(57)【要約】【課題】細胞のプロモーター活性に影響されずに、受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができる受容体発現量解析方法等を提供することを課題とする。【解決手段】本実施例において、ルシフェラーゼを含む細胞を作製し、作製した細胞にルシフェリンを添加し、ルシフェリンが添加された後の細胞にドーパミンを添加し、ドーパミンが添加された後の細胞の発光量を測定し、測定した発光量に基づいて細胞内におけるＡＴＰの濃度を解析し、解析したＡＴＰの濃度に基づいてＤ２受容体の発現量を解析する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において受容体の発現量を解析する受容体発現量解析方法であって、
ＡＴＰ依存性のレポータタンパク質を含む前記細胞を作製する作製工程と、
前記作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から、発光させるための所定の処置を行う発光処置工程と、
前記発光処置工程が行われた後の前記細胞に当該細胞外から所定の受容体結合物質を添加する物質添加工程と、
前記物質添加工程が行われた後の前記細胞の発光量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定した前記発光量に基づいて前記細胞内における前記ＡＴＰの濃度を解析する濃度解析工程と、
前記濃度解析工程で解析した前記ＡＴＰの濃度に基づいて前記受容体の発現量を解析する発現量解析工程と、
を含むことを特徴とする受容体発現量解析方法。
【請求項２】
前記作製工程において、前記レポータタンパク質は前記ＡＴＰ依存性の発光タンパク質であること、
を特徴とする請求項１に記載の受容体発現量解析方法。
【請求項３】
前記発光タンパク質は前記細胞内の前記ＡＴＰと相互作用して発光するものであること、
を特徴とする請求項２に記載の受容体発現量解析方法。
【請求項４】
前記発光タンパク質はホタルのルシフェラーゼまたはヒカリコメツキのルシフェラーゼであること、
を特徴とする請求項２または３に記載の受容体発現量解析方法。
【請求項５】
前記作製工程において、前記細胞は前記受容体を含有するものであること、
を特徴とする請求項１から４のいずれか１つに記載の受容体発現量解析方法。
【請求項６】
前記作製工程において、前記細胞は前記受容体の遺伝子が導入されたものであること、
を特徴とする請求項１から４のいずれか１つに記載の受容体発現量解析方法。
【請求項７】
前記測定工程は、前記ＡＴＰ依存性の発光標識の光子量を測定する光子量測定工程をさらに含むこと、
を特徴とする請求項１から６のいずれか１つに記載の受容体発現量解析方法。
【請求項８】
前記測定工程は、前記ＡＴＰ依存性の発光標識を撮像する撮像工程をさらに含むこと、
を特徴とする請求項１から６のいずれか１つに記載の受容体発現量解析方法。
【請求項９】
前記撮像工程は、複数の異なる前記細胞に対して同時に実行され、
前記濃度解析工程は、前記撮像工程で撮像した複数の前記発光画像を前記細胞ごとに照合する照合工程をさらに含むこと、
を特徴とする請求項８に記載の受容体発現量解析方法。
【請求項１０】
前記測定工程は繰り返し実行されること、
を特徴とする請求項１から９のいずれか１つに記載の受容体発現量解析方法。
【請求項１１】
前記受容体はＤ２受容体であること、
を特徴とする請求項１から１０のいずれか１つに記載の受容体発現量解析方法。
【請求項１２】
前記物質添加工程において、前記受容体結合物質はドーパミンであること、
を特徴とする請求項１１に記載の受容体発現量解析方法。
【請求項１３】
ＡＴＰ依存性の発光タンパク質であって、
受容体の発現量を解析するためのものであること、
を特徴とする発光タンパク質。
【請求項１４】
ＡＴＰと相互作用して発光するものであること、
を特徴とする請求項１３に記載の発光タンパク質。
【請求項１５】
前記受容体はＤ２受容体であること、
を特徴とする請求項１３または１４に記載の発光タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内のＡＴＰの濃度を非侵襲的に解析することにより、例えばＤ２受容体などの受容体（受容体遺伝子）の発現量を解析する受容体発現量解析方法および受容体の発現量を解析するための発光タンパク質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多くのホルモンや神経伝達物質は、Ｇタンパク質共役型受容体に働き、細胞内セカンドメッセンジャーを介して様々な細胞活動を引き起こしている。Ｇタンパク質共役型受容体に働く神経伝達物質は、ヒトの情動や気分、依存、認知、学習、記憶などの広範囲に亘る脳機能の調節に関わっており、なかでも、モノアミンおよびその受容体は、躁うつ病や統合失調症、気分障害、自閉症、注意欠陥／多動性障害などの精神疾患に対する治療の標的とされている。このような脳の高次機能は、脳内の伝達物質およびその受容体の時間的および空間的な濃度分布によって制御されている。したがって、特定の情動活動に関する情報伝達機構を解析するにあたって、脳内のＧタンパク質共役型受容体の時間的および空間的な変化をリアルタイムに捉えることが必要である。
【０００３】
従来、Ｇタンパク質共役型受容体の量や分布は、放射線ラベルした化合物を用いて測定されている。これは、受容体に対するリガンドを放射線ラベルして、細胞や組織、個体またはこれらの粗精製画分に存在する受容体に対して標識リガンドと被験化学物質とを競合的に結合させた後、結合および遊離したリガンド量を測定することにより被験化学物質と受容体との結合を知る方法である。さらに、近年、新たな受容体検出方法が見出されてきた。例えば、Ｂｅｒｔｒａｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚらは、ドーパミン受容体のサブタイプであるＤ１およびＤ２受容体遺伝子のプロモーター領域の下流に蛍光タンパク質であるＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子を繋いだトランスジェニックマウスを作製して、当該トランスジェニックマウスの細胞もしくは組織を蛍光観察することを開示している（非特許文献１参照）。このトランスジェニックマウスでは、Ｄ１またはＤ２受容体遺伝子のプロモーターが働いている細胞、すなわちＤ１またはＤ２受容体が発現している細胞において蛍光タンパク質が発現しているので、細胞もしくは組織を蛍光観察することでＤ１またはＤ２受容体が発現している細胞を観察できることが明らかにされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｅｒｔｒａｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｊ，  Ｂｏｓｃｈ  Ｃ，  Ｍａｒｏｔｅａｕｘ  Ｍ，  Ｍａｔａｍａｌｅｓ  Ｍ，  Ｈｅｒｖｅ  Ｄ，  Ｖａｌｊｅｎｔ  Ｅ，  Ｇｉｒａｕｌｔ  ＪＡ．，  “Ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｄ１  ａｎｄ  Ｄ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｔｒｉａｔａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｏｃａｉｎｅ  ａｎｄ  ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ．”，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．２８，  Ｎｏ．２２，  ｐｐ５６７１−５６８５，  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、放射性ラベルしたリガンドを用いた従来技術の受容体の発現・分布解析方法では、被験化学物質がアゴニストなのかアンタゴニストであるのかは判別できない上、標識リガンドの検出時における解像度が悪いため、受容体の発現量や分布・機能状態（応答）を正確には示せていない、という問題点があった。
また、受容体遺伝子のプロモーターに蛍光タンパク質を繋いだプローブを用いた従来技術の受容体の発現・分布解析方法では、プロモーター活性と遺伝子発現量が必ずしも一致しないため、受容体の発現量や分布・機能状態（応答）を正確には示せていない、という問題点があった。
【０００６】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、細胞のプロモーター活性に影響されずに、受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができる受容体発現量解析方法および受容体の発現量を解析するための発光タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、細胞において受容体の発現量を解析する受容体発現量解析方法であって、ＡＴＰ依存性のレポータタンパク質を含む前記細胞を作製する作製工程と、前記作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から、発光させるための所定の処置を行う発光処置工程と、前記発光処置工程が行われた後の前記細胞に当該細胞外から所定の受容体結合物質を添加する物質添加工程と、前記物質添加工程が行われた後の前記細胞の発光量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定した前記発光量に基づいて前記細胞内における前記ＡＴＰの濃度を解析する濃度解析工程と、前記濃度解析工程で解析した前記ＡＴＰの濃度に基づいて前記受容体の発現量を解析する発現量解析工程と、を含むことを特徴とする。ここで、本発明において、レポータタンパク質とは、蛍光タンパク質や発光タンパク質を包含するものである。また、発光タンパク質とは、具体的には生物発光タンパク質などである。また、発光させるための所定の処置とは、例えば発光基質を添加することや励起光を照射することなどである。
【０００８】
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記作製工程において、前記レポータタンパク質は前記ＡＴＰ依存性の発光タンパク質であること、を特徴とする。
【０００９】
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記発光タンパク質は前記細胞内の前記ＡＴＰと相互作用して発光するものであること、を特徴とする。
【００１０】
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記発光タンパク質はホタルのルシフェラーゼまたはヒカリコメツキのルシフェラーゼであること、を特徴とする。
【００１１】
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記作製工程において、前記細胞は前記受容体を含有するものであること、を特徴とする。
【００１２】
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記作製工程において、前記細胞は前記受容体の遺伝子が導入されたものであること、を特徴とする。
【００１３】
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記測定工程は、前記ＡＴＰ依存性の発光標識の光子量を測定する光子量測定工程をさらに含むこと、を特徴とする。
【００１４】
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記測定工程は、前記ＡＴＰ依存性の発光標識を撮像する撮像工程をさらに含むこと、を特徴とする。
【００１５】
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記撮像工程は、複数の異なる前記細胞に対して同時に実行され、前記濃度解析工程は、前記撮像工程で撮像した複数の前記発光画像を前記細胞ごとに照合する照合工程をさらに含むこと、を特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記測定工程は繰り返し実行されること、を特徴とする。
【００１７】
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記受容体はＤ２受容体であること、を特徴とする。
【００１８】
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記物質添加工程において、前記受容体結合物質はドーパミンであること、を特徴とする。
【００１９】
また、本発明は発光タンパク質に関するものであり、本発明にかかる発光タンパク質は、ＡＴＰ依存性の発光タンパク質であって、受容体の発現量を解析するためのものであること、を特徴とする。
【００２０】
また、本発明にかかる発光タンパク質は、前記に記載の発光タンパク質において、ＡＴＰと相互作用して発光するものであること、を特徴とする。
【００２１】
また、本発明にかかる発光タンパク質は、前記に記載の発光タンパク質において、前記受容体はＤ２受容体であること、を特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
この発明によれば、ＡＴＰ依存性のレポータタンパク質を含む細胞を作製し、作製した細胞に当該細胞外から、発光させるための所定の処置を行い、当該処置が行われた後の細胞に当該細胞外から所定の受容体結合物質を添加し、当該添加が行われた後の細胞の発光量を測定し、測定した発光量に基づいて細胞内におけるＡＴＰの濃度を解析し、解析したＡＴＰの濃度に基づいて受容体の発現量を解析するので、細胞のプロモーター活性に影響されずに、受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができるという効果を奏する。
【００２３】
この発明によれば、レポータタンパク質はＡＴＰ依存性の発光タンパク質であるので、生物発光によるＡＴＰ検出原理を利用して受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができるという効果を奏する。
【００２４】
この発明によれば、発光タンパク質は細胞内のＡＴＰと相互作用して発光するものであるので、ＡＴＰの存在下で相互作用が強化された発光によりＡＴＰ濃度を検出することができるという効果を奏する。
【００２５】
この発明によれば、発光タンパク質はホタルのルシフェラーゼまたはヒカリコメツキのルシフェラーゼであるので、発光量を測ればＡＴＰ濃度を算出することができるという効果を奏する。
【００２６】
この発明によれば、細胞は受容体を含有するものであるので、解析対象となる受容体を人工的に含めた扱い易い細胞を用いて実験をやり易くすることができるという効果を奏する。
【００２７】
この発明によれば、細胞は受容体の遺伝子が導入されたものであるので、解析対象となる受容体を人工的に含めた扱い易い細胞を用いて実験をやり易くすることができる他、自然に近い応答を得ることができるという効果を奏する。
【００２８】
この発明によれば、ＡＴＰ依存性の発光標識の光子量を測定するので、フォトンカウンティングの技術を利用して細胞全体または細胞集団全体からの発光量を得ることができるという効果を奏する。
【００２９】
この発明によれば、ＡＴＰ依存性の発光標識を撮像するので、発光顕微鏡を利用して個々の細胞からの発光量を得ることができるという効果を奏する。
【００３０】
この発明によれば、撮像を複数の異なる細胞に対して同時に実行し、撮像した複数の発光画像を細胞ごとに照合するので、細胞一つ一つからの発光量を個別に且つ同時に得ることができるという効果を奏する。
【００３１】
この発明によれば、発光量の測定を繰り返し実行するので、発光量の経時変化を観察することができるという効果を奏する。
【００３２】
この発明によれば、受容体はＤ２受容体であるので、Ｄ２受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてＤ２受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができるという効果を奏する。
【００３３】
この発明によれば、受容体結合物質はドーパミンであるので、Ｄ２受容体の活性を観察することができるという効果を奏する。
【００３４】
この発明によれば、発光タンパク質はＡＴＰ依存性であって受容体の発現量を解析するためのものであるので、当該発光タンパク質を用いれば、細胞のプロモーター活性に影響されずに、受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができるという効果を奏する。
【００３５】
この発明によれば、発光タンパク質はＡＴＰと相互作用して発光するものであるので、当該発光タンパク質を用いれば、ＡＴＰの存在下で相互作用が強化された発光によりＡＴＰ濃度を検出することができるという効果を奏する。
【００３６】
この発明によれば、発光タンパク質はＤ２受容体の発現量を解析するためのものであるので、当該発光タンパク質を用いれば、Ｄ２受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてＤ２受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。
【図２】図２は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【図３】図３は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【図４】図４は、発光観察システム１００の画像解析装置１１０の構成の一例を示すブロック図である。
【図５】図５は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を用いたＡＴＰの検出原理を示す図である。
【図６】図６は、ルミノメーターによって測定された、ホタルルシフェラーゼおよびＤ１受容体またはＤ２受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞におけるドーパミン刺激によるルシフェラーゼの発光強度の経時変化のグラフを示す図である。
【図７】図７は、ホタルルシフェラーゼおよびＤ２受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むドーパミン刺激前の発光画像を示す図である。
【図８】図８は、ホタルルシフェラーゼおよびＤ２受容体が導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むドーパミン刺激１０分後の発光画像を示す図である。
【図９】図９は、ルミノメーターによって測定された、選択された細胞におけるドーパミン刺激によるルシフェラーゼの発光強度の経時変化のグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下に、本発明にかかる受容体発現量解析方法および受容体の発現量を解析するための発光タンパク質の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、本実施の形態により本発明が限定されるものではない。ここで、本実施の形態では発光タンパク質（具体的には生物発光タンパク質）を用いてＤ２受容体の発現量を解析する場合を一例として説明するが、蛍光タンパク質や他の受容体に対しても同様に実施することができる。
【００３９】
［１．構成］
まず、本発明にかかる受容体発現量解析方法で用いる発光観察システム１００の構成について、図１、図２および図３を参照して説明する。図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。
【００４０】
図１に示すように、発光観察システム１００は、細胞１０２を収納した容器１０３（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３を配置するステージ１０４と、微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット１０６と、画像解析装置１１０と、で構成されている。なお、発光画像撮像ユニット１０６をステージ１０４の下側に配置してもよい。これにより、カバー（図示せず）の開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断でき、その結果、発光画像のＳ／Ｎ比を増すことができる。発光画像撮像ユニット１０６は、レーザー走査式の光学系であってもよい。
【００４１】
細胞１０２は、例えば、ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）濃度に依存して発光するよう発光標識された生きた細胞である。ここで、ＡＴＰ濃度に依存して発光するタンパク質（発光タンパク質）として、ホタルのルシフェラーゼの他に、例えばヒカリコメツキのルシフェラーゼやこれらの改変体を用いてもよい。また、ここで、当該発光タンパク質が発現されるよう構成した、当該発光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞１０２に導入することにより、当該発光タンパク質が細胞１０２内で発現されるよう構成してもよい。なお、細胞１０２には、当該細胞１０２外から所定の発光基質（例えばルシフェリンなど）および所定の刺激（例えば薬物刺激など）が与えられる。
【００４２】
発光画像撮像ユニット１０６は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、細胞１０２の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６は、図示の如く、対物レンズ１０６ａと、ダイクロイックミラー１０６ｂと、ＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）カメラ１０６ｃと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されている。対物レンズ１０６ａは、具体的には（開口数／倍率）２の値が０．０１以上のものが好ましい。ダイクロイックミラー１０６ｂは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６ｃは、対物レンズ１０６ａ、ダイクロイックミラー１０６ｂおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、画像解析装置１１０と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、当該撮像範囲中に含まれる複数の細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ１０６ｆは、対物レンズ１０６ａおよびダイクロイックミラー１０６ｂを介して当該結像レンズ１０６ｆに入射した像（具体的には細胞１０２を含む像）を結像する。なお、図１では、ダイクロイックミラー１０６ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６は、対物レンズ１０６ａ、１台のＣＣＤカメラ１０６ｃおよび結像レンズ１０６ｆで構成されてもよい。
【００４３】
ここで、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット１０６は、図２に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、スプリットイメージユニット１０６ｄと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、スプリットイメージユニット１０６ｄおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像（スプリットイメージ）および明視野像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット１０６ｄは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー１０６ｂと同様、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【００４４】
また、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合（つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット１０６は、図３に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、フィルターホイール１０６ｅと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、フィルターホイール１０６ｅおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール１０６ｅは、細胞１０２から発せられた発光をフィルタ交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【００４５】
図１に戻り、画像解析装置１１０は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、画像解析装置１１０は、図４に示すように、大別して、制御部１１２と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４と、記憶部１１６と、通信インターフェース部１１８と、入出力インターフェース部１２０と、入力装置１２２と、出力装置１２４と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。
【００４６】
記憶部１１６は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭ（ｒａｎｄｏｍ  ａｃｃｅｓｓ  ｍｅｍｏｒｙ）やＲＯＭ（ｒｅａｄ−ｏｎｌｙ  ｍｅｍｏｒｙ）等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部１１６は制御部１１２の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。通信インターフェース部１１８は、画像解析装置１１０と、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。入出力インターフェース部１２０は、入力装置１２２や出力装置１２４に接続する。ここで、出力装置１２４には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力装置１２４をモニターとして記載する場合がある。）。また、入力装置１２２には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。
【００４７】
制御部１１２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１１２は、大別して、発光画像撮像指示部１１２ａと、発光画像取得部１１２ｂと、画像解析部１１２ｃと、解析結果出力部１１２ｄと、で構成されている。
【００４８】
発光画像撮像指示部１１２ａは、通信インターフェース部１１８を介して、ＣＣＤカメラ１０６ｃへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部１１２ｂは、ＣＣＤカメラ１０６ｃで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１８を介して取得する。制御部１１２は、発光画像撮像指示部１１２ａを制御して、ＣＣＤカメラ１０６ｃに細胞１０２の発光画像および明視野画像を繰り返し撮像させ、発光画像取得部１１２ｂを制御して、撮像した発光画像および明視野画像を、撮像される度に又は全撮像が終了後纏めて取得する。
【００４９】
画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂで取得した複数の発光画像に基づいて、細胞１０２から発せられる発光の発光強度を経時的に測定する。解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃでの解析結果を出力装置１２４に出力する。具体的には、解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃで得られた、細胞１０２から発せられる発光の発光強度に関する時系列データを、グラフ化して出力装置１２４に表示する。
【００５０】
［２．実施例］
本実施の形態における実施例について、以下に図５〜図９を用いて説明する。ここで、図５はルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を用いたＡＴＰの検出原理を示す図である。
【００５１】
ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応において、ルシフェリンとＡＴＰが反応してアデニル酸ルシフェリンとなり、当該アデニル酸ルシフェリンと酸素がルシフェラーゼの存在下で酸化的脱炭酸反応により分解されるとオキシルシフェリン、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）および二酸化炭素が生じる。この反応の過程で得られるエネルギーの一部が発光する。この発光を定量することでＡＴＰの定量を行うことが出来る。
【００５２】
本実施例では、上述したＡＴＰの検出原理を用いてＤ２受容体の発現量を解析する解析方法について説明する。本実施例における実験の流れ（手順）は、以下の通りである。
【００５３】
［前準備：ヒトＤ１受容体遺伝子およびＤ２受容体遺伝子のクローニング］
［手順１］
ヒトＤ１受容体遺伝子およびＤ２受容体遺伝子の作製のために、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いる合成オリゴＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を以下に示す配列で調整した。
［ヒトＤ１受容体遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＨＵ＿Ｄ１Ｒ＿Ｆｗ（配列番号１）：５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣ−３’
ＨＵ＿Ｄ１Ｒ＿Ｒｖ（配列番号２）：５’−ＴＣＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＡＴ−３’
［ヒトＤ２受容体遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＨＵ＿Ｄ２Ｒ＿Ｆｗ（配列番号３）：５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＧＴＣＣＴＧＧ−３’
ＨＵ＿Ｄ２Ｒ＿Ｒｖ（配列番号４）：５’−ＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＴ−３’
【００５４】
［手順２］
ヒト脳ｃＤＮＡライブラリ（タカラバイオ社製）を鋳型として、Ｄ１受容体遺伝子（ヒトのＤ１受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む。）およびＤ２受容体遺伝子（ヒトのＤ２受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む。）を、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。
【００５５】
［手順３］
ＰＣＲで増幅させたＤ１受容体遺伝子およびＤ２受容体遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングした後、作製したＤＮＡの配列をＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【００５６】
［手順４］
それぞれの遺伝子を哺乳類細胞の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）へ組み込み、ヒトＤ１受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ１ＲおよびヒトＤ２受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ２Ｒを作製した。
【００５７】
［実験その１：Ｄ２受容体を発現させたＨＥＫ２９３細胞でのドーパミン刺激による発光量測定］
［手順１：ＨＥＫ２９３細胞の培養］
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）社より入手したＨＥＫ２９３細胞を、５％  ＣＯ２インキュベーター内で、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍおよび１×  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓを添加したＥａｒｌｅ'ｓ  ＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養した。
【００５８】
［手順２：ルシフェラーゼ発現プラスミドの導入］
ＨＥＫ２９３細胞を、直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに２×１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％  ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養し、ルシフェラーゼ発現用プラスミドｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（プロメガ社製）とヒトＤ１受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ１ＲまたはヒトＤ２受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ２Ｒとを混合し、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（ロシュ社製）を用いてトランスフェクションを行い、５％  ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。なお、ヒトＤ１受容体のアミノ酸配列は具体的には配列番号５のアミノ酸配列であり、ヒトＤ２受容体のアミノ酸配列は具体的には配列番号６のアミノ酸配列である。また、ルシフェラーゼのアミノ酸配列は具体的には配列番号７のアミノ酸配列である。
【００５９】
［手順３：発光量の測定］
培地中にルシフェリン２ｍＭ（プロメガ社製）を加えて１時間静置してから、培養ディッシュを培養ディッシュ対応型ルミノメーターＫｒｏｎｏｓ（アトー社製）にセットし、３分間隔で発光量の測定を行った。発光量測定条件として、装置内温度は３６℃、各培養ディッシュの露出時間は１０秒とした。
【００６０】
［手順４：ドーパミン刺激による発光量の測定］
発光量測定開始から１時間後、ドーパミン（ＤＡ：最終濃度１０μＭ）で刺激を行い、引き続き発光量の経時的測定を行った。
【００６１】
［手順５：発光量の経時変化のグラフ表示］
測定した発光量（発光強度）の経時変化をグラフ（図６参照）で表示した。なお、図６において、Ｄ１Ｒに対応するグラフはＤ１受容体における発光強度の経時変化を示しており、Ｄ２Ｒに対応するグラフはＤ２受容体における発光強度の経時変化を示している。
【００６２】
［実験その１の結果］
以上の実験の結果、図６に示すように、Ｄ２受容体へのドーパミン刺激に対する細胞の応答の変化を検出することができた。一方、図６に示されているＤ１受容体へのドーパミン刺激に対する発光強度の変化を見ると、ドーパミン刺激に対する細胞の応答は見られなかった。このように、ルミノメーターを用いた発光量変化の解析で、細胞集団全体の応答をリアルタイムに観察することができ、Ｄ２受容体の発現量を詳細に研究することができた。
【００６３】
［実験その２：Ｄ２受容体を発現させたＨＥＫ２９３細胞でのドーパミン刺激による発光イメージング］
［手順１：ＨＥＫ２９３細胞の培養］
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）社より入手したＨＥＫ２９３細胞を、５％  ＣＯ２インキュベーター内で、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍおよび１×  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓを添加したＥａｒｌｅ'ｓ  ＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養した。
【００６４】
［手順２：ルシフェラーゼおよびドーパミン受容体発現プラスミドの導入］
ＨＥＫ２９３細胞を、直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに２×１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％  ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養し、ルシフェラーゼ発現用プラスミドｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（プロメガ社製）とヒトＤ２受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ２Ｒとを混合し、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（ロシュ社製）を用いてトランスフェクションを行い、５％  ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。なお、ヒトＤ２受容体のアミノ酸配列は具体的には配列番号６のアミノ酸配列である。また、ルシフェラーゼのアミノ酸配列は具体的には配列番号７のアミノ酸配列である。
【００６５】
［手順３：発光画像の撮像］
培地中にルシフェリン２ｍＭ（プロメガ社製）を加えて１時間静置してから、培養ディッシュを発光顕微鏡“ＬＶ（ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ）−２００”（オリンパス社製）にセットし、２０秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。発光観察条件として、装置内温度が３６℃、対物レンズの倍率は６０倍、露出時間は１０秒、ビニングは１×１とした。ＣＣＤカメラ１０６ｃとしてＥＭ−ＣＣＤカメラｉＸｏｎ（アンドール社製）を用い、画像解析装置１１０として構成したパーソナルコンピュータに発光画像を取り込んだ。
【００６６】
［手順４：ドーパミン刺激による発光画像の撮像］
タイムラプス撮影開始から５分後、ドーパミン（ＤＡ：最終濃度１０μＭ）で刺激を行い、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。
【００６７】
［手順５：発光量の経時変化のグラフ表示］
ドーパミン刺激前に撮影した各々の発光画像（図７参照）に対して図示の如く複数のＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定し、またドーパミン刺激後に撮影した各々の発光画像（図８参照）に対して図示の如く複数のＲＯＩを指定した。指定した各ＲＯＩの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定し、当該測定した発光強度の経時変化をグラフ（図９参照）で表示した。発光画像の解析は、画像解析部１１２ｃとして機能するＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。なお、図９において、Ｃｅｌｌ１〜Ｃｅｌｌ５のそれぞれに対応する各グラフは、図７および図８における番号１〜番号５のそれぞれに対応する各ＲＯＩの発光強度の経時変化を示している。
【００６８】
［実験その２の結果］
以上の実験の結果、図７、図８および図９に示すように、Ｄ２受容体へのドーパミン刺激に対する細胞の応答の変化をシングルセルレベル（一細胞レベル）で検出することができた。また、図９に示されている個々の細胞における発光強度の変化を見ると、ドーパミン刺激に対する細胞間の応答に大きなばらつきがあることがわかった。ドーパミン受容体を介する細胞内情報伝達機構のこれまでの研究から、刺激されたドーパミン受容体の数あるいは分布が異なるとシグナルの意味が異なる、ということが明らかにされている。ルミノメーターを用いた従来の発光量変化の解析では、細胞集団全体の応答を観察することはできるが、個々の細胞の応答までを解析することはできなかった。ところが、発光顕微鏡“ＬＶ−２００”では、生体内の変化を一細胞毎にリアルタイムに観察することができ、組織または細胞集団におけるシグナルの働きを詳細に研究することができた。
【００６９】
［本実施例のまとめ］
以上、本実施例によれば、細胞の受容体遺伝子プロモーター活性に影響されず、細胞集団あるいは各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、細胞集団や個々の細胞においてＤ２受容体の発現量および分布を再現性良く経時的に観察することができた。
【００７０】
［３．他の実施の形態］
上述した実施の形態においては、主に、ホタルのルシフェラーゼ（配列番号７）をＡＴＰセンサータンパク質として説明を行ったが、本発明はこれに限られず、ホタルのルシフェラーゼに替えてヒカリコメツキのルシフェラーゼ（配列番号８）およびこれらの改変体を用いてもよい。
【００７１】
また、上述した実施の形態においては、主に、株化された細胞または細胞集団を用いて説明を行ったが、本発明はこれに限られず、個体由来の細胞および細胞集団、切片、組織、個体を用いてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
以上説明したように、本発明にかかる受容体発現量解析方法および発光タンパク質は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。
【符号の説明】
【００７３】
１００  発光観察システム
１０３  容器（シャーレ）
１０４  ステージ
１０６  発光画像撮像ユニット
１０６ａ  対物レンズ（発光観察用）
１０６ｂ  ダイクロイックミラー
１０６ｃ  ＣＣＤカメラ
１０６ｄ  スプリットイメージユニット
１０６ｅ  フィルターホイール
１０６ｆ  結像レンズ
１１０  画像解析装置
１１２  制御部
１１２ａ  発光画像撮像指示部
１１２ｂ  発光画像取得部
１１２ｃ  画像解析部
１１２ｄ  解析結果出力部
１１４  クロック発生部
１１６  記憶部
１１８  通信インターフェース部
１２０  入出力インターフェース部
１２２  入力装置
１２４  出力装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2010213661.tif 000009
【図９】
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【配列表】
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