(57)【要約】【課題】キレーター固定化ナノ粒子を、非特異性吸着を抑制することが可能であって、かつ生理活性物質を強固に固定することが可能なものとする。【解決手段】金属イオンに配位結合可能なキレーター２が表面に結合しているコア３からなるキレーター固定化ナノ粒子１であって、キレーター固定化ナノ粒子１の水中粒径が300nm以下であり、キレーター２の密度が7.8×1015個/mm3以上とする。【選択図】図１
2010139289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属イオンに配位結合可能なキレーターが表面に結合しているコアからなるキレーター固定化ナノ粒子であって、該ナノ粒子の水中粒径が300nm以下であり、前記キレーターの密度が7.8×1015個/mm3以上であることを特徴とするキレーター固定化ナノ粒子。
【請求項２】
前記コアが水不溶性粒子であって、該粒子の周囲が前記キレーターを有するキレーター層で被覆されていることを特徴とする請求項１記載のキレーター固定化ナノ粒子。
【請求項３】
前記キレーター層が水溶性ポリマーを含むことを特徴とする請求項２記載のキレーター固定化ナノ粒子。
【請求項４】
前記キレーターに金属イオンが固定されていることを特徴とする請求項１、２または３記載のキレーター固定化ナノ粒子。
【請求項５】
前記金属イオンに生理活性物質が固定化されていることを特徴とする請求項４記載のキレーター固定化ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質の検出等に用いられるキレーター固定化ナノ粒子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療診断や生物学的検査においては、タンパク質と化学物質との間、あるいはタンパク質同士の間等、生理活性物質同士の相互作用を利用するための担体として微小な微粒子（ビーズ）が利用されている。微粒子を用いた生理活性物質間相互作用測定系においては、特定の生理活性物質が固定化された微粒子に対して被験物質を接触させてその相互作用を解析したり、あるいは被験物質の精製や被験物質を検出するためのプローブとして利用されている。従って、微粒子に生理活性物質を固定化する必要がある。生理活性物質を微粒子に固定化する一般的な方法としては、化学的な処理により共有結合させるか、抗体などのタンパク質性キャプチャ分子を利用する必要がある。
【０００３】
しかし、これらの方法では微粒子が不安定になり、基板や他の生理活性物質などへの非特異性吸着が増加してしまうという問題がある。非特異性吸着の問題を解決するため、共有結合を形成する処理や抗体などを用いずに生理活性物質を微粒子に固定化する方法として、キレーターを介してヒスタグ含有生理活性物質を固定化する方法が知られているが、この固定化方法は結合強度が弱く、経時的に少しずつ解離してしまうため、安定的に充分量の固定化が行えないという問題があることが知られている。
【０００４】
この結合力の向上を図るための技術が提案されており、例えば非特許文献１にはタグを拡張することで結合力を向上させる技術が記載されている。しかし、拡張タグの作製は技術的に困難である上に、拡張タグが凝集を促してしまい目的とする被験物質の結合量が減少してしまうという問題がある。このため、タグを介さない、あるいはタグの短い固定化方法が求められている。また、微粒子の観点からは、生理活性物質を微粒子に固定化する場合、微粒子としてはナノ粒子が好ましいことが知られている（特許文献１）。  
一方、タンパク質を強固に固定化するという観点からは、金属イオン（Ni）を用い、このNiの密度を高くすることによって、タグを介することなくタンパク質を強固に固定化することができる技術が知られている（非特許文献２）。
【非特許文献１】Analytical Chemistry 2006, 78, 3072-3079
【特許文献１】特開2008-191143号公報
【非特許文献２】Journal of Chromatography B 793.2003,325-329
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献２に記載されている技術を適用し、金属イオンを構成成分として用いて生理活性物質を固定化すれば、微粒子に生理活性物質を強固に固定できると考えられる。しかし、非特許文献２に記載されている技術では、金属イオンが露出しているために非特異性吸着が抑制できないという問題がある。
【０００６】
また、特許文献１に記載されているように、微粒子のサイズを１μｍ未満まで小さくすることで比表面積を増大させ、生理活性物質固定化量を増大させることは可能であるが、特許文献１にはキレーターの固定化に関する記載はない。このようなナノ粒子は分散性が高く、ナノ粒子に対して、キレーターを高密度で固定化させることは、高い反応性を得るための分散性を確保するとともに、効率的な精製を行うための凝集性を制御する必要があるため、合成上、非常に困難である。
【０００７】
本発明はこのような事情に鑑みなされたものであって、非特異性吸着を抑制することが可能であって、かつ生理活性物質を強固に固定することが可能なキレーター固定化ナノ粒子を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のキレーター固定化ナノ粒子は、金属イオンに配位結合可能なキレーターが表面に結合しているコアからなるキレーター固定化ナノ粒子であって、該ナノ粒子の水中粒径が300nm以下であり、前記キレーターの密度が7.8×1015個/mm3以上であることを特徴とするものである。  
前記コアは水不溶性粒子であって、該粒子の周囲が前記キレーターを有するキレーター層で被覆されていることが好ましい。
【０００９】
前記キレーター層は水溶性ポリマーを含むことが好ましい。  
前記キレーターには金属イオンが固定されていることが好ましい。  
前記金属イオンには生理活性物質が固定化されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のキレーター固定化ナノ粒子は、金属イオンに配位結合可能なキレーターが表面に結合しているコアからなるキレーター固定化ナノ粒子であり、非特許文献１に記載されている微粒子のように金属イオンが露出する構成ではなく、また生理活性物質の共有結合反応や、抗体分子などのキャプチャ分子の固定化を行わないため、非特異性吸着を抑制することが可能である。そして、このナノ粒子の水中粒径が300nm以下であるため、より非特異性吸着を抑制することができ、キレーターの密度が7.8×1015個/mm3以上であるため生理活性物質を強固に固定することができる。従って、被験物質を高感度に検出、反応させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のキレーター固定化ナノ粒子を図面を用いて説明する。図１は本発明のキレーター固定化ナノ粒子の概略模式図である。本発明のキレーター固定化ナノ粒子１は、金属イオンに配位結合可能なキレーター２が表面に結合しているコア３からなるナノ粒子であって、このナノ粒子の水中粒径Ｐが300nm以下であって、キレーター２の密度が7.8×1015個/mm3以上であることを特徴とする。なお図１では、コア３の周囲を、キレーター２が結合した水溶性ポリマー４からなるキレーター層５で被覆されているものを示しているが、コア３の材料によっては、キレーター２はキレーター層５を形成することなく、コア３の表面に結合していてもよい。
【００１２】
キレーター２は金属イオン（図示せず）に配位していることが好ましく、金属イオンには生理活性物質が固定化されていることが好ましい。この状態のキレーター固定化ナノ粒子に対して被験物質を含む検体を付与すると、固定化されている生理活性物質に対して免疫学的反応等の相互作用をする被験物質を検出、反応させることができる。  
以下、本発明のキレーター固定化ナノ粒子の各構成要素について説明する。
【００１３】
（コア）
コアは水不溶性粒子であることが好ましい。ここで水不溶性粒子とは生理活性物質の相互作用測定系で用いられる水や各種バッファーに対して不溶性である粒子を意味する。具体的には無機材料として、金、銀、銅、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、コバルト、鉄、ニッケルなどの金属粒子、シリカ、ジルコニア、チタニア、アルミナ、各種フェライト、マグヘマイト、酸化亜鉛、酸化ニオブ、酸化スズ、酸化インジウム、酸化ランタン、酸化ガドニウム、酸化ハフニウム、酸化エルビウム、酸化ネオジウム、酸化セリウム、酸化ジスプロシウム、チタン酸バリウムなどの酸化物粒子、窒化ガリウム、窒化ケイ素などの窒化物粒子、硫化亜鉛、硫化カドミウムなどの硫化物粒子、セレン化カドミウム、セレン化テルル化カドミウム、セレン化亜鉛、セレン化鉛などのセレン化物粒子、他ガリウムヒ素、インジウムヒ素などの粒子が好適に挙げられる。
【００１４】
また、コアは有機材料であってもよく、例えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリグリシジルメタクリレート、ポリメトキシエチルアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなどの水不溶性ポリマー粒子、アゾ系顔料、多環式系顔料などの水不溶性色素粒子、アガロース、デキストラン、カゼイン、ゼラチン、アルブミンなどの水溶性ポリマーを架橋などの手法で不溶化した粒子などを好適に挙げることができる。  
コアとしては上記各材料の単独からなる粒子でも良く、複数の材料の混合粒子、複層構造粒子であってもよい。
【００１５】
（コアの作製方法）
本発明のキレーター固定化ナノ粒子におけるコアの作製方法としては、ナノ粒子の状態で300nm以下になる粒径、つまり300nmより充分に小さい粒径であれば特に限定はされず、公知のあらゆる手法を用いることができる。例えば、無機粒子からなるコアであれば、液相還元法、ゾルゲル法、共沈法、逆ミセル法、ホットソープ法、水熱法、噴霧熱分解法、溶媒蒸発法、溶射噴霧法、プラズマ法、レーザ法などを挙げることができる。また、有機ポリマーであれば粒子状に重合した粒子でも、また、重合したポリマーを乳化した粒子でもよく、水溶性ポリマーを架橋などで水不溶化した粒子でもよい。
【００１６】
（水溶性ポリマー）
キレーター層を構成する水溶性ポリマーとしては、デキストラン、アガロース、カラゲナン、アルギン酸、澱粉、ゼラチン、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール又はこれらの誘導体及び、キトサン、セルロースの誘導体を好適に挙げることができる。
【００１７】
さらに、水溶性ポリマーとしては、カルボキシル基含有合成ポリマーおよびカルボキシル基含有多糖類をより好ましく用いることができる。カルボキシル基含有合成ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特開昭59-53836号明細書３頁20行〜６頁49行、特開昭59-71048号明細書３頁41行〜７頁54行明細書に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有するポリマーに酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。
【００１８】
カルボキシル基含有多糖類としては、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、デキストランのカルボキシル基誘導体、特にはカルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるCMD、CMD-L、CMD-D40（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）等を挙げることができる。
【００１９】
本発明で用いる水溶性ポリマーの分子量は特に限定されないが、一般的には２×102以上５×106以下であることが好ましい。さらに好ましい水溶性ポリマーの分子量は５×103以上２×106以下である。上記したような水溶性ポリマーは、コアに直接結合されていても、間接的に結合されていてもよい。あるいはモノマーを含む溶液から直接コア表面に形成させてもよい。
【００２０】
水溶性ポリマーのコアへの固定化方法としては水溶性ポリマーがコアから解離しなければ特に限定はされず、コアと水溶性ポリマーの両者に適切な公知の手法を用いることができる。例えば、コアがマグネタイトやアルミナのようにカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基に対し吸着性を有する物質の場合、それらの吸着性官能基を有する水溶性ポリマーを接触させることで、充分に固定化することが可能である。また、コアが金や銀などの場合も同様にチオールやジスルフィドを含む水溶性ポリマーを接触させることで固定化が可能である。
【００２１】
また、コアがシリカ、ジルコニア、アルミナ、銅などのようにシランカップリング剤と結合性を有する物質の場合、シランカップリング反応性基を有するポリマーを用いて縮合させて固定化することが可能である。さらに、コアがアミノ基やヒドロキシル基のように求核性官能基を有する場合、カルボキシル基含有ポリマーのカルボキシル基を活性化、縮合反応することで固定化することができる。また、コアが４級アミンを有するなど、正に帯電している場合、カルボキシル基含有ポリマーなどのような負に帯電しているポリマーを接触させて固定化することができる。
【００２２】
（キレーター）
キレーターは金属イオンに配位結合可能なものであり、各種キレート剤を用いることができる。例えば、ニトリロトリ酢酸誘導体（NTA（N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid））、イミノジ酢酸、フェナンスロリン、テルピリジン、ビピリジン、トリエチレンテトラアミン、ビ(エチレントリアミン）、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ポリピラゾリルホウ酸、1,4,7−トリアゾシクロノナン、ジメチルグリオキシム、ジフェニルグリオキシム等の多座配位子を好ましくあげることができ、４座配位子であるNTAがより好ましい。
【００２３】
キレーターの固定化は、例えば、コア表面にカルボキシル基を有する水溶性ポリマーが設けられている場合には、このカルボキシル基を活性化した後に、キレーターとなる化合物を反応させることによって、キレーターを水溶性ポリマーに固定化することができる。カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、又はEDC単独により活性化する方法を好ましく用いることができる。この手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基などの求核性基を有するキレーターと反応させることで、コアにキレーターが固定される。
【００２４】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として含窒素化合物を用いる方法があり、具体的には、下記一般式(Ia)又は(Ib)（式中、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表し、Ｒ1及びＲ2は結合により５〜６員環を形成しても良く、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す）に示される含窒素化合物を用いることもできる。
【化１】
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【００２５】
ここで、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表すが、好ましくはＲ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成する。特に好ましくは、ヒドロキシコハク酸、ヒドロキシフタル酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、3,4−ジヒドロキシ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン、及びその誘導体が提供される。
【００２６】
また、好ましくは下記に示される含窒素化合物を用いることもできる。  
【化２】
2010139289.tif 000004
【００２７】
また、好ましくは含窒素化合物としては、下記一般式(I)（式中、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表す）で表される化合物を用いることもできる。  
【化３】
2010139289.tif 000005
【００２８】
一般式（I）の具体的化合物としては、下記の化合物等が好ましくあげられる。  
【化４】
2010139289.tif 000006
【００２９】
また、含窒素化合物としては、下記の化合物等も好ましくあげられる。  
【化５】
2010139289.tif 000007
【００３０】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式(II)（式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す）を用いることもできる。  
【化６】
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【００３１】
ここで、Ａで表される炭素原子またはリン原子の置換基としては、置換基を有するアミノ基が好ましく、ジメチルアミノ基やピロリジノ基の様なジアルキルアミノ基が好ましい。Ｍで表される（n-1）価の元素は、リン原子、ホウ素原子、ヒ素原子などが挙げられるが、好ましくはリン原子があげられる。Ｘで表されるハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、好ましくはフッ素原子が挙げられる。
【００３２】
一般式（II）の具体的化合物としては、下記の化合物等が好ましくあげられる。  
【化７】
2010139289.tif 000009
【００３３】
また、含窒素化合物としては、下記一般式(III)（式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す）を用いることもできる。
【化８】
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【００３４】
一般式（III）の具体的化合物としては、下記の化合物等が好ましくあげられる。  
【化９】
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【００３５】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として、電子吸引性基を有するフェノール誘導体を使用することも好ましく、更に電子吸引性基のσ値が0.3以上であることが好ましい。具体的には、下記化合物などを用いることができる。  
【化１０】
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【００３６】
さらに、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法では、別にカルボジイミド誘導体物を併用することができ、好ましくは、水溶性カルボジイミド誘導体を併用することができ、更に好ましくは下記の化合物、（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride）を併用することができる。
【化１１】
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【００３７】
上記のカルボジイミド誘導体及び、含窒素化合物、またはフェノール誘導体は併用して使用するだけではなく、所望により、夫々、単独で用いることもできる。好ましくはカルボジイミド誘導体と含窒素化合物との併用である。
【００３８】
また、カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法として、下記化合物を用いることもできる。該化合物は単独で用いることもできるが、カルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体と併用してもよい。
【化１２】
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【００３９】
さらに、カルボキシル基を含有するポリマーにおけるカルボン酸を活性化する手法としては、特開2006-58071号公報「0011」〜「0022」に記載の方法（即ち、支持体の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特開2006-90781号公報「0011」〜「0019」に記載の方法（即ち、支持体の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を好ましく用いることもできる。
【００４０】
なお、上記した特開2006-58071号公報における特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体とは、下記一般式１で表されるウロニウム塩、下記一般式２で表されるホスホニウム塩、又は下記一般式３で表されるトリアジン誘導体である。
【化１３】
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【００４１】
（一般式１において、Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ3は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式２において、Ｒ4とＲ5はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ6は炭素数６から20の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式３において、Ｒ7はオニウム基を示し、Ｒ8及びＲ9はそれぞれ独立に電子供与基を示す。）
なお、水溶性ポリマーが設けられていない場合にはコアに直接固定化させることもできる。水溶性ポリマーを設けない系としては、例えばコア表面に自己組織化膜やゾルゲル層、水不溶性ポリマー層などを形成させてその上にキレーターを固定化することができる。自己組織化膜としては例えば、金や銀性もしくは金や銀で被覆されたコアに対して、チオール含有分子やジスルフィド含有分子などを自己組織化的に吸着させた膜が挙げられる。また、ゾルゲル層としては例えば、シリカやアルミナ、ジルコニア、銅などのコアであれば、シランカップリング剤を縮合させた層が挙げられる。
【００４２】
キレーターの密度は7.8×1015個/mm3以上であり、好ましくは1.0×1016個/mm3以上、さらには1.7×1016個/mm3以上であることが好ましい。ここで、キレーターの密度とは本発明のキレーター固定化ナノ粒子からコアを除いた部分におけるキレーターの密度を意味する。従って、本発明のキレーター固定化ナノ粒子がキレーター層で被覆されている場合には、キレーター層におけるキレーターの密度を意味する。キレーターの密度が7.8×1015個/mm3よりも小さい場合には、生理活性物質とキレーターとの金属イオンを介した結合における再結合の効率が低下するため、解離速度が大きくなって好ましくない。このキレーターの固定化の際には有機溶剤を用いることでキレーター密度を向上させることができる。ただし、コアもしくは水溶性ポリマー被覆コアが均一に分散しなければ、キレーター固定化密度を向上させることは困難であるため、用いるコアや水溶性ポリマーに応じて適切な溶媒を選択する必要がある。
【００４３】
有機溶剤としては、ジメチルスルホキサイド、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチルピロリドン、アセトン、メチルエチルケトン、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、sec-ブチルアルコール、tert−ブチルアルコール、ブチルセロソルブ、テトラヒドロフラン、ジグライム等を好ましくあげることができ、反応基質の溶解性および副反応の抑制の観点からはジメチルスルホキサイドあるいはN、N−ジメチルホルムアミドを用いることがより好ましい。なお、これらの有機溶剤はカルボキシメチルデキストランで被覆したコアを均一に分散させることが可能であるため、この観点からも好ましい。
【００４４】
このキレーター密度は以下のようにして求めることができる。実際に測定を行って求める場合は、コア表面にキレーターを結合した後、金属イオンを付与し、コア上に固定された金属イオンの数をICP分析装置などで求め、この金属イオンの数とキレーターが結合している部分の体積から、単位体積あたりのキレーターの数を求めることができる。なお、キレーター密度は固定化した生理活性物質を除去後、金属イオンの数を測定することによっても求めることもできる。
【００４５】
（金属イオン）
キレーターが配位する金属イオンとしては、不飽和金属錯体を形成する金属イオンであればよく、得られる金属錯体の安定性の観点からは遷移金属イオンが好ましい。具体的には、Ni(II)、Cu(I)、Cu(II)、Co(II)、Co(III)、Fe(II)、Fe(III)、Ga(III)のいずれかのイオンであり、キレーターの種類に応じて適宜選択することができる。中でも好ましくは、Ni(II)、Cu(II)、Co(III)、Fe(III)であり、さらに好ましくは、Ni(II)、Cu(II)である。金属イオンは、価数によって結合力が異なるが、Co(II)、Fe(II)の場合は、特開平6-157600 号の[0037]、[0038]に記載されている酸化還元方法で、金属イオンの酸化数を変化させ、結合力を変えることが可能である。  
金属イオンとキレーター密度の組み合わせとしては、金属イオンがCu(II)の場合、キレーター密度は1.7×1016以上であることが好ましい。
【００４６】
（水中粒径）
本発明のキレーター固定化ナノ粒子の水中粒径は300nm以下である。水中粒径が300nmよりも大きいと比表面積が低いため、生理活性物質の充分な固定化量が得られない。水中粒径は小さい程、同じ重量の粒子に対する生理活性物質の固定化量を向上させることができるが、例えば本発明のキレーター固定化ナノ粒子をプローブとして用いる場合には水中粒径が10nmよりも小さくなると、プローブとしての感度が低下し、また、本粒子を反応の担体として用いる場合も10nmを小さくなるとその操作性が著しく低下するため好ましくない。より好ましい水中粒径は、20nm以上250nm以下、さらには50nm以上200nm以下が好ましい。
【００４７】
本発明のキレーター固定化ナノ粒子の水中粒径の測定は、例えば動的光散乱法で測定することができる。動的光散乱によって粒子の水中粒径を測定する方法としては、具体的には大塚電子製のDLS-8000シリーズ、DLS-6500シリーズ、FPAR-1000、Malvern製ゼータサイザーナノシリーズ、Beckman Coulter製Delsa Nano Sなどの装置を用い、各装置の取扱説明書に従って測定することができる。
【００４８】
（生理活性物質）
生理活性物質は、例えば免疫タンパク質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫タンパク質、免疫グロブリン結合性タンパク質、糖結合性タンパク質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチド、オリゴDNA、RNA、PNA（ペプチド核酸）などが挙げられる。これらの生理活性物質はヒスチジンユニットを有し、このヒスチジンユニットを介して金属イオンと配位結合する。ヒスチジンユニットは３以上であることが好ましく、より強固に結合させるという観点からはヒスチジンユニットは６以上であることがより好ましい。結合をさらに強化する目的においてはヒスチジンユニットは８以上にすることも可能であるが、遺伝子改変によってヒスチジンユニットを生理活性物質に導入する場合、ヒスチジンユニットが８以上では発現の際に生理活性物質の凝集を促す場合があるため、生理活性物質によって適宜適切な長さを選択することが好ましい。
【００４９】
（キレーター固定化ナノ粒子の適用）
本発明のキレーター固定化ナノ粒子は、生理活性物質（被験物質）のプローブや反応担体として用いることができる。  
また、本発明のキレーター固定化ナノ粒子は、生体分子間の相互作用を光学的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサー、より詳細には、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成されるバイオセンサー等に用いることができる。
【００５０】
例えば、コアとして金ナノ粒子を用いた局所表面プラズモン共鳴バイオセンサー（LPR）では、外部から照射された光が金ナノ粒子の局所表面プラズモンと共鳴する条件が、その粒子表面の屈折率に依存するため、吸収波長を解析することによって、粒子表面に生理活性物質が結合したことを検出することが可能である。  
以下に本発明のキレーター固定化ナノ粒子の実施例を示す。
【実施例１】
【００５１】
（実施例１）
0.1M塩化鉄II（FeCl2：和光純薬製）50mlと0.1M塩化鉄III（FeCl3：和光純薬製）100mlを0.3M NaOH 150ml中で混合して、黒色のマグネタイトナノ粒子を得た。得られたマグネタイトナノ粒子を磁石で回収し、上清を除去した。回収したマグネタイトナノ粒子に、0.2wt%のCMD-L（名糖産業製）水溶液を混合・撹拌することでマグネタイトナノ粒子のCMD分散液を得た。この分散液に対して９倍量の1,4-dioxane（和光純薬製）を混合することで粒子を再沈殿させ、再度、粒子を磁石で回収し、上清を除去した。回収した粒子ペーストにDMSO（ジメチルスルフォキシド：和光純薬製）を混合、撹拌することでDMSOに分散されたナノ粒子（DMSO分散液）を得た。
【００５２】
このDMSO分散液1mlに対してEDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩；同仁化学研究所製）を1mmol、NHS（Nヒドロキシスクシンイミド：ナカライテスク製）を0.2mmolを添加した。30分間振動させて反応させた後、AB-NTA(同仁化学研究所製)を0.1mmol添加し、さらに12時間振動させて反応させた。反応後、反応液1mlに対して19mlの1,4-dioxaneを混合することで粒子を再沈殿させた。純水1mlで再分散後、透析によって未反応のAB-NTAを除去した。ここに、終濃度1mMになるように CuCl2水溶液を添加し10分間反応させた。9mlの1,4-dioxaneを混合することで粒子を再沈殿させ、上清を除去後、純水で再分散させることでNTA-Cu化ナノ粒子の分散液を得た。  
NTA-Cu化ナノ粒子100μlと20nMのヒスタグ付き抗CRP scFv（1%BSA含有PBS溶液）400μlとを混合して４℃で１時間反応させることでscFv固定化ナノ粒子を作製した。
【００５３】
（実施例２）
実施例１においてAB-NTAを固定化する際にAB-NTAを0.1mmol反応させる代わりに0.03mmol反応させ、実施例１と同様にしてscFv固定化ナノ粒子を作製した。
【００５４】
（実施例３）
実施例１において0.2wt%のCMD-L を混合・撹拌する代わりに0.5wt%のCMD-Lを混合・撹拌することでNTA-Cu化ナノ粒子のCMD分散液を得、実施例１と同様にしてscFv固定化ナノ粒子を作製した。
【００５５】
（比較例１）
実施例１においてAB-NTAを固定化する際にAB-NTAを0.1mmol反応させる代わりに0.001mmol反応させ、実施例１と同様にしてscFv固定化ナノ粒子を作製した。
【００５６】
（比較例２）
実施例１において、NTA化反応をDMSO中ではなく純水中で行った以外は実施例１と同様にしてNTA-Cu化ナノ粒子の分散液を得、scFv固定化ナノ粒子を作製した。
【００５７】
（比較例３）
実施例１において0.2wt%のCMD-L を混合・撹拌する代わりに0.02wt%のCMD-Lを混合・撹拌することでマグネタイトナノ粒子のCMD分散液を得、実施例１と同様にしてscFv固定化ナノ粒子を作製した。
【００５８】
（比較例４）
0.1M塩化鉄II 50mlと0.1M塩化鉄III 100mlを混合し、50℃に昇温した。これに25重量%アンモニア溶液15mlを滴下し、１時間撹拌することによって黒色のマグネタイト粒子を合成した。合成された黒色の粒子を磁石で回収して上清を除去した。回収したマグネタイト粒子を実施例１のマグネタイトナノ粒子の代わりに用いた以外は実施例１と同様にしてNTA-Cu化ナノ粒子の分散液を得、scFv固定化ナノ粒子を作製した。
【００５９】
（比較例５）
比較例３において、0.1M塩化鉄II 50mlと0.1M塩化鉄III 100mlを混合する代わりに、0.1M塩化鉄II 75mlと0.1M塩化鉄III 75mlを混合し、scFv固定化粒子を作製した。
【００６０】
（比較例６）
実施例１のDMSO分散液を調製する際にDMSOの代わりに純水を用いて、純水分散液を得た。この純水分散液１mlに対してEDCを1mmol、NHSを0.2mmolを添加した。30分間振動して反応させた後、100μlを分注し、そこに200nMヒスタグ付き抗CRP scFv（2mMアセテートバッファー溶液、pH5.0）を100μl混合し、２時間振動させて反応させた。PBSを200μl混合して中和し、scFVアミンカップリング固定化ナノ粒子を作製した。
【００６１】
（水中粒径の測定）
実施例１〜３および比較例１〜６のナノ粒子を、Malvern製水中粒子径測定装置Nano-ZSを用いて取扱説明書の標準プロトコルに従ってNTA-Cu化ナノ粒子の水中粒径を測定した。なお、Intensity分布で95%以上を占めるピークをデータとした。
【００６２】
（NTA密度の測定）
実施例１〜３および比較例１〜５において、CuCl2の代わりにNiCl2を添加し、NTA-Cu化ナノ粒子を得た。終濃度が100mMになるようにEDTAを添加した。更に終濃度が１MになるようにNaClを添加した。磁石で粒子を回収後、上清に含まれるNi量をICP分析装置で測定した。このNi量からNTA量を換算し、キレーター層中のNTA密度（キレーター密度）を算出した。なお、キレーター層の総体積の算出は、TG測定（熱重量測定）からコア／キレーター層の比を算出し、これと水中粒径から１粒子中のキレーター層体積を算出し、液の固形分率から粒子数を算出することによって求めた。  
水中粒径、NTA密度の測定、算出結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
2010139289.tif 000016
【００６４】
（イムノアッセイ）
実施例１〜３および比較例１〜６のナノ粒子のそれぞれに対して、０M、10nM、１μMの各濃度のCRP（1%BSA含有PBS溶液）を同量混合して１時間静置した。Nunc製Maxisorpスライドに対して、10μg/mlの抗CRP抗体（Fitzgerald製）をスポットし、室温、多湿環境中で１時間静置することで抗体を固定化した。PBSで洗浄後、１%カゼイン（in TBS（PIERCE製））をスライド全面にキャストし室温、多湿環境中で1時間静置することでブロッキング処理を行った。PBSで洗浄後、上記の実施例１〜３および比較例１〜６のナノ粒子の各濃度サンプルを全面キャストした。１時間後にPBSで３分×３回洗浄し、磁気センサー（アイチ・マイクロ・インテリジェント製MI-CB-1DS）により、ナノ粒子由来の磁場信号を検出した。  
検出した磁気信号値および磁気信号のS/N比を表２に、それぞれをグラフ化したものを図２および図３に示す。
【００６５】
【表２】
2010139289.tif 000017
【００６６】
表２、図２および図３から明らかなように、本発明のキレーター固定化粒子である実施例１〜３においては、非常に高いS/N比でCRPを測定できており、非特異性吸着が抑制された状態で効率よく結合していることがわかる。NTA密度が低い比較例１および２では非特異性吸着は抑制されているものの、信号量が充分ではなかった。一方、水中粒径が大きい比較例３〜５、キレーターを用いていない比較例６では、信号量は実施例１とほぼ同程度に得られるものの、非特異性吸着を抑制することができなかった。
【００６７】
実施例１、３および比較例３、４における水中粒径とS/N比の相関関係を示すグラフを図４に示す。これらの実施例、比較例は、表１に示すようにいずれもキレーターの密度が7.8×1015個/mm3以上のキレーター固定化粒子であるが、水中粒径が373nm（比較例３）よりも小さくなると、S/N比が有意差をもって向上していることがわかる。そして、磁気信号量とを比較考量すれば、キレーターの密度が7.8×1015個/mm3以上のキレーター固定化粒子においては、300nm以下の水中粒径であれば、非特異性吸着を抑制することができるとともに、生理活性物質を強固に固定することができることがわかる。
【００６８】
図５は実施例１、２および比較例１、２におけるキレータ密度とS/N比の相関関係を示すグラフである。これらの実施例、比較例は、表１に示すようにいずれも水中粒径が300nm以下のキレーター固定化粒子であるが、キレーターの密度が4.8×1015個/mm3（比較例１）より大きくなると、S/N比が有意差をもって向上していることがわかる。そして、磁気信号量とを比較考量すれば、水中粒径が300nm以下のキレーター固定化粒子においては、キレーターの密度が7.8×1015個/mm3以上であれば、非特異性吸着を抑制することができるとともに、生理活性物質を強固に固定することができることがわかる。
【００６９】
以上のように、本発明のキレーター固定化ナノ粒子は、ナノ粒子の水中粒径が300nm以下であるため、より非特異性吸着を抑制することができ、キレーターの密度が7.8×1015個/mm3以上であるため生理活性物質を強固に固定することができる。従って、被験物質を高感度に検出、反応させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明のキレーター固定化ナノ粒子の概略模式図
【図２】濃度毎の磁気信号量を示すグラフ
【図３】磁気信号量のS/N比を示すグラフ
【図４】水中粒径とS/N比の相関関係を示すグラフ
【図５】キレーター密度とS/N比の相関関係を示すグラフ
【符号の説明】
【００７１】
１    キレーター固定化ナノ粒子
２    キレーター
３    コア
４    水溶性ポリマー
５    キレーター層
Ｐ    水中粒径
【図２】
2010139289.tif 000018
【図３】
2010139289.tif 000019
【図４】
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【図５】
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【図１】
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