(57)【要約】【課題】微量な反応液でのＰＣＲ定量反応を実現するとともに、効率よく検査を行うことが可能な生体試料反応容器を得る。【解決手段】透明基板１０２と、透明基板１０２に貼り合わされた核酸検出シート５０を備え、透明基板１０２は、核酸検出シート５０と貼り合わせる面が開口した複数の反応チャンバー１０３と、反応チャンバー１０３に繋がる反応液定量用流路１０４及び反応液導入用流路１０５とを備え、核酸検出シート５０は、フィルムシート５１と、フィルムシート５１上に設けられ、反応チャンバー１０３に重なるプライマー塗布領域５２と、フィルムシート５１と透明基板１０２を接着するための粘着剤５３とを備える。【選択図】図１
2010213649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明基板と、
前記透明基板に貼り合わされた核酸検出シートと、を備え、
前記透明基板は、
前記核酸検出シートと貼り合わせる面が開口した複数の反応室と、
前記反応室に繋がる流路と、
を備え、
前記核酸検出シートは、
フィルムシートと、
前記フィルムシート上に設けられ、前記反応室の開口に対向するプライマー塗布領域と、
前記フィルムシートと前記透明基板を接着するための粘着剤と、を備えた生体試料反応容器。
【請求項２】
前記反応室毎に貼り合わされる複数の前記核酸検出シートを備え、
各々の核酸検出シートは、１つの前記プライマー塗布領域のみを備えていることを特徴とする請求項１に記載の生体試料反応容器。
【請求項３】
貼り合わせの際、前記透明基板に対して前記核酸検出シートの貼り合わせ位置を案内するガイド構造を備えていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体試料反応容器。
【請求項４】
前記プライマー塗布領域は、プライマー溶液を吸収させる多孔質体を備えていることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体試料反応容器。
【請求項５】
前記核酸検出シートを挟んで前記透明基板と反対側に設けられた熱伝導体を備え、
前記熱伝導体は、前記反応室に対向する前記核酸検出シート側に向かって突出した凸部を備えていることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体試料反応容器。
【請求項６】
透明基板と、
前記透明基板に貼り合わされた核酸検出シートと、を備え、
前記透明基板は、
前記核酸検出シートと貼り合わせる面が開口した複数の反応室と、
前記反応室に繋がる流路と、
を備え、
前記核酸検出シートは、
フィルムシートと、
前記フィルムシート上に設けられ、前記反応室の開口に対向するプライマー塗布領域と、
前記フィルムシートと前記透明基板を接着するための粘着剤と、を備えた生体試料反応容器を用いた生体試料反応方法であって、
前記プライマー塗布領域に、プライマーを塗布する第１工程と、
前記透明基板と前記核酸検出シートを貼り合わせる第２工程と、
前記流路を通して前記反応室に前記反応液を充填する第３工程と、
前記反応室に対向する凸部を備えた加熱手段上に、前記核酸検出シート側を下にして、前記凸部と前記反応室が対向するように前記生体試料反応容器を配置する第４工程と、
前記生体試料反応を行い、その結果を検出する第５工程と、を有する生体試料反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅などの生体試料反応を行うための、生体試料反応容器及び生体試料反応方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液や組織細胞などの検体に、疾病に由来する遺伝子が含まれるか否かを検査する手法の一つとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いた遺伝子の定量法が知られている。ＰＣＲ法は、ＤＮＡポリメラーゼという酵素の作用により、検体中の目的の遺伝子を増幅させる反応であり、増幅された遺伝子を蛍光標識によって検出することにより、検体に含まれる目的の遺伝子を定量することができる。
【０００３】
ＰＣＲ反応は、従来ＰＣＲチューブやＰＣＲプレートと呼ばれる反応容器を用いて行うことが一般的であり、検出反応には２０〜５０μｌの反応液（検体と試薬を含む）が必要となる。ＰＣＲ反応に用いられる試薬は高価なため、大量の検体の検査を行うにはコストがかかり、病院などの医療現場での活用はまだ少ない。
【０００４】
特許文献１には、ＰＣＲ反応を行うための反応ボリュームの低減を目的とした、複数の反応チャンネルを有する反応容器が提案されている。
また、特許文献２や３には、回転駆動装置を使用して、ＰＣＲ反応溶液や血液などの液状の検体試料を複数のチャンバーに正確に流し込む方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３５５１９１７号公報
【特許文献２】特許第３６９９７２１号公報
【特許文献３】特開２００６−１２６０１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１では、各反応チャンネルへの反応液の分注にはディスペンサーが用いられており、複数の反応チャンネルへのディスペンサーによる分注は、時間がかかる上に作業が煩雑である。
また、特許文献２や３では、複数のプライマーを同時に反応させる多項目同時検出について考慮されていないため、１回の反応で１検体について１種類の遺伝子の検出しか行うことができない。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、微量な反応液でのＰＣＲ定量反応を実現するとともに、効率よく検査を行うことが可能な生体試料反応容器及び生体試料反応方法を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る生体試料反応容器は、透明基板と、透明基板に貼り合わされた核酸検出シートとを備え、透明基板は、核酸検出シートと貼り合わせる面が開口した複数の反応室と、反応室に繋がる流路とを備え、核酸検出シートは、フィルムシートと、フィルムシート上に設けられ、反応室の開口に対向するプライマー塗布領域と、フィルムシートと透明基板を接着するための粘着剤とを備えている。
これにより、ピペットやディスペンサーで定量することが難しい非常に少量の反応液を容易に扱うことが可能となる。また、一度に複数の反応室で異なる配列のプライマーを用いた処理を行うことができるため、煩雑な分注作業を行わずに多項目の検査を効率よく行うことができる。さらに、透明基板と核酸検出シートの貼り合わせは粘着剤によっておこなうため、接着剤を用いる場合のように接着剤の硬化のための紫外線照射処理や加熱処理を行う必要がなく、これらの処理によるプライマー活性の低下を防ぐことができる。
【０００９】
また、反応室毎に貼り合わされる複数の核酸検出シートを備え、各々の核酸検出シートは、１つのプライマー塗布領域のみを備えていても良い。
これにより、利用者は、プライマーの配置、すなわち検査項目の配置を自由に設定することができる。また、検査項目の追加や変更にも柔軟に対応することができる。
【００１０】
また、貼り合わせの際、透明基板に対して核酸検出シートの貼り合わせ位置を案内するガイド構造を備えていることが望ましい。
これにより、透明基板と核酸検出シートを正確な位置関係で貼り合わせることができる。
【００１１】
また、プライマー塗布領域は、プライマー溶液を吸収させる多孔質体を備えるようにしてもよい。
プライマーを塗布する際に、プライマー溶液を多孔質体に吸収させるようにすることにより、プライマー塗布領域からプライマー溶液が溢れることを防止できる。
【００１２】
また、本発明に係る生体試料反応容器は、核酸検出シートを挟んで透明基板と反対側に設けられた熱伝導体をさらに備え、熱伝導体は、反応室に対向する核酸検出シート側に向かって突出した凸部を備えるようにしてもよい。
これにより、反応室を塞ぐ部分の核酸検出シートを、凸部で加圧することができるため、反応室からの液漏れを防止することができる。さらに、凸部において反応室を選択的に加温することができるので、反応液への熱伝達が早く、処理時間を短縮することができる。
【００１３】
本発明に係る生体試料反応方法は、透明基板と、透明基板に貼り合わされた核酸検出シートとを備え、透明基板は、核酸検出シートと貼り合わせる面が開口した複数の反応室と、反応室に繋がる流路とを備え、核酸検出シートは、フィルムシートと、フィルムシート上に設けられ、反応室の開口に対向するプライマー塗布領域と、フィルムシートと透明基板を接着するための粘着剤と、を備えた生体試料反応容器を用い、プライマー塗布領域に、プライマーを塗布する第１工程と、透明基板と核酸検出シートを貼り合わせる第２工程と、流路を通して反応室に反応液を充填する第３工程と、反応室に対向する凸部を備えた加熱手段上に、核酸検出シート側を下にして、凸部と反応室が対向するように生体試料反応容器を配置する第４工程と、生体試料反応を行い、その結果を検出する第５工程と、を有するものである。
これにより、ピペットやディスペンサーで定量することが難しい非常に少量の反応液を容易に扱うことが可能となる。また、一度に複数の反応室で異なる配列のプライマーを用いた処理を行うことができるため、煩雑な分注作業を行わずに多項目の検査を効率よく行うことができる。さらに、透明基板と核酸検出シートの貼り合わせは粘着剤によっておこなうため、接着剤を用いる場合のように接着剤の硬化のための紫外線照射処理や加熱処理を行う必要がなく、これらの処理によるプライマー活性の低下を防ぐことができる。
【００１４】
また、加熱手段の凸部によって、反応室を塞ぐ部分の核酸検出シートを加圧することができるため、反応室からの液漏れを防止することができる。さらに、凸部において反応室を選択的に加温することができるので、反応液への熱伝達が早く、処理時間を短縮することができる。また、加熱手段が凹凸構造を有することで、加熱手段自体の熱容量を低減することができ、処理時間の短縮を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１による生体試料反応用カートリッジの概略構成を示す上面図、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＢ−Ｂ断面図である。
【図２】図２（Ａ）は、本発明の実施の形態１による核酸検出シートの概略構成を示す上面図、図２（Ｂ）は図２（Ａ）のＢ−Ｂ断面図である。
【図３】核酸検出シートにプライマーを塗布する工程を示す図である。
【図４】貼り合わせ前の透明基板を示す図である。
【図５】生体試料反応用カートリッジの内部を減圧するための装置の例を示す模式図である。
【図６】生体試料反応用カートリッジに反応液を充填する方法を説明する模式図である。
【図７】生体試料反応用カートリッジに遠心力をかけるための遠心装置の概略構成を示す図である。
【図８】本発明の実施の形態１による、生体試料反応方法を説明する図である。
【図９】図９（Ａ）は、本発明の実施の形態２による生体試料反応用カートリッジの断面図、図９（Ｂ）は、実施の形態２による核酸検出シートの上面図である。
【図１０】本発明の実施の形態３による生体試料反応用カートリッジの断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００１７】
実施の形態１．
図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１による生体試料反応用カートリッジ（生体試料反応容器）１０の概略構成を示す上面図、図１（Ｂ）は図１（Ａ）のＢ−Ｂ断面図である。図に示すように、生体試料反応用カートリッジ１０は、透明基板１０２、反応チャンバー（反応室）１０３、反応液定量用流路１０４、反応液導入用流路１０５、反応液供給口１０６、排気用開口部１０７、核酸検出シート５０を備えている。
【００１８】
図１に示すように、生体試料反応用カートリッジ１０は、透明基板１０２と核酸検出シート５０を貼り合わせて構成されている。透明基板１０２には、複数の反応チャンバー１０３、複数の反応液定量用流路１０４、反応液導入用流路１０５、反応液供給口１０６、排気用開口部１０７が形成されている。透明基板１０２は、例えばポリカーボネートなどの自家蛍光の少ない透明樹脂を用いて、射出成型により形成することができる。
【００１９】
反応チャンバー１０３は、底部が開口しており、核酸検出シート５０と貼り合わせることによって、開口部を密閉することができる。透明基板１０２の核酸検出シート５０に対する貼り合わせ面には、核酸検出シート５０を正確な位置に貼り合わせできるように案内するガイド構造１０８が設けられている。また、後述するように、核酸検出シート５０にも対応するガイド構造が設けられている。
【００２０】
反応液定量用流路１０４は反応液導入用流路１０５に直交し、一端が反応チャンバー１０３に繋がっている。反応液供給口１０６は反応液導入用流路１０５の上流端に連なっており、排気用開口部１０７は反応液導入用流路１０５の下流端に連なっている。また、反応液供給口１０６および排気用開口部１０７は、透明基板１０２の反応チャンバー１０３の開口部と反対側の面に開口している。
【００２１】
反応チャンバー１０３は、例えば直径５００μｍの円形状で、深さ１００μｍに形成されている。反応液定量用流路１０４及び反応液導入用流路１０５は、反応液の流れる方向に垂直な断面が、幅１００μｍ、深さ１００μｍに形成されている。また、反応液定量用流路１０４は、反応液の流れる方向に沿った方向の長さが３ｍｍに形成されている。反応チャンバー１０３の容積は、反応液定量用流路１０４の容積よりも小さく形成されている。
【００２２】
なお、反応チャンバー１０３、反応液定量用流路１０４、及び反応液導入用流路１０５は、気泡の吸着を防止するため内壁面が親液性となるように表面処理を施しておくことが望ましい。また、反応チャンバー１０３、反応液定量用流路１０４、及び反応液導入用流路１０５の内壁面にはタンパク質などの生体分子の非特異吸着を抑制する表面処理が施されていることが望ましい。
【００２３】
核酸検出シート５０の反応チャンバー１０３の開口部に重なる領域には、予めＰＣＲ用のプライマーＰが乾燥状態で塗布されている。プライマーは、増幅しようとするＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の両端の配列に相補的な配列を有する短い核酸の断片であり、プライマーが結合した部分を起点としてＤＮＡが増幅される。それぞれの領域には異なる配列を持つプライマーＰが塗付されており、これにより、各々の反応チャンバー１０３内で同時に多種類の遺伝子についてのＰＣＲが行えるようになっている。
【００２４】
図２（Ａ）は、透明基板１０２と貼り合わされる前の核酸検出シート５０の概略構成を示す上面図、図２（Ｂ）は図２（Ａ）のＢ−Ｂ断面図である。図に示すように、核酸検出シート５０は、フィルムシート５１と、フィルムシート５１上に設けられた複数のプライマー塗布領域５２、フィルムシート５１上に塗布された粘着剤５３、核酸検出シート５０と透明基板１０２を貼り合わせる際に、正確な位置に貼り合わせできるように案内するガイド構造５４を備えている。
【００２５】
各々のプライマー塗布領域５２は、透明基板１０２と貼り合わせた際に、反応チャンバー１０３の開口部に重なる位置に形成されている。それぞれのプライマー塗布領域５２には異なるプライマーが塗付されており、予めプライマーが塗布されていないプライマー塗布領域５２も含まれる。
【００２６】
粘着剤５３は、フィルムシート５１の透明基板１０２に対する貼り合わせ面の、プライマー塗布領域５２以外の領域に一様に塗布されている。粘着剤５３には、アクリル系粘着剤やシリコーン系粘着剤を用いることができる。なお、粘着剤５３は、フィルムシート５１の透明基板１０２に対する貼り合わせ面の全面に塗布されていても良い。
【００２７】
ガイド構造５４は、透明基板１０２のガイド構造１０８と対応して設けられた凹凸構造などである。例えば、透明基板１０２のガイド構造１０８として円筒状や四角柱状などの凸形状を設けた場合には、核酸検出シート５０のガイド構造５４として、透明基板１０２のガイド構造１０８に対応する位置に、その凸形状に合わせた孔や凹部を設けることができる。透明基板１０２と核酸検出シート５０を貼り合わせる際に互いのガイド構造を合わせることにより、正確な位置関係で貼り合わせることができる。これにより、反応チャンバー１０３の開口部を、プライマー塗布領域５２で塞ぐことができる。
【００２８】
図２（Ｂ）に示すように、核酸検出シート５０の透明基板１０２に対する貼り合わせ面は保護フィルム８０で覆われている。透明基板１０２と貼り合わせる際は、この保護フィルム８０を剥がして貼り合わせる。
【００２９】
上述したように、プライマー塗布領域５２の中には、何も塗布されていない領域が含まれている。このような領域には、図３に示すように、利用者が任意のプライマーＰ１を塗布することができる。プライマーの塗布は、マイクロピペット、ディスペンサー、インクジェットヘッド等を用いて、所定の領域にプライマー溶液を滴下し乾燥させることにより行う。これにより、予め核酸検出シート５０に塗布されていないプライマーを用いた検査も同時に行うことが可能である。
プライマーを塗布したら、図４に示す透明基板１０２と粘着剤５３を介して貼り合わせる。
【００３０】
次に、生体試料反応用カートリッジ１０に反応液を充填する方法を説明する。
まず、図５に示すように、生体試料反応用カートリッジ１０を、圧力計２３を備えた密閉容器２０に入れ、真空ポンプ２１により６０ｋＰａまで減圧する。これにより、生体試料反応用カートリッジ１０の内部（反応チャンバー１０３、反応液定量用流路１０４、及び反応液導入用流路１０５の内部）が６０ｋＰａになる。生体試料反応用カートリッジ１０の反応液供給口１０６には、反応液充填用のシリンジポンプ２２を接続し、密閉容器２０内を６０ｋＰａに保ったまま、シリンジポンプ２２を用いて反応液導入用流路１０５内に反応液を供給する。
【００３１】
反応液には、増幅対象となるターゲット核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、及びヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、増幅された核酸に結合する、Ｔａｑｍａｎ(登録商標)プローブなどの蛍光プローブが反応に適した所定の濃度で含まれている。蛍光プローブの代わりに、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎのような二本鎖結合蛍光色素を用いても良い。
ターゲット核酸は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出したＤＮＡ、または抽出したＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡなどを用いることができる。
【００３２】
なお、生体試料反応用カートリッジ１０内部の減圧は、図５に示すような密閉容器２０を用いる方法に限らず、排気用開口部１０７に直接真空ポンプ２１を接続して行っても良い。
【００３３】
次に、生体試料反応用カートリッジ１０の内部の圧力を大気圧に戻す。図６（Ａ）に示すように、反応液導入用流路１０５内に反応液を供給した段階では、反応液は反応液導入用流路１０５内に留まり、反応液定量用流路１０４へは流入していかない。これは、反応液定量用流路１０４とそれに接続する反応チャンバー１０３の中の気圧と毛管力が均衡するためである。ここで生体試料反応用カートリッジ１０内部の圧力を大気圧に戻すと、図６（Ｂ）に示すように、反応液導入用流路１０５から反応液定量用流路１０４内へ一定量Ｖの反応液が浸入する。液量Ｖは、最終的に反応チャンバー１０３に充填される反応液の液量となる。
【００３４】
ここで、初めに生体試料反応用カートリッジ１０内部を減圧した際の設定圧力をＰｃ（ここでは６０ｋＰａ）、反応チャンバー１０３の容積をＶ１、反応液定量用流路１０４の容積をＶ２、大気圧（≒１００ｋＰａ）をＰ０、反応液定量用流路１０４内から反応チャンバー１０３に導入する反応液の液量をＶとすると、式（１）の関係が成り立つ。
Ｖ／（Ｖ１＋Ｖ２）＝（Ｐ０−Ｐｃ）／Ｐ０・・・（１）
【００３５】
よって、液量Ｖは、以下の式（２）で求めることができる。
Ｖ＝（Ｖ１＋Ｖ２）×（Ｐ０−Ｐｃ）／Ｐ０・・・（２）
【００３６】
ここでは、Ｐｃ＝６０ｋＰａなので、Ｐ０＝１００ｋＰａとすると、反応チャンバー１０３と反応液定量用流路１０４を足した容積（Ｖ１＋Ｖ２）の４０％に相当する反応液が、各々の反応液定量用流路１０４に流入する。
【００３７】
なお、設定圧力Ｐｃは、大気圧Ｐ０の５０％以上かつ大気圧Ｐ０より小さいことが望ましい。
圧力Ｐｃを大気圧Ｐ０の５０％以上かつ大気圧Ｐ０より小さくすることにより、反応液導入用流路１０５から反応液定量用流路１０４内に導入される液量は、反応チャンバー１０３と反応液定量用流路１０４を足した容積（Ｖ１＋Ｖ２）の５０％以下となる。上述したようにＶ１＜Ｖ２とすれば、反応液定量用流路１０４に流れ込む液量がこの範囲であれば反応液が反応チャンバー１０３まで到達してしまうことはない。もし反応液が反応チャンバー１０３まで流入してしまうと、予め反応チャンバー１０３内に塗付してある試薬が反応液中に溶け出し、反応液定量用流路１０４及び反応液導入用流路１０５を介して隣接する反応チャンバー１０３とコンタミネーションをおこす可能性がある。
【００３８】
次に、図６（Ｃ）に示すように、シリンジ等を用いて、反応液導入用流路１０５に残留する反応液を吸引除去する。次に、反応液供給口１０６と排気用開口部１０７を粘着シート等でシールし、生体試料反応用カートリッジ１０を図７に示すような遠心装置３０を用いて回転させる。
図７に示すように、遠心装置３０の回転テーブル３１上に生体試料反応用カートリッジ１０を固定し、遠心装置３０を回転させることにより、生体試料反応用カートリッジ１０には、反応液定量用流路１０４から反応チャンバー１０３に向かう方向に遠心力がかかる。
【００３９】
生体試料反応用カートリッジ１０に遠心力がかかることにより、反応液定量用流路１０４内の反応液が反応チャンバー１０３内に移動する。反応チャンバー１０３内の空気は反応液よりも比重が軽いため反応液定量用流路１０４を通って反応液導入用流路１０５内へ押し出され、反応液と入れ替わることにより、反応チャンバー１０３が反応液で満たされる。
【００４０】
次に、回転を停止し、反応液供給口１０６から、ピペット等を用いて反応液導入用流路１０５にミネラルオイルを供給する。さらに、遠心装置３０で生体試料反応用カートリッジ１０を回転させることにより、反応液導入用流路１０５と反応液定量用流路１０４にミネラルオイルを充填する。この時、反応液の比重がミネラルオイルよりも重いので、反応チャンバー１０３内の反応液はミネラルオイルと入れ替わらない。これにより、個々の反応チャンバー１０３を分離して、反応チャンバー１０３間でのコンタミネーションを防止することができる。また、反応処理中に、反応チャンバー１０３内が乾燥することを防止することもできる。なお、ミネラルオイルの代わりに反応液よりも比重が軽く、反応液と混和せず反応液よりも蒸発しにくい液体であれば用いることができる。
【００４１】
以上のような手順で生体試料反応用カートリッジ１０に反応液を充填したら、次に、ＰＣＲ処理を行う。反応液供給口１０６と排気用開口部１０７を封止し、図８に示すように、生体試料反応用カートリッジ１０を、核酸検出シート５０側を下にしてヒートブロック（加熱手段）６０上に配置する。
【００４２】
図に示すように、ヒートブロック６０は、反応チャンバー１０３に重なる凸部６１を有している。これにより、凸部６１で反応チャンバー１０３の開口部を塞いでいる核酸検出シート５０を加圧し、反応チャンバー１０３からの液漏れを防止することができる。ヒートブロック６０は所定の温度を数分の周期で繰り返して生体試料反応用カートリッジ１０を加温する。一般的には、まず、９４℃で２本鎖ＤＮＡを解離させる工程を実行し、次に、プライマーを約５５℃でアニーリングする工程を実行し、次に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用して約７２℃で相補鎖の複製を行う工程を含むサイクルを繰り返す。
【００４３】
本実施形態によるヒートブロック６０は、凸部６１において生体試料反応用カートリッジ１０の反応チャンバー１０３と接触しているため、反応チャンバー１０３を選択的に加温することができるので反応液への熱伝達が早いという利点もある。
【００４４】
ＰＣＲ反応後、生体試料反応用カートリッジ１０の上面から、各反応チャンバー１０３内の蛍光輝度を測定し、各々のプライマーによって増幅したＤＮＡを定量する。蛍光輝度の測定には、フォトダイオードやＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ）、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）などの蛍光検出に用いられる汎用機構を用いる。
【００４５】
また、反応の１サイクル毎に蛍光輝度を測定することにより、リアルタイム定量ＰＣＲを行うこともできる。特定の蛍光輝度に到達したサイクル数から、増幅前のターゲット核酸の量を算出することができる。
【００４６】
以上のように、本実施形態によれば、遠心力を利用して、反応液導入用流路１０４を通して反応チャンバー１０３内に反応液を供給することにより、ピペットやディスペンサーで定量することが難しい非常に少量の反応液でのＰＣＲ定量反応が可能となる。また、一度に多数の反応チャンバー１０３内で異なる配列のプライマーを用いた処理を行うことができるため、煩雑な分注作業を行わずに多項目の検査を効率よく行うことができる。
【００４７】
また、核酸検出シート５０のプライマー塗布領域５２には、予めプライマーが塗布されていない領域を含むようにしたので、利用者が検査項目に合わせて任意のプライマーを塗布することにより、検査項目の追加や変更に簡単に対応することができる。
【００４８】
また、透明基板１０２と核酸検出シート５０の貼り合わせは粘着剤によっておこなうため、接着剤を用いる場合のように接着剤の硬化のための紫外線照射処理や加熱処理を行う必要がなく、これらの処理によるプライマー活性の低下を防ぐことができる。
【００４９】
また、ＰＣＲ反応に用いるヒートブロック６０は、生体試料反応用カートリッジ１０の反応チャンバー１０３を塞ぐ核酸検出シート５０を加圧する凸部６１を有しているため、反応チャンバー１０３からの液漏れを防止することができる。さらに、凸部６１において反応チャンバー１０３を選択的に加温することができるので、反応液への熱伝達が早く、処理時間を短縮することができる。また、ヒートブロック６０が凹凸構造を有することで、ヒートブロック６０自体の熱容量を低減することができ、処理時間の短縮を図ることができる。
【００５０】
なお、生体試料反応用カートリッジ１０の構造は、図１に示すものに限られず、透明基板１０２に核酸検出シート５０に対する貼り合わせ面が開口した複数の反応チャンバー１０３と、反応チャンバー１０３に反応液を導入するための流路が備えられたものであればよい。貼り合わせる核酸検出シート５０は、反応チャンバー１０３に対応したプライマー塗布領域５２を有していれば良い。
【００５１】
また、生体試料反応用カートリッジ１０への反応液の充填方法は、本実施形態ではカートリッジ１０内の減圧と遠心力を用いているが、生体試料反応用カートリッジ１０の構造等に適した方法を任意に選択することができる。
【００５２】
さらに、核酸検出シート５０のプライマー塗布領域５２に、プライマー溶液を吸収させる多孔質体を配置してもよい。プライマーを塗布する際に、プライマー溶液を多孔質体に吸収させるようにすることにより、プライマー塗布領域５２からプライマー溶液が溢れることを防止できる。特に、微量の検体を分注する生体試料反応容器においては、一つの反応チャンバー１０３の容量は小さく、これに対応する核酸検出シート５０のプライマー塗布領域５２の面積も小さくなるため、プライマー塗布領域５２に反応するのに十分な量のプライマー溶液を塗布できない可能性がある。しかし、プライマー塗布領域５２に多孔質体を配置することにより、プライマー塗布領域５２の面積が小さくても多量のプライマー溶液を塗布できる。多孔質体としては、ニトロセルロースやナイロン、ポリカーボネート等で形成された膜を用いることができる。
【００５３】
実施の形態２．
図９（Ａ）は、本発明の実施の形態２による生体試料反応用カートリッジ１１の断面図、図９（Ｂ）は、実施の形態２による核酸検出シート５５の上面図である。図に示すように、実施の形態２では、生体試料反応用カートリッジ１１は複数の核酸検出シート５５を備えている。また、１つの核酸検出シート５５は、１つのプライマー塗布領域５２のみを有しており、反応チャンバー１０３毎に貼り合わせることができるようになっている。また、実施の形態１と同様に、透明基板１０２と核酸検出シート５５の両方に、核酸検出シート５５を正確な位置に貼り合わせできるように案内するガイド構造を設けるようにしてもよい。
【００５４】
実施の形態２によれば、利用者は、プライマーの配置、すなわち検査項目の配置を生体試料反応用カートリッジ１１上で自由に設定することができる。また、検査項目の追加や変更にもより柔軟に対応することができる。
【００５５】
実施の形態３．
図１０は、本発明の実施の形態３による生体試料反応用カートリッジ１２の断面図である。図に示すように、実施の形態３では、生体試料反応用カートリッジ１２は、核酸検出シート５０を挟んで透明基板１０２と反対側に、熱伝導体７０を備えている。
【００５６】
熱伝導体７０は、反応チャンバー１０３に重なる核酸検出シート５０側に向かって突出した凸部７１を有している。これにより、凸部７１で反応チャンバー１０３の開口部を塞いでいる核酸検出シート５０を加圧し、反応チャンバー１０３からの液漏れを防止することができる。
【００５７】
実施の形態３によれば、熱伝導体７０が、実施の形態１で用いた凸部６１を有するヒートブロック６０と同様の役割を果たすので、ヒートブロックには一般的な構造のものを用いても、反応チャンバー１０３からの液漏れを防止することができる。さらに、凸部７１において反応チャンバー１０３を選択的に加温することができるので、反応液への熱伝達が早く、処理時間を短縮することができる。
【符号の説明】
【００５８】
１０，１１，１２  生体試料反応用カートリッジ、１０２  透明基板、１０３  反応容器、１０４  反応液定量用流路、１０５  反応液導入用流路、１０６  反応液供給口、１０７  排気用開口部、１０８  ガイド構造、２０  密閉容器、２１  真空ポンプ、２２  シリンジポンプ、２３  圧力計、３０  遠心装置、３１  回転テーブル、５０，５５  核酸検出シート、５１  フィルムシート、５２  プライマー塗布領域、５３  粘着剤、５４  ガイド構造、６０  ヒートブロック、６１  凸部、７０  熱伝導体、７１  凸部、８０  保護フィルム
【図１】
2010213649.tif 000003
【図２】
2010213649.tif 000004
【図３】
2010213649.tif 000005
【図４】
2010213649.tif 000006
【図５】
2010213649.tif 000007
【図６】
2010213649.tif 000008
【図７】
2010213649.tif 000009
【図８】
2010213649.tif 000010
【図９】
2010213649.tif 000011
【図１０】
2010213649.tif 000012