(57)【要約】【課題】細胞洗浄の際に、細胞塊をより確実に解れさせて、細胞を効果的に洗浄することができ、回収される細胞の純度を向上し、細胞を健全な状態に維持する。【解決手段】遠心分離容器１内に、細胞懸濁液Ａと、該細胞懸濁液Ａに含まれる回収すべき細胞と略同等の比重を有する固形物Ｂとの混合液を収容して、遠心分離容器１をその底部１ａが半径方向外方に向かうように回転させる細胞処理方法を提供する。細胞洗浄の際に、細胞塊をより確実に解れさせて、細胞を効果的に洗浄することができ、回収される細胞の純度を向上し、細胞を健全な状態に維持することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遠心分離容器内に、細胞懸濁液と、該細胞懸濁液に含まれる回収すべき細胞と略同等の比重を有する固形物との混合液を収容して、遠心分離容器をその底部が半径方向外方に向かうように回転させる細胞処理方法。
【請求項２】
前記固形物が、固相と液相とで相転移可能な材質からなる請求項１に記載の細胞処理方法。
【請求項３】
前記固形物が、温度によって相転移する温度感受性材料からなる請求項２に記載の細胞処理方法。
【請求項４】
前記固形物が、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドからなる請求項３に記載の細胞処理方法。
【請求項５】
前記固形物が、キレート剤によって相転移する材料からなる請求項２に記載の細胞処理方法。
【請求項６】
前記固形物が、アルギン酸ビーズからなる請求項５に記載の細胞処理方法。
【請求項７】
前記遠心分離容器を回転させることにより、混合物を細胞群と上清とに層分離させるステップと、
層分離した上清を除去するステップと、
前記遠心分離容器内に残る細胞群に対して、洗浄液を供給するステップと、
前記固形物を液相に相転移させるステップと含む請求項２から請求項６のいずれかに記載の細胞処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体組織を消化酵素で分解して得られた組織由来細胞を回収するために、消化酵素を洗浄する必要があり、消化工程で得られた消化酵素を含む細胞懸濁液を遠心分離することが行われている。この場合、遠心分離処理の結果得られた上清を廃棄して、新たな洗浄液を供給することにより、細胞懸濁液内の消化酵素濃度を低減していくことができる（特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００７／０１２４８０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、遠心力を加えて比重の大きな細胞を凝集させる際に、細胞どうしが接着状態となってペレット状の塊となり、次に洗浄液を供給した際に、細胞塊が解れずに再懸濁できないことがある。再懸濁できない場合には、細胞塊を構成する細胞と細胞との間に消化酵素や塵埃が挟まれたままで残存し、回収される細胞の純度が低下したり、細胞にダメージが与えられたりする不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞洗浄の際に、細胞塊をより確実に解れさせて、細胞を効果的に洗浄することができ、回収される細胞の純度を向上し、細胞を健全な状態に維持することができる細胞処理方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、遠心分離容器内に、細胞懸濁液と、該細胞懸濁液に含まれる回収すべき細胞と略同等の比重を有する固形物との混合液を収容して、遠心分離容器をその底部が半径方向外方に向かうように回転させる細胞処理方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、細胞懸濁液を遠心分離容器内に収容して遠心分離を行う際に、回収すべき細胞と略同等の比重を有する固形物を細胞懸濁液内に混合するので、固形物は回収すべき細胞とともに半径方向外方に移動する。そして、細胞群と上清とに層分離される際には、細胞群内に固形物が取り込まれた状態で分離される。したがって、遠心分離の際の遠心力によって細胞がペレット状に固まったとしても、洗浄液を供給することによって、固形物が細胞塊の崩壊を補助し、細胞塊が解れて細胞間に挟まれていた塵埃や消化酵素を放出することができる。したがって、回収される細胞の純度を向上し、健全な細胞を回収することができる。
【０００８】
上記発明においては、前記固形物が、固相と液相とで相転移可能な材質からなることが好ましい。
このようにすることで、洗浄工程において細胞塊の崩壊を補助した固形物は、回収の際に不要となるので、液相に相転移させることにより細胞群を容易に回収することができる。
【０００９】
また、上記発明においては、前記固形物が、温度によって相転移する温度感受性材料からなっていてもよい。
このようにすることで、細胞群の洗浄後に、洗浄液と細胞群との混合液の温度を変化させることで、固形物を液相に相転移させ、細胞群の回収を容易にすることができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記固形物が、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドからなっていてもよい。
このようにすることで、３７℃程度で固相となって、洗浄時に細胞塊の崩壊を補助し、洗浄後に１５℃以下に冷却することで液相となって、細胞群の回収を容易にすることができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記固形物が、キレート剤によって相転移する材料からなっていてもよい。
このようにすることで、細胞群の洗浄後に、洗浄液と細胞群との混合液のｐＨを変化させることで、固形物を液相に相転移させ、細胞群の回収を容易にすることができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記固形物が、アルギン酸ビーズからなっていてもよい。
このようにすることで、クエン酸等の酸性物質を加えてｐＨを低下させることにより、アルギン酸ビーズを液相に相転移させて、細胞群の回収を容易にすることができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記遠心分離容器を回転させることにより、混合物を細胞群と上清とに層分離させるステップと、層分離した上清を除去するステップと、前記遠心分離容器内に残る細胞群に対して、洗浄液を供給するステップと、前記固形物を液相に相転移させるステップと含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細胞洗浄の際に、細胞群をより確実に解れさせて、細胞を効果的に洗浄することができ、回収される細胞の純度を向上し、細胞を健全な状態に維持することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞処理方法を説明するフローチャートである。
【図２】図１の細胞処理方法において、遠心分離容器内に細胞懸濁液を収容した状態を示す縦断面図である。
【図３】図１の細胞処理方法における遠心分離ステップを行った状態を示す縦断面図である。
【図４】図１の細胞処理方法における上清除去ステップを示す縦断面図である。
【図５】図１の細胞処理方法における洗浄ステップを示す縦断面図である。
【図６】図１の細胞処理方法における相転移ステップを示す縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の一実施形態に係る細胞処理方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞処理方法は、図１に示されるように、遠心分離容器１内に、回収すべき細胞を含む細胞懸濁液Ａと、複数個のビーズ（固形物）Ｂとを収容して（図２）、回転させる遠心分離ステップＳ１と、該遠心分離ステップＳ１により細胞群Ｃから層分離（図３）された上清Ｄを吸引して除去する上清除去ステップＳ２（図４）と、上清Ｄが除去された後に洗浄液Ｅを供給する洗浄ステップＳ３（図５）と、洗浄液Ｅにより再懸濁された細胞懸濁液Ａを遠心分離する遠心分離ステップＳ４と、該遠心分離ステップＳ４により細胞群Ｃから層分離された上清Ｄを吸引して除去する上清除去ステップＳ５と、必要によりステップＳ３からステップＳ５を繰り返すステップＳ６と、ビーズＢを液相に相転移させるステップＳ７（図６）と、細胞群Ｃを回収するステップＳ８とを含んでいる。
【００１７】
本実施形態において、ビーズＢは、回収すべき細胞と略同等の比重を有する材料、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのような温度感受性材料により製造されている。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、低温（０℃以上１５℃以下）で流動性のある水溶液（ゾル状態）、室温（２５℃）以上で流動性のないハイドロゲル（ゲル状態）となるように相転移する材料である。
ビーズＢの濃度は、１．２％以上である。
【００１８】
遠心分離ステップＳ１，Ｓ４は、閉塞された底部１ａを有する遠心分離容器１を、その底部１ａが半径方向外方に向かうようにして回転させることにより、図３に示されるように、内部に収容されている細胞懸濁液Ａ内の比重の大きな物質を底部１ａ側に移動させ、それよりも比重の小さい物質と層分離させるようになっている。
【００１９】
上清除去ステップＳ２，Ｓ５は、遠心分離ステップＳ１，Ｓ４によって、細胞懸濁液Ａが底部１ａの細胞群Ｃとその上方の上清Ｄとに層分離された状態で、底部１ａが鉛直下方に向かうように配置する。そして、図４に示されるように、遠心分離容器１内の細胞群Ｃと上清Ｄとの境界面Ｆよりも若干上方に吸引口２ａを配置した吸引管２によって吸引することにより、上清Ｄを遠心分離容器１外に排出するようになっている。
【００２０】
洗浄ステップＳ３は、上清除去ステップＳ２，Ｓ５において上清Ｄが除去された後の遠心分離容器１内に、図５に示されるように、洗浄液Ｅ、例えば、生理食塩水を供給管３の供給口３ａから供給する。供給口３ａは、遠心分離容器１の底部１ａ近傍に配置しておく。これにより、遠心分離容器１の底部１ａに堆積された細胞群Ｃに洗浄液Ｅを噴射して、その勢いによって細胞群Ｃを解しやすくすることができる。
【００２１】
相転移させるステップＳ７は、例えば、図６に示されるように、１５℃以下の乳酸リンゲル液Ｇを供給する。これにより、乳酸リンゲル液Ｇによってペレット状の細胞群Ｃが再懸濁されるとともに、その細胞郡Ｃ内に取り込まれていたビーズＢが液相に相転移させられる。
【００２２】
本実施形態に係る細胞処理方法によれば、遠心分離ステップＳ１，Ｓ４において、細胞懸濁液Ａ内に回収すべき細胞と略同等の比重を有するビーズＢを混合して遠心力を加えるので、細胞はビーズＢとともに半径方向外方に移動して堆積され、上清Ｄと分離される。このとき、遠心力によって細胞群Ｃが押し固められても細胞どうしの接触がビーズＢによって低減されているので、細胞どうしの接着が低減され、ペレット状に固まる力が弱められる。
【００２３】
したがって、遠心分離ステップＳ１，Ｓ４の後に行われる洗浄ステップＳ３において、洗浄液Ｅが供給されたときに、洗浄液Ｅの流れの勢いによって容易に細胞群Ｃが崩壊して再懸濁される。
【００２４】
これにより、洗浄液Ｅによる洗浄の際に、細胞群Ｃが解れるので、細胞間に挟まれていた塵埃や消化酵素が洗浄液Ｃ内に放出される。そして、その後に行われる遠心分離ステップＳ１，Ｓ４において、これら塵埃や消化酵素等が細胞群Ｃから分かれて上清Ｄ内に留められることで、上清除去ステップＳ２，Ｓ５において上清Ｄとともに排出される。すなわち、塵埃を除去することで最終的に回収される細胞の純度を向上することができ、消化酵素を除去することで、細胞に与えるダメージを低減することができる。
【００２５】
さらに、本実施形態に係る細胞処理方法においては、相転移させるステップＳ７を行うことで、ビーズＢを液相に相転移させることができる。これにより、その後に行われる回収するステップＳ８においては、回収物の中にビーズＢのような固形物が含まれないので、シリンジ等によって容易に吸引回収することができる。
【００２６】
なお、本実施形態においては、相転移ステップＳ７において、１５℃以下の乳酸リンゲル液Ｇを供給することとしたが、これに代えて、容器全体を１５℃以下に冷却することにしてもよい。
また、ビーズＢの材料として、室温で固相、低温で液相となるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのような温度感受性材料を採用したが、これに代えて、ゼラチンのように、高温で液相となる温度感受性材料を採用してもよい。また、温度感受性材料に代えて、キレート剤によって液相と固相とが相転移する材料、例えば、アルギン酸を採用してもよい。
【００２７】
アルギン酸からなるビーズＢを採用する場合、その濃度は、１．２％以上、好ましくは、２．５％以上とする。また、この場合の相転移させるステップＳ７は、上清Ｄが除去された後の遠心分離容器１内に、例えば、５５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）からなる可溶化液をアルギン酸からなるビーズＢの５倍量程度供給し、室温で１５〜３０分攪拌することによりビーズＢを溶解させることができる。
【符号の説明】
【００２８】
１  遠心分離容器
１ａ  底部
Ａ  細胞懸濁液
Ｂ  ビーズ（固形物）
Ｃ  細胞群
Ｄ  上清
Ｅ  洗浄液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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