(57)【要約】【課題】  簡便且つ安価に行うことができ、その他の研究手法との組み合わせも容易な、細胞内のプロテアーゼ活性を解析する方法及びその方法に使用するキメラタンパク質を提供する。【解決手段】  プロテアーゼ認識配列を含むリンカーを介してエネルギー受容タンパク質とエネルギー発生タンパク質とが連結して成るキメラタンパク質を細胞内に発現させ、前記細胞内における前記リンカーの切断を検出する、前記プロテアーゼの細胞内活性の解析方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ認識配列を含むリンカーを介してエネルギー受容タンパク質とエネルギー発生タンパク質とが連結して成るキメラタンパク質を細胞内に発現させ、
前記細胞内における前記リンカーの切断を検出する、
前記プロテアーゼの細胞内活性の解析方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼがカスパーゼ３である請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記リンカーの切断の検出が、細胞外液中に分泌されたエネルギー発生タンパク質の量を検出することで行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記エネルギー発生タンパク質が、分泌シグナルを含むルシフェラーゼ、または分泌シグナルが付加されたルシフェラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ルシフェラーゼが、ガウシアルシフェラーゼである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記エネルギー受容タンパク質が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＤｓＲｅｄおよびＲＦＰから成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
観察用ルシフェラーゼを付加した標的タンパク質を前記細胞内に発現させ、発光による前記標的タンパク質の観察を、前記リンカーの切断の検出と並行して行う請求項１に記載の方法であって、
前記エネルギー発生タンパク質がルシフェラーゼである場合、前記ルシフェラーゼと前記観察用ルシフェラーゼとが異なるルシフェラーゼである方法。
【請求項８】
前記細胞の形態の明視野観察を、前記リンカーの切断の検出と並行して行う請求項１に記載の方法。
【請求項９】
プロテアーゼ認識配列を含むリンカーを介してエネルギー受容タンパク質とエネルギー発生タンパク質とが連結して成るキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記プロテアーゼが、カスパーゼ３である請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
前記エネルギー発生タンパク質が、分泌シグナルを含むルシフェラーゼ、または分泌シグナルが付加されたルシフェラーゼである請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記ルシフェラーゼが、ガウシアルシフェラーゼである請求項１１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記リンカーが４から１６のアミノ酸から成る請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
前記リンカーが配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
前記エネルギー受容タンパク質が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＤｓＲｅｄおよびＲＦＰから成る群から選択される請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
配列番号３で示されるアミノ酸配列から成るキメラタンパク質。
【請求項１７】
請求項９から１６の何れか１項に記載のキメラタンパク質をコードする核酸。
【請求項１８】
配列番号２で示される塩基配列を含む核酸。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の核酸を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内のプロテアーゼ活性、特に細胞内のカスパーゼ３活性を解析する方法および前記解析に使用されるキメラタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスとは、多細胞生物において積極的に行われる細胞の死のことであり、組織形成、生体防御等に関与する。アポトーシスは、癌やアルツハイマー病等との関与が報告されており、これらの疾病を治療するためのターゲットと成り得るとして注目されている。
【０００３】
カスパーゼは、アポトーシスのシグナル伝達経路を構成する一群の因子である。カスパーゼは、システインプロテアーゼの１種であり、基質となるタンパク質を開裂することで下流へとシグナルを伝える。複数存在するカスパーゼのうち、カスパーゼ３は、様々なアポトーシス経路への関与が認められ、特に重要な因子と考えられている。
【０００４】
カスパーゼといったプロテアーゼの細胞内活性を解析する方法は、これまでにも考案されているものの、そのような方法では、主に細胞破砕液を使用する必要があり、手間を要する。また、ルシフェラーゼを用いた解析の場合には、細胞破砕液の使用に起因して発光基質が急速に消費されてしまい、長時間の検出が行えないという問題もある。
【０００５】
特許文献１には、カスパーゼ等を解析するための発光分析法が記載されている。この方法でも細胞破砕液が使用される（特許文献１の段落番号００１７）。また、この方法に使用される発光基質にカスパーゼ３の活性検出能を付与した化合物が一般に市販されているが、その価格は高価である。
【０００６】
特許文献２には、高いＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）効率を有する蛍光標識用キメラタンパク質が記載されている。しかし、このキメラタンパク質は、カスパーゼといったプロテアーゼの細胞内活性の検出を目的としておらず、酵素活性測定などの機能は有していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−５３０４８５号公報
【特許文献２】特開２００８−２８３９５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、簡便且つ安価に行うことができ、その他の研究手法との組み合わせも容易な、細胞内のプロテアーゼ活性を解析する方法及びその方法に使用するキメラタンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、プロテアーゼ認識配列を含むリンカーを介してエネルギー受容タンパク質とエネルギー発生タンパク質とが連結して成るキメラタンパク質を細胞内に発現させ、前記細胞内における前記リンカーの切断を検出する、前記プロテアーゼの細胞内活性の解析方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によるキメラタンパク質を使用すれば、プロテアーゼの活性を、細胞外液を用いて検出できるため、長時間にわたって簡便に解析でき、また、キメラタンパク質をコードするプラスミドは大腸菌等で増やすことができるため、市販される検出用試薬を用いるよりも安価に解析できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係る細胞内プロテアーゼ活性解析方法の概要を示す図。
【図２】本発明に係る細胞内プロテアーゼ活性解析方法に使用されるキメラタンパク質を示す模式図。
【図３】本発明に係るキメラタンパク質の発現ベクターの一例を示す模式図。
【図４】本発明に係るキメラタンパク質の発光スペクトルを示す図。
【図５】本発明に係るキメラタンパク質の発現ベクターの一例を示す模式図。
【図６】本発明に係る細胞内プロテアーゼ活性解析方法によって解析されたカスパーゼ３活性を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、細胞内プロテアーゼ活性解析方法に関するものである。また、本発明は、当該方法に使用できるキメラタンパク質に関するものである。更に、本発明は、当該キメラタンパク質の発現のためのベクター、当該キメラタンパク質をコードする塩基配列から成る核酸、当該キメラタンパク質の遺伝子が導入された細胞及び当該キメラタンパク質を発現している細胞に関するものである。
【００１３】
以下、図面を参照しながら本発明の実施態様を説明する。  
図１は、本発明に係る細胞内プロテアーゼ活性解析方法の概要を示す図である。本発明に係る方法は、プロテアーゼ認識配列を含むリンカーを介してエネルギー受容タンパク質とエネルギー発生タンパク質とが連結して成るキメラタンパク質を細胞内に発現させること、および、前記細胞内における前記リンカーの切断を検出することを含む。その他に、任意の工程として、図１ａ〜ｇに示されるような工程を含んでよい。各工程を以下に説明する。
【００１４】
図１（ａ）に示すように、まず、特定のプロテアーゼ４の細胞内活性を解析しようとする細胞１に、本発明に係るキメラタンパク質３を発現するためのベクター２を導入する。
【００１５】
解析の対象となるプロテアーゼ４は、特定のアミノ酸配列を特異的に認識し、当該配列を切断する、すなわちペプチド結合の加水分解を触媒するものであれば、何れのプロテアーゼであってもよい。特に、そのプロテアーゼ活性が、細胞の生命機能にとって重要な働きとなることが解明されているものが好ましい。例えば、プロテアーゼ４は、カスパーゼ、カテプシンまたはカルパインであってよい。カスパーゼとはアポトーシスに関与するタンパク質の一群であるが、なかでもカスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ8またはカスパーゼ10であってよい。
【００１６】
ベクター２が導入される細胞１は、特定のプロテアーゼ活性を解析しようとする何れの細胞であってよい。例えば、動物細胞、植物細胞または微生物細胞を使用できる。好ましくは、これらの培養細胞、単離細胞または遊離細胞が使用される。特定のプロテアーゼ活性を解析する場合に、そのプロテアーゼ４を発現することがわかっている細胞を用いることが好ましい。しかし、そのプロテアーゼ４を発現するかまたはそのプロテアーゼ４の活性を有するかが不明である細胞について、発現または活性の有無を調べる目的で本発明に係る方法を適用することも可能である。プロテアーゼ４がカスパーゼである場合には、細胞１は多細胞性の動物細胞であることが好ましく、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＵ２ＯＳ細胞等、カスパーゼ活性が確認されている細胞を使用することができる。
【００１７】
細胞１にベクター２を導入する方法は、既知の何れかの方法を使用することができる。例えば、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルスを使用する方法またはリポフェクション法等が使用できる。また、市販される遺伝子導入キットを使用してもよい
ベクター２は、後述するキメラタンパク質３をコードする核酸を含むプラスミドやウイルス等であってよい。例えば、使用する細胞１に合わせて、既知のベクターを適宜選択して使用できる。例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン）、ｐＣＡＴ３（プロメガ）、ｐＲＳＥＴ（インビトロジェン）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ストラタジーン）等であってよい。例えば、配列番号４に示されるｐＲＳＥＴＢを使用できる。ベクター２は、少なくともキメラタンパク質３の遺伝子を含み、その他、キメラタンパク質３の発現を調節するための配列および／またはマーカー遺伝子（選択マーカー）等を含んでよい。発現を調節するための配列としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、リプレッサーおよび／またはエンハンサーを含む。マーカー遺伝子としては、例えば、蛍光タンパク質遺伝子、薬剤耐性遺伝子を含む。また精製用のタグ配列（例えばＨｉｓ−ｔａｇ）を含んでよい。ベクター２は、既知の方法を用いて製造することができる。例えば、キメラタンパク質３を構成するエネルギー発生タンパク質３１の遺伝子、エネルギー受容タンパク質３２の遺伝子およびリンカー３３の核酸を用意し、これらを何れかの発現ベクターに挿入することで作製できる。
【００１８】
図１（ｂ）に示すように、次に、細胞１内において、導入したベクター２からキメラタンパク質３が発現される。当該キメラタンパク質の発現のための培養条件は、使用する細胞１およびベクター２等に合わせて適宜設定してよく、例えば、既知の培養条件を使用してよい。
【００１９】
発現されるキメラタンパク質３は、エネルギー発生タンパク質３１、エネルギー受容タンパク質３２、およびそれらを連結するリンカー３３から成る（図２）。好ましくは、Ｃ末端側にエネルギー発生タンパク質３１が位置し、Ｎ末端側にエネルギー受容タンパク質３２が位置する。
【００２０】
本発明による方法は、キメラタンパク質３の有する「生物発光共鳴エネルギー移動（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＢＲＥＴ）」の作用を利用するものである。ＢＲＥＴにおいて、エネルギー発生タンパク質３１は、最初にエネルギーを発生させる部分であり、いわゆるエネルギードナーとして作用する。それに対し、エネルギー受容タンパク質３２は、エネルギー発生タンパク質３１に起因するエネルギーを受けて、発光等のエネルギーを発生する部分であり、いわゆるエネルギーアクセプターとして作用する。
【００２１】
本発明において、エネルギー発生タンパク質３１は、エネルギー受容タンパク質３２に先立ってエネルギーを発生させるものであれば、何れのタンパク質も使用できる。例えば、ＢＲＥＴシステムにおいて一般的に使用される既知のタンパク質であってもよい。例えば、ルシフェラーゼをエネルギー発生タンパク質３１として使用できる。特に、エネルギー発生タンパク質３１は、プロテアーゼ４の触媒作用によってエネルギー受容タンパク質３２と切り離された後（詳細は後述する）、細胞外へと分泌されることが本発明の方法に好適である。従って、エネルギー発生タンパク質３１には分泌シグナルが含まれていることが好ましい。例えば、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼまたはメトリディア（Ｍｅｔｒｉｄｉａ）ルシフェラーゼといった分泌型ルシフェラーゼを使用できる。あるいは、分泌シグナルの付加により分泌性を獲得したルシフェラーゼを使用してもよい。すなわち、ルシフェラーゼに分泌シグナルとなるペプチドを融合させたタンパク質を使用できる。
【００２２】
エネルギー受容タンパク質３２は、エネルギー発生タンパク質３１に起因するエネルギーを受けて、発光等のエネルギーを発生するものであれば、あらゆるタンパク質が使用できる。例えば、ＢＲＥＴシステムにおいて一般的に使用される既知のタンパク質であってよい。特に、エネルギー受容タンパク質３２は、エネルギー発生タンパク質３１に起因して発生する発光エネルギーを吸収し、その発光の波長とは異なる波長の光エネルギーを発生させるタンパク質を使用することが好ましい。例えば、エネルギー受容タンパク質３２として、蛍光タンパク質を使用してよく、とりわけ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＤｓＲｅｄおよびＲＦＰから成る群から選択される蛍光タンパク質を使用してよい。特に、エネルギー発生タンパク質３１としてガウシアルシフェラーゼを使用する場合には、エネルギー受容タンパク質３２としてＹＦＰを使用することが好ましい。
【００２３】
エネルギー発生タンパク質３１とエネルギー受容タンパク質３２とを連結するリンカー３３は、プロテアーゼ認識配列３３１を含む。リンカー３３は、その他に、エネルギー発生タンパク質３１とプロテアーゼ認識配列３３１との間に発生側リンカー３３２を、エネルギー受容タンパク質３２とプロテアーゼ認識配列３３１との間に受容側リンカー３３３を、それぞれ任意に含んでよい。プロテアーゼ認識配列３３１とは、プロテアーゼ４によって特異的に認識され、その配列またはその付近の配列が切断される配列のことをいう。従って、プロテアーゼ認識配列３３１は、標的とするプロテアーゼ４に対応して設定される。例えば、カスパーゼ３を標的とする場合、プロテアーゼ認識配列３３１はアミノ酸配列の一文字表記でＤＥＶＤである。発生側リンカー３３２および受容側リンカー３３３は、例えば、ＢＲＥＴの良好な機能のため、プロテアーゼ４による良好なプロテアーゼ認識配列３３１の認識および切断のため、または、キメラタンパク質３の細胞内での安定性の向上のために、任意に設定してよい。リンカー３３は、好ましくは、４から１６のアミノ酸から成ってよい。また、発生側リンカー３３２は０から６のアミノ酸から成ってよく、好ましくは６のアミノ酸から成る。受容側リンカー３３３は０から４のアミノ酸から成ってよく、好ましくは４のアミノ酸から成る。具体的には、リンカー３３は、認識配列１に示される配列であってよい。
【００２４】
本発明に係るキメラタンパク質３は、例えば、配列番号３に示される配列から成るタンパク質である。また、本発明に係るキメラタンパク質３をコードする遺伝子は、例えば、配列番号２である。さらに、本発明に係る方法に使用されるベクター２は、例えば、配列番号５に示されるベクターである。
【００２５】
図１（ｃ）に示されるとおり、細胞１がキメラタンパク質３を発現した後に、任意に、プロテアーゼ４の発現または活性化を誘導する処理が行なわれる。プロテアーゼ４がカスパーゼである場合には、アポトーシス誘導刺激をプロテアーゼの発現または活性化の誘導処理に使用できる。例えば、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ、デキサメタゾンまたはシクロヘキシミドを使用してアポトーシスを誘導してもよい。このようなプロテアーゼの発現または活性化の誘導処理は、本発明に係る方法に必ずしも必要ではなく、自発的にプロテアーゼ活性を生じる細胞や、自発的にアポトーシスを行う細胞等を使用する場合には、省略することもできる。
【００２６】
図１（ｄ）および（ｅ）に示されるとおり、プロテアーゼ４が発現または活性化し、キメラタンパク質３を基質として触媒作用を及ぼす。プロテアーゼ４は、キメラタンパク質３のプロテアーゼ認識配列３３１を認識して切断し、エネルギー発生タンパク質３１とエネルギー受容タンパク質３２とに分ける（図１ｅ）。
【００２７】
図１（ｆ）に示されるとおり、プロテアーゼ４の触媒作用によって、エネルギー受容タンパク質３２から切断されたエネルギー発生タンパク質３１は、単独で細胞外へ分泌される。上述の通り、エネルギー受容タンパク３２は、好ましくは、細胞外へと分泌されるための分泌シグナルを含んでいる。しかし、エネルギー受容タンパク質３２と繋がっている状態では、分泌が阻害され、細胞内に留まっている。プロテアーゼ４によって切断され単独の分子となることをきっかけに、エネルギー発生タンパク質３１の細胞外への分泌が活発化する。
【００２８】
図１（ｇ）に示されるとおり、細胞を培養するための培地、すなわち細胞外液の一部が分取され、細胞外液中のエネルギー発生タンパク質３１の量が定量される。好ましくは、経時的に細胞外液が分取および定量され、細胞内のプロテアーゼ活性の変化が解析される。当該定量は、エネルギー発生タンパク質３１としてルシフェラーゼを使用する場合には、分取した細胞外液に発光基質であるルシフェリンを適当な量で添加し、その発光強度を計測することで行ってよい。発光基質は、使用するルシフェラーゼに合わせて、既知のものを使用してよい。エネルギー発生タンパク質３１としてガウシアルシフェラーゼを使用する場合には、セレンテラジン（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）、セレンテラジンｈ（プロメガ）、ＶｉｖｉＲｅｎ（プロメガ）、ＥｎｄｕＲｅｎ（プロメガ）等を使用することができる。発光強度を測定する装置としては、例えば、ルミノメーター（ＡＴＴＯ製）を使用してよい。分取した細胞外液をそのまま発光強度測定に用いることも可能であるし、必要に応じて、精製、遠心分離または濾過等の処理を行った後に測定に用いてもよい。
【００２９】
以上、図面を参照しながら説明した本発明の一実施態様は、従来の細胞内プロテアーゼ活性解析方法と比較して格別顕著な効果を有する。本発明によれば、エネルギー発生タンパク質３１の定量（図１ｇ）に、従来の細胞破砕液ではなく、細胞外液が使用される。そのため、定量前における細胞破砕等の処理を省略でき、簡便に定量できる。また、細胞外液を使用するので、定量のための溶液に含まれる夾雑物は従来の場合より非常に少ない。すなわち、エネルギー発生タンパク質３１と発光基質との反応を阻害する物質も少なく、より長時間に、より正確に、エネルギー発生タンパク質３１の量を発光強度として計測することが可能となる。さらに、本発明の方法に使用するためのベクター２は、大腸菌を用いるなどの簡単な技術によって大量に増やすことができるため、市販されるキットを用いた解析よりも非常に安価に行うことができる。
【００３０】
本発明はまた、図１に示される方法と並行して細胞１の観察を行う方法に関する。例えば、図１による細胞内プロテアーゼ活性の経時的な解析と並行して、細胞の形態の変化が明視野観察される。または、図１による細胞内プロテアーゼ活性の経時的な解析と並行して、細胞内の特定のタンパク質が蛍光または発光によって観察される。また、図１による細胞内プロテアーゼ活性の経時的な解析と並行して、明視野観察と蛍光または発光による観察とを同時に行うことができる。
【００３１】
蛍光または発光による観察を並行して行う場合には、その観察の対象となるタンパク質に観察用ルシフェラーゼを付加したものを細胞内に発現させる。ここで、観察の対象とするタンパク質のことを「標的タンパク質」と称する。標的タンパク質はプロテアーゼ４とは異なるタンパク質である。エネルギー発生タンパク質３１としてルシフェラーゼを用いる場合には、前記ルシフェラーゼと観察用ルシフェラーゼとが異なる種類のものである必要がある。標的タンパク質としては、プロテアーゼ４の働きとの関連が示唆されているものを選択することが好ましいが、プロテアーゼ４の働きに関連があるかどうかを調べる目的で、適当な細胞内タンパク質を標的タンパク質とすることもできる。プロテアーゼ４としてカスパーゼを選択し、図１による方法によってアポトーシスの経過を解析する場合には、標的タンパク質は、例えば、ｐ５３、ＮＦκＢまたはＩκＢが選択される。また、エネルギー発生タンパク質３１としてガウシアルシフェラーゼを用いる場合には、観察用ルシフェラーゼとしてはホタルルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、鉄道虫ルシフェラーゼ等のガウシアルシフェラーゼと発光基質または発光極大波長が異なるルシフェラーゼを使用できる。観察は、例えば蛍光顕微鏡を使用して行うことができ、経時的に観察画像を記録していくこともできる。
【００３２】
明視野観察を並行して行う場合には、例えば明視野顕微鏡等を使用して、細胞の形態等が経時的に観察される。このとき、経時的に観察画像を記録していくことも可能である。プロテアーゼ４をカスパーゼとする場合には、そのカスパーゼの活性の変化と、アポトーシスによる細胞形態の変化との関係を調べることが可能となる。
【００３３】
また、蛍光または発光による観察および明視野観察に限定されず、既存の研究手法と本発明による解析方法とを組み合わせることも可能である。例えばカスパーゼ３を解析の対象とする場合には、本発明による解析結果をアポトーシスの進行の指標として利用することも可能である。
【００３４】
このように、各研究手法と本発明による解析方法との組み合わせによれば、従来の組み合わせよりも、格別顕著な効果が得られる。すなわち、従来の組み合わせでは、エネルギー発生タンパク質の検出のために細胞破砕液を用意する必要があり、経時的に検出しようとする場合に、検出の都度細胞を回収し使用することになる。従って、従来の場合では、使用する細胞の培養液を大量に準備する必要があり、及び、大きなサイズで培養する必要がある。このように大きなサイズで実験を行うことは非常に手間を要し、さらに、細胞の成育条件を整えることが困難となるため、得られる実験結果の信頼性も下がる。それに対し、本発明に係る分析方法を各研究手法と組み合わせる場合には、プロテアーゼ活性の分析のために細胞外液を回収するだけであるため、培養液を管理しやすいサイズにすることが可能となり、信頼性の高い実験結果が得られる。
【実施例】
【００３５】
[例１]
キメラタンパク質として「ＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシア」を、大腸菌を使用して作製し、その発光スペクトルを測定した。
【００３６】
ＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシアとは、具体的には、ＹＦＰとガウシアルシフェラーゼとを、アミノ酸配列「ＧＧＳＧＤＥＶＤＧＴＧＧＳＧＧＳ」（配列番号１）で表されるリンカーで連結したものである。
【００３７】
大腸菌におけるＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシアの発現のために、ｐＲＳＥＴ Ｂ／ＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシアと名付けられるプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に導入した。当該プラスミドは、図３に示されるように、ＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシアの遺伝子を有している。なお、ＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシアをコードする遺伝子の塩基配列は配列番号２に示され、ベクターｐＲＳＥＴ Ｂ／ＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシアの塩基配列は配列番号５に示される。
【００３８】
プラスミドを導入した大腸菌を３７℃で２４時間培養し、ＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシアを発現させた。その後、大腸菌の破砕液を調製し、当該破砕液をＮｉ−Ａｇａｒカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィで精製し、ＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシアを得た。
【００３９】
得られたＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシアを１０μｇ／ｍｌで含む０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に、セレンテラジン（プロメガ）を６０μＭに成るように添加し、発光スペクトルを測定した。その結果を図４に（ａ）として示す。
【００４０】
ガウシアルシフェラーゼとセレンテラジンとの反応による発光波長は、一般に４８０ｎｍ付近であることが知られている。それに対し、ＹＦＰの発光波長は、一般に５３０ｎｍ付近であることが知られている。図４によると、５３０ｎｍ付近の発光強度が、４８０ｎｍ付近の発光強度を上回っている。すなわち、ＹＦＰに対する励起光を放射していないにも関わらず、ＹＦＰが強く発光している。このことから、ルシフェラーゼの発光反応に伴い、ＹＦＰが励起され発光していることがわかり、すなわちＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシア内でのＢＲＥＴが良好に生じていることがわかる。
【００４１】
さらに、ＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシアをカスパーゼ３によって６０分間処理した後、その発光スペクトルデータを図４に（ｂ）として示す。カスパーゼ３による処理は、ＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシアを１０μｇ／ｍｌで含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に、終濃度（２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）となるようにカスパーゼ３（ＭＢＬ）を添加し、３７℃にて６０分間インキュベートすることで行った。発光スペクトルの測定は、（ａ）の場合と同様に行った。
【００４２】
カスパーゼ３にて処理を行った場合（ｂ）では、カスパーゼ３で処理しない場合（ａ）と比較して、５３０ｎｍ付近の発光強度が大きく低下した。このことは、ＹＦＰ−ガウシア間におけるＢＲＥＴの低下を意味する。すなわち、本発明にかかるキメラタンパク質を用いることで、カスパーゼ３によるリンカー部分の切断を、５３０ｎｍ付近の発光強度の低下として検出できることが示された。
【００４３】
[例２]
本発明に係る解析方法の有効性を、動物細胞中のカスパーゼ３の活性を対象として確認した。
【００４４】
３５ｍｍディッシュに播種したＨｅＬａ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロジェン）を用いて、ベクターとしてｐｃＤＮＡ３．１／ＹＦＰ−４−ＤＥＶＤ−６−ガウシア（図５）をトランスフェクションした。トランスフェクションの方法は、製造者の指示書通りに行った。
【００４５】
その後、３７℃で２４時間インキュベートし、細胞培養液（ＤＭＥＭ）を交換した。
【００４６】
終濃度が４μＭとなるようにスタウロスポリン（Ｗａｋｏ）を細胞培養液に添加し、ＨｅＬａ細胞のアポトーシスを誘導した。添加後、経時的に細胞培養液を１０μｌづつ分取した。
【００４７】
分取した細胞培養液に、終濃度が６０μＭとなるようにセレンテラジン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、ルミノメーター（ＡＴＴＯ）を用いて発光量を測定した。測定結果に基づいて、以下の式からカスパーゼ３活性を算出した。  
カスパーゼ３活性＝全波長の発光量／５３０ロングパスフィルターによる分光後の発光量
その結果を図６に示す。
【００４８】
図６から、算出される発光強度比が、刺激後の時間の経過とともに増大することがわかる。これは、アポトーシスに進行に対応しており、本発明に係る解析方法によってカスパーゼ３の細胞内活性の変化を有効に解析出来ることが示されている。
【符号の説明】
【００４９】
１…細胞、２…ベクター、３…キメラタンパク質、３１…エネルギー発生タンパク質、３２…エネルギー受容タンパク質、３３…リンカー、３３１…プロテアーゼ認識配列、３３２…発生側リンカー、３３３…受容側リンカー、４…プロテアーゼ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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