(57)【要約】【課題】骨粗鬆症、骨形成不全症、又は骨密度形成不良症の発症リスクを診断する方法、並びに発現遺伝子の塩基置換を検出する方法を提供する。【解決手段】女性の爪を検体とし、エストロゲン受容体発現遺伝子、ＬＤＬ受容体関連タンパク５発現遺伝子、及びＩ型コラーゲン発現遺伝子の少なくとも１つの発現遺伝子における塩基置換を検出することを特徴とする、骨粗鬆症、骨形成不全症、又は骨密度形成不良症の発症リスクを診断する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
女性の爪を検体とし、エストロゲン受容体発現遺伝子、ＬＤＬ受容体関連タンパク５発現遺伝子、及びＩ型コラーゲン発現遺伝子の少なくとも１つの発現遺伝子における塩基置換を検出することを特徴とする、骨粗鬆症、骨形成不全症、又は骨密度形成不良症の発症リスクを診断する方法。
【請求項２】
エストロゲン受容体発現遺伝子が、ＥＳＲＸ又はＥＳＲＰであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
女性の年齢が、１２〜２０歳であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
女性の爪を動植物由来プロテアーゼのアルカリ性水溶液に溶解してＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡをＰＣＲ法に付して、エストロゲン受容体発現遺伝子、ＬＤＬ受容体関連タンパク５発現遺伝子、及びＩ型コラーゲン発現遺伝子の少なくとも１つの発現遺伝子の塩基置換部位を増幅することを特徴とする、発現遺伝子の塩基置換を検出する方法。
【請求項５】
動植物由来プロテアーゼが、メロン由来プロテアーゼであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨粗鬆症、骨形成不全症、又は骨密度形成不良症の発症リスクを診断する方法、並びに発現遺伝子の塩基置換を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣のような環境的因子と、遺伝的因子とが相互作用して発症する疾患を多因子疾患といい、そのような疾患として、例えば骨粗鬆症が挙げられる。骨粗鬆症とは、骨量が減少し、骨の中の構造が壊れて、骨が非常にもろく、折れやすくなる症状を指し、圧倒的に女性に多く発症する。その理由は、女性の最大骨量が男性より低く、また骨形成に影響を与える女性ホルモンが加齢により減少するからである。
遺伝的因子として、遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ：Single Nucleotide Polymorphism）が骨疾患などの特定の疾患の発症リスクを高めることが知られている（非特許文献１〜１２）。骨密度減少に関連する骨粗鬆症などの疾患は発症後の治癒が困難であるので、発症前、例えば最大骨量に達する思春期から２０歳頃までに発症リスクを知ることが、その後の生活習慣を改善し、発症を予防する上で非常に有効である。
ＳＮＰなどの遺伝子の診断には、血液、毛髪、口腔内細胞、唾液などの生体試料から抽出したＤＮＡが主に用いられている。しかし、これらの生体試料には、採取する際に痛みを伴う、採取に時間がかかる、医療従事者及び医療機器が必要である、被験者に抵抗感を与えるなどの問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Gentics of Osteoporpsis John A. Eisman: Genetics of Osteroporosis Endocrine Reviewa in Endocrine Society 20(6) 788-804 (1999)
【非特許文献２】Molecular studies of identification of genes for osteoporosis: the 2002 update. Yao-Zhong Liu, Young-Jun Liu, Robert R Recker, Hong-Wee Deng Journal of Endocrinology 177 147-196 (2003)
【非特許文献３】財団法人  日本医療機能評価機構ＨＰ（医療情報サービスMinds）骨粗鬆症の予防と治療ＧＬ作成委員会編（２００６）
【非特許文献４】日本医師会ＨＰ  健康の森  http://www.med.or.jp/forest
【０００４】
【非特許文献５】Omasu F, Kitagawa J, Koyama K, Asakawa K, Yokouchi J, Ando D, Nakahara Y. The influence of VDR genotype andd exercise on ultrasound parameters in young adult Japanese women. J Physiol Anthropol Human Sci 23(2) 49-55 (2004)
【非特許文献６】Morrison NA, QiJC, Tokita A, Kelly PJ, Crofts L, Nguyen TV, Sambrook PN, Eisman JA. Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles. Nature Jan 20 367 (6460) 284-287 (1994)
【非特許文献７】Heaney RP  Vitamin D in health and disease.Clin J Am Soc Nephrol. 2008 Sep;3(5):1535-41. Epub (2008 Jun 4)
【非特許文献８】Blair D, Byham-Gray L, Lewis E, McCaffrey S  Prevalence of vitamin D [25(OH)D] deficiency and effects of supplementation with ergocalciferol (vitamin D2) in stage 5 chronic kidney disease patients. J Ren Nutr. 2008 Jul;18(4):375-82
【非特許文献９】Zisman AL, Hristova M, Ho LT, Sprague SM.  Impact of ergocalciferol treatment of vitamin D deficiency on serum parathyroid hormone concentrations in chronic kidney disease.Am J Nephrol. 2007;27(1):36-43. Epub 2007 Jan 11
【非特許文献１０】牧野秀紀、鈴木泰伸、高山雅臣  ビタミンＤレセプターおよびエストロゲンレセプター遺伝子多型が閉経後日本人女性の骨量低下に対する各治療法の効果に及ぼす影響  日本産婦人学会雑誌  ５０（３）１２５−１３２（１９９８）
【非特許文献１１】清水省志  ビタミンＤ結合タンパク（ＤＢＰ）遺伝子多型と閉経後女性における骨量・骨代謝マーカーとの関連  埼玉医科大学雑誌  ３２（２）Ｔ４３−Ｔ５０（２００５）
【非特許文献１２】中村和利  若年女性の最大骨量獲得に対するカルシウム摂取量とビタミンＤ受容体遺伝子多型との交互作用−陰膳法（Duplicate Portion Sampling）を用いて  牛乳栄養学研究会委託研究報告書Ｈ１６  １２７−１３５  日本酪農乳業協会（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、侵襲性が低く、検体試料の採取が簡便である骨粗鬆症、骨形成不全症、又は骨密度形成不良症の発症リスクを診断する方法、並びに発現遺伝子の塩基置換を検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ね、爪を種々の動植物由来のプロテアーゼに溶解させた結果、市販のキットよりも効率よくＤＮＡを抽出でき、多因子疾患の一因となる遺伝子多型を検出できることを見出した。
すなわち、本発明は、
（１）女性の爪を検体とし、エストロゲン受容体発現遺伝子、ＬＤＬ受容体関連タンパク５発現遺伝子、及びＩ型コラーゲン発現遺伝子の少なくとも１つの発現遺伝子における塩基置換を検出することを特徴とする、骨粗鬆症、骨形成不全症、又は骨密度形成不良症の発症リスクを診断する方法、
（２）エストロゲン受容体発現遺伝子が、ＥＳＲＸ又はＥＳＲＰであることを特徴とする、（１）に記載の方法、
（３）女性の年齢が、１２〜２０歳であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の方法、
（４）女性の爪を動植物由来プロテアーゼのアルカリ性水溶液に溶解してＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡをＰＣＲ法に付して、エストロゲン受容体発現遺伝子、ＬＤＬ受容体関連タンパク５発現遺伝子、及びＩ型コラーゲン発現遺伝子の少なくとも１つの発現遺伝子の塩基置換部位を増幅することを特徴とする、発現遺伝子の塩基置換を検出する方法、
（５）動植物由来プロテアーゼが、メロン由来プロテアーゼであることを特徴とする、（４）に記載の方法、に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、侵襲性が低く、検体試料の採取が簡便かつ容易である、骨粗鬆症、骨形成不全症、又は骨密度形成不良症の発症リスクを診断する方法、並びに発現遺伝子の塩基置換を検出する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】リアルタイムＰＣＲによるＥＳＲＸの判定結果を示す図である。
【図２】リアルタイムＰＣＲによるＥＳＲＰの判定結果を示す図である。
【図３】リアルタイムＰＣＲによるＬＲＰ５の判定結果を示す図である。
【図４】ＥＳＲＸの遺伝子多型と骨評価値との相関を示す図である。
【図５】ＥＳＲＰの遺伝子多型と骨評価値との相関を示す図である。
【図６】ＬＲＰ５の遺伝子多型と骨評価値との相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、検体として用いられる爪は、動物の手足の爪であればよく、性別及び年齢を問わないが、骨密度減少に関連する疾患を予防するという観点から女性の爪が好ましく、最大骨量に達する思春期から２０歳頃までの女性の爪が特に好ましい。爪は足の爪でも手の爪でもよい。爪は通常はさみで採取するが、採取した爪をさらに細断してもよいし、粉砕してもよい。
検出する遺伝子の塩基置換としては、骨形成に関与する遺伝子における塩基置換であればよく、骨形成に関与する遺伝子は、特に限定されないが、例えばエストロゲン受容体発現遺伝子（ＥＳＲＸ、ＥＳＲＰ）、ＬＤＬ受容体関連タンパク５発現遺伝子（ＬＲＰ５）、Ｉ型コラーゲン発現遺伝子（ＣＬＡ１）などにおけるＳＮＰなどが挙げられる。ＳＮＰとしては、例えばＥＳＲＸ：rs9340799、ＥＳＲＰ：rs2234693、ＬＲＰ５：rs376228、ＣＬＡ１：rs1800012などが挙げられる。
【００１０】
本発明において、爪からのＤＮＡの抽出は、爪を動植物由来プロテアーゼのアルカリ水溶液で溶解することにより行われる。動植物由来プロテアーゼとしては、爪の主成分であるケラチンを分解するものであればよい。このようなプロテアーゼを多く含むものとして、パパイヤ、パイナップル、キウイフルーツ、メロン、イチジク、洋ナシなどの果物の果肉が好ましく、メロンの果肉が特に好ましい。また、果肉をホモジナイズし、氷冷しながら、ろ過することによって取得するのが好ましい。
アルカリ性水溶液は、特に限定されるものではなく、公知のものを使用することができるが、ＤＮＡ抽出時のｐＨを一定に保つという点から、トリス塩酸緩衝液、トリシン緩衝液、グリシン緩衝液、アンモニア塩化アンモニウム緩衝液、ホウ酸-炭酸ナトリウム緩衝液、グッド緩衝液（ＡＭＰＳＯ，ＣＨＥＳ，ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ，ＣＡＰＳ）などの緩衝液が好ましく、グリシン緩衝液が特に好ましい。
アルカリ性水溶液のｐＨは、爪のケラチンを分解し、プロテアーゼの活性が高く、ＤＮＡを効率良く抽出するという点から、ｐＨ約８〜１２が好ましく、ｐＨ約９〜１１が特に好ましい。
アルカリ水性水溶液は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、脂肪酸塩、アルファスルホ脂肪酸エステル塩（α−ＳＦＥ）、アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＡＢＳ）、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキル硫酸トリエタノールアミン、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウムクロリド、アルキルピリジニウムクロリド、アルキルカルボキシベタインなどの界面活性剤、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス―β―アミノエチルエーテル（ＥＧＴＡ）、クエン酸などのキレート剤などをさらに含んでいてもよい。
爪１重量部に対して、プロテアーゼを約９〜１１重量部、アルカリ水溶液を約１６〜２０重量部を混合し、所望により撹拌することにより、爪に含まれるＤＮＡを水溶液に移行させ、ＤＮＡの抽出が行われる。
【００１１】
ＤＮＡの抽出温度は、特に限定されないが、プロテアーゼの活性が高く、ＤＮＡを効率良く抽出できるという点から、約６０〜８０℃が好ましく、約６５℃〜７５℃が特に好ましい。ＤＮＡの抽出時間は、特に限定されないが、ＤＮＡの増幅に十分な量を得ることができるという点から、約２０〜４０分が好ましく、特に約２５〜３５分が好ましい。
ＤＮＡを含むアルカリ水溶液に有機溶媒（例えばフェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールなど親油性有機溶媒が好ましい）を加え、遠心分離し、水相を分取し、さらにアルカリ水溶液（例えば、酢酸ナトリウム水溶液）と新油性有機溶媒（イソプロピルアルコール）を加えて、遠心分離し、沈殿を採取することによって、目的のＤＮＡを得る。
抽出したＤＮＡは、公知のＰＣＲ(polymerase chain reaction)法により増幅することができる。増幅したＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動などの公知の方法に付すことにより、目的の塩基置換部位（上述したＳＮＰ）を検出することができる。ＰＣＲ法またはTaqmanプローブなどの蛍光標識プローブによるリアルタイムＰＣＲ法を用いると、ＤＮＡの増幅と同時に目的のＳＮＰを検出でき、アガロースゲル電気泳動が不要となるので、特に好ましい。骨粗鬆症、骨形成不全症、又は骨密度形成不良症の発症リスクについては、増幅したＤＮＡからＳＮＰが検出されることによって、遺伝子が変異ヘテロ又は変異ホモであることが確認されれば、骨粗鬆症、骨形成不全症、又は骨密度形成不良症の、将来、特に閉経後に発症のリスクがあると判断される。
本発明により、骨粗鬆症、骨形成不全症、又は骨密度形成不良症の発症リスクがあると判断されても、例えば週１回以上の２時間程度の運動を習慣とする、ヨーグルト、牛乳、豆製品、魚などのカルシウムを多く含む食品を摂取する、喫煙、飲酒を控えるなどの生活改善により、上記疾患の発症リスクを顕著に低減することができる。
【実施例】
【００１２】
［メロン由来プロテアーゼの調製］
アンデスメロンの果肉部をワーリングブレンダーでホモジナイズした。ホモジナイズした果肉部を氷冷しながら、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で湿らせたガーゼでろ過してメロン由来プロテアーゼを得た。
【００１３】
［ＤＮＡ溶液の調製］
武庫川女子大学３回生（２００７年度）１７５名を対象とした。被験者１７５名の身体データを下記表１に示す。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
被験者からインフォームドコンセントを得て採取した爪を検体として用いた。爪を細かく切断し、１００％エタノールで洗浄した後、５ｍｇを１．５ｍＬマイクロチューブに取り、solution（５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ）８０μＬ、及び５％（ｗ／ｗ）ＳＤＳ水溶液２０μＬを加えた。軽くタッピングした後、１０分間静置した。メロン由来プロテアーゼ５０μＬを加え、５分おきにタッピングを行いながら、７０℃で３０分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１（容量比））１５０μＬを加え、５分間転倒混和した後、１４０００ｒｐｍ、２３〜２４℃で５分間遠心分離した。
別の１．５ｍＬマイクロチューブに上層（水相）を取り、３Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ水溶液１０μＬ、及びイソプロピルアルコール１００μＬを加え、１４０００ｒｐｍ、２３〜２４℃で５分間遠心分離した。上清をデカンテーションにより除き、沈殿を５５℃でインキュベートして乾燥させた。−３０℃で保存しておいた７０％（ｖ／ｖ）エタノールを加え、１４０００ｒｐｍ、２３〜２４℃でさらに５分間遠心分離した。上層（エタノール）をデカンテーションにより除き、下層を５５℃でインキュベートして乾燥させた。TE buffer（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ）２０μＬを加え、ＤＮＡ溶液を調製した。溶液は３℃で冷蔵保存した。
【００１６】
［リアルタイムＰＣＲ］
次の３種類のプライマーを用いて多型部位を含む遺伝子断片を増幅した。各遺伝子のＳＮＰ  ＩＤと遺伝子多型の塩基配列を以下に示す。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
１．５ｍＬマイクロチューブにMaster Mix 12.5μＬ、プライマー１．２５μＬ、滅菌水１．２５μＬをピペッティングにより混合した。Micr Amp.プレートwellに各ＤＮＡ溶液を１３．７５μＬずつ加え、滅菌水１０．２５μＬをさらに加え、反応液を調製した。但し、NEGATIVE CONTROLには、ＤＮＡ溶液ではなく、滅菌水を１１．２５μＬ加えた。反応組成を下記表２に示す。
【００１９】
【表３】
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【００２０】
これらの反応溶液を用いて、Real-Time PCR 7500（Applied Bio systems）によりリアルタイムＰＣＲを行った。２５℃１分間でPre-Readを行い、５０℃２分間、９５℃１０分間で反応させた後、９２℃１５秒間及び６０℃１分間の反応を４０サイクル行って、最後に２５℃１分間でPost-Readを行った。各遺伝子多型をＶＩＣ、及びＦＡＭの蛍光強度にて判定した。
【００２１】
【表４】
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【００２２】
［遺伝子多型の分布度数と割合］
(i)エストロゲン受容体−α（ＥＳＲＸ）
被験者１７５名のＥＳＲＸの遺伝子多型の分布度数と割合を下記表４に示す。また、リアルタイムＰＣＲによるＥＳＲＸの蛍光強度による判定結果を図１に示す。
【００２３】
【表５】
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【００２４】
(ii)エストロゲン受容体−α（ＥＳＲＰ）
被験者１７５名のＥＳＲＰの遺伝子多型の分布度数と割合を下記表５に示す。また、リアルタイムＰＣＲによるＥＳＲＰの蛍光強度による判定結果を図２に示す。
【００２５】
【表６】
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【００２６】
(iii)ＬＤＬ受容体関連タンパク５（ＬＲＰ５）
被験者１７５名のＬＲＰ５の遺伝子多型の分布度数と割合を下記表６に示す。また、リアルタイムＰＣＲによるＬＲＰ５の蛍光強度による判定結果を図３に示す。
【００２７】
【表７】
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【００２８】
［遺伝子多型と骨評価値との相関］
超音波骨評価値測定装置（アロカ株式会社製  超音波骨評価装置ＡＯＳ−１００ＮＷ）を用い足の踵骨に超音波を照射して音響的骨評価値（ＯＳＩ）を測定した。
(i)エストロゲン受容体−α（ＥＳＲＸ）
下記表８に示すように、ＥＳＲＸの遺伝子多型では、Ｘｘ型（ヘテロ）の骨評価値がＸＸ型（野生ホモ）及びＸｘ型（変異ホモ）に比べて低かった。
【００２９】
【表８】
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【００３０】
(ii)エストロゲン受容体−α（ＥＳＲＰ）
下記表９に示すように、ＥＳＲＰの遺伝子多型では、Ｐｐ型（ヘテロ）の骨評価値がｐｐ型（野生ホモ）及びＰＰ型（変異ホモ）に比べて低かった。
【００３１】
【表９】
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【００３２】
(iii)ＬＤＬ受容体関連タンパク５（ＬＲＰ５）
下記表１０に示すように、ＬＲＰ５の遺伝子多型では、ＣＴ型（ヘテロ）及びＴＴ型（変異ホモ）の骨評価値がＣＣ型（野生ホモ）に比べて低かった。
【００３３】
【表１０】
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【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の骨粗鬆症、骨形成不全症、又は骨密度形成不良症の発症リスクを診断する方法、並びに発現遺伝子の塩基置換を検出する方法は、侵襲性が低く、簡便である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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