(57)【要約】【課題】細胞の取り扱いに好適であり、特に中空糸が用いられることによって、凍結保存や培養に際しての細胞の取り扱いに適し、かつ中空糸の破損防止に適した手段を提供する。【解決手段】細胞用デバイス１０は、両端が開口された中空糸１１と、中空糸１１の第１端２１に接続されて、その内部空間が中空糸１１の内部空間と連続する流路を構成する注射針１２と、中空糸１１に挿通された芯材１３と、を具備する。芯材１３は、使用に際して中空糸１１から脱抜可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
両端が開口された中空糸と、
上記中空糸の第１端に接続されて、その内部空間が当該中空糸の内部空間と連続する流路を構成する管体と、
上記中空糸に挿通された芯材と、を具備し、
上記芯材は、使用に際して上記中空糸から脱抜可能である細胞用デバイス。
【請求項２】
上記芯材は、中空糸の両端から突出されたものである請求項１に記載の細胞用デバイス。
【請求項３】
上記中空糸の第１端に対して上記管体が外嵌されて、上記中空糸と上記管体とが接続され、
上記芯材は、上記中空糸の第１端に当接する段差部を有するものである請求項１又は２に記載の細胞用デバイス。
【請求項４】
両端が開口された中空糸に挿通可能な芯部と、当該中空糸の第１端と当接し得る段差部とを有する芯材を、当該中空糸を挿入可能な管体に挿通して、その段差部を当該管体内の所定位置に位置決めする第１ステップと、
上記芯材の芯部を中空糸に挿通させるようにして、当該中空糸の第１端を上記管体に挿入し、当該第１端を上記芯材の段差部に当接させて、上記管体に対して当該中空糸を位置決めする第２ステップと、
上記中空糸の第１端側と上記管体との間に接着剤を充填して、上記中空糸と上記管体とを結合する第３ステップと、を含む細胞用デバイスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の取り扱いに好適に用いられ、中空糸の内部空間に細胞を内包しうる細胞用デバイスに関し、特に中空糸の破損防止に適した手段を有する細胞用デバイスに関する。
【０００２】
また、本発明は、中空糸の破損防止に適した芯材を、中空糸を管体に結合するに適した治具として用いる細胞用デバイスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトの不妊治療や動物のクローンの分野において、卵子や初期胚などの生殖細胞を培養したり凍結保存することがある。この培養や凍結保存において、生殖細胞を培地から取り出したり、凍結保存容器に対して出し入れしたりすることがある。このような生殖細胞の取り扱い作業は、ピペットの如くストロー形状の器具を用いて、生殖細胞をストロー内へ吸い込む或いはストロー内から吐き出すことにより行われている。この他にも、膜状又は板状のデバイス（例えば、北里サプライ社製、クライオトップ）が用いられたり、ループ形状のナイロン糸（例えば、北里サプライ社製、クライオループ）が用いられたりしている。
【０００４】
特許文献１には、初期胚の遺伝情報の判定のために使用される器具が開示されている。この器具は、移植前初期胚から細胞を取り出すために使用され、ピペットに類似するパイプ材（２）を有する。このパイプ材（２）は、細いガラス管であり、その先端に鋭利な突き刺し部（３）が形成されている。パイプ材（２）の他端はマイクロマニピュレータ用の微量吸引及び排出が可能な操作器具に接続されている。初期胚にパイプ材（２）が突き刺され、初期胚内の細胞がパイプ材（２）の内部に吸引される。
【０００５】
特許文献２には、中空糸内部で細胞を培養又は保存するための器具が開示されている。この器具は、細胞懸濁液流通管（１）に中空糸固定部（３）を介して中空糸（４）の束が固定され、その中空糸（４）の束の先端が硬化性樹脂（５）で封止されている。中空糸（４）の束が培地に浸漬された状態で細胞懸濁液流通管（１）が吸引され、細胞懸濁液流通管（１）及び中空糸（４）の束に培地が満たされる。その後、細胞懸濁液流通管（１）を通じて中空糸（４）の束に細胞懸濁液が注入されると、中空糸（４）の内部に細胞が堆積される。
【０００６】
特許文献３には、生体組織マトリックスへ細胞を播種する方法が開示されている。この方法においては、播種すべき細胞が充填された生体分解性中空糸が生体組織片に埋め込まれ、その生体組織片において中空糸から細胞が放出される。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−３３２００号公報
【特許文献２】特開２００３−３３９３６８号公報
【特許文献３】特開２００７−１６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、生殖細胞の培養において培地を交換する度に、従来のストロー形状の器具を用いて、培地などに対して生殖細胞の取出し及び吐き出しを繰り返す作業は煩雑であるという問題がある。
【０００９】
また、生殖細胞を凍結保存する際に、例えばガラス化により凍結保存するのであれば、濃度勾配を有する複数のガラス化平衡液に生殖細胞を順次浸漬するが、その際に、従来のストロー形状の器具を用いて、複数種のガラス化平衡液に対して生殖細胞の注入及び取出しを繰り返す作業は煩雑であるという問題がある。さらには、凍結保存された生殖細胞を解凍して培地に注入する際にも、同様の煩雑さが問題となる。
【００１０】
本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞の取り扱いに好適であり、特に中空糸が用いられることによって、凍結保存や培養に際しての細胞の取り扱いに適し、かつ中空糸の破損防止に適した手段を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の目的は、中空糸の破損防止に適した芯材を、中空糸を管体に結合するに適した治具として用いて細胞用デバイスを簡易に製造できる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
(1)  本発明に係る細胞用デバイスは、両端が開口された中空糸と、上記中空糸の第１端に接続されて、その内部空間が当該中空糸の内部空間と連続する流路を構成する管体と、上記中空糸に挿通された芯材と、を具備する。上記芯材は、使用に際して上記中空糸から脱抜可能である。
【００１３】
本発明における細胞としては、生殖細胞が挙げられる。生殖細胞とは、始原生殖細胞、精子、精子細胞、卵子、卵母細胞、初期胚を含む包括的な概念である。ここで、精子細胞とは、精子となる過程における前駆細胞をいう。卵母細胞とは、卵子となる過程における前駆細胞をいう。初期胚とは、着床前の受精卵をいう。なお、本発明に係る細胞用デバイスは、生殖細胞以外にも、ＥＳ細胞のような細胞の取り扱いに用いられてもよい。
【００１４】
中空糸とは、細胞を通過させないが、水や電解質、タンパク質などを通過させうる径の孔を複数有する膜がストロー形状に成形されたものをいう。中空糸を形成する膜として、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、再生セルロースなどが挙げられる。この膜が有する細孔径は、ナノメートルオーダーのものであればよい。また、膜の厚みは、前述の細胞を観察できる程度の透明性を中空糸が有するためには、好ましくは０．５〜３０μｍであり、さらに好ましくは１〜１０μｍである。
【００１５】
中空糸の内径は、対象となる細胞を内包することができる程度が選択され、好ましくは２０〜１０００μｍであり、さらに好ましくは５０〜５００μｍである。
【００１６】
中空糸の長さは、数個の細胞を内包することが可能であり、後述される気泡を形成したりするに適した長さが選択され、好ましくは１〜１００ｍｍであり、さらに好ましくは１０〜４０ｍｍである。中空糸の長さがこの範囲内であれば、卵母細胞、卵子及び初期胚であれば１〜数十個程度を内包することができ、始原生殖細胞、精子及び精子細胞であれば数十〜数万個程度を内包することができ、かつ、その内包された複数個の生殖細胞に対して中空糸の両開口側に気泡を形成することができる。
【００１７】
第１管体は、中空糸と接続可能なものであって、接続された中空糸を支持する剛性を有する。第１管体は、その内部空間が中空糸の内部空間と連続して気体又は液体の流路となり得るものである。第１管体の素材は特に限定されないが、例えば、ステンレスなどの金属や、プラスチック、ガラスなどが挙げられる。
【００１８】
第１管体の形状は、特に限定されず、円管、角管などを採用しうるが、通常、中空糸が円筒形状となるので、円管であることが好ましい。
【００１９】
第１管体の外径又は内径は、中空糸との接続を考慮して選択される。例えば、第１管体に対して中空糸を外嵌させるのであれば、第１管体の外径は中空糸の内径と同程度としてもよい。逆に、中空糸に対して第１管体を外嵌させるのであれば、第１管体の内径は中空糸の外径と同程度としてもよい。また、筒形状のジョイントを用いて中空糸と第１管体とを接続するのであれば、第１管体の外径は中空糸の外径と同程度としてもよい。
【００２０】
第１管体の長さは、ハンドリングを考慮して選択され、５０〜１０００ｍｍ程度がハンドリングに優れるので好適である。
【００２１】
中空糸と第１管体との接続は、内嵌や外嵌、ジョイントによる機械的な接続構造が選択されてもよく、さらに医療用接着剤などを用いて接着固定が行われてもよい。
【００２２】
芯材は、中空糸に挿抜可能なものであって、中空糸に挿通された状態において、中空糸が折れ曲がらないように支持する程度の剛性を有する。芯材の素材は特に限定されないが、例えば、ステンレスなどの金属やプラスチックなどが挙げられる。なお、芯材は、中空糸のみに挿通されるものであっても、中空糸及び第１管体に挿通されるものであってもよい。
【００２３】
芯材の形状は、特に限定されず、円柱や角柱などの棒材が採用されうるが、通常、中空糸が円筒形状となるので、円柱形状の棒材であることが好ましい。また、芯材の外径は、中空糸への挿通を考慮して選択され、中空糸の内径より若干小さい外径のものが好適である。
【００２４】
細胞用デバイスの使用に際して、芯材を中空糸から脱抜する。これにより、中空糸内に細胞を吸引することができる。一方、使用までの間においては、芯材によって中空糸が支持されることにより、中空糸が他の部材に接触したりして外力が加わって、中空糸が折れ曲がることが防止される。
【００２５】
中空糸から芯材を抜き取った後、例えば、顕微鏡などによって培地中の細胞を確認して、細胞用デバイスの第１管体を操作して、第１管体に接続された中空糸を培地中に挿入し、中空糸の先端を細胞に近接させる。そして、適当な吸引具を用いて、第１管体を通じて中空糸の内部空間を負圧とすると、その負圧が吸引圧となって、中空糸の先端から細胞が培養液と共に中空糸の内部空間へ吸引される。複数個の細胞を中空糸の内部空間へ吸引する場合には、この作業を繰り返す。
【００２６】
培地から取り出した細胞を凍結保存する場合には、中空糸から細胞を取り出すことなく、中空糸に内包された状態の細胞を凍結保存溶液に浸漬する。前述のように、中空糸の孔は、細胞を通過させないが、培養液や凍結保存溶液などを通過させるので、中空糸の内部空間に細胞が内包された状態を維持しながら、中空糸の内部空間の培養液や細胞の細胞内液などを凍結保存溶液に置換することができる。そして、その中空糸を液体窒素などに浸漬することによって、中空糸内の細胞を凍結する。
【００２７】
凍結された細胞を内包する中空糸を保存するために、中空糸において細胞が存在する一部分を第１管体から切断して、中空糸を第１管体から分離する。そして、分離された中空糸をディープフリーザなどで冷凍保存する。また、中空糸を第１管体から切断することなく、中空糸が接続された第１管体を吸飲具等から取り外して、中空糸及び第１管体を冷凍保存に適した容器などに封入してディープフリーザなどで冷凍保存してもよい。
【００２８】
なお、前述のように中空糸の内部空間に内包されて凍結保存された細胞は、中空糸と共に加温液に浸すことにより解凍される。解凍後に、中空糸の一端から内部空間へ排出圧を付与すると、中空糸の内部空間から細胞が外部へ排出される。また、中空糸の内部空間に細胞を内包させた状態で培養を行うのであれば、解凍された中空糸を所望の培地中に投入すればよい。
【００２９】
(2)  上記芯材は、中空糸の両端から突出されたものであってもよい。
【００３０】
これにより、中空糸の両端が芯材によって支持されるので、その両端の破損が防止される。
【００３１】
(3)  上記中空糸の第１端に対して上記管体が外嵌されて、上記中空糸と上記管体とが接続され、上記芯材は、上記中空糸の第１端に当接する段差部を有するものであってもよい。
【００３２】
中空糸の第１端側から芯材を挿入すると、芯材の段差部が中空糸の第１端と当接して、芯材の挿入限界が決定される。また、芯材の脱抜が、第１端側から引き抜く向きに限定されるので、中空糸の第１端側を鉛直上向きにしていれば、自重によって芯材が中空糸から脱落することがない。
【００３３】
(4)  本発明に係る細胞用デバイスの製造方法は、両端が開口された中空糸に挿通可能な芯部と、当該中空糸の第１端と当接し得る段差部とを有する芯材を、当該中空糸を挿入可能な管体に挿通して、その段差部を当該管体内の所定位置に位置決めする第１ステップと、上記芯材の芯部を中空糸に挿通させるようにして、当該中空糸の第１端を上記管体に挿入し、当該第１端を上記芯材の段差部に当接させて、上記管体に対して当該中空糸を位置決めする第２ステップと、上記中空糸の第１端側と上記管体との間に接着剤を充填して、上記中空糸と上記管体とを結合する第３ステップと、を含む。
【００３４】
第１ステップにおいて、管体の所定の位置まで芯材を挿入する。この芯材の挿入において、管体において中空糸の第１端と接続される側に芯材の段差部が向くようにする。管体に対して芯材を挿入する位置は、管体の内部空間において、中空糸の第１端が位置決めされるべき位置に、芯材の段差部が配置されるように決定される。このような管体の芯材との配置は、適当な治具などによって決められてもよい。
【００３５】
第２ステップにおいて、芯材の芯部を中空糸に挿通させるようにして、芯部に沿って中空糸を移動させながら、管体に中空糸の第１端を挿入する。管体に挿入された中空糸の第１端は、管体の内部空間に配置された芯材の段差部と当接する。この当接によって、管体へ中空糸を挿入する位置が決定される。このようにして、芯材が、管体へ挿入される中空糸のガイドとして用いられ、また、中空糸の第１端を位置決めする治具として用いられる。
【００３６】
第３ステップにおいて、中空糸の第１端側と管体との間に接着剤を充填する。中空糸と管体との間に隙間があれば、その隙間に接着剤を充填する。中空糸と管体との間に隙間が殆ど無ければ、中空糸と管体との境界に接着剤を塗布するように充填する。この接着剤は、いわゆる医療用接着剤を使用する。これにより、管体と中空糸とが結合される。製造後の細胞用デバイスは、芯材により中空糸が支持されて、中空糸の折れ曲がりや破損が防止される。この芯材は、使用に際して中空糸から引き抜かれる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明に係る細胞用デバイスによれば、各々の内部空間が流路として連続されて第１管体と中空糸とが接続されているので、吸引具により流路に吸引圧を付与すると、中空糸の内部空間へ細胞を取り込むことができる。この中空糸の孔は、細胞を通過させないが、培養液や凍結保存溶液などを通過させるので、中空糸の内部空間に細胞が内包された状態を維持しながら、中空糸の内部空間の培養液や細胞の細胞内液などを凍結保存溶液に置換することができる。
【００３８】
また、使用に際して脱抜可能な芯材が中空糸に挿通されているので、使用までの間においては、芯材によって中空糸が支持される。これにより、中空糸が他の部材に接触したりして外力が加わって、中空糸が折れ曲がることが防止される。
【００３９】
また、本発明に係る細胞用デバイスの製造方法によれば、管体に挿通された芯材が、管体へ挿入される中空糸のガイドとして機能する。また、管体内に位置決めされた芯材の段差部が、管体に挿入された中空糸の第１端と当接して、管体へ中空糸を挿入する位置が決定されるので、芯材が、管体へ挿入される中空糸の第１端を位置決めする治具として機能するとともに、製造後においては、芯材により中空糸が支持されて、中空糸の折れ曲がりや破損が防止される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。
【００４１】
［図面の説明］
図１は、本発明の実施形態にかかる細胞用デバイス１０の全体構成を示す斜視図である。図２は、中空糸１１、注射針１２及び芯材１３の分解斜視図である。図３は、芯材１３の全体構成を示す斜視図である。図４から図７は、細胞用デバイス１０の製造方法を説明するための断面図である。図８は、細胞用デバイス１０にチューブ１４を介して注射筒１５が接続された状態を示す斜視図である。図９〜図１６は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。なお、図９〜図１６には、細胞用デバイス１０の中空糸１１、注射針１２の一部のみが示されており、チューブ１４及び注射筒１５は各図に示されていない。
【００４２】
［細胞用デバイス１０］
図１及び図２に示されるように、細胞用デバイス１０は、主として、中空糸１１と、注射針１２と、芯材１３と、を有する。
【００４３】
中空糸１１は、細胞を通過させないが、水や電解質、タンパク質などを通過させうる径の孔を複数有する膜が、両端が開口したストロー形状に成形されたものである。中空糸１１の内径及び長さは、対象となる細胞に対応させて適宜選択されるが、内径は数百μｍ程度であり、長さは数ｃｍ程度である。
【００４４】
注射針１２は、本発明における第１管体の一実施態様である。注射針１２は一般的なものであり、ポリウレタン樹脂製のカヌラがハブに固定されている。注射針１２のカヌラの先端開口に中空糸１１の一端が挿入されて、医療用接着剤により中空糸１１と注射針１２固定されている。これにより、中空糸１１の内部空間が注射針１２のカヌラの内部空間と連続する。この連続した内部空間は、後述されるように吸引圧が付与されて気体又は液体の流路となる。本明細書において、注射針１２と連結された側の中空糸１１の端が第１端２１と称され、注射針１２から延出された先端が中空糸１１の第２端２２と称される。
【００４５】
図１から図３に示されるように、芯材１３は、中空糸１１及び注射針１２の軸線１０１と同じ方向に長尺の部材であり、全体として、概ね細長な円柱形状をなしている。芯材１３は、軸線１０１に沿って小径部２４と大径部２５とが並設された形状であり、その小径部２４と大径部２５との境界に段差部２６が形成されている。
【００４６】
小径部２４の外径は、中空糸１１の内径とほぼ同等乃至若干小さい。したがって、小径部２４は、中空糸１１に挿通可能である。小径部２４の軸線１０１方向に沿った長さは、中空糸１１の長さより若干長い。したがって、小径部２４が中空糸１１に挿通された状態において、小径部２４は、中空糸１１の両端である第１端２１及び第２端２２からそれぞれ突出し得る。この小径部２４が、本発明における芯材の芯部に相当する。
【００４７】
大径部２５の外径は、中空糸１１の内径より大きく、かつ注射針１２の内径とほぼ同等乃至若干小さい。したがって、大径部２５は、注射針１２に挿通可能であるが、中空糸１１に挿通することはできない。大径部２５の軸線１０１に沿った長さは、注射針１２より若干長い。
【００４８】
小径部２４と大径部２５との境界に形成された段差部２６は、軸線１０１と直交する方向へ拡がる平面を形成している。この段差部２６をなす平面は、小径部２４の外径と大径部２５の外径との差となる寸法幅で環状をなしている。後述されるように、段差部２６には、中空糸１１の第１端２１が当接し得る。
【００４９】
芯材１３は、小径部２４が中空糸１１に挿通された状態において、中空糸１１が容易に折れ曲がらないように支持できる剛性を有する。芯材１３の素材は特に限定されないが、例えば医療用ステンレスから芯材１３が作製されうる。
【００５０】
［細胞用デバイス１０の製造方法］
以下に、前述された細胞用デバイス１０の製造方法が説明される。
【００５１】
細胞用デバイス１０の製造方法は、主として、芯材１３を注射針１２に挿通して、段差部２６を注射針１２内の所定位置に位置決めする第１ステップ（Ｓ１）と、芯材１３の小径部２４を中空糸１１に挿通させるようにして、中空糸１１の第１端２１を注射針１２に挿入し、第１端２１を段差部２６に当接させて位置決めする第２ステップ（Ｓ２）と、中空糸１１の第１端２１側と注射針１２との間に接着剤２７を充填して、中空糸１１と注射針１２とを結合する第３ステップ（Ｓ３）と、からなる。
【００５２】
図４に示されるように、第１ステップ（Ｓ１）において、注射針１２の所定の位置まで芯材１３を挿入する。この芯材１３の挿入において、注射針１２において中空糸１１の第１端２１と接続される側へ芯材１３の段差部２６の平面が向くようにする。つまり注射針１２の先端から芯材１３の小径部２４が突出するように、芯材１３を注射針１２に挿入する。
【００５３】
注射針１２に対して芯材１３を挿入する位置は、注射針１２の内部空間において、中空糸１１の第１端２１が位置決めされるべき位置に、芯材１３の段差部２６が配置されるように決定される。図４には治具が現れていないが、注射針１２に芯材１３が挿入された状態において、注射針１２のカヌラ側及び芯材１３の小径部２４側を上側とし、注射針１２のハブ側及び芯材１３の大径部２５側を下側として、注射針１２及び芯材１３を不図示の治具上に起立させる。この治具によって、注射針１２と芯材１３との配置が決定され、図４に示されるように、注射針１２の先端付近に芯材１３の段差部２６が配置される。
【００５４】
図５に示されるように、第２ステップ（Ｓ２）において、注射針１２の先端側へ中空糸１１の第１端２１を挿入する。芯材１３の小径部２４に沿って中空糸１１を注射針１２側へスライドさせると、中空糸１１の第１端２１が注射針１２に挿入される。つまり、芯材１３が、注射針１２へ挿入される中空糸１１のガイドとして用いられる。
【００５５】
図６に示されるように、注射針１２に挿入された中空糸１１の第１端２１は、注射針１２の内部空間に配置された芯材１３の段差部２６と当接する。この当接によって、注射針１２へ中空糸１１を挿入する位置が決定される。つまり、芯材１３が、注射針１２へ挿入される中空糸１１の第１端２１を位置決めする治具として用いられる。前述されたように、芯材１３の段差部２６は上側を向いているので、中空糸１１は、第１端２１が段差部２６に支持された状態で静止する。
【００５６】
図７に示されるように、第３ステップ（Ｓ３）において、中空糸１１の第１端２１側と注射針１２との間に接着剤２７を充填する。中空糸１１の外周に沿って注射針１２との間に隙間があれば、その隙間に接着剤２７を充填すればよいし、中空糸１１の外周に沿って注射針１２との間に隙間が殆ど無ければ、中空糸１１の外周に沿った注射針１２との境界に接着剤２７を塗布するように充填する。この接着剤２７は、いわゆる医療用接着剤を使用する。これにより、中空糸１１と注射針１２とが結合される。
【００５７】
［細胞凍結保存方法］
以下に、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法が説明される。
【００５８】
以下に説明される細胞凍結保存方法は、主として、細胞浮遊液から細胞４１及び培養液４２を中空糸１１の内部空間へ吸引する第１ステップ（Ｓ１１）と、細胞４１及び培養液４２を内包した中空糸１１をガラス化溶液４３に浸漬する第２ステップ（Ｓ１２）と、中空糸１１を注射針１２から分離する第３ステップ（Ｓ１３）と、分離された中空糸１１を冷却する第４ステップ（Ｓ１４）と、の４つのステップを有する。
【００５９】
細胞用デバイス１０の使用に際して、芯材１３を中空糸１１から脱抜する。前述されたように、注射針１２の内部空間において、芯材１３の段差部２６が中空糸１１の第１端２１と当接しているので、注射針１２のハブ側から芯材１３を引き抜く。これにより、中空糸１１内に細胞４１を吸引することができる状態となる。一方、使用までの間においては、芯材１３によって中空糸１１が支持されることにより、中空糸１１が他の部材に接触したりして外力が加わって、中空糸１１が折れ曲がることが防止される。
【００６０】
図８に示されるように、芯材１３が脱抜された後の細胞用デバイス１０は、チューブ１４を介して注射筒１５と接続される。
【００６１】
チューブ１４は、シリコーンゴム製である。チューブ１４の内径及び外径は、注射針１２及び注射筒１５に対応させて適宜選択される。図８においては、チューブ１４が、その長さ方向に対して一部が省略されて現されているが、チューブ１４の長さは、注射針１２と注射筒１５とを作業者が両手に分けて持って操作できるに適した長さであり、通常、数十ｃｍ程度である。チューブ１４の可撓性は、注射針１２と注射筒１５とを作業者が両手に分けて持って操作した際にチューブ１４が座屈せず、かつチューブ１４の内部空間が後述される吸引に適した負圧にされた際にチューブ１４が内部空間を閉塞して潰れない程度である。チューブ１４の一端は、ジョイントなどを介して注射針１２のハブと接続されている。これにより、注射針１２の内部空間は、チューブ１４の内部空間と連続されている。このジョイントなどは、公知のものを適宜用いればよいので、ここでは詳細な説明が省略される。
【００６２】
なお、チューブ１４は、可撓性を有するものであれば、例えば天然ゴム、ポリウレタン、シリコーンゴム、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン・プロピレン共重合体などをチューブ形状に成形したものが適宜用いられる。チューブ１４の長さは特に限定されないが、注射針１２と注射筒１５とを別々に操作するに適した長さが採用され、５０〜１０００ｍｍ程度であれば、一方の手で注射針１２を操作しながら他方の手で注射筒１５を操作できるの好適である。
【００６３】
注射筒１５の構成は一般的である。シリンジ３１は略円筒形状であり、その先端側が縮径されて円筒形状の取付部３３が形成されている。取付部３３の両端は開口しており、一端がシリンジ３１の内部空間と通ずる。つまり、取付部３３の内部空間は、シリンジ３１の内部空間と外部とを連続させるポートを形成する。この取付部３３にチューブ１４の他端が外嵌されて、シリンジ３１の内部空間とチューブ１４の内部空間とが連続されている。シリンジ３１の基端側は開口されており、その基端側からプランジャ３２が内部空間へ挿入されている。プランジャ３２は、シリンジ３１の内部空間の軸線１０１方向の長さより長く、シリンジ３１の内部空間の最奥部まで挿入された状態で、プランジャ３２の一部がシリンジ３１の基端から外部へ突出している。
【００６４】
各図には現れていないが、プランジャ３２の先端にはガスケットが接続されている。ガスケットは、ゴムなどの弾性素材からなる円柱体であり、シリンジ３１の内部空間に気密に嵌合されて、プランジャ３２とともにシリンジ３１の内部空間を軸線１０１に沿った方向へスライド移動可能である。プランジャ３２が延びる方向は、ガスケットのスライド方向と一致する。ガスケットがシリンジ３１の基端側へ移動されると、シリンジ３１の内部空間が負圧となって、取付部３３から気体又は液体が内部空間へ吸引される。
【００６５】
なお、注射筒１５は吸引具の一例であって、マイクロポンプなどの他の吸引具が用いられてもよいが、コストや廃棄の観点からは、吸引具としてディスポーザブルの注射筒１５が好ましい。また、注射針１２と注射筒１５との接続は特に限定されず、本実施形態に示されるようにチューブ１４を介して接続されても、注射筒１５に注射針１２が直接に接続されてもよい。また、注射筒１５が用いられずに、チューブ１４に対して口などから吸引圧が付与されてもよい。
【００６６】
凍結保存すべき細胞４１は培養液４２中に浮遊している。培養液４２は、培地皿などの容器に保持されているが、図９〜図１４では容器が省略されて複数個の細胞４１及び培養液４２の一部のみが示されている。培養液４２中には複数個の細胞４１が浮遊しており、これら細胞４１は、同一個体から採取された単一種類のものである。
【００６７】
培養液４２は、細胞４１を浮遊させるに適した液体であり、細胞４１の種類及び目的により選択され、例えば、精子細胞や卵母細胞、初期胚を培養する場合には、ＴＣＭ−１９９培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地などが挙げられる。また、ヒトの体外受精を目的とする培地として、ＨＵＣＵＭ培地（ニプロ社製）が挙げられる。ウシの体外受精を目的とする培地として、ＴＣＭ−１９９培地、ＳＯＦ培地、ＣＲ１培地、ＫＳＯＭ培地、ＩＶＦ１００培地、ＩＶＦ１１０Ｓ培地、ＩＶＭＤ１０１培地、ＩＶＤ１０１培地（機能性ペプチド研社製）が挙げられる。ブタの体外受精を目的とする培地として、ＮＣＳＵ培地、ＰＺＭ−５培地（機能性ペプチド研社製）が挙げられる。
【００６８】
図９に示されるように、第１ステップ（Ｓ１１）において、細胞用デバイス１０の注射針１２を片手で持って操作し、中空糸１１の第２端２２を培養液４２中に挿入する。そして、他方の手で注射筒１５を操作してプランジャ３２をシリンジ３１から引き出し、中空糸１１内に微量の培養液４２を吸引する。
【００６９】
つづいて、図１０に示されるように、注射針１２を操作して中空糸１１の第２端２２を培養液４２から取り出し、再び注射筒１５を操作して微量の空気を中空糸１１の内部空間へ吸引する。これにより、中空糸１１に吸引された微量の培養液４２は、中空糸１１の内部空間を注射針１２側へ若干移動する。
【００７０】
つづいて、図１１に示されるように、注射針１２を操作して中空糸１１の第２端２２を再び培養液４２中に挿入し、顕微鏡を用いて培養液４２中の細胞４１を確認しながら、中空糸１１の第２端２２を細胞４１に近接させる。そして、注射筒１５を操作して、中空糸１１の内部空間へ細胞４１を培養液４２と共に吸引する。これにより、中空糸１１の内部空間において、細胞４１及び培養液４２が存在する液体層４４より第１端２１側に、微量の気体層４５が形成される。つまり、中空糸１１の内部空間には、第１端２１側から第２端２２側へ向かって順次、培養液４２のみの層、気体層４５、細胞４１及び培養液４２を含む液体層４４がそれぞれ形成される。
【００７１】
つづいて、図１２に示されるように、中空糸１１の第２端２２を培養液４２から取り出さずに、第２端２２を他の細胞４１に近接させ、注射筒１５を操作して、中空糸１１の内部空間へ他の細胞４１を培養液４２と共に吸引する。中空糸１１の内部空間へ吸引する細胞４１の個数は特に限定されないが、本実施形態では、３個の細胞４１が培養液４２とともに中空糸１１の内部空間へ吸引されて液体層４４が形成されている。
【００７２】
中空糸１１の内部空間へ３個の細胞４１を吸引した後、図１３に示されるように、注射針１２を操作して中空糸１１の第２端２２を培養液４２から取り出し、注射筒１５を操作して、微量の空気を中空糸１１の内部空間へ吸引する。これにより、中空糸１１内の液体層４４及び気体層４５は、中空糸１１の内部空間を注射針１２側へ若干移動する。
【００７３】
つづいて、図１４に示されるように、注射針１２を操作して中空糸１１の第２端２２を再び培養液４２中に挿入し、注射筒１５を操作して、中空糸１１の内部空間へ培養液４２を吸引する。これにより、液体層４４に対して第２端２２側に、微量の気体層４６が形成される。
【００７４】
第２ステップ（Ｓ１２）において、図１５に示されるように、内部空間に細胞４１及び培養液４２を内包する中空糸１１をガラス化溶液４３に浸す。前述されたように、中空糸１１の孔は、細胞４１を通過させないが、培養液４２やガラス化溶液４３を通過させるので、中空糸１１の内部空間に細胞４１が内包された状態が維持されながら、中空糸１１の内部空間の培養液４２や細胞４１の細胞内液などがガラス化溶液４３に置換される。
【００７５】
また、中空糸１１内の培養液４２をガラス化溶液４３に置換する際に、細胞４１に対して緩慢な条件を選択したい場合には、ガラス化溶液４３として、培養液４２が適度な濃度勾配で混合された複数種のものが用いられる。このような濃度勾配は、例えば２〜５種類に設定される。複数種のガラス化溶液４３が用いられる場合には、予め調整された各ガラス化溶液４３が準備されており、図１５に示されるようにして、複数種のガラス化溶液４３に中空糸１１が順次浸漬される。
【００７６】
なお、細胞の凍結保存方法として、高濃度の凍害保護液中での急速冷凍と、低濃度の凍害保護液での通常冷凍とが挙げられる。高濃度の凍害保護液中での急速冷凍は、ガラス化とも称され、また、凍害保護液はガラス化溶液とも称される。細胞内保護タイプのガラス化溶液として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有液、エチレングリコール含有液、プロパンジオール含有液などが挙げられる。細胞外保護タイプのガラス化溶液として、シュークロース含有液、トレハロース含有液、フィルコールコンレイ溶液が挙げられる。
【００７７】
図１６に示されるように、第３ステップ（Ｓ１３）において、細胞４１を内包する中空糸１１を注射針１２から分離する。この分離は、中空糸１１を、細胞４１が含まれる液体層４４及び気体層４５より第１端２１側において、鋏などで切断することによって行う。これにより、細胞用デバイス１０から、細胞４１及びガラス化溶液４３を内包する中空糸１１が分離される。
【００７８】
図には示されていないが、第４ステップ（Ｓ１４）において、細胞用デバイス１０から分離された中空糸１１を液体窒素又は液体ヘリウムに投入して冷却する。これにより、中空糸１１の内部空間に内包された細胞４１がガラス化される。そして、ガラス化された細胞４１を含有する中空糸１１は、適当な容器内に投入してフリーザ内に保存する。
【００７９】
なお、前述のように中空糸１１の内部空間に内包されて凍結保存された細胞４１は、中空糸１１と共に加温液に浸すことにより解凍される。解凍を終えた後、中空糸１１の第１端２１又は第２端２２から内部空間へ排出圧を付与すると、中空糸１１の内部空間から細胞４１が外部へ排出される。また、中空糸１１の内部空間に細胞４１を内包させた状態で培養を行うのであれば、解凍後に、細胞４１を内包する中空糸１１を所望の培地中に投入すればよい。
【００８０】
［本実施形態の作用効果］
本実施形態に係る細胞用デバイス１０及び細胞凍結保存方法によれば、各々の内部空間が流路として連続されて中空糸１１と注射針１２とが接続されているので、注射筒１５により流路に吸引圧を付与すると、中空糸１１の内部空間へ細胞４１を取り込むことができる。この中空糸１１の孔は、細胞４１を通過させないが、培養液４２やガラス化溶液４３などを通過させるので、中空糸１１の内部空間に細胞４１が内包された状態を維持しながら、中空糸１１の内部空間の培養液４２や細胞４１の細胞内液などをガラス化溶液４３に置換することができる。
【００８１】
また、使用に際して脱抜可能な芯材１３が中空糸１１に挿通されているので、使用までの間においては、芯材１３によって中空糸１１が支持される。これにより、中空糸１１が他の部材に接触したりして外力が加わって、中空糸１１が折れ曲がることが防止される。
【００８２】
また、芯材１３は、中空糸１１の両端である第１端２１及び第２端２２から突出されるので、中空糸１１の両端が芯材１３によって支持され、中空糸１１の両端の破損が防止される。
【００８３】
また、芯材１３は、中空糸１１の第１端２１に当接する段差部２６を有するので、中空糸１１の第１端２１側から芯材１３を挿入すると、芯材１３の段差部３６が中空糸１１の第１端２１と当接して、芯材１３の挿入限界が決定される。また、芯材１３の脱抜が、第１端２１側から引き抜く向きに限定されるので、中空糸１１の第１端２１側を鉛直上向きにしていれば、自重によって芯材１３が中空糸１１から脱落することがない。
【００８４】
また、本実施形態に係る細胞用デバイス１０の製造方法によれば、注射針１２に挿通された芯材１３の小径部２４が、注射針１２へ挿入される中空糸１１のガイドとして機能する。また、注射針１２内に位置決めされた芯材１３の段差部３６が、注射針１２に挿入された中空糸１１の第１端２１と当接して、注射針１２へ中空糸１１を挿入する位置が決定されるので、芯材１３が、注射針１２へ挿入される中空糸１１の第１端２１を位置決めする治具として機能するとともに、製造後においては、芯材１３により中空糸１１が支持されて、中空糸１１の折れ曲がりや破損が防止される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、本発明の実施形態にかかる細胞用デバイス１０の全体構成を示す斜視図である。
【図２】図２は、中空糸１１、注射針１２及び芯材１３の分解斜視図である。
【図３】図３は、芯材１３の全体構成を示す斜視図である。
【図４】図４は、細胞用デバイス１０の製造方法を説明するための断面図である。
【図５】図５は、細胞用デバイス１０の製造方法を説明するための断面図である。
【図６】図６は、細胞用デバイス１０の製造方法を説明するための断面図である。
【図７】図７は、細胞用デバイス１０の製造方法を説明するための断面図である。
【図８】図８は、細胞用デバイス１０にチューブ１４を介して注射筒１５が接続された状態を示す斜視図である。
【図９】図９は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。
【図１０】図１０は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。
【図１１】図１１は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。
【図１２】図１２は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。
【図１３】図１３は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。
【図１４】図１４は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。
【図１５】図１５は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。
【図１６】図１６は、細胞用デバイス１０を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。
【符号の説明】
【００８６】
１０・・・細胞用デバイス
１１・・・中空糸
１２・・・注射針（管体）
１３・・・芯材
２１・・・第１端
２４・・・小径部（芯部）
２６・・・段差部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2010148457.tif 000007
【図６】
2010148457.tif 000008
【図７】
2010148457.tif 000009
【図８】
2010148457.tif 000010
【図９】
2010148457.tif 000011
【図１０】
2010148457.tif 000012
【図１１】
2010148457.tif 000013
【図１２】
2010148457.tif 000014
【図１３】
2010148457.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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