(57)【要約】      （修正有）【課題】ソフトコーラルから有用な炭酸脱水酵素を分離精製する方法および新規な炭酸脱水酵素を提供する。【解決手段】ソフトコーラルの骨片をエチレンジアミン四酢酸溶液により抽出し、透析処理、シリカゲルカラムクロマトグラフィー処理により分離精製した後、さらに凍結乾燥後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、電気溶出法、遠心限外濾過法により精製・濃縮する方法である。これによって得られる炭酸脱水酵素は従来公知のものに比べて熱安定性に優れている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
０〜８０℃の範囲で活性を示す炭酸脱水酵素。
【請求項２】
次の理化学的性質を有する請求項１記載の炭酸脱水酵素。
（１）作用：
二酸化炭素と水から重炭酸イオンと水素イオンを生成する反応を触媒する。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ：
作用ｐＨ範囲は４〜１０（０℃）であり、最適ｐＨは６．１〜７．３である。
（３）最適温度及び熱安定性：
最適温度は０℃であり、８０℃までは加熱（ｐＨ４〜１０、１０分間）処理後活性を示す。
（４）分子量：
約６７ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
【請求項３】
次の理化学的性質を有する請求項１記載の炭酸脱水酵素。
（１）作用：
二酸化炭素と水から重炭酸イオンと水素イオンを生成する反応を触媒する。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ：
作用ｐＨ範囲は４〜１０であり（０℃）、最適ｐＨは６〜７である。
（３）最適温度及び熱安定性：
最適温度は０℃であり、８０℃までは加熱（ｐＨ６〜７、１０分間）処理後活性を示す。
（４）分子量：
約１０２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
【請求項４】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する請求項２記載の炭酸脱水酵素。
【請求項５】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項２記載の炭酸脱水酵素。
【請求項６】
ソフトコーラル由来のものである請求項１ないし５いずれかの項記載の炭酸脱水酵素。
【請求項７】
ソフトコーラルが、Lobophytum crassumである請求項８記載の炭酸脱水酵素。
【請求項８】
次の工程を含む炭酸脱水酵素の製造方法。
（１）ソフトコーラルの骨片をエチレンジアミン四酢酸溶液により抽出する工程
（２）（１）で得られた抽出液を透析処理する工程
（３）（２）で得られた透析処理内液をシリカゲルカラムに供し、アセトニトリルにより
溶出させて吸着画分を得る工程
（４）（３）で得られた画分を凍結乾燥する工程
（５）（４）で得られた凍結乾燥物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）に供する工程
（６）（５）で得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから炭酸脱水酵素を含むバンドを切り出し
、これを電気溶出法により精製し炭酸脱水酵素の粗精製物を得る工程
（７）（６）で得られた粗精製物を遠心限外濾過法により精製・濃縮し、炭酸脱水酵素の
精製物を得る工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な炭酸脱水酵素に関し、より詳細には、ソフトコーラルから分離された従来よりも熱安定性に優れる炭酸脱水酵素およびその分離精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ソフトコーラル（軟体サンゴ）は、柔軟な群体を形成するサンゴであり、世界中に非常に多くの種が存在するが、インド洋から太平洋における熱帯の浅水域には、９０属のソフトコーラルが生息する。琉球諸島では、Clavulariidae科、Alycyoniidae科、Briareidae科の９属５６種のソフトコーラルが認められている（非特許文献１）。
【０００３】
ソフトコーラルの重要な構成成分は、「骨片」と呼ばれる小さな炭酸カルシウムの針状体である。骨片は一般に石灰化に先立って形成される有機基質とその中の炭酸カルシウムから構成される。ソフトコーラルは、硬い石灰質を持たず、相互にポリプの群体を保持する柔軟な骨格を有する。ソフトコーラルのポリプはそれぞれ８本の触手を有し、鮮やかな黄色、赤、オレンジ、紫などの美しい様々な形態の群体を形成する。
【０００４】
このようなソフトコーラルの生態については研究が進められているものの、ソフトコーラルを構成するタンパク質等の成分については、これを分離精製する技術が確立されていなかったため、その構造や機能に関する知見がほとんどないのが実情であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Y.Benayahu,2002,Galaxea,JCRS,4;11-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ソフトコーラルから有用なタンパク質を分離精製する手法を確立し、その構造や機能を解明することが切望されており、本発明はそのようなタンパク質の分離精製方法および新規なタンパク質を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ソフトコーラルの骨片をエチレンジアミン四酢酸溶液により抽出し、透析処理、シリカゲルカラムクロマトグラフィー処理により分離精製した後、さらに凍結乾燥後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、電気溶出法、遠心限外濾過法により精製・濃縮することにより、ソフトコーラルの骨片中に含まれるタンパク質を分離精製することが可能となり、またこれらの中には、従来知られていなかった新規な炭酸脱水酵素が含まれることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は０〜８０℃の範囲で活性を示す炭酸脱水酵素である。
【０００９】
また本発明は、次の理化学的性質を有する炭酸脱水酵素である。
（１）作用：
二酸化炭素と水から重炭酸イオンと水素イオンを生成する反応を触媒する。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ：
作用ｐＨ範囲は４〜１０（０℃）であり、最適ｐＨは６．１〜７．３である。
（３）最適温度及び熱安定性：
最適温度は０℃であり、８０℃までは加熱（ｐＨ４〜１０、１０分間）処理後活性を示す。
（４）分子量：
約６７ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
【００１０】
また本発明は、次の理化学的性質を有する炭酸脱水酵素である。
（１）作用：
二酸化炭素と水から重炭酸イオンと水素イオンを生成する反応を触媒する。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ：
作用ｐＨ範囲は４〜１０（０℃処理）であり、最適ｐＨは６〜７である。
（３）最適温度及び熱安定性：
最適温度は０℃であり、８０℃までは加熱（ｐＨ６〜７、１０分間）処理後活性を示す。
（４）分子量：
約１０２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
【００１１】
さらに本発明は次の工程を含む炭酸脱水酵素の製造方法である。
（１）ソフトコーラルの骨片をエチレンジアミン四酢酸溶液により抽出する工程
（２）（１）で得られた抽出液を透析処理する工程
（３）（２）で得られた透析処理内液をシリカゲルカラムに供し、アセトニトリルにより
溶出させて吸着画分を得る工程
（４）（３）で得られた画分を凍結乾燥する工程
（５）（４）で得られた凍結乾燥物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）に供する工程
（６）（５）で得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから炭酸脱水酵素を含むバンドを切り出し
、これを電気溶出法により精製し炭酸脱水酵素の粗精製物を得る工程
（７）（６）で得られた粗精製物を遠心限外濾過法により精製・濃縮し、炭酸脱水酵素の
精製物を得る工程
【発明の効果】
【００１２】
本発明方法によれば、ソフトコーラルから有用なタンパク質を分離精製することが可能である。またこの方法により得られた炭酸脱水酵素は、従来公知のものと比べ熱安定性に優れるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例４における炭酸脱水酵素に対するダイアモックスの阻害作用を示す図である。
【図２】実施例５における炭酸脱水酵素の温度依存性を示す図である。
【図３】実施例５における炭酸脱水酵素のｐＨ依存性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の炭酸脱水酵素は、８０℃の加熱（ｐＨ６〜７、１０分間）処理後も活性を示す炭酸脱水酵素であり、従来知られているＩ型ヒト炭酸脱水酵素（６０℃）や真珠に含まれるナクレイン（７０℃）と比べて熱安定性が高いものである。
【００１５】
本発明の炭酸脱水酵素には、具体的に、次の理化学的性質を有する炭酸脱水酵素が含まれる。
（１）作用：
二酸化炭素と水から重炭酸イオンと水素イオンを生成する反応を触媒する。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ：
作用ｐＨ範囲は４〜１０であり（０℃）であり、最適ｐＨは６．１〜７．３である。
（３）最適温度及び熱安定性：
最適温度は０℃であり、８０℃までは加熱（ｐＨ４〜１０、１０分間）処理後活性を示す。
（４）分子量：
約６７ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
【００１６】
またこの炭酸脱水酵素は、下記（１）のアミノ酸配列（配列番号１）または当該アミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むものであり、特にＮ末端に含むものである。
（１）ＤＥＬＮＫＫＶＤＳＤＥＴＩＳＤＤＧＶＶＡ
【００１７】
本発明の炭酸脱水酵素には、上記の他に次の理化学的性質を有する炭酸脱水酵素も含まれる。
【００１８】
（１）作用：
二酸化炭素と水から重炭酸イオンと水素イオンを生成する反応を触媒する。
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ：
作用ｐＨ範囲は４〜１０であり（０℃）であり、最適ｐＨは６〜７である。
（３）最適温度及び熱安定性：
最適温度は０℃であり、８０℃までは加熱（ｐＨ６〜７、１０分間）処理後活性を示す。
（４）分子量：
約１０２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
【００１９】
上記炭酸脱水酵素はいずれも、ソフトコーラルから次の工程を含む分離精製方法により得ることができる。
【００２０】
（１）ソフトコーラルの骨片をエチレンジアミン四酢酸溶液により抽出する工程
（２）（１）で得られた抽出液を透析処理する工程
（３）（２）で得られた透析処理内液をシリカゲルカラムに供し、アセトニトリルにより
溶出させて吸着画分を得る工程
（４）（３）で得られた画分を凍結乾燥する工程
（５）（４）で得られた凍結乾燥物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）に供する工程
（６）（５）で得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから炭酸脱水酵素を含むバンドを切り出し
、これを電気溶出法により精製し炭酸脱水酵素の粗精製物を得る工程
（７）（６）で得られた粗精製物を遠心限外濾過法により精製・濃縮し、炭酸脱水酵素の
精製物を得る工程
【００２１】
本発明に使用するソフトコーラルは、Lobophytum属に属する種のものであれば特に制限なく使用できるが、具体的には、Lobophytum crassum、Lobophytum batarum、Lobophytum durum等が挙げられ、中でもLobophytum crassumが好ましく用いられる。
【００２２】
上記ソフトコーラルから骨片を分離するにあたっては、通常の機械的、化学的処理により行えばよい。例えば、ハサミやミキサー等を用いてソフトコーラルの組織を細断し、骨片を含む組織を回収して、ＮａＯＨ溶液やＮａＣｌＯ溶液によって骨片に付着した組織を除去する方法が例示できる。さらに必要に応じ、蒸留水等で洗浄して夾雑物を除去してもよい。
【００２３】
得られた骨片をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液により抽出する（脱灰）。ＥＤＴＡの濃度は、通常０．５Ｍ程度であり、これを骨片の湿潤重量に対して１０ｇ（乾燥重量に対して５ｇ）程度用いることにより可溶性成分を抽出する。抽出条件は特に限定されないが、通常、室温で一晩程度で行えばよい。
【００２４】
次いで、この抽出液を透析処理することによりＥＤＴＡを除去する。透析外液としては水を用いることが好ましく、例えば、抽出液を透析膜に入れ、水に対して通常６４時間、−４℃で、透析外液の水を４回程度交換すればよい。透析膜としては、ＵＣ３６−３２−１００（Ｖｉｓｋａｓｅ社製）やCanada Wide Scientific社製の透析膜が例示できる。
【００２５】
透析処理後の透析内液は、遠心分離により可溶性成分と不溶性成分とに分離することが好ましい。遠心分離の条件は特に制限されないが、例えば４０００ｒｐｍ（１２５２ｘｇ）で１５分程度行えば良い。遠心分離後の上清液はさらに濾過することが好ましい。
【００２６】
次に、遠心分離後の上清液またはその濾液をシリカゲルカラムに供し、可溶性タンパク質を吸着させる。シリカゲルカラムとしては、Ｓｅｐ−ｐａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）やSK Science Kit ＆ Boreal Laboratories社製のカラムが例示できる。その後５０％アセトニトリルで溶出させることにより吸着画分を回収する。溶出させる前に、予めシリカゲルカラムは必要に応じて蒸留水および１０％アセトニトリル溶液で洗浄し、ＥＤＴＡを除去することが好ましい。またシリカゲルカラムは、予めメタノールを通してカラムを活性化した後、蒸留水で平衡化させてから使用することが好ましい。
【００２７】
回収した画分は、凍結乾燥処理することが好ましい。凍結乾燥は常法により行うことができる。
【００２８】
得られた凍結乾燥物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはLaemmliの方法（U.K.Laemmli ,Nature 227:680-685(1970))に従って行うことができる。例えば、サンプルバッファーとしては、６．２５ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、５０％(ｗ／ｖ)グリセロール、１０％(ｗ／ｖ)ＳＤＳ、５％(ｖ／ｖ)２−メルカプトエタノール、０．５％(ｗ／ｖ)ブロモフェノール溶液を使用することができ、泳動用バッファーは、１．５ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、０．５ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、１０％(ｗ／ｖ)ＳＤＳ、ビスアクリルアミド、１０％アンモニウムパースルフェイト、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）溶液を用いることができる。
【００２９】
泳動後、ゲルから分離されたバンドをそれぞれ切り出し、電気溶出法により精製する。電気溶出法に用いられる装置としては、例えば、エレクトロエルーター(Ｍｏｄｅｌ４２２；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)やＡＴＴＯ社製の装置が使用される。電気溶出の条件は、通常各チューブにつき１２０Ｖ、５ｍＡ程度で行えば良い。このようにしてソフトコーラルの骨片に含まれる炭酸脱水酵素の粗精製物が得られる。
【００３０】
次いで、この炭酸脱水酵素の粗精製物を、遠心限外濾過法により濃縮・精製する。遠心限外濾過においては、ポア径０．１μｍの遠心限外濾過フィルターにより濃縮することが好ましい。このような遠心限外濾過装置としては、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−ＭＣやＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ（いずれもミリポア社製）が例示できる。遠心限外濾過後、さらに必要に応じて真空遠心分離を行うことが好ましい。
【００３１】
このようにして、本発明の炭酸脱水酵素の精製物が得られるが、上記方法はLobophytum属のソフトコーラルだけでなく、あらゆるソフトコーラルに適用することができ、また炭酸脱水酵素に限らず、その他のタンパク質を分離精製することが可能な極めて有用な手法である。
【実施例】
【００３２】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００３３】
実施例１  
ソフトコーラルからの炭酸脱水酵素の精製：
Lobophytum crassum（採集地  瀬底、砂辺）２００ｇを鋭利なハサミにより小片に切断し、次いでミキサー（ＢＭ−ＦＥ０８、象印社製）を用いて細断した。これを水道水で洗浄し骨片を含む組織を回収した。骨片は１Ｍ  ＮａＯＨ溶液中で２時間撹拌し、その後１％ＮａＣｌＯ溶液中で２時間撹拌することによって付着した組織等を除去した。最終的に蒸留水で洗浄して夾雑物を除去した。
【００３４】
得られた骨片およそ１０ｇ（湿潤重量）を０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液２５０ｍＬに浸漬し一晩抽出した。次いで、この抽出液を透析膜（ＵＣ３６−３２−１００；Ｖｉｓｋａｓｅ社製）に入れ、１Ｌ超純水に対して−４℃で３６時間透析を行った。透析外液の超純水は５回交換した。透析処理後の透析内液は、遠心分離機（Ｈ−１０３、コクサン社製）により４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った。遠心分離後の上清液を、Ｗｈａｔｍａｎ社製の濾紙を使用して濾過した。
【００３５】
濾液は、２連に連結したＳｅｐ−ｐａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）に通気ポンプ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて通液させた。Ｓｅｐ−ｐａｋＣ１８は予めエタノールで活性化させ（４ｍＬ、３回）、次いで蒸留水（６ｍＬ、２回）で平衡化させてから用いた。通液後、Ｓｅｐ−ｐａｋＣ１８を蒸留水（２ｍＬ、３回）および１０％アセトニトリル溶液（２ｍＬ、３回）で洗浄した後、５０％アセトニトリルで溶出させた（２ｍＬ、３回）。この画分を回収し、凍結乾燥した。
【００３６】
凍結乾燥物は、次いでLaemmliの方法(U.K.Laemmli ,Nature 227:680-685(1970))に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。凍結乾燥物２ｍｇをサンプルバッファー５ｍＬ（６．２５ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、５０％(ｗ／ｖ)グリセロール、１０％(ｗ／ｖ)ＳＤＳ、５％(ｖ／ｖ)２−メルカプトエタノール、０．５％(ｗ／ｖ)ブロモフェノール）に溶解し、１００℃で３時間加熱した。泳動用バッファー（１．５ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、０．５ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、１０％ＳＤＳ、ビスアクリルアミド、１０％過硫酸アンモニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））を用い、２時間電気泳動を行った。予め染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥマーカータンパク質（ホスフォリラーゼＢ（１１３ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（９２ｋＤａ）、オボアルブミン（５２．９ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（３５．４ｋＤａ）、大豆トリプシンインヒビター（２９ｋＤａ）、リゾチーム（２１．５ｋＤａ））についても電気泳動を行った。その後ゲルをクーマシーブリリアントブルー（４０％メタノール／７．５％酢酸中１％ＣＢＢ  Ｒ−２５０）で染色し、１０％メタノール／７．５％酢酸溶液で脱色した。
【００３７】
ゲルから分子量６７ｋＤａ付近のバンドを切り出し、エレクトロエルーター(Ｍｏｄｅｌ４２２、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)を用いて１２０Ｖ、５ｍＡで１．５〜２時間電気溶出を行った。次いで、電気溶出後の液２ｍＬをポアサイズ０．１μｍのマイクロコン遠心分離フィルターユニット（ミリポア社製）を用いて処理し、さらに、ＭｉｎｉＳｐｉｎ  Ｐｌｕｓ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用いアミコンウルトラフリーＭＣによる遠心限外濾過によって０．５ｍＬまで濃縮した。さらに、−８０℃にて凍結し、凍結乾燥することにより、分子量６７ｋＤａの炭酸脱水酵素（ＭＰＬ−２）を得た（収量約０．５μg）。同様にして分子量１０２ｋＤａの炭酸脱水酵素（ＭＰＬ−１）を得た（収量約０．６μg）。
【００３８】
実施例２
アミノ酸配列の解析：
実施例１で得られた６７ｋＤａの炭酸脱水酵素ＭＰＬ-２を２５μＬのサンプルバッファー（６．２５ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、５０％(ｗ／ｖ)グリセロール、１０％(ｗ／ｖ)ＳＤＳ、５％(ｖ／ｖ)２−メルカプトエタノール、０．５％(ｗ／ｖ)ブロモフェノール）に溶解し、４０℃で３０分間インキュベートした。次いでトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（泳動用バッファー；3ｘgel buffer, Monomer（Separaing gel 49.5%T 6%C；Stacking gel 49.5%T 3%C）, Water, 70%Glycerol, 10%APS（ammoniun persulfate）、 TEMED）。ゲル上には７種の精製されたタンパク質のバンドが検出された。
【００３９】
６７ｋＤａのバンドを含むゲルを切り出し、これを１００％メタノール中で１５秒保持し、その後１０分間バッファー中で振盪とうした。この試料を、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｂｌｏｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて３５０ｍＡ、６０Ｖの条件で４時間処理することにより、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写膜はクーマシーブリリアントブルー溶液（５０％メタノール／５％酢酸中１％ＣＢＢ）で染色し、５０％メタノール／５％酢酸溶液で脱色した。蒸留水で洗浄後、一晩乾燥した。乾燥後、膜からタンパク質のバンドを切り出し、プロテインシーケンサー（model PPSQ-21A；SHIMADZU社製）にセットし、Ｎ末端アミノ酸配列を解析した（下記（１）；配列番号１）。
【００４０】
（１）ＤＥＬＮＫＫＶＤＳＤＥＴＩＳＤＤＧＶＶＡ
(Asp-Glu-Leu-Asn-Lys-Lys-Val-Asp-Ser-Asp-Glu-Thr-Ile-Ser-Asp-Asp-Gly-Val-Val-Ala)
【００４１】
実施例３
炭酸脱水酵素活性の測定：
炭酸脱水酵素は二酸化炭素と水から重炭酸イオンと水素イオンを生成する反応を触媒するが、Ｙａｎｇらの方法に従い実施例１で得られた炭酸脱水酵素についてその活性を測定した（Yang,S.Y.,Tsuzuki.M.,Miyauchi,S.,Plant Cell Physiol.1985,26,225-34）。すなわち、フェノールレッド２００μＬ、２０ｍＭベローナル緩衝液（５，５−ジエチルバルビツール酸ナトリウム、ｐＨ８．３）３ｍＬ、試料０．５ｍＬを混合し、氷水中に置いた。０℃の２酸化炭素飽和水２ｍＬを添加し、反応を開始させた。ｐＨが７．３に低下し、溶液が赤から黄色に変化するまでの時間を測定しＴとした。同様にして酵素が存在しない場合の時間も測定しＴ０として、次式により酵素活性を算出した。測定は５回行いその平均値を求めた。結果を表１に示す。
活性単位（ＥＵ）＝（Ｔ０−Ｔ）／Ｔ
【００４２】
【表１】
2010220510.tif 000003
【００４３】
実施例４
炭酸脱水酵素に対するダイアモックスによる阻害作用：
実施例１で得られた炭酸脱水酵素（ＭＰＬ−１および２）について以下の方法により、炭酸脱水酵素阻害剤であるダイアモックスによる阻害作用を調べた。阻害剤（10-2M 〜10-１２M Diamox）を20mMのベローナル緩衝液バッファー（Sodium 5. 5-Diethylbarniturate, pH 8.3）および炭酸脱水酵素を含む反応容器に入れて、pH値の減少を測定し、実施例３と同様にして活性を求めた。結果を図１に示す。
【００４４】
実施例５
炭酸脱水酵素の性質：
実施例１で得られた炭酸脱水酵素について、以下の方法によりｐＨ依存性および温度依存性について調べた。実施例３と同様の方法によって、炭酸脱水酵素を０〜８０℃の１０℃毎の温度で１０分間加熱後炭酸脱水酵素活性を測定した。また、ｐＨ４〜１０の範囲で同様にして活性を測定した。結果を図２および３に示す。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によれば、ソフトコーラルの骨片からタンパク質を精製分離することが可能であり、有用なタンパク質の探索・取得のために有用な手法である。
【図１】
2010220510.tif 000004
【図２】
2010220510.tif 000005
【図３】
2010220510.tif 000006
【配列表】
2010220510000001.app