(57)【要約】【課題】除草剤耐性を付与する新規なポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供すること。【解決手段】グリホセートのアセチル化を触媒できる蛋白質および他の構造的に関連する蛋白質を含めた新規な蛋白質がここに提供される。また、これらの蛋白質をコードすることができる新規なポリヌクレオチド、これらの新規な蛋白質および／またはポリヌクレオチドの１つ以上を含む組成物、これらの新規な化合物を含む組換え細胞およびトランスジェニック植物、新規な化合物に関連する多様化方法、および該化合物を用いる方法も提供される。本明細書中で提供される新規な方法および化合物のいくつかを用いて、植物のような生物をグリホセートに対して抵抗性とすることができる。【選択図】図１
2010220617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック植物細胞であって、以下：
（ａ）グリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する第一のポリペプチドをコードする第一の異種ヌクレオチド配列；および
（ｂ）アセト乳酸シンターゼの高抵抗性対立遺伝子（ＨＲＡ）をコードする第二のヌクレオチド配列
を含み、該植物細胞は、該第一のポリペプチドを含まない同じ種、系統または品種の植物細胞と比較して、グリホセートに対する耐性を示す、トランスジェニック植物細胞。
【請求項２】
前記植物細胞を含む植物が、前記第一のポリペプチドを含まない前記同じ種、系統または品種の植物の成長を阻害するために有効なレベルで適用されるグリホセートでの処理の後に、収率の低下を示さない、請求項１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３】
前記トランスジェニック植物が、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、およびワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）からなる群より選択される属の農作物植物に由来する、請求項１または２に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４】
前記トランスジェニック植物細胞が、エレウシン（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ）、ドクムギ（Ｌｏｌｌｉｕｍ）、ホウライチク（Ｂａｍｂｕｓａ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダクチリス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、ペニセタム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、コイクス（Ｃｏｉｘ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）およびワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）からなる群より選択される属の農作物植物に由来する、請求項１または２に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物細胞を含む、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
【請求項６】
請求項５に記載のトランスジェニック植物によって生成される、トランスジェニック種子。
【請求項７】
農作物を含む圃場で雑草を制御するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ）グリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する第一のポリペプチドをコードする第一の異種ヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の高抵抗性対立遺伝子をコードする第二のヌクレオチド配列
を含む農作物の種子または植物を、該圃場に植える工程；ならびに
（ｂ）該圃場における農作物および雑草に、該農作物に重大な影響を及ぼすことなく該雑草を制御するに十分な量の除草剤を適用する工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）が工程（ａ）の前に行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記除草剤がグリホセートを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記除草剤がスルホニル尿素除草剤を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記スルホニル尿素除草剤がクロリムロン、クロルスルフロン、リムスルフロン、チフェンスルフロンまたはトリベヌロンのうち少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記除草剤がグリホセートおよびスルホニル尿素除草剤を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記スルホニル尿素除草剤が、以下：
（ｉ）クロリムロン；
（ｉｉ）クロルスルフロン；
（ｉｉｉ）リムスルフロン；
（ｉｖ）チフェンスルフロン；および
（ｖ）トリベヌロン；
からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記スルホニル尿素除草剤がトリベヌロンであり、前記工程（ｂ）がさらに、前記圃場にチフェンスルフロンを適用する工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記農作物の植物または種子が、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、およびワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）からなる群より選択される属に由来する、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記農作物の植物または種子が、エレウシン（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ）、ドクムギ（Ｌｏｌｌｉｕｍ）、ホウライチク（Ｂａｍｂｕｓａ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダクチリス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、ペニセタム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、コイクス（Ｃｏｉｘ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）およびワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）からなる群より選択される属に由来する、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．７１（Ｅ）に従う著作権の通知）
本特許書類の開示の一部は、著作権の保護に従う事項を含む。著作権の所有者は、特許商標局の特許のファイルまたは記録に記載されるように、特許書類または特許開示の何人にもよるファクシミリ再生に対して異議を有しないが、そうでなければ、すべての著作権を留保する。
【０００２】
（発明の背景）
特定の除草剤に対する作物の感受性は、適当な除草剤代謝酵素をコードする遺伝子を作物中に作り出すことによって確認することができる。いくつかの場合、これらの酵素、およびそれをコードする核酸は植物に由来する。他の場合には、それらは微生物のような他の生物に由来する。例えば、Ｐａｄｇｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）「Ｎｅｗ  ｗｅｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｒｏｕｎｄ  ＵＰ  ＲｅａｄｙＴＭ  ｇｅｎｅ」およびＶａｓｉｌ  （１９９６）  「Ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｒｏｐｓ」、共に  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｃｒｏｐｓ中，  Ｄｕｋｅ編  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ）  ｐｐ．５４−８４およびｐｐ．８５−９１参照。事実、トランスジェニック植物は、種々の生物からの、種々の除草剤耐性／代謝遺伝子（類）を発現するように作成されてきた。例えば、この酵素を発現する植物を多数のタイプの除草剤に対して抵抗性とすることが見出されているアセトヒドロキシ酸シンターゼは種々の植物に導入されてきた（例えば、Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６：４１９参照）。除草剤に耐性を付与する他の遺伝子は：ラットチトクロームＰ４５０７Ａ１および酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０オキシドレダクターゼのキメラ蛋白質をコードする遺伝子（Ｓｈｉｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：１７）、グルタチオンレダクターゼおよびスーパーオキシドジスムターゼについての遺伝子（Ａｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６：１６８７）、および種々のホスホトランスフェラーゼについての遺伝子（Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：６１９）を含む。
【０００３】
この点に関して多くの調査の対象となる１つの除草剤は、一般にグリホセートといわれるＮ−ホスホノメチルグリシンである。グリホセートは世界中で一番販売されている除草剤であって、販売は２００３年までに５０億ドルに達すると計画されている。それは、広葉樹および草類の植物双方を死滅させる広いスペクトルの除草剤である。トランスジェニック植物における商業レベルのグリホセート抵抗性の成功した態様は、修飾されたアグロバクテリウムＣＰ４  ５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（以下、ＥＰＳＰシンターゼまたはＥＰＳＰＳという）遺伝子の導入による。該導入遺伝子は、グリホセートの存在下でホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）およびシキメート−３−ホスフェートからＥＰＳＰをそこで継続して合成できる葉緑体を標的とする。対照的に、自然発生型ＥＰＳＰシンターゼはグリホセートによって阻害される。該導入遺伝子無くしては、グリホセートを噴霧された植物は、芳香族アミノ酸、ホルモンおよびビタミン生合成に必要な下流経路を停止させるＥＰＳＰシンターゼの阻害により迅速に死滅する。ＣＰ４グリホセート抵抗性大豆トランスジェニック植物は、例えば、商品名「Ｒｏｕｎｄ  ＵＰ  ＲｅａｄｙＴＭ」下でＭｏｎｓａｎｔｏによって市販されている。
【０００４】
環境においては、それによりグリホセートが分解する支配的なメカニズムは、土壌の植物系微生物群代謝を介するものである。土壌中でのグリホセートの一次性代謝産生物はアミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）と同定されており、これは、結局は、アンモニア、リン酸塩および二酸化炭素に変換される。ＡＭＰＡ経路を介する土壌中でのグリホセートの分解を記載する提案されている代謝スキームを図８に示す。ある種の土壌細菌によるグリホセートの分解に対する別の代謝経路、サルコシン経路は、図９に示すように、無機リン酸塩およびサルコシンを与えるＣ−Ｐ結合の初期切断を介して起こる。
【０００５】
もう１つの成功した除草剤／トランスジェニック作物のパッケージは、例えば、Ａｖｅｎｔｉｓによって市販されるグリフォシネート（ホスフィノトリシン）およびＬｉｂｅｒｔｙ  ＬｉｎｋＴＭ特性である。グリフォシネートもまた広いスペクトルの除草剤である。その標的は、葉緑体のグルタミン酸シンターゼ酵素である。抵抗性植物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｄｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓからのｂａｒ遺伝子を運び、グリフォシネートを修飾し、解毒する、ｂａｒのＮ−アセチル化活性によって抵抗性を獲得する。
【０００６】
ＡＭＰＡの第一級アミンをアセチル化することができる酵素は、ＰＣＴ出願ＷＯ  ００／２９５９６に報告されている。該酵素は、第二級アミンを有する化合物（例えば、グリホセート）をアセチル化することができるとは記載されていなかった。
【０００７】
種々の除草剤抵抗性の戦略が前記したように利用できるが、さらなるアプローチはかなりの商業的価値を有するであろう。本発明は、除草剤耐性を付与する新規なポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに開示をレビューする間に明らかになるであろう多数の他の利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
単離されたポリヌクレオチドまたは組み換えポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）ＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップ存在ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して、配列番号３００、配列番号４４５および配列番号４５７からなる群より選択される配列と最適に整列させて、少なくとも４６０の類似性スコアを出し得るアミノ配列をコードするヌクレオチド配列であって、
ここで、該アミノ酸配列は、以下：
（ｉ）１８位および３８位に、Ｚ５アミノ酸残基；
（ｉｉ）６２位に、Ｚ１アミノ酸残基；
（ｉｉｉ）１２４位に、Ｚ６アミノ酸残基；および
（ｉｖ）１４４位に、Ｚ２アミノ酸残基、
からなる群より選択される少なくとも１つの制限に適合する、１つ以上のアミノ酸残基を含有し、
ここで：
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ２は、Ｆ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｚ６は、Ｃ、ＧおよびＰからなる群より選択されるアミノ酸残基である、
ヌクレオチド配列；または、
（ｂ）その相補的ヌクレオチド配列、
を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは組み換えポリヌクレオチド。
（項目２）
項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列中のアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、３１位、４５位、５１位、５４位、８６位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、１１４位、１２３位、１２９位、１３９位、および／または１４５位において、該アミノ酸残基は、Ｂ１である；および
（ｂ）３位、５位、８位、１０位、１１位、１４位、１７位、２４位、２７位、３２位、３７位、４７位、４８位、４９位、５２位、５７位、５８位、６１位、６３位、６８位、６９位、７９位、８０位、８２位、８３位、８９位、９２位、１００位、１０１位、１０４位、１１９位、１２０位、１２５位、１２６位、１２８位、１３１位、および／または１４３位において、該アミノ酸残基は、Ｂ２である；
に適合し、ここでＢ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そしてＢ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目３）
項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の制限：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、５１位、５４位、８６位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、１１４位、１２９位、１３９位、および／または１４５位において、該アミノ酸残基はＺ１である；
（ｂ）３１位および／または４５位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｃ）８位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｄ）８９位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ６である；
（ｅ）８２位、９２位、１０１位および／または１２０位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｆ）３位、１１位、２７位および／または７９位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｇ）１８位において、該アミノ酸残基はＺ４またはＺ５である；
（ｈ）１２３位において、該アミノ酸残基はＺ１またはＺ２である；
（ｉ）１２位、３３位、３５位、３９位、５３位、５９位、１１２位、１３２位、１３５位、１４０位および／または１４６位において、該アミノ酸残基はＺ１またはＺ３である；
（ｊ）３０位において、該アミノ酸残基はＺ１である；
（ｋ）６位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
（ｌ）８１位において、該アミノ酸残基はＺ２またはＺ４である；
（ｍ）１１３位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｎ）１３８位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｏ）１４２位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｐ）５７位および／または１２６位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ４である；；
（ｑ）５位、１７位および６１位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｒ）２４位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｓ）１０４位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｔ）５２位および／または６９位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｕ）１４位および／または１１９位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｖ）１０位、３２位、６３位および／または８３位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｗ）４８位および／または８０位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
（ｘ）４０位において、該アミノ酸残基はＺ１またはＺ２である；
（ｙ）９６位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ５である；
（ｚ）６５位において、該アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６である；
（ａａ）８４位および／または１１５位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ａｂ）９３位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ａｃ）１３０位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ａｄ）５８位において、該アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６である；
（ａｅ）４７位において、該アミノ酸残基はＺ４またはＺ６である；
（ａｆ）４９位および／または１００位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ４である；
（ａｇ）６８位において、該アミノ酸残基はＺ４またはＺ５である；
（ａｈ）１４３位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ａｉ）１３１位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ａｊ）１２５位および／または１２８位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ａｋ）６７位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ４である；
（ａｌ）６０位において、該アミノ酸残基はＺ５である；および
（ａｍ）３７位において、該アミノ酸残基はＺ４またはＺ６である；
に適合し、ここで
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ２は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｚ４は、Ｒ、Ｈ、およびＫからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；そして
Ｚ６は、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目４）
項目３に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで（ａ）〜（ａｍ）に特定される位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、（ａ）〜（ａｍ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目５）
項目１〜４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであっって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、３６位、４２位、４６位、５０位、５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＢ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、４１位、４３位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＢ２である；
に適合し、ここでＢ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目６）
項目１〜４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、４２位、４６位、５０位、５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＢ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、３６位、４１位、４３位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位、および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＢ２である；
に適合し、ここで
Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目７）
項目１〜４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％は、以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、２０位、４２位、５０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１１０位、１２１位、および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＺ１である；
（ｂ）１３位、４６位、５６位、７０位、１０７位、１１７位、および／または１１８位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｃ）２３位、５５位、７１位、７７位、８８位、および／または１０９位において、該アミノ酸残基はＺ３であり；
（ｄ）１６位、２１位、４１位、７３位、８５位、９９位、および／または１１１位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｅ）３４位および／または９５位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｆ）２２位、２５位、２９位、４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１０２位、１０８位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位、および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
に適合し、ここで
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ２は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ４は、Ｒ、Ｈ、およびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；そしてＺ６は、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目８）
項目７に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、３６位において、Ｚ１およびＺ３からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目９）
項目７または８に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、６４位において、Ｚ１およびＺ２からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１０）
項目１〜９のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の制限：
（ａ）２位において、該アミノ酸残基はＩまたはＬである；
（ｂ）３位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｃ）４位において、該アミノ酸残基はＶまたはＩである；
（ｄ）５位において、該アミノ酸残基はＫである；
（ｅ）６位において、該アミノ酸残基はＰである；
（ｆ）８位において、該アミノ酸残基はＮである；
（ｇ）１０位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｈ）１１位において、該アミノ酸残基はＤまたはＥである；
（ｉ）１２位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｊ）１４位において、該アミノ酸残基はＥまたはＤである；
（ｋ）１５において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｌ）１７位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｍ）１８位において、該アミノ酸残基は、Ｒ、ＥまたはＫである；
（ｎ）１９位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ｏ）２４位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ｐ）２６位において、該アミノ酸残基は、Ｍ、Ｌ、ＶまたはＩである；
（ｑ）２７位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｒ）２８位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＶである；
（ｓ）３０位において、該アミノ酸残基はＭである；
（ｔ）３１位において、該アミノ酸残基は、ＹまたはＦである；
（ｕ）３２位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ｖ）３３位において、該アミノ酸残基は、ＴまたはＳである；
（ｗ）３５位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｘ）３７位において、該アミノ酸残基は、Ｒ、Ｇ、ＥまたはＱである；
（ｙ）３９位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＳである；
（ｚ）４０位において、該アミノ酸残基は、ＦまたはＬである；
（ａａ）４５位において、該アミノ酸残基は、ＹまたはＦである；
（ａｂ）４７位において、該アミノ酸残基は、ＲまたはＧである；
（ａｃ）４８位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ａｄ）４９位において、該アミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、またはＱである；
（ａｅ）５１位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ａｆ）５２位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ａｇ）５３位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ａｈ）５４位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｉ）５７位において、該アミノ酸残基は、ＨまたはＮである；
（ａｊ）５８位において、該アミノ酸残基は、Ｑ、Ｋ、ＲまたはＰである；
（ａｋ）５９位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｌ）６０位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ａｍ）６１位において、該アミノ酸残基は、ＨまたはＲである；
（ａｎ）６３位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ａｏ）６５位において、該アミノ酸残基は、Ｅ、ＰまたはＱである；
（ａｐ）６７位において、該アミノ酸残基は、ＱまたはＲである；
（ａｑ）６８位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＥである；
（ａｒ）６９位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ａｓ）７９位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ａｔ）８０位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ａｕ）８１位において、該アミノ酸残基は、Ｙ、ＨまたはＦである；
（ａｖ）８２位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ａｗ）８３位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ａｘ）８４位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ａｙ）８６位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｚ）８９位において、該アミノ酸残基は、Ｇ、ＴまたはＳである；
（ｂａ）９０位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｂｂ）９１位において、該アミノ酸残基は、Ｌ、ＩまたはＶである；
（ｂｃ）９２位において、該アミノ酸残基は、ＲまたはＫである；
（ｂｄ）９３位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｂｅ）９６位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＱである；
（ｂｆ）９７位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｂｇ）１００位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＮである；
（ｂｈ）１０１位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｉ）１０３位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＶである；
（ｂｊ）１０４位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｂｋ）１０５位において、該アミノ酸残基は、Ｍ、ＬまたはＩである；
（ｂｌ）１０６位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｂｍ）１１２位において、該アミノ酸残基は、ＴまたはＡである；
（ｂｎ）１１３位において、該アミノ酸残基は、ＳまたはＴである；
（ｂｏ）１１４位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ｂｐ）１１５位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ｂｑ）１１９位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｒ）１２０位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｓ）１２３位において、該アミノ酸残基は、ＦまたはＬである；
（ｂｔ）１２５位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｂｕ）１２６位において、該アミノ酸残基は、ＱまたはＨである；
（ｂｖ）１２８位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ｂｗ）１２９位において、該アミノ酸残基は、ＶまたはＩである；
（ｂｘ）１３０位において、該アミノ酸残基はＦである；
（ｂｙ）１３１位において、該アミノ酸残基は、ＤまたはＥである；
（ｂｚ）１３２位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｃａ）１３５位において、該アミノ酸残基はＶである；
（ｃｂ）１３８位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｃｃ）１３９位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｃｄ）１４０位において、該アミノ酸残基は、ＬまたはＭである；
（ｃｅ）１４２位において、該アミノ酸残基はＹである；
（ｃｆ）１４３位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｃｇ）１４５位において、該アミノ酸残基は、ＬまたはＩである；そして
（ｃｈ）１４６位において、該アミノ酸残基はＴである、
に適合する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１１）
項目１０に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで（ａ）〜（ｃｈ）において特定される位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、（ａ）〜（ｃｈ）に特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１２）
項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％は、以下の制限：
（ａ）９位、７６位、９４位および１１０位において、該アミノ酸残基Ａである；
（ｂ）２９位および１０８位において、該アミノ酸残基はＣである；
（ｃ）３４位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｄ）９５位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｅ）５６位において、該アミノ酸残基はＦである；
（ｆ）４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１０２位、１１６位、１２２位、１２７位および１３６位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ｇ）４１位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｈ）７位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｉ）８５位において、該アミノ酸残基はＫである；
（ｊ）２０位、４２位、５０位、７８位および１２１位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｋ）１位および１４１位において、該アミノ酸残基はＭである；
（ｌ）２３位および１０９位において、該アミノ酸残基はＮである；
（ｍ）２２位、２５位、１３３位、１３４位および１３７位において、該アミノ酸残基はＰである；
（ｎ）７１位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ｏ）１６位、２１位、７３位、９９および１１１位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ｐ）５５位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ｑ）７７位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｒ）１０７位において、該アミノ酸残基はＷである；および
（ｓ）１３位、４６位、７０位および１１８位において、該アミノ酸残基はＹである、に適合する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１３）
項目１〜１２のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下：
（ａ）３６位において、該アミノ酸残基は、Ｍ、Ｌ、またはＴである；
（ｂ）７２位において、該アミノ酸残基は、ＬまたはＩである；
（ｃ）７５位において、該アミノ酸残基は、ＭまたはＶである；
（ｄ）６４位において、該アミノ酸残基は、Ｌ、Ｉ、またはＦである；
（ｅ）８８位において、該アミノ酸残基は、ＴまたはＳである；
（ｆ）１１７位において、該アミノ酸残基は、ＹまたはＦである、
からなる群より選択される、アミノ酸残基を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１４）
項目１〜１３のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下：
（ａ）１４位において、該アミノ酸残基は、Ｄである；
（ｂ）１８位において、該アミノ酸残基は、Ｅである；
（ｃ）２６位において、該アミノ酸残基は、ＭまたはＶである；
（ｅ）３０位において、該アミノ酸残基は、Ｉである；
（ｆ）３２位において、該アミノ酸残基は、Ｄである；
（ｇ）３６位において、該アミノ酸残基は、ＭまたはＴである；
（ｉ）３７位において、該アミノ酸残基は、Ｃである；
（ｊ）３８位において、該アミノ酸残基は、Ｄである；
（ｊ）５３位において、該アミノ酸残基は、Ｖである；
（ｋ）５８位において、該アミノ酸残基は、Ｒである；
（ｌ）６１位において、該アミノ酸残基は、Ｒである；
（ｍ）６２位において、該アミノ酸残基は、Ｌである；
（ｎ）６４位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＦである；
（ｏ）６５位において、該アミノ酸残基は、Ｐである；
（ｐ）７２位において、該アミノ酸残基は、Ｉである；
（ｑ）７５位において、該アミノ酸残基は、Ｖである；
（ｒ）８８位において、該アミノ酸残基は、Ｔである；
（ｓ）８９位において、該アミノ酸残基は、Ｇである；
（ｔ）９１位において、該アミノ酸残基は、Ｌである；
（ｕ）９８位において、該アミノ酸残基は、Ｉである；
（ｖ）１０５位において、該アミノ酸残基は、Ｉである；
（ｗ）１１２位において、該アミノ酸残基は、Ａである；
（ｘ）１２４位において、該アミノ酸残基は、ＧまたはＣである；
（ｙ）１２８位において、該アミノ酸残基は、Ｄである；
（ｚ）１４０位において、該アミノ酸残基は、Ｍである；
（ａａ）１４３位において、該アミノ酸残基は、Ｒである；および
（ａｂ）１４４位において、該アミノ酸残基は、Ｗである；
からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を含む、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１５）
項目１４に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで（ａ）〜（ａｂ）において特定される位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、（ａ）〜（ａｂ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１６）
項目１〜１５のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下：
（ａ）４１位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｂ）１３８位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｃ）３４位において、該アミノ酸残基はＮである；および
（ｄ）５５位において、該アミノ酸残基はＳである、
からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１７）
単離されたポリヌクレオチドまたは組み換えポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）配列番号５７７と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５７８と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号６２１と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号５７９と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号６０２と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号６９７と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号７２１と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号６１３と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｉ）配列番号６７７と少なくとも８９％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｊ）配列番号５８４と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｋ）配列番号７０７と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｌ）配列番号６１６と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｍ）配列番号６１２と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｎ）配列番号５９０と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｏ）（ａ）〜（ｎ）の任意の１つと相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含有する、単離されたポリヌクレオチドまたは組み換えポリヌクレオチド。
（項目１８）
項目１７に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下：
（ｉ）１８および３８位において、Ｚ５アミノ酸残基；
（ｉｉ）６２位において、Ｚ１アミノ酸残基；
（ｉｉｉ）１２４位において、Ｚ６アミノ酸残基；および
（ｉｖ）１４４位において、Ｚ２アミノ酸残基、
からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を含み、ここで：
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ２は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ６は、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群より選択されるアミノ酸残基である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１９）
項目１７に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、３１位、４５位、５１位、５４位、８６位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、１１４位、１２３位、１２９位、１３９位、および／または１４５位において、該アミノ酸残基はＢ１である；および
（ｂ）３位、５位、８位、１０位、１１位、１４位、１７位、２４位、２７位、３２位、３７位、４７位、４８位、４９位、５２位、５７位、５８位、６１位、６３位、６８位、６９位、７９位、８０位、８２位、８３位、８９位、９２位、１００位、１０１位、１０４位、１１９位、１２０位、１２５位、１２６位、１２８位、１３１位、および／または１４３位において、該アミノ酸残基はＢ２である；
に適合し、ここで：
Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２０）
項目１７に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の制限：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、５１位、５４位、８６位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、１１４位、１２９位、１３９位、および／または１４５位において、該アミノ酸残基は、Ｚ１である；
（ｂ）３１位および／または４５位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｃ）８位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｄ）８９位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３またはＺ６である；
（ｅ）８２位、９２位、１０１位および／または１２０位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｆ）３位、１１位、２７位および／または７９位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｇ）１８位において、該アミノ酸残基は、Ｚ４またはＺ５である；
（ｈ）１２３位において、該アミノ酸残基は、Ｚ１またはＺ２である；
（ｉ）１２位、３３位、３５位、３９位、５３位、５９位、１１２位、１３２位、１３５位、１４０位、および／または１４６位において、該アミノ酸残基は、Ｚ１またはＺ３である；
（ｊ）３０位において、該アミノ酸残基はＺ１である；
（ｋ）６位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
（１）８１位において、該アミノ酸残基は、Ｚ２またはＺ４である；
（ｍ）１１３位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｎ）１３８位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｏ）１４２位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｐ）５７位および／または１２６位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３またはＺ４である；
（ｑ）５位、１７位、および６１位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｒ）２４位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｓ）１０４位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｔ）５２位および／または６９位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｕ）１４位および／または１１９位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｖ）１０位、３２位、６３位、および／または８３位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｗ）４８位および／または８０位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
（ｘ）４０位において、該アミノ酸残基は、Ｚ１またはＺ２である；
（ｙ）９６位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３またはＺ５である；
（ｚ）６５位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３、Ｚ４、またはＺ６である；
（ａａ）８４位および／または１１５位において、該アミノ酸残基  ｉｓ  Ｚ３である；
（ａｂ）９３位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ａｃ）１３０位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ａｄ）５８位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３、Ｚ４またはＺ６である；
（ａｅ）４７位において、該アミノ酸残基は、Ｚ４またはＺ６である；
（ａｆ）４９位および／または１００位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３またはＺ４である；
（ａｇ）６８位において、該アミノ酸残基は、Ｚ４またはＺ５である；
（ａｈ）１４３位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ａｉ）１３１位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ａｊ）１２５位および／または１２８位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ａｋ）６７位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ４である；
（ａｌ）６０位において、該アミノ酸残基はＺ５である；および
（ａｍ）３７位において、該アミノ酸残基はＺ４またはＺ６である；
に適合し、ここで
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ２は、Ｆ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ４は、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；そしてＺ６は、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２１）
項目２０に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで（ａ）〜（ａｍ）において特定される位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、（ａ）〜（ａｍ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２２）
項目１７〜２１のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、３６位、４２位、４６位、５０位、５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＢ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、４１位、４３位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位、および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＢ２である；
に適合し、ここで
Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２３）
項目１７〜２２のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、４２位、４６位、５０位、５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位、および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＢ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、３６位、４１位、４３位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＢ２である；
に適合し、ここで
Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２４）
項目１７〜２２のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、２０位、４２位、５０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１１０位、１２１位および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＺ１である；
（ｂ）１３位、４６位、５６位、７０位、１０７位、１１７位、および／または１１８位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｃ）２３位、５５位、７１位、７７位、８８位、および／または１０９位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｄ）１６位、２１位、４１位、７３位、８５位、９９位、および／または１１１位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｅ）３４位および／または９５位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｆ）２２位、２５位、２９位、４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１０２位、１０８位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位、および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
に適合し、ここで
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ２は、Ｆ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ４は、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；そしてＺ６は、Ｃ、ＧおよびＰからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２５）
項目２４に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、３６位において、Ｚ１およびＺ３からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２６）
項目２４または２５に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、６４位において、Ｚ１およびＺ２からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２７）
項目１７〜２６のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の制限：
（ａ）２位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＬである；
（ｂ）３位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｃ）４位において、該アミノ酸残基は、ＶまたはＩである；
（ｄ）５位において、該アミノ酸残基はＫである；
（ｅ）６位において、該アミノ酸残基はＰである；
（ｆ）８位において、該アミノ酸残基はＮである；
（ｇ）１０位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｈ）１１位において、該アミノ酸残基は、ＤまたはＥである；
（ｉ）１２位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｊ）１４位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ｋ）１５位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｌ）１７位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｍ）１８位において、該アミノ酸残基は、Ｒ、ＥまたはＫである；
（ｎ）１９位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ｏ）２４位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ｐ）２６位において、該アミノ酸残基は、Ｍ、ＬＶまたはＩである；
（ｑ）２７位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｒ）２８位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＶである；
（ｓ）３０位において、該アミノ酸残基はＭである；
（ｔ）３１位において、該アミノ酸残基は、ＹまたはＦである；
（ｕ）３２位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ｖ）３３位において、該アミノ酸残基は、ＴまたはＳである；
（ｗ）３５位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｘ）３７位において、該アミノ酸残基は、Ｒ、Ｇ、ＥまたはＱである；
（ｙ）３９位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＳである；
（ｚ）４０位において、該アミノ酸残基は、ＦまたはＬである；
（ａａ）４５位において、該アミノ酸残基は、ＹまたはＦである；
（ａｂ）４７位において、該アミノ酸残基は、ＲまたはＧである；
（ａｃ）４８位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ａｄ）４９位において、該アミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、またはＱである；
（ａｅ）５１位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ａｆ）５２位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ａｇ）５３位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ａｈ）５４位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｉ）５７位において、該アミノ酸残基は、ＨまたはＮである；
（ａｊ）５８位において、該アミノ酸残基は、Ｑ、Ｋ、ＲまたはＰである；
（ａｋ）５９位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｌ）６０位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ａｍ）６１位において、該アミノ酸残基は、ＨまたはＲである；
（ａｎ）６３位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ａｏ）６５位において、該アミノ酸残基は、Ｅ、ＰまたはＱである；
（ａｐ）６７位において、該アミノ酸残基は、ＱまたはＲである；
（ａｑ）６８位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＥである；
（ａｒ）６９位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ａｓ）７９位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ａｔ）８０位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ａｕ）８１位において、該アミノ酸残基は、Ｙ、ＨまたはＦである；
（ａｖ）８２位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ａｗ）８３位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ａｘ）８４位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ａｙ）８６位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｚ）８９位において、該アミノ酸残基は、Ｇ、ＴまたはＳである；
（ｂａ）９０位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｂｂ）９１位において、該アミノ酸残基は、Ｌ、ＩまたはＶである；
（ｂｃ）９２位において、該アミノ酸残基は、ＲまたはＫである；
（ｂｄ）９３位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｂｅ）９６位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＱである；
（ｂｆ）９７位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｂｇ）１００位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＮである；
（ｂｈ）１０１位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｉ）１０３位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＶである；
（ｂｊ）１０４位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｂｋ）１０５位において、該アミノ酸残基は、Ｍ、ＬまたはＩである；
（ｂｌ）１０６位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｂｍ）１１２位において、該アミノ酸残基は、ＴまたはＡである；
（ｂｎ）１１３位において、該アミノ酸残基は、ＳまたはＴである；
（ｂｏ）１１４位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ｂｐ）１１５位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ｂｑ）１１９位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｒ）１２０位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｓ）１２３位において、該アミノ酸残基は、ＦまたはＬである；
（ｂｔ）１２５位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｂｕ）１２６位において、該アミノ酸残基は、ＱまたはＨである；
（ｂｖ）位１２８において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ｂｗ）１２９位において、該アミノ酸残基はＶまたはＩである；
（ｂｘ）１３０位において、該アミノ酸残基はＦである；
（ｂｙ）１３１位において、該アミノ酸残基は、ＤまたはＥである；
（ｂｚ）１３２位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｃａ）１３５位において、該アミノ酸残基はＶである；
（ｃｂ）１３８位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｃｃ）１３９位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｃｄ）１４０位において、該アミノ酸残基は、ＬまたはＭである；
（ｃｅ）１４２位において、該アミノ酸残基はＹである；
（ｃｆ）１４３位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｃｇ）１４５位において、該アミノ酸残基は、ＬまたはＩである；および
（ｃｈ）１４６位において、該アミノ酸残基はＴである、
に適合する、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２８）
項目２７に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで（ａ）〜（ｃｈ）において特定される位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％は、（ａ）〜（ｃｈ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目２９）
項目１７に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の制限：
（ａ）９位、７６位、９４位、および１１０位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ｂ）２９位および１０８位において、該アミノ酸残基はＣである；
（ｃ）３４位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｄ）９５位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｅ）５６位において、該アミノ酸残基はＦである；
（ｆ）４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１０２位、１１６位、１２２位、１２７位および１３６位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ｇ）４１位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｈ）７位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｉ）８５位において、該アミノ酸残基はＫである；
（ｊ）２０位、４２位、５０位、７８位および１２１位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｋ）１位および１４１位において、該アミノ酸残基はＭである；
（ｌ）２３位および１０９位において、該アミノ酸残基はＮである；
（ｍ）２２位、２５位、１３３位、１３４位および１３７位において、該アミノ酸残基はＰである；
（ｎ）７１位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ｏ）１６位、２１位、７３位、９９位および１１１位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ｐ）５５位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ｑ）７７位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｒ）１０７位において、該アミノ酸残基はＷである；および
（ｓ）１３位、４６位、７０位および１１８位において、該アミノ酸残基はＹである、に適合する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目３０）
項目１〜２９のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基：
（ａ）１４位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｂ）１８位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｃ）２６位において、該アミノ酸残基はＭまたはＶである；
（ｅ）３０位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｆ）３２位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｇ）３６位において、該アミノ酸残基はＭまたはＴである；
（ｉ）３７位において、該アミノ酸残基はＣである；
（ｊ）３８位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｊ）５３位において、該アミノ酸残基はＶである；
（ｋ）５８位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ｌ）６１位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ｍ）６２位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｎ）６４位において、該アミノ酸残基はＩまたはＦである；
（ｏ）６５位において、該アミノ酸残基はＰである；
（ｐ）７２位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｑ）７５位において、該アミノ酸残基はＶである；
（ｒ）８８位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｓ）８９位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ｔ）９１位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｕ）９８位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｖ）１０５位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｗ）１１２位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ｘ）１２４位において、該アミノ酸残基はＧまたはＣである；
（ｙ）１２８位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｚ）１４０位において、該アミノ酸残基はＭである；
（ａａ）１４３位において、該アミノ酸残基はＲである；および
（ａｂ）１４４位において、該アミノ酸残基はＷである、
を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目３１）
項目３０に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで（ａ）〜（ａｂ）において特定される位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、（ａ）〜（ａｂ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目３２）
項目１７〜３１のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下：
（ａ）４１位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｂ）１３８位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｃ）３４位において、該アミノ酸残基はＮである；および
（ｅ）５５位において、該アミノ酸残基はＳである、
からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を含む
、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目３３）
グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
【数１】
2010220617.tif 000003
からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目３４）
項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目３５）
項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、グリホセートＮ−アシルトランスフェラーゼ活性を有する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目３６）
項目３４に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリペプチドは、グリホセートについて少なくとも１０ｍＭ−１分−１のｋｃａｔ／Ｋｍでグリホセートのアセチル化を触媒する、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目３７）
項目３４に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリペプチドは、アミノメチルホスホン酸のアセチル化を触媒する、ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目３８）
項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む、核酸構築物。
（項目３９）
項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、項目３８に記載の核酸構築物であって、ここで該プロモーターは、該ポリヌクレオチドに関して異種であり、前記コードされるポリペプチドの十分な発現を引き起こして、該核酸構築物で形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を増強するに有効である、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目４０）
項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドは、選択マーカーとして機能する、項目３８に記載の核酸構築物。
（項目４１）
前記構築物はベクターである、項目３８に記載の核酸構築物。
（項目４２）
有効なレベルの第２のポリペプチドを発現する細胞または生物に対して検出可能な表現型形質を付与する、該第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目４１に記載のベクター。
（項目４３）
前記検出可能な表現型形質は、選択マーカーとして機能する、項目４２に記載のベクター。
（項目４４）
前記検出可能な表現型形質は、除草剤耐性および目視可能なマーカーからなる群より選択される、項目４２に記載のベクター。
（項目４５）
前記ベクターはＴ−ＤＮＡ配列をさらに含む、項目４１に記載のベクター。
（項目４６）
前記単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドは、調節性配列に作動可能に連結される、項目４１に記載のベクター。
（項目４７）
前記ベクターは植物形質転換ベクターである、項目４１に記載のベクター。
（項目４８）
少なくとも１つの、項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む細胞であって、ここで該ポリヌクレオチドは、該細胞に対して異種である、細胞。
（項目４９）
前記単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドは、調節性配列に作動可能に連結される、項目４８に記載の細胞。
（項目５０）
項目４１に記載のベクターによって形質導入された、細胞。
（項目５１）
前記細胞は、トランスジェニック植物細胞である、項目４９または５０に記載の細胞。
（項目５２）
前記トランスジェニック植物細胞は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する外因性ポリペプチドを発現する、項目５１に記載のトランスジェニック植物細胞。
（項目５３）
前記トランスジェニック植物細胞は、グリホセートＮ−アシルトランスフェラーゼ活性を有する外因性ポリペプチドを発現する。項目５１に記載のトランスジェニック植物細胞。
（項目５４）
項目５２の細胞を含む、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目５５）
項目５３に記載の細胞を含む、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目５６）
前記植物または植物外植片は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、項目５４に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目５７）
前記植物または植物外植片は、グリホセートＮ−アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、項目５５に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目５８）
前記植物または植物外植片は、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ、Ｌｏｌｌｉｕｍ、Ｂａｍｂｕｓａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｚｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ａｖｅｎａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｃｏｉｘ、ＧｌｙｃｉｎｅおよびＧｏｓｓｙｐｉｕｍからなる属の群より選択される農作物植物である、項目５６に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目５９）
前記植物または植物外植片は、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ、Ｌｏｌｌｉｕｍ、Ｂａｍｂｕｓａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｚｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ａｖｅｎａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｃｏｉｘ、ＧｌｙｃｉｎｅおよびＧｏｓｓｙｐｉｕｍからなる属の群より選択される農作物植物である、項目５７に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目６０）
前記植物または植物外植片は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓである、項目５６に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目６１）
前記植物または植物外植片は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓである、項目５７に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目６２）
前記植物または植物外植片は、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍである、項目５６に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目６３）
前記植物または植物外植片は、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍである、項目５７に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目６４）
前記植物または植物外植片は、同じ種、系統または品種の野生型植物と比較して、グリホセートに対する増強された耐性を示す、項目５６に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目６５）
前記植物または植物外植片は、同じ種、系統または品種の野生型植物と比較して、グリホセートに対する増強された耐性を示す、項目５７に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目６６）
項目５６に記載の植物によって生成される、種子。
（項目６７）
項目５７に記載の植物によって生成される、種子。
（項目６８）
異種遺伝子を含むトランスジェニック植物であって、該遺伝子は、以下：
【数２】
2010220617.tif 000004
からなる群より選択され、該遺伝子は、グリホセートについて少なくとも１０ｍＭ−１分−１のｋｃａｔ／Ｋｍを有するグリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードし、ここで該植物は、除草剤適用に起因する有意な収率減少なしで、該異種遺伝子を欠いている同じ植物の生長を阻害するに有効なレベルで適用されるグリホセートに対する耐性を示す、
トランスジェニック植物。
（項目６９）
前記グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼは、アミノメチルホスホン酸のアセチル化を触媒する、項目６８に記載のトランスジェニック植物。
（項目７０）
以下を含む単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって：
（ａ）ＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップ存在ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して、配列番号３００、配列番号４４５および配列番号４５７からなる群より選択される配列と最適に整列させて、少なくとも４６０の類似性スコアを出し得るアミノ配列であって、
ここで、該アミノ酸配列は、以下：
（ｉ）１８位および３８位に、Ｚ５アミノ酸残基；
（ｉｉ）６２位に、Ｚ１アミノ酸残基；
（ｉｉｉ）１２４位に、Ｚ６アミノ酸残基；および
（ｉｖ）１４４位に、Ｚ２アミノ酸残基、
からなる群より選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基を含有し、
ここで：
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ２は、Ｆ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｚ６は、Ｃ、ＧおよびＰからなる群より選択されるアミノ酸残基である、
アミノ酸配列；または、
（ｂ）その相補的ヌクレオチド配列、
を含む、単離されたポリペプチドまたは組み換えポリペプチド。
（項目７１）
項目１に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列中のアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、３１位、４５位、５１位、５４位、８６位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、１１４位、１２３位、１２９位、１３９位、および／または１４５位において、該アミノ酸残基は、Ｂ１である；および
（ｂ）３位、５位、８位、１０位、１１位、１４位、１７位、２４位、２７位、３２位、３７位、４７位、４８位、４９位、５２位、５７位、５８位、６１位、６３位、６８位、６９位、７９位、８０位、８２位、８３位、８９位、９２位、１００位、１０１位、１０４位、１１９位、１２０位、１２５位、１２６位、１２８位、１３１位、および／または１４３位において、該アミノ酸残基は、Ｂ２である；
に適合し、ここでＢ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そしてＢ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目７２）
項目７０に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の制限：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、５１位、５４位、８６位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、１１４位、１２９位、１３９位、および／または１４５位において、該アミノ酸残基はＺ１である；
（ｂ）３１位および／または４５位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｃ）８位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｄ）８９位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ６である；
（ｅ）８２位、９２位、１０１位および／または１２０位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｆ）３位、１１位、２７位および／または７９位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｇ）１８位において、該アミノ酸残基はＺ４またはＺ５である；
（ｈ）１２３位において、該アミノ酸残基はＺ１またはＺ２である；
（ｉ）１２位、３３位、３５位、３９位、５３位、５９位、１１２位、１３２位、１３５位、１４０位および／または１４６位において、該アミノ酸残基はＺ１またはＺ３である；
（ｊ）３０位において、該アミノ酸残基はＺ１である；
（ｋ）６位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
（ｌ）８１位において、該アミノ酸残基はＺ２またはＺ４である；
（ｍ）１１３位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｎ）１３８位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｏ）１４２位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｐ）５７位および／または１２６位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ４である；；
（ｑ）５位、１７位および６１位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｒ）２４位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｓ）１０４位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｔ）５２位および／または６９位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｕ）１４位および／または１１９位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｖ）１０位、３２位、６３位および／または８３位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｗ）４８位および／または８０位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
（ｘ）４０位において、該アミノ酸残基はＺ１またはＺ２である；
（ｙ）９６位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ５である；
（ｚ）６５位において、該アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６である；
（ａａ）８４位および／または１１５位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ａｂ）９３位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ａｃ）１３０位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ａｄ）５８位において、該アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６である；
（ａｅ）４７位において、該アミノ酸残基はＺ４またはＺ６である；
（ａｆ）４９位および／または１００位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ４である；
（ａｇ）６８位において、該アミノ酸残基はＺ４またはＺ５である；
（ａｈ）１４３位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ａｉ）１３１位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ａｊ）１２５位および／または１２８位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ａｋ）６７位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ４である；
（ａｌ）６０位において、該アミノ酸残基はＺ５である；および
（ａｍ）３７位において、該アミノ酸残基はＺ４またはＺ６である；
に適合し、ここで
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ２は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｚ４は、Ｒ、Ｈ、およびＫからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；そして
Ｚ６は、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目７３）
項目７２に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで（ａ）〜（ａｍ）に特定される位置において対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、（ａ）〜（ａｍ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目７４）
項目７０〜７３のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、３６位、４２位、４６位、５０位、５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＢ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、４１位、４３位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＢ２である；
に適合し、ここでＢ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群より選択
されるアミノ酸である、
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目７５）
項目７０〜７３のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、４２位、４６位、５０位、５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＢ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、３６位、４１位、４３位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位、および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＢ２である；
に適合し、ここで
Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目７６）
項目７９〜７３のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％は、以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、２０位、４２位、５０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１１０位、１２１位、および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＺ１である；
（ｂ）１３位、４６位、５６位、７０位、１０７位、１１７位、および／または１１８位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｃ）２３位、５５位、７１位、７７位、８８位、および／または１０９位において、該アミノ酸残基はＺ３であり；
（ｄ）１６位、２１位、４１位、７３位、８５位、９９位、および／または１１１位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｅ）３４位および／または９５位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｆ）２２位、２５位、２９位、４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１０２位、１０８位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位、および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
に適合し、ここで
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ２は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ４は、Ｒ、Ｈ、およびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；そしてＺ６は、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目７７）
項目７６に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、３６位において、Ｚ１およびＺ３からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目７８）
項目７６または７７に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、６４位において、Ｚ１およびＺ２からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目７９）
項目７０〜７８のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の制限：
（ａ）２位において、該アミノ酸残基はＩまたはＬである；
（ｂ）３位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｃ）４位において、該アミノ酸残基はＶまたはＩである；
（ｄ）５位において、該アミノ酸残基はＫである；
（ｅ）６位において、該アミノ酸残基はＰである；
（ｆ）８位において、該アミノ酸残基はＮである；
（ｇ）１０位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｈ）１１位において、該アミノ酸残基はＤまたはＥである；
（ｉ）１２位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｊ）１４位において、該アミノ酸残基はＥまたはＤである；
（ｋ）１５において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｌ）１７位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｍ）１８位において、該アミノ酸残基は、Ｒ、ＥまたはＫである；
（ｎ）１９位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ｏ）２４位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ｐ）２６位において、該アミノ酸残基は、Ｍ、Ｌ、ＶまたはＩである；
（ｑ）２７位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｒ）２８位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＶである；
（ｓ）３０位において、該アミノ酸残基はＭである；
（ｔ）３１位において、該アミノ酸残基は、ＹまたはＦである；
（ｕ）３２位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ｖ）３３位において、該アミノ酸残基は、ＴまたはＳである；
（ｗ）３５位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｘ）３７位において、該アミノ酸残基は、Ｒ、Ｇ、ＥまたはＱである；
（ｙ）３９位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＳである；
（ｚ）４０位において、該アミノ酸残基は、ＦまたはＬである；
（ａａ）４５位において、該アミノ酸残基は、ＹまたはＦである；
（ａｂ）４７位において、該アミノ酸残基は、ＲまたはＧである；
（ａｃ）４８位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ａｄ）４９位において、該アミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、またはＱである；
（ａｅ）５１位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ａｆ）５２位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ａｇ）５３位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ａｈ）５４位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｉ）５７位において、該アミノ酸残基は、ＨまたはＮである；
（ａｊ）５８位において、該アミノ酸残基は、Ｑ、Ｋ、ＲまたはＰである；
（ａｋ）５９位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｌ）６０位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ａｍ）６１位において、該アミノ酸残基は、ＨまたはＲである；
（ａｎ）６３位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ａｏ）６５位において、該アミノ酸残基は、Ｅ、ＰまたはＱである；
（ａｐ）６７位において、該アミノ酸残基は、ＱまたはＲである；
（ａｑ）６８位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＥである；
（ａｒ）６９位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ａｓ）７９位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ａｔ）８０位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ａｕ）８１位において、該アミノ酸残基は、Ｙ、ＨまたはＦである；
（ａｖ）８２位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ａｗ）８３位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ａｘ）８４位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ａｙ）８６位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｚ）８９位において、該アミノ酸残基は、Ｇ、ＴまたはＳである；
（ｂａ）９０位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｂｂ）９１位において、該アミノ酸残基は、Ｌ、ＩまたはＶである；
（ｂｃ）９２位において、該アミノ酸残基は、ＲまたはＫである；
（ｂｄ）９３位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｂｅ）９６位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＱである；
（ｂｆ）９７位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｂｇ）１００位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＮである；
（ｂｈ）１０１位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｉ）１０３位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＶである；
（ｂｊ）１０４位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｂｋ）１０５位において、該アミノ酸残基は、Ｍ、ＬまたはＩである；
（ｂｌ）１０６位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｂｍ）１１２位において、該アミノ酸残基は、ＴまたはＡである；
（ｂｎ）１１３位において、該アミノ酸残基は、ＳまたはＴである；
（ｂｏ）１１４位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ｂｐ）１１５位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ｂｑ）１１９位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｒ）１２０位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｓ）１２３位において、該アミノ酸残基は、ＦまたはＬである；
（ｂｔ）１２５位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｂｕ）１２６位において、該アミノ酸残基は、ＱまたはＨである；
（ｂｖ）１２８位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ｂｗ）１２９位において、該アミノ酸残基は、ＶまたはＩである；
（ｂｘ）１３０位において、該アミノ酸残基はＦである；
（ｂｙ）１３１位において、該アミノ酸残基は、ＤまたはＥである；
（ｂｚ）１３２位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｃａ）１３５位において、該アミノ酸残基はＶである；
（ｃｂ）１３８位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｃｃ）１３９位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｃｄ）１４０位において、該アミノ酸残基は、ＬまたはＭである；
（ｃｅ）１４２位において、該アミノ酸残基はＹである；
（ｃｆ）１４３位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｃｇ）１４５位において、該アミノ酸残基は、ＬまたはＩである；そして
（ｃｈ）１４６位において、該アミノ酸残基はＴである、
に適合する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目８０）
項目１０に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで（ａ）〜（ｃｈ）において特定される位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、（ａ）〜（ｃｈ）に特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目８１）
項目７０に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％は、以下の制限：
（ａ）９位、７６位、９４位および１１０位において、該アミノ酸残基Ａである；
（ｂ）２９位および１０８位において、該アミノ酸残基はＣである；
（ｃ）３４位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｄ）９５位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｅ）５６位において、該アミノ酸残基はＦである；
（ｆ）４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１０２位、１１６位、１２２位、１２７位および１３６位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ｇ）４１位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｈ）７位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｉ）８５位において、該アミノ酸残基はＫである；
（ｊ）２０位、４２位、５０位、７８位および１２１位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｋ）１位および１４１位において、該アミノ酸残基はＭである；
（ｌ）２３位および１０９位において、該アミノ酸残基はＮである；
（ｍ）２２位、２５位、１３３位、１３４位および１３７位において、該アミノ酸残基はＰである；
（ｎ）７１位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ｏ）１６位、２１位、７３位、９９および１１１位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ｐ）５５位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ｑ）７７位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｒ）１０７位において、該アミノ酸残基はＷである；および
（ｓ）１３位、４６位、７０位および１１８位において、該アミノ酸残基はＹである、に適合する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目８２）
項目７０〜８１のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下：
（ａ）３６位において、該アミノ酸残基は、Ｍ、Ｌ、またはＴである；
（ｂ）７２位において、該アミノ酸残基は、ＬまたはＩである；
（ｃ）７５位において、該アミノ酸残基は、ＭまたはＶである；
（ｄ）６４位において、該アミノ酸残基は、Ｌ、Ｉ、またはＦである；
（ｅ）８８位において、該アミノ酸残基は、ＴまたはＳである；
（ｆ）１１７位において、該アミノ酸残基は、ＹまたはＦである、
からなる群より選択される、アミノ酸残基を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目８３）
項目７０〜８３のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下：
（ａ）１４位において、該アミノ酸残基は、Ｄである；
（ｂ）１８位において、該アミノ酸残基は、Ｅである；
（ｃ）２６位において、該アミノ酸残基は、ＭまたはＶである；
（ｅ）３０位において、該アミノ酸残基は、Ｉである；
（ｆ）３２位において、該アミノ酸残基は、Ｄである；
（ｇ）３６位において、該アミノ酸残基は、ＭまたはＴである；
（ｉ）３７位において、該アミノ酸残基は、Ｃである；
（ｊ）３８位において、該アミノ酸残基は、Ｄである；
（ｊ）５３位において、該アミノ酸残基は、Ｖである；
（ｋ）５８位において、該アミノ酸残基は、Ｒである；
（ｌ）６１位において、該アミノ酸残基は、Ｒである；
（ｍ）６２位において、該アミノ酸残基は、Ｌである；
（ｎ）６４位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＦである；
（ｏ）６５位において、該アミノ酸残基は、Ｐである；
（ｐ）７２位において、該アミノ酸残基は、Ｉである；
（ｑ）７５位において、該アミノ酸残基は、Ｖである；
（ｒ）８８位において、該アミノ酸残基は、Ｔである；
（ｓ）８９位において、該アミノ酸残基は、Ｇである；
（ｔ）９１位において、該アミノ酸残基は、Ｌである；
（ｕ）９８位において、該アミノ酸残基は、Ｉである；
（ｖ）１０５位において、該アミノ酸残基は、Ｉである；
（ｗ）１１２位において、該アミノ酸残基は、Ａである；
（ｘ）１２４位において、該アミノ酸残基は、ＧまたはＣである；
（ｙ）１２８位において、該アミノ酸残基は、Ｄである；
（ｚ）１４０位において、該アミノ酸残基は、Ｍである；
（ａａ）１４３位において、該アミノ酸残基は、Ｒである；および
（ａｂ）１４４位において、該アミノ酸残基は、Ｗである；
からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を含む、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目８４）
項目８３に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで（ａ）〜（ａｂ）において特定される位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、（ａ）〜（ａｂ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目８５）
項目７０〜８４のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下：
（ａ）４１位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｂ）１３８位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｃ）３４位において、該アミノ酸残基はＮである；および
（ｄ）５５位において、該アミノ酸残基はＳである、
からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目８６）
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号５７７と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号５７８と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号６２１と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号５７９と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６０２と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号６９７と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号７２１と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号６１３と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号６７７と少なくとも８９％同一なアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号５８４と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７０７と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号６１６と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号６１２と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号５９０と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；
（ｏ）（ａ）〜（ｎ）の任意の１つと相補的なアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目８７）
項目８６に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下：
（ｉ）１８および３８位において、Ｚ５アミノ酸残基；
（ｉｉ）６２位において、Ｚ１アミノ酸残基；
（ｉｉｉ）１２４位において、Ｚ６アミノ酸残基；および
（ｉｖ）１４４位において、Ｚ２アミノ酸残基、
からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を含み、ここで：
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ２は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｚ６は、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群より選択されるアミノ酸残基である、
単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目８８）
項目８６に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、３１位、４５位、５１位、５４位、８６位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、１１４位、１２３位、１２９位、１３９位、および／または１４５位において、該アミノ酸残基はＢ１である；および
（ｂ）３位、５位、８位、１０位、１１位、１４位、１７位、２４位、２７位、３２位、３７位、４７位、４８位、４９位、５２位、５７位、５８位、６１位、６３位、６８位、６９位、７９位、８０位、８２位、８３位、８９位、９２位、１００位、１０１位、１０４位、１１９位、１２０位、１２５位、１２６位、１２８位、１３１位、および／または１４３位において、該アミノ酸残基はＢ２である；
に適合し、ここで：
Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目８９）
項目８６に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の制限：
（ａ）２位、４位、１５位、１９位、２６位、２８位、５１位、５４位、８６位、９０位、９１位、９７位、１０３位、１０５位、１０６位、１１４位、１２９位、１３９位、および／または１４５位において、該アミノ酸残基は、Ｚ１である；
（ｂ）３１位および／または４５位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｃ）８位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｄ）８９位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３またはＺ６である；
（ｅ）８２位、９２位、１０１位および／または１２０位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｆ）３位、１１位、２７位および／または７９位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｇ）１８位において、該アミノ酸残基は、Ｚ４またはＺ５である；
（ｈ）１２３位において、該アミノ酸残基は、Ｚ１またはＺ２である；
（ｉ）１２位、３３位、３５位、３９位、５３位、５９位、１１２位、１３２位、１３５位、１４０位、および／または１４６位において、該アミノ酸残基は、Ｚ１またはＺ３である；
（ｊ）３０位において、該アミノ酸残基はＺ１である；
（ｋ）６位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
（１）８１位において、該アミノ酸残基は、Ｚ２またはＺ４である；
（ｍ）１１３位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｎ）１３８位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｏ）１４２位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｐ）５７位および／または１２６位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３またはＺ４である；
（ｑ）５位、１７位、および６１位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｒ）２４位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｓ）１０４位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｔ）５２位および／または６９位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｕ）１４位および／または１１９位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｖ）１０位、３２位、６３位、および／または８３位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｗ）４８位および／または８０位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
（ｘ）４０位において、該アミノ酸残基は、Ｚ１またはＺ２である；
（ｙ）９６位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３またはＺ５である；
（ｚ）６５位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３、Ｚ４、またはＺ６である；
（ａａ）８４位および／または１１５位において、該アミノ酸残基  ｉｓ  Ｚ３である；
（ａｂ）９３位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ａｃ）１３０位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ａｄ）５８位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３、Ｚ４またはＺ６である；
（ａｅ）４７位において、該アミノ酸残基は、Ｚ４またはＺ６である；
（ａｆ）４９位および／または１００位において、該アミノ酸残基は、Ｚ３またはＺ４である；
（ａｇ）６８位において、該アミノ酸残基は、Ｚ４またはＺ５である；
（ａｈ）１４３位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ａｉ）１３１位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ａｊ）１２５位および／または１２８位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ａｋ）６７位において、該アミノ酸残基はＺ３またはＺ４である；
（ａｌ）６０位において、該アミノ酸残基はＺ５である；および
（ａｍ）３７位において、該アミノ酸残基はＺ４またはＺ６である；
に適合し、ここで
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ２は、Ｆ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ４は、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；そしてＺ６は、Ｃ、Ｇ、およびＰからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目９０）
項目８９に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで（ａ）〜（ａｍ）において特定される位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、（ａ）〜（ａｍ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目９１）
項目８６〜９０のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、３６位、４２位、４６位、５０位、５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＢ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、４１位、４３位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位、および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＢ２である；
に適合し、ここで
Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目９２）
項目８６〜９１のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、１３位、２０位、４２位、４６位、５０位、５６位、６４位、７０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１０７位、１１０位、１１７位、１１８位、１２１位、および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＢ１である；および
（ｂ）１６位、２１位、２２位、２３位、２５位、２９位、３４位、３６位、４１位、４３位、４４位、５５位、６６位、７１位、７３位、７４位、７７位、８５位、８７位、８８位、９５位、９９位、１０２位、１０８位、１０９位、１１１位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＢ２である；
に適合し、ここで
Ｂ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目９３）
項目８６〜９１のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が、以下の制限：
（ａ）１位、７位、９位、２０位、４２位、５０位、７２位、７５位、７６位、７８位、９４位、９８位、１１０位、１２１位および／または１４１位において、該アミノ酸残基はＺ１である；
（ｂ）１３位、４６位、５６位、７０位、１０７位、１１７位、および／または１１８位において、該アミノ酸残基はＺ２である；
（ｃ）２３位、５５位、７１位、７７位、８８位、および／または１０９位において、該アミノ酸残基はＺ３である；
（ｄ）１６位、２１位、４１位、７３位、８５位、９９位、および／または１１１位において、該アミノ酸残基はＺ４である；
（ｅ）３４位および／または９５位において、該アミノ酸残基はＺ５である；
（ｆ）２２位、２５位、２９位、４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１０２位、１０８位、１１６位、１２２位、１２７位、１３３位、１３４位、１３６位、および／または１３７位において、該アミノ酸残基はＺ６である；
に適合し、ここで
Ｚ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ２は、Ｆ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ３は、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ４は、Ｒ、ＨおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；そしてＺ６は、Ｃ、ＧおよびＰからなる群より選択されるアミノ酸である、
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目９４）
項目９３に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、３６位において、Ｚ１およびＺ３からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目９５）
項目９３または９４に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、６４位において、Ｚ１およびＺ２からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目９６）
項目８６〜９５のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の制限：
（ａ）２位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＬである；
（ｂ）３位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｃ）４位において、該アミノ酸残基は、ＶまたはＩである；
（ｄ）５位において、該アミノ酸残基はＫである；
（ｅ）６位において、該アミノ酸残基はＰである；
（ｆ）８位において、該アミノ酸残基はＮである；
（ｇ）１０位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｈ）１１位において、該アミノ酸残基は、ＤまたはＥである；
（ｉ）１２位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｊ）１４位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ｋ）１５位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｌ）１７位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｍ）１８位において、該アミノ酸残基は、Ｒ、ＥまたはＫである；
（ｎ）１９位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ｏ）２４位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ｐ）２６位において、該アミノ酸残基は、Ｍ、ＬＶまたはＩである；
（ｑ）２７位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｒ）２８位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＶである；
（ｓ）３０位において、該アミノ酸残基はＭである；
（ｔ）３１位において、該アミノ酸残基は、ＹまたはＦである；
（ｕ）３２位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ｖ）３３位において、該アミノ酸残基は、ＴまたはＳである；
（ｗ）３５位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｘ）３７位において、該アミノ酸残基は、Ｒ、Ｇ、ＥまたはＱである；
（ｙ）３９位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＳである；
（ｚ）４０位において、該アミノ酸残基は、ＦまたはＬである；
（ａａ）４５位において、該アミノ酸残基は、ＹまたはＦである；
（ａｂ）４７位において、該アミノ酸残基は、ＲまたはＧである；
（ａｃ）４８位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ａｄ）４９位において、該アミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、またはＱである；
（ａｅ）５１位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ａｆ）５２位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ａｇ）５３位において、該アミノ酸残基は、ＩまたはＶである；
（ａｈ）５４位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｉ）５７位において、該アミノ酸残基は、ＨまたはＮである；
（ａｊ）５８位において、該アミノ酸残基は、Ｑ、Ｋ、ＲまたはＰである；
（ａｋ）５９位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｌ）６０位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ａｍ）６１位において、該アミノ酸残基は、ＨまたはＲである；
（ａｎ）６３位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ａｏ）６５位において、該アミノ酸残基は、Ｅ、ＰまたはＱである；
（ａｐ）６７位において、該アミノ酸残基は、ＱまたはＲである；
（ａｑ）６８位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＥである；
（ａｒ）６９位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ａｓ）７９位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ａｔ）８０位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ａｕ）８１位において、該アミノ酸残基は、Ｙ、ＨまたはＦである；
（ａｖ）８２位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ａｗ）８３位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ａｘ）８４位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ａｙ）８６位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ａｚ）８９位において、該アミノ酸残基は、Ｇ、ＴまたはＳである；
（ｂａ）９０位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｂｂ）９１位において、該アミノ酸残基は、Ｌ、ＩまたはＶである；
（ｂｃ）９２位において、該アミノ酸残基は、ＲまたはＫである；
（ｂｄ）９３位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｂｅ）９６位において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＱである；
（ｂｆ）９７位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｂｇ）１００位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＮである；
（ｂｈ）１０１位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｉ）１０３位において、該アミノ酸残基は、ＡまたはＶである；
（ｂｊ）１０４位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｂｋ）１０５位において、該アミノ酸残基は、Ｍ、ＬまたはＩである；
（ｂｌ）１０６位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｂｍ）１１２位において、該アミノ酸残基は、ＴまたはＡである；
（ｂｎ）１１３位において、該アミノ酸残基は、ＳまたはＴである；
（ｂｏ）１１４位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ｂｐ）１１５位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ｂｑ）１１９位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｒ）１２０位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｂｓ）１２３位において、該アミノ酸残基は、ＦまたはＬである；
（ｂｔ）１２５位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｂｕ）１２６位において、該アミノ酸残基は、ＱまたはＨである；
（ｂｖ）位１２８において、該アミノ酸残基は、ＥまたはＤである；
（ｂｗ）１２９位において、該アミノ酸残基はＶまたはＩである；
（ｂｘ）１３０位において、該アミノ酸残基はＦである；
（ｂｙ）１３１位において、該アミノ酸残基は、ＤまたはＥである；
（ｂｚ）１３２位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｃａ）１３５位において、該アミノ酸残基はＶである；
（ｃｂ）１３８位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｃｃ）１３９位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｃｄ）１４０位において、該アミノ酸残基は、ＬまたはＭである；
（ｃｅ）１４２位において、該アミノ酸残基はＹである；
（ｃｆ）１４３位において、該アミノ酸残基は、ＫまたはＲである；
（ｃｇ）１４５位において、該アミノ酸残基は、ＬまたはＩである；および
（ｃｈ）１４６位において、該アミノ酸残基はＴである、
に適合する、
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目９７）
項目９６に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで（ａ）〜（ｃｈ）において特定される位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％は、（ａ）〜（ｃｈ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目９８）
項目８６に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで以下の位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、以下の制限：
（ａ）９位、７６位、９４位、および１１０位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ｂ）２９位および１０８位において、該アミノ酸残基はＣである；
（ｃ）３４位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｄ）９５位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｅ）５６位において、該アミノ酸残基はＦである；
（ｆ）４３位、４４位、６６位、７４位、８７位、１０２位、１１６位、１２２位、１２７位および１３６位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ｇ）４１位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｈ）７位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｉ）８５位において、該アミノ酸残基はＫである；
（ｊ）２０位、４２位、５０位、７８位および１２１位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｋ）１位および１４１位において、該アミノ酸残基はＭである；
（ｌ）２３位および１０９位において、該アミノ酸残基はＮである；
（ｍ）２２位、２５位、１３３位、１３４位および１３７位において、該アミノ酸残基はＰである；
（ｎ）７１位において、該アミノ酸残基はＱである；
（ｏ）１６位、２１位、７３位、９９位および１１１位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ｐ）５５位において、該アミノ酸残基はＳである；
（ｑ）７７位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｒ）１０７位において、該アミノ酸残基はＷである；および
（ｓ）１３位、４６位、７０位および１１８位において、該アミノ酸残基はＹである、に適合する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目９９）
項目７０〜９８のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基：
（ａ）１４位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｂ）１８位において、該アミノ酸残基はＥである；
（ｃ）２６位において、該アミノ酸残基はＭまたはＶである；
（ｅ）３０位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｆ）３２位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｇ）３６位において、該アミノ酸残基はＭまたはＴである；
（ｉ）３７位において、該アミノ酸残基はＣである；
（ｊ）３８位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｊ）５３位において、該アミノ酸残基はＶである；
（ｋ）５８位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ｌ）６１位において、該アミノ酸残基はＲである；
（ｍ）６２位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｎ）６４位において、該アミノ酸残基はＩまたはＦである；
（ｏ）６５位において、該アミノ酸残基はＰである；
（ｐ）７２位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｑ）７５位において、該アミノ酸残基はＶである；
（ｒ）８８位において、該アミノ酸残基はＴである；
（ｓ）８９位において、該アミノ酸残基はＧである；
（ｔ）９１位において、該アミノ酸残基はＬである；
（ｕ）９８位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｖ）１０５位において、該アミノ酸残基はＩである；
（ｗ）１１２位において、該アミノ酸残基はＡである；
（ｘ）１２４位において、該アミノ酸残基はＧまたはＣである；
（ｙ）１２８位において、該アミノ酸残基はＤである；
（ｚ）１４０位において、該アミノ酸残基はＭである；
（ａａ）１４３位において、該アミノ酸残基はＲである；および
（ａｂ）１４４位において、該アミノ酸残基はＷである、
を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目１００）
項目９９に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで（ａ）〜（ａｂ）において特定される位置に対応する前記アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が、（ａ）〜（ａｂ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目１０１）
項目８６〜１００のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで前記アミノ酸配列は、以下：
（ａ）４１位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｂ）１３８位において、該アミノ酸残基はＨである；
（ｃ）３４位において、該アミノ酸残基はＮである；および
（ｅ）５５位において、該アミノ酸残基はＳである、
からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目１０２）
項目６９に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、グリホセートについて少なくとも１０ｍＭ−１分−１のｋｃａｔ／Ｋｍでグリホセートのアセチル化を触媒する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目１０３）
項目１０２に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、グリホセートについて少なくとも１００ｍＭ−１分−１のｋｃａｔ／Ｋｍでグリホセートのアセチル化を触媒する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目１０４）
項目１０３に記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、アミノメチルホスホン酸のアセチル化を触媒する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目１０５）
ＧＡＴ活性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
【数３】
2010220617.tif 000005
からなる群より選択され、該ポリペプチドは、以下
（ａ）少なくとも約２ｍＭ以下のグリホセートについてのＫｍ；
（ｂ）少なくとも約２００μＭ以下のアセチルＣｏＡについてのＫｍ；および
（ｃ）少なくとも約６／分に等しいｋｃａｔ、
により特徴づけられる、ポリペプチド。
（項目１０６）
グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
【数４】
2010220617.tif 000006
からなる群より選択される、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目１０７）
グリホセート耐性のトランスジェニック植物または植物細胞を生産する方法であって、該方法は：
（ａ）植物または植物細胞を、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドで形質転換する工程であって、該ポリヌクレオチドは、以下：
【数５】
2010220617.tif 000007
からなる群より選択される、工程、
（ｂ）該形質転換した植物細胞から、必要に応じてトランスジェニック植物を再生する工程、
を包含する、方法。
（項目１０８）
核酸構築物を含む植物または植物細胞を選択するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）核酸構築物を含むトランスジェニック植物または植物細胞を提供する工程であって、ここで該核酸構築物は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、以下：
【数６】
2010220617.tif 000008
からなる群より選択される、工程、
（ｂ）該トランスジェニック植物または植物細胞を、グリホセートの存在下で、該グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼが有効なレベルで発現される条件下で生長させ、それにより、該植物または植物細胞が、該核酸構築物を含んでいない場合に生長したときより早く、該トランスジェニック植物または植物細胞が、認識できる速度で生長する、工程、
を包含する、方法。
（項目１０９）
農作物を含む圃場で雑草を選択的に制御するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子での形質転換の結果としてグリホセート耐性である農作物の種子または植物を、該圃場に植える工程であって、該遺伝子は、以下：
【数７】
2010220617.tif 000009
からなる群より選択される、工程、
（ｂ）該圃場における農作物および雑草に、該農作物に重大な影響を及ぼすことなく該雑草を制御するに十分な量のグリホセートを適用する工程、
を包含する、方法。
（項目１１０）
前記農作物は、綿実、トウモロコシ、またはダイズである、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
グリホセートに対する増強された耐性を有するトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片であって、ここで該植物または植物外植片は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し、該ポリペプチドは、以下：
【数８】
2010220617.tif 000010
からなる群より選択され；そして少なくとも１つのポリペプチドは、さらなる機構によってグリホセート耐性を与える、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目１１２）
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片であって、ここで該植物または植物外植片は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し、該ポリペプチドは、以下：
【数９】
2010220617.tif 000011
からなる群より選択され、少なくとも１つのポリペプチドは、さらなる除草剤に対する耐性を与える、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目１１３）
グリホセートに対する増強された耐性を有するトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片であって、ここで該植物または植物外植片は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し、該ポリペプチドは、以下：
【数１０】
2010220617.tif 000012
からなる群より選択され、少なくとも１つのポリペプチドは、さらなる機構によってグリホセート耐性を与え、少なくとも１つのポリペプチドは、さらなる除草剤に対する耐性を与える、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物外植片。
（項目１１４）
農作物を含む圃場において雑草を制御するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で形質転換された農作物の種子または植物を、圃場に植える工程であって、該遺伝子は、以下：
【数１１】
2010220617.tif 000013
からなる群より選択され、少なくとも１つの遺伝子は、さらなる機構によってグリホセート耐性を与えるポリペプチドをコードする、工程；および
（ｂ）該圃場における農作物および雑草に、該農作物に重大な影響を及ぼすことなく該圃場における雑草の生長を阻害するに十分なグリホセートの有効な散布を適用する工程、を包含する、方法。
（項目１１５）
農作物を含む圃場における雑草を選択的に制御するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で形質転換された農作物の種子または植物を、圃場に植える工程であって、該遺伝子は、以下：
【数１２】
2010220617.tif 000014
からなる群より選択され；少なくとも１つの遺伝子は、さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチドをコードする、工程；
（ｂ）該農作物に重大な影響を及ぼすことなく、該圃場における雑草の生長を阻害するに十分であるグリホセートおよびさらなる除草剤の同時のまたは経時的な時間差的散布を、該圃場における農作物および雑草に、適用する工程、
を包含する、方法。
（項目１１６）
農作物を含む圃場における雑草を選択的に制御するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で形質転換された農作物の種子または植物を、圃場に植える工程であって、該遺伝子は、以下：
【数１３】
2010220617.tif 000015
からなる群より選択され；少なくとも１つの遺伝子は、さらなる機構によりグリホセート耐性を与えるポリペプチドをコードし、少なくとも１つの遺伝子は、さらなる除草剤に対する耐性を与えるポリペプチドをコードする、工程；
（ｂ）該農作物に重大な影響を及ぼすことなく、該圃場における雑草の生長を阻害するに十分であるグリホセートおよびさらなる除草剤の同時のまたは経時的な時間差的散布を、該圃場における農作物および雑草に、適用する工程、
を包含する、方法。
（項目１１７）
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号９１９に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号９２９に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号８４７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号８５１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号８５３に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号８５５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号８５７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号８６１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列番号８７１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列番号８７５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列番号８８１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）配列番号８８５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｍ）配列番号８８７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｎ）配列番号８８９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｏ）配列番号８９３に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｐ）配列番号８９７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｑ）配列番号８９９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｒ）配列番号９０９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｓ）配列番号９１１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｔ）配列番号８３７に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｕ）配列番号８４１に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｖ）配列番号８６５に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｗ）配列番号８６９に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
（ｘ）配列番号８７９に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
（項目１１８）
配列番号９２９に対して少なくとも９５％同一であり、配列番号９２９の３３位に対応するアミノ酸位置においてＧｌｙ残基またはＡｓｎ残基を含む、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１１９）
グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
【数１４】
2010220617.tif 000016
からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１２０）
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド：
（ａ）配列番号９１９に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号９２９に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号８４７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８５１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号８５３に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号８５５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号８５７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号８６１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号８７１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号８７５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号８８１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号８８５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号８８７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号８８９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｏ）配列番号８９３に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｐ）配列番号８９７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号８９９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｒ）配列番号９０９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｓ）配列番号９１１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；
（ｔ）配列番号８３７に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
（ｕ）配列番号８４１に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号８６５に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
（ｗ）配列番号８６９に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；および
（ｘ）配列番号８７９に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列。
（項目１２１）
配列番号９２９に対して少なくとも９５％同一であり、配列番号９２９の３３位に対応するアミノ酸位置においてＧｌｙ残基またはＡｓｎ残基を含むアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
（項目１２２）
以下：
【数１５】
2010220617.tif 000017
からなる群より選択されるアミノ酸配列の残基２〜１４６を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１２３）
以下：
【数１６】
2010220617.tif 000018
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチド。
（項目１２４）
植物または植物細胞におけるポリヌクレオチドの発現を増大する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップ存在ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して、配列番号３００、配列番号４４５および配列番号４５７からなる群より選択される配列と最適に整列させて、少なくとも４６０の類似性スコアを出し得るアミノ配列を含むポリペプチドコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドを得る工程であって、該核酸配列は、開始メチオニンＡＴＧコドンを含む、工程；
（ｂ）該開始メチオニンＡＴＧコドンのすぐ下流であってかつ隣接させて、該核酸配列に１つまたは２つのＧＣＧコドンまたはＧＣＴコドンを挿入して、改変ポリヌクレオチドを得る工程；および
（ｃ）該改変ポリヌクレオチドで該植物または植物細胞を形質転換する工程であって、ここで該改変ポリヌクレオチドで形質転換された植物または植物細胞は、該第１のポリヌクレオチドで形質転換された植物または植物細胞と比較して、大量のコードされたポリヌクレオチドを蓄積する、工程、
を包含する、方法。
（項目１２５）
植物において頻繁には利用されない核酸配列における１以上のコドンを同定する工程、および植物において頻繁には利用されない該コドンを、植物においてより頻繁に利用される同じアミノ酸をコードするコドンに代わって使用する工程をさらに包含する、項目１２４に記載の方法。
本発明は、植物のような生物に、以下に記載される実施形態のうちの１以上によって、グリホセートに対して耐性にするための方法および試薬を提供する。
【０００９】
本発明の一実施形態は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（「ＧＡＴ」）ポリペプチドとして本明細書でいわれる新規なポリペプチドを提供する。ＧＡＴポリペプチドは、（例えば、ＧＡＴポリペプチドを互いに整列させた場合に、配列類似性に関して）互いに対する構造的類似性によって特徴づけられる。本発明のＧＡＴポリペプチドは、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性（すなわち、グリホセートのアセチル化を触媒する能力）を有する。これらのＧＡＴポリペプチドは、アセチル基を、アセチルＣｏＡからグリホセートのＮに移す。さらに、いくつかのＧＡＴポリペプチドは、プロピオニルＣｏＡのプロピオニル基をグリホセートのＮに移す。いくつかのＧＡＴポリペプチドはまた、グリホセートアナログおよび／またはグリホセート代謝産物（例えば、アミノメチルホスホン酸）のアセチル化を触媒することができる。例示的なＧＡＴポリペプチドは、以下：
【００１０】
【数１７】
2010220617.tif 000019
に対応する。
【００１１】
また提供されるのは、以下のＧＡＴポリヌクレオチドとして本明細書でいわれる新規なポリヌクレオチドである：
【００１２】
【数１８】
2010220617.tif 000020
。ＧＡＴポリヌクレオチドは、ＧＡＴポリペプチドをコードする能力によって特徴づけられる。本発明のいくつかの実施形態において、ＧＡＴポリヌクレオチドは、親のコドンに対して植物で優先的に使用される類似のコドンで、１以上の親のコドンを置換することによって、よりよい植物発現のために操作される。他の実施形態において、ＧＡＴポリヌクレオチドは、Ｎ末端クロロプラスト転移ペプチドをコードするヌクレオチド配列の導入によって改変される。他の実施形態において、ＧＡＴポリヌクレオチドは、開始Ｍｅｔコドンのすぐ下流であってかつこのコドンに隣接させて、１以上のＧ＋Ｃコドン（すなわち、ＧＣＧまたはＧＣＴ）を挿入することによって改変される。
【００１３】
ＧＡＴポリペプチド、ＧＡＴポリヌクレオチドおよびグリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性は、以下により詳細に記載される。本発明はさらに、本明細書に記載されるＧＡＴポリペプチドおよびＧＡＴポリヌクレオチドの特定のフラグメントを包含する。
【００１４】
本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドのネイティブでない改変体を包含する。ここでそのコードされるポリペプチドの１以上のアミノ酸が変異される。
【００１５】
特定の好ましい実施形態において、本発明のＧＡＴポリヌクレオチドは、以下のように特徴づけられる。ＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップ存在ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して、配列番号３００、配列番号４４５および配列番号４５７からなる群より選択される参照アミノ酸と最適に整列させて、少なくとも４６０の類似性スコアを出し得る場合、以下の位置のうちの１以上が、以下の制限：（ｉ）１８位および３８位に、Ｚ５アミノ酸残基；（ｉｉ）６２位に、Ｚ１アミノ酸残基；（ｉｉｉ）１２４位に、Ｚ６アミノ酸残基；および（ｉｖ）１４４位に、Ｚ２アミノ酸残基に適合し、ここでＺ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２は、Ｆ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Ｚ５は、ＤおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Ｚ６は、Ｃ、ＧおよびＰからなる群より選択されるアミノ酸残基である。
【００１６】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号５７７と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｂ）配列番号５７８と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列；（ｃ）配列番号６２１と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列；（ｄ）配列番号５７９と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｅ）配列番号６０２と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｆ）配列番号６９７と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列；（ｇ）配列番号７１２と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列；（ｈ）配列番号６１３と少なくとも９７％同一なアミノ酸配列；（ｉ）配列番号６７７と少なくとも８９％同一なアミノ酸配列；（ｊ）配列番号５８４と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列；（ｋ）配列番号７０７と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｌ）配列番号６１６と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｍ）配列番号６１２と少なくとも９６％同一なアミノ酸配列；（ｎ）配列番号５９０と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列。
【００１７】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号９１９の２位〜１４６位に少なくとも９６％同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、８３３、８３５、８３９、８４３、８４５、８５９、８６３、８７３、８７７、８９１、８９５、９０１、９０５、９０７、９１３、９１５または９５０）；（ｂ）配列番号９２９の２位〜１４６位に少なくとも９７％同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号９２９、９３１、８３５、８４３、８４９、または８６７）；（ｃ）配列番号８４７の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号８４５または８４７）；（ｄ）配列番号８５１の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｅ）配列番号８５３の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｆ）配列番号８５５の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号８３５または８５５）；（ｇ）配列番号８５７の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｈ）配列番号８６１の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号８３９、８６１、または８８３）；（ｉ）配列番号８７１の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｊ）配列番号８７５の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｋ）配列番号８８１の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｌ）配列番号８８５の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号８４５または８８５）；（ｍ）配列番号８８７の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｎ）配列番号８８９の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号８６３、８８９、８９１、または９０３）；（ｏ）配列番号８９３の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｐ）配列番号８９７の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｑ）配列番号８９９の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｒ）配列番号９０９の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号８８３または９０９）；（ｓ）配列番号９１１の２位〜１４６位に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列；（ｔ）配列番号８３７の２位〜１４６位に少なくとも９９％同一なアミノ酸配列；（ｕ）配列番号８４１の２位〜１４６位に少なくとも９９％同一なアミノ酸配列；（ｖ）配列番号８６５の２位〜１４６位に少なくとも９９％同一なアミノ酸配列；（ｗ）配列番号８６９の２位〜１４６位に少なくとも９９％同一なアミノ酸配列；および（ｘ）配列番号８７９の２位〜１４６位に少なくとも９９％同一なアミノ酸配列。本発明のいくつかの実施形態において、このポリペプチドのアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の２位に対応するアミノ酸のＮ末端側に、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、またはＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａを含む。
【００１８】
本発明はさらに、配列番号９２９の２位〜１４６位に少なくとも９５％同一であり、配列番号９２９の３３位に対応するアミノ酸位置にＧｌｙ残基またはＡｓｎ残基を含むアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド（例えば、配列番号８３７、８４９、８９３、８９７、９０５、９２１、９２７、９２９または９３１）を提供する。本発明のいくつかの実施形態において、このポリペプチドのアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の２位に対応するアミノ酸のＮ末端側に、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、またはＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａを含む。
【００１９】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物を提供する。この構築物は、ベクター（例えば、植物形質転換ベクター）であり得る。いくつかの局面において、本発明のベクターは、Ｔ−ＤＮＡ配列を含む。この構築物は、必要に応じて、ＧＡＴ配列に作動可能に連結された調節性配列（例えば、プロモーター）を含む。ここでこのプロモーターは、このポリヌクレオチドに対して異種であり、このコードされたポリペプチドの十分な発現を引き起こして、この核酸構築物で形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を増強するに有効である。
【００２０】
本発明のいくつかの局面において、ＧＡＴポリヌクレオチドは、例えば、植物、細菌、放線菌類、酵母、藻類、または他の真菌において、選択マーカーとして機能する。例えば、ＧＡＴポリヌクレオチド選択マーカーを含むベクターで形質転換された生物は、グリホセートの存在下でのその生長能力に基づいて選択されうる。ＧＡＴマーカー遺伝子は、この遺伝子を発現する形質転換細胞の選択またはスクリーニングのために使用されうる。
【００２１】
本発明はさらに、積み重なった（ｓｔａｃｋｅｄ）形質を有するベクター（すなわち、ＧＡＴポリペプチドをコードし、かつ細胞または生物が有効なレベルで第２のポリペプチドを発現する際に検出可能な表現型形質（例えば、疾患耐性または病害虫耐性）を付与する第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列もまた含むベクター）を提供する。この検出可能な表現型形質はまた、選択マーカーとして、例えば、除草剤耐性を付与することによって、またはいくつかの種の目視可能なマーカーを提供することによって、機能し得る。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、本発明の２以上のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。好ましくは、このＧＡＴポリヌクレオチドは、異なる動的パラメーターを有するＧＡＴポリペプチドをコードする（すなわち、より低いＫｍを有するＧＡＴポリペプチド改変体が、より高いｋｃａｔを有するものと合わせられ得る）。さらなる実施形態において、この異なるＧＡＴポリヌクレオチドは、クロロプラスト転移配列または他のシグナル配列に連結され得、それにより、異なる細胞区画、オルガネラにおけるＧＡＴポリペプチド発現、またはこのＧＡＴポリヌクレオチドポリペプチドの１以上の分泌を提供する。
【００２３】
従って、２以上のＧＡＴポリヌクレオチドまたはコードされるポリペプチドを含む組成物が、本発明の特徴である。いくつかの場合において、これらの組成物は、例えば、少なくとも３以上のこのような核酸を含む核酸のライブラリーである。本発明の核酸を制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅもしくはＲＮａｓｅで消化するか、または他の方法でこの核酸をフラグメント化すること（例えば、機械的剪断、化学的切断など）により生成される組成物はまた、本発明の特徴であり、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートおよび核酸ポリメラーゼ（例えば、熱安定性核酸ポリメラーゼ）とともに、本発明の核酸をインキュベートすることにより、生成される組成物も同様である。
【００２４】
本発明のベクターによって形質導入された細胞、または他の方法で本発明の核酸を組み込んでいる細胞は、本発明の一局面である。好ましい実施形態において、この細胞は、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを発現する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸を組み込んでいる細胞は、植物細胞である。本発明の核酸を組み込んでいるトランスジェニック植物、トランスジェニック植物細胞、およびトランスジェニック植物外植片もまた、本発明の特徴である。いくつかの実施形態において、このトランスジェニック植物、トランスジェニック植物細胞、およびトランスジェニック植物外植片は、本発明の核酸によってコードされるグリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する外因性ポリペプチドを発現する。本発明はまた、本発明のトランスジェニック植物によって生成されるトランスジェニック種子を提供する。
【００２６】
本発明は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、ならびに別の機構（例えば、グリホセート耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよび／またはグリホセート耐性グリホセートキシド−レダクターゼ）によりグリホセート耐性を付与するポリペプチドの発現に起因して、グリホセートに対する増強された耐性を有する、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物外植片またはトランスジェニック種子を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、別の機構（例えば、グリホセート耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよび／またはグリホセート耐性グリホセートキシド−レダクターゼ）によりグリホセート耐性を付与するポリペプチド、ならびにさらなる除草剤に対する耐性を付与するポリペプチド（例えば、変異ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼおよび変異プロトポルフィリンノゲンオキシダーゼ）の発現に起因して、グリホセートに対する増強された耐性を有するトランスジェニック植物、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物外植片、またはトランスジェニック種子を提供する。
【００２７】
本発明はまた、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、およびさらなる除草剤に対する耐性を付与するポリペプチド（例えば、変異ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼおよび変異プロトポルフィリンノゲンオキシダーゼ）の発現に起因して、グリホセートに対する増強された耐性およびさらなる除草剤に対する耐性を有するトランスジェニック植物、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物外植片、またはトランスジェニック種子を提供する。本発明はまた、グリホセートに対する増強された耐性および１以上のさらなる導入遺伝子によって付与されうるさらなる望ましい形質を有するトランスジェニック植物、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物外植片、またはトランスジェニック種子を提供する。
【００２８】
本発明のポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入し、次いで、これらの核酸を発現させ、必要に応じて、細胞または培養培地からこれらのポリペプチドを回収することによる、本発明のポリペプチドを生成する方法は、本発明の特徴である。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドを発現する細胞は、トランスジェニック植物細胞である。
【００２９】
開始メチオニンＡＴＧコドンのすぐ下流であってかつ隣接させて、ポリペプチドコード配列に、１つまたは２つのＧ／Ｃリッチコドン（例えば、ＧＣＧコドンまたはＧＣＴコドン）を挿入すること、ならびに／あるいはこのポリペプチドにおいて、植物において頻繁には利用されない１以上のコドンを、植物においてより頻繁に利用される同じアミノ酸をコードするコドンに代わって使用すること、ならびにこの改変ポリヌクレオチドを植物または植物細胞に導入すること、およびこの改変コード配列を発現させることによる、植物または植物細胞における本発明のポリペプチドの発現レベルを増大させる方法もまた、本発明の特徴である。
【００３０】
以下もまた本発明の特徴である：
【００３１】
【数１９−１】
2010220617.tif 000021
【００３２】
【数１９−２】
2010220617.tif 000022
に由来する抗原に対して反応するポリクローナル抗血清によって特異的に結合されるが、天然に存在する関連配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ７０６６４の配列の部分配列によって示されるペプチド）には結合しないポリペプチド、ならびに
【００３３】
【数２０】
2010220617.tif 000023
のいずれか１つ以上から得られ抗原を投与することによって生成され、そして／またはこのような抗原に特異的に結合するが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ７０６６４の配列に対応する天然に存在するポリペプチドに特異的に結合しない、抗体。
【００３４】
本発明の別の局面は、インビトロまたはインビボで本発明の核酸を組み換えるかまたは変異させることによって、新規なＧＡＴポリヌクレオチドまたはＧＡＴポリペプチドを生成するためにポリヌクレオチドを多様化する方法に関する。一実施形態において、この組換え性生物は、組み換えＧＡＴライブラリーの少なくとも１つのライブラリーである。このようにして生成されたライブラリーは、本発明の実施形態であり、このライブラリーを含む細胞もまた同様である。さらに、本発明の核酸を変異させることによって改変ＧＡＴポリヌクレオチドを生成する方法は、本発明の実施形態である。本発明の方法によって生成される組換えまたは変異体のＧＡＴポリヌクレオチドまたはＧＡＴポリペプチドもまた、本発明の実施形態である。
【００３５】
本発明のいくつかの局面において、多様化は、反復組換えを用いることで達成される。この反復組換えは、インビトロ、インビボ、インシリコ、またはこれらの組み合わせで達成されうる。以下により詳細に記載される多様化方法のいくつかの例は、ファミリーシャッフリング法および合成シャッフリング法である。本発明は、グリホセート耐性トランスジェニック植物または植物細胞を生成するための方法を提供し、この方法は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドで植物または植物細胞を形質転換する工程、および必要に応じて、この形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生する工程を包含する。いくつかの局面において、このポリヌクレオチドは、ＧＡＴポリヌクレオチド、必要に応じて、細菌源由来のＧＡＴポリヌクレオチドである。本発明のいくつかの局面において、この方法は、同じ種の野生型植物の生長を阻害するグリホセート濃度で、形質転換植物の生長を阻害することなく、この形質転換植物または形質転換植物細胞を生長させる工程を包含する。この方法は、形質転換植物または形質転換植物細胞またはこの植物もしくは細胞の子孫を、漸増濃度のグリホセートおよび／または同じ種の野生型の植物もしくは植物細胞に対して致死的なグリホセート濃度で、生長させる工程を包含する。この方法によって生成されたグリホセート耐性トランスジェニック植物は、例えば、この植物を第２の植物と交配して、この交配の少なくともいくらかの子孫が、グリホセート耐性を示すようにすることで、繁殖させうる。
【００３６】
本発明はさらに、農作物を含む圃場において雑草を選択的に制御するための方法を提供し、この方法は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子での形質転換の結果としてグリホセート耐性である農作物の種子または植物を、該圃場に植える工程、およびこの圃場における農作物および雑草に、この農作物に重大な影響を及ぼすことなく雑草を制御するに十分な量のグリホセートを適用する工程を包含する。
【００３７】
本発明はさらに、農作物を含む圃場において雑草を制御し、この圃場におけるグリホセート耐性の雑草の出現を防止するための方法を提供し、この方法は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および別の機構によりグリホセート耐性を付与するポリペプチド（例えば、グリホセート耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよび／またはグリホセート耐性グリホセートオキシド−レダクターゼ）をコードする遺伝子で形質転換された結果として、グリホセート耐性である農作物の種子または植物を、圃場に植える工程、ならびにこの圃場における農作物および雑草に、この農作物に重大な影響を及ぼすことなくこの雑草を制御するに十分な量のグリホセート適用する工程を包含する。
【００３８】
さらなる実施形態において、本発明は、農作物を含む圃場における雑草を制御し、この圃場における除草剤耐性の雑草の出現を防止するための方法を提供し、この方法は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、別の機構（例えば、グリホセート耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよび／またはグリホセート耐性グリホセートキシド−レダクターゼ）によりグリホセート耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子、ならびにさらなる除草剤に対する耐性を付与するポリペプチド（例えば、変異ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼおよび変異プロトポルフィリンノゲンオキシダーゼ）をコードする遺伝子で形質転換された結果として、グリホセート耐性である農作物の種子または植物を圃場に植える工程；ならびにこの農作物に重大な影響を及ぼすことなく、この雑草を制御するに十分な量のグリホセートおよびさらなる除草剤（例えば、ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼインヒビター、スルホンアミド、イミダゾリノン、ビアラフォス、ホスフィノスリシン、アザフェニジン、ブタフェナシル、スルホセート、グルホシネート、およびプロトクスインヒビター）を、この圃場における農作物および雑草に適用する工程を包含する。
【００３９】
本発明はさらに、農作物を含む圃場における雑草を制御し、この圃場における除草剤耐性の雑草の出現を防止するための方法を提供し、この方法は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、ならびにさらなる除草剤に対する耐性を付与するポリペプチド（例えば、変異ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、スルホンアミド耐性アセトラクテートシンターゼ、スルホンアミド耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトラクテートシンターゼ、イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼおよび変異プロトポルフィリンノゲンオキシダーゼ）をコードする遺伝子で形質転換された結果として、グリホセート耐性である農作物の種子または植物を圃場に植える工程；ならびにこの農作物に重大な影響を及ぼすことなく、この雑草を制御するに十分な量のグリホセートおよびさらなる除草剤（例えば、ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼインヒビター、スルホンアミド、イミダゾリノン、ビアラフォス、ホスフィノスリシン、アザフェニジン、ブタフェナシル、スルホセート、グルホシネート、およびプロトクスインヒビター）を、この圃場における農作物および雑草に適用する工程を包含する。
【００４０】
本発明はさらに、グリホセートに耐性である遺伝的に形質転換された植物を生成するための方法を提供し、この方法は、植物細胞のゲノムに、組換え二本鎖ＤＮＡ分子を挿入する工程であって、この分子は、（ｉ）植物細胞において、ＲＮＡ配列の生成を引き起こすように機能するプロモーター；（ｉｉ）ＧＡＴをコードするＲＮＡ配列の生成を引き起こす構造的ＤＮＡ配列；および（ｉｉｉ）植物細胞において、このＲＮＡ配列の３’末端にポリアデニルヌクレオチドのストレッチの付加を引き起こす３’非翻訳領域、を含み、ここでこのプロモーターは、この構造的ＤＮＡ配列に対して異種であり、このコードされるポリペプチドの十分な発現を引き起こして、このＤＮＡ分子で形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を増強するように適合されている、工程；形質転換植物細胞を得る工程；ならびにこの形質転換植物細胞から、グリホセートに対する増大した耐性を有する遺伝的に形質転換された植物を再生する工程を包含する。
【００４１】
本発明はさらに、農作物を生成する方法を提供し、この方法は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で形質転換された結果として、グリホセート耐性である農作物植物を、このような農作物植物が農作物をもたらす条件下で生長させる工程、およびこの農作物植物から農作物を収穫する工程を包含する。これらの方法はしばしば、この農作物植物に、雑草を制御するに有効な濃度で、グリホセートを適用する工程を包含する。例示的な農作物植物としては、綿実、トウモロコシ、およびダイズが挙げられる。
【００４２】
本発明はまた、配列番号１〜１０、１６、４８、１９０、１９３、１９６、２０２、２０５、２６８、３００、４４２、４４５、４４８、４５４、４５７、５１５〜８３０および８３２〜９７２に対応する文字列を含む配列記録から構成されるデータベースを含む、コンピューター、コンピューター読み取り可能媒体および一体化システムもまた提供する。このような一体化システムは、必要に応じて、配列番号１〜１０、１６、４８、１９０、１９３、１９６、２０２、２０５、２６８、３００、４４２、４４５、４４８、４５４、４５７、５１５〜８３０および８３２〜９７２に対応するいずれか１つ以上の文字列を選択し、各他の核酸配列もしくはアミノ酸配列および／または任意のさらなる核酸配列もしくはアミノ酸配列と整列させ、翻訳し、逆翻訳し、または調べるために設定された１以上の指示を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（「ＧＡＴ」）によって触媒されるグリホセートのＮ−アセチル化を示す。
【図２】図２は、自然発生型ＧＡＴ活性を発現する例示的Ｂａｃｉｌｌｕｓ培養によって生産されたＮ−アセチルグリホセートのマススペクトル検出を示す。
【図３】図３は、細菌の異なる株から単離されたＧＡＴ配列およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓからのｙｉｔＩの間の相対的同一性を示す表である。
【図４】図４は、Ｅ．  ｃｏｌｉ培養からのＧＡＴ酵素の発現および精製のためのプラスミドｐＭＡＸＹ２１２０のマップである。
【図５】図５は、典型的なＧＡＴ酵素反応ミックスにおける、経時的な、増大したＮ−アセチルグリホセート生産を示すマススペクトロメトリー結果である。
【図６】図６は、それからグリホセートについての２．９ｍＭのＫＭが計算されるＧＡＴ酵素の動的データのプロットである。
【図７】図７は、それからアセチルＣｏＡにつき２μＭのＫＭが計算された図６のデータから取った動的データのプロットである。
【図８】図８は、ＡＭＰＡ経路を介する土壌中のグリホセートの分解を説明するスキームである。
【図９】図９は、グリホセート分解のサルコシン経路を記載するスキームである。
【図１０】図１０は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列である。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＭＡＸＹ２１９０のマップである。
【図１２】図１２は、ＧＡＴ選択マーカーを持つＴ−ＤＮＡ構築物を示す。
【図１３】図１３は、ＧＡＴ選択マーカーを持つ酵母発現ベクターを示す。
【図１４】図１４は、タッセリングにおける植物高さに対するグリホセートの効果を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび１５Ｂは、実施例１８に記載するように、添加したＫＣｌ（影をつけない棒線）の不存在下、または２０ｍＭ  ＫＣｌの存在下（影をつけた棒線）においてアッセイした種々のＧＡＴ酵素についての、各々、動的パラメーターＫｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍの比較を供する。誤差バーは、適用可能であれば、多数のアッセイの標準偏差を表す。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは、実施例１８に記載するように、添加したＫＣｌ（影をつけない棒線）の不存在下、または２０ｍＭ  ＫＣｌの存在下（影をつけた棒線）においてアッセイした種々のＧＡＴ酵素についての、各々、動的パラメーターＫｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍの比較を供する。誤差バーは、適用可能であれば、多数のアッセイの標準偏差を表す。
【図１６Ａ】図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃは、実施例１９に記載したように、本発明のいくつかのさらに展開されたＧＡＴ酵素（影をつけた棒線）の動的パラメーターに対する本発明の種々のＧＡＴ酵素（影をつけない棒線）の、各々、動的パラメーターＫｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍの比較を供する。誤差バーは、適用可能であれば、多数のアッセイの標準偏差を表す。
【図１６Ｂ】図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃは、実施例１９に記載したように、本発明のいくつかのさらに展開されたＧＡＴ酵素（影をつけた棒線）の動的パラメーターに対する本発明の種々のＧＡＴ酵素（影をつけない棒線）の、各々、動的パラメーターＫｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍの比較を供する。誤差バーは、適用可能であれば、多数のアッセイの標準偏差を表す。
【図１６Ｃ】図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃは、実施例１９に記載したように、本発明のいくつかのさらに展開されたＧＡＴ酵素（影をつけた棒線）の動的パラメーターに対する本発明の種々のＧＡＴ酵素（影をつけない棒線）の、各々、動的パラメーターＫｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍの比較を供する。誤差バーは、適用可能であれば、多数のアッセイの標準偏差を表す。
【図１７】図１７は、実施例１６に記載されたように、種々の温度でのインキュベーションの後における残存ＧＡＴ活性を示す。
【図１８】図１８は、実施例３０に記載されたように、ＫｃａｔおよびＫＭに対するｐＨの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を呈する酵素の新規なクラスに関する。１つの態様において、本発明は、グリホセートおよびグリホセートアナログをアセチル化することができる酵素、例えば、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（「ＧＡＴ」）活性を保有する酵素の新規なクラスに関する。そのような酵素は、化合物の第二級アミンをアセチル化する能力によって特徴付けられる。本発明のいくつかの態様において、図１に模式的に示すように、この化合物は除草剤、例えば、グリホセートである。この化合物はグリホセートアナログ、またはグリホセート分解の代謝産生物、例えば、アミノメチルホスホン酸でもあり得る。グリホセートのアセチル化はグリホセートの異化のための１つの代謝経路において鍵となる触媒工程であるが、天然に存在する単離されたまたは組換え酵素によるグリホセートの酵素的アセチル化は、従来は、記載されていなかった。このようにして、本発明の核酸およびポリペプチドは、除草剤抵抗性を作成するための新しい生化学的経路を提供する。
【００４５】
１つの態様において、本発明はＧＡＴポリペプチドをコードする新規な遺伝子を提供する。天然に存在するポリヌクレオチドに対応する単離されたおよび組換えＧＡＴポリヌクレオチド、ならびに組換えおよび作成された、例えば、変形されたＧＡＴポリヌクレオチドは本発明の特徴である。ＧＡＴポリヌクレオチドは配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２、８２４、８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４７、９４９、９５１および９５２によって例示される。具体的なＧＡＴポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本発明を説明するのを助けるために例として掲げ、本明細書中で記載し、および／または特許請求するＧＡＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドのジーナスの範囲を限定する意図ではない。
【００４６】
また、本発明は、本明細書中で記載された新しいまたは改良された活性につきライブラリーのポリヌクレオチド構成要素の選択に基づいて、改良されたおよび／または増強された特徴、例えば、グリホセートについての改変されたＫｍ、増大した触媒の速度、増大した安定性などを持つＧＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めたさらなるＧＡＰポリヌクレオチドを生産するための変形されたライブラリーを生成し、それを選択する方法も提供する。そのようなポリヌクレオチドは、グリホセート抵抗性トランスジェニック植物の生産で特に好都合に使用される。
【００４７】
本発明のＧＡＰポリペプチドは新規な酵素活性を呈する。具体的には、合成除草剤グリホセートの酵素アセチル化は、本発明に先立っては認識されていなかった。このようにして、例えば、配列番号：５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６１３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９４６、９４８、９５０、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１および９７２によって例示される本明細書中に記載されたポリペプチドは、例えば、植物において、インビボで機能性であるグリホセートの解毒用の新規な生化学経路を提示する。
【００４８】
従って、本発明の核酸およびポリペプチドは、トランスジェニック植物において除草剤選択性の作成のための新しい核酸、ポリペプチドおよび生物学的経路を提供することによって、グリホセート抵抗性植物の創製においてかなり有用である。
【００４９】
定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、勿論変化させることができる特定の組成物または生物学的系に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書中に用いる技術用語は、特定の具体例のみを記載する目的であり、限定する意図ではないことも理解されるべきである。本明細書および添付の請求の範囲において、単数形態「ある」および「この（その）」は、その内容が明確にそうではないことを指示しない限り複数の対象物を含む。このようにして、例えば、「あるデバイス」への言及は、２つ以上のそのようなデバイスの組合せを含み、「ある遺伝子融合構築物」への言及は、構築物の混合物などを含む。
【００５０】
特記しない限り、本明細書中で用いられるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中に記載されたのと同様または同等のいずれの方法および材料も、本発明のテストを実施するのに用いることができるが、適当な材料および方法の具体的例は本明細書中に記載する。
【００５１】
本発明を記載し、特許請求するにおいて、以下の技術用語を、以下に記載する定義に従って用いるであろう。
【００５２】
従って、本発明の目的では、用語「グリホセート」は、（いずれのその塩も含めた）Ｎ−ホスホノメチルグリシンのいずれの除草学的に有効な形態も、およびｉｎ  ｐｌａｎｔａにてグリホセートアニオンの生成をもたらす他の形態も含むと考えるべきである。用語「グリホセートアナログ」は、グリホセートアナログが除草的に有効であるようなレベルでＥＰＳＰＳを阻害する能力を有するグリホセートのいずれの構造的アナログもいう。
【００５３】
本明細書中で用いるように、用語「グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性」または「ＧＡＴ活性」とは、例えば、図１で示されるように、グリホセートの第二級アミン基のアセチル化を触媒する能力をいう。「グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ」または「ＧＡＴ」は、グリホセート、グリホセートアナログ、および／またはグリホセート一次性代謝産生物（すなわち、ＡＭＰＡまたはサルコシン）のアミン基のアセチル化を触媒する酵素である。本発明のいくつかの好ましい具体例において、ＧＡＴは、アセチルＣｏＡからのアセチル基をグリホセートの第二級アミンおよびＡＭＰＡの第一級アミンへ移すことができる。加えて、いくつかのＧＡＴはプロピオニルＣｏＡのプロピロニル基をグリホセートに移動させることもでき、これは、ＧＡＴがやはりアセチルトランスフェラーゼであることを示す。本明細書中に記載される例示的ＧＡＴは約ｐＨ５ないし９で活性であり、最適な活性は約ｐＨ６．５ないし８．０の範囲におけるものである。活性は、当該分野でよく知られた種々の動的パラメーター、例えば、ｋｃａｔ、ＫＭおよびｋｃａｔ／ＫＭを用いて定量することができる。これらの動的パラメーターは、実施例７または実施例１９において後記するように測定することができる。
【００５４】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」および「核酸」は、関連する文脈に応じて、ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇなど、または天然に存在するまたは人工的なヌクレオチドアナログ）のポリマー、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはその代表、例えば、文字ストリングを表すのに用いられる。与えられたポリヌクレオチドまたは相補的ポリヌクレオチドは、いずれかの特定のヌクレオチド配列から決定することができる。
【００５５】
同様に、「アミノ酸配列」は、文脈に応じて、アミノ酸のポリマー（蛋白質、ポリペプチドなど）、またはアミノ酸ポリマーを表す文字ストリングである。用語「蛋白質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は本明細書中では交換可能に用いられる。
【００５６】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の成分は、それが、通常は会合している成分（他の蛋白質、核酸、細胞、合成試薬など）からそれが部分的にまたは完全に分離されると、「単離」されている。核酸またはポリペプチドは、それが人工的な、または作成された、または人工的もしくは作成された蛋白質または核酸に由来すると、「組換え」である。例えば、ベクターまたはいずれかの他の異種位置に、例えば、組換え生物のゲノムに、それが、自然発生的に見出されるようにポリペプチドに通常近接するヌクレオチド配列と会合していないように挿入されるポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドである。組換えポリヌクレオチドからインビトロまたはインビボで発現された蛋白質は、組換えポリペプチドの例である。同様に、天然に存在しないポリヌクレオチド配列、例えば、天然に存在する遺伝子の変種は組換え体である。
【００５７】
用語「グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼポリペプチド」および「ＧＡＴポリペプチド」は、本明細書中で提供される新規なポリペプチドのファミリーのいずれかをいうように相互交換的に用いられる。
【００５８】
用語「グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼポリヌクレオチド」および「ＧＡＴポリヌクレオチド」は、ＧＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを言うように相互交換的に用いられる。
【００５９】
「サブ配列」または「断片」は全配列のいずれかの部分である。
【００６０】
アミノ酸またはポリヌクレオチドポリマーのナンバリングは、該ポリマーの与えられたモノマー成分（アミノ酸残基、取込まれたヌクレオチドなど）の位置が選択された参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド中の同一の残基位置に対応する場合、選択されたアミノ酸ポリマーまたは核酸のナンバリングに対応する。
【００６１】
ベクターは、選択された核酸による細胞形質導入／形質転換、または細胞中の核酸の発現を促進するための組成物である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、細菌、ポリ−リシン、染色体組込みベクター、エピソームベクターなどを含む。
【００６２】
「ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の実質的に全長」とは、配列の少なくとも約７０％、一般には少なくとも約８０％、または典型的には約９０％以上をいう。
【００６３】
本明細書中で用いるように、「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にまたは部分的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含む蛋白質をいう。認められている免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに膨大な免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、これらは、今度は、各々、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定義する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位はテトラマーを含む。各テトラマーはポリペプチド鎖の２つの同一な対よりなり、各々の対は１つの「軽」（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０ないし７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ−末端は、主として、抗原認識を担う約１００ないし１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）とは、各々、これらの軽および重鎖をいう。抗体は、無傷免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化によって生じた多数のよく特徴付けられた断片として存在する。このようにして、例えば、ペプシンはヒンジ領域中のジスルフィド結合未満で抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２、それ自体はジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結した軽鎖であるＦａｂのダイマーを生じる。該Ｆ（ａｂ）’２は温和な条件下で還元されて、ヒンジ領域中のジスルフィド結合を破壊し、それにより、該Ｆ（ａｂ’）２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換する。該Ｆａｂ’モノマーは、実質的には、ヒンジ領域の一部を持つＦａｂである（他の抗体断片のより詳細な記載については、Ｐａｕｌ編（１９９８）  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （第４版，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ参照））。種々の抗体断片が無傷抗体の消化の観点から定義されているが、当業者であれば、そのようなＦａｂ’断片は、化学的に、または組換えＤＮＡ技術を利用することによってデ・ノボ合成することができるのを認識するであろう。このようにして、本明細書中で用いる用語抗体は、全抗体の修飾によって生じた、または組換えＤＮＡ方法を用いてデ・ノボ合成された抗体断片も含む。抗体は、可変重鎖および可変軽鎖が（直接的に、またはペプチドリンカーを介して）一緒に連結して、連続的ポリペプチドを形成する単一鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）抗体を含めた単一鎖抗体を含む。
【００６４】
「葉緑体トランジットペプチド」は、蛋白質と組み合されて翻訳され、蛋白質を、蛋白質が作成される細胞に存在する葉緑体または他のプラスチドタイプへ向けるアミノ酸配列である。「葉緑体トランジット配列」とは、葉緑体トランジットペプチドをコードするヌクレオチド配列をいう。
【００６５】
「シグナルペプチド」は、蛋白質と一緒に翻訳され、蛋白質を分泌系に向けるアミノ酸配列である（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ（１９９１）  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３）。もし蛋白質が液胞に向けられるべきならば、液胞標的化シグナルをさらに加えることができ、あるいはもし小胞体に向けるべきならば、小胞体滞留シグナルを加えることができる。もし蛋白質が核に向けられるべきならば、存在するいずれのシグナルペプチドも除去するべきであり、その代わり、核局所化シグナルを含める（Ｒａｉｋｈｅｌ．（１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２）。
【００６６】
ポリヌクレオチドに適用される用語「多様化」および「多様性」とは、親ポリヌクレオチドの複数の修飾された形態、または複数の親ポリヌクレオチドの創製をいう。ポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列における多様性は、対応するコードされたポリペプチドの多様性、例えば、複数のポリペプチド変種をコードするポリヌクレオチドの多様なプールをもたらすことができる。本発明のいくつかの具体例において、この配列多様性は、所望の機能的属性を持つ変種につき多様化されたポリヌクレオチドのライブラリー、例えば、増強された機能的特徴を持つＧＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをスクリーニング／選択することによって開発される。
【００６７】
用語「コードする」とは、１つ以上のアミノ酸配列につきコードするヌクレオチド配列の能力をいう。該用語は開始または停止コドンを必要としない。アミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列およびその相補体によって供される６つの異なるリーディングフレームのうちのいずれか１つにおいてコードされ得る。
【００６８】
本明細書中で用いる場合、用語「人工的変種」とは、修飾されたＧＡＴポリヌクレオチド、例えば、配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２、８２４、８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４７、９４９、９５１および９５２のいずれか１つの修飾された形態、または生物から単離された天然に存在するＧＡＴポリヌクレオチドのいずれか１つの修飾された形態によってコードされた、ＧＡＴ活性を有するポリペプチドをいう。人工的変種が、適当な宿主で発現された場合にそれから生成される修飾されたポリヌクレオチドは、ＧＡＴポリヌクレオチドの修飾によってヒト介入を介して得られる。
【００６９】
用語「核酸構築物」または「ポリヌクレオチド構築物」は、天然に存在する遺伝子から単離された、あるいはそうでなければ自然発生的には存在しないような核酸のセグメントを含むように修飾された、一本鎖または二本鎖いずれかの核酸分子を意味する。用語核酸構築物は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要な制御配列を含む場合には用語「発現カセット」と同義である。
【００７０】
用語「制御配列」は、本明細書中においては、本発明のポリペプチドの発現に必要な、または該発現に有利なすべての成分を含むように定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して自然発生型または外来性であり得る。そのような制御配列は、限定されるものではないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーター配列を含む。最小で、制御配列はプロモーターおよび転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを含む。制御配列には、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード配列と制御配列との連結を容易とする特異的制限部位を導入する目的でリンカーを設けることができる。
【００７１】
用語「作動可能に連結した」とは、本明細書中においては、制御配列が、当該制御配列がポリペプチドの発現を指令するように、ＤＮＡ配列のコード配列に対して一定の位置に適切に置かれる配置と定義される。
【００７２】
本明細書中において用いる場合、用語「コード配列」は、その蛋白質産生物のアミノ酸配列を直接的に特定するヌクレオチド配列をカバーすることを意図する。コード配列の境界は、一般には、ＡＴＧ開始コドンで通常は開始するオープンリーディングフレームによって決定される。コード配列は、典型的には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または組換えヌクレオチド配列を含む。この意味においては、用語「発現」は、限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含めた、ポリペプチドの生産に関与するいずれの工程も含む。
【００７３】
この意味において、用語「発現ベクター」は、本発明のポリペプチドをコードするセグメントを含み、その転写を供するさらなるセグメントに作動可能に連結した、線状または環状のＤＮＡ分子をカバーする。
【００７４】
本明細書中で用いるように、用語「宿主細胞」は、核酸構築物での形質転換に感受性であるいずれの細胞型も含む。
【００７５】
用語「植物」は、全植物、苗条植物器官／構造（例えば、葉、幹および塊茎）、根、花および花の器官／構造（例えば、包葉、萼、花弁、雄蘂、心皮、葯および胚珠）、（胚、胚乳、および種子被覆を含めた）種子および果実（成熟子房）、植物組織（例えば、管組織、地表組織）および細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞、毛状体など）、およびその子孫を含む。本発明の方法で用いることができる植物のクラスは、一般には、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）、裸子植物、シダ、および多細胞藻類を含めた、形質転換技術に使用できる高等および下等植物のクラスと同程度に広い。それは、アニュプロイド、ポリプロイド、ジプロイド、ハプロイドおよびヘミ接合体を含めた種々の倍数性の植物を含む。
【００７６】
本明細書中で用いる用語「異種」は、エレメントは自然発生では相互に近接して通常は見出されないことを示す２つ以上のエレメントの間の関係を説明する。このようにして、例えば、それが外来種に由来すれば、あるいはもし同一種からのものであれば、その元来の形態から修飾されていれば、ポリヌクレオチド配列は生物または第二のポリヌクレオチド配列「に対して異種」である。例えば、異種コード配列に作動可能に連結したプロモーターとは、それからプロモーターが由来するものとは異なった種からのコード配列をいい、あるいは、もし同一種からのものであれば、プロモーターと自然発生的には会合していないコード配列（例えば、遺伝子工学により作成されたコード配列、または異なる生態型または品種からの対立遺伝子）をいう。異種ポリペプチドの例は、トランスジェニック生物における組換えポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドである。異種ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは組換え分子の形態である。
【００７７】
種々のさらなる用語は本明細書中で定義され、そうでなければ特徴付けられる。
【００７８】
グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ
１つの態様において、本発明は、本明細書中では「グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ」、「ＧＡＴ」または「ＧＡＴ酵素」という単離されたまたは組換え酵素の新規なファミリーを提供する。ＧＡＴは、ＧＡＴ活性、好ましくは、ＧＡＴを発現するように作成されたトランスジェニック植物に対してある程度のグリホセート耐性を付与するのに十分な活性を有する酵素である。ＧＡＴのいくつかの例は、後により詳細に記載されるＧＡＴポリペプチドを含む。
【００７９】
ＧＡＴ−媒介グリホセート耐性は、ＧＡＴ活性、トランスジェニック植物、特定の植物におけるＧＡＴ発現レベル、および限定されるものではないが、除草剤適用の性質およびタイミングを含めた多数の他の因子の複合的機能である。当業者であれば、過度の実験無くして、特定の意味におけるグリホセート耐性を行うのに必要なＧＡＴ活性のレベルを決定することができる。
【００８０】
ＧＡＴ活性は、慣用的動的パラメーターｋｃａｔ、ＫＭ、およびｋｃａｔ／ＫＭを用いて特徴付けることができる。ｋｃａｔはアセチル化の速度の尺度と考えることができ、特に、高い基質濃度においては、ＫＭはその基質（例えば、アセチルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡおよびグリホセート）に対するＧＡＴの親和性の尺度であり、およびｋｃａｔ／ＫＭは、基質親和性および触媒速度の双方を考慮する触媒有効性の尺度である。ｋｃａｔ／ＫＭは、基質の濃度が少なくとも部分的に律速である状況において特に重要である。一般に、より高いｋｃａｔまたはｋｃａｔ／ＫＭを持つＧＡＴは、より低いｋｃａｔまたはｋｃａｔ／ＫＭを持つもう１つのＧＡＴよりも効果的な触媒である。より低いＫＭを持つＧＡＴは、より高いＫＭを持つもう１つのＧＡＴよりも効果的な触媒である。このようにして、１つのＧＡＴがもう１つのＧＡＴよりも効果的であるか否かを判断するためには、２つの酵素についての動的パラメーターを比較することができる。ｋｃａｔ、ｋｃａｔ／ＫＭおよびＫＭの相対的重要性は、ＧＡＴが機能することが予測される状況、例えば、グリホセートに対するＫＭに対するグリホセートの予測しうる効果的な濃度に応じて変化するであろう。ＧＡＴ活性は、限定されるものではないが、安定性、阻害に対する感受性、または他の分子による活性化を含めた多数の機能的特徴のいずれかの点で特徴付けることもできる。
【００８１】
グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼポリペプチド
１つの態様において、本発明は、本明細書中においては、「グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼポリペプチド」または「ＧＡＴポリペプチド」という単離されたまたは組換えポリペプチドの新規なファミリーを提供する。ＧＡＴポリペプチドは、ＧＡＴの新規なファミリーに対するそれらの構造的類似性によって特徴付けられる。すべてではないが多くのＧＡＴポリペプチドはＧＡＴである。区別は、ＧＡＴが機能の点で定義されるのに対し、ＧＡＴポリペプチドは構造の点で定義されることである。ＧＡＴポリペプチドのサブセットは、好ましくは、有効なレベルで当該蛋白質を発現するトランスジェニック植物にグリホセート抵抗性を付与するように機能するであろうレベルにて、ＧＡＴ活性を有するＧＡＴポリペプチドよりなる。グリホセート耐性を付与するのに用いられるいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは少なくとも１分−１以上、好ましくは少なくとも１０分−１、１００分−１または１０００分−１のｋｃａｔを有する。グリホセート耐性を付与するのに用いられる他の好ましいＧＡＴポリペプチドは、１００ｍＭ以下、より好ましくは１０ｍＭ、１ｍＭ、または０．１ｍＭ以下のＫＭを有する。グリホセート耐性を付与するのに用いられるなお他の好ましいＧＡＴポリペプチドは少なくとも１ｍＭ−１分−１以上、好ましくは、少なくとも１０ｍＭ−１分−１、１００ｍＭ−１分―１、１０００ｍＭ−１分−１、または１０，０００ｍＭ−１分−１のｋｃａｔ／ＫＭを有する。
【００８２】
例示的ＧＡＴポリペプチドは種々の細菌株から単離され、特徴付けられている。単離され、特徴付けられているモノマーＧＡＴポリペプチドの１つの例はほぼ１７ｋＤの分子半径を有する。Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの株から単離された例示的ＧＡＴ酵素、配列番号：７はほぼ２．９ｍＭのグリホセートに対するＫｍ、およびほぼ２μＭのアセチルＣｏＡに対するＫｍを呈し、ｋｃａｔは６／分に等しい。
【００８３】
用語「ＧＡＴポリペプチド」とは、配列番号：３００、４４５および４５７よりなる群から選択されるアミノ酸配列と最適に整列して、ＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて少なくとも４６０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ延長ペナルティーを生じさせることができるアミノ酸配列を含むいずれかのポリペプチドを表し、ここに、以下の位置の少なくとも１つは以下の制限に適合する：（ｉ）位置１８および３８において、Ｚ５アミノ酸残基があり；（ｉｉ）位置６２において、Ｚ１アミノ酸残基があり；（ｉｉｉ）位置１２４において、Ｚ６アミノ酸残基があり；および（ｉｖ）位置１４４において、Ｚ２アミノ酸残基があり、ここに：Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸残基である。本発明のいくつかの態様は、配列番号：３００、４４５および４５７よりなる群から選択されるアミノ酸配列と最適に整列して、ＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて少なくとも４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、または７６０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティーおよび１のギャップ延長ペナルティーを生じさせることができるアミノ酸配列を含むＧＡＴポリペプチドに関し、ここに、以下の位置の１つ以上は以下の制限に適合し；（ｉ）位置１８および３８において、Ｚ５アミノ酸残基；（ｉｉ）位置６２において、Ｚ１アミノ酸残基；（ｉｉｉ）位置１２４において、Ｚ６アミノ酸残基；および（ｉｖ）位置１４４において、Ｚ２アミノ酸残基、ここに：Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【００８４】
２つの配列は、規定されたアミノ酸置換マトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）、ギャップ存在ペナルティーおよびギャップ延長ペナルティーを用いて、配列のその対に可能な最高のスコアに到達するように類似性スコアリングにつき整列する場合に「最適に整列」される。２つの配列の間の類似性を定量するにおけるアミノ酸置換マトリックスおよびそれらの使用は当該分野でよく知られており、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）「Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」ｉｎ「Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」，  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３（Ｍ．Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ編），  ｐｐ．３４５−３５２．  Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９に記載されている。該ＢＬＯＳＵＭ６２行列（図１０）は、しばしば、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．０のような配列整列プロトコルにおけるデフォルトスコアリング置換マトリックスとして用いられる。ギャップ存在ペナルティーが、整列した配列の１つにおける単一アミノ酸ギャップの導入に対して課され、ギャップ延長ペナルティーは、すでに開いたギャップに挿入された各さらなる空のアミノ酸位置に対して課される。該整列は、整列が開始し、終了する各配列のアミノ酸位置によって、および選択的に、最高の可能なスコアに到達するような、１または双方の配列におけるギャップまたは複数ギャップの挿入によって定義される。最適整列およびスコアリングは手動で達成することができるが、該プロセスは、コンピューター−実行整列アルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載され、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）において公に入手可能とされるギャップドＢＬＡＳＴ２．１の使用によって促進される。多重整列を含めた最適整列は、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを通じて入手でき、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって記載されたＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて調製することができる。
【００８５】
参照配列と最適に整列したアミノ酸配列に関しては、アミノ酸残基は、該残基が整列において対となる参照配列中の位置で「に対応」する。該「位置」は、Ｎ−末端に対するその位置に基づいて参照配列中の各アミノ酸を順次に同定する数によって指定される。例えば、配列番号：３００において、１はＭであり、位置２はＩであり、位置３はＥである等々。テスト配列が配列番号：３００と最適に整列する場合、位置３におけるＥと整列するテスト配列における残基は、配列番号：３００の「位置３に対応」するといわれる。最適整列を決定する場合に考慮しなければならない欠失、挿入、切形、融合などのため、一般に、単純にＮ−末端からカウントすることによって決定されたテスト配列中のアミノ酸残基番号は必ずしも参照配列におけるその対応する位置の番号とは同一ではないであろう。例えば、整列したテスト配列に欠失がある場合、欠失の部位における参照配列中の位置に対応するアミノ酸はないであろう。整列した参照配列中に挿入がある場合、その挿入は、参照配列中のいずれのアミノ酸位置にも対応しないであろう。切形または融合の場合には、対応する配列中のいずれのアミノ酸にも対応しない参照もしくは整列配列いずれか中のアミノ酸ストレッチがあり得る。
用語「ＧＡＴポリペプチド」は、さらに、（ａ）配列番号：５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｅ）配列番号：６０２に対して少なくともとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｆ）配列番号：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；（ｇ）配列番号：７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列；（ｊ）配列番号：５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｍ）配列番号：６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むいずれかのポリペプチドをいう。
【００８６】
用語「ＧＡＴポリペプチド」は、さらに、配列番号：６７７のアミノ酸配列の残基１ないし９６に対して少なくとも８９％配列同一性を有するアミノ酸配列；配列番号：６９７のアミノ酸配列の残基１ないし９６に対して少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列；配列番号：５８４、６１２および７２１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の残基１ないし９６に対して少なくとも９６％配列同一性を有するアミノ酸配列；配列番号：５７８、６１３および６２１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の残基１ないし９６に対して少なくとも９７％配列同一性を有するアミノ酸配列；配列番号：５７７、５７９、５９０、６０２、６１６および７０７よりなる群から選択されるアミノ酸配列の残基１ないし９６に対して少なくとも９８％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むいずれかのポリペプチドをいう。
【００８７】
用語「ＧＡＴポリペプチド」は、さらに、配列番号：６７７のアミノ酸配列の残基５１ないし１４６に対して少なくとも８９％配列同一性を有するアミノ酸配列；配列番号：６９７のアミノ酸配列の残基５１ないし１４６に対して少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列；配列番号：５８４、６１２および７２１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の残基５１ないし１４６に対して少なくとも９６％配列同一性を有するアミノ酸配列；配列番号：５７８、６１３および６２１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の残基５１ないし１４６に対して少なくとも９７％配列同一性を有するアミノ酸配列；配列番号：５７７、５７９、５９０、６０２、６１６、および７０７よりなる群から選択されるアミノ酸配列の残基５１ないし１４６に対して少なくとも９８％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むいずれかのポリペプチドをいう。
【００８８】
用語「ＧＡＴポリペプチド」とは、さらに、（ａ）配列番号：９１９の残基２ないし１４６に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：９２９の残基２ないし１４６に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：８４７の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：８５１の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｅ）配列番号：８５３の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｆ）（例えば、配列番号：８３５または８５５のような）配列番号：８５５の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｇ）配列番号：８５７の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｈ）配列番号：８６１の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｉ）配列番号：８７１の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｊ）配列番号：８７５の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｋ）配列番号：８８１の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｌ）配列番号：８８５の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｍ）配列番号：８８７の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｎ）配列番号：８８９の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｏ）配列番号：８９３の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｐ）配列番号：８９７の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｑ）配列番号：８９９の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｒ）配列番号：９０９の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｓ）配列番号：９１１の残基２ないし１４６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｔ）配列番号：８３７の残基２ないし１４６に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｕ）配列番号：８４１の残基２ないし１４６に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号：８６５の残基２ないし１４６に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｗ）配列番号：８６９の残基２ないし１４６に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；および（ｘ）配列番号：８７９の残基２ないし１４６に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むいずれかのポリペプチドをいう。
【００８９】
用語「ＧＡＴポリペプチド」とは、さらに、配列番号：９２９の残基２ないし１４６に対して少なくとも９５％同一であって、配列番号：９２９の位置３３に対応するアミノ酸位置においてＧｌｙまたはＡｓｎ残基を含むアミノ酸配列を含むいずれかのポリペプチドをいう。
【００９０】
用語「ＧＡＴポリペプチド」とは、さらに、本明細書中に開示する例示的ＧＡＴポリペプチドに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むいずれかのポリペプチドをいう。このようにして、例えば、本発明のＧＡＴポリペプチドは、配列番号：９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１および９７２のいずれかに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００９１】
本明細書中で用いるように、整列されたアミノ酸配列の特定の対に関して用いる場合、用語「同一性」または「パーセント同一性」とは、整列において同一のマッチの数をカウントし、そのような同一マッチの数を、（ｉ）整列した配列の長さ、および（ｉｉ）９６のいずれか大きい方で割り、以下のデフォルトＣｌｕｓｔａｌＷパラメーター−ギャップオープンペナルティー：１０；ギャップ延長ペナルティー：０．１０；蛋白質重量マトリックス：Ｇｏｎｎｅｔシリーズ；ＤＮＡ重量マトリックス：ＩＵＢ；Ｔｏｇｇｌｅ  Ｓｌｏｗ／Ｆａｓｔ対様式整列＝ＳＬＯＷまたはＦＵＬＬ整列を用いて遅延／正確対様式整列を達成し、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫから入手可能なバージョンＷ１．８）によって得ることができるパーセントアミノ酸配列同一性をいう。
【００９２】
もう１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号：５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して９７％同一であるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｅ）配列番号：６０２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｆ）配列番号：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；（ｇ）配列番号：７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列；（ｊ）配列番号：５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｍ）配列番号：６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも２０、あるいは少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４１、少なくとも１４２、少なくとも１４３、少なくとも１４４または少なくとも１４５の連続アミノ酸を含む単離されたまたは組換えポリペプチドを提供する。
【００９３】
もう１つの態様において、本発明は、配列番号：５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、および８２５よりなる群から選択されるアミノ酸配列の残基２ないし１４６を含むポリペプチドを提供する。本発明のいくつかの具体例において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の位置２に対応するアミノ酸のＮ−末端側のＭｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、またはＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａを含む。
【００９４】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、配列番号：３００、４４５および４５７よりなる群から選択される参照アミノ酸配列と最適に整列させて、ＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いる少なくとも４６０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ延長ペナルティーを生じさせることができ、ここに、以下の位置の少なくとも１つは以下の制限に適合し：（ｉ）位置１８および３８において、Ｚ５アミノ酸残基があり；（ｉｉ）位置６２において、Ｚ１アミノ酸残基があり；（ｉｉｉ）位置１２４において、Ｚ６アミノ酸残基があり；および（ｉｖ）位置１４４において、Ｚ２アミノ酸残基があり；ここに：Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり、さらに、ここに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置２、４、１５、１９、２６、２８、３１、４５、５１、５４、８６、９０、９１、９７、１０３、１０５、１０６、１１４、１２３、１２９、１３９および／または１４５において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置３、５、８、１０、１１、１４、１７、２４、２７、３２、３７、４７、４８、４９、５２、５７、５８、６１、６３、６８、６９、７９、８０、８２、８３、８９、９２、１００、１０１、１０４、１１９、１２０、１２５、１２６、１２８、１３１および／または１４３において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｖよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群からアミノ酸である。アミノ酸またはアミノ酸残基を特定するのに用いる場合、単一文字表示Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹは当該分野で用いられる、かつ本明細書中の表１に掲げたその標準的意味を有する。
【００９５】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、配列番号：３００、４４５および４５７よりなる群から選択される参照アミノ酸配列と最適に整列して、ＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いる少なくとも４６０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ延長ペナルティーを生じさせることができ、ここに、以下の位置の少なくとも１つは以下の制限に適合し：（ｉ）位置１８および３８において、Ｚ５アミノ酸残基があり；（ｉｉ）位置６２において、Ｚ１アミノ酸残基があり；（ｉｉｉ）位置１２４において、Ｚ６アミノ酸残基があり；および（ｉｖ）位置１４４において、Ｚ２アミノ酸残基があり、ここに：Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２はＦ、Ｗ、およびＹよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；さらに、ここに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置２、４、１５、１９、２６、２８、５１、５４、８６、９０、９１、９７、１０３、１０５、１０６、１１４、１２９、１３９および／または１４５において、アミノ酸残基がＺ１はあり；（ｂ）位置３１および／または４５において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｃ）位置８において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｄ）位置８９において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ６であり；（ｅ）位置８２、９２、１０１および／または１２０において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｆ）位置３、１１、２７および／または７９において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｇ）位置１８において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ５であり；（ｈ）位置１２３において、アミノ酸残基はＺ１またはＺ２であり；（ｉ）位置１２、３３、３５、３９、５３、５９、１１２、１３２、１３５、１４０および／または１４６において、アミノ酸残基はＺ１またはＺ３であり；（ｊ）位置３０において、アミノ酸残基はＺ１であり；（ｋ）位置６において、アミノ酸残基はＺ６であり；（ｌ）位置８１において、アミノ酸残基はＺ２またはＺ４であり；（ｍ）位置１１３において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｎ）位置１３８において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｏ）位置１４２において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｐ）位置５７および／または１２６において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ｑ）位置５、１７および６１において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｒ）位置２４において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｓ）位置１０４において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｔ）位置５２および／または６９において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｕ）位置１４および／または１１９において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｖ）位置１０、３２、６３および／または８３において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｗ）位置４８および／または８０において、アミノ酸残基はＺ６であり；（ｘ）位置４０において、アミノ酸残基はＺ１またはＺ２であり；（ｙ）位置９６において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ５であり；（ｚ）位置６５において、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６であり；（ａａ）位置８４および／または１１５において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ａｂ）位置９３において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ａｃ）位置１３０において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ａｄ）位置５８において、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６であり；（ａｅ）位置４７において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ６であり；（ａｆ）位置４９および／または１００において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ａｇ）位置６８において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ５であり；（ａｈ）位置１４３において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ａｉ）位置１３１において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ａｊ）位置１２５および／または１２８において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ａｋ）位置６７において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ａｌ）位置６０において、アミノ酸残基はＺ５であり；および（ａｍ）位置３７において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ６であり；ここに、Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ３はＮ、Ｑ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ４はＲ、ＨおよびＫよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【００９６】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、（ａ）ないし（ａｍ）において特定される位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を含み、ここに、少なくとも９０％は（ａ）ないし（ａｍ）で特定されるアミノ酸残基制限に適合する。
【００９７】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、加えて、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を含み、ここに、少なくとも９０％は以下の制限に適合し、（ａ）位置１、７、９、１３、２０、３６、４２、４６、５０、５６、６４、７０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、４１、４３、４４、５５、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【００９８】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、加えて、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を含み、ここに、少なくとも９０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置１、７、９、１３、２０、４２、４６、５０、５６、６４、７０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、３６、４１、４３、４４、５５、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【００９９】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、加えて、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を含み、ここに、少なくとも９０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置１、７、９、２０、４２、５０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１１０、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＺ１であり；（ｂ）位置１３、４６、５６、７０、１０７、１１７および／または１１８において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｃ）位置２３、５５、７１、７７、８８および／または１０９において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｄ）位置１６、２１、４１、７３、８５、９９および／または１１１において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｅ）位置３４および／または９５において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｆ）位置２２、２５、２９、４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１０８、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＺ６であり；ここに、Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ３はＮ、Ｑ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ４はＲ、ＨおよびＫよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＺ６はＣ、Ｇ、およびＰよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１００】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、Ｚ１およびＺ３よりなる群から選択される位置３６におけるアミノ酸残基を含む。本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、Ｚ１およびＺ２よりなる群から選択される位置６４におけるアミノ酸残基を含む。
【０１０１】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を含み、ここに、少なくとも８０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置２において、アミノ酸残基はＩまたはＬであり；（ｂ）位置３において、アミノ酸残基はＥであり；（ｃ）位置４において、アミノ酸残基はＶまたはＩであり；（ｄ）位置５において、アミノ酸残基はＫであり；（ｅ）位置６において、アミノ酸残基はＰであり；（ｆ）位置８において、アミノ酸残基はＮであり；（ｇ）位置１０において、アミノ酸残基はＥであり；（ｈ）位置１１において、アミノ酸残基はＤまたはＥであり；（ｉ）位置１２において、アミノ酸残基はＴであり；（ｊ）位置１４において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｋ）位置１５において、アミノ酸残基はＬであり；（ｌ）位置１７において、アミノ酸残基はＨであり；（ｍ）位置１８において、アミノ酸残基はＲ、ＥまたはＫであり；（ｎ）位置１９において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ｏ）位置２４において、アミノ酸残基はＱであり；（ｐ）位置２６において、アミノ酸残基はＭ、Ｌ、ＶまたはＩであり；（ｑ）位置２７において、アミノ酸残基はＥであり；（ｒ）位置２８において、アミノ酸残基はＡまたはＶであり；（ｓ）位置３０において、アミノ酸残基はＭであり；（ｔ）位置３１において、アミノ酸残基はＹまたはＦであり；（ｕ）位置３２において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｖ）位置３３において、アミノ酸残基はＴまたはＳであり；（ｗ）位置３５において、アミノ酸残基はＬであり；（ｘ）位置３７において、アミノ酸残基はＲ、Ｇ、ＥまたはＱであり；（ｙ）位置３９において、アミノ酸残基はＡまたはＳであり；（ｚ）位置４０において、アミノ酸残基はＦまたはＬであり；（ａａ）位置４５において、アミノ酸残基はＹまたはＦであり；（ａｂ）位置４７において、アミノ酸残基はＲまたはＧであり；（ａｃ）位置４８において、アミノ酸残基はＧであり；（ａｄ）位置４９において、アミノ酸残基はＫ、ＲまたはＱであり；（ａｅ）位置５１において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ａｆ）位置５２において、アミノ酸残基はＳであり；（ａｇ）位置５３において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ａｈ）位置５４において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｉ）位置５７において、アミノ酸残基はＨまたはＮであり；（ａｊ）位置５８において、アミノ酸残基はＱ、Ｋ、ＲまたはＰであり；（ａｋ）位置５９において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｌ）位置６０において、アミノ酸残基はＥであり；（ａｍ）位置６１において、アミノ酸残基はＨまたはＲであり；（ａｎ）位置６３において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ａｏ）位置６５において、アミノ酸残基はＥ、ＰまたはＱであり；（ａｐ）位置６７において、アミノ酸残基はＱまたはＲであり；（ａｑ）位置６８において、アミノ酸残基はＫまたはＥであり；（ａｒ）位置６９において、アミノ酸残基はＱであり；（ａｓ）位置７９において、アミノ酸残基はＥであり；（ａｔ）位置８０において、アミノ酸残基はＧであり；（ａｕ）位置８１において、アミノ酸残基はＹ、ＨまたはＦであり；（ａｖ）位置８２において、アミノ酸残基はＲであり；（ａｗ）位置８３において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ａｘ）位置８４において、アミノ酸残基はＱであり；（ａｙ）位置８６において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｚ）位置８９において、アミノ酸残基はＧ、ＴまたはＳであり；（ｂａ）位置９０において、アミノ酸残基はＬであり；（ｂｂ）位置９１において、アミノ酸残基はＬ、ＩまたはＶであり；（ｂｃ）位置９２において、アミノ酸残基はＲまたはＫであり；（ｂｄ）位置９３において、アミノ酸残基はＨであり；（ｂｅ）位置９６において、アミノ酸残基はＥまたはＱであり；（ｂｆ）位置９７において、アミノ酸残基はＩであり；（ｂｇ）位置１００において、アミノ酸残基はＫまたはＮであり；（ｂｈ）位置１０１において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｉ）位置１０３において、アミノ酸残基はＡまたはＶであり；（ｂｊ）位置１０４において、アミノ酸残基はＤであり；（ｂｋ）位置１０５において、アミノ酸残基はＭ、ＬまたはＩであり；（ｂｌ）位置１０６において、アミノ酸残基はＬであり；（ｂｍ）位置１１２において、アミノ酸残基はＴまたはＡであり；（ｂｎ）位置１１３において、アミノ酸残基はＳまたはＴであり；（ｂｏ）位置１１４において、アミノ酸残基はＡであり；（ｂｐ）位置１１５において、アミノ酸残基はＳであり；（ｂｑ）位置１１９において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｒ）位置１２０において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｓ）位置１２３において、アミノ酸残基はＦまたはＬであり；（ｂｔ）位置１２５において、アミノ酸残基はＥであり；（ｂｕ）位置１２６において、アミノ酸残基はＱまたはＨであり；（ｂｖ）位置１２８において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｂｗ）位置１２９において、アミノ酸残基はＶまたはＩであり；（ｂｘ）位置１３０において、アミノ酸残基はＦであり；（ｂｙ）位置１３１において、アミノ酸残基はＤまたはＥであり；（ｂｘ）位置１３２において、アミノ酸残基はＴであり；（ｃａ）位置１３５において、アミノ酸残基はＶであり；（ｃｂ）位置１３８において、アミノ酸残基はＨであり；（ｃｃ）位置１３９において、アミノ酸残基はＩであり；（ｃｄ）位置１４０において、アミノ酸残基はＬまたはＭであり；（ｃｅ）位置１４２において、アミノ酸残基はＹであり；（ｃｆ）位置１４３において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｃｇ）位置１４５において、アミノ酸残基はＬまたはＩであり；および（ｃｈ）位置１４６において、アミノ酸残基はＴである。
【０１０２】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、前記（ａ）ないし（ｃｈ）において特定される位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を含み、ここに、少なくとも９０％は（ａ）ないし（ｃｈ）で特定されるアミノ酸残基制限に適合される。
【０１０３】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、配列番号：３００、４４５および４５７よりなる群から選択される参照アミノ酸配列と最適に整列させて、ＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて少なくとも４６０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ延長ペナルティーを生じさせることができ、ここに、以下の位置の少なくとも１つは以下の制限に適合し：（ｉ）位置１８および３８において、Ｚ５アミノ酸残基があり；（ｉｉ）位置６２において、Ｚ１アミノ酸残基があり；（ｉｉｉ）位置１２４において、Ｚ６アミノ酸残基があり；および（ｉｖ）位置１４４において、Ｚ２アミノ酸残基があり；ここに：Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；さらに、ここに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置９、７６、９４および１１０において、アミノ酸残基はＡであり；（ｂ）位置２９および１０８において、アミノ酸残基はＣであり；（ｃ）位置３４において、アミノ酸残基はＤであり；（ｄ）位置９５において、アミノ酸残基はＥであり；（ｅ）位置５６において、アミノ酸残基はＦであり；（ｆ）位置４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１１６、１２２、１２７および１３６において、アミノ酸残基はＧであり；（ｇ）位置４１において、アミノ酸残基はＨであり；（ｈ）位置７において、アミノ酸残基はＩであり；（ｉ）位置８５において、アミノ酸残基はＫであり；（ｊ）位置２０、４２、５０、７８および１２１において、アミノ酸残基はＬであり；（ｋ）位置１および１４１において、アミノ酸残基はＭであり；（ｌ）位置２３および１０９において、アミノ酸残基はＮであり；（ｍ）位置２２、２５、１３３、１３４および１３７において、アミノ酸残基はＰであり；（ｎ）位置７１において、アミノ酸残基はＱであり；（ｏ）位置１６、２１、７３、９９および１１１において、アミノ酸残基はＲであり；（ｐ）位置５５において、アミノ酸残基はＳであり；（ｑ）位置７７において、アミノ酸残基はＴであり；（ｒ）位置１０７において、アミノ酸残基はＷであり；および（ｓ）位置１３、４６、７０および１１８において、アミノ酸残基はＹである。
【０１０４】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、アミノ酸残基が以下の制限のうちの少なくとも１つを満たすアミノ酸配列を含み：（ａ）位置３６において、アミノ酸残基はＭ、ＬまたはＴであり；（ｂ）位置７２において、アミノ酸残基はＬまたはＩであり；（ｃ）位置７５において、アミノ酸残基はＭまたはＶであり；（ｄ）位置６４において、アミノ酸残基はＬ、ＩまたはＦであり；（ｅ）位置８８において、アミノ酸残基はＴまたはＳであり；および（ｆ）位置１１７において、アミノ酸残基はＹまたはＦである。
【０１０５】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、アミノ酸残基が以下のさらなる制限のうちの少なくとも１つを満足するアミノ酸配列を含み：（ａ）位置１４において、アミノ酸残基はＤであり；（ｂ）位置１８において、アミノ酸残基はＥであり；（ｃ）位置２６において、アミノ酸残基はＭまたはＶであり；（ｅ）位置３０において、アミノ酸残基はＩであり；（ｆ）位置３２において、アミノ酸残基はＤであり；（ｇ）位置３６において、アミノ酸残基はＭまたはＴであり；（ｉ）位置３７において、アミノ酸残基はＣであり；（ｊ）位置３８において、アミノ酸残基はＤであり；（ｊ）位置５３において、アミノ酸残基はＶであり；（Ｋ）位置５８において、アミノ酸残基はＲであり；（ｌ）位置６１において、アミノ酸残基はＲであり；（ｍ）位置６２において、アミノ酸残基はＬであり；（ｎ）位置６４において、アミノ酸残基はＩまたはＦであり；（ｏ）位置６５において、アミノ酸残基はＰであり；（ｐ）位置７２において、アミノ酸残基はＩであり；（ｑ）位置７５において、アミノ酸残基はＶであり；（ｒ）位置８８において、アミノ酸残基はＴであり；（ｓ）位置８９において、アミノ酸残基はＧであり；（ｔ）位置９１において、アミノ酸残基はＬであり；（ｕ）位置９８において、アミノ酸残基はＩであり；（ｖ）位置１０５において、アミノ酸残基はＩであり；（ｗ）位置１１２において、アミノ酸残基はＡであり；（ｘ）位置１２４において、アミノ酸残基はＧまたはＣであり；（ｙ）位置１２８において、アミノ酸残基はＤであり；（ｚ）位置１４０において、アミノ酸残基はＭであり；（ａａ）位置１４３において、アミノ酸残基はＲであり；および（ａｂ）位置１４４において、アミノ酸残基はＷである。
【０１０６】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、前記した（ａ）ないし（ａｂ）において特定される位置に対応するアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が（ａ）ないし（ａｂ）で特定されるアミノ酸残基制限に適合するアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、その少なくとも１つが以下のさらなる制限を満足するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し：（ａ）位置４１において、アミノ酸残基はＨであり；（ｂ）位置１３８において、アミノ酸残基はＨであり；（ｃ）位置３４において、アミノ酸残基はＮであり；および（ｄ）位置５５において、アミノ酸残基はＳである。
【０１０８】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、（ａ）配列番号：５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｅ）配列番号：６０２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｆ）配列番号：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；（ｇ）配列番号：７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくともとも８９％同一であるアミノ酸配列；（ｊ）配列番号：５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｍ）配列番号：６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは（ａ）配列番号５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｅ）配列番号：６０２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｆ）配列番号：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；（ｇ）配列番号７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列；（ｊ）配列番号５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｍ）配列番号６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここに、以下の位置の少なくとも１つは、さらに、以下の制限に適合し：（ｉ）位置１８および３８において、Ｚ５アミノ酸残基があり、（ｉｉ）位置６２において、Ｚ１アミノ酸残基があり、（ｉｉｉ）位置１２４において、Ｚ６アミノ酸残基があり；および（ｉｖ）位置１４４において、Ｚ２アミノ酸残基があり、ここに：Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２は、Ｆ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり、およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【０１１０】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、（ａ）配列番号５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｅ）配列番号：６０２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｆ）配列番号：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；（ｇ）配列番号７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列；（ｊ）配列番号５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｍ）配列番号６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９８％は以下の更なる制限に適合し：（ａ）位置２、４、１５、１９、２６、２８、３１、４５、５１、５４、８６、９０、９１、９７、１０３、１０５、１０６、１１４、１２３、１２９、１３９および／または１４５において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置３、５、８、１０、１１、１４、１７、２４、２７、３２、３７、４７、４８、４９、５２、５７、５８、６１、６３、６８、６９、７９、８０、８２、８３、８９、９２、１００、１０１、１０４、１１９、１２０、１２５、１２６、１２８、１３１および／または１４３において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、およびＴよりなる群から選択されるアミノ酸配列である。
【０１１１】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、（ａ）配列番号５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｅ）配列番号：６０２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｆ）配列番号：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；（ｇ）配列番号７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列；（ｊ）配列番号５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｍ）配列番号６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８９％は以下のさらなる制限に適合し：（ａ）位置２、４、１５、１９、２６、２８、５１、５４、８６、９０、９１、９７、１０３、１０５、１０６、１１４、１２９、１３９および／または１４５において、アミノ酸残基はＺ１でああり；（ｂ）位置３１および／または４５において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｃ）位置８において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｄ）位置８９において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ６であり；（ｅ）位置８２、９２、１０１および／または１２０において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｆ）位置３、１１、２７および／または７９において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｇ）位置１８において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ５であり；（ｈ）位置１２３において、アミノ酸基はＸ１またはＺ２であり；（ｉ）位置１２、３３、３５、３９、５３、５９、１１２、１３２、１３５、１４０および／または１４６において、アミノ酸残基はＺ１またはＺ３であり；（ｊ）位置３０において、アミノ酸残基はＺ１であり；（ｋ）位置６において、アミノ酸残基はＺ６であり、（ｌ）位置８１において、アミノ酸残基はＺ２またはＺ４であり；（ｍ）位置１１３において、アミノ酸残基はＺ３であり、（ｎ）位置１３８において、アミノ酸残基はＺ４であり、（ｏ）位置１４２において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｐ）位置５７および／または１２６において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ｑ）位置５、１７および６１において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｒ）位置２４において、アミノ酸基はＺ３であり；（ｓ）位置１０４において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｔ）位置５２および／または６９において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｕ）位置１４および／または１１９において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｖ）位置１０、３２、６３および／または８３において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｗ）位置４８および／または８０において、アミノ酸残基はＺ６であり；（ｘ）位置４０において、アミノ酸基はＺ１またはＺ２であり；（ｙ）位置９６において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ５であり；（ｚ）位置６５において、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６であり；（ａａ）位置８４および／または１１５において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ａｂ）位置９３において、アミノ酸残基はＺ４であり、（ａｃ）位置１３０において、アミノ酸残基はＺ２であり、（ａｂ）位置５８において、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６であり；（ａｅ）位置４７において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ６であり；（ａｆ）位置４９および／または１００において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ａｇ）位置６８において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ５であり；（ａｈ）位置１４３において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ａｉ）位置１３１において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ａｊ）位置１２５および／または１２８において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ａｋ）位置６７において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ａｌ）位置６０において、アミノ酸残基は、Ｚ５であり；および（ａｍ）位置３７において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ６であり；ここに、Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ３はＮ、Ｑ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ４はＲ、Ｈ、およびＫよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１１２】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、（ａ）ないし（ａｍ）において特定される位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を含み、ここに、少なくとも９０％は（ａ）ないし（ａｍ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合する。
【０１１３】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を含み、ここに、少なくとも９０％は以下のさらなる制限に適合し；（ａ）位置１、７、９、１３、２０、３６、４２、４６、５０、５６、６４、７０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、４１、４３、４４、５５、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＢ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１１４】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を含み、ここに、少なくとも９０％は以下のさらなる制限に適合し；（ａ）位置１、７、９、１３、２０、４２、４６、５０、５６、６４、７０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、３６、４１、４３、４４、５５、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸である；およびＢ２は、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１１５】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を含み、ここに、少なくとも９０％は以下のさらなる制限に適合し；（ａ）位置１、７、９、２０、４２、５０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１１０、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＺ１であり；および（ｂ）位置１３、４６、５６、７０、１０７、１１７および／または１１８において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｃ）位置２３、５５、７１、７７、８８および／または１０９において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｄ）位置１６、２１、４１、７３、８５、９９、および／または１１１において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｅ）位置３４および／または９５において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｆ）位置２２、２５、２９、４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１０８、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＺ６であり；ここに、Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸である；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ３はＮ、Ｑ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ４はＲ、ＨおよびＫよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１１６】
本発明のいつくかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、位置３６におけるアミノ酸残基がＺ１およびＺ３よりなる群から選択されるアミノ酸を含む。本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、位置６４におけるアミノ酸残基がＺ１およびＺ２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１７】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、以下の位置に対応するアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が以下のさらなる制限に適合するアミノ酸配列を含み：（ａ）位置２において、アミノ酸残基はＩまたはＬであり；（ｂ）位置３において、アミノ酸残基はＥであり；（ｃ）位置４において、アミノ酸残基はＶまたはＩであり；（ｄ）位置において、アミノ酸残基はＫであり；（ｅ）位置６において、アミノ酸残基はＰであり；（ｂ）位置８において、アミノ酸残基はＮであり；（ｇ）位置１０において、アミノ酸残基はＥであり；（ｈ）位置１１において、アミノ酸残基はＤまたはＥであり；（ｉ）位置１２において、アミノ酸残基はＴであり；（ｊ）位置１４において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｋ）位置１５において、アミノ酸残基はＬであり；（ｉ）位置１７において、アミノ酸残基はＨであり；（ｍ）位置１８において、アミノ酸残基はＲ、ＥまたはＫであり；（ｎ）位置１９において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ｏ）位置２４において、アミノ酸残基はＱであり；（ｐ）位置２６において、アミノ酸残基はＭ、Ｌ、ＶまたはＩであり；（ｑ）位置２７において、アミノ酸残基はＥであり；（ｒ）位置２８において、アミノ酸残基はＡまたはＶであり；（ｓ）位置３０において、アミノ酸残基はＭであり；（ｔ）位置３１において、アミノ酸残基はＹまたはＦであり；（ｕ）位置３２において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｖ）位置３３において、アミノ酸残基はＴまたはＳであり；（ｗ）位置３５において、アミノ酸残基はＬであり；（ｘ）位置３７において、アミノ酸残基はＲ、Ｇ、ＥまたはＱであり；（ｙ）位置３９において、アミノ酸残基はＡまたはＳであり；（ｚ）位置４０において、アミノ酸残基はＦまたはＬであり；（ａａ）位置４５において、アミノ酸残基はＹまたはＦであり；（ａｂ）位置４７において、アミノ酸残基はＲまたはＧであり；（ａｃ）位置４８において、アミノ酸残基はＧであり；（ａｄ）位置４９において、アミノ酸残基はＫ、ＲまたはＱであり；（ａｅ）位置５１において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ａｆ）位置５２において、アミノ酸残基はＳであり；（ａｇ）位置５３において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ａｈ）位置５４において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｉ）位置５７において、アミノ酸残基はＨまたはＮであり；（ａｊ）位置５８において、アミノ酸残基はＱ、Ｋ、ＲまたはＰであり；（ａｋ）位置５９において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｌ）位置６０において、アミノ酸残基はＥであり；（ａｍ）位置６１において、アミノ酸残基はＨまたはＲであり；（ａｎ）位置６３において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ａｏ）位置６５において、アミノ酸残基はＥ、ＰまたはＱであり；（ａｐ）位置６７において、アミノ酸残基はＱまたはＲであり；（ａｑ）位置６８において、アミノ酸残基はＫまたはＥであり；（ａｒ）位置６９において、アミノ酸残基はＱであり；（ａｓ）位置７９において、アミノ酸残基はＥであり；（ａｔ）位置８０において、アミノ酸残基はＧであり；（ａｕ）位置８１において、アミノ酸残基はＹ、ＨまたはＦであり；（ａｖ）位置８２において、アミノ酸残基はＲであり；（ａｗ）位置８３において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ａｘ）位置８４において、アミノ酸残基はＱであり；（ａｙ）位置８６において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｚ）位置８９において、アミノ酸残基はＧ、ＴまたはＳであり；（ｂａ）位置９０において、アミノ酸残基はＬであり；（ｂｂ）位置９１において、アミノ酸残基はＬ、ＩまたはＶであり；（ｂｃ）位置９２において、アミノ酸残基はＲまたはＫであり；（ｂｄ）位置９３において、アミノ酸残基はＨであり；（ｂｅ）位置９６において、アミノ酸残基はＥまたはＱであり；（ｂｆ）位置９７において、アミノ酸残基はＩであり；（ｂｇ）位置１００において、アミノ酸残基はＫまたはＮであり；（ｂｈ）位置１０１において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｉ）位置１０３において、アミノ酸残基はＡまたはＶであり；（ｂｊ）位置１０４において、アミノ酸残基はＤであり；（ｂｋ）位置１０５において、アミノ酸残基はＭ、ＬまたはＩであり；（ｂｌ）位置１０６において、アミノ酸残基はＬであり；（ｂｍ）位置１１２において、アミノ酸残基はＴまたはＡであり；（ｂｎ）位置１１３において、アミノ酸残基はＳまたはＴであり；（ｂｏ）位置１１４において、アミノ酸残基はＡであり；（ｂｐ）位置１１５において、アミノ酸残基はＳであり；（ｂｑ）位置１１９において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｒ）位置１２０において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｓ）位置１２３において、アミノ酸残基はＦまたはＬであり；（ｂｔ）位置１２５において、アミノ酸残基はＥであり；（ｂｕ）位置１２５において、アミノ酸残基はＱまたはＨであり；（ｂｖ）位置１２８において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｂｗ）位置１２９において、アミノ酸残基はＶまたはＩであり；（ｂｘ）位置１３０において、アミノ酸残基はＦであり；（ｂｙ）位置１３１において、アミノ酸残基はＤまたはＥであり；（ｂｘ）位置１３２において、アミノ酸残基はＴであり；（ｃａ）位置１３５において、アミノ酸残基はＶであり；（ｃｂ）位置１３８において、アミノ酸残基はＨであり；（ｃｃ）位置１３９において、アミノ酸残基はＩであり；（ｃｄ）位置１４０において、アミノ酸残基はＬまたはＭであり；（ｃｅ）位置１４２において、アミノ酸残基はＹであり；（ｃｆ）位置１４３において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｃｇ）位置１４５において、アミノ酸残基はＬまたはＩであり；および（ｃｈ）位置１４６において、アミノ酸残基はＴである。
【０１１８】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、前記（ａ）ないし（ｃｈ）において特定された位置に対応する残基のうち、少なくとも９０％が（ａ）ないし（ｃｈ）において特定されたアミノ酸残基制限に適合するアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、（ａ）配列番号：５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｅ）配列番号：６０２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｆ）配列番号：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；（ｇ）配列番号：７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列；（ｊ）配列番号：５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｍ）配列番号：６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミン酸配列を含み、さらに、ここに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％は以下の制限に適合し；（ａ）位置９、７６、９４および１１０において、アミノ酸残基はＡであり；（ｂ）位置２９および１０８において、アミノ酸残基はＣであり；（ｃ）位置３４において、アミノ酸残基はＤであり；（ｄ）位置９５において、アミノ酸残基はＥであり；（ｅ）位置５６において、アミノ酸残基はＦであり；（ｆ）位置４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１１６、１２２、１２７および／または１３６において、アミノ酸残基はＧであり；（ｇ）位置４１において、アミノ酸残基はＨであり；（ｈ）位置７において、アミノ酸基はＩであり；（ｉ）位置８５において、アミノ酸残基はＫであり；（ｊ）位置２０、４２、５０、７８および１２１において、アミノ酸残基はＬであり；（ｋ）位置１および１４１において、アミノ酸残基はＭであり、（ｌ）位置２３および１０９において、アミノ酸残基はＮであり；（ｍ）位置２２，２５、１３３、１３４および１３７において、アミノ酸残基はＰであり、（ｎ）位置７１において、アミノ酸残基はＱであり（ｏ）位置１６、２１、７３、９９および１１１において、アミノ酸残基はＲであり；（ｐ）位置５５において、アミノ酸残基はＳであり；（ｑ）位置７７において、アミノ酸残基はＴであり；（ｒ）位置１０７において、アミノ酸基はＷであり；および（ｓ）位置１３、４６、７０および１１８において、アミノ酸残基はＹである。
【０１２０】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、以下の基準の少なく１つを満足するアミノ酸配列を含む：（ａ）位置１４であり、アミノ酸残基はＤであり；（ｂ）位置１８において、アミノ酸残基はＥであり；（ｃ）位置２６において、アミノ酸残基はＭまたはＶであり；（ｅ）位置３０において、アミノ酸残基はＩであり；（ｆ）位置３２において、アミノ酸残基はＤであり；（ｇ）位置３６において、アミノ酸残基はＭまたはＴであり；（ｉ）位置３７において、アミノ酸残基はＣであり；（ｊ）位置３８において、アミノ酸残基はＤであり；（ｊ）位置５３において、アミノ酸残基はＶであり；（ｋ）位置５８において、アミノ酸残基はＲであり、（ｌ）位置６１において、アミノ酸残基はＲであり；（ｍ）位置６２において、アミノ酸残基はＬであり、（ｎ）位置６４において、アミノ酸残基はＩまたはＦであり（ｏ）位置６５において、アミノ酸残基はＰであり；（ｐ）位置７２において、アミノ酸残基はＩであり；（ｑ）位置７５において、アミノ酸残基はＶであり；（ｒ）位置８８において、アミノ酸基はＴであり；（ｓ）位置８９において、アミノ酸残基はＧであり；（ｔ）位置９１において、アミノ酸残基はＬであり；（ｕ）位置９８において、アミノ酸残基はＩであり（ｖ）位置１０５において、アミノ酸残基はＩであり；（ｗ）位置１１２において、アミノ酸残基はＡであり；（ｘ）位置１２４において、アミノ酸残基はＧまたはＣであり；（ｙ）位置１２８において、アミノ酸基はＤであり；（ｚ）位置１４０において、アミノ酸残基はＭであり；（ａａ）位置１４３において、アミノ酸残基はＲであり；および（ａｂ）位置１４４において、アミノ酸残基はＷである。
【０１２１】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、前記した（ａ）ないし（ａｂ）において特定された位置に対応するアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％が（ａ）ないし（ａｂ）において特定されたアミノ酸残基制限に適合するアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、さらに、以下の条件も満たすアミノ酸配列を含み：（ａ）位置４１において、アミノ酸残基はＨであり（ｂ）位置１３８において、アミノ酸残基はＨであり；（ｃ）位置３４において、アミノ酸残基はＮであり；および（ｄ）位置５５において、アミノ酸残基はＳである。
【０１２３】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、配列番号：３００、４４５および４５７よりなる群から選択される参照アミノ酸配列と最適に整列させて、ＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて少なくとも４６０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ延長ペナルティーを生じさせる場合、以下の位置の１つ以上が以下の制限を適合するようなアミノ酸配列を有し：（ｉ）位置１８および３８において、Ｚ５アミノ酸残基があり；（ｉｉ）位置６２において、Ｚ１アミノ酸残基があり；（ｉｉｉ）位置１２４において、Ｚ６アミノ酸残基があり；および（ｉｖ）位置１４４において、Ｚ２アミノ酸残基があり、ここに：Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸残基である。前記したＧＡＴポリペプチドのあるものにおいては、位置２８に対応するポリペプチドにおけるアミノ酸残基はＶ、ＩまたはＡである。位置２８におけるバリンまたはイソロイシンは、一般には、低下したＫＭと相関し、他方、その位置におけるアラニンは、一般には、増加したｋｃａｔと相関する。位置８９におけるスレオニンおよび位置５８におけるアルギニンは、一般には、低下したＫＭと相関する。他の好ましいＧＡＴポリペプチドは、Ｉ２７（すなわち、位置２７におけるＩ）、Ｍ３０、Ｄ３４、Ｓ３５、Ｒ３７、Ｓ３９、Ｈ４１、Ｇ４８、Ｋ４９、Ｎ５７、Ｑ５８、Ｐ６２、Ｔ６２、Ｑ６５、Ｑ６７、Ｋ６８、Ｖ７５、Ｅ８３、Ｓ８９、Ａ９６、Ｅ９６、Ｒ１０１、Ｔ１１２、Ａ１１４、Ｋ１１９、Ｋ１２０、Ｅ１２８、Ｖ１２９、Ｄ１３１、Ｔ１３１、Ｖ１３２、Ｖ１３４、Ｖ１３５、Ｈ１３８、Ｒ１４４、Ｉ１４５またはＴ１４６、またはそのいずれかの組合せを有することによって特徴付けられる。
【０１２４】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは配列番号：５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３および８２５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
もう１つの態様において、本発明は、（ａ）（例えば、配列番号：９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、８３３、８３５、８３９、８４３、８４５、８５９、８６３、８７３、８７７、８９１、８９５、９０１、９０５、９０７、９１３、９１５または９５０のような）配列番号：９１９に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｂ）（例えば、配列番号：９２９、９３１、８３５、８４３、８４９または８６７のような）配列番号：９２９に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）（例えば、配列番号８４５または８４７のような）配列番号：８４７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：８５１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｅ）配列番号：８５３に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｆ）（例えば、配列番号：８３５または８５５のような）配列番号：８５５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｇ）配列番号：８５７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｈ）（例えば、配列番号：８３９、８６１または８８３のような）配列番号：８６１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｉ）配列番号：８７１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｊ）配列番号：８７５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｋ）配列番号：８８１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｌ）（例えば、配列番号：８４５または８８５のような）配列番号：８８５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｍ）配列番号：８８７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｎ）（例えば、配列番号：８６３、８８９、８９１または９０３のような）配列番号：８８９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｏ）配列番号：８９３に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｐ）配列番号：８９７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｑ）配列番号：８９９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｒ）（例えば、配列番号：８８３または９０９のような）配列番号：９０９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｓ）配列番号：９１１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｔ）配列番号：８３７に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｕ）配列番号：８４１に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号：８６５に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｗ）配列番号：８６９に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；および（ｘ）配列番号：８７９に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも２０、あるいは少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４１、少なくとも１４２、少なくとも１４３、少なくとも１４４または少なくとも１４５連続アミノ酸を含む単離されたまたは組換えポリペプチドを提供する。
【０１２６】
もう１つの態様において、本発明は、配列番号：９２９に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の少なくとも２０、あるいは少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４１、少なくとも１４２、少なくとも１４３、少なくとも１４４または少なくとも１４５連続アミノ酸を含み、かつ（例えば、配列番号：８３７、８４９、８９３、８９７、９０５、９２１、９２７、９２９または９３１のような）配列番号：９２
９の位置３３に対応するアミノ酸位置においてＧｌｙまたはＡｓｍ残基を含む単離されたまたは組換えポリペプチドを提供する。
【０１２７】
もう１つの態様において、本発明は、配列番号：８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、６７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１および９７２よりなる群から選択されるアミノ酸配列の残基２ないし１４６を含むポリペプチドを提供する。本発明のいくつかの具体例において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の位置２に対応するアミノ酸のＮ−末端側のＭｅｔ、Ｍｅｔ−ＡｌａまたはＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａを含む。
【０１２８】
本発明のいくつかの好ましいＧＡＴポリペプチドは、配列番号：８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、６７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９４６、９４８、および９５０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
本発明は、さらに、これまでのアミノ酸残基位置制限の組合せによって特徴付けられる好ましいＧＡＴポリペプチドを提供する。
【０１３０】
加えて、本発明は、前記した好ましいＧＡＴポリペプチドをコードするＧＡＴポリヌクレオチドおよびその相補的ポリヌクレオチド配列を提供する。
【０１３１】
本発明のいくつかの態様は、特に、本明細書中に記載したように、ＧＡＴ活性を有する前記カテゴリーのＧＡＴポリペプチドのいずれかのサブセットに関する。これらのＧＡＴポリペプチドは、例えば、グリホセート抵抗性を植物に付与するための剤として用いるのに好ましい。所望のレベルのＧＡＴ活性の例は本明細書中に記載する。
【０１３２】
１つの態様において、ＧＡＴポリペプチドは、自然発生源、例えば、細菌株から単離された天然に存在する核酸の組換えまたは単離された形態によってコードされるアミノ酸配列を含む。そのようなＧＡＴポリペプチドをコードする野生型ポリヌクレオチドは、当該分野で知られた標準的な技術によって具体的にスクリーニングすることができる。配列番号：６ないし１０によって定義されるポリペプチドは、例えば、後により詳細に記載されるように、ＧＡＴ活性を呈するＢａｃｉｌｌｕｓ株からの配列の発現クローニングによって発見された。
【０１３３】
また、本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２および８２４よりなる群から選択されるヌクレオチド配列、それらの相補体、およびそれらの相補対を含めた、配列番号：５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３および８２５よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の実質的に全長にハイブリダイズするヌクレオチド配列含む単離されたまたは組換えポリヌクレオチドによってコードされる単離されたまたは組換えポリペプチドを含む。
【０１３４】
また、本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号：８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２４、９２６、９２８および９３０よりなる群から選択されるヌクレオチド配列、それらの相補体、および配列番号：８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１および９７２よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の実質的に全長にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離されたまたは組換えポリヌクレオチドによってコードされる単離されたまたは組換えポリペプチドも含む。
【０１３５】
本発明は、さらに、本明細書中に記載されたＧＡＴ−コーディングポリヌクレオチドのいずれかの断片によってコードされるＧＡＴ活性を有するいずれかのポリペプチドを含む。
【０１３６】
本発明は、一緒にスプライシングされて、機能的ＧＡＴポリペププチドを形成することができるＧＡＴポリペプチドの断片も提供することもできる、スプライシングはインビトロまたはインビボで達成することができ、シス−またはトランス−スプライシング（すなわち、分子内または分子間スプライシング）を含むことができる。断片それ自体はＧＡＴ活性を有することができるが、必ずしも有する必要はない。例えば、ＧＡＴポリペプチドの２つ以上のセグメントはインテインによって分離することができ；シス−スプライシングによるインテイン配列の除去の結果、機能的ＧＡＴポリペプチドが得られる。もう１つの例において、暗号化ＧＡＴポリペプチドは２つ以上の別々の断片として発現させることができ；これらのセグメントのトランス−スプライシングの結果、機能的ＧＡＴポリペプチドが回収される。シス−およびトランス−スプライシング遺伝子暗号化および介入配列の導入の種々の態様は、共に引用してその全体を援用する米国特許出願第０９／５１７，８９３３号および０９／７１０，６８６号により詳細に記載されている。
【０１３７】
一般に、本発明は、本明細書中に記載されたポリヌクレオチド配列の突然変異、繰り返して使用できる配列組換えおよび／または多様化によって誘導された修飾されたＧＡＴポリヌクレオチドによってコードされるいずれのポリペプチドも含む。本発明のいくつかの態様において、ＧＡＴポリペプチドは、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、またはこれらのタイプの修飾の１つ以上の組合せによって修飾される。置換は保存的または非−保存的とすることができ、機能を改変することができ、または改変できず、および新しい機能を付加することができる。配列の実質的断片の切形の場合のような、あるいは内部での、またはＮまたはＣ末端でのさらなる配列の融合において、挿入および欠失は実質的であり得る。本発明のいくつかの具体例において、ＧＡＴポリペプチドは、例えば、分泌シグナル、葉緑体トランジットペプチド、精製タグ、または当業者に明らかであって、本明細書中の他の箇所でより詳細に記載する多数の他の官能基のいずれかのような機能的付加を含む融合蛋白質の一部である。
【０１３８】
本発明のポリペプチドは１つ以上の修飾されたアミノ酸を含むことができる。修飾されたアミノ酸の存在は、例えば、（ａ）ポリペプチドのインビボ半減期を増加させ、（ｂ）ポリペプチドの抗原性を低下させ、または増加させ、および（ｃ）ポリペプチドの貯蔵安定性を増加させるのに有利であろう。アミノ酸（類）は、例えば、組換え手法の間に共−翻訳により、または翻訳後に修飾され（例えば、哺乳動物細胞における発現の間におけるＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフでのＮ−結合グリコシル化）、または合成手段によって修飾される。
【０１３９】
修飾されたアミノ酸の非限定的例は、グリコシル化、アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化された（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化された）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸等を含む。アミノ酸の修飾において当業者をガイドするのに適当な参照は文献を通じて十分である。例示的なプロトコルはＷａｌｋｅｒ（１９９８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ）に見出される。
【０１４０】
本発明のＧＡＴポリペプチドを生産し、単離するための組換え方法は本明細書中に記載される。組換え生産に加え、ポリペプチドは固相技術を用いて直接的ペプチド合成によって生産することができる（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９６９）  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９６３）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）。ペプチド合成は手動技術を用いて、または自動化によって行うことができる。自動化合成は、例えば、製造業者によって提供された指令書に従い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて達成することができる。例えば、サブ配列は化学的に別々に合成し、化学的方法を用いて組み合わせて、全長ＧＡＴポリペプチドを提供することができる。また、ペプチドは種々の源から注文することができる。
【０１４１】
本発明のもう１つの態様において、本発明のＧＡＴポリペプチドを用いて、例えば、トランスジェニック植物の種々の組織における、例えば、ＧＡＴポリペプチドの活性、分布および発現に関連した、例えば、診断用途を有する抗体を得る。
【０１４２】
抗体誘導のためのＧＡＴホモログポリペプチドは生物学的活性を必要としない；しかしながら、ポリペプチドまたはオリゴペプチドは抗原性でなければならない。特異的抗体を誘導するのに用いられるペプチドは、少なくとも１０のアミノ酸、好ましくは少なくとも１５または２０のアミノ酸よりなるアミノ酸配列を有することができる。ＧＡＴポリペプチドの短いストレッチは、キーホールリンペットヘモシアニン、およびキメラ分子に対して生じた抗体のようなもう１つの蛋白質と融合させることができる。
【０１４３】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生産するための方法は当業者に知られており、多くの抗体が入手できる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，  ＮＹ）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ）；  Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（編）  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第４版（Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｌｏｓ  Ａｎｌｔｏｓ，  ＣＡ）、およびそこに引用された文献；  Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  第二版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）；およびＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７参照。抗体調製のための他の適当な技術はファージまたは同様なベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択を含む。Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６参照。特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗血清は、通常、少なくとも約０．１μＭ、好ましくは少なくとも約０．０１μＭまたはそれより良好、最も典型的かつ好ましくは、０．００１μＭまたはそれより良好なＫＤにて結合するであろう。
【０１４４】
抗体の生産および作成技術の更なる詳細はＢｏｒｒｅｂａｃｅｋ編（１９９５）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  第二版（Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ＮＹ）；  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｒｃｈ  （ＩＲＬ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）；およびＰａｕｌ  （１９９５）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ）に見出すことができる。
【０１４５】
配列の変形
本発明のＧＡＴポリペプチドは配列番号：  ５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１および９７２として本明細書中に開示された配列の保存的に修飾された変形を含む。そのような保存的に修飾された変形は、配列番号：  ５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、��１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１および９７２のいずれかにおける単一アミノ酸またはアミノ酸の小さなパーセンテージ（典型的には約５％未満、より典型的には約４％、２％または１％未満）を改変し、付加しまたは欠失する置換、付加または欠失を含む。
【０１４６】
例えば、配列番号：６として本明細書中で確認される１４６アミノ酸ポリペプチドの保存的に修飾された変形（例えば、欠失）は、ポリペプチド配列の約５％未満、４％、２％または約１％以下の欠失に対応する、少なくとも１４０アミノ酸、好ましくは少なくとも１４１アミノ酸、より好ましくは少なくとも１４４アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも１４５アミノ酸の長さを有するであろう。
【０１４７】
配列番号：６として本明細書中で確認されるポリペプチドを保存的に修飾された変形（例えば、「保存的に置換された変形」）のもう１つの例は、１４６アミノ酸ポリペプチドの約７残基まで（すなわち、約５％未満）において、表２に記載した６つの置換基に従った「保存的置換」を含むであろう。
【０１４８】
保存的に置換された配列を含めた本発明のＧＡＴポリペプチド配列ホモログは、シグナル配列、例えば、葉緑体標的化配列と融合したＧＡＴ融合において、あるいは蛋白質の精製用の１つ以上のドメインの付加に際して（例えば、ポリｈｉｓセグメント、ＦＬＡＧタグセグメント等）、ＧＡＴポリペプチドにおいて起こるようなより大きなポリペプチド配列の一部として存在することができる。後者の例において、さらなる機能的ドメインは蛋白質のＧＡＴ部分の活性に対して、あるいはさらなるドメインがプロテアーゼでの処理によるような合成後プロセッシング工程によって除去できる場合に、ほとんどまたは全く効果を有しない。
【０１４９】
免疫反応性によるポリペプチドの定義
本発明のポリペプチドは定義された活性、すなわち、グリホセートのアセチル化およびアシル化を持つ新しいクラスの酵素を提供するので、ポリペプチドは、例えば、免疫学的アッセイにおいて認識することができる新しい構造的特徴も提供する。本発明のポリペプチド、ならびにそのような抗血清によって結合するポリペプチドに特異的に結合する抗血清の創製は、本発明の特徴である。
【０１５０】
本発明は、配列番号：  ５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１および９７２の１つ以上から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原に対して生じた抗体または抗血清に特異的に結合する、またはそれに対して特異的に免疫反応性であるＧＡＴポリペプチドを含む。他のＧＡＴホモログとの交差−反応性を排除するためには、抗体または抗血清を、本発明出願の出願日の時点で入手可能なＧｅｎＢａｎｋ受託番号に対応する蛋白質またはペプチドによって表され、ＣＡＡ７０６６４、Ｚ９９１０９およびＹ０９４７６によって例示されるもののような入手可能な関連蛋白質で減算する。受託番号が核酸に対応する場合、該核酸によってコードされるポリペプチドが生じ、抗体／抗血清減算目的で用いる。図３は、例示的ＧＡＴ配列と、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて入手可能な最も密室に関連する配列、ＹｉｔＩの間の相対的同一性配列を表にしたものである。自然発生型ＹｉｔＩの機能は未だ解明されていないが、当該酵素は検出可能なＧＡＴ活性を保有することが示されている。
【０１５１】
１つの典型的な様式において、免疫アッセイは、配列番号：５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１および９７２、またはその実質的配列（すなわち、提供された全長配列の少なくとも約３０％）の１つ以上に対応する配列の１つ以上を含む１つ以上のポリペプチドに対して生起されたポリクローナル抗血清を用いる。配列番号：  ５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５���６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１および９７２に由来する潜在的ポリペプチド免疫原の全組は、以下、集合的に、「免疫原性ポリペプチド」という。得られた抗血清は、選択的に、他の関連配列に対して低い交差−反応性を有するように選択され、いずれのそのような交差−反応性も、免疫アッセイにおけるポリクローナル抗血清の使用に先立って、関連配列の１つ以上との免疫吸収によって除去される。
【０１５２】
免疫アッセイで用いられる抗血清を生じさせるためには、免疫原性ポリペプチド（類）の１つ以上を生産し、本明細書中に記載されたように精製する。例えば、組換え蛋白質は細菌細胞系で生産することができる。（結果がマウスの実質的遺伝子同一性配列のためより再生可能なゆえに本アッセイで用いられる）マウスの近交系を、標準的なマウス免疫化プロトコルを用い、フロイントのアジュバントのような標準的アジュバントと組み合わせて免疫原性ポリペプチド（類）で免疫化する（特異的免疫反応性を測定するのに用いることができる抗体創製、免疫アッセイフォーマットおよび条件の標準的な記載の方法については、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。別法として、本明細書中で開示された配列に由来する１つ以上の合成または組換えポリペプチドをキャリアー蛋白質にコンジュゲートし、免疫原として用いる。
【０１５３】
ポリクローナル血清を収集し、免疫アッセイ、例えば、固体支持体に固定化された免疫原性蛋白質の１つ以上を用いる固相免疫アッセイにおいて免疫原性ポリペプチド（類）に対して力価測定する。１０６以上の力価を持つポリクローナル抗血清を選択し、プールし、関連ポリペプチド、例えば、前記したＧＥＮＢＡＮＫから同定されるもので減算して、減算され、プールされ、力価測定されたポリクローナル抗血清を得る。
【０１５４】
減算され、プールされ、力価測定されたポリクローナル抗血清を、関連ポリペプチドに対する交差反応性につきテストする。好ましくは、少なくとも２つの免疫原性ＧＡＴを、好ましくは、少なくとも２つの関連ポリペプチドと組み合わせてこの決定で用いて、免疫原性ポリペプチド（類）によって特異的に結合される抗体を同定する。
【０１５５】
この比較アッセイにおいて、区別される結合条件を減算され、力価測定されたポリクローナル抗血清につき決定し、その結果、関連ポリペプチドに対する結合と比較して、免疫原性ＧＡＴポリペプチドへの力価測定されたポリクローナル抗血清の結合につき少なくとも約５ないし１０倍高いシグナル−対−ノイズ比が得られる。すなわち、結合反応のストリンジェンシーは、アルブミンまたは脱脂粉乳のような非特異的競合体の付加によって、または塩条件、温度等を調整することによって調整される。これらの結合条件は、テストポリペプチドがプールされ、減算されたポリクローナル抗血清によって特異的に結合されるか否かを測定するための引き続いてのアッセイで用いられる。特に、区別される結合条件下で対照ポリペプチドよりも少なくとも２ないし５倍大きなシグナル−対−ノイズ比を示し、免疫原性ポリペプチド（類）と比較して、少なくとも約１／２のシグナル−対−ノイズ比を示すテストポリペプチドは、公知のＧＡＴと比較して免疫原性ポリペプチド（類）との実質的構造類似性を共有し、したがって、本発明のポリペプチドである。
【０１５６】
もう１つの例において、競合結合様式における免疫アッセイは、テストポリペプチドの検出で用いる。例えば、前記したように、対照ＧＡＴポリペプチドとの免疫吸収によって、交差−反応抗体をプールした抗血清混合物から除去する。次いで、免疫原性ポリペプチド（類）を固体支持体に固定化し、それを減算したプールされた抗血清に曝露する。テスト蛋白質をアッセイに加えて、プールされ、減算された抗血清への結合につき競合させる。固定化された蛋白質（類）と比較して、プールされ、減算された抗血清への結合につき競合するテスト蛋白質（類）の能力を、結合につき競合するアッセイに加えられた免疫原性ポリペプリド（類）の能力と比較する（免疫原性ポリペプチド（類）は、プールされた抗血清への結合につき固定化免疫原性ポリペプチド（類）と効果的に競合する）。テスト蛋白質についてのパーセント交差−反応性を、標準的な計算を用いて計算する。
【０１５７】
平行アッセイにおいて、プールされ、減算された抗血清への結合につき競合する対照蛋白質の能力は、選択的に、抗血清への結合につき競合する免疫原性ポリペプチド（類）の能力と比較して決定される。再度、標準的な計算を用い、対照ポリペプチドについてのパーセント交差−反応性を計算する。パーセント交差−反応性がテストポルオペにつき少なくとも５ないし１０×高い場合、テストポリペプチドはプールされ、減算された抗血清に特異的に結合するといわれる。
【０１５８】
一般に、免疫吸収されプールされた抗血清は、本明細書中に記載した競合結合免疫アッセイで用いて、いずれのテストペプチドも免疫原性ポリペプチド（類）と比較することができる。この比較をなすために、２つのポリペプチドを、各々、広い範囲の濃度でアッセイし、固定化蛋白質への減算された抗血清の結合の５０％を阻害するのに必要な各ポリペプチドの量を、標準的な技術を用いて測定する。もし必要なテストポリペプチドの量が、必要な免疫原性ポリペプチド（類）の量の２倍未満であれば、テストポリペプチドは免疫原性ポリペプリド（類）に対して生じた抗体に特異的に結合するといわれ、但し、該量は対照ポリペプチドにつき少なくとも約５ないし１０×高いものとする。
【０１５９】
特性の最終決定において、プールされた抗血清は、選択的に、免疫原性ポリペプチド（類）への、減算され、プールされた抗血清の結合がほとんどまたは全く検出できなくなるまで、（対照ポリペプチドよりはむしろ）免疫原性ポリペプチド（類）と十分に免疫吸収される。次いで、この十分に免疫吸収された抗血清を、テストポリペプチドとの反応性につきテストする。もしほとんどまたは全く反応性が観察されなければ（すなわち、免疫原性ポリペプリド（類）への十分に免疫吸収された抗血清の結合につき観察されたシグナル−対−ノイズ比の２倍以下）、テストポリペプチドは、免疫原性ポリペプチド（類）によって誘導された抗血清によって特異的に結合される。
【０１６０】
グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼポリヌクレオチド
１つの態様において、本発明は、本明細書中においては「グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼポリヌクレオチド」または「ＧＡＴポリヌクレオチド」という単離されたまたは組換えポリヌクレオチドの新規なファミリーを提供する。ＧＡＴポリヌクレオチド配列は、ＧＡＴポリペプチドをコードする能力によって特徴付けられる。一般に、本発明は、本明細書中に記載する新規なＧＡＴポリペプチドのいずれかをコードするいずれのヌクレオチド配列も含む。本発明のいくつかの態様において、ＧＡＴ活性を持つＧＡＴポリペプチドをコードするＧＡＴポリヌクレオチドが好ましい。
【０１６１】
１つの態様において、ＧＡＴポリヌクレオチドは、生物、例えば、細菌株から単離された天然に存在する核酸の組換えまたは単離された形態を含む。例示的ＧＡＴポリヌクレオチド、例えば、配列番号：１ないし５は、ＧＡＴ活性を呈するＢａｃｉｌｌｕｓ株からの配列の発現クローニングによって発見された。簡単に述べれば、ほぼ５００のＢａｃｉｌｌｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株のコレクションをグリホセートをＮ−アセチル化する自然発生的能力につきスクリーニングした。株をＬＢ中で一晩増殖させ、遠心によって収穫し、希薄なトルエンに浸透させ、次いで、洗浄し、緩衝液、５ｍＭグリホセート、および２００μＭアセチル−ＣｏＡを含有する反応ミックス中に再懸濁させた。細胞を反応ミックス中で１および４８時間の間インキュベートし、その時点で、等用量のメタノールを反応に加えた。次いで、遠心によって細胞をペレット化し、親イオンモードの質量分析による分析前に、上澄を濾過した。図２に示すように、反応ミックスの質量分析プロフィールをＮ−アセチルグリホセート標準と比較することによって、反応の生成物はＮ−アセチルグリホセートとして工程的に同定された。生成物の検出は双方の基質（アセチルＣｏＡおよびグリホセート）の含有に依存し、細菌細胞を加熱変性することによってなくなった。
【０１６２】
次いで、個々のＧＡＴポリヌクレオチドを、機能スクリーニングによって同定された株からクローン化した。ゲノミックＤＮＡを調製し、Ｓａｕ３Ａ１酵素で部分的に消化した。ほぼ４ｋｂの断片をＥ．  ｃｏｌｉ発現ベクターにクローン化し、エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。トルエン洗浄をＰＭＢＳでの浸透化によって置き換える以外は、前記した反応に従って、ＧＡＴ活性を呈する個々のクローンを質量分析によって同定した。ゲノミック断片を配列決定し、推定ＧＡＴポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを同定した。ＧＡＴ遺伝子の同一性配列は、Ｅ．ｃｏｌｏにおけるオープンリーディングフレームの発現、反応混合物から生じた高レベルのＮ−アセチルグリホセートの検出によって確認した。
【０１６３】
本発明のもう１つの態様において、ＧＡＴポリヌクレオチドは、１つ以上の天然に存在する、単離された、または組換えＧＡＴポリヌクレオチドを態様化し、例えば、組換えおよび／または突然変異させることによって生じる。本明細書中の他の箇所でより詳細に記載するように、優れた機能的属性、例えば、多様化プロセスにおける基質または親として用いるＧＡＴポリヌクレオチドよりも増大した触媒機能、増大した安定性、より高い発現レベルを持つＧＡＴポリペプチドをコードする多様化ＧＡＴポリヌクレオチドを生じさせるのはしばしば可能である。
【０１６４】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のＧＡＴポリペプチドの組換え生産（すなわち、発現）において；（例えば、トランスジェニック植物において除草剤抵抗性を付与するための）導入遺伝子として；形質転換およびプラスミド維持のための選択マーカーとして；免疫原として；（自然発生型ＧＡＴコーディング核酸の検出用を含めた）補充的または部分的相補性核酸の存在に対する診断プローブとして；さらなる多様性創製、例えば、新しいおよび／または改良されたＧＡＴホモログ等を生じさせるための組換え反応または突然変異反応のための基質として種々の用途を有する。
【０１６５】
ある種の特異的、実質的および信頼のできるＧＡＴポリヌクレオチドの用途は、ポリヌクレオチドが実質的ＧＡＴ活性を持つポリペプチドをコードする必要がないことに注意するのは重要である。例えば、活性な酵素をコードしないＧＡＴポリヌクレオチドは、望ましい機能的特性（例えば、熱または他の環境的因子に対する高いｋｃａｔまたはｋｃａｔ／Ｋｍ、低いＫｍ、高い安定性、高い転写または翻訳速度、蛋白質分解切断に対する抵抗性、抗原性の低下等）を持つＧＡＴポリヌクレオチド変種、または非−ＧＡＴポリヌクレオチドに到達するための、多様化手法で用いる親ポリヌクレオチドの価値ある源となり得る。例えば、ほとんどまたは全く検出可能な活性を有しないプロテアーゼ変種をコードするヌクレオチド配列は、コードに活性なプロテアーゼをコードする子孫を生じさせるために、ＤＮＡシャッフリング実験で親ポリヌクレオチドとして用いられてきた（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：８９３−９６）。
【０１６６】
多様性創製方法または繰り返し使用できる配列組換え（「ＲＳＲ」）方法（例えば、ＤＮＡシャッフリング）によって生じたポリヌクレオチド配列は、本発明の特徴である。本明細書中に記載された核酸を用いる突然変異および組換え方法は、本発明の特徴である。
例えば、本発明の１つの方法は、１つ以上のさらなるヌクレオチドと、前記したおよび後記する本発明の１つ以上のヌクレオチド配列とを繰り返し的に組み換えることを含む。組換え工程は、選択的に、インビボ、エクス・ビボ、イン・シリコまたはインビトロで行われる。この多様性創製または繰り返し使用できる配列組換えにより、組換え修飾ＧＡＴポリヌクレオチドの少なくとも１つのライブラリーが生じる。このライブラリーのメンバーによってコードされるポリペプチドは本発明に含まれる。
【０１６７】
ストリンジェントまたは高ストリンジェント条件下でＦＧＡＴポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする、典型的には少なくとも１２塩基、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０、３０、または５０以上の塩基を有する、本明細書中においてはオリゴヌクレオチドともいうポリヌクレオチドの使用も考えられる。該ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載するような方法に従い、プローブ、プライマー、センスおよびアンチセンス剤として用いることができる。
【０１６８】
本発明に従い、ＧＡＴポリペプチド、ＧＡＴポリペプチドの断片、関連融合蛋白質または機能的同等体をコードするヌクレオチド配列を含めたＧＡＴポリヌクレオチド配列は細菌または植物細胞のような適当な宿主細胞においてＧＡＴポリペプチドの発現を指令する組換えＤＮＡ分子で用いられる。遺伝暗号の固有の縮重のため、実質的に同一または機能的に同等なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列を用いて、ＧＡＴポリヌクレオチドをクローン化し、それを発現させることもできる。
【０１６９】
本発明は、引き続いてスプライシングされて、結局は機能的ＧＡＴポリペプチドを生じる転写および／または翻訳産生物をコードするＧＡＴポリヌクレオチドを提供する。スプライシングはインビトロまたはインビボで達成することができ、シス−またはトランス−スプライシングを含むことができる。スプライシングに対する基質はポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ転写体）またはポリペプチドであり得る。ポリヌクレオチドのシス−スプライシングの例は、コード配列に挿入されたイントロンが除去され、２つのフランキングエキソン領域がスプライシングされて、ＧＡＴポリペプチドコード配列を生じる場合である。トランス−スプライシングの例は、別々に転写され、次いで、スプライシングされて全長ＧＡＴコーシング配列を形成することができる２つ以上の断片にコード配列を分離することによってＧＡＴポリヌクレオチドが暗号化される場合である。（本発明の構築物に導入することができる）スプライシングエンハンサー配列の使用は、シスまたはトランスいずれかのスプライシングを促進することができる。ポリペプチドのシス−およびトランス−スプライシングは本明細書中の他の箇所、および米国特許出願第０９／５１７，９３３号および第０９／７１０，６８６号により詳細に記載されている。
【０１７０】
このようにして、いくつかのＧＡＴポリヌクレオチドは全長ＧＡＴポリペプチドを直接的にはコードせず、むしろ、ＧＡＴポリペプチドの断片または複数断片をコードする。これらのＧＡＴポリヌクレオチドを用いて、スプライシングを含めたメカニズムを介して機能的ＧＡＴポリペプチドを発現させることができ、ここに、スプライシングはポリヌクレオチド（例えば、イントロン／エキソン）および／またはポリペプチド（例えば、インテイン／エキステイン）のレベルで起こり得る。これは、例えば、ＧＡＴ活性の発現を制御するに置いて有用である。というのは、機能的ＧＡＴポリペプヂトは、もしすべての必要な断片が環境で発現されて、それが、スプライシングプロセスが機能的産生物を生じさせるのを可能とすれば発現されるに過ぎないからである。もう１つの例において、１つ以上の挿入配列のＧＡＴポリヌクレオチドへの導入は、ホモロジーポリヌクレオチドとの組換えを容易とでき；挿入配列のためのイントロンまたはインテインの使用は、介入配列の除去を促進し、それにより、コードされた変種の機能を回復する。
【０１７１】
当業者によって理解されるように、特定の宿主におけるその発現を増強するようにコード配列を修飾するのは有利であり得る。遺伝暗号は６４の可能なコドンで冗長であるが、ほとんどの生物はこれらのコドンのサブセットを優先的に用いる。種で最も頻繁に利用されるコドンは最適コドンと呼ばれ、非常にしばしばは利用されないものは稀なまたは低−用法コドンとして分類される（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ
１０５：６１−７２参照）。コドンは、宿主の好ましいコドン用法を反映するように置換することができ、プロセスは、時々、「コドン最適化」または「種コドン偏り用の制御」と呼ばれる。
【０１７２】
特定の原核生物または真核生物宿主によって好まれるコドンを含む最適化コード配列（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−５０８も参照）は、例えば、転写の速度を増大するように、または非−最適化配列から生じた転写体と比較して、より長い半減期のような望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写体を生じるように調製することができる。また、転写停止コドンを修飾して宿主の選択性を反映することもできる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物についての好ましい停止コドンは、各々、ＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物についての好ましい停止コドンはＵＧＡであり、他方、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは停止コドンとしてＵＡＡを用いるのを好む（Ｄａｌｐｈｉｎ  ｅｔａｌ．（１９９６）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２１６−２１８）。植物での発現用にヌクレオチド配列を最適化する方法は、例えば、米国特許第６，０１５，８９１号、およびそこに引用された文献に提供される。
【０１７３】
本発明の１つの具体例は、関連宿主、例えば、トランスジェニック植物宿主における発現のための最適コドンを有するＧＡＴポリヌクレオチドを含む。これは、細菌起源のＧＡＴポリヌクレオチドをトランスジェニック植物に導入して、例えば、グリホセート抵抗を植物に付与する場合に特に望ましい。
【０１７４】
本発明のポリヌクレオチド配列は、限定されるものではないが、遺伝子産生物のクローニング、プロセッシングおよび／または発現を修飾する改変を含めた、種々の理由でＧＡＴポリヌクレオチドを改変するように作成することができる。例えば、当該分野でよく知られた技術、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて改変を導入して、新しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを改変し、コドン選択性を変化させ、スプライス部位を導入する等を用いて改変を導入することができる。
【０１７５】
本明細書中でより詳細に記載するように、本発明のポリヌクレオチドとは、新規なＧＡＴポリペプチドとをコードする配列、および該コード配列に相補的な配列、およびコード配列の新規な断片、およびその相補体を含む。該ポリヌクレオチドはＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態とすることができ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ，ゲノミックＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドは二本鎖または一本鎖とすることができ、もし一本鎖とするならば、コーディング鎖または非−コーディング（アンチセンス、相補性）鎖であり得る。該ポリヌクレオチドは、選択的に、（ｉ）単離において、（ｉｉ）例えば、融合蛋白質、プレ−蛋白質、プレプロ−蛋白質等をコードするようなさらなるコード配列との組合せにおいて、（ｉｉｉ）イントロンまたはインテインのような非−コード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターエレメント、または適当な宿主におけるコード配列の発現に効果的な５‘および／または３’非翻訳領域との組合せにおいて、および／または（ｉｖ）ＧＡＴポリヌクレオチドが異種遺伝子であるベクターまたは宿主環境において、ＧＡＴポリペプチドのコード配列を含む。また、配列は、担体、緩衝液、アジュバント、賦形剤等の存在下を含めた、核酸の典型的な組成物処方との組合せで見出すこともできる。
【０１７６】
本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、公知の合成方法に従って、標準的な固相方法によって調製することができる。典型的には、約１００塩基までの断片を個々に合成し、（例えば、酵素または化学的連結方法、またはポリメラーゼ媒介反応によって）接合して、実質的にいずれかの所望の連続配列を形成する。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−６９によって記載された古典的なホスホルアミダイト方法、または例えば、自動合成方法で実施するのに典型的な、Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１−０５に記載された方法を用い、化学合成によって調製することができる。ホスホルアミダイト方法に従い、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーで合成し、精製し、アニールし、連結し、適当なベクターにクローン化する。
【０１７７】
加えて、基本的にいずれの核酸も、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）および多くのその他のような種々の商業的源のいずれかから注文することができる。同様に、ペプチドおよび抗体はＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｅｔｉｃ（ｐｋｉｍ＠ｃｃｎｅｔ．ｃｏｍ）、ＨＴＩ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｈｔｉｂｉｏ．ｃｏｍ）、ＢＭＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ  （Ｕ．Ｋ．）、Ｂｉｏ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｉｎｃ．および多くのその他のような種々の源のいずれかから注文することができる。
【０１７８】
また、ポリヌクレオチドは、技術文献に記載されたよく知られた技術によって構成することもできる。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８（１９８２）、およびＡｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１参照。次いで、二本鎖ＤＮＡ断片は、相補的鎖を合成し、適当な条件下で一緒に該鎖をアニールすることによって、あるいは適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補的鎖を付加することによって得ることができる。
【０１７９】
突然変異誘発を含めた、本明細書中で有用な分子生物学技術を記載する一般的テキストは、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １５２  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−３  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；  およびＡｕｓｕｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．編（２０００）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）を含む。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ―レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含めた、インビトロ増幅方法を介して当業者に指令するのに十分な技術の例はＢｅｒｇｅｒ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．編（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）；  Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ  （１９９０年１０月１日）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  ３６−４７；  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９９１）  ３：８１−９４；  Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３；  Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘’ｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４；  Ｌｏｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．３５：１８２６；  Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；  Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ  （１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１−２９４；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ  （１９８９）  Ｇｅｎｅ  ４：５６０；  Ｂａｒｒｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｇｅｎｅ  ８９：１１７，  ａｎｄ  Ｓｏｏｋｎａｎａｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ  （１９９５）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４に見出される。インビトロ増幅された核酸をクローニングする改良された方法はＷａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。ＰＣＲによって大きな核酸を増幅する改良された方法はＣｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４−６８５およびそこに引用された文献にまとめられており、ここに、４０ｋｂまでのＰＣＲアンプリコンが生じる。当業者であれば、実質的にいずれのＲＮＡも、逆転写酵素およびポリメラー��を用い、制限消化、ＰＣＲ延長および配列決定に適した２本鎖ＲＮＡに変換することもできることを認識するであろう。Ａｕｓｂｅｌ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，すべて前掲参照。
【０１８０】
本発明の１つの態様は配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２、８２４、８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４７、９４９、９５１および９５２よりなる群から選択される単離されたまたは組換えポリヌクレオチドを提供する。
【０１８１】
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：３００、４４５および４５７よりなる群から選択される参照アミノ酸配列と最適に整列して、ＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて少なくとも４６０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティーおよび１のギャップ延長ペナルティーを生じさせることができるアミノ酸配列をコードする単離されたまたは組換えポリヌクレオチド配列を含み、ここに、以下の位置の１つ以上は以下の制限に適合し：（ｉ）位置１８および３８において、Ｚ５アミノ酸残基があり；（ｉｉ）位置６２において、Ｚ１アミノ酸残基があり；（ｉｉｉ）位置１２４において、Ｚ６アミノ酸残基があり；および（ｉｖ）位置１４４において、Ｚ２アミノ酸残基があり、ここに：Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり、および、さらに、ここに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置２、４、１５、１９、２６、２８、３１、４５、５１、５４、８６、９０、９１、９７、１０３、１０５、１０６、１１４、１２３、１２９、１３９および／または１４５において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置３、５、８、１０、１１、１４、１７、２４、２７、３２、３７、４７、４８、４９、５２、５７、５８、６１、６３、６８、６９、７９、８０、８２、８３、８９、９２、１００、１０１、１０４、１１９、１２０、１２５、１２６、１２８、１３１および／または１４３において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択され；およびＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸である。アミノ酸またはアミノ酸残基を特定するのに用いる場合、単一文字表示Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹは当該分野で用いられる、および本明細書中の表１に掲げたそれらの標準的意味を有する。
【０１８２】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、配列が配列番号：３００、４４５、および４５７よりなる群から選択される参照アミノ酸配列と最適に整列して、ＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて少なくとも４６０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティーおよび１のギャップ延長ペナルティーを生じさせる場合に、以下の位置の１つ以上が以下の制限を適合するようなアミノ酸配列をコードし：（ｉ）位置１８および３８において、Ｚ５アミノ酸残基があり；（ｉｉ）位置６２において、Ｚ１アミノ酸残基があり；（ｉｉｉ）位置１２４において、Ｚ６アミノ酸残基があり；および（ｉｖ）位置１４４において、Ｚ２アミノ酸残基があり、ここに：Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり、および、さらに、ここに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置２、４、１５、１９、２６、２８、５１、５４、８６、９０、９１、９７、１０３、１０５、１０６、１１４、１２９、１３９および／または１４５において、アミノ酸残基はＺ１であり；（ｂ）位置３１および／または４５において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｃ）位置８において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｄ）位置８９において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ６であり；（ｅ）位置８２、９２、１０１および／または１２０において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｆ）位置３、１１、２７および／または７９において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｇ）位置１８において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ５であり；（ｈ）位置１２３において、アミノ酸残基はＺ１またはＺ２であり；（ｉ）位置１２、３３、３５、３９、５３、５９、１１２、１３２、１３５、１４０および／または１４６において、アミノ酸残基はＺ１またはＺ３であり；（ｊ）位置３０において、アミノ酸残基はＺ１であり；（ｋ）位置６において、アミノ酸残基はＺ６であり；（ｌ）位置８１において、アミノ酸残基はＺ２またはＺ４であり；（ｍ）位置１１３において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｎ）位置１３８において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｏ）位置１４２において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｐ）位置５７および／または１２６において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ｑ）位置５、１７および６１において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｒ）位置２４において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｓ）位置１０４において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｔ）位置５２および／または６９において、アミノ酸残基はＺ３であり、（ｕ）位置１４および／または１１９においてアミノ酸残基はＺ５であり；（ｖ）位置１０、３２、６３および／または８３において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｗ）位置４８および／または８０において、アミノ酸残基はＺ６であり；（ｘ）位置４０において、アミノ酸残基はＺ１またはＺ２であり；（ｙ）位置９６において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ５であり；（ｚ）位置６５において、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６であり；（ａａ）位置８４および／または１１５において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ａｂ）位置９３において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ａｃ）位置１３０において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ａｄ）位置５８において、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６であり；（ａｅ）位置４７において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ６であり；（ａｆ）位置４９および／または１００において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ａｇ）位置６８において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ５であり；（ａｈ）位置１４３において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ａｉ）位置１３１において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ａｊ）位置１２５および／または１２８において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ａｋ）位置６７において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ａｌ）位置６０において、アミノ酸残基はＺ５であり；および（ａｍ）位置３７において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ６であり；ここに、Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ３はＮ、Ｑ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ４はＲ、ＨおよびＫよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１８３】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、さらに、（ａ）ないし（ａｍ）において特定された位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列をコードし、少なくとも９０％は（ａ）ないし（ａｍ）において特定されたアミノ酸残基制限に適合する。
【０１８４】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、当該配列を配列番号：３００、４４５または４５７と最適に整列させた場合に、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の少なくとも９０％が以下の制限に適合するようなアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置１、７、９、１３、２０、３６、４２、４６、５０、５６、６４、７０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、４１、４３、４４、５５、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１８５】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、当該配列を配列番号：３００、４４５または４５７と最適に整列させた場合に、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の少なくとも９０％が以下の制限に適合するようなアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置１、７、９、１３、２０、４２、４６、５０、５６、６４、７０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、３６、４１、４３、４４、５５、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１８６】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、当該配列を配列番号：３００、４４５または４５７と最適に整列させた場合、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の少なくとも９０％は以下の制限に適合するようなアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置１、７、９、２０、４２、５０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１１０、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＺ１であり；（ｂ）位置１３０、４６、５６、７０、１０７、１１７および／または１１８において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｃ）位置２３、５５、７１、７７、８８および／または１０９において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｄ）位置１６、２１、４１、７３、８５、９９および／または１１１において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｅ）位置３４および／または９５において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｆ）位置２２、２５、２９、４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１０８、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＺ６であり；ここに、Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ２はＦ、Ｗ、およびＹよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ３はＮ、Ｑ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ４はＲ、ＨおよびＫよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１８７】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、さらに、Ｚ１およびＺ３よりなる群から選択されるアミノ酸残基を位置３６に含むアミノ酸配列をコードする。本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、Ｚ１およびＺ２よりなる群から選択されるアミノ酸残基を位置６４にさらに含むアミノ酸配列をコードする。
【０１８８】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、当該配列を配列番号：３００、４４５または４５７と最適に整列させた場合に、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の少なくとも８０％が以下の制限に適合するようなアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置２において、アミノ酸残基はＩまたはＬであり；（ｂ）位置３において、アミノ酸残基はＥであり；（ｃ）位置４において、アミノ酸残基はＶまたはＩであり；（ｄ）位置５において、アミノ酸残基はＫであり；（ｅ）位置６において、アミノ酸残基はＰであり；（ｆ）位置８において、アミノ酸残基はＮであり；（ｇ）位置１０において、アミノ酸残基はＥであり；（ｈ）位置１１において、アミノ酸残基はＤまたはＥであり；（ｉ）位置１２において、アミノ酸残基はＴであり；（ｊ）位置１４において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｋ）位置１５において、アミノ酸残基はＬであり；（ｌ）位置１７において、アミノ酸残基はＨであり；（ｍ）位置１８において、アミノ酸残基はＲ、ＥまたはＫであり；（ｎ）位置１９において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ｏ）位置２４において、アミノ酸残基はＱであり；（ｐ）位置２６において、アミノ酸残基はＭ、Ｌ、ＶまたはＩであり；（ｑ）位置２７において、アミノ酸残基はＥであり；（ｒ）位置２８において、アミノ酸残基はＡまたはＶであり；（ｓ）位置３０において、アミノ酸残基はＭであり；（ｔ）位置３１において、アミノ酸残基はＹまたはＦであり；（ｕ）位置３２において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｖ）位置３３において、アミノ酸残基はＴまたはＳであり；（ｗ）位置３５において、アミノ酸残基はＬであり；（ｘ）位置３７において、アミノ酸残基はＲ、Ｇ、ＥまたはＱであり；（ｙ）位置３９において、アミノ酸残基はＡまたはＳであり；（ｚ）位置４０において、アミノ酸残基はＦまたはＬであり；（ａａ）位置４５において、アミノ酸残基はＹまたはＦであり；（ａｂ）位置４７において、アミノ酸残基はＲまたはＧであり；（ａｃ）位置４８において、アミノ酸残基はＧであり；（ａｄ）位置４９において、アミノ酸残基はＫ、ＲまたはＱであり；（ａｅ）位置５１において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ａｆ）位置５２において、アミノ酸残基はＳであり；（ａｇ）位置５３において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ａｈ）位置５４において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｉ）位置５７において、アミノ酸残基はＨまたはＮであり；（ａｊ）位置５８において、アミノ酸残基はＱ、Ｋ、ＲまたはＰであり；（ａｋ）位置５９において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｌ）位置６０において、アミノ酸残基はＥであり；（ａｍ）位置６１において、アミノ酸残基はＨまたはＲであり；（ａｎ）位置６３において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ａｏ）位置６５において、アミノ酸残基はＥ、ＰまたはＱであり；（ａｐ）位置６７において、アミノ酸残基はＱまたはＲであり；（ａｑ）位置６８において、アミノ酸残基はＫまたはＥであり；（ａｒ）位置６９において、アミノ酸残基はＱであり；（ａｓ）位置７９において、アミノ酸残基はＥであり；（ａｔ）位置８０において、アミノ酸残基はＧであり；（ａｕ）位置８１において、アミノ酸残基はＹ、ＨまたはＦであり；（ａｖ）位置８２において、アミノ酸残基はＲであり；（ａｗ）位置８３において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ａｘ）位置８４において、アミノ酸残基はＱであり；（ａｙ）位置８６において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｚ）位置８９において、アミノ酸残基はＧ、ＴまたはＳであり；（ｂａ）位置９０において、アミノ酸残基はＬであり；（ｂｂ）位置９１において、アミノ酸残基はＬ、ＩまたはＶであり；（ｂｃ）位置９２において、アミノ酸残基はＲまたはＫであり；（ｂｄ）位置９３において、アミノ酸残基はＨであり；（ｂｅ）位置９６において、アミノ酸残基はＥまたはＱであり；（ｂｆ）位置９７において、アミノ酸残基はＩであり；（ｂｇ）位置１００において、アミノ酸残基はＫまたはＮであり；（ｂｈ）位置１０１において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｉ）位置１０３において、アミノ酸残基はＡまたはＶであり；（ｂｊ）位置１０４において、アミノ酸残基はＤであり；（ｂｋ）位置１０５において、アミノ酸残基はＭ、ＬまたはＩであり；（ｂｌ）位置１０６において、アミノ酸残基はＬであり；（ｂｍ）位置１１２において、アミノ残基はＴまたはＡであり；ｂｎ）位置１１３において、アミノ酸残基はＳまたはＴであり；（ｂｏ）位置１１４において、アミノ酸残基はＡであり；（ｂｐ）位置１１５において、アミノ酸残基はＳであり；（ｂｑ）位置１１９において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｒ）位置１２０において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｓ）位置１２３において、アミノ酸残基はＦまたはＬであり；（ｂｔ）位置１２５において、アミノ酸残基はＥであり；（ｂｕ）位置１２６において、アミノ酸残基はＱまたはＨであり；（ｂｖ）位置１２８において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｂｗ）位置１２９において、アミノ酸残基はＶまたはＩであり；（ｂｘ）位置１３０において、アミノ酸残基はＦであり；（ｂｙ）位置１３１において、アミノ酸残基はＤまたはＥであり；（ｂｘ）位置１３２において、アミノ酸残基はＴであり；（ｃａ）位置１３５において、アミノ酸残基はＶであり；（ｃｂ）位置１３８において、アミノ酸残基はＨであり；（ｃｃ）位置１３９において、アミノ酸残基はＩであり；（ｃｄ）位置１４０において、アミノ酸残基はＬまたはＭであり；（ｃｅ）位置１４２において、アミノ酸残基はＹであり；（ｃｆ）位置１４３において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｃｇ）位置１４５において、アミノ酸残基はＬまたはＩであり；および（ｃｈ）位置１４６において、アミノ酸残基はＴである。
【０１８９】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレチドは、当該配列を配列番号：３００、４４５または４５７と最適に整列させた場合に、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基は少なくとも９０％が前記（ａ）ないし（ｃｈ）で特定されるアミノ酸残基制限に適合するようなアミノ酸配列をコードする。
【０１９０】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、配列番号：３００、４４５、および４５７よりなる群から選択される参照アミノ酸配列と最適に整列させて、ＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて少なくとも４６０の類似性スコア、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ延長ペナルティーを得る場合、以下の位置の１つ以上が以下の制限に適合するようなアミノ酸配列をコードし：（ｉ）位置１８および３８において、Ｚ５アミノ酸残基があり；（ｉｉ）位置６２において、Ｚ１アミノ酸残基があり；（ｉｉｉ）位置１２４において、Ｚ６アミノ酸残基があり；および（ｉｖ）位置１４４において、Ｚ２アミノ酸残基があり、ここに：Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；さらに、ここに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置９、７６、９４および１１０において、アミノ酸残基はＡであり；（ｂ）位置２９および１０８において、アミノ酸残基はＣであり；（ｃ）位置３４において、アミノ酸残基はＤであり；（ｄ）位置９５において、アミノ酸残基はＥであり；（ｅ）位置５６において、アミノ酸残基はＦであり；（ｆ）位置４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１１６、１２２、１２７および１３６において、アミノ酸残基はＧであり；（ｇ）位置４１において、アミノ酸残基はＨであり；（ｈ）位置７において、アミノ酸残基はＩであり；（ｉ）位置８５において、アミノ酸残基はＫであり；（ｊ）位置２０、４２、５０、７８および１２１において、アミノ酸残基はＬであり；（ｋ）位置１および１４１において、アミノ酸残基はＭであり；（ｌ）位置２３および１０９において、アミノ酸残基はＮであり；（ｍ）位置２２、２５、１３３、１３４および１３７において、アミノ酸残基はＰであり；（ｎ）位置７１において、アミノ酸残基はＱであり；（ｏ）位置１６、２１、７３、９９および１１１において、アミノ酸残基はＲであり；（ｐ）位置５５において、アミノ酸残基はＳであり；（ｑ）位置７７において、アミノ酸残基はＴであり；（ｒ）位置１０７において、アミノ酸残基はＷであり；および（ｓ）位置１３、４６、７０および１１８において、アミノ酸残基はＹである。
【０１９１】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、以下のさらなる制限の少なくとも１つに適合するアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置３６において、アミノ酸残基はＭ、ＬまたはＴであり；（ｂ）位置７２において、アミノ酸残基はＬまたはＩであり；（ｃ）位置７５において、アミノ酸残基はＭまたはＶであり；（ｄ）位置６４において、アミノ酸残基はＬ、ＩまたはＦであり；（ｅ）位置８８において、アミノ酸残基はＴまたはＳであり；（ｆ）位置１１７において、アミノ酸残基はＹまたはＦである。
【０１９２】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレチドは、以下のさらなる条件の少なくとも１つが満足されたアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置１４において、アミノ酸残基はＤであり；（ｂ）位置１８において、アミノ酸残基はＥであり；（ｃ）位置２６において、アミノ酸残基はＭまたはＶであり；（ｅ）位置３０において、アミノ酸残基はＩであり；（ｆ）位置３２において、アミノ酸残基はＤであり；（ｇ）位置３６において、アミノ酸残基はＭまたはＴであり；（ｉ）位置３７において、アミノ酸残基はＣであり；（ｊ）位置３８において、アミノ酸残基はＤであり；（ｊ）位置５３において、アミノ酸残基はＶであり；（ｋ）位置５８において、アミノ酸残基はＲであり；（ｌ）位置６１において、アミノ酸残基はＲであり；（ｍ）位置６２において、アミノ酸残基はＬであり；（ｎ）位置６４において、アミノ酸残基はＩまたはＦであり；（ｏ）位置６５において、アミノ酸残基はＰであり；（ｐ）位置７２において、アミノ酸残基はＩであり；（ｑ）位置７５において、アミノ酸残基はＶであり；（ｒ）位置８８において、アミノ酸残基はＴであり；（ｓ）位置８９において、アミノ酸残基はＧであり；（ｔ）位置９１において、アミノ酸残基はＬであり；（ｕ）位置９８において、アミノ酸残基はＩであり；（ｖ）位置１０５において、アミノ酸残基はＩであり；（ｗ）位置１１２において、アミノ酸残基はＡであり；（ｘ）位置１２４において、アミノ酸残基はＧまたはＣであり；（ｙ）位置１２８において、アミノ酸残基はＤであり；（ｚ）位置１４０において、アミノ酸残基はＭであり；（ａａ）位置１４３において、アミノ酸残基はＲであり；および（ａｂ）位置１４４において、アミノ酸残基はＷである。
【０１９３】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、前記した（ａ）ないし（ａｂ）において特定された位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくともとも８０％が（ａ）ないし（ａｂ）で特定されたアミノ酸残基制限に適合するアミノ酸配列をコードする。
【０１９４】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、以下のさらなる制限の少なくとも１つに適合するアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置４１において、アミノ酸残基はＨであり；（ｂ）位置１３８において、アミノ酸残基はＨであり；（ｃ）位置３４において、アミノ酸残基はＮであり；および（ｄ）位置５５において、アミノ酸残基はＳである。
【０１９５】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号：５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号：５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号：６０２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列弁護ｕ：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号：７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｊ）配列番号：５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｍ）配列番号：６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択される。
【０１９６】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号：５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号：５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号：６０２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列番号：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号：７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｊ）配列番号：５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｍ）配列番号：６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択され、ここに、以下の位置は以下の制限に適合し：（ｉ）位置１８および３８において、Ｚ５アミノ酸残基があり；（ｉｉ）位置６２において、Ｚ１アミノ酸残基があり；（ｉｉｉ）位置１２４において、Ｚ６アミノ酸残基があり；および（ｉｖ）位置１４４において、Ｚ２アミノ酸残基があり、ここに：Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【０１９７】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号：５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号：５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号６０２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列番号：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号：７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｊ）配列番号：５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｍ）配列番号：６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択され、さらに、ここに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置２、４、１５、１９、２６、２８、３１、４５、５１、５４、８６、９０、９１、９７、１０３、１０５、１０６、１１４、１２３、１２９、１３９および／または１４５において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置３、５、８、１０、１１、１４、１７、２４、２７、３２、３７、４７、４８、４９、５９、５７、５８、６１、６３、６８、６９、７９、８０、８２、８３、８９、９２、１００、１０１、１０４、１１９、１２０、１２５、１２６、１２８、１３１、および／または１４３において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１９８】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号：５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号：５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号：６０２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列番号：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号：７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｊ）配列番号：５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｍ）配列番号：６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択され、およびさらに、ここに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置２、４、１５、１９、２６、２８、５１、５４、８６、９０、９１、９７、１０３、１０５、１０６、１１４、１２９、１３９および／または１４５において、アミノ酸残基はＺ１であり；（ｂ）位置３１および／または４５において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｃ）位置８において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｄ）位置８９において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ６であり；（ｅ）位置８２、９２、１０１および／または１２０において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｆ）位置３、１１、２７および／または７９において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｇ）位置１８において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ５であり；（ｈ）位置１２３において、アミノ酸残基はＺ１またはＺ２であり；（ｉ）位置１２、３３、３５、３９、５３、５９、１１２、１３２、１３５、１４０および／または１４６において、アミノ酸残基はＺ１またはＺ３であり；（ｊ）位置３０において、アミノ酸残基はＺ１であり；（ｋ）位置６において、アミノ酸残基はＺ６であり；（ｌ）位置８１において、アミノ酸残基はＺ２またはＺ４であり；（ｍ）位置１１３において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｎ）位置１３８において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｏ）位置１４２において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｐ）位置５７および／または１２６において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ｑ）位置５、１７および６１において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｒ）位置２４において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｓ）位置１０４において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｔ）位置５２および／または６９において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｕ）位置１４および／または１１９において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｖ）位置１０、３２、６３および／または８３において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｗ）位置４８および／または８０において、アミノ酸残基はＺ６であり；（ｘ）位置４０において、アミノ酸残基はＺ１またはＺ２であり；（ｙ）位置９６において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ５であり；（ｚ）位置６５において、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６であり；（ａａ）位置８４および／または１１５において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ａｂ）位置９３において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ａｃ）位置１３０において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ａｄ）位置５８において、アミノ酸残基はＺ３、Ｚ４またはＺ６であり；（ａｅ）位置４７において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ６であり；（ａｆ）位置４９および／または１００において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ａｇ）位置６８において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ５であり；（ａｈ）位置１４３において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ａｉ）位置１３１において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ａｊ）位置１２５および／または１２８において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ａｋ）位置６７において、アミノ酸残基はＺ３またはＺ４であり；（ａｌ）位置６０において、アミノ酸残基はＺ５であり；および（ａｍ）位置３７において、アミノ酸残基はＺ４またはＺ６であり；ここに、Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択され；Ｚ２はＦ、ＷおよびＹよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ３はＮ、Ｑ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ４はＲ、ＨおよびＫよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１９９】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、さらに、（ａ）ないし（ａｍ）において特定された位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が（ａ）ないし（ａｍ）において特定されるアミノ酸残基制限に適合するアミノ酸配列をコードする。
【０２００】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも９０％が以下のさらなる制限に適合するアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置１、７、９、１３、２０、３６、４２、４６、５０、５６、６４、７０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、４１、４３、４４、５５、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｂ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０２０１】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、当該配列を配列番号：３００、４４５または４５７と最適に整列させた場合に、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の少なくとも９０％が以下の制限に適合するようなアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置１、７、９、１３、２０、４２、４６、５０、５６、６４、７０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１０７、１１０、１１７、１１８、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＢ１であり；および（ｂ）位置１６、２１、２２、２３、２５、２９、３４、３６、４１、４３、４４、５５、６６、７１、７３、７４、７７、８５、８７、８８、９５、９９、１０２、１０８、１０９、１１１、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＢ２であり；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＢ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０２０２】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、当該配列を配列番号：３００、４４５または４５７と最適に整列させた場合に、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の少なくとも９０％が以下の制限に適合するようなアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置１、７、９、２０、４２、５０、７２、７５、７６、７８、９４、９８、１１０、１２１および／または１４１において、アミノ酸残基はＺ１であり；（ｂ）位置１３、４６、５６、７０、１０７、１１７および／または１１８において、アミノ酸残基はＺ２であり；（ｃ）位置２３、５５、７１、７７、８８および／または１０９において、アミノ酸残基はＺ３であり；（ｄ）位置１６、２１、４１、７３、８５、９９および／または１１１において、アミノ酸残基はＺ４であり；（ｅ）位置３４および／または９５において、アミノ酸残基はＺ５であり；（ｆ）位置２２、２５、２９、４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１０８、１１６、１２２、１２７、１３３、１３４、１３６および／または１３７において、アミノ酸残基はＺ６であり；ここに、Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ２はＦ、Ｗ、およびＹよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ３はＮ、Ｑ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ４はＲ、ＨおよびＫよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ５はＤおよびＥよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＺ６はＣ、ＧおよびＰよりなる群から選択されるアミノ酸である。
【０２０３】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、さらに、Ｚ１およびＺ３よりなる群から選択されるアミノ酸残基を位置３６において含むアミノ酸配列をコードする。本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、Ｚ１およびＺ２よりなる群から選択されるアミノ酸残基を位置６４においてさらに含むアミノ酸配列をコードする。
【０２０４】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、当該配列を配列番号：３００、４４５または４５７と最適に整列させた場合に、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の少なくとも８０％が以下の制限に適合するようなアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置２において、アミノ酸残基はＩまたはＬであり；（ｂ）位置３において、アミノ酸残基はＥであり；（ｃ）位置４において、アミノ酸残基はＶまたはＩであり；（ｄ）位置５において、アミノ酸残基はＫであり；（ｅ）位置６において、アミノ酸残基はＰであり；（ｆ）位置８において、アミノ酸残基はＮであり；（ｇ）位置１０において、アミノ酸残基はＥであり；（ｈ）位置１１において、アミノ酸残基はＤまたはＥであり；（ｉ）位置１２において、アミノ酸残基はＴであり；（ｊ）位置１４において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｋ）位置１５において、アミノ酸残基はＬであり；（ｌ）位置１７において、アミノ酸残基はＨであり；（ｍ）位置１８において、アミノ酸残基はＲ、ＥまたはＫであり；（ｎ）位置１９において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ｏ）位置２４において、アミノ酸残基はＱであり；（ｐ）位置２６において、アミノ酸残基はＭ、Ｌ、ＶまたはＩであり；（ｑ）位置２７において、アミノ酸残基はＥであり；（ｒ）位置２８において、アミノ酸残基はＡまたはＶであり；（ｓ）位置３０において、アミノ酸残基はＭであり；（ｔ）位置３１において、アミノ酸残基はＹまたはＦであり；（ｕ）位置３２において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｖ）位置３３において、アミノ酸残基はＴまたはＳであり；（ｗ）位置３５において、アミノ酸残基はＬであり；（ｘ）位置３７において、アミノ酸残基はＲ、Ｇ、ＥまたはＱであり；（ｙ）位置３９において、アミノ酸残基はＡまたはＳであり；（ｚ）位置４０において、アミノ酸残基はＦまたはＬであり；（ａａ）位置４５において、アミノ酸残基はＹまたはＦであり；（ａｂ）位置４７において、アミノ酸残基はＲまたはＧであり；（ａｃ）位置４８において、アミノ酸残基はＧであり；（ａｄ）位置４９において、アミノ酸残基はＫ、ＲまたはＱであり；（ａｅ）位置５１において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ａｆ）位置５２において、アミノ酸残基はＳであり；（ａｇ）位置５３において、アミノ酸残基はＩまたはＶであり；（ａｈ）位置５４において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｉ）位置５７において、アミノ酸残基はＨまたはＮであり；（ａｊ）位置５８において、アミノ酸残基はＱ、Ｋ、ＲまたはＰであり；（ａｋ）位置５９において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｌ）位置６０において、アミノ酸残基はＥであり；（ａｍ）位置６１において、アミノ酸残基はＨまたはＲであり；（ａｎ）位置６３において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ａｏ）位置６５において、アミノ酸残基はＥ、ＰまたはＱであり；（ａｐ）位置６７において、アミノ酸残基はＱまたはＲであり；（ａｑ）位置６８において、アミノ酸残基はＫまたはＥであり；（ａｒ）位置６９において、アミノ酸残基はＱであり；（ａｓ）位置７９において、アミノ酸残基はＥであり；（ａｔ）位置８０において、アミノ酸残基はＧであり；（ａｕ）位置８１において、アミノ酸残基はＹ、ＨまたはＦであり；（ａｖ）位置８２において、アミノ酸残基はＲであり；（ａｗ）位置８３において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ａｘ）位置８４において、アミノ酸残基はＱであり；（ａｙ）位置８６において、アミノ酸残基はＡであり；（ａｚ）位置８９において、アミノ酸残基はＧ、ＴまたはＳであり；（ｂａ）位置９０において、アミノ酸残基はＬであり；（ｂｂ）位置９１において、アミノ酸残基はＬ、ＩまたはＶであり；（ｂｃ）位置９２において、アミノ酸残基はＲまたはＫであり；（ｂｄ）位置９３において、アミノ酸残基はＨであり；（ｂｅ）位置９６において、アミノ酸残基はＥまたはＱであり；（ｂｆ）位置９７において、アミノ酸残基はＩであり；（ｂｇ）位置１００において、アミノ酸残基はＫまたはＮであり；（ｂｈ）位置１０１において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｉ）位置１０３において、アミノ酸残基はＡまたはＶであり；（ｂｊ）位置１０４において、アミノ酸残基はＤであり；（ｂｋ）位置１０５において、アミノ酸残基はＭ、ＬまたはＩであり；（ｂｌ）位置１０６において、アミノ酸残基はＬであり；（ｂｍ）位置１１２において、アミノ酸残基はＴまたはＡであり；（ｂｎ）位置１１３において、アミノ酸残基はＳまたはＴであり；（ｂｏ）位置１１４において、アミノ酸残基はＡであり；（ｂｐ）位置１１５において、アミノ酸残基はＳであり；（ｂｑ）位置１１９において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｒ）位置１２０において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｂｓ）位置１２３において、アミノ酸残基はＦまたはＬであり；（ｂｔ）位置１２５において、アミノ酸残基はＥであり；（ｂｕ）位置１２６において、アミノ酸残基はＱまたはＨであり；（ｂｖ）位置１２８において、アミノ酸残基はＥまたはＤであり；（ｂｗ）位置１２９において、アミノ酸残基はＶまたはＩであり；（ｂｘ）位置１３０において、アミノ酸残基はＦであり；（ｂｙ）位置１３１において、アミノ酸残基はＤまたはＥであり；（ｂｘ）位置１３２において、アミノ酸残基はＴであり；（ｃａ）位置１３５において、アミノ酸残基はＶであり；（ｃｂ）位置１３８において、アミノ酸残基はＨであり；（ｃｃ）位置１３９において、アミノ酸残基はＩであり；（ｃｄ）位置１４０において、アミノ酸残基はＬまたはＭであり；（ｃｅ）位置１４２において、アミノ酸残基はＹであり；（ｃｆ）位置１４３において、アミノ酸残基はＫまたはＲであり；（ｃｇ）位置１４５において、アミノ酸残基はＬまたはＩであり；および（ｃｈ）位置１４６において、アミノ酸残基はＴである。
【０２０５】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、当該配列を、配列番号：３００、４４５または４５７と最適に整列させた場合に、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の少なくともとも９０％が前記（ａ）ないし（ｃｈ）で特定されたアミノ酸残基制限に適合するようなアミノ酸配列をコードする。
【０２０６】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号：５７７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：５７８に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号：６２１に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号：５７９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号：６０２に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列番号：６９７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号：７２１に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｈ）配列番号：６１３に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｉ）配列番号：６７７に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｊ）配列番号：５８４に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｋ）配列番号：７０７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｌ）配列番号：６１６に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｍ）配列番号：６１２に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および（ｎ）配列番号：５９０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択され、さらに、ここに、以下の位置に対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基のうち、少なくとも８０％は以下の制限に適合し：（ａ）位置９、７６、９４および１１０において、アミノ酸残基はＡであり；（ｂ）位置２９および１０８において、アミノ酸残基はＣであり；（ｃ）位置３４において、アミノ酸残基はＤであり；（ｄ）位置９５において、アミノ酸残基はＥであり；（ｅ）位置５６において、アミノ酸残基はＦであり；（ｆ）位置４３、４４、６６、７４、８７、１０２、１１６、１２２、１２７および１３６において、アミノ酸残基はＧであり；（ｇ）位置４１において、アミノ酸残基はＨであり；（ｈ）位置７において、アミノ酸残基はＩであり；（ｉ）位置８５において、アミノ酸残基はＫであり；（ｊ）位置２０、４２、５０、７８および１２１において、アミノ酸残基はＬであり；（ｋ）位置１および１４１において、アミノ酸残基はＭであり；（ｌ）位置２３および１０９において、アミノ酸残基はＮであり；（ｍ）位置２２、２５、１３３、１３４および１３７において、アミノ酸残基はＰであり；（ｎ）位置７１において、アミノ酸残基はＱであり；（ｏ）位置１６、２１、７３、９９および１１１において、アミノ酸残基はＲであり；（ｐ）位置５５において、アミノ酸残基はＳであり；（ｑ）位置７７において、アミノ酸残基はＴであり；（ｒ）位置１０７において、アミノ酸残基はＷであり；および（ｓ）位置１３、４６、７０および１１８において、アミノ酸残基はＹである。
【０２０７】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、以下の基準を満足する少なくとも１つのアミノ酸残基をさらに含むアミノ酸配列をコードし：（ａ）位置１４において、アミノ酸残基はＤであり；（ｂ）位置１８において、アミノ酸残基はＥであり；（ｃ）位置２６において、アミノ酸残基はＭまたはＶであり；（ｅ）位置３０において、アミノ酸残基はＩであり；（ｆ）位置３２において、アミノ酸残基はＤであり；（ｇ）位置３６において、アミノ酸残基はＭまたはＴであり；（ｉ）位置３７において、アミノ酸残基はＣであり；（ｊ）位置３８において、アミノ酸残基はＤであり；（ｊ）位置５３において、アミノ酸残基はＶであり；（ｋ）位置５８において、アミノ酸残基はＲであり；（ｌ）位置６１において、アミノ酸残基はＲであり；（ｍ）位置６２において、アミノ酸残基はＬであり；（ｎ）位置６４において、アミノ酸残基はＩまたはＦであり；（ｏ）位置６５において、アミノ酸残基はＰであり；（ｐ）位置７２において、アミノ酸残基はＩであり；（ｑ）位置７５において、アミノ酸残基はＶであり；（ｒ）位置８８において、アミノ酸残基はＴであり；（ｓ）位置８９において、アミノ酸残基はＧであり；（ｔ）位置９１において、アミノ酸残基はＬであり；（ｕ）位置９８において、アミノ酸残基はＩであり；（ｖ）位置１０５において、アミノ酸残基はＩであり；（ｗ）位置１１２において、アミノ酸残基はＡであり；（ｘ）位置１２４において、アミノ酸残基はＧまたはＣであり；（ｙ）位置１２８において、アミノ酸残基はＤであり；（ｚ）位置１４０において、アミノ酸残基はＭであり；（ａａ）位置１４３において、アミノ酸残基はＲであり；および（ａｂ）位置１４４において、アミノ酸残基はＷである。
【０２０８】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、当該配列を配列番号：３００、４５５または４５７と最適に整列させた場合に、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の少なくとも８０％が前記（ａ）ないし（ａｂ）において特定されたアミノ酸残基制限に適合するようなアミノ酸配列をコードする。
【０２０９】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、（ａ）（例えば、配列番号：９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、８３３、８３５、８３９、８４３、８４５、８５９、８６３、８７３、８７７、８９１、８９５、９０１、９０５、９０７、９１３、９１５または９５０をコードするヌクレオチド配列のような）配列番号：９１９に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｂ）（例えば、配列番号：９２９、９３１、８３５、８４３、８４９または８６７をコードするヌクレオチド配列のような）配列番号：９２９に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）（例えば、配列番号：８４５または８４７をコードするヌクレオチド配列のような）配列番号：８４７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：８５１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｅ）配列番号：８５３に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｆ）（例えば、配列番号：８３５または８５５をコードするヌクレオチド配列のような）配列番号：８５５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｇ）配列番号：８５７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｈ）（例えば、配列番号：８３９、８６１または８８３をコードするヌクレオチド配列のような）配列番号：８６１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｉ）配列番号：８７１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｊ）配列番号：８７５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｋ）配列番号：８８１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｌ）（例えば、配列番号：８４５または８８５をコードするヌクレオチド配列のような）配列番号：８８５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｍ）配列番号：８８７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｎ）（例えば、配列番号：８６３、８８９、８９１または９０３をコードするヌクレオチド配列のような）配列番号：８８９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｏ）配列番号：８９３に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｐ）配列番号：８９７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｑ）配列番号：８９９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｒ）（例えば、配列番号：８８３または９０９をコードするヌクレオチド配列のような）配列番号：９０９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｓ）配列番号：９１１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｔ）配列番号：８３７に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｕ）配列番号：８４１に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号：８６５に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｗ）配列番号：８６９に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；および（ｘ）配列番号：８７９に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２１０】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号：９１９に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、８３２、８３４、８３８、８４２、８４４、８５８、８６２、８７２、８７６、８９０、８９４、９００、９０４、９０６、９１２、９１４、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４９、９５１または９５２のようなヌクレオチド配列）；（ｂ）配列番号：９２９に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：９２８、９３０、８３４、８４２、８４８、８６６、９３６または９３７のようなヌクレオチド）；（ｃ）配列番号：８４７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８４４または８４６のようなヌクレオチド配列）；（ｄ）配列番号：８５１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８５０のようなヌクレオチド配列）；（ｅ）配列番号：８５３に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８５２のようなヌクレオチド配列）；（ｆ）配列番号：８５５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８３４または８５４のようなヌクレオチド配列）；（ｇ）配列番号：８５７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８５６のようなヌクレオチド配列）；（ｈ）配列番号：８６１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８３８、８６０または８８２のようなヌクレオチド配列）；（ｉ）配列番号：８７１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８７０のようなヌクレオチド配列）；（ｊ）配列番号：８７５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８７４のようなヌクレオチド配列）；（ｋ）配列番号：８８１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８８０のようなヌクレオチド配列）；（ｌ）配列番号：８８５に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８４４または８８４のようなヌクレオチド配列）；（ｍ）配列番号：８８７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８８６のようなヌクレオチド配列）；（ｎ）配列番号：８８９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８６２、８８８、８９０または９０２のようなヌクレオチド配列）；（ｏ）配列番号：８９３に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８９２のようなヌクレオチド配列）；（ｐ）配列番号：８９７に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８９６のようなヌクレオチド配列）；（ｑ）配列番号：８９９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８９８のようなヌクレオチド配列）；（ｒ）配列番号：９０９に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８８２または９０８のようなヌクレオチド配列）；（ｓ）配列番号：９１１に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：９１０のようなヌクレオチド配列）；（ｔ）配列番号：８３７に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８３６のようなヌクレオチド配列）；（ｕ）配列番号：８４１に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８４０のようなヌクレオチド配列）；（ｖ）配列番号：８６５に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８６４のようなヌクレオチド配列）；（ｗ）配列番号：８６９に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８６８のようなヌクレオチド配列）；および（ｘ）配列番号：８７９に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：８７８のようなヌクレオチド配列）よりなる群から選択される。
【０２１１】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、配列番号：９２９に対して少なくとも９５％同一であり、かつ（例えば、配列番号：８３７、８４９、８９３、８９７、９０５、９２１、９２７、９２９または９３１のような）配列番号：９２９の位置３３に対応するアミノ酸位置においてＧｌｙまたはＡｓｎ残基を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、配列番号：９２９に対して少なくとも９５％同一であって、配列番号：９２９の位置３３に対応するアミノ酸位置においてＧｌｙまたはＡｓｎ残基を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む（例えば、配列番号：８３６、８４８、８９２、８９６、９０４、９２０、９２６、９２８、９３０、９３８のようなヌクレオチド配列）。
【０２１２】
本発明のいくつかの好ましい単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、以下の基準を満足する１つ以上のアミノ酸残基をさらに含むアミノ酸配列を含む：（ａ）位置４１において、アミノ酸残基はＨであり；（ｂ）位置１３８において、アミノ酸残基はＨであり；（ｃ）位置３４において、アミノ酸残基はＮであり；および（ｄ）位置５５において、アミノ酸残基はＳである。
【０２１３】
本発明のポリペプチドの記載は、時々、本明細書中においては、いずれのアミノ酸残基が特定の位置で見出されるかについての可能な制限のリストとして表されるが、いくつかの具体例においては、本発明のポリペプチドは可能な制限の特定の組のすべてを満足する。すなわち、本明細書中におけるいくつかの例において、可能な制限のリストは、接続詞「および／または」によって接合されたオプションのリストとして表され、いくつかの具体例においては、各そのような接続詞は「または」よりもむしろ「および」として働く。いくつかの具体例において、別の可能性として表される可能な制限は本発明のポリペプチドに見出されるすべてであり；これは、別の可能性が相互に排他的でない場合にのみ真実である。
【０２１４】
配列の変動
遺伝子暗号の縮重により、本発明のＧＡＴポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が生じ得、そのいくつかは、本明細書中に明示的に開示された核酸配列に対して実質的な同一性を有することは当業者に認識されよう。
【０２１５】
【表１−１】
2010220617.tif 000024
【０２１６】
【表１−２】
2010220617.tif 000025
例えば、コドンの表（表１）を精査すると、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧおよびＣＧＵはすべてアミノ酸アルギニンをコードすることが示される。このようにして、アルギニンがコドンによって特定される本発明の核酸における各位置において、該コドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく前記した対応するコドンのいずれかに変化させることができる。ＲＮＡ配列におけるＵはＤＮＡ配列におけるＴに対応することが理解される。
【０２１７】
例として、配列番号：１のヌクレオチド１ないし１５  （ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＡＡＡ（配列番号：８２６））に対応するアミノ酸配列を用い、この配列のサイレント変異はＡＧＴ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  （配列番号：８２７）を含み；双方の配列はアミノ酸配列ＭＩＥＶＫ（配列番号：８２８）をコードし、これは、配列番号：６のアミノ酸１ないし５に対応する。
【０２１８】
かかる「サイレント変異」は、後に議論するように、「保存的に修飾された変異」の１つの種である。当業者であれば、（通常メチオニンに対するコドンのみであるＡＵＧを除き）核酸における各コドンは、機能的に同一のポリペプチドをコードするように標準的な技術によって修飾することができることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変種はいずれの記載された配列においても暗に含まれている。本発明は、可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することによってなすことができる本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の各いずれの可能な変異も提供する。これらの組合せは、本発明のＧＡＴホモログポリペプチドをコードする核酸配列に対して適用される標準的なトリプレット遺伝暗号（例えば、表１に記載）に従ってなされる。本明細書中における各核酸のすべてのそのような変種は特別に供され、遺伝暗号と組合された配列の考慮によって記載される。いずれの変種も本明細書中に記載するように生産される。
【０２１９】
同一の意味に翻訳される場合、すべてが同一アミノ酸をコードする２つ以上の異なるコドンの群は、本明細書中においては、「同義コドン」という。本明細書中に記載するように、本発明のいくつかの態様においては、ＧＡＴポリペプチドは、所望の宿主生物、例えば、植物宿主における最適化コドン用法に対して作成される。用語「最適化された」または「最適な」は、コドンの非常に最良な可能な組合せに制限されるつもりはなく、コード配列は、全体として、それが由来する前駆体ポリヌクレオチドに対するコドンの改良された用法を保有することを単に示す。このようにして、１つの態様において、本発明は、親コドンに対して、所望の宿主生物、例えば、植物で優先的に用いられる同義コドンで、ヌクレオチド配列中の少なくとも１つの親に置き換えることによってＧＡＴポリヌクレオチド変種を生産する方法を提供する。
【０２２０】
特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異」または単に「保存的変異」は、同一のまたは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、実質的に同一の配列をいう。当業者であれば、コードされた配列における単一のアミノ酸または小さなパーセンテージのアミノ酸（典型的には、５％未満、より典型的には４％、２％または１％以下）を改変、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加は、当該改変の結果、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に同様なアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす場合、「保存的に修飾された変異」である。
【０２２１】
機能的に同様なアミノ酸を提供する保存的置換の表は当該分野でよく知られている。表２は、相互に対して「保存的置換」であるアミノ酸を含む６つの群を記載する。
【０２２２】
（表２：保存的置換群）
【０２２３】
【表２】
2010220617.tif 000026
このようにして、本発明のリストされたポリペプチド配列の「保存的に置換された変異」は、ポリペプチド配列のアミノ酸の小さなパーセンテージ、典型的には５％未満、より典型的には２％未満、しばしば１％未満の、同一の保存的置換群の保存的に選択されたアミノ酸での置換を含む。このようにして、本発明のポリペプチドの保存的に置換された変異は、同一の保存的置換群の保存的に置換された変異での１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の置換を含み得る。
【０２２４】
例えば、本明細書中において配列番号：６で確認されるポリペプチドの保存的に置換された変異は、１４６のアミノ酸ポリペプチドにおける７までの残基（すなわち、アミノ酸５％）において、前記定義の６つの群に従った「保存的置換」を含むであろう。
【０２２５】
さらなる例において、もし４つの保存的置換が、配列番号：６のアミノ酸２１ないし３０に対応する領域に突き止められれば、この領域、
ＲＰＮ  ＱＰＬ  ＥＡＣ  Ｍ（配列番号：８２９）
の保存的に置換された変異の例は、表２にリストされた保存的置換に従って、
ＫＰＱ  ＱＰＶ  ＥＳＣ  Ｍ（配列番号：８３０）および
ＫＰＮ  ＮＰＬ  ＤＡＣ  Ｖ（配列番号：８３１）等を含む（前記した例においては、保存的置換には下線を施す）。前記置換の表と組み合わせて、本明細書中の蛋白質配列のリストは、すべての保存的に置換された蛋白質の表現リストを提供する。
【０２２６】
最後に、非−機能的または非−コード配列の付加のような、核酸分子のコードされた活性を改変しない配列の付加は、基本的な核酸の保存的変異である。
【０２２７】
当業者であれば、開示された核酸構築物の多くの保存的変異は、機能的に同一の構築物を生じることを認識するであろう。例えば、前記したように、遺伝暗号の縮重のため、「サイレントな置換」（すなわち、コードされたポリペプチドの改変をもたらさない核酸配列における置換）は、アミノ酸をコードする各核酸配列の暗に示された特徴である。同様に、アミノ酸配列中の１または数個のアミノ酸における「保存的アミノ酸置換」は高度に同様な特性を持つ異なるアミノ酸で置換され、開示された構築物に高度に同様なものとして容易に同定される。各開示された配列のそのような保存的変異は、本発明の特徴である。
【０２２８】
特定の核酸の非−保存的修飾は、保存的置換としては特徴付けられないいずれかのアミノ酸を置換するものである。例えば、表２に記載された６つの群の境界を横切るいずれかの置換。これらは、中性アミノ酸に代えての塩基性または酸性アミノ酸（例えば、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔに代えてのＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、またはＧｌｎ）、塩基性または酸性アミノ酸に代えての芳香族アミノ酸（例えば、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎに代えてのＰｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐ）の置換、またはアミノ酸を同様なアミノ酸で置き換えないいずれかの他の置換を含む。
核酸ハイブリダイゼーション
核酸は、それが典型的には溶液中で会合する場合、「ハイブリダイズする」。核酸は、水素結合、溶媒排除、塩基スタッキングなどのような種々のよく−特徴付けられた物理−化学的力のためハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドはＴｉｊｓｓｅｎ  （１９９３）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，  “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （“Ｔｉｊｓｓｅｎ”）），  ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，  前掲，  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ  （“Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １”）ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ  （“Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２”）に見い出され、オリゴヌクレオチドを含めたＤＮＡおよびＲＮＡの合成、標識、検出および定量についての詳細を提供している。
【０２２９】
サザーンおよびノーザーンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーショ
ン実験の関係での「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であって、異なる環境パラメーターの下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドはＴｉｊｓｓｅｎ  （１９９３）、前掲、およびＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １およびＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２，前掲に見い出される。
【０２３０】
本発明の目的では、一般に、「高度にストリンジェントな」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列につき熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃以下低いように選択される（後に記載するように、高度にストリンジェントな条件は比較用語においてもいうことができる）。該Ｔｍは、テスト配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてＴｍと等しくなるように選択される。
【０２３１】
核酸二重鎖のＴｍは、与えられた条件下で該二重鎖が５０％変性し、それが核酸ハイブリッドの安定性の直接的尺度を表す温度を示す。このようにして、Ｔｍは、ラセンからランダムコイルへの転移における中央点に対応する温度に対応し、それは、ヌクレオチドの長いストレッチについての、長さ、ヌクレオチド組成、およびイオン強度に依存する。
【０２３２】
ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしていない核酸物質を一連の洗浄によって除去することができ、その洗浄のストリンジェンシーは所望の結果に応じて調整することができる。（例えば、より高い塩およびより低い温度を用いる）低いストリンジェンシー洗浄条件は感度を増大させるが、非特異的ハイブリダイゼーションシグナルおよび高いバックグラウンドシグナルを生じ得る。（例えば、より低い塩、およびハイブリダイゼーション温度により近いより高い温度を用いる）より高いストリンジェンシー条件はバックグラウンドシグナルを低下させ、典型的には、特異的シグナルのみが残る。ここに引用してすべての目的でその全体を援用する、Ｒａｐｌｅｙ，  Ｒ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｊ．Ｍ．編，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  （Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．１９９８）（以下、「Ｒａｐｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ」）参照。
【０２３３】
ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは以下の方程式１を用いて見積もることができる：
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ｆ）−５００／ｎ
ここに、Ｍは一価カチオン（通常Ｎａ＋）のモル濃度であり、（％Ｇ＋Ｃ）はグアニシン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドのパーセンテージであり、（％ｆ）はホルマライズのパーセンテージであって、ｎはハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち、長さ）である。Ｒａｐｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  前掲参照。
【０２３４】
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは以下のように方程式２を用いることによって見積もることができる。
【０２３５】
Ｔｍ（℃）＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．５８（％Ｇ＋Ｃ）−１１．８（％Ｇ＋Ｃ）２−０．５６（％ｆ）−８２０／ｎ  ［式中、Ｍは一価カチオン（通常Ｎａ＋）のモル濃度であり、（％Ｇ＋Ｃ）はグアノシン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドのパーセンテージであり、（％ｆ）はホルムアミドのパーセンテージであって、ｎはハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち、長さ）である。Ｉｄ
方程式１および２は、典型的には、約１００ないし２００ヌクレオチドよりも長いハイブリッド二重鎖に対してのみ正確である。Ｉｄ  ５０ヌクレオチドよりも短い核酸配列のＴｍは以下のように計算することができる。
【０２３６】
Ｔｍ（℃）＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）
式中、Ａ（アデニン）、Ｃ、Ｔ（チミン）およびＧは対応するヌクレオチドの数である。  
【０２３７】
サザーンまたはノーザーンブロットにおけるフィルター上の、１００を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションについてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃における１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルマリンであり、ハイブリダイゼーションは一晩行う。ストリンジェントな洗浄条件の例は６５℃における１５分間の０．２×  ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液に記載についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前掲参照）。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄は、バックグラウンドプローブシグナルを除去するための低ストリンジェンシー洗浄が先行する。低ストリンジェンシー洗浄の例は４０℃における１５分間の２×  ＳＳＣである。
【０２３８】
一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける関連しないプローブで観察されたものよりも２．５×−５×（以上）のシグナル−対−ノイズ比率は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。本発明の意味における２つの配列の間の少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中における配列表に掲げた本発明の核酸に対する比較的強い構造的類似性またはホモロジーを示す。
【０２３９】
記載するように、「高度にストリンジェントな」条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特異的配列についての熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃以下低いように選択される。注目するヌクレオチド配列（例えば、「プローブ」）に密接に関連する、またはそれと同一の標的配列は、高度にストリンジェントな条件下で同定することができる。より低いストリンジェンシー条件は、相補性が低い配列に適している。例えば、Ｒａｐｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，前掲参照。
【０２４０】
比較ハイブリダイゼーションを用いて、本発明の核酸を同定することができ、この比較ハイブリダイゼーション方法は本発明の核酸を区別する好ましい方法である。本発明の意味における２つのヌクレオチド配列の間の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中における配列表に掲げた核酸に対する比較的強い構造的類似性／相同性を示す。２つのヌクレオチド配列の間の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件によって検出されるものよりも大きな構造、ヌクレオチド塩基組成、配置または順序のある程度の類似性またはホモロジーを示す。特に、本発明の意味における高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中における配列表に掲げた核酸に対する強い構造的類似性または構造的ホモロジー（例えば、ヌクレオチド構造、塩基組成、配置または順序）を示す。例えば、ストリンジェントな条件下で本明細書中における例示的核酸にハイブリダイズするテスト核酸を同定するのが望ましい。
【０２４１】
このようにして、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの１つの尺度は、高度にストリンジェントな条件（または非常にストリンジェントな条件、または超高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、または超−超高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件）下で、リストされた核酸（例えば、核酸配列、配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２、８２４、８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４７、９４９、９５１および９５２、およびその相補的ポリヌクレオチド配列）のうちの１つにハイブリダイズする能力である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション（ならびに高度にストリンジェントな、超−高ストリンジェンシー、または超−超高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件）および洗浄条件は、いずれのテスト核酸についても経験的に容易に決定することができる。例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を決定するにおいて、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、選択された組の基準が満たされるまで、（例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄における、温度を上昇させ、塩濃度を減少させ、洗剤濃度を増加させおよび／またはホルマリンのような有機溶媒の濃度を増加させることによって）徐々に増加させる。例えば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２、８２４、８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４７、９４９、９５１および９５２、およびその相補的ポリヌクレオチド配列から選択される１つ以上の核酸配列を含むプローブが、完全にマッチした相補的標的（再度、配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２、８２４、８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４７、９４９、９５１および９５２、およびその相補的ポリヌクレオチド配列から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸）に、少なくとも約２．５×、選択的に、マッチしていない標的に対するプローブのハイブリダイゼーションについて観察されたものの５×以上高いシグナル−対−ノイズ比率でもって結合するまで徐々に増加させる。この場合、マッチしていない標的は、本出願の出願時にＧｅｎＢａｎｋＴＭのような公のデータベースに存在する（添付の配列表におけるもの以外の）核酸に対応する核酸である。そのような配列は当業者によってＧｅｎＢａｎｋにおいて同定することができる。その例は、受託番号Ｚ９９１０９およびＹ０９４７６を含む。さらなるそのような配列は、例えば、当業者によってＧｅｎＢａｎｋにおいて同定することができる。
【０２４２】
テスト核酸は、それが、完全にマッチしたプローブが、受託番号Ｚ９９１０９およびＹ０９４７６のマッチしていないポリヌクレオチドのいずれかに対するハイブリダイゼーションで観察されたものよりも少なくとも約２×ないし１０×、場合によっては、２０×、５０×以上であるシグナル−対−ノイズ比率でもって完全にマッチした相補的標的に結合する条件下で、完全にマッチした相補的標的に対するプローブに少なくとも１／２よく、すなわち、標的に対するプローブのハイブリダイゼーションよりも少なくとも１／２の高さであるシグナル−対−ノイズ比率でもってハイブリダイズする場合に、プローブ核酸に特異的にハイブリダイズするといわれる。
【０２４３】
超高−ストリンジェンシーハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、完全にマッチした相補的標的核酸に対するプローブの結合についてのシグナル−対−ノイズ比率が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ９９１０９およびＹ０９４７６のマッチしていない標的核酸のいずれかへのハイブリダイゼーションで観察されたものの少なくとも１０×高くなるまでハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のストリンジェンシーを増加させるものである。完全にマッチした相補的標的核酸のそれの少なくとも１／２であるシグナル−対−ノイズ比率でもって、そのような条件下でプローブにハイブリダイズする標的核酸は、超高−ストリンジェンシー条件下でプローブに結合するといわれる。
【０２４４】
同様に、より高いレベルのストリンジェンシーでさえ、関連ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を徐々に増加させることによって決定することができる。例えば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のストリンジェンシーを、完全にマッチした相補的標的核酸へのプローブの結合についてのシグナル−対−ノイズ比率が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ９９１０９およびＹ０９４７６のマッチしていない標的核酸の高さのいずれかに対するハイブリダイゼーションについて観察されたものの少なくとも１０×、２０×、５０×、１００×、または５００×以上高くなるまで増加させるもの。完全にマッチした相補的標的核酸のそれの少なくとも１／２のシグナル−対−ノイズ比率でもって、そのような条件下でプローブにハイブリダイズする標的核酸は、超−超−高ストリンジェンシー条件下でプローブに結合するといわれる。
【０２４５】
配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２、８２４、８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４７、９４９、９５１および９５２によって表される核酸に、高、超−高および超−超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする標的核酸は本発明の特徴である。そのような核酸の例は、与えられた核酸配列と比較して１つの、または数個のサイレントなまたは保存的核酸置換を持つものを含む。
【０２４６】
ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸は、もしそれらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝子暗号によって許される最大コドン縮重を用いて核酸のコピーが作り出された場合、あるいはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ７０６６４のものを含めた、公知のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを用いて減算された、配列番号：５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９４６、９４８、９５０、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、および９７２の１つ以上に対して抗血清が生じた場合に起こる。本発明のポリペプチドの免疫学的同定についてのさらなる詳細は、後に見い出される。加えて、約１００ヌクレオチド未満の配列を持つ二重鎖の間を区別するためには、当業者に知られたＴＭＡＣ１ハイブリダイゼーション手法を用いることができる。ここに引用してその全体をすべての目的で援用するＳｏｒｇ，Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（Ｓｅｐｔ．１１，１９９１）１９（１７）参照。
【０２４７】
１つの態様において、本発明は、配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２、８２４、８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４７、９４９、９５１および９５２から選択される核酸におけるユニークなサブ配列を含む核酸を提供する。該ユニークなサブ配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ９９１０９およびＹ０９４７６のいずれかに対応する核酸と比較してユニークである。そのようなユニークなサブ配列は、配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２、８２４、８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４７、９４９、９５１および９５２のいずれかを、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ９９１０９およびＹ０９０７６によって表される核酸または本出願の出願日現在に公のデータベースで入手できる他の関連配列の完全な組に対して整列させることによって決定することができる。整列は、デフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて行うことができる。いずれかのユニークなサブ配列は、本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０２４８】
同様に、本発明は、配列番号：５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９４６、９４８、９５０、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、および９７２から選択されるポリペプチドにおけるユニークなサブ配列を含むポリペプチドを含む。ここに、該ユニークなサブ配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ７０６６４のそれに対応するポリペプチドと比較してユニークである。ここに、再度、ポリペプチドは受託番号ＣＡＡ７０６６４によって表される配列に対して整列される。もし該配列が偽遺伝子のような非−翻訳配列に対応するならば、対応するポリペプチドは、単に、核酸配列のアミノ酸配列へのイン・シリコ翻訳によって生じ、ここに、リーディングフレームは相同ＧＡＴポリヌクレオチドのリーディング配列に対応するように選択されることに注意されたし。
【０２４９】
また、本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号：５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、７６９、７７１、７７３、７７５、７７７、７７９、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９４６、９４８、９５０、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、および９７２から選択されるポリペプチドにおけるユニークなサブ配列をコードするユニークなコーディングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする標的核酸を提供し、ここに、ユニークなサブ配列は対照ポリペプチドのいずれかに対応するポリペプチドと比較してユニークである。ユニークな配列は前記したように決定される。
【０２５０】
１つの例において、ストリンジェント条件は、コーディングオリゴヌクレオチドに対する完全に相補的なオリゴヌクレオチドが、対照ポリペプチドのいずれかに対応する対照核酸への完全に相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションについてよりも少なくとも約２．５×ないし１０×高い、好ましくは少なくとも約５ないし１０×高いシグナル−対−ノイズ比率でもってコーディングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように選択される。条件は、シグナル−対−ノイズのより高い比率が、用いる特定のアッセイで観察されるように選択できる。例えば、約１５×、２０×、３０×、５０×以上。この例において、標的核酸は、コーディングオリゴヌクレオチドへの対照核酸のハイブリダイゼーションと比較して少なくとも２×高いシグナル−対−ノイズ比率でもってユニークなコーディングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。再度、より高いシグナル−対−ノイズ比率を選択することができる。例えば、約２．５×、５×、１０×、２０×、３０×、５０×以上。特定のシグナルは関連アッセイで用いる標識、例えば、蛍光標識、比色標識、放射性標識などに依存するであろう。
【０２５１】
ベクター、プロモーターおよび発現系
また、本発明は、前記にて広く記載したように、核酸配列の１つ以上を含む組換え構築物も含む。該構築物は、それに本発明の核酸配列が順方向または逆方向に挿入されたプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などのようなベクターを含む。この具体例の好ましい態様において、該構築物は、さらに、例えば、配列に作動可能に連結したプロモーターを含めた調節配列を含む。非常に多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、商業的に入手可能である。
【０２５２】
既に述べたように、ベクター、プロモーターおよび多くの他の関連トピックスの使用を含めた、ここにいうような分子生物学技術を記載する一般的なテキストはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５２，  （ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，  ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）（「Ｂｅｒｇｅｒ」）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｖｏｌ．１−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，（１９９９年を通じて補われたもの）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）を含む。例えば、本発明の相同核酸の生産のための、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含めたインビトロ増幅方法を通じて当業者を指令するのに十分なプロトコルの例は、Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．編（１９９０）  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｌｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）（「Ｉｎｎｉｓ」）；  Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ  （１９９０年１０月１日）  Ｃ  ＆  ＥＮ３６−４７；  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９９１）  ３：８１−９４；  Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１１７３；  Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４；  Ｌｏｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ３５：１８２６；  Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；  Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ  （１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１−２９４；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ  （１９８９）  Ｇｅｎｅ  ４：５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｇｅｎｅ  ８９：１１７；  およびＳｏｏｋｎａｎａｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ（１９９５）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４に見い出される。インビトロ増幅核酸をクローニングするための改良された方法は、Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。ＰＣＲによって大きな核酸を増幅させるための改良された方法は、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４−６８５およびそこに引用された文献にまとめられており、そこでは、４０ｋｂまでのＰＣＲアンプリコンが作られる。当業者であれば、実質的にいずれのＲＮＡも、制限消化、ＰＣＲ拡大および配列決定に適した二本鎖ＤＮＡに逆転した酵素およびポリメラーゼを用いて変換することができるのを認識するであろう。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ、すべて前掲参照。
【０２５３】
また、本発明は、本発明のベクター（例えば、本発明のクローニングベクターまたは本発明の発現ベクター）で形質導入（形質転換またはトランスフェクト）された作成された宿主細胞、ならびに組換え技術による本発明のポリペプチドの生産に関する。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどであってよい。作成された宿主細胞は、適切には、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはＧＡＴ相同遺伝子を増幅するために修飾された慣用的栄養培地中で培養することができる。温度ｐＨなどのような培養条件は発現のために選択された宿主細胞で以前用いられたものであり、当業者にとって、および、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＡｕｓｕｂｅｌおよびＢｅｒｇｅｒ、ならびに例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  第３版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびそこに引用された文献を含めたそこに引用された文献において明らかであろう。
【０２５４】
本発明のＧＡＴポリペプチドは、植物、酵母、真菌、細菌などのような非−動物細胞において生産することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌに加えて、非−動物細胞培養に関しての詳細は、Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）；  Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編  （１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ／Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ）；  およびＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ編，  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ  （１９９３）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬに見い出すことができる。
【０２５５】
本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するのに適した種々の発現ベクターのいずれか１つに取り込むことができる。適当なベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、レトロウイルスのようなウイルスＤＮＡ、および多くのその他を含む。遺伝子物質を細胞に導入するいずれのベクターも、もし複製が望まれれば、これは関連宿主中で複製可能であって、生存可能であるが、これを用いることができる。
【０２５６】
発現ベクターに取り込む場合、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ合成を指令するように適切な転写制御配列（プロモーター）に作動可能に連結される。トランスジェニック植物で用いるのに特に適したそのような転写制御配列の例は、米国仮出願第６０／２４５，３５４号に記載されたカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、ゴマノハグサ科ヒナノウスツボ属モザイクウイルス（ＦＭＶ）およびイチゴ葉脈縞模様ウイルス（ＳＶＢＶ）プロモーターを含む。原核生物または真核生物細胞またはそれらのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られており、本発明のいくつかの具体例で用いることができる他のプロモーターはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、およびファージラムダＰＬプロモーターを含む。発現ベクターは、選択的に、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、およびＰｉｎＩＩのような転写ターミネーターを含む。ベクターは、選択的に、発現を増幅するための適当な配列、例えば、エンハンサーを含む。
【０２５７】
加えて、本発明の発現ベクターは、選択的に、形質転換された宿主細胞の選択用の表現型形質を供するために１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。通常、選択マーカー遺伝子は抗生物質または除草剤抵抗性をコードする。適当な遺伝子は、抗生物質スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する抵抗性をコードするもの（例えば、ａａｄａ遺伝子）、ストレプトマイシン抵抗性につきコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）遺伝子、カナマイシンまたはジェネティシン抵抗性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ヒブロマイシン抵抗性につきコードするヒブロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子を含む。さらなる選択マーカー遺伝子は、真核生物細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン抵抗性、およびＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン抵抗性を含む。
【０２５８】
除草剤に対する抵抗性につきコードする適当な遺伝子はアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、特に、スルホニル尿素−タイプ除草剤の作用を阻害するように働くもの（例えば、そのような抵抗性に導く突然変異、特に、Ｓ４および／またはＨｒａ突然変異を含むアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子）、ホスフィノトリシンまたはバスタのようなグルタミンシンターゼの作用を阻害するように働くもの（例えば、ｂａｒ遺伝子）、または当該分野で知られた他のそのような遺伝子を含む。ｂａｒ遺伝子は除草剤バスタに対する抵抗性をコードし、ＡＬＳ遺伝子は除草剤クロルスルフロンに対する抵抗性をコードする。いくつかの例において、修飾されたＧＡＴ遺伝子は選択マーカーとして用いられる。
【０２５９】
本発明のベクターは、適当な宿主を形質転換して、該宿主が本発明の蛋白質またはポリペプチドを発現するのを可能とするように使用することができる。適当な発現宿主の例はＥ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような細菌細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａのような真菌細胞；ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３またはＢｏｗｅｓメラノーマのような哺乳動物細胞；または植物細胞または外植体などを含む。すべての細胞または細胞系が十分に機能的なＧＡＴポリペプチドを生産することができる必要はないことが理解され；例えば、ＧＡＴポリペプチドの抗原性断片を生産することができる。本発明は使用される宿主細胞によって制限されない。
【０２６０】
細菌系においては、ＧＡＴポリペプチドについての意図した使用に応じて、多数の発現ベクターを選択することができる。例えば、大量のＧＡＴポリペプチドまたはその断片が商業的生産または抗体の誘導で必要な場合、容易に精製される融合蛋白質の高レベル発現を指令するベクターが望ましい。そのようなベクターは、限定されるものではないが、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなマルチ機能的Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクターを含み、そこでは、ＧＡＴポリペプチドをコードする配列は、ハイブリッド蛋白質が生産されるように、ベータ−ガラクトシダーゼのアミノ−末端Ｍｅｔおよび引き続いての７残基のための配列にイン・フレーム連結することができる；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）；など。
【０２６１】
同様に、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、アルファ因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨのような構成的または誘導性プロモーターを含有する多数のベクターを、本発明のＧＡＴポリペプチドの生産で用いることができる。レビューについては、Ａｕｓｕｂｅｌ（前掲）およびＧｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４参照。
【０２６２】
哺乳動物宿主細胞においては、ウイルス−ベースの系を含めた多数の発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、例えば、ＧＡＴポリペプチドのコード配列を、選択的に、後期プロモーターおよび三部リーダー配列よりなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結する。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域へのＧＡＴポリペプチドコーディング領域の挿入の結果、感染された宿主細胞中でＧＡＴを発現することができる生きたウイルスが得られる（Ｌｏｇａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ（１９８４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３６５５−３６５９）。加えて、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることができる。
【０２６３】
同様に、植物細胞においては、発現は、植物染色体に組み込まれた導入遺伝子から、あるいはエピソームまたはウイルス核酸から細胞質で駆動できる。安定に組み込まれた導入遺伝子の場合、例えば、ウイルス、例えば、ＣａＭＶ、または植物由来調節配列を用い、本発明のＧＡＴポリヌクレオチドの構成的または誘導性発現を駆動することができる配列を供するのがしばしば望ましい。組織特異的に発現を指令する配列、例えば、ＴｏｂＲＢ７、パタチンＢ３３、ＧＲＰ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳ−３Ａプロモーターなどを含めた多数の植物由来調節配列が記載されている。別法として、植物ウイルスベクター、例えば、ＴＭＶ、ＢＭＶなどの外因性配列を一過的に発現することによって、高レベルの発現を達成することができる。典型的には、本発明のＧＡＴポリヌクレオチドを構成的に発現するトランスジェニック植物が好ましく、調節配列は、ＧＡＴポリペプチドの構成的安定な発現を確実とするように選択される。
【０２６４】
高等植物において核酸の発現で有用な典型的なベクターは当該分野でよく知られており、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：２５３−２７７によって記載されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍−誘導（Ｔｉ）プラスミドに由来するベクターを含む。ここで有用な例示的Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベクターはＳｃｈａｒｄｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｇｅｎｅ  ６１：１−１１およびＢｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：８４０２−８４０６のプラスミドｐＫＹＬＸ６およびｐＫＹＬＸ７である。ここに、もう１つの有用なベクターはＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）から入手可能なプラスミドｐＢＩ１０１．２である。ベクターとして使用することができる種々の植物組織は当該分野で知られており、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、ジェミニウイルス、スズメノチャヒキモザイクウイルス、およびタバコモザイクウイルスを含む。
【０２６５】
本発明のいくつかの具体例において、植物細胞の形質転換で適したＧＡＴポリヌクレオチド構築物が調製される。例えば、所望のＧＡＴポリヌクレオチドを組換え発現カセットに導入して、遺伝子の植物への導入、およびコードされたポリペプチドの引き続いての発現を容易とすることができる。発現カセットは、典型的には、形質転換された植物の意図した組織（例えば、全植物、葉、種子）における当該配列の発現を指令する、プロモーター配列および他の転写および翻訳開始調節配列に作動可能に連結したＧＡＴポリヌクレオチド、またはその機能的断片を含む。
【０２６６】
例えば、強くまたは弱く構成的な植物プロモーターを使用することができ、これは、植物のすべての組織においてＧＡＴポリペプチドの発現を指令する。そのようなプロモーターはほとんどの環境条件および発生または細胞分化の状態下で活性である。構成的プロモーターの例はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡに由来する１’−または２’−プロモーター、ユビキチン１プロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（米国特許第５，６８３，４３９号）、Ｎａｓプロモーター、ｐＥｍｕプロモーター、ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター、ＧＲＰ１−８プロモーター、および当業者に知られた種々の植物遺伝子からの他の転写開始領域を含む。ＧＡＴポリヌクレオチドの過剰発現が植物にとって有害であるか、またはそうでなければ望ましくない状況においては、当業者であれば、本開示をレビューすると、弱い構成的プロモーターを低レベルな発現で用いることができるのを認識するであろう。高レベルの発現が植物にとって有害でない場合には、強力なプロモーター、例えば、ｔ−ＲＮＡまたは他のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、あるいはカリフラワーモザイクウイルスプロモーターのような強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターを用いることができる。
【０２６７】
別法として、植物プロモーターは環境制御下に置くことができる。そのようなプロモーターは、本明細書中においては、「誘導性」プロモーターといわれる。誘導性プロモーターによって転写を行うことができる環境条件の例は病原体攻撃、嫌気性条件、または光の存在を含む。特に、誘導性プロモーターの例は低酸素症または低温ストレスによって誘導できるＡｄｈ１プロモーター、熱ストレスによって誘導できるＨｓｐ７０プロモーター、および光によって誘導できるＰＰＤＫプロモーターである。また、化学的に誘導できるプロモーターも有用である。
【０２６８】
本発明で用いるプロモーターは「組織−特異的」であり得、それ自体、葉、根、果実、花および／または種子のようなある組織においてのみポリヌクレオチドが発現される点で発生制御下であり得る。例示的プロモーターは葯特異的プロモーター５１２６である（米国特許第５，６８９，０４９号および第５，６８９，０５１号）。種子−特異的プロモーターの例は、限定されるものではないが、２７ｋＤガンマゼインプロモーターおよびワクシプロモーターを含む。Ｂｏｒｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．４７，９５−１０２；Ｒｅｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２１）：６４２６；およびＫｌｏｅｓｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：２３７−２４４。胚、果皮、および胚乳において発現させるプロモーターは１９９８年８月２０日に出願された米国特許出願第６０／０９７，２３３号、および１９９８年８月２８日に出願された第６０／０９８，２３０号に開示されている。これらの各々の開示を、ここに、引用によりその全体を援用する。植物系に対して内因性である１つ以上の核酸配列を構築物に取り込む具体例において、これらの遺伝子からの内因性プロモーター（またはその変種）は、トランスフェクトされた植物における遺伝子の発現を指令するために使用することができる。また、組織−特異的プロモーターを用いて、異種ポリヌクレオチドの発現を指令することもできる。
【０２６９】
一般に、植物において発現カセットで用いる特定のプロモーターは、意図した適用に依存する。異種または非−異種（すなわち、内因性）いずれかのプロモーターを使用して、本発明の核酸の発現を指令することができる。これらのプロモーターは、例えば、アンチセンス核酸の発現を駆動して、所望の組織における本発明の蛋白質の濃度および／または組成を低下させ、増加させ、または改変するために発現カセットで用いることもできる。植物細胞において転写を指令する多数のプロモーターのいずれも適当である。プロモーターは構成的または誘導性いずれかであり得る。前記したプロモーターに加えて、植物中で働く細菌起源のプロモーターはオクトピンシンターゼプロモーター、ネパリンシンターゼプロモーター、および自然発生型Ｔｉプラスミドに由来する他のプロモーターを含む（Ｈｅｒｒａｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３参照）。ウイルスプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターを含む（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）。他の植物プロモーターはリブロース−１，３−ビホスホン酸カルボキシラーゼ小サブユニットプロモーターおよびファゼオリンプロモーターを含む。Ｅ８遺伝子および他の遺伝子からのプロモーター配列を用いることもできる。Ｅ８プロモーターの単離および配列はＤｅｉｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  （１９８８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３３１５−３３２７に詳細に記載されている。
【０２７０】
候補プロモーターを同定するためには、ゲノミッククローンの５’部分を、プロモーター配列に特徴的な配列につき分析する。例えば、プロモーター配列エレメントはＴＡＴＡボックスコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）を含み、これは、通常、転写開始部位の上流の２０ないし３０塩基対である。植物においては、位置−８０ないし−１００におけるＴＡＴＡボックスからさらに上流には、典型的には、Ｍｅｓｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ，  Ｋｏｓａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．編，ｐｐ．２２１−２２７に記載されているように、トリヌクレオチドＧ（またはＴ）を囲う一連のアデニンを持つプロモーターエレメントがある。
【０２７１】
本発明のポリヌクレオチド構築物、例えば、ベクターを調製するにおいて、プロモーターおよび共接合ポリヌクレオチド以外の配列を使用することもできる。通常のポリペプチド発現が望まれるならば、ＧＡＴ−コーディング領域の３’−末端におけるポリアデニル化領域を含めることができる。該ポリアデニル化領域は、例えば、種々の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡに由来することができる。付加すべき３’末端配列は、例えば、ノパリンシンターゼまたはオクトピンシンターゼ遺伝子に由来することができるか、あるいは別法として、もう１つの植物遺伝子、またはより好ましくはないが、いずれかの他の真核生物遺伝子に由来することができる。
【０２７２】
イントロン配列を、コード配列または部分的コード配列の５’非翻訳領域に付加して、蓄積する成熟メッセージの量を増加させることができる。例えば、Ｂｕｃｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ  （１９８８）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：４３９５−４４０５およびＣａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：１１８３−１２００参照。トウモロコシイントロンＡｄｈ１、イントロン１、２および６、およびＢｒｏｎｚｅ−１イントロンの使用は当該分野で知られている。一般に、Ｆｒｅｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｌｂｏｔ編（１９９４）  Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），第１１６章参照。
【０２７３】
該構築物は、植物細胞に選択可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含むこともできる。例えば、マーカーは殺生物剤耐性、特に、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒブロマイシンに対する耐性のような抗生物質耐性、またはクロルスルフロン、またはホスフィノトリシン（除草剤ビアラフォスおよびバスタ中の有効成分）に対する耐性のような除草剤耐性をコードすることができる。
【０２７４】
特異的開始シグナルは、本発明のＧＡＴポリヌクレオチド−コード配列の効果的な翻訳を助けることができる。これらのシグナルは、例えば、ＡＴＧ開始コドンおよびアジュバント配列を含むことができる。ＧＡＴポリペプチド−コード配列、その開始コドンおよび上流配列を適当な発現ベクターに挿入する場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要ないであろう。しかしながら、コード配列（例えば、成熟蛋白質コード配列）またはその部分のみを挿入する場合、開始コドンを含めた外因性転写制御シグナルが供されなければならない。さらに、開始コドンは、全インサートの転写を確実とするために正しいリーディングフレームになければならない。外因性転写エレメントおよび開始コドンは、自然発生的および合成双方の種々の源のものであり得る。発現の効率は、使用する細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって増強することができる（Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−６２およびＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４）。
【０２７５】
分泌／局所化配列
本発明のポリヌクレオチドを、例えば、分泌／局所化配列をコードする核酸にイン−フレーム融合させて、ポリペプチド発現を宿主細胞の所望の細胞区画、膜またはオルガネラに標的化させ、あるいはペリプラズム空間への、または細胞培養培地へのポリペプチド分泌を指令することもできる。そのような配列は当業者に知られており、分泌リーダーペプチド、オルガネラ標的化配列（例えば、核局所化配列、ＥＲ滞留シグナル、ミトコンドリアトランジット配列、および葉緑体トランジット配列）、膜局所化／アンカー配列（例えば、停止移動配列、ＧＰＩアンカー配列）などを含む。
【０２７６】
好ましい具体例において、本発明のポリヌクレオチドは、通常は葉緑体に標的化されるポリペプチドをコードする遺伝子に由来するＮ−末端葉緑体トランジット配列（または葉緑体トランジットペプチド配列）とインフレーム融合される。そのような配列は、典型的には、セリンおよびスレオニンが豊富であり；アスパルテート、グルタメートおよびチロシンが不足し；一般に、正に荷電したアミノ酸が豊富な中央ドメインを有する。
【０２７７】
発現宿主
さらなる具体例において、本発明は、前記した構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、または植物細胞のような真核生物細胞であり得、あるいは宿主細胞は細菌細胞のような原核生物細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、または他の通常の技術によって行うことができる（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【０２７８】
宿主細胞は、選択的に、挿入された配列の発現を変調する、または所望の様式で発現された蛋白質をプロセッシングするその能力につき選択される。蛋白質のそのような修飾は、限定されるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含む。蛋白質の「プレ」または「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングもまた、正しい挿入、折り畳みおよび／または機能で重要であろう。Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、酵母、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などのような哺乳動物細胞のような異なる宿主細胞は特異的細胞マシーナリー、および例えば、翻訳後活性のための特徴的なメカニズムを有し、導入された外来性蛋白質の所望の修飾およびプロセッシングを確実とするように選択することができる。
【０２７９】
組換え蛋白質の長期の高収率生産のためには、安定な発現系を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドを安定に発現する植物細胞、外植体または組織、例えば、苗条または葉ディスクを、ウイルス複製起点または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質導入される。ベクターの導入に続き、細胞を、細胞型に対して適当であるように決められた期間、例えば、細菌細胞では１時間以上、植物細胞では１ないし４日、いくつかの植物外植体では２ないし４週間、豊富化培地中で増殖するようにでき、しかる後、それらは選択培地にスイッチされる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在は、導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能とする。例えば、本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物は、除草剤、グリホセートに対する耐性につき直接選択することができる。安定に形質転換された外植体に由来する耐性胚は、例えば、細胞型に適した組織細胞技術を用いて増殖させることができる。
【０２８０】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養からのコードされた蛋白質の発現および回収に適した条件下で培養される。組換え細胞によって生産された蛋白質またはその断片は、用いる配列および／またはベクターに応じて、分泌され、膜−結合され、または細胞内に含有され得る。当業者によって理解されるように、本発明のＧＡＴポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞膜を通じての成熟ポリペプチドの分泌を指令するシグナル配列を持つように設計することができる。
【０２８１】
さらなるポリペプチド配列
また、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、コードされたポリペプチドの精製を容易とするマーカー配列にイン−フレーム融合したコード配列も含む。そのような精製を容易とするドメインは、限定されるものではないが、固定化された金属での精製を可能とするヒスチジン−トリプトファンモジュール、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）（インフルエンザヘマグルチニン蛋白質に由来するエピトープに対応する；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ３７：７６７）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、マルトース結合蛋白質配列、ＦＬＡＧＳ延長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，  Ｓｅａｔｔｌｅ，  ＷＡ）などのような金属キレート化ペプチドを含む。精製ドメインおよびＧＡＴホモログ配列の間にプロテアーゼ−切断可能ポリペプチドリンカー配列を含めるのは、精製を容易とするのに有用である。本明細書中に記載された組成物および方法で用いるのに考えられる１つの発現ベクターは、エンテロキナーゼ切断部位によって分離されたポリヒスチジン領域に融合した本発明のポリペプチドを含む融合蛋白質の発現を提供する。ヒスチジン残基はＩＭＩＡＣ（Ｐｏｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３：２６３−２８１に記載された固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）による精製を容易とし、他方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合蛋白質からＧＡＴホモログポリペプチドを分離する手段を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般に、そのような融合蛋白質は可溶性であって、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ−融合）の場合にはグルタチオン−アガロースへの吸着、続いての遊離リガンドの存在下での溶出によって、溶解された細胞から容易に精製することができる。
【０２８２】
ポリペプチドの生産および回収
適当な宿主の形質導入、および適当な細胞密度までの宿主細胞の増殖に続き、適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によって選択されたプロモーターを誘導し、細胞をさらなる期間培養する。細胞は、典型的には、遠心によって収穫し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗製抽出物をさらなる形成のために保持する。蛋白質の発現で使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクリング、音波処理、機械的破壊を含めたいずれかの便宜な方法、または当業者によく知られた細胞溶解剤、またはその他の方法の使用によって破壊することができる。
【０２８３】
記載したように、多くの文献が細菌、植物、動物（特に哺乳動物）および古細菌起源の細胞を含めた、多くの細胞培養および生産で利用できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ（すべて前掲）、ならびにＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  第３版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびそこに引用された文献；Ｄｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７）  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ）；  Ｈｕｍａｓｏｎ（１９７９）  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  第４版（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；  およびＲｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：１０１６−１０２４参照。植物細胞の培養および再生については、Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）；  Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ／Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ）；  Ｊｏｎｅｓ編  （１９８４）  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｈｕｍａｌａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）；  およびＣｒｏｙ編（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｕ．Ｋ．），ＩＳＢＮ０  １１２  １９８３７０  ６参照。細胞培養基は、一般に、Ａｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ編（１９９３）  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ）参照。細胞培養についてのさらなる情報は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）からのＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  （１９９８）（「Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ」）および、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）からのＴｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  （１９９７）（「Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳ」）のような入手可能な商業的文献に見出される。植物細胞の形質転換およびトランスジェニック植物の生産に関するさらなる詳細は以下に見出される。
【０２８４】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、本明細書中で述べたタギングシステムのいずれかを用いるアフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）を含めた、当該分野でよく知られた多数の方法のいずれかによって組換え細胞培養から回収し、精製することができる。蛋白質再折畳み工程は、所望であれば、成熟蛋白質の立体配置を完成するのに用いることができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終の精製工程で使用することができる。前記した文献に加えて、例えば、Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ，；  Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  第２版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  ＮＹ）；  Ｗａｌｋｅｒ  （１９９６）  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  （Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＪ），  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）；  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）；  Ｓｃｏｐｅｓ  （１９９３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  第３版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  ＮＹ）；  Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ  （１９９８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｓｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  第２版（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  ＮＹ）；  およびＷａｌｋｅｒ  （１９９８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＪ）に記載されたものを含めた、種々の精製方法が当該分野でよく知られている。
【０２８５】
いくつかの場合、産業および／または商業適用に適した大規模で本発明のＧＡＴポリペプチドを生産するのが望ましい。簡単に述べれば、ＧＡＴポリヌクレオチド、例えば、配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２、８２４、８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４７、９４９、９５１および９５２のいずれか１つを含むポリヌクレオチド、または本発明のＧＡＴポリペプチドをコードする他の核酸を発現ベクターにクローン化することができる。例えば、Ｗｉｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，９５５，３１０号「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  Ａ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ  ＩＮ  Ａ  ＢＡＣＩＬＬＵＳ  ＣＥＬＬ」は、タンデムプロモーター、およびポリペプチドコード配列に作動可能に連結した安定化配列を持つベクターを記載する。注目するポリヌクレオチドをベクターに挿入した後、該ベクターを細菌、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＰＬ１８０１ＩＩＥ（ａｍｙＥ、ａｐｒ、ｎｐｒ、ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７）宿主に形質転換する。発現ベクターのＢａｃｉｌｌｕｓへの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換によって（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ（１９７９）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．��６８：１１１参照）、コンピテント細胞を用いることによって（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｉｎ（１９６１）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３、またはＤｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ（１９７１）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９参照）、エレクトロポレーションによって（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ  （１９８８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２）、またはコンジュゲーションによって（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ（１９８７）  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１参照）によって行うことができ、また、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ、すべて前掲、を参照されたし。
【０２８６】
形質転換された細胞を、当該分野で知られた方法を用い、ポリペプチドの生産に適した栄養培地中で培養する。例えば、細胞は、適当な培地中にて、かつポリペプチドが発現されおよび／または単離されるのを可能とする条件下で行う実験室または産業用ファーメンターにて、振盪フラスコ培養、（連続、バッチ、フェッド−バッチ、または固体状態発酵を含めた）小規模または大規模発酵によって培養することができる。培養は、当該分野で公知の手法を用い、炭素および窒素源および無機塩を含む適当な栄養培地中で行う。適当な培地は商業的供給業者から入手することができ、（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中の）公開された組成に従って調製することができる。分泌されたポリペプチドは培地から直接的に回収することができる。
【０２８７】
得られたポリペプチドは当該分野で公知の方法によって単離することができる。例えば、ポリペプチドは、限定されるものではないが、遠心、濾過、抽出、スプレイ−乾燥、蒸発または沈殿を含めた慣用的な手法によって栄養培地から単離することができる。次いで、単離されたポリペプチドを、限定されるものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動手法（例えば、分取用等電点電気泳動）、差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）または抽出を含めた当該分野で知られた種々の手法によってさらに精製することができる（例えば、Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  第２版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  ＮＹ）およびＷａｌｋｅｒ  （１９９６）  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  （Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＪ参照）。
【０２８８】
無細胞転写／翻訳システムを使用して、本発明のＤＮＡまたはＲＮＡを用いてポリペプチドを生産することもできる。いくつかのそのようなシステムは商業的に入手可能である。インビトロ転写および翻訳プロトコルに対する一般的なガイドはＴｙｍｍｓ  （１９９５）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ＮＹ），  ｖｏｌ．３７に見出される。
【０２８９】
配列組換え用の基質およびフォーマット
本発明のポリヌクレオチドは、選択的に、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋに記載された標準的クローニング方法でのそれらの使用に加えて、種々の多様性創製手法、例えば、突然変異、組換えおよび繰り返し可能組換え反応用の基質として用いて、所望の特性を持つさらなるＧＡＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドを得る。種々の多様性創製プロトコルは当該分野で入手でき、記載されている。該手法は別々に、および／または組み合せて用いて、ポリヌクレオチドの１つ以上の変種またはポリヌクレオチドの組、ならびにコードされた蛋白質の変種を生産することができる。個々に、および集合的に、これらの手法は、例えば、新しいおよび／または改良された特徴を持つポリヌクレオチド、蛋白質、経路、細胞および／または生物の作成または迅速な進化で有用な多様化ポリヌクレオチドおよび（例えば、ポリヌクレオチドライブラリーを含めた）ポリヌクレオチドの組を創製する頑強で広く適用できる方法を提供する。配列を改変するプロセスの結果、例えば、単一ヌクレオチド置換、多数ヌクレオチド置換、および核酸配列の領域の挿入または欠失をもたらし得る。
【０２９０】
明確性のために議論を確実とする間に、区別および分類がなされるが、技術はしばしば相互に排他的ではないことが認識されるであろう。事実、種々の方法を単独で、または組み合わせて、平行して、または系列的に用いて、多様な配列変種にアクセスすることができる。
【０２９１】
本明細書中で記載される多様性創製手法のいずれかの結果は１つ以上のポリヌクレオチドの創製であり得、これは、蛋白質をコードする、または所望の特性を付与するポリヌクレオチドにつき選択し、またはスクリーニングすることができる。本明細書中に記載された、または当業者に入手できる１つ以上の方法による多様化の後、生産されるいずれかのポリヌクレオチドを、所望の活性または特性、例えば、グリホセートに対する改変されたＫｍ、アセチルＣｏＡに対する改変されたＫｍ、別の補因子（例えば、プロピオニルＣｏＡ）の増大されたｋｃａｔの使用、などにつき選択することができる。これは、当該分野におけるアッセイのいずれかによって、例えば、自動または自動化可能フォーマットにて検出することができるいずれかの活性を同定することを含むことができる。例えば、増大した特異的活性を持つＧＡＴホモログは、グリホセートのＮ−アセチルグリホセートへの変換をアッセイすることによって、例えば、質量分析によって検出することができる。別法として、グリホセートに対する抵抗性を付与する改良された能力は、本発明の核酸で形質転換された細菌を、増大させる濃度のグリホセートを含有する寒天上で増殖させることによって、あるいは本発明の核酸を取り込むトランスジェニック植物にグリホセートをスプレイすることによってアッセイすることができる。種々の関連（または非関連でさえの）特性を実行者の判断により系列的にまたは平行して評価することができる。除草剤耐性に対する組換えおよび選択に関するさらなる詳細は、例えば、１９９９年８月１２日に出願された「ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｒｏｐｓ」（米国公開番号２００２／００５８２４９）に見出すことができる。
【０２９２】
マルチジーンシャッフリング、および多数の酵素ドメインをコードする修飾された核酸配列を作り出す方法を含めた、種々の多様性創製手法の記載は、以下の刊行物およびそこに引用された文献で見出される：Ｓｏｏｎｇ，  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５（４）：４３６−３９；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ４：１−４；Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：８９３−８９６；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７−７９３−７９７；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ  ３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４５０４−４５０９；Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．８：７２４−７３３；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１００−１０３；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３１５−３１９；Ｇａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：３７３−３８６；Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９６）“Ｓｅｘｕａｌ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ＡｓｓｅｍｂｌｙＰＣＲ”  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｐｐ．４４７−４５７；Ｃｒａｍｅｒｉ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９５）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：１９４−１９５；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）  Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１５１０；Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５４９−５５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０７４７−１０７５１。
【０２９３】
多様性を創製する突然変異方法は、例えば、部位特異的突然変異誘発（Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ」  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８；  Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ」  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｉｎ  ＆  Ｓｈｏｒｔｌｅ  （１９８５）「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１；  Ｃａｒｔｅｒ  （１９８６）「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  ２３７：１−７；およびＫｕｎｋｅｌ（１９８７）「Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｅｃｋｓｔｉｎ，  Ｆ．ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，  Ｄ．Ｍ．Ｊ．編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ））；ウラシル含有鋳型を用いる突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；  Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｅｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２；およびＢａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）「Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；  Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ  （１９８２）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ」  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；  Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ  （１９８３）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；およびＺｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ  （１９８７）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ」  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０）；
ホスホロチオエート−修飾ＤＮＡ突然変異誘発（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４；  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）「Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７；  Ｎａｋａｍａｙｅ  ＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  （１９８６）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８；Ｓａｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）「Ｙ−Ｔ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２；  およびＳａｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  「Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ」  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４）；  ギャップド二重鎖ＤＮＡを用いる突然変異誘発（Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）「Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ」１５４：３５０−３６７；  Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７；およびＦｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：  Ａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａ��ｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９）を含む。
【０２９４】
さらなる適当な方法はミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）「Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ」  Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７）、修復−欠乏宿主株を用いる突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ」  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；  およびＣａｒｔｅｒ  （１９８７）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ」  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３）、欠失突然変異（Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  （１９８６）「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ」  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５）、制限−選択および制限−精製（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）「Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ」  Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ  ３１７：４１５−４２３）、全遺伝子合成による突然変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）「Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ」  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１；  Ｓａｋａｎａｒ  ａｎｄ  Ｋｈｏｒａｎａ（１９８８）  「Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）」  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２；  Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）「Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ」Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３；およびＧｒｕｎｄｓｔｒｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ‘ｓｏｈｔ−ｇｕｎ’  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６；  二本鎖破壊修復（Ｍａｎｄｅｓｋｉ（１９８６）；  Ａｒｎｏｌｄ  （１９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５５；および「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８３：７１７７−７１８１）を含む。前記方法の多くについてのさらなる詳細は、やはり、種々の突然変異誘発方法に伴う発生の問題についての有用な制御を記載するＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５４に見出すことができる。
【０２９５】
種々の多様性創製方法に関するさらなる詳細は以下の米国特許、ＰＣＴ公開およびＥＰＯ公開に見出すことができる：Ｓｔｅｍｍｅｒに対する米国特許第５，６０５，７９３号（１９９７年２月２５日）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，８１１，２３８号（１９９８年９月２２日）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，８３０，７２１号（１９９８年１１月３日）、「ＤＮＡ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；  Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，８３４，２５２号（１９９８年１１月１０日）「Ｅｎｄ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」；  Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，８３７，４５８号（１９９８年１１月１７日）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；  ＷＯ  ９５／２２６２５、Ｓｔｅｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒａｍｅｒｉ、「Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；  Ｓｔｅｍｍｅｒ  ａｎｄ  ＬｉｐｓｃｈｕｔｚによるＷＯ  ９６／３３２０７「Ｅｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」；  Ｓｔｅｍｍｅｒ  ａｎｄ  ＣｒａｍｅｒｉによるＷＯ  ９７／２００７８  「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｈａｉｖｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；  Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  ａｎｄ  ＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ  ９７／３５９６６、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；  Ｐｕｎｎｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ９９／４１４０２、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」；  Ｐｕｎｎｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ９９／４１３８３、「Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」；  Ｐｕｎｎｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ９９／４１３６９、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；  Ｐｕｎｎｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ９９／４１３６８、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；  Ｓｔｅｍｍｅｒ  ａｎｄ  ＣｒａｍｅｒｉによるＥＰ  ７５２００８、「ＤＮＡ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；  ＳｔｅｍｍｅｒによるＥＰ  ０９３２６７０「Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ  Ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；  Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ９９／２３１０７、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｒｏｐｉｓｍ  ａｎｄ  Ｈｏｓｔ  Ｒａｎｇｅ  ｂｙ  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；  Ａｐｔ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ９９／２１９７９、「Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」；  Ｄｅｌ  Ｃａｒｄａｙｒｅ  ｅｔ  ａｌによるＷＯ  ９８／３１８３７、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；  Ｐａｔｔｅｎ  ａｎｄ  ＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ  ９８／２７２３０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；  Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ９８／１３４８７、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」；  ＷＯ  ００／００６３２、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」；  ＷＯ  ００／０９６７９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｎｋｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」；  Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ９８／４２８３２、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｒａｎｄｏｍ  ｏｒ  Ｒｅｆｉｎｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒｓ」；  Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ９９／２９９０２、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｒｅａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」；  ＶｉｎｄによるＷＯ  ９８／４１６５２、「Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ」；  Ｂｏｒｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ９８／４１６２２、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；  Ｐａｔｉ  ａｎｄ  ＺａｒｌｉｎｇによるＷＯ  ９８／４２７２７、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；  Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ００／１８９０６、「Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ−Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｇｅｎｅｓ」；  ｄｅｌ  Ｃａｒｄａｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ００／０４１９０、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；  Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ００／４２５６１、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；  Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ  ａｎｄ  ＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ  ００／４２５５９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｄａｔａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」；  Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ００／４２５６０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」；  Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ０１／２３４０１、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；  およびＡｆｆｈｏｌｔｅｒによるＷＯ  ０１／６４８６４、「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」。
【０２９６】
１９９９年９月２８日に出願されたＰａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．による「ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ  ＯＦ  ＣＯＤＯＮ  ＡＬＴＥＲＥＤ  ＧＥＮＳ」（ＵＳＳＮ  ０９／４０７，８００）；１９９８年７月１５日（ＵＳＳＮ  ０９／１６６，１８８）および１９９９年７月１５日（米国特許第６，３７９，９６４号）に出願されたｄｅｌ  Ｃａｒｄａｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．による「ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＷＨＯＬＥ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＯＲＧＡＮＩＳＭＳ  ＢＹ  ＲＥＣＵＲＳＩＶＥ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」；  １９９９年９月２８日に出願されたＣｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．による「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」（米国特許第６，３７６，２４６号）；  ２０００年１月１８日に出願されたＣｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．による「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」（ＷＯ  ００／４２５６１）；  １９９９年９月２８日に出願されたＷｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．による「ＵＳＥ  ＯＦ  ＣＯＤＯＮ−ＢＡＳＥＤ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＦＯＲ  ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ」（米国特許第６，４３６，６７５号）；  ２０００年１月１８日に出願されたＳｅｌｉｆｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．による「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＡＫＩＮＧ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ  ＳＴＲＩＮＧＳ，  ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＆  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＤＥＳＩＲＥＤ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（ＷＯ  ００／４２５６０）；  ２０００年７月１８日に出願されたＳｅｌｉｆｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．による「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＡＫＩＮＧ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ  ＳＴＲＩＮＧＳ，  ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＆  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＤＥＳＩＲＥＤ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（ＵＳＳＮ  ０９／６１８，５７９；  ２０００年１月１８日に出願されたＳｅｌｉｆｏｎｏｖ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒによる「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＯＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＤＡＴＡ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ  ＦＯＲ  ＵＳＥ  ＩＮ  ＥＶＯＬＵＴＩＯＮＡＲＹ  ＳＩＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」（ＷＯ  ００／４２５５９）；およびＡｆｆｈｏｌｔｅｒによる「ＳＩＮＧＬＥ−ＳＴＲＡＮＤＥＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＴＥＭＰＬＡＴＥ−ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＦＲＡＧＭＥＮＴ  ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ」（２０００年３月２日に出願されたＵＳＳＮ６０／１８６，４８２）を含めたある米国出願は、種々の多様性創製方法に関するさらなる詳細を提供する。
【０２９７】
手短に述べれば、突然変異、組換えなどのようないくつかの異なる一般的クラスの配列修飾方法を本発明に適用することができ、それは前記文献に記載されている。すなわち、生産された遺伝子融合構築物への成分核酸配列に対する改変は、配列の共接合前に、または共接合工程後のいずれかに、いずれかの数の記載されたプロトコルによって行うことができる。以下に、例えば、ある組換えベースの多様性創製フォーマットを含めた、本発明の意味における多様性創製のための異なるタイプの好ましいフォーマットのいくつかを例示する。
【０２９８】
核酸は、例えば、組換えるべき核酸のＤＮＡｓｅ消化、続いての、核酸の連結および／またはＰＣＲ再組立を含めた、前記文献に述べられた種々の技術のいずれかによってインビトロで組換えることができる。例えば、性的ＰＣＲ突然変異誘発を用いることができる、そこでは、ＤＮＡ分子のランダム（または偽ランダム、または非−ランダムさえの）断片化に続いて、異なるが関連するＤＮＡ配列を持つＤＮＡ分子間の配列類似性に基づいてインビトロで組換えを行い、続いて、ポリメラーゼ鎖反応における延長により交差を固定する。このプロセスおよび多くのプロセスの変形は前記した文献のいくつか、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１に記載されている。
【０２９９】
同様に、核酸は、例えば、細胞中の核酸の間で組換えを起こさせることによって、反復可能にインビボで組換えることができる。多くのそのようなインビボ組換えフォーマットは、前記した文献に記載されている。そのようなフォーマットは、選択的に、注目する核酸の間の直接的組換えを提供するか、あるいは注目する核酸を含むベクター、ウイルス、プラスミドなどの間の組換え、ならびに他のフォーマットを提供する。そのような手法に関する詳細は前記した文献に見出される。
【０３００】
全ゲノム組換え方法を用いることもでき、そこでは、細胞または他の生物のゲノムが組換えられ、選択的に、望むライブラリー成分（例えば、本発明の経路に対応する遺伝子）でのゲノム組換え混合物のスパイキングを含む。これらの方法は、標的遺伝子の同一性配列が知られていないものを含めた、多くの適用を有する。そのような方法についての詳細は、例えば、ｄｅｌ  Ｃａｒｄａｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ９８／３１８３７「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙＲｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；および、例えば、やはり「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙＲｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」なる発明の名称のｄｅｌ  Ｃａｒｄａｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ００／０４１９０に見出される。このようにして、単独での、または組み合わせての、組換え、反復可能組換え、およびゲノム組換えのためのこれらのプロセスおよび技術のいずれかを用いて、本発明の修飾された核酸配列および／または修飾された遺伝子融合構築物を創製することができる。
【０３０１】
合成組換え方法を用いることもでき、そこでは、注目する標的に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、１を超える親核酸に対応するオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲまたは連結反応で再組立てし、それにより、新しい組換えられた核酸を得る。オリゴヌクレオチドは標準的なヌクレオチド付加方法によって作成することができるか、あるいは、例えば、トリ−ヌクレオチド合成アプローチによって作成することができる。そのようなアプローチに関する詳細は、例えば、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ００／４２５６１、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ０１／２３４０１、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；  Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ００／４２５６０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」；およびＳｅｌｉｆｏｎｏｖ  ａｎｄ  ＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ  ００／４２５５９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｄａｔａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」を含めた前記文献に見出される。
【０３０２】
組換えのイン・シリコ方法を行うことができ、そこでは、遺伝子アルゴリズムをコンピューターで用いて、相同な（非−相同性）核酸に対応する配列ストリングを組換える。得られた組換えられた配列ストリングは、選択的に、例えば、オリゴヌクレオチド合成遺伝子再組立技術と共働して、組換えられた配列に対応する核酸の合成によって核酸に変換される。このアプローチはランダムな、部分的にランダムなまたは設計された変種を創製できる。対応する核酸（および／または蛋白質）の創製、ならびに（例えば、交差部位選択に基づいた）設計された核酸および／または蛋白質の組合せ、ならびに設計された偽−ランダムまたはランダム組換え方法と組み合わせた、遺伝子アルゴリズム、遺伝子オペレーターなどのコンピューターシステムにおける使用を含めた、イン・シリコ組換えに関する多くの詳細は、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ  ００／４２５６０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」、およびＳｅｌｉｆｏｎｏｖ  ａｎｄ  ＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ  ００／４２５５９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｄａｔａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」に記載されている。イン・シリコ組換え方法に関する広範な詳細はこれらの出願に見出される。この方法は、一般に、イン・シリコでの、（例えば、カロテノイド生合成経路、エクトイン生合成経路、ポリヒドロキシアルカノエート生合成経路、芳香族ポリケチド生合成経路などのような）種々の代謝経路に関与する核酸配列および／または蛋白質をコードする遺伝子融合構築物の組合せ、および／または対応する核酸または蛋白質の創製を提供するにおいて本発明に適用できる。
【０３０３】
例えば、多様な核酸または核酸断片の１本鎖鋳型へのハイブリダイゼーション、続いての、全長配列を再生するための重合および／または連結、選択的に、続いての、鋳型の分解および得られた修飾された核酸の回収により、自然発生的な多様性にアクセスする多くの方法を同様に用いることができる。１本鎖鋳型を使用する１つの方法において、ゲノムライブラリー（類）に由来する断片の集団を、反対鎖に対応する部分的、またはしばしばはほぼ全長のｓｓＤＮＡまたはＲＮＡと共にアニールする。次いで、この集団からの複合キメラ遺伝子の組立ては、非−ハイブリダイジング断片末端のヌクレアーゼ−ベースの除去、そのような断片の間にギャップを満たすための重合、および引き続いての１本鎖の連結によって媒介される。親ポリヌクレオチド鎖は、（例えば、もしＲＮＡまたはウラシルを含有するならば）消化、（もしそのような分離に導くように標識されたならば）変性条件下での時期的分離、および他の利用可能な分離／精製方法によって除去することができる。別法として、親鎖は、選択的に、キメラ鎖と共−精製され、引き続いてのスクリーニングおよびプロセッシング工程の間に除去される。このアプローチに関するさらなる詳細は、例えば、Ａｆｆｈｏｌｔｅｒによる「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」、ＷＯ  ０１／６４８６４に見出される。
【０３０４】
もう１つのアプローチにおいて、１本鎖分子は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換され、ｄｓＤＮＡ分子はリガンド−媒介結合によって固体支持体に結合される。未結合ＤＮＡの分離の後、選択されたＤＮＡ分子を支持体から放出させ、適当な宿主細胞に導入して、プローブにハイブリダイズする豊富化配列のライブラリーを得る。このようにして生じたライブラリーは、本明細書中に記載する手法のいずれかを用いるさらなる多様化のための望ましい基質を提供する。
【０３０５】
これまでの一般的組換えフォーマットのいずれも反復して実行して（例えば、突然変異／組換えの１つ以上のサイクルまたは他の多様性創製方法、選択的に、続いての１つ以上の選択方法）、組換え核酸のより多様な組を得ることができる。
【０３０６】
ポリヌクレオチド鎖停止方法を使用する突然変異誘発も提案されており（例えば、Ｓｈｏｒｔに対する米国特許第５，９６５，４０８号、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、および前記文献参照）、本発明に適用することができる。このアプローチにおいて、配列類似性の領域を共有する１つ以上の遺伝子に対応する二本鎖ＤＮＡを組合せ、該遺伝子に特異的なプライマーの存在下または不存在下で変性させる。次いで、一本鎖ポリヌクレオチドをアニールし、ポリメラーゼおよび鎖停止試薬（例えば、紫外線、ガンマまたはＸ−線照射；臭化エチジウム他のインターカレーター；一本鎖結合蛋白質、転写活性化因子またはヒストンのようなＤＮＡ結合蛋白質；多環芳香族炭化水素；三価クロムまたは三価クロム塩；または迅速熱サイクリングによって媒介される省略された重合など）の存在下でインキュベートし、その結果、部分的二重鎖分子が生産される。次いで、例えば、部分的に延長された鎖を含有する部分的二重鎖分子を変性し、複製または部分的複製の引き続いてのラウンドで再度アニールし、その結果、種々の程度の配列類似性を有し、ＤＮＡ分子の出発集団に対して多様化されたポリヌクレオチドが得られる。選択的に、生成物、または生成物の部分的プールをプロセス中の１つ以上の段階で増幅することができる。前記したような鎖停止方法によって生じたポリヌクレオチドは、いずれかの他の記載された組換えフォーマット用の適当な基質である。
【０３０７】
多様性は、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）「Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ」  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１２０５に記載された（ハイブリッド酵素の創製用の増分切形「ＩＴＣＨＹ」）といわれる組換え手法を用い、核酸または核酸の集団において作り出すことができる。このアプローチを用いて、選択的に、１つ以上のインビトロまたはインビボ組換え方法のための基質として働く変種の初期ライブラリーを得ることができる。また、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ」，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９６：３５６２−６７；およびＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）、「Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ」，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ７：２１３９−４４も参照。
【０３０８】
個々のヌクレオチドまたは連続もしくは非−連続ヌクレオチドの群の改変をもたらす突然変異方法は、好都合には、本発明の核酸配列および／または遺伝子融合構築物へヌクレオチド多様性を導入するのに使用することができる。多くの突然変異誘発方法は前記引用の文献に見出され；突然変異誘発方法に関するさらなる詳細は以下に見出すことができ、これを本発明に適用することもできる。
【０３０９】
例えば、エラー−傾向ＰＣＲを用いて、核酸変種を創製することができる。この技術を用い、完全長のＰＣＲ産生物と共に高い割合の点突然変異が得られるように、ＤＮＡポリメラーゼのコピーイング忠実度が低い条件下でＰＣＲを行う。そのような技術の例は前記文献および、例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５およびＣａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３で見出される。同様に、小さなＤＮＡ断片の混合物からＰＣＲ産生物を組立てることを含むプロセスにおいて、アセンブリーＰＣＲを用いることができる。非常に多数の異なるＰＣＲ反応が同一反応混合物中で平行して起こることができ、１つの反応の産生物はもう１つの反応の産生物の起点となる。
【０３１０】
オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いて、注目する核酸配列に部位−特異的突然変異を導入することができる。そのような技術の例は前記文献および、例えば、Ｌｅｉｂｈａａｒ−ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７で見出される。同様に、二本鎖ＤＮＡ分子の小さな領域を、自然発生的配列とは異なる合成オリゴヌクレオチドカセットで置き換えるプロセスで、カセット突然変異誘発を用いることができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、完全におよび／または部分的にランダム化された自然発生的配列（複数配列）を含むことができる。
【０３１１】
反復可能なアンサンブル突然変異誘発は、蛋白質突然変異誘発用のアルゴリズムを用いて、そのメンバーがアミノ酸とは異なる、表現型的に関連する突然変異体の多様な集団を作り出すプロセスである。この方法は、連続ラウンドのコンビナトーリアルカセット突然変異誘発をモニターするためにフィードバックメカニズムを用いる。このアプローチの例はＡｒｋｉｎ  ＆  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５で見出される。
【０３１２】
指数関数アンサンブル突然変異誘発は、高いパーセンテージのユニークかつ機能的突然変異体でのコンビナトーリアルライブラリーを創製するために用いることができる。注目する配列中の残基の小さな群を平行してランダム化して、各改変された位置において、機能的蛋白質に導くアミノ酸を同定する。そのような手法の例はＤｅｌｅｇｒａｖａ  ＆  Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｒｅｓ．１１：１５４８−１５５２に見出される。
【０３１３】
インビボ突然変異誘発を用いて、例えば、ＤＮＡ修復経路の１つ以上において突然変異を運ぶＥ．  ｃｏｌｉの株においてＤＮＡを増殖させることによって、注目するいずれかのクローン化されたＤＮＡにおいてランダム突然変異を作り出すことができる。これらの「ミューテーター」株は、野生型親のそれよりも大きなランダム突然変異率を有する。これらの株の１つにおけるＤＮＡの増殖は、結局は、ＤＮＡ内にランダム突然変異を生じさせるであろう。そのような手法は前記した文献に記載されている。
【０３１４】
ゲノム、例えば、細菌、真菌、動物または植物ゲノムに多様性を導入する他の手法は、前記したおよび／または参照される方法と組み合わせて用いることができる。例えば、前記した方法に加えて、種々の種への形質転換に適した核酸マルチマーを生じる技術が提案されている（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇａｒの米国特許第５，７５６，３１６号および前記文献参照）。（例えば、自然発生的多様性に由来する、あるいは部位特異的突然変異誘発、エラー傾向ＰＣＲ、突然変異細菌株を通じての継代の適用を介する）相互に対して多様な遺伝子よりなるそのようなマルチマーでの適当な宿主の形質転換により、例えば、前記したインビボ組換えプロセスによって、ＤＮＡ多様化のための核酸多様性の源が提供される。
【０３１５】
別法として、部分的配列類似性の領域を共有する多数のモノマーポリヌクレオチドを宿主種に形質転換し、宿主細胞によってインビボで組み換えることができる。細胞分裂の引き続いてのラウンドを用いて、そのメンバーがモノマーポリヌクレオチドの単一の相同集団またはプールを含むライブラリーを作り出すことができる。別法として、モノマー核酸は標準的な技術、例えば、ＰＣＲおよび／またはクローニングによって回収することができ、前記した反復可能組換えフォーマットを含めた組換えフォーマットのいずれかで組み換えることができる。
【０３１６】
マルチ種発現ライブラリーを作り出すための方法は記載されており（前記文献に加え、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  米国特許第５，７８３，４３１号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＡＮＤ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＮＯＶＥＬ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＰＡＴＨＷＡＹＳ」；およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  米国特許第５，８２４，４８５号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＡＮＤ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＮＯＶＥＬ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＰＡＴＨＷＡＹＳ」参照）、注目する蛋白質活性を同定するためのそれらの使用が提案されている（前記文献に加え、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）米国特許第５，９５８，６７２号、「ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＯＦ  ＣＬＯＮＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＤＮＡ  ＦＲＯＭ  ＵＮＣＵＬＴＩＶＡＴＥＤ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ」参照。マルチ種発現ライブラリーは、一般には、発現カセット中に、適当な調節配列に作動可能に連結した複数の種または株からのｃＤＮＡまたはゲノム配列を含むライブラリーを含む。ｃＤＮＡおよび／またはゲノム配列は、選択的に、ランダムに連結されて、さらに多様性を増強させる。ベクターは、宿主生物、例えば、細菌種または真核生物細胞の１を超える種における形質転換および発現に適したシャトルベクターであり得る。
いくつかの場合には、ライブラリーは、注目する蛋白質をコードする、または注目する核酸にハイブリダイズする配列を予め選択することによってバイアスされる。いずれのそのようなライブラリーも、本明細書中に記載された方法のいずれかのための基質として提供することができる。
【０３１７】
前記した手法は、増大する核酸および／またはコードされた蛋白質の多様性に大いに向けられてきた。しかしながら、多くの場合において、多様性のすべてが有用というのではなく、例えば、機能的であり、スクリーニングまたは選択して、小数の好都合な変種を同定しなければならない変種のバックグラウンドの増大に単に寄与する。いくつかの適用においては、例えば、組換え−ベースの突然変異誘発手法によって、多様化に先立ち、ライブラリー（例えば、増幅されたライブラリー、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、正規化されたライブラリーなど）または他の基質核酸を予め選択し、または予めスクリーニングし、あるいはそうでなければ、機能的産生物をコードする核酸に向けて基質をバイアスするのが望ましい。例えば、抗体作成の場合には、記載した方法のいずれかによって、操作の前にインビボ組換え事象を利用することにより、機能的抗原結合部位を持つ抗体に対して多様性創製プロセスをバイアスすることができる。例えば、本明細書中に記載する方法のいずれかに従う多様化に先立ち、Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリーに由来する組み換えられたＣＤＲを増幅し、フレームワーク領域に組立てることができる（例えば、Ｊｉｒｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）「Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐａｃｅ：ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｏｒｍｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｍａｓｔｅｒ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ」Ｇｅｎｅ  ２１５：４７１）。
【０３１８】
ライブラリーは、所望の酵素活性を持つ蛋白質をコードする核酸に向けてバイアスすることができる。例えば、特定された活性を呈するライブラリーからクローンを同定した後、ＤＮＡ改変を導入するためのいずれかの公知の方法を用いて突然変異誘発することができる。次いで、突然変異誘発されたホモログを含むライブラリーを、最初に特定された活性と同一または異なり得る所望の活性につきスクリーニングする。そのような手法の例は、「ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＤＥＳＩＲＥＤ  ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ  ＢＹ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ」についてのＳｈｏｒｔ  （１９９９）  米国特許第５，９３９，２５０号に提案されている。所望の活性は当該分野で知られたいずれかの方法によって同定することが可能なことが示唆されている（例えば、ＷＯ５８／５８０８５）。例えば、ＷＯ  ９９／１０５３９は、代謝的に豊富な細胞から得られた成分と遺伝子ライブラリーからの抽出物とを合わせ、所望の活性を呈する組合せを同定することによって遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることができることを提案する。また、所望の活性を持つクローンは、ライブラリーの試料に生活性基質を挿入し、蛍光アナライザー、例えば、フローサイトメトリーデバイス、ＣＣＤ、フルオロメーターまたは分光光度計を用いて所望の活性の産生物に対応する生活性蛍光を検出することによって同定することができる。
【０３１９】
また、ライブラリーは、特定の特徴、例えば、選択された核酸プローブへのハイブリダイゼーションを有する核酸に向けてバイアスすることもできる。例えば、ＷＯ  ９９／１０５９３は、所望の活性（例えば、酵素活性、例えば：リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、オキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、ヒドラターゼ、ニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、アミダーゼまたはアシラーゼ）をコードするポリヌクレオチドは、ゲノミックＤＮＡ配列から同定することができると提案している。特に、ゲノミックＤＮＡの集団からの一本鎖ＤＮＡ分子はリガンド−コンジュゲーテッドプローブにハイブリダイズされる。ゲノミックＤＮＡは、培養されたまたは培養されていない微生物から、または環境試料から由来することができる。別法として、ゲノミックＤＮＡは多細胞生物、またはそれに由来する組織に由来することができる。第二の鎖合成は、捕獲培地からの先立っての放出の有りまたは無しにて、あるいは当該分野で知られた広く種々の他の戦略によって、捕獲で用いるハイブリダイゼーションプローブから直接的に行うことができる。別法として、単離された一本鎖ゲノミックＤＮＡ集団は、さらなるクローニング無くして断片化し、例えば、前記したように一本鎖鋳型を使用する組換え−ベースのアプローチで直接的に用いることができる。
【０３２０】
核酸およびポリペプチドを創製する「非−確率的」方法はＳｈｏｒｔ  「Ｎｏｎ−Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」  ＷＯ  ００／４６３４４に記載されている。提案された非−確率的ポリヌクレオチド再組立ておよび部位−飽和突然変異誘発方法を含めたこれらの方法は同様に本発明に適用することができる。ドープドまたは変性オリゴヌクレオチドを用いるランダムまたはセミ−ランダム突然変異誘発も、例えば、Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）  「Ｏｐｒｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９７−３００；Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）「Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６；  Ｌｉｍ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ  （１９９１）  「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐａｃｋｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ」  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３５９−７６；Ｂｒｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ  （１９８９）  「Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ５１Ｆ  ｔｏ  ｌａｍｂｄａ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ」  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３３５５−６０）；  「Ｗａｌｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」（Ｃｒｅａ，  Ｒ；米国特許第５，８３０，６５０号および第５，７９８，２０８号、およびＥＰ特許０５２７８０９  Ｂ１）に記載されている。
【０３２１】
また、多様化に先立ってライブラリーを豊富化するのに適した前記技術のいずれかを用いて、多様性創製方法によって生じた生成物または生成物のライブラリーをスクリーニングすることもできるのは容易に認識されよう。前記方法のいずれかは反復して、あるいは組み合わせて実施して、核酸、例えば、ＧＡＴをコードするポリヌクレオチドを改変することができる。
【０３２２】
突然変異誘発用のキット、ライブラリー構築および他の多様性創製方法も商業的に入手可能である。例えば、キットは、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位−特異的突然変異誘発キット；およびＣｈａｍｅｌｅｏｎＴＭ二本鎖部位−特異的突然変異誘発キット）；Ｂｉｏ／Ｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ（例えば、前記したＫｕｎｋｅｌ方法を使用）；  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；  Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （例えば、５プライマー３プライマーキット）；  Ｇｅｎｐａｋ  Ｉｎｃ．；Ｌｅｍａｒｇｏ  Ｉｎｃ．；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｌｏｒｏｇｉｅｓ  （Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）；  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．；Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ（例えば、前記Ｅｃｋｓｔｉｎ方法を使用）；およびＡｍｇｌｉａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ（例えば、前記Ｃａｒｔｅｒ／Ｗｉｎｔｅｒ方法を使用）から入手できる。
【０３２３】
前記文献は組換え、反復可能組換え、反復可能突然変異、および突然変異と他の形態の突然変異誘発との組合せを含めた多くの突然変異フォーマット、ならびにこれらのフォーマットの多くの修飾を提供する。用いられる多様性創製フォーマットにかかわらず、本発明の核酸を（相互に、または関連する（関連しないさえの）配列と）組換えて、例えば、相同核酸の組、ならびに対応するポリペプチドを含めた、本発明の遺伝子融合構築物および修飾された遺伝子融合構築物で用いるための組換え核酸の多様な組を得ることができる。
【０３２４】
修飾されたポリヌクレオチドを創製するための前記方法の多くは、親配列または複数配列の非常に多数の多様な変種を作り出す。本発明のいくつかの好ましい具体例において、修飾技術（例えば、シャッフリングのいくつかの形態）を用いて、変種のライブラリーを創製し、次いで、これを、いくつかの所望の機能的属性、例えば、改良されたＧＡＴ活性をコードする修飾されたポリヌクレオチドまたは修飾されたポリヌクレオチドプールにつきスクリーニングする。スクリーニングすることができる例示的酵素活性は（ｋｃａｔおよびＫＭのような動的定数の点で慣用的に特徴付けられる）触媒速度、基質特異性、および基質、産生物または他の分子（例えば、阻害剤またはアクチベーター）による活性化または阻害に対する感受性を含む。
【０３２５】
所望の酵素活性についての選択の１つの例は、注目する酵素活性、例えば、ＧＡＴ活性を十分には発現しない細胞の増殖および／または生存を阻害する条件下で宿主細胞を増殖させることを含む。そのような選択プロセスの使用は、所望の酵素活性をコードするものを除いたすべての修飾されたポリヌクレオチドを考慮から排除することができる。例えば、本発明のいくつかの具体例においては、十分なレベルのＧＡＴの存在下で細胞の増殖または生存を阻害する条件、例えば、ＧＡＴポリヌクレオチドを欠くまたはそれを発現しない同一活性の野生型植物の増殖にとって致死的である、またはそれを阻害するグリホセートの濃度下で、宿主細胞を維持する。これらの条件下では、十分なレベルの産生物の生産を触媒することができる酵素活性または複数酵素活性をコードする修飾された核酸を保有する宿主細胞のみが生存し、増殖する。本発明のいくつかの具体例は、グリホセートまたはグリホセートアナログの増大する濃度において、多数ラウンドのスクリーニングを使用する。
【０３２６】
本発明のいくつかの具体例において、質量分析を用いて、グリホセート、またはグリホセートのアナログもしくは代謝産生物のアセチル化を検出する。質量分析の使用は、後の実施例でより詳細に記載する。
【０３２７】
便宜および高スループットのためには、微生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌において所望の修飾された核酸につきスクリーニング／選択するのがしばしば望ましいであろう。他方、植物細胞または植物におけるスクリーニングは、ある場合には、究極の目的が植物系での発現のための修飾された核酸を作り出すことであれば、好ましい。
【０３２８】
本発明のいくつかの好ましい具体例において、スループットは、単独で、あるいは遺伝子融合構築物の一部として、異なる修飾された核酸を発現する宿主細胞のプールをスクリーニングすることによって増大させる。有意な活性を示すいずれのプールを解除して、所望の活性を発現する単一クローンを同定することができる。
【０３２９】
当業者であれば、所望の宿主生物、および当該分野で知られた他のパラメーターに依存して、関連アッセイ、スクリーニングまたは選択方法が変化することを認識するであろう。高スループットフォーマットで実行することができるアッセイを使用するのが通常は有利である。
【０３３０】
高スループットアッセイでは、一日に数千までの異なる変種をスクリーニングするのが可能である。例えば、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて別々のアッセイを行うことができるか、あるいはもし濃度またはインキュベーション時間の効果を観察すべきであれば、５ないし１０ウェルで単一変種をテストすることができる。
【０３３１】
流体アプローチに加えて、前記したように、所望の酵素または代謝機能につき選択する細胞または培地プレート上で簡単に細胞を増殖させることが可能である。このアプローチは単純かつ高スループットのスクリーニング方法を供する。
【０３３２】
多数のよく知られたロボットシステムが、アッセイシステムで有用な液相化学のために開発されている。これらのシステムは、Ｔａｋｅｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  ＬＴＤ．（Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）によって開発された自動合成装置のような自動化ワークステーション、および科学者によって実行される手動合成操作を模倣するロボットアームを利用する多くのロボットシステムを含む（Ｚｙｍａｔｅ  ＩＩ、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ；およびＯｒｃａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を含む。前記デバイスのいずれも、本発明への適用で適している。これらの装置（もしあれば）が統合されたシステムとの関係でここで議論するように操作できるようなそれらのデバイスの性質およびそれらのデバイスに対する修飾の実行は当業者に明らかであろう。
【０３３３】
高スループットスクリーニングシステムは商業的に入手可能である（例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．，  Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，  ＭＡ；  Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｍｅｎｔｏｒ，  ＯＨ；  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎａｔｉｃｋ，  ＭＡなど参照）。これらのシステムは、典型的には全サンプルおよび試薬ピペッディング、液体分注、適宜インキュベーション、および特定のアッセイに適したディテクター（類）におけるマイクロプレートの最終的な読みを含めた全手法を自動化する。これらの配置可能なシステムは高スループットおよび迅速な開始ならびに高度な柔軟性および慣用化を提供する。
【０３３４】
そのようなシステムの製造は、種々の高スループットデバイスのための詳細なプロトコルを提供する。このようにして、例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写、リガンド結合等の変調を検出するためのスクリーニングシステムを記載する技術ブレチンを提供する。試薬操作に対するに微量流体アプローチも、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （マウンティンＶｉｅｗ，  ＣＣＡ）によって開発されている。
【０３３５】
カメラまたは他の記録デバイス（例えば、フォトダイオードおよびデータ貯蔵デバイス）によって見られ（選択的に、記録された）光学イメージは、選択的に、例えば、イメージをデジタル化しおよび／または該イメージを貯蔵し、コンピュータで分析することによって、本明細書中の具体例のいずれかでさらに貯蔵される。様々な商業的に入手可能な末梢機器およびソフトウエアは、例えば、ＰＣ（Ｉｎｔｅｌ×８６またはＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）チップコンパティブルＤＯＳ、ＯＳＴＭ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ＮＴまたはＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ９５ベースのマシーン）、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨＴＭ、またはＵＮＩＸ（登録商標）ベースの（例えば、ＳＵＮＴＭワークステーション）コンピュータを用いて、デジタル化ビデオまたはデジタル化光学イメージをデジタル化し、貯蔵し、および分析するために入手できる。
【０３３６】
１つの慣用的なシステムは、アッセイデバイスから、冷却された電化−カップルドデバイス（ＣＣＤ）カメラに光を運び、これは当該分野で通常に使用される。ＣＣＤカメラはピクチャーエレメント（画素）のアレイを含む。検体の領域からの光はＣＣＤにイメージする。検体（例えば、生物学的ポリマーアレイ上の個々のハイブリダイゼーション部位）に対応する特定の画素をサンプリングして、各位置について光強度の読みを得る。多数の画素が平行して処理されて、スピードを増加させる。本発明の装置および方法は、例えば、蛍光または暗視野顕微鏡技術によっていずれの試料を得るのにも容易に用いられる。
【０３３７】
他のポリヌクレオチド組成物
また、本発明は、（例えば、組換え用の基質として）本発明の２つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物を含む。該組成物は組換え核酸のライブラリーを含むことができ、ここに、該ライブラリーは少なくとも２、３、５、１０、２０または５０以上のポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、選択的に、発現ベクターにクローン化され、発現ライブラリーが得られる。
【０３３８】
また、本発明は、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドの（例えば、前記した組換えフォーマットのあるもので実行されるように）、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅまたはＤＮＡｓｅで消化することによって生じた組成物；および機械的手段（例えば、音波処理、渦形成等）により本発明の１つ以上のポリヌクレオチドの断片化または剪断することによって生じた組成物を提供し、これらは、前記した方法において組換え用の基質を供するのに用いることもできる。同様に、本発明の１を超える核酸に対応するオリゴヌクレオチドの組を含む組成物は組換え基質として有用であり、本発明の特徴である。便宜には、これらの断片化され、剪断され、またはオリゴヌクレオチド合成の混合物は断片化核酸組といわれる。
【０３３９】
また、本発明には、リボヌクレオチドーまたはデオキシリボヌクレオチド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下で１つ以上の断片化核酸組をインキュベートすることによって生じた組成物も含まれる。この得られた組成物は、前記した組換えフォーマットの多くで組換え混合物を形成する。核酸ポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ−特異的ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、「逆転写酵素」）とすることができ；該ポリメラーゼは、例えば、（ＶＥＮＴ、ＴＡＱ等のような）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【０３４０】
統合システム
本発明は、例えば、本明細書中でリストした配列およびその種々のサイレント置換および保存的置換を含めた、本明細書中におけるポリペプチドおよび核酸用の本明細書中の配列情報に対応する文字ストリングを含むコンピュータ、コンピュータリーダブル媒体および統合システムを提供する。
【０３４１】
例えば、当該分野で知られた種々の方法および遺伝子アルゴリズム（ＧＡ）を用いて、異なる文字ストリングの間の相同性または類似性を検出することができ、あるいはそれを用いて、アウトプットファイルを制御し、配列等を含めた情報の提示を行うためのバイアスを供するように他の望ましい機能を行うことができる。その例は前記したＢＬＡＳＴを含む。
【０３４２】
このようにして、種々のストリンジェンシーおよび長さの異なるタイプの相同性および類似性を検出し、個々に記載する統合システムで認識することができる。例えば、生体ポリマーの配列の比較分析のために、ワードプロセッシングにおけるスペル−チェッキングのために、および種々のデータベースからのデータ検索のために、多くの相同性決定方法が設計されている。自然発生型ポリヌクレオチドにおける４つの主なヌクレオ塩基の中で二重ラセン対様式補体相互作用を理解して、相補的相同ポリヌクレオチドストリングのアニーリングをシミュレートするモデルを、本明細書中における配列に対応する文字ストリングで典型的には行われる配列整列または他の操作の基礎として用いることもできる（例えば、ワード−プロセッシング操作、配列またはサブ配列文字ストリングを含む図面の構築、アウトプット表等）。配列類似性を計算するためのＧＡでのソフトウエアパッケージの例はＢＬＡＳＴであり、本明細書中における配列に対応する文字ストリングをインプットすることによって、それを本発明に適合させることができる。
【０３４３】
同様に、ワードプロセッシングソフトウエア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＷｏｒｄＴＭまたはＣｏｒｅｌ  ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔＴＭ）およびデータベースソフトウエア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌＴＭ、Ｃｏｒｅｌ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＰｒｏＴＭのようなスプレッドシートソフトウエア、またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＡｃｃｅｓｓＴＭまたはＰａｒａｄｏｘＴＭのようなデータベースプログラム）のような標準的デスクトップアプリケーションソフトウエアを、本発明のＧＡＴホモログに対応する文字ストリングをインプットすることによって本発明に適合させることができる（核酸または蛋白質いずれか、あるいは双方）。例えば、統合システムは、例えば、ユーザーインターフェース（例えば、ＷＩｎｄｏｗｓ（登録商標），  ＭａｃｉｎｔｏｓｈまたはＬＩＮＵＸシステムのような標準オペレーティングシステムにおけるＧＵＩ）と組み合わせて用いられる、適当な文字ストリング情報を有するこれまでのソフトウエアを含めて、文字ストリングを操作することができる。記載したように、ＢＬＡＳＴのような特殊化された整列プログラムを、核酸または蛋白質（または対応する文字ストリング）のために本発明のシステムに取り込むこともできる。
【０３４４】
本発明における分析用の統合システムは、典型的には、配列を整列させるためのＧＡソフトウエア、ならびに本明細書中における配列のいずれかを含むソフトウエアシステムにエンターされたデータ組を持つデジタルコンピュータを含む。該コンピュータは、例えば、ＰＣ（Ｉｎｔｅｌ×８６またはＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）チップコンパチブルＤＯＳ、ＯＳ２ＴＭ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）    ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ＮＴ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ９５、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ９８、  ＬＩＮＵＸベースのマシーン、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨＴＭ、Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ、またはＵＮＩＸ（登録商標）ベースの（例えば、ＳＵＮＴＭワークステーション）マシーン）または当業者に知られた他の商業的に通常のコンピュータであり得る。配列を整列させる、またはそうでなければ操作するためのソフトウエアは入手可能であるが、あるいはＶｉｓｕａｌｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）等のような標準プログラミング言語を用いて当業者が容易に構築することができる。
【０３４５】
いずれのコントローラーまたはコンピュータも選択的に、しばしば陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、フラットパネルディスプレイ（例えば、活性マトリック液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイ）その他であるモニターを含む。コンピュータ回路は、しばしば、マイクロプロセッサー、メモリー、インターフェース回路その他のような多数の集積回路チップを含むボックスに入れられる。該ボックスは、選択的に、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、書き込み可能ＣＤ−ＲＯＭのような高容量取り出し可能ドライブ、および他の通常の端末エレメントを含む。キーボードまたはマウスのような入力デバイスは、選択的に、ユーザーからの入力を供し、関連コンピューターシステムにおいて比較される、またはそうでなければ操作されるべき配列のユーザー選択を供する。
【０３４６】
コンピュータは、典型的には、組パラメータフィールドへのユーザーインプットの形態、例えば、ＧＵＩの形態、または例えば、種々の異なる具体的操作のためにプレプログラムされたプレプログラム指令の形態で、ユーザー指令を受け取るための適当なソフトウエアを含む。次いで、ソフトウエアは、流体向きおよび輸送コントローラの操作を指令するための適切な言語に変換して、所望の操作を行う。
【０３４７】
また、ソフトウエアは、（例えば、本明細書中における配列または配列の整列に基づいた）核酸合成、または本明細書中における配列に対応する文字ストリングを用いて行われる整列または他の操作から下流で起こる他の操作を制御するためのアウトプットエレメント  をふくむこともできる。核酸合成機器は、それに従い、本明細書中における１つ以上の統合システムにおいて構成要素となり得る。
【０３４８】
更なる態様において、本発明は、本明細書中における方法、組成物、システムおよび装置を具体化するキットを提供する。本発明のキットは、選択的に、以下の：（１）本明細書中に記載された装置、システム、システム構成要素または装置構成要素；（２）本明細書中に記載された方法を行うための、および／または本明細書中における装置または装置構成要素を操作するための、および／または本明細書中における組成物を用いるための指令；（３）１つ以上のＧＡＴ組成物または構成要素；（４）構成要素または組成物を保持するための容器、および（５）パッキング材料のうちの１つ以上を含む。
【０３４９】
さらなる態様において、本発明は、本明細書中におけるいずれかの装置、装置構成要素、組成物またはキットの使用、本明細書中におけるいずれかの方法またはアッセイの実施、および／または本明細書中におけるいずれかのアッセイまたは方法を実施するためのいずれかの装置またはキットの使用を提供する。
【０３５０】
宿主細胞および生物
宿主細胞は、真核生物、例えば、真核生物細胞、植物細胞、動物細胞、プロトプラストまたは組織培養細胞であり得る。宿主細胞は、選択的に、複数の細胞、例えば、生物を含む。別法として、宿主細胞は、限定されるものではないが、細菌（例えば、グラム陽性細菌、紫細菌、緑硫黄細菌、緑非−硫黄細菌、シアノバクテリアスピロヘーター、テルマトゲール（ｔｈｅｒｍａｔｏｇａｌｅ）、フラボバクテリアおよびバクテロイデス）および古細菌（すなわち、Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｄｕｓ、および極Ｈａｌｏｐｈｉｌｅｓ）を含めた原核生物であり得る。
【０３５１】
本発明のＧＡＴ核酸を取り込む、および／または本発明のＧＡＴポリペプチドを持つゲンするトランスジェニック植物、または植物細胞は、本発明の特徴である。植物細胞およびプロトプラストの形質転換は、実質的に、限定されるものではないが、本明細書中に記載されたものを含めた植物分子生物学における当業者に知られた種々の方法のいずれかで行うことができる。一般に、ここに引用して援用する、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｐａｒｔ  Ｄ）  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ（編）１９８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  およびＷｅｉｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７（１９８８）参照。例えば、ＤＮＡ構築物は、エレクトロポレーション、ＰＥＧ−媒介トランスフェクション、粒子衝撃、シリコン繊維送達、または植物細胞のプロトプラストまたは胚性カルスのマイクロインジェクションのような技術を用いて植物のゲノムＤＮＡに直接導入することができる。例えば、Ｔｏｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  「Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｆａｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｌ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ）、ｐｐ。１９７−２１３参照。種々の宿主細胞を形質転換するさらなる方法はＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｐｅｓ，  Ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｂｙ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０（３）：２８６−２９１に開示されている。
【０３５２】
ポリエチレングリコール沈殿を用いるＤＮＡ構築物の導入はＰａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  ＭＯＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２に記載されている。Ｅｌｅｃｔｒｏｎポレーション技術はＦｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：５８２４に記載されている。弾丸形質転換技術はＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３に記載されている。
【０３５３】
別法として、ＤＮＡ構築物は適当なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組み合せ、慣用的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクターに導入することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主のビルレンス機能は、細胞が該細菌に感染すると、該構築物および隣接マーカーの植物細胞ＤＮＡへの挿入を指令するであろう。米国特許第５，５９１，６０６号参照。
【０３５４】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ―媒介形質転換技術は科学文献によく記載されている。例えば、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４９６−４９８、およびＦｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：４８０３参照。例えば、トウモロコシのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換は米国特許第５，５５０，３１８号および第５，９８１，８４０号に記載されている。
【０３５５】
形質転換の他の方法は（２）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ−媒介技術（例えば、Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｕｌｌｅｒ  Ｉｎ：  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌ．６，  ＰＷＪ  Ｒｉｇｂｙ編，  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；  Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｃ．Ｂ．，  ａｎｄ  Ｄｒａｐｅｒ，  Ｊ．  Ｉｎ：  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌ．ＩＩ，  Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＩＲＩ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８５；  ＷＯ  ８８／０２４０５はＡ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベクターｐＡＲＣ８またはｐＡＲＣ１６と共にＡ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株Ａ４およびそのＲｉプラスミドの使用を記載する）；（２）リポソーム−媒介ＤＮＡ摂取（例えば、Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２５：１３５３）（３）渦巻き方法（例えば、Ｋｉｎｄｌｅ  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１２２８参照）を含む。
【０３５６】
ＤＮＡは、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：４３３；  Ｄ．Ｈｅｓｓ（１９８７）  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１０７．３６７  Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ６：１６５によって記載された花粉への直接的ＤＮＡ導入によって植物に導入することもできる。ポリペプチドをコードする核酸の発現は、Ｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：２７４によって記載された植物の生殖器官へのＤＮＡの注入によって得ることができる。また、Ｎｅｕｈｄｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：３０；およびＢｅｎｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｄｉｎｇｓ  Ｂｉｏ  Ｅｘｐｏ１９８６、  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，  Ｓｔｏｎｅｈａｍ，  Ｍａｓｓ．，ｐｐ．２７−５４によって記載されているように、ＤＮＡは未成熟胚の細胞に直接注入することもでき、乾燥された胚の再水和を行うことができる。
【０３５７】
動物および下等真核生物（例えば、酵母）宿主細胞はトランスフェクションにつきコンピテントであるか、または、種々の手段によってコンピテントとされる。動物細胞へＤＮＡを導入するいくつかのよく知られた方法がある。これらの方法はリン酸カルシウム沈殿；受容体細胞の、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとの融合；受容体細胞の、ＤＮＡを含有するリポソームでの処理；ＤＥＡＥデキストラン；エレクトロポレーション；バイオリスティックス；および細胞へのＤＮＡの直接的マイクロインジェクションを含む。トランスフェクトされた細胞は、当該分野でよく知られた手段によって培養される。Ｋｕｃｈｌｅｒ，  Ｒ．Ｊ．（１９７７）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （Ｄｏｗｄｅｎ，  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓ，  Ｉｎｃ．）参照。本明細書中で用いるように、用語「形質転換」は、核酸配列、例えば、「異種」または「外来性」核酸配列の導入による宿主細胞の遺伝子型の改変を意味する。異種核酸配列は異なる源に必ずしも由来する必要はないが、いくつかの点において、それが導入される細胞に対して外部であったものであろう。
【０３５８】
Ｂｅｒｇｅｒ，  ＡｕｓｕｄｅｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋに加えて、植物細胞クローニング、培養および再生のための有用な一般的文献は、Ｊｏｎｅｓ編（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ヴぉぅめ４９（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｗａｔａ，  ＮＪ）；  Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｎｈ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ（「Ｐａｌｎｅ」）；  およびＧａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；  Ｆａｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ／Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ）（「Ｇａｍｂｏｒｇ」）を含む。種々の細胞培養基はＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ編，  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ＢｏｃａＲａｔｏｎ，  ＦＬ）（「Ａｔｌａｓ」）に記載されている。植物細胞培養のためのさらなる情報は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）からのＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  （１９９８）（Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ）および、例えば、やはりＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）からのＰｌａｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  （１９９７）（Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳ）のような入手可能な商業的文献に見出される。植物細胞培養に関するさらなる詳細はＣｒｏｙ編（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ）に見出される。
【０３５９】
本発明の具体例において、植物細胞の形質転換に適した、１つ以上のＧＡＴポリヌクレチドを含めた組換えベクターが調製される。例えば、配列番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６８、７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８、７９０、７９２、７９４、７９６、７９８、８００、８０２、８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１６、８１８、８２０、８２２、８２４、８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４７、９４９、９５１および９５２の中から選択された所望のＧＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を便宜には用いて、組換え発現カセットを構築し、これは所望の植物に導入することができる。本発明の関連では、発現カセットは、典型的には、プロモータ配列に作動可能に連結した選択されたＧＡＴポリヌクレオチド、および形質転換された植物の意図した組織（例えば、全植物、葉、根等）におけるＧＡＴ配列の転写を指令するのに十分な他の転写および翻訳開始調節配列を含む。
【０３６０】
本発明の実施では多数のプロモータを用いることができる。プロモータは所望の結果に基づいて選択することができる。すなわち、核酸は、植物中での発現のために、構成的に、組織−優先的または他のプロモータと組み合わせることができる。
【０３６１】
構成的プロモータは、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモータのコアプロモータ、およびＷＯ  ９９／４３８３８および米国特許第６，６７２，０５０号に開示された他の構成的プロモータ；コアＣａＭＶ３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ３１３：９（８１０−８１２）；  米アクチン（Ｍｃｅｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ：  ２：１６３−１７１）；  ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｏｉｏｌ．  １２：６１９−６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；  ｐＥＭＵ  （Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；  ＭＡＳ  （Ｖｅｌｔｅｎ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３−２７３０）；  ＡＬＳ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  （米国特許第５，６５９，０２６号）等を含む。他の構成的プロモータは、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号；第５，６０４，１２１号；第５，５６９，５９７号；第５，４６６，７８６号；第５，３９９，６８０号；第５，２６８，４６３号；第５，６０８，１４２号；および第６，１７７，６１１号に開示されたものを含む。
【０３６２】
化学的−調節プロモータを用いて、外因性化学レギュレータの適用を介して植物における遺伝子の発現を変調することができる。対象に応じて、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する場合には、プロモータは化学−誘導性プロモータであり得、あるいは化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する場合には、化学−抑制プロモータであり得る。化学−誘導性プロモータは当該分野で知られており、限定されるものではないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤安全剤によって活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモータ；プレ−発芽除草剤として用いられる疎水性求電子性化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモータ；およびサレチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモータを含む。注目する他の化学−調節プロモータはステロイド−応答性プロモータを含む。例えば、ここに引用して援用するＳｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０４２１−１０４２５およびＭｃＮｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４（２）：２４７におけるグルココルチコイド−誘導性プロモータ、および例えば、Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７、および米国特許第５，８１４，６１８号、および第５，７８９，１５６号におけるテトラサイクリン−誘導性およびテトラサイクリン−抑制性プロモータ参照。
【０３６３】
また、組織−優先性プロモータを利用して、特定の植物組織内でのＧＡＴ発現を標的化することができる。組織−優先性プロモータはＹａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；  Ｋａｗａｍａｔａ  ｅｔａｌ．（１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；  Ｈａｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８；  Ｒｉｎｅｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１；  Ｖａｌ．Ｃａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１２（２）：５２５−５３５；  Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４；  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；  Ｌａｍ（１９９４）  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６；  Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３（６）１１２９−１１３８；  Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０  Ｇｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４（３）：４９５−５０５に開示されたものを含む。そのようなプロモータは、必要であれば、弱い発現のために修飾することができる。
【０３６４】
葉−特異的プロモータは当該分野で知られている。例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；  Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：３５７−６７；  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；  Ｇｏｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３：５０９−１８；  Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；およびＭａｔｓｕｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０参照。
【０３６５】
根−優先性プロモータは知られており、文献から利用できる多くのものから選択することができるか、あるいは種々の適合する種からデ・ノボ単離することができる。例えば、Ｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０（２）：２０７−２１８（大豆根−特異的グルタミンシンテターゼ遺伝子）；  Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３（１０）：１０５１−１０６１（インゲン豆のＧＲＰ  １．８遺伝子における根−特異的制御エレメント）；Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４（３）：４３３−４４３（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのマンノピンシンターゼ（ＭＡＳ）遺伝子の根−特異的プロモータ）；およびＭｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３（１）：１１−２１  （大豆の根および根瘤で発現されるサイトゾルグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）をコードする全長ｃＤＮＡクローン）参照。また、窒素−固定非マメ科植物Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ  ａｎｔｅｒｓｏｎｉｉおよび関連する非−窒素−固定非マメ科植物Ｔｒｅｍａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａからのヘモグロビン遺伝子から単離された２つの根−特異的プロモータを開始するＢｏｇｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ２（７）：６３３−６４１参照。これらの遺伝子のプロモータはβ−グルクロニダーゼレポータ遺伝子に連結されており、非マメ科植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍおよびマメ科植物Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ双方に導入され、双方の場合、根特異的プロモータ活性が維持される。Ｌｅａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの高度に発現されたｒｏｌＣおよびｒｏｌＤ根−誘導遺伝子のプロモータのそれらの分析を記載する（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｌｉｍｅｒｉｃｋ）  ７９（１）：６９−７６参照）。彼らは、エンハンサーおよび組織−優先性ＤＮＡ決定基はそれらのプロモータ中で解離していると結論した。Ｔｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  ＥＭＢＯ  Ｊ．８（２）：３４３−３５０はｌａｃＺに対する遺伝子融合を用いて、オクトピンシンターゼをコードするＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔ−ＤＮＡ遺伝子が、根先端の表皮において特に活性であり、ＴＲ２’遺伝子は無傷植物において根特異的であって、葉組織における創傷によって刺激されることを示しており、これは、殺虫性または殺幼虫遺伝子で用いるための特徴の特に望ましい組み合わせである。ｎｐｔＩＩ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ）に融合したＴＲ１‘’遺伝子は同様の特徴を示した。さらなる根−優先性プロモータはＶｆＥＮＯＤ−ＧＲＰ３遺伝子プロモータ（Ｋｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９（４））：７５９−７７２）；ＺＲＰ２プロモータ（米国特許第５，６６３，６３６号）；ＩＦＳ１プロモータ（米国特許出願第１０／１０４、７０６号）およびｒｏｌＢプロモータ（Ｃａｐａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５（４）：６８１−６９１）を含む。また、米国特許第５，８３７，８７６号；第５，７５０，３���６号；第５，４５９，２５２号；第５，４０１，８３６号；第５，１１０，７３２号；および第５，０２３，１７９号参照。
【０３６６】
「種子−優先性」プロモータは「種子−特異的」プロモータ（種子貯蔵蛋白質のプロモータのような種子発生の間に活性なプロモータ）ならびに「種子−発芽」プロモータ（種子発芽の間に活性なプロモータ）を共に含む。ここに引用して援用するＴｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １０：１０８参照。そのような種子−優先性プロモータは、限定されるものではないが、Ｃｉｍ１（サイトキニン−誘導メッセージ）；ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）；ｍｉｌｐｓ（ｍｙｏ―イノシトール−１−リン酸シンターゼ）；およびｃｅｌＡ（セルロースシンターゼ）を含む（ここに引用して援用する米国特許第６，２２５，５２９号参照）。ガンマ−ゼインは胚乳−特異的プロモータである。ｇｌｏｂ−１は胚−特異的プロモータである。双子葉植物では、種子−特異的プロモータは、限定されるものではないが、豆β−ファゼオリン、ナピン、β−コングリシニン、大豆レクチン、クロシフェリン等を含む。単子葉植物では、種子−特異的プロモータは、限定されるものではないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ｇ−ゼイン、ワクシー、シュルンケン１、シュルンケン、グロボリン等を含む。また、ここに引用して援用する、ｅｎｄ１およびｅｎｄ２遺伝子からの種子−優先性プロモータを開示するＷＯ  ００／１２７３３も参照。
【０３６７】
特に、植物のすべての組織におけるＧＡＴ核酸の発現を指令する強くまたは弱く構成的な植物プロモータは好都合に使用することができる。そのようなプロモータはほとんどの環境条件および発生または細胞分化の段階下で活性である。前記したプロモータに加え、構成的にプロモータの例はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの１’−または２’−プロモータ、および当業者に知られている種々の植物遺伝子からの他の転写開始領域を含む。本発明のＧＡＴポリペプチドの過剰発現が植物にとって有害である場合、当業者は、弱く構成的なプロモータを低レベルの発現のために用いることができるのを認識するであろう。一般に、「弱いプロモータ」とは、低レベルでコード配列の発現を駆動するプロモータが意図される。「低レベル」とは、細胞当たり約１／１０００転写体ないし約１／１００，０００転写体から、約１／５００，０００転写体と低いまでのレベルが意図される。別法として、弱いプロモータは、少数の細胞でのみ発現し、他のものでは発現せずに、総じて低いレベルの発現を与えるプロモータを含むと認識される。プロモータが許容できないほど高いレベルで発現されるである場合、プロモータ配列の一部を欠失し、または修飾して、発現レベルを減少させることができる。高レベルの発現が植物にとって有害でない場合、強力なプロモータ、例えば、ｔ−ＲＮＡ、または他のｐｏｌ  ＩＩＩプロモータ、強力なｐｏｌ  ＩＩプロモータ（例えば、カリフラワーモザイクウイルスプロモータ、ＣａＭＶ、３５Ｓプロモータ、を用いることができる。
【０３６８】
別法として、植物プロモータは環境の制御下にあり得る。そのようなプロモータは「誘導性」プロモータといわれる。誘導性プロモータによって転写を改変できる環境条件の例は病原体の攻撃、嫌気性条件、またはリ仮の存在を含む。いくつかの例において、ＧＡＴポリヌクレオチドがある組織、または発生の段階、例えば、葉、根、苗条等においてのみ発現されるように、「組織−特異的」および／または発生制御下にあるプロモータを用いるのが望ましい。除草剤耐性および関連表現型に関連する遺伝子の内因性プロモータは、ＧＡＴ核酸、例えば、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ホモグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グリホセートキシダーゼおよび５−エノールピルビルシキミ酸−２−リン酸シンターゼの発現を駆動するのに特に有用である。
【０３６９】
組織特異的プロモータを用いて、本明細書中で記載したＧＡＴポリヌクレオチドを含めた異種構造遺伝子の発現を指令することもできる。このようにして、組換え発現カセットでプロモータを用いて、その発現が本発明のトランスジェニック植物で望ましいいずれかの遺伝子、例えば、除草剤抵抗性または耐性を付与するＧＡＴおよび／または他の遺伝子、他の有用な特徴、例えば、へテロシスに影響する遺伝子の発現を駆動することができる。同様に、例えば、５’調節配列または異種遺伝子のイントロンに由来するエンハンサーエレメントを用いて、ＧＡＴポリヌクレオチドのような異種構造遺伝子の発現を改良することもできる。
【０３７０】
一般に、植物における発現カセットで用いる特定のプロモータは、意図された適用に依存する。植物細胞において転写を指令する多数のプロモータのいずれも適当であり得る。該プロモータは構成的または誘導性いずれかであり得る。前記したプロモータに加え、植物で働く細菌起源のプロモータはオクトピンシンターゼプロモータ、ナパリンシンターゼプロモータおよびＴｉプラスミドに由来する他のプロモータを含む。Ｈｅｒｒｅｒａ−ｅＥｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９参照。ウイルスプロモータはＣａＭＶの３５Ｓおよび１９ＳＲＮＡプロモータを含む。Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０参照。他の植物プロモータはリブロース−１，３−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニットプロモータおよびファゼオリンプロモータを含む。Ｅ８遺伝子（ＤｅｉｋｍａｎおよびＦｕｓｃｈｅｒ（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：３３１号参照）および他の遺伝子からのプロモータ配列も好都合に使用される。単子葉植物種に特異的なプロモータも考えられる（ＭｃＥｌｒｏｙ  ａｎｄ  Ｂｒｅｔｔｅｌｌ（１９９４）  「Ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｃｅｒｅａｌｓ」  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：６２−６８）。別法として、有用な特徴を持つ新規なプロモータは、当該分野で知られた配列分析、エンハンサーまたはプロモータトラッピングなどを含めた方法によって、いずれかのウイルス、細菌または植物源から同定することができる。
【０３７１】
本発明の発現ベクターを調製するにおいて、プロモータおよびＧＡＴをコードする遺伝子以外の配列も好都合に用いられる。もし適切なポリペプチド発現が望まれれば、ポリアデニル化領域は自然発生型遺伝子から、種々の他の植物遺伝子から、またはＴ−ＤＮＡから由来することができる。例えば、発現されたポリペプチドの内部オルガネラ（例えば、葉緑体）への移動、または細胞外分泌を促進するシグナル／局所化ペプチドも使用することができる。
【０３７２】
また、ＧＡＴポリヌクレオチドを含むベクターは、選択可能な表現型を植物細胞に付与するマーカー遺伝子を含むことができる、例えば、マーカーは殺生物剤耐性、特に、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒブロマイシンに対する耐性のような抗生物質耐性、またはクロロスルフロン、またはホスフィノトリシンに対する耐性のような除草剤耐性をコードすることができる。可視化反応生成物（例えば、ベータ−グルクロニダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を介して、または遺伝子産生物それ自体（例えば、緑色蛍光蛋白質、ＧＦＰ；Ｓｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８：７７７）の直接的可視化によって、遺伝子発現および蛋白質局所化をモニターするのに用いられるレポーター遺伝子は、例えば、植物細胞における一過性遺伝子発現をモニターするのに用いることができる。一過性発現系は、例えば、除草剤耐性活性につき植物細胞培養をスクリーニングするにおいて植物細胞で使用することができる。
【０３７３】
植物形質転換
プロトプラスト
種々の植物型からの形質転換可能なプロトプラストの確立、および培養されたプロトプラストの引き続いての形質転換のための膨大なプロトコルが当該分野で利用でき、ここに引用して援用する。例えば、それら各々をここに引用して援用する、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９３：８５７；  Ｆｏｗｋｅ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔａｂｅｌ編（１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ；  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，  ＵＰＭ  １６−１８；およびＬｙｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０：２９５参照。
【０３７４】
葉緑体
葉緑体はいくつかの除草剤耐性活性の作用部位であり、いくつかの場合には、ＧＡＴポリヌクレオチドを葉緑体トランジット配列ペプチドに融合させ、遺伝子産生物の葉緑体への移動を促進する。これらの場合、ＧＡＴポリヌクレオチドを植物宿主細胞の葉緑体に形質転換するのが有利であり得る。膨大な方法が葉緑体形質転換発現を達成するのに利用できる（例えば、Ｄａｎｉｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：３４６；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：７２９；およびＭａｌｉｇａ  （１９９３）  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１）。発現構築物は、ＧＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した植物において機能的な転写調節配列を含む。（ＧＡＴポリヌクレオチドを含めた発現カセットのような）葉緑体において機能するように設計される発現カセットは、葉緑体における発現を確実とするのに必要な配列を含む。典型的には、コード配列には、葉緑体ゲノムとの相同組換えを行うためのクロロプラスチドゲノムに対する相同性の２つの領域が近接し；しばしば、選択マーカー遺伝子をフランキングプラスチドＤＮＡ配列内に存在させて、得られたトランスプラストニック植物細胞における遺伝的に安定な形質転換葉緑体の選択を促進する（例えば、Ｌａｌｉｇａ（１９９３）およびＤａｎｉｄｌｌ（１９９８）前掲、およびそこに引用された文献参照）。
【０３７５】
一般的形質転換方法
本発明のＤＮＡ構築物は、種々の慣用的技術によって所望の植物宿主のゲノムに導入することができる。広く種々の高等植物種を形質転換する技術はよく知られており、技術および科学文献に記載されている。例えば、Ｐａｙｎｅ、Ｇａｍｂｏｒｇ、Ｃｒｏｙ、Ｊｏｎｅｓ等、すべて前掲、ならびに例えば、ここに引用して援用するＷｅｉｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１および米国特許第５，８８９，１９１号、第５，８８９，１９０号、第５，８６６，７８５号、第５，５８９，３６７号および第５，３１６，９３１号参照。
【０３７６】
種々の他の形質転換プロトコルが本発明では考えられる。形質転換プロトコル、ならびにヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換に標的化される、植物または植物細胞の型、すなわち、単子葉植物または双子葉植物に依存して変化し得る。ヌクレオチド配列を植物細胞に導入する適当な方法、および引き続いての植物ゲノムへの挿入は、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｂｉｏｔａｃｈｎｉｃｓ  ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−媒介形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号および第５，９８１，８４０号）、直接的遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２）、および弾丸粒子加速（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；米国特許第５，８７９，９１８号；第５，８８６，２４４号；第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）「Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ，  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｆａｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ）；  ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｂｉｏｔａｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３−９２６；）およびＬｅｃ１形質転換（ＷＯ  ００／２８０５８）を含む。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；  Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （タマネギ）；  Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（大豆）；  ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３−９２６（大豆）；  Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ  （１９９１）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（大豆）；  Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（大豆）；  Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｂｉｏｔａｃｈｎｏｌｏｇｙ（：７３６−６４０（コメ）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；  Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；  米国特許第５，２４０，８５５号；第５，３２２，７８３号および第５，３２４，６４６号；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｌ��Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ）Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４；米国特許第５，７３６，３６９号（穀物）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５３４５−５３４９（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）；  Ｄｅ  Ｗｅｔ  ａｌ．（１９８５）  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｕｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，  Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｏｎｇｍａｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐｐ。１９７−２０９（花粉）；  Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８およびＫａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウィスカー−媒体形質転換）；  Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：２５０−２５５およびＣｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ（１９９５）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−４１３（コメ）；  Ｏｓｇｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｎｓを介するトウモロコシ）を含み；そのすべてをここに引用して援用する。
【０３７７】
例えば、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレ−ションおよびマイクロインジェクション技術を用いてＤＮＡを植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入することができるか、あるいはＤＮＡ構築物を、ＤＮＡ粒子衝撃のような弾丸方法を用いて植物組織に直接的に導入することができる。別法として、ＤＮＡ構築物を、適当なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組ミ合わせて、慣用的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクターに導入することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主のビルレンス機能は、植物細胞が該細菌に感染した場合に、該構築物および隣接マーカーの植物細胞ＤＮＡへの挿入を指令するであろう。
【０３７８】
マイクロインジェクション技術は当該分野で知られており、科学および特許文献によく記載されている。ポリエチレングリコール沈殿を用いるＤＮＡ構築物の導入はＰａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：２７１７に記載されている。エレクトロポレーション技術はＦｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’Ｌａ  ｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：５８２４に記載されている。弾丸形質転換技術はＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．ａｌ．（１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ８２７：７０；およびＷｅｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０２：１０７７に記載されている。
【０３７９】
いくつかの具体例において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換技術を用いて、本発明のＧＡＴ配列をトランスジェニック植物に導入する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−媒介形質転換は双子葉植物の形質転換で広く用いられるが、ある種の単子葉植物もＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって形質転換することもできる。例えば、イネのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換はＨｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１；米国特許第５，１８７，１７３号；米国特許第５，５９１，６９１号；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ  ３４：５４；およびＲａｉｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：３３によって記載されている。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換による形質転換されたトウモロコシ、大麦、ライ麦およびアスパラガスも記載されている（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ  Ｂｏｔ．２：８１）。
【０３８０】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換技術は、植物細胞ゲノムに組み込まれ、注目する核酸を植物細胞に共導入されるＡ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍−誘導（Ｔｉ）プラスミドの能力を利用する。典型的には、本発明のＧＡＴポリヌクレオチドのような注目する核酸がやはりＴ−ＤＮＡ配列を含有する自己複製プラスミドに連結された、発現ベクターが生じる。Ｔ−ＤＮＡ配列は、典型的には、注目する発現カセットヌクレオチド核酸を近接し、それは、プラスミドの組込み配列を含む。発現カセットに加え、Ｔ−ＤＮＡは、典型的には、マーカー配列、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子を含む。次いで、Ｔ−ＤＮＡおよび発現カセットを持つプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞にトランスフェクトする。典型的には、植物細胞の効果的な形質転換には、Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細菌はプラスミド上の必要なｖｉｒ領域を保有し、あるいはその染色体に組み込まれる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の議論については、Ｆｉｒｏｏｚａｂａｄｙ  ａｎｄ  Ｋｕｅｈｎｌｅ（１９９５）  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆａｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編を参照されたし。
【０３８１】
ある具体例において、本発明のポリヌクレオチドを注目するポリヌクレオチド配列のいずれかの組合せとで合わせて、所望の表現型を持つ植物を創製することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒性蛋白質（米国特許第５，３６６，８９２号；第５，７４７，４５０号；第５，７３７，５１４号；第５，７２３，７５６号；第５，５９３，８８１号；およびＧｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４８：１０９に記載）、レクチン（Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：８２５）、ペンチン（米国特許第５，９８１，７２２号に記載）等のような、殺虫および／または殺虫剤活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの他のポリヌクレオチドと合わせることができる。生じた組合せは、注目するポリヌクレオチドのいずれか１つの複数コピーを含むことができる。また、本発明のポリペプチドは、いずれかの他の遺伝子または遺伝子の組合せと合わせて、限定されるものではないが、高油遺伝子（例えば、米国特許第６，２３２，５２９号）；バランスの取れたアミノ酸（例えば、ホルドチオニン（米国特許第５，９９０，３８９号；第５，８８５，８０１号；第５，８８５，８０２号；および第５，７０３，４０９号）；大麦高リシン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５：９９−１０６；およびＷＯ  ９８／２０１２２）および高メチオニン蛋白質（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６２７９；  Ｋｉｒｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｇｅｎｅ  ７１：３５９；  およびＭｉｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．１２：１２３））；増大した消化性（例えば、修飾された貯蔵蛋白質（２００１年１１月７日に出願された米国出願第１０／０５３，４１０号）；およびチオレドキシン（２００１年１２月３日に出願された米国出願第１０／００５，４２９号））を含めた種々の所望の特性の組合せを持つ植物を生産することもでき；それらの開示をここに引用して援用する。
【０３８２】
本発明のポリヌクレオチドは病気または除草剤耐性（例えば、フモニシン解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号）；アビルレンスおよび病気耐性遺伝子（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９）；  Ｓ４および／またはＨｒａ突然変異のような除草剤抵抗性に導くアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）突然変異体；ホスフィノトリシンまたはバスタ  （例えば、ｂａｒ遺伝子）のようなグルタミンシンターゼの阻害剤；およびグリホセート抵抗性（ＥＰＳＰＳ遺伝子））で望ましい特性；および高油（例えば、米国特許第６，２３２，５２９号）；修飾された油（例えば、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子（米国特許第５，９５２，５４４号；ＷＯ  ９４／１１５１６））；修飾された澱粉（例えば、ＡＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、澱粉シンターゼ（ＳＳ）、澱粉分岐酵素（ＳＢＥ）、および澱粉枝切酵素（ＳＤＢＥ））；およびポリマーまたはバイオプラスチック（例えば、米国特許第５，６０２，３０１；ベータ−ケトチオラーゼ−ポリヒドロキ酪酸シンターゼ、およびアセトアセチル−ＣｏＡレラクターゼ（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−５９４７）はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＳ）の発現を容易とする）について望ましい特性と合わせることもでき；それらの開示をここに引用して援用する。また、本発明のポリヌクレオチドを、雄性不稔性（例えば、米国特許第５，５８３，２１０号）、茎強度、開花時間のような耕種学特性を供するポリヌクレオチド、または細胞周期または遺伝子標的化のような形質転換技術特性（例えば、ＷＯ  ９９  １６１９、ＷＯ  ００／１７３６４、およびＷＯ  ９９／２５８２１）と組み合わせることもでき、それらの開示をここに引用して援用する。
【０３８３】
これらのスタックされた組合せは、限定されるものではないが、いずれかの慣用的なもしくはＴｏｐＣｒｏｓｓ方法、または遺伝子形質転換による交差型−植物種を含めたいずれかの方法によって創製することができる。もし特性が植物を遺伝子的に形質転換することによって合わせられれば、注目するポリヌクレオチド配列は任意の時点において任意の順序で組み合わせることができる。例えば、１つ以上の所望の特性を含むトランスジェニック植物を標的として、引き続いての形質転換によってさらに特性の導入することができる。該特性は、形質転換カセットのいずれかの組合せによって供された注目するポリヌクレオチドと共に共形質転換プロトコルにて同時に導入することができる。例えば、もし２つの配列が導入されれば、２つの配列は別々の形質転換カセットで含めることができる（トランス）か、あるいは同一の形質転換カセットに含めることができる（シス）。配列の発現は、同一のプロモータによって、または異なるプロモータによって駆動することができる。ある場合には、注目するポリヌクレオチドの発現を抑制する形質転換カセットを導入するのが望ましいであろう。これは、他の抑制カセットまたは過剰発現カセットのいずれかの組合せと組み合わせて、植物において特性の所望の組合せを作り出すことができる。ポリヌクレオチド配列は、部位−特異的組換えシステムを用いて所望のゲノム位置にスタックできることがさらに認識される。例えば、ここに引用してその全部を援用する、Ｗ０  ９９・２５８２１、ＷＯ  ９９／２５８５４、ＷＯ  ９９／２５８４０、ＷＯ  ９９／２５８５５、ＷＯ  ９９／２５８５３参照。
【０３８４】
トランスジェニック植物の再生
前記したものを含めた、植物形質転換技術によって由来する形質転換された植物細胞を培養して、形質転換された遺伝子型（すなわち、ＧＡＴポリヌクレオチド）および、このようにして、グリホセートまたはグリホセートアナログに対する獲得された抵抗性（すなわち、耐性）のような所望の表現型を保有する全植物を再生することができる。そのような再生技術は、組織に培養成長培地中でのある種の植物ホルモンの操作に頼っており、典型的には、所望のヌクリオチド配列と共に導入されている殺生物剤および／または除草剤マーカーに頼っている。トウモロコシの形質転換および再生については、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔａｌ．、  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、  ２：６０３−６１８（１９９０）参照。別法として、本発ＧＡＴポリヌクリオチドによって付与されたグリホセート抵抗性についての選択を行うことができる。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａ  ｅｔａｌ．  （１９８３）  Ｐｒｏｔｏｐｌ  ｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、  Ｈａｎｄｂｏｏｆ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、  ｐｐ−２４−１７６、  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐ、ｎｙ、  ＮｅｗＹｏｒｋ；  およびＢｉｎｄｉｎｇ  （１９８５）  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉ  ｏｆ  Ｐｌａ、ｔｓ、  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａ、  ｐｐ２１８−７３、  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｃｏｃａ  Ｒａｔｏｎに記載されている。また、植物カルス、外植体、器官、または、その部分から再生を得ることもできる。そのような再生技術は、一般には、Ｋｌｅ  ｅｔａｌ。（１９８７）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ３８：４６７に記載されている。また、例えば、Ｐａｙｎｅ  ａｎｄ  Ｇａｍｂｏｒｇ参照。
【０３８５】
形質転換された植物細胞、カルスまたは外植体は、暗所中の再生培地で数週間、一般には約１ないし３週間培養して、体細胞胚を成熟させることがでる。この再生培地はＭＳＮを含有する培地を含む。次いで、植物細胞、カルスまたは外植体は、典型的には、苗条および根が発育するまで、明／暗サイクルにて発根培地で培養する。植物再生の方法は当該分野で知られており、好ましい方法はＫａｍｏ  ｅｔａｌ．（Ｂｏｔ．Ｇａｚ．１４６（３）；３２４−３３４、  １９８５）；Ｗｅｓｔ  ｅｔａｌ．（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１３６１−１３６９、  １９９３）；およびＤｕｎｃａｎ  ｅｔａｌ．（Ｐｌａｎｔａ  １６５：３２２−３３２、  １９８５）によって供される。
【０３８６】
次いで、小さな苗木を、発根培地を含有するチューブに移し、ほぼもう一週間の間、より多くの根を成長させて、発生させることができる。次いで、植物を温室中の鉢の土壌混合物に移植することができる。
【０３８７】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって導入された外来性遺伝子を含有する植物の再生は、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２７：１２２９−１２３１（１９８５）およびＦｒａｌｅｙ  ｅｔａｌ．、  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：４８０３（１９８３）によって記載されているように達成することができる。この手法は、典型的には、２ないし４週間内に苗条を生じさせ、次いで、これらの形質転換体苗条を、選択剤および抗生物質を含有する適当な根−誘導培地に移して、細菌の増殖を妨げることができる。本発明のトランスジェニック植物は稔性または不稔性であってよい。
【０３８８】
また、再生は、植物カルス、外植体、器官、またはその部分から得ることもできる。そのような再生技術は、一般には、Ｋｌｅａ  ｅｔａｌ．、  Ａｍｍ．Ｒｅｖ．  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．３８：４６７−４８６（１９８７）に記載される。単一植物プロトプラストまたは種々の外植体いずれかからの植物の再生は当該分野でよく知られている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ａ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｈ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ編、  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｉｎｃ．、  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、  Ｃａｌｉｆ．（１９８８）参照。トウモロコシ細胞培養および再生については、一般に、Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、  Ｆｒｅｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｌｂｏｔ編、  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、  ＮＹ（１９９４）；  Ｃｏｒｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、  第三版、  Ｓｐｒａｇｅ  ａｎｄ  Ｄｕｄｌｅｙ編、  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ、  Ｍａｄｉｓｏｎ、  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  （１９９８）参照。
【０３８９】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍでの形質転換の後、外植体、典型的には、選択培地に移す。当業者は、選択培地は、外植体に共にトランスフェクトされる選択マーカーに依存することを認識するであろう。適当な時間の後に、形質転換体は苗条を形成し始めるであろう。苗条が約１ないし２ｃｍの長さになった後、苗条を適当な根および苗条培地に移すべきである。選択圧を根および苗条培地において維持すべきである。
【０３９０】
典型的には、形質転換体は約１ないし２週間のうちに根を発達させ、苗木を形成する。苗木が約３ないし５ｃｍの高さになった後、それを繊維鉢中の不稔性土壌に入れる。当業者であれば、異なる順化手法を用いて、異なる種の形質転換された植物を得られることを認識するであろう。例えば、根および苗条を発達させた後、形質転換された植物の切穂ならびに体細胞胚を、苗木の確立のための培地に移す。形質転換された植物の選択および再生の記載については、例えば、Ｄｏｄｄｓ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９９５）  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、  第３版、  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  参照。
【０３９１】
真空浸透を用いるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ  Ｎ．、  Ｅｌｌｉｓ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  Ｇ．、  １９９３、  Ｉｎｐｌａｎｔａ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｐｌａｎｔｓ．  ＣＲＡｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｐａｒｉｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１６：１１９４−１１９９）  および開花植物の単純な浸漬（Ｄｅｓｆｅｕｘ、  Ｃ．、  Ｃｌｏｕｇｈ  Ｓ．Ｊ．、  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ  Ａ．Ｆ．、２０００、Ｆｅｍａｌｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｆｌｏａｒａ  ｄｉｐ  ｍｅｔｈｏｄ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３：８９５−９０４）のための方法もある。これらの方法を用いて、組織培養の必要性なくして、トランスジェニック種子が生産される。
【０３９２】
効果的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−媒介形質転換プロトコルがまだ開発されていない植物品種がある。例えば、トランスジェニック植物を生産するための形質転換組織の再生とカップリングされた成功した組織形質転換は、ほとんどの商業的に重要な綿の栽培変種植物のいくつかでは報告されていない。それにも拘らず、これらの植物で用いることができるアプローチは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−媒介形質転換を介して関連植物品種にポリノヌクレオチドを安定に導入し、作動可能性を確認し、次いで、標準的な性的交配または戻し−交配技術を用いて導入遺伝子を所望の商業的を株に移すことを含む。例えば、綿の場合には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いて、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｕｓｔｕｍのＣｏｋｅｒ系（例えば、Ｃｏｋｅｒ系３１０．３１２．５１１０  Ｄｅｌｔａｐｉｎｅ６１またはＳｔｏｎｅｖｉｌｌｅ２１３）を形質転換することができ、次いで、戻し−交配によって、導入遺伝子をもう一つのより商業的に重要なＧ．ｈｉｒｕｓｔｕｍ栽培変種植物に導入することができる。
【０３９３】
本発明のトランスジェニック植物を遺伝子型または表現型的に特徴付けして、本発明のＧＡＴポリヌクレオチドの存在を決定することができる。遺伝子型分析は、ゲノミックＤＮＡのＰＣＲ増幅、およびゲノミックＤＮＡと特異的標識プローブとのハイブリダイゼーションを含めた、多数のよく知られた技術のいずれかによって行うことができる。表現型分析は、例えば、グリホセートのような選択された除草剤に曝露された植物または植物組織の生存を含む。
【０３９４】
当業者であれば、ＧＡＴ遺伝子を含有する発現カセットが安定にトランスジェニック植物に取り込まれ、作動するのが確認された後に、性的交配によってそれを他の植物に導入することができるのを認識するであろう。交配させるべき種に応じて、多数の標準育種技術のいずれかを用いることができる。
【０３９５】
成長により増殖させた作物においては、成熟トランスジェニック植物は、切穂を利用することによって、または組織培養技術によって増殖させて、多数の同一植物を生産することができる。望ましいトランスジェニックの選択がなされ、新しい品種が得られ、商業的使用のために成長により増殖される。種子増殖作物においては、成熟トランスジェニック植物は自植させて、ホモ接合同系繁殖植物を生産することができる。同系繁殖植物は、新しく導入された異種核酸を含有する種子を生産する。これらの種子を成長させて、選択された表現型を生じるであろう植物を生産することができる。
【０３９６】
花、種子、葉、枝、果実等のような再生された植物から得られる部分は本発明に含まれ、但し、これらの部分は単離されたＧＡＴ核酸を含む細胞を含むものとする。再生された植物の子孫および変種、および突然変異体も本発明の範囲内に含まれ、但し、これらの部分は導入された核酸配列を含むものとする。
【０３９７】
選択マーカーを発現するトランスジェニック植物は、例えば、標準的なイムノブロットおよびＤＮＡ検出技術によって、ＧＡＴ核酸の伝達につきスクリーニングすることができる。また、トランスジェニック系は、典型的には、異種核酸の発現のレベルについても評価される。ＲＮＡレベルにおける発現を最初に測定して、発現−陽性植物を同定し、定量することができる。ＲＮＡ分析のための標準的な技術を使用することができ、それは、異種ＲＮＡ鋳型のみを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅アッセイ、および異種核酸−特異的プローブを用いる溶液ハイブリダイゼーションアッセイを含む。次いで、本発明の特異的に反応する抗体を用いるウェスタンイムノブロット分析によって、ＲＮＡ−陽性植物を蛋白質発現につき分析することができる。加えて、標準的なプロトコルに従うイン・サイチュハイブリダイゼーションおよび免疫細胞化学を、各々、異種核酸特異的ポリヌクレオチドプローブおよび抗体を用いて行って、トランスジェニック組織内での発現の部位を突き止めることができる。一般に、多数のトランスジェニック系を取り込まれた核酸につき、通常スクリーニングして、最も適当な発現プロフィールを持つ植物を同定し、選択する。
【０３９８】
好ましい具体例は、付加された異種核酸につきホモ接合性であるトランスジェニック植物；すなわち、染色体対各染色体上の同一遺伝子座に２つの付加された核酸配列、１つの遺伝子を含有するトランスジェニック植物である。ホモ接合トランスジェニック植物は、単一の付加された異種核酸を含有するヘテロ接合性トランスジェニック植物を性的に接合（自植）し、生じた種子のいくつかを発芽させ、対照植物（すなわち、自然発生、非−トランスジェニック）に対する改変された細胞分裂につき、生産された結果としての植物を分析することによって得ることができる。親植物に対する戻し−交配および非−トランスジェニック植物との異系交配も考えられる。
【０３９９】
実質的にいずれの植物も、本発明のＧＡＴポリノンクレオチドで形質転換することができる。形質転換および本発明の新規なＧＡＴポリノヌクレオチドの発現に適した植物は、耕種学的におよび園芸学的に重要な種を含む。そのような種は、限定されるものではないが、科：イネ科（トウモロコシ、ライ麦、ライ小麦、大麦、キビ、米、小麦、オート麦等を含む）；マメ科（エンドウ、豆類、ヒラマメ、落花生、クズイモ、ササゲ、ベルベットビーン、大豆、クローバー、アルファルファ、ハウチワマメ、ソラマメ、ミヤコグサ、シナガワハギ、フジ、およびスイートピーを含む）；キク科（ヒマワリのような重要な商業的作物を含めた、少なくとも１，０００属を含む葉脈の最大の科）；およびバラ科（ラズベリー、アンズ、アーモンド、モモ、バラ等を含む）；ならびに堅果植物（クルミ、ペカン、ヘーゼル等を含む）；および森林樹木（Ｐｉｎｕｓ、Ｑｕｅｒｃｕｓ、Ｐｓｅｕｔｏｔｓｕｇａ、Ｓｅｑｕｏｉａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ等を含む）を含む。
【０４００】
本発明のＧＡＴポリヌクレオチド、ならびに前記で特定したものによる修飾のためのさらなる標的は属：Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｌｌｉｕｍ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ａｐｉｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ａｖｅｎａ（例えば、オート麦）、Ｂａｍｂｕｓａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｃａｍｅｌｌｉａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃｉｃｅｒ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ、Ｃｈｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｏｉｘ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｒｃｕｂｉｔｅ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｄａｔｕｒａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｇｌｙｃｉｌｅ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｈｅｖｅａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ（例えば、大麦）、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｉｐｏｍｏｅａ、Ｌａｕｔｕｃａ、Ｌｅｎｓ、Ｌｉｌｉｕｍ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｏｔｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｍａｊｏｒｎａ、Ｍａｌｕｓ、Ｍａｎｇｉｆｅｒａ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｏｒｙｚａ（例えば、コメ）、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ（例えば、キビ）、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｐｒｕｌｕｓ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｒｉｂｅｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｒｕｂｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ（例えば、ライ麦）、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｅｔａｒｉａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ（例えば、小麦）、Ｖｉｃｉａ、Ｖｉｇｎａ、Ｖｉｔｉｓ、Ｚｅａ（例えば、トウモロコシ）、およびＯｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅおよび多くのその他からの植物を含む。記載したように、科Ｇｒａｍｉｎａｅにおける植物は、本発明の方法のための特に望ましい標的植物である。
【０４０１】
本発明の標的である通常の作物植物は、トウモロコシ、コメ、ライ小麦、ライ麦、綿、大豆、ソルガム、小麦、オート麦、大豆、キビ、ヒマワリ、カノーラ、エンドウ、豆類、ヒラマメ、落花生、クズイモ、ササゲ、ベルベットビーン、クローバー、アルファルファ、ハウチワマメ、ソラマメ、ミヤコグサ、シナガワハギ、フジ、スイートピーおよび堅果植物（例えば、クルミ、ペカン等）を含む。
【０４０２】
１つの態様において、本発明は、作物植物が作物を生産するような条件下で、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で形質転換された結果としてグリホセート耐性である植物を成長させ、該作物を収穫することによる作物の生産方法を提供する。好ましくは、グリホセートが、トランスジェニック作物が成長し、作物を生産するのを妨げることなく、雑草を防除するのに効果的な濃度にて植物、または植物の近傍に適用される。グリホセートの適用は植える前に、または収穫の時期を含め植えた後のいずれの時点でもあり得る。グリホセートは一回または複数回適用することができる。グリホセート適用のタイミング、適用する量、適用の態様、および他のパラメーターでは、作物植物の具体的な性質および成長する環境に基づいて変化し、これは、当業者が容易に決定することができる。本発明は、さらに、この方法によって生産された作物を提供する。
【０４０３】
本発明は、ＧＡＴポリヌクレオチド導入遺伝子を含有する植物の増殖を提供する。該植物は、例えば、単子葉植物または双子葉植物であり得る。１つの態様において、増殖は、ＧＡＴポリヌクレオチド導入遺伝子を含有する植物を、交配の少なくともいくらかの子孫がグリホセート耐性を呈するように、第２の植物と交配させることを含む。
【０４０４】
１つの態様において本発明は、作物が成長する圃場において雑草を選択的に防除する方法を提供する。該方法は、ＧＡＴをコードする遺伝子、例えば、ＧＡＴポリヌクレオチドで、形質転換された結果としてグリホセート耐性である作物種子または植物を植え、作物およびいずれかの雑草に、作物に対する有意な有害インパクトなくして、雑草を防除するのに十分な量のグリホセートを適用することを含む。雑草の阻害から得られる利益が、作物または作物植物に対するグリホセートまたはグリホセートアナログのいずれかの負のインパクトを凌ぐ限り、作物は除草剤に全く感受性でないことは必要ないことに注意するのは重要である。
【０４０５】
もう１つの態様において、本発明は、選択マーカー遺伝子としてのＧＡＴポリヌクレオチドの使用を提供する。本発明のこの具体例においては、細胞または生物中でのＧＡＴポリヌクレオチドの存在は、細胞または生物にグリホセート抵抗性の検出可能な表現型形質を付与し、それにより、ＧＡＴポリヌクレオチドに連結された注目する遺伝子で形質転換された細胞または生物につき選択することができる。このようにして、例えば、ＧＡＴポリヌクレオチドを核酸構築物、例えば、ベクターに導入することができ、それにより、グリホセートの存在下で宿主を成長させ、核酸構築物を欠く宿主が生存し、または成長するよりも認識可能により大きな速度で生存しおよび／または、成長する能力につき選択することによって、核酸構築物を含有する宿主（例えば、細胞またはトランスジェニック植物）の同定が可能である。ＧＡＴポリヌクレオチドは、植物、（Ｅ．Ｃｏｌｉを含めた）ほとんどの細菌、アクチノミセス、酵母、藻類および真菌を含めた、グリホセートに感受性の広く種々の宿主において選択マーカーとして用いることができる。慣用的な抗生物質抵抗性とは反対に、植物におけるマーカーとして除草剤抵抗性を用いる一つの利点は、それが、抗生物質抵抗性が環境に逃げ込むであろう公のいくつかのメンバーの関心を軽減することである。多様な宿主系における選択マーカーとしてのＧＡＴポリヌクレオチドの使用を示す実験からのいくらかの実験データを、本明細書の実施例のセクションに記載する。
【０４０６】
トランスジェニック植物における増強されたグリホセート抵抗性を付与するＧＡＴポリヌクレオチドの選択
本明細書中に記載された方法に従って多様化された核酸コードするＧＡＴライブラリーは、トランスジェニック植物においてグリホセートに対する抵抗性を付与する能力につき選択することができる。多様化および選択の１つ以上のサイクルに続き、修飾されたＧＡＴ遺伝子を選択マーカーとして用いて、トランスジェニック植物の生産および評価を促進することができ、および実験または農業植物において除草剤抵抗性を付与する手段として用いることができる。例えば、多様化されたＧＡＴポリヌクレオチドのライブラリーを生じさせるための、例えば、配列番号：１ないし５のうちのいずれか１つ以上の多様化の後、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＡＴコード配列のライブラリーを発現させることによって初期機能的評価を行うことができる。発現されたＧＡＴポリペプチドは前記したように精製し、または部分的に精製することができ、質量分析によって改良されたキネティックススクリーニングすることができる。１つ以上の予備的ラウンドの多様化および選択に続き、改良されたＧＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、Ｃａｍｖ  ３５Ｓプロモータのような、例えば、強力な構成的プロモータに作動可能に連結した植物発現ベクターにクローン化する。修飾されたＧＡＴ核酸を含む発現ベクターを、典型的には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によってＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ宿主細胞に形質転換する。例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ宿主は、花をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｕｉｍの溶液に浸漬し、それを成長させて、種子を結ばせることによって容易に形質転換される。数千の種子がほぼ６週間以内に回収される。次いで、種子を浸漬された植物から大量に収集し、土壌中で発芽させる。このようにして、評価用の数千の独立した形質転換植物を創製することが可能である、高スループット（ＨＴＰ）植物形質転換フォーマットを構成する。大量の成長した実生にグリホセートを噴霧し、グリホセート抵抗性を呈する生存する実生は選択プロセスに対して生存し、他方、非−トランスジェニック植物、および好都合ではなく修飾されたＧＡＴ核酸を取り込む植物は除草剤処理によって損傷され、あるいは死滅させられる。選択的に、グリホセートに対する改良された抵抗性を付与するＧＡＴコーディング核酸は、例えば、ライブラリーインサートに近接するＴ−ＤＮＡプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって回収され、さらなる多様化手法で用いられ、あるいは同一または異なる種のさらなるトランスジェニック植物を生産するのに用いられる。所望であれば、各引き続いての選択において増大させる濃度のグリホセートを用いて、さらなるラウンドの多様化および選択を行うことができる。このように、圃場条件で有用なグリホセートの濃度に対する抵抗性を付与するＧＡＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドを得ることができる。
【０４０７】
除草剤抵抗性
本発明は、本発明の２つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。好ましくは、ＧＡＴポリペプチドは、異なる動的パラメーターを有するＧＡＴポリペプチドをコードし、すなわち、より低いＫｍを有するＧＡＴ編集をより高いｋｃａｔを有するものと組み合わせることができる。さらなる具体例において、異なるＧＡＴポリヌクレオチドを葉緑体トランジット配列または他のシグナル配列にカップリングすることができ、それにより、異なる細胞区画、オルガネラにおけるＧＡＴポリペプチド発現、または１つ以上のＧＡＴポリペプチドの分泌を提供することができる。
【０４０８】
本発明のグリホセート抵抗性のメカニズムは、当該分野で知られた他の形態のグリホセート抵抗性と組み合わせて、優れたグリホセート抵抗性を持つ植物および植物外植体を生産することができる。例えば、すべての目的で、ここに引用してその全体を援用する、米国特許第６、２４８、８７６Ｂ１号；第５、６２７、０６１号；第５、８０４、４２５号；第５、６３３、４３５号；第５、１４５、７８３号；第４、９７１、９０８号；第５、３１２、９１０号；第５、１８８、６４２号；第４、９４０、８３５号；第５、８６６、７７５号；第６、２２５、１１４Ｂ１号；第６、１３０、３６６号；第５、３１０、６６７号；第４、５３５、０６０号；第４、７６９、０６１号；第５、６３３、４４８号；第５、５１０、４７１号；ＲＥ．第３６、４４９５；ＲＥ  第３７、２８７Ｅ号；および第５、４９１、２８８号；および国際公開ＷＯ  ９７／０４１４３ＷＯ  ００／６６７４６；ＷＯ  ０１／６６７０４；およびＷＯ  ００／６６７４７により十分に記載されているように、植物のゲノムに、高レベルの５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）を生産する能力を挿入することによって、グリホセート耐性植物を生産することができる。すべての目的で、ここに引用してその全体を援用する、米国特許第５、７７６、７６０号および第５、４６３、１７５号により十分に記載されているように、グリホセートキシド−レラクターゼ酵素をコードする遺伝子を発現する植物にグリホセート抵抗性はやはり付与される。
【０４０９】
さらに、本発明のグリホセート抵抗性のメカニズムは、除草剤抵抗性の他の形態と組み合わせて、グリホセートおよび１つ以上の他の除草剤に対して抵抗性である植物および植物外植体を生産することができる。例えば、ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼは、パラ−ヒドロキシフェニルピルベート（ＨＰＰ）がホモゲンチセートに形質転換される反応を触媒する酵素である。この酵素を阻害し、酵素に結合して、ＨＰＰのホモゲンチセートへの形質転換を阻害する分子は除草剤として有用である。ある種の除草剤に対してより抵抗性の植物は、すべての目的で、ここに引用してその全体を援用する米国特許第６、２４５、９６８Ｂ１号；第６、２６８、５４９号；および第６、０６９、１１５号；および国際公開ＷＯ  ９９／２３８８６に記載されている。
【０４１０】
また、スルホニル尿素およびイミダゾリノン除草剤は、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）またはアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）をブロックすることによって高等植物の成長を阻害する。スルホニル尿素およびイミダゾリノン耐性植物の生産は、すべての目的で、ここに引用してその全体を援用する米国特許第５、６０５、０１１号；第５、０１３、６５９号；第５、１４１、８７０号；第５、７６７、３６１号；第５、７３１、１８０号；第５、３０４、７３２号；第４、７６１、３７３号；第５、３３１、１０７号；第５、９２８、９３７号；および第５、３７８、８２４号；および国際公開ＷＯ  ９６／３３２７０により十分に記載されている。
【０４１１】
グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）は、ほとんどの植物細胞の発生および生命に必要な必須の酵素であるように見える。ＧＳの阻害剤は植物細胞に対して毒性である。グルフォシネート除草剤は、植物におけるＧＳの阻害による毒性効果に基づいて開発されてきた。これらの除草剤は非―選択的である。それらは、存在する植物のすべての異なる種の成長を阻害し、それらの完全な破壊を引き起こす。外因性ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼを含有する植物の発生は、そのすべての目的でここに引用してその全体を援用する米国特許第５、９６９、２１３号；第５、４８９、５２０号；第５、５５０、３１８号；第５、８７４、２６５号；第５、９１９、６７５号；第５、５６１、２３６号；第５、６４８、４７７号；第５、６４６、０２４号；第６、１７７、６１６Ｂ１号；および第５、８７９、９０３号に記載されている。
【０４１２】
プロトポルフィノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）は、すべての植物の生存に必要な葉緑素の生産に必要である。該ｐｒｏｔｏｘ酵素は種々の除草剤化合物に対する標的として働く。これらの除草剤は、存在する植物のすべての異なる種の成長をやはり阻害し、それらの完全な破壊を引き起こす。これらの除草剤に対して抵抗性の改変されたｐｒｏｔｏｘ活性を含む植物の発生は、すべての目的で、ここに引用してその全体を援用する米国特許第６、２８８、３０６Ｂ１号；第６、２８２、８３７、Ｂ１号；および第５、７６７、３７３号；および国際公開ＷＯ  ０１／１２８２号に記載されている。
【０４１３】
従って、本発明は、グリホセートＮ−アセチルトランスファーゼをコードする遺伝子で形質転換された結果としてグリホセート耐性である作物種子または植物を圃場に植え、次いで、該作物に有意に悪影響を及ぼすことなく、雑草を防除するのに十分な量のグリホセートを圃場中の作物および雑草に含む、作物を含む圃場において雑草を選択的に防除する方法を提供する。
【０４１４】
本発明は、さらに、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および別の機構によりグリホセート耐性を付与するポリペプチド（例えば、グリホセート耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよび／またはグリホセート耐性グリホセートオキシド−レダクターゼ）をコードする遺伝子で形質転換された結果として、グリホセート耐性である作物種子または植物を圃場に植え、次いで、該作物に有意に悪影響することなく、雑草を防除するのに十分な量のグリホセートを圃場中の作物および雑草に適用することを含む、作物を含む圃場中の雑草を防除し、および圃場中のリフォセート−抵抗性雑草の発芽を予防する方法を提供する。
【０４１５】
さらなる具体例において、本発明は、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、別の機構によりグリホセート耐性を付与するポリペプチド（例えば、グリホセート耐性５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼおよび／またはグリホセート耐性グリホセートオキシド−レダクターゼ）をコードする遺伝子、突然変異したヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、スルホンアミノ−耐性アセト乳酸シンターゼ、スルホンアミド−耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾリノン−耐性アセト乳酸シンターゼ、イミダゾリノン−耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼおよび突然変異したプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのようなさらなる除草剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換された結果としてグリホセート耐性である作物種子または植物を圃場に植え、次いで、グリホセート、およびヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ阻害剤、スルホンアミド、イミダゾリノン、ビアラフォス、ホスフィノトリシン、アザフェミジン、ブタフェナシル、スルフォセート、グルフォシネートのようなさらなる除草剤、およびｐｒｔｏｘ阻害剤の十分な量を圃場中の作物および雑草に適用して、作物に有意に悪影響することなく雑草を防除することを含む。作物を含む、圃場中の雑草を防除し、および作物を含む圃場中での除草剤抵抗性雑草の発芽を予防する方法を提供する。
【０４１６】
本発明は、さらに、グリホセートＮ−アセチルトランスフェラーゼ、および突然変異したヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ、スルホンアミド−耐性アセト乳酸シンターゼ、スルホンアミド−耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、イミダゾリノン−耐性アセト乳酸シンターゼ、イミダゾリノン−耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼおよび突然変異したプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのようなさらなる除草剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換された結果としてグリホセート耐性である作物種子または植物を圃場に植え、次いで、作物に有意に悪影響することなく、グリホセート、およびヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ阻害剤、スルホンアミド、イミダゾリノン、ビアラフォス、フォスフィノトリシン、アザフェニジン、ブタフェナシル、スルフォセート、グルフォシネートのようなさらなる除草剤、およびｐｒｏｔｏｘ阻害剤の十分な量を圃場中の作物および雑草に適用して、雑草を防除することを含む、圃場中の雑草を防除し、および作物を含む圃場において除草剤抵抗性雑草の発芽を予防する方法を提供する。
【実施例】
【０４１７】
以下の実施例には説明をするものであって、限定するものではない。当業者であれば、種々の非−臨界的パラメーターを変化させて、実質的に同様な結果を達成することができるのを認識するであろう。
【０４１８】
実施例１：新規な自然発生型ＧＡＴポリペプチドの単離
ＧＡＴ活性を呈するＢａｃｉｌｌｕｓ株からの配列の発現クローニングによって、５つの自然発生型ＧＡＴポリヌクレオチド（すなわち、非−遺伝子的に修飾された生物において天然に存在するＧＡＴポリヌクレオチド）を発見した。それらのヌクレオチ配列を決定し、ここに配列番号：１ないし５として提供する。簡単に述べれば、ほぼ５００のＢａｃｉｌｌｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株のコレクションを、グリホセートをＮ−アセチル化する自然発生的能力につきスクリーニングした。株をＬＢ中で一晩増殖させ、遠心によって収穫し、希薄なトルエンに浸透させ、次いで、洗浄し、緩衝液、５ｍＭグリホセート、および２００μＭアセチル−ＣｏＡを含有する反応ミックスに再懸濁させた。細胞を反応ミックス中で１時間および４８時間の間の時間インキュベートし、その時点で、等容量のメタノールを反応に加えた。次いで、遠心によって細胞をペレット化し、親イオン濃度の質量分析による分析の前に、上澄を濾過した。反応の生成物は、反応ミックスの質量分析プロフィールを、図２に示されたＮ−アセチルグリホセート標準と比較することによってＮ−アセチルグリホセートと肯定的に同定された。生成物検出は双方の基質（アセチルＣｏＡおよびグリホセート）を含めることに依存し、細胞を加熱変性することによってなくなった。
【０４１９】
次いで、個々のＧＡＴポリヌクレオチド、機能スクリーニングによって同定された株からクローン化した。ゲノミックＤＮＡを調製し、Ｓａｕ３Ａ１酵素で部分的に消化した。ほぼ４Ｋｂの断片をＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクローン化し、エレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。トルエン洗浄をＰＭＢＳでの浸透によって置き換えた以外は、前記したような反応に従い、ＧＡＴ活性を呈する個々のクローンを質量分析によって同定した。ゲノミック断片を配列決定し、推定ＧＡＴポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを同定した。ＧＡＴ遺伝子の同一性は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるオープンリーディングフレームの発現点および反応混合物から生じた高レベルのＮ−アセチルグリホセートの検出によって確認した。
【０４２０】
実施例２：Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株Ｂ６から単離されたＧＡＴポリペプチドの特徴付け
Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株Ｂ６からのゲノミックＤＮＡを精製し、Ｓａｕ３Ａ１で部分的に消化し、１ないし１０Ｋｂの断片をＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクローン化した。２．５ｋｂインサートを持つクローンは、質量分析で測定すると、グリホセートＮ−アセシチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）活性をＥ．ｃｏｌｉ宿主に付与した。該インサートの配列決定により、４４１塩基対の単一の完全なオープンリーディングフレームが明らかとされた。このオープンリーディングフレームの引き続いてのクローニングにより、それはＧＡＴ酵素をコードすることが確認された。プラスミドｐＭＡＸＹ２１２０を図４に示す。Ｂ６のＧＡＴ酵素をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１  Ｂｌｕｅに形質転換した。飽和した培養の１０％接種物をＬｕｒｉａブロスに加えて、培養を３７℃において１時間インキュベートした。ＧＡＴの発現は、１ｍＭの濃度におけるＩＰＴＧの添加によって誘導した。培養をさらに４時間インキュベートし、それに続き、遠心によって細胞を収穫し、細胞ペレットを−８０℃で貯蔵した。
【０４２１】
細胞の溶解は、１ｍｌの以下の緩衝液を０．２ｇの細胞に加えることによって行った：Ｓｉｇｍａから得られ、製造業者の推奨によって用いた点２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１００ｍＭ  ＫＣｌおよび１０％メタノール（ＨＫＭ）＋０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌのニワトリ卵リゾチウム、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル。室温（例えば、２２ないし２５℃）における２０分間のインキュベーションの後に、簡単な音波処理で溶解は完了した。溶解物を遠心し、ＨＫＭで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５を通過させることによって、上澄みを脱塩した。ＣｏＡアガロース（Ｓｉｇｍａ）でのアフィニティークロマトグラフィーによって部分的精製が得られた。カラムをＨＫＭで平衡化し、清澄化された抽出物を静水圧下で通過させた。カラムをＨＫＭで洗浄することによって非−結合蛋白質を除去し、１ｍＭコエンザイムＡを含有するＨＫＭでＧＡＴを溶出させた。この手法により、４倍精製が得られた。この段階で、粗溶解物を負荷したＳＤＳポリアクリルアミドゲルで観察された蛋白質染色のほぼ６５％はＧＡＴによるものであり、さらに２０％は、ベクターによってコードされたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼによるものであった。
【０４２２】
Ｓｕｐｅｒｔｅｘ７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通す部分的に精製された蛋白質のゲル濾過によって、均一とする精製が実現された。移動相はＨＫＭであり、ここに、ＧＡＴ活性は１７ｋＤの分子半径に対応する容量で溶出した。１２％アクリルアミドゲル、１ｍｍ厚み上でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付された３μｇのＧＡＴ試料のクーマシー染色によって判断して、この物質は均一であった。精製は、比活性の６倍増加で達成された。
【０４２３】
酢酸および２０％エチレングリコールでｐＨ７．７に調整された５ｍＭモルホリンを含有する緩衝液中に飽和（２００μＭ）アセチルＣｏＡ、変化させる濃度のグリホセート、および１μＭ精製ＧＡＴを含有する反応混合物で、グリホセートに対する見掛けのＫＭを測定した。初期の反応速度は、２３５ｎｍにおけるアセチルＣｏＡのチオエステル結合の加水分解の連続的モニタリングによって決定した。双曲線飽和キネティックスが観察され（図５）、それから、２．９±０．２（ＳＤ）ｍＭの見掛けのＫＭが得られた。
【０４２４】
酢酸および５０％メタノールでｐＨ７．７に調整された５ｍＭモルホリンを含有する緩衝液中に、５ｍＭグリホセート、変化させる濃度のアセチルＣｏＡ．および０．１９μＭ  ＧＡＴを含有する反応混合物にて、アセチルＣｏＡに対する見掛けのＫＭを測定した。初期の反応速度は、Ｎ−アセチルグリホセートの質量分析検出を用いて測定した。５μｌを反復して機器に注入し、積分したピークの面積に対して反応時間をプロットすることによって反応速度が得られた（図６）。双曲線飽和キネティックスが観察され（図７）、それから２μＭの見掛けのＫＭが得られた。既知濃度の酵素で得られたＶｍａｘに対する値から、６／分のｋｃａｔが計算された。
【０４２５】
実施例３：質量分析（ＭＳ）スクリーニングプロセス
２６秒毎に１つの試料のスピードで、９６−ウエルのマイクロタイタープレートから試料（５μｌ）を吸出し、いずれの分離もすることなく、質量スペクトロメーター（Ｍｉｃｒｏｍａｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＬＣ、三重四極質量スペクトロメーター）に注入した。５００Ｕｌ／分の流速にて、水／メタノール（５０：５０）の移動相によって、試料を質量スペクトロメーターに運び込んだ。各注入された試料は、負電子スプレイイオン化プロセスによってイオン化した（ニードル電圧、−３．５ＫＶ；コーン電圧、２０Ｖ；源温度、１２０℃；脱溶媒和温度、２５０℃；コーンガス流量、９０Ｌ／時間；および脱溶媒和ガス流速、６００Ｌ／時間）。このプロセスの間に形成された分子イオン（ｍ／ｚ２１０）は、第二の四極において衝突誘導解離（ＣＩＤ）を実行するための第一の四極によって選択され、そこでは、圧力は５×１０−４ｍバールに設定され、衝突エネルギーは２０Ｅｖに調整された。第三の四極は、親イオン（ｍ／ｚ２１０）から生じた娘イオン（ｍ／ｚ１２４）の１つのみがシグナル記録用のディテクターに入るように設定された。第一および第三の四極は単位分解能に設定され、他方、光電子増倍管は６５０Ｖで操作した。純粋なＮ−アセチルグリホセート標準を比較のために用い、ピーク積分を用いて濃度を見積もった。この方法によって、２００Ｎｍ未満のＮ−アセチルグリホセートを検出することが可能であった。
【０４２６】
実施例４：自然発生的または低活性ＧＡＴ酵素の検出
自然発生的または低活性ＧＡＴ酵素は、典型的には、ほぼ１分−１のｋｃａｔおよび１．５ないし１０Ｍｎのグリホセートに対するＫＭを有する。アセチルＣｏＡに対するＫＭは典型的には２５μＭ未満であった。
【０４２７】
細菌培養物を深い９６−ウエルプレート中の豊富な培地で増殖させ、０．５ｍｌの静止期細胞を遠心によって収穫し、５ｍＭモルホリン酢酸ｐＨ８で洗浄し、５ｍＭモルホリン酢酸ｐＨ８中に２００μＭアンモニウムアセチルＣｏＡ、５ｍＭアンモニウムグリホセート、および５μｇ／ｍｌのＰＭＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を含有する０．１ｍｌの反応ミックスに再懸濁させた。ＰＭＢＳは細胞膜に浸透し、基質および生成物を、全細胞内容物を放出することなく、細胞から緩衝液に移動させる。反応は２５ないし３７℃にて１ないし４８時間行った。反応を等容量の１００％エタノールでクエンチし、全混合物を０．４５μｍのＭＡＨＶ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｏ）で濾過した。前記したように、試料を質量スペクトロメーターを用いて分析し、合成Ｎ−アセチルグリホセート標準と比較した。
【０４２８】
実施例５：高活性ＧＡＴ酵素の検出
高活性ＧＡＴ酵素は、典型的には、４００分−１までのｋｃａｔ、および０．１ｍＭグリホセート未満のＫＭを有する。
【０４２９】
ＧＡＴ酵素をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＱＥ８０（Ｑｉａｇｅｎ）にクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入した。培養を浅いＵ−底９６−ウエルのポリスチレンプレート中の１５０ｕｌの豊富な培地（５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ）で後期対数期まで増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＵＳＢ）を含有する新鮮な培地で１：９希釈した。４ないし８時間のインキュベーションの後、細胞を収穫し、５ｍＭモルホリン酢酸ｐＨ６．８で洗浄し、等容量の同モルホリン緩衝液に再懸濁させた。反応は１０ｕｌまでの洗浄された細胞で行った。より高い活性レベルにおいては、細胞をまず１：２００まで希釈し、５ｕｌを１００ｕｌの反応ミックスに加えた。ＧＡＴ活性を測定するために、低活性につき記載したのと同一の反応ミックスを用いた。しかしながら、高度に活性なＧＡＴ酵素を検出するために、グリホセートの濃度は０．１５ないし０．５ｍＭまで低下させ、ｐＨを６．８まで低下させ、反応は３７℃にて１時間行った。反応仕上げ処理およびＭＳ検出は本明細書中に記載した通りであった。
【０４３０】
実施例６：ＧＡＴ酵素の精製
酵素精製は、ＣｏＡ−アガロースでの細胞溶解物のアフィニティークロマトグラフィー、およびＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５でのゲル−濾過によって達成した。１０ｍｇまでの精製されたＧＡＴ酵素の量は以下の通りに得られた：ｐＱＥ８０ベクター上にＧＡＴポリヌクレオチドを運び、５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＬＢ中で一晩増殖させたＥ．ｃｏｌｉの１００−ｍｌ培養を用いて、１ＬのＬＢ＋５０ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンを接種した。１時間後、ＩＰＴＧを１ｍＭに加え、培養をさらに６時間増殖させた。細胞を遠心によって収穫した。２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０％メタノール（ＨＫＭ）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって供給されたプロテアーゼ阻害剤カクテル、および１ｍｇ／ｍｌのニワトリ卵リゾチウム中に細胞を懸濁させることによって、溶解を行った。室温での３０分後に、細胞を軽く音波処理した。粒状物質を遠心によって除去し、溶解物をコエンザイムＡ−アガロースのベッドを通過させた。カラムを数ベッド容量のＨＫＭで洗浄し、ＧＡＴは、１ｍＭアセチルＣｏＡを含有する１．５ベッド容量のＨＫＭに溶出された。溶出物中のＧＡＴを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ５０限外濾過膜上でのその滞留によって濃縮した。さらなる精製は、０．６−ｍｌ注入のシリーズを介する、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムに蛋白質を通過させることによって実現された。ＧＡＴ活性のピークは、１７ｋＤの分子量に対応する容量で溶出した。この方法の結果、ＧＡＴ酵素は＞８５％回収の均一性まで精製された。同様の手法を用いて、一度に０．１ないし０．４ｍｇ量の９６までのシャッフルされた変種を得た。誘導された培養の容量を１ないし１０ｍｌまで低下させ、コエンザイムＡ−アガロースアフィニティークロマトグラフィーをＭＡＨＶフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に充填された０．１５−ｍｌカラムで行い、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５クロマトグラフィーを省略した。
【０４３１】
実施例７：ｋｃａｔおよびＫＭの測定のための標準的なプロトコル
精製された蛋白質のグリホセートに対するｋｃａｔおよびＫＭは、連続分光学的アッセイを用いて測定し、そこでは、アセチルＣｏＡのスルホエステル結合の加水分解を２３５ｎｍでモニターした。反応は、以下の成分：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、１０％エチレングリコール、０．２ｍＭアセチルＣｏＡ、および種々の濃度のアンモニウムグリホセートが最終容量０．３ｍｌ中に存在する９６−ウエルアッセイプレートのウエル中にて、雰囲気温度（約２３℃）で行った。２つのＧＡＴ酵素のキネティックスの比較において、双方の酵素を同一条件、例えば、共に２３℃下でアッセイした。ｋｃａｔは、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定したＶｍａｘおよび酵素濃度から計算した。ＫＭは、ミカエリス−メンテン方程式のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ変換を用い、０．１２５ないし１０ｍＭの範囲のグリホセート濃度から得られた初期反応速度から計算した。ｋｃａｔ／ＫＭは、ｋｃａｔにつき測定した値をｋｃａｔにつき測定した値によって割ることによって決定した。
【０４３２】
この方法を用い、本明細書中で例示された多数のＧＡＴポリペプチドについての動的パラメーターを決定した。例えば、配列番号：４４５に対応するＧＡＴポリペプチドについてのｋｃａｔ、ＫＭおよびｋｃａｔ／ＫＭは、前記したアッセイ条件を用いて各々、３２２分−１、０．５ｍＭおよび６６０ｍＭ−１分−１と決定された。配列番号：４５７に対応するＧＡＴポリペプチドについてのｋｃａｔ、ＫＭおよびｋｃａｔ／ＫＭは、前記したアッセイ条件を用いて、各々、１１８分−１、０．１ｍＭおよび１１８４ｍＭ−１分−１と決定された。配列番号：３００に対応するＧＡＴポリペプチドについてのｋｃａｔ、ＫＭおよびｋｃａｔ／ＫＭは、前記したアッセイ条件を用い、各々、２９６分−１、０．６５ｍＭおよび４５６ｍＭ−１分−１と決定された。当業者であれば、これらの数を用いて、ＧＡＴ活性アッセイが、ここに与えられた値との比較に適したＧＡＴについての動的パラメーターを創製していることを確認できるであろう。例えば、ＧＡＴの活性を比較するのに用いる条件は、該条件を用いて、テストＧＡＴを本明細書中に例示したＧＡＴポリペプチドと比較する場合、本明細書中で報告されたものと（正常な実験偏差内の）配列番号：３００、４４５および４５７についての同一動的定数を生じるはずである。
【０４３３】
アセチルＣｏＡについてのＫＭは、反応の間に反復してサンプリングを行って質量分析方法を用いて測定した。アセチルＣｏＡおよびグリホセート（アンモニウム塩）を、５０倍濃縮ストック溶液として、質量分析試料プレートのウエルに入れた。反応は、モルホリン酢酸または炭酸アンモニウムのような揮発性緩衝液（ｐＨ６．８または７．７）中にほぼ希釈された酵素を添加することによって開始した。試料を反復して機器に注入し、初期速度は滞留時間およびピーク面積のプロットから計算した。ＫＭはグリホセートにつき計算した。
【０４３４】
実施例８：形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの選択
進化したＧＡＴ遺伝子（ＧＡＴコード配列の５’末端に直接結合した自然発生型Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓリボソーム結合部位（ＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＣＴＣ；配列番号：５１５）とのキメラ）をＥ．ｃｏｌｉおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にて発現ベクターｐＱＥ８０（Ｑｉａｇｅｎ）にクローン化し、その結果、プラスミドｐＭＡＸＹ２１９０が得られた（図１１）。これはプラスミドからのＨｉｓタグドメインを排除し、抗生物質アンピシリンおよびカリベニシリンに対する抵抗性を付与するＢ−ラクタマーゼ遺伝子を保持した。ｐＭＡＸＹ２１９０をＸＬ１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞にエレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）した。細胞をＳＯＣリッチの培地に懸濁させ、１時間で回収した。次いで、細胞を温和にペレット  化し、芳香族アミノ酸を欠くＭ９最小培地（１２．８ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、０．４％グルコース、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍｇ／Ｌ置換チアミン、１０ｍｇ／Ｌプロチン、３０ｍｇ／Ｌカルベニシリン）で１回洗浄し、２０ｍｌの同一Ｍ９培地に再懸濁させた。２５０ｒｐｍにおける３７℃での一晩の増殖の後、等容量の細胞をＭ９培地またはＭ９＋１ｍＭグリホセート培地いずれか上で平板培養した。ＧＡＴ遺伝子を含まないｐＥ８０ベクターを同様にＥ．ｃｏｌｉ細胞に導入し、比較のために単一コロニーにつき平板培養した。表３は結果の概要を示し、これは、ＧＡＴ活性が、１％未満のバックグラウンドでもって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の選択および増殖を可能とすることを示す。十分なＧＡＴ活性が形質転換された細胞が増殖を可能とするのに、ＩＰＴＧ誘導は必要がなかったことに注意されたし。形質転換は、グリホセートの存在下で増殖させたＥ．ｃｏｌｉ細胞からのｐＭＡＸＹ２１９０の再単離によって証明した。
【０４３５】
（表３．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐＭＡＸＹ２１９０のグリホセート選択）
【０４３６】
【表３】
2010220617.tif 000027
実施例９：形質転換された植物細胞の選択
植物細胞のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−媒介形質転換は低い効率で起こる。非−形質転換細胞の増殖を阻害しつつ形質転換細胞の増殖を可能とするためには、選択マーカーが必要である。除草性化合物ホスフィノトリシンを解毒するカナマイシンおよびヒグロマイシンに対する抗生物質マーカー、および除草剤修飾遺伝子ｂａｒは、植物で用いられる選択マーカーの例である（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９５，４９：９−１８）。ここに、我々は、ＧＡＴ活性が植物形質転換のための有効な選択マーカーとして働くことを示す。図１２に示すように、進化したＧＡＴ遺伝子（０ ５Ｂ８）、配列番号：１９０、を植物プロモータ（増強されたイチゴ葉脈帯状ウイルス）およびユビキノンターミネーターの間にクローン化し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｓ  ＥＨＡ１０５を介する植物細胞の形質転換に適した二元ベクターｐＭＡＸＹ３７９３のＴ−ＤＮＡ領域に導入した。スクリーニング可能なＧＵＳマーカーはＴ−ＤＮＡに存在して、形質転換の確認を可能とした。唯一の選択剤としてグリホセートを用い、トランスジェニックタバコ苗条を創製した。
【０４３７】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．Ｘａｎｔｈｉの腋芽をスクロース（１．５％）およびゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）（０．３％）を含む半−強度ＭＳ培地上で、１６時間照明（３５ないし４２μアインシュタインｍ−２ｓ−１、冷白色蛍光ランプ）下にて、２ないし３週間毎に２４℃で継代培養した。２ないし３週間の継代培養の後に若い葉を植物から切り出し、３×３ｍｍセグメントに切断した。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５をＬＢ培地に接種し、Ａ６００＝１．０の密度まで一晩増殖させた。細胞を４，０００ｒｐｍにおいて５分間ペレット化し、２ｍｇ／ＬのＮ６−ベンジルアデニン（ＢＡ）、１％グルコースおよび４００ｕＭアセチシリンゴンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（ＭＳ）培地（ｐＨ５．２）よりなる３容量の液体共培養培地に再懸濁させた。次いで、葉ピースを１００×２５ｍｍペトリ皿中の２０ｍｌのＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに３０分間沈め、オートクレーム処理した濾紙でブロットし、次いで、固体共−培養培地（０．３％ゲルライト）上に置き、前記したようにインキュベートした。３日間の共−培養の後、２０ないし３０セグメントを、２ｍｇ／ＬのＢＡ、３％のスクロース、０．３％のゲルライト、０ないし２００ｕＭのグリホセート、および４００ｕｇ／ｍｌのチメンチンを含むＭＳ固体培地（ｐＨ５．７）よりなる基礎苗条誘導（ＢＳＩ）培地に移した。
【０４３８】
３週間後、苗条は、ＧＡＴ遺伝子の存在または不存在に拘らず、グリホセートを含まない培地に置かれた外植体上で明らかであった。双方の構築物からのＴ−ＤＮＡ導入は、再生した苗条からの葉のＧＵＳ組織化学染色によって確認された。２０ｕＭを超えるグリホセート濃度は、ＧＡＴ遺伝子を欠く外植体からのいずれの苗条形成をも完全に阻害した。ＧＡＴ構築物を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで感染された外植体は、２００ｕＭ（テストした最高レベル）までのグリホセート濃度において苗条を再生した。形質転換は、ＧＵＳ組織化学染色によって、およびプロモータおよび３’領域にアニールするプライマーを用いるＧＡＴ遺伝子のＰＣＲ断片増幅によって確認した。結果を表４にまとめる。
【０４３９】
（表４．グリホセート選択でのタバコ苗条再生）
【０４４０】
【表４】
2010220617.tif 000028
実施例１０：形質転換された酵母細胞のグリホセート選択
酵母形質転換のための選択マーカーは、通常、特定のアミノ酸またはヌクレオチドを欠く培地での形質転換細胞の増殖を可能とする栄養要求性遺伝子である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはグリホセートに感受性であるので、ＧＡＴは選択マーカーとしても用いることができる。これを証明するために、進化したＧＡＴ遺伝子（０  ６Ｄ１０）、配列番号：１９６、を全コーディング領域を含有するＰｓｔＩ−ＣｌａＩ断片として（図９に示されるように）Ｔ−ＤＮＡベクターｐＭＡＸＹ３７９３からクローン化し、図１３に示すように、ＰｓｔＩ−ＣｌａＩ消化ｐ４２４ＴＥＦ（Ｇｅｎｅ，１９９５，１５６：１１９−１２２）に連結する。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点、およびカルベニシリン抵抗性を付与する遺伝子、ならびにＴＲＰ１、酵母形質転換のためのトリプトファン栄養要求株選択マーカーを含有する。
【０４４１】
ＧＡＴ含有構築物をＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢカルベニシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）寒天培地上で平板培養する。プラスミドＤＮＡを調整し、形質転換キット（Ｂｉｏ１０１）を用いて酵母株ＹＰＨ４９９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換する。グリホセートを加えたすべての芳香族アミノ酸（トリプトファン、チオシンおよびフェニルアラニン）を欠くＣＳＭ−ＹＮＢ−グルコース培地（Ｂｉｏ１０１）上で平板培養する。比較のために、ＧＡＴ遺伝子を欠くｐ４２４ＴＥＦをＹＰＨ４９９に導入し、前記したように平板培養する。結果は、ＧＡＴ活性が有効な選択マーカーとして機能することを示す。グリホセート選択コロニーにおけるＧＡＴ含有ベクターの存在は、プラスミドの再−単離および制限消化分析によって確認することができる。
【０４４２】
実施例１１：ＧＡＴ発現タバコ植物の除草剤噴霧テスト
実施例９に記載されたように作成したタバコ苗条を外植体から切り出し、１．５％のスクロース、０．３％のゲルライト、０ないし２００ｕＭのグリホセート、および４００ｕｇ／ｍｌを含む半−強度ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（ＭＳ）培地、ｐＨ５．７、よりなる基礎根誘導（ＢＲＩ）培地に移した。発根した植物および腋苗条を、所望の数のクローンが得られるまで、幹を切断し、それを新鮮なＤＲＩ培地に移すことによってクローン的に増殖させた。発根した植物を固体培地から注意深く取り出した。植物を土壌の小さな鉢に入れる前に、根を洗浄していずれの残存するゲルライトも除去した。保護プラスチックカバーを、植物がよく確立されるまで、少なくとも１週間の間植物上に維持した。
【０４４３】
ＧＡＴ発現タバコ植物がグリホセートのシミュレートされた圃場速度噴霧に耐えることができるかを決定するために、ＧＡＴ変種当たり数事象のクローン系をテストした。典型的なテストは以下の通りに設定した：各事象からの１つのクローンに、噴霧した有効成分の量が市販のグリホセート製品に存在するのと同等となるように、グリホセートのイソプロピルアミン塩（Ｓｉｇｍａ  Ｐ５６７１）および０．１２５％トリトンＸ−１００、ｐＨ６．８を含有する１ｍｌの溶液を噴霧した。例えば、４０％有効成分（「ＡＩ」）を含有する３２ｏｚ／エーカー（１×）の除草剤を達成するために、２．４ｕｌの４０％ａｉ処方を１ｍｌの水に希釈し、４−平方インチ鉢（１６ｉｎ２）中の植物に噴霧した。界面活性剤のみでのモック適用（０×）も含めた。いくつかの場合において、１ないし４週間後に第二の噴霧を適用した。植物を２５℃および７０％湿度で１６時間照射する制御された成長室中に維持した。
【０４４４】
この実施例において、１０事象は、ＧＡＴ０  ６Ｄ１０（配列番号：１９６）につき陽性であることが確認され、１０がＧＡＴ０  ５Ｄ３（配列番号：１９３）につき確認され、８事象がＧＡＴ０  ５Ｂ８（配列番号：１９０）で確認され、ベクターのみ（ＧＡＴなし）で形質転換された植物をクローン的に増殖させ、土壌に移し、植物が平均５つの葉を有すると噴霧した。また、種子−成長野生型植物も噴霧した。２週間後に、０．５、２または４×グリホセートを噴霧したベクターおよび種子成長植物は成長を停止し、萎れ、茶色に変化した。トランスジェニックＧＡＴ植物の各々は、白化、葉の伸長、発育停止または茶色化のようなグリホセート損傷の兆候なくして噴霧手法で生存した。非−ＧＡＴ対照植物を含めたすべての０×植物は健康であった。３週間後、生存する植物のすべてに８×容量を噴霧した。０×対照植物は２週間以内に死滅した。再度、すべてのＧＡＴ植物は生存した。
【０４４５】
ＧＡＴで形質転換し、グリホセートで選択したタバコ植物は稔性であった。開花および種子の組は野生型植物から検出可能に異ならなかった。
【０４４６】
実施例１２：ＧＡＴ遺伝子およびグリホセート耐性表現型のメンデル遺伝  ＧＡＴ遺伝子およびグリホセート耐性表現型のメンデル遺伝は、形質転換されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓで証明された。ＣｏｌｕｍｂｉａタイプのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を成長させ、キメラと呼ばれるＧＡＴ変種を含む構築物（配列番号：１６）を用いる浸漬方法（Ｃｌｏｕｇｈ，ＳＪ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，ＡＦ，（１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６（６）：７３５−４３）によって形質転換した。バルク種子を集め、Ｔ−ＤＮＡ内のインサートに特異的なプライマーでのＰＣＲによって、ＧＡＴ植物を確認した。個々の事象からのＴ１種子を、２−平方インチ鉢当たり１０ないし３０にて種子を土壌に蒔いた。本葉の最初の組が発芽しつつある時に、鉢に、（実施例１１におけるように計算して）０．５および１×市販製品と同等のグリホセートを噴霧した。２週間後、導入遺伝子および耐性表現型の分離は表５に示すように明らかであった。
【０４４７】
（表５．  ０．５および１×グリホセート耐性Ｔ１  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓについての分離データのまとめ）
【０４４８】
【表５】
2010220617.tif 000029
３：１近くの比率は、単一分離の支配的事象を示す。３：１より大きな比率は、数個の分離インサートを示す。３：１未満の比率は、小さな試料サイズの効果、不完全な優性、または位置効果によるものであり得、これは、発現を余りにも低くして除草剤耐性を付与できない。対照と比較して、ＧＡＴ遺伝子がＴ１世代に伝達し、グリホセート耐性を付与したことが明らかであった。
【０４４９】
実施例１３：ＧＡＴ導入遺伝子を発現するグリホセート抵抗性トウモロコシの生産
ＧＡＴ変種導入遺伝子を発現するトウモロコシ植物は、ここに引用して援用する米国特許第５，９８１，８４９号に記載された方法を用いて生産した。具体的には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｎｅｓベクターを当該分野で知られた方法によって構築した。各ベクターはユビキチンプロモータおよびイントロンを有するインサート、ＧＡＴ変種およびＰｉｎＩＩターミネーターを含んだ。トウモロコシ未成熟胚を切り出し、注目するＧＡＴ変種を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｎｅｓベクターで感染させた。感染の後、胚を共−培養媒地に移し、そこで培養した。共−培養の後、感染した未成熟の胚を、１．０ｍＭグリホセート（Ｒｏｕｎｄｕｐ  ＵＬＴＲＡＭＡＸＴＭ）を含有する培地に移した。活動的に成長する推定トランスジェニックカルスが同定されるまで、この選択を継続した。推定トランスジェニックカルス組織をＰＣＲおよびウエスタンアッセイ（データは示さず）につきサンプリングして、ＧＡＴ遺伝子の存在を確認した。推定トランスジェニックカルス組織を、植物再生前に、さらなる成長および選択のために０．１ｍＭグリホセート選択培地で維持した。再生において、トランスジェニックであることが確認されたカルス組織を、０．１ｍＭグリホセートを含有する成熟培地に移し、体細胞胚成熟のために培養した。次いで、苗条および根形成のために０．１ｍＭグリホセートを含有する再生培地に成熟胚を移した。苗条および根が現した後、０．１ｍＭグリホセートを含有する発根培地を含むチューブに個々の苗木を移した。確立された苗条および根を持つ苗木を、さらなる成長、Ｔ０噴霧データの作成、およびＴ１種子の生産のために温室中の鉢に移植した。
【０４５０】
ＧＡＴ変種導入遺伝子を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物のグリホセート抵抗性のレベルを強化するために、温室中で、Ｔ０植物にグリホセート（Ｒｏｕｎｄｕｐ  ＵＬＴＲＡ  ＭＡＸＴＭ）を噴霧した。植物抵抗性レベルを、植物変色スコアおよび植物高さ測定によって見積もった。植物変色および植物高さは以下のスケールに従って評価した。
【０４５１】
グリホセートでの噴霧から１、２、３および４週間後における変色スコア
９＝葉／幹変色無し
７＝わずかな葉／幹変色
５＝悪化した葉／幹変色
３＝ひどく変色した植物または死滅しつつある植物
１＝死滅した植物
植物高さの測定
グリホセートの噴霧前
グリホセートでの噴霧から１、２、３および４週間後
（房がある）成熟植物
２つの植物を、表６にリストした各事象（独立したトランスジェニックカルス）から温室に送った。植物１は種子生産のために維持し、グリホセートを噴霧しなかった。植物２は移植から１４日後に４×グリホセート（１×グリホセート＝２６オンス／エーカー）で噴霧した。噴霧から７および１４日後における４×噴霧でのＴ０植物変色スコアを表６および７に示す。房形成時における高さのデータを図１４に示す。さらに実験を行い、そこでは、Ｔ６植物に６×グリホセートを噴霧した。噴霧から１０日後における６×噴霧でのＴ０植物変色スコアを表８に示す。
【０４５２】
（表６．  ４×グリホセートでの処理から７日後における抵抗性スコア）
【０４５３】
【表６】
2010220617.tif 000030
（表７．  ４×グリホセートでの処理から１４日後における抵抗性スコア）
【０４５４】
【表７】
2010220617.tif 000031
（表８  ６×グリホセートでの処理から１０日後における抵抗性スコア）
【０４５５】
【表８】
2010220617.tif 000032
実施例１４：ＧＡＴはアシルトランスフェラーゼでもある。
【０４５６】
プロピオニル基をプロピオニルＣｏＡからグリホセートに移動させるＧＡＴ変種（Ｂ６（配列番号：７）、０  ６Ｄ１０（配列番号：４４８）、１７−１５Ｈ３（配列番号：６０１）、および２０−８Ｈ１２ｃ（配列番号：８１７））の能力を、５ｍＭグリホセートを含有する、またはグリホセートを含有しない反応混合物中でテストした。プロピオニルＣｏＡは１ｍＭで存在させた。３０分後に、反応を停止し、遊離プロピオニルＣｏＡの存在をＤＴＮＢの添加によって決定した。すべての変種は、プロピオニルＣｏＡのグリホセート依存性加水分解を示した。これらの結果は、ＧＡＴがアセチルトランスフェラーゼとしても機能することを示す。
【０４５７】
実施例１５：ＧＡＴ導入遺伝子を発現するグリホセート抵抗性トウモロコシのＴ１実験
実施例１３に記載された方法を用い、ＧＡＴ変種導入遺伝子１８−２８Ｄ９ｂ（配列番号：８１４）および１７−１５Ｈ３（配列番号：５４９）を発現するトウモロコシ植物を生産した。Ｔ１植物をグリホセート圃場耐性データの作成のために用いた。Ｔ１植物を、各事象につき、４つの異なるグリホセート噴霧処理（０×、４×、８×、および４×＋４×）にて圃場で処理した。植物はＶ３およびＶ８で噴霧した。実施例１３に記載したように、植物を処理から１０日後に葉変色および植物高さ比較のためにスコア取りした。Ｔ１圃場噴霧データは、実施例１３で報告した温室で先に得られた結果とよく相関した。Ｔ２種子をさらなる実験のために収集した。
【０４５８】
実施例１６：ＧＡＴポリペプチドの熱安定性
Ａ．ＧＡＴ導入遺伝子を発現するグリホセート抵抗性トウモロコシのグリホセート耐性に対する温度変動の効果
実施例１３に記載した方法を用い、ＧＡＴ変種導入遺伝子１０  ４Ｆ２（配列番号：２０３）、１７−１５Ｈ３（配列番号：５４９）、および１８−２８Ｔ９ｂ（配列番号：８１４）を発現するトウモロコシ植物を生産した。グリホセート耐性に対する温度の効果をＴ１植物において評価した。Ｔ１植物を涼／冷（日中１４℃、夜間８℃、）、温（日中２８℃、夜間２０℃）および暑（日中３７℃、夜間２０℃）条件で成長させた。Ｔ１植物に４つの異なるグリホセート噴霧処理（０×、４×、６×、および８×）にて、Ｖ２で噴霧した。実施例１３に記載したように、植物を葉変色および植物高さの比較のために処理から５および１４日後にスコア取りした。視覚観察により、グリホセート耐性はテストした温度の範囲によって悪影響を受けないことが示された。
【０４５９】
Ｂ．インビトロにおけるＧＡＴ活性に対する温度変動の効果
数個のＧＡＴポリペプチド（ＤＳ３（配列番号：８に対応する自然発生型ＧＡＴポリペプチド）、６  ６Ｄ５（配列番号：４１０）、１７−１５Ｈ３（配列番号：６０１）、２０−８Ｈ１２（配列番号：７３９）、２２−１３Ｂ１２（配列番号：７８１）および４０１（配列番号：６に対応する自然発生型ＧＡＴポリペプチド））のインビトロ熱安定性を、以下の方法に従って評価した。酵素を２００μｌストリップＰＣＲチューブ（ＶＷＲ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）に分配し、図１７に示したように、３０℃および６０℃の間の種々の温度にて１５分間、グラジエントサーモサイクラー（ＭＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）中でインキュベートした。沈殿した蛋白質を遠心によって除去し、残存する可溶性蛋白質の生存酵素活性を、実施例７に記載したように、連続分光学的アッセイによって２２℃で測定した。飽和濃度のグリホセート（ＤＳ３（配列番号：８）、４０１（配列番号：６）および６  ６Ｄ５（配列番号：４１０）については１０ｍＭ；１７−１５Ｈ３（配列番号：６０１）、２０−８Ｈ１２（配列番号：７３９）、および２２−１３Ｂ１２（配列番号：７８１）については５ｍＭ、およびＡｃＣｏＡ（１６７μＭ））を用いた。
【０４６０】
データを図１７に示す。自然発生型（すなわち、野生型）ＧＡＴポリペプチドＤＳ３（配列番号：８）および４０１（配列番号：６）は、約４２ないし約４４℃までの温度における活性に関して安定に見えた。いずれかの生物に対して自然発生的でない（すなわち、野生型でない）ＧＡＴポリペプチドは、約４７℃ないし約５４℃の範囲の温度で安定に見えた。
【０４６１】
また、いくつかのＧＡＴポリペプチドの半減期を以下の手法に従って３７．５℃で測定した。ＧＡＴポリペプチド４０１（配列番号：６）、１７−１５Ｈ３（配列番号：６０１）、２０−８Ｈ１２（配列番号：７３９）、２２−１３Ｂ１２（配列番号：７８１）、２２−１５Ｂ４（配列番号：９４６）および２２−１８Ｃ５（配列番号：７９５）を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、１０ｍＭのＫＣｌおよび１０％メタノールのマトリックス（「ＨＫＭ」）中でインキュベートした。種々の時刻において、アリコットを取り出し、飽和濃度のグリホセート（４０１については２０ｍＭ、残りについては５ｍＭ）およびＡｃＣｏＡ（１６７ｕＭ）を用い、実施例７に記載された連続分光学的アッセイを用いて２２℃にて三連でアッセイした。各時点における標準誤差は平均して約２．９％であった。ＧＡＴ活性をインキュベーション時間の関数としてプロットし、指数関数的崩壊についての曲線（ｙ＝ｅ−ｘ）（式中、ｙは酵素活性であって、ｘは時間で表した時間である）にデータをフィットさせ、それから半減期を計算した。データを以下の表９に示す。
【０４６２】
（表９  ３７．５℃におけるＧＡＴポリペプチドの半減期）
【０４６３】
【表９】
2010220617.tif 000033
実施例１７：ＧＡＴ導入遺伝子を発現するグリホセート抵抗性大豆の生産
ＤｕＰｏｎｔ弾丸ＰＤＳ１０００／Ｈｅ機器を用いる粒子ガン衝撃の方法（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３参照）を用いて、ＧＡＴ変種導入遺伝子を発現する大豆植物を生産した。形質転換プロセスの間に用いた選択剤はヒグロマイシンであった。トランスジェニック事象で残ったヒグロマイシン選択マーカー遺伝子またはヒグロマイシン遺伝子いずれかを、当該分野で公知の方法によって切り出した。合成構成的プロモータ、ＧＡＴ変種およびＰｉｎＩＩターミネーターにて、ＤＮＡ断片を調製した。３５Ｓ  ＣａＭＶプロモータ、ＨＰＴ遺伝子およびＮＯＳターミネーターを含む選択マーカー遺伝子を、前記したように、ＧＡＴ遺伝子変種と共に共衝撃させた。衝撃させた大豆胚形成性懸濁液組織を選択剤の不存在下で１週間培養した。胚形成性懸濁液組織を液体選択培地中に６週間入れた。推定トランスジェニック懸濁液組織をＰＣＲ分析のためにサンプリングして、ＧＡＴ遺伝子の存在を測定した。推定トランスジェニック懸濁液培養組織を３週間選択培地中に維持して、植物再生用の十分な組織を得た。標準的な手法を用いて懸濁液組織を４週間成熟させ；成熟した体細胞胚を４ないし７日間乾燥し、次いで、２ないし４週間発芽誘導培地上に置いた。発芽した苗木を、順化のために、細胞パックトレイ中の土壌に３週間移した。グリホセート抵抗性の評価のために、苗木を温室中の１０−インチ鉢に植えた。
【０４６４】
ＧＡＴ変種導入遺伝子を発現するトランスジェニック大豆のグリホセート抵抗性のレベルを測定するために。Ｔ０植物を温室中でグリホセート（Ｒｏｕｎｄｕｐ  ＵＬＴＲＡ  ＭＡＸＴＭ）を噴霧した。植物抵抗性レベルを、植物変色スコアおよび植物高さの測定によって評価した。
【０４６５】
グリホセートでの噴霧から２週間後における変色スコア
９＝葉／幹変色無し
７＝わずかな葉／幹変色
５＝悪化した葉／幹変色
３＝ひどく変色した植物または死滅しつつある植物
１＝死滅した植物
１ないし４つの植物を各独立したトランスジェニック事象から温室に送った。事象当たりさらに１ないし２の植物を、種子生産用の制御された環境成長チャンバー中で成長させ、グリホセートを噴霧しなかった。土壌に移してから３ないし４週間後、温室植物に１×、２×または４×グリホセート（１×グリホセート＝２６オンス／エーカーＲｏｕｎｄＵｐＵＬＴＲＡ  ＭＡＸＴＭ）を噴霧した。２×および４×噴霧速度でのＴ０植物変色スコアを、各々、表１０および表１１に示す。
【０４６６】
これらの結果は、ＰＣＲ分析によって確認されるように、大豆がＧＡＴ遺伝子変種で効果的に形質転換されることを示す。ＧＡＴ遺伝子変種を発現するトランスジェニック大豆は２×および４×噴霧速度にてグリホセートに対して抵抗性である。４×グリホセート噴霧で生き残る事象はいくらかわずかな葉変色を示すが、噴霧テストから２週間以内に、植物は回復し、正常な葉の形態を示す。
【０４６７】
（表１０  ２×グリホセートでの処理から１０日における抵抗性スコア）
【０４６８】
【表１０】
2010220617.tif 000034
（表１１  ４×グリホセートでの処理から１０日後における抵抗性スコア）
【０４６９】
【表１１】
2010220617.tif 000035
実施例１８：ＧＡＴキネティックスに対する塩の効果
本発明のＧＡＴ酵素が意図したように用いられる（例えば、植物細胞）生理学的条件を良好に近似するために、本発明のいくつかのＧＡＴ酵素の活性を添加した塩の存在下で再度評価した。図１５Ａおよび１５Ｂは、添加したＫＣｌの不存在下（陰影を付けない棒線）または２０ｍＭ  ＫＣｌの存在下で（陰影を付けた棒線）いずれかでアッセイした、自然発生型ＧＡＴ酵素ＧＡＴ４０１（配列番号：６）、Ｂ６（配列番号：７）、およびＤＳ３（配列番号：８）、および進化したＧＡＴ酵素０  ６Ｄ１０（配列番号：４４８）、１０  ４Ｆ２（配列番号：４５４）、１８−２８Ｄ９（配列番号：６１８）、１７−１５Ｈ３（配列番号：６０１）、１７−１０Ｂ３（配列番号：５９２）、２０−８Ｈ１２（配列番号：７３９）、２０−１６Ａ３（配列番号：６３９）、および２０−３０Ｃ６（配列番号：６８３）についての、各々、動的パラメーターＫｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍの比較を掲げる。実施例７に記載されたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて蛋白質濃度を測定した。ＫＣｌの不存在下でのグリホセートに対するその極端に低いＫｍのため、進化した酵素０  ６Ｄ１０、１８−２８Ｄ９および２０−８Ｈ１２についての動的パラメーターは、実施例３に記載された質量分析アッセイを用いてＫＣｌの不存在下で測定し、他方、（ＫＣｌの不存在下または存在下いずれかにおける）すべての他の動的パラメーターは、実施例７に記載された連続分光学的アッセイを用いて測定した。誤差棒線は、利用可能な場合には、複数のアッセイの標準偏差を表す。図１５Ａは、アッセイ緩衝液への塩（２０ｍＭ  ＫＣｌ）の添加が、グリホセートについてのＫｍ値を有意に増加させることを示す。該ｋｃａｔ値は比較的変化しないままであるか、あるいはわずかに増加し、正味の結果は、添加されたＫＣｌの不存在下におけるよりも２０ｍＭ  ＫＣｌの存在下においてアッセイしたＧＡＴ酵素についてより低い観察されたｋｃａｔ／Ｋｍ値である（図１５Ｂ）。
【０４７０】
実施例１９：極端に高い活性を持つＧＡＴ酵素をコードするさらなる進化したＧＡＴ遺伝子
指向された分子進化のさらなる反復により、極端に高いＧＡＴ活性を呈する、例えば、先に記載したＧＡＴ酵素と比較して、グリホセートについての低下したＫｍ、増加したｋｃａｔ、または増加したｋｃａｔ／Ｋｍのような１つ以上の改良された特性を呈するＧＡＴ酵素をコードするさらに進化したｇａｔ遺伝子を生じた。
【０４７１】
１ｍＭグリホセートよりはむしろ５ｍＭグリホセートを選択で用いた以外は、実施例８に記載されたように、さらに進化したｇａｔ遺伝子を、まず、最小Ｍ９培地中でＥ．ｃｏｌｉにおける増殖につき選択した。蛋白質を前記実施例に記載したように精製した。
【０４７２】
蛋白質濃度を２０５ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって決定した。消光係数は、式Ｅ（ｍｇ  ｍｌ−１ｃｍ−１）＝２７＋１２０（Ａ２８０／Ａ２０５）＝３０．５に従い、Ｓｃｏｐｅｒによって記載された方法（１９９４；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によって決定した。ＵＶ吸光度による定量に先立ち、ＮＡＰ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、蛋白質溶液を５０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４に緩衝液−交換した。
【０４７３】
例示的さらに進化したｇａｔコード配列は、各々、配列番号：８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９および９３１として本明細書中では確認されるアミノ酸配列を含むさらに進化したＧＡＴ酵素をコードする配列番号：８３２、８３４、８３６、８３８、８４０、８４２、８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８および９３０として本明細書中では確認される核酸配列を含む。いくつかのそのようなさらに進化したＧＡＴ酵素は、それらが同一条件下でアッセイした先に記載したＧＡＴ酵素と比較してグリホセートについての低下したＫｍ、増加したｋｃａｔ、または増加したｋｃａｔ／Ｋｍのような１つ以上の改良された特性を呈する点で極端に高いＧＡＴ活性を呈する。
【０４７４】
図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃは、前記したようにＵＶ吸光度を介して定量された蛋白質と２０ｍＭ  ＫＣｌの存在下で連続分光高度アッセイを用いてアッセイされた、本発明のいくつかのさらに進化したＧＡＴ酵素の動的パラメータ（陰影を付けた棒線）に対するいくつかの先に記載したＧＡＴ酵素の、各々、動的パラメーターＫｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ・Ｋｍ（陰影を付けない棒線）の比較を掲げる。誤差棒線は、利用可能な場合、複数アッセイの標準偏差を表す。これらのアッセイ条件下では、自然発生型ＧＡＴ酵素ＧＡＴ４０１（配列番号：６）は約４ｍＭのグリホセートについてのＫｍ、約５．４分―１のｋｃａｔ、および約１．３５ｍＭ−１分−１のｋｃａｔ／Ｋｍを呈した。これらの条件下でアッセイした場合、本発明のいくつかのさらに進化したＧＡＴ酵素（陰影を付けた棒線）は（約０．４ｍＭおよび０．１ｍＭの間のような）約０．４ｍＭ未満のグリホセートについてのＫｍ値、（約１０００分−１および約２５００分−１の間のような）少なくとも約１０００分−１のｋｃａｔ値、および（約４８００ｍＭ−１分−１および約８０００ｍＭ−１分−１の間のような）少なくとも約４８００ｍＭ−１分−１のｋｃａｔ／Ｋｍ値の範囲を呈する。例えば、本発明のいくつかのさらに進化したＧＡＴ酵素は、これらのアッセイ条件下で、自然発生型ＧＡＴ酵素ＧＡＴ４０１よりも優れたｋｃａｔ／Ｋｍの少なくとも約７０００倍増加を呈する。
【０４７５】
本発明のいくつかのさらに進化したＧＡＴ酵素は、位置２７における、Ｂ１、Ｚ１またはＡアミノ酸残基；位置３３における、ＮまたはＧアミノ酸残基；位置４６における、Ｂ２、Ｚ４またはＨアミノ酸残基；および位置９３における、Ｒアミノ酸残基のような、先に記載したＧＡＴポリペプチドおよびＧＡＴ酵素で観察されない１つ以上のアミノ酸残基位置を含み；ここに、Ｂ１はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｂ２はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、ＳおよびＴよりなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｚ１はＡ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶよりなる群から選択されるアミノ酸であり；およびＺ４はＲ、ＨおよびＫよりなる群から選択されるアミノ酸である。例えば、本発明のいくつかのさらに進化したＧＡＴ酵素は：位置２７におけるＡｌａ（すなわち、Ａｌａ２７）；位置３３におけるＡｓｎまたはＧｌｙ（すなわち、Ａｓｎ３３またはＧｌｙ３３）；位置４６におけるＨｉｓ（すなわち、Ｈｉｓ４６）；および位置９３におけるＡｒｇ（すなわち、Ａｒｇ９３）のうちの１つ以上を含み、配列ナンバリングは、例えば、配列番号：９０７のそれに対応する。
【０４７６】
配列／活性分析を行って、（高いｋｃａｔ、低いＫｍまたは双方によって発現される）高いｋｃａｔ／Ｋｍと正に相関するアミノ酸残基を同定した。高いｋｃａｔ／Ｋｍの正に相関するように見えるアミノ酸残基はＧｌｕ１４、Ａｓｐ３２、Ａｓｎ３３、Ｇｌｙ３８、およびＴｈｒ６２を含む（配列番号：９０７のそれに対応する）。さらなるＧＡＴ酵素は、これらの残基の１つ以上についてのコドンを、鋳型ＧＡＴポリペプチドのコード配列の適当な位置（複数位置）に置き換えることによって構築することができる。例えば、さらなるＧＡＴ酵素は、コドン位置１４におけるＧｌｕ、位置３２におけるＡｓｐ、位置３３におけるＡｓｎ、位置３８におけるＧｌｙ、および位置６２におけるＴｈｒをコードするコドンの１つ以上を、前記した極端に高い活性を呈するさらに進化したＧＡＴ酵素の２つであるＧＡＴ  ２４−５Ｈ５（配列番号：８４５）またはＧＡＴ２５−８Ｈ７（配列番号：９０７）のような鋳型ポリペプチドをコードするアミノ酸配列に置換されることによって作成された。各々、配列番号：９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８および９３０として確認される核酸によってコードされたＲ１２Ｇ１（配列番号：９１７）、Ｒ１２Ｇ２（配列番号：９１９）、Ｒ１２Ｇ３（配列番号：９２１）、Ｒ１２Ｇ４（配列番号：９２３）、Ｒ１２Ｇ５（配列番号：９２５）、Ｒ１２Ｇ６（配列番号：９２７）、Ｒ１２Ｇ７（配列番号：９２９）、およびＲ１２Ｇ８（配列番号：９３１）として本明細書中では確認される、このようにして作成された例示的さらに進化したＧＡＴ酵素は、鋳型ポリペプチドのそれと匹敵する極端に高いＧＡＴ活性を呈した。
【０４７７】
実施例２０：高いＧＡＴ活性に相関するアミノ酸
アミノ酸アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）およびシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）は、種々のアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性部位と会合していることが知られている。いずれかのそのような残基がＧＡＴ活性において役割を演じているかを決定するために、ＧＡＴ２０−３−Ｃ６（配列番号：６８３）のすべてのＤ、ＣおよびＨ残基を個々にアラニン（Ａｌａ，Ａ）に突然変異させ、突然変異した酵素をＮ−アセチルグリホセート活性につきアッセイした。置換Ｔ３４ＡおよびＨ４１Ａを含有する変種は未修飾酵素の活性の約２％ないし３％を保持したに過ぎず、他方、置換Ｈ１３８Ａを含有する変種は実質的に測定可能なＧＡＴ活性を呈しなかった。他方、置換Ｈ１３８ＲおよびＨ１３８Ｓを含有する変種は（特に、６．８４よりも大きなｐＨにおいて）低いが測定可能なＧＡＴ活性を保持し、これは、位置１３８におけるＨｉｓ（および名目上ＡｒｇおよびＳｅｒ）が活性−部位塩基として働くことができることを示唆する。
【０４７８】
【表１２】
2010220617.tif 000036
実施例２１：植物におけるＧＡＴ発現の改良
植物、動物および微生物は、遺伝子転写体の翻訳の間にアミノ酸取り込みの効率に影響する特異的コドン優先性を有することが知られている。稀なコドンは翻訳の間にｔＲＮＡ動員で問題を引き起こし、これは、次いでコードされた蛋白質のより低い蓄積に導く。元の親ｇａｔ遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのような細菌からのものであり、それ自体は、植物における発現のための最適なコドン分布を有しないであろう。本発明の進化したｇａｔ遺伝子は植物において首尾よく発現されたが（例えば、前記実施例９、１１、１３および１７参照）、植物における翻訳効率を増加させることによって蛋白質の生産を改良する機会が存在する。これを達成するための１つの方法は、コドンについて植物で頻繁ではなく用いられるｇａｔ  コード配列における１つ以上のコドンを、植物においてより頻繁に用いられる同一アミノ酸（複数アミノ酸）についてのコドンに代えて置換することによるものであり、それにより、コードされた蛋白質の変化しない配列を持つｇａｔコード配列にサイレント突然変異を生じさせる。
【０４７９】
（例えば、Ｋａｚｕｓａ  ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎによって維持されたウェブサイトから入手可能な）トウモロコシ、綿および大豆におけるコドン用法の頻度を示す表を比較して、一般に、単子葉植物または双子葉植物いずれかでより頻繁に、またはより低い頻度で利用されるコドンを示す以下の表（表１３）を作成した。
【０４８０】
【表１３】
2010220617.tif 000037
微生物遺伝子の植物発現を増加させるための第二の方法は、開始メチオニン残基近くのＧ＋Ｃ含有量を増加させることである。植物における天然に存在するコード配列は、ＡＴＧ開始コドンの直ぐ下流に２または３のＧおよび／またはＣ残基を含有する傾向がある（Ｊｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：９９３−１００１）。１または２のＣＧ−リッチコドンをＡＴＧ開始コドンの直ぐ下流のｇａｔコーディング領域に導入すると、より植物−様コード配列を生じさせることができ、このようにして、植物におけるその発現を増強させることができる。アラニンコドン（ＧＣＧ）に代えての第二のコドン（イソロイシン、ＡＴＡ）の置換の結果、未修飾酵素と比較して低下したｋｃａｔを持つＩｌｅ２Ａｌａ変種が得られた。他方、コドン位置１におけるＭｅｔおよびコドン位置２におけるＩｌｅについてのコドンの間へのアラニンコドン（ＧＣＧまたはＧＣＴいずれか）の挿入の結果、位置１におけるＭｅｔおよび位置２におけるＩｌｅの間に挿入されたＡｌａ残基を含有するＧＡＴ酵素をコードするＧＡＴコード配列が得られた。（位置１におけるＭｅｔに直ぐに続いて２つのＡｌａ残基の挿入を示す）２２−１５Ｂ４  Ｍ１ＭＡＡとして同定される、示されたＭｅｔ１およびＩｌｅ２の間に挿入された２つのアラニンを含有し、かつ蛋白質配列の配列番号：９４８を有する例示的ＧＡＴ酵素変種は、未修飾酵素２２−１５Ｂ４（配列番号：７８９）と比較して低下したｋｃａｔを呈した。（位置１におけるＭｅｔに直ぐに続いてＡｌａ残基の挿入を示す）２２−１５Ｂ４  Ｍ１ＭＡで示される、Ｍｅｔ１およびＩｌｅ２の間に挿入された１つのアラニンを含有し、蛋白質配列の配列番号：９４６を有する例示的ＧＡＴ酵素は、未修飾酵素２２−１５Ｂ４と比較して実質的に改変されていないキネティックスを呈した。
【０４８１】
植物におけるＧＡＴ発現を改良するための一般的戦略が開発された。進化したＧＡＴコード配列は、例えば、前記表に従い、植物でより頻繁に利用されるコドンに代えて植物で頻度が低く利用されるコドンで置き換えることによって改変することができる。（例えば、前記表に従うと）植物において頻度が低く利用されるコドンは一般には避けるべきである。このようにして、（少なくとも３つのコドン、少なくとも５つのコドン、または少なくとも１０のコドンのような）少なくとも１つのコドンを、植物でより低い頻度で利用されるコドンからのＧＡＴコード配列において、植物でより頻繁に利用されるコドンに変化させることができる。置き換えられるコドンは、ｇａｔコード配列の（例えば、最初の１０コドン内、最初の２０コドン内、最初の５０コドン内、または最初の１００コドン内の）コード配列の５’末端に位置することができる。別法として、置き換えられるコドンは、ｇａｔコード配列の全体を通じて位置させることができる。より頻繁に利用されるコドンは、さらに、コード配列内のＧ＋Ｃの、またはＡ＋Ｔの（例えば、約５を超える、約６を超える、約７を超える、約８を超える、約９を超える、または約１０を超えるような）、約５ないし１０を超える連続出現を回避するように選択することができる。また、コード配列は、例えば、ｇａｔコード配列の直ぐ下流に、およびｇａｔコード配列の開始Ｍｅｔコドンに隣接してＡｌａコドン（例えば、頻繁に利用されるＡｌａコドン）を挿入することによるなどして、ＡＴＧ開始コドンの直ぐ下流に１または２のＣＧ−リッチコドンを含むように改変することもできる。
【０４８２】
表１４は前記したように改変された例示的ｇａｔコード配列を掲げる。
【０４８３】
【表１４−１】
2010220617.tif 000038
【０４８４】
【表１４−２】
2010220617.tif 000039
Ｔ−ＤＮＡ中のｄＭＭＶ−ｇａｔ−ＵＢＱ３カセットを持つ二元ベクターをエレクトロポレーションによってコンピテントなＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株Ｃ５８細胞に形質転換した（ＭｃＣｏｒｍａｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５５−１５９，１９９８）。ＬＢ＋４０ｕｇ／ｍｌカナマイシンプレート上で２８℃にて２日間増殖させた後、コロニーをＬＢ＋４０ｕｇ／ｍｌカナマイシン液体培地に接種し、２８℃にて一晩振盪した。４００ｇにおける１０分間の遠心によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を収集し、次いで、初期培養容量と同等なある容量の１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４に再懸濁した。この細菌懸濁液を、１ｍｌのプラスチックシリンジ（針無し）を用いてＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉の細胞内空間に強制的に入れるか、または「浸透」させた。２００ないし３００μｌの細菌懸濁液を各スポット（典型的には、浸透領域において３ないし４ｃｍ２）、４以上のスポットを、植物に依然として付着した単一葉上に整列させることができた。いくつかの場合、浸透に先立って、ｇａｔ−含有Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株をｇａｔを欠く第二のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株で５：１または１０：１希釈した。この希釈工程は植物細胞におけるｇａｔ遺伝子の過剰発現を減少させる効果を有し、それにより、飽和を妨げ、変種および構築物の間の発現の差のより容易な可視化を可能とする。３日後、葉材料を粉砕し、水性緩衝液中に抽出し、遠心した。可溶性蛋白質を含有する上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ゲルをブロットし、抗ＧＡＴポリクローナル抗体でプローブした。
【０４８５】
ＧＡＴ４６２０遺伝子を浸透させたタバコ葉に蓄積したＧＡＴ蛋白質のレベルは、未修飾ＧＡＴ２５−８Ｈ７／４６１８遺伝子で形質転換した葉に蓄積した蛋白質のレベルと匹敵するものであった。他方、ＧＡＴ４６２１遺伝子を保有するタバコ葉は、未修飾ＧＡＴ２５−８Ｈ７／４６１８遺伝子を発現する葉と比較して、合計蛋白質のパーセントとして、約２倍大きいＧＡＴ蛋白質蓄積を呈した。
【０４８６】
実施例２２：ＧＡＴ導入遺伝子を発現するグリホセート抵抗性ダイズのＴ１実験
実施例１７に記載した方法を用い、ＧＡＴ導入遺伝子１８−２８Ｄ９ｃ（配列番号：８２４）を発現するダイズ植物を生産した。グリホセート噴霧Ｔ０植物からＴ１種子を収集した。Ｓｃｏｔｔｓ，Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ，ＯＨから入手可能なＲｅｄｉＥａｒｔｈＲ３６０培地中にて温室条件下でＴ１種子を発芽させ、Ｖ２ないしＶ３段階にて、実施例１７に記載された方法にて、２×または４×グリホセート（Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能なＲｏｕｎｄＵｐ  ＵＬＴＲＡ  ＭＡＸＴＭ）いずれかを噴霧した。１０日後に植物をスコア取りし、実施例１７に記載したように葉変色スコアを取った。Ｔ１温室噴霧データは、Ｔ０植物段階における先の温室結果とよく相関した。Ｔ２種子をさらなる実験のために収集した。
【０４８７】
実施例２３：ＧＡＴおよびＨＲＡ導入遺伝子を発現するグリホセートおよびスルホンアミド抵抗性ダイズの生産
ＧＡＴ  ＆  ＨＲＡ、アセト乳酸シンターゼ（米国特許第５，６０５，０１１号、第５，３７８，８２４号、第５，１４１，８７０号および第５，０１３，６５９号）遺伝子の高抵抗性対立遺伝子を発現するダイズ植物を、実施例１７に記載された方法を用いて生産した。該ＨＲＡ遺伝子は、形質転換用の選択マーカー遺伝子として用いた。選択剤は１００ｎｇ／ｍｌ濃度のクロルスルフロンであった。選択マーカー遺伝子はＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（米国２００３／２２６１６６）からのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンシンテターゼ（ＳＡＭＳ）プロモーター、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘからのＨＲＡコード配列およびＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘからのアセト乳酸シンターゼターミネーターよりなるものであった。選択マーカー遺伝子は、合成構成的プロモーター（米国特許第６，０７２，０５０号および第６，５５５，６７３号）またはトウモロコシヒストン２Ｂプロモーター（米国特許第６，１７７，６１１号）、ＧＡＴ変種（１８−２８Ｄ９ｃ（配列番号：８２４））およびＰｉｎ  ＩＩターミネーター（Ｇｙｈｅｕｎｇ  ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１１５：１２２（１９８９））よりなるＧＡＴ構築物に連結するか、またはそれで共−衝撃した。トランスジェニック植物は実施例１７に記載したように創製された。グリホセート抵抗性の葉は、２×または４×グリホセート適用速度後に植物変色スコアを用い、実施例１７に記載したように決定した。表１５に示す結果は、ＧＡＴ変種（１８−２８Ｄ９ｃ（配列番号：８２４））を駆動する異なる構成的プロモーターはＴ０植物においてグリホセート抵抗性を付与することを示す。
【０４８８】
（表１５  ４×グリホセートでの処理から１０日後における抵抗性スコア）
【０４８９】
【表１５】
2010220617.tif 000040
実施例２４：ＧＡＴおよびＨＲＡ導入遺伝子を発現するダイズのＴ１予備−発芽実験
実施例１７に記載された実験から生じたＴ１種子を、温室中のタマシルトロームの鉢に植えた。鉢に、発芽前適用のクロリムロン、リムスルフロンまたはトリベヌロンで７０ｇｍｓ  ａ．ｉ．／ヘクタールの率の速度で直ちに噴霧した。発芽する植物を、実施例１７に記載された植物変色スコアに基づいて噴霧適用から１０日後に評価した。すべてのＨＡＲおよびＧＡＴは、９の速度でのすべての発芽前噴霧適用で生き残った（損傷無し）。これらの結果は、ダイズにおけるスルホンアミド化学に対する発芽前抵抗性を示す。
【０４９０】
実施例２５：ＧＡＴおよびＨＲＡ導入遺伝子を発現するダイズのＴ１発芽後実験
実施例１７に記載された実験から生じたＴ１種子を、温室中のＲｅｄｉＥａｒｔｈＲ  ３６０培地中で発芽させた。植物に、Ｖ２ないしＶ３段階（鉢植えから１４日後）において、チフェンスルフロン、クロリムロン、リムスルフロンまたはトリベヌロン（各々、７０、７０、３５、３５ｇｍ  ａ．ｉ．／ヘクタール）を噴霧した。実施例１７に記載された植物変色スコアに基づいて、植物を適用から１０日後に評価した。結果を表１６に示す。
【０４９１】
（表１６  スルホンアミド化学での発芽後処理から１０日後における抵抗性スコア）
【０４９２】
【表１６】
2010220617.tif 000041
チフェンスルフロン噴霧後に植物変色等級を有する事象に、実施例１７に記載された方法により、１０日後にグリホセートの２×または４×適用いずれかを噴霧した。実施例１７に記載された変色スコアに基づいて事象を評価した。すべてのチフェンスルフロン耐性事象は、７または８のスコアにてグリホセート噴霧から生き残った（結果は示さず）。これらの結果は、各々、７０ｇｍ  ａ．ｉ．／ヘクタールのチフェンスルフロンおよび２×グリホセートにおける、各々、ＨＲＡおよびＧＡＴ遺伝子によって付与された温室条件下でのグリホセート耐性とのチフェンスルフロン耐性の１００％相関を示す。
【０４９３】
実施例２６：ＧＡＴ導入遺伝子を発現するグリホセート抵抗性トウモロコシ植物のＴ３実験
実施例１３に記載された方法を用い、ＧＡＴ導入遺伝子２０−Ｈ８１２（配列番号：７３８）および２０−１６Ａ３（配列番号：６３８）を発現するトウモロコシ植物を生産した。実施例１３に記載するように、１０日後に植物をスコア取りし、葉変色スコアを取った。具体的には、Ｖ４葉段階にて植物に噴霧した。噴霧処理の適用の後、植物を等しい間隔およびスタンドカウントに間引きした。商業的に入手可能なＮＫ６０３（Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を対照として用いた。抵抗性スコアを表１８に示す。処理から１０日後に植物の高さの測定も行い、これを表１８に示す。
【０４９４】
（表１８  グリホセートでの処理から１０日後における抵抗性スコア）
【０４９５】
【表１８】
2010220617.tif 000042
（表１９  グリホセートでの処理から１０日後における（インチで表した）植物の高さ）
【０４９６】
【表１９】
2010220617.tif 000043
実施例２７：ＧＡＴ導入遺伝子を発現するグリホセート抵抗性トウモロコシのＴ３収率実験
実施例１５からのＴ３種子を用いて、ハイブリッドについてのグリホセート圃場耐性データの作成のためにＴ３植物を創製した。実験は、スプリット−プロットデザインを用い、４複製にてＶｉｌｕｃｏ，Ｃｈｉｌｅで行った。具体的には、３つのエントリーを含めた。エントリーの２つは、ＧＡＴ変種導入遺伝子１７−１５Ｈ３（配列番号：５４９）を発現するトウモロコシ植物よりなるものであった。Ｍｏｎｓａｎｔｏから商業的に入手可能なグリホセート抵抗性対照ＮＫ６０３は第三のエントリーであった。すべてのエントリーを、圃場にて、各事象につき４つの異なるグリホセート噴霧処理（０×、Ｖ４における４×、Ｖ４における８×、およびＶ４における４×およびＶ８における４×）で処理した。実施例１３に記載されているように、植物の高さの比較のために、植物を処理から１０日後にスコア取りした。Ｔ３圃場噴霧データは、実施例１５に報告された圃場で先に得られた結果とよく相関した。具体的には、１×および４×グリホセートで噴霧したすべてのエントリーは、高さが、未噴霧対照と同様であった。Ｖ４におけるより高い４×およびＶ３等級における４×では、ＧＡＴエントリーは高さが一時的に１２および１７％の間まで戻り、ＮＫ６０３エントリーは６％戻った；しかしながら、（繁殖成熟の間の）季節の後半では、グリホセート処理エントリーの高さは未噴霧エントリーにおけると同一であった。さらに、グリホセート処理エントリー間の収率は、数字的にも、統計学的にも、未噴霧エントリーから低下しなかった（ＬＳＤ０．０５＝１１．８ｂｕ．／エーカー、エントリー当たりの平均収率＝２４３ｂｕ．／エーカー）。同様の結果が、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡおよびＹｏｒｋ，ＮＥに植えた同一事象のＴ２植物での予備的耕種学試験で観察された
（データは示さず）。
【０４９７】
実施例２８：ＧＡＴ導入遺伝子を発現するグリホセート抵抗性トウモロコシのＴ２実験
実験はＧＡＴ陽性およびＧＡＴ陰性イソ−系で行った。ＧＡＴ導入遺伝子１８−２８Ｄ９ｂ（配列番号：８１４）、１７−１５Ｈ３（配列番号：５４９）、２０−８Ｈ１２（配列番号：７３８）、２０−１６Ａ３（配列番号：６３８）を発現するトウモロコシ植物を、実施例１７に記載された方法を用いて生産した。Ｔ２植物を調べた。ＧＡＴ陽性Ｔ２植物にＶ４において１×（２６  ｏｚ／Ａ  ＵＬＴＲＡ  ＭＡＸＴＭ）を噴霧した。ＧＡＴ陰性植物はＶ４においてＰＣＲサンプリングした。ＧＡＴ陽性植物を列から除いた。ＧＡＴ陰性植物にはグリホセートを適用しなかった。植物を間引きして、各列内の植物間で等しい間隔を生じさせた。４回の反復試験を行った。各列の中央から収穫した５つの穂からの穀物を乾燥し、秤量した。表２０に示すように、構築物のいずれについても、収率の低下は検出されなかった。
【０４９８】
（表２０  収率のデータ）
【０４９９】
【表２０】
2010220617.tif 000044
実施例２９：ＧＡＴポリペプチドのアミノ酸基質
本発明のいくつかのＧＡＴポリペプチドのＧＡＴ活性を、多数のアミノ酸基質に関して評価した。ＧＡＴポリペプチド、ＡｃＣｏＡおよびアミノ基質を、９６−ウェルのポリスチレンプレートのウェル中にて、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、Ｐｈ６．８、１０％エチレングリコール中でインキュベートした。３０分後、５００ｍＭトリス、ｐＨ７．５中の３０μｌの１０ｍＭ  ５，５’−ジチオビス−２−ニトロベンゾエート（ＤＴＮＢ）の添加によって反応を停止した。２分後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）にて、吸光度を４１２ｎｍで読んだ。
【０５００】
グリホセートに加え、自然発生型ＧＡＴポリペプチド４０１（配列番号：６）（またはホスホセリンの場合には、Ｂ６（配列番号：７））は、１２アミノ酸で検出可能な活性を呈した。自然発生型ＧＡＴポリペプチドは、グリホセートにてよりも、Ｌ−アスパルテートにて同程度活性であり、Ｌ−セリンにて約４．７倍活性であり、およびホスホ−Ｌ−セリンにて約２倍活性であった。自然発生型ＧＡＴポリペプチドと比較して、非−自然発生型ＧＡＴポリペプチド１７−１５Ｈ３（配列番号：６０１）および２５−８Ｈ７（配列番号：９０７）は、アスパルテートにて活性の４０倍増加を呈したが、セリンおよびホスホセリンに関しては活性の喪失を呈した。
【０５０１】
アスパルテートおよびセリンに加えて、１ｍＭで存在する場合にグリホセートに対するものの３％以上にて自然発生型ＧＡＴポリペプチドでの活性が以下のＬ−アミノ酸で観察された：ヒスチジン（１０％）、チロシン（１８％）、スレオニン（２５０％）、バリン（１２％）、グルタメート（５１％）、アスパラギン（２７％）、グルタミン（３２％）、アラニン（３３％）、グリシン（２１％）およびシステイン（５０％）。他の蛋白質アミノ酸での活性は検出されないか、あるいは基質としてのグリホセートに対するＧＡＴ活性のそれの３％未満であった。Ｌ−アスパルテート（２ｍＭ）、Ｌ−アラニン（１０ｍＭ）およびグリシン（すなわち、サルコシン、１０ｍＭ）のＮ−メチル誘導体上の自然発生型ＧＡＴポリペプチドに関しては検出可能な活性は観察されなかった。パーセンテージは、基質、グリホセートに対してのＧＡＴポリペプチドの活性に対するパーセント活性をいう。データのいくつかを以下の表２１に示す。
【０５０２】
（表２１：グリホセート、アスパルテートおよびセリンに関するＧＡＴ活性）
【０５０３】
【表２１】
2010220617.tif 000045
実施例３０：ＧＡＴ活性に対するｐＨの効果
野生型酵素Ｂ６（配列番号：７）およびＧＡＴポリペプチド１７−１５Ｈ３（配列番号：６０１）についてのｋｃａｔおよびＫＭのｐＨ最適値を、アッセイ緩衝液がある範囲のｐＨ値に滴定された、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび１０％エチレングリコールであった以外は実施例７に記載された分光学的アッセイを用いて決定した。蛋白質濃度は実施例１９に記載されたＵＶ吸光度アッセイによって決定した。ＫＭおよびｋｃａｔに対するｐＨの効果をクローンＢ６（配列番号：７）および１７−１５Ｈ３（配列番号：６０１）について図１８に示す。
【０５０４】
これまでの発明は明確性および理解の目的で幾分詳細に記載してきたが、形態および詳細の種々の変形を本発明の真の範囲から逸脱することなくなすことができるのはこの開示を読めば当業者に明らかであろう。例えば、前記したすべての技術、方法、組成物、装置およびシステムは種々の組合せで用いることができる。本発明は、本明細書中に記載したすべての方法および試薬、ならびにこれらの新規な方法および試薬の生成物であるすべてのポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、生物、植物、作物などを含むことを意図する。
【０５０５】
本出願において引用したすべての刊行物、特許、特許出願、または他の書類は、あたかも各個々の刊行物、特許、特許出願、または他の書類がすべての目的で引用により個々に一体化されるように示される程度まで、すべての目的で引用してその全体を一体化させる。
【図１】
2010220617.tif 000046
【図２】
2010220617.tif 000047
【図３】
2010220617.tif 000048
【図４】
2010220617.tif 000049
【図５】
2010220617.tif 000050
【図６】
2010220617.tif 000051
【図７】
2010220617.tif 000052
【図８】
2010220617.tif 000053
【図９】
2010220617.tif 000054
【図１０】
2010220617.tif 000055
【図１１】
2010220617.tif 000056
【図１２】
2010220617.tif 000057
【図１３】
2010220617.tif 000058
【図１４】
2010220617.tif 000059
【図１５Ａ】
2010220617.tif 000060
【図１５Ｂ】
2010220617.tif 000061
【図１６Ａ】
2010220617.tif 000062
【図１６Ｂ】
2010220617.tif 000063
【図１６Ｃ】
2010220617.tif 000064
【図１７】
2010220617.tif 000065
【図１８】
2010220617.tif 000066
【配列表】
2010220617000001.app