(57)【要約】【課題】高効率に抗体を捕捉・分離することができる超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムにおいて、磁気ビーズの表面に付けるアフィニティー物質がプロテインＡである問題点と、アフィニティー・クロマトグラフィーで用いている安価なマンノシル・エリスリトールリピッド（MEL）は分離効率が悪い問題点を解決する。【解決手段】超伝導コイルを用いて発生させた磁界内に磁性フィルターを設け、磁性フィルターにより、抗体と結合するアフィニティー物質を表面に付けた磁気ビーズを吸着して捕捉し、磁界を消磁することにより捕捉した磁気ビーズをフィルターから分離する高勾配磁気分離装置に用いるアフィニティー磁気ビーズにおいて、表面のアフィニティー物質としてマンノシル・エリスリトールリピッド(MEL)を用いる。この超伝導コイルＬに対して抵抗Ｒ及びコンデンサＣを直列接続した消磁回路を設けると効率的にフィルターから磁気ビーズを分離できる。【選択図】図１
2010227907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に抗体と結合するアフィニティー物質を付けた磁性材からなるアフィニティー磁気ビーズにおいて、
前記アフィニティー物質としてマンノシル・エリスリトールリピッドを用いたことを特徴とするアフィニティー磁気ビーズ。
【請求項２】
超伝導コイルを用いて発生させた磁界内に磁性フィルターを設け、該磁性フィルターにより、抗体と結合するアフィニティー物質を表面に付けた磁気ビーズを吸着して捕捉し、磁界を消磁することにより捕捉した磁気ビーズをフィルターから分離する高勾配磁気分離装置に用いるアフィニティー磁気ビーズにおいて、
前記磁気ビーズ表面のアフィニティー物質としてマンノシル・エリスリトールリピッドを用いたことを特徴とするアフィニティー磁気ビーズ。
【請求項３】
前記アフィニティー磁気ビーズを、前記超伝導コイルＬの電源回路切断時に、該超伝導コイルＬに対して抵抗Ｒ及びコンデンサＣを直列接続し、該超伝導コイルに磁場を発生させた状態から、該ＬＲＣの直列共振回路を形成して交流磁場を発生させ、該交流磁場によりコイルを減衰させて消磁する消磁回路を備えている高勾配磁気分離装置に用いることを特徴とするアフィニティー磁気ビーズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
近年、最先端バイオ医療技術が相次ぎ実用化されようとしている。とくに、ヒト免疫機能を使う抗体医薬は高い効能が期待できるうえ、副作用も比較的少ないため、今後の医療の中心とみられている。抗体医薬は今後の医薬の主流に成るとされ、我が国の製薬会社各社は開発・実用化を急いでいる。
【０００２】
この抗体医薬やワクチンの開発・実用化に欠かせないのがダウンストリーム技術の抗体の連続・大量・高速の分離・精製技術である。近年、バイオ・創薬の分野において、アフィニティー・マイクロ／ナノビーズを用いた細胞・分子の分離（スクリーニング）技術が進歩し、多くの細胞・分子のタンパク質をビーズを用いて分離可能に成った。
【０００３】
しかし、現在、先行する非磁性ナノビーズは、分離にはアフィ二ティー・クロマトグラフィーを用いるため、数十倍から百倍にも希釈する必要がある。これに対し磁気ビーズで分離する場合は、希釈する必要はなく、高濃度のまま分離可能である。このため、処理速度は格段に向上する。
【０００４】
また、アフィ二ティー磁気ビーズと抗体が会合し結合する確率は、同じ質量のアフィ二ティー磁気ビーズを拡散させるとすると、アフィ二ティー磁気ビーズの直径をN分の一に小さくすると、同じ質量ではNの３乗倍の多数のアフィ二ティー磁気ビーズがコロイド状に分散して含まれることになり、この磁気ビーズの全表面積はN倍になり、したがって、結合する確率は少なく見積もってもN倍と格段に高くなり、処理時間の大幅な短縮が可能になり実用的に大変有利である。したがって、可能な限りアフィ二ティー磁気ビーズの直径は小さいほうが良いと考えられる。
【０００５】
しかし、この磁気ビーズの直径が小さいと、磁気ビーズに作用する磁気力が小さくなる為、既存技術では、永久磁石を使用していることもあり、分離できる磁気ビーズの大きさは直径が約１．５ミクロン程度以上に制限され、これ以下の直径の小さな磁気ビーズは捕捉することが出来なかった。
【０００６】
しかし、超伝導マグネットを用いることにより、永久磁石の数十倍から数百倍もの強力な磁場を発生させ、さらに、高勾配磁気分離の原理（局所的に大きな磁場勾配）を用いることで磁気ナノビーズを効率よく分離・精製（捕捉）出来ることを本発明者等が実験で示した。
【０００７】
この技術のシステム原理図を図３に示す。このシステムに基づく実験においては、小型冷凍機を採用した伝導冷却式である卓上型の小型超伝導電磁石３１を用いて、永久磁石の数十〜数百倍もの強力な磁場である、最大５Tの磁場を発生させる。小型超伝導電磁石３１の中心部分３２には直径約２６ｍｍの円筒状の室温の空間を持たせ、この空間に内径２０ｍｍ、外形２４ｍｍのガラス管３３を通し、この管３３の中に直径数〜数十ミクロン程度の磁性細線のステンレスウール３４からなるフィルター３５を挿入する。この直径数ミクロン程度のステンレス細線の周辺に高勾配磁場を作り出す。
【０００８】
このような装置において、所望の抗体のほか種々のタンパク質や他の物質が混入した溶液中に更に前記磁気ビーズを混合し、磁気ビーズに所望の抗体を結合した状態となっている溶液３６を、管３３の上方から注ぎ込む。この溶液３６は前記のような高勾配磁場を周囲に作り出すステンレスウール３４からなるフィルター３５内を通過するとき、磁気ビーズは超伝導電磁石によって得られる高磁界により磁気を帯びたビーズとなり、且つ４Ｔ程度の高磁界により局所的に磁化した磁性細線であるフィルター３５の周りに作られた非常に大きな磁場勾配によって所望の抗体を結合した磁気ビーズをフィルター３５に吸着する。
【０００９】
その後磁場を４Ｔから０Ｔに下げた後、磁性微粒子を含まないエタノールを前記と同様にフィルター３５に流し、それを更に濾紙で濾過して、濾紙上に磁性微粒子を捕捉することによって分離する。このように、固定したい目的物質を含む原液に磁性ナノビーズを混合し、この管に流すだけで、大容量の溶液から短時間に高効率で微量含有の貴重な目的物質を捕獲・分離できるようになった。
【００１０】
上記のような装置を用いて実際に免疫グロブリンを分離・精製する実験を行いその性能を確かめた。免疫グロフリンは糖を２％含むポリペプチドで、約１０〜１５ｎｍのＹ字形の分子で、図４（ａ）に示すようにＹ端部のＬ鎖（Light Chain)先端には抗体に特異的に結合する部位をもつ。したがってこの部位と特異的に結合する物質を磁性ナノ粒子の表面に付けることにより、免疫グロブリンの連続・高速の分離・精製が可能となる。このときに用いる表面活性剤は、既に酸化鉄等に対して開発されており、直径数ミクロンの磁性マイクロビーズは市販されている。
【００１１】
実験においては約１５０ｃｃのエタノールに、平均粒径約１００ｎｍのナノ磁性微粒子を０．０５ｇ加え、良く攪拌した後、強加工されて磁性を持った磁気分離用のＳＵＳ３０４細線フィルターとほぼ同一のフィルターで濾過した。次に濾過した磁性微粒子を含むエタノールを、４Ｔの磁場中にセットしたフィルターの中を約７〜２５ｃｃ／ｍｉｎの速度で流し、それを更に濾紙で濾過して磁性微粒子を捕捉した。その結果は、濾過後の液体について微粒子は検出できなかったのに対して、磁場をゼロにして同様の処理を行ったところ、０．０４ｇの微粒子が検出された。このことからこのシステムは極めて効率よく平均粒径約１００ｎｍの磁性微粒子を捕捉できることがわかった。このことから、医療用タンパク質のうち特に血清中に微量存在する免疫グロブリンの分離／精製に超伝導マグネットを用いた高勾配磁気分離システムが有効であることを確認した。
【００１２】
上記のような技術の開発によって、磁性ナノビーズの表面に抗体と特異的に結合するアフィ二ティー物質（リガンド）を付けることにより、抗体の連続・大量・高速の分離・精製技術が完成したものであり、現在はアフィ二ティー物質として、主にタンパク質系リガンドのプロテインAが用いられている。
【００１３】
なお、粒子状物質の表面に特定の抗体に特異的結合性を有する性状を持たせ、液体中から所望の抗体等を分離する技術は特開２００２−１１６３号公報（特許文献１）に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００２−１１６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
前記のように、本発明者等が提案している図３に示すような超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムの採用により、磁性ナノビーズの表面に抗体と特異的に結合するアフィ二ティー物質を付けることによって、抗体の連続・大量・高速の分離・精製技術が開発されたものであるが、ここではアフィ二ティー物質として、主にタンパク質系リガンドのプロテインＡが用いられている。
【００１６】
しかし、このプロテインＡの価格は、１００万円／ｋｇ程度と、非常に高価で、しかも、抗体のIgMやIgAには結合せず、IgGのFc部とのみ特異的に強く結合するという特性を備えている。
【００１７】
一方、従来より抗体を捕捉・分離する手法としてアフィニティー・クロマトグラフィー法を用いて行われており、その際にマンノシル・エリスリトールリピッド（Mannosyl Erythritol Lipid ：MEL）を用いて抗体を捕捉・分離することが行われている。このアフィニティー・クロマトグラフィー法を用いるときには、分離用のカラムの表面にマンノシル・エリスリトールリピッドを固定して、免疫グロブリンG（IgG）を分離しようとすると、その分離効率はプロテインＡの約７分の１に低下してしまう。これはカラム担体にマンノシル・エリスリトールリピッドを固定しても、分離効率はカラム担体の表面の細孔などの物性に依存するため低下すると考えられる。
【００１８】
したがって本発明は、従来、アフィニティー・クロマトグラフィー法において、比較的安価なマンノシル・エリスリトールリピッド（MEL）を用いて抗体を捕捉・分離する際の分離効率の低下を解消し、また、本発明者等が提案している、極めて高効率に抗体を捕捉・分離することができる超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムにおいて、磁性ナノビーズの表面に付けるアフィ二ティー物質として用いているプロテインＡが極めて高価であるという両問題点を解決することができる技術の提供を主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、本発明者等が提案している、極めて高効率に抗体を捕捉・分離することができる超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムにおいて、磁性ナノビーズの表面に付けるアフィ二ティー物質として、極めて安価なマンノシル・エリスリトールリピッド（MEL）を用いことにより、前記両問題点を一挙に解決したものである。
【００２０】
即ち、本発明に係るアフィニティー磁気ビーズは、前記課題を解決するため、表面に抗体と結合するアフィニティー物質を付けた磁性材からなるアフィニティー磁気ビーズにおいて、前記アフィニティー物質としてマンノシル・エリスリトールリピッドを用いたことを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る他のアフィニティー磁気ビーズは、超伝導コイルを用いて発生させた磁界内に磁性フィルターを設け、該磁性フィルターにより、抗体と結合するアフィニティー物質を表面に付けた磁気ビーズを吸着して捕捉し、磁界を消磁することにより捕捉した磁気ビーズをフィルターから分離する高勾配磁気分離装置に用いるアフィニティー磁気ビーズにおいて、前記磁気ビーズ表面のアフィニティー物質としてマンノシル・エリスリトールリピッドを用いたことを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る他のアフィニティー磁気ビーズは、前記アフィニティー磁気ビーズを、前記超伝導コイルＬの電源回路切断時に、該超伝導コイルＬに対して抵抗Ｒ及びコンデンサＣを直列接続し、該超伝導コイルに磁場を発生させた状態から、該ＬＲＣの直列共振回路を形成して交流磁場を発生させ、該交流磁場によりコイルを減衰させて消磁する消磁回路を備えた高勾配磁気分離装置に用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、従来、アフィニティー・クロマトグラフィー法において、比較的安価なマンノシル・エリスリトールリピッド（MEL）を用いて抗体を捕捉・分離する際の分離効率の低下を解消し、また、本発明者等が提案している、極めて高効率に抗体を捕捉・分離することができる超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムにおいて、磁性ナノビーズの表面に付けるアフィ二ティー物質として用いているプロテインＡが極めて高価であるという両問題点を一挙に解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】（ａ）は本発明によるアフィニティー物質を用いる超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離装置の例を示す図であり、（ｂ）は同装置に用いる消磁回路の例を示す図である。
【図２】本発明でアフィニティー物質として用いるマンノシル・エリスリトールリピッド（ＭＥＬ）の化学式を示す図である。
【図３】本発明者等が先に提案している超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムの原理を示す図である。
【図４】（ａ）は抗体（免疫グロブリン）の基本構造を示す図であり、（ｂ）は同抗体のＦｃ領域とFab領域を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００２５】
本発明で用いる超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムの原理は前記図３に示すようなものであるが、この原理を用いて実際に試作した装置を図１に示している。即ち、図1に示す例においては、所望の抗体のほか種々のタンパク質や他の物質が混入した溶液の入った溶液槽Ｓ１について、バルブＶ１を開くことにより攪拌槽Ｓ２内に供給可能とし、その際前記のような目的物質捕捉用の磁性ナノビーズも攪拌槽Ｓ２に供給可能としている。攪拌槽Ｓ２においては攪拌機により攪拌可能とし、これをバルブＶ２を介して管３内に流下できるようにしている。この管３にはそのほか洗浄・回収搬送液の入った洗浄・回収液槽Ｓ３から、バルブＶ３を開放することにより内部の液を供給可能としている。
【００２６】
管３は超伝導磁石１の中心に配置され、内部に前記のような磁性フィルター５を内装している。この超伝導磁石１は冷凍システム４によって冷却され、且つシステム制御装置６のコイル励磁制御回路７で内部の電磁コイルの励磁が制御されるとともに、冷凍制御回路９によって冷凍システム４も関連制御される。また、超伝導磁石１のコイルは、磁性フィルターの洗浄に際して、システム制御装置に設けた図１（ｂ）に例示し、後に詳述するような消磁回路８を用いて消磁制御される。
【００２７】
管３の下部には切替弁Ｖ４を設け、超伝導磁石による磁界発生中に管３に攪拌槽Ｓ２から攪拌溶液が供給されて、高勾配磁気分離用磁性フィルター５に磁気ビーズを捕捉し、捕捉されないものは、その他回収槽Ｓ５側に流れるように切り替えが行われる。次にバルブＶ２を閉じＶ３を開けて、管３に洗浄・回収搬送液が流れて、管３および磁性フィルター５を洗浄する。次に洗浄後は、超伝導磁石を消磁し、更に消磁回路を動作させて磁気ビーズと磁性フィルターを消磁し、Ｖ４を目的物回収糟Ｓ４側に流れるように切り替え、Ｓ３から回収搬送液を流して、目的物質回収糟に磁気ビーズを回収する。システム制御装置７にはバルブ切替制御回路１１を備えており、前記のようなバルブＶ１〜Ｖ４の制御を行い、一連の作動を自動的に行うことを可能とする。
【００２８】
前記のように磁性フィルターに捕捉されたビーズは、磁場をゼロにしても、残留磁気によりビーズ同士が互いに引き合って大きな塊となり、残留磁気が残っているフィルターに捕捉されたままで、回収され難い。そのため図１（ｂ）に示すような消磁回路を用いる。即ち図１（ｂ）に示す消磁回路においてはスイッチＳ１〜Ｓ４の４個のスイッチを用いており、図中のＬは超伝導マグネット用のコイルであって、同図（ａ）の管の内部のフィルターを磁化し、またフィルターを通過する液体中の磁気ビーズを超伝導による高勾配の磁界の中で磁化して、磁気ビーズを磁気フィルターに効率よく吸着させる作用を行っている。
【００２９】
このコイルＬに対して、直流電源Ｅ、スイッチＳ１、スイッチＳ２を順に直列に接続し、これらのスイッチＳ１及びＳ２を閉じることにより、直流電源ＥからコイルＬに電流を供給し、超伝導電磁石の駆動を行い、電磁フィルターを励磁する。この状態から電磁フィルターの作用を停止してコイルを消磁し、磁気フィルター及び磁気ビーズを消磁するときには、このまま所定の電流まで超伝導マグネットを減磁する。前記の作動は、図１（ｂ）の回路状態で行うことができる。
【００３０】
その後スイッチＳ３のみを閉じ、保護抵抗Ｒ0を介してコイルＬ内の電流をＬ-Ｒ0の閉回路に転流させ、次いでスイッチＳ１を開放し、超伝導コイルＬへの通電を完全に停止する。更にその後同スイッチＳ２を開くと共にスイッチＳ４を閉じる。このときＬＲＣ回路が形成されて、電源の接続なしに交流消磁回路を形成し、それによるコイル、及びその周囲の磁性フィルター及び磁気ビーズの消磁がなされる。
【００３１】
このような消磁回路において、コイルＬは超伝導マグネットが高い磁場を作り出す大きなインダクタンスをもち、且つ抵抗の小さな超伝導マグネットシステムが用いられているので、ここでは前記のように消磁用の磁場発生装置として利用して、交流消磁を行わせることができる。しかもこのような回路を予めシステム制御装置７に組み込んでおくことにより、これらのスイッチＳ１〜Ｓ４を所定のタイミングで前記の順序で開閉作動させることによって自動化が図れる。
【００３２】
一般に、通常の消磁にはＬＲＣ直列回路を用いた交流消磁法が用いられており、Ｌは磁場を発生させるコイルでもあり、これに抵抗とコンデンサを直列接続し、交流電圧をかけてLRCの直列共振により交流磁場を発生させ減衰させる。しかし、コイルが常電導では、装置が大掛かりで高価なものになる。さらに、この交流消磁を行う装置を高勾配磁気分離装置に新たに組み込むことは、物理的空間的にも困難であり、また装置も大掛かりになり、費用もかさむことになる。それに対して前記のような超電導マグネットを用いた高勾配磁気分離装置には、高い磁場を作り出す、大きなインダクタンスをもち、かつ抵抗の殆ど無い超電導マグネットシステムが用いられているため、この超電導マグネットを消磁用の磁場発生装置として利用し、交流電源が不要な、交流消磁を行わせる上記のような付加回路を提案したものである。即ち、図１（ｂ）に示すような付加回路としての消磁回路を用意し、消磁に必要な残留磁場以上の磁場を超電導マグネットにより発生させた状態（直流通電状態）から、抵抗RとコンデンサＣを直列接続にスイッチ回路で切り替えることにより、ＬＲＣの直列共振を利用し、交流磁場を発生・減衰させて消磁を行うことが出来たものである。
【００３３】
本発明においては、上記のような消磁回路を用いている高勾配磁気分離装置において、磁性ナノビーズの表面に付けるアフィ二ティー物質として、マンノシル・エリスリトールリピッド（Mannosyl Erythritol Lipid ：MEL）を用いたものである。なお、その化学構造を図２に示す。
【００３４】
一般に、微生物によって菌体外に生産される両親媒性脂質であるバイオサーファクタント（BS）は、これまで十数種類生産が報告されている。代表的なものとして、１）糖型、２）アミノ酸型、３）有機酸型、４）高分子型などがある。一部のＢＳは、既に食洗機用洗剤（ソホロリピッド）、化粧品素材（サーファクチン）等として実用化されている。ＢＳは、優れた界面活性と生体・環境適合性を併せ持つため、新素材・材料として注目されている。
【００３５】
特に、酵母によって生産されるマンノシル-エリスリトール-リピッド（MEL）は、微生物生産性が高く、特に抗微生物活性に加え、ヒト白血病細胞やメラノーマ細胞等に対して抗腫瘍・分化誘導活性を示す。また、抗体やレクチン等に対して特異的に結合する（結合定数：106 M-1）。特にIgG、IgM、IgAに対しては、既存リガンドに比べて優れた結合特性を示すため、安価かつ高機能なリガンドとして用いることができる。即ち、このマンノシル・エリスリトールリピッドは図３（ｂ）に示すような抗体のFab部と特異的に結合するためIgMやIgAも分離出来、またワクチンなどに多用されるニワトリの抗体であるIgYとも結合するという特徴を持ち、表面プラズモン共鳴（SPR）や原子間力顕微鏡（AFM）などで調べると、プロテインAに比べて約4倍の親和性を示すとされ、プロテインAでは得られない高い有効性がある。
【００３６】
なお、マンノシル-エリスリトール-リピッドは上記のような特性の他、MELを含有するリポソームは、DNAに対して優れた結合・保護特性を示し、培養細胞への遺伝子導入において、非常に高い効率を示す。MELがリポソームと細胞膜との融合を誘発し、DNA導入を促進することが判っており、新しいタイプのリポフェクション手法になり得るという特性を備えている。更に、低濃度から大きな界面活性を示し、自己組織化によって様々な液晶構造（スポンジ相、キュービック相、ラメラ相）を形成する。また、液晶を形成する濃度・温度範囲が、合成界面活性剤に比べて非常に大きく、また、セラミドと同様の肌荒れ改善効果や保湿効果を示すため、スキンケア用の化粧・医薬品への応用が可能である、等の特性も備えた物質である。
【００３７】
本発明においては、磁性ナノビーズの表面に付けるアフィ二ティー物質として、上記のような特性を備え、各種の用途に広く用いられて、価格が数千円〜数万円/ｋｇ程度と非常に安価であり、大豆油から作られるマンノシル・エリスリトールリピッド（MEL）を用い、その欠点である分離効率がプロテインＡの約７分の１であるという問題を、超電導により高勾配磁場を形成した管の中の磁性フィルターを通過させて磁気ビーズを捕捉すると共に、捕捉した磁気ビーズを簡単な構成で効率的に消磁可能な前記の消磁技術を用いて効率良く磁気ビーズを回収することができるようになり、全体として極めて効率良く抗体を捕捉・分離することができる。
【符号の説明】
【００３８】
１  超伝導磁石
２  中心部分
３  管
４  冷凍システム
５  高勾配磁気分離用磁性フィルター
６  システム制御装置
７  コイル励磁制御回路
８  消磁回路
９  冷凍制御回路
１０  バルブ切替制御回路
【図１】
2010227907.tif 000003
【図２】
2010227907.tif 000004
【図３】
2010227907.tif 000005
【図４】
2010227907.tif 000006