(57)【要約】【課題】哺乳動物における所望の行動と関連する遺伝子を特定すること。【解決手段】哺乳動物における所望の行動と関連する遺伝子を特定する方法であって、（ａ）所望の行動を有する哺乳動物の試験集団を準備する工程；（ｂ）所望の行動を欠如する哺乳動物のコントロール集団を準備する工程；（ｃ）試験集団の神経組織から発現ＲＮＡを単離し、プールする工程；（ｄ）コントロール集団の神経組織から発現ＲＮＡを単離し、プールする工程；（ｅ）工程（ｃ）と（ｄ）において造られた各ＲＮＡプールにおいて複数の遺伝子の発現レベルを定量する工程；および、（ｆ）複数の遺伝子から、哺乳動物の試験集団とコントロール集団との間で発現が異なる遺伝子を選択する工程であって、選択された遺伝子は、前記所望の行動と関連する候補遺伝子である工程、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
認知障害に関する理解が増すにつれて、障害を検出するための感受性の高い方法を開発すること、および、障害の治療法を開発することの必要も高まっている。認知障害について感受性の高い検出法が実現されたならば、その患者が恩恵を受けると予想される病態は数多くある。例えば、痴呆（例えば、レーヴィ体痴呆、血管性痴呆、アルツハイマー病、およびＨＩＶ関連痴呆）、ハンチントン病、パーキンソン病、分裂病、うつ病、筋萎縮性側索硬化症、軽度認知障害（ＭＣＩ）、および、加齢性認知衰退（ＡＲＣＤ）がそれである。
【０００２】
認知障害を伴う各種病態（例えば、レーヴィ体痴呆、血管性痴呆、アルツハイマー病、ＨＩＶ関連痴呆、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ＭＣＩおよびＡＲＣＤ）に導く主要な危険因子は加齢である。このような病態を抱える個人は、病気進行と共に重度を増す認知症状を有する。このような病気が無い場合、加齢そのものが認知に対してどのような影響を及ぼすかを知ることは、病気と、正常な加齢の間の境界を定義するために重要である。同時に、加齢の認知に及ぼす作用は、神経変性疾患における病気の進行、感受性の決定、病気の進行速度やその他の特性と相互作用を持つ可能性もある。
【０００３】
認知障害に対する検出法および治療処置の開発にとって重要な手段は、実験動物の使用を含む。動物モデルにおいて認知障害を特徴づける特性は、ヒトの認知障害にも拡張されると考えられる。加齢性認知障害の場合、広範な行動的特性解明によって、高齢ロングエバンスラットの雑種系では天然型の認知障害が特定されている（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｇａｌｌｇａｈｅｒ  Ｍ，等、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０７：６１８−６２６；１９９３）。この認知加齢変化のモデルには、病原体に一生さらされないように飼育した動物が使用されている。全ての老齢ラットについて生理学的機能試験および検屍を実施し、それを用いて、加齢と、疾患または病気の研究とを混同させ兼ねない病態を有する動物を排除した。このモデルの重要な特質は、ヒト高齢者に見られる認知衰退の変動現象を正確に映し出していることである。さらに、このモデルにおける高齢ラットの認知衰退の個人差は、内側側頭葉−これはヒトの陳述記憶にとって不可欠のシステムである−の相互連結構造の機能の影響を受けやすい行動評価にも見られる。
【０００４】
このモデルのもう一つの重要な特質は、このモデルが、加齢性認知障害に寄与する多数の遺伝子の理解につながっていることである。加齢性認知障害に対する遺伝的寄与は単一遺伝子性である可能性は少なく、単一遺伝子の欠失または突然変異で引き起こされる可能性は少ない。単一遺伝子性疾患は極めて稀であり、かつ典型的には若者が罹る。単一遺伝子性疾患は、重度であるがために、平均余命の達成とは合致しないことが多い。ヒトでは、成人集団が罹るありふれているが重大な病態の大多数は、暦年齢の増加と共にその頻度と重度を増すのであるから、単一遺伝子に帰せしめることはできない（例えば、Ｈｅｇｅｌｅ  ＲＡ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２００３  ８：３７１−３７７；Ｓｈｉｈ  ＤＱ等、Ｃｕｒｒ  Ｄｉａｂ  Ｒｅｐ．２００２：１２５−１３４；Ｂａｒｌａｓｓｉｎａ  Ｃ，等、Ｊ．Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００２  Ｓｕｐｐｌ３：Ｓ１５５−Ｓ１６４）。現在証拠が次第に蓄積されつつあるが、それの示唆するところによれば、成熟開始、または加齢性病態の遺伝的成分は、単一遺伝子性疾患の根本的な原因となる機能の絶対的欠損または劇的獲得と言うよりは、多数の遺伝子発現におけるより微妙な変化を反映する。この加齢性病態の分子基盤を定義するに際して問題となるのは、多数の遺伝子を特定し、かつ、ある特定グループの遺伝子の発現における比較的僅かな変化が、実際に、ヒトの集団のような雑種集団における病態と関連するか否か、または、そのような病態を招くのか否かを確定することである。従って、加齢の哺乳類雑種モデルを使用することによって、雑種の若年被験体および高齢被験体の海馬内での多数遺伝子発現レベルと学習能力との間の関係分析がやり易くなる。
【０００５】
モリスの水迷路（ＭＷＭ）による行動評価では、ラットは学習し、迷路周囲の空間目印（キュー）の配置によって導かれて避難踏み台の位置を思い出す。パフォーマンスの認知の基礎は、プローブ試行において、避難踏み台の位置を探す際の動物の空間偏倚の測定値を用いて試験される。試験集団における高齢ラットは、目に見える踏み台には難なく泳ぎ着けるが、台がカモフラージュされて空間情報の使用が必要になると、加齢性障害が検出される。多くの公刊物に報告されているように、雑種ロングエバンス系の高齢ラット個々のパフォーマンスは大きく変動し、一定比率のラットは若年成獣と並ぶパフォーマンスを示すが、約４０−５０％は若者のパフォーマンスの範囲から外れる（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ等、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０７：６１８−６２６，１９９３）。高齢ラットに見られるこの変動は確かな個体差を反映する。従って、高齢集団内では、認知障害を受けて、老衰（ＡＩ）と表示される動物がいる。一方で、認知障害を受けず、達者（ＡＵ）な高齢動物もいる。
【０００６】
最初の特性解明の数週間後新しい空間環境のＭＷＭを用いて再評価すると、ＡＩ動物は一貫して障害を示すのに、一方、ＡＵ動物は再び優れたパフォーマンスを示す（Ｃｏｌｏｍｂｏ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１４１９５−１４１９９，１９９７）。ＡＩおよびＡＵラットに対するＭＷＭ評価に見られる認知能力のこの差は、３ヶ月の期間においても確実である（ＧａｌｌａｇｈｅｒとＢｕｒｗｅｌｌ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １０：６９１−７０８，１９８９）。さらに、ＭＷＭにおけるＡＩおよびＡＵの特徴づけは、同じ認知機能を要求する他の行動タスク、例えば、バーネスの円迷路（ＧａｌｌａｇｈｅｒとＢｕｒｗｅｌｌ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １０：６９１−７０８，１９８９）、および、放射状迷路（ＲＡＭ）における同じ高齢被験体のパフォーマンスとの間にも差が見られる。齧歯類の高齢集団に見られるこの自然な障害は、認知の加齢性は必然ではなく、または、厳密に暦年齢に結び付けられるものではないことを示しており、重要なことは、この障害が、衰退または記憶維持をもたらす脳の変化の軌跡を比較するきっかけを与えてくれるものであるということである。このモデルを用いたさらに別の背景研究から、認知障害は、神経細胞の喪失、または関連回路の広範な変性を含む神経変性とは独立に起こることが示されている（ＲａｐｐとＧａｌｌａｇｈｅｒ
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：９９２６−９９３０，１９９６）。従って、このモデルは、神経細胞喪失の作用を測定することを意図して調製された製剤よりも、認知の加齢変化に対しより感度の高い試験となる可能性がある。
【０００７】
信頼性に加えて、このモデルで用いられる認知評価は、加齢の関連脳組織に及ぼす作用に対しても感受性の高いことが判明している。ＭＷＭで評価した認知機能において決定的に重要である神経回路内において、ＡＵラットとＡＩラットには生物学的に有意な差が生じていることが示されている。例えば、海馬神経細胞は、ＡＵおよび若年ラットの両方に比べて、ＡＩラットにおいて、ある種の化学伝達物質、例えば、アセチルコリンやグルタメートに対する反応が低下する（Ｎｉｃｏｌｌｅ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：９６０４−９６１０，１９９９）。グルタメート受容体サブタイプの解剖学的分布に関する研究においてこのモデルを用いたところ、高齢無障害ラットに限定され、若年ラットや高齢障害ラットとも異なる、海馬のＣＡ３領域のカイネート結合の低下が認められた（Ｎｉｃｏｌｌｅ等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ７４：７４１−７５６，１９９６）。認知障害の生物学的および遺伝学的基盤に関してさらに包括的な理解が求められる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
４．発明の概要
一つの局面において、本発明は、被験体、例えば、哺乳動物の望ましい行動に関連する遺伝子を特定する方法であって、その所望の行動を有する被験体から成る試験集団を供給すること、その所望の行動を欠如する被験体から成る対照集団を供給すること、試験および対照集団の神経組織、例えば、海馬から発現ＲＮＡを、それぞれ、単離・プールすること、対照および試験ＲＮＡプールのそれぞれにおいて複数の遺伝子の発現レベルを定量すること、および、その複数の遺伝子から、その発現が、哺乳動物の試験集団と対照集団との間で異なる１個の遺伝子を選択することを含む方法を提供することを特徴とする。この選択された遺伝子は、所望の行動に関連することが予想される候補遺伝子である。複数の遺伝子の発現レベルは、任意の適当な手段、例えば、マイクロアレイ分析、インサイチュ・ハイブリダイゼーション組織化学、定量的ＰＣＲ、ＳＡＧＥ分析、ノーザンブロット分析、またはドットブロット分析によって検出してもよいし、あるいは、ウェスタンブロット、タンパクスロットブロット、またはタンパクアレイを含むタンパクレベルを測定する適当な方法によって検出してもよい。この複数の遺伝子は、例えば、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４およびＥＡＡＴ５のようなグルタメート輸送に関わる遺伝子、グルタメート輸送遺伝子ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４およびＥＡＡＴ５以外の遺伝子、あるいは、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのように、シナプス間隙および／または神経細胞間のシナプス外空間においてグルタメートの分解に与る遺伝子を含んでもよい。好ましくは、複数の遺伝子から選ばれる遺伝子は発現レベルの上昇を示す。別に、選択される遺伝子は、発現レベルの低下を示してもよい。
【０００９】
別の局面では、本発明は、被験体の認知機能に関連する遺伝子を特定する方法であって、所望の認知機能を有する哺乳動物から成る試験集団を供給すること、その所望の認知機能を欠如する哺乳動物から成る対照集団を供給すること、試験および対照集団の神経組織、例えば、海馬から発現ＲＮＡを、それぞれ、単離・プールすること、対照および試験ＲＮＡプールのそれぞれにおいて複数の遺伝子の発現レベルを定量すること、および、その複数の遺伝子から、その発現が、哺乳動物の試験集団と対照集団との間で異なる１個の遺伝子を選択することを含む方法を提供することを特徴とする。この選択された遺伝子は、所望の認知機能に関連することが予想される候補遺伝子である。複数の遺伝子の発現レベルは、任意の適当な手段、例えば、マイクロアレイ分析、インサイチュ・ハイブリダイゼーション組織化学、定量的ＰＣＲ、ＳＡＧＥ分析、ノーザンブロット分析、またはドットブロット分析によって検出してもよいし、あるいは、ウェスタンブロット、タンパクスロットブロット、またはタンパクアレイを含むタンパクレベルを測定する適当な方法によって検出してもよい。この複数の遺伝子は、例えば、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４およびＥＡＡＴ５のようなグルタメート輸送に関わる遺伝子、グルタメート輸送遺伝子ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４およびＥＡＡＴ５以外の遺伝子、あるいは、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのように、シナプス間隙および／または神経細胞間のシナプス外空間においてグルタメートの分解に与る遺伝子を含んでもよい。好ましくは、複数の遺伝子から選ばれる遺伝子は発現レベルの上昇を示す。別に、選択される遺伝子は、発現レベルの低下を示してもよい。
【００１０】
本発明の別の局面は、認知機能を増進するのに有用な化合物のスクリーニング法であって、被験体、例えば、哺乳動物に試験化合物を投与すること、前記試験化合物の投与後に前記被験体の神経組織、例えば海馬における遺伝子の発現レベルを定量すること、前記遺伝子の前記発現レベルを、前記試験化合物が投与されていない被験体の神経組織における同遺伝子の、参照発現レベルと比較すること、および、前記遺伝子の発現レベルが、その、対応する参照発現レベルと異なるか否かを確定することを含む方法であって、前記差は、試験化合物が、認知機能を増進することが予想される候補薬剤であることを示すことを特徴とするスクリーニング法を含む。試験化合物は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに認められるもののような低分子であってもよいが、ただしそれらに限定されない。さらに、この方法は、前記遺伝子の発現レベルを、セフトリアキソンが投与された被験体の神経組織における、同遺伝子の参照発現レベルと比較することを含んでもよい。遺伝子の発現レベルは、任意の適当な手段、例えば、マイクロアレイ分析、インサイチュ・ハイブリダイゼーション組織化学、定量的ＰＣＲ、ＳＡＧＥ分析、ノーザンブロット分析、またはドットブロット分析によって検出してもよいし、あるいは、ウェスタンブロット、タンパクスロットブロット、またはタンパクアレイを含むタンパクレベルを測定する適当な方法によって検出してもよい。この遺伝子は、例えば、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４およびＥＡＡＴ５のようなグルタメート輸送に関わるものであってもよいし、あるいは、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのように、シナプス間隙および／または神経細胞間のシナプス外空間においてグルタメートの分解に関与していてもよい。好ましくは、複数の遺伝子から選ばれる遺伝子は発現レベルの上昇を示す。別に、選択される遺伝子は、発現レベルの低下を示してもよい。
本発明の別の局面は、認知機能を増進するのに有用な化合物のスクリーニング法であって、被験体、例えば、哺乳動物に試験化合物を投与すること、前記試験化合物の投与後に前記被験体の神経組織、例えば海馬におけるグルタメート輸送遺伝子の発現レベルを定量すること、前記遺伝子の前記発現レベルを、前記試験化合物が投与されていない被験体の神経組織における同遺伝子の、参照発現レベルと比較すること、および、前記遺伝子の発現レベルが、その、対応する参照発現レベルと異なるか否かを確定することを含む方法であって、前記差は、試験化合物が、認知機能を増進することが予想される候補薬剤であることを示すことを特徴とするスクリーニング法を含む。試験化合物は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに認められるもののような低分子であってもよいが、ただしそれらに限定されない。さらに、この方法は、前記遺伝子の発現レベルを、セフトリアキソンが投与された被験体の神経組織における、同遺伝子の参照発現レベルと比較することを含んでもよい。遺伝子の発現レベルは、任意の適当な手段、例えば、マイクロアレイ分析、インサイチュ・ハイブリダイゼーション組織化学、定量的ＰＣＲ、ＳＡＧＥ分析、ノーザンブロット分析、またはドットブロット分析によって検出してもよいし、あるいは、ウェスタンブロット、タンパクスロットブロット、またはタンパクアレイを含むタンパクレベルを測定する適当な方法によって検出してもよい。この遺伝子は、例えば、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４およびＥＡＡＴ５のようなグルタメート輸送に関わるものであってもよいし、あるいは、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのように、シナプス間隙および／または神経細胞間のシナプス外空間においてグルタメートの分解に関与していてもよい。好ましくは、複数の遺伝子から選ばれる遺伝子は発現レベルの上昇を示す。別に、選択される遺伝子は、発現レベルの低下を示してもよい。
【００１１】
被験体、例えば、哺乳動物の認知機能を増進するのに有用な化合物のスクリーニング法であって、図４に列挙される遺伝子、例えば、グルタメート輸送遺伝子ＥＡＡＴ１、２、３、４または５、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、または、下垂体アデニルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）を発現する細胞に試験化合物を接触させること、前記遺伝子の発現レベルが、前記細胞の試験化合物との接触によって変化させられるか否かを確定することを含み、前記変化がもしあるならばそれは、前記化合物が、認知機能回復を必要とする被験体、例えば、哺乳動物の認知機能を増進することが可能であることを示すことを特徴とするスクリーニング法。試験化合物は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに認められるもののような低分子であってよい。細胞は、神経組織、例えば、培養神経細胞、培養グリア、または、神経細胞の一次培養物から得られたものであってよい。あるいは、不死化された細胞系統、神経細胞系統、グリア細胞系統、または、星状細胞系統であってもよい。好ましくは、複数の遺伝子から選ばれる遺伝子は発現レベルの上昇を示す。別に、選択される遺伝子は、発現レベルの低下を示してもよい。
【００１２】
本発明の前述の局面のそれぞれに使用される試験化合物は、低分子、例えば、第三世代セファロスポリン（セフスロジン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、モキサラクタム、およびセフタジジム）、バルプロ酸、またはＭＳ−１５３であってもよい。さらに、試験化合物は、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４、およびＥＡＡＴ５から成るグループから選ばれるグルタメート輸送遺伝子、またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含む遺伝子の発現を活性化してもよい。別に、試験化合物は、遺伝子発現の抑制因子であってもよい。
【００１３】
別の局面において、本発明は、哺乳動物における認知機能の保持のために、哺乳動物の神経組織において差示的に発現される遺伝子をコードする、複数のｃＤＮＡ配列を含むライブラリーを提供することを特徴とする。ライブラリーは、哺乳動物をセフトリアキソン、バルプロ酸またはＭＳ−１３５で治療すると、神経組織において差示的に発現される遺伝子をコードする複数のｃＤＮＡ配列を含んでいることが好ましい。ライブラリーは、グルタメート輸送遺伝子、例えば、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４およびＥＡＡＴ５に関して得られたｃＤＮＡ配列、あるいは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼから得られた配列を含んでもよい。ライブラリーは、グルタメート輸送遺伝子から得られた配列の内少なくとも約２０％、５０％または８０％のｃＤＮＡを含む。
【００１４】
本発明の別の局面は、マイクロアレイチップであって、個別のアドレスを持つ位置に、前述のｃＤＮＡライブラリーのメンバー、例えば、被験体の認知機能の保持において、あるいは、被験体をセフトリアキソンまたはバルプロ酸で治療した際に、神経組織において差示的に発現されるｃＤＮＡ配列メンバーを付着させた固体支持体を含むマイクロアレイチップである。マイクロアレイチップのメンバーは、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４およびＥＡＡＴ５から成るグループから選ばれるグルタメート輸送遺伝子、または、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ配列のいずれかを含む。
【００１５】
本発明はまた、図４に列挙される遺伝子、例えば、グルタメート輸送遺伝子ＥＡＡＴ１、２、３、４または５、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、または、下垂体アデニルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）の神経組織発現を刺激する化合物の治療有効量を含む、製薬組成物を提供することを特徴とする。この製薬組成物は低分子をさらに含んでもよい。
【００１６】
さらに別の局面において、本発明は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの治療有効量を含む製薬組成物を提供することを特徴とする。別に、製薬組成物は、セフトリアキソンまたはバルプロ酸以外の化合物であって、認知機能を増進するのに有用な化合物をスクリーニングする方法によって特定される化合物、すなわち、被験体、例えば、哺乳動物または細胞に複数の化合物を投与し、それらの化合物に暴露された被験体または細胞と、暴露されていない被験体または細胞との間の、遺伝子発現の差を測定することによるスクリーニング法によって特定される化合物の治療有効量を含んでもよい。これらの化合物は、認知機能を増進するための候補化合物である。
【００１７】
本発明の別の局面は、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて認知機能を保持する方法、または、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて認知機能障害を治療する方法であって、神経組織におけるグルタメート輸送またはグルタメート分解に関わる遺伝子の神経組織発現を刺激することによる方法を提供することを特徴とする。さらに、認知機能の保持を、それを必要とする哺乳動物、例えば、ヒトにおいて実現することは、図４に列挙される遺伝子、例えば、グルタメート輸送遺伝子ＥＡＡＴ１、２、３、４または５、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、または、下垂体アデニルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）の神経組織発現を刺激する製薬組成物を投与することを含む。
【００１８】
本発明はまた、認知機能の保持を、それを必要とする哺乳動物、例えば、ヒトにおいて実現する方法であって、下記の式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの内から選ばれる任意の一つから成る低分子である製薬組成物を投与することを含む方法を提供することを特徴とする。認知機能の保持を、それを必要とする哺乳動物、例えば、ヒトにおいて実現するために、式Ｉの化合物を投与することを含む方法において、その哺乳動物は、抗生物質治療が適応とされる感染病の症状が皆無である。
【００１９】
本発明はまた、認知機能の増進を、それを必要とする哺乳動物、例えば、ヒトにおいて実現することは、下記の認識機能、すなわち、空間記憶獲得、長期空間記憶、または、空間記憶想起を増進するのに十分なほど、図４に列挙される遺伝子の、神経組織発現レベルを刺激することが可能な製薬組成物の量を、前記哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする。本発明はまた、高齢哺乳動物、例えば、ヒトの認知機能を保持すること、または、認知障害を治療すること、また、哺乳動物、例えば、ヒトの認知機能障害を治療することは、その保持・治療を必要とする哺乳動物に対して、セフトリアキソン、あるいはその類縁体または誘導体、バルプロ酸、あるいはその類縁体または誘導体、ＭＳ−１５３、あるいはその類縁体または誘導体の治療有効量を投与することによるものであることを特徴とする。哺乳動物が認識機能障害を現している症例では、その認識機能障害は、下記の病態、すなわち、軽度の認知障害、加齢性認知衰退、記憶喪失、老化または痴呆の内から選ばれる一つと関連してもよい。さらに、哺乳動物が認知機能障害を現す症例では、その認知機能障害はアルツハイマー病と関連してもよい。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
（項目１）
哺乳動物における所望の行動と関連する遺伝子を特定する方法であって、
（ａ）所望の行動を有する哺乳動物の試験集団を準備する工程；
（ｂ）所望の行動を欠如する哺乳動物のコントロール集団を準備する工程；
（ｃ）試験集団の神経組織から発現ＲＮＡを単離し、プールする工程；
（ｄ）コントロール集団の神経組織から発現ＲＮＡを単離し、プールする工程；
（ｅ）工程（ｃ）と（ｄ）において造られた各ＲＮＡプールにおいて複数の遺伝子の発現レベルを定量する工程；および、
（ｆ）複数の遺伝子から、哺乳動物の試験集団とコントロール集団との間で発現が異なる遺伝子を選択する工程であって、選択された遺伝子は、前記所望の行動と関連する候補遺伝子である工程、
を含む方法。
（項目２）
哺乳動物において認知機能と関連する遺伝子を特定する方法であって、
（ａ）所望の認知機能を有する哺乳動物の試験集団を準備する工程；
（ｂ）そのような認知機能を障害されている哺乳動物のコントロール集団を準備する工程；
（ｃ）試験集団の神経組織から発現ＲＮＡを単離し、プールする工程；
（ｄ）コントロール集団の神経組織から発現ＲＮＡを単離し、プールする工程；
（ｅ）工程（ｃ）と（ｄ）において造られた各ＲＮＡプールにおいて複数の遺伝子の発現レベルを定量する工程；および、
（ｆ）複数の遺伝子から、哺乳動物の試験集団とコントロール集団との間で発現が異なる遺伝子を選択する工程であって、選択された遺伝子は、認知機能と関連する候補遺伝子である工程、
を含む方法。
（項目３）
前記複数の遺伝子の発現レベルは、マイクロアレイ分析、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学、定量的ＰＣＲ、ＳＡＧＥ分析、ノーザンブロット分析、およびドットブロット分析から成るグループから選ばれる方法によって検出される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記複数の遺伝子は、グルタメート輸送に与る遺伝子を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
グルタメート輸送に関係する前記遺伝子は、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４、およびＥＡＡＴ５から成るグループから選ばれることを特徴とする項目４に記載の方法。
（項目６）
前記複数の遺伝子は、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４、およびＥＡＡＴ５から成るグループから選ばれるグルタメート輸送因子以外の遺伝子を含むことを特徴とする項目１または２に記載の方法。
（項目７）
認知機能を増進するのに有用な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を哺乳動物に投与する工程；
（ｂ）前記試験化合物の投与後、前記哺乳動物の神経組織において遺伝子の発現レベルを定量する工程；
（ｃ）前記遺伝子の前記発現レベルを、前記試験化合物が投与されていない哺乳動物の神経組織におけるその発現の参照レベルと比較する工程；および、
（ｄ）前記遺伝子の発現レベルが、その発現の対応する参照レベルと異なるか否かを判定する工程であって、前記相違は、試験化合物が、認知機能増進のための候補治療剤であることを示すものとする工程、
を含む方法。
（項目８）
前記遺伝子の前記発現レベルを、セフトリアキソンが投与された哺乳動物の神経組織におけるその発現の参照レベルと比較する工程をさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記遺伝子の発現レベルは、マイクロアレイ分析、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学、定量的ＰＣＲ、ＳＡＧＥ分析、ノーザンブロット分析、およびドットブロット分析から成るグループから選ばれる方法によって検出される、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記遺伝子は、グルタメート輸送因子である、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記遺伝子は、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４、およびＥＡＡＴ５から成るグループから選ばれることを特徴とする項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記神経組織は海馬組織である、項目１、２または７に記載の方法。
（項目１３）
認知機能を増進するのに有用な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を哺乳動物に投与する工程；
（ｂ）前記試験化合物の投与後、前記哺乳動物の神経組織においてグルタメート輸送体遺伝子の発現レベルを定量する工程；
（ｃ）前記遺伝子の前記発現レベルを、前記試験化合物が投与されていない哺乳動物の神経組織におけるその発現の参照レベルと比較する工程；および、
（ｄ）前記遺伝子の発現レベルが、その発現の対応する参照レベルと異なるか否かを判定する工程であって、前記相違は、試験化合物が、認知機能増進のための候補治療剤であることを示すものとする工程、
を含む方法。
（項目１４）
哺乳動物において認知機能を増進するのに有用な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を、図４に挙げられる遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；および、
（ｂ）前記遺伝子の発現レベルが、前記細胞を前記試験化合物と接触させたことによって変化するか否かを判定する工程であって、前記変化はもしあれば、前記試験化合物は、認知機能を、それが必要な哺乳動物において増進する能力を有することを示すものとする工程、
を含む方法。
（項目１５）
前記細胞は神経組織由来のものである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記細胞は不死化細胞である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞は、神経細胞系統、グリア細胞系統、または、アストロサイト細胞系統である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記遺伝子はグルタメート輸送因子である、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記遺伝子の発現レベルが上昇している、項目１、２、７、１３、または１４に記載の方法。
（項目２０）
前記遺伝子の発現レベルが低下している、項目１、２、７、１３、または１４に記載の方法。
（項目２１）
前記試験化合物は低分子である、項目７、１３、または１４に記載の方法。
（項目２２）
前記試験化合物は、
【化１】
2010227105.tif 000002
であり、前式において、各場合において、
ＬはＯまたはＳであり；
ＲはＨ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、アリール、アラルキル、−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈであり；
Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｘであり、
式中、
ＸはＯＨ、ＮＲ２、ＳＨ，Ｏ−アルカリ金属、または、−ＯＣ（ＣＨ３）ＯＣ（Ｏ）ＯＣＨ（ＣＨ３）２であり；および、
ｎは、０以上６以下の整数であり；
Ｒ２はＨ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−８アルケニル、または−（ＣＨ２）ａ−Ｗ−Ｒ３であり；
式中、
Ｒ３はＨ、Ｃ１−１０アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−１０アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、
アリール、アラルキル、またはＡであり；
ＷはＯ、Ｓ、またはＮＲ４であり；および、
ａは、１以上６以下の整数であり；
式中、
Ｒ４はＨ、Ｃ１−１０アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−１０アルキル、アリール、アラルキル、あるいは、Ｒ３とＲ４は一緒になって、未置換の、または置換されたヘテロアルキルまたはヘテロアリール環を形成してもよく、
−−線は、単結合または二重結合を示し、
Ｒ５はＲ１、Ｈ、ＳＯ３Ｈ、アリール、Ｃ１−１０アルキル、アラルキルであり；あるいは、Ｒ５は、−−線が二重結合である場合＝ＣＨＣＨ２ＣＯ２Ｈおよび＝ＮＲから成るグループから選ばれ、
ｍは０か１であり、および、
Ａはアリールか、式Ｉａのヘテロアリールであり、
【化２】
2010227105.tif 000003
式中、各場合において、独立して
ＪはＯ、Ｓ、ＮＲ６、またはＣＲ６であり；および、
ｙは１か２であり；
ここに、Ｒ６は電子対、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、アリール、または、−ＮＲ２であり；
あるいはＡは、式ＩｂまたはＩｃのヘテロシクロアルキルであり
【化３】
2010227105.tif 000004
式中、各場合において、独立して
ＪはＯ、Ｓ、またはＮＲであり；および、
ＸはＯまたはＨ２である、
項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記試験化合物は、
【化４】
2010227105.tif 000005
であり、前式において、各場合において、独立して
Ｘは−ＯＨ、Ｃ１−１０アルコキシ、−Ｏ−アルカリ金属、−Ｎ（Ｒ１）２、−ＳＨ、または、−Ｓ−Ｃ１−１０アルキルであり；
Ｒは、直鎖または分枝鎖のＣ１−３０アルキルであり；および、
Ｒ１はＨ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、アリール、または、アラルキルである；
ただし、Ｒは、未置換であるか、または、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルコキシ、−Ｎ（Ｒ１）２、−ＳＨ、−Ｓ−Ｃ１−１０アルキル、またはアリールの１個以上によって置換され得る、
項目２１に記載の方法。
（項目２４）
哺乳動物における認知機能の維持において神経組織で差示的に発現される遺伝子をコードする複数のｃＤＮＡ配列を含むライブラリー。
（項目２５）
セフトリアキソンによる哺乳動物の治療において神経組織で差示的に発現される遺伝子をコードする複数のｃＤＮＡ配列を含むライブラリー。
（項目２６）
バルプロ酸による哺乳動物の治療において神経組織で差示的に発現される遺伝子をコードする複数のｃＤＮＡ配列を含むライブラリー。
（項目２７）
前記複数のｃＤＮＡ配列は、グルタメート輸送体遺伝子由来の配列を含む、項目２４、２５、または２６に記載のライブラリー。
（項目２８）
前記グルタメート輸送体遺伝子は、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４、およびＥＡＡＴ５から成るグループから選ばれることを特徴とする項目２７に記載のライブラリー。
（項目２９）
項目２７に記載のライブラリーであって、前記複数のｃＤＮＡ配列は、その中に存在する全ての配列の少なくとも２０％を含む、ライブラリー。
（項目３０）
項目２７に記載のライブラリーであって、前記複数のｃＤＮＡ配列は、その中に存在する全ての配列の少なくとも５０％を含む、ライブラリー。
（項目３１）
項目２７に記載のライブラリーであって、前記複数のｃＤＮＡ配列は、その中に存在する全ての配列の少なくとも８０％を含む、ライブラリー。
（項目３２）
個別にアドレスを付された位置において、項目２４、２５、または２６のライブラリーのメンバーに相当するｃＤＮＡ配列を付着させた固相支持体を含むマイクロアレイチップ。
（項目３３）
図４に挙げた遺伝子の神経組織発現を刺激することが可能な組成物の、治療における使用。
（項目３４）
前記遺伝子はグルタメート輸送因子である、項目３３に記載の使用。
（項目３５）
前記グルタメート輸送体は、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４、またはＥＡＡＴ５であることを特徴とする項目３４に記載の使用。
（項目３６）
前記化合物は低分子である、項目３３に記載の使用。
（項目３７）
治療有効量の式：
【化５】
2010227105.tif 000006
の、治療における使用であって、
ここで、各場合において、個々に
ＬはＯまたはＳであり；
ＲはＨ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、アリール、アラルキル、−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈであり；
Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｘであり、
ここに、
ＸはＯＨ、ＮＲ２、ＳＨ，Ｏ−アルカリ金属、または、−ＯＣ（ＣＨ３）ＯＣ（Ｏ）ＯＣＨ（ＣＨ３）２であり；および、
ｎは、０以上６以下の整数であり；
Ｒ２はＨ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−８アルケニル、または−（ＣＨ２）ａ−Ｗ−Ｒ３であり；
ここに、
Ｒ３はＨ、Ｃ１−１０アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−１０アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、アリール、アラルキル、またはＡであり；
ＷはＯ、Ｓ、またはＮＲ４であり；および、
ａは、１以上６以下の整数であり；
ここに、
Ｒ４はＨ、Ｃ１−１０アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−１０アルキル、アリール、アラルキル、あるいは、Ｒ３とＲ４は一緒になって、未置換の、または置換されたヘテロアルキル環またはヘテロアリール環を形成してもよく、
−−線は、単結合または二重結合を示し、
Ｒ５はＲ１、Ｈ、ＳＯ３Ｈ、アリール、Ｃ１−１０アルキル、アラルキルであり；あるいは、Ｒ５は、−−線が二重結合である場合＝ＣＨＣＨ２ＣＯ２Ｈおよび＝ＮＲから成るグループから選ばれ、
ｍは０か１であり、および、
Ａは式Ｉａのアリールまたはヘテロアリールであり、
【化６】
2010227105.tif 000007
式中、各場合において、独立して
ＪはＯ、Ｓ、ＮＲ６、またはＣＲ６であり；および、
ｙは１か２であり；
ここに、Ｒ６は電子対、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、アリール、または、−ＮＲ２であり；
あるいはＡは、式ＩｂまたはＩｃのヘテロシクロアルキルであり
【化７】
2010227105.tif 000008
式中、各場合において、独立して
ＪはＯ、Ｓ、またはＮＲであり；および、
ＸはＯまたはＨ２である、
使用。
（項目３８）
治療有効量の式：
【化８】
2010227105.tif 000009
の、治療における使用であって、
ここで、各場合において、独立して
Ｘは−ＯＨ、Ｃ１−１０アルコキシ、−Ｏ−アルカリ金属、−Ｎ（Ｒ１）２、−ＳＨ、または、−Ｓ−Ｃ１−１０アルキルであり；
Ｒは、直鎖または分枝鎖のＣ１−３０アルキルであり；および、
Ｒ１はＨ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、アリール、または、アラルキルである；
ただし、Ｒは、未置換であるか、または、−ＯＨ、Ｃ１−１０アルコキシ、−Ｎ（Ｒ１）２、−ＳＨ、−Ｓ−Ｃ１−１０アルキル、またはアリールの１個以上によって置換され得る、
使用。
（項目３９）
項目７、１３、または１４の方法に従って特定された、セフトリアキソンまたはバルプロ酸以外の組成物の、治療における使用。
（項目４０）
哺乳動物において認知機能を維持するための医薬品の製造法であって、前記医薬品は、前記哺乳動物においてグルタメート輸送体遺伝子の神経組織発現を刺激することを特徴とする方法。
（項目４１）
哺乳動物において認知機能障害を処置するための医薬品の製造法であって、前記医薬品は、前記哺乳動物においてグルタメート輸送体遺伝子の神経組織発現を刺激することを特徴とする方法。
（項目４２）
哺乳動物において認知機能を維持するための医薬品の製造法であって、前記医薬品は、項目３３の組成物を含むことを特徴とする方法。
（項目４３）
認知機能を、それが必要な哺乳動物において維持するための医薬品の製造法であって、前記医薬品は項目３７の組成物を含むことを特徴とする方法。
（項目４４）
認知機能を、それが必要な哺乳動物において維持するための医薬品の製造法であって、前記医薬品は項目３８の組成物を含むことを特徴とする方法。
（項目４５）
認知機能を、それが必要な哺乳動物において維持するための医薬品の製造法であって、前記医薬品は項目３９の組成物を前記哺乳動物に対して含むことを特徴とする方法。
（項目４６）
前記哺乳動物は、抗生物質治療が適応的である感染症症状を持たないことを特徴とする項目４３に記載の方法。
（項目４７）
項目３３の組成物を含み、認知機能を、それが必要な哺乳動物において増進するための医薬品の製造法であって、前記認知機能は、空間記憶獲得、長期空間記憶、および空間記憶想起から成るグループから選ばれることを特徴とする方法。
（項目４８）
高齢哺乳動物において認知機能を維持するための医薬品の製造法であって、前記医薬品は、セフトリアキソン、あるいは、その類縁体または誘導体を含むことを特徴とする方法。
（項目４９）
哺乳動物において認知機能障害を処置するための医薬品の製造法であって、前記医薬品は、セフトリアキソン、あるいは、その類縁体または誘導体を含むことを特徴とする方法。
（項目５０）
前記認知機能障害は、軽度認知障害、加齢性認知衰退、記憶喪失、老衰、および、痴呆から成るグループから選ばれる状態である、項目４１または４９に記載の方法。
（項目５１）
前記認知機能障害はアルツハイマー病である、項目４１または４９に記載の方法。
（項目５２）
前記哺乳動物はヒトである、項目４１または４９に記載の方法。
（項目５３）
前記哺乳動物はヒトである、項目４０、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４７に記載の方法。
本発明の、その他の特質・利点は、下記の詳細な説明および特許請求の範囲に基づいて自ずから明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＭＷＭ評価における若年ラットと高齢ラットの行動特徴を示すグラフである。
【図２】図２は、１０匹の高齢ラットにおける最初のＭＷＭ特性評価と、同じラットのＲＡＭにおける記憶成績との間の信頼度を示すグラフである。
【図３】図３は、脳組織に見られる各種細胞型における、哺乳類グルタメート輸送体およびそのヒト相同体の分布をまとめた表である。
【図４】図４は、若年（Ｙ）、高齢障害有り（ＡＩ）、および、高齢障害無し（ＡＵ）動物における、マイクロアレイによるＥＡＡＴ２／ＧＬＴ１、ＥＡＡＴ１／ＧＬＡＳＴ、および、ＥＡＡＴ３／ＥＥＡＣ１  ｍＲＮＡの発現をまとめた表である。
【図５】図５は、若年（Ｙ）、高齢障害有り（ＡＩ）、および、高齢障害無し（ＡＵ）動物における、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学によるＥＡＡＴ２／ＧＬＴ１、ＥＡＡＴ１／ＧＬＡＳＴ、および、ＥＡＡＴ３／ＥＥＡＣ１  ｍＲＮＡの量をまとめた表である。
【図６】図６は、セフトリアキソンによって治療された（毎日２００ｍｇ／ｋｇ筋注、１週間）ＡＩラットにおける記憶エラーの低下を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
６．発明の詳細な説明
説明の都合上、明細書、実施例および付属の特許請求項で用いられるいくつかの用語をこの場所に集めた。別様に指示しない限り、本明細書に使用される技術・科学用語は全て、本発明の所属する従来技術において通常の錬度を有する当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２２】
６．１  定義
冠詞“ａ”および“ａｎ”は、本明細書で使用する場合、その冠詞の文法的目的物の１個、または、１個以上（すなわち、少なくとも１個）を指す。例を挙げて説明すると、ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔは、１個の要素、または、１個以上の要素を指す。
【００２３】
本明細書で用いる「高齢者（体）」とは、その平均寿命の終末期にある、または、終末期近くにある哺乳動物を指す。例えば、高齢ラットは約２４−３０月齢となろう。高齢者は７０歳以上となろう。
【００２４】
「脂肪族」という用語は当該分野で認知され、直鎖状、分枝鎖状、環状の、アルカン、アルケン、またはアルキンを指す。いくつかの実施態様では、本発明の脂肪族基は、直鎖または分枝鎖であり、１から約２０個の炭素原子を有する。
【００２５】
「アルキル」という用語は当該分野で認知され、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環）基、アルキル置換シクロアルキル基、および、シクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基を含む。いくつかの実施態様では、直鎖または分枝鎖アルキルは、そのバックボーンに約３０個以下の炭素原子（例えば、直鎖の場合Ｃ１−Ｃ３０、分枝鎖の場合Ｃ３−Ｃ３０）を、別に約２０以下の炭素原子を有する。同様に、シクロアルキルは、その環状構造の中に約３から約１０個の炭素原子を有し、別に、その環状構造の中に約５個、６個または７個の炭素を有する。「アルキル」という用語は、ハロ置換アルキルをも含むように定義される。
【００２６】
「アミン」および「アミノ」という用語は当該分野で認知され、アミンの未置換体および置換体の両方を指し、例えば、一般式：
【００２７】
【化９】
2010227105.tif 000010
で表される機能基であって、Ｒ５０、Ｒ５１およびＲ５２がそれぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１であり、または、Ｒ５０とＲ５１とは、それらが付着するＮ原子と共に、その環状構造の中に４から８原子を有する複素環を完成し；Ｒ６１はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、または、多環を表し、ｍは、ゼロまたは、１から８の範囲の整数を表す、式で表される機能基である。ある実施態様では、Ｒ５０またはＲ５１の一方のみがカルボニルであってもよいが、例えば、Ｒ５０、Ｒ５１と窒素は一緒になってイミドを形成しない。別の実施態様では、Ｒ５０とＲ５１（および要すれば随意にＲ５２も）それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、または、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１を表す。従って、「アルキルアミン」という用語は、置換された、または、未置換のアルキルを付着させた、すなわち、Ｒ５０とＲ５１の少なくとも一方がアルキル基である、上に定義した通りのアミン基を含む。
【００２８】
「アシルアミノ」という用語は当該分野で認知され、一般式：
【００２９】
【化１０】
2010227105.tif 000011
において、Ｒ５０は上に定義した通りであり、Ｒ５４は水素、アルケニル、アルキル、または、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１であり、ｍとＲ６１は上に定義した通りである式によって表される機能基を指す。
【００３０】
「アミド」という用語は、アミノ置換カルボニルとして当該分野で認知され、一般式：
【００３１】
【化１１】
2010227105.tif 000012
において、Ｒ５０とＲ５１とは上に定義した通りである式によって表され得る機能基を含む。本発明におけるアミドのいくつかの実施態様は、不安定の可能性のあるイミドを含まない。
【００３２】
「アルキルチオ」という用語は、上に定義した通りのアルキル基であって、硫黄基を付着させたアルキル基を指す。いくつかの実施態様では、「アルキルチオ」基は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニルおよび、−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１の内から選ばれる一つによって表され、ｍとＲ６１は上に定義した通りである。代表的アルキルチオ基としては、メチルチオ、エチルチオ等が挙げられる。
【００３３】
「アラルキル」という用語は当該分野で認知され、アリール基（例えば、芳香族または芳香族複素環基）で置換されたアルキル基を指す。
【００３４】
「アルケニル」および「アルキニル」という用語は当該分野で認知され、前述のアルキルと、長さと置換の可能性において類似するが、ただし、それぞれ、二重結合、または、三重結合を含む不飽和脂肪族基を指す。
【００３５】
炭素数を別様に指定しない限り、「低級アルキル」とは、上に定義した通りのアルキル基であって、そのバックボーン構造において、１から約１０個の炭素を、別に１から約６個の炭素原子を有するアルキル基を指す。同様に、「低級アルケニル」および「低級アルキニル」も同様の鎖長を有する。
【００３６】
「アルコキシル」または「アルコキシ」という用語は当該分野で認知され、上に定義した通りのアルキル基であって、酸素ラジカルを付着させたアルキル基を指す。代表的なアルコキシル基としては、メトキシ、エトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等が挙げられる。「エーテル」とは、一つの酸素によって共有的に結ばれた二つの炭化水素である。従って、アルキルの置換体であって、そのアルキルをエーテルとする置換体は、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１の内から選ばれる一つによって表されるアルコキシルである、または、そのようなアルコキシルと類似する。なお、ｍとＲ６１は前述の通りである。
【００３７】
本明細書で用いる「類縁体」とは、機能的には別の化学的実体と類似するが、それと同一の化学的構造を分かち持たない化合物を指す。例えば、セフトリアキソン類縁体は、セフトリアキソンの構造とは僅かな構造的違いがあるにも拘わらず、治療用途においてはセフトリアキソンの代替となることができるほどセフトリアキソンに類似する。
【００３８】
本明細書で用いる「アレイ」および「マトリックス」とは、装置上の、アドレス指定可能な位置、または、「アドレス」の配置を指す。位置は、二次元アレイ、三次元アレイ、または、他のマトリックス方式で配置することが可能である。位置の数は、数千から、少なくとも数十万の範囲に渡ることが可能である。もっとも重要なことは、各位置は、完全に独立な反応部位を表すということである。「核酸アレイ」とは、核酸プローブ、例えば、オリゴヌクレオチド、または、それよりも大きな遺伝子部分を含むアレイを指す。アレイ上の核酸は１本鎖であってもよい１。（１ｃＤＮＡアレイは２本鎖であってもよい）。プローブがオリゴヌクレオチドであるアレイは、「オリゴヌクレオチドアレイ」または「オリゴヌクレオチドチップ」と呼ばれる。本明細書では「バイオチップ」、「生物チップ」、または、「遺伝子チップ」とも呼ばれる「マイクロアレイ」は、少なくとも約１００／ｃｍ２の、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２の一定密度の不連続領域を有する領域アレイである。マイクロアレイの領域は、典型的な大きさ、例えば、約１０−２５０μｍの範囲の直径を持ち、アレイ上では他の領域からほぼ同じ距離だけ隔てられる。
【００３９】
本明細書で用いられる「アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ」は、オキサロアセテートとグルタメートのアスパルテートと２−オキソグルタメートへの変換を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１）、および、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸をコードする核酸および相同体（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＢＣ０００４９８またはＸＭ＿０６２６７８を参照）を指す。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、シナプス間隙およびシナプス外空間においてグルタメートの分解に関わる。前記の相同体は、霊長類、イヌ類、ネコ類、およびげっ歯類を含む他の哺乳動物にも存在すると考えられる。
【００４０】
本明細書で用いられる「ベータ−アレスチン２」とは、活性化されたＧタンパク共役受容体から発せられる追加信号の伝達を促進する、細胞内支柱／アダプタータンパクを指す。さらに、これらのタンパクは、膜貫通型受容体エンドサイトーシスのエンドサイトーシスに関わる。ベータ−アレスチン２はまた、β−アレスチンタンパクをコードする核酸も指す。前記の相同体は、霊長類、イヌ類、ネコ類、およびげっ歯類を含む他の哺乳動物にも存在すると考えられる。
【００４１】
「炭素環」という用語は当該分野で認知され、環の各原子が炭素である芳香族または非芳香族環を指す。
【００４２】
「カルボニル」という用語は当該分野で認知され、一般式：
【００４３】
【化１２】
2010227105.tif 000013
において、Ｘ５０は結合であり、あるいは、酸素または硫黄を表し、Ｒ５５およびＲ５６は、水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１、または製薬学的に受容可能な塩を表し、Ｒ５６は、水素、アルキル、アルケニル、または、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１を表し、ｍとＲ６１は上に定義した通りである式によって表される機能基を含む。Ｘ５０が酸素でありＲ５５またはＲ５６が水素でなければ、前式は「エステル」を表す。Ｘ５０が酸素でありＲ５５が上に定義した通りであると、この機能基は本明細書ではカルボキシル基と呼ばれ、特にＲ５５が水素である場合には、この式は「カルボン酸」を表す。Ｘ５０が酸素であり、Ｒ５６が水素である場合は、この式は「ギ酸塩」を表す。一般に、上式の酸素原子が硫黄で置換された場合、この式は「チオールカルボニル」基を表す。Ｘ５０が硫黄であり、Ｒ５５またはＲ５６が水素でない場合、この式は「チオールエステル」を表す。Ｘ５０が硫黄であり、Ｒ５５が水素である場合、この式は「チオールカルボン酸」を表す。Ｘ５０が硫黄であり、Ｒ５６が水素である場合、この式は「チオールギ酸塩」を表す。一方、Ｘ５０が結合であり、Ｒ５５が水素でない場合は、上式は「ケトン」基を表す。Ｘ５０が結合であり、Ｒ５５が水素である場合、上式は「アルデヒド」基を表す。
【００４４】
「キラル」という用語は当該分野で認知され、鏡像パートナーの非重複性を有する分子同士を指すが、一方、「アキラル」という用語は、その鏡像パートナーに対して重複可能な分子同士を指す。「プロキラル分子」とは、特定の過程においてキラル分子へと変換される可能性を持つ分子である。
【００４５】
「シス」という用語は当該分野で認知され、二重結合の周囲の二つの原子または基において、その原子または基が、二重結合の同じ側にあるような配置を指す。シス構成は、（Ｚ）構成と表示されることがよくある。
【００４６】
本明細書で用いられる「認知機能」とは、学習や記憶に与る、高次の知的な、脳の過程であって、注意、習得、短期記憶、長期記憶、および、記憶喚起を含み−ただし、それらに限定されない−、自己の周囲や、自身の身仕舞い・健康に対する興味を表明する過程を指す。動物モデルのシステムでは、認知機能は、当該分野で公知のやり方−下記の装置、すなわち、モリスの水迷路、バーネスの円迷路、高架放射状迷路、Ｔ迷路、その他、被験体が空間情報を用いる全ての迷路を含むやり方の中から選ばれる任意の数の方法によって測定されてよい。当該分野で公知の他の試験法、例えば、恐怖条件付け、積極的回避、照明開放野、暗黒活動メーター、高架型プラス迷路、二区画探究試験、または、強制スイミング試験を用いて認知機能を評価してもよい。ヒトでは、認知機能は−ただし限定されることなく−アルツハイマー病評価スケール−認知サブスケール（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ）、臨床的粗大印象変化スケール（ＣＩＢＩＣ−プラススケール）、アルツハイマー病協力研究日常活動スケール（ＡＤＣＳ−ＡＤＬ）、ミニ精神状態試験（ＭＭＳＥ）、神経精神科一覧試験（ＮＰＩ）、臨床的痴呆レイティングスケール（ＣＤＲ）、ケンブリッジ神経精神科自動化試験（ＣＡＮＴＡＢ）、または、サンドス臨床評価老人学（ＳＣＡＧ）で測定してもよい。さらに、認知機能は、画像法、例えば、ポジトロン照射断層撮影（ＰＥＴ）、機能的核磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、単一フォトン照射ＣＴ（ＳＰＥＣＴ）、または、その他、脳機能の測定を可能とする任意の画像法を用いて測定してもよい。
【００４７】
認知機能を「増進する」とは、認知機能障害に対して、それが、年齢的に適合した、正常な、損なわれていない被験体の機能により近似するように作用を及ぼすことを指し、認知機能が、正常な被験体と比べて、例えば、約１０％、３０％、５０％、７５％、９０％、または９５％低下している状態に作用することを含む。認知機能は、検出可能な任意のレベルだけ増進させることが可能であるが、障害被験体が、正常な日常活動を実行可能となるほど十分に増進させられるのが好ましい。
【００４８】
認知機能を「保持する」とは、正常な、または認知機能障害に対して、最初の出現時または診断時にその被験体において観察された状態以下に衰えないまたは低下しないように作用を及ぼすことを指す。
【００４９】
「認知機能障害」とは、年齢適合の正常な被験体に観察されるものほど堅実ではない認知機能を指し、認知機能が、年齢適合正常被験体で測定された認知機能に比べて、約１０％、３０％、５０％、７５％、９０％、または９５％低下している状態を含む。認知機能障害は、痴呆（例えば、レーヴィ体痴呆、血管性痴呆、アルツハイマー病、およびＨＩＶ関連痴呆）、ハンチントン病、パーキンソン病、分裂病、筋萎縮性側索硬化症、軽度認知障害（ＭＣＩ）、および、加齢性認知衰退（ＡＲＣＤ）を含む多くの疾患または障害と関連する可能性がある。別に、認知機能障害は、診断可能な疾患または障害を提示しない被験体において現れてもよい。例えば、認知機能障害は、その被験体における微妙な代謝的、毒性の、神経毒性の、医原性の、熱的または化学的変化によってもたらされてもよい。これらの微妙な変化としては、虚血症、低酸素症、脳血管性事故、外傷、外科手術、圧、質量作用、出血、放射、血管痙攣、神経変性疾患または感染が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。
【００５０】
本明細書で用いる「対照集団」とは、認知機能と関連する所望の行動を欠如する複数の哺乳動物を指し、通常若くない哺乳動物を含む。
【００５１】
「共有結合」という用語は当該分野で認知され、二つの原子の間の結合であって、電子が、二つの原子の両方の核に向けて静電気的に引き付けられ、二つの核の間の電子密度増加による正味の作用が、核間の反発力に釣合っている結合を指す。共有結合という用語は、結合が金属イオンに関わる場合配位結合を含む。
【００５２】
「組み合わせライブラリー」または「ライブラリー」という用語は当該分野で認知され、ライブラリーにおける「メンバー」と呼ばれる複数の化合物であって、１種以上の開始材料から、各反応において同じ、または、別の反応因子または反応条件を用いることによって合成される、または他のやり方で調製される複数の化合物を指す。組み合わせライブラリーに関連して他にもいくつかの用語（他の技法も）がある。「特定タグ」という用語は当該分野で認知され、化学ライブラリーの合成に使用される一連の反応における一工程を記録する手段を指す。「固定化」という用語は当該分野で公知であり、ある分子種に関連して用いられる場合、その分子種が、意図する表面使用環境に存在する牽引力よりも強く、従ってその分子種に対して作用する牽引力によって表面に付着される状態を指す。「固相支持体」という用語は当該分野で認知され、不溶の基質である材料であって、（要すれば随意に）剛性の、または、半剛性の表面を持つ材料を指す。「リンカー」という用語は当該分野で認知され、固相支持体またはポリマー支持体を含む支持体と、組み合わせライブラリーメンバーとを結合する１個の分子、または分子群を指す。「ポリマー支持体」という用語は当該分野で認知され、化学的機能基が、ポリマー支持体の機能基との反応によって共有的に結合される、可溶の、または不溶のポリマーを指す。「ポリマー支持体の機能基」という用語は当該分野で認知され、化学的機能基と反応してポリマー支持アミノエステルを形成することが可能な、ポリマー支持体の化学的機能基を指す。
【００５３】
本明細書で用いる「誘導体」という用語は、化合物、例えば、セファロスポリン、またはバルプロ酸の化学的修飾を指す。ある化合物の化学的修飾としては、例えば、水素の、アルキル、アシル、またはアミノ基による置換が挙げられる。他にも多くの修飾が可能である。化合物の誘導体は、元の化合物の、少なくとも１種の機能性を保存する。
【００５４】
本明細書で用いる「所望の行動」とは、正常で、損なわれていない被験体において観察される認知機能の行動的発現を指す。例えば、動物では、所望の行動は、いくつかの下記の装置、例えば、モリスの水迷路、バーネスの円迷路、高架放射状迷路、Ｔ迷路の内から選ばれる任意の一つの装置によって測定される、あるいは、いくつかの下記の試験、例えば、恐怖条件付け、積極的回避、照明開放野、暗黒活動メーター、高架型プラス迷路、二区画探究試験、または、強制スイミング試験の内から選ばれる任意の一つの試験によって測定される動物の認知機能を反映する。ヒトでは、所望の行動は、被験体が正常な日常行動を実行する能力によって測定される被験体の認知機能を反映するが、または、ＡＤＡＳ−ｃｏｇ、ＣＩＢＩＣ−プラススケール、ＡＤＣＳ−ＡＤＬ、ＭＭＳＥ、ＮＰＩ、ＣＤＲ、ＣＡＮＴＡＢ、またはＳＣＡＧを含む−がそれに限定されない−認知機能試験の内から選ばれる任意の数の試験における成績によって測定してもよい。
【００５５】
「ヘテロ原子」という用語は当該分野で認知され、炭素または水素以外の任意の元素の原子を指す。具体的なヘテロ原子としては、ホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄、およびセレンが挙げられる。
【００５６】
「アリール」という用語は当該分野で認知され、０から４個のヘテロ原子を含んでもよい、単一の、５−、６−、および、７−員環芳香族グループ、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンとピリミジン等を指す。環構造の中にヘテロ原子を有するアリール基は、「ヘテロアリール」と呼んでもよい。芳香環は、１個以上の環位置において、前述の置換基、例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、フォスフォネート、フォスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルフォニル、スルフォンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族基、−ＣＦ３、−ＣＮ等によって置換されてもよい。「アリール」という用語はまた、２個以上の環を有する多環システムであって、２個以上の炭素が二つの隣接環にとって共通であり（これらの環は「縮合環」である）、環の内の少なくとも１個は芳香族であり、例えば、他の環はシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、および／または、ヘテロシクリルであることを特徴とする多環システムを指す。
【００５７】
オルト、メタ、パラという用語は当該分野で公知であり、それぞれ、１，２−、１，３−、および、１，４−二置換ベンゼンを指す。例えば、１，２−ジメチルベンゼンとオルト−ジメチルベンゼンとは同義語である。
【００５８】
「ヘテロシクリル」または「ヘテロ環基」という用語は当該分野で公知であり、３−から約１０−員環構造、別に３−から約７−員環であって、その環状構造が１から４個のヘテロ原子を含む環構造を指す。ヘテロ環はまた多環であってもよい。ヘテロシクリルとしては、例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサンテン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルフォリン、ラクトン、アゼチジノンやピロリジノンのようなラクタム類、スルタム、スルトン等が挙げられる。ヘテロ環は、１個以上の位置において、前述の置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、フォスフォネート、フォスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルフォニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族基、−ＣＦ３、−ＣＮ等によって置換されてもよい。
【００５９】
本明細書で用いられる「差示的に発現される」とは、異なる処理を受けた、あるいは、異なる環境因子に暴露された、あるいは、生理学的環境において異なる変化に曝された、組織中の対象遺伝子の、定性・定量両測定値を含む、異なる発現レベルを指す。
【００６０】
本明細書で用いる「遺伝子」または「遺伝子配列」とは、遺伝子の部分的または完全なコード配列、その相補体、および、その５’または３’未翻訳領域を指す。遺伝子の「コード配列」とは、その遺伝子のｍＲＮＡ転写物に存在する一組のヌクレオチドである。「遺伝子発現」とは、遺伝子のＤＮＡ配列に基づいてＲＮＡを製作、または転写する過程を指す。遺伝子発現の「活性因子」とは、遺伝子のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物への転写を刺激する化合物を指す。「内因性」遺伝子とは、その種の内部に天然に見出される遺伝子で、ランダム挿入やトランスフェクション等によって、その生物または細胞の中に人工的に組み込まれたものではない遺伝子を指す。
【００６１】
本明細書で用いる「グルタメート輸送因子」とは、哺乳類中枢神経系（ＣＮＳ）の主要神経伝達物質であるＬ−グルタメートを、シナプス間隙およびシナプス外空間を含めた細胞外空間から排除する、膜貫通タンパクを指す。グルタメート輸送因子は、神経細胞とグリア細胞の両方の膜に見出される可能性がある。いくつかのグルタメート輸送因子がヒトにおいて特定されているが、例えば、溶質搬送因子１族、１員（ＳＬＣ１Ａ１またはＥＡＡＣ１またはＥＡＡＴ３、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００４１７０）、溶質搬送因子１族、２員（ＳＬＣ１Ａ２またはＥＡＡＴ２またはＧＬＴ１、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００４１７１）、溶質搬送因子１族、３員（ＳＬＣ１Ａ３またはＥＡＡＴ１、ＧＬＡＳＴまたはＧＬＡＳＴ１、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００４１７２）、溶質搬送因子１族、６員（ＳＬＣ１Ａ６またはＥＡＡＴ４、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００５０７１）、および、溶質搬送因子１族、７員（ＳＬＣ１Ａ７またはＥＡＡＴ５、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００６６７１）が挙げられる。さらに、グルタメート輸送因子は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓおよびＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（Ｓ１ｃ１ａ１／Ｅａａｃ１／ＲＥＡＡＣ１、Ｓ１ｃ１ａ２／ＧＬＴ−１／ＧｌｕＴ−Ｒ、Ｓ１ｃ１ａ３／Ｅａａｔ１／ＧＬＡＳＴ／ＧｌｕＴ−１、および、Ｓ１ｃ１ａ６／Ｅａａｔ４）でも特定されている。前記の相同体は、霊長類、イヌ類、ネコ類、およびげっ歯類を含むその他の哺乳類にも存在すると考えられている。グルタメート輸送因子の活性は、グルタメート輸送タンパクのグルタメート輸送活性を上昇させる薬剤を投与することによって増大される。グルタメート輸送タンパクの活性を増大させることが報告されている薬剤の例としては、例えば、（（Ｒ）−（−）−５−メチル−１−ニコチノイル−２−ピラゾリン（ＭＳ−１５３、Ｓｈｉｍａｄａ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８６：２６３−７０，１９９９）、リドカイン（Ｄｏ等、Ａｎｅｓｔｈ．Ａｎａｌｇ．９５：１２６３−８，２００２）、および、キナーゼ阻害剤（例えば、Ｃｏｎｒａｄｔ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６８：１２４４−５１，１９９７）が挙げられる。
【００６２】
本明細書で用いる遺伝子の「発現レベル」とは、遺伝子発現の存在を、閾値量を、定性的または定量的測定値を検出するために使用される、任意の方法によって測定される遺伝子発現レベル、例えば、ｍＲＮＡレベル（例えば、「ノーザンブロット」または「マイクロアレイ分析」によって）、またはタンパク（例えば、全長そのままの、または、先端切断型のポリペプチド遺伝子産物を検出することによって（例えば、抗体によって免疫学的に））を測定することによって得られる遺伝子発現レベルを指す。
【００６３】
「メソ化合物」という用語は当該分野で認知され、少なくとも２個のキラル中心を有し、平面または対称中心のためにアキラルとなる化合物を指す。
【００６４】
本明細書で用いる「代謝型グルタミン酸受容体」（ｍＧｌｕＲ）は、神経伝達物質グルタメートに反応するＧタンパク共役受容体を指す。一次配列の類似性、シグナル伝達の連鎖、および、薬理学的性質に基づいて３群のｍＧｌｕＲがある。Ｉ群は、ｍＧｌｕＲ１（ｍＧｌｕＲ１ａ、ｍＧｌｕＲ１ｂ、ｍＧｌｕＲ１ｃ、ｍＧｌｕＲ１ｄ，例えば、ヒトスプライス変種ｍＧｌｕＲ１ａに対するＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００８３８）、およびｍＧｌｕＲ５（ｍＧｌｕＲ５ａ、ｍＧｌｕＲ５ｂ、例えば、ヒトスプライス変種ｍＧｌｕＲ５ａに対するＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００８４２）から成り、これらはフォスフォリパーゼＣに正に共役される。ＩＩ群は、ｍＧｌｕＲ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００８３９）、およびｍＧｌｕＲ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００８４０）から成り、これらはアデニルシクラーゼに負に連鎖される。ＩＩ群は、ｍＧｌｕＲ４（ｍＧｌｕＲ４ａ、ｍＧｌｕＲ４ｂ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００８４１）、ｍＧｌｕＲ６（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００８４３）、ｍＧｌｕＲ７（ｍＧｌｕＲ７ａ、ｍＧｌｕＲ７ｂ、例えば、ｍＧｌｕＲ７ａのヒトスプライス変種に対するＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００８４４）、およびｍＧｌｕＲ８（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００８４５）から成り、これらはアデニルシクラーゼに負電荷として結合される。各種ｍＧｌｕＲ群に対する作用薬・拮抗薬がいくつか市販されている。例えば、Ｉ群作用薬として、Ｌ−キスカル酸（（Ｌ）−（＋）−α−アミノ−３，５−ジオキソ−１，２，４−オキサジアゾリジン−２−プロパン酸）、（Ｓ）−３，５−ジヒドロキシフェニルグリシン（（Ｓ）−３，５−ＤＨＰＧ）、トランス−アゼチジン−２，４−ジカルボン酸（ｔＡＤＡ）、（１Ｓ，３Ｒ）−１−アミノシクロペンタン−１，３−ジカルボン酸（（１Ｓ，３Ｒ）−ＡＣＰＤ）、および、（ＲＳ）−２−クロロ−５−ヒドロキシフェニルグリシン（ＣＨＰＧ）が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。拮抗剤としては、（Ｓ）−４−カルボキシ−３−ヒドロキシフェニルグリシン（（Ｓ）−４Ｃ３ＨＰＧ）、７−（ヒドロキシイミノ）シクロプロパ［ｂ］クロメン−１ａ−カルボキシレートエチルエステル（ＣＰＣＣＯＥｔ）、（ＲＳ）−１アミノインダン−１，５−ジカルボン酸（ＡＩＤＡ、ＵＰＦ５２３）、２−メチル−６−（フェニルエチニル）ピリジン（ＭＰＥＰ塩酸）、２−メチル−６−（２−フェニルエテニル）ピリジン（ＳＩＢ−１９８３）、６−メチル−２−（フェニルアゾ）−３−ピリジノール（ＳＩＢ−１７５７）、および、（Ｓ）−（＋）−α−アミノ−４−カルボキシ−２−メチルベンゼン酢酸（ＬＹ３６７３８５）が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。ＩＩ群作用剤としては、（２Ｓ，２’Ｒ，３’Ｒ）−２−（２’，３’−ジカルボキシシクロプロピル）グリシン（ＤＣＧＩＶ）、（２Ｓ，１’Ｓ，２’Ｓ）−２−（カルボキシシクロプロピル）グリシン（Ｌ−ＣＣＧ−Ｉ；（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ）−ＣＣＧ）、（Ｓ）−３カルボキシ−４−ヒドロキシフェニルグリシン（（Ｓ）−３��４ＨＰＧ）、および、（２Ｒ，４Ｒ）−４−アミノピロリジン−２，４−ジカルボキシレート（（２Ｒ，４Ｒ）−ＡＰＤＣ）が挙げられ、拮抗剤としては（２Ｓ）−α−エチルグルタミン酸（ＥＧＬＵ）および（２Ｓ）−２−アミノ−２［（１Ｓ，２Ｓ）−２−カルボキシシクロプロピル−１−イル］−３−（キサント−９−イル）プロパン酸（ＬＹ３４１４９５）が挙げられる。ＩＩＩ群作用剤としては（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−１−アミノシクロペンタン−１，２，４−トリカルボン酸（ＡＣＰＴ−１）、Ｌ（＋）−２−アミノ−４−フォスフォノ酪酸（Ｌ−ＡＰ４）、（Ｒ，Ｓ）−４−フォスフォノフェニルグリシン（（Ｒ，Ｓ）−ＰＰＧ）、および、Ｏ−フォスフォ−Ｌ−セリン（Ｌ−ＳＯＰ）が挙げられ、拮抗剤としては（ＲＳ）−α−シクロプロピル−４−フォスフォノフェニルグリシン（ＣＰＰＧ）、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−４−フォスフォノブタン酸（ＭＡＰ４）、および、（ＲＳ）−α−メチルセリン−Ｏ−フォスフェート（ＭＳＯＰ）が挙げられる。最近の証拠から、グリアに関連する代謝型グルタミン酸受容体は、グルタメート輸送因子の発現を変えることが可能であることが示されている（Ａｒｏｎｉｃａ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３；１７：２１０６−１８，２００３）。
【００６５】
本明細書で用いる「中年」とは、性的成熟年齢を過ぎた、すなわち、若くはないが、その種の平均寿命にはまだ近づいていない、すなわち、高齢ではない哺乳動物を指す。例えば、中年ラットは約１２−１８月齢となろう。中年ヒトは、２０歳と７０歳の間となろう。
【００６６】
本明細書で用いる「神経組織」とは、神経系、すなわち、神経細胞とグリアの両方を含む組織を指す。具体的に指定する場合には、神経組織は、「海馬組織」を含む脳内に見られる特定の構造を指す。海馬組織とは、下記を含む側頭葉に見られる海馬型をした構造を指す。すなわち、内嗅皮質、前海馬台、海馬台、前部海馬台、歯状回、および、ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３およびＣＡ４とい名前で知られる領域である。海馬は、短期記憶、長期記憶の形成、記憶喚起、陳述記憶、および、空間ナビゲーションのような過程に関わる。
【００６７】
本明細書で用いる「神経保護」とは、認知機能障害を低減させ、停止させ、または緩和させ、かつ、認知機能障害を被った神経組織を保護、救済、または再生する組成物および治療を指す。
【００６８】
「ニトロ」という用語は当該分野で認知され、−ＮＯ２を指す。「ハロゲン」という用語は当該分野で認知され、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを指す。「スルフヒドリル」という用語は当該分野で認知され、−ＳＨを指す。「ヒドロキシル」という用語は−ＯＨを意味し、「スルフォニル」という用語は当該分野で認知され、−ＳＯ２−を指す。「ハロゲン化物」とは、ハロゲンの対応陰イオンを示し、「擬似ハロゲン化物」とは、ＣｏｔｔｏｎおよびＷｉｌｋｉｎｓｏｎによる「上級無機化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」の５６０ページに記載される通りの定義を有する。
【００６９】
「フォスフォリル」という用語は当該分野で認知され、一般に式：
【００７０】
【化１３】
2010227105.tif 000014
において、Ｑ５０はＳまたはＯを表し、Ｒ５９は水素、低級アルキルまたはアリールを表す式によって表すことが可能である。例えば、アルキルを置換するのに用いる場合は、フォスフォリルアルキルのフォスフォリル基は、一般式：
【００７１】
【化１４】
2010227105.tif 000015
において、Ｑ５０とＲ５９は、それぞれ独立に上に定義した通りであって、Ｑ５１は、Ｏ、ＳまたはＮを表す式によって表すことが可能である。Ｑ５０がＳの場合は、フォスフォリル基は「フォスフォロチオエート」である。
【００７２】
「フォスフォロアミダイト」という用語は当該分野で認知され、一般式：
【００７３】
【化１５】
2010227105.tif 000016
において、Ｑ５１，Ｒ５０，Ｒ５１およびＲ５９は上に定義した通りである式によって表すことが可能である。
【００７４】
「フォスフォノアミダイト」という用語は当該分野で認知され、一般式：
【００７５】
【化１６】
2010227105.tif 000017
においてＱ５１，Ｒ５０、Ｒ５１およびＲ５９は上に定義した通りであり、Ｒ６０は低級アルキル、またはアリールを表す式によって表すことが可能である。
【００７６】
アルケニル基やアルキニル基にたいして類似の置換を行って、例えば、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル置換アルケニルまたはアルキニルを生成することが可能である。各表現、例えば、アルキル、ｍ、ｎ等の定義は、いずれの構造であっても１回以上出現する場合は、同じ構造において別の場所で行われた定義とは独立することが意図される。
【００７７】
「セレノアルキル」という用語は当該分野で認知され、セレノ置換基を付着させたアルキル基を指す。アルキルにおいて置換され得る例示の「セレノエーテル」は、−Ｓｅ−アルキル、−Ｓｅ−アルケニル、−Ｓｅ−アルキニル、および、−Ｓｅ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１の内の一つから選ばれる。なお、ｍとＲ６１は上に定義した通りである。
【００７８】
トリフリル、トシル、メシル、およびノナフリルという用語は当該分野で認知され、それぞれ、トリフルオロメタンスルフォニル、ｐ−トルエンスルフォニル、メタンスルフォニル、および、ノナフルオロブタンスルフォニルの各基を指す。トリフレート、トシレート、メシレート、およびノナフレートという用語は当該分野で認知され、それぞれ、トリフルオロメタンスルフォネートエステル、ｐ−トルエンスルフォネートエステル、メタンスルフォネートエステル、およびノナフルオロブタンスルフォネートエステル官能基、および、前記官能基を含む分子を指す。
【００７９】
Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、Ｔｆ、Ｎｆ、Ｔｓ、および、Ｍｓという略号は、それぞれ、メチル、エチル、フェニル、トリフルオロメタンスルフォニル、ノナフルオロブタンスルフォニル、ｐ−トルエンスルフォニル、および、メタンスルフォニルを表す。従来技術において通常の錬度を有する有機化学者によって利用される略号に関するさらに包括的なリストが、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（「有機化学雑誌」）各巻の第１号に掲載されている。このリストは通常略号標準リストという題名の表に掲載されている。
【００８０】
本明細書で用いる「下垂体アデニルシクラーゼ活性化ポリペプチド」（ＰＡＣＡＰ）とは、ｃＡＭＰ依存性シグナル伝達経路の強力な活性因子である神経性ポリペプチドを指す。ＰＡＣＡＰは、多機能性ペプチドとして作用し、ホルモン分泌調整、エネルギー代謝、神経の生存のような多様な過程に関わり、かつ、グリアのグルタメート輸送因子ＥＡＡＴ１およびＥＡＡＴ２の調整因子でもある（ＦｉｇｉｅｌとＥｎｇｅｌｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３５９６−３６０５，２０００）。ＰＡＣＡＰは、セクレチン／グルカゴン／血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）スーパーファミリーに属し、同じ前駆物質由来の、２種類のアミド化形、ＰＡＣＡＰ３８（３８アミノ酸残基）およびＰＡＣＡ２７（２７アミノ酸残基）として存在する。ＰＡＣＡＰの一次構造は、進化を通じて尾索類、魚形類、爬虫類および哺乳類の間でしっかりと保存されており、ＰＡＣＡＰ様神経性ペプチドはショウジョウバエでも確認されている。ＰＡＣＡＰ−３８およびＰＡＣＡＰ−２７の他に、ＰＡＣＡＰ受容体の第３の作用因子がマキサジランである。マキサジランは、吸血砂バエの唾液腺抽出物から単離された強力な血管拡張性ペプチドである。最近、マキサジランは、ＰＡＣＡＰとは目立ったアミノ酸配列相同性を持っていないけれども、哺乳動物においてＰＡＣＡＰ受容体１型にたいして結合することが証明された（ＭｏｒｏとＬｅｒｎｅｒ：Ｍａｘａｄｉｌａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２）：９６６−７０，１９９７）。ＰＡＣＡＰとその受容体はいずれも、神経および内分泌系に主に分布し、高い能力をもって多面的作用を示す。従って、ＰＡＣＡＰペプチド、マキサジランまたはペプチド誘導体および類縁体、ＰＡＣＡＰ受容体を起動するペプチド様化合物および低分子作用因子は、グルタメート輸送因子活性を上昇させるのに用いることが可能である。
【００８１】
「ポリシクリル」または「多環基」という用語は当該分野で認知され、２個以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、および／または、ヘテロシクリル）であって、２個以上の炭素が二つの隣接環にとって共通であり、例えば、これらの環は「縮合環」である、そのような多環を指す。非隣接原子によって接合される環同士は、「架橋」環と呼ばれる。多環を構成する各環は、前述の置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシリル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、フォスフォネート、フォスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルフォニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族機能基、−ＣＦ３，−ＣＮ等によって置換されてもよい。
【００８２】
本明細書で用いる「複数」とは２個以上を指す。
【００８３】
「薬剤前駆物質」とは当該分野で認知され、生理的条件下で、本発明の抗菌剤に変換される化合物を含むことが意図される。薬剤前駆物質を製造するための一般的方法は、生理的条件下で加水分解されて所望の化合物を与える機能基を選択することである。別の実施態様では、薬剤前駆物質は、宿主動物の酵素活性によって変換される。
【００８４】
「保護基」という用語は当該分野で認知され、潜在能力としては反応性の高い官能基を、望まない化学的変形から保護する、一時的置換基を指す。そのような保護基の例としては、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、アルデヒドおよびケトンの、それぞれ、アセタールとケタールが挙げられる。保護基化学の分野は、「有機合成（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（第２版、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、１９９１）の「保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ）」においてＧｒｅｅｎｅとＷｕｔｓによって総覧されている。
【００８５】
「ヒドロキシル保護基」という用語は当該分野で認知され、合成過程においてヒドロジル基を好ましくない反応から保護するために設けられた基を指し、例えば、ベンジル、または、当該分野で認知され、その他のエステルまたはエーテルが挙げられる。
【００８６】
「カルボキシル保護基」という用語は当該分野で認知され、カルボン酸基、例えば、アミノ酸またはペプチドのＣ末端、酸性またはヒドロキシルアゼピン環置換基を、合成過程中に好ましくない反応から保護するために設けられる基を指し、カルボキシル基の保護基の例としては、例えば、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、４−ニトロベンジルエステル、ｔ−ブチルエステル、４−ピリジルメチルエステル等が挙げられる。
【００８７】
「アミノ遮断基」という用語は当該分野で認知され、アミノ基が、何か他の官能基で起こっている反応に参加するのを阻止するが、要時にはアミンから除去することが可能な基を指す。このような基は、前述のＧｒｅｅｎｅとＷｕｔｓの第７章、および、「有機化学（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第２章の保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ）（ＭｃＯｍｉｅ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク、１９７３）においてＢａｒｔｏｎによって論じられている。適当な基の例としては、アシル保護基、例えば、フォルミル、ダンシル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、メトキシスクシニル、ベンジルおよび、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジルおよびトリフェニルメチルのような置換ベンジル；式−ＣＯＯＲにおいてＲがメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、２，２，２−トリクロロエチル、１−メチル−１−フェニルエチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｔ−アミル、ビニル、アリル、フェニル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｏ−ニトロベンジル、および２，４−ジクロロベンジルのような基を含むもの；アシル基、および、フォルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、およびｐ−メトキシベンゾイルのような置換アシル；および、その他の基、例えば、メタンスルフォニル、ｐ−トルエンスルフォニル、ｐ−ブロモベンゼンスルフォニル、ｐ−ニトロフェニルエチル、および、ｐ−トルエンスルフォニル−アミノカルボニルが挙げられる。好ましいアミノ遮断基は、ベンジル（−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）、アシル［Ｃ（Ｏ）Ｒ１］またはＳｉＲ１３においてＲ１はＣ１−Ｃ４アルキル、ハロメチル、または２−ハロ−置換−（Ｃ２−Ｃ４アルコキシ）であるもの、芳香族ウレタン保護基、例えば、カルボニルベンジルオキシ（Ｃｂｚ）；および、脂肪族ウレタン保護基、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）または９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）である。
【００８８】
各表現、例えば、低級アルキル、ｍ、ｎ、ｐ等の定義は、いずれの構造であっても１回以上出現する場合は、同じ構造において別の場所で行われた定義とは独立することが意図される。
【００８９】
「電子求引基」という用語は当該分野で認知され、置換基が、隣接原子から価電子を引き付ける傾向の強さを指す。すなわち、置換基は隣接原子に対して電気的陰性となる。電子吸引性能レベルの定量は、ハメットのシグマ（σ）定数で与えられる。この周知の定数は、多くの参考書に、例えば、Ｍａｒｃｈ「上級有機化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」２５１−５９（ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、１９７７）に記載されている。ハメットの定数は一般に電子付与基に対しては負であり（ＮＨ２に対してはσ（Ｐ）＝−０．６６）、電子求引基に対しては正であり（ニトロ基に対してはσ（Ｐ）＝０．７８）、σ（Ｐ）はパラ置換を示す。例示の電子求引基としては、ニトロ、アシル、フォルミル、スルフォニル、トリフルオロメチル、シアノ、クロリド等が挙げられる。例示の電子付与基としては、アミノ、メトキシ等が挙げられる。
【００９０】
本明細書で用いる「ＲＮＡ」は、各種のリボ核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、成熟ＲＮＡ、ポリアデニル化ＲＮＡ、非ポリアデニル化ＲＮＡ、および、イントロンおよび／または５’または３’未翻訳領域を含むＲＮＡを指す。本明細書で用いる「発現ＲＮＡ」とは、ゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡからポリメラーゼによって転写されるＲＮＡを指す。
【００９１】
「位置異性体」という用語は当該分野で認知され、同じ分子式を有するが、原子の接続性が異なる化合物同士を指す。従って、「位置選択過程」とは、ある特定の位置異性体の生産を、他の異性体に優って促進する過程であり、例えば、この反応は、ある特定の位置異性体の収率において統計的有意な増加をもたらす。
【００９２】
「エピマー」という用語は当該分野で認知され、同一化学構成を持ち、１個より多い立体中心を含むが、それらの立体中心のただ一つにおいてのみ配置が異なる分子同士を指す。
【００９３】
本明細書で用いる「低分子」とは、約５ｋＤ未満、もっとも好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を持つ組成物を指す。低分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド様物質、炭水化物、脂質、または、その他の有機（炭素含有）または無機の分子である可能性がある。多くの製薬会社および供給業者が、化学的および／または生物学的混合物、多くの場合、真菌、細菌または藻類抽出物の膨大なライブラリーを有しており、これらは、本発明のアッセイ法から任意に選ばれる一つを用いて、生物活性、例えば、所望の行動または認知機能を修飾する化合物を特定するために、スクリーニングすることが可能である。
【００９４】
「立体異性体」という用語は当該分野で認知され、同一の化学的構成を持つが、空間における原子または基の配置に関して異なる化合物同士を指す。特に、「エナンチオマー」とは、互いに重ね合わせることができない鏡像の、化合物の二つの立体異性体を指す。一方、「ジアステレオマー」とは、２個以上の非対称中心を持ち、その分子が互いに鏡像とはならない立体異性体同士を指す。
【００９５】
さらに、「立体選択過程」とは、ある反応産物において、他の可能な立体異性体に優って特定の立体異性体を生産する過程である。「エナンチオ選択過程」とは、ある反応産物において、二つの可能なエナンチオマーの内の一つの生産を優先する過程である。
【００９６】
「構造活性関係」すなわち「（ＳＡＲ）」とは当該分野で認知され、薬剤またはその他の化合物の分子構造を変えることによって、受容体、酵素、核酸またはその他の標的等と、その化合物との相互作用を変化させるやり方を指す。
【００９７】
本明細書で用いる「被験体」とは、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、げっ歯類、または、イヌを指す。被験体はヒトであることが好ましい。本発明による治療「を必要とする」被験体または哺乳動物は、本明細書に記述される方法および組成物によって緩和することが可能な認知機能障害を有する。「置換」または「置換される」とは、その置換は、置換される原子、および置換基の許された価と一致して為されること、および、置換によって安定な化合物が得られること、例えば、再配置、環化、除去、またはその他の反応によって生ずるような変形を自発的に受けることは無い安定な化合物であるという暗黙の条件を含むことを理解しなければならない。
【００９８】
「置換される」という用語は、有機化合物の全ての可能な置換基を含むと考えられる。広い意味では、可能な置換基は、有機化合物の、非環状および環状、分枝鎖および非分枝鎖、炭素環およびヘテロ環、芳香族および非芳香族置換基を含む。例示の置換基としては、例えば前述のものが挙げられる。可能な置換基は、適当な複数の有機化合物に対して１種以上で、同じか異なる可能性がある。本発明の目的のためには、窒素のようなヘテロ原子は、水素置換基を持ってもよいし、および／または、ヘテロ原子の価数を満たす、本明細書に記載される、有機化合物の任意の可能な置換基を持ってもよい。本発明は、有機化合物の可能な置換基によっていかなるやり方でも限定されるものではない。
【００９９】
「スルフォネート」という用語は当該分野で認知され、一般式：
【０１００】
【化１７】
2010227105.tif 000018
においてＲ５７は、電子対、水素、アルキル、シクロアルキル、またはアリールである式によって表される機能基を指す。
【０１０１】
「スルフェート」という用語は当該分野で認知され、一般式：
【０１０２】
【化１８】
2010227105.tif 000019
においてＲ５７は上に定義した通りである式によって表される機能基を含む。
【０１０３】
「スルフォンアミド」という用語は当該分野で認知され、一般式：
【０１０４】
【化１９】
2010227105.tif 000020
においてＲ５０とＲ５６は上に定義した通りである式によって表される機能基を含む。
【０１０５】
「スルファモイル」という用語は当該分野で認知され、一般式：
【０１０６】
【化２０】
2010227105.tif 000021
においてＲ５０とＲ５１は上に定義した通りである式によって表される機能基を指す。
【０１０７】
「スルフォニル」という用語は当該分野で認知され、一般式：
【０１０８】
【化２１】
2010227105.tif 000022
においてＲ５８は、下記、すなわち、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールの内の一つである式によって表される機能基を指す。
【０１０９】
「スルフォキシド」という用語は当該分野で認知され、一般式：
【０１１０】
【化２２】
2010227105.tif 000023
においてＲ５８は上に定義した通りである式によって表される機能基を指す。
【０１１１】
「合成」という用語は当該分野で認知され、インビトロにおける化学的または酵素的合成による生産を指す。
【０１１２】
本明細書で用いる「試験集団」とは、所望の行動または認知機能を有する複数被験体を指す。試験集団のメンバーは、若年、中年、および高齢被験体を含んでもよい。
【０１１３】
本明細書で用いる「治療薬剤」とは、それを必要とする被験体に対して適切に投与されると、所望の治療的または予防的効果を誘起することが可能な化学的化合物または組成物を指す。「治療薬剤」とは、それを必要とする被験体において局所的にまたは全身的に作用する、生物学的、生理学的、または薬理学的活性を有する物質である、全ての化学的機能基または生物物質であってもよい。化学的治療薬剤は、これは「薬剤」とも呼ばれるが、周知の文献資料、例えば、メルクインデックス、医師の机上参考資料（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）、治療の薬学的基礎（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に記載されており、例えば、ただしそれらに限定はされないが、医薬品；ビタミン類；ミネラル添加物；病気または疾患の処置、予防、診断、治癒または緩和のために使用される物質；生体の構造または機能に影響を及ぼす物質；生理的環境に置かれると生物学的に活性を帯びる、または、より活性を持つようになる薬剤前駆物質が挙げられる。抗生物因子およびＦａｂ  Ｉ／Ｆａｂ  Ｋ阻害剤は治療薬剤の例である。生物学的治療薬剤の例としては、遺伝子を含み、その遺伝子を被験体に搬送するウィルスベクターが挙げられる。
【０１１４】
治療薬剤は、動物、特に哺乳類、さらに特定的にはヒトにおいて、薬理学的活性物質によって局所的または全身的作用を引き起こす。従って、治療薬剤は、有害状態の診断、治癒、緩和、処置、または予防のために、あるいは、動物またはヒトにおける望ましい肉体的または精神的発達および／または状態の強化のために用いてよい。
【０１１５】
効果的であるためには、治療薬剤は、全ての処置に適用できる正当な利益／危険比において所望の局所的または全身的効果をもたらす量または濃度で搬送される。この治療薬剤の有効量は、治療される被験体や状態、被験体の重量や年齢、病状の重度、投与のやり方等、当業者には簡単に確定することが可能な因子に応じて変動する。例えば、本発明のある組成物は、このような処置に対して適用が可能な、正当な利益／危険比で効果をもたらすのに十分な量で投与してよい。認知機能障害の背景で言えば、治療効果の程度は、認知機能評価のための標準行動試験、または、他の当該分野で公知の試験によって評価することが可能である。
【０１１６】
「トランス」という用語は当該分野で認知され、二重結合の周囲の二つの原子または基の配置であって、その原子または基同士が、二重結合の反対側に存在するような配置を指す。トランス構成は、（Ｅ）構成と表示されることが多い。
【０１１７】
本明細書で用いる、被験体の認知機能障害を「治療する」、または、認知機能障害を持つ被験体を「治療する」とは、その被験体に、適当な手段によって治療薬剤を供給すること、例えば、認知機能障害の少なくとも一つの症状が安定化する、または低減するように薬剤を投与することを指す。認知機能障害を治療することは、障害を予防すること、障害の進行を遅くすること、または、障害を改善すること（病気の重度を低減させること）または障害を治癒することであってもよい。
【０１１８】
本明細書で用いる「ベクター」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを組織の中に導入するために用いることが可能な組成物を指す。適当な転写／翻訳調節シグナルに結合された、対象タンパクをコードする核酸を含む発現ベクターを、当業者には周知の方法を用いて構築することが可能である。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（第３版）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（２００１）、および、Ａｕｓｅｂｅｌ等、「分子生物学における最近のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８９）に記載されている技術を参照されたい。
【０１１９】
ベクターまたはプラスミドを細胞に移送するための適当な方法は、米国特許第５，５７８，４７５、５，６２７，１７５、５，７０５，３０８、５，７４４，３３５、５，９７６，５６７、６，０２０，２０２、および、６，０５１，４２９号に記載されているもののような脂質／ＤＮＡ複合体を含む。適当な試薬としては、リポフェクタミン、ポリ陽イオン脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボックス−アミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＡ）（ケミカルアブストラクト登録名：Ｎ−［２−（２，５−ビス［（３−アミノプロピル）アミノ］−１−オキシペンチル）アミノ］エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−１−プロパミン−トリフルオロアセテート）、および、中性脂肪ジオレイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の、膜フィルター水溶液の３：１（ｗ／ｗ）リポソーム処方が挙げられる。例示のものとしては、リポフェクタミン２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（前のＧｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＃１１６６８０１９）処方がある。他の試薬としては、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション剤（非リポソーム形態の脂質と、８０％エタノールに溶解した他の化合物との混合液、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．＃１８１４４４３から入手可能）、および、ＬｉｐｏＴＡＸＩ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から市販される脂質処方で、所望の生物学的活性タンパク＃２０４１１０を生産する）が挙げられる。細胞のトランスフェクションは、ＲｏａｃｈとＭｃＮｅｉｓｈに記載される通り（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８５：１（２００２））電気穿孔によって実行する。安定な遺伝的変異を含む細胞を製造するための適当なウィルスベクターシステムは、アデノウィルス、レンチウィルス、レトロウィルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）、およびその他のウィルスに基づくものでよいが、市販のウィルス成分を用いて調製してもよい。ベクターは、注入（例えば、脳の特定領域に対する）、脳室空間または脳脊髄液に対するシャント、および、その他の機械的手段を含む当該分野で公知の方法によって、神経細胞および組織へ導入される。
【０１２０】
「若年」とは、ほぼ性的成熟年齢で、海馬が完全に成熟した、思春期および正常な成熟哺乳動物を指す。ラットの場合で言えば、「若年」ラットとは６−９月齢となろう。ヒトの場合では、「若年」ヒトは１０−２０歳となろう。
【０１２１】
６．２  序論：認識機能の行動的・遺伝的評価の組み合わせ研究
モリスの水迷路と放射状迷路による認識機能の行動評価は、認識機能における加齢性変化を特定するのに有用であった。これらの行動評価を、動物を、その認知機能に基づいて表現型を分類する方法として用いた場合、行動評価を、認知機能の遺伝学的・生理学的測定値と組み合わせて、加齢の脳に及ぼす作用における差を検出することが可能になる。
【０１２２】
脳における年齢・行動関連性変化の遺伝的鋳型を獲得するために、遺伝子発現アレイを用いることによって最大数千の発現遺伝子を同時に分析する可能性が得られる。同時にこのような方法はいくつかの問題点も提供する。先ず、我々のラットモデルは、ヒトの加齢集団と同様、遺伝的に雑種集団を含み、これは、遺伝子発現プロフィール作成における混乱因子として個体変動を増す可能性がある。第二に、海馬における特異的ｍＲＮＡレベルを評価する、従来の定量法を用いた場合、我々の見たところでは、年齢および行動関連性の遺伝子発現変化は多くの場合比較的小さく、既存のＧｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）すなわちマイクロアレイ法の識別力限界と報告されている遺伝子発現レベルの２倍差よりも小さいことである。例えば、Ｌａｎｄｆｅｌｄとその同僚達による研究は、遺伝子発現における２倍未満の変化を検出できないことによって制限を受けた（ＷＯ０３／０２５１２２Ａ２）。
【０１２３】
本明細書において我々はこの問題点を克服する戦略を記載する。すなわち、従来法によって高齢ラットと若年ラットの間で異なることを明らかにした、遺伝子発現の僅かな変化に関する高信頼度検出を示すことである。さらに広範な遺伝子を分析することによって、この方法が、高齢ラットの行動状態と関連する海馬内で発現変化を示す、ある実質的な数の遺伝子を再現可能的に明らかにすることが示される。
【０１２４】
認知障害と関連する遺伝子を特定することによって始めて、ある候補化合物が、正常の認識機能と関連する遺伝子の発現を修飾することができるか否かを確定することが可能になる。このような遺伝子を、所望の認知機能を有する哺乳動物、例えば、ヒトにおけるその発現レベルにより近似させるように修飾する化合物は、治療薬剤として用いられた場合、認知機能を回復または改善することが期待される。この方法を用い、我々は、高齢哺乳動物における認知機能の保持と関連する遺伝子の発見を報告する。推論によって限定されることなく、我々は、このような保持は、適当な治療薬剤による処置によって起動または誘発が可能な、積極的な生物過程を表すものと考える。事実、我々は、本明細書において、そのような薬剤の一つは、第三世代セファロスポリンであるセフトリアキソンであることを報告する。他にそのような薬剤としてバルプロン酸とＭＳ−１５３がある。後述のスクリーニング法を用いることによってさらに別の同様の治療薬剤を特定し、最適化することが可能である。本発明に至る実験手法および本発明そのものに加えさらに本発明実施のための技術も下記の分節に記載される。
【０１２５】
６．２．１  ＲＮＡを単離する
個体から得られた組織サンプルまたは細胞からＲＮＡを単離する場合、組織または細胞を被験体から取り出した後、遺伝子発現にそれ以上の変化が起こらないように阻止することが重要である。発現レベルの変化は、下記の擾乱、例えば、熱ショック、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）またはその他の試薬による活性化後、急速に起こることが知られている。さらに、組織・細胞中のＲＮＡは速やかに変性することがある。従って、好ましい実施態様では、被験体から得た組織または細胞はできるだけ早く急冷凍される。
【０１２６】
ＲＮＡは、組織サンプルから様々な方法によって、例えば、実施例に記載される方法、あるいは、グアニジニウムチオシアネート溶解後のＣｓＣｌ遠心（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５２９４−５２９９）によって抽出することが可能である。冷凍組織からのＲＮＡは、組織をフェノール／グアニジニウムチオシアネート混合液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）中で均一化し、クロロフォルム抽出後、イソプロパノール沈殿によって単離することが可能である。次に、このＲＮＡペレットを再懸濁し、ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）上で精製する。ＲＮＡは全てＲＮアーゼ阻害剤不在下に−８０℃で保存し、その完全性はアガロースゲル電気泳動によって評価することが可能である。単一細胞からのＲＮＡは、単一細胞からのｃＤＮＡライブラリー調製法、例えばＤｕｌａｃ，Ｃ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３６，２４５およびＪｅｎａ等（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１９０：１９９に記載されるやり方で入手が可能である。例えば、ＲＮアーゼ阻害剤を含める等によってＲＮＡ変性を回避する配慮をしなければならない。
【０１２７】
次に、ＲＮＡサンプルを、特定分子種について濃縮することが可能である。一つの実施態様では、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡがＲＮＡサンプルから単離される。一般に、この精製は、ｍＲＮＡにおけるポリＡ尾部を利用するものである。特に前述したように、ポリＴオリゴヌクレオチドを、ｍＲＮＡに対するアフィニティーリガンドとなるように固体支持体の上に固定化してもよい。この目的のためにキットが、例えば、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０２９８０１６）が市販されている。
【０１２８】
ある好ましい実施態様では、ＲＮＡ集団は、対象とする配列、例えば、認知機能に関わる遺伝子の配列において濃縮される。濃縮は、例えば、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成、あるいは、ｃＤＮＡ合成に基づく、多数回の直線増幅と鋳型指向インビトロ転写によって実施することが可能である（例えば、Ｗａｎｇ等（１９８８）ＰＮＡＳ８６，９７１７；Ｄｕｌａｃ等上述、およびＪｅｎａ等上述を参照されたい）。
【０１２９】
特定の分子種または配列について濃縮したものであれ、濃縮されていないものであれ、ＲＮＡ集団をさらに増幅することが可能である。このような増幅は、単一細胞または少数細胞からのＲＮＡを用いる場合は特に重要である。本発明の方法として、例えば、ＰＣＲ、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕとＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，５６０（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７（１９８８）参照）、自己持続性配列複製（ＳＳＲ）（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）参照）、核酸準拠配列増幅（ＮＡＳＢＡ）、および、転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３（１９８９）参照）を含む、各種増幅法の使用が好適である。ＰＣＲ技術に関しては、例えば、「ＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅の原理と応用（“ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”）」（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９２）；「ＰＣＲプロトコール：方法と応用ガイド（“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”）」（Ｉｎｎｉｓ等編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州、１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔ等、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １，１７（１９９１）；「ＰＣＲ」（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ等編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号を参照されたい。増幅法は、例えば、Ｏｈｙａｍａ等（２０００）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２９：５３０；Ｌｕｏ等（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５，１１７；Ｈｅｇｄｅ等（２０００）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２９：５４８；Ｋａｃｈａｒｍｉｎａ等（１９９９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３：３；Ｌｉｖｅｓｅｙ等（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：３０１；Ｓｐｉｒｉｎ等（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０：３１０８；およびＳａｋａｉ等（２０００）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８７：３２に記載されている。ＲＮＡ増幅およびｃＤＮＡ合成は、細胞そのものの中で実行することも可能である（例えば、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ等（１９９２）ＰＮＡＳ８９：３０１０参照）。「定量的ＰＣＲ」とは、サンプル中の反応産物の量または反応産物の数を定量可能とするＰＣＲプロトコールの使用を指す。
【０１３０】
当業者であれば、用いる増幅法が何であれ、定量的結果を望むのであれば、定量的増幅を実現するためには、増幅された核酸の相対的頻度を維持する、または調節する方法を用いるよう配慮しなければならないことが理解できるであろう。「定量的」増幅法は当業者には周知である。例えば、定量的ＰＣＲとは、同じプライマーを用いた、既知量のコントロール配列の同時増幅を含む。これによって、ＰＣＲ増幅を較正するのに使用が可能な内部標準が得られる。次に、高密度アレイは、増幅された核酸の定量化のために、その内部標準に対して特異的なプローブを含んでもよい。
【０１３１】
一つの好ましい内部標準は、合成ＡＷ１０６  ｃＤＮＡである。このＡＷ１０６  ｃＤＮＡは、当業者には既知の標準法に従ってサンプルから単離されたＲＮＡと混合される。次に、ＲＮＡは、逆転写酵素により逆転写されコピーＤＮＡを与える。次にｃＤＮＡ配列を、標識プライマーを用いて（例えばＰＣＲにより）増幅する。増幅産物を、典型的には電気泳動によって分離し、放射能量（増幅産物の量に比例する）を定量する。次に、サンプルの中のｍＲＮＡの量を、既知のＡＷ１０６  ＲＮＡ標準によって作られる信号と比較することによって計算する。定量的ＰＣＲに関する詳細なプロトコールが、「ＰＣＲプロトコール、方法と応用ガイド（“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”）」Ｉｎｎｉｓ等、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ニューヨーク（１９９０）に記載されている。
【０１３２】
ある好ましい実施態様では、サンプルｍＲＮＡは、逆転写酵素と、オリゴ（ｄＴ）から成るプライマー、およびファージＴ７プロモーターをコードする配列によって逆転写されて１本鎖ＤＮＡ鋳型を与える。ＤＮＡポリメラーゼを用いて、２番目のＤＮＡ鎖を合成する。２本鎖ｃＤＮＡの合成後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを加え、ｃＤＮＡ鋳型からＲＮＡを転写する。各単一ｃＤＮＡ鋳型から次々に転写ラウンドを繰り返すことによってＲＮＡが増幅される。インビトロ合成法は当業者には周知である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌ（上述）を参照、この特定法は、Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１６６３−１６６７（１９９０）にも詳細に記述されているが、この著者等は、この方法によるインビトロ増幅は、各種ＲＮＡ転写物の相対的頻度を保存することを証明した）。さらに、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３０１０−３０１４は、インビトロ転写による２ラウンドの増幅を用いて、元の開始材料の１０６倍を超える増幅を達成し、生物サンプルに限界がある場合でも発現監視を可能とするプロトコールを提供している。
【０１３３】
当業者ならば、前述の直接転写法はアンチセンス（ａＲＮＡ）プールを与えることが了解されるであろう。アンチセンスＲＮＡが標的核酸として使用される場合、アレイに与えられるオリゴヌクレオチドプローブは、このアンチセンス核酸の配列に対して相補的となるように選ばれる。逆に、標的核酸がセンス核酸のプールである場合には、オリゴヌクレオチドプローブは、このセンス核酸の配列に対して相補的となるように選ばれる。最後に、核酸プールが２本鎖である場合は、プローブの方向はいずれであってもよい。なぜなら、標的核酸は、センスとアンチセンスの両鎖を含んでいるのであるから。
【０１３４】
６．２．２  ＲＮＡを分析する
いくつかの実施態様では、数百または数千の遺伝子ではなく、一つの、または、ごく少数の遺伝子の発現を定量するだけで十分である。これらの実施態様でもマイクロアレイを使用することは可能であるが、他の、遺伝子発現を検出するための各種の方法が利用可能である。この節では、ｍＲＮＡ、またはそれによってコードされるポリペプチドを検出・定量するための、二三の例示的方法を記述する。方法の第一工程が細胞からのｍＲＮＡの単離を含む場合、この工程は前述した通りに実行することが可能である。１種以上の核酸の標識は後述のように実行することが可能である。
【０１３５】
一つの実施態様では、サンプルから得られたｍＲＮＡは逆転写して第一ｃＤＮＡとし、ＰＣＲ，例えばＲＴ−ＰＣＲを実施する。ハウスキーピング遺伝子、または、その発現が変動しないその他の遺伝子を、内部コントロール、および、実験相互間のコントロールとして使用することが可能である。ＰＣＲ反応後、増幅産物は電気泳動によって分離し、検出することが可能である。定量的ＰＣＲを用いれば、増幅産物のレベルは、サンプル中に存在するＲＮＡのレベルと相関する。増幅サンプルはまた、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルで分離し、フィルターに移し、このフィルターに、対象遺伝子に対して特異的なプローブによってハイブリダイズさせることも可能である。平行的ＰＣＲ増幅、例えば、多重化ＰＣＲを実行することにより、数多くのサンプルを同時に分析することが可能である。
【０１３６】
使用が可能な定量的ＰＣＲ法は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの使用に基づく。特異的配列検出は、５’と３’末端において、２本のＰＣＲプライマーの間にアニールする、それぞれ、リポーター蛍光染料と消光蛍光染料によって標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（ＦＱプローブ）の存在下に、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ７７００配列検出システムにおいて標的配列を増幅することによって実行される。プローブがプライマーの間に結合した場合、特異的産物のみが検出される。ＰＣＲ増幅が進行するにつれて、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性が最初は、リポーター染料をプローブから分断する。リポーター染料が消光染料から物理的に分離された時に発せられる信号は、付属のＣＣＤカメラでその信号を測定することによって検出される。ｓｙｂｒグリーンのような介在染料を用いることも可能である。各発生信号は１分断プローブに等しく、１分断プローブは１標的鎖の増幅に相当する。ＰＣＲ反応は、供給される取り扱い説明に従ってＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍタクマンコア試薬キットを用いることによって設定してもよい。この技術はさらに、例えば、米国特許第６，３２６，４６２号にも記載されている。別に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの白金定量ＰＣＲキットおよびＲｏｔｏｒｇｅｎｅ３０００に用いるプローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよびＱｉａｇｅｎから入手することも可能である。
【０１３７】
別の実施態様で、ｍＲＮＡレベルは、ドットブロット分析および関連法（例えば、Ｇ．Ａ．Ｂｅｌｔｚ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏ．１００，Ｐａｒｔ  Ｂ，  Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｍ，  Ｋ．Ｍｏｌｄａｖｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９章、２６６−３０８ページ、１９８５を参照）によって定量される。一つの実施態様では、細胞から抽出された特定量のＲＮＡがフィルターにブロットされ（すなわち、非共有的に結合される）、このフィルターは、対象遺伝子のプローブにハリブリダイズされる。１ブロットが多数のＲＮＡスポットを含むことが可能なので、数多くのＲＮＡサンプルを同時に分析することが可能である。ハイブリダイゼーションは、プローブの標識のタイプに応じた方法を用いて検出される。別のドットブロット法では、認知障害において上向または下向調整される１個以上の遺伝子から成る１種以上のプローブがメンブレインに付着され、このメンブレインは、被験体の細胞または組織のＲＮＡから得られた、また、要すれば随意に抽出された標識核酸とインキュベートする。このようなドットブロットは、事実上、マイクロアレイよりも数少ないプローブを含むアレイである。
【０１３８】
「ドットブロット」ハイブリダイゼーションは広範な普及を見、多くの改訂法が開発された（例えば、Ｍ．Ｌ．Ｍ．ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＢ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、「核酸ハイブリダイゼーション−実施法（“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”）」、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤ．Ｃ．，４章、７３−１１１ページ、１９８５を参照）。
【０１３９】
別の方式、所謂「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションは、固相基板にオリゴヌクレオチドプローブを共有的に付着させ、それらを用いて多数の核酸標的を捕捉・検出することを含む（例えば、Ｍ．Ｒａｎｋｉ等、Ｇｅｎｅ、２１、ｐｐ．７７−８５，１９８３；Ａ．Ｍ．Ｐａｌｖａ，Ｔ．Ｍ．ＲａｎｋｉおよびＨ．Ｅ．Ｓｏｄｅｒｌｕｎｄ、英国特許出願ＧＢ２１５６０７４Ａ、１９８５年１０月２日；Ｔ．Ｍ．ＲａｎｋｉおよびＨ．Ｅ．Ｓｏｄｅｒｌｕｎｄ、米国特許第４，５６３，４１９号、１９８６年１月７日；Ａ．Ｄ．Ｂ．ＭａｌｃｏｌｍおよびＪ．Ａ．Ｌａｎｇｄａｌｅ、ＰＣＴ  ＷＯ８６／０３７８２、１９８６年７月３日；Ｙ．Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４，７５１，１７７号、１９８８年１月１４日；Ｔ．Ｈ．Ａｄａｍｓ等、ＰＣＴ  ＷＯ９０／０１５６４、１９９０年２月２２日；Ｒ．Ｂ．Ｗａｌｌａｃｅ等、６Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１．ｐ．３５４３，１９７９；および、Ｂ．Ｊ．Ｃｏｎｎｏｒ等、８０Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｐｐ．２７８−２８２，１９８３を参照されたい）。これらの方式の多重化版は「逆転ドットブロット」と呼ばれる。
【０１４０】
ｍＲＮＡレベルもノーザンブロットで定量することが可能である。指定量のＲＮＡをゲル電気泳動によって分離し、フィルターに移行し、次に、対象遺伝子に対応するプローブとハイブリダイズさせる。この方法は、多数のサンプルと遺伝子を分析しなければならない場合は負担が比較的大きいが、きわめて正確であるという利点を与える。
【０１４１】
遺伝子発現に関する高処理分析のための好ましい方法は、最初にＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ等（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０，４８４−４８７によって記載された、遺伝子発現連続分析（“ＳＡＧＥ”）技術である。ＳＡＧＥの利点の中には、ＳＡＧＥでは、任意の細胞型において発現される全ての遺伝子の検出が実現されること、それらの遺伝子の相対的発現度について定量的な情報が得られること、二つの細胞における遺伝子の発現を簡単に比較できること、検出遺伝子の特定に使用が可能な配列情報が得られることがある。これまでに、ＳＡＧＥ法は、各種の細胞型において、調整、および未調整遺伝子の発現を高信頼度で検出することを立証している（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ等（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８，２４３−２５１；Ｚｈａｎｇ等（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６，１２６８−１２７２；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ等（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３，３８７−３８８）。
【０１４２】
核酸を生産し、釣り上げる技術はさらに、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌ（上述）にも記載されている。認知障害において上向または下向調整される１個以上の遺伝子の発現レベルは、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学によって定量される。一つの実施態様では、組織サンプルが被験体から得られ、薄切切片が調製され、当該分野で公知の方法によってインサイチュハイブリダイゼーションが実行され、対象遺伝子の発現レベルが定量される。
【０１４３】
上記方法を用いて、下記の条件で活性化される内因性遺伝子の発現増加を評価することも可能である。すなわち、外来性の調整配列、外来性エキソン、およびスプライス部位を、内因性遺伝子の第２エキソンに動作的に結合させて含む新規転写単位または遺伝子活性化構築体を、哺乳動物に導入し、それによって細胞は、内因性遺伝子中に存在するエキソンの他にさらに外来性エキソンを含むようになる条件である（例えば、米国特許第５，６４１，６７０、５，７７３，７４６、５，７３３，７６１、５，９６８，５０２、６，７０２，９８９、および６，５６５，８４４号を参照）。
【０１４４】
別の方法では、遺伝子の発現レベルは、その遺伝子によってコードされるタンパクのレベルを測定することによって検出される。これは、例えば、仲介因子、例えば、その遺伝子によってコードされるタンパクを特異的に検出する抗体を用いる、例えば、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、または免疫組織化学によって実行することが可能である。その他の技法としてはウェスタンブロット分析が挙げられる。免疫アッセイ（イムノアッセイ）は通常、細胞サンプル中のタンパクレベルを定量化するのに用いられるが、他にも多くの免疫アッセイが当該分野で公知である。本発明はある特定のアッセイ過程に限定されるものではなく、従って均質的および異質的過程の両方を含むことが意図される。本発明に従って実行が可能な例示のイムノアッセイとしては、蛍光極性イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比濁分析による抑制イムノアッセイ（ＮＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。インディケーター機能基、すなわち標識基は、被験体抗体に付着させることが可能なので、アッセイ装置や、適合的なイムノアッセイ過程の利用可能性によって規定されることの多い、様々な方法使用要求に合致するように選択される。前述の各種イムノアッセイを実行する際に使用される一般的技術は、従来技術において通常の錬度を有する当業者には公知である。
【０１４５】
細胞から分泌されるポリペプチドの場合、それらポリペプチドの発現レベルは、生物学的流体の中で測定が可能である。
【０１４６】
いくつかの実施態様では、ｍＲＮＡレベルは、以下の節で詳述されるマイクロアレイ分析によって検出および／または測定される。
【０１４７】
６．３  序論：マイクロアレイ
一般に、アレイによって発現プロフィールを確定することは下記の工程を含む。すなわち、（ａ）被験体からｍＲＮＡサンプルを入手し、それから標識核酸を調製すること（「標的核酸」または「標的」）、（ｂ）この標的核酸を、アレイの上において対応するプローブと、例えば、ハイブリダイゼーションまたは特異的結合によって結合するのに十分な条件下で、アレイと接触させること、（ｃ）要すれば随意にアレイから未結合の標的を除去すること、（ｄ）結合標的を検出すること、および、（ｅ）結果を分析すること、という工程である。本明細書で用いる「核酸プローブ」または「プローブ」とはアレイに付着される核酸であり、一方、「標的核酸」とは、アレイにハイブリダイズされる核酸である。これら工程のそれぞれを下記にさらに詳述する。
【０１４８】
６．３．１  マイクロアレイ分析のために核酸を標識する
一般に、標的分子は、標的分子のマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションの検出を可能とするよう標識される。「標識」とは、プローブはシグナル発生システムの１メンバーを含み、従って、直接でか、または、シグナル発生システムの、別の１種以上のメンバーとの組み合わせ作用を通じて検出可能となることを意味する。直接検出可能な標識の例としては、プローブの機能基、例えば、ヌクレオチドモノマー単位、例えば、プライマーのｄＮＭＰに組み込まれる、通常共有的に結合される放射性同位元素性および蛍光性機能基、または、プローブ分子の機能基に結合が可能な、検出可能な標識の、光学活性を持つ、または、化学的活性を持つ誘導体が挙げられる。
【０１４９】
核酸は、ＲＮＡの濃縮および／または増幅の後に、または、その最中に標識することが可能である。例えば、標識ｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライマー、または、ランドムプライマーをプライマーとする逆転写によってｍＲＮＡから調製することが可能であり、このいずれも従来技術で周知である（例えば、ＫｌｕｇおよびＢｅｒｇｅｒ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３１６−３２５）。逆転写は、検出可能な標識、もっとも好ましくは蛍光標識ｄＮＴＰに接合させたｄＮＴＰの存在下に実行することが可能である。別に、単離ｍＲＮＡを、標識ｄＮＴＰの存在下に２本鎖ｃＤＮＡのインビトロ転写によって標識アンチセンスＲＮＡに変換することも可能である（Ｌｏｃｋｈａｒｔ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５，１９９６）。別の実施態様では、ｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、検出可能な標識の不在下に合成し、その後、例えば、ビオチニル化ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰを取り込むことによって、または、何かの類似手段を用いて（例えば、ビオチンのソラレン誘導体をＲＮＡに光照射架橋結合させて）標識し、その後標識ストレプトアビジン（例えば、フィコエリスリン接合ストレプトアビジン）またはそれと等価のものを添加することが可能である。
【０１５０】
一つの実施態様では、標識ｃＤＮＡを、ＲＮＡおよび０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ、プラス、０．１ｍＭ  ｄＴＴＰ、プラス、蛍光デオキシリボヌクレオチド（例えば、０．１ｍＭローダミン１１０  ＵＴＰ（Ｐｅｒｋｅｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）または０．１ｍＭ  Ｃｙ３  ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を含む混合液を、逆転写酵素（例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ、ＬＴＩ  Ｉｎｃ．）と４２℃で６０分インキュベートすることによって合成する。
【０１５１】
蛍光性機能基、すなわち対象表示としては、クマリンとその誘導体、例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリン、ｂｏｄｉｐｙ染料、例えば、Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬ、カスケードブルー、フルオレセインおよびその誘導体、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、オレゴングリーン、ローダミン染料、例えば、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオジンおよびエリスロシン、シアニン染料、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ、ランタニドイオンの多環キレート剤、例えば、量子染料（登録商標）、蛍光エネルギー転移染料、例えば、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体、ＴＯＴＡＢ、ダンシル等が挙げられる。本発明の装置またはアッセイにおいて検出されるのが望ましい要素に対して結合する機能性を持つ蛍光化合物、あるいは、そのような機能性を取り込むように修飾が可能な蛍光化合物を個別に挙げると、例えば、塩化ダンシル；フルオレセイン、例えば、３，６−ジヒドロキシ−９−フェニルキサンチドロール；ローダミンイソチオシアネート；Ｎ−フェニル１−アミノ−８−スルフォナトナフタレン；Ｎ−フェニル２−アミノ−６−スルフォナトナフタレン；４−アセタミド−４−イソチオシアナート−スチルベン−２，２’−ジスルフォン酸；ピレン−３−スルフォン酸；２−トルイジノナフタレン−６−スルフォネート；Ｎ−フェニル−Ｎ−メチル−２−アミノアフタレン−６−スルフォネート；臭化エチジウム；ステブリン；オーロミン−０，２−（９’−アンスロイル）パルミテート；ダンシルフォスファチジルエタノールアミン；Ｎ，Ｎ’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン；Ｎ，Ｎ’−ジヘキシルオキサカルボシアニン；メロシアニン、４−（３’−ピレニル）ステアレート；ｄ−３−アミノデソキシ−エキレニン；１２−（９’−アンスロイル）ステアレート；２−メチルアントラセン；９−ビニールアントラセン；２，２’（ビニレン−ｐ−フェニレン）ビスベンゾキサゾール；ｐ−ビス（２−メチル−５−フェニル−オキサゾリル））ベンゼン；６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェナジン；レチノール；ビス（３’−アミノピリジニウム）１，１０−デカンジルジイオジド；ヘリブリエニンのスルフォナフチルヒドラゾン；クロロテトラシクリン；Ｎ−（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−クロメニル）マレイミド；Ｎ−（ｐ−（２ベンジミダゾリル）−フェニル）マレイミド；Ｎ−（４−フルオロアンチル）マレイミド；ビス（ホモバニリン酸）；レサザリン；４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール；メロシアニン５４０；レソルフィン；ローズベンガル；および、２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノンがある（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，１９９２、「非放射性同位元素性ＤＮＡプローブ技術（“Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”）」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ、カリフォルニア州を参照）。多くの蛍光タグが、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐｆｉｚｅｒ（以前のＰｈａｒｍａｃｉａ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓ��ｉｅｎｃｅｓ（以前のＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ，スイス）、および、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州）の他、当業者に既知の他の業者からも販売されている。
【０１５２】
化学発光標識としては、ルシフェリン、および、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられる。
【０１５３】
放射性同位元素性機能基または標識としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、２Ｈ，１４Ｃ等が挙げられる（Ｚｈａｏ等、Ｇｅｎｅ１５６：２０７，１９９５；Ｐｉｅｔｕ等、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：４９２，１９９６を参照）。
【０１５４】
標識はまた、シグナル発生システムのメンバーであって、同じシステムの１種以上のさらに別のメンバーと協力して検出可能なシグナルを発生する、そのようなメンバーであってもよい。このような標識の例としては、リガンドのような特異的結合ペア、例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、抗原、多価陽イオン、キレートグループ等のメンバーが挙げられ、その場合、このメンバーは、シグナル発生システムの追加メンバーと特異的に結合し、その追加のメンバーは、検出可能なシグナルを直接的か間接的に与え、例えば、蛍光体半量体、または、基質を色素発生産物に変換することが可能な酵素半量体に接合させた抗体、例えば、アルカリフォスファターゼ接合抗体等である。
【０１５５】
好ましい追加標識は、それらの関連するプローブが標的分子に特異的に結合した時にのみシグナルを供給するものを含み、その場合の標識は、ＴｙａｇｉとＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：３０３，１９９６および欧州特許第００７０６８５Ｂ１号に記載される通りの「分子ビーコン」を含む。他の好ましい標識としては、米国特許第５，５６３，０３７号、および、ＷＯ９７／１７４７１およびＷＯ９７／１７０７６に記載されているものが挙げられる。
【０１５６】
場合によっては、ハイブリダイズした標的核酸を、ハイブリダイズ後に標識してもよい。例えば、ビオチン標識ｄＮＴＰを、例えば、増幅または転写に用いる場合、ストレプトアビジン結合リポーター基を用いてハイブリッド複合体を標識してもよい。
【０１５７】
また場合によっては、標的核酸は標識されない。この場合、ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｔｈｉｅｌ等、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：４９４８，１９９７に記載されるようにプラスモン共鳴によって確定することが可能である。
【０１５８】
一つの実施態様では、複数（例えば、２、３、４、５組以上）セットの標的核酸が標識され、一つのハイブリダイゼーション反応に使用される（「多重化」分析）。例えば、１セットの核酸は、一つの細胞または組織サンプルからのＲＮＡに対応し、別のセットの核酸は、別の細胞または組織サンプルからのＲＮＡに対応する。この複数セットの核酸は、別々の標識、例えば、それぞれが区別可能となるように、それぞれ異なる発射スペクトラム持つ別々の蛍光標識で標識することが可能である。次にこれらのセットは混ぜ合わされ、同時に一つのマイククロアレイにハイブリダイズされる。
【０１５９】
遺伝子発現における変化を定義するために、２色蛍光標識・検出スキームの使用が、例えば、Ｓｈｅｎａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４６７−４７０，１９９５に記載されている。２種の異なる蛍光色素で標識されたｃＤＮＡを使用することの利点は、二つの細胞状態における各配列遺伝子に対応するｍＲＮＡレベルの、直接的、内部的にコントロールされた比較が実行可能であること、実験条件における僅かな違い（例えばハイブリダイゼーション条件）による変動が、その後の分析に影響を及ぼさないことである。
【０１６０】
一つのアレイに対する複数の標的核酸をハイブリダイズさせる場合に使用される識別可能な標識の例は当該分野で周知であり、下記のものが挙げられる。すなわち、Ｃｙ３とＣｙ５のような、２種以上の異なる発射波長を持つ蛍光染料、フィコエリスリンおよびＣｙ５のような蛍光タンパクと染料の組み合わせ、３２Ｐと３３Ｐのような異なる発射エネルギーを持つ２種以上の放射性同位元素、異なる分散スペクトラムを持つ金または銀粒子、温度、ｐＨ、他の化学薬剤等のような異なる処理条件の下で、あるいは、処理後の異なる時点で複数のシグナルを発生する標識である。シグナル発生のために１種以上の酵素を用いることによって、酵素の様々な基質特異性（アルカリフォスファターゼ／ペルオキシダーゼ）に基づきさらに多様な識別可能な標識の使用が可能となる。
【０１６１】
さらに、２色差動ハイブリダイゼーション実験では、実験誤差を低減させるために、蛍光標識を逆転し個々の遺伝子またはアレイスポット位置に特有の偏倚を低減させることが好ましい。言い換えれば、測定される２種類の細胞から得られたｍＲＮＡについて、最初に一方の標識で遺伝子発現を測定し（例えば、第一細胞から得られた核酸を第一蛍光色素で標識し、第二細胞から得られた核酸を第二蛍光色素で標識する）、次に、２種類の細胞において逆転させた標識で遺伝子発現を測定する（例えば、第一細胞から得られた核酸を第二蛍光色素で標識し、第二細胞から得られた核酸を第一蛍光色素で標識する）ことが好ましい。露出レベルおよび、かく乱コントロールパラメータレベルに関しても多数回の測定を行うことによって実験誤差コントロールについてさらに別の手段が得られる。
【０１６２】
標識核酸の品質は、アレイに対するハイブリダイゼーションの前に評価することが可能である。例えば、標識核酸の内の一サンプルを、核酸サンプル中に存在することが既知である、または、存在することが疑われる遺伝子の５’、中間、および、３’部分から得られたプローブにハイブリダイズさせることが可能である。これによって、その標識核酸が完全長核酸であるか、または、変性しているかが示される。一つの実施態様では、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、カリフォルニア州）から市販されるＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイがこの目的のために使用が可能である。このアレイは、哺乳類を含む数種類の生物体から得られた、特性が明らかにされた遺伝子のサブセットを代表するプローブを含む。従って、ある標識核酸サンプルの品質は、サンプルの一部を、アレイに、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、カリフォルニア州）から市販されるＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３アレイにハイブリダイズさせることで確定することが可能である。
【０１６３】
６．３．２  マイクロアレイ分析
本発明に従って使用するのに好適なアレイ、例えば、マイクロアレイは、認知機能に関わるとされる候補遺伝子である遺伝子から成る１種以上のプローブを含む。例示のアレイとしては、認知機能を調べるに当たって興味のある１種以上の遺伝子、例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ラット発現セット２３０アレイ、または、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ラット神経生物学Ｕ３４アレイを含む。後者は、神経生物学の研究に関わりのある１，２００を越える配列（キナーゼ、細胞表面に対する遺伝子を含む）を含む。さらに、ヒトの全ゲノムを調べるためにＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨｕＳＮＰ（商標）を使用することも可能である。この場合、同時に、ゲノム全体に渡って散在する一塩基多型（ＳＮＰ、スニップ）と呼ばれる約１，５００個の遺伝子変動を追跡することができる。スニップはゲノム探索において優れたマーカーとなる。なぜなら、スニップは、単純で、多量で、分散し、異なるヒト集団間の遺伝的変動の多くの原因となるものだからである。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイのような高処理技術を用いることにより、スニップは、従来のマーカー、例えば、マイクロサテライト配列よりも簡単に追跡することが可能である。
【０１６４】
アレイは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも１０００種の遺伝子に相当するプローブを含んでもよい。アレイは図３に挙げた遺伝子、またはマイクロアレイ上で利用が可能なその他の遺伝子の約１０％、２０％、５０％、７０％、９０％、または９５％に相当するプローブを含んでもよい。アレイは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも１０００種の遺伝子に相当するプローブを含んでもよい。アレイは図３に挙げた遺伝子、または、その発現が細胞中では少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、５倍、７倍、もっとも好ましくは少なくとも約１０倍高くなる遺伝子の約１０％、２０％、５０％、７０％、９０％、または９５％に相当するプローブを含んでもよい。使用が可能な一つの好ましい例示のアレイは、実施例で使用され、記載されるアレイである。
【０１６５】
マイクロアレイ上では、各遺伝子に対応して１個を越えるプローブがあってもよい。例えば、一つのマイクロアレイが、一つの遺伝子に対応する２から２０個のプローブを含んでもよいが、好ましくは約５から１０個である。プローブは、候補疾患遺伝子特有の遺伝子の、完全長ＲＮＡ配列、または、その相補配列に相当するものであってもよいし、あるいは、その一部であるが、特異的ハイブリダイゼーションを可能とするのに十分な長さを持つ一部に相当するものであってもよい。このようなプローブは、約５０ヌクレオチドから、約１００、２００、５００、または１０００ヌクレオチド、あるいは、１０００ヌクレオチド以上まで含んでもよい。本明細書に後述するように、マイクロアレイは、約１０から５０ヌクレオチド、好ましくは約１５から３０ヌクレオチド、さらに好ましくは２０−２５ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドプローブを含んでもよい。このプローブは１本鎖であることが好ましい。このプローブは、その標的に対して、所望のレベルの配列特異的ハイブリダイゼーション（後述）を実現するのに十分なほどの相補性を有する。
【０１６６】
典型的には、本発明で使用されるアレイは、ｃｍ２当たり１００を越える様々なプローブが存在する部位密度を有する。好ましくは、アレイは、５００／ｃｍ２を越える部位密度、さらに好ましくは約１０００／ｃｍ２を越える部位密度、もっとも好ましくは約１０，０００／ｃｍ２を越える部位密度を有する。好ましくは、アレイは、一枚の基板に１００以上の異なるプローブ、より好ましくは１０００以上の異なるプローブ、さらに好ましくは１０，０００以上の異なるプローブ、もっとも好ましくは単一基板に１００，０００以上の異なるプローブを有する。
【０１６７】
マイクロアレイは、後述するように当該分野で公知の方法によって調製が可能であり、あるいは、企業、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、カリフォルニア州）に特注することも可能である。
【０１６８】
一般に、２種類のマイクロアレイが使用可能である。これら２種類は「合成」と「搬送」と呼ばれる。合成型では、マイクロアレイは、ヌクレオチドから核酸をその場合成することによって段階的過程によって調製される。各合成ラウンド毎に、成長する鎖にヌクレオチドが添加され、これが、所望の長さが実現されるまで続けられる。搬送型マイクロアレイでは、調製された核酸が、各種搬送技術によって既知の位置に堆積される。数多くの論文が様々なマイクロアレイ技法について記載している。例えば、Ｓｈｅｎａ等、Ｔｉｂｔｅｃｈ  １６：３０１，１９９８；Ｄｕｇｇａｎ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１０，１９９９；Ｂｏｗｔｅｌｌ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２５，１９９９である。
【０１６９】
一つの新規の合成法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、カリフォルニア州）によって開発されたものである。これは、フォトリソグラフィー技術をＤＮＡ合成化学と組み合わせて高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイ製造を可能とするものである。このようなチップは、約１．６ｃｍ２の面積に最大４００，０００群のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは３’末端において固定化されているので、ハイブリダイゼーションのための１本鎖核酸の利用度は最大となる。一般に、“ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）”と呼ばれるこのチップは、ある特定遺伝子について数種類の、例えば、１５−２０種類、例えば、１６種類のオリゴヌクレオチドを含む。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、カリフォルニア州）は特注マイクロアレイを販売しているので、認知障害において上向または下向調整される遺伝子を含むマイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、カリフォルニア州）に注文して購入することが可能である。
【０１７０】
マイクロアレイはまた、機械的な微細スポッティングによって、例えば、Ｓｙｎｔｅｎｉ（フリーモント、カリフォルニア州）で市販されるものを用いて調製することも可能である。この方法によれば、少量の核酸が固体表面にプリントされる。Ｓｙｎｔｅｎｉで調製された微細スポッティングアレイは、約３．６ｃｍ２の面積に１０，０００群ものｃＤＮＡを含む。
【０１７１】
第三群のマイクロアレイ技術は、「要求次第滴下」搬送法による。このもっとも進歩したものはインクジェット法であり、この方法は、核酸を微小ノズルから固体表面に転送するのに、圧電形式およびその他の噴射形式を利用する。インクジェット法は、Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（パロアルト、カリフォルニア州）およびＰｒｏｔｏｇｅｎｅ（パロアルト、カリフォルニア州）を含むいくつかのセンターで開発されている。この技術では、ｃｍ２当たり１０，０００スポットの密度が実現されている。さらにＨｕｇｈｅｓ等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｃｈｎ．１９：３４２，１００１を参照されたい。
【０１７２】
アレイは、対照（コントロール）および参照核酸を含むことが好ましい。コントロール核酸とは、ハイブリダイゼーションが効果的であることを示すのに有用な核酸である。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、カリフォルニア州）の発現アレイは全て、いくつかの前核細胞遺伝子、例えば、大腸菌のビオチン合成由来のｂｉｏＢ、ｂｉｏＣおよびｂｉｏＤ、および、Ｐ１バクテリオファージ由来のｃｒｅに対する複数セットのプローブを含む。これらのアレイに対するハイブリダイゼーションは、遺伝子、または、その一部の混合物、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、カリフォルニア州）から支給される混合物の存在下に実行され、それによってハイブリダイゼーションが効果的であることが確認される。標的核酸と共に含められるコントロール核酸は、インビトロ転写によるｃＤＮＡクローンから合成されたｍＲＮＡであってもよい。アレイに含めてもよいその他のコントロール遺伝子としては、ポリＡコントロール、例えば、ｄａｐ、ｌｙｓ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、およびｔｒｐ（これらはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）に含まれる）である。
【０１７３】
参照核酸は、一つの実験から得られた結果を別の実験に対して正規化し、かつ、複数の実験を定量的レベルで比較することを可能とする。例示の参照核酸としては、既知の発現レベルを持つハウスキーピング遺伝子、例えば、グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒロドゲネーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、および、アクチンの遺伝子が挙げられる。
【０１７４】
発現レベルコントロールまたは正規化コントロールのために、標的遺伝子のプローブに対してミスマッチコントロールを供給してもよい。ミスマッチコントロールとは、１個以上のミスマッチ塩基の存在を除いては、対応する試験またはコントロールプローブと同一のオリゴヌクレオチドプローブ、またはその他の核酸プローブである。
【０１７５】
アレイはまた、ある遺伝子の１個以上の対立遺伝子にハイブリダイズする複数のプローブを含んでもよい。例えば、アレイは、ある特定の遺伝子の対立遺伝子１を認識する一つのプローブ、および、その遺伝子の対立遺伝子２を認識するもう一つのプローブを含むことも可能である。
【０１７６】
マイクロアレイは下記のように調製することが可能である。一つの実施態様では、オリゴヌクレオチドから成るアレイが固相支持体の上で合成される。例示の固相支持体としては、ガラス、プラスチック、ポリマー、金属、半金属、セラミクス、有機化合物等が挙げられる。チップマスキング技術および光保護化学を用いて、整然とした配列の核酸プローブを生成することが可能である。これらのアレイ、例えば「ＤＮＡチップ」、または、極大規模固定化ポリマーアレイ（“ＶＬＳＩＰＳＴＭ”アレイ）と呼ばれるものは、約１ｃｍ２から数ｃｍ２の面積を持つ基板の上に、数百万のはっきりと区画されたプローブ領域を持ち、そのために数個から数百万のプローブから成る複数セットを含むことを可能とする（例えば、米国特許第５，６３１，７３４号を参照）。
【０１７７】
標的核酸を検出するための固相核酸アレイの構築は文献に十分に記載されている。Ｆｏｄｏｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７７，１９９１；Ｓｈｅｌｄｏｎ等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３９（４）：７１８−７１９，１９９３；Ｋｏｚａｌ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（７）：７５３−７５９，１９９６、および、Ｈｕｂｂｅｌｌ、米国特許第５，５７１，６３９号；Ｐｉｎｋｅｌ等、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６１５５（ＷＯ９６／１７９５８）；米国特許第５，６７７，１９５；５，６２４，７１１；５，５９９，６９５；５，４５１，６８３；５，４２４，１８６；５，４１２，０８７；５，３８４，２６１；５，２５２，７４３および５，１４３，８５４号；ＰＣＴ特許公報第９２／１００９２および９３／０９６６８号；および、ＰＣＴ  ＷＯ９７／１０３６５を参照されたい。要するに、組み合わせ戦略により、最小数の合成工程を用いて多数のプローブを含むアレイの合成が可能となる。例えば、僅か３２個の化学合成工程を用いて、可能な全てのＤＮＡ８マーオリゴヌクレオチド（４８、すなわち６５，５３６通りの可能な組み合わせ）を合成し、付着させることが可能である。一般に、ＶＬＳＩＰＳＴＭ手順により、僅か４ｎ個の合成工程を用いて、アレイの上に４ｎ個の異なるオリゴヌクレオチドプローブを生産する方法が得られる（例えば、米国特許第５，６３１，７３４５；１４３，８５４号、および、ＰＣＴ特許公報第ＷＯ９０／１５０７０；ＷＯ９５／１１９９５およびＷＯ９２／１００９２号を参照）。
【０１７８】
ガラス表面における、オリゴヌクレオチドアレイの、光指向性組み合わせ合成が、自動化フォスフォロアミダイト化学と、コンピュータチップ産業のフォトレジスト技術と同様のチップマスキング技術によって実行が可能である。典型的には、ガラス表面に、機能基、例えば、光感受性の高い保護基によってブロックされたヒドロキシルまたはアミン基を含むシラン試薬による誘導体が形成される。フォトリソグラフィーマスクによる光分解を用いて官能基を選択的に露光すると、この官能基は次に、入力する５‘−光保護ヌクレオシドフォスフォロアミダイトとすぐに反応する。フォスフォロアミダイトは、照明された（従って、光感受性の高いブロッキング基の除去によって暴露された）部位としか反応しない。従って、フォスフォロアミダイトは、先行工程で選択的に暴露された部位においてのみ添加される。この工程を、所望の配列のアレイが固体表面上に合成されるまで繰り返す。
【０１７９】
合成サイクル数を減らすためのマスク設計アルゴリスムが、Ｈｕｂｂｅｌ等、米国特許第５，５７１，６３９号および米国特許第５，５９３，８３９号に記載されている。コンピュータシステムを用いて、米国特許第５，５７１，６３９号に記載する通りに基板上の核酸プローブを選択し、アレイのレイアウトを設計してもよい。
【０１８０】
高密度アレイを合成するためのもう一つの方法が米国特許第６，０８３，６９７号に記載されている。この方法は、照射によってポリマー配列合成の支援を開始する触媒システムを用いる、新規化学増幅法を利用する。この方法は、合成中間体を、ポリマー配列の形成を促進する方向に、触媒として化学的に変化させるように作用する光感受性化合物の使用を含む。このような光感受性化合物としては、一般に照射活性化触媒（ＲＡＣ）と呼ばれるものが、さらに具体的には、光活性化触媒（ＰＡＣ）が挙げられる。ＲＡＣはそれ自体が合成中間体を変化させることが可能であるし、あるいは、合成中間体を、さらに後に加わる合成中間体またはその他の化合物と化学的に結合するように、化学的に変化させる自動触媒化合物を活性化することも可能である。
【０１８１】
アレイはまた、機械的に制限された流通路を通じて、支持体のセルにモノマーを搬送することによって組み合わせ式に合成することも可能である。Ｗｉｎｋｌｅｒ等、欧州特許第６２４，０５９号を参照されたい。アレイはまた、インクジェットプリンターを用いて、モノマー試薬を支持体の上にスポット印刷することによって合成することも可能である。上記およびＰｅａｓｅ等欧州特許第７２８，５２０号を参照されたい。
【０１８２】
ｃＤＮＡプローブは、従来技術で既知であり、本明細書で記載される方法、例えば、配列特異的プライマーによるＲＮＡの逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に従って調製することが可能である。オリゴヌクレオチドプローブは化学的に合成することが可能である。それからプローブを調製する遺伝子またはｃＤＮＡは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、その他の公共データベースまたは出版物から入手することが可能である。
【０１８３】
核酸プローブは、天然の核酸であっても、化学的に修飾された核酸、例えば、ヌクレオチド類縁体から構成されるものであっても、それらが結合化学と適合的な活性化ヒドロキシル基を有している限り、構わない。保護基は自体が光感受性を持つものであってもよい。別に、保護基は、ある化学的条件、例えば、酸の下で脆弱になってもよい。この例では、固体支持体の表面は、露光すると酸を発生する組成物を含むことが可能である。従って、基板のある領域を光に暴露すると、その領域に酸が生成され、これが、その暴露領域の保護基を除去する。さらに、合成法は、３’−保護５’−Ｏ−フォスフォロアミダイト活性化デオキシヌクレオシドを使用することが可能である。この場合、オリゴヌクレオチドは５’から３’方向に合成され、その結果遊離５’末端が得られる。
【０１８４】
アレイのオリゴヌクレオチドは、数千のオリゴヌクレオチドを製造することが可能な（Ｌａｓｈｋａｒｉ等、ＰＮＡＳ  ９３：７９１２，１９９５）９６ウェル自動多重化オリゴヌクレオチド合成装置（Ａ．Ｍ．Ｏ．Ｓ．）を用いて合成することが可能である。
【０１８５】
オリゴヌクレオチド設計は、意図する用途によって影響されるのは了解されよう。例えば、プローブの全てについて同じ融解点を持つことが望ましい。従って、プローブの長さは、アレイ上の全プローブの融解温度が緊密に近似するように調節される（様々なプローブが異なるＧＣ内容を持つ場合、ある特定のＴ［ｍ］を実現するためには、様々なプローブについて異なる長さが必要とされることは了解されよう）。プローブ設計において融解温度は主要な考慮対象ではあるが、プローブ構築をさらに調整するために他の要因も、例えば、プライマーの自己相補性回避の選択等も要すれば随意に使用される。
【０１８６】
アレイ、例えば、マイクロアレイは、製造後、または、購入後、後の使用時に備えて保存するのが好都合である。適当な条件下では、被験体アレイは、少なくとも約６ヶ月保存することが可能であるし、最大１年未満保存してもよい。アレイは一般に約−２０℃から室温の間で保存され、その場合、アレイはプラスチック容器、例えば、バッグの中に密封し、日光を遮断する。
【０１８７】
６．３．３  標的核酸をマイクロアレイにハイブリダイズする
次の工程は、標的核酸をアレイと、標的核酸とアレイのプローブとの間に結合が起こるのに十分な条件下で、接触させることである。好ましい実施態様では、標的核酸は、アレイと、標的核酸とマイクロアレイのプローブとの間にハイブリダイゼーションが起こるのに十分な条件下で接触させられるが、その際、ハイブリダイゼーション条件は、所望のレベルのハイブリダイゼーション特異性が実現されるように選ばれる。
【０１８８】
アレイと標的核酸との接触は、アレイを、標的核酸を含む水性媒体と接触させることを含む。接触は、アレイの特異的形態に依存して様々のやり方で実現が可能である。例えば、アレイが、「平板様」剛性基板の表面にサイズ区分プローブのパターンを単純に含む場合、接触は、アレイを単純に、標的核酸溶液を含む容器、例えば、ポリエチレンバッグ等の中に移すことによって実現される。アレイが、二つの剛性プレートによって隔てられた分離媒体に捕捉されている別の実施態様では、標的核酸を電気泳動手段によって輸送する機会も存在する。別に、アレイが、流体の流入口と流出口を備えたバイオチップデバイスに組み込まれている場合、標的核酸溶液は、チェンバーに導入することが可能であり、それによって標的分子のパターンは流入口を通じて提示され、その際流体導入は手動により、または自動装置により実行される。多数ウェル実施態様では、標的核酸溶液は、アレイを含む反応チェンバー内に、手動で、例えば、ピペットにより、または、流体操作自動装置によって導入される。
【０１８９】
標的核酸溶液とプローブとの接触は、標的とプローブの間に結合が起こるのに十分な時間維持される。プローブと標的の性質によるが、接触は一般に約１０分から約２４時間、通常約３０分から１２時間、さらに一般的には約１時間から約６時間の範囲の期間維持される。
【０１９０】
市販のマイクロアレイを使用する場合には、メーカーによって十分なハイブリダイゼーションの条件が提供される。市販のものではないマイクロアレイを使用する場合には、ハイブリダイゼーション条件は、下記のハイブリダイゼーションガイドラインを始め、マイクロアレイの用法に関する数多くの刊行論文に記載されるハイブリダイゼーション条件に基づいて確定することが可能である。
【０１９１】
核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブが特定のアレイ部位に「特異的に結合する」または「特異的にハイブリダイズする」、すなわち、プローブが、相補的核酸配列を有する、アレイの配列部位に対してハイブリダイズする、２本鎖を作る、または結合するが、非相補的核酸配列を有する部位に対してはハイブリダイズしないよう最適なものが選択される。本明細書で用いる場合、一つのポリヌクレオチドは、下記の条件を満たした場合にのみ、別のポリヌクレオチドに対して相補的であると考慮される。すなわち、それらのポリヌクレオチドの内の短い方が２５塩基以下である場合、標準的な塩基対合規則を用いてミスマッチがない場合、あるいは、それらのポリヌクレオチドの内の短い方が２５塩基よりも長い場合、ミスマッチが５％未満である場合である。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは完全に相補的である（ミスマッチが無い）。陰性コントロールを含めたハイブリダイゼーションアッセイを実行することによって、特異的ハイブリダイゼーション条件が特異的ハイブリダイゼーションを実現可能とすることを簡単に証明することができる。
【０１９２】
ハイブリダイゼーションは、事実上特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件において実行される。プローブの長さとＧＣ含量は、ハイブリッドのＴｍを、従って、プローブの鋳型核酸に対する特異的ハイブリダイゼーションを実現するのに必要なハイブリダイゼーション条件を決める。これらの因子は、当業者にはよく知られており、またアッセイでもテストすることが可能である。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドが、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）「生化学および分子生物学における実験室技術−核酸プローブとのハイブリダイゼーション（“Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ”）」に認められる。一般に、厳格条件は、ある定義されたイオン強度とｐＨにおいて、特異的配列の融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選ばれる。Ｔｍとは、標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度とｐＨの下で）である。高い厳格条件は、特定プローブのＴｍ点と等しくなるように選ばれる。時に“Ｔｄ”という用語が、プローブの少なくとも半分が、完全マッチ核酸から解離する温度を定義するのに用いられる。いずれにしろ、ＴｍまたはＴｄを推定するための様々な推定技術が利用可能であり、Ｔｉｊｓｓｅｎ上記に総合的に記載されている。典型的には、２本鎖におけるＧ−Ｃ塩基対はＴｍに対して約３℃貢献しており、一方、Ａ−Ｔ塩基対は約２℃貢献し、最高は約８０−１００℃の理論的最大値となる。ＴｍとＴｃに関するさらに精細なモデルが、Ｇ−Ｃによる膠着相互作用、溶媒効果、所望のアッセイ温度等を考慮する場合には利用可能であり、また適切である。例えば、プローブは、下式を用いて約６０℃の解離温度（Ｔｄ）を持つように設計することが可能である。すなわち、
式：Ｔｄ＝（（（（（３ｘ＃ＧＣ）＋（２ｘ＃ＡＴ））ｘ３７）−５６２）／＃ｂｐ）−５、前式において、＃ＧＣ、＃ＡＴ、および、＃ｂｐは、それぞれ、プローブの鋳型ＤＮＡに対するアニールにおいて関与するグアニン−シトシン塩基対の数、アデニン−チミン塩基対の数、および、全塩基対の数である。
【０１９３】
完全にマッチした２本鎖と、ミスマッチ２本鎖の間の安定度差は、ミスマッチがただ一つの塩基である場合、ごく僅かで、二つの間のＴｍの差は０．５度という僅少なものである可能性がある（Ｔｉｂａｎｙｅｎｄａ，Ｎ．等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９：１９，１９８４、および、Ｅｂｅｌ，Ｓ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１２０８３，１９９２参照）。さらに重要なことに、相同領域の長さが増すにつれて、単一塩基ミスマッチの、全体２本鎖安定度に及ぼす作用は減少する。
【０１９４】
核酸ハイブリダイゼーションの理論と実際は、例えば、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ（編）、「分子生物学の方法（“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”）」２０巻に記載されており、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）「生化学および分子生物学における実験室技術−核酸プローブとのハイブリダイゼーション（“Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ”）」の例えばＩ部２章「ハイブリダイゼーション原理概観および核酸プローブアッセイ戦略（“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓｅｙ”）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨークは、核酸ハイブリダイゼーションに関する基本的ガイドを提供する。
【０１９５】
ある種のマイクロアレイは「能動性」を持つ、すなわち、これらのアッセイは、各特異的微細位置で起こるハイブリダイゼーション反応（またはその他の全てのアフィニティー反応）の全局面において独立した電子制御を与える。これらのデバイスは、電子厳格度制御（ＥＳＣ）と呼ばれるハイブリダイゼーション作用のための新機構を提供する。この能動装置は、各微細位置毎に「異なる厳格度条件」を電子的に提供することが可能である。従って、全てのハイブリダイゼーションを同じ粗大溶液において最適条件で実行することが可能である。このようなアレイはＳｏｓｎｏｗｓｋｉ等、米国特許第６，０５１，３８０号に記載される。
【０１９６】
ある好ましい実施態様では、背景信号は、界面活性剤（例えばＣ−ＴＡＢ）、または、ブロッキング試薬（例えば、精子ＤＮＡ、ｃｏｔ−１ＤＮＡ等）を、非特異的結合を下げるために、ハイブリダイゼーション中に使用することによって低減される。特に好ましい（実施態様では、ハイブリダイゼーションは、約０．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ（例えば、ニシン精子ＤＮＡ）の存在下に実行される。ハイブリダイゼーション中におけるブロッキング試薬の使用は、当業者には周知である（例えば、「生化学および分子生物学における実験室技術、２４巻、核酸プローブとのハイブリダイゼーション（“Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ”）」の８章、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク（１９９３）を参照）。
【０１９７】
方法は、標的核酸について用いられた特定標識に依存して、検出工程の前に、非結合標識除去工程をさらに含んでもよいし、含まなくともよい。例えば、あるアッセイ方式では（例えば、「均一アッセイ方式」）検出可能な信号は、標的がプローブに対して特異的結合を行った時にのみ生成される。このような場合、このアッセイ方式では、ハイブリダイゼーションパターンは、非結合標識除去工程なしに検出することが可能である。別の実施態様では、用いた標識は、標的がプローブに特異的に結合するか否かを問わず信号を発生する。このような実施態様では、非結合標識標的は固体表面から除去される。非結合標識標的を除去する一つの手段は、周知の洗浄技術を実行することである。この場合、各種洗浄液、および、非結合標識除去におけるそれらの使用プロトコールは当業者には既知であり、使用が可能である。別に、非結合標識標的は電気泳動手段によって除去することも可能である。
【０１９８】
標的配列の全てが同じ標識によって検出される場合、各生理学的供給源に対して異なるアレイが用いられる（この場合、異なるとは、異なる時間に同じアレイを使用することを含む）。前述の方法は、異なる標的集団に対して異なる、識別可能な標識（アッセイされる異なる生理学的供給源のそれぞれを表す）を用いることによって多重化分析を実行できるよう改変することが可能である。この多重化法では、同じアレイが、異なる標的集団のそれぞれに対して同時に使用される。
【０１９９】
別の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、電荷結合素子（ＣＣＤ）画像カメラを用いてリアルタイムで監視される（Ｇｕｓｈｉｎ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０：２０３，１９７７）。光ファイバーバンドル上にアレイが合成されているために、簡単で、高感度の読み取りが可能になる（Ｈｅａｌｙ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１：２７０，１９９７）。別の実施態様では、リアルタイムハイブリダイゼーション検出は、マイクロアレイ上で、表面に結合した蛍光色素のみを励起するエバネッセント波効果を用いて洗浄無しに実行される（例えば、Ｓｔｉｍｐｓｏｎ等、ＰＮＡＳ  ９２：６３７９，１９９５）。
【０２００】
６．３．４  ハイブリダイズした核酸の検出およびマイクロアレイの結果分析
前述の工程により、アレイ表面において標的核酸のハイブリダイゼーションパターンが生産される。このパターンは目視することも可能であるし、あるいは、様々の方法があるが、標的核酸の特定の標識に基づいて選ばれた特定の検出法によって検出することが可能である。代表的な検出手段としては、シンチレーションカウンティング、オートラジオグラフィー、蛍光測定、比色測定、発光測定、光散乱等が挙げられる。
【０２０１】
一つの検出法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、カリフォルニア州）から販売されているアレイスキャナー、例えば、４１７ＴＭアレイヤー、４１８ＴＭアレイスキャナー、または、Ａｇｉｌｅｎｔ遺伝子アレイＴＭスキャナーを含む。このスキャナーは、ウィンドウズ（登録商標）Ｒインターフェイスおよび使い易いソフトウェアツールを備えたシステムコンピュータによって制御される。出力は１６ビットｔｉｆファイルであり、これは直接取り込むことが可能であるし、あるいは、様々のソフトウェアアプリケーションによって直接読み取ることも可能である。好ましいスキャニング装置は例えば米国特許第５，１４３，８５４および５，４２４，１８６号に記載される。
【０２０２】
蛍光標識プローブを使用した場合、転写アレイの各部位における蛍光発射は、走査型共焦点レーザー顕微鏡検査によって検出することが可能である。一つの実施態様では、使用した２種類の蛍光色素のそれぞれに対して、適当な励起線を用いた別々のスキャンを実行する。別に、２種類の蛍光色素に対してそれぞれに特異的な波長で標本を同時照明し、この２種類の蛍光色素からの発射光を同時に分析可能とするレーザーを用いることも可能である（Ｓｈａｌｏｎ等、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：６３９−６４５，１９９６）。ある好ましい実施態様では、アレイは、コンピュータ制御Ｘ−Ｙステージおよび顕微鏡対物レンズを備えた、レーザー蛍光スキャナーによってスキャンされる。２種類の蛍光色素の継時的励起は、多重線、混合ガスレーザーによって実現され、発射光は波長によって分割され、２本の光増倍管によって検出される。蛍光性標的核酸が使用される一つの実施態様では、アレイを、プローブアレイの領域にハイブリダイズした蛍光標識標的を励起するレーザーを用いてスキャンし、次にこのハイブリダイズ領域を、アレイの広視野スキャニング用電荷結合素子（“ＣＣＤ”）を用いて画像化することも可能である。蛍光レーザースキャニング装置は、例えば、Ｓｃｈｅｎａ等上記に記載される。別に、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６８１−１６８４，１９９６によって記述される光ファイバーバンドルを用いてｍＲＮＡの量的レベルを監視してもよい。
【０２０３】
データ収集操作の次は、データは、通常は、データ分析操作に送られる。サンプル分析操作をやり易くするために、装置のリーダーによって得られたデータは、通常、ディジタルコンピュータによって分析される。典型的には、コンピュータは、装置からのデータ受信・保存を始めとして、集められたデータの分析、例えば、背景の引き算、多重色彩画像の重複除去、アーチファクトのマーキングまたは除去、制御の適正の確認、信号の正規化、蛍光データを解釈してハイブリダイズした標的量の決定、背景の正規化、および、一塩基ミスマッチハイブリダイゼーション等、および、データ送信のために適当にプログラムされている。ある好ましい実施態様では、システムは、特定のパターン、例えば、認知障害を有する患者のあるサンプルの発現プロフィールと、対立する正常被験体の発現プロフィールの間の、例えば、差動的遺伝子発現に関連するパターンの探索を可能とする、探索機能を備える。システムは、２種類以上のサンプルの間の遺伝子発現パターン差を探索可能とするものであることが好ましい。
【０２０４】
データ分析用の望ましいシステムは、遺伝子発現データの視覚化、操作、および分析のための総合的、弾力的システムである。このようなシステムは、発現データの中をブラウズし、ナビゲートすることを可能とするグラフィカルなユーザーインターフェイスを含み、そのためユーザーが、興味の遺伝子を選択的に目視し強調できるようになっていることが好ましい。システムはまた、ソートおよび探索機能を含むことが好ましく、かつ、ＰＣ、ＭａｃまたはＵｎｉｘ（登録商標）ワークステーションを持つ一般ユーザーにも利用可能であることが好ましい。さらにシステムに含まれると好ましいのが、既存のものよりも質的に効率的なクラスタリングアルゴリスムである。このアルゴリスムの正確度は階層構造において調節可能となっており、そのためにクラスタリングの精密レベルは、望みのままに体系的に向上が可能となっていることが好ましい。
【０２０５】
遺伝子発現プロフィールデータ、例えば、実行する比較のタイプを分析するためには各種のアルゴリスムが利用可能である。ある実施態様では、共同制御される遺伝子同士をグループにまとめることが望ましい。これによって、多数のプロフィールの比較が可能になる。このような遺伝子群を特定するための好ましい実施態様はクラスタリングアルゴリスムを含む（クラスタリングアルゴリスムの総覧については、例えば、Ｆｕｋｕｎａｇａ、１９９０、「統計学的パターン認識（“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”）」、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ；Ｅｖｅｒｉｔｔ，１９７４、「クラスター分析（“Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”）」、ロンドン、Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ  Ｅｄｕｃ．Ｂｏｏｋｓ；Ｈａｒｔｉｇａｎ，１９７５、「クラスタリングアルゴリスム（“Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  Ａｌｏｇｏｒｉｔｈｍｓ”）」、ニューヨーク、Ｗｉｌｅｙ；ＳｎｅａｔｈとＳｏｋａｌ，１９７３，「数値分類学（“Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ”）」、Ｆｒｅｅｍａｎ；Ａｎｄｅｒｂｅｒｇ，１９７３，「応用クラスター分析（“Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨークを参照されたい）。
【０２０６】
クラスタリング分析は、数千の時間曲線から成る複雑なパターンを、比較的少数組の代表的クラスターに低減させるのに有用である。配列に基づいて遺伝子をクラスター分割し目視することを可能するシステムがある。また、遺伝子の他の特質、例えば、発現レベルに基づいてクラスター分割を可能とするシステムもある（例えば、米国特許第６，２０３，９８７号参照）。時間曲線のクラスター分割を可能とするシステムもある（例えば、米国特許第６，２６３，２８７号参照）。クラスター分析は、ｈｃｌｕｓｔルーチンを用いて実行することが可能である（例えば、ソフトウェアパッケージＳ−Ｐｌｕｓ、ＭａｔｈＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．ケンブリッジ、マサチューセッツ州由来の“ｈｃｌｕｓｔ”ルーチンを参照）。
【０２０７】
いくつかの特定実施態様では、遺伝子は、米国特許第６，２０３，９８７号に記載されるように、転写時の共変動、恐らくは共同制御の程度に従ってグループ分けされる。共変動転写物を有する遺伝子グループは「遺伝子セット」と呼ばれる。クラスター分析、またはその他の統計的分類法は、各種擾乱に呼応する、例えば、病気や薬剤によって引き起こされる遺伝子転写の共変動を分析するのに使用することが可能である。一つの特定実施態様では、クラスタリングアルゴリスムを発現プロフィールに用いて、遺伝子を提示される共同制御の量に基づいて関連付ける「類似ツリー」または「クラスターツリー」が構築される。遺伝子セットは、１本のクラスターツリーにおいて、枝分かれ階層の様々のレベルでツリーを切断することによって定義される。
【０２０８】
ある実施態様では、遺伝子発現は、遺伝子発現投射プロフィールに変換される。この遺伝子発現投射プロフィールとは、遺伝子セット発現値の集合である。この変換は、ある実施態様では、各遺伝子セットにおける遺伝子の発現レベルを平均することによって実現される。別の実施態様では、他の直線的投射過程が用いられる。投射操作は、プロフィールを、より小さな、生物学的により意味のある一組の座標系に表現する。これは、各細胞組成セットについて平均することで測定誤差の作用を低減し、プロフィールの生物学的解釈を容易にする。
【０２０９】
比較される数値としては、粗大発現レベル；例えば、異なる実験から得られた、同じ被験体の異なるサンプルから得られた、または、異なる被験体からえられた複数サンプルの、発現レベルの平均；および、発現レベルの比が挙げられる。
【０２１０】
６．３．５  マイクロアレイのデータ分析法
認知障害の抑制に応じて上向調整される１種以上の遺伝子の発現レベルを、認知障害の抑制が無い場合の発現レベル、例えば、病気または正常被験体に特徴的な発現レベルを参照して行う比較は、コンピュータシステムを用いて実行するのが好ましい。一つの実施態様では、１種以上の発現レベルが二つのサンプルから得られ、これら二組の発現レベルが、比較のためにコンピュータシステムに導入される。ある好ましい実施態様では、１種以上の発現レベルから成る一組が、コンピュータシステムに、そのコンピュータシステムに既に存在する数値との比較のために入力される、あるいは、コンピュータ読み取り可能な形に変換され、次にコンピュータシステムに入力される。
【０２１１】
一つの実施態様では、本発明は、本発明の遺伝子発現プロフィールデータについて、あるいは、被験体の認識障害の抑制に応じて上向調整される、少なくとも１個の遺伝子の発現レベルに対応する数値についてコンピュータ読み取り可能な形式を提供する。数値は、実験、例えば、マイクロアレイ分析から得られるｍＲＮＡ発現レベルであってもよい。数値はまた、その発現が、多くの細胞において、多くの条件下で定常である参照遺伝子、例えば、ＧＡＰＤＨに対して正規化されたｍＲＮＡレベルであってもよい。また別の実施態様では、コンピュータの数値は、異なるサンプルにおける正規化された、または正規化されていないｍＲＮＡレベル間の比、または、差である。
【０２１２】
コンピュータ読み取り可能な媒体は、少なくとも約２個、少なくとも３個、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００個以上の遺伝子を含んでもよい。ある好ましい実施態様では、コンピュータ読み取り可能な媒体は、少なくとも１個の発現プロフィールを含む。
【０２１３】
遺伝子発現データは、表、例えば、エクセルの表の形に収めることが可能である。データはそれ単独であってもよいし、例えば、他の発現プロフィールを含むより大きいデータベース、例えば、公共データベースの一部であってもよい。コンピュータ読み取り可能な形式はコンピュータの中に存在することが可能である。別の実施態様では、本発明は、遺伝子発現プロフィールデータを表示するコンピュータを提供する。
【０２１４】
本発明は、単一遺伝子の発現レベルが、２種以上の細胞または組織サンプルにおいて比較される方法を提供する。ある実施態様では、複数遺伝子の発現レベルが比較される。例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００個以上の遺伝子の発現レベル。ある実施態様では、複数のプロフィールが比較される。
【０２１５】
一つの実施態様において、本発明は、認知障害の抑制に応じて上向調整される１個以上の遺伝子の発現レベル間の類似性を確定する方法を提供する。方法は、第一サンプルにおいて、認知障害の抑制に応じて上向調整される１個以上の遺伝子の発現レベルを入手すること、および、この数値をコンピュータに入力することを含み、前記コンピュータは（ｉ）コントロールの未処置サンプルにおける１個以上の遺伝子の発現レベルに対応する数値の記録を含むデータベース、および（ｉｉ）プロセッサー指令、例えば、ユーザーインターフェイスであって、コンピュータに保存されるデータとの比較目的のために１個以上の数値の選択を受容することが可能なプロセッサー指令を含むことを特徴とする。コンピュータはさらに、比較データを模式図またはチャートまたはその他の出力形に変換する手段を含んでもよい。
【０２１６】
一つの実施態様では、本発明は、単一または複数遺伝子の遺伝子発現データを受容するための手段；前記単一または複数遺伝子それぞれの遺伝子発現データを、共通参照フレームと比較する手段；および、比較結果を提示する手段を含むシステムを提供する。このシステムは、データをクラスター分割する手段をさらに含んでもよい。
【０２１７】
別の実施態様では、本発明は、遺伝子発現データを分析するためのコンピュータプログラムであって、（ｉ）入力として、複数の遺伝子の遺伝子発現データを受容するコンピュータコード、および、（ｉｉ）前記複数の遺伝子それぞれの前記遺伝子発現データを共通参照フレームと比較するコンピュータコードを含むコンピュータプログラムを提供する。
【０２１８】
本発明はまた、マシン読み取り可能な、または、コンピュータ読み取り可能な媒体であって、下記の２工程、すなわち（ｉ）調査細胞においてＮＭＤの抑制に応じて上向調整される１個以上の遺伝子の発現レベルに相当する複数の数値を、１種以上の細胞、および、指定の型の細胞の参照発現記録を含むデータベースと比較する工程、および（ｉｉ）調査細胞が、発現レベルの類似性に基づいて、どの細胞に類似するかを示す工程を実行するためのプログラム指令を含む媒体を提供する。
【０２１９】
二つの生物サンプルにおける発現の相対的レベル、例えば、ｍＲＮＡの相対量は、擾乱度（相対量差）、または、擾乱フリー度（すなわち、相対量は同じである）として点数評価することが可能である。例えば、擾乱度は、二つの供給源の間の、係数として少なくとも約２５％のＲＮＡの発現レベルの差（一方の供給源のＲＮＡの方が、他方のものよりも２５％多量である）であってもよいし、より一般的には約５０％でもよいし、さらに多くの場合係数が約２（量が２倍）、３（量が３倍）、または、５（量が５倍）であってもよい。擾乱度は、比較を計算し提示するためにコンピュータによって使用される。
【０２２０】
擾乱度が正か負かを特定するのに加えて、擾乱度の大きさを確定することができたら有利である。これは、前述のように、差動標識のために使用される、２種の蛍光色素の発光比率を計算することによって、あるいは、当業者には直ちに明らかな類似の方法によって実行することが可能である。
【０２２１】
コンピュータの読み取り可能な媒体は、発現レベルまたは発現プロフィールの記述子、例えば、そのレベルまたはプロフィールがどの供給源から得られたのか、例えば、どの患者から得られたのかを示す記述子に対するポインターをさらに含んでもよい。記述子は、病気の状態、患者が現在受けている治療、または、その他の、発現レベルの供給源に関する任意の記載事項を反映することが可能である。
【０２２２】
操作時、遺伝子発現データを受容する手段、遺伝子発現データを比較する手段、表示手段、正規化手段、および、本発明のシステムの目的に沿ってクラスター分割する手段は、ハードウェア、または、ハードウェアとソフトウェアにおいて具現化された、本明細書に記述されるそれぞれの機能性を備えた、プログラム化されたコンピュータ；コンピュータプログラムによって指令される、本明細書において具体的に指定される操作を実行するプログラム化コンピュータの論理回路またはその他の成分；または、コンピュータを本明細書に記述する特定のやり方で機能させるコンピュータプログラムを表す実行可能な指令のコードを記録したコンピュータメモリーに関与することが可能である。
【０２２３】
当業者であれば、本発明のシステムおよび方法は、ＭＳ−ＤＯＳまたはマイクロソフトウィンドウズ（登録商標）を登載するＩＢＭ−適合パソコンを含む各種システムに適用可能であることが理解されよう。さらに、パソコンは、そのようなシステムに通常関連するハードウェアおよびソフトウェア成分の全てを持っているのであるから、ユーザーは、有能なメモリー、ネットワーク接続性、印刷可能性、および、各種コンピュータ言語によるプログラム性を持つことになろう。コンピュータシステムが適正であれば、ユーザーは先ず、発現プロフィールデータをコンピュータシステムにロードすることが可能であろう、米国特許第６，２０３，９８７号。遺伝子セット定義は、記憶媒体から、離れたコンピュータから、好ましくは、ネットワークを通じてダイナミック遺伝子セットデータベースシステムからロードされる。次に、ユーザーは、投射ソフトウェアの実行を起動し、ソフトウェアは、発現プロフィールを投射型発現プロフィールに変換する工程を実行する。
【０２２４】
さらに別の例示の設定では、ユーザーは先ず投射プロフィールをメモリーに導く。次に、ユーザーは、参照プロフィールのメモリーへのロードを起動する。次に、ユーザーは、比較ソフトウェアの実行を起動し、ソフトウェアは、これらのプロフィールを客観的に比較する工程を実行する。
【０２２５】
７．  認知機能を増進または保持する化合物をスクリーニングする。
【０２２６】
本発明の開示に導かれて、認知機能と関連する遺伝子の発現を修飾する薬剤を、本発明のインビトロおよびインビボスクリーニング法を用いて特定することが可能である。
【０２２７】
本発明は、哺乳類、例えば、ラットおよびヒトにおいて認知機能を増進する、または保持するのに有用な薬剤を特定するための方法を提供する。一つの局面において、このスクリーニング法は、グルタメート輸送タンパク、例えば、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４、またはＥＡＡＴ５をコードする遺伝子の発現、あるいは、そのような遺伝子によってコードされるグルタメート輸送タンパクの活性を修飾する薬剤を特定するアッセイを実行することを含む。簡単のために、下記では“ＥＡＡＴ”への言及は、ＥＡＡＴ１，ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４およびＥＡＡＴ５それぞれ、その遺伝子／タンパクの全てを含むグループ、および、それらの下位成分の組み合わせ（例えば、ＥＡＡＴ１とＥＡＡＴ２）を言及するものとする。別に、このスクリーニング法は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの発現を修飾する薬剤を特定するアッセイを実行することを含む。
【０２２８】
哺乳類細胞（例えば、ラット細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞）においてＥＡＡＴおよび／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの発現レベルを修飾する薬剤を特定するには、いくつかの異なるスクリーニングプロトコールの利用が可能である。一般的に言うと、スクリーニング法は、ＥＡＡＴの活性またはレベルを変化させる薬剤を特定するために、複数の薬剤（「試験薬剤」）を、例えば、と言ってそれらに限定されないが、ＥＡＡＴポリペプチドに結合させることによって、阻害剤がＥＡＡＴポリペプチドに結合するのを阻止させることによって、ＥＡＡＴ遺伝子の発現を増加させることによって、スクリーニングすることを含む。さらに、スクリーニング法は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性またはレベルを変化させる薬剤を特定するために、複数の薬剤（「試験薬剤」）を、例えば、と言ってそれらに限定されないが、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチドに結合させることによって、阻害剤がアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチドに結合するのを阻止させることによって、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現を増加させることによって、スクリーニングすることを含む。
【０２２９】
「試験薬剤」とは、小型有機分子、既知の製剤、ポリペプチド；オリゴサッカライドやポリサッカライドのような炭水化物；ポリヌクレオチド；脂質またはリン脂質；脂肪酸；ステロイド；またはアミノ酸類縁体を含む（ただしそれらに限定されない）各種一般形の化合物を含む。試験薬剤は、ライブラリー、例えば、天然産物ライブラリー、および組み合わせライブラリーから入手することが可能である。いくつかの異なるタイプのライブラリーが市販されており、ライブラリーを調製する方法も、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９３／０６１２１、ＷＯ９５／１２６０８、ＷＯ９５／３５５０３、ＷＯ９４／０８０５１，およびＷＯ９５／３０６４２を含めて記載されている。さらに、数千の化合物を短期間にスクリーングすることを可能とするアッセイの自動化法も既知である。
【０２３０】
いくつかのスクリーニング法は、細胞においてＥＡＡＴおよび／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパクの発現または活性を増大させる化合物を求めるスクリーニングを含む。このような方法は、ＥＡＡＴ遺伝子またはタンパクを発現する１個以上の細胞と試験化合物を接触させる細胞系アッセイを実行すること、次にＥＡＡＴ発現（例えば、ＥＡＡＴ  ＲＮＡのレベル）または活性における変化を検出することを含むことが可能である。もう一つの方法は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子またはタンパクを発現する１個以上の細胞と試験化合物を接触させる細胞系アッセイを実行すること、次にアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ発現（例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＲＮＡのレベル）または活性における変化を検出することを含むことが可能である。従って、ある実施態様では、この方法は、細胞を試験薬剤と接触させること、遺伝子の発現レベルがその試験薬剤の存在下で変化するか否かを確定することを含み、発現の変化（例えば、増加）は、その試験薬剤が、認知機能を増進または維持するのに有用であることを示すものであることを特徴とする。細胞は、インビトロ（試験管内）、インビボ（体内）、またはエクソビボ（体外）で接触させることが可能である。通常、発現は、試験化合物不在時の発現に比べて少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または、少なくとも約１００％増加する。
【０２３１】
ある実施態様では、本発明は、認知障害の低減における有用性を判定するための薬剤をスクリーニングする方法であって、グルタメート輸送因子を発現する細胞、または哺乳類神経細胞によって発現されるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を供給すること、細胞を試験薬剤に接触させること、および、グルタメート輸送因子（例えば、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４およびＥＡＡＴ５の内の１種以上）、および／または、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性または発現レベルが試験薬剤の存在下で増加しているか否かを確定することによって有用性判定を行う方法であって、そのような増加は、試験薬剤が認知機能を増進または維持するのに有用であることを示すものとするスクリーニング法を提供する。発現は、ＥＡＡＴまたは、ＡＴ  ｍＲＮＡの生産率または量における変化の検出を含めた、当該分野で公知の方法によって評価することが可能である。グルタメート輸送タンパクの活性は、細胞への３Ｈ−グルタメートの取り込みの測定（Ｌｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：８４−８８，２００１）を含めた当該分野で公知の方法によって評価することが可能である。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパク活性は、ＮＡＤＨの存在下におけるリンゴ酸デヒドロゲナーゼとの共役反応（Ｋａｒｍｅｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４：１３１，１９５５；ＡｍａｄｏｒとＷａｃｋｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．８：３４３，１９６２）を含む当該分野で公知の方法によって評価してもよい。
【０２３２】
通常、この判定は、試験細胞における活性または発現を、試験化合物と接触されていない類似の１個の細胞または複数細胞（すなわち、コントロール細胞）と比較することを含む。ある関連実施態様では、試験化合物は、多細胞生物（例えば、動物）に投与される。ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ成分は、全部が、その細胞または多細胞生物にとって内因性のものであってもよいし、１種以上の組み換え発現されたＥＡＡＴおよび／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパクを含む組み換え細胞またはトランスジェニック動物であってもよい。組み換えＥＡＡＴおよび／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパクの発現は、公表されている遺伝子とタンパク配列と、通例法を用いて実現することが可能である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等、「分子生物学における最新プロトコール（“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”）」、Ｇｒｅｅｎｅ  ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇとＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（２００２年まで補充）を参照）。
【０２３３】
アッセイは、ＥＡＡＴおよび／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を発現するものであればいずれの細胞型、各種実施態様では、培養細胞（例えば、一次培養体、または不死細胞系統における細胞）および体内細胞を含む細胞型を用いても実行が可能である。例示の細胞としては、神経細胞、グリア細胞、混合神経性培養体、または、ＥＡＡＴおよび／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子発現が組み換え発現によって誘発された細胞が挙げられる。このような細胞（例えば、一次培養体）は、胎児海馬から得ることが可能である。他にも多くの適当な細胞または細胞系統が実地の技術者には知られているであろう。
【０２３４】
ある細胞またはインビトロシステムにおいて、ある薬剤が、ＥＡＡＴおよび／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす作用は、その試験薬剤の不在下の、その細胞またはインビトロシステムにおける典型的発現レベルである基礎値と比較することが可能である。発現レベルはまた、陰性コントロールとして、ＥＡＡＴおよび／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを発現しない細胞について定量することも可能である。一般に、このような細胞も、試験細胞とその他の点では遺伝学的に実質的に同じである。
【０２３５】
その他の、細胞使用アッセイとして、ＥＡＡＴおよび／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを必ずしも発現しない細胞について行われるリポーターアッセイがある。これらのアッセイのあるものは、検出可能な産物をコードするリポーター遺伝子に動作的にリンクする、ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターを含むヘテロ核酸構築体を用いて実行される。多くの場合、ＥＡＡＴ遺伝子プロモーターは、転写開始部位の約３００から１０００ｂｐ上流（または５’側）の領域に配置され、例えば、Ｓｕ等、ＰＮＡＳ  １００：１９５５−１９６０，２００３に記載されている。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターは、多くの場合、転写開始部位の約３００から１０００ｂｐ上流（または５’側）の領域内に配置され、例えば、Ｏｂａｒｕ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００：１３−２２，１９８８に記載されている。いくつかのＥＡＡＴおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）および科学文献に記載されている。いくつかの異なるリポーター遺伝子の利用が可能である。例示のリポーターとしては、緑色蛍光タンパク、Ｊ−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、Ｊ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等が挙げられる。これらのアッセイにおいては、リポーター構築体を抱える細胞が試験化合物に接触させられる。結合することによってプロモーターを活性化するか、またはプロモーターを活性化する分子を生産するカスケード反応を起動する試験化合物は、検出可能なリポーターの発現を引き起こす。リポーターアッセイには、様々な異なるタイプの細胞が利用可能である（例えば、酵母のような真核細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅｐＧ２、およびＨｅＬａ細胞系統）。
【０２３６】
ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパクに結合することが可能な化合物を求めるスクリーニングを含んでもよい。なぜなら、このようにして特定された化合物の内の少なくともいくつかは、ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの修飾因子である可能性が高いからである。このスクリーニングにおいて特定されたリード化合物は、さらに多くの活性類縁体合成のための基盤となる可能性がある。従って、一つの局面において、本発明は、認知障害の低減における有用性を判定するための薬剤をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子によってコードされるポリペプチド、または、そのようなポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させること、および、（ｂ）ポリペプチドが試験化合物に結合するか否かを確定することによって薬剤をスクリーニングする方法を提供する。このような結合は、試験薬剤が認知障害の低減に有用であることの証しである。結合アッセイは通常、ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチドを、１種以上の試験化合物と接触させること、および、そのタンパクと試験化合物が結合複合体を形成するのに十分な時間を与えることを含む。試験化合物が直接ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチドに結合する能力を持つか否かの判定は、例えば、化合物を、放射性同位元素または酵素標識に結合させ、そのために、化合物のＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチドに対する結合が、複合体における標識ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチドを検出することによって判定可能となるようにすることによって実現される。形成される結合複合体が少しでもあればそれは、いくつかの既存の分析技術の内のいずれかを用いて検出することが可能である。タンパク結合アッセイとしては、共沈殿、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける共移動、および、ウェスタンブロットにおける共移動を測定する方法（例えば、Ｅ．Ｃ．Ｈｕｌｍｅ，１９９２，「受容体−リガンド相互作用（“Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”）」、「実験技術法／実験技術法シリーズ」内、（シリーズ編集Ｄ．ＲｉｃｋｗｏｏｄとＢＤ  Ｈａｍｅｓ）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。このアッセイに利用されるＥＡＡＴ（または、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、精製したものであっても、組み換えであってもよい。前述したように、ＥＡＡＴ（またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の組み換え発現と精製は、通例法によって実現することが可能である。
【０２３７】
ＥＡＡＴ、またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパクは、本明細書で「結合パートナー」と呼ばれる、１種以上の細胞内および細胞外分子と相互作用を持つことが可能である。ＥＡＡＴの、天然の、体内における結合パートナーを特定するためにはいくつかの方法が、例えば、２および３ハイブリッドアッセイが知られている（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ等、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ等、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ等、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ等、１９９３  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；Ｂｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照）。このようなＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパクの結合パートナーは、ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパク、または、ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパク介在性シグナル伝達経路の下流要素によるシグナル伝達に関与する可能性がある、あるいは、別に、ＥＡＡＴ、またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパクの阻害剤であることが判明する可能性がある。当該分野で公知のアッセイを、ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパクと、その結合パートナーの間の相互作用を修飾する（例えば、正の方向か、負の方向に作用する）化合物を特定できるように、本発明の用法を通じて改訂することが可能である。通常、ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパクと、その結合パートナーの間の相互作用に干渉する化合物を求めるアッセイは、ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパクと、その結合パートナーとを含む反応混合液を、この二つの産物が相互作用を持ち、結合し、複合体を形成するのに十分な条件および時間に渡って調製することを含む。ある薬剤についてその抑制活性を試験するためには、反応混合物を、試験化合物の存在下に、また、不在下に調製する。また、本発明の範囲内にあるものとして、均一な、または、不均一なアッセイシステムにおいて、ＥＡＡＴまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパクと、その天然結合パートナーおよび／または試験化合物の間の相互作用を、それ以上サンプル操作をすることなく直接検出する方法がある。例えば、蛍光エネルギー転移技術を利用してもよい（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ等、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ等、米国特許第４，８６８，１０３号を参照）。
【０２３８】
一つの局面で、前述のアッセイ（単数または複数）によって特定される薬剤は実験動物に投与して、その認識促進および維持活性を測定することが可能である（例えば、下記の実施例参照）。
【０２３９】
一つの局面で、本発明の特質は、哺乳動物の認知機能を増進するのに有用な化合物をスクリーニングする方法であって、試験化合物を動物に投与すること、前記試験化合物の投与後にその哺乳動物の神経組織における１個以上のＥＡＡＴまたはＡＴ遺伝子（単複）の発現レベルを定量すること、この遺伝子（単複）の発現レベルを、試験化合物を投与されていない哺乳動物の神経組織における参照発現レベルと比較すること、および、遺伝子の発現レベルが、対応する参照レベルと異なっているか否かを判定することによる方法であって、その差は、試験化合物が、認知機能を増進する候補治療薬剤であることを示すとするスクリーニング法である。この方法は、遺伝子の発現レベルを、セフトリアキソンまたはバルプロ酸を投与した哺乳動物の神経組織における参照発現レベルと比較する工程をさらに含んでもよい。一つの実施態様では、哺乳動物はラット、例えば、高齢ラットである。
【０２４０】
８．  治療法および組成物
本発明のさらに別の実施態様は、前述の治療効果の中から選ばれる任意の一つを実現するために、製薬学的に受容可能な担体と共に、製薬または無菌組成物を投与することに関する。このような製薬組成物は、加齢の際に、認知機能の維持または促進に関連する遺伝子の発現を有利に修飾する分子、例えば低分子を含む可能性がある。
【０２４１】
本発明者等は、脳において神経細胞とグリア細胞を取り囲む、シナプス間隙およびシナプス外空間を含めた細胞外空間のＬ−グルタメートレベルを低減させることが、加齢時の認知機能の維持または促進と相関することを思いがけず発見した。一つの局面で、本発明は、哺乳動物において認知機能を維持または促進する（例えば、加齢と関連する認知障害の治療）ための方法であって、それを脳細胞による、グルタメート輸送タンパクの発現を増大させることによって実現する方法を提供する。関連局面において、本発明は、哺乳動物における加齢に伴う認知障害を低減する方法であって、それを脳細胞で発現される、グルタメート輸送タンパクの活性を上昇させることによって実現する方法を提供する。
【０２４２】
一つの局面で、グルタメート輸送タンパクの発現または活性は、低分子を哺乳動物に投与することによって増大される。例示の低分子としては、セファロスポリンおよびその類縁体または誘導体、バルプロ酸およびその類縁体または誘導体、ＭＳ−１５およびその類縁体または誘導体、および、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ、Ａｒｏｎｉｃａ等、上記参照）が挙げられる。この低分子は、直接的に（例えば、輸送タンパクコード遺伝子のプロモーターと相互作用を持つことによって、または、タンパク産物そのものと相互作用を持つことによって）、あるいは、間接的に（例えば、輸送タンパクの発現または活性を刺激するタンパクの発現または活性を上昇させる、あるいは、輸送タンパクの発現または活性を抑制するタンパクの発現または活性を低下させる）輸送タンパクの、および、ＰＡＣＡＰ（「下垂体アデニルシクラーゼ活性化ポリペプチド」）の発現と活性化を増大させる可能性がある。
【０２４３】
グルタメート輸送タンパクの発現または活性を増大させる可能性のある、その他の例示の化合物としては、リドカイン（Ｄｏ等、Ａｎｅｓｔｈ．Ａｎａｌｇ．２００２  ９５：１２６３−８、「リドカインの、グルタメート輸送因子ＥＡＡＴ３の活性に及ぼす作用：タンパクキナーゼＣとフォスファチジルイノシトール３−キナーゼの役割（“Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｌｉｄｏｃａｉｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＥＡＡＴ３：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３−ｋｉｎａｓｅ”）」、および、キナーゼ阻害剤（例えば、Ｃｏｎｒａｄｔ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９７６８：１２４４−５１、「直接的リン酸化による、脳の、高親和性グルタメート輸送因子ＧＬＡＳＴ−１の抑制（“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｒａｉｎ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＧＬＡＳＴ−１  ｖｉａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ”）」）が挙げられる。
【０２４４】
具体的に明らかにするために、以下の節において、非限定的例示の治療化合物をさらに詳細に説明する。
【０２４５】
８．１  例示の治療組成物
加齢時に認知機能を増進または維持するのに関連する遺伝子（例えば、ＥＡＡＴ遺伝子）の発現を有利に修飾する低分子の例としては、式Ｉのセファロスポリンに関連する化合物が挙げられる、すなわち、
【０２４６】
【化２３】
2010227105.tif 000024
ここに、各場合において、
ＬはＯまたはＳであり；
ＲはＨ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、アリール、アラルキル、−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈであり；
Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｘであり、
ここに、
ＸはＯＨ、ＮＲ２、ＳＨ，Ｏ−アルカリ金属、または、
−ＯＣ（ＣＨ３）ＯＣ（Ｏ）ＯＣＨ（ＣＨ３）２であり；および、
ｎは、０と６を含めた０から６までの整数であり；
Ｒ２はＨ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−８アルケニル、または
−（ＣＨ２）ａ−Ｗ−Ｒ３であり；
ここに、
Ｒ３はＨ、Ｃ１−１０アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−１０アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、
アリール、アラルキル、またはＡであり；
ＷはＯ、Ｓ、またはＮＲ４であり；および、
ａは、１と６を含めた１から６までの整数であり；
ここに、
Ｒ４はＨ，Ｃ１−１０アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−１０アルキル、アリール、アラルキル、あるいは、Ｒ３とＲ４は一緒になって、未置換の、または置換されたヘテロアルキルまたはヘテロアリール環を形成してもよく、
−−線は、単結合または二重結合を示し、
Ｒ５はＲ１、Ｈ、ＳＯ３Ｈ、アリール、Ｃ１−１０アルキル、アラルキルであり；あるいは、Ｒ５は、−−線が二重結合である場合の＝ＣＨＣＨ２ＣＯ２Ｈおよび＝ＮＲから成るグループから選ばれ、
ｍは０か１であり、および、
Ａはアリールか、式Ｉａのヘテロアリールであり、
【０２４７】
【化２４】
2010227105.tif 000025
ここに、各場合において、
ＪはＯ、Ｓ、ＮＲ６、またはＣＲ６であり；および、
ｙは１か２であり；
ここに、Ｒ６は電子対、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、アリール、または、−ＮＲ２であり；
あるいはＡは、式ＩｂまたはＩｃのヘテロシクロアルキルであり
【０２４８】
【化２５】
2010227105.tif 000026
ここに、各場合において、
ＪはＯ、Ｓ、またはＮＲであり；および、
ＸはＯまたはＨ２である。
【０２４９】
式Ｉによって記載されるクラスの特定化合物としては、「セフトリアキソン」が挙げられる。これは、広い抗菌スペクトラム抗生物質、（６Ｒ，７Ｒ）−７−［２−（２−アミノ−４−チアゾリル）グリオキシルアミド］−８−オキソ−３−［［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−アス−トリアジン−３−イル）チオ］メチル］−５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクト−２−エン−２−カルボン酸、７２−（Ｚ）−（Ｏ−メチルオキシム）、二ナトリウム塩、３／２水和物を指す。セフトリアキソンは、Ｒｏｃｅｐｈｉｎ（登録商標）という商品名の下にＲｏｃｈｅから市販されている。式の化合物の製造法は、例えば、米国特許第５，５７４，１５５、５，７３９，３４６、５，８５６，５０２、５，８６９，６４９、５，９４５，４１４、５，９４５，５３２、および、６，０９０，８０１号に見出すことが可能である。セフトリアキソンの誘導体としては、好気性グラム陰性桿菌を殺戮することが可能な第三世代セファロスポリンの内から任意に選ばれるものが挙げられる。第三世代セファロスポリンの例としては、セフスロジン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セルトリアキソン、セフォペラゾン、モキサラクタム、および、セフタジジムがある。
【０２５０】
加齢時に認知機能を増進または維持するのに関連する遺伝子（例えば、ＥＡＡＴ遺伝子）の発現を有利に修飾する低分子の、その他の例としては、式ＩＩのバルプロ酸に関連する化合物が挙げられる、すなわち、
【０２５１】
【化２６】
2010227105.tif 000027
ここに、各場合において、
Ｘは−ＯＨ、Ｃ１−１０アルコキシ、−Ｏ−アルカリ金属、−Ｎ（Ｒ１）２、−ＳＨ、または、−Ｓ−Ｃ１−１０アルキルであり；
Ｒは、直鎖または分枝鎖Ｃ１−３０アルキルであり；および、
Ｒ１はＨ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、アリール、または、アラルキルである；
ただし、Ｒは、未置換であるか、または、１個以上の−ＯＨ、Ｃ１−１０アルコキシ、−Ｎ（Ｒ１）２、−ＳＨ、−Ｓ−Ｃ１−１０アルキル、またはアリールによって置換されるものとする。
【０２５２】
式ＩＩによって記載されるクラスの特定化合物としては、「バルプロ酸」が挙げられる。これは、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の脳内濃度の増加と関連する可能性のある抗痙攣剤２−プロピルペンタノエートを指す。バルプロ酸のその他の名前・記述が本明細書の中にも認められる。例えば、デパコテ（登録商標）、バルプロエート（登録商標）、バルレリース（登録商標）、およびバルプロ酸ナトリウムである。式の化合物の製造法は、例えば、米国特許第４，５５８，０７０、４，５９５，６９５、４，６５４，３７０、４，８９５，８７３、４，９１３，９０６、５，０１７，６１３、５，０１９，３９８、５，０４９，５８６、５，１６２，５７３、５，４４０，０２３、５，８５６，５６９、６，１３１，１０６、および、６，６１０，３２６号に見出すことが可能である。
【０２５３】
加齢時に認知機能を増進または維持するのに関連する遺伝子（例えば、ＥＡＡＴ遺伝子）の発現を有利に修飾する低分子の、その他の例としては、式ＩＩＩの（Ｒ）−（−）−５−メチル−１−ニコチノイル−２−ピラゾリンに関連する化合物が挙げられる、すなわち、
【０２５４】
【化２７】
2010227105.tif 000028
ここに、各場合において、
ＲはＨ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、アリール、または、アラルキルであり；
Ｒ１はＨ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、アリール、または、アラルキルであり；
Ｒ２は、下記、すなわち、Ｎ、Ｏ、またはＳから選ばれる１−４個のヘテロ原子を含むヘテロ環またはヘテロアリール環であり；
ＬはＯ、Ｓ、またはＮＲであり；および、
ＸはＣＲ２、Ｏ、またはＳである。
【０２５５】
式ＩＩＩの特定化合物としては（Ｒ）−（−）−５−メチル−１−ニコチノイル−２−ピラゾリン（ＭＳ−１５３）が挙げられる。
【０２５６】
本発明の方法にはさらに、式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物の、製薬学的に受容可能な付加塩および複合体も含まれる。化合物が１個以上のキラル中心を有する場合、特に断らない限り、本発明は、各一意のラセミ化合物を始めとして、各一位の非ラセミ化合物も含む。化合物が、不飽和の炭素−炭素二重結合を有する場合、シス（Ｚ）およびトランス（Ｅ）両異性体とも本発明の範囲に含まれる。複数の阻害剤が、互変異性体、例えば、ケト−エノール互変異性体、例えば、
【０２５７】
【化２８】
2010227105.tif 000029
として存在する場合、各互変異性体は、平衡状態で存在していても、Ｒ’による適当な置換によって一方の形に固定されることがあっても、本発明の範囲に含まれるものと考えられる。ある一回の出現時における置換基の意味は、任意に選ばれる、他の出現時の、その置換基の意味とも、あるいは、任意に選ばれる、他の置換基の意味とも独立する。
【０２５８】
本発明の方法にはさらに、式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物の前駆薬剤も含まれる。
【０２５９】
本発明に利用される製薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄腔内、硬膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所投与、舌下、または直腸手段を含むルートから選ばれる任意の数のルートを通じて投与されてよいが、ただし上記のルートに限定されない。
【０２６０】
この組成物は、単独で、または、少なくとも１種の他の薬剤、例えば、安定化化合物と組み合わせて投与され、これらは、無菌の、生物適合性製薬担体、すなわち、生食液、バッファー生食液、デキストロース、および水を含む（ただしそれらに限定されない）担体から選ばれる任意のものに溶解して投与される。この組成物は、単独で、または、他の仲介因子、薬剤、またはホルモンと組み合わせて患者に投与されてもよい。
【０２６１】
本発明の組成物に含まれるいくつかの化合物は、ある特定の幾何学的形態または立体異性形として存在してもよい。さらに、本発明のポリマーは、光学的に活性を有していてもよい。本発明は、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−異性体、Ｒ−およびＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物、および、それらの他の混合物を含む混合物は全て本発明の範囲に含まれるものと考える。その他にも、非対称炭素原子が、アルキル基のような置換基の中に存在する可能性がある。このような異性体全部を始めとして、それらの混合物は本発明に含まれることが意図される。
【０２６２】
例えば、本発明の化合物のある特定のエナンチオマーが望まれる場合、それは、非対称合成によって調製してもよいし、あるいは、キラル補助剤による誘導によって調製してもよい。後者の場合、得られたジアステレオマー混合物を分離し、補助基を分断すると、純粋な所望のエナンチオマーが得られる。別に、分子が、アミノのような塩基性官能基、あるいは、カルボキシルのような酸性官能基を含む場合、適当な光学的活性を持つ酸または塩基によってジアステレオマー塩が形成され、次に、当該分野で周知であるように分画結晶化またはクロマトグラフィー手段によって、このジアステレオマーを解離し、その後純粋なエナンチオマーが回収される。
【０２６３】
本発明の目的のために、化学元素は、元素周期律表、ＣＡＳ版、「化学物理ハンドブック（“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ”）」、６７版、１９８６−８７、表紙裏に従って特定される。また本発明の目的のために、「炭化水素」という用語は、少なくとも１個の水素と１個の炭素を有する、可能な全ての化合物を含むと考えられる。広い意味で、可能な炭化水素は、非環状および環状の、分枝鎖および非分枝鎖の、炭素環およびヘテロ環の、芳香族および非芳香族の、置換されたまたは未置換の有機化合物を含む。
【０２６４】
８．２  治療組成物
本明細書に記載される組成物に対する等価物と考えられるものとして、その他の点では一致し、それと同じ一般的性質を持つ組成物であって、その興味の組成物の特性に重大な影響を与えない、１個以上の単純な変動が置換基または成分に形成される組成物が挙げられる。
【０２６５】
活性成分、例えば、１種以上の治療薬剤の他に、本発明の製薬組成物は、活性成分を、製薬学的に使用が可能な調剤へ加工することを助ける、賦形剤および補助剤を含む、好適な製薬学的に受容可能な担体を含んでもよい。処方および投与用技術に関するさらに詳細な説明が、レミントンの製薬科学（“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”）（Ｍａａｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，イーストン、ペンシルバニア州）の最新版に見出される。
【０２６６】
経口投与用製薬組成物は、当該分野で周知の製薬学的に受容可能な担体を用いて、経口投与に好適な剤形に処方することが可能である。このような担体を用いることによって、製薬組成物は、患者による摂取のために、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤等として処方することが可能になる。
【０２６７】
経口用製剤は、活性成分を、固相賦形剤と混合し、得られた顆粒（要すれば随意に粉砕後）から成る混合物を加工して錠剤または糖剤コアを得る。要すれば、適当な補助剤を加えることが可能である。適当な賦形剤としては、炭水化物またはタンパクの充填剤、例えば、糖類、すなわち、ラクトース、蔗糖、マニトール、およびソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、またはその他の植物由来のでん粉；セルロースで、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロース；ガムで、すなわち、アラビア、およびトラガカントを含むガム；および、タンパク質で、例えば、ゼラチンおよびコラーゲンが挙げられる。要すれば、崩壊剤または可溶化剤、例えば、架橋されたポリビニールピロリドン、寒天、および、アルギン酸またはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウム等を加えてもよい。
【０２６８】
糖剤コアは、適当なコーティング、例えば、濃縮糖液であって、さらにアラビアゴム、タルク、ポリビニールピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および、適当な有機溶媒または溶媒混合液を含む糖液と組み合わせて使用してもよい。染料または色素を、製剤の特定のために、または、活性化合物の量、例えば、用量を明らかにするために、錠剤または糖剤のコーティングに加えてもよい。
【０２６９】
経口使用の可能な製薬組成物は、ゼラチン製の押してパチン式のカプセルを始めとして、ゼラチン製の、柔らかい密封カプセルと、グリセロールまたはソルビトールのようなコーティングとを含む。押してパチン式カプセルは、充填剤または結合剤、例えば、ラクトースまたはでん粉、滑沢剤、例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム、および、要すれば随意に安定化剤と混ぜ合わせた活性成分を含むことが可能である。柔軟カプセルにおいては、活性化合物は、適当な液体、例えば、脂肪油、リキッド、または液体ポリエチレングリコールの中に、安定化剤の存在下に、または不在下に溶解または懸濁される。
【０２７０】
非経口投与用に好適な製薬処方を、水溶液として、好ましくは、生理学的に適応的なバッファー、例えば、ハンクス液、リンゲル液、または生理学的バッファー液における溶液として処方することが可能である。注射用水性懸濁液は、その懸濁液の粘度を上昇させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランを含んでもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性の注射用懸濁液として調製されてもよい。適当な親脂質性溶媒またはベヒクルとしては、脂肪油、例えば、ごま油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。非脂質性ポリ陽イオン性アミノポリマーも搬送用に使用が可能である。要すれば随意に、懸濁液はまた、適当な安定化剤、または、化合物の可溶性を増し、高濃度溶液の調製を可能とする薬剤を含んでもよい。
【０２７１】
局所または鼻腔投与のためには、浸透すべき特定の障壁にたいして適切な浸透剤が処方の中に使用される。このような浸透剤は当該分野で広く公知である。
【０２７２】
本発明の製薬組成物は、当該分野で公知のやり方で、例えば、通例の混合、溶解、顆粒形成、糖剤製造、磨砕、乳化、カプセル導入、封入、または、解凍過程によって製造される。
【０２７３】
製薬組成物は、塩として提供され、多くの酸、例えば、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、およびクエン酸（ただしこれらに限定されない）を含む酸によって形成することも可能である。塩の方が、対応する遊離塩基形よりも、水性またはプロトン溶媒により溶解する傾向がある。別のケースでは、好ましい製剤は、下記の内から選ばれる任意のものまたは全てを４．５から５．５のｐＨ範囲で含む凍結乾燥粉末であり、下記のものとはすなわち、１ｍＭから５０ｍＭのヒスチジン、０．１％から２％の蔗糖、および２％から７％のマンニトールであって、これらは使用直前にバッファーと混合される。
【０２７４】
製薬組成物が調製された後に、適当な容器に移され、適応状態の治療のためにラベルが付けられる。例えば、セフトリキソンの投与用としては、ラベルは、量、頻度、および投与法を含む。
【０２７５】
本発明で使用するのに好適な製薬組成物としては、活性成分が意図する目的を果たすように有効量だけ含有される組成物が挙げられる。有効量の決定は、十分当業者の能力の範囲内にある。
いずれの化合物においても、治療的有効量は、先ず、細胞培養アッセイ、例えば、Ａｒｏｎｉｃａ等、上記の方法に従って、あるいは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、またはブタのような動物モデルにおいて推定することが可能である。特に好ましい動物モデルは、本明細書に記載される、行動的に特徴のあるラットを用いる。次に、この情報を用いて、ヒトに対する有用な用量および投与ルートを決定する。
【０２７６】
治療的有効量とは、活性成分、例えば、セルトリアキソン、セルトリアキソン類縁体、セフトリアキソン誘導体、バルプロ酸、バルプロ酸類縁体、バルプロ酸誘導体、ＭＳ−１５３、ＭＳ−１５３類縁体またはＭＳ−１５３誘導体であって、症状または病態を緩和する活性成分の量である。治療効果および毒性は、細胞培養において、あるいは、実験動物において、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療効果を発揮する用量）、または、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致命的な用量）統計量を計算することによって決定することが可能である。毒性作用に対する治療効果の用量比は治療示数であるが、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表される。大きな治療示数を示す製薬組成物が好まれる。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて、ヒト使用の場合の用量範囲を処方する。この組成物に含まれる用量は、殆んどまたは全く毒性が無くＥＤ５０を含む循環濃度の範囲にあることが好ましい。用量は、この範囲内において、使用する剤形、患者の感受性、および投与ルートに応じて変動する。
【０２７７】
正確な用量は、治療を必要とする被験体に関連する要因に照らして、担当医によって決められる。用量と投与法は、十分なレベルの活性機能基が与えられるように、所望の効果が維持されるように調節される。考慮すべき要因としては、認知障害の程度、被験体の一般的健康状態、年齢、体重、および、被験体の性別、投与の時間と頻度、薬剤併用（単複数）、反応感受性、および治療に対する応答が挙げられる。長期作用性製薬組成物は、特定処方の半減期およびクリアランス速度に応じて、３から４日おき、毎週、２週に１度投与される。
【０２７８】
正常な投与量は、投与ルートに応じて、０．１μｇから１００，０００μｇ、最大合計用量約１グラムまでの間を変動する。特定の用量および搬送法に関するガイダンスが文献に載せられており、広く従来技術の開業医に利用可能となっている。
【０２７９】
中枢神経系標的、例えば、ＥＡＡＴ１、２、３、４、または５に対して治療効果を施すために、本発明の方法で使用される化合物は、末梢的に投与された場合、速やかに血液脳関門を浸透しなければならない。しかしながら、血液脳関門を浸透することができない化合物であっても、中枢神経系に直接、例えば、脳室内ルートを通じて効果的に投与することが可能である。
【０２８０】
「製薬学的に受容可能な塩」という用語は当該分野で公知であり、化合物の、比較的毒性の低い、無機および有機の酸添加塩であって、例えば、本発明の組成物に含まれるものを含めた塩を指す。
【０２８１】
「製薬学的に受容可能な担体」という用語は当該分野で公知であり、製薬学的に受容可能な物質、組成物、またはベヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル材料であって、生体の一つの器官または部分から、生体の別の器官または部分へ、任意の主題組成物、またはその成分を搬送する、または輸送するのに与る物質、組成物、またはベヒクルを指す。各担体は、主題組成物およびその成分と適合的であり、かつ患者に対して有害ではないという意味で「受容可能」でなければならない。製薬学的に受容可能な担体として利用が可能な材料の例を二三挙げると、（１）糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよび蔗糖、（２）でん粉、例えば、トウモロコシでん粉およびジャガイモでん粉、（３）セルロースとその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、および酢酸セルロース、（４）トラガカント粉末、（５）モルツ、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス、（９）オイル、例えば、ピーナツオイル、綿実油、紅花油、ごま油、オリーブ油、コーン油、および大豆油、（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール、（１１）ポリオール類、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール、（１２）エステル類、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）バッファー剤、例えば、塩化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質非含有水、（１７）等張生食液、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸バッファー液、および、（２１）その他の、製薬処方で使用される非毒性、適合物質がある。
【０２８２】
「全身投与」、「全身的に投与する」、「末梢投与」および「末梢的に投与する」という用語は当該分野で公知であり、主題組成物、治療的またはその他の物質を、直接中枢神経系に導入するのではない別のやり方で、物質が患者の全身に入り、従って、代謝その他の過程を受けることになる投与法、例えば、皮下投与を指す。
【０２８３】
「非経口投与」および「非経口的に投与される」という用語は当該分野で公知であり、通常注入による経腸的および局所的投与以外の投与方式を指し、例えば、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、硬膜下腔内、関節腔内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、関節腔下、くも膜下腔内、脊髄腔内、および、胸骨内注入および輸液がある。
【実施例】
【０２８４】
９．  実施例
これまで概括的に説明してきたので、下記の実施例を参照することによって本発明がさらに容易に理解されよう。この実施例は、単に、いくつかの点と本発明の実施態様を具体的に説明するために含められるもので、いかなる意味でも本発明を限定することを意図するものではない。
【０２８５】
９．１  若年の、加齢障害動物（ＡＩ）と加齢未障害（ＡＵ）動物の判定
９．１．１  モリスの水迷路（ＭＷＭ）と放射状迷路（ＲＡＭ）被験体
我々は、９匹の若年（４−６月齢）と１８匹の高齢（２５−２７月齢）病原性無縁のロングエバンス系ラットについてＭＷＭによる行動試験を行い、マイクロアレイ分析にも同じ動物を用いた。さらに別の１０匹の高齢ラットをＭＷＭでテストし、その後、ＲＡＭで訓練と試験を行い、２種の試験を通じて認知機能個体差の試験−再試験信頼度を評価した。
【０２８６】
９．１．２  モリス水迷路装置
ＭＷＭ装置は、水（２７℃）を満たした大きな、円形プール（直径１．８３ｍ、高さ０．５８ｍ）から成る。水は、あらかじめ非毒性色素またはその他の物質を加えて不透明にしておく。作業の典型的な「隠れ台」バージョンの場合、ラットは、隠された避難台（高さ３４．５ｃｍ）を見つけ出すように訓練される。この台は、迷路の４分の１円の一つの中心部において水面下丁度１．０ｃｍに配される。この台は、行動試験中、迷路の外部から、タンクの底部に沈下させることも、その正規の位置に上昇させることもできる。この台の位置は、複数の試行の間一定に置かれる。台の位置をマークする局所的目印が無いため、ラットが、プール周辺の任意のスタート地点から始めて効率的にその台の位置を特定することを可能とする能力は、迷路周囲の情報の利用に依存する。迷路は、白い模様が添えられた黒いカーテンで囲まれており、これが空間目印の形を与える。表面を黒く塗った第二の台（高さ３７．５ｃｍ）が目印訓練の際水面２ｃｍ上に突出する。これは、認知に無関係な要因に対するコントロールとして使用される作業バージョンとなる。プールにおけるラットの行動は、プールの中心２．５ｍ上に吊り下げられたカメラによって記録された。カメラは、ビデオ追跡システム（ＨＶＳ  Ｉｍａｇｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｒａｃｋｅｒ  ＶＰ２００）および、ＨＶＳ  Ｉｍａｇｅ、ハンプトン、英国のＲｉｃｈａｒｄ  Ｂａｋｅｒによって開発されたＨＶＳソフトウェアを搭載するＰＣコンピュータに接続された。
【０２８７】
９．１．３  モリス水迷路試験過程
我々は、ロングエバンス雑種ラットの高齢集団において、加齢の認知に及ぼす作用に対する感度、および、信頼度の高い個体差測定に関して、ＭＷＭプロトコールを最適化した（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｍ，Ｂｕｒｗｅｌｌ，Ｒ，Ｂｕｒｃｈｉｎａｌ  Ｍ，Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０７：６１８−６２６；１９９３）。
【０２８８】
ラットは、６０秒の試行間隔を置いた、１日当たり３回の試行を連続８日受けた。各訓練試行において、ラットは、プール周辺に設けられた、４箇所の等間隔に隔てられたスタート地点の内の一つから迷路に放たれた。このスタート地点は試行毎に変動させて、応答戦略の使用を阻止した（例えば、避難台の位置を特定するために、スタート地点から常に左に曲がる等）。どの試行でも、もしもラットが９０秒以内に避難台の位置を特定しなかった場合には、実験者がラットを台に導き、ラットはそこに３０秒留まった。試行の６回目ごとに探求試行を行った。これは、迷路における空間偏倚の発達を評価するためである。この試行の間、ラットは、台がプールの底に３０秒間引き下げられた状態で泳ぎ、３０秒時点で、台は正規の位置に引き上げられ、１回の避難試行が完了する。隠れ台を用いるプロトコールの終了時に、目に見える台を用いて目印学習についてラットを評価した。この台の位置は、６回の訓練試行から成る１セッションにおいて、試行毎に変動させた。
【０２８９】
我々は、訓練試行と探求試行の成績分析のために、ゴールに対する動物の位置の接近度を用いた。接近度は、迷路における動物の位置をサンプルし（１０Ｘ／秒）、１秒平均における避難台からの距離記録を得た。探求試行と訓練試行の両方について、補正過程を導入した。これは、試行成績が、プール周辺の様々なスタート位置からゴールまでの距離の差によって比較的偏倚することがないようにするためである。この補正を実行する際、平均水泳速度を各試行毎に計算した（経路長／潜時）。次に、試行で用いたスタート地点からゴールまでそのスピードで泳ぐのに要する時間量を、試行成績、すなわち、訓練試行における累積距離と探求試行におけるゴールからの平均距離を計算する前に、記録から取り除いた。従って、接近度を用いて得られたスコアは、最適探索、すなわち、探求試行時の、ゴールへの直接経路、および、ゴール位置直近における探索からの偏倚を表す探索エラーを反映するように設計されている。
【０２９０】
９．１．４  モリス水迷路分析
ビデオ追跡のコンピュータ記録を編集し、迷路における各ラットの成績に関するデータを得た。訓練試行と探求試行における測定値は変動分析によって分析した。
【０２９１】
９．１．５  モリス水迷路データ結果
隠れ、カモフラージュ台に関する訓練時の成績は、若年ラットグループと、高齢ラットグループの間では異なっていた［Ｆ（１，２３）＝１２．６９、ｐ＜０．００２］。目視可能な台による目印訓練では両グループの間に差は無かった。目印訓練における避難までの潜時は、若年ラットでは平均９．３６秒で、高齢ラットでは１０．６０秒であった。
【０２９２】
Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｍ，Ｂｕｒｗｅｌｌ  Ｒ，Ｂｕｒｃｈｉｎａｌ  Ｍ，Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０７：６１８−６２６，１９９３に詳細に論じられている通り、間に挿入された探求試行における接近度平均値を用いて、各被験体の空間学習示数を計算した。ラットが、台を求めてその位置近くを探し回ることを速やかに学ぶと、そのラットの空間学習示数は低い。全体として、高齢ラットは、若年と異なっていた［Ｆ（１，２３）＝１５．１８、ｐ＜０．００１］。高齢ラットは、若年の実験集団の学習示数プロフィールに対する相対値に基づいて障害無し、障害ありに分類された。若年ラット（示数スコア＜２４１）の正常範囲に含まれる高齢ラットは、高齢障害無しと表示された（図１）。示数スコアが、若年集団の成績の範囲外となる残りの高齢被験体は、高齢障害有りと表示された。
【０２９３】
９．１．６  放射状迷路装置
８本の高架放射状迷路の各アーム（７ｘ７５ｃｍ）は、８角形の中心台（直径３０ｃｍ、高さ５１．５ｃｍ）の各辺から突出する。アームにおける透明な側壁は高さが１０ｃｍで、６５oの角度をなし凹形を形成する。食物ウェル（直径４ｃｍ、深さ２ｃｍ）が、各アームの遠位端に配される。プレクシグラスでできたブロック（高さ３０ｃｍ、幅１２ｃｍ）は、設置されると任意のアームへの進入を阻止することが可能である。多数の、迷路外目印が、装置を取り巻く室内に供給されており、照明も頭上の固定器を通じて与えられた。
【０２９４】
９．１．７  放射状迷路試験過程
ラットは先ず、８分間セッションで連続４日間迷路に馴らされた。各セッションにおいて、食物報酬がＲＡＭの上にばら撒かれた。最初は中央台と複数のアームの上で、次第に複数のアームに限局していく。この馴化相の後、食物ペレットを各アーム末端に置く標準的訓練プロトコールが使用された。ラットは、１日１回の試行を連続１８日受けた。１日１回の試行は、８個の食物ペレット全てが獲得された時点、または、１６回の選択がなされたか、または、１５分が経過したか、そのいずれかの時点で終了した。エラーとは、食物を既に獲得したアームへ戻ること（そのアームに４肢全てを置く）である。この相の終了後、作業の記憶要求を、試行中に遅れを課すことによって増した。各試行の開始時、３本のアームは閉鎖された。閉鎖アームの実体および形態は試行毎に変えた。ラットは、試行の開始時にアクセスが可能な５本のアームにおいて食物を得ることが許された。次に、ラットは６０秒間迷路から取り出された。この間に迷路に対する障壁が取り除かれ、８本全てのアームに対するアクセスが可能となった。次にラットは中央台に戻され、残りの食物報酬を獲得することが許された。
【０２９５】
９．１．８  放射状迷路分析
記憶エラーは、６０秒遅延を用いた試験試行において、ラットが、遅延前に既に訪れた５本のアームの内の１本に戻った時に起こった。各ラットの成績は、４回の連続試験試行について平均された。パラメトリック統計（非対合ｔ−検定）を用いて、若年グループと高齢グループの間の成績を比較した。相関分析（ピアソンのｒ）を用いて、高齢ラット（Ｎ＝１０）について、モリス水迷路における成績（学習示数スコア）と放射状迷路（記憶エラー）の間の関係を調べた。
【０２９６】
９．１．９  放射状迷路結果
ＲＡＭの遅延バージョンにおける若年成人ラットの成績は、６０秒から８時間に渡る遅延間隔の関数として変動する（Ｃｈａｐｐｅｌｌ等、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３７：４８１−４８８，１９９８）。以前にＭＷＭにおいてその特性が明らかにされた高齢ラットは、若年ラットに比べて、６０秒の遅延後より多くの記憶エラーを冒した（ｐ＜０．０２５）。平均すると、若年ラットは０．１７エラーを冒したのに対し、高齢ラットは平均１．５２エラーを冒した。一方、１０匹の高齢ラットは、ＲＡＭにおいて広範囲の成績を示した。最初のＭＷＭ特徴と、ＲＡＭにおける記憶力成績の間には有意な相関が観察された（ｒ＝０．８２、データを図２に示す）。
【０２９７】
９．２  若年、高齢障害（ＡＩ）および高齢無障害（ＡＵ）動物の遺伝子発現分析
９．２．１  行動的に特性解明された動物からのＲＮＡ調製
２７匹の行動的に特性解明されたラット（データを図１に示す）を、ナトリウムペントバルビタールの過剰投与（１００ｍｇ／ｋｇ）により屠殺した。両側海馬を剖出し、凍結した（−８０℃）。各動物について一方の海馬を、重量測定し、適当容量のフェノール−グアナジンイソチオシアネート（トリゾール試薬、組織１００ｍｇ当たり１ｍｌで、１ｍｌを最小容量とする）中でホモジェナイズした。各サンプルをクロロフォルム（トリゾール１ｍｌ当たり２００μｌ）で抽出し、イソプロパノロールで沈殿させた。ＲＮＡペレットを空気乾燥し、ＤＥＰＣ処理水に再懸濁させた。サンプルは全て−８０℃で保存した。ＲＮＡの一部を、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニＲＮＡ抽出キットを、メーカーの指示に従って用いてさらに精製し、その後−８０℃で保存した。サンプルの２６０ｎｍにおける吸収を定量し、純度を、２６０ｎｍと２８０ｎｍにおける吸収比で定めた。サンプルの完全性と濃度を、アガロースゲル電気泳動にて確認した。アガロースゲルの写真を走査し、ピクセルを逆転し、ＮＩＨ−画像を用いて定量化した。次に、必要に応じて濃度を調整した。
【０２９８】
遺伝子マイクロアレイにおける分析のために、同じ表現型、Ｙか、ＡＩか、ＡＵのいずれかを持つ３匹のラットから得られたサンプルをプールした。これによって３ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）／表現型サンプルサイズについて、独立したマイクロアレイ分析が得られた。ＭＷＭにおける空間学習示数による行動特性評価に関して、組織を、表Ｉに記載するようにプールした。
【０２９９】
【表１】
2010227105.tif 000030
９．２．２  逆転写およびマイクロアレイに対するハイブリダイゼーヨン
ハイブリダイゼーション用標識ｃＲＮＡプローブは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏａｒｒａｙ高収率ＲＮＡ転写標識システムを用いて調製した。ＲＮＡは逆転写してｃＤＮＡとし、さらにビオチン標識ｃＲＮＡに変換した。逆転写前に、各標識システムによって供給される内部標準を試験ＲＮＡに加えた。次に、実験のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）に対してハイブリダイゼーションを実行する前に、逆転写と標識が最適であることを確認するために、ｃＲＮＡをコントロールチップに対してテストした。ｃＲＮＡを、Ｕ３４Ａ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイに与えた。これらのアレイは、７０００種の発現ラット遺伝子おより１０００ＥＳＴクラスターに対する特異的配列を含み、最近開発された、より小型の神経科学遺伝子マイクロアレイの上に搭載される全ての遺伝子を含んでいた。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎは、標識ｃＤＮＡの遺伝子アレイへの導入と、ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションオーブンで実行される通りのハイブリダイゼーションとを自動化する。ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナーを用いて、各オリゴマーセットに対するハイブリダイゼーション信号を、共焦点レーザースキャンに基づいて定量化した。
【０３００】
９．２．３  マクロアレイのデータ分析
我々のデータ分析には、Ｇｅｎｅｃｈｉｐ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＳｕｉｔｅとＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＡＳ４．０、および比較的最近開発されたＭＡＳ５．０アルゴリスムを用いた。両アルゴリスムとも、既知の陰性遺伝子と、チップ当たりの平均信号強度に基づくデフォールト閾値を持っている。Ｇｅｎｅｃｈｉｐ間の比較を可能とするために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって定義された、あらかじめ定義されたオリゴマーセットに基づく正規化および縮尺法を適用した。両アルゴリスムとも、完全マッチｃＲＮＡのハイブリダイゼーションを抑制するよう計算された変異塩基を持つ一組のミスマッチ（ＭＭ）オリゴマーに対する、各発現遺伝子に対応する完全マッチ（ＰＭ）オリゴマーの、セット当たりの発現レベルの相対的数値を生成した。経験的なＭＡＳ４．０は生のデータを用いて、食い違いコールの平均値を生成するが、これは、各遺伝子についてコントロールのＭＭオリゴマーに対する、ＰＭオリゴマーのハイブリダイゼーション信号強度の相対値を与える。存在する（Ｐ）、僅か（Ｍ）、または欠如（Ａ）の絶対コールは、ＭＭオリゴマーに対して正となるＰＭオリゴマーの相対数値に基づく。統計的なＭＡＳ５．０アルゴリスムは、事実上同じタイプの比較に依存するが、存在のコールは背景よりも高い発現レベルを反映する確率を強調するために、ｐ値を生成する統計的方法を適用した。さらに、ハイブリダイゼーション信号強度を計算する際に、各探求セットにおいてＰＭおよびＭＭオリゴマー内の外来者の影響を最小とすることを意図した統計的基準を信号アルゴリスムに適用した。この二つのアルゴリスムによって生成された発現レベルを表すデータにおける基本的な差は、ＭＡＳ５．０は、二つの比較グループの間で、変動発現レベルを有する遺伝子の数を過大評価させることになりかねない、陰性発現レベルを除去するように設計されていることである。全体として、ＭＡＳ５．０によって設定される１オリゴマー当たり得られる信号は、ＭＡＳ４．０の場合よりも小さかった。
【０３０１】
我々のモデルの長所は、一部は、３群Ｙ、ＡＵとＡＩ間の比較を実行できる能力であって、これによって、若年海馬と高齢海馬の間で変化する、従って全体として加齢に関わる遺伝子と、ＡＵとＡＩラットを識別する遺伝子とを特定することを可能とする能力である。この過程を通じて特定された遺伝子は、特異的に、加齢性認知障害に関わるか、または、認知機能の維持に関わる。
【０３０２】
本明細書に開示されるデータを生成するに際し、我々は、年齢と認知障害のモデルにとって情報豊かな３組の遺伝子を特定するよう一連の分析工程を実行した。セット１は、若年個体とは、年齢のみの関数として異なる興味の遺伝子を含んでいた。セット２は、若年・高齢障害無しに対して高齢障害ラットにおいて異なる興味の遺伝子を含んでいた。セット３（高齢障害無し遺伝子と呼ぶ）は、若年、および高齢障害有りの両方に対して、高齢障害無しにおいて異なる、従って、認知機能の加齢性維持と関連すると考えられる遺伝子から成る。各セットは、全体マイクロアレイセットから、ＭＡＳ５．０分析後、実効サイズ分析に同様のアルゴリスムを用いて生成された。
【０３０３】
本明細書で我々は、グルタメート輸送因子が含まれるセット３（高齢障害無し遺伝子）を生成する工程を記載した。第一工程では、若年ラット（Ｎ＝３）における遺伝子発現を表すチップ、および、高齢障害有り（Ｎ＝３）のチップにおける全てのプローブセットに対する数値を検出基準を定めるために調べた。ＭＡＳ５．０分析の絶対コールによる検出基準を満たさないプローブペアセットは全て以後の考察から除外した。次に単純な作用分析を行って、二つのグループ（若年と高齢障害有り）のチップの数値が、１．０未満の作用サイズだけしか違わないか否かを定めた。検出基準と、比較グループのプーリング基準の両方に合致したプローブセットは全て（若年と、高齢障害有りが１．０以上の作用サイズ分違わない）。次に、若年、および高齢障害有りのプールされたプローブセットに対して、高齢障害無しチップからの対応プローブセットと共に、単純な作用分析を行った。この単純な作用分析によって、認知機能の加齢性維持にとって「興味の遺伝子」を表す、１．２５以上の実効サイズを持つ３８４組のプローブセットが得られた。類推的統計的有意検定用パワー分析により、マイクロアレイ実験のサンプルサイズ（高齢障害無し３チップ、プールされた比較グループ６チップ）は、２．５以上の作用サイズを持つ遺伝子に対して８０％パワーとしてｐ＜０．０５で差を検出することが示された。９名の高齢障害無し、および、各比較グループ（若年、および高齢障害有り）における９名の被験体から成る、現在進行中の追跡分析では、１．２５以上の作用サイズに対して８０％の統計パワーを期待することが可能である。
【０３０４】
９．２４  マイクロアレイから得られた結果
グルタメート輸送因子に関する様々な転写物が、ヒトおよびげっ歯類神経系で検出された（図３）。これらの転写物の内二つは、海馬形成において発現されなかった（ＥＡＡＴ４とＥＡＡＴ５）。残りの３種の転写物は、神経細胞とグリアにおいて異なる細胞局在パターンを有しており、全てが海馬において発現された。マイクロアレイにおける高齢障害無し遺伝子（セット３）に対する作用サイズ分析では、データセットＧＬＴ−１が５．８７の作用サイズを持っており（高齢障害無し遺伝子の作用サイズ分析における最大値）、第二のグルタメート輸送因子であるＧＬＡＳＴは１．９３の作用サイズを持っていた（図４）。いずれの場合も、グルタメート輸送因子ｍＲＮＡは、若年、および高齢障害有りのプールされた比較対象に対して、高齢障害無しラットにおいて増加していた。マイクロアレイ実験設計に対するパワー分析から予想されたように、ＧＬＴ１ｍＲＮＡは、比較対象である若年、および高齢障害有りに比べて有意に増加していた（ｐ＜０．０００２）。同様の分析において、ＧＬＡＳＴも有意に増加した（ｐ＝０．０４８４、図４）。
【０３０５】
グルタメートが、高齢ではあるが、認知機能が維持されているラットでは別様に制御されているということを示すさらに別の所見が、若年、および高齢障害有りに対して、高齢障害無しでアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのｍＲＮＡに差が見られるという事実によって与えられた。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは細胞外グルタメート不活性化のための主要機構であるが、この酵素のプローブセットは、比較対象のＹ＋ＡＬに対してＡＵラットにおいて有意な増加を示した。同プローブセットはＹとＡＬの間では相違は無かった。そのｍＲＮＡの作用サイズは２．５８であった。
【０３０６】
マイクロアレイ上の一つのプローブセットは、下垂体アデニルシクラーゼ活性化ポリペプチドに対する特定された遺伝子であった（ＰＡＣＡＰ、ＧｅｎＢａｎｋ、アクセス番号：ＡＩ２２７７１５；ＥＳＴ２２４４１０）。これは、グルタメート輸送と代謝を制御する（ＦｉｇｉｅｌとＥｎｇｅｌｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３５９６−３６０５，２０００）。ＰＡＣＡＴ  ｍＲＮＡは、比較対象である若年、および高齢者障害有りラットに比べて、高齢障害無しにおいて有意に上昇していた（作用サイズ３．２９、ｔ＝４．１３、ｐ＜０．００５、図４）。
【０３０７】
ＰＡＣＡＰ受容体は、脱感作を示すタイプのものであるから、β−アレスチン２  ｍＲＮＡにおける強大な増加が、グルタメート輸送因子に対する作用に加わっているかも知れない。ベータ−アレスチン２は、受容体エンドサイトーシス、および、同じ受容体を経由するシグナルカスケードを仲介する二重の役割を持つ（Ｗｅｉ等、ＰＮＡＳ、１００；１０７８２−７，２００３；Ａｈｎ等、ＰＮＡＳ、１００：１７４０−４，２００３；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＸＭ＿３４５０８４）。高齢障害無しラットにおけるβ−アレスチン２のプローブセットは、比較の対象である若年、および高齢障害有りに比べて有意の上昇を示した（作用サイズ＝２．７８、ｔ＝２．５９、ｐ＜０．０５）。
【０３０８】
９．２．５  インサイチュハイブリダイゼーション組織化学分析
独立した一組の動物（グループ当たりのＮが３または４）について、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学用に処理した海馬切片を用いて追跡分析を行った。
【０３０９】
９．２．６  インサイチュハイブリダイゼーションプローブの調製
我々は、マイクロアレイ分析によってＡＵラット海馬において上向調整されることが特定された、グルタメート輸送因子に対応する特定プローブを生成するために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いた。高齢ラット（学習係数スコアが（ＡＵ）内にあり、（ＡＩ）若年動物のスコアの外にある動物のプール）の海馬から調製したサンプルＲＮＡを、オリゴｄＴと逆転写酵素を用いて逆転写した。次にこのｃＤＮＡを、第１回ＰＣＲ反応において、鋳型として、センスとアンチセンスオリゴマープローブ（表ＩＩ）と共に用い、後述の特定のグルタメート輸送因子に対応する２本鎖ｃＤＮＡを増幅した。標準ＰＣＲ条件を用いた（初回変性９４℃で４分、初回アニーリング７２℃で４０秒、９４℃３０秒の変性、５５℃３０秒のアニーリング、および７２℃３０秒の伸長を３５サイクル、最終伸長７２℃で４分および４℃へ冷却）。ＰＣＲ産物の分液を、臭化エチジウム−アガロースゲル上で電気泳動し、適当なサイズのプローブが生成されたことを確認した。第二ラウンドＰＣＲ反応を、各増幅ｃＤＮＡ、ＳＰ６プロモーター配列プラス各グルタメート輸送因子ＰＣＲ産物を得るために用いられた元のセンスオリゴマーに対応するセンスオリゴマーと、Ｔ７プロモーター配列および各グルタメート輸送因子ＰＣＲ産物に対する元のアンチセンスオリゴマーを含むアンチセンスオリゴマーとを含む伸長オリゴマー（表ＩＩ）を用いて実行した。これによって、それぞれ、センス鎖およびアンチセンス鎖上のＳＰ６およびＴ７プロモーターを有する特異的グルタメート輸送因子ｃＤＮＡが生成された。ＰＣＲ産物を、エタノール沈殿により収集し、その配列を、ＤＮＡ自動シーケンサーおよびＳＰ６プライマーによるヌクレオチド配列決定法によって確認した。
【０３１０】
ＳＰ６およびＴ７プロモーター部位を備えた各グルタメート輸送因子に対応する、配列確認ＰＣＲ産物が、第二ラウンドのグルタメート輸送因子の各ＰＣＲ産物から、センスおよびアンチセンスＲＮＡのＤＮＡ指向性インビトロ転写において使用された。インビトロ転写は、各ＰＣＲ産物、ＳＰ６またはＴ７ポリメラーゼ（各酵素は、各プローブ毎に別々の反応に使用された）、未標識ヌクレオチド三リン酸、および、高い特異的活性を持つ３５Ｓ標識ウリジン三リン酸によって実行した。これらの反応により、組織切片において、塩基対合により異なるグルタメート輸送因子ｍＲＮＡのそれぞれを特異的に認識する３種の放射標識アンチセンスグルタメート輸送因子プローブ、および、グルタメート輸送因子ｍＲＮＡと同じ配列を含むが、ｍＲＮＡとは塩基対合することができず、陰性コントロールの役目を果たす対応センスプローブが得られた。アンチセンスプローブを、海馬全体に渡る切片を代表する、Ｙ、ＡＵおよびＡＩラット由来の海馬凍結切片とインキュベートした。センスプローブは、海馬において、少ないが、均一的に陰性のハイブリダイゼーション信号を確認するには十分なほどの選択領域からの切片とハイブリダイズし、アンチセンスプローブによって得られたハイブリダイゼーション信号の特異性の有効性を確かめた。ハイブリダイゼーションと洗浄後に、切片をＸ線フィルムに接着し、標準的定量オートラジオグラフィー（Ｂｉｚｏｎ２００１）を用いて信号を定量した。
【０３１１】
インサイチュハイブリダイゼーション組織化学用の、グルタメート輸送因子のセンスおよびアンチセンスＲＮＡプローブ調製のための鋳型を導出するために用いたオリゴマーを表ＩＩに記した。
【０３１２】
【表２】
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９．２．７  インサイチュハイブリダイゼーション組織化学のための組織調製
１１匹の行動学的に特性解明されたラット（ｎ＝４若年、ｎ＝７高齢）を、ナトリウムペントバルビタールの過剰投与（１００ｍｇ／ｋｇ）により屠殺し、０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４（ＰＰＢ）に溶解した４％パラフォルムアルデヒドによって心臓内環流した。環流は全て０７００時と１０００時の間で行った。固定後、脳を頭骨から取り出し、右と左の両側海馬を直ちに周囲組織から解剖分離した。剖出海馬をＰＰＢにて２４時間後続固定し、２０％蔗糖を含むＰＰＢにて２４時間低温保護し、「延びた」方向で乾燥氷粉末上で凍結し、さらに処理するまで−８０℃で保存した。
【０３１３】
各動物の海馬を、凍結ミクロトームを用いて長軸に対して冠状方向に切断し（２５ｍｍ）、冷却ＰＰＢに収集した。組織の、浮遊する遊離切片を、０．１Ｍリン酸バッファーｐＨ７．２（ＰＢ）に溶解した０．７５％グリシン、および、０．１Ｍ  ＰＢのみにて洗浄し、過剰な固定液を除去した。切片を３７℃で３０分間タンパク分解酵素Ｋ（０．０５％ＳＤＳを含む０．１Ｍトリスバッファーに溶解した１ｍｇ／ｍｌ溶液）で処理し、０．１ＭトリエタノールアミンｐＨ８．０に溶解した０．２５％無水酢酸にてアセチル化し、２Ｘの生食液クエン酸ナトリウムバッファー（ＳＳＣ；１ＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）にて二度濯いだ。次に、組織を、５０％フォルムアミド、１Ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、４ＸＳＳＣ、０．２５ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、０．３ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、１００ｍｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および、最終濃度１Ｘ１０７ＣＰＭ／ｍｌの適当な３５Ｓ−標識ｃＲＮＡを含む溶液にて６０℃で４２−４４時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、切片を３０分間隔で洗浄し、４ＸＳＳＣで２度、６０℃で５０％フォルムアミド／２ＸＳＳＣで１度、次に、リボヌクレアーゼＡ（１ｍＭのエチレン−ジアミン四酢酸を含む１０ｍＭトリス生食液バッファーに溶解した２０ｍｇ／ｍｌ液）にて３７℃にて３０分処理した。組織切片をさらに、１００ｍＭ  ＤＴＴを含むＳＳＣバッファーから成り、０．１ＸＳＳＣの最終洗浄に至る下降濃度系列で洗浄し、フィルムオートラジオグラフィーのためにゼラチンをコートしたスライドに載せた。この海馬切片の空気乾燥切片を、１４Ｃ−標準（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．セントルイス、ミズーリ州）と共にβ−マックスハイパーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に２４−７２時間暴露した。吻側冠状切片に対する露光時間は１１０−１３０時間であった。フィルムは、ＧＢＸ現像液を用いて現像し、コダック高速定着液にて定着した。
【０３１４】
インサイチュハイブリダイゼーション標識は、ＭＣＩＤ画像システム（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、セントカテリーヌ、オンタリオ州、カナダ）を用いてフィルムオートラジオグラムを濃度分析することによって定量化した。フィルム濃度は、組織切片と共に各フィルムシートに暴露された１４Ｃ−標識標準に対して直線化され較正された。ハイブリダイゼーション信号強度の値（タンパク１ｇ当たりのｍＣｉ）を、各ラットについて、６−８枚の組織切片から得られた複数の測定値平均として計算した。あるグループにおける各ラットのハイブリダイゼーション信号平均強度を平均し、グループ平均±標準誤差を得た。一方向ＡＮＯＶＡを用いて統計的比較を行った。全ての統計的検定において、９５％信頼レベル（ｐ＜０．０５）を有意と考えた。
【０３１５】
９．２．８  インサイチュハイブリダイゼーション組織化学の結果
ＧＬＴ１の量は、若年、および高齢障害有りに比べて高齢障害無しにおいて有意に多く（ｐ＜０．０３）、一方、ＧＬＡＳＴ  ｍＲＮＡが多くなる傾向も認められた（ｐ＝０．０８９、図５）。インサイチュハイブリダイゼーションのために使用された一組のラットにおける認知状態を表す学習示数スコアは、マイクロアレイ実験における動物と同様であった。すなわち、高齢障害無し（１８２、２２３、２４０）、若年（１７７、２１９、２００、２２７）、および、高齢障害有り（２９０、２８５、２９７、２９８）であった。
【０３１６】
マイクロアレイのデータセットおよびインサイチュのデータセットにおいて、第三のグルタメート輸送因子ｍＲＮＡ（ＥＡＡＣ１）の数値は、比較対象である若年、および高齢障害ラットよりも、高齢障害無しグループにおいて数値的には高かったけれども、その差は統計的に有意では無かった。マイクロアレイ（ＡＦ０３８５７１）の一つのプローブセットのｍＲＮＡは、ＥＡＡＣ１が、高齢障害有りに比べて、高齢障害無しにおいて有意に上昇していることを示した。第２プローブセットにおけるＥＡＡＣ１のｍＲＮＡも同様の傾向を示した（高齢障害無しの方が、高齢障害有りよりも多い、ｐ＝０．０９）。
【０３１７】
９．３  セフリアキソンによる認知機能の維持
９．３．１  若年ラットのＧＬＴ１  ｍＲＮＡに対するセフトリアキソン治療の効果
若年ラットに、セフトリアキソンを２００ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝２）で、または、ベヒクル（Ｎ＝３）を、筋肉内に連日１週間注入した。屠殺後、海馬を剖出し、凍結した。
【０３１８】
９．３．２  ＧＬＴ−１  ｍＲＮＡを定量化するためのリアルタイム逆転写−ＰＣＲ法
９．３．２．１  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡ調製
ＲＮＡを、セフトリアキソン、または、生食液投与を受けた動物（状態当たり３匹の若年動物）の右側海馬から、トリゾール試薬を用いて抽出し、マイクロアレイ実験で用いた手順と同様にして、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカラムにて精製した。濃度と完全性を確かめた後（マイクロアレイＲＮＡの場合と同様にして）、サンプルを、マイクロリットル当たり５０ｎｇの濃度に希釈した。このサンプルの１００ｎｇを、下記の条件下で、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｔｅｍｓのＴａｑｍａｎ逆転写試薬を用いて１０μｌの総容量において逆転写させた。その条件とは、１ｘ逆転写バッファー、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、５．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２５単位／μＬの多数転写逆転写酵素、０．４単位／μＬのＲＮアーゼ阻害剤、および、２．５μＭのオリゴｄＴプライマーである。サンプルを室温で１０分インキュベートし、その後４８℃で４５分、９５℃で５分インキュベートした。サンプルを、リアルタイムＰＣＲ反応で用いるため１：２０および１：１００に希釈した。２匹の別々の動物から得た抽出・精製海馬ＲＮＡを結合し、このＲＮＡを、５００ｎｇのＲＮＡを５０μｌの反応液で用いることを除いては、前述の実験サンプルのものと同一の条件で逆転写することによって標準ＲＮＡを生成した。標準ｃＤＮＡを、連続希釈により１：２０、１：１００、１：５００、および１：２５００に希釈した。さらに、２００ｎｇの標準ＲＮＡを、逆転写酵素を省略したことを除いては前述のものと同じ条件で２０μｌ反応液に移した。このサンプルをＲＴフリーサンプルと呼び、ＲＮＡサンプルそのものの背景活性を示すために含めた。このサンプルを１：２０と１：１００に連続希釈した。
【０３１９】
９．３．２．２  リアルタイムＰＣＲ
ｃＤＮＡの１：２０と１：１００希釈を用いてＧＬＴ１ａ、ＧＬＴ１およびＧＡＰＤＨの２種類の異なる濃度で、各ｃＤＮＡサンプルについて３重にＰＣＲ反応を実行した。ＰＣＲ反応におけるｃＤＮＡの最終濃度は、１００ｐｇ／μｌと２０ｐｇ／μｌであるが、これはインプットＲＮＡ濃度から外挿したものであった。この標準を４種類の希釈液全てに用いて、１００ｐｇ／μｌ、２０ｐｇ／μｌ、４ｐｇ／μｌ、および０．８ｐｇ／μｌの外挿最終濃度を生成した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの白金定量ＰＣＲキットによるＰＣＲ反応混合物を、全てのサンプルについて同じプライマーとプローブセットを用いて集合し、次にこれらを、各濃度各ｃＤＮＡについて別々の管に分割した。次にこのｃＤＮＡを混合液に加え、続いて、３本のリアルタイムＰＣＲ管に分けた。反応は全て、下記の条件でＲｏｔｏｒＧｅｎｅ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）において行った。すなわち、５０℃で２分、９５℃で５分、次に、９５℃で２５分と６０℃で６０秒から成る４５サイクルである。データは、プライマーセットについてＧＬＴ１とＧＬＴ１ａプローブに対するＧＡＰＤＨとＦＡＭ／ＳＹＢＲチャンネル用のＪｏｅチャンネル上で獲得した。全ての試行に対して、スパイク抑圧およびダイナミック管正規化を用いた。個別試行中に、場合によって、ＧＬＴ１またはＧＬＴ１ａおよびＧＡＤＰＨリアルタイムＰＣＲを実行した。
【０３２０】
ＧＡＰＤＨについては、最適反応条件は０．６単位白金Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２００μＭのｄＧＴＰ，２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ、４００μＭのｄＵＴＰ、０．４単位のＵＤＧ、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの前進プライマー、２００ｎＭの逆行プライマー、５’末端においてＶｉｃによって標識される５０ｎＭプローブ、および、３’末端におけるＴＡＭＲＡ消光子であった。プライマーとプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｔ＃４３０８３１３）から入手した。配列は未知であるが、アンプリコンの長さは１７７ｂｐｓであった。
【０３２１】
ＧＬＴ１については、最適反応条件は０．６単位白金Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２００μＭのｄＧＴＰ，２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ、４００μＭのｄＵＴＰ、０．４単位のＵＤＧ、６．０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｎＭの前進プライマー、２００ｎＭの逆行プライマー、５０ｎＭプローブであった。アンプリコンの長さは６５ｂｐｓであった。前進プライマーは５’ＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＴＴＧＡＣＴＣ３’であり、逆行プライマーは５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＣ３’であった。プローブは、５’６−ｆａｍおよび３’ｔａｍｒａによって標識された５’ＣＡＡＣＡＣＣＧＡＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＡＴＣ３’であった。
【０３２２】
ＧＬＴ１ａについては、最適反応条件は０．６単位白金Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２００μＭのｄＧＴＰ，２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ、４００μＭのｄＵＴＰ、０．４単位のＵＤＧ、６．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの前進プライマー、２００ｎＭの逆行プライマー、１００ｎＭプローブであった。アンプリコンの長さは７６ｂｐｓであった。前進プライマーは５’ＡＴＧＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＡＡＣＴＣＴＧＧ３’であり、逆行プライマーは５’ＴＣＡＣＧＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＴＣＴＴＣ３’であった。プローブは、５’６−ｆａｍおよび３’ＢＨＱ１（ブラックホール消光子１）によって標識された５’ＣＣＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＧＣＡ３’であった。
【０３２３】
９．３．２．３  リアルタイムＰＣＲのデータ分析
ＧＡＰＤＨおよびＧＬＴ１またはＧＬＴ１ａの比較量を、ＤＤＣｔ法（ＬｉｖａｋおよびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ２５：４０２−４０８、２００１）を用いて確定した。全ての反応に対する閾値を０．０５蛍光単位に設定し、各サンプルのＣｔを、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅソフトウェアによって定量した。各濃度における各ＧＬＴ１  ｃＤＮＡの平均Ｃｔ値を求め、ＧＡＤＰＨの平均値から差し引いた。ＧＡＤＰＨ値が、ＧＡＤＰＨの平均値より１５％以上上回るまたは１５％以上下回る場合、そのサンプルを取り除いた。ＧＬＴ１  ｍＲＮＡは、薬剤治療動物において平均１．３４倍増加し、ＧＬＴ１ａ  ｍＲＮＡは、薬剤治療動物において平均１．２７倍増加した。これらの値は、マイクロアレイにおいてＡＵラットで観察された、１．３１の増加を示したＧＬＴ１における全体変化と一致した。
【０３２４】
９．４  セフトリアキソン治療の、高齢ラットのＲＡＭにおける成績に及ぼす作用
ＭＷＭにおける認知状態について特性解明した後、高齢障害有りラットを、それ等のＭＷＭ学習示数スコアに関して等しくなるように、二つの治療条件の内の一つに割り当てた（コントロールベヒクル、またはセフトリアキソン２００ｍｇ／ｋｇ）。最初は、両治療条件下のラットはＲＡＭ作業で訓練した（馴化、遅延無しバージョンで、次に６０秒遅延）。次に、ベヒクルまたは薬剤の注入を毎日朝行った（午前８：００−９：００）。ラットは、毎日、放射状迷路において、遅延を３時間まで延長させて試験を受けた。３時間遅延における決定的試験を８−１０日目に行った（注入７日後）。ベヒクルを投与された高齢ラットにおける記憶エラーは、同時にテストした若年グループに比べて有意に上昇していた。ベヒクルを投与された高齢ラットに比べて、薬剤投与を受けた高齢ラットの冒すエラーはより少なかった（図６）。３匹の薬剤治療ラットと、ベヒクルによって治療された４匹の高齢ラットによる、この最初の試験的評価を、さらに行動的に特性解明したラットを含めて、サンプルサイズをグループ当たり７−８匹のラットに増加させて現在再度試行中である。
【０３２５】
９．４．１  高齢ラットにおけるＧＬＴ１  ｍＲＮＡに及ぼすセルトリアキソン治療の作用
ＲＡＭ試験の終了時、ベヒクルおよび薬剤治療を受けた高齢ラットを屠殺した。剖出海馬を凍結し、ＧＬＴ１  ｍＲＮＡ分析のために保存した（−８０℃）。この分析は、さらに高齢ラットを加えた行動試験再試行の終了時に行った。薬剤治療が、同じ用量で薬剤治療した場合に若年ラットに見られた作用に基づいて期待されたように、薬剤治療がＧＬＴ１  ｍＲＮＡを増した場合、マイクロアレイ分析を行って、セフトリアキソンによる治療を受けた高齢障害有りラットの遺伝子発現プロフィールを、コントロールの高齢障害有り被験体と比較した。
【０３２６】
９．４．２  セフトリアキソン治療の、ＭＷＭの試験−再試に及ぼす作用
試験−再試信頼度は、高齢ラットを標準ＭＷＭプロトコールにて特性解明し、次に、数週または数ヶ月後、新たな空間環境でＭＷＭを用いてテストすると得られる。認知障害を持つ高齢ラットにおいて機能を改善する化合物の、臨床前効力は、ＭＷＭによる再試において評価することが可能である。二つの作業（ＲＡＭとＭＷＭ）を通じる治療効果は、その二つの作業において異なる他の成分（例えば、演技にたいするモチベーション基盤）とは独立した、認知機能に対する薬剤作用の実証性を強化する。
【０３２７】
９．５  他の成分によって改善・維持された認知機能
この研究は、認知機能を改善または維持する治療用投与スケジュールを定めるために、若年ラットに試験化合物またはベヒクルを投与することを含む。試験化合物としては、バルプロ酸、代謝共役型グルタメート受容体（ｍＧｌｕＲ）活性を修飾する化合物、および、下垂体アデニルシクラーゼ活性ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）発現を修飾する化合物が含まれる。ＭＷＭにて特性解明された高齢障害有りラットを、薬剤またはベヒクル治療に割り当て、ＲＡＭにてテストした。次に、行動試験の終了時に、グルタメート輸送因子発現、および、その他の遺伝子プロフィール作成、例えば、ｍＧｌｕＲ発現と活性、ＰＡＣＡＰ発現、またはβ−アレスチン２発現を実施した。
【０３２８】
９．６  等価物
これまで本発明の特異的実施態様を論じてきたが、前記の詳細説明は例示のものであって限定的ではない。本明細書を精読するならば、当業者には、本発明に関する多くの変種が明らかであろう。付属の特許請求項は、そのような実施態様および変種の全てを請求することを意図するものではなく、本発明の全範囲は、特許請求項を、等価物の完全範囲と共に、そして明細書を、上記変種と共に参照することによって定められるべきである。
【０３２９】
本明細書で引用した全ての出版物および特許は、引用することによって、あたかも個々の出版物または特許が引用によって特異的個別的に組み込まれることが意図されていたかの如く、その全体が本明細書に組み込まれる。衝突のあった場合、本出願が、本出願における全ての定義を含めて、先導となる。
【０３３０】
出版物、特許、および、特許出願を含む、本出願で引用された各参考文献の内容は、引用することによりその全体が本明細書に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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