(57)【要約】【課題】１つ以上のＲＮＡを発現する細胞を分析し、もしくは単離し、または１つ以上のＲＮＡを発現する細胞株を作製するための新規なシグナリングプローブを含む方法および組成物を提供すること。【解決手段】本発明は、標的配列へのハイブリダイゼーションの際にシグナルを生じるシグナリングプローブを用いて細胞を単離し、または細胞株を作製する方法に関する。シグナリングプローブを利用する他の方法としては、ＲＮＡ発現のレベルを定量化する方法、生きた細胞において遺伝的組換え事象を同定する方法、および単離された細胞を用いてトランスジェニック動物を作製する方法が挙げられる。本発明はプロテアーゼプローブも提供する。ステム−ループ構造、３アーム接合構造、およびダンベル構造を形成するシグナリングプローブおよびプロテアーゼプローブを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／５４６，０７５号の優先権を主張し、この開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
特異的核酸配列の存在を認識し、報告する核酸プローブは、主としてインビトロ反応において特異的核酸を検出するのに用いられてきた。例えば、特許文献１を参照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される。プローブの１つの型は、標的配列に相補的なヌクレオチドの中央ストレッチおよび短い互いに相補的な配列を含む末端と共に、ヘアピン形状の構造を有するように設計される。例えば、非特許文献１を参照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される。ステム−ループ形状のプローブの１つの末端は、フルオロフォアに共有結合しており、他の末端は消光部分に共有結合している。末端がハイブリダイズしたその天然状態にある場合、フルオロフォアおよびクエンチャーの近傍は、比較的ほとんど蛍光が生じないか、または本質的に全く蛍光が生じないようにされている。ステム−ループプローブは、フルオロフォアからの蛍光の生成に検出可能な変化を生じるその標的核酸へハイブリダイズする場合、立体配座の変化を受ける。研究者は、生きた細胞においてメッセンジャーＲＮＡのイン−サイチュの可視化を行うためにヘアピン形状のプローブを用いてきた（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５，９２５，５１７号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９６年、第１４巻、ｐ．３０３−３０８
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｏ、「Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」、１９９８年、第１３７９巻、ｐ．１７８−１８４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、１つ以上のＲＮＡを発現する細胞を分析し、もしくは単離し、または１つ以上のＲＮＡを発現する細胞株を作製するための新規なシグナリングプローブを含む方法および組成物を提供する。上記方法は、標的配列とのそのハイブリダイゼーションの際にプローブによって生じるシグナルの検出に基づく。上記ＲＮＡはＤＮＡ構築物を介して細胞に導入され得るか、または細胞は内因的にＲＮＡを発現することが疑われ得る。上記ＤＮＡ構築物は、さらに、タグ配列をコードし得、上記シグナリングプローブはタグ配列に対して相補的である。１つの実施形態において、単離された細胞、または作製された細胞株は発現に対して機能的にヌルであるか、または１つ以上の予め選択されたタンパク質またはＲＮＡの発現が低下している。本発明はまた、記載された方法に従って単離された細胞を用いてトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。
本発明は、１つ以上のＲＮＡ転写産物の発現レベルを定量化するための方法で用いられるシグナリングプローブを提供する。さらに、上記シグナリングプローブは、少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡの転写を調節する化合物またはＲＮＡ配列を同定するための方法で用いられる。別の実施形態において、上記シグナリングプローブは、生きた細胞における遺伝的組換え事象を同定するための方法で用いられる。上記シグナリングプローブはヌクレオチドの１つ以上の鎖を含み、ここで、上記シグナリングプローブは目的の標的核酸（例えば、ＲＮＡ）に相補的なヌクレオチドを含み、そしてここで、上記シグナリングプローブは、さらに、２つの部分を含む相互作用する対を含む。上記シグナリングプローブの構造は、シグナリングプローブが標的配列にハイブリダイズしていない場合には、相互作用する対の２つの部分が、シグナルを生じないか、またはバックグラウンドシグナルが生じるように物理的に位置するようにされる。上記シグナリングプローブが標的配列にハイブリダイズする場合、２つの部分は、シグナルが生じるようにされる。あるいは、シグナリングプローブの部分は、プローブが標的にハイブリダイズしない場合には、特定のシグナルが生じ、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションの際に異なるシグナルが生じるようにされ得る。相互作用する対の２つの部分は、シグナリングプローブの１つ以上の鎖の１つ以上の末端に結合され得る。あるいは、上記部位は、シグナリングプローブの１つ以上の鎖の内部に組み込まれ得る。シグナリングプローブのヌクレオチドもまた修飾され得る。
また、本発明は、プロテアーゼプローブを提供する。１つの実施形態において、シグナリングまたはプロテアーゼプローブは、その１つ以上の部分が互いにアニーリングする核酸または修飾された核酸の２つの別個の鎖を含み、１つの鎖の少なくとも１つの末端は他の鎖の末端に隣接する。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。２つの別個の鎖を有するシグナリングプローブでは、１つの実施形態において、１つの鎖は１つの末端に少なくとも１つのクエンチャー部分を有し、他の鎖は隣接する末端に少なくとも１つのフルオロフォアを有する。プロテアーゼプローブでは、１つの実施形態において、１つの鎖は１つの末端に少なくとも１つのタンパク質分解酵素を有し、他の鎖は隣接する末端に少なくとも１つのタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。
【０００６】
別の実施形態においてシグナリングまたはプロテアーゼプローブは、少なくとも１つの互いに相補的な領域および少なくとも１つの非相補的領域を含むように設計される。１つの実施形態において、少なくとも１つの非相補的領域はループ領域を形成するように設計され得る。１つの実施形態において、上記プローブは少なくとも１つのステム−ループ構造を形成するように設計される。別の実施形態において、上記プローブはダンベル構造または３アーム接合構造を形成する。１つの実施形態において、シグナリングプローブは鎖の各末端において少なくとも１つのフルオロフォアおよび少なくとも１つのクエンチャー部分を有する。１つの実施形態において、プロテアーゼプローブは鎖の各末端においてタンパク質分解酵素およびタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。
【０００７】
別の実施形態において、上記シグナリングまたはプロテアーゼプローブは化学的に修飾される。１つ以上の糖−ホスホジエステルタイプの骨格、２’ＯＨおよびプリンまたはピリミジン塩基が修飾される。１つの実施形態において、デオキシリボース骨格はペプチド核酸によって置換される。
【０００８】
１つの実施形態において、タグ配列は構造ＲＮＡであり、すなわち、このＲＮＡは二次構造、好ましくは、３アーム接合構造を有する。１つの実施形態において、タグ配列は図４２Ａ、ＢまたはＣに従った構造または配列を含む。また、本発明は、少なくとも１つの目的のＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡおよびタグ配列を含むＤＮＡ構築物を提供する。また、本発明は上記ＤＮＡ構築物を含むベクターおよび細胞を提供する。
【０００９】
他の実施形態において、以下が提供される：
１．少なくとも１つのＲＮＡを発現する細胞を単離するための方法であって、以下：
ａ）少なくとも１つのＲＮＡコードする少なくとも１つのＤＮＡを細胞に導入する工程；
ｂ）上記細胞を、上記少なくとも１つのＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに暴露する工程；および
ｃ）シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００１０】
２．段落１に記載の方法であって、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記少なくとも１つのＲＮＡを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、方法。
【００１１】
３．２つ以上のＲＮＡのうち少なくとも１つを発現する細胞を単離するための方法であって、以下：
ａ）第一のＲＮＡをコードする第一のＤＮＡを細胞に導入する工程；
ｂ）少なくとも１つの第二のＲＮＡをコードする少なくとも１つの第二のＤＮＡを上記細胞に導入する工程；
ｃ）上記細胞を、上記第一のＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
ｄ）上記細胞を、上記少なくとも１つの第二のＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
ｅ）上記シグナリングプローブのそれらの各ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも１つを生じる細胞を単離する工程；
を包含する方法。
【００１２】
４．段落３に記載の方法であって、さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記２つ以上のＲＮＡのうち少なくとも１つを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、方法。
【００１３】
５．複数の細胞を単離するための方法であって、ここで、上記細胞の少なくとも１つの部分は少なくとも１つの異なるＲＮＡを発現し、以下：
ａ）複数のＲＮＡをコードする複数のＤＮＡを細胞に導入する工程であって、上記細胞の少なくとも１つの部分は、少なくとも１つの異なるＲＮＡをコードする少なくとも１つの異なるＤＮＡが導入される、工程；
ｂ）上記細胞を、複数のシグナリングプローブに連続してまたは同時に暴露する工程であって、上記シグナリングプローブは、上記複数のＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程；および
ｃ）シグナルを生じる上記細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００１４】
６．さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、少なくとも１つの異なるＲＮＡを発現する複数の細胞株を作製する工程を包含する段落５に記載の方法。
【００１５】
７．少なくとも１つのＲＮＡを発現する細胞を単離するための方法であって、以下：
ａ）上記少なくとも１つのＲＮＡおよび少なくとも１つのタグ配列をコードする少なくとも１つのＤＮＡを細胞に導入する工程；
ｂ）上記細胞を、上記タグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに暴露する工程；および
ｃ）シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００１６】
８．さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記少なくとも１つのＲＮＡを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落７に記載の方法。
【００１７】
９．２つ以上のＲＮＡのうちの少なくとも１つを発現する細胞を単離するための方法であって、以下：
ａ）第一のＲＮＡおよび少なくとも１つの第一のタグ配列をコードする第一のＤＮＡを細胞に導入する工程；
ｂ）少なくとも１つのさらなるＲＮＡおよび少なくとも１つの第二のタグ配列をコードする少なくとも１つの第二のＤＮＡを上記細胞に導入する工程であって、上記第二のタグ配列は上記第一のタグ配列と同一であるかまたは異なる、工程；
ｃ）上記細胞を、上記第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
ｄ）上記細胞を、上記第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
ｅ）上記シグナリングプローブの、それらの各ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも１つを生じる細胞を単離する工程；
を包含する方法。
【００１８】
１０．さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記２つ以上のＲＮＡのうちの少なくとも１つを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落９に記載の方法。
【００１９】
１１．上記第一のＲＮＡの上記工程が、上記少なくとも１つのさらなるＲＮＡの対応する工程と同時に、または連続して行われる段落３または９に記載の方法。
【００２０】
１２．２つ以上のＲＮＡまたは上記２つ以上のＲＮＡによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるＲＮＡまたはタンパク質、互いの上流または下流で作用するＲＮＡまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するＲＮＡまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するＲＮＡまたはタンパク質、複合体を形成するＲＮＡまたはタンパク質、タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、段落３または９に記載の方法。
【００２１】
１３．少なくとも１つのＲＮＡを過剰発現する細胞を単離する方法であって、以下：
ａ）上記少なくとも１つのＲＮＡおよび少なくとも１つの第一のタグ配列をコードする少なくとも１つの第一のＤＮＡ；および上記少なくとも１つのＲＮＡおよび少なくとも１つの第二のタグ配列をコードする少なくとも１つの第二のＤＮＡを細胞に導入する工程であって、ここで、第一および第二のＤＮＡ構築物の導入は、順次または同時に行われ、上記第一および第二のタグ配列は同一であるか、または異なる、工程；
ｂ）上記細胞を、上記少なくとも１つの第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第一のシグナリングプローブに、および上記少なくとも１つの第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
ｃ）上記シグナリングプローブのそれらの各ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルのうちの少なくとも１つを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００２２】
１４．さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記ＲＮＡを過剰発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落１３に記載の方法。
【００２３】
１５．上記第一のシグナリングプローブが、上記第二のシグナリングプローブによって生じたシグナルとは異なるシグナルを生じる、段落３、９および１３のいずれか１つに記載の方法。
【００２４】
１６．上記第一のシグナリングプローブの上記工程が、上記第二のシグナリングプローブの対応する工程と同時または連続して行われる、段落１３に記載の方法。
【００２５】
１７．上記第一のＤＮＡおよび上記第二のＤＮＡが同一の構築物または異なる構築物上に存在する、段落３、９および１３のいずれか１つに記載の方法。
【００２６】
１８．複数の細胞を単離するための方法であって、ここで、上記細胞の少なくとも１つの部分は、少なくとも１つの異なるＲＮＡを発現する方法であって、以下：
ａ）複数のＲＮＡおよび少なくとも１つのタグ配列をコードする複数のＤＮＡを細胞に導入する工程であって、ここで、上記細胞の少なくとも１つの部分は、少なくとも１つの異なるＲＮＡをコードする少なくとも１つの異なるＤＮＡに導入される、工程；
ｂ）上記細胞を、上記タグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに暴露する工程、および、
ｃ）シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００２７】
１９．上記複数のＲＮＡが少なくとも１つの発現ライブラリーを形成する、段落１８に記載の方法。
【００２８】
２０．さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、少なくとも１つの異なるＲＮＡを発現する複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落１８に記載の方法。
【００２９】
２１．細胞の２つ以上のＲＮＡ発現ライブラリーのうちの少なくとも１つを単離する方法であって、以下：
ａ）少なくとも１つの第一のＲＮＡ発現ライブラリーおよび少なくとも１つの第一のタグ配列をコードするＤＮＡを細胞に導入する工程；
ｂ）少なくとも１つの第二のＲＮＡ発現ライブラリーおよび少なくとも１つの第二のタグ配列をコードするＤＮＡを細胞に導入する工程であって、上記第二のタグ配列が上記第一のタグ配列と同一であるか、または異なる、工程；
ｃ）上記細胞を、上記少なくとも１つの第一のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
ｄ）上記細胞を、上記少なくとも１つの第二のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程であって、ここで、上記第一のシグナリングプローブからの検出可能なシグナルは、上記第二のシグナリングプローブからの検出可能なシグナルと同一であるか、または異なる、工程；および
ｅ）上記シグナルの少なくとも１つを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００３０】
２２．さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記２つ以上のＲＮＡ発現ライブラリーのうちの少なくとも１つを作製する工程を包含する、段落２１に記載の方法。
【００３１】
２３．上記複数のＲＮＡ、または上記複数のＲＮＡによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるＲＮＡまたはタンパク質、互いの上流または下流で作用するＲＮＡまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するＲＮＡまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するＲＮＡまたはタンパク質、複合体を形成するＲＮＡまたはタンパク質、タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、段落５または１８に記載の方法。
【００３２】
２４．上記複数のＤＮＡの少なくとも１つの部分が同一のタグ配列をコードする、段落１８に記載の方法。
【００３３】
２５．上記タグ配列が少なくとも１つのシグナリングプローブによって認識される複数の標的配列を含む、段落７、９，１３、１８または２１に記載の方法。
【００３４】
２６．上記タグ配列が構造ＲＮＡである、段落７、９、１３，１８および２１のいずれか１つに記載の方法。
【００３５】
２７．上記タグ配列が３アーム接合構造を形成する、段落２５に記載の方法。
【００３６】
２８．上記ステム領域が８〜９の塩基対を含み、上記第一のステム−ループ領域が４〜６の塩基対を含み、および上記第二のステム−ループ領域が１３〜１７の塩基対を含む、段落２７に記載の方法。
【００３７】
２９．上記３つのアームのステム領域が、さらに、非相補性領域を含む、段落２７に記載の方法。
【００３８】
３０．上記ステム領域および上記第一のステム−ループ領域が、共に、さらに、１つのミスマッチ領域を含み、そして上記第二のステム−ループ領域が、さらに、２〜７つのミスマッチ領域またはバルジ領域（ｂｕｌｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む、段落２７に記載の方法。
【００３９】
３１．上記ステム領域の間の結合が合計８〜１２のヌクレオチドを有する段落２７に記載の方法。
【００４０】
３２．上記タグ配列が図４２Ａ、ＢおよびＣに示された配列からなる群より選択される、段落２６に記載の方法。
【００４１】
３３．上記タグ配列が、図４２Ａ、ＢまたはＣに示された配列によって予測される、よりエネルギー的に好都合な構造を形成する、段落３２に記載の方法。
【００４２】
３４．上記標的配列が、上記第一のステムループ領域と上記第二のステムループ領域との間の結合に対して、上記第二のステムループ領域のステムの５’側の全てまたは部分に対して、上記第一のステムループ領域のステムの３’側の全てまたは一部由来の領域である、段落２７に記載の方法。
【００４３】
３５．上記ＤＮＡの少なくとも１つの部分が複数の同一のタグ配列をコードする、段落７、９、１３、１８および２１のいずれか１つに記載の方法。
【００４４】
３６．上記ＤＮＡの少なくとも１つの部分が５０までの同一のタグ配列をコードする、段落３５に記載の方法。
【００４５】
３７．上記タグ配列をコードするＤＮＡが上記ＲＮＡをコードするＤＮＡとともにフレーム内にある、段落７、９、１３、１８および２１のいずれか１つに記載の方法。
【００４６】
３８．上記タグ配列をコードするＤＮＡが上記ＲＮＡをコードするＤＮＡとともにフレーム外にある、段落７、９、１３、１８および２１のいずれか１つに記載の方法。
【００４７】
３９．少なくとも１つのＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
ａ）上記少なくとも１つのＲＮＡを潜在的に発現する細胞を提供する工程；
ｂ）上記細胞を、上記少なくとも１つのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに暴露する工程；
ｃ）シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００４８】
４０．さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記少なくとも１つのＲＮＡを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落３９に記載の方法。
【００４９】
４１．上記細胞が、さらに、１つ以上のさらなるＲＮＡを潜在的に発現する段落３９に記載の方法であって、さらに、以下：
ａ）上記細胞を、上記少なくとも１つのさらなるＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのさらなるシグナリングプローブに暴露する工程；および
ｂ）シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００５０】
４２．さらに、上記単離された細胞を増殖することによって、上記少なくとも１つのＲＮＡおよびさらなるＲＮＡを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落４１に記載の方法。
【００５１】
４３．さらに、工程ａ）の前に、上記ＲＮＡ、さらなるＲＮＡまたは複数のＲＮＡの発現を調節しまたは調整する化合物を細胞に添加する工程を包含する、段落１、３、５，７、９、１３、１８および２１のいずれか１つに記載の方法。
【００５２】
４４．上記化合物が上記ＲＮＡ、さらなるＲＮＡまたは複数のＲＮＡの発現を誘導する、段落４３に記載の方法。
【００５３】
４５．上記複数のＲＮＡの上記工程が同時にまたは連続して行われる、段落５または１８に記載の方法。
【００５４】
４６．少なくとも１つの外因性ＲＮＡおよび少なくとも１つの内因性ＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
ａ）上記少なくとも１つの外因性ＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞に導入する工程であって、ここで、上記細胞は少なくとも１つの内因性ＲＮＡを潜在的に発現する、工程；
ｂ）上記細胞を、上記少なくとも１つの外因性ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
ｃ）上記細胞を、上記少なくとも１つの内因性ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
ｄ）上記シグナリングプローブのそれらの各ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも１つを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００５５】
４７．さらに、上記単離された細胞を増殖させることによって、上記少なくとも１つの外因性ＲＮＡ、または上記少なくとも１つの内因性ＲＮＡ、または両方を発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落４６に記載の方法。
【００５６】
４８．上記外因性ＲＮＡの上記工程が、上記内因性ＲＮＡの対応する工程と同時にまたは連続して行われる、段落４６に記載の方法。
【００５７】
４９．上記第二のシグナリングプローブが、上記第一のシグナリングプローブによって生じたシグナルとは異なるシグナルを生じる、段落４６に記載の方法。
【００５８】
５０．上記内因性ＲＮＡおよび上記外因性ＲＮＡ、または上記内因性ＲＮＡおよび外因性ＲＮＡによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるＲＮＡまたはタンパク質、互いの上流または下流で作用するＲＮＡまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するＲＮＡまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するＲＮＡまたはタンパク質、複合体を形成するＲＮＡまたはタンパク質、タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、段落４６に記載の方法。
【００５９】
５１．上記ＲＮＡが、タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ、ペプチドをコードするＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、構造ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよびｓｎＲＮＡの１つ以上を含む、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１および３９のいずれか１つに記載の方法。
【００６０】
５２．上記タンパク質が細胞表面局所化タンパク質、分泌されたタンパク質および細胞内タンパク質からなる群より選択される、段落５１に記載の方法。
【００６１】
５３．少なくとも１つの第一のタンパク質を過剰発現し、かつ少なくとも１つの第二のタンパク質についての発現が機能的にヌルであるか、または少なくとも１つの第二のタンパク質についての発現が低下した細胞を単離する方法であって、以下：
ａ）上記少なくとも１つの第一のタンパク質をコードする少なくとも１つのＲＮＡ、および少なくとも１つの第一のタグ配列をコードする少なくとも１つの第一のＤＮＡ；ならびに上記少なくとも１つのＲＮＡおよび少なくとも１つの第二のタグ配列をコードする少なくとも１つの第二のＤＮＡを細胞に導入する工程であって、ここで、上記第一および第二のタグ配列が異なる、工程；
ｂ）上記少なくとも１つの第二のタンパク質のｍＲＮＡ転写産物に結合し、またはそれに干渉する少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡを細胞に導入する工程；
ｃ）上記細胞を、上記少なくとも１つの第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第一のシグナリングプローブに、および上記少なくとも１つの第二のタグ配列とのハイブリダイゼ−ションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つの第二のシグナリングプローブに暴露する工程；
ｄ）上記細胞を、上記少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに暴露する工程；および
ｅ）上記シグナリングプローブのそれらの各ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に上記シグナルの少なくとも１つを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００６２】
５４．さらに、少なくとも１つの第一のタンパク質を過剰発現し、かつ少なくとも１つの第二のタンパク質についての発現が機能的にヌルであるか、または少なくとも１つの第二のタンパク質についての発現が低下した細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落５３に記載の方法。
【００６３】
５５．上記第一のタンパク質の上記工程が、上記第二のタンパク質の対応する工程と同時にまたは連続して行われる、段落５３に記載の方法。
【００６４】
５６．上記ＤＮＡが条件プロモーターに操作可能に連結される、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９、および５３のいずれか１つに記載の方法。
【００６５】
５７．上記プロモーターが誘導性または抑制性であって、工程（ａ）の前に、最少量のインデューサーまたは十分量のリプレッサーが細胞に添加される、段落５６に記載の方法。
【００６６】
５８．上記ＲＮＡがアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、段落５７に記載の方法。
【００６７】
５９．上記ＲＮＡが細胞にとって致死的であるか、または損傷的である、段落５７に記載の方法。
【００６８】
６０．さらに、上記ＤＮＡを細胞に導入する工程の後であるが、上記細胞を上記シグナリングプローブに暴露する前に、細胞を選択する工程を包含する、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９および５３のいずれか１つに記載の方法。
【００６９】
６１．少なくとも１つのＤＮＡが、さらに、少なくとも１つの薬物耐性マーカーをコードし、かつ上記方法が、さらに、上記マーカーが耐性を付与する少なくとも１つの薬物に対して耐性である細胞を選択する工程を包含する、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９および５３のいずれか１つに記載の方法。
【００７０】
６２．組織特異的プロモーターの制御下にあるＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ構築物を含む細胞を単離する方法であって、以下：
ａ）構成的プロモーターの制御下で少なくとも１つの第一のＲＮＡ配列をコードし、かつ組織特異的プロモーターの制御下で少なくとも１つの第二のＲＮＡ配列をコードする少なくとも１つのＤＮＡ構築物を細胞に導入する工程；
ｂ）上記細胞を、上記第一のＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに暴露する工程；および
ｃ）上記シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００７１】
６３．さらに、組織特異的プロモーターの制御下にあるＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ構築物を含む細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落６２に記載の方法。
【００７２】
６４．上記組織特異的プロモーターが選択マーカー遺伝子の発現を制御する、段落６２に記載の方法。
【００７３】
６５．上記選択マーカー遺伝子が薬物耐性遺伝子または検出可能タンパク質遺伝子である、段落６２に記載の方法。
【００７４】
６６．組織特異的プロモーターを活性化する化合物を同定する方法であって、以下：
ａ）段落６２から単離された細胞に化合物を添加する工程；
ｂ）選択マーカーによって細胞を同定する工程；
ｃ）上記組織特異的プロモーターを活性化する化合物として上記化合物を同定する工程；
を包含する、方法。
【００７５】
６７．少なくとも１つの試験ＲＮＡ配列、および組織特異的プロモーターの制御下にあるＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ構築物を含む細胞を単離する方法であって、以下：
ａ）構成的プロモーターの制御下にある少なくとも１つの試験ＲＮＡ配列、同一または異なる第二の構成的プロモーターの制御下にある少なくとも１つの第二のＲＮＡ配列、および組織特異的プロモーターの制御下にある少なくとも１つの第三のＲＮＡ配列をコードする少なくとも１つのＤＮＡ構築物を細胞に導入する工程；
ｂ）上記細胞を、上記第二のＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに暴露する工程；および
ｃ）シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
【００７６】
６８．さらに、少なくとも１つの試験ＲＮＡ配列、および組織特異的プロモーターの制御下にあるＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ構築物を含む細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、段落６７に記載の方法。
【００７７】
６９．上記試験ＲＮＡ配列が発現ライブラリー由来である、段落６７に記載の方法。
【００７８】
７０．上記組織特異的プロモーターが選択マーカー遺伝子の発現を制御する、段落６７に記載の方法。
【００７９】
７１、上記選択マーカー遺伝子が薬物耐性遺伝子または検出可能タンパク質遺伝子である、段落６７に記載の方法。
【００８０】
７２．組織特異的プロモーターを活性化する試験ＲＮＡ配列を同定する方法であって、以下：
ａ）選択マーカーによって段落６７に記載の単離された細胞を同定する工程；
ｂ）上記組織特異的プロモーターを活性化する試験ＲＮＡ配列を同定する工程；
を包含する、方法。
【００８１】
７３．段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９および５３のいずれか１つに記載の方法であって、さらに以下：
ｉ）上記単離された細胞を、各ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；
ｉｉ）上記単離された細胞が各ＲＮＡを発現するか否かを決定する工程；または上記シグナルのレベルを定量して、各ＲＮＡの発現のレベルを決定する工程；
を包含する、方法。
【００８２】
７４．上記細胞が細胞ベースのアッセイにおいて適用される、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９および５３のいずれか１つに記載の方法から得られた単離された細胞。
【００８３】
７５．上記細胞が動物に移植可能である、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９および５３のいずれか１つの方法から得られた単離された細胞。
【００８４】
７６．胚性幹細胞または動物に移植され得る細胞を利用して段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９および５３のいずれか１つに記載の工程を行う工程、上記幹細胞または細胞の生存度を決定する工程、および、上記生きた胚性幹細胞または細胞を用いてトランスジェニック動物を作製する工程を包含する、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９および５３のいずれか１つに記載のＲＮＡを発現するトランスジェニック動物を作製する方法。
【００８５】
７７．上記ＲＮＡがアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであって、上記単離された細胞における少なくとも１つの予め選択されたタンパク質が、アンチセンスＲＮＡの結合、または上記少なくとも１つの予め選択されたタンパク質のｍＲＮＡ転写産物に対するｓｉＲＮＡの干渉の結果として、機能的にヌルであるか、または低下した発現レベルを有する、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１および３９に記載の方法。
【００８６】
７８．上記予め選択されたタンパク質が遺伝子産物の別のスプライシングされた形態である、段落７７に記載の方法。
【００８７】
７９．トランスジェニック動物を作製する方法であって、少なくとも１つの予め選択されたタンパク質が発現に対して機能的にヌルであるか、または発現が低下している方法であって、以下、段落７７に記載の工程を実施する工程、胚性幹細胞または動物に移植可能な細胞を利用する工程、上記幹細胞の生存度を決定する工程、および上記生きた胚性幹細胞または上記トランスジェニック動物を作製するための細胞を使用する工程を包含する、方法。
【００８８】
８０．生物学的試料における少なくとも１つのＲＮＡ転写産物発現のレベルを定量化する方法であって、以下：
ａ）上記生物学的試料を、上記ＲＮＡ転写産物とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
ｂ）上記生物学的試料におけるシグナルのレベルを定量する工程；および
ｃ）上記シグナルのレベルを上記少なくとも１つのｍＲＮＡ転写産物のレベルに相関させる工程；
を包含する、方法。
【００８９】
８１．上記生物学的試料が細胞試料、組織試料またはこれらに由来する調製物である、段落８０に記載の方法。
【００９０】
８２．上記ＲＮＡ転写産物が、タンパク質をコードする１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ、ペプチドをコードするＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、構造ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよびｓｎＲＮＡである、段落８０に記載の方法。
【００９１】
８３．上記生物学的試料が固定されている、段落８０に記載の方法。
【００９２】
８４．少なくとも１つの第二のＲＮＡ転写産物発現のレベルが、上記第二のＲＮＡ転写産物へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブを用いて上記生物学的試料において定量される、段落８０に記載の方法。
【００９３】
８５．少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡの転写を調節する化合物を同定する方法であって、以下：
ａ）上記予め選択されたＲＮＡを外因的にまたは内因的に発現する細胞に化合物を添加する工程；
ｂ）上記細胞を、少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに暴露する工程；
ｃ）上記細胞においてシグナルのレベルを定量する工程；
ｄ）化合物を添加しない細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を同定する工程；および
ｅ）上記少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡの転写を調節する化合物を同定する工程；
を包含する、方法。
【００９４】
８６．上記予め選択されたＲＮＡを外因的に発現する細胞が、段落１または７の方法に従って単離された、段落８５に記載の方法。
【００９５】
８７．上記ＤＮＡ構築物がプロモーターまたはオペレーターを含み、かつリプレッサー、エンハンサー、または転写を調節する配列をコードする、段落８５に記載の方法。
【００９６】
８８．少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡの転写を調節するＲＮＡ配列を同定する方法であって、以下：
ａ）外因的または内因的に発現された少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡの転写を潜在的に調節する少なくとも１つの試験ＲＮＡ配列を細胞に導入する工程；
ｂ）上記細胞を、上記少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに暴露する工程；
ｃ）上記細胞におけるシグナルのレベルを定量する工程；
ｄ）試験ＲＮＡ配列を有さない細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を同定する工程；および
ｅ）上記少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡの転写を調節する試験ＲＮＡ配列を同定する工程；
を包含する、方法。
【００９７】
８９．上記予め選択されたＲＮＡを外因的に発現する細胞が段落１または７に記載の方法に従って単離された、段落８８に記載の方法。
【００９８】
９０．ＲＮＡの発現ライブラリーが試験ＲＮＡ配列として用いられる、段落８８に記載の方法。
【００９９】
９１．生きた細胞において遺伝的組換え事象を同定する方法であって、以下：
ａ）細胞を、組換えられた配列から転写されたもの、および非組換え配列から転写されたものからなる群より選択されるＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；
ｂ）上記ＲＮＡ配列を発現する上記細胞を検出する工程；
を包含する、方法。
【０１００】
９２．上記シグナリングプローブが、少なくとも１つの互いに相補的な領域を形成する、核酸または修飾された核酸の２つの別個の鎖を含む、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９、５３、６２、６７、７３、８０、８５、８８、および９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１０１】
９３．上記２つの別個の鎖が５’〜３’末端に連続した互いに相補的な領域を形成し、かつ上記２つの鎖は同一数のヌクレオチドを有する、段落９２に記載の方法。
【０１０２】
９４．互いに相補的な領域が上記２つの鎖の間で形成された後、１方の鎖の５’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の３’末端が他の鎖からずれているか、またはその両方であり、ここで、上記ずれは１０までのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドである、段落９２に記載の方法。
【０１０３】
９５．上記２つの鎖が各末端において５または６つの連続する塩基対の互いに相補的な領域を形成する、段落９２に記載の方法。
【０１０４】
９６．２つの鎖の配列が同一ではない、段落９２に記載の方法。
【０１０５】
９７．上記鎖が３０を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを有する、段落９２に記載の方法。
【０１０６】
９８．上記核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方である、段落９２に記載の方法。
【０１０７】
９９．上記修飾された核酸がペプチド核酸、化学的に修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはこれらの組合せを含む、段落９２に記載の方法。
【０１０８】
１００．上記修飾された核酸が、糖基、ホスホジエステル結合および塩基性基の１つ以上において化学的に修飾されている、段落９２に記載の方法。
【０１０９】
１０１．上記ホスホジエステル結合が、−ＯＰ（ＯＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ２）ＮＨ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ３）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）（Ｏ）Ｏ−、−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）２ＮＨ−からなる群より選択される化学基で置換されている、段落１００に記載の方法。
【０１１０】
１０２．上記ホスホジエステル結合が−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−または−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−で置換されている、段落１０１に記載の方法。
【０１１１】
１０３．上記化学的に修飾されたＲＮＡの２’位が、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ＝０，１．．．３０）、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＯＣＨ３からなる群より選択される化学基を含む、段落１００に記載の方法。
【０１１２】
１０４．上記化学的に修飾されたＲＮＡが２’−Ｏ−メチル置換基を含む、段落１００に記載の方法。
【０１１３】
１０５．上記シグナリングプローブが、２つの化学基を含む少なくとも１つの相互作用する対を含み、１方の化学基が１つの鎖の１つの末端に存在し、他の化学基が他の鎖の隣接末端に存在する、段落９２に記載の方法。
【０１１４】
１０６．上記シグナリングプローブが２つの相互作用する対を有し、ここで、上記プローブの各末端が両方の鎖の隣接末端において１つの相互作用する対を有する、段落９２に記載の方法。
【０１１５】
１０７．上記相互作用する対が、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマー、ＦＲＥＴドナーおよびアクセプター、ならびにタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターまたは上記酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、段落９２に記載の方法。
【０１１６】
１０８．上記相互作用する対がフルオロフォアおよびクエンチャーであって、蛍光を発する細胞が単離される、段落９２に記載の方法。
【０１１７】
１０９．上記シグナリングプローブが同一または異なる少なくとも２つのフルオロフォアを含む、段落９２に記載の方法。
【０１１８】
１１０．上記シグナリングプローブが、ＦＲＥＴドナーおよびアクセプター対、またはハーベスターおよびエミッターフルオロフォアである少なくとも２つのフルオロフォアを含む、段落１０９に記載の方法。
【０１１９】
１１１．蛍光細胞分析分離装置、蛍光顕微鏡または蛍光計を用いて、蛍光を発する上記細胞を単離する工程を行う、段落１０８に記載の方法。
【０１２０】
１１２．上記シグナリングプローブがステム−ループ構造を含む、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９、５３、６２、６７、７３，８０、８５、８８および９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１２１】
１１３．上記ステム領域が４〜６つの連続塩基対を形成する段落１１２に記載の方法。
【０１２２】
１１４．上記ステム−ループ構造が、２つの化学基を含む少なくとも１つの相互作用する対を含み、１つの化学基は鎖の各末端に存在し、ここで、上記ステム領域は非相補的領域を介して連結された２つの互いに相補的な領域を含み、上記相互作用する対に隣接する互いに相補的な領域は５〜６の塩基対を形成し、かつループ領域に隣接する互いに相補的な領域は４〜５の塩基対を形成する、段落１１２に記載の方法。
【０１２３】
１１５．上記非相補的領域が一本鎖ループ領域またはミスマッチ領域である、段落１１４に記載の方法。
【０１２４】
１１６．上記ステム−ループ構造が２つの化学基を含む少なくとも１つの相互作用する対を含み、かつ１つの化学基は鎖の各末端に存在し、ここで、上記ステム領域は２つの非相補的領域を介して連結された３つの互いに相補的な領域を含み、上記相互作用する対に隣接する第一の互いに相補的な領域は４〜５の塩基対を形成し、第二の互いに相補的な領域は２〜３の塩基対を形成し、かつループ領域に隣接する第三の互いに相補的な領域は２〜３の塩基対を形成する、段落１１２に記載の方法。
【０１２５】
１１７．上記非相補的領域が一本鎖ループ領域およびミスマッチ領域の１つ以上である、段落１１６に記載の方法。
【０１２６】
１１８．上記シグナリングプローブがダンベル構造を含む、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９、５３、６２、６７、７３、８０、８５、８８および９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１２７】
１１９．上記ダンベル構造が４連続塩基対の１つのステム領域、および３の連続塩基対の１つのステム領域を含む、段落１１８に記載の方法。
【０１２８】
１２０．上記２つのステム領域が、上記ステム領域の１つのアームを介してホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結される、段落１１８に記載の方法。
【０１２９】
１２１．上記２つのステム領域が上記ステム領域の１つのアームを介して１もしくは２個のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結される、段落１１８に記載の方法。
【０１３０】
１２２．上記シグナリングプローブが３アーム接合構造を含む、段落１、３、５、７、９、１３、１８、２１、３９、５３、６２，６７、７３、８０、８５，８８および９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１３１】
１２３．上記３アーム接合構造が２つの化学基を含む少なくとも１つの相互作用する対を含み、かつ１つの化学基が鎖の各末端に存在し、ここで、上記相互作用する対に隣接するステム領域が３〜４の連続塩基対を形成し、上記第一のステム−ループ構造のステム領域が４〜５の連続塩基対を形成し、かつ上記第二のステム−ループ構造のステム領域が２〜３の連続塩基対を形成する、段落１２２に記載の方法。
【０１３２】
１２４．上記３つの領域が、ステム領域のアームを介して、ホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結される、段落１２２に記載の方法。
【０１３３】
１２５．上記３つの領域が、ステム領域のアームを介して、１もしくは２個のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結される、段落１２２に記載の方法。
【０１３４】
１２６．上記ステム−ループ構造、ダンベル構造または３アーム接合構造が３０を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを有する、段落１１２、１１８および１２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１３５】
１２７．上記構造がＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、化学的に修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せである、段落１１２、１１８および１２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
１２８．上記構造が糖基、ホスホジエステル結合および塩基の１つ以上において化学的に修飾される、段落１１２、１１８および１２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１３７】
１２９．上記ホスホジエステル結合が、−ＯＰ（ＯＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２ＮＨ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ３）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）（Ｏ）Ｏ−、−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）２ＮＨ−からなる群より選択される化学基で置換されている、段落１２８に記載の方法。
【０１３８】
１３０．上記ホスホジエステル結合が−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−または−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−で置換される、段落１２９に記載の方法。
【０１３９】
１３１．上記化学的に修飾されるＲＮＡの２’位が、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ＝０，１．．．３０）、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＯＣＨ３からなる群より選択される化学基を含む、段落１２８に記載の方法。
【０１４０】
１３２．上記化学的に修飾されたＲＮＡが２’−Ｏ−メチル置換を有する、段落１２８に記載の方法。
【０１４１】
１３３．上記相互作用する対が、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマー、ＦＲＥＴドナーおよびアクセプター、ならびにタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターまたは上記酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、段落１１２、１１８および１２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１４２】
１３４．上記相互作用する対がフルオロフォアおよびクエンチャーであって、蛍光を発する細胞が単離される、段落１３３に記載の方法。
【０１４３】
１３５．蛍光を発する上記細胞を単離する工程が、蛍光細胞分析分離装置、蛍光顕微鏡または蛍光計を用いて行われる、段落１３４に記載の方法。
【０１４４】
１３６．上記シグナリングプローブが、上記鎖の１つの末端に少なくとも２つのフルオロフォア、および上記鎖の他の末端にクエンチャーを含み、ここで、２つのフルオロフォアはＦＲＥＴドナーおよびアクセプター対である、段落１１２、１１８および１２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１４５】
１３７．標的配列および互いに相補的な配列、および少なくとも１つのタンパク質分解酵素および少なくとも１つの上記タンパク質分解酵素のインヒビターに相補的な配列を含む核酸または修飾された核酸を含むプローブであって、ここで、上記プローブは、上記標的配列の非存在下におけるアッセイ条件下で、そのレベルが上記タンパク質分解酵素およびそのインヒビターの相互作用の程度の関数である特徴的タンパク質分解活性を有し、そしてここで、過剰の上記標的配列の存在下での条件下で、標的相補体配列の標的配列へのハイブリダイゼーションは上記特徴的タンパク質分解活性レベルを増加させる、プローブ。
【０１４６】
１３８．上記タンパク質分解酵素が部位特異的プロテアーゼまたは標的特異的プロテアーゼである、段落１３７に記載のプローブ。
【０１４７】
１３９．上記タンパク質分解酵素インヒビターがペプチドまたは化合物である、段落１３７に記載のプローブ。
【０１４８】
１４０．上記タンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターが、アミノペプチダーゼおよびアマスタチン、トリプシン様システインプロテアーゼおよび抗パイン、アミノペプチダーゼおよびベスタチン、キモトリプシン様システインプロテアーゼおよびキモスタチン、アミノペプチダーゼおよびジプロチンＡまたはＢ、カルボキシペプチダーゼＡおよびＥＤＴＡ、エラスターゼ様セリンプロテアーゼおよびエラスチナール、ならびにテルモルシンまたはアミノペプチダーゼＭおよび１，１０−フェナントロリンからなる群より選択される、段落１３７に記載のプローブ。
【０１４９】
１４１．少なくとも１つの互いに相補的な領域を形成する核酸または修飾された核酸の２つの別個の鎖を含む、段落１３７に記載のプローブ。
【０１５０】
１４２．上記タンパク質分解酵素が１つの鎖の１つの末端に存在し、上記タンパク質分解酵素インヒビターが他の鎖の隣接末端に存在する、段落１４１に記載のプロ−ブ。
【０１５１】
１４３．上記２つの別個の鎖が５’から３’末端へ連続する互いに相補的な領域を形成し、かつ上記２つの鎖は同一数のヌクレオチドを有する、段落１４１に記載のプローブ。
【０１５２】
１４４．互いに相補的な領域が上記２つの鎖の間で形成された後、１方の鎖の５’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の３’末端が他の鎖からずれているか、またはその両方であり、ここで、上記ずれは１０までのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドである、段落１４１に記載のプローブ。
【０１５３】
１４５．上記２つの鎖が各末端において５または６つの連続塩基対の互いに相補的な領域を形成する、段落１４１に記載のプローブ。
【０１５４】
１４６．上記２つの鎖の配列が同一ではない、段落１４５に記載のプローブ。
【０１５５】
１４７．上記鎖が３０を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを有する、段落１４１に記載のプローブ。
【０１５６】
１４８．上記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは両方である、段落１４１に記載のプローブ。
【０１５７】
１４９．上記修飾された核酸がペプチド核酸、化学的に修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはこれらの組合せを含む、段落１４１に記載のプローブ。
【０１５８】
１５０．上記修飾された核酸が、糖基、ホスホジエステル結合および塩基性基の１つ以上において化学的に修飾されている、段落１４１に記載のプローブ。
【０１５９】
１５１．上記ホスホジエステル結合が、−ＯＰ（ＯＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ２）ＮＨ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ３）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）（Ｏ）Ｏ−、−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）２ＮＨ−からなる群より選択される化学基で置換されている、段落１５０に記載のプローブ。
【０１６０】
１５２．上記ホスホジエステル結合が−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−または−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−で置換されている、段落１５０に記載のプローブ。
【０１６１】
１５３．上記化学的に修飾されたＲＮＡの２’位がＣ１−Ｃ４アルコキシ、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ＝０，１．．．３０）、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＯＣＨ３からなる群より選択される化学基を含む、段落１５０に記載のプローブ。
【０１６２】
１５４．上記化学的に修飾されたＲＮＡが２’−Ｏ−メチル置換を含む、段落１５０に記載のプローブ。
【０１６３】
１５５．ステム−ループ構造を含む、段落１３７に記載のプローブ。
【０１６４】
１５６．上記ステム領域が５〜６つの連続塩基対を形成する、段落１５５に記載のプローブ。
【０１６５】
１５７．上記ステム−ループ構造が鎖の各末端において少なくとも１つのタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターを含み、ここで、上記ステム領域が非相補的領域を介して連結された２つの互いに相補的な領域を含み、鎖の末端に隣接する互いに相補的な領域が５〜６つの塩基対を形成し、かつループ領域に隣接する互いに相補的な領域が４〜５つの塩基対を形成する、段落１５５に記載のプローブ。
【０１６６】
１５８．上記非相補的領域が一本鎖ループ領域またはミスマッチ領域である、段落１５７に記載のプローブ。
【０１６７】
１５９．上記ステム−ループ構造が鎖の各末端において少なくとも１つのタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターを含み、ここで、上記ステム領域が２つの非相補的領域を介して連結された３つの互いに相補的な領域を含み、鎖の末端に隣接する第一の互いに相補的な領域が４〜６つの塩基対を形成し、第二の互いに相補的な領域が２〜３つの塩基対を形成し、かつループ領域に隣接する第三の互いに相補的な領域が２〜３つの塩基対を形成する、段落１５５に記載のプローブ。
【０１６８】
１６０．上記非相補的領域が１つ以上の一本鎖ループ領域およびミスマッチ領域である、段落１５９に記載のプローブ。
【０１６９】
１６１．ダンベル構造を含む、段落１３７に記載のプローブ。
【０１７０】
１６２．上記ダンベル構造が４つの連続塩基対の１つのステム領域、および３の連続塩基対の１つのステム領域を含む、段落１６１に記載のプローブ。
【０１７１】
１６３．上記２つのステム領域が、上記ステム領域の１つのアームを介して、ホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結されている、段落１６１に記載のプローブ。
【０１７２】
１６４．上記２つのステム領域が、上記ステム領域の１つのアームを介して、１または２つのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結されている、段落１６１に記載のプローブ。
【０１７３】
１６５．３アーム接合構造を含む、段落１３７に記載のプローブ。
【０１７４】
１６６．上記３アーム接合構造が鎖の各末端において少なくとも１つのタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターを含み、ここで、鎖の末端に隣接するステム領域が３〜４個の連続塩基対を形成し、上記第一のステム−ループ構造のステム領域が４〜５個の連続塩基対を形成し、かつ第二のステム−ループ構造のステム領域が２〜３個の連続塩基対を形成する、段落１６５に記載のプローブ。
【０１７５】
１６７．上記３つの領域が、上記ステム領域のアームを介して、ホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結されている、段落１６５に記載のプローブ。
【０１７６】
１６８．上記３つの領域が、上記ステム領域のアームを介して、１または２つのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結されている、段落１６５に記載のプローブ。
【０１７７】
１６９．上記ステム−ループ構造、ダンベル構造または３アーム接合構造が３０を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを有する、段落１５５、１６１、または１６５に記載のプローブ。
【０１７８】
１７０．上記構造がＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、化学的に修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組合せである、段落１５５、１６１または１６５に記載のプローブ。
【０１７９】
１７１．上記構造が糖基、ホスホジエステル結合および塩基の１つ以上において化学的に修飾されている、段落１５５、１６１、または１６５に記載のプローブ。
【０１８０】
１７２．上記ホスホジエステル結合が、−ＯＰ（ＯＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２ＮＨ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ３）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）（Ｏ）Ｏ−、−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）２ＮＨ−からなる群より選択される化学基で置換されている、段落１７１に記載のプローブ。
【０１８１】
１７３．上記ホスホジエステル結合が−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−または−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−で置換されている、段落１７１に記載のプローブ。
【０１８２】
１７４．上記化学的に修飾されたＲＮＡの２’位が、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ＝０，１．．．３０）、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＯＣＨ３からなる群より選択される化学基を含む、段落１７１に記載のプローブ。
【０１８３】
１７５．上記化学的に修飾されたＲＮＡが２’−Ｏ−メチル置換を含む、段落１７１に記載のプローブ。
【０１８４】
１７６．少なくとも１つの目的のＲＮＡおよびタグ配列をコードする少なくとも１つのＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、ここで、上記タグ配列は３アーム接合構造を形成し、かつ上記ステム領域は８〜９つの塩基対を含み、上記第一のステム−ループ領域は４〜６つの塩基対を含み、かつ上記第二のステム−ループ領域は１３〜１７個の塩基対を含む、ＤＮＡ構築物。
【０１８５】
１７７．上記３つのアームのステム領域が、さらに、非相補的領域を含む、段落１７６に記載のＤＮＡ構築物。
【０１８６】
１７８．上記ステム領域および上記第一のステム−ループ領域が、共に、さらに、１つのミスマッチ領域を含み、かつ上記第二のステム−ループ領域が、さらに、２〜７つのミスマッチ領域またはバルジ領域を含む、段落１７６に記載のＤＮＡ構築物。
【０１８７】
１７９．上記ステム領域の間の結合が合計８〜１２個のヌクレオチドを有する、段落１７６に記載のＤＮＡ構築物。
【０１８８】
１８０．少なくとも１つの目的のＲＮＡおよびタグ配列をコードする少なくとも１つのＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、ここで、上記タグ配列は図４２Ａ、ＢおよびＣに示された配列からなる群より選択される、ＤＮＡ構築物。
【０１８９】
１８１．少なくとも１つの目的のＲＮＡおよびタグ配列をコードする少なくとも１つのＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、ここで、上記タグ配列は、図４２Ａ、ＢまたはＣに示された配列によって予測されるよりエネルギー的に好都合な構造を形成する、ＤＮＡ構築物。
【０１９０】
１８２．段落１７６〜１８１のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物を含む、ベクター。
【０１９１】
１８３．段落１８２に記載のベクター、または段落１７６〜１８１のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物を含む、細胞。
【０１９２】
１８４．不死化された初代幹細胞および生殖細胞からなる群より選択される、段落１８３に記載の細胞。
【０１９３】
１８５．ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ細胞からなる群より選択される、段落１８３に記載の細胞。
【０１９４】
１８６．それぞれが少なくとも１つの安定に組み込まれた発現された配列を含む少なくとも１０，０００個の細胞株を含む、安定な哺乳動物細胞株のライブラリー。
【０１９５】
１８７．それぞれが少なくとも２つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも５００個の細胞株を含む、安定な哺乳動物細胞株のライブラリー。
【０１９６】
１８８．それぞれが少なくとも３つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも５０個の細胞株を含む、安定な哺乳動物細胞株のライブラリー。
【０１９７】
１８９．それぞれが少なくとも４つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも２０個の細胞株を含む安定な哺乳動物細胞株のライブラリー。
【０１９８】
１９０．上記細胞株が、さらに、薬物耐性遺伝子を含む、段落１８６〜１８９のいずれか１つに記載のライブラリー。
【０１９９】
１９１．それぞれが、少なくとも１つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも５０個の細胞株を含む安定な哺乳動物細胞株のライブラリーであって、ここで、上記細胞株は薬物耐性遺伝子を欠く、ライブラリー。
【０２００】
１９２．それぞれが、少なくとも２つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも２０個の細胞株を含む安定な哺乳動物細胞株のライブラリーであって、ここで、上記細胞株は薬物耐性遺伝子を欠く、ライブラリー。
【０２０１】
１９３．各細胞株が可変ライブラリー配列を含む、段落１８６〜１９２のいずれか１つに記載のライブラリー。
【０２０２】
１９４．上記発現ライブラリーの可変配列が、ゲノム配列、ゲノム非翻訳配列、ゲノム翻訳配列、遺伝子配列、ｃＤＮＡ配列、ＥＳＴ配列、オリゴ配列、ランダム配列、ＲＮＡ配列、タンパク質配列、タンパク質ドメイン配列、ペプチド配列、イントロン配列、エクソン配列、タグ配列、またはリンカー配列、またはこれらの組合せ、またはこれらの組換え物、あるいは未修飾配列、突然変異誘発配列、ランダム化配列、シャッフルされた配列または組換え配列の１つ以上からなる群より選択される、段落１９３に記載のライブラリー。
【０２０３】
１９５．上記ライブラリーが、未知の配列同一性を有する遺伝子配列の少なくとも１つのプールまたは混合物を用いて作製された、段落１８６〜１９２のいずれか１つに記載のライブラリー。
【０２０４】
１９６．未知の同一性を有する上記配列が、共有された配列相同性、機能的重要性、または関連起源を有する、段落１９５に記載のライブラリー。
【０２０５】
１９７．上記ライブラリーが、既知の同一性を有する特異的配列を含む個々に合成された構築物の集合である、段落１８６〜１９２のいずれか１つに記載のライブラリー。
【０２０６】
１９８．上記特異的配列が、共有された配列相同性、機能的重要性、または関連起源を有する、段落１９７に記載のライブラリー。
【０２０７】
１９９．上記発現された配列が構成的プロモーターの制御下にある、段落１８６〜１９２のいずれか１つに記載のライブラリー。
【０２０８】
２００．上記発現された配列が、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、組織特異的プロモーター、一時的プロモーターまたは熱ショックプロモーターからなる群より選択される条件プロモーターの制御下にある、段落１８６〜１９２のいずれか１つに記載のライブラリー。
【０２０９】
２０１．上記ライブラリーが細胞ベースのスクリーニングアッセイで用いられる、段落１８６〜１９２のいずれか１つに記載のライブラリー。
【０２１０】
２０２．上記細胞ベースのスクリーニングアッセイが、上記ライブラリーにおける全ての細胞株に関して平行して行われる、段落２０１に記載のライブラリー。
【０２１１】
２０３．上記細胞ベースのスクリーニングアッセイが上記ライブラリーにおける細胞株の一部に関して行われる、段落２０１に記載のライブラリー。
【０２１２】
２０４．図８〜２４および４１に示されるＦＰ１〜ＦＰ１８のいずれか１つの配列を含む、核酸分子または修飾された核酸分子。
【０２１３】
２０５．さらに、相互作用する対を含む、段落２０４に記載の核酸分子または修飾された核酸分子。
【０２１４】
２０６．上記相互作用する対が、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマー、ＦＲＥＴドナーおよびアクセプター、ならびにタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターまたは上記酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、段落２０５に記載の核酸分子または修飾された核酸分子。
【０２１５】
２０７．図４２Ｄ１、２または３に示される配列にハイブリダイズする、核酸分子または修飾された核酸分子。
【０２１６】
２０８．さらに、相互作用する対を含む、段落２０７に記載の核酸または修飾された核酸分子。
【０２１７】
２０９．上記相互作用する対が、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマー、およびＦＲＥＴドナーおよびアクセプター、ならびにタンパク質分解酵素および上記タンパク質分解酵素のインヒビターまたは上記酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、段落２０８に記載の核酸分子または修飾された核酸分子。
【０２１８】
２１０．図４２Ａ、ＢまたはＣ中の配列を含む、核酸分子または修飾された核酸分子。
【０２１９】
２１１．図４２Ｄ１またはＤ２中の配列を含む、核酸分子または修飾された核酸分子。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
ＲＮＡを潜在的に発現する細胞を提供する工程；
該細胞を、該ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；および
シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目２）
ＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
該ＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞に導入する工程；
該細胞を、該ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；および
シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目３）
内因性ＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
内因性ＲＮＡの発現を生じるＤＮＡを細胞に導入する工程；
該細胞を、該内因性ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；および
シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目４）
ＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
該ＲＮＡをコードし、さらにタグ配列をコードするＤＮＡを細胞に導入する工程；
該細胞を、該タグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；および
シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目５）
外因性ＲＮＡおよび内因性ＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
該外因性ＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞に導入する工程であって、該細胞が内因性ＲＮＡを潜在的に発現する、工程；
該細胞を、該外因性ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
該細胞を、該内因性ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目６）
２つ以上の外因性ＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
第一の内因性ＲＮＡの発現を生じるＤＮＡを細胞に導入する工程であって、該細胞がさらなる内因性ＲＮＡを潜在的に発現する、工程；
該細胞を、該第一の内因性ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
該細胞を、該さらなる内因性ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目７）
２つ以上の異なるＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
２つ以上の異なるＲＮＡを潜在的に発現する細胞を提供する工程；
該細胞を、第一のＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
該細胞を、さらなるＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目８）
２つ以上の異なるＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
第一のＲＮＡをコードする第一のＤＮＡを細胞に導入する工程；
さらなるＲＮＡをコードするさらなるＤＮＡを該細胞に導入する工程；
該細胞を、該第一のＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
該細胞を、該さらなるＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目９）
２つ以上の異なる内因性ＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
第一の内因性ＲＮＡの発現を生じる第一のＤＮＡを細胞に導入する工程；
さらなる内因性ＲＮＡの発現を生じるさらなるＤＮＡを該細胞に導入する工程；
該細胞を、該第一の内因性ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
該細胞を、該さらなる内因性ＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目１０）
２つ以上の異なるＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、以下：
第一のＲＮＡをコードし、さらに第一のタグ配列をコードする第一のＤＮＡを細胞に導入する工程；
さらなるＲＮＡをコードし、さらにさらなるタグ配列をコードするさらなるＤＮＡを該細胞に導入する工程；
該細胞を、該第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
該細胞を、該さらなるタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目１１）
１つより多い外因性ＤＮＡのコピーを含む細胞を単離する方法であって、以下：
ＲＮＡをコードし、さらに第一のタグ配列をコードする第一のＤＮＡを細胞に導入する工程；
該ＲＮＡをコードし、およびさらなるタグ配列をさらにコードするさらなるＤＮＡを該細胞に導入する工程；
該細胞を、該第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
該細胞を、該第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目１２）
前記暴露工程を同時に行う、項目５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記暴露工程を連続して行う、項目５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
２つ以上のＲＮＡまたは該２つ以上のＲＮＡによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるＲＮＡまたはタンパク質、互いの上流または下流に作用するＲＮＡまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するＲＮＡまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するＲＮＡまたはタンパク質、同一複合体の成分であるＲＮＡまたはタンパク質、および同一タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、項目５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記第一のシグナリングプローブが、前記第二のシグナリングプローブによって生じるシグナルとは異なるシグナルを生じる、項目５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
条件プロモーターの制御下にあるＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を含む細胞を単離する方法であって、以下：
構成的プロモーターの制御下にある第一のＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を細胞に導入する工程であって、該ＤＮＡ構築物は、第二のＲＮＡが発現しない条件下で、条件プロモーターの制御下にある第二のＲＮＡをさらにコードする工程；
該細胞を、該第一のＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；および
シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目１７）
前記ＤＮＡ構築物が、さらに、試験ＲＮＡをコードする、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
複数の細胞を単離する方法であって、該細胞の部分集合が、該細胞の別の部分集合によって発現されないＲＮＡを発現する方法であって、以下：
複数のＲＮＡをコードする複数のＤＮＡを細胞に導入する工程であって、該複数のＲＮＡの少なくとも１つの部分集合が互いに異なる、工程；
該細胞を、複数の異なるシグナリングプローブに暴露する工程であって、該シグナリングプローブが、該複数のＤＮＡによってコードされる１つ以上のＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程；および
シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目１９）
複数の細胞を単離する方法であって、該細胞の部分集合が、該細胞の別の部分集合によって発現されないＲＮＡを発現する方法であって、以下：
複数の内因性ＲＮＡの発現を生じる複数のＤＮＡを細胞に導入する工程であって、該複数の内因性ＲＮＡの少なくとも１つの部分集合が互いに異なる、工程
該細胞を、複数の異なるシグナリングプローブに暴露する工程であって、該シグナリングプローブが、該複数の内因性ＲＮＡの１つ以上のＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程；および
シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目２０）
複数の細胞を単離する方法であって、該細胞の少なくとも１つの部分集合が、該細胞の別の部分集合によって発現されないＲＮＡを発現する方法であって、以下：
複数のＲＮＡをコードする複数のＤＮＡを細胞に導入する工程であって、各ＤＮＡはさらにタグ配列をコードする、工程；
該細胞を、該タグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；および
シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目２１）
前記複数のＲＮＡが発現ライブラリーを形成する、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記複数のＲＮＡまたは該複数のＲＮＡによってコードされるタンパク質が、同一または関連する生物学的経路におけるＲＮＡまたはタンパク質、互いの上流または下流に作用するＲＮＡまたはタンパク質、互いに対して調節機能、活性化機能または抑制機能を有するＲＮＡまたはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存するＲＮＡまたはタンパク質、同一複合体の成分であるＲＮＡまたはタンパク質、および同一タンパク質ファミリー由来のタンパク質からなる群より選択される、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記複数のＤＮＡの少なくとも１つの部分集合が同一のタグ配列をコードする、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
細胞の２つ以上のＲＮＡ発現ライブラリーを単離する方法であって、以下：
第一のＲＮＡ発現ライブラリーをコードする複数のＤＮＡを細胞に導入する工程であって、各ＤＮＡが、さらに、第一のタグ配列をコードする、工程；
第二のＲＮＡ発現ライブラリーをコードする複数のＤＮＡを該細胞に導入する工程であって、各ＤＮＡが、さらに、第二のタグ配列をコードする、工程；
該細胞を、該第一のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
該細胞を、該第二のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに暴露する工程；および
両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目２５）
さらに、前記単離された細胞を培養する工程を包含する、項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
さらに、前記単離された細胞を培養する工程によって、細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含する、項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記タグ配列が複数の標的配列を含み、１つのシグナリングプローブが各標的配列にハイブリダイズする、項目４、１０、１１、２０または２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記タグ配列が二次構造を有するＲＮＡである、項目４、１０、１１、２０または２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記タグ配列が、ステム領域、第一のステム−ループ領域および第二のステム−ループ領域を含む３アーム接合構造を形成する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ＤＮＡが複数のタグ配列をコードする、項目４、１０、１１、２０または２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記タグ配列をコードするＤＮＡが前記ＲＮＡをコードするＤＮＡに対してフレーム内にある項目４、１０、１１、２０または２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記タグ配列をコードするＤＮＡが該ＲＮＡをコードするＤＮＡに対してフレーム外にある項目４、１０、１１、２０または２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
さらに、前記提供する工程または導入する工程の前に、前記ＲＮＡ、さらなるＲＮＡまたは複数のＲＮＡの発現を調節する化合物を細胞に添加する工程を包含する、項目１〜１６、１８〜２０または２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
タンパク質の低下した発現を有する細胞を単離する方法であって以下：
アンチセンスＲＮＡ、または該タンパク質の発現を低下させるｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞に導入する工程；
該細胞を、該アンチセンスＲＮＡまたはｓｈＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；および、
シグナルを生じる細胞を単離する工程；
を包含する、方法。
（項目３５）
前記ＤＮＡが条件プロモーターに作動可能に連結される、項目２、４、５、８、１０、１１、１８、２０または２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記ＲＮＡが細胞に対して致死的であるか、または損傷的である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記ＤＮＡが選択マーカーをさらにコードし、ここで、該方法が、該ＤＮＡを細胞に導入する工程の後であるが、該細胞を前記シグナリングプローブに暴露する前に、該選択マーカーを用いて該細胞を選択する工程をさらに包含する、項目２〜６、８〜１１、１６〜２０、２４または３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
条件プロモーターを活性化する化合物を同定する方法であって、以下：
項目１６に記載の方法によって単離された細胞に試験化合物を添加する工程；
該条件プロモーターの制御下で第二のＲＮＡの存在に関してアッセイする工程；および
該細胞が該第二のＲＮＡを発現する場合、組織特異的プロモーターを活性化する化合物として試験化合物を同定する工程；
を包含する、方法。
（項目３９）
条件プロモーターを活性化するＲＮＡを得る方法であって、以下：
項目１７に記載の方法によって単離された細胞を得る工程；
条件プロモーターの制御下で第二のＲＮＡの存在に関してアッセイする工程；および
該第二のＲＮＡを発現する細胞を得る工程；
を包含する、方法。
（項目４０）
生物学的試料中のＲＮＡの発現レベルを定量化するための方法であって、以下：
該生物学的試料を、該ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに暴露する工程；
該生物学的試料中のシグナルのレベルを定量する工程；および
該シグナルのレベルを該ＲＮＡの発現レベルと相関させる工程；
を包含する、方法。
（項目４１）
ＲＮＡの発現を調節する化合物を同定する方法であって、以下：
該ＲＮＡを発現する細胞に試験化合物を添加する工程；
該細胞を、該ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；
該試験化合物に暴露した細胞によって生じるシグナルを、該試験化合物に暴露しなかった細胞によって生じるシグナルと比較する工程；
を包含し、
ここで、該試験化合物に暴露しなかった細胞によって生じたシグナルと比較して該試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加または減少が、該化合物が該ＲＮＡの発現を調節する化合物であることを示す、方法。
（項目４２）
前記ＲＮＡが、細胞に導入されるＤＮＡによってコードされる、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
ＲＮＡの発現を調節するＲＮＡを同定する方法であって、以下：
試験ＲＮＡを細胞に導入する工程であって、該細胞がＲＮＡを含む、工程；
該細胞を、該ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；および
該試験ＲＮＡに暴露された細胞によって生じたシグナルを、該試験ＲＮＡに暴露されなかった細胞によって生じたシグナルと比較する工程；
を包含し、
ここで、該試験ＲＮＡに暴露しなかった細胞によって生じたシグナルと比較して該試験ＲＮＡに暴露された細胞によって生じたシグナルの増加または減少は、該試験ＲＮＡが該ＲＮＡの発現を調節することを示す、方法。
（項目４４）
生きた細胞における遺伝的組換え事象を同定するための方法であって、以下
細胞を、組換え配列から転写されたＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程を包含し、
ここで、該シグナルを生じる細胞の検出は、該細胞が遺伝的組換え事象を含むことを示唆する、方法。
（項目４５）
さらに、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
項目１〜２４、３４または４５のいずれか１項に記載の方法によって得られた、細胞。
（項目４７）
前記細胞が細胞ベースのアッセイで用いられる、項目４６に記載の細胞。
（項目４８）
前記細胞が動物に移植される、項目４６に記載の細胞。
（項目４９）
前記細胞が胚性幹細胞である、項目４６に記載の細胞。
（項目５０）
項目４９に記載の胚性幹細胞を用いて、トランスジェニック動物またはキメラ動物を作製する工程を包含する、トランスジェニック動物をまたはキメラ動物を作製する、方法。
（項目５１）
前記シグナリングプローブが、少なくとも１つの互いに相補的な領域を形成する核酸または修飾された核酸の２つの別個の鎖を含む、項目１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記２つの別個の鎖が５’末端〜３’末端の連続する互いに相補的な領域を形成し、ここで、該２つの鎖は同じ数のヌクレオチドを有する、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
互いに相補的な領域が前記２つの鎖の間で形成された後、１つの鎖の５’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の３’末端が他の鎖からずれているか、またはその両方であり、ここで、該ずれは１０までのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドである、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記核酸がＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方である、項目５１に記載の方法。
（項目５５）
前記修飾された核酸が、ペプチド核酸、化学的に修飾されたＤＮＡ、化学的に修飾されたＲＮＡ、またはこれらの組合せを含む、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記修飾された核酸が糖基、ホスホジエステル結合および塩基性基の１つ以上において化学的に修飾されている、項目５１に記載の方法。
（項目５７）
前記ホスホジエステル結合が、−ＯＰ（ＯＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２ＮＨ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ３）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）（Ｏ）Ｏ−、−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）２ＮＨ−からなる群より選択される化学基で置換されている、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ホスホジエステル結合が、−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−または−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−で置換されている、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
化学的に修飾されたＲＮＡの２’位が、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ＝０，１．．．３０）、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＯＣＨ３からなる群より選択される化学基を含む、項目５６に記載の方法。
（項目６０）
前記化学的に修飾されたＲＮＡが２’−Ｏ−メチル置換を含む、項目５６に記載の方法。
（項目６１）
前記シグナリングプローブが２つの化学基を含む相互作用する対を含み、ここで、１つの化学基が１つの鎖の１つの末端に存在し、ここで、該他の化学基が他の鎖の隣接末端に存在する、項目５１に記載の方法。
（項目６２）
前記シグナリングプローブが２つの相互作用する対を有し、ここで、該プローブの各末端が両方の鎖の隣接末端において１つの相互作用する対を有する、項目５１に記載の方法。
（項目６３）
前記相互作用する対が、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマー、ＦＲＥＴドナーおよびアクセプター、ハーベスターおよびエミッターフルオロフォア、ならびに酵素および該酵素のインヒビターまたは該酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記シグナリングプローブがステム−ループ構造を含む、項目１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
前記シグナリングプローブが、２つのステム領域を含むダンベル構造を含む、項目１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記シグナリングプローブが、ステム領域、第一のステム−ループ領域および第二のステム−ループ領域を含む３アーム接合構造を形成する一本鎖を含む、項目１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
前記構造の領域が前記ステム領域のそれぞれのアームを介してホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結されている、項目６５または６６に記載の方法。
（項目６８）
前記構造がＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、化学的に修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せである、項目６４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目６９）
前記構造が糖基、ホスホジエステル結合および塩基の１つ以上において化学的に修飾されている、項目６４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
前記ホスホジエステル結合が、−ＯＰ（ＯＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２ＮＨ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ３）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）（Ｏ）Ｏ−、−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）２ＮＨ−からなる群より選択される化学基で置換されている、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記ホスホジエステル結合が−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−または−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−で置換されている、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記化学的に修飾されたＲＮＡの２’位が、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ＝０，１．．．３０）、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＯＣＨ３からなる群より選択される化学基を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７３）
前記化学的に修飾されたＲＮＡが２’−Ｏ−メチル置換を有する、項目６９に記載の方法。
（項目７４）
前記相互作用する対が、フルオロフォアとクエンチャー、化学発光標識とクエンチャーまたはアダクト、色素ダイマーとＦＲＥＴドナーおよびアクセプター、ハーベスターとエミッターフルオロフォア、タンパク質分解酵素と該タンパク質分解酵素のインヒビターまたは該酵素を可逆的に不活化し得る別の分子からなる群より選択される、項目６４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目７５）
前記シグナリングプローブが、前記鎖の１つの末端に少なくとも２つのフルオロフォア、および該鎖の他の末端にクエンチャーを含み、ここで、該２つのフルオロフォアはＦＲＥＴドナーおよびアクセプター対である項目６４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目７６）
標的配列に相補的な配列および互いに相補的な配列、酵素および該酵素のインヒビターを含む核酸または修飾された核酸を含むプローブであって、ここで、該プローブは、該標的配列へのハイブリダイゼーションの際に酵素活性の検出可能な増加を生じる、プローブ。
（項目７７）
前記酵素がタンパク質分解酵素である、項目７６に記載のプローブ。
（項目７８）
前記プローブが、少なくとも１つの互いに相補的な領域を形成する核酸または修飾された核酸の２つの別個の鎖を含む、項目７６に記載のプローブ。
（項目７９）
酵素が１つの鎖の１つの末端に存在し、該酵素のインヒビターが他の鎖の隣接する末端に存在する、項目７６に記載のプローブ。
（項目８０）
前記２つの別個の鎖が５’末端〜３’末端の連続する互いに相補的な領域を形成し、該２つの鎖は同じ数のヌクレオチドを有する、項目７８に記載のプローブ。
（項目８１）
互いに相補的な領域が２つの鎖の間で形成された後、１つの鎖の５’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の３’末端が他の鎖からずれているか、またはその両方であり、ここで、該ずれは１０までのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドである、項目７８に記載のプローブ。
（項目８２）
前記核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方である、項目７８に記載のプローブ。
（項目８３）
前記修飾された核酸が、ペプチド核酸、化学的に修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはこれらの組合せを含む、項目７８に記載のプローブ。
（項目８４）
前記修飾された核酸が、糖基、ホスホジエステル結合および塩基性基の１つ以上において化学的に修飾されている、項目７８に記載のプローブ。
（項目８５）
前記ホスホジエステル結合が、−ＯＰ（ＯＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ２）ＮＨ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ３）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）（Ｏ）Ｏ−、−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）２ＮＨ−からなる群より選択される化学基で置換されている、項目８４に記載のプローブ。
（項目８６）
前記ホスホジエステル結合が、−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−または−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−で置換されている、項目８４に記載のプローブ。
（項目８７）
化学的に修飾されたＲＮＡの２’位が、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ＝０，１．．．３０）、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＯＣＨ３からなる群より選択される化学基を含む、項目８４に記載のプローブ。
（項目８８）
前記化学的に修飾されたＲＮＡが２’−Ｏ−メチル置換を含む、項目８４に記載のプローブ。
（項目８９）
ステム−ループ構造を含む、項目７６に記載のプローブ。
（項目９０）
２つのステム領域を含むダンベル構造を含む、項目７６に記載のプローブ。
（項目９１）
ステム領域、第一のステム−ループ領域および第二のステム−ループ領域を含む３アーム接合構造を含む、項目７６に記載のプローブ。
（項目９２）
前記構造の領域が前記ステム領域のそれぞれのアームを介してホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結されている、項目９０または９１に記載のプローブ。
（項目９３）
前記構造がＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、化学的に修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せである項目９０〜９２のいずれか１項に記載のプローブ。
（項目９４）
前記構造が、糖基、ホスホジエステル結合および塩基の１つ以上において化学的に修飾されている、項目９０〜９２のいずれか１項に記載のプローブ。
（項目９５）
前記ホスホジエステル結合が、−ＯＰ（ＯＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ２）ＮＨ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ３）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）（Ｏ）Ｏ−、−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）２ＮＨ−からなる群より選択される化学基で置換されている、項目９４に記載のプローブ。
（項目９６）
前記ホスホジエステル結合が−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−または−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−で置換されている、項目９４に記載のプローブ。
（項目９７）
前記化学的に修飾されたＲＮＡの２’位がＣ１−Ｃ４アルコキシ、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ＝０，１．．．３０）、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＯＣＨ３からなる群より選択される化学基を含む、項目９４に記載のプローブ。
（項目９８）
前記化学的に修飾されたＲＮＡが２’−Ｏ−メチル置換を有する、項目９４に記載のプローブ。
（項目９９）
目的のＲＮＡおよびタグ配列をコードするＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築物。
（項目１００）
項目９９に記載のＤＮＡ構築物を含む、ベクター。
（項目１０１）
項目９９に記載のＤＮＡ構築物を含む、細胞。
（項目１０２）
前記細胞が不死化された、初代幹細胞または生殖細胞である、項目１０１に記載の細胞。
（項目１０３）
それぞれが安定に組み込まれた発現された配列を含む少なくとも１，０００個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
（項目１０４）
それぞれが少なくとも２つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも５００個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
（項目１０５）
それぞれが少なくとも３つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも５０個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
（項目１０６）
それぞれが少なくとも４つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも２０個の細胞株を含む、哺乳動物細胞株のライブラリー。
（項目１０７）
それぞれが少なくとも１つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも５０個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーであって、該細胞株が、薬物耐性遺伝子を欠く、ライブラリー。
（項目１０８）
それぞれが少なくとも２つの安定に組み込まれた配列を含む少なくとも２０個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーであって、該細胞株が、薬物耐性遺伝子を欠く、ライブラリー。
（項目１０９）
各細胞株が可変ライブラリー配列を含む、項目１０３〜１０８のいずれか１項に記載のライブラリー。
（項目１１０）
前記発現ライブラリーの可変配列が、ゲノム配列、ゲノム非翻訳配列、ゲノム翻訳配列、遺伝子配列、ｃＤＮＡ配列、ＥＳＴ配列、オリゴ配列、ランダム配列、ＲＮＡ配列、タンパク質配列、タンパク質ドメイン配列、ペプチド配列、イントロン配列、エクソン配列、タグ配列、もしくはリンカー配列、またはこれらの組合せ、またはこれらの組換え物、あるいは未修飾配列、突然変異誘発配列、ランダム化配列、シャッフルされた配列または組換え配列の１つ以上からなる群より選択される、項目１０９に記載のライブラリー。
（項目１１１）
前記ライブラリーが未知の配列同一性を有する複数の異なる配列を用いて作製される、項目１０３〜１０８のいずれか１項に記載のライブラリー。
（項目１１２）
前記ライブラリーが複数の構築物を含み、各構築物が既知の配列同一性を有する配列を含む、項目１０３〜１０８のいずれか１項に記載のライブラリー。
（項目１１３）
前記配列が共有された配列相同性、機能的重要性、または関連起源を有する、項目１１１または１１２に記載のライブラリー。
（項目１１４）
前記ライブラリーが細胞ベースのスクリーニングアッセイで用いられる、項目１０３〜１０８のいずれか１項に記載のライブラリー。
（項目１１５）
シグナリングプローブを用いる、細胞における標的の検出を増強する化合物を同定する方法であって、以下：
標的配列を含む細胞にシグナリングプローブを導入する工程であって、ここで、該シグナリングプローブは標的配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程；
該細胞を試験化合物に暴露する工程；および
該細胞によって生じるシグナルを検出する工程；
を包含し、
ここで、該試験化合物に暴露されなかった細胞によって生じたシグナルと比較して該試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加は、該試験化合物が、シグナリングプローブを用いる細胞における標的の検出を増強させる化合物であることを示す、方法。
（項目１１６）
シグナリングプローブの細胞への導入を媒介し、または改良する化合物を同定する方法であって、以下：
試験化合物の存在下でシグナリングプローブに細胞を暴露する工程であって、ここで、該細胞は標的配列を含み、該シグナリングプローブは該標的配列とのハイブリダイゼーションの際にシグナルを生じる、工程；および
該細胞によって生じたシグナルを検出する工程；
を包含し、
ここで、該試験化合物に暴露されなかった細胞と比較して該試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加は、該試験化合物が、シグナリングプローブの細胞への導入を媒介し、または改良する化合物であることを示す、方法。
【０２２０】
本発明は、ＲＮＡを発現する細胞を単離する方法を提供し、この方法は、
上記ＲＮＡを発現する細胞を提供する工程、上記細胞を、上記ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程、および、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。１つの実施形態において、上記ＲＮＡは内因性ＲＮＡである。別の実施形態において、上記内因性ＲＮＡは、細胞に導入されるＤＮＡの結果として発現され、例えば、そのＤＮＡはエンハンサーまたはプロモーター、または内因性ＲＮＡの発現を誘導する他の配列を含む。例えば、ＤＮＡはタンパク質（例えば、ＲＮＡの発現を誘導する転写因子）をコードし得る。なお別の実施形態において、上記ＲＮＡは、細胞に導入される核酸によってコードされる。細胞に導入されるＤＮＡは、さらに、タグ配列をコードし得、ここで、上記シグナリングプローブは、必要に応じて、タグ配列および／またはＲＮＡ配列に標的化され得る。上記タグ配列はＲＮＡのオープンリーディングフレームのフレーム内またはフレーム外に存在し得る。１つの実施形態において、上記方法は、外因性または異種ＲＮＡおよび内因性ＲＮＡの両方の発現を検出する工程を包含する。これらの方法を行って、同時に複数のＲＮＡおよび／またはタグを検出し得る。上記ＲＮＡは、同一または異なるＲＮＡであり得る。上記方法を用いて、１を超えるシグナリングプローブを用いて１を超えるＲＮＡを検出する実施形態において、異なるシグナリングプローブによって生じたシグナルは、互いに同一であっても異なっていてもよい。
【０２２１】
また、本発明は、外因性または異種ＤＮＡの１を超えるコピーを含む細胞を単離する方法も提供する。このような方法は、ＲＮＡおよびタグ配列をコードするＤＮＡを導入する工程、同一ＲＮＡおよび異なるタグ配列をコードするＤＮＡを導入する工程；細胞を、両方のタグに対する検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに暴露する工程；および、両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。
【０２２２】
１を超える暴露工程が存在する本発明の方法のいずれかにおいて、１回以上の暴露工程（すなわち、細胞がシグナリングプローブに暴露される工程）を同時または連続して行い得る。
【０２２３】
本発明の方法のいずれかにおいて、上記ＲＮＡまたはタンパク質は、同一または関連する生物学的経路におけるものであってもよく、互いから上流または下流で作用してもよく、機能または活性に関して互いに依存して、互いに対して調節、活性化または抑制機能を有してもよく、同一複合体の成分、同一タンパク質ファミリーのメンバーなどである。
【０２２４】
本発明は、条件プロモーターの制御下にある第一のＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を含む細胞を単離する方法を提供し、この方法は、条件プロモーターの制御下にあるＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を細胞に導入する工程であって、ここで、上記ＤＮＡ構築物は、さらに、第二のＲＮＡが発現されないか、または低レベルで発現される条件下で、条件プロモーターの制御下にある第二のＲＮＡをコードする、工程；第一のＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程；および、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。上記ＤＮＡ構築物は、さらに、試験ＲＮＡをコードし得、ここで、例えば、上記試験ＲＮＡは可変であり、例えば、発現ライブラリーに由来する。これらの細胞を用いて、第二のＲＮＡの発現を駆動する条件プロモーターを活性化し得るＲＮＡまたは化合物を得るか、または同定し得る。
【０２２５】
また、本発明は、上記細胞の部分集合は細胞の別の部分集合によって発現されないＲＮＡを発現する、複数の細胞を単離する方法を提供し、この方法は、複数のＲＮＡをコードする複数のＤＮＡを細胞に導入する工程であって、上記複数のＲＮＡの少なくとも１つの部分集合は互いに異なっている、工程、複数の異なるシグナリングプローブに細胞を暴露する工程であって、ここで、上記シグナリングプローブは複数のＤＮＡによってコードされる１つ以上のＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる、工程、および、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。細胞の部分集合は、１つの細胞であっても、または１を超える細胞であってもよい。１つの実施形態において、ＤＮＡはＲＮＡをコードしないが、外因性ＲＮＡの発現を生じ、例えば、上記ＤＮＡはエンハンサー配列またはプロモーター配列を含み、例えば、ＤＮＡは内因性ＲＮＡの発現を誘導する配列を含む。例えば、上記ＤＮＡは、タンパク質（例えば、ＲＮＡの発現を誘導する転写因子）をコードし得る。上記ＤＮＡは、さらに、タグ配列をコードし得、上記シグナリングプローブは、タグ配列および／またはＲＮＡ配列を標的とし得る。１つの実施形態において、複数のＲＮＡは発現ライブラリーを形成する。別の実施形態において、ＤＮＡの少なくとも１つの部分集合は、同一タグ配列をコードする。
【０２２６】
本発明はまた、細胞の２つ以上のＲＮＡライブラリーを単離する方法を提供し、この方法は、第一のＲＮＡ発現ライブラリーをコードするＤＮＡを細胞に導入する工程であって、各ＤＮＡは、さらに、第一のタグ配列をコードする、工程、第二のＲＮＡ発現ライブラリーをコードするＤＮＡを細胞に導入する工程であって、各ＤＮＡは、さらに、第二のタグ配列をコードする、工程、第一のタグへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブ、および第二のタグ配列へのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに細胞を暴露する工程、および、両方のシグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。この方法は、さらなるＲＮＡ発現ライブラリーをコードするＤＮＡで行うことができ、第三のタグなどを用いる。
【０２２７】
本発明の方法のいずれかを用いて、化合物を細胞に添加し、次いで、シグナリングプローブによって生じたシグナルの変化（増加または減少）に関してアッセイすることによって、ＲＮＡまたは複数のＲＮＡの発現を調節する化合物を同定し得る。
【０２２８】
本発明は、タンパク質の発現を低下させる方法を提供し、この方法は、上記タンパク質の発現を低下させるアンチセンスＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞に導入する工程、アンチセンスＲＮＡまたはｓｈＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに細胞を暴露する工程、および、シグナルを生じる細胞を単離する工程を包含する。この方法は、さらに、上記タンパク質をコードするＲＮＡへのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに細胞を暴露する工程を包含し得、ここで、第二のシグナリングプローブからのシグナルの欠如は、タンパク質の発現が低下することを示唆する。また、他の方法を用いて、例えば、上記タンパク質に特異的に結合する抗体を用い、機能的試験を用いて（例えば、タンパク質の既知の生物学的活性に関してアッセイするなど）、タンパク質の低下した発現に関してアッセイし得る。この方法の１つの実施形態において、細胞を第一のシグナリングプローブに暴露する工程を省略し得る。ｓｈＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡを用いる方法のいずれかを行うこともできる。
【０２２９】
本発明の方法のいずれかにおいて、細胞に導入されるＤＮＡは、条件プロモーターに作動可能に連結され得る。１つの実施形態において、ＤＮＡによってコードされるＲＮＡは細胞に対して致死的であるか、または損傷的である。ＤＮＡは、加えて、ＤＮＡを含む細胞を選択するのに使用され得る選択マーカーを含み得る。
【０２３０】
本発明はまた、生物学的試料中のＲＮＡの発現レベルを定量化する方法を提供し、この方法は、ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに生物学的試料を暴露する工程、生物学的試料中のシグナルのレベルを定量する工程、およびシグナルのレベルをＲＮＡの発現レベルに相関させる工程を包含する。
【０２３１】
本発明はさらに、ＲＮＡの発現を調節する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、ＲＮＡを発現する細胞に試験化合物を添加する工程、ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程、および試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルを試験化合物に暴露されなかった細胞によって生じたシグナルと比較する工程を包含し、ここで、後者の細胞によって生じたシグナルと比較して前者の細胞によって生じたシグナルの増加または減少は、上記化合物がＲＮＡの発現を調節することを示唆する。１つの実施形態において、上記ＲＮＡは、細胞に導入されるＤＮＡによってコードされる。１つの実施形態において、上記化合物はＲＮＡまたはタンパク質である。
【０２３２】
本発明は、生きた細胞において遺伝的組換え事象を同定する方法を提供し、この方法は、組み換えられた配列から転写されたＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに細胞を暴露する工程を包含し、ここで、シグナルを生じる細胞の検出は、上記細胞が遺伝的組換え事象を含むことを示唆する。
【０２３３】
また、本発明は、上記方法のいずれかによって作製された細胞を提供する。これらの細胞は培養することができ、細胞株または複数の細胞株を作製するのに用いることができる。上記細胞は、例えば、細胞ベースのアッセイにおいて、あるいは、細胞を動物、非ヒト動物、または哺乳動物に移植する場合に、種々の目的で用いることができる。上記細胞は、胚性幹細胞、初代生殖細胞または初代幹細胞であってもよい。上記細胞はまた、不死化された細胞であってもよい。上記細胞は、内皮細胞、表皮細胞、間葉細胞、神経細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、造血系細胞、または免疫細胞であってよい。上記細胞は、真核生物、原核生物、哺乳動物、酵母、植物、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ネコ、げっ歯類、有袋類、ネズミまたは他の細胞であってもよい。
【０２３４】
上記タグ配列は、複数の標的配列を含み得、ここで、１つのシグナリングプローブは各標的配列にハイブリダイズする。上記タグ配列は二次構造を有するＲＮＡであってもよい。上記構造は３アーム接合構造であってもよい。ＤＮＡは複数のタグ配列を含み得る。上記タグ配列はＤＮＡによってコードされるＲＮＡと同一のＲＮＡとして転写されてもよく、あるいはタグ配列は別個のＲＮＡとして転写されてもよい。また、ＲＮＡおよびタグ配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物が提供される。タグ配列は本明細書中に記載されたもののいずれか１つであり得る。ＤＮＡ構築物を含む細胞およびベクターも提供される。
【０２３５】
本発明はまた、少なくとも１，０００個、少なくとも８００個、少なくとも６００個、少なくとも５００個、少なくとも４００個、少なくとも２００個、少なくとも１００個または少なくとも５０個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーを提供し、ここで、各細胞株は安定に組み込まれた発現された配列を含む。また、少なくとも５００個、少なくとも４００個、少なくとも３００個、少なくとも２００個、少なくとも２００個、少なくとも１００個、少なくとも５０個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーも提供され、ここで、各細胞株は少なくとも２つの安定に組み込まれた配列を含む。また、少なくとも１００個、少なくとも５０個、少なくとも２５個、少なくとも１０個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーが提供され、ここで、各細胞株は少なくとも３つの安定に組み込まれた配列を含む。また、少なくとも５０個、少なくとも２５個、少なくとも２０個、少なくとも１０個の細胞株を含む哺乳動物細胞株のライブラリーが提供され、ここで、各細胞株は少なくとも４つの安定に組み込まれた配列を含む。これらの細胞株における安定に組み込まれた配列はさらに、選択マーカー、例えば、薬物耐性遺伝子を欠いていてもよい。安定に組み込まれた配列は、既知または未知の配列同一性のものであってよい。これらの配列は共有された配列相同性、機能的重要性、または関連する起源を有し得る。これらのライブラリーは、例えば、細胞ベースのスクリーニングアッセイにおいて種々の目的で用いることができる。
【０２３６】
本発明はまた、シグナリングプローブを用いて細胞における標的の検出を増強する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、標的配列を含む細胞にシグナリングプローブを導入する工程であって、ここで、上記シグナリングプローブは上記標的配列とのハイブリダイゼーションの際に検出可能なシグナルを生じる工程、上記細胞を試験化合物に暴露する工程、および、細胞によって生じたシグナルを検出する工程を包含し、ここで、上記試験化合物に暴露されなかった細胞によって生じたシグナルと比較して上記試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加は、上記試験化合物が、シグナリングプローブを用いて細胞における標的の検出を増強する化合物であることを示す。
【０２３７】
本発明はまた、シグナリングプローブの細胞への導入を媒介または改良する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、試験化合物の存在下でシグナリングプローブに細胞を暴露する工程であって、上記細胞は標的配列を含み、上記シグナリングプローブは上記標的配列とのハイブリダイゼーションの際にシグナルを生じる工程、および上記細胞によって生じたシグナルを検出する工程を包含し、ここで、上記試験化合物に暴露されなかった細胞と比較して上記試験化合物に暴露された細胞によって生じたシグナルの増加は、上記試験化合物が、シグナリングプローブの細胞への導入を媒介または改良する化合物であることを示す。
本発明のこれらおよび他の局面は以下の詳細な説明から理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】図１は、２つの別個の鎖を有するシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の１つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色および灰色の楕円形は異なるフルオロフォアを示す。
【図２】図２は、２つの別個の鎖を有するシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の１つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色および灰色の楕円形は異なるフルオロフォアを示す。
【図３】図３は、ステム−ループ構造を有するように設計されたシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の１つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色楕円形はフルオロフォアを示す。
【図４】図４は、ステム−ループ構造を有するように設計されたシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の１つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色楕円形はフルオロフォアを示す。
【図５】図５は、ステム−ループ構造を有するように設計されたシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の１つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色楕円形はフルオロフォアを示す。
【図６】図６は、３アーム接合構造を有するシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は、本発明の１つの実施形態を表し、ここで、黒の楕円形はクエンチャー部分を示し、白色楕円形はフルオロフォアを示す。
【図７】図７は、ダンベル構造を有するシグナリングまたはプロテアーゼプローブを示す。相互作用する化学基は楕円形として示す。異なる楕円形は本発明の１つの実施形態を表し、ここで、暗い楕円形はクエンチャー部分を示し、白色楕円形はフルオロフォアを示す。
【図８】図８は、蛍光プローブＦＰ１の配列および予測される天然立体配座を示す。ＦＰ１配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルＡは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）に従ってＤＮＡ折り畳みプログラムを用いて予測した配列の構造を示す。パネルＢは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐで利用可能なｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ３．０ソフトウェアに従って予測されるＦＰ１配列の自己二量体化を示す。両方のパネルＡおよびＢにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。
【図９】図９は、蛍光プローブＦＰ２の配列および予測される天然立体配座を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルＡは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）に従ってＤＮＡ折り畳みプログラムを用いて予測した配列の構造を示す。影をつけた領域の全てまたは一部はワトソン−クリック塩基対を形成するようであり、それにより、３アーム接合を形成するようである。パネルＢは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐで入手可能なｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ３．０ソフトウェアに従って予測されるＦＰ２配列の自己二量体化を示す。両方のパネルＡおよびＢにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。
【図１０】図１０は、蛍光プローブＦＰ３の配列および予測される天然立体配座を示す。ＦＰ３配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。図面は、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐで利用可能なｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ  ３．０ソフトウェアに従って予測されるＦＰ３配列の自己二量体化を示す。フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。
【図１１】図１１は、蛍光プローブＦＰ４の配列および予測される天然立体配座を示す。ＦＰ４配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。図面は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）に従ってＤＮＡ折り畳みプログラムを用いて予測した配列の構造を示す。フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。
【図１２】図１２は、蛍光プローブＦＰ５の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング配列は下線を施す。
【図１３】図１３は、蛍光プローブＦＰ６の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング配列は下線を施す。
【図１４】図１４は、蛍光プローブＦＰ７の配列および予測される天然立体配座を示す。ＦＰ７配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐで利用可能なｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ  ３．０ソフトウェアに従って予測されるＦＰ７配列の自己二量体化が示される。フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。
【図１５】図１５は、蛍光プローブＦＰ８の配列および予測される天然立体配座を示す。ＦＰ８配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基には下線を施す。パネルＡは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）に従ってＤＮＡ折り畳みプログラムを用いて予測した配列の構造を示す。パネルＢは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐで利用可能なｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ  ３．０ソフトウェアに従って予測されるＦＰ１配列の自己二量体化を示す。両方のパネルＡおよびＢにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。
【図１６】図１６は、蛍光プローブＦＰ９の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。
【図１７】図１７は、蛍光プローブＦＰ１０の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。
【図１８】図１８は、蛍光プローブＦＰ１１の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。
【図１９】図１９は、蛍光プローブＦＰ１２の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。
【図２０】図２０は、蛍光プローブＦＰ１３の配列を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。
【図２１】図２１は、蛍光プローブＦＰ１４の配列および予測される天然立体配座を示す。ＦＰ１４配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。図面は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）に従ってＤＮＡ折り畳みプログラムを用いて予測される配列の構造を示す。フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。
【図２２】図２２は、それぞれ、蛍光プローブＦＰ１５の配列および予測される天然立体配座を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルＡは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）に従ってＤＮＡ折り畳みプログラムを用いて予測される配列の構造を示す。パネルＢは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐで利用可能なｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ  ３．０ソフトウェアに従って予測されるＦＰ１５配列の自己二量体化を示す。両方のパネルＡおよびＢにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。
【図２３】図２３は、それぞれ、蛍光プローブＦＰ１６の配列および予測される天然立体配座を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルＡは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）に従ってＤＮＡ折り畳みプログラムを用いて予測される配列の構造を示す。パネルＢは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐで利用可能なｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ  ３．０ソフトウェアに従って予測されるＦＰ１５配列の自己二量体化を示す。両方のパネルＡおよびＢにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。
【図２４】図２４は、それぞれ、蛍光プローブＦＰ１７の配列および予測される天然立体配座を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルＡは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）に従ってＤＮＡ折り畳みプログラムを用いて予測される配列の構造を示す。パネルＢは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐで利用可能なｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ  ３．０ソフトウェアに従って予測されるＦＰ１５配列の自己二量体化を示す。両方のパネルＡおよびＢにおいて、フランキング塩基は灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。
【図２５】図２５は、ＦＡＣＳプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図２５Ａは、シグナリングプローブＦＰ１に暴露されたコントロールＮＩＨ３Ｔ３細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６３３をＦＰ１で用いた。コントロールＮＩＨ３Ｔ３細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図２５Ｂは、シグナリングプローブＦＰ１に暴露されたトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、図４２Ａに示された、目的のＲＮＡおよびタグ１配列をコードするＤＮＡを含んでいた。図２５Ｃは図２５Ａおよび２５Ｂの重なりである。図２５Ｃは、ＦＡＣＳが、トランスフェクトされてないコントロール細胞から、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を識別することを示す。
【図２６】図２６は、ＦＡＣＳプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図２６Ａは、シグナリングプローブＦＰ２に暴露されたコントロールＮＩＨ３Ｔ３細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６８０をＦＰ２で用いた。コントロールＮＩＨ３Ｔ３細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図２６Ｂは、シグナリングプローブＦＰ２に暴露されたトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、図４２Ｂに示された、目的のＲＮＡおよびタグ２配列をコードするＤＮＡを含んでいた。図２６Ｃは、図２６Ａおよび２６Ｂの重なりである。図２６Ｃは、ＦＡＣＳが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から識別することを示す。
【図２７】図２７は、ＦＡＣＳプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図２７Ａは、シグナリングプローブＦＰ３に暴露されたコントロールＮＩＨ３Ｔ３細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアフルオレセインをＦＰ３で用いた。コントロールＮＩＨ３Ｔ３細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図２７Ｂは、シグナリングプローブＦＰ３に暴露されたトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、図４２Ｃで示された、目的のＲＮＡおよびタグ３配列をコードするＤＮＡを含んでいた。図２７Ｃは、図２７Ａおよび２７Ｂの重なりである。図２７Ｃは、ＦＡＣＳが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から識別することを示す。
【図２８】図２８は、ＦＡＣＳプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図２８Ａは、シグナリングプローブＦＰ１に暴露されたコントロールＨｅＬａ細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアフルオレセインをＦＰ１で用いた。コントロールＨｅＬａ細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図２８Ｂは、シグナリングプローブＦＰ１に暴露されたトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、逆ｖａｖ  ＲＮＡをコードするＤＮＡを含んでいた。図２８Ｃは、図２８Ａおよび２８Ｂの重なりである。図２８Ｃは、ＦＡＣＳが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から識別することを示す。
【図２９】図２９は、ＦＡＣＳプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図２９Ａは、シグナリングプローブＦＰ８に暴露されたコントロールＨｅＬａ細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアフルオレセインをＦＰ８で用いた。コントロールＨｅＬａ細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図２９Ｂは、シグナリングプローブＦＰ８に暴露されたトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は逆ｖａｖ  ＲＮＡをコードするＤＮＡを含んでいた。図２９Ｃは、図２９Ａおよび２９Ｂの重なりである。図２９Ｃは、ＦＡＣＳが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から区別することを示す。
【図３０】図３０は、ＦＡＣＳプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図３０Ａは、シグナリングプローブＦＰ５に暴露されたコントロールＨｅＬａ細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアフルオレセインをＦＰ５で用いた。コントロールＨｅＬａ細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図３０Ｂは、シグナリングプローブＦＰ５に暴露されたトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、逆ｖａｖ  ＲＮＡをコードするＤＮＡを含んでいた。図３０Ｃは、図３０Ａおよび３０Ｂの重なりである。図３０Ｃは、ＦＡＣＳが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から識別することを示す。
【図３１】図３１は、ＦＡＣＳプロセスの間に蛍光強度を参照して観察された細胞の数を示す。図３１Ａは、シグナリングプローブＦＰ９に暴露されたコントロールＨｅＬａ細胞についてのプロフィールを示す。フルオロフォアフルオレセインをＦＰ９で用いた。コントロールＨｅＬａ細胞はプラスミドでトランスフェクトされておらず、標的配列を含まない。図３１Ｂは、シグナリングプローブＦＰ９に暴露されたトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞についてのプロフィールを示す。トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、逆ｖａｖ  ＲＮＡをコードするＤＮＡを含んでいた。図３１Ｃは、図３１Ａおよび３１Ｂの重なりである。図３１Ｃは、ＦＡＣＳが、標的配列をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクトされていないコントロール細胞から識別することを示す。
【図３２】図３２は、逆向きにクローン化されたｖａｖ（ｒ−ｖａｖという）の配列の一部、ならびに薬物耐性遺伝子をコードする発現プラスミドでトランスフェクトされた薬物選択ＨｅＬａ細胞の蛍光画像を示す。細胞を、ｒ−ｖａｖ内の同一標的配列（５’ＧＴＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡ３’）を認識するように設計された蛍光プローブ（ＦＰ）に暴露した。画像は、Ｆａｍから蛍光を検出するように設計された蛍光顕微鏡およびフィルターを用いて得られた。全てのＦＰを、ここでは、フルオレセインを用いて標識されたＦＰ１を除くＦＡＭを用いて標識した。パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、それぞれ、ＦＰ１０、ＦＰ１１、ＦＰ１２およびＦＰ１３に暴露した。
【図３３】図３３は、ＦＰ１５によって認識されるように設計されたＲＮＡおよびタグ配列をコードする構築物でトランスフェクトされた（パネルＡ、Ｂ、Ｄ）、またはタグ配列ではなく同一のＲＮＡをコードするコントロール構築物でトランスフェクトされた（パネルＣまたはＥ）細胞の蛍光画像を示す。用いたタグ配列を６−５、６−７、または６Ｂ１０と名付け、これは、それぞれ、ＦＰ１５が認識するように設計された、標的配列の１、２および３コピーを含む。ＦＰ１５によって認識されるように設計されたタグ配列を含む構築物でトランスフェクトされた細胞（パネルＡ、ＢおよびＤ）はコントロール細胞（パネルＣまたはＥ）よりも大きな蛍光を示した。
【図３４】図３４は、ＦＰ１６によって認識されるように設計されたＲＮＡおよびタグ配列６ＣＡ４をコードする構築物でトランスフェクトされた（パネルＡ）、またはタグ配列ではなく同一のＲＮＡをコードするコントロール構築物でトランスフェクトされた（パネルＢ）細胞の蛍光画像を示す。タグ配列を含む構築物でトランスフェクトされた細胞（パネルＡ）は、コントロール細胞（パネルＢ）よりも大きな蛍光を示した。
【図３５】図３５Ａは、タグ配列の形成に関して選択されたｖａｖ  ＤＮＡ配列の逆相補体（ｒ−ｖａｖ  ＤＮＡ）の一部（下線を施す）を示す。この配列は、ｒ−ｖａｖ  ｍＲＮＡを発現するように設計された発現プラスミドにクローン化された。太字で示された配列は、特定の蛍光プローブについての標的配列である。図３５Ｂは、それらがタグ配列（タグ１配列）を形成するように組み合わされた後における、図３５Ａで下線を施した配列を示す。
【図３６】図３６Ａは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）におけるＲＮＡ折り畳みプログラムを用いてｒ−ｖａｖ  ＲＮＡの一部の予測された構造を示す。図３６Ｂは、図３５Ｂに示されるタグ１配列の予測された構造である。陰影は、蛍光プローブのいくつかによって認識されるように設計された標的配列を示す。
【図３７】図３７Ａ、ＢおよびＣは、図４２に記載されたタグ１配列、タグ２配列およびタグ３配列についての予測される構造を示す。これらの構造は互いに似ているが、蛍光プローブによる認識に関して異なる配列を表す。予測は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）におけるＲＮＡ折り畳みプログラムを用いて行った。
【図３８】図３８は、標的オリゴ配列またはコントロールオリゴ配列の存在下での溶液中のＦＰから発せられた蛍光シグナルを示す。試料はＵＶを照射し、写真を撮影した。ここで用いる全てのＦＰはフルオレセインを組み込んだ。チューブは、それぞれ、ほぼ２．３４ｍＭの最終マグネシウム濃度を有する、５ｕＬの２０ｕＭ  ＦＰストック、１．５ｕＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８ｕＬの２０ｕＭオリゴ、および１．５ｕＬの水からなる合計１６ｕＬを含む。ＦＰ１およびＦＰ１８をここで用い、硫黄結合を、それぞれ、標的オリゴＴＯ−ＦＰ１およびＴＯ−ＦＰ１８を認識するように設計された配列の塩基の間に組み込んで合成した。ＦＰ１は標的オリゴ１（ＴＯ−ＦＰ１  ５’ＧＴＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡ３’）の配列に対して指向し、ＦＰ１８は標的オリゴＦＰ１８（ＴＯ−ＦＰ１８  ５’ＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣ３’）の配列に対して指向する。ＴＯ−ＦＰ１およびＴＯ−ＦＰ１８の配列は、互いの逆相補体であった。ＴＯ−ＦＰ１８はＦＰ１によって標的化されない配列を有し、ＦＰ１についてのコントロールオリゴとして役立った。ＴＯ−ＦＰ１はＦＰ１８によって標的化されない配列を有し、ＦＰ１８についてのコントロールオリゴとして役立った。全てのパネルにおけるチューブの組成を以下に示す：
【化２】
2010246570.tif 000002
この図面は、試験したＦＰのそれぞれが、非標的化配列を有するオリゴを含有するコントロールチューブと比較して標的化された配列を有するオリゴを含有するチューブにおいてより大きなシグナルを発することによって、標的配列の存在を特異的に報告することを示す。標的配列を含むオリゴの存在下でＦＰを含有するチューブは星印によって示される。
【図３９】図３９は、標的オリゴ配列またはコントロールオリゴ配列の存在下での溶液中のＦＰから発せられた蛍光シグナルを示す。試料はＵＶを照射し、写真を撮影した。ここで用いる全てのＦＰはＦＡＭを組み込んだ。パネルＡ、Ｂ、Ｃは、それぞれ、同一ＦＰが加えられた４つのチューブを示す。各チューブは、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２に補充されたＰＢＳ中の２μＬの２０μＭ  ＦＰストックおよび１μＬの１００μＭオリゴストックを含有する合計１０μＬを含有する。各パネルにおいて、チューブ１はオリゴストックを含有せず、その代わり、１ｕＬの水を含有し、チューブ２はオリゴＴＯ−Ｍ１を含有し、チューブ３はオリゴＴＯ−Ｍ２を含有し、およびチューブ４はオリゴＴＯ−Ｍ３を含有した。ＦＰによって認識されるように設計された配列を含むオリゴと共に、各パネルで試験されたＦＰを以下に列挙する：
【化３】
2010246570.tif 000003
この図面は、試験したＦＰのそれぞれが、オリゴを含有しないか、または非標的化配列を有するオリゴを含有するコントロールチューブと比較して、標的化配列を有するオリゴを含有するチューブにおいてより大きなシグナルを発することによって、標的配列の存在を特異的に報告することを示す。標的配列を含むオリゴの存在下でＦＰを含有するチューブを星印によって示す。ＴＯ−Ｍ１、ＴＯ−Ｍ２およびＴＯ−Ｍ３についての５’〜３’方向の配列を以下に列挙する：
【化４】
2010246570.tif 000004
【図４０】図４０は、標的オリゴ配列またはコントロールオリゴ配列の存在下で溶液中のＦＰから発せられた蛍光シグナルを示す。試料はＵＶを照射し、写真を撮影した。ここで用いた全てのＦＰはＦＡＭを組み込んだ。ＦＰ１、ＦＰ２およびＦＰ３は、それぞれ、パネルＡ、パネルＢおよびパネルＣで試験し、それぞれは、図４２に記載されるように、それぞれ、タグ１、タグ２およびタグ３に組み込まれた関連標的配列を認識するように設計されている。標的配列を含むオリゴの存在下でＦＰを含有するチューブを星印によって示す。パネルＡ、Ｂ、Ｃについてのプロトコルは図３９についてのプロトコルに従い、試料を以下に記載する：
【化５】
2010246570.tif 000005
【図４１】図４１は、蛍光プローブＦＰ１８の配列および予測される天然立体配座を示す。上記配列は、標的配列およびさらなるフランキング塩基に対して相補的となるように設計された塩基を含む。フランキング塩基は下線を施す。パネルＡは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）に従ってＤＮＡ折り畳みプログラムを用いて予測された配列の構造を示す。パネルＢは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐで利用可能なｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ  ３．０ソフトウェアに従って予測されるＦＰ２配列の自己二量体化を示す。両方のパネルＡおよびＢにおいて、フランキング塩基を灰色で影をつけ、白色および黒色の楕円形は、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を示す。
【図４２】図４２Ａ、ＢおよびＣは蛍光プローブによって認識される３つのタグ配列を示す。図４２Ａ、ＢおよびＣにおいて、標的配列を太文字で示し、それらを図４２Ｄにおいても示す。第一の配列（タグ１、４２Ａ）は図３５Ｂに示した配列と同一である。次の２つの配列（タグ２、４２Ｂおよびタグ３、４２Ｃ）はタグ１の改変されたバージョンである。標的１と比較した標的２および標的３の配列の違いを、パネルＤにおいて下線を施す。さらなる配列の変化を残りのタグ配列で行って、示された部分でなされた変化を補う。
【図４３】図４３は、タグ１配列からのタグ２配列の設計を示す。Ａ〜Ｆは、設計の間になされた連続的な塩基変化を示す。
【図４４】図４４は、タグ１配列からのタグ３配列の設計を示す。Ａ〜Ｆは、設計の間になされた連続的な塩基変化を示す。
【図４５】図４５は、本発明の方法に従って単離された細胞が生きていることを示す。パネルＡは、細胞を、それぞれが、タグ１、タグ２およびタグ３でタグが付された目的のＲＮＡをコードする３つのＤＮＡ構築物でトランスフェクトした後に、ＦＡＣＳを用いて単離された細胞を示す。細胞を薬物選択し、ＦＰ１、ＦＰ２およびＦＰ３に暴露し、単離した。３つのプローブのそれぞれについての細胞の蛍光強度は、いずれのＤＮＡ構築物によってもトランスフェクトされていないコントロール細胞と比較してバックグラウンド強度を超えるものであった。細胞を、直接的に、ＦＡＣＳによって９６ウェルプレートのウェル中で個々に平板培養し、その単離の後に直ちに１つを画像化した。パネルＢは、それをウェルの表面に付着させた後における、１時間後の同一細胞を示す。パネルＣは、それが細胞分裂を受けた後、翌日の同一細胞を示す。３つのパネルは、それぞれ、細胞をプローブに暴露するのに用いた試薬のこれまでに未知の効果にもかかわらず、上記方法に従って単離された細胞が生きたままであることを示す。これらの効果は、細胞の原形質膜を損ない、そしておそらくは、さらに、細胞をＦＡＣＳの間に高い圧力に供することを含む。パネルＡは、細胞膜が損なわれていることが見出されていないことを示し、パネルＢおよびＣは、さらに、細胞が生きていることを実証する。なぜならば、それは、培養皿の表面に付着し得、分裂し得、その両方は生きた細胞の特性だからである。
【図４６】図４６は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ１でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図４７】図４７は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ２でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図４８】図４８は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ３でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図４９】図４９は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ４でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図５０】図５０は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ５でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図５１】図５１は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ６でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図５２】図５２は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ７でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図５３】図５３は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ８でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図５４】図５４は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ９でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図５５】図５５は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ１０でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図５６】図５６は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ１１でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図５７】図５７は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ１２でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図５８】図５８は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ１３でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図５９】図５９は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ１４でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図６０】図６０は、コントロール細胞と比較した、ｍｃｏｎ１５でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２３９】
（発明の詳細な説明）
他の定義がなされない限り、本明細書中で用いる全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって共通に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中で言及する全ての刊行物および他の文献は、本明細書においてその全体が参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。
【０２４０】
プローブに関連して用いられる用語「隣接」とは、相互作用する対が相互に機能的に相互作用することを可能とする、近接条件をいう。例えば、近接条件は、クエンチャー部位がフルオロフォアを消光するかもしくは部分的に消光すること、またはプロテアーゼインヒビターがプロテアーゼを阻害するかもしくは部分的に阻害することを可能にする。現在公知のフルオロフォアおよびクエンチャーが相互作用するために必要な距離は約２０〜１００Åである。
【０２４１】
用語「塩基対」とは、ワトソン−クリック塩基対をいう。
【０２４２】
用語「バルジ（ｂｕｌｇｅ）領域」とは、塩基対形成されていない、１つのヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの一本鎖領域をいう。バルジヌクレオチドは、相互に相補的な領域の間にあり得る（例えば、図４Ａ）。
【０２４３】
用語「ダンベル構造」とは、ステム領域の各々からのアームの末端を介して連結された２つのステム−ループ構造の高次構造を有する核酸または修飾された核酸の鎖をいう（例えば、図７）。結合は非相補的領域、または修飾された、または修飾されていないホスホジエステル結合であり得る。
【０２４４】
用語「相互作用する対」とは、相互に隣接した場合、および相互に隣接しない場合、機能的に相互作用し、シグナルのない状態または相互作用する化学基によって生じたバックグラウンドシグナルと比較して、検出可能なシグナルを生じるか、あるいは相互作用する化学基によって生じたシグナルとは異なるシグナルを生じる２つの化学基をいう。相互作用する対としては、フルオロフォアおよびクエンチャー、化学発光標識およびクエンチャーもしくはアダクト、色素ダイマーおよびＦＲＥＴのドナーとアクセプター、またはその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。シグナリングプローブは１つより多くの相互作用する対を含むことができる。例えば、波長シフトシグナリングプローブは、共にクエンチャーと相互作用する、第一のフルオロフォアおよび第二のフルオロフォアを有し、この２つのフルオロフォアはＦＲＥＴドナーとアクセプターとの対である。
【０２４５】
用語「ループ領域」とは、塩基対形成していない、１つより多くのヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの一本鎖領域をいう（例えば、図４Ｂおよび図２３Ａ）。ループは相互に相補的な領域の間にあることもできる（図８Ａ）。
【０２４６】
用語「シグナリングプローブ」とは、標的核酸配列に相補的な配列、および少なくとも１つの相互に相補的な領域を含み、さらに、少なくとも１つの相互作用する対を含むプローブをいう。シグナリングプローブがその標的配列に結合しない場合、相互作用する対の部分は、全くシグナルが生じないようにか、またはほとんどシグナルが生じないようにか、または異なるシグナルが生じないように、相互に隣接する。シグナリングプローブは標的配列に結合する場合、相互作用する対の部分はもはや相互に隣接せず、検出可能なシグナル、またはその未結合状態のプローブによって生じたシグナルとは異なるシグナルが生じる。１つの実施形態において、シグナリングプローブはフルオロフォアおよびクエンチャー部分を含む蛍光原性プローブまたは蛍光プローブであり、蛍光の変化は標的配列へのハイブリダイゼーションに際して生じる。相互作用する対の部分はシグナリングプローブの末端に結合することができるか、あるいは核酸配列内に結合させることができる。シグナリングプローブの配列の内部に取り込むことができる部分の例としては、クエンチャー：ｄａｂｃｙｌ  ｄＴ、ＢＨＱ２  ｄＴ、およびＢＨＱ１  ｄＴ、およびフルオロフォア：フルオレセインｄＴ、Ａｌｅｘａ  ｄＴ、およびＴａｍｒａ  ｄＴが挙げられる。
【０２４７】
用語「プロテアーゼプローブ」とは、標的配列に相補的な配列、および少なくとも１つの相互に相補的な領域を含み、さらに、少なくとも１つのタンパク質分解酵素および少なくとも１つのこのタンパク質分解酵素のインヒビター、または上記酵素を可逆的に不活化することができる別の分子を含む、プローブをいう。プローブが標的配列にハイブリダイズされない場合、タンパク質分解酵素およびタンパク質分解酵素のインヒビターの近接は、それらが、相互作用し、タンパク質分解活性を阻害することを可能とする。プローブの標的配列のハイブリダイゼーションに際して、タンパク質分解酵素およびそのインヒビターが分離され、タンパク質分解酵素を活性化する。タンパク質分解酵素およびインヒビターはプローブに共通結合されても、または非共有的に結合されてもよい。
【０２４８】
用語「ミスマッチ領域」とは、核酸分子または修飾された核酸分子中の二本鎖領域をいい、この領域において、塩基または修飾された塩基は、ワトソン−クリック塩基対形成を形成していない（例えば、図４ＢおよびＣ）。ミスマッチ領域は２つの塩基対形成領域間にある。二本鎖領域は非水素結合性に結合するか、または水素結合して、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対などを形成し得るか、あるいは両方によりＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対などを形成し得る。
【０２４９】
用語「相互に相補的な領域」とは、ワトソン−クリック塩基対形成した、核酸分子中または修飾核酸分子中の領域をいう。
【０２５０】
用語「非相補的領域」とは、ワトソン−クリック塩基対形成していない、核酸分子中または修飾核酸分子中の領域をいう。例えば、非相補的領域は、バルジヌクレオチド、一本鎖ループ、５’末端もしくは３’末端における突出ヌクレオチド、またはミスマッチ領域を有するように設計され得る。
【０２５１】
用語「ステム領域」とは、少なくとも２つのワトソン−クリック塩基対を有する核酸分子または修飾された核酸分子中の領域をいう。例えば、ステム領域は、非相補的領域によって連結された１つより多くの相互に相補的な領域を有するか、あるいは連続的な相互に相補的領域を形成するように設計され得る。
【０２５２】
用語「ステム−ループ構造」とは、５’および３’オリゴヌクレオチド対のアームまたは５’および３’修飾オリゴヌクレオチド対のアームによって近接された、一本鎖ループ配列を持つ、核酸分子または修飾核酸分子をいう（例えば、図４）。５’および３’アームはステム領域を形成する。
【０２５３】
用語「３アーム接合構造」とは、ステム領域と、ステム領域のアームを介して一緒に連結された、第一のステム−ループ領域と、第二のステム−ループ領域との高次構造を有する、核酸または修飾核酸の鎖をいう（例えば、図６）。第一のステム−ループ領域は第二のステム−領域に対して５’側である。この３つの領域は、非相補的領域、ホスホジエステル結合もしくは修飾されたホスホジエステル結合、またはその組合せを介して結合され得る。
【０２５４】
（シグナリングプローブ）
（相互作用する対）
シグナリングプローブは、１つより多くの相互作用する対を有し得るか、または異なる相互作用する対を有し得る。１つの実施形態において、シグナリングプローブは、蛍光原性プローブである。１つの実施形態において、蛍光原性プローブは、そのハイブリダイズしていない状態ではバックグラウンドレベルの蛍光を発しないが、その標的への結合に際してバックグラウンドレベルの蛍光、またはバックグラウンドレベルを超える蛍光を発する。複数のフルオロフォアを用いて、シグナルを増加させ得るか、または異なる色範囲で蛍光を提供し得る。複数のクエンチャーを用いて、標的配列の非存在下においてシグナルを減少させ得るか、または排除し得る。クエンチャーの例としては、ＤＡＢＣＹＬ、ＥＤＡＣ、セシウム、臭化ｐ−キシレン−ビス−ピリジニウム、タリウムおよび金ナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：スルホローダミン１０１、アクリジン、５−（２’−アミノエチル）アミノアフサリン（ａｍｉｎｏａｐｈｔｈａｌｉｎｅ）−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、テキサスレッド、エオシン、およびＢｏｄｉｐｙおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０、アロフィコシアニン、アミノクマリン、Ｂｏｄｉｐｙ−ＦＬ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、カスケードブルー、ＡＰＣ−Ｃｙ５、ＡＰＣ−Ｃｙ５．５、ＡＰＣ−Ｃｙ７、クマリン、ＥＣＤ（Ｒｅｄ６１３）、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ヘキサクロルフルオレセイン（ＨＥＸ）、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミンＢ（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ）、ルシファーイエロー、メトキシクマリン、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＰＥ−Ｃｙ７結合体、ＰｅｒＣ、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド−Ｘ、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、ＴＲＩＴＣ、テトラメチルローダミン、テキサスレッド−Ｘ、ＴＲＩＴＣ、ＸＲＩＴＣ、およびクアンタムドット（Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ）。例えば、本明細書において参考として援用される、Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：４９−５３、（１９９８）およびＤｕｂｅｒｔｒｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：３６５−３７０（２００１）参照。
【０２５５】
また、本発明は、波長シフト性シグナリングプローブも提供する。１つの実施形態において、このプローブの１つの末端は、少なくとも１つのハーベスター（ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）フルオロフォアおよびエミッター（ｅｍｉｔｔｅｒ）フルオロフォアを有し、このプローブの隣接末端は、少なくとも１つのクエンチャー部位を有する。例えば、本明細書において参考として援用される、Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，１１９１−１１９６（２０００）参照。１つの実施形態において、ハーベスターフルオロフォアおよびエミッターフルオロフォアは、同一末端におけるものであり、ここで、エミッターフルオロフォアは、遠位末端にあり、クエンチャー部位は、ハーベスターフルオロフォアに対して反対の末端におけるものである。エミッターフルオロフォアは、数個のヌクレオチドのスペーサーアームによってハーベスターフルオロフォアから分離され得る。ハーベスターフルオロフォアは、単色光源の波長範囲において強く吸収する。標的配列の非存在下では、双方のフルオロフォアは、消光される。標的の存在下で、プローブは、エミッターフルオロフォアの放射範囲において蛍光を発する。放射スペクトルにおけるシフトは、蛍光共鳴エネルギー移動による、ハーベスターフルオロフォアからエミッターへの吸収されたエネルギーの移動によるものである。これらのタイプのシグナリングプローブは、単色光源から効果的にエネルギーを吸収できないフルオロフォアを含有するシグナリングプローブよりも強いシグナルを提供することができる。１つの実施形態において、ハーベスターフルオロフォアはフルオレセインであって、エミッターフルオロフォアは、６−カルボキシローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミンまたはテキサスレッドである。
【０２５６】
別の実施形態において、プローブの１つの末端は、少なくとも１つのフルオロフォア  Ｆ１を有し、および別の隣接末端は、少なくとも１つの別のフルオロフォア  Ｆ２を有する。２つのフルオロフォアは、それらが密に近接する場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こるように選択される。プローブがその標的配列に結合していない場合、Ｆ１の吸収バンドにおける励起に際して、Ｆ１の蛍光はＦ２によって消光され、Ｆ２の蛍光が観察される。プローブがその標的配列に結合している場合、ＦＲＥＴは、低下するかまたは排除され、Ｆ１の蛍光は上昇する一方、Ｆ２の蛍光は減少するかまたは消失する。蛍光強度のこの差はモニターすることができ、Ｆ１およびＦ２の蛍光の間の比率が計算され得る。残存蛍光が時々フルオロフォア−クエンチャー系で観察されるので、この系は標的配列の定量的検出でより有利である。本明細書において参考として援用される、Ｚｈａｎｇら、Ａｎｇｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４０，２，ｐｐ．４０２−４０５（２００１）参照。ＦＲＥＴドナー−アクセプター対の例としては、各々、クマリン基および６−カルボキシフルオレセイン基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５７】
１つの実施形態において、シグナリングプローブは、発光標識とアダクトとの対を含む。アダクトと発光標識との相互作用は、標識から生じたシグナルを減少させる。本明細書において参考として援用される、ＢｅｃｋｅｒおよびＮｅｌｓｏｎの米国特許第５，７３１，１４８号参照。
【０２５８】
別の実施形態において、シグナリングプローブは、少なくとも１つの色素ダイマーを含む。プローブが標的配列に結合すると、色素からのシグナルは、ダイマーの構造である色素のシグナルとは異なる。
【０２５９】
なお別の実施形態において、相互作用する対は、酵素およびその酵素のインヒビター、例えば、ヌクレアーゼおよびヌクレアーゼインヒビター、キナーゼおよびキナーゼのインヒビター、プロテアーゼおよびプロテアーゼのインヒビター、ホスファターゼおよびホスファターゼのインヒビター、カスパーゼおよびカスパーゼのインヒビター、またはリボザイムおよびリボザイムのインヒビター、または抗原、およびその抗原に特異的に結合する（その結果、検出されたプローブの標的が、抗原の特異的細胞局在部、例えば、ニューロンのシナプスなどへ運ばれ得る）抗体であり得る。
【０２６０】
（シグナリングプローブおよびプロテアーゼプローブまたは他のプローブの高次構造）
（二本鎖構造）
本発明は、相互に対してアニールするか、または少なくとも１つの相互に相補的な領域を形成するように設計された核酸の少なくとも２つの別々の鎖を含む、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブを提供する。１つの鎖の少なくとも１つの末端は、他の鎖の末端に隣接する（図１）。この核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。２つの鎖は、自己ダイマーを形成する同一の鎖であり得る（図８Ｂ）。これらの鎖は、配列が同一でなくてもよい。
【０２６１】
２つの別々の鎖は、十分に相補的であるか、相補的領域および非相補的領域を含むように設計することができる。１つの実施形態において、２つの別々の鎖は、互いに対して十分に相補的であるように設計される。１つの実施形態において、２つの鎖は、各末端において、４〜９個、５〜６個、２〜１０個、１０〜４０個、または４０〜４００個の連続する塩基対の相互に相補的な領域を形成する（例えば、図８、９、１５、２２、２４または４１参照）。鎖は、５〜７、８〜１０、１１〜１５、１６〜２２、３０を超える、３〜１０、１１〜８０、８１〜２００、または２００を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むことができる。２つの鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有することができる（図２）。例えば、１つの鎖は他の鎖よりも長くてよい（図２Ｃ）。１つの実施形態において、１つの鎖の５’末端が他の鎖からずれているか、またはその鎖の３’末端が他の鎖からずれているか、またはその双方であり、ここで、このずれは、ヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドで１０個まで、２０個まで、または３０個までである。
【０２６２】
標的配列にハイブリダイズする領域は、一方もしくは両方の鎖の相補的な領域、非相補的な領域、またはそれらの組合せ中にあり得る。１つより多くの標的核酸配列が、同一のシグナリングプローブによって標的され得る。１つ以上の標的は、同一または異なる配列上にあってよく、そしてそれらは標的に結合するように設計されたプローブの部分に対して正確に相補的であり得るか、または少なくとも十分に相補的であり得る。１つの実施形態において、２つの鎖は、各末端において相互に相補的な領域を形成し、標的相補的配列は、末端においてこの相互に相補的な領域以外の領域に存在する（図８Ｂ）。
【０２６３】
１つの実施形態において、少なくとも２つの別々の鎖を持つシグナリングプローブは、蛍光原性プローブである。１つの実施形態において、１つの鎖は、１つの末端に少なくとも１つのクエンチャー部分を有し、他の鎖の隣接する末端にフルオロフォアを有する（図１）。１つの実施形態において、１つの鎖の５’末端および３’末端の各々は、同一または異なるフルオロフォアを有し、および他の鎖の５’末端および３’末端の各々は、同一または異なるクエンチャー部分を有する（図１Ｂおよび２Ａ）。１つの実施形態において、１つの鎖の５’末端は、フルオロフォアを有し、かつ３’末端は、クエンチャー部分を有し、そして他の鎖の３’末端は、同一または異なるクエンチャー部分を有し、かつ５’末端は、同一または異なるフルオロフォアを有する（図１Ｃおよび２Ｂ）。
【０２６４】
プロテアーゼプローブでは、１つの実施形態において、１つの鎖は、１つの末端に少なくとも１つのタンパク質分解酵素を有し、および他の鎖の隣接する末端にこのタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。１つの実施形態において、１つの鎖の５’末端および３’末端の各々は、タンパク質分解酵素を有し、そして他の鎖の５’末端および３’末端の各々は、このタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。１つの実施形態において、１つの鎖の５’末端はタンパク質分解酵素を有し、かつ３’末端はこのタンパク質分解酵素のインヒビターを有し、そして他の鎖の３’末端はこのタンパク質分解酵素のインヒビターを有し、かつ５’末端はタンパク質分解酵素を有する。
【０２６５】
（ステム−ループ構造）
もう１つの実施形態において、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブは、少なくとも１つの相互に相補的な領域と少なくとも１つの非相補的領域とを含む、核酸または修飾核酸の鎖である。１つの実施形態において、プローブは、ステム−ループ構造を形成する。ステム領域は、相互に相補的であり得るか、または相互に相補的な領域と非相補的領域とを含み得る（図４）。例えば、ステム領域は、塩基対形成していないバルジヌクレオチドを有することができる（図４）。また、ステム領域は、塩基対形成していない５’末端または３’末端において、突出ヌクレオチドを含むこともできる（図３Ｂおよび３Ｃ）。
【０２６６】
ステム領域が十分に相補的な場合、ステム領域は、３〜４個、５〜６個、７〜８個、９〜１０個、２〜６個、７〜１０個、または１１〜３０個の塩基対を含むことができる（例えば、図３および５参照）。ループ領域は、１０〜１６個、１７〜２６個、２７〜３６個、３７〜４５個、３〜１０個、１１〜２５個、または２５〜６０個のヌクレオチドを含有することができる。１つの実施形態において、ステム領域は４〜１０個、４個または５個の連続する塩基対を形成する（例えば、図２３参照）。
【０２６７】
１つの実施形態において、ステム−ループ構造は、２つの化学基を含む少なくとも１つの相互作用する対を含み、１つの化学基は鎖の各末端にある。１つの実施形態において、シグナリングプローブは、少なくとも１つのフルオロフォアおよびクエンチャー部分を鎖の各末端に有する（図３、４および５）。プロテアーゼプローブは、少なくとも１つのタンパク質分解酵素およびこのタンパク質分解酵素のインヒビターを鎖の各末端に有する。
【０２６８】
１つの実施形態において、ステム領域は、非相補的領域を介して連結した２つの相互に相補的な領域を含み、相互作用する対に隣接する相互に相補的な領域は、５〜９個の塩基対を形成し、およびループ領域に隣接する相互に相補的な領域は、４〜５個の塩基対を形成する（図８、１５、２１、２２、２４または４１）。１つの実施形態において、非相補的領域は、一本鎖ループ領域（図８）、ミスマッチ領域（図１５）、または両方である。別の実施形態において、ステム領域は、２つの非相補的領域を介して連結された３つの相互に相補的な領域を含み、相互作用する対に隣接する第一の相互に相補的な領域は、４〜５個の塩基対を形成し、第二の相互に相補的な領域は、２〜３個の塩基対を形成し、そしてループ領域に隣接する第三の相互に相補的な領域は、２〜３個の塩基対を形成する。
【０２６９】
ステム−ループ構造において、標的配列に相補的である領域は、１つ以上のステム領域またはループ領域、または両方にあり得る。標的にハイブリダイズするステム領域は、相互に相補的な領域、非相補的領域、または両方にあり得る。１つの実施形態において、標的相補的配列は、一本鎖ループ領域にある。１つの実施形態において、相互作用する対に隣接するステム領域以外の領域は、標的相補的配列である（図８）。１つより多くの標的核酸配列は、同一のプローブによって標的化され得る。１つ以上の標的は、同一でも異なっていてもよく、それらは、標的に結合するように設計されたプローブの部分に対して、正確に相補的であり得るか、あるいは少なくとも十分に相補的であり得る。
【０２７０】
ステム長さの増加は、シグナリングプローブの、それらの閉じた高次構造における安定性を増加させることができ、したがって、検出可能なシグナルの、シグナル  対  ノイズ比を増加させることができる。これらのシグナリングプローブの細胞への暴露は、わずかに上昇した（細胞にとってまだ安全な）温度で、その後常温に戻すことで、行うことができる。より高い温度においては、シグナリングプローブは開き、もし存在すれば、それらの標的に結合する。一旦冷却されると、標的に結合していないシグナリングプローブは、それらの閉じた状態に戻る（これは、ステムの増大した安定性によって助けられる）。同様に、他の力を用いて、同一の結果を達成することができる。例えば、塩基対を緩めると考えられるＤＭＳＯ。
【０２７１】
（３アーム接合構造）
もう１つの実施形態において、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブは、３アーム接合構造を形成する核酸の鎖である（図６Ａおよび６Ｂ）。この構造において、ステム領域および２つのステム−ループ領域は、連結されて、三方接合を形成する。ステム領域は、２〜５個、７〜９個、１０〜１２個の塩基対を含有することができる。ステム−ループ領域のループは、３〜７個、８〜１０個、１１〜１３個のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含有することができる。
【０２７２】
１つの実施形態において、３アーム接合構造は、２つの化学基を含む少なくとも１つの相互作用する対を含み、１つの化学基が、鎖の各末端にある。１つの実施形態において、プローブは、鎖の各末端に、少なくとも１つのフルオロフォアおよびクエンチャー部分を有する。プロテアーゼプローブは、鎖の各末端に、タンパク質分解酵素およびこのタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。
【０２７３】
１つの実施形態において、相互作用する対に隣接するステム領域は、３〜４個、または３〜６個の連続する塩基対を形成し、第一のステム−ループ構造のステム領域は、４〜５個の連続する塩基対を形成し、第二のステム−ループ構造のステム領域は、２〜３個の連続する塩基対を形成する（図９）。１つの実施形態において、３つの領域は、ステム領域のアームを介して、ホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結される。１つの実施形態において、３つの領域は、ステム領域のアームを介して、１個または２個の、ヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結される。
【０２７４】
標的にハイブリダイズするステムにおける領域は、相互に相補的な領域、非相補的領域、または両方に存在し得る。１つの実施形態において、標的相補的配列は、一本鎖ループ領域にある。１つの実施形態において、相互作用する対に隣接するステム領域以外の領域は、標的相補的配列である（図９）。１つより多くの標的核酸配列が、同一プローブによって標的化され得る。１つ以上の標的が同一または異なる配列上に存在でき、そしてそれらは、標的に結合するように設計されたプローブの部分に対して正確に相補的であり得るか、あるいは少なくとも十分に相補的である。
【０２７５】
（ダンベル構造）
別の実施形態において、シグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブは、ダンベル形状構造を形成する核酸の鎖である（図７または１１）。この構造は、２つのステム領域の１つのアームを介して連結された２つのステム−ループ領域である。ステム領域は、３〜５個の、７〜９個の、１０〜１２個の塩基対を含むことができる。ステム−ループ領域のループは、５〜７個の、８〜１０個の、１１〜１３個のヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、ダンベル構造は、３つの連続する塩基対である１つのステム領域、および４つの連続する塩基対である１つのステム領域を有する。１つの実施形態において、２つのステム領域は、１個または２個のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドによって連結される。もう１つの実施形態において、２つのステム領域は、ホスホジエステル結合または修飾されたホスホジエステル結合によって連結される。１つの実施形態において、ステム−ループ構造、ダンベル構造または３アーム接合構造は、３０個を超えるヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを有する。
【０２７６】
１つの実施形態において、シグナリングプローブは、鎖の各末端に少なくとも１つのルオロフォアおよびクエンチャー部位を有する。プロテアーゼプローブは、鎖の各末端に少なくとも１つのタンパク質分解酵素およびこのタンパク質分解酵素のインヒビターを有する。
【０２７７】
標的にハイブリダイズするステムにおける領域は相互に相補的な領域、非相補的領域またはその組合せ中にあり得る。１つの実施形態において、標的相補的配列は、一本鎖ループ領域にある。１つの実施形態において、標的相補的配列は、２つのステム領域以外の領域である。１津より多くの標的核酸配列が、同一プローブによって標的化され得る。１つ以上の標的が同一または異なる配列上に存在でき、そしてそれらは、標的に結合するように設計されたプローブの部分に対して正確に相補的であり得るか、あるいは少なくとも十分に相補的である。
【０２７８】
ＤＮＡまたはＲＮＡ折り畳みプログラムは、所与の核酸または修飾核酸の高次構造を予測するために当該分野で利用可能である。そのような折り畳みプログラムとしては、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）に記載されたプログラム、およびｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐで利用できるｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ  ３．０ソフトウェア（これらは、本明細書において参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような折り畳みプログラムは、しばしば、多数のエネルギー的により好適な構造を予測する。他の実施形態において、本発明は、折り畳みプログラムによって予測されるプローブＦＰ１〜１８の、エネルギー的により好適な構造を包含する（図８ないし２４および４１）。高次構造のエネルギーが自由エネルギーによって測定される場合、より低い自由エネルギー値（負）は、高次構造がよりエネルギー的に好適であることを示す。
【０２７９】
（シグナリングおよびプロテアーゼプローブまたは他のプローブの化学的修飾）
また、本発明は、化学的に修飾されるシグナリングプローブまたはプロテアーゼプローブまたは他のプローブを提供する。糖−ホスホジエステル型の骨格、２’ＯＨ、塩基のうちの１つ以上が修飾され得る。ホスホジエステル結合の置換としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：−ＯＰ（ＯＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＳＨ）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ−Ｍ＋）（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ２）ＮＨ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ３）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）（Ｏ）Ｏ−、−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）２ＮＨ−。Ｍ＋は無機カチオンまたは有機カチオンである。上記骨格はペプチド核酸でもあり得、ここで、デオキシリボースリン酸骨格は、偽（ｐｓｅｕｄｏ）ペプチド骨格によって置き換えられている。ペプチド核酸は、以下によって記載されているＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：５−２３、１９９６、ならびにＨｙｄｉｇ−ＨｉｅｌｓｅｎおよびＧｏｄｓｋｅｓｅｎ，ＷＯ９５／３２３０５（これらの各々は、本明細書により、参考として本明細書において援用される）。
【０２８０】
糖の２’位は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ＝０、１．．．３０）、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＯＣＨ３を含むが、これらに限定されない。Ｃ１〜Ｃ４アルコキシおよびＣ１〜Ｃ６アルキルは、直鎖、分岐鎖または環状である基であり得るか、またはそれを含み得る。
【０２８１】
ヌクレオチドの塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、イノシン、または上記の修飾されたもののうちの、いずれか１つであり得る。修飾された塩基としては、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザプリンまたはアザプリン、およびデアザピリミジンまたはアザピリミジンが挙げられるが、これらに限定されない。アデニンのＮ１、グアニンのＮ７、シトシンのＮ３のような環窒素はアルキル化され得る。ピリミジン塩基は、５位または６位において置換され得、プリン塩基は、２位、６位または８位において置換され得る。例えば、本明細書において参考として援用される、Ｃｏｏｋ，ＷＯ９３／１３１２１；Ｓａｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）参照。
【０２８２】
慣用的ヌクレオチドの誘導体は、当該分野で周知であり、これらとしては、例えば、異なる型の糖を有する分子が挙げられる。この糖のＯ４’位は、ＳまたはＣＨ２で置換され得る。例えば、ヌクレオチド塩基認識配列は、連結部分によって連結されたシクロブチル部分を有し得、ここで、このシクロブチル部分は、それに結合した複素環塩基を有する。例えば、Ｃｏｏｋら、国際公開ＷＯ９４／１９０２３（本明細書において参考として援用される）参照。
【０２８３】
プローブの細胞への送達を促進するのに有用なプローブの他の化学的修飾としては、コレステロール、導入ペプチド（例えば、ＴＡＴ、ペネトラチンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８４】
（方法）
本発明の方法は、生きた細胞中の標的ＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる、シグナリングプローブの能力に基づく。生じたシグナルは、コントロール細胞で生じたもの（例えば、バックグラウンド蛍光）よりも検出可能に高くあるべきである。したがって、コントロール細胞が全く蛍光を生じないことは、必要でない。１つの実施形態において、この方法は、ＲＮＡを検出または定量化するためのものである。１つの方法は、少なくとも１種のＲＮＡを発現する細胞を単離するためのものか、またはそのような細胞株を作製するためのものである。細胞を単離することを含む本発明の方法のいずれかにおいて、細胞が培養され得るか、または、培養して、細胞株を作製し得る。ＲＮＡまたはＲＮＡおよびタグ配列をコードするＤＮＡ構築物が細胞に導入される。ＤＮＡ構築物は、細胞のゲノム中の異なる位置に組み込まれ得る。１つ以上の特異的遺伝子座における組込みも、また達成され得る。次いで、トランスフェクトされた細胞がシグナリングプローブに暴露され、これは、標的ＲＮＡまたはタグ配列への結合に際して検出可能なシグナルを生じる。検出可能なシグナルを生じる細胞が単離される。細胞は単離されて、当該分野におけるいずれかの方法によって培養され得る（例えば、細胞は個々に、またはまとめて（ｉｎ  ｂａｔｃｈ）、単離し、平板培養することができる。細胞株は、単離された細胞を増殖することによって作製され得る。
【０２８５】
任意の本発明の方法が、選択マーカーを用いて行われ得る。薬物選択（または任意の他の適当な選択マーカーを用いる選択）は必要な工程ではないが、それを用いて、安定にトランスフェクトされた細胞について、トランスフェクトされた細胞集団が濃縮され得る（但し、トランスフェクトされた構築物が薬物耐性を付与するように設計されている場合）。シグナリングプローブを用いる選択がトランスフェクションに続いてあまりにも直ぐに行われる場合、いくつかの陽性細胞は、一過性のものに過ぎず、そして安定にトランスフェクトされていない可能性がある。しかしながら、これは、安定にトランスフェクトされていない細胞由来のトランスフェクトされたプラスミドの希釈または除去を可能とする、十分な細胞継代を仮定すれば、最小化され得る。いくつかの安定に組み込まれたプラスミドが、クローン化されたｃＤＮＡインサートに対応するＲＮＡを何も産生しない可能性がある。他のものは、シグナリングプローブによって検出され得ないか、または十分に検出され得ないＲＮＡを産生する可能性がある。
【０２８６】
ＲＮＡは、以下の種々の役割の１つ以上を有し得る：メッセンジャーＲＮＡ（タンパク質、融合タンパク質、タンパク質に融合したペプチド、輸出シグナル、輸入シグナル、細胞内局在化シグナル、またはタンパク質またはペプチドに融合することができる他のシグナルをコードする）；アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、構造ＲＮＡ、細胞ＲＮＡ（リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない）；ランダムＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＥＳＴに対応するＲＮＡ；多様な種に由来するＲＮＡ、オリゴヌクレオチドに対応するＲＮＡ、全細胞、組織、または生物ｃＤＮＡ調製物に対応するＲＮＡ；他の核酸、タンパク質、他の細胞成分または薬物分子に対する何らかの結合活性を有するＲＮＡ；種々の高分子複合体に取り込まれ得るＲＮＡ；いくつかの細胞機能に影響し得るＲＮＡ；あるいは、上記の機能または活性を有さないが、それにもかかわらず、細胞によって発現され得るＲＮＡ；ウイルスまたは外来性ＲＮＡに対応するＲＮＡ、リンカーＲＮＡ、または１つまたは複数のＲＮＡに結合する配列；あるいはタグとして働くＲＮＡか、または上記のいずれか１つ以上の配列の、未修飾の突然変異誘発されているか、ランダム化されているか、もしくはシャッフルされている組合せもしくは組換え。ＲＮＡは、構成的または条件プロモーターの制御下にあり得る：これらのプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：誘導性、抑制性、組織特異的、熱ショック、発生、細胞株特異的、または一時的プロモーター、あるいは上記のいずれか１つ以上の未修飾もしくは突然変異誘発された、ランダム化された、シャッフルされた配列の組合せまたは組換え。
【０２８７】
１つの実施形態において、シグナリングプローブは蛍光原性プローブである。蛍光細胞ソーターまたは関連する技術を、蛍光原性プローブと共に用いて、１つ以上の波長においてあるレベルの蛍光を示す細胞を同定および／または分離し得る。生きた細胞において信頼性よくかつ有効にｍＲＮＡならびに他のＲＮＡを検出できることは、それを使用して、例えば、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を用いて、細胞の所望の特性に基づいて細胞を同定し、必要であれば、分離することを可能とする。ＦＡＣＳ技術は、現在、１秒当たり７０，０００細胞までを分類することを可能とする。５，０００，０００細胞が、２分未満で分類され得る。
【０２８８】
（１．タンパク質発現細胞株の作製）
細胞株を作製することに関与する最も退屈な工程のいくつかは、本明細書中に記載されるシグナリングプローブの適用によって排除される。１つの実施形態において、所望の遺伝子をコードするＤＮＡ構築物でのトランスフェクションに続いて、これらの細胞に、目的の遺伝子のメッセージを認識するように設計された蛍光原性プローブが導入される。この工程は、選択マーカーを用いる選択（例えば、薬物選択）に続いて行われ得る（但し、トランスフェクトされたＤＮＡ構築物もまた、薬物耐性をコードする）。遺伝子を転写する細胞は蛍光を発する。その後のＦＡＣＳ分析の結果、蛍光細胞の単離物が生じ、次いで、これが増殖させられて、目的の細胞を発現する細胞株を生じさせることができる。
【０２８９】
１つの実施形態において、シグナリングプローブは、目的のタンパク質をコードするＲＮＡの部分、またはそれらの５’または３’非翻訳領域の部分いずれかに対して相補的なように設計される。もし目的のメッセンジャーＲＮＡを認識するように設計されたシグナリングプローブが、内因性に存在する標的配列を検出できるならば、トランスフェクトされた細胞によって生じた標的配列の割合に対するそれらの割合により、ソーターは２つの細胞型を区別可能である。目的の遺伝子はタグ配列でタグ化され得、シグナリングプローブは、それがタグ配列を認識するように設計され得る。タグ配列は、生成されるタンパク質をタグ化することを所望するか否かに依存して、遺伝子のメッセージのタンパク質コーディング部分を含むフレームの中にあり得るか、またはそれを含むフレームの外にあり得る。
【０２９０】
加えて、任意の所与の細胞における目的の遺伝子の発現のレベルは、変化し得る。これは、ＲＮＡ発現のレベルに影響し得る種々の要因に起因し得る：この要因としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞にトランスフェクトされるＤＮＡの量またはコピー数、何らかのＤＮＡのゲノム組込みが生じた部位、ならびにゲノム組込みに続く、ＤＮＡの一体性、およびそれから生じる発現。ＦＡＣＳを適用して、発現レベルを評価し、そして同一遺伝子を発現する個々の細胞を差別的に選択することができる。
【０２９１】
（２．遺伝子をダウンレギュレートする細胞株の作製）
タンパク質をコードするＲＮＡではなく、遺伝子または遺伝子の一部のアンチセンスであるＲＮＡを発現する細胞株の作製を記載する、いくつかの研究がある。そのような方法は、所与の細胞における特定のＲＮＡまたはタンパク質の量を低下させることを目的とする。タンパク質発現細胞株の作製について上記した工程は、ここで等しく適用可能であり、この工程は、シグナリングプローブをアンチセンスＲＮＡであるＲＮＡを検出するように設計することを除いて、実質的に同一である。
【０２９２】
安定にトランスフェクトされたアンチセンス発現細胞株を作製する全ての試みが、標的化されたタンパク質の発現が十分に影響を受ける細胞株をもたらすわけではない。この困難性は、そのような細胞株の生成を追及することをあまり価値のないものとしてきた。本明細書中に記載された手順の容易性を考えると、活性な、すなわち、効果的なアンチセンス発現細胞株を生じるそれらの能力について、多数の異なる遺伝子配列の有効性が容易にアッセイされる。次いで、これらの遺伝子配列を分析して、どの遺伝子配列が標的化された遺伝子のダウンレギュレーションを分析し得る適切な発現プロフィールを示すかを決定し得る。
【０２９３】
ＲＮＡ干渉は、特異的遺伝子の転写レベルを低下させることをやはり目的とする、代替的アプローチである。ＲＮＡ干渉は、化学的に合成されたｓｉＲＮＡまたは短いｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を用いて一過的に誘導され得るか、あるいは短いｓｉＲＮＡを適切に発現する安定な細胞が作製される場合、安定的に誘導され得る。本明細書中に記載された方法を用いて、細胞または細胞株を、それらのこのようなｓｉＲＮＡの発現に基づいて、分析または単離し得る。
【０２９４】
ＲＮＡ干渉を誘導するＲＮＡを発現する細胞を得るための本明細書中に記載された方法の適用は加えて重要である。なぜならば、それはそのような細胞で現在遭遇しているいくつかの複雑性を克服するのを助けるだろうからである。例えば、ＲＮＡ干渉は、標的化されたＲＮＡの転写レベルを低下させるために行われ、他のＲＮＡの転写レベルに対する下流効果を引き起こし得るが、これが、意図した標的ではないＲＮＡの転写レベルを低下させることも示されている。これらの意図しない標的の同定は、ＲＮＡ干渉を誘導するのに用いたＲＮＡの配列に依存して変化する。これは、結果がそのような意図しない結果によって損なわれ得るという、細胞におけるＲＮＡ干渉の使用の複雑な特徴である。本明細書中に記載された方法は、例えば、同一遺伝子に対するＲＮＡ干渉を誘導するのに用いられる異なるＲＮＡ配列を各々発現する、複数の安定な細胞の効果的な作製を可能とするため、これらの配列の各々は、他の遺伝子の転写レベルに対するその効果について、その細胞においてアッセイされ得る。この情報の分析を用いて、減少した転写レベルを有し、その減少は標的化されたＲＮＡの減少した発現レベルによるものではないＲＮＡを、区別することができる。ＲＮＡ干渉は急速に人気を増してきた。というのは、ＲＮＡ干渉は、アンチセンスＲＮＡを用いて特異的ダウンレギュレーションを達成することに伴う困難さを克服するためにうまく用いられているためである。１つの方法は、非特異的活性を低下させたより特異的なＲＮＡ干渉のために最も効果的な配列を決定することの助けとなり得る。この方法は、最も効果的かつ特異的なアンチセンスの選択のための方法も提供するので、この方法はまた、効果的なアンチセンスＲＮＡを同定する方法も表す。
【０２９５】
（３．細胞表面−局所化抗原に基づく細胞の間の区別）
免疫学者などは、長い間、細胞を分類するのにＦＡＣＳを用いてきた。一般に、この方法は、差別的に標識されるプローブ（通常、フルオロフォア標識抗体プローブ）で、細胞表面局在タンパク質を標識することに基づく。例えば、細胞表面局在タンパク質の発現について陽性の細胞を調査することができる。この方法は、細胞の一体性を保存し、その生存性を維持するように設計された条件下で最も通常に用いられる。
【０２９６】
本発明によると、細胞表面局在タンパク質の存在を検出するためには、シグナリングプローブを作成して、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的化する。シグナリングプローブを、細胞生存性をなくすることなくトランスフェクションによって細胞に導入する。次いで、細胞ソーターを用いて、陽性分類細胞を単離する。次いで、目的のタンパク質の１つのｍＲＮＡに各々標的化されるシグナリングプローブの組合せを用いる場合、各々は別々に標識され得る。もし細胞が、ＦＡＣＳの単回の適用において検出することができるものよりも多数の標的を有するならば、複数ラウンドの分類を行って細胞を分類する。
【０２９７】
本明細書中に記載された方法は、他の細胞ＲＮＡ、例えば、内部に局在化されるか、または細胞から分泌されるタンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはタンパク質をコードしないＲＮＡについての細胞の分析または分類も可能とする。その結果、通常用いられる抗体プローブに接近できない、あるいはそれに対してプローブが未だ開発されていないタンパク質をコードするＲＮＡを含めた、先に記載された細胞ＲＮＡの１つまたは複数を標的として検出することができる。これらとしては、膜会合タンパク質、膜架橋タンパク質、膜固定タンパク質、細胞質タンパク質または核細胞質タンパク質が挙げられる。
【０２９８】
（４．特異的ＲＮＡの発現についての細胞のアッセイ、および細胞におけるＲＮＡ発現のレベルの定量）
もし細胞に導入される蛍光原性プローブの標的ＲＮＡが存在すれば、細胞は蛍光を発する。この情報は蛍光顕微鏡（共焦点顕微鏡、レーザー走査顕微鏡または他のタイプの顕微鏡を含む）またはＦＡＣＳの使用によって定量的に評価することができ、それはこれらのいずれかによって定量可能でもある。例えば、イン・サイチュ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を組織のスライスに対して行って、特定のＲＮＡについての発現のパターンを判定する代わりに、シグナリングプローブを用いて、同一実験を行う。さらに、各々が特異的ＲＮＡを標的化する、異なる蛍光性の発蛍光プローブの組合せを用い、１つの工程で目的の数個のＲＮＡの存在または量につきアッセイする。（固定された試料中の）ＲＮＡの検出を経験的に決定された温度で行って、非標的特異的シグナル発生を制限することができる。核酸プローブを用いる場合、標的検出のための最適な温度条件を確立するのは通常の方法である（細胞および組織におけるＲＮＡの検出と組み合わせ抗原の局在化）。
【０２９９】
固定された細胞または組織スライスを用いて、認識されたタンパク質抗原の局在を記載するのに免疫細胞化学を用いて、シグナリングプローブ標的性特異的ＲＮＡを用いて、注目するＲＮＡを同一試料中で共局在させる。ＲＮＡに標的化される蛍光原性プローブが固定細胞で機能することが示されている。
【０３００】
（５．複数のＲＮＡまたはタンパク質を発現する細胞株の作製）
本発明の方法を用い、多数の選択薬剤の混合物の存在下で（または他の選択剤を用いて）これらの細胞を維持する必要性がなくとも、いずれかの数のＲＮＡまたはタンパク質を発現する安定にトランスフェクトされた細胞株が非常に迅速に作製される。遺伝子トランスフェクション（および所望により、薬物−選択）に続いて、シグナリングプローブの組合せ（１つが各タンパク質についてのメッセージに対する）が細胞に導入される。遺伝子のうちの１つのみのｍＲＮＡに、またはメッセージが関連するタグ配列にハイブリダイズするように、各蛍光原性プローブの標的相補的配列を設計することによって、各シグナリングプローブは、遺伝子のうちの１つのみによってコードされるｍＲＮＡを認識するように設計される。１つの実施形態においては、次いで、細胞は、ＦＡＣＳによって分類される。１つまたは複数のシグナルについて選択することによって、種々の細胞株を単回の適用で作製する。
【０３０１】
ＦＡＣＳの単回の適用において同定することができる数を超える、多数の目的のＲＮＡを発現する細胞株を生じさせる必要性があり得る。例えば、特定の複合体の形成に関与する、あるいは生物学的経路に関与すると考えられるタンパク質およびＲＮＡ配列の全てが過剰発現される細胞株を有するのは情報性が高い。例えば、同一または関連する生物学的経路におけるＲＮＡまたはタンパク質、互いの上流または下流で作用するＲＮＡまたはタンパク質、相互に対する調節、活性化または抑制機能を有するＲＮＡまたはタンパク質、機能または活性につき相互に依存するＲＮＡまたはタンパク質、複合体を形成し、または相互に結合するＲＮＡまたはタンパク質、相同性（例えば、配列、構造、または機能的相同性）を共有するＲＮＡまたはタンパク質。もし必要な数のＲＮＡが、ＦＡＣＳの１回の適用で分析できる数を超えれば、これを達成するには、さらなるＲＮＡをコードするさらなる構築物がトランスフェクトされる宿主細胞として、ＲＮＡのいくつかの組合せを既に発現している細胞を用いて上記の工程を反復する。複数ラウンドの上記方法を用いて、必要なＲＮＡの全てまたは部分集合を発現する細胞を得ることができる。
【０３０２】
発現させるべき複数のＲＮＡが、全て、同一薬物に対する耐性を細胞に付与する構築物にクローン化される場合、一実施形態において、ＦＡＣＳを用いて、所望のＲＮＡの全てを発現する細胞を単離することができる。配列が安定にゲノムに組み込まれる場合、細胞がいずれの配列の発現も失わないことが所望される。しかしながら、配列の１つ以上が失われ得る可能性がある。この場合、これらの細胞が増殖される培地中の選択薬物または選択因子の濃度を増加させ、この確率をより低くさせる。別法として、その各々が異なる薬物に対する耐性を付与する構築物が用いられ、適切な薬物の混合物中に細胞を維持する。また、細胞に安定にトランスフェクトすべき構築物の部分集合を選択して、１つの薬物に対する１つの耐性遺伝子をコードさせることができ、別の部分集合を選択して、別の薬物についての耐性遺伝子をコードさせることができる。
【０３０３】
さらに、細胞株のいくつかの細胞が目的のＲＮＡの発現を失う場合、１つの手段として、上記の細胞株を単離する第一の実験を反復し、新しい細胞が得られる。別法として、所望のＲＮＡの全てを発現する細胞を再度単離することを目的として、記載した細胞の混合物がＦＡＣＳによって分析される。これは非常に有用な手順である。なぜなら、この手順は、選択された元の細胞株と同一の遺伝子的構成を有する細胞株を生じる細胞を、再度もたらすためである。
【０３０４】
上記のアプローチは、タンパク質配列およびＲＮＡ配列の任意の組合せを発現する細胞の非限定的な供給をもたらし、実質的に限定されない分析方法に従う。過剰発現されるタンパク質は細胞に対して毒性であり得る可能性があるが、後に記載されるように、この確率は容易に対処され得る。
【０３０５】
ＲＮＡの全てをもはや発現しない細胞から所望のＲＮＡの全てを発現する細胞を再度単離することが可能であるという容易性は、薬物の非存在下、または最小濃度の薬物の存在下で細胞株を維持することを可能にさせる。本明細書中に記載された方法は、シグナリングプローブの、以前に作製された細胞または細胞株への再適用も可能とする。例えば、細胞が、ＲＮＡのいずれかの１つ以上（元々、これらに関して細胞が単離された）に対して依然として陽性であるか、またはどの程度陽性であるかを決定すること。
【０３０６】
（６．１つ以上のＲＮＡまたはタンパク質を劇的に過剰発現する細胞株の作製）
高度に過剰発現されるべき各遺伝子については、例えば、同一遺伝子についての２以上の配列を、まず、薬物耐性または他の選択マーカーを必要に応じてまた付与するＤＮＡ構築物中に、クローン化する。各遺伝子についての複数配列の各々を、異なるタグ配列をコードする配列を含むように設計する。１つの実施形態において、細胞へのＤＮＡ構築物のトランスフェクション、およびその後の選択に続き、その各々が１つのみのタグ配列に標的化され、差別的に蛍光的に標識される蛍光原性プローブが細胞に導入され、細胞ソーターを用いて、それらのシグナルにつき陽性である細胞が単離される。そのような細胞は、差別的にタグ化された配列の各々の少なくとも１つのコピーをそれらのゲノムに導入され、したがって、目的の配列の発現が、増大した数の、目的の配列の実質的に同一のコピーから生じる。目的の配列は細胞中のゲノムの種々の位置に一体化させることができる。この方法をＦＡＣＳの使用と組み合わせて用いて、各フルオロフォアのシグナルについて最も強いスコアを示す細胞を拾い出す。上記種々のタグの一部または全ては、同一であり得、したがってこの共通配列に対する共通の１つのシグナリングプローブを用いて、細胞における種々のタグの全てを検出することができる。
【０３０７】
（７．複数のアンチセンスＲＮＡを発現する細胞株の作製）
複数のアンチセンスメッセージを生じる安定にトランスフェクトされた細胞株は以下のように作製される。このようなアンチセンスメッセージは、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡいずれかを標的とする。トランスフェクトされたアンチセンス配列のうちのいずれか１つを異なるレベルで発現する細胞を選択する。安定なトランスフェクションの反復されたラウンドを通じて、限定されない数のＲＮＡのアンチセンスメッセージを発現する安定にトランスフェクトされた細胞株を生起する細胞が容易に選択される。
【０３０８】
もちろん、アンチセンスＲＮＡ以外の他のＲＮＡを発現する細胞は、本明細書中に記載された方法によって調製され得る。そのようなＲＮＡとしては、限定されるものではないが、１種以上のｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡのような他の構造ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉活性を有するＲＮＡ、タグとして働くＲＮＡなどが挙げられる。
【０３０９】
（８．細胞株のライブラリーの作製）
複数の細胞を、発現ライブラリーを形成するＤＮＡ構築物でトランスフェクトする。ＤＮＡ配列の発現ライブラリーとしては、限定されるものではないが、例えば、全生物、組織、細胞もしくは細胞株から作製されたｃＤＮＡまたはＥＳＴライブラリーを含めた当該分野で公知の種類のいずれかまたはこれらの混合物、および限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド、またはペプチドをコードする配列を含めた合成ライブラリーが挙げられ得る。同様に、発現ライブラリーとして特異的に設計されていないＤＮＡ構築物のライブラリーが使用され得る。例えば、ＤＮＡ構築物ライブラリーは、プロモーター、リプレッサーまたはエンハンサーエレメントのような調節機能を有し得るＤＮＡの配列を含み得、これらは構成的であっても、誘導的であっても、抑制的であってもよい。同様に、ＤＮＡ構築物ライブラリーは、それから転写が起こり得る全遺伝子座もしくは部分的遺伝子座またはゲノムＤＮＡのようなＤＮＡの大きなセグメントを含み得る。ＤＮＡ構築物のこれらの発現ライブラリーのいずれも、各々、全体的または部分的に、突然変異され、ランダム化され、組換えられ、シャッフルされ、改変され得るか、あるいはそのいずれかの組合せで処理され得る。加えて、これらの型のライブラリーのいずれも、さらに、発現され、そしてシグナリングプローブのための標的として使用され得る少なくとも１つのタグを含み得る。
【０３１０】
タンパク質の特定クラスについてのＤＮＡ配列の発現ライブラリーが作製され得、これを用いて、細胞株ライブラリーが作製され得る。例えば、プロテインキナーゼについてのｃＤＮＡは、タグ配列を含む発現構築物にクローン化され得る。異なるキナーゼを安定に発現する細胞が得られ得、これを用いて、キナーゼを発現する細胞株に限定された細胞株ライブラリーを作製し得る。この配列のクラスは、薬物スクリーニングのようなさらなる適用を満足するように選択され得る。
【０３１１】
細胞株のライブラリーは、同一タンパク質ファミリーに属するか、または機能的ファミリー内の、配列相同性を有するタンパク質のクラス、また、所定のタンパク質の経路または複合体または系におけるその役割によって規定されるタンパク質も発現し得る。例えば、種々のＨＩＶタンパク質に結合できる化合物に対する薬物スクリーニングにおいて、各細胞株が異なるＨＩＶタンパク質を発現する細胞株ライブラリーが作製され得、これを薬物化合物をスクリーニングするのに用いることができる。
【０３１２】
細胞株のライブラリーを用いて、所望の活性を有する分泌されたペプチドまたはタンパク質をアッセイし得る。まず、上記ペプチド／タンパク質に対してフレーム内で翻訳された輸出シグナルをさらにコードする（ペプチド、タンパク質、ＥＳＴ、ｃＤＮＡなどについての）発現ライブラリーを用いて、細胞株ライブラリーが作製され得る。発現されたペプチド／タンパク質は増殖培地に分泌される。次いで、特定の活性に対するこれらのペプチドの効果は、適当に設計されたアッセイを仮定すると測定することができる。細胞株からの組織培養上清が収集され、試験細胞に適用して、活性に対してアッセイし得る。
【０３１３】
加えて、例えば、発現ライブラリーを細胞にトランスフェクトし、必要に応じて、まず、（例えば、発現ライブラリーに含まれるタグに対して向けられたシグナリングプローブを用いて）発現ライブラリーでトランスフェクトされた細胞を選択し、次いで、目的の１種以上のＲＮＡに対して向けられた１つまたは複数のシグナリングプローブに細胞を暴露することによって、細胞株のライブラリーが作製され得る。これにより、細胞において種々のＲＮＡを発現し、これらのＲＮＡのいずれが、目的の１種以上の複数のＲＮＡの下流転写のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションをもたらすかを決定することが可能となる。
【０３１４】
（９．１種以上のタンパク質について機能的にノックアウトされた細胞株の作製）
本発明の方法は、培養細胞において機能的ノックアウトを調製する手段を提供する。複数の遺伝子座から、ユニークなＲＮＡ配列に対するＲＮＡ干渉活性を有する実質的に同一のアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する細胞を作製することによって、目的のいずれか１つのタンパク質の機能的ノックアウトである細胞株が作製される。ｓｉＲＮＡを用いる本発明の方法の任意のものがまた、ｓｈＲＮＡを用いて実施され得る。例えば、その各々が、特定遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ、または上記遺伝子に対するＲＮＡ干渉活性を有するｓｉＲＮＡ、あるいは双方のいずれかをコードする複数の構築物を細胞にトランスフェクトする。ここに、各アンチセンスＲＮＡ配列は、各々がユニークなタグ配列のヌクレオチド配列をタグとして付された点でのみ異なる。異なってタグに付されたアンチセンスＲＮＡの１つまたは複数または全てを発現する細胞が選択される。同様に、ＲＮＡ干渉活性を持つ各ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの存在は、各ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが関連するタグの検出によって測定される。ＦＡＣＳを用いて先に記載されたように蛍光を定量化するので、この特徴により、アンチセンス配列のいずれか１つまたは複数を最も強く発現する細胞について選択するのが可能となる。所望の発現レベルの標的化されたＲＮＡを呈するか、あるいは標的化されたＲＮＡの発現レベルを増大させるように作用する、発現されたＲＮＡのいずれかの数または組合せの発現に起因してその発現をほとんどまたは全く呈しない細胞を単離することが可能である。
【０３１５】
重要なことには、同一遺伝子を標的化するＲＮＡ干渉活性を有する異なるアンチセンス配列およびｓｉＲＮＡの１つまたは複数が、このアプローチにおいて使用され得る。例えば、その発現が、シグナリングプローブおよびＦＡＣＳを使用することによって選択されるアンチセンスＲＮＡのいくつかは、遺伝子に対するメッセンジャーＲＮＡの特定の領域を標的化するように設計され、他方、他のものは、それらが同一メッセンジャーの別の部分を標的化するように設計される。目的のタンパク質の機能的ノックアウトである細胞株を作製するために、目的のタンパク質の発現の検出可能なレベルを呈しないか、あるいは発現の許容される低いレベルを呈する細胞株の作製が必要とされる場合、目的の同一遺伝子に対してＲＮＡ干渉活性を有する類似もしくは異なるアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする多くの遺伝子配列として、細胞に安定にトランスフェクトする。
【０３１６】
さらに、いずれかの数の機能的にノックアウトすべき配列をアンチセンスまたはｓｉＲＮＡによって標的化しつつ、上記した手順を反復することによって、複数タンパク質が機能的にノックアウトされたか、または低下した発現レベルを有する細胞株を作製する。例えば、タンパク質の複合体の機能を研究するためには、複合体を形成するタンパク質の１つ、全て、またはいずれかの組合せの発現レベルを、ノックアウトまたは低下させる。
【０３１７】
（１０．１以上の遺伝子の選択された交互にスプライシングされた形態のみの機能的ノックアウトである細胞株の作製）
単一遺伝子の異なってスプライシングされたバージョンは、しばしば、異なる機能を持つタンパク質に翻訳される。本発明の方法を用い、１以上のタンパク質の選択された交互にスプライシングされた形態のみが機能的ノックアウトされたか、または発現レベルが低下した細胞株を作製する。例えば、細胞から排除したい遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの交互にスプライシングされたバージョンのみを標的とするアンチセンスまたはｓｉＲＮＡを設計することによって、目的の遺伝子の交互にスプライシングされたＲＮＡの全てを機能的にノックアウトするか、あるいは目的の交互にスプライシングされたメッセージ以外を、その発現レベルを所望のレベルまで十分に低下させる。
【０３１８】
（１１．１以上の他のタンパク質を機能的にノックアウトしつつ、１以上のＲＮＡまたはタンパク質を発現する細胞株の作製）
例えば、相互に相互作用すると考えられるタンパク質の所定の群に対して、目的のタンパク質の１以上が機能的にノックアウトされたか、あるいは低下した発現レベルを有する安定にトランスフェクトされた細胞株を、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡ）の細胞の発現によって作製することによって、それらの相互作用を研究することができる。次いで、細胞における目的の残りのタンパク質の機能を調べることができるが、おそらくはより興味深いことには、それが次に１以上の目的の残りのタンパク質を過剰発現するように、それをさらに操作することによって、そのような細胞をさらに改変し得る。加えて、細胞中でのさらなるタンパク質の発現を、過剰発現させても、排除しても、低下させてもよい。再度、ある種のタンパク質またはある種のタンパク質の機能的ノックアウトの過剰発現は細胞にとって致死的であり得る可能性がある。これは、以下に取り組む問題である。
【０３１９】
類似の方法を用いて、転写調節において直接的または間接的役割を持つＤＮＡを導入することによって、ランダムに遺伝子をアップレギュレート、またはダウンレギュレートし得る。例えば、限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー配列、あるいは１以上のＲＮＡについての転写レベルの改変をもたらすいくつかの他の結合または機能的活性を有する配列のうちの１つ、または組合せを含めたＤＮＡ配列が、細胞にトランスフェクトされ得る。これらのエレメントの活性は、構成的であってもの、誘導的であっても、抑制的であってもよい。１以上の特異的ＲＮＡに対するシグナリングプローブを用いて、これらのＲＮＡの発現レベルが増加または減少している細胞を同定または単離し得る。記載された方法を用いるいくつかのＤＮＡ配列の安定な組込みは、遺伝子座からの転写をランダムに十分に開始または遮断することができる。これらの細胞株ライブラリーは、特異的遺伝子につき効果的に過剰発現するか、またはノックアウトされた細胞につきスクリーニングすることがされ得る。１以上のＲＮＡの所望のレベルを持つ細胞が、このようにして選択され得る。複数ラウンドのこの手順を行って、必要な場合、目的の複数のＲＮＡに対して所望の発現プロフィールを有する細胞を単離することができる。
【０３２０】
（１２．トランスジェニックマウスの作製）
いくつかの目的に対して、培養物中の細胞の研究は十分ではない。しかしながら、上記した方法は、胚性幹細胞の操作に向けてそれ自体も役に立つ。上記した手順に従い、複数のＲＮＡまたはタンパク質を発現するか、あるいは複数のタンパク質、または複数のタンパク質の交互にスプライシングされた形態の部分集合の機能的ノックアウトとして働くかのいずれかである胚性幹細胞を得ることができる。次いで、そのような胚性幹細胞は、トランスジェニック動物の作製のための基礎として使用される。
【０３２１】
記載された方法に従って単離された細胞は、生物に直接移植され得るか、あるいはそれらの核は、他のレシピエント細胞に導入され得、次いで、これらは移植され得る。１つの使用は、トランスジェニック動物を作製することであり、他の使用は、限定するものではないが、細胞産物を合成または生物に分泌する細胞、および生物において所望の役割を行うように操作された細胞の導入を包含し得る。
【０３２２】
（１３．誘導性の安定にトランスフェクトされた細胞株の作製）
細胞における特定のタンパク質もしくはＲＮＡの過剰発現または発現の欠如は、致死的、または損傷を与えかねない。しかし、毒性タンパク質またはＲＮＡを過剰発現する細胞、あるいはそれがなければ細胞が生存できないタンパク質またはＲＮＡの機能的ノックアウトである細胞を研究することは、非常に重要である。この目的で、細胞に対してそのような有害効果を有する選択されたＲＮＡが誘導性または条件プロモーターの制御下にある、安定にトランスフェクトされた細胞を作製する。そのような細胞株を単離するためには、１つの実施形態において、トランスフェクトされ、必要に応じて薬物選択された細胞が、まず、誘導性遺伝子の転写に影響するよう最小限に誘導され、次いで、適当なＲＮＡを認識するように設計されたシグナリングプローブのそれへのトランスフェクションに続いて、細胞がＦＡＣＳ分析に供される。得られた細胞は、必要な場合のみ、毒性ＲＮＡが誘導され、転写されるように維持される。
【０３２３】
誘導系は、毒性ＲＮＡの発現以外の適用で有利であり得る。例えば、同調された細胞株の細胞周期の間のある時点において、細胞に安定にトランスフェクトされた遺伝子配列の発現を誘導する。あるいは、１以上の安定にトランスフェクトされた遺伝子配列のセットの発現産物が別のセットの発現産物に対して作用すると考えられる場合、１つの誘導性プロモーターの制御下にある第一のセットの遺伝子配列、および第二の誘導性プロモーターの制御下にある第二のセットの遺伝子配列をクローン化することが目的である。種々の誘導によって、他のセットの発現産物の非存在または存在いずれかにおいて、遺伝子配列のいずれかのセットによってコードされた発現産物を調べる。一般に、上記した方法に記載されたように細胞に取り込まれたＤＮＡ配列は、各々、プロモーター、または所望の活性を有する転写の他のレギュレーターの制御下に置くことができる。例えば、誘導性、組織特異的、時間特異的もしくは一時的なプロモーター、エンハンサーまたはリプレッサーが使用され得、ならびに限定されるものではないが、化合物または化学物質、他の細胞、タンパク質、ペプチド、ホルモン、シグナル伝達分子、細胞から分泌された因子、生物、組織もしくは細胞、または環境試料からの全抽出物あるいは分画された抽出物の１種以上を含めた、細胞または細胞外シグナルに起因して調節され、活性化されまたは抑制される調節エレメントが使用され得る。これらの場合において、細胞は、まず、シグナリングプローブへのその暴露に先立って、転写を調節する薬剤の適切なレベルに暴露される。
【０３２４】
（１４．生きた細胞における遺伝子組み換え事象の検出、および非組換え細胞または異なって組み換えられた細胞の引き続いての単離）
ある種の安定な細胞株に関与する組換え事象を受けた細胞を検出するためのシグナリングプローブの使用と平行して、生きた細胞の混合物から、他の特異的組換え事象を受けた細胞を検出し、単離するためのシグナリングプローブを使用する。同一の原理を用いて、例えば、ＶＤＪ組換え、トランスロケーション、およびウイルスゲノム組込みに対してアッセイし得る。
【０３２５】
細胞組換え事象において、例えば、ゲノムＤＮＡの１つの配列を別の配列と交換する。組換え事象が起こった領域をコードするＤＮＡ配列がＲＮＡに転写された場合、そのような事象の存在は、組換えられていないＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡ、または組換えられた配列から転写されたＲＮＡいずれかを認識するように設計されたシグナリングプローブによって検出される。そのようなアッセイはまた、蛍光顕微鏡（または得られたシグナルを定量できる他の機器）を用いて実施され得る。組換えられなかった細胞から組み換えられた細胞を分離したい場合、細胞をＦＡＣＳに供し、それを分類する。加えて、ＦＡＣＳは、多数の組換え事象の存在または非存在に基づいて細胞を分類するために使用され得る。
【０３２６】
（１５．発現されたＲＮＡに基づく細胞の分類）
本明細書中に記載したシグナリングプローブの使用は、内部に局所化されたタンパク質、細胞表面に局所化されたタンパク質、または分泌されたタンパク質をコードするＲＮＡの発現に基づき、ならびに細胞に存在し得る他のＲＮＡについて細胞が分類されるのを可能とする。例えば、細胞の混合された集団から出発し、これらのタンパク質を生じるｍＲＮＡを認識するシグナリングプローブを設計することによって、目的の内部に局所化されたタンパク質を発現する細胞を単離する。これらのシグナリングプローブは、細胞の混合物にトランスフェクトされ、ＦＡＣＳを用いて、適切にはそれらを分類し得る。複数ラウンドのソーティングが実施され得る。
【０３２７】
加えて、研究者は、例えば、１以上の特異的タンパク質のｍＲＮＡ、または所定の付加された因子に応答して転写されるＲＮＡを発現する細胞を単離すること、あるいはいずれの付加された因子が１種以上のタンパク質またはＲＮＡの転写を誘導し、または抑制するのかを決定することに興味を持ち得る。このようにして試験できる付加された因子は、限定されるものではないが、核酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、シグナリング分子、化学化合物、無機化学物質または有機化学物質、細胞、生物、組織または細胞からの、またはそれに由来する全抽出物または分画された抽出物、細胞または生物から精製されたまたは単離された産物、環境または他の供給源からの試料を含むことができる。
【０３２８】
サイトカインに応答して１種以上の特異的ＲＮＡを発現するように誘導される細胞を単離するためには、例えば、サイトカインによってまず細胞の混合物を誘導し、次いで、その各々が、目的のタンパク質の１つを生じるｍＲＮＡを認識するように設計されたシグナリングプローブでトランスフェクトする。１つの実施形態において、次いで、ＦＡＣＳを用いて、目的のｍＲＮＡに対して陽性のスコアである細胞を単離する。代替的な実施形態において、例えば、特定の遺伝子のその発現について、ウイルスで感染された細胞もアッセイする。あるいは、化学化合物ライブラリーのような化合物のセットまたはライブラリー、あるいはＲＮＡの発現ライブラリーを細胞に適用して、いずれかの化合物もしくは化合物の混合物、またはＲＮＡが、１種以上の特異的タンパク質またはＲＮＡの転写を誘導し、抑制しまたは調節するかを決定し得る。
【０３２９】
上記した方法で、以下の異なる役割の１以上を持つＲＮＡの存在について陽性の細胞を検出することが可能である：タンパク質、融合タンパク質、タンパク質に融合したペプチド、輸出シグナル、輸入シグナル、細胞内局所化シグナルまたはタンパク質またはペプチドに融合することができる他のシグナルをコードするメッセンジャーＲＮＡ；アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡと同様な活性を有するヘアピン構造を形成する短いＲＮＡ；限定されるものではないが、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡを含めた構造ＲＮＡ、細胞ＲＮＡ；ランダムＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＥＳＴに対応するＲＮＡ；多様な種由来のＲＮＡ、オリゴヌクレオチドに対応するＲＮＡ、全細胞、組織または生物ｃＤＮＡ調製物に対応するＲＮＡ；他の核酸、タンパク質、他の細胞成分または薬物分子に対していくらかの結合活性を有するＲＮＡ；種々のマクロ分子複合体に取り込まれ得るＲＮＡ；いくつかの細胞機能に影響し得るＲＮＡ；または上記した機能または活性を有しないが、それにもかかわらず細胞によって発現され得るＲＮＡ；ウイルスまたは外来性ＲＮＡに対応するＲＮＡ、リンカーＲＮＡ、または１以上のＲＮＡを連結する配列；またはタグ、あるいは上記のいずれかの１つ以上の未改変の変異誘発された配列、ランダム化された配列、またはシャッフルされた配列の組合せまたは組換えとして働くＲＮＡ。ＲＮＡは、限定されるものではないが、誘導的、抑制的、組織特異的、または一時的なプロモーター、あるいは上記のいずれかの１以上の未改変または変異誘発された配列、ランダム化された配列、シャッフルされた配列の組合せまたは組換えを含めた、構成的プロモーターまたは条件プロモーターの制御下にあり得る。上記したＲＮＡの発現は、ＤＮＡ構築物、ベクター、あるいはその発現をもたらす核酸を送達する他の送達方法の細胞への導入に由来し得る。
【０３３０】
（１６．プロテアーゼプローブを用いる核酸のインビボ検出および細胞の引き続いての選択）
本発明は、シグナリングプローブとは対照的に、その標的核酸への結合に際してタンパク質分解活性を呈するプロテアーゼプローブの新規な形態にも指向される。そのようなタンパク質分解活性は、標的核酸が細胞に存在する場合、検出目的で、また、細胞において特定のタンパク質配列を分解させるのに用いることができる。例えば、特異的にウイルスタンパク質を切断するプロテアーゼは、潜伏感染におけるように、ウイルス配列の転写が活性化される場合に、そして例えば、プロテアーゼプローブがウイルスメッセージに対して向けられる場合に、活性化され得る。
【０３３１】
別の局面において、本発明は、本明細書においてプロテアーゼプローブといわれる、タンパク質分解活性作製単位ハイブリダイゼーションプローブに指向される。そのようなプロテアーゼプローブは、標的ＲＮＡに相補的なヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチド、および相互に相補的なヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドも含む。これらのプロテアーゼプローブは上記したプローブと同様の様式で作動するが、その標的核酸配列とシグナリングプローブとの相互作用に際しての蛍光シグナルの生成または変化の代わりに、このプロテアーゼプローブは標的の存在下でタンパク質分解性となる。
【０３３２】
上記方法におけるシグナリングプローブの代わりにプロテアーゼプローブで置き換えることができ、新しい可能性が生じる。プロテアーゼプローブによって認識されるＲＮＡを発現する細胞へのプロテアーゼプローブのトランスフェクションに際して、プロテアーゼプローブはその標的にハイブリダイズする。これはそのハイブリダイズされた状態のようにプロテアーゼの活性化を引き起こし、このプロテアーゼはもはやそのプロテアーゼインヒビターの近隣には存在しない。そのようなプロテアーゼプローブの標的が存在し、認識される細胞は、損傷され、かくして、それに対して選択される。このｍＲＮＡを発現しない細胞は影響されない。逆に、プロテアーゼプローブは、細胞の増殖または生存性に有益な効果を刺激するか、またはそうでなければこのような効果を与えるか、あるいはその標的が存在し、認識される細胞に増殖の利点を与えるタンパク質分解反応を触媒するように設計され得る。
【０３３３】
加えて、プロテアーゼプローブは種々の他の適用において有用である。プロテアーゼの活性は容易に測定され得、さらに、特定の核酸標的配列の存在下において活性なプロテアーゼは検出目的のみならず、治療目的でも使用され得る。ここで、例えば、特定の遺伝子（例えば、細胞形質転換、癌形成、増殖異常（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）などに関連する遺伝子）が転写された場合、プロテアーゼプローブが送達される細胞は、タンパク質分解され、生きていないようにされる。例えば、細胞のいくつかが特定のウイルスによって影響される細胞の混合物を考慮して、特異的にウイルスｍＲＮＡを標的とするプロテアーゼプローブを細胞に導入する。このようなｍＲＮＡを運ぶ細胞は、それが含むプロテアーゼプローブのタンパク質分解活性を活性化し、このことによってこれらの細胞を破壊する。
【０３３４】
好ましくは、限定されるものではないが、金属および金属キレーターを含む他の分子も、インヒビターとの相互作用に際して酵素の可逆的阻害を供するのにやはり有用であるが、タンパク質分解酵素インヒビターはペプチドまたは小さな化学物質である。タンパク質分解酵素、およびタンパク質分解酵素のインヒビターの有用な対の例は、限定されるものではないが、アミノペプチダーゼとアマスタチン、トリプシン様システインプロテアーゼとアンチパイン、アミノペプチダーゼとベスタチン、キモトリプシン様システインプロテアーゼとキモスタチン、アミノペプチダーゼとジプロチンＡまたはＢ、カルボキシペプチダーゼＡとＥＤＴＡ、エラスターゼ様セリンプロテアーゼとエラスチナール、およびテルモリシンまたはアミノペプチダーゼＭと１，１０−フェナントロニンが挙げられる。
【０３３５】
加えて、他の相互作用対を取り込むプローブを用いることができ、ここに、相互作用対の１つのメンバーは所望の活性を有し、第二のものは、プローブが標的に結合していない場合にこの活性を阻害または減少させるように作用する。それらの標的への結合に際して、プローブの活性が呈される。なぜならば、相互作用対の阻害メンバーはもはや所望の活性を有するメンバーの近隣には存在しないためである。
【０３３６】
これまでの記載に基づき、以下の方法が実施され得る。
【０３３７】
少なくとも１つのＲＮＡを発現する細胞を単離するための方法であって、この方法は、
ａ）少なくとも１つのＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞に導入する工程；
ｂ）上記少なくとも１つのＲＮＡへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程；および
ｃ）上記シグナルを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
【０３３８】
この方法は、単離された細胞を増殖させて、ＲＮＡを発現する細胞株を作製する工程をさらに包含し得る。ＤＮＡ構築物がトランスフェクトされた細胞のゲノム中の異なる位置に組み込まれる場合、複数の細胞株が作製され得る。トランスフェクトされた構築物のゲノム取り込みがゲノムを持つ特定の位置に向けられない限り、組込みはランダムに起こると考えられ、従って、各陽性細胞は相互に異なり得、それらが選択されるＲＮＡに対して全て陽性の複数の異なる細胞株が存在し得る。ＤＮＡ構築物が、細胞（例えば、不死化された、初代の、幹細胞または細胞株）の混合された集団に導入される場合、複数の細胞株がまた作製され得る。細胞は、限定されるものではないが、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、Ｃａｃｏ、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＨＯ−Ｋ１、Ｈｕｖｅｃ、ＣＶ−１、ＨｕＨ−７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＩＭＲ−９０、ＭＣＦ−７、Ｕ−２  ＯＳまたはＣＨＯを含めた任意の樹立された細胞株に由来してもよい。必要に応じて、ＤＮＡ構築物は、さらに、少なくとも薬物耐性マーカーまたは他の選択マーカーをコードし得、そして上記方法は、工程ａ）後に選択マーカーを用いて細胞を選択する工程をさらに包含し得る。単離された細胞は、別々に増殖させてもよいし、またはプールされてもよい。細胞が単離される場合は常に、１以上の構築物または１以上の発現ライブラリーでのトランスフェクションが続くか否かにかかわらず、単離された細胞は、相互から分離して増殖させてもよいし、またはプールされてもよい。
【０３３９】
単離された細胞は、第二のＲＮＡを発現するようにさらに調製され得る。同時または順次いずれかの様式において、さらなる工程は、細胞または細胞株を、第二のＲＮＡをコードする第二のＤＮＡ構築物でトランスフェクトする工程；上記第二のＲＮＡへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程；および、上記ＲＮＡおよび第二のＲＮＡの少なくとも一方または双方のシグナルを呈する細胞を単離する工程を包含する。上記第一のシグナリングプローブは、第二のシグナリングプローブと同一または異なるシグナルを生じることができ、例えば、それらは同一または異なるフルオロフォアを有し得る。２を超えるＲＮＡを発現する細胞または細胞株は、上記工程を同時または順次に反復することによって提供され得る。第二のＤＮＡ構築物は、同一または異なる薬物耐性または他の選択マーカーも含み得る。第一の薬物耐性マーカーおよび第二の薬物耐性マーカーが同一である場合、薬物のレベルを増大させることによって、同時選択が達成され得る。発現ライブラリーを形成するＤＮＡ構築物を用いて上記工程を同時または順次様式で反復することによって、複数の細胞株が作製され得、ここに、上記細胞の少なくとも一部は異なるＲＮＡを発現する。
【０３４０】
トランスフェクトされた遺伝子と会合したタグ配列を、シグナリングプローブのための標的として用いる関連するアプローチが開示され、その内、１つの適用は、例えば、シグナリングプローブが密接に関連するＲＮＡ種を検出する場合、そのＲＮＡがバックグラウンドを超えて同定するのが困難であり得る細胞の選択を可能にすることである。従って、少なくとも１種のＲＮＡを発現する細胞を単離するための方法が提供され、この方法は、
ａ）少なくとも１つのＲＮＡおよび少なくとも１つのタグ配列をコードするＤＮＡを細胞に導入する工程；
ｂ）タグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程；および
ｃ）シグナルを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
【０３４１】
この方法は、用いるシグナリングプローブが、上記ＲＮＡよりはむしろタグ配列を認識するように設計された以外は、上記したのと実質的に同一である。先のものよりも優れたこの手順の利点は、異なるタグ配列の数に対応する少数のシグナリングプローブのみが、１種以上のＲＮＡを発現する非常に多数の異なる細胞株を調製するのに必要とされることである。必要に応じて、ＤＮＡ構築物は、さらに、少なくとも薬物耐性マーカーまたは他の選択マーカーをコードし得、上記方法は、工程ａ）後に上記マーカーが耐性を付与する少なくとも１つの薬物または他の選択剤に対して耐性である細胞を選択する工程をさらに包含する。単離された細胞は、別々に増殖されてもよいし、またはプールされてもよい。細胞を単離する場合は常に、１以上の構築物または１以上の発現ライブラリーでのトランスフェクション後であるかを問わず、単離された細胞は、相互に分離して増殖させてもよいし、プールされてもよい。
【０３４２】
タグ配列とは、シグナリングプローブによって検出されるべきＲＮＡの部分として発現される核酸配列をいう。シグナリングプローブは、上記プローブを、タグの配列に対して相補的である部分を含むように設計することによって、タグに対して向けることができる。本発明で使用され得、かつシグナリングプローブがそれに対して調製され得るタグ配列の例としては、限定されるものではないが、ＨＡ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質）、ｍｙｃ、ｈｉｓ、プロテインＣ、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＬＡＧまたはＦＬＵを含むがそれに限定されないエピトープタグのＲＮＡ転写産物が挙げられる。これらおよび他のタグ配列は当業者に公知であり、代表的には、発現されたタンパク質産物に取り込まれ得るアミノ酸配列に対応し、しばしば、それらの存在を報告するのに使用され得る頑強な抗体またはタンパク質検出試薬の利用可能性に基づいて選択される。本明細書中に記載されたタグ配列は、タグが付されるＲＮＡによってコードされるタンパク質産物をアミノ酸レベルで改変するか、または対応する抗体もしくはタンパク質検出試薬の使用を介していずれかのそのような改変されたタンパク質産物の引き続いての検出を助けるために使用され得る配列のみをいうことは意味されない。本明細書中で使用される場合、タグ配列は、シグナリングプローブによる認識のための少なくともユニークな核酸配列を提供する。シグナリングプローブは、種々のＲＮＡの検出で用いるのに記載されてきた。これらのＲＮＡのいずれもタグとして用いることができる。タグ配列をコードする構築物のＤＮＡ部分は、少なくとも１つのＲＮＡのタンパク質コード部分をコードするＤＮＡ構築物の一部を有するフレーム内であっても、フレーム外であってもよい。かくして、タグ配列は、シグナリングプローブによる検出のために翻訳される必要はない。
【０３４３】
タグ配列は、シグナリングプローブ用の標的部位として作用するように設計された複数反復配列を含み得る。そのようなタグ配列は、複数シグナリングプローブ標的部位を提供する。結果として、非常に多数のシグナリングプローブが結合し得る。これは、シグナリングプローブによって検出されるべきいずれか１つの核酸分子から生じ得る合計シグナルを増大させ、かくして、ノイズに対するシグナルの比を増大させる。
【０３４４】
プローブについての標的配列に加えて、タグは、タグを発現する細胞の検出を改良するように同定されまたは選択された、設計された１以上のさらなる配列（「ヘルパー」または「ヘルパー配列」という）を含み得る。例えば、ヘルパーは、限定されるものではないが、タグの折畳み、局所化、または二次構造、三次構造または四次構造に対する効果を含めた多数の効果を有し得、そこでは、これらの効果のいずれかまたは組合せは細胞における標的配列の検出を改良または増加させるように作用する。ヘルパーは、標的配列がプローブ結合に対してより接近可能であるように表されるようなタグの折畳みまたは構造に影響し得る。これは、改変された塩基対形成に由来し、あるいはそれはヘルパーとタンパク質または他の細胞成分もしくは導入された成分との間の結合相互作用に起因する。ヘルパーは、それらを含む配列の折畳みまたは構造を安定化するか、またはより動的にするように働き得る。また、ヘルパーは、プローブ結合の前、その間またはその後いずれかに、それらを含む配列の分解に対して安定化するよう働き得る、そのような効果は、配列の折畳みまたは構造の変化から直接、あるいはタンパク質または細胞成もしくは導入された成分のヘルパー配列への結合の結果として由来し得る。また、ヘルパーは、例えば、転写開始またはプロセッシングの効率を増強させ、転写の未成熟停止を減少させ、あるいは転写後プロセッシングの効率を増大させることによって、それらを含む配列の転写を増大させるように作用し得る。
【０３４５】
機能的アプローチを用いて、どのようにしてそれらがそれらの効果を発揮するかに拘らずヘルパーを同定することが可能であり、いずれかの所定のタグおよび対応するプローブに対して異なるヘルパー配列が存在し得る。タグおよび対応するプローブの複数のセットに対して働くヘルパー配列は、また機能的に同定され得る。
【０３４６】
可変配列を試験して、例えば、遺伝子配列およびタグ配列を含む発現ライブラリーを構築することによって、ヘルパーとしていずれが作用するかを同定することができ、ここに、可変配列は、上記遺伝子とタグ配列との間に挿入される。遺伝子が停止コドンを有する場合、可変配列は、停止コドンの下流に挿入され得る。さらなる可変配列は、異なる部位に挿入され得る。次に、発現ライブラリーが細胞に導入され、引き続いて、標的配列に対して向けられたシグナリングプローブの導入によって、細胞がアッセイされる。コントロールを超える増大したシグナルを呈する細胞が検出される（ここで、コントロールシグナルは、コントロール細胞、またはコントロール発現構築物（例えば、遺伝子およびタグを含むが、さらなる可変配列を含まないもの）が導入された細胞によって呈されるシグナルである）。そのような細胞は、例えば、ＦＡＣＳによって単離され得、所望の場合、それらによって表される可変配列が単離され、さらに特徴付けされ得る。このアプローチを用いて、用いる遺伝子、タグおよび対応するシグナリングプローブの特異的組合せについてのヘルパー配列として作用する配列を検出または同定し得る。本質的に同一のアプローチを用いて、対応するシグナリングプローブについての少なくとも標的配列を含むいずれかの配列に対するヘルパー配列を見出すことができる（すなわち、可変配列および標的配列いずれかを含むが、例えば、遺伝子を含まない発現ライブラリー、または遺伝子を含む発現ライブラリー、標的配列を含む発現ライブラリー、および可変配列を含むが、タグを含まない発現ライブラリーが、各々適当なヘルパーを検出するために使用され得る）。単離される細胞が増殖され得、細胞株が作製され得る。
【０３４７】
このようにして検出しまたは同定されたヘルパー配列の利点は、用いた配列の状況に対して（すなわち、特異的なタグ、遺伝子、標的配列または対応するプローブに対して）特異的であり得る。種々の配列状況でより広く利点があるより多様なヘルパー配列は、例えば、上記した方法によって実験的に決定され得る。例えば、反復ラウンドの可変配列の選択を行うことができ、そこでは、ヘルパー配列として作用する可変配列は、各ラウンドで単離され得、次いで、引き続いてのラウンドで試験され得る。この場合、例えば、各引き続いてのラウンドの試験は、発現ベクターを作り出すことによって行われ、そこでは、前のラウンドから単離された配列を用いて、第一のラウンドの発現構築物で用いたのとは異なる遺伝子またはタグまたは標的配列を含む発現構築物を作製され得る。記載された方法を用いて、多様な配列の状況を仮定すれば、ヘルパー配列の多様性を確認することも可能である。多様なヘルパー配列または普遍的なヘルパー配列の同定は、細胞における多様な配列の検出を助けるのに有用であり得る。
【０３４８】
可変配列の１つの供給源はゲノム配列であり得る。ゲノム配列は制限酵素で消化され、クローニングのために入手して、発現ライブラリーを作製することができる種々のサイズのフラグメントを生じ得る。
【０３４９】
タグ配列は、シグナリングプローブ結合のためのタグ配列を最適に提示するのを目標とし、ある量の予測された二次構造または実験的に決定された二次構造を呈するように選択され得るか、または設計され得る。従って、タグ配列は、それに対して少なくとも１つのシグナリングプローブが向けられる少なくとも１つの配列を含み、タグ配列は、加えて、シグナリングプローブと直接相互作用するように選択または設計されていないさらなる配列を含み得る。核酸折畳み予測アルゴリズムを用いて、それらの構造適合に従って潜在的タグ配列を設計し得る。例えば、本明細書において参考として援用する、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４２９−３４３１（２００３）を参照のこと。核酸折畳み予測アルゴリズムは、しばしば、所定の配列の多数のエネルギー的に最も有利な構造を予測する。あるいは、例えば、限定されるものではないが、消化されたゲノムＤＮＡを含めた可変核酸配列を表す配列のライブラリーをアッセイして、いずれの配列がシグナリングプローブによるタグ配列の検出を助けるように作用するかを決定または同定し得る。これはタグ配列の同定または単離に対する機能的アプローチを表す。これは、シグナリングプローブ、および少なくとも可変配列によって認識されるように、選択または設計された少なくとも共通する配列を含む発現ライブラリーを作製することによって達成され得る。そのような発現ライブラリーは、細胞にトランスフェクトされ得、次いで、細胞はシグナリングプローブに暴露され得、最も高度に陽性である細胞がＦＡＣＳによって単離され得る。次いで、これらの細胞によって表された可変配列が単離され得る。例えば、ＰＣＲ技術、続いて、増幅された産物のクローニングによって、配列は、単離された細胞から直接増幅され得る。あるいは、単離された細胞を溶解して、単離された細胞で発現された可変配列に対応するＤＮＡ構築物の放出をもたらし得、これらの構築物またはベクターを単離し、得られた物質から増幅され得る。例えば、構築物がプラスミドベクターである場合、溶解した物質を用いて、コンピテント細菌細胞を形質転換し、続いて、細菌宿主を用いてプラスミドを単離し、増幅し得る。複数反復配列ユニットを取り込むタグ配列については、これらのユニットの各々は、タグ配列を取り込む分子に存在する反復ユニットおよび／または他の配列の間の潜在的相互作用に起因して、必ずしも同一構造をとる必要はない。いずれかの所定のタグ配列の構造は、その配列の状況によって影響され得る。
【０３５０】
１つの実施形態において、タグ配列は逆−ｖａｖ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｖａｖ）  ＲＮＡに由来する。１つの実施形態において、タグ配列は３アーム接合構造を形成する（図３６）。１つの実施形態において、タグ配列は長さが１０〜１００、８０〜１００、９０〜１００、８０〜１２０、１００〜２Ｋｂ、２Ｋｂ〜１５Ｋｂのヌクレオチドである。１つの実施形態において、標的配列は、第一ステム−ループ領域と第二のステム−ループ領域との間の結合に対して、第一のステム−ループの領域のステムの３’側の全てまたは部分から第二のステム−ループ領域のステムの５’側の全てまたは部分の領域である（図３６）。
【０３５１】
１つの実施形態において、ステム領域は８〜９の塩基対を含み、第一のステム−ループ領域は４〜６の塩基対を含み、第二のステム−ループ領域は１３〜１７の塩基対を含む（図３７）。１つの実施形態において、３つのアームのステム領域は、さらに、非相補的領域を含む。１つの実施形態において、ステム領域および第一のステム−ループ領域のステムは、さらに、１つのミスマッチ領域を含み、第二のステム−ループ領域は、さらに、２〜７のミスマッチ領域またはバルジ領域を含む。１つの実施形態において、ステム領域の間の結合は合計８〜１２のヌクレオチドを有する（図３７）。１つの実施形態において、タグ配列は図４２Ａ、ＢまたはＣによる構造または配列を含む。別の実施形態において、タグ配列は図４２Ａ、ＢまたはＣによる配列から予測されるエネルギー的により好都合な構造を有する。
【０３５２】
また、本発明は、上記したように、目的の少なくとも１つのＲＮＡおよびタグ配列をコードする少なくとも１つのＤＮＡを含むＤＮＡ構築物も提供する。また、本発明は、ＤＮＡ構築物を含むベクターおよび細胞を提供する。
【０３５３】
さらなる実施形態において、細胞株は、少なくとも第二のＲＮＡを発現するように作製され得；この工程は、さらに、第二のＲＮＡおよび第二のタグ配列および、必要に応じて、第二の選択マーカー（例えば、薬物耐性マーカー）をコードする第二のＤＮＡ構築物で細胞株をトランスフェクトする工程；必要に応じて、第二のマーカーを転写する細胞につき選択する工程；第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブに細胞を暴露する工程、ならびに、第一のタグ配列および第二のタグ配列の双方または少なくとも１つのシグナルを呈する細胞を単離する工程を包含する。２つのＲＮＡの場合には、第二のタグ配列をコードするＤＮＡ配列の部分もまた、第二のＲＮＡのタンパク質コード部分をコードするＤＮＡ配列の部分を有するフレーム内であっても、フレーム外であってもよい。第二のＲＮＡは、第一のものと同時にまたは順次のいずれかでトランスフェクトされ得る。上記方法を同時に行い、かつ同一選択マーカー（例えば、薬物耐性マーカー）を双方の構築物で用いることを仮定すると、より高いレベルの薬物または適当な選択剤を用いて、双方の構築物を発現する細胞につき選択することができる。さらに、２を超えるＲＮＡが、上記した工程を反復することによって、細胞株に提供され得る。
【０３５４】
発現ライブラリーを形成するＤＮＡ構築物を用いて同時または順次様式で上記工程を反復することによって、複数の細胞株が作製され得る。１つの実施形態において、発現ライブラリーは単一タグ配列を用い、タグ配列に対して相補的である同一シグナリングプローブに細胞を暴露する。別の実施形態において、異なる発現ライブラリーは異なるタグ配列を使用し得る。１つの実施形態において、各細胞株は１つのＲＮＡを発現する。別の実施形態において、各細胞株は１を超えるＲＮＡを発現する。これは、複数のＤＮＡ構築物で細胞を順次または同時にトランスフェクトすることによって達成され得る。複数ＤＮＡ構築物で安定にトランスフェクトされた細胞を得る可能性は、トランスフェクションで使用されるより高い濃度のＤＮＡ構築物を導入することによって増加させ得る。あるいは、出発細胞は、複数ＤＮＡ構築物をもつ細胞を得るために第一のＤＮＡ構築物ですでにトランスフェクトされていてもよい。また、複数の異なる発現ライブラリーを用いて、細胞をトランスフェクトし得る。各ライブラリーは、対応するシグナリングプローブを用いて検出される区別されるタグ配列を取り込み得る。各発現ライブラリーは、選択マーカー（例えば、薬物耐性遺伝子）を含み得る。
【０３５５】
単離された細胞は、個々に増殖させてもよいし、プールされてもよい。個々に単離された細胞またはプールされた細胞を増殖させて、細胞の集団を生じ得る。細胞株は、個々に単離された細胞を増殖させることによって作製され得る。個々の細胞株または複数の細胞株は、別々に増殖させてもよいし、プールされてもよい。細胞株のプールが所望の活性を生じる場合、この効果を有する細胞株または細胞株のセットが同定されるまで、それはさらに分画され得る。これは、各々を別々に維持する必要性なくして非常に多数の細胞株を維持することをより容易にし得る。
【０３５６】
ＲＮＡを過剰発現する細胞株を作製するためのさらに別の方法が提供され、この方法は、
ａ）ＲＮＡおよび第一のタグ配列をコードする第一のＤＮＡ；および上記ＲＮＡおよび第二のタグ配列をコードする少なくとも第二のＤＮＡを細胞に導入する工程であって、ここに、上記第一のタグ配列と第二のタグ配列とは異なる、工程；
ｂ）上記第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションに対して検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブ、および上記第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションに対して検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程；ならびに
ｃ）上記シグナリングプローブの少なくとも１つのシグナルを呈する細胞を単離する工程、
を包含する。
【０３５７】
この方法は、さらに、単離された細胞を増殖させて、ＲＮＡを発現または過剰発現する細胞株を作製する工程を包含し得る。ＤＮＡ構築物がトランスフェクトされた細胞のゲノム中の異なる位置に組み込まれる場合、複数の細胞株が作製され得る。トランスフェクトされた構築物のゲノム取り込みがゲノムに関して特定の位置に向けられない限り、組込みはランダムに起こり、従って、各陽性細胞は相互に異なり得、それらが選択されるＲＮＡに対して全て陽性である複数の異なる細胞株となると考えられる。必要に応じて、ＤＮＡ構築物は、さらに、少なくとも選択マーカー（例えば、薬物耐性マーカー）をコードし得、上記方法は、さらに、選択マーカーを用いて細胞を選択し、例えば、上記マーカーが工程ａ）後に耐性を付与する少なくとも１つの薬物に対する耐性に対して選択する工程を包含し得る。細胞が単離される場合は常に、１以上の構築物または１以上の発現ライブラリーでのトランスフェクション後であるかを問わず、単離された細胞は、相互から分離して増殖されてもよいし、プールされてもよい。
【０３５８】
１つの実施形態において、細胞はアンチセンスまたはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたはタンパク質を発現する。加えて、特定のタンパク質を発現するようにされた細胞は、タンパク質およびアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞を作製するための出発点として使用され得る。もちろん、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子を発現する細胞は、本明細書中の方法を用い、さらなるタンパク質をコードするさらなるＲＮＡを加えるための出発点として使用され得る。対応するシグナリングプローブおよび、所望の場合、タグ配列での、タンパク質およびアンチセンスまたはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子をコードするＲＮＡの同時トランスフェクションもまた、実施され得る。上記した手順の種々の組み合わせは、本明細書において包含される。
【０３５９】
同様に、少なくとも１種のＲＮＡを発現する細胞を単離するための方法が提供され、この方法は、
ａ）少なくとも１つのＲＮＡを発現することが疑われる細胞を提供する工程；
ｂ）少なくとも１つのＲＮＡとのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程；
ｃ）シグナルを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
【０３６０】
上記方法は、その標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる第二のシグナリングプローブを用い、第二のＲＮＡも発現する細胞を同定するために使用され得、第一のシグナリングプローブおよび第二のシグナリングプローブの双方または各々の蛍光を有する細胞が単離される。２を超えるＲＮＡの同時発現も達成可能である。細胞が単離される場合は常に、１以上の構築物または１以上の発現ライブラリーでのトランスフェクションの後であるかを問わず、単離された細胞は、相互から分離して増殖させてもよいし、プールされてもよい。
【０３６１】
少なくとも１つの外因性ＲＮＡおよび１つの内因性ＲＮＡを発現する細胞を単離するための別の方法が提供され、この方法は、
ａ）少なくとも１つの外因性ＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞に導入する工程であって、ここに、上記細胞は潜在的に少なくとも１つの内因性ＲＮＡを発現する、工程；
ｂ）上記少なくとも１つの外因性ＲＮＡへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第一のシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程；
ｃ）上記少なくとも１つの内因性ＲＮＡへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第二のシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程であって、ここに、上記第二のシグナリングプローブは第一のシグナリングプローブのシグナルとは異なるシグナルを生じる、工程；ならびに
ｄ）それらの各ＲＮＡへの上記シグナリングプローブのハイブリダイゼーションに際して上記シグナルの少なくとも１つを生じる上記細胞を単離する工程、
を包含する。
【０３６２】
上記した２つの方法は、さらに、上記単離された細胞を増殖することによって、上記少なくとも１つの外因性ＲＮＡおよび少なくとも１つの内因性ＲＮＡを発現する細胞株または複数の細胞株を作製する工程を包含し得る。
【０３６３】
これらの方法は、タンパク質（例えば、細胞表面−局所化タンパク質、細胞内タンパク質、分泌タンパク質または他のタンパク質）を発現するＲＮＡで有用である。これらの方法は、より困難であり得るか、またはさらなる実験を行うことができないような細胞に影響する、タンパク質それ自体のためのプローブの使用を必要としない。タンパク質をコードする１を超えるＲＮＡは、複数のシグナリングプローブ、単離のために用いられる技術によって同時に検出可能な数までのプローブを用いて同定され得る。必要に応じて、ＤＮＡ構築物は、さらに少なくとも１つの選択可能なマーカー（例えば、薬物耐性マーカー）をコードし得、上記方法は、例えば、上記マーカーが工程ａ）後に耐性を付与する少なくとも１つの薬物に対して抵抗性である細胞を選択することによって、選択マーカーを用いて細胞を選択する工程をさらに包含し得る。単離された細胞は、別々に増殖されてもよいし、プールされてもよい。細胞が単離される場合は常に、１以上の構築物または１以上の発現ライブラリーでのトランスフェクション後かを問わず、単離された細胞は、相互から別々に増殖されてもよいし、プールされてもよい。
【０３６４】
上記した方法では、１つの実施形態において、細胞は動物に移植することができる。１つの実施形態において、シグナリングプローブは発蛍光性プローブであり、上記ＲＮＡを発現する細胞は蛍光を発する。蛍光を発する上記細胞の単離は、蛍光細胞分析分離装置技術または蛍光に基づいて細胞を単離するために使用され得るいずれかの技術を用いて実施され得る。１つの実施形態において、２つのシグナリングプローブを用いて、ＲＮＡまたはタグ配列を標的化する。第一のプローブのフルオロフォアは、第二のプローブのフルオロフォアと同一であっても異なっていてもよい。２つの異なるフルオロフォアの場合には、それらは同一または異なる発光波長を有し得る。現在、ＦＡＣＳ技術は、分類手順の間に７つまでの異なるフルオロフォアの検出を可能とすることができる。上記方法を同時に反復して、７つまでの異なるタンパク質の発現を得ることができる。所望の場合、次いで、７つの異なるタンパク質を発現する細胞株は、上記手法に続いてより多くのタンパク質の導入のための出発点として使用され得る。ＦＡＣＳ技術が進むにつれ、より多数のシグナルを分解することができ、ＦＡＣＳの１つの適用においてより多数のＲＮＡを有する細胞についての選択が可能になる。
【０３６５】
当然、上記した手順を用いて、生物学的試料における少なくとも１つのＲＮＡ転写産物の発現のレベルを定量化し得、この方法は、
ａ）ＲＮＡ転写産物とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる第一のシグナリングプローブに生物学的試料を暴露する工程；
ｂ）生物学的試料におけるシグナルのレベルを定量する工程；および
ｃ）少なくとも１つのｍＲＮＡ転写産物の上記レベルとシグナルのレベルとを相関させる工程、
を包含する。
【０３６６】
生物学的試料は、細胞試料であっても、組織試料であっても、それに由来する調製物であってよく；それらは凍結し、および／または、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはシグナリングプローブを用いるＲＮＡの検出に干渉しないいずれかの数の公知の細胞固定剤で固定され得る。細胞試料の調製物としては、限定されるものではないが、非細胞小器官または区画、ミトコンドリア、細胞の小器官、非細胞画分、細胞の原形質膜、細胞内物質または細胞外物質、膜調製物、これらのいずれかの１以上由来の核酸の調製物、これらのいずれかの１以上に存在するいずれかのウイルスまたは他のウイルスまたは生物の調製物、あるいはこれらの１以上のいずれかの組合せが挙げられる。
【０３６７】
発蛍光性プローブの実施形態では、蛍光は、蛍光顕微鏡または蛍光細胞分析分離装置技術によって定量化され得る。さらなるＲＮＡ種は、第二のＲＮＡ転写産物へのハイブリダイゼーションに際して蛍光を発する第二のシグナリングプローブを用いて同時に定量（ｑｕａｎｔｔｉｔａｔｅ）（すなわち、定量化（ｑｕａｎｔｉｆｙ））され得る。上記方法は、細胞内の事象、状態または組成物の検出のための発蛍光性レポーターを利用するアッセイと同時に使用され得る。そのような蛍光アッセイとしては、限定されるものではないが、ＴＵＮＥＬ、アポトーシス、壊死、Ｃａ２＋／イオンフラックス、ｐＨフラックス、免疫蛍光、小器官標識、細胞接着、細胞周期、ＤＮＡ含有量、およびタンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ＲＮＡの間の相互作用を検出するのに用いるアッセイが挙げられる。これらのアッセイで用いるために蛍光標識され得る試薬としては、限定されるものではないが、（蛍光分子または自動蛍光タンパク質で標識された）タンパク質；蛍光代謝インジケーター（細胞分裂のためのＣ１２レザズリン、ＣＦＳＥ）；蛍光基質または副産物；蛍光標識されたレクチン；蛍光化学物質；ケージド（ｃａｇｅｄ）蛍光化合物；蛍光核酸色素；蛍光ポリマー、脂質、アミノ酸残基およびヌクレオチド／側（ｓｉｄｅ）アナログが挙げられる。
【０３６８】
細胞へのアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子の導入は、細胞からの１以上のタンパク質もしくはＲＮＡのレベルを機能的に排除または低下させるのに有用である。上記方法に続き、予め選択された少なくとも１つのタンパク質もしくはＲＮＡの、機能的にヌルな細胞または発現レベルを低下した細胞を単離あるいは作製するための方法が提供され、この方法は、上記細胞において、上記予め選択されたタンパク質またはＲＮＡに対する複数のアンチセンスまたはｓｉＲＮＡを提供する工程であって、各々は、上記した方法によって提供され、ここで、上記複数のアンチセンスまたはｓｉＲＮＡは、上記少なくとも１種の予め選択されたタンパク質またはＲＮＡのｍＲＮＡ転写産物の本質的に全てあるいは十分なレベルに結合する工程を包含する。予め選択されたタンパク質は、遺伝子産物の交互にスプライシングされた形態であり得る。
【０３６９】
同様な方針に従い、トランスジェニック動物を作製するための方法が提供される。このトランスジェニック動物は、少なくとも１種の予め選択されたタンパク質またはＲＮＡの機能的ヌルを発現する変異体であるか、あるいは少なくとも１種の予め選択されたタンパク質またはＲＮＡを低下したレベルで発現する。この方法は、胚性幹細胞を利用し、かつ生きた胚性幹細胞を用いて上記した工程を行って、上記トランスジェニック動物を作製する工程を包含する。
【０３７０】
同様に、同一細胞に対して本明細書における方法を行うことを包含する、少なくとも１つのタンパク質またはＲＮＡの機能的にヌルであるかまたはその発現レベルが低下し、かつ少なくとも１つの他のタンパク質またはＲＮＡを過剰発現する細胞を単離するか、あるいはそのような細胞株を作製する方法が提供される。同じ様式で、誘導性プロモーター、または転写レベルの調節をもたらすいくらかの他の結合活性または機能的活性を有する配列の制御下にある、致死的アンチセンスまたはｓｉＲＮＡを発現する細胞株を作製する方法が提供される。これは本明細書の方法を行うことによって達成され得ることができ、ここに、上記トランスフェクション工程は最小量のインデューサーまたは化合物の存在下で行われる。
【０３７１】
従って、本発明は、
ａ）少なくとも第一のタンパク質をコードする少なくとも１つのＲＮＡ、および少なくとも第一のタグ配列をコードする少なくとも第一のＤＮＡ；および上記少なくとも１つのＲＮＡおよび少なくとも第二のタグ配列をコードする少なくとも第二のＤＮＡを細胞に導入する工程であって、ここに、上記第一のタグ配列と第二のタグ配列は異なる、工程；
ｂ）上記少なくとも第二のタンパク質のｍＲＮＡ転写産物に結合し、またはそれに干渉する少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡを細胞に導入する工程；
ｃ）上記少なくとも第一のタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第一のシグナリングプローブ、および上記少なくとも第二のタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも第二のシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程；
ｄ）上記少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡへのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程；ならびに
ｅ）それらの各ＲＮＡへの上記シグナリングプローブのハイブリダイゼーションに際して上記シグナルの少なくとも１つを生じる細胞を単離する工程、
を包含する、少なくとも第一のタンパク質を過剰発現し、かつ少なくとも第二のタンパク質につき機能的にヌルであるものを発現するか、または発現が低下した細胞を単離するための方法を提供する。
【０３７２】
さらに別の実施形態において、本発明は、
ａ）個々の化合物または化合物のセットを細胞に加える工程；
ｂ）少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡとのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程；
ｃ）上記細胞においてシグナルのレベルを定量する工程；
ｄ）化合物を加えない細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を同定する工程；ならびに、必要に応じて、
ｅ）上記少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡの転写を調節する化合物を同定する工程、
を包含する、少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡの転写を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【０３７３】
１つの実施形態において、上記予め選択されたＲＮＡは、細胞のゲノムによってコードされる。１つの実施形態において、上記予め選択されたＲＮＡは、工程ａ）に先立って細胞にトランスフェクトされたＤＮＡ構築物によってコードされる。１つの実施形態において、トランスフェクトされた細胞は、上記ＲＮＡを認識するように設計されたシグナリングプローブに暴露され、上記細胞は上記ＲＮＡを発現する。１つの実施形態において、ＤＮＡ構築物はプロモーターまたはオペレーターを含み、リプレッサー、エンハンサー、または転写を調節する配列をコードする。１つの実施形態において、予め選択されたＲＮＡはタグ配列に連結され、そしてシグナリングプローブはタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる。
【０３７４】
もう１つの実施形態において、本発明は、
ａ）少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡの転写を潜在的に調節する試験ＲＮＡ配列をコードする少なくとも１つの構築物を細胞に導入する工程；
ｂ）上記少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡとのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくとも１つのシグナリングプローブに上記細胞を暴露する工程；
ｃ）上記細胞におけるシグナルのレベルを定量する工程；
ｄ）試験ＲＮＡ配列無しの細胞のシグナルと比較してシグナルの増加または減少を有する細胞を選択する工程；ならびに、必要に応じて、
ｅ）上記少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡの転写を調節する試験ＲＮＡ配列を同定する工程、
を包含する、少なくとも１つの予め選択されたＲＮＡの転写を調節するＲＮＡ配列を同定する方法を提供する。
【０３７５】
これらの細胞は、単離され、増殖させて、細胞株を生じ得る。それらは、別々に増殖させてもよいし、プールされてもよい。転写の調節は、予め選択されたＲＮＡの下流のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションであり得る。１つの実施形態において、上記予め選択されたＲＮＡはゲノムによってコードされる。上記予め選択されたＲＮＡは、工程ａ）に先立って細胞にトランスフェクトされるＤＮＡ構築物によってコードされる。１つの実施形態において、トランスフェクトされた細胞は、上記ＲＮＡを認識するように設計されたシグナリングプローブに暴露され、上記細胞は上記ＲＮＡを発現する。１つの実施形態において、予め選択されたＲＮＡはタグ配列に連結され、シグナリングプローブはタグ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる。１つの実施形態において、ＲＮＡ配列の発現ライブラリーを用いて、転写を調節するＲＮＡ配列を同定する。１つの実施形態において、試験ＲＮＡ配列はタグ配列に連結される。工程ｅ）は、工程ａ）に続いて、上記ＲＮＡ配列またはタグ配列へのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じる少なくともシグナリングプローブに細胞を暴露し、続いて、工程ｂ）を行うことによって促進される。試験ＲＮＡ配列またはそのタグ配列に向けられたシグナリングプローブによって生じたシグナルは、予め選択されたＲＮＡに向けられたシグナリングプローブとは異なり得、従って、細胞は、異なるシグナリングプローブに同時に暴露され得る。
【０３７６】
また、
ａ）組換え配列から転写されたもの、および非組換え配列から転写されたものからなる群から選択されるＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションに際して検出可能なシグナルを生じるシグナリングプローブに細胞を暴露する工程；および
ｂ）上記ＲＮＡ配列を発現する上記細胞を検出する工程、
を包含する、生きた細胞において遺伝子的組換え事象を同定するための方法も、本明細書において提供される。
【０３７７】
細胞の検出および／または分類は、ＦＡＣＳまたは蛍光顕微鏡によって行うことができる。
【０３７８】
本発明は、本発明の例示として提供される、以下の非限定的実施例を参照することによって良好に理解され得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に説明するために提示される。しかしながら、それらは、断じて、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書中に記載されたのと同様もしくは同等の方法および材料もまた、本発明の実施または試験で使用され得る。
【０３７９】
（１７．シグナリングプローブの細胞への導入を誘導または改良するか、あるいは標的の検出を増強するための試薬または化合物の同定）
シグナリングプローブを細胞に導入するのに使用され得る試薬は、限定されるものではないが、タンパク質、脂質、ポリマー、抽出物またはこれらの化合物もしくは混合物を含めた種々の化学物質を試験することによって同定され得る。化学物質は、気体、液体、または固体の形態であってよい。これは、限定されるものではないが、有機溶媒および水性溶媒、緩衝化溶液または培地またはこれらの任意の組合せを含めた種々の溶媒において、１：１，０００，０００，０００〜１，０００，０００，０００：１の範囲の種々の比率で化学物質をシグナリングプローブと混合することによってなされ得る。ここで、上記混合物は、１分〜４８時間の範囲の種々の時間の間インキュベートされ、そして上記インキュベーションは、何も行わないか、ないし温和な振盪、または揺動ないしボルテックス、または一定のピペッティングの種々の程度の攪拌または混合を行いつつ、０℃未満〜１００℃を超える範囲の種々の温度条件下で行われ、そして、上記インキュベーションは明所または暗所にて、あるいは種々の他の環境条件下で行われる。次に、混合物は、細胞に適用され、プローブの送達は、蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー技術を使用するか、あるいはＦＡＣＳまたは他の蛍光検出方法によってアッセイされる。これは、例えば、引き続いての高スループット分析に適合可能な、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートもしくは１５３６ウェルプレートにて、またはビーズにて行われ得る。ビーズを用いる場合、ＦＡＣＳを用いて、ビーズは分析または単離され得、それらがさらにコードされる場合、単離されたビーズを用いて、それらが処理された混合物の同一性を決定し得ることに注意されたい。
【０３８０】
用いる細胞は、生きたものでも、固定されたものでもよく、限定されるものではないが、組織培養プレートまたはビーズを含めた固体表面に付着して提示され得るか、あるいはそれらは懸濁液中に存在し得る。種々の緩衝液または溶液を混合物の添加に先立って用い、細胞が洗浄され得る。一旦試薬が細胞に適用されたならば、反応物は、上記したように、明所または暗所にて、または種々の他の環状条件下で、かつ種々の温度において、種々の程度の攪拌または混合を行いつつ種々の時間の間インキュベートされ得る。ここで、例えば、細胞生存率を維持すべきならば、これらのパラメーターは制限され得る。インキュベーションに続き、細胞は、直接分析されてもよいし、分析の前に上記したように洗浄されてもよい。
【０３８１】
上記方法は、シグナリングプローブまたは構成的に活性なプローブを用いて実施され得る（例えば、発蛍光性プローブの場合、クエンチャーを欠くプローブが使用され得る）。また、試験すべき混合物の各々は、１以上の細胞試料を用いて試験され得る。例えば、混合物は、使用されるシグナリングプローブの標的を含むことが公知である細胞、ならびにコントロール細胞の双方を用いて試験され得る。複数の細胞型は、混合されて存在してもよいし、別々に存在してもよい。好ましい混合物は、増大したノイズに対するシグナルをもたらすものであり、例えば、コントロール細胞と比較して標的を含む細胞において増大したシグナルを生じる。
【０３８２】
同様に、細胞が混合物に加えられる以外は、本質的に同一の方法が実施される。例えば、試験すべき混合物は、まず、試験チャンバー、例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートまたは１５３６ウェルプレートのウェル、あるいはビーズに適用され、そして、細胞は次に適用され得る。細胞は、プレートした混合物に直接添加され得るか、あるいは、例えば、乾燥、加熱またはエバポレーションによって、一旦混合物を処理して添加され得る。
【０３８３】
関連した方法で、シグナリングプローブを用いて細胞における標的の検出を増強する能力について、化合物は試験され得る。この場合、シグナリングプローブは、まず細胞に導入され、ここで、細胞は標的を含むことが公知である細胞およびコントロール細胞を共に含む。次に、上記に記載され、かつ上記に記載された種々の条件およびパラメーターを用いる化学物質は、シグナルを改良するそれらの能力についてアッセイされ得る。この場合に用いる化学物質はシグナリングプローブと混合しないことに注意されたい。好ましい化学物質は、ノイズに対するシグナルの比を増大させることが検出または同定されるもの、例えば、コントロール細胞と比較して標的を含む細胞における増大したシグナルをもたらすものである。このアプローチを用いて同定される化学物質は、限定されるものではないが、シグナリングプローブの細胞の細胞質への送達の増大、プローブによるその検出が（例えば、標的の改良された接近可能性を引き起こすことによって）改良されるような標的の折畳みまたは構造への影響を含めた多数のメカニズムによって、あるいは非特異的バックグラウンドシグナルを低下させることによって（例えば、細胞の外側表面に付着したシグナリングプローブの量を低下させることによって）作用し得る。
【０３８４】
シグナリングプローブを細胞に導入するために使用され得るか、または標的の検出を増強するために使用され得ることができるノイズに対するシグナルの比を増大するよう作用する化学物質はまた、各々が標的を含むことが知られた細胞に適用される試験シグナリングプローブおよびコントロールシグナリングプローブを使用し、コントロールシグナリングプローブと比較して試験シグナリングプローブを用いる場合に増大したシグナルに対して化学物質を分析することによって、決定され得る。
【実施例】
【０３８５】
（実施例１）
一般的プロトコル。出発材料；シグナリングプローブは、ＤＮＡ構築物からいずれのＲＮＡも発現していない細胞に導入することができるか、あるいはそれらを用いて、ＤＮＡ構築物からコードされたＲＮＡメッセージを検出することができる。シグナリングプローブをこれらの２つの型の細胞のいずれかに導入する方法は同一である。以下のプロトコルは、分析すべき細胞が相互から分離可能であって、かつＦＡＣＳ分析に使用できることのみを必要とする。
【０３８６】
１）本発明の記載においてより徹底的に記載されるように、シグナリングプローブをＦＡＣＳと組み合わせて用いて、特異的ＲＮＡの細胞内での発現または発現の欠如に基づいて、組織の細胞を分類し得る。この目的では、ホモゲナイゼーションおよびさらなる化学的処理のような標準方法および良く確立された方法によって、細胞をまず相互から分離する。次いで、以下のプロトコルに従い、適当なシグナリングプローブをそのような細胞に導入することができる。
【０３８７】
２）第二に、シグナリングプローブを用いて、細胞の集団にトランスフェクトされているＤＮＡ構築物によってコードされる、特定のＲＮＡを発現する細胞について選択することができる。この目的では、まず、所望のＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を細胞の培養物にトランスフェクトする。次いで、シグナリングプローブを作製して、発明の説明においてより詳細に記載したように、これらのＲＮＡを認識することができる。ＤＮＡ構築物の細胞へのトランスフェクションは、限定されるものではないが、製造者の指示に従って、バイオテクノロジーの会社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ等）から得た試薬またはキットいずれかを用いることを含めた、非常に種々の方法を介して達成することができる。ＤＮＡ構築物を、各々が抗生物質に対する耐性を付与しするように選択する。これらのＤＮＡ構築物の細胞へのトランスフェクション、および細胞の回収のための短い時間（通常、２４時間）に続き、ＤＮＡ構築物が抗生物質耐性を付与した細胞のみが生存する適切な抗生物質に細胞を供す。これは、一般に、細胞の型および用いる抗生物質の双方に依存して、３〜４日、そして時々は、それより長い時間を必要とする。
【０３８８】
結果は、細胞のプールが残り、これらの全ては抗生物質に対して耐性であるが、目的のＲＮＡを発現するものの小さな画分に過ぎないというものである。所望のＲＮＡを発現する細胞について選択するために、以下のプロトコルを行う。
【０３８９】
（実施例２  シグナリングプローブを用いる細胞の選択）
１）シグナリングプローブの細胞へのトランスフェクション：シグナリングプローブは、ＲＮＡにおいて内因的な配列へハイブリダイズすること、または天然ＲＮＡ配列に付加したタグへハイブリダイズすることのいずれかによって、所望のＲＮＡを認識するように設計されなければならない。シグナリングプローブの設計は、本発明の説明おいて詳しく述べる。
【０３９０】
ＤＮＡ構築物の細胞へのトランスフェクションと同様に、トランスフェクションは非常に種々の方法によって行うことができる。使用する方法は、用いる細胞のタイプに基づいて選択すべきである。なぜならば、一部の細胞は他の方法よりもいくらかのトランスフェクション方法に対して良好に応答するからである。トランスフェクションは、用いるトランスフェクション試薬の製造者の指示に従って行うべきであり、最適化する必要があり得る。最適化は、トランスフェクトした材料の細胞または細胞質への送達を増強する化学物質での処理を包含し得る。
【０３９１】
シグナリングプローブの細胞へのトランスフェクションは、用いる細胞およびトランスフェクション試薬に依存して、懸濁液中の細胞、または固体表面で増殖する細胞に対して行うことができる。
【０３９２】
２）発蛍光性プローブの細胞へのトランスフェクションに続き、次いで、細胞をＦＡＣＳ分析に供し得る。ＦＡＣＳを用いて、用いる発蛍光性プローブのいずれかの１以上に対して陽性の細胞を分類することができる。また、それを用いて、発蛍光性プローブのシグナルの強度に基づいて細胞を分類し、それにより、研究者が種々のレベルでＲＮＡを発現する細胞を選択することが可能となる。
【０３９３】
（実施例３）
（１以上のＲＮＡを発現する細胞株の作製）
ＦＡＣＳ選択に続き、陽性スコアリング細胞を、発明の説明においてより詳細に記載したように適当な培地中に維持することができる。これらの細胞は、目的のＲＮＡを発現する細胞株を生じる。
【０３９４】
シグナリングプローブの濃度：用いるべきシグナリングプローブの濃度はいくつかの因子に依存する。例えば、検出すべきＲＮＡの細胞内での豊富さ、およびこのＲＮＡのシグナリングプローブへの接近性を考慮しなければならない。例えば、検出すべきＲＮＡが非常に少量で存在する場合、あるいは検出すべきＲＮＡの三次元折畳みに基づいて、またはタンパク質のＲＮＡへの結合に起因して接近できないＲＮＡの部分に見い出される場合、検出すべきＲＮＡが非常に豊富である場合、およびシグナリングプローブによって認識される部位が十分に接近可能な場合に、より多くのシグナリングプローブをここでは用いるべきである。用いるべきシグナリングプローブの正確な量は、各適用に対して経験的に決定されなければならない。
【０３９５】
これは、細胞の異なる群へ異なる量のシグナリングプローブを導入し、そして、バックグラウンド蛍光が低く、かつシグナルが高い条件（全てではないがいくつかの細胞がシグナリングプローブに対して陽性のスコアである条件）を選択することによって達成することができる。
【０３９６】
（実施例４）
（シグナリングプローブへの細胞の暴露）
限定されるものではないが、マイクロインジェクション、渦巻または混合のような機械的剪断力、ニードルの通過、または掻き落としを含めた細胞負荷技術、特定の抗生物質もしくは洗剤または試薬もしくは溶媒の組合せのような試薬を用いる浸透化のような当該分野で公知の方法を含めた、分子を細胞に導入する種々の方法を用いるか、あるいは種々の化学的特性（例えば、リポソームベース、化学物質、またはタンパク質ベース）を有する種々のトランスフェクション試薬の使用を通じて、またはこれらの方法のいずれか１以上の組合せを通じて、表面または溶液中に付着した細胞、部分的に付着した細胞、または沈降した細胞をＦＰに暴露することができる。
【０３９７】
脂質ベースのトランスフェクション試薬の使用を記載するより詳細な試料プロトコルを以下に概説する。
【０３９８】
（１．細胞の調製）
ＦＰへの暴露の前（細胞プレーティング方法１）またはそれと同日に細胞を組織培養のウェルにプレートするか（細胞プレーティング方法２）、あるいは細胞をＦＰへの暴露同日にミクロ遠心機チューブに移した（細胞プレーティング方法３）。
【０３９９】
全ての３つの調製方法を首尾よく用いた。細胞プレーティング方法１は、培養ウェルの表面へ細胞が付着するのに十分な時間を可能とし、他方、細胞プレーティング方法２は、どれ位の時間が細胞がさらに処理される前に過ぎるかに依存して、細胞が処理すべき種々の程度にプレートに沈降または付着するのを可能とした。そして細胞プレーティング方法３は、細胞がいずれかの表面に沈降または付着するいずれの時間も可能とすることなく、細胞がチューブに移された後直接に処理されるのを可能とするが、処理は所定の量の時間が過ぎた後に行うこともできる。
【０４００】
細胞を無血清培地またはＰＢＳのような緩衝液で１回以上リンスしたが、他の緩衝液を用いることもできる。一般に、緩衝液は種々のｍＭ濃度でＭｇＣｌ２を含む。暴露の方法に依存して、リンスする工程を省略することができる。
【０４０１】
（２．ＦＰ試薬の調製および細胞への暴露）
商業的に入手可能なトランスフェクション試薬を用い、かつ製造者によって記載された以下のプロトコルに従い、ＦＰを細胞調製への添加のために調製した。製造者のプロトコルは、複数パラメーターは、いずれの細胞型を用いるか、いずれのコンフルエンスまたは濃度にて細胞を処理すべきか、いずれの特定の分子を導入すべきか、いずれの割合および絶対量にて種々の試薬を組み合わせるべきか、そしていずれの間種々の工程を行い、またはインキュベートすべきか、いずれの工程を省略できるか、および他の変数を含めた複数の変数に対して経験的に決定される必要があることを指示する。製造者のプロトコルにおいて、特定の範囲が提供されているが、上記プロトコルはまた、これらは超過されなければならない可能性があり、あるいは他のパラメーターはそれらの試薬の首尾のよい使用のために最適化されなければならない可能性があることも示唆する。一般には、細胞のＦＰへの暴露は、製造者のプロトコルによる予備的範囲として提案された範囲内にあるこれらの条件のためのパラメーターを用いて行った。
【０４０２】
一般に、製造者によって提案された容量および濃度を用い、ＦＰは無血清培地含有チューブに加えられ、トランスフェクション試薬はやはり無血清培地を含有する第二のチューブに加えられる。全て製造業者のプロトコルによって示されるように、各チューブの内容物を混合し、合わせ、一定時間インキュベートする。次に、ＦＰを細胞の調製物に適用し、種々のインキュベーション時間に続いて細胞をアッセイする。
【０４０３】
図３２におけるＦＰを細胞に暴露するプロトコルは以下の通りである：
２４ウェルプレートのウェル当たりほぼ１×１０５細胞／ｍＬかつ０．５ｍＬにおいて、ＦＰへの暴露の前日に細胞をプレートした。用いた細胞を薬物でトランスフェクトし、ｒ−ｖａｖをコードする発現構築物について選択した。
【０４０４】
１つのチューブ中に１〜４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する５０ｕＬ〜２００ｕＬの無血清培地中の０．６２５〜２．５ｕＬの２０ｕＭのＦＰのストック、および第二のチューブ中の同一濃度のＭｇＣｌ２を含む等容量の無血清培地中の０．６２５〜２．５ｕＬのＴｆＸ５０（Ｐｒｏｍｅｇａ）をインキュベートすることによって、ＦＰ試薬を調製した。各チューブの内容物を混合し、次いで、合わせ、室温にて１５〜４５分間インキュベートした。
【０４０５】
細胞を、上記で用いたのと同一濃度のＭｇＣｌ２を補足した無血清培地で１回以上リンスした。ＦＰの調製物を細胞に適用し、過剰の無血清培地＋ＭｇＣｌ２を、必要に応じて、細胞が覆われるように加えたＦＰ調製物の容量に応じて加えることができる。
【０４０６】
細胞を組織培養インキュベーター中で３〜５時間インキュベートし、次いで、アッセイし、必要に応じて、観察に先立ってＤＭＳＯを加えることができる。ＤＭＳＯは、シグナリングプローブの細胞への送達において、検出すべき標的の折畳みまたは提示において助けとなることができる。他の溶媒または化学物質は、シグナリングプローブの細胞または細胞質への送達を増大させる目的で、またはシグナリングプローブによる標的の検出を改良する目的で用いることもできる。溶媒および化学物質は、双方の細胞型がシグナリングプローブに暴露される場合、それらが、標的を発現しない細胞と比較して標的を発現する細胞における標的の検出に対して増大した送達効率または増大したノイズに対するシグナルをもたらすか否かを測定することによって、それらの所望性または適当性について試験することができる。
【０４０７】
図３４についてのプロトコルは、トランスフェクトされた細胞またはトランスフェクトされていない細胞にＦＰ１６を加え、標的配列６ＣＡ４を含むＲＮＡをコードする発現構築物につき薬物を選択する以外は、図３２に記載したように実質的に行った。
【０４０８】
図３３（Ａ、Ｂ、Ｃ）におけるＦＰを細胞に暴露するプロトコルは以下の通りである。
【０４０９】
４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補足したＰＢＳ（ＰＢＳ＋４）中にて、ほぼ２．５×１０５細胞／ｍＬでプレートしたほぼ５０〜１００ｕｌの細胞を９６ウェルプレートのウェル中でプレートし、それらがプレート表面に沈降するのに過ぎた十分な時間の後であるが、それらが拡大する前に細胞をＦＰに暴露した。
【０４１０】
１つのチューブ中で１００ｕＬのＰＢＳ＋４中の２．５ｕＬの２０ｕＭのＦＰのストックを混合することによってＦＰ試薬を調製し、第二のチューブ中で７ｕＬのリポフェクタミン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を１００ｕＬのＰＢＳ＋４に加えた。各チューブの内容物を混合し、溶液を室温にて３０分間インキュベートし、その後、それらを合わせ、混合し、室温にてさらに１５分間インキュベートした。５０ｕＬのＦＰ調製物を各ウェルに加えた。無血清培地または他の緩衝液での細胞のリンスは任意である。２〜３時間の組織培養インキュベーター中でのインキュベーションに続いて細胞をアッセイし、次いで、アッセイした。
【０４１１】
図３３（Ｄ、Ｅ）におけるＦＰの細胞への暴露のためのプロトコルは、４ｕｌのＰｌｕｓ試薬（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＦＰを含有するチューブに加えた以外は図３２と本質的に同一であった。
【０４１２】
（実施例５  ＦＡＣＳを介する細胞の分析および単離）
上記したように細胞をＦＰに暴露し、次いで、処理して、それらが付着している場合それらを表面から脱着させ、（例えば、（他の酵素または非酵素手順を用いることができるが）トリプシンを用いることによって）それらを相互から分離し、次いで、それらをＦＡＣＳに適用する。
【０４１３】
ＦＰへの暴露に続き、ＦＰ含有溶液を細胞から除去し、トリプシンを細胞に直接適用する。いずれかのＦＰ試薬、または細胞のＦＰへの暴露の間に細胞表面に会合し得る他の試薬を除去するように設計された試薬を含めた、種々の緩衝液または試薬を用いるこの工程に先立って、細胞をリンスすることができる。細胞を緩衝液（例えば、血清およびマグネシウムを含有する培地）中に再懸濁し、例えば、ピペッティングによって細胞をさらに分配させる。
【０４１４】
次いで、標準的ＦＡＣＳ方法に従い、細胞をＦＡＣＳによって分析した。細胞の分析については、ＦＰを用い、これらの配列の存在について、コントロール細胞、および標的配列を潜在的に発現する細胞の蛍光強度を比較することによって、この手順を受けた細胞のバックグラウンド蛍光を測定して、標的化配列を潜在的に発現する細胞がいずれかの変化した蛍光を示すかを判断することができる。細胞は、この情報に基づいて、個々にまたはバッチにて単離することができる。例えば、既存の技術は、９６ウェルプレートのユニークなウェルへの所望の細胞の直接的単離を可能とするか、あるいは複数の所望の細胞を得ることができる。
【０４１５】
ＦＡＣＳにおける蛍光強度の閾値を増加または減少させることによって、異なるレベルの蛍光シグナルを呈する細胞を単離することができる。例えば、陽性細胞についての単離された細胞を豊富化するのを単に望む場合には、細胞が事実陽性であるという高い確信を有するように非常に高い閾値を設定するのを望むことができるか、あるいは得られる集団における陽性細胞の純度が臨界的でないのであればより低い閾値を設定することができる。
【０４１６】
（実施例６  発現の安定性の測定）
細胞中の１以上の遺伝子の発現レベルを経時的にモニターすることができる。例えば、配列を認識するように設計されたＦＰを用いる配列の発現について陽性として単離された細胞に由来する細胞株を考慮すると、細胞およびコントロール細胞をＦＰに暴露することができ、そしてＦＰによって発せられたシグナルについての２つの細胞型の蛍光強度の比率を測定することができる。この手法は経時的に反復することができ、比率の変化はＦＰによって検出されるべき配列についての発現の相対的レベルの変化を反映する。この手順は複数ＦＰを用いて行うことができる。
【０４１７】
（実施例７  タグ配列の設計）
タグ１についての配列を用いて、シグナリングプローブの標的配列が同様に結合につき示されるように、シグナリングプローブの結合に最も直接的に関与する構造の領域に特に関与して同一または同様な予測される構造を有する配列を作製する意図をもって、配列の各々をユニークなシグナリングプローブによって認識できるように、２つのさらなる異なる配列を作製した。作製された２つの異なるタグ配列（タグ２およびタグ３）の各々については、タグ１についての元の配列内の標的化配列をまず変化させ、これらの同一位置での相互作用を維持する努力において変化した配列と相互作用することが予測されたいくつかのさらなる塩基に対して、補償変化を行った（図４３および４４）。新しい配列の予測された配列を得、もしそれがタグ１の予測された構造に密接にマッチしないならば、上記構造を用いて、いずれのさらなる変化が必要であるかを予測した。これは、タグ１の構造と同様な予測された構造を有する新規な配列が得られるまで行った反復プロセスである。これらの配列に対してなされた変化は、塩基の置換、欠失および付加を含む。
【０４１８】
（実施例８  上昇した温度におけるシグナリングプローブの暴露）
ＦＰ１７は、相互作用対に隣接する７塩基対の相互に相補的な領域を形成すると予測される。コントロールオリゴと比較して、標的オリゴの存在下でインキュベートした場合、より強い蛍光シグナルをＦＰ１７が与えるため上昇した温度が必要であった。例えば、これはそれらを９０〜９５℃の熱水中に軽く入れることによる。ここで用いるチューブは、ほぼ２．３４ｍＭの最終マグネシウム濃度を有する、５ｕＬの２０ｕＭ  ＦＰストック、１．５ｕＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８ｕＬの２０ｕＭオリゴ、および１．５ｕＬの水よりなる合計１６ｕＬを含有した。用いた標的オリゴはＴＯ−ＦＰ１であり、用いたコントロールオリゴは上記したようなＴＯ−ＦＰ１８であった。
【０４１９】
（実施例９  化学的に改変したシグナリングプローブ）
ＦＰ１プローブ配列に基づく１５の異なる化学的に改変したプローブを合成した。これらのプローブの全ては同一配列を有し、同一標的配列に対して向けられる。プローブを２９３Ｔ細胞に導入した。これらの細胞はＦＰ１の標的配列を含むタグ配列を発現する。ＦＡＣＳを用いて、これらの細胞からの蛍光を分析した。１５の異なるプローブを以下に記載する。ＦＡＣＳ分析の結果を図４６〜６０に示す。結果は、１５個の全てのプローブは、標的配列を発現する細胞を検出することができることを示す。プローブの全ては、化学的改変を除いて、濃度、送達の方法、フルオロフォア、クエンチャーおよび配列に関して同一であった。
【０４２０】
【化１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図４５】
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