(57)【要約】      （修正有）【課題】癌感受性の診断のための方法及び組成物、欠損ＤＮＡ修復メカニズム及びその処置の提供。【解決手段】ファンコーニ貧血及び癌の診断、新規治療薬をスクリーニングのためのプローブ及びプライマーとしてのＦＡＮＣＳ２遺伝子配列の使用。欠損ＤＮＡ修復に関与する症状を処置するための新規治療薬をスクリーニングに使用する実験マウスモデル、遺伝子治療陽ベクターの調製。ＦＡＮＣＤ２アイソフォームの同定と、２つのアイソフォームを区別するポリクローナル及びモノクローナル抗体の調製とその診断試験での使用。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）（ｂ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号：５から８、１８７から１８８に示すヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；及び
（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２】
ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがｃＤＮＡ分子である請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子である請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
ＤＮＡ修復を促進するための細胞の核のＦＡＮＣＤ２の短い形態から長い形態への変換の生物学的特性を保持するために配列番号：４のアミノ酸配列に十分類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から本質的に構成される単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号：９から１９１に少なくとも９０％同一であるか、または配列番号：９から１９１に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドから本質的に構成される単離された核酸分子。
【請求項７】
配列が表６に開示される配列番号：９から９４より選択されるイントロン／エクソン配列である請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
配列が表７に開示される配列番号：１１５から１８６より選択されるＰＣＲプライマーである請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項１の単離された核酸分子をベクターに挿入することからなる組換えベクターを作製する方法。
【請求項１０】
請求項９の方法により製造される組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０の組換えベクターを宿主細胞に導入することからなる組換え宿主細胞を作製する方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法により製造される組換え宿主細胞。
【請求項１３】
（ａ）ＦＡ−Ｄ２に関連する相補群のビアレリック変異を有する対象から細胞を入手すること；及び
（ｂ）細胞を形質転換ウイルスで感染させてＦＡ−Ｄ２細胞系を作成すること；
からなるＦＡ−Ｄ２細胞系の作製方法。
【請求項１４】
細胞が繊維芽細胞及びリンパ球から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
形質転換ウイルスがエプスタイン・バー・ウイルス及びレトロウイルスから選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
さらに欠損ＦＡＮＣＤ２の存在を決定することによりＦＡ−Ｄ２細胞系を特徴付けることからなる請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＦＡ−Ｄ２細胞系の特徴付けがさらに（ｉ）ＦＡＮＣＤ２に特異的な抗体を用いるウェスタンブロットまたは核免疫蛍光；及び（ｉｉ）ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイから選択される診断アッセイを細胞系で実施することを含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１の単離された核酸分子を含んでなる組換え宿主細胞を培養することからなるポリペプチドを製造するための組換え方法。
【請求項１９】
（ａ）配列番号：４；
（ｂ）（ａ）に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：５から８、１８７から１８８の少なくとも１つに少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；及び
（ｄ）フラグメントが少なくとも５０アミノ酸の長さである（ａ）から（ｄ）のポリペプチドフラグメント；
から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
ｎｔ３７６のＡからＧ、ｎｔ３７０７のＧからＡ、ｎｔ９０４のＣからＴ、及びｎｔ９５８のＣからＴより選択される変異を有するＤＮＡによりコードされる請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
多型がｎｔ１１２２のＡからＧ、ｎｔ１４４０のＴからＣ、ｎｔ１５０９のＣからＴ、ｎｔ２１４１のＣからＴ、ｎｔ２２５９のＴからＣ、ｎｔ４０９８のＴからＧ、ｎｔ４４５３のＧからＡより選択される、ポリペプチドをコードするＤＮＡの多型によりポリペプチドが特徴付けられる請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドがアミノ酸２２２またはアミノ酸５６１での変異により特徴付けられる請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
ＦＡＮＣＤ２タンパク質に結合特異性を有する抗体調製物。
【請求項２４】
さらにモノクローナル抗体を含んでなる請求項２３に記載の抗体調製物。
【請求項２５】
さらにポリクローナル抗体を含んでなる請求項２３に記載の抗体調製物。
【請求項２６】
ＦＡＮＣＤ２タンパク質がＦＡＮＣＤ２−Ｓである請求項２３に記載の抗体調製物。
【請求項２７】
ＦＡＮＣＤ２タンパク質がＦＡＮＣＤ２−Ｌである請求項２３に記載の抗体調製物。
【請求項２８】
（ａ）サンプルを第１抗体に暴露してＦＡＮＣＤ２−Ｌと第１複合体を形成し、場合によっては第２抗体に暴露してＦＡＮＣＤ２−Ｓと第２複合体を形成すること；
（ｂ）マーカーでサンプル中の第１複合体及び第２複合体の量を検出すること；からなる生物学的サンプル中のＦＡＮＣＤ２アイソフォームを測定するための診断方法。
【請求項２９】
サンプルが無傷細胞を含んでなる請求項２８に記載の診断方法。
【請求項３０】
サンプルがライゼート中に溶解された細胞を含んでなる請求項２８に記載の診断方法。
【請求項３１】
生物学的サンプルが癌に対する感受性を有するかまたは初期段階の癌を有するヒト対象からのものである請求項２８に記載の診断方法。
【請求項３２】
生物学的サンプルがヒト対象の癌からのものであり、ここで癌が黒色腫、白血病、アストチトーム、神経膠芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び膵臓、乳房、卵巣、子宮、精巣、脳下垂体、腎臓、胃、食道及び直腸の癌から選択される請求項３１に記載の診断方法。
【請求項３３】
生物学的サンプルがヒト胎児からのものである請求項２８に記載の診断方法。
【請求項３４】
生物学的サンプルが成人からのものである請求項２８に記載の診断方法。
【請求項３５】
生物学的サンプルが血液サンプル、対象及び細胞系からの組織の生検サンプルから選択される請求項２８に記載の診断方法。
【請求項３６】
生物学的サンプルが心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢血またはリンパ球に由来する請求項２８に記載の診断方法。
【請求項３７】
マーカーが蛍光マーカー、場合によってはＦＡＮＣＤ２−Ｌ抗体に抱合されていてよい蛍光マーカーである請求項２８に記載の診断方法。
【請求項３８】
マーカーが化学ルミネセンスマーカー、場合によってはＦＡＮＣＤ２−Ｌ抗体に抱合されていてよい化学ルミネセンスマーカーである請求項２８に記載の診断方法。
【請求項３９】
さらに第１及び第２複合体が基質に抱合された第３抗体に結合することからなる請求項２８に記載の診断方法。
【請求項４０】
ライゼートを分離手順に供してＦＡＮＣＤ２アイソフォームを分離し、第１または第２ＦＡＮＣＤ２抗体への結合を決定することにより分離されたアイソフォームを同定する請求項３０に記載の診断方法。
【請求項４１】
ＦＡＮＣＤ２タンパク質に対する抗体を選択し、細胞集団におけるＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの量が野生型集団における量と比較して低減されているかどうかを決定し；ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の量が低減されている場合、次いで細胞集団におけるＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦまたはＦＡＮＣＧタンパク質のいずれかの量が野生型集団における量と比較して変化しているかどうかを決定して、細胞集団におけるファンコーニ貧血経路における欠損を同定すること；
からなる対象からの細胞集団におけるファンコーニ貧血経路における欠損を同定するための診断試験。
【請求項４２】
アイソフォームの量の決定がＦＡＮＣＤ２−Ｌ及びＦＡＮＣＤ２−Ｓアイソフォームの分離に依存する請求項４１に記載の診断試験。
【請求項４３】
分離がゲル電気泳動により達成される請求項４１に記載の診断試験。
【請求項４４】
分離が遊走結合バンド試験ストリップにより達成される請求項４１に記載の診断試験。
【請求項４５】
ＦＡＮＣＤ２−Ｌが低減された量で作製される細胞集団を選択すること；
細胞集団を候補治療分子のライブラリーの個々のメンバーに暴露すること；及び
細胞集団においてＦＡＮＣＤ２−Ｌの量を増加させるこれらの個々のメンバー分子を同定すること；
からなる治療薬を同定するためのスクリーニングアッセイ。
【請求項４６】
細胞集団がインビトロ細胞集団である請求項４５に記載のスクリーニングアッセイ。
【請求項４７】
細胞集団がインビボ細胞集団であり、インビボ細胞集団が実験動物内にあり、実験動物が変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子を有している請求項４５に記載のスクリーニングアッセイ。
【請求項４８】
実験動物がノックアウトマウスであり、ここでマウスのＦＡＮＤ２遺伝子がヒト変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子により置換されている請求項４５に記載のスクリーニングアッセイ。
【請求項４９】
ＦＡＮＣＤ２が低減された量で作製される細胞集団に化学発癌物質を添加し、分子のいずれかのメンバーがＦＡＮＣＤ２−Ｌの量を増加させて化学発癌物質の有害な影響から細胞を保護するかどうかを決定する請求項４５に記載のスクリーニングアッセイ。
【請求項５０】
動物のＦＡＮＣＤ２遺伝子が除去されており、場合によっては請求項１の核酸分子により置換されていてもよい実験動物モデル。
【請求項５１】
対象からの細胞サンプルにおいて、変異が疑われるＦＡＮＣＤ２アレルの変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列を同定する方法であって、変異が疑われるＦＡＮＣＤ２アレルのヌクレオチド配列を野生型ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列と比較し、ここで疑わしい変異体及び野生型配列間の差異により細胞サンプル中の変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列が同定される方法。
【請求項５２】
変異が疑われるアレルが生殖細胞系アレルである請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列の同定により対象における癌の素因が診断される請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列の同定によりファンコーニ貧血を有する子孫を産む対象の危険性の増加が診断される請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
変異が疑われるアレルが腫瘍型の体細胞アレルであり、変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列を同定することにより腫瘍型が診断される請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
野生型のヌクレオチド配列及び変異が疑われるＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列が遺伝子、ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡから選択される請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
変異が疑われるＦＡＮＣＤ２アレルのポリヌクレオチド配列を野生型ＦＡＮＣＤ２ポリヌクレオチド配列と比較することがさらに：変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＦＡＮＣＤ２プローブを選択すること、及びプローブでのハイブリダイゼーションにより変異配列の存在を検出することを含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
変異が疑われるＦＡＮＣＤ２アレルのポリヌクレオチド配列を野生型ＦＡＮＣＤ２ポリヌクレオチド配列と比較することがさらに：野生型ＦＡＮＣＤ２  ＤＮＡに特異的なプライマーのセットを用いてＦＡＮＣＤ２遺伝子の全てまたは一部を増幅して増幅されたＦＡＮＣＤ２  ＤＮＡを製造すること、及びＦＡＮＣＤ２  ＤＮＡを解読して変異配列を同定することを含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列がヒト対象のＦＡＮＣＤ２アレルにおける生殖細胞系の変化であり、変化が表３に示す変化から選択される請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列がヒト対象のＦＡＮＣＤ２アレルにおける体細胞の変化であり、変化が表３に示す変化から選択される請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
対象からの組織サンプルにおけるＦＡＮＣＤ２遺伝子の生殖細胞系の配列またはそのｍＲＮＡの配列をＦＡＮＣＤ２遺伝子の生殖細胞系の配列またはそのｍＲＮＡの配列と比較することを含む対象における癌に対する感受性を診断する方法であって、ここで対象のＦＡＮＣＤ２遺伝子の生殖細胞系の配列またはそのｍＲＮＡの配列における変化が癌に対する感受性を示す方法。
【請求項６２】
ＦＡＮＣＤ２遺伝子の制御領域において変化を検出する請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
生殖細胞系の配列における変化の検出が（ａ）非変性ポリアクリルアミドゲルにおける一本鎖ＤＮＡの電気泳動可動性のシフトを観察すること、（ｂ）ＦＡＮＣＤ２遺伝子プローブを組織サンプルから単離されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズすること、（ｃ）アレル特異性プローブを組織サンプルのゲノムＤＮＡにハイブリダイズすること、（ｄ）組織サンプルからのＦＡＮＣＤ２遺伝子の全てまたは一部を増幅して増幅された配列を製造し、増幅された配列をシーケンシングすること、（ｅ）特異的ＦＡＮＣＤ２変異アレルのプライマーを用いて組織サンプルからＦＡＮＣＤ２遺伝子の全てまたは一部を増幅すること、（ｆ）組織サンプルからのＦＡＮＣＤ２遺伝子の全てまたは一部を分子クローニングしてクローン化された配列を製造し、クローン化された配列をシーケンシングすること、（ｇ）（ｉ）組織サンプルから単離したＦＡＮＣＤ２遺伝子またはＦＡＮＣＤ２  ｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）ヒト野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列に相補的な核酸プローブ間の誤対合を同定することであって、この場合、分子（ｉ）及び（ｉｉ）は互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する、（ｈ）組織サンプル中のＦＡＮＣＤ２遺伝子配列の増幅及び増幅された配列の野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を含んでなる核酸プローブへのハイブリダイゼーション、（Ｉ）組織サンプル中のＦＡＮＣＤ２遺伝子配列の増幅及び増幅された配列の、変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を含んでなる核酸プローブへのハイブリダイゼーション、（ｊ）組織サンプル中の欠失変異に関するスクリーニング、（ｋ）組織サンプル中の点変異に関するスクリーニング、（ｌ）組織サンプル中の挿入変異に関するスクリーニング、（ｍ）組織サンプル中のＦＡＮＣＤ２遺伝子との、ＦＡＮＣＤ２遺伝子を含んでなる核酸プローブとのインサイチュウ・ハイブリダイゼーションからなる群から選択されるアッセイにより決定される請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
（ａ）対象からの遺伝物質を評価し、欠損ＤＮＡ修復を決定すること；
（ｂ）ＦＡＮＤ２及び少なくとも１つのＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤＥ、ＦＡＮＤＦ、ＦＡＮＤＧ、ＢＲＡＣＡ１及びＡＴＭを含んでなる遺伝子のセットにおける変異の存在を決定すること；並びに
（ｃ）遺伝子のセットにおける変異の存在から癌の感受性を診断すること；
からなる対象における癌の感受性を診断するための方法。
【請求項６５】
対象の損傷からの組織サンプルにおけるＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡの配列を野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡの配列と比較し、ここで対象のＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡの配列における変化が腫瘍性損傷のＦＡＮＣＤ２遺伝子での変異を示すことを含む：ヒト対象におけるＦＡＮＣＤ２遺伝子での腫瘍性損傷における変異を検出する方法。
【請求項６６】
腫瘍性損傷のＦＡＮＣＤ２遺伝子での変異に従って腫瘍性損傷を処置するための治療プロトコルを決定することをさらに含む請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ヒト対象の損傷からの組織サンプルにおけるＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡの配列を野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのＲＮＡの配列と比較し、ここで組織サンプルにおける野生型配列の存在がＦＡＮＣＤ２遺伝子での変異の欠如を示すことを含むヒト対象からの腫瘍性損傷におけるＦＡＮＣＤ２変異の欠如を確認する方法。
【請求項６８】
（ａ）請求項２５に記載のＦＡＮＣＤ２アイソフォームを測定することにより対象からの細胞サンプルにおいてＦＡＮＣＤ２−Ｌの欠乏を生じるかどうかを決定すること；
（ｂ）（ａ）で欠乏が検出された場合、次いで欠乏が非癌細胞における遺伝的欠損の結果であるかどうかを決定すること；及び
（ｃ）（ｂ）が陽性である場合、ＤＮＡ損傷を増加させて対象における正常な組織を保護する治療プロトコルの使用を減らし、（ｂ）が陰性であり、欠乏は癌細胞における遺伝的欠損にのみ含まれる場合、次いでＤＮＡ損傷を増加させ癌細胞に悪影響を与える治療プロトコルの使用を増やす：
ことからなる、癌を有する対象の治療プロトコルを決定する方法。
【請求項６９】
有効量のＦＡＮＣＤ２タンパク質または外来性核酸を標的に投与することからなる細胞標的におけるＦＡ経路欠損を処置する方法。
【請求項７０】
ＦＡ経路欠損が欠損ＦＡＮＣＤ２遺伝子であり、外来性核酸ベクターがさらに請求項１０に記載のベクターを導入すること含んでなる請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ベクターが変異ヘルペスウイルス、Ｅ１／Ｅ４欠失組換えアデノウイルス、変異レトロウイルス、感染性新規ウイルス粒子の生成に必須のウイルス遺伝子に関して欠損があるウイルスベクターから選択される請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ベクターが脂質ミセルに含まれる請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
配列番号：４に記載のポリペプチドを提供し、欠損ＦＡＮＣＤ２遺伝子から生じる条件から生じる欠損を機能的に修正すること：
からなる欠損ＦＡＮＣＤ２遺伝子で患者を処置する方法。
【請求項７４】
（ａ）対象から細胞サンプルを入手すること；
（ｂ）細胞サンプルをＤＮＡ損傷物質に暴露すること；及び
（ｃ）ＦＡＮＣＤ２−Ｌが上方制御されているかどうかを検出することであって、上方制御の不在がＦＡ経路欠損を示している：
からなるＦＡ経路欠損を検出するための細胞基盤のアッセイ。
【請求項７５】
核フォーカスを検出するためのイムノブロッティング；ＦＡＮＣＤ２アイソフォームの量を検出するためのウェスタンブロット及びＤＮＡプローブでのハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡを定量することによりＦＡＮＣＤ２の量が測定される請求項７４に記載の細胞基盤のアッセイ。
【請求項７６】
（ａ）高ストリンジェント条件下でＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列に結合するプライマー対であって、プライマー対は表７に記載される変化した核酸配列を特異的に増幅するために選択される；及び
（ｂ）各々のプライマーの容器：
からなる生物学的サンプル中の癌細胞を検出するのに使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載した研究は国立衛生研究所の援助を受け、ＮＩＨ  グラントｖＮｏ．ヘルス・グラントＲＯ１ＨＬ５２７２５−０４、ＲＯ１ＤＫ４３８８９−０９、１ＰＯ１ＨＬ４８５４６及びＰＯ１ＨＬ５４７８５−０４であった。米国政府は請求された発明に対して特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
本発明はＦＡＮＣＤ２遺伝子に欠損を有する対象における癌感受性の診断及び癌が進行したこれらの対象のための適当な処置プロトコルの決定に関する。ＦＡＮＣＤ２遺伝子に欠損を有する動物モデルを用いて治療薬のスクリーニングをすることができる。
【０００３】
ファンコーニ貧血（ＦＡ）は先天性欠損、骨髄障害及び癌素因により特徴づけられる常染色体劣性癌感受性症候群である。ＦＡ患者からの細胞はＤＮＡ鎖間架橋を生み出す作用物質、例えばマイトマイシンＣまたはジエポキシブタンに対して特徴的な過敏症を示す。ＦＡ患者は急性骨髄性白血病及び皮膚、胃腸；及び婦人科系の癌などのいくつかの型の癌を進行させる。皮膚及び胃腸腫瘍は通常扁平上皮癌である。少なくとも２０％のＦＡの患者で癌を進行させる。癌を進行させる患者の平均年齢は白血病で１５歳、肝臓腫瘍で１６歳、及びその他の腫瘍で２３歳である。（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：１７２５（１９９７）、Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２：８３−８８（１９９９）及びＨｅｉｊｎａら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６６：１５４０−１５５１）
【０００４】
ＦＡは遺伝的に異種性である。体細胞融合研究は少なくとも７つの別個の相補群で同定された（Ｊｏｅｎｊｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６１：９４０−９４４（１９９７）及びＪｏｅｎｊｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７：７５９−７６２（２０００））。この観察により、ＦＡ遺伝子がＤＮＡ架橋に対する細胞応答に関与する多成分性経路を明確化するという仮説に至った。ＦＡ遺伝子の５つ（ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ及びＦＡＮＣＧ）がクローン化され、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、及びＦＡＮＣＧタンパク質が主に核局在を伴う分子複合体を形成することが示されている。ＦＡＮＣＣは細胞質にも局在する。異なるＦＡタンパク質は、無脊椎動物種のＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ及びＦＡＮＣＧタンパク質の強相同体を有さない公知の配列モチーフを少ししか、または全く有さない。ＦＡＮＣＦは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡ結合タンパク質に対して有意性が未知の弱い相同性を有する。２つの最も頻繁な相補群は、一緒ではＦＡ患者の７５％から８０％を占めるＦＡ−Ａ及びＦＡ−Ｃである。８０ｋｂにわたり、少なくとも４３個のエクソンからなるＦＡＮＣＡ遺伝子では複数の変異が認識されている。ＦＡＮＣＣは１４個のエクソンを有し、およそ８０ｋｂにわたることが見出されている。ＦＡＮＣＣ遺伝子における多くの変異が同定されており、これはの重篤度の程度が異なるＦＡと相関する。ＦＡ−Ｄは明確ではあるが稀な相補群として同定されている。ＦＡ−Ｄ患者は別のサブタイプの患者とは表現型で区別できるが、ＦＡタンパク質複合体は通常ＦＡ−Ｄ細胞に集まる（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９５：１３０８５−１３０９０（１９９８））。
【０００５】
クローン化されたＦＡタンパク質は互いにまたはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）の別のタンパク質に配列類似性を有さないオーファンタンパク質をコードし、タンパク質配列が明白である機能的ドメインはない。これらのタンパク質の細胞性または生化学的機能に関してはほとんど知られていない。
【０００６】
ＦＡの診断はＦＡ患者の表現型の広範な多様性により複雑になっている。さらに診断を混乱させることに、およそ３３％のＦＡ患者が明白な先天的異常を有していない。さらに、既存の診断試験は一般の集団からＦＡキャリヤを区別しない。診断に伴う問題はＤ’Ａｎｄｒｅａら（１９９７）により記載されている。ＦＡ細胞で多くの細胞性表現型が報告されているが、最も一貫性があるのは２価性アルキル化剤、例えばマイトマイシンＣまたはジエポキシブタンに対する過敏症である。これらの作用物質はＤＮＡの鎖間架橋（ＤＮＡ損傷の重要なクラス）を作製する。
【０００７】
癌の形成に関与している非常に多くの制御遺伝子及び生化学的経路のために、癌感受性の診断は複雑になっている。どのように発生したかに依存する異なる癌及び関与する遺伝的損傷は、対象がいずれかの特定の治療的処置にどのように応答するかを決定し得る。欠損修復メカニズムに伴う遺伝的損傷は細胞分割障害及びアポトーシスを生じることができ、これが今度は患者の癌に対する感受性を高め得る。ＦＡは癌感受性に加えて複数の病理学的結果が欠損修復メカニズムに関連付けられる疾病症状である。
【０００８】
ファンコーニ貧血経路の分子遺伝学及び細胞生物学の理解により、非ＦＡ患者及びＦＡ患者に生じるＤＮＡ修復メカニズムにおける欠損に関連する特定のクラスの癌及び症状の予後、診断及び処置に洞察を供し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の最初の実施形態では、（ａ）配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）（ｂ）のポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；（ｃ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号：５から８、１８７から１８８に示すヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；及び（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が提供される。ポリヌクレオチドはＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子、例えばｃＤＮＡでよい。
【００１０】
本発明の別の実施形態では、ＤＮＡ修復を促進するために、細胞の核においてＦＡＮＣＤ２の短い形態から長い形態に変換する生物学的特性を保持するために配列番号：４のアミノ酸配列に十分類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から本質的に構成される単離された核酸分子が提供される。また別に、単離された核酸分子は配列番号：９から１９１に少なくとも９０％同一であるか、または配列番号：９から１９１に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドから本質的に構成される。
【００１１】
１つの実施形態では、前記した単離された核酸分子のいずれかをベクターに挿入することを含む組換えベクターを作製するための方法が提供される。組換えベクター生成物をこの方法により作製し、ベクターを宿主細胞に導入して組換え宿主細胞を形成することができる。
【００１２】
本発明の１つの実施形態では、（ａ）ＦＡ−Ｄ２に関連する相補群におけるビアレリック変異を有する対象から細胞を得ること；及び（ｂ）形質転換ウイルスで細胞を感染させて、細胞を繊維芽細胞及びリンパ球から選択できるＦＡ−Ｄ２細胞系を作成すること、並びにエプスタイン・バー・ウイルス及びレトロウイルスから選択されるウイルスを形質転換すること；を含むＦＡ−Ｄ２細胞系を作製するための方法が提供される。例えば（ｉ）ウェスタンブロットまたはＦＡＮＣＤ２に特異的な抗体を用いる核免疫蛍光及び（ｉｉ）ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイから選択される診断アッセイを実施することにより細胞系における欠損ＦＡＮＤＣ２の存在を決定することによりＦＡ−Ｄ２細胞系を特徴づけすることができる。
【００１３】
本発明の１つの実施形態では、宿主細胞が前記したいずれかの単離された核酸分子を含む組換え宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドを生成するための組換え方法が提供される。
【００１４】
本発明の１つの実施形態では、単離されたポリペプチドは（ａ）配列番号：４；（ｂ）（ａ）に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：５から８、１８７から１８８の少なくとも１つに少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：５から８、１８７から１８８の少なくとも１つに相補的な配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；及び（ｅ）フラグメントが少なくとも５０個のアミノ酸の長さである（ａ）から（ｄ）のポリペプチドフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
単離されたポリペプチドはｎｔ３７６ＡからＧ、ｎｔ３７０７ＧからＡ、ｎｔ９０４ＣからＴ及びｎｔ９５８ＣからＴより選択される変異を有するＤＮＡによりコードされ得る。また別にポリペプチドをコードするＤＮＡの多型によりポリペプチドを特徴づけることができ、多型はｎｔ１１２２ＡからＧ、ｎｔ１１４０ＴからＣ、ｎｔ１５０９ＣからＴ、ｎｔ２１４１ＣからＴ、ｎｔ２２５９ＴからＣ、ｎｔ４０９８ＴからＧ、ｎｔ４４５３ＧからＡより選択される。また別にアミノ酸２２２またはアミノ酸５６１での変異によりポリペプチドを特徴づけることができる。
【００１６】
本発明の１つの実施形態では、ＦＡＮＣＤ２タンパク質に関して結合特異性を有する抗体調製物が記載されており、ここで抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でよく、ここでＦＡＮＣＤ２はＦＡＮＣＤ２−ＳまたはＦＡＮＣＤ２−Ｌでよい。
【００１７】
本発明の１つの実施形態では、生物学的サンプル中のＦＡＮＣＤ２アイソフォームを測定するための診断方法が提供され、ここで方法は（ａ）サンプルを第１抗体に暴露してＦＡＮＣＤ２−Ｌとの第１複合体を形成し、場合によっては第２抗体に暴露してＦＡＮＣＤ２−Ｓとの第２複合体を形成してもよいこと；及び（ｂ）サンプル中の第１複合体及び第２複合体の量をマーカーを用いて検出することを含む。サンプルは無傷の細胞またはライゼート中の溶解された細胞でよい。
生物学的サンプルは癌に対する感受性を有するか、または第1段階の癌を有するヒト対象からのものでよい。サンプルはヒト対象の癌からのものでよく、ここで癌は黒色腫、白血病、アストチトーム、神経膠芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び膵臓、乳房、卵巣、子宮、精巣、脳下垂体、腎臓、胃、食道及び直腸の癌から選択される。生物学的サンプルはヒト胎児または成人からのものでよく、血液サンプル、対象及び細胞系からの組織の生検サンプルのいずれかに由来するものでよい。生物学的サンプルは心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢血またはリンパ球に由来してよい。マーカーは蛍光マーカー、場合によってはＦＡＮＣＤ２−Ｌ抗体に抱合されていてもよい蛍光マーカー、場合によってはＦＡＮＣＤ２−Ｌ抗体に抱合されていてもよい化学ルミネセンスマーカーでよく、第１及び第２複合体を基質に抱合された第３抗体に結合させることができる。サンプルがライゼートである場合、これを分離手段に供してＦＡＮＣＤ２アイソフォームを分離でき、第１または第２ＦＡＮＣＤ２抗体への結合を決定することにより分離されたアイソフォームを同定できる。
【００１８】
本発明の１つの実施形態では、対象からの細胞集団のファンコーニ貧血経路における欠損を同定するための診断試験が提供され、試験にはＦＡＮＣＤ２タンパク質に対する抗体の選択及び、野生型細胞集団における量と比較してＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの量が細胞増殖において低下するかどうかを決定すること；例えばＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の量が低下する場合、次いでＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦまたはＦＡＮＣＧタンパク質のいずれかの量が野生型と比較して細胞集団において変化するかどうかを決定して、細胞集団におけるファンコーニ貧血経路における欠損を同定することが含まれる。１つの実例では、アイソフォームの量はＦＡＮＣＤ２−Ｌ及びＦＡＮＣＤ２−Ｓアイソフォームの分離に依存し、ここで分離はゲル電気泳動によるかまたは遊走結合バンド試験ストリップにより達成できる。
【００１９】
本発明の１つの実施形態では、治療薬を同定するためのスクリーニングアッセイが提供され、このアッセイにはＦＡＮＣＤ２−Ｌが低減された量で生成される細胞集団を選択すること；細胞集団を候補治療分子のライブラリーの個々のメンバーに暴露すること；及び細胞集団においてＦＡＮＣＤ２−Ｌの量の増加を引き起こすこれらの個々のメンバー分子を同定することが含まれる。１つの実例では、細胞集団はインビトロ細胞集団である。別の実例では、細胞集団はインビボ細胞集団、実験動物内に在るインビボ集団、変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子を有する実験動物である。さらなる実例では、実験動物はマウスＦＡＮＣＤ２遺伝子がヒト変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子により置換されているノックアウトマウスである。別の実例では、ＦＡＮＣＤ２−Ｌが低減された量で生成される細胞集団に化学発癌物質を添加し、いずれかのメンバー分子がＦＡＮＣＤ２−Ｌの量を増加させて化学発癌物質の有害な影響から細胞を保護するかどうかを決定する。
【００２０】
本発明の１つの実施形態では、動物ＦＡＮＣＤ２遺伝子が除去されており、場合によっては前記したいずれかの核酸分子で置換されていてもよい実験動物モデルが提供される。
【００２１】
本発明の１つの実施形態では、変異が疑われるＦＡＮＣＤ２アレルのヌクレオチド配列を野生型ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列と比較することからなる、対象からの細胞サンプル中の変異が疑われるＦＡＮＣＤ２アレルにおける変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列を同定するための方法が提供され、ここで疑わしい変異体と野生型配列の差異により細胞サンプル中の変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列が同定される。１つの実例では、疑わしい変異体アレルは生殖細胞系アレルである。別の実例では、変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列の同定は、対象における癌の素因及び対象がファンコーニ貧血の子孫を産む危険性の高まりを診断するためのものである。別の実例では、変異が疑わしいアレルは腫瘍型の体細胞アレルであり、変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列の同定は腫瘍型を診断するためのものである。別の実例では、野生型ヌクレオチド配列及び変異が疑われるＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列は遺伝子、ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡから選択される。別の実例では変異が疑わしいＦＡＮＣＤ２アレルと野生型ＦＡＮＣＤ２ポリヌクレオチド配列との比較はさらに変異体ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＦＡＮＣＤ２プローブを選択し、プローブでのハイブリダイゼーションにより変異体配列の存在を検出することを含む。
別の実例では、変異が疑われるＦＡＮＣＤ２アレルと野生型ＦＡＮＣＤ２ポリヌクレオチド配列との比較は、さらに野生型ＦＡＮＣＤ２  ＤＮＡに特異的なプライマーのセットを用いてＦＡＮＣＤ２遺伝子の全てまたは一部を増幅して増幅されたＦＡＮＣＤ２  ＤＮＡを生成し、ＦＡＮＣＤ２  ＤＮＡを解読して変異体配列を贈呈することを含む。別の実例では、変異体ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列がヒト対象のＦＡＮＣＤ２アレルにおける生殖細胞系の変化である場合、変化は表３に示す変化から選択され、変異体ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列がヒト対象のＦＡＮＣＤ２アレルにおける体細胞の変化である場合、変化は表３に示す変化から選択される。
【００２２】
本発明の１つの実施形態では、対象における癌の感受性を診断するための方法が提供され、この方法はＦＡＮＣＤ２遺伝子の生殖細胞系配列または対象からの組織サンプルのそのｍＲＮＡの配列をＦＡＮＣＤ２遺伝子の生殖細胞系配列またはそのｍＲＮＡの配列と比較することからなり、ここでＦＡＮＣＤ２遺伝子の生殖細胞系配列または対象のそのｍＲＮＡの配列における変化は癌に対する感受性を示す。ＦＡＮＣＤ２遺伝子の制御領域において変化を検出できる。生殖細胞系配列における変化を、（ａ）非変性ポリアクリルアミドゲルにおける一本鎖ＤＮＡの電気泳動可動性のシフトを観察すること、（ｂ）ＦＡＮＣＤ２遺伝子プローブを組織サンプルから単離されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズすること、（ｃ）アレル特異性プローブを組織サンプルのゲノムＤＮＡにハイブリダイズすること、（ｄ）組織サンプルからのＦＡＮＣＤ２遺伝子の全てまたは一部を増幅して増幅された配列を製造し、増幅された配列をシーケンシングすること、（ｅ）特異的ＦＡＮＣＤ２変異体アレルのプライマーを用いて組織サンプルからＦＡＮＣＤ２遺伝子の全てまたは一部を増幅すること、（ｆ）組織サンプルからのＦＡＮＣＤ２遺伝子の全てまたは一部を分子クローニングしてクローン化された配列を製造し、クローン化された配列をシーケンシングすること、（ｇ）（ｉ）組織サンプルから単離したＦＡＮＣＤ２遺伝子またはＦＡＮＣＤ２  ｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）ヒト野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列に相補的な核酸プローブ間の誤対合を同定することであって、この場合、分子（ｉ）及び（ｉｉ）は互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する、（ｈ）組織サンプル中のＦＡＮＣＤ２遺伝子配列の増幅及び増幅された配列の野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を含んでなる核酸プローブへのハイブリダイゼーション、（ｉ）組織サンプル中のＦＡＮＣＤ２遺伝子配列の増幅及び増幅された配列の、変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を含んでなる核酸プローブへのハイブリダイゼーション、（ｊ）組織サンプル中の欠失変異に関するスクリーニング、（ｋ）組織サンプル中の点変異に関するスクリーニング、（ｌ）組織サンプル中の挿入変異に関するスクリーニング、（ｍ）組織サンプル中のＦＡＮＣＤ２遺伝子の、ＦＡＮＣＤ２遺伝子を含んでなる核酸プローブとのインサイチュウ・ハイブリダイゼーションからなる群から選択
されるアッセイにより決定することができる。
【００２３】
本発明の１つの実施形態では、対象における癌の感受性を診断するための方法が提供され、この方法は（ａ）対象からの遺伝物質を評価し、欠損ＤＮＡ修復を決定すること；（ｂ）ＦＡＮＣＤ２及び少なくとも１つのＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤＥ、ＦＡＮＤＦ、ＦＡＮＤＧ、ＢＲＡＣＡ１及びＡＴＭを含んでなる遺伝子のセットにおける変異の存在を決定すること；並びに（ｃ）遺伝子のセットにおける変異の存在から癌の感受性を診断することを含む。
【００２４】
本発明の１つの実施形態では、ヒト対象におけるＦＡＮＣＤ２遺伝子での腫瘍性損傷の変異を検出する方法が提供され、この方法は；
対象の損傷からの組織サンプルのＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡ配列を野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡ配列と比較することからなり、ここで対象のＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡ配列における変化は腫瘍性損傷のＦＡＮＣＤ２遺伝子での変異を示している。腫瘍性損傷のＦＡＮＣＤ２遺伝子での変異に従って腫瘍性損傷を処置するための治療用プロトコルを提供できる。
【００２５】
本発明の１つの実施形態では、該対象の損傷からの組織サンプルのＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡ配列を野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡ配列と比較することからなる、ヒト対象からの腫瘍性損傷におけるＦＡＮＣＤ２変異の欠如を確認するための方法が提供され、ここで組織サンプルでの野生型配列の存在はＦＡＮＣＤ２遺伝子での変異の欠如を示している。
【００２６】
本発明の１つの実施形態では、癌を有する対象のための治療用プロトコルを決定するための方法が提供され、これは（ａ）特異的抗体を用いてＦＡＮＣＤ２アイソフォームを測定することにより対象からの細胞サンプルでＦＡＮＣＤ２−Ｌの欠損が生じるかどうかを決定すること、（ｂ）（ａ）で欠損が検出された場合、次いで欠損が非癌細胞における遺伝的欠損に結果であるかどうかを決定すること；及び（ｃ）（ｂ）が陽性であった場合、ＤＮＡ損傷の増加を引き起こす治療用プロトコルの使用を減らし、対象における正常な組織を保護し、（ｂ）が陰性で、欠損が癌細胞における遺伝的欠損に含まれる場合、ＤＮＡ損傷の増加を引き起こす治療用プロトコルの使用を増やし、癌細胞に悪影響を与えること；が含まれる。
【００２７】
本発明の１つの実施形態では、細胞標的におけるＦＡ経路欠損を処置する方法が提供され、この方法には；有効量のＦＡＮＣＤ２タンパク質または外因性の核酸を標的に投与することが含まれる。ＦＡ経路欠損は欠損ＦＡＮＣＤ２遺伝子でよく、及び外因性核酸ベクターはさらに前記に従ってベクターを導入することを含んでよい。ベクターを変異ヘルペスウイルス、Ｅ１／Ｅ４欠失組換えアデノウイルス、変異レトロウイルス、感染性新規ウイルス粒子の生成に必須であるウイルス遺伝子に関して欠損性であるウイルスベクターから選択できる。ベクターは脂質ミセルに含まれてよい。
【００２８】
本発明の１つの実施形態では、欠損ＦＡＮＣＤ２遺伝子を有する患者を処置する方法が提供され、その方法には欠損ＦＡＮＣＤ２遺伝子から生じる欠損に機能的に修正するための、配列番号：４に記載されたポリペプチドを提供することが含まれる。
【００２９】
本発明の１つの実施形態では、ＦＡ経路欠損を検出するための細胞基盤のアッセイが提供され、その方法には対象から細胞サンプルを入手すること；細胞をＤＮＡ損傷物質に暴露すること；及びＦＡＮＣＤ２−Ｌが上方制御されているかどうかを検出することが含まれ、上方制御の不在はＦＡ経路欠損を示している。細胞基盤のアッセイでは、核フォーカスを検出するためのイムノブロッティング；ＦＡＮＣＤ２アイソフォームの量を検出するためのウェスタンブロット及びＤＮＡプローブでのハイブリダイズすることによるｍＲＮＡの定量化から選択される分析技術によりＦＡＮＣＤ２の量を測定することができる。
本発明の１つの実施形態では、生物学的サンプルにおいて癌細胞を検出するのに用いられるキットが提供され、そのキットは（ａ）高ストリンジェント条件下でＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列に結合するプライマー対であって、プライマー対は表７に記載される、変化した核酸配列を特異的に増幅するように選択される；及び各プライマーのための容器を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明の前記の特徴は、添付の図面を参考にして以下の詳細な記載を参照することにより容易に理解されよう。ここで；
【図１Ａ】図１Ａはファンコーニ貧血タンパク質複合体がＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化に必要であることを示すウェスタンブロットを提供する。正常な（ＷＴ）細胞（レーン１）はＦＡＮＣＤ２タンパク質の２つのアイソフォームである低分子量アイソフォーム（ＦＡＮＣＤ２−Ｓ）（１５５ｋＤ）及び高分子量アイソフォーム（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ）（１６２ｋＤ）を発現する。レーン３、７、９、１１はＦＡ細胞系がＦＡＮＣＤ２−Ｓアイソフォームのみを発現するＡ、Ｃ、Ｇ及びＦ型患者に由来することを示している。レーン４、８、１０、１２は対応するＦＡ  ｃＤＮＡを有する細胞系のトランスフェクションの後の高分子量アイソフォームＦＡＮＣＤ２−Ｌの回復を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＨｅＬａ細胞をＨＡ−ユビキチンをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトした後に得られたウェスタンブロットを示している。トランスフェクションの後、指示された用量のマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で細胞を処置した。指示されるようにＦＡＮＣＤ２に対するポリクローナル抗体（Ｅ３５）で細胞性タンパク質を免疫沈降させた。ＦＡＮＣＤ２を免疫沈降させ、免疫複合体を抗ＦＡＮＣＤ２または抗ＨＡモノクローナル抗体でブロットした。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＨｅＬａ細胞をＨＡ−ユビキチンをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトした後に得られたウェスタンブロットを示している。トランスフェクションの後、指示された用量の電磁放射線（ＩＲ）で細胞を処置した。ＦＡＮＣＤ２を免疫沈降させ、免疫複合体を抗ＦＡＮＣＤ２または抗ＨＡモノクローナル抗体でブロットした。
【図１Ｄ】図１ＤはＦＡ−Ｇ繊維芽細胞系（ＦＡＧ３２６ＳＶ）または修正された細胞（ＦＡＧ３２６ＳＶプラスＦＡＮＣＧ  ｃＤＮＡ）をＨＡ−Ｕｂ  ｃＤＮＡでトランスフェクトし、ＦＡＮＣＤ２を免疫沈降し、免疫複合体を抗ＦＡＮＣＤ２または抗ＨＡ抗血清でブロットした後に得られたウェスタンブロットを示す。
【図１Ｅ】図１ＥはＨｅｌａ細胞を１ｍＭ  ヒドロキシウレアで２４時間処置した後に得られたウェスタンブロットを示す。ＨｅＬａ細胞ライゼートを抽出し、指示された温度で指示された時間、２．５μＭ  ユビキチンアルデヒドを伴って、または伴わずにインキュベートした。モノクローナル抗ＦＡＮＣＤ２（ＦＩ１７）でのイムノブロットによりＦＡＮＣＤ２タンパク質を検出した。
【図２】図２はファンコーニ貧血経路がＦＡＮＣＤ２核フォーカスの形成に必要であることを示している。上部パネルは全細胞抽出物として調製された、ＳＶ４０形質転換された繊維芽細胞の抗ＦＡＮＣＤ２イムノブロットを示す。パネルａからｈはアフィニティー精製された抗ＦＡＮＣＤ２抗血清での免疫蛍光を示す。未修正（変異体、Ｍ）ＦＡ繊維芽細胞はＦＡ−Ａ（ＧＭ６９１４）、ＦＡ−Ｇ（ＦＡＧ３２６ＳＶ）、ＦＡ−Ｃ（ＰＤ４２６）、及びＦＡ−Ｄ（ＰＤ２０Ｆ）であった。ＦＡ−Ａ、ＦＡ−Ｇ及びＦＡ−Ｃ繊維芽細胞を対応するＦＡ  ｃＤＮＡで機能的に補足した。ＦＡ−Ｄ細胞をネオマイシンタグ化ヒト染色体３ｐで補足した（Ｗｈｉｔｎｅｙら、１９９５）。
【図３Ａ−Ｅ】図３はＦＡＮＣＤ２タンパク質の２つのアイソフォームの細胞周期依存性発現を示す。（ａ）ＨｅＬａ細胞、ＦＡ−Ａ患者からのＳＶ４０形質転換された繊維芽細胞（ＧＭ６９１４）、及びＦＡＮＣＡ  ｃＤＮＡで修正したＧＭ６９１４細胞を二重チミジン遮断法により同調させた。細胞周期の指示された相に対応する細胞を溶解し、ＦＡＮＣＤ２イムノブロッティングのために処理した。（ｂ）ノコダゾール遮断による同調（ｃ）ミモシン遮断による同調（ｄ）ノコダゾールまたは（ｅ）ミモシンを用いてＨｅＬａ細胞を細胞周期で同調させ、細胞周期の指示された相に対応する細胞を抗ＦＡＮＣＤ２抗体で免疫染色し、免疫蛍光により分析した。
【図４Ａ−Ｅ】図４はＭＭＣ、電離放射線、または紫外線に対する細胞性暴露の後の活性化されたＦＡＮＣＤ２核フォーカスの形成を示す。指数関数的に成長したＨｅＬａ細胞は未処置であるかまたは指示されたＤＮＡ損傷物質、（ａ）マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、（ｂ）γ線放射（ＩＲ）、または（ｃ）紫外線（ＵＶ）に暴露し、ＦＡＮＣＤ２イムノブロッティングまたはＦＡＮＣＤ２免疫染色のために処理した。（ａ）細胞を指示するように４０ｎｇ／ｍｌ  ＭＭＣに０から７２時間連続的に暴露するか、または２４時間処置し、免疫蛍光のために固定した。（ｂ）及び（ｃ）細胞をγ線放射（１０Ｇｙ、Ｂ）またはＵＶ光（６０Ｊ／ｍ２）に暴露し、指示された時間の後収集する（上部パネル）かまたは指示された用量で照射し、１時間後に収穫した（下部パネル）。免疫蛍光分析のために、細胞を処置後８時間に固定した（Ｂ、１０Ｇｙ、Ｃ、６０Ｊ／ｍ２）。（ｄ）正常な固体（ＰＤ７）または種々のファンコーニ貧血患者からの、指示されたＥＢＶ形質転換されたリンパ芽球系を４０ｎｇ／ｍｌマイトマイシンＣで連続的に処置するか（レーン１から２１）、または１５Ｇｙのγ線放射（レーン２２から３３）に暴露し、ＦＡＮＣＤ２イムノブロッティングのために処理した。ＭＭＣまたはＩＲ処置後のＦＡＮＣＤ−Ｌの上方制御がＰＤ７及び修正されたＦＡ−Ａ細胞（レーン２８から３３）で認められたが、変異体ファンコーニ貧血細胞系のいずれにおいても観察されなかった。同様に、ＩＲ誘起のＦＡＮＣＤ２核フォーカスはＦＡ繊維芽細胞（ＦＡ−Ｇ＋ＩＲ）では検出されなかったが、機能的補足（ＦＡ−Ｇ＋ＦＡＮＣＧ）の後には回復した。
【図５Ａ−Ｂ】図５はＤＮＡ損傷後の散在性核フォーカスにおける活性化ＦＡＮＣＤ２及びＢＲＣＡ１の同時局在化を示している。ＨｅＬａ細胞は未処置であるかまたは指示されるように電離放射線（１０Ｇｙ）に暴露し、８時間後に固定した。（ａ）細胞をＤ−９モノクローナル抗ＢＲＣＡ１抗体（緑色、パネルａ、ｄ、ｇ、ｈ）及びウサギポリクローナル抗ＦＡＮＣＤ２抗体（赤色、パネルｂ、ｅ、ｈ、ｋ）で二重染色し、染色した細胞を免疫蛍光で分析した。緑色及び赤色のシグナルが重複する場合（融合、パネルｃ、ｆ、ｉ、ｌ）、黄色のパターンが認められ、これはＢＲＣＡ１及びＦＡＮＣＤ２の同時局在化を示している。（ｂ）ＦＡＮＣＤ２及びＢＲＣＡ１の同時免疫沈降。ＨｅＬａ細胞は未処置（−ＩＲ）かまたは１５Ｇｙのγγ線放射（＋ＩＲ）に暴露し、１２時間後に収集した。細胞ライゼートを調製し、モノクローナルＦＡＮＣＤ２抗体（ＦＩ−１７、レーン９から１０）か、またはヒトＢＲＣＡ１に対して別個に誘導された３つのモノクローナル抗体（レーン３から８）：Ｄ−９（サンタ・クルーズ）、Ａｂ−１及びＡｂ−３（オンコジーン・リサーチ・プロダクツ）のいずれか１つのいずれかで細胞タンパク質を免疫沈降した。同量の精製されたマウスＩｇＧ（シグマ）を対照サンプルに用いた（レーン１から２）。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、抗ＦＡＮＣＤ２または抗ＢＲＣＡ１抗血清でイムノブロットした。ＦＡＮＣＤ−ＬアイソフォームはＢＲＣＡ１で優先的に同時免疫沈降された。
【図６】図６はＳ期の間の別個の核フォーカスでの活性化されたＦＡＮＣＤ２及びＢＲＣＡ１の同時局在を示す。（ａ）ＨｅＬａ細胞をミモシンでＧ１後期に同調させ、Ｓ期に開放された。Ｓ期細胞をモノクローナル抗ＢＲＣＡ１抗体（緑色、パネルａ、ｄ）及びウサギポリクローナル抗ＦＡＮＣＤ２抗体（赤色、パネルｂ、ｅ）で二重染色し、染色した細胞を免疫蛍光Ｊにより分析した。緑色及び赤色のシグナルが重複する場合（融合、パネルｃ、ｆ）、黄色のパターンが認められ、これはＢＲＣＡ１及びＦＡＮＣＤ２の同時局在化を示している。（ｂ）Ｓ期で同調されたＨｅＬａ細胞を指示されたように、未処置（ａ、ｂ、ｋ、ｌ）またはＩＲに暴露（５０Ｇｙ、パネルｃ、ｄ、ｍ、ｎ）、ＭＭＣ（２０μｇ／ｍｌ、パネルｅ、ｆ、ｏ、ｐ）、またはＵＶ（１００ｊ／ｍ２、パネルｇ、ｈ、ｑ、ｒ）に暴露し、１時間後に固定した。続いて細胞をＦＡＮＣＤ２またはＢＲＣＡ１に特異的な抗体で免疫染色した。
【図７】図７はマウス精母細胞の減数分裂の間にＢＲＣＡ１で同時局在化できる対合複合体でＦＡＮＣＤ２がフォーカスを形成することを示している。（ａ）後期パキテン期マウス核における対合複合体の抗ＳＣＰ−３（白色）及び抗ＦＡＮＣＤ２（赤色）染色。（ｂ）後期パキテン期染色体のＳＰＣ３染色。（ｃ）この染色を抗ＦＡＮＣＤ２  Ｅ３５抗体に関する免疫前血清で広げたもの。（ｄ）マウスディプロテン期核の対合複合体の抗ＳＣＰ３染色。（ｅ）この同時染色をＥ３５抗ＦＡＮＣＤ２抗体で広げたもの。対になっていない性染色体及び常染色体のテロメアの双方を抗ＦＡＮＣＤ２で染色することに注目すべきである。（ｆ）この染色を抗ＢＲＣＡ１抗体で広げたもの。性染色体は優先的に染色される。（ｇ）後期パキテン期性染色体対合複合体の抗ＦＡＮＣＤ２染色。（ｈ）同一の複合構造の抗ＢＲＣＡ１染色。（ｉ）抗ＦＡＮＣＤ２（赤色）及び抗ＢＲＣＡ１（緑色）同時染色（黄色の部分により反映される同時局在化）。
【図８】図８は細胞経路におけるＦＡタンパク質の相互作用の概略図を提供する。ＦＡタンパク質（Ａ、Ｃ及びＧ）は機能的核複合体で結合する。この複合体の活性化時にＳ期への参加またはＤＮＡ損傷のいずれかにより、この複合体がＤタンパク質を酵素的に修飾（モノユビキチン化）する。このモデルに従って、活性化されたＤタンパク質が続いて核フォーカスに標的化され、そこでこれがＢＲＣＡ１タンパク質及びＤＮＡ修復に関与するその他のタンパク質と相互作用する。
【図９】図９はＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡ全長でプローブし、２４時間暴露したヒト成人の心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸及び末梢血リンパ球、並びにヒト胎児の脳、配列、肝臓及び腎臓からの細胞のノーザンブロットを示す。
【図１０Ａ−Ｆ】図１０は２つのＦＡＮＣＤ２ファミリーの変異分析のためのアレル特異的アッセイを示し、ここでファミリー系統図（ａ、ｄ）並びにパネルｂ、ｃ、ｅ及びｆを垂直に並べ、対応する変異が問題の個体の下になるようにする。パネルａからｃはＰＤ２０を表し、パネルｄからｆはＶＵ００８ファミリーを表す。パネルｂ及びｅは、新規ＭｓｐＩ部位（ＰＤ２０）またはＤｄｅＩ部位（ＶＵ００８）の作製により検出される母性変異の分離を示す。双方のファミリーで父性遺伝される変異はアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより検出された（パネルｃ及びｆ）。
【図１１】図１１はヒトファンコーニ貧血細胞系におけるＦＡＮＣＤ２タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。指示された繊維芽細胞及びリンパ芽球系から全細胞ライゼートを作製した。抗ＦＡＮＣＤ２抗血清を用いるイムノブロッティングによりタンパク質ライゼート（７０μｇ）をプローブした。ＦＡＮＣＤ２タンパク質（１５５ｋＤ及び１６２ｋＤ）は矢印で示す。イムノブロットのその他のバンドは非特異的である。（ａ）試験した細胞系には野生型細胞（レーン１、７）、ＰＤ２０、繊維芽細胞（レーン２）、ＰＤ２０リンパ芽球（レーン４）、復帰変異体ＭＭＣ抵抗性ＰＤ２０リンパ芽球（レーン５、６）及びＰＤ２０繊維芽細胞で補足された染色体３ｐ（レーン３）などがある。ＨＳＣ６２（レーン８）及びＶＵ００８（レーン９）などのいくつかのその他のＦＡのＤ群細胞系が分析された。ＦＡ−Ａ細胞はＨＳＣ７２（レーン１０）、ＦＡ−Ｃ細胞はＰＤ４（レーン１１）及びＦＡ−Ｇ細胞はＥＵＦＡ３１６（レーン１２）であった。（ｂ）第３のＦＡＮＣＤ２患者の同定。ＦＡＮＣＤ２タンパク質は野生型及びＦＡ群Ｇ細胞において容易に検出できたが、ＰＤ７３３細胞では検出されなかった。（ｃ）抗体の特異性。レトロウイルスＦＡＮＣＤ２発現ベクターで形質導入されたＰＤ２０ｉ細胞は、空ベクター対照（レーン３）及びトランスフェクトされていないＰＤ２０ｉ細胞（レーン２）と対照的に、ＦＡＮＣＤ２タンパク質の双方のアイソフォームを展示する（レーン４）。野生型細胞では、内因性ＦＡＮＣＤ２タンパク質（２つのアイソフォーム）もまた抗体と免疫反応性であった（レーン１）。
【図１２】図１２はクローン化ＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡでのＦＡ−Ｄ２細胞の機能的補足を示す。ＳＶ４０形質転換したＦＡ−Ｄ２繊維芽細胞系であるＰＤ２０ｉをｐＭＭＰ−ｐｕｒｏ（ＰＤ２０＋ベクター）またはｐＭＭＰ−ＦＡＮＣＤ２（ＰＤ２０＋ＦＡＮＣＤ２ｗｔ）で形質導入した。ピューロマイシン選択細胞をＭＭＣ感受性分析に供した。分析した細胞は親ＰＤ２０Ｆ細胞（△）、ヒト染色体３ｐで修正したＰＤ２０（ｏ）、及びｐＭＭＰ−ｐｕｒｏ（  ）またはｐＭＭＰ−ＦＡＮＣＤ２（ｗｔ）−ｐｕｒｏ（◆）で形質導入したＰＤ２０細胞であった。
【図１３】図１３はＰＤ２０リンパ芽球の復帰のための分子基盤を示す。（ａ）エクソン５または６に対するＰＣＲプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅した。対照サンプル（右レーン）は１１４ｂｐで単一のバンドを生じたが、一方ＰＤ２０  ｃＤＮＡ（左レーン）は２つのバンドを示し、大きい方は１３ｂｐのイントロン配列の母性アレルへの挿入を反映している。ＰＤ２０から復帰したＭＭＣ抵抗性リンパ芽球（中央レーン）は第３の１１４＋３６ｂｐのフレーム内スプライシング変種を示している。（ｂ）ＦＡＮＣＤ２エクソン５／イントロン５境界でのスプライシングの該略図。野生型ｃＤＮＡでは１００％のスプライシング事象が適切なエクソン／イントロン境界で生じており、一方母性Ａ−＞Ｇ変異（矢印で示す）はこれもまた１００％でスプライシング異常を招く。復帰した細胞では母性変異を有する全てのｃＤＮＡはまた第２の配列変化をも有し、１３ｂｐ（〜４０％のｍＲＮＡ）または３６ｂｐ（〜６０％のｍＲＮＡ）のいずれかの挿入との混ざったスプライシングパターンを示した。
【図１４】図１４は卵巣癌の患者に由来する癌細胞系のＦＡＮＣＤ２ウェスタンブロットを示す。
【図１５】図１５はヒトＦＡＮＣＤ２のアミノ酸配列及びＢＥＡＵＴＹアルゴリズムを用いたハエ及び植物相同体とのアラインメントに関する配列表を示す（Ｗｏｒｌｅｙら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．５：１７３−１８４（１９９５））（配列番号：１から３）。黒色四角はアミノ酸同一性を示し、灰色は類似性を示す。最良のアラインメントスコアはキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ｐ＝８．４×１０−５８、受け入れ番号ＡＡＦ５５８０６）及びシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）（ｐ＝９．４×１０−４５、受け入れ番号Ｂ７１４１３）での仮説タンパク質で観察された。
【図１６】図１６はＦＡＮＣＤ  ｃＤＮＡ配列（６３から５１２７ヌクレオチド）（配列番号：５）及びこの配列によりコードされるポリペプチド（アミノ酸１から１４７２）（配列番号：４）である。
【図１７】図１７はＦＡＮＣＤ  ｃＤＮＡ（配列番号：１８８）と比較したＦＡＮＣＤ−Ｓ．ＯＲＦ（配列番号：１８７）に関するヌクレオチド配列である。
【図１８】図１８はヒトＦＡＮＣＤ２−Ｌに関するヌクレオチド配列である（配列番号：６）。
【図１９】図１９はヒトＦＡＮＣＤ２−Ｓに関するヌクレオチド配列である（配列番号：７）。
【図２０】図２０はヒトＦＡＮＣＤ２に関するヌクレオチド配列である（配列番号：８）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義：
この記載及び添付の請求の範囲で用いる以下の用語は、前後関係から別に必要とされる以外は指示する意味を有する：
「ＦＡＮＣＤ２−Ｌ治療薬」はいずれかのタンパク質異性体を意味し、ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質のペプチド、ペプチド誘導体、類似体または異性体を含み、さらにＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質に機能的に等価であるいずれかの小型分子誘導体、類似体、異性体またはアゴニストを含む。定義には全長もしくは部分長遺伝子配列またはｃＤＮＡでよいか、または核酸を活性化する遺伝子もしくは遺伝子配列を変調するように作用できるアンチセンス分子のアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）などの分子に結合する核酸でよい、ＦＡＮＣＤ２をコードする核酸も含まれる。
【００３２】
「ＦＡＮＣＤ−２をコードする核酸」には、前記で定義したＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質を発現するためのＦＡＮＣＤ２の完全なｃＤＮＡもしくはゲノム配列またはその部分が含まれる。核酸はさらに核酸キャリヤまたはベクターに含まれてよく、標的部位に有効に分配するために適当に修飾されている核酸を含む。
【００３３】
「ハイブリダイゼーションのストリンジェント条件」には一般に３０℃以上、典型的には３７℃以上、好ましくは４５℃以上の温度が含まれる。ストリンジェント塩条件は通常１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満である。
【００３４】
核酸に関する「実質的相同性または類似性」は、別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列化（適当な核酸挿入または欠失を伴う）した場合に少なくとも約６０％、通常少なくとも約７０％、より通常的には少なくとも約８０のヌクレオチド塩基でヌクレオチド配列同一性があれば、核酸またはそのフラグメントが別のものに「実質的に相同である」（「または実質的に類似している」）場合のことある。
【００３５】
「抗体」にはポリクローナル及びモノクローナル抗体及び、一本鎖抗体を含み、一本鎖抗体及びＦａｂフラグメントを含むそのフラグメント、並びにタンパク質のアイソフォームを区別するのに十分な結合特異性を有するその免疫結合性等価物が含まれる。これらの抗体はアッセイ及び医薬品において有用である。
【００３６】
「単離された」とは、その天然の状態においてそれに付随する成分から分離されているタンパク質、ポリペプチドまたは核酸を記載するのに用いられる。サンプルの少なくとも約６０から７５％が単一のアミノ酸またはヌクレオチド配列を呈する場合、「単離された」タンパク質または核酸は実質的には純粋である。
【００３７】
「制御配列」は通常遺伝子座のコード化領域の１００ｋｂ以内のこれらの配列を意味するが、コード化領域からさらに遠位でもよく、遺伝子の発現（遺伝子の転写、及び翻訳、スプライシング、安定性またはメッセンジャーＲＮＡのようなものを含む）に影響する。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」はＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成体、及び混合ポリマー、センス及びアンチセンス鎖の双方を含み、技術分野の技術者に容易に理解されるように、化学的または生化学的に修飾されていてよく、または非天然または誘導ヌクレオチド塩基を含んでよい。かかる修飾には、例えば標識、メチル化、１つまたはそれ以上の天然発生ヌクレオチドの類似体との置換、ヌクレオチド内修飾、例えば非荷電性結合（例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）、荷電性結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、懸垂基（例えばポリペプチド）及び修飾された結合（例えばアルファ・アノマー核酸）などがある。水素結合またはその他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合する能力において核酸を擬似する合成分子もまた含まれる。
【００３９】
「変異」は、野生型に比較して、制御配列の遺伝子内または遺伝子外のヌクレオチド配列における変化である。変化は欠失、置換、点変異、複数のヌクレオチドの変異、転位、逆位、フレームシフト、ナンセンス変異、または機能細胞において正常に発現された遺伝子のものから核酸またはタンパク質を区別する染色体異常の別の形態でよく、この場合発現及び機能性は正常に発生する範囲内である。
【００４０】
「対象」とはヒトなどの哺乳動物を含む動物を意味する。
【００４１】
「野性型ＦＡＮＣＤ２」とは細胞内でモノユビキチン化してＦＡＮＣＤ−ＳからＦＡＮＣＤ２−Ｌを形成することができるタンパク質または発現されたタンパク質をコードする遺伝子を意味する。
【００４２】
いくつかのファンコーニ貧血は毛細血管拡張性運動失調（ＡＴ）、色素性乾皮症（ＸＰ）、コケーン症候群（ＣＳ）、ブルーム症候群、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、癌感受性症候群及びＨＮＰＣＣなどの症候群の群と類似性を有する（表２参照）。これらの症候群はＤＮＡ修復に基礎的欠損を有し、染色体の完全性の維持における欠損に関連する。ＤＮＡ修復及び染色体の完全性の維持に関連する経路における欠損の結果、ゲノム不安定性、及びＤＮＡ損傷物質、例えば鎖間架橋を引き起こす２価性アルキル化剤に対する細胞感受性を招く。さらに、ＤＮＡ修復メカニズムにおける障害は、遺伝子再配列により癌の域を誘発する可能性を実質的に増大させるようだ。この観察はマイトマイシンＣ、シスプラチン、シクロホスファミド、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）及びＵＶＡ照射などのＤＮＡ架橋剤の臨床使用に関して直接関係する。
【００４３】
ファンコーニ貧血は稀な疾患であるが、ＦＡの多形質発現効果はゲノム安定性、アポトーシス、細胞サイクル調節及びＤＮＡ架橋に対する抵抗性などの多様な細胞性過程の経路におけるＦＡタンパク質の野生型機能の重要性を示している。
ＦＡの細胞性異常には、架橋化剤に対する感受性、細胞周期Ｇ２期の延長、周囲Ｏ２下での成長低下などの酸素に対する感受性、Ｏ２ラジカルの過剰生生成、Ｏ２ラジカル防御の欠如、スーパーオキシドジスムターゼの欠乏；電離放射線に対する感受性（Ｇ２特異的）；腫瘍壊死因子の過剰生成、ＤＮＡ付加物の蓄積などのＤＮＡ修復の直接的な欠損、及びＤＮＡ架橋の修復における欠損、自発的染色体切断などのゲノム不安定性、及び欠失メカニズムによる過剰易変性、アポトーシスの増加、ｐ５３誘導の欠損、インビトロコロニー成長の低下などの内因性幹細胞欠損；生殖腺幹細胞生存性の低下などがある。
【００４４】
これらの特徴は造血及び生殖腺幹細胞の維持、並びに骨格及び泌尿性器系などの多くの異なる構造での正常な胚発生におけるＦＡの関与を反映している。患者からの細胞サンプルを分析してＦＡの相補Ｄ群における欠損を決定した。1人の患者からのリンパ芽球はＰＤ２０細胞系を上昇させ、これはＤ相補群の欠損を有する別の1人の患者に由来するＨＳＣ６２からの異なる遺伝子において変異していることが解った。双方の患者からの変異をＤ相補群にマッピングされたが、異なる遺伝子にはマッピングされず、よってＦＡＮＣＤタンパク質・ＦＡＮＣＤ１（ＨＳＣ６２）及びＦＡＮＣＤ２（ＰＤ２０）と命名された（Ｔｉｍｍｅｒｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ７：２４１−２４８（２００１））。我々はＦＡＮＣＤ２がＦＡ経路の終点であり、ＦＡ核複合体の部分ではなく、その集合または安定性に必要でもなく、ＦＡＮＣＤ２は２つのアイソフォームであるＦＡＮＣＤ２−Ｓ及びＦＡＮＣＤ２−Ｌで存在することを示した。我々はまたタンパク質の短い形態（ＦＡＮＣＤ２−Ｓ）のタンパク質の長い形態（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ）への形質転換がＦＡ複合体に応答して生じることをも示した（図８）。ＦＡ経路に関連する特定のタンパク質の欠損の結果、ＦＡＮＣＤ２−Ｌとして同定される、ＦＡＮＣＤ２の重要な翻訳後修飾形態の作製に失敗する。ＦＡＮＣＤ２の２つのアイソフォームは短形態及び長形態として同定される。
【００４５】
ＦＡＮＣＤ２−Ｌの作製の失敗はＤＮＡ修復におけるエラー及び前記で列挙した疾患に関連する細胞周期異常に相関する。
【００４６】
前記した症候群におけるＦＡＮＣＤ２の役割についてさらに理解するために、我々はＦＡＮＣＤ２遺伝子をクローン化し、タンパク質配列を決定した。ＦＡＮＣＤ２遺伝子は４３５３塩基対のオープン・リーディング・フレーム及び、推定分子量１６６ｋＤａの新規１４５１アミノ酸核タンパク質をコードする４４個のエクソンを有する。ウェスタンブロット分析により１６２及び１５５ｋＤの２つのタンパク質アイソフォームの存在が示された。４４イントロン／エクソン接合部に対応する配列を表６（配列番号９から９４）で提示する。
【００４７】
以前にクローン化されたＦＡタンパク質とは異なって、いくつかの無脊椎動物真核細胞からのＦＡＮＣＤ２タンパク質はキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）及び線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のタンパク質と高度に有意なアラインメントスコアを示した。ショウジョウバエ相同体はＦＡＮＣＤ２に対して２８％のアミノ酸同一性及び５０％の類似性を有し（図及び配列番号：１から３）、各々の種では機能実験は実施しなかった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びパン酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ではＦＡＮＣＤ２に類似するタンパク質は見出されなかった。
【００４８】
我々は、ＦＡＮＣＤ２遺伝子においてビアレリック変異を有する２つのＦＡ細胞系であるＰＤ２０及びＶＵ００８の染色体３ｐ遺伝子座を分析することによりＦＡＮＣＤ２  ＤＮＡ配列（配列番号：５）を得た（図１０）。患者からのリンパ芽球はＨＳＣ６２を補足し損なっていたので、細胞系をＤ群の参照細胞系であるＤ相補群に割り当てた。ＦＡＮＣＤ２変異はこのＤ群参照細胞系では検出されず、これはＨＳＣ６２において変異した遺伝子がＦＡＮＣＤ１をコードする遺伝子であり、ＰＤ２０及びＶＵ００８ではＦＡＮＣＤ２であることを示している（図１１）。微小核体媒介染色体移動を用いて変異を同定した（Ｗｈｉｔｎｅｙら、Ｂｌｏｏｄ  ８８：４９−５８（１９９５））。遺伝子座を包含する小さな重複欠失を含有する５つの微小核体ハイブリッドの詳細な分析により、ＦＡＮＣＤ２遺伝子の候補領域が２００ｋｂに狭められた。ＦＡＮＣＤ２遺伝子は以下の様に単離された：３つの候補ＥＳＴをこのＦＡＮＣＤ２臨界領域内または近くに局在させた。ｃＤＮＡ全長を得るために、５’及び３’ＲＡＣＥを用いて遺伝子をシーケンシングし、各々の発現パターンをノーザンブロットにより分析した。ＥＳＴ  ＳＧＣ３４６０３は以前にクローン化されたＦＡ遺伝子に類似して偏在性であり、５ｋｂ及び７ｋｂ  ｍＲＮＡの発現は低レベルであった。ＴＩＧＥＲ−Ａ００４Ｘ２８、ＡＡ６０９５１２及びＳＧＣ３４６０３でオープン・リーディグ・フレームが見出され、各々の長さは２３４、５３１及び４４１３ｂｐであった。クローン化ＲＴ−ＰＣＲ生成物をシーケンシングすることよりＰＤ２０細胞における変異に関して３つ全てを分析した。ＴＩＧＥＲ−Ａ００４Ｘ２８及びＡＡ６０９５１２では配列変化は検出されなかったが、ＳＧＣ３４６０３では５つの配列変化が見出された。次に、我々は臨界領域からのＢＡＣ１７７Ｎ７におけるｃＤＮＡシーケンシングプライマーを用いてＳＧＣ３４６０３遺伝子の構造を決定した。
【００４９】
ゲノム配列情報に基づいてＰＣＲプライマー対を設計し（表７）、推定される変異を含有するエクソンを増幅し、アレル特異的アッセイを発展させてＰＤ２０ファミリー及び５６８対照染色体をスクリーニングした。アレルの３つが共通の多型性であった；しかしながら、対照において２つの変化が見出されず、従って、変異の可能性が示された（表３）。第１は母性遺伝したｎｔ３７６におけるＡ−＞Ｇ変化であった。アミノ酸の変化（Ｓ１２６Ｇ）に加えて、この変異はスプライシングミス及びイントロン５からｍＲＮＡへの１３ｂｐの挿入に随伴された。母性変異を有する４３／４３（１００％）の別個にクローン化されたＲＴ−ＰＣＲ生成物はこの挿入を有し、一方対照ｃＤＮＡクローンの３％（１／３１）のみでｍＲＮＡのスプライシングミスが示された。１３ｂｐの挿入によりフレームシフトを生じ、たった１８０個のアミノ酸長の重度にトランケートされたタンパク質が予測される。第２の変異は１２３６位置で父性遺伝されたミスセンス変化であった（Ｒ１２３６Ｈ）。ＰＤ２０コアファミリーにおける変異の分離を図１０に示す。ＰＤ２０のＳＧＣ３４６０３遺伝子は５６８対照染色体には存在しない母性及び父性アレルの双方を含有し、母性変異は分析したｃＤＮＡの１００％でスプライシングミスに随伴されたので、我々はＳＧＣ３４６０３がＦＡＮＣＤ２遺伝子であると結論した。
【００５０】
ＦＡＮＣＤ２にコードされるタンパク質はＰＤ２０には存在しない：ＳＧＣ３４６０３のＦＡＮＣＤ２としての同定をさらに確実にするために、タンパク質に対して抗体を上昇させ、ウェスタンブロット分析を実施した（図１１）。レトロウイルス形質導入及びＰＤ２０細胞におけるＦＡＮＣＤ２の安定発現により抗体の特異性が示された（図１１ｃ）。野生型細胞ではこの抗体は２つのバンド（１５５及び１６２ｋＤ）で検出され、我々はＦＡＮＣＤ２−Ｓ及びＬと称する（図１１ｃで最もよく認められる）。ＦＡＮＣＤ２タンパク質レベルは患者のＰＤ２０からの全てのＭＭＣ感受性細胞系で著明に減少したが（図１１ａ、レーン２、４）、野生型細胞系及び別の相補群からのＦＡ細胞には存在した。さらに、染色体３の微小核体媒介移動により修正されたＰＤ２０細胞はまた正常量のタンパク質を生成した（図１１ａ、レーン３）。
【００５１】
ＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡでのＦＡ−Ｄ２細胞の機能的補足：我々は次にクローン化されたＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡがＦＡ−Ｄ２細胞のＭＭＣ感受性を補足する能力を評価した（図１２）。ＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡ全長を前記したレトロウイルス発現ベクターであるｐＭＭＰ−ｐｕｒｏにサブクローンジングした（Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４：４６８−４７９（１９９８））。形質導入されたＰＤ−２０細胞はＦＡＮＣＤ２タンパク質のアイソフォームであるＦＡＮＣＤ２−Ｓ及びＦＡＮＣＤ２−Ｌの双方を発現した（図１２ｃ）。ｐＭＭＰ−ＦＡＮＣＤ２によるＦＡ−Ｄ２（ＰＤ２０）細胞の形質導入は細胞のＭＭＣ感受性を修正した。これらの結果はさらにクローン化されたＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡがＦＡＮＣＤ２−Ｓタンパク質をコードし、これをＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームに翻訳後修飾することができる。この重要な修飾は以下で詳細に論じる。
【００５２】
表現型的に復帰したＰＤ２０クローンの分析：我々は次に、ＰＤ２０細胞における配列変化は機能的に中立である多型性ではないことを示すさらなる証拠を作製した。この目的のために、我々はもはやＭＭＣに感受性を示さない患者ＰＤ２０からの復帰変異リンパ芽球クローン（ＰＤ２０−ｃ１．１）の分子分析を実施した。復帰及び体細胞モザイク現象はＦＡにおいてしばしば見出され、遺伝子内事象、例えば有糸分裂組換えまたは代償性フレームシフトに随伴された。実際に、母性由来するＳＧＣ３４６０３  ｃＤＮＡの〜６０％が、通常観察される１３ｂｐよりむしろイントロン５配列の３６ｂｐを挿入する新規スプライシング変種を有した（図１３）。ＩＶＳ５＋６でＧからＡへのデノボ変化に相関するフレーム内スプライシング変種の出現（図１３）及び正確な読み枠の回復がウェスタンブロット分析により確認された。患者ＰＤ２０からの全てのＭＭＣ感受性繊維芽細胞及びリンパ芽球であるＰＤ２０−ｃ１．１は容易に検出できる量の、正常タンパク質よりもわずかに高分子量のＦＡＮＣＤ２タンパク質を生成した。
【００５３】
別の「ＦＡＮＣＤ」患者からの細胞系の分析：また抗体を用いて、ＦＡのＤ群の参照細胞系、ＨＳＣ及び欧州ファンコーニ貧血登録所（ＥＵＦＡＲ）によりＤ群として同定された２つの別の細胞系などのさらなるＦＡ患者細胞系をスクリーニングした。ＶＵ００８はＦＡＮＣＤ２タンパク質を発現せず、双方共にエクソン１２でミスセンス及びナンセンス変異を有する異型接合性化合物であることが見出され、３７０対照染色体では見出されなかった（表３、図１１）。ＶＵ００８細胞からのライゼートではＦＡＮＣＤ２タンパク質を検出できないので、ミスセンス変異はＦＡＮＣＤ２タンパク質を不安定化するようである。第３の患者ＰＤ７３３もまたＦＡＮＣＤ２タンパク質を欠き（図１１ｂ、レーン３）、エクソン１７の不在に至るスプライシング変異及びタンパク質の内部欠失が見出された。変異とこれらの患者に由来する細胞ライゼート中のＦＡＮＣＤ２タンパク質不在との相関は、ＦＡＮＣＤ２のＦＡ遺伝子との同一性を実証する。対照的に、容易に検出できる量のＦＡＮＣＤ２タンパク質の双方のアイソフォームがＨＳＣ６２（図１１ａ、レーン８）及びＶＵ４２３  ｃＤＮＡで見出され、双方の細胞系からのゲノムＤＮＡが変異に関して詳細に分析され、何も見出されなかった。加えて、ＶＵ４２３及びＰＤ２０繊維芽細胞間の全細胞融合が染色体切断表現型の補足を示した（表５）。これらのデータを合わせて考慮すると、ＦＡのＤ群は遺伝的に異種性であり、ＨＳＣ６２及びＶＵ４２３において欠損している（複数の）遺伝子がＦＡＮＣＤ２とは区別されることが示される。
【００５４】
ＦＡＮＣＤ２遺伝子及びタンパク質の同定及びシーケンシングにより、非限定例としては表２に列挙するものなどのＤＮＡ修復の失敗及び細胞周期異常に関連する疾患の治療の開発、診断試験及びスクリーニングアッセイのための新規目標が提供される。
【００５５】
以下の記載によりＦＡ経路におけるＦＡＮＣＤ２の生物学的役割に新規で有用な洞察が提供され、前記の症候群の診断及び処置のための基礎が提供される。
【００５６】
ＦＡ細胞が細胞周期制御における基本的な分子性欠損を有するという証拠には以下のものなどがある：（ａ）ＦＡ細胞は化学的架橋化剤での処置により増強される４Ｎ  ＤＮＡ含量を伴う細胞周期遅延を示し、（ｂ）ＦＡ細胞の細胞周期停止及び増殖低下はタンパク質のサイクリンファミリーのメンバーであるタンパク質、ＳＰＨＡＲの過剰発現により部分的に修正されることができ、並びに（ｃ）カフェインはＦＡ細胞のＧ２停止を止めさせる。これらの結果に合致して、カフェインは構造的にｃｄｃ２を活性化し、ＦＡ細胞の正常なＧ２細胞周期チェックポイントを覆すことができる。最終的にＦＡＮＣＣタンパク質はサイクリン依存性キナーゼであるｃｄｃ２に結合する。我々はＦＡ複合体がサイクリンＢ／ｃｄｃ２複合体の基質またはモデュレーターであり得ることを提示している。
【００５７】
加えて、ＦＡ細胞がＤＮＡ修復において基礎的な欠損を有しているという証拠は、（ａ）架橋ＤＮＡまたは二本鎖切断の修復における特異的欠損を示唆する、ＤＮＡ架橋化剤及び電離放射線（ＩＲ）に感受性のあるＦＡ細胞、（ｂ）修復欠損でしかも無傷のチェックポイント活性の存在を示唆する、過剰反応性ｐ５３応答に至るＦＡ細胞のＤＮＡ損傷、及び（ｃ）非相同性末端結合の適合性の欠損及び相同組換え率の増加を伴うＦＡ細胞により示唆される（Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．７：２４９−２６２（２００１））、（Ｇｒｏｍｐｅら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１−７（２００１））。
【００５８】
これらの細胞周期及びＤＮＡ修復の一般的な異常にかかわらず、ＦＡ経路がこれらの活性を制御するメカニズムは解りにくい。我々はここでＦＡＮＣＤ２タンパク質がＦＡタンパク質複合体の下流で機能することを示す。集合したＦＡタンパク質複合体の存在下で、ＦＡＮＣＤ２タンパク質は活性化されて高分子量のモノイビキチン化アイソフォームになり、これはＳ期特異的ＤＮＡ修復応答を変調するようである。活性化されたＦＡＮＣＤ２タンパク質はＤＮＡ損傷物質に応答して核フォーカスに蓄積し、公知のＤＮＡ修復タンパク質であるＢＲＣＡ１と同時局在化及び同時免疫沈降する。これらの結果は以前矛盾していたＦＡ経路（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら、１９９７）のモデルを解決し、ＦＡタンパク質がＤＮＡ損傷に対する細胞性応答と協働することを示している。
【００５９】
ＦＡ経路にはＦＡマルチサブユニット核複合体の形成が含まれ、Ａ／Ｃ／Ｇに加えて我々は複合体のサブユニットとしてＦＡＮＣＦもまた含まれることを示した（図８）。ＦＡ経路はＳ期の間に「活性化」し、Ｓ期特異的修復応答またはチェックポイント応答を提供する。ＦＡマルチサブユニット複合体に依存するＦＡ経路の正常な活性化の結果、ＦＡＮＣＤ−２Ｌとして同定される高分子量活性化アイソフォームへのリン酸化工程を介するホスホプロテインＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化の制御に至る（図１）。モノユビキチン化は細胞輸送に関連する。ＦＡＮＣＤ２−ＬはＳ期特異的ＤＮＡ修復応答を変調するようである（図３）。ＦＡ細胞がＦＡＮＣＤ２のＳ期特異的活性化を活性化し損なうことは細胞周期特異的異常に関連する。活性化されたＦＡＮＣＤ２タンパク質はＤＮＡ損傷物質、ＭＭＣ及びＩＲに応答して核フォーカスに蓄積し、公知のＤＮＡ修復タンパク質であるＢＲＣＡ１と同時局在化及び同時免疫沈降する（図４から６）。これらの結果は以前矛盾していたＦＡ経路のモデルを解決し（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら、１９９７）、ＤＮＡ修復におけるＦＡ経路の役割を強く支持する。
【００６０】
我々はＦＡ経路に関するＦＡＮＣＤ２アイソフォーム間の会合及び種々の癌の公知の診断用分子であるタンパク質を初めて同定した。Ｓ期においてまたはＤＮＡ損傷に応答して翻訳後修飾された高分子量のアイソフォームに活性化されるＢＲＣＡ１タンパク質の、ＤＮＡ損傷に関する類似の経路は、活性化されたＦＡＮＣＤ２タンパク質がＢＲＣＡ１と相互作用することを示唆している。さらにとりわけ、ＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化の制御は、ＦＡＮＣＤ２タンパク質を、ＢＲＣＡ１を含有する核フォーカスに標的化するようである。ＦＡＮＣＤ２はＢＲＣＡ１と同時免疫沈降し、別の「ドット」タンパク質、例えばＲＡＤ５０、Ｍｒｅ１１、ＮＢＳ、またはＲＡＤ５１とさらに結合できる。最近の研究ではＢＲＣＡ１フォーカスが大きな（２メガダルトン）のマルチタンパク質複合体から構成されることが示されている（Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：９２７−９３９（２０００））。この複合体にはＡＴＭ、ＤＮＡ修復機能に関与するＡＴＭ基質（ＢＲＣＡ１）、及びチェックポイント機能に関与するＡＴＭ基質（ＮＢＳ）などがある。さらに損傷認識及びＦＡ経路活性化はＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１またはＣＨＫ２などのＤＮＡ損傷に応答するキナーゼに関与することが示唆されている。
【００６１】
我々はＤＮＡ損傷物質、ＩＲ及びＭＭＣがＦＡＮＣＤ２の独立した翻訳後修飾を活性化し、異なる機能的結果に至ることを見出した。ＩＲはセリン２２２でＡＴＭ依存的にＦＡＮＣＤ２のリン酸化を活性化し、Ｓ期チェックポイント応答に至る。ＭＭＣはリジン５６１でＢＲＡＣＡ−１依存的及びＦＡ経路依存的にＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化を活性化し、ＦＡＮＣＤ２／ＢＲＣＡ１核フォーカスの集合及びＭＭＣ抵抗に至る。従って、ＦＡＮＣＤ２は、共通の経路における２つの別の癌感受性遺伝子（ＡＴＭ及びＢＲＣＡ１）間の連結を提供する２つの異なる翻訳後修飾の結果、染色体安定性の維持において２つの独立した機能的役割を有する。いくつかの別の系の証拠によりＦＡＮＣＤ２及びＢＲＣＡ１間の相互作用が支持される。第１に、ＢＲＣＡ１（−／−）細胞系であるＮＣＣ１９３７（Ｓｃｕｌｌｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．４：１０９３−１０９９（１９９９））は、染色体不安定で、トリラジカル及びテトララジカル染色体形成の増加を伴う「ファンコーニ貧血様」表現型を有する。第２にＢＲＣＡ１フォーカス（及びＲＡＤ５１フォーカス）からのＦＡ細胞は通常ＩＲに応答するが、ＢＲＣＡ１（−／−）細胞は検出可能なＢＲＣＡ１フォーカスを有さず、正常細胞に比較してＦＡＮＣＤ２フォーカスの数が非常に増加している。ＢＲＣＡ１（−／−）細胞の機能的補足によりＢＲＣＡ１フォーカス及びＦＡＮＣＤ２フォーカスが正常レベルに回復し、正常なＭＭＣ抵抗性が回復した。
【００６２】
ＦＡＮＣＤ２−Ｌの量は一部ｆａｎｃｄ２遺伝子から合成されるＦＡＮＣＤ２−Ｓの量により決定され、一部はＦＡＮＣＤ２−Ｌを形成するモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２−Ｓに対するＦＡ複合体の利用性により決定される。ＢＲＣＡ及びＡＴＭを含む核フォーカスとのＦＡＮＣＤ２−Ｌの会合及びＤＮＡ修復におけるＦＡＮＣＤ２−Ｌの役割の決定により、このタンパク質を広範な癌の患者における癌進行の可能性を観察するための強力な標的にする。かかる癌には染色体３ｐにおける損傷から生じるもの、及び変異が結果的にＦＡ経路の上流のメンバー、例えばＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＣまたはＦＡＮＣＡの生成を干渉するような別の染色体上の癌などがある。癌系及びバイオプシなどの癌患者からの１次細胞をＦＡＮＣＤ−Ｌに関してスクリーニングし、このタンパク質のレベル異常を予測して疾患の早期診断に相関させる。ＦＡＮＣＤ２タンパク質はＤＮＡ修復への経路の最終工程であるので、ＦＡＮＣＤ２−ＳのＦＡＮＣＤ−Ｌへの変換に至る１つまたはそれ以上の経路におけるタンパク質のいずれかの異常はＦＡＮＣＤ２のレベルを測定することにより容易に検出されると考えられる。さらに、ＦＡＮＣＤ２のレベルは別のタンパク質、例えば核内のＢＲＣＡ及びＡＴＭがどのように機能的に患者の結果と相互作用するかに影響する。患者のＦＡＮＣＤ２レベルの分析は、患者に提示される癌のクラスの理解に関する臨床決定において医師を補助すると予測される。例えば、癌細胞がモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの作製に失敗する場合、細胞は染色体不安定性を増し、恐らく照射または化学療法剤に対する感受性を増すであろう。この情報は患者の処置を改善する方法において医師を補助するであろう。
【００６３】
ファンコーニ貧血は異なる癌の広範なスペクトルのみならず、先天的異常にも関連する。胎児の発達は複雑ではあるが秩序だった過程である。特定のタンパク質は、この秩序だった発達の進行を破壊させるので、とりわけ広いスペクトルの影響を有する。ＦＡ経路は発達において重要な役割を果たし、ＦＡ経路の破壊の結果、多数の悪影響に至る。ＦＡ経路におけるエラーは胎児細胞からのＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質を分析することにより検出できる。ＦＡＮＣＤ２は正常な胎児発達のための診断マーカー及び治療的介入に可能な標的に相当する。
【００６４】
前記に一致して、我々は生存精子の生成においてＦＡＮＣＤ２が役割を果たすことを示した。ＦＡＮＣＤ２は後期パキテン及びディプロテン期のネズミ精母細胞においてＸＹ２価染色体の不対軸でフォーカスを形成する。（図７）興味深いことに、ＦＡＮＣＤ２フォーカスはまたディプロネマの常染色体テロメアでも認められる。ＦＡ患者及びＦＡ−Ｃノックアウトマウスにおいて知られている生殖障害を考慮に入れて、我々の観察により、減数分裂Ｉを経る精母細胞の正常な発達に、活性化されたＦＡＮＣＤ２タンパク質が必要であることが示唆される。ＸＹ軸で認められるたいていのＦＡＮＣＤ２フォーカスはＢＲＣＡ１フォーカスと同時局在していることが見出され、これは２つのタンパク質が減数分裂細胞で一緒に機能し得ることを示唆している。ＢＲＣＡ１と同様、ＦＡＮＣＤ２は発達中の対合複合体の軸（対合していない）エレメントにおいて検出された。組換えは対合している領域で生じるので、ＦＡＮＣＤ２は組換えが開始される前に機能して、恐らく染色体がシナプシスの準備をするのを助けるかまたは続く組換え事象を制御することができる。ＦＡＮＣＤ２は減数分裂染色体において集合し、有糸分裂細胞でドット構造を形成し、これは有糸分裂及び減数分裂の双方の細胞周期調節におけるＦＡＮＣＤ２の役割を示唆している。
【００６５】
本発明の実施形態は翻訳後修飾されたアイソフォーム：ＦＡＮＣＤ−２ＬのＦＡ経路の完全性を決定するための診断標的として使用することを志向する。ＦＡＮＣＤ２のユビキチン化及びＦＡＮＣＤ２核フォーカスの形成はＦＡ経路の下流の事象であり、いくつかのＦＡ遺伝子の機能を必要とする。我々はいずれかの上流ＦＡ遺伝子（ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ及びＦＡＮＣＧ）のビアレリック変異が、ユビキチン化されていないＦＡＮＣＤ２（ＦＡＮＣＤ２−Ｓ）形態からユビキチン化（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ）へのＦＡＮＣＤ２の翻訳後修飾を遮断することを見出した。これらの上流の欠損のいずれかはＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡで細胞をトランスフェクトすることにより覆される。（図１ａ）
我々は初めてＦＡＮＣＤ２の存在及びＦＡ経路におけるその役割を示した。我々は、ＦＡＮＣＤ２がＤＮＡ損傷物質に応答して核フォーカスにおいて蓄積され、そこで別のＤＮＡ修復タンパク質、例えばＢＲＣＡ１及びＡＴＭに関連することを示した。我々はＦＡＮＣＤ２が細胞内で２つのアイソフォームで存在し、そこで２つのアイソフォームの１つの低下がファンコーニ貧血及び癌感受性の増大と相関することをも示した。我々はこれらの知見を用いて患者の看護を補助する臨床使用のための多くの診断試験を提供した。
【００６６】
これらの試験には：（ａ）将来の子孫または既存の妊娠における遺伝性ファニコーニ貧血を心配する親のための遺伝及び親のカウンセリング；（ｂ）ＦＡ経路欠損に相関する癌に対する感受性の増大を決定するための成人のための遺伝カウンセリング及び免疫診断試験；並びに（ｃ）対象にすでに既存の癌を診断して、副作用を最小限にし、対象に最大の効果を発揮する処置プロトコルを開発するための機会を提供すること；が含まれる。
【００６７】
本明細書に記載する診断試験は技術分野で公知の標準的なプロトコルに依存し、我々はその試験のためにＦＡＮＣＤ２タンパク質及びヌクレオチド配列を試験するための新規試薬を提供した。これらの試薬はＦＡＮＣＤ２アイソフォームに特異的な抗体、ＦＡＮＣＤ２遺伝子における遺伝子変化を検出するためのベクター、プローブ及びプライマーが誘導されたヌクレオチド配列、並びにＦＡ経路における欠損を保護及び試験するための細胞系及び組換え細胞が含まれる。
【００６８】
我々は実施例１に記載するように、ＦＡＮＣＤ２−Ｌ及びＦＡＮＣＤ２−Ｓタンパク質に特異的なモノクローナル及びポリクローナル抗体調製物を調製した。
加えて、ＦＡＮＣＤ２アイソフォーム特異的抗体フラグメント及び一本鎖抗体を標準的技術を用いて調製できる。我々は、生物学的サンプルにおけるＦＡＮＣＤ２アイソフォームを同定するために、湿式化学アッセイ、例えば免疫沈降アッセイ、例えばウェスタンブロットでこれらの抗体を使用した（図１）。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量アッセイ（ＩＲＭＡ）及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を含み、さらにサンドウィッチアッセイなどを含む慣用されるイムノアッセイをも使用した。別のイムノアッセイは全細胞のサンプル、及び溶液中の抗体と反応し、場合によっては貯蔵容器内で液体状態で分析される溶解した細胞を利用することができる。細胞系、組織バイオプシ及び血液などの無傷細胞で、例えば蛍光活性化細胞分類、及び免疫蛍光細胞を検出するためのレーザーまたは光学顕微鏡を用いる免疫学的技術によりＦＡＮＣＤ２のアイソフォームをインサイチュウ同定できる（図１から７、９から１４）。例えば保存状態、例えばパラフィンに包埋してスライド上で調製した、または凍結組織切片として、組織または細胞単層のバイオプシを抗体に暴露し、ＦＡＮＣＤ２−Ｌを検出し、次いで蛍光顕微鏡により試験できる。
【００６９】
本発明の実施形態では、患者に由来する細胞系または癌細胞系をイムノブロッティング及び免疫蛍光により分析し、ＦＡＮＣＤ２アイソフォームの量の変化を検出するための新規の単純診断試験を提供する。ＦＡ経路の上流に欠損を有する個体はＦＡＮＣＤ２をユビキチン化することができないので、診断試験はまたＦＡ経路の上流の欠損をスクリーニングするための手段、及び現在用いられているＦＡのＤＥＢ／ＭＭＣ染色体切断試験の実質的代替方法をも提供する。形質転換された患者由来細胞系を形成するレトロウイルス遺伝子移動（Ｐｕｌｓｉｐｈｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４：４６８−１７９（１９９８））をＦＡＮＣＤ２イムノブロッティングと一緒に組み合わせたアッセイなどの別のアッセイを用いて、表２に記載するいずれかの症候群、とりわけＦＡの症候群を有する、新規に診断された患者を迅速にサブタイピング分析することができる。
【００７０】
前記のアッセイは診断用研究室により実施され得るか、また別に診断キットが製造され、医療介護提供者または自己診断のための私用に個人に販売され得る。これらの試験の結果及び解釈の情報は患者の症状の診断及び処置において医療介護提供者に有用である。
【００７１】
遺伝学的試験は対象に、疫学的基礎に対する特定の症状に関する迅速で信頼できる危険性分析を提供できる。我々のデータは、遺伝的異種性がＦＡＮＣＤ２相補群の中のＦＡを有する患者に生じることを示唆している。我々は遺伝的異種性及び疾患、並びに遺伝的異種性及びＦＡＮＣＤ２−Ｌの存在または不在に至る翻訳後修飾異常の間に相関性を見出した。この相関性により予後診断試験及び診断試験の基礎、並びにＤＮＡ修復異常により特徴付けられるいずれかの症候群の処置が提供される。例えば、採血した血液から得られた細胞サンプルまたは対象に由来する別の細胞からの核酸を、ＦＡＮＣＤ２遺伝子における変異に関して分析でき、対象が癌に対する感受性を増していることを診断できる。
【００７２】
我々は高頻度の癌に相関する領域の染色体３ｐ上の３０２５．３のＦＡＮＣＤ２遺伝子を位置決定した。細胞遺伝学及び異型接合性損失（ＬＯＨ）研究により、染色体３ｐの欠失は肺癌の全ての形態において高頻度で発生することが示された（Ｔｏｄｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：１３４４−１３５２）。例えば異型接合性欠失は３つの扁平上皮細胞系で３ｐ２１の領域内に見出された。同型接合性欠失もまた小型細胞腫瘍において３ｐ１２及び３ｐ１４．２で見出された（Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：１３４４−１３５２（１９９７））。ＦＡＮＣＤ２のこのマッピングは、この染色体領域が重要な腫瘍サプレッサー遺伝子を含有するという理論を支持する。家族性卵巣癌の新規感受性遺伝子の染色体３ｐ２２からｐ２５への局在を報告している、Ｓｅｋｉｎｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １０：１４２１−１４２９（２００１）の最近の文献によりこれはさらに支持されている。ＦＡＮＣＤ２部位（３ｐ２５．３）のみならず、環境物質への暴露及び正常な加齢過程から生じる細胞損傷に続くＤＮＡ修復の欠損から生じる可能性がある染色体の別の部位での変異の結果である腫瘍の危険性の増加を診断するために、ＦＡＮＣＤ２−Ｌの低下または不在が本明細書で提案される。
【００７３】
より多くの個人及び家族がＦＡＮＣＤ２遺伝子の遺伝的欠損をスクリーニングされると、データベースに異なる変異のための集団頻度が集められ、これらの変異及び個体の健康プロファイル間の相関性が作成され、遺伝学的分析の予測価値が継続的に改善されるように、データベースが開発される。２つの家族のＦＡＮＣＤ２に関するアレル特異的系統図分析の実例を図１０に提示する。
【００７４】
ＦＡＮＣＤ２遺伝子の変異の診断を、ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の量の低下を検出するための迅速な免疫学的アッセイにより最初に検出できる。次いでＦＡ経路のいずれかの遺伝子の欠損に利用可能なプローブ及びプライマーで陽性サンプルをスクリーニングできる。ＦＡＮＣＤ２遺伝子における欠損が関係する場合、例えば表７で提供されるプライマーまたはプローブを用いて変異を検出できる。かかるプライマーまたはプローブにより変異が検出されないこれらのサンプルでは、ＦＡＮＣＤ２遺伝子全体をシーケンシングして遺伝子における変異の存在及び位置を決定できる。
【００７５】
ＦＡＮＣＤ２遺伝子座における遺伝子欠損を同定するのに用いられる核酸スクリーニングアッセイにはＰＣＲ及び変異を検出するための非ＰＣＲ基盤アッセイなどが含まれ得る。特定のアレルにおける変異の存在に関して細胞ゲノムを分析する多くの研究法がある。野生型ＦＡＮＣＤ２アレルの変化を、例えば点変異、欠失または挿入によるかそうでなくても、プローブを用いる標準的な方法により検出できる（米国特許第６０３３８５７号）。標準的な方法には：（ａ）無傷全細胞で用いることができる蛍光インサイチュウ・ハイブリダイゼーション（ＦＳＨ）；及び（ｂ）アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などがあり、これらを用いて、単離された核酸におけるハイブリダイゼーションを用いて変異を検出できる（Ｃｏｎｎｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８５：５５−７４（１９８９））。別の技術には（ａ）非変性ポリアクリルアミドゲル上の一本鎖ＤＮＡの電気泳動可動性のシフトを観察すること、（ｂ）組織サンプルから単離されたゲノムＤＮＡにＦＡＮＣＤ２遺伝子プローブをハイブリダイズすること、（ｄ）組織サンプルからのＦＡＮＣＤ２遺伝子の全てまたは一部を増幅して増幅された配列を製造し、増幅された配列をシーケンシングすること、（ｅ）特異的ＦＡＮＣＤ２変異アレルのためのプライマーを用いて組織サンプルからのＦＡＮＣＤ２遺伝子の全てまたは一部を増幅すること、（ｆ）組織サンプルからのＦＡＮＣＤ２遺伝子の全てまたは一部を分子クローニングして、クローン化された配列を製造し、クローン化された配列をシーケンシングすること、（ｇ）（ｉ）組織サンプルから単離されたＦＡＮＣＤ２遺伝子またはＦＡＮＣＤ２  ｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）ヒト野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列に相補的な核酸プローブ間の誤対合を同定することであって、ここで（ｉ）及び（ｉｉ）は互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する、（ｈ）組織サンプル中のＦＡＮＣＤ２遺伝子配列の増幅及び野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を含んでなる核酸プローブに増幅された配列をハイブリダイズすること、（Ｉ）組織サンプル中のＦＡＮＣＤ２遺伝子ハイブリダイズの増幅及び変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を含んでなる核酸プローブに増幅された配列をハイブリダイズすること、（ｊ）組織サンプル中の欠失変異を検出するためにスクリーニングすること、（ｋ）組織サンプル中の点変異
を検出するためにスクリーニングすること、（ｌ）組織サンプル中の挿入変異を検出するためにスクリーニングすること、並びに（ｍ）組織サンプルのＦＡＮＣＤ２遺伝子の、ＦＡＮＣＤ２遺伝子を含んでなる核酸プローブとのインサイチュウ・ハイブリダイゼーションなどがある。
【００７６】
点変異に関して遺伝子またはゲノムの比較的短い領域をスキャンするのがしばしば望ましい：配列の全ての可能性のある部位を試験するのに必要な多くのオリゴヌクレオチドを効率的な組換え方法により作製できる（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：１３６８−１３７３（１９９４））。アレイをリガーゼまたはポリメラーゼと組み合わせて使用して標的配列の全ての部位を探すことができる（米国特許第６３０７０３９号）。ハイブリダイゼーションによる変異の分析を例えばゲル、アレイまたはドットブロットの手段により実施できる。
【００７７】
全遺伝子をシーケンシングして変異を同定することができる（米国特許第６０３３８５７号）。標的配列に結合したときに固体相支持体上の補体に結合するようになる最低交差ハイブリダイジングセットからのオリゴヌクレオチドタグを用いてＦＡＮＣＤ２遺伝子座のシーケンシングを達成できる（米国特許第６２８０９３５号）。
【００７８】
ＦＡＮＣＤ２遺伝子の変異を検出する別の研究法には米国特許第６２９７０１０号、米国特許第６２８７７７２号及び米国特許第６３０００７６号に記載されているものなどがある。核酸マイクロチップ技術またはチップのラボラトリーを使用する複数のサンプルの分析をアッセイに用いることができることもさらに企図されている。
【００７９】
ＦＡＮＣＤ２遺伝子変異またはＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の欠損を検出するための核酸診断試験または抗体基盤の試験を用いて腫瘍が進行している対象をスクリーニングすることができる。かかるスクリーニングに基づいてサンプルを、黒色腫、白血病、アストチトーム、神経膠芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病並びに膵臓、乳房、卵巣、子宮、精巣、脳下垂体、腎臓、胃、食道及び直腸の癌などの広範な癌を有する対象から入手することができる。患者の処置利益を最大にするための適当な処置プロトコル選択するための臨床医の能力が改善されている。とりわけ、遺伝的損傷またはＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の欠損を種々の既存の化学療法剤及び放射線治療に対する応答性と相関させることができる。
【００８０】
細胞アッセイ（実施例１１から１２）において、及びノックアウトマウスモデル（実施例１０）においてＦＡＮＣＤ２−Ｌを上昇させるＦＡＮＣＤ２−Ｓのモノユビキチン化を変調する分子に関してスクリーニングすることにより新規治療的処置を開発できる。かかる分子には直接ＦＡＮＣＤ２に、またはＢＲＡＣＡ−１と相互作用すると思われる分子例えばＢＲＡＣＡ−２に結合して、今度はＦＡＮＣＤ２を活性化すると思われる分子などでよい。
【００８１】
ＦＡＮＣＤ２遺伝子またはタンパク質の欠損に依存するスクリーニングアッセイに加えて、ＦＡＮＣＤ２−Ｌの形成に必要であるユビキチン化反応の失敗が観察されるが、それはＦＡＮＣＤ２−Ｓそのものを含むＦＡＮＣＤ２の翻訳後修飾に先行する、いずれかの点でのＦＡ経路における欠失の結果であろう。反応の終末工程を知ることにより、分子が破壊された経路を修復することが見出されるまで、小型分子が「ＦＡ経路破壊」含有する細胞において、またはインビトロでスクリーニングされるスクリーニングアッセイを構築することが可能になる。次いでこの分子をプローブとして利用して欠損の特性を同定することができる。これをさらに治療用物質として用いて欠損を修復することができる。例えば、我々は、細胞周期停止及びＦＡ細胞の増殖低下がタンパク質のサイクリンファミリーのメンバーであるＳＰＨＡＲタンパク質の過剰発現により部分的に修正され得ることを示した。これは治療用小型分子を同定するためのスクリーニングとして適当であるアッセイの基礎を成すことができる。
【００８２】
翻訳後修飾されたＦＡＮＣＤ２で欠損している細胞はとりわけＤＮＡ損傷に対して感受性が高い。化合物（毒性分子を含む）がＤＮＡを損傷する能力を有しているかどうかを決定するための感受性スクリーニングとしてこれらの細胞を提供できる。逆にいえば、これらの細胞はまた、化合物がＤＮＡ損傷に対して細胞を保護できるかどうかを決定するための感受性スクリーニングとして提供される。
【００８３】
ＦＡ患者及びＤＮＡ修復損傷に関連する症候群を患う患者は骨髄損傷の合併症から死亡する。遺伝子移入は欠損を修正するための治療オプションである。複数の欠損がＦＡ経路の至る所で生じ得る。我々は、終末工程が細胞及び生物の適切な機能化に非常に重要であることを示した。本発明の実施形態では、ＦＡＮＣＤ２−ＳのＦＡＮＣＤ２−Ｌへの変換がうまく達成されるようにこの変換を標的化する遺伝子治療または治療薬により、ＦＡ経路のどこかの欠損の修正が満足できるように達成され得る。
【００８４】
一般に許容される方法に従って、例えばＦｒｉｅｄｍａｎにより「Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ」Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ編、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス、１０５−１２１頁（１９９１）に記載されるように、遺伝子治療を実施できる。エクソビボまたはインビトロ遺伝子治療に関して標的化された組織には骨髄例えば貧血を発症する前の造血幹細胞及び発達異常に関与する胎児組織などがある。遺伝子治療は、変異ＦＡＮＣＤ２アレルを担持する細胞に野生型ＦＡＮＣＤ２−Ｌ機能を提供できる。かかる機能を提供することにより、受体細胞の腫瘍成長が抑制されるか、またはファンコーニ貧血の症状が改善されるはずである。
【００８５】
野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子または遺伝子の一部を、遺伝子が染色体外因子のままであるようにベクターの細胞に導入できる。かかる状況では、遺伝子は染色体外位置から細胞により発現され得る。遺伝子部分が変異ＦＡＮＣＤ２アレルを担持する細胞に導入及び発現される場合、遺伝子部分は細胞の非腫瘍性成長に必要なＦＡＮＣＤ２タンパク質の一部をコードできる。また別に、野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子またはその一部を、それが細胞に存在する内因性変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子と組換わるように変異細胞に導入することができる。
【００８６】
ウイルスベクターは遺伝子治療を達成するためのベクターの１つのクラスである。ウイルス媒介遺伝子治療を、リポソーム分配を用いるインビボ直接遺伝子移入と組み合わせることができ、これによりウイルスベクターを腫瘍細胞に指向させ、周辺の非分裂細胞には指向させないようにすることができる。また別に、ウイルスベクター産生細胞系を腫瘍に注入することができる（Ｃｕｌｖｅｒら、１９９２）。産生細胞の注入により、次いでベクター粒子の連続的な供給源が提供される。この技術は手術不能な脳腫瘍を有するヒトへの使用が認められている。
【００８７】
ベクターを患者に、腫瘍の部位に局所的または全身的のいずれかで（別の部位に転移したいずれの腫瘍細胞にも到達するように）注入できる。移入された遺伝子は標的化された腫瘍細胞の各々のゲノムに永続的に組み込まれない場合、処置を定期的に繰り返さなければならない。
【００８８】
組換え及び染色体外保持の双方のための遺伝子の導入用ベクターは技術分野で公知であり（例えば米国特許第５２５２４７９号及びＰＣＴ９３／０７２８２及び米国特許第６３０３３７９号）、ＦＡＮＣＤ２−Ｌを含有するウイルスベクター例えばレトロウイルス、ヘルペスウイルス（米国特許第６２８７５５７号）またはアデノウイルス（米国特許第６２８１０１０号）またはプラスミドベクターなどを含む。
【００８９】
治療用遺伝子配列を担持するベクターまたは遺伝子もしくは遺伝子の断片をコードするＤＮＡを患者に、腫瘍の部位に局所的または全身的のいずれかで注入して、転移した腫瘍細胞に到達するようにできる。ベクターをさらに操作することなく標的化を達成できるか、またはベクターを腫瘍に結合特異性を有する分子と結合させることができ、ここでかかる分子はレセプターアゴニストまたはアンタゴニストでよく、さらにペプチド、脂質（リポソームを含む）または糖類（オリゴ多糖類または多糖類を含む）及び合成標的化分子を含んでよい。ＤＮＡはポリリジンを介して結合リガンドに抱合され得る。トランスフェクトされた遺伝子が永続的に標的化腫瘍細胞の各々のゲノムに組み込まれない場合、処置を定期的に繰り返さなければならない。
【００９０】
患者に導入する前にＤＮＡを細胞に導入する方法は、技術分野で報告されているような技術（米国特許第６０３３８５７号）、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿及びウイルス形質導入を用いて達成でき、方法の選択は通常の経験者の能力範囲内である。
【００９１】
野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子または変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子で形質転換された細胞をモデル系として用いて欠損ＤＮＡ修復の結果である疾患の緩解及びかかる緩解を促進する薬物処置を研究することができる。
【００９２】
前記に一般的に論じたように、ＦＡＮＣＤ２遺伝子またはそのフラグメントを、適当な場合遺伝子治療方法に用いて、異常細胞においてかかる遺伝子の発現産物の量を増加させることができる。かかる遺伝子治療はとりわけ前癌細胞での使用に適しており、ここで正常細胞と比較してＦＡＮＣＤ２−Ｌポリペプチドのレベルを不在または低減させ、ＦＡＮＣＤ２−Ｌのレベル増加は欠損ＤＮＡ修復から生じる欠損の蓄積を減速させ、従って癌状態の開始を遅延させる。変異遺伝子が「正常」レベルで発現されるが、ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームのレベルが低下しているこれらの細胞でさえ、ＦＡＮＣＤ２遺伝子の発現レベルを増加させることはまた有用である。正常なＤＮＡ修復におけるＦＡＮＣＤ２−Ｌの非常に重要な役割により、ＦＡＮＣＤ２−Ｌのレベル低下を引きおこす欠損を修正する治療薬を開発する機会が提供される。新規治療薬を開発するための１つの研究法は合理的な薬物設計によるものである。合理的な薬物設計により、さらに活性なもしくは安定なポリペプチドの形態に変えるために、またはインビボでポリペプチドの機能を増強もしくは干渉する小型分子を設計するために、目的の生物学的に活性なポリペプチドの、またはこれらが相互作用する小型分子（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、インヒビターまたはエンハンサー）の構造類似体が提供され得る。Ｈｏｄｇｓｏｎ、１９９１。合理的な薬物設計によりＦＡＮＣＤ２−Ｌ活性もしくは安定性が改善されているか、またはＦＡＮＣＤ２−Ｌ活性のエンハンサー、インヒビター、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する小型分子を提供され得る。クローン化されたＦＡＮＣＤ２配列の利用率のために、十分量のＦＡＮＣＤ２−Ｌポリペプチドを、Ｘ線結晶学としてかかる分析実験を実施するために利用可能にできる。加えて、本明細書で提供するＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の配列に関する知識は、Ｘ線結晶学の代わりに、またはそれに加えてこれらをコンピューターモデリング技術に使用する手引きとなる。
【００９３】
ＦＡＮＣＤ２−Ｌ活性を有するペプチドまたはその他の分子を治療用処方でタンパク質が欠乏している細胞に供給できる。ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の配列はいくつかの生物（ヒト、ハエ及び植物）に関して開示されている（配列番号：１から３）。細菌におけるｃＤＮＡ配列の発現により、例えばさらなる翻訳後修飾を有する公知の発現ベクターを用いてＦＡＮＣＤ２を製造することができる。或いは、ＦＡＮＣＤ２−ＬポリペプチドをＦＡＮＣＤ２−Ｌ産生哺乳動物細胞から抽出することができる。加えて、合成化学の技術を用いてＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質を合成することができる。ＦＡＮＣＤ２−Ｌ活性を有する別の分子（例えばペプチド、薬物または有機化合物）を治療薬として用いることもできる。実質的に類似する機能を有する修飾されたポリペプチドはペプチド治療にも用いられる。
【００９４】
同様に、変異ＦＡＮＣＤ２アレルを担持するかまたは不十分なレベルのＦＡＮＣＤ２−Ｌを作製する細胞及び動物をモデル系として用いて、治療薬としての可能性を有する物質に関して研究及び試験することができる。体細胞または生殖細胞系のいずれかでよい細胞をＦＡＮＣＤ２−Ｌのレベルが低下した個体から単離することができる。また別に、前記したようにＦＡＮＣＤ２−Ｌのレベルが低下するように細胞系を操作することができる。被験物質を細胞に適用した後、細胞のＤＮＡ修復欠陥形質転換表現型を決定する。
【００９５】
新規候補治療用分子の有効性を有効性及び毒性欠如に関する動物実験において試験できる。標準的な技術を用いて、動物全体の変異誘発の後か、または生殖細胞または接合子の遺伝子操作の後に動物を選択して、トランスジェニック動物を形成できる。かかる処置には、通常第２の動物種からの変異ＦＡＮＣＤ２アレルの挿入、及び破壊された相同性遺伝子の挿入などがある。また別に、慣用される技術を用いて、動物の内因性ＦＡＮＣＤ２遺伝子を挿入もしくは欠失変異または別の遺伝子変化により破壊することができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２（１９８９）；Ｖａｌａｎｃｉｕｓ及びＳｍｉｔｈｉｅｓ、（１９９１））。被験物質を動物に投与した後、腫瘍の成長を評価しなければならない。被験物質が欠損ＤＮＡ修復から生じる病理を防御または抑制する場合、次いで被験物質は本明細書で同定された疾患の処置のための治療薬の候補となる。
【００９６】
本発明を以下の実施例を参照して記載するが、これは説明のために提示されるものであり、本発明をいかなるようにも限定することを意図するものではない。技術分野で公知の標準的な技術または以下に特記する技術を利用した。
【００９７】
本明細書で引用した全ての参照文献は引用により本明細書に包含される。
【００９８】
（実施例）
実施例１：実施例２から８で用いられる実験プロトコル
細胞系及び培養条件
エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球を、１５％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ培地中で維持し、３７℃で５％ＣＯ２含有加湿大気下で成長させた。対照リンパ芽球系（ＰＤ７）及びＦＡリンパ芽球系（ＦＡ−Ａ（ＨＳＣ７２）、ＦＡ−Ｃ（ＰＤ−４）、ＦＡ−Ｄ（ＰＤ−２０）、ＦＡ−Ｆ（ＥＵＦＡ１２１）、及びＦＡ−Ｇ（ＥＵＦＡ３１６））が以前に報告されている（ｄｅ  Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：２８１−２８３（１９９８））（Ｗｈｉｔｎｅｙら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：３４１−３４３（１９９５））（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９１：６７１２−６７１６（１９９４））（ｄｅ  Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７：１３０６−１３０８（２０００））。ＰＤ８１はＦＡ−Ａ患者からのリンパ芽球細胞系である。ＳＶ４０形質転換ＦＡ繊維芽細胞であるＧＭ６９１４、ＰＤ４２６、ＦＡＧ３２６３ＳＶ及びＰＤ２０Ｆ、並びにＨｅＬａ細胞を１５％ＨＣＳを補充したＤＭＥＭ中で成長させた。ＦＡ細胞（リンパ芽細胞及び繊維芽細胞の双方）は対応するＦＡＮＳ  ｃＤＮＡを含有するｐＭＭＰレトロウイルスベクターで機能的に補足され、機能的な補足はＭＭＣアッセイにより確認された（Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｒｅａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ。１９：４８６６−４８７３（１９９９））（Ｋｕａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９６：１６２５−１６３２（２０００））。
【００９９】
細胞周期同調化
ＨｅＬａ細胞、ＧＭ６９１４細胞及びｐＭＭＰ−ＦＡＮＣＡレトロウイルスで修正されたＧＭ６９１４を前記した二重チミジン遮断法にわずかに修正を加えた方法（Ｋｕｐｆｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：１０４７−１０５４（１９９７））より同調化した。簡単には、細胞を２ｍＭ  チミジンで１８時間、チミジン不含培地で１０時間、及びさらに２ｍＭ  チミジンで１８時間処置して、Ｇ１／Ｓ境界で細胞周期を停止させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ついでＤＭＥＭ＋１５％ＦＣＳ中に放出させて、種々の時間間隔で分析した。
【０１００】
また別に、ＨｅＬａ細胞を０．５ｍＭ  ミモシン（シグマ）で２４時間処置して、Ｇ１期に同調させ（Ｋｒｕｄｅ、１９９９）、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ＋１５％ＦＣＳ中に放出させた。Ｍ期での同調化に関しては、ノコダゾール遮断を用いた（Ｒｕｆｆｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：４８４３−４８５４（１９９９））。細胞を０．１μｇ／ｍｌ  ノコダゾール（シグマ）で１５時間処置し、非付着性細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ＋１５％中に再プレートした。
【０１０１】
細胞周期分析
トリプシン処置した細胞をＰＢＳ  ０．５ｍｌに再懸濁し、氷冷エタノール５ｍｌを加えて固定した。次に細胞を１％ウシ血清アルブミン分画Ｖを含むＰＢＳ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）（シグマ）で２回洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ  ０．２４ｍｌに再懸濁した。３８ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中５００μｇ／ｍｌ  ヨウ化プロピジウム（シグマ）３０μｌ及び１０ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼ不含ＲＮアーゼＡ（シグマ）３０μｌを加えた後、サンプルを３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ含量をＦＡＣスキャン（ベックトン・ディッキンソン）により測定し、データをセル・クエスト及びモディフィットＬＴプログラム（ベックトン・ディッキンソン）により分析した。
【０１０２】
抗ＦＡＮＣＤ２抗血清の作製
抗原供給源としてＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ末端）融合タンパク質を用いてＦＡＮＣＤ２に対するウサギポリクローナル抗血清を作製した。プアリマー（配列番号：９５）ＤＦ４ＥｃｏＲＩ（５’ＡＧＣＣＴＣｇａａｔｔｃＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡ−３’）及び（配列番号：９６）ＤＲ８１６Ｘｈ（５’−ＧＧＴＡＴＣｃｔｃｇａｇＴＣＡＡＧＡＣＧＡＣＡＡＣＴＴＡＴＣＣＡＴＣＡ−３’）を用いて、ＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡ全長からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により５’フラグメントを増幅した。得られた８４１ｂｐのＰＣＲ産物はＦＡＮＣＤ２ポリペプチドのアミノ末端２７２アミノ酸をコードし、これをＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化し、プラスミドＧＥＸ４Ｔ−１（ファルマシア）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。予想された大きさ（５４ｋＤ）のＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ末端）融合タンパク質が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５γ株で発現され、グルタチオン−Ｓ−セファロースで精製し、ニュージーランド白ウサギを免疫するのに使用した。ＧＳＴタンパク質を負荷したアミノリンク・プラス・カラム（ピヤース）で継代することにより、及びＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ末端）融合タンパク質を負荷したアミノリンク・プラス・カラムで継代することにより、ＦＡＮＣＤ２特異的免疫抗血清をアフィニティー精製した。
【０１０３】
抗ＦＡＮＣＤ２モノクローナル抗体の作製
２つの抗ＦＡＮＣＤ２モノクローナル抗体を以下のように作製した。Ｂａｌｂ／ｃマウスをＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ末端）融合タンパク質で免疫し、これはＦＡＮＣＤ２に対するウサギポリクローナル抗血清（Ｅ３５）の作製に用いたのと同一の融合タンパク質である。融合精母細胞を収穫する前に動物を４に置換免疫原で追加免疫し、骨髄腫細胞でハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリドーマ上澄を収集し、最初のスクリーニングとして標準的なＥＬＩＳＡアッセイを、第２のスクリーニングとしてＦＡＮＣＤ２のイムノブロット分析を用いて検定した。２つの抗ヒトＦＡＮＣＤ２モノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）（ＦＩ１７及びＦＩ１４）をさらなる研究のために選択した。２つの陽性細胞系からのハイビリドーマ上澄を遠心により清澄化した。上澄をＭｏＡｂｓとしてウェスタンブロットに使用した。ＩｇＧに関するアフィニティカラムを用いてＭｏＡｂｓを精製した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中ＭｏＡｂｓを０．５ｍｇ／ｍｌストックとして保存した。抗ＨＡ抗体（ＨＡ．１１）はバブコのものである。
【０１０４】
イムノブロッティング
細胞を１Ｘサンプルバッファー（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ６．８、８６ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で溶解し、５分間沸騰させ、７．５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動に供した。電気泳動の後、２５ｍＭ  トリス塩基、２００ｍＭ  グリシン、２０％メタノールで充填した浸漬移動装置（バイオラッド）を用いてタンパク質をニトロセルロースに移した。ＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％トゥイーン２０）中５％脱脂粉乳で遮断した後、膜をＴＢＳ−Ｔで希釈した１次抗体（アフィニティー精製した抗ＦＡＮＣＤ２ポリクローナル抗体（Ｅ３５）または抗ＨＡ（ＨＡ．１１）には１：１０００希釈、抗ＦＡＮＣＤ２マウスモノクローナル抗体（ＦＩ１７）には１：２００希釈）と共にインキュベートし、何度も洗浄し、適当なセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合２次抗体（アマシャム）と共にインキュベートした。検出に化学ルミネセンスを用いた。
【０１０５】
ＤＮＡ損傷の作製
ガンマセル４０装置を用いてガンマ線を照射した。穏やかに培養培地を吸引した後、ストラタリンカー（ストラタジーン）を用いてＵＶ暴露を達成した。マイトマイシンＣ処置用に細胞を継続的に指示された時間薬物に暴露した。ヒドロキシウレア（シグマ）を最終濃度１ｍＭまで２４時間添加した。
【０１０６】
モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２の検出
製造者のプロトコルに従って、ＨｅＬａ細胞（またはＦＡ−Ｇ繊維芽細胞、ＦＡＧ３２６ＳＶ）をＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ）を用いてトランスフェクトした。ＨｅＬａ細胞を１５ｃｍ組織培養皿にプレートし、皿あたり１５μｇのＨＡタグ化ユビキチン発現ベクター（ｐＭＴ１２３）（Ｔｒｅｉｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７８：７８７−７９８（１９９４））でトランスフェクトした。トランスフェクション後１２時間、指示された濃度のＭＭＣ（０、１０、４０、１６０ｎｇ／ｍｌ）または指示された用量のＩＲ（０、５、１０、２０Ｇｙ）で細胞を処置した。
ＭＭＣと共に１２時間のインキュベート、またはＩＲ処置後２時間の後、プロテアーゼインヒビター（１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン及びペプスタチン、２１μｇ／ｍｌ  アプロチニン、１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル）及びホスファターゼインヒビター（１ｍＭ  オルソバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭ  フッ化ナトリウム）を補充した溶解バッファー（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１（容量／容量）％トリトンＸ−１００）中で全細胞抽出物を調製した。各々の免疫沈降（ＩＰ）を４ｍｇのタンパク質を含有するように標準化したこと以外は本質的には記載されたように（Ｋｕｐｆｅｒら、１９９７）、ＦＡＮＣＤ２（Ｅ３５）に対するモノクローナル抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を実施した。陰性対照として同一のウサギからの免疫前血清をＩＰ反応において使用した。抗ＨＡ（ＨＡ．１１）または抗ＦＡＮＣＤ２（ＦＩ１７）モノクローナル抗体を用いてイムノブロッティングを行った。
【０１０７】
ユビキチンアルデヒド処置
ＨｅＬａ細胞を１ｍＭ  ヒドロキシウレアで２４時間処置し、プロテアーゼインヒビター及びホスファターゼインヒビターを補充した溶解バッファー中で全細胞抽出物を調製した。ＤＭＳＯ中１５μＭ  ユビキチンアルデヒド（ボストン・バイオケム）６．７μｌを伴うかまたはＤＭＳＯ６．７μｌを伴う反応物６７μｌ中細胞ライゼート２００μｇを指示された期間３０℃または３７℃でインキュベートした。２Ｘサンプルバッファー６７μｌを各サンプルに加え、サンプルを５分間沸騰させ、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＦＩ１７モノクローナル抗ヒトＦＡＮＣＤ２抗体を用いてＦＡＮＣＤ２に関してイムノブロッティングした。
【０１０８】
免疫蛍光顕微鏡法
ＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、続いてＰＢＳ中０．３％トリトンＸ−１００で透過処理した（１０分間）。１０％ヤギ血清で遮断した後、ＰＢＳ中０．１％ＮＰ−４０（遮断バッファー）、特異的抗体を遮断バッファー中適当な希釈率で加え、室温で２から４時間インキュベートした。アフィニティー精製されたＥ３５ポリクローナル抗体（１／１００）を用いてＦＡＮＣＤ２を検出した。ＢＲＣＡ１検出に関しては、我々は市販のモノクローナル抗体（Ｄ−９、サンタ・クルーズ）を２μｇ／ｍｌで用いた。続いて細胞をＰＢＳ＋０．１％ＮＰ−４０で３回洗浄し（各洗浄１０から１５分）、種特異的蛍光またはテキサス・レッド抱合２次抗体（ジャクソン・イムノリサーチ）を遮断バッファー（抗マウス  １／２００、抗ウサギ  １／１０００）で希釈し、添加した。室温で１時間の後、１０から１５分の洗浄をさらに３回適用し、ベクタシールド（ベクター・ラボラトリーズ）中でスライドをマウントした。画像をニコン顕微鏡で捕らえ、アドビ・フォトショップ・ソフトウェアを用いて処理した。
【０１０９】
減数分裂染色体染色
１６から２８日齢の雄マウスからのパキテン期及びディプロテン期精母細胞の表面塗抹を記載されるように（Ｐｅｔｅｒｓら、１９９７）調製した。マウスＳＣＰ３タンパク質に対するポリクローナルヤギ抗体を用いて、減数分裂調製物の軸エレメント及び対合複合体を可視化した。マウスＢＲＣＡ１に対するＭ１１８マウスモノクローナル抗体を標準的な技術により、マウスをネズミＢＲＣＡ１タンパク質で免疫することにより作製した。アフィニティー精製Ｅ３５ウサギポリクローナル抗体を１：２００希釈で用いてＦＡＣＤを検出した。抗体インキュベーション及び検出方法は（Ｋｅｅｇａｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：２４２３−２４３７（１９９６））に記載されるように、（Ｍｏｎｅｎｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：９３−１０３（１９８７））のプロトコルを修飾したものであった。ロバ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ抱合、ロバ抗ウサギＩｇＧＴＲＩＴＣ抱合、及びロバ抗ヤギＩｇＧ−Ｃｙ５抱合２次抗体を検出に使用した（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ）。全ての調製物を４’，６’ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、シグマ）で対比染色し、ＤＡＢＣＯ（シグマ）退色防止溶液にマウントした。調製物をニコンＥ１０００顕微鏡（６０Ｘ  ＣＦＩ  プラン・アポクロマット及び１００Ｘ  ＣＦＩプラン・フルオロオイル・イマージョン・オブジェクティブズ）で試験した。各々の蛍光色素（ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ｃｙ５及びＤＡＰＩ）画像を冷却ＣＣＤカメラ（プリンストン・インスツルメンツ・マイクロマックス）を調節するＩＰラブソフトウェア（スキャナリティック）による８００×１０００ピクセル１２ビットソースイメージとして別個に捕らえ、アドビ・フォトショップを用いて別個の１２ビット・グレー・スケール・イメージを再度サンプリングし、２４ビット擬似着色し、マージした。
【０１１０】
実施例２：共通の細胞経路におけるＦＡ遺伝子相互作用
正常なリンパ芽球はＦＡＮＣＤ２の２つのアイソフォームである短形態（ＦＡＮＣＤ２−Ｓ、１５５ｋＤ）及び長形態（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ、１６２ｋＤ）を発現する。図１は全細胞抽出物をリンパ芽球系から調製し、細胞性タンパク質を抗ＦＡＮＣＤ２抗血清で免疫沈降した場合に何が生じるかを示している。正常な野生型細胞はＦＡＮＣＤ２の２つのアイソフォームである低分子量アイソフォーム、ＦＡＮＣＤ２−Ｓ（１５５ｋＤ）及び高分子量アイソフォーム、ＦＡＮＣＤ２−Ｌ（１６２ｋＤ）を発現する。ＦＡＮＣＤ２−Ｓはクローン化されたＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡの１次翻訳産物である。我々は次にＦＡＮＣＤ２アイソフォームの発現に関して大きな一連のＦＡリンパ芽球及び繊維芽細胞を評価した（表５）。ＦＡ細胞系の対応するＦＡ  ｃＤＮＡでの修正により機能的補正及び高分子量アイソフォーム、ＦＡＮＣＤ２−Ｌの回復に至った。
【０１１１】
以前に報告されているように、ＦＡ細胞はＤＮＡ架橋試薬であるＭＭＣに、及びある場合には電離放射線（ＩＲ）に感受性を有する。興味深いことに、複数の相補群（Ａ、Ｃ、Ｇ及びＦ）からのＦＡ細胞はＦＡＮＣＤ２−Ｓアイソフォームのみを発現した（図１Ａ、レーン３、７、９、１１）。相補群Ｂ及びＥからのＦＡ細胞もまたＦＡＮＣＤ２−Ｓのみを発現する。対応するＦＡＮＣ  ｃＤＮＡを有するＦＡ細胞のＭＭＣ及びＩＲ感受性の機能的修正によりＦＡタンパク質複合体を回復させ、高分子量アイソフォーム（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ）を回復させた（図１Ａ、レーン４、８、１０、１２）。これらを考慮に入れて、これらの結果からＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＦ及びＦＡＮＣＧを含むＦＡタンパク質複合体は直接的または間接的にＦＡＮＣＤ２の２つのアイソフォームの発現を制御することが示された。従って、６個のクローン化ＦＡ遺伝子は共通の経路で相互作用するようである。
【０１１２】
実施例３：ＦＡタンパク質複合体はＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化に必要である。
【０１１３】
ＦＡＮＣＤ２の高分子量アイソフォームはＦＡＮＣＤ２ｍＲＮＡの代替スプライシングまたはＦＡＮＣＤ２タンパク質の（複数の）翻訳後修飾などの１つまたはそれ以上のメカニズムの結果である。リン酸塩での処置はＦＡＮＣＤ２−ＬをＦＡＮＣＤ２−Ｓに変換せず、これはリン酸化単独では観察された分子量の差に寄与しないことを示している。
【０１１４】
別の可能なＦＡＮＣＤ２の翻訳後修飾を同定するために、我々は最初にＦＡＮＣＤ２−ＳのＦＡＮＣＤ２−Ｌへの変換を制御する細胞条件を捜した（図１Ｂ、Ｃ）。ＦＡ細胞はＭＭＣ及びＩＲに感受性を有するので、これらの物質が正常な脂肪においてＦＡＮＣＤ２−ＳのＦＡＮＣＤ２−Ｌへの変換を制御するのではと推論した。興味深いことに、ＭＭＣ（図１Ｂ、レーン１から６）またはＩＲ（図１Ｃ、レーン１から６）で処置したＨｅＬａ細胞はＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの発現の濃度依存的増加を示した。
【０１１５】
ＦＡＮＣＤ２−ＬがＦＡＮＣＤ２−Ｓのユビキチン化アイソフォームであるかどうかを決定するために、ＨＡ−ユビキチンをコードするｃＤＮＡでＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした（Ｔｒｅｉｅｒら、１９９４）。ＭＭＣ（図１Ｂ、レーン７から１０）またはＩＲ（図１Ｃ、レーン７から１０）への細胞暴露によりＦＡＮＣＤ２のＨＡ−ユビキチン抱合体が用量依存的に増加した。ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームのみが抗ＨＡ抗体と免疫反応し、ＦＡＮＣＤ２−Ｓアイソフォームは反応しなかった。ＦＡＮＣＤ２はＦＡ細胞においてユビキチン化されなかったが、ＦＡＮＣＤ２ユビキチン化はこれらの細胞の機能的補足で回復した。
ＦＡＮＣＤ２−Ｓ及びＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームは７ｋＤだけ異なり、ＦＡＮＣＤ２−Ｌは恐らくアミド結合によりＦＡＮＣＤ２の内部リジン残基に共有結合した単一のユビキチン部分を含有する。
【０１１６】
モノユビキチン化を確認するために、我々はＨｅＬａ細胞からＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質を単離し、質量分析によりそのトリプシンフラグメントを分析した（Ｗｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１１ａ）。明らかにユビキチントリプシンフラグメントが同定され、モノユビキチン化部位（ＦＡＮＣＤ２のＫ５６１）もまた同定された。興味深いことに、このリジン残基はヒト、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、及び線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）からのＦＡＮＣＤ２配列間で保存されており、これはこの部位のユビキチン化が複数の生物におけるＦＡ経路に非常に重要であることを示唆している。このリジン残基であるＦＡＮＣＤ２（Ｋ５６１）の変異によりＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化の喪失に至る。
【０１１７】
実施例４：ＦＡＮＣＤ２を含有する核フォーカスの形成は無傷のＦＡ経路に必要である。
【０１１８】
我々は修正されていない、ＭＭＣ感受性ＦＡ繊維芽細胞及び機能的に補足された繊維芽細胞におけるＦＡＮＣＤ２タンパク質の免疫蛍光パターンを試験した（図２）。
【０１１９】
修正されたＦＡ細胞はＦＡＮＣＤ２−Ｓ及びＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの双方を発現した（図２Ａ、レーン２、４、６、８）。内因性ＦＡＮＣＤ２タンパク質はヒト細胞の核でもっぱら観察され、細胞質染色が明らかであるものはなかった（図２Ｂ、ａからｈ）。ＰＤ−２０（ＦＡ−Ｄ）細胞では核免疫蛍光が低下し（図２Ｂ、ｄ）、これはイムノブロットによるこれらの細胞におけるＦＡＮＣＤ２タンパク質の発現の低下に合致する（図２Ａ、レーン７）。染色体移動によりＦＡＮＣＤ２遺伝子で機能的に修正されたＰＤ−２０細胞では、ＦＡＮＣＤ２タンパク質が２つの核パターンで染色された。最も修正された細胞は染色の拡散核パターンを有し、細胞の小分画は核フォーカスが染色された（パネルｈのドットを参照）。双方の核パターンは３つの別個に誘導された抗ＦＡＮＣＤ２抗血清で観察された（１ポリクローナル、２モノクローナル抗血清）。サブタイプＡ。Ｇ及びＣからのＦＡ繊維芽細胞はＦＡＮＣＤ２核免疫蛍光の拡散パターンのみを示した。これらの細胞のＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＧまたはＦＡＮＣＣ  ｃＤＮＡ各々での機能的補足によりこれらの細胞のＭＭＣ抵抗性が回復し（表６）、いくつかの細胞では核フォーカスが回復した。従って、高分子量ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの存在ＦＡＮＣＤ２核フォーカスの存在と相関し、これはモノユビキチン化されたＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームのみが選択的にこれらのフォーカスに局在する。
【０１２０】
実施例５：ＦＡＮＣＤ２タンパク質は細胞周期のＳ期の間核フォーカスに局在する。
【０１２１】
非同調性機能補足細胞のフラクションのみがＦＡＮＣＤ２核フォーカスを含有したので、我々はこれらのフォーカスが細胞周期の異なる時期に集合するのかもしれないと推論した。この仮説を試験するために、同調化した細胞のＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの形成及びＦＡＮＣＤ２核フォーカスを試験した（図３）。ＨｅＬａ細胞をＧ１／Ｓ境界で同調化し、Ｓ期に放出し、ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの形成に関して分析した(図３Ａ)。ＦＡＮＣＤ２−ＬアイソフォームはＧ１後期及びＳ期の間中に特異的に発現された。同調化し、補足されていないＦＡ細胞（ＦＡ−Ａ繊維芽細胞、ＧＭ６９１４）は正常から増加レベルのＦＡＮＣＤ２−Ｓタンパク質を発現したが、細胞周期のいずれの時期にもＦＡＮＣＤ２−Ｌを発現し損ねた。ＦＡＮＣＤ  ｃＤＮＡでの安定したトランスフェクションによるこれらのＦＡ−Ａ細胞の機能的補足はＦＡＮＣＤ２−ＬのＳ期特異的発現を回復させた。ＨｅＬａ細胞を別の方法、例えばノコダゾール停止（図３Ｂ）またはミモシン暴露（図３Ｂ）で同調化した場合、ＦＡＮＣＤ２−ＬアイソフォームのＳ期特異的発現が確認された。有糸分裂で停止した細胞はＦＡＮＣＤ２−Ｌを発現せず、これはＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームが細胞分割の前に除去または分解されることを示唆している（図３Ｂ、有糸分裂）。これらを考慮して、これらの結果はＦＡＮＣＤ２タンパク質のモノユビキチン化は細胞周期の間に高度に制御され、この修飾には無傷のＦＡ経路が必要であることが示唆される。
【０１２２】
ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの細胞周期依存的発現はＦＡＮＣＤ２核フォーカスの形成とも相関する（図３Ｃ）。ノコダゾール停止（有糸分裂）細胞はＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームを発現せず、ＦＡＮＣＤ２核フォーカスを呈しない（図３Ｃ、０時間）。これらの同調化細胞がＳ期を横切ることができる場合（１５から１８時間）、ＦＡＮＣＤ２核フォーカスの増加が観察された。
【０１２３】
実施例６：ＤＮＡ損傷に応答してＦＡＮＣＤ２タンパク質が核フォーカスに局在する。
【０１２４】
我々はＤＮＡ損傷に応答したＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォーム及びＦＡＮＣＤ２核フォーカスの蓄積を試験した（図４）。以前の研究で、ＦＡ細胞がＤＮＡ鎖間架橋（ＭＭＣ）または二本鎖切断（ＩＲ）を引き起こす作用物質に対して感受性があるが、紫外線（ＵＶ）及び単官能基アルキル化剤に対して比較的抵抗することが示されている。同調化されたＨｅＬａ細胞においてＭＭＣはＦＡＮＣＤ２−ＳのＦＡＮＣＤ２−Ｌへの変換を活性化した（図４Ａ）。ＦＡＮＣＤ２−Ｌへの最大変換はＭＭＣ暴露の２４時間後に生じ、これはＦＡＮＣＤ２核フォーカス形成が最大になる時期に相関した。ＦＡＮＣＤ２−Ｌでの増加に対応してＦＡＮＣＤ２核フォーカスが増加した。電離放射線もまたＨｅＬａ細胞におけるＦＡＮＣＤ２−Ｌの時期依存的及び用量依存的増加を活性化し、これはＦＡＮＣＤ２フォーカスの対応する増加を伴った（図４Ｂ）。驚くべきことに、紫外線（ＵＶ）は時期依存的及び用量依存的なＦＡＮＣＤ２−ＳのＦＡＮＣＤ２−Ｌの変換を活性化しこれはＦＡＮＣＤ２フォーカスの対応する増加を伴った（図４Ｃ）。
【０１２５】
我々はＦＡ細胞におけるＤＮＡ損傷の影響を試験した（図４Ｄ）。複数の相補群からのＦＡ細胞（Ａ、Ｃ及びＧ）はＭＭＣまたはＩＲ暴露に応答したＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームを活性化し損ない、ＦＡＮＣＤ２核フォーカスを活性化し損なった。これらのデータは、ＦＡ細胞の細胞感受性は少なくとも部分的にＦＡＮＣＤ２−Ｌ及びＦＡＮＣＤ２核フォーカスの活性化の失敗の結果であることを示唆している。
【０１２６】
実施例７：活性化されたＦＡＮＣＤ２及びＢＲＣＡ１タンパク質の同時局在化  
ＦＡＮＣＤ２と同様に、乳癌感受性タンパク質であるＢＲＣＡ１は細胞の増殖において上方制御され、Ｓ期にまたはＤＮＡ損傷に応答して翻訳後修飾により活性化される。ＢＲＣＡは高度な酸性ＨＭＧ様ドメインを含有するカルボキシ末端の２０個のアミノ酸を有し、これはクロマチン修復の可能なメカニズムを示唆している。ＢＲＣＡ１タンパク質はＩＲ誘導フォーカス（ＩＲＩＦ）でＤＮＡ修復に関与する別のタンパク質、例えばＲＡＤ５１またはＮＢＳ／Ｍｒｅ１１／ＲＡＤ５０複合体と同時局在化する。ＢＲＣＡ１のビアレリック変異を有する細胞はＤＮＡ修復で欠損を有し、ＤＮＡ損傷物質、例えばＩＲ及びＭＭＣに対して感受性を有する（表５）。これらを考慮に入れて、これらのデータはＦＡＮＣＤ２及びＢＲＣＡ１タンパク質間の可能な機能的相互作用を示唆している。ＢＲＣＡフォーカスはＤＮＡ修復（ＢＲＣＡ１）及びチェックポイント機能（ＮＢＳ）に関与するＡＴＭ及びＡＴＭ基質を含む大きな（２ｍＤａ）多タンパク質複合体である。
【０１２７】
活性化されたＦＡＮＣＤ２タンパク質がＢＲＣＡ１タンパク質と共に同時局在化するかどうかを決定するために、ＨｅＬａ細胞の二重免疫標識を実施した（図５）。電離放射線の不在下で、およそ３０から５０％の細胞がＢＲＣＡ１核フォーカスを含有した（図５Ａ）。対照的に、Ｓ期を横切るわずかの細胞のみがＦＡＮＣＤ２ドットを含有した（ｂ，ｅ）。これらの核フォーカスはまたＢＲＣＡ１及びＦＡＮＣＤ２の双方に対する抗血清と免疫反応性であった（ｃ、ｆ）。ＩＲ暴露の結果、核フォーカスを含有する細胞数及び細胞あたりのフォーカス数が増加した。これらの核フォーカスはＩＲ不在時に観察されたフォーカスよりも大きく、より蛍光性であった。またこれらのフォーカスはＢＲＣＡ１及びＦＡＮＣＤ２タンパク質の双方を含有した（ｉ、ｌ）。ＦＡＮＣＤ２−Ｌ及びＢＲＣＡ１の相互作用はさらにＩＲに暴露され、指数関数的に成長しているＨｅＬａ細胞からのタンパク質の同時免疫沈降（図５Ｂ）により確認された。
【０１２８】
我々はＦＡＮＣＤ２−Ｌ及び核フォーカスの形成に及ぼすＢＲＣＡ１発現の影響を試験した（図６）。ＢＲＣＡ１（−／−）細胞系であるＨＣＣ１９３７はカルボキシ末端トランケーションを有するＢＲＣＡ１タンパク質の変異体を発現する。これらの細胞は低レベルのＦＡＮＣＤ２−Ｌを発現したが（図６Ａ）、ＩＲはＦＡＮＣＤ２−Ｌレベル増加を活性化し損ねた。また、これらの細胞ではＩＲ誘導ＦＡＮＣＤ２フォーカス数が低下した（図６Ｂ、パネルｃ、ｄ）。ＢＲＣＡ１  ｃＤＮＡでの安定したトランスフェクションによるこれらのＢＲＣＡ１（−／−）細胞の修正によりＩＲ誘導ＦＡＮＣＤ２ユビキチン化及び核フォーカスが回復した（図６Ｂ、パネルｋ、ｌ）。これらのデータは野生型ＢＲＣＡ１タンパク質がＩＲ誘起ＦＡＮＣＤ２ドット形成の「オーガナイザー」として必要であることを示唆し、さらにタンパク質間の機能的相互作用を示唆する。
【０１２９】
実施例８：減数分裂染色体におけるＦＡＮＣＤ２及びＢＲＣＡ１の同時局在化  
有糸分裂におけるＦＡＮＣＤ２及びＢＲＣＡ１の会合により、これらのタンパク質が減数分裂前期にも同時局在するかもしれないことが示唆された。以前の研究により、ＢＲＣＡ１タンパク質が接合子及びパキテン期精母細胞におけるヒト対合複合体の非対合／軸エレメントに集中することが示された。減数分裂細胞におけるＦＡＮＣＤ２及びＢＲＣＡ１の可能な同時局在化を試験するために、我々はパキテン後期及びディプロテン初期のマウス精母細胞の表面塗抹をＦＡＮＣＤ２及びＢＲＣＡ１タンパク質の存在に関して試験した（図７）。我々はウサギポリクローナル抗ＦＡＮＣＤ２抗体Ｅ３５が、パキネマ後期（図７ａ）及びディプロネマ期（図７ｄ、７ｅ及び７ｇ）のＸ及びＹ染色体の非対軸を特異的に染色することを見出した。同一の実験条件下で、免疫前血清は対合複合体を染色しなかった（図７ｂ及び７ｃ）。Ｍ１１８抗ＢＲＣＡ１抗体はＭスヅパキテン期及びディプロテン期精母細胞の非対性染色体を染色した（図７ｆ及び７ｈ）。性染色体の対合していない軸のＦＡＮＣＤ２抗体染色が中断され、糸に通したビーズ様の外観を呈した（図７ｇ）。２０個のパキテン期の核の一貫した試験により、これらの抗ＦＡＮＣＤ２核フォーカスの多くが（〜６５％）強度な抗ＢＲＣＡ１染色の領域と共に同時局在することが示され、さらにこれらのタンパク質間の相互作用が支持された（図７ｇ、７ｈ及び７ｉ）。これらの結果により、クロマチンに結合するＦＡＮＣタンパク質（活性化ＦＡＮＣＤ２）の第１の実例が提供される。
【０１３０】
実施例９：ＦＡＮＣＤ２のＤＮＡ及びタンパク質配列を入手及び分析するための実験プロトコル
ノーザンハイブリダイゼーション。ヒト成人及び胎児の多組織ｍＲＮＡブロットをクロンテックから購入した（パロ・アルト、カリフォルニア州）。ブロットをＥＳＴクローンＳＧＣ３４６０３からの３２Ｐ標識ＤＮＡでプローブした。標準的なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用した。ブロットをアクチンｃＤＮＡプローブで再ハイブリダイズすることにより同等の負荷が確認された。
【０１３１】
変異分析。全細胞ＲＮＡを市販のキット（ギブコ／ＢＲＬ）を用いて逆転写した。ネステッドＰＣＲプロトコルを用いて得られた患者及び対照ｃＤＮＡからＦＡＮＣＤ２の５’末端部分を増幅した。第１ラウンドをプライマー（配列番号：９７）ＭＧ４７１  ５’−ＡＡＴＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＧＧＣＧ−３’及び（配列番号：９８）ＭＧ４５７  ５’−ＧＡＧＡＡＣＡＣＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＧＣ−３’を用いて実施した。このラウンドからのＰＣＲ産物を、プライマー（配列番号：９９）ＭＧ４９２  ５’−ＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＣＧＧＡＡＧＴＡＡＴＴＴＡＡＧ−３’及び（配列番号：１００）ＭＧ４７２  ５’−ＡＧＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＴＧ−３’を用いる次のラウンドのために１：５０に希釈した。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：９４℃で３分、並びに９４℃で４５秒、５０℃で４５秒、７２℃で３分及び最後に７２℃で５分の２５サイクル。プライマー（配列番号：１０１）ＭＧ４７４  ５’−ＴＧＧＣＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＧ−３’及び（配列番号：１０２）ＭＧ４７５  ５’−ＴＧＧＣＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＧ−３’を用いる以外は前記したように遺伝子の３’部分を増幅した。ＰＣＲの第２ラウンドを（配列番号：１０３）ＭＧ４９１  ５’−ＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＧ−３’及び（配列番号：１０４）ＮＧ４７６  ５’−ＧＴＧＣＣＡＧＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＧ−３’を用いて実施した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＴ−Ａｄｖベクター（クロンテック）にクローン化し、内部プライマーを用いてシーケンシングした。
【０１３２】
アレル特異的アッセイ：アレル特異的アッセイをＰＤ２０ファミリー及び２９０個の対照サンプル（＝５８０染色体）で実施した。ＰＤ２０ファミリーは混合北欧系の家系であり、ＶＵ００８はオランダの家系である。対照ＤＮＡサンプルはＣＥＰＨファミリー（ｎ＝９５）の関連性のない個体からのものであり、サンプルは外胚葉性異形成症（ｎ＝９５）またはファンコーニ貧血（ｎ＝９４）のいずれかを有する関連性のない北米の家系からのものであった。ＰＤ２０ファミリーの母性ｎｔ３７６ａ→ｇ変異は新規ＭｓｐＩ制限部位を作製した。ゲノムＤＮＡに関しては、アッセイはエクソン４に位置する（配列番号：１０５）ＭＧ７９２  ５’−ＡＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣＴＴＣＣＴＡＴＣＣ−３’及びイントロン５にある（配列番号：１０６）ＭＧ８０３  ５’−ＧＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴＧ−３’プライマーを用いてゲノムＤＮＡを増幅することを含んだ。ＰＣＲ産物の大きさは３４０ｂｐであり、これは変異が存在する場合、ＭｓｐＩ消化時に２８３ｂｐ及び５７ｂｐの２つのフラグメントを生じた。復帰したｃＤＮＡクローンの分析のために、プライマー（配列番号：１０７）ＭＧ９２４  ５’−ＴＧＴＣＴＴＧＴＧＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧ−３’及び（配列番号：１０８）ＭＧ７５３  ５’−ＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＡＴＧＧＣＡＧＧＣ−３’を用いてＰＣＲを実施した。ＰＤ２０の父性エクソン３７変異（Ｒ１２３６Ｈ）及びＶＵ００８のエクソン１２ミスセンス変異（Ｒ３０２Ｗ）をアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーションにより試験した（Ｗｕら、ＤＮＡ  ８：１３５−１４２（１９８９））。エクソン１２アッセイのために、ゲノムＤＮＡをプライマー（配列番号：１０９）ＭＧ９７９  ５’−ＡＣＴＧＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＣＣＡＣＴＡＴＧ−３’及び（配列番号：１１０）ＭＧ９８４  ５’−ＣＣＴＧＴＧＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴ−３’で増幅した。プライマー（配列番号：１７１）ＭＧ８１８  ５’−ＡＧＡＧＧＴＡＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＴＡＣ−３’及び（配列番号：１７２）ＭＧ８１３  ５’−ＣＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧ−３’をエクソン３７に関して使用した。野生型（配列番号：１１１）（Ｒ３０２Ｗに関しては５’−ＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＴＣＡＧ−３’及びＲ１２３６Ｈに関しては（配列番号：１
１２）５’−ＴＴＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＧＡＴＧＡ−３’）及び変異体  配列番号：１１１（Ｒ３０２Ｗに関しては５’−ＴＴＣＴＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＡＧ−３’及びＲ１２３６Ｈに関しては配列番号：１１２  ５’−ＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＧＴＧＡＴＧＡ−３’）オリゴヌクレオチドをγ３２Ｐ−［ＡＴＰ］で末端標識し、新規ＤｄｅＩ部位として以前のようにドットブロット標的ＰＣＲ産物にハイブリダイズした。野生型ＰＣＲ産物を１１７及び７１ｂｐ産物に消化し、一方変異アレルは５６、６１及び７１ｂｐの長さ３つのフラグメントを生じた、前記のアッセイの全てでＰＣＲはゲノムＤＮＡ  ５０ｎｇで、９４℃で２５秒、５０℃で２５秒及び７２℃で３５秒の３７サイクルを実施した。
【０１３３】
抗ＦＡＮＣＤ２抗血清の作製：抗原供給源としてＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ−末端）融合タンパク質を用いて、ＦＡＮＣＤ２に対するウサギポリクローナル抗血清を作製した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡ全長から、プライマー（配列番号：１１３）ＤＦ４ＥｃｏＲＩ（５’−ＡＧＣＣＴＣｇａａｔｔｃＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡ−３’）及び（配列番号：１１４）ＤＲ８１６Ｘｈ（５’−ＧＧＴＡＴＣｃｔｃｇａｇＴＣＡＡＧＡＣＧＡＣＡＡＣＴＴＡＴＣＣＡＴＣＡ−３’）を用いて５’フラグメントを増幅した。ＦＡＮＣＤ２ポリペプチドのアミノ末端２７２個のアミノ酸をコードする、得られた８４１ｂｐのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−１（ファルマシア）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。予測した大きさ（５４ｋＤ）のＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ末端）融合タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５□株に発現し、グルタチオン−Ｓ−セファロース上で精製し、ニュージーランド白ウサギの免疫に使用した。ＦＡＮＣＤ２特異的免疫抗血清を、ＧＳＴタンパク質を負荷したアミノリンク・プラス・カラム（ピアース）上で、及びＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ末端）融合タンパク質を負荷したアミノリンク・プラス・カラム（ピアース）上でアフィニティー精製した。
【０１３４】
実施例１に記載したのと同様のイムノブロッティング
細胞系及びトランスフェクション：オレガノ・ヘルス・サイエンシズ・ファンコーニ貧血細胞貯蔵所により作成された、ＰＤ２０ｉは不死化された、及びＰＤ７３３は１次繊維芽細胞系である（Ｊａｋｏｂｓら、Ｓｏｍｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２２：１５１−１５７（１９９６））。ＰＤ２０リンパ芽球は骨髄サンプルに由来した。欧州ファンコーニ貧血登録所（ＥＵＦＡＲ）により作製された、ＶＵ００８はリンパ芽球であり、ＶＵ４２３は繊維芽球系である。ＶＵ４２３ｉはＳＶ４０Ｔ抗原でのトランスフェクション（Ｊａｋｏｂｓら、１９９６）及びテロメラーゼ（Ｂｏｄｎａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３４９−３５２（１９９８））により誘導された不死化系である。別のＦＡ細胞系は以前に記載されている。ヒト繊維芽細胞をＭＥＭ及び２０％ウシ胎児血清中で培養した。形質転換されたリンパ芽球を、１５％熱不活性化ウシ胎児結成を補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。
【０１３５】
ＦＡＮＣＤ２発現構築物を作製するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔでクローン化されたＲＴ−ＰＣＲ産物からｃＤＮＡ全長を集め、ＰＣＲ誘導変異の不在をシーケンシングにより確認した。発現ベクターｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＲｅｖＴＲＥ及びｐＲｅｖＴｅｔ−ｏｆｆはクロンテック（パロ・アルト、カリフォルニア州）のものである。ＦＡＮＣＤ２をこれらのベクターの適当な多クローニング部位に挿入した。標準的な条件を用いてＰＤ２０細胞系及び正常な対照繊維芽細胞系であるＦＭ６３９に発現構築物を電気穿孔処理した（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｆｆら、１９９２）。４００μｇ／ｍｌの活性Ｇ４１８でネオマイシン選別を実施した（ギブコ）。
【０１３６】
全細胞融合：全細胞融合実験のために、ヒグロマイシンＢに抵抗し、ＨＰＲＴ遺伝子座を欠失したＰＤ２０細胞系（ＰＤ２０ｉ）を使用した（Ｊａｋｏｂｓら、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２３：１−７（１９９７））。対照はＰＤ２４（ＰＤ２０の罹患同胞からの１次繊維芽細胞）及びＰＤ３１９ｉ（Ｊａｋｏｂｓら、１９９７）（非Ａ、Ｃ、ＤまたはＧ  ＦＡ患者からの不死化繊維芽細胞）を含有した。各細胞系からの２．５×１０５セルをＴ２５フラスコで混合し、２４時間回復させた。細胞を血清不含培地で洗浄し、次いで５０％ＰＥＧで１分間融合させた。ＰＥＧを除去した後、細胞を血清不含培地で３回洗浄し、選別しない完全培地中で一晩回復させた。翌日、４００μｇ／ｍｌ  ヒグロマイシンＢ（ロッシュ・モレキュラー）及び１Ｘ  ＨＡＴを含有する選択培地に細胞を１：１０で分配した。選別が完了した後、ハイブリッドを１回継代し、次いで以下に記載するように分析した。
【０１３７】
ＦＡ−Ｄ２細胞のレトロウイルス形質導入及び補足分析：ＦＡＮＣＤ２  ｃＤＮＡ全長をベクターｐＭＭＰ−ｐｕｒｏにサブクローニングした（Ｐｕｌｓｉｐｈｅｒら、１９９８）。レトロウイルス上澄を用いてＰＤ２０Ｆを形質導入し、ピューロマイシン抵抗性細胞を選択した。クリスタルバイオレットアッセイによりＭＭＣ感受性に関して細胞を分析した（Ｎａｆら、１９９８）。
【０１３８】
染色体切断分析：ＯＨＳＵ（ポートランド、オレゴン州）でサイトジェネティクス・コア・ラブにより染色体切断分析を実施した。分析のために（Ｃｏｈｅｎら、１９８２）、細胞をＴ２５フラスコにプレートし、回復させ、次いで３００ｎｇ／ｍｌのＤＥＢで２日間処置した。処置後、細胞をコルセミドに３時間暴露し、０．０７５Ｍ  ＫＣｌ及び３：１  メタノール：酢酸を用いて収穫した。スライドをライト染料で染色し、５０−１００分裂中期をラジアルに関してスコアを取った。
【０１３９】
実施例１０：可能性のある治療薬のスクリーニングに使用するためのＦＡに関するマウスモデル
Ｄ’Ａｎｄｒｅａら、９０：１７２５−１７３６（１９９７）、及びＹａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９８：１−６（２００１）に記載されるように胚幹細胞における相同性組換えまたは標的破壊を用いてＦＡＮＣＤ２のネズミモデルを作製できる。マウスのＦＡＮＣＤ２遺伝子座のノックアウトは致死的変異ではない。これらのノックアウト動物は癌に対する感受性が増しており、さらにＦＡに特徴的な別の症状を展示する。特定の治療薬をノックアウトマウスに投与することはマウスの癌に対する感受性を低減させると予測される。さらに、特定の確立された化学療法剤は特定の遺伝子欠損の結果として癌を進行させたノックアウトマウスを処置するのにさらに有効であると同定され、これはまた癌に対する感受性を有するヒト対象またはＦＡＮＣＤ２遺伝子座の変異の結果として癌を進行させたヒト対象の処置に有用であると予測される。
【０１４０】
我々は例えば遺伝子のエクソンに破壊を創ったＦａｎｃｃに関して、Ｃｈｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２：４４８−４５１（１９９６）により、及び相同性組換えを用いて遺伝子のエクソンに破壊を創ったＷｈｉｔｎｅｙら、８８：４９−５８（１９９６）により記載された研究法を用いて、ＦＡＮＣＤ２の標的破壊壊で実験マウスモデルを作製できる。双方の動物モデルでは自発的染色体切断及び２官能基アルキル化剤に応答した脾臓リンパ球における染色体切断の増加が観察される。双方のモデルでは、Ｆａｎｃｄ２−／−マウスは生殖細胞欠損及び生殖能力の低下を有する。Ｆａｎｃｄ２ネズミノックアウトモデルは（１）ＤＮＡ損傷に対する造血細胞の生理学的応答におけるＦａｎｃｄ２遺伝子の役割、（２）ＦＡ骨髄細胞における抑制性サイトカインのインビボの影響を試験するのに有用である。１２９／Ｓｖ及びＣ５７ＢＬを以下の標準的なプロトコルに従って作製できる。マウステールゲノムＤＮＡを以前に記載したように調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）遺伝子型同定の鋳型として使用できる。
【０１４１】
公知のＦａｎｃｄ２遺伝子型の６週齢マウスから脾臓細胞を調製できる。脾臓を切開し、ＲＰＭＩ培地中ですり潰し、単一細胞懸濁液にし、７０μｍフィルターを通した。赤色細胞を低張性塩化アンモニウム中で溶解する。得られた脾臓リンパ球をリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、ＲＰＭＩ／１０％ウシ胎児血清＋フィトヘマグルチニンに懸濁した。トリパンブルー排除アッセイにより生存性に関して細胞を試験する。培地中細胞を２４時間培養し、さらに４８時間ＭＭＣまたはＤＥＢに暴露する。また別に５０時間細胞を培養し、ＩＲ（指示するように１または４Ｇｙ）に暴露し、染色体切断またはトリパンブルー排除（生存性）分析の前に１２時間回復させる。
【０１４２】
以前に記載したように、４から６週齢のＦａｎｃｄ２＋／−またはＦａｎｃｄ２−／−マウスの大腿及び脛骨から単核細胞を単離できる。ＭｅｔｈｏＣｕｌｔＭ３４３培地（ステムセル・テクノロジーズ、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州）１ｍｌ中、ＭＭＣ処置を伴うかまたは伴わずに、２×１０４セルの全てを培養した。７日にコロニーを計数し、この時たいていのコロニーは顆粒球・マクロファージコロニー形成ユニットまたは赤芽球バースト形成ユニット系列に属する。各々の数は２検体ずつのプレートからの平均であり、データは２つの別個の実験から誘導された。
【０１４３】
胸腺、脾臓及び末梢リンパ節から単離されたリンパ球を、フルオレセインイソチオシアネート抱合抗ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ１９、並びにＰＥ抱合抗ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ４５Ｂ、免疫グロブリンＭ、及びＢ２２０（ＢＤファルミンゲン、カリフォルニア州）でＴ−またはＢ−リンパ球表面分子に関して染色する。染色された細胞をカウンター・エピックスＸＬフロー・サイトメトリー・システムで分析した。
【０１４４】
マウス卵巣及び精巣を単離し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、マサチューセッツ総合病院の病理部門の中心的施設でさらに処理した。
【０１４５】
実施例１１：ヒト対象における癌感受性の増加を検出するための抗体試薬を用いるスクリーニングアッセイ
ＦＡＮＣＤ２−Ｌに比較したＦＡＮＣＤ２−Ｓの相対量及びＦＡＮＣＤ２−Ｌの存在または不在に関して試験するために、血液サンプルまたは組織サンプルを対象から採取できる。ＦＡＮＣＤ２−Ｓ及びＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質に特異的な抗体試薬を用いて（実施例１）、図１４に示すウェスタンブロットで陽性サンプルを同定できる。別の抗体アッセイ、例えば５６５４１６２及び５０７３４８４に記載される１工程遊走結合バンドアッセイを利用できる。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドウィッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ及びその他の技術分野で公知の免疫診断アッセイを用いてＦＡＮＣＤ２−Ｓ及びＦＡＮＣＤ２−Ｌの相対結合濃度を決定できる。
【０１４６】
この研究法の実行可能性を以下に説明する：
ヒト癌細胞系をスクリーニングするためのＦＡＮＣＤ２診断ウェスタンブロット
ヒト癌細胞系を電離放射線を伴って、または伴わずに（図１４に示すように）処置し、全細胞タンパク質を電気穿孔処置し、ニトロセルロースに移し、実施例１の抗ＦＡＮＣＤ２モノクローナル抗体でイムノブロットした。卵巣癌細胞系（ＴＯＶ２１Ｇ）はＦＡＮＣＤ２−Ｓを発現したが、ＦＡＮＣＤ２−Ｌを発現しなかった（レーン９、１０参照）。この細胞系はＦＡＮＣＤ２遺伝子を重複するヒト染色体３ｐの欠失を有し、ＦＡＮＣＤ２に関して半接合性であり、第２のＦＡＮＣＤ２アレルで変異を有すると予測され、従ってＦＡ複合体によりモノユビキチン化に失敗し、よってＦＡＮＣＤ２−Ｌがない（レーン９、１０）。この実施例は、抗体基盤の試験が癌感受性の増加に至るＦＡＮＣＤ２遺伝子の損傷を決定するのに適していることを示している。
【０１４７】
実施例１２：ヒト対象における癌感受性の増加を検出するための核酸試薬を用いるスクリーニングアッセイ
血液サンプルまたは組織サンプルを対象から採取し、シーケンシング技術または核酸プローブを用いてスクリーニングし、対象のゲノムにあるとすれば、遺伝子損傷の大きさ及び位置を決定する。スクリーニング方法には全遺伝子のシーケンシング、またはプローブのセットもしくは単一のプローブを使用して損傷を同定することによるものなどがある。単一の損傷は集団において優勢であるが、別の遺伝的条件、例えば嚢胞性繊維症及びＰ５３腫瘍抑制遺伝子の場合にあるように、低頻度で遺伝子中いたるところで別の損傷を生じ得る。
【０１４８】
この研究法の実行可能性を以下に説明する：
標準的なフィコール・ハイパーク・グラジエントを用いて患者から末梢血リンパ球を単離し、ゲノムＤＮＡをこれらのリンパ球から単離する。我々はゲノムＰＣＲを用いてヒトＦＡＮＣＤ２遺伝子の４４個のエクソン（表７参照）を増幅し、２つのＦＡＮＣＤ２アレルをシーケンシングして変異を同定する。かかる変異が見出される場合、ＦＡ−Ｄ２インディケーター細胞系の機能的補足を排除する能力によりこれらを良性多型性から区別する。
【０１４９】
【表１】
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【０１５０】
【表２】
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【０１５１】
【表３】
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【０１５２】
【表４】
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【０１５３】
【表５】
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【０１５４】
【表６】
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【０１５５】
【表７】
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2010246550.tif 000010
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月22日(2010.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：７に示すヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）（ｂ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号：６に示すヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）（ｂ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項３】
（ａ）配列番号：５に示すヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）（ｂ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項４】
（ａ）配列番号：８に示すヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）（ｂ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項５】
（ａ）配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）（ｂ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項６】
ＤＮＡ修復を促進するための細胞の核においてＦＡＮＣＤ２タンパク質の短い形態から長い形態への変換の生物学的特性を保持するのに十分に、配列番号：４のアミノ酸配列と類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から本質的に構成される単離された核酸分子。
【請求項７】
ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、又はＲＮＡ分子である請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号：９から１９１に少なくとも９０％同一であるか、または配列番号：９から１９１に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列に相補的である、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドから本質的に構成される単離された核酸分子。
【請求項９】
配列が、配列番号：９から９４より選択されるイントロン／エクソン配列である請求項８に記載の単離された核酸分子。  
【請求項１０】
配列が、配列番号：１１５から１８６より選択されるＰＣＲプライマーの配列である、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
（ａ）配列番号：７のヌクレオチド配列を有する核酸によりコードされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：７のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸によりコードされるアミノ酸配列；及び
（ｃ）少なくとも５０アミノ酸の長さを有する、（ａ）又は（ｂ）の、ポリペプチドフラグメント；
から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
（ａ）配列番号：６のヌクレオチド配列を有する核酸によりコードされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：６のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸によりコードされるアミノ酸配列；及び
（ｃ）少なくとも５０アミノ酸の長さを有する、（ａ）又は（ｂ）の、ポリペプチドフラグメント；
から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
（ａ）配列番号：５のヌクレオチド配列を有する核酸によりコードされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：５のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸によりコードされるアミノ酸配列；及び
（ｃ）少なくとも５０アミノ酸の長さを有する、（ａ）又は（ｂ）の、ポリペプチドフラグメント；
から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
（ａ）配列番号：８のヌクレオチド配列を有する核酸によりコードされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：８のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸によりコードされるアミノ酸配列
（ｃ）フラグメントが少なくとも５０アミノ酸の長さである（ａ）又は（ｂ）の、ポリペプチドフラグメント；
から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
（ａ）配列番号：４；
（ｂ）（ａ）に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：１８７から１８８の少なくとも１つに少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列；及び
（ｄ）少なくとも５０アミノ酸の長さを有する、（ａ）から（ｃ）の、ポリペプチドフラグメント；
から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
ｎｔ３７６のＡからＧ、ｎｔ３７０７のＧからＡ、ｎｔ９０４のＣからＴ、及びｎｔ９５８のＣからＴより選択される変異を有するＤＮＡによりコードされる請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
多型がｎｔ１１２２のＡからＧ、ｎｔ１４４０のＴからＣ、ｎｔ１５０９のＣからＴ、ｎｔ２１４１のＣからＴ、ｎｔ２２５９のＴからＣ、ｎｔ４０９８のＴからＧ、ｎｔ４４５３のＧからＡより選択される、ポリペプチドをコードするＤＮＡの多型によりポリペプチドが特徴付けられる請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
ポリペプチドがアミノ酸２２２またはアミノ酸５６１での変異により特徴付けられる請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
生物学的サンプルが、ファンコーニ貧血経路を有するか否かを決定する方法であって、
（ａ）ＦＡＮＣＤ２タンパク質のアイソフォームであるＦＡＮＣＤ２−Ｌと第１複合体を形成するために、生物学的サンプルを第１抗体に暴露すること
（ｂ）ＦＡＮＣＤ２タンパク質のアイソフォームであるＦＡＮＣＤ２−Ｓと第２複合体を形成するために、生物学的サンプルを第２抗体に暴露すること；
（ｃ）マーカーでサンプル中の第１複合体及び第２複合体の量を検出すること
（ｄ）第１複合体の量と第２複合体の量との比を測定すること；及び
（ｅ）（ｄ）で得られた比を野生型細胞におけるＦＡＮＣＤ２−Ｌ複合体の量とＦＡＮＣＤ２−Ｓ複合体の量との比と比較すること；
を含む方法。
【請求項２０】
生物学的サンプルが、無傷細胞又はライゼート中に溶解された細胞を含んでなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的サンプルが癌に対する感受性を有するかまたは初期段階の癌を有するヒト被検対象からのものである請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的サンプルがヒト対象の癌からのものであり、ここで癌が黒色腫、白血病、アストチトーム、神経膠芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び、膵臓、乳房、卵巣、子宮、精巣、脳下垂体、腎臓、胃、食道及び直腸の癌から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
生物学的サンプルがヒト胎児又は成人からのものである請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
生物学的サンプルが血液サンプル、被験対象及び細胞系からの組織の生検サンプルから選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
生物学的サンプルが心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢血またはリンパ球に由来する請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
マーカーが蛍光マーカー又は化学ルミネセンスマーカーであり、該蛍光マーカー又は化学ルミネセンスマーカーは第１抗体及び第２抗体と抱合されていてよい、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
第１及び第２複合体を、基質に抱合された第３抗体に結合することをさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
被験対象からの細胞集団におけるファンコーニ貧血経路における欠損を同定する方法であって、
（ａ）細胞集団におけるＦＡＮＣＤ２タンパク質のアイソフォームであるＦＡＮＣＤ２−Ｌの量を決定すること；
（ｂ）細胞集団におけるＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦまたはＦＡＮＣＧタンパク質のいずれかの量を決定すること；
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）で決定された量を、野生型細胞集団における、ＦＡＮＣＤ２−Ｌの量、及び、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦまたはＦＡＮＣＧタンパク質のいずれかの量と比較すること；
を含む方法。
【請求項２９】
アイソフォームの量の決定が、ＦＡＮＣＤ２タンパク質のアイソフォームである、ＦＡＮＣＤ２−ＬとＦＡＮＣＤ２−Ｓとの分離に依存する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
分離がゲル電気泳動、又は遊走結合バンド試験ストリップにより達成される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）被験対象から細胞サンプルを入手すること；
（ｂ）細胞サンプルをＤＮＡ損傷手段に暴露すること；及び
（ｃ）ＦＡＮＣＤ２タンパク質のアイソフォームであるＦＡＮＣＤ２−Ｌを決定すること、
を含む、ＦＡ経路欠損を検出するための細胞に基くアッセイであって、ここで、（ｃ）で決定された量が、初期の量より増えていないことがＦＡ経路欠損を示している、アッセイ。
【請求項３２】
核フォーカスを検出するためのイムノブロッティング；ＦＡＮＣＤ２アイソフォームの量を検出するためのウェスタンブロット、及びＤＮＡプローブでのハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡを定量すること、からなる群より選ばれる方法により、ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの量が測定される請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項３３】
（ａ）ＦＡＮＣＤ２タンパク質のアイソフォームであるＦＡＮＣＤ２−Ｌが低減された量で作製される細胞集団を選択すること；
（ｂ）細胞集団を候補治療薬分子のライブラリーの各メンバーに暴露すること；及び
（ｃ）細胞集団においてＦＡＮＣＤ２−Ｌの量を増加させる、個々のメンバー分子を同定すること；
からなる治療薬を同定するためのスクリーニングアッセイ。
【請求項３４】
細胞集団がインビトロ細胞集団、変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子を有している実験動物のインビボ細胞集団、又はＦＡＮＤ２遺伝子がヒト変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子により置換されているノックアウトマウスのインビボ細胞集団である、請求項３３記載のスクリーニングアッセイ。
【請求項３５】
（ｂ）の前に、ＦＡＮＣＤ２−Ｌが低減された量で作製される細胞集団に化学発癌物質が添加される、請求項３３に記載のスクリーニングアッセイ。
【請求項３６】
（ａ）高ストリンジェント条件下でＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列に結合する配列番号：１１５から１８６より選択されるプライマー対；及び
（ｂ）各々のプライマー対の容器：
からなる生物学的サンプル中の癌細胞を検出するのに使用するためのキット。
【外国語明細書】
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