(57)【要約】【課題】高感度かつ高精度に多型を検出する方法の提供。【解決手段】被検核酸試料中の核酸を鋳型とし、第１型検出用プライマー及びポリメラーゼを用いて、阻害用オリゴヌクレオチドの存在下で、核酸鎖伸長反応を行う伸長工程と、前記伸長工程において、前記第１型検出用プライマーが伸長されたか否かにより、被検核酸試料中に含まれている核酸の多型を識別する識別工程とを有し、前記第１型検出用プライマーは、多型部位の塩基配列が第１の塩基配列である核酸と当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズするプライマーであり、前記阻害用オリゴヌクレオチドは、前記第１型検出用プライマーとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、前記第１型検出用プライマーにおいて、前記阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域は、前記多型部位とハイブリダイズする多型検出部位よりも５’側の領域である多型の識別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多型部位を有する核酸の多型を識別する方法であって、
被検核酸試料中の核酸を鋳型とし、第１型検出用プライマー及びポリメラーゼを用いて、阻害用オリゴヌクレオチドの存在下で、核酸鎖伸長反応を行う伸長工程と、
前記伸長工程において、前記第１型検出用プライマーが伸長されたか否かにより、前記被検核酸試料中に含まれている核酸の多型を識別する識別工程と、
を有し、
前記第１型検出用プライマーは、多型部位の塩基配列が第１の塩基配列である核酸と、当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズするプライマーであり、
前記阻害用オリゴヌクレオチドは、前記第１型検出用プライマーとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、
前記第１型検出用プライマーにおいて、前記阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域は、前記多型部位とハイブリダイズする多型検出部位よりも５’側の領域であることを特徴とする多型の識別方法。
【請求項２】
前記阻害用オリゴヌクレオチド中の、前記第１型検出用プライマーとハイブリダイズする領域の塩基配列は、前記第１型検出用プライマー中の阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の塩基配列と、少なくとも１塩基のミスマッチを含む配列であることを特徴とする請求項１記載の多型の識別方法。
【請求項３】
前記阻害用オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基が、プライマーとして動作しないようにブロッキングされていることを特徴とする請求項１又は２記載の多型の識別方法。
【請求項４】
前記第１型検出用プライマー中の、前記阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域よりも３’側の領域の長さが、５塩基以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の多型の識別方法。
【請求項５】
前記第１型検出用プライマー中の、前記阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の長さが、１０塩基以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の多型の識別方法。
【請求項６】
前記核酸鎖伸長反応が、被検核酸試料中の核酸を一本鎖化する変性ステップ、一本鎖化された核酸と、前記第１型検出用プライマー又は前記阻害用オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるアニーリングステップ、前記第１型検出用プライマーを起点として核酸鎖を伸長させる伸長ステップとからなり、
前記第１型検出用プライマーと前記阻害用オリゴヌクレオチドとからなる会合体のＴｍ値が、前記アニーリングステップの温度よりも高く、前記伸長ステップの温度よりも低いことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の多型の識別方法。
【請求項７】
前記第１型検出用プライマーの、前記多型部位とハイブリダイズする多型検出部位が、３’末端にあることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の多型の識別方法。
【請求項８】
前記核酸鎖伸長反応が、前記変性ステップ、前記アニーリングステップ、及び前記伸長ステップとからなるサイクルを、２回以上繰り返すことを特徴とする請求項６又は７記載の多型の識別方法。
【請求項９】
前記多型部位の塩基配列が、前記第１の塩基配列とは異なる塩基配列である核酸と、当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズする検出用プライマーの存在下で、前記核酸鎖伸長反応を行うことを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の多型の識別方法。
【請求項１０】
多型部位を有する核酸の多型の識別に用いられるキットであって、第１型検出用プライマー及び阻害用オリゴヌクレオチドを含み、
前記第１型検出用プライマーは、多型部位の塩基配列が第１の塩基配列である核酸と、当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズするプライマーであり、
前記阻害用オリゴヌクレオチドは、前記第１型検出用プライマーとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、
前記第１型検出用プライマーにおいて、前記阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域は、前記多型部位とハイブリダイズする多型検出部位よりも５’側の領域であることを特徴とする、多型識別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来よりも、高感度かつ高精度に多型を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子操作技術や遺伝子組換え技術等の進歩に伴い、核酸分析による遺伝子検査は、医療、研究、産業への応用に広く用いられている。このような検査は試料中の標的塩基配列を有するＤＮＡの存在の検出を行うものであり、疾患の診断、治療だけでなく、食品検査等の様々な分野において応用されている。特に、ＳＮＰ（一塩基多型）等の遺伝子多型は、癌等の特定の疾患に対する罹り易さや、薬物代謝能等の個体差の主要な一因と考えられており、学術研究においてのみならず、実際の臨床検査においても、遺伝子多型解析が広く行われている。このため、高精度かつ迅速に遺伝子多型を検出し得る方法の開発が盛んである。
【０００３】
遺伝子多型を検出・識別する方法として、プローブやプライマー等の人工合成したポリヌクレオチドを用いて核酸の塩基配列を調べる方法が多数報告されている。例えば、ＳＮＰ等の多型を含む領域をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅して検出する方法や、検出対象であるＳＮＰを３’末端に有するプローブと、該ＳＮＰの５’側の隣の塩基を５’末端に有するプローブを用いて、ライゲーション反応を行い、２つのプローブが結合された一のポリヌクレオチドが得られるか否かによりＳＮＰを検出する方法等のように、分子生物学的な酵素反応を用いて、解析対象であるＳＮＰ及びその近傍の塩基配列を解析する方法等がある。
【０００４】
特に、ＳＮＰ解析においては、特定の塩基配列やアレル等に特異的に結合し得るプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の有無によりＳＮＰを検出するＳＳＰ−ＰＣＲ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒｓ−ＰＣＲ）法やＡＳＰ−ＰＣＲ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒｓ−ＰＣＲ）法が汎用されている。ＳＳＰ／ＡＳＰ−ＰＣＲ法による多型の検出は、塩基配列（遺伝子多型）の検出及び識別とシグナルの増幅を同時に行うことができるため、臨床検査における検体等のように、検体が微量である場合や試料中の核酸濃度が非常に低い場合であってもＳＮＰを検出することができ、非常に利便性が高いためである。
【０００５】
ＳＳＰ−ＰＣＲ法やＡＳＰ−ＰＣＲ法とは異なり、増幅反応を用いないＳＮＰ解析法も多数報告されている。例えば、（１）（ａ）検出対象とする核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、（ｂ）（ａ）の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする１又は２の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であり、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含む領域と相補的であることを特徴とする核酸分子を用いて、ＳＮＰを検出する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。当該部分二重鎖型核酸分子を、検出対象とする核酸分子と共存させると、鎖交換反応によって本発明の核酸分子の短鎖と標的核酸分子が交換し、本発明の核酸分子の長鎖と標的核酸分子との二重鎖構造が形成され、これを検出することにより、標的核酸分子を検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０５／０１２５７１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＳＳＰ−ＰＣＲ法やＡＳＰ−ＰＣＲ法は、プライマーの塩基配列の設計自由度が低いため、識別対象である遺伝子多型の塩基配列によっては、十分な感度が得られない、という問題がある。
一方、上記（１）の方法は、ハイブリダイゼーションを用いる検出方法であり、鎖伸長反応を使用しないため、シグナルの増幅ができない。このため、臨床検体等のように、元々核酸含有量が微量である試料からは、十分な感度で遺伝子多型を検出することは困難である。また、鎖交換反応を用いているため、識別対象である遺伝子多型の塩基配列によっては、遺伝子多型を識別する場合には、前記部分二重鎖型核酸分子の検出対象とする型以外の型の塩基配列をからなる核酸分子とも比較的安定してハイブリダイズし、鎖交換反応が生じる可能性が高く、識別の精度も十分ではない。
【０００８】
本発明は、ＳＳＰ−ＰＣＲ法又はＡＳＰ−ＰＣＲ法を用いて、高感度かつ高精度に多型を識別する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＳＳＰ−ＰＣＲ法又はＡＳＰ−ＰＣＲ法において、多型のいずれかのアレルと特異的にハイブリダイズするプライマーと、鋳型となる核酸とをハイブリダイズさせて核酸伸長反応を行う際に、この反応溶液に、当該プライマーの多型検出部位よりも５’側の領域で当該プライマーとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを添加することにより、非特異的な核酸伸長反応を抑制することができ、多型の識別精度を改善できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）  多型部位を有する核酸の多型を識別する方法であって、被検核酸試料中の核酸を鋳型とし、第１型検出用プライマー及びポリメラーゼを用いて、阻害用オリゴヌクレオチドの存在下で、核酸鎖伸長反応を行う伸長工程と、前記伸長工程において、前記第１型検出用プライマーが伸長されたか否かにより、前記被検核酸試料中に含まれている核酸の多型を識別する識別工程と、を有し、前記第１型検出用プライマーは、多型部位の塩基配列が第１の塩基配列である核酸と、当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズするプライマーであり、前記阻害用オリゴヌクレオチドは、前記第１型検出用プライマーとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、前記第１型検出用プライマーにおいて、前記阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域は、前記多型部位とハイブリダイズする多型検出部位よりも５’側の領域であることを特徴とする多型の識別方法、
（２）  前記阻害用オリゴヌクレオチド中の、前記第１型検出用プライマーとハイブリダイズする領域の塩基配列は、前記第１型検出用プライマー中の阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の塩基配列と、少なくとも１塩基のミスマッチを含む配列であることを特徴とする前記（１）記載の多型の識別方法、
（３）  前記阻害用オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基が、プライマーとして動作しないようにブロッキングされていることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の多型の識別方法、
（４）  前記第１型検出用プライマー中の、前記阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域よりも３’側の領域の長さが、５塩基以上であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の多型の識別方法、
（５）  前記第１型検出用プライマー中の、前記阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域の長さが、１０塩基以上であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の多型の識別方法、
（６）  前記核酸鎖伸長反応が、被検核酸試料中の核酸を一本鎖化する変性ステップ、一本鎖化された核酸と、前記第１型検出用プライマー又は前記阻害用オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるアニーリングステップ、前記第１型検出用プライマーを起点として核酸鎖を伸長させる伸長ステップとからなり、前記第１型検出用プライマーと前記阻害用オリゴヌクレオチドとからなる会合体のＴｍ値が、前記アニーリングステップの温度よりも高く、前記伸長ステップの温度よりも低いことを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の多型の識別方法、
（７）  前記第１型検出用プライマーの、前記多型部位とハイブリダイズする多型検出部位が、３’末端にあることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の多型の識別方法、
（８）  前記核酸鎖伸長反応が、前記変性ステップ、前記アニーリングステップ、及び前記伸長ステップとからなるサイクルを、２回以上繰り返すことを特徴とする前記（６）又は（７）記載の多型の識別方法、
（９）  前記多型部位の塩基配列が、前記第１の塩基配列とは異なる塩基配列である核酸と、当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズする検出用プライマーの存在下で、前記核酸鎖伸長反応を行うことを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の多型の識別方法、
（１０）  多型部位を有する核酸の多型の識別に用いられるキットであって、第１型検出用プライマー及び阻害用オリゴヌクレオチドを含み、前記第１型検出用プライマーは、多型部位の塩基配列が第１の塩基配列である核酸と、当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズするプライマーであり、前記阻害用オリゴヌクレオチドは、前記第１型検出用プライマーとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、前記第１型検出用プライマーにおいて、前記阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域は、前記多型部位とハイブリダイズする多型検出部位よりも５’側の領域であることを特徴とする、多型識別用キット、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の多型の識別方法を用いることにより、多型の検出用プライマーの設計の自由度が低いＳＳＰ−ＰＣＲ法及びＡＳＰ−ＰＣＲ法において、効果的に非特異的な核酸伸長反応を抑制することができ、多型を高精度かつ高感度に識別することができる。中でも、体細胞変異等の、従来のＳＳＰ−ＰＣＲ法等では検出や識別が非常に困難であった多型も、感度よく検出・識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１型検出用プライマー（１）と阻害用オリゴヌクレオチド（２）とからなる会合体を、模式的に示した図である。
【図２】第１型核酸、第２型核酸、第１型検出用プライマー、及び阻害用オリゴヌクレオチドが存在する溶液中において形成される会合体を模式的に示した図である。
【図３】図２に示した各種会合体の安定性の望ましい関係を模式的に示した図である。
【図４】実施例１において、ＥＧＦＲ遺伝子の、野生型（Ｗｔ）及び変異型（Ｍｔ）における当該多型部位の周囲の塩基配列のアラインメントを示した図である。
【図５】実施例１において、１ｓｔ  ＰＣＲの産物の塩基配列を示した図である。
【図６】実施例１において、測定された変異型検出用プライマーの消費率（Ｋ２％）を、変異型核酸の含有割合ごとに示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、多型とは、ある生物種の個体間若しくは同一個体中の細胞間において、同じ遺伝子の塩基配列に相違部分があることを意味する。具体的には、同じ遺伝子において、一の細胞由来の特定の遺伝子の塩基配列に対して、同じ生物種の別個体由来の、又は同一個体の他の細胞由来の当該遺伝子の塩基配列が、１又は複数の塩基が置換、欠損、若しくは挿入されている場合に、当該遺伝子は多型であるといい、両者の塩基配列で相違する部位を多型部位という。なお、ゲノムＤＮＡ上における多型であってもよく、ミトコンドリアＤＮＡにおける多型であってもよい。
【００１４】
本発明において多型部位とは、各多型において、遺伝子の塩基配列が異なる部位を意味する。例えば、置換型の遺伝子多型においては、一の型（第１型）における塩基配列がｇｇｇａａａであり、第１型とは異なる型（第２型）における塩基配列がｇｇｃａａａである場合に、第１型においてｇであり、第２型においてｃである５’側から３番目の塩基が多型部位である。一方、挿入・欠損型の遺伝子多型においては、一の型（第１型）における塩基配列がｇｇｇｃｃｃａａａであり、第１型とは異なる型（第２型）における塩基配列がｇｇｇａａａである場合に、第１型の５’側から４〜６番目の塩基（ｃｃｃ）が多型部位であり、同じく第２型の５’側から３〜４番目の塩基間が多型部位である。
【００１５】
また、本発明において、多型を識別するとは、ある被検核酸試料に含有されている核酸の多型部位が、いずれの多型と同じ塩基配列を有しているかを識別することを意味する。したがって、本発明の多型の識別方法の対象となる多型は、識別が可能である程度に塩基配列が明らかになっているものである。
【００１６】
本発明において識別対象とする多型としては、上記多型であって、遺伝子組換え技術等により検出が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。また、先天的な多型であってもよく、腫瘍細胞等において多くみられる後天的な多型であってもよい。該多型として、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト、体細胞変異等がある。
【００１７】
本発明における被検核酸試料は、多型を識別すべき核酸が含まれている試料であれば、特に限定されるものではない。該被検核酸試料は、動物等から採取した生体試料であってもよく、培養細胞溶液等から調製した試料であってもよく、生体試料等から抽出・精製した核酸溶液であってもよい。特に臨床検査等に用いられるヒト由来の生体試料や、ヒト由来の生体試料から抽出・精製した核酸試料であることが好ましい。ヒト由来の生体試料として、例えば、血液、骨髄液、リンパ液、尿、喀痰、腹水、滲出液、羊膜液、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、膀胱洗浄液、膵液、唾液、精液、胆汁、又は大便等がある。また、該被検核酸試料は、生物から採取された状態の試料であってもよく、調製した試料であってもよい。該調製の方法は、該生体試料中に含有されているＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、通常、生体試料に対してなされている調製方法を行うことができる。その他、生体試料から抽出・精製したＤＮＡをＰＣＲ等により増幅処理して得られたものであってもよく、生体試料中に含有されるＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡであってもよい。生体試料から抽出・精製したＤＮＡ等を用いる場合には、含有する多型部位を含む核酸をＰＣＲ反応により増幅させ、得られた増幅産物を被検核酸試料とすることが好ましい。
【００１８】
本発明の多型の識別方法は、多型部位を有する核酸の多型を識別する方法であって、多型のうちの一の型（第１型）と特異的にハイブリダイズする第１型検出用プライマーを用いた核酸鎖伸長反応を、当該第１型検出用プライマーと、多型検出部位よりも５’側の領域でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの存在下で行う方法である。なお、「多型検出部位」とは、検出用プライマー中の部分領域であって、核酸中の多型部位とハイブリダイズする部位を意味する。
【００１９】
本発明において、第１型検出用プライマーとは、識別対象である多型の多型部位の塩基配列が第１の塩基配列である核酸（以下、「第１型核酸」ということがある。）と、当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズするプライマーである。第１型検出用プライマーは、第１型核酸中の当該多型部位を含む部分領域とハイブリダイズし得るものであればよく、第１型核酸の塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、１又は数塩基のミスマッチを有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。より高い識別精度を達成可能であることから、本発明においては、第１型検出用プライマーは、第１型核酸の塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００２０】
その他、第１型検出用プライマーは、第１型核酸とハイブリダイズする領域以外にも、５’側に付加的な塩基配列を有するものであってもよい。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、核酸の標識に供される配列等がある。
また、第１型検出用プライマーは、当該プライマーを起点として得られる伸長産物の検出を容易にするために、標識されたものであってもよい。該標識をするための物質は、核酸の標識に用いることができるものであれば、特に限定されるものではなく、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン等がある。
【００２１】
第１型検出用プライマーは、第１核酸の多型部位とハイブリダイズする多型検出部位が、プライマーの５’側よりも３’側に存在するように設計されることが好ましい。中でも、多型検出部位は、第１型検出用プライマーの３’末端から５塩基以内に存在するように設計することが好ましく、３’末端から２塩基以内に存在するように設計することがより好ましく、３’末端にあるように設計することが特に好ましい。
【００２２】
本発明において、阻害用オリゴヌクレオチドとは、第１型検出用プライマーとハイブリダイズするものであって、第１型検出用プライマーにおいて、当該阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域が、多型部位とハイブリダイズする多型検出部位よりも５’側の領域となるオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
つまり、第１型検出用プライマーは、３’側に多型検出部位を有し、当該多型検出部位よりも５’側の領域において、阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。以下、第１型検出用プライマー中の、阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域を「共通領域」といい、この共通領域の３’側の領域を「多型検出領域」という。第１型検出用プライマーの多型検出部位は、多型検出領域に存在する。図１は、第１型検出用プライマー（１）と阻害用オリゴヌクレオチド（２）とからなる会合体を、模式的に示した図である。図１中、領域１ａが多型検出領域であり、領域１ｂが共通領域である。
【００２４】
第１型検出用プライマーは、低温環境下、例えば核酸鎖伸長反応のアニーリングステップにおいては、第１型核酸に対してと同様に、多型部位の塩基配列が第２の塩基配列である核酸（以下、「第２型核酸」ということがある。）ともハイブリダイズする。このように、第１型検出用プライマーが第２型核酸とハイブリダイズし、非特異的な核酸鎖伸長反応が起こることにより、多型の識別精度が低下する。
【００２５】
なお、「第２の塩基配列」とは、識別対象である多型の多型部位の塩基配列であって、前記第１の塩基配列とは異なる配列を意味する。例えば、識別対象である多型が、野生型と変異型の２種類の多型を有するＳＮＰである場合に、第１の塩基配列を変異型の塩基配列とし、第２の塩基配列を野生型の塩基配列とする。また、識別対象である多型が、体細胞変異である場合に、第１の塩基配列を変異型とし、第２の塩基配列を正常型の塩基配列とする。なお、多型部位の塩基配列が３種類以上ある多型の場合には、第２の塩基配列は、第１の塩基配列以外のいずれの塩基配列を選択してもよい。
【００２６】
図２は、第１型核酸、第２型核酸、第１型検出用プライマー、及び阻害用オリゴヌクレオチドが存在する溶液中において形成される会合体を模式的に示した図である。第１型検出用プライマー（１）は、第１型核酸（３）とのみならず、多型部位以外の領域において、第２型核酸（４）ともハイブリダイズし得る。一方、溶液中には、第１型検出用プライマー（１）と阻害用オリゴヌクレオチド（２）との会合体も存在する。そして、第１型検出用プライマー（１）と阻害用オリゴヌクレオチド（２）との会合体は、第１型検出用プライマー（１）と第１型核酸（３）との会合体と、これら三者の会合体を介した動的な平衡状態にあると想定される。一方、第１型検出用プライマー（１）と阻害用オリゴヌクレオチド（２）との会合体は、第１型検出用プライマー（１）と第２型核酸（４）との会合体とも動的な平衡状態にある。
【００２７】
本発明の多型の識別方法は、第１型検出用プライマーとハイブリダイズする阻害用オリゴヌクレオチドを用いることにより、図２に示すような平衡状態を形成し、アニーリングステップ等の低温環境下での核酸鎖伸長を抑制し、かつ、第１型以外の他の型の核酸と第１型検出用プライマーとの会合体の不安定化することにより、第１型検出用プライマーを起点とする非特異的な核酸鎖伸長反応を効果的に抑制する結果、多型の識別精度が改善されると推定される。
【００２８】
従来のＳＳＰ−ＰＣＲでは、多型部位の周辺配列の種類によっては多型の識別が非常に困難な場合もあった。本発明の多型の識別方法は、阻害用オリゴヌクレオチドが、第１型検出用プライマーの多型検出部位以外の部位とハイブリダイズすることにより、識別精度を向上させているため、このような場合であっても効果を発揮することができる。
【００２９】
第１型検出用プライマーの多型検出領域及び共通領域の長さは、図２に示すような第１型検出用プライマー（１）と阻害用オリゴヌクレオチド（２）と第１型核酸（３）との会合体の安定性のほうが、第１型検出用プライマー（１）と阻害用オリゴヌクレオチド（２）との会合体の安定性よりも高くなる長さであれば、特に限定されるものではなく、これら三者の塩基配列、核酸鎖伸長反応の反応条件等を考慮して、適宜決定することができる。具体的には、一般的な反応条件で行う場合には、第１型検出用プライマーの多型検出領域の長さを５塩基以上とし、共通領域の長さを１０塩基以上とすることが好ましい。
【００３０】
第１型検出用プライマーと阻害用オリゴヌクレオチドは、非特異的な核酸鎖伸長反応を抑制しつつ、特異的な核酸鎖伸長反応を促進するために、図２に示す各種会合体のうち、第１型検出用プライマーと第１型核酸との会合体の安定性が最も良好になるように、設計することが好ましい。図３は、図２に示した各種会合体の安定性の望ましい関係を模式的に示した図である。非特異的な反応である第１型検出用プライマーと第２型核酸との会合体が最も安定性が低く、目的の特異的反応である第１型検出用プライマーと第１型核酸との会合体が最も安定性を高くする。さらに、第１型検出用プライマーと阻害用オリゴヌクレオチドとの二者会合体と第１型核酸とが別個に存在している場合よりも、第１型検出用プライマーと阻害用オリゴヌクレオチドと第１型核酸との三者会合体のエネルギー準位が低くなり、かつ、この三者会合体よりも、第１型検出用プライマーと第１型核酸との会合体のエネルギー準位が低くなるように設計する。
【００３１】
阻害用オリゴヌクレオチド中の第１型検出用プライマーとハイブリダイズする領域の塩基配列は、第１型検出用プライマー中の共通領域（阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域）の塩基配列と、少なくとも１塩基のミスマッチを含む配列であることが好ましい。阻害用オリゴヌクレオチドにミスマッチ塩基を導入することにより、第１型検出用プライマーと阻害用オリゴヌクレオチドと第１型核酸との三者会合体よりも、第１型検出用プライマーと第１型核酸との会合体の安定性をより高くすることができる。
【００３２】
なお、本発明及び本願明細書において、「ミスマッチ」とは、２のオリゴヌクレオチド（又は一本鎖核酸）が、互いにハイブリダイズし会合体を形成する場合に、水素結合による塩基対を形成しない（非相補的な塩基である）ことを意味する。
【００３３】
また、アニーリング条件下では、図２に示すように各種会合体が平衡状態にあり、かつ、核酸鎖伸長反応時には、阻害用オリゴヌクレオチドが第１型検出用プライマーから解離していることが好ましい。阻害用オリゴヌクレオチドを、このように設計することにより、第１型核酸を鋳型とし第１型検出用プライマーを起点とする目的の核酸鎖伸長反応を阻害することなく、非特異的な核酸鎖伸長反応のみを抑制することができるためである。
【００３４】
具体的には、核酸鎖伸長反応が、被検核酸試料中の核酸を一本鎖化する変性ステップ、一本鎖化された核酸と、前記第１型検出用プライマー又は前記阻害用オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるアニーリングステップとからなる場合に、前記第１型検出用プライマーと前記阻害用オリゴヌクレオチドとからなる会合体のＴｍ値が、アニーリングステップの温度よりも高く、かつ伸長ステップの温度よりも低くなるように、阻害用オリゴヌクレオチドを設計することが好ましい。
【００３５】
なお、本発明において、検出用プライマーや阻害用オリゴヌクレオチドのＴｍ値は、塩基配列に基づいて、常法により算出することができる。また、ＶｉｓｕａｌＯＭＰ（ＤＮＡ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）等の市販のシミュレーションソフトウェアを用いて算出することもできる。
【００３６】
また、前記阻害用オリゴヌクレオチドは、プライマーとして動作しないオリゴヌクレオチドであることが好ましい。ここで、「プライマーとして動作しない」とは、ポリメラーゼによっても、オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基に新たな塩基が結合せず、核酸鎖が伸長しないことを意味する。具体的には、３’末端の塩基をブロッキングすることにより、プライマーとして動作しないオリゴヌクレオチドとすることができる。３’末端の塩基のブロッキング方法は、当該技術分野において公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。例えば、阻害用オリゴヌクレオチドの３’末端の３’位の水酸基を水酸基以外の官能基に置換する方法、３’末端の塩基をジデオキシヌクレオチドに置換する方法、３’末端の塩基の３’位に（必要に応じてリンカーを介して）、色素、蛍光物質分子、消光物質分子、又はアミノ基等を結合させる方法等がある。
【００３７】
具体的には、本発明の多型の識別方法は、まず、被検核酸試料中の核酸を鋳型とし、前記第１型検出用プライマー及びポリメラーゼを用いて、前記阻害用オリゴヌクレオチドの存在下で、核酸鎖伸長反応を行う（伸長工程）。
【００３８】
核酸鎖伸長反応は、１回のみ行うものであってもよく、複数回繰り返すものであってもよい。例えば、ＰＣＲ法のように、変性ステップ、アニーリングステップ、及び伸長ステップとからなるサイクルを、２回以上繰り返すものであってもよい。なお、核酸鎖伸長反応を１回のみ行う場合であっても、蛍光物質等で標識したヌクレオチドを用いることにより、得られた核酸鎖伸長産物を検出するためのシグナルを増幅することができる。
【００３９】
また、核酸鎖伸長反応は、ＰＣＲのように、第１型検出用プライマーのような多型特異的なプライマーと、多型非特異的なプライマーとを要する反応であってもよく、ＳＳＰＣＥ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）法（例えば、Current Pharmaceutical Biotechnology、２００３年、第４巻、４７７〜４８４ページ参照。）のように、第１型検出用プライマーのみを用いる反応であってもよい。
【００４０】
核酸鎖伸長反応の反応条件は、特に限定されるものではなく、使用するポリメラーゼの種類、第１型検出用プライマー、阻害用オリゴヌクレオチドのＴｍ値等を考慮して、適宜決定することができる。
また、核酸鎖伸長反応に用いられるポリメラーゼ、ヌクレオチド、バッファー等の試薬は、特に限定されるものではなく、通常核酸鎖伸長反応を行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。
【００４１】
本発明の核酸鎖伸長反応は、マルチプレックスＰＣＲのように、さらに、前記多型部位の塩基配列が、前記第１の塩基配列とは異なる塩基配列である核酸と、当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズする検出用プライマーの存在下で行ってもよい。この第１型検出用プライマー以外の検出用プライマーは、第２型核酸と多型部位を含む領域においてハイブリダイズする第２型検出用プライマーであることが好ましい。その他、多型部位の塩基配列が３種類以上ある多型の場合には、第２の塩基配列及び第１の塩基配列以外の塩基配列である核酸とハイブリダイズする検出用プライマーであってもよい。
【００４２】
なお、第２型検出用プライマーとしては、第１型検出用プライマーと同様、第２型核酸中の当該多型部位を含む部分領域とハイブリダイズし得るものであればよく、第２型核酸の塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、１又は数塩基のミスマッチを有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。さらに、第２型核酸とハイブリダイズする領域以外にも、５’側に付加的な塩基配列を有するものであってもよく、標識されたものであってもよい。付加的な塩基配列や標識をするための物質は、第１型検出用プライマーと同様のものが挙げられる。
【００４３】
通常、第１型検出用プライマーと第２型検出用プライマーとは、多型識別部位以外の塩基配列の大部分の領域は共通する。このため、阻害用オリゴヌクレオチドは、第１型検出用プライマーと同様に第２型検出用プライマーともハイブリダイズする。つまり、阻害用オリゴヌクレオチドによって、第２型検出用プライマーを起点とする非特異的な核酸鎖伸長反応をも抑制することができる。
【００４４】
本発明において用いられる第１型検出用プライマー、第２型検出用プライマー、及び阻害用オリゴヌクレオチドは、識別対象である多型部位及びその近傍の塩基配列に応じて、常法により設計することができる。例えば、公知のゲノム配列データやＳＮＰデータと、汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便に設計することができる。公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースであるＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）等において入手することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ, Ｓ., Ｈ.Ｊ. Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ、１９９６年、ｈｔｔｐ: //ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ.ｗｉ.ｍｉｔ.ｅｄｕ/ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ/ｏｔｈｅｒ/ｐｒｉｍｅｒ３. ｈｔｍｌ）や、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）等がある。
【００４５】
このようにして設計したプライマー等は、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、オリゴ合成メーカーに合成をされ依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。
【００４６】
次いで、この伸長工程において、第１型検出用プライマーが伸長されたか否かにより、前記被検核酸試料中に含まれている核酸の多型を識別する（識別工程）。すなわち、第１型検出用プライマーを起点とする核酸鎖伸長産物が検出された場合には、被検核酸試料中には、第１型核酸が含まれている、と判断することができる。
【００４７】
例えば、識別対象である多型が、野生型と変異型の２種類の多型を有するＳＮＰであり、第１の塩基配列を変異型の塩基配列とし、第２の塩基配列を野生型の塩基配列とした場合に、第１型検出用プライマーの核酸鎖伸長産物が検出された場合には、被検核酸試料中の核酸には、変異型アレルが含まれており、当該被検核酸試料が回収された個体は、変異型アレルのホモ型又はヘテロ型であると識別することができる。一方、識別対象である多型が体細胞変異であり、第１の塩基配列を変異型とし、第２の塩基配列を正常型の塩基配列とした場合に、第１型検出用プライマーの核酸鎖伸長産物が検出された場合には、被検核酸試料中の核酸には変異型核酸が含まれており、当該被検核酸試料が回収された個体は、体細胞変異が起こっていると判断できる。
【００４８】
識別工程における核酸鎖伸長産物の検出方法は、特に限定されるものではなく、核酸鎖伸長産物の定量的測定に用いられる公知の方法の中から、適宜選択して行うことができる。例えば、塩基長の差異を利用して、電気泳動法やカラムクロマトグラフィー法により分離して検出してもよく、ＴＯＦ−ＭＳ等の質量分析法により検出してもよい。
【００４９】
検出用プライマーとして、予め標識物質で標識されたものを用いた場合には、当該標識物質から発されるシグナルを指標として検出することができる。例えば、検出用プライマーが、蛍光物質により標識されたプライマーである場合には、核酸鎖伸長産物量と未反応のプライマー量の比率を、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下、ＦＣＳという。）、蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、以下、ＦＩＤＡという。）、及び蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ−ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ、以下、ＦＩＤＡ−ＰＯという。）からなる群より選択される１以上を用いて測定することができる。そして、この核酸鎖伸長産物量と未反応のプライマー量の比率から、核酸鎖伸長産物を検出することができる。
【００５０】
さらに、本発明の多型の識別方法において用いられる第１型検出用プライマーと阻害用オリゴヌクレオチドとをキット化することにより、より簡便に本発明の多型の識別方法を行うことができる。なお、当該キットには、その他に、核酸鎖伸長反応に用いられる酵素、反応溶液を調製するためのバッファー、ヌクレオチド等の試薬を含めてもよい。
【実施例】
【００５１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
［実施例１］
阻害用オリゴヌクレオチド存在下、又は非存在下で、ＳＳＰ−ＰＣＲを行うことにより、本発明の多型の識別方法の多型の識別精度を検証した。
具体的には、腫瘍細胞において高頻度に検出される多型であるＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子の７４６〜７５０番目のアミノ酸が欠損した変異（以下、「ＥＧＦＲ＿Ｅｘｏｎ＿１９＿Ｄｅｌ」と表記する。)を、本発明の多型の識別方法を用いて識別し、その精度を調べた。図４に、ＥＧＦＲ遺伝子の、野生型（Ｗｔ）及び変異型（Ｍｔ）における当該多型部位の周囲の塩基配列のアラインメントを示す。変異型は、１５塩基が欠損している。
【００５３】
＜検出用プライマー及び阻害用オリゴヌクレオチドの作製＞
図４に示す塩基配列に基づき、野生型核酸を検出するための野生型検出用プライマー、変異型核酸を検出するための変異型検出用プライマー、及び阻害用オリゴヌクレオチドを設計し作製した。表１にそれぞれの塩基配列を示す。なお、表中「Ｙ」は、Ｔ（チミン）又はＣ（シトシン）を示す。
具体的には、３’末端から７〜８塩基目が多型検出部位（３’末端から７塩基目が野生型遺伝子の７５０番目のアミノ酸のコドンの第１塩基に相当する塩基と、３’末端から８塩基目が野生型遺伝子の７４６番目のアミノ酸のコドンの第３塩基に相当する塩基と、それぞれハイブリダイズする部位）となり、かつ、３’末端から８塩基目よりも５’側（９塩基目以降）が共通領域（阻害用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする領域）となるように変異型検出用プライマー（２ｎｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｔ）を設計した。当該変異型検出用プライマーの５’末端の塩基には、蛍光物質ＡＴＴＯ６４７Ｎ（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ社製）を結合させ、蛍光標識プライマーとした（シグマジェノシス社製、ＨＰＬＣグレード）。
また、３’末端から６〜２２塩基目が多型検出部位となるように野生型検出用プライマー（２ｎｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｗｔ）を設計した。当該野生型検出用プライマーの５’末端の塩基には、蛍光物質ＴＡＭＲＡを結合させた（シグマジェノシス社製、ＨＰＬＣグレード）。
【００５４】
一方、変異型検出用プライマーの共通領域とハイブリダイズするように、阻害用オリゴヌクレオチドを設計し作製した。阻害用オリゴヌクレオチドは、変異型検出用プライマーの共通領域と完全に相補的なもの｛Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｏｌｉｇｏ（−）｝と、１塩基のミスマッチを含むもの｛Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｏｌｉｇｏ（＋）｝の２種類を作成した。表１の「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｏｌｉｇｏ（＋）」の配列中の下線を付した塩基がミスマッチ部位である。これらは、プライマーとして機能しないように、３’末端の塩基の水酸基をアミノ基で修飾した（シグマジェノシス社製、カートリッジ精製）。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
＜標準被検核酸試料の調製＞
本発明の多型の識別方法を用いた場合のＥＧＦＲ＿Ｅｘｏｎ＿１９＿Ｄｅｌの識別精度を検証するため、変異型核酸と野生型核酸の含有割合が既知の標準挽被検核酸試料を調製した。
まず、変異型核酸と野生型核酸を、変異型核酸の含有割合（変異型核酸と野生型核酸の総量に対する変異型核酸量の割合）がそれぞれ、０％、４％、５０％、及び１００％となるようにそれぞれ混合し、変異型核酸含有割合が既知の標準被検核酸試料系列を調製した。なお、標準被検核酸試料の調製に用いた変異型核酸及び野生型核酸は、表２に示す２種類のプライマー（１ｓｔＰＣＲ−Ｐｒｉｍｅｒ１及び１ｓｔＰＣＲ−Ｐｒｉｍｅｒ２、いずれもシグマジェノシス社製、脱塩グレード）を用いて、図５に示す塩基配列（「Ｗｔの１ｓｔＰＣＲ産物」及び「Ｍｔの１ｓｔＰＣＲ産物」）をそれぞれ有する核酸を鋳型としてＰＣＲ増幅し、得られた増幅産物の塩基配列を確認した後、プラスミドに導入したものを、それぞれ用いた。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
図５の「Ｗｔの１ｓｔＰＣＲ産物」及び「Ｍｔの１ｓｔＰＣＲ産物」の両末端の下線部は、各ＰＣＲ産物中の表２に示す２種類のプライマー由来の領域を示す。また、「Ｗｔの１ｓｔＰＣＲ産物」中の四角で囲まれた領域は、野生型検出用プライマー（２ｎｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｗｔ）がハイブリダイズする領域を示す。また、「Ｍｔの１ｓｔＰＣＲ産物」中の四角で囲まれた領域は、変異型検出用プライマー（２ｎｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｔ）がハイブリダイズする領域を、波線が付された領域が、阻害用オリゴヌクレオチド（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｏｌｉｇｏ）が変異型検出用プライマーとハイブリダイズする領域を、それぞれ示す。
【００５９】
＜１ｓｔＰＣＲ＞
一般的な遺伝子検査においては、テンプレート量を十分量とするため、多型部位を含むゲノム断片を予め増幅し、得られた増幅産物を鋳型としてＳＳＰ−ＰＣＲ等の多型を識別するための核酸鎖伸長反応を行う。
本実施例においても同様にテンプレート量を十分量とするため、調製した標準被検核酸試料をテンプレートとし、１ｓｔＰＣＲ−Ｐｒｉｍｅｒ１及び１ｓｔＰＣＲ−Ｐｒｉｍｅｒ２を用いてＰＣＲを行い、変異型核酸及び野生型核酸を増幅させた。なお、同じプライマーを用いているため、該増幅処理によっては、各試料中の変異型核酸の含有割合に影響はない。
具体的には、１０μＬの２×ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ社製）に、２μＬの標準被検核酸試料（２０ｎｇ／μＬ）をそれぞれ添加し、さらに、最終濃度が０．１μＭとなるように１ｓｔＰＣＲ−Ｐｒｉｍｅｒ１と１ｓｔＰＣＲ−Ｐｒｉｍｅｒ２とをそれぞれ添加し、純水で最終容量が２０μＬとなるように調製したものを、反応溶液とした。該反応溶液を、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を４０サイクル行い、さらに７２℃で１０分間処理する工程からなる反応条件によりＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応溶液を、増幅処理後の被検核酸試料（増幅後被検核酸試料）とした。
【００６０】
＜２ｎｄＰＣＲ（ＳＳＰ−ＰＣＲ）＞
１ｓｔＰＣＲにより増幅処理された増幅後被検核酸試料を鋳型とし、阻害用オリゴヌクレオチド存在下、又は非存在下で、ＳＳＰ−ＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を用いた。
具体的には、阻害用オリゴヌクレオチド存在下における反応は、２μＬの１０×Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)に、１μＬの増幅後被検核酸試料をそれぞれ添加し、さらに、最終濃度がそれぞれ０．０１μＭとなるように変異型検出用プライマー、野生型検出用プライマー、及び阻害用オリゴヌクレオチドを添加し、さらに１．６μＬのｄＮＴＰ  Ｂｌｅｎｄ（１０ｍＭ、ＴａＫａＲａ社製）、２μＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び０．８μＬのＳｔｏｆｆｅｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を加え、純水で最終容量が２０μＬとなるように調製したものを反応溶液とした。これらの反応溶液を、９５℃で２分間処理した後、９５℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を４０サイクル行い、さらに７２℃で１０分間処理する工程からなる反応条件によりＳＳＰ−ＰＣＲを行った。
一方、上記反応溶液において、阻害用オリゴヌクレオチドに代えて等量の純水を添加したものを、阻害用オリゴヌクレオチド非存在下における反応の反応溶液とした。これらの反応溶液を、９５℃で２分間処理した後、９５℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を４０サイクル行い、さらに７２℃で１０分間処理する工程からなる反応条件によりＳＳＰ−ＰＣＲを行った。
【００６１】
＜プライマー消費率の測定＞
２ｎｄＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで１０倍に希釈し、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下、ＦＣＳという。）により、２ｎｄＰＣＲによる変異型検出用プライマーと野生型検出用プライマーのそれぞれのプライマーの消費率（Ｋ２％）を測定した。
ここで、プライマー消費率は、下記の式により算出される値である。
【００６２】
プライマー消費率  ＝［核酸鎖伸長産物量］／［初期プライマー量］
＝［核酸鎖伸長産物量］／（［核酸鎖伸長産物量］＋［未反応のプライマー量］）
【００６３】
ＦＣＳの測定は、蛍光相関分光装置ＭＦ−２０（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いて行った。なお、測定は、１試料につき１５秒３回行い、平均値を測定結果とした。測定の結果得られた拡散時間の短い成分を未反応のプライマーとし、拡散時間の長い成分を核酸鎖伸長産物として、両者の比率を求めた後、該比率からプライマーの消費率（Ｋ２％）を算出した。
【００６４】
図６は、測定された変異型検出用プライマーの消費率（Ｋ２％）を、変異型核酸の含有割合ごとに示した図である。図中、「Ｐｎ％」は、鋳型として用いた標準被検核酸試料中の変異型核酸の含有割合がｎ％であることを意味する。また、「阻害オリゴなし」は、阻害用オリゴヌクレオチドを添加しなかった場合の結果を、「阻害オリゴ入り」は、ミスマッチのない阻害用オリゴヌクレオチド｛Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｏｌｉｇｏ（−）｝を添加した場合の結果を、「阻害オリゴ入り＋ミスマッチ」は、１塩基のミスマッチを含む阻害用オリゴヌクレオチド｛Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｏｌｉｇｏ（＋）｝を添加した場合の結果を、それぞれ示す。
【００６５】
この結果、野生型核酸のみを鋳型とした場合（Ｐ０％）においても、阻害用オリゴヌクレオチドを添加しなかった場合には、ＦＣＳ測定により分子量の大きい分子のシグナルが検出され、変異型検出用プライマーの消費率が１０％以上であり、核酸鎖伸長反応産物が生じたことが確認された。これに対して、阻害用オリゴヌクレオチドを添加した場合には、ミスマッチの有無に関わらず、変異型検出用プライマーの消費率は非常に小さかった。
一方、反応溶液中の変異型核酸の含有割合が高くなるにつれて、阻害用オリゴヌクレオチドを添加した場合には、無添加の場合と同様に変異型検出用プライマーの消費率が高くなり、変異型核酸が検出し得ることが確認された。
また、阻害用オリゴヌクレオチドを添加することにより、特異的な核酸鎖伸長反応によるシグナルが減少する傾向が観察されたが、ミスマッチを含む阻害用オリ後ヌクレオチドを用いた場合には、プライマー消費率が非常に高く、よって、阻害用オリ後ヌクレオチドにミスマッチを導入することにより、特異的な核酸鎖伸長反応によるシグナルの減少が低減できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の多型の検出方法を用いることにより、体細胞変異等の非常に高い検出感度が要求される多型も良好に検出することができるため、ＳＮＰ識別等の遺伝子検査や腫瘍関連の体細胞変異解析等の臨床検査の分野で、特に有用である。
【符号の説明】
【００６７】
１…第１型検出用プライマー、２…阻害用オリゴヌクレオチド、３…第１型核酸、３ｔ…多型部位、４…第２型核、４ｔ…多型部位、２ｍ…ミスマッチ部位。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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