(57)【要約】【課題】目的タンパク質の活性をより確実に維持し、且つ、より高効率に目的タンパク質を大量に取得するための方法を提供する。【解決手段】２個以上のシャペロニンサブユニットが直列に連結されてなり、前記シャペロニンサブユニットがリング状に配置されたリング状構造体を形成可能な融合タンパク質であって、オープンリング型の形態を安定的に維持可能であることを特徴とする融合タンパク質が提供される。Ｎ末端又はＣ末端に目的タンパク質がさらに連結され、当該目的タンパク質をリング状構造体の内部に格納可能である構成が好ましい。当該融合タンパク質をコードする遺伝子も提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２個以上のシャペロニンサブユニットが直列に連結されてなり、前記シャペロニンサブユニットがリング状に配置されたリング状構造体を形成可能な融合タンパク質であって、オープンリング型の形態を安定的に維持可能であることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
前記シャペロニンサブユニットは、グループ１型シャペロニンのサブユニットであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記グループ１型シャペロニンは、大腸菌由来シャペロニンであることを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
シングルリングからなるリング状構造体を形成するものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
Ｎ末端又はＣ末端に目的タンパク質がさらに連結され、当該目的タンパク質をリング状構造体の内部に格納可能であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質、並びに、遺伝子に関し、さらに詳細には、シャペロニンと目的タンパク質との融合タンパク質、並びに、当該融合タンパク質をコードする遺伝子に関する。本発明は、活性を維持した目的タンパク質を高効率で生産することを可能とするものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト、マウス、酵母をはじめ様々な生物種の全ゲノム配列の解析が完了し、バイオ研究の流れは遺伝子の解析からタンパク質の網羅的研究へと移りつつある。この結果、疾病に関わるタンパク質の発見や、生体内におけるタンパク質間相互作用の解明により、新しい医薬品の開発につながることが期待されている。近年、そのための研究ツールとして、タンパク質間相互作用を検出するツーハイブリッド法や、生体内におけるタンパク質の発現を検出するタンパク質チップなどが開発され、広く用いられるようになってきた。すなわち、これまで、疾病に関連する遺伝子をスクリーニングする研究ツールとしてＤＮＡチップが主に用いられてきたが、遺伝子の翻訳とタンパク質の発現との間に必ずしも相関性あるとは言えなかった。そこで、これに代わってタンパク質チップをはじめとするタンパク質を材料とする研究ツールが特に注目を集めている。
【０００３】
タンパク質を扱う上で注意すべき点は、変性を防ぎ、活性を維持した状態を保つことである。ところが、目的のタンパク質を遺伝子組み換え技術により発現・生産しようとする場合、機能・活性が維持されたタンパク質が得られるとは限らず、試行錯誤を繰り返すことが多いのが現状である。このような課題を解決するための技術として、シャペロニンを用いる方法が知られている（特許文献１）。
【０００４】
シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、分子量約６万のサブユニット（シャペロニンサブユニット）からなる複合タンパク質である。代表的なシャペロニンは、シャペロニンサブユニット７〜９個からなるリング状構造体２層がリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を有する、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合体を形成している。シャペロニンはその内部に他のタンパク質を格納し、正しく折り畳むことができる。
【０００５】
特許文献１に記載された発明では、２個以上のシャペロニンサブユニットを直列に連結してなる人工タンパク質（シャペロニン連結体）を作製し、この末端に目的タンパク質を連結した融合タンパク質を用いている。シャペロニン連結体も天然のシャペロニンと同様にリング状構造体を形成可能であり、目的タンパク質を内部に格納して正しく折り畳むことができる。特許文献１の方法によれば、宿主ベクター系を用いた遺伝子組み換え技術よる目的タンパク質の強制発現の際にしばしば起こる、（ａ）宿主由来のプロテアーゼによる目的タンパク質の分解、（ｂ）目的タンパク質が本来持つ宿主毒性によるタンパク質の生産困難性、（ｃ）目的タンパク質の構造形成不良による封入体の形成、といった問題を解決することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０２／０５２０２９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載の発明によって、目的タンパク質の活性を維持し、且つ、高効率で発現させることができる方法が提供された。しかし、目的タンパク質の種類によっては、シャペロニンを作用させても活性を維持した目的タンパク質が得られないことが依然としてある。そこで本発明は、特許文献１の方法をさらに発展させ、目的タンパク質の活性をより確実に維持し、且つ、より高効率に目的タンパク質を大量に取得するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、シャペロニンを作用させても活性を維持した目的タンパク質が得られないことがある原因について検討し、目的タンパク質のリング状構造体内部への格納段階に着目した。そして、この課題を解決するための方策について検討した結果、オープンリング型の形態を安定的に保持できる変異型シャペロニンを利用することで当該課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００９】
請求項１に記載の発明は、２個以上のシャペロニンサブユニットが直列に連結されてなり、前記シャペロニンサブユニットがリング状に配置されたリング状構造体を形成可能な融合タンパク質であって、オープンリング型の形態を安定的に維持可能であることを特徴とする融合タンパク質である。
【００１０】
本発明は２個以上のシャペロニンサブユニットが直列に連結されてなる融合タンパク質（すなわち、シャペロニン連結体）に係るものであり、オープンリング型の形態を安定的に維持可能であることを特徴とする。本発明の融合タンパク質はオープンリング型の形態を維持しているので、天然型のシャペロニンに比べてリング状構造体のキャビティが大きい。そのため、正しい構造に折り畳まれた際に天然型のシャペロニンのキャビティ内に格納できない目的タンパク質であっても、確実に格納することができる。
【００１１】
ここで「オープンリング型」とは、シャペロニンのリング状構造体において、リングの頂上部分がリング面に対して垂直方向に開いた形態をいう。オープンリング型の形態は、天然型シャペロニンが目的タンパク質を格納する過程で極めて短時間（数秒〜十数秒程度）に観察される。本発明で採用されるシャペロニンはオープンリング型の形態を安定的に維持可能なものであり、天然型のシャペロニンにように一時的にオープンリング型の形態を取るものではなく、平常状態でもオープンリング型の形態を取る。オープンリング型シャペロニンは、例えば、天然型シャペロニンの一部のアミノ酸残基を置換することにより作製することができる。
【００１２】
前記シャペロニンサブユニットがグループ１型シャペロニンのサブユニットである構成が好ましい（請求項２）。
【００１３】
前記グループ１型シャペロニンが大腸菌由来シャペロニンである構成が好ましい（請求項３）。
【００１４】
シングルリングからなるリング状構造体を形成するものである構成が好ましい（請求項４）。
【００１５】
請求項５に記載の発明は、Ｎ末端又はＣ末端に目的タンパク質がさらに連結され、当該目的タンパク質をリング状構造体の内部に格納可能であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質である。
【００１６】
本発明の融合タンパク質は、シャペロニン連結体の末端に目的タンパク質が連結されたものである。本発明の融合タンパク質によれば、目的タンパク質を確実にリング状構造体の内部に格納することができる。
【００１７】
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子である。
【００１８】
本発明は遺伝子に係るものであり、上記した本発明の融合タンパク質をコードするものである。本発明の遺伝子を宿主内で転写・翻訳することにより、本発明の融合タンパク質を高効率で生産することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の融合タンパク質はオープンリング型の形態を維持しているので、天然型のシャペロニンに比べてリング状構造体のキャビティが大きい。そのため、正しい構造に折り畳まれた際に天然型のシャペロニンのキャビティ内に格納できない目的タンパク質であっても、確実に格納することができる。
【００２０】
本発明の遺伝子によれば、本発明の融合タンパク質を高効率で生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】大腸菌ＧｒｏＥＬが変性タンパク質を正しく折り畳む過程を説明する説明図であり、（ａ）は平常状態（クローズ型）、（ｂ）は折り畳み途上の目的タンパク質をトラップした状態（クローズ型）、（ｃ）は目的タンパク質を内部に格納した状態（オープンリング型）、（ｄ）は目的タンパク質の折り畳みが終了した状態（オープンリング型）、（ｅ）は目的タンパク質を放出した状態（クローズ型）を示す。
【図２】実施例で行ったアレスト活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の融合タンパク質は、２個以上のシャペロニンサブユニットが直列に連結されてなり、前記シャペロニンサブユニットがリング状に配置されたリング状構造体を形成可能な融合タンパク質であって、オープンリング型の形態を安定的に維持可能であることを特徴とするものである。ここでまず、「オープンリング型」のシャペロニンについて、大腸菌ＧｒｏＥＬを例に詳述する。なお、図１に示す一連の機構については、例えば、Nature, 388, 792-798 (1997)に説明されている。
【００２３】
大腸菌ＧｒｏＥＬ（シャペロニン）が変性タンパク質を正しく折り畳む過程は図１（ａ）〜（ｅ）に示すとおりであり、まず２層からなるリング状構造体（図１（ａ））の一方の頂上部分に、折り畳み途上の目的タンパク質がトラップされる（図１（ｂ））。次に、補因子（コシャペロニン）であるＧｒｏＥＳとＡＴＰの結合を伴って、目的タンパク質がリング内のキャビティに格納される（図１（ｃ））。このとき、目的タンパク質がキャビティ内に格納された状態では、リングを形成する７つのＧｒｏＥＬサブユニットの頂上ドメインが垂直方向に角度を変えることが知られており、この形態を「オープンリング型」と称している。次に、ＡＴＰがＡＤＰに変換されると共に目的タンパク質がキャビティ内で正しく折り畳まれ（図１（ｄ））、その後、正しく折り畳まれた目的タンパク質がキャビティから放出される（図１（ｅ））。すなわち、ＧｒｏＥＬの形態に関しては、図１（ｃ）〜（ｄ）に示す段階において「オープンリング型」の形態をとり、図１（ａ）〜（ｂ）と図１（ｅ）に示す段階においては平常状態と同様の「クローズ型」の形態をとる。ここで、図１（ｃ）〜（ｄ）のオープンリング型の形態をとる段階は数秒から十数秒程度といった一時的なものであり、オープンリング型の状態が長時間安定的に維持されることはない。具体的には、ＧｒｏＥＬがオープンリング型の形態を取るのは８秒〜１５秒の間と言われている。なお、オープンリング型シャペロニンは、頂上ドメインが垂直方向に角度を変えているため、クローズ型と比較してキャビティの容積が大きい。
【００２４】
このように、天然型のシャペロニンではオープンリング型の形態を取ることは一時的であって、オープンリング型の形態を安定的に維持することはない。しかし一方で、オープンリング型の形態を安定的に維持できる変異型シャペロニンが知られている。本発明の融合タンパク質は、この変異型シャペロニンを利用したものである。オープンリング型の形態を安定的に維持できる変異型シャペロニンは、例えば、シャペロニンサブユニットを構成するアミノ酸の一部を改変することにより得られる。例えば、大腸菌ＧｒｏＥＬ（配列番号１，２）の場合、隣接する一方のサブユニットの３８４番目のアラニンと他方のサブユニットの５０９番目のセリンとの距離について、クローズ型シャペロニンでは比較的離れているが、オープンリング型ではより近接している。そこで、この２つのアミノ酸をシステインに置換し、両者の間でジスルフィド結合により架橋することで２つのアミノ酸は元の位置に戻ることができず、近接した状態を常時保つことができる。これにより、結果的にシャペロニンリングはオープン型で安定的に維持されることになる。
【００２５】
なお、システイン間のジスルフィド結合を利用したオープンリング型シャペロニンを採用する場合には、融合タンパク質（シャペロニン連結体）を緩やかな酸化的環境下におくことが望ましい。例えば、システイン置換したシャペロニンサブユニットをＤＴＴなどの還元剤存在下で取得した後には、適切な緩衝液中で還元剤を透析などにより完全に除去した後、自然酸化によるジスルフィド結合の形成や、低濃度の酸化型グルタチオンやジアミドの存在化でジスルフィド結合を形成させるための処理をすることが好ましい。
【００２６】
次に、シャペロニンのグループについて説明する。一般に、シャペロニンはグループ１型とグループ２型とに大別されている。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、いずれも分子量６０ｋＤａからなるシャペロニンサブユニット７つが環状に連なるリング状構造体を形成し、さらに２つのリング状構造体が重なった２層構造を有する、１４量体のホモオリゴマーを形成する。これらはコシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状７量体を補因子とする。グループ１型シャペロニンの具体例としては、大腸菌由来のシャペロニンであるＧｒｏＥＬが挙げられる。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられ、通常８〜９個のシャペロニンサブユニットからなるリング状構造体が重なった２層構造を有する、１６〜１８量体のホモ又はヘテロオリゴマーを形成する。本発明の融合タンパク質で採用するシャペロニンは、グループ１型とグループ２型のいずれでもよいが、グループ１型シャペロニンが好ましく、上述の大腸菌ＧｒｏＥＬが取扱い易さの点から特に好ましい。ここで、ＧｒｏＥＬの遺伝子塩基配列とアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
【００２７】
一般的なシャペロニンは２層のリング状構造体からなるが、１層のリング状構造体からなる「シングルリング」のシャペロニンも存在する。本発明の融合タンパク質においては、シングルリングからなるリング状構造体を形成するシャペロニンを採用することが好ましい。すなわち、シャペロニンリングを１層化することにより、シャペロニンリング内に格納されている目的タンパク質と外部環境がシャペロニンリングの２つの開口部を介して外部環境とアクセス可能となる。その結果、目的タンパク質が、例えば、基質や低分子リガンドなどと作用する必要がある場合、それらの目的タンパク質に対するアクセス性がよくなる。
【００２８】
シングルリングのシャペロニンは、例えば、シャペロニンサブユニットを構成するアミノ酸の一部を改変することにより得られる。例えば、大腸菌ＧｒｏＥＬ（配列番号１，２）の場合には、結晶構造解析より赤道ドメインの４つの荷電アミノ酸（Ｒ４５２、Ｅ４６１、Ｓ４６３、Ｖ４６４）がリング間の結合に強く寄与していていることが分かっている。そこで、４５２番目のアミノ酸残基（アルギニン）をグルタミン酸に、４６１（グルタミン酸）、４６３（セリン）、４６４番目（バリン）のアミノ酸残基をアラニンに置換することにより、リング間相互作用が軽減し、シングルリングを構成することが分かっている（Weissman et al., Cell, 1995, 83, 577-587）。また、真核生物のミトコンドリア由来のシャペロニン６０は、通常、シングルリングとして精製されるため、特別の遺伝子操作なしで得ることができる（Viitanen et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 695-698）。ここで、大腸菌ＧｒｏＥＬのオープンリング型かつシングルリングの変異体（オープン型シングルリング変異体）の一例を配列番号３，４に示す。なお、シングルリングのシャペロニンも、基本的に図１（ａ）〜（ｅ）に示す機構で目的タンパク質を折り畳むことができ、オープンリング型の形態を安定的に維持できる変異型シャペロニンを作製する手段についても、上述の手段をそのまま適用することができる。
【００２９】
好ましい実施形態では、融合タンパク質（シャペロニン連結体）のＮ末端又はＣ末端に目的タンパク質がさらに連結され、当該目的タンパク質をリング状構造体の内部に格納可能である。本実施形態の融合タンパク質によれば、目的タンパク質を確実にリング状構造体の内部に格納することができる。
【００３０】
本発明で採用される目的タンパク質としては特に限定はないが、分子量についてはシャペロニンのリング構造内に格納可能な分子量であることが好ましく、例えば、１０万以下、より好ましくは６万以下である。タンパク質の種類についても特に限定はなく、例えば、ヒト、マウス、線虫等の動物、病原菌、感染性ウィルス等由来の全てのタンパク質を採用することができる。例えば、Ｇタンパク質共役型受容体、チャネル型受容体などを含む複数回膜貫通型タンパク質；リン酸化酵素、脱リン酸化酵素、細胞接着因子などを含む１回膜貫通型タンパク質、などが挙げられる。その他、膜貫通型タンパク質だけではなく、生体膜の表層付近に存在する膜表在性タンパク質なども挙げられる。このような膜近傍に存在し、情報伝達に関わる受容体群だけではなく、ウィルス由来プロテアーゼ、核内ホルモン受容体タンパク質、逆転写酵素など、従来の遺伝子組み換え技術では生産することが困難であったタンパク質などを好適に採用することができる。
【００３１】
本発明の遺伝子は、本発明の融合タンパク質をコードするものである。本発明の遺伝子を宿主内で転写・翻訳することにより、本発明の融合タンパク質を高効率で生産することができる。例えば、本発明の遺伝子を発現ベクターに組み込み、該組換えベクターを適宜の宿主に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体内で当該遺伝子を発現させればよい。このときに用いる宿主としては特に限定はないが、培養コストが安価であり、培養日数が短く、培養操作が簡便な点からバクテリア等の微生物が好ましく、特に、大腸菌が取り扱いの容易さの面でより好ましい。
【００３２】
シャペロニンは宿主生物の細胞質又は体液等の可溶性画分へ発現されるため、シャペロニンリング内に格納された目的タンパク質が膜結合性のタンパク質であっても、膜へ移行し、宿主生物の膜構造を破壊することはなく、宿主生物に対する毒性は発現しない。また、目的タンパク質の種類にかかわらず、シャペロニンリング内に格納されれば、同一の精製条件で融合タンパク質として精製することが可能である。なお、本発明の融合タンパク質等を精製する方法としては特に限定されず、例えば、塩析、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜用いて精製することができる。また、融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に６残基程度のヒスチジン配列を付加させることにより、ニッケルキレート担体を用いるキレートクロマトグラフィーによっても融合タンパク質を精製することが可能である。
【００３３】
以下に実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
（１）オープンリング型シャペロニンの発現ベクター構築
大腸菌ＧｒｏＥＬ（配列番号１，２）のオープン型シングルリング変異体（ＯＳＲＥＬ；配列番号４）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号３）を人工合成した。なお、当該合成ＤＮＡの５’末端にはＳｐｅＩサイトが、３’末端にはＸｂａＩサイトを設けた。当該合成ＤＮＡをｐＵＣ５７プラスミド上に組み込み、ｐＵＣ５７−ＯＳＲＥＬを得た。ｐＵＣ５７−ＯＳＲＥＬを制限酵素ＳｐｅＩ／ＸｂａＩで処理し、ＯＳＲＥＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した（ＤＮＡ断片Ａ）。このＤＮＡ断片Ａを、あらかじめＸｂａＩで処理しておいたｐＴｒｃ９９Ａベクター（アマシャムファルマシア社）に導入した。ＯＳＲＥＬ遺伝子がプロモーターに対して正しい向きで導入されていることをシークエンサーで確認した。このベクターをｐＴｒｃ９９Ａ（ＯＳＲＥＬ）１と命名した。
【００３５】
ｐＵＣ５７−ＯＳＲＥＬを制限酵素ＳｐｅＩ／ＸｂａＩで処理し、ＯＳＲＥＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片Ａを再度取得した。このＤＮＡ断片Ａを、あらかじめＸｂａＩで処理しておいたｐＴｒｃ９９Ａ（ＯＳＲＥＬ）１に導入した。これにより、ＯＳＲＥＬ遺伝子の下流に、ＯＳＲＥＬ遺伝子がさらに１個挿入されたベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ＯＳＲＥＬ）２が構築された。同様の手順を繰り返し、プロモーター下流に７個のＯＳＲＥＬ遺伝子が連結された融合遺伝子（（ＯＳＲＥＬ）７遺伝子）を含むベクターを構築した。この際、各ＯＳＲＥＬ遺伝子が正しい向きに導入されていることをＤＮＡシークエンサーにて随時確認した。これにより、７個のＯＳＲＥＬ（サブユニット）が直列に連結されてなるシャペロニン連結体を発現するベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ＯＳＲＥＬ）７が構築された。
【００３６】
さらに、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＯＳＲＥＬ）７の（ＯＳＲＥＬ）７遺伝子の下流に目的タンパク質をコードする遺伝子を導入するためのマルチクローニングサイトを導入し、３’側には、ＦＬＡＧペプチドを発現する遺伝子配列を設けた。本発現ベクターをＴｒｃ９９Ａ（ＯＳＲＥＬ）７−Ｆと命名した。
【００３７】
（２）融合タンパク質の生産
上記（１）で構築したＴｒｃ９９Ａ（ＯＳＲＥＬ）７−Ｆを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、その形質転換株１コロニーを２×ＹＴ液体培地（バクトトリプトン １６ｇ，酵母エキス １０ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ）に接種し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）の存在下２５℃で４８時間撹拌培養した。培養終了後、菌体を回収した。
【００３８】
回収した菌体を１ｍＭ ＤＴＴを含むＰＢＳ緩衝液に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離して上清を回収した。この上清に対して、抗ＦＬＡＧ抗体固定化ビーズ（シグマ社製）を用いて免疫沈降反応を行った。ビーズ洗浄後ＦＬＡＧペプチドで溶出される画分を１０％硫酸アンモニウム／ＰＢＳ緩衝液（１ｍＭ ＤＴＴ含有）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦカラム ５ｍＬ（アマシャムファルマシア社）に供した。次に、ＰＢＳ緩衝液（１ｍＭ ＤＴＴ含有）で溶出し、融合タンパク質を含む画分を回収した。この画分を、ＰＢＳ緩衝液（１ｍＭ ＤＴＴ含有）であらかじめ平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬを用いたゲル濾過に供し、（ＯＳＲＥＬ）７を含む画分を回収した。得られた画分を濃縮後、ＰＢＳ緩衝液に対して透析してＤＴＴを除去することにより、自然酸化処理を施した。これにより、ＧｒｏＥＬサブユニットのオープン型シングルリング変異体７個が直列に連結してなるシャペロニン連結体（ＯＳＲＥＬ）７を得た。
【００３９】
得られた（ＯＳＲＥＬ）７を２−１５％のアクリルアミドグラジエントゲルを用いるネイティブ電気泳動により分子量を評価したところ、シングルリング型シャペロニンと同じ位置にバンドが検出された。このことより、得られた（ＯＳＲＥＬ）７がシングルリングを形成していることが確認された。
【００４０】
（３）オープンリング型シャペロニンの変性タンパク質との相互作用評価
クローズ型シャペロニンが変性したタンパク質を捕捉する機能（アレスト活性）をもつのに対し、オープン型シャペロニンはアレスト活性が非常に低いことが知られている。上記（２）で得られた（ＯＳＲＥＬ）７のアレスト活性を、グアニジン変性クエン酸合成酵素（ＣＳ）を用いて、以下の手順で評価した。対照として、クローズ型シングルリングＧｒｏＥＬの７回連結体を用いた。
【００４１】
シグマアルドリッチ社から購入したＣＳ（Ｃ−９４５４）を６Ｍ塩酸グアニジン中で６０分間作用させることにより、完全にアンフォールドさせた。１．５μＭの（ＯＳＲＥＬ）７を含むＴＭＫ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ ＫＣｌ）３００μＬに、上記でアンフォールドさせた変性ＣＳを終濃度０．５μＭ（ＴＭＫ緩衝液に対して１００倍希釈）となるように添加し、変性ＣＳの自発的な凝集反応を開始させた。ＣＳの凝集は、３２０ｎｍの光散乱強度により評価した。結果を図２に示す。図中、Ａ（実線）は（ＯＳＲＥＬ）７（オープン型シングルリング）を添加、Ｂ（破線）は対照のＧｒｏＥＬ７回連結体（クローズ型シングルリング）を添加、Ｃ（細破線）はシャペロニン連結体未添加の場合を示す。その結果、クローズ型シングルリングシャペロニンの場合には変性ＣＳの凝集が効率よく抑制されたのに対し、オープン型シングルリングシャペロニン（ＯＳＲＥＬ）７を用いた場合には変性ＣＳの凝集抑制効果が低かった。これは、オープン型シャペロニンの性質を示すものであった。このことから、上記（２）で調製したシャペロニン連結体（ＯＳＲＥＬ）７はオープンリング型の形態を安定的に維持しているものであることが示された。
【実施例２】
【００４２】
（１）目的タンパク質が連結されたオープンリング型シャペロニンの発現ベクター構築
本実施例では目的タンパク質としてヒトエンドセリン受容体タイプＡ（ｈＥＴＡＲ）を採用した。
ＯｒｉＧｅｎｅ社より入手したアクセッションナンバー NM_001957のｈＥＴＡＲ遺伝子を含むクローンを鋳型とし、配列番号５と配列番号６のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｈＥＴＡＲ遺伝子（配列番号７）の５’末端にＢｇｌＩＩサイト、３’側にＸｈｏＩサイトが導入されたＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片をｐＴ７ｂｌｕｅＴベクターに導入した。導入されたＤＮＡ断片の塩基配列を確認した後、ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩにてｈＥＴＡＲ遺伝子を同ベクターから切り出した。切り出したｈＥＴＡＲ遺伝子を、実施例１で構築したＴｒｃ９９Ａ（ＯＳＲＥＬ）７−Ｆのマルチクローニングサイトに含まれるＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩサイトに導入した。これにより、（ＯＳＲＥＬ）７のＣ末端にｈＥＴＡＲ（目的タンパク質）が連結されてなる融合タンパク質を発現させることができる発現ベクターＴｒｃ９９Ａ（ＯＳＲＥＬ）７−ＥＴＡＲ−Ｆが構築された。
【００４３】
（２）融合タンパク質の生産
構築した発現ベクターＴｒｃ９９Ａ（ＯＳＲＥＬ）７−ＥＴＡＲ−Ｆを実施例１の（２）と同様の方法で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、培養後、菌体ペレットを回収した。さらに、回収した菌体を実施例１の（２）と同様の方法で破砕し、抗ＦＬＡＧ抗体固定化ビーズによる免疫沈降、ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦカラムによる疎水クロマト、及び、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬを用いたゲル濾過に供することにより、（ＯＳＲＥＬ）７のＣ末端にｈＥＴＡＲが連結されてなる融合タンパク質を得た。得られた融合タンパク質の純度は９０％以上、回収率は約１ｍｇ／１Ｌ cultureであった。
【図１】
2010246522.tif 000003
【図２】
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【配列表】
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