(57)【要約】【課題】長期の動物実験を要することなく物質の発がん性を予測する新たな方法を提供する。【解決手段】被験物質を投与したラットにおける、所定のUnigene番号で特定される少なくも１の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定し、この発現量から、判別分析法によって、げっ歯類における肝発がん性を予測する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質をラットに１〜９０日の範囲内の一定期間投与する工程（ｉ）と、
工程（ｉ）の後、後記の第１組〜第８組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号で特定される、少なくとも１の遺伝子もしくはその塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子のｍＲＮＡの、前記ラットにおける発現量値Ｔを測定する工程（ｉｉ）と、
前記被験物質を投与していないラットにおける前記ｍＲＮＡの発現量値Ｃを用意する工程（ｉｉｉ）と、
前記発現量値Ｔと前記発現量値Ｃとの比に基づいて、前記被験物質のげっ歯類肝における発がん性を予測する予測式を用意する工程（ｉｖ）と、
前記発現量値Ｔと前記発現量値Ｃとの比を前記式に入力して、前記被験物質のげっ歯類肝における発がん性を予測する工程（ｖ）と、
を含む被験物質のげっ歯類肝における発がん性の予測方法。
第１組：Unigene番号Rn.6171，Rn.23677，Rn.14535，Rn.4328，Rn.20274，Rn.17071，Rn.13818，Rn.12688，Rn.41761，Rn.625，Rn.4085，およびRn.17238
第２組：Unigene番号Rn.9836，Rn.10249，Rn.6515，Rn.20031，Rn.11347，Rn.10037，Rn.3603，およびRn.23088
第３組：Unigene番号Rn.977，Rn.9836，Rn.32282，Rn.1354，Rn.127，Rn.265，Rn.5950，Rn.9583，Rn.40130，Rn.1456，およびRn.4085
第４組：Unigene番号Rn.9836，Rn.3181，Rn.24981，Rn.51349，およびRn.3603
第５組：Unigene番号Rn.11110，Rn.9913，Rn.17562，Rn.44300，Rn.24701，Rn.15584，Rn.18696，Rn.16371，Rn.7832，Rn.13080，およびRn.40661
第６組：Unigene番号Rn.2269，Rn.9506，Rn.52985，Rn.15913，Rn.54118，Rn.51349，Rn.3669，Rn.17014，Rn.1456，Rn.1416，およびRn.3761
第７組：Unigene番号Rn.69，Rn.7875，Rn.15994，Rn.13111，Rn.54394，Rn.20140，Rn.40130，およびRn.6501
第８組：Unigene番号Rn.2269，Rn.5834，Rn.34505，Rn.46188，Rn.23375，およびRn.22066
【請求項２】
前記被験物質の投与期間が１〜２１日であって、
前記Unigene番号が、前記第１組〜第４組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号であることを特徴とする
請求項１に記載の予測方法。
【請求項３】
前記被験物質の投与期間が２１〜９０日であって、
前記Unigene番号が、前記第５組〜第８組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号であることを特徴とする
請求項１に記載の予測方法。
【請求項４】
前記予測式は、２以上の発がん物質および２以上の非発がん物質のそれぞれをラットに１〜９０日の範囲内の一定期間投与することと、
前記の第１組〜第８組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号で特定される、少なくとも１の遺伝子もしくはその塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子のｍＲＮＡの、前記ラットにおける発現量値Ｔ０を測定することと、
前記被験物質を投与していないラットにおける前記ｍＲＮＡの発現量値Ｃ０を用意することと、
前記発現量値Ｔ０と前記発現量値Ｃ０との比を、分類器に入力することと、を含む方法によって構築される
請求項１〜３のいずれか１項に記載の予測方法。
【請求項５】
前記げっ歯類肝が、ラット肝、マウス肝、ハムスター肝、またはモルモット肝である
請求項１〜４のいずれか１項に記載の予測方法。
【請求項６】
前記被験物質の変異原性を調べることを更に含み、
（１）前記被験物質の変異原性が、陰性である場合は、
前記Unigene番号が、前記第１組〜第８組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号であり、および
（２）前記被験物質の変異原性が、陽性である場合は、
前記Unigene番号が、前記第１組、第３組、第５組、および第７組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号であることを特徴とする
請求項１〜５のいずれか１項に記載のげっ歯類肝発がん性予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラット、マウス等のげっ歯類に被験物質を投与した後所定の遺伝子から発現するｍＲＮＡの発現量を測定することにより、げっ歯類肝における被験物質の発がん性を予測する被験物質のげっ歯類肝における発がん性の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質の有害性（ハザード）の評価項目の一つに長期毒性の評価がある。通常、化学物質の発がん性を評価する動物実験では、試験動物にがんが出現するまで、あるいは試験動物が死亡するまで化学物質の連続投与が行われる。がんは長い潜伏期間を経て出現するため、長期にわたる動物実験が必要になる。
このように、発がん性などの化学物質の長期毒性を評価するには、多額の費用と長期の試験期間を要する動物実験の実施が必要とされる。
一方、近年のゲノム情報に関する技術の著しい発展により、遺伝子レベルで化学物質の有害性評価が行われるようになっている。例えば、特許文献１には、化学物質に曝露された組織および細胞における遺伝子の発現の差異を検出することにより、化学物質の肝毒性の機構を予測する方法が記載されている。
【特許文献１】特開２００３−３０４８８８号公報（特許請求の範囲）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在、化学物質が引き起こす遺伝子レベルでの発がんメカニズムはほとんど解明されていない。また、発がんメカニズムは化学物質によって多様であると考えられている。さらに、化学物質が生体に及ぼす作用は多様かつ複雑であり、発がんメカニズムとは異なる要因によって発現量が変動する遺伝子であっても、発がんメカニズムに起因して発現量が変動する遺伝子と関連して、その発現量が変動する可能性がある。従って、化学物質の発がん性を遺伝子発現量から予測するため、発現量が発がん性因子に特異的に影響され変動する遺伝子または遺伝子の組合せを見出すことが求められているが、現在、げっ歯類での肝発がん性予測に有用な遺伝子およびその組合せについての報告はなされていない。
本発明の目的は、被験物質のげっ歯類での肝発がん性を予測する新たな方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、かかる状況の下、被験物質をラットに投与したときの後記表１および表２における各Unigene番号で特定される遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果によって、げっ歯類における肝発がん性を予測可能であることを見出した。
本発明はかかる知見に基づくものであり、後記表１および表２における各Unigene番号で特定される遺伝子のｍＲＮＡを、げっ歯類における肝発がん性の予測に用いることを要旨とする。
なお、本明細書中、Unigene番号とは、米国の国立生物情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）が提供するUnigeneデータベースで付与される番号を意味する。
【０００５】
すなわち本発明は、
［１］
被験物質をラットに１〜９０日の範囲内の一定期間投与する工程（ｉ）と、
工程（ｉ）の後、後記の第１組〜第８組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号で特定される、少なくとも１の遺伝子もしくはその塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子の、ｍＲＮＡの前記ラットにおける発現量値Ｔを測定する工程（ｉｉ）と、
前記被験物質を投与していないラットにおける前記ｍＲＮＡの発現量値Ｃを用意する工程（ｉｉｉ）と、
前記発現量値Ｔと前記発現量値Ｃとの比に基づいて、前記被験物質のげっ歯類肝における発がん性を予測する予測式を用意する工程（ｉｖ）と、
前記発現量値Ｔと前記発現量値Ｃとの比を前記式に入力して、前記被験物質のげっ歯類肝における発がん性を予測する工程（ｖ）と、
を含む被験物質のげっ歯類肝における発がん性の予測方法。
第１組：Unigene番号Rn.6171，Rn.23677，Rn.14535，Rn.4328，Rn.20274，Rn.17071，Rn.13818，Rn.12688，Rn.41761，Rn.625，Rn.4085，およびRn.17238（後記表１および表２の第１組）
第２組：Unigene番号Rn.9836，Rn.10249，Rn.6515，Rn.20031，Rn.11347，Rn.10037，Rn.3603，およびRn.23088（後記表１および表２の第２組）
第３組：Unigene番号Rn.977，Rn.9836，Rn.32282，Rn.1354，Rn.127，Rn.265，Rn.5950，Rn.9583，Rn.40130，Rn.1456，およびRn.4085（後記表１および表２の第３組）
第４組：Unigene番号Rn.9836，Rn.3181，Rn.24981，Rn.51349，およびRn.3603（後記表１および表２の第４組）
第５組：Unigene番号Rn.11110，Rn.9913，Rn.17562，Rn.44300，Rn.24701，Rn.15584，Rn.18696，Rn.16371，Rn.7832，Rn.13080，およびRn.40661（後記表１および表２の第５組）
第６組：Unigene番号Rn.2269，Rn.9506，Rn.52985，Rn.15913，Rn.54118，Rn.51349，Rn.3669，Rn.17014，Rn.1456，Rn.1416，およびRn.3761（後記表１および表２の第６組）
第７組：Unigene番号Rn.69，Rn.7875，Rn.15994，Rn.13111，Rn.54394，Rn.20140，Rn.40130，およびRn.6501（後記表１および表２の第７組）
第８組：Unigene番号Rn.2269，Rn.5834，Rn.34505，Rn.46188，Rn.23375，およびRn.22066（後記表１および表２の第８組）
［２］
前記被験物質の投与期間が１〜２１日であって、
前記Unigene番号が、前記第１組〜第４組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号であることを特徴とする
前記［１］に記載の予測方法。
［３］
前記被験物質の投与期間が２１〜９０日であって、
前記Unigene番号が、前記第５組〜第８組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号であることを特徴とする
前記［１］に記載の予測方法。
［４］
前記予測式は、２以上の発がん物質および２以上の非発がん物質のそれぞれをラットに１〜９０日の範囲内の一定期間投与することと、
前記の第１組〜第８組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号で特定される、少なくとも１の遺伝子もしくはその塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子のｍＲＮＡの、前記ラットにおける発現量値Ｔ０を測定することと、
前記被験物質を投与していないラットにおける前記ｍＲＮＡの発現量値Ｃ０を用意することと、
前記発現量値Ｔ０と前記発現量値Ｃ０との比を、分類器に入力することと、を含む方法によって構築される
前記［１］〜［３］のいずれかに記載の予測方法。
［５］
前記げっ歯類肝が、ラット肝、マウス肝、ハムスター肝、またはモルモット肝である
前記［１］〜［４］のいずれかに記載の予測方法。
［６］
前記被験物質の変異原性を調べることを更に含み、
（１）前記被験物質の変異原性が、陰性である場合は、
前記Unigene番号が、前記第１組〜第８組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号であり、および
（２）前記被験物質の変異原性が、陽性である場合は、
前記Unigene番号が、前記第１組、第３組、第５組、および第７組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号であることを特徴とする
前記［１］〜［５］のいずれかに記載のげっ歯類肝発がん性予測方法。
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
後記の第１組〜第８組に記載されているUnigene番号で特定される遺伝子は、そのｍＲＮＡ発現量が、肝発がん性物質と非肝発がん性物質とで異なるため、これらのいずれかもしくはその塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定することにより、被験物質のげっ歯類における肝発がん性を予測することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本明細書中、「げっ歯類」としては、例えば、ラット、マウス、ハムスター、およびモルモットが挙げられる。
本明細書中、「ラット以外のげっ歯類」とは、例えば、マウス、ハムスター、およびモルモットが挙げられる。
【０００８】
〔１〕被験物質のげっ歯類肝における発がん性の予測方法
本発明の予測方法は、
被験物質をラットに１〜９０日の範囲内の一定期間投与する工程（ｉ）と、
工程（ｉ）の後、後記の第１組〜第８組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号で特定される、少なくとも１の遺伝子もしくはその塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子のｍＲＮＡの前記ラットにおける発現量値Ｔを測定する工程（ｉｉ）と、
前記被験物質を投与していないラットにおける前記ｍＲＮＡの発現量値Ｃを用意する工程（ｉｉｉ）と、
前記発現量値Ｔと前記発現量値Ｃとの比に基づいて、前記被験物質のげっ歯類肝における発がん性を予測する予測式を用意する工程（ｉｖ）と、
前記発現量値Ｔと前記発現量値Ｃとの比を前記式に入力して、前記被験物質のげっ歯類肝における発がん性を予測する工程（ｖ）と、
を含む。
「発現量値Ｔと発現量値Ｃとの比」における「比」（及び、「発現量値Ｔ０と発現量値Ｃ０との比」における「比」）としては、ＴとＣとの関係を示す数値であれば任意の数値を用いることができ、通常の商（Ｔ／Ｃ）に加えて、ｌｏｇ２比およびｌｏｇ１０比などを用いてもよい。中でも好ましくはｌｏｇ２比である。
第１組：Unigene番号Rn.6171，Rn.23677，Rn.14535，Rn.4328，Rn.20274，Rn.17071，Rn.13818，Rn.12688，Rn.41761，Rn.625，Rn.4085，およびRn.17238（後記表１および表２の第１組）
第２組：Unigene番号Rn.9836，Rn.10249，Rn.6515，Rn.20031，Rn.11347，Rn.10037，Rn.3603，およびRn.23088（後記表１および表２の第２組）
第３組：Unigene番号Rn.977，Rn.9836，Rn.32282，Rn.1354，Rn.127，Rn.265，Rn.5950，Rn.9583，Rn.40130，Rn.1456，およびRn.4085（後記表１および表２の第３組）
第４組：Unigene番号Rn.9836，Rn.3181，Rn.24981，Rn.51349，およびRn.3603（後記表１および表２の第４組）
第５組：Unigene番号Rn.11110，Rn.9913，Rn.17562，Rn.44300，Rn.24701，Rn.15584，Rn.18696，Rn.16371，Rn.7832，Rn.13080，およびRn.40661（後記表１および表２の第５組）
第６組：Unigene番号Rn.2269，Rn.9506，Rn.52985，Rn.15913，Rn.54118，Rn.51349，Rn.3669，Rn.17014，Rn.1456，Rn.1416，およびRn.3761（後記表１および表２の第６組）
第７組：Unigene番号Rn.69，Rn.7875，Rn.15994，Rn.13111，Rn.54394，Rn.20140，Rn.40130，およびRn.6501（後記表１および表２の第７組）
第８組：Unigene番号Rn.2269，Rn.5834，Rn.34505，Rn.46188，Rn.23375，およびRn.22066（後記表１および表２の第８組）
【０００９】
（１−１）投与
前記の通り、本発明の予測方法は、被験物質をラットに投与することを含む。
投与時の被験物質の形態は、固体、粉体、液体、またはこれらの混合物のいずれであってもよい。なお、液体には溶液および分散液が含まれる。
被験物質を溶解または分散させる溶媒としては、非発がん性の溶媒が好適に用いられる。溶媒は、油溶性か水溶性か等の被験物質の特性に応じて、被験物質が溶解または分散可能なものを適宜選択すればよい。具体的な溶媒としては、トウモロコシ油および精製水等、動物実験に汎用的に使用される溶媒を挙げることができる。被験物質を溶液中に分散させるには、発がん性のない界面活性剤等の分散剤を好適に用いることができる。
ラットへの被験物質の投与方法としては、経口投与および非経口投与（静脈内投与、腹腔内投与等）等の種々の方法が用いられる。投与方法は、被験物質の特性、投与期間等の種々の条件に応じて適宜選択すればよい。
被験物質の投与量は、被験物質の刺激によりラットのｍＲＮＡの発現量に適度な増加または減少を引き起こす量とすることが望ましい。投与量を決定するにあたっては、被験物質のラットに対するＬＤ５０値を基準とすることができる。１日あたりの投与量は、ＬＤ５０値の１／２５０〜１／２とすることが好ましく、１／５０〜１／２とすることがより好ましく、１／１０〜１／２とすることが更に好ましい。
ラットへの被験物質の投与期間は、具体的な時間または日数に限定されるものではなく、例えば１〜９０日の範囲内の任意の日数とすることができる。予測結果を迅速に得る観点からは投与期間は短い方が好ましい。一方、発がん性の検出の精度の観点からは、投与期間は長い方が好ましい。具体的には例えば、１５〜９０日、２１〜９０日、２５〜３１日、２７〜２９日、２８日、１〜４０日、１〜２１日、１１〜１７日、１３〜１５日、および１４日等が挙げられる。当該期間によって、前記発現量値Ｔを測定する対象となる遺伝子は異なりうる。逆に、前記発現量値Ｔを測定する対象となる遺伝子に応じて、当該期間を設定することもできる。また、高い予測精度を得るためには、被験物質の投与期間は、後述のトレーニング物質の投与期間に近い長さであることが好ましい。具体的には、例えば、被験物質の投与期間は、好ましくはトレーニング物質の投与期間±３日、より好ましくはトレーニング物質の投与期間±１日、特に好ましくはトレーニング物質の投与期間と同じ長さである。
投与期間中の被験物質の投与頻度は特に限定されるものではないが、１日１〜数回、好ましくは１日１回とすることができる。
また、被験物質については、変異原性が明らかになっていることが好ましい。従って、本発明の予測方法は、被験物質の変異原性を調べることをさらに含んでいてもよい。被験物質の変異原性は、例えば、Ａｍｅｓ試験等の復帰突然変異試験、および動物培養細胞を用いる染色体異常試験等の試験、ならびに定量的構造活性相関手法等による予測によって調べることができる。また、被験物質が公知の物質である場合、変異原性を調べることは、文献調査などによって行ってもよい。
【００１０】
（１−２）ｍＲＮＡ発現量値の測定
前記の通り、本発明の予測方法は、被験物質を投与されたラットにおけるｍＲＮＡの発現量を測定することを含む。
ｍＲＮＡは、投与期間終了後、ラットから組織を採取して、その組織からｍＲＮＡを抽出および精製することによって取得する。抽出方法および精製方法については、公知の方法を好適に用いることができる。
抽出対象となる「組織」としては、肝臓、腸、肺、腎臓、胃、脾臓、脳、および血液等を挙げることができる。なかでも肝臓が好ましい。
ｍＲＮＡの発現量の測定方法としては、ＤＮＡマイクロアレイ（マイクロプレートを含む）、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、およびＲＮａｓｅプロテクションアッセイ等の公知の方法を使用可能である。
ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法では、発現量を測定すべきｍＲＮＡと相補的な配列を有するｃＤＮＡまたはＤＮＡが固定されたマイクロアレイを用いて、ｍＲＮＡから調製した蛍光標識化ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の蛍光強度を測定することによって、ｍＲＮＡ発現量を測定することができる。マイクロアレイには、Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ（商品名、アフィメトリクス社製）、Ｒａｔ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（商品名、アジレント社製）等の市販品を利用することができる。
測定対象となるのは、表１および表２（表中の“○”は、その組が含むUnigene番号（または、当該Unigene番号で特定される遺伝子）を示す。）から選択されるUnigene番号で特定される、少なくとも１の遺伝子もしくはその塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子のｍＲＮＡの発現量値Ｔである。表１および表２の
Unigene番号で特定される遺伝子は、いずれも公のデータベースに登録されたものであり、公知の遺伝子である。「実質的に同一の塩基配列」とは、各Unigene番号で特定される遺伝子が有する塩基配列からなる核酸と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を意味する。ここで「高ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄を意味する。例えば、各Unigene番号で特定される遺伝子の塩基配列と実質的に同一の塩基配列としては、各Unigene番号で特定される遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
なお、当業者に明らかなように、特定の塩基配列を有するｍＲＮＡの発現量を測定する目的においては、この塩基配列に特徴的な部分配列の発現量を測定すればよい。
【００１１】
【表１】
2010148480.tif 000002
【００１２】
【表２】
2010148480.tif 000003
【００１３】
実際に測定対象となるのはｍＲＮＡの発現量であるが、本明細書中、説明の便宜上、Unigene番号で特定される遺伝子を「測定対象」と称することがある。測定対象は、被験物質の変異原性、発がん性を予測する対象となるげっ歯類の種類、および投与期間等に条件に応じて、適宜選択される。
表１〜２に示すように、各遺伝子は、第１組〜第８組に分類される。測定に当たっては、被験物質の変異原性の有無、発がん性を予測する対象となるげっ歯類の種類、および投与期間等に応じて、第１〜第８組から１以上の組を選択し、選択した各組からさらに１以上の遺伝子を、測定対象として選択することができる。上記の条件等によって、各組から測定対象として選択すべき遺伝子の数は異なるが、予測精度の高さの観点からは、各組から３個以上の遺伝子を選択することが好ましく、すべての遺伝子を選択することがさらに好ましい。測定対象は、所望により、その組に含まれない遺伝子を含んでもよいが、その数は、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２である。
【００１４】
投与期間が比較的短い場合、例えば１〜４０日の場合、好ましくは１〜２１日の場合、より好ましくは１０〜１８日の場合は、測定対象である遺伝子の組は、好ましくは、第１組〜第４組から選択される。一方、投与期間が比較的長い場合、例えば１５〜９０日、好ましくは２１〜９０日、より好ましくは２４〜３２日の場合には、測定対象である遺伝子の組は、好ましくは、第５組〜第８組から選択される。
また、被験物質の変異原性が陰性である場合は、測定対象である遺伝子の組は、好ましくは、第１組〜第８組、より好ましくは第２組、第４組、第６組、および第８組から選択される。一方、被験物質の変異原性が陽性である場合は、測定対象である遺伝子の組は、好ましくは、第１組、第３組、第５組、および第７組から選択される。
また、発がん性を予測する対象がげっ歯類全体の肝臓である場合は、測定対象として、好ましくは、第１組、第２組、第５組、および第６組から選択される遺伝子である。一方、発がん性を予測する対象がラットの肝臓である場合は、測定対象として、好ましくは、第３組、第４組、第７組、および第８組から選択される遺伝子である。
【００１５】
これらの条件は、組み合わせて用いられる。一例を示せば、投与期間が比較的短い場合であって、かつ、被験物質の変異原性が陰性である場合は、測定対象である遺伝子の組は、好ましく、第２組、および第４組から選択される。予測精度の高さの観点からは、組み合わされる条件の数は多い方が好ましい。
【００１６】
一方、予測精度の高さの観点からは、選択される組の数は、多い方が好ましい。複数の組が選択される場合、総合的に（具体的には例えば、各組で得られた陽性確率の算術平均、または各組で得られた予測結果の多数決等によって）発がん性を予測する。
具体的には例えば、被験物質の変異原性が陰性である場合は、最も好ましくは、第１組〜第８組の全ての組から得られた結果を用いて総合的に発がん性を予測する。
【００１７】
（１−３）発現量値Ｃの用意
前記の通り、本発明の予測方法は、被験物質を投与していないラットにおけるｍＲＮＡの発現量値Ｃを用意することを含む。
発現量Ｃを用意するために、本発明の予測方法は、前記（１−１）の投与によって被験物質を投与したラットである被験群の他に、被験物質を投与しないラットである対照群を用意することを含んでいてもよい。
前記「被験物質を投与していない」ことには、被験物質を例えば溶液または分散液の状態で被験群に投与した場合は、溶液または分散液の調製に使用した溶媒を対照物質として対照群に投与することも含まれる。対照群への溶媒の投与量は、被験群へ投与した被験物質の溶液または分散液と同量とすればよい。被験群と対照群とでは投与におけるその他の条件（投与期間、投与頻度等）も同一とすればよい。
また、ラットの組織からのｍＲＮＡの抽出方法、ｍＲＮＡの発現量値の測定の対象とする遺伝子、発現量の測定方法等の諸条件は、前記（１−２）と同一とすることが好ましい。
なお、「発現量値Ｃの用意すること」は、文献等によりｍＲＮＡの通常の発現量値を調査することもまた包含される。
【００１８】
（１−４）予測式の用意
本発明の予測方法は、被験物質のげっ歯類肝における発がん性を予測する予測式を用意することを含む。
予測式とは、ｍＲＮＡ発現量値ＴとＣとの比に基づいて、被験物質のげっ歯類肝における発がん性を予測可能な１または２以上の式であればよく、その構成は具体的に限定されるものではない。すなわち、データを入力して結果が得られさえすればよく、具体的な数式に記載できないものでもよい。予測式の構築には、例えば、ＳＶＭ、線形判別分析、ニューラルネットワーク、決定木、Ｋ近傍識別器、または集団学習等の種々の機械学習手法を用いることができる。機械学習は、トレーングと言い換えてもよい。
予測式の構築方法の一例として、以下の工程Ａ）〜Ｄ）を含む方法が挙げられる。
工程Ａ）トレーニング物質のそれぞれをラットに１〜９０日の範囲内の一定期間投与することと、
工程Ｂ）工程Ａ）の後、第１組〜第８組から選択される少なくとも１の組のいずれかに記載されているUnigene番号で特定される、少なくとも１の遺伝子もしくはその塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子のｍＲＮＡの前記ラットにおける発現量値Ｔ０を測定することと、
工程Ｃ）前記トレーニング物質を投与していないラットにおける前記ｍＲＮＡの発現量値Ｃ０を用意することと、
工程Ｄ）前記発現量値Ｔ０と前記発現量値Ｃ０との比Ｄ０を用いて１または２以上の予測式を作成すること、
工程Ａ）は、投与する物質が異なる以外は、投与方法、投与期間、投与頻度等の条件を、前記（１−１）の投与と同条件とすることが好ましい。ただし、これらの条件は完全に同一である必要はなく、予測結果の精度を大きく低下させない範囲内で異ならせることができる。例えば、被験物質の投与期間と本工程の投与期間とのずれは、前記（１−１）欄でも述べたように、一定の範囲内であれば許容され得る。ここで、前記の第１組〜第４組に含まれる遺伝子は、それぞれ１４日間の投与期間で最適な予測結果が得られるように選択されているので、当該期間としては、通常、１〜４０日、好ましくは１〜２１日、より好ましくは１１日〜１７日、さらに好ましくは１３〜１５日、および特に好ましくは１４日である。
ただし、実際には、当業者に明らかなように、投与期間が２１日を超える場合は、前記の第５組〜第８組に含まれる遺伝子を用いればよいので、当該期間としては、通常、２１日を超えることはない。
一方、前記の第５組〜第８組に含まれる遺伝子は、それぞれ２８日間の投与期間で最適な予測結果が得られるように選択されているので、当該期間としては、通常、１５〜９０日、好ましくは２１〜９０日、より好ましくは２５〜３１日、さらに好ましくは２７〜２９日、および特に好ましくは２８日である。ただし、実際には、当業者に明らかなように、投与期間が２１日未満の場合は、前記の第１組〜第４組に含まれる遺伝子を用いればよいので、当該期間としては、通常、２１日未満になることはない。
工程Ａ）における「トレーニング物質」としては、発がん物質および非発がん物質を用いる。発がん物質および非発がん物質とは、ラットまたはラット以外のげっ歯類の肝臓における発がん性の有無が判明している物質である。
トレーニング物質としては、例えば、特定のげっ歯類肝における被験物質の発がん性を予測したい場合には、この特定のげっ歯類肝において発がん性が陽性の物質および陰性の物質が用いられる。この場合、「特定のげっ歯類」としては、ラットが好適である。
またげっ歯類全体等、複数のげっ歯類肝における被験物質の肝臓における発がん性を予測したい場合には、げっ歯類肝における発がん性が陽性の物質および陰性の物質が用いられる。ここでの「げっ歯類肝」には、少なくともラットが含まれることが好ましい。
予測精度を高めるには、１の予測式を構築するトレーニングデータとして、１の遺伝子につき、２以上の発がん性物質に対するｍＲＮＡ発現量データ、および２以上の非発がん性物質に対するｍＲＮＡ発現量データが用いられることが好ましい。すなわち、１の予測式を構築するトレーニングデータの取得対象に複数の遺伝子が用いられる場合には、各遺伝子について、それぞれ２以上の発がん性物質および非発がん性物質に対するｍＲＮＡの発現量のデータを用いて、１の予測式が構築されることが好ましい。
トレーニング物質は、特に、ラット肝における発がん性の有無、ラット以外のげっ歯類の肝臓における発がん性の有無、および変異原性の有無によって次表のように６種類に分類される。変異原性は、前記の被験物質の変異原性と同様にして調べられる。
【表３】
2010148480.tif 000004
トレーニング物質として好適に用いられる物質の例を表４〜表８に示す。
【表４】
2010148480.tif 000005
【表５】
2010148480.tif 000006
【表６】
2010148480.tif 000007
【表７】
2010148480.tif 000008
【表８】
2010148480.tif 000009
表４〜８に挙げた８５種の化合物は、その発がん性および変異原性によって、表９のように分類できる。なお、発がん物質１〜４および非発がん物質１〜２の分類は、前記表３の分類に従う。
【表９】
2010148480.tif 000010
すなわち、表９で発がん物質１および２に分類した物質は、マウスで肝発がんを誘発することが知られている。発がん物質３および４に分類した物質は、ラットで肝発がんを誘発することが知られている。
非発がん物質１および非発がん物質２に分類した物質は、ラットで肝発がんを誘発しないことが知られている。
また、発がん物質１および３並びに非発がん物質１に分類した物質は変異原性陽性であり、発がん物質２および４並びに非発がん物質２に分類した物質は変異原性陰性である。
工程Ｂ）において測定の対象となる遺伝子の群（遺伝子の数が１個である場合を包含する）は、前記（１−２）の測定の対象となる遺伝子を包含していればよい。すなわち、本工程において測定の対象となる遺伝子の群（遺伝子の数が１個である場合を包含する）は、前記（１−２）の測定の対象となる遺伝子の他に、他の遺伝子を包含していてもよい。なお、好ましくは、工程Ｂ）は、前記（１−２）と近い条件、特に好ましくは同一の条件で行われる。すなわち、本工程でｍＲＮＡの測定の対象とされる遺伝子もまた、前記（１−２）の測定の測定対象となる遺伝子と同一であることが特に好ましい。つまり、前記（１−２）の測定における測定対象となる遺伝子が、第１組の全ての遺伝子であれば、トレーニングデータ取得時の測定対象としても第１組の全ての遺伝子が選択されることが好ましい。前記（１−２）の測定で測定対象として複数の遺伝子が選ばれた場合には、１の予測式を構築するトレーニングデータとして、これらと同一の複数の遺伝子のｍＲＮＡの発現量値を測定することが好ましい。
なお、当業者に明らかなように、特定の塩基配列を有するｍＲＮＡの発現量を測定する目的においては、この塩基配列に特徴的な部分配列の発現量を測定すればよい。また、本工程と、前記（１−２）（および（前記１−３））とで、同一の塩基配列を有するｍＲＮＡの発現量を測定する目的においては、この目的を達成できる限り、当該「特徴的な部分配列」が同一であることは、必ずしも必要とされない。
工程Ｃ）の発現量Ｃ０の用意は、前記（１−３）発現量値Ｃの用意と同様の方法により行われる。
工程Ｄ）としては、例えば、前記発現量値Ｔ０と前記発現量値Ｃ０との比Ｄ０を分類器に入力することが挙げられる。当該「分類器」とは、特に具体的な構成に限定されるものではなく、例えばＳＶＭ等の判別分析法により構築される分類器を好適に用いることができる。判別分析法については、種々のソフトウェアが提供されており、これを利用することも可能である。
工程Ｄ）において、前記のように分類された各トレーニング被験物質の前記発現量値Ｔ０と前記発現量値Ｃ０との比Ｄ０は、表１０の区分に従い、前記第１組〜第８組についての各予測式の作成に用いることができる。表中の“○”は、比Ｄ０を用いることを示す。
【表１０】
2010148480.tif 000011
【００１９】
（１−５）予測
前記の通り、本発明の予測方法は、発現量値Ｔと発現量値Ｃとの比を予測式に入力して、被験物質のげっ歯類肝における発がん性を予測することを含む。
前記（１−１）投与欄における説明からも理解されるように、予測にあたっては、複数の予測式を用いることができる。このとき、各予測式による予測結果が異なる結果となった場合には、より多くの予測式が予測した結果を、最終的な予測結果として採用することができる。例えば、３個の予測式のそれぞれに発現量値Ｔと発現量値Ｃとを入力したときに、そのうちの１個の予測式による予測結果が発がん性陰性であって、２個の予測式による予測結果が発がん性陽性であれば、最終的な予測結果は陽性となる。
また、げっ歯類全体の肝臓について発がん性陽性、かつラット肝で陰性との予測結果が得られれば、ラット以外のげっ歯類（例えばマウス等）の肝臓における発がん性は陽性であると予測される。つまり、げっ歯類の特定の種について発がん性を予測すると共に、げっ歯類全体での発がん性を予測することによって、特定の種以外のげっ歯類についての発がん性を予測することができる。
なお、「げっ歯類肝」とは、げっ歯類の肝臓であればよく、具体的な動物種は限定されないが、げっ歯類肝として、例えばラット肝、マウス肝、ハムスター肝、またはモルモット肝を挙げることができる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以下で用いる用語の説明については、実験医学別冊、マイクロアレイデータ統計解析報告書（羊土社、２００８）を参照されたい。
【００２１】
＜実施例１：予測式の作成＞
（ａ）トレーニングデータの取得
（ａ−１）トレーニング物質についてのｍＲＮＡ発現量の測定
（ａ−１−１）投与
日本チャールス・リバー社から入手した５週令の雄性ラット（Ｆ３４４、ＳＰＦ系統）を４匹／群に分け、各群のラットに、表４〜表８に示す全８５種の化合物をそれぞれ同表に示す溶媒に溶解させて調製した溶液を、同表に示す用量で強制経口投与、または餌に混合して投与した。投与は１日１回、１４日間あるいは２８日間行った。
【００２２】
（ａ−１−２）ｍＲＮＡの抽出
投与開始から１５日目または２９日目に各個体の肝臓を採取した。肝臓から断片を切り出し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  保存安定用試薬であるＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）  ＲＮＡ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  に浸漬させた。これを室温で２４時間放置後、ＲＮＡｌａｔｅｒ  ＲＮＡ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  に浸漬させたまま−２０℃で保存した。
ラット組織からＡＧＰＣ法によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＱＩＡＧＥＮ社ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ３０００  を用いて、ＱＩＡＧＥＮ  社ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ  によりｍＲＮＡを精製した。精製法は製造会社の使用法に準じて行ったが、概略は以下のとおりである。
切り出した組織サンプル５０−１００ｍｇ  と破砕用ビーズ（直径５ｍｍ、ジルコニア製）を２ｍＬ  エッペンドルフチューブに入れた。ＲＬＴバッファーを添加した後、Ｍｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により、２５Ｈｚ  ４分間で２回、組織破砕を行った。破砕後の試料を５，０００×ｇ  ５分間遠心し、未破砕物を沈殿させた。
上清に７０％エタノールを添加し混合した後、この混合物をカラム（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  ｃｏｌｕｍｎ）へ添加した。３，０００−５，０００×ｇで５分間の遠心分離によりカラムから通過物を除き、ＲＷ１バッファーをカラムに添加して、さらに３，０００−５，０００×ｇで５分間の遠心分離により通過物を除いた。その後、ＤＮａｓｅ  Ｉ  溶液（ＱＩＡＧＥＮ  社製）をカラムに添加し室温で１５分間放置し、さらにＲＷ１バッファーを添加した。３，０００−５，０００×ｇで５分間の遠心分離によりカラムから通過物を除き、ＲＰＥバッファーを添加した。さらに３，０００−５，０００×ｇで２分間の遠心分離に供した後、カラムに再度ＲＰＥバッファーを添加した。そして、３，０００−５，０００×ｇで２分間、さらに３，０００−５，０００×ｇで５分間の遠心分離によって、カラムを乾燥させた。
ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  水をカラムに添加して５分間放置した後、３，０００−５，０００×ｇで２分間の遠心分離によって、ＲＮＡ溶液を回収した。濃度および回収率を向上させるために、回収したＲＮＡ  溶液を再度カラムに添加して５分間放置した後、３，０００−５，０００×ｇで２分間遠心分離することで、最終的な精製ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  溶液を得た。
精製ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  の純度を示す２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比は、アマシャムファルマシアバイオテク社製光学的測定装置Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３１００  ｐｒｏを用いて測定した。
さらに、精製ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  について、Ａｇｉｌｅｎｔ  社ＢｉｏＡｎａｌｙｓｅｒ２１００  を用いてその泳動パターンを検査した。泳動にはＲＮＡ６０００ｎａｎｏ  チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  社製）を用い、操作法は製造会社の使用法に準じて行った。精製ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  の濃度測定はアマシャムファルマシアバイオテク社製光学的測定装置Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３１００  ｐｒｏを用いた方法で行った。
光学的測定装置として、分光光度計による場合は光路長１ｃｍの場合１｛吸光度（２６０ｎｍ）−吸光度（３２０ｎｍ）｝  ＝  ４０μｇ  ＲＮＡ／ｍＬ  として計算した。
（ａ−１−３）ラベル化ｃＲＮＡの調製
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ３’−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｏｎｅ−Ｃｙｃｌｅ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（アフィメトリックス社製）、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ３’−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ＩＶＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ（アフィメトリックス社製）、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅ（アフィメトリックス社製）を用い、ラベル化ｃＲＮＡを調製した。調製法は製造会社の使用法に準じて行った。概略は以下のとおりである。
前記（ａ−１−２）で得たｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５μｇおよびＴ７−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー１００ｐｍｏｌを含む１２μｌの混合液を、７０℃で１０分間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  ４μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ、および１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １μｌを添加し、４２℃で２分間加熱した。さらに、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ  ２μｌ（４００Ｕ）を添加し、４２℃で１時間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、ＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水９１μｌ、５×Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  ３０μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  ３μｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  １μｌ（１０Ｕ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ４μｌ（４０Ｕ）、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  １μｌ（２Ｕ）を添加し、１６℃で２時間反応させた。次いで、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μｌ（１０Ｕ）を加え、１６℃で５分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを添加した。次いで、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅに添付のｃＤＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを用い、合成されたｃＤＮＡを精製した。精製法は製造会社の使用法に従った。
さらに、溶出された１２μｌのｃＤＮＡ溶液にＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水８μｌ、１０×ＩＶＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、ＩＶＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  １２μｌ、およびＩＶＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ４μｌを添加し、３７℃で１６時間加熱した。再び、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅに添付のＩＶＴ  ｃＲＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを用い、合成されたラベル化ｃＲＮＡを精製した。精製法は製造会社の使用法に従った。
（ａ−１−３）ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化、プローブアレイとのハイブリダイゼーション、プローブアレイの染色およびスキャン、並びにｍＲＮＡ発現量の数値化
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｒａｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  ２３０  ２．０  アレイ（アフィメトリックス社製、以下「プローブアレイ」と称する）、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）解析システム、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ３’−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｋｉｔ（アフィメトリックス社製）およびＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｈｉｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈ，  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（アフィメトリックス社製）を用い、ｍＲＮＡの発現量を測定した。測定は製造会社の使用法に準じて行ったが、概略は以下のとおりである。
精製されたラベル化ｃＲＮＡ  ２０μｇ、５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅに添付）８μｌを含む反応液４０μｌを、９４℃、３５分間加熱後、氷冷し、フラグメント化ｃＲＮＡ溶液を得た。次いで、フラグメント化ｃＲＮＡを、以下のようにしてプローブアレイとハイブリダイゼーションさせた。
すなわち、フラグメント化ｃＲＮＡ溶液  ４０μｌ、３ｎｍ  Ｃｏｎｔｏｌ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂ２  ６．７μｌ、２０×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ２０μｌ、２×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  ２００μｌ、ＤＭＳＯ  ４０μｌおよびＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水９３．３μｌを混合し、４００μｌのハイブリダイゼーションカクテルを得た。得られたハイブリダイゼーションカクテルを９９℃で５分間加熱、さらに４５℃で５分間加熱した。加熱後、室温において１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ハイブリダイゼーションカクテル上清を得た。
一方、Ｐｒｅ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｘで満たしたプローブアレイを、ハイブリダイゼーションオーブン内で、４５℃において６０ｒｐｍで１０分間回転させた後、Ｐｒｅ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｘを除去した。その後、プローブアレイにハイブリダイゼーションカクテル上清２００μｌを添加し、ハイブリダイゼーションオーブン内で４５℃において６０ｒｐｍで１６時間回転させ、ハイブリダイゼーション済みプローブアレイを得た。プローブアレイからハイブリダイゼーションカクテルを除去し、プローブアレイをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａで満たした。
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０の所定の位置にプローブアレイを装着し、プロトコールに従って前記プローブアレイを洗浄した後、Ｓｔａｉｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  １および２を用いてプローブアレイを染色した。染色後、アレイをＡｒｒａｙ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで満たした。
プローブアレイをＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００に供し、シグナルを５７０ｎｍの蛍光輝度を測定することによって読み取った。得られた結果をＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより解析し、表１および２における各Unigene番号で特定される６４の遺伝子について、ｍＲＮＡ発現量データを得た。
【００２３】
（ａ−２）コントロール物質についてのｍＲＮＡ発現量の測定
溶媒のみを投与した以外は、前記（１）と同様の手順でｍＲＮＡ発現量データ（溶媒対照）を得た。
【００２４】
（ａ−３）ｍＲＮＡ発現量データの加工
各物質に対するｍＲＮＡ発現量データを溶媒対照のｍＲＮＡ発現量データで除算したもののＬｏｇ２値を計算し、縦の項目が被験物質の化合物名、横の項目が遺伝子名（Unigene番号）からなるＣＳＶ形式のファイルを作成した。
【００２５】
（ｂ）予測式の作成
（ｂ−１）ＳＶＭソフト
本実施例で、ＳＶＭを用いた判別分析を実施するため、Ｒ言語およびｅ１０７１パッケージ（Support Vector Machines, The Interface to libsvm in package e1071 by David MeyerTechnische Universitaet Wien, Austria, David.Meyer@ci.tuwien.ac.at（October 21, 2007））を使用した。いずれも、オープンソースのフリーソフトで有志により管理されており、インターネットを利用してＲ言語のサイトより入手できる。
Ｒ言語本体は筑波大学のサイト（２００８年９月時点でのホームページ：http://cran.md.tsukuba.ac.jp/）より入手した。
ｅ１０７１パッケージは  Misc Functions of the Department of Statistics（ｅ１０７１）、ウイーン工科大学（TU Wien）で製作された物であり、同大学のサイト（製作者：Evgenia Dimitriadou,、Kurt Hornik,、Friedrich Leisch,、David Meyer and Andreas Weingessel、２００８年９月時点でのホームページ：  http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html）より入手したものを使用した。
（ｂ−２）トレーニングによる予測式の構築
前記（３）にて得られたＣＳＶ形式ファイルから、データを抽出してトレーニングデータとし、予測式１〜８を構築した。各予測式１〜８のトレーニングデータは、表１１に示す通りである。
【表１１】
2010148480.tif 000012
予測式１〜８による予測の妥当性を検定するために、各予測式１〜８を用いて、各予測式の構築に用いたトレーニングデータから、発がん性の予測を行い、その正答率を算出した。結果を表１１に示す。
例えば、予測式１を用いて、発がん物質１〜４に含まれる物質をそれぞれ１４日間投与したときのｍＲＮＡ発現量から、げっ歯類全体の肝臓における発がん性予測を行ったところ、正答率は１００％であった。
その他の予測式２〜８についても、表１２に示すように、予測精度は良好であった。
【表１２】
2010148480.tif 000013
【００２６】
（ｃ）発がん性の予測
次に、トレーニングデータ取得時には用いなかった物質、つまりトレーニング物質以外の物質についての発がん性予測を行った。
具体的には、表１３に示す９種類の被験物質１〜９を用いた。被験物質１〜９について、ラット肝またはラット以外のげっ歯類肝における発がん性の有無および変異原性等は、表１３に示す通りである。
【表１３】
2010148480.tif 000014
各被験物質について、前記（ａ）欄と同様の手順によって、１４日間および２８日間ラットに投与し、表１および表２の各Unigene番号で特定される６４の遺伝子についてのｍＲＮＡの発現量を取得し、これを数値化した。
そして、この数値に基づき、表１３に示す予測式の組合せによって、各被検物質の肝発がん性を予測した。被検物質１および２のげっ歯類全体での肝発がん性は予測式１〜４を用いて、被検物質１および２のラットでの肝発がん性は予測式３および４を用いて、被検物質３のげっ歯類全体での肝発がん性は予測式３および４を用いて、被検物質４および５のげっ歯類全体での肝発がん性およびラットでの肝発がん性は予測式３を用いて、被検物質６のげっ歯類全体での肝発がん性は予測式１および３を用いて、被検物質のラットでの肝発がん性は予測式３を用いて、被検物質７〜９のげっ歯類での肝発がん性は予測式１〜８を用いて、被検物質７〜９のラットでの肝発がん性は予測式３、４、７、および８を用いて予測した。
総合的な予測結果として、各予測式から得られた陽性確率の算術平均が０．５以上の場合、陽性と予測し、０．５未満の場合、陰性と予測した。予測に使用した予測式での予測結果の多い方を採用した。表１３中、「陽性」を“＋”と記し、陰性を“−”と記した。また、予測が正解であったものを“Ｔ”と記し、不正解であったものを、“Ｆ”と記した。なお、被検物質の肝発がん性が不明であるものについては、正誤不明として、“Ｎ”を記した。
表１３に示すように、総合的な予測結果は、予測できなかったもの以外は全て文献情報と同一であり、予測の精度は良好であった。
表１４に、被験物質についての各予測式の正答率を示す。表１４に示すように、各予測式は、トレーニング物質以外の物質についても、良好な予測結果を示した。
【表１４】
2010148480.tif 000015
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明の方法は、げっ歯類における肝発がん性を予測することができる。この方法によって、発がん性未知の物質について、長期に渡る動物実験を行うことなく、げっ歯類における肝発がん性を予測することができる。よって、本発明の方法は、例えば新薬開発時において、複数の候補物質から発がんのリスクの低い物質を選択することに用いることができる。