(57)【要約】      （修正有）【課題】発症前および臨床的アルツハイマー病の診断を可能にするアッセイを提供する。試験は被験者にある抗Ａβ抗体を投与した後のアミロイドβ（Ａβ）ペプチドレベルを評価する。【解決手段】発症前および臨床的アルツハイマー病の診断テストは、Ａβ40、Ａβ42の血漿レベル、それらの比率またはＡβを隔絶する抗体を投与した後のそれらの侵入速度に基づく。これらのうちのいずれかのパラメーターのコントロール値からの変化によって、発症前または臨床的アルツハイマー病を同定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における臨床的および発症前アルツハイマー病の診断用キットであって、以下のアミノ酸配列：
軽鎖ＣＤＲ１：
2010044078.tif 000024
軽鎖ＣＤＲ２：
2010044078.tif 000025
軽鎖ＣＤＲ３：
2010044078.tif 000026
重鎖ＣＤＲ１：
2010044078.tif 000027
重鎖ＣＤＲ２：
2010044078.tif 000028
および重鎖ＣＤＲ３：
2010044078.tif 000029
を有するヒト化抗体を含む容器、ならびに
（ａ）少なくとも１つの測定値を得るために、被験者に抗体を投与した後の予め選択した時間間隔で得た被験者の血液サンプル中の１つ以上の下記成分を測定し、
（１）循環Ａβ40のレベル
（２）循環Ａβ42のレベル
（３）循環Ａβ42のレベルに対する循環Ａβ40のレベルの比率
（ｂ）少なくとも１つの測定値を予め選択したコントロール値と比較し、
（ｃ）コントロール値と比較して上昇した測定値という既定の基準に基づいて、該被験者をアルツハイマー病の発症前または臨床的段階であると同定するための一連の指示を包含する、抗体を投与するための指示書を含むキット。
【請求項２】
被験者における臨床的および発症前アルツハイマー病の診断用キットであって、以下の配列：
2010044078.tif 000030
ここで：
第２位のＸａａはＶａｌまたはＩｌｅである；
第７位のＸａａはＳｅｒまたはＴｈｒである；
第１４位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである；
第１５位のＸａａはＬｅｕまたはＰｒｏである；
第３０位のＸａａはＩｌｅまたはＶａｌである；
第５０位のＸａａはＡｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓである；
第８８位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである；
第１０５位のＸａａはＧｌｎまたはＧｌｙである；
第１０８位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである；および
第１０９位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである；
を有する軽鎖可変領域；および
以下の配列：
2010044078.tif 000031
ここで：
第１位のＸａａはＧｌｕまたはＧｌｎである；
第７位のＸａａはＳｅｒまたはＬｅｕである；
第４６位のＸａａはＧｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＳｅｒである；
第６３位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである；
第７５位のＸａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＴｈｒである；
第７６位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである；
第８９位のＸａａはＧｌｕまたはＡｓｐである；および
第１０７位のＸａａはＬｅｕまたはＴｈｒである；
を含む重鎖可変領域；
を含むヒト化抗体を含む容器、ならびに
（ａ）少なくとも１つの測定値を得るために、被験者に抗体を投与した後の予め選択した時間間隔で得た被験者の血液サンプル中の１つ以上の下記成分を測定し、
（１）循環Ａβ40のレベル
（２）循環Ａβ42のレベル
（３）循環Ａβ42のレベルに対する循環Ａβ40のレベルの比率
（ｂ）少なくとも１つの測定値を予め選択したコントロール値と比較し、
（ｃ）コントロール値と比較して上昇した測定値という既定の基準に基づいて、該被験者をアルツハイマー病の発症前または臨床的段階であると同定するための一連の指示を包含する、抗体を投与するための指示書を含むキット。
【請求項３】
血液中のＡβ40および／またはＡβ42のレベルを評価するための試薬をさらに含む請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
正常な被験者の血液中のＡβ40レベル、Ａβ42レベルまたはＡβ40／Ａβ42比率のコントロール値の説明書をさらに含む請求項１または２に記載のキット。
【請求項５】
循環Ａβ40、循環Ａβ42の測定値の上昇、または循環Ａβ42のレベルに対する循環Ａβ40のレベルの比率の上昇を同定する方法であって、
（ａ）以下のアミノ酸配列：
軽鎖ＣＤＲ１：
2010044078.tif 000032
軽鎖ＣＤＲ２：
2010044078.tif 000033
軽鎖ＣＤＲ３：
2010044078.tif 000034
重鎖ＣＤＲ１：
2010044078.tif 000035
重鎖ＣＤＲ２：
2010044078.tif 000036
および重鎖ＣＤＲ３：
2010044078.tif 000037
を有するヒト化抗体をアルツハイマー病の臨床的または発症前段階にある被験者の血液中の循環Ａβペプチドのレベルを変更するのに有効な量で被験者に投与した後の、予め選択された時間間隔で得た被験者の血液サンプル中の１つ以上の下記成分を測定し、
（１）循環Ａβ40のレベル
（２）循環Ａβ42のレベル
（３）循環Ａβ42のレベルに対する循環Ａβ40のレベルの比率
（ｂ）各測定値を予め選択したコントロール値と比較することを含む方法。
【請求項６】
循環Ａβ40、循環Ａβ42の測定値の上昇、または循環Ａβ42のレベルに対する循環Ａβ40のレベルの比率の上昇を同定する方法であって、
（ａ）以下の配列：
2010044078.tif 000038
ここで：
第２位のＸａａはＶａｌまたはＩｌｅである；
第７位のＸａａはＳｅｒまたはＴｈｒである；
第１４位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである；
第１５位のＸａａはＬｅｕまたはＰｒｏである；
第３０位のＸａａはＩｌｅまたはＶａｌである；
第５０位のＸａａはＡｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓである；
第８８位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである；
第１０５位のＸａａはＧｌｎまたはＧｌｙである；
第１０８位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである；および
第１０９位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである；
を有する軽鎖可変領域；および
以下の配列：
2010044078.tif 000039
ここで：
第１位のＸａａはＧｌｕまたはＧｌｎである；
第７位のＸａａはＳｅｒまたはＬｅｕである；
第４６位のＸａａはＧｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＳｅｒである；
第６３位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである；
第７５位のＸａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＴｈｒである；
第７６位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである；
第８９位のＸａａはＧｌｕまたはＡｓｐである；および
第１０７位のＸａａはＬｅｕまたはＴｈｒである；
を含む重鎖可変領域；
を含むヒト化抗体をアルツハイマー病の臨床的または発症前段階にある被験者の血液中の循環Ａβペプチドのレベルを変更するのに有効な量で被験者に投与した後の、予め選択された時間間隔で得た被験者の血液サンプル中の１つ以上の下記成分を測定し、
（１）循環Ａβ40のレベル
（２）循環Ａβ42のレベル
（３）循環Ａβ42のレベルに対する循環Ａβ40のレベルの比率
（ｂ）各測定値を予め選択したコントロール値と比較することを含む方法。
【請求項７】
循環Ａβ40、循環Ａβ42の測定値の上昇、または循環Ａβ42のレベルに対する循環Ａβ40のレベルの比率の上昇を同定する方法であって、
（ａ）以下の配列：
2010044078.tif 000040
ここで：
第２位のＸａａはＶａｌまたはＩｌｅである；
第７位のＸａａはＳｅｒまたはＴｈｒである；
第１４位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである；
第１５位のＸａａはＬｅｕまたはＰｒｏである；
第３０位のＸａａはＩｌｅまたはＶａｌである；
第５０位のＸａａはＡｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓである；
第８８位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである；
第１０５位のＸａａはＧｌｎまたはＧｌｙである；
第１０８位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである；および
第１０９位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである；
を有する軽鎖可変領域；および
以下の配列：
2010044078.tif 000041
ここで：
第１位のＸａａはＧｌｕまたはＧｌｎである；
第７位のＸａａはＳｅｒまたはＬｅｕである；
第４６位のＸａａはＧｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＳｅｒである；
第５６位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５７位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもなく、第５９位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第５６位のＸａａはＡｓｎではない；
第５７位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５６位のＸａａがＡｓｎであり、第５８位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第５７位のＸａａはＡｓｐまたはＰｒｏである；および
第５８位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５６位のＸａａがＡｓｎであり、第５７位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもない場合、第９位のＸａａはＳｅｒでもＴｈｒでもない
第６３位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである；
第７５位のＸａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＴｈｒである；
第７６位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである；
第８９位のＸａａはＧｌｕまたはＡｓｐである；および
第１０７位のＸａａはＬｅｕまたはＴｈｒである
を含む重鎖可変領域；
を含むヒト化抗体をアルツハイマー病の臨床的または発症前段階にある被験者の血液中の循環Ａβペプチドのレベルを変更するのに有効な量で被験者に投与した後の、予め選択された時間間隔で得た被験者の血液サンプル中の１つ以上の下記成分を測定し、
（１）循環Ａβ40のレベル
（２）循環Ａβ42のレベル
（３）循環Ａβ42のレベルに対する循環Ａβ40のレベルの比率
（ｂ）各測定値を予め選択したコントロール値と比較することを含む方法。
【請求項８】
予め選択した時間間隔が、２４時間以内である請求項５〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
予め選択した時間間隔が、３時間以内である請求項５〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
被験者がヒトであり、抗体が抗体断片である請求項５〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
ヒト化抗体が、配列番号１１で示される軽鎖および配列番号１２で示される重鎖を含む請求項５〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
ヒト化抗体が、配列番号１１で示される軽鎖および配列番号１６で示される重鎖を含む請求項５〜７のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連特許）
本出願は、米国仮出願である２００１年１０月２３日出願の６０／３３４,９８７、２００１年８月１７日出願の米６０／３１３,２２１および２００１年８月１７日出願の６０／３１３,２２４（これらの開示内容は引用により本明細書中に包含される）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、発症前および臨床的アルツハイマー病の診断を可能にするアッセイに関する。テストは、被験者にある抗Ａβ抗体を投与した後のアミロイドベータ(Ａβ)ペプチドのレベルを評価することに頼っている。
【背景技術】
【０００３】
認識欠損、発作、脳出血および全般的精神衰弱を生じさせる多くの総合的症状は、アミロイドベータペプチド（Ａβ）を含有する脳内の神経突起および脳血管プラークと関連すると思われる。これらの症状には、前臨床的および臨床的なアルツハイマー疾患、ダウン症候群、および前臨床的および臨床的な脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）がある。アミロイドプラークは、アミロイドベータペプチドから形成される。これらのペプチドは、血中および脳脊髄液（ＣＳＦ）中を循環する。循環型のＡβペプチドは、共通前駆体タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（しばしばＡＰＰと称される）の分解により生じた３９〜４３アミノ酸（ほとんどが４０または４２アミノ酸）から構成される。
【０００４】
Ａβが脳および血液の間を行きつ戻りつして輸送され得ることを示唆する証拠がある（Ghersi-Egea, J-F.ら、J. Neurochem. (1996) 67: 880-883; Zlokovic, B. V.ら、Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67: 1034-1040; Shibata Mら、J. Clin, Invest. (2000) 106: 1489-1499）。さらに、プラーク中のＡβは、脳および血液内の可溶性Ａβと平衡状態にある（Kawarabayashi Tら、J. Neurosci. (2001) 21: 372-381）、DeMattosら、Proc. Natl.Acad. Sci USA (2001) 98:8850-8855。
【０００５】
引用により本明細書中に包含されるＰＣＴ出願ＵＳ００／３５６８１および米国第０９／１５３,１３０号に記載されるように、ＣＳＦ中のＡβペプチドのトータル循環レベルは、正常な個体およびアルツハイマーの症状を示す傾向がある個体において同様である。しかし、Ａβ42レベルは、アルツハイマー疾患を有する個体において平均的に少ない（Nitsch, R. M.ら、Ann. Neurol. (1995) 37: 512-518）。Ａβ42がＡβ40より凝集する傾向があることが既知であり、これが起こると、アミロイドプラーク中のＡβ蓄積、Ａβの毒性可溶型への変換、神経細胞の損傷および痴呆のような行動上の障害のような有害な結果が生じる（Golde, T. E.ら、Biochem. Biophys. Acta. (2000) 1502: 172-187）。
【０００６】
２００１年２月２６日出願の「Ａβペプチドを隔絶するヒト化抗体」と題するＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０６１９１（この開示内容は引用により本明細書中に包含される）は、血液脳関門をかなりの程度で横切らず、体液中を循環するＡβペプチドを隔絶する抗体を記載する。これらの抗体は、脳内のＡβ含有拡散性、神経突起および脳血管プラークの形成に関連するコンディションの予防および治療的処置に有用であると記載される。本出願は、抗体を投与し、次いで、治療の進展を評価するために、血液中のＡβペプチドの循環レベルを測定することを記載する。しかし、抗体を投与した後のＡβペプチドのレベルがそのコンディションの診断に役立つという明確な示唆はない。本発明は、個体に抗体が投与されると、Ａβ40およびＡβ42の両方の増大されたレベルならびにＡβ40／Ａβ42比率が、脳内のＡβペプチド蓄積のレベルに相関するという驚くべき結果に属するものである。したがって、抗体を投与した後の血液中のこれらの成分の測定は、臨床的および発症前のアルツハイマー病および関連する神経障害のための単純で簡単な診断テストを提供する。
【０００７】
Ａβペプチド抗体の性質に関するさらなる関連文献がある。たとえば、
１９９９年６月１０日公開のＰＣＴ公開ＷＯ９９／２７９４４には、アミロイド蓄積を減少させるための免疫応答を誘導する方法が記載されている。１９９９年１１月２５日公開のＷＯ９９／６００２４には、抗アミロイド抗体を用いるアミロイド除去のための方法が記載されている。ＷＯ００／７２８８０、ＷＯ００／７２８７６およびＷＯ００／７７１７８などのさらに他のＰＣＴ公開公報には、種々の抗Ａβペプチド抗体が記載されている。このペプチドのＮ末端に結合する抗体は、トランスジェニックマウスモデルにおいてプラークを減少させると言われている。アミロイド自体による免疫感作が、ペプチドの加水分解を触媒するように設計された抗体であると記載されている。
【０００８】
Ａβ代謝に関する一経路は、ＣＮＳから血漿への輸送を介するものであることが示されている（Zlokovic, B. V.ら、Proc. Natl. Acad. Sci (USA) (1996) 93: 4229-4234; Ghersi-Egea, J-F.ら、J. Neurochem. (1996) 67: 880-883）。さらに、血漿中のＡβが血液脳関門を横切って脳にはいることができることが示されている（Zolkovic, B. V.ら、Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67: 1034-1040）。また、アルツハイマー疾患のＡＰＰＶ７１７Ｆトランスジェニックマウスモデルにおいて、特定のポリクローナルおよびモノクローナルＡβ抗体を投与するとアミロイドプラーク中のＡβ蓄積が減少することが示されている（Bard, F.ら、Nature Med. (2000)6:916-919）。しかしこれは、特定の抗Ａβ抗体が血液脳関門を横切り、アミロイドプラークのミクログリア細胞による貪食を刺激したせいであると言われた。Bardの実験では、脳スライスのエクスビボアッセイにより、外部から加えられたミクログリアとともに添加Ａβ抗体が存在することがＡβの貪食を誘導し、結果的にＡβ蓄積の除去を導くことが示された。
【０００９】
ＣＳＦおよび血液中の可溶性Ａβ４０およびＡβ４２両者のレベルは、Ａβ鎖に沿ったエピトープに対する抗体を用いる標準化されたアッセイにより容易に検出できる。このようなアッセイは、たとえば、米国特許５,７６６,８４６；５,８３７,６７２；および５,５９３,８４６中に報告されている。これらの特許は、Ａβペプチドの中央ドメインに対するマウスモノクローナル抗体の作成を記載しており、これらは、第１６位および第１７位まわりおよびこれらを含むエピトープを有することが報告された。Ｎ末端領域に対する抗体も同様に記載された。いくつかのモノクローナル抗体がＡβペプチドの第１３−２８位と免疫反応することが示され；これらは、第１７−２８位を表すペプチドと結合せず、したがって、引用特許によれば、これらの抗体の標的が第１６−１７位（α−セクレターゼ部位）を含むこの領域であることが確立された。Ａβのアミノ酸１３および２８の間と結合することが既知である抗体には、マウス抗体２６６、４Ｇ８、および１Ｃ２がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Ａβペプチドに対するアッセイを行うのに有用であり、脳内のアミロイドプラークに関連するコンディションの治療に有用な抗体が、脳内のＡβペプチドレベルの著しい増加を引き起こす応答を引き出すことができ、このレベルを臨床的および発症前アルツハイマー病のための診断マーカーとして用いることができることが現在見出されている。これらの抗体（ヒト化されてもされなくてもよい）は、Ａβペプチドをその血中の結合、循環型から隔絶し、中枢神経系および血漿中の可溶型および結合型Ａβのクリアランスを変更する。こららの抗体およびその断片は、Ａβ分子のアミノ酸１３および２８の間のエピトープに特異的に結合する。これらの抗体のＣＤＲは、マウスモノクローナル抗体２６６（配列番号１〜配列番号６）由来である。有用な抗体として、可変領域がマウス抗体２６６由来のＣＤＲおよび特定のヒトフレームワーク配列を含む配列（配列番号７〜配列番号１０）を有するものであって、マウス抗体の結合性質をほぼ保持し、マウス抗体２６６と機能的に同等なインビトロおよびインビボ性質を有する抗体およびその断片が挙げられる。軽鎖が配列番号１１であり、重鎖が配列番号１２であるヒト化抗体およびその断片が、特に有用である。
【００１１】
したがって、１つの態様において、本発明は、臨床的および発症前段階にある患者におけるアルツハイマー病の診断方法に関するものであり、該方法は、Ａβペプチドをその血中の結合、循環型から隔離し、中枢神経系および血漿中の可溶型および結合型Ａβのクリアランスを変更するかまたはＡβのアミノ酸１３および２８の間に含まれるエピトープに特異的に結合する抗体であって、好ましくは患者がアルツハイマー病の臨床的または発症前段階にある場合に、患者の血液中の循環Ａβペプチドのレベルを変更するのに有効なマウス抗体２６６と同等な免疫活性を有する抗体を該患者に投与し、次いで、患者の血液中のＡβ40、Ａβ42のレベルまたはＡβ40／Ａβ42比率（ここで、患者におけるＡβ40、Ａβ42の増加したレベルおよび／またはＡβ40／Ａβ42比率によって、該患者がアルツハイマー病または脳アミロイド血管障害の発症前または臨床的段階にあることが同定される）を測定することを含む。他の態様において、本発明は、該診断方法を行うための適当な機材を含むキットに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ヒト体液中を循環するＡβペプチドは、染色体２１上にコードされる前駆体タンパク質のカルボキシ末端領域である。インビトロ実験の結果から、Ａβペプチドは、細胞の脂質膜にその長い前駆体をアンカーする領域の一部分である一連の疎水性アミノ酸を含有するために、生理溶液中で低い溶解性しか有さないことが報告されている。したがって、循環Ａβペプチドが通常、その凝集を防ぐ他の部分と複合体化していることは驚くべきことではない。これは、体液中の循環Ａβペプチドの検出を困難にしてきた。
【００１３】
上記特許文献（米国特許５,７６６,８４６；５,８３７,６７２および５,５９３,８４６）は、Ａβペプチドのアミノ酸１３−２８を含むペプチドに対して産生され、これに特異的に結合することが示されたクローン２６６（ｍ２６６）と称される抗体（モノクローナル抗体を含む）の製造を記載している。出願人は、アルツハイマー病のマウスモデルであるＡＰＰＶ７１７Ｆマウスにｍ２６６を投与した後、脳内のアミロイドプラークのレベルの診断に役立つ循環中のＡβペプチドのレベルを測定することができることを見出している。したがって、これらの抗体は、循環Ａβペプチドについてのアッセイを行うのに有用であるのみならず、それ自体、脳内のアミロイドプラークの量の診断に役立つ循環血液レベルを顕在化させるアッセイを行うのにも有用であり、したがって、アルツハイマー病の臨床的および発症前段階にある個人を同定するのに有用である。
【００１４】
「Ａβペプチドの中間領域に結合するモノクローナル抗体」とは、Ａβの第１３位から第２８位間に含有されるエピトープを表すアミノ酸配列と結合するモノクローナル抗体（ＭａｂまたはＭａｂｓ）を意味する。全領域が標的化される必要はない。抗体がこの領域内の少なくとも１エピトープ（特に、たとえばα−セクレターゼ部位１６−１７または抗体２６６が結合する部位を含む）と結合する限り、このような抗体は本発明の方法において有効である。
【００１５】
「抗体」とは、モノクローナル抗体それ自体または免疫学的に有効なその断片、たとえばそのＦａｂ、Ｆａｂ'またはＦ(ａｂ')２断片を意味する。本明細書中、いくつかの関連では、強調のために断片が具体的に記載される；しかし、当然のことながら、断片が特定されるかどうかにかかわらず、用語「抗体」にはこのような断片ならびに単鎖型が含まれる。タンパク質が意図される標的に結合する特異的能力、そしてこの場合、血液中でＡβペプチドをその担体タンパク質から隔絶する能力を保持している限り、用語「抗体」に含まれる。また、定義「抗体」に含まれるものは、たとえば、この特異性を有する抗体の、単鎖型、一般にはＦｖ領域と称されるものである。ヒト化型に変換するために、適当な特異性を有する、典型的にはマウスまたは他の非ヒト抗体の操作が必要とされるため、必ずしもそうではないが、好ましくは、本発明において有用な抗体は、組換え的に作成されたものである。抗体はグリコシル化されていてもいなくてもよいが、グリコシル化された抗体が好ましい。抗体は、周知のように、ジスルフィド結合を介して適正に架橋されている。
【００１６】
基本的な抗体の構造単位は、テトラマーを含むことが既知である。各テトラマーは、２つの同一対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。
【００１７】
軽鎖は、ガンマ、ミュー、アルファおよびラムダとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、それぞれ抗体のイソ型、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。軽鎖および重鎖のうち、可変領域および定常領域は、約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約１０またはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含んでいる。
【００１８】
各軽／重鎖対の可変領域は、抗体の結合部位を形成する。したがって、無傷の抗体は、２結合部位を有する。鎖はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲｓと称される３つの超可変領域と連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の全体構造を示す。各対の２つの鎖由来のＣＤＲｓは、フレームワーク領域によって向きを調節され、特異的エピトープと結合することが可能にされている。Ｎ末端からＣ末端で、軽鎖および重鎖はともに、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。アミノ酸の各ドメインへの割り当ては周知の慣例にしたがうものである［Kabat 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 および 1991; Chothiaら、J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothiaら、Nature 342:878-883 (1989)］。
【００１９】
当分野でよく理解されているように、哺乳類を免疫化し、該哺乳類の抗体産生細胞由来のハイブリドーマを形成させまたはそれを不死化し、ならびにハイブリドーマまたは不死化細胞を培養し、その適当な特異性に関して評価する標準的技術によって適当な特異性を有するモノクローナル抗体を容易に作成できる。この場合、このような抗体は、ヒト、ウサギ、ラットまたはマウスをたとえばＡβペプチドの１３−２８領域を含むエピトープを表すペプチドまたはその適当なサブ領域を用いて免疫化することにより作成できる。組換え操作に関する材料は、所望の抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から所望の抗体をコードするヌクレオチド配列を回収することによって得ることができる。次いで、要すれば、これらのヌクレオチド配列を処理して、ヒト化型の抗体を提供することができる。
【００２０】
ヒト患者においてペプチドの所望の循環レベルを引き出すために、ヒト化型のこれらの抗体を使用するのが望ましい。投与は短期間であり、診断目的のためだけなので、これは必須事項というものではないが、免疫応答のあらゆる可能性を回避するのが好ましいのは明らかであり、ゆえに、この目的にはヒト化型の使用が好ましい。もちろん、エクスビボでのＡβレベルのアッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）の実行には、それらのマウス型を用いることができる。
【００２１】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体の配列を変更することによって、ヒト抗体生殖系列由来のアミノ酸配列から部分的に、あるいは全体的に構成される抗体を意味する。最もシンプルなこのような変更は単に、マウス定常領域をヒト抗体の定常領域で置換し、したがって、医薬的使用に関して許容されるほど十分に低い免疫原性を有し得るヒト／マウスキメラを作成することからなるものであり得る。しかし、好ましくは、抗体の可変領域およびＣＤＲでさえもまた、現在までに当分野に周知である技術によってヒト化される。可変領域のフレームワーク領域は、対応するヒトフレームワーク領域によって置換され、非ヒトＣＤＲは実質的に無傷のままであるか、あるいはそのＣＤＲはヒトゲノム由来の配列で置換されることさえある。完全なヒト抗体は、免疫系がヒト免疫系に対応するように変更された遺伝的に修飾されたマウス内で生産される。上記のように、単鎖型である断片を含む、抗体の免疫学的に特異的な断片を用いれば、本発明の方法における使用に関しては十分である。
【００２２】
このように、ヒト化抗体とは、ヒトフレームワーク、少なくとも１つの非ヒト抗体由来ＣＤＲを含み、存在する任意の定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち少なくとも約８５−９０％、好ましくは少なくとも９５％同一であるものを意味する。したがって、可能性としてはＣＤＲを除いて、ヒト化抗体のすべての部分は、１つまたはそれ以上の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。たとえば、ヒト化免疫グロブリンは典型的にはキメラマウス可変領域／ヒト定常領域抗体を含まない。
【００２３】
ヒト化免疫グロブリンの設計は、以下のように行うことができる。アミノ酸が以下のカテゴリーに含まれる場合、用いられるヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリン）のフレームワークアミノ酸は、ＣＤＲ提供非ヒト免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリン）由来のフレームワークアミノ酸で置換される：（ａ）アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸は、その部位のヒト免疫グロブリンに関して通常でないが、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸は、その部位のヒト免疫グロブリンに関して典型的である；（ｂ）このアミノ酸の位置がＣＤＲの１つのすぐ隣であるか；あるいは（ｃ）フレームワークの任意の側鎖原子が、三次元免疫グロブリンモデル中、ＣＤＲアミノ酸の任意の原子の約５−６オングストローム（中心から中心）内である［Queenら、前掲およびCoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)］。アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中の各アミノ酸およびドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がその位置のヒト免疫グロブリンに関して通常でない場合、このようなアミノ酸は、その位置のヒト免疫グロブリンに関して典型的なアミノ酸によって置換される。
【００２４】
好ましいヒト化抗体は、マウス抗体２６６のヒト化型である。ヒト化２６６のＣＤＲｓは、以下のアミノ酸配列を有する：
軽鎖ＣＤＲ１：
【数１】
2010044078.tif 000002
軽鎖ＣＤＲ２：
【数２】
2010044078.tif 000003
軽鎖ＣＤＲ３：
【数３】
2010044078.tif 000004
重鎖ＣＤＲ１：
【数４】
2010044078.tif 000005
重鎖ＣＤＲ２：
【数５】
2010044078.tif 000006
および重鎖ＣＤＲ３：
【数６】
2010044078.tif 000007
【００２５】
本発明のヒト化抗体の好ましい軽鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を有し、そのフレームワークは、ヒト生殖系列ＶｋセグメントＤＰＫ１８およびＪセグメントＪｋｌ起源であり、同一ヒトＶサブグループ内のコンセンサスアミノ酸へのいくつかのアミノ酸置換を有し、潜在的免疫原性が減少している：
【数７】
2010044078.tif 000008
ここで：
第２位のＸａａはＶａｌまたはＩｌｅである；
第７位のＸａａはＳｅｒまたはＴｈｒである；
第１４位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである；
第１５位のＸａａはＬｅｕまたはＰｒｏである；
第３０位のＸａａはＩｌｅまたはＶａｌである；
第５０位のＸａａはＡｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓである；
第８８位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである；
第１０５位のＸａａはＧｌｎまたはＧｌｙである；
第１０８位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである；および
第１０９位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである。
【００２６】
本発明のヒト化抗体の好ましい重鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を有し、そのフレームワークは、ヒト生殖系列ＶＨセグメントＤＰ５３およびＪセグメントＪＨ４を起源とし、同一ヒトサブグループ内のコンセンサスアミノ酸へのいくつかのアミノ酸置換を有し、潜在的免疫原性が減少している：
【数８】
2010044078.tif 000009
ここで：
第１位のＸａａはＧｌｕまたはＧｌｎである；
第７位のＸａａはＳｅｒまたはＬｅｕである；
第４６位のＸａａはＧｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＳｅｒである；
第６３位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである；
第７５位のＸａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＴｈｒである；
第７６位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである；
第８９位のＸａａはＧｌｕまたはＡｓｐである；および
第１０７位のＸａａはＬｅｕまたはＴｈｒである。
【００２７】
本発明のヒト化抗体の特に好ましい軽鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を有し、そのフレームワークは、ヒト生殖系列ＶｋセグメントＤＰＫ１８およびＪセグメントＪｋｌ起源であり、同一ヒトＶサブグループ内のコンセンサスアミノ酸へのいくつかのアミノ酸置換を有し、潜在的免疫原性が減少している：
【数９】
2010044078.tif 000010
。
【００２８】
本発明のヒト化抗体の特に好ましい重鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を有し、そのフレームワークは、ヒト生殖系列ＶＨセグメントＤＰ５３およびＪセグメントＪＨ４起源である：
【数１０】
2010044078.tif 000011
【数１１】
2010044078.tif 000012
。
【００２９】
本発明のヒト化抗体にとって好ましい軽鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
【数１２】
2010044078.tif 000013
【数１３】
2010044078.tif 000014
。
【００３０】
本発明のヒト化抗体の好ましい重鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
【数１４】
2010044078.tif 000015
【数１５】
2010044078.tif 000016
。
【００３１】
他の配列は、本発明のヒト化抗体およびヒト化２６６の軽鎖および重鎖にとって可能である。免疫グロブリンは、二対の軽鎖／重鎖複合体を有し、少なくとも１つの鎖は、１つまたはそれ以上のヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に結合した相補性決定領域を含む。
重鎖可変領域の５６位から開始して、ｍ２６６およびヒト化２６６の両方が、Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒを含む。この配列は、Ｎ−結合グリコシル化に対するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒシグナルの一例であり、Ａｓｎが、Ｎ−結合グリコシル鎖の付着の部位である。ｍ２６６およびヒト化２６６の両方が、この部位で頻繁にグリコシル化される。まったく予測がつかず、そして有利なことには、重鎖ＣＤＲ２において脱グリコシルされるヒト化２６６のＡβペプチドに対する親和性は、ヒト化２６６の親和性よりも著しく高い。脱グリコシルされたヒト化２６６の重鎖ＣＤＲ２は、以下のアミノ酸配列を有する：
【数１６】
2010044078.tif 000017
ここで：
第７位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第８位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもなく、第９位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第７位のＸａａはＡｓｎではない；
第８位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第７位のＸａａがＡｓｎであり、第９位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第８位のＸａａはＡｓｐまたはＰｒｏである；および
第９位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第７位のＸａａがＡｓｎであり、第８位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもない場合、第９位のＸａａはＳｅｒでもＴｈｒでもない。
【００３２】
「いずれかのアミノ酸」は、天然に発生するアミノ酸のいずれかを意味する。好ましい天然アミノ酸は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒである。
【００３３】
好ましい脱グリコシルされたヒト化抗体は、ｍ２６６のヒト化型であり、ここで、脱グリコシルされた重鎖ＣＤＲ２は、配列番号１３である：
ここで：
配列番号１３の第７位のＸａａは、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒから選ばれる、ただし、第８位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもなく。第９位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第７位のＸａａはＡｓｎではない；
配列番号１３の第８位のＸａａは、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒから選ばれる、ただし、第７位のＸａａがＡｓｎであり、第９位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第８位のＸａａはＡｓｐまたはＰｒｏである；および
配列番号１３の第９位のＸａａは、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒから選ばれる、ただし、第７位のＸａａがＡｓｎであり、第８位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもない場合、第９位のＸａａはＳｅｒでもＴｈｒでもない。
【００３４】
本発明の脱グリコシルされたヒト化抗体の好ましい重鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を有し、そのフレームワークは、ヒト生殖系列ＶＨセグメントＤＰ５３およびＪセグメントＪＨ４を起源とし、同一ヒトサブグループ内のコンセンサスアミノ酸へのいくつかのアミノ酸置換を有し、潜在的免疫原性が減少しており、重鎖ＣＤＲ２におけるＮ−グリコシル化部位は、Ｎ−グリコシル化されないように修飾される：
【数１７】
2010044078.tif 000018
ここで：
第１位のＸａａはＧｌｕまたはＧｌｎである；
第７位のＸａａはＳｅｒまたはＬｅｕである；
第４６位のＸａａはＧｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＳｅｒである；
第５６位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５７位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもなく、第５９位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第５６位のＸａａはＡｓｎではない；
第５７位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５６位のＸａａがＡｓｎであり、第５８位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第５７位のＸａａはＡｓｐまたはＰｒｏである；および
第５８位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５６位のＸａａがＡｓｎであり、第５７位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもない場合、第９位のＸａａはＳｅｒでもＴｈｒでもない
第６３位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである；
第７５位のＸａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＴｈｒである；
第７６位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである；
第８９位のＸａａはＧｌｕまたはＡｓｐである；および
第１０７位のＸａａはＬｅｕまたはＴｈｒである。
【００３５】
本発明の脱グリコシルされたヒト化抗体の特に好ましい重鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を有し、そのフレームワークは、ヒト生殖系列ＶＨセグメントＤＰ５３およびＪセグメントＪＨ４を起源とし、同一ヒトサブグループ内のコンセンサスアミノ酸へのいくつかのアミノ酸置換を有し、潜在的免疫原性が減少しており、重鎖ＣＤＲ２におけるＮ−グリコシル化部位は、Ｎ−グリコシル化されないように修飾される：
【数１８】
2010044078.tif 000019
【数１９】
2010044078.tif 000020
ここで：
第５６位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５７位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもなく、第５９位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第５６位のＸａａはＡｓｎではない；
第５７位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５６位のＸａａがＡｓｎであり、第５８位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第５７位のＸａａはＡｓｐまたはＰｒｏである；および
第５８位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５６位のＸａａがＡｓｎであり、第５７位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもない場合、第９位のＸａａはＳｅｒでもＴｈｒでもない。
【００３６】
本発明の脱グリコシルされたヒト化抗体の好ましい重鎖領域は、以下のアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２におけるＮ−グリコシル化部位は、Ｎ−グリコシル化されないように修飾される：
【数２０】
2010044078.tif 000021
【数２１】
2010044078.tif 000022
【数２２】
2010044078.tif 000023
ここで：
第５６位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５７位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもなく、第５９位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第５６位のＸａａはＡｓｎではない；
第５７位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５６位のＸａａがＡｓｎであり、第５８位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第５７位のＸａａはＡｓｐまたはＰｒｏである；および
第５８位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５６位のＸａａがＡｓｎであり、第５７位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもない場合、第９位のＸａａはＳｅｒでもＴｈｒでもない。
【００３７】
配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６で示される重鎖可変領域を有する脱グリコシルされた２６６抗体が好ましい：
ここで：
第５６位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５７位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもなく、第５９位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第５６位のＸａａはＡｓｎではない；
第５７位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５６位のＸａａがＡｓｎであり、第５８位のＸａａがＳｅｒまたはＴｈｒである場合、第５７位のＸａａはＡｓｐまたはＰｒｏである；および
第５８位のＸａａはいずれかのアミノ酸である、ただし、第５６位のＸａａがＡｓｎであり、第５７位のＸａａがＡｓｐでもＰｒｏでもない場合、第９位のＸａａはＳｅｒでもＴｈｒでもない。
【００３８】
配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６で示される重鎖のＣＤＲ２（第５６、５７および５８位）にとって好ましい配列には、単一のアミノ酸のみが変更される配列、２つのアミノ酸のみが変更される配列または３つのアミノ酸すべてが変更される配列が包含される。第５６位のＡｓｎを置き換えるのが好ましい。第５８位のＴｈｒをＳｅｒ以外のアミノ酸で置き換えるのが好ましい。第５７位のＳｅｒをＰｒｏまたはＡｓｐで置き換えることによって２６６重鎖のＣＤＲ２中のＮ−グリコシル化部位を破壊しないのが好ましい。１箇所、２箇所または全３箇所の部位での同類置換が好ましい。第５６位のＡｓｎがＳｅｒまたはＴｈｒで置き換えられるのが最も好ましい。第５６位がＳｅｒまたはＴｈｒであり、第５７位がＳｅｒであり、第５８位が配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６である抗体が特に好ましい。
特に好ましい脱グリコシルされた種類は、配列番号１１の軽鎖および配列番号１６の重鎖を含む抗体であり、ここで、配列番号１６において、第５６位のＸａａはＳｅｒであり、第５７位のＸａａはＳｅｒであり、第５８位のＸａａはＴｈｒである（Ｎ５６Ｓ）か、または配列番号１６において、第５６位のＸａａはＴｈｒであり、第５７位のＸａａはＳｅｒであり、第５８位のＸａａはＴｈｒである（Ｎ５６Ｔ）。
【００３９】
本発明に有用な抗体の産生は、典型的には、先に引用され、全体を参考文献として本発明に援用されるPCT／US01／06191に記載の組み換え技術を含む。
臨床的または発症前アルツハイマー疾患あるいは臨床的または発症前アミロイド血管障害などのＡβ蓄積に関連するコンディションを評価するために、標準的投与技術を用いて、静脈内、腹腔内、皮下、肺性、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下または坐剤投与により、好ましくは末梢的に（すなわち中枢神経系への投与によってではなく）、被験者に抗体（免疫学的反応性断片を含む）を投与する。
【００４０】
投与用医薬組成物は選択される投与様式に適当であるように設計され、分散剤、緩衝液、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などの医薬に許容しうる賦形剤が適当に用いられる。全体を参考文献として本発明に援用されるRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, latest edition は、概して当業者に既知の製剤化技術の概論を提供する。たとえばリポソーム内にカプセル化するか、あるいは極性基をブロックすることによって本発明の抗体の可溶性特徴を変更し、それらをより親油性にすることは特に有用である。
【００４１】
静脈内または腹腔内または皮下注射による末梢全身性デリバリーが好ましい。このような注射に関する適当なビヒクルは簡単なものである。しかし、さらに鼻腔エアロゾルまたは坐剤を用いて、粘膜を介して投与することもできる。このような投与様式に適当な製剤は周知であり、典型的には膜を横切る移動を促進する界面活性剤を含む。このような界面活性剤はしばしばステロイド由来であり、あるいはカチオン性脂質、たとえばＮ−[１−(２,３−ジオレオイル)プロピル−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）または種々の化合物、たとえばコレステロール ヘミスクシネート、ホスファチジル グリセロールなどである。
【００４２】
選択される特定の投与様式にしたがって、製剤中のヒト化抗体の濃度は、少なくて約０.１重量％〜多くて１５または２０重量％であり、主に液体容量、粘度などに基づいて選択される。したがって、典型的な注射用医薬組成物は、リン酸緩衝化塩類溶液の１ｍＬ滅菌緩衝水および本発明のヒト化抗体１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜１００ｍｇを含有して構成され得る。この製剤は、製剤の作成後に滅菌ろ過するか、あるいは微生物学的に許容されるものにすることができる。典型的な静脈内注入用組成物は、１〜２５０ｍＬ量の液体、たとえば滅菌リンガー溶液、および１〜１００ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の抗体濃度を有し得る。本発明の治療剤は保存用に凍結あるいは凍結乾燥することができ、使用前に適当な滅菌担体中に再組成することができる。凍結乾燥および再組成は、抗体活性喪失の程度を変化させ得る（たとえば慣用的免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より大きな活性喪失を示す傾向がある）。用量を調節して補正する必要がある場合もある。製剤のｐＨは、抗体の安定性（化学的および物理的）および投与時の患者に対する苦痛のなさのバランスをとって択される。一般に、４〜８の範囲のｐＨが寛容される。
【００４３】
タンパク質、たとえばヒト化抗体の投与には、前記方法が最も都合がよく、最も適当であると思われるが、適当な適合化により、適正な製剤されれば、他の投与技術、たとえば経皮投与および経口投与を用いることができる。
【００４４】
さらに、生物分解性フィルムおよびマトリクス、または浸透性ミニポンプ、またはデキストランビーズ、アルギナート、またはコラーゲンに基づくデリバリー系を利用する制御放出製剤を用いるのが望ましいこともある。
まとめると、製剤は、本発明の抗体の投与に利用可能であり、当分野に周知であり、種々のオプションから選択することができる。
典型的な投与量は、標準的臨床技術を用いて最適化することができ、これは投与の様式および患者の症状に応じる。
【００４５】
被検者に抗体を投与した後、分、時間、日にわたって定期的に血液サンプルを採取する。適当な期間は、２,３分、１０分、３０分または１時間であり、あるいは数時間もしくは数日が経過した後に血液サンプルを採取してもよい。３時間以内に測定するのが好ましい。必要に応じて、分析を簡略化するために、血漿フラクションを得ることができる。Ａβ40、Ａβ42およびそれらの比率のための標準的分析技術を用いる。これらの技術は、たとえば、米国特許第5,766,846号に記載されている。しかし、クロマトグラフィー分離、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡアッセイ、ホモジニアスアッセイなどの分析のためのいずれかの適当な技術を用いることができる。
【００４６】
次いで、Ａβ40、Ａβ42の濃度またはその比率を、コントロールの値と比較する。典型的なコントロールは、１０代の若者または非常に若い成人などのアミロイドプラークに関連するコンディションに該当しないことがわかっている個体であり、さらには、一般集団からの平均値による年齢に適合して認知的に正常なコントロールが得られる。初老の年齢に適合して認知的に正常なコントロールは、発症前ＡＤであることもあるが、大部分はそうではない。したがって、このような集団からの平均値を得ることは、有用であり、重要である。標準コントロールの設計は、当業者には周知のプロセスである。次いで、コントロール値と比較して、当該ペプチドのレベルまたはＡβ42に対するＡβ40の比率が上昇している個体を、アミロイドプラークの形成に関連する臨床的または発症前コンディションの確率が高いものとして同定する
【００４７】
本発明のアッセイを実行するための構成要素をパッケージングして便利なキットにするのが望ましい。このようなキットは、採取された血液サンプルにおいてアッセイを行うための、投与される抗体のサンプルならびに適当な試薬を含むボトルまたはバイアルなどの容器を含む。キットは、さらに、アッセイを行うための指示書および、必要に応じて、コントロール値のチャートを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１のＡ、ＢおよびＣは、抗体ｍ２６６の投与前のトランスジェニックマウスの血漿中のＡβ40（図１Ａ）、Ａβ42（図１Ｂ）のレベルおよびＡβ40／Ａβ42比率（図１Ｃ）ならびに脳Ａβ蓄積との相関関係の欠如を示すグラフである。
【図２】図２のＡおよびＢは、抗体ｍ２６６の注射後１時間のトランスジェニックマウスの血漿Ａβ40（図２Ａ）および血漿Ａβ40／Ａβ42比率（図２Ｂ）ならびに脳Ａβ蓄積との有意な相関関係を示すグラフである。
【図３】図３のＡ、ＢおよびＣは、モノクローナル抗体ｍ２６６の注射後２４時間の２つのＡβペプチド（図３Ａおよび３Ｂ）およびその比率（図３Ｃ）と脳内Ａβ蓄積との有意な相関関係を示すグラフである。
【図４】図４のＡ、ＢおよびＣは、２つのＡβペプチドの循環への侵入速度（図４Ａおよび４Ｂ）およびその比率（図４Ｃ）とトランスジェニックマウスにおけるＡβペプチド蓄積との有意な相関関係を示すグラフである。
【図５】図５のＡおよびＢは、Ａβ蓄積によって被覆された海馬のパーセンテージと相関させたｍ２６６の注射後２４時間(図５Ａ)および１時間（図５Ｂ）の血漿中のＡβ40レベルの別の図示的表現を示すグラフである。
【図６】図６は、血漿Ａβ値（ｍ２６６注射前および後）と海馬Ａβまたはアミロイド負荷との間で決定されたPearson相関係数（Pearson r）および有意性（Ｐ値）を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下の実施例は本発明を制限するためのものではなく、例示するためのものである。
本明細書中以下の実施例は、特に、元々、ヒトＡβペプチドの残基１３−２８から構成されるペプチドを用いる免疫化によって製造された「２６６」と称されるマウスモノクローナル抗体を用いる。この抗体はこのペプチドと免疫反応することが確認されているが、ヒトＡβペプチドの残基１７−２８のみを含有するペプチド、またはＡβペプチド内の任意の他のエピトープにおいては反応しないことが以前に報告されている。この抗体の製造は、引用により本明細書中に包含される米国特許５，７６６，８４６に記載されている。本明細書中の実施例はマウス系において行われた実験を記載しているので、マウスモノクローナル抗体の使用で十分である。しかし、ヒトにおける使用を意図される本発明の処置方法では、抗体２６６の免疫特異性に対応する免疫特異性を有するヒト化型の抗体が好ましい。
【実施例１】
【００５０】
循環ペプチドレベルとプラークの相関関係
これらのアッセイには、アルツハイマー病のマウスモデルであるＡＰＰ Ｖ７１７Ｆトランスジェニックマウスを用いる。これらのマウスは、Games、D.ら、Nature (1995) 373:523-527; Bales、K.R.ら、Nature Genet. (1997) 17:263-264;およびHoltzman、D.M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2000) 97:2892-2897に記載されている。このモデルにおいては、突然変異型のヒトＡＰＰ遺伝子が発現され、結果として早期発症型の家族性アルツハイマー病になる。これらのマウスの脳は、最初は正常と思われるが、６〜１５ヶ月で広汎な老人斑の形状でＡβ蓄積が生じる。トランス遺伝子に対してホモ接合型のマウスは、９〜１４ヶ月齢において変異性を示すが、他のマウスが発症していないのにＡβ蓄積を発症させるマウスもある。
この実験には、１２ヶ月齢の５３匹のホモ接合型マウスを用いた。
【００５１】
５００μｇのｍ２６６の投与前およびこの抗体の投与後の２４時間以内の種々時間間隔において、ＥＬＩＳＡによって、これらのマウス血漿におけるＡβ40、Ａβ42の血漿レベルおよびＡβ40／Ａβ42の比率を測定した。DeMattosら Proc. Nat'l. Acad. Sci USA (2001) 98:8850-8855に記載されているように、２４時間後にマウスを屠殺し、脳内のＡβ蓄積量を海馬および皮質において評価し、Ａβ蓄積によって被覆された脳のパーセンテージとして評定した。
【００５２】
図１のＡ、ＢおよびＣに示すように、抗体投与前に、ｙ軸の血漿中の各ペプチドのレベルおよびそれらの比率に対して、海馬における蓄積によるＡβ被覆パーセンテージをｘ軸にプロットする場合には、相関関係は見出されない。Ａβ蓄積％が本質的にゼロであるかまたは７５％以上であるかどうかに関わらず、Ａβ40の平均レベルはおよそ２５０(pg／ml)であり、Ａβ42の平均レベルはおよそ４００(pg／ml)である。したがって、Ａβ42に対するＡβ40の比率は、およそ０.５〜０.６であった。
しかし、図２のＡ、ＢおよびＣに示すように、Ａβ40の血漿レベルは、ｍ２６６注射後１時間での海馬におけるＡβ蓄積のパーセンテージと強く相関し、Ａβ42に対するＡβ40の比率に関しても同様であった。
【００５３】
図３のＡ、ＢおよびＣは、注射後２４時間で得られた同様の結果を示す。得られたＡβ40のレベルおよびＡβ40／Ａβ42比率は、海馬におけるＡβ蓄積％と相関した。Ａβ40レベルのみならず、Ａβ42レベルもＡβ蓄積％と相関した。
図４のＡ、ＢおよびＣは、血漿への２つのＡβペプチドの侵入速度に関する同様な結果およびこれらのペプチドの比率の関数として侵入速度について計算された値を示す。Ａβ蓄積と最も相関するのは、Ａβ40の侵入速度およびＡβ40／Ａβ42の比率である。
図５のＡおよびＢは、注射後２４時間および１時間の血漿Ａβ40レベルのデータについての別の表現を示す。海馬におけるＡβ被覆の度合いを低、中または高のグループに分けた場合、Ａβ蓄積が低い動物は、血漿Ａβ40レベルの関数として、高蓄積の動物から完全に区別することができた。
【実施例２】
【００５４】
実施例１で示した実験と同様の実験において、同世代の４９匹のホモ接合型ＡＰＰ Ｖ７１７Ｆマウスを用いた。５００μｇのｍ２６６の静脈内注射の前後に、５分、１時間、３時間、６時間および２４時間の時点で血漿サンプルを採取し、実施例１に記載したように、Ａβ40およびＡβ42のレベルを評価した。２４時間後にマウスを屠殺し、Ａβペプチドによって占められた海馬または帯状皮質の領域（定量的Ａβ免疫蛍光染色を用いる）およびアミロイドによって占められた領域（チオフラビン−Ｓ(アミロイド)染色）のパーセンテージについて一方の半球を評価した。
【００５５】
他方の半球からの領域を、ＥＬＩＳＡによってＡβペプチドについて評価した。
GraphPad Prism software (version 3.00 for Windows、San Diego、USA)を用いて、血漿Ａβ値(ｍ２６６の注射の前後)と海馬Ａβまたはアミロイド負荷の間でPearson相関係数(Pearson r)および有意性(Ｐ値)を決定した。Ａβ負荷は、Ａβ免疫反応性蓄積によって被覆された海馬の領域パーセンテージとして定義される。アミロイド負荷は、チオフラビン−陽性蓄積によって被覆された海馬の領域パーセンテージとして定義される。２４時間にわたっての血漿Ａβ蓄積(曲線下領域、ＡＵＣ)と海馬Ａβ負荷またはアミロイド負荷との間の相関関係も決定した。
【００５６】
図６は、得られた結果を示す。簡単に述べると、ベースラインレベル（注射前）のＡβ40、Ａβ42およびｍ２６６注射前の計算されたＡβ40／42比率が、Ａβまたはアミロイド蓄積のパーセンテージと相関しないことが見出された。しかし、ｍ２６６の投与後、海馬および帯状皮質において、血漿Ａβ40、Ａβ42およびＡβ40／42比率とＡβおよびアミロイド負荷の両方との間に有意な相関関係があった。
結果の統計分析から、ｍ２６６注射後２４時間での血漿Ａβ40レベルに基づいて、これらのマウスにおける海馬Ａβ負荷の正確な予測ができることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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