(57)【要約】【課題】  第１工程でＬＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し、第２工程でＬＤＬコレステロールを定量する測定方法において試料中の高ＴＧの影響を回避する方法を提供すること。【解決手段】  被検試料中の低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量する第２工程とから成る、被検試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法において、前記第１工程をアルブミンの存在下で行う。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量する第２工程とから成る、被検試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法において、前記第１工程をアルブミンの存在下で行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１工程の反応溶液中の前記アルブミンの濃度は0.1〜5.0 g/dLである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１工程の反応は、ｐＨ５〜９、温度３０〜４０℃で行う請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記第１工程は、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することから成る、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記第２工程は、前記第１工程の産物に、少なくとも低密度リポ蛋白に作用する界面活性剤を加え、前記コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することから成る、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも低密度リポ蛋白と作用する界面活性剤は、全てのリポ蛋白に作用するものである請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記第１工程で用いられる、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤は、ＨＬＢ値が１３以上１５以下であるポリアルキレンオキサイド誘導体である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２工程で用いられる、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤は、ＨＬＢ値が１１以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体である請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、「ＬＤＬコレステロール」という）は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、特に粥状動脈硬化において血管壁に沈着したコレステロールは主にＬＤＬに由来している。ＬＤＬの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の１つであり、分別定量することは臨床上有用である。
【０００３】
従来からのＬＤＬコレステロールの定量方法は、分画とコレステロール定量の２つの操作から求める方法と総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド値より求めるＦｒｉｅｄｅｗａｌｄ式による演算方法がある。
【０００４】
分画操作としては超遠心法、沈殿法、免疫法等があるが、試料を遠心処理またはフィルター処理による操作が必要となり、臨床検査の場において簡便性や経済性において普及しにくい状況にあった。また、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ式による演算方法もその使用に制限があり、かつ個体差を加味していないため正確性に問題があった。
【０００５】
しかしながら、近年になり分画操作を要しないＬＤＬコレステロール定量方法（公開番号 特開平11−318496）が報告され、現在、臨床検査用試薬として検査の場で適用されつつある。この方法は、第１工程で試料中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールを選択的に消去（消去とはエステル型コレステロールと遊離型コレステロールを分解し、その分解物が第２工程で検出されないようにすることを意味する）し、第２工程でＬＤＬコレステロールを定量するものである。
【０００６】
しかし、特殊な臨床検体においては、トリグリセリド（ＴＧ）値が異常高値を示すものについて負の測定誤差を生じるという問題点があった。それ故に、この問題点を回避することが測定法としての有用性を高めることとなり、その方法が望まれている状況にあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平11−318496
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、第１工程でＬＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し、第２工程でＬＤＬコレステロールを定量する測定方法において試料中の高ＴＧの影響を回避する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは負の測定誤差の原因について調査した結果、第１工程の消去時において試料中に高濃度のＴＧが存在すると、本来消去されてはいけないＬＤＬ中コレステロールが消去され始めることを突き止めた。さらに高濃度ＴＧの存在はＴＧを多く含むカイロミクロン(ＣＭ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）等のリポ蛋白が多く存在することを意味し、これらが、ＬＤＬコレステロールの消去を誘発していることがわかった（ＬＤＬを含むこれらリポ蛋白は、コレステロールやＴＧ、リン脂質、蛋白の集合体として粒子系を形成しており、それぞれのリポ蛋白によって蛋白の種類やコレステロール、ＴＧ量の違いがある）。
【００１０】
具体的には、ＣＭとＶＬＤＬが試料中に存在すると第１工程においてＣＭ、
ＶＬＤＬ中のコレステロールは分解し消去されるが、他の蛋白、リン脂質等の残骸物は残る。そのため試料中のＣＭ、ＶＬＤＬ濃度が高くなるにつれて、これら残骸物濃度も高くなり、一部の残骸物のＬＤＬへの吸着も起こり始める。そして、吸着したＬＤＬが、ＬＤＬ以外のリポ蛋白と認識され消去が起こり始めることが明らかとなってきた。
【００１１】
そこで、残骸物のＬＤＬへの吸着を抑える方法について検討した結果、第１工程中にアルブミンを添加することにより、残骸物がアルブミンに吸着され、ＬＤＬへの影響を回避する事ができた。
【００１２】
すなわち、本発明は、被検試料中の低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量する第２工程とから成る、被検試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法において、前記第１工程をアルブミンの存在下で行うことを特徴とする方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、アルブミンを添加することにより、他のリポ蛋白の影響を回避でき、従来方法に比べより高精度にＬＤＬ中のコレステロールを定量することができるという効果が奏される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
リポ蛋白中に含まれるコレステロールとしては、エステル型コレステロール（コレステロールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明細書において、単に「コレステロール」という場合には、これらの両者を包含する。
【００１５】
本発明の方法に供される被検試料としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の方法は、第１工程及び第２工程から成り、第１工程では被検試料中のＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールを消去し、続く第２工程では、被検試料中の残存コレステロールを定量する。第１工程でＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールが消去されているので、第２工程で定量されるコレステロールは、主として被検試料中のＬＤＬ中のコレステロールである。
【００１７】
第１工程における「消去」とは、コレステロールを分解し、かつ、その分解産物が次の第２工程で検出されないようにすることを意味する。ＬＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等に含まれるコレステロールを選択的に消去する方法としては以下の方法を挙げることができる。
【００１８】
すなわち、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去する。
【００１９】
過酸化水素を消去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼを用いてフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
第１工程の反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、由来としてはシュードモナス属細菌から生成されるものが効果的である。また、コレステロールオキシダーゼの濃度は０．１〜  ０．７Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、細菌や酵母由来のものを用いることが好ましい。さらに、カタラーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合のペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍＬが好ましく、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物の濃度としては０．４〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００２１】
第１工程で用いられる、ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１３以上１５以下、好ましくは１３以上１４以下であるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。なお、界面活性剤のＨＬＢ算出方法は周知であり、例えば「新界面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版に記載されている。
【００２２】
ＨＬＢ値が１３以上１５以下のポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１３以上１５以下の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２３】
第１工程で用いられる上記界面活性剤の濃度は、０．１〜１０ｇ／ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５．０ｇ／ｌ程度である。
【００２４】
第１工程は、ｐＨ５〜９の緩衝液中で行うことが好ましく、緩衝液としてはトリス、トリエタノールアミン、グットの緩衝液等のアミンを含む緩衝液が好ましい。特にグット緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯが好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍＭ程度が好ましい。
【００２５】
第１工程で、ＬＤＬとの反応を抑え、他のリポ蛋白の消去をさらに高めるために、反応液中に２価の金属イオンを含ませてもよい。２価の金属イオンとしては銅イオン、鉄イオン及びマグネシウムイオンを使用することができるが、特にマグネシウムイオンが好ましい。２価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍＭ程度が好ましい。
【００２６】
なお、第１工程の反応液中には、任意的に、リポ蛋白分解酵素を加えることもできる。この酵素を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロールが反応しやすくなるので好ましい。この酵素の反応液中濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。
【００２７】
第１工程の反応温度は３０〜４０℃程度が適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間は２〜１０分間程度でよい。
【００２８】
本発明の方法では、第１工程をアルブミンの存在下で行う。アルブミンは、アルブミンであれば何ら限定されるものではなく、血清アルブミン等の市販のアルブミンを好適に用いることができる。アルブミンの起源は何ら限定されるものではなく、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ等いずれの動物であってもよく、特に、広く用いられているウシ血清アルブミンを好適に用いることができる。第１工程の反応溶液中の前記アルブミンの濃度は0.1〜5.0 g/dLが好ましく、0.3〜3.0 g/dLがさらに好ましい。
【００２９】
続く第２工程では、被検試料中の残存コレステロールを定量する。これは、例えば、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤を加え、第１工程で加えたコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより行なうことができる。ここで、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤は、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面活性剤でもよいし、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であってもよい。
【００３０】
全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１１以上１３未満、好ましくは１２以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。
【００３１】
ＨＬＢ値が１１以上１３未満のポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１１以上１３未満の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００３２】
また、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面活性剤として、陰イオン界面活性剤を挙げることができる。ここで用いられる陰イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、芳香環に炭素数４〜１８の直鎖状又は分枝状アルキル基が結合したものを有するものが好ましい。ここで、芳香環は、ベンゼン、ナフタレン、ジフェニール等のように炭素と水素のみから成るものが好ましい。さらに、上記芳香環にスルホン酸塩のような親水基が結合したものが好ましい。このような好ましい陰イオン界面活性剤の例を下記式（I）ないし（V）に示す。
【００３３】
【化１】
2010148526.tif 000002
【００３４】
【化２】
2010148526.tif 000003
【００３５】
【化３】
2010148526.tif 000004
【００３６】
【化４】
2010148526.tif 000005
【００３７】
【化５】
2010148526.tif 000006
【００３８】
但し、式（I）〜（V）において、Ｒは炭素数４〜１８の直鎖状又は分枝状アルキル基を示す。また、第２工程で用いられる好ましい陰イオン界面活性剤として、高級アルコール硫酸ナトリウム等を挙げることができる。
第２工程で用いられる界面活性剤の濃度は、０．１〜１００ｇ／ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは１〜５０ｇ／ｌ程度である。
【００３９】
第２工程のその他の好ましい反応条件は、第１工程における好ましい反応条件と同様である。
【００４０】
以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。もっとも本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４１】
（試薬）
次の組成からなるＬＤＬコレステロール定量試薬を調製した。さらに第１試薬にウシ血清由来のアルブミンを１．０ｇ/ｄＬ添加した試薬も調製し、２種類の試薬で効果の確認を行った（第２試薬は共通に使用）。
【００４２】
第１試薬
PIPES緩衝液  pH7.0                            50  mmol/L
HDAOS                                          0.7  mmol/L
コレステロールエステラーゼ                     0.8  U/mL
コレステロールオキシダーゼ                     0.5  U/mL
カタラーゼ                                     80  U/mL
塩化マグネシウム                               10  mmol/L
界面活性剤  エマルゲンＢ６６(花王社製）         0.2  %
【００４３】
第２試薬
PIPES緩衝液  pH7.0                  50  mmol/L
４−アミノアンチピリン              4.0  mmol/L
ペルオキシダーゼ                    2.4  単位/mL
アジ化ナトリウム                    0.1  %
TritonX100                          3.0  %
【００４４】
（試料）
ＣＭ試料として６種類調製、それぞれ６種類の試料は全てＬＤＬコレステロール濃度を同じとし、ＣＭ濃度だけを変えたものとした（ＣＭの濃度差はＴＧ値として示した）。ＶＬＤＬ試料もＣＭ試料と同様に６種類調製した。
【００４５】
（測定方法）
試料各4μLに、あらかじめ３７℃に加温した第１試薬３００μLを混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬１００μLを加え５分間反応させ６００ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度から事前に測定していた既知濃度試料の吸光度と比較を行い、ＬＤＬコレステロール濃度を算出した。
【００４６】
【表１】
2010148526.tif 000007
(単位:mg/dL)
【００４７】
表1に示されるように、アルブミンを添加した試薬はＣＭの濃度が上昇しても測定値の低下とはならず、影響を回避していることがわかる。
【００４８】
【表２】
2010148526.tif 000008
(単位:mg/dL)
【００４９】
表２のＶＬＤＬについてもＣＭと同様にアルブミンの効果が十分に確認できる。
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月5日(2010.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤の存在下において、被検試料中の低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量する第２工程とから成る、被検試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法において、前記第１工程をアルブミンの存在下で行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１工程の反応溶液中の前記アルブミンの濃度は0.1〜5.0 g/dLである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１工程の反応は、ｐＨ５〜９、温度３０〜４０℃で行う請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記第１工程は、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することから成り、前記第１工程で用いられる、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤は、ＨＬＢ値が１３以上１５以下であるポリアルキレンオキサイド誘導体である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２工程は、前記第１工程の産物に、少なくとも低密度リポ蛋白に作用する界面活性剤を加え、前記コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することから成り、前記少なくとも低密度リポ蛋白と作用する界面活性剤は、全てのリポ蛋白に作用するものであって、前記第２工程で用いられる、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤は、ＨＬＢ値が１１以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体である請求項４記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
すなわち、本発明は、界面活性剤の存在下において、被検試料中の低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量する第２工程とから成る、被検試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法において、前記第１工程をアルブミンの存在下で行うことを特徴とする方法を提供する。