(57)【要約】      （修正有）【課題】改善された腐食安定性を有するクロマトグラフィーリガンドを提供する。【解決手段】ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の２つ若しくはそれ以上のＢドメイン若しくは２つ若しくはそれ以上のＺドメイン又はこれらの機能的断片若しくは変形物を含むアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドである。さらに２つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は２つ若しくはそれ以上のＺドメインが樹脂上の２以上の部位においてクロマトグラフィー樹脂に付着されている、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の２つ若しくはそれ以上のＢドメイン若しくは２つ若しくはそれ以上のＺドメイン又はその機能的断片若しくは変形物を含むアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の２つ若しくはそれ以上のＢドメイン若しくは２つ若しくはそれ以上のＺドメイン又はこれらの機能的断片若しくは変形物を含むアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。
【請求項２】
２つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は２つ若しくはそれ以上のＺドメインが樹脂上の２以上の部位においてクロマトグラフィー樹脂に付着されている、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の２つ若しくはそれ以上のＢドメイン若しくは２つ若しくはそれ以上のＺドメイン又はその機能的断片若しくは変形物を含むアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。
【請求項３】
リガンドがＳｐＡの３つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は３つ若しくはそれ以上のＺドメインを含む、請求項１又は請求項２アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。
【請求項４】
リガンドがＳｐＡの４つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は４つ若しくはそれ以上のＺドメインを含む、請求項１又は請求項２アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。
【請求項５】
リガンドがＳｐＡの５つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は５つ若しくはそれ以上のＺドメインを含む、請求項１又は請求項２アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。
【請求項６】
リガンドがＳｐＡの６つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は６つ若しくはそれ以上のＺドメインを含む、請求項１又は請求項２アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。
【請求項７】
リガンドがＳｐＡの７つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は７つ若しくはそれ以上のＺドメインを含む、請求項１又は請求項２アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。
【請求項８】
Ｆａｂ結合を変化させるための少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含む、請求項１から７の何れかアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。
【請求項９】
変異が２９位のグリシンのアラニンでの置換を含む、請求項８アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。
【請求項１０】
請求項１から９の何れか一項リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックス。
【請求項１１】
（ａ）１つ又はそれ以上の免疫グロブリンを含む試料を準備する工程；
（ｂ）１つ又はそれ以上の免疫グロブリンがマトリックスへ結合するような条件下で、請求項１０マトリックスと前記試料を接触させる工程；及び
（ｃ）適切な条件下で溶出することによって、１つ又はそれ以上の結合された免疫グロブリンを回収する工程；
を含む、１つ又はそれ以上の免疫グロブリンを試料からアフィニティー精製する方法。
【請求項１２】
リガンドが、０．５ＭＮａＯＨ中での５時間又は１０時間又は１５時間又は２０時間の温置後に、その結合能の少なくとも９５％を保持する、請求項１から９の何れか一項リガンド。
【請求項１３】
リガンドが、ｗｔＳｐＡと比べて、少なくとも１．５倍又は２倍又は３倍又はそれ以上のＩｇＧを結合することができる、請求項１から９の何れか一項リガンド。
【請求項１４】
１つ又はそれ以上の単離されたブドウ球菌プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺドメインを含み、１つ又はそれ以上の単離されたドメインがシステイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）以外の天然に存在するあらゆるアミノ酸へ変異された１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を位置ｎ＋１（ｎは、アスパラギンを表す。）に含む、アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。
【請求項１５】
１つ又はそれ以上の単離されたブドウ球菌プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺドメインを含み、１つ又はそれ以上の単離されたドメインがアルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）及びバリン（Ｖ）（ｎは、アスパラギンを表す。）からなる群から選択されたアミノ酸に変異された１つ又はそれ以上のアミノ酸残基をｎ＋１位に含む、アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド。
【請求項１６】
ｎが２３位のアスパラギンである、請求項１４又は１５リガンド。
【請求項１７】
多点付着を介して、固体支持体に付着されたＳｐＡの３つ若しくはそれ以上又は４つ若しくはそれ以上又は５つ若しくはそれ以上又は６つ若しくはそれ以上又は７つ若しくはそれ以上のＳｐＡのＢ又はＺドメインを含む腐食安定的アフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
【請求項１８】
（ａ）ＳｐＡを基礎とするリガンドを腐食物で処理する工程；
（ｂ）腐食処理されたＳｐＡリガンドを多ウェルプレートへ添加する工程；
（ｃ）第一の免疫グロブリンがリガンドへ結合するように、ＳｐＡを基礎とするリガンドを第一の免疫グロブリンの飽和量と接触させる工程；
（ｄ）第一の免疫グロブリンを結合することができる分子と、結合された第一の免疫グロブリンを接触させる工程（前記分子には、検出可能な因子が連結されている。）；及び
（ｅ）前記因子からのシグナルの量を検出する工程（シグナルの量はリガンドの腐食安定性に比例し、これにより、ＳｐＡを基礎とするリガンドを腐食安定的であると同定する。）；
を含む、腐食安定的であるＳｐＡを基礎とするクロマトグラフィーリガンドを同定するための方法。
【請求項１９】
分子が第二の免疫グロブリンである、請求項１８方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年１２月２４日に出願された米国仮特許出願６１／２０３，６６４号（これらの内容全体が、本明細書中に組み込まれる。）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、改善された腐食安定性を有するクロマトグラフィーリガンド（例えば、ブドウ球菌プロテインＡなどの免疫グロブリン結合タンパク質を基礎とするリガンド）及びこのようなリガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスに関する。
【背景技術】
【０００３】
アフィニティークロマトグラフィーにおいて使用されるリガンドは、通例、標的分子に対して高い選択性を付与し、これにより、標的分子を高い収率で、迅速且つ経済的に精製する。ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）を基礎とする試薬及びクロマトグラフィーマトリックスは、抗原に対する免疫グロブリンの親和性に対して著しい影響を及ぼさずにＩｇＧを結合する能力の故に、抗体の捕捉及び精製のためのアフィニティークロマトグラフィーの分野において並びに抗体検出方法の分野において広い用途を見出ししている。
【０００４】
従って、例えば、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）−ｖＡＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙ、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）−ｖＡＵｌｔｒａ及びＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）ＵｌｔｒａＰｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びプロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＸｔｒａＴＭ及びＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（Ｒ）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）並びにＰｏｒｏｓＭａｂＣａｐｔｕｒｅＡＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの、プロテインＡリガンドを含む様々な試薬及び溶媒が開発され、市販されている。
【０００５】
例えば、ＳｐＡを基礎とするクロマトグラフィーリガンドを含む樹脂などのクロマトグラフィーリガンドの選択性及び結合能を維持するために、リガンドが結合された樹脂（クロマトグラフィーマトリックスと称される。）は、洗浄されなければならず、典型的には、例えば水酸化ナトリウムを用いて、アルカリ条件下で洗浄される。例えば、マトリックスを洗浄し、回復させるために使用される標準的な方法は、１ＭＮａＯＨ、ｐＨ１４でのマトリックスの処理を通例伴う定置洗浄（ＣＩＰ（ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ））アルカリプロトコールである。しかしながら、このような厳しい処理は、とりわけ、リガンドがタンパク質又はタンパク質を基礎とする分子である場合には、しばしば望ましくない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、例えば、反復される定置洗浄（ＣＩＰ）サイクルに耐えることができる、アルカリに対して安定的な、ＳｐＡを基礎とするクロマトグラフィーリガンドを提供する。より具体的には、本発明のリガンドは、長期間にわたって、旧来のアルカリ洗浄に耐えることができ、このため、本発明のリガンドは、特に、免疫グロブリンの費用対効果の高い大規模精製のための魅力的な候補となる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様において、アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドは、ＳｐＡの２つ又はそれ以上のドメインを含む。例えば、この態様に係る幾つかの実施形態において、２つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は２つ若しくはそれ以上のＺドメインが、樹脂上の２以上の部位において、クロマトグラフィー樹脂に付着されている、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）２つ若しくはそれ以上のＢドメイン若しくは２つ若しくはそれ以上のＺドメイン又はその機能的断片若しくは変形物を含むアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドが提供される。
【０００８】
この態様に係る幾つかの実施形態において、リガンドは、ＳｐＡの３つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は３つ若しくはそれ以上のＺドメイン又はこれらの機能的断片若しくは変形物を含み、３つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は３つ若しくはそれ以上のＺドメインは、樹脂上の２以上の部位において、クロマトグラフィー樹脂に付着されている。幾つかの他の実施形態において、リガンドは、ＳｐＡの４つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は４つ若しくはそれ以上のＺドメインを含み、前記４つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は４つ若しくはそれ以上のＺドメインは、樹脂上の２以上の部位において、クロマトグラフィー樹脂に付着されている。さらに別の実施形態において、リガンドは、ＳｐＡの５つ若しくはそれ以上のＢドメイン若しくは５つ若しくはそれ以上のＺドメイン、又はＳｐＡの６つ若しくはそれ以上のＢドメイン若しくは６つ若しくはそれ以上のＺドメインを含み、又はＳｐＡの７つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は７つ若しくはそれ以上のＺドメインを含み、前記５つ若しくはそれ以上のＢドメイン若しくは５つ若しくはそれ以上のＺドメイン又は６つ若しくはそれ以上のＢドメイン若しくは６つ若しくはそれ以上のＺドメイン又は７つ若しくはそれ以上のＢドメイン若しくは７つ若しくはそれ以上のＺドメインは、樹脂上の２以上の部位において、クロマトグラフィー樹脂に付着される。
【０００９】
本発明の別の形態において、アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドは、ブドウ球菌プロテインＡの１つ又はそれ以上の単離されたＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺドメインを含み、１つ又はそれ以上の単離されたドメインは、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）を除く天然に存在するあらゆるアミノ酸へ変異された１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を位置ｎ＋１に含む。幾つかの実施形態において、ｎは、単離されたＳｐＡドメインの２３位のアスパラギン残基を表す。単離されたＳｐＡドメインの２４位に変異を有する典型的なリガンド（ｎは、アスパラギンを表す。）が表１に示されている。
【００１０】
【表１】
2010156687.tif 000002
【００１１】
【表２】
2010156687.tif 000003
【００１２】
天然に存在するアミノ酸に対する一文字コード及び各アミノ酸をコードする対応する三文字コドンが、表２に図示されている。一般に、コドンの縮重のために、２以上の三文字コドンが同じアミノ酸をコードし得る。
【００１３】
【表３】
2010156687.tif 000004
【００１４】
例えば、少なくとも１つの不溶性担体などの固体支持体に結合された、本発明の１つ又はそれ以上の形態に係るリガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスも、本発明によって包含される。
【００１５】
さらに、本明細書中に記載されているリガンドを使用する方法も本明細書において提供される。従って、（ａ）１つ又はそれ以上の標的分子（例えば、免疫グロブリン）を含む試料を準備する工程、（ｂ）前記１つ又はそれ以上の標的分子（例えば、免疫グロブリン）がマトリックスに結合する条件下で、前記試料を本発明のマトリックスと接触させる工程、及び（ｃ）例えば、適切なｐＨなどの適切な条件下で溶出することによって、１つ又はそれ以上の結合された標的分子（例えば、免疫グロブリン）を回収する工程を含む、１つ又はそれ以上の標的分子（例えば、免疫グロブリン）を試料からアフィニティー精製する方法が提供される。
【００１６】
幾つかの実施形態において、本発明のアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドは、０．５ＭＮａＯＨ中での温置の５時間後又は１０時間後、１５時間後又は２０時間後又は２５時間後又は３０時間後に、その結合能の少なくとも９５％を保持する。
【００１７】
本明細書中に記載されている様々なリガンドによって結合され得る免疫グロブリンには、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ又は抗体及び抗体のあらゆる断片を含むあらゆる融合タンパク質が含まれる。
【００１８】
本明細書中に記載されている様々なリガンドをコードする核酸分子及びこのような核酸分子を含む宿主細胞も本明細書において提供される。幾つかの実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。
【００１９】
さらに、本発明は、本明細書中に記載されている１つ又はそれ以上のリガンド並びにその機能的断片及び変形物を含むポリペプチドのライブラリーを包含する。さらに別の実施形態において、本発明は、本発明によって包含される１つ若しくはそれ以上のリガンドをコードし、又はその機能的断片及び変形物をコードする核酸分子のライブラリーを提供する。
【００２０】
幾つかの実施形態において、本発明は、免疫グロブリンのＦｃ部分を結合する能力を保持しながら、以前に公知のＳｐＡリガンドと比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分へ変化した（増加した又は減少した）結合を示す、ＳｐＡを基礎とするリガンドを提供する。一実施形態において、本発明のＳｐＡを基礎とするリガンドは、野生型ＳｐＡと比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への減少した結合を示す。典型的な実施形態において、本発明のアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドは、アラニンで置換された２９位のアミノ酸グリシンをさらに含む。別の実施形態において、本発明のアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドは、アラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸で置換された２９位のグリシンをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、配列番号１から５によって表される、ＳｐＡの野生型（ｗｔ）ＩｇＧ結合ドメインに対する核酸配列を図示している。配列番号１は、ｗｔＥドメインに対する核酸配列を表す。配列番号２は、ｗｔＤドメインに対する核酸配列を表す。配列番号３は、ｗｔＡドメインに対する核酸配列を表す。配列番号４は、ｗｔＢドメインに対する核酸配列を表す。配列番号５は、ｗｔＣドメインに対する核酸配列を表す。
【図２】図２は、配列番号６によって表される、ＳｐＡのＺドメインに対する核酸配列を図示する。
【図３】図３は、ＳｐＡの野生型（ｗｔ）ＩｇＧ結合ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣ）のアミノ酸配列並置を図示する。配列番号７は、ｗｔＥドメインのアミノ酸配列を表し、配列番号８は、ｗｔＤドメインのアミノ酸配列を表し、配列番号９は、ｗｔＡドメインのアミノ酸配列を表し、配列番号１０は、ｗｔＢドメインのアミノ酸配列を表し、及び配列番号１１は、ｗｔＣドメインのアミノ酸配列を表す。
【図４】図４は、配列番号１２によって表されるＺドメインのアミノ酸配列を図示する。
【図５】図５は、プラスミドｐＪ５６：８６２０の模式図を表す。
【図６−１】図６は、ＳｐＡのヒスチジンタグが付加されたｗｔＢドメイン及びヒスチジンタグが付加された様々なｎ＋１変異体に対するアミノ酸配列を図示する。配列番号１３は、ＳｐＡのヒスチジンタグが付加されたｗｔＢドメインに対するアミノ酸配列を表し、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５及び２６は、それぞれ、ｎ＋１Ｂドメイン変異体Ｅ２４Ｍ、Ｅ２４Ｉ、Ｅ２４Ｆ、Ｅ２４Ｔ、Ｅ２４Ｐ、Ｅ２４Ｗ、Ｅ２４Ｒ、Ｅ２４Ｖ、Ｅ２４Ｌ、Ｅ２４Ｙ、Ｅ２４Ｈ、Ｅ２４Ｋ及びＥ２４Ｄに対するアミノ酸配列を表す。
【図６−２】図６は、ＳｐＡのヒスチジンタグが付加されたｗｔＢドメイン及びヒスチジンタグが付加された様々なｎ＋１変異体に対するアミノ酸配列を図示する。配列番号１３は、ＳｐＡのヒスチジンタグが付加されたｗｔＢドメインに対するアミノ酸配列を表し、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５及び２６は、それぞれ、ｎ＋１Ｂドメイン変異体Ｅ２４Ｍ、Ｅ２４Ｉ、Ｅ２４Ｆ、Ｅ２４Ｔ、Ｅ２４Ｐ、Ｅ２４Ｗ、Ｅ２４Ｒ、Ｅ２４Ｖ、Ｅ２４Ｌ、Ｅ２４Ｙ、Ｅ２４Ｈ、Ｅ２４Ｋ及びＥ２４Ｄに対するアミノ酸配列を表す。
【図７−１】図７は、ＳｐＡのヒスチジンタグが付加されたｗｔＢドメインに対する核酸配列及びヒスチジンタグが付加された様々なｎ＋１変異体をコードする核酸配列を図示する。配列番号２７は、ＳｐＡのヒスチジンタグが付加されたｗｔＢドメインをコードする核酸配列を表し、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０は、それぞれ、ｎ＋１Ｂドメイン変異体Ｅ２４Ｍ、Ｅ２４Ｉ、Ｅ２４Ｆ、Ｅ２４Ｔ、Ｅ２４Ｐ、Ｅ２４Ｗ、Ｅ２４Ｒ、Ｅ２４Ｖ、Ｅ２４Ｌ、Ｅ２４Ｙ、Ｅ２４Ｈ、Ｅ２４Ｋ及びＥ２４Ｄをコードする核酸配列を表す。
【図７−２】図７は、ＳｐＡのヒスチジンタグが付加されたｗｔＢドメインに対する核酸配列及びヒスチジンタグが付加された様々なｎ＋１変異体をコードする核酸配列を図示する。配列番号２７は、ＳｐＡのヒスチジンタグが付加されたｗｔＢドメインをコードする核酸配列を表し、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０は、それぞれ、ｎ＋１Ｂドメイン変異体Ｅ２４Ｍ、Ｅ２４Ｉ、Ｅ２４Ｆ、Ｅ２４Ｔ、Ｅ２４Ｐ、Ｅ２４Ｗ、Ｅ２４Ｒ、Ｅ２４Ｖ、Ｅ２４Ｌ、Ｅ２４Ｙ、Ｅ２４Ｈ、Ｅ２４Ｋ及びＥ２４Ｄをコードする核酸配列を表す。
【図８】図８は、本明細書中に記載されている高情報量ＥＬＩＳＡを基礎とするアッセイを用いて、ヒスチジンタグが付加された様々なｎ＋１Ｂドメイン変異体中の（ｎは、２３位のアスパラギンを表す。）残存ＩｇＧ結合をアッセイする典型的実験の結果を要約する棒グラフを図示する。Ｘ軸は、２４位に変異を有する様々なｎ＋１Ｂドメイン変異体を表し、Ｙ軸は、１ＮＮａＯＨへの６時間の曝露後に残存する％ＩｇＧ結合を表す。グラフ中に示されているように、嵩が大きい側鎖を含有するアミノ酸を２４位に有するｎ＋１Ｂドメイン変異体は、ｗｔＢドメインと比較して、増加した腐食性安定性を示す。
【図９】図９は、アガロース樹脂への多点付着後における、様々なＳｐＡドメイン三量体（すなわち、ＥＥＥ、ＤＤＤ、ＡＡＡ、ＢＢＢ、ＣＣＣ及びＺＺＺ）の保持されたＩｇＧ結合能のパーセントをアッセイするための典型的実験の結果を図示する。ｎＰｒＡは、ｗｔＳｐＡを表す。Ｘ軸は、腐食性曝露のサイクル数を表し、各サイクルは、０．５ＮＮａＯＨへの１５分の曝露からなる。Ｙ軸は、付着されたＳｐＡリガンドの保持されたＩｇＧ結合能を表す。図９中のグラフに示されているように、Ｃ又はＺドメイン三量体を含むリガンドの腐食性安定性は概ね等しく、Ｂドメイン三量体を含むリガンドより腐食安定性が高く、Ｂドメイン三量体を含むリガンドはＡドメイン三量体を含むリガンドより腐食安定性が高く、Ａドメイン三量体を含むリガンドはＥ又はＤドメイン三量体を含むリガンドより腐食安定性が高い。
【図１０】図１０は、多点付着を介してアガロース樹脂に付着された、３つ（Ｂ３）又は４つ（Ｂ４）又は５つ（Ｂ５）Ｂドメインを含有する本発明の付着されたリガンドの保持されたＩｇＧ結合能のパーセントをアッセイするための典型的な実験の結果を図示している。また、５つのＢドメイン又は７つのＢドメインを含有し、及びＦａｂ結合を低下させるための変異（Ｇ２９Ａ）をさらに含む付着されたリガンド（それぞれ、Ｂ５−ＮＦ及びＢ７−ＮＦと称される。）が使用される。ｎＰｒＡは、ｗｔＳｐＡを表す。Ｘ軸は、腐食性曝露のサイクル数を表し、各サイクルは、０．５ＮＮａＯＨへの１５分の曝露からなる。Ｙ軸は、付着されたＳｐＡリガンドの保持されたＩｇＧ結合能を表す。図１０中のグラフに示されているように、腐食安定性のレベル又は程度は、リガンド中のＢドメインの数に正比例し、Ｆａｂ結合を減少させるためのＧ２９Ａ変異によって変化を受けない。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ＳｐＡを基礎とするアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド、特に、ＳｐＡの１つ又はそれ以上のドメインを基礎とするリガンドを提供する。以前に記載された典型的な、ＳｐＡを基礎とするアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドには、例えば、抗体のＦａｂ部分を結合することができ、及び末端のカップリング基を用いて、単一部位において、不溶性担体へ連結されるＳｐＡのＣドメインを基礎とするアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドを論述する国際ＰＣＴ特許公開ＷＯ２００８／０３９１４１号に記載されているもの並びに１つ又はそれ以上のアスパラギンアミノ酸残基が修飾されているＳｐＡを基礎とするアルカリベースのクロマトグラフィーリガンドについて論述している米国特許第６，８３１，１６１号中に記載されているものが含まれる。
【００２３】
本開示がより容易に理解され得るようにするために、まず、ある種の用語を定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通じて記載されている。
【００２４】
Ｉ．定義
本明細書において使用される「ＳｐＡ」又は「スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ」という用語は、細菌スタフィロコッカス・オーレウスから単離される４２ｋＤａのマルチドメインタンパク質を表す。ＳｐＡは、そのカルボキシ末端細胞壁結合領域（Ｘドメインと称される。）を介して、細菌の細胞壁へ結合されている。ＳｐＡは、アミノ末端領域に、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣと称される５つの免疫グロブリン結合ドメインを含む（Ｓｊｏｄｈａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｅｐ；７８（２）：４７１−９０（１９７７）；Ｕｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．Ｆｅｂ１０；２５９（３）：１６９５−７０２（１９８４））。これらのドメインの各々は、約５８アミノ酸残基を含有し、６５から９０％のアミノ酸配列同一性を有する。ＳｐＡのＺドメインは、ＳｐＡのＢドメインの加工された類縁体であり、２９位のグリシン残基の代わりにアラニンを含む（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．，Ｎｏ．２，１０７−１１３（１９８７））。ＳｐＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインの各々は、異なるＩｇ結合部位を有する。１つの部位はＦｃγ（ＩｇのＩｇＧクラスの定常領域）に対するものであり、他の部位はある種のＩｇ分子のＦａｂ部分（抗原認識に必要とされるＩｇの部分）に対するものである。ドメインの各々がＦａｂ結合部位を含有することが報告されている。ＳｐＡの非Ｉｇ結合部分はＣ末端に位置しており、Ｘ領域又はＸドメインと称される。
【００２５】
ＳｐＡをコードする遺伝子のクローニングが、米国特許第５，１５１，３５０号（その内容全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
【００２６】
本発明は、ＳｐＡを基礎とするアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドを提供する。本発明の幾つかの形態において、アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドは、ＳｐＡの単離されたｗｔＢ又はＺドメインの２つ若しくはそれ以上又は３つ若しくはそれ以上又は４つ若しくはそれ以上又は５つ若しくはそれ以上又は６つ若しくはそれ以上又は７つ若しくはそれ以上を含む。本発明の他の形態において、アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドは、ＳｐＡの１つ又はそれ以上の単離されたＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺドメインを含み、前記１つ又はそれ以上の単離されたドメインは、トリプトファン、アルギニン、スレオニン、イソロイシン、バリン及びメチオニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異された、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を位置ｎ＋１（ｎは、アスパラギンを表す。）に含む。
【００２７】
特定の実施形態において、本発明は、樹脂上の２以上の部位に、クロマトグラフィー樹脂に付着されたＳｐＡの２つ又はそれ以上のＢドメインを含むクロマトグラフィーリガンドを提供する。別の実施形態において、本発明は、樹脂上の２以上の部位に、クロマトグラフィー樹脂に付着されたＳｐＡの２つ又はそれ以上のＺドメインを含むクロマトグラフィーリガンドを提供する。さらに別の実施形態において、クロマトグラフィーリガンドは、本樹脂上の２以上の部位に、クロマトグラフィー樹脂に付着されたＳｐＡの２つ又はそれ以上のＣドメインを含む。
【００２８】
ＳｐＡのアミノ酸変形物も本発明によって包含され、該変形物は、該変形物が誘導された親アミノ酸配列とは、親アミノ酸配列内の任意の場所の１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入において異なり得、並びにアルカリ安定性である。幾つかの実施形態において、アミノ酸配列変形物は、親配列（すなわち、ｗｔＳｐＡドメイン又はＺドメイン）と少なくとも約７０％又は少なくとも約８０％又は少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％又は少なくとも約９６％又は少なくとも約９７％又は少なくとも約９８％の同一性を有し、このような変形物は、アルカリ安定性である。特定の実施形態において、ＳｐＡの変形物は、そのアルカリ安定性を保持しながら、アラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸残基によって置換された２９位のグリシンアミノ酸残基をさらに含む。
【００２９】
本発明において、タンパク質の「機能的変形物」という用語は、機能（本発明に関して、アルカリ安定性として定義される。）が実質的に保持された変形物タンパク質を意味する。機能的変形物には、ＳｐＡの以上のドメインを含むＳｐＡ変形物、例えば、ＳｐＡの様々なドメインの二量体、三量体、多量体、並びに本明細書中に定義されているように、アルカリ安定性を保持しながら、ＳｐＡの１つ又はそれ以上の野生型ドメイン中に１つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するＳｐＡ変形物が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書において、「親分子」という用語は、本発明に従って修飾される前の形態又は本発明に従って変異が導入される前の形態の対応するタンパク質に対して使用される。
【００３１】
「配列同一性」という用語は、初期設定ギャップウエイトを使用して、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどによって、最適に並置されたときに、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列が少なくとも７０％の配列同一性又は少なくとも８０％の配列同一性又は少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性又は少なくとも９５％の配列同一性又はそれ以上を有することを意味する。配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列（例えば、親配列）として作用し、これに対して、検査配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、検査及び参照配列がコンピュータに入力され、必要であれば、サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した検査配列に対する％配列同一性を計算する。
【００３２】
比較のための配列の最適な並置は、例えば、「Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）」の局所的相同性アルゴリズムによって、「Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）」の相同性並置アルゴリズムによって、「Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）」の類似検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実装によって、又は視覚的検査（全般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）によって行うことができる。％配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、「Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）」に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて、公に入手可能（国立衛生研究所ＮＣＢＩインターネットサーバを通じて公にアクセス可能）である。典型的には、配列比較を実施するために、初期設定プログラムパラメータを使用することができるが、特別設計されたパラメータを使用することもできる。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを初期設定として使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）参照）を使用する。
【００３３】
本明細書において互換的に使用される、「Ｅドメイン」、「ＳｐＡのＥドメイン」及び「ブドウ球菌プロテインＡのＥドメイン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号７に記載されているポリペプチド又は例えば、配列番号１に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを表す。「Ｅドメイン」は、三らせん束構造へ折り畳まれる５１アミノ酸のポリペプチドである。「Ｅドメイン」は、ヘリックス１及び２の表面上の残基を介してＦｃを結合することが可能であり、又はヘリックス２及び３の表面上の残基を介してＦａｂを結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＥドメインは、配列番号７に記載されているアミノ酸配列と、配列において、少なくとも７０％同一、又は少なくとも８０％同一、又は少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％又はそれ以上同一である。
【００３４】
本明細書において互換的に使用される、「Ｄドメイン」、「ＳｐＡのＤドメイン」及び「ブドウ球菌プロテインＡのＤドメイン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号８に記載されているポリペプチド又は例えば、配列番号２に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを表す。「Ｄドメイン」は、三らせん束構造へ折り畳まれる６１アミノ酸のポリペプチドである。「Ｄドメイン」は、ヘリックス１及び２の表面上の残基を介してＦｃを結合することが可能であり、又はヘリックス２及び３の表面上の残基を介してＦａｂを結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＤドメインは、配列番号８に記載されているアミノ酸配列と、配列において、少なくとも７０％同一、又は少なくとも８０％同一、又は少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％又はそれ以上同一である。
【００３５】
本明細書において互換的に使用される、「Ａドメイン」、「ＳｐＡのＡドメイン」及び「ブドウ球菌プロテインＡのＡドメイン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号３に記載されているポリペプチド又は例えば、配列番号９に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを表す。「Ａドメイン」は、三らせん束構造へ折り畳まれる５８アミノ酸のポリペプチドである。「Ａドメイン」は、ヘリックス１及び２の表面上の残基を介してＦｃを結合することが可能であり、又はヘリックス２及び３の表面上の残基を介してＦａｂへ結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＡドメインは、配列番号３に記載されているアミノ酸配列と、配列において、少なくとも７０％同一、又は少なくとも８０％同一、又は少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％又はそれ以上同一である。
【００３６】
本明細書において互換的に使用される、「Ｂドメイン」、「ＳｐＡのＢドメイン」及び「ブドウ球菌プロテインＡのＢドメイン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号１０に記載されているポリペプチド又は例えば、配列番号４に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを表す。「Ｂドメイン」は、三らせん束構造へ折り畳まれる５８アミノ酸のポリペプチドである。「Ｂドメイン」は、ヘリックス１及び２の表面上の残基を介してＦｃを結合することが可能であり、又はヘリックス２及び３の表面上の残基を介してＦａｂへ結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＢドメインは、配列番号１０に記載されているアミノ酸配列と、配列において、少なくとも７０％同一、又は少なくとも８０％同一、又は少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％又はそれ以上同一である。
【００３７】
本明細書において互換的に使用される、「Ｃドメイン」、「ＳｐＡのＣドメイン」及び「ブドウ球菌プロテインＡのＣドメイン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号１１に記載されているポリペプチド又は例えば、配列番号５に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを表す。「Ｃドメイン」は、三らせん束構造へ折り畳まれる５８アミノ酸のポリペプチドである。「Ｃドメイン」は、ヘリックス１及び２の表面上の残基を介してＦｃを結合することが可能であり、又はヘリックス２及び３の表面上の残基を介してＦａｂへ結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＣドメインは、配列番号１１に記載されているアミノ酸配列と、配列において、少なくとも７０％同一、又は少なくとも８０％同一、又は少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％又はそれ以上同一である。
【００３８】
本明細書において互換的に使用される、「Ｚドメイン」、「ＳｐＡのＺドメイン」及び「プロテインＡのＺドメイン」という用語は、プロテインＡのＢドメインの変形物である、三らせんの５９アミノ酸のポリペプチドを表す。Ｚドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２に記載されている。典型的なＺドメインは、「Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．，１：１０７−１１３（１９９７）」（その内容全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
【００３９】
本明細書において使用される「アルカリ安定的」、「アルカリ安定性」、「腐食性安定的」又は「腐食性安定性」という用語は、単独での又はクロマトグラフィー樹脂上に固定化された場合の本発明のクロマトグラフィーリガンドが、その結合能を失わずに、アルカリ洗浄を用いた反復定置洗浄（ＣＩＰ）サイクルに耐える能力を一般に表す。一般的に、本発明のリガンドがその上に固定化されている樹脂は、単独では、最大３０時間の０．５ＭＮａＯＨ中に浸された後の安定性における５％未満の変化に寄与すると仮定される。例えば、幾つかの実施形態において、本発明のクロマトグラフィーリガンドは、長期間にわたる旧来のアルカリ洗浄に耐えることができ、特に、免疫グロブリンの費用対効果に優れた大規模精製のための魅力的な候補となる。幾つかの実施形態において、本発明のリガンドは、アルカリ環境（例えば、約１０超など、又は最大約１３若しくは１４の増加したｐＨ値を有するものとして定義され得る。）中での改良された化学的安定性を示す。あるいは、アルカリ環境は、塩基、例えば、約１．０ＭＮａＯＨ又は約０．７ＭＮａＯＨ又は約０．５ＭＮａＯＨの濃度によって定義され得る。一実施形態において、アルカリ安定性は、０．５ＭＮａＯＨ中での温置の５時間後又は１０時間後、１５時間後又は２０時間後又は２５時間後又は３０時間後に、本発明のアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドがその結合能の少なくとも８０％又は少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％を保持する能力を表す。別の実施形態において、アルカリ安定性は、５時間又は７．５時間又は１０時間又は１５時間又は２０時間又は２５時間又は３０時間の０．５ＭＮａＯＨでの処理後でさえ、リガンドの結合能が７０％未満又は６０％未満又は５０％未満又は３０％未満減少することを表す。
【００４０】
幾つかの実施形態において、本発明のＳｐＡを基礎とするクロマトグラフィーリガンドは、野生型ＳｐＡと比較して、増加した又は改善したアルカリ安定性を示す。
【００４１】
アルカリ安定性は、定型的な実験操作を用いて及び／又は本明細書に記載されているように、当業者によって容易に測定することができる。
【００４２】
本明細書中において使用される「クロマトグラフィー」という用語は、目的の分析物（例えば、免疫グロブリン）を混合物中の他の分子から分離し、分析物の単離を可能とする動的分離技術を表す。典型的には、クロマトグラフィー法において、移動相（液体又は気体）が、固定相（通常、固体）媒体を横切って又は通じて、目的の分析物を含有する試料を輸送する。固定相に対する分配又は親和性の差が異なる分析物を分離するのに対して、移動相は、異なる時間で、異なる分析物を搬出する。
【００４３】
本明細書において使用される「アフィニティークロマトグラフィー」という用語は、分離されるべき分析物が、分析物と特異的に相互作用する分子（例えば、アルカリ安定的クロマトグラフィーリガンド）とのその相互作用によって単離されるクロマトグラフィーの様式を表す。一実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーは、標的分析物（例えば、免疫グロブリン）を含有する試料を、本明細書中に記載されているようにその上にアルカリ安定的クロマトグラフィーを担持する固体支持体へ付加することを含む。
【００４４】
本明細書において使用される「プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー」という用語は、ＳｐＡ又はプロテインＡリガンドが、例えば、固体支持体上に固定化されている、本明細書中に記載されているようなプロテインＡ又はＳｐＡリガンドを用いた物質の分離又は単離を表す。本分野において公知のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー媒体／樹脂の例には、制御化多孔性ガラス骨格上に固定化されたプロテインＡを有するもの、例えば、ＰＲＯＳＥＰ  ＡＴＭ及びＰＲＯＳＥＰ  ｖＡＴＭ媒体／樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；ポリスチレン固相上に固定化されたプロテインＡを有するもの、例えば、ＰＯＲＯＳ５０ＡＴＭ及びＰｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅＡＴＭ媒体／樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、並びにアガロース固体支持体上に固定化されたプロテインＡを有するもの、例えば、ｒＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴＦＬＯＷＴＭ又はＭＡＢＳＥＬＥＣＴＴＭカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれる。
【００４５】
「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」又は「抗体」（本明細書において互換的に使用される。）という用語は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる基本的な４ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質（前記鎖は、例えば、抗原を特異的に結合する能力を有する鎖間ジスルフィド結合によって安定化されている。）を表す。「一本鎖免疫グロブリン」又は「一本鎖抗体」（本明細書において互換的に使用される。）という用語は、１つの重鎖及び１つの軽鎖からなる２ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質（前記鎖は、例えば、抗原を特異的に結合する能力を有する鎖間ペプチドリンカーによって安定化されている。）を表す。「ドメイン」という用語は、例えば、β−プリーツシート及び／又は鎖内ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループを含む（例えば、３から４のペプチドループを含む）１つの重鎖及び１つの軽鎖ポリペプチドの球状領域を表す。本明細書において、「定常」ドメインの場合における様々なクラスメンバーのドメイン内での配列変動の相対的欠如又は「可変」ドメインの場合における様々なクラスメンバーのドメイン内での著しい変動に基づいて、ドメインは、さらに、「定常」又は「可変」と称される。本分野において、抗体又はポリペプチド「ドメイン」は、しばしば、抗体又はポリペプチド「領域」と互換的に表記される。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域又は「ＣＬ」ドメインと互換的に表記される。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域又は「ＣＨ」ドメインと互換的に表記される。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域又は「ＶＬ」ドメインと互換的に表記される。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域又は「ＶＨ」ドメインと互換的に表記される。
【００４６】
免疫グロブリン又は抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得、単量体又は多量体の形態（例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体及び／又は単量体、二量体又は多量体形態で存在するＩｇＡ抗体）で存在し得る。「断片」という用語は、無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の一部又は部分を表す。断片は、無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処置を介して得ることができる。断片は、組換え手段によって取得することも可能である。典型的な断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ及び／又はＦｖ断片が含まれる。
【００４７】
「抗原結合タンパク質」という用語は、抗原を結合する又は抗原結合（すなわち、特異的結合）に関して無傷の抗体と（すなわち、抗原結合タンパク質が誘導された無傷の抗体と）競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチドの一部を表す。結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又は無傷の免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断によって作製することができる。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖及び一本鎖抗体が含まれる。
【００４８】
その一部として、抗体又はその断片を含む融合タンパク質も包含される。
【００４９】
本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、あらゆる長さのヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの何れか）のポリマー形態を表す。これらの用語には、一本鎖、二本鎖若しくは三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド又はプリン及びピリミジン塩基又は他の天然の、化学的に若しくは生化学的に修飾された、非天然の若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。ポリヌクレオチドの骨格は、（ＲＮＡ又はＤＮＡ中に、典型的に見出され得るような）糖及びホスファート基又は修飾された若しくは置換された糖若しくはホスファート基を含むことができる。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖を徐冷することによって、又は適切なプライマーとともにＤＮＡポリメラーゼを使用して、新規に相補鎖を合成することによって、化学的合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。核酸分子は、多くの異なる形態（例えば、遺伝子又は遺伝子断片、１つ又はそれ以上のエキソン、１つ又はそれ以上のイントロン、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐したポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー）を採ることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類縁体、ウラシル、フルオロリボース及びチオアートなどの他の糖及び連結基並びにヌクレオチド分岐などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。本明細書において使用される「ＤＮＡ」又は「ヌクレオチド配列」には、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧが含まれるのみならず、メチル化されたヌクレオチド、帯電していない連結及びチオアートなどのヌクレオチド間修飾、糖類縁体の使用並びにポリアミドなどの修飾された及び／又は代替的骨格構造など、これらの塩基の類縁体又は修飾された形態の何れもが含まれる。特定の実施形態において、核酸分子は、ＳｐＡの変形物をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
「Ｆｃ結合」、「Ｆｃ部分へ結合する」又は「Ｆｃ部分への結合」という用語は、抗体の結晶化可能部分（Ｆｃ）へ結合する、本明細書中に記載されているアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドの能力を表す。幾つかの実施形態において、本発明のリガンドは、少なくとも１０−７Ｍ又は少なくとも１０−８Ｍ又は少なくとも１０−９Ｍの親和性で抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４）Ｆｃ部分を結合する。
【００５１】
本明細書において使用される「Ｆａｂ結合」又は「Ｆａｂ部分への結合」は、本明細書中に記載されているアルカリ安定的クロマトグラフィーグランドが抗体又は免疫グロブリン分子のＦａｂ領域へ結合する能力を表す。「Ｆａｂ部分への低下した結合」という用語は、ｗｔＳｐＡと比較した、本発明のＳｐＡを基礎とするリガンド（リガンドは、１つ又はそれ以上のアミノ酸中に変異をさらに含む。）による免疫グロブリン分子のＦａｂ（又はＦ（ａｂ）２）部分への結合のあらゆる減少を表す。典型的な実施形態において、本発明のリガンドは、アラニンで置換されたグリシン残基を２９位にさらに含む。別の実施形態において、本発明のリガンドは、アラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸で置換されたグリシンを２９位にさらに含む。一実施形態において、免疫グロブリン分子のＦａｂ部分への結合は、本分野における旧来の技術及び本明細書中に記載されている技術を用いて検出することができない。免疫グロブリン分子への結合は、本明細書中に記載されている技術など、並びに例えば、アフィニティークロマトグラフィー及び表面プラズモン共鳴分析など（但し、これらに限定されない。）周知の技術を用いて検出することができる。幾つかの実施形態において、本発明によって包含される免疫グロブリン結合タンパク質は、少なくとも１０−１０Ｍの親和性で免疫グロブリン分子を結合する。
【００５２】
ＩＩ．クロマトグラフィーリガンドとして使用するためのＳｐＡを基礎とする分子の作製
本発明に包含されるＳｐＡを基礎とするクロマトグラフィーリガンドは、本分野において公知のあらゆる適切な方法を用いて作製することができる。
【００５３】
例えば、最初の工程として、本明細書中に記載されているＳｐＡリガンド分子を発現する核酸の作製のために、標準的な遺伝子工学技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」という表題の実験室マニュアルに記載されている技術を使用し得る。
【００５４】
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上のＳｐＡのドメイン又はその一部をコードする核酸分子は、適切な宿主細胞中で発現するために、適切なベクター中にクローニングすることができる。適切な発現ベクターは本分野において周知であり、変形物ＳｐＡコード配列の転写及び翻訳のために必要な要素を通例含む。
【００５５】
本明細書に記載されているＳｐＡ分子は、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）又はＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アプローチなどの固相ペプチド合成法（例えば、米国特許第６，０６０，５９６号；米国特許第４，８７９，３７８号；米国特許第５，１９８，５３１号；米国特許第５，２４０，６８０号参照）などの本分野において周知の方法を用いて、断片に対するアミノ酸前駆体から化学的に合成することもできる。
【００５６】
本明細書中に記載されているＳｐＡ分子の発現は、酵母、昆虫若しくは哺乳動物などの真核生物宿主由来の細胞中で、又は原核生物宿主細胞（例えば、イー・コリなどの細菌）中で達成することができる。
【００５７】
幾つかの実施形態において、各ファージがファージ表面上に提示された各ＳｐＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含有するように、ＳｐＡ分子又はその断片及び変形物は、バクテリオファージの表面上に発現され得る。免疫グロブリンに対するＳｐＡ分子の親和性は、本分野において標準的な技術及び本明細書中に記載されている技術、例えば、ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅＴＭ２０００標準セットアップ（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、容易にアッセイすることができる。免疫グロブリンへの本発明のＳｐＡ分子の結合親和性は親分子の結合親和性と少なくとも同等であることが望ましい。さらに、ＳｐＡ分子のアルカリ安定性は、親分子のアルカリ安定性より一般に改善されていることが望ましい。
【００５８】
ＩＩＩ．ＳｐＡ分子のアルカリ安定性のアッセイ
本明細書中に記載されているように、適切なＳｐＡリガンド分子の作製及び精製に続いて、分子のアルカリ安定性は、本分野において標準的な技術及び本明細書中に記載されている技術を用いてアッセイすることができる。例えば、本発明のＳｐＡ分子のアルカリ安定性は、例えば下記の実験の部に記載されているように、約０．５Ｍの濃度でのＮａＯＨでの定型的処理を用いてアッセイすることが可能である。
【００５９】
幾つかの実施形態において、アルカリ安定的ＳｐＡ分子は、「増加した」又は「改善された」アルカリ安定性を示し、野生型ＳｐＡと比較して、この分子が、長期間にわたって、アルカリ条件下で安定であることを意味する。以前に、ＳｐＡの野生型Ｃドメインを基礎とするＳｐＡ分子又は１つ若しくはそれ以上のアスパラギン残基の変異を有するＳｐＡ分子は改善された化学的安定性を与え、従って、ｐＨが約１０より大きい（最大約１３又は１４など）環境中で減少した分解速度を与えることが報告されている。
【００６０】
本発明は、Ｃドメイン以外のドメインを基礎としている場合でさえ、又はアスパラギン以外のアミノ酸中に変異を有する場合でさえ、増加したアルカリ安定性を示す新規ＳｐＡ分子の驚くべき、予想できない発見に基づいている。例えば、本発明は、Ｂ又はＺドメインを基礎とするアルカリ安定的ＳｐＡ分子及び位置ｎ＋１のアミノ酸（ｎはアスパラギン（例えば、２３位のアスパラギン）を表す。）中に変異を有するＳｐＡ分子を提供する。
【００６１】
幾つかの実施形態において、本発明のＳｐＡリガンドの作製に続いて、リガンドのアルカリ安定性は、下記の実施例中にさらに詳しく記載されている、新規高情報量免疫学的アッセイを用いて評価される。アッセイは、長期の腐食性曝露に応答したＳｐＡの分解は、ＩｇＧ結合の喪失又は低下として反映されるという仮定に基づいている。簡潔に述べれば、ＳｐＡを基礎とする可溶性リガンドが、水又は１．０ＭＮａＯＨで約６時間処理される。ＥＬＩＳＡプレート（例えば、９６ウェルプレート）の形態の固体支持体へ、中和された候補リガンドのμｇ量を付着させるために、疎水性相互作用が使用される。次いで、１．０ＭＮａＯＨへの曝露前及び曝露後に、各候補リガンドに対して、ＩｇＧ結合が評価される。腐食性曝露後における、リガンドへの残存ＩｇＧ結合の量が、リガンドが誘導された野生型ＳｐＡ又は親ＳｐＡを超える場合に、増強された腐食安定性が示唆される。
【００６２】
ＩＶ．クロマトグラフィーマトリックスを調製するために使用される支持体
幾つかの実施形態において、例えば、免疫グロブリンなどの生物分子の分離に適したクロマトグラフィーマトリックスを作製するために、本発明によって包含されるアルカリ安定的ＳｐＡリガンドは、支持体、例えば、固体支持体又は可溶性支持体に付着される。
【００６３】
幾つかの実施形態において、本発明のリガンドは、固体支持体に付着される。理論に拘泥することを望むものではないが、本発明のリガンドの付着のために、あらゆる適切な固体支持体を使用し得ることが想定される。例えば、固体支持体マトリックスには、制御化多孔性ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、アガロース、ポリメタクリラート、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド及びポリスチレンが含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
０．５ＭＮａＯＨ中での約３０時間の浸漬後に、付着されたリガンドのアルカリ安定性の５％未満の変化に寄与するあらゆる多孔性材料を固体支持体として使用し得ることが想定される。
【００６５】
固体支持体として使用される多孔性材料は、親水性化合物、疎水性化合物、疎油性化合物、親油性化合物又はこれらのあらゆる化合物から構成され得る。多孔性材料は、ポリマー又はコポリマーから構成され得る。適切な多孔性材料の例には、ポリエーテルスルホン、ポリアミド（例えば、ナイロン）、例えば、アガロース及びセルロースなどの多糖、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリビニリデンフルオリド、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボナート、フッ化炭素（例えば、ポリ（テトラフルオロエチレン−コ−ペルフルオロ（アルキルビニルエーテル）））、ガラス、シリカ、ジルコニア、チタニア、セラミック及び金属が含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
多孔性材料は、有機若しくは無機分子又は有機及び無機分子の組み合わせから構成され得、反応させるのに適した、例えば、タンパク質へ共有的に結合させるために、さらなる化学的修飾用の共有結合を形成させるのに適した１つ又はそれ以上の官能基（例えば、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、カルボニル基又はカルボン酸基）から構成され得る。別の実施形態において、多孔性材料は、官能基を有さなくてもよいが、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、カルボニル基又はカルボン酸基などの官能基を有する材料の層で被覆することができる。
【００６７】
幾つかの実施形態において、例えば、使用されている水性溶媒に親水性表面を曝露する（すなわち、ポリマーの外部表面上に、及び存在する場合には内部表面上に、ヒドロキシ(−ＯＨ)、カルボキシ(−ＣＯＯＨ)、カルボニル（−ＣＨＯ又はＲＣＯ−Ｒ’）、カルボキサミド（−ＣＯＮＨ２、おそらくＮ置換された形態）を露出する）、アミノ（−ＮＨ２、おそらく置換された形態）、オリゴ又はポリエチレンオキシ基）ポリマーを基礎とする、有機性の旧来のアフィニティー分離マトリックスが使用される。一実施形態において、ポリマーは、例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロースなどの多糖を基礎とし得、多糖は、例えば、適切な多孔性と剛直性を与えるために、ビスエポキシド、エピハロヒドリン、１，２，３−トリハロ置換された低級炭化水素で有利に架橋されている。別の実施形態において、固体支持体は、多孔性アガロースビーズを含む。本発明において使用される様々な支持体は、例えば、例えば「Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ７９（２），３９３−３９８（１９６４）」中に記載されている逆懸濁ゲル化など、本分野において公知の標準的な方法に従って容易に調製することができる。あるいは、基礎マトリックスは、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの市販の製品であり得る。大規模な分離に対して特に有利な幾つかの実施形態において、その剛直性を増加させるために支持体は改変され、これにより、マトリックスは高い流速により適するようになる。
【００６８】
あるいは、固体支持体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリラート、ポリヒドロキシアルキルメタクリラート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどの合成ポリマーを基礎とし得る。ジビニル及びモノビニル置換されたベンゼンを基礎とするマトリックスなどの疎水性ポリマーの場合には、周囲の水性液体に対して上で定義されているような親水性基を露出させるために、マトリックスの表面は、しばしば親水性化される。このようなポリマーは、標準的な方法に従って容易に製造することができる。例えば、「Ａｒｓｈａｄｙ，Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ７０（９），７０−７５（１９８８）」を参照されたい。あるいは、ＳｏｕｒｃｅＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＰｏｒｏｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの市販の製品を使用し得る。
【００６９】
さらに別の実施形態において、固体支持体は、無機性の支持体（例えば、シリカ、酸化ジルコニウムなど）を含む。無機マトリックスの表面は、ＳｐＡ及びその変形物へのさらなる反応のために、適切な反応性の基を含むようにしばしば修飾される。例には、ＣＭ  Ｚｉｒｃｏｎｉａ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ−ＢｉｏＳｅｐｒａ（ＣｅｒｇｙＰｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）及びＣＰＧ（Ｒ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が含まれる。
【００７０】
幾つかの実施形態において、ポリマーは、例えば、ジルコニア又はシリカ又は制御化多孔性ガラスを基礎とし得、これらは、リガンドへ結合させるために、反応性の基を含有するように、及び／又は腐食性浸漬を維持するように修飾され得る。
【００７１】
典型的な固体支持体の形式には、ビーズ、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレート又はモノリスが含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
マトリックスの形式に関して、一実施形態において、多孔性モノリスの形態である。別の実施形態において、マトリックスは、多孔性又は非多孔性であり得るビーズ化された形態又は粒子形態である。ビーズ化された形態又は粒子形態のマトリックスは、充填された床として又は懸濁された形態で使用することができる。懸濁された形態には、粒子又はビーズがその中で自由に移動する伸長された床及び純粋な懸濁液として公知の形態が含まれる。モノリス、充填された床及び伸長された床の場合には、分離操作は、濃度勾配を有する旧来のクロマトグラフィーに一般に従う。純粋な懸濁液の場合には、バッチ式モードが使用される。また、表面、チップ、毛細管又はフィルターなどの形態の固体支持体が使用され得る。
【００７３】
マトリックスは、カートリッジ中の膜の形態でもあり得る。膜は、平坦なシート、らせん状又は中空繊維形式であり得る。
【００７４】
別の実施形態において、本発明のリガンドは、可溶性支持体、例えば、可溶性ポリマーに付着される。典型的な可溶性支持体には、例えば、タンパク質又は核酸などの生物ポリマーが含まれるが、これに限定されない。幾つかの実施形態において、ビオチンは、例えば、米国特許公開２００８０１０８０５３号に記載されているような可溶性ポリマーとして使用され得る。例えば、ビオチンは、リガンド（例えば、本発明に係るＳｐＡを基礎とする腐食安定性リガンド）に結合され得、リガンドに結合された後に、例えば、未精製混合物中に存在する目的のタンパク質（例えば、抗体又はその断片）を単離するために使用することができ、目的のタンパク質は、可逆的な又は非可逆的な様式の何れかで、ビオチン−リガンド−タンパク質ポリマー複合体の沈殿を介して、単離又は分離することができる。ポリマーは、合成可溶性ポリマー（例えば、負に帯電した基（カルボン酸又はスルホン酸）、正に帯電した基（四級アミン、三級アミン、二級または一級基）、疎水性基（フェニル又はブチル基）、親水性基（ヒドロキシル又はアミノ基）又は上記の組み合わせを含有するポリマーなど（但し、これらに限定されない。）の合成可溶性ポリマーでもあり得る。典型的な合成可溶性ポリマーは、国際特許公開ＷＯ２００８０９１７４０号及び米国特許公開ＵＳ２００８０２５５０２７号に見出すことができ、これらの各々の教示全体は、参照により、本明細書中に組み込まれる。ｐＨ、伝導度又は温度などの１つ又はそれ以上の条件の特異的な物理的変化に際して、可逆性又は非可逆性様式で、沈殿を介して、目的のタンパク質を精製するために、これらのポリマーを使用することができる。合成可溶性ポリマーは、単独で使用し、又は本発明の腐食安定性リガンドと結合することができ、可逆的又は非可逆的な様式での沈殿を介して、目的のタンパク質（例えば、抗体又はその断片など）の捕捉／精製のために使用され得る。
【００７５】
Ｖ．支持体へリガンドを付着させるための方法
支持体（例えば、本分野において周知のもの及び本明細書に記載されているものを含む固体支持体）へリガンドを付着させるために、あらゆる適切な技術を使用し得る。例えば、幾つかの実施形態において、例えば、リガンド中に存在するアミノ及び／又はカルボキシ基を用いた慣用の結合技術を介して、リガンドを支持体に付着させ得る。例えば、ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)などが周知のカップリング試薬である。幾つかの実施形態において、支持体とリガンドの間にスペーサーが導入され、スペーサーはリガンドの利用可能性を向上させ、支持体へのリガンドの化学的結合を促進する。あるいは、リガンドは、物理的吸着又は二重特異的吸着などの非共有結合によって支持体に付着させ得る。
【００７６】
本発明によって包含される様々な実施形態において、例えば、２以上の部位に、例えばクロマトグラフィー樹脂などの固体支持体へ、リガンドが付着され、これにより、クロマトグラフィーマトリックスがもたらされる。
【００７７】
ＳｐＡを基礎とするアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドの固体支持体への付着は、多くの異なる公知の方法（その多くは、本分野において周知である。）及び本明細書中に記載されている公知の方法を介して達成することが可能である。例えば、「Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５１−１３６（１９９２）」を参照されたい。
【００７８】
例えば、タンパク質リガンドは、固体支持体又はタンパク質リガンドの何れかの表面上の活性基（例えば、ヒドロキシル、チオール、エポキシド、アミノ、カルボニル、エポキシド又はカルボン酸基など）を介して固体支持体に連結させることができる。臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル、エポキシ（ビスオキシラン）活性化及び還元的アミノ化の使用など（但し、これらに限定されない。）、公知の化学を用いて、付着を達成することが可能である。
【００７９】
例えば、チオールによって誘導されるタンパク質連結が、文献に記載されている。例えば、「Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ１８６，ｐｐ．５５８−６６１（１９８９）」を参照されたい。この技術は、ＳｐＡを固体支持体へ連結するために、以前に適用されてきた。野生型ＳｐＡはチオール基を含有していないので、ＳｐＡのＣ末端にチオール含有システインを組換え的に挿入することによって、付着が達成される。例えば、米国特許第６，３９９，７５０号を参照されたい。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭＸｔｒａ及びＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭＳｕＲｅなどの幾つかの市販の製品が、この機序を介して作製される。この末端のシステインは固体表面上のエポキシド基のみと反応することによって、ＳｐＡの固体支持体への一点付着をもたらすと報告されている。例えば、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００６，ｐａｇｅ４７３」を参照されたい。
【００８０】
本発明の場合には、ある種の実施形態において、ＳｐＡの２つ又はそれ以上のドメインを含むＳｐＡを基礎とするクロマトグラフィーリガンドは、無差別的な多点付着を介して、２以上の部位において固体支持体に付着される。一般に、ＳｐＡは、各ドメイン中の多くのリジンに由来する多数の遊離アミノ基を含有する。固体支持体（例えば、エポキシド又はアルデヒド基を有するクロマトグラフィー樹脂）上の２以上の部位へのＳｐＡドメインの付着は、それぞれ、エポキシド開環又は還元的アミノ化を介して、ＳｐＡ上のリジンのアミノ基を反応させることによって達成され得る。ある種の実施形態において、多点付着は、例えば、セリン及びチロシンなどの遊離のヒドロキシル基を有するＳｐＡ上の１つ又はそれ以上の天然に存在するアミノ酸を、開環反応を介して、エポキシド基を含有する支持体と反応させることによって達成することができる。あるいは、多点付着は、例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸などの遊離のカルボン酸基を有するＳｐＡ上の天然に存在するアミノ酸を、例えば、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを介して、アミノ基を含有する支持体と反応させることによって達成することができる。支持体へのリガンドの多点付着は、上記機序の全ての組み合わせによっても達成することができる。
【００８１】
Ｂ及びＺドメインの多量体を用いて腐食安定性を達成するために、本発明は、一点付着をもたらす単一のシステイン変異を除外する。
【００８２】
ＳｐＡを基礎とするクロマトグラフィーリガンドは、会合的な機序を介して、固体支持体へ付着させることもできる。例えば、会合性の基は、イオン性、疎水性相互作用又は相互作用の組み合わせを介して、非共有的に、目的のリガンドと相互作用することにより、目的のリガンドを固体表面上に付着させ得る。例えば、米国特許公開２００７０２０７５００Ａ１中に記載されているように、これは、固体マトリックスへのリガンドの高効率連結を促進することにより、会合性の基を持たないものより高いリガンド密度をもたらす。本発明における使用に適した会合性の基には、イオン性の種などの帯電した種及び疎水性の種などの帯電していない種が含まれる。会合性の基は、例えば、固体支持体と直接共有結合することによって、固体支持体を修飾させ得る。イオン性の種の適切な例には、四級アミン、三級アミン、二級アミン、一級アミン、スルホン基、カルボン酸又はこれらのあらゆる組み合わせが含まれ得る。疎水性の種の適切な例には、フェニル基、ブチル基、プロピル基又はこれらのあらゆる組み合わせが含まれ得る。混合モードの種が使用され得ることも想定される。会合性の基は、タンパク質リガンドとも相互作用し得る。従って、会合性の基とタンパク質リガンドの間の相互作用は、相互作用の混合（例えば、イオン性の種と疎水性の種）から構成され得る。
【００８３】
会合性の基は、固体支持体上の官能基を会合性の基上の官能基と反応させることによって、固相支持体へ共有結合させ得る。適切な官能基には、アミン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシル、イミン、アルデヒド、ケトン、アルケン、アルキン、アゾ、ニトリル、エポキシド、シアン及び活性化されたカルボン酸基が含まれるが、これらに限定されない。一例として、アガロースビーズは、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリドなどの正に帯電された会合性の基のエポキシド官能性と反応し得るヒドロキシル基を含有する。当業者は、少なくとも１つの二官能性の会合性の基が使用されれば、複数の会合性の基を固体支持体へ連結し得ることを理解する。従って、会合性の基は、固体支持体へ直列に連結することができ、又は固体支持体へ個別に直接連結することができる。
【００８４】
幾つかの実施形態において、本発明は、介在するリンカーを介して固体支持体へ連結され得る会合性の基及び／又はタンパク質リガンドを提供する。リンカーは、連結部分に連結された少なくとも１つの官能基を含み得る。連結部分は、官能基に結合され得るあらゆる分子を含み得る。例えば、連結部分は、アルキル、アルケニル又はアルキニル基の何れをも含み得る。連結部分は、１から３０個の範囲の炭素原子の炭素鎖を含み得る。幾つかの実施形態において、リンカーは、３０を超える炭素原子から構成され得る。連結部分は、窒素、酸素及び硫黄などの少なくとも１つのヘテロ原子を含み得る。連結部分は、分岐鎖、非分岐鎖又は環状鎖から構成され得る。連結部分は、２つ又はそれ以上の官能基で置換され得る。
【００８５】
固体支持体へタンパク質リガンドを連結させるための適切な緩衝液条件を選択することは、当業者の能力の範囲に十分含まれる。適切な緩衝液には、カルボナート、バイカルボナート、ホスファート及びアセタート緩衝液などのあらゆるアミン非含有緩衝液が含まれる。会合性化学が使用される場合、緩衝液の塩濃度は、使用される会合性の基に依存する。例えば、塩濃度は、５ｎＭから１００ｍＭの範囲であり得る。帯電された種が使用される場合、塩濃度は、少なくとも５ｎＭ、但し、０．１Ｍ未満、少なくとも５ｎＭ、但し、０．０１Ｍ未満、少なくとも５ｎＭ、但し、０．００１Ｍ未満であり得る。ある種の実施形態において、塩濃度は、０．０１Ｍであり得る。疎水性の種が使用される場合には、高い塩濃度が通常望ましい。従って、塩濃度は、０．００１Ｍ超、０．０１Ｍ超、又は０．１Ｍ超であり得る。
【００８６】
幾つかの実施形態において、会合性の化学が使用される場合に、反応は、０℃から９９℃の範囲の温度で実施される。ある種の実施形態において、反応法は、６０℃未満、４０℃未満、２０℃未満又は１０℃未満の温度で実施される。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、約４℃の温度で実施される。他の実施形態において、本発明の方法は、２０℃の温度で実施される。
【００８７】
ＶＩ．付着されたリガンドのアルカリ安定性をアッセイする方法
支持体への付着後におけるリガンドの増加したアルカリ安定性は、本分野において周知の技術及び本明細書中に記載されている技術によってアッセイすることができる。例えば、幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されているような、樹脂に付着されたＳｐＡドメイン（例えば、クロマトグラフィー樹脂に付着されたＳｐＡのＢ及びＺドメイン）の多量体のアルカリ安定性は、樹脂を０．５ＭＮａＯＨで処理することによって確認することができる。増加した安定性とは、野生型ＳｐＡ分子によって達成可能なものより、より長期間、初期のＩｇＧ結合能が保持されることを意味することを理解すべきである。例えば、本発明の場合には、０．５ＮＮａＯＨでの１５分の処理を各々含む１００サイクル後に、ＳｐＡリガンド（例えば、複数のＢ又はＺドメインを含むもの）の保持された能力のパーセントは、野生型ＳｐＡのものより少なくとも１．５倍超、２．０倍超、２．５倍超又は３倍超である。一実施形態において、経時的なＩｇＧ結合能の保持によってアッセイされる結合されたリガンドのアルカリ安定性は、以下のように測定される。当初のＩｇＧ濃度の５０％のＵＶ２８０ｎｍになるように搭載されたＩｇＧの容量を取得することによって、Ｑｄ５０％と表される結合能が測定される。まず、カラム中に充填された当初の未使用樹脂のＱｄ５０％を測定する。次いで、０．８ｍＬ／分で、０．５ＮＮａＯＨの１５分の曝露の約１０サイクルへ樹脂が曝露する。Ｑｄ５０％を再度測定する。０．５ＮＮａＯＨの合計約１００サイクルに樹脂が曝露されるまで、この過程を反復する。最後に一回、Ｑｄ５０％を測定し、異なるリガンドから作製された樹脂から得られた結果を野生型ＳｐＡと比較する。
【００８８】
別のアッセイにおいて、樹脂の腐食安定性又はアルカリ安定性は、目的の樹脂の静的浸漬によって測定される。穏やかに回転しながら２５時間、０．５ＮＮａＯＨ中に、樹脂の測定された量を浸漬し、ＮａＯＨ浸漬前及び浸漬後のＩｇＧ結合能を測定することによって、樹脂の結合能の保持によってアルカリ安定性を測定することができる。
【００８９】
ＶＩＩ．本発明のクロマトグラフィーリガンドを用いて、標的分子を精製する方法
幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されているアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドを用いて、標的分子を混合物から精製する方法を提供する。標的分子は、本明細書中に提供されるアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドによって認識されるあらゆる分子であり得、リガンドは固体支持体へ連結される。標的分子の例には、免疫グロブリンが含まれる。免疫グロブリンは、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体又はこれらの機能的断片であり得る。機能的断片には、固体支持体に結合されたタンパク質リガンドへ特異的に結合する能力を同時に保持しながら、その抗原へ特異的になお結合する可変領域を含む免疫グロブリンのあらゆる断片が含まれる。
【００９０】
幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されているアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドを用いて目的の標的分子を単離する方法は、（ａ）標的分子がリガンドへ特異的に結合するような条件下で、ＳｐＡを基礎とする付着されたアルカリ安定的クロマトグラフィーリガンドを含む固体支持体を、目的の分子を含む混合物と接触させる工程、及び（ｂ）標的分子がリガンドへもはや結合されないように条件を変化させることによって、標的分子を単離する工程を含む。
【００９１】
幾つかの実施形態において、変化させる工程は、標的分子がもはやリガンドへ結合されないように、ｐＨを変化させることを含む。特定の実施形態において、工程（ａ）中のｐＨ条件より酸性であるような様式で、ｐＨが変化される。例えば、一実施形態において、中性ｐＨ、すなわち、約６から約８の範囲のｐＨで、工程（ａ）が実施され得、酸性ｐＨ、例えば、約１から約５の範囲のｐＨで、工程（ｂ）が実施され得る。
【００９２】
別の実施形態において、工程（ｂ）は、標的分子がもはやリガンドへ結合されないように、使用されている緩衝液の塩濃度を変化させることを含む。例えば、一実施形態において、高い塩濃度（例えば、＞０．１Ｍ）が工程（ａ）において使用され得、より低い塩濃度（例えば、＜０．１Ｍ）が工程（ｂ）において使用され得る。逆に、幾つかの実施形態において、低い塩濃度（例えば、＜０．１Ｍ）が工程（ａ）において使用され得、高い塩濃度が工程（ｂ）において使用され得る。さらに別の実施形態において、緩衝液のｐＨ及び塩濃度の両方が、工程（ａ）と工程（ｂ）の間で変化され得る。
【００９３】
当業者は、標的分子をリガンドへ結合させるのに適した条件を容易に決定することが可能であり、これにより、リガンドへの分子の結合を破壊させるために条件を変化させることができる。
【００９４】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、以下の実施例は限定的なものと解釈すべきでない。本願を通じて引用されている全ての参考文献、特許及び公開された特許出願の内容並びに図面は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００９５】
実施例
【実施例１】
【００９６】
ｎ＋１変異（ｎは、アスパラギンを表す。）を有するＳｐＡＢドメイン変形物の作製
典型的な実験では、プロテインＡの「Ｂドメイン」をコードする合成遺伝子をＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）から入手する。遺伝子の５’末端は、開始メチオニンに対するコドンを含み、遺伝子の３’末端に６つのヒスチジンコドンを含む。ＤＮＡ２．０由来のベクターｐＪ５６；８６２０中に遺伝子を与える。親ベクターｐＪ５６は、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール及びゲンタマイシンに対する耐性を付与する。発現ベクター中へ遺伝子をその後クローニングするための適切な制限酵素部位を、遺伝子の５’及び３’末端の両方に導入する。ベクターのプラスミド地図が、図５に示されている。
【００９７】
続いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用するＰＣＲを基礎とした方法により、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、グリシン（ｇ）、アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）を除く、天然に存在する他の全てのアミノ酸へ、２４位のグルタミン酸を変異させるために、飽和突然変異導入を使用する。プライマーは、ＴｒｉｓＥＤＴＡ緩衝液中の１００μＭ溶液として、ＩＤＴＤＮＡ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入する。突然変異導入プライマーは、配列ＣＴＧＣＣＧＡＡＣＣＴＧＡＡＣＮＮＳＧＡＡＣＡＡＣＧＣＡＡＣＧＧ（配列番号４１）（ＮＮＳは、２４位のアミノ酸をコードする３つの塩基を表す。）を有する。ｄＮＴＰ（各０．２ｍＭ）、各プライマー１２５ｎｇ、テンプレートプラスミド５０ｎｇ及びＰｈｕｓｉｏｎ酵素１Ｕを含有する反応５０μＬ中でＰＣＲを行う。ＰＣＲは、表ＩＩＩに概要が記載されているスキームに従って実施される。
【００９８】
【表４】
2010156687.tif 000005
【００９９】
野生型のバックグラウンドを低下させるために、制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）でＰＣＲ反応を処理する。各ＰＣＲ反応５０μＬに、ＤｐｎＩ酵素約１μＬを添加し、３７℃で約１時間、試料を温置する。
【０１００】
ＤｐｎＩ処理されたＰＣＲ反応物２μＬで、イー・コリＮＥＢ５α形質転換受容性細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を形質転換する。氷上で細胞を溶かし、細胞２５μＬに、ＰＣＲ反応２μＬを添加する。氷上で約３０分間温置した後、約４２℃で３０秒間、細胞に熱ショックを与える。氷上で約５分間、細胞を回復させ、次いで、ＳＯＣ溶媒（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１２５μＬを添加する。３７℃で約１時間、細胞を温置し、次いで、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレート（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗｉｎｓｌｏｗ，ＭＥ）上に１００μＬを播種し、約３７℃で一晩増殖させる。ＳＤＳＰＡＧＥを用いて、全細胞可溶化液中でのタンパク質の発現を検査することによって、陽性クローンを同定する。精製されたＤＮＡを得るために、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ中で一晩培養するために、各コロニーを摘み出す。Ｑｉａｇｅｎ(Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ)のスピンミニプレップキットを用いて、ＤＮＡを精製する。
【０１０１】
各クローンの正体を確認するために、ミニプレップ調製されたＤＮＡの配列を決定する（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ  ＡＬ）。上記イー・コリＮＥＢ５α形質転換受容性細胞を形質転換するために、得られたプラスミドを使用する。
【０１０２】
陽性クローンの同定後、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを加えたＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ中で、一晩培養物３５ｍＬを増殖させ、１３，５００ｇでの１０分間の遠心によって、細胞を沈降させる。ＰＢＳ(リン酸緩衝化生理的食塩水)中の２０ｍＭイミダゾール１０ｍＬ中に沈降物を再懸濁し、音波処理によって溶解し、不溶性の破砕物を沈降させるために、１３，５００ｇで３０分間遠心する。続いて、ＰＢＳ中の２０ｍＭイミダゾールの１０カラム容量で予め平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ樹脂７５０μＬに、可溶化液をかける。ＰＢＳ中の２０ｍＭイミダゾールの２０カラム容積での洗浄後、ＰＢＳ中の２００ｍＭイミダゾールを用いて、樹脂から試料を溶出する。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ３．５ＭＷＣＯ透析カセットを用いて、精製されたタンパク質をＰＢＳに対して一晩透析する。透析後、Ｐｉｅｒｃｅ  ＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイを用いて、全タンパク質の定量を行い、試料を−３０℃で保存する。
【０１０３】
ヒスチジン付加された野生型Ｂドメイン及び様々なｎ＋１変異体に対するアミノ酸及び核酸配列が、図６及び７に図示されている。
【実施例２】
【０１０４】
アルカリ安定性に関して、発現されたタンパク質をアッセイする
実施例１に記載されている、アフィニティー精製された野生型及び変異体のＳｐＡヒスチジンタグ付加された構築物を、１Ｎの最終濃度になるように、ＭｉｌｌｉＱ水又はＮａＯＨで希釈し、室温で６時間温置する。各試料５０μＬをＰＢＳ中に中和し、緩衝液交換するために、Ｂｉｏｒａｄ  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏｓｐｉｎ６ゲルろ過カラムを使用する。ＰｉｅｒｃｅＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイを用いて、全タンパク質の定量を達成し、ＥＬＩＳＡプレート上へ搭載するために、１０μｇ／ｍＬになるように、試料をＰＢＳ中に希釈する。処理されたＰｒＡの約２００μＬ（２μｇ）を、３７℃で２から２４時間、ＥＬＩＳＡプレートのウェルへ吸着させる。室温で約２時間、ＰＢＳ中のＰｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒｂｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ−ＰＢＳ）中でプレートのブロッキングを行う。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ−ＰＢＳ（１０μｇ）中に、０．０５ｍｇ／ｍＬになるように希釈されたＳｉｇｍａのヒトγグロブリン約２００μＬをプレートの各ウェルへ添加し、室温で約１時間、結合を進行させる。約０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、ヒトＩｇＧに対して産生されたニワトリＩｇＹ−ＨＲＰ連結物の１：１０，０００希釈物２００μＬとともに、室温で約１時間、プレートを温置する。ＰＢＳ−Ｔでの最後の３回の洗浄後、室温で３０分間、Ｐｉｅｒｃｅ１−Ｓｔｅｐ  Ｓｌｏｗ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ１００μＬを用いてプレートを展開する。１ＮＨＣｌ１００μＬの添加により、反応を停止させ、４５０ｎｍで読み取られた吸光度として、一次ＩｇＧ結合を定量する。全ての試料は３つ組みでアッセイされ、データは、腐食性処理前と処理後における一次ＩｇＧ結合の変化として分析する。
【０１０５】
様々なｎ＋１Ｂドメイン変異体のアルカリ安定性をアッセイする典型的な実験の結果は、図８の棒グラフ中に要約されている。様々な構築物がＸ軸上に図示されており、１ＭＮａＯＨへの６時間後の曝露後に残存するＩｇＧ結合の対応するパーセントがＹ軸上にプロットされている。図８中の棒グラフに図示されているように、Ｂドメインの２４位に嵩が大きなアミノ酸を有するｎ＋１変異体の幾つかは、増強された腐食安定性を示す。
【０１０６】
別の実験では、ＳｐＡの２つ若しくはそれ以上のＢドメイン又は２つ若しくはそれ以上のＺドメインを有するＳｐＡリガンドが、上記アッセイを用いて、アルカリ安定性に関してアッセイされている。さらに別の実験では、３つのＢドメイン（Ｂ３）、４つのＢドメイン（Ｂ４）、５つのＢドメイン（Ｂ５）、６つのＢドメイン（Ｂ６）又は７つのＢドメイン（Ｂ７）を有するＳｐＡリガンドが、上記アッセイを用いて、アルカリ安定性に関してアッセイされている。
【０１０７】
典型的な実験において、本明細書に記載されているＥＬＩＳＡを基礎とする方法を用いてアッセイされた、リガンドＢ３、Ｂ４及びＢ５の残存するＩｇＧ結合能のパーセントは以下のとおりである。Ｂ３リガンドは、１ＭＮａＯＨへの６時間の曝露後に、その残存ＩｇＧ結合能の約７９％を保持し、Ｂ４リガンドは、１ＭＮａＯＨへの６時間の曝露後に、その残存ＩｇＧ結合能の約８６％を保持し、Ｂ５リガンドは、１ＭＮａＯＨへの６時間の曝露後に、その残存ＩｇＧ結合能の約８３％を保持する。ｗｔＳｐＡリガンド（ｎＰｒＡ）は、１ＭＮａＯＨへの６時間の曝露後に、その残存ＩｇＧ結合能の約４９％を保持するに過ぎない。
【実施例３】
【０１０８】
固体支持体への野生型ＳｐＡ及びＳｐＡ変形物の付着
様々なＳｐＡ変形物の作製並びに本分野において公知の及び実施例２に記載されている１つ又はそれ以上のアッセイを用いた、腐食安定的であるＳｐＡ変形物の同定に続いて、ＳｐＡ変形物を支持体（例えば、固体支持体）へ付着させる。典型的な実験では、以前に記載された方法（Ｐｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５１：４７９（１９７９））に従い、エピクロロヒドリンを用いて、アガロースビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＰｉｓｃａｔａｗａｙＮＪ）を架橋する。以下の方法に従って、正に帯電した会合性の基（例えば、陽イオン）とアガロースビーズを反応させる。７５重量％グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＴＭＡＣ）４０ｇ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（Ｒ）水１０ｍＬ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）及び５０重量％水酸化ナトリウム１．６７ｇに、ビーズ５０ｍＬを添加する。室温で一晩、回転式振盪機上で反応を激しく（＞１００ｒｐｍ）振盪させる。次いで、ビーズをろ過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（Ｒ）水（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）の１００ｍＬ容量で３回洗浄する。
【０１０９】
４．６ＭＮａＯＨ１５ｍＬを含有するジャーに、ビーズ（５０ｍＬ、ろ過されたケーキ）を添加する。混合物をスラリー状にし、次いで、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＵＤＧＥ）１９．５ｍＬを添加する。３５℃で約２時間、この混合物を振盪させる。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（Ｒ）水７５０ｍＬ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で、ビーズを洗浄し、１０ｍＭＮａＨＣＯ３の２５０ｍＬで平衡化する。
【０１１０】
ＢＵＤＧＥ活性化工程の直後に、ろ過されたビーズケーキ１０ｍＬを、野生型ＳｐＡ又は本発明のＳｐＡリガンドの１５ｇ／Ｌ濃度を含有する１０ｍＭＮａＨＣＯ３の溶液１０ｍＬに添加する。ガラスバイアル中で混合物に蓋をし、３７℃で約２時間、混合機中でバイアルを回転させる。２時間後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（Ｒ）水３０ｍＬＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）でビーズを洗浄する。チオグリセロール１ｍＬ並びに０．２ＭＮａＨＣＯ３及び０．５ＭＮａＣｌを加えた緩衝溶液９ｍＬから構成される溶液１０ｍＬを含有するジャーに、ろ過されたビーズケーキ（１０ｍＬ）を添加する。混合物をスラリー状にし、室温で一晩回転させる。次いで、以下の緩衝液３０ｍＬで、ビーズを洗浄する。０．１ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）、０．１５ＭＮａＣｌを加えた０．１ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）、５０ｍＭ酢酸(ｐＨ４．５）、０．００２％アジ化ナトリウムを加えたＰＢＳ(ｐＨ７．４）。
【０１１１】
異なるＳｐＡ変形物が結合された樹脂試料を、以下のように表記する。野生型ＳｐＡに対してｎＰｒＡ、３つのＺドメインを含有するＳｐＡリガンドに対してＺ３、３つのＥドメインを含有するＳｐＡリガンドに対してＥ３、３つのＤドメインを含有するＳｐＡリガンドに対してＤ３、３つのＡドメインを含有するＳｐＡリガンドに対してＡ３、３つのＣドメインを含有するＳｐＡリガンドに対してＣ３、３つのＢドメインを含有するＳｐＡリガンドに対してＢ３、４つのＢドメインを含有するＳｐＡリガンドに対してＢ４、５つのＢドメインを含有するＳｐＡリガンドに対してＢ５、それぞれ、５及び７つのＢドメインを含有し、並びに２９位にＧ２９Ａ変異をさらに含有するＢ５ＮＦ及びＢ７ＮＦ。樹脂への付着後、様々なＳｐＡ変形物をアルカリ安定性に関してアッセイする。
【実施例４】
【０１１２】
腐食サイクル前及び後における樹脂ＩｇＧ結合能（Ｑｄ５０％）試験
典型的な実験において、支持体への付着後、ＩｇＧ結合能力に関して、本発明の様々なＳｐＡ構築物をアッセイする。１つの典型的な実験において、市販のポリクローナルＩｇＧを使用して樹脂／媒体動的能力を検査するための標準的な方法が使用される。要約すれば、本発明のＳｐＡリガンドが結合された樹脂を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中のＯｍｎｉｆｉｔカラム（６．６ｍｍ×７０ｍｍ）中に充填し、流速を３００ｃｍ／時間に設定する。１０カラム容積（ＣＶ）に対するＰＢＳで、充填されたカラムを平衡化する。ＵＶ２８０ｎｍが最初のＩｇＧ濃度の５０％超に達するまで、ポリクローナルＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）をカラム上に搭載する。平衡化緩衝液での洗浄後、０．１Ｍクエン酸、ｐ３．０でＩｇＧを溶出する。各実行後、６Ｍ塩酸グアニジニンを用いて、媒体を消毒する。ＵＶ２８０ｎｍが最初のＩｇＧ濃度の５０％に達した時点で搭載されたＩｇＧの量に基づいて、Ｑｄ５０％を計算する。
【０１１３】
当初の動的能力測定後、１５分、０．５ＮＮａＯＨ（流速１００ｃｍ／時間）の１０サイクルに媒体を曝露した後、さらにＩｇＧ動的能力を測定する。続いて、１５分、０．５ＮＮａＯＨ曝露のさらに１０サイクルと媒体を接触させた後、さらに動的結合能測定を行った。１５分、０．５ＮＮａＯＨの１００サイクルに各サイクルを曝露した後に、動的能力の測定を実施する。
【０１１４】
図９に結果が図示されている典型的な実験において、天然のＢドメインリンカーを含有するＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＺドメインの三量体をアガロース樹脂に付着させ、腐食的曝露の１００サイクル（各サイクルは、０．５ＮなＮａＯＨへの１５分の曝露を含む。）にわたる動的結合能によって、これらの腐食安定性を測定する。図９中のグラフに要約されているように、サイクルの数をＸ軸上にプロットし、ＩｇＧ結合能をＹ軸上にプロットする。Ｃ及びＺドメイン三量体は、腐食安定性の概ね同じレベルを示す。Ｂドメイン三量体は、Ａドメイン三量体より腐食安定的であり、Ａドメイン三量体は、Ｅ及びドメイン三量体より腐食安定的である。従って、腐食安定性の順序は、以下のよう要約することができる。Ｃ及びＺ＞Ｂ＞Ａ＞Ｅ及びＤ。
【０１１５】
別の典型的な実験において、腐食的曝露の１００サイクル（各サイクルは、０．５ＮＮａＯＨへの１５分の曝露を含む。）にわたってＩｇＧ動的結合能をアッセイするために、上記アッセイを用いて、Ｂドメイン変形物：ＢＢＢ（Ｂ３）、ＢＢＢＢ（Ｂ４）、ＢＢＢＢＢ（Ｂ５）、ＢＢＢＢＢ−ＮＦ（Ｂ５−ＮＦ）及びＢＢＢＢＢＢＢ−ＮＦ（Ｂ７−ＮＦ）が結合されたアガロース樹脂を野生型ＳｐＡ（ｎＰｒＡ）と比較する。図１０のグラフに要約されているように、腐食安定性の程度は、ドメインの数に正比例し、さらに、Ｆａｂ結合を低下させるためのＧ２９Ａ変異は腐食安定性に影響を及ぼさない。
【０１１６】
本明細書は、参照により本明細書中に組み込まれる、本明細書中に引用されている参考文献の教示に照らして最も完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明における実施形態の例示を与えるものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。多くの他の実施形態が本発明によって包含されることが、当業者に容易に認識される。全ての公報及び発明の全体が、参照により組み込まれる。参照によって組み込まれた資料が本明細書と矛盾し又は不一致である程度まで、本明細書はかかる一切の資料に優先する。本明細書中でのあらゆる参考文献の引用は、かかる参考文献が本発明に対して従来技術であることを認めたものではない。
【０１１７】
別段の記載がなければ、特許請求の範囲を含む本明細書中において使用される、成分の量、細胞培養、処理条件などを表す全ての数字は、全ての事例で、「約」という用語によって修飾されているものと理解すべきである。従って、別段の記載がなければ、数的パラメータは近似であり、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る。別段の記載がなければ、要素の系列に先行する「少なくとも」という用語は、その系列中のあらゆる要素を表すものと理解される。当業者は、本明細書中に記載されている本発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識し、定型的な実験操作のみを用いて多くの均等物を確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【０１１８】
当業者に自明であるように、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの修飾及び変形を施すことが可能である。本明細書に記載されている具体的な実施形態は例として与えられているものに過ぎず、いかなる意味においても、限定を意味するものではない。本明細書及び実施例は例示に過ぎないと考えられることが意図され、本発明の真の範囲及び精神は、以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年4月5日(2010.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【外国語明細書】
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