(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｆａｓ／Ａｐｏ-１、ＴＮＦ-Ｒ１、又はＴＮＦ-Ｒ２レセプター等によって感知できるほどに阻害されない新規なサイトカインを提供する。【解決手段】哺乳動物癌細胞のアポトーシスを誘発するＡｐｏ-２リガンドと命名された新規なサイトカイン。Ａｐｏ-２リガンドは、ＴＮＦサイトカインファミリーのメンバーに属すると考えられる。Ａｐｏ-２リガンドキメラを含有する組成物、Ａｐｏ-２リガンドをコードする核酸、及びＡｐｏ-２リガンドに対する抗体、さらに、アポトーシスを誘発し癌などの病理学的状態を治療するためのＡｐｏ-２リガンドの使用方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基９１〜２８１を含んでなる単離された可溶性Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項２】
図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基９２〜２８１を含んでなる請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項３】
図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基９１〜２８１からなる単離された可溶性Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項４】
図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基９１〜２８１から実質的になる単離された可溶性Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項５】
図１Ａ(配列番号：１)のアミノ酸残基９２〜２８１から実質的になる単離された可溶性Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項６に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する請求項７に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリぺプチドが図１Ａ(配列番号：１)の配列における位置２０３のアスパラギン酸残基に置換したアラニン残基を有する置換変異体である請求項６に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリぺプチドが図１Ａ(配列番号：１)の配列における位置２１８のアスパラギン酸残基に置換したアラニン残基を有する置換変異体である請求項６に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリぺプチドが図１Ａ(配列番号：１)の配列における位置２６９のアスパラギン酸残基に置換したアラニン残基を有する置換変異体である請求項６に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリぺプチドが図１Ａ(配列番号：１)の配列における位置２０３、２１８及び２６９のアスパラギン酸残基に置換したアラニン残基を有する置換変異体である請求項６に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが非タンパク質性ポリマーに結合した請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項１４】
前記非タンパク質性ポリマーがポリエチレングリコールである請求項１３に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項１５】
異種ポリペプチド配列に融合した請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド。
【請求項１６】
異種ポリペプチド配列がタグポリペプチド配列である請求項１５に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞を含んでなる請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が大腸菌を含んでなる請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞が酵母細胞を含んでなる請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１９に記載の宿主細胞を培養し、宿主細胞培地からＡｐｏ-２リガンドポリペプチド回収することを含んでなるＡｐｏ-２リガンドポリペプチドの作成方法。
【請求項２４】
全長ヒトＡｐｏ-２リガンドをコードする遺伝子をＣＨＯ細胞で発現させることにより作成された可溶性Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが天然配列Ａｐｏ-２リガンドの細胞外ドメインからなる請求項２４に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが図１Ａのアミノ酸残基９２〜２８１を含む請求項２４に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド及び担体を含んでなる組成物。
【請求項２８】
担体中に請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドの有効量を含有してなる哺乳動物細胞アポトーシスの刺激に有用な組成物。
【請求項２９】
請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドの有効量に哺乳動物癌細胞を暴露することを含んでなる哺乳動物癌細胞におけるアポトーシスを誘発する方法。
【請求項３０】
前記Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドが癌を持つと診断された哺乳動物への注入により投与される請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、ここに「Ａｐｏ-２リガンド」と命名する新規サイトカインの同定、単離、及び組換え生産、及びそのような組成物の使用方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
哺乳動物における細胞数のコントロールは、一部には細胞増殖と細胞死のバランスにより決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特徴付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば、Barr等, Bio/Technology, 12：487-493(1994)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itohら, Cell, 66：233-243(1991)］。アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、癌、狼瘡、ヘルペスウイスル感染を含む種々の病理的条件に関連している［Thompson, Science, 267：1456-1462(1995)］。
【０００３】
アポトーシス性細胞死には、典型的には、細胞内における一又は複数の特徴的な形態学的及び生化学的変化、例えば細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失が伴う。様々な外因的及び内因的シグナルが、このような形態学的及び生化学的な細胞変化を惹起又は誘発すると考えられている［Raff, Nature, 356：397-400(1992)；Steller, Science, 267: 1445-1449 (1995);  Sachs等, Blood, 82：15(1993)］。例えば、ホルモンの刺激、例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン、並びにある種の成長因子の退薬により惹起され得る［Watanabe-Fukunagaら, Nature, 356：314-317(1992)］。また、幾つかの同定された発癌遺伝子、例えばｍｙｃ、ｒｅｌ、及びＥ１Ａ、及び腫瘍サプレッサーは、ｐ５３と同様に、アポトーシスの誘発においてある役割を有していることも報告されている。ある種の化学療法薬及びある種の放射線も同様にアポトーシス誘発活性を有していることも見出されている［Thompson, 上掲］。
【０００４】
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、及びＡｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定された［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、及びＡｐｏ-２リガンド(TRAIL)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性死を誘発することが報告されている［Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83：1881(1986)；Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17：689(1987)］。ゼングらは、ＴＮＦ-αがＣＤ８ポジティブＴ細胞のポスト刺激性アポトーシスに関与していることを報告している［Zheng等, Nature, 377：348-351(1995)］。他の研究者らは、ＣＤ３０リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に関与していることを報告している［Amakawa等, プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)］。
【０００５】
マウスのＦａｓ／Ａｐｏ-１レセプター又はリガンド遺伝子(それぞれｌｐｒ及びｇｌｄと呼称される)における変異が幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Ａｐｏ-１リガンドが末梢の自己反応性リンパ球のクローン除去の調節においてある役割を担っていることを示している［Krammer等, Curr. Op. Immunol., 6：279-289(1994)； Nagata等, Science, 267：1449-1456(1995)］。また、Ａｐｏ-１リガンドは、ＣＤ４-ポジティブＴリンパ球及びＢリンパ球においてポスト刺激性アポトーシスを誘発することが報告されており、それらの機能がもはや必要でなくなった際の活性化リンパ球の除去に関与している［Krammer等, 上掲； Nagata等, 上掲］。Ａｐｏ-１レセプターと特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ-αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている［Yonehara等, J. Exp. Med., 169：1747-1756(1989)］。
【０００６】
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応の誘発は、それらが特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約５５-ｋＤａ(ＴＮＦ-Ｒ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦ-Ｒ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されており［Hohman等, J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhaus等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開されたEP417,563］、双方のレセプター型に対応するヒト及びマウスｃＤＮＡが単離され、特徴付けされている［Loetscher等, Cell, 61：351(1990)；Schall等, Cell, 61：361(1990)；Smith等, Science, 248：1019-1023(1990)；Lewis等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwin等, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。
【０００７】
イトー等は、Ａｐｏ-１レセプターが５５-ｋＤａのＴＮＦ-Ｒ１によりシグナル化されるものと同様のアポトーシス性細胞死をシグナル化し得ることを開示している［Itoh等, 上掲］。また、Ａｐｏ-１抗原の発現は、細胞をＴＮＦ-α又は抗Ａｐｏ-１のマウスモノクローナル抗体で処理した場合に、ＴＮＦ-Ｒ１のものと共にダウンレギュレーションされることが報告されている［Krammer等, 上掲；Nagata等, 上掲］。従って、Ａｐｏ-１及びＴＮＦ-Ｒ１レセプターの双方を同時発現する株化細胞が、共通のシグナル伝達経路を通して細胞死を媒介しているとの仮説を唱える研究者もいた［同］。
【０００８】
今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、リンホトキシン-αを除き、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのレセプター類はＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；各場合に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性リガンドのＥＣＤを放出する。サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプター類の概説については、上掲のGruss及びDowerを参照されたい。
【０００９】
（発明の概要）
本出願人は、「Ａｐｏ-２リガンド」と命名される新規なサイトカインをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。現在では、Ａｐｏ-２リガンドはＴＮＦサイトカインファミリーのメンバーであると信じられており；Ａｐｏ-２リガンドは、Ａｐｏ-１リガンドを含む幾つかの知られたＴＮＦ関連タンパク質とアミノ酸配列において関連している。しかしながら、本出願人は、Ａｐｏ-２リガンドが知られた可溶性Ａｐｏ-１又はＴＮＦレセプター類、例えばＦａｓ／Ａｐｏ-１、ＴＮＦ-Ｒ１、又はＴＮＦ-Ｒ２レセプター等によって感知できるほどに阻害されないことを見出した。
【００１０】
一実施態様において、本発明は、単離されたＡｐｏ-２リガンドを提供する。特に、本発明は、図１Ａの残基１１４〜２８１を含んでなるアミノ酸配列を含む単離されたＡｐｏ-２リガンドを提供する。他の実施態様においては、Ａｐｏ-２リガンドは、図１Ａの残基９２〜２８１を含んでなるアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様では、Ａｐｏ-２リガンドは、図１Ａの残基９１〜２８１を含んでなるアミノ酸配列を含む。さらに他の実施態様では、Ａｐｏ-２リガンドは、図１Ａの残基４１〜２８１又は１５〜２８１を含んでなるアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様では、図１Ａ（配列番号：１）の残基１〜２８１として示したアミノ酸配列を含む。
【００１１】
また、本発明の単離されたＡｐｏ-２リガンドは、上記の参照配列の置換変異体を含む。特に、一実施態様では、図１Ａのアミノ酸９１〜２８１を含むＡｐｏ-２リガンドにおいて、位置２０３、２１８又は２６９の少なくとも１つがアラニンに置換された置換変異体が提供される。これらの置換変異体は特に、「Ｄ２０３Ａ」；「Ｄ２１８Ａ」及び「Ｄ２６９Ａ」と定義される。この命名法は、例えば図１Ａのアミノ酸９１〜２８１を含むＡｐｏ-２リガンドポリペプチドであって、（図１Ａに示した番号を用いた）位置２０３、２１８及び／又は２６９のアスパラギン酸残基がアラニン残基で置換されたものを同定するのに用いられる。場合によっては、置換変異体は一又は複数のそのような置換を含んでいてもよい。
他の実施態様では、本発明は、他の異種ポリペプチドに融合したＡｐｏ-２リガンドを含むキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、タグポリペプチド配列に融合したＡｐｏ-２リガンドを含む。
【００１２】
他の実施態様では、本発明は、Ａｐｏ-２リガンドをコードする単離された核酸分子を提供する。一態様では、核酸分子はＲＮＡ又はＤＮＡであり、Ａｐｏ-２リガンドをコードするか、又はそのようなＡｐｏ-２リガンドをコードする核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の厳密性条件下で、それを安定に結合させたままである。一実施態様では、核酸配列は：
（ａ）残基１から残基２８１までの全長タンパク質をコードする図１Ａの核酸配列のコード領域（即ち、ヌクレオチド９１〜９３３）、あるいは図１Ａ（配列番号：２）に示した核酸配列の又は残基４１〜２８１の細胞外タンパク質をコードするヌクレオチド２１１〜９３３、又は残基９２〜２８１の細胞外タンパク質をコードするヌクレオチド３６４〜９３３、又は残基９１〜２８１の細胞外タンパク質をコードするヌクレオチド３６１〜９３３、又は残基１１４〜２８１の細胞外タンパク質をコードするヌクレオチド４３０〜９３３；あるいは、
（ｂ）遺伝子コードの縮退の範囲内で（ａ）の配列に相当する配列から選択される。
【００１３】
さらなる実施態様において、本発明は、当該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列に作用可能に結合したＡｐｏ-２リガンドをコードする核酸分子を含む複製可能なベクターを提供する。このベクター又は核酸分子を含む宿主細胞も提供される。さらに、この核酸分子を含む宿主細胞を培養し、当該宿主細胞培地からタンパク質を回収することを含んでなるＡｐｏ-２リガンドの作成方法が提供される。
他の実施態様では、本発明はＡｐｏ-２リガンドに結合する抗体を提供する。一態様において、この抗体はＡｐｏ-２リガンドに対して抗原特異性を有するモノクローナル抗体である。
他の実施態様では、本発明はＡｐｏ-２リガンド及び担体を含んでなる組成物を提供する。この組成物は、アポトーシスを誘発又は刺激するのに有用な製薬組成物であってよい。
他の実施態様では、本発明は、アポトーシスの誘発に有効な量のＡｐｏ-２リガンドに、インビボ又はエキソビボで、哺乳動物細胞を暴露することを含んでなる、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発する方法を提供する。
【００１４】
他の実施態様では、本発明は癌を持つ哺乳動物の治療方法を提供する。この方法においては、癌を持つと診断された哺乳動物に、有効量のＡｐｏ-２リガンドが投与される。Ａｐｏ-２リガンドは、一又は複数の他の治療、例えば化学治療、放射線治療、又は抗腫瘍活性を示す他の薬剤とともに哺乳動物に投与してもよい。
さらなる実施態様では、本発明はＡｐｏ-２リガンド又はＡｐｏ-２リガンド抗体を含む製造品及びキットを提供する。この製造品及びキットは、容器、容器上のラベル、及び容器内に収容された組成物を具備する。容器上のラベルは、組成物が或る種の治療又は非治療用途に使用できることを表示する。この組成物は活性薬を含有し、この活性薬はＡｐｏ-２リガンド又はＡｐｏ-２リガンド抗体を含む。
【００１５】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「Ａｐｏ-２リガンド」及び「Ａｐｏ-２Ｌ」という用語には、図１Ａのに示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１１４〜２８１を含む、又は残基９２〜２８１を含む、又は残基９１〜２８１を含む、又は残基４１〜２８１を含む、又は残基１５〜２８１を含む、又は残基１〜２８１を含むポリペプチド配列、並びに、前記配列の欠失、挿入、又は置換変異体を意味する。一実施態様では、このポリペプチド配列は、少なくとも図１Ａの残基１１４〜２８１を有する。場合によっては、ポリペプチド配列は、少なくとも図１Ａの残基９２〜２８１又は残基９１〜２８１を有する。他の好ましい実施態様では、変異体は生物学的に活性であり、上記の配列の１つと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する。この定義は、図１Ａのアミノ酸９１〜２８１を複ｍｙＡｐｏ-２リガンドの置換変異体であって、位置２０３、２１８又は２６９の少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されたものを含む。また、この定義はＡｐｏ-２リガンド供給源から、例えばここに述べるヒト組織型（実施例８参照）から、又は他の供給源から単離された、又は組換え又は合成方法によって調製された天然配列Ａｐｏ-２リガンドを含む。Ａｐｏ-２リガンドのこの定義は、周知のＥＳＴ配列、例えばGenBank HHEA47M、T90422、R31020、H43566、H44565、H44567、H54628、H44772、H54629、T82085、及びT10524は除外する。
【００１６】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＡｐｏ-２リガンド、又はそれらの一部を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さはＡｐｏ-２リガンドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００１７】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、ポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど精製される。Ａｐｏ-２リガンドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００１８】
「単離された」Ａｐｏ-２リガンド核酸分子は、同定され、Ａｐｏ-２リガンド核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＡｐｏ-２リガンド核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＡｐｏ-２リガンド核酸分子は、天然の細胞中に存在するＡｐｏ-２リガンド核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＡｐｏ-２リガンド核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるＡｐｏ-２リガンドを通常発現する細胞に含まれるＡｐｏ-２リガンド核酸分子を含む。
【００１９】
ここで同定されている配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、Ａｐｏ-２リガンド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。％同一性の値は、Altschul等, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996);http://blast.wustl/edu/blast/README.htmlから得られるWU-BLAST-2によって算出することができる。WU-BLAST-2は幾つかの検索パラメータを使用し、その殆どが初期値に設定される。調節可能なパラメータは次の値：オーバーラップ・スパン＝１、オーバーラップ・フラクション＝０．１２５、ワードしきい値（Ｔ）＝１１に設定する。同様にして、Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドの核酸配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、Ａｐｏ-２リガンドコード配列のヌクレオチドと同一の候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。同一性の値は、オーバーラップ・スパン及びオーバーラップ・フラクションが各々１及び０．１２５に設定された初期設定のWU-BLAST-2のBLASTNモジュールにより算出される。
【００２０】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合されている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００２１】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に単一の抗Ａｐｏ-２リガンドモノクローナル抗体(アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗Ａｐｏ-２リガンド抗体組成物を包含している。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対応する。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対応する。
【００２２】
ここで、モノクローナル抗体は、起源の種又は免疫グロブリンクラス又はサブクラスの命名に拘わらず、定常ドメインを有する抗Ａｐｏ-２リガンド抗体の可変(高頻度可変を含む)ドメイン、又は重鎖を有する軽鎖、又は他の種由来の鎖を有する或る種由来の鎖、あるいは異種タンパク質との融合体をスプライシングすることによって得られるハイブリッド及び組換え抗体（例えば「ヒト化」抗体）、並びにそれが所望の生物的活性を有する限り抗体断片(例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ)を特に含む。例えば、米国特許第4,816,567号、及びMage等, Monoclonal Antibody Productuon Techniques and Applications, pp.79-97(Marcel Dekker, Inc.:ニューヨーク, 1987)を参照。
従って、「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler及びMilsteinによって、Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは例えば米国特許第4,816,567号に記載された組換えＤＮＡ法によって作ることができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、McCafferty等, Nature, 348：552-554(1990)に記載された技術を用いてファージライブラリから作成することができる。
【００２３】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいはそれらの断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域又はドメインの少なくとも一部を含んでなる。
【００２４】
ここで意図している「生物学的に活性な」とは、(ａ)インビボ又はエキソビボで少なくとも一種類の哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発する能力を有しているか；(ｂ)抗体を生成できる、即ち、免疫原性であるか；又は(ｃ)天然又は天然発生Ａｐｏ-２Ｌ活性を保持していることを意味する。
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝縮、原形質膜の微絨毛の喪失、核の断片化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この活性は、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法等、全て従来から知られている方法により決定し測定することができる。
【００２５】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、神経芽腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。一実施態様では、癌は濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を持つ癌、又はホルモン依存性癌、例えば乳癌、前立腺癌、又は卵巣癌を含む。
ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び防護的療法を称する。
ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。本発明の好ましい実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
【００２６】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
本発明は、ＴＮＦリガンドファミリーに関連するサイトカインであり、ここで「Ａｐｏ-２リガンド」と定義されるサイトカインを提供する。ヒトＡｐｏ-２リガンドの推定成熟アミノ酸配列は２８１アミノ酸を含み、約３２．５ｋＤａの計算された分子量及び約７．６３の等電点を有する。Ｎ末端には明確なシグナル配列は無いが、ヒドロパシー分析は残基１５と４０との間に疎水性領域の存在を示している。シグナル配列が無いこと及び内部疎水性領域が存在することは、Ａｐｏ-２リガンドがＩＩ型膜貫通タンパク質であることを示唆している。潜在的なＮ結合グリコシル化部位は、推定細胞外領域の残基１０９に位置している。図１Ａに示したように、推定細胞質領域はアミノ酸残基１−１４を含み、膜貫通領域はアミノ酸残基１５−４０を含み、細胞外領域はアミノ酸残基４１−２８１を含む。可溶性細胞外ドメインＡｐｏ-２リガンドポリペプチドは本発明の範囲内に含まれ、限定されるわけではないが、図１Ａに示した細胞外領域のアミノ酸残基１１４−２８１、９２−２８１、又は９１−２８１を含むＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを包含する。
【００２７】
また本発明はＡｐｏ-２Ｌ置換変異体も提供する。ここに記載するように、幾つかの生物学的活性を有する置換変異体を同定するためにアラニンスキャンニング技術が利用される。Ａｐｏ-２リガンドの特別な置換変異体は、図１Ａのアミノ酸残基９１−２８１において、位置２０３、２１８又は２６９の少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されたものを含む。これらの置換変異体は、「Ｄ２０３Ａ」；「Ｄ２１８Ａ」及び「Ｄ２６９Ａ」と定義される。この命名法は、例えば図１Ａのアミノ酸９１〜２８１を含むＡｐｏ-２リガンドポリペプチドであって、（図１Ａに示した番号を用いた）位置２０３、２１８及び／又は２６９のアスパラギン酸残基がアラニン残基で置換されたものを特定するのに用いられる。場合によっては、置換変異体は一又は複数のそのような置換を含んでいてもよい。
【００２８】
Ａ．Ａｐｏ-２リガンドの調製
以下の説明は、主として、Ａｐｏ-２リガンド核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養し、細胞培地からポリペプチドを回収することによりＡｐｏ-２リガンドを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＡｐｏ-２リガンドを調製することはできると考えられる。
１．  Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡの単離
Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡは、Ａｐｏ-２リガンドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＡｐｏ-２リガンドＤＮＡは、実施例１に記載されたヒト胎盤ｃＤＮＡのバクテリオファージライブラリのように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＡｐｏ-２リガンドコード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
【００２９】
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(Ａｐｏ-２リガンドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングできる。オリゴヌクレオチドプローブの例は実施例１に提供する。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。Ａｐｏ-２リガンドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
スクリーニングの一つの好ましい方法は、種々のヒト組織からｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために選別したオリゴヌクレオチド配列を用いることである。以下の実施例１には、２つの異なるオリゴヌクオチドプローブでのｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド化時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は、当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。
【００３０】
全てのタンパク質コード化配列を有する核酸は、ここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらにより記述されている従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
Ａｐｏ-２リガンドのアミノ酸配列変異体は、Ａｐｏ-２リガンドＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、所望のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを合成することにより調製することができる。このような変異体は全長Ａｐｏ-２リガンドについて図１Ａに示したアミノ酸配列の細胞内領域、膜貫通領域、又は細胞外領域の内部あるいは一方又は両方の末端に残基の挿入、置換及び／又は欠失を示す。挿入、置換及び／又は欠失の任意の組み合わせで最終構造物に到達することができるが、この最終構造物は、例えばここに定義する所望のアポトーシス活性を有する。好ましい実施態様では、変異体は、Ａｐｏ-２リガンドの細胞内、膜貫通、又は細胞外領域についてここで同定した配列、あるいはＡｐｏ-２リガンドの全長配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する。また、アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、膜係留特性の変更のように、Ａｐｏ-２リガンドの翻訳後過程を改変し得る。
【００３１】
ここで記載されているＡｐｏ-２リガンド配列における変異は、米国特許第5,364,934号に記載された保存的あるいは非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して起こすことができる。これらは、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発などを含む。
近接配列に沿った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使用することができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越えた側鎖が除去されるため、アラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングアミノ酸である［Cunningham等, Science, 244: 1081 (1989)］。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることによっても好ましい。さらに、アラニンは埋設及び露出位置の双方に頻繁に見出される［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)；Chothia, J. Mol. Biol., 150：１(1976)］。
また、本発明の範囲内に含まれるＡｐｏ-２リガンド配列の変異体は、アミノ末端誘導体又は修飾形にも関連する。このようなＡｐｏ-２リガンド配列は、ポリペプチド配列のＮ末端にメチオニン又は修飾メチオニン（例えばホルミルメチオニル又は他のブロックしたメチオニル種など）を有するここに記載した任意のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを含む。
【００３２】
２．  複製可能なベクターへの核酸の挿入
天然又は変異体Ａｐｏ-２リガンドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、及び転写終結配列であり、それぞれを以下に説明する。
(ｉ)  シグナル配列成分
Ａｐｏ-２リガンドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＡｐｏ-２リガンドＤＮＡの一部である。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開された国際特許出願第WO 90/13646号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、単純ヘルペスグリコタンパク質Ｄシグナルのようなウイルス分泌リーダーのような他の哺乳動物のシグナル配列をタンパク質の直接分泌に使用してもよいが、インビボにおけるヒト細胞の細胞膜へのＡｐｏ-２リガンドの挿入を通常指示する天然Ａｐｏ-２リガンドプレ配列が十分である。
このような前駆体領域のＤＮＡは、好ましくは、Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡにリーディングフレームが結合される。
【００３３】
(ｉｉ)複製開始点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる)。
殆どの発現ベクターは「シャトル」ベクターである、すなわち、それらは少なくとも一つのクラスの生物において複製可能であるが、発現のために他の生物に形質移入され得る。例えば、大腸菌においてベクターがクローン化され、そのベクターが酵母あるいは哺乳動物細胞に形質移入され、宿主細胞染色体と独立して複製することはできないとしても、発現する。
ＤＮＡは宿主ゲノムに挿入することによって増幅され得る。これは、例えばベクターにバシラス(Bacillus)ゲノムＤＮＡに見られる配列と相補的なＤＮＡ配列を含めることにより、宿主としてバシラス種を用いて容易に達成される。このベクターを用いたバシラスの形質移入は、ゲノムとの相同的組換え及びＡｐｏ-２リガンドＤＮＡの挿入をもたらす。しかし、Ａｐｏ-２リガンドをコードするゲノムＤＮＡの回収は、Ａｐｏ-２リガンドＤＮＡを切断するのに制限酵素による消化を必要とするために、外来的に複製したベクターの場合よりも複雑である。
【００３４】
(ｉｉｉ)選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択的培地で成長させた形質転換宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターと共に形質転換されていない宿主細胞は培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択技術の一例においては、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、抗薬物性を付与し、選択工程を生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン［Southern等, J. Molec. Appl. Genet., 1：327(1982)］、ミコフェノール酸［Mulligan等, Science, 209：1422(1980)］又はハイグロマイシン［Sugden等, Mol. Cell. Biol., 5：410-413(1985)］が使用される。上述した３つの例は、真核生物のコントロール下で細菌遺伝子を用いて、適切な薬物Ｇ４１８又はネオマイシン(ジェネテシン)、ｘｇｐｔ(ミコフェノール酸)、又はハイグロマイシンにそれぞれ耐性を付与する。
【００３５】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、Ａｐｏ-２リガンド核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるものである。哺乳動物細胞の形質転換細胞は、マーカーを捕捉することによって当該形質転換細胞のみが生存できるように独特に適応化された淘汰圧下に置かれる。淘汰圧は、培地中の選択剤の濃度が次第に変化する条件下で形質転換細胞を培養することにより課し、選択遺伝子とＡｐｏ-２をコードするＤＮＡの双方を増幅させる。増幅は、成長に重要なタンパク質の生産に対する要求度が高い遺伝子が、組換え細胞の後の世代の染色体内に直列に反復されるプロセスである。増幅されたＤＮＡから増大したＡｐｏ-２リガンド量が合成される。増幅可能な遺伝子のほかの例には、メタロチオネインＩ及びＩＩ、アデノシンデアミナーゼ、及びオルニチンデカルボキシラーゼが含まれる。
ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。形質転換した細胞は次に濃度の高いメトトレキセートに接触させる。これによりＤＨＦＲ遺伝子の複数コピーが合成され、同時に、Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡのような発現ベクターを含む他のＤＮＡの複数コピーが作られる。この増幅方法は、もしＭｔｘに高度に耐性である変異体ＤＨＦＲ遺伝子が使用されたような場合には内在性ＤＨＦＲの存在にかかわらず、任意の他の適切な宿主、例えば、ＡＴＣＣ番号CCL61 CHO-K1を使用することができる(EP117,060)。
【００３６】
あるいは、Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選べるマーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第4,965,199号を参照。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号44076あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ATCC 20,622あるいは 38,626)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
さらに、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる［Bianchi 等., Curr. Genet., 12:185(1987)］。より最近では、組換え子ウシのキモシンの大量生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている［Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)］。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている［Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)］。
【００３７】
(ｉｖ)プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ａｐｏ-２リガンド核酸配列に作用可能に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合したＡｐｏ-２リガンド核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺伝子(一般的に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘発的なクラス及び構成的なクラスの２つのクラスに属する。誘発的なプロモーターは、養分の存在あるいは不存在、温度変化等の培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然のＡｐｏ-２リガンドプロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれもＡｐｏ-２リガンドＤＮＡの直接増幅及び／又は発現に用いることができる。
【００３８】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng 等, Nature, 275:615 (1978), Goeddel 等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、よって当業者は、任意の所望の制限部位を提供するためにリンカーあるいはアダプターを使用することでＡｐｏ-２をコードするＤＮＡ［Siebenlist 等, Cell, 20:269 (1980)］にそれらを作用可能に結合させることが可能である。細菌系で使用するプロモータもまたＡｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｘが任意のヌクレオチドであるCXCAAT領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００３９】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP73,657に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００４０】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＡｐｏ-２リガンド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱衝撃プロモーター、そしてＡｐｏ-２配列に通常付随するプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をさらに含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる［Fiers等, Nature, 273:113 (1978);Mulligan及びBerg, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7398-7402 (1981)］。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる［Greenaway等, Gene, 18:355-360 (1982)］。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の修飾は米国特許第4,601,978号に開示されている［また、サル細胞での免疫インターフェロンをコードしているｃＤＮＡの発現について、Gray等, Nature, 295：503-508(1982)を；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を；培養されたマウス及びウサギの細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現について、Canaani及びBerg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79：5166-5170(1982)を；プロモーターとしてラウス肉腫ウィルスの長い末端反復を用いたＣＶ-１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、及びマウスＮＩＨ-３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現について、Gorma等, Proc. Natl. Acas. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982)を参照のこと］。
【００４１】
(ｖ)エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明のＡｐｏ-２リガンドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。エンハンサーは、相対的に配向及び位置が独立しており、転写ユニットの５'［Laimins等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 (1981)］及び ３'［Lusky等, Mol. Cell Bio., 3:1108 (1983)］、イントロン内部［Banerji等, Cell, 33:729 (1983)］並びにコード配列自身の内部［Osborne等, Mol. Cell Bio., 4:1293 (1984)］に見出されている。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、Ａｐｏ-２リガンドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００４２】
(ｖｉ)転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、Ａｐｏ-２リガンドをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【００４３】
(ｖｉｉ)ベクターの作成と分析
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの作成には標準的なライゲーション技術を用いる。分離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ATCC 31446)を形質転換し、適切な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又はMessing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)の方法又はMaxam等, Methods in Enzymology, 65:499 (1980)の方法によって配列決定する。
【００４４】
(ｖｉｉｉ)一過性発現ベクター
Ａｐｏ-２リガンドをコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む［Sambrook等, 上掲］。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、生物学的に活性なＡｐｏ-２リガンドであるＡｐｏ-２リガンドの類似物及び変異体を同定する目的のために特に有用である。
【００４５】
(ｉｘ)適切な例示的脊椎動物細胞ベクター
組換え脊椎動物細胞培養でのＡｐｏ-２リガンドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP117,060; 及びEP117,058に記載されている。Ａｐｏ-２リガンドの哺乳動物細胞培地での発現に特に適したプラスミドは、ｐＲＫ５［EP307,247;実施例１にも記載］又はｐＳＶＩ６Ｂ［1991年6月13日に発行のWO 91/08291］である。
【００４６】
３．  宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開されたDD266,710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Ａｐｏ-２リガンドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能で有用である。
【００４７】
グリコシル化Ａｐｏ-２リガンドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は、複雑なプロセシング及びグリコシル化活動が可能である。原則的には、脊椎動物であろうと無脊椎動物培養であろうと、任意のより高等の真核生物細胞培養が使用できる。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている［例えば、Luckow等, Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller等, Genetic Engineering, Setlow等, eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp.277-279; 及びMaeda等, Nature, 315:592-594 (1985)を参照のこと］。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、それらのウイルスは、特に実施例２に記載するSpodopterafugiperda（「Ｓｆ９」）の形質移入のために、本発明に従うウイルスとして使用できる。
【００４８】
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの、既にＡｐｏ-２リガンドコード化ＤＮＡを含むように操作された或る菌株と共にインキュベートすることによってトランスフェクトされる。A. トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡが、植物細胞宿主にそれが形質移入されるよう移され、そして適切な条件下でＡｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡが発現される。加えて、例えば、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞と適合しうる調節及びシグナル配列が利用できる［Depicker等, J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)］。また、Ｔ-ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡを含む植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化又は増強しうる［1989年6月21日公開のEP 321,196］。
【００４９】
培地(組織培地)中での脊椎動物細胞の増殖は、当該分野おいてよく知られている［例えば、Tissue Culture,Academic Press,編者Kruse及びPatterson(1973)を参照のこと］。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株［293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)］;ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞［TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)］;サルの腎細胞 (CVI ATCC CCL 70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34); バッファローラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51);ＴＲＩ細胞［Mother等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)］;ＭＲＣ５細胞;及びＦＳ４細胞である。
【００５０】
宿主細胞をトランスフェクトし、好ましくは上述のＡｐｏ-２リガンド産生のための発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された標準栄養培地で培養する。
形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数の形質移入の方法が当業者に知られている。例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功した形質移入が一般に認められる。
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等により記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際特許出願第WO 89/05859に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、1991年1月10日に公開された国際特許出願第WO 91/00358に記載されているように、超音波処理を用いて植物を形質移入することもできる。
【００５１】
このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００５２】
４．宿主細胞の培養
本発明のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを生成るために用いられる原核細胞は、前掲のSambrook等により記載されているような適切な培地で培養される。
Ａｐｏ-２リガンドの産生に用いられる哺乳動物の宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」,シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
この明細書において言及される宿主細胞は培養中の細胞並びに宿主動物内にある細胞を包含する。
【００５３】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドもまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性ヌクレオチド、蛍光剤又は酵素のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位として作用する。また、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、又はルミネサンス標識である。
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＡｐｏ-２リガンドＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００５４】
６．Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドの精製
Ａｐｏ-２リガンドは、培養培地から分泌されたポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナル無しで直接産生される場合は宿主細胞溶解液から回収してもよい。Ａｐｏ-２リガンドが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて膜から引き離すか、又は酵素的切断によりその細胞外ドメインを放出させる。
Ａｐｏ-２リガンドがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられるときは、Ａｐｏ-２リガンドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含んでいない。しかしながら、Ａｐｏ-２リガンドに関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又はポリペプチドからＡｐｏ-２リガンドを精製することが望ましい。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Ａｐｏ-２リガンドを、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;及びＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
好ましい実施態様では、Ａｐｏ-２リガンドは実施例３に記載するようなアフィニティクロマトグラフィによって精製される。
【００５５】
残基が欠失され、挿入され、又は置換されたＡｐｏ-２リガンド変異体は、その変異によってしばしば惹起される実質的な特性変化を考慮に入れて、天然Ａｐｏ-２リガンドと同じようにして回収することができる。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原とＡｐｏ-２リガンドとの融合体の調製は精製を容易にする；配列に対する抗体を含む免疫アフィニティーカラムを、融合ポリペプチドを吸着するために使用することができる。好ましい実施態様では、Ａｐｏ-２リガンドの細胞外配列をＨｉｓ１０ペプチドに融合させ、Ｎｉ２＋キレートアフィニティクロマトグラフィにより精製する。
例えばフェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。天然Ａｐｏ-２リガンドに適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるＡｐｏ-２リガンド又はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれば理解するであろう。
【００５６】
７．Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドの共有結合的修飾
Ａｐｏ-２リガンドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。天然Ａｐｏ-２リガンド及びＡｐｏ-２リガンドのアミノ酸配列変異体の両方が共有結合的に修飾されうる。Ａｐｏ-２リガンドの共有結合的修飾の一つの型は、Ａｐｏ-２リガンドの標的化アミノ酸残基を、Ａｐｏ-２リガンドのＮ末端又はＣ末端残基、又は選択された側鎖と反応できる有機誘導体形成剤と反応させることによって分子内に導入することができる。
二官能性試薬による誘導体形成は、抗Ａｐｏ-２リガンド抗体を精製する方法に使用する水不溶性支持体マトリックス又は表面へのＡｐｏ-２リガンドの架橋に有用であり、またその逆も同様である。通常使用される架橋剤には、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４-アジドサリチル酸とのエステル、３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを包含するホモ二官能性イミドエステル、及びビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタンのような二官能性マレイミドが含まれる。メチル-３-［(ｐ-アジドフェニル)ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体形成剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生じる。また、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性の水不溶性マトリックス及び米国特許第3,969,287号；3,691,016号；4,195,128号；4,247,642号；4,229,537号及び4,330,440号に記載されている反応物質がタンパク固定化に用いられる。
【００５７】
その他の修飾は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化［T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, PP.79-86 (1983)］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。残基の修飾型も本発明の範囲に入る。
本発明の範囲内に含まれるＡｐｏ-２リガンドポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然Ａｐｏ-２リガンドに見出される一又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は天然Ａｐｏ-２リガンドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位を付加することを意味することをここでは意図している。
【００５８】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)というトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、可能性のあるグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシルアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられるが)に、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味する。
Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって達成される。この変化は、天然Ａｐｏ-２リガンドへの一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。場合によっては、Ａｐｏ-２リガンドアミノ酸配列はＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳するコドンが産生されるように予め選んだ塩基でＡｐｏ-２リガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡを突然変異させることによって変更される。このＤＮＡ突然変異は、上記に記載され前掲の米国特許第5,364,934号に記載された方法を用いてなされる。
【００５９】
Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、該ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。用いられる結合形態に応じて、糖(類)は、(ａ)アルギニンとヒスチジンに、(ｂ)遊離のカルボキシル基に、(ｃ)遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、(ｄ)セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基に、(ｅ)フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は(ｆ)グルタミンのアミノ基に結合される。これらの方法は1987年9月11日公開の国際特許出願第WO 87/05330号及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp259-306 (1981)に記載されている。
Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的になされる。例えば、化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価な化合物へ該ポリペプチドを曝露し、該ポリペプチドを無傷のまま残しながら、結合糖(Ｎ-アセチルグルコサミン又はＮ-アセチルガラクトサミン)を除く殆ど又は全ての糖を開裂させる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin等, Arch. Biochem Biophys., 259:52 (1987)及びEdge等, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura等, Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを使用して達成することができる。
【００６０】
潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Duskin等, J. Biol. Chem., 257:3105 (1982)に記載されているように、化合物ツニカマイシンを使用して防止することができる。ツニカマイシンはタンパク質-Ｎ-グルコシド結合の形成を阻害する。
Ａｐｏ-２リガンドの共有結合的修飾の他の型は、Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドの種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの１つに結合させることを含み、これは例えば米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載されているように行われる。
【００６１】
８．エピトープタグＡｐｏ-２リガンド
また本発明は、他の異種性ポリペプチドと融合したＡｐｏ-２リガンドを含むキメラポリペプチドを提供する。一実施態様では、キメラポリペプチドは、抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープを提供するタグポリペプチドとのＡｐｏ-２リガンドの融合体を含む。エピトープタグは一般にＡｐｏ-２リガンドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。Ａｐｏ-２リガンドのこのようなエピトープタグが付けられた形の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグを供給すると、Ａｐｏ-２リガンドを抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の種類のアフィニティーマトリックスを用いたアフィニティー精製によって容易に精製することが可能になる。
【００６２】
様々なタグポリペプチドとその各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ｆｌｕＨＡタグポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；ｃ-ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウィルス糖タンパクＤ(ｇＤ)タグとその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］が含まれる。他のタグポリペプチドには、フラッグ-ペプチド(Flag-peptide)［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパクペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］が含まれる。ひとたびタグポリペプチドが選択されれば、それに対する抗体を、ここに開示した方法を用いて産生することができる。
【００６３】
一般的に、エピトープタグＡｐｏ-２リガンドは、天然又は変異体Ａｐｏ-２リガンドに対して上述した方法に従い作成され生産される。Ａｐｏ-２リガンド-タグポリペプチド融合体は、Ａｐｏ-２リガンド部分をインフレームでコードしているｃＤＮＡ配列をタグポリペプチドＤＮＡ配列に融合させ、得られたＤＮＡ融合作成物を適当な宿主細胞に発現させることによって好ましく作成される。通常は、本発明のＡｐｏ-２リガンド-タグポリペプチドキメラを調製するときは、Ａｐｏ-２リガンドをコードしている核酸を、タグポリペプチドのＮ末端をコードしている核酸にその３'末端で融合させるが、５'融合もまた可能である。エピトープタグＡｐｏ-２リガンドの例は、下記の実施例２にさらに詳細に記載する。
エピトープタグＡｐｏ-２リガンドは、抗タグ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。アフィニティー抗体が固着されるマトリクスには、例えばアガロース、調整穴明きガラス又はポリ(スチレンジビニル)ベンゼンが含まれる。ついで、エピトープタグＡｐｏ-２リガンドは、当該分野において知られた技術を使用して、アフィニティーカラムから溶出することができる。
【００６４】
Ｂ．Ａｐｏ-２の治療的用途
本明細書に開示されているように、Ａｐｏ-２リガンドは治療的に用いることができる。例えばＡｐｏ-２リガンド哺乳動物癌細胞にアポトーシスを誘発するために用いることができる。一般的に、哺乳動物癌細胞においてアポトーシスを誘発する方法は、当該細胞を有効量のＡｐｏ-２リガンドに暴露することを含む。これは、例えば下記の実施例に記載する方法に従って、インビボ又はエキソビボで行うことができる。アポトーシスを誘発する方法は、アポトーシスレベルの低下を特徴とする特定の病理学的状態の治療に用いることができる。このような病理学的状態の例は、自己免疫疾患、例えば狼瘡及び免疫媒介糸球体腎炎、及び癌を含む。Ａｐｏ-２リガンドの癌の治療のための治療的用途を以下に詳細に説明する。
癌の治療方法において、Ａｐｏ-２リガンドは癌を持つと診断された哺乳動物に投与される。言うまでもなく、Ａｐｏ-２リガンドは、他のアポトーシス誘発剤、化学治療、放射線治療、及び手術を含むさらに他の治療的組成物及び技術と組み合わせて用いることもできる。
【００６５】
Ａｐｏ-２リガンドは、好ましくは担体中で哺乳動物に投与される。好適な担体とそれらの製剤は、Oslo等により編集されたRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co.,に記載されている。典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。製薬的に許容可能な担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、さらに好ましくは約７．４〜約７．８である。例えば投与経路及び投与されるＡｐｏ-２リガンドの濃度よっては、或る種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。
Ａｐｏ-２リガンドは、注射(例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内)、又は点滴のように、有効な形態で血流への送達を確実にする他の方法により哺乳動物に投与することができる（実施例１５参照）。また、Ａｐｏ-２リガンドはインビボ又はエキソビボ遺伝子治療により投与できるとも考えられる。
【００６６】
Ａｐｏ-２リガンド投与の有効な用量とスケジュールは経験的に決定することができ、このような決定は当業者の技量の範囲に含まれる。今日では、単独で用いられるＡｐｏ-２リガンドの有効用量又は量は、１日に体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１００ｍｇ又はそれ以上の範囲であると考えられている。用量の種内スケーリングは、この分野で周知の方法、例えばMordenti等, Pharmaceut. Res., 8 1351 (1991)に記載されているように実施することができる。当業者はＡｐｏ-２リガンドの投与しなければならない用量が、例えばＡｐｏ-２リガンドを受容する哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に施される他の医薬又は治療に応じて変化することを理解するであろう。
哺乳動物に施される一又は複数の他の治療には、限定されるものではないが、化学治療及び／又は放射線治療、イムノアジュバント、サイトカイン、及び抗体ベース療法が含まれる。例としては、インターロイキン(例えば、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-６)、白血病抑制因子、インターフェロン、ＴＧＦ-β、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、抗-ＶＥＧＦ抗体及びＨＥＲ-２抗体が含まれる。哺乳動物細胞でアポトーシスを誘発することが知られた他の薬剤を用いてもよく、そのような薬剤にはＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β(リンホトキシン-α)、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、及びＡｐｏ-１リガンドが含まれる。
【００６７】
本発明において考慮される化学治療薬には、当該分野において既知であって市販されている化学物質又は薬物、例えばドキソルビシン、５-フルオロウラシル（「５-ＦＵ」）、エトポシド、カンプトテシン、ロイコボリン、シトシンアラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン及びカルボプラチンが含まれる。このような化学治療薬に対する調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務家により経験的に決定される。そのような化学治療薬に対する調製法及び用量スケジュールはまた化学療法サービス(Chemotherapy Cervice), M.C.Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。
化学治療薬は、Ａｐｏ-２リガンドについて上述したもののような、製薬的に許容可能な担体で好ましく投与される。化学治療薬の投与方法はＡｐｏ-２リガンドについて用いられるのと同様としてもよく、あるいは異なる方法を介して投与してもよい。例えば、Ａｐｏ-２リガンドを注射する一方、化学治療薬を経口で哺乳動物に投与してもよい。Ａｐｏ-２リガンドと組み合わせた化学治療薬の投与方法は、下記の実施例９−１２に更に詳細に記載する。
【００６８】
放射線治療は、この分野で通常用いられ当業者に知られたプロトコールに従って哺乳動物に施すことができる。このような治療は、セシウム、イリジウム、ヨウ素、又はコバルト照射を含む。放射線治療は、全身照射でもよく、又は身体の特定部位又は組織に局所的に向けられてもよい。典型的には、放射線治療は約１〜約２週間の期間に渡ってパルス的に施される。しかしながら、放射線治療は、より長期間にわたって施してもよい。場合によっては、放射線治療は１回照射又は多数、連続照射として施してもよい。
Ａｐｏ-２リガンド及び一又は複数の他の治療は、哺乳動物に同時に又は連続的に施すことができる。Ａｐｏ-２リガンド及び一又は複数の他の治療の施与に続いて、哺乳動物の癌及び生理学的状態を、熟練した実務者に知られた種々の方法で監視することができる。例えば、腫瘍の量は、生検により、又は標準的なＸ線画像技術により物理的に観察できる。
【００６９】
Ａｐｏ-２リガンドがエキソビボでの癌細胞の治療に用いられると考えられる。このような秋曽比簿治療は、骨髄移植、及び一部の自己骨髄移植において有用である。例えば、癌細胞を持つ細胞又は組織の、場合によっては上記したような一又は複数の他の治療と共に行うＡｐｏ-２リガンドでの治療は、アポトーシスを誘発し、受容者哺乳動物に移植する前に実質的に癌細胞を除去するために用いることができる。
癌細胞を含む細胞又は組織は、供与者哺乳動物において最初に観察される。細胞又は組織は手術により、好ましくは無菌で得られる。移植用骨髄の治療方法では、骨髄は哺乳動物から針吸引により得る。次いで、癌細胞を含む細胞又は組織をＡｐｏ-２リガンドで、場合によっては上記のような一又は複数の他の治療と共に治療する。骨髄は、好ましくは、Ａｐｏ-２リガンドでの処理に先立って、単細胞分画を得るために（フィコール‐ハイパーク勾配の遠心分離などで）分画する。
処理した細胞又は組織は、次いで、受容者哺乳動物に注入又は移植する。受容者哺乳動物は、供与者哺乳動物と同じ個体でもよく、他の異種哺乳動物でもよい。自己骨髄移植については、哺乳動物は移植の前に有効用量の当該分野で知られ、例えば、Autologous Bone Marrow Transplantation: Proceedings of the Third International Symposium, Dicke等, 編, University of Texas M.D. Anderson Hospital and Tumor Institute (1987)に記載された放射線又は化学治療で処理される。
【００７０】
Ｃ．Ａｐｏ-２リガンドの非治療的用途
本発明のＡｐｏ-２リガンドは非治療的用途においても有用性を有している。ＲＡｐｏ-２リガンドをコードする核酸配列を、組織特異性の型分類のための診断に使用することもできる。例えば、インサイツハイブリッド形成、ノーザン及びサザンブロット法、及びＰＣＲ分析のような手順を、Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡが評価されている細胞型に存在しているか否かを決定するために使用することができる。Ａｐｏ-２リガンド核酸は、ここに記載されている組換え技術によるＡｐｏ-２リガンドポリペプチドの調製にもまた有用である。
単離されたＡｐｏ-２リガンドは、定量的診断アッセイで対照として用いられ、それに対して未知量のＡｐｏ-２リガンドを含有するサンプルが調製される。またＡｐｏ-２リガンド調製物は、抗体を産生する際、(例えば、ラジオイムノアッセイ、ラジオレセプターアッセイ又は酵素結合免疫測定法における標準としての使用のためにＡｐｏ-２リガンドを標識することにより)Ａｐｏ-２リガンドに対するアッセイにおける標準として、アフィニティー精製技術において、及び例えば放射性ヨウ素、酵素又はフルオロフォアで標識された場合の競合型レセプター結合アッセイにおいて有用である。
【００７１】
また、Ａｐｏ-２リガンドをコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、Ａｐｏ-２リガンドをコードするｃＤＮＡ又はその適当な配列を、確立された技術に従ってＡｐｏ-２リガンドをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列は、Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＡｐｏ-２リガンド導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＡｐｏ-２リガンドをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＡｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。
【００７２】
あるいは、Ａｐｏ-２リガンドの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＡｐｏ-２リガンドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、Ａｐｏ-２リガンドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、Ａｐｏ-２リガンドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＡｐｏ-２リガンド「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、Ａｐｏ-２リガンドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、Ａｐｏ-２リガンドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。Ａｐｏ-２リガンドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーション等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば腫瘍の発達を含む、Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の発達に対する防御能力によって特徴付けられる。
【００７３】
Ｄ．抗Ａｐｏ-２リガンド抗体の調製
本発明は、さらに抗Ａｐｏ-２リガンド抗体を提供するものである。Ａｐｏ-２リガンドに対する抗体は以下のようにして調製することができる。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
Ａｐｏ-２リガンド抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を、免疫化される哺乳動物で免疫原性が知られたタンパク質に抱合させるのが有用である。使用され得るそのような免疫原性タンパク質の例は、限定するものではないが、キーホール・リンペット(keyhole limpet))ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。また、哺乳動物の免疫反応を増強するために、ミョウバンのような凝集剤を使用してもよい。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。哺乳動物から採血し、血清を検定して抗体価を求める。望まれるならば、抗体価が増加又は平坦化するまで哺乳動物に追加免疫を施す。
【００７４】
２．モノクローナル抗体
あるいは、Ａｐｏ-２リガンド抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256: 495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化する(上述したようにして)ことで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはＡｐｏ-２リガンドポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。表面にＡｐｏ-２リガンドを発現する細胞もまた使用することができる。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット及びマウスの骨髄腫細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親の細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００７５】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものが望ましい。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これはカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
ハイブリドーマ細胞が培養される培地を、Ａｐｏ-２リガンドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）又は酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知であり、下記の実施例でさらに記載される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００７６】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程を経てサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培地又は腹水液から分離又は精製される。
本発明の一実施態様では、モノクローナル抗体は、ここ及び下記の実施例に記載する１Ｄ１、２Ｇ６、２Ｅ１１、又は５Ｃ２抗体を含んでよい。また、モノクローナル抗体は、各々アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの登録番号ATCC HB-12256, HB-12257, HB-12258, 又はHB-12259で寄託されたハイブリドーマ細胞系によって分泌された１Ｄ１、２Ｇ６、２Ｅ１１、又は５Ｃ２モノクローナル抗体と同じ生物学的特性を有する抗体も含む。「生物学的活性」という用語は、モノクローナル抗体のインビトロ及び／又はインビボ活性、例えば、Ａｐｏ-２リガンド誘発アポトーシスを実質的に低減又は阻害する、又はＡｐｏ-２リガンドのそのレセプターへの結合を低減又は阻止する能力を意味するのに用いられる。抗体は、ここに記載した１Ｄ１、２Ｇ６、２Ｅ１１、又は５Ｃ２抗体と同じエピトープ、又は実質的に同じエピトープに結合するのが好ましい。
【００７７】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法によって(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。
【００７８】
本発明の抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連したシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の調製は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。例えば、消化はパパインの使用により行うことができる。パパイン消化の例は、12/22/94に公開された国際公開第WO 94/29348号、及び米国特許第4,342,566号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂ断片と呼ばれ各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、残りのＦｃ断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し抗原の架橋が尚も可能なＦ(ａｂ')２断片が得られる。
また、抗体の消化により生産されたＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン(ＣＨ１)を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域から一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されているということで、Ｆａｂ断片とは異なっている。Ｆａｂ’-ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を担持しているＦａｂ’に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ’)２抗体断片は、本来は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
【００７９】
３．ヒト化抗体
本発明のＡｐｏ-２リガンド抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann 等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００８０】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野で良く知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法、及びコンピュータモデルを用いたQueen等, Proc Natl. Acad. Sci., 86: 10029-10033 (1989)の方法に従って、齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である(米国特許第4,816,567号)。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を軽減するには、ヒト化抗体を作成するために使用するヒトの軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方の選択が非常に重要である。「ベストフィット法」に従うと、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列ライブラリ全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトの配列を次にヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる［Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia及びLesk, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)］。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる［Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623 (1993)］。
【００８１】
さらに、抗体は、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは入手可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性を高めるといった、望ましい抗体特徴が得られるように、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている［1994年、3月3日に公開されたWO 94/04679を参照］。
免疫化することで、内在性免疫グロブリンが生成されない状態でもヒト抗体の完全リパートリを生成することができるトランスジェニック動物(例えばマウス)を使用することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおいて抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子をホモ接合的に欠失させると内在性抗体生産の完全な阻害が生じることが記述されている。このような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列を移すと、抗原投与時にヒト抗体の生成が生じる［例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)を参照］。また、ヒト抗体はファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］において作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。
【００８２】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＡｐｏ-２リガンドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を生成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成方法は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えたため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を作成でき、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開の国際特許出願第  WO 93/08829号、及びTraunecke等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
【００８３】
別のより好ましいアプローチによれば、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これは、作成に使用する三つのポリペプチド鎖が不等の比であるときに最高の収率が得られる実施態様において、三つのポリペプチド断片の相互比率の調節に大なるフレキシビリティをもたらす。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖が同比率で発現すると高収率が得られる場合や比率が特に重要ではない場合には、一つの発現ベクターに二つ又は三つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することができる。このアプローチの好適な形態では、二重特異性抗体は、一方のアームの第一結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖／軽鎖対(第二の結合特異性をもたらす)からなる。このような非対称的構造は、二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在すると容易な方法で分解できるので、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組合わせから分解し易くすることが見出された。このアプローチは1994 3月３日公開の国際公開WO 94/04690号によって開示されている。二重特異性抗体を生成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【００８４】
５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有的に結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対して標的化させるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案された。本抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク質化学における既知の方法を使用してインビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが含まれる。
【００８５】
Ｅ．Ａｐｏ-２リガンド抗体の用途
さらに、Ａｐｏ-２リガンド抗体は、Ａｐｏ-２リガンドの診断アッセイ法、例えば特異的細胞、組織又は血清におけるその発現の検出に使用することができる。当該分野において知られている様々な診断アッセイ技術、例えば、競合的結合アッセイ、直接的又は間接的サンドイッチアッセイ及び不均一又は均一相の何れにおいても実施される免疫沈降検定を使用することができる［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,CRC Press,Inc.,(1987) pp.147-158］。診断アッセイ法に使用される抗体は、検出可能部分で標識することができる。検出可能成分は、直接的に又は間接的に検出可能なシグナルをつくりだすことができなければならない。例えば検出可能部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、蛍光イソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、もしくはアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素であってもよい。Hunter等, Nature, 144: 945 (1962)、David等, Biochemistry,13:1014(1974)、Pain等, J. Immunol. Meth.,40:219 (1981)及びNygren等, J. Histochem. and Cytochem.,30:407 (1982)などに記載されている方法を含み、検出可能部分に抗体を抱合させるための当該分野において知られている任意の方法を使用することができる。
【００８６】
また、Ａｐｏ-２リガンド抗体は天然供給源又は組換え細胞培養からのＡｐｏ-２リガンドのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、Ａｐｏ-２リガンドに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定する。次に、固定された抗体を、精製するＡｐｏ-２リガンドを含有する試料と接触させ、次いで、固定された抗体に結合したＡｐｏ-２リガンド以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、Ａｐｏ-２リガンドを抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。またＡｐｏ-２リガンド抗体は、可溶化Ａｐｏ-２レセプターのアフィニティ精製又はＡｐｏ-２レセプターの発現クローニングにも有用である。
ここに記載した抗体は、治療的にも使用される。例えば、Ａｐｏ-２リガンド活性（Ａｐｏ-２リガンド誘発アポトーシス等）を阻止する抗-Ａｐｏ-２リガンド抗体は、増大したアポトーシスに伴う病理学的状態又は疾患の治療に用いられる［Thompson, 上掲参照］。
【００８７】
Ｆ．Ａｐｏ-２リガンド又はＡｐｏ-２リガンド抗体を含むキット
本発明のさらなる実施態様においては、例えば上述の治療的又は非治療的用途に使用可能なＡｐｏ-２リガンド又はＡｐｏ-２リガンド抗体を含むキット及び製造品が提供される。製造品にはラベルが付された容器が含まれる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、上述のような治療的又は非治療的用途に有効な活性剤を含む組成物を収容する。組成物中の活性剤は、Ａｐｏ-２リガンド又はＡｐｏ-２リガンド抗体である。容器のラベルには、組成物が特定の治療的又は非治療的用途に使用されることが示され、また上述のもののような、インビボ又はインビトロのいずれかの使用の指示が示されている。
【００８８】
本発明のキットは、典型的には、上述の容器と、商業上及び使用者の観点から望まれる、バッファー、希釈液、フィルター、針、注入器及び使用説明が記されたパッケージ挿入物を含む、材料を含む一又は複数の他の容器を含んでいる。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【００８９】
（実施例）
実施例において言及されている全ての制限酵素は、ニューイングランドバイオラボ社(New England Biolabs)から購入し、製造者の使用説明に従い使用した。実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示していない限りは、製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により次の実施例及び明細書全体を通して特定している細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Mannasas,Virginia)である。
【００９０】
（実施例１）
ヒトＡｐｏ-２リガンドをコードするｃＤＮＡクローンの単離
Ａｐｏ-２リガンドの全長ｃＤＮＡを単離するために、ヒト胎盤ｃＤＮＡのラムダｇｔ１１バクテリオファージライブラリ（約１ｘ１０６クローン）（ＨＬ１０７５６、Clontechから市販）を、ヒトＦａｓ／Ａｐｏ-１リガンドに幾分の相同性を示すＥＳＴ配列（GenBank locus HHEA47M）に基づく合成オリゴヌクレオチドプローブでハイブリッド形成することによりスクリーニングした。ＨＨＥＡ４７ＭのＥＳＴ配列は３９０塩基対で、その３＋フレームで翻訳した場合、ヒトＡｐｏ-１リガンドの３４アミノ酸領域に１６の同一性を示す。ＨＨＥＡ４７Ｍの配列は次の通りである：
GGGACCCCAATGACGAAGAGAGTATGAACAGCCCCTGCTGGCAAGTCAAGTGGCAACTCCGTCAGCTCGTTAGAAAGATGATTTTAGATTCCTCTGAGGAAACCATTTCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAAAATATTTCTCCCCTAGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGG  配列番号：３。
以下の配列を持つ６０塩基対のオリゴヌクレオチドをスクリーニングに用いた：
TGACGAAGAGAGTATGAACAGCCCCTGCTGGCAAGTCAAGTGGCAACTCCGTCAGCTCGT  配列番号：４。
ハイブリッド形成は、２０％のホルムアルデヒド、５Ｘ ＳＳＣ、１０％のデキストラン硫酸、０．１％のＮａＰｉＰＯ４、０．０５ＭのＮａＰＯ４、０．０５ｍｇのサケ精子ＤＮＡ、及び０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含むバッファー中、室温で終夜行い、次いで４２℃において５Ｘ ＳＳＣ、続いて２Ｘ ＳＳＣ中で数回洗浄した。ｃＤＮＡライブラリ中で１２の陽性クローンを同定し、陽性クローンを以下の配列を有する６０塩基対の第２のオリゴヌクレオチドプローブ（第１のプローブとの重複は無い）にハイブリッド形成することによって再スクリーニングした。
GGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGA  配列番号：５。
ハイブリッド形成は、上記のように行った。
【００９１】
得られた４つの陽性クローンを、フランキング５’ベクター配列に基づき外部ＣｌａＩ制限部位を付加したプライマー及び３’フランキングベクター配列に基づき外部ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を付加したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により同定した。ＰＣＲ産物はゲル精製し、Ｔ-ＡライゲーションによりｐＧＥＭ-Ｔ（Promegaから市販）にサブクローニングした。異なるＰＣＲからの３つの独立したクローンに、次いでジデオキシＤＮＡ配列を施した。これらのクローンのＤＮＡ配列分析は、それらが５’領域に幾分の長さ変化を持つが実質的に同一であることを示した。
Ａｐｏ-２リガンドのコード化領域の核酸配列を図１Ａに示した。クローンの１つの下流側３’末端領域の配列分析により、特徴的なポリアデニル化部位が明らかにされた（データは示さず）。ｃＤＮＡは１つのオープンリーディングフレームを含み、それはヌクレオチド位置９１−９３のＡＴＧコドンに割り当てられた開始部位を持つ。この部位を取り囲む配列は、開始部位について提案されたコンセンサス配列［Kozak, J. Cell Biol., 115: 887-903 (1991)］と合理的に一致した。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド位置９３４−９３６の停止コドンＴＡＡで終端する。
【００９２】
ヒトＡｐｏ-２リガンドの推定成熟アミノ酸配列は、２８１アミノ酸を含み、約３２．５ｋＤａの計算された分子量及び約７．６３の等電点を有する。Ｎ末端には明らかなシグナル配列は存在しないが、ヒドロパシー分析（データは示さず）は残基１５と４０との間に疎水性領域の存在を示している。シグナル配列が無いこと及び内部疎水性領域が存在することは、Ａｐｏ-２リガンドがＩＩ型膜貫通タンパク質であることを示唆している。推定細胞内、膜貫通及び細胞外領域は、各々１４、２６及び２４１アミノ酸長である。推定膜貫通領域は、図１Ａで下線を付した。潜在的なＮ結合グリコシル化部位は、推定細胞外領域の残基１０９に位置している。
Ａｐｏ-２リガンドのＣ末端領域と、ＴＮＦサイトカインファミリーの知られたメンバーとのアミノ酸配列のアラインメントは、Ｃ末端領域内で、Ａｐｏ-２リガンドがＡｐｏ-１リガンドと２３．２％の同一性を有することを示した（図１Ｂ）。アラインメント分析は、他のＴＮＦファミリーメンバーとのより低い程度の同一性を示した：ＣＤ４０Ｌ（２０．８％）、ＬＴ-α１（２０．２％）ＬＴ-β（１９．６％）、ＴＮＦ-α（１９．０％）、ＣＤ３０Ｌ及びＣＤ２７Ｌ（１５．５％）、ＯＸ-４０Ｌ（１４．３％）、及び4-１ＢＢＬ（１３．７％）。ＴＮＦサイトカインファミリーの中で、ＴＮＦ-α及びＬＴ-αの構造［Eck等, J. Bio. Chem., 264: 17595-17605 (1989); Eck等, J. Bio. Chem., 267: 2119-2122 (1992)］に基づいてβ鎖を形成すると予想される領域内の残基は、予想される連結ループ内の残基よりも高度に他のＴＮＦファミリーメンバーに保持される傾向がある。Ａｐｏ-２リガンドが、予想される連結ループ内の相同性に比較して、その推定β鎖領域において他のＴＮＦファミリーメンバーと大きな相同性を示すことが見いだされた。また、ループ連結推定β鎖、Ｂ及びＢ’は、Ａｐｏ-２リガンドにおいて顕著に長い。
【００９３】
（実施例２）
ヒトＡｐｏ-２リガンドの発現   Ａ．全長ｃＤＮＡ融合作成物の２９３細胞における発現
ｍｙｃエピトープタグに融合した全長Ａｐｏ-２リガンドｃＤＮＡを次のように作成した。Ａｐｏ-２リガンドｃＤＮＡ挿入物を親ｐＧＥＭ-ＴＡｐｏ-２リガンドプラスミド（実施例１に記載）からＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる消化により除去し、同じ制限酵素で消化されたｐＲＫ５哺乳動物発現プラスミド［Schall等, Cell, 61:361-370 (1990)；Suva等, Science, 237:893-896 (1987)］に挿入した。１３アミノ酸のｍｙｃエピトープタグSer Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn  配列番号：６［Evan等, Mol. Cell. Biol., 5: 3610-3616 (1985)］をコードする配列を、Ａｐｏ-２リガンドコード化配列の３’末端のコドン２８１と停止コドン（コドン２８２）との間にオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発［Zoller等, Nucleic Acids Res., 10: 6487-6469 (1982)］により挿入し、プラスミドｐＲＫ５Ａｐｏ-２リガンド-ｍｙｃを与えた。
ｐＲＫ５Ａｐｏ-２リガンド-ｍｙｃプラスミドを、リン酸カルシウム沈殿法によりヒト２９３細胞（ATCC CRL 1573）にネオマイシン耐性遺伝子を持つｐＲＫ５プラスミドと同時形質移入した。抗生物質Ｇ４１８（０．５ｍｇ／ｍＬ）（GIBCO）の存在下での５０％ＨＡＭ’ＳＦ１２／５０％ＤＭＥＭ（GIBCO）中での成長能力によりＡｐｏ-２リガンド-ｍｙｃを発現する安定なクローンを選択した。
Ａｐｏ-２リガンドのトポロジーを試験するために、Ｇ４１８耐性クローンを、抗ｍｙｃモノクローナル抗体（ｍＡｂ）クローン９Ｅ１０［Evans, 上掲：Oncogene Scienceから市販］、次いでフィコエリスリン（ＰＥ）抱合ヤギ抗マウス抗体（Jackson ImmunoReserchから市販）で染色した後にＦＡＣＳ分析した。ＦＡＣＳ分析により、ｍｏｃｋ形質移入細胞に比較してＡｐｏ-２リガンド-ｍｙｃ形質移入細胞では特定の正の染色シフトが明らかとなり、Ａｐｏ-２リガンドが細胞表面で発現され（図１Ｃ）、そのカルボキシル末端が露出されることが示された。従って、Ａｐｏ-２リガンドはＩＩ型膜貫通タンパク質であると考えられる。
【００９４】
Ｂ．ＥＣＤ融合作成物の２９３細胞及びバキュロウイルスでの発現
Ａｐｏ-２リガンドのＣ末端領域の上流側に他の配列を融合させた２つの可溶性Ａｐｏ-２リガンド細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）融合作成物を調製した。
一方の作成物では、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（「ｇＤ」）シグナルペプチド［Lasky等, DNA, 3: 23-29 (1984); Pennica等, Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 1142-1146 (1995); Paborsky等, Protein Engineering, 3: 547-553 (1990)に記載］の２７アミノ酸及びエピトープタグ配列
Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Gln  配列番号：７をｐＲＫ５哺乳動物発現プラスミド内でＡｐｏ-２リガンドのコドン１１４−２８１の上流側に融合させた。簡単に言えば、ｇＤ配列は親プラスミドｐＣＨＡＤ（Genentech, Lasty等, Science, 233: 209-212 (1986)に記載されたように調製）から、３’プライマーがｇＤの３’領域並びにＡｐｏ-２リガンドのコドン１１４−１２１に相補的なＰＣＲで増幅した。生成物は、ｐＲＫ５Ａｐｏ-２リガンドプラスミドがテンプレートとして用いられる引き続くＰＣＲにおいて、Ａｐｏ-２リガンドコード化領域の３’末端に相補的な３’プライマーとともに５’プライマーとして使用した。生成物は、ｇＤ-Ａｐｏ-２リガンドＥＣＤ融合物をコードするが、次いでｐＲＫ５プラスミドにサブクローニングしてプラスミドｐＲＫ５ｇＤ-Ａｐｏ-２リガンドＥＣＤを与えた。
【００９５】
ヒト胚腎臓２９３細胞（ATCC CRL 1573）をリン酸カルシウム沈殿法により、ｐＲＫ５ｇＤ-Ａｐｏ-２リガンドＥＣＤプラスミド又はｐＲＫ５で一過性形質移入した。可溶性ｇＤ-Ａｐｏ-２リガンドタンパク質の発現を、形質移入細胞の３５Ｓ-Ｃｙｓ及び３５Ｓ-Ｍｅｔで代謝的に標識することにより試験した。細胞上清を２４時間後に回収し、遠心分離で透明化した。免疫沈降法のために、５ｍｌの上清を５Ｂ６抗-ｇＤモノクローナル抗体（Genentech）とともに１μｇ／ｍｌで終夜４℃でインキュベートした。次いで、２５μｌのパンソルビン（Sigma）を添加して更に４℃で１時間おいた。管を回旋させ、ペレットをＰＢＳ中で洗浄し、ＳＤＳ試料バッファー中で５分間煮沸した。煮沸試料を再度回旋させ、上清にＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィを施した。
抗ｇＤ抗体での免疫沈降は、ｇＤ-Ａｐｏ-２リガンドプラスミドで形質移入した細胞の上清中に３つの優勢なタンパク質バンドを明示した（図１Ｅ）。これらのバンドは、２３，４８及び７４ｋＤａの相対分子量（Ｍｒ）で泳動した。成熟ｇＤ-Ａｐｏ-２ポリペプチドの計算分子量は約２２．５ｋＤａである；よって、観察されたバンドは融合タンパク質の単量体（２３ｋＤａ）、二量体（４８ｋＤａ）及び三量体（７４ｋＤａ）形であり、Ａｐｏ-２リガンドが哺乳動物細胞において分泌された可溶性ｇＤ融合タンパク質として発現されうることを示した。
【００９６】
第２の作成物では、ＭｅｔＧｌｙＨｉｓ１０配列（プラスミドｐＥＴ１９Ｂから誘導、Novagen）、次いで１２アミノ酸の塩テロキナーゼ切断部位
Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met  配列番号：８をバキュロウイルス発現プラスミド（ｐＶＬ１３９２、Pharmingen）内のＡｐｏ-２リガンドのコドン１１４−２８１の上流側に融合させた。簡単に言えば、Ａｐｏ-２リガンドコドン１１４−２８１領域を、ｐＲＫ５Ａｐｏ-２リガンドプラスミド（実施例１に記載）から、各々フランキングＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を導入した５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅した。生成物は、Ｔ−ＡライゲーションによりｐＧＥＭ-Ｔ（Promega）にサブクローニングし、ＤＮＡ配列を確認した。次いで、挿入物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩでの消化により除去し、アミノ末端ＭｅｔＧｌｙＨｉｓ１０タグ及びエンテロキナーゼ切断部位を含む修飾バキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９２（Pharmingenから市販）にサブクローニングした。
組換えバキュロウイルスは、Ｈｉｓ１０-Ａｐｏ-２ＥＣＤプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodopterafrugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC SRL 1711）にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより生成した。２８℃で４−５日のインキュベーションの後、放出されたウイルスを回収し、さらなる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Relley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。タンパク質は、下記実施例３に記載するようにＮｉ２＋キレートアフィニティクロマトグラフィで精製した。
【００９７】
（実施例３）
組換えヒトＡｐｏ-２リガンドの精製
抽出物を、組換えウイルス感染及びmock感染Ｓｆ９細胞（実施例２、項目Ｂ参照）から、Rupert等, Nature, 362: 175-179 (1993)に記載されているように調製した。簡単に言えば、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％のグリセロール；０．１％のＮＰ-４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物は、遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ７．８）中に５０倍に希釈し、０．４５μｍフィルターを通して濾過した。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬのベッド容量で調製し、２５ｍＬの水で洗浄して２５ｍＬの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物を１分当たり０．５ｍＬでカラムに負荷した。分画回収を開始する点であるベースラインＡ２８０までカラムを負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、非特異的結合したタンパク質を溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。再度ベースラインＡ２８０に達した後、カラムを二次洗浄バッファー中の０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬ分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に抱合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットにより分析した。溶離したＨｉｓ１０−Ａｐｏ-２タンパク質を含有する分画をプールし、負荷バッファーに対して透析した。
出発材料としてのｍｏｃｋ感染Ｓｆ９細胞に同じ手法を繰り返し、同様の分画をプールし、透析し、精製したヒトＡｐｏ-２の対照として使用した。
精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Ｈｉｓ１０-Ａｐｏ-２リガンド単量体について計算された分子量２２．４ｋＤａに相当するＭｒ２４ｋＤａの優勢なバンドを明示し（図１Ｄ、レーン３）；タンパク質配列マイクロ分析（データは示さず）は２４ｋＤａのバンドがＨｉｓ１０-Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドに相当することを確認した。少量の４８ｋＤａ及び６６ｋＤａバンドも観察され、可溶性Ａｐｏ-２リガンドの同種二量体及び同種三量体の存在を示した。スルホ-ＮＨＳ（５ｍＭ）（Pierce Chemical）及びＥＣＤ（Pierce Chemical）２５ｍＭ及び５０ｍＭとのインキュベーションによる精製Ｈｉｓ１０-Ａｐｏ-２リガンドの化学的架橋（各々、図１Ｄ、レーン１及び２）は、タンパク質を主に６６ｋＤａのバンドにシフトさせた。これらの結果は、溶液内でのＡｐｏ-２の優勢な形態は同種三量体であり、これらの三量隊がＳＤＳの存在下で二量体又は単量体に分解することを示している。
【００９８】
（実施例４）
Ａｐｏ-２リガンドのヒトリンパ細胞系に対するアポトーシス活性
精製した可溶性Ａｐｏ-２リガンド（実施例３に記載）のアポトーシス活性を、幾つかのヒトリンパ細胞系を用いて試験した。第１の実験では、Ａｐｏ-２リガンドの、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）形質転換ヒト末梢血Ｂ細胞から誘導した９Ｄ細胞（Genentech, Inc.）への影響を試験した。９Ｄ細胞（５ｘ１０４細胞／ウェル、ＰＲＭＩ１６４０培地プラス１０％ウシ胎児血清）を、対照培地、Ａｐｏ-２（３μｇ／ｍｌ、上記実施例３のように調製した）、又は抗Ａｐｏ-１モノクローナル抗体、ＣＨ１１（１μｇ／ｍｌ）［Yonehara等, J. Exp. Med., 169: 1747-1756 (1989)に記載；Medical and Biological Laboratories Co.から市販］のいずれかとともに２４時間インキュベートした。ＣＨ１１抗Ａｐｏ-１抗体はＦａｓ／Ａｐｏ-１リガンド活性の類似したアゴニスト抗体である。
インキュベーションの後、細胞をサイトスピンスライドガラス上に回収し、逆光顕微鏡下で写真撮影した。Ａｐｏ-２リガンド及び抗Ａｐｏ-１モノクローナル抗体の両方が類似のアポトーシス効果を誘発し、細胞質凝集及び細胞数の減少を特徴としていた（図２Ａ参照）。
Ａｐｏ-２リガンドの、９Ｄ細胞、並びにＲａｊｉ細胞（ヒトバーキットリンパＢ細胞系、ATCC CCL 86）及びジャーカット細胞（ヒト急性Ｔ細胞白血病細胞系、ATCC TIB 152）に対する効果をＦＡＣＳにより更に分析した。ＦＡＣＳ分析は、アポトーシス性細胞死について確立された基準を用いて、即ち２つのマーカー（ａ）アポトーシス細胞は染色するが生存細胞はしないヨウ化プロピジウム（［ＰＩ」）染料及び（ｂ）アポトーシス細胞には見られるが生存細胞には見られない露出されたホスファチジルセリンに結合するタンパク質アネキシンＶの蛍光誘導体での細胞の蛍光染色関係を用いて実施した［Darzykiewicz等, Methods in Cell Biol., 41: 15-38 (!994); Fadok等, J. Immunol., 14: 2207-2214 (1992); Koopman等, Blood, 84: 1415-1420 (1994)］。
９Ｄ細胞（図２Ｂ）、Ｒａｊｉ細胞（図２Ｃ）及びジャーカット細胞（図２Ｄ）を、対照培地（左側パネル）、Ａｐｏ-２リガンド（３μｇ／ｍｌ、実施例３に記載したように調製）（真中パネル）、又は抗Ａｐｏ-１抗体（１μｇ／ｍｌ）（右側パネル）とともに２４時間インキュベート（１ｘ１０６細胞／ウェル）した。次いで細胞を洗浄し、ＰＩ及びフルオレセインチオシアネート（ＦＩＴＣ）-抱合アネキシンＶ（Brand Applicationsから購入）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＰＩ及びアネキシンＶ染色の両方に陰性の細胞（第３象限）が生存細胞を表し；ＰＩ陰性、アネキシンＶ陽性染色細胞（第４象限）は初期アポトーシス細胞を表し；ＰＩ陽性、アネキシンＶ陽性染色細胞（第２象限）は主にアポトーシスの後期段階の細胞を表す。
【００９９】
Ａｐｏ-２リガンド処理９Ｄ細胞は、向上した細胞外アネキシンＶ結合性、並びに顕著に増加したＰＩの取り込みを示し（図２Ｂ）、Ａｐｏ-２リガンドが細胞でアポトーシスを誘発したことを示している。抗Ａｐｏ-１抗体、ＣＨ１１では匹敵する結果がえられた（図２Ｂ）。Ａｐｏ-２リガンドは、Ｒａｊｉ及びジャーカット細胞で抗Ａｐｏ-１抗体と類似の応答を誘発した（図２Ｃ及び２Ｄ参照）。対照及び抗Ａｐｏ-１抗体と比較したときのこれらの細胞系でのＡｐｏ-２リガンドによるアポトーシスの誘発（アポトーシス細胞の％で測定した場合）を下記の表１に示す。
Ａｐｏ-２リガンドによるヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化の活性化も分析した。ジャーカット細胞（左側レーン）及び９Ｄ細胞（右側レーン）を対照培地又はＡｐｏ-２リガンド（３μｇ／ｍｌ、実施例３に記載したように調製）とともに６時間インキュベート（２ｘ１０６細胞／ウェル）し、次いでＤＮＡを細胞から抽出し、ターミナルトランスフェラーゼを用いて３２Ｐ-ｄｄＡＴＰで標識した。標識したＤＮＡ試料に電気泳動２％アガロースゲルを施し、後にオートラジオグラフィで分析した［Moore等, Cytotechnology, 17: 1-11 (1995)］。Ａｐｏ-２リガンドは、ジャーカット細胞及び９Ｄ細胞の両方でヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化を誘発した（図２Ｅ）。このような断片化はアポトーシスに特徴的である［Cohen, Advances Immunol., 50: 55-85 (1991)］。
Ａｐｏ-２リガンドのアポトーシス活性の時間変化を試験するために、９Ｄ細胞をミクロタイターディッシュ（５ｘ１０４細胞／ウェル）で、対照培地又はＡｐｏ-２リガンド（３μｇ／ｍｌ、実施例３に記載したように調製）とともに０〜５０時間の範囲の期間インキュベートした。インキュベーションに続いて、死亡及び生存細胞の数を、ヘモサイトメータを用いて顕微鏡検査で測定した。
図３Ａに示すように、細胞死の最大レベルは９Ｄ細胞において２４時間以内に起こる。
Ａｐｏ-２リガンド誘発細胞死の用量依存性を試験するために、９Ｄ細胞（５ｘ１０４細胞／ウェル）を、連続的に希釈した対照培地又はＡｐｏ-２（実施例３に記載したように調製）とともに２４時間インキュベートした。インキュベーション後の死亡及び生存細胞の数を上記のように測定した。結果を図３Ｂに示した。特異的アポトーシスは、Ａｐｏ-２リガンド処理細胞でのアポトーシス％を対照中でのアポトーシス％で除することにより決定した。最大値の半分のアポトーシス活性化は約０．１μｇ／ｍｌ（約１ｎＭ）で起こり、最大誘発は約１〜３μｇ／ｍｌ（約１０〜３０ｎＭ）で起こった。
【０１００】
（実施例５）
Ａｐｏ-２リガンドのヒト非リンパ腫瘍細胞系に対するアポトーシス活性
Ａｐｏ-２リガンドのヒト非リンパ腫瘍細胞系に対する影響を、以下の細胞系を用いて試験した：ＨｅＬａ（ヒト頸部癌から誘導、ATCC CCL 22）；Ｍｅ-１８０（ヒト頸部癌から誘導、ATCC HTB 33）；ＭＣＦ７（ヒト乳癌から誘導、ATCC HTB 22）；Ｕ-９３７（ヒト組織リンパ腫から誘導、ATCC CRL 1593 ；Ａ５４９（ヒト肺癌から誘導、ATCC CCL 185）；及び２９３（アデノウイルス形質移入ヒト胚腎臓細胞から誘導、ATCC CCL 1573）。
アッセイにおいて、各細胞系の１ｘ１０６細胞を、対照培地、Ａｐｏ-２リガンド（３μｇ／ｍｌ、実施例３に記載したように調製）、又は抗Ａｐｏ-１抗体ＣＨ１１（１μｇ／ｍｌ）とともに２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、アポトーシスを実施例４に記載したようにＦＡＣＳ分析で測定した。結果を下記の表１に示す。
【０１０１】
（表１）
2010246560.tif 000002
【０１０２】
ＨｅＬａ細胞及びＭＣＦ７細胞は、ＣＨ１１抗Ａｐｏ-１抗体に比較してＡｐｏ-２リガンドによるアポトーシス誘発に対して等しい感受性であった。これに対して、Ｕ-９３７細胞及びＡ５４９細胞は、Ａｐｏ-２リガンドによるアポトーシス誘発に対して極めて大きな感受性を有していた。ＭＥ-１８０細胞はＡｐｏ-２リガンドに対しては全く感受性であったが、抗Ａｐｏ-１抗体には比較的耐性があった。２９３細胞はＡｐｏ-２リガンドに耐性であり、抗Ａｐｏ-１抗体には若干応答した。
よって、Ａｐｏ-２リガンドは非リンパ由来の細胞、並びにリンパ由来の細胞（実施例４参照）でアポトーシスを誘発できる。また、十分に理解されておらず、いかなる特定の理論との結びつけるつもりはないが、本出願人は、Ａｐｏ-２リガンドがＡｐｏ-１とは区別されるレセプターを介して作用すると考えている。この考えは、上記の細胞系がＡｐｏ-２リガンド及び抗Ａｐｏ-１抗体に対して異なる感受性パターンを示すここに記載したデータによって支持されている。
【０１０３】
（実施例６）
Ａｐｏ-２リガンドのヒト末梢血液単球に対する影響
末梢血液単核細胞（「ＰＢＭＣ」）は、ヒト供与者の血液から、リンパ球分離媒体（LSM(登録商標)、Organon Teknika）を用いたフィコール密度勾配遠心分離により単離した。単離下Ｔ細胞集団は、抗Ｉｇカラムへの表面Ｉｇ結合によりＢ細胞を除去し、ＩｇカラムへのＦｃレセプターの結合を通して単球を除去することによりＰＢＭＣから調製した（R & D Systems）。単離したＢ細胞集団はＯＫＴ３骨髄細胞（ATCC, CRL 8001）により生成された抗ＣＤ３抗体と反応したＴ細胞及び４Ｆ２Ｃ１３ハイブリドーマ（ATCC, HB 22）により生成された単球特異的抗体と反応した単球の補体媒介除去によりＰＢＭＣから調製した。さらなる単球除去はプラスチックへの接着によって達成した。
【０１０４】
新たに単離した末梢血液Ｂ又はＴ細胞（１ｘ１０６細胞／ウェル）を、対照培地又はＡｐｏ-２リガンド（３μｇ／ｍｌ、実施例３に記載したように調製）の存在下で３日間培養した。活性化のために、Ｂ細胞は同時にリポ多糖（「ＬＰＳ」、１μｇ／ｍｌ）で処理し、Ｔ細胞はホルボールミリステートアセテート（「ＰＭＡ」、１０ｎｇ／ｍｌ）プラスイノマイシン（１μｇ／ｍｌ）（Sigma）で処理した。インターロイキン-２（「ＩＬ-２」）前処理のために、Ｔ細胞は、Ａｐｏ-２リガンドに暴露する前に、ＩＬ-２（５０Ｕ／ｍｌ）（Genzyme）の存在下で３−５日間培養した。アポトーシスは、本質的に実施例４に記載したようにＦＡＣＳ分析で決定した。しかし、Ｂ細胞は、抗ＣＤ１９／ＣＤ２０抗体（Jackson Immunoreserch）でゲートし、Ｔ細胞は抗ＣＤ４／ＣＤ８抗体（Jackson Immunoreserch）でゲートした。結果を下記の表２に示すが、独立した実験［Ｂリンパ球−９実験；Ｔリンパ球−８実験；Ｔリンパ球プラスＩＬ-２−５実験］の平均±ＳＥで表し、各データ点毎に５００，０００細胞が分析された。統計的分析をスチューデントｔ試験を用いて実施した、表２において、個々の対照に対してａ＝ｐ＜０．０５及びｂ＝ｐ＜０．０２である。
【０１０５】
（表２）
2010246560.tif 000003
Ａｐｏ-２リガンドは、非刺激Ｂ細胞、ＬＰＳで活性化したＢ細胞、及びＰＭＡ及びイノマイシンで活性化したＴ細胞においてアポトーシスを誘発した。ＩＬ-２の存在下で細胞を培養することにより末梢Ｔ細胞がアポトーシスを起こしやすくなることは既に報告されている［Lenardo等, Nature, 353: 858-861 (1991)］。本研究は、ＩＬ-２での前処理は、末梢Ｔ細胞をＡｐｏ-２リガンド誘発死に対して敏感化させないことを示した。
【０１０６】
（実施例７）
Ｆａｓ／Ａｐｏ-１及びＴＮＦレセプターを用いた阻害アッセイ
Ｆａｓ／Ａｐｏ-１レセプター、並びにＩ型及びＩＩ型ＴＮＦレセプター（ＴＮＦ-Ｒ１及びＴＮＦ-Ｒ２）がＡｐｏ-２リガンドのアポトーシス活性の媒介に含まれているか否かを決定するために、これらのレセプターの可溶化形態が精製した可溶性Ａｐｏ-２リガンド（実施例３に記載）のアポトーシス活性を阻害するか否かを試験することにより検定した。
９Ｄ細胞（５ｘ１０４細胞／ウェル）を対照培地又はＡｐｏ-２リガンド（３μｇ／ｍｌ、実施例３に記載したように調製）とともに、対照バッファー、ＣＤ４-ＩｇＧ対照（２５μｇ／ｍｌ）、可溶性Ａｐｏ-１-ＩｇＧ（２５μｇ／ｍｌ）、可溶性ＴＮＦＲ１-ＩｇＧ（２５μｇ／ｍｌ）又は可溶性ＴＮＦＲ２-ＩｇＧ融合タンパク質（２５μｇ／ｍｌ）の存在下で２４時間インキュベートした。
Ｆａｓ／Ａｐｏ-１、ＴＮＦ-Ｒ１及びＴＮＦ-Ｒ２レセプターの可溶性誘導体はAshkenazi等, Methods, 8: 104-115 (1995)に記載したようにＩｇＧ融合タンパク質として作成した。ＣＤ４-ＩｇＧは、Byrn等, Nature, 344: 667-670 (1990)に記載されたようにＩｇＧ融合タンパク質として作成し、対照として用いた。
図３Ｃに示したように、レセプター融合分子はＡｐｏ-２リガンドの９Ｄ細胞に対するアポトーシス活性を阻害しなかった。これらの結果は、Ａｐｏ-２リガンドのアポトーシス活性がＦａｓ／Ａｐｏ-１及びＴＮＦ-Ｒ１及びＴＮＦ-Ｒ２とは独立であることを示している。
【０１０７】
（実施例８）
哺乳動物組織におけるＡｐｏ-２リガンドｍＲＮＡの発現
ヒト組織におけるＡｐｏ-２リガンドｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロット分析によって検査した（図４）。ヒトＲＮＡブロットを、全長Ａｐｏ-２リガンドｃＤＮＡをベースにした３２Ｐ標識ＤＮＡプローブ、又はGenBank EST配列、ＨＨＥＡ４７Ｍ（実施例１参照）をベースにした３２Ｐ標識ＲＮＡプローブにハイブリッド形成させた。ヒト胎児ＲＮＡブロットＭＴＮ(Clontech)及びヒト成人ＲＮＡブロットＭＴＮ-II(Clonetech)をＤＮＡプローブと共にインキュベートし、ヒト成人ＲＮＡブロットＭＴＮ-I(Clonetech)をＲＮＡプローブと共にインキュベートした。ブロットをハイブリッド形成用バッファー［5X SSPE；２X デンハード溶液；１００ｍｇ／ｍＬの変性剪断されたサケ精子ＤＮＡ；５０％のホルムアミド；２％のＳＤＳ］に入ったプローブと共に、４２℃で１６時間インキュベートした。ブロットを１Ｘ ＳＳＰＥ；２％のＳＤＳを用い、６５℃で１時間数回洗浄し、ついで５０％の脱イオンホルムアミド；１Ｘ ＳＳＰＥ；０．２％のＳＤＳを用い、６５℃で３０分間洗浄した。ブロットを一晩さらした後、リン光画像機（Fuji）を用いた展開させた。
結果を図４に示す。ヒト胎児組織では、Ａｐｏ-２リガンドｍＲＮＡ発現は、肺、肝臓及び腎臓で検出されたが脳組織ではされなかった。ヒト成人組織では、Ａｐｏ-２リガンドｍＲＮＡ発現は、脾臓、胸腺、前立腺、卵巣、小腸、末梢血液リンパ球、心臓、胎盤、肺、及び腎臓で検出された。精巣、脳、骨格筋、及び膵臓では殆ど又は全く発現は検出されなかった。上記のようなＡｐｏ-２リガンドの発現パターンは、主にＴ細胞及び精巣で発現されるＡｐｏ-１リガンドと同じではなかった［Nagata等, 上掲］。
【０１０８】
（実施例９）
Ａｐｏ-２リガンドのヒト腫瘍細胞系に対するアポトーシス活性
Ａｐｏ-２リガンド（実施例３に記載）のヒト腫瘍細胞系に対するアポトーシス活性を、幾つかの化学治療薬の存在又は不存在下でさらに試験した。
以下のヒト腫瘍細胞系をアッセイした：Ａ５４９（肺癌、ATCC CCL 185）；ＨＴＣ１１６（結腸癌、ATCC CCL 247）；ＳＷ４８０（結腸腺癌、ATCC CCL 228）；ＭＤＡ２３１（乳癌、ATCC HTB 26）；ＨｅＬａ（頸部癌、ATCC CCL 22）；ＭＥ-１８０（頸部癌、ATCC HTB 33）；Ｔ２４（膀胱癌、ATCC HTB 4）；ＳＫ-Ｎ-ＡＳ（神経芽腫、White等, Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 5520-5524 (1995)）。下記表３に示すように、これらの細胞系の幾つかは野生型ｐ５３を発現するが(WT)、他は突然変異により発現しない(mut)。細胞を２．５ｘ１０５細胞／ウェルで９６ウェルプレートに蒔き、終夜インキュベートした。細胞を２倍希釈のＡｐｏ-２リガンド（１００ｎｇ／ｍｌから０．０１ｎｍ／ｍｌ）の存在下で培養した。幾つかの培地には化学治療薬−シクロヘキサミド（「ＣＨＸ」）（５０μｇ／ｍｌ；Sigma Chemicals）、ドキソルビシン（１０−１００μｇ／ｍｌ；Pharmacia）、又は５-ＦＵ（６ｍｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ）も２４時間添加した。
２４時間のインキュベーション後、細胞を０．５％クリスタル-ビオレチン２０％メタノールで染色した。０．１Ｍクエン酸ナトリウム（５０％メタノール中０．１Ｍクエン酸）で染色細胞から染料を溶離し、５４０ｎｍでの吸収を測定して細胞生存を測定した。
結果を下記の表３に示す。
【０１０９】
（表３）
2010246560.tif 000004
＋：        100nm/mlＡｐｏ-２Ｌで24時間後＞35%死亡。
＋＋：      100nm/mlＡｐｏ-２Ｌで24時間後＞70%死亡。
＋＋＋：    10nm/mlＡｐｏ-２Ｌで24時間後＞70%死亡。
これらの結果は、Ａｐｏ-２リガンドが種々の腫瘍型から誘導された腫瘍細胞系において細胞死を誘発したことを示し、Ａｐｏ-２Ｌが腫瘍細胞のｐ５３状態とは無関係に細胞死を誘発したことを示している。これらの結果はまた、Ａｐｏ-２リガンド誘発細胞死が幾つかの異なる化学治療薬によって増強されることも示している。
【０１１０】
（実施例１０）
インビボでのＡｐｏ-２リガンドのアポトーシス活性
腫瘍を持つヌードマウスにおけるＡｐｏ-２リガンドの影響を試験した。ヌードマウス（各群当たり５−１０匹のマウス）（Harlan Sprague Dawleyから購入）に、ＭＤＡ２３１ヒト乳ガン細胞（ATCC HTB 26）（２ｘ１０６細胞／マウス）を皮下注射した（第０日）。腫瘍を１４日間成長させた。１４及び１５日目に、２μｇ／０．０５ｍｌ／マウスのＡｐｏ-２リガンド（実施例３）及び／又は１０μｇ／０．０５ｍｌ／マウスのドキソルビシン（Pharmacia）を腫瘍部位に注射した。対照動物は同様に０．０５ｍｌのＰＢＳを注射した。２１日目に動物を犠牲にし、腫瘍を切除して秤量（グラム）した。
結果を図５に示す。データは、Ａｐｏ-２リガンド処理が腫瘍成長そのものを阻害し、Ａｐｏ-２リガンドが腫瘍成長に対するドキソルビシンの効果を向上させたことを示している。
【０１１１】
（実施例１１）
インビボでのＡｐｏ-２リガンドのアポトーシス活性
実施例１０に記載したように、腫瘍を持つヌードマウスにおけるＡｐｏ-２リガンドの抗腫瘍効果を試験した。ただし、第０日において、マウスにＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞（ATCC CCL 247）（２ｘ１０６細胞／マウス）皮下注射した。腫瘍を１４日間成長させた。１４及び１５日目に、２μｇ／０．０５ｍｌ／マウスのＡｐｏ-２リガンド及び／又は１０μｇ／０．０５ｍｌ／マウスの５-ＦＵ（Roche）を腫瘍部位に注射した。対照動物は同様に０．０５ｍｌのＰＢＳを注射した。２１日目に動物を犠牲にし、腫瘍を切除して秤量（グラム）した。
結果を図６に示す。これらの結果は、Ａｐｏ-２リガンド処理が腫瘍成長そのものを阻害し、Ａｐｏ-２リガンドが腫瘍成長に対する５-ＦＵの阻害効果を向上させたことを示している。
【０１１２】
（実施例１２）
インビボでのＡｐｏ-２リガンドのアポトーシス活性
実施例１１に記載したように、腫瘍を持つヌードマウスにおけるＡｐｏ-２リガンドの抗腫瘍効果を試験した。ただし、第１及び２日目に、１０μｇ／０．０５ｍｌ／マウスのＡｐｏ-２リガンド及び／又は１００μｇ／０．０５ｍｌ／マウスの５-ＦＵ（Roche）を腹膜内注射した。対照動物は同様にＰＢＳを注射した。腫瘍サイズ（ｍｍ２）を５、９及び１５日目に測定し、動物を犠牲にし、腫瘍を切除して秤量（グラム）した。
結果を図７及び８に示す。これらの結果は、Ａｐｏ-２リガンドが腹膜内注射したときでも皮下の腫瘍部位に到達でき抗腫瘍活性を発揮できることを示している。また、これらの結果は、腫瘍成長自体を阻害し、腫瘍成長に対する５-ＦＵの阻害効果を向上させるＡｐｏ-２リガンドの能力を確認した。
【０１１３】
（実施例１３）
ＣｒｍＡを用いた阻害アッセイ
ＩＣＥ及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａ等のプロテアーゼがＡｐｏ-２リガンドによるアポトーシス誘発において役割を果たしているか否かを実験するために、ＣｒｍＡがＡｐｏ-２リガンド誘発アポトーシスを阻止するか否化を決定するアッセイを行った［Marsters等, Current Biology, 6: 750-752 (1996)］。ＣｒｍＡは、死亡プロテアーゼＩＣＥ及びＣＰＰ／Ｙａｍａのポックスウイルス誘導阻害剤であり、ＴＮＦＲ１及びＦａｓＡｐｏ-１による死亡シグナル伝達を阻止する。さらに、Ａｐｏ-１リガンド及びＴＮＦによるアポトーシスを媒介するアダプタータンパク質ＦＡＤＤを含む「死亡ドメイン」［Chinnaiyan等, Cell, 81: 505-512 (1995); Hsu等, Cell, 84: 299-308 (1996)］が、Ａｐｏ-２リガンド誘発アポトーシスに含まれるか否かを実験するために、ＦＡＤＤのドミナントネガティブ突然変異（ＦＡＤＤ-ＤＮ）［Hsu, 上掲］がＡｐｏ-２リガンド機能を阻害するか否かを決定するアッセイを行った［Marsters等, Current Biology, 6: 750-752 (1996)］。
ＨｅＬＡ-Ｓ３（ATCC CCL 22）細胞をｐＲＫ５-ＣｒｍＡ発現プラスミド（Ray等, 上掲で報告されたＣｒｍＡ配列）又はｐＲＫ５-ＦＡＤＤ-ＤＮ発現プラスミド（Hsu等, Cell, 84: 299-308 (1996)）で形質移入した。ｐＲＫ５は対照として使用した。細胞を、プラスミドＤＮＡ取り込みのマーカーとしてのｐＲＫ５-ＣＤ４（Smith等, Science, 238: 1704-1707 (1988)）と同時形質移入した。形質移入細胞をフィコエリスリン抱合抗ＣＤ４抗体（Jackson Immunoreserch）で染色して同定し、アポトーシスは本質的に上記実施例４に記載したようにＦＡＣＳで分析した。
結果を図９に示す。ＣｒｍＡは、Ａｐｏ-２リガンド誘発アポトーシス、並びに抗Ａｐｏ-１抗体に誘発されたアポトーシスを阻止した。これに対して、ＦＡＤＤ-ＮＤはＡｐｏ-２誘発アポトーシスには殆ど影響しなかったが、抗Ａｐｏ-１抗体に誘発されたアポトーシスは実質的に阻止した。従って、このアッセイの結果は、Ａｐｏ-２リガンド、ＴＮＦＲ１及びＦａｓ／Ａｐｏ-１はアポトーシス性細胞死を活性化するのに共通の遠位シグナル伝達経路を用いることを示唆している。特に、結果は、ＩＣＥ及びＣＰＰ／Ｙａｍａ等のプロテアーゼがＡｐｏ-２リガンド誘発アポトーシスには必要であることを示している。これに対して、ＦＡＤＤはＴＮＦＲ１及びＦａｓ／Ａｐｏ-１に誘発される細胞死には必要であるがＡｐｏ-２リガンドでは必要ない。
【０１１４】
Ａｐｏ-２リガンド抗体の調製
１μｇのＡｐｏ-２リガンド(実施例３に記載したように調製し、Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MTから購入したMPL-TDMアジュバントで希釈)を、各々の後足の裏の柔らかい部分に、１週間の間隔で１０回注射することで、Ｂａｌｂ／ｃマウス(チャールズリヴァー研究所から得たもの)を免疫化した。最終の追加免疫から３日後に、膝窩リンパ節をマウスから取り除き、単細胞懸濁液を、１％のペニシリン-ストレプトマイシンが補われたＤＭＥＭ培地(Biowhitakker Corp.から得たもの)中で調製した。ついで、リンパ節細胞を３５％のポリエチレングリコールを使用し、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ.１(ATCC CRL 1597)と融合させ［Laskov等, Cell. Immunol., 55:251(1980)］、９６-ウェル培養プレートで培養した。融合の結果得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地において選択した。融合から１０日後に、ハイブリドーマ培養の上清をＥＬＩＳＡでスクリーニングし［Kim等, J. Immunol. Meth., 156: 9-17 (1992)］、Ａｐｏ-２リガンドタンパク質に結合するモノクローナル抗体の有無を試験した。
ＥＬＩＳＡにおいて、各々のウェルに、ＰＢＳに０．５μｇ／ｍｌのＡｐｏ-２リガンド（実施例３参照）が入ったものを５０μｌ添加して、９６-ウェルマイクロタイタープレート(Nunc)をコートし、４℃で一晩インキュベートした。ついでプレートを洗浄用バッファー(０．０５％のトゥイーン２０を含有するＰＢＳ)で３回洗浄した。ついで、マイクロタイタープレートのウェルを、２．０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μｌでブロックし、室温で１時間インキュベートした。ついでプレートを、洗浄用バッファーで、再度３回洗浄した。
【０１１５】
洗浄工程後、２μｇ／ｍｌのＡｐｏ-２リガンド抗体５０μｌ又は１００μｌのハイブリドーマ上清を指定ウェルに添加した。１００μｌのＰ３Ｘ６３ＡｇＵ.１骨髄腫細胞の条件培地を、対照として他の指定ウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄用バッファーで３回洗浄した。
次に、アッセイ用バッファー（０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％のトゥイーン２０、０．０１％のチメルソール(Thimersol)がＰＢＳに入ったもの）で、１：１０００に希釈されたＨＲＰ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ(Cappel Laboratories社から購入)を５０μｌ、各々のウェルに添加し、プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄用バッファーで３回洗浄し、ついで各々のウェルに５０μｌの基質(ＴＭＢ、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン；Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MDから入手)を添加し、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌの終止溶液(Kirkegaard & Perry)を各々のウェルに添加して反応を終了させ、４５０ｎｍでの吸光度を自動マイクロタイタープレート読取装置で読み取った。
【０１１６】
ハイブリドーマ上清（選択した９９）を、Ａｐｏ-２２リガンド誘発９Ｄ細胞死を阻止する活性について試験した。活性は、トリパンブルー染料排除を用いて処理した９Ｄ細胞の生存％を試験することにより最初に決定した。
阻止活性はＦＡＣＳ分析でも確認した。９Ｄ細胞（５ｘ１０５細胞／０．５ｍｌ）を完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩプラス１０％のＦＣＳ、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム）に懸濁し、２４ウェルのミクロタイタープレートに配した。０．５ｍｌのＡｐｏ-２リガンド（１μｇ／ｍｌ）（実施例３で調製）を完全ＲＰＭＩ培地に懸濁し、１０μｇの精製モノクローナル抗体又は１００μｌの培地上清とともにプレインキュベートし、次いで９Ｄ細胞を含む２４マクロタイターウェルに添加した。マクロタイタープレートは７％ＣＯ２の存在下で終夜３７℃でインキュベートした。インキュベートした細胞は、次いで回収し、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞の生存を製造者（Clontech）の推奨に従ってホスファチジルセリンに結合したＦＩＴＣアネキシンＶの染色により決定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、２００μｌ結合バッファー中に再懸濁した。１０μｌのアネキシンＶ-ＦＩＴＣ（１μｇ／ｍｌ）及び１０μｌのヨウ化プロオピジウムを細胞に添加した。暗中１５分のインキュベーションの後、９Ｄ細胞をＦＡＣＳで分析した。
８つの潜在的阻止、４つの非阻止抗体分泌ハイブリドーマが同定され、更に制限希釈技術によりクローニング（２回）した。
【０１１７】
モノクローナル抗体１Ｄ１、２Ｇ６、２Ｅ１１、及び５Ｃ２と命名した４つの抗体のＦＡＣＳ分析を図１０に例示した（後述するように、１Ｄ１、２Ｇ６、２Ｅ１１、及び５Ｃ２抗体は、各々ハイブリドーマ１Ｄ１．１２．４、２Ｇ６．３．４、２Ｅ１１．５．５、及び５Ｃ２．４．９から生成され、それらは全てＡＴＣＣに寄託されている）。Ａｐｏ-２リガンドで処理した９Ｄ細胞（左上図）は、未処理の対照細胞（右上図）より５０％高いのアポトーシス細胞を示した。Ａｐｏ-２リガンドに、２Ｅ１１５Ｃ２、２Ｇ６、又は１Ｄ１抗体を加えて処理した９Ｄ細胞は、未処理の対照細胞より各々０％、６％、２６％、及び４８％高いアポトーシス細胞を示した。これらの結果は、５Ｃ２、２Ｅ１１及び２Ｇ６抗体は阻止抗体であるが１Ｄ１抗体は非阻止抗体であることを示す。最も高い阻止活性は５Ｃ２抗体で得られた。
４つの抗体の抗原特異性もＥＬＩＳＡで試験した。ミクロタイターウェルを２μｇ／ｍｌのリンホトキシン（Genentech, Inc., EP 164,965, Gray等, Nature, 312: 721-724 (1984)も参照）、ＴＮＦ-α（Genentech, Inc., Pennica等, Nature, 312: 724-729 (1984); Aggarwal等, J. BIol. Chem., 260: 2345-2354 (1985)も参照）、又はＡｐｏ-２リガンド（実施例３参照）でコートした。モノクローナル抗体１Ｄ１、２Ｇ６、２Ｅ１１、及び５Ｃ２は１０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。
アッセイの結果は図１１に示した。図１１の結果は、モノクローナル抗体２Ｇ６、２Ｅ１１、及び５Ｃ２はＡｐｏ-２リガンドに特異的だが、モノクローナル抗体１Ｄ１はリンホトキシン及びＴＮＦ-αと弱い交差反応結合を有することを示した。
【０１１８】
Ｂ．アイソタイピング
１Ｄ１、２Ｇ６、２Ｅ１１、及び５Ｃ２抗体（上記項目Ａに記載）のアイソタイプを、アイソタイプ特異的ヤギ抗マウスＩｇ（Fisher Biotech, Pitsburgh, PA）でミクロタイタープレートを４℃で終夜コートすることにより決定した。プレートは次いで上記の洗浄バッファーで洗浄した。ミクロタイタープレートのウェルを２００μｌの２％ウシ血清アルブミンでブロックし、室温で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄バッファーで３回洗浄した。
次に、１００μｌの５μｇ／ｍｌの精製Ａｐｏ-２リガンド抗体又は１００μｌのハイブリドーマ培地上清を指定ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、次いで５０μｌのＨＲＰ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ（上記）を各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートした。ＨＲＰのレベルを上記のＴＲＰ基質を用いて検出した。
アイソタイピング分析は、１Ｄ１及び２Ｇ６抗体はＩｇＧ２ｂ抗体であり、２Ｅ１１及び５Ｃ２抗体はＩｇＧ２ａ抗体であることを示した。
【０１１９】
Ｃ．エピトープマッピング
エピトープマッピングは、上掲のKim等に記載されているように、ビオチニル化モノクローナル抗体を用いて競合的結合ＥＬＩＳＡを使用して実施した。選択されたモノクローナル抗体は、Antibodies, a laboratory Manual, Eds. E. Harlow及びD. Lane, p.342に記載されているようにＮ-ヒドロキシスクシンイミドを用いてビオチニル化した。ミクロタイタープレートウェルを、５０μｌのＡｐｏ-２リガンド（実施例３参照、０．１μｇ／ｍｌ）でコートし、４℃で終夜維持し、次いで２％ＢＳＡで室温において１時間ブロックした。ミクロタイターウェルを洗浄した後、あらかじめ決定した最適濃度のビオチニル化抗体及び１０００倍過剰の非標識抗体を各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ビオチニル化抗体の量をＨＲＰ-ストレプトアビジンの添加で検出した。ミクロタイターウェルを洗浄した後、結合した酵素を基質（ＴＭＢ）の添加で検出し、プレートをＥＬＩＳＡプレート読み取り機で４９０ｎｍで読み取った。
結果を図１２に示す。結果は、ＨＲＰ-抱合抗体の結合は、それ自身の抗体の過剰量で有効に阻害されたが、アッセイした他の抗体ではされないことを示した。
モノクローナル抗体で認識されるＡｐｏ-２リガンドの領域は、合成ペプチド［図１Ａに示したようにＡｐｏ-２リガンド配列のaa 128-143(ペプチド「ＡＰＯ１４」)；aa 144-159(ペプチド「ＡＰＯ１５」)；aa 192-204(ペプチド「ＡＰＯ１７」)；aa 230-238(ペプチド「ＡＰＯ１８」）；aa 261-272(ペプチド「ＡＰＯ１９」）］を用いてChuntharapai等, J. Immunol., 152: 1783-1789 (1994)に記載されているようにＥＬＩＳＡで決定した。結果を図１３に示した。１Ｄ１抗体は、Ａｐｏ-２リガンドのアミノ酸残基１９２−２０４を含むＡＰＯ１７ペプチドに結合性を示した。
【０１２０】
（実施例１５）
ＣＨＯ細胞におけるＡｐｏ-２リガンドの発現
ｐＧＥＭ-ＴＡｐｏ-２リガンドプラスミド（上記実施例１及び２に記載）からの全長Ａｐｏ-２リガンドｃＤＮＡ挿入物をｐＲＫ５プラスミドに挿入した。このプラスミドを、次いで、リポフェクタミンプラス（Gibco/BRL）法を用いて、ＤＨＦＲ選択遺伝子を持つｐＦＤ１１プラスミド（ＳＶ４０初期プロモーター）とＤＰ-１２ＣＨＯ細胞に同時形質移入した。Ａｐｏ-２リガンドを発現する安定なクローンを、２．５％透析ＦＢＳを含むＰＳ２１（Ｇ１０７４）／２８０ＧＨＴ-枯渇選択成長培地中での成長能力で選択した。
選択したＡｐｏ-２リガンドを発現するＣＨＯ細胞を３７℃で２−４日インキュベートした。次いで細胞培地を回収して濾過した。細胞培地上清中のＡｐｏ-２リガンドの存在は、ウェスタンブロット分析により試験した。ウェスタン分析用のタンパク質を調製するために、培地上清を、制御された孔のガラスビーズに結合させたここに記載の５Ｃ２抗Ａｐｏ-２抗体とともにインキュベートした。インキュベーションに続いて、ビーズを洗浄し、結合タンパク質を２５ｍＭのＤＴＴを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーで溶離した。次いで培地を、４−２０％ポリアクリルアミド勾配ＳＤＳゲルを走らせ、ニトロセルロースフィルター上にエレクトロブロットした。フィルターをポリクローナルウサギ抗ヒトＡｐｏ-２リガンドポリクローナル抗体、続いてセイヨウワサビペルオキシダーゼに抱合させた抗ウサギＩｇＧとともにインキュベートし、製造者（ＮＥＢ）の指示に従って化学発光によって展開した。Ａｐｏ-２リガンドを発現するＣＨＯ細胞からの試料は、ゲル上に２２，０００ダルトンの単一のバンドを生じた（データは示さず）。
【０１２１】
形質移入したＣＨＯ細胞によって発現したＡｐｏ-２リガンドの配列を決定するために、２５ｍｌの細胞培養培地上清を抗Ａｐｏ-２Ｌ抗体（ここに記載した５Ｃ２抗体）を用いて精製した。精製カラムを調製するために、２．０ｍｇの５Ｃ２抗体を０．５ｍｌの制御孔ガラスビーズ（CPG, Inc., Fairfield, NJ）に製造者の指示に従って結合させた。結合の後、樹脂を１５ｍｌの５０ｍＭトリスｐＨ７．５、次いで１５ｍｌの０．１Ｍ酢酸／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．０５ＭのＮａＣｌで洗浄した。
負荷に先立って、０．５ｍｌカラムを１５ｍｌの５０ｍＭトリスｐＨ７．５で平衡させた。約２５ｍｌの回収したＣＨＯ細胞培養培地、ｐＨ７．２、導電性１０．２ｍｍｈｏを、抗体カラムに勾配を与える負荷モードで負荷した。負荷流出物をカラムにリサイクルして全負荷時間を１時間とした。負荷に続いて、非特異的タンパク質を２ｍｌの０．５ＭのＴＭＡＣ／０．２５ＭのＮａＣｌで洗い落とした。カラムを１．５ｍｌの０．１Ｍ酢酸／０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ３．０で溶離した。１．５ｍｌの溶離物を管に回収し、即座に５０μｌの３ＭトリスｐＨ９．０でｐＨ７．０に中和した。
【０１２２】
溶離物質のアリコートをＳＤＳゲル上で分析し、平行して、既に大腸菌で発現された図１Ａのアミノ酸残基９６−２８１をからなる精製対照Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドを精製した。ゲルは、ＣＨＯ細胞発現可溶性Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドが５Ｃ２抗体アフィニティカラム上で精製されたことを確認した。溶離物質の他のアリコートを濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を走らせ、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットし、次いでＥｄｍａｎ分解で配列決定した。タンパク質配列分析により、ＣＨＯ細胞が図１Ａの配列の位置９２におけるＮ末端アミノ酸を有するＡｐｏ-２リガンドの可溶化形態を発現することが明らかとなった。よって、可溶化Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドは図１Ａのアミノ酸９２−２８１を含む。現在では、Ａｐｏ-２リガンドのこの可溶化９２−２８１アミノ酸形態は、Ａｐｏ-２リガンドの天然に切断された形態を含むと考えられている。
ＣＨＯ細胞の発現されたＡｐｏ-２リガンドのアポトーシス活性を、培養したＨｅＬａ細胞（ATCC CCL 22）で試験した。ＨｅＬａ細胞を１０％のＦＢＳを含むＨａｍのＦ１２培地中で６ウェルの培養プレートに蒔き、３７℃で終夜インキュベートした。培地を吸引し、発現されたＡｐｏ-２リガンド（１：１０、１；２０、１：４０希釈）を含む２ｍｌのＣＨＯ細胞培地上清を各資料ウェルに添加した。プレートを３７℃で終夜インキュベートした。２ｍｌの一条件培地（非形質移入ＣＨＯ細胞培地上清）を含む対照ウェルを同じ条件下で平行に走らせた。
次いで、処理したＨｅＬａ細胞を、光顕微鏡下でアポトーシス形態について分析した（図１４Ａ−１４Ｄ参照）。各視野でのアポトーシス細胞の数を図１４Ｅに示す。発現されたＡｐｏ-２リガンドを含有するＣＨＯ細胞培地上清で処理したＨｅＬａ細胞は、非条件培地で処理した細胞よりアポトーシス形態において２倍又はそれ以上の増加を示した。
【０１２３】
（実施例１６）
大腸菌発現Ａｐｏ-２リガンドのアポトーシス活性
Ａｐｏ-２リガンドの抗腫瘍効果を腫瘍を持つヌードマウスで試験した。上記の実施例とは対照的に、可溶性Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドは大腸菌で発現され、次いで埋め込みミニポンプ装置を通して動物中に注入した。
Ａｐｏ-２リガンドは、アミノ酸９１−２８１（図１Ａ参照）をコードするｃＤＮＡをｐＳ１３４６プラスミドに挿入することにより調製した［pS1346は挿入された転写停止剤を持つhgh207-1プラスミドを含む；DeBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 21-25 (1983); Scholtissek等, Nucl. Acids Reserch, 15: 3185 (1987)参照］。このプラスミドは、次いで大腸菌株５２Ａ７に形質移入した。株５２Ａ７は次の遺伝子型を持つ大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０株である：ｆｈｕＡ(ｔｏｎＡ)ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ(ｈｔｐＲｔｓ)ｃｌｐＰ ｌａｃＩｑ。大腸菌の２５ｍｌ培地をＬＢ培地で光学密度約１．０ＯＤ５５０まで成長させ、遠心分離（５０００ｒｐｍで１５分間）で回収した。細胞ペレットを０．１５ＭのＮａＣｌで１回洗浄した後２．５ｍｌのバッファー（ＬＢブロス、ＨＣｌでｐＨ６．１、１００ｇ／ＬのＰＥＧ８０００、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのＭｇＣｌｌ２及び５％ＤＭＳＯを含有）中で再懸濁した。細胞懸濁物を氷上に３０〜４５分間放置し、アリコートを−８０℃で保存した。この細胞懸濁物を形質転換プロセスの競合細胞として提供した。競合細胞のプラスミド調製物でも形質転換、形質転換物の選択及び単離は、Maniatis等, Molecular Cloning: A Laboratory manual, second Edition, vol.1: 1.74-1.84に記載された標準プロトコールで実施した。
【０１２４】
１ｍｌの形質転換体を５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有する５００ｍｌのＬＢ培地に播種して発酵種菌を調製した。この培地を振盪する２Ｌのバッフルフラスコで３０又は３７℃において１０時間インキュベートした。次いで、得られた培地を、２５ｇ／ＬのＮＺアミンＡＳ、６．２５ｇ／Ｌの酵母菌抽出物、０．１２５ｇ／Ｌのトリプトファン、６．２５ｇ／Ｌのテトラサイクリン、０．９４ｇ／Ｌのグルコース、０．６２５ｇ／ＬのＬ-イソロイシン、及び９４ｍｇ／ＬのＬ-６１抗発泡剤(antifoam)を含む８リットルの培地（６．２５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、７．５ｇ／Ｌの二塩基リン酸カリウム、３．７５ｇ／Ｌの一塩基リン酸ナトリウム二水和物、及び１．２５ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム）を含む１０リットル発酵器の播種に使用した。
発酵は３０℃において、強く撹拌しながら通気し、ＮＨ４ＯＨ添加でｐＨを７．０に調節して行った。最初のグルコースが消費された後、無菌の５０％グルコース溶液を与えて培地を維持した。約３０ＯＤにおいて、温度を２５℃にシフトさせて発泡を最小にした。培地のＯＤが約５０（Ａ５５０）に達したとき、２５ｍｇ／ｍｌのＩＡＡ（３-ベータ-インドールアクリル酸）２５ｍｌを添加してｔｒｐプロモータに調節されたＡｐｏ-２リガンド発現を誘発した。ＩＡＡ添加の６〜１０時間後に遠心分離により細胞を回収した。
【０１２５】
発現されたポリペプチドを以下のように精製した。大腸菌から発現されたＡｐｏ-２リガンドを含む細胞ペーストを、０．１Ｍのトリス、０．２ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８バッファーで抽出した。次いで抽出物を４０％の硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた。全てのクロマトグラフィ工程は、特に示さない場合は室温で実施した。硫酸アンモニウム沈殿物を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５％のTriton x-100、ｐＨ８バッファー中に溶解させ、次いで５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５％のTriton-x100、ｐＨ８バッファーで平衡させたマクロ-prepヒドロキシアパタイトのカラムに８０ｃｍ／時間の流速で適用した。カラムを平衡バッファーでＡ２８０での吸収がベースライン近くに戻るまで洗浄した。Ａｐｏ-２リガンドを０から０．２Ｍリン酸ナトリウム平衡バッファーの線形勾配で８カラム容量によってカラムから溶離した。Ａｐｏ-２リガンドを含む分画をプールし、ｐＨを６．５に調節した。ｐＨ調節したプールを、０．３５ＭのＮａＣｌ／ＰＢＳバッファーで平衡させたＮｉ-ＮＴＡスーパーフローのカラムに８０ｃｍ／時間の流速で負荷した。カラムを平衡バッファーで洗浄して吸収をベースライン近くにした。Ａｐｏ-２リガンドを０から５０ｍＭイミダゾール／平衡バッファーの線形勾配で８カラム容量によってカラムから溶離した。Ａｐｏ-２リガンドを含む分画をプールし、Millipore Lab TFF system, Biomax 8 膜を用いて濃縮した。濃縮したプールを、２０ｍＭのトリス、８％のトレハロース、０．０１％トゥイーン２０バッファー中のＧ-２５カラムで調製した。調製したＡｐｏ-２リガンドプールを０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。
精製した物質の分析により、それが（約５０：５０の比率で）アミノ酸９１−２８１（図１Ａ参照））を有するＡｐｏ-２リガンドポリペプチド、及びアミノ酸９２−２８１（図１Ａ参照を有するＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを含むことが公にされた（この比率は現在のところ潜在的Ｎ末端加工によると考えられており；図１Ａに示したアミノ酸残基９１はメチオニン残基である）。
【０１２６】
実験において、ヌードマウスにＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞（ATCC CCL 247）（１ｘ１０６細胞）を動物の各側に皮下注射した。次いで腫瘍を直径約１ｃｍとなるまで（およそ１０日間）成長させた。第０日に、腫瘍容積をノギスで測定した。容積は、ａ＝長さ及びｂ＝幅としたときのπ／６ｘａｂ２として計算した。次いで、浸透ミニポンプ（Alza Corp.から購入、Model 1003）を（１）対照媒体（２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、８％のトレハロース、０．０１％のトゥイーン-２０）又は（２）Ａｐｏ-２リガンドのいずれかで負荷した。各群の５匹の動物は対照媒体又はＡｐｏ-２リガンドのいずれかを受容する。ミニポンプを較正して毎日１０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ-２リガンド（１０ｍｇ／ｍｌｘ２μｌ／時間）又は２μｌ／時間の対照媒体を輸送した。
第３日目に、腫瘍容積を再度測定し、動物を犠牲にした。動物の試験は毒性の如何なる証拠も示さなかった。図１５において、結果は腫瘍容積のパーセント変化を示す。媒体群には腫瘍容積の変化は無かったが、Ａｐｏ-２Ｌを注入したマウスでは腫瘍サイズの顕著な縮小が起こった。Ａｐｏ-２リガンドでの処理は、３日に渡って腫瘍を約５０％に収縮させた。
【０１２７】
（実施例１７）
Ａｐｏ-２リガンド置換変異体の調製
レセプター結合及びアポトーシス誘発活性にとって重要なエピトープを発見し記述するためにアラニンスキャニング突然変異誘発を用いた。アラニンスキャニング突然変異誘発は、Kelley等, Biochemistry, 34: 10383-10392 (1995)及びCunningham及びWells, Sience, 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように、結合性エピトープを同定するのに用いられる。一般的にアミノ酸アラニンをコードする特全変異が他の残基に代えてここに記載された方法によって導入される。アラニンは、先端を切ったような側鎖（メチル基のみ）を有するので選択される置換基である。さらに、アラニンは表面及びタンパク質内部に埋まった状態の両方で見出されるので、発現されたタンパク質の構造一体性を乱す可能性が最も低いと思われる。
アラニン置換タンパク質をコードするプラスミドをオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（Kunkel, T.A.等, Methods in Enzymology, 154: 367-382 (1987)）を用いてプラスミドｐＡＰＯＫ５の一本鎖形態上で作成した（図１６参照）。トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターによるＡｐｏ-２Ｌの９１−２８１形態の細胞内大腸菌発現のために、このプラスミドを設計した。ｐＡＰＯＫ５はＡｐｏ-２ＬｃＤＮＡ（残基９１−２８１をコードする）をｔｒｐプロモーターを持つプラスミドｐＳ１１６２にクローニングするＰＣＲを用いて作成した。全てのアラニン置換基はジデオキシヌクレオチド配列により確認した（Sanger, F.等, Proc. Natl. Acad.. Sci., 74: 5463-5467 (1977)）。
アラニン置換されたＡｐｏ-２Ｌタンパク質をコードするプラスミドは、次いで発現のために大腸菌株２９４に形質転換した。培地はルリアブロスに５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを追加したものの中で３７℃において終夜成長させて飽和させた。続いて細胞を、Ｎａ２ＨＰＯ４（６ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／Ｌ）、グルコース（４．９ｇ／Ｌ）、カサミノ酸(casamino acids)（４．９ｇ／Ｌ）、２７ｍＭのＭｇＳＯ４、０．００３％のチアミンＨＣｌ、及び５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンの２０倍希釈物を追加した無菌フィルター培地に蒔き、３７℃で１時間成長させた。
【０１２８】
次いで、２５μｇ／ｍＬでの３-β-インドールアクリル酸（ＩＡＡ）（Sigma, St.Louis, MO.）で発現を誘発し、細胞を３０℃で振盪させながら終夜成長させた。細胞を遠心分離で回収し、以下に述べるようなＡｐｏ-２Ｌの引き続く回収のために−２０℃で凍結貯蔵した。
Ａｐｏ-２Ｌタンパク質は、１０容量（重量／容量）の１００ｍＭトリス、ｐＨ８．０／２００ｍＭのＮａＣｌ／５ｍｌのＥＤＴＡ／１ｍＭのＤＴＴ中で、モデルM110-Fマイクロフリューダイザ（Microfluidics Corporation, Newton, MA.）を用いた均質化により凍結大腸菌細胞ペレットから抽出した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を最終濃度０．５％（容量／容量）でホモジェネートに添加し、それを次いで遠心分離して細胞断片を除去した。個体硫酸アンモニウムを抽出上清に室温で撹拌しながら飽和の４５％という最終濃度で添加し、ペレットを遠心分離で回収した。硫酸アンモニウムペレットを５０％硫酸アンモニウム溶液で洗浄して残ったＥＤＴＡを除去し、次いで５０容量（重量／容量）の５０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ７．５／０．１％トリトンX-100中に再懸濁した。得られた溶液を遠心分離で透明化し、５ｍＬのＨｉＴｒａｐキレート化セファロースＴＭがカラム（Pharmacia, Piscataway, NJ.）を用いた固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）により精製した。１００ｍＭのＮｉＳＯ４／３００ｍＭのトリス、ｐＨ７．５中のニッケルでカラムを負荷し、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中の３５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化した。負荷後、カラムをＰＢＳ中３５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、５０ｍＭのイミダゾール／３５０ｍＭのＮａＣｌ（ＰＢＳ中）で溶離した。ＩＭＡＣ溶離物を２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５に対して透析し、遠心分離で透明化し、５ｍＬのＴｉＴｒａｐＳＰセファロースＴＭがカラム（Pharmacia）を用いたカチオン交換クロマトグラフィーで更に精製し、それを２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５で平衡化して洗浄した。ＨｉＴｒａｐＳＰカラムを２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５／０．５ＭのＮａＣｌで溶離した。Ｓｐカラム溶離物は２ｍＭのＤＴＴで還元し、続いて室温で撹拌しながら飽和の４５％という最終濃度まで固体硫酸アンモニウムを添加することにより沈殿させた。硫酸アンモニウムペレットを、３．５ｍＬの２０っＭトリス、ｐＨ７．５／１００ｍＭのＮａＣｌに再懸濁し、ＰＤ１０カラム（Pharmacia）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５／１００ｍＭのＮａＣｌという最終バッファーに交換した。精製したＡｐｏ-２Ｌアラニン置換タンパク質は、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＮ末端配列決定によって特徴付けし、−２０℃で凍結保存した。
【０１２９】
（実施例１８）
Ａｐｏ-２Ｌ置換変異体を用いたアポトーシス活性
上記実施例１７に記載したように調製した幾つかのＡｐｏ-２リガンド置換変異体のアポトーシス活性を決定するためにインビトロアッセイを行った。
ＳＫ-ＭＥＳ-１ヒト肺癌細胞（ATCC HTB 58）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ-グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００マイクログラムのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ：ＨａｍのＦ-１２（５０：５０）培地で培養した。ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞を９６ウェルのファルコン組織培地で処理したミクロプレートに、４．０ｘ１０４細胞／ウェルの密度で０．１ｍｌの容量で蒔き、３７℃で終夜接着させた。種々のＡｐｏ-２Ｌ置換変異体又はＡｐｏ-２Ｌ（図１Ａのアミノ酸残基９１−２８１からなる；Ａｐｏ-２Ｌ．２と呼ぶ）を２４時間添加してアポトーシスを誘発した。試験タンパク質での処理に続いて、培地を除去し、ウェルをメタノール中のクリスタルバイオレットの０．５％溶液で１５分間染色した。SLT 340 ATCプレートリーダー（Salzburg, Austria）を用いて５４０ｎｍで乾燥プレートの光学密度を測定することにより細胞数を決定した。
結果を図１７及び１８に示した。図１７は変異体Ｄ２１８Ａ、Ｄ２６９Ａ、及びＶ２０７ＡのバイオアッセイデータをＡｐｏ-２Ｌ．２分子と比較して示す（Ｖ２０７Ａは図１のアミノ酸９１−２８１を含むが図１Ａの配列の位置２０７におけるバリンがアラニンに置換されたと定義される置換変異体である）。変異体Ｄ２１８Ａ及びＤ２６９Ａは、Ａｐｏ-２Ｌ．２に比較した場合、各々約３倍及び７倍増加したアポトーシス活性を示した。Ｖ２０７ＡはバイオアッセイにおいてＡｐｏ-２Ｌ．２より約９倍小さな活性であった。
図１８は、Ａｐｏ-２Ｌ．２と比較したＤ２０３Ａのバイオアッセイデータを示す。変異体Ｄ２０３Ａは、Ａｐｏ-２Ｌ．２に比較した場合、約２倍の増大したアポトーシス誘発活性を示した。
【０１３０】
（実施例１９）
Ａｐｏ-２リガンド置換変異体の結合分析
Ａｐｏ-２Ｌアラニン-置換タンパク質（上記実施例１８で参照したＤ２０３Ａ、Ｄ２１８Ａ及びＤ２６９Ａ）を、文献に記載された種々のＡｐｏ-２Ｌレセプター、ＤＲ４［Pan等, Science, 276: 111-113 (1997)］；ＤＲ５［Sheridan等, Science, 277: 818-821 (1997)］；デコイレセプターＤｃＲ２［Marsters等, Current Biology, 7: 1003-1006 (1997)］；及びＯＰＧ［simonet等, Cell, 89: 309-319 (1997)］に対する結合性をＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia）を用いて分析した。比較のため、アミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ-２ＬもＢＩＡｃｏｒｅにおいてＩｇＧ-レセプター融合分子への結合性を試験した。Ａｐｏ-２Ｌレセプタータンパク質の各々を、Ashkenazi等, Proc. Natl. acad. Sci., 88: 10535-10539 (1991)に実質的に記載されているようにイムノアドヘシンとして調製した。ＩｇＧ-レセプター融合分子は、ＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅチップ、研究等級（Pharmacia）にＮＨＳ-ＥＤＣアミンカップリング化学を用いて固定化した。Ａｐｏ-２Ｌアラニン置換タンパク質をＢＩＡｃｏｒｅランニングバッファー、ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で５００ｎＭから１５．６２５ｎＭまで連続的に２倍希釈して、固定化レセプターを有するセンサーチップ表面を横切って通過させた。ＫＤ値を決定するためにＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアを（製造者の指示に従って）使用して特異的動的結合パラメータを用いた。
結果を図１９に示す。この表は、ＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia）を用いた動的結合分析によって決定した場合のＡｐｏ-２Ｌ．２と比較した変異体Ｄ２０３Ａ、Ｄ２１８Ａ及びＤ２６９Ａの解離定数（ＫＤ）を示す。データは、Ａｐｏ-２Ｌ．２と比較した場合、アラニン置換変異体類のＩｇＧ-レセプター融合タンパク質ＤＲ４、ＤＲ５、及びＤｃＲ２に対する結合性に有意な変化（＞２倍）は無かった。ＯＰＧＲ-ＩｇＧへの結合の場合、変異体Ｄ２０３Ａ、Ｄ２１８Ａ、及びＤ２６９Ａは、Ａｐｏ-２Ｌ．２に比較してより緊密な結合性を示した（２＜ＫＤｗｔ＜ＫＤｍｕｔ＜４）。
【０１３１】
材料の寄託
次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Boulevard., Manassas, VA, USA(ATCC)に寄託した：
細胞系                       ATCC寄託番号  寄託日
2935-pRK5-hApo-2L-myc clone2.1  CRL-12014    1996年1月3日
1D1.12.4                        HB-12257    1997年1 月8日
2G6.3.4                         HB-12259    1997年1 月8日
2E11.5.5                        HB-12256    1997年1 月8日
5C2.4.9                         HB-12258    1997年1 月8日
【０１３２】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１Ａ】ヒトＡｐｏ-２リガンドｃＤＮＡの核酸配列及びその誘導アミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｂ】ヒトＡｐｏ-２リガンドのＣ末端領域の、ヒトＴＮＦサイトカインファミリーの知られたメンバー、４-１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＮＦ-α、ＬＴ-β、ＬＴ-α、ＣＤ４０Ｌ、及びＡｐｏ-１Ｌの対応する領域とのアラインメントを示す図である。
【図１Ｃ−１Ｅ】（Ｃ）抗-ｍｙｃエピトープ抗体を用いたＦＡＣＳ分析で測定した場合の、ヒト２９３細胞で発現された組換え、全長、Ｃ末端ｍｙｃエピトープタグＡｐｏ-２リガンドの細胞トポロジーを示す図である。（Ｄ）化学的架橋有り（レーン２、３）又は無し（レーン１）に次いでＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色で測定した場合の、組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞で発現されＮｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィで精製した組換えＨｉｓ１０エピトープタグ可溶性Ａｐｏ-２のサイズ及びサブユニット構造を示す図である。（Ｅ）抗-ｇＤエピトープ抗体での免疫沈降に次いでＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィで測定した場合の、代謝性標識されたヒト２９３細胞で発現された組換えｇＤエピトープタグ可溶性Ａｐｏ-２リガンドのサイズ及びサブユニット構造を示す図である。
【図２Ａ】Ａｐｏ-２リガンドによるＢ及びＴリンパ球細胞系におけるアポトーシスの誘発を示す図である。アポトーシス細胞は特徴的な形態変化により同定した。
【図２Ｂ】Ａｐｏ-２リガンドによるＢ及びＴリンパ球細胞系におけるアポトーシスの誘発を示す図である。アポトーシス細胞はフローサイトメトリーで測定したヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びＦＩＴＣ複合アネキシンＶでの正の蛍光染色で同定した。
【図２Ｃ】Ａｐｏ-２リガンドによるＢ及びＴリンパ球細胞系におけるアポトーシスの誘発を示す図である。アポトーシス細胞はフローサイトメトリーで測定したヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びＦＩＴＣ複合アネキシンＶでの正の蛍光染色で同定した。
【図２Ｄ】Ａｐｏ-２リガンドによるＢ及びＴリンパ球細胞系におけるアポトーシスの誘発を示す図である。アポトーシス細胞はフローサイトメトリーで測定したヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びＦＩＴＣ複合アネキシンＶでの正の蛍光染色で同定した。
【図２Ｅ】Ａｐｏ-２リガンドによるＢ及びＴリンパ球細胞系におけるアポトーシスの誘発を示す図である。アポトーシス細胞はヌクレオソーム内ＤＮＡ断片化の分析（Ｅ）により同定した。
【図３Ａ】Ａｐｏ-２リガンド誘発アポトーシスの時間変化を示す図である。
【図３Ｂ】Ａｐｏ-２リガンド誘発アポトーシスの用量依存性を示す図である。
【図３Ｃ】Ｆａｓ／Ａｐｏ-１レセプター、ＴＮＦ-Ｒ１レセプター、又はＴＮＦ-Ｒ２レセプターに基づく可溶性レセプター−ＩｇＧ融合タンパク質によるＡｐｏ-２リガンド誘発アポトーシスの阻害欠如を示す図である。
【図４】ノーザンブロット分析で測定した場合の、ヒト胎児及びヒト成人組織におけるＡｐｏ-２リガンドｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図５】ヌードマウスにおいて成長させたヒトＭＤＡ２３１乳癌細胞に基づく腫瘍の重量に対する、単独又はドキソルビシンと混合して腫瘍内注射で投与したＡｐｏ-２リガンドのインビボ効果を示す図である。
【図６】ヌードマウスにおいて成長させたヒトＨＣＴ１１６結腸癌細胞に基づく腫瘍の重量に対する、単独又は５-ＦＵと混合して腫瘍内注射で投与したＡｐｏ-２リガンドのインビボ効果を示す図である。
【図７】ヌードマウスにおいて成長させたヒトＨＣＴ１１６結腸癌細胞に基づく腫瘍のサイズに対する、単独又は５-ＦＵと混合して腹膜内注射で投与したＡｐｏ-２リガンドのインビボ効果を示す図である。
【図８】ヌードマウスにおいて成長させたヒトＨＣＴ１１６結腸癌細胞に基づく腫瘍の重量に対する、単独又は５-ＦＵと混合して腹膜内注射で投与したＡｐｏ-２リガンドのインビボ効果を示す図である。
【図９】ドミナントネガティブＦＡＤＤではなくＣｒｍＡがＨｅＬａ-Ｓ３細胞におけるＡｐｏ-２リガンド誘発アポトーシスを阻止することを示す棒グラフである。
【図１０】Ａｐｏ-２リガンドに誘発されたアポトーシス及び４つの抗-Ａｐｏ-２リガンド抗体：１Ｄ１、２Ｇ６、２Ｅ１１及び５Ｃ２による影響のＦＡＣＳ分析を示す図である（ＦＩＴＣ複合アネキシンＶを用いて検出したアポトーシス９Ｄ細胞−太線；生存、非染色細胞−細線）。
【図１１】モノクローナル抗体１Ｄ１、２Ｇ６、２Ｅ１１、及び５Ｃ２の抗原特異性を示す棒グラフである。
【図１２】モノクローナル抗体１Ｄ１、２Ｇ６、２Ｅ１１、及び５Ｃ２のエピトープマッピングアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１３】Ａｐｏ-２リガンドの特異的アミノ酸領域からなる数種の合成ペプチドに対するモノクローナル抗体１Ｄ１が結合する能力を試験するアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１４Ａ−Ｄ】発現されたＡｐｏ-２リガンドを含有するＣＨＯ細胞培地上清（１：１０、１：２０、１：４０希釈）又は非条件培地で処理した培養ＨｅＬａ細胞を示す図である。
【図１４Ｅ】上記各視野におけるアポトーシス細胞の数を示す棒グラフである。
【図１５】（実施例１６に記載したように）大腸菌で発現されたＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを浸透ミニポンプを介して投与したヌードマウスにおけるＨＣＴ１１６結腸癌腫瘍容積におけるパーセント（％）変化を示す図である。
【図１６】ｐＡＰＯＫ５プラスミドの制限マップを示す図である。
【図１７】バイオアッセイにおいて、図１Ａのアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ-２リガンド（「Ａｐｏ２Ｌ．２」）と比較した場合の、Ａｐｏ-２リガンド置換変異体Ｄ２１８Ａ、Ｄ２６９Ａ及びＤ２０７Ａの、アポトーシス細胞死を誘発する能力を示す図である。
【図１８】バイオアッセイにおいて、図１Ａのアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ-２リガンド（「Ａｐｏ２Ｌ．２」）と比較した場合の、Ａｐｏ-２リガンド置換変異体Ｄ２０３Ａのアポトーシス細胞死を誘発する能力を示す図である。
【図１９】ＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia）を用いた動力学的結合アッセイで測定した場合の、図１Ａのアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ-２リガンド（「Ａｐｏ２Ｌ．２」）と比較した場合の、Ａｐｏ-２リガンド置換変異体Ｄ２０３Ａ、Ｄ２１８Ａ、及びＤ２６９Ａの解離定数（ＫＤ）を示す表である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ−１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１４Ｃ−Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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