(57)【要約】【課題】被検出物質を極めて高感度に検出可能とする。【解決手段】液体試料Ｓが流下されるマイクロ流路１１を有する流路部材１２の、該流路１１の壁面に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質１３が固定層１４としてが固定されてなる流路型センサチップ１０を用い、流路１１内に被検出物質Ａを含む液体試料Ｓを流下させ、被検出物質Ａの量に応じた量の結合物質２５を固定層１４に結合させた後、流路１１内において、液体３０を、該固定層１４に加わる下記式（１）で現されるずり応力Ｔが0.08〜2.8Ｐａの範囲となる流速で移動させることにより、固定層１４上の非特異吸着した結合物質２５を除去した後に、固定層１４上の結合物質２５からの信号を検出する。      Ｔ＝８ηＶ／ｈ・・・・（１）ここで、ηは液体の粘性係数[Ｐａ・s]、Ｖはマイクロ流路内における断面平均流速[ｍ/ｓ]、ｈはマイクロ流路の流路厚[ｍ]である。【選択図】図３Ｃ
2010112730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の、該流路の壁面に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質が固定層として固定されてなる流路型センサチップを用い、前記流路内に被検出物質を含む液体試料を流下させ、該被検出物質の量に応じて前記固定層に結合する、前記２つの物質のうちの他方の物質を含む結合物質を該固定層に結合させて、該固定層上の該結合物質からの信号を検出する検出方法において、
前記結合物質を前記固定層に結合させた後、
前記流路内において、液体を、該固定層に加わる下記式（１）で表されるずり応力Ｔが0.08〜2.8Ｐａの範囲となる流速で移動させることにより、前記固定層上の非特異吸着した前記結合物質を除去した後に、前記信号を検出することを特徴とする検出方法。
Ｔ＝８ηＶ／ｈ・・・・（１）
ここで、ηは前記液体の粘性係数[Ｐａ・s]、Ｖは前記マイクロ流路内における断面平均流速[ｍ/ｓ]、ｈは前記マイクロ流路の流路厚[ｍ]である。
【請求項２】
請求項１記載の検出方法において用いられる流路型センサチップであって、
前記流路内を液体が流下される際に、前記固定層に加わる前記式（１）で表されるずり応力Ｔが、0.08〜2.8Ｐａの範囲にあるとき、固定されている前記固定層の初期量の少なくとも９割が流されることなく固定状態を維持することを特徴とする流路型センサチップ。
【請求項３】
前記流路厚ｈが50μｍであり、
前記液体として前記粘性係数ηが１ｍＰａ・ｓのものを用い、前記断面平均流速Ｖが0.5〜17.5ｍｍ／ｓの範囲で前記流路内を流下させた際に、固定されている前記固定層の初期量の少なくとも９割が流されることなく固定状態を維持することを特徴とする請求項２記載の流路型センサチップ。
【請求項４】
前記流路部材の、少なくとも前記固定層が固定されている領域が、樹脂もしくはガラスから形成されていることを特徴とする請求項２または３記載の流路型センサチップ。
【請求項５】
請求項２から４いずれか１項記載の流路型センサチップの製造方法であって、
前記流路の壁面に前記固定層を固定する前に、該壁面の該固定層が設けられる領域に、紫外線、あるいは放射線を照射することを特徴とする流路型センサチップの製造方法。
【請求項６】
前記固定層が設けられる領域への、前記紫外線、あるいは放射線の照射量が、250ｍＪ／ｃｍ2〜650ｍＪ／ｃｍ2であることを特徴とする請求項５記載の流路型センサチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法であって、特に、該被検出物質の量に応じて結合する結合物質と特異的に結合する固定層を備えたマイクロ流路型センサチップを用いて結合物質と固定層との結合に基づく信号を検出する検出方法に関するものである。また、本発明は、その検出方法に用いられるマイクロ流路型センサチップおよびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定においては、抗原抗体反応などの生体分子反応を検出することにより、被検出物質である抗原（あるいは抗体）などの存在の有無、量を測定している。
【０００３】
互いに特異的に結合する２つの物質の一方の物質（例えば、抗原、抗体、各種酵素、受容体など）を基板上に固定化し、被検出物質の量に応じた量の他方の物質を基板上に固定された固定層に結合させ、この結合反応を検出することにより、試料中における被検出物質の有無、量を測定することができる。具体的には、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上にその抗原と特異的に結合する抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより抗体に抗原を特異的に結合させ、次いで、抗原と特異的に結合する、標識が付与された標識抗体を添加し、抗原と結合させることにより、抗体―抗原―標識抗体の、所謂サンドイッチを形成し、標識からの信号を検出するサンドイッチ法や、標識された競合抗原を抗原と競合的に固定化抗体と結合させ、固定化抗体と結合した競合抗原に付与されている標識からの信号を検出する競合法などのイムノアッセイがなされている。
【０００４】
バイオ測定においては、より短時間での測定を可能とすることが望まれており、センサ部上における反応を効率よく生じさせ、測定時間の短縮を図る方法が種々提案されており、例えば、マイクロ流路型のセンサチップを用いることにより測定効率の向上が図られている。特許文献１においては、液体試料を高速で流下させることにより測定の高速化を図ることが提案されている。なお、この特許文献１には、流体を高速で移動させても流出しないように蛋白質を強固に基板上に固定させることが必要である旨が記載されている。
【０００５】
生体分子の固定化技術としては、エレクトロスプレーディポジション法、ピンタイプスポッター、インクジェット、マイクロコンタクトプリンティングを用いた固定法などが知られているが、特許文献１では、そのうち、特にエレクトロスプレーディポジション法が蛋白質を強固に固定する上で好ましいと記載されている。
【０００６】
また、特許文献２には、多重性変性核酸分子を固定支持体に固定する方法において、固定支持体としてプラスチックを用いる場合、プラスチック表面を紫外線放射によって機能化することにより、核酸分子等の固体化を容易にすることができることが開示されており、特許文献３には、主として核酸を対象とした固定法として、生体分子の溶液を樹脂製の担体上にスポットした後に、生体分子溶液をスポットした担体に紫外線を照射することによって、効率よく固定する方法が提案されている。
【特許文献１】特開２００７−１０１２２１号公報
【特許文献２】特表２００４−５３８４５６号公報
【特許文献３】特開２００３−２９４７５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
イムノアッセイにおいては、基板上に固定されている固定層と、結合物質との特異的な結合に基づく信号をＳ／Ｎよく検出することが望まれる。そのため、結合反応をさせた後、固定層上に浮遊している未反応の結合物質を除去する目的で、溶液の置換（洗浄工程）を行った上で、信号を検出することが一般に行われている。
【０００８】
本発明者らは流路型センサチップを用いた、測定の効率化を図ったイムノアッセイ方法について検討する過程において、溶液の置換を行うだけの従来の洗浄方法では、Ｓ／Ｎが十分に改善せず、このＳ／Ｎが十分に改善しない主たる原因は、センサ部に非特異吸着している標識抗体によるものであることを明らかにし、この非特異吸着によるＳ／Ｎの低下を防止し、Ｓ／Ｎよく信号検出を行う信号検出方法を確立する必要性があることを見いだした。
【０００９】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、Ｓ／Ｎよく生体反応を検出可能なマイクロ流路型センサチップおよびその製造方法を提供することを目的とする。また、本発明はＳ／Ｎよく生体反応を検出する検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
電気泳動、化学反応、細胞培養および分離検出などのラボプロセスが集積化されたラボ-オン-ア-チップ（Lab-0n-a-chip：Laboratory on a Chip）やマイクロ-タス(μ-TAS：Micro-Total Analysis Systems)などに設けられるマイクロスケールの流路を備えたマイクロ流路型センサチップの流路における流体の流れは生体由来の分析物（血液、尿など）を扱う場合、レイノルズ数（Re）がRe＜200と低いため、乱流は生じず層流が支配的となる。
【００１１】
層流とは、図１に示すように、マイクロ流路１１内の流線が壁面に対して平行で、流路中央部で最も流速が大きく、流路壁面近傍では摩擦力により流速が小さい、流路の中心部から壁面側に向かって速度分布を持つ流れのことである。
【００１２】
本発明者は、この層流に伴い、流路壁面に固定されている固定層や該固定層に非特異吸着した結合物質に対してずり応力Ｔが加わる点、および非特異吸着した物質を取り除く手段としてこのずり応力Ｔの利用可能性に着目し、鋭意研究を行った。研究の過程において、非特異吸着した結合物質をずり応力を利用して取り除く際には、同時に固定層に対してもずり応力が加わることから、固定層の剥がれが問題となることがわかった。そのため、この剥がれが問題とならない範囲で、かつ洗浄効果を得ることができるずり応力を非特異吸着した物質に印加する必要があること、固定層をずり応力に対して強固なものとする必要があること、固定層の剥がれを抑制しつつ、洗浄効果を得ることができるずり応力を生じさせる必要があることを見いだした。本発明は上記見地に基づいて為されたものである。
【００１３】
本発明の検出方法は、液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の、該流路の壁面に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質が固定層として固定されてなる流路型センサチップを用い、前記流路内に被検出物質を含む液体試料を流下させ、該被検出物質の量に応じて前記固定層に結合する、前記２つの物質のうちの他方の物質を含む結合物質を該固定層に結合させて、該固定層上の該結合物質からの信号を検出する検出方法において、
前記結合物質を前記固定層に結合させた後、
前記流路内において、液体を、該固定層に加わる下記式（１）で現されるずり応力Ｔが0.08〜2.8Ｐａの範囲となる流速で移動させることにより、前記固定層上の非特異吸着した前記結合物質を除去した後に、前記信号を検出することを特徴とする。
【００１４】
Ｔ＝８ηＶ／ｈ・・・・（１）
ここで、ηは前記液体の粘性係数[Ｐａ・s]、Ｖは前記マイクロ流路内における断面平均流速[ｍ/ｓ]、ｈは前記マイクロ流路の流路厚[ｍ]である。
【００１５】
本発明の流路型センサチップは、本発明の検出方法において用いられる流路型センサチップであって、
前記流路内を液体が流下される際に、前記固定層に加わる前記式（１）で表されるずり応力Ｔが、0.08〜2.8Ｐａの範囲にあるとき、固定されている前記固定層の初期量の少なくとも９割が流されることなく固定状態を維持することを特徴とする流路型センサチップ。
【００１６】
例えば、前記流路厚ｈが50μｍであり、前記液体として前記粘性係数ηが１ｍＰａ・ｓのものを用い、前記断面平均流速Ｖが0.5〜17.5ｍｍ／ｓの範囲で前記流路内を流下させた際に、固定されている前記固定層の初期量の少なくとも９割が流されることなく固定状態を維持するものであることが望ましい。
【００１７】
なお、前記流路部材の、少なくとも前記固定層が固定されている領域が、樹脂もしくはガラスから形成されていることが望ましい。
【００１８】
本発明の流路型センサチップの製造方法は、
前記流路の壁面に前記固定層を固定する前に、該壁面の該固定層が設けられる領域に、紫外線、あるいは放射線を照射することを特徴とする。
【００１９】
なお、前記固定層が設けられる領域への、前記紫外線、あるいは放射線の照射量は、250ｍＪ／ｃｍ2〜650ｍＪ／ｃｍ2であることが望ましい。
【００２０】
なお、固定層は、被検出物質に応じて、抗原、抗体、各種酵素、受容体などからなるものとすることができる。
【００２１】
「被検出物質の量に応じて前記固定層に結合する、前記２つの物質のうちの他方の物質を含む結合物質」は、固定層上において検出可能な、光学的、電気的、あるいは磁気的な信号を発生する性質を備えるものであり、該被検出物質自体、被検出物質に標識が付与されてなるもの、あるいは、被検出物質を含まず、該被検出物質と競合して固定層に結合する物質からなるものなどいずれであってもよい。なお、前記結合物質が被検出物質自体、あるいは被検出物質に標識が付与されてなるものである場合、被検出物質が他方の物質を構成し、被検出物質を含まない場合には、該被検出物質と競合して固定層に結合する物質が前記他方の物質を構成する。結合物質は、主として光学的、電気的あるいは磁気的な信号を発生する標識を含み、該標識の存在により前述の性質を備えるものとなるが、被検出物質自体が信号を発生する性質を備える（例えば、蛍光色素を備えている、あるいはイオン化されている）場合には、必ずしも標識が付与されていなくてもよい。
【００２２】
例えば、抗原抗体反応を検出する方法において、抗原が被検出物質であるとき、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、固定層は該抗原と特異的に結合する抗体から構成され、結合物質は、前記他方の物質である抗原と標識抗体とからなり、競合法によるアッセイを行う場合には、結合物質は、抗原と競合して固定化抗体と結合する標識競合抗原から構成される。なお、このとき、「結合物質からの信号」とは、サンドイッチ法では、標識抗体の標識からの信号であり、競合法では、標識競合抗原の標識からの信号である。
【００２３】
光学的信号を生じる標識としては、例えば、励起光に対し光応答性を有するものであればよく、励起光の照射により蛍光を生じる蛍光色素分子、蛍光微粒子、量子ドット（半導体微粒子）のみならず、励起光の照射により散乱光を生じる金属微粒子などであってもよい。電気的信号を生じる標識としては、電荷を有するイオン化物質を用いることができ、磁気的信号を生じる標識としては、磁性体をそれぞれ用いることができる。他の物質自体が蛍光色素を備えている場合、あるいは他の物質自体がイオン化物質である場合などには他の物質自体が結合物質となり得る。
【００２４】
信号を検出する具体的手段としては、光学的信号を検出するためには、蛍光検出器などの光検出器を用いればよく、電気的信号を検出するためには、ＦＥＴ（Field Effect Transistor)などの電荷検出器を用いればよく、磁性信号を検出するためには、ＳＱＵＩＤ（超電導量子干渉計）や磁気抵抗効果素子などの磁気センサを用いればよい。
【００２５】
なお、従来技術の項に記載の特許文献２および３においては、生体分子を確実に、効率よく固定するための方法として紫外線照射を用いることが開示されているが、マイクロ流路内における流体の移動に伴い固定層の剥がれが生じる恐れについては記載も示唆もなく、流体の移動により生じるずり応力による固定層の剥がれについては何ら考慮されていない。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の流路型センサチップを用いた検出方法によれば、固定層上に結合物質を結合させた後、液体を固定層に加わるずり応力Ｔが0.08〜2.8Ｐａの範囲となる流速で移動させることにより、マイクロ流路内に層流を生じさせ、この層流により、固定層に非特異吸着した結合物質に一定以上のずり応力をかけることにより固定層から引き剥がすことができるため、洗浄効果を極めて高くすることができる。一方、強くなりすぎると、固定層の剥がれが生じるが、固定層に加わるずり応力は2.8Ｐａまでとしていることから剥がれは大きくなく、また、固定層と結合物質との結合を取るほどの大きさでないため、効果的にＳ／Ｎを向上させることができる。
【００２７】
特に、本発明の流路型センサチップであれば、ずり応力は、固定層の剥がれが１割未満に抑制される大きさであるため、信号の低下を生じることなく、非特異吸着した結合物質によるノイズを低減することができるので、効果的にＳ／Ｎを向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００２９】
「流路型センサチップ」
図２Ａ〜図２Ｃは本発明の実施形態に係る流路型センサチップを模式的に示す斜視図、側面図および平面図である。
【００３０】
流路型センサチップ１０は、液体試料が流下されるマイクロ流路１１を有する流路部材１２の該流路１１の壁面に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質からなる固定層１４を備えてなるものである。本実施形態では、抗原抗体反応において、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合を例とし、固定層１４として、被検出物質である抗原Ａと特異的に結合する抗体１３を備えている場合について説明する。
【００３１】
流路型センサチップ１０は、図２Ａ〜図２Ｃに示すように、マイクロ流路１１を有する流路部材１２と、液だめ１６ａ、１６ｂと該液だめの底部に設けられた開口１５ａ、１５ｂとを備えた上板部材１７とが、超音波溶接により接続されて構成されている。流路部材１２および上板部材１７は、ポリスチレン等の透明な誘電体材料からなり、射出成型によりそれぞれ成型することができる。流路サイズは、一例として、流路の幅が２ｍｍ、流路の深さが５０μｍ程度である。流路型センサチップ１０には、少なくとも固定層１４が形成されている領域の上流側および下流側にそれぞれ１つずつ開口（空気口）が流路内の流体の流速を調整するために必要である。例えば、上流側の開口１５ａは液体試料を注入する注入口として用いられ、下流側の開口１５ｂにはポンプが接続され、流速の調整が可能とされる。
【００３２】
また、本実施形態においては、図２Ｂに示すようにセンサチップ１０の固定層１４が設けられている領域の上流側に、標識抗体２０が付着されている。標識抗体２０は、被検出物質に対して、前述の固定層１４を構成する抗体１３とは異なるエピトープに特異的に結合する抗体２３と標識２２とから構成されるものである。ここでは、標識として、多数の蛍光色素分子ｆと該蛍光色素分子ｆを内包する光透過材料２１とからなる蛍光微粒子を用いている（図３Ａ参照）。蛍光微粒子の大きさには特に制限はないが、直径数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度が好ましく、ここでは、一例として直径100ｎｍのものを用いる。材料２１としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ、該蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。本実施形態における標識２２は、抗体２３に対して大きく、標識抗体２０は標識２２に抗体が表面修飾されて構成されている。
【００３３】
上記流路型センサチップを製造する方法においては、抗体を固定化する前に、固定領域に紫外線（ＵＶ）あるいは放射線を照射しておく。ＵＶ、あるいは放射線の照射により、抗体を強固に固定することができ、流速を加えた場合にも抗体の剥がれを抑制することができる。ＵＶ照射後に、固定化する抗体を含む溶液を点着し、乾燥させることにより固定することができる。エレクトロスプレーディポジション法などのように高電圧を印加する必要がないため、簡易かつ低コストに固定化が可能であり、また、抗体へのダメージもない。
【００３４】
なお、ＵＶ、放射線を照射する場合、抗体を固定化する流路壁面を形成する材料としては樹脂あるいはガラスが特に好ましいが、ＵＶあるいは放射線の照射によりオゾンが発生し、そのオゾンにより表面が酸化されて親水的になるものであれば特に制限はない。
【００３５】
「検出方法」
上記流路型センサチップを用いた本発明の一実施形態の検出方法について説明する。図３Ａ〜図３Ｄはサンドイッチ法によるアッセイ工程を順次示す模式図である。図３Ａ〜図３Ｄにおいては、流路の固定層の近傍のみを示している。
【００３６】
１）まず、図３Ａに示すように、マイクロ流路１１の上流側の開口から生体試料である液体試料Ｓを注入し、下流側の開口に接続された図示しない吸引ポンプの吸引操作により液体試料Ｓをマイクロ流路１１内に導入する。
【００３７】
２）図３Ｂに示すように、流路１１に導入された試料Ｓは流路１１に吸着固定されている標識抗体２０と混ぜ合わされ、抗原Ａが標識抗体２０の抗体２３と結合し、さらに抗体２３と結合した抗原Ａが、固定層１４の抗体１３と結合し、抗原Ａが抗体１３と抗体２３で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。なお、ここでは、標識抗体２０とそれに結合した抗原Ａとにより「結合物質２５」が構成されている。
【００３８】
３）流路中には、固定されている抗体１３と結合していない抗原Ａや標識抗体２０が浮遊しており、また、固定層１４には標識抗体２０が非特異吸着している。これらを除去するため、図３Ｃに示すように、洗浄液３０を流路に導入する。このとき、固定層１４加わるずり応力Ｔが0.08〜2.8Ｐａとなる流速で流体を移動させる。本流路型センサチップは、固定層に加わるずり応力がこの範囲であるとき、ＵＶ処理後に固定された固定層は９割以上が流されない。一方、非特異吸着していた標識抗体２０はずり応力Ｔにより固定層から剥がれて流されるため、洗浄効果を得ることができる。なお、図２Ａ〜図２Ｃで示したサイズの流路を用い、粘性係数ηが１ｍＰａ・ｓの洗浄液を用いる場合、断面平均流速Ｖが0.5〜17.5ｍｍ／ｓの範囲となるように流下させる。
【００３９】
なお、抗原抗体反応の結合エネルギーは、一般的に−15〜30KBT程度（KBはボルツマン定数、Ｔは絶対温度）であり、標識である蛍光微粒子による非特異吸着の力（流路壁面と蛍光微粒子と間で生じているファンデルワールス力）は蛍光微粒子（直径100ｎｍ）と流路壁面との距離30ｎｍとすると、0.2KBT程度と見積もることができる。このことから、抗原抗体反応による特異吸着は、非特異吸着と比較して十分大きく、結合が強固であるため、上記範囲のずり応力による洗浄で結合が破れないと結論付けられる。
【００４０】
４）上記洗浄工程により、図３Ｄに示すように、浮遊している標識抗体、抗原のみならず、基板や固定層に非特異吸着している標識抗体は効果的に洗浄され、固定層の剥がれはなく、特異吸着している標識抗体の剥がれもない。この状態で、固定層上の標識からの蛍光を、抗原抗体反応に基づく信号として光検出器５０によって検出することにより、ノイズを低減してＳ／Ｎの良好な信号を得ることができる。
【００４１】
上記実施形態においては、下流側の開口１５ｂに吸引ポンプを接続して吸引操作により流体を移動させる構成について説明したが、上流側の開口１５ａに押し出しポンプを接続して押し出し操作により流体を移動させるよう構成することもできる。なお、ポンプは、圧力をかけて流れを引き起きこす圧力ポンプに限定されず、微細流路で用いられる一般的な送液制御可能なものであればよく、例えば、電気浸透流ポンプなどを用いてもよい。
【００４２】
なお、上記実施形態では標識として蛍光微粒子を用い、蛍光検出を行って抗原抗体反応を検出する場合について記述したが、抗原抗体反応を検出する検出方法は蛍光検出に限るものではなく、金微粒子による散乱光量やＲＩ標識による放射線量検出など通常知られている抗原抗体反応の定量方法を用いることができる。
【００４３】
さらに、標識は蛍光微粒子、蛍光色素分子、量子ドット、金属微粒子など、励起光の照射により何らかの光（蛍光、散乱光など）を生じる光応答性を有するものに制限されず、電気的、磁気的な信号を生じ、その信号により生体反応を検出可能なものであってもよい。なお、電気的信号を検出する方法としては、（ＦＥＴ（Field Effect Transistor)バイオセンサによる、ゲート表面上に固定層として抗体を固定し、この固定層上に結合する抗原の電荷をFETで検出する方法が挙げられる。また、磁気的信号を検出する方法としては、特開2001-033455号公報に開示されているように、標識として磁性体を用い、固定層への結合物質の結合反応を磁気センサＳＱＵＩＤ（超電導量子干渉計）を用いて検出する方法や、磁気抵抗効果素子を用いて磁性を検出する方法（米国特許第5981297号）などが挙げられる。
【００４４】
本発明の流路型センサチップおよびそれを用いた検出方法においては、アッセイはサンドイッチ法に限らず競合法を用いてもよい。また、抗原抗体反応のみならず、他の生体反応を検出するよう構成することもできる。
【００４５】
また、上記実施形態において、固定層は流路部材の流路壁面に直接固定するものとしたが、流路壁面に設けられた誘電体膜等の上に設けてもよい。
【００４６】
＜ＵＶ照射条件の検討＞
固定層の固定化前に行う、基板へのＵＶ照射の照射量について検討を行った。ここでは、基板としてポリスチレン材料からなる基板を用いた。
【００４７】
マイクロプレートにそれぞれ０、150、300、450、900ｍＪ／ｃｍ2の照射量でＵＶ照射を行った後、抗体を固定化した。なお、照射量０とは、ＵＶ照射を行っていないものである。ｈＣＧ抗原90ｐＭと標識抗体溶液を混合し、25℃、1200ｒｐｍの条件下で10分間インキュベートして一次反応を行った。標識抗体溶液は、抗体に蛍光微粒子（粒径510ｎｍ）を標識したもので、濃度は0.02ｗｔ％とした。一次反応液を、上記抗体を固定化したマイクロプレートに点着し、約４時間反応させてサンドイッチアッセイを行い、その後PBS-T 300μＬで４回叩き出し洗浄を行った。各照射量でＵＶ照射を行ったマイクロプレートについて、蛍光微粒子の固定量（抗原抗体反応による結合量）を求めた。その結果を図６に示す。
【００４８】
図６に示されるように、信号固定量は、ＵＶ照射量が300ｍＪ／ｃｍ2までは照射量の増加に伴い信号固定量が増加しているが、300ｍＪ／ｃｍ2以降は緩やかに減少した。信号固定量は、プレートに固定されている抗体の量を間接的に示しており、ＵＶ照射によりプレートに抗体が効率よく固定されることは明らかである。なお、図６のグラフから、信号量が十分なものとなる程度に抗体を固定するためには、特に250-650ｍＪ／ｃｍ2の範囲が好ましく、300ｍＪ／ｃｍ2が最も好ましいと考えられる。
【００４９】
＜ＵＶ照射による効果の検証＞
「実験例１」
実験例１として、ポリスチレン材料を射出成型して形成された流路部材の流路内壁面の一部にＵＶ照射を行い、該ＵＶ照射を施した部分にｈＣＧ抗体を固定した後に、ポリスチレン製の蓋材を接着させてマイクロ流路を備えた流路型センサチップを作製した。
【００５０】
流路内壁面への抗体固定化処理の詳細は以下の通りである。
【００５１】
１）セン特殊光源株式会社製の卓上型光表面処理装置（型式PL16-100）にポリスチレン製の流路部材を入れ、ＵＶ照射を行った。具体的には254ｎｍ波長のＵＶ光を300ｍＪ／ｃｍ2照射した。ＵＶランプと流路壁面との距離５ｃｍ、このとき流路壁面におけるＵＶ照度は15ｍＷ／ｃｍ2であり、照射時間20秒とすることにより、15×20＝300ｍＪ／ｃｍ2の照射量となるようにした。
【００５２】
２）150ｍＭ ＮａＣｌバッファを用いて抗ｈＣＧ抗体 (Medix Biochemica社、Anti-h alpha subunit 6601 SPR-5)を濃度10μg/ｍＬに調液する。
【００５３】
３）抗ｈＣＧ抗体溶液を基板の抗体固定領域に点着させ、点着後、約60分経過後に抗体溶液を廃液する。
【００５４】
４）ブロッキング液（Thermo Scientific社、Blocker Casein in TBS 品番37532）500ｍＬをバットに入れ、流路部材を浸漬しそのまま60分間静置した。
【００５５】
５）ブロッキング液を廃液し、乾燥させる。
【００５６】
以上の手順により抗体の固定化を行った。
【００５７】
流路形状は図２Ａ〜図２Ｃに示した実施形態の流路型センサチップのものと同様であり、幅2.0ｍｍ、流路厚50μｍで、ｈＣＧ抗体が固定されたセンサ部領域の上流側、下流側にそれぞれ、インレット、アウトレットを設けたものである。なお、ここでは流路内に標識２次抗体を備えていないものを用いた。
【００５８】
「実験例２」
実験例２として、実験例１と同様の流路型センサチップであるが、流路壁面へのＵＶ照射を行うことなく、抗体の固定化を行ったものを用意した。  
実験例１および２の流路型センサチップを用いて、以下の手順で実験を行った。  
なお、流路型センサチップの流路に設けられたアウトレットには、電装産業株式会社製のペンシルポンプ（型式PP100AZ132、容量997.5uL）を接続し、流路中の流速の制御を行った。
【００５９】
１）まず、流路外で、所定濃度の抗原溶液と標識抗体溶液を混合し、25℃、1200ｒｐｍの条件下で10分間インキュベートして一次反応を行った。標識抗体溶液は抗体に蛍光微粒子を標識したもので、濃度は0.02wt％とした。
【００６０】
２）その後、抗原と標識抗体の混合液をインレットに点着させ、ポンプで吸引することにより流路中を流下させ、流路壁面に予め固定されている抗ｈＣＧ抗体と二次反応をさせ、サンドイッチアッセイを行った。反応液量30μＬ、流速0.5μL/min、反応時間60分とした。
【００６１】
３）その後、未反応の遊離標識抗体を除去するために、洗浄液（濃度0.05％）ＰＢＳＴを流して洗浄を行った。未反応の遊離標識抗体は光検出時に固定標識抗体と共に、蛍光を発してノイズとなるために、感度低下の要因となる。このときの洗浄はセンサ部上の液体の置換を目的とし、洗浄流速は0.5μL/minとした。
【００６２】
４）その後、洗浄液の流速を0.5、5、30、100、150、300μL/minと変化させ、各流速での蛍光信号量を測定した。蛍光測定は、蛍光イメージング装置（ＬＡＳ−4000  富士フイルム社）を用いた観察画像の解析データを用いて行った。なお、蛍光測定は、顕微鏡（ＥＬＩＰＳＥ  80ｉ  ニコン社）などの観察画面からの粒子数カウント値を用いて行ってもよい。
【００６３】
図５は、実験例１（黒丸、ＵＶあり）、実験例２（白抜き四角、ＵＶなし）について、洗浄液の流速と信号量との関係を示すグラフであり、図６は、実験例１（黒丸、ＵＶあり）、実験例２（白抜き四角、ＵＶなし）について、洗浄液の流速と、各実験例における流速0.5μL/minの時の信号量を１としたときの信号比との関係を示すグラフである。なお、ここで、信号量（あるいは信号比）が減衰した後に、再度反応液を流下させても信号量は増加しなかったことから、信号量の減衰は流速による抗体の剥離によるものであることを確認している。
【００６４】
図５に示すように、ＵＶ照射を行って抗体の固定化を行った実験例１については、信号比の減衰が始まる流速がＵＶ照射なしで抗体の固定化を行った実験例２に対して大きかった。これは、ＵＶ照射により抗体がずり応力に対して強固になっていることを示すものである。ただし、いずれの場合についても流速が大きくなるにつれて信号比が大きく減衰しており、流速を大きくしすぎるのは好ましくないことが分かった。
【００６５】
以下において、初期の固定化抗体量に対する洗浄後の固定化抗体量の割合を抗体残存率と定義する。また、初期の固定化抗体量は、便宜的に極めて遅い流速（ここでは0.5μL/min）での洗浄時の固定化抗体量と等しいとする。この抗体残存率は図５中において信号比で表される。図５のグラフにフィッティング曲線を描いて、信号比（抗体残存率）が90％以上となる流速範囲を求めた。これにより、実験例２（ＵＶなし）の場合は３μL／minで抗体残存率が90％未満になるのに対し、実験例１（ＵＶあり）の場合は105μL／minを超えて初めて抗体残存率が90％未満となることが分かった。すなわち、抗体残存率90％以上となり、かつ、ＵＶ照射なしのものに対するＵＶ照射ありの効果が有効となるのは流速３μL／min〜105μL／minの範囲であることが分かった。
【００６６】
なお、以下の考察に基づいて、上記実験により求められた流速を他の系においても利用できるように一般化した。
【００６７】
マイクロ流路内の流れはハーゲンポワズイユの法則を用いて記述できる。流路厚50μｍ、流路幅２ｍｍの長方形流路内のずり応力を近似的に求める。流路壁面表面に発生するずり応力を計算する。図１に示すように、抗体が固定される流路壁面表面に原点を取り、表面の法線方向にｙ軸を、表面に平行で、流れの向きにｘ軸を取る。ずり応力をＴ[Ｐａ］、粘性係数をη[Ｐａ・ｓ]、流路厚をｈ[ｍ]、断面平均流速をＶ[ｍ／ｓ]（ｘ軸方向に垂直な断面における平均流速）、流路流れ方向（ｘ軸方向）圧力をp[Ｐａ]とおくと、ずり応力、断面平均流速は次のように表される。
【数１】
2010112730.tif 000003
【００６８】
この二式からずり応力と平均流速の関係が得られ、
【数２】
2010112730.tif 000004
【００６９】
と表される。
【００７０】
一般的に、流路厚ｈに対して表面からレセプタが存在する領域は十分小さいので、ｙ＝０として上式は
Ｔ＝８ηＶ／ｈ・・・・（１）
と近似することができる。
【００７１】
上記実験において、粘性係数１ｍＰａ・s、流路厚50μｍの条件下で、抗体残存率90％以上となり、かつ、ＵＶ照射なしのものに対するＵＶ照射ありの効果が有効となるのは流速３〜105μｍ/minの範囲であった。流速３〜105μｍ/minを断面平均流速に換算すると、0.5〜17.5ｍｍ/ｓとなる。これを用いて流路内壁面近傍におけるずり応力を計算すると、上記（１）式から、Ｔ＝0.08〜2.8Ｐａと得られる。
【００７２】
このずり応力は上記実験とは異なる系においても有効であり、例えば、粘係数２ｍＰａ・ｓの液体試料を上記と同一の流路型センサチップにおいて用いた場合、Ｔ＝0.08〜2.8Ｐａのずり応力がかかる断面平均流速は0.25〜8.75ｍｍ／ｓである。
【００７３】
＜流速印加による洗浄効果の検証＞
上記実験例と同様に作製した流路型センサチップを用い、以下の手順で実験を行った。
【００７４】
１）まず、流路外で、所定濃度の抗原溶液と標識抗体溶液を混合し、25℃、1200ｒｐｍの条件下で10分間インキュベートして一次反応を行った。標識抗体溶液は抗体に蛍光微粒子を標識したもので、濃度は0.02wt％とした。ｈＣＧ抗原濃度は抗原溶液と標識抗体溶液を混合後に、それぞれ90ｐＭと0ｐＭとなる２つの異なる抗原濃度の混合液を調液した。なお、抗原濃度0ｐMの混合液とは、抗原希釈に用いるバッファ（1％BSA in PBS)と標識抗体溶液とを混合したものである。
【００７５】
２）その後、抗原と標識抗体の混合液をインレットに点着させ、ポンプで吸引することにより流路中を流下させ、流路壁面に予め固定されている抗ｈＣＧ抗体と二次反応をさせ、サンドイッチアッセイを行った。２つのチップを用い、それぞれ濃度90ｐＭ、濃度0ｐＭの混合液を液量50μＬ、流速1.0μL/minで50分反応させた。
【００７６】
３）反応させた後、洗浄液ＰＢＳＴ(濃度0.05％)を流速0.5μL/min、液量10μL、置換時間20分で流下させることにより、遊離標識抗体の除去を目的として流路内の液体の置換を行った。この状態を「洗浄なし」として、蛍光信号量を測定した。
【００７７】
４）その後、洗浄液ＰＢＳＴ(濃度0.05％）を流速30μL/minで液量210μL流下させ、洗浄を行った。このときの洗浄時間は7分であった。この状態を「洗浄あり」として、蛍光信号量を測定した。
【００７８】
蛍光信号量の測定は、蛍光イメージング装置（ＬＡＳ−4000  富士フイルム社）を用いた観察画像の解析データを用いて行った。なお、蛍光信号量は、顕微鏡（ＥＬＩＰＳＥ  80ｉ  ニコン社）などの観察画面からの粒子数カウント値を用いることも可能である。
【００７９】
０ｐＭの混合液で反応させたチップからの信号は非特異吸着した標識抗体からのものと考えられる。従って、特異吸着した標識抗体からの信号量は、90ｐＭの混合液で反応させたチップからの信号量から０ｐＭの混合液で反応させたチップからの信号量を差し引いた値とした。
【００８０】
図７のグラフは、上記測定をＮ＝３について行った結果の平均値である。図７に示すように、30μL/minの流速で洗浄することにより、非特異吸着した標識抗体からの信号は１桁以上低減することができた。一方、特異吸着した標識抗体からの信号は変化せず、固定されている抗体の剥がれが生じていないと考えられる。この結果から、結合反応後、30μL/minの流速で洗浄することにより、Ｓ／Ｎが１桁以上向上し、非常に感度よく測定することができることが明らかになった。
【００８１】
上記のような実験の結果、本発明者らは、抗体を固定化する前にＵＶ照射をあらかじめ行っておくと、マイクロ流路特有のずり応力に対して有効であることを明らかにした。また、ＵＶ照射により有効かつ、固定層の剥がれが生じないずり応力の範囲を見出した。その範囲において、非特異吸着物資を効果的に洗浄することが可能であることを見出し、結果としてＳ／Ｎのよい信号検出を実現した。
【００８２】
なお、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質が固定層とし、２つの物質のうちの他方の物質を含む結合物質を固定層に結合させる形態には、少なくとも図８Ａ〜図８Ｄに示す４つのパターンがある。ここでは、互いに特異的に結合する２つの物質は抗体と抗原とからなるものとして説明する。
【００８３】
図８Ａ〜図８Ｄ中において、左から被検出物質Ａ（本例ではすべて抗原）、標識物質７０（図８Ｃには存在しない）、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの他方の物質６３を含む結合物質７５、および固定層６１と結合物質７５との結合状態をそれぞれ示している。なお、いずれのパターンにおいても、基板６０（流路内壁面）上に固定化されている固定層６１は、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質６２により構成されている。
【００８４】
図８Ａに示す第１のパターンにおいて、固定層６１は一方の物質６２（ここでは１次抗体Ｂ）により構成される。被検出物質Ａは抗原であり、標識物質７０は標識Ｌと２次抗体７２（Ｂ’）とからなる標識抗体であり、結合物質７５は標識物質７０と他方の物質６３（ここでは、被検出物質（抗原）Ａ）とからなる。そして、固定層６１を構成する一方の物質６２に、結合物質７５に含まれる他方の物質６３（Ａ）を結合させて結合物質７５の標識Ｌからの信号を検出する。この第１のパターンは上述のサンドイッチ法によるアッセイに相当する。
【００８５】
図８Ｂに示す第２のパターンにおいて、固定層６１は一方の物質６２（ここでは抗体Ｂ）により構成される。被検出物質は抗原Ａであり、標識物質７０は標識Ｌと競合抗原Ａ’とからなる標識競合抗原であり、結合物質７５は標識物質７０自体からなる。ここでは、競合抗原Ａ’が他方の物質６３を構成する。そして、固定層６１を構成する一方の物質６２に、結合物質７５に含まれる他方の物質６３（Ａ’）を結合させて結合物質７５の標識Ｌからの信号を検出する。この第２のパターンは競合法によるアッセイに相当する。
【００８６】
図８Ｃに示す第３のパターンにおいて、固定層６１は一方の物質６２（ここでは抗体Ｂ）により構成される。被検出物質は抗原Ａであり、結合物質７５は、他方の物質６３である被検出物質（抗原Ａ）自体からなる。そして、固定層６１を構成する一方の物質６２（Ｂ）に結合物質７５である他方の物質６３（Ａ）が結合させ、結合物質７５からの信号を検出する。この場合、被検出物質Ａ自体がイオンである、あるいは蛍光色素を含んでいるなどにより信号を発生するものである。
【００８７】
図８Ｄに示す第４のパターンにおいて、固定層６１は一方の物質６２（ここでは抗原Ａ’）により構成される。被検出物質は抗原Ａであり、標識物質７０は標識Ｌと抗体Ｂとからなる標識抗体であり、結合物質７５は標識抗体７０自体からなる。ここでは、抗体Ｂが他方の物質６３を構成する。そして、固定層６１を構成する一方の物質６２（Ａ’）に結合物質７５である他方の物質６３（Ｂ）を結合させて結合物質７５の標識Ｌからの信号を検出する。なお、この場合、結合物質７５である標識抗体の一部に被検出物質Ａが結合していてもよい。液体試料中に含まれている被検出物質が少量であれば、結合物質である標識抗体に結合する被検出物質が少ないために、結合物質は固定層により多く結合し、一方試料液中に含まれている被検出物質が多量であれば、標識抗体に結合する被検出物質が多くなり、空いている抗体が少なくなるために、結合物質は固定層に結合しにくくなる。
【００８８】
以上のいずれのパターンにおいても本発明の検出方法および流路型センサチップは有効に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】流路内の速度分布（層流）を示す図
【図２Ａ】本発明の一実施形態に係る流路型センサチップを示す斜視図
【図２Ｂ】本発明の一実施形態に係る流路型センサチップを示す側断面図
【図２Ｃ】本発明の一実施形態に係る流路型センサチップを示す平面図
【図３Ａ】流路型センサチップを用いたアッセイ工程を示す図（その１）
【図３Ｂ】流路型センサチップを用いたアッセイ工程を示す図（その２）
【図３Ｃ】流路型センサチップを用いたアッセイ工程を示す図（その３）
【図３Ｄ】流路型センサチップを用いたアッセイ工程を示す図（その４）
【図４】洗浄流速と信号量との関係を示すグラフ
【図５】洗浄流速と信号比との関係を示すグラフ
【図６】ＵＶ照射量と信号固定量との関係を示すグラフ
【図７】洗浄無し、洗浄有りの場合における信号量およびＳ／Ｎを示すグラフ
【図８Ａ】特異的に結合する２つの物質および結合物質の例を示す模式図(第１のパターン）
【図８Ｂ】特異的に結合する２つの物質および結合物質の例を示す模式図(第２のパターン）
【図８Ｃ】特異的に結合する２つの物質および結合物質の例を示す模式図(第３のパターン）
【図８Ｄ】特異的に結合する２つの物質および結合物質の例を示す模式図(第４のパターン）
【符号の説明】
【００９０】
１０  流路型センサチップ
１１  流路
１２  流路部材
１３  抗体
１４  固定層
２０  標識抗体
２２  蛍光微粒子
２３  抗体
２５  結合物質
Ａ    抗原（被検出物質）
ｆ    蛍光色素分子
【図１】
2010112730.tif 000005
【図２Ａ】
2010112730.tif 000006
【図２Ｂ】
2010112730.tif 000007
【図２Ｃ】
2010112730.tif 000008
【図３Ａ】
2010112730.tif 000009
【図３Ｂ】
2010112730.tif 000010
【図３Ｃ】
2010112730.tif 000011
【図３Ｄ】
2010112730.tif 000012
【図４】
2010112730.tif 000013
【図５】
2010112730.tif 000014
【図６】
2010112730.tif 000015
【図７】
2010112730.tif 000016
【図８Ａ】
2010112730.tif 000017
【図８Ｂ】
2010112730.tif 000018
【図８Ｃ】
2010112730.tif 000019
【図８Ｄ】
2010112730.tif 000020