(57)【要約】【課題】  心筋細胞分化誘導促進剤、およびその使用方法を提供すること。【解決手段】  本発明の心筋細胞分化誘導促進剤は、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンを有効成分として含有し、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する。また、本発明の心筋細胞分化促進方法は、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロン存在下において間葉系幹細胞を処理することを特徴とする。この間葉系幹細胞は、心筋細胞へ分化する能力を有する細胞である。さらに、本発明の間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化させる分化誘導方法は、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロン存在下で処理した間葉系幹細胞をフィーダー細胞上で培養する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する促進剤であって、
ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンを有効成分として含むことを特徴とする心筋細胞分化誘導促進剤。
【請求項２】
前記間葉系幹細胞が子宮内膜、羊膜、胎盤、臍帯血、月経血由来であることを特徴とする、請求項１に記載の促進剤。
【請求項３】
間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する方法であって、
ＩＬ−１０あるいはプロゲステロン存在下において間葉系幹細胞を培養することを特徴とする、心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞が、前記ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンの存在下で、２週間以上培養されることを特徴とする請求項３に記載の心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項５】
前記間葉系幹細胞が子宮内膜、羊膜、胎盤、臍帯血、月経血由来であることを特徴とする、請求項３または４に記載の心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項６】
間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化させる分化誘導方法であって、前記間葉系細胞をＩＬ−１０あるいはプロゲステロンで処理する工程と、
ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンで処理した前記間葉系幹細胞をフィーダー細胞上で培養する工程と、を包含する分化誘導方法。
【請求項７】
前記フィーダー細胞が、哺乳類胎仔由来の心筋細胞であることを特徴とする請求項６に記載の分化誘導方法。
【請求項８】
前記間葉系幹細胞が、前記ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンの存在下で、２週間以上培養されることを特徴とする請求項６または７に記載の心筋細胞分化誘導方法。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞が子宮内膜、羊膜、胎盤、臍帯血、月経血由来であることを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載の心筋細胞分化誘導方法。
【請求項１０】
心筋細胞へ分化する能力を有する間葉系幹細胞であって、
ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンで処理されたことを特徴とする間葉系幹細胞。
【請求項１１】
前記ＩＬ−１０あるいはプロゲステロン存在下において２週間以上培養されたことを特徴とする請求項１０に記載の間葉系幹細胞。
【請求項１２】
前記間葉系幹細胞が、子宮内膜、羊膜、胎盤、臍帯血、月経血由来であることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の間葉系幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞分化誘導促進剤およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞等間葉系細胞への多分化能及び自己増殖能を有しているため、骨や軟骨、筋肉等の再生医療への応用が期待されている。
現在までに、心筋細胞に分化する能力を有する細胞として、子宮内膜、月経血、臍帯血、又は胎児付属臓器から単離された間葉系幹細胞が同定されている。この間葉系幹細胞は、フィーダー細胞との共培養により、心筋細胞に分化することが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０７８０３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、心筋細胞分化誘導促進剤、およびその使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、以下の実施例に示すように、間葉系幹細胞をフィーダー細胞と共培養して心筋細胞に分化誘導させる際、予めＩＬ−１０またはプロゲステロンの存在下で間葉系幹細胞を前処理することによって、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進できることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明に係る心筋細胞分化誘導促進剤は、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する促進剤であって、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンを有効成分として含むことを特徴とする。ここで、間葉系幹細胞が子宮内膜、羊膜、胎盤、臍帯血、月経血由来であることが好ましい。
【０００７】
また、本発明に係る心筋細胞分化誘導促進方法は、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する方法であって、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロン存在下において間葉系幹細胞を培養することを特徴とする。この心筋細胞分化誘導促進方法において、間葉系幹細胞が、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンの存在下で、２週間以上培養されることが好ましい。また、間葉系幹細胞が子宮内膜、羊膜、胎盤、臍帯血、月経血由来であることが好ましい。
【０００８】
本発明に係る分化誘導方法は、間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化させる方法であって、間葉系細胞をＩＬ−１０あるいはプロゲステロンで処理する工程と、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンで処理したその間葉系幹細胞をフィーダー細胞上で培養する工程と、を包含することを特徴とする。ここで、フィーダー細胞が、哺乳類胎仔由来の心筋細胞であることが好ましい。また、間葉系幹細胞が、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンの存在下で、２週間以上培養されることが好ましい。さらに、間葉系幹細胞が子宮内膜、羊膜、胎盤、臍帯血、月経血由来であることが好ましい。
【０００９】
本発明に係る間葉系幹細胞は、心筋細胞へ分化する能力を有する間葉系幹細胞であって、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンで処理されたことを特徴とする。このＩＬ−１０あるいはプロゲステロンによる処理が、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロン存在下において２週間以上培養することにより行われることが好ましい。また、間葉系幹細胞が、子宮内膜、羊膜、胎盤、臍帯血、月経血由来であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、心筋細胞分化誘導促進剤及びその使用方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態である、羊膜、臍帯、胎盤の各組織１ｇあたりの間葉系幹細胞数を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施形態である、フィーダー細胞との共培養によるヒト羊膜由来間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導促進を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施形態において、羊膜由来間葉系幹細胞の心筋梗塞巣への移植による心機能の回復を示すグラフ（Ａ）および、心臓組織の顕微鏡写真（Ｂ）である。
【図４】本発明の一実施形態である、ＧＦＰ標識ヒト羊膜由来間葉系幹細胞移植後２週間目の心臓組織の写真である。
【図５】本発明の一実施形態である、ＪＥＧ−３細胞抽出物、プロゲステロン、ＩＬ−１０、あるいは、ＩＮＦ−γの存在下で間葉系幹細胞を２週間培養した場合のＨＬＡ−Ｇタンパク質の発現を示したウエスタンブロットである。
【図６】本発明の一実施形態である、プロゲステロン（Ａ）あるいはＩＬ−１０（Ｂ）の存在下で間葉系幹細胞を培養した場合の心筋細胞分化誘導を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施形態である、対照群、ＩＬ−１０処理群、プロゲステロン処理群およびＦＫ５０６処理群における、移植後２週間目の間葉系幹細胞の心筋分化細胞率を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されない。
【００１３】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis （Ed.）, Molecular cloning, a laboratory manual （3rd edition）, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York （2001）; F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl （Ed.）, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
（１）薬理作用
ＩＬ−１０またはプロゲステロン存在下において間葉系幹細胞を培養し、この培養後の間葉系幹細胞をフィーダー細胞である哺乳類胎仔由来の心筋細胞と共培養すると、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化を促進することができる。このことから、ＩＬ−１０またはプロゲステロンは、分化誘導前の間葉系幹細胞に作用することによって、その間葉系幹細胞の分化状態を心筋細胞の方向へ進めると考えられる。
【００１６】
（２）ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンを含有する薬剤の有用性
前述の通り、ＩＬ−１０およびプロゲステロンは分化誘導前の間葉系幹細胞に作用することによって、その間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進することができる。従って、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンを有効成分として含有する薬剤は、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する心筋細胞分化誘導促進剤として有用である。本発明に係る心筋細胞分化誘導促進剤は、ＩＬ−１０とプロゲステロンのどちらかを有効量含有しても、または、その両方を含有してもよい。
【００１７】
間葉系幹細胞は、それ自身、自己複製能、自己増殖能、および多分化能を有するため、これらの薬剤あるいは製剤を用いることによって、in vitroで培養することにより、間葉系幹細胞から多量の心筋細胞を産生することが可能になる。現在、新薬の開発において、薬物スクリーニング試験、毒性試験、安全性薬理試験等に用いることが可能な心筋細胞の供給が求められているので、本発明の心筋細胞分化誘導方法を用いれば、このような試験の実施に合わせて十分な量の心筋細胞を確保することが可能になる。
【００１８】
また、本発明に係る薬剤で間葉系幹細胞を処理することにより、他家移植可能な細胞を得ることができる。このようにして得られた細胞は、再生医療分野において高い利用価値を有する。例えば、本発明に係る薬剤で処理した間葉系幹細胞を、ダメージを受けたり機能不全に陥ったりした心臓組織に必要量移植することにより、移植部位において新たな心筋細胞分化を促し、組織再生および心機能改善することができる。この場合、移植細胞である間葉系幹細胞の由来動物種（ドナー）と、移植を受ける動物種（レシピエント）は同一であることが好ましいが、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンにより処理された間葉系幹細胞は高い免疫寛容性を有するため、特に限定されず、例えばヒトの間葉系幹細胞をマウスの心臓に移植することも可能である。心筋へ分化する能力を有する間葉系幹細胞の移植のための調製法は特に制限されず、当業者が適宜選択できるが、例えば、培地やバッファーに懸濁して調製しても、あるいは細胞塊や細胞シートに調製してもよい。ここで、上記レシピエントの疾病は、心筋の再生により病状の改善が期待される疾病であれば特に限定されず、例えば、心筋梗塞が挙げられる。
【００１９】
（３）本発明に係る薬剤の製造
ＩＬ−１０は生体から単離されたものであっても、遺伝子組み換え技術を用いて製造された組み換え体であってもよい。なお、ＩＬ−１０が由来する動物は心筋細胞分化誘導機能を有する範囲で特に制限されないが、間葉系幹細胞が由来する動物種と同じであることが好ましく、例えば、ヒト由来の間葉系幹細胞を培養する場合には、ヒト由来のＩＬ−１０を用いることが好ましい。本薬剤に含まれるＩＬ−１０濃度は、下記分化誘導方法に必要な最終濃度を考慮し、当業者が適宜決定できる。
【００２０】
本発明に係るプロゲステロンは、生体から単離、精製された天然プロゲステロン（化学名4−prehnene−3,20−dione）であっても、あるいは、人工プロゲステロン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、化学名17−hydroxy−4−pregnene−3,20−dione hexanoate）であってもよく、間葉系幹細胞の心筋細胞分化誘導機能を有する範囲で制限されない。生体から単離するために用いる動物については、プロゲステロンが間葉系幹細胞の心筋細胞分化誘導機能を有する範囲で特に制限されないが、間葉系幹細胞が由来する動物種と同じであることが好ましく、例えば、ヒト由来の間葉系幹細胞を培養する場合には、ヒト由来のプロゲステロンを用いることが好ましい。これらの天然および人工プロゲステロンは、試薬や医薬品として市販されているものであってもよい。天然プロゲステロンの市販医薬品としては、例えばプロゲホルモン（Progehormon、 持田製薬株式会社）がある。また、人工プロゲステロンの市販医薬品としては、例えばプロゲデボー（持田製薬株式会社）がある。いずれの医薬品も、製剤化のために必要に応じてプロゲステロン以外の添加物等が含まれていてもよい。本薬剤に含まれるプロゲステロン濃度は、下記心筋細胞分化誘導方法に必要な最終濃度を考慮し、当業者が適宜決定できる。
【００２１】
さらに、本発明に係る心筋細胞分化誘導促進剤は、ＩＬ−１０とプロゲステロン以外の物質であって、間葉系細胞に作用して心筋細胞への分化誘導を促進する物質を一種類、あるいは複数種含有してもよい。この物質として、例えば、テルミサルタンやバルサルタン等のアンギオテンシンＩＩ受容体薬、および、ピオグリタゾン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
また、この薬剤は、必要に応じて上記有効成分以外の、薬学的に許容される担体を含有し製剤化される。ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される医薬組成物の形態に応じて、慣用されている担体の中から適宜選択して用いることができる。例えば、医薬組成物が溶液形態として調製される場合、担体として、精製水（滅菌水）または生理学的緩衝液、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような注射投与可能な有機エステルなどを使用することができる。また、この医薬組成物には、慣用的に用いられる安定剤、賦形剤などを含むことができる。
【００２３】
（４）間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導方法
本発明に係る間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導促進方法は、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロンの存在下で間葉系幹細胞を処理することを特徴とする。以下、間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する方法について、詳細を述べる。
【００２４】
（i）間葉系幹細胞の調製及び前処理
間葉系幹細胞は、心筋細胞に分化する能力を有する間葉系幹細胞であればよく、例えば、子宮内膜、羊膜、胎盤、臍帯、臍帯血、月経血から採取することができる。これら間葉系幹細胞の材料は、月経あるいは出産の際に十分な量を容易に確保することができるため、通常の臓器移植のようにドナー不足に陥ることがない。また、自家移植の場合には必要性が生じてから、原料となる移植細胞や組織を採取するため、移植前処理のための待ち時間が必要であるが、間葉系幹細胞の場合には事前に必要な処理を行って移植に備えておくことができる。
【００２５】
これらの材料から間葉系幹細胞を調製する際、用いる材料に対して適切な前処理を行う。例えば、間葉系幹細胞を巻き込んだ細胞塊になっている場合には、含まれている細胞を解離するために、材料に対してピペッティング等による物理的処理や、酵素等による化学的処理を行えばよい。酵素としては、トリプシン、コラゲナーゼ等、常法で用いられている酵素が挙げられる。また、例えば、臍帯血、月経血等の血液から間葉系幹細胞を調製する際は、低張溶液（例えば、水等）で処理することにより、赤血球を溶血しておくことが好ましい。
【００２６】
このようにして得られた間葉系幹細胞を遠心分離（５００〜２０００ｒｐｍ、３〜１０分）し、沈殿させた細胞に培地を入れて細胞浮遊液を調製した後、細胞を１０，０００〜２０，０００／ｃｍ２でプレートに播種し、５日以上、好ましくは２週間以上、最も好ましくは２週間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養する。
【００２７】
ここで用いる培地は、間葉系幹細胞を培養することができる培地であれば特に限定されず、例えば、α−ＭＥＭ（α−minimum essential medium）、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）、ＩＭＤＭ（Isocove’s modified Dulbecco’s medium）等が挙げられる。また、培地は、５〜１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでいることが好ましく、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を含んでいてもよい。また、後にフィーダー細胞と共培養して心筋細胞へ分化誘導する際、その分化を促進するために、培地にはＩＬ−１０あるいはプロゲステロンを含む心筋分化誘導促進剤を添加しておく。添加するＩＬ−１０の濃度は、例えば、１〜１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬであることが特に好ましい。プロゲステロンの濃度は、１〜１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬであることが特に好ましい。このような条件下で培養した結果、間葉系幹細胞は心筋へ分化する能力が亢進した間葉系幹細胞となる。
【００２８】
なお、ＩＬ−１０またはプロゲステロンの存在下で間葉系幹細胞を培養する際、他の分化誘導促進方法を組み合わせてもよく、例えば、フィーダー細胞（例えば、心筋細胞）との共培養、５−アザシチジン、ＤＭＳＯ、またはオキシトシン等の投与が挙げられる。また、ＩＬ−１０およびプロゲステロンの両方の存在下で間葉系幹細胞を培養してもよい。
【００２９】
（ii）フィーダー細胞の調製
フィーダー細胞は、間葉系幹細胞の分化誘導を起こさせることができる細胞であれば特に限定されないが、心筋細胞の初代培養細胞等が挙げられる。なお、フィーダー細胞として培養細胞を用いる場合、細胞の増殖を防ぐために、用いる培養細胞に対して、γ線照射やマイトマイシン等による処理を予め施しておくことが好ましい。ここでは、哺乳類胎仔由来の心筋細胞を用いたフィーダー細胞の調製方法の一例について述べる（詳細は、The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845, 2004 を参照のこと）。
【００３０】
まず、胎生１４〜１６日目の哺乳類（例えば、マウス等）の胎仔の心臓を切除し、５〜１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地、又は５〜１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に入れ、眼科用ハサミを用いて細かく切る。次に、心筋組織から心筋細胞を解離するために、組織の間質を消化するトリプシンなどの酵素を上記培養皿に入れて、３７℃で５分間インキュベートする。
【００３１】
酵素処理後、上記手法によって調製した細胞を遠心分離（５００〜２０００ｒｐｍ、３〜１０分）し、沈殿物にＤＭＥＭなどの培地を入れて細胞浮遊液を調製する。また、培地は、５〜１０％ＦＣＳを含んでいることが好ましく、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を含んでいてもよい。細胞浮遊液を培養皿に入れて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養する。培養皿は、予めゼラチン等でコーティングしておくことが好ましい。培養後、培養上清を吸引によって除去し、培養皿に付着した細胞を、以下の実験に用いるフィーダー細胞とする。
【００３２】
（iii）間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導
得られた間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化誘導するため、フィーダー細胞上に、１×１０１〜１×１０２細胞／ｃｍ２の濃度になるように間葉系幹細胞を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養する。この際、培地には、ＩＬ−１０またはプロゲステロンを添加してもしなくてもよく、ＩＬ−１０およびプロゲステロンの両方を添加してもよい。
【００３３】
ここで用いるフィーダー細胞は、間葉系幹細胞と同じ動物種から調製することが好ましいが、これに限定されず、例えばヒト間葉系幹細胞との共培養のために、入手が比較的容易なマウスやラットの心筋細胞を用いることができる。
【００３４】
なお、フィーダー細胞と間葉系幹細胞とを区別するために、フィーダー細胞を予め標識しておいてもよい。標識方法としては、例えば、Green fluorescent protein（ＧＦＰ）遺伝子を体全体で発現するトランスジェニック動物からフィーダー細胞を調製したり、ＧＦＰ遺伝子をフィーダー細胞に遺伝子導入して標識したり、細胞に無害な色素を微細注入することにより標識したりする方法等が挙げられる（Takeda et al., The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845, 2004 を参照のこと）。
【００３５】
（iv）分化誘導された心筋細胞の同定
分化誘導された心筋細胞は、一つ一つの細胞の辺縁が細胞の中心方向に集合するように拍動し、収縮時に細胞質が厚くなるため、間葉系幹細胞を予めＧＦＰ等で蛍光標識しておけば、心筋細胞を細胞レベルで同定することができ、容易に心筋細胞を観察できるようになる。また、複数の細胞の拍動が同期化して、一群の細胞で拍動を打つようになることもある。分化誘導された心筋細胞はこのような特徴を有するので、顕微鏡下において、容易に同定することができる。
【００３６】
あるいは、心筋細胞に特異的なマーカーを用いて、分化誘導した心筋細胞数を測定してもよい。例えば、in situ hybridization 法や免疫染色法などにより、心筋細胞に特異的なｍＲＮＡやタンパク質の発現を検出することができる。心筋細胞に特異的なマーカーとしては、例えば、Ｎｋｘ２．５／Ｃｓｘ、ＧＡＴＡ４、ＴＥＦ−１、ＭＥＦ−２Ｃ、ＭＥＦ−２Ｄ、ＭＥＦ−２Ａ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、α−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）、β−ミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖−２ａ（ＭＬＣ−２ａ）、ミオシン軽鎖−２ｖ（ＭＬＣ−２ｖ）、α−心筋アクチン、心筋Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ、心筋Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３（Ｃｘ４３）等が挙げられる（J. Clin. Invest., 103, 697-705, 1999）を参照のこと）が、これらに限定されない。
【実施例】
【００３７】
[実験方法]
＝＝抗体＝＝
一次抗体として、抗ヒト心筋Ｔｒｏｐｏｎｉｎ ＩマウスＩｇＧ抗体（Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human（カタログ番号4T21、Lot 98／10-T21-C2、HyTest社））、抗Sarcomeric-alpha actininマウスＩｇＧ抗体（カタログ番号A7811、Sigma-aldrich社）、抗Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３ウサギＩｇＧ抗体（カタログ番号C6219、Sigma-aldrich社）、抗ＨＬＡ−ＧマウスＩｇＧ抗体（Ab7758、Abcam社）を用いた。なお、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉは心筋を標識する。また、Sarcomeric-alpha actininはアクチン結合タンパク質であり、これに対する抗体によりアクチンの局在を検出することができる。Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３は心臓のギャップジャンクションに存在するタンパク質で、心臓の分化・発達に関与しているとされる。
【００３８】
免疫組織化学染色法の二次抗体として、ＴＲＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Sigma社）、Ｃｙ５標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Sigma社）を適宜用いた。
【００３９】
＝＝ＧＦＰ標識間葉系幹細胞の調製＝＝
慶應大学病院倫理委員会で承認されたプロコールに従って、インフォームドコンセントを行ったボランティアから、出産の際に羊膜、胎盤、あるいは臍帯を採取した。各組織を、２０ｍｌのＤＭＥＭ培地（１％ ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｎｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び５００Ｕ／Ｌ ヘパリン含有）を入れた５０ｍｌポリプロピレンチューブに移した。チューブ内で組織を軽く洗浄した後、１０ｃｍ培養皿に移した。眼科用ハサミを用いて、組織を約１〜５ｍｍ３大に細かく切り、数分間静置した後、血液細胞が含まれる上清を除去し、再び、ＤＭＥＭ培地で洗浄した。この操作を３〜４回繰り返し、最終的に、切断された各組織を１０％ＦＣＳ含有α―ＭＥＭ培地に入れ、この組織片が３〜５個／ｃｍ２の濃度になるように培養皿に静置し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。その後、Takeda et al. （J. Gene Med., 6, 833-845, 2004）の方法に従って、組織から自然に遊走してきた間葉系幹細胞にＧＦＰ遺伝子発現アデノウイルスを感染させ、間葉系幹細胞をＧＦＰで標識した。さらに４日間培養を続けた後、共焦点蛍光顕微鏡（FV1000、 Olympus社）を用いて、間葉系幹細胞におけるＧＦＰの発現を確認した。
【００４０】
＝＝フィーダー細胞の調製＝＝
フィーダー細胞としては、マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）胎仔由来の心筋細胞を用いた。その調製は以下のようにして行った。
【００４１】
まず、胎生１４〜１６日目の心臓を切除し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地中で、眼科用ハサミを用いて、細かく切った。心筋組織から心筋細胞を解離させるために、組織の間質を消化するタンパク質分解酵素（０．０５％トリプシンおよび０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ）を培地に添加し、３７℃で５分間インキュベートした。  
【００４２】
酵素処理後、遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分）し、沈殿した細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞浮遊液を調製し、培養皿に播種して３７℃でインキュベートした。３０分〜３時間後、培養上清を吸引によって除去し、５×１０３細胞／ｃｍ２の濃度になるように培養皿に播種した。これをフィーダー細胞として、各実施例に用いた。
【００４３】
＝＝心筋細胞分化誘導の評価法＝＝
本実施例では、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ発現を心筋細胞の分化マーカーとして用い、ＧＦＰ標識間葉系幹細胞数に対するＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ陽性細胞数の頻度を算出し（Exp. Cell Res., 15, 313 （12）, 2550-62, 2007）、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を評価した。
【００４４】
＜in vitroでの分化誘導評価＞
間葉系幹細胞とフィーダー細胞である心筋細胞との共培養開始から１週間後、培養皿に存在する細胞に対して、ヒト心筋細胞に特異的なタンパク質であるＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉに対する抗体を用いて、免疫染色を行った。
【００４５】
まず、１％ＨＣＬ含有７０％エタノールで洗浄したスライドグラスに、１０倍希釈したPoly-L-Lysine溶液 （P8920、 Sigma社）を上層し、室温で５分間放置した後、Poly-L-Lysine溶液を除去し、スライドグラスを十分乾燥することによって、免疫染色を行うスライドグラスをリジンコートした。次に、間葉系幹細胞とフィーダー細胞である心筋細胞を共培養した後の細胞を０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳで剥がし、遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分）し、沈殿した細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に入れて細胞浮遊液を調製した。この細胞浮遊液を、リジンコートしたスライドグラスの上にのせて１時間放置し、スライドグラスに細胞を接着させた後、４％ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定し、０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ含有ＰＢＳ溶液に２０分間浸して、細胞膜を破壊した。一次抗体として、ＰＢＳで希釈した抗Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ抗体（４００倍希釈）を上層し、保湿しながら冷蔵庫内で１日反応させた後、ＰＢＳで洗浄し、次に、二次抗体として、ＴＲＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（２００倍希釈）を上層し、保湿しながら室温で３０分反応させた。細胞をＰＢＳで洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡（FV1000、Olympus社）を用いて観察した。
【００４６】
＜in vivoでの分化誘導評価＞
ラットから摘出した心臓組織を４％ホルムアルデヒトで固定した後、凍結心臓短軸切片を作製した。この切片にＰＢＳで希釈した抗Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ抗体（４００倍希釈）を上層し、４℃で１２時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。二次抗体としてＰＢＳに希釈したＴＲＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（１００倍希釈）を上層し、２０℃で１時間反応させた後、細胞をＰＢＳで洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡（FV1000、Olympus社）を用いて観察した。
【００４７】
＝＝心筋梗塞モデルラット作製＝＝
ラット（Ｗｉｓｔｅｒ Ｒａｔ、６〜８週齢、雄雌）を２％イソフルレンにより麻酔し、人工呼吸器を装着した。このラットの胸部を切開し、心臓冠状動静脈を絹糸で結紮して心臓血管障害を誘発した。その後胸部を縫合し、ラットが回復後、飼育を続けた。この心臓血管障害によって血流のなくなった組織において、通常心筋梗塞が引き起こされる。
【００４８】
＝＝間葉系幹細胞処理試薬のストック溶液＝＝
ＩＬ−１０（I9276、Sigma-aldrich社）、プロゲステロン（p7556、Sigma-aldrich社）、ＪＥＧ−３細胞抽出物（GTX14841、GeneTex社）、ＩＮＦ−γ（R&D systems社）、ＦＫ５０６（免疫抑制剤、F4679、Sigma-aldrich社）について、０．１ｍＭの各ストック溶液を作製し、この溶媒が間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導に影響がないことを確認した。
【００４９】
[実施例１]
本実施例では、妊娠付属器中に間葉系幹細胞が含まれることを示す。
【００５０】
まず、ボランティアから羊膜、胎盤、および臍帯を得て、ＧＦＰ標識間葉系幹細胞を調製した。各組織１ｇあたり、得られたＧＦＰ標識間葉系幹細胞数を図１に示す。
【００５１】
羊膜、胎盤、臍帯の全てに間葉系幹細胞が含まれるが、中でも羊膜に顕著に高い割合で含まれていた。この結果は、羊膜、胎盤、臍帯をはじめとする妊娠付属器官から間葉系幹細胞が採取できるが、特に羊膜から効率よく採取できることを示す。
【００５２】
[実施例２]
本実施例では、心筋細胞との共培養によるヒト羊膜由来間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を示す。
【００５３】
＝＝心筋細胞への分化誘導＝＝
ＧＦＰ標識ヒト羊膜由来間葉系幹細胞を、５×１０４細胞／ｃｍ２の濃度になるように１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で調製した。この間葉系幹細胞を、フィーダー細胞に重層し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した（J. Gene Med., 6, 833-845, 2004を参照）。対照群の間葉系幹細胞は、フィーダー細胞を用いずに同条件下で培養した。共培養開始から１週間後、培養間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を評価した。  
【００５４】
図２はＧＦＰ標識間葉系幹細胞数に対する心筋細胞に分化した細胞数（Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ陽性細胞数）を示す。フィーダー細胞と共培養した羊膜由来間葉系幹細胞における心筋細胞率は３３％であり、共培養しなかった間葉系幹細胞における心筋細胞率（０％）と比較して有意に高かった（ｐ＜０．０５、ｔ検定）。
【００５５】
このように、フィーダー細胞との共培養は、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する。
【００５６】
[実施例３]
本実施例では、心筋梗塞巣に間葉系幹細胞を移植することにより心機能が改善することを示す。
【００５７】
＝＝間葉系幹細胞移植＝＝
心筋梗塞モデルラットを作製するための梗塞巣作製手術から２週間後、再びラットの胸部を切開した。ここで、ＧＦＰ標識ヒト羊膜由来間葉系幹細胞を２〜４×１０７細胞／ｍＬの濃度でＤＭＥＭ−Ｈ（高グルコースＤＭＥＭ）に懸濁し、心筋梗塞巣に移植した。移植後、ラットの胸部を再び縫合し、さらに２週間飼育を続けた（移植群、Ｎ＝１１）。
【００５８】
本実施例では対照群として、梗塞、移植共に偽手術をした群（偽群、Ｎ＝６）、および、梗塞巣を作製したが偽移植手術をした群（偽移植群、Ｎ＝８）を用いた。
【００５９】
＝＝心機能改善の評価＝＝
本実施例では、左心室収縮能を示す左室径短縮率（ＬＶＦＳ）を心機能改善の評価法として用いた。心筋梗塞巣作製手術後２週間目（移植前）および移植後２週間目に、各ラット個体の心エコー図を取得し、この画像からＬＶＦＳを算出した（臨床心エコー図学  吉川純一著、分光堂、参照）。
【００６０】
また、実験群、および偽移植群のラットにおいて、移植後２週間目に心臓を摘出した。この心臓組織を４％ホルムアルデヒドで固定した後、心臓短軸凍結切片を作製した。これをマッソン染色し、光学顕微鏡下で心臓組織を観察した。
【００６１】
図３Ａに示すように、偽移植群（白丸）では梗塞巣作製後、ＰＶＳＦは低下した。一方、心筋梗塞巣作製後間葉系幹細胞を移植した群（黒丸）では、移植後２週間目までにＬＶＳＦが上昇し、偽移植群と比較し有意に高くなった（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ法、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ比較法）。また図３Ｂは、偽移植群の心臓組織に比較し、移植群の心臓組織では心筋層（矢印）が肥厚化することを示す。
【００６２】
このように、間葉系幹細胞の移植により、心筋梗塞巣における新たな心筋細胞分化および心機能改善が促進される。
【００６３】
[実施例４]
本実施例では、羊膜由来間葉系幹細胞が免疫学的寛容性を有することを示す。
【００６４】
心筋梗塞巣作製後２週間目のモデルラットにＧＦＰ標識ヒト羊膜由来間葉系幹細胞を移植した。このラットを、さらに２週間あるいは２か月飼育を続けた後、組織学的解析のため心臓組織を採取した。
【００６５】
この心臓組織を４％ホルムアルデヒドで固定した後、心臓短軸凍結切片を作製した。この切片を、抗Sarcomeric-alpha actinin 抗体（３００倍希釈、４℃一晩）と抗Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３抗体（３００倍希釈、４℃一晩）で二重標識し、それぞれ、ＴＲＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（１００倍希釈）とＣｙ５標識抗ウサギＩｇＧ抗体（１００倍希釈）を二次抗体として用いて可視化した。あるいは、抗Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ 抗体（３００倍希釈、４℃一晩）で標識し、ＴＲＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（１００倍希釈）を二次抗体として用いた。さらに、各切片をＤＡＰＩ（Ｗａｋｏ社）で対比染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
【００６６】
図４はＧＦＰ標識ヒト羊膜由来間葉系幹細胞の移植２週間後の心臓組織の写真である。図４ＡはＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ（Ｔｒｏｐ Ｉ、グレー）およびＧＦＰ（ＥＧＦＰ、矢じり）の局在を示す。図４ＢはＡと同じ切片のＧＦＰの局在のみを示した顕微鏡像である。ＧＦＰの局在は、移植した標識間葉系幹細胞の局在を示す。通常、本実施例に用いたWister Ratにおいては免疫学的な拒絶が移植後２週間以内に完了することが、当業者間では広く知られているが、本実施例では移植２週間後にも移植された間葉系幹細胞が多く残っている。
【００６７】
図４Ｃの写真上方に左右に見られる白い部分（＊）はＧＦＰの局在を示し、組織全体に散在する白点はＣｏｎｎｅｘｉｎ４３の局在を示している（Ｃｘ４３、矢じり）。ＧＦＰ非標識細胞は、ホスト細胞であるが、ＧＦＰ標識細胞とホスト細胞との接合部に特に濃くＣｏｎｎｅｘｉｎ４３タンパク質を発現している（矢印）。
【００６８】
図４Ｄは心筋（Ｔｒｏｐ Ｉ、グレー）とＧＦＰ陽性移植間葉系幹細胞（ＥＧＦＰ、＊）の局在を示す。ＧＦＰで標識された移植細胞はＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉにより標識された明瞭な横紋を有し、これは間葉系幹細胞が心筋細胞に分化したことを示している。
【００６９】
このように、羊膜由来間葉系幹細胞は、in vivoで心筋細胞への優れた分化能を有し、さらに、移植後２週間においても多くが残留し、すなわち優れた免疫寛容性を有する。
【００７０】
[実施例５]
ＨＬＡ−Ｇ（human leukocyte antigen-G）は妊娠時に、母体の胎児に対する免疫寛容性に関与することが知られている（Hunt et al., FASEB Journal, vol. 19, 681-693, 2005）。本実施例では、各種条件下で培養した間葉幹細胞の免疫寛容性の指標として、ＨＬＡ-Ｇタンパク質発現量の変化を解析した。
【００７１】
＝＝間葉系幹細胞の処理＝＝  
ＧＦＰ標識ヒト羊膜由来間葉系幹細胞を、５×１０４細胞／ｃｍ２の濃度になるように１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で調製した。ここに、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬになるようにＩＬ-１０、プロゲステロン、ＪＥＧ−３細胞抽出物、ＩＮＦ−γの各ストック溶液を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２週間培養した。なお、対照群は、上記いずれの試薬も加えずに、同様にして培養を行った。
【００７２】
＝＝ウエスタンブロット法＝＝
培養細胞を５０ ｍＭ 細胞溶解バッファー（Tris-HCl（pH 8.0）、1% NP40、250 mM NaCl、50 mM NaF、1 mM NaVO4、1 mM プロテアーゼ阻害剤 （PMSF、aprotinin、leupeptin）、1 mM DDT）中で溶解し、遠心分離した。ここで得られた上清を変性ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜にブロットした。この膜を抗ＨＬＡ−Ｇ抗体（２００倍希釈、４℃一晩）で標識し、二次抗体としてGoat f（ab’）2 anti-mouse Ig’s,HRP conjugate（８０００倍希釈、室温、３０分、カタログ番号AMI4404、 BIOSOURCE社）を用いて可視化した。ここで得られた特異的バンドをNIH-Image（アメリカ国立衛生研究所）を用いて定量化し、各条件下でのＨＬＡ−Ｇタンパク質の発現を比較した。内部標準およびゲルに泳動したタンパク質量補正のため、βアクチンを用いた。
【００７３】
図５Ａはウエスタンブロットの結果を示している。このバンドを定量化した結果を図５Ｂに示す。対照群に比較したＨＬＡ−Ｇタンパク質の発現量は、ＪＥＧ−３細胞抽出物存在下で培養した場合には１００倍、プロゲステロン存在下では１０００倍、ＩＬ−１０存在下では１００００倍、ＩＮＦ−γでは１５倍に増加した。
【００７４】
このように、ＩＬ−１０あるいはプロゲステロン存在下でヒト羊膜由来間葉系幹細胞を培養することによって、ＨＬＡ−Ｇタンパク質発現が顕著に増加する、すなわち、間葉系幹細胞の免疫寛容性が向上する。
【００７５】
[実施例６]
本実施例では、ＩＬ−１０とプロゲステロンによる、間葉系幹細胞の心筋細胞へのin vitroでの分化誘導効率を検討する。
【００７６】
ＧＦＰ標識ヒト羊膜由来間葉系幹細胞を、５ｘ１０４細胞／ｃｍ２の濃度になるように１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で調製した。この間葉系幹細胞をフィーダー細胞に重層し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した（J. Gene Med., 6, 833-845, 2004を参照）。この際、フィーダー細胞との共培養開始４８時間前から共培養開始まで、培地にＩＬ−１０（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、あるいは、プロゲステロン（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を加え、間葉系幹細胞を処理した。培養を始めて４日後、間葉系幹細胞から心筋細胞への分化を検出した。
【００７７】
図６Ａに示すように、プロゲステロン処理を全く行わない場合と比較し、フィーダー細胞との共培養開始前２週間プロゲステロンで処理した場合に有意に心筋細胞分化誘導効率が高かった（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ法、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ比較法）。また、図６Ｂに示すように、ＩＬ−１０については、共培養前、共培養開始後、あるいはその両方のいずれの条件であってもＩＬ−１０で処理した間葉系幹細胞は非処理群と比較して有意に心筋細胞への分化誘導率が高いが、共培養前にＩＬ−１０の処理を行った群の心筋細胞分化誘導率はさらに高かった（ｐ＜０．０５）。
【００７８】
この結果は、間葉系幹細胞を心筋細胞誘導のためフィーダー細胞と共培養する前にＩＬ−１０あるいはプロゲステロンで処理することにより、心筋細胞分化誘導が促進されることを示す。
【００７９】
[実施例７]
本実施例では、間葉系幹細胞をＩＬ−１０あるいはプロゲステロンで処理することにより、心臓組織へ移植後の間葉系幹細胞の心筋分化細胞率が改善されることを示す。
【００８０】
ＧＦＰ標識ヒト羊膜由来間葉系幹細胞を、５ｘ１０４細胞／ｃｍ２の濃度になるように１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で調製し、ここにＩＬ−１０（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、あるいは、プロゲステロン（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を加え２週間培養した。対照群の間葉系幹細胞は、これらのいずれの試薬も加えずに、同様に培養を行った。これらの細胞を、２〜４×１０７細胞／ｍＬの濃度でＤＭＥＭ−Ｈに懸濁した。
【００８１】
心筋梗塞モデルラットを作製するための梗塞巣作製手術から２週間経過したラットの胸部を再び切開し、この間葉系幹細胞溶液を、心筋梗塞巣に移植した。移植後、ラットの胸部を再び縫合し、さらに２週間飼育を続けた（各Ｎ＝６）。
【００８２】
また、対照群と同様の処理をしたラット（Ｎ＝６）において、移植後２週間にわたりＦＫ５０６（１ｍｇ／ｋｇ／日）を筋肉注射により投与し、これをＦＫ５０６処理群とした。
【００８３】
２週間後、ラットから心臓を摘出した。上述のin vivoでの分化誘導評価法に従って１ｍｍ厚凍結切片を作製し、心筋梗塞巣における移植間葉系幹細胞の心筋細胞への分化を検出した。
【００８４】
心筋分化細胞率（％）は、心筋梗塞巣に移植した間葉系幹細胞数当たりのＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ陽性細胞数の割合（％）として算出した。
【００８５】
切片中に観察されるＴｒｏｐｏｎｉｎＩ陽性細胞数をＡとし、式  Ａｘ１０００／３０を用いた。この式は、心筋の標準的な長さおよび直径（Cric. Res., 68, 1501-1526, 1991参照）から算出された、切片中に心筋細胞が出現する頻度を考慮したものである。  
【００８６】
各処理を施した間葉系幹細胞の、移植後２週間目の心筋分化細胞率を図７に示す。対照群およびＦＫ５０６処理群と比較し、ＩＬ−１０またはプロゲステロンで処理した間葉系幹細胞では心筋分化細胞率が有意に高かった（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ法、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ比較法）。
【００８７】
このように、心筋再生を目的とした間葉系幹細胞の移植に際し、移植前にＩＬ−１０やプロゲステロンで処理することにより移植細胞の心筋細胞分化を促進することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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