(57)【要約】      （修正有）【課題】短時間で生理活性試料物質の高感度測定が可能な方法を提供する。【解決手段】測定試料物質の溶液と、試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体の溶液とを、溶液容量比が１：１〜２０：１にて接触させて、リガンドに結合した生理活性物質と測定試料物質との複合体を溶液中で形成する事；複合体含有溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタに滴下して、該複合体のリガンド部分をリガンド補捉剤に結合させる事；フィルタに、測定試料物質に特異的に結合する、酵素で標識された第二の生理活性物質の溶液を滴下して、この酵素標識生理活性物質を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介してフィルタに結合している第一の生理活性物質と測定試料物質との複合体に結合させる事；フィルタを洗浄して未結合の酵素標識第二生理活性物質を除去する事；次にフィルタに結合した酵素の活性を測定する事からなる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性を有する測定試料物質を含む試料溶液と、該測定試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体を含む溶液とを、それらの溶液の容量比が１：１乃至２０：１となるように接触させて、リガンドに結合した生理活性物質と測定試料物質との複合体を溶液中にて形成する工程；該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程；該多孔性フィルタの表面に、上記測定試料物質に特異的に結合する、酵素で標識された第二の生理活性物質の溶液を滴下して、この酵素標識を持つ第二の生理活性物質を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の生理活性物質と測定試料物質との複合体に結合させる工程；多孔性フィルタを洗浄することにより未結合の酵素標識第二生理活性物質を除去する工程；そして多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定する工程からなることを特徴とする、多孔性フィルタを用いる生理活性を有する試料物質の測定方法。
【請求項２】
生理活性を有する測定試料物質を含む試料溶液、該測定試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体を含む溶液、そして該測定試料物質に特異的に結合する、酵素で標識された第二の生理活性物質を含む溶液とを、該試料溶液と該結合体溶液との容量比が１：１乃至２０：１となるように接触させて、リガンドに結合した第一の生理活性物質と、測定試料物質と、酵素標識第二生理活性物質とからなる複合体を溶液中にて形成する工程；該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程；多孔性フィルタを洗浄することにより未結合の酵素標識生理活性物質を除去する工程；そして多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定する工程からなることを特徴とする、多孔性フィルタを用いる生理活性を有する試料物質の測定方法。
【請求項３】
多孔性フィルタとして、繊維質多孔性フィルタを用いることを特徴とする請求項１もしくは２に記載の試料物質の測定方法。
【請求項４】
試料溶液と、測定試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体を含む溶液とを、それらの溶液の容量比が２：１乃至１０：１となる量にて接触させることを特徴とする請求項１乃至３のうちのいずれかの項に記載の試料物質の測定方法。
【請求項５】
リガンドとしてビオチンを用いることを特徴とする請求項１乃至４のうちのいずれかの項に記載の試料物質の測定方法。
【請求項６】
リガンド補捉剤として抗ビオチン抗体を用いることを特徴とする請求項５に記載の試料物質の測定方法。
【請求項７】
第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体として、ビオチン化アレルゲンを用いることを特徴とする請求項１乃至６のうちのいずれかの項に記載の試料物質の測定方法。
【請求項８】
リガンド補捉剤がスペーサを介して結合している繊維質多孔性フィルタを用いることを特徴とする請求項１乃至７のうちのいずれかの項に記載の試料物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相担体として多孔性フィルタを用い、免疫学的測定法に基づく生理活性有する試料物質の量の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
固相免疫測定法においては、測定対象とする抗原あるいは抗体に応じて、あらかじめ該当する抗原に対応する固定化抗体固相あるいは該当する抗体に対する固定化抗原固相を調製し、測定の都度、対象とする物質に対応した当該固相を選択する方法が従来では一般的であった。このような方法では、測定対象物質ごとに必要とされる固相の種類は無数となるため、固相の調製が煩雑を極め、かつ、測定操作も機械的あるいは用手法に関わらず、測定対象物質に応じて適当な固相ごとに選択しなければならないという煩雑さが重なっていた。
【０００３】
上記の問題を解決しようとする試みはすでになされている。例えば、一種類のリガンド捕捉剤固定化固相を用い、測定対象物質に応じたリガンド標識生理活性物質を選択して、リガンド捕捉剤固定化固相上で測定時に必要とするリガンド標識生理活性物質、即ち、リガンド標識抗原あるいは抗体を固相に捕捉することに基づく方法が知られている。また、必要な固相を調製するか、あるいは、試料中の測定対象の抗原あるいは測定対象抗体とリガンド標識抗体もしくはリガンド標識抗原をリガンド捕捉剤固定化固相上に添加し、捕捉することにより、免疫的に測定される任意の測定対象物質の測定を可能にする方法も知られている。これらの方法は、たとえば、特公平４−４９６５７号公報及び特開平２−１４５９６７号公報に記載されている。
【０００４】
しかしながら、公知の方法では、極めて短い時間で、１ｍＬ当たりナノグラム量のレベルでの測定感度を得ることはできなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、汎用性の高い測定具を用いて、従来の免疫学的測定法に要する時間よりも極めて短い時間にて、１ｍＬ当たりナノグラム量のレベルでの測定感度を得ることのできる免疫学的測定法に基づく生理活性を持つ試料物質の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、生理活性を有する測定試料物質を含む試料溶液と、該測定試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体を含む溶液とを、それらの溶液の容量比が１：１乃至２０：１（好ましくは、２：１以上であり、また１０：１以下である）となるような量に接触させて、リガンドに結合した生理活性物質と測定試料物質との複合体を溶液中にて形成する工程；該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程；該多孔性フィルタの表面に、上記測定試料物質に特異的に結合する、酵素で標識された第二の生理活性物質を含む溶液を滴下して、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の生理活性物質と測定試料物質と
の複合体に結合させる工程；多孔性フィルタを洗浄することにより未結合の酵素標識第二生理活性物質を除去する工程；そして多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定する工程からなることを特徴とする多孔性フィルタを用いる生理活性を有する試料物質の量の測定方法にある。この本発明の測定方法で用いる多孔性フィルタとしては、繊維質多孔性フィルタが好ましいが、多孔性セラミックフィルタを使用することもできる。
【０００７】
本発明はまた、生理活性を有する測定試料物質を含む試料溶液、該測定試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体を含む溶液、そして該測定試料物質に特異的に結合する、酵素で標識された第二の生理活性物質を含む溶液とを、該試料溶液と該結合体溶液との容量比が１：１乃至２０：１（好ましくは、２：１以上であり、また１０：１以下である）となるように接触させて、リガンドに結合した第一の生理活性物質と、測定試料物質と、酵素標識生理活性物質とからなる複合体を溶液中にて形成する工程；該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程；多孔性フィルタを洗浄することにより未結合の酵素標識第二生理活性物質を除去する工程；
そして、多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定する工程からなることを特徴とする多孔性フィルタを用いる生理活性を有する試料物質の量の測定方法にもある。この本発明の測定方法で用いる多孔性フィルタとしては、繊維質多孔性フィルタが好ましいが、多孔性セラミックフィルタを使用することもできる。
【０００８】
本発明の試料物質の測定方法の好ましい態様を次に記す。
（１）リガンドとしてビオチンを用いること。
（２）リガンド補捉剤として抗ビオチン抗体を用いること。
（３）リガンド補捉剤が抗ビオチン抗体で、スペーサが抗ビオチン抗体に対する抗体であること。
（４）第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体としてビオチン化アレルゲンを用いること。
【０００９】
（５）リガンド補捉剤がスペーサを介して結合している繊維質多孔性フィルタを用いること。
（６）リガンド捕捉剤がストレプトアビジンであること。
（７）リガンド捕捉剤がストレプトアビジンで、スペーサが抗ストレプトアビジン抗体であること。
（８）リガンド捕捉剤がストレプトアビジンで、スペーサが抗ストレプトアビジン抗体に対する抗体に抗ストレプトアビジン抗体を重層したものであること。
（９）繊維質多孔性フィルタの下部に吸収体が備えられていること。
【００１０】
（１０）繊維質多孔性フィルタを固相担体とし、リガンドを捕捉するリガンド捕捉剤をこの固相担体上に担持し、測定試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された物質と、測定試料物質を含む試料とを液中で混合攪拌し反応させたのち、その反応液の一定量を、リガンド捕捉剤が結合している固相担体上に直接滴下し、その後、該滴下部分に、測定試料物質に特異的に結合する、酵素で標識された第二の生理活性物質を含む溶液を滴下して反応させ、その反応液がフィルタの縦方向に浸透後、洗浄液を滴下して、次いで、繊維質多孔性フィルタ上の酵素活性の量を測定することによって、測定試料物質の量を測定する繊維質多孔性フィルタ免疫測定方法において、測定試料物質を含む試料と測定試料物質に特異的に結合する生理活性物質にリガンドが結合された物質との液
中での比率が２０：１〜１：１までの範囲、好ましくは１０：１〜２：１、さらに好ましくは１０：１〜４：１の範囲で測定すること。
【００１１】
（１１）測定試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された物質と測定試料物質を含む試料との溶液中での結合反応の後、該反応液を適当な希釈液で希釈した後、その一定量をとり、固相担体上に滴下すること。
（１２）酵素反応後の信号量の測定方法として、積分球を使用して反射率を測定すること。
【００１２】
（１３）上記信号量の測定に際して、信号強度の初速度を測定すること。
（１４）固相担体上に結合した酵素活性の信号強度の初速度を測定し終わるまでの時間が、リガンド捕捉剤が結合している繊維質多孔性フィルタ上に直接、溶液を滴下後、１５分以内、好ましくは８分以内に反応を終了させること。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の生理活性物質の存在量や感度の測定方法によれば、免疫学的測定法を利用して、測定対象物質に応じた別々の固相を調製・設置することなく単一のリガンド捕捉剤固定化固相を用いて、多種類の測定対象物質を簡便、迅速、高感度、かつ高精度で測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の多孔性フィルタを用いる生理活性試料物質の量や生理活性の測定法において、多孔性フィルタとしてはグラスファイバーフィルタを用いることが好ましい。リガンドとしては、ビオチンを用いることが好ましく、また多孔性フィルタに結合させるリガンド補捉剤としては、抗ビオチン抗体もしくはストレプトアビジンを用いることが好ましい。
【００１５】
なお、リガンド補捉剤は、多孔性フィルタにスペーサを介して結合されていてもよい。たとえば、リガンドとしてビオチンを用いるとき、スペーサを介さないときは、リガンド捕捉剤としては、リガンドに対する抗体、すなわち抗ビオチン抗体あるいはストレプトアビジンを、そしてスペーサを介するときには、スペーサとしてリガンド捕捉剤に対する抗体、すなわち抗ビオチン抗体に対する抗体に抗ビオチン抗体を重層することが好ましい。また、スペーサとして抗ストレプトアビジン抗体を用いるか、あるいは抗ストレプトアビジンに対する抗体に抗ストレプトアビジンを重層するかして用いることもできる。
【００１６】
次に、本発明の多孔性フィルタを用いる生理活性試料物質の測定方法を、抗体（アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体）を測定対象の生理活性物質とし、第一の生理活性物質として抗原（アレルゲン）を用い、酵素標識された第二の生理活性物質として、酵素標識された第二抗体（抗ヒトＩｇＥ抗体）を用いる場合において、そして上記の好ましい多孔性フィルタ、リガンド、リガンド補捉剤を利用する系を例にとって、さらに詳しく説明する。
【００１７】
本発明の測定方法では、多孔性フィルタを固相担体として用いて、測定物質に特異的に結合する生理活性物質にリガンドが結合された結合体、例えば、リガンド標識抗原、あるいはリガンド標識抗体を含む溶液と測定試料物質を含む試料溶液とを、予め液中で反応させ、その後、この反応液をリガンド捕捉剤が結合している多孔性フィルタ固相上に直接滴下し、滴下した反応液がフィルタの縦方向に浸透した後、測定試料物質に特異的に結合する第二の生理活性物質であって、酵素で標識されたもの、たとえば、酵素標識抗体あるいは酵素標識抗原を滴下して反応させ、次いで洗浄液を滴下して未反応物を除去した後、繊維質多孔性フィルタ上の酵素活性の量を測定することにより、測定物質の量を測定することができるが、本発明の測定法においては、測定試料物質を含む試料溶液と、測定試料物
質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体とを、容量比で２０：１〜１：１までの範囲、好ましくは１０：１〜２：１の範囲とすることにより、たとえば、１５分以下の短時間で、ｎｇ／ｍＬレベルの微量の測定が可能になった。
【００１８】
多孔性フィルタ（固相担体）の下部には、溶液の通過を迅速ならしめるための吸収体を設置することも好ましい。具体的には、固相担体として、例えば特開平４−３１８４６２号公報あるいは特開平７−２１８４３８号公報に記載されているごとく、通液性に優れ、蛋白質や糖蛋白質を物理的あるいは化学的に固定化する能力に優れ、適度な物理的強度を有するグラスファイバーを用い、その下部に固相担体を通過した溶液を吸収するためのセルロースから成る吸収層とを組み合わせた免疫学的測定用の反応容器（すなわち、ブロット装置）を用いることが好ましい。
【００１９】
スペーサあるいはリガンド捕捉剤の固相担体への固定化方法は、物理的固定化法としては、当該固相担体の上部から、順次、湿潤用緩衝液、ビオチンを特異的に認識する蛋白質溶液（リガンド捕捉剤溶液）、測定目的物質以外の夾雑物質の非特的吸着を防止するためのブロッキング溶液及び安定化剤を含む緩衝液を添加し、凍結乾燥してリガンド捕捉剤固定化固相担体を調製する方法を利用することができる。また、化学的固定化法としては、グラスファイバー担体を、例えば、石川らの方法（酵素免疫測定法：医学書院、ｐ９４，１９７８）に従って、アミノアルキルシラン−グルタールアルデヒドで処理した後、吸収層と組み合わせてブロット装置を作成し、前記の物理的固定化法と同様の溶液を、同様の順序で添加、凍結乾燥して、リガンド捕捉剤固定化固相を作製することができる。
【００２０】
本発明の測定方法において、リガンド捕捉剤として、抗ビオチン抗体もしくはストレプトアビジンを用いることができるが、直接これらの蛋白質をグラスファイバー固相担体に固定化するよりも、以下に述べるスペーサーを介して固定化したとき、より高感度が得られる。即ち、望ましくは、固相担体に抗ビオチン抗体に対する抗体を介して抗ビオチン抗体を固定化し、若しくは、固相担体に抗ストレプトアビジン抗体を介してストレプトアビジンを固定化、あるいは、抗ストレプトアビジン抗体に対する抗体に抗ストレプトアビジン抗体を重層した固相にストレプトアビジンを固定化して作製した固相は、本発明の測定法の有利さをさらに増すことができる。
【００２１】
本発明の測定方法では、免疫学的測定法において多種類の測定対象物質を迅速、高感度、特異的、高精度で測定するために、リガンド捕捉剤固定化固相が効果的に利用できる。
【００２２】
試料中の測定対象物質（測定試料物質）と免疫学的に特異的に反応するリガンド標識抗原あるいはリガンド標識抗体のリガンドとして、小分子のビオチンを用いることが好ましい。ビオチン標識抗原あるいはビオチン標識抗体は、それ自身の免疫学的活性を損なうことなく測定対象物質と速やかに反応するため、測定時間の短縮が可能となる。ビオチン標識により、抗原あるいは抗体の活性の変化が認められる場合には、ビオチン化試薬の側鎖長を変更したり、抗原あるいは抗体の末端糖鎖を酸化後ビオチン標識にする方法などを利用することができる。
【００２３】
本発明の測定方法において、リガンド捕捉剤固定化固相担体及びリガンド標識体を用いて試料中の測定対象物質を測定するとき、測定対象物質の検出に必要とされる測定感度あるいは測定対象物質とリガンド標識体との反応に応じて、測定対象の生理活性物質の溶液とリガンド標識体を含む溶液との容量比を変え、リガンド標識物質の濃度を上げ、測定対象物質の濃度を維持されるような容量比、即ち、リガンド標識体溶液：測定対象物質溶液を１：２０から１：１、好ましくは１：１０〜１：２の範囲で反応させることにより、高感度、短時間の測定が可能になったものである。なお、感度がレンジオーバーした場合には適当な希釈液で測定試料を希釈後、リガンド標識体と混合することも可能であり、また測定試料とリガンド標識体を混合後、適当な希釈液で希釈し、その後にその一定量を検体
量として使用することも可能である。
【００２４】
本発明の測定方法では、測定試料物質とリガンド標識抗原もしくはリガンド標識抗体、そして酵素標識抗体を予め溶液中で反応させ、当該反応混合物をリガンド捕捉剤固定化固相に添加し、次いで洗浄液を添加し、余分な酵素標識抗体を除いた後に、さらに酵素基質を反応させる方法をとることもできる。これらの方法は高分子量の物質上にエピトープが一種類で多数存在する糖鎖抗原のＣＡ１９−９のような場合には非常に有効である。
【００２５】
本発明の測定方法において、測定対象となる試料物質としては、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体、非特異的ＩｇＥ、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型）、ウイルス性感染症（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペス、ロタ、ルベラなど）、原虫性感染症（トキソプラズマ、スピロヘータなど）、真菌性感染症（クラミジア、カンジダ、トリコモナスなど）など各種感染症マーカー、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９，ＣＡ１２５，フェリチン、ＤＵＰＡＮＩＩなどの腫瘍マーカー、ＣＲＰ、ＡＳＯ、ＲＦなどの炎症マーカー、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ミオグロビンなどの心筋梗塞マーカーなどを例示することができる。
【００２６】
次に本発明の実施例と比較例とを示す。
【実施例】
【００２７】
［実施例１］
（１）物理的固定化法による抗ビオチン抗体固定化多孔性固相の作製
１）抗ビオチン抗体ヤギＩｇＧ抗体固定化固相の作製
グラスフィルターと吸収層とを組み込んだブロット装置（特開平７−２１８４３８号公報の記載参照）に、そのフィルター上部から室温で１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液（湿潤液：ｐＨ７．４）を添加、次いで１〜１０００μｇ／ｍＬの抗ビオチン抗体ヤギＩｇＧ溶液（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３〜４、あるいは１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を添加、１０〜３０分間放置した後、ブロックエース（大日本製薬（株）製）を含有するブロッキング剤と防腐剤とを含有する安定化剤混合液を添加した。前記ブロット装置を一昼夜凍結乾燥して、抗ビオチン抗体固定化固相を作製した。
【００２８】
２）抗ヤギ抗体ウサギＩｇＧに抗ビオチン抗体ヤギＩｇＧを重層した固相の作製
グラスフィルターを組み込んだブロット装置に、室温でフィルター上部から湿潤液を添加、次いで１〜１００μｇ／ｍＬの抗ヤギ抗体ウサギＩｇＧ溶液（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３〜４、あるいは１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を添加して、１０〜３０分間放置した。ついで、１〜１０００μｇ／ｍＬの抗ビオチン抗体ヤギＩｇＧ溶液（１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を添加し、さらに１０〜３０分間放置し、次いでブロッキング剤と安定化剤混合液を添加した。一昼夜凍結乾燥して、重層抗ビオチン抗体固定化固相を作製した。
【００２９】
（２）標準ＩｇＥを使用した検出感度比較
上記の２）で作製した抗ビオチン抗体固定化固相担体を組み込んだブロット装置にブロックエースと防腐剤とを含有するブロック液を各５０μＬ添加し、次いで、予めヒトＩｇＥ抗体標品５０μＬに抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体をビオチン化試薬で標識した試薬５μＬを加え、５分間３７℃で加温混合した液５０μＬを滴下した。２分間３７℃で加温後、ペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を２０μＬ滴下し、３７℃２分間加温後、０．５％の非イオン界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含有する緩衝化生理食塩水から成る洗浄液８０μＬ、２回をそれぞれが完全に吸収された後滴下し、フィルター固相担体に残った過剰の標識抗体を除去した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液をそれぞれ４０μＬづつ添加して３７℃で反応させ、６７０ｎｍのレーザー光を光源とする積分球検出器で固相担体表面の青色の色調の反射率（ΔＫ／Ｓ）を測定した。測定に際しては、ブロット装置に液を滴下後６分以内で酵素反応の初速度を測定し終えた。基質の添加時からａ、ｂ秒後の反射率をそれぞれ（Ｋ／Ｓ）ａ、（Ｋ／Ｓ）ｂとすると、初速度（ΔＫ／Ｓ）は、下記の式で表わされる。
ΔＫ／Ｓ  ＝  （（Ｋ／Ｓ）ｂ−（Ｋ／Ｓ）ａ）×６０／（ｂ−ａ）
【００３０】
上記の本発明の測定方法で用いる固相との比較のために、未感作のガラス繊維を打ち抜いて組み上げたブロット装置を用いて、フィルター上部から室温で１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液（湿潤液：ｐＨ７．４）を添加、次いで１〜１００μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体溶液（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３〜４、あるいは１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）５０μＬを添加、１０〜３０分間放置した後、ブロックエースを含有するブロッキング剤と防腐剤を含有する安定化剤混合液を添加した。前記ブロット装置を一昼夜凍結乾燥して、抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体固定化固相を作製した。この固相担体を用い、測定操作に際して、希釈液と検体を１：１で混ぜ合わせ、検体として５０μＬを使用し、上記の本発明方法と同様な操作をしてヒトＩｇＥ
標品を測定し、測定値を求めた（比較例１）。
測定結果を表１に示す。
【００３１】
表１    標準ヒトＩｇＥ抗体濃度の感度比較
────────────────────────────────────
検体          本発明方法        比較例１        本発明方法／比較例
（ΔＫ／Ｓ）      （ΔＫ／Ｓ）
────────────────────────────────────
ＩｇＥ標準液（ｉｕ／ｍＬ）
０          ０．００５５２    ０．００６７０        ０．８２
０．３５    ０．０２８５１    ０．００８１９      ３４．８
１．００    ０．０８８１６    ０．０２０３６      ４３．３
────────────────────────────────────
【００３２】
表１の結果から、本発明に従う測定法では、比較例に比べて、３０倍〜４０倍測定感度が高いことが確認された。
【００３３】
（３）患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥの測定
前記の（１）−２）で作製した抗ビオチン抗体固定化固相を組み込んだブロット装置を５個×３名分計１５個準備した。各々の上部からブロックエースを含有するブロッキング剤と防腐剤を含有するブロック液を各５０μＬを添加し、次いで、ビオチン化ハウスダスト２・アレルゲン液（Ｈ２）、ビオチン化コナヒョウダニ・アレルゲン液（Ｄ２）、ビオチン化カモガヤ花粉・アレルゲン液（Ｇ３）、ビオチン化ブタクサ花粉・アレルゲン液（Ｗ１）、ビオチン化アルテルナリア・アレルゲン液（Ｍ６）の各々５μＬに患者血清を各５０μＬ加え３７℃で５分間加温した。
【００３４】
これらを各々のブロット装置に、５０μＬずつ添加して３７℃で２分間加温した後、それぞれのブロット装置に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナル抗体溶液を各々２０μＬずつ加えて、３７℃で２分間加温した。各々のブロット装置を０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する緩衝化生理食塩水から成る洗浄液８０μＬを２回、直前に供給した溶液が完全に吸収された後供給し、フィルター固相に残った過剰の標識抗体を除去し、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液をそれぞれ４０μＬずつ添加して３７℃で反応させ、次いで、６７０ｎｍのレーザー光を光源とする積分球検出器で固相表面の青色の色調の反射率（ΔＫ／Ｓ）を測定した。測定に際しては、ブロット装置に液を滴下後６分以内で酵素反応の初速度を測定し終えた。その結果を表２に示す。
【００３５】
比較のために、各種のアレルゲン液（１〜５μｍｇ／ｍＬ濃度）を用いて、グラスフィルターと吸収層とを組み込んだブロット装置に、フィルター上部から室温で１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液（湿潤液：ｐＨ７．４）５０μｍを添加、次いで１〜５μｇ／ｍＬのアレルゲン液１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３〜４、あるいは１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液（湿潤液：ｐＨ７．４）１００μｍを添加し、１０〜３０分間放置した後、ブロックエースを含有するブロッキング剤と防腐剤を含有する安定化剤混合液５０μＬを添加した。前記ブロット装置を一昼夜凍結乾燥してアレルゲン固定化固相を得た。
【００３６】
上記の固相を使用し、ブロック液を添加後、患者血清を各２５μＬに希釈液２５μＬを加え混合した後、ブロット装置に５０μＬずつ添加して、３７℃で２分間加温した後、それぞれのブロット装置に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体マウスモノクローナル抗体溶液を各々２０μＬずつ加えて、３７℃で２分間加温した。各々のブロット装置を０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する緩衝化生理食塩水から成る洗浄液８０μＬを２回、直前に供給した溶液が完全に吸収された後供給し、フィルター固相に残った過剰の標識抗体を除去した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液をそれぞれ４０μＬずつ添加して３７℃で反応させた。そののち、６７０ｎｍのレーザー光を光源とする積分球検出器で固相表面の青色の色調の反射率
（ΔＫ／Ｓ）を測定した（比較例２）。その結果を表２に示す。
【００３７】
表２    抗ビオチン抗体固相による患者血清中の
アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体反応性
────────────────────────────────────
患者    アレルゲン    本発明方法            比較例２
（ΔＫ／Ｓ）        （ΔＫ／Ｓ）
────────────────────────────────────
Ａ        Ｈ２        ２．５４０１６      １．２１９６１
Ｄ２        ２．６０３３２      １．４２７５３
Ｇ３      １１．５１１６２      ５．９３５５３
Ｗ１        ５．５７４８５      ３．１６９１７
Ｍ６        ２．７４４８１      ０．９４９５３
────────────────────────────────────
Ｂ        Ｈ２        ０．３５５３７      ０．１１５５８
Ｄ２        ０．５６３４３      ０．１４１０９
Ｇ３        １．５１１３０      ０．６６３１７
Ｗ１        ０．２１８１０      ０．０７２５２
Ｍ６        ０．１６４５９      ０．０２２４８
────────────────────────────────────
Ｃ        Ｈ２        ０．００１０９      ０．００１８１
Ｄ２        ０．０００９３      ０．０００１６
Ｇ３        ０．００９６３      ０．００２８７
Ｗ１        ０．０１２３４      ０．００５１０
Ｍ６        ０．００２４４      ０．００１５６
────────────────────────────────────
【００３８】
上記の結果から、比較例の測定操作（比較例２）に比して本発明に従う測定操作では測定感度（即ちΔＫ／Ｓの値）が二倍以上であり、比較例に比して、低い値（患者Ｃ）でも、本発明方法では感度よく測定され、判定が容易であることが明らかである。
【００３９】
［実施例２］
（１）物理的固定化法によるストレプトアビジン固定化多孔性固相の作製
１）ストレプトアビジン固定化固相の作製
グラスフィルターを組み込んだブロット装置に、室温でそのフィルター上部から湿潤液を添加、次いで１〜１０００μｇ／ｍＬのストレプトアビジン溶液（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３〜４、あるいは１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を添加、１０〜３０分間放置した後、ブロッキング剤と安定化剤混合溶液を添加した。一昼夜凍結乾燥して、ストレプトアビジン固定化固相を作製した。
【００４０】
２）抗ストレプトアビジン抗体ヤギＩｇＧにストレプトアビジンを重層した固相の作製
グラスフィルターを組み込んだブロット装置に、室温でフィルター上部から湿潤液を添加、次いで１〜１００μｇ／ｍＬの抗ストレプトアビジン抗体ヤギＩｇＧ溶液（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３〜４、あるいは１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を添加、１０〜３０分間放置した後、１〜１０００μｇ／ｍＬのストレプトアビジン溶液（１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を添加し、１０〜３０分簡放置した後、ブロッキング剤と安定化剤混合溶液を添加した。一昼夜凍結乾燥して、重層ストレプトアビジン固定化固相を作製した。
【００４１】
比較例として、実施例１に記載の比較例２（アレルゲンを直接固相上に結合させたもの）をそのまま使用し、上記の２）の固相を使用して、実施例１と同じ方法で患者血清のアレルゲン特異的ＩｇＥを測定した場合も、実施例１とほぼ同じ値が得られ、感度として、二倍くらいの高感度を示した。即ち、固相をストレプトアビジンに変えても同じ結果が得られることが確認された。
【００４２】
［実施例３］
（１）化学的固定化法による抗ビオチン抗体固定化多孔性固相の作製
直径８ｍｍに打ち抜いたグラスフィルターを、２％の３−アミノプロピルエトキシシラン−アセトン溶液に４５℃で一昼夜浸漬した後、アセトンで洗浄して乾燥した。次いで、これを１％グルタールアルデヒド（ＧＡ）水溶液に室温で１時間浸漬した後、０．２５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてグルタールアルデヒド臭が消えるまで洗浄して、グルタールアルデヒド活性化フィルターを調製した。これをブロット装置に組み込み、室温でフィルター上部から、１〜１００μｇ／ｍＬの抗ヤギ抗体ウサギＩｇＧ溶液（１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を添加、室温で１０〜３０分間放置した後、１〜１０００μｇ／ｍＬの抗ビオチン抗体ヤギＩｇＧ溶液（１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を添加して、室温で１０〜３０分間放置した。次いで、ブロッキング剤と安定化混合溶液を上から加え、一昼夜凍結乾燥して重層抗ビオチン抗体固定化固相を作製した。
上記で得られた固相を用いて、実施例１と同じ方法で検出感度を求めた結果、実施例１と同様な結果が得られることが確認された。
【００４３】
［実施例４］
（１）重層抗ビオチン抗体固相を用いた患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥの測定
サンプルカップを８個×８名分計６４個用意し、各々に、ビオチン化ギョウギシバ花粉・アレルゲン液（Ｇ２）、ビオチン化オオアワガエリ花粉・アレルゲン液（Ｇ６）、ビオチン化アキノキリンソウ花粉・アレルゲン液（Ｗ１２）、ビオチン化シラカンバ花粉・アレルゲン液（Ｔ３）、ビオチン化ペニシリウム（Ｍ１）・アレルゲン液、ビオチン化クラドスポリウム・アレルゲン液（Ｍ２）、ビオチン化ピーナッツアレルゲン液（Ｆ１３）、ビオチン化卵黄・アレルゲン液（Ｆ７５）を各々５μＬ分取し、これに患者血清を各々５０μＬずつ添加して３７℃で５分間加温した。即ち、ビオチン化アレルゲン液１容量に対して被検試料液１０容量を用いた。予めブロック液５０μＬを添加して湿潤させた実施例１の（１）−２）で作製したブロット装置の各々のフィルター上部から、これらの反応混合液をそれぞれ５０μＬ加えて、２分間３７℃で加温した。加温後、各々のブロ
ット装置の上部から西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナル抗体溶液を２０μＬずつ加えて３７℃で２分間加温した。次いで、各々のブロット装置の上部から洗浄液１００μＬを２回ずつ加えて過剰の標識抗体を除去した後、ＴＭＢＺ溶液を各々４０μＬずつ添加し、３７℃で反応させ、積分球検出器で固相担体表面に呈する青色の反射率（ΔＫ／Ｓ）を測定した。全反応時間は１０分間で終わった。予め同様な操作法でヒトＩｇＥ抗体標品を用いて作製した検量線から、８名の患者血清中の各々８種類のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体濃度を算出した。結果を表３に示した。
【００４４】
表３  重層抗ビオチン抗体固相による
患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥ濃度
────────────────────────────────────
アレル          アレルゲン特異的ＩｇＥ濃度（ｉｕ／ｍＬ）
ゲン  患者Ｄ  患者Ｅ  患者Ｆ  患者Ｇ  患者Ｈ  患者Ｉ  患者Ｊ  患者Ｋ
────────────────────────────────────
Ｇ２     88.0    10.1    2.3     73.5    91.5    91.3    94.2     2.6
Ｇ６     75.0    44.6    1.7     75.4   182.0   122.6   111.9     1.4
Ｗ１      6.1     0.4    0.7      9.9   144.3     9.1     3.5     1.8
Ｔ３      8.9     0.4    0.6     11.8    90.5     8.6     0.9     0.4
Ｍ１      6.8     0.2    0.2      3.7     1.2     3.1     2.1     0.0
Ｍ２      6.5     0.9    0.4      4.4    25.8     2.9    59.4     0.1
Ｆ13      1.2     0.3    0.6      0.9     4.1     0.6     0.5     0.5
Ｆ75      0.5     0.1    0.5      0.3     0.8     0.0     0.5     0.1
────────────────────────────────────
【００４５】
表３の結果から、本発明に従う測定方法によれば、各種のアレルゲン特異的ＩｇＥを感度よく測定することが可能であることが確認された。
【００４６】
［実施例５］
（１）アレルゲン特異的ＩｇＥ濃度の相関
抗ビオチン抗体固定化固相を用いて、実施例４と同じ方法にて、５名の患者について２８種のアレルゲン特異的ＩｇＥ（Ｈ１：ハウスダスト、Ｈ２：ハウスダスト２、Ｄ１：ヤケヒョウダニ、Ｄ２：コナヒョウダニ、Ｅ１：ネコ上皮、Ｅ２：イヌ上皮、Ｅ５：イヌ皮屑、Ｇ１：ハルガヤ、Ｇ３：カモガヤ、Ｇ６：オオアワガエリ、Ｗ１：ブタクサ、Ｗ６：ヨモギ、Ｗ１２：アキノキリンソウ、Ｔ１７：スギ、Ｆ１：卵白、Ｆ２：牛乳、Ｆ４：小麦、Ｆ９：米、Ｆ１１：ソバ、Ｆ１４：大豆、Ｆ２３：カニ、Ｆ２４：エビ、Ｆ７５：卵黄、Ｍ１：ペニシリウム、Ｍ２：クラドスポリウム、Ｍ３：アスペルギルス、Ｍ５：カンジダ、Ｍ６：アルテルナリア）を測定した。市販のファルマシア・アップジョン社のアレルゲン特異的ＩｇＥ測定試薬（比較）を用いて同じ検体を測定し、本発明の測定方法（発明）と相関を求めた。結果を表４と表５に示した。
【００４７】
表４    患者血清中アレルゲン特異的ＩｇＥの相関
────────────────────────────────────
ＩｇＥ濃度（ｉｕ／ｍＬ）
アレル  患者Ａ        患者Ｂ        患者Ｃ        患者Ｄ        患者Ｅ
ゲン  比較  発明    比較  発明    比較  発明    比較  発明    比較  発明
────────────────────────────────────
Ｈ１  57.9  38.7    100>  100>    29.7   9.6     0.8   1.1    17.6  6.9
Ｈ２  62.1  57.1    100>  100>    14.2   8.8     2.0   2.5    2.65  2.7
Ｄ１  38.0  25.0    100>  100>    26.0  13.2     0.65  2.4    0.53 0.34<
Ｄ２  58.4  83.2    100>  100>    14.9  11.3     1.35  3.4    0.5  0.34<
Ｅ１  16.1  17.7     17.0  18.0    2.0   3.3     2.25  1.3    24.2  16.7
Ｅ２  19.8  29.2     45.4 100>    13.5   8.4     3.75  0.8    27.4  20.4
Ｅ５  39.5  55.3     86.6 100>    24.5  12.4     3.55  4.8    48.6  44.5
Ｇ１  100>  100>    100>  100>    47.5  33.3     1.5   2.4    33.3  37.7
Ｇ３  53.2  100>    100>  100>    45.9  31.6     2.3   3.7    47.4  37.4
Ｇ６  100>  100>    100>  100>    30.9  35.2     1.6   3.3    10.7  34.8
Ｗ１  100>  100>     28.4  28.3   10.4   7.0     2.9   2.8     1.07  0.5
Ｗ６  100>  100>     11.8   8.1   13.5  11.1     0.34< 0.34<   0.7   1.2
Ｗ12  100>  100>     6.5    1.9    5.4   4.7     0.34< 2.1     0.34< 1.3
Ｔ17  33.2  50.2     7.8   16.2    5.6   7.9     1.45  1.7     1.63  3.7
────────────────────────────────────
【００４８】
表５    患者血清中アレルゲン特異的ＩｇＥの相関
────────────────────────────────────
ＩｇＥ濃度（ｉｕ／ｍＬ）
アレル  患者Ａ        患者Ｂ        患者Ｃ        患者Ｄ        患者Ｅ
ゲン  比較  発明    比較  発明    比較  発明    比較  発明    比較  発明
────────────────────────────────────
Ｆ１   2.2   6.4     2.0   4.9    0.34<  0.6     0.7   1.1   0.63  0.34<
Ｆ２   1.8   4.6     1.0   2.8    0.34<  0.34<   1.05  1.4   0.65  0.34<
Ｆ４  18.3  14.0     1.2   2.5    0.75   8.3     0.34< 1.7   0.34<  2.2
Ｆ９  24.2  23.7     5.7  11.7    1.1    2.6     0.4   0.5   0.5    1.9
Ｆ11  36.6  43.3     0.34< 1.1    0.34<  2.4     0.5   2.4   0.34<  2.0
Ｆ14  72.1  97.1     0.9   3.6    2.9    4.2     1.65  2.1   0.77   0.9
Ｆ23  13.5   8.3     6.3   7.4    0.34<  1.9     0.34< 2.8   0.34<  2.7
Ｆ24  10.9   6.7     4.0  14.0    0.34<  0.34<   0.34< 2.1   0.34<  2.1
Ｆ75   5.9   6.2     0.7   1.4    0.34<  0.34<   0.34< 1.6   0.34<  1.6
Ｍ１   7.2   7.6     0.8   0.35   5.6    2.0     0.34< 0.6   0.34<  1.3
Ｍ２  54.6  24.4    28.5   6.6    5.4    2.3     0.34< 0.34< 0.34<  2.5
Ｍ３  100>  100>    17.8  12.0     6.2   3.2     1.1   1.0    1.45  1.5
Ｍ５  30.5  23.7    21.0  17.6     2.8   0.34<   0.34< 0.34<   2.0  2.0
Ｍ５  76.7  48.3    17.8   9.1     8.5   2.8     1.25  1.1    20.1  7.7
────────────────────────────────────
【００４９】
アレルゲンスコアは表６に従って分類した。
【００５０】
表６  ＩｇＥ単位とアレルゲンスコア
────────────────────────────────────
ＩｇＥ単位（ｉｕ／ｍＬ)        アレルゲンスコア
────────────────────────────────────
０．３４＜                      ０
０．３５〜０．７                １
０．７  〜３．５                ２
３．５  〜１７．５              ３
１７．５  〜５０                  ４
５０      〜１００                ５
１００＞                            ６
────────────────────────────────────
【００５１】
表４及び表５に示された比較用の市販アレルゲン特異的ＩｇＥ測定試薬を用いた場合と本発明方法を用いた場合との相関は、次の通りである。  測定総数ｎ＝１４０、アレルゲン特異的ＩｇＥ単位（ｉｕ／ｍＬ)では
Ｙ＝０．９１１Ｘ＋１．７６９（ｒ＝０．９５４２）、
アレルゲンスコアでは
Ｙ＝０．９７８Ｘ−０．１２３（ｒ＝０．８６６８）。
従って、両測定法の相関は良好であることが確認された。
【００５２】
［実施例６］
試料物質溶液とリガンド結合体溶液との混合の際の容量比の影響の検討
１）試料物質溶液（標準ＩｇＥ溶液：１００ｉｕ／ｍＬ）とリガンド結合体溶液（ビオチン化抗ヒトＩｇＥ溶液（ＬＷ）とを用いて、その混合比（容量比）の測定感度への影響を、実施例１−１）で作成した抗ビオチン抗体ヤギＩｇＧ抗体固定化固相担体を用いて同様な方法での測定を行なって調べた。その測定と結果を表７に示す。
【００５３】
表７  標準ＩｇＥ液量／ビオチン化抗ヒトＩｇＥ液量（μＬ）の検討
────────────────────────────────────
標準ＩｇＥ液量／ビオチン化抗ヒトＩｇＥ液量（μＬ）
５５／５        ５０／１０      ３０／３０      １０／５０
────────────────────────────────────
容量比率      １１／１          ５／１          １／１          １／５
測定液量      ５０μＬ        ５０μＬ        ５０μＬ        ５０μＬ
────────────────────────────────────
ΔＫ／Ｓ       2.36552         2.35153         1.30979         0.30871
────────────────────────────────────
相対感度        １９５          １９４          １００            ２６
────────────────────────────────────
【００５４】
表７の結果から、試料物質溶液とリガンド結合体溶液との混合の際の容量比の測定感度に与える影響が大きく、前者／後者の比で、１／１以上であることが望ましいこと、そして感度上昇は、約５／１でほぼ飽和状態となることが分る。
【００５５】
２）各種の試料物質溶液（アレルゲン陽性血清）とそれに対応するリガンド結合体溶液（ビオチン化アレルゲン溶液）とを用いて、その混合比（容量比）の測定感度への影響を混合比５／１（混合系Ａ）と混合比１／１（混合系Ｂ）について、測定時のサンプリング量を共に５０μＬとして、実施例１−１）で作成した抗ビオチン抗体ヤギＩｇＧ抗体固定化固相を用いて同様な方法での測定を行なって調べた。その測定と結果を表８に示す。
【００５６】
表８  感度測定結果（ΔＫ／Ｓ）
────────────────────────────────────
アレルゲン      混合系Ａ          混合系Ｂ                感度比
（５／１）        （１／１）      （混合系Ａ／混合系Ｂ）
────────────────────────────────────
Ｈ１        １．２３９７８    ０．４４４４５            ２．７９
Ｈ２        １．１１０３８    ０．３３９８１            ３．２７
Ｄ１        ０．６２２５０    ０．３２８７５            １．８９
Ｄ２        １．０５７４３    ０．３３０２４            ３．２０
Ｔ１７      ０．４４０３０    ０．２０７８８            ２．１２
Ｍ５        ０．２３２９３    ０．１７９９０            １．２９
Ｗ６        ２．７６９２３    １．６２０５９            １．７１
Ｇ６        ４．３５５６９    ２．０５９３５            ２．１２
Ｆ４        ０．１８３３１    ０．０９７９０            １．８７
Ｅ２        ０．３２４９７    ０．１１３６４            ２．８６
Ｍ１        ０．０４２９５    ０．０１８７２            ２．２９
────────────────────────────────────
平均値  ２．３１
────────────────────────────────────
【００５７】
表８の結果から、アレルゲン測定に際しても、前処理した繊維質多孔性固相を用いての測定において予め行なうアレルゲン溶液／ビオチン化アレルゲン溶液の混合比の増加が感度の明らかな向上をもたらすことが分る。
【００５８】
３）試料物質溶液（ＩｇＥ溶液）の濃度を種々変え、ＩｇＥ溶液（試料溶液）
とビオチン化抗ヒトＩｇＥ液の混合比（容量比）の測定感度への影響を混合比５／１（混合系Ａ）と混合比１／１（混合系Ｂ）について、測定時のサンプリング量を共に５０μＬとして、前記１）と同様な実験を行なった（検量線の作成）。
その結果を表９に示す。
【００５９】
表９  検量線：ＩｇＥ溶液の濃度を変えての感度測定結果（ΔＫ／Ｓ）
────────────────────────────────────
ＩｇＥ溶液          混合系Ａ        混合系Ｂ              感度比
濃度            （５／１）        （１／１）    （混合系Ａ／混合系Ｂ）
────────────────────────────────────
０(iu/mL)     ０．０００５５    ０．００１３３          ０．４１
１            ０．００９５７    ０．００４３０          ２．２３
５            ０．１０３７９    ０．０４６８０          ２．２２
２５            ０．８３７６３    ０．３８６４３          ２．１７
１００          ２．５５４９４    １．７６６００          １．４５
────────────────────────────────────
平均値  ２．０２
────────────────────────────────────
【００６０】
表９の結果から、検量線の感度も試料物質溶液とリガンド結合体溶液との混合の際の混合比の増加により明らかな向上が現れることが分る。
【００６１】
［実施例７］
糖鎖抗原であり、分子上に一種類の抗原が多数存在するＣＡ１９−９を測定する場合には実施例１のやり方では感度の向上が見られなかったので、三者を同時に反応する方法について実施した。
【００６２】
実施例３の化学的固定化法による抗ビオチン抗体固定化多孔性固相を用いて、ブロット装置に多孔性固相を組み込んだ。ビオチン標識抗ヒトＣＡ１９−９モノクローナル抗体４μｇ／ｍＬ、１５μＬとＣＡ１９−９標準各濃度３０μＬ、そしてペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体３０μＬを混合、３７℃に５分間加温保持し、ブロット装置にブロックエースを含有するブロッキング剤と防腐剤を含有するブロック液を各５０μＬ添加し、次いで、予め加温しておいた試料５０μＬを滴下し、３７℃で３〜４分加温し、各々のブロット装置を０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する緩衝化生理食塩水から成る洗浄液８０μＬを２回、直前に供給した溶液が完全に吸収された後供給し、フィルター固相に残った過剰の標識抗体を除去した。
ついで、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液をそれぞれ４０μＬずつ添加して３７℃で反応させ、６７０ｎｍのレーザー光を抗原とする積分球検出器で固相表面の青色の色調の反射率（ΔＫ／Ｓ）を測定した。標準液の測定値を表１０に示す。
【００６３】
次に、比較例として、処理していないガラス繊維フィルターを組み上げたブロット装置を用いて、フィルター上部から室温で１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液（湿潤液：ｐＨ７．４）を添加、次いで１００μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＡ１９−９モノクローナル抗体溶液（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３〜４，あるいは１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を添加、１０〜３０分間放置した後、ブロックエースを含有するブロッキング剤と防腐剤と防腐剤を含有する安定化剤混合液を添加した。前記ブロット装置を一昼夜凍結乾燥抗ヒトＣＡ１９−９モノクローナル抗体固定化固相を作製した。この固相を比較例として使用した。測定方法は、希釈液とＣＡ１９−９標準液を１：１で混ぜ合わせ、検体として５０μＬを使用し、本発明方法と同様な操作をして、ヒトＣＡ１９−９標品を測定し、測定値を求めた。その結果も表１０に示す。
【００６４】
表１０  ＣＡ１９−９の標準液測定値
────────────────────────────────────
ＣＡ１９−９標準            本発明方法          比較例
────────────────────────────────────
０Ｕ／ｍＬ              ０．０１１        ０．００５
４０Ｕ／ｍＬ              ０．５４８        ０．４５６
１６０Ｕ／ｍＬ              ４．０６２        ２．０４３
６４０Ｕ／ｍＬ              ８．８２２        ５．８１９
────────────────────────────────────
【００６５】
この結果は、三者を同時に混合した方が感度的に高いことを示している。
【手続補正書】
【提出日】平成21年11月4日(2009.11.4)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明は、生理活性を有する測定試料物質を含む試料溶液、該測定試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体を含む溶液、そして該測定試料物質に特異的に結合する、酵素で標識された第二の生理活性物質を含む溶液とを、該試料溶液と該結合体溶液との容量比が１：１乃至２０：１（好ましくは、２：１以上であり、また１０：１以下である）となるように接触させて、リガンドに結合した第一の生理活性物質と、測定試料物質と、酵素標識生理活性物質とからなる複合体を溶液中にて形成する工程；該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程；多孔性フィルタを洗浄することにより未結合の酵素標識第二生理活性物質を除去する工程；そして、多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定する工程からなることを特徴とする多孔性フィルタを用いる生理活性を有する試料物質の量の測定方法にある。この本発明の測定方法で用いる多孔性フィルタとしては、繊維質多孔性フィルタが好ましいが、多孔性セラミックフィルタを使用することもできる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明の測定方法の別法では、多孔性フィルタを固相担体として用いて、測定物質に特異的に結合する生理活性物質にリガンドが結合された結合体、例えば、リガンド標識抗原、あるいはリガンド標識抗体を含む溶液と測定試料物質を含む試料溶液とを、予め液中で反応させ、その後、この反応液をリガンド捕捉剤が結合している多孔性フィルタ固相上に直接滴下し、滴下した反応液がフィルタの縦方向に浸透した後、測定試料物質に特異的に結合する第二の生理活性物質であって、酵素で標識されたもの、たとえば、酵素標識抗体あるいは酵素標識抗原を滴下して反応させ、次いで洗浄液を滴下して未反応物を除去した後、繊維質多孔性フィルタ上の酵素活性の量を測定することにより、測定物質の量を測定することができるが、本発明の測定法においては、測定試料物質を含む試料溶液と、測定試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体とを、容量比で２０：１〜１：１までの範囲、好ましくは１０：１〜２：１の範囲とすることにより、たとえば、１５分以下の短時間で、ｎｇ／ｍＬレベルの微量の測定が可能になった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明の測定方法では、測定試料物質とリガンド標識抗原もしくはリガンド標識抗体、そして酵素標識抗体を予め溶液中で反応させ、当該反応混合物をリガンド捕捉剤固定化固相に添加し、次いで洗浄液を添加し、余分な酵素標識抗体を除いた後に、さらに酵素基質を反応させる方法をとる。これらの方法は高分子量の物質上にエピトープが一種類で多数存在する糖鎖抗原のＣＡ１９−９のような場合には非常に有効である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
次に本発明の実施例（但し、以下の実施例の内、実施例１〜６は参考例であり、本発明の実施例は実施例７である）と比較例とを示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性を有する測定試料物質を含む試料溶液、該測定試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体を含む溶液、そして該測定試料物質に特異的に結合する、酵素で標識された第二の生理活性物質を含む溶液とを、該試料溶液と該結合体溶液との容量比が１：１乃至２０：１となるように接触させて、リガンドに結合した第一の生理活性物質と、測定試料物質と、酵素標識第二生理活性物質とからなる複合体を溶液中にて形成する工程；該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程；多孔性フィルタを洗浄することにより未結合の酵素標識生理活性物質を除去する工程；そして多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定する工程からなることを特徴とする、多孔性フィルタを用いる生理活性を有する試料物質の測定方法。
【請求項２】
多孔性フィルタとして、繊維質多孔性フィルタを用いることを特徴とする請求項１に記載の試料物質の測定方法。
【請求項３】
試料溶液と、測定試料物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体を含む溶液とを、それらの溶液の容量比が２：１乃至１０：１となる量にて用いることを特徴とする請求項１もしくは２に記載の試料物質の測定方法。
【請求項４】
リガンドとしてビオチンを用いることを特徴とする請求項１乃至３のうちのいずれかの項に記載の試料物質の測定方法。
【請求項５】
リガンド補捉剤として抗ビオチン抗体を用いることを特徴とする請求項４に記載の試料物質の測定方法。
【請求項６】
第一の生理活性物質にリガンドが結合された結合体として、ビオチン化アレルゲンを用いることを特徴とする請求項１乃至５のうちのいずれかの項に記載の試料物質の測定方法。
【請求項７】
リガンド補捉剤がスペーサを介して結合している繊維質多孔性フィルタを用いることを特徴とする請求項１乃至６のうちのいずれかの項に記載の試料物質の測定方法。