(57)【要約】【課題】新規マルトース産生アルファアミラーゼ変異体の提供。【解決手段】マルトース産生アルファアミラーゼのアミノ酸配列が修飾された変異体。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親マルトース産生アルファアミラーゼ変異体の製造方法であって、
ａ）前記の親アルファアミラーゼの三次元構造を産み出すための、付表において表わされる配列番号１の三次元構造上での前記親アルファアミラーゼのモデリング；
ｂ）段階ａ）において得られる三次元構造における前記の親の少なくとも１つの構造的部分の同定であって、前記の構造的部分における変化が前記の変化した特性を生むことを予測する同定；
ｃ）前記の構造的部分に相当する位置での１又は複数のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換をコードする核酸を産生するための、前記の親アルファアミラーゼをコードする核酸の修飾；及び
ｄ）前記の変異体アルファアミラーゼを産生するための、宿主細胞における、前記の修飾された核酸の発現、
を含んで成る前記方法
（ここで前記変異体はアルファアミラーゼの酵素活性を有し、そして前記の親と比較して、変化した特性を少なくとも１つ有する）。
【請求項２】
前記の変化した特性がpH依存活性、熱安定性、基質開裂パターン、開裂の比活性、トランスグリコシル化、澱粉の凝集を減少させる能力、パンの劣化を減少させる能力、基質特異性、基質との結合又はカルシウムとの結合である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法であって；
ａ）前記の親の三次元構造における前記親アミラーゼの活性部位の残基から、１５Å (特に１０Å）以内にあり、そして活性部位の残基と静電性又は疎水性の相互作用に関与するアミノ酸残基の同定；
ｂ）活性部位の残基の静電性及び／又は疎水性の環境を変化させ、そして前記構造において適応できる、別のアミノ酸残基による前記アミノ酸残基の置換；
ｃ）循環的な、段階ａ）及びｂ）の任意な繰り返し；
ｄ）ｂ）以外の、１又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換のうちの、いずれかの変化の任意な作製；
ｅ）段階ａ）〜ｄ）から生じる前記変異体の調製；
ｆ）前記変異体のpH依存活性の試験；及び
ｇ）循環的な、段階ａ）〜ｆ）の任意な繰り返し；及び
ｈ）前記の親アミラーゼと比較して、変化したpH依存活性を有する変異体の選択、
を含んで成る方法。
【請求項４】
親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法であって；
ａ）前記の親の三次元構造における内部の穴又は割れ目の同定；
ｂ）前記の穴又は割れ目に近いアミノ酸残基の別のアミノ酸残基による置換であって、前記の疎水性相互作用を増大させ、そして／あるいは前記の穴若しくは割れ目のサイズを大きくし、又は減少させる置換；
ｃ）循環的な、段階ａ）及びｂ）の任意な繰り返し；
ｄ）ｂ）以外の、１又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換のうちの、いずれかの変化の任意な作製；
ｅ）段階ａ）〜ｄ）から生じる前記変異体の調製；
ｆ）前記変異体の熱安定性の試験；及び
ｇ）循環的な、段階ａ）〜ｆ）の任意な繰り返し；及び
ｈ）前記の親アミラーゼと比較して、増大した熱安定性を有する変異体の選択、
を含んで成る方法。
【請求項５】
前記のアミノ酸残基の置換が前記の疎水性相互作用の増大、プロリンによる置換、別のアミノ酸によるヒスチジンの置換、カルシウム結合の安定化、ドメイン間のジスルフィド結合の導入、脱アミド化部位の除去、水素結合の接触の変化、より大きな側鎖の基を有するアミノ酸による内部構造の穴の充填、ドメイン間の相互作用の導入、電荷分布の変化、ヘリックスのキャッピング、又は塩橋の導入をもたらす、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法であって：
ａ）前記アミラーゼの三次元構造におけるカルシウム結合部位から、１０Å以内のアミノ酸残基の同定；
ｂ）カルシウムイオンとの相互作用を向上するための、別のアミノ酸による前記アミノ酸の置換；
ｃ）循環的な、段階ａ）及びｂ）の任意な繰り返し；
ｄ）ｂ）以外の、１又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換のうちの、いずれかの変化の任意な作製；
ｅ）段階ａ）〜ｄ）から生じる前記変異体の調製；
ｆ）前記変異体の熱安定性の試験；及び
ｇ）循環的な、段階ａ）〜ｆ）の任意な繰り返し；及び
ｈ）前記の親アミラーゼと比較して、増大した熱安定性を有する変異体の選択、
を含んで成る方法。
【請求項７】
親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法であって：
ａ）前記の親アミラーゼの三次元構造のモデルにおける、基質結合領域の同定；
ｂ）アミノ酸の置換、欠失又は挿入による、基質結合領域の修飾；
ｃ）循環的な、段階ｂ）の任意な繰り返し；及び
ｄ）ｂ）以外の、１又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換のうちの、いずれかの変化の任意な作製；
ｅ）段階ａ）〜ｄ）から生じる前記変異体の調製；
ｆ）前記変異体の基質開裂パターンの試験；及び
ｇ）循環的な、段階ａ）〜ｆ）の任意な繰り返し；及び
ｈ）前記の親アミラーゼと比較して、変化した基質開裂パターンを有する変異体の選択、
を含んで成る方法。
【請求項８】
マルトース産生アルファアミラーゼ変異体の産生方法であって；
ａ）請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法による前記変異体の構築；
ｂ）前記変異体をコードするＤＮＡ配列による、微生物の形質転換；
ｃ）前記変異体の産生にとって誘導的な条件下での、前記の形質転換した微生物の培養；及び
ｄ）生じた培養液からの前記変異体の任意な回収；
を含んで成る方法。
【請求項９】
ａ）マルトース産生アルファアミラーゼ活性を有し；
ｂ）配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有し；
ｃ）Ｄ１２７，Ｖ１２９，Ｆ１８８，Ａ２２９，Ｙ２５８，Ｖ２８１，Ｆ２８４，Ｔ２８８，Ｎ３２７，Ｍ３３０，Ｇ３７０，Ｎ３７１、及び／又はＤ３７２に相当する位置で、配列番号１と比較されるアミノ酸修飾を含んで成り；そして
ｄ）配列番号１のポリペプチドと比較して、変化したpH依存活性を有する、
ポリペプチド。
【請求項１０】
前記修飾がＤ１２７Ｎ／Ｌ，Ｖ１２９Ｓ／Ｔ／Ｇ／Ｖ，Ｆ１８８Ｅ／Ｋ／Ｈ，Ａ２２９Ｓ／Ｔ／Ｇ／Ｖ，Ｙ２５８Ｅ／Ｄ／Ｋ／Ｒ／Ｆ／Ｎ，Ｖ２８１Ｌ／Ｔ，Ｆ２８４Ｋ／Ｈ／Ｄ／Ｅ／Ｙ，Ｔ２８８Ｅ／Ｋ／Ｒ，Ｎ３２７Ｄ，Ｍ３３０Ｌ／Ｆ／Ｉ／Ｄ／Ｅ／Ｋ，Ｇ３７０Ｎ，Ｎ３７１Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ、及び／又はＤ３７２Ｎ／Ｖに相当する置換を含んで成る請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ａ）マルトース産生アルファアミラーゼ活性を有し；
ｂ）配列番号１に少なくとも７０％の同一性を有し；そして
ｃ）
【化１】
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に相当する位置で、配列番号１と比較されるアミノ酸修飾を含んで成り；そして
ｄ）配列番号１のポリペプチドと比較して向上した安定性を有する、
ポリペプチド。
【請求項１２】
前記修飾がＫ４０，Ｖ７４，Ｈ１０３，Ｓ１４１，Ｔ１４２，Ｆ１８８，Ｈ２２０，Ｎ２３４，Ｋ２４９，Ｄ２６１，Ｌ２６８，Ｖ２７９，Ｎ３４２，Ｈ３４４，Ｇ３９７，Ａ４０３，Ｋ４２５，Ｓ４４２，Ｓ４７９，Ｓ４９３，Ｔ４９４，Ｓ４９５，Ａ４９６，Ｓ４９７，Ａ４９８，Ｑ５００，Ｋ５２０，Ａ５５５及び／又はＮ５９５に相当する位置で；好ましくはＫ４０Ｒ，Ｖ７４Ｐ，Ｈ１０３Ｙ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｙ，Ｓ１４１Ｐ，Ｔ１４２Ａ，Ｆ１８８Ｉ／Ｌ，Ｈ２２０Ｙ／Ｌ／Ｍ，Ｎ２３４Ｐ，Ｋ２４９Ｐ，Ｄ２６１Ｇ，Ｌ２６８Ｐ，Ｖ２７９Ｐ，Ｎ３４２Ｐ，Ｈ３４４Ｅ／Ｑ／Ｎ／Ｄ／Ｙ，Ｇ３９７Ｐ，Ａ４０３Ｐ，Ｋ４２５Ｅ，Ｓ４４２Ｐ，Ｓ４７９Ｐ，Ｓ４９３Ｐ，Ｔ４９４Ｐ，Ｓ４９５Ｐ，Ａ４９６Ｐ，Ｓ４９７Ｐ，Ａ４９８Ｐ，Ｑ５００Ｐ，Ｋ５２０Ｒ，Ａ５５５Ｐ及び／又はＮ５９５Ｉに相当する置換を含んで成る、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記修飾が、カルシウム配位を向上する様な、Ｄ１７，Ｎ２８，Ｐ２９，Ａ３０，Ｓ３２，Ｙ３３，Ｇ３４，Ｒ９５，Ｈ１０３，Ｎ１３１，Ｈ１６９，Ｉ１７４及び／又はＱ２０１に相当する位置で、好ましくはＤ１７Ｑ／Ｅ，Ａ３０Ｄ／Ｍ／Ｌ／Ａ／Ｖ／Ｉ／Ｅ／Ｑ，Ｓ３２Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ，Ｒ９５Ｍ／Ｌ／Ａ／Ｖ／Ｉ／Ｅ／Ｑ，Ｈ１０３Ｙ／Ｎ／Ｑ／Ｄ／Ｅ，Ｎ１３１Ｄ，Ｈ１６９Ｎ／Ｄ／Ｅ／Ｑ，Ｉ１７４Ｅ／Ｑ，Ｑ２０１Ｅに相当する置換を含んで成る、請求項１１又は１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記修飾が、脱アミド化部位を除去する様な、Ｑ１３，Ｎ２６，Ｎ７７，Ｎ８６，Ｎ９９，Ｑ１１９，Ｎ１２０，Ｎ１３１，Ｎ１５２，Ｎ１７１，Ｎ１７６，Ｎ１８７，Ｑ２０１，Ｎ２０３，Ｎ２３４，Ｑ２４７，Ｎ２６６，Ｎ２７５，Ｎ２７６，Ｎ２８０，Ｎ２８７，Ｑ２９９，Ｎ３２０，Ｎ３２７，Ｎ３４２，Ｑ３６５，Ｎ３７１，Ｎ３７５，Ｎ４０１，Ｎ４３６，Ｎ４５４，Ｎ４６８，Ｎ４７４，Ｑ５００，Ｎ５０７，Ｎ５１３，Ｑ５２６，Ｎ５７５，Ｑ５８１，Ｎ６２１，Ｑ６２４及び／又はＮ６６４に相当する位置で、
【化２】
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に相当する置換を含んで成る、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記修飾が、水素結合の接触を向上する様な、Ｉ１６，Ｌ３５，Ｍ４５，Ｐ７３，Ｄ７６，Ｄ７９，Ａ１９２，Ｉ１００，Ａ１４８，Ａ１６３＋Ｇ１７２，Ｌ２６８，Ｖ２８１，Ｄ２８５，Ｌ３２１，Ｆ２９７，Ｎ３０５，Ｋ３１６，Ｓ５７３，Ａ３４１，Ｍ３７８，Ａ３８１，Ｆ３８９，Ａ４８３，Ａ４８６，Ｉ５１０，Ａ５６４，Ｆ５８６，Ｋ５８９，Ｆ６３６，Ｋ６４５，Ａ６２９、及び／又はＴ６８１に相当する位置での置換、好ましくは
【化３】
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に相当する置換を含んで成る、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記修飾が１又は複数のドメイン間のジスルフィド結合を導入する様な、好ましくはＧ２３６Ｃ＋Ｓ５８３Ｃ，Ｇ６１８Ｃ＋Ｒ２７２Ｃ、及び／又はＡ３４８Ｃ＋Ｖ４８７Ｃに相当する置換を含んで成る、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記の内部の穴又は割れ目を埋める様なＬ５１，Ｌ７５，Ｌ７８，Ｇ８８，Ｇ９１，Ｔ９４，Ｖ１１４，Ｉ１２５，Ｖ１２６，Ｔ１３４，Ｇ１５７，Ｌ２１７，Ｓ２３５，Ｇ２３６，Ｖ２５４，Ｖ２７９，Ｖ２８１，Ｌ２８６，Ｖ２８９，Ｉ２９０，Ｖ３０８，Ｌ３２１，Ｉ３２５，Ｄ３２６，Ｌ３４３，Ｆ３４９，Ｓ３５３，Ｉ３５９，Ｉ４０５，Ｌ４４８，Ｑ４４９，Ｌ４５２，Ｉ４７０，Ｇ５０９，Ｖ５１５，Ｓ５８３，Ｇ６２５，Ｌ６２７，Ｌ６２８及び／又はＡ６７０に相当する位置での置換、好ましくは
【化４】
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及び／又はＷ７５と組合わせたＬ２１７（例えばＬ７５Ｆ／Ｙと組合わせたＬ２１７Ｆ／Ｙ）に相当する置換を有する、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記の修飾が、塩橋を形成する様な、Ｎ１０６，Ｎ３２０及びＱ６２４に相当する位置での置換、好ましくはＮ１０６Ｒ，Ｎ３２０Ｅ／Ｄ及び／又はＱ６２４Ｅに相当する置換を含んで成る、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記修飾が、電荷分布を変える様な、Ｋ２４４及び／又はＫ３１６に相当する位置での置換、好ましくはＫ２４４Ｓ及び／又はＫ３１６Ｇ／Ｎ／Ｄに相当する置換を含んで成る、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記修飾が、前記結合部位を変える様な、Ｖ２８１及び／又はＡ６２９に相当する位置での置換、好ましくはＶ２８１Ｑ及び／又はＡ６２９Ｎ／Ｄ／Ｅ／Ｑに相当する置換を含んで成る、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記修飾がＦ１４３＋Ｆ１９４＋Ｌ７８，Ａ３４１＋Ａ３４８＋Ｌ３９８＋Ｉ４１５＋Ｔ４３９＋Ｌ４６４＋Ｌ４６５，Ｌ５５７，Ｓ２４０＋Ｌ２６８，Ｑ２０８＋Ｌ６２８，Ｆ４２７＋Ｑ５００＋Ｎ５０７＋Ｍ５０８＋Ｓ５７３及び／又はＩ５１０＋Ｖ６２０に相当する位置で前記のドメイン間の相互作用を変える様な置換、好ましくは
【化５】
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に相当する置換を含んで成る、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ａ）マルトース産生アルファアミラーゼ活性を有し；
ｂ）配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有し；
ｃ）Ｐ１９１，Ａ１９２，Ｇ１９３，Ｆ１９４及び／又はＳ１９５に相当する位置で、配列番号１と比較されるアミノ酸修飾を含んで成り；そして
ｄ）配列番号１のポリペプチドよりも、高いアミラーゼ比活性を有する、
ポリペプチド。
【請求項２３】
前記修飾が欠失、好ましくは欠失Δ（１９１〜１９５）を含んで成る、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記修飾が挿入、好ましくは１９２−Ａ−１９３を含んで成る、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
ａ）マルトース産生アルファアミラーゼ活性を有し；
ｂ）配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有し；
ｃ）Ａ３０，Ｋ４０，Ｎ１１５，Ｔ１４２，Ｆ１８８，Ｔ１８９，Ｐ１９１，Ａ１９２，Ｇ１９３，Ｆ１９４，Ｓ１９５，Ｄ２６１，Ｔ２８８，Ｎ３２７，Ｋ４２５，Ｋ５２０及び／又はＮ５９５に相当する位置で、配列番号１と比較されるアミノ酸修飾を含んで成り；そして
ｄ）配列番号１のポリペプチドより、澱粉の凝集及び／又はパンの劣化を減少させる高い能力を有する、
ポリペプチド。
【請求項２６】
前記修飾が、Ａ３０Ｄ，Ｋ４０Ｒ，Ｎ１１５Ｄ，Ｔ１４２Ａ，Ｆ１８８Ｌ，Ｔ１８９Ｙ，Δ（１９１〜１９５），Ｄ２６１Ｇ，Ｔ２８８Ｐ，Ｎ３２７Ｓ，Ｋ４２５Ｅ，Ｋ５２０Ｒ及び／又はＮ５９５Ｉを含んで成る、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
適当な発現宿主において、前記変異体の発現を方向づける、１又は複数の調節配列に好ましくは作用可能に連結した、請求項９〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸配列、プロモーター、並びに転写及び翻訳終結シグナルを含んで成り、そして好ましくは更に選択マーカーを含んで成る組換え発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２７に記載の核酸配列又は請求項２８に記載のベクターを含んで成る、形質転換される宿主細胞。
【請求項３０】
ａ）前記変異体の発現を誘導する条件下で、請求項２９に記載の形質転換した宿主細胞の培養；及び
ｂ）前記変異体の回収、
を含んで成る、請求項９〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項３１】
請求項９〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド、又は請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって製造した変異体を、パンの劣化を遅らせるのに効果的である量において、生地に加えることを含んで成る、生地又は前記の生地から製造した焼いた産物の製造方法。
【請求項３２】
前記変異体が、小麦粉のkg当たり０．１〜５mg、好ましくは０．５〜２mg／kgの量において加えられる請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマルトース産生アルファアミラーゼの変異体及びその様な変異体の構築方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マルトース産生アルファアミラーゼ（グルカン  １，４−α−マルトハイドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３３）は、アミロース及びアミロペクチンをα−配置においてマルトースに加水分解することができ、そしてマルトトリオース及びシクロデキストリンもまた加水分解することができる。
【０００３】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のマルトース産生アルファアミラーゼ（欧州特許第１２０６９３号）は商品名Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）（ＤｅｎｍａｒｋのNovo Nordisk A/Sの製品）のもと、商業的に入手可能であり、そしてその澱粉の凝集（retrogradation）を減少させる能力により、抗劣化剤としてベーキング薬において幅広く使用されている。Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）はシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）と、配列の相同性（Henrissat B., Bairoch A. 1996)及びトランスグリコシル化生成物（Christophersen, C., et al., 1997, Starch, vol.50, No.1, 39〜45) の構成を含む、いくつかの特徴を分かち合う。
【０００４】
シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ又はシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼとしても称され、本明細書ではＣＧＴアーゼとして省略されるシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．１９）は、澱粉及び類似の基質のシクロマルトデキストリンへの変換を触媒し、これは分子内トランスグリコシル化反応を介し、それによって様々なサイズのシクロマルトデキストリン（又はＣＤ）を形成する。
【０００５】
ＣＧＴアーゼは幅広く分布し、そしていくつかの異なる細菌源に由来し、これは文献に詳細に記述されてきたバチルス、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）及びサーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含む。サーモアナエロバクター・スペーシスによって産生したＣＧＴアーゼは、Norman B B, Jorgersen S T ;Denpun Kagaku 1992 39 99 〜106 、及び国際公開第８９／０３４２１号において報告され、そしてアミノ酸配列が国際公開第９６／３３２６７号に開示された。サーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリジェネス（ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）由来及びバチルス・サーキュランシス（ｃｉｒｃｕｌａｎｓｉｓ）由来のＣＧＴアーゼの配列はｐｄｆファイル１ＣＩＵとしてインターネット（ＳＣＯＰ又はＰＤＦのホームページ）上で入手可能であり、そしてＢ．サーキュランス（ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のＣＧＴアーゼの配列は、ｐｄｆファイル１ＣＤＧとして入手可能である。
【０００６】
Tachibana, Y., Journal of Fermentation and Bioengineering, 83 (6), 540〜548 (1997)は、ＣＧＴアーゼのクローニング及び発現を記載している。ＣＧＴアーゼの変異体はKim, Y. H., Biochemistry and Molecular Biology International, 41 (2), 227 〜234 (1997) ; Sin K-A, Journal of Biotechnology, 32 (3), 283 〜288 (1994) ; D Penninga, Biochemistry, 34 (10), 3368〜3376 (1995) ; 及び国際公開第９６／３３２６７号によって記載されてきた。
【０００７】
近年、いくつかのＣＧＴアーゼの三次構造が報告されてきた。Hofman等〔Hofman B E, Bender H, Schuitz G E ; J. Mol. Biol. 1989 209 793〜800 〕及びKlein とSchultz [Klein C, Schultz G E ; J. Mol. Biol. 1991 217 737〜750]はバチルス・サーキュランスの菌株８由来のＣＧＴアーゼの三次構造を報告し、Kubota等〔Kubota M, Matsuura Y, Sakai S and Katsube Y ; Denpun Kagaku 1991 38 141 〜146 〕はバチルス・ステアロサーモフィラス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＴＣ−９１由来のＣＧＴアーゼの三次構造を報告し、Lawson等〔Lawson C L, van Montfort R, Strokopytov B, Rozeboom H J, Kalk K H, de Vries G E, Peaninga D, Dijkhuizen L, and Dijkstra B W ; J. Mol. Biol 1994 236 590 〜600 〕はバチルス・サーキュランスの菌株２５１由来のＣＧＴアーゼの三次構造を報告し、Strokopytov 等〔Strokopytov B, Penninqa D, Rozeboom H J ; Kalk K H, Dijkhuizen L and Dijkstra B W ; Biochemistry 1995 34 2234 〜2240〕はバチルス・サーキュランスの菌株２５１由来のＣＧＴアーゼの三次構造を報告し、このＣＧＴアーゼはアカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）、効果的なＣＧＴアーゼ阻害剤と共に複合されており、そしてKnegtel 等〔Knegtel R M A, Wind R D, Rozeboom H J, Kalk K H, Buitelaar R M, Dijkhaizen L and Dijkstra B W ; J. Mol. Biol. 1996 256 611〜622 〕はサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリジェネス由来のＣＧＴアーゼの三次構造を報告している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者は、前記のマルトース産生アルファアミラーゼの三次元構造に基づき、向上した特性を有する変異体を得るために、マルトース産生アルファアミラーゼのアミノ酸配列を修飾した。前記変異体は、変化した物理化学的特性、例えば変化した至適pH、向上した熱安定性、向上した比活性、変化した開裂パターン又は澱粉の凝集若しくはパンの劣化を減少させることの増大した能力を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法を提供し、ここで前記変異体は、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼと比較して少なくとも１つの変化した特性を有し、この方法は：
ｉ）構造的配位の評価に基づき、前記の特性の変化に関係する、前記マルトース産生アルファアミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基又は少なくとも１つの構造的領域を同定するために、前記マルトース産生アルファアミラーゼの構造を解析し；
ii）前記の親と比較して、前記の特性を変えるために、アミノ酸残基又はｉ）において同定される構造的な部分において修飾された、前記マルトース産生アルファアミラーゼの変異体を構築し；そして
iii)前記の生じたマルトース産生アルファアミラーゼ変異体を前記特性について試験する、
ことを含んで成る。
【００１０】
本発明の上述した方法によって変化することができる特性は、例えば安定性、pH依存活性、澱粉又はパンの劣化を減少させる能力、比活性、あるいは基質特異性であることができる。従って、前記変異体は、例えば増大した熱安定性若しくはより低いpHでのより高い活性である変化した至適pH、向上した熱安定性、増大した比活性又は澱粉の凝集若しくはパンの劣化を減少させることの増大した能力を有することができる。
【００１１】
より更なる観点において、本発明はマルトース産生アルファアミラーゼの変異体、その様な変異体をコードするＤＮＡ及び前記変異体の製造方法に関する。最終的に、本発明は様々な工業用の目的、特にベーキングのための、前記変異体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はｐＬＢｅｉ０１０を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
マルトース産生アルファアミラーゼ
前記マルトース産生アルファアミラーゼはＥＣ３．２．１．１３３に分類される酵素である。酵素活性は基質の非還元末端を必要とせず、そして主な酵素活性はマルトース及び長鎖マルトデキストリンへのアミロペクチン及びアミロースの分解を引き起こす。アミロース及びアミロペクチンをアルファ配置においてマルトースに加水分解することが可能であり、そしてマルトトリオース及びシクロデキストリンを加水分解することもまた可能である。
【００１４】
特に好ましいマルトース産生アルファアミラーゼは、欧州特許第１２０６９３号に記載の、バチルスからクローン化したアミラーゼである（以後Ｎｏｖａｍｙｌとして言及する）。Ｎｏｖａｍｙｌは配列番号１の１〜６８６のアミノ酸に記載のアミノ酸配列を有する。Ｎｏｖａｍｙｌは配列番号１に記載の核酸配列を有するバチルスの菌株ＮＣＩＢ  １１８３７に宿されている遺伝子においてコードされる。Ｎｏｖａｍｙｌの三次元構造を下文に記載する。
【００１５】
一般に、好ましいマルトース産生アルファアミラーゼは１又は複数の以下の特徴を有するべきである：
ｉ）Ｎｏｖａｍｙｌに対する三次元構造の相同性、
ii）配列番号１に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％又は９０％、例えば９５％又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列、
iii)配列番号１に記載のＤＮＡ配列又はバチルスの菌株ＮＣＩＢ１１８３７に宿されるＮｏｖａｍｙｌをコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列；
iv）付表１に位置を示した、Ａｓｎ７７からの主鎖のカルボニル原子、Ｇｌｕ１０２からの側鎖の原子ＯＥ２及びＯＥ１、Ａｓｐ７９からの側鎖の原子ＯＤ１、Ａｓｐ７６からの側鎖の原子ＯＤ１、及びＧｌｕ１０１からの側鎖の原子ＯＥ１、並びに水分子ＷＡＴ  Ｖ２１、原子ＯＷ０に相当する配位を含んで成るカルシウム結合部位；
ｖ）配列番号１に示すアミノ酸配列の残基１９１〜１９５に等しい位置における、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒに相当する５個のアミノ酸の配列；そして
上述のｉ）で言及される構造の相同性は、他の配列の相同性、疎水性クラスター解析に基づき、あるいはreverse threading (Huber, T ; Torda, AE,PROTEIN SCIENCE Vol.7, No.1 pp.142〜149 (1998)) により、そしてこれらの方法のいずれかによってＮｏｖａｍｙｌと同じ三次構造を持つことが予想され、ここで前記の三次構造は全体のフォールディング又は更に好ましくはドメインＤを含み、そして最も好ましくはドメインＥを含むドメインＡ，Ｂ、及びＣのフォールディングを言及する。あるいは、Ｎｏｖａｍｙｌとマルトース産生アルファアミラーゼとの間の構造の配列合わせは、等しい位置を同定するために使用することができる。
【００１６】
上述のiv）で言及したカルシウム結合部位はＮｏｖａｍｙｌの三次元構造において定義されるカルシウム結合部位に基づき、そして下文の“カルシウム結合部位”の項目において議論される。
上述のｖ）で言及した“等しい位置”は当業界で知られている方法を用いる、アミノ酸若しくはＤＮＡ配列の配列合わせ又は構造の相同性に基づいている。
マルトース産生アルファアミラーゼの三次元構造
Ｎｏｖａｍｙｌを本発明の基礎を形成する三次元構造を解明するために使用した。
【００１７】
Ｎｏｖａｍｙｌの構造をＸ線結晶学法の原理に従い、例えば、X-Ray Structure Determination, Stout, G. K. and Jersen, L. H., John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989 に与えられている様に解決した。
同形置換法を用いる２，２Åの分離での、Ｎｏｖａｍｙｌの解決された結晶構造の構造配置を、付表１に記載した標準的なＰＤＢ形式（Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, CT)に与える。付表１が本出願の一部を形成することが理解される。付表１の文脈において、以下の略語を使用する：ＣＡはカルシウムイオン又はポリペプチド主鎖のアルファ炭素原子を意味し、ＷＡＴは水又はカルシウムを意味し、ＭＡＬはマルトースを意味し、ＨＥＸは基質類似体の炭水化物単位を意味し、そしてＳＵＬは硫酸イオンを意味する。
【００１８】
前記酵素のアミノ酸残基は、それら各自の一又は三文字アミノ酸コードによって、本明細書で同定される。
前記マルトース産生アルファアミラーゼの構造は、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ及びＥに整理される５つの球状ドメインから構成される。前記ドメインは、ドメインＡが残基１〜１３２及び２０４〜４０３、ドメインＢが残基１３３〜２０３、ドメインＣが残基４０４〜４９６、ドメインＤが残基４９７〜５７９、そしてドメインＥの残基５８０〜６８６であるとして定義され、ここで前記の番号付けは配列番号１のアミノ酸配列を言及する。
ドメインＡ
ドメインＡは最大のドメインであり、そして前記酵素の表面における割れ目の底で空間的に配置される、３つのアミノ酸残基Ｄ３２９，Ｄ２２８及びＥ２５６のクラスターを含んで成る活性部位を含む。ドメインＡの構造は、構造が知られている前記のαアミラーゼと共通の、全体の折りたたみを示し、すなわち８個の中心のベータストランド（１〜８と番号を付けた）を有する（ベータ／アルファ）の８個のバレル（ｂａｒｒｅｌ）及び８個の側面に位置するα−ヘリックスの構造である。前記のβ−バレルは引用書のMcGregorによって定義される。前記のベータストランド１のＣ末端の端はループ１と表わされるループによって、ヘリックス１に連結し、そして同一のパターンが他のループで見出されるが、前記ループはサイズのいくつかの変化を示し、そしていくつかは極めて長いことがある。
【００１９】
前記の（ベータ／アルファ）の８個のバレルにおける８個の中心のベータストランドは、ＣＧＴアーゼの知られている構造と、合理的によく重なり合う。前記のベータストランドのＣ末端に位置する活性部位の近辺を含む、前記の構造の一部は、ＣＧＴアーゼと、高い値の同一性を示す。
対照的に、ベータストランド及びアルファヘリックスに連結するループは、ＣＧＴアーゼの知られている構造から、高い値の変化を示す。これらのループは、前記活性部位の構造的な前後関係を構成し、そして前記の基質に接触する大部分が、これらのループ内に位置する残基の間で見出される。基質特異性、基質結合、pH活性プロファイル、基質開裂パターンなどの様な特徴の識別は、特異的なアミノ酸、及びこれらのループ内でそれらが占める位置によって決定される。Ｎｏｖａｍｙｌにおいて、ドメインＡは２つのカルシウム結合部位を含み、この１つはＣＧＴアーゼにおけるカルシウム結合部位と相同性があり；他方はＮｏｖａｍｙｌに独特である。前記のカルシウム結合部位の構造は、下文の“カルシウム結合部位”の項目において更に議論される。
ドメインＢ
ドメインＢは、前記の（ベータ／アルファ）の８個のバレルのループ３としても言及され、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１３３〜２０３を含んで成る。前記の構造はＣＧＴアーゼ内のドメインＢの構造に、部分的に相同であり、最も目立つ差異は、ＣＧＴアーゼに見られない、配列番号１に示すアミノ酸配列における１９１〜１９５位に相当する５個のアミノ酸挿入の存在である。この挿入は前記活性部位の近くに、及び基質との接触の近くに、空間的に位置する。
ドメインＣ
ＮｏｖａｍｙｌのドメインＣは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基４０４〜４９６を含んで成る。ドメインＣは自身の背後を折りたたむ、単一の８個のストランドシート構造を形成する、β−ストランドの全体から構成され、そしてその結果β−サンドイッチ構造として記述されることがある。前記β−シートの一部分はドメインＡの界面を形成する。
カルシウム結合部位
前記のマルトース産生アルファアミラーゼの構造は、３つのカルシウム結合部位を示し；それはカルシウムイオンが前記の構造内に存在することが見出されているということである。知られているファミリーの１３の構造の多くと共通して、付表１の１つのカルシウムイオン、ＷＡＴ６９３は、ドメインＡとＢとの間に位置する。このカルシウムイオンは、Ｇｌｕ１８４及びＨｉｓ２３２の主鎖のカルボニル原子、Ａｓｐ１９８の側鎖の原子ＯＤ２及びＯＤ１、Ａｓｎ１３１の側鎖のＯＤ１、並びに３つの水分子ＷＡＴ  Ｖ１，ＷＡＴ  Ｖ５及びＷＡＴ  Ｖ８によって配位する。
【００２０】
第２のカルシウムイオンはＡのドメイン内に位置し、そしてＣＧＴアーゼに共通しているが、α−アミラーゼ内には見出されない。カルシウムイオンＷＡＴ６９４が、Ｇｌｙ４８及びＡｓｐ２３の主鎖のカルボニル原子、Ａｓｐ５０の側鎖の原子ＯＤ２、Ａｓｐ２１の側鎖の原子ＯＤ１、Ａｓｎ２６の側鎖のＯＤ１、並びにＡｓｎ２７の側鎖の原子のＯＤ１、並びに１つの水分子ＷＡＴ  Ｖ６２によって配位する。
【００２１】
第３のカルシウムイオンはＡのドメイン内に位置し、そしてＮｏｖａｍｙｌに独特である。そのカルシウムイオンはＷＡＴ６９２であり、そしてその配位はＡｓｎ７７の主鎖のカルボニル原子、Ｇｌｕ１０２の側鎖の原子ＯＥ２及びＯＥ１、Ａｓｐ７９の側鎖の原子ＯＤ１、Ａｓｐ７６の側鎖の原子ＯＤ１、並びにＧｌｕ１０１の側鎖の原子ＯＥ１、並びに１つの水分子ＷＡＴ  Ｖ２１を含んで成る。
基質結合部位
ドメインＡ及びＢの前後における、上文で議論したループの一部は、それぞれ基質の相互作用及び活性部位との特定の注目がある。特に、ドメインＡにおける、ループ１内の残基３７〜４５、ループ５内の残基２６１〜２６６、ループ７内の残基３２７〜３３０及びループ８内の残基３７０〜３７６であり；ドメインＢにおける、ループ３内の残基１３５〜１４５、ループ３内の残基１７３〜１８０及び１８８〜１９６であり、ここで残基の位置は配列番号１のアミノ酸配列中のアミノ酸に相当する。
【００２２】
あらゆる理論に限定されることなしに、前記の基質分子と酵素との間の４〜６Åの範囲内に見出される有利な相互作用、例えば水素結合及び／又は強い静電的相互作用によって、基質と酵素との間の結合が支持されると現在信じられている。Ｎｏｖａｍｙｌ（配列番号１）の以下の残基は、基質のＨＥＸの６Åの距離以内にあり、そしてその結果前記の基質との相互作用に関わることが信じられている：
４４，８９，９０，９２，９３，１２７，１２９，１３２，１３５，１７７，１７８，１８８，１９１，１９４，１９６，２２６，２２８，２２９，２３０，２３１，２３２，２５６，２５８〜２６１，２８８，３２８，３２９，３７１，３７２，３７３，３７６、及び６９０。
【００２３】
Ｎｏｖａｍｙｌの以下の残基は、基質のＨＥＸの４Åの距離以内にあり、そしてその結果、前記の基質との相互作用に関わることが信じられている：
９０，９２，９３，１２９，１３２，１７７，１８８，１８９，１９０，１９１，１９６，２２６，２２８，２２９，２３１，２３２，２５６，２５８，２５９，２６０，２６１，３２８，３２９，３７２，３７６、及び６９０。
Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）の相同性構築
Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）の構造は、本明細書の付表１に開示した構造上に構築されたモデルであった。他のマルトース産生アルファアミラーゼの構造を相似的に構築することができる。
【００２４】
マルトース産生アルファアミラーゼのモデル構造は、相同性プログラム又は比較プログラム、例えばＭｏｄｅｌｌｅｒ（共にMolecular Simulations, Inc., San Diego, CA) を用いて構築することができる。知られている構造を有するマルトース産生アルファアミラーゼの配列と、モデル構造が構築されるべきマルトース産生アルファアミラーゼのそれとを配列合わせすることが原理である。次に構造的に保存されている領域を、共通配列を基にして構築することができる。相同性を欠く領域において、例えばプログラムの相同性を用いてループ構造を挿入することができ、あるいは配列が、必要な残基に続く結合を欠失することができる。前記構造の続く弛緩及び最適化は相同性又は別の分子のシミュレーションプログラムのいずれか、例えば分子のシミュレーションからのＣＨＡＲＭｍを行うべきである。
【００２５】
新規マルトース産生アルファアミラーゼ変異体の設計方法
第１の観点において、本発明は親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法に関し、ここで前記変異体は前記の親α−アミラーゼと比較して、少なくとも１つの変化した特徴を有し、この方法は：
ｉ）構造又は機能の考察に基づき、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼの前記の特徴の変化に最適であることが決定される、前記α−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸又は構造的領域を同定するための前記のマルトース産生アルファアミラーゼの構造解析；
ii）前記の親と比較して、ｉ）において同定されたアミノ酸残基又は構造的な領域において修飾され、前記の特徴を変化させるために修飾された、マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築；及び
iii)前記特徴のための、生じた変異体の試験、
を含んで成る。
【００２６】
本発明の方法の段階ｉ）において同定される構造部分を、１つのアミノ酸残基から構成することができる。しかしながら、通常、前記構造部分は１以上のアミノ酸残基を含んで成り、これは典型的に前記のマルトース産生アルファアミラーゼ構造の上述の部分の１つ、例えばＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ又はＥのドメイン、これらのドメインのいずれかの間の界面、カルシウム結合部位、ループ構造、基質結合部位などを構成している。
【００２７】
前記の構造又は機能の考察は、関連のある構造又は構造部分、及び前記酵素の機能上のその予期される影響に関与することができる。例えば、マルトース産生アルファアミラーゼと、様々なＣＧＴアーゼとの間の機能の差異の解析は、Ｎｏｖａｍｙｌのある特徴がＮｏｖａｍｙｌのある部分に原因があるとするために、又はその様な関係を予期するために使用することができる。例えば、前記の活性部位の周辺のループのパターン又は構造における差異は、基質の活性部位への接近における差異、そしてその結果、基質特異性及び／又は開裂パターンにおける差異を生むことができる。
【００２８】
更に、基質の結合、並びにこの様な、例えば基質特異性及び／又は開裂、カルシウムイオンの結合、輸送、例えば前記酵素のカルシウム依存性などに関わるマルトース産生アルファアミラーゼの部分が、同定されてきた（以下を参照とのこと）。
構造領域のアミノ酸残基の修飾は、典型的に問題の親ペプチドをコードするＤＮＡ配列の適当な修飾によって達成される。前記の修飾は、アミノ酸残基又は構造部分の置換、欠失又は挿入であることができる。
【００２９】
修飾されるべき特性は安定性（例えば熱安定性）、pH依存活性、基質特異性、比活性あるいは澱粉の凝集又はパンの劣化を減少させる能力であることができる。従って、変化した特徴は与えられたpHでの変化した比活性及び／又は変化した基質特異性、例えば基質の開裂の変化したパターン若しくは基質の阻害の変化したパターンであることができる。
【００３０】
本発明に従う方法の段階ii）において、同定されるべき構造の部分は、好ましくは折りたたまれた酵素における基質と接触することが信じられており（上文の“基質結合部位”と題した項目を参照とのこと）、あるいは基質特異性及び／又は開裂パターンに関わるものであり、並びに／あるいはカルシウムイオンの１つと接触するもの、並びに／あるいは前記酵素のpH若しくは温度のプロファイルに寄与し、又はさもなければ前記のマルトース産生アルファアミラーゼの特徴に責任のあるものである。
【００３１】
以下に記載するのは、本発明の方法の使用によって設計された変異体の具体的な型である。
本発明の変異体は、本明細書に記載の修飾に加えて、更なる修飾を含んで成ることができる。前記変異体は、配列番号１と７０％以上、好ましくは８０％以上、特に９０％以上、とりわけ９５％以上、例えば９８％以上の同一性を有するアミノ酸を有する。
変化したpH依存活性プロファイルを有するマルトース産生アルファアミラーゼ
pH依存活性プロファイルは、前記のマルトース産生アルファアミラーゼの活性部位の１０Å以内の残基のpKa を変化させることによって変化することができる。前記の活性部位のpKa の変化は、例えば与えられるアミノ酸残基のアミノ酸側鎖の官能基と、その近辺との間の静電的相互作用又は疎水性相互作用を変化させることによって達成される。より高いpHにおいて、より高い活性を得るために、負電荷の残基が水素を提供する酸の近くに位置するのに対し、正電荷の残基が求核性の酸の近くに位置することで、低いpHでのより高い活性が引き起こされるだろう。また、前記のpKa の減少は水の接近しやすさの減少又は周囲の疎水性の増大によって得ることができる。
【００３２】
従って、本発明の別の観点は親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体に関し、ここで前記変異体は、前記の親と比較して変化したpH依存活性プロファイルを有し、ここで前記変異体は以下の方法によって得ることができる：
ｉ）前記親マルトース産生アルファアミラーゼの三次元構造における、マルトース産生アルファアミラーゼの活性部位の残基から１５Å、特に活性部位の残基から１０Å以内のアミノ酸残基の同定であって、活性部位の残基との静電的又は疎水性的相互作用に関わることが予期される前記アミノ酸残基の同定；
ii）前記の構造における、活性部位の残基の静電的及び／又は疎水性的環境を変化させるアミノ酸残基による、前記のアミノ酸残基の置換、及び前記構造におけるアミノ酸残基の適応の評価、
iii)アミノ酸の置換が前記構造内に適応されたことを確認するまでの、循環的な、段階ｉ）及び／又はii）の任意な繰り返し、
iv）段階ｉ）及びii）、並びに任意にiii)から生じるマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の構築、並びに前記変異体のpH依存酵素活性の試験。
【００３３】
好ましい態様において、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼと比較して、変化したpH依存活性プロファイルを有するマルトース産生アルファアミラーゼの変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１又は複数の以下の残基に相当するアミノ酸残基の修飾を含んで成る：
Ｄ１２７，Ｖ１２９，Ｆ１８８，Ａ２２９，Ｙ２５８，Ｖ２８１，Ｆ２８４，Ｔ２８８，Ｎ３２７，Ｍ３３０，Ｇ３７０，Ｎ３７１、及びＤ３７２、
Ｌ７１，Ｓ７２，Ｖ７４，Ｌ７５，Ｌ７８，Ｔ８０，Ｌ８１，Ｇ８３，Ｔ８４，Ｄ８５，Ｎ８６，Ｔ８７，Ｇ８８，Ｙ８９，Ｈ９０，Ｇ９１，Ｔ９４，Ｒ９５，D ９６，F ９７，Ｉ１７４，S １７５，Ｎ１７６，Ｄ１７８，Ｄ１７９，Ｒ１８０，Ｙ１８１，Ｅ１８２，Ａ１８３，Ｑ１８４，Ｋ１８６，Ｎ１８７，Ｆ１８８，Ｔ１８９，Ｄ１９０，Ａ１９２，Ｇ１９３，Ｆ１９４，Ｓ１９５，Ｌ１９６。
【００３４】
更に好ましい態様において、前記変異体は配列番号１に記載のアミノ酸配列における１又は複数の以下の修飾に相当する修飾を含んで成る：
【００３５】
【化１】
2010148525.tif 000003
【００３６】
同様の修飾を他のマルトース産生アルファアミラーゼの等しい位置において導入することができる。特定の注目がある変異体は、本明細書で開示した他の修飾のいずれかと、１又は複数の上述したものとの組合わせを有する。
変化した安定性を有するマルトース産生アルファアミラーゼ変異体
向上した安定性（典型的に増大した安定性）を有する変異体を、カルシウム結合の安定化、プロリンによる置換、別のアミノ酸によるヒスチジンの置換、ドメイン間ジスルフィド結合の導入、脱アミド化部位の除去、水素結合の接触の変化、より大きな側鎖の基を有する１又は複数のアミノ酸による、内部構造の穴の充填、電荷分布の変化、ヘリックスのキャッピング、あるいは塩橋の導入によって得ることができる。
カルシウム結合
本発明は、親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体を提供し、これは変化したカルシウム（Ｃａ2+）結合の安定性により、変化した安定性を有する。前記の酵素変異体は変化した熱安定性又はpH依存安定性を有することができ、あるいはそれは低濃度のカルシウムイオンの存在下でのマルトース産生アルファアミラーゼ活性を有することができる。現在、カルシウムイオンから１０Å以内に位置するアミノ酸残基が関与し、あるいは前記酵素のＣａ2+結合能力にとって重要であることが信じられている。
【００３７】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するマルトース産生アルファアミラーゼのＣａ2+結合部位から１０Åの距離以内に見出されるアミノ酸残基は、例２に記載した様に決定され、そして以下の様である：
１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３５，３６，４０，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５６，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８７，８８，８９，９１，９３，９４，９５，９６，９９，１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０９，１２９，１３０，１３１，１３２，１３３，１３４，１４５，１５０，１６７，１６８，１６９，１７０，１７１，１７２，１７４，１７７，１８０，１８１，１８２，１８３，１８４，１８５，１８６，１８７，１８８，１８９，１９６，１９７，１９８，１９９，２００，２０１，２０２，２０６，２１０，２２８，２２９，２３０，２３１，２３２，２３３，２３４，２３５，２３７，３７８、及び６３７。
【００３８】
本発明のこの観点に従う変異体を構築するために、少なくとも１つの上述したアミノ酸残基を置換することが望ましく、これは前記変異体酵素のＣａ2+結合親和性を向上する他のアミノ酸残基のいずれかにより、至適でないカルシウム結合に関わることを決定する。従って、本発明の別の観点は親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法に関し、ここで前記変異体は前記の親と比較して、安定化したＣａ2+結合を有し、この方法は：
ｉ）構造又は機能の考察から、至適でないカルシウムイオンの相互作用の原因であることが決定される前記α−アミラーゼの三次元構造のモデルにおける、マルトース産生アルファアミラーゼのＣａ2+結合部位から１０Å以内のアミノ酸残基の同定；
ii）前記アミノ酸残基が、構造又は機能の考察から、変化したＣａ2+結合親和性を確立するために重要であることが決定される別のアミノ酸残基と置換される変異体の構築；及び
iii)生じたマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の、Ｃａ2+結合の試験、
を含んで成る。
【００３９】
別の残基による、至適でないカルシウムイオンの相互作用の原因であるアミノ酸残基の置換は、前記酵素のカルシウムイオン結合相互作用を変えることができる。例えば、問題のアミノ酸残基は１又は複数の以下の目的を基本として選択することができる：
ａ）前記のマルトース産生アルファアミラーゼの構造から同定した様な、カルシウムイオンとアミノ酸残基との間の向上した相互作用を得るため。例えば、問題のアミノ酸残基が周囲の溶媒にさらされているならば、前記アミノ酸残基とカルシウムイオンとの間の相互作用を安定化させるために、溶媒からの前記アミノ酸残基の遮へいを増大することは有利であることができる。このことは、前記アミノ酸、又は前記の遮へいに寄与する前記のアミノ酸残基の近傍のアミノ酸残基を、より大きな側鎖の基を有するか又は向上した遮へい効果を生む他の状態のアミノ酸残基で置換することによって達成することができる。
【００４０】
ｂ）例えば前記マルトース産生アルファアミラーゼの構造を安定化することによりカルシウム結合部位を安定化させるためであって、例えば２又はそれ以上の５個のドメインの間の接触を安定化すること、又は１又は複数の個々のドメイン自身を安定化することによる。このことは、例えばアミノ酸側鎖により良い配位を提供することによって達成することができ、これは例えばカルシウム結合部位の、例えば１０Å以内、及び好ましくは３又は４Å以内のＮ残基をＤ残基によって、そして／あるいはＱ残基をＥ残基によって置換することで達成することができる。
【００４１】
ｃ）前記カルシウムイオンと前記カルシウム結合残基との間の配位を向上するためであって、例えば、これは前記イオンと前記配位残基との間の相互作用を向上させるか又は配位している水をアミノ酸の側鎖で置換することによって側鎖の配位数を増大させることによる。
ｄ）アミノ酸残基にカルシウムを配位させることにより、水を置換するため。
【００４２】
好ましくは、修飾されるべきアミノ酸残基はＣａ2+イオンの８Å以内、好ましくはＣａ2+イオンの５Å以内に位置する。８Å及び５Å以内のアミノ酸残基はそれぞれ、１０Å以内のアミノ酸残基を同定するために使用される類似の方法によって容易に同定することができる（例２を参照のこと）。
好ましい態様において、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼと比較したときに、変化したＣａ2+結合を有するマルトース産生アルファアミラーゼの変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１又は複数の以下の残基に相当するアミノ酸残基の置換を含んで成る；
Ｄ１７，Ａ３０，Ｓ３２，Ｒ９５，Ｈ１０３，Ｎ１３１，Ｑ２０１，Ｉ１７４、及び／又はＨ１６９、
Ｖ７４，Ｌ７５，Ｌ７８，Ｔ８０，Ｌ８１，Ｔ８７，Ｇ８８，Ｙ８９，Ｈ９０，Ｇ９１，Ｔ９４，Ｒ９５，Ｄ９６，Ｆ９７，Ｙ１６７，Ｆ１６８，Ｈ１６９，Ｈ１７０，Ｎ１７１，Ｇ１７２，Ｄ１７３，Ｉ１７４，Ｓ１７５，Ｎ１７６，Ｄ１７８，Ｄ１７９，Ｒ１８０，Ｙ１８１，Ｅ１８２，Ａ１８３，Ｑ１８４，Ｋ１８６，Ｎ１８７，Ｆ１８８，Ｔ１８９。
【００４３】
更に好ましい態様において、マルトース産生アルファアミラーゼの前記変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１又は複数の以下の置換に相当する置換を含んで成る：
【００４４】
【化２】
2010148525.tif 000004
【００４５】
マルトース産生アルファアミラーゼのＣａ2+結合を変化させることに関する、本発明の別の好ましい態様において、配列番号１に記載の部分配列Ｎ２８−Ｐ２９−Ａ３０−Ｋ３１−Ｓ３２−Ｙ３３−Ｇ３４が修飾される。
同様の置換を、他のマルトース産生アルファアミラーゼの等しい位置において導入することができる。特定の注目がある修飾は、本明細書に開示した他の修飾のいずれかと、１又は複数の上述したものとの組合わせのいずれかである。
他の置換
前記酵素の向上した安定性を有する変異体は、新規のドメイン間及びドメイン内の接触の存在又は導入を向上することによって達成することができる。その様な向上した安定性は、以下に記載する修飾によって達成することができる。
【００４６】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するマルトース産生アルファアミラーゼは、１又は複数のドメイン間ジスルフィド結合の導入によって安定化することができる。従って、本発明の別の好ましい態様は、前記の親と比較したときに向上した安定性及び少なくとも１又は複数のジスルフィド結合を有する親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体に関し、ここで前記の変異体は配列番号１の位置の少なくとも１つの以下の対に相当する位置の修飾を含んで成る：
Ｇ２３６＋Ｓ５８３，Ｇ６１８＋Ｒ２７２，Ｔ２５２＋Ｖ４３３及び／又はＡ３４８＋Ｖ４８７。
【００４７】
更に好ましい態様において、前記の置換は少なくとも１つの前記の以下の対に相当する：
Ｇ２３６Ｃ＋Ｓ５８３Ｃ，Ｇ６１８Ｃ＋Ｒ２７２Ｃ，Ｔ２５２Ｃ＋Ｖ４３３Ｃ及び／又はＡ３４８Ｃ＋Ｖ４８７Ｃ。
本発明の別の好ましい態様は前記の親と比較したときに向上した安定性及び変化したドメイン間相互作用を有する親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体に関し、ここで前記変異体は配列番号１の位置の、少なくとも１つの以下の組合わせに相当する位置の置換を含んで成る：
ｉ）Ｆ１４３，Ｆ１９４，Ｌ７８；
ii）Ａ３４１，Ａ３４８，Ｌ３９８，Ｉ４１５，Ｔ４３９，Ｌ４６４，Ｌ４６５；
iii)Ｌ５５７；
iv）Ｓ２４０，Ｌ２６８；
ｖ）Ｑ２０８，Ｌ６２８；
vi）Ｆ４２７，Ｑ５００，Ｎ５０７，Ｍ５０８，Ｓ５７３；及び
vii)Ｉ５１０，Ｖ６２０。
【００４８】
更に好ましい態様において、前記の置換は少なくとも１つの以下の組合わせに相当する：
ｉ）Ｆ１４３Ｙ，Ｆ１９４Ｙ，Ｌ７８Ｙ／Ｆ／Ｗ／Ｅ／Ｑ；
ii）Ａ３４１Ｓ／Ｄ／Ｎ，Ａ３４８Ｖ／Ｉ／Ｌ，Ｌ３９８Ｅ／Ｑ／Ｎ／Ｄ，Ｉ４１５Ｅ／Ｑ，Ｔ４３９Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｎ，Ｌ４６４Ｄ／Ｅ，Ｌ４６５Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｋ；
iii)Ｌ５５７Ｑ／Ｅ／Ｎ／Ｄ；
iv）Ｓ２４０Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ，Ｌ２６８Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｋ；
ｖ）Ｑ２０８Ｄ／Ｅ／Ｑ，Ｌ６２８Ｅ／Ｑ／Ｎ／Ｄ；
vi）Ｆ４２７Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｋ／Ｙ，Ｑ５００Ｙ，Ｎ５０７Ｑ／Ｅ／Ｄ，Ｍ５０８Ｋ／Ｒ／Ｅ／Ｑ，Ｓ５７３Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ；及び／又は
vii)Ｉ５１０Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｓ，Ｖ６２０Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ。
【００４９】
本発明の別の好ましい態様は、前記の親と比較したときに向上した安定性及び１又は複数の塩橋を有する親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体に関し、ここで前記変異体は配列番号１の位置の少なくとも１つの以下の組合わせに相当する位置の置換を含んで成る：
Ｎ１０６，Ｎ３２０及びＱ６２４。
【００５０】
更に好ましい態様において、前記のマルトース産生アルファアミラーゼの変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の以下の置換に相当する置換を含んで成る：
Ｎ１０６Ｒ，Ｎ３２０Ｅ／Ｄ及び／又はＱ６２４Ｅ。
本発明の別の態様は、向上した安定性を有する親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体に関し、そしてここで、前記変異体は配列番号１の少なくとも１つの以下の組合わせに相当する位置の置換を含んで成る：
Ｋ４０，Ｖ７４，Ｓ１４１，Ｔ１４２，Ｆ１８８，Ｎ２３４，Ｋ２４９，Ｄ２６１，Ｄ２６１，Ｌ２６８，Ｖ２７９，Ｎ３４２，Ｇ３９７，Ａ４０３，Ｋ４２５，Ｓ４４２，Ｓ４７９，Ｓ４９３，Ｔ４９４，Ｓ４９５，Ａ４９６，Ｓ４９７，Ａ４９８，Ｑ５００，Ｋ５２０，Ａ５５５及びＮ５９５。
【００５１】
更に好ましい態様において、前記のマルトース産生アルファアミラーゼの変異体は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、プロリンによる１又は複数の以下の置換に相当する置換を含んで成る：
Ｖ７４Ｐ，Ｓ１４１Ｐ，Ｎ２３４Ｐ，Ｋ２４９Ｐ，Ｌ２６８Ｐ，Ｖ２７９Ｐ，Ｎ３４２Ｐ，Ｇ３９７Ｐ，Ａ４０３Ｐ，Ｓ４４２Ｐ，Ｓ４７９Ｐ，Ｓ４９３Ｐ，Ｔ４９４Ｐ，Ｓ４９５Ｐ，Ａ４９６Ｐ，Ｓ４９７Ｐ，Ａ４９８Ｐ，Ｑ５００Ｐ、及び／又はＡ５５５Ｐ。
【００５２】
他の好ましい置換はＫ４０Ｒ，Ｔ１４２Ａ，Ｆ１８８Ｉ／Ｌ，Ｄ２６１Ｇ，Ｋ４２５Ｅ，Ｋ５２０Ｒ、及び／又はＮ５９５Ｉ。
同様に、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼに存在する１又は複数のヒスチジン残基が、非ヒスチジン残基、例えばＹ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｆ，Ｍ，Ｅ，Ｑ，Ｎ、又はＤで置換されることは好ましいことがある。従って、別の好ましい態様において、前記のマルトース産生アルファアミラーゼの変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１又は複数の以下の残基に相当するアミノ酸残基の置換を含んで成る：
Ｈ１０３，Ｈ２２０、及びＨ３４４。
【００５３】
更に好ましい態様において、前記のマルトース産生アルファアミラーゼの変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１又は複数の以下の置換に相当する置換を含んで成る：
Ｈ０１３Ｙ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｙ，Ｈ２２０Ｙ／Ｌ／Ｍ、及びＨ３４４Ｅ／Ｑ／Ｎ／Ｄ／Ｙ。
【００５４】
前記の親マルトース産生アルファアミラーゼに存在する１又は複数のアスパラギン又はグルタミン残基が、側鎖上のアミドを欠く残基で置換されることは好ましいことがある。従って、別の好ましい態様において、Ｎｏｖａｍｙｌ様の変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の、１又は複数の以下の残基に相当するアミノ酸残基を含んで成る：
Ｑ１３，Ｎ２６，Ｎ７７，Ｎ８６，Ｎ９９，Ｑ１１９，Ｎ１２０，Ｎ１３１，Ｎ１５２，Ｎ１７１，Ｎ１７６，Ｎ１８７，Ｑ２０１，Ｎ２０３，Ｎ２３４，Ｑ２４７，Ｎ２６６，Ｎ２７５，Ｎ２７６，Ｎ２８０，Ｎ２８７，Ｑ２９９，Ｎ３２０，Ｎ３２７，Ｎ３４２，Ｑ３６５，Ｎ３７１，Ｎ３７５，Ｎ４０１，Ｎ４３６，Ｎ４５４，Ｎ４６８，Ｎ４７４，Ｑ５００，Ｎ５０７，Ｎ５１３，Ｑ５２６，Ｎ５７５，Ｑ５８１，Ｎ６２１，Ｑ６２４及びＮ６６４。
【００５５】
更に好ましい態様において、前記のマルトース産生アルファアミラーゼの変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１又は複数の以下の残基に相当するアミノ酸残基の置換を含んで成る：
【００５６】
【化３】
2010148525.tif 000005
【００５７】
本発明の別の態様は、前記の親と比較して向上した安定性及び向上した水素結合の接触を有する親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体に関し、ここで前記変異体は配列番号１の１又は複数の以下の位置に相当する位置の修飾を含んで成る：
Ｉ１６，Ｌ３５，Ｍ４５，Ｐ７３，Ｄ７６，Ｄ７９，Ａ１９２，Ｉ１００，Ａ１４８，Ａ１６３＋Ｇ１７２，Ｌ２６８，Ｖ２８１，Ｄ２８５，Ｌ３２１，Ｆ２９７，Ｎ３０５，Ｋ３１６，Ｓ５７３，Ａ３４１，Ｍ３７８，Ａ３８１，Ｆ３８９，Ａ４８３，Ａ４８６，Ｉ５１０，Ａ５６４，Ｆ５８６，Ｋ５８９，Ｆ６３６，Ｋ６４５，Ａ６２９、及び／又はＴ６８１。
【００５８】
好ましい態様において、前記修飾は１又は複数の以下のものに相当する：
【００５９】
【化４】
2010148525.tif 000006
【００６０】
同様の置換を、他のマルトース産生アルファアミラーゼの等しい位置に導入することができる。特定の注目がある置換は、本明細書に開示した他の修飾のいずれかと、１又は複数の上述したものとの組合わせのいずれかである。
上述した目的のいずれかを達成するための、マルトース産生アルファアミラーゼ変異体を正確に構築する前に、前記の予期されるアミノ酸修飾が前記マルトース産生アルファアミラーゼ構造内に、例えば前記の親マルトース産生アルファアミラーゼの三次元構造内に適応されることができるかどうかを評価することは都合がよい。
変化した熱安定性及び／又は変化した温度依存活性プロファイルを有するマルトース産生アルファアミラーゼ変異体
本発明は更に、変化した熱安定性又は温度依存活性プロファイルを有する変異体を得るための、１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入により生じる、親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体に関する。
【００６１】
前記のマルトース産生アルファアミラーゼの構造は、水及びいくつかの割れ目を含むことがある、いくつかの独特の内部の穴を含む。前記ポリペプチドの熱安定性を増大させるために、前記の穴及び割れ目の数又はサイズを減少させることは望ましいことがあり、例えばこれは１又は複数の疎水性の接触を導入すること、好ましくは前記の穴の近傍又は周辺において、より大きな側鎖の基を有するアミノ酸を導入することによって達成される。例えば、修飾されるべきアミノ酸残基は、前記の穴の形成に関わるものである。
【００６２】
従って、更なる観点において本発明は、親マルトース産生アルファアミラーゼの、熱安定性を増大させ、そして／又は温度依存活性プロファイルを変化させる方法に関し、この方法は：
ｉ）前記ポリペプチドの三次元構造における、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼの、内部の穴又は割れ目の同定；
ii）前記の構造における、段階ｉ）で同定した穴又は割れ目の近傍の１又は複数のアミノ酸残基の、構造又は機能の考察から疎水性相互作用を増大させ、そして前記の穴又は割れ目のサイズを埋めるか又は減少させることが決定される別のアミノ酸残基による置換；そして
iii)段階ii）から生じる前記の親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築並びに前記変異体の熱安定性及び／又は温度依存活性の試験、
を含んで成る。
【００６３】
付表１で同定される構造は、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼの穴又は割れ目を同定するために使用することができる。
前記の穴又は割れ目が、前記の穴又は割れ目を囲むアミノ酸残基によって同定され、そして前記のアミノ酸残基の修飾が、前記の穴又は割れ目のサイズを埋めるか又は減少させるのに重要であることは理解されるだろう。好ましくは、前記の修飾は、より大きなアミノ酸残基、すなわち、より大きな側鎖のかさを有するものによる置換である。例えば、全てのアミノ酸がＧｌｙよりも大きいのに対し、Ｔｙｒ及びＴｒｐはＰｈｅより大きい。以下に言及される特定のアミノ酸残基は、結晶構造において問題の穴又は割れ目の側面に位置することが見出されたものである。
【００６４】
好ましい態様において、前記のマルトース産生アルファアミラーゼの変異体は、前記構造の内部に位置する穴を完全にか又は部分的にかのいずれかで埋めるために、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１又は複数の残基に相当するアミノ酸残基の置換を含んで成る：
【００６５】
【化５】
2010148525.tif 000007
【００６６】
更に好ましい態様において、前記のマルトース産生アルファアミラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列における以下の置換に相当する１又は複数の置換を含んで成る：
Ｌ７５と組合わせたＬ２１７（例えば、Ｌ７５Ｆ／Ｙと組合わせたＬ２１７Ｆ／Ｙ）、
【００６７】
【化６】
2010148525.tif 000008
【００６８】
同様の置換を、他のマルトース産生アルファアミラーゼの等しい位置に導入することができる。特定の注目がある変異体は、本明細書に開示した他の修飾のいずれかと、１又は複数の上述したものとの組合わせを有する。
変化した開裂パターンを有するマルトース産生アルファアミラーゼ変異体
本発明の目的の１つは、マルトース産生アルファアミラーゼの分解特性を変化させることである。従って、Ｎｏｖａｍｙｌは澱粉を加水分解して、支配的にマルトース（Ｇ２）及び少量のグルコース（Ｇ１）を形成するが、事実上それ以上のオリゴ糖（Ｇ３＋）は形成しない。例えば、より多くの量のより大きなオリゴ糖、例えばマルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）及びマルトペンタオース（Ｇ５）を形成するために、この開裂パターンを変化させることは望ましいことがある。
【００６９】
前記の親と比較して、基質の開裂パターンが変化する、親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体は、以下のことを含んで成る方法によって構築することができる：
ｉ）前記の三次元構造のモデルにおける、前記マルトース産生アルファアミラーゼの基質結合領域、例えば“基質結合部位”と題した上述の項目において定義した、基質結合部位から４Åの範囲内の同定；
ii）構造又は機能の考察から、変化した基質の開裂パターンを起こすことが信じられている別のアミノ酸による、前記の親の開裂パターンの原因であると信じられている、ｉ）で定義した割れ目の基質結合領域の、前記のモデルにおける１若しくは複数のアミノ酸残基の置換、又は前記の基質に好ましい相互作用を導入することが予想される基質結合領域の１若しくは複数のアミノ酸残基の欠失、又は前記の基質に好ましい相互作用を導入することが予想される基質結合領域への１若しくは複数のアミノ酸残基の付加；並びに
iii)段階ii）から生じるマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の構築、及び前記変異体の基質開裂パターンの試験。
【００７０】
従って、本発明の別の観点は、前記の親と比較して変化した基質結合部位を有する親マルトース産生アルファアミラーゼに関し、この変異体は配列番号１の１又は両方の以下の位置に相当する位置の修飾を含んで成る：
Ｖ２８１及び／又はＡ６２９。
好ましい態様において、前記変異体は：Ｖ２８１Ｑ及び／又はＡ６２９Ｎ／Ｄ／Ｅ／Ｑに相当する修飾を含んで成る。
【００７１】
同様の修飾を、他のマルトース産生アルファアミラーゼの等しい位置に導入することができる。特定の注目がある置換は、本明細書に開示した他の修飾のいずれかと、１又は両方の上述したものとの組合わせのいずれかである。
澱粉の凝集及び／又はパンの劣化を減少させる能力が向上したマルトース産生アルファアミラーゼ変異体
本発明は、澱粉の凝集及び／又はパンの劣化を減少させる能力が向上したマルトース産生アルファアミラーゼ変異体を提供する。好ましい変異体は、配列番号１の以下のアミノ酸残基に相当する、１又は複数の位置での置換を含んで成る：
Ａ３０，Ｋ４０，Ｎ１１５，Ｔ１４２，Ｆ１８８，Ｔ１８９，Ｐ１９１，Ａ１９２，Ｇ１９３，Ｆ１９４，Ｓ１９５，Ｄ２６１，Ｎ３２７，Ｋ４２５，Ｋ５２０及びＮ５９５。
【００７２】
更に好ましい態様において、前記変異体は配列番号１の以下のものに相当する、１又は複数の修飾を含んで成る：
Ａ３０Ｄ，Ｋ４０Ｒ，Ｎ１１５Ｄ，Ｔ１４２Ａ，Ｆ１８８Ｌ，Ｔ１８９Ｙ，Δ（１９１−１９５），Ｄ２６１Ｇ，Ｄ２６１Ｇ，Ｎ３２７Ｓ，Ｋ４２５Ｅ，Ｋ５２０Ｒ及びＮ５９５Ｉ。
カルシウムイオンから１０Å以内の残基の決定
付表１の配位はＩＮＳ（登録商標）ＩＧＨＴプログラム（ＢＩＯＳＹＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で読み込まれる。空間的な配位を、原子間の結合を示すことで提示する。前記イオンを、水分子と同様に提示する。部分集合を作製するためのプログラムパッケージの一部を、コマンドＺＯＮＥを用いて前記構造におけるカルシウムイオンの周辺の１０Åの部分集合を作製するために使用した。カルシウムイオンから指定の１０Åの距離以内の原子を有するとして定義される全ての残基は、コマンドＬＩＳＴ  ＭＯＬＥＣＵＬＥを用いることによって編集され、そして列挙される。配位ファイルにおいて、“ＶＡＴ  ＣＡ”の名前を前記のイオンに与えることで、“ＶＡＴ  ＣＡ”と称される全ての原子の周りの１０Åの空間が編集される。この方法で同定される特定の残基は、更に上文の“カルシウム結合”と題した項目において与えられる。
穴の決定
付表１に記載の構造的な配位を有するＮｏｖａｍｙｌの解決した構造は、多くの内部の割れ目及び穴を明らかにした。その様な穴を解析するとき、通常Ｃｏｎｎｏｌｌｙプログラムが使用される（Lee, B. and Richards, F. M. (1971) J. Mol. Biol. 55 : 379 〜400)。前記プログラムは、前記タンパク質の外部及び内部の面を探索するために、半径を有するプローブを使用する。この方法において観察できる最も小さい割れ目は、プローブ半径を有する。
【００７３】
前記の解決した構造を解析するために、ＩＮＳ（登録商標）ＩＧＨＴのプログラムを含むＣｏｎｎｌｙプログラムの修正版を使用した。最初の段階において、前記の水分子及びイオンは、前記の解決した構造からこれらの原子を取り出すことで除去した。コマンドＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＳＯＬＶＥＮＴを用いることで、前記溶媒に接近可能な領域を、１．４Åのプローブ半径を用いて全ての原子及び残基のために計算し、そして前記の解決した構造のモデルと一緒に写実的に示した。次に前記の内部の穴を、前記の外部の面に関係しないドットの面として見る。
【００７４】
前記の穴を埋めるための具体的な修飾の提案を、“変化した熱安定性及び／又は変化した温度依存活性プロファイルを有する変異体”と題した上文の項目に与える。構築した構造の相同性又は／及び配列合わせに基づく比較を用いることによって、マルトース産生アルファアミラーゼの相同性構造の変異を作製することができる。
アミノ酸修飾のための命名
変異を定義するために本明細書で使用した命名は、本質的に国際公開第９２／０５２４９号に記載されている。従って、Ｆ１８８Ｈは、アミノ酸Ｈ（Ｈｉｓ）による、１８８位のアミノ酸Ｆ（Ｐｈｅ）の置換を示す。Ｖ１２９Ｓ／Ｔ／Ｇ／Ｖは、Ｓ，Ｔ，Ｇ又はＶによるＶ１２９の置換を示す。Δ（１９１−１９５）又はΔ（１９１−１９５）は、１９１−１９５位のアミノ酸の欠失を示す。１９２−Ａ−１９３は、１９２と１９３のアミノ酸の間のＡの挿入を示す。
ポリペプチド配列の同一性
本発明の目的のため、同一性の値を、Needleman, S. B and wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45 に記載の方法に従い適当に決定することができ、ここでポリペプチド配列の比較のために以下の設定を用いる：３．０のＧＡＰクリエイション  ペナルティー（ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）及び０．１のＧＡＰエクステンション  ペナルティー（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）。ＧＣＧプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)において提供されるＧＡＰの様な知られているコンピュータープログラムによって、前記の決定を行うことができる。
【００７５】
本発明の変異体は、配列番号１のアミノ酸１〜６８６と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％のアミノ酸同一性を有する。
ハイブリダイゼーション
核酸プローブと相同性のＤＮＡ又はＲＮＡ配列との間のハイブリダイゼーションを決定するための適当な実験条件は、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、Sambrook, et al., 1989) 中で１０分間ハイブリダイズするための、前記のＤＮＡフラグメント又はＲＮＡを含むフィルターの予備浸漬、並びに５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Sambrook, et al., 1989) 、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／mlの変性音波処理サケ精子ＤＮＡ（Sambrook, et al., 1989) の溶液中でのプレハイブリダイゼーション、続くランダムプライミング（Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132 : 6〜13) した、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識（比活性＞１×１０9 cpm ／μｇ）プローブを含む前記溶液中での、約４５℃、１２時間のハイブリダイゼーションを含む。次に前記フィルターを少なくとも５５℃（低い厳密さ）、好ましくは少なくとも６０℃（中間の厳密さ）、更に好ましくは少なくとも６５℃（中間の／高い厳密さ）、更に好ましくは少なくとも７０℃（高い厳密さ）、より更に好ましくは少なくとも７５℃（非常に高い厳密さ）で、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で３０分間、２回洗浄した。
【００７６】
これらの条件下で、前記のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムにさらすことによって検出される。
マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の製造方法
Ｎｏｖａｍｙｌ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のクローニング
親マルトース産生アルファアミラーゼをコードする前記ＤＮＡ配列は、問題のマルトース産生アルファアミラーゼを産生する細胞又は微生物のいずれかから単離することができ、これには当業界で公知の様々な方法、例えば、バチルスの菌株ＮＣＩＢ１１８３７を用いる。
【００７７】
はじめに、研究されるべきマルトース産生アルファアミラーゼを産生する生物からの染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーを構築すべきである。次に、前記α−アミラーゼのアミノ酸配列が知られているならば、問題の生物から調製したゲノムライブラリー由来のマルトース産生アルファアミラーゼをコードするクローンを同定するために、相同性、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、そして使用することができる。あるいは知られているα−アミラーゼ遺伝子に相同性がある配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブを、低い厳密さのハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を用いて、マルトース産生アルファアミラーゼをコードするクローンを同定するためのプローブとして使用することができる。
【００７８】
マルトース産生アルファアミラーゼをコードするクローンを同定するための別の方法は、発現ベクター、例えばプラスミドにゲノムＤＮＡのフラグメントを挿入すること、前記の生じたゲノムＤＮＡライブラリーによりα−アミラーゼ陰性細菌を形質転換すること、及び続く、マルトース産生アルファアミラーゼのための基質を含む寒天上に前記の形質転換細菌をプレーティングすること、それにより同定すべきマルトース産生アルファアミラーゼ活性を、クローンに発現させることを含む。
【００７９】
あるいは、前記酵素をコードするＤＮＡ配列を、確立された標準的な方法によって合成的に調製することができ、例えばS. L. Beaucage及びM. H. Caruthers (1981)によって記載されたホスホロアミダイト法又はMatthes 等によって記載された方法（１９８４）である。ホスホロアミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、そして適当なベクターにおいてクローン化される。
【００８０】
最終的に、前記ＤＮＡ配列は、混合されたゲノム及び合成起源のもの、混合された合成及びｃＤＮＡ起源のもの、又は混合されたゲノム及びｃＤＮＡ起源のものから、合成、ゲノム若しくはｃＤＮＡ起源のもののフラグメントをライゲーションすることによって調製することができ、ここで前記のフラグメントは、前記の全ＤＮＡ配列の様々な部分に相当し、これは当業界で公知の方法に従う。前記ＤＮＡ配列はまた、得意的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製することができ、例えばこれは米国特許第４，６８３，２０２号又はR. K. Saiki et al. (1988) に記載されている。
【００８１】
部位指定変異導入法
一度、マルトース産生アルファアミラーゼをコードするＤＮＡ配列が単離され、そして修飾のための所望の部位が同定されたならば、合成オリゴヌクレオチドを用いて修飾を導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは前記の所望の修飾部に隣接するヌクレオチド配列を含み; 変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの合成の間に挿入される。具体的な方法において、マルトース産生アルファアミラーゼをコードする配列を架橋する、ＤＮＡの一本鎖のギャップが、前記のマルトース産生アルファアミラーゼ遺伝子を有するベクターにおいて作製される。次に、前記の所望の修飾を生む合成ヌクレオチドが、前記の一本鎖ＤＮＡの相同性部分にアニールされる。次に残っているギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）で埋め、そして前記のコンストラクトをＴ４リガーゼを用いてライゲーションする。この方法の具体的な例は、Morinaga et al. (1984)に記載である。米国特許第４，７６０，０２５号は、カセットのわずかな改変を行うことによる、複数の修飾をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示している。しかしながら、より多くの変化がある修飾を、前記のMorinagaの方法によって同時に導入することができるのは、様々な長さの多数のオリゴヌクレオチドを導入することができるからである。
【００８２】
マルトース産生アルファアミラーゼをコードするＤＮＡ配列に修飾を導入する別の方法は、Nelson and Long (1989)に記載されている。それはＰＣＲフラグメントの３段階産生（３−Ｓｔｅｐ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を伴ない、これは前記のＰＣＲ反応におけるプライマーの１つとして、化学的に合成したＤＮＡ鎖を用いて導入される、前記の所望の修飾を含む。前記のＰＣＲで産生したフラグメントから、前記の修飾を有するＤＮＡフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼを用いる開裂によって単離し、そして発現プラスミドに再挿入することができる。
無作為変異導入法
無作為変異導入法は、問題の示されたアミノ酸配列に翻訳される遺伝子の少なくとも３つの部分、又は前記の全遺伝子内で、局所的若しくは領域特異的、いずれかの無作為変異導入法で適当に行われる。
【００８３】
親マルトース産生アルファアミラーゼをコードするＤＮＡ配列の無作為変異導入法は、当業界で知られている方法のいずれかの使用によって、都合よく行うことができる。
上述したものに関して、本発明の更なる観点は親Ｎｏｖａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体の製造方法に関し、ここで前記変異体は、前記の親と比較して、低pH及び低カルシウム濃度で、増大した安定性を示し、前記方法は：
（ａ）無作為変異導入法への前記Ｎｏｖａｍｙｌ様α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列の適用、
（ｂ）宿主細胞における、段階（ａ）で得られる変異ＤＮＡ配列の発現、及び
（ｃ）前記の親Ｎｏｖａｍｙｌ様α−アミラーゼと比較して、変化した特性を有するＮｏｖａｍｙｌ様α−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞のスクリーニング、
を含んで成る。
【００８４】
本発明の上述の方法の段階（ａ）は、好ましくは、本明細書の実施例（以下を参照のこと）に記載の、ドープ（ｄｏｐｅｄ）されたプライマーを用いて行われる。
例えば、前記の無作為変異導入法は、適当な物理的又は化学的変異導入剤の使用によって、適当なオリゴヌクレオチドの使用によって、又は変異を生むＰＣＲに前記のＤＮＡをかけることによって行うことができる。更に、前記の無作為変更導入法は、これらの変異導入剤のいずれかの組合わせの使用によって行うことができる。前記の変異導入剤は、例えば転移、転換、転化、混合、欠失、及び／又は挿入を含むものであることができる。
【００８５】
本目的に適した物理的又は化学的変異導入剤の例は、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、重亜硫酸ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチド類似体を含む。その様な導入剤を使用するとき、前記の変異導入法は、起きるべき変異のための適当な条件下、選択の変更導入剤の存在において、変異化されるべき前記の親酵素をコードするＤＮＡ配列をインキュベートすること、及び前記の所望の特性を有する変異したＤＮＡを選択することによって典型的に行われる。
【００８６】
前記変異導入法をオリゴヌクレオチドの使用によって行うとき、前記のオリゴヌクレオチドを、変化すべき位置でのオリゴヌクレオチドの合成の間、３つの非親ヌクレオチドによってドープするか又はスパイク（ｓｐｉｋｅ）することができる。前記のドープ化又はスパイク化は、不所望のアミノ酸のコドンを防ぐために行うことができる。前記のドープ化又はスパイク化オリゴヌクレオチドを、公の技術のいずれかによって前記のマルトース産生アルファアミラーゼ酵素をコードするＤＮＡに組込むことができ、これは、例えば、ＰＣＲ，ＬＣＲ、又は適当だと思われるＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼのいずれかを用いる。
【００８７】
好ましくは、前記のドープ化は各位置における野生型及び修飾のパーセンテージがあらかじめ決定される、“一定の無作為ドープ化”を用いて行われる。更に前記のドープ化は、あるヌクレオチドの導入を好む、そしてそれにより１又は複数の特異的なアミノ酸残基の導入を好む方向へと向かわせることができる。前記のドープ化は、例えば、各位置において、９０％の野生型及び１０％の修飾の導入を行わせる様に行うことができる。ドープ化の計画の選択における、更に考慮すべきことは、遺伝的及びタンパク質的な構造の制約に基づく。前記のドープ化計画は、とりわけ終止コドンの導入を避けることを確実にする、ＤＯＰＥプログラムを用いて作製される。
【００８８】
ＰＣＲによる変異導入法を用いるとき、化学的処理又は無処理の遺伝子のいずれかである、親マルトース産生アルファアミラーゼ酵素をコードする遺伝子は、ヌクレオチドの誤った組込みを増大させる条件下でＰＣＲにかけられる（Deshler 1992 ; Leung et al., Technique, Vol. 1, 1989, pp.11 〜15) 。
E.コリ（coli) (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp179〜191)、Ｓ．セレビシアエ（セレビシアエ）又は他の微生物のいずれかの変異誘発菌株を、前記マルトース産生アルファアミラーゼをコードするＤＮＡの、前記の無作為変異導入法のために使用することができ、これは、例えば前記親酵素を含むプラスミドが前記の変異誘発菌株に形質転換させること、前記プラスミドと共に前記の変異誘発菌株を生育すること、及び前記の変異誘発菌株から変異したプラスミドを単離することによる。前記の変異したプラスミドは、続けて発現生物に形質転換させることができる。
【００８９】
変異導入されるべきＤＮＡ配列は、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼを発現する生物から調製されるゲノム又はｃＤＮＡライブラリーに都合よく存在することができる。あるいは、前記ＤＮＡ配列は適当なベクター、例えばプラスミド又はバクテリオファージ上に存在することができ、これはそれ自身を前記の変異導入剤とインキュベートするか、あるいは前記の変異導入剤にさらすことができる。変異導入されるべきＤＮＡはまた、宿主細胞内に存在することができ、これは前記細胞のゲノムに組込まれるか、又は前記細胞内に宿されるベクター上に存在するかのいずれかによる。最終的に、変異導入されるべきＤＮＡ配列は、単離型において存在することができる。無作為変異導入法にかけられるべきＤＮＡ配列が、好ましくはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列であることが理解されるだろう。
【００９０】
いくつかの場合において、前記の発現段階ｂ）又は前記のスクリーニング段階ｃ）を行う前に、前記の変異したＤＮＡ配列を増幅することは、都合がよいことがある。その様な増幅を当業界で知られている方法に従い行うことができ、現在好まれている方法は、前記親酵素のＤＮＡ又はアミノ酸配列を基に調製したオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、ＰＣＲによる増幅である。
【００９１】
前記の変異導入剤とのインキュベーション又はそれへの曝露に続けて、前記の変異したＤＮＡは、発現を起こさせる条件下、前記ＤＮＡ配列を有する適当な宿主細胞を培養することによって発現する。この目的のために使用する宿主細胞は、任意にベクター上に存在する、前記の変異したＤＮＡ配列により形質転換したものか、又は前記の変異導入処理の間に前記の親酵素をコードするＤＮＡ配列を有するものであることができる。適当な宿主細胞の例は、以下のものである：グラム陽性細菌、例えばバチルス・ズブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンタス（ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィラス（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアグランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・スリンジエンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトマイセス・ムリナス（ｍｕｒｉｎｕｓ）；及びグラム陰性細菌、例えばＥ．コリ。
【００９２】
前記の変異したＤＮＡ配列は更に、前記の変異したＤＮＡ配列に発現をさせる機能をコードするＤＮＡ配列を含んで成ることができる。
局所的無作為変異導入法
前記の無作為変異導入法は、問題の親マルトース産生アルファアミラーゼの一部に、有利に集中することができる。これは、例えば以下のときに有利であることができ、それは前記の酵素のある領域が前記の酵素の与えられた特性に特に重要であると同定されたとき、及び修飾が向上した特性を有する変異体を生じることが予期されるときである。その様な領域は、通常前記の親酵素の三次構造が解明され、そして前記酵素の機能に関与しているとき、同定することができる。
【００９３】
前記の局所的、又は領域特異的無作為変異導入法は、上述のＰＣＲによる変異導入法技術又は当業界で知られている他の適当な技術のいずれかの使用によって行うことができる。あるいは、修飾されるべきＤＮＡ配列の一部をコードするＤＮＡ配列を、例えば、適当なベクターへの挿入によって単離することができ、そして前記の一部を、上文で議論した変異導入法のいずれかの使用によって、続けて変異導入法にかけることができる。
【００９４】
親マルトース産生アルファアミラーゼのカルシウム結合安定性を向上させるための領域特異的無作為変異導入法のため、配列番号１に記載のアミノ酸配列由来の以下のアミノ酸残基に相当する位置のコドンを、適当に標的にすることができる：
残基：領域：
１６〜３３、３５〜３６、４０：１６〜４０
４６〜５４、５６：４６〜５６
７３〜８１：７３〜８１
８７〜８９、９１、９３〜９６、９９〜１０５、１０９：８７〜１０９
１２９〜１３４、（１４５、１５０）：１２９〜１３４
１６７〜１７２、１７４、１７７、１８０〜１８９：１６７〜１８９
１９６〜２０２、２０６〜２１０：１９６〜２１０
２２８〜２３５、２３７：２２８〜２３７
３７８
６３７
向上した基質の結合、すなわち向上した炭水化物の種類、例えばアミロース又はアミロペクチンの結合を、以下の修飾を有するマルトース産生アルファアミラーゼによって達成するために（ここで修飾は、例えばより高い基質特異性及び／又は、例えば基質の開裂、すなわち加水分解に関する、より高い特異性である）、配列番号１に示すアミノ酸配列の以下の領域の位置のコドンを、領域特異的変異導入法によって、修飾のために特に適当に標的にすることができることは明らかである：
７０〜９７、１２７〜１４３、１７４〜１９８、２２６〜２３３、２５５〜２７０、２８２〜２９２、３２４〜３３１、３７０〜３７６。
【００９５】
基質特異体及び／又はpH依存活性プロファイルを変えるための領域特異的無作為変異導入法のため、配列番号１の以下の領域を標的にすることができる：７０〜９７、１７４〜１９８。
熱安定性を向上するために、以下の領域を標的にすることができる：７０〜１０９、１６７〜２００。
【００９６】
ＤＯＰＥプログラムの使用による無作為変異導入法のための一般的方法
前記の無作為変異導入法は、以下の段階によって行うことができる。
１．前記酵素の修飾のための、注目の領域の選択
２．前記の選択領域の、変異部位及び非変異部位の決定
３．例えば前記の所望の安定性及び／又は構築されるべき変異体の性能に関する、実行されるべき変異の種類の決定
４．構造的に無理のない変異の選択
５．段階４に関する、段階３によって選択された残基の調整。
【００９７】
６．適当なドープアルゴリズムの使用による前記ヌクレオチドの分布の解析。
７．必要な場合の、遺伝子コードのリアリズムへの所望の残基の調整（例えば前記の遺伝子コードから生じる制約を考慮に入れることであり、例えば終止コドンの導入を避けるためである）：当業者は、いくつかのコドンの組合わせを慣行において使用できず、そして適応することが必要であろうことを認識するだろう。
【００９８】
８．プライマーの作製
９．前記プライマーの使用による無作為変異導入法の実行
１０．前記の所望の向上した特性のスクリーニングによる、生じるα−アミラーゼ変異体の選択。
段階６における使用のための適当なドープアルゴリズムは、当業界で公知である。その様なアルゴリズムの１つは、Tomandl, D. et al., 1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11 : 29〜38に記載されている。別のアルゴリズムはＤＯＰＥである（Jersen, LJ, Andersen, KV, Svendsen, A, and Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids Research 26 : 697〜702)。
【００９９】
マルトース産生アルファアミラーゼ変異体の発現
注目の変異体の構築は、前記変異体の産生に誘導的である条件下の、前記変異体をコードするＤＮＡ配列を含んで成る微生物の培養、及びそれに続く、生じた培養液からの前記変異体の任意な回収によって達成される。これを以下に、更に詳細に記述する。
【０１００】
本発明に従い、上述した方法によって、又は当業界で知られている代わりの方法のいずれかによって産生する変異体をコードするＤＮＡ配列は、タンパク質又はポリペプチドの形態で発現することができ、これは典型的にプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルをコードする調節配列、及び任意にリプレッサー遺伝子又は様々なアクチベーター遺伝子を含む発現ベクターを使用する。
【０１０１】
本発明のマルトース産生アルファアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を有する組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡの方法に都合よく適用することができるベクターのいずれかであることができ、そしてベクターの選択はそれを導入すべき宿主細胞にしばしば依存するであろう。従って、前記ベクターは自律複製ベクター、すなわち染色体外の存在物として存在するベクターであることができ、染色体複製から独立的である複製をするもの、例えばプラスミド、バクテリオファージ又は染色体外の因子、ミニクロモソームあるいは人工的な染色体である。あるいは、前記ベクターは、宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞のゲノムに組込まれ、そして組込まれた染色体と一緒に複製されるものであることができる。
【０１０２】
前記ベクターにおいて、本ＤＮＡ配列は適当なプロモーター配列に作用可能に連結する。前記プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列のいずれかであることができ、そして宿主細胞に対して相同性か又は非相同性かのどちらかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。特に細菌の宿主における、本発明のマルトース産生アルファアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を方向づけるのに適当なプロモーターの例は、Ｅ．コリのｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・コエリコローのアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、バチルス・リチェニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィラスのマルトース産生アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリクエファシエンスのα−アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・ズブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターなどである。菌類の宿主における転写のために、有用なプロモーターの例は、Ａ．オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）のタカアミラーゼ、リゾムコール・ミエーイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定α−アミラーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエーイのリパーゼ、Ａ．オリザエのアルカリ性プロテアーゼ、Ａ．オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼ又はＡ．ニジュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。
【０１０３】
本発明の発現ベクターはまた、適当な転写ターミネーター及び、真核生物における、本発明のマルトース産生アルファアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結したポリアデニル化配列を含んで成ることができる。終結及びポリアデニル化配列は、前記プロモーターと同一の供給源に適当に由来することができる。
【０１０４】
更に、前記ベクターは、問題の宿主細胞において前記ベクターが複製することを可能にするＤＮＡ配列を含んで成ることができる。その様な配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９，ｐＡＣＹＣ１７７，ｐＵＢ１１０，ｐＥ１９４，ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製起点である。
前記ベクターはまた、選択マーカー、例えば宿主細胞の欠損を補完する生成物の遺伝子、例えばＢ．ズブチリス又はＢ．リチェニホルミス由来のｄａｌ遺伝子、あるいは抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を与えるものを含んで成ることができる。更に、前記ベクターはアスペルギルス選択マーカー、例えばａｍｄＳ，ａｒｇＢ，ｎｉａＤ及びｓＣ、ハイグロマイシン耐性を引き起こすマーカーを含んで成ることができ、あるいは前記選択を共同形質転換によって、例えば国際公開第９１／１７２４３号に記載の様に達成することができる。
【０１０５】
細胞内発現はいくつかの点、例えば宿主細胞としてある細菌を使用するとき、において有利であることができるが、細胞外での発現が一般に好ましい。一般に、本明細書で述べたバチルスのα−アミラーゼは、前記の培養培地に、発現したプロテアーゼを分泌させるプレ領域を含んで成る。所望ならば、このプレ領域を異なるプレ領域又はシグナル配列によって置換することができ、これは、それぞれのプレ領域をコードするＤＮＡ配列の置換によって都合よく達成される。
【０１０６】
マルトース産生アルファアミラーゼ変異体をコードする本発明のＤＮＡコンストラクトを、前記プロモーター、ターミネーター及び他の因子に、それぞれライゲーションするために、そして複製に必要な情報を含む適当なベクターにそれらを挿入するために使用する方法は、当業者に公知である（例えばSambrook et al. (1989)を参照のこと）。
【０１０７】
上文で定義した本発明のＤＮＡコンストラクト又は発現ベクターのいずれかを含んで成る、本発明の細胞は、本発明のマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の組換え体生成において宿主細胞として有利に使用される。宿主細胞のクロモソームにおける、（１又は複数のコピーにおける）前記ＤＮＡコンストラクトが都合よく組込まれることによって、前記細胞を前記変異体をコードする本発明のＤＮＡコンストラクトで形質転換することができる。この組込みは、宿主細胞内で安定に維持されやすいＤＮＡ配列ほど有利であると一般に考えられている。宿主のクロモソームへのＤＮＡコンストラクトの組込みは、従来の方法に従い、例えば相同性又は非相同性組換えによって行うことができる。あるいは、異なる型の宿主細胞に関連する、上述の発現ベクターによって、前記細胞は形質転換することができる。
【０１０８】
本発明の細胞は、高等生物、例えば哺乳類又は昆虫の細胞であることができるが、好ましくは微生物細胞、例えば細菌類又は菌類（酵母を含む）の細胞である。
培養において、本発明の酵素を製造することができる微生物の宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばバチルスの菌株、例えばＢ．ズブチリス、Ｂ．リチェニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモファラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ラウツス、Ｂ．メガテリウム又はＢ．サーリンジエンシス、あるいはストレプトマイセス・リビダンス（ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトマイセス・ムリヌス（ｍｕｒｉｎｕｓ）、あるいはグラム陰性細菌、例えばＥ．コリである。前記細菌の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換か、又は本質的に知られている方法におけるコンピテント細胞を用いることによって果たすことができる。
【０１０９】
酵母生物はサッカロミセス又はシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から都合よく選択することができる。糸状菌はアスペルギルスに都合よく属することができ、例えばアスペルギルス・オリザエ又はアスペルギルス・ニガーである。菌類細胞を、プロトプラストの形成を含む方法によって形質転換することができ、プロトプラストの形質転換に、本質的に知られている方法における前記の細胞壁の再生が続く。アスペルギルスの宿主細胞の形質転換のための適当な方法は、欧州特許第２３８０２３号に記載されている。
【０１１０】
より更なる観点において、本発明は本発明のマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の製造方法に関し、この方法は前記変異体の産生に誘導的である条件下での、上述した宿主細胞培養、及び前記細胞及び／又は培養培地からの前記変異体の回収を含んで成る。
前記細胞を培養するために使用する培地は、問題の宿主細胞の成育、及び本発明のマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の発現の獲得に適当な、従来の培地のいずれかであることができる。適当な培地は商業的提供者から入手可能であり、そして公表された方法（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログに記載されている）に従い調製することができる。
【０１１１】
前記宿主細胞から分泌されるマルトース産生アルファアミラーゼ変異体は、公知の方法によって培養培地から都合よく回収することができ、これは遠心若しくは濾過により前記の培地から細胞を分離すること、及び塩、例えば硫安によって前記の培地からタンパク質成分を沈澱させること、それに続くクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどの使用を含む。
【０１１２】
マルトース産生アルファアミラーゼ変異体の試験
上述した方法のいずれかによって製造したマルトース産生アルファアミラーゼを、精製の前又は後のいずれかに、スクリーニングアッセイにおいてアミロース分解活性の試験を行うことができ、これは前記変異体の澱粉を分解する能力を測定する。本発明の、上述した無作為変異導入法の段階１０におけるスクリーニングは、以下の方法に基づくフィルターアッセイの使用によって都合よく行うことができる：注目の変異したマルトース産生アルファアミラーゼを発現することができる微生物を、適当な培地で、及び前記酵素の分泌のための適当な条件下でインキュベートし、ここで前記の培地は２枚のフィルターによって覆われ、これは低いタンパク質結合能を示す第２のフィルターの下に据えられたタンパク質結合フィルターを含んで成る。前記微生物は、第２の、上側のフィルター上で成育する。インキュベーションに続いて、微生物から分泌された酵素を含んで成る、底側のタンパク質結合フィルターを、前記微生物を含んで成る第２のフィルターから分離する。次に、前記のタンパク質結合フィルターを所望の酵素活性のスクリーニングにかけ、そして第２のフィルター上に存在する、相当する微生物のコロニーを同定する。前記酵素活性の結合のために使用した第１のフィルターは、タンパク質結合フィルターのいずれか、例えばナイロン又はニトロセルロースであることができる。前記の発現生物のコロニーを有する第２のフィルターは、タンパク質に結合する親和性を持たないか、又は低い親和性を持つフィルターのいずれか、例えば酢酸セルロース若しくはＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）であることができる。
【０１１３】
スクリーニングは、α−アミラーゼ活性の検出をする基質と、前記の分泌タンパク質が結合している第１のフィルターの処理から成る。前記酵素活性は、染色、蛍光、沈澱、pH指示薬、ＩＲ−吸収、又は酵素活性の検出のための他の知られている技術のいずれかによって検出することができる。前記の検出化合物を固定化剤のいずれかによって固定化することができ、例えばアガロース、寒天、ゼラチン、ポリアクリルアミド、澱粉、濾紙、布；又は固定化剤の組合わせのいずれかである。例えば、α−アミラーゼ活性を、アガロースに固定される、シバクロンレッドで標識したアミロペクチンによって検出することができる。この基質上でのα−アミラーゼ活性は、赤色の強度の減少による、前記のプレート上のゾーンを提供する。
【０１１４】
増大した安定性を有する変異体のスクリーニングのために、結合したマルトース産生アルファアミラーゼ変異体を有するフィルターを、上述の検出段階の前にあらかじめ処理することができ、これは前記の親マルトース産生アルファアミラーゼと比べて向上した安定性を持たない変異体を不活性化するためである。この不活性化段階は、限定しないが、pH２〜１２のいずれかのpHでの、緩衝化した溶液の存在下における、及び／あるいは安定性の変化に寄与することが知られているか、又は考えられている別の化合物、例えば界面活性剤、ＥＤＴＡ，ＥＧＴＡ、小麦粉の成分、若しくは他の関連する添加物のいずれかを含む緩衝液における、上昇する温度でのインキュベーションから成る。次に、指定時間処理したフィルターを脱イオン水中で簡単にすすぎ、そして上述した様な活性の検出のためのプレートに据える。安定化した変異体が、検出培地上でのインキュベーション後、前記の親と比較して増大した酵素活性を示す様に、前記の条件は選択される。
【０１１５】
変化した熱安定性を有する変異体のスクリーニングのために、結合した変異体を有するフィルターを、ほぼ全ての前記の親マルトース産生アルファアミラーゼを不活性化するための緩衝液中で、与えられたpH（例えばpH２〜１２の範囲）で、上昇する温度（例えば５０°〜１１０℃の範囲）で、ある時間の区切り（例えば１〜２０分）でインキュベートし、水の中ですすぎ、続けて固定化シバルコンレッド標識アミロペクチンを含む検出プレート上に直接据え、そして活性が検出されるまでインキュベートする。同様に、pH依存安定性を、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼが不活性化されるような、上文の不活性化段階における緩衝液のpHに調節することによってスクリーニングすることができ、これによって問題のpHで増大した安定性を有する変異体のみの検出を行う。増大したカルシウム依存安定性を有する変異体のスクリーニングのために、カルシウムキレート剤、例えばエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）を、不活性化緩衝液に加え、これは、更に定義される条件、例えば緩衝液のpH、温度又はインキュベーションの指示される長さのもと、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼが不活性化される様な濃度で加えられる。
【０１１６】
本発明の変異体を、前記変異体の澱粉分解活性をアッセイすることによって適当に試験することができ、これは例えば澱粉を含むアガロースプレート上での、変異体をコードするＤＮＡ配列により形質転換した宿主細胞の成育及び上述した様な澱粉分解宿主細胞の同定による。更に、比活性、基質特異性、開裂パターン、熱による活性化、熱安定性、pH依存活性又は至適pH、pH依存安定性、温度依存活性又は至適温度、トランスグリコシル化活性、安定性、並びに注目の他のパラメーターのいずれかを含む、変化した特性に関する試験を、下文に記載する、当業界で知られている方法に従い精製した変異体で行うことができる。
【０１１７】
マルトース産生アルファアミラーゼによるβ−限界デキストリンの分解
マルトース産生アルファアミラーゼ変異体の基質特異性の評価における、別の重要なパラメーターは、その様な酵素がエキソグリコシラーゼβ−アミラーゼによって徹底的に処理された澱粉を分解することができる度合であることができる。前記の親マルトース産生アルファアミラーゼによって生まれるパターンと異なる、その様な基質上での分解のパターンを示す変異体のスクリーニングのために、以下のアッセイを行う：β−限界デキストリンをＭｃｌｌｖａｎｅ緩衝液（４８．５mMクエン酸及び１９３mMリン酸ナトリウム、pH５．０）中の２５mlの１％アミロペクチンを２４μｇ／mlβ−アミラーゼと３０℃で一晩インキュベートすることによって調製する。加水分解されないアミロペクチン（すなわちβ−限界デキストリン）を、１体積の９８％エタノールで沈澱させ、水の中で洗浄し、そして再溶解する。１mlのβ−限界デキストリンを、１８μｌの酵素（２．２mg／ml）及び１００μｌの０：２Ｍクエン酸−リン酸pH５．０と、３０℃で２時間インキュベーションし、そして上述した様にＨＰＬＣによって解析する。β−限界デキストリンの全加水分解を、２ＭのＨＣｌ中、９５℃で行う。還元末端の濃度を当業界で知られている方法によって測定する。
【０１１８】
カルシウム結合親和性
熱又はグアニジン塩酸の様な変性剤にさらすことによるマルトース産生アルファアミラーゼの変性は、蛍光の減少を伴い、そしてカルシウムイオンの損失は変性を引き起こす。従って、カルシウムへのマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の親和性を、蛍光測定によって測定することができ、これは異なる濃度のカルシウム（例えば１mM〜１００mMの範囲）又はＥＧＴＡ（例えば１〜１０００mMの範囲）と一緒の、充分に長い時間（例えば５５℃で２２時間）での、緩衝液（例えば５０mM  ＨＥＰＥＳ，pH７）中の前記変異体（例えば１０mg／mlの濃度）のインキュベーションの前及び後に行う。
【０１１９】
測定される蛍光、下は前記酵素の未変性及び変性の寄与形態から成る。以下の方程式を、カルシウム濃度（〔Ｃａ〕）へのＦの依存を記述することで導くことができる：
Ｆ＝〔Ｃａ〕／（Ｋdiss＋〔Ｃａ〕）（ａN −ｂN ｌｏｇ（〔Ｃａ〕））＋Ｋdiss／（Ｋdiss＋〔Ｃａ〕）（ａu −ｂu ｌｏｇ（〔Ｃａ〕））
ここで、ａN は前記酵素の天然（未変性）の蛍光であり、ｂN はカルシウム濃度（実験的に観測したもの）の対数への一次従属性であり、ａu は変性形態の蛍光であり、そしてｂu はカルシウム濃度の対数への、ａu の一次従属性である。Ｋdissは以下の平行過程の、見かけのカルシウム結合定数である：
Ｋdiss
Ｎ−Ｃａ＜＜Ｕ＋Ｃａ（Ｎ＝天然の酵素；Ｕ＝変性酵素）
事実、変性は極度にゆっくりと進行し、そして不可逆性である。変性の速度はカルシウム濃度に依存し、そしてその様な、与えられる酵素の依存性は、前記酵素のカルシウム結合親和性の測定を提供する。反応条件（例えば５５℃で２２時間）の標準的な組合わせを定義することによって、異なるマルトース産生アルファアミラーゼ変異体のためのＫdissの、意味のある比較を行うことができる。
【０１２０】
工業的適用
本発明のマルトース産生アルファアミラーゼ変異体は価値のある特性を有しており、これを様々な工業的適用において有利に使用することができる。特に、前記酵素は、澱粉を基にした食品、例えばベーキング工業で一般的なものの、退行、及びそれに従う劣化の遅延又は維持のための潜在的適用を見出す。
【０１２１】
前記変異体を、当業界で知られている従来の技術に従い、パン及び他のパン製品の製造に使用することができる。
本発明の使用による前記の澱粉画分の修飾が、パン製品のかさの増大、及び器官感覚受容性の質、例えば風味、口当たり、美味しさ、香味及びパンの皮の色の向上をもたらすことが信じられている。
【０１２２】
前記のマルトース産生アルファアミラーゼを、その唯一の酵素として、あるいは１又は複数の追加の酵素、例えばキシラナーゼ、リパーゼ、グルコースオキシダーゼ及び他のオキシドレダクターゼ、若しくはアミロース分解酵素と組合わせての主な酵素活性として使用することができる。
本発明の酵素変異体はまた、洗濯、皿洗い及び固い表面の清掃用洗剤の成分としての工業用適用性を見出す。いくつかの変異体は直鎖オリゴ糖の製造方法、又は澱粉からの甘味料及びエタノールの製造、並びに／あるいは織物のデサイジングのために特に有用である。澱粉の液化及び／又は糖化方法を含む、従来の澱粉変換方法は、例えば米国特許第３，９１２，５９０号及び欧州特許公開第２５２，７３０号及び第６３，９０９号に記載されている。
【０１２３】
本発明を以下の例に関して更に例示し、これは請求した本発明の範囲を限定するあらゆる方法におけるものであることを意図しない。
ＭＡＮＵにおけるマルトース産生アルファアミラーゼの決定
１マルトース産生アルファアミラーゼＮｏｖｏユニット（ＭＡＮＵ）は、スタンダードのもと１分当たり１μmol のマルトトリオースを開裂する酵素量である。前記のスタンダードの条件は、１０mg／mlのマルトトリオース、３７℃、pH５．０、３０分の反応時間である。
【０１２４】
pH依存性は、前記の同じ条件で、しかし異なるpH値で、この測定を繰り返すことによって見出される。
例
例１：変化したpH依存活性を有するＮｏｖａｍｙｌの変異体の構築
Ｎｏｖａｍｙｌを、本明細書でｐＬＢｅｉ０１０として表されるプラスミドから、バチルス・ズブチリスにおいて発現させる。このプラスミドはａｍｙＭを含み、ここでａｍｙＭの発現はそれ自身のプロモーターによって方向づけられ、そして、例えばＤＳＭ１１８３７の菌株に含まれる、Ｎｏｖａｍｙｌをコードする完全な遺伝子を含む。前記プラスミドはプラスミドｐＵＢ１１０由来の複製起点、ｏｒｉ及び選択目的のためのカナマイシン耐性マーカーを含む。ｐＬＢｅｉ０１０を図１に示す。
【０１２５】
プライマー配列
Ｎｏｖａｍｙｌの部位指定変異導入体を、本質的にKamman等によって記述されているメガプライマー法（１９８９）によって構築した。簡単に言うと、変異オリゴヌクレオチドプライマーを、予備的なＰＣＲ産物を作製するためにＰＣＲ反応中で適当な反対のＤＮＡ鎖エンド（ｅｎｄ）プライマーと一緒に使用する。次に、この産物をメガプライマーとして、二本鎖ＤＮＡ産物を作製するために、別の反対のＤＮＡ鎖エンドプライマーと一緒に使用する。前記の最終ＰＣＲ反応産物を、標準的なクローニング法によって、ｐＬＢｅｉ０１０プラスミドの相当するＤＮＡフラグメントを置換するために、常用通りに使用した。バチルス・ズブチリスの菌株ＳＨａ２７３、ａｐｒ- ，ｎｐｒ- ，ａｍｙＥ- ，ａｍｙＲ２- であり、当業界で知られている方法によって調製したバチルス・ズブチリスの誘導体１６８に変異体を直接形質転換させた。
【０１２６】
記載した変異体の構築において使用したオリゴヌクレオチドプライマーを以下に列挙する：
変異体配列（５’→３’）
Ｆ１８８Ｈ：配列番号３
Ｆ１８８Ｅ：配列番号４
Ｆ２８４Ｅ：配列番号５
Ｆ２８４Ｄ：配列番号６
Ｆ２８４Ｋ：配列番号７
Ｈ３２７Ｄ：配列番号８
変異体配列（３’→５’）
Ｔ２８８Ｋ：配列番号９
Ｔ２８８Ｒ：配列番号１０
Ｆ２８４，Ｔ２８８及びＮ３２７のアスペラギン酸変異体を、エンドプライマーとしてプライマーＡ１８９（配列番号１１）及びＢ６４９（配列番号１２）を用いて得た。
【０１２７】
Ｆ１８８変異体Ｆ１８８Ｌ，Ｔ１８９Ｙを、エンドプライマーとしてプライマーＡ８２（配列番号１３）及びＢ３４６（配列番号１４）を用いて得た。
所望の修飾を有するＰＣＲ産物を精製し、適当な酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、抽出し、グリコーゲンの存在下、エタノール沈澱し、Ｈ2 Ｏ中で再懸濁し、前記と同一の酵素で消化したｐＬＢｅｉ０１０にライゲーションし、そしてバチルス・ズブチリスのＳＨａ２７３を形質転換させた。形質転換体を、コロニーＰＣＲでサイズ、並びに制限酵素消化によって特定の制限部位の挿入又は除去を調べた。ポジティブなコロニーを、当業界で知られているＤＮＡ配列決定法で確かめた。
【０１２８】
発酵
前記のＢ．ズブチリスＳＨａ２７３変異体クローンをＬＢ−カナマイシン（１０μｇ／ml）−澱粉プレート上で、３７℃で一晩成育させた。前記プレートからのコロニーを１０mlのルリア液中で再懸濁した。前記懸濁液の６分の１ずつを、５００mlの振盪フラスコ中に接腫し、これは１００mlのＰＳ−１培地、大豆半分／ショ糖を基にした培地、最終濃度１０μｇ／mlのカナマイシン及び１００μｌの５Ｍ  ＮａＯＨを含む。接腫の前に、pHをＮａＯＨによって、７．５に調整した。前記培養液を２７０〜３００rpm の振盪により、３０℃で５日間インキュベートした。
【０１２９】
酵素精製
前記培地由来の大きな粒子を、親和性クロマトグラフィーの前に凝結によって除去した。陽イオン性凝結剤としてSuperfloc C521 (American Cyanmide Company)を使用し、陰イオン性凝結剤としてSuperfloc A130 (American Cyanmide Company)を使用した。
【０１３０】
前記の培養懸濁液を脱イオン水で１：１に希釈し、そしてpHを約７．５に調整した。希釈した培養液のml当たり、０．０１mlの量の５０ｗ／ｗ％ＣａＣｌ2 を撹拌している間に加えた。希釈した培養液のml当たり、０．０１５mlの量の２０ｗ／ｗ％Ｎａ−アルミン酸塩を、pHを７と８の間に保ちながら、２０％ギ酸と一緒に滴下した。撹拌しながら、希釈した培養液のml当たり、０．０２５mlの１０ｖ／ｖ％のＣ５２１を加え、続けて希釈した培養液のml当たり、１ｗ／ｖ％のＡ１３０を０．０５ml、又は凝結が確認されるまで加えた。前記溶液を４５００rpm で３０分間遠心した。より大きな粒子及びあらゆる残っている細菌を排除するために、孔のサイズが０．４５μｍのフィルターを用いて、濾過を行った。前記の濾過溶液を−２０℃で保存した。
【０１３１】
ＤＳＶアガロースへのα−シクロデキストリンの固定化
分子量９７２．８６ｇ／mol （Ｆｌｕｋａ２８７０５）の１００mgのα−シクロデキストリンを、２０mlの結合緩衝液（０．５Ｍ  Ｎａ2 ＣＯ3 pH１１）に溶解した。１０mlのＤＳＶアガロース（ジビニルスルホン活性化したアガロース（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ）のＭｉｎｉ−Ｌｅａｋ，Ｍｅｄｉｕｍ  １０〜２０mmol／ｌ）を脱イオン水で入念に洗浄し、次に吸込みによって乾燥させ、そしてα−シクロデキストリン溶液に移した。混合液を周囲温度で２４時間撹拌した後、ゲルを脱イオン水、それに続き０．５Ｍ  ＫＨＣＯ3 で洗浄した。前記のゲルをブロッキング緩衝液（２０ml  ０．５Ｍ  ＫＨＣＯ3 ＋１mlメルカプトエタノール）に移し、周囲温度で２時間撹拌し、続いて脱イオン水で洗浄した。
【０１３２】
親和性クロマトグラフィー
前記変異体を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＦＰＬＣシステムを用いる親和性クロマトグラフィーによって精製した。０．０４体積のpH５，１Ｍ酢酸ナトリウムを、pHを調整するために、凝結によって得られた前記濾液に加え、そしてＣａＣｌ2 を最終濃度１０-10 Ｍになるまで加えた。前記溶液を濾過し、そして脱気した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ１６カラムを１０mlの固定化α−シクロデキストリンを用いて調製し、次に平衡化緩衝液（pH５の２５mM酢酸ナトリウム）中、約１０倍のカラム体積で洗浄することによって平衡化した。洗浄液中でもはやタンパク質が検出されなくなるまで、前記の平衡化緩衝液で続けて洗浄されるＸＫ１６カラムに、前記の濾液をかけた。非特異的材料を溶出するために、 0．5 Ｍ  ＮａＣｌを含む平衡緩衝液で洗浄し、続けてカラム体積の２〜３倍の前記平衡化緩衝液でもう１度洗浄した。全ての洗浄を１０ml／分の流速を用いて行った。特異的に結合した材料を２％α−シクロデキストリン／前記洗浄緩衝液の溶液を用いて溶出し、そして５ml／分の流速を用いて、Ｐｈａｒｍａｃｉａの液体クロマトグラフィーコレクターＬＣＣ−５００  Ｐｌｕｓを用いて回収した。
【０１３３】
例２：変異体のpH依存活性
上述の例において調製した変異体を、以下の様々なpH値で活性を試験した。
マルトトリオース又はアミロペクチンから遊離されるグルコースのための比色グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼアッセイを、前記酵素変異体のpH活性プロファイルを決定するために使用した（グルコース／ＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ（登録商標）法、Boehringer Mannheim, Indianapolis IN) 。２５mMのクエン酸−リン酸緩衝液中、２，２．５，３，３．５，４，４．５，５，５．５，６，６．５，７，７．５，８及び８．６のpH値で、活性をアッセイした。前記緩衝液のpHをＮａＯＨを用いて調整し、そして酵素をpH５，２５mMのクエン酸−リン酸中で希釈した。測定を、平均値を得るために２回１組で行った。全ての値は、最も高いレベルの活性が見られるpHに関する。
【０１３４】
以下の表に示す結果は、前記の親Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）と比較したときに、前記の各変異体がpH依存活性プロファイルにおける変化を有していることを示している。各変異体の活性の最も高いレベルを、１００％で表わし、そして他に示すpH値で測定される変異体の活性は、その最大の相対的パーセンテージである。
【０１３５】
【表１】
2010148525.tif 000009
【０１３６】
更に、いくつかのＮｏｖａｍｙｌ変異体を、pH４．０及び５．０のpHで活性試験し、１００％として同じpHでのＮｏｖａｍｙｌの活性を採用した。前記活性を、６０℃、５０mM酢酸ナトリウム、１mM  ＣａＣｌ2 でのマルトトリオースの加水分解によって決定した。結果をpH５．０とpH４．０の活性の間の比率として表わす。
【０１３７】
【表２】
2010148525.tif 000010
【０１３８】
本発明に従い、より高い又はより低い至適pHを有する変異体が得られることを前記結果は示している。
例３：変異体の熱安定性
８０℃でのインキュベーション
いくつかのＮｏｖａｍｙｌ変異体の熱安定性を、８０℃及びpH４．３で水溶液をインキュベートし、そして様々な時間で残留アミラーゼ活性を測定することによって試験した。前記親酵素、Ｎｏｖａｍｙｌを比較のために含めた。結果を、最初の活性のパーセントにおいて、様々な時間での残留活性として表わす。
【０１３９】
【表３】
2010148525.tif 000011
【０１４０】
上述の結果は、前記の親アミラーゼと比較して前記変異体の熱安定性が明らかに向上したことを示している。
カルシウムとの８５℃でのインキュベーション
前記Ｎｏｖａｍｙｌ変異体Ｓ３２Ｅを、８５℃での１mM  Ｃａ++との１５分間のインキュベーションによって試験した。前記変異体は４８％の残留活性を示し、一方前記親酵素（Ｎｏｖａｍｙｌ）は同じ条件で３２％の残留活性を示した。
【０１４１】
ＤＳＣ
更に、pH４．３又は５．５でのＤＳＣ（示差走査熱量測定）によって、いくつかのＮｏｖａｍｙｌ変異体の熱安定性を試験した。再び、前記親アミラーゼを比較のために含めた。結果を変性温度（Ｔｍ）として表わす：
【０１４２】
【表４】
2010148525.tif 000012
【０１４３】
両変異体の熱安定性の向上を前記の結果は示している。
例４：変異体の比活性
pH５．０及び６０℃でのファデバス板（ｐｈａｄｅｂａｓ  Ｔａｂｌｅｔ）への作用の後、比色分析によってアミラーゼ活性を決定した。Ｎｏｖａｍｙｌに関する、２つのＮｏｖａｍｙｌ変異体の結果は以下の様であった：
【０１４４】
【表５】
2010148525.tif 000013
【０１４５】
上述したＭＡＮＵ法による、pH４．０，６０℃でのマルトトリオースへの作用によって、前記の比活性を更に試験した。前記変異体Ｇ３７０Ｎ，Ｎ３７１Ｇが、Ｎｏｖａｍｙｌと比較して１０６％のマルトトリオース活性を有することを前記結果は示した。
例５：凝集の阻害
凝集を阻害するＮｏｖａｍｙｌ及びＮｏｖａｍｙｌ変異体の効率を、以下の様に決定した：
選択したpH（３．７，４．３又は５．５）での、７３０mgの５０％（ｗ／ｗ）アミロペクチンスラリーを、２０μｌの酵素試料と混合し、そして前記混合物を、封をしたアンプル中、４０℃で１時間インキュベートし、続けて前記試料をゼラチン化するために１００℃で１時間インキュベートした。前記アミロペクチンを再結晶化させるために、次に前記試料を室温で７日間熟成した。酵素無しのコントロールを含めた。
【０１４６】
熟成の後、９０℃／時間の、一定の走査速度で、５℃から９５℃までを走査することによって、ＤＳＣを前記の試料で行った。温度記録図の最初の吸熱ピークのもとの領域を、凝集したアミロペクチンの量を表わすために採用し、そして相対的な凝集の阻害を、酵素無しのコントロールと比較する、領域の減少（％）として採用した。
【０１４７】
以下の表において、前記酵素の投与量（ＭＡＮＵ／ml）に対する相対的な凝集の阻害として、前記酵素の効率を表わした。
【０１４８】
【表６】
2010148525.tif 000014
【０１４９】
多くの変異体が、凝集を阻害することにおいて前記親アミラーゼよりもより効率的であることを前記の結果は示している。
例６：変異体の抗劣化効果
パンを、欧州のストレート生地法（Ｓｔｒａｉｇｈｔ  Ｄｏｕｇｈ  ｍｅｔｈｏｄ）によって、あるいは酵素の添加有り又は無しの酸性の生地から製造し、そして焼きパンを、増大効果を防ぐために、ふたのある平鍋で焼いた。前記のパンを２時間冷やし、そして質感を解析した。次に、残っている焼きパンを、プラスチックバッグに包み、そして１，４及び７日後の質感解析のために室温で保存した。
【０１５０】
各焼きパンの質感解析を、４枚に切ることで行った；力を２５％圧縮（Ｐ１）、４０％圧縮（Ｐ２）、及び３０秒間の４０％一定圧縮後（Ｐ３）で測定した。Ｐ１を固さとして採用し、そして比率（Ｐ３／Ｐ２）を、パンの中味の弾力性として採用した。７日間の保存後の凝集の範囲を、例７に記載した様にＤＳＣによって決定した。
【０１５１】
欧州のストレート生地（pH５．５〜６．０）
Ｎｏｖａｍｙｌ変異体（Ｔ１４２Ａ＋Ｎ３２７Ｓ＋Ｋ４２５Ｅ＋Ｋ５２０Ｒ＋Ｎ５９５Ｉ）を、０〜２mgの酵素／kg小麦粉の範囲内の投与量で試験し、そして前記の親酵素（Ｎｏｖａｍｙｌ）を比較のために使用した。
等しい投与量で、前記変異体が２時間及び１日後に、前記親酵素よりもより良い弾力性（Ｐ３／Ｐ２）を与えることを前記の結果は示した。１〜２mg／kgの投与量で、前記変異体が、同じ投与量の前記の親酵素よりも有意に柔かいパンの中身（より低い固さ、Ｐ１）を与えることを、７日後の結果は示している。従って、前記変異体は７日間の保存期間中、より良い抗劣化作用を有する。
【０１５２】
酸性生地（pH約４．５）
Ｎｏｖａｍｙｌ変異体（Ｆ１８８Ｌ＋Ｄ２６１Ｇ＋Ｔ２８８Ｐ）を酸性生地において試験し、そして前記の親酵素（Ｎｏｖａｍｙｌ）を比較のために使用した。以下の結果を７日後の固さ（Ｐ１）、４及び７日後の弾力性（Ｐ３／Ｐ２）並びに７日後の凝集から得た。
【０１５３】
【表７】
2010148525.tif 000015
【０１５４】
【表８】
2010148525.tif 000016
【０１５５】
【表９】
2010148525.tif 000017
【０１５６】
前記結果は、前記変異体がpH４．５の酸性生地において固さ及び弾力性として評価される質感に対する、著しく向上した作用を有することを示している。前記変異体の１〜３mg／kgの投与量は、試験された全てのパラメーター上で、１３mg／kgの前記親酵素よりも優れており、そして前記変異体により達成される弾力性に、あらゆる濃度で親酵素は匹敵しなかった。
【０１５７】
例７：変異体の開裂パターン
澱粉の加水分解における開裂パターンを、２つの変異体及び前記親酵素、Ｎｏｖａｍｙｌと比較した。
以下の結果は各オリゴ糖（Ｇ１〜Ｇ８）の重量％を示し、これは５０℃で、pH５．０の５０mM酢酸ナトリウム、１mM  ＣａＣｌ2 、を用いる１％（ｗ／ｖ）澱粉溶液中での２４時間のインキュベーション後に形したものである。前記のオリゴ糖をＨＰＬＣを用いて同定し、そして定量した。
【０１５８】
【表１０】
2010148525.tif 000018
【０１５９】
前記結果は、有意に変化した開裂パターンを示している。２４時間後、Ｎｏｖａｍｙｌは主にマルトースを産生し、そして事実上それ以上のオリゴ糖は産生しない。対照的に、前記の２つの変異体は、有意な量のマルトース及びそれ以上のオリゴ糖を産生する。
参考文献
【０１６０】
【表１１】
2010148525.tif 000019
【０１６１】
【表１２】
2010148525.tif 000020
【０１６２】
【表１３】
2010148525.tif 000021
【０１６３】
【表１４】
2010148525.tif 000022
【０１６４】
【表１５】
2010148525.tif 000023
【０１６５】
【表１６】
2010148525.tif 000024
【０１６６】
【表１７】
2010148525.tif 000025
【０１６７】
【表１８】
2010148525.tif 000026
【０１６８】
【表１９】
2010148525.tif 000027
【０１６９】
【表２０】
2010148525.tif 000028
【０１７０】
【表２１】
2010148525.tif 000029
【０１７１】
【表２２】
2010148525.tif 000030
【０１７２】
【表２３】
2010148525.tif 000031
【０１７３】
【表２４】
2010148525.tif 000032
【０１７４】
【表２５】
2010148525.tif 000033
【０１７５】
【表２６】
2010148525.tif 000034
【０１７６】
【表２７】
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【０１７７】
【表２８】
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【０１７８】
【表２９】
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【０１７９】
【表３０】
2010148525.tif 000038
【０１８０】
【表３１】
2010148525.tif 000039
【０１８１】
【表３２】
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【０１８２】
【表３３】
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【０１８３】
【表３４】
2010148525.tif 000042
【０１８４】
【表３５】
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【０１８５】
【表３６】
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【０１８６】
【表３７】
2010148525.tif 000045
【０１８７】
【表３８】
2010148525.tif 000046
【０１８８】
【表３９】
2010148525.tif 000047
【０１８９】
【表４０】
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【０１９０】
【表４１】
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【０１９１】
【表４２】
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【０１９２】
【表４３】
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【０１９３】
【表４４】
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【０１９４】
【表４５】
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【０１９５】
【表４６】
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【０１９６】
【表４７】
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【０１９７】
【表４８】
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【０１９８】
【表４９】
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【０１９９】
【表５０】
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【０２００】
【表５１】
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【０２０１】
【表５２】
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【０２０２】
【表５３】
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【０２０３】
【表５４】
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【０２０４】
【表５５】
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【０２０５】
【表５６】
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【０２０６】
【表５７】
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【０２０７】
【表５８】
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【０２０８】
【表５９】
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【０２０９】
【表６０】
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【０２１０】
【表６１】
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【０２１１】
【表６２】
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【０２１２】
【表６３】
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【０２１３】
【表６４】
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【０２１４】
【表６５】
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【０２１５】
【表６６】
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【０２１６】
【表６７】
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【０２１７】
【表６８】
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【０２１８】
【表６９】
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【０２１９】
【表７０】
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【０２２０】
【表７１】
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【０２２１】
【表７２】
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【０２２２】
【表７３】
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【０２２３】
【表７４】
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【０２２４】
【表７５】
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【０２２５】
【表７６】
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【０２２６】
【表７７】
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【０２２７】
【表７８】
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【０２２８】
【表７９】
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【０２２９】
【表８０】
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【０２３０】
【表８１】
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【０２３１】
【表８２】
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【０２３２】
【表８３】
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【０２３３】
【表８４】
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【０２３４】
【表８５】
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【０２３５】
【表８６】
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【０２３６】
【表８７】
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【０２３７】
【表８８】
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【０２３８】
【表８９】
2010148525.tif 000097
【図１】
2010148525.tif 000103
【配列表】
2010148525000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月12日(2010.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）マルトース産生アルファアミラーゼ活性を有し；
ｂ）配列番号１に少なくとも７０％の同一性を有し；そして
ｃ）Ｔ２８８に相当する位置で、配列番号１と比較されるアミノ酸修飾を含んで成り；そして
ｄ）配列番号１のポリペプチドと比較して向上した安定性を有する、
ポリペプチド。
【請求項２】
前記修飾がＴ２８８Ｒ、Ｔ２８８Ｐ又はＴ２８８Ｋに相当する位置の置換を含んで成る、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項４】
適当な発現宿主において、前記ポリペプチドの発現を方向づける、１又は複数の調節配列に作用可能に連結した、請求項３に記載の核酸配列。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の核酸配列、プロモーター、並びに転写及び翻訳終結シグナルを含んで成る、組換え発現ベクター。
【請求項６】
更に選択マーカーを含んで成る、請求項５に記載の組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項３又は４に記載の核酸配列又は請求項５又は６に記載のベクターを含んで成る、形質転換される宿主細胞。
【請求項８】
ａ）請求項１又は２に記載のポリペプチドの発現を誘導する条件下で、請求項７に記載の形質転換した宿主細胞の培養；及び
ｂ）前記ポリペプチドの回収、
を含んで成る、請求項１又は２に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のポリペプチド、又は請求項８に記載の方法によって製造したポリペプチドを、パンの劣化を遅らせるのに効果的である量において、生地に加えることを含んで成る、生地又は前記の生地から製造した焼いた産物の製造方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、小麦粉のkg当たり０．１〜５mgの量において加えられる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記量が０．５〜２mg／kgである、請求項１０に記載の方法。