(57)【要約】【課題】グルコースからα−グルカンを効率よく製造する方法を提供すること。【解決手段】グルコースと、ポリリン酸と、プライマーと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法であって、反応開始時の該溶液中のグルコース濃度は、１００ｍＭ〜２０００ｍＭであり、反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ５．７〜ｐＨ１２であり、反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）が０．１５以下である、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースと、ポリリン酸と、プライマーと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のグルコース濃度は、１００ｍＭ〜２０００ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ５．７〜ｐＨ１２であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）が０．１５以下である、方法。
【請求項２】
前記反応開始時の前記溶液中のグルコース濃度が２００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応開始時の前記溶液中のグルコース濃度が５００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ７．４〜ｐＨ１１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記α−グルカンがアミロースである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液が、ゲスト化合物を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
グルコース−６−リン酸と、プライマーと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のグルコース−６−リン酸濃度は、２０ｍＭ〜２０００ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ６．７〜ｐＨ１１であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコース−６−リン酸のモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）が０．４以下である、方法。
【請求項９】
前記反応開始時の前記溶液中のグルコース−６−リン酸濃度が１００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ７．３〜ｐＨ１１である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記α−グルカンがアミロースである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶液が、ゲスト物質を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
セロビオースと、ポリリン酸と、プライマーと、セロビオースホスホリラーゼと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のセロビオース濃度は、１００ｍＭ〜３５０ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ１１であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とセロビオースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）が２．０以下である、方法。
【請求項１５】
前記反応開始時の前記溶液中のセロビオース濃度が１２０ｍＭ〜３５０ｍＭである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ５．６〜ｐＨ１１である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記α−グルカンが、アミロースである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液が、ゲスト物質を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースからα−グルカンを製造する方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、セロビオースからα−グルカンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間は、デンプンなどのα−グルカンを消化してエネルギー源として利用している。そのため、α−グルカンは、人類にとってエネルギー源として非常に重要である。さらに、α−グルカンは、食品産業をはじめ、医薬、化粧品、化学工業、製紙、繊維などにおける原料としても幅広く利用されている。特に、アミロースは、種々の機能を有するので、幅広い分野での利用が期待されている。
【０００３】
近年、人口増加により食糧危機が問題視されており、植物の生産するデンプンだけでは将来エネルギー源が不足すると予想されている。
【０００４】
一方、人間は、セルロースなどのβ−グルカンを消化できないので、エネルギー源として利用することができず、β−グルカンは、食物繊維成分としてのみ利用されている。それゆえ、β−グルカンを食糧危機問題の解決には利用できない。しかし、β−グルカンの年間生産量は、デンプンの約２万倍と推定されており、枯渇の心配はない。そのため、β−グルカンを、人間がエネルギー源とし得る物質に変換する種々の試みが行われている。
【０００５】
例えば、セルロースをグルコースまで分解し、エタノール醗酵に利用することが検討されている。グルコースは、セルロース以外にも、種々の糖類を変換することにより入手することができる。グルコースは安価で大量に入手可能な原料である。グルコースは人間によって代謝され得るが、甘すぎるため、エネルギー源として大量に摂取することができない。また、グルコースは極めて水溶性が高いため、水分を含む食品中では固形物としてのテクスチャー（食感）を持つことができない。
【０００６】
他方、α−グルコースの直鎖状ポリマーであるα−グルカン（例えば、デンプン）は、通常人間によって摂食されており、大量摂取することが可能である。それゆえ、グルコースを原料として、α−グルカンのようなテクスチャーを持ちかつ甘くない素材を合成することができれば、非常に有用である。
【０００７】
さらに、上記のように、セルロースはバイオマス資源として豊富に存在し、枯渇の心配がない。そのため、セルロース資源を原料としたα−グルコースポリマーの合成技術が開発されれば食糧危機問題の解決に大きな貢献ができる。しかし、これまでにそのような技術は開示されていない。
【０００８】
本願発明で利用する種々の酵素反応の従来技術について以下に説明する。
【０００９】
図１の（１）に示すように、グルコースおよびポリリン酸にポリホスフェートグルコキナーゼ（ＰＧＫ）を作用させると、グルコース−６−リン酸（Ｇ６−Ｐ）が生成する。この反応は公知であり、例えば、非特許文献１および２に記載されている。
【００１０】
図１の（２）に示すように、グルコースまたはグルコース−１，６−ビスホスフェートをコファクターとし、Ｇ６−Ｐにホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）が作用することによりグルコース−１−リン酸（Ｇ１−Ｐ）が生成する。この反応は公知であるが、これは、植物体内におけるデンプン合成反応や動物の肝臓や筋肉細胞あるいは微生物におけるグリコーゲン合成反応の一部であり、進行するためにエネルギーを必要とし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧ１−Ｐ合成方法としての先行技術はない。逆にＧ１−ＰにＰＧＭを作用させることによりＧ６−Ｐを生成する技術は多く存在する。ＰＧＭによる酵素反応は平衡反応であるが、Ｇ６−Ｐが非常に安定であるために、９９％以上がＧ６−Ｐとなる（非特許文献３を参照のこと）。すなわち、（２）の反応は、Ｇ６−Ｐ生成側に非常に大きく傾いている。このことを利用して、Ｇ１−Ｐ濃度をＧ６−Ｐ経由で測定する方法が確立されている（非特許文献４を参照のこと）。しかし、Ｇ６−ＰからＧ１−Ｐを生成することはｉｎ  ｖｉｔｒｏでは行なわれていなかった。Ｇ６−Ｐから得られたＧ１−Ｐを基質としてアミロースを合成することはまったく考えられてこなかった。
【００１１】
図１の（３）に示すように、Ｇ１−ＰとプライマーにＧＰを作用させることによりアミロースが生産される。この技術は公知であり、例えば、非特許文献５および特許文献１に記載されている。特許文献１に記載される反応の概略を以下に示す：
【００１２】
【化１】
2010148407.tif 000002
この反応において、他の酵素が存在しなければ、α−グルカンはアミロースとなり、ブランチングエンザイム（ＢＥ）、ディスプロポーショネーティングエンザイム（ＭａｌＱ）などの他の酵素が存在すると、α−グルカンは、デンプン、グリコーゲンなどとなる。
【００１３】
グルコースを出発原料とし、ＰＧＫとＰＧＭとＧＰという３種類の酵素を同時に作用させる１つの反応系で直接アミロースを生産する方法は知られていない。
【００１４】
セロビオースの利用に関しては、セロビオースを原料に、１つの反応系でα−グルカンを製造する技術が知られている（特許文献２）。特許文献２の方法では、セロビオースの一部をＧ１−Ｐとグルコースに変換し、得られたＧ１−Ｐにα−１，４−グルカンホスホリラーゼを作用させてα−グルカンに変換している。特許文献２の方法では、２つの平衡反応をカップリングさせるため、リン酸はリサイクルされて蓄積しないが、グルコースは反応に利用されないため、反応中に蓄積し続ける。それゆえ、特許文献２の方法では、平衡反応をα−グルカン合成側に向かわせる目的で、グルコースをフラクトースに変換するかもしくはグルコースを反応系から消去する方法をとっている。そのため、特許文献２の方法では、α−グルカンに変換されるグルコース源はＧ１−Ｐに由来するグルコース部分のみであり、セロビオースに対するα−グルカン収率は最大でも５０％以下であった。
【特許文献１】国際特許公開第０２／０９７１０７号パンフレット
【特許文献２】国際特許公開第２００５／０５６８１号パンフレット
【非特許文献１】Ｓｉｍｏｎ  Ｊ．  Ｐｉｌｋｉｓ，  Ｉｒｅｎｅ  Ｔ．  Ｗｅｂｅｒ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｗ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｇｒａｅｍｅ  Ｉ．  Ｂｅｌｌ  （１９９４）  Ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ  ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｊ．  ｂｏｉｌ．  ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ２６９．  Ｎｏ．  ３５．  ｐｐ．  ２１９２５−２１９２８
【非特許文献２】Ｓｈｏｔａｒｏ  Ｔａｎａｋａ，  Ｓｕｎ−Ｏｇ  Ｌｅｅ，  Ｋａｚｕｈｉｒｏ  Ｈａｍａｏｋａ，  Ｊｕｎｉｃｈｉ  Ｋａｔｏ，  Ｎｏｂｏｒｕ  Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ，  Ｋａｚｕｎｏｒｉ  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｈｉｓａｏ  Ｏｈｔａｋｅ，  Ａｋｉｏ  Ｋｕｒｏｄａ  （２００３）  Ｓｔｒｉｃｔｌｙ  ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，  Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｒｕｓ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  Ｖｏｌ．  １８５．  Ｎｏ．  １８．  ｐｐ．  ５６５４−５６５６
【非特許文献３】Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．  Ｒａｙ，  Ｊｒ．，  ａｎｄ  Ｇｅｒｔｒｕｄｅ  Ａ．  Ｒｏｓｃｅｌｌｉ  （１９６４）Ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｊ．  ｂｏｉｌ．  ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．  ２３９．  Ｎｏ．  １１．  ｐｐ．  ３９３５−３９４１
【非特許文献４】Ｇ．  Ｍｉｃｈａｅｌ  （１９７４）  Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ  １−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ２ｎｄ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ｅｄ．  （Ｈ．  Ｕ．  Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，  ｅｄ）  Ｖｏｌ．  ４，  ｐｐ．１８５−１９１，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献５】Ｍｉｃｈｅａｌ  Ｊ．  Ｇｉｄｌｅｙ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｖ．  Ｂｕｌｐｉｎ  （１９８９）  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｙｌａｓｅ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ：  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈａｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２２，  ｐｐ．  ３４１−３４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、グルコースからα−グルカンを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ポリホスフェートグルコキナーゼおよびポリリン酸を用いてグルコースをほぼ１００％、Ｇ６−Ｐに変換し、生成したＧ６−ＰをＧ１−Ｐに変換することにより、これまでアミロース合成の阻害剤となっていた副産物グルコースを除去するのではなく、積極的に利用できることを見出した。本発明によれば、グルコースを基質としてアミロース合成に利用することができ、セロビオースを理論的に１００％アミロースに変換できる。本発明者らは、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【００１７】
本発明により、グルコースおよびポリリン酸を基質とし、３種類の酵素（ポリホスフェートグルコキナーゼ、ホスホグルコムターゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼ）を１つの反応溶液中で作用させることを含む、アミロースを合成する方法が提供される。
【００１８】
グルコースを原料としてアミロースを合成する技術はこれまでにない。従来の方法でグルコースからアミロースを合成するためには、（１）グルコースとポリリン酸にＰＧＫを作用させてＧ６−Ｐを得て；（２）得られたＧ６−ＰにＰＧＭを作用させてＧ１−Ｐを生成し、そして（３）得られたＧ１−ＰにＧＰを作用させてアミロースを合成する。この３段階の方法の理論上のアミロース合成収率は、主に（２）および（３）の平衡反応の収率に基づく。（２）の反応（ＰＧＭによるＧ６−Ｐ⇔Ｇ１−Ｐ平衡反応）は、Ｇ６−Ｐ側に大きく偏っており、その比率はＧ６−Ｐ  ：  Ｇ１−Ｐ  ＝９４．２  ：  ５．８である。（３）の反応（ＧＰによるアミロース合成反応）では、アミロース  ：  Ｇ１−Ｐ＝７３：２７である。また、（１）の反応は不可逆反応であり、ポリリン酸濃度を調節することにより、ほぼ１００％のグルコースがＧ６−Ｐに変換され得る。以上のことから、計算すると（１）の反応と、（２）の反応と、（３）の反応とをそれぞれ別個の工程で行なった場合の理論上のアミロース収率は、グルコースに対して約４．２％と算出される。
【００１９】
グルコースからアミロースができないかまたは収率が非常に低い原因は２点考えられる。１点目は、反応溶液中の遊離リン酸濃度とＧ１−Ｐ濃度との比率の影響である。２点目は、このグルコースからのアミロース合成が平衡収支に逆らった反応であることである。本発明ではグルコースからアミロースを合成するために、溶液中のグルコースと遊離リン酸との濃度比を調節することと、物質のポテンシャルエネルギーに逆らいアミロースを獲得するためにアミロースの老化（沈澱）を利用することで問題解決を図った。
【００２０】
まず１点目について、アミロースが得られない原因は、（３）の反応（ＧＰによるアミロース合成反応）がＧ１−Ｐと遊離のリン酸との濃度比に大きく影響されることによる。アミロース合成反応に対するＧ１−Ｐ／リン酸濃度比の影響を検討したところ、遊離リン酸の濃度がＧ１−Ｐ濃度の４倍以上のときアミロースが合成されないことがわかった。本発明の方法においては、一般に、最初の反応液にリン酸を意図的に添加しない。しかし、一般に、通常の方法で工業的に製造されるポリリン酸、あるいは一般に工業的に市販されているポリリン酸には、重合していないモノマーのリン酸、すなわち遊離のリン酸が不純物として少量含まれている。そのため、リン酸を意図的に添加しなくても、（１）の反応で用いるポリリン酸として、工業的に入手可能なポリリン酸を用いると、その中に少量の不純物として遊離のリン酸が含まれていることが多い。この、ポリリン酸溶液由来の遊離リン酸の濃度がグルコースからアミロースを合成するときの中間生成物として生じるＧ１−Ｐ濃度の４倍を超えるとアミロースが合成されない。そのため、ポリリン酸溶液由来の遊離リン酸が生成されるＧ１−Ｐ濃度の４倍濃度より小さくなるようにグルコース濃度およびポリリン酸濃度を調節することが好ましい。
【００２１】
２点目の原因はＧ６−Ｐが非常に安定であることに起因する。（２）の平衡反応は上記したようにＧ６−Ｐ側に大きく偏り、平衡反応は「酵素ハンドブック」丸尾文治、田宮信雄監修 朝倉書店によるとＧ６−Ｐ生成側に大きくよることが記載されている。それに対して（３）の平衡反応ではアミロース合成側に偏っている。従って、（２）の反応と（３）の反応を１つの溶液中で同時に行うと、Ｇ１−ＰからＧ６−Ｐへの転移反応と、Ｇ１−Ｐからアミロースへの合成反応が競合すると考えられる。（２）の反応および（３）の反応は平衡反応であり、同時に反応させた場合、ひとつの平衡反応と見ることができる。このときの平衡収支は、Ｇ６−Ｐとアミロースのポテンシャルエネルギーに依存する。実験例２に示すように、Ｇ６−Ｐとアミロースではどちらが安定しているのかを検討するために、低濃度アミロースの溶解液にＰＧＭ、ＧＰおよびリン酸を加えて反応させた。その結果、図６に示すように、アミロースの９５％以上がＧ６−ＰとＧ１−Ｐに分解された。この結果より、溶液に溶けている状態のアミロースでは、ＰＧＭとＧＰとの平衡反応により、Ｇ６−Ｐへの変換方向に強くシフトされることが確認され、アミロースと比べてもＧ６−Ｐが安定であると考えられる。
【００２２】
しかし、本願発明の方法においては、４００ｍＭのグルコースを原料とし、ポリリン酸および酵素の濃度、ｐＨ等を適切に調整することにより、７％程度のアミロース合成収率を得ることができた。この値は、ＰＧＭ−ＧＰ平衡状態におけるアミロースの割合を超える。この原因はアミロースの老化現象に起因すると考える。老化しやすい条件として基質濃度を５００ｍＭに上げアミロース合成反応をおこなうとアミロース収率は１９．６％にまで上昇した。さらにアミロース合成反応の経時的な測定によって酵素反応が平衡に達した後、老化によるものと考えられるアミロースの増加を測定できた。よって、グルコースからアミロースを合成するためには、合成したアミロースを老化させることが非常に有用であると考えられる。
【００２３】
さらに、本願発明の方法を使用することにより、セロビオースから効率よくα−グルカンに変換することが可能となった。上記のように、従来の方法では、セロビオースの一部をＧ１−Ｐとグルコースに変換し、得られたＧ１−Ｐにα−１，４−グルカンホスホリラーゼを作用させることにより、α−グルカンを得ていた。従来の方法では、グルコースは蓄積し続けるので、平衡反応をα−グルカン合成側に向かわせる目的で、グルコースをフラクトースに変換するかもしくは反応系から消去する方法をとっている。そのため、α−グルカンに変換されるグルコース源はＧ１−Ｐに由来するグルコース部分のみであり、セロビオースに対するα−グルカン収率は最大でも５０％以下であった。
【００２４】
我々は、ポリホスフェートグルコキナーゼとポリリン酸を用いてグルコースを１００％Ｇ６−Ｐに変換して、生成したＧ６−ＰをＧ１−Ｐに変換することで、これまでアミロース合成の阻害となっていた副産物グルコースを消去するのではなく、積極的に基質としてアミロース合成に利用する技術を検討し、理論的にセロビオースを１００％アミロースに変換できる技術を完成させた。
【００２５】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）
グルコースと、ポリリン酸と、プライマーと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のグルコース濃度は、１００ｍＭ〜２０００ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ５．７〜ｐＨ１２であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）が０．１５以下である、方法。
【００２６】
（項目２）
前記反応開始時の前記溶液中のグルコース濃度が２００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【００２７】
（項目３）
前記反応開始時の前記溶液中のグルコース濃度が５００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【００２８】
（項目４）
前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ７．４〜ｐＨ１１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【００２９】
（項目５）
前記α−グルカンがアミロースである、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【００３０】
（項目６）
前記溶液が、ゲスト化合物を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【００３１】
（項目７）
前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、項目６に記載の方法。
【００３２】
（項目８）
グルコース−６−リン酸と、プライマーと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のグルコース−６−リン酸濃度は、２０ｍＭ〜２０００ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ６．７〜ｐＨ１１であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコース−６−リン酸のモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）が０．４以下である、方法。
【００３３】
（項目９）
前記反応開始時の前記溶液中のグルコース−６−リン酸濃度が１００ｍＭ〜２０００ｍＭである、請求項８に記載の方法。
【００３４】
（項目１０）
前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ７．３〜ｐＨ１１である、請求項８または９に記載の方法。
【００３５】
（項目１１）
前記α−グルカンがアミロースである、項目８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【００３６】
（項目１２）
前記溶液が、ゲスト物質を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、項目８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【００３７】
（項目１３）
前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、項目１２に記載の方法。
【００３８】
（項目１４）
セロビオースと、ポリリン酸と、プライマーと、セロビオースホスホリラーゼと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する方法であって、
反応開始時の該溶液中のセロビオース濃度は、１００ｍＭ〜３５０ｍＭであり、
反応開始時の該溶液のｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ１１であり、
反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とセロビオースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）が２．０以下である、方法。
【００３９】
（項目１５）
前記反応開始時の前記溶液中のセロビオース濃度が１２０ｍＭ〜３５０ｍＭである、請求項１４に記載の方法。
【００４０】
（項目１６）
前記反応開始時の前記溶液のｐＨが、ｐＨ５．６〜ｐＨ１１である、請求項１４または１５に記載の方法。
【００４１】
（項目１７）
前記α−グルカンが、アミロースである、項目１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【００４２】
（項目１８）
前記溶液が、ゲスト物質を含み、該ゲスト化合物は前記製造されるα−グルカンに包接され得る化合物であり、
前記製造工程において得られるα−グルカンと該ゲスト化合物との包接化合物を形成させる、項目１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【００４３】
（項目１９）
前記ゲスト化合物が、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである、項目１８に記載の方法。
【発明の効果】
【００４４】
本願発明の方法により、大量摂取が不可能なグルコースを、大量摂取可能な食品へと変換できる。また、本発明は、食糧危機問題の解決にも大きく貢献する。
【００４５】
特定の実施形態では、本願発明の方法により、非消化性のセルロースを、可食性の食品へと変換できる。また、本発明は、食糧危機問題およびゴミ問題の解決にも大きく貢献する。
【００４６】
グルコースとアミロースとでエネルギー状態を比較すると、アミロースの方がエネルギー準位が高い。そのため、グルコースからアミロースを合成するのは、エネルギー論的に困難である。
【００４７】
図１の（１）、（２）、（３）の反応を個別に反応させた場合、（１）の収率はほぼ１００％であり、（２）の収率は約７％であり、（３）の収率は約７０％である。そのため、グルコースからのアミロースの理論収率は、約５％である（１００×０．０５８×（０．７３）＝４．２（％））である。それに対して、（１）〜（３）の反応を１つの溶液中で同時に反応させた場合、（ａ）溶液のｐＨを調整することおよび（ｂ）溶液中の基質の濃度を高くすること、によって、高いアミロース収率を上げることができる。
【００４８】
詳細には、反応溶液の初期ｐＨ（反応開始時の溶液のｐＨ）を好ましくはｐＨ７．４〜ｐＨ１１に、さらに好ましくはｐＨ７．４〜８．５にする。反応で使用する各酵素の代表的な至適ｐＨは、ＰＧＫが約ｐＨ７．０であり、ＰＧＭが約ｐＨ７．５であり、そしてＧＰが約ｐＨ５．６である。初期ｐＨが低すぎるとアミロース合成収率が低くなるかまたはアミロースが合成されない。反応溶液の初期ｐＨをｐＨ７．５からｐＨ１１に調整することにより、約１５％以上のアミロース収率を得られる。
【００４９】
さらに、基質濃度を高くすることにより、アミロースが老化して沈澱し、反応系から外れやすくなる。アミロースが沈澱すると反応系内のアミロース濃度が低下し、その結果、ＧＰによるアミロース合成が促進される。それに伴い、ＰＧＭ平衡反応によってＧ１−Ｐが生成される。合成アミロースを効率よく老化させることにより、Ｇ１−Ｐが連続的に供給され、アミロース収率を約２０％程度まで向上させることができる。これは、３つの反応を個別に反応させた場合の理論上のアミロース収率の約５倍であり、極めて顕著な効果である。
【００５０】
さらに、ゲスト物質の存在下で合成反応を行なうことにより、アミロースの沈澱形成が促進される。特定のゲスト物質の存在下では、アミロース収率を約３５％まで向上させることができた。
【００５１】
特許文献２に記載される方法では、セロビオースにセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を作用させると、目的の生成物Ｇ１−Ｐの他に同量の副生成物グルコース（Ｇｌｃ）が生成される。そのため、特許文献２に記載の方法では、アミロースの収率の理論的上限は、５０％であった。実際にはＣＢＰの平衡反応がセロビオース合成側に有利であるため、アミロースの収率は１６％程度であり、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼをグルコースに作用させて副生成物のＧｌｃを除去することでアミロースの最大収率は３２．４％まであがった。
【００５２】
それに対して、本願発明において、セロビオースからのアミロースの合成反応と（１）および（２）の反応を組み合わせた場合、グルコースをアミロース合成に利用することが可能となり、その結果、アミロース収率の理論的上限を１００％にすることができる。本明細書中に記載した実施例においては、反応溶液の初期ｐＨを調整することにより、実際に最大６６．８％のアミロース収率を得ることができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００５４】
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００５５】
本明細書中では「α−グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、α−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。α−グルカンは、直鎖状、分岐状または環状の分子であり得る。直鎖状α−グルカンとα−１，４−グルカンとは同義語である。直鎖状α−グルカンでは、α−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。α−１，６−グルコシド結合を１つ以上含むα−グルカンは、分岐状α−グルカンである。α−グルカンは、好ましくは、直鎖状の部分をある程度含む。分岐のない直鎖状α−グルカンがより好ましい。本発明で製造されるα−グルカンは、好ましくは、アミロース、環状構造を有するグルカンまたは分岐構造を有するグルカンであり、より好ましくはアミロースである。１分子のα−グルカンに含まれる糖単位の数を、このα−グルカンの重合度という。
【００５６】
α−グルカンは、場合によっては、分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）が少ないことが好ましい。このような場合、分岐の数は、代表的には０〜１００００個、好ましくは０〜１０００個、より好ましくは０〜５００個、さらに好ましくは０〜１００個、さらに好ましくは０〜５０個、さらに好ましくは０〜２５個、さらに好ましくは０個である。
【００５７】
本発明の方法によって製造される分岐状α−グルカンでは、α−１，６−グルコシド結合を１としたときのα−１，６−グルコシド結合の数に対するα−１，４−グルコシド結合の数の比は、好ましくは１〜１００００であり、より好ましくは１０〜５０００であり、さらに好ましくは５０〜１０００であり、さらに好ましくは１００〜５００である。
【００５８】
α−１，６−グルコシド結合は、α−グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。α−グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。
【００５９】
α−グルカンは、Ｄ−グルコースのみから構成されていてもよいし、α−グルカンの性質を損なわない程度に修飾された誘導体であってもよい。修飾されていないことが好ましい。α−グルカンの性質を損なわない程度の修飾としては、エステル化、エーテル化、架橋などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの修飾は、当該分野で公知の方法に従って行われ得る。
【００６０】
α−グルカンは、代表的には約１×１０３以上、好ましくは約５×１０３以上、より好ましくは約１×１０４以上、さらに好ましくは約５×１０４以上、さらに好ましくは約１×１０５以上の分子量を有する。α−グルカンは、代表的には約１×１０６以下、好ましくは約５×１０５以下、さらに好ましくは約１×１０５以下の分子量を有する。
【００６１】
当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質（例えば、プライマー、グルコース、グルコース−６−リン酸、セロビオースなど）の量、酵素の量、反応時間などを適宜設定することによって所望の分子量のα−グルカンが得られることを容易に理解する。
【００６２】
＜α−グルカンの製造に用いる材料＞
一つの実施形態では、本発明の製造方法では、例えば、グルコースと、ポリリン酸と、プライマーと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を用いる。
【００６３】
別の実施形態では、本発明の製造方法では、例えば、グルコース−６−リン酸と、プライマーと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を用いる。
【００６４】
さらに別の実施形態では、本発明の製造方法では、例えば、セロビオースと、ポリリン酸と、プライマーと、セロビオースホスホリラーゼと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を用いる。
【００６５】
これらの方法で用いる溶液の調製においては、例えば、これらの各物質と、緩衝剤および溶媒を主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加されるが、反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追加して添加してもよい。
【００６６】
本発明の製造方法では、溶液中にゲスト化合物をさらに含み得る。
【００６７】
本発明の製造方法では、必要に応じて、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を用いることができる。枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素は、目的とするα−グルカンの構造に応じて、本発明の製造方法の最初から溶液中に添加してもよく、途中から溶液中に添加してもよい。
【００６８】
（１．グルコース）
グルコースは、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６で示される、分子量約１８０の単糖である。グルコースは、代表的なアルドヘキソースであり、天然に広く分布する単糖である。グルコースは、甘い果実および他の植物組織中に遊離型で多量に存在する。グルコースは、スクロース、マルトース、ラクトースなどのオリゴ糖；澱粉、セルロース、デキストラン、ラミナリン、グリコーゲンなどの多糖；種々の配糖体などの構成成分として多量に存在する。これらの物質を酸で加水分解するとＤ−グルコースを生じる。本発明で使用するグルコースは、純粋なものであってもよく、ある程度不純なものであってもよい。グルコースは、グルコースを構成成分とする種々の物質を分解することによって入手されたものであってもよい。例えば、セルロースは、グルコースがβ結合で連結したものであり、セルラーゼによって加水分解することにより、グルコースが生成される。例えば、デンプンをアミラーゼなどの酵素によって加水分解することにより、グルコースが生成される。さらに、フラクトースをグルコースイソメラーゼによって変換することにより、グルコースが生成される。本発明で使用されるグルコースは、特定の実施形態では、グルコースとして溶液に添加されることが好ましい。別の実施形態では、分解または変換されることによってグルコースを生じる物質を反応溶液中に添加することによって、グルコースが提供されてもよい。
【００６９】
（２．ポリリン酸）
本明細書において使用される場合、用語「ポリリン酸（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」とは、ポリリン酸（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）およびその塩をいう。酸である狭義のポリリン酸は、オルトリン酸の脱水縮合によって生じる直鎖状高分子リン酸である。狭義のポリリン酸は、一般式Ｈｎ＋２ＰｎＯ３ｎ＋１（ｎ＝２以上の整数）によって示される。塩であるポリリン酸（すなわち、ポリリン酸塩）は、一般式ＭＩｎ＋２ＰｎＯ３ｎ＋１（ｎ＝２以上の整数）によって示される。本明細書において、特に断りの無い限り、「ポリリン酸」は、広義のポリリン酸、すなわち狭義のポリリン酸およびその塩を示す。狭義のポリリン酸の例としては、二リン酸、三リン酸、四リン酸、五リン酸などが挙げられる。狭義のポリリン酸は、例えば、（１）リン酸を加熱する方法、または（２）リン酸に五酸化二リンを添加する方法によって製造され得る。一般に、それぞれのポリリン酸を純品として製造することは困難であるので、種々の重合度のポリリン酸の混合物が市販されている。ポリリン酸の水溶液は容易に加水分解して低分子量のポリリン酸を経て、最終的にはオルトリン酸になる。本発明で使用されるポリリン酸の重合度は、好ましくは２以上であり、より好ましくは５以上である。本発明で使用されるポリリン酸の重合度は、好ましくは２０以下であり、より好ましくは１２以下である。
【００７０】
ポリリン酸もまた、陽イオンを含む水溶液中で使用される。この場合、酸であるポリリン酸と塩であるポリリン酸とポリリン酸のイオンとが水溶液中で共存するので、酸であるポリリン酸と塩であるポリリン酸とは区別をしにくい。そのため、塩であるポリリン酸は、ポリリン酸と同様に使用され得る。本発明において、ポリリン酸塩は、好ましくはポリリン酸の任意の塩であり、より好ましくはポリリン酸の金属塩である。ポリリン酸塩の好ましい具体例としては、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ポリリン酸アンモニウム、ポリリン酸カルシウム、ポリリン酸第２鉄などが挙げられる。市販のポリリン酸ナトリウムは、一般に、トリポリリン酸ナトリウムを主成分とし、少量のピロリン酸塩、トリメタリン酸塩および非結晶性の高重合リン酸塩が混在する。市販のポリリン酸カリウムは、一般に、トリポリリン酸カリウム（Ｋ５Ｐ３Ｏ１０）を主成分とする。
【００７１】
ポリリン酸塩は、ポリリン酸ナトリウム単独で、ポリリン酸カリウム単独で、またはポリリン酸ナトリウムとポリリン酸カリウムとの混合物として用いられてもよい。
【００７２】
（３．プライマー）
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」とは、α−１，４−グルコシド結合で糖単位が結合できる遊離部分を１個以上有する分子をいう。プライマーは、α−グルカンの合成においてグリコシド残基を付加するための出発物質として作用する。なお、本明細書中では、グリコシド残基とグルコース残基とは交換可能に使用され得る。プライマーは、Ｇ１−Ｐのグリコシド残基のアクセプターとして作用する分子ともいうことができる。プライマーは、α−１，４−グルコシド結合で糖単位が結合できる遊離部分を１個以上有すれば、他の部分は糖以外の部分によって形成されていてもよい。本発明の方法では、反応開始時に含まれるプライマーに対して１つのグリコシド残基がα−１，４結合で転移することによって、このプライマーよりも重合度が１大きいα−グルカンが形成される。形成されたこのα−グルカンは、同じ溶液中で再度アクセプターとして作用することができる。このようにして、本発明の方法では、プライマーに対してグリコシド残基がα−１，４−グルコシド結合で順次結合されて、任意の重合度のα−グルカンが合成される。プライマーとしては、α−１，４−グルカンホスホリラーゼによって糖単位が付加され得る任意の糖が挙げられる。
【００７３】
プライマーは、本発明の反応の出発物質として作用し得ればよく、例えば、本発明の方法によって合成されたα−グルカンをプライマーとして用いて、本発明の方法によってα−１，４−グルコシド鎖を再度伸長することも可能である。
【００７４】
ただし、後述するゲスト化合物を用いる場合には、そのゲスト化合物を包接しない化合物をプライマーとして用いることが好ましい。
【００７５】
プライマーは、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンであっても、α−１，６−グルコシド結合を部分的に有してもよい。当業者は、所望のグルカンに応じて、適切なプライマーを容易に選択し得る。直鎖状のアミロースを合成する場合には、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンをプライマーとして用いれば、枝切り酵素などを用いずに直鎖状アミロースを合成できるので好ましい。
【００７６】
プライマーの例としては、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉およびこれらの誘導体が挙げられる。
【００７７】
マルトオリゴ糖は、本明細書中では、約２個〜約１０個のグルコースが脱水縮合して生じた物質であって、α−１，４結合によって連結された物質をいう。マルトオリゴ糖は、好ましくは約３個〜約１０個の糖単位、より好ましくは約４個〜約１０個の糖単位、さらに好ましくは約５個〜約１０個の糖単位を有する。マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオース、マルトデカオースなどのマルトオリゴ糖が挙げられる。１つの実施形態では、マルトオリゴ糖は、好ましくはマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースであり、より好ましくはマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースであり、さらに好ましくはマルトテトラオースである。マルトオリゴ糖は、単品であってもよいし、複数のマルトオリゴ糖の混合物であってもよい。コストが低いため、マルトオリゴ糖の混合物が好ましい。１つの実施態様では、マルトオリゴ糖の混合物は、重合度４以上のマルトオリゴ糖に加えて、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースのうちの少なくとも１つを含有する。オリゴ糖は、直鎖状のオリゴ糖であってもよいし、分枝状のオリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、その分子内に、環状部分を有し得る。本発明では、直鎖状のオリゴ糖が好ましい。
【００７８】
アミロースとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子である。アミロースは、天然の澱粉中に含まれる。
【００７９】
アミロペクチンとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位に、α１，６結合でグルコース単位が連結された、分枝状分子である。アミロペクチンは天然の澱粉中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。例えば、重合度が約１×１０５程度以上のアミロペクチンが原料として用いられ得る。
【００８０】
グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動植物の貯蔵多糖としてほとんどあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシの種子などに存在する。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−１，４−結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ３単位おきに１本程度の割合で、平均重合度１２〜１８のグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。また、α−１，６−結合で結合している分枝にも同様にグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。
【００８１】
グリコーゲンの分子量は代表的には約１×１０５〜約１×１０８であり、好ましくは約１×１０６〜約１×１０７である。
【００８２】
プルランは、マルトトリオースが規則正しく、階段状にα−１，６−結合した、分子量約１０万〜約３０万（例えば、約２０万）のグルカンである。プルランは、例えば、澱粉を原料として黒酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓを培養することにより製造される。プルランは、例えば、林原商事から入手され得る。
【００８３】
カップリングシュガーは、ショ糖、グルコシルスクロース、マルトシルスクロースを主成分とする混合物である。カップリングシュガーは、例えば、ショ糖と澱粉との混合溶液にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍなどが産生するサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることにより製造される。カップリングシュガーは、例えば、林原商事から入手され得る。
【００８４】
澱粉は、アミロースとアミロペクチンとの混合物である。澱粉としては、通常市販されている澱粉であればどのような澱粉でも用いられ得る。澱粉に含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、澱粉を産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有する澱粉のほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まない澱粉は、通常の植物からは得られない。
【００８５】
澱粉は、天然の澱粉、澱粉分解物および化工澱粉に区分される。
【００８６】
天然の澱粉は、原料により、いも類澱粉および穀類澱粉に分けられる。いも類澱粉の例としては、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉、およびわらび澱粉などが挙げられる。穀類澱粉の例としては、コーンスターチ、小麦澱粉、および米澱粉などが挙げられる。天然の澱粉の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースの含量を５０％〜７０％まで高めたハイアミロース澱粉（例えば、ハイアミロースコーンスターチ）である。天然の澱粉の別の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースを含まないワキシー澱粉である。
【００８７】
可溶性澱粉は、天然の澱粉に種々の処理を施すことにより得られる、水溶性の澱粉をいう。
【００８８】
化工澱粉は、天然の澱粉に加水分解、エステル化、またはα化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせた澱粉である。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広い種類の化工澱粉が入手可能である。化工澱粉の種類には種々ある。このような澱粉の例は、澱粉の糊化温度以下において澱粉粒子を酸に浸漬することにより、澱粉分子は切断するが、澱粉粒子は破壊していない澱粉である。
【００８９】
澱粉分解物は、澱粉に酵素処理または加水分解などの処理を施して得られる、処理前よりも分子量が小さいオリゴ糖もしくは多糖である。澱粉分解物の例としては、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物および澱粉部分加水分解物が挙げられる。
【００９０】
澱粉枝切り酵素分解物は、澱粉に枝切り酵素を作用させることによって得られる。枝切り酵素の作用時間を種々に変更することによって、任意の程度に分岐部分（すなわち、α−１，６−グルコシド結合）が切断された澱粉枝切り酵素分解物が得られる。枝切り酵素分解物の例としては、糖単位数４〜１００００のうちα−１，６−グルコシド結合を１個〜２０個有する分解物、糖単位数３〜５００のα−１，６−グルコシド結合を全く有さない分解物、マルトオリゴ糖およびアミロースが挙げられる。澱粉枝切り酵素分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解物の分子量の分布が異なり得る。澱粉枝切り酵素分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。
【００９１】
澱粉ホスホリラーゼ分解物は、澱粉にα−１，４−グルカンホスホリラーゼ（ホスホリラーゼともいう）を作用させることによって得られる。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、澱粉の非還元性末端からグルコース残基を１糖単位ずつ他の基質へと転移させる。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、α−１，６−グルコシド結合を切断することができないので、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを澱粉に充分に長時間作用させると、α−１，６−グルコシド結合の部分で切断が終わった分解物が得られる。本発明では、澱粉ホスホリラーゼ分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。
【００９２】
デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、澱粉を、酸、アルカリ、酵素などの作用によって部分的に分解して得られる分解物をいう。本発明では、デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、種々の長さを持つ糖鎖の混合物であり得る。
【００９３】
澱粉は、可溶性澱粉、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物、澱粉部分加水分解物、化工澱粉、およびこれらの誘導体からなる群から選択されることが好ましい。
【００９４】
本発明の方法では、上記各種糖の誘導体は、プライマーとして用いられ得る。例えば、上記糖のアルコール性水酸基の少なくとも１つが、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、あるいはリン酸化された誘導体などが用いられ得る。さらに、これらの２種以上の誘導体の混合物が原料として用いられ得る。
【００９５】
（４．ポリホスフェートグルコキナーゼ）
ポリホスフェートグルコキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．６３）とは、重合度ｎのポリリン酸（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のリン酸基をＤ−グルコースに転移して重合度ｎ−１のポリリン酸とグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素をいう。この反応は以下のように記載される：
（リン酸）ｎ＋Ｄ−グルコース→（リン酸）ｎ−１＋Ｄ−グルコース−６−リン酸
ポリホスフェートグルコキナーゼは、ポリホスフェート−グルコースホスホトランスフェラーゼ、ポリホスフェート：Ｄ−グルコース６−ホスホトランスフェラーゼまたはＰＧＫとも呼ばれる。
【００９６】
ポリホスフェートグルコキナーゼは、多くの微生物に存在する。ポリホスフェートグルコキナーゼを産生する微生物の例としては、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌（例えば、Ｍ．ｐｈｌｅｉ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌(例えばＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃ．ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ)、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒなどが挙げられる。本発明においては、任意の生物由来のポリホスフェートグルコキナーゼを使用し得る。本発明においては、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓ由来のポリホスフェートグルコキナーゼを用いることが好ましい。
【００９７】
また、至適ｐＨの観点からは、約５．５以上の至適ｐＨを有するポリホスフェートグルコキナーゼが好ましい。ポリホスフェートグルコキナーゼの至適ｐＨは、より好ましくは約６．０以上であり、さらに好ましくは約６．５以上である。また、約１０以下の至適ｐＨを有するポリホスフェートグルコキナーゼが好ましい。ポリホスフェートグルコキナーゼの至適ｐＨは、より好ましくは約８．０以下であり、さらに好ましくは約７．５以下である。
【００９８】
また、ポリホスフェートグルコキナーゼの反応至適温度は、可能な限り高いことが好ましい。至適温度の観点からは、約３５℃以上の至適温度を有するポリホスフェートグルコキナーゼが好ましい。ポリホスフェートグルコキナーゼの至適温度は、より好ましくは約４０℃以上であり、さらに好ましくは約４５℃以上である。当該分野においては、至適温度の高い種々のポリホスフェートグルコキナーゼが公知である。高温条件で生育する細菌の有する酵素は、一般的に反応至適温度が高温である。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの生育温度は、約５０℃であるので、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの有する酵素は一般的に、反応至適温度が約５０℃であるか、または少なくとも約５０℃での反応性が非常に高い。Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの好適な生育条件は、約５０℃にてｐＨ７．４であり、このポリホスフェートグルコキナーゼを産生するＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａは、ＡＴＣＣから購入することができる。Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ由来のポリホスフェートグルコキナーゼのヌクレオチド配列を配列番号９に示し、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ由来のポリホスフェートグルコキナーゼのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。ポリホスフェートグルコキナーゼの至適温度に特に上限はなく、至適温度は例えば、約８０℃以下、約７５℃以下、約７０℃以下、約６５℃以下、約６０℃以下、約５５℃以下、約５０℃以下、約４５℃以下、約４０℃以下などであり得る。至適温度が非常に高い酵素については、その酵素を入手することが困難である場合がある。
【００９９】
反応開始時の溶液中に含まれるポリホスフェートグルコキナーゼの量は、目的の反応を進行させるに充分な量であればよい。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるポリホスフェートグルコキナーゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコース１ｇに対して、好ましくは約１Ｕ以上であり、より好ましくは約１０Ｕ以上であり、さらに好ましくは約５０Ｕ以上であり、特に好ましくは約１００Ｕ以上であり、最も好ましくは約１５０Ｕ以上である。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるポリホスフェートグルコキナーゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコースに対して、好ましくは約１５００Ｕ以下であり、より好ましくは約１０００Ｕ以下であり、さらに好ましくは約５００Ｕ以下であり、特に好ましくは約３００Ｕ以下であり、最も好ましくは約２００Ｕ以下である。ポリホスフェートグルコキナーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１００】
（５．ホスホグルコムターゼ）
ホスホグルコムターゼ（ＥＣ：２．７．５．１）とは、α−Ｄ−グルコース１，６−二リン酸とα−Ｄ−グルコース１−リン酸から、α−Ｄ−グルコース６−リン酸とα−Ｄ−グルコースを生成する反応を触媒する酵素をいう。この反応は以下のように記載される：
【０１０１】
【化２】
2010148407.tif 000003
ホスホグルコムターゼは、α−ホスフェートグルコムターゼ、α−Ｄ−グルコース−１，６−ビスホスフェート：α−Ｄ−グルコース−１−ホスフェートホスホトランスフェラーゼまたはＰＧＭとも呼ばれる。
【０１０２】
ホスホグルコムターゼは、糖代謝の主経路に位置する酵素のためほとんどすべての生物に存在する。ホスホグルコムターゼは、微生物、動物および植物に存在する。ホスホグルコムターゼを産生する生物の例としては、例えば、ウサギ、ヒラメ、サメ、ウシ、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、馬鈴薯（Ｐｏｔａｔｏ）が挙げられる。本発明においては、任意の生物由来のホスホグルコムターゼを使用し得る。本発明においては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホスホグルコムターゼを使用することが好ましい。
【０１０３】
また、至適ｐＨの観点からは、約６．０以上の至適ｐＨを有するホスホグルコムターゼが好ましい。ホスホグルコムターゼの至適ｐＨは、より好ましくは約６．５以上であり、さらに好ましくは約７．０以上である。また、約１０以下の至適ｐＨを有するホスホグルコムターゼが好ましい。ホスホグルコムターゼの至適ｐＨは、より好ましくは約８．５以下であり、さらに好ましくは約８．０以下である。
【０１０４】
また、至適温度の観点からは、約３５℃以上の至適温度を有するホスホグルコムターゼが好ましい。ホスホグルコムターゼの至適温度は、より好ましくは約４０℃以上であり、さらに好ましくは約４５℃以上である。当該分野においては、至適温度の高い種々のホスホグルコムターゼが公知である。高温条件で生育する細菌の有する酵素は、一般的に、反応至適温度が高温である。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの生育温度は、約７５℃であるので、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの有する酵素は、一般的に、反応至適温度が約７５℃であるか、または少なくとも約７５℃での反応性が非常に高い。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの好適な生育条件は、約７５℃にてｐＨ７．５であり、このホスホグルコムターゼを産生するＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、ＡＴＣＣから購入することができる。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列を配列番号１１に示し、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のホスホグルコムターゼのアミノ酸配列を配列番号１２に示す。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ生育温度は、約６５℃であるので、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅの有する酵素は、一般的に、反応至適温度が約６５℃であるか、または少なくとも約６５℃での反応性が非常に高い。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅの好適な生育条件は、約６５℃にてｐＨ７．５であり、このホスホグルコムターゼを産生するＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅは、ＡＴＣＣから購入することができる。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ由来のホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列を配列番号１３に示し、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ由来のホスホグルコムターゼのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。ホスホグルコムターゼの至適温度に特に上限はなく、至適温度は例えば、約８０℃以下、約７５℃以下、約７０℃以下、約６５℃以下、約６０℃以下、約５５℃以下、約５０℃以下、約４５℃以下、約４０℃以下などであり得る。至適温度が非常に高い酵素については、その酵素を入手することが困難である場合がある。
【０１０５】
反応開始時の溶液中に含まれるホスホグルコムターゼの量は、目的の反応を進行させるに充分な量であればよい。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるホスホグルコムターゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコース１ｇに対して、好ましくは約１Ｕ以上であり、より好ましくは約１０Ｕ以上であり、さらに好ましくは約５０Ｕ以上であり、特に好ましくは約１００Ｕ以上であり、最も好ましくは約１５０Ｕ以上である。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるホスホグルコムターゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコースに対して、好ましくは約１５００Ｕ以下であり、より好ましくは約１０００Ｕ以下であり、さらに好ましくは約５００Ｕ以下であり、特に好ましくは約３００Ｕ以下であり、最も好ましくは約２００Ｕ以下である。ホスホグルコムターゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１０６】
（６．α−１，４−グルカンホスホリラーゼ）
α−１，４−グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．１）とは、α−１，４−グルカン（重合度ｎ）の加リン酸分解による、α−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）とα−Ｄ−グルコース−１−リン酸との産生を触媒する酵素の総称であり、ホスホリラーゼ、スターチホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと呼ばれる場合もある。α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応である、α−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）およびα−Ｄ−グルコース−１−リン酸からα−１，４−グルカン（重合度ｎ）を合成する反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、α−１，４−グルカンホスホリラーゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。本発明の方法では、無機リン酸は、β−１，４−グルカンの加リン酸分解に使われ、反応溶液中に含まれる無機リン酸の量が少ないので、α−グルカンの合成の方向に反応が進む。
【０１０７】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。
【０１０８】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ（馬鈴薯ともいう）、サツマイモ（甘藷ともいう）、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバなどの芋類、キャベツ、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。
【０１０９】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類などが挙げられる。
【０１１０】
α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物の例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．などが挙げられる。α−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１１１】
本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来することが好ましく、ジャガイモに由来することがより好ましい。特定の実施形態では、本発明で用いられるα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いα−１，４−グルカンホスホリラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１１２】
また、至適ｐＨの観点からは、約４．０以上の至適ｐＨを有するα−１，４−グルカンホスホリラーゼが好ましい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適ｐＨは、より好ましくは約４．５以上であり、さらに好ましくは約５．０以上である。また、約７．０以下の至適ｐＨを有するα−１，４−グルカンホスホリラーゼが好ましい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適ｐＨは、より好ましくは約６．５以下であり、さらに好ましくは約６．０以下である。
【０１１３】
本発明においては、後述するとおり、反応開始時点における反応溶液のｐＨを弱アルカリ性側にすることが好ましいが、その場合、α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適ｐＨと比較して、多少の差が生じることになる。反応開始時点における反応溶液のｐＨと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適ｐＨとの差は、約０．５以上とすることが可能であり、約１．０以上とすることも可能であり、さらには約１．５以上とすることも可能である。反応開始時点における反応溶液のｐＨと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適ｐＨとの差は、好ましくは約５．５以下であり、より好ましくは約４．０以下であり、さらに好ましくは約２．５以下である。
【０１１４】
また、至適温度の観点からは、約３０℃以上の至適温度を有するα−１，４−グルカンホスホリラーゼが好ましい。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適温度は、より好ましくは約３５℃以上であり、さらに好ましくは約４０℃以上である。当該分野においては、至適温度の高い種々のα−１，４−グルカンホスホリラーゼが公知である。例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のα−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適温度は約９０℃であり、至適ｐＨは５．６である。このα−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生するＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓは、例えば、ＡＴＣＣから入手可能である。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの至適温度に特に上限はなく、至適温度は例えば、約８０℃以下、約７５℃以下、約７０℃以下、約６５℃以下、約６０℃以下、約５５℃以下、約５０℃以下、約４５℃以下、約４０℃以下などであり得る。至適温度が非常に高い酵素については、その酵素を入手することが困難である場合がある。
【０１１５】
反応開始時の溶液中に含まれるα−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、目的の反応を進行させるに充分な量であればよい。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるα−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコース１ｇに対して、好ましくは約１Ｕ以上であり、より好ましくは約１０Ｕ以上であり、さらに好ましくは約５０Ｕ以上であり、特に好ましくは約１００Ｕ以上であり、最も好ましくは約１５０Ｕ以上である。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるα−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のグルコースに対して、好ましくは約１５００Ｕ以下であり、より好ましくは約１０００Ｕ以下であり、さらに好ましくは約５００Ｕ以下であり、特に好ましくは約３００Ｕ以下であり、最も好ましくは約２００Ｕ以下である。α−１，４−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１１６】
（７．ゲスト化合物）
アミロースなどの直鎖状α−グルカン、および分岐状α−グルカンのうちの直鎖状の部分がゲスト化合物を包接することが公知である。すなわち、これらのα−グルカンは、ホスト化合物として作用することが公知である。これらのα−グルカンは、ゲスト化合物を包接すると沈澱しやすくなる。そのため、本発明の方法においては、反応溶液中にゲスト化合物を含むことが好ましい。ゲスト化合物は、反応開始時から溶液中に含有されてもよく、あるいは、ある程度反応が進んでから溶液中に添加されてもよい。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、用語「ゲスト化合物」とは、アミロースによって包接される化合物をいう。ゲスト化合物がアミロースによって包接された場合に得られる包接化合物が難溶性または不溶性であるものが好ましい。
【０１１８】
ゲスト化合物は、好ましくは、プライマーによって包接されない化合物である。
【０１１９】
本発明で好ましく使用され得るゲスト化合物の例としては、デカン酸（カプリン酸）、ラウリン酸、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートなどが挙げられる。ゲスト化合物は、好ましくは、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートであり、より好ましくは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートである。
【０１２０】
（８．グルコース−６−リン酸、グルコース−１−リン酸、または無機リン酸）
本発明において、出発物質としてグルコース−６−リン酸を使用することが可能である。本明細書において使用される場合、用語「グルコース−６−リン酸（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とは、グルコース−６−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ；ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）およびその塩をいう。グルコース−６−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−６−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。狭義のグルコース−６−リン酸は、グルコースの６位の炭素にリン酸基が結合している物質である。グルコース−６−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−６−リン酸二ナトリウム、グルコース−６−リン酸二カリウム、グルコース−６−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、特に断りの無い限り、グルコース−６−リン酸は、広義のグルコース−６−リン酸、すなわち狭義のグルコース−６−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩を示す。
【０１２１】
反応開始時の反応溶液は、１種類のグルコース−６−リン酸を含有してもよく、複数種類のグルコース−６−リン酸を含有してもよい。
【０１２２】
本明細書において使用される場合、用語「グルコース−１−リン酸（ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」とは、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ；ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）およびその塩をいう。グルコース−１−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。グルコース−１−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−１−リン酸二ナトリウム、グルコース−１−リン酸二カリウム、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を書いていないグルコース−１−リン酸は、広義のグルコース−１−リン酸、すなわち狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩を示す。
【０１２３】
反応開始時の反応溶液は、１種類のグルコース−１−リン酸を含有してもよく、複数種類のグルコース−１−リン酸を含有してもよい。
【０１２４】
本明細書において使用される場合、用語「無機リン酸」とは、リン酸のあらゆる種類のイオンおよび塩の総称である。例えば、無機リン酸は、セロビオースからグルコース−１−リン酸を合成する反応においてリン酸基質を供与する。すなわち、無機リン酸は、この反応においてリン酸源として作用する。ここでリン酸基質とは、グルコース−１−リン酸のリン酸部分（ｍｏｉｅｔｙ）の原料となる物質をいう。β−１，４−グルカンホスホリラーゼによって触媒されるβ−１，４−グルカン加リン酸分解において、無機リン酸はリン酸イオンの形態で基質として作用していると考えられる。当該分野ではこの基質を慣習的に無機リン酸というので、本明細書中でも、この基質を無機リン酸という。無機リン酸には、リン酸およびリン酸の無機塩が含まれる。通常、無機リン酸は、アルカリ金属イオンなどの陽イオンを含む水中で使用される。この場合、リン酸とリン酸塩とリン酸イオンとは平衡状態になるので、リン酸とリン酸塩とは区別をしにくい。従って、便宜上、リン酸とリン酸塩とを合わせて無機リン酸という。本発明において、無機リン酸は好ましくは、リン酸の任意の金属塩であり、より好ましくはリン酸のアルカリ金属塩である。無機リン酸の好ましい具体例としては、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウムなどが挙げられる。
【０１２５】
反応開始時の反応溶液は、１種類の無機リン酸を含有してもよく、複数種類の無機リン酸を含有してもよい。
【０１２６】
無機リン酸は、例えば、ポリリン酸（例えば、ピロリン酸、三リン酸および四リン酸）のようなリン酸縮合体またはその塩を、物理的、化学的または酵素反応などによって分解したものを反応溶液に添加することによって提供され得る。ポリリン酸は、通常、少量の無機リン酸を不純物として含有する。そのため、α−グルカンの合成には無機リン酸が必要であるが、市販のポリリン酸を添加すれば、無機リン酸を添加する必要がない場合がある。
【０１２７】
（９．グルコースイソメラーゼ（ＥＣ：５．３．１．５））
本発明の方法において、出発物質としてフルクトースを使用することも可能である。他の酵素反応の副産物としてフルクトースが得られる場合、本発明ではこのフルクトースを有効に利用することができる。
【０１２８】
出発物質としてフルクトースを使用する実施形態では、反応溶液中にグルコースイソメラーゼをさらに含むことが好ましい。溶液中にグルコースイソメラーゼを含むことにより、フルクトースをグルコースへと変換できる。
【０１２９】
本発明の製造方法で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースとの相互変換を触媒し得る酵素である。グルコースイソメラーゼは、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースとの相互変換をも触媒し得るので、キシロースイソメラーゼとも呼ばれる。
【０１３０】
グルコースイソメラーゼは、微生物、動物および植物に存在する。グルコースイソメラーゼを産生する微生物の例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓおよびＰａｒａｃｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｇｅｎｏｉｄｅｓが挙げられる。グルコースイソメラーゼを産生する動物の例としては、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉが挙げられる。グルコースイソメラーゼは、植物由来であってもよい。グルコースイソメラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１３１】
本発明で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．に由来することが好ましく、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられるグルコースイソメラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグルコースイソメラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１３２】
反応開始時の溶液中に含まれるグルコースイソメラーゼの量は、目的の反応を進行させるに充分な量であればよい。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中のフルクトース１ｇに対して、好ましくは約０．０１Ｕ以上であり、より好ましくは約０．０５Ｕ以上であり、さらに好ましくは約０．１Ｕ以上であり、特に好ましくは約０．５Ｕ以上であり、最も好ましくは約１Ｕ以上である。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中のフルクトース１ｇに対して、好ましくは約５００Ｕ以下であり、より好ましくは約１００Ｕ以下であり、さらに好ましくは約５０Ｕ以下であり、特に好ましくは約１０Ｕ以下であり、最も好ましくは約５Ｕ以下である。グルコースイソメラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１３３】
（１０．β−１，４−グルカンホスホリラーゼ）
本発明において、出発物質としてβ−１，４−グルカンを使用することも可能である。出発物質としてβ−１，４−グルカンを使用する実施形態では、反応溶液中にβ−１，４−グルカンホスホリラーゼを含むことが好ましい。
【０１３４】
本明細書中では、「β−１，４−グルカンホスホリラーゼ」とは、β−１，４−グルカンの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるβ−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存するが、この反応は、β−１，４−グルカン合成反応の方向に進みやすい傾向がある。β−１，４−グルカンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【０１３５】
【化３】
2010148407.tif 000004
なお、この式において、出発時のβ−１，４−グルカンの重合度が２の場合、β−１，４−グルカンの代わりにグルコースが得られる。
【０１３６】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼは好ましくは、セロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．２０）またはセロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．４９）である。
【０１３７】
セロビオースホスホリラーゼは、セロビオースの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロビオースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【０１３８】
【化４】
2010148407.tif 000005
セロデキストリンホスホリラーゼは、重合度３以上のセロオリゴ糖の非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロオリゴ糖は、セロデキストリンとも呼ばれる。セロデキストリンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【０１３９】
【化５】
2010148407.tif 000006
本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロビオースである場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においてはまた、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。この場合、セロデキストリンホスホリラーゼの作用によってセロオリゴ糖が分解されることによって生じたグルコース−１−リン酸がα−グルカン合成に使用され、かつ最終的に生じたセロビオースをセロビオースホスホリラーゼによって分解し得るので、セロオリゴ糖からα−グルカンの合成速度がより速くなる。
【０１４０】
出発物質としてβ−１，４−グルカンホスホリラーゼを使用する実施形態では、反応用液中に少なくともセロビオースホスホリラーゼを含有することが好ましい。セロビオースによって記載される上記反応によって生成されるグルコースは、ポリホスフェートグルコキナーゼおよびホスホグルコムターゼによって触媒される反応によりＧ１−Ｐへと変換されるため、β−１，４−グルカン（特に、セロビオース）を効率よく利用できる。
【０１４１】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ  ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ  ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ  ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ  ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．からなる群より選択される。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。
【０１４２】
セロビオースホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。セロビオースホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ
ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ  ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ  ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。セロビオースホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ  ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ  ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．からなる群より選択され、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓであり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍである。セロビオースホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。
【０１４３】
セロデキストリンホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。セロデキストリンホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ属の生物（例えば、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の生物（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ属の生物（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ  ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｆｏｍｅｓ属の生物（例えば、Ｆｏｍｅｓ  ａｎｎｏｓ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属の生物およびＥｒｗｉｎｉａ属の生物が挙げられる。セロデキストリンホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ  ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ  ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．からなる群より選択され、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍである。セロデキストリンホスホリラーゼホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。
【０１４４】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）を産生する任意の生物由来であり得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを１．４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で５５℃にて２０分間加熱した場合に加熱前のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの活性の５０％以上の活性を保持するものであることが好ましく、６０％以上の活性を保持するものであることがより好ましく、７０％以上の活性を保持するものであることがさらに好ましく、８０％以上の活性を保持するものであることが特に好ましく、８５％以上の活性を保持するものであることが最も好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ  ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ  ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来である。
【０１４５】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ
ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ  ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ  ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓ由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。
【０１４６】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ
ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ  ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ  ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。
【０１４７】
反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、目的の反応を進行させるに充分な量であればよい。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンの１ｇに対して、好ましくは約０．０１Ｕ以上であり、より好ましくは約０．０５Ｕ以上であり、さらに好ましくは約０．１Ｕ以上であり、特に好ましくは約０．５Ｕ以上であり、最も好ましくは約１Ｕ以上である。好ましい実施形態では、反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のβ−１，４−グルカンの１ｇに対して、好ましくは約１，０００Ｕ以下であり、より好ましくは約５００Ｕ以下であり、さらに好ましくは約１００Ｕ以下であり、特に好ましくは約５０Ｕ以下であり、最も好ましくは約７Ｕ以下である。β−１，４−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。
【０１４８】
（１１．アミラーゼ）
本発明の方法において、出発物質としてデンプンを使用することも可能である。デンプンを出発物質として使用する実施形態では、アミラーゼなどのデンプン分解酵素は、アミロース合成を行う反応溶液とは別の溶液に含まれることが好ましい。生成したアミロースが分解されてしまうからである。アミラーゼを使用する場合は、デンプンをアミラーゼで分解してグルコースを得た後に、その反応液を加熱してアミラーゼを失活させることが好ましい。
【０１４９】
アミラーゼはデンプンを加水分解する酵素の総称である。アミラーゼには、非還元性末端から特定数のグルコース単位を切り離していくエキソ型と、ほぼランダムに近い分解様式をもつエンド型がある。本発明においてアミラーゼを使用する場合には、エキソ型およびエンド型のいずれのアミラーゼを使用してもよい。アミラーゼの例としては、エキソ−１，４−α−Ｄ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３；グルコシダーゼとも呼ばれる）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、エキソ−イソマルトトリヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９５）、エキソ−マルトテトラオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）、エキソ−マルトヘキサオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９８）が挙げられる。
【０１５０】
（１２．β−１，４−グルカン）
本発明において、出発物質としてβ−１，４−グルカンを使用することが可能である。本明細書中では「β−１，４−グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、β−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。β−１，４−グルカンは、直鎖状の分子であり得る。直鎖状β−グルカンとβ−１，４−グルカンとセルロースとは同義語である。直鎖状β−グルカンでは、β−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。１分子のβ−１，４−グルカンに含まれる糖単位の数を、このβ−１，４−グルカンの重合度という。β−１，４−グルカンの重合度は、好ましくは、約２〜約１０であり、より好ましくは約２〜約８であり、より好ましくは約２〜約５である。重合度が約２〜約１０のβ−１，４−グルカンを、セロオリゴ糖ともいう。重合度が２のβ−１，４−グルカンを特に、セロビオースという。重合度が３のβ−１，４−グルカンをセロトリオースという。重合度が４のβ−１，４−グルカンをセロテトラオースという。β−１，４−グルカンの重合度が低いほど溶解度が高く、取り扱いが容易であるので、重合度の低いβ−１，４−グルカンがより好ましい。β−１，４−グルカンは、あらゆる植物中に存在する。β−１，４−グルカンは、植物から単離されたまま未改変のものであってもよく、植物から単離したものを化学的または酵素的に処理することによって得られたものであってもよい。β−１，４−グルカンはまた、古紙、建材、古布などの廃棄物から再生されるセルロースまたはそれから調製されたものであってもよい。例えば、植物から単離した高分子量のセルロースに対してセルラーゼを作用させることによって、より低分子量のセロオリゴ糖が得られる。植物からセロオリゴ糖を大量に生産する方法は当該分野で公知である。このような文献の例としては、特開２００１−９５５９４号公報が挙げられる。β−１，４−グルカンは、β−１，４−グルカンを含む植物破砕液から精製β−１，４−グルカンに至るいずれの生成段階のものとして提供されてもよい。本発明の方法で使用されるβ−１，４−グルカンは、純粋なものであることが好ましい。しかし、本発明で用いる酵素の作用を阻害しない限り、任意の他の夾雑物を含んでいてもよい。
【０１５１】
出発物質としてβ−１，４−グルカンを使用する実施形態において、反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンの濃度は、好ましくは約０．１重量％以上であり、より好ましくは約０．５重量％以上であり、さらに好ましくは約１重量％以上であり、特に好ましくは約２重量％以上であり、最も好ましくは約３重量％以上である。出発物質としてβ−１，４−グルカンを使用する実施形態において、反応開始時の溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンの濃度は、好ましくは約４０重量％以下であり、より好ましくは約３０重量％以下であり、さらに好ましくは約２０重量％以下であり、特に好ましくは約１５重量％以下であり、最も好ましくは約１２重量％以下である。なお、本明細書中でβ−１，４−グルカンの濃度は、Ｗｅｉｇｈｔ／Ｖｏｌｕｍｅで、すなわち、
（β−１，４−グルカンの重量）×１００／（溶液の容量）
で計算する。β−１，４−グルカンの重量が多すぎると、溶液中に未反応のβ−１，４−グルカンが析出する場合がある。β−１，４−グルカンの使用量が少なすぎると、高温での反応において、反応自体は起こるものの、収率が低下する場合がある。
【０１５２】
（１３．枝切り酵素）
本発明の方法において、プライマーとしてα−１，６−グルコシド結合を含有するものを用いる場合などの、生成物に分岐が生じる場合には、必要に応じて、枝切り酵素を用いることができる。
【０１５３】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、α−１，６−グルコシド結合を切断し得る酵素である。枝切り酵素は、アミロペクチンおよびグリコーゲンにともによく作用するイソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）と、アミロペクチン、グリコーゲンおよびプルランに作用するα−デキストリンエンド−１，６−α−グルコシダーゼ（プルラナーゼともいう）（ＥＣ  ３．２．１．４１）との２つに分類される。
【０１５４】
枝切り酵素は、微生物および植物に存在する。枝切り酵素を産生する微生物の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｔｈａｌｐｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマイモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウダイコンなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する生物はこれらに限定されない。
【０１５５】
本発明で用いられ得る枝切り酵素は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａに由来することが好ましく、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａに由来することがより好ましい。本発明で用いられる枝切り酵素は、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い枝切り酵素は、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１５６】
（１４．ブランチングエンザイム（ＥＣ．２．４．１．１８））
本発明の方法において、生成物に分岐を生じさせることが所望される場合には、必要に応じて、ブランチングエンザイムを用いることができる。
【０１５７】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、α−１，４−グルカン鎖の一部をこのα−１，４−グルカン鎖のうちのあるグルコース残基の６位に転移して分枝を作り得る酵素である。ブランチングエンザイムは、１，４−α−グルカン分枝酵素、枝つくり酵素またはＱ酵素とも呼ばれる。
【０１５８】
ブランチングエンザイムは、微生物、動物、および植物に存在する。ブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｌｉｃ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｉｒｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、酵母などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する動物の例としてはヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１５９】
本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、ジャガイモ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓに由来することが好ましく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられるブランチングエンザイムは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いブランチングエンザイムは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１６０】
（１５．４−α−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．４．１．２５））
本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、４−α−グルカノトランスフェラーゼを用いることができる。
【０１６１】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ディスプロポーショネーティングエンザイム、Ｄ−酵素、アミロマルターゼ、不均化酵素などとも呼ばれ、マルトオリゴ糖の糖転移反応（不均一化反応）を触媒し得る酵素である。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からグルコシル基あるいは、マルトシルもしくはマルトオリゴシルユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。従って、酵素反応は、最初に与えられたマルトオリゴ糖の重合度の不均一化をもたらす。供与体分子と受容体分子とが同一の場合は、分子内転移が生じ、その結果、環状構造をもつ生成物が得られる。
【０１６２】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、微生物および植物に存在する。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物の例としては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓなどが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、トウモロコシ、イネ、コムギ、などの穀類、えんどう豆、大豆、などの豆類などが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１６３】
本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｒａｌｉｓに由来することが好ましく、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来することがより好ましい。本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い４−α−グルカノトランスフェラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【０１６４】
（１６．グリコーゲンデブランチングエンザイム（ＥＣ．２．４．１．２５／ＥＣ．３．２．１．３３））
本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、グリコーゲンデブランチングエンザイムを用いることができる。
【０１６５】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、α−１，６−グルコシダーゼ活性と、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性との２種類の活性をもつ酵素である。グリコーゲンデブランチングエンザイムが持つ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性により、環状構造を持つ生成物が得られる。
【０１６６】
グリコーゲンデブランチングエンザイムは、微生物および動物に存在する。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、酵母などが挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。
【０１６７】
本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、酵母に由来することが好ましい。本発明で用いられるグリコーゲンデブランチングエンザイムは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグリコーゲンデブランチングエンザイムは、例えば、タンパク質工学的手法により、中温で作用し得る酵素に改変を加えることで得られる。
【０１６８】
（１７．本発明で使用される酵素についての一般的説明）
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物が天然で有するその酵素のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有することをいう。ある生物の有するある酵素をその生物から直接単離した場合も、遺伝子組換え技術を用いてその生物の有するアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する酵素を別の生物から得た場合も、その生物に由来するという。人工合成された遺伝子であっても同じ配列を有する場合はその生物に由来するという。場合によっては、それらの場合を含めて、その生物から得られた酵素という。例えば、あの生物から入手したある酵素をコードする核酸分子を大腸菌に導入して、その大腸菌からその酵素を単離する場合も、その酵素は「その生物に由来する」または「その生物から得られた」という。
【０１６９】
本発明で用いられる各種酵素は、各酵素について記載したような、自然界に存在する、その酵素を産生する生物から直接単離された酵素であってよい。あるいは、本発明で用いられる各種酵素は、その酵素を産生する生物から単離した、その酵素をコードする核酸分子を用いて組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離した酵素であってもよい。
【０１７０】
本発明においては、天然の酵素と同等以上の酵素活性を有するのであれば、そのアミノ酸配列の一部が改変された酵素を使用してもよい。改変された酵素が使用される場合、この改変された酵素は、天然の酵素に対して、好ましくは少なくとも約８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも約９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、最も好ましくは約９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。好ましくは、この改変された酵素は、天然の酵素に対して１または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加を有する。このような置換、欠失または付加は、保存的なものであることが好ましい。このような置換、欠失または付加は、酵素の非活性部位に存在することが好ましい。天然の酵素活性に悪影響を及ぼさずにアミノ酸の置換、欠失または付加をする方法は、当業者に公知である。好ましくは、この改変された酵素は、天然の酵素と比較して約９０％以上の活性を有し、より好ましくは約９５％以上の活性を有し、さらに好ましくは約１００％以上の活性を有する。このような改変された酵素は、当業者に公知の方法によって作製され得る。
【０１７１】
本発明の方法で用いられる各種酵素は、例えば、以下のようにして調製され得る。まず、その酵素を産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）を培養する。この微生物は、その酵素を直接生産する微生物であってもよい。また、その酵素をコードする核酸分子をクローン化し、得られた核酸分子で、その酵素の発現に有利な微生物（例えば、細菌、真菌など）を組換えして、組換えされた微生物を得、得られた微生物からその酵素を得てもよい。
【０１７２】
各種酵素をコードする核酸分子での組換えに用いられる微生物は、各種酵素の発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。アミラーゼは、生成されたグルカンを分解してしまうので、本発明のアミロース合成方法に使用される各種酵素は、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましい。従って、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。各種酵素の遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される各種酵素は、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。
【０１７３】
クローン化した遺伝子での微生物（例えば、細菌、真菌など）の遺伝子組換えは、当業者に周知の方法に従って行われ得る。クローン化した遺伝子を用いる場合、この遺伝子を、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結することが好ましい。「作動可能に連結する」とは、プロモーターと遺伝子とが、そのプロモーターによって遺伝子の発現が調節されるように連結されることをいう。誘導性プロモーターを用いる場合、培養を、誘導条件下で行うことが好ましい。種々の誘導性プロモーターは当業者に公知である。
【０１７４】
クローン化した遺伝子について、生産される各種酵素が菌体外に分泌されるように、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をこの遺伝子に連結し得る。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は当業者に公知である。
【０１７５】
当業者は、各種酵素を生産するために、微生物（例えば、細菌、真菌など）の培養の条件を適切に設定し得る。微生物の培養に適切な培地、各誘導性プロモーターに適切な誘導条件などは当業者に公知である。
【０１７６】
例えば、発現された酵素が形質転換細胞内に蓄積する場合、形質転換細胞を適切な条件下で培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を回収し、次いで適切な緩衝液に懸濁する。次いで超音波処理などにより細胞を破砕した後、遠心分離もしくは濾過することによって上清を得る。あるいは、発現された酵素が形質転換細胞外に分泌される場合、このようにして形質転換細胞を培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を分離して上清を得る。目的の酵素が形質転換細胞内に蓄積する場合も、形質転換細胞外に分泌される場合も、このようにして得られた酵素含有上清を通常の手段（例えば、塩析法、溶媒沈澱、限外濾過）を用いて濃縮し、酵素を含む画分を得る。この画分を濾過、あるいは遠心分離、脱塩処理などの処理を行い粗酵素液を得る。さらにこの粗酵素液を、凍結乾燥、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、晶出などの通常の酵素の精製手段を適宜組み合わせることによって、比活性が向上した粗酵素あるいは精製酵素が得られる。α−アミラーゼなどのグルカンを加水分解する酵素が含まれていなければ、粗酵素をそのまま、例えば、α−グルカンの製造に用い得る。
【０１７７】
各種酵素は、精製されていても未精製であってもよい。各種酵素は、固定化されていても固定化されていなくともよい。各種酵素は、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。各種酵素は、担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１７８】
（１８．溶媒）
本発明の方法に用いる溶媒は、本発明で用いられる各種酵素の酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。
【０１７９】
なお、グルカンを生成する反応が進行し得る限り、溶媒が本発明の方法に用いる材料を完全に溶解する必要はない。例えば、酵素が固体の担体上に担持されている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、グルコースなどの反応材料も全てが溶解している必要はなく、反応が進行し得る程度の材料の一部が溶解していればよい。
【０１８０】
代表的な溶媒は、水である。溶媒は、各種酵素を調製する際に得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。
【０１８１】
水は、軟水、中間水および硬水のいずれであってもよい。硬水とは、硬度２０°以上の水をいい、中間水とは、硬度１０°以上２０°未満の水をいい、軟水とは、硬度１０°未満の水をいう。水は、好ましくは軟水または中間水であり、より好ましくは軟水である。
【０１８２】
（１９．他の成分）
本発明で使用される溶液中には、目的の反応を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、各種酵素を産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。
【０１８３】
＜α−グルカンの製造＞
１つの実施形態では、本発明のα−グルカンは、グルコースと、ポリリン酸と、プライマーと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法によって製造される。
【０１８４】
別の実施形態では、本発明のα−グルカンは、グルコース−６−リン酸と、プライマーと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼとを含む溶液を反応させてα−グルカンを製造する工程を包含する方法によって製造される。
【０１８５】
別の実施形態では、本発明のα−グルカンは、セロビオースと、ポリリン酸と、プライマーと、セロビオースホスホリラーゼと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する方法によって製造される。
【０１８６】
別の実施形態では、本発明のα−グルカンは、フルクトースと、ポリリン酸と、プライマーと、グルコースイソメラーゼと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する方法によって製造される。
【０１８７】
別の実施形態では、本発明のα−グルカンは、デンプンをアミラーゼによってグルコースに分解する工程；アミラーゼを失活させる工程；ポリリン酸と、プライマーと、ポリホスフェートグルコキナーゼと、ホスホグルコムターゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する方法によって製造される。
【０１８８】
図１５に、これらの方法をまとめて記載する。本発明の最も基本的な方法は、Ｇ６−ＰからＧ１−Ｐを経てアミロース、デンプン、グリコーゲンなどのα−グルカンを製造する方法である。Ｇ６−Ｐは、グルコースおよびポリリン酸にＰＧＫを作用させることにより生成され得る。グルコースは、フルクトースにグルコースイソメラーゼを作用させることによって生成され得る。グルコースはまた、セルロースにセルラーゼ、セロビオースホスホリラーゼなどを作用させることによって生成され得る。グルコースはまた、デンプンにアミラーゼを作用させることによって生成され得る。生成物であるα−グルカンを分解してしまうアミラーゼを使用する方法を除けば、これらのグルコースを生成する方法は、グルコースからＧ６−Ｐを経て、次いでＧ１−Ｐを経てα−グルカンを製造する方法と同一の溶液中で同時に行われ得る。
【０１８９】
本発明の製造方法においては例えば、まず、溶液を調製する。溶液は、例えば、適切な溶媒に、反応に使用する各種物質を添加することにより調製され得る。あるいは、溶液は、反応に使用する各種物質をそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、溶液は、反応に使用する各種物質のうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。本発明の製造方法で用いられる溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。この溶液のｐＨは、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意のｐＨであり得る。ｐＨ値は、好ましくは約５．７〜約１１であり、より好ましくは約７．４〜約８．５である。ｐＨは、反応に用いる酵素の至適ｐＨに合わせて適切に設定され得る。溶液の塩濃度もまた、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意の塩濃度であり得る。ＰＧＭはＭｇイオンを必要とするため、ＭｇＣｌ２などのＭｇイオンを放出する物質を溶液に添加することが好ましい。Ｍｇイオンを放出する物質の、反応開始時の溶液中での濃度は、好ましくは約２０ｍＭ以上であり、より好ましくは約３０ｍＭ以上であり、さらに好ましくは約４０ｍＭ以上である。Ｍｇイオンを放出する物質の、反応開始時の溶液中での濃度は、好ましくは約１００ｍＭ以下であり、より好ましくは約８０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは約６０ｍＭ以下である。
【０１９０】
また、この溶液には、必要に応じて枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を添加してもよい。これらの酵素は、α−グルカン合成反応の開始時に添加されてもよく、反応の途中に添加されてもよく、また、反応が終了した後に添加されてもよい。
【０１９１】
さらに、この溶液には、ゲスト化合物を添加してもよい。ゲスト化合物は、反応開始時にこの溶液中に含有されてもよく、あるいは、反応がある程度進んだ時点で反応溶液に添加されてもよい。ゲスト化合物としてＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度は、好ましくは約０．１ｍＭ以上であり、より好ましくは約１ｍＭ以上であり、さらに好ましくは約１０ｍＭ以上であり；この化合物の濃度は、好ましくは約５０ｍＭ以下であり、より好ましくは約２０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは約１５ｍＭ以下である。ゲスト化合物としてＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度が１０ｍＭであると、コントロール（ゲスト化合物を添加しない場合）の約１．５倍の収率を得ることができるという顕著な効果が得られる。
【０１９２】
ゲスト化合物として３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度は、好ましくは約０．１ｍＭ以上であり、より好ましくは約１ｍＭ以上であり、さらに好ましくは約１０ｍＭ以上であり；この化合物の濃度は、好ましくは約５０ｍＭ以下であり、より好ましくは約２０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは約１５ｍＭ以下である。ゲスト化合物として３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度が１ｍＭ〜１０ｍＭであると、コントロール（ゲスト化合物を添加しない場合）の約１．８倍〜約２倍の収率を得ることができるという顕著な効果が得られる。
【０１９３】
ゲスト化合物として３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度は、好ましくは約０．１ｍＭ以上であり、より好ましくは約１ｍＭ以上であり、さらに好ましくは約１０ｍＭ以上であり；この化合物の濃度は、好ましくは約５０ｍＭ以下であり、より好ましくは約２０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは約１５ｍＭ以下である。ゲスト化合物として３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチル−アンモニオ）プロパンスルホネートを使用する場合、この化合物の濃度が１０ｍＭであると、コントロール（ゲスト化合物を添加しない場合）の約２．７倍の収率を得ることができるという顕著な効果が得られる。
【０１９４】
次いで、溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。溶液の温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり、添加した酵素がその活性を示す温度である。例えば、耐熱性酵素を用い、反応温度をその耐熱酵素に最適な温度にすることによって、添加した耐熱性酵素以外の混入した酵素の活性を抑え得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれる各種酵素の活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。反応に使用する各種酵素の反応至適温度がいずれも約３０℃〜４０℃の範囲内である場合、反応温度は、好ましくは約２５℃以上であり、より好ましくは約３０℃以上であり；反応温度は、好ましくは約５０℃以下であり、より好ましくは約４０℃以下である。反応に使用する各種酵素がいずれも耐熱性酵素である場合、反応温度は、その耐熱性酵素の反応至適温度の±１０℃以内にあることが好ましく、±５℃以内にあることが好ましい。反応に使用する各種酵素の反応至適温度が幅広い範囲にわたる場合、反応温度は、その範囲内で適切に設定され得る。反応に使用する各種酵素の反応至適温度が±５℃以内にあることが好ましく、ほぼ同じであることが好ましい。
【０１９５】
グルコースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨ（反応開始時の溶液のｐＨ）は、好ましくは約５．７以上であり、より好ましくは約７．４以上である。グルコースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨは、好ましくは約１２．０以下であり、より好ましくは約１１．０以下であり、さらに好ましくは約８．５以下である。反応で使用する各酵素の代表的な至適ｐＨは、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓ由来のＰＧＫが約ｐＨ７．０であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＰＧＭが約ｐＨ７．５であり、そしてＧＰが約ｐＨ５．５である。初期ｐＨが低すぎるとアミロース合成収率が低くなるかまたはアミロースが合成されない。反応溶液の初期ｐＨを適切に調整することにより、約２０％程度のアミロース収率を得られる。
【０１９６】
Ｇ６−Ｐを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨは、好ましくは約７．３以上であり、より好ましくは約７．５以上である。Ｇ６−Ｐを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨは、好ましくは約１２．０以下であり、より好ましくは約１１．０以下であり、さらに好ましくは約８．５以下である。初期ｐＨが低すぎるとアミロース合成収率が低くなるかまたはアミロースが合成されない。反応溶液の初期ｐＨを適切に調整することにより、約２５％以上のアミロース収率を得られる。
【０１９７】
セロビオースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨは、好ましくは約５．６以上であり、より好ましくは約７．５以上である。セロビオースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期ｐＨは、好ましくは約１２以下であり、より好ましくは約８．５以下である。初期ｐＨが低すぎるとアミロース合成収率が低くなるかまたはアミロースが合成されない。反応溶液の初期ｐＨを適切に調整することにより、約６２％以上のアミロース収率を得られる。
【０１９８】
グルコースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期グルコース濃度（反応開始時の溶液のグルコース濃度）は、好ましくは約１００ｍＭ以上であり、より好ましくは約２００ｍＭ以上であり、特に好ましくは約４００ｍＭ以上であり、最も好ましくは約５００ｍＭ以上である。グルコースを出発材料として用いる場合、溶液中に含まれるグルコースの濃度に特に上限はないが、例えば、約２．５Ｍ以下、約２Ｍ以下、約１．５Ｍ以下、約１Ｍ以下、約７５０ｍＭ以下などであり得る。グルコースの量が多すぎると、反応に適切な量のポリリン酸を溶解することができず、収率が低下する場合がある。グルコースの使用量が少なすぎると、アミロース合成の方向に反応が進まない場合がある。
【０１９９】
グルコース−６−リン酸を出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期グルコース−６−リン酸濃度（反応開始時の溶液のグルコース−６−リン酸濃度）は、好ましくは約２０ｍＭ以上であり、より好ましくは約１００ｍＭ以上であり、特に好ましくは約２００ｍＭ以上である。グルコース−６−リン酸を出発材料として用いる場合、溶液中に含まれるグルコース−６−リン酸の濃度に特に上限はないが、例えば、約２Ｍ以下、約１．５Ｍ以下、約１Ｍ以下、約７５０ｍＭ以下などであり得る。グルコース−６−リン酸の量が多すぎると溶解することができず、収率が低下する場合がある。グルコース−６−リン酸の使用量が少なすぎると、アミロース合成の方向に反応が進まない場合がある。
【０２００】
セロビオースを出発物質とする実施形態では、反応溶液の初期セロビオース濃度（反応開始時の溶液のセロビオース濃度）は、好ましくは約１００ｍＭ以上であり、より好ましくは約１５０ｍＭ以上であり、特に好ましくは約１７５ｍＭ以上である。セロビオースを出発材料として用いる場合、溶液中に含まれるセロビオースの濃度に特に上限はないが、例えば、約１．０Ｍ以下、約７５０ｍＭ以下、約５００ｍＭ以下、約２５０ｍＭ以下、約１２５ｍＭ以下などであり得る。セロビオースの量が多すぎると、セロビオースそのものや反応に適切な量のポリリン酸を溶解することができず、収率が低下する場合がある。セロビオースの使用量が少なすぎると、アミロース合成の方向に反応が進まない場合がある。
【０２０１】
グルコースを出発物質とする実施形態では、反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）が、好ましくは約０．１５以下であり、より好ましくは約０．０３以下である。
【０２０２】
Ｇ６−Ｐを出発物質とする実施形態では、反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）が、好ましくは約０．４以下であり、より好ましくは約０である。
【０２０３】
セロビオースを出発物質とする実施形態では、反応開始時の該溶液中の遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）が、好ましくは約０〜４であり、より好ましくは約０．００８〜２であり、更に好ましくは０．０２８〜０．８１０であり、最も好ましくは０．０５６〜０．１６２である。
【０２０４】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるグルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、好ましくは約１時間以上であり、より好ましくは約２時間以上であり、さらに好ましくは約３時間以上である。反応時間は、好ましくは約１００時間以下であり、より好ましくは約７２時間以下であり、さらに好ましくは約５４時間以下であり、特に好ましくは約３６時間以下であり、最も好ましくは約２４時間以下である。
【０２０５】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
【０２０６】
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、各種原料のうちの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。
【０２０７】
このようにして、α−グルカンを含有する溶液が生産される。
【０２０８】
反応終了後、溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。溶液は、そのまま保存されてもよいし、生産されたグルカンを単離するために処理されてもよい。
【０２０９】
＜精製方法＞
生産されたα−グルカンは、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、グルコースである。α−グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２））および有機溶媒を用いない方法がある。
【０２１０】
有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、ｎ−アミルアルコール、ペンタゾール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、２−エチル−１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−ブチルアルコール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、ｄ，ｌ−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。
【０２１１】
有機溶媒を用いない精製方法の例を、以下に示す。
【０２１２】
（１）α−グルカン生産反応後、反応溶液を冷却することによりα−グルカンを沈澱させ、そして沈澱したα−グルカンを、膜分画、濾過、遠心分離などの一般的な固液分離方法により精製する方法；
（２）α−グルカン生産反応の間もしくはα−グルカン生産反応後に反応溶液を冷却してα−グルカンをゲル化し、ゲル化したα−グルカンを回収し、そしてゲル化したα−グルカンから、グルコースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過などの操作によって除去する方法；ならびに
（３）α−グルカン生産反応後、水に溶解しているα−グルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してグルコースを除去する方法。
【０２１３】
精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約１，０００〜約１００，０００、好ましくは約５，０００〜約５０，０００、より好ましくは約１０，０００〜約３０，０００の限外濾過膜（ダイセル製ＵＦ膜ユニット）が挙げられる。
【０２１４】
クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。
【実施例】
【０２１５】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。
【０２１６】
（１．測定方法および計算方法）
本発明における各種酵素の活性および得られるα−グルカンの収率を、以下の測定方法によって測定した。
【０２１７】
（１．１  ポリホスフェートグルコキナーゼの活性測定法）
２００ｍＭ  グルコース、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８％ポリリン酸の混合液２５μｌと適切に希釈した酵素液２５μｌを加えて５０μｌの混合溶液として反応を開始させる。この混合溶液を４５℃で１５分間インキュベートして反応させた後、１００℃で１０分間保持することにより酵素を失活させる。続いて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）  ５５０μｌおよび３ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．１６μｇ／ｍｌ  グルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７）を含む混合溶液３００μｌを酵素反応溶液に添加して混合する。この溶液を３０℃、３０分間保持した後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−６−リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−６−リン酸濃度を求める。この方法により、１分間に１μｍｏｌのグルコース−６−リン酸を生成する活性をポリホスフェートグルコキナーゼ１単位とする。
【０２１８】
（１．２  ホスホグルコムターゼの活性測定法）
２００ｍＭ  グルコース−１−リン酸、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｃｏｆａｃｔｏｒ  （グルコース  またはグルコース−１，６−ビスホスフェート）の混合液２５μｌと適切に希釈した酵素液２５μｌを加えて５０μｌの混合溶液として反応を開始させる。この混合溶液を４５℃で１５分間インキュベートして反応させた後、１００℃で１０分間保持することにより酵素を失活させる。続いて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）  ５５０μｌおよび３ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．１６μｇ／ｍｌ  グルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７）を含む混合溶液３００μｌを酵素反応溶液に添加して混合する。この溶液を３０℃、３０分間保持した後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−６−リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−６−リン酸濃度を求める。この方法により、１分間に１μｍｏｌのグルコース−６−リン酸を生成する活性をホスホグルコムターゼ１単位とする。
【０２１９】
（１．３  α−１，４−グルカンホスホリラーゼの活性測定法）
５０μｌの４％クラスターデキストリン水溶液と５０μｌの５０ｍＭグルコース−１−リン酸ナトリウム水溶液とを混合し、さらに適切に希釈した酵素液１００μｌを加えて２００μｌの混合物として反応を開始させる。この混合物を３７℃で１５分間インキュベートして反応を進行させた後、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ  モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ  酢酸亜鉛）を混合し、反応を停止させる。続いて２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。この方法により、１分間に１μｍｏｌの無機リン酸を生成する活性を、α−１，４−グルカンホスホリラーゼ１単位とする。
【０２２０】
（１．４  セロビオースホスホリラーゼの活性測定法）
２５μｌの４０ｍＭセロビオース水溶液と２５μｌの４０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）とを混合し、さらに適切に希釈した酵素液（試料）５０μｌを加えて１００μｌの混合物として反応を開始させる。この混合物を３７℃で１０分間インキュベートすることにより反応を進行させた後、１００℃で１０分間保持することによって酵素を失活させる。続いて６００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）および３００μｌの発色試薬（ＣＩＩ発色試薬（和光純薬社製））をこの混合液に添加して混合し、３０℃で２０分間保持した後、５０５ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース水溶液を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース量を求める。セロビオースホスホリラーゼ１単位とは、上記方法により２０ｍＭセロビオースから１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量と定義する。
【０２２１】
（１．５  得られるα−グルカンの収率の計算方法）
本発明の製造方法によるα−グルカンの収率を、得られたα−グルカン中に取り込まれたグルコース残基のモル数が、最初に添加された初発物質のグルコース当量でのモル数（Ｓ；グルコース当量のモル数）（例えば、グルコースを出発物質とする場合はグルコースのモル数、Ｇ６−Ｐを出発物質とする場合はＧ６−Ｐのモル数、二糖のセロビオースを出発物質とする場合はセロビオースのモル数の２倍量）の何％にあたるかによって計算した。反応終了後、反応溶液を１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。次いで、反応溶液を適切に希釈し、充分量のα−アミラーゼと充分量のグルコアミラーゼを添加して４０℃で６時間インキュベートすることによって溶液中のα−グルカンをグルコースにまで分解した。α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼによる処理を行った溶液のグルコース量（Ｇ１；モル数）、およびこの処理を行ってない溶液のグルコース量（Ｇ２；モル数）を測定した。グルコース当量でＧ３モルのプライマーを使用したとすると、Ｇｘ＝（Ｇ１−Ｇ２−Ｇ３）によって、α−グルカンに取り込まれたグルコース量（収量；モル数）が計算できる。このグルコース量を初発物質のモル数で除算して１００倍することにより、収率を計算した。この計算式を次式に示す。
【０２２２】
【数１】
2010148407.tif 000007
（１．６  グルコース濃度測定方法）
適切に希釈した試料１００μｌに６００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）および３００μｌの発色試薬（ＣＩＩ発色試薬（和光純薬社製））を添加して混合し、３７℃、２０分間保持した後、５０５ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース水溶液を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース量を求める。
【０２２３】
（１．７  リン酸濃度測定方法）
適切に希釈した試料２００μｌに８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ  モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ  酢酸亜鉛）および２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。
【０２２４】
（１．８  Ｇ１−Ｐ濃度測定方法）
適切に希釈した試料５０μｌに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）  ５５０μｌおよび３ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５μＭ  グルコース−１，６−ビスホスフェート、３μｇ／ｍｌ  ウサギ筋肉由来ホスホグルコムターゼ、６．１６μｇ／ｍｌ  グルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７）を含む混合溶液３００μｌを添加して混合する。この混合溶液を３０℃、３０分間保持した後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−１−リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−１−リン酸濃度を求める。
【０２２５】
（１．９  Ｇ６−Ｐ濃度測定方法）
適切に希釈した試料５０μｌに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）  ５５０μｌおよび３ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．１６μｇ／ｍｌ  グルコース−６−ホスホデヒドロゲナーゼ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７）を含む混合溶液３００μｌを添加して混合する。この混合溶液を３０℃、３０分間保持した後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−６−リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−６−リン酸濃度を求める。
【０２２６】
（２．酵素の調製）
本発明の実験例および実施例で用いた各種酵素を、以下の方法によって調製した。
【０２２７】
（２．１  組換えポリホスフェートグルコキナーゼ（ＰＧＫ）の調製方法）
Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓに由来するポリホスフェートグルコキナーゼのヌクレオチド配列（配列番号１）を合成し、発現ベクターｐＥＴ２８ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ２８ａ−ＰＧＫを得た。このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。
【０２２８】
その後、得られた大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で大腸菌の増殖したコロニーを選択することにより、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓ由来ポリホスフェートグルコキナーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。それらの大腸菌についてポリホスフェートグルコキナーゼを発現していることを酵素活性測定によって確認した。
【０２２９】
この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＴＢ培地（１．２％トリプトン、２．４％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、０．２３１％リン酸二水素カリウム、１．２５４％リン酸水素二カリウム、０．４％グリセリン）６００ｍＬに接種し、１００ｒｐｍで振盪させながら３７℃、２４時間培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、１８０ｍＬの５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ７）中に懸濁し、次いで１％リゾチームを２０ｍＬ加え溶菌させた。溶菌後、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、ポリホスフェートグルコキナーゼを含む沈澱を得た。この沈澱を再度１８０ｍＬの５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７）中に懸濁し、酵素保持のため２０ｍＬグリセリン（ｆｉｎａｌ１０％）を加えた。この懸濁液中には３５７Ｕ／ｍＬのポリホスフェートグルコキナーゼが含まれていた。
【０２３０】
なお、得られた組換えポリホスフェートグルコキナーゼの反応至適温度は６５℃であり、反応至適ｐＨは約７．０である。
【０２３１】
（２．２  組換えホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）の調製方法）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来するホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列（配列番号３）を合成し、発現ベクターｐＥＴ２８ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ２８ａ−ＰＧＫを得た。このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。
【０２３２】
その後、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で大腸菌の増殖したコロニーを選択することにより、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来ホスホグルコムターゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。それらの大腸菌についてホスホグルコムターゼを発現していることを酵素活性測定によって確認した。
【０２３３】
この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＴＢ培地（１．２％トリプトン、２．４％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、０．２３１％リン酸二水素カリウム、１．２５４％リン酸水素二カリウム、０．４％グリセリン）６００ｍＬに接種し、１００ｒｐｍで振盪させながら３７℃、２４時間培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、１８０ｍＬの５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ７）中に懸濁し、次いで１％リゾチームを２０ｍＬ加え溶菌させた。溶菌後、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、ホスホグルコムターゼを含む酵素溶液を得た。この酵素溶液には５００Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼが含まれていた。
【０２３４】
なお、得られた組換えホスホグルコムターゼの反応至適温度は６０℃であり、反応至適ｐＨは約７．５である。
【０２３５】
（２．３  組換え馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）の調製方法）
馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子（Ｎａｋａｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）１０６（１９８９）６９１；配列番号５）を選択マーカー遺伝子Ａｍｐｒとともに発現ベクターｐＥＴ３ｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ−ＰＧＰ１１３を得た。このプラスミドでは、α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、馬鈴薯由来α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がα−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がα−１，４−グルカンホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
【０２３６】
この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ、ピリドキシンを１ｍＭになるようにそれぞれこの培地に添加し、２２℃でさらに２０時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、４．７Ｕ／ｍｇのα−１，４−グルカンホスホリラーゼが含まれていた。
【０２３７】
この菌体破砕液を、５５℃で３０分間加熱した。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得た。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに流してα−１，４−グルカンホスホリラーゼを樹脂に吸着させた。樹脂を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、組換えα−１，４−グルカンホスホリラーゼ酵素溶液とした。
【０２３８】
なお、得られた組換えα−１，４−グルカンホスホリラーゼの反応至適温度は４０℃であり、反応至適ｐＨは約５．６である。
【０２３９】
（２．４  組換えセロビオースホスホリラーゼの調製方法）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの染色体遺伝子を抽出し、これをテンプレートとした。以下の２種の合成ＤＮＡプライマー：
合成ＤＮＡプライマー１：５’  ａａａｃｔｃｔａｇａａａｔａａｔｔｔｔｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃｃａｔｇｇａｇｔｔｃｇｇｔｔｔｔｔｔｔｇａｔｇａｔ  ３’（配列番号７）および
合成ＤＮＡプライマー２：５’  ａａａｃｔｃｇａｇａａｔｔａｃｔｔｃａａｃｔｔｔｇｔｇａｇｔｃｔｔｔ  ３’（配列番号８）
を用い、
９８℃で１分間、５５℃で１分間、６８℃で３分間の順で３０サイクル加熱
の条件下でＰＣＲを行うことにより、ＣＢＰ遺伝子を含む領域を増幅させた。増幅した遺伝子を選択マーカー遺伝子Ｋｍｒとともに発現ベクターｐＥＴ２８ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ２８ａ−ＣＢＰ１を得た。このプラスミドでは、セロビオースホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。
【０２４０】
このプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来セロビオースホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。
【０２４１】
得られた大腸菌がセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がセロビオースホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
【０２４２】
この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを１．０ｍＭになるようにこの培地に添加し、３７℃でさらに８時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの１．４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、１３２Ｕ／ｍｌのセロビオースホスホリラーゼが含まれていた。
【０２４３】
この菌体破砕液を、５５℃で２０分間加熱した。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得た。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいたＨｉｓ−Ｔａｇ吸着樹脂Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に流してセロビオースホスホリラーゼをこの樹脂に吸着させた。この樹脂を、３００ｍＭ塩化ナトリウムと２０ｍＭイミダゾールおよび１．４ｍＭ２−メルカプトエタノール含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムと１５０ｍＭイミダゾールおよび１．４ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液で溶出させ、組換えセロビオースホスホリラーゼ酵素溶液とした。
【０２４４】
なお、得られた組換えセロビオースホスホリラーゼの反応至適温度は６０℃であり、反応至適ｐＨは６．０である。
【０２４５】
（実施例１：グルコースからのアミロースの合成）
以下の表１に記載の組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを７．０に調整し、そして４５℃で２４時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、約２０ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）は、約０．０４であった。
【０２４６】
【表１】
2010148407.tif 000008
グルコース（Ｇｌｃ）濃度、グルコース−６−リン酸（Ｇ６−Ｐ）濃度、グルコース−１−リン酸（Ｇ１−Ｐ）濃度、およびアミロース収率を経時的に測定した。結果を以下の表２および図２に示す。
【０２４７】
【表２】
2010148407.tif 000009
反応開始から１２時間以降Ｇ６−Ｐ濃度とＧ１−Ｐ濃度がほぼ一定になったことから、溶液中の酵素反応は、反応開始から１２時間で平衡に達したと考えられる。それに対して、アミロース収率は増加し、グルコース濃度が減少した。反応開始から１２時間以降のアミロースの増加はグルコース減少量にほぼ一致している。この結果は、酵素反応が平衡に達した後アミロースが老化することで反応系外に出てそれに伴い平衡状態を保つためにＧｌｃが消費され、反応がアミロース合成側にシフトすることによってアミロースが合成されたことを示すと考えられる。
【０２４８】
表２および図２においては、反応開始時のグルコース濃度を１００％（ｍＭ／ｍＭ）とし、グルコース濃度、Ｇ６−Ｐ濃度、Ｇ１−Ｐ濃度およびアミロース収率をそれぞれ、反応開始時のグルコース濃度（ｍＭ）に対する比率として示した。
【０２４９】
（実施例２：反応開始時の反応溶液のｐＨ）
反応開始時の溶液のｐＨを５．２〜１２に変化させたこと以外は、上記表１の組成と同じ組成の溶液を調製し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成させた。合成されたアミロースの濃度を測定し、収率を計算した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、いずれの条件でも約１２ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）は、いずれの条件でも約０．０３であった。
【０２５０】
反応開始時点で測定したｐＨの値と、アミロースの収率の結果を以下の表３および図３に示す。
【０２５１】
【表３】
2010148407.tif 000010
反応溶液の初期ｐＨを弱アルカリ側以上にすることでアミロース合成収率が上がり、約２０％の値が得られた。初期ｐＨが５．６までの酸性側ではアミロースが酵素合成されず、弱酸性から中性付近では低収率でアミロースが得られた。初期ｐＨ７．１のとき収率９．１％であった。ｐＨ７．４からｐＨ１１ではアミロース収率１５％以上を示し、ｐＨ７．４からｐＨ８．５では約１９％のアミロース収率を示した。初期ｐＨ７．７のとき収率１９．６％であった。
【０２５２】
（実施例３：反応溶液中の遊離リン酸とグルコースとのモル比（Ｐｉ／Ｇｌｃ）の検討）
溶液中の遊離のリン酸濃度はアミロース合成反応に大きく影響を与える。直接的にはGP酵素の平衡反応に影響する。この平衡反応ではアミロースとともに副生成物としてリン酸が生成されるためリン酸濃度は高くなるとアミロース合成側への反応が進まなくなる。反応初期には溶液中にリン酸の存在しないことが望ましいが、ＧｌｃからＧ６−Ｐへの変換反応に必要なポリリン酸には遊離のリン酸が含まれてしまう。そのため、アミロース合成可能な初期遊離リン酸／Ｇｌｃ濃度比（Ｐｉ／Ｇｌｃ）を検討した。
【０２５３】
以下の表４に示す濃度の無機リン酸を添加したこと以外は表１の組成の溶液を作製して４５℃で１６時間反応させてアミロースを合成した。反応開始時点でのこの溶液のｐＨを約８に調整した。合成されたアミロースの量を測定し、収率を計算した。添加した無機リン酸の量、無機リン酸とグルコースとのモル比（Ｐｉ／Ｇｌｃ）、アミロースの合成濃度（ｍＭ）および収率（％）を以下の表４に示す。アミロースの収率（％）とＰｉ／Ｇｌｃとの関係を図４に示す。
【０２５４】
【表４】
2010148407.tif 000011
この結果、グルコースの約０．２倍濃度の遊離のリン酸が含まれるとアミロース合成が阻害された。
【０２５５】
（実験例１：グルコースからのＧ６−Ｐの生成反応）
先行技術（１）の反応の方向を確認するために、以下の実験を行った。
【０２５６】
以下の表５に記載の組成の溶液を作成し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを７に調整し、４５℃で２４時間インキュベートすることにより、Ｇ６−Ｐを生成させた。
【０２５７】
【表５】
2010148407.tif 000012
生成されたＧ６−Ｐの濃度を測定し、Ｇ６−Ｐの収率（変換率）（％）を計算した。結果を図５に示す。この結果、先行技術の（１）の反応は不可逆反応であり、グルコースに対して９０％以上がＧ６−Ｐに変換されることが確認された。
【０２５８】
（実験例２：Ｇ６−ＰとＧ１−Ｐとアミロースとの平衡反応）
アミロースをＭＯＰＳ（ｐＨ７）バッファーに加えて１００℃で熱処理して完全に溶解し、その後、４５℃に保ったまま、以下の表６に記載の組成になるようにＰＧＭ、ＧＰ、リン酸などを加え、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを７に調整し、そして４時間インキュベートして、平衡反応を行なった。
【０２５９】
【表６】
2010148407.tif 000013
反応途中でサンプリングした。アミロース、Ｇ１−ＰおよびＧ６−Ｐの濃度を測定し、反応開始時のアミロースのモル数を１００％としたときのアミロース、Ｇ１−Ｐ、Ｇ６−ＰおよびＧ１−Ｐ＋Ｇ６−Ｐの濃度を計算した。結果を図６に示す。その結果、アミロースの９５％以上がＧ６−ＰとＧ１−Ｐに分解された。２種類の酵素ＰＧＭ−ＧＰの平衡反応はＧ６−Ｐ側に非常に有利で、完全に溶解したアミロースに対してＰＧＭとＧＰを作用させたとき反応開始から４時間後ではＧ６−Ｐ：８８．５％、Ｇ１−Ｐ：６．８％、アミロース：４．７％の割合で存在した。
【０２６０】
（実施例４：アミロース合成）
以下の表７に記載の組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、約１２ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）は、０．０３であった。
【０２６１】
【表７】
2010148407.tif 000014
アミロースの合成濃度を測定し、収率を計算した。その結果、収率は１９．６％であった。上記の実験例２によれば、平衡状態でのアミロース収率が約４．７％であった。これに対し、本実施例では、５００ｍＭのグルコースを基質としたアミロース合成の収率が１９．６％であった。この値は、本実施例によって得られるアミロースの収率が、ＰＧＭ−ＧＰ平衡反応によって得られるアミロース収率を大きく上回ることを示す。本実施例によってＰＧＭ−ＧＰ平衡反応によるアミロース収率よりも高い値が得られた理由は、アミロースの老化によって反応系外に出たアミロースが蓄積されたためであると考えられる。
【０２６２】
（実施例５：出発グルコース濃度を変えた場合のアミロース収率の変化）
グルコース濃度を変化させ、それに合わせて酵素量、プライマー濃度およびポリリン酸濃度を比例して増加させたこと以外は、表１と同じ組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。合成されたアミロース濃度を測定し、収率を計算した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、約０．５〜約５０．２であり、遊離リン酸のモル濃度とグルコースのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇｌｃ）は、約０．０３であった。
【０２６３】
結果を以下の表８および図７Ａおよび図７Ｂに示す。
【０２６４】
【表８】
2010148407.tif 000015
基質濃度を上昇させるとそれに伴い溶液中のアミロース濃度も上昇するので、アミロースが老化しやすい状態になる。そのため、高濃度基質からのアミロース合成ではアミロース収率が高くなる傾向にある（図７Ａ）。また、グルコース濃度が増加するに従ってアミロースの収量も増加した（図７Ｂ）。
【０２６５】
（実施例６：Ｇ６−Ｐを出発原料として使用した、ゲスト化合物の存在下でのアミロース合成）
以下の表９に記載の組成をベースとして以下の表１０に記載の量で各種ゲスト化合物を添加した組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、０ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とＧ６−Ｐのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）は、０であった。コントロールは、ゲスト化合物を添加しない比較例６である。合成されたアミロース量を測定し、収率を計算した。
【０２６６】
【表９】
2010148407.tif 000016
結果を以下の表１０および図８に示す。
【０２６７】
【表１０】
2010148407.tif 000017
アミロースは脂肪酸などを包接する作用を持ち、包接される側の物質(ゲスト化合物)の種類によっては沈澱しやすくなる。アミロース合成反応溶液中にゲスト化合物を添加し、この沈澱促進作用を利用することで、アミロース収率を上げることができる。Ｇ６−Ｐからアミロースを合成するとき、アミロース収率は２０％程度であるが、ゲスト化合物を加えることで有意に収率が上昇した。ゲスト化合物ＳＢ３−１６を１０ｍＭ添加したときアミロース収率は５３．３％まで上がった。
【０２６８】
（実施例７−１〜７−３：セロビオースからのアミロース合成）
以下の表１１に記載の組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを約７．８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成させた。比較例７として、ＰＧＫ、ＰＧＭおよびポリリン酸を含まず、リン酸を含む組成でアミロースを合成させた。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、実施例７−１では約１５ｍＭであり、実施例７−２および７−３では約１０ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とセロビオースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）は、実施例７−１では約０．１５であり、実施例７−２では約０．１０、７−３では約０．０５７であった。合成されたアミロースの濃度を測定し、収率を計算した。
【０２６９】
【表１１】
2010148407.tif 000018
結果を以下の表１２に示す。
【０２７０】
【表１２】
2010148407.tif 000019
セロビオースを出発原料としたときのアミロース合成収率は従来の方法（比較例７）では１６．３％であったが、ＰＧＫ、ＰＧＭを共存させることで約４０％まで上昇し（実施例７−１）、さらに基質濃度を上げ、初期ｐＨを弱アルカリ側にすることでアミロース収率が６６．８％にあがった（実施例７−３）。
【０２７１】
（実施例８−１から８−３：種々のｐＨ条件下での、セロビオースを出発物質としたアミロース合成）
反応開始時のｐＨの影響を調べるために、以下の表１３に記載の組成の溶液を調製し、反応開始時の溶液のｐＨをそれぞれ５．６、７．０または７．８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成させた。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、実施例８−１から８−３では約１０ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とセロビオースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）は、実施例８−１および８−２では約０．１０であり、実施例３では約０．０５７であった。合成されたアミロースの量を測定し、収率を計算した。
【０２７２】
反応開始時点で測定したｐＨの値と、収率の結果を以下の表１４および図９に示す。
【０２７３】
【表１３】
2010148407.tif 000020
【０２７４】
【表１４】
2010148407.tif 000021
この結果、反応溶液の初期ｐＨ値が高くなるほど、アミロース収率が上がることがわかった。
【０２７５】
（実施例９：反応溶液中の遊離リン酸とセロビオースとのモル比（Ｐｉ／ＣＢ）の検討）
以下の表１５に示す組成の溶液を作製して４５℃で１６時間反応させてアミロースを合成した。反応開始時点でのこの溶液のｐＨを約７．８に調整した。合成されたアミロースの濃度を測定し、収率を計算した。添加した無機リン酸の量、無機リン酸とセロビオースとのモル比（Ｐｉ／ＣＢ）、アミロースの収率（％）を以下の表１６に示す。結果を図１０に示す。
【０２７６】
【表１５】
2010148407.tif 000022
【０２７７】
【表１６】
2010148407.tif 000023
この結果、セロビオースの約４倍濃度の遊離のリン酸が含まれるとアミロース合成が阻害された。
【０２７８】
（実施例１０：出発セロビオース濃度を変えた場合のアミロース収率の変化）
セロビオース濃度を変化させ、それに合わせて酵素量およびプライマー濃度を比例して増加させたことと実施例１０−１のポリリン酸濃度が１％であること以外は、実施例７−２と同じ組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを７．８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。合成されたアミロース量を測定し、収率を計算した。実施例１０−２は、実施例７−２と同じ条件での反応であり、実施例１０−３は、実施例７−３と同じ条件での反応であった。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、実施例１０−１では約２．８であり、実施例１０−２および１０−３では約１１．２あり、遊離リン酸のモル濃度とセロビオースのモル濃度との比率（Ｐｉ／ＣＢ）は、実施例１０−１では０．１４０であり、実施例１０−２では約０．１１２であり、実施例１０−３では０．０６４であった。
【０２７９】
結果を以下の表１７および図１１に示す。
【０２８０】
【表１７】
2010148407.tif 000024
基質濃度を上昇させるとそれに伴い溶液中のアミロース濃度も上昇するので、アミロースが老化しやすい状態になる。そのため、高濃度基質からのアミロース合成ではアミロース収率が高くなる傾向にある（図１１）。
【０２８１】
（実施例１１：種々のｐＨ条件下での、Ｇ６−Ｐを出発物質としたアミロース合成）
反応開始時の溶液のｐＨを６．７〜８．５に変化させたこと以外は上記表９と同じ組成の溶液を調製し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成させた。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、いずれの条件でも０ｍＭであり、遊離リン酸のモル濃度とＧ６−Ｐのモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）は、いずれの条件でも０であった。合成されたアミロースの濃度を測定し、収率を計算した。
【０２８２】
反応開始時点で測定したｐＨの値と、収率の結果を以下の表１８および図１２に示す。
【０２８３】
【表１８】
2010148407.tif 000025
反応溶液の初期ｐＨを弱アルカリ側以上にすることでアミロース合成収率があがり約３０％の値を得た。初期ｐＨが６．７までの酸性側ではアミロースがほとんど合成されず、弱酸性から中性付近では低収率でアミロースを得た。初期ｐＨ７．１のとき収率６．３７％であった。ｐＨ７．３からｐＨ８．５ではアミロース収率１０％以上を示し、ｐＨ７．６からｐＨ８．５では約２４％以上のアミロース収率を示した。初期ｐＨ８．４のとき収率３０．５１％であった。
【０２８４】
（実施例１２：反応溶液中の遊離リン酸とグルコース−６−リン酸とのモル比（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）の検討）
以下の表１９に示す濃度の無機リン酸を添加したこと以外は表９の組成の溶液を作成して４５℃で１６時間反応させてアミロースを合成した。反応開始時点でのこの溶液のｐＨを約８に調整した。合成されたアミロースの濃度を測定し、収率を計算した。添加した無機リン酸の濃度、無機リン酸とグルコース−６−リン酸とのモル比（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）、アミロースの濃度（ｍＭ）および収率（％）を以下の表１９に示す。結果を図１３に示す。
【０２８５】
【表１９】
2010148407.tif 000026
この結果、グルコース−６−リン酸の約０．５倍濃度の遊離のリン酸が含まれるとアミロース合成が阻害された。また、遊離リン酸の濃度が高いほど、収率が下がった。従って、この反応では、遊離リン酸をできる限り添加しないことが好ましい。
【０２８６】
（実施例１３：出発グルコース−６−リン酸濃度を変えた場合のアミロース収率の変化）
グルコース−６−リン酸濃度を変化させ、それに合わせて酵素量およびプライマー濃度を比例して増加させたこと以外は、表９と同じ組成の溶液を調製し、反応開始時点でのこの溶液のｐＨを８に調整し、そして４５℃で１６時間インキュベートすることにより、アミロースを合成した。合成されたアミロース濃度を測定し、収率を計算した。反応開始時の溶液中の遊離リン酸の濃度を測定したところ、約０であり、遊離リン酸のモル濃度とグルコース−６−リン酸のモル濃度との比率（Ｐｉ／Ｇ６−Ｐ）は、約０であった。
【０２８７】
結果を以下の表２０、図１４Ａおよび図１４Ｂに示す。
【０２８８】
【表２０】
2010148407.tif 000027
基質濃度を上昇させるとそれに伴い溶液中のアミロース濃度も上昇するので、アミロースが老化しやすい状態になる。そのため、高濃度基質からのアミロース合成ではアミロース収率が高くなる傾向にある（図１４Ａ）。
【産業上の利用可能性】
【０２８９】
本発明により、安価で容易に入手可能なグルコースからα−グルカンを効率よく製造することができる。
【０２９０】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２９１】
【図１】図１は、本願発明で利用する種々の酵素反応の概略を示す図である。
【図２】図２は、グルコースを出発物質とした場合の、グルコース（Ｇｌｃ）量、グルコース−６−リン酸（Ｇ６−Ｐ）量、グルコース−１−リン酸（Ｇ−１−Ｐ）量、およびアミロースの合成量の経時変化を示すグラフである。
【図３】図３は、グルコースを出発物質とした場合の、種々のｐＨでのアミロースの合成量を示すグラフである。
【図４】図４は、グルコースを出発物質とした場合の、反応開始時の溶液中の無機リン酸濃度／グルコース濃度比によるアミロース収率の変化を示すグラフである。
【図５】図５は、グルコースおよびポリホスフェートグルコキナーゼを含む溶液をインキュベートした場合にグルコース−６−リン酸に変換された割合を示すグラフである。
【図６】図６は、アミロース、ホスホグルコムターゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液をインキュベートした場合のアミロース量、グルコース−１−リン酸量、グルコース−６−リン酸量および（グルコース−１−リン酸量とグルコース−６−リン酸量との合計）を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、グルコースを出発物質とした場合の、グルコース濃度とアミロースの収率（％）との関係を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、グルコースを出発物質とした場合の、グルコース濃度とアミロースの収量（ｍＭ）との関係を示すグラフである。
【図８】図８は、種々の包接化合物を使用し、グルコースを出発物質とした場合の、アミロースの収率を示すグラフである。
【図９】図９は、セロビオースを出発物質とした場合の、種々のｐＨでのアミロースの合成量を示すグラフである。
【図１０】図１０は、セロビオースを出発物質とした場合の、反応開始時の溶液中の無機リン酸濃度／セロビオース濃度比によるアミロース収率の変化を示すグラフである。
【図１１】図１１は、Ｇ６−Ｐを出発物質とした場合の、セロビオース濃度とアミロースの収率（％）との関係を示すグラフである。
【図１２】図１２は、Ｇ６−Ｐを出発物質とした場合の、種々のｐＨでのアミロースの合成量を示すグラフである。
【図１３】図１３は、Ｇ６−Ｐを出発物質とした場合の、反応開始時の溶液中の無機リン酸濃度／Ｇ６−Ｐ濃度比によるアミロース収率の変化を示すグラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ｇ６−Ｐを出発物質とした場合の、Ｇ６−Ｐ濃度とアミロースの収率（％）との関係を示すグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、グルコースを出発物質とした場合の、Ｇ６−Ｐ濃度とアミロースの収量（ｍＭ）との関係を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明で使用され得る種々の方法をまとめて示す模式図である。
【配列表フリーテキスト】
【０２９２】
配列番号１：Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓに由来するポリホスフェートグルコキナーゼのヌクレオチド配列；
配列番号２：Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｌａｓに由来するポリホスフェートグルコキナーゼのアミノ酸配列；
配列番号３：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来するホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列；
配列番号４：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来するホスホグルコムターゼのアミノ酸配列；
配列番号５：馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列；
配列番号６：馬鈴薯α−１，４−グルカンホスホリラーゼ遺伝子のアミノ酸配列；
配列番号７：合成ＤＮＡプライマー１のヌクレオチド配列；
配列番号８：合成ＤＮＡプライマー２のヌクレオチド配列；
配列番号９：Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａに由来するポリホスフェートグルコキナーゼのヌクレオチド配列；
配列番号１０：Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａに由来するポリホスフェートグルコキナーゼのアミノ酸配列；
配列番号１１：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列；
配列番号１２：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するホスホグルコムターゼのアミノ酸配列；
配列番号１３：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅに由来するホスホグルコムターゼのヌクレオチド配列；
配列番号１４：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ由来のホスホグルコムターゼのアミノ酸配列。
【図１】
2010148407.tif 000028
【図２】
2010148407.tif 000029
【図３】
2010148407.tif 000030
【図４】
2010148407.tif 000031
【図５】
2010148407.tif 000032
【図６】
2010148407.tif 000033
【図７Ａ】
2010148407.tif 000034
【図７Ｂ】
2010148407.tif 000035
【図８】
2010148407.tif 000036
【図９】
2010148407.tif 000037
【図１０】
2010148407.tif 000038
【図１１】
2010148407.tif 000039
【図１２】
2010148407.tif 000040
【図１３】
2010148407.tif 000041
【図１４Ａ】
2010148407.tif 000042
【図１４Ｂ】
2010148407.tif 000043
【図１５】
2010148407.tif 000044
【配列表】
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