(57)【要約】【課題】癌、特に転移性癌の治療に非常に有用に使用できる、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗癌剤の提供。【解決手段】本発明の抗癌剤は、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与によりアネルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させることを特徴とし、第１抗癌剤としてのｉＮＫＴ細胞リガンドと第２抗癌剤としての抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体から構成される。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与によりアネルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させ、第１抗癌剤としてのｉＮＫＴ細胞リガンドと第２抗癌剤としての抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体から構成される、抗癌剤。
【請求項２】
前記ｉＮＫＴ細胞リガンドは、α−ガラクトシルセラミド、α−グルクロノシルセラミド、ホスファチジルイノシトールテトラマンノシド、イソグロボトリヘキソシルセラミド、ガングリオシドＧＤ３、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スルファチド、β−ガラクトシルセラミド、リポホスホグリカン、グリコイノシトールホスホリピド、α−ガラクトシルセラミドの類似体であるβ−アノマーガラクトシルセラミドおよびα−アノマーガラクトシルセラミド、並びにバクテリア脂質抗原よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
前記抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項４】
前記癌は、肺癌、胃癌、肝癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、大腸癌、結腸癌、乳房癌、子宮肉腫、喇叭管癌腫、子宮内膜癌種、子宮頚部癌腫、膣癌腫、外陰部癌腫、食道癌、喉頭癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、幼年期の固型腫瘍、分化リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、第１中枢神経系リンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、および脳下垂体アデノーマよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項５】
ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与によりアネルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞に抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を処理してｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させる方法。
【請求項６】
前記ｉＮＫＴ細胞リガンドは、α−ガラクトシルセラミド、α−グルクロノシルセラミド、ホスファチジルイノシトールテトラマンノシド、イソグロボトリヘキソシルセラミド、ガングリオシドＧＤ３、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スルファチド、β−ガラクトシルセラミド、リポホスホグリカン、グリコイノシトールホスホリピド、α−ガラクトシルセラミドの類似体であるβ−アノマーガラクトシルセラミドおよびα−アノマーガラクトシルセラミド、並びにバクテリア脂質抗原よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗癌剤に係り、さらに詳しくは、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与によりアネルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させる抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫＴ）細胞は、Ｔ細胞の受容体とＮＫ細胞特異的な表面標識子を発現しており、多様な免疫疾患、例えば自己免疫疾患、感染性疾患、癌等で免疫調節作用および免疫強化作用を行っているＴ細胞である。ＮＫＴ細胞は、胸腺、肝、骨髄などの器官に多く存在し、脾臓、リンパ節、血液には少量存在する。
【０００３】
一般に、Ｔ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスIまたはＭＨＣクラスIIに提示された小さいペプチド抗原を認知するが、これに対し、ＮＫＴ細胞は、ＭＨＣクラスI様分子(MHC class 1 like-molecule)としてのＣＤ１ｄによって提示された糖脂質抗原を認識する。ＮＫＴ細胞の重要な種である第１型ＮＫＴ細胞は、不変性ナチュラルキラーＴ細胞（invariant natural killer T cells；ｉＮＫＴ細胞）とも呼ばれる。マウスの場合、Ｖα１４−Ｊα１８（ヒトの場合にはＶα２４−Ｊα１８）からなる不変性ナチュラルキラーＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。また、α−ガラクトシルセラミド（α-galactosylceramide；α−ＧＣ）などのリガンドでＴ細胞受容体に刺激を加えると、ｉＮＫＴ細胞はＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦなどの多様なサイトカインを速く生成する。このように速くて強力なリガンドに対する反応によって、ｉＮＫＴ細胞は先天的免疫反応と後天的免疫反応に関与する多様な免疫細胞の活性を統制または増強させることができる。したがって、ｉＮＫＴ細胞の免疫調節作用は、例えば抗癌効果の増進や自己免疫疾患の調節などと多様な疾患で解明されており、癌または自己免疫疾患に対する免疫治療方法の一つとして研究されている。
【０００４】
ところが、ｉＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体による１次刺激の後、反復的なリガンド刺激によってアネルギー状態に至って反応性が大幅減少するという傾向を示す。例えば、生体内でα−ＧＣで刺激を受ける場合、同じリガンドで２次刺激を与えたとき、ｉＮＫＴ細胞の分裂またはサイトカインの生成が減少する。このようなｉＮＫＴ細胞のアネルギーはｉＮＫＴ細胞を標的とした免疫治療において足かせになる。
【０００５】
一般的なＴ細胞におけるアネルギーは、Ｔ細胞受容体の刺激が補助刺激分子(co-stimulatory molecule)の不十分な刺激と共に与えられるときに起ると知られている。ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳなどの補助刺激因子がｉＮＫＴ細胞の生成および活性化に関連していることは既に知られている。最近では、４−１ＢＢが補助刺激因子としてｉＮＫＴ細胞に作用して活性化の促進に寄与し、ｉＮＫＴ細胞によって媒介されるアレルギー性肺炎症に影響を与えるという研究結果の発表がある（非特許文献１）。また、ＰＤ−１(programmed death-1)、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４などの補助阻害分子が、Ｔ細胞受容体で刺激されたＴ細胞へ抑制信号を送ることにより、Ｔ細胞を免疫性欠如または免疫耐性に陥るようにすると報告されている。また、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（lymphocytic choriomeningitis virus；ＬＣＭＶ）感染モデルにおいて抗原を積載している樹枝状細胞によってＣＤ８Ｔ細胞が免疫耐性に陥るが、この際、ＰＤ−１分子の信号伝達を阻害すると、ＣＤ８Ｔ細胞のアネルギー現象が克服されるということを確認したことがある。また、慢性感染モデルで発生する免疫能力枯渇ＣＤ８Ｔ細胞の場合にもＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断すると、その反応性が回復するということが報告されている。
【０００６】
一方、ＰＤ−１は、５５ｋＤａのI型膜貫通タンパク質であって、Ｉｇ相と遺伝子の一部を成しており、免疫グロブリン分子群に属するＴ細胞の補助阻害分子としてよく知られている。すなわち、ＰＤ−１は活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞上に発現される受容体のＣＤ２８群（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡを含む）に属する抑制因子の一員である。ＰＤ−１に対するリガンドとしてはＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２があり、これらのリガンドはＰＤ−１と結合するときにＴ細胞の活性化を下向き調節するものと知られている。ＰＤ−１は、一般的なＴ細胞では正常細胞のときに発現されず、活性化されると発現が増加するものと知られている。これに対し、ＰＤ−Ｌ１は、正常状態のＴ細胞でもある程度発現し、活性化されるとその発現が増加するものと報告されている。ＰＤ−Ｌ１は多数のヒト癌で多量発見され、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用はＴ細胞に刺激または抑制信号を伝達する。すなわち、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１間の相互作用により腫瘍侵襲性リンパ球が減少し、Ｔ細胞受容体媒介増殖が減少し、癌細胞による免疫回避現象が発生する。ＰＤ−１は、ＰＤ−１欠乏動物では多様な自己免疫性表現型、例えば自己免疫性心筋梗塞、関節炎および腎臓炎を同伴するループス様症候群が誘発されるうえ、自己免疫性脳脊髄炎、全身紅斑性ループス病、移植片対宿主病(Graft versus host disease; GVHD)、第１型糖尿病およびリウマチ性関節炎において重要な役割を果たすものとして明らかになっている。老齢のＰＤ−１欠乏マウスは、自己免疫疾患を示すことから、ＰＤ−１が自己免疫性および免疫耐性に関連して重要な役割を果たすことが示される。特に、ＰＤ−１信号は慢性感染におけるＴ細胞の免疫能枯渇の誘導に必須的である。
【０００７】
従来では、ＮＫＴ細胞のリガンドであるα−ＧＣがＴ細胞受容体を刺激してｉＮＫＴ細胞の多様なサイトカインを速く生成させることにより、抗癌剤として使用されてきた。ところが、ｉＮＫＴ細胞にα−ＣＧで反復的な刺激を与えると、アネルギー状態に至って反応性が大きく減少する傾向を示すので、効果的な抗癌効果を見せていない。したがって、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与により発生するアネルギー状態のｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させることが可能な抗癌剤の開発が切実に求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kim, D. H., W. S. Chang, Y. S. Lee, K. A. Lee, Y. K. Kim, B. S. Kwon, and C. Y. Kang. 2008. 4-1BB engagement costimulates NKT cell activation and exacerbates NKT cell ligand-induced airway hyperresponsiveness and inflammation. J Immunol 180:2062-2068.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与により発生するアネルギー状態のｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させることが可能な抗癌剤に対して研究したところ、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いてＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の信号伝達を遮断することにより、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与により発生するｉＮＫＴ細胞のアネルギー誘導を防ぐことができ、既にアネルギー状態にあるｉＮＫＴ細胞の場合にもサイトカインの分泌能力を回復させてｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させ、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫癌細胞を用いた肺転移モデルで肺結節の数を著しく減少させてｉＮＫＴ細胞の抗癌免疫反応を効果的に誘導することを見出し、本発明を完成することになった。
本発明の目的は、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与によりアネルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させることを特徴とし、第１抗癌剤としてのｉＮＫＴ細胞リガンドと第２抗癌剤としての抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体から構成される、抗癌剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与によりアネルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させることを特徴とし、第１抗癌剤としてのｉＮＫＴ細胞リガンドと第２抗癌剤としての抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体から構成される、抗癌剤を提供する。
【００１１】
また、本発明は、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与によりアネルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞に抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を処理してｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させる方法を提供する。
【００１２】
前記ｉＮＫＴ細胞リガンドは、α−ガラクトシルセラミド、α−グルクロノシルセラミド、ホスファチジルイノシトールテトラマンノシド、イソグロボトリヘキソシルセラミド、ガングリオシドＧＤ３、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スルファチド、β−ガラクトシルセラミド、リポホスホグリカン、グリコイノシトールホスホリピド、α−ガラクトシルセラミドの類似体であるβ−アノマーガラクトシルセラミドおよびα−アノマーガラクトシルセラミド、並びにバクテリア脂質抗原よりなる群から選択できる。
【００１３】
前記抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗癌剤は、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与によりアネルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させるのに効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスにα−ＧＣを投与した後、時間帯別（０時間、６時間、７２時間、７日、一ヶ月、二ヶ月）に脾臓細胞を摘出してｉＮＫＴ細胞におけるＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現程度を示すグラフである。
【図２】正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓細胞を摘出し、脾臓細胞を対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体の存在下にα−ＧＣと共に培養した後、上澄み液で生成されるＩＦＮ−γとＩＬ−４の量をＥＬＩＳＡによって測定して示すグラフである（インビトロ）。
【図３】正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ２抗体を腹腔注射し、２４時間後にα−ＧＣを投与した後、０時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間後に血清を得、血液内ＩＦＮ−γとＩＬ−４の量をＥＬＩＳＡによって測定して示すグラフである（インビボ）。
【図４】図３で血液内ＩＦＮ−γとＩＬ−４がｉＮＫＴ細胞に由来したものかを確認するために、細胞内サイトカイン染色法を用いてＩＦＮ−γ＋またはＩＬ−４＋ｉＮＫＴ細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示す図である。
【図５】正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスにα−ＧＣを投与してｉＮＫＴ細胞のアネルギーを誘導した後、７日および一ヶ月の後に脾臓細胞を摘出し、脾臓細胞を対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体の存在下にα−ＧＣと共に培養した後、上澄み液で生成されるＩＦＮ−γとＩＬ−４の量をＥＬＩＳＡによって測定して示すグラフである（インビトロ）。
【図６】正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ２抗体を腹腔注射し、２４時間後にα−ＧＣを投与した後、１４日目にα−ＧＣを再投与し、２時間および１２時間の後に血清を得、血液内ＩＦＮ−γとＩＬ−４の量をＥＬＩＳＡによって測定して示すグラフである（インビボ）。
【図７】２時間後に得た脾臓細胞を用いて細胞内サイトカイン染色法を用いてＩＦＮ−γ＋またはＩＬ−４＋ｉＮＫＴ細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示す図である（インビボ）。
【図８】１２時間後に得た脾臓細胞を用いてｉＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞におけるＣＤ６９発現をフローサイトメトリーで測定した図である（インビボ）。
【図９】正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を腹腔注射し、２４時間後に皮膚癌細胞を静脈注射した後、０日、４日、８日目に対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と共にα−ＧＣを投与した後、１４日後に肺の重量を測定し、転移された肺と通常の肺との重量差異をグラフによって示す図である。
【図１０】正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を腹腔注射し、２４時間後にα−ＧＣを投与した後、７日後に皮膚癌細胞を静脈注射し、０日、４日、８日目にα−ＧＣを投与した後、１４日後に肺を分離し、癌細胞転移によって発生した肺結節の数（Ａ）および分離した肺を光学顕微鏡によって観察した図（Ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の信号伝達を遮断することにより、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与により発生するｉＮＫＴ細胞のアネルギー誘導を防ぐことができ、既にアネルギー状態にあるｉＮＫＴ細胞の場合にもサイトカインの分泌能力を回復させてｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させることができる。また、本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫癌細胞を用いた肺転移モデルでｉＮＫＴ細胞のアネルギー誘導を阻害して肺結節の数を著しく減少させることにより、ｉＮＫＴ細胞の抗癌免疫反応を効果的に誘導することができるうえ、優れた癌転移抑制効果を有する。したがって、本発明に係る抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗癌剤は、癌、特に転移性癌の治療に非常に有用に使用できる。
【００１８】
前記癌は、人体の各種癌、婦人科腫瘍、内分泌系癌、中枢神経系腫瘍、輸尿管癌などがあり、具体的には、肺癌、胃癌、肝癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、大腸癌、結腸癌、乳房癌、子宮肉腫、喇叭管癌腫、子宮内膜癌種、子宮頚部癌腫、膣癌腫、外陰部癌腫、食道癌、喉頭癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、幼年期の固型腫瘍、分化リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、第１中枢神経系リンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫または脳下垂体アデノーマを含む。
【００１９】
本発明の組成物は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と共に、抗癌効果を有する公知の有効成分を少なくとも１種含有することができる。
【００２０】
本発明の組成物は、投与のために、前述した有効成分以外に、薬学的に許容される担体をさらに少なくとも１種含んで製造することができる。薬学的に許容される担体は、食塩水、滅菌水、リンガー溶液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれら成分の少なくとも１成分を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を加えることができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。ひいては、当分野の適正な方法、または文献『Remington's Pharmaceutical Science（最近版）, Mack Publishing Company, Easton PA』に開示されている方法を用いて、各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００２１】
本発明の組成物は、目的の方法に応じて経口投与または非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）を行うことができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などに応じてその範囲が多様である。前記抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１日投与量が約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、１日１回〜数回にわたって投与することがさらに好ましい。
【００２２】
本発明の組成物は、癌の予防および治療のために、単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療および生物学的反応調節剤を使用する方法と併用することができる。
【００２３】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかし、下記実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
ｉＮＫＴ細胞におけるＰＤ−１およびＰＤリガンドの発現
１．実験動物
６〜８週齢の雌Ｃ５６ＢＬ／６マウスをオリエントバイオから購入した。全てのマウスは病原体のない特殊環境で飼育された。
【００２５】
２．試薬および抗体
α−ＧＣは０．５％ツイン２０含有のＰＢＳに溶かした。マウスのＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４、ラット ＩｇＧ２ａ）、ＰＤ−Ｌ１（ＭＩＨ−５、ラット ＩｇＧ２ａ）、ＰＤ−Ｌ２（Ｔｙ２５、ラット ＩｇＧ２ａ）に対する阻害抗体を生産する融合細胞は、ヤマザキなどの方法で生産された[Yamazaki, T., H. Akiba, H. Iwai, H. Matsuda, M. Aoki, Y. Tanno, T. Shin, H. Tsuchiya, D. M. Pardoll, K. Okumura, M. Azuma, and H. Yagita. 2002. Expression of programmed death 1 ligands by murine T cells and APC. J Immunol 169:5538-5545.; Tsushima, F., H. Iwai, N. Otsuki, M. Abe, S. Hirose, T. Yamazaki, H. Akiba, H. Yagita, Y. Takahashi, K. Omura, K. Okumura, and M. Azuma. 2003. Preferential contribution of B7-H1 to programmed death-1-mediated regulation of hapten-specific allergic inflammatory responses. Eur J Immunol 33:2773-2782.; Yamazaki, T., H. Akiba, A. Koyanagi, M. Azuma, H. Yagita, and K. Okumura. 2005. Blockade of B7-H1 on macrophages suppresses CD4+ T cell proliferation by augmenting IFN-gamma-induced nitric oxide production. J Immunol 175:1586-1592.]。全てのクローンは１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を含有したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地で培養した。全ての抗体はカプリル酸を用いた精製によってヌードマウスの腹水から得た。対照ラットＩｇＧは正常ラットの血清から同一の方法で得た。
【００２６】
３．α−ＧＣ投与後のｉＮＫＴ細胞におけるＰＤ−１およびＰＤリガンドの発現
正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２μｇのα−ＧＣを投与した後、時間帯別（０時間、６時間、７２時間、７日、一ヶ月、二ヶ月）に脾臓細胞を摘出した。細胞は、ＰＥ結合抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、ＰＥ−結合抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体、ＰＥ−結合抗ＰＤ−Ｌ２モノクローナル抗体、ＰＥ結合同型対照モノクローナル抗体でそれぞれ染色した。ｉＮＫＴ細胞は、Ｂ２２０―ＴＣＲ−βｉｎｔα−ＧＣ／ＣＤ１ｄ：Ｉｇ＋である細胞と指定した。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２の発現（白色グラフ）はＦＡＣＳによって測定した。その結果は図１に示し、灰色グラフは同型対照モノクローナル抗体の発現結果である。
【００２７】
図１に示すように、正常状態のｉＮＫＴ細胞におけるＰＤ−１は少ない水準で発現されており、活性化された後にはその発現が増加した。このような増加した性向は２ヶ月間持続した。これに対し、ＰＤ−Ｌ１は、正常状態のｉＮＫＴ細胞で発現されていて、活性化された後にはしばらく増加し、さらに正常状態の水準に戻る傾向を示した。ＰＤ−Ｌ２はｉＮＫＴ細胞で発現されないものと確認された。
【実施例２】
【００２８】
実施例２：ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２がｉＮＫＴ細胞の活性化に及ぼす影響
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２がｉＮＫＴ細胞の活性化に及ぼす影響を確認するために、インビトロおよびインビボで次の実験を行った。
【００２９】
１．インビトロにおけるｉＮＫＴ細胞の活性化
正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓細胞を摘出し、摘出した脾臓細胞５×１０５を５０μｇ／ｍＬの対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ２抗体の存在下に１００ｎｇ／ｍＬのα−ＧＣと共に３日間培養した。その後、上澄み液を回収してＩＦＮ−γとＩＬ−４をＥＬＩＳＡによって測定した。その結果は図２に示した。
【００３０】
図２に示すように、抗ＰＤ−１抗体を加えた場合、ＩＦＮ−γの分泌が対照ＩｇＧに比べて大きく増加した。ＩＬ−４も、少ないが、有意的に増加する傾向を示した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体を加えた場合にはＩＦＮ−γの分泌が増加し、抗ＰＤ−Ｌ２抗体を加えた場合にはあまり影響がないことを確認した。
【００３１】
２．インビボにおけるｉＮＫＴ細胞の活性化
正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２００μｇの対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ２抗体を腹腔注射し、２４時間後に２μｇのα−ＧＣを投与した。０時間、２時間、６時間、１２時間、４８時間、７２時間後に血清を得、血液内ＩＦＮ−γとＩＬ−４の数値をＥＬＩＳＡによって測定した。
【００３２】
また、血液内で増加したＩＦＮ−γが明確にｉＮＫＴ細胞に由来したものかを確認するために、細胞内サイトカイン染色法を用いてフローサイトメトリーで分析した。すなわち、α−ＧＣ投与２時間後に脾臓細胞を摘出し、提出した脾臓細胞５×１０６をゴルジプラグ(Golgi plug)と共に２時間培養してサイトカインを蓄積させた。細胞内サイトカイン染色はＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓ ｗｉｔｈ Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇ ｋｉｔを使用し、製作者のプロトコル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に応じて進行した。ｉＮＫＴ細胞はＢ２２０―ＴＣＲ−βｉｎｔα−ＧＣ／ＣＤ１ｄ：Ｉｇ＋の細胞と指定した後、ＩＦＮ−γ＋またはＩＬ−４＋ｉＮＫＴ細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【００３３】
血液内ＩＦＮ−γとＩＬ−４の数値は図３に示し、ＩＦＮ−γ＋またはＩＬ−４＋ｉＮＫＴ細胞をフローサイトメトリーで分析した結果は図４に示した。
【００３４】
図３に示すように、α−ＧＣを投与した後、ｉＮＫＴ細胞が活性化されると、血液内ＩＦＮ−γは１２時間以内に最高値を示し、ＩＬ−４は２時間以内に最高値を示した。抗ＰＤ−１抗体または抗−ＰＤ−Ｌ１抗体を投与した場合、最高点における血液内ＩＦＮ−γの量が対照群よりさらに大きく増加することを確認した。ところが、ＩＬ−４の場合は若干の差異を示したが、有意的な結果を示してはいない。
【００３５】
また、図４に示すように、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体によって相互作用を遮断した場合、ＩＦＮ−γを生産しているｉＮＫＴ細胞が対照群に比べて増加していることを確認した。これに対し、ＩＬ−４を生産するｉＮＫＴ細胞は、対照群とは大きい差異を示していない。したがって、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断すると、ｉＮＫＴ細胞の活性化中に補助阻害信号を伝達してｉＮＫＴ細胞のＩＦＮ−γの分泌を増加させるということが分かる。
【実施例３】
【００３６】
ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の相互作用の遮断がアネルギー状態のｉＮＫＴ細胞の反応性回復に及ぼす影響
ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断すると、アネルギー状態であるｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させることができるかを確認するために、インビトロおよびインビボで次の実験を行った。
【００３７】
１．インビトロにおけるアネルギー状態のｉＮＫＴ細胞の反応性回復
α−ＧＣによって反応性が低くなる現象は、α−ＧＣ投与後３日から現れ始め７〜３０日まで持続的に確認された。したがって、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２μｇのα−ＧＣを投与してｉＮＫＴ細胞のアネルギーを誘導した後、７日および一ヶ月の後に脾臓細胞を摘出した。摘出した脾臓細胞５×１０５を５０μｇ／ｍＬの対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＰＤ−Ｌ２抗体の存在下に１００ｎｇ／ｍＬのα−ＧＣと共に３日間培養した。正常マウスから得た脾臓細胞も１００ｎｇ／ｍＬのα−ＧＣの存在下に３日間培養し、これを「活性化(activation)」と表示した。その後、上澄み液を回収してＩＦＮ−γとＩＬ−４をＥＬＩＳＡによって測定した［＊：ｐ＜０．０５および＊＊：ｐ＜０．０１（対照ラットＩｇＧに対して）］。その結果は図５に示した。
【００３８】
図５に示すように、７日前にα−ＧＣを予め処理してｉＮＫＴ細胞のアネルギーを誘導したマウスの脾臓細胞は、対照ＩｇＧと共にさらにα−ＧＣで刺激を与えると、ＩＦＮ−γとＩＬ−４の生産が大きく減少することを確認した。これに対し、ｉＮＫＴ細胞のアネルギーが誘導された状態の脾臓細胞を抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と共にα−ＧＣでさらに刺激する場合、ＩＦＮ−γとＩＬ−４の生産が大きく増加することを確認した（Ａ）。また、このような傾向は１ヶ月〜２ヶ月間持続された（Ｂ）。したがって、α−ＧＣによる再刺激の際に、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断すると、アネルギー状態であるｉＮＫＴ細胞の非反応性を克服することができるものと思われる。
【００３９】
２．インビボにおけるアネルギー状態のｉＮＫＴ細胞の反応性回復
正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２００μｇの対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を腹腔注射し、２４時間後に２μｇのα−ＧＣを投与した。その後、１４日目に２μｇのα−ＧＣを再投与した。α−ＧＣの再投与２時間後および１２時間後に血清を得た。２時間後に得た血清ではＩＬ−４の数値を、１２時間後に得た血清ではＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによって測定した。
【００４０】
また、α−ＧＣ再投与２時間後および１２時間後に摘出した脾臓細胞５×１０６をゴルジプラグと共に２時間培養してサイトカインを蓄積させた。２時間後に得た脾臓細胞は、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓ ｗｉｔｈ Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇ ｋｉｔを用いた細胞内サイトカイン染色に使用した。１２時間後に得た脾臓細胞は、ｉＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞におけるＣＤ６９発現の測定に使用した。ｉＮＫＴ細胞はＢ２２０―ＴＣＲ−βｉｎｔα−ＧＣ／ＣＤ１ｄ：Ｉｇ＋である細胞と指定し、ＮＫ細胞はＢ２２０―ＴＣＲ−β―ＮＫ１．１ｈｉｇｈである細胞と指定した。ＩＦＮ−γ＋またはＩＬ−４＋ｉＮＫＴ細胞をフローサイトメトリーで分析し、ｉＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞におけるＣＤ６９発現はフローサイトメトリーで測定した。
血液内ＩＦＮ−γとＩＬ−４の数値は図６に示し、ＩＦＮ−γ＋またはＩＬ−４＋ｉＮＫＴ細胞をＦＡＣＳによって分析した結果は図７に示し、ｉＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞におけるＣＤ６９発現は図８に示した。
図６に示すように、対照ラットＩｇＧと一番目のα−ＧＣの投与後、２番目のα−ＧＣ投与によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の分泌は著しく減少し、抗ＰＤ−１抗体と一番目のα−ＧＣの投与後、２番目のα−ＧＣ投与によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の分泌は大きく増加した。
また、図７に示すように、サイトカインの分泌がｉＮＫＴ細胞で起ることを確認した。
また、図８に示すように、抗ＰＤ−１抗体と一番目のα−ＧＣを投与した後、２番目のα−ＧＣを投与した場合、ＣＤ６９発現がｉＮＫＴ細胞とＮＫ細胞で同一に増加した。したがって、ｉＮＫＴ細胞のアネルギー誘導におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用が重要な役割を果たすものと思われる。
【実施例４】
【００４１】
抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体が活性化されたｉＮＫＴ細胞の抗癌効果に及ぼす影響
抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体がＢ１６Ｆ１０黒色腫癌細胞を用いた肺転移モデルで活性化されたｉＮＫＴ細胞の抗癌効果に及ぼす影響を調べるために、次の実験を行った。
１．肺の重量測定
皮膚癌細胞（Ｂ１６Ｆ１０、ＡＴＣＣ）は１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有したＤＭＥＭ培地で培養した。Ｃ５６ＢＬ／６マウスに２００μｇの対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を腹腔注射し、２４時間後に皮膚癌細胞（Ｂ１６Ｆ１０）２×１０５を静脈注射で接種した。その後、０日、４日、８日目に２００μｇの対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と共に５００ｎｇのα−ＧＣを投与した。１４日後に肺の重量を測定し、転移された肺と通常の肺との重量差をグラフによって図９に示した。
【００４２】
図９に示すように、抗ＰＤ−１抗体と共にα−ＧＣを投与した場合、癌細胞が転移された肺の重量が対照ラットＩｇＧと共にα−ＧＣを投与した場合より大きく減少したことを確認した。
【００４３】
２．肺結節の数測定
アネルギーが誘導されたｉＮＫＴ細胞の抗癌効果回復を測定するために、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２００μｇの対照ラットＩｇＧ、抗ＰＤ−１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を腹腔注射し、２４時間後に２μｇのαＧＣを投与してアネルギーを誘導した。７日後に皮膚癌細胞（Ｂ１６Ｆ１０）５×１０５を静脈注射した後、０日、４日、８日目に５００ｎｇのα−ＧＣを処理してｉＮＫＴ細胞の抗癌効果を誘導した。１４日後に肺を分離した後、癌細胞転移により発生した肺結節の数を数えた（Ａ）。そして、分離した肺を光学顕微鏡によって観察した（Ｂ）。その結果は図１０に示した。
【００４４】
図１０に示すように、対照ＩｇＧを処理し、α−ＧＣを投与してｉＮＫＴ細胞のアネルギーを誘導した場合には、アネルギー状態がそのまま維持されて通常の癌転移対照群とほぼ類似した結果を示すことにより、正常な抗癌効果を見せていない。これに対し、抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体を処理してα−ＧＣによるアネルギーの誘導を防いだ場合には、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫癌細胞を用いた肺転移モデルで肺結節の数を著しく減少させてｉＮＫＴ細胞の抗癌効果を著しく増加させ、優れた癌転移抑制効果を示すことを確認した。よって、ｉＮＫＴ細胞のアネルギー誘導の際に抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を処理してＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の信号伝達を遮断すると、ｉＮＫＴ細胞の抗癌効果を持続させることができることが分かる。
【００４５】
次に、本発明の組成物のための製剤例を例示する。
【００４６】
製剤例１：散剤の製造
抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体           ０．１ｇ
乳糖                                           １．５ｇ
タルク                                         ０．５ｇ
これらの成分を混合し、気密布に充填して散剤を製造した。
製剤例２：錠剤の製造
抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体           ０．１ｇ
ラクトース                                     ７．９ｇ
結晶性セルロース                               １．５ｇ
ステアリン酸マグネシウム                       ０．５ｇ
これらの成分を混合した後、直接打錠法(direct tableting method)によって錠剤を製造した。
製剤例３：カプセル剤の製造
抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体           ０．１ｇ
トウモロコシ澱粉                               ５ｇ
カルボキシセルロース                                  ４．９ｇ
これらの成分を混合して粉末を製造した後、前記粉末を通常のカプセル剤の製造方法に応じて硬質カプセルに充填してカプセル剤を製造した。
製剤例４：注射剤の製造
抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体           ０．１ｇ
注射用滅菌蒸留水                               適量
ｐＨ調節剤                                     適量
通常の注射剤の製造方法によって１アンプル当り（２ｍＬ）前記成分含量で製造した。
製剤例５：液剤の製造
抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体           ０．１ｇ
異性化糖                                       １０ｇ
マンニトール                                   ５ｇ
精製水                                         適量
通常の液剤の製造方法によって精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適量加えた後、前記の成分を混合した。その後、精製水を加えて全体１００ｍＬに調節した後、茶色瓶に充填し、滅菌させて液剤を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の信号伝達を遮断することにより、ｉＮＫＴ細胞リガンドの投与により発生するｉＮＫＴ細胞のアネルギー誘導を防ぐことができ、既にアネルギー状態にあるｉＮＫＴ細胞の場合にもサイトカインの分泌能力を回復させてｉＮＫＴ細胞の反応性を回復させ、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫癌細胞を用いた肺転移モデルで肺結節の数を著しく減少させてｉＮＫＴ細胞の抗癌免疫反応を効果的に誘導することができるうえ、優れた癌転移抑制効果を示す。よって、本発明に係る抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗癌剤は、癌、特に転移性癌の治療に非常に有用に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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