(57)【要約】【課題】新たながんマーカーを提供すること。【解決手段】ＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を指標とする、がんの検出方法であって、上記がんが、前立腺がん、肺がん、胃がん、膀胱がん及び子宮がんからなる群より選ばれる、方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を指標とする、がんの検出方法であって、
前記がんが、前立腺がん、肺がん、胃がん、膀胱がん及び子宮がんからなる群より選ばれる、方法。
【請求項２】
がんが疑われる検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を測定する工程と、
前記ＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を、正常検体、及び、がん検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量と比較する工程と、
がんが疑われる検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量が、
（ｉ）正常検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量よりも低い、
（ｉｉ）がん検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量と同じレベル、又は、
（ｉ）及び（ｉｉ）の両方
に該当する場合に、当該がんが疑われる検体をがんと判定する工程と、
を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検体が、細胞又は組織片である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記がんが、前立腺がんである、請求項１〜３いずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＤＤ３を標的とするｓｉＲＮＡであって、
前記ｓｉＲＮＡが、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチド対からなる二本鎖ｓｉＲＮＡ。
（ａ）配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号３１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項６】
請求項５に記載のｓｉＲＮＡを有効成分とする、がん治療剤。
【請求項７】
前記がんが、前立腺がん、肺がん、胃がん、膀胱がん及び子宮がんからなる群より選ばれる、請求項６に記載のがん治療剤。
【請求項８】
前記がんが、前立腺がんである、請求項６に記載のがん治療剤。
【請求項９】
抗がん剤をさらに含む、請求項８に記載のがん治療剤。
【請求項１０】
前記抗がん剤が、シスプラチンである、請求項９に記載のがん治療剤。
【請求項１１】
抗アンドロゲン剤をさらに含む、請求項８〜１０いずれか一項に記載のがん治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんマーカー、及び、がんの治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺がんは、欧米において男性の罹患率が最も高いがんである。日本においても、食生活の欧米化及び人口の高齢化に伴い、前立腺がん患者数が年々増加している。前立腺がんにはアンドロゲン依存的腫瘍とアンドロゲン非依存的腫瘍が存在する。一般に前立腺癌細胞の増殖は、アンドロゲンにより刺激される。そのため、切除不能な進行前立腺がんの治療においては、アンドロゲンの産生及び機能を阻害するアンドロゲンブロック療法がしばしば行われる。前立腺がんは、初めは大部分がアンドロゲン依存的ながんであるためアンドロゲンブロック療法に反応することが多いが、アンドロゲン非依存腫瘍に進行すると、アンドロゲンブロック療法を施すことが出来ない上に良い治療方法が存在しない。そこでアンドロゲン非依存腫瘍に対する効果的治療が必要とされている。
【０００３】
ＢＭＣＣ１遺伝子は、千葉県がんセンターにおける研究プロジェクト「神経芽腫の腫瘍由来ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた腫瘍組織の網羅的遺伝子発現解析と、それを利用したがん抑制遺伝子、がん遺伝子、および予後決定因子の同定」の成果として明らかとなった新規遺伝子であり、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現が神経芽腫の予後と強い相関を示すことが報告されている（特許文献１及び非特許文献１）。しかしながら、ＢＭＣＣ１遺伝子と前立腺がんとの関与は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−０６１６７２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｃｈｉｄａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｖｏｌ．２５，ｐ１９３１−１９４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
がんに関与する遺伝子の分子機構を解明し、新たな機構に基づく治療薬を開発することができれば、がん診断、及び、がん治療の選択の幅を広げることができる。したがって、本発明の目的の一つは、新たながんマーカーを提供することである。本発明の別の目的は、新たながんの治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、がん組織における発現解析の実験結果から、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現が、これまでに知られていた神経系組織以外の組織にも発現しており、前立腺がん、肺がん、胃がん、膀胱がん及び子宮がんにおけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現が、正常検体よりも低下していることを見出した。また、ＤＤ３特異的なｓｉＲＮＡによってＤＤ３の発現抑制をすると、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現が亢進することを本発明者らは新たに見出した。これらの知見は、初期の前立腺がんにおいてＤＤ３の発現が亢進し、後期の前立腺がんにおいてＢＭＣＣ１の発現が抑制しているという知見と考え併せて、ＤＤ３がＢＭＣＣ１遺伝子の発現を抑制し、がんの進行を促進している可能性を示唆している。以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を指標とする、がんの検出方法であって、上記がんが、前立腺がん、肺がん、胃がん、膀胱がん及び子宮がんからなる群より選ばれる、方法を提供する。また、上記がんは、前立腺がんであることが好ましい。
【０００９】
また、上記の本発明のがんの検出方法は、がんが疑われる検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を測定する工程と、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を、正常検体、及び、がん検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量と比較する工程と、がんが疑われる検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量が、（ｉ）正常検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量よりも低い、（ｉｉ）がん検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量と同じレベル、又は、（ｉ）及び（ｉｉ）の両方に該当する場合に、当該がんが疑われる検体をがんと判定する工程と、を備えることを特徴とする。上記検体は、細胞又は組織片であることが好ましい。
【００１０】
本発明のがんの検出方法は、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現が、これまでに知られていた神経系組織以外の組織にも発現しており、前立腺がん、肺がん、胃がん、膀胱がん及び子宮がんにおけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現が、正常組織よりも低下しているという本願発明者が発見した知見に基づくものである。これによって、がんの検出方法のためのがんマーカーの提供が可能となる。
【００１１】
本発明は、ＤＤ３を標的とするｓｉＲＮＡであって、上記ｓｉＲＮＡが、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチド対からなる二本鎖ｓｉＲＮＡを提供する。
（ａ）配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号３１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド
【００１２】
本発明は、さらに、上記ｓｉＲＮＡを有効成分とする、がん治療剤を提供する。上記がんは、前立腺がん、肺がん、胃がん、膀胱がん及び子宮がんからなる群より選ばれることが好ましく、前立腺がんであることがより好ましい。
【００１３】
ＤＤ３は、前立腺がんのマーカーとして知られるｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡである。ＤＤ３は９番染色体のｑ２１．１３にコードされるが、興味深いことに、ＢＭＣＣ１遺伝子の第６イントロンに逆向きに挿入されていることから（図１）、本願発明者はＤＤ３がＢＭＣＣ１遺伝子の発現を抑制的に制御するという仮説を立て、本願の実施例において検証した。実際に、ＤＤ３特異的なｓｉＲＮＡによってＤＤ３の発現抑制をすると、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現が亢進すること、及び、がん細胞の増殖を抑制できることを、本願発明者は始めて見いだした。本発明は上記の知見に基づくものであり、本発明の治療剤によって、がんの進行遅延、症状改善等が期待できる。
【００１４】
本発明は、抗がん剤をさらに含む、がん治療剤を提供する。抗がん剤は、シスプラチンであることが好ましい。また、本発明は、抗アンドロゲン剤をさらに含む、がん治療剤を提供する。がんは、前立腺がんであることが好ましい。
【００１５】
本発明は、ＤＤ３の発現抑制に加えてシスプラチン処理及び／又はアンドロゲン除去を併用することによって、より効果的にがん細胞の増殖を抑制できることができるという知見に基づくものであり、本発明の治療剤によって、がんの進行遅延、症状改善等が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトのＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の染色体位置を模式的に示す図である。
【図２】ヒト正常組織におけるＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた結果を示す図である。
【図３】ヒト正常組織とがん組織のマッチペアにおけるＢＭＣＣ１遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた結果を示す図である。Ｎ：正常組織由来サンプル、Ｔ：腫瘍細胞組織由来サンプル、ＮＤ：評価せず。
【図４】前立腺がん細胞株におけるＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた結果を示す図である。
【図５】ＤＤ３  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の構造、及び、ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡの位置を模式的に示す図である。
【図６】ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡを導入した前立腺がん細胞株におけるＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた結果を示す図である。
【図７】ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡを導入したＬＮＣａＰ細胞におけるＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた結果を示す図（ａ）、及び、ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後の細胞を示す図（ｂ）である。
【図８】ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡを導入したＬＮＣａＰ細胞におけるＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた結果を示す図である。
【図９】ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のＬＮＣａＰ細胞におけるＢＭＣＣ１タンパク質の免疫染色像である。
【図１０】ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡを導入したＬＮＣａＰ細胞におけるＢＭＣＣ１タンパク質のウエスタンブロット像である。
【図１１】ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のＬＮＣａＰ細胞の相対的細胞増殖率を示す図である。
【図１２】シスプラチン存在下でのｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のＬＮＣａＰ細胞を示す図である。
【図１３】シスプラチン存在下でのｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のＬＮＣａＰ細胞の相対的細胞増殖率を示す図である。
【図１４】シスプラチン存在下でのｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のアポトーシス細胞を示す図である。
【図１５】シスプラチン存在下でのＬＮＣａＰ細胞の相対的細胞増殖率を示す図である。
【図１６】シスプラチン存在下でのｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のＬＮＣａＰ細胞の相対的細胞増殖率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１８】
（ＢＭＣＣ１遺伝子及びＤＤ３）
ＢＭＣＣ１遺伝子（ＢＣＨ  ｍｏｔｉｆ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  １）は、神経芽腫の予後決定に関与する遺伝子として本願発明者らが同定した遺伝子であり（特許文献１及び非特許文献１）、そのＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．は、ＡＢ０５０１９７である。ＢＭＣＣ１タンパク質は、３４０ｋＤａであり、Ｂｃｌ２／Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＢＮＩＰ２）及びＣｄｃ４２ＧＡＰホモロジードメイン（ＢＣＨドメイン）をＣ末端側に有している。図１は、ヒトのＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の染色体位置を模式的に示す図である。図１に示すとおり、ＢＭＣＣ１遺伝子は、ヒト９番染色体のｑ２１．１３に位置する。また、同じ染色体領域に、ＰＲＵＮＥ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ１３８８１８）が存在する。また、ＢＭＣＣ１遺伝子の第６イントロンに逆向きにＤＤ３遺伝子が挿入されていることを見いだした。すなわち、ＤＤ３遺伝子の配列は、ＢＭＣＣ１遺伝子の第６イントロンの一部に対して、完全に相補的であった。ＤＤ３遺伝子によりコードされるＤＤ３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１０３９０７）は、前立腺がん抗原（ＰＣＡ）とも呼ばれるｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）であり、前立腺がんのマーカーとして知られている。しかしながら、ＤＤ３の腫瘍発生メカニズムへの関与は明らかとなっていない。
【００１９】
本発明者らは、ＤＤ３遺伝子の配列がＢＭＣＣ１遺伝子の配列に相補的であること、及び、以下に示す実施例１及び２の結果から示唆された、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現とＤＤ３の発現が逆相関の傾向にあるという知見から、ＢＭＣＣ１の機能抑制機構の一つとして、ＤＤ３によるＢＭＣＣ１の発現抑制機構が存在するという仮説を考えた。以下に示す実施例３〜６により、この仮説をサポートする知見を得た。すなわち、ＤＤ３の発現抑制により、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現が亢進したことから、ＤＤ３がＢＭＣＣ１遺伝子発現を抑制的に制御していることが強く示唆された。また、ＤＤ３の発現抑制により、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現を亢進でき、がん細胞の増殖を抑制できることが明らかとなった。
【００２０】
前立腺がんは、初めは大部分がアンドロゲン依存的ながんであるためアンドロゲンブロック療法によって治癒することが多いが、その後に再発したものに関してはアンドロゲンブロック療法を施すことが出来ない上に、良い治療方法が存在しない。アンドロゲン依存的な前立腺がんの多くがアンドロゲンブロック療法で治癒することは、アンドロゲンによって誘導される遺伝子群が前立腺のがん化に関わることを示唆している。本発明において初めて明らかとなった、初期の前立腺がんにおいてＤＤ３の発現が亢進し、後期の前立腺がんにおいてＢＭＣＣ１の発現が抑制しているという知見は、ＤＤ３がＢＭＣＣ１遺伝子の発現を抑制し、がんの進行を促進している可能性を示唆している。したがって、ＤＤ３を特異的に発現抑制することにより、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現を亢進させることは、がん治療、がんの進行遅延という観点から効果が期待できる。また、以下の実施例７及び８に示す通り、ＤＤ３の発現抑制に加えてシスプラチン処理及び／又はアンドロゲン除去を併用することによって、より効果的にがん細胞の増殖を抑制できることが分かった。したがって、本発明の治療剤と、抗がん剤や抗アンドロゲン剤等を用いた他の治療法との併用が有効であることが示唆された。
【００２１】
（がんの検出方法）
本実施形態である、がんの検出方法について説明する。本実施形態のがんの検出方法は、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を指標とする。ＢＭＣＣ１遺伝子をがんマーカーとして用いるものであり、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現量が低いこととがんとの相関があるという本発明の知見に基づき、がん細胞又はがん組織を検出する。また、本実施形態のがんの検出方法は、がんが疑われる検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を測定する工程と、ＢＭＣＣ１遺伝子の発現量を、正常検体、及び、がん検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量と比較する工程と、がんが疑われる検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量が、（ｉ）正常検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量よりも低い、（ｉｉ）がん検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量と同じレベル、又は、（ｉ）及び（ｉｉ）の両方に該当する場合に、当該がんが疑われる検体をがんと判定する工程と、を備える。
【００２２】
好適な対象としては、ヒトが挙げられる。がんは、前立腺がん、肺がん、胃がん、膀胱がん及び子宮がんからなる群より選ばれることが好ましく、前立腺がんであることがより好ましい。検体は、検査対象のがんが発症する組織の細胞又は組織片であることが好ましい。
【００２３】
ここで、遺伝子の発現量とは、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量及び／又はその翻訳産物であるタンパク質の発現量を指す。ｍＲＮＡの発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、具体的には、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法等が挙げられる。タンパク質の発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨや、ベータアクチン等のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現量を用い、ＢＭＣＣ１遺伝子等の目的の遺伝子の発現量を標準化する。また、同一の対象から採取した複数のサンプル及び／又は同一のサンプルに由来するアリコットにおける目的遺伝子及び／又はコントロール遺伝子の発現量を測定し、それぞれの平均値から発現量を求めてもよい。これら方法を用いることによって、遺伝子発現を定量的に測定することが可能である。
【００２４】
ＢＭＣＣ１  ｍＲＮＡの検出に用いるプライマー及びプローブは、当業者にとって周知の方法により設計することができる。ＢＭＣＣ１  ｍＲＮＡの検出に用いるプライマーとしては、ＢＭＣＣ１（ＢＮＦ２／ＢＮＲ２）プライマーセット（配列番号１及び２）、ｋｉａａ０３６７Ｆ／Ｒプライマーセット（配列番号８及び９）等が例示できるが、これらに限定されない。また、ＢＭＣＣ１タンパク質の検出に用いる抗体、抗体断片等は当業者にとって周知の方法により調製することができる。利用可能な抗ＢＭＣＣ１抗体としては、ＢＭＣＣ１タンパク質の２０７４−２０９３番目の残基（アミノ酸配列：ＡＫＫＰＦＳＬＫＡＤＧＥＮＰＤＩＬＴＨＣ、アミノ酸一文字表記；配列番号２３）を含むエピトープに対して作製した抗体、ＢＭＣＣ１タンパク質の３０６８−３０８８番目の残基（アミノ酸配列：ＹＮＤＰＥＭＳＳＭＥＫＤＩＤＬＫＬＫＥＫＰ、アミノ酸一文字表記）を含むエピトープに対して作製した抗体、ＢＭＣＣ１タンパク質の１７３３−１７５３番目の残基（アミノ酸配列：ＫＳＥＮＩＹＤＹＬＤＳＳＥＰＡＥＮＥＮＫＳＮＰＦＣ、アミノ酸一文字表記）を含むエピトープに対して作製した抗体、市販の抗体等が好適に使用できるが、これらに限定されない。
【００２５】
正常検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量とは、単一又は複数の対象から得られたがん化していない複数の正常組織由来の検体（対照群）から得られた発現量の測定値を統計的に処理したものでもよく、また、がん検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量とは、単一又は複数のがん患者から得られた複数のがん組織由来の検体（疾患群）から得られた発現量の測定値を統計的に処理したものでもよい。がんの検出に関しては、具体的には、（ｉ）がんが疑われる検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量が、正常検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量よりも低い場合、及び／又は、対照群から得られた発現量との比較において、統計的に対照群の分布範囲よりも低い範囲に該当する場合に、がんが疑われる検体ががん検体であると判定することができる。また、（ｉｉ）がんが疑われる検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量が、がん検体におけるＢＭＣＣ１遺伝子の発現量と同じレベル、及び／又は、疾患群から得られた発現量との比較において、統計的に疾患群の分布範囲に該当する場合に、がんが疑われる検体ががん検体であると判定することができる。（ｉ）及び（ｉｉ）の両方に該当する場合も、がんが疑われる検体ががん検体であると判定することができる。
【００２６】
（がんの治療剤）
本実施形態である、ＤＤ３を標的とするｓｉＲＮＡは、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチド対からなる二本鎖ｓｉＲＮＡである。
（ａ）配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号３１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド
【００２７】
ここで、ｓｉＲＮＡとは、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡの長さは、一般的には１０〜３０塩基、好ましくは約１５〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基程度である。ｓｉＲＮＡは、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。
【００２８】
ｓｉＲＮＡを細胞に投与すると、ＲＮＡｉ効果によりＤＤ３の発現を特異的に抑制することができる。すなわち、ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。上記のように、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと相同な配列を有するｍＲＮＡを分解することにより、その標的となる遺伝子（本発明においては、ＤＤ３遺伝子）の発現を抑制することができる。このような現象をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）という。ＲＮＡｉ現象は、線虫、昆虫、原虫、ヒドラ、植物、脊椎動物（哺乳動物を含む）において見られる現象である。
【００２９】
また、別の実施形態においては、上記以外のＤＤ３に特異的なｓｉＲＮＡを用いてもよい。さらに、上記ｓｉＲＮＡを生成するようなｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）又はそれらを発現できる発現ベクターを用いることができる。ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはそれらの発現ベクターを細胞に投与すると、細胞内でｓｉＲＮＡが生成する。ＲＮＡ発現ベクターのプロモーターには、Ｕ６ＲＮＡまたはＨ１ＲＮＡの転写系であるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）のプロモーターを用いることができる。
【００３０】
さらに、別の実施形態においては、上記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、又は、修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）であってもよい。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、さらにはポリヌクレオチドアミドやオリゴヌクレオチドアミドの分解に抵抗性を有するもの等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００３１】
本実施形態であるがん治療剤は、上記のｓｉＲＮＡを有効成分とする。がん治療剤は、上記のｓｉＲＮＡのうち、単独又は２以上の組み合わせを含んでいてもよい。
【００３２】
本発明のがん治療剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００３３】
本発明のがん治療剤の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分としての上記ｓｉＲＮＡは、製剤中０．１から９９．９重量％含有することができる。
【００３４】
本発明のがん治療剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法等により差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して一日につき約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜１００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇに対して）、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師の判断により適宜決定することができる。
【００３５】
本発明のがん治療剤は、前立腺がん、肺がん、胃がん、膀胱がん及び子宮がん等の予防・治療、好ましくは、前立腺がんの予防・治療に用いられる。
【００３６】
別の実施形態において、本発明のがん治療剤は、抗がん剤と組合わせて用いることができる。抗がん剤としては、シスプラチン、ペプロマイシン、イフォアファミド、テガフールウラシル、エストラムチン、ドセタキセル、ジェムシタビン、オキサリプラチン等が挙げられ、中でもシスプラチンが好ましい。また、別の実施形態において、本発明のがん治療剤は、抗アンドロゲン剤と組合わせて用いることができる。さらに別の実施形態において、本発明のがん治療剤は、抗がん剤及び抗アンドロゲン剤と組合わせて用いることができる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１：ヒト正常組織におけるＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現解析）
ヒト正常組織から抽出したｔｏｔａｌＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、以下の実験手順で半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子のｍＲＮＡ発現を調べた。
【００３９】
１−１）ｃＤＮＡ合成
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、製品のプロトコールに沿ってｃＤＮＡ合成を行った。行った。なお、ｃＤＮＡ合成には、２μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、及び、ランダムプライマー（Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒｓ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。
【００４０】
１−２）ＰＣＲ反応
以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
＜プライマー＞
ＢＭＣＣ１；
ＢＮＦ２：５’−ｃｔｇａａｃｇａｔｇａａｇｇｇａａａｃｔｇｔｃｇａｔａａｃｇｃ−３’  （配列番号１）及び
ＢＮＲ２：５’−ｃａｃｔｇｃｃｔｇｃｃａｃｇｇｃｔｔｃｔｇｔｔｇ−３’  （配列番号２）
ＰＲＵＮＥ２；
ＢＮＦ２（配列番号１）及び
ＰＲＵＮＥ２Ｒ１：５’−ｃａｃａｇｃａｇａｔｇｔｔｇａａｃｔｃｃａｇｇｔｇｔｔｃ−３’  （配列番号３）
ＤＤ３；
ＤＤ３Ｆ３：５’−ｇｇｔｇｇｇａａｇｇａｃｃｔｇａｔｇａｔａｃ−３’  （配列番号４）及び
ＤＤ３Ｒ３：５’−ｇｃａｃａｇｇｇｃｇａｇｇｃｔｃａｔｃｇａｔｇ−３’  （配列番号５）
ＧＡＰＤＨ１；
ＧＡＰＤＨ１Ｆ：５’−ａｃｃａｃａｇｔｃｃａｔｇｃｃａｔｃａｃ−３’  （配列番号６）
ＧＡＰＤＨ１Ｒ：５’−ｔｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｔｔｇｃｔｇｔａ−３’  （配列番号７）
＜反応液組成＞
ｃＤＮＡ                              １μｌ
１０×ｒＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ          １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                １μｌ
フォワードプライマー（１０μＭ）  ０．５μｌ
リバースプライマー（１０μＭ）    ０．５μｌ
滅菌水                                ６μｌ
ｒＴａｑ                          ０．１μｌ
総量                                １０μｌ
＜反応条件＞
上記組成の反応液が入ったチューブをサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ（Ｒ）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にセットし、ＢＭＣＣ１（ＢＮＦ２／ＢＮＲ２）プライマーセット（配列番号１及び２）の場合は、９５℃（２分間）に加熱した後、９５℃(１５秒間)→５９℃(１５秒間)→７２℃（２０秒間）のサイクルを３８回行い、さらに７２℃で６分間保持した。ＰＲＵＮＥ２（ＢＮＦ２／ＰＲＵＮＥ２Ｒ１）プライマーセット（配列番号１及び３）の場合は、９５℃（２分間）に加熱した後、９５℃(１５秒間)→５９℃(１５秒間)→７２℃（２０秒間）のサイクルを３８回行い、さらに７２℃で７分間保持した。ＤＤ３（Ｆ３／Ｒ３）プライマーセット（配列番号４及び５）の場合は、９５℃（２分間）に加熱した後、９５℃(１５秒間)→６３℃(１５秒間)→７２℃（２０秒間）のサイクルを３８回行い、さらに７２℃で６分間保持した。ＧＡＰＤＨ１（Ｆ１／Ｒ１）プライマーセット（配列番号６及び７）の場合は、９５℃（２分間）に加熱した後、９５℃(１５秒間)→５８℃(１５秒間)→７２℃（２０秒間）のサイクルを２８回行い、さらに７２℃で６分間保持した。得られたＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド（ＳＩＧＭＡ社）を用いて検出した。
【００４１】
ヒト正常組織におけるＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた結果を図２に示す。その結果、これまでにＢＭＣＣ１の発現が報告されていた神経系以外の組織でも発現が確認された。また、ＤＤ３の発現は、前立腺において顕著であった。
【００４２】
（実施例２：ヒト正常組織とがん組織のマッチペアにおけるＢＭＣＣ１遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現解析）
そこで、種々のがんにおけるＢＭＣＣ１の発現について、肺がん（２例）、胃がん（２例）、膀胱がん（４例）、子宮がん（１例）、前立腺がん（２例）患者由来の正常組織とがん組織のマッチペアを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によって検討した。
【００４３】
ヒト正常組織とがん組織のマッチペアから抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（クローンテック社）、及び、ＢＭＣＣ１検出用のプライマーとして、ＢＮＦ２／ＢＮＲ２プライマーセット（配列番号１及び２）に加えて、ｋｉａａ０３６７Ｆ／Ｒプライマーセット（配列番号８及び９）を用いた以外は、実施例１に記載の方法を用いた。
【００４４】
＜ＢＭＣＣ１（ｋｉａａ０３６７Ｆ／Ｒ）プライマー及びＰＣＲ反応条件＞
ＢＭＣＣ１；
ｋｉａａ０３６７Ｆ：５’−ｇａａｇｃｃｔｃｔｇｇｔｃｃａｇｔｃａｇ−３’  （配列番号８）及び
ｋｉａａ０３６７Ｒ：５’−ｃｔｔｃｇｇｃｃｇｔａｔａｔｔｃｔｇｇａ−３’  （配列番号９）
ＢＭＣＣ１（ｋｉａａ０３６７Ｆ／Ｒ）プライマーセットを用いたＰＣＲ反応は、９５℃（２分間）に加熱した後、９５℃(１５秒間)→６１℃(１５秒間)→７２℃（２０秒間）のサイクルを３５回行い、さらに７２℃で６分間保持することにより行った。
【００４５】
ヒト正常組織とがん組織のマッチペアにおけるにおけるＢＭＣＣ１遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた結果を図３に示す。その結果、がん部位では正常部位と比べてＢＭＣＣ１の発現が低下することがわかった。このことは、がんにおけるＢＭＣＣ１の機能抑制はその発現低下によることを示唆している。また、複数のがん組織において、ＤＤ３の発現が亢進していることがわかった。
【００４６】
（実施例３：前立腺がん細胞株におけるＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現解析）
ＤＤ３がＢＭＣＣ１の遺伝子発現を抑制的に制御する可能性を検証するために、まず、前立腺がんより樹立した細胞株におけるＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現を、以下の方法により確認した。
前立腺がんより樹立した細胞株であるＬＮＣａＰ細胞株、ＰＣ３細胞株、及び、Ｄｕ１４５細胞株を植田先生（千葉がん泌尿器科部長）より供与頂き、これらを使用した。ＬＮＣａＰ細胞はアンドロゲン依存的な細胞株で、ＰＣ３細胞とＤｕ１４５細胞はアンドロゲン非依存的な細胞株である。これらの細胞株の性質を表１に示す。また、コントロールとして、神経芽腫細胞株であるＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞株を用いた。
【００４７】
【表１】
2010148501.tif 000002
【００４８】
各細胞株の培養細胞（１００ｍｍ  ｄｉｓｈ、８０％コンフルエント）を回収し、１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）に懸濁後、製品のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ反応は、実施例１に記載の方法を用いた。ただし、ＤＤ３検出用のプライマーとして、Ｆ３／Ｒ３プライマーセット（配列番号４及び５）に加えて、Ｆ３／Ｒプライマーセット（配列番号４及び１０）を用いた。
【００４９】
＜ＤＤ３（Ｆ３／Ｒ）プライマー及びＰＣＲ反応条件＞
ＤＤ３；
Ｆ３（配列番号４）及び
ＤＤ３Ｒ：５’−ｔｃｃｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｔｔａａｇｇ−３’  （配列番号１０）
ＤＤ３（Ｆ３／Ｒ）プライマーセットを用いたＰＣＲ反応では、９６℃（５分間）に加熱した後、９６℃(３０秒間)→６２℃(６０秒間)のサイクルを３５回行った。
【００５０】
前立腺がん細胞株におけるＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた結果を図４に示す。その結果、ＤＤ３は、アンドロゲン依存的なＬＮＣａＰ細胞で高発現することが確認できた。興味深いことにＢＭＣＣ１の発現もＬＮＣａＰ細胞で高いこと、より悪性度の高い前立腺がんに相当するＰＣ３細胞及びＤｕ１４５細胞ではＢＭＣＣ１の発現が低下していることが明らかとなった。このことは、前立腺がんが進行するとＢＭＣＣ１遺伝子の発現が抑制的に制御されることを示唆している。
【００５１】
（実施例４：ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡによるＤＤ３発現抑制がＢＭＣＣ１遺伝子発現に与える影響）
次に、ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡによるＤＤ３発現抑制がＢＭＣＣ１遺伝子発現に与える影響を調べるために、ｓｉＲＮＡを導入した前立腺がん細胞株（ＬＮＣａＰ細胞株及びＰＣ３細胞株）から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＴを行った。
【００５２】
ＤＤ３に対する３種類のｓｉＲＮＡを設計及び購入した（ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ  ＤＮＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）。ＤＤ３  ｎｃＲＮＡの構造、及び、ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡの位置を図５に模式的に示した。ＤＤ３に対する３種類のｓｉＲＮＡ（ＤＤ３  ｓｉＲＮＡ１、２及び３）の配列は以下の通りである。
ＤＤ３  ｓｉＲＮＡ１：５’−ｇｇａａｃｃａａｇａｕａｃａａａｇａａｃｕｃｕｇａ−３’  （配列番号１１）及び５’−ｕｃａｇａｇｕｕｃｕｕｕｇｕａｕｃｕｕｇｇｕｕｃｃｕｕ−３’  （配列番号１２）
ＤＤ３  ｓｉＲＮＡ２：５’−ｕｃａｃｕａｇａａａｃａｇｃａａｇａｕｇａｃａａｔ−３’  （配列番号１３）及び５’−ａｕｕｇｕｃａｕｃｕｕｇｃｕｇｕｕｕｃｕａｇｕｇａｕｇ−３’  （配列番号１４）
ＤＤ３  ｓｉＲＮＡ３：５’−ｇｇｃａｕａｃｕａｕａｕｃａａｃｕｕｕｇａｕｕｃｔ−３’  （配列番号１５）及び５’−ａｇａａｕｃａａａｇｕｕｇａｕａｕａｇｕａｕｇｃｃａａ−３’  （配列番号１６）
コントロールｓｉＲＮＡ：センス鎖５’−ｃｕｕｃｃｕｃｕｃｕｕｕｃｕｃｕｃｃｃｕｕｇｕｇａ−３’  （配列番号１７）及びアンチセンス鎖５’−ｕｃａｃａａｇｇｇａｇａｇａａａｇａｇａｇｇａａｇｇａ−３’  （配列番号１８）
【００５３】
ｓｉＲＮＡの形質導入には、キアゲン社のＨｉＰｅｒｆｅｃｔを用いた。製品のプロトコールに従って、各細胞株の培養細胞に、５ｎＭの各ｓｉＲＮＡを形質導入した。形質導入から４８時間後に培養細胞を回収し、製品のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ反応は、実施例１〜４に記載の方法を用いた。ただし、ＤＤ３検出用のプライマーとして、図６ではＤＤ３（Ｆ３／Ｒ）プライマーセット（配列番号４及び１０）、図７ではＤＤ３（ｔａｑＦ４／ｔａｑＲ２）プライマーセット（配列番号２１及び２２）を用いた。ＢＭＣＣ１検出用のプライマーとして、ＢＭＣＣ１（ＢＮＦ２／ＢＮＲ２）プライマーセット（配列番号１及び２）、ＰＲＵＮＥ２検出用のプライマーとして、ＰＲＵＮＥ２（ＢＮＦ２／ＰＲＵＮＥ２Ｒ１）プライマーセット（配列番号１及び３）、ＧＡＰＤＨ１検出用のプライマーとして、ＧＡＰＤＨ１（Ｆ／Ｒ）プライマーセット（配列番号６及び７）を用いた。
【００５４】
＜ＤＤ３（ｔａｑＦ４／ｔａｑＲ２）プライマー及びＰＣＲ反応条件＞
ＤＤ３；
ｔａｑＦ４：５’−ｃａｃａｇａｇａｔｃｃｃｔｇｇｇａｇａａａｔ−３’  （配列番号２１）及び
ｔａｑＲ２：５’−ｃｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｔｔａａｇｇａａｃａｃ−３’  （配列番号２２）
＜反応液組成＞
ｃＤＮＡ                              １μｌ
１０×ＬＡ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ      １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                １μｌ
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                １μｌ
フォワードプライマー（１０μＭ）  ０．５μｌ
リバースプライマー（１０μＭ）    ０．５μｌ
滅菌水                                ５μｌ
ＬＡ−Ｔａｑ                      ０．１μｌ
総量                                １０μｌ
ＤＤ３（ｔａｑＦ４／ｔａｑＲ２）プライマーセットを用いたＰＣＲ反応は、ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を含む上記組成の反応液入ったチューブをサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ（Ｒ）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にセットし、９５℃（２分間）に加熱した後、９５℃(１５秒間)→６０℃(１５秒間)→７２℃（２０秒間）のサイクルを３５回行い、さらに７２℃で７分間保持することにより行った。
【００５５】
ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡを導入した前立腺がん細胞株におけるＢＭＣＣ１遺伝子、ＰＲＵＮＥ２遺伝子及びＤＤ３遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた結果を図６及び７に示す。その結果、いずれのｓｉＲＮＡにおいてもＤＤ３の発現抑制が確認された（図６及び７）。ＤＤ３を発現抑制した細胞では、アンドロゲン依存性に関係なくＬＮＣａＰ細胞とＰＣ３細胞の両方においてＢＭＣＣ１の発現が亢進することが明らかとなった（図６）。
【００５６】
（実施例５：抗ＢＭＣＣ１抗体の作製）
ＢＭＣＣ１タンパク質の２０７４−２０９３番目の残基（アミノ酸配列：ＡＫＫＰＦＳＬＫＡＤＧＥＮＰＤＩＬＴＨＣ、アミノ酸一文字表記；配列番号２３；ＭＢＬ社製合成ペプチド）を抗原ペプチドとして用い、以下の手順により抗ＢＭＣＣ１抗体を作製した。
【００５７】
抗原ペプチドを用いてウサギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔ）への免疫及び追加免疫を行った。８回目の免疫後に全採血を行い、抗原ペプチドを固相化したカラムを用いて、抗原ペプチドを特異的に認識する抗体成分を精製した。抗原ペプチドを使用したＥＬＩＳＡ解析により、抗体の特異性を確認した。得られた抗体成分を抗ＢＭＣＣ１抗体として、以下の実験に用いた。
【００５８】
（実施例６：ＤＤ３発現抑制がＢＭＣＣ１タンパク質発現及び細胞増殖に与える影響）
実施例５と同様の手法により、ｓｉＲＮＡをリポフェクション法（ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ、キアゲン社）にて導入した後、４８時間培養を行ったヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰより抽出した全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成し、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った（図８）。
ＢＭＣＣ１に対するｓｉＲＮＡとして、以下の配列を有するｓｉＲＮＡを設計及び購入した（ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ  ＤＮＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）。
ｓｉＢＭＣＣ１−１：５’−ｇｇａｇａａｇｇａｕａｕｕｇａｃｕｕｇａａｇｃｔｇ−３’  （配列番号２４）及び５’−ｃａｇｃｕｕｃａａｇｕｃａａｕａｕｃｃｕｕｕｃｕｃｃａｕ−３’  （配列番号２５）
ｓｉＢＭＣＣ１−２：５’−ｇｇａｇｕａｕｃａｇｇａａｇｃａａａｕｃａｇｇｔａ−３’  （配列番号２６）及び５’−ｕａｃｃｕｇａｕｕｕｇｃｕｕｃｃｕｇａｕａｃｕｃｃａａ−３’  （配列番号２７）
ｓｉＢＭＣＣ１−３：５’−ｃｃｃａｇｕｇａｇａｕａａａｃａａｕｇａａｇｃａｇ−３’  （配列番号２８）及び５’−ｃｕｇｃｕｕｃａｕｕｇｕｕｕａｕｃｕｃａｃｕｇｇｇｕｇ−３’  （配列番号２９）
また、ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡとして、ＤＤ３  ｓｉＲＮＡ１（配列番号１１及び１２）、ＤＤ３  ｓｉＲＮＡ３（配列番号１５及び１６）及びＤＤ３  ｓｉＲＮＡ４（配列番号３０及び３１）を用いた。
ＤＤ３  ｓｉＲＮＡ４：５’−ｇｇａｇｕｕａｇａｕｕｕａｕｇｃａｕａｕｕｇｕｇｇｕｕ−３’  （配列番号３０）及び５’−ｃｃａｃａａｕａｕｇｃａｕａａａｕｃｕａａｃｕｃｃ−３’  （配列番号３１）
【００５９】
ＤＤ３検出用のプライマーとして、ＤＤ３（Ｆ３／Ｒ）プライマーセット（配列番号４及び１０）、ＢＭＣＣ１検出用のプライマーとして、ＢＭＣＣ１Ｎ（ＢＮＦ２／ＢＮＲ２）プライマーセット（配列番号１及び２）及びＢＭＣＣ１Ｃ（ｋｉａａ０３６７Ｆ／Ｒ）プライマーセット（配列番号８及び９）、ＰＲＵＮＥ２検出用のプライマーとして、ＰＲＵＮＥ２（ＢＮＦ２／ＰＲＵＮＥ２Ｒ１）プライマーセット（配列番号１及び３）、Ｃａｓｐａｓｅ−３検出用のプライマーとして、Ｃａｓｐａｓｅ−３（Ｆ／Ｒ）プライマーセット（非特許文献１参照）、ＰＳＡ検出用のプライマーとして、ＰＳＡ（Ｆ／Ｒ）プライマーセット（配列番号３２及び３３）、ＡＤＲ検出用のプライマーとして、ＡＤＲ（Ｆ／Ｒ）プライマーセット（配列番号３４及び３５）、ＧＡＰＤＨ１検出用のプライマーとして、ＧＡＰＤＨ１（Ｆ／Ｒ）プライマーセット（配列番号６及び７）を用いた。
＜ＰＳＡ（Ｆ／Ｒ）プライマー及びＡＤＲ（Ｆ／Ｒ）プライマー＞
ＰＳＡ；
Ｆ：５’−ｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔ−３’  （配列番号３２）及び
Ｒ：５’−ｇｇｇｔｇａａｃｔｔｇｃｇｃａｃａｃａｃ−３’  （配列番号３３）
ＡＤＲ；
Ｆ：５’−ｔｃａａａａｇａｇｃｃｇｃｔｇａａｇｇｇａａａｃａ−３’  （配列番号３４）及び
Ｒ：５’−ａｃａｃｃａｔｇａｇｃｃｃｃａｔｃｃａｇｇａｇｔａ−３’  （配列番号３５）
【００６０】
次に、ＤＤ３又はＢＭＣＣ１を発現抑制した細胞におけるＢＭＣＣ１タンパク質の発現を、抗ＢＭＣＣ１抗体を用いた免疫染色及びウエスタンブロットによって確認した（図９及び１０）。免疫染色の手順は以下の通りである。ｓｉＲＮＡを導入後４８時間経った細胞を１０％ホルマリンにて室温１５分間固定した後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸを含むＰＢＳで室温１０分間処理した。さらに、抗ＢＭＣＣ１抗体（１／５００希釈）で室温３時間、Ａｌｅｘａ４８８でラベルした抗ウサギ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社、１／１０００希釈）で室温２時間処理を行った。核をＤＡＰＩで染色した細胞は共焦点レーザー顕微鏡（ライカ社）にて観察を行った。ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のＬＮＣａＰ細胞におけるＢＭＣＣ１タンパク質の免疫染色像（核：青色、ＢＭＣＣ１：緑色、Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ：赤色）を図９に示す。
【００６１】
ウエスタンブロットの手順は以下の通りである。ｓｉＲＮＡを導入後４８時間経った細胞全抽出液をＳＤＳ−ｐａｇｅにて分離し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した後、抗ＢＭＣＣ１抗体（１／５００希釈）で室温３時間、ＨＲＰでラベルした抗ウサギ抗体（ＺＹＭＥＤ社、１／１５００希釈）で室温２時間処理を行った。メンブレンはＥＣＬ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて発色させた後、X線フィルム（富士フィルム社）に感光させて検出を行った。ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡを導入したＬＮＣａＰ細胞におけるＢＭＣＣ１タンパク質のウエスタンブロット像を図１０に示す。
【００６２】
さらに、ｓｉＲＮＡを導入後４８時間経った細胞の増殖（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）はＷＳＴ−８  ｋｉｔ（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用い、マニュアルに従って測定した。ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後の細胞増殖を図１１に示す。
【００６３】
その結果、ＤＤ３の発現を抑制したＬＮＣａＰ細胞においてＢＭＣＣ１の発現亢進がＲＴ−ＰＣＲによって確認された（図８）。ｍＲＮＡレベルの解析に加えて、タンパク質レベルにおいてもＢＭＣＣ１の発現が亢進されることが、抗ＢＭＣＣ１抗体を用いた免疫染色とウエスタンブロットによっても確認された（図９及び１０）。さらに、ＤＤ３を発現抑制したＬＮＣａＰ細胞において細胞増殖が抑制されることが確認された（図１１）。
【００６４】
（実施例７：抗がん剤シスプラチン存在下におけるＤＤ３発現抑制が前立腺がん細胞に与える影響）
シスプラチン存在下におけるＤＤ３発現抑制が前立腺がん細胞に与える影響を以下の手法により調べた。ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡを導入したＬＮＣａＰ細胞をＤＭＳＯ（ナカライテスク社）又はシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＣＤＤＰ；ＳＩＧＭＡ社）で４８時間処理した後、顕微鏡（ライカ社）観察を行った（図１２）。また、ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後の細胞の増殖（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をＷＳＴ−８  ｋｉｔを用いて測定した（図１３）。アポトーシス細胞の検出は、ＴＵＮＥＬアッセイｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてマニュアルに従って行い、共焦点レーザー顕微鏡（ライカ社）観察にて定量を行った。図１４に、ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のＬＮＣａＰ細胞におけるアポトーシス細胞の検出結果（核：青色、アポトーシス細胞：赤色）を示す。なお、条件毎に、それぞれ約４００個の細胞についてアポトーシス細胞／核の割合を測定し、割合（％）を各パネルの下部に記載した。
【００６５】
その結果、ＤＤ３の発現を抑制したＬＮＣａＰ細胞において抗がん剤シスプラチンに対する感受性が上昇することが明らかとなった（図１２〜１４）。すなわち、シスプラチンによる前立腺がん細胞の増殖抑制効果（図１２及び１３）及び細胞死の促進効果（図１４）が、ＤＤ３の発現抑制により相加的及び／又は相乗的に増強されることが分かった。
【００６６】
（実施例８：アンドロゲン非存在下におけるＤＤ３発現抑制が前立腺がん細胞に与える影響）
初期段階の前立腺がんは大部分がアンドロゲン依存的であるためアンドロゲンブロック療法が有効であることが知られている。また、ＬＮＣａＰ細胞の増殖はアンドロゲン非存在下で抑制される。そこで、アンドロゲン非存在下におけるＤＤ３発現抑制及びシスプラチン処理が前立腺がん細胞に与える影響を以下の方法により調べた。まず、ＬＮＣａＰ細胞を５％の低アンドロゲン含有ＦＢＳ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）添加ＲＰＭＩ培地中で、ＤＭＳＯ又はＣＤＤＰ処理を４８、７２時間行った後、細胞の増殖についてＷＳＴ−８  ｋｉｔを用いて測定した（図１５）。次に、ｓｉＲＮＡを導入したＬＮＣａＰ細胞について５％の低アンドロゲン含有ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地中で、ＤＭＳＯ又はＣＤＤＰ（ＳＩＧＭＡ社）処理を４８時間行った後、細胞の増殖をＷＳＴ−８  ｋｉｔを用いて測定した（図１６）。
【００６７】
その結果、アンドロゲン非存在下でのＬＮＣａＰ細胞の増殖抑制効果が、シスプラチン処理によってさらに増強された（図１５）。ホルモン療法と抗がん剤との併用による前立腺癌の治療は臨床で行われている。興味深いことに、ＤＤ３を発現抑制したＬＮＣａＰ細胞はアンドロゲン非存在下でシスプラチン処理を行うことによって相乗的に細胞の増殖が抑制されることが明らかとなった（図１６）。また、アンドロゲン非存在下でのＬＮＣａＰ細胞の増殖抑制効果が、ＤＤ３の発現抑制によってさらに増強された（図１６、ＣＤＤＰ添加なしのデータ）。したがって実施例７及び８の結果から、ＤＤ３の発現抑制に加えてシスプラチン処理及び／又はアンドロゲン除去を併用することによって、より効果的に細胞の増殖が抑制されることが分かった。この結果は、ＢＭＣＣ１の発現が、ＤＤ３の発現抑制に加えて、シスプラチン処理及びアンドロゲン除去によってもそれぞれ上昇することと相関している。反対に、ＤＤ３の発現抑制に加えてＢＭＣＣ１の発現を抑制した細胞は部分的ではあるが細胞の増殖抑制が解除されることも分かった（図１１）。したがって、ＤＤ３の発現抑制及び他の治療法との併用は、前立腺癌の新規治療法として有用であると考えられる。
【００６８】
以上より、初期段階の前立腺がんに相当するアンドロゲン依存的がん細胞において、ＤＤ３の発現が亢進し、前立腺がんが進行するとＢＭＣＣ１遺伝子の発現が抑制的に制御されるという知見（図４）と、ＤＤ３の発現抑制によりＢＭＣＣ１遺伝子の発現が亢進するという知見（図６及び７）から、ＤＤ３がＢＭＣＣ１遺伝子の発現を抑制し、がんの進行を促進している可能性が強く示唆された。ＢＭＣＣ１はアポトーシスを促進する働きを持ち、がん抑制遺伝子としての側面を持つことから、ＤＤ３をｓｉＲＮＡで発現抑制してＢＭＣＣ１の発現を回復させるという本願の実施例において見出した方法は、がんの治療に有用と考えられる。実際に、ＤＤ３の発現抑制によってＢＭＣＣ１の発現がｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルにおいて亢進されること（図６〜１０）、及び、ＤＤ３の発現抑制によって前立腺がん細胞の細胞増殖が抑制され、細胞死が促進されること（図１１及び１４）から、ＤＤ３の発現抑制がＢＭＣＣ１遺伝子の発現を亢進し、がんの進行を抑制することが明らかとなり、ＤＤ３に対するｓｉＲＮＡが、がんの治療剤として有用であることが示唆された。また、ＰＣ３細胞の結果（図６）から、治療の難しいアンドロゲン非依存性の前立腺がんの治療法としても有用であると考えられる。
【００６９】
さらに、ＤＤ３の発現抑制に加えてシスプラチン処理及び／又はアンドロゲン除去を併用することによって、より効果的に細胞の増殖が抑制されることが分かった（実施例７及び８）。したがって、本発明の治療剤と、抗がん剤やアンドロゲンブロック療法等の他の治療法との併用が有効であることが示唆された。
【００７０】
また、ＤＤ３の発現はアンドロゲン依存的であることから、アンドロゲン非依存的な前立腺がんでは検出することができない。したがって、より悪性化した前立腺がんにおいてはＤＤ３の発現亢進よりもＢＭＣＣ１の発現低下の方がより良いマーカーとなりうる。すなわちＢＭＣＣ１の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで、又は、抗体を用いてタンパク質レベルでモニターする手法は、がん細胞の検出にも有用であることが明らかとなった。
【図１１】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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