(57)【要約】      （修正有）【課題】早期癌のマーカーとして有用である新規なポリペプチドによる早期癌の体外診断方法を提供する。【解決手段】さまざまな癌を有する患者の血中あるいは尿中には、早いステージでＭＫ（ミッドカイン）が出現することを見出し、当該知見に基づいて、血中あるいは尿中のＭＫを測定する工程を含む早期癌の検出方法を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の行程を含む、癌の予後判定方法。
ａ）生物学的試料中のミッドカインおよび／またはそのフラグメントを測定する行程、
ｂ）行程ａ）によって得られる測定値を癌の予後判定と関連付ける工程、
【請求項２】
癌が、胃癌、肝細胞癌、または肺癌である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、早期癌を検出するための腫瘍マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の進展ないし拡大の程度は、早期癌、進行癌、末期癌と表現される。このうち早期癌とは、一般的に“小さく、転移も少なく、治療によって永久ないし長期治癒が得られる進行度の癌”として位置づけられている。
早期癌は基本的には無症状である。したがって、早期癌を完全に近く検出するには、無症状の被験者を対象とする検査となる。幅広く無症状の被験者を対象として、特定の疾患に罹患した患者を見つけ出すための検査、あるいはより高度な二次的な検査が必要な対象者を絞り込むための検査を、一般にスクリーニングと呼んでいる。スクリーニングは、一般に検査対象の数が極端に多い。多くの検査対象者を検査するためには、先ずは簡便で、かつ経済的でなければならない。腫瘍マーカー検査は、患者への侵襲が少なく好適な検査法であるが、現時点では、腫瘍マーカーの測定により、早期癌を検出することは、通常は不可能とされている。
【０００３】
ミッドカイン（以下、「ＭＫ」と称する）は、レチノイン酸応答遺伝子の産物として発見された増殖分化因子で、塩基性アミノ酸とシステインに富む分子量１３kDaのポリペプチドである（Kadomatsu, K. et al. : Biochem. Biophys. Res. Commun., 151 : 1312-1318; Tomomura, M. et al. : J. Biol. Chem., 265 : 10765-10770, 1990）。ＭＫは、さまざまな悪性腫瘍において、その周辺の正常組織と比較して増強しているので、発癌において重要な役割を果たしていることが示唆されている。そこで、ＭＫ遺伝子をプローブとしたノーザンブロットによる癌の診断法（特開平6-113898）、および抗ＭＫタンパク質抗体を含む癌の診断薬（特開平6-172218）が提案されている。しかしながら、これらの公開特許には、ＭＫ遺伝子、あるいはＭＫタンパク質が、早期癌検出に有用であるとの記載も示唆もなされていない。その後 Yeらは、ヒト結腸癌のアデノーマ段階における前癌組織で、ＭＫの発現が上昇していることを報告している（Ye C. et al.: Br. J Cancer., 79 : 179-183, 1999）。しかしながら、この論文には、早期癌の検出については記載も示唆もなされていない。
したがって、早期癌の状態から検出されうる腫瘍マーカーの発見および検査法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、早期癌のマーカーとして有用である新規なポリペプチドを提供することを課題とする。また、本発明は、該ポリペプチドを指標とする早期癌の検出方法の提供を課題とする。さらに、本発明は、該ポリペプチドを検出することができる早期癌の体外診断薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、肝細胞癌患者において、抗ＭＫ抗体により検出されるＭＫレベルが、健常者や肝炎患者に比べ、肝細胞癌の組織中だけでなく、血中や尿中においても、肝細胞癌の早いステージで、有意に増大していることを見出した。また胃癌についても、肝癌と同様に早いステージで、血中や尿中のＭＫレベルが有意に増大することを見出した。さらに、食道癌、十二指腸癌、結腸癌、胆管及び胆嚢癌、膵臓癌、甲状腺癌、肺癌、及び乳癌など多くの癌において、癌の早期において、血清中ＭＫレベルが有意に上昇していることを見出した。すなわち、ＭＫが、不特定癌の検出に対して、公知の腫瘍マーカーにはみられない、非常に広いスペクトルを有していることを示している。
本発明者らは、これらの知見に基づいて、ＭＫが、早期癌のマーカーとして有用であることを明らかにした。そして、本発明者らが開発した、簡便な高感度な１ステップサンドイッチ法を用いて、あらゆる癌について、早期に患者の体液中に出現するＭＫレベルを、ＥＩＡにより高感度に検出することにより、早期癌のスクリーニング診断を可能とした。ＥＩＡは、全自動化が可能で、早期癌の検出を目的とするMKの測定方法として非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
すなわち本発明は、以下の早期癌の検出方法、あるいは早期癌の診断方法、並びにこれらの方法のための診断剤、およびキットに関する。
〔１〕次の行程を含む、早期癌の検出方法：
ａ）生物学的試料中のミッドカインおよび／またはそのフラグメントを測定する行程、
ｂ）行程ａ）によって得られる測定値を正常者の測定値と比較する行程、
〔２〕早期癌が、胃癌である〔１〕に記載の方法。
〔３〕胃癌がステージ１である〔２〕に記載の方法。
〔４〕早期癌が、肝細胞癌である〔１〕に記載の方法。
〔５〕肝細胞癌がステージＩである〔４〕に記載の方法。
〔６〕早期癌が、肺癌である〔１〕に記載の方法。
〔７〕肺癌がステージＩである〔６〕に記載の方法。
〔８〕生物学的試料が血清または尿である〔１〕に記載の方法。
〔９〕ミッドカインおよび／またはそのフラグメントを認識する抗体の早期癌の検出における使用。
〔１０〕               
ミッドカインおよび／またはそのフラグメントを認識する抗体からなる早期癌の診断剤。
〔１１〕               
生物学的試料中のミッドカインおよび／またはそのフラグメントの存在を決定するための早期癌検出キットであって、ミッドカインおよび／またはそのフラグメントの少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する抗体を収容する容器を含む早期癌検出キット。
〔１２〕               
前記抗体が固相に吸着している〔１１〕に記載の早期癌検出キット。
〔１３〕               
次の行程を含む、癌の予後判定方法。
ａ）生物学的試料中のミッドカインおよび／またはそのフラグメントを測定する行程、
ｂ）行程ａ）によって得られる測定値を癌の予後判定と関連付ける工程、
〔１４〕               
癌が、胃癌、肝細胞癌、または肺癌である〔１３〕に記載の方法。
【０００７】
定義
本明細書で用いられる以下の用語は、他に断らない限り、以下の意味を有する。
「早期癌」とは、腫瘍が発生した局所（粘膜内）に限局していて、周囲組織への浸潤のないもの、あるいは浸潤があってもその範囲が局所に限局しているものを言う。特に、浸潤が見られないものは、公知の腫瘍マーカーでその存在を検出することが困難であったことから、本発明における重要な検出対象である。この定義は、皮膚、口腔、気道、消化管、子宮頸部、卵巣、胆嚢、膀胱などほとんどの癌にあてはめることができる。早期癌はTNM分類のステージ０（carcinoma in situ）とステージ I を含み、この病期では、脈管内侵襲や遠隔転移はなく、局所の腫瘍切除だけで完治できる。
本発明において、「腫瘍マーカー」とは、腫瘍細胞またはその存在に反応した細胞が産生する物質で、組織、体液、排泄物などのなかに見出され、腫瘍の存在、性状、あるいは広がり等の腫瘍が有する何らかの性状の指標としうる物質と定義される。
「ＭＫ」とは、全長ＭＫタンパク質、及びＭＫの生物活性を有する任意の長さのアミノ酸配列を有するフラグメントを含む。Ｎドメインを欠く変異型ＭＫが癌特異的に発現しており（Kaname T. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 219: 256-260, 1996）、このような変異型ＭＫも含む。遺伝子組み換え技術によって生成されたＭＫ、および化学合成されたＭＫは、本明細書では交換可能に用いられる。ヒト全長ＭＫをコードするＤＮＡ配列は公知（米国特許：5,461,029）である。ＭＫの生物活性とは、MKが細胞に与える生理的な作用のみならず、抗MK抗体との免疫学的な反応性も含む。
「感度」とは、腫瘍が存在する群での測定値が陽性となる比率であり、陽性率ともいわれる。
「特異性」とは、腫瘍が存在しない群での測定値が陰性となる比率であり、陰性率ともいわれる。
「生物学的試料」とは、生物より得ることができる試料を意味する。より具体的には、例えば、血液、血清、尿、及びその他の分泌物等を挙げることができる。これらの生物学的試料の中でも、尿は侵襲性の低い試料として有用である。尿量は変動の幅が大きいので、尿中成分の濃度をより正確に比較するには尿量補正を行うのが望ましい。尿量を補正する手法として、クレアチニン補正等の手法が公知である。
「ステージ分類」とは、一般に癌の肉眼的進展度による分類として、ＴＮＭ分類（tumor-node-metastasis staging）が国際的に広く用いられている。本発明で用いる“ステージ分類”は、ＴＮＭ分類に対応している［臨床・病理 原発性肝癌取り扱い規約: 22p. 日本肝癌学研究会編(改訂第3版), 金原出版, 1992］。
また本発明において、「癌の検出」とは、被験者の生体内に癌が存在する可能性が高いと判定することを意味する。検出に対して、スクリーニングという用語は、特に任意の集団を対象として癌が存在する可能性が高い被験者を絞り込むことを目的として行われる検査を指す用語である。一方、スクリーニングが任意の集団を対象とするのに対して、特定の被験者を対象に癌を検出することを、特に診断と言う。本発明においては、スクリーニングと診断とは、その対象が異なっているだけで、いずれも本発明による癌の検出方法に含まれる。
【０００８】
癌細胞がつくるマーカーは、癌がある程度大きくなるまで血中レベルは健常人の基準値と変わらないため、血清マーカーの増加から早期癌を検出することは、上記したように、通常は不可能とされている。
本発明者らは、ＭＫが、結腸癌の前癌段階で、ｍＲＮＡレベルおよびタンパクレベルで高発現（Ye C. et al.: Br. J Cancer., 79 : 179-183, 1999）していることから、さまざまな種類の癌を有する患者の血中ＭＫレベルを調べたところ、ほとんどの患者（８７％）で、血中ＭＫレベルが、健常人の血中ＭＫ量と比較して、有意に上昇していることを見出した。この８７％という数値は、既存の腫瘍マーカーと比較して、きわめて高い数値である。癌組織で発現したＭＫは、おそらく血中に分泌され、このため血中ＭＫレベルが増加していると考えられる。さらに、肝細胞癌、胃癌、肺癌などでは、血中ＭＫレベルが、癌の早期に上昇していた。
【０００９】
肝細胞癌あるいは肺癌患者血中のＭＫレベルは、ステ−ジ I で、既に、健常人の基準値に比較して有意に上昇しており、ステージII〜IVでは、さらなる上昇が見られた。これに対し、胃癌患者では、ステ−ジ １で、健常人の基準値に比較して有意に上昇しているが、ステージ２以降もステージに関係なくＭＫレベルがほぼ同じ値で推移した。これらのことから、ＭＫの測定によって、肝細胞癌、肺癌、あるいは胃癌をはじめとする幅広い癌において、ステージＩに分類される早期癌の検出が可能であることが明らかである。更にＭＫの測定によって、癌の増大やMKの蓄積によらずに、早期癌のみならずあらゆるステージの癌をも検出できるということができる。この特徴は、腫瘍マーカーとしては重要である。なぜなら、早期癌のみに見出される腫瘍マーカーでは、進行した癌を見落とす恐れがある。
さて、一般に腫瘍マーカーの有用性は、癌患者を陽性と判定する「感度」、非癌患者を陰性と判定する「特異性」などによって評価される。ところが公知の各腫瘍マーカーの感度や特異性には限界がある。
【００１０】
ＭＫの場合は、実施例において示すようにさまざまなタイプの不特定癌において、早期に血中や尿中のＭＫレベルが健常人の基準値に比較して上昇する。すなわち、不特定癌に対する広いスペクトルを有し、感度が高いといってよい。臓器を問わず幅広く早期癌のスクリーニングを行うには、特定癌に対する高い検出感度、特異性とともに、不特定癌検出に対する広いスペクトルが求められる。ＭＫは、このようなスクリーニングに必要な感度と特異性を備えていると言える。
更に、本発明に基づく早期癌の検出方法によって、公知の腫瘍マーカーの感度や特異度の限界を補うことができる。複数の腫瘍マーカーを組み合わせることによって、ある一定の特異性を維持しつつ、感度を上昇させることができる場合のあることが知られている。感度や特異度の改善につながる複数の腫瘍マーカーを組み合わせたスクリーニング方法は、一般にコンビネーションアッセイ (combination assay)と呼ばれている。
【００１１】
本発明において、無症状の被験者を対象としたスクリーニングで、被験者の血液や尿中のＭＫレベルをＥＩＡ等で測定することにより様々なタイプの悪性腫瘍の存在を早期のステージで検出することができる。更に、他の腫瘍マーカーの測定を組み合わせることによって、感度や特異度を向上させることができる場合がある。
combination assayを行うに当たっては、２つの考慮すべき点がある。一つは、どの腫瘍マーカーを組み合わせに選択するかである。そして組み合わせる腫瘍マーカーが決定したとして、次に考慮すべき点は、そのcut off値をいかに定めるかである。
【００１２】
腫瘍マーカーの選択のポイントは、できるだけ相関の低い組み合わせを選択することである。例えば、肝癌マーカーであるＡＦＰとPIVKA-IIは相関が低く、PIVKA-IIのcut off値を0.1 Au/mlにとるとほぼ１００％の特異性を示す。一方、膵癌マーカーであるCA19-9とCA-50を組み合わせると真陽性の症例は同一で、偽陽性の症例は重なりがない組み合わせとなり、効率が悪い組み合わせとなる。
組み合わせる腫瘍マーカーが選択されると、次の段階はcut off値の設定である。cut off値は、感度と特異性を左右する重要な要素である。一般に腫瘍マーカーの感度と特異性とはtrade off の関係にあるが、当業者であれば、適切なcut off値は、関連文献（例えば、川村  武: 腫瘍マーカー. 日本臨床 54: 1649-1653, 1996）を参照して設定することが可能である。
【００１３】
理想的な腫瘍マーカーは、腫瘍群と非腫瘍群での測定値が重なり合わず、測定値が腫瘍の存在を決定できる。しかしこのような理想的な腫瘍マーカーは、これまで開発されていない。このため、腫瘍群と非腫瘍群を識別・鑑別する最も適切なcut off 値を設定する必要がある。
一つの好適な態様において、cut off値は固相化抗体が、癌の存在しない患者からのサンプルとインキュベートするとき得られるシグナルの平均値である。通常、予め決定したcut off値の標準偏差の３倍のシグナルを生じるサンプルは、癌に対して陽性であると考えられる。cut off値は、健常者の測定値の分布の９５％信頼区間（基準範囲）の上・下限値が用いられることが多い。しかし、基準範囲の設定では、病態の分布が一切考慮されていない。そこで、cut off値は、その検査で識別すべき病態を明確に定義し、それに基づいて、その疾患群と非疾患群を一定数集め、検査し、２群の測定値の分離度（検査の分別能）と有病率（検査が適用される状況）を考慮して決めるのが望ましい。この方法によって決定されるcut off値より高いシグナルを生じるサンプルは癌に対して陽性と考えられる。
【００１４】
更に肝細胞癌患者の場合、腫瘍を外科的に除去した後、血中のＭＫレベルが著明に低下した。このことは、ＭＫが癌の診断のみならず、病状経過のモニタリングの指標、予後判定の因子、あるいは再発のモニターとして有用であるということができる。予後とは、治療に対する患者の反応を意味する。したがって、腫瘍の治療の前後においてMKを測定し、MKの測定値の低下が認められれば、有効な治療が行われていることが推測できる。更に、MK測定値が健常者の値にまで低下すれば、腫瘍の治療が成功したことが推測される。腫瘍の治療とは、外科的な除去をはじめとして、放射線療法、免疫療法、あるいは化学療法などを例示することができる。
また他の態様において、ＭＫは、ある種の癌、例えば肝細胞癌の進行に対してのマーカーとして用いることができる。肝細胞癌においては、ＭＫはステージの進行に伴い血中ＭＫレベルが上昇する。癌診断に対して上記に記載したようなアッセイは、経時的に複数回（オーバータイム）行い、ＭＫのレベルの変化を評価する。例えば、該アッセイは、６ヶ月から１年の期間２４-７２時間ごとに行い、そしてその後必要に応じて行う。一般に、抗体によって検出されるＭＫがオーバータイムで経時的に増加する患者においては、癌は進展している。
【００１５】
本発明において、生物学的試料中のＭＫレベルは、ラテックス凝集法、ＭＫに対する特異的ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いたＥＩＡやＲＩＡ法、ＦＩＡ、化学発光イムノアッセイ、あるいはECLIA法などを用いて測定することができる。このうちＥＩＡは、本発明におけるＭＫの測定手法として好適である。ＥＩＡは酵素を標識として用いることから、放射性廃棄物や半減期の問題を伴うＲＩＡに比べて、容易に実施することができる。また、理論的には、ＲＩＡよりも測定法の高感度化が可能である。
その他に、ＥＩＡに関しては、さまざまなアッセイ系が当業者に知られている（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。特にＭＫの測定に関しては、優れたＥＩＡ法が開発されており（特開平10-160735）、当業者であれば、この公知方法を、検出目的に沿って適宜改良することができる。
【００１６】
関連ある態様において、アッセイは、抗体をニトロセルロースのようなメンブレン上に固相化したフロースルー（flow-through）又はストリップテスト型を用いて実施できる。フロースルーテストにおいては、サンプルがメンブレンを通り抜けるとき、サンプル中のＭＫは固相化抗体に結合する。次に、該第二抗体を含む溶液がメンブレンを通り抜けるとき、標識した第二抗体が、抗体-ポリペプチド複合体に結合する。次に、結合した第二抗体を上記したように検出する。ストリップテスト型においては、抗体が結合したメンブレンの一端をサンプルを含む溶液中に浸す。サンプルは、第二抗体を含む領域を通過するようにメンブレンを移動し固相化抗体のエリアに向かって移動する。固相化抗体のエリアにおける第二抗体の濃度が癌の存在を示す。代表的には、その部位における第二抗体の濃度は、視覚的に読みとることができるラインのような一つのパターンを生じる。このようなパターンが存在しない場合は陰性結果を示す。一般に、メンブレンに固相化される抗体の量は、視覚的に識別できるパターンを生じるように選択される。その場合、生物学的試料が、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるに十分なＭＫのレベルを含む。好ましくは、メンブレン上に固相化される抗体の量は、およそ２５ｎｇ〜１μｇであり、さらに好ましくは、およそ５０ｎｇ〜５００ｎｇである。このようなテストは通常、非常に少ない量の生物学的試料で行う。
【００１７】
フロースルー（flow-through）又はストリップテストタイプのアッセイフォーマットにおいては、シグナル強度を機械的に読み取ることにより定量的な測定が可能である。あるいは、一定濃度以上のＭＫが存在するときにのみ陽性結果を生じるように感度を調整することもできる。感度の調整によって、陽性結果を特別
な装置を用いることなく視覚的に判定することができる。この種のアッセイフォーマットにおける感度を調整する方法は、当業者にとって周知の技術である。たとえば、抗体の使用量を調整することにより、感度を変化させることができる。
勿論、他に多数のアッセイプロトコールが本発明の抗原或いは抗体とともに使用に対して好都合である。上記の記載はほんの例示的なものを意図している。
【００１８】
以上のような各種のアッセイプロトコールに必要な抗ＭＫ抗体や、標準試料として用いられるＭＫは、早期癌の検出用キットとして有用である。本発明による早期癌の検出用キットとは、少なくとも抗ＭＫ抗体と、標準試料として用いられるＭＫとからなる。本発明の検出用キットには、この他に、標識成分の検出に必要な酵素基質、陰性対照、及び取り扱い指示書等を組み合わせることができる。検出用キットがＥＩＡなどの手法に用いられる場合には、前記抗ＭＫ抗体は、予め固相担体に結合させておくことができる。固相には、一般に、反応容器、ビーズ、あるいは磁気粒子等が用いられる。抗ＭＫ抗体を予め固相に結合させておくことにより、ＥＩＡの操作を容易に行うことができるのみならず、自動化にも貢献する。
【００１９】
上記方法で使用する抗ＭＫ抗体は、当業者に公知の様々な技術によって作製することができる（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照）。抗ＭＫ抗体は、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体であってもよい。たとえば本特許出願人による特許出願2000-272199号（平成12年9月7日出願）に記載されたような、ＭＫを特異的に認識するモノクローナル抗体を本発明に利用することができる。抗ＭＫ抗体は、その抗原結合部位を含む断片として用いることもできる。さらに、抗体は単鎖、キメラ、ＣＤＲ-グラフト、又はヒト化されたものであってもよい。抗体はここに記載された方法及び当業者によく知られたその他の方法によって作製され得る。
本発明の抗ＭＫ抗体作成のための免疫原や、標準試料としてＭＫが用いられる。これらに用いるＭＫは、生体由来ＭＫ、組み換えＭＫあるいは化学合成ＭＫ、さらにＭＫの生物活性を有する断片を含む。ＭＫを組み換え体として得る方法は、公知である（特開平9-95454）。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００２０】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例及び試験例により説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
抗ヒトＭＫポリクローナル抗体の作製
免疫に用いるＭＫタンパク質、及び標準物質（standard material）として用いる組換えＭＫタンパク質は、特開平9-95454の実施例１に記載されている方法に準じて作製した。
ピキア酵母を宿主とする発現ベクターPHIL-D4に、ヒトＭＫのＯＲＦをカバーするｃＤＮＡを導入した。このＭＫ発現ベクターを、ピキア酵母Ｇ１１５（ピキアパストリス  Ｇ１１５;Research Corporation Technologies）にトランスフェクションした。ヒスチジン及びＧ４１８選択によりＭＫ発現クローンを得た。ＭＫは、イオン交換クロマトグラフィー及びヘパリンカラムによるアフイニティークロマトグラフィーにより精製した。精製ＭＫタンパクの神経栄養活性は、組み換えＬ細胞が産生したマウスＭＫのそれと類似していた。
ウサギ、及びニワトリに対する免疫注射は、ウサギの場合は、２週間おきに計６回、ニワトリの場合は、２週間おきに計８回行った。
すなわち、ウサギの場合は、初回に、400μgのＭＫをフロイント完全アジュバントと等量混合したものを、ウサギの皮下に注射し、２回目以降は、１回あたり400μgのＭＫをフロイント不完全アジュバントと混合したものを皮下に注射した。ニワトリの場合は、１回あたり100μgのＭＫを用いニワトリに注射した他は、ウサギと同様であった。
ウサギから得た抗血清は、硫安で塩析した後、プロテインＡカラムでＩｇＧを単離し、さらに、ＭＫをAffigel-10ＴＭ（Bio Rad）に固定化したＭＫアフィニティカラムにより、アフィニティ精製して、精製ウサギ抗ヒトＭＫ特異的抗体を得た。一方、ニワトリから得た抗血清は、硫安で塩析の後、ＭＫアフィニティカラムでアフィニティ精製して、精製ニワトリ抗ヒトＭＫ特異的抗体を得た。これらの抗体は、ウエスタンブロット解析でヒトＭＫを特異的に検出した。
【実施例２】
【００２２】
１-ステップサンドイッチ法によるＭＫの測定
（１）  ウサギ抗ヒトＭＫ抗体を、0.１％ＮａＮ３を含む５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ7.２）に溶解（5.5μg/ml）し、その５０μlを、マイクロタイタープレート（Polysorp plates ,Nunc）の各ウエルに分注した。プレートを室温で１６時間おき、抗体をウエルに吸着させた。０．１％Tween２０を含むＰＢＳでウエルを洗浄後、0.５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ１５０μlを各ウエルに加え、３７℃で２時間インキュベートし、ブロッキングした。
一方、肝癌の各ステージの血清サンプル、胃癌の各ステージの血清サンプル、あるいは健常人血清サンプル（コントロール）各々１０μlは、0.５Ｍ ＫＣｌ、0.５％ＢＳＡ、および0.０１％Microcide I（aMReSCO, Solon, Ohio）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８.４）に溶解したペルオシシダーゼ標識ニワトリ抗ヒトＭＫ抗体（０.１μｇ/ｍｌ）１００μｌと反応させた。この反応液５０μｌを、プレートの各ウエルに加え、室温で１時間インキュベーションした。各ウエルを、１％Tween２０を含むＰＢＳで５回洗浄した。基質溶液（０.５ｍｇ/ｍｌのtetrametylbenzidine）１００μｌを各ウエルに加え、室温で３０分間インキュベートした。２N-H２SO４を加えて反応を停止し、４５０ｎｍ/６５５ｎｍにおける吸光度をmultiplate reader（Model 3550, BioRad）により測定した。測定時、濃度既知のＭＫ標準物質についても同様な操作で実施し、標準曲線を作成した。
（２）ウサギ抗ヒトＭＫ抗体溶解緩衝液は、５０ｍＭ ＰＢＳに替えて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１−８．３）を用い、さらに、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを該緩衝液に含ませ、抗体濃度は５μｇ/ｍｌとした点、２）ブロッキング液を、０.５％ＢＳＡに替えて、０.１％カゼインを含むＰＢＳを使用した点、および３）ペルオシシダーゼ（ＰＯＤ）標識ニワトリ抗ヒトＭＫ抗体溶解緩衝液を、0.５Ｍ ＫＣｌ、０．１％カゼイン、０.５％ＢＳＡ、１ｍｇ/ｍｌウサギγグロブリン、および０.０１％ Microcide I（aMReSCO, Solon, Ohio）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２−８．４）とした点、が上記（１）と異なり、それ以外は、上記（１）と同様の方法で１-ステップサンドイッチ法によるＭＫの測定を行った。
【００２３】
［試験例１］  肝細胞癌の各ステージと血清中のＭＫレベルとの相関
（１）  血清サンプルの調製
健常人１３５名（男性：９４名、女性：４１名、年齢２１〜７５）、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma: ＨＣＣ）患者７６名（ステージI：７名、ステーII：１９名、ステージIII：２３名、及びIV：２７名）、及び肝疾患対照としてウイルス肝炎患者７名、腺癌患者７２名（ステージ１：２３名、ステージ２：９名、ステージ３：７名、ステージ４：９名、ステージ５：５名、ステージ６：９名、及びステージ７：１０名）、から採血し血清を調製した。血清は直ちに凍結し、ＭＫ測定まで、ー２０℃で保存した。
その後、さらに新たに健常人３７６名（男性１５２名、女性２２４名）から採血し血清を調製した。
（２）  血清中のＭＫレベルの測定
ＨＣＣ患者、ウイルス肝炎患者、及び健常人１３５名、のそれぞれの血清中のＭＫレベルを、実施例２の（１）に記載の方法で測定した（図１）。図中のバーは標準偏差を示す。ＨＣＣ患者の血清中のＭＫレベルは、ステージIIから、健常人のそれよりも有意に高くなることが認められた。
ＥＩＡの感度を高めた実施例２の（２）の１ステップサンドイッチ法を用いて、上記ＨＣＣ患者、ウイルス肝炎患者、及び健常人３７６名、のそれぞれの血清中のＭＫレベルを測定した（図２）。図中のバーは標準偏差を示す。
ＨＣＣ患者のステージIにおける血清中のＭＫレベルは０.２２ng/mL（平均値）と、健常人の０.０２ng/mL（平均値）に対して有意（＊＊ｐ＜０.０１；Mann Whiteney検定）に高かった。すなわち、ＭＫは、早期のＨＣＣの血清腫瘍マーカーとして、きわめて有用であることが明らかとなった。
【００２４】
［試験例２］  ＨＣＣにおけるPIVKA-II及びＡＦＰとの比較試験
PIVKA-II及びＡＦＰは、現在ＨＣＣの腫瘍マーカーとして広く用いられている。PIVKA-IIとＡＦＰは相補的な関係にあり、PIVKA-IIとＡＦＰの組み合わせで診断率は上がる。そこでＡＦＰとPIVKA-IIを、比較対照の腫瘍マーカーとした。
血清中のPIVKA-IIは、エイテストPIVKA-II（三光純薬株式会社）を用いて測定した（図３）。測定方法はＥＩＡである。ＨＣＣは、ステージIIIから陽性である可能性が示唆された。
血清中のＡＦＰは、α-フェト・リアビーズ（ダイナボット社）を用いて測定した（図４）。測定方法はイムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）である。ＡＦＰは、ＨＣＣのステージIでは検出されず、ステージIIから検出されることが示唆された。
すなわち、ＭＫは、ＨＣＣを早期に検出することが可能であり、さらに、ＨＣＣのステージの進行と、血清中のＭＫ濃度上昇との間には強い相関関係が認められた。
【００２５】
［試験例３］  胃癌の各ステージと血清中のＭＫレベルの相関
（１）  血清サンプルの調製
胃癌患者７２名（ステージ１：２３名、ステージ２：９名、ステージ３：７名、ステージ４：９名、ステージ５：５名、ステージ６：９名、及びステージ７：１０名）、から採血し血清を調製した。血清は直ちに凍結し、ＭＫ測定まで、ー２０℃で保存した。健常人１３５名あるいは健常人３７６名の血清中のＭＫレベルは、それぞれ、試験例１の数値を用いた。
（２）  血清中のＭＫレベルの測定
胃癌の各ステージ（１〜７）における血清中のＭＫレベルと健常人１３５名のそれを図５（図中バーは標準偏差を示す）に、また、健常人が３７６名の場合を図６（＊＊ｐ＜０.０１；Mann-WhitneyのU検定；図中バーは標準偏差を示す）にそれぞれ示す。
図６から、胃癌患者の血清中のＭＫレベルは、ステージ１から、健常人のそれよりも有意に高くなっていることが認められた。すなわち、ＭＫは胃癌の早期診断の腫瘍マーカーとして有用であることが明らかとなった。
【００２６】
［試験例４］  胃癌におけるＣＥＡ及びＣＡ１９-９との比較試験
比較対照の腫瘍マーカーとして、ＣＥＡ、及びＣＡ１９-９を選んだ。ＣＥＡは、各種消化器癌をはじめとして、種々の癌でも血清レベルの上昇が見られ、広く臨床応用されている。一方、ＣＡ１９-９は、膵、胆道系の癌で高い陽性率値を示すことが明らかとなった。現在、ＣＡ１９-９は、ＣＥＡと並んで、消化器癌の腫瘍マーカーとして日常診療上最も普及している。
血清中のＣＥＡをＣＥＡリアビーズ（ダイナボット社）を用いて、胃癌患者の血清中のＭＫレベルを測定した（図７；図中のバーは標準誤差を示す）。測定方法は、ＩＲＭＡである。ＣＥＡは、ステージ７から陽性とされる可能性が示唆されるが、各ステージ間での標準偏差が大きく、ステージ間での有意差が認められない。
血清中のＣＡ１９-９は、セントコアＣＡ１９-９ＲＩＡキット（Centocor社；正常値：37U/ml以下、）を用いて測定した（図８；図中バーは標準誤差を示す）。測定方法は、ＩＲＭＡである。ＣＡ１９-９は、ステージ５でのみ高値を示しており、ステージとの相関性はないものと推測される。
すなわち、ＭＫは、早期胃癌の血清腫瘍マーカーとして有用であることが明らかとなった。
【００２７】
［試験例５］  胃癌患者と肺癌患者の血清中のＭＫレベル
胃癌患者と肺癌患者の早期ステージにおいて、血清中のＭＫレベルを調べた（表１）。胃癌患者及び肺癌患者の両者とも、ステージIにおける血清中のＭＫレベルの平均値は、ステージII〜IVのそれよりも低い値を示したが、その差は胃癌患者と肺癌患者の両者ともに統計的に有意ではなかった。
【表１】
2010139293.tif 000002
【００２８】
［試験例６］  癌患者尿中のＭＫレベルの測定
癌患者尿（胃癌：２４名、肝細胞癌：２４名、大腸癌：２４名）７２検体、及び健常人の人間ドック時における早朝尿５０検体中のＭＫレベルを実施例２の（２）の方法で測定した。また、同じ尿中のクレアチニン値を測定し、クレアチニン値でＭＫの値を補正した。結果を図９に示す。健常人と癌患者の尿中ＭＫ値の間に有意差（ｐ＜0.01；Mann-WhitneyのU検定を使用）が認められた。
【００２９】
［試験例７］  癌患者の尿中ＭＫ値と癌のステージとの相関
癌患者の尿中ＭＫ値が癌のステージとの相関を調べた。胆管癌３名、乳癌３名、大腸癌６名、食道癌３名、胆嚢癌１名、肝細胞癌１０名、膵臓癌３名、直腸癌７名、胃癌２８名、及び甲状腺癌１名、の計６５名の患者について、ステージ分け（stage１〜７）を行い、尿中ＭＫレベルを測定した。各ステージにおけるＭＫレベルを尿中ＭＫ補正値で図１０に示す（＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１；Mann-WhitneyのU検定）。尿中ＭＫレベルが、癌のステージIで、健常人に対して有意に上昇することが明らかとなった。これまで、癌の早期ステージに上昇する尿中の腫瘍マーカーは報告されていない。すなわち、尿中のＭＫレベルは、各種癌の早期スクリーニングに有用である。
【００３０】
［試験例８］  ＨＣＣにおける腫瘍除去が血清中のＭＫレベルに与える影響
ＨＣＣ患者５名について、外科手術による腫瘍除去が血清中のＭＫレベルに与える影響を調べた（図１１）。４名で、腫瘍除去７日後に血清中のＭＫレベルが有意に低下した。すなわち、血清中ＭＫレベルは、ＨＣＣ治療効果を反映している。
【００３１】
［試験例９］  各種癌における血清中のＭＫレベル
食道癌１８名、胃癌３０名、十二指腸癌２名、結腸２５名、肝細胞癌２５名、胆管癌及び胆嚢癌１２名、膵臓癌９名、甲状腺癌５名、肺癌１９名、及び乳癌５名、計１５０名の癌患者について、ステージの内訳を表２に示す。この１５０名の癌患者の血清中のＭＫレベルをＥＩＡで測定した結果を図１２に示す。１５０名の癌患者の血清中のＭＫレベルは健常人のそれとは有意な差（ｐ＜０.００１、Mann-Whiteny U-test）を示した。患者の８７％が、cut off値の０.５ng/mLよりも大き血清中ＭＫレベルを示した。
【表２】
2010139293.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明により、早期癌の診断に有用な腫瘍マーカーが提供された。該腫瘍マーカーは、早期癌のスクリーニング、ある種の癌のステージと予後の推定、治療経過のモニタリングとして有用である。
本発明により、早期癌の診断に有用な腫瘍マーカーが提供された。該腫瘍マーカーは、早期癌のスクリーニング、ある種の癌のステージと予後の推定、治療経過のモニタリングとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ステージI〜IVの肝細胞癌患者７６名（ステージI：７名、ステージII：１９名、ステージIII：２３名、及びIV：２７名）、比較対照として、ウイルス肝炎患者７名、及び対照として健常人１３５名の血清中のＭＫレベルを、実施例２の（１）に記載の１-ステップサンドイッチ法で測定した結果を示す図である（**ｐ＜０.０１）。エラーバーは標準偏差を示す。
【図２】同じくステージI〜IVの肝細胞癌患者７６名、比較対照として、ウイルス肝炎患者７名、及び対照として健常人３７６名の血清中のＭＫレベルを、実施例２の（２）に記載の１-ステップサンドイッチ法で測定した結果を示す図である（**ｐ＜０.０１、Mann-WhitneyのU検定）。エラーバーは標準偏差を示す。
【図３】同じくステージI〜IVの肝細胞癌患者の血清中におけるPIVKA-IIを、エイテストPIVKA-II（三光純薬株式会社）を用いて測定した結果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。
【図４】同じくステージI〜IVの肝細胞癌患者の血清中のＡＦＰを、α-フェト・リアビーズ（ダイナボット社）を用いて測定した結果を示す図である（*ｐ＜０.０１）。エラーバーは標準誤差を示す。
【図５】ステージ１〜７の胃癌患者７２名、及び健常者１３５名のそれぞれの血清中のＭＫレベルを、実施例２の（１）に記載の１-ステップサンドイッチ法で測定した結果を示す図である。エラーバーは標準偏差を示す
【図６】同じくステージ１〜７の胃癌患者７２名、及び健常者３７６名の血清中のＭＫを、実施例２の（２）に記載の１-ステップサンドイッチ法で測定した結果を示す図である（**ｐ＜０.０１、Mann-WhitneyのU検定）。エラーバーは標準偏差を示す。
【図７】同じくステージ１〜７の胃癌患者７２名の血清中のＣＥＡを、ＣＥＡリアビーズ（ＩＲＭＡ法）（ダイナボット社）を用いて測定した結果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。
【図８】同じくステージ１〜７の胃癌患者７２名の血清中のＣＡ１９-９を、セントコアＣＡ１９-９キット（ＩＲＭＡ法）（Centocor社）を用いて測定した結果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。
【図９】７２名の癌患者尿（胃癌：２４名、肝細胞癌：２４名、及び大腸癌：２４名）、及び５０名の健常者の尿中のＭＫレベルをクレアチニン値で補正した値の分布を示す図である（ｐ＜0.01；統計ソフトStatView-J5.0；Mann-WhitneyのU検定を使用）。
【図１０】胆管癌３名、乳癌３名、大腸癌６名、食道癌３名、胆嚢癌１名、肝細胞癌１０名、膵臓癌３名、直腸癌７名、胃癌２８名、及び甲状腺癌１名の計６５名のステージ１〜７における尿中ＭＫレベルをクレアチニン値で補正した結果を示す図である(*ｐ＜０.０５、**ｐ＜０.０１)。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１１】肝細胞癌切除が血清中ＭＫ値に及ぼす影響を示す図である。点を含む棒は腫瘍切除前(pre-op)、黒く塗りつぶされた棒は腫瘍切除後(Day 7)を示す。
【図１２】さまざまなタイプの癌における血清中のＭＫレベルを比較した図でる。太線は健常者１３５名の血清中のＭＫレベルの平均値を示し、点線はcut off値０.５０ｎｇ／ｍｌを示す。各タイプの癌の名前の下に示す数字は、患者数、中央値、及び２５〜７５％信頼区間を示す。アスタリスクは健常者に対して有意差（Mann-Whitney U-test）を示す。*:ｐ＜０.０５、**:ｐ＜０.０１
【図１】
2010139293.tif 000004
【図２】
2010139293.tif 000005
【図３】
2010139293.tif 000006
【図４】
2010139293.tif 000007
【図５】
2010139293.tif 000008
【図６】
2010139293.tif 000009
【図７】
2010139293.tif 000010
【図８】
2010139293.tif 000011
【図９】
2010139293.tif 000012
【図１０】
2010139293.tif 000013
【図１１】
2010139293.tif 000014
【図１２】
2010139293.tif 000015