(57)【要約】      （修正有）【課題】Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを製造し、化学的に修飾するための方法、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドの製剤を提供する。【解決手段】Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞を提供し、培養培地を提供し、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で培養培地中で宿主細胞を培養し、宿主細胞又は培養培地からＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを回収し、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを精製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項５】
上記宿主細胞は大腸菌、酵母細胞又はＣＨＯ細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
（ａ）請求項４に記載のベクターを含んでなる宿主細胞を提供し；（ｂ）培養培地を提供し；（ｃ）Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で培養培地中で宿主細胞を培養し；（ｄ）宿主細胞又は培養培地からＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを回収し；（ｅ）Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを精製する工程を含んでなる、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドの製造方法。
【請求項７】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドの実際の分子量を増大させる一又は複数のポリオール基に抱合又は結合されている、請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項８】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドのインビボ半減期を増大させる一又は複数のポリオール基に抱合又は結合されている、請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項９】
一又は複数のポリオール基がポリ(エチレングリコール)である、請求項７に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１０】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、約２０００ダルトンの分子量を有するポリ(エチレングリコール)の一分子に抱合又は結合されている、請求項９に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１１】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、可溶型細胞外ドメインＡｐｏ-２リガンドポリペプチドである、請求項１に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１２】
図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドであって、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるポリペプチドに結合するＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１３】
図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドであって、一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導するＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１７】
上記宿主細胞は大腸菌、酵母細胞又はＣＨＯ細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
（ａ）請求項１５に記載のベクターを含んでなる宿主細胞を提供し；（ｂ）培養培地を提供し；（ｃ）Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で培養培地中で宿主細胞を培養し；（ｄ）宿主細胞又は培養培地からＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを回収し；（ｅ）Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを精製する工程を含んでなる、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドの製造方法。
【請求項１９】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドの実際の分子量を増大させる一又は複数のポリオール基に抱合又は結合されている、請求項１２に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２０】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドのインビボ半減期を増大させる一又は複数のポリオール基に抱合又は結合されている、請求項１２に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２１】
一又は複数のポリオール基がポリ(エチレングリコール)である、請求項１９に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２２】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、約２０００ダルトンの分子量を有するポリ(エチレングリコール)の一分子に抱合又は結合されている、請求項２１に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２３】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、可溶型細胞外ドメインＡｐｏ-２リガンドポリペプチドである、請求項１２に記載のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２４】
一又は複数のポリオール基に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する組成物であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる組成物。
【請求項２５】
一又は複数のポリオール基に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する組成物であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の次の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６；Ｓ１０１；Ｓ１１１；Ｖ１１４；Ｒ１１５；Ｅ１１６；Ｎ１３４；Ｎ１４０；Ｅ１４４；Ｎ１５２；Ｓ１５３；Ｒ１７０；Ｋ１７９；Ｄ２３４；Ｅ２４９；Ｒ２５５；Ｅ２６３；Ｈ２６４に抱合又は結合した一又は複数のポリオール基を有するアミノ酸配列を含んでなる組成物。
【請求項２６】
一又は複数のポリオール基に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する組成物であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の次の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃに抱合又は結合した一又は複数のポリオール基を有するアミノ酸配列を含んでなる組成物。
【請求項２７】
一又は複数のポリオール基がポリエチレングリコールである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
ポリエチレングリコールが約１０００から約２５０００ダルトンの分子量を有する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ポリエチレングリコールが約２０００ダルトンの分子量を有する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
一又は複数のポリオール基に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する組成物であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含み、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるポリペプチドに結合する組成物。
【請求項３１】
一又は複数のポリオール基に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する組成物であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６；Ｓ１０１；Ｓ１１１；Ｖ１１４；Ｒ１１５；Ｅ１１６；Ｎ１３４；Ｎ１４０；Ｅ１４４；Ｎ１５２；Ｓ１５３；Ｒ１７０；Ｋ１７９；Ｄ２３４；Ｅ２４９；Ｒ２５５；Ｅ２６３；Ｈ２６４に抱合又は結合した一又は複数のポリオール基を有するアミノ酸配列を含み、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるポリペプチドに結合する組成物。
【請求項３２】
一又は複数のポリオール基に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する組成物であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃに抱合又は結合した一又は複数のポリオール基を有するアミノ酸配列を含み、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるポリペプチドに結合する組成物。
【請求項３３】
一又は複数のポリオール基がポリエチレングリコールである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
ポリエチレングリコールが約１０００から約２５０００ダルトンの分子量を有する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
ポリエチレングリコールが約２０００ダルトンの分子量を有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の次の残基位置：Ｓ９６；Ｓ１０１；Ｓ１１１；Ｖ１１４；Ｒ１１５；Ｅ１１６；Ｎ１３４；Ｎ１４０；Ｅ１４４；Ｎ１５２；Ｓ１５３；Ｒ１７０；Ｋ１７９；Ｄ２３４；Ｅ２４９；Ｒ２５５；Ｅ２６３；Ｈ２６４に一又は複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなるＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項３７】
図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含む少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなるＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項３８】
図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含む少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなるＡｐｏ-２リガンド三量体であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるポリペプチドに結合するＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項３９】
図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含む少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなるＡｐｏ-２リガンド三量体であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導するＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項４０】
三量体が少なくとも二の上記Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含む、請求項３６に記載のＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項４１】
Ａｐｏ-２リガンド三量体が三の上記Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含む、請求項３６に記載のＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項４２】
一又は複数のポリオール基に抱合又は結合した少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなるＡｐｏ-２リガンド三量体であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置の次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含むＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項４３】
一又は複数のポリオール基に抱合又は結合した少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなるＡｐｏ-２リガンド三量体であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃに抱合又は結合した一又は複数のポリオール基を有するアミノ酸配列を含み、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるポリペプチドに結合するＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項４４】
三量体が一又は複数のポリオール基に抱合又は結合した三の上記Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含む、請求項４２に記載のＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項４５】
一又は複数のポリオール基がポリエチレングリコールである、請求項４２に記載のＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項４６】
ポリエチレングリコールが約１０００から約２５０００ダルトンの分子量を有する、請求項４５に記載のＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項４７】
ポリエチレングリコールが約２０００ダルトンの分子量を有している、請求項４６に記載のＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項４８】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項４２に記載の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項４９】
図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
（ａ）図３に示されたＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体のレセプター接触領域の外側にあり；かつ
（ｂ）図３に示されたＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体の結晶構造において高溶媒到達性を示す；
残基位置となるように図３に示されたＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体のX線結晶構造から同定された残基位置に一又は複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５０】
残基位置が、図３に示されたＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体の結晶構造に示された上部から底部のＡｐｏ２Ｌ単量体の一面に位置している、請求項４９に記載の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５１】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｖ１１４；Ｒ１１５；Ｅ１１６；Ｎ１３４；Ｎ１４０；Ｅ１４４；Ｎ１５２；Ｎ１５３；Ｒ１７０；Ｄ２３４；Ｅ２４９；Ｒ２５５；Ｅ２６３；Ｈ２６４の一又は複数を有する、請求項４９に記載の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５２】
単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが一又は複数のポリオール基に抱合又は結合している、請求項４９に記載の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５３】
一又は複数のポリオール基がポリエチレングリコールである、請求項５２に記載の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５４】
ポリエチレングリコールが約１０００から約２５０００ダルトンの分子量を有する、請求項５３に記載の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５５】
ポリエチレングリコールが約２０００ダルトンの分子量を有する、請求項５４に記載の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５６】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるポリペプチドに結合する、請求項４９に記載の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５７】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項４９に記載の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５８】
Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；及びＨ２６４Ｃからなる群から選択される図１（配列番号：１）の残基位置にアミノ酸置換を有することによって、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなる単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５９】
約２０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコール基に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する組成物であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なるアミノ酸配列を含み、ポリエチレングリコール基はＳ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；及びＨ２６４Ｃからなる群から選択される図１（配列番号：１）の残基位置に抱合又は結合している組成物。
【請求項６０】
約２０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコール基に抱合又は結合した三のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなるＡｐｏ-２リガンド三量体であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なるアミノ酸配列を含み、ポリエチレングリコール基はＳ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；及びＨ２６４Ｃからなる群から選択される図１（配列番号：１）の残基位置に抱合又は結合しているＡｐｏ-２リガンド三量体。
【請求項６１】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるポリペプチドに結合する、請求項６０に記載の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項６２】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項６０に記載の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項６３】
製薬的に許容可能な担体と混合せしめられて、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる有効量の単離Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する製薬組成物。
【請求項６４】
製薬的に許容可能な担体と混合せしめられて、一又は複数のポリオール基に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなる有効量の組成物を含んでなり、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなり、組成物が、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるポリペプチドに結合する製薬組成物。
【請求項６５】
製薬的に許容可能な担体と混合せしめられて、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の次の残基位置に：Ｓ９６；Ｓ１０１；Ｓ１１１；Ｖ１１４；Ｒ１１５；Ｅ１１６；Ｎ１３４；Ｎ１４０；Ｅ１４４；Ｎ１５２；Ｓ１５３；Ｒ１７０；Ｋ１７９；Ｄ２３４；Ｅ２４９；Ｒ２５５；Ｅ２６３；Ｈ２６４の一又は複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなる有効量のＡｐｏ-２リガンド三量体を含有する製薬組成物。
【請求項６６】
上記製薬組成物は一又は複数の二価金属イオンを更に含有する、請求項６３に記載の製薬組成物。
【請求項６７】
Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項６３に記載の製薬組成物。
【請求項６８】
ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるレセプターを発現する哺乳動物細胞を、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる治療的有効量の単離Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドに暴露することを含む、哺乳動物においてアポトーシスを誘導する方法。
【請求項６９】
ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるレセプターを発現する哺乳動物細胞を、一又は複数のポリオール基に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する治療的有効量の組成物に暴露することを含んでなる哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６；Ｓ１０１；Ｓ１１１；Ｖ１１４；Ｒ１１５；Ｅ１１６；Ｎ１３４；Ｎ１４０；Ｅ１４４；Ｎ１５２；Ｓ１５３；Ｒ１７０；Ｋ１７９；Ｄ２３４；Ｅ２４９；Ｒ２５５；Ｅ２６３；Ｈ２６４に抱合又は結合した一又は複数のポリオール基を有するアミノ酸配列を含んでなる方法。
【請求項７０】
ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるレセプターを発現する哺乳動物細胞を、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなる治療的有効量のＡｐｏ-２リガンド三量体に暴露することを含む、哺乳動物においてアポトーシスを誘導する方法。
【請求項７１】
哺乳動物細胞が大腸又は結腸直腸癌細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
哺乳動物細胞における癌を治療する方法において、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる有効量の単離Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを上記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項７３】
哺乳動物細胞における癌を治療する方法において、一又は複数のポリオール基に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する有効量の組成物を上記哺乳動物に投与することを含み、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６；Ｓ１０１；Ｓ１１１；Ｖ１１４；Ｒ１１５；Ｅ１１６；Ｎ１３４；Ｎ１４０；Ｅ１４４；Ｎ１５２；Ｓ１５３；Ｒ１７０；Ｋ１７９；Ｄ２３４；Ｅ２４９；Ｒ２５５；Ｅ２６３；Ｈ２６４に抱合又は結合した一又は複数のポリオール基を有するアミノ酸配列を含み、組成物が、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるポリペプチドに結合する方法。
【請求項７４】
哺乳動物細胞における癌を治療する方法において、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなる有効量のＡｐｏ-２リガンド三量体を上記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項７５】
上記癌が肺癌、乳癌、大腸癌又は結腸直腸癌である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
哺乳動物細胞における免疫関連疾患を治療する方法において、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる有効量の単離Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを上記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項７７】
哺乳動物細胞における免疫関連疾患を治療する方法において、一又は複数のポリオール基に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する有効量の組成物を上記哺乳動物に投与することを含み、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドが、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６；Ｓ１０１；Ｓ１１１；Ｖ１１４；Ｒ１１５；Ｅ１１６；Ｎ１３４；Ｎ１４０；Ｅ１４４；Ｎ１５２；Ｓ１５３；Ｒ１７０；Ｋ１７９；Ｄ２３４；Ｅ２４９；Ｒ２５５；Ｅ２６３；Ｈ２６４に抱合又は結合した一又は複数のポリオール基を有するアミノ酸配列を含み、組成物が、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるポリペプチドに結合する方法。
【請求項７８】
哺乳動物細胞における免疫関連疾患を治療する方法において、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなる有効量のＡｐｏ-２リガンド三量体を上記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項７９】
上記免疫関連疾患が関節炎又は多発性硬化症である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
少なくとも二のＡｐｏ-２リガンド三量体を結合させること含むＡｐｏ-２リガンドオリゴマーの調製方法であって、各Ａｐｏ-２リガンド三量体中の少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド単量体が、図１（配列番号：１）のアミノ酸残基位置１７０にシステインアミノ酸置換を有するＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含み、Ａｐｏ-２リガンド三量体が、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドの位置１７０のシステインアミノ酸残基間でジスルフィド結合によって結合している方法。
【請求項８１】
少なくとも二のＡｐｏ-２リガンド三量体を含んでなるＡｐｏ-２リガンドオリゴマーであって、各Ａｐｏ-２リガンド三量体中の少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド単量体が、図１（配列番号：１）のアミノ酸残基位置１７０にシステインアミノ酸置換を有するＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含み、Ａｐｏ-２リガンド三量体が、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドの位置１７０のシステインアミノ酸残基間でジスルフィド結合によって結合しているＡｐｏ-２リガンドオリゴマー。
【請求項８２】
容器と、該容器内に、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置の次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含む単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、一般にＡｐｏ-２リガンド変異体、特にＡｐｏ-２リガンド置換変異体、並びにその化学的修飾形態に関する。
【０００２】
(発明の背景)
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死のバランスにより部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特性付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば、Barrら, Bio/Technology, 12：487-493(1994)；Stellerら, Science, 267：1445-1449(1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itohら,Cell, 66：233-243(1991)］。
【０００３】
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「ＬＴ-β」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ又はＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド（ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される）、及びＴＡＬＬ-１(ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定されている［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986)；Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)；Pittiら, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)；Wileyら, Immunity, 3：673-682(1995)；Browningら, Cell, 72:847-856(1993)；Armitageら, Nature, 357:80-82(1992), 1997年1月16日公開のWO97/01633；1997年7月17日公開のWO97/25428；Marstersら, Curr. Biol., 8:525-528(1998)；Chicheporticheら, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日公開のWO98/28426；1998年10月22日公開のWO98/46751；1998年5月7日公開のWO/98/18921；Mooreら, Science, 285:260-263(1999)；Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ)及びＡｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫ)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。
【０００４】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはサイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーとして数年前に同定された。［例えばWileyら, Immunity, 3:673-682 (1995); Pittiら, J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); ２００１年９月４日発行の米国特許第６２８４２３６を参照］。完全長ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは２８１アミノ酸長のＩＩ型膜貫通タンパク質である。ある細胞は、ポリペプチドの細胞外領域の酵素による切断を通して、そのポリペプチドの天然の可溶型を生じうる［Marianiら, J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)］。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型の結晶学的研究はＴＮＦ及び他の関連タンパク質の構造に類似したホモ三量体構造を明らかにする［Hymowitzら, Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitzら, Biochemistry, 39:633-644 (2000)］。しかし、他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、（ホモ三量体の各サブユニットの位置２３０の）３つのシステイン残基が併せて亜鉛原子を配位しており、亜鉛の結合が三量体の安定性と生物学的活性のために重要であるという独特の構造的特徴を有していることが分かった。［上掲のHymowitzら; Bodmerら, J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)］。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患を含む免疫系の調節に役割を担っている可能性があることが文献において報告されている［例えば、Thomasら, J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsenら, Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffithら, J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Songら, J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)］。
【０００５】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型はまた大腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣及び脳腫瘍を含むインビトロの様々な癌細胞並びに黒色腫、白血病、及び多発性骨髄腫においてアポトーシスを誘導することが報告されている［例えば、上掲のWileyら; 上掲のPittiら; Riegerら, FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenaziら, J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczakら, Nature Med., 5:157-163 (1999); Keaneら, Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutaniら, Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yuら, Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyanら, Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)を参照のこと］。マウス腫瘍モデルでのインビボ研究は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、単独で又は化学療法又は放射線療法と組み合わせて、実質的な抗腫瘍効果を生じうることを示唆している［例えば上掲のAshkenaziら;上掲のWalzcakら;Gliniakら, Cancer Res., 59:6153-6158 (1999);上掲のChinnaiyanら; Rothら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)を参照のこと］。多くのタイプの癌細胞とは対照的に、殆どの正常なヒト細胞タイプはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある種の組換え形態によるアポトーシスの誘導に対して耐性があるように思われる［上掲のAshkenaziら;上掲のWalzcakら］。Ｊｏらは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのポリヒスチジンタグ可溶型が正常な単離された非ヒトではなくヒト肝細胞においてインビトロにてアポトーシスを誘導したことを報告している［Joら, Nature Med., 6:564-567 (2000);またNagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)を参照のこと］。ある種の組換えＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ調製物は、例えばタグ分子の有無、亜鉛含有量、及び三量体の含有％に応じて、死亡対正常細胞に対する生化学的性質及び生物学的活性に関して変動しうると考えられている。［Lawrenceら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qinら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)］。
【０００６】
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞応答の誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定され［Hohmanら, J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；１９９１年３月２０日に公開された欧州特許第４１７５６３号］、両者のレセプター型に対応するヒト及びマウスｃＤＮＡが単離され特徴付けられている［Loetscherら, Cell, 61：351(1990)；Schallら, Cell, 61：361(1990)；Smithら, Science, 248：1019-1023(1990)；Lewisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwinら, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。広範な多型が両方のＴＮＦレセプター遺伝子に伴っている［例えばTakaoら, Immunogenetics, 37:199-203 (1993)］。両方のＴＮＦＲが細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有している。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶型ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出されている［Nophar, Yら, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)］。組換え可溶型ＴＮＦレセプターのクローニングはHale等［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］によって報告されている。
【０００７】
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２-末端から出発して、１から４と命名される４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む［Schallら, 上掲；Loetscherら, 上掲；Smithら, 上掲；Nopharら, 上掲；Kohnoら, 上掲］。ＴＮＦＲ１における、４つのＣＲＤのおおよその境界は次の通りである：ＣＲＤ１−約１４から約５３までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５４から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１３８までのアミノ酸；ＣＲＤ４−約１３９から約１６７までのアミノ酸。ＴＮＦＲ２における、ＣＲＤ１は１７から約５４までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５５から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１４０までのアミノ酸；及びＣＲＤ４−約１４１から約１７９までのアミノ酸を含む［Bannerら, Cell, 73:431-435 (1993)］。リガンド結合におけるＣＲＤの潜在的な役割はまた上掲のBannerらに記載されている。
【０００８】
ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnsonら, Cell, 47：545(1986)；Radekら, Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovicら, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Malletら, EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yoneharaら, J. Exp. Med. 及びItohら, Cell, 66:233-243(1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Uptonら, Virology, 160：20-29(1987)；Smithら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Uptonら, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研究では、ＣＲＤ１の欠失［Welcher A.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:159-163 (1991)］又はこのドメインでの５-アミノ酸の挿入がＮＧＦ結合には殆ど又は全く効果がないことを示した［上掲のYan, H.及びChao, M.V.］。ｐ７５ＮＧＦＲはそのＣＲＤ４及び膜貫通領域の間に約６０のアミノ酸のプロリンリッチなストレッチを含んでおり、これはＮＧＦ結合には関与していない［Peetre, C.ら, Eur. J. Hematol., 41:414-419 (1988); Seckinger, Pら, J. Biol. Chem., 264:11966-11973 (1989); 上掲のYan, H及びChao, M.V.］。
【０００９】
リンホトキシン-αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのほとんどのレセプターはＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；それぞれの場合に得られるタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【００１０】
最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定されている。このような新たに同定されたＴＮＦＲのメンバーは、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ及びオステオプロテジェリン(osteoprotegerin)（ＯＰＧ）［Brojatschら, Cell, 87:845-855 (1996); Montgomeryら, Cell, 87:427-436 (1996); Marstersら, J.Biol.Chem., 272:14029-14032 (1997); Simonetら, Cell, 89:309-319 (1997)］を含む。上掲のSimonetらは、他の周知のＴＮＦＲ様分子とは異なり、ＯＰＧは疎水性の膜貫通−スパニング配列を含まないと報告している。下記にて検討されているように、ＯＰＧはデコイ(囮)レセプターのように作用すると考えられている。
Panらは、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Panら, Science, 276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞自殺機構に関与可能な細胞質デスドメインを含むと報告されている。Panらは、ＤＲ４がＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
【００１１】
Sheridanら, Science, 277: 818-821 (1997)及びパンら, Science, 277: 815-818 (1997)においては、Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するレセプターと思われる他の分子が記載されている［１９９８年１１月１９日に公開の国際公開９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開の国際公開９８／４１６２９もまた参照のこと］。この分子は、ＤＲ５と呼ばれる（あるいは、Ａｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれている［Screatonら, Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczakら, EMBO J., 16:5386-5387 (1997);Wuら, Nature Genetics, 17:141-143 (1997);１９９８年８月２０日公開の国際公開９８／３５９８６；１９９９年１月２１日公開の国際公開９９／０２６５３；１９９８年２月２５日公開の国際公開９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開の国際公開９９／１１７９１］）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質デスドメインを含み、アポトーシスをシグナル伝達可能であると報告されている。Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＤＲ５の間に形成される複合体の結晶構造はHymowitzら, Molecular Cell, 4:563-571 (1999)に記載されている。
【００１２】
最近同定されたＴＮＦＲファミリーメンバーの更なるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達トランスデューサーというよりはむしろ阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、ＤＣＲ１（ＴＲＩＤ、ＬＩＴ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ３とも称される）［Panら, Science, 276：111-113(1997)；Sheridanら, Science, 277：818-821 (1997)；McFarlaneら, J. Biol. Chem., 272：25417-25420(1997)；Schneiderら, FEBS Letters, 416：329-334(1997)；Degli-Espostiら, J. Exp. Med., 186：1165-1170(1997)；及びMongkolsapayaら, J. Immunol., 160：3-6(1998)］及びＤＣＲ２（ＴＲＵＮＤＤ，又はＴＲＡＩＬ-Ｒ４とも称される）［Marstersら, Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Panら, FEBS Letters, 424：41-45(1998)；Degli-Espostiら, Immunity, 7：813-820(1997)］が含まれ、両者とも細胞表面分子であり、更にＯＰＧ［上掲のSimonetら］及びＤＣＲ３［Pitti等, Nature, 396:699-703(1998)］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称されるレセプターに結合すると報告されている。
【００１３】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは細胞表面「デスレセプター」ＤＲ４及びＤＲ５を通して作用してカスパーゼ、又は細胞死プログラムを実施する酵素を活性化させると考えられている。［例えば、Salvesenら, Cell, 91:443-446 (1997)を参照のこと］。リガンド結合の際、ＤＲ４とＤＲ５は、双方共、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１［Kischkelら, Immunity, 12:611-620 (2000); Sprickら, Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmerら, Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)］と称されるデスドメイン含有アダプター分子を通してアポトーシス発動因子であるカスパーゼ-８を独立して補充し活性化することによってアポトーシスを惹起しうる。ＤＲ４及びＤＲ５とは対照的に、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２レセプターはアポトーシスをシグナル伝達しない。
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプターの概説については、Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308(1998)；Ashkenazi及びDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997)；上掲のGruss及びDower、及びNagata, Cell, 88:355-365(1997); Locksleyら, Cell, 104:487-501 (2001)を参照のこと。
【００１４】
多様な境界面に関与するあるタンパク質のタンパク質-タンパク質相互作用において、亜鉛結合部位は構造的役割を担うことが示されているが［Feeseら, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:3544-3548(1994)；Somersら, Nature, 372: 478-481(1994)；Ramanら, Cell, 95: 939-950(1998)］、ＴＮＦファミリー（ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−α、又はＴＮＦ−β）で以前に構造的に特徴付けられたメンバーには、金属へ結合するものはない。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ような種々のホルモンの製剤における亜鉛のような金属イオンの利用は、文献に記載されている。［例えば、１９９２年１０月１５日公開の国際公開９２／１７２００を参照のこと］。レセプターへのｈＧＨの結合における亜鉛の関与は同様に１９９２年３月５日公開の国際公開９２／０３４７８に記載されている。インターフェロン-α二量体及びインターフェロン-β二量体における亜鉛結合の役割は、それぞれWalterら, Structure, 4:1453-1463(1996)及びKarpusasら, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:11813-11818(1997)に報告されている。亜鉛のような種々の金属イオンの構造的及び生物学的役割は、当該分野で概説されていおり、例えば、Christiansonら, Advances in Protein Chemistry, 42: 281-355(1991)を参照のこと。
【００１５】
（発明の概要）
本発明はＡｐｏ-２リガンド変異体を提供する。特に、本発明は、Ａｐｏ-２リガンドの天然配列（図１）中に一又は複数のアミノ酸置換を含むＡｐｏ-２リガンド変異体を提供する。場合によっては、Ａｐｏ-２リガンド変異体は以下の表Ｉに提供されるようにシステイン、リジン及びセリン置換を含みうる。本発明の代表的な実施態様は、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含む。本発明の関連実施態様は、一又は複数のポリオール基、例えばポリ(エチレングリコール)に抱合又は結合したそのようなＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含む。本発明の非常に好適な実施態様は、そのような置換を有し、更にＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるデスレセプターに結合し、及び／又は一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導するＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含む。
【００１６】
本発明の関連実施態様は、そのようなＡｐｏ-２リガンド変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸、そのような核酸を含んでなるベクター及びこれらのベクターを含んでなる宿主細胞（例えば大腸菌）を含む。関連実施態様は、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で培養培地中で培養し、ついでＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを回収し精製する方法を含む。
本発明の更に他の実施態様は、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の次の残基位置：Ｓ９６；Ｓ１０１；Ｓ１１１；Ｖ１１４；Ｒ１１５；Ｅ１１６；Ｎ１３４；Ｎ１４０；Ｅ１４４；Ｎ１５２；Ｓ１５３；Ｒ１７０；Ｋ１７９；Ｄ２３４；Ｅ２４９；Ｒ２５５；Ｅ２６３；Ｈ２６４に一又は複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなるＡｐｏ-２リガンド三量体である。本発明の関連実施態様は、一又は複数のポリオール基、例えばポリ(エチレングリコール)に抱合又は結合したＡｐｏ-２リガンド三量体を含む。本発明の好適な実施態様では、これらの三量体はＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるデスレセプターに結合する。
【００１７】
本発明の更に他の実施態様は、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図３に示されたＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体のX線結晶構造から同定された残基位置に一又は複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドである。好適な実施態様では、残基位置は、ＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体のレセプター接触領域の外側にあり、かつ高溶媒到達性を示す。非常に好適な実施態様では、そのような単離Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドの残基位置は、図３に提供されたＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体のX線結晶構造に示されるように上部から底部までのＡｐｏ２Ｌ単量体の一面に位置している。本発明の関連実施態様は、ポリ(エチレングリコール)のような一又は複数のポリオール基に抱合又は結合したかかるＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含む。本発明の非常に好適な実施態様は、そのような置換を有し、更にＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるデスレセプターに結合し、及び／又は一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導するＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含む。
【００１８】
本発明の更に他の実施態様は、少なくとも二のＡｐｏ-２リガンド三量体を含んでなるＡｐｏ-２リガンド三量体オリゴマーであって、各Ａｐｏ-２リガンド三量体中の少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド単量体が、図１（配列番号：１）のアミノ酸残基位置１７０にシステインアミノ酸置換を有するＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含み、Ａｐｏ-２リガンド三量体が、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドの位置１７０のシステインアミノ酸残基間でジスルフィド結合によって結合しているＡｐｏ-２リガンド三量体オリゴマーを含む。
他の実施態様では、本発明はＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する製剤を提供する。特に、本発明は一又は複数のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチド及び担体、例えば製薬的に許容可能な担体、及び場合によっては一又は複数の二価金属イオンを含有する組成物を提供する。一実施態様では、そのような組成物は製造物品又はキットに収容されうる。該組成物は、例えば哺乳動物の癌細胞においてアポトーシスを誘導又は刺激し、又は免疫関連疾患、例えば関節炎又は多発性硬化症を治療するために有用な製薬的に許容可能な製剤でありうる。
また、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを使用する治療方法が提供される。
【００１９】
本発明の特定の実施態様は、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含む。このようなＡｐｏ-２リガンド変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸、ベクター及び宿主細胞が更に提供される。Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを製造する方法において、そのような宿主細胞を提供し；培養培地を提供し；Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で培養培地中で宿主細胞を培養し；宿主細胞又は培養培地からＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを回収し；Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを精製する工程を含んでなる方法が提供される。場合によっては、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドは、Ａｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドの実際の分子量を増大させる一又は複数のポリオール基に抱合又は結合されている。場合によっては、かかるＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドは、２０００ダルトン又は約２０００ダルトンの分子量を有するポリ(エチレングリコール)の一分子に抱合又は結合されている。
【００２０】
本発明の更なる実施態様は、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の次の残基位置に一又は複数のアミノ酸置換：Ｓ９６；Ｓ１０１；Ｓ１１１；Ｖ１１４；Ｒ１１５；Ｅ１１６；Ｎ１３４；Ｎ１４０；Ｅ１４４；Ｎ１５２；Ｓ１５３；Ｒ１７０；Ｋ１７９；Ｄ２３４；Ｅ２４９；Ｒ２５５；Ｅ２６３；Ｈ２６４を有するアミノ酸配列を含んでなる少なくとも一のＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含んでなるＡｐｏ-２リガンド三量体を含む。
本発明の更なる実施態様は、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
（ａ）図３に示されたＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体のレセプター接触領域の外側にあり；かつ
（ｂ）図３に示されたＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体の結晶構造において高溶媒到達性を示す；
残基位置となるように図３に示されたＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体のX線結晶構造から同定された残基位置に一又は複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含む。場合によっては、そのようなＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドは、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６；Ｓ１１１；Ｖ１１４；Ｒ１１５；Ｅ１１６；Ｎ１３４；Ｎ１４０；Ｅ１４４；Ｎ１５２；Ｎ１５３；Ｒ１７０；Ｄ２３４；Ｅ２４９；Ｒ２５５；Ｅ２６３；Ｈ２６４の一又は複数を有する。場合によっては、そのようなＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドは一又は複数のポリオール基に抱合又は結合している。
【００２１】
本発明の更なる実施態様は、製薬的に許容可能な担体と混合せしめられて、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる有効量の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する製薬的組成物を含む。場合によっては、かかる製薬組成物は一又は複数の二価金属イオンを含む。
本発明の更なる実施態様は、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されるレセプターを発現する哺乳動物細胞を、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる治療的有効量の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドに暴露することを含む、哺乳動物においてアポトーシスを誘導する方法を含む。
【００２２】
本発明の更なる実施態様は、哺乳動物細胞における癌を治療する方法において、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる有効量の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを上記哺乳動物に投与することを含む方法を含む。場合によっては、該方法において、癌は肺癌、乳癌、大腸癌、又は直腸結腸癌である。
本発明の更なる実施態様は、哺乳動物細胞における免疫関連疾患を治療する方法において、図１（配列番号：１）の天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号：１）の残基位置に次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｖ１１４Ｃ；Ｒ１１５Ｃ；Ｅ１１６Ｃ；Ｎ１３４Ｃ；Ｎ１４０Ｃ；Ｅ１４４Ｃ；Ｎ１５２Ｃ；Ｓ１５３Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｒ１７０Ｋ；Ｒ１７０Ｓ；Ｋ１７９Ｃ；Ｄ２３４Ｃ；Ｅ２４９Ｃ；Ｒ２５５Ｃ；Ｅ２６３Ｃ；Ｈ２６４Ｃの一又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる有効量の単離されたＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを上記哺乳動物に投与することを含む方法を含む。場合によっては、該方法では、免疫関連疾患は関節炎又は多発性硬化症である。
【００２３】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
「Ａｐｏ-２リガンド」、「Ａｐｏ２Ｌ」、「Ａｐｏ-２Ｌ」及び「ＴＲＡＩＬ」という用語は、ここでは図１に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１１４−２８１、９５−２８１、残基９２−２８１、残基９１−２８１、残基４１−２８１、残基１５−２８１、又は残基１−２８１、並びに上記配列の生物学的に活性な断片、欠失、挿入、又は置換変異体を含むポリペプチド配列を意味するものとして使用される。一実施態様では、ポリペプチド配列は図１（配列番号：１）の残基１１４−２８１を含む。場合によっては、ポリペプチド配列は図１の残基９５−２８１、残基９２−２８１又は残基９１−２８１を含む。Ａｐｏ-２Ｌポリペプチドは図１に示された天然ヌクレオチド配列によってコードされていてもよい。場合によっては、残基Ｐｒｏ１１９（図１）をコードするコドンは「ＣＣＴ」又は「ＣＣＧ」でありうる。他の好適な実施態様では、断片又は変異体は生物学的に活性であり、上記の配列の何れか一と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。この定義には、その天然のアミノ酸の少なくとも一がシステイン残基のような他のアミノ酸残基によって置換されているＡｐｏ-２リガンドの置換変異体が包含される。好適な置換変異体は、以下の表Ｉに特定された残基の置換の一又は複数を含む。定義には、組換え又は合成法によって調製された、又はＡｐｏ-２リガンド源から単離された天然配列Ａｐｏ-２リガンドもまた包含される。本発明のＡｐｏ-２リガンドは１９９７年１月１６日公開の国際公開９７／０１６３３、１９９７年７月１７日公開の国際公開９７／２５４２８及び２００１年１月４日公開の国際公開０１／００８３２に開示されたＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬと称されるポリペプチドを含む。「Ａｐｏ-２リガンド」、「Ａｐｏ２Ｌ」又は「Ａｐｏ-２Ｌ」という用語は、一般に、ポリペプチドの単量体、二量体又は三量体を含むＡｐｏ-２リガンドの形態を意味するものとして使用される。Ａｐｏ-２Ｌ配列において言及されているアミノ酸残基の全ての番号付けは、特に他の定義を述べない限り、図１（配列番号：１）における番号付けを使用している。例えば、「Ｄ２０３」又は「Ａｓｐ２０３」は図１（配列番号：１）に与えられた配列中、位置２０３のアスパラギン酸残基を意味する。
【００２４】
「Ａｐｏ-２リガンド細胞外ドメイン」又は「Ａｐｏ-２リガンドＥＣＤ」という用語は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に持たないＡｐｏ-２リガンドの可溶型を意味する。通常、ＥＣＤは、そのような膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満だけ有する。
「Ａｐｏ-２リガンド単量体」又は「Ａｐｏ-２Ｌ単量体」という用語はＡｐｏ-２Ｌの細胞外ドメイン配列の共有結合鎖を意味する。
「Ａｐｏ-２リガンド二量体」又は「Ａｐｏ-２Ｌ二量体」という用語はジスルフィド結合を介して共有結合によって結合した二つのＡｐｏ-２Ｌ単量体を意味する。ここで使用される該用語には、Ａｐｏ-２Ｌの三量体型内にあるＡｐｏ-２Ｌ二量体及び遊離しているＡｐｏ-２Ｌ二量体が含まれる（すなわち、他のＡｐｏ-２Ｌ単量体と結合している）。
「Ａｐｏ-２リガンド三量体」又は「Ａｐｏ-２Ｌ三量体」という用語は非共有的に結合している(associated)三つのＡｐｏ-２Ｌ単量体を意味する。  
【００２５】
「Apo-２L．０」又は「Ａｐｏ２Ｌ．０」という用語は図１（配列番号：１）のアミノ酸１１４から２８１からなり、如何なるエピトープタグ配列にも結合又は抱合されていないポリペプチドを意味する。
ここで使用されるところの「ＤＲ４レセプター」という用語は、Panら, Science, 276:111-113 (1997)に記載されているレセプターの完全長及び細胞外ドメイン型を意味する。ＤＲ４レセプターの完全長アミノ酸配列は図２０Ａ−２０Ｂ（配列番号：４）に与えられている。
ここで使用されるところの「ＤＲ５レセプター」という用語は、Sheridanら, Science, 277:818-821 (1997)；Panら, Science, 277:815-818 (1997)、１９９８年１１月１９日公開の国際公開９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開の国際公開９８／４１６２９；Screatonら, Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczakら, EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wuら, Nature Genetics, 17:141-143 (1997);１９９８年１０月２２日公開の国際公開９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日公開のＥＰ８７０８２７；１９９８年１０月２２日公開の国際公開９８／４６６４３；１９９９年１月２１日公開の国際公開９９／０２６５３；１９９９年２月２５日公開の国際公開９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開の国際公開９９／１１７９１に記載されているレセプターの完全長及び細胞外ドメイン型を意味する。ＤＲ５レセプターは当該分野においてＡｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれている。ここで使用されるところのＤＲ５という用語には、図２１（配列番号：５）に提供された完全長４１１アミノ酸ポリペプチド及び図２２Ａ−Ｂ（配列番号：６）に提供された完全長４４０アミノ酸ポリペプチドが含まれる。
【００２６】
ここで使用される場合の「ポリオール」という用語は広義に多価アルコール化合物を意味する。ポリオールは例えば任意の水可溶型ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであり得、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには、一又は複数のヒドロキシル位置に化学基、例えば１から４の炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ(アルキレングリコール)、好ましくはポリ(エチレングリコール)である。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを、ここでＰＥＧについて記載した抱合技術を使用して用いることができることが分かるであろう。本発明のポリオールには当該分野でよく知られたもの及び公的に入手可能なもの、例えば商業的に利用可能な供給源からのものが含まれる。
「抱合（コンジュゲート）」という用語は、ここではその最も広い定義で使用され、共に接合（joined）又は結合（linked）されていることを意味する。分子は、接合されているように作用又は機能する場合、「抱合」されている。
【００２７】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＡｐｏ-２リガンド、又はそれらの部分を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、抗体が産生され得るモノに対するエピトープを提供するのに十分な残基を有しているが、Ａｐｏ-２リガンドの活性を阻害しないよう十分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８から約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０から約２０の残基)を有する。
「二価の金属イオン」という用語は、二つの正電荷を有する金属イオンを称する。本発明において使用される二価金属イオンの例には、限定されるものではないが、亜鉛、コバルト、ニッケル、カドミウム、マグネシウム、及びマンガンが含まれる。かかる金属の特定の形態は塩形態（例えば、製薬剤的に許容可能な塩形態）、例えば、上述の二価の金属イオンの塩化物、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩及び硫酸塩形態を含むものが用いられうる。
本発明において使用される好適な二価金属イオンは、亜鉛、より好ましくはその塩形態、硫酸亜鉛である。ここにおいて記載の二価金属イオンは、好ましくは、例えば、（１）所望する期間にわたってＡｐｏ-２Ｌ三量体の貯蔵安定性を高め、（２）組換え細胞培養又は精製法においてＡｐｏ-２Ｌ三量体の生産又は収量を高め、（３）Ａｐｏ-２Ｌ三量体の溶解性を高め（又は凝集性を低下させ）、又は（４）Ａｐｏ-２Ｌ三量体の形成を高めるのに十分な濃度又は量（例えば有効量）で用いられる。
【００２８】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療的な使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで充分なほど精製される。Ａｐｏ-２リガンドの自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツでのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００２９】
「単離された」Ａｐｏ-２リガンド核酸分子は、同定され、Ａｐｏ-２リガンド核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＡｐｏ-２リガンド核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離されたＡｐｏ-２リガンド核酸分子は、天然の細胞中に存在するＡｐｏ-２リガンド核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＡｐｏ-２リガンド核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるＡｐｏ-２リガンドを通常発現する細胞に含まれるＡｐｏ-２リガンド核酸分子を含む。
【００３０】
ここで特定されている配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならば最大のパーセント配列同一性を得るために間隙を導入し、如何なる同類置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、Ａｐｏ-２リガンド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法で達成可能であり、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムを割り当てることを含み、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸同一性値は、ジェネンテック社によって作成され、ソースコードが米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、South San Francisco, CAを通して公に入手可能である。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ-２プログラムにより設定され、変化しない。
【００３１】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適なコントロール配列は、例えばプロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合する」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３２】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-αあるいはＴＧＦ-βのような形質転換成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子-I及び-II；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン-α、-β、及び-γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)；ＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質のことをいう。この用語は放射性アイソトープ（例えばＩ131，Ｉ125，Ｙ90及びＲｅ186）、化学療法剤、及び細菌性、真菌性、植物又は動物起源、又はそれらの断片の酵素的に活性な毒素のようなものを含むことが意図されている。
【００３３】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin ）；デュカロマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む）； エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin ）；サルコデイチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin ）；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンθＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；エスペラマイシン(esperamicin）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カリミノマイシン(carminomycin）、カルチノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシン．Ｃ、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)のようなマイトマイシン(mitomycins）；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin )のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は��導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００３４】
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ期でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakamiら, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００３５】
ここにおける目的のための「生物学的に活性」又は「生物学的活性」は、（ａ）インビボ又はエキソビボで少なくとも一のタイプの哺乳動物癌細胞又はウイルス感染細胞において、アポトーシスを誘導し又は刺激する能力を有すること；（ｂ）抗体を産生することが可能であること、すなわち免疫原性であること；（ｃ）Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのレセプターへ結合し及び／又はこれを刺激することが可能あること；又は（ｄ）天然又は天然に生じるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドの活性を保持することを意味する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの生物学的活性を定量するためのアッセイは、細胞毒性、ＤＮＡ断片化（例えばMarstersら, Curr. Biology, 6: 1669 (1996)）、カスパーゼ不活性化、ＤＲ４結合、ＤＲ５結合（例えば１９９８年１１月１９日公開の国際公開９８／５１７９３を参照）並びにＰＣＴ公報番号ＷＯ９７／０１６３３、ＷＯ９７／２５４２８、ＷＯ０１／００８３２、及びＷＯ０１／２２９８７に記載されたアッセイ法などの当該分野で既知の方法を使用して実施することができる。
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この活性は、例えば細胞生死判別アッセイ（例えばアラマーブルーアッセイ又はＭＴＴアッセイ）、ＦＡＣＳ分析、ＤＮＡ断片化（Nicolettiら, J. Immunol. Methods, 139:271-279 (1991)）、又はポリ-ＡＤＰリボースポリメラーゼ、「ＰＡＲＰ」切断アッセイにより決定し測定することができる。
【００３６】
ここで用いられる場合、「疾患」という用語は、一般に、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのような有効量のポリペプチドによって治療することができる任意の疾病又は疾患を含む、ここに記載の組成物を用いた治療により恩恵を受ける任意の状態を意味する。これは慢性及び急性疾患、並びに哺乳動物を当該疾患にかかりやすくする病理的状態を含む。限定されないが、ここで治療される疾患の例には、良性及び悪性癌；炎症性、血管由来、及び免疫疾患、自己免疫疾患、関節炎（リウマチ様関節炎を含む）、多発性硬化症、及びＨＩＶ／ＡＩＤＳが含まれる。
「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫、及び肉腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、芽細胞腫、胃腸癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮体癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、多形神経膠芽腫、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、大腸癌、及び頭部及び頸部の癌が含まれる。
ここで使用される「治療する」、「治療」、及び「療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び防護的療法を称する。
「哺乳類」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、犬及びネコを含む哺乳類と分類されるあらゆる動物に相当する。本発明の好ましい実施態様では、哺乳類はヒトである。
【００３７】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
ＴＮＦリガンドファミリーに関連したサイトカインで、ここにおいて「Ａｐｏ-２リガンド」と特定されたサイトカインが記載されている。ヒトＡｐｏ-２リガンドの予測成熟アミノ酸配列は、２８１個のアミノ酸を含み、約３２．５ｋＤａの計算上の分子量を有する。シグナル配列が存在せず内在性疎水性領域が存在することは、Ａｐｏ-２リガンドがＩＩ型膜貫通タンパク質であることを示唆する。また、可溶性細胞外ドメインＡｐｏ-２リガンドポリペプチドが記載されている。例えば１９９７年７月１７日に公開のＷＯ９７／２５４２８を参照のこと。Ａｐｏ-２Ｌ置換変異体がさらに記載されている。アラニンスキャンニング技術が、生物学的活性を有する種々の置換変異体分子を同定するために利用されてきた。Ａｐｏ-２リガンドの特定の置換変異体は、少なくとも一つのアミノ酸がシステイン残基によって置換されているものを含む。置換変異体は、例えば「Ｒ１１５Ｃ」、「Ｅ１１６Ｃ」及び「Ｒ１７０Ｃ」として同定されている。この命名法は、位置１１５、１１６、及び／又は１７０（図１に示した番号を使用）の残基がシステイン残基によって置換されているＡｐｏ-２リガンド変異体を同定するために利用されている。場合によっては、Ａｐｏ-２Ｌ変異体は、下記の表１に記載されている置換の一又は複数を含んでもよい。
【００３８】
Ａｐｏ-２リガンドの細胞外ドメインのＸ線結晶構造が提供され、アラニンスキャンニング突然変異誘発が、そのレセプター接触領域のマッピングを提供するために実施されている。Ａｐｏ-２リガンドに対して得られた構造は、Ａｐｏ-２リガンド三量体分子の三つのサブユニットの相互作用を統合する新規な二価金属イオン（亜鉛）結合部位を含むホモ三量体タンパク質を明らかにする。
Ａｐｏ-２ＬのＸ線構造は、ＴＮＦ-αのモデルを利用する分子置換［Eckら, J. Bio. Chem., 264: 17595-17605 (1989)］によって決定され、３．９オングストローム（１１４−２８１残基形態に対して）及び１．３オングストローム（Ｄ２１８Ａ変異体；９１−２８１形態に対して）まで精緻化される。ＴＮＦファミリーの他のメンバーのように、Ａｐｏ-２Ｌは、約５１００平方オングストローム（単量体当たり平方１７００オングストローム）を埋めて球状三量体を形成する、三つのゼリーロール単量体からなる緻密な三量体を含むと思われる（図２Ａを参照のこと）。コアのβストランドの位置は、ＴＮＦファミリーの他の構造的に特徴付けられたメンバーのＴＮＦ-α［Eckら, 上掲；Jonesら, Nature, 338:225-228(1989)］、ＴＮＦ-β［Eckら, J. Biol. Chem., 267:2119-2122(1992)］、及びＣＤ４０Ｌ［Karpusasら, Structure, 3:1031-1039(1995)］で、ＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β のコアストランドと比較して０．８オングストロームのr.m.s.d.のものと比較して良好に保持されている。Ａｐｏ-２Ｌ三量体の境界面のどの残基も、現在知られている全てのヒトＴＮＦファミリーメンバーの配列において完全に保持されているものはないようである；しかしながら、これら残基の疎水化学的性質は保持されている。Ａｐｏ-２Ｌ三量体における保境界面の保持された残基は、塩基の近傍（三量体の最も広い部分）及び三回転軸に沿ってクラスターを形成する。Ｃｙｓ２３０の近傍のＡｐｏ-２Ｌ三量体境界面の頂点の近くでは、構造は分岐しているように思われ、１９０及び２３０のループのコンホメーションは各構造において変動する。
【００３９】
β骨格コアとは対照的に、レセプター結合表面及びループの構造は、ＴＮＦファミリーメンバーの中でかなり変化する。Ａｐｏ-２リガンドの構造とＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、及びＣＤ４０Ｌの構造の間の一つの違いは、ストランドＡ及びＡ’の間の接合である。ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、及びＣＤ４０Ｌでは、ストランドＡの後に、緻密なループが続いている。Ａｐｏ-２リガンドでは、１５残基の挿入がこのループを長くし、そのコンホメーションを変える。ループの最初の部分（残基１３１から１４１）は、ループの二番目の部分（残基１４２から１５４）がＣＤ４０Ｌに類似するコンホメーションをそのＣ末端部分に有して、分子の表面を一つの単量体-単量体境界面から次へ（図２Ａを参照のこと）と越える際に乱れる。
三量体化境界面の頂点の近くに、二価金属イオン（亜鉛）結合部位が埋もれている。ＴＮＦファミリーメンバーは、配列分析によって、Ｃｙｓ２３０に関して三つのグループに分けられる：（１）Ｃｙｓ２３０に対応する位置のシステイン残基に、金属イオンとの相互作用を妨げるジスルフィド結合を形成することが可能な隣接ループ（Ａｐｏ-２Ｌの１９４−２０３ループ）の中の他のシステインが伴っているＴＮＦ-α及びＦａｓリガンドのようなタンパク質、（２）Ｃｙｓ２３０に対応するシステインを持たないタンパク質（例えばＴＮＦ−β及びＯＰＧＬ）、及び（３）Ｃｙｓ２３０に対応するシステイン残基を一つのみ有するタンパク質である。Ａｐｏ-２Ｌ及び他の種におけるそのオルソログは、後者の基準に当てはまり（すなわち、Ｃｙｓ２３０のみを持つタンパク質）、三量体表面において二価金属イオンと結合することが期待される。Ａｐｏ-２ＬのＣｙｓ２３０の直ぐ前の主要鎖のコンホメーションは、ＴＮＦ-α及びＣＤ４０ＬのようなＴＨＦファミリーメンバーを含むジスルフィドとは異なる。Ａｐｏ-２Ｌでは、Ｃｙｓ２３０の側鎖は、境界面から遠ざかるのではなく、境界面に向かっている。
【００４０】
各Ａｐｏ-２Ｌ単量体のＣｙｓ２３０残基は内部を三量体軸へ向いて内方を指し、内部の溶媒分子と共に二価金属イオンを配位する。この二価金属イオン結合部位は、亜鉛結合部位にとって適切な結合及び角度を持つ僅かに歪んだ四面体幾何を示し、溶媒へは完全に接触不可能である（図２Ｂを参照のこと）。結合金属の同一性は、誘導結合プラズマ原子発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を利用して確認された。ＩＣＰ-ＡＥＳを利用したＣｄ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＣｕの定量分析では、Ａｐｏ-２Ｌ三量体の一分子当たり０．７９モルのＺｎと０．０６モルのＣｏが検出され、構造中の結合イオンが、約１対１のモル比の亜鉛であることが示された。この部位の重要性は、Ｃｙｓ２３０のアラニン置換が８倍未満のアポトーシス活性の減少となったという観察によって立証された。更に、キレート試薬に対する透析によるＡｐｏ-２Ｌからの結合金属の除去により、ＤＲ５親和性の７倍の低下及びアポトーシス活性の９０倍未満の低下が生じた。Ｚｎの除去によって、システインは酸化されやすくなり、アポトーシス活性が低下したジスルフィド結合Ａｐｏ-２Ｌ二量体が形成された。金属結合部位はＡｐｏ-２Ｌ三量体構造に埋もれているように思われ、レセプターに接触するとは予想されないことから、データは、二価金属イオン結合が、Ａｐｏ-２Ｌの安定性と三量体構造を維持するのに重要であろうことを示唆している。
【００４１】
Ａｐｏ-２リガンドとＡｐｏ-２レセプターの細胞外ドメイン配列（ＤＲ５）との間の複合体の結晶構造は決定されている。（Hymowitzら, Mol. Cell., 4:563-571 (1999)を参照のこと）。Ａｐｏ-２は全体構造がＴＮＦＲ１に似ており、比較的定まっていない二次構造を持つ。それは一連の７つのジスルフィド結合によって長い形状に繋ぎ止められており、そのジスルフィド結合の６つはＴＮＦＲ１レセプターの第二及び第三のＣＲＤに構造的に対応するＡｐｏ-２のサブドメイン（それぞれ残基４３−８４及び８５−１３０）に見出される。
Ａｐｏ-２リガンド／Ａｐｏ-２複合体の接触面は、２つのパッチ、パッチＡとパッチＢに分けられる。Ａｐｏ-２Ｌ／Ａｐｏ-２接触面のパッチＢの顕著な特徴はＡｐｏ-２ＬのＴｙｒ２１６（図１に提供されるＡｐｏ-２Ｌのアミノ酸配列の番号付けを用いて）とＡｐｏ-２レセプターの５０ｓループの間の相互作用である。残基Ｔｙｒ２１６は、ＴＮＦのスーパーファミリーリガンド（ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＦａｓＬ及びＯＰＧＬを含む）の多くに保存され、他のメンバーはこの位置に同様の大きな疎水性残基を有する。ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＦａｓＬ及びＡｐｏ-２Ｌの突然変異誘発研究は、この残基が結合に重要である（Schneiderら, J. Biol. Chem., 272:18827-18833(1997); Gohら, Protein Eng., 4:785-791(1991); Yamagishiら, Protain Eng., 3:713-719(1990); Van Ostadeら, Protein Eng., 7:5-22(1990); Hymowitzら, Personal communication）ことを示す全てである。チロシン側鎖の相互作用はＡｐｏ-２Ｌ／Ａｐｏ-２とＴＮＦ-β-ＴＮＦＲ１の複合体の間に保存される。さらに、側鎖の結合ポケットを形成するレセプターの５０ｓループのバックボーン構造は、Ａｐｏ-２及びＴＮＦＲ１の間（残基５１から６２のＣ-α原子の間の僅か０．３５のｒｍｓｄ）で実質的に同一である。さらに、このループの長さは、異なるＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバーの間で保存されている。このループが、ＣＲＤ３により媒介されるより特異的な接触のためにレセプターの上位の部分を適切に判断する助けとなりうるリガンドの保存された疎水性特性と相互作用する一般的な疎水性結合パッチのように機能しうることが考えられる。
【００４２】
パッチＢでの保存的な相互作用に比較して、接触面の下方付近のパッチＡはＴＮＦＲ１の対応するループに比べ完全に異なる構造を有するＡｐｏ-２のＣＲＤ３の９０ループにより成される相互作用に関連している。
パッチＢにおいて、レセプターの５０ｓループ及びＡｐｏ-２リガンド残基２１６が結合に一般的に重要な疎水性パッチを提供していることが考えらるが、パッチＡにおいては、レセプター９０ｓループと、位置２０５の、又はその付近のＡｐｏ-２リガンド残基が特異性と交差反応をコントロールする。Ａｐｏ-２レセプターの５０ｓループ及び９０ｓループがリガンド結合決定基のほとんどを運ぶと思われる。Ａｐｏ-２配列の位置５３及び５９のヒスチジン及びフェニルアラニン残基は、それぞれ共に比較的大きな残基である。これら２つの残基は、Ａｐｏ-２リガンドの残基Ａｓｐ２１８及びＳｅｒ１５９と接触すると考えられ；従って、Ａｐｏ-２配列の５３及び５９位置の導入した大きい側鎖はＡｐｏ-２に対するＡｐｏ-２親和性に逆に影響しうる（しかし、ＤＲ４に対する親和性を向上させる）。
【００４３】
Ａｐｏ-２リガンドレセプター結合及び活性を特徴付けるために、アミノ酸置換部位を、ＤＲ５・Ａｐｏ-２Ｌ複合体のX線構造の検査に基づいて選択した（図３）。置換システインアミノ酸残基の突然変異又は続く修飾の際に活性が失われることを避けるために、セプター接触領域の外側の部位を突然変異誘発のために考慮した。システイン側鎖の効率的な化学的修飾を確かなものにするために、結晶構造で高い溶媒接近性を示した残基を選択した。これらの基準に適合した残基には、限定されるものではないが、Ｇｌｕ１４４、Ａｓｎ１５２、Ｓｅｒ１５３、Ａｒｇ１７０、Ａｓｐ２３４、Ｇｌｕ２４９、Ａｒｇ２５５、Ｇｌｕ２６３、及びＨｉｓ２６４が含まれる。また、Ｖａｌ１１４、Ａｒｇ１１５、Ｇｌｕ１１６、Ａｓｎ１３４及びＡｓｎ１４０をシステイン置換部位として選択した。これらの残基はＡｐｏ-２Ｌ-ＤＲ５結晶構造において分子の乱れた部分にあり、このように溶媒接近性でありと推定され、レセプター結合には寄与しない。図３に示されるように、この残基群はＡｐｏ-２Ｌ単量体の一面の頂部から底部までにかかっている。実験的に検査したシステイン置換Ａｐｏ-２Ｌタンパク質のなかで、Ｅ１１６ＣがＳＫ-ＭＥＳ細胞に対するアポトーシス活性を有意に低減させた（表Ｉを参照のこと）。Ｒ１７０Ｃ変異体は約１０倍増加した能力を示した。また、Ａｒｇ１７０をＡｌａ、Ｌｙｓ又はＳｅｒ残基の何れかで置換したＡｐｏ-２Ｌ変異体はＡｐｏ-２Ｌ．０ポリペプチドに匹敵する活性を有していた。本発明のある実施態様では、好適なＡｐｏ-２Ｌ変異体は、図１のＡｐｏ-２Ｌ配列にけるＥ１１６、Ｎ１３４、Ｎ１４０及び／又はＲ２５５に対応する位置に天然の残基を含む（つまり突然変異していない）と考えられる。
【００４４】
下記の説明は、核酸をコードするＡｐｏ-２リガンド変異体を含むベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することによってＡｐｏ-２リガンド変異体を生産する方法に関する。
Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡは、Ａｐｏ-２リガンドｍＲＮＡを有し、これを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリーから得ることできる。従って、ヒトＡｐｏ-２リガンドＤＮＡは、国際公開９７／２５４２８に記載されているヒト胎盤ｃＤＮＡのバクテリオファージライブラリーのような、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることが可能である。また、Ａｐｏ-２リガンドコード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又はオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(Ａｐｏ-２リガンドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングすることができる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。Ａｐｏ-２リガンドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００４５】
Ａｐｏ-２リガンドのアミノ酸配列断片又は変異体は、Ａｐｏ-２リガンドＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、所望のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを合成することにより調製することができる。このような断片又は変異体は、完全長Ａｐｏ-２リガンドについて図１（配列番号：１）に示したアミノ酸配列の、又は細胞内領域、膜貫通領域、又は細胞外領域（例えば１１４−２８１アミノ酸形態）の内部あるいは一方又は両方の末端に残基の挿入、置換及び／又は欠失を示す。最終構築物が例えばここに定義する所望の生物活性又はアポトーシス活性を有する限り、挿入、置換及び／又は欠失の任意の組み合わせで最終構造物に到達することができる。好ましい実施態様では、断片又は変異体は、Ａｐｏ-２リガンドの細胞内、膜貫通、又は細胞外領域についてここで同定した配列、あるいはＡｐｏ-２リガンドの完全長配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。また、アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、又は膜係留特性（膜アンカー特性）の改変のように、Ａｐｏ-２リガンドの翻訳後プロセスを改変し得る。
【００４６】
ここで記載されているＡｐｏ-２リガンド配列における変異は、米国特許第５３６４９３４号に記載された保存的あるいは非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して生じさせることができる。これらは、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を含む。
近接配列に沿った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使用することができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越えた側鎖が除去されるため、アラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングアミノ酸である［Cunninghamら, Science, 244: 1081 (1989)］。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることによっても好ましい。さらに、アラニンは埋設及び露出位置の双方に頻繁に見出される［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)；Chothia, J. Mol. Biol., 150：１(1976)］。
【００４７】
本発明の特定のＡｐｏ-２Ｌ変異体は、下記の表１に与えられた一又は複数の列挙された置換を含むＡｐｏ-２Ｌポリペプチドを含む。このようなＡｐｏ-２Ｌ変異体は、典型的には、少なくとも一又は複数のアミノ酸が天然配列Ａｐｏ-２Ｌ（例えば、図１に提供のもの；Ａｐｏ-２Ｌの完全長又は成熟形態あるいはその細胞外ドメイン配列）と異なる非天然に生じるアミノ酸配列を含む。場合によっては、天然配列Ａｐｏ-２Ｌと比較してＡｐｏ-２Ｌ変異体において異なる一又は複数のアミノ酸は、表１に示されたもののようなアミノ酸置換を含む。本発明のＡｐｏ-２Ｌ変異体は、図１の残基９１−２８１、９２−２８１、９５−２８１又は１１４−２８１を含んでなり、表１に記載されている一又は複数のアミノ酸置換を有する可溶性Ａｐｏ-２Ｌ変異体を含む。好ましいＡｐｏ-２Ｌ変異体は、図１（配列番号：１）の残基９１−２８１、９２−２８１、９５−２８１又は１１４−２８１を含んでなり、表Ｉに記載された一又は複数のアミノ酸置換を有し、ここに記載されるような所望の生物活性を更に有する変異体を含む。
【００４８】
また、本発明の範囲に含まれるＡｐｏ-２リガンド配列の変異体は、アミノ末端誘導体又は修飾形にも関連する。このようなＡｐｏ-２リガンド配列は、ポリペプチド配列のＮ末端にメチオニン又は修飾メチオニン（例えばホルミルメチオニル又は他のブロックされたメチオニル種など）を有するここに記載した任意のＡｐｏ-２リガンド変異体を含む。
天然又は変異体Ａｐｏ-２リガンドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、及び転写終結配列であり、それぞれを以下に説明する。用いられるであろう任意のシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント及び転写終結配列は当該分野で知られており、ＷＯ９７／２５４２８にさらに詳しく記載されている。
【００４９】
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ａｐｏ-２リガンド核酸配列に作用可能に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合したＡｐｏ-２リガンド変異体核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子(一般的に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘発的なクラス及び構成的なクラスの２つのクラスに属する。誘発的なプロモーターは、例えば、養分の存在あるいは不存在、温度変化などの培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Ａｐｏ-２リガンド変異体をコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然のＡｐｏ-２リガンドプロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれもＡｐｏ-２リガンドＤＮＡの直接増幅及び／又は発現に用いることができる。
【００５０】
原核生物及び真核生物宿主に適したプロモーターは当該分野で知られており、ＷＯ９７／２５４２８にさらに詳しく記載されている。
大腸菌におけるＡｐｏ-２Ｌの生産の好ましい方法には、生産物発現の制御のための誘発的プロモーターが用いられる。制御可能な誘発的なプロモーターの利用は、生産物発現の誘発、及び宿主によってよく耐えることのできないかなりの量の生産物の蓄積の前に、所望する細胞密度への培養成長を可能にする。
Ａｐｏ-２Ｌ（１１４−２８１形態）の発現のために、三つの誘発的なプロモーター系（Ｔ７ポリメラーゼ、ｔｒｐ及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ））が出願人によって評価された。これら三つのプロモーターのそれぞれの利用は、収集細胞ペーストから回収されたかなりの量の可溶性で生物学的に活性なＡｐｏ-２Ｌ三量体を結果として生じた。しっかりとしたプロモーターコントロール、及び収集細胞ペーストにおいて到達したより高い細胞密度及び力価のために、試験されたこれら三つの誘発的なプロモーター系の中でＡＰプロモーターが好まれている。
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの構築には、標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい形態に再びライゲーションする。
【００５１】
作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又は当該分野で知られている標準的技術を利用して配列を決定する［例えば、Messingら, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)；Maxamら, Methods in Enzymology, 65:499 (1980)を参照のこと］。
Ａｐｏ-２リガンドをコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む［Sambrookら, 上掲］。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、生物学的に活性であるＡｐｏ-２リガンドの類似物及び変異体を同定する目的のために特に有用である。
【００５２】
組換え脊椎動物細胞培養でのＡｐｏ-２リガンド変異体の合成に適応化させるのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979); EP117,060; 及びEP117,058に記載されている。
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びにバシラス、例えば枯草菌及びバシラス・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシラス・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。
【００５３】
大腸菌は、本発明において好ましい宿主細胞である。大腸菌は、グリコシル化の必要がなく、大きさが２０ｋｄ未満であるポリペプチドである、Ａｐｏ-２リガンド（１１４−２８１形態）の発現に特によく適している。生産宿主として、大腸菌は比較的に高い細胞密度で培養が可能であり、比較的に高いレベルの異種タンパク質の生産が可能である。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Ａｐｏ-２リガンドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化Ａｐｏ-２リガンドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。ＣＨＯ細胞を含むすべてのこのような宿主細胞の例は、さらにＷＯ９７／２５４２８に記載されている。
宿主細胞を形質移入し、好ましくは上述のＡｐｏ-２リガンド産生のための発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された標準栄養培地で培養する。
トランスフェクション（形質移入）は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
【００５４】
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、１９９１年１月１０日に公開されたＷＯ９１／００３５８に記載されているように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクションすることもできる。
【００５５】
このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
Ａｐｏ-２リガンド変異体を生産するために用いられる原核細胞は、前掲のSambrookらにより記載されているような適切な培地で培養される。大腸菌の培養に用いられうる培養培地の特定の形態は、下記の実施例にさらに記載されている。Ａｐｏ-２リガンドを生産するための哺乳動物宿主細胞は、種々の培養培地において培養することができる。
【００５６】
市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」、シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」、シグマ)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
【００５７】
場合によっては、ここに記載のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド組成物は亜鉛のような二価金属を含む。ここに記載の方法及び製剤において二価金属イオンが存在するとジスルフィド結合の形成から保護されうる。Ａｐｏ-２Ｌ三量体の合成と構築の間に二価金属イオンを含有させると、正しく折り畳まれたホモ三量体Ａｐｏ-２Ｌの蓄積と回収を更に改善しうると思われる。従って、本発明の他の側面では、宿主細胞の培養又は発酵のために、典型的には一又は複数の二価金属イオンが培養培地へ添加されるかあるいは含まれる。二価金属イオンは、好ましくは、貯蔵安定性を増すため、溶解性を増すため、又は一又は複数の亜鉛イオンによって調整される安定なＡｐｏ-２Ｌ三量体の形成を補助するために十分な濃度レベルで培養培地に存在するかあるいは添加される。添加されうる二価金属イオンの量は、一部は培養中の宿主細胞密度又はこのような二価金属イオンへの潜在的な宿主細胞感受性に依存する。培養におけるより高い細胞密度では、二価金属イオンの濃度を増すことは有益である。宿主細胞による生産物の発現中又は発現後に二価金属イオンが添加される場合は、宿主細胞による産物の発現が増加するのに応じて二価金属イオン濃度を調節又は増加させることが望ましい。典型的な普通に入手可能な細胞培養培地に存在しうる微量レベルの二価金属イオンは、安定な三量体形成には十分ではないと一般的に考えられている。従って、更なる量の二価金属イオンの添加が好ましい。
【００５８】
培養中の宿主細胞の成長期の間に二価金属イオンが添加される場合は、二価金属イオンは、逆に又は負の方向に宿主細胞へ影響しない濃度で培養培地へ添加されるのが好ましい。振盪フラスコ培養では、１ｍＭより高い濃度でのＺｎＳＯ４の添加は、結果として低い宿主細胞密度を生じる可能性がある。当業者であれば、細菌細胞は、細胞マトリックスと金属イオン複合体を形成することで、効果的に金属イオンを隔離することが可能であることが分かる。従って、細胞培養では、成長期の後（所望する宿主細胞密度に達した後）又は宿主細胞による生産物発現の直前に、選択された二価金属イオンを添加することが好ましい。十分な量の二価金属イオンが存在していることを確かめるために、更なる二価金属イオンを、生産物発現期の間に細胞培養培地へ添加又は供給することができる。
培養培地の二価金属イオン濃度は、宿主細胞に対して有害又は毒性でありうる濃度を越えてはならない。宿主細胞として大腸菌を用いる本発明の方法では、培養培地の二価金属イオンの濃度が約１ｍＭ（好ましくは≦１ｍＭ）を越えないことが好ましい。さらにより好ましくは、培養培地の二価金属イオン濃度は、約５０マイクロモルから約２５０マイクロモルである。最も好ましくは、このような方法で使用される二価金属イオンは硫酸亜鉛である。金属イオン及びＡｐｏ-２リガンド三量体が１対１モル比で存在することが可能である量の二価金属イオンを細胞培養へ添加することが望ましい。
二価金属イオンは、細胞培養へ如何なる許容可能な形態でも添加が可能である。例えは、金属イオンの溶液は水を使って調製することが可能であり、次に、二価金属イオン溶液は培養培地へ添加又は供給することが可能である。
【００５９】
本発明の一実施態様では、選択されたＡｐｏ-２Ｌ変異体は大腸菌で発現され、細胞培養の培養又は発酵の間、約４０−５０ｇｍ／Ｌ乾燥細胞重量につき約１．０−３．０ｍｍｏｌｅｓ／Ｌ-分の酸素取り込み速度で細胞活動が行われるようにプロセスパラメーターが設定される。新規に合成された新生Ａｐｏ-２Ｌポリペプチドは、適切なタンパク質の折り畳み（フォールディング）及びＡｐｏ-２Ｌ単量体の三量体化に十分な時間を有していることが好ましい。発酵プロセスの成長期は、好ましくは３０℃で行われる。生産物発現の開始の直前において、プロセスの温度制御設定値は３０℃のまま又は残りの発酵のために２５℃へ下方制御されてもよい。場合によっては、細胞培養中の細胞密度を増加させることが望ましく、これに応じて、上において言及したパラメーターを調節（又は増加）させることが可能である。例えば、容積生産高を増やすために細胞培養中の細胞密度を増やすことは有利な可能性がある。当業者であれば、所望に応じて、当該分野で知られている常套的技術を利用し、細胞密度を徐々に増加させ、上述のパラメーターを徐々に増加させることができる。
Ａｐｏ-２Ｌの発現は、例えば、ここに記載された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、一般的なサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)）、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインシトゥハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾ヌクレオチドを用いる方法もまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性核種、蛍光剤又は酵素等のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位となる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、検定を実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【００６０】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液の検定によって測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、ルミネセンス標識等である。
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳類において調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＡｐｏ-２リガンドＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
Ａｐｏ-２リガンドは、好ましくは培養培地から分泌されたポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナル無しで直接産生される場合は宿主細胞溶菌液から回収してもよい。Ａｐｏ-２リガンドが膜結合性である場合は、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて膜から引き離すか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を切り離すことができる。
【００６１】
Ａｐｏ-２リガンドがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられる場合は、Ａｐｏ-２リガンドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含まない。しかしながら、Ａｐｏ-２リガンドに関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又はポリペプチドからＡｐｏ-２リガンドを精製することが通常必要である。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Ａｐｏ-２リガンドを、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ又はＣＭ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;及びＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
好ましい実施態様では、Ａｐｏ-２リガンドはアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。残基が欠失され、挿入され、又は置換されたＡｐｏ-２リガンド断片又は変異体は、その変異によってしばしば惹起される実質的な性質変化を考慮に入れて、天然Ａｐｏ-２リガンドと同じようにして回収することができる。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原とのＡｐｏ-２リガンド融合体の調製は精製を容易にする；抗原に対する抗体を含む免疫アフィニティーカラムを、融合ポリペプチドを吸着させるために使用することができる。
【００６２】
例えばフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。天然Ａｐｏ-２リガンドに適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるＡｐｏ-２リガンド又はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれば分かるであろう。
このような精製工程では、回収されたＡｐｏ-２Ｌを二価金属イオン含有溶液又は一又は複数の二価金属イオンを含有する精製物質（例えばクロマトグラフィー媒体又は支持体）へ曝露することが望ましいであろう。好ましい実施態様では、二価金属イオン及び／又は還元剤は、Ａｐｏ-２Ｌの精製又は回収の間に使用される。場合によっては、ＤＴＴ又はＢＭＥのような二価金属イオン及び還元剤の両方を、Ａｐｏ-２Ｌの精製又は回収の間に使用してもよい。精製又は回収の間に二価金属イオンを使用することは、Ａｐｏ-２Ｌ三量体の安定性を提供するか、あるいは細胞培養段階の間に形成されるＡｐｏ-２Ｌ三量体を維持すると考えられる。
原核生物宿主細胞（最も好ましくは細菌宿主細胞）から発現Ａｐｏ-２Ｌを精製及び回収する好ましい方法は以下の工程を含む：（ａ）大腸菌細胞からＡｐｏ-２Ｌ（細胞内）を抽出する；（ｂ）二価金属イオン及び／又は還元剤を含んでなるバッファー液において適切に折り畳まれたＡｐｏ-２Ｌを安定化する；（ｃ）順次、カチオン（陽イオン）交換体、ハイドロキシアパタイト及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するクロマトグラフィーによってＡｐｏ-２Ｌを精製する、及び（ｄ）各クロマトグラフィー支持体から、二価金属イオン及び／又は還元剤を含んでなるバッファー液へ選択的にＡｐｏ-２Ｌを溶出する。このような方法に使用される二価金属イオン及び還元剤には、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸コバルト、ＤＴＴ及びＢＭＥ、そしてより好ましくは硫酸亜鉛又はＤＴＴが含まれうる。
【００６３】
以下の記載はまた一又は複数の化学基に共有的に結合した（以下「抱合された(conjugated)」）Ａｐｏ-２リガンド変異体を製造する方法に関する。本発明のＡｐｏ-２Ｌ抱合体に使用するのに適した化学基は好ましくは有意に毒性又は免疫原性ではない。化学基は場合によっては保存することができ保存に適した条件下で使用できるＡｐｏ-２Ｌ変異体抱合体を製造するために選択される。ポリペプチドに抱合されうる様々な例示的化学基が当該分野で知られており、例えば糖タンパク質に天然に生じる炭水化物のような炭水化物、及び非タンパク様ポリマー、例えばポリオールが含まれる（米国特許第６２４５９０１号を参照）。
例えばポリオールは、上掲の国際公開９３／００１０９に開示されているように、リジン残基を含む一又は複数のアミノ酸残基においてＡｐｏ-２Ｌ変異体のようなポリペプチドに抱合されうる。用いられるポリオールは任意の水溶性ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーとでき、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには一又は複数のヒドロキシル位置で１から４の炭素を有するアルキル基のような化学基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ(アルキレングリコール)、例えばポリ(エチレングリコール)（ＰＥＧ）であり、よって記載を簡単にするために、以下の議論においては、用いるポリオールがＰＥＧである例示的な実施態様に関するものとし、ポリペプチドにポリオールを抱合させる方法を「ペグ化(pegylation)」と称する。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを、ＰＥＧに対してここに記載した抱合法を使用して用いることができることは理解できるであろう。
【００６４】
Ａｐｏ-２Ｌ変異体のペグ化に用いられるＰＥＧの平均分子量は変動し得、典型的には約５００から約３００００ダルトン（Ｄ）の範囲でありうる。好ましくは、ＰＥＧの平均分子量は約１０００から約２５０００Ｄであり、より好ましくは約２０００から約５０００Ｄである。一実施態様では、ペグ化は約２０００Ｄの平均分子量を持つＰＥＧを用いて実施される。好ましくは、ＰＥＧホモポリマーは未置換であるが、一端にアルキル基が置換されていてもよい。好ましくは、アルキル基はＣ１−Ｃ４アルキル基、最も好ましくはメチル基である。ＰＥＧ調製物は商業的に入手可能であり、典型的には本発明において使用するのに適したＰＥＧ調製物は平均分子量に応じて販売されている非均一調製物である。例えば、市販のＰＥＧ(５０００)調製物は典型的には分子量が僅かに変動し、通常は±５００Ｄの分子を含む。
本発明のＡｐｏ-２リガンド変異体は単量体形態又は三量体形態（３つの単量体を含む）でありうる。場合によっては、Ａｐｏ-２Ｌ変異体三量体は、ＰＥＧ分子が三量体Ａｐｏ-２Ｌ変異体を構成する３つの単量体の各々に結合又は抱合されるようにペグ化される。そのような実施態様では、用いられるＰＥＧは約２０００から約５０００Ｄの平均分子量を有するのが好ましい。また、Ａｐｏ-２Ｌ変異体三量体は「部分的に」ペグ化され得、つまり、三量体を構成する三の単量体の一又は二だけがＰＥＧに結合又は抱合される。そのような「部分的に」ペグ化されたＡｐｏ-２Ｌ変異体では、用いられるＰＥＧが約５０００Ｄ又は５０００Ｄを超える平均分子量を有することが好ましい。
【００６５】
タンパク質をペグ化するための様々な方法が当該分野で知られている。ＰＥＧに抱合したタンパク質を製造するための特定の方法には、米国特許第４１７９３３７号、米国特許第４９３５４６５号及び米国特許第５８４９５３５号に記載された方法が含まれる。典型的には、タンパク質は、主に反応条件、ポリマーの分子量等々に応じて、ポリマーの末端反応性基にタンパク質のアミノ酸残基の一又は複数を介して共有的に結合される。反応性基を有するポリマーはここでは活性化ポリマーと命名する。反応性基はタンパク質の遊離のアミノ又は他の反応性基と選択的に反応する。ＰＥＧポリマーは無作為な形又は部位特異的な形の何れかの形でタンパク質上のアミノ又は他の反応性基に結合しうる。しかし、最適な結果を得るために、選択される反応性基のタイプと量、並びに用いられるポリマーのタイプは、反応性基がタンパク質上の余りに多くの特に活性な基と反応することを避けるために用いられる特定のタンパク質又はタンパク質変異体に依存するものと理解される。これは完全に避けることができないであろうため、タンパク質１モル当たり一般に約０．１から１０００モル、好ましくは２から２００モルの活性化ポリマーを、タンパク質濃度に応じて用いることが推奨される。タンパク質１モル当たりの活性化ポリマーの最終量は、最適な活性を維持し、同時に可能ならばタンパク質の循環半減期を最適化するためのバランス量である。
【００６６】
残基はタンパク質の任意の反応性アミノ酸、例えばＮ末端アミノ酸基であってもよいが、好ましくは反応性アミノ酸はシステインであり、これは、例えば国際公開９９／０３８８７、国際公開９４／１２２１９、国際公開９４／２２４６６、米国特許第５２０６３４４号、米国特許第５１６６３２２号、及び米国特許第５２０６３４４号に示されているように、その遊離のチオール基を介して活性化ポリマーの反応性基に結合している。あるいは、反応性基はリジンであり、これは、活性化ポリマーの反応性基にその遊離のイプシロン-アミノ基を介して結合しており、あるいはグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、これはアミド結合を介してポリマーに結合している。ついで、この反応性基は例えばタンパク質のα及びεアミンと反応して共有結合を形成する。簡便には、ＰＥＧ分子の他端はメトキシ基のような非反応性基で「ブロック」されて、タンパク質分子のＰＥＧ架橋複合体の形成を低減させることができる。
好適な活性化ＰＥＧは多くの一般的な反応によって生成させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ-ＮＨＳ-ＰＥＧ）は、Buckmann及びMerr, Makromol. Chem., 182:1379-1384 (1981)の方法に従って、ＰＥＧ-モノメチルエーテル（ユニオンカーバイド社から市販されている）から、Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応によって調製することができる。また、ＰＥＧ末端ヒドロキシ基は、例えば臭化チオニルと反応させてＰＥＧ-Ｂｒを生成した後、過剰のアンモニアでアミノ分解してＰＥＧ-ＮＨ２を形成することによって、アミノ基に転換できる。ついで、ＰＥＧ-ＮＨ２は標準的なカップリング試薬、例えばウッドワード試薬Ｋを使用して対象のタンパク質に抱合される。更に、ＰＥＧ末端-ＣＨ２ＯＨ基は、例えばＭｎＯ２での酸化によってアルデヒド基に転換できる。アルデヒド基は水素化シアノホウ素のような試薬を用いる還元性アルキル化によってタンパク質に抱合される。あるいは、本発明における使用に適した活性化ＰＥＧは多数の製造元から購入することができる。例えば、Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.)は、メトキシ-ＰＥＧのスクシンイミジル炭酸塩及びメトキシ-ＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸塩に加えて、分子量２０００のメトキシ-ＰＥＧ-マレイミドを販売している。
【００６７】
本発明のＡｐｏ-２Ｌ変異体のペグ化の度合いを調節して、対応する非ペグ化Ａｐｏ-２Ｌ変異体と比較してインビボ半減期（以下、「半減期」）を望ましく増加させることができる。ペグ化Ａｐｏ-２Ｌ変異体の半減期は典型的にはペグ化の度合いが増加するのに応じて徐々に増加する。タンパク質のペグ化の度合いと部位は、例えば（１）ペグ化部位の数と反応性（例えば第一級アミン）及び（２）ペグ化反応条件によって、決まる。タンパク質におけるペグ化部位のいくつかは相対的に非反応性である可能性が高いので、標準的なペグ化反応では典型的には完全なペグ化にはならない。
標準的な突然変異誘発法を用いてタンパク質中の潜在的なペグ化部位の数を変えることができる。よって、アミノ酸置換がシステインやリジンのようなアミノ酸を導入又は置換する程度まで、本発明のＡｐｏ-２Ｌ変異体は（図１に示された）天然配列Ａｐｏ-２Ｌよりもより多い又は少ない数の潜在的ペグ化部位を含むことができる。ペグ化の度合いと部位はまた反応条件、例えば活性化ＰＥＧ及びタンパク質の相対濃度並びにｐＨを調節することによって操作することができる。所望の度合いのＰＥＧ化に対する好適な条件は、標準的なペグ化反応のパラメータを変えることによって経験的に決定することができる。
Ｒ１７０ＣのようなＡｐｏ-２Ｌ変異体のペグ化は任意の簡便な方法によって実施される。例示的な実施態様では、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０のＣｙｓ１７０側鎖（つまり、図１のアミノ酸１１４−２８１を持ち、位置１７０の天然アルギニン残基がシステイン残基に置換された変異体Ａｐｏ-２Ｌ；このような分子はここではまた「Ｒ１７０Ｃ．０」と特定されうる）は、分子量２０００Ｄのメトキシ-ＰＥＧ-マレイミド（Shearwater Polymers）との反応によって共有結合的に修飾される。簡便には、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０は、最初に約３０分間、周囲温度で１０ｍＭのＤＴＴを用いて還元し、ついでＰＤ-１０ゲル濾過カラムに通して、平衡にし、ＨＩＣバッファー（０．４５ＭのＮａ２ＳＯ４、２５ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で溶出させて還元剤を除去することによって、修飾の準備がなされる。ついで、一定量のＰＥＧ-マレイミド溶液（ｄＨ２０中１０ＭＭ）を直ぐに添加する。完全な反応を確実なものにするために必要な時間と試薬濃度の条件は経験的に決定することができる。０．５から５倍の範囲のＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０単量体に対するＰＥＧ-マレイミドのモル濃度比と２又は２４時間の反応時間を使用することができる。反応は、あらゆる未ペグ化Ｃｙｓ１７０チオールがカルボキシアミドメチル化されるように、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０単量体濃度に対して１０倍のモルの過剰のヨードアセトアミドを添加することによって停止される。ヨードアセトアミドでの修飾は約３０分であり、その後、過剰な試薬は、平衡化されＰＢＳで溶出されるＮＡＰ-５カラム（Pharmacia）でのゲル濾過によって除去される。
【００６８】
ペグ化タンパク質はＳＤＳ-ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、ペプチドマッピング、液体クロマトグラフィー-質量分析法、及びインビトロ生物学的アッセイによって特徴付けすることができる。ペグ化の度合いは典型的にはＳＤＳ-ＰＡＧＥによって最初に示される。１０％のＳＤＳ中でのポリアクリルアミドゲル電気泳動は、典型的には溶出バッファーとして１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中で実施される。どの残基がペグ化されているかを証明するために、トリプシン及びＬｙｓ-Ｃプロテアーゼのようなプロテアーゼ類を使用するペプチドマッピングを実施することができる。しかして、ペグ化及び非ペグ化Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の試料を、Ｌｙｓ-Ｃプロテアーゼのようなプロテアーゼで消化させ、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣのような方法で分離することができる。生成されたペプチドのクロマトグラフィーパターンを、Ａｐｏ-２Ｌ．０ポリペプチドに対して過去に決定したペプチドマップと比較することができる。ついで、各ピークをピーク中のフラグメントのサイズを証明するために質量分析によって分析することができる。ＰＥＧ基を有するフラグメントは、通常、注入後にはＨＰＬＣカラムに保持されておらず、クロマトグラフから消失している。クロマトグラフからのそのような消失は、少なくとも一のペグ化可能なアミノ酸残基を含んでいるに違いない特定のフラグメントに対するペグ化を示している。ペグ化Ａｐｏ-２Ｌ変異体は、Ａｐｏ-２Ｌレセプターと相互作用し、及び／又は哺乳動物においてアポトーシスを誘導する能力について、及び／又は他の生物学的活性について、当該分野で知られている方法を使用して、更にアッセイすることができる。
【００６９】
また、このようなＡｐｏ-２リガンド変異体ポリペプチドを含有する製剤が、本発明により提供される。このような製剤は、治療的投与のみならず、特に貯蔵に適している（及びＡｐｏ-２Ｌ三量体の維持）。任意の製剤は、Ａｐｏ-２Ｌ変異体及び亜鉛又はコバルトを含む。より好ましくは、この製剤は金属がタンパク質に対して＜２Ｘモル比であるＡｐｏ-２Ｌ変異体及び亜鉛又はコバルト溶液を含む。水溶性懸濁液が所望されるならば、製剤中の二価金属イオンはタンパク質に対して＞２Ｘモル比であってもよい。当業者であれば、＞２Ｘモル比では、金属が製剤にとって有害になりうるか又は治療用製剤として望ましくない製剤中の二価金属イオン濃度の上限範囲がありうることが分かるであろう。
製剤は、既知の技術で調製することが可能である。例えば、Ａｐｏ-２Ｌ変異体製剤はゲル濾過カラム上でのバッファー交換によって調製することが可能である。
典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。製薬的に許容可能な担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。製剤のｐＨは、好ましくは約６〜約９、さらに好ましくは約７〜約７．５である。好ましくは、亜鉛がＡｐｏ-２Ｌへ結合したままであることを確かなものにするためにｐＨは選択される。ｐＨが高すぎる又は低すぎるならば、亜鉛はＡｐｏ-２Ｌへ結合したままではなく、結果としてＡｐｏ-２Ｌ変異体の二量体が形成される傾向となる。例えばＡｐｏ-２リガンド変異体及び二価金属イオンの濃度及び投与経路よっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。
【００７０】
Ａｐｏ-２Ｌ変異体の治療用製剤は、凍結乾燥製剤、水溶液又は水性分散液の形態で、任意的な製薬上許容可能な担体、賦形剤又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences, １６版, A. Osol, A.編 (1980)）と、適切な純度を有する所望のＡｐｏ-２Ｌ変異体分子を混合することにより調製される。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、トリス（Ｔｒｉｓ）、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００７１】
このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばグリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、及びセルロースベースの物質である。局所用の担体又はゲルベースの形態は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、及び徐放性製剤を含む。
Ａｐｏ-２リガンド変異体の製剤としての有効な用量は経験的に決定することができ、このような決定は当業者の技量の範囲に含まれる。今日では、Ａｐｏ-２リガンド変異体の有効用量又は量は、１日体重１ｋｇ当たり約１マイクログラム〜約１００ｍｇ又はそれ以上の範囲であると考えられている。用量の種内スケーリングは、この分野で周知の方法、例えばMordentiら, Pharmaceut. Res., 8 1351 (1991)に記載されているように実施することができる。当業者はＡｐｏ-２リガンド変異体の投与しなければならない用量が、例えばＡｐｏ-２リガンド変異体を受容する哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に施される他の薬又は治療に応じて変化することを理解するであろう。
【００７２】
インビボ投与に使用されるＡｐｏ-２Ｌ変異体は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。Ａｐｏ-２Ｌ変異体は通常は凍結乾燥形態又は全身投与される場合には溶液中に貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、Ａｐｏ-２Ｌ変異体は典型的には使用時の適当な希釈剤を含む他の成分と組み合わせて処方される。Ａｐｏ-２Ｌ変異体の液体製剤の例は、無菌の、透明な、無色の生鮮溶液で、皮下注射用の１回投与バイアルに充填されている。
治療的Ａｐｏ-２Ｌ変異体製剤は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。製剤は、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）の繰り返し注射として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される（肺内送達については、例えばＥＰ２５７９５６参照）。
また、Ａｐｏ-２Ｌ変異体は、徐放性調製物の形態で投与することが可能である。徐放性調製物の適切な例には、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、Langerら, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)に記載されたポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８１)、Ｌ-グルタミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidmanら, Biopolymers 22: 547-556 (1983)）、非分解性エチレン-酢酸ビニル（Langerら, 上掲）、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能な微小球)、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８）が含まれる。
ここに記載されたＡｐｏ-２Ｌ変異体及びその製剤は、種々の治療的及び非治療的応用へ用いられる。これら応用は、種々の癌（上記に提供されている）、免疫関連症状、及びウイルス性症状の治療の方法である。このような治療的及び非治療的応用は、例えば、国際公開９７／２５４２８、国際公開９７／０１６３３、国際公開０１／００８３２及び国際公開０１／２２９８７に記載されている。
【００７３】
ここに記載のＡｐｏ２Ｌ変異体は種々の病理状態、例えば免疫関連疾患又は癌を治療するのに有用である。ここに記載した様々な病理状態の哺乳動物における診断は、熟練した実務者によって行うことが可能である。例えば、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断と検出を可能にする診断技術は、当該分野で利用可能である。例えば、癌は、限定されるものではないが、触診（法）、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲ等々を含む技術を通して同定され得る。また、免疫関連疾患は容易に同定できる。全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体、及び引き続き起こる免疫媒介炎症の産生である。腎臓、肺、骨格筋系、皮膚と粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を包含する複数の臓器と系が、臨床的に影響を受ける。リウマチ様関節炎(ＲＡ)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成を伴い、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間／体液でもである。影響を受けている組織は、多くの場合対称的パターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾腫大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【００７４】
Ａｐｏ２Ｌ変異体は、周知の方法に従い、ボーラスとしての静脈内投与、又は一定期間にわたる連続的な注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、骨液内、くも膜腔内、経口、局所的、又は吸入の経路により投与できる。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプでの注入によって実施することもできる。
Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与の有効な用量とスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。単独又は複数の用量が使用されうる。単独に使用されるＡｐｏ２Ｌ変異体の効果的な用量又は量は一日当り約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重あるいはそれ以上までの範囲であると現在は考えられる。用量の種間スケーリングは、例えば、Mordentiら, Pharmaceut. Res., 8:1351(1991)に開示されているような当該分野で知られている方法で実施することができる。
Ａｐｏ２Ｌ変異体のインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４６５７７６０号、第５２０６３４４号、又は第５２２５２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。当業者であれば、投与されなければならないＡｐｏ２Ｌ変異体の用量が、例えば、Ａｐｏ２Ｌ変異体を受入れる哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与されている他の薬剤又は治療法に依存して変わりうることは理解できるであろう。
【００７５】
更なる治療法を本方法において使用することも考えられる。一又は複数の他の治療法には、これらに限定されるものではないが、当該技術分野において既知であり、前述のセクションＩにおいてさらに詳細に定義された、放射線療法、サイトカイン、成長阻害剤、化学治療剤、細胞障害剤、チロシンキナーゼ阻害因子、ラスファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子、血管形成阻害因子、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害因子の投与が含まれる。更に、治療法は、ＲｉｔｕｘａｎＴＭ又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭなどの腫瘍抗原を標的とする治療的抗体並びに抗ＶＥＧＦなどの抗血管形成抗体、又はＤＲ５又はＤＲ４のようなＡｐｏ２Ｌレセプターを標的とする抗体に基づく。
化学治療剤に対する調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務家により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service, M.C.Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。また、化学療法剤は、Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与に先行し、又はその後に行い、又はそれらと共に与えられてもよい。
また、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)、又は他のＴＮＦＲファミリーメンバー（例えばＤＲ４、ＤＲ５、ＯＰＧ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２）に結合する抗体などの他の抗原に対する抗体を投与することも好ましい。他の方法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、ここにおけるＡｐｏ２Ｌ変異体は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて当該発明のＡｐｏ２Ｌ変異体を投与する。
【００７６】
Ａｐｏ２Ｌ変異体（及び一又は複数の他の治療剤）は同時的又は経時的に投与される。Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与の後、インビトロにおいて処理された細胞を分析することができる。インビボでの治療がなされた場合、治療された哺乳動物は熟練した実務家にとって周知の様々な方法によりモニターすることができる。例えば、壊死をアッセイするために腫瘍細胞を病理検査することができ、又は血清の免疫系応答を分析することができる。
ここに記載した疾患の診断又は治療に有用なＡｐｏ-２Ｌ変異体を含むキットのような製造品は、少なくとも容器及びラベルを具備する。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、状態の診断又は治療に有効なＡｐｏ-２Ｌ変異体製剤を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。容器上又は添付されるラベルには、製剤が選択した状態の診断又は治療に使用されることが示されている。この製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液を収容した第２の容器をさらに具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を備えた包装挿入物を含む、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料を具備してもよい。また、この製造品は、上述の他の活性剤を収容した第２又は第３の容器を具備してもよい。
【００７７】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【００７８】
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【００７９】
（実施例１）
Ａｐｏ-２Ｌの結晶学分析
Ａｐｏ-２Ｌ（アミノ酸残基１１４−２８１）の結晶は、２０℃で、５０％のｐｅｇ ２Ｋ ＭＭＥのウェル溶液を覆う、４０ｕＬタンパク質（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中の２．６ｍｇ／ｍＬ）、２０ｕＬ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、及び１０ｕＬ ８％ ｐｅｇ ２Ｋ ＭＭＥを含有する、７０ｕＬシッティングドロップ（sitting drop)の中で成長させ、非対称単位中に二つの単量体を有し、単位胞格子定数ａ＝７２．５、ｃ＝１４０オングストロームで室温では３．９オングストロームへ回折する空間群Ｐ６３のメンバーであった。Ｄ２１８Ａ変異体の結晶は、４℃で、３２％ ＭＰＤのウェル溶液を覆う４ｕＬの４％ＭＰＤ及び１０ｕＬタンパク質（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５の１．７ｍｇ／ｍｌ）を含有する１４ｕＬシッティングドロップ中で成長し、非対称単位当たり１単量体で、単位胞格子定数ａ＝６６．４、ｃ＝１９７．７オングストロームで、シンクロトロン放射光で−１８０℃では１．３オングストロームへ回折する空間群Ｒ３２のメンバーであった。データは、Ａｐｏ-２Ｌ（残基１１４−２８１）の結晶に対して回折を３．９オングストロームに設定し、Ｄ２１８Ａ変異体の１．９オングストロームは、ＭＡＲ検出器が装備されているRigaku回転陽極X線発生装置で測定され、ＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで処理された［Otwinowskiら, Proceeding of the CCP4 Study Weekend：Data Collection and Processing(eds. Sawyerら）pp56-62 Daresbury Laboratory, Daresbury, England, 1993］。Ｄ２１８Ａ変異体のための１．３オングストロームの設定データは、アルゴンヌ国立研究所のアドバンストフォトンソースにおいて測定、及びＨＫＬ２０００／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで加工されて、１００％の完成性と１２倍の冗長性、及びＩ／＜Ｉ＞＝１２．４を伴う６．４％のＲｓｙｍ（１．３５−１．３０シェルの中に３４％）を有した。
【００８０】
天然Ａｐｏ-２Ｌ構造は、プログラムＡｍｏｒｅ［Acta Cryst., D50:760-763(1994)］によるＴＮＦ−α（ｐｄｂコード１ＴＮＦ）を基礎とするモデルを利用した分子置換によって解明され［Brunger, X-PLOR:version 3.1, Yale Press, New Haven 1987］、３５％のＲｆｒｅｅまで 厳密な２倍の非結晶学的リストレイン（non-crystallographic restraints)によって精密化された。この構造は、２５％のＲｆｒｅｅ まで１．９オングストロームデータセットに対して、最後には、Ｒｅｆｍａｃ及びＳＨＥＬＸＬ ［Sheldrickら, Methods in Enzymology, pp.319-343, Academic Press, San Diego 1997］によってＲｆｒｅｅ＝２２％及び良好な幾何学（rmsd 結合０．０１１オングストローム、rsmd角度１．７°）を有する２０％Ｒｆａｃｔｏｒへ精密化された。すべての残基は、許容されるラマチャンドランプロットの領域の内側にある。精密化の間、電子密度の２８シグマピークは、三量体軸上のＣｙｓ２３０に関連する対称の間に観察された。この密度は、亜鉛イオンとしてモデル化され、Ｂ−因子の１０へ精密化された。三量体軸上の塩素分子は、亜鉛に対して四番目のリガンドとして存在する。最終モデルは、１７０の溶媒分子及び１亜鉛イオンそして１塩素イオンをともなう残基１２０−１３０、１４２−１９４、２０３−２８１から構成される。残基９１−１１９、１３１−１４１、及び１９５−２０２は秩序が乱れている。出発物質の質量分析が結晶が完全長であることを示す一方で、幾つかの結晶のＮ末端配列の決定は、Ｎ末端が原形態を保っていることを確かなものにした。
結晶学的データの要約は図２Ｃに提供されている。
【００８１】
（実施例２）
Ａｐｏ２Ｌシステイン置換変異体の設計と生産
システイン置換の部位はＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体のＸ線構造（図３）の検査を元にして選択した。突然変異の際の活性の喪失又は導入されたシステイン残基の引き続いての修飾を避けるために、レセプター接触領域の外側の部位のみを突然変異誘発のために考慮した。システイン側鎖の効率的な化学修飾を確実にするために、結晶構造において高い溶媒接近性を示した残基のみを選択した。これらの基準に合致する残基には、限定されるものではないが、Ｖａｌ１１４、Ａｒｇ１１５、Ｇｌｕ１１６、Ａｓｎ１３４、Ａｓｎ１４０、Ｇｌｕ１４４、Ａｓｎ１５２、Ｓｅｒ１５３、Ａｒｇ１７０、Ａｓｐ２３４、Ｇｌｕ２４９、Ａｒｇ２５５、Ｇｌｕ２６３及びＨｉｓ２６４が含まれる。図３に示されるように、この残基群はＡｐｏ２Ｌ単量体の一面を頂部から底部までをスパンしている。
Ａｐｏ-２Ｌのシステイン置換変異体は、プラスミドｐＡＰＯＫ５．０の一本鎖型でのオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Kunkelら, Proc. Natl. Acad. Sci., 82:488-492 (1985)；Kunkelら, Methods in Enzymology, 154: 367-382 (1987)）によって構築した。このプラスミドは、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターにより推進されるＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸型の細胞内大腸菌発現のために設計した。ｐＡＰＯＫ５．０はＡｐｏ-２Ｌの残基９１−１１３（図１）をコードしているＤＮＡセグメントの欠失突然変異誘発によってｐＡＰＯＫ５（１９９９年７月２２日公開の国際公開９９／３６５３５）から構築した。ｐＡＰＯＫ５は、ｔｒｐプロモーターを持つプラスミドｐＳ１１６２へＡｐｏ-２ＬｃＤＮＡ（図１の残基９１−２８１をコードする）をクローニングするためのＰＣＲを利用して構築した。突然変異誘発後に、プラスミドの同一性をプラスミドのＡｐｏ２Ｌの全体部分のジデオキシヌクレオチド配列決定（Sanger）によって確認した。
ついで、システイン置換タンパク質をコードするプラスミドを、発現のための大腸菌株２９４に形質転換した。培養物をＬｕｒｉａブロス＋５０μｇ／ｍＬカルベニシリン中で３７℃にて飽和するまで一晩成長させた。続いて、飽和した培養物を５０倍希釈してＮａ２ＨＰＯ４（６ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／Ｌ）、グルコース（４．９ｇ／Ｌ）、カザミノ酸（４．９ｇ／Ｌ）、２７ｍＭのＭｇＳＯ４、０．００３％チアミンＨＣｌ及び適量の蒸留水＋カルベニシリン４０μｇ／ｍＬからなる滅菌濾過培地中に蒔いた。Ａ５００が０．５−０．８になるまで培養物を３７℃にて成長させた後、２５μｇ／ｍＬの最終濃度になるまで３-α-インドールアクリル酸（ＩＡＡ）（Sigma, St.Louis, MO）を添加して発現を誘導した。振盪しながら細胞を３０℃で一晩成長させ、遠心分離して収集し、以下に記載されたようなＡｐｏ２Ｌの引き続いての回収のために−２０℃で凍結保存した。
【００８２】
モデルＭ１１０-Ｆマイクロフルイダイザー（Microfluidics Corporation, Newton, MA）を使用して、凍結した大腸菌細胞ペレットから、１０容量（ｗｔ／ｖｏｌ）の１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０／２００ｍＭのＮａＣｌ／５ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＤＴＴ中での均質化によってＡｐｏ-２Ｌタンパク質を抽出した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の最終濃度までホモジネートに添加して、これをついで遠心分離して細胞片を除去した。固形の硫酸アンモニウムを撹拌しながら周囲温度にて４５％の飽和度の最終濃度になるまで抽出上清に加え、遠心分離によってペレットを回収した。硫酸アンモニウムペレットを５０％の硫酸アンモニウム溶液で洗浄して残留ＥＤＴＡを除去した後、５０容積（ｗｔ／ｖｏｌ）の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５／０．１％トリトンＸ-１００中に再懸濁させた。得られた溶液を遠心分離によって透明にし、５ｍＬのＨｉＴｒａｐキレーティングセファロースカラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）を使用して固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。カラムに、１００ｍＭのＮｉＳＯ４／３００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５中のニッケルを充填し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化した。充填後、カラムを、ＰＢＳ中３５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、ＰＢＳ中５０ｍＭのイミダゾール／３５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。ＩＭＡＣ溶出液を２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５に対して透析し、遠心分離によって透明にし、更に、平衡化し２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５で洗浄した５ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＳＰセファロースカラム（Pharmacia）を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ＨｉＴｒａｐ ＳＰカラムを２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５／０．５ＭのＮａＣｌで溶出させた。ＳＰカラム溶出液を２ｍＭのＤＴＴで還元し、続いて周囲温度で４５％の飽和度の最終濃度になるまで撹拌しながら固形の硫酸アンモニウムを加えることによって沈殿させた。硫酸アンモニウムペレットを３．５ｍＬの２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５／１００ｍＭのＮａＣｌ中に再懸濁させ、ＰＤ１０カラム（Pharmacia）を使用するゲル濾過クロマトグラフィーによって２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５／１００ｍＭのＮａＣｌ／２ｍＭのＤＴＴの最終バッファー中に交換した。精製したＡｐｏ-２Ｌシステイン置換タンパク質を、クーマシー染色ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び質量分析によって特徴付けし、−２０℃で凍結して保存した。
【００８３】
（実施例３）
インビトロでのＡｐｏ２Ｌ変異体のアポトーシス活性
蛍光色素の代謝転換から細胞生存度を測定するバイオアッセイを、Ａｐｏ２Ｌ変異体のアポトーシス活性を測定するために用いた。Ａｐｏ-２Ｌ．０、Ａｐｏ２Ｌ．２、又はＡｐｏ２Ｌ変異体の２倍段階希釈物を、０．１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ-１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で作製し、５０μｌの各希釈物を、９６ウェルのファルコン培養マイクロプレートの個々のウェルへ移した。５０μｌのＳＫ-ＭＥＳ-１ヒト肺癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ５８）（ＲＭＰＩ-１６４０、０．１％ＢＳＡ中）を、２ｘ１０４細胞／ウェルの密度にて添加した。これらの混合物を、３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。２０時間目に、２５μＬのアラマーブルー（AccuMed, Inc., Westlake, Ohio）を添加した。細胞数を、５３０ｎｍの励起時に５９０ｎｍで相対蛍光を測定することで決定した。これらのデータを、細胞生存度の５０％減少を示すＡｐｏ２Ｌ．０の濃度であるＥＤ５０を計算するために、４パラメーターフィットを使用して分析した。
試験したシステイン置換Ａｐｏ２Ｌ変異体のうち、Ｅ１１６ＣはＳＫ-ＭＥＳ細胞に対するアポトーシス活性に有意な（＞２倍）減少を示した（表Ｉ）。Ｒ１７０Ｃ変異体は約１０倍増加した能力を有していた。Ｒ１７０Ｃ変異体の活性の増加はバイオアッセイ培地でのインキュベーション中のＣｙｓ１７０の酸化に関連していると思われる。このアッセイにおいて、タンパク質はアッセイ培地で希釈され、貯蔵バッファー中に含まれる還元剤（２ｍＭのＤＴＴ）が同時に希釈される。還元剤の濃度の減少により、ジスルフィド結合が形成されることになる。Ｎ-エチルマレイミド（ＮＥＭ）（表Ｉ）又はヨードアセトアミド（図４）でのＣｙｓ１７０の先のアルキル化が活性の増加を阻止した。また、Ａｒｇ１７０がＡｌａ、Ｌｙｓ又はＳｅｒ残基の何れかで置き換えられたＡｐｏ２Ｌ変異体はＡｐｏ-２Ｌ．０ポリペプチドに一層匹敵する活性を有していた。
【００８４】
【表１】
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「ＮＤ」＝定量されず；タンパク質の９１−２８１型からつくられた変異体Ｓ９６Ｃ．２、Ｓ１０１Ｃ．２、及びＳ１１１Ｃ．２（「Ａｐｏ２Ｌ．２」）を除いてＡｐｏ-２リガンド変異体の全てがタンパク質の１１４−２８１型（Ａｐｏ２Ｌ．０）としてつくられた。
【００８５】
Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ-２Ｌ．０三量体間のジスルフィド結合形成の可能性を、空気酸化の速度を測定することによって更に調べた。２ｍＭのＤＴＴの存在下で保存したＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ-２Ｌ．０の１．４ｍｇ／ｍＬ溶液の一部を、ＤＴＴを除去するためにＨＩＣバッファー（０．４５ＭのＮａ２ＳＯ４、２５ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化したＰＤ-１０カラムに通した。この溶液（３．５ｍＬの１．１ｍｇ／ｍＬ Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ-２Ｌ．０）を穏やかに撹拌しながら１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中で周囲温度にてインキュベートした。一定量を様々な時点で除去し、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ-２Ｌ．０に残る全ての溶媒接近可能なチオール類を１０倍のモル過剰のヨードアセトアミドでアルキル化した。最初の時点は３分であるが、これはＰＤ-１０カラムからタンパク質を溶出させるのに必要な時間量であるためである。これらの試料を、上述のようにしてＳＫ-ＭＥＳ細胞での生物活性について特徴付けを行い、また多角度光散乱検出（ＳＥＣ-ＭＡＬＳ）を備えたサイズ排除クロマトグラフィーによって分子量について特徴付けを行った。クロマトグラフィーを、平衡化されＰＢＳで溶出させられ、光散乱検出器とＵＶ検出器の双方を備えたＦＰＬＣシステムで操作されるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（１．６ｘ３０ｃｍ）（Wyatt Technology, Inc.）を使用して実施した。
【００８６】
図５に示されるように、３分だけの空気酸化では、大部分がＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ-２Ｌ．０は７００００Ｄの算定分子量を持つ三量体形態で見出される。２時間では、有意な量のより高分子量の形態が見出される。２時間での三つのピークは７００００、１４００００及び６０００００Ｄの算定分子量を有している。空気酸化２４時間の時点では、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ-２Ｌ．０の殆どが６０００００Ｄ分子量の種として見出される。更なる２４時間のインキュベーションでも６０００００Ｄを越える種は生産されない。ＳＤＳ-ＰＡＧＥの際に、より大きい分子量の形態がジスルフィド結合二量体として移動する。これらの結果は、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ-２Ｌ．０タンパク質が、ジスルフィド結合を介して三量体が互いに結合したオリゴマー種を形成することを示唆している。１４００００Ｄ形態は互いに結合した２つの三量体に対応する一方、６０００００Ｄ形態は共有結合した８−１０の三量体を有している。ＳＤＳでの変性の際に、これらのオリゴマーはジスルフィド結合二量体に分解する。２４時間の空気酸化後に、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ-２Ｌ．０は、アポトーシスバイオアッセイにおいてＳＫ-ＭＥＳ細胞に対してほぼ２０倍のＥＤ５０の減少を生じさせた。生物活性の増加の時間的経過はオリゴマー形態の蓄積と同時進行する（図６）。Ｃｙｓ１７０ジスルフィド結合を通してのオリゴマー生成はまたＤＲ５レセプターに対する親和性を増大させる結果となる。
これらの結果は、レセプター結合を排除しない形でのＡｐｏ２Ｌのオリゴマー形成により腫瘍細胞に対して更に強力なデスシグナルを生じる分子が得られることを示唆している。
【００８７】
（実施例４）
Ｃｙｓ残基でのＡｐｏ-２Ｌのペグ化
システイン置換Ａｐｏ２Ｌタンパク質を、メトキシ-ＰＥＧ-マレイミド、分子量２０００Ｄ（Shearwater Polymers）との反応により共有結合的に修飾した。ＰＤ-１０ゲル濾過カラムを通過させて保存バッファー中に含まれるＤＴＴを最初に除去して、Ａｐｏ２Ｌ変異体の修飾の準備をした。カラムを平衡化し、ＨＩＣバッファー（０．４５ＭのＮａ２ＳＯ４、２５ｍＭトリス-ＨＣｌ ｐＨ  ７．５）又はアルギニン製剤バッファー（０．５Ｍのコハク酸アルギニン、２０ｍＭトリス-ＨＣｌ ｐＨ  ７．５）で溶出させた。一定量のＰＥＧ-マレイミド溶液（１０ｍＭのｄＨ２Ｏ溶液）を直ぐに添加した。最初の実験では、完全な反応を行わしめるのに必要な反応時間と試薬濃度を決定するためにＲ１７０Ｃ変異体を使用した。１：１、２：１、５：１又は１０：１のＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０単量体に対するＰＥＧ-マレイミドのモル濃度比及び２から２４時間の反応時間を使用した。反応を、２ｍＭになるまでＤＴＴを添加することにより終結させ、周囲温度で３０分インキュベーションした後、ヨードアセトアミドを１０ｍＭになるまで添加した。この反応停止手順によって、反応中に生じたあらゆるジスルフィド結合を減少させ、あらゆる未ペグ化Ｃｙｓ１７０チオールをカルボキシアミドメチル化させた。ヨードアセトアミドでの修飾は３０分間で、その後、過剰な試薬を、平衡化されＰＢＳで溶出されるＮＡＰ-５カラム（Pharmacia）でのゲル濾過によって除去した。これらの試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びＳＥＣ-ＭＡＬＳによって分析した。またＳＫ-ＭＥＳ細胞に対するアポトーシス誘導活性を上述のようにしてアッセイした。図８に示されるように、ＰＥＧ-２Ｋ-マレイミドでのＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の処理によって単量体分子量のおよそ２０００ダルトンのシフトがあることがＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分かる。２：１又はそれ以上のＰＥＧ：タンパク質の比を用いる反応によって同様の程度の修飾が得られた。これらの反応について、残留した未修飾単量体を観察した。クーマシーブルー染色ゲルの視覚検査によって、未修飾単量体が全タンパク質の＜１０％であることが示唆される。２：１未満のＰＥＧ：タンパク質モル比では、得られた修飾は少なかった。２４時間の反応時間では生成物の明らかな変化は観察されなかったので、反応は２時間以内に完了するように思われる。
【００８８】
ＰＥＧ化Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の水力学的性質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに使用したランニングバッファーを０．４Ｍの硫酸アンモニウム、１５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５にした以外は上述のようにしてＳＥＣ-ＭＡＬＳによって評価した。この高イオン強度のバッファーを使用すると、カラム材料とのＡｐｏ２Ｌの相互作用が低減される。ヨードアセトアミドでブロックされたＣｙｓ１７０を有するＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０は、６００００ｇ／ｍｏｌとして光散乱法から算定されたモル質量で、１０．６５ｍＬを中心とする単一の対称ピークとして溶出された。２：１のＰＥＧ比と２時間の反応時間を使用して調製されたＰＥＧ-２Ｋ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０はまた単一の対称ピークとして溶出されたが、溶出容積は９．２５ｍＬ、算定モル質量は６９０００ｇ／ｍｏｌであった。ＳＤＳ-ＰＡＧＥからの結果と併せると、これらのデータは、この試料が三量体当たり３つの共有結合ＰＥＧ鎖を有しており、単量体当たり１ＰＥＧ鎖を伴っていることが示唆される。ＰＥＧ-２Ｋ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の算定分子量（６９０００Ｄ）は測定の標準誤差（±１０％）の範囲で予想質量（６６０００Ｄ）に一致する。三量体当たり３つの共有結合ＰＥＧ鎖を有しており、単量体当たり１ＰＥＧ鎖を伴っているＡｐｏ-２Ｌのこの三量体形態は、有意な生物活性性状と腎臓濾過カットオフより大なるＭＷａｐｐを含む多くの共存する最適な特性を示すことによって本発明の好適な実施態様を表す複合体を生じる。ＩＡＭ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０に対して５００００Ｄ、ＰＥＧ-２Ｋ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０に対して１０００００Ｄの見かけ分子量は相対溶出容積に基づいて計算された。既知の分子量の一連のタンパク質を使用して、見かけ分子量に溶出容積を関係づける校正曲線を構築した。ＩＡＭ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０とまた未修飾のＡｐｏ２Ｌ．０は予想よりも些か少ない分子量を示したが、三量体の緻密な形状と一致していた。ＰＥＧ-２Ｋ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０に対して算定されたより大なる分子量は親水性で延長されたＰＥＧ鎖から生じ、修飾されたタンパク質の水力学的半径を大きく増大させる。
【００８９】
上記の結果に基づいて、他のシステイン置換変異体での最初のＰＥＧ化実験では２：１のＰＥＧ対単量体モル比と２時間の反応時間を用いた。これらの反応条件は通常３つの結合ＰＥＧ鎖を有する三量体を生じた。しかし、Ｖ１１４Ｃ及びＲ１１５Ｃ変異体は、実験では反応性に乏しく、より完全な反応を達成するにはより高いＰＥＧ比とより長い反応時間を必要とした。Ｒ２５５Ｃ変異体はより高いＰＥＧ比とより長い反応時間でも修飾できなかった。修飾実験はＥ１１６Ｃ変異体では実施されなかった。
システイン置換タンパク質の多くは、上述のようにＰＥＧ化されたときに減少した生物活性（表Ｉ）を示した。生物活性の減少はＰＥＧ-Ｖ１１４Ｃの２．１倍からＰＥＧ-Ｎ１３４Ｃの１３４倍まで変動した。Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０はＰＥＧ化の際に比較的高いレベルの活性を保持し、低ＰＥＧ：タンパク質比で修飾が急速に完了まで進んだので、この変異体を更なる研究のために選択した。
より多量のＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の生産のために、ＰＥＧ：Ａｐｏ２Ｌ単量体の２：１のモル比及び２４時間の反応時間を使用した。７０ｍｇのＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０をゲル濾過した後、周囲温度で２４時間の間、ＰＥＧ-マレイミドと反応させた。１０倍のモル過剰のヨードアセトアミドで反応を停止させた後、タンパク質を、製剤バッファー（コハク酸アルギニン）で平衡化したセファデックスＧ-２５のカラムでのゲル濾過クロマトグラフィーによって遊離のＰＥＧから分離した。この調製物はロット番号３２１７６-８７Ｃであった。精製したＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）はＡｐｏ２Ｌ．０に対して測定したものと等価なＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、及びＯＰＧに対する結合親和性を示した（表ＩＩ）。
【表２】
2010220623.tif 000003
【００９０】
ついで、ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）を質量分析及びペプチドマッピングによって分析した。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ（図１０）は、少量の未修飾単量体（分子量＝１９４４０）の存在と単一の結合ＰＥＧを持つタンパク質に対応する主要ピークを示している。ＰＥＧ分子はポリマー単位エチレングリコール（分子量＝４４）の増分だけ分子量が異なる質量不均一性を有することがよく知られている。その結果、約２１６８０を中心とする広い質量範囲が、単一のＰＥＧが結合したタンパク質に対して観察された。ペグ化及び非ペグ化Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０間の平均質量差は、ＰＥＧの平均質量が２２００Ｄであることを示している。
ＰＥＧ結合部位はペプチドマッピングによって確認された。ペグ化及び非ペグ化Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の試料をＬｙｓ-Ｃプロテアーゼで消化し、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離した（図１１）。生成されたペプチドのパターンを、Ａｐｏ２Ｌ．０に対して過去に決定されたマップと比較した。Ｌｙｓ１５０及びＬｙｓ１７９後の切断により生成されたＬ４と標識されたペプチドはＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の消化にＣｙｓ１７０残基を含んでいる。このピークは消失し、ペグ化タンパク質において、広い、後で溶出するピーク（Ｌ４＊）によって置き換わる。このフラクションのＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトルは、予想されたペプチド質量より大きい１．９−２．６ｋＤａの分布を持つ４４Ｄａによって分離された一連のピークを示している。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦでのインソースフラグメンテーションによる更なる分析では、Ｌ４＊を、Ｃｙｓ１７０がＰＥＧで修飾された１５１−１７９ペプチドと確認した。これらの結果と対照的に、Ｌ１０ペプチド（２２５−２３３）は未修飾及びペグ化Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の双方において同様のピーク面積を示す。これは、埋もれており亜鉛イオンのキレート化に関与する天然Ｃｙｓ２３０残基がＰＥＧ-マレイミドによって修飾されないことを示している。Ｌｙｓ残基の側鎖のような他の官能基の有意な修飾は観察されなかった。無傷のタンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトルと併せると、これらのデータは、各単量体がＣｙｓ１７０に結合した一つのＰＥＧを有していることを示唆している。よって、天然の条件下では、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０三量体は３つの結合したＰＥＧ分子を有している。
【００９１】
（実施例５）
ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の薬物動態学
Ａｐｏ２Ｌのクリアランスに対するＰＥＧ化の効果をマウスで試験した。時間ゼロにおいてマウスの尾部にＡｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈注射した。血漿試料を１、２０、４０、６０、及び８０分に収集した。Ａｐｏ２Ｌ濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。
図１２に示されるように、Ａｐｏ２Ｌ．０は循環から迅速に排除されるのに対して、ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）はよりゆっくりと排除された。注射後６０分で、Ａｐｏ２Ｌ．０の血漿濃度は１分での濃度の１％未満であった。これに対して、ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）の血漿濃度はこの時間では５０％減少しただけである。よって、Ａｐｏ２Ｌに対するＰＥＧ-２０００の部位特異的付着によりクリアランス速度が有意に減少した。
【００９２】
（実施例６）
マウス異種移植モデルにおけるヒトＣＯＬＯ２０５腫瘍の成長に対するＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）の効果
胸腺欠損ヌードマウス（Jackson Laboratories）に５ｘ１０６のＣＯＬＯ２０５ヒト大腸癌細胞（ＮＣＩ）を皮下注射した。腫瘍を生じさせ、ノギスでの測定で約１５０ｍｍ３の体積になるまで成長させた。マウス（１グループ当たり８匹）にビヒクル（２ｘ／週）、Ａｐｏ２Ｌ．０（６０ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）、Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）、又はＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）（１０ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）を静脈内注射した。腫瘍体積を三日毎に測定し、二週間後に治療を停止した。図１３に示されるように、１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）での処置はＡｐｏ２Ｌ．０の等価な投薬量よりも腫瘍体積を大きく減少させた。１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）の抗腫瘍効果はＡｐｏ２Ｌ．０のより高い投薬量（６０ｍｇ／ｋｇ）で観察されたものと同様であった。Ｃｙｓ１７０でのＡｐｏ２ＬのＰＥＧ化はこのヒト癌異種移植モデルにおいて効果を達成するのに必要とされる投薬量を低減させる。
【００９３】
（実施例７）
部分的にＰＥＧ化され、ジスルフィド架橋されたＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の調製
上述したように、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の一晩の空気酸化により、ＳＫ-ＭＥＳ細胞に対するインビトロでの生物活性を有意に増大させた６０００００Ｄ分子量の種を生じる。しかし、予備的な結果は、この高分子量形態がマウスでは有意に増加した半減期を持っていないことを示している。また、酸化されたＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０はマウス異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を増大させず、ある種の正常な肝細胞に対して毒性であると思われる。ジスルフィド結合形態の生物活性の増加をＰＥＧ化Ａｐｏ２Ｌの遅いクリアランスと組み合わせるための努力において、ＰＥＧ化実験を、ＰＥＧ-マレイミド：Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０単量体の不足化学量論比を使用して実施した。これは同じ分子に対して架橋とＰＥＧ化の双方を可能にすることになる。
ＨＩＣバッファーで平衡化したセファデックスＧ-２５カラムでＤＴＴを除去することによりＰＥＧ化反応のためのＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（９５ｍｇ）を調製した。メトキシ-ＰＥＧ-マレイミド、分子量２０００Ｄ（Shearwater Polymers）を０．７５：１のＰＥＧ：Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０-単量体の最終比になるまで添加した。単量体濃度は５５μＭであった。この溶液を周囲温度で一晩インキュベートした後、ヨードアセトアミドを１００μＭになるまで添加することによって反応を停止した。過剰な試薬を除去し、コハク酸アルギニン製剤バッファーで平衡化したセファデックスＧ-２５カラムでの修飾タンパク質のゲル濾過によって、バッファーを交換した。この材料はＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）と命名され、増加したレセプター親和性（表ＩＩ）及びインビトロ生物活性（図１４）を示した。
【００９４】
ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）の水力学的特性を、カラムを平衡化しＰＢＳで溶出させた点以外はロット３２１７６-８７Ｃに対して上述したようなゲル濾過クロマトグラフィーによって調べた。ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）は３つの主要ピークでカラムから溶出している（図１５）。最初のピークは３１５０００Ｄの算定分子量を有し、注入された材料の３０％を占める。第二のピークは１９４０００Ｄの算定分子量を有し、全体の２３％を占める。第三のピークは１０８０００Ｄの算定分子量を有し、全質量の４６％を占める。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分析は、全ての３つのピークがＰＥＧ化単量体とジスルフィド結合二量体を含むことを示す。これらの成分の比は、ピーク３が主として完全にＰＥＧ化された三量体からなり、ピーク２はほとんど「六量体」−ジスルフィド結合で結合した２つの三量体−であるように思われ、ピーク１はジスルフィド結合を介して結合した「九量体」であることを示唆している。六量体形態の模式図を図１６に示す。ピーク１はアポトーシスアッセイにおいて最も高い活性を有しており、５０の相対強度を示す。ピーク２は１７の相対強度を示し、ピーク１は３の相対強度を有していた。
【００９５】
マウス中のＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）の薬物速度を、血漿試料を１０分、及び１、２、４、８及び２４時間で採取したこと以外にロット３２１７６-８７Ｃに対して上述したようにして定量した。ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）の血漿濃度を図１７にプロットする。２コンパートメントモデルに従ったこれらのデータの分析（表ＩＩＩ）は、ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）がＡｐｏ２Ｌ．０に対して４８倍の増加した半減期と１５倍の減少したクリアランス速度を有していることを示している。
【表３】
2010220623.tif 000004
【００９６】
ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）を次の変更点の下で上述したマウス異種移植モデルにおいて試験した：１）全ての注射を腹腔内で行った；２）ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）の注射を２週間の間、１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇで２ｘ／週、実施した；３）Ａｐｏ２Ｌ．０の注射を共に２週間の間、６０ｍｇ／ｋｇで５ｘ／週、又は１０ｍｇ／ｋｇで２ｘ／週、実施した。図１８に示されるように、ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）の３通り全ての投薬は各群の８匹全ての動物において完全な腫瘍後退を引き起こした。腫瘍体積はゼロまで低減され、治療停止後にそのレベルまで維持された。Ａｐｏ２Ｌ．０の双方の投薬によって腫瘍体積の減少を生じたが、全ての処置動物において完全な腫瘍後退は引き起こさなかった。ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０処置の３つの群では、投薬計画完了後に腫瘍を有していた動物はいなかった。より高い投薬量が腫瘍のより早い除去を生じるという用量応答があった。Ａｐｏ２Ｌ．０で処置した群はより少ない腫瘍消失％であり、腫瘍は６０ｍｇ／ｋｇ用量を与えた８／８の動物と１０ｍｇ／ｋｇ用量を受けた４／６で処置の中止時に再成長し始めた。ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）処置群では、腫瘍が再びあらわれるのにより長い時間がかかりゆっくりと成長した。１、３及び１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）処置群では、腫瘍はそれぞれ２／７、４／８及び３／８動物において再発した。これらのデータは、部分的にＰＥＧ化され架橋されたＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０が、未修飾のＡｐｏ２Ｌ．０で観察されるよりも低い投薬量で大なる抗腫瘍効果を有していることを示している。
カニクイザル由来の正常な肝細胞に対するＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０のロット番号３２１７６-７８及び３２１７６-８７Ｃの効果を図１９において比較した。ロット３２１７６-８７Ｃは肝細胞に対して細胞毒性をあまり示さなかったが、ロット３２１７６-７８は中間の高くない濃度である程度の毒性を示した。この濃度依存性は細胞表面上でのレセプターの高次のクラスター形成から生じる毒性と一致していると考えられる。
【００９７】
（実施例８）
ＰＥＧ化Ｋ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の調製
薬物動態学的及び効能実験をまたオリゴマー形成に対して減少した傾向を持つシステイン変異体を用いて実施した。（上記実施例に記載されたようにして調製された）Ｋ１７９Ｃ変異体がこれらの実験のために選択されたが、これは、その天然形態のこの変異体が野生型（天然）Ａｐｏ-２リガンド分子に匹敵する活性を有し、予備ペグ化実験がＣｙｓ１７９修飾の際に活性が２倍だけ消失することを示していたためである（表Ｉ参照）。この変異体はジスルフィド結合オリゴマーを直ぐには形成しないようであった（データ示さず）。Ｋ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（４０ｍｇ）を８ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、周囲温度で２時間、１０ｍＭのＤＴＴで還元した。還元剤を、コハク酸アルギニン製剤バッファーで平衡化したＰＤ-１０カラムでのゲル濾過によって除去した。タンパク質濃度を吸光度測定で定量した後、２Ｋ-メトキシＰＥＧ-マレイミドを５：１のＰＥＧ：Ａｐｏ２Ｌ単量体の最終モル濃度になるまで添加した。この混合物を周囲温度で一晩インキュベーションした後、ＤＴＴを５ｍＭになるまで添加することによって反応を停止させた。９０分後に、２０ｍＭの濃度までヨードアセトアミドを添加することによって還元剤をブロックした。アルキル化を６０分進行させた後、混合物を、ＰＤ-１０カラムでコハク酸アルギニン製剤バッファー中に交換した。
【００９８】
２Ｋ ＰＥＧ-Ｋ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の水力学的性質を、平衡化しＰＢＳで溶出させるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムでのＳＥＣ-ＭＡＬＳによって調べた。２Ｋ ＰＥＧ-Ｋ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０は８５０００の算定分子量を持つ溶出容積（１１．８ｍＬ）の単一ピークとして溶出した（図２３）。より早い溶出ピークは検出されず、この調製物にジスルフィド結合オリゴマーがないことを示唆している。ＰＥＧ化は、Ｋ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０のヨードアセトアミド修飾形態が１３．４ｍＬで溶出し、７００００の算定分子量を有するので、増加した見かけ分子量を生じた。
ＳＫ-ＭＥＳ細胞に対するアポトーシス誘導活性を、上記の実施例に記載されているようにして、２Ｋ ＰＥＧ-Ｋ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０について測定した。ＰＥＧ化タンパク質は非常に活性であり、未修飾Ａｐｏ２Ｌ．０に対して生物活性が９倍減少しただけであった（図２４）。
ヒトＣＯＬＯ２０５腫瘍の成長に対する２Ｋ ＰＥＧ-Ｋ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の効果を、上述のマウス異種移植モデル（実施例６）を使用して定量した。マウス（一群当たり８）にビヒクル（５ｘ／週）、Ａｐｏ２Ｌ．０（６０ｍｇ／ｋｇ、５ｘ／週）、又はＰＥＧ-Ｋ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（６０ｍｇ／ｋｇ、１ｘ／週）の腹腔内注射を与えた。血漿試料を最初の注射の１分及び２４時間後に採取した。これらの試料中のＡｐｏ２Ｌの濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。図２５に示されるように、Ａｐｏ２Ｌ．０と比較してＰＥＧ化タンパク質の場合に２４時間後に更に高いフラクションの注射投薬量が血漿中に保持されていた。マウス中の腫瘍体積を三日毎に測定し、二週間後に治療を停止した。図２６に示されるように、ＰＥＧ-Ｋ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の１ｘ／週の投薬は、Ａｐｏ２Ｌ．０での５ｘ／週の治療より平均腫瘍体積を大きく減少させた。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ヒトＡｐｏ-２リガンドｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２）とその誘導アミノ酸配列（配列番号：１）を示す。ヌクレオチド位置４４７の「Ｎ」は、「Ｔ」又は「Ｇ」でありうるヌクレオチド塩基を示すために使用される。
【図２Ａ】図２Ａ−２ＣはＡｐｏ-２Ｌの結晶構造に関する。図２Ａは、３回転軸に沿った三量体の概略を示す。各単量体は同一である。秩序だったタンパク質構造は残基１２０から始まり、残基１３１−１４１は秩序だっておらず、残基１９５−２０１も同じである（破線で印が付けられている）。溶媒リガンドと三つの対称性に関連したシステインを含む亜鉛結合部位は空間充填図として示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、亜鉛結合部位の斜視立体密集図を提供する；Ｓγ−亜鉛−Ｓγ間の角度は１１２℃で、Ｓγ−亜鉛−溶媒角度は１０７℃で２．３オングストロームの亜鉛−硫黄及び２．３オングストロームの亜鉛−溶媒結合距離を有する。図２は、プログラムＭｏｌｓｃｒｉｐｔ［Kraulisら, J. Appl. Cryst., 24:946-950(1991)］及びＲａｓｔｅｒ３Ｄ［Merritら, Acta Cryst., D50:869-873(1994)］を用いて作成された。
【図２Ｃ】図２Ｃは結晶データの要約を提供する。
【図３】ＤＲ５・Ａｐｏ２Ｌ複合体のＸ線構造を示す。
【図４】ＳＫ-ＭＥＳ肺癌細胞に対するＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０のアポトーシス誘導活性を示す。Ｒ１７０Ｃ変異体の活性の増加はバイオアッセイ培地でのインキュベーション中のＣｙｓ１７０の酸化に関連しているように思われる。Ｎ-エチルマレイミド（ＮＥＭ）又はヨードアセトアミドでのＣｙｓ１７０の予めのアルキル化が活性の増加を阻止した。
【図５】オンライン光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を備えたクロマトグラフィー系を使用しての（Wyatt Technology, Inc.）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Amersham Biotech）でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０オリゴマーの分析を示す。実線はＵＶのトレースを示し、符号は光散乱データから計算したモル質量を示す。３分だけの空気酸化では、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ-２Ｌ．０は大部分が７００００Ｄの算定分子量を持つ三量体形態で見出される（溶出容積＝１１ｍＬｓ）。２時間では、有意な量のより高分子量の形態が見出される。２時間での三つのピークは７００００Ｄ、１４００００Ｄ（９．５ｍＬの溶出容積）及び６０００００Ｄ（６ｍＬの溶出容積）の算定分子量を有している。２４時間後には、６０００００Ｄの分子量の種のみが見出される。
【図６】Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０に対するオリゴマー形成の反応速度と生物活性の増加を示す。生物活性の増加の時間過程はオリゴマー形態の蓄積と同時に進行している。
【図７】カニクイザル肝細胞に対する酸化Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の効果を示す。
【図８】ＰＥＧ化反応のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す。レーン（左から右）１、２−Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０、３−ＰＥＧ-マレイミド無添加、４−ＮＥＭ修飾Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０、５−１：１ ＰＥＧ：Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０、６−２：１ ＰＥＧ：Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０、７−５：１ ＰＥＧ：Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０、８−１０：１ ＰＥＧ：Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０、９−分子量標準物、１０−空気酸化Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０。ＰＥＧ-マレイミドでのＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の処理によって単量体分子量のおよそ２０００ダルトンのシフトがあることがＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分かる。２：１又はそれ以上のＰＥＧ：タンパク質の比を用いる反応によって同様の程度の修飾が得られた。これらの反応について、残留した未修飾単量体を観察した。クーマシーブルー染色ゲルの視覚検査によって、未修飾単量体が全タンパク質の＜１０％であることが示唆される。２：１未満のＰＥＧ：タンパク質モル比では、得られた修飾は少なかった。２４時間の反応時間では生成物の明らかな変化は観察されなかったので、反応は２時間以内に完了するように思われる。
【図９】ＳＥＣ-ＭＡＬＳによるＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）の分析を示す。１１．３ｍＬのピーク溶出容積を持つカルボキシアミドメチル-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の曲線を比較のために示す。ＰＥＧ化により溶出容積の減少と見かけ分子量の増大が引き起こされる。
【図１０】質量分析によるＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の分析を示す。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳは、少量の未修飾単量体（分子量＝１９４４０Ｄ）の存在と単一結合ＰＥＧを有するタンパク質に対応する主要ピークを示している。ＰＥＧ分子はポリマー単位エチレングリコール（分子量＝４４）の増分だけ分子量が異なる質量不均一性を有することがよく知られている。その結果、約２１６６０Ｄを中心とする広い質量範囲が、単一のＰＥＧが結合したタンパク質に対して観察された。ペグ化及び非ペグ化Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０間の平均質量差は、ＰＥＧの平均質量が２２００Ｄであることを示している。
【図１１Ａ】ＰＥＧ結合部位を確認するために使用したペプチドマッピングを示す。ペグ化及び非ペグ化Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の試料をＬｙｓ-Ｃプロテアーゼで消化し、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離した。生成されたペプチドのパターンを、Ａｐｏ２Ｌ．０に対して過去に決定されたマップと比較した。Ｌｙｓ１５０及びＬｙｓ１７９後の切断により生成されたＬ４と標識されたペプチドはＲ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の消化にＣｙｓ１７０残基を含んでいる。このピークは消失し、ペグ化タンパク質において、広い、後で溶出するピーク（Ｌ４＊）によって置き換わる。
【図１１Ｂ】図１１Ａと同様の図である。
【図１１Ｃ】図１１Ａと同様の図である。
【図１２】マウス中のＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）の薬物速度を示している。時間ゼロにおいてマウスの尾部にＡｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈注射した。血漿試料を１、２０、４０、６０、及び８０分に収集した。Ａｐｏ２Ｌ濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。これらのデータは、ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）がＡｐｏ２Ｌ．０より長い半減期を有していることを示している。
【図１３】マウス異種移植モデルにおけるヒトＣＯＬＯ２０５腫瘍の成長い対するＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３１２７６-８７Ｃ）の効果を示す。胸腺欠損ヌードマウス（Jackson Laboratories）に５ｘ１０６のＣＯＬＯ２０５ヒト大腸癌細胞（ＮＣＩ）を皮下注射した。腫瘍を生じさせ、ノギスでの測定で約１５０ｍｍ３の体積になるまで成長させた。マウス（１グループ当たり８匹）にビヒクル（２ｘ／週）、Ａｐｏ２Ｌ．０（６０ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）、Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）、又はＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）（１０ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）を静脈内注射した。腫瘍体積を三日毎に測定し、二週間後に治療を停止した。１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）での処置によりＡｐｏ２Ｌ．０の等価用量よりも大なる腫瘍体積の減少が達成された。
【図１４】ＳＫ-ＭＥＳ肺癌細胞に対するＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）のアポトーシス誘導効果を示す。ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）の活性はＡｐｏ２Ｌ．０に対して３９倍増加している。
【図１５】ＳＥＣ-ＭＡＬＳによるＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）の分析を示す。ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）は３つの主要ピークでカラムから溶出する。最初のピークは３１５０００Ｄの算定分子量を有し、注射された材料の３０％を占める。第二のピークは１９４０００Ｄの算定分子量を有し、全体の２３％を占める。第三のピークは１０８０００Ｄの算定分子量を有し、全質量の４６％を占める。
【図１６】ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）の「六量体」の提案された構造の概略図である。２つのＡｐｏ２Ｌ三量体がＣｙｓ１７０を通してのジスルフィド結合にて示されており、三量体の残りのサブユニットはＣｙｓ１７０に結合したＰＥＧ鎖を有している。
【図１７】マウスにおけるＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）の薬物速度を示す。マウスに時間ゼロにおいてＡｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）（１０ｍｇ／ｋｇ）の静脈注射を尾部に与えた。血漿試料を１０分、及び１、２、４、８及び２４時間で収集した。Ａｐｏ-２Ｌ濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。これらのデータは、ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）がＡｐｏ２Ｌ．０よりも４８倍長い半減期を有していることを示している。
【図１８】マウス異種移植モデルにおけるヒトＣＯＬＯ２０５腫瘍の成長に対するＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-８７Ｃ）の効果を示す。胸腺欠損ヌードマウス（Jackson Laboratories）に５ｘ１０６のＣＯＬＯ２０５ヒト大腸癌細胞（ＮＣＩ）を皮下注射した。腫瘍を形成させ、キャリパー測定で判断して約１５０ｍｍ３の体積になるまで成長させた。マウス（一群当たり８匹）にビヒクル（５ｘ／週）、Ａｐｏ２Ｌ．０（６０ｍｇ／ｋｇ、５ｘ／週）、Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）、ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）、ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）、又はＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（１ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）を腹腔内注射した。腫瘍体積を三日毎に測定し二週間後に処置を停止した。ＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（３２１７６-７８）の３通り全ての投薬量が、各群の８匹全ての動物において完全な腫瘍の後退を生じた。
【図１９】カニクイザル由来の正常な肝細胞の生存に対するＰＥＧ-Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の効果を示す。ロット３２１７６-７８は中程度の濃度で効果を示す一方、ロット３１２７６-８７Ｃは肝細胞の生存に対して効果を持たない。
【図２０Ａ】完全長ヒトＤＲ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４）及びその誘導アミノ酸配列（配列番号：３）を示す。ヒトＤＲ４に対する各ヌクレオチド及びアミノ酸配列はPanら, 276:111 (1997)にも報告されている。
【図２０Ｂ】図２０Ａの続きである。
【図２１】１９９８年１１月１９日に国際公開９８／５１７９３中で公開されたヒトＤＲ５（Ａｐｏ-２とも称される）の４１１のアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。ヒトＤＲ５のスプライシング変異体は当該分野で知られている。このＤＲ５スプライシング変異体は図２２Ａ及び２２Ｂに示されたヒトＤＲ５の４４０のアミノ酸配列（配列番号：６）をコードする。
【図２２Ａ】１９９８年８月２０日に国際公開９８／３５９８６中で公開されたヒトＤＲ５の４４０のアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａの続きである。
【図２３】ＳＥＣ-ＭＡＬＳによる２Ｋ ＰＥＧ-Ｒ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の分析を示す。
【図２４】ＳＫ-ＭＥＳ肺癌細胞に対する２Ｋ ＰＥＧ-Ｒ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（図では「２ＫＰＥＧ-Ｋ１７９．０」と称される）のアポトーシス誘導活性を示す。
【図２５】Ｃｏｌｏ２０５マウスモデルにおける２ＫＰＥＧ-Ｒ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の薬物速度を示す。血漿試料を示された時間において収集し、示されたタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。
【図２６】マウス異種移植モデルにおけるヒトＣＯＬＯ２０５腫瘍の成長に対する２Ｋ ＰＥＧ-Ｒ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の効果を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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