したもの以外の高分子もまた含まれる。
【０１０２】
"高分子"との用語は，高い分子複雑性または高い分子量を有する分子を表す。これらは，好ましくは，生物分子，例えば，バイオポリマー，特に蛋白質，オリゴペプチドまたはポリペプチドであるが，ＤＮＡ，ＲＮＡ，オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド，
補欠分子団，脂質，オリゴ糖および多糖類，およびこれらの改変物，ならびに合成分子も含まれる。蛋白質は，好ましくは融合蛋白質をも含む。ペプチドまたは蛋白質との用語には，天然のおよび合成のペプチドまたは蛋白質が含まれる。天然の蛋白質の例には，とりわけ，抗体，抗体フラグメント，その特定のリガンドに結合するレセプター，その特定のレセプターと相互作用するペプチド性リガンド，または，蛋白質および補酵素等の特定の基質と相互作用するペプチドドメイン，および他のペプチドまたは酵素等が含まれる。さらに，組換え的に製造された形の上述の蛋白質またはペプチドもまた含まれる。対応して，天然のペプチドには，とりわけ，特定のアフィニティーリガンドと相互作用する上述の蛋白質のフラグメントが含まれる。合成の蛋白質またはペプチドには，発現させるように導かれた偽遺伝子またはそのフラグメント，およびランダムなアミノ酸配列を有する蛋白質またはペプチドが含まれる。
【０１０３】
"低分子量分子"との用語は，上で定義した高分子より低い分子複雑性を有する分子を表す。文献においては，"小分子"または"低分子量分子"との用語は一貫して用いられていない。ＷＯ８９／０３０４１およびＷＯ８９／０３０４２においては，７，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する分子を小分子と記述している。しかし，一般には，５０−３，０００ｇ／ｍｏｌ，より一般には７５−２，０００ｇ／ｍｏｌ，最も一般的には１００−１，０００ｇ／ｍｏｌの分子量の範囲を示す。当業者は，以下の文献からその例を知ることができる：ＷＯ８６／０２７３６，ＷＯ９７／３１２６９，ＵＳ−Ａ−５９２８８６８，ＵＳ−Ａ−５２４２９０２，ＵＳ−Ａ−５４６８６５１，ＵＳ−Ａ−５５４７８５３，ＵＳ−Ａ−５６１６５６２，ＵＳ−Ａ−５６４１６９０，ＵＳ−Ａ−４９５６３０３およびＵＳ−Ａ−５９２８６４３。
【０１０４】
オリゴマーまたは小有機分子，例えば，オリゴペプチド，オリゴヌクレオチド，炭水化物（グリコシド），イソプレノイドまたは脂質構造は，そのような小分子の例として挙げることができる。文献においては，ほとんどの場合，そのような小分子の定義は分子量に基づく。
【０１０５】
本発明の別の好ましい態様においては，レセプター結合物質および／またはレセプター認識物質に結合した上述の化合物はペプチドである。
【０１０６】
本発明にしたがう使用のさらに別の好ましい態様においては，レセプター結合物質および／またはレセプター認識物質は，免疫エフェクター機能を誘導することができるさらに別のドメインを含む。
【０１０７】
本発明の文脈においては，"免疫エフェクター機能"との用語は，とりわけ，レセプター（標的細胞）を有する細胞の排除につながる免疫系のエフェクター機能を記述する。排除は，好ましくは，プログラムされた細胞死（アポトーシス）の誘導であるが，また，標的細胞の壊死性排除であってもよい。細胞死を検出するためのインビトロ方法は当業者に知られている（とりわけ，Ｄｕｌａｔら（２００１）を参照）。
【０１０８】
そのような免疫エフェクター機能の誘導は，好ましくは，生物の免疫系のために標的細胞を標識するシグナルの誘導である。好ましくは，標的細胞は，この誘導によってのみ免疫系により認識される。この誘導により，細胞が免疫系によってより良く認識されることがさらに好ましい。免疫系による標的細胞の認識またはより良い認識により，標的細胞の治療が可能となる。
【０１０９】
好ましい態様においては，誘導される免疫エフェクター機能は細胞性エフェクター機能である。細胞媒介性免疫エフェクター機能の例は，エフェクター−Ｔ−細胞，単球またはマクロファージによる標的細胞の排除である。特に，細胞性エフェクター機能には，ＭＨ
Ｃ媒介性およびＦc−レセプター媒介性エフェクター機能が含まれる。
【０１１０】
別の好ましい態様においては，誘導される免疫エフェクター機能は体液性エフェクター機能である。免疫系の体液性エフェクター機能の例は，抗体媒介性反応または補体系の反応である。この点に関して，標的細胞のオプソニン化の誘導は本発明の好ましい態様である。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】組換えヴィスクミンおよびリシンの種々のレセプターの可能な構造の概略図である。
【図２】種々の細胞画分における組換えヴィスクミン特異的ガングリオシドの同定のためのＴＬＣ試験の図である。
【図３】単離されたガングリオシド上の炭水化物に対する組換えヴィスクミンの結合特異性を明確化するためのＴＬＣ試験の図である。
【図４】リシンに特異的な結合モチーフを同定するためのＴＬＣ試験の図である。
【図５】リシンのガングリオシドへの結合のＴＬＣ試験の図である。
【図６】種々の感受性細胞株を用いる細胞毒性試験の図である。
【図７】組換えヴィスクミンに対する感受性と組換えヴィスクミンに特異的なガングリオシドバンドの出現との半定量的相関の図である。
【図８】特定のガングリオシドとのプレインキュベートによる，組換えヴィスクミンに対して非感受性の細胞株ＣＨＯ−Ｋ１に関する感受性化の図である。
【図９】マイクロタイタープレートに吸着させた中性ＧＳＬおよびガングリオシドを用いる組換えヴィスクミンの酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）の図である。
【図１０】免疫に用いたガングリオシド抗原に対する特異的抗体の同定の図である。
【図１１】ネオラクト系の抗α２−６シアリル化モノクローナルガングリオシド抗体の特性決定の図である。
【図１２】ネオラクト系の抗α２−６シアリル化モノクローナルガングリオシド抗体のさらなる特性決定の図である。
【図１３】糖蛋白質上の組換えヴィスクミンのＣＤ７５ｓの認識の検出の図である。
【図１４】糖蛋白質上の組換えヴィスクミンのＣＤ７５ｓの認識の検出の図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
図１：  組換えヴィスクミンおよびリシンの種々のレセプターの可能な構造（概略図）
リシン（図１Ａ）および組換えヴィスクミン（図１Ｂ）のレセプターの概略図。示されるものは，図２および３および図４および５にまとめられているＴＬＣ重層アッセイの結果の解釈の結果である。Ｇａｌ＝ガラクトース，ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチル−グルコサミン，Ｇｌｃ＝グルコース，Ｃｅｒ＝セラミド，Ｓｉａｌｉｃ＝シアル酸。組換えヴィスクミンのレセプターは末端α２−６結合シアル酸残基を有するガングリオシドである。リシンにより認識される構造（図１Ａ）の認識は，組換えヴィスクミンによっては行われない。
【０１１３】
図２：  種々の細胞画分における組換えヴィスクミン特異的ガングリオシドの同定のためのＴＬＣ試験
組換えヴィスクミンと，ヒト顆粒球の中性ＧＳＬ（Ａ）およびガングリオシド（Ｂ）とのＴＬＣ重層結合試験。（Ａ）レーンａ：１５μｇの中性ＧＳＬのクロマトグラム（オルシノールで染色，完全糖染色）；レーンｂ：対応する重層アッセイ。（Ｂ）レーンａ：ヒト顆粒球からの１５μｇのヒトガングリオシドのクロマトグラム（レゾルシノールで染色，シアル酸染色）；レーンｂ：対応する重層アッセイ。
【０１１４】
図３：  単離されたガングリオシド上の炭水化物に対する組換えヴィスクミンの結合特異性を明確化するためのＴＬＣ試験
（Ａ）レゾルシノール染色（実施例１）；（Ｂ）抗ＩＶ6ｎＬｃ４Ｃｅｒ抗血清のＴＬ
Ｃ重層試験（実施例１）；（Ｃ）組換えヴィスクミンのＴＬＣ重層試験（実施例２）：すべてのＴＬＣアッセイは，ＨＰＬＣで精製したα２−３−およびα２−６−シアリル化ネオラクト系モノシアロガングリオシドを用いて行った。適用は３つのクロマトグラムすべてについて同一である：レーンａ：１５μｇのヒト脳ガングリオシド（ＨＢＧ）；レーンｂ：１５μｇのヒト顆粒球ガングリオシド（ＨＧＧ）；レーンｃ：４μｇのＩＶ3ｎＬｃ
４Ｃｅｒ（ＨＧＧ１）；レーンｄ：４μｇのＶＩ3ｎＬｃ６Ｃｅｒ（ＨＧＧ２）；レーン
ｅ：４μｇのＩＶ6ｎＬｃ４Ｃｅｒ（ＨＧＧ３）；レーンｆ：８μｇのＶＩ6ｎＬｃ６ＣｅｒおよびＩＶ6ｎＬｃ４Ｃｅｒ。
【０１１５】
図４：  リシンに特異的な結合モチーフを同定するためのＴＬＣ試験
中性ＧＳＬを用いる（Ａ）オルシノール染色および（Ｂ）リシンＴＬＣ重層試験。適用は両方のクロマトグラムについて同一である。レーンａ：ヒト赤血球からの１０μｇの中性ＧＳＬ：レーンｂ：ヒト顆粒球からの１５μｇの中性ＧＳＬ；レーンｃ：ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞からの２０μｇの中性ＧＳＬ。
【０１１６】
図５：  リシンのガングリオシドへの結合のＴＬＣ試験
ガングリオシドを用いる（Ａ）オルシノール染色および（Ｂ）リシンＴＬＣ重層試験。レーンａ：１０μｇのヒト脳ガングリオシド（ＨＢＧ）；レーンｂ：８μｇのヒト顆粒球ガングリオシド（ＨＧＧ）。
【０１１７】
図６：  種々の感受性細胞株を用いる細胞毒性試験
組換えヴィスクミンの生物学的活性の説明：ＨＬ−６０細胞（点），５６３７細胞（三
角）およびＣＨＯ−Ｋ１細胞（白丸）の生存率を，組換えヴィスクミン濃度に対して示す。生存率はＷＳＴ−１の比色反応により測定し，未処理対照と比較した％生存細胞として示す。最大の半分の細胞毒性は曲線の変曲点に対応し，これを測定可能な変数とした。これらのＩＣ50値は，ＨＬ−６０については６６ｐｇ／ｍｌ，５６３７細胞については６９０ｐｇ／ｍｌと計算された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は，測定に適用した組換えヴィスクミン濃度である３００ｎｇ／ｍｌまでの組換えヴィスクミンに対して非感受性であると考えられる。
【０１１８】
図７：  組換えヴィスクミンに対する感受性と組換えヴィスクミンに特異的なガングリオシドバンドの出現との半定量的相関
インビトロで増殖させた細胞株からのガングリオシドを用いる（Ａ）オルシノール染色，および（Ｂ）抗ＩＶ6ｎＬｃ４Ｃｅｒ抗血清ＴＬＣ重層試験。（Ａ）レーンａ：７μｇ
のヒト顆粒球ガングリオシド（ＨＧＧ）；レーンｂ：１ｘ１０7個のＣＨＯ−Ｋ１細胞か
らのガングリオシド；レーンｃ：４ｘ１０7個の５６３７細胞からのガングリオシド；レ
ーンｄ：４ｘ１０7個のＨＬ−６０細胞からのガングリオシド；レーンｅ：１０μｇのヒ
ト脳ガングリオシド（ＨＢＧ）。（Ｂ）レーンａ：０．１３４μｇのヒト顆粒球ガングリオシド（ＨＧＧ）；レーンｂ：１ｘ１０7個のＣＨＯ−Ｋ１細胞からのガングリオシド；
レーンｃ：１ｘ１０7個の５６３７細胞からのガングリオシド；レーンｄ：１ｘ１０7個のＨＬ−６０細胞からのガングリオシド；レーンｅ：１０μｇのヒト脳ガングリオシド（ＨＢＧ）。レーンａは，ネオラクト系の特異的ガングリオシドの同定のための陽性対照ＩＶ6ｎＬｃ４Ｃｅｒ（Ｃ２４脂肪酸，物質１）およびＩＶ6ｎＬｃ４Ｃｅｒ（Ｃ１６脂肪酸，物質２）を示す。
【０１１９】
図８：  特定のガングリオシドとのプレインキュベートによる，組換えヴィスクミンに対して非感受性の細胞株ＣＨＯ−Ｋ１に関する感受性化
増加する量のヒト顆粒球ガングリオシドをウエルに入れ，ここでＣＨＯ−Ｋ１細胞を成長させ，４８時間インキュベートした。細胞を無血清培地（薄い灰色のバンド）または血清含有培地（濃いバンド）のいずれかで洗浄し，次に３００ｎｇ／ｍｌの組換えヴィスクミンでさらに４８時間処理した。生存率はＷＳＴ−１を用いて測定し，未処理対照（ガングリオシドおよび組換えヴィスクミンを加えない）に対する％で表した。
【０１２０】
図９：  マイクロタイタープレートに吸着させた中性ＧＳＬおよびガングリオシドを用いる組換えヴィスクミンの酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）
異なる起源からのＧＳＬの量は，左から右に以下のバンドに対応する：
Ａ）  ヒト赤血球からの中性ＧＳＬ：１０，５，２．５，１．２５および０μｇ
Ｂ）  ヒト顆粒球からの中性ＧＳＬ：１５，７．５，３．７５，１．９および０μｇ
Ｃ）  ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞からの中性ＧＳＬ：２０，１０，５，２．５および０μｇ
Ｄ）  ヒト脳ガングリオシド（ＨＢＧ）：１０，５，２．５，１．２５および０μｇ
Ｅ）  ヒト顆粒球ガングリオシド（ＨＧＧ）：１０，５，２．５，１．２５および０μｇ
【０１２１】
図１０：  免疫に用いたガングリオシド抗原に対する特異的抗体の同定
種々のハイブリドーマクローンを薄めた後にＥＬＩＳＡでＩｇＭ（Ａ）およびＩｇＧ（Ｂ）の産生について試験した。ＥＬＩＳＡは実施例８に記載されるようにして行った。基質溶液のインキュベート時間を変化させた（１５分間，３０分間，４５分間，６０分間，１２０分間および１８０分間）。クローン３３．３，３３．５および３３．６は，ＩｇＭに対して明らかなタイターを示した（Ａ）。試験したクローンのいずれにおいても，ＩｇＧに対するタイターは検出できなかった（Ｂ）。
【０１２２】
図１１：  ネオラクト系の抗α２−６シアリル化モノクローナルガングリオシド抗体の特性決定
ｍＡｂクローンの認識モチーフの特性決定のためのＴＬＣ重層アッセイ。実施例２に記載されるように，ＤＣプレート上で分離されたヒト顆粒球ガングリオシド（４μｇ／レーン）を検出するために，図１０に既に示したクローンを，その認識モチーフについて調べた。クローン５９．３３．３，５９．３３．５および５９．３３．６は，組換えヴィスクミンと同一の結合または認識モチーフを示す。
【０１２３】
図１２：  ネオラクト系の抗α２−６シアリル化モノクローナルガングリオシド抗体のさらなる特性決定
（Ａ）ヒト顆粒球から単離したネオラクト系の中性ＧＳＬ（１５μｇ／レーン），（Ｂ）グロボ系（ヒト赤血球より；１０μｇ／レーン）および（Ｃ）ガングリオ系（ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞より；１０μｇ／レーン）を用いるＴＬＣ重層アッセイ。実験方法は実施例９に記載される。図１２Ａ−Ｃのそれぞれの最初の３つのレーンにおいては，ｍＡｂクローン５０．３３．３，５９．３３．５および５９．３３．６を用いた。図１２Ａ−Ｃのレーン４の陽性対照は，適用した中性ＧＳＬの末端糖構造のそれぞれに対する特異的抗体との反応を反映する。レーン５においては，ヤギ由来のポリクローナル抗血清（Ｍｕｔｈｉｎｇら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２，４８５−４９７を参照）を試験した。レーン１−３で試験したｍＡｂクローンの交叉反応性は無視することができる。
【０１２４】
図１３：  糖蛋白質上の組換えヴィスクミンのＣＤ７５ｓの認識の検出
それぞれ１μｇの対応する蛋白質。レーンＴ：トランスフェリン，Ｎｅｕ５Ａｃａ２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性蛋白質，およびレーンＡＦ：アシアロフェツイン，（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−残基およびＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）をＳＤＳゲルに負荷し，次にニトロセルロース膜に写した。次にこれをウエスタンブロット手法において，組換えヴィスクミン（１μｇ／ｍｌ）により，次に抗Ａ鎖ｍＡｂＴＡ５およびアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧにより，ＣＤ７５ｓ構造の検出を試みた（実施例２を参照）。Ｍは標識の痕跡を反映する。分子量はｋＤａで示される。
【０１２５】
図１４：  糖蛋白質上の組換えヴィスクミンのＣＤ７５ｓの認識の検出
それぞれ１μｇの対応する蛋白質。レーンＴ：トランスフェリン，Ｎｅｕ５Ａｃａ２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性蛋白質，レーンＡＦ：アシアロフェツイン，（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−残基およびＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）をＳＤＳゲルに適用し，次にニトロセルロース膜に写した。次に，実施例９に記載されるように，ウエスタンブロットにおいて，ｍＡｂ５９．３３．３および５９．３３．５を用いてＣＤ７５ｓ構造の検出を試みた。
【０１２６】
【表１】
2010156699.tif 000002
【０１２７】
以下の実施例は，本発明を例示する。
実施例１：  スフィンゴ糖脂質を分離および検出し，これらを特異的に検出するための薄層クロマトグラフィー
中性ＧＳＬはヒト顆粒球，ヒト赤血球およびＭＤＡＹ−Ｄ２細胞から回収し，ガングリオシドはヒト顆粒球およびヒト脳から回収した（図２，図４，図５および図７）。分析にはＨＰＬＣ精製サンプルを用いた（図３）。対応するサンプルは，シリカゲルでコーティングした薄層クロマトグラフィープレート（ＨＰＴＬＣプレート，１０ｘ１０ｃｍ，０．２ｍｍ厚さ，Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ＃５６３３）で分離した。中性ＧＳＬは溶媒１（クロロホルム／メタノール／水，１２０／７０／１７  ｖ／ｖ／ｖ）中で，ガングリオシドは溶媒２（クロロホルム／メタノール／水１２０／８５／２０  ｖ／ｖ／ｖ＋２ｍＭＣａＣｌ2）中で分離した。中性ＧＳＬはオルシノールで染色し，ガングリオシドは
オルシノールまたはレゾルシノールのいずれかで染色した（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，１９５６，１９５７）。ヒト顆粒球およびＭＤＡＹ−Ｄ２細胞からの中性ＧＳＬ，およびヒト顆粒球からのガングリオシドはＤＣプレート上で二本のバンドとして現れる。
【０１２８】
個々のガングリオシドを同定するために，特異的抗血清を用いて，Ｍｕｔｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｕｈｌｒａｄｔ（１９８８）およびＭｕｔｈｉｎｇ（１９９８）にしたがって，免疫染色法を行った。ポリクローナル抗ＩＶ6ｎＬｃ４Ｃｅｒ抗血清を用いてネオラクト
系の末端α２−６−シアリル化ガングリオシドを同定した。これを行うために，最初にプレートをポリイソブチルメタクリレート（Ｒｏｈｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）で固定した。次に，プレートをＰＢＳ（２０ｍＭリン酸，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．２）＋１％ＢＳＡ（溶液Ａ）中でブロッキングした。次に，上で同定したポリクローナル抗血清を溶液Ａ中１：１，０００希釈で用い，次に溶液Ｂ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。結合した抗血清は，溶液Ａ中１：２，０００希釈の二次抗血清ウサギ抗トリＩｇＹで検出した。次に，これを溶液Ｂで３回，グリシンバッファー（０．１Ｍグリシン，１ｍＭ  ＺｎＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ１０．４）で１回洗浄した。検出は，グリシンバッファー中の０．０５％（ｗ／ｖ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を用いて行った。別のＴＬＣ試験において用いた対照ガングリオシドは詳細に特性決定されており，ヒト血液細胞または培養細胞からの種々の単離物に由来する組換えヴィスクミンに特異的なガングリオシドの同定において参照物質として用いた（Ｍｕｔｈｉｎｇら，１９９４；Ｍｕｔｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｅｍｍｉｎｅｒ，１９９６；Ｓｃｈｗａｒｔｚら，１９８５；Ｍｕｔｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｃｉｃ，１９９７）。
【０１２９】
実施例２：  中性ＧＳＬまたはガングリオシドに結合した炭水化物結合蛋白質（例えばリシンおよび組換えヴィスクミン）を特異的に検出するためのＴＬＣ試験
薄層クロマトグラフィープレートで分離した中性ＧＳＬまたはガングリオシドをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ８０（０．１ｇ／Ｌ  Ｔｗｅｅｎ８０，ＰＢＳ中）で洗浄した。次に，組換えヴィスクミンまたはリシン蛋白質溶液（１μｇ／ｍｌ，ＰＢＳ−Ｔ８０中）でコーティングを行い，１時間インキュベートした。次に，溶液Ｂ（実施例１を参照）で洗浄し，次にプレートを溶液Ａ（実施例１を参照）中で１５分間インキュベートした。次に，結合した組換えヴィスクミンは，モノクローナルＡｂＴＡ５（１μｇ／ｍｌ，溶液Ａ中）（Ｔｏｎｅｖｉｔｚｋｙら１９９５に記載）を用いて認識し，または結合したリシンは，ウサギ抗リシン抗血清（Ｓｉｇｍａ＃Ｒ−１２５４（溶液Ａ中１：２００希釈））で認識した。結合した抗体の検出は，それぞれマウスまたはウサギイムノグロブリンに対する二次抗体を用いて，実施例１に記載されるようにして行った。
【０１３０】
実施例３：  種々の細胞株の組換えヴィスクミンに対する感受性の比較
培養：
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）およびＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）は，ＤＭＥＭおよびＨａｍ’ｓＦ１２培地の１：１混合物中で成長させた。
ヒト膀胱癌細胞株５６３７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９）はＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞の培養は，Ｍｏｃｋｅｌら（１９９７）に記載される標準的な条件下で行った。組換えヴィスクミンに対する細胞株の感受性は，インビトロ細胞毒性試験において確認した。それぞれウエルあたり８ｘ１０3個の５６３７細胞，１ｘ１０4個のＣＨＯ−Ｋ１細胞および１．８ｘ１０4個のＨＬ−６０細胞を９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）に播種し，増加
する濃度の組換えヴィスクミンとともに，最終容量１００μｌで１０％ＣＯ2雰囲気で３
７℃で７２時間インキュベートした。すべての測定は６回の判定で行った。７２時間後，生きている細胞を検出するために，１０μｌのＷＳＴ−１をピペットで加えた（Ｉｓｈｉｙａｍａら，１９９３；Ｍｏｃｋｅｌら，１９９７）。細胞は着色塩とともに３７℃で４時間インキュベートし，次にＴｈｅｒｍｏｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍで測定した。ここでは，染料の量は生きている細胞の数に直接比例する。図６は，増加する組換えヴィスクミン濃度に対する種々の細胞集団の生存曲線を示す。
【０１３１】
細胞株ＨＬ−６０（点）は，組換えヴィスクミンに非常に高い感受性をもって反応するヒト前骨髄細胞株であり，ＩＣ50値は６６ｐｇ／ｍｌである。膀胱癌細胞株５６３７（三角）においてはＩＣ50の測定値は６９０ｐｇ／ｍｌであり，ハムスター細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（白丸）は３００ｎｇ／ｍｌまでの試験濃度では組換えヴィスクミンに対して感受性を示さなかった。種々の細胞株の組換えヴィスクミンに対する感受性は，図７において潜在的レセプターが生ずることと相関しうる。図７Ａは，それぞれの場合に用いた細胞株の完全ガングリオシド分画のオルシノール染色薄膜クロマトグラムを示す。図７Ｂは，抗Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ抗血清を用いる潜在的組換えヴィスクミンレセプターの特異的免疫学的検出（重層アッセイ）を示す。図７Ｂのレーンｂ，ｃおよびｄにおいては，それぞれＣＨＯ−Ｋ１，５６３７およびＨＬ−６０細胞の同一の細胞数のガングリオシドの量を負荷した。図７Ｂのレーンｂにおいて，組換えヴィスクミンに非感受性であるＣＨＯ−Ｋ１細胞はこのレベルの潜在的レセプターに対しては特異的バンドを示さない。一方，同じ細胞数を負荷した場合，最も感受性の高い細胞株（ＨＬ−６０）は最も強い二重のバンドを示す。
【０１３２】
ＴＬＣ重層アッセイにおいて観察された，試験したレクチンの異なる特異性から，リシンおよびヤドリギレクチン（特に組換えヴィスクミン）の，インビボまたは培養細胞におけるそれらのレセプターへの結合の挙動について結論を得ることができる。この実施例は，ＣＨＯ−Ｋ１細胞株は試験した３００ｎｇ／ｍｌまでの濃度の組換えヴィスクミンに対して非感受性であることを示す（図６を参照）。しかし，組換えヴィスクミンに特異的なガングリオシド（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ構造）をＣＨＯ−Ｋ１細胞の膜に導入することにより，組換えヴィスクミンに対して非常に感受性の低いこれらの細胞が感受性となった（図８を参照）。
【０１３３】
実施例４：  特異的ガングリオシドとのプレインキュベーションによる細胞株の感受性化（図８を参照）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を９６ウエルプレートに細胞密度５ｘ１０3細胞／ウエルで播種した
。細胞は無血清Ｘ−Ｖｉｖｏ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で３７℃で２４時間培養した。次に，培地を廃棄し，０（対照），２５，５０，１００および２００μＭのヒト顆粒球ガングリオシド画分を含むＸ−Ｖｉｖｏ培地で置き換えた。ガングリオシドをＣＨＯ−Ｋ１細胞の膜に取り込ませるために，細胞を細胞培養条件下で３７℃で４８時間保持した。次に，細胞を無血清Ｘ−Ｖｉｖｏまたは５％ＦＣＳを含有するＸ−Ｖｉｖｏのいずれかでよく洗浄した。次に，細胞を組換えヴィスクミン（３００ｎｇ／ｍｌ）で４８時間処理した。細胞の生存率はＷＳＴ−１染色により定量し，未処理対照（組換えヴィスクミンおよびガングリオシドを加えない）と相関させた。サンプルは最終容量１００μｌ／ウエルで三重に成長させた。
【０１３４】
実施例５：  インビトロで増殖させた細胞のガングリオシドの精製および細胞株における特異的ガングリオシドの存在と組換えヴィスクミンに対する感受性との相関
続くＧＳＬまたはガングリオシドの単離のために細胞重量を示す：ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）およびＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）はＤＭＥＭとＨａｍ’ｓＦ１２培地との１：１混合物中で培養した。細胞は５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンおよび２．５ｍｇ／ＬのアンホテリシンＢの存在下で培養した。５６３７細胞の培養は，１７５ｃｍ2フラスコ中で行った。ＨＬ−６０およびＣＨＯ−Ｋ１細胞は，Ｄｕ
ｖａｒら（１９９６）およびＭｕｔｈｉｎｇら（１９９６ｂ）に記載されるようにして，１Ｌ−スピナーフラスコ中で培養した。生理学的パラメータは以下のとおりである：３７℃，ｐＨ７．２，酸素燻蒸，撹拌速度：４０ｒｐｍ。最終細胞密度に達した後に細胞を回収し，ＰＢＳで２回洗浄し，次にクロロホルム／メタノール抽出を行った（実施例１を参照）。ヒト膀胱癌細胞株５６３７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９）は，ＲＰＭＩ１６４０中で培養した。Ｌｅｄｅｅｎ  ａｎｄ  Ｙｕ（１９８２），Ｍｕｔｈｉｎｇら（１９８７）またはＤｕｖａｒら（１９９７）に記載されるように，陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる標準的方法により，ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂでガングリオシドを単離した。リン脂質のサポニン化のためには，ガングリオシドを１Ｎ  ＮａＯＨ中で３７℃で１時間インキュベートした。次に，ガングリオシド画分を酢酸で中和し，透析した。ラクトビーズ６ＲＳ−８０６０（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｕｅｎｏら，１９８７）への吸着クロマトグラフィーによりさらなる精製工程を行った。次に，細胞溶解物からガングリオシド画分を分離したとき，細胞の数が常にほぼ同じであると仮定した。すなわち，特定のガングリオシドの存在に関して，半定量的であるということが可能であった。検出は，実施例１に記載されるように，ポリクローナル抗ＩＶ6ｎ
Ｌｃ４Ｃｅｒ抗血清を用いて免疫学的に行った。
【０１３５】
実施例６：  ネオラクト系の末端α２−３−およびα２−６−シアル化ガングリオシドの精製
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ−６５０−Ｓ（ＭＥＲＣＫ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を充填したカラムにヒト顆粒球（ＨＧＧ）からのガングリオシドを加える。ＴＭＡＥに結合したガングリオシドは，酢酸アンモニアの直線勾配を用いて溶出し，プールし，脱イオン化する。末端α２−３−シアル化（ＨＧＧ１およびＨＧＧ２）および末端α２−３−シアル化ネオラクト系モノシアロガングリオシド（ＨＧＧ３およびＨＧＧ４）の４つの画分を得た。すべてのガングリオシドは，薄層クロマトグラフィーで二本のバンドとして分離された。この相違は，セラミド単位によるものであり，上側バンドはＣ２４脂肪酸で，下側バンドはＣ１６脂肪酸でエステル化されたものである。この方法で表すことができるすべてのガングリオシドの構造は既に特性決定されている（Ｍｕｔｈｉｎｇら，１９９３；Ｍｕｔｈｉｎｇら，１９９６，Ｍｅｔｅｌｍａｎｎら，２０００）。精製したガングリオシドは，図３に示されるように分離され，組換えヴィスクミンの炭水化物結合特異性をより詳細に特徴づけるために参照された。
【０１３６】
実施例７：酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）
ＥＬＬＡは，対応する中性ＧＳＬまたはガングリオシドで室温でコーティングされたプレート（ＮＵＮＣ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｆ９６，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）で行った。ウエルに１００μｌメタノール中の対応するＧＳＬを加えた。ＧＳＬ保存溶液から出発して，１：２希釈を調製した。これには以下のＧＳＬが含まれる：ヒト赤血球の中性ＧＳＬ：１０，５，２．５および１．２５μｇ；ヒト顆粒球の中性ＧＳＬ：１５，７．５，３．７５および１．９μｇ；ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞からの中性ＧＳＬ：２０，１０，５および２．５μｇ；ヒト脳ガングリオシド（ＨＢＧ）：１０，５，２．５および１．２５μｇ；ヒト顆粒球ガングリオシド（ＨＧＧ）：１０，５，２．５および１．２５μｇ。次に，乾燥雰囲気下でメタノールを蒸発させた（４５分間，３７℃）。以降のすべての工程は実施例２に記載されるＴＬＣ重層アッセイと同様にして行った。すべてのインキュベーションは，１０
０μｌの容量で行った。ＧＳＬをコーティングしたプレートを，ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）（０．０１ｍｇ／ｍｌ）とともに１５分間インキュベートし，次に１μｇの組換えヴィスクミン（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ８０に溶解）とともに１時間インキュベートした。その後，プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）（０．０１ｍｇ／ｍｌ）で洗浄し，次にＰＢＳとともに１５分間インキュベートした。次に，サンプルをネズミ抗ＭＬ−１Ａモノクローナル抗体ＴＡ５（１μｇ／ｍｌ，ＰＢＳ中）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）でさらに３回洗浄した後，ＰＢＳ中で１：２０００希釈の抗マウスＩｇＧ（アルカリホスファターゼ結合）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）でさらに３回洗浄した後，基質である４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムｘ６Ｈ2Ｏ（１６ｍＭ，０．１Ｍグリシンバ
ッファー中，ｐＨ１０．４）との反応により比色検出を行った。プレートを２５℃で２０分間インキュベートした後に，マイクロタイタープレートリーダーで４０５ｎｍで測定した。
【０１３７】
予測されなかったことに，組換えヴィスクミンのへの結合は，ネオラクト系のＧＳＬの末端でα２−６−結合ガラクトースがＮｅｕ５Ａｃ（ヒト顆粒球からのＨＧＧ画分）に曝露されているスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）においてのみ見られた。種々の起源（ヒト顆粒球および赤血球，ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞）からの，それぞれが末端ガラクトース残基を有する他のすべての中性ＧＳＬおよびガングリオ系のヒト脳ガングリオシドは，用いた最高濃度においても結合を示さなかった。
【０１３８】
実施例８：  ネオラクト系のα２−６−シアリル化ガングリオシドに対するモノクローナル抗体の製造
ネオラクト系のα２−６−シアリル化ガングリオシドは白血球（全血からのバフィコート）から単離した。ガングリオシドの精製は，実施例５に記載されるようにして行った。追加の工程においては，これらのネオラクト系のα２−６−シアリル化ガングリオシドを抗原として用いて，２ｘ３匹のマウスを免疫した。抗原はサイズが小さいために単独では免疫原効果を有しないため，これらはいわゆるハプテンとともにマウスに投与した。ここでは，２つの方法を平行して行った。方法１においては，メチル−ＢＳＡを１ｍｇ／ｍｌの濃度でハプテンとして用いた。３匹のマウスに異なる量の抗原を与えた（５，１０および２０μｇ）。マウスは既知の間隔で免疫し，１０日間の間隔でさらに合計２回ブースターを行った。方法２においては，リポソームとリポ多糖（ＬＰＳ）の混合物をハプテンとして用いた。この場合にも，異なる濃度の抗原（５，１０および２０μｇ）を，マウスに１０日間の間隔で３回与えた。
【０１３９】
２つの方法で免疫した合わせて６匹のマウスのうち，３匹のマウスの血液中で抗原に対する陽性のタイターを検出することができた。メチル−ＢＳＡのハプテンを用いた調製物は陰性であった。リポソーム中リポ多糖のハプテンを用いた調製物は，投与した抗原の用量に関係なくすべて陽性であった。マウスを犠牲死させ，脾臓細胞を用いて融合を行った。融合アッセイの上清をＤＣ重層アッセイ（実施例１および２に記載）およびＥＬＩＳＡで調べた。この工程においては，実施例７に記載されるように，マイクロタイタープレートを５０μｌメタノール中１μｇのＨＧＧガングリオシド（ヒト顆粒球ガングリオシド）でコーティングした。５０μｌの対応する血漿サンプルまたは融合アッセイの上清を希釈せずにコーティングされたプレートに加え，２５℃で６０分間インキュベートした。次に，ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。アルカリホスファターゼで標識した抗マウス−ＩｇＧまたは抗マウス−ＩｇＭ抗体を用いてＩｇＭまたはＩｇＧを検出した。基質ｐ−ＮＰＰの反応は，実施例７に記載されるようにして行った。次に，陽性タイターの融合アッセイをクローンレベルで希釈した。図１０Ａは，３つの陽性ＩｇＭクローン（５９．３３．３，５９．３３．５および５９．３３．６）の検出を示す。また，ＩｇＧの産生についてすべてのクローンを調べたが，ＩｇＧに対しては陽性反応を示さなかった（図１０Ｂ）。
【０１４０】
実施例９：  ネオラクト系の抗α２−６−シアリル化モノクローナルガングリオシド抗体の特性決定
ネオラクト系のα２−６−シアリル化ガングリオシドは常にその末端にＮｅｕ５Ａｃα２−６−Ｇａｌを持つ。別のモチーフ（これもまた本発明において記載される）は，Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ；（"Ｒ"は残基を表す）のガングリオシド構造を有する。このモチーフは，文献ではＣＤ７５ｓと記述される（Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ａｌｂｉｅｚ（２０００），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ  １４，２８４−２８５）。図１１は種々のＩｇＭクローンを用いるＤＣ重層アッセイを示し，これは実施例８に記載されるようにしてＥＬＩＳＡで試験した。ここでは，ヒト顆粒球（ＨＧＧ）からのガングリオシドを薄層クロマトグラフィーを用いて分離した。アッセイは実施例２に記載されるようにして行った。ここでは，４μｇのＨＧＧを分離した。プレートに結合した抗ＣＤ７５ｓｍＡｂの検出は，実施例８に記載されるようにして行った。クローン５９．３３．３，５９．３３．５および５９．３３．６は，この試験においても陽性シグナルを示した。３つのクローンはすべて同じガングリオシド（ＩＶ6
ｎＬＣ４およびＩＶ6ｎＬＣ６）を認識し，したがって，組換えヴィスクミン（図２Ｂｂ
）と同一の結合挙動を有していた。予測される，糖構造のコア部分に対する３種類の抗体の交叉反応性は，ヒト顆粒球からのネオラクト系（１レーンあたり１５μｇ；図１２Ａ），またはグロボ系（ヒト赤血球より，１０μｇ／レーン，図１２Ｂ）およびガングリオ系（ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞より；１０μｇ／レーン；図１２Ｃ）からの単離された中性ＧＳＬを用いることにより，実験的に無視することができた。実験方法は，上述したものと同一であった。図１２Ａ−Ｃのそれぞれについて，最初の３つのレーンにおいては，ｍＡｂクローン５９．３３．３，５９．３３．５および５９．３３．６を用いてシグナルを検出することができなかった。３つの場合すべてにおいて，末端α２−６結合シアル酸がないため，特異的シグナルが得られなかった。図１２Ａ−Ｃのレーン４の陽性対照は，負荷した中性ＧＳＬのそれぞれの末端糖構造に対する特異的抗体との反応を反映する。レーン５においては，ヤギからのポリクローナル抗血清（Ｍｕｔｈｉｎｇ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２，４８５−４９７を参照）を加えた。この抗血清は，元々はネオラクト系のα２−６−シアリル化ガングリオシドに対して調製したものであり，ここで適用した抗原の多くに対して交叉反応性を示す。このことは，特にこの抗血清を患者からの材料の試験に用いる場合に偽陽性シグナルにつながる可能性がある。レーン１−３に示される，モノクローナル抗体５９．３３．３，５９．３３．５および５９．３３．６を用いた結果は，そのような望ましくない交叉反応性は生じず，これはより重要であると考えなければならない。ｍＡｂ−クローン５９．３３．３は，ブダペスト条約にしたがって，２００２年１２月２０日にＤＳＭＺ，Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋに受託番号として寄託した。
【０１４１】
実施例１０：糖蛋白質上のＣＤ７５ｓの検出
モノクローナル抗体５９．３３．３および５９．３３．５（図１４）および組換えヴィスクミン（図１３）それ自体について，糖蛋白質上のＣＤ７５ｓモチーフの検出に用いることができるかどうかを試験した。ここでは，各１μｇの対応する蛋白質をＳＤＳゲルに適用し，次にニトロセルロースに写した：レーンＴ：トランスフェリン（ＮｅｕＳＡｃａ２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−残基を有する可溶性蛋白質），およびレーンＡＦ：アシアロフェツイン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ残基およびＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）。次に，組換えヴィスクミン（１μｇ／ｍｌ）および次に抗Ａ鎖ｍＡｂ  ＴＡ５およびアルカリホスファターゼで標識した抗マウスＩｇＧを用いてウエスタンブロットによりＣＤ７５ｓ構造の検出を試みた（実施例２を参照）。蛋白質をニトロセルロースに写した後にｍＡｂ５９．３３．３および５９．３３．５によるＣＤ７５ｓエピトープの結合／認識を調べる場合には，実施例９に記載されるようにして行った。トランスフェリンはｍＡｂ５９．３３．３および５９．３３．５により，および組換えヴィスクミンにより明白に認識される。試験した抗体クローン５９．３３．３および５９．３３．
５のいずれも，糖蛋白質トランスフェリン上のＣＤ７５ｓモチーフをエピトープとして認識する。
【０１４２】
参考文献
【表２】
2010156699.tif 000003
【０１４３】
【表３】
2010156699.tif 000004
【０１４４】
【表４】
2010156699.tif 000005
【０１４５】
【表５】
2010156699.tif 000006
【０１４６】
【表６】
2010156699.tif 000007
【０１４７】
【表７】
2010156699.tif 000008
【０１４８】
【表８】
2010156699.tif 000009
【図１】
2010156699.tif 000010
【図２】
2010156699.tif 000011
【図３】
2010156699.tif 000012
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2010156699000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月21日(2010.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤドリギレクチンまたはヤドリギレクチン一本鎖に対する個体の応答性を判定するための診断用組成物であって，α２−６グリコシド結合によりガラクトース（Ｇａｌ）に結合した末端Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）により特徴づけられるレセプターを特異的に認識するかまたはこれに結合する，抗体および抗体フラグメントの群より選択される物質を含む診断用組成物。
【請求項２】
レセプターが，ガラクトースにα２−６結合で結合したＮ−アセチルノイラミン酸の後に少なくともＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含むガングリオシドを含む，請求項１記載の診断用組成物。
【請求項３】
レセプターが，Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−Ｇａｌ−［Ｇａｌ／ＧｌｃＮＡｃ］Ｘ−Ｃｅｒの構造のガングリオシドを含む，請求項１または２記載の診断用組成物。
【請求項４】
レセプターが，Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３］ＸＧａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒの構造を有するガングリオシドを含む，請求項１−３のいずれかに記載の診断用組成物。
【請求項５】
レセプターが，Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒの構造を有するガングリオシド，またはＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒの構造を有するガングリオシドを含む，請求項１−４のいずれかに記載の診断用組成物。
【請求項６】
レセプターが細胞膜結合性である，請求項１−５のいずれかに記載の診断用組成物。
【請求項７】
ヤドリギレクチンが組換えヤドリギレクチン／組換えヴィスクミンである，請求項１−６のいずれかに記載の診断用組成物。
【請求項８】
組換えヤドリギレクチンが，配列番号１，配列番号３または配列番号５に示されるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む，請求項７記載の診断用組成物。
【請求項９】
組換えヤドリギレクチンが，配列番号２，配列番号４または配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか，またはその機能的フラグメントを含む，請求項７または８記載の診断用組成物。
【請求項１０】
細胞でレセプターを検出するために用いられる，請求項１−９のいずれかに記載の診断用組成物。
【請求項１１】
細胞が腫瘍細胞である，請求項１０記載の診断用組成物。
【請求項１２】
細胞が生検材料に由来する，請求項１０または１１記載の診断用組成物。
【請求項１３】
細胞が血液サンプルから単離されたものである，請求項１０または１１記載の診断用組成物。
【請求項１４】
抗体および抗体フラグメントの群より選択される物質は検出可能なように標識されている、請求項１−１３のいずれかに記載の診断用組成物。
【請求項１５】
抗体はモノクローナル抗体であり，これは２００２年１２月２０日にＤＳＭ  ＺＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５８０で寄託されたハイブリドーマ細胞株から回収することができる，請求項１−１４のいずれかに記載の診断用組成物。