(57)【要約】【課題】食道癌などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法及び細胞増殖抑制剤を提供すること。【解決手段】検体において、１ｑ３２−１ｑ４１の染色体領域に存在する遺伝子の増幅を少なくとも１つ以上を検出することにより癌化を検出することを含む、癌の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体において、１ｑ３２−１ｑ４１の染色体領域に存在する遺伝子の増幅を少なくとも１つ以上を検出することにより癌化を検出することを含む、癌の検出方法。
【請求項２】
前記遺伝子がＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦから選択される少なくとも１つ以上である、請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項３】
増幅の指標が、正常検体と比較して１．３２倍以上である、請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
【請求項４】
遺伝子が、ＳＭＹＤ２である、請求項３に記載の癌の検出方法。
【請求項５】
検体が食道由来の組織である、請求項１から４の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項６】
癌が食道癌である、請求項１から５の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項７】
遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、または、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、又はＣＯＢＲＡ法を用いて検出する、請求項１から６の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項８】
検体において、ＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦから選択される少なくとも１つ以上の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することを含む、癌の検出方法。
【請求項９】
蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する、請求項８に記載の癌の検出方法。
【請求項１０】
検体の悪性度を含めた癌化を検出する、請求項１から９の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項１１】
ＳＭＹＤ２およびｐ５３の発現を指標に癌化を検出する、請求項１から１０の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項１２】
ＳＭＹＤ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食道癌などの癌の検出方法、及び癌の抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食道癌（Esophageal carcinoma）は、食道に発生する上皮性由来の腫瘍（癌）であり、日本では毎年１００００人以上が発症する。男女比は約６：１と男性に多く、男性では６番目に多い癌である。年間の死亡者数は日本で９，０００-１０，０００人と全癌の３％を占める。組織学的分類では食道扁平上皮癌(E s o p h a g e a l  s q u a m o u s  c e l l  c a r c I n o m a  ：ＥＳＣＣ)と腺癌がある。前者は食道の粘膜上皮細胞が癌化するもので、全体の９０％以上を占める。後者はバレット食道の細胞が癌化するもので、両者を合わせると食道癌全体の９５％以上を占める。
【０００３】
食道癌は深達度の浅い段階から高頻度にリンパ節転移を来たし、また解剖学的にも食道は他の消化器臓器と異なり、漿膜（外膜）を有していないために癌が比較的周囲の組織に浸潤しやすい。5年生存率は現在でも平均約30%と他の消化器癌（胃癌60%、大腸癌70%、肝癌40%、膵癌15%）にのなかでも極めて予後不良である。したがって、更なる診断・治療技術の向上が望まれている。診断法としては、食道造影、内視鏡、超音波内視鏡検査、ＣＴ（コンピュータトモグラフィー）、ＰＥＴ（ポジトロン放射断層撮影装置）等の画像所見とＳＣＣ（扁平上皮癌関連抗原）及びＣＥＡ（癌胎児抗原）等の腫瘍マーカーに基づく方法が知られている。しかし、実地臨床の現場において、早期に食道癌の悪性度を診断する、あるいは再発を予測する有望なバイオマーカーが未だ存在しないのが現状である。一方、治療としては、内視鏡的粘膜切除術や手術療法が一般的であるが、根治手術が困難な症例では、術前や術後に化学療法や化学放射線療法を用いた集学的治療が行われる。しかし、治療の感受性を予測するバイオマーカーも未だ存在しないのが現状である。また、乳癌、大腸癌、肺癌等で有効性が明らかにされ臨床応用されているような分子治療標的治療薬も食道癌では未だ存在しないのが現状である。
【０００４】
以上から、（１）食道癌の発生・進展にかかわる分子機構の更なる詳細な解明、（２）進行・再発食道癌に対する治療標的分子の探索、及び（３）治療方針決定のための診断・予後予測マーカーの開発は緊急の課題であると考えられる。
【０００５】
これまでに、Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ｂ  （ＬＲＰ１Ｂ）の発現低下或いは当該ゲノム遺伝子の欠失が食道癌の診断に使用できることが報告された（特許文献１）。また、ヒトＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ヒトＣＲＡＢＰ１）の発現低下或いは当該ゲノム遺伝子の欠失が食道癌の診断に使用できることが報告された（特許文献２）。しかしながら、ＥＳＣＣの分子機構の解明は未だ不十分であり、更なる解析が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−３０４４９６号公報
【特許文献２】特開２００８−１１８８６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
食道の癌化についての遺伝子レベルでのメカニズムが解明されれば、遺伝子レベルにおける食道由来細胞の癌化の早期発見や、食道癌の悪性度の診断、進行の抑制をおこなうことが可能となり、さらに、メカニズムに基づく薬剤の選別、開発や治療法の確立が可能となるはずである。具体的には、食道扁平上皮癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して、遺伝子を中心とした技術的検討をおこなうことにより、この課題を解決することができると考えられる。即ち、本発明は、食道癌などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法及び細胞増殖抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （ＣＧＨ）はゲノム上で多数の遺伝子増幅並びに欠失、あるいは遺伝子の不活性化に伴う遺伝子異常を解析するためには、簡便で迅速であり、最良の方法である。本発明者らは、これまでに、癌化並びに癌の悪性化などに関与するゲノム上の遺伝子異常を解析するためにＣＧＨアレイに搭載する４５００種類のＢＡＣ／ＰＡＣ  ＤＮＡを選別した、ＭＣＧ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９５，５５９−５６３，２００４）を用いて、様々な癌の遺伝子異常について解析を行い、癌関連遺伝子の検出を行ってきた。本発明者らは、今回、ＭＣＧ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ‐４５００を用いて検出した増幅領域を対象に、更に詳細な解析法（Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏ−ａｒｒａｙ  ＣＧＨ法）、およびＦＩＳＨ法を用いた解析を行い、ＥＳＣＣ由来の細胞の癌化を促進する癌関連遺伝子、すなわち、ＳＭＹＤ２（ＳＥＴ  ａｎｄ  ＭＹＮＤ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２）遺伝子を含む１ｑ３２−１ｑ４１のコピー数の異常の同定に成功した。また43種類のＥＳＣＣ細胞株及び153例の臨床検体を用いて、免疫組織化学的解析によりＳＭＹＤ２タンパク質の過剰発現を明確にした。そして、ＥＳＣＣ細胞株では、ＳＭＹＤ２タンパク質の発現亢進がＥＳＣＣ細胞の増殖を顕著に促進すること、また、ＳＭＹＤ２遺伝子の転写産物を抑制するとＥＳＣＣ細胞の増殖が著しく低下することを見出すことに成功した。臨床検体では、ＳＭＹＤ２高発現患者は極めて予後不良で、かつＳＭＹＤ２が独立した予後因子であることを明らかにした。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  検体において、１ｑ３２−１ｑ４１の染色体領域に存在する遺伝子の増幅を少なくとも１つ以上を検出することにより癌化を検出することを含む、癌の検出方法。
（２）  前記遺伝子がＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦから選択される少なくとも１つ以上である、（１）に記載の癌の検出方法。
（３）  増幅の指標が、正常検体と比較して１．３２倍以上である、（１）又は（２）に記載の癌の検出方法。
【００１０】
（４）  遺伝子が、ＳＭＹＤ２である、（３）に記載の癌の検出方法。
（５）  検体が食道由来の組織である、（１）から（４）の何れかに記載の癌の検出方法。
（６）  癌が食道癌である、（１）から（５）の何れかに記載の癌の検出方法。
（７）  遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、または、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、又はＣＯＢＲＡ法を用いて検出する、（１）〜（６）の何れかに記載の癌の検出方法。
【００１１】
（８）  検体において、ＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦから選択される少なくとも１つ以上の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することを含む、癌の検出方法。
（９）  蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する、（８）に記載の癌の検出方法。
（１０）  検体の悪性度を含めた癌化を検出する、（１）から（９）の何れかに記載の癌の検出方法。
（１１）  ＳＭＹＤ２およびｐ５３の発現を指標に癌化を検出する、（１）から（１０）の何れかに記載の癌の検出方法。
（１２）  ＳＭＹＤ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む、細胞増殖抑制剤。
（１３）  ＳＭＹＤ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、食道由来の細胞検体における癌化、悪性度を的確に把握することが可能となった。また、食道癌において、ＳＭＹＤ２遺伝子を不活性化することにより、食道癌の増殖を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＥＳＣＣ細胞株での１ｑ３２−１ｑ４１遺伝子領域の増幅地図（ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｍａｐ）を示す。上段の左側は、１ｑ３２−１ｑ４１領域の、アジレント２４４Ｋ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏ−ａｒｒａｙ  を用いた解析結果を示している（横軸は、コピー数のＬＯＧ10値を示している）。上段の右側は、ＦＩＳＨ解析に用いた、７種類のＢＡＣの領域、及び本領域に含まれる４２種の遺伝子を示している（ＢＡＣ−１〜７は、１：RP11-162H7, DTL,1q32.3 green（control：RP11-351H16, 1q41 red）、２：RP11-90A5, ATF3, 1q32.3 green（control：RP11-351H16, 1q41 red）、３：RP11-262H5, CENPF,1q41 green（control：RP11-351H16, 1q41 red）、４：RP11-74E6, SMYD2, 1q41 green（control：RP11-82D16, 1p36.3 red）、５：RP11-157G15, GPATC2, 1q41 green（control：RP11-351H16, 1q41 red）、６：RP11-170J15, TGFβ2 1q41 green（control：RP11-351H16, 1q41red）、７：RP11-49H1，DUSP10, 1q41 green（control：RP11-351H16, 1q41 red））。下段の写真は、ＢＡＣ−１,４,５,８をプローブとして用いた時のＦＩＳＨ解析の結果を示している。
【図２】図２は、２２個の遺伝子の発現パターンを示す。左側縦軸に２２種の遺伝子名を示し、横軸に、解析に用いた４３種の細胞株の名前を示し、右側縦軸に、発現が食道正常組織より高い細胞株の比率を示している。下段表は、発現の程度と塗りつぶし色の対応を示している。
【図３】図３は、本発明の１０種の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡによる、ｍＲＮＡ発現の抑制効果を示す。左は、１０種の候補遺伝子名、中央は１０種類の遺伝子におけるｓｉＲＮＡを用いたmRNAレベルでのノックダウンを確認、右はノックダウン処理７２時間後のｍＲＮＡ抑制の程度を示している。
【図４】図４は、ＫＹＳＥ細胞株（中間期）のＦＩＳＨ解析の結果を示す。緑は、ＲＰ１１−７４Ｅ６（１ｑ４１，ＳＭＹＤ２を含む）由来の蛍光シグナル、赤はコントロール（１ｐ３６．３）の蛍光シグナルを示す。
【図５】図５は、Real-time RT-PCR法を用いたESCC４３株におけるSMYD2の定量的発現解析の結果を示す。
【図６】図６は、ESCC４３株におけるWestern blot法によるSMYD2、p53の蛋白発現解析を示す。一列目に、ＳＭＹＤ２タンパクの結果を、２列目にｐ５３タンパクの結果を、３列目にコントロールとして、β−ａｃｔｉｎを示している。
【図７】図７は、ＳＭＹＤ２の細胞増殖分析を示す。KYSE150（SMYD２高発現、p53mutation(+)）、KYSE790（SMYD2高発現、p53 wild type）、KYSE220（SMYD2低発現、p53mutation(+)）、KYSE200（SMYD2低発現、p53 wild type）について、上段はｓｉ−ＲＮＡを用いたノックダウンによるWestern blot解析、中上段は定量ＲＴ−ＰＣＲを用いたｍＲＮＡの発現量の変化、中下段はＭＴＴアッセイによる解析結果、下段は、７２時間目のFACS解析の結果を示している。
【図８】図８は、コロニーフォーメーションアッセイによるSMYD２遺伝子過剰発現系における細胞増殖能の評価を示す。左がKYSE200株、右がKYSE510株で施行した結果を示している。上段はpＣＭＶ-3tag1A-empty vector, pＣＭＶ-3tag1A-SMYD2, pＣＭＶ-3tag1A-SMYD2 MD(methylation defective mutant of SMYD2)をトランスフェクションした蛋白をウエスタンブロットで示した。中段はシャーレのコロニー形成写真、下段はコロニーカウントを示したグラフである。
【図９】図９は、SMYD2関連分子p53、p21、Histone H3のまとめを示す。
【図１０】図１０は、免疫組織化学染色法による、ＳＭＹＤ２タンパクの発現量の解析を示す。上段は、食道正常組織と免疫組織化学染色法による、SMYD2の染色状態を示している。下段グラフの、横軸は治療後の経過日数、縦軸は生存率を示している。
【図１１】図１１は、免疫組織化学染色法による、ｐ５３タンパクの発現量の解析を示す。上段グラフの、横軸は治療後の経過日数、縦軸は生存率を示している。下段は免疫組織化学染色法による、p53の染色状態を示している。
【図１２】図１２は、ＥＳＣＣ１５３症例における、ＳＭＹＤ２およびｐ５３蛋白の発現と生存率の関係を示す。ＳＭＹＤ２およびｐ５３蛋白の発現と生存率の関係を示している。
【図１３】図１３は、作製したSNYD２特異抗体の精度評価を示す。
【図１４】図１４は、SaOS2(ｐ53 null 株)でのSMYD2ノックダウンでp21が発現誘導することを示す。mRNA（real-time Rt-PCR）、蛋白レベル(Western bloting)で確認した。MTT assayでは軽度の増殖抑制効果がみられた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
（１）癌の検出方法
本発明による癌の検出方法は、検体において、１ｑ３２−１ｑ４１の染色体領域（以下、本発明の染色体領域とも称する）に存在する遺伝子の増幅を少なくとも１つ以上を検出することを特徴とする。好ましくは、検出される遺伝子は、ＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦから選択される少なくとも１つ以上の遺伝子（以下、本発明の遺伝子とも称する）であり、更に好ましくはＳＭＹＤ２遺伝子である。また、本発明においては、検体において、ＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦから選択される少なくとも１つ以上の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することによって、癌を検出することもできる。
【００１５】
上記の通り、好ましくは、本発明は、食道癌細胞におけるＳＭＹＤ２遺伝子の増幅や蛋白発現を検出することにより、当該癌細胞の悪性度を検出し、食道癌を検出することができる。
【００１６】
ＳＭＹＤ２（SET AND MYND DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 2）は、1q41に坐位し、433アミノ酸からなる蛋白質をコードする。SETドメインがMYDNドメインによって2つに分断された形状をとり、MYNDドメインに連続するCystein-richドメインからなるSETドメインをもつ。哺乳類のSMYD2は、（１）ヒストンH3のlys36をdimethylateし、（２）SV40 reporter plasmidからの転写を抑制し、（３）マウス線維芽細胞で、SMYD2のexogenous expressionがあると細胞増殖が減少する、などの機能を有するとの報告（Brown MA et al. Mol Cancer 2006）がある一方、SMYD２は、Lysine methyltransferaseとしてp53のLysine370をメチル化して、p53の腫瘍抑制機能を阻害することにより、癌遺伝子として機能している可能性があるとの報告（Huang J et al. Nature 2006）があった。しかし、実際にＳＭＹＤ２遺伝子とヒトの癌との関係を示す報告はない。
【００１７】
上述したように、本検出方法（アレイCGH法など）は、食道由来の細胞や食道癌における、本発明の染色体領域および本発明の遺伝子の増幅を検出することを特徴とする方法である。
本発明の染色体領域および本発明の遺伝子の増幅を検出する対象となる食道由来の細胞や食道癌は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。
【００１８】
この検体組織細胞は、健常人の食道に由来する細胞か、食道癌患者の癌組織であるかを問わないが、現実的には、検査等の結果、癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織、または食道癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある食道癌の組織、等が主な対象となり得る。
【００１９】
本検出方法により、「検査等の結果、食道に由来する組織や細胞に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織」における本発明の染色体領域および本発明の遺伝子の増幅が認められた場合には、病変組織は癌化に向かって進行しているか或いは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。また、「食道癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある食道癌の組織」における本発明の染色体領域および本発明の遺伝子の増幅が認められた場合にも、癌組織の悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。検体として採取された食道癌組織は、必要な処理、例えば、採取された組織を用い、あるいは、採取された組織からのＤＮＡ或いはＲＮＡの調製をおこない、本検出方法をおこなう対象とすることができる。
【００２０】
本検出方法は、上述したように、食道由来の細胞、および食道癌細胞における本発明の染色体領域および本発明の遺伝子の増幅を検出することにより、当該細胞の腫瘍化の検出、分類をおこなうことが可能である。
【００２１】
次に、本発明の染色体領域および本発明の遺伝子の増幅の検出について説明する。
本発明の染色体領域および本発明の遺伝子の増幅の検出を直接的におこなうことができる代表的な方法として、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法とＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を挙げることができる。この態様の本検出方法は、本発明の染色体領域および本発明の遺伝子を有するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｒｉｖｅｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ（以下、ＢＡＣ  ＤＮＡ等ともいう）を標識し、ＦＩＳＨをおこなうと、本発明の染色体領域および本発明の遺伝子の増幅を検出することができる。具体的には、ＳＭＹＤ２遺伝子を有するＢＡＣ  ＤＮＡとしては、ＲＰ１１−７４Ｅ６等を上げることができる。
【００２２】
上記の態様の方法は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を用いておこなうことが、好適であり、かつ、現実的である。
【００２３】
通常に得られるＢＡＣ  ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣ  ＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなう。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３'−末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ  ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用いることもできる。
【００２４】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ  ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。固体基盤としては、ガラス板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。
【００２５】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ／μｌ〜５μｇ／μｌ、より好ましくは１ｎｇ／μｌ〜２００ｎｇ／μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ或るいはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。
【００２６】
乾燥スポットの調整は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ  ＤＮＡ等を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェット式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが望ましい。例えば、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。
【００２７】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ  ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
【００２８】
また、オリゴヌクレオチドを定着基板に固定化した、オリゴヌクレオチドアレイを用いたＣＧＨ解析も、好ましく用いることができる。例えば、アジレント社製ＣＧＨアレイ（２４４Ｋ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏ−ａｒｒａｙ）等を用いることができる。
【００２９】
また、本発明の染色体領域および本発明の遺伝子の増幅を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムＤＮＡを分離して固定し、これと、対象遺伝子とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。
【００３０】
また、対象遺伝子に由来する、ｍＲＮＡ発現の定量解析により増幅を検出することもできる。
【００３１】
また、この対象遺伝子の増幅を直接的に検出する手段の一つとしてＰＣＲ法も用いることができる。被検検体よりゲノムＤＮＡを分離して当該遺伝子の全部、または一部を増幅することが可能なプライマーを用いて増幅後、定量をおこなうことにより検出することが可能である。
【００３２】
さらに、本発明においては、ＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦから選択される少なくとも１つ以上の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することによって、癌を検出することができる。蛋白質の量は免疫組織化学的法により検出することができる。免疫組織学的染色法は定法に準じて行うことができる。
【００３３】
本発明の遺伝子（例えば、ＳＭＹＤ２遺伝子など）を取り扱う場合、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、又は、ＳＭＹＤ２遺伝子を使用する場合には本明細書の配列表の配列番号１に記載の塩基配列に基づいてＰＣＲ法などにより酵素学的に合成したものでもよい。なお、配列表の配列番号１には、SMYD2 のcDNA (NM_020197)配列を示し、配列番号２にはSMYD2のアミノ酸配列を示す。ＰＣＲ法により配列番号１に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計したプライマーを使用してＰＣＲをおこなう。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００３４】
本発明の遺伝子の検出ブローブ又はプライマーの調製、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じておこなうことができる。
【００３５】
（２）細胞増殖の抑制方法及び細胞増殖抑制剤。
本発明によれば、ＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦから選択される少なくとも１つ以上の遺伝子のｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を、インビトロで細胞に導入することを含む細胞の増殖を抑制する方法、並びに上記のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは機能欠失型遺伝子を含む細胞増殖抑制剤が提供される。
【００３６】
ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡ は、細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡ の標的となる遺伝子（本発明においては、ＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦ遺伝子）の発現を抑制することができる。
【００３７】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡ は、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。ここで、「ｓｉＲＮＡ 」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡ に特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡ と同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡ の中央部でｍＲＮＡを切断する。
【００３８】
ｓｉＲＮＡ の配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡ の中央から外れた位置の塩基が一致していない場合については、ＲＮＡｉによる切断活性は部分的には残存することが多いので、必ずしも１００％一致していなくてもよい。
【００３９】
ｓｉＲＮＡの塩基配列と、発現を抑制すべきＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦ遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、当該遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。翻訳開始領域には種々の転写因子や翻訳因子が結合することが予想されるため、ｓｉＲＮＡ が効果的にｍＲＮＡに結合することができず、効果が低減することが予測されるからである。従って、相同性を有する配列は、当該遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、より好ましくは当該遺伝子の翻訳開始領域から７０塩基離れている。相同性を有する配列としては、例えば、当該遺伝子の３'末端付近の配列でもよい。
【００４０】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡｉにより標的遺伝子の発現を抑制することができる因子として、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を使用することができる。ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことを言う。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。上記の通りｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。
【００４１】
ｓｈＲＮＡは好ましくは、３'突出末端を有している。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約２０ヌクレオチド以上である。ここで、３'突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のＤＮＡであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのＤＮＡである。
【００４２】
上記の通り、本発明では、ＲＮＡｉによりＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦ遺伝子の発現を抑制することができる因子として、ｓｉＲＮＡ またはｓｈＲＮＡを使用することができる。ｓｉＲＮＡの長所としては、（１）細胞内に導入してもＲＮＡ自体は正常細胞の染色体内に組み込まれないので、子孫に伝わる変異を起こすような治療ではなく、安全性が高いこと、及び（２）短鎖二本鎖ＲＮＡは化学合成が比較的容易であり二本鎖にするとより安定であること、などが挙げられる。また、ｓｈＲＮＡの長所としては、遺伝子発現を長期間抑制することによって治療を行う場合、細胞内でｓｈＲＮＡを転写するようなベクターを作製して細胞内に導入することができることなどが挙げられる。
【００４３】
本発明で用いるＲＮＡｉによりＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦ遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、標的遺伝子の発現が抑制される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、oligofectamine、Lipofectamineおよびlipofectionなど）を用いてそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００４４】
上記したｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、細胞増殖抑制剤として有用である。本発明の細胞増殖抑制剤の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。  薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。
【００４６】
さらに、本発明の細胞増殖抑制剤の有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
【００４７】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの種類などを考慮して、当業者が決定することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与量は特に限定されないが、例えば、約０．１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１ｎｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。ＲＮＡｉは、一般に投与後１〜３日間効果が見られる。したがって、毎日〜３日に１回の頻度で投与することが好ましい。発現ベクターを用いる場合、１週間に１回程度投与することも可能である。
【００４８】
本発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖抑制剤として使用することもできる。本発明で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦ遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであって、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであっても良く、また機能に支障がない限りにおいて修飾されたものであってもよい。本明細書で言う「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドがすべて相補的であるもののみならず、ＤＮＡ又はｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが安定にハイブリダイズできる限り、多少のミスマッチが存在してもよい。
【００４９】
なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよい。適当な修飾を施すことにより、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは生体内で分解されにくくなり、より安定して標的を阻害できるようになる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、Ｓ−オリゴ型（ホスフォロチオエート型）、Ｃ−５チアゾール型、Ｄ−オリゴ型（フォスフォジエステル型）、Ｍ−オリゴ型（メチルフォスフォネイト型）、ペプチド核酸型、リン酸ジエステル結合型、Ｃ−５プロピニルピリミジン型、２−Ｏ−プロピルリボース、２'−メトキシエトキシリボース型等の修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されているものでもよい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性、水溶性、ＲＮＡへの親和性に特に優れている。リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｓ−オリゴ型等のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は、５０以下であることが好ましく、２５以下であることがより好ましい。塩基数があまりに多くなると、オリゴヌクレオチドの合成の手間とコストが増大し、また、収率も低下する。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は５以上であり、９以上であることが好ましい。塩基数が４以下の場合には、標的遺伝子に対する特異性が低下して好ましくないためである。
【００５１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（又はその誘導体）は常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる。
【００５２】
本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖抑制剤として使用する場合には、一般的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと製剤用添加物（担体、賦形剤など）とを含む医薬組成物の形態で提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトを含む哺乳動物に医薬として投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。
【００５３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの製剤形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。
【００５４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００５５】
さらに本発明では、ＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、又はＣＥＮＰＦ遺伝子の機能欠失型遺伝子を細胞増殖抑制剤として使用することもできる。機能欠失型遺伝子とは、該当する遺伝子においてその機能を欠失するように変異が導入されている遺伝子のことを言う。具体的には当該遺伝子から作製されるアミノ酸配列の少なくとも１個の構成アミノ酸を欠くもの、少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの、少なくとも１個のアミノ酸が付加されたもの等の本来の機能を欠失した一般にムテインと呼ばれるタンパク質を翻訳する当該遺伝子がこれに相当する。
【００５６】
機能欠失型遺伝子を細胞増殖抑制剤として使用する場合は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００５７】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００５８】
機能欠失型遺伝子の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００５９】
機能欠失型遺伝子の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００６０】
また、上記した本発明の各種の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液に遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００６１】
本発明の細胞増殖抑制剤は、抗腫瘍剤として有用である。本明細書でいう「抗腫瘍」とは、腫瘍の発生又は転移・着床を防止するという予防的作用、ならびに腫瘍細胞の増殖を抑制したり、腫瘍を縮小することによって腫瘍の進行を阻止したり、症状を改善させるという治療的作用の両方を含む最も広い意味を有し、いかなる場合においても限定的に解釈されるものではない。
【００６２】
本発明の抗腫瘍剤の適用対象となる癌の具体例としては、例えば悪性黒色腫、悪性リンパ腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽細胞腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記のうち特に好ましい適用対象となる癌は、食道癌である。
【００６３】
（３）ＳＭＹＤ２遺伝子を用いた腫瘍の検出方法
本発明の細胞増殖抑制剤（抗腫瘍剤）の適用対象となる腫瘍を選別するための検出方法は、ＳＭＹＤ２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＳＭＹＤ２遺伝子を解析する工程を含む。ここで、ＳＭＹＤ２遺伝子の一部とは、配列番号１に記載するＳＭＹＤ２遺伝子の塩基配列のうち、例えば約１０〜３０個の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを意味する。検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。
【００６４】
上記の「細胞増殖抑制剤（抗腫瘍剤）の適用対象となる腫瘍を選別するための検出」とは組織等における本発明における細胞増殖抑制剤（抗腫瘍剤）が有効に作用する腫瘍の存在の有無を知ることをいう。
【００６５】
腫瘍を選別するための検出は、ＳＭＹＤ２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡをプライマー又はプローブとして用いて検体試料中のＳＭＹＤ２遺伝子を解析することによりおこなう。ここで「ＳＭＹＤ２遺伝子を解析する」とは、具体的にはゲノムＤＮＡの当該遺伝子の増幅・欠失の検出又は遺伝子の発現量の異常を検出することをいう。
【００６６】
遺伝子の変異の検出は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡをプライマーとして用いる場合では、例えば選択した２種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、その存在の有無を確認する、もしくはその増幅物をそのまま、あるいは各種プラスミドベクターに組み換えた後配列を確認することにより可能である。
【００６７】
一方、遺伝子の発現量の異常の検出は、上記ＲＮＡ配列を含むプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーション法又はＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によっておこなうことができる。
【００６８】
（４）ＳＭＹＤ２タンパク質抗体又はその断片を用いた腫瘍を選別するための検出方法
本発明の細胞増殖抑制剤（抗腫瘍剤）の適用対象となる腫瘍を選別するための検出方法は、ＳＭＹＤ２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＳＭＹＤ２タンパク質の量を解析する工程を含む。
【００６９】
本方法に用いるＳＭＹＤ２タンパク質に対する抗体（以下、ＳＭＹＤ２抗体という）は、ＳＭＹＤ２タンパク質の全部又は一部を抗原として、通常の方法で作製することができる。ＳＭＹＤ２タンパク質の一部とは、配列番号２に記載するＳＭＹＤ２タンパク質のアミノ酸配列のうち、例えば連続する少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう。抗原とするＳＭＹＤ２タンパク質の全部又は一部の調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。
【００７０】
ポリクローナル抗体は、例えば上記抗原をマウス、モルモット、ウサギなどの動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などに複数回接種し十分に免疫した後、該動物から採血、血清分離して作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば上記抗原で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作製後、該ハイブリドーマ培養上清、又は該ハイブリドーマ投与マウス腹水から作製することができる。
【００７１】
上記のようにして調製したＳＭＹＤ２タンパク質抗体又はその断片を用いることによって検体試料中のＳＭＹＤ２タンパク質の発現量を知ることができる。測定には、例えばイムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色などの免疫学的方法、又はウエスタンブロット法などが利用できる。ここで、ＳＭＹＤ２タンパク質抗体の断片とは当該抗体の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などをいう。また、検体試料としては、腫瘍が疑われる骨髄試料、組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。測定した検体試料中のＳＭＹＤ２タンパク質の発現量が低い場合は、検体とした組織や細胞においてＳＭＹＤ２遺伝子の発現が抑制されていることになり、本発明の抗腫瘍化剤の適用対象となる腫瘍を選別することができる。
【００７２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００７３】
実験材料：
用いた４３種のＥＳＣＣ細胞株（表１）は臨床サンプルより樹立した細胞株を使用した。これら細胞株を１０％胎児牛血清と１００Ｕ／ｍｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／１００μｇ／ｍｌｓｔｒｅｐｕｔｏｍｙｃｉｎ液で培養をおこなった。
【００７４】
【表１】
2010220577.tif 000002
【００７５】
また、１５３症例の食道癌手術患者の検体を使用し、免疫組織学的染色による解析を行った。臨床検体は防衛医科大学病院外科で1981年から2005年の間に食道癌切除術を施行した連続症例の固定標本を用いた。臨床検体使用に際しては、倫理委員会規定の形式による内容を説明し患者から文書で同意を頂いた。全症例において術前に粘膜切除術や化学療法、放射線療法など前治療は行われていない症例を解析対象とした。
【００７６】
実施例１：ＥＳＣＣ細胞株での１ｑ３２−１ｑ４１遺伝子領域の増幅地図（ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｍａｐ）の作成
食道癌での新規な遺伝子変化を検出するために、上述の４３種類のＥＳＣＣ細胞株から調製したゲノムＤＮＡを用いてＣＧＨ  ｄａｔａ  ｂａｓｅ  Ｊａｐａｎ（http://www.cghtmd.jp/CGHDatabase/）で公開しているＥＳＣＣ細胞株の既知の増幅領域のうち１ｑ３２−１ｑ４１に位置する約１２ＭＢの増幅領域を高密度オリゴアレイ（アジレント２４４Ｋ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏ−ａｒｒａｙ  ）ＣＧＨ解析とＦＩＳＨ法でマッピングし、領域内の４２候補遺伝子を同定した（図１Ａ）。具体的には、オリゴアレイで評価した微細なコピー数変化のうち、コピー数の最も高い領域では、FISH法でも丸数字１から丸数字４の領域でHomogeneously Staining region、HSRパターンとして検出され、BACの丸数字６ 、丸数字８の領域ではコピー数の減少と相関したシグナルパターンの変化を認めた（図１Ｂ）。また、この一段高い領域内には２２種の遺伝子が含まれる事がわかった（図１Ａ）。
【００７７】
なお、対象として食道由来の正常な細胞から抽出したゲノムを使用しＣｙ５で標識した。被検ＤＮＡとしてＥＳＣＣ癌細胞株から調製したゲノムＤＮＡを使用しＣｙ３で標識した。
【００７８】
以下に、アジレント244Ｋ high−density oligo−array CGH解析の具体的な解析方法を示す。ゲノムDNAの増幅を行わないダイレクト法を示す。
【００７９】
１．ゲノムDNAの制限酵素反応
２μg分のDNAをNuclease free waterで希釈し合計20.2μlになるようにサンプルを調節する。次に、1反応あたりNuclease-free water 2.0μ、10xReaction Buffer C 2.6μl、Acetylated BSA(10μg/μl) 0.2μl、AluI（10U/μl）0.5μl、RsaI（10U/μl）0.5μlを加え合計26μlになるようにする。37℃のウオーターバスまたはヒートブロックで2時間インキュベートする。反応終了後、65℃のヒートブロックで20分インキュベートし酵素を失活させる。失活後氷上におく。
【００８０】
２．ゲノムDNAのラベル化
アジレントGenomic DNA Labelingキットを利用して、制限酵素消化ゲノムDNAのラベル化を行う。具体的には、ランダムプライマーとExo-Klenowを用いた反応で、Cyanine3-dUTPあるいはCyanine5-dUTPを取り込ませ、ゲノムDNAのラベル化を行う。
【００８１】
３．ラベル化DNAの精製・測定
Microcorn YM-30 filter units(ミリポア製、製品番号42410)を用いてラベル化DNAの精製及び濃縮を行う。NanoDrop ND-1000(UV-Vis測定器)を使ってラベル化DNAの測定を行う。Cy3-dUTP、Cy5-dUTPの取り込み効率の計算を行う。
【００８２】
４．ハイブリダイゼーション
ラベル化サンプル（Cy3及びCy5ラベル化DNAの混合）液153μl、Human Cot-1 DNA(1.0mg/ml)50μl、10xBlocking Agent52μl、2xHybridizaton Buffer 260μlを加え、95度で3分間インキュベート、37度30分間のインキュベートを行う。ハイブリダーゼーションチャンバーにアレイスライドをセットし、溶液をアプライする。65度のオーブンのローターで40時間ハイブリダイゼーションさせる。
【００８３】
５．スライドガラス洗浄・スキャンニング
Agilent Oligo aCGH洗浄バッファー1とAgilent Oligo aCGH洗浄バッファー2で洗浄し、Agilentスキャナーを用いてスキャンニングする。スキャンニング画像をAgilent Feature Extractionソフトウエアを用いて数値化し、CGH analysisソフトウエアを用いて染色体上にコピー数の変化を可視化して表現する。
【００８４】
また、ＦＩＳＨ解析の具体的な解析方法としては、表２に記載のプローブセットを用い、1q36.3領域のＢＡＣ（RP11-82D16）または1p42領域のBAC（RP11-351H16）をコントロールプローブとして、定法（Ｉｎｏｕｅ  Ｊ，  Ｏｔｓｕｋｉ  Ｔ，  Ｈｉｒａｓａｗａ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．；１６５：７１−８１．，２００４）により、おこなった。
【００８５】
【表２】
2010220577.tif 000003
【００８６】
実施例２：上記２２遺伝子のｍＲＮＡ発現の定量解析
前述のＥＳＣＣ４３株を用いて、実施例１で選択した２２種類の遺伝子のｍＲＮＡの発現定量解析を行った。定量ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとして正常食道上皮を用いた。対数増殖期の各細胞よりtotal  ＲＮＡを採取後、定法にてｃＤＮＡを作製した。ABI社のTaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems)のプロトコールを用いて、各遺伝子に特異的なプライマーでｃDNAからquantitative real-time fluorescence detection method (ABI PRISM 7500 sequence detection System; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)でmRNAの発現レベルの測定を行った。
【００８７】
結果を図２に示す。図２において、左側が遺伝子名（Ｇｅｎｅ  ｎａｍｅ）、上がｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ名、右側が正常組織より高発現している細胞株の頻度である。これらの結果と各種データベース（ＮＣＢＩ、ＬＳＢＭ、その他）を元に、ＥＳＣＣ細胞株４３株で高頻度に高発現し、またＬＳＢＭにおいて他の癌腫においても正常組織より癌細胞株で発現頻度の高い傾向がある遺伝子に注目した。その結果、１０の候補遺伝子、即ち、ＤＴＬ、Ｃ１ｏｒｆ７５、ＡＴＦ３、ＳＮＦＴ、ＮＳＬ１、ＦＬＶＣＲ、ＡＮＧＥＬ２、ＳＭＹＤ２、ＰＴＰＮ１４、及びＣＥＮＰＦ遺伝子がその特徴を有していることがわかった（図２）。
【００８８】
実施例３：上記１０遺伝子のｓｉＲＮＡを用いたノックダウン実験
実施例２の１０種の遺伝子の各種ｓｉＲＮＡを用いてノックダウンを行いｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｓｓａｙを行った。具体的には、増幅株を用いて、Santa Cruzs（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）社 、Dharmacon (Lafayette, CO, USA)社またはSigma (Tokyo, Japan)社のsiRNAを用いて解析した。Lipofectamine 2000 (Invitrogen, St. Louis, MO, USA) を用いてsiRNA（Santa Cruzs 10nmol/L,  Dharmacon 20nmol/L, Sigma 50nmol/L）添付プロトコールを参考にトランスフェクションした。増殖抑制程度の評価は、WST assay (colorimetric water-soluble tetrazolium salt assay)を用いて行った。
【００８９】
結果を図３に示す。図３の右はｍＲＮＡの発現レベルであり、ｓｉＲＮＡによりノックダウンされていることを発現定量解析で確認した。特にＣ１ｏｒｆ７５とＳＭＹＤ２が７２時間目の増殖抑制効果が著しいことがわかった（図３）。
【００９０】
実施例４：ＦＩＳＨ法によるＳＭＹＤ２遺伝子の増幅の確認
ＳＭＹＤ２の遺伝子の増幅を確認するため、ＢＡＣのＲＰ１１−７４Ｅ６  （１ｑ４１，  ＳＭＹＤ２；  ｇｒｅｅｎ）を  、ＲＰ１１−８２Ｄ１６  （１ｐ３６．３，  ｃｏｎｔｒｏｌ；  ｒｅｄ）をコントロールとして、ＦＩＳＨ法で解析した。また、解析方法としては、定法（Ｉｎｏｕｅ  Ｊ，  Ｏｔｓｕｋｉ  Ｔ，  Ｈｉｒａｓａｗａ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．；１６５：７１−８１．，２００４）により行った。
【００９１】
結果を図４に示す。ＨＳＲ（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｌｙ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）パターンとなっていることが確認された。
【００９２】
実施例５：ＳＭＹＤ2 ｍＲＮＡ発現の食道癌細胞株の発現定量解析
ＳＭＹＤ２の遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現亢進を確認するため、ＥＳＣＣ４３株での定量的発現解析（real-time RT-PCR）を行った。ABI社のTaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems)のプロトコールを用いて、SMYD2の遺伝子に特異的なプライマーでｃDNAからquantitative real-time fluorescence detection method (ABI PRISM 7500 sequence detection System; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)でmRNAの発現レベルの測定を行った。
【００９３】
結果を図５に示す。図５に示す通り、55.8%（24/43）のESCC株で食道粘膜正常組織より高発現を認めた。
【００９４】
実施例６：ＳＭＹＤ２遺伝子のタンパク発現レベルの確認
ＥＳＣＣ細胞株でのSMYD2遺伝子の過剰発現を確認するため、特異抗体を用いたウェスタン・ブロット法によりタンパクの発現を解析した。具体的には、各細胞をｐｒｏｔｅａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含むＲＩＰＡバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％  ＳＤＳ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ７．４）にて溶解後、ＢＣＡ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）にてタンパク濃度を測定し各20μｇをＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した。これを、ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜に転写した。特異抗体は、ヒトSMYD2の12個のアミノ酸からなるペプチドを用いて、抗ＳＭＹＤ２ポリクローナル抗体(HPYISEIKQEIESH; Operon Biotechnology, Tokyo, Japan)を作製し、アフィニティ精製後の抗体を用いた。SMYD2の抗体検定はKYSE150株をポジティブコントロールとし、HLE、KYSE510をネガティブコントロールとした。また、KYSE200、KYSE510にpCMV-3tag1A−SMYD2を過剰発現させてFLAGtag抗体或いはSMYD2抗体で検出することでも確認を行った（図１３）。コントロールとして抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）にて一次検出後、パーオキシダーゼ結合二次抗体にてｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い発色、検出した。
【００９５】
結果を図６に示す。図６に示す通り、ｍRNAの発現とほぼ相関して高頻度に発現していることを確認した。
【００９６】
実施例７：WST assay (colorimetric water-soluble tetrazolium salt assay)によるＥＳＣＣ細胞の増殖抑制効果の確認
ＥＳＣＣ細胞増殖に対するＳＭＹＤ２発現の過剰効果を調べるため、WST assay (colorimetric water-soluble tetrazolium salt assay)による解析を行った。具体的な実験方法を以下に示す。
【００９７】
ｍＲＮＡの発現レベルの減少は、実施例３と同様の方法にて解析した。ＳＭＹＤ２遺伝子に対応するｓｉＲＮＡは  ＧＣＡＡＡＧＡＵＣＡＵＣＣＡＵＡＵＡＵＵＵ（配列番号３）とデザインし購入（シグマ社）した。また、コントロールのｓｉＲＮＡとしてルシフェラーゼ遺伝子に対応する  ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ（配列番号４）を購入（シグマ社）した。合成したｓｉＲＮＡ（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｓｉＲＮＡ  ＭＡＸ試薬（インビトロジェン社）を用いる（製品プロトコールで処理）ことで、それぞれのＥＳＣＣ細胞株に遺伝子導入された。
【００９８】
結果を図７に示す。ＳＭＹＤ２が増幅／過剰発現している細胞については、非特異的なｓｉＲＮＡのコントロールに比べＳＭＹＤ２に特異的なｓｉＲＮＡにより、２４から７２時間後にＳＭＹＤ２のｍＲＮＡの発現が、大きく抑制されることをＲＴ−ＰＣＲ法にて確認した。また内在性ＳＭＹＤ２タンパクの発現が抑制されていることをウェスタン・ブロット法により確認した。コントロールとして抗β−アクチン抗体を用いた。また、特異的ｓｉＲＮＡによるＳＭＹＤ２の発現抑制しWST assay、FACS解析を行ったところ、SMYD2高発現株のKYSE150、KYSE790ではノックダウンにより、トランスフェクション後72時間のWSTassay で40％以上の細胞増殖抑制効果を認め、FACS解析でG1-Sアレストを認めた。またこの時p21が発現誘導されることをRT-PCR法、ウェスタン・ブロット法で確認した。一方、ＥＳＣＣ４３株のうち、ＳＭＹＤ２の発現が蛋白レベルで極めて低い細胞株ＫＹＳＥ２２０、ＫＹＳＥ２００を用いて上記と同様にｓｉＲＮＡでノックダウンを行い増殖抑制効果比較したところ、ＳＭＹＤ２低発現株ではＳＭＹＤ２ノックダウンによる増殖抑制効果は殆ど認めず、FACS解析でもG1-Sアレストを認めず、p21の発現誘導もRT-PCR法、ウェスタン・ブロット法で認めなかった。これらの細胞株ではWSTassayのみならず、real-time RT-PCR、ウェスタン・ブロット法でも確認を行った。以上により、ＳＭＹＤ２蛋白発現レベルに応じた増殖抑制効果（ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）がみられたことから、ＳＭＹＤ２標的分子として治療に用いる場合、ＳＭＹＤ２発現の低い正常組織での影響が少なく、副作用が低くなる可能性がわかった。上記の通り、SMYD2の増幅株KYSE150でのＳＭＹＤ２ノックダウンでは、ＲＮＡレベル、蛋白レベル、細胞増幅の肉眼的所見でもコントロールに比較して著しい増殖抑制効果を認めた（図７）。
【００９９】
実施例８：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法を用いたＳＭＹＤ２遺伝子の作用機序（ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ）の解析
ＥＳＣＣ細胞の細胞周期に対するＳＭＹＤ２の作用機序を明らかにするため、ＳＭＹＤ２高発現のＫＹＳＥ１５０、ＫＹＳＥ７９０、ＳＭＹＤ２低発現株のＫＹＤＥ２２０、ＫＹＳＥ２００を用いて、ＳＭＹＤ２特異的ｓｉＲＮＡを導入した細胞とコントロール細胞の細胞周期をＦＡＣＳ解析で比較した（図７）。
【０１００】
具体的には、細胞はトリプシン処理後、７０％エタノール液にオーバーナイトで固定化処理し、引き続きＲＮａｓｅＡ（４０Ｕ／ｍｌ）で２０分、さらにＰＢＳバッファーのＰＩ液（２０ｇ／ｍｌ）で３０分処理をした。細胞のＤＮＡ量はＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒおよびＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（共にＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にて解析された。実験は３回おこなった。
【０１０１】
結果を図７に示す。解析の結果、ｓｉＲＮＡ−ＳＭＹＤ２によるノックダウンにより、ＳＭＹＤ２高発現株ではコントロールと比べＧ０／Ｇ１を分画の割合の著しい増加を認めた。一方、ＳＭＹＤ２低発現株ではコントロールと殆ど差を認めなかった。ＳＭＹＤ２はＧ１／Ｓチェックポイントで細胞サイクルを活性化して癌細胞増殖に関与していることが明らかとなった。
【０１０２】
実施例９：ＳＭＹＤ２遺伝子のノックダウンによる、ｐ５３標的分子活性化有無の確認。
実施例７と同様の方法にて、食道扁平上皮癌細胞株でＳＭＹＤ２をノックダウンしｐ５３の標的分子が活性化されるかどうかを確認した。
その結果、mRNAレベルで細胞周期停止の指標となるｐ２１が活性化されることがわかった。ウェスタン・ブロット法でも同様に確認された。FACSの結果から、p21が誘導されることでG1/Sアレストを生じていることが明らかとなった（図７）。また、SMYD2高発現株でかつp53mutation(+)のKYSE150や、SaOS2（p53null）でもSMYD２ノックダウンによりp21の発現誘導が認められることから、p53を介さずにp21が誘導され細胞周期を起こすことが明らかとなった。SMYD２は一部でp53とindependentにp21を抑制し、細胞サイクルを活性化して癌細胞増殖に関与していることが明らかとなった（図７、図９及び図１４）。
【０１０３】
実施例１０：コロニーフォーメーションアッセイによるSMYD２遺伝子過剰発現系における細胞増殖能について
コロニーフォーメーションアッセイにより、SMYD２遺伝子過剰発現系における細胞増殖能を調べた。具体的には、SMYD2低発現株であるKYSE200株、KYSE510株にpＣＭＶ-3tag1A-empty vector, pＣＭＶ-3tag1A-SMYD2, pＣＭＶ-3tag1A-SMYD2 MD(methylation defective mutant of SMYD2)をリポフェクトアミン2000を用いてトランスフェクションし、24時間後に細胞を回収し各プラスミドベクターからの蛋白の発現をWestern blotで確認した。同時に、1x104個/mlでシャーレに細胞をまき、24時間後にG418（Neomycin）でセレクションを開始してコロニー形成能を評価した。
【０１０４】
結果を図８に示す。左がKYSE200株、右がKYSE510株で施行した結果を示している。上段はpＣＭＶ-3tag1A-empty vector, pＣＭＶ-3tag1A-SMYD2, pＣＭＶ-3tag1A-SMYD2 MD(methylation defective mutant of SMYD2)をトランスフェクションした蛋白をWestern blotで示した。中段はシャーレのコロニー形成写真、下段はコロニーカウントを示したグラフである。KYSE200、KYSE510のいずれにおいてもSMYD２を過剰発現させた場合、コントロールと比較してコロニー形成能が亢進した。一方、SMYD2のmutantを導入した場合、コントロールと比較してコロニー形成能の亢進は認めなかった（図８）。
【０１０５】
上記の結果に基づき、既知の報告を黒線、実施例１から１０までの細胞生物学的実験データで考えられる内容を黒点線で表記すると、図９のようにまとめられる。
【０１０６】
実施例１１：食道扁平上皮癌におけるＳＭＹＤ２タンパクの高発現の確認および予後との対応について
ＥＳＣＣでのＳＭＹＤ２の発現状態を調べるため、１５３の原発性食道癌検体の免疫組織化学染色を行った（図１０の上段）。また、治療後の経過日数と生存率の関係を生存曲線（図１０の下段）で示した。
【０１０７】
免疫組織化学染色法はABC法で行った。具体的な方法としては、パラフィン包埋した組織切片をホルマリン固定することでおこなった。シランコートされたガラススライド上の切片は、脱パラフィン化とエタノールによる段階的な脱水をおこなった。抗原は、９５℃で４０分間１０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ  ６．０）中で温浴処理した。内因性ペルオキシダーゼは５％過酸化水素を用いて阻害した。次に、Avidin Biotin Blocking Kit（VECTOR社, Cat No.SP-2001）を用いて、プロトコールに準じてAvidin、Biotin Block処理を行った。次に１次抗体としてSMYD2抗体を200倍希釈させ、４度で一晩反応させた。翌朝洗浄し、２次抗体として、Biotin標識２次抗体を100倍希釈で１時間反応させた。洗浄後、ABC Kit (VECTOR社,Cat No.PK-4000)を用いプロトコールに準じてAvidin 100倍希釈、Viotin 100倍希釈混合液をサンプルにかけ約1時間反応させた。洗浄し、TBS（Tris-Buffered Saline pH7.6 ＋0.3% tween 20）になじませ、DABで発色させた。マイヤー ヘマトキシリンを用いて対比染色した。流水洗浄し、エタノール上昇系列で脱水し、キシロールで透徹した。
【０１０８】
ＳＭＹＤ２の免疫染色パターンを図１０の上段に示す。正常食道粘膜では染色されず、腫瘍では浸潤部で特に強い陽性所見を認めた。１５３検体中１１７検体が免疫染色陽性であった。また、図１０の下段に示す通り、ＳＭＹＤ２蛋白高発現症例は極めて予後不良であることが明らかとなった（ｐ＜０．００５）。
【０１０９】
実施例１２：床病理学的因子との対応
上述の１５３の原発性食道癌検体と臨床病理学的因子との比較検討では、ＳＭＹＤ２蛋白高発現症例では有意に静脈浸潤が陽性で、腫瘍深達度が深く、再発頻度が高かった（表３）。Ｃｏｘ比例ハザードモデルによる多変量解析ではＳＭＹＤ２が独立した予後因子であることが明らかとなった（表４）。
【０１１０】
【表３】
2010220577.tif 000004
【０１１１】
【表４】
2010220577.tif 000005
【０１１２】
実施例１３：ｐ５３の発現パターンと予後の相関解析、およびｐ５３とＳＭＹＤ２の発現の相関解析
ｐ５３の発現パターンと予後を解析した結果を図１１の上段に示す。また、免疫組織化学染色法によるｐ５３タンパクの発現量を解析した結果を図１１の下段に示す。
ｐ５３タンパクの免疫組織化学染色で陽性または陰性の症例で予後に差を認めなかった（図１１）。また、ｐ５３の発現とＳＭＹＤ２発現には相関関係を認めなかった。
【０１１３】
実施例１４：ＳＭＹＤ２／ｐ５３のタンパク発現有無と予後の相関
免疫組織学的染色によるＳＭＹＤ２とｐ５３のタンパク発現の有無と、予後の関連の相関解析を行った。
【０１１４】
結果を図１２に示す。ｐ５３陰性（正常ｐ５３）かつＳＭＹＤ２陽性症例が最も予後不良であった。逆に、ｐ５３陰性（正常ｐ５３）かつＳＭＹＤ２発現陰性症例は極めて予後良後であることがわかった。  また、ＳＭＹＤ２はｐ５３の発現とは独立した予後因子であることが明らかとなった（図１２）。
【０１１５】
図１３では、作製したSNYD２特異抗体の精度評価をしめす。HLE（肝癌細胞株）、KYSE200、KYSE510をネガティブコントロール、KYSE150をポジティブコントロールとした。また、pＣＭＶ-3tag4A-SMYD2によるKYSE200、KYSE510の過剰発現系でも評価した。
【０１１６】
図１４では、SaOS2(ｐ53 null 株)でのSMYD2ノックダウンでp21が発現誘導されることを確認した。つまり、SMYD2はp53とは独立して細胞増殖にかかわる可能性があることが示唆された。
【０１１７】
（結論）
実施例１から１４の結果をまとめると以下の通りである。
（１）アレイＣＧＨ法によるスクリーニングから、１ｑ３２−１ｑ４１の遺伝子領域が、食道癌の新しい癌マーカーとなることを見出した。
（２）その中で、１ｑ３２−１ｑ４１の染色体領域に含まれるＳＭＹＤ２遺伝子が、より好ましい癌マーカーとなることを見出した。
（３）ＳＭＹＤ２遺伝子の発現は食道癌の細胞増殖を促進していることが明らかとなった。
【図１】
2010220577.tif 000006
【図２】
2010220577.tif 000007
【図３】
2010220577.tif 000008
【図４】
2010220577.tif 000009
【図５】
2010220577.tif 000010
【図６】
2010220577.tif 000011
【図７】
2010220577.tif 000012
【図８】
2010220577.tif 000013
【図９】
2010220577.tif 000014
【図１０】
2010220577.tif 000015
【図１１】
2010220577.tif 000016
【図１２】
2010220577.tif 000017
【図１３】
2010220577.tif 000018
【図１４】
2010220577.tif 000019
【配列表】
2010220577000001.app