(57)【要約】      （修正有）【課題】グリセロールから生成されるＤ−乳酸の量は未だ不十分であり、Ｄ−乳酸生産能力を有する微生物を好気条件下で培養し、グリセロールから、Ｄ−乳酸を安価で、効率的に生産する方法を提供する。【解決手段】Ｄ−乳酸を生成する活性を有する微生物を酸素移動容量係数が０．２７ｍｉｎ−１以上の範囲である好気的条件下で、グリセロールを炭素源とする培地で培養してＤ−乳酸を得る、Ｄ−乳酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−乳酸を生成する活性を有する微生物を酸素移動容量係数が０．２７ｍｉｎ−１以上の範囲である好気的条件下で、グリセロールを炭素源とする培地で培養してＤ−乳酸を得る、Ｄ−乳酸の製造方法。
【請求項２】
Ｄ−乳酸生産能力を有する微生物が、アクロモバクタ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌である請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｄ−乳酸生産能力を有する微生物が、アクロモバクタ・デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）である請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｄ−乳酸生産能力を有する微生物が、アクロモバクタ・デニトリフィカンスＮＢＲＣ  １２６６９株である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−乳酸生産能力を有する微生物を用いるＤ−乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油資源の枯渇対策や地球温暖化問題により、カーボンニュートラルなプラスチック、燃料等への関心が近年高まっている。
【０００３】
ポリ乳酸は、植物が生成した糖類や澱粉を発酵することによって得られた乳酸を用いて合成される生分解性ポリマー（バイオプラスチックとも呼ばれる）であり、カーボンニュートラルなプラスチックである。発酵法で乳酸を合成する場合、用いる微生物の種類や発酵時の培養条件により、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸等光学活性体やそのある割合の混合物、あるいはラセミ体が得られる。
【０００４】
Ｌ−乳酸の重合によって合成されるポリ−Ｌ−乳酸は、環境に配慮した材料として注目を集めているが、従来のプラスチックと比較すると耐熱性に劣る。しかし、ポリ−Ｌ−乳酸とポリ−Ｄ−乳酸との混合物（ステレオコンプレックス型ポリ乳酸とも呼ばれる）を用いることにより、得られる生分解性ポリマーの耐熱性が向上することが知られている。
【０００５】
バイオディーゼル燃料（Ｂｉｏ  Ｄｉｅｓｅｌ  Ｆｕｅｌ、ＢＤＦ）は、カーボンニュートラルな軽油代替燃料であり、エネルギー資源枯渇、地球温暖化、大気汚染等の環境問題の解決に貢献する燃料として近年注目を集めている。バイオディーゼル燃料は、植物性油、動物性油、廃油等から製造されるが、その際、グリセロールを含有する廃液が副生成物として生じる。この廃液には特に有効な活用法がなく、廃棄されているのが現状である。
【０００６】
グリセロールから乳酸を生成し得る微生物が、これまでにいくつか知られている。例えば、特許文献１、非特許文献１、２及び３には、嫌気培養条件下でグリセロールから乳酸を生成し得る微生物が記載されている。また、特許文献１には、シトロバクタ・フレウンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）及びクレブシエラ・プネウモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が、嫌気的条件下でグリセロールからＤ−乳酸を生成することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平３−６５１９２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｅ−Ｋｅ  Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００４）２６：９１１−９１５
【非特許文献２】Ｆ．  Ｂａｒｂｉｒａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９５）４３：７８６−７９３
【非特許文献３】Ｔ．  Ｈｏｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９０）３３：１２１−１２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、いずれの文献においてもグリセロールから生成されるＤ−乳酸の量は未だ不十分である。また、Ｄ−乳酸生産能力を有する微生物が好気条件下でグリセロールからＤ−乳酸を製造することを示唆する記載はない。Ｄ−乳酸を安価で、効率的に生産する方法の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、好気的な条件下で、グリセロールから効率良くＤ−乳酸を得ることができるＤ−乳酸の製造方法を提供することを可能とし、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下を提供する：
［１］Ｄ−乳酸を生成する活性を有する微生物を酸素移動容量係数（ＫＬａ）が０．２７ｍｉｎ−１以上の範囲である好気的条件下で、グリセロールを炭素源とする培地で培養してＤ−乳酸を得る、Ｄ−乳酸の製造方法。
［２］Ｄ−乳酸生産能力を有する微生物が、アクロモバクタ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属菌である上記［１］記載の方法。
［３］Ｄ−乳酸生産能力を有する微生物がアクロモバクタ・デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）である上記［１］記載の方法。
［４］Ｄ−乳酸生産能力を有する微生物がアクロモバクタ・デニトリフィカンスＮＢＲＣ  １２６６９株である上記［１］記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、Ｄ−乳酸生産能力を有する微生物を用いてグリセロールから良好な変換率、かつ、高い光学純度で、Ｄ−乳酸を効率的に生成することができる。したがって、Ｄ−乳酸を安価で、効率的に生産することができる。このように、本発明は、グリセロールやグリセロール混合物等から、Ｄ−乳酸を生成する方法を提供する。
【００１３】
本発明の方法によれば、グリセロールやグリセロールを含有するバイオディーゼル廃液等から、高効率でＤ−乳酸を簡便に生成することができる。Ｄ−乳酸は、バイオプラスチック原料の用途で用いられている。このように、本発明は、グリセロールやグリセロールを含有するバイオディーゼル廃液等から有用物質を生成するのに有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明方法において用いられるＤ−乳酸生産能力を有する微生物としては、好気的条件下でグリセロールからＤ−乳酸を生産する微生物であればよく、好気的条件下でグリセロールから良好な変換率、かつ、高い光学純度でＤ−乳酸を生成し得る微生物が好ましい。このような微生物として、アクロモバクタ属菌が挙げられる。アクロモバクタ属菌のうちでも好気的条件下でグリセロールから良好な変換率、かつ、高い光学純度でＤ−乳酸を生成し得る細菌が好ましく、このような細菌としては、アクロモバクタ・デニトリフィカンス、特に、アクロモバクタ・デニトリフィカンスＮＢＲＣ  １２６６９株が挙げられる。アクロモバクタ・デニトリフィカンスＮＢＲＣ  １２６６９株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門が公開しているＮＢＲＣ  Ｃｕｌｔｕｒｅカタログに掲載されており、出願前に入手可能な株である。
【００１５】
また、本発明で用いる好気的な条件下でグリセロールから良好な変換率でＤ−乳酸を生成する微生物は、それらの野生株だけでなく、任意の自然又は人工の突然変異体、例えば、Ｘ線照射、紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン等の化学的変異誘発剤等の処理により得られる変異体、すなわち、野生株よりも良好な変換率及び／又はより高い光学純度でＤ−乳酸を生成する微生物であってよい。
【００１６】
ここで、「高い光学純度」でＤ−乳酸が生成されるとは、エナンチオマー過剰率で示す場合、Ｄ−乳酸が約７０％ｅ．ｅ．以上で生成されることを意味する。好ましくは、Ｄ−乳酸は、約８０％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは約９０％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは約９５％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは約９７％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは９８％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは９９％ｅ．ｅ．以上、さらに好ましくは９９．９％ｅ．ｅ．以上で生成物中に存在する。光学純度・エナンチオマー過剰率は、自体公知の方法に従って決定できる。例えば、特開２００３−８８３９２に記載される方法を使用することができるが、これに限定されない。高い光学純度でＤ−乳酸を生成する微生物の選択は、候補菌株を試験管もしくはフラスコを用いてスモールスケールで培養し、培養液中に蓄積したＤ−乳酸の光学純度を上記方法により測定することによって行うことができる。
【００１７】
グリセロール含有培地は、培養培地中に純粋なグリセロールを添加したものであってもよく、グリセロール含有混合物を添加したものであってもよい。グリセロール含有混合物中の他の成分及びそれらの量は、本発明で用いるＤ−乳酸産生細菌に対して悪影響を及ぼさないものであることが好ましい。グリセロール含有混合物の由来は特に限定されないが、資源の有効利用の観点から、バイオディーゼル廃液を使用することが好ましい。
【００１８】
バイオディーゼル燃料の製造法の１つは、アルカリ触媒を用いたトリグリセリドのアルコリシスにより、脂肪酸メチルエステル（Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ、ＦＡＭＥ）を生成させることである。この方法では、副生成物としてグリセロールを含有する廃液（バイオディーゼル廃液と呼ぶ）が発生する。この廃液には、触媒や未変換の脂肪酸（使用する油によって異なる）等が通常混入している。例えば、本発明の実施例で用いたバイオディーゼル廃液の組成は、グリセロール：５１％、メタノール：１１％、水酸化カリウム：８％、水：４％、グリセリド等その他：２６％である。これ以外で、Ｓ．  Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００２）８２：４３−４９に記載されるグリセロール：６５％、カリウム・ナトリウム塩：４−５％、メタノール：１％、水：２８％や、Ｍ．  Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐａｊｕｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００４）３１：４４２−４４６に記載されるグリセロール：６５％、ナトリウム塩：５％以下等の、任意の組成を有するバイオディーゼル廃液も使用することができる。
【００１９】
本発明の方法でバイオディーゼル廃液を培地に添加した場合、純粋なグリセロールを添加した場合と同等又はそれ以上の収量及び変換率で、Ｄ−乳酸を生成することが可能である。
【００２０】
本発明の方法で使用する培地は、微生物の培養に通常用いられる成分を含有する培地であればよく、特定の培地に限定されない。本発明の方法では、炭素源、窒素源及び無機塩を含有する、ごく単純な組成の培地を用いても、高い光学純度でＤ−乳酸を得ることも可能である。
【００２１】
本発明の方法で用いる培地は、炭素源としてグリセロールを含む。培地中に含まれるグリセロールの濃度は、微生物の生育やＤ−乳酸産生に悪影響を与えない範囲で適宜選択され得るが、通常、約０．１〜約５００ｇ／Ｌ、好ましくは約１〜約３００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは約５〜約１００ｇ／Ｌである。上記バイオディーゼル廃液をグリセロール源として用いる場合、当該廃液が含有するグリセロールの濃度に応じて、培地中のグリセロールの量が上記範囲になるように、希釈又はグリセロール添加してもよい。
【００２２】
培地は、グリセロール以外の物質を炭素源としてさらに含んでもよいが、他の炭素源は、グリセロールからのＤ−乳酸の生成を妨げない量で添加されるべきである。本発明で用いられる他の炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、デンプン、ラクトース、アラビノース、キシロース、デキストリン、糖蜜、麦芽エキス等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、他の炭素源は、グリセロールに対して約１０重量％以下、より好ましくは約１重量％以下である。好ましくは、グリセロールは、炭素源に対して約９０重量％以上、より好ましくは約９９重量％以上である。培地は、グリセロールを単一の炭素源として含むことが最も好ましい。
【００２３】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合物、尿素等の有機窒素化合物等を用いることができる。もしくは、グルテン粉、綿実粉、大豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、カザミノ酸等の有機窒素源を用いてもよい。なお、天然有機窒素源は窒素源であるとともに炭素源にもなりうる。
【００２４】
炭素源及び窒素源は組み合わせて使用すると有利であるが、痕跡量の生育因子や相当量の無機栄養素を含む低純度の物質もまた、使用に適しているので、それらを純粋な形で使用する必要はない。
【００２５】
所望により、第一リン酸カリウム、第二リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の無機塩を使用することができる。また、必要な場合、特に培地が著しく発泡する場合には、液状パラフィン、高級アルコール、植物油、鉱物油、シリコーン等の消泡剤を添加してもよい。必要に応じて、各種ビタミン類等のさらなる成分を培地に添加してもよい。上記窒素源、無機塩及びさらなる成分は、当業者に公知である。
【００２６】
上記の微生物の培養は、一般微生物の通常の培養方法に準じて行うことができ、例えば、ジャーファーメンターを用いた液体培養法をあげることができる。培養形式としては、例えば回分培養、半回分培養、連続培養等が挙げられる。
【００２７】
本発明方法において上記の微生物を培養するための培養装置には、一般微生物の通常の培養に用いられるような、通気装置及び攪拌翼をもつ攪拌装置を備えたジャーファーメンターを用いることができる。無菌空気をジャーファーメンター内に送るためにジャーファーメンターに備えつけられる通気装置としては、スパージャー（通気管）をあげることができる。スパージャーとしては、例えば、オリフィススパージャー（穿孔管）、末端が開放されているか又は部分的に絞られた形状をなすノズルスパージャー、攪拌機軸中にスパージャーが通されてなる攪拌機とスパージャーの複合型（発酵工学の基礎，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ著、石崎文彬訳、学会出版センター第２版、ｐ１２７−１２８（１９８９））等を使用することができる。細かい気泡を発生させるために、ノズルスパージャーの先に、焼結金属を接続してもよい。ジャーファーメンターで使用される攪拌装置の攪拌翼の形状としては、例えば、デスクタービン、ファンタービン、わん曲羽根ファンタービン、矢羽根タービン、ファウドラー型攪拌翼、ブルマージン型攪拌翼、角度付羽根ファンタービン、プロペラ、多段翼、アンカー型攪拌翼、らせん帯翼、らせん軸型攪拌翼、（化学工学協会・編：化学工学便覧（第４版）、丸善、ｐ１３１０（１９７８））等を使用することができる。また、培養液中の気泡を細かくする装置、例えば、籠を攪拌翼につけてもよい。
【００２８】
本発明における「好気的な条件」とは、分子状酸素の存在下での培養をいう。酸素供給等のために、通気、攪拌、振盪等を行ってもよい。具体的には、上記通気装置を用い通気を行い、上記攪拌装置を用いて培養液の攪拌を行い、培養槽内に酸素を含む気体を流入させることにより行われる。
【００２９】
酸素移動容量係数（ＫＬａ）とは、ジャーファーメンターの酸素移動能を表す指標となるもので、同じ条件ではＫＬａの値が大きい方が酸素移動の能力が大きいことを表す。ジャーファーメンターに供給される酸素量と細菌による酸素の取り込み量とのバランスが溶存酸素濃度に表される。発酵による代謝生産物の生産の場合、微生物による酸素の取り込み可能な量よりも過剰に酸素を供給する必要がある代謝生産物もあれば、酸素の取り込み可能な量より過小に酸素を供給した方が良好に生産される代謝生産物もある。目的とする代謝生産物に応じて至適な酸素を供給することが重要となる。
【００３０】
ＫＬａは、通気攪拌培養時において、気相から供給される酸素と微生物によって消費される酸素とによって表される培養液中の酸素の収支式（１）（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ３１０（１９９２））において次のように示される。
ｄＣ／ｄｔ＝ＫＬａ×（Ｃ＊−Ｃ）−ＱＯ２×Ｘ      （１）
ここで、
Ｃ：培養液中の溶存酸素濃度（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  Ｏｘｙｇｅｎ、ＤＯ）〔ｐｐｍ〕、
Ｃ＊：微生物による酸素の消費がない場合気相と平衡の溶存酸素濃度〔ｐｐｍ〕、
Ｘ：菌体濃度〔ｇ／Ｌ〕、
ＱＯ２：比呼吸速度〔ｍｇＯ２／(ｇｃｅｌｌ・ｈ)〕、
ＫＬａ：酸素移動容量係数〔１／ｈ〕である。
【００３１】
ジャーファーメンターのＫＬａは、例えば気体置換法（Ｓｔａｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ）、動的測定法（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ）等で測定することができる（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ３１１（１９９２）;発酵工学の基礎，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ著、石崎文彬訳、学会出版センター第２版、ｐ１７３−１７６（１９８９））。
【００３２】
気体置換法でのＫＬａの測定例として以下に具体例を記す。ジャーファーメンターに、水もしくは培養に使用する培地を入れ、これらの液体中の酸素を、窒素ガスにより置換するか、亜硫酸ナトリウムをほぼ飽和濃度に達する程度に加えること等により脱酸素するかして、該液体の酸素濃度を低下させる。次いで、かかる液体中に溶存酸素濃度電極を差し込み、温度、通気速度、攪拌速度を設定した後、ジャーファーメンターの運転を開始させる。ジャーファーメンターに仕込んだ液体の溶存酸素濃度を、溶存酸素濃度電極を用いて測定する。溶存酸素濃度の増加は、式（１）より、
ｄＣ／ｄｔ＝ＫＬａ×（Ｃ＊−Ｃ）                  （２）
で与えられる関係にあるから、（２）式を積分すると、
ｌｎ（Ｃ＊−Ｃ）＝−ＫＬａ×ｔ                      （３）
となる。すなわち、［（微生物による酸素の消費がない場合の気相と平衡の溶存酸素濃度）−（測定した溶存酸素濃度）］の値の対数を、通気を行った時間に対してプロットすれば直線関係が得られ、その勾配が−ＫＬａとなるので、その勾配を計算することによりＫＬａを求めることができる。
【００３３】
本発明方法においてＫＬａが０．２７ｍｉｎ−１以上の範囲で、好ましくは０．２７ｍｉｎ−１〜２．５ｍｉｎ−１の範囲で、さらに好ましくは０．２９ｍｉｎ−１〜１．９ｍｉｎ−１の範囲で微生物を培養することが好ましい。
【００３４】
Ｋｌａを所定の値に設定するには、例えば、まず、培養に用いるジャーファーメンターに通気管、攪拌翼をとりつけた後、培養を行うときと同量の培養液もしくは水を該ジャーファーメンターに仕込み、培養時と同じ温度条件、圧力条件下にて、例えば、通気条件を培養液容量の約０．１〜約２倍容量／分の範囲から１点選んで設定し、攪拌条件は約２００ｒｐｍ〜約１０００ｒｐｍの範囲から数点選び、１点の攪拌条件でジャーファーメンターを運転して溶存酸素濃度が平衡に達したらその条件におけるＫＬａを前記記載の方法に従って測定するという操作を繰返すことにより、選んだ数点の攪拌条件それぞれにおけるＫＬａを測定する。次に、通気条件を変更し、再度、攪拌条件数点について、ＫＬａを前記記載の方法に従って測定する。このようにして、培養に使用するジャーファーメンターにおいてＫＬａが例えば０．２７ｍｉｎ−１以上の範囲となる通気条件と攪拌条件との組合せをあらかじめ求めることができる。このような通気条件と攪拌条件とで微生物を培養すれば、Ｄ−乳酸を効率よく製造することが可能となる。
【００３５】
ＫＬａが０．２７ｍｉｎ−１以上の範囲となる具体的な通気条件及び攪拌条件の組合せとしては、例えば、３．０Ｌ容ジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ３００型）を使用し、スパージャーにはオリフィス型スパージャー（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ３００型）を使用し、攪拌翼としてデスクタービン（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ３００型）用い、温度を３０℃、培地量を１Ｌ、通気量を０．３Ｌ／分とし、攪拌速度を約２００ｒｐｍから約８００ｒｐｍの範囲とする場合等をあげることができる。使用するジャーファーメンターの仕様が変更された場合、例えば、容量が変更された場合、スパージャーが変更された場合、又は攪拌翼が変更された場合等においても、上記の方法に従ってＫＬａが例えば０．２７ｍｉｎ−１以上の範囲となる通気条件と攪拌条件の組合せをあらかじめ求めておけば、種々の通気、攪拌条件等において実際に微生物を培養してＤ−乳酸生産量を測定することによりＤ−乳酸生産に適した酸素供給条件を検討することなく、簡便にＤ−乳酸製造に最適な通気、攪拌等の酸素供給条件を求めることが可能となる。
【００３６】
培養条件は、本発明で用いるＤ−乳酸産生細菌の培養に適したものであればよい。例えば、培養温度は、約４℃〜約４０℃、好ましくは約２０℃〜約３７℃である。培地のｐＨは、約５〜約９、好ましくは約６〜約８である。Ｄ−乳酸の生成に伴い、培地のｐＨが低下する場合があるので、必要に応じて、培養中にアンモニア水、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリを添加して、培地のｐＨをこれらの範囲内に調整する。
【００３７】
培養時間は、他の培養条件によっても異なるが、通常、約０．５〜約５０日間程度、好ましくは約１〜約１０日間程度、より好ましくは、約２〜４日間程度である。
【００３８】
上記培地の組成、上記及び他の培養条件等は、当業者によって適宜調節可能である。Ｄ−乳酸の収量や光学純度等をさらに向上させるために、これらを調節することも考えられよう。
【００３９】
Ｄ−乳酸の分離及び精製は、従来公知の方法に準じて実施され得る。例えば、培養物を酸性化した後に直接蒸留する方法、乳酸のラクチドを形成させて蒸留する方法、アルコールと触媒を加え乳酸をエステル化した後蒸留する方法、有機溶媒中に乳酸を抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着させた後に溶出させ分離するイオン交換カラムで乳酸を分離する方法、カルシウムイオン等との金属塩をつくり単離する方法、電気透析により乳酸を濃縮分離する方法等の方法により分離、精製される。具体的には、例えば、特開２００３−８８３９２記載の実施例に従って乳酸の分離及び精製を行なってもよい。
【実施例】
【００４０】
本発明を以下の実施例によって例示するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能であることを理解すべきである。
【００４１】
（実施例１）
アクロモバクタ・デニトリフィカンスＮＢＲＣ  １２６６９株を、試験管（直径１．５ｃｍ×１５ｃｍ）に入れた５ｍｌのＡ液体培地（組成：第一リン酸カリウム３ｇ、第二リン酸ナトリウム６ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、酢酸アンモウム０．４３２ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物４９２ｍｇ、グリセロール１０ｇ及び蒸留水１Ｌ（最終ｐＨ７．４））に接種し、３０℃で一晩振とう培養（前々培養）した。この培養液の１ｍｌを、５００ｍｌ容バッフル付三角フラスコにいれた５０ｍｌのＢ液体培地（組成：Ａ液体培地にペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）を１０ｇ／Lを加えた培地）に植菌し、３０℃、２４時間、２００ｒｐｍで振盪培養（前培養）した。このように生育した同菌株培養液５０ｍｌを、３．０Ｌ容ジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ３００型）に仕込んだ１ＬのB液体培地に接種し、３０℃で通気攪拌培養した。このとき、通気量は０．３Ｌ／分、攪拌速度は２００ｒｐｍ一定とした。培養中は、ｐＨが７．３５から７．４５の範囲になるように４Ｍ  リン酸溶液と２Ｎ  水酸化ナトリウム水とを添加し、また、泡がたたないように消泡剤としてアデカノールＬＧ２９５Ｓ（旭電化工業製）を培養開始時に適量添加した。攪拌翼としては、デスクタービン（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ３００型）を用いた。スパージャーには、オリフィス型スパージャー（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ３００型）を使用した。培養開始から３日後に１リットル当り乳酸が１．２ｇ蓄積していた。Ｄ−乳酸の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【００４２】
前記の培養に使用した培養装置に１Ｌの水を入れ、そこへ溶存酸素電極（東亜ディーケーケー株式会社製ＯＥ−９２５０型）を挿入した。溶存酸素濃度が約１．５ｐｐｍ以下になるまで窒素ガスを通気した後、窒素ガスの通気を止め、温度を３０℃に設定し、通気量を０．３Ｌ／分、攪拌速度を２００ｒｐｍとしてジャーファーメンターの運転を開始した。溶存酸素濃度の経時変化を測定し、通気を行った時間に対して[（微生物による酸素の消費がない場合気相と平衡の溶存酸素濃度）−（測定した溶存酸素濃度）]の値の対数値をプロットし、その傾きからＫＬａを計算したところ、ＫＬａは０．２９ｍｉｎ−１であった。
【００４３】
（実施例２）
攪拌速度を３００ｒｐｍ一定とした以外は、実施例１と同様の条件で培養した。培養開始から３日後に１リットル当り乳酸が２．１ｇ蓄積していた。Ｄ−乳酸の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。また、実施例１と同様の方法で前記培養条件におけるＫＬａを測定したところ、ＫＬａは０．６８ｍｉｎ−１であった。
【００４４】
（実施例３）
攪拌速度を４００ｒｐｍ一定とした以外は、実施例１と同様の条件で培養した。培養開始から２日後に１リットル当り乳酸が２．１ｇ蓄積していた。Ｄ−乳酸の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。また、実施例１と同様の方法で前記培養条件におけるＫＬａを測定したところ、ＫＬａは１．２ｍｉｎ−１であった。
【００４５】
（実施例４）
攪拌速度を５００ｒｐｍ一定とした以外は、実施例１と同様の条件で培養した。培養開始から２日後に１リットル当り乳酸が２．１ｇ蓄積していた。Ｄ−乳酸の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。また、実施例１と同様の方法で前記培養条件におけるＫＬａを測定したところ、ＫＬａは１．９ｍｉｎ−１であった。
【００４６】
（実施例５）
攪拌速度を７００ｒｐｍ一定とした以外は、実施例１と同様の条件で培養した。培養開始から３日後に１リットル当り乳酸が２．７ｇ蓄積していた。Ｄ−乳酸の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。また、実施例１と同様の方法で前記培養条件におけるＫＬａを測定したところ、ＫＬａは０．７５ｍｉｎ−１であった。
【００４７】
（参考例１）
攪拌速度を１００ｒｐｍ一定とした以外は、実施例１と同様の条件で培養した。培養開始から３日後に１リットル当り乳酸の蓄積は観察されなかった。また、実施例１と同様の方法で前記培養条件におけるＫＬａを測定したところ、ＫＬａは０．１１ｍｉｎ−１であった。