(57)【要約】      （修正有）【課題】生物系を使用して生成されたいくつかの新規なＰＨＡ（ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノエート］）ポリマー組成物を提供する。【解決手段】ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、アシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびヒドロキシアシルＣｏＡシンテターゼからなる群から選択される１以上酵素を発現する細胞系に、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシプロピオネート、２−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、および５−ヒドロキシバレレートのようなモノマーを基質として提供することによって、ポリマーを蓄積させることからなる。【選択図】図１
2010213700.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌系に、
１）２−ヒドロキシブチレート；
２）３−ヒドロキシプロピオネート；
３）４−ヒドロキシバレレート；
４）３−ヒドロキシブチレートおよび４−ヒドロキシバレレート；および
５）５−ヒドロキシバレレート、
からなる群より選択される１以上の基質を提供することによって生成される、ポリマーを作製するための細菌系であって、該細菌系は、ポリマーが蓄積するように、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、並びにアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびヒドロキシアシルＣｏＡシンテターゼからなる群から選択される１以上の酵素を発現し、
ここで、該ポリマーが、
ポリ（３−ヒドロキシブチレートコ−４−ヒドロキシバレレート）、
ポリ（４−ヒドロキシバレレート）、
ポリ（３−ヒドロキシプロピオネートコ−５−ヒドロキシバレレート）、
ポリ（５−ヒドロキシバレレート）、
ポリ（２−ヒドロキシブチレートコ−３−ヒドロキシブチレート）、
ポリ（３−ヒドロキプロピオネート）、
ポリ（３−ヒドロキシブチレートコ−２−ヒドロキシブチレート）、および
ポリ（２−ヒドロキブチレート）
からなる群より選択される、細菌系。
【請求項２】
前記ポリマーが、ポリ（２−ヒドロキシブチレート）およびポリ（２−ヒドロキシブチレートコ−３−ヒドロキシブチレート）からなる群より選択される、請求項１に記載の細菌系。
【請求項３】
前記ポリマーが、２−ヒドロキシブチレート、並びに３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、および６−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される１以上の基質を提供することによって生成される、請求項１に記載の細菌系。
【請求項４】
前記ポリマーが、ポリ（２−ヒドロキシブチレートコ−４−ヒドロキシバレレート）である、請求項１に記載の細菌系。
【請求項５】
前記細菌系が、前記酵素をコードする１以上の遺伝子を発現するように遺伝子操作されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌系。
【請求項６】
アシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびヒドロキシアシルＣｏＡシンテターゼからなる群より選択される１以上の酵素を発現するように遺伝子操作された細菌系。
【請求項７】
細菌系においてポリマーを作製する方法であって、
１）２−ヒドロキシブチレート；
２）３−ヒドロキシプロピオネート；
３）４−ヒドロキシバレレート；
４）３−ヒドロキシブチレートおよび４−ヒドロキシバレレート；および
５）５−ヒドロキシバレレート、
からなる群から選択される１以上の基質を細菌系に提供する工程を包含し、
該細菌系は、ポリマーが蓄積するように、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、並びにアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびヒドロキシアシルＣｏＡシンテターゼからなる群から選択される１以上の酵素を発現し；
ここで、該ポリマーが、
ポリ（３−ヒドロキシブチレートコ−４−ヒドロキシバレレート）、
ポリ（４−ヒドロキシバレレート）、
ポリ（３−ヒドロキシプロピオネートコ−５−ヒドロキシバレレート）、
ポリ（５−ヒドロキシバレレート）、
ポリ（２−ヒドロキシブチレートコ−３−ヒドロキシブチレート）、
ポリ（３−ヒドロキプロピオネート）、
ポリ（３−ヒドロキシブチレートコ−２−ヒドロキシブチレート）、および
ポリ（２−ヒドロキブチレート）
からなる群より選択される、方法。
【請求項８】
前記細菌系が、前記酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
２−ヒドロキシブチレート、並びに３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、および６−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される１以上の基質を提供する工程を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記１以上の基質が、２−ヒドロキシブチレートおよび４−ヒドロキシバレレートである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
細菌系においてポリマーを作製する方法であって、該細菌系において３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡを形成する基質を提供する工程を包含し、
ここで、該細菌系が、ポリマーが蓄積するように、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、並びにアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびヒドロキシアシルＣｏＡシンテターゼからなる群より選択される１以上の酵素を発現し、
ここで、該ポリマーが、ポリ（３−ヒドロキプロピオネート）およびポリ（３−ヒドロキシプロピオネートコ−５−ヒドロキシバレレート）から選択される、方法。
【請求項１２】
細菌系においてポリマーを作製する方法であって、該細菌系において４−ヒドロキシバレリルＣｏＡを形成する基質を提供する工程を包含し、
ここで、該細菌系が、ポリマーが蓄積するように、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、並びにアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびヒドロキシアシルＣｏＡシンテターゼからなる群より選択される１以上の酵素を発現し、
ここで、該ポリマーが、ポリ（３−ヒドロキブチレートコ−４−ヒドロキシバレレート）およびポリ（４−ヒドロキシバレレート）から選択される、方法。
【請求項１３】
前記細菌系が前記酵素の１以上を発現するように遺伝子操作されている、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
生物系においてポリマーを作製する方法であって、２−ヒドロキシ酪酸を含む１以上の基質を提供する工程を包含し、
ここで、該生物系が、２−ヒドロキシ酪酸を含むポリマーが蓄積するように、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、アシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびヒドロキシアシルＣｏＡシンテターゼからなる群より選択される１以上の酵素を発現するよう遺伝子操作されている、方法。
【請求項１５】
生物系が、酵素をコードする１以上の異種遺伝子を発現する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２−ヒドロキシブチレートと、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシプロピオネート、４−ヒドロキシバレレートおよび４−ヒドロキシブチレートからなる群から選択される少なくとも１種のモノマーとのコポリマーを作製する、請求項１４に記載の方法であって、
２−ヒドロキシブチレートに加えて、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシプロピオネート、４−ヒドロキシバレレートおよび４−ヒドロキシブチレートからなる群から選択される少なくとも１種のモノマーを提供する工程；および
前記モノマーを４−ヒドロキシブチレートＣｏＡトランスフェラーゼと共にインキュベートする工程、
とを更に包含する、方法。
【請求項１７】
生物系が、所望のポリマー組成物の産生に必要とされる酵素のみ発現されるよう、酵素発現が防止されるように遺伝子操作されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
生物系が突然変異により操作される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
生物系が酵素発現または活性を増強するように遺伝子操作される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
生物系においてポリマーを作製する方法であって、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシバレレート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、４−ヒドロキシヘキサノエート、および６−ヒドロキシヘキサノエートからなる群から選択される１以上の基質を提供する工程を包含し；
ここで、該生物系が、細菌、酵母、真菌、および植物からなる群から選択され、
さらに、該生物系が、１以上の基質を含むポリマーが蓄積するように、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、アシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびヒドロキシアシルＣｏＡシンテターゼからなる群より選択される酵素を発現し；
ここで、ポリマーが、ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）、ポリ（３−ヒドロキシプロピオネートコ−５−ヒドロキシバレレート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレートコ−４−ヒドロキシバレレート）、ポリ（４−ヒドロキバレレート）、およびポリ（５−ヒドロキバレレート）からなる群より選択される、方法。
【請求項２１】
生物系が酵素をコードする１以上の異種遺伝子を発現する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
生物系が細菌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
生物系が植物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ポリマーがポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ポリマーがポリ（３−ヒドロキシプロピオネートコ−５−ヒドロキシバレレート）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
ポリマーがポリ（３−ヒドロキシプロピオネートコ−４−ヒドロキシバレレート）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
ポリマーがポリ（４−ヒドロキシバレレート）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
ポリマーがポリ（５−ヒドロキシバレレート）である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第６０／０８６，３９６号（１９９８年５月２２日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
多くの微生物が、ＰＨＡポリマーの細胞内貯蔵を蓄積する能力を有する。ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノエート］（ＰＨＡ）は、再生可能な供給源から生成される、生分解性かつ生体適合性熱可塑性材料であり、広範な産業上の適用および生体医学適用を有する（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ  ２６、３８−４４）。文献（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，１９９５，ＦＥＭＳ  Ｍｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８；２１９−２２８）で報告されるように、約１００の異なるモノマーが、ＰＨＡポリマーに組込まれ、そしてそれらの代謝の生物学および遺伝学が、最近総説されている（ＨｕｉｓｍａｎおよびＭａｄｉｓｏｎ，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３）。
【０００３】
今日まで、ＰＨＡは、開発量で利用可能である、コポリマーであるポリ（２−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢＶ）のみに、限定された商業的利用能が見い出されてきた。このコポリマーは、細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａの発酵によって生成されてきた。他のＰＨＡ型についての発酵および回収工程もまた、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅならびに遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａを含む範囲の細菌を利用して開発され、そして最近総説されている（Ｂｒａｕｎｅｇｇら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６５：１２７−１６１；ＣｈｏｉおよびＬｅｅ，１９９９．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５１：１３−２１）。より伝統的なポリマー合成アプローチもまた試験されており、これらには、対応するラクトンの直接縮合および開環重合が挙げられる（ＪｅｓｕｄａｓｏｎおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ、１９９４、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２７：２５９５−２６０２）。
【０００４】
モノマー４−ヒドロキシブチレートを含むＰＨＡポリマー（ＰＨＢ４ＨＢ、Ｄｏｉ，Ｙ．１９９５，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８，５８５−５９９）または４−ヒドロキシバレレートおよび４−ヒドロキシヘキサノエート含有ＰＨＡポリエステルの合成は記載されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，５０７−５１４、ならびにＶａｌｅｎｔｉｎら、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０，７１０−７１６）。これらのポリステルは、ＰＨＢＶについて元来記載された方法に類似する方法を使用して製造され、この方法は、微生物にモノマーのＰＨＡポリエステル内への組み込みを強制するように、比較的広範な非炭水化物供給源を摂食させる。ＰＨＢ４ＨＢコポリマーは、再度広範なポリマーを提供する広範なモノマー組成物を用いて生成される（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｈｉｒａｍｉｔｓｕ，Ｍ．およびＤｏｉ，Ｙ．，１９９６，Ｐｏｌｙｍ．Ｉｎｔ．３９：１６９）。
【０００５】
３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシプロピオネートのＰＨＡコポリマーもまた、記載されている（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、１９９４、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２７：４４２９−４４３５；Ｃａｏら、１９９７、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９８：３５３９−３５５７）。高レベルの３−ヒドロキシプロピオネートは、これらのコポリマーに８８モル％で組み込まれる（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、１９９４、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２７：４４２９−４４３５）。
【０００６】
４−ヒドロキシバレレートを含むＰＨＡターポリマーは、４−ヒドロキシバレレートまたはレブリン酸上で遺伝子操作したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ株を摂食させ、この株に３成分のＰＨＡ、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレート−４−ヒドロキシバレレート）が生じることによって生成されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−５１４；ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＧｒｅｎｆｌｏ，１９９７，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．１２３：６１−６６）。４−ヒドロキシバレレートを含む２成分のポリマーまたはポリ（４−ヒドロキシバレレート）のホモポリマーを生成するために生物学的系を開発することが望ましい。ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＧｏｒｅｎｆｌｏ（１９９７、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．１２３：６１−６６）の結果は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａがレブリン酸を４−ヒドロキシバレレートへ変換する能力を有することを示す。
【０００７】
Ｈｅｉｎら（１９９７）は、トランスジェニックＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを使用してポリ−４ＨＶを合成することを試みたが、成功しなかった。これらの細胞は、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＡシンターゼおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉの４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするプラスミドを保持した。このトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉに４ＨＶ、□−バレロラクトン（□−ｖａｌｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、またはレブリン酸を摂食させた場合、これらは、少量のＰＨＢホモポリマーのみを生成した。
【０００８】
産業上の理由のために、ある範囲の定義されたＰＨＡホモポリマー、コポリマーおよびターポリマー組成物を生成することが可能であることが明らかに望ましい。このことを達成するために、個々の酵素の対応するＰＨＡ生合成経路の利用能を制御することが可能であることが望ましい。
【０００９】
従って、ある範囲の定義されたＰＨＡホモポリマー、コポリマーおよびターポリマー組成物を提供することが本発明の目的である。
【００１０】
個々の酵素の対応するＰＨＡ生合成経路の利用能を制御するための方法および材料を提供することは、本発明の別の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｒａｕｎｅｇｇら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６５：１２７−１６１
【非特許文献２】ＣｈｏｉおよびＬｅｅ，１９９９．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５１：１３−２１
【非特許文献３】Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，５０７−５１４
【非特許文献４】Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０，７１０−７１６
【非特許文献５】Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、１９９４、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２７：４４２９−４４３５
【非特許文献６】Ｃａｏら、１９９７、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９８：３５３９−３５５７
【非特許文献７】ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＧｒｅｎｆｌｏ，１９９７，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．１２３：６１−６６
【発明の概要】
【００１２】
生物学的系を使用して生成されたいくつかの新規なＰＨＡポリマー組成物としては、３−ヒドロキシブチレート（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、３−ヒドロキシプロピオネート（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、２−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート（ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、および５−ヒドロキシバレレートのようなモノマーが挙げられる。これらのＰＨＡ組成物は、例えば、３−ヒドロキシヘキサノエート（ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ）、４−ヒドロキシヘキサノエート、６−ヒドロキシヘキサノエート、または７以上の炭素を含む、他のより長鎖の３−ヒドロキシ酸を含むさらなるモノマーを組込むように容易に伸長され得る。これは、天然のＰＨＡ生成者を取得し、そして化学的変異またはトランスポゾン変異を介して変異を与え、所望しない活性をコードする遺伝子を欠失または不活性化することによって達成され得る。あるいは、その株は、所望のポリマー組成物の生成に必要とされるこれらの酵素のみを発現するよう遺伝子操作され得る。ＰＨＡ生成微生物を遺伝子操作するための方法は、当該分野で広く公知である（ＨｕｉｓｍａｎおよびＭａｄｉｓｏｎ，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３）。これらのポリマーは、医用領域、産業領域および他の商業的領域において種々の使用を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、レブリン酸からポリ−４−ヒドロキシバレレートへの経路の概略図である。
【図２】図２は、ＩａｃＩ（誘導物質）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびｈｂｃＴ遺伝子を含む、プラスミドｐＦＳ１６の構築物の概略図である。
【図３】図３は、ＩａｃＩ（誘導物質）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼ（ｐｈａＣ）遺伝子、およびｈｂｃＴ遺伝子を含む、プラスミドｐＦＳ３０の構築物の概略図である。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
いくつかの新規なＰＨＡポリマー組成物が、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシプロピオネート、２−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、および５−ヒドロキシバレレートのようなモノマーを組込むように、生物学的系を使用して生成されている。これらのＰＨＡ組成物は、例えば、３−ヒドロキシヘキサノエート、４−ヒドロキシヘキサノエート、６−ヒドロキシヘキサノエート、または７以上の炭素を含む、他のより長鎖の３−ヒドロキシ酸を含むさらなるモノマーを組込むように容易に伸長され得る。単一の構成物かまたはコモノマーのいずれかとしてこれらのモノマーの１以上を含むＰＨＡを合成するトランスジェニック生物体を操作するための技術および手順が開発されている。これらの系において、このトランスジェニック生物体は、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（正式には、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、またはＰＨＡを合成し得る他の微生物）、あるいは高等植物または植物の構成要素（例えば、油料穀物（Ｂｒａｓｓｉｃａ、ヒマワリ、ダイズ、コーン、ベニバナ、アマ、ヤシまたはココナッツ）あるいはデンプン蓄積植物（ジャガイモ、タピオカ、カサバ）の種子）のいずれかである。
【００１５】
組換えＥ．ｃｏｌｉ株における効果的なＰＨＡ合成のために、この経路に関与する全ての遺伝子の発現が十分であることが重要である。この目的のために、目的の遺伝子は、染色体外ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）から発現され得、この染色体外ＤＮＡ分子は、コピー数の効果およびその結果の高い発現レベルを内因的に生じるか、または、より好ましくは、目的の遺伝子は、染色体から発現され得る。汎用型産物の大規模の発酵については、プラスミドベースの系が、プラスミドの維持の過負荷および安定的な発現の問題に起因して十分なものでないことが、一般的に公知である。これらの欠点は、発現が十分かつ安定であるように、目的の遺伝子に先行する転写シグナルおよび翻訳シグナルを改善することによって染色体にコードされる酵素を使用して克服され得る。
【００１６】
生物学的系は、モノマーをポリマーに変換するために、必要な場合１以上の酵素を発現しなければならない。適切な基質としては、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシプロピオネート、２−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、４−ヒドロキシヘキサノエート、６−ヒドロキシヘキサノエート、および７以上の炭素を含む、他のより長鎖の３−ヒドロキシ酸が挙げられる。これらの酵素としては、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、アシルＣｏＡトランスフェラーゼおよびヒドロキシアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ならびにヒドロキシアシルＣｏＡシンテターゼが挙げられる。これらの酵素は、生物学的系（例えば、細菌、酵母、真菌または植物）においてポリマー（例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−４−ヒドロキシバレレート）、ポリ（４−ヒドロキシバレレート）、ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート−コ−５−ヒドロキシバレレート）、ポリ（２−ヒドロキシブチレート）、ポリ（２−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシブチレート）、およびポリ（３−ヒドロキシプロピオネート））を生成するために、これらの基質と共に使用され得る。
【００１７】
必要とされる酵素をコードする遺伝子は、複数の供給源から獲得され得る。Ｐｅｏｐｌｅｓらに対する、米国特許第５，７９８，２３５号および同第５，５３４，４３２号は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、レダクターゼおよびチオラーゼを記載する。Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来の４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼが、ＷｉｌｌａｄｓｅｎおよびＢｕｃｋｅｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）７０：１８７−１９２に記載されるか、またはＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼが、ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，８７１−８８０に記載される。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ由来のアシル補酵素Ａシンテターゼは、ＨｉｉおよびＣｏｕｒｔｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８２．１５０（２），９８１−９８３に記載される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ由来のヒドロキシアシルトランスフェラーゼは、ＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒおよびＢｕｃｋｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２，２０６（２）、５４７−５５２によって記載される。
【００１８】
効果的なＰＨＡ生成のために、種菌生育および生成過程の継続時間中にバイオポリマーを合成する能力を損失しないことが重要である。任意のｐｈａ遺伝子の損失は、産物の損失を生じる。両方が望ましくなく、従って、株の安定した増殖が必要とされる。トランスフェラーゼまたはシンターゼをコードする遺伝子を単に組込むことは、有意なポリマー生成を生じないかもしれない。酵素の発現は、プロモーター領域の改変または変異あるいは他の公知の技術を経て増強され、その後ポリマー生成についてスクリーニングされ得る。これらの組換えＰＨＡ生成者の増殖および形態は、染色体上のｐｈａ遺伝子の存在によって解決されない。
【００１９】
本発明は、以下の制限されない実施例を参照することによってさらに理解される。
【実施例１】
【００２０】
（実施例１  Ｅ．ｃｏｌｉにおける４−ヒドロキシバレレートおよびグルコースからのポリ（３ＨＢ−コ−４ＨＶ））
【００２１】
（ｐＦＳ１６の構築）
プラスミドｐＴｒｃＮは、ｐＴｒｃ９９ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の誘導体であり；ｐＴｒｃＮと区別するその改変は、ＮｃｏＩでの消化、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでの処理、および自己連結による、ＮｃｏＩ制限部位の除去である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードするｏｒｆＺ遺伝子は、標的ＤＮＡとしてプラスミドｐＣＫ３（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０）および以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−ＴＣＣＣＣＴＡＧＧＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧ−３’
（ｏｒｆＺ  ５’  ＡｖｒＩＩ）
５’−ＣＣＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＣ−３’
（ｏｒｆＺ  ３’  ＳａｌＩ）
を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からのキットを使用して増幅した。
【００２２】
生じたＰＣＲ産物を、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼがＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−グルコピラノシド）誘導性ｔｒｃプロモーターから発現され得るように、ＡｖｒＩＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、そしてＸｂａＩ（これらはＡｖｒＩＩに適合可能である）およびＳａｌＩで消化したｐＴｒｃＮに連結し、プラスミドｐＦＳ１６を形成した。
【００２３】
（ｐＦＳ３０の構築）
プラスミドｐＦＳ３０を、（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：９３１１−９３２０）に記載されるような強力なＥ．ｃｏｌｉリボソーム結合部位を付加することによって改変された、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）遺伝子（ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−１５３０３）を付加することによってｐＦＳ１６から誘導した。プラスミドｐＡｅＴ４１４を、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａプロモーターおよびｐｈａＣ構造遺伝子が、１つのフラグメント上に存在するように、ＸｍａＩおよびＳｔｕＩで消化した。ｐＦＳ１６をＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作製し、次いで、ＸｍａＩで切断した。従って、得られた２つのＤＮＡフラグメントを共に連結して、ｐＦＳを形成した。この構築物において、ＰＨＢシンターゼおよび４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのｐｈｂＣプロモーター（ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−１５３０３）から発現される。ＰＨＢシンターゼおよび４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼを発現する他の適切なプラスミドは、（Ｈｅｉｎら、１９９７、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５３：４１１−４１８；ＶａｌｅｎｔｉｎおよびＤｅｎｎｉｓ，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：３３−３８）に記載されている。
【００２４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＢＸ７６９は、その染色体内に組込まれたＰＨＡシンターゼを有する。この株は、染色体外遺伝子の存在なしに、グルコースからポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を合成し得る。ＭＢＸ７６９はまた、ｆａｄＲ（脂肪酸分解経路のリプレッサーおよび多くの他の細胞機能のエフェクター）を欠損し、ｒｐｏＳ（定常期の遺伝子発現のレギュレーター）を欠損し、そしてａｔｏＡ（アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼの１つのサブユニット）を欠損している。ＭＢＸ７６９はまた、ａｔｏＣ（アセトアセテート系のポジティブレギュレーター）を構成的に発現する。
【００２５】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉの４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼの発現を可能にするプラスミドｐＦＳ１６（図２）を保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＭＢＸ７６９を、２５０ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する１００ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃、２００ｒｐｍで振盪して前培養した。１６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：４．１または１２．４ｇの４−ヒドロキシバレレート（４ＨＶ）ナトリウム；５ｇ／Ｌの４−ヒドロキシブチレート（４ＨＢ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有する１００ｍＬの培地中に再懸濁した。４−ヒドロキシバレレートナトリウムは、水酸化ナトリウム溶液中でγ−バレロラクトンの加水分解によって得た。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養した同じフラスコで３２℃、２００ｒｐｍで振盪して培養した。４．１ｇ／Ｌの４−ヒドロキシバレレートナトリウムが最初に存在する場合、この細胞は、乾燥細胞重量の５２．６％までポリマーを蓄積し、このポリマーは、６３．４％の３ＨＢユニットおよび３６．６％の４ＨＢユニットからなり、４ＨＶユニットを含まなかった。
【００２６】
１２．４ｇ／Ｌの４ＨＶナトリウムが最初に存在する場合、この細胞は、乾燥細胞重量の４５．９％までポリマーを蓄積し、このポリマーは、９５．５％の３ＨＢユニットおよび４．５％の４ＨＶユニットからなるが、検出可能な４ＨＢユニットは含まなかった。ＰＨＢ−コ−４ＨＶポリマーの正体を、全細胞のクロロホルム抽出、続いて、濾過、濾過物からのポリマーのエタノール沈殿、およびこのポリマーの水での洗浄によって得られた固体産物の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析によって検証した。このポリマーをまた、以下のように行う、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって検証した。抽出したポリマー（１〜２０ｍｇ）または凍結乾燥全細胞（１５〜５０ｍｇ）を、５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノール、および１０％の濃塩酸からなる３ｍＬのプロパノール溶解（ｐｒｏｐａｎｏｌｙｓｉｓ）溶液中、１００℃で５時間インキュベートした。生じた混合物の水溶性成分を、３ｍＬの水での抽出によって除去した。有機相（２ｍｌ／分の全体流速で、１：５０のスプリット比で１μＬ）を、ＳＰＢ−１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；０．３２ｍｍ  ＩＤ；０．２５μｍフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ）上で、以下の温度プロフィールで分析した：８０℃、２分；２５０℃まで、１０℃／分；２５０℃、２分。ポリマー中の４ＨＶユニットの存在について試験するために使用されるスタンダードは、γ−バレロラクトンであり、これは４−ヒドロキシバレレート酸のように、プロパノール溶解（ｐｒｏｐａｎｏｌｙｚｅｄ）の際にプロピル４−ヒドロキシバレレートを形成する。ポリマー中の３ＨＢユニットについて試験するために使用されるスタンダードは、ＰＨＢであった。
【実施例２】
【００２７】
（実施例２  Ｅ．ｃｏｌｉにおける４−ヒドロキシバレレートからのポリ（４ＨＶ））
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＢＸ１１７７は、グルコースからポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を合成し得ない。ＭＢＸ１１７７は、ＤＨ５□株の自発性変異体であり、炭素源として４−ヒドロキシブチレート酸を使用し得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉの４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＡシンターゼの発現を可能にするプラスミドｐＦＳ３０（図２）を保持するＭＢＸ１１７７を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する１００ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃で振盪して前培養した。
【００２８】
１６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：５ｇの４−ヒドロキシバレレート（４ＨＶ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末；１００ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地中に再懸濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養した同じフラスコで３０℃、２００ｒｐｍで振盪して培養した。
【００２９】
この細胞は、乾燥細胞重量の０．２５％までポリマーを蓄積し、このポリマーは、１００％の４ＨＶユニットからなった。このポリ（４ＨＶ）ポリマーの正体を、水で洗浄し、そして５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノール、および１０％の濃塩酸の混合物中で、１００℃で５時間プロパノール溶解した全細胞のＧＣ分析によって、スタンダードとしてγ−バレロラクトンを用いて検証した。
【実施例３】
【００３０】
（実施例３  Ｅ．ｃｏｌｉにおける２−ヒドロキシブチレートおよびグルコースからのポリ（３ＨＢ−コ−２ＨＢ））
プラスミドｐＦＳ１６を保持するＭＢＸ７６９を、２５０ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含有する１００ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃、２００ｒｐｍで振盪して前培養した。１６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：５ｇの２−ヒドロキシブチレート（２ＨＢ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地中に再懸濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養した同じフラスコで３３℃、１５０ｒｐｍで振盪して培養した。この細胞は、乾燥細胞重量の１９．０％までポリマーを蓄積し、このポリマーは、９９．７％の３ＨＢユニットおよび０．３％の２ＨＢユニットからなった。このポリ（３ＨＢ−コ−２ＨＢ）ポリマーの正体を、全細胞のクロロホルム抽出、続いて、濾過、濾液からのポリマーエタノール沈殿、およびこのポリマーの水での洗浄によって得られた固体産物のＧＣ分析によって検証した。このポリマーをまた、水で洗浄し、そして５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノール、および１０％の濃塩酸の混合物中、１００℃で５時間、プロパノール溶解させた全細胞のＧＣ分析により、スタンダードとしてＰＨＢおよび２−ヒドロキシブチレートナトリウムを用いて検証した。
【実施例４】
【００３１】
（実施例４  Ｅ．ｃｏｌｉにおける２−ヒドロキシブチレートからのポリ（２ＨＢ））
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＢＸ１８４は、グルコースからポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を合成し得ない。ＭＢＸ１８４は、ｆａｄＲを欠損し、そしてａｔｏＣを構成的に発現する。
【００３２】
プラスミドｐＦＳ３０を保持するＭＢＸ１８４を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する１００ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃で前培養した。１６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：５ｇの２−ヒドロキシブチレート（２ＨＢ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地中に再懸濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養した同じフラスコで３３℃、１５０ｒｐｍで振盪して培養した。
【００３３】
この細胞は、乾燥細胞重量の１．０％までポリマーを蓄積し、このポリマーは、１００％の２ＨＢユニットからなった。このポリ（２ＨＢ）ポリマーの正体を、水で洗浄し、そして５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノール、および１０％の濃塩酸の混合物中、１００℃で５時間プロパノール溶解した全細胞のＧＣ分析により、スタンダードとして２−ヒドロキシブチレートを用いて検証した。
【実施例５】
【００３４】
（実施例５  １，３−プロパンジオールから、および１．５−ペンタンジオールからのポリ−３ＨＰおよびポリ−３ＨＰ−コ−５ＨＶ）
プラスミドｐＦＳ３０を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＢＸ１８４を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する１００ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃で前培養した。１６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：１０ｇの１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）または１，５−ペンタンジオール（１，５−ＰＤ）；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地中に再懸濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養した同じフラスコで３０℃、２００ｒｐｍで振盪して培養した。ジオール基質が１，３−ＰＤであった場合、この細胞は、乾燥細胞重量の７．０％までポリマーを蓄積し、このポリマーは、全体的に３ＨＢユニットからなった。ジオール基質が１，５−ＰＤであった場合、この細胞は、乾燥細胞重量の２２．１％までポリマーを蓄積し、９０％を超える３−ヒドロキシプロピオネートユニットおよび１０％未満の５−ヒドロキシバレレートユニットからなった。このポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）ポリマーの正体を、全細胞の次亜塩素酸ナトリウム抽出、続いて、遠心分離およびこのポリマーの水での洗浄によって得られた固体産物のＮＭＲ分析によって検証した。この両方のポリマーの正体を、５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノール、および１０％の濃塩酸の混合物中、１００℃で５時間、プロパノール溶解させた次亜塩素酸ナトリウム抽出したポリマーのＧＣ分析により、スタンダードとしてβ−プロピオラクトンおよびδ−バレロラクトンを用いて検証した。
【実施例６】
【００３５】
（実施例６  ５−ヒドロキシバレレートからのポリ−５ＨＶ）
ｐＦＳ３０を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＭＢＸ１１７７を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する５０ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃で前培養した。８時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：１０ｇの５−ヒドロキシバレレート（５ＨＶ）ナトリウム；５ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地中に再懸濁した。５ＨＶナトリウムをδ−バレロラクトンのけん化によって得た。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養した同じフラスコで３０℃、２００ｒｐｍで振盪して培養した。９０％の１−ブタノール、および１０％の濃塩酸の混合物中、１１０℃で５時間ブタノール溶解（ｂｕｔａｎｏｌｙｚｅｄ）した凍結乾燥全細胞を用いて、ＧＣ分析を実行した；スタンダードは、５−ヒドロキシバレレートナトリウムであった。この分析物は、この細胞が乾燥細胞重量の１３．９％までポリ（５ＨＶ）を蓄積したことを示した。このポリ（５−ヒドロキシバレレート）ポリマーの正体を、全細胞の１，２−ジクロロエタン抽出、続いて、遠心分離およびこのポリマーの水での洗浄によって得られた固体産物のＮＭＲ分析によって検証した。
【図１】
2010213700.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【配列表】
2010213700000001.app
【外国語明細書】
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