(57)【要約】【課題】対象細胞に効率よくかつ好適に穿孔を形成することができ、かつより小さい穿孔を形成することができるマニピュレーションシステムを提供することにある。【解決手段】複数の対象細胞を含有する試料を保持する試料保持部材と、対象細胞を保持する細胞保持手段と、対象細胞に穿孔を形成する穿孔形成手段とを有し、細胞保持手段は、複数個形成された微小孔で対象細胞を吸引して保持し、穿孔形成手段は、電源からオンオフが繰り返された電流を先端が尖鋭な電極に供給し、電極の尖鋭な先端部分の周囲にミクロ制御の発熱乱流を発生させることで、上記課題を解決する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の微小穴が列上に形成された板状部材と、該微小穴を負圧にする吸引機構とを備え、それぞれ前記微小穴で、前記対象細胞を吸引して、前記対象細胞を保持することを特徴とする細胞保持機構。
【請求項２】
前記微小穴は、一列に配列されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞保持機構。
【請求項３】
基板と、前記基板に配置され、前記基板の先端側の部分が尖鋭に形成されている電極と、前記電極に所定周期でオンオフを繰り返す電流を送る電源とを備え、前記電源から前記電極にオンオフが繰り返された電流を供給することで、前記電極の尖鋭な先端部分の周囲にミクロ制御の発熱乱流を発生させることを特徴とする穿孔形成機構。
【請求項４】
前記基板は、先端部が、先端に向かうに従って幅が狭くなる形状であることを特徴とする請求項３に記載の穿孔形成機構。
【請求項５】
対象細胞を含有する試料を保持する試料保持部材と、
請求項１または２に記載の細胞保持機構、及び、請求項３または４に記載の穿孔形成機構との少なくとも一方を有することを特徴とする細胞穿孔装置。
【請求項６】
請求項１または２に記載の細胞保持機構、及び、請求項３または４に記載の穿孔形成機構の少なくとも一方と、
前記細胞保持機構及び穿孔形成機構の少なくとも一方を移動させ操作する操作機構とを有することを特徴とするマニピュレータ。
【請求項７】
対象細胞を含有する試料を保持する試料保持部材と、
請求項１または２に記載の細胞保持機構、及び、請求項３または４に記載の穿孔形成機構の少なくとも一方と、
前記細胞保持機構及び穿孔形成機構の少なくとも一方を移動させ操作する操作機構とを有することを特徴とするマニピュレーションシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を保持する細胞保持機構、細胞に穿孔を形成する穿孔形成機構及び、それを有する細胞穿孔装置、マニピュレータ、マニピュレーションシステムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーの分野では、微小な対象物に微細な操作を行う、体外で卵細胞を受精させる体外授精、体細胞に他の細胞の核を移植する体細胞核移植、細胞の内部細胞塊を取り出す内部細胞塊単離などがある。これら体外授精、体細胞核移植、内部細胞塊単離では、細胞の内部に物質を混入させたり、細胞の内部の物体を取り出したりするために、細胞膜に穿孔を形成する。
【０００３】
例えば、特許文献１には、配管内に流体が充填されるマイクロピペットと、流体に接触するダイヤフラムを介して配置される圧電素子とこの圧電素子を駆動する駆動電源とを備え、圧電素子の駆動によりマイクロピペット内の流体を駆動するマイクロマニピュレーション装置が記載されている。このマイクロマニピュレーション装置は、吸着孔を有する保持ピペットによって卵細胞を固定する。その卵細胞の透明帯にマイクロピペットの先端を接触させた後、ダイヤフラムによりマイクロピペット内を負圧にして、卵細胞の微小部分を吸着して、その微小部分を弱体化させ穿通する。その後、マイクロピペットにより、細胞の内容物を吸引したり、あるいは、外部から薬液、ＤＮＡ溶液、静止、細胞の核等の物質を注入したりする。
【０００４】
また、細胞膜に穿孔を形成する方法としては、例えば、特許文献２に、哺乳動物から採取された未受精卵の周囲を覆う透明帯であって、前記未受精卵の細胞収縮処理により、該細胞質と透明帯との間の囲卵腔の容積が最大となる透明帯部位に対し、レーザ光線を所定波長、所定出力および所定パルス幅の穿孔条件下において照射し、該透明帯を貫通するほぼ円形状の穿孔を形成させることを特徴とする哺乳動物の透明帯穿孔卵の作製方法が記載されている。
【０００５】
【特許文献１】特開平８−２９０３７７号公報
【特許文献２】特許第４１３８４５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ここで、特許文献１に記載の装置では、保持ピペットを用いて１つの卵細胞等の穿孔を形成する細胞（以下「対象細胞」という。）を保持し、保持された卵細胞に穿孔を形成する。そのため、連続して複数の対象細胞に穿孔を形成する場合は、対象細胞の保持、穿孔、解放を繰り返す必要があり、作業効率がよくないという問題がある。また、吸引により穿孔を形成する場合は、一度の作業により、吸引して、穿孔を形成することができる数に限りがあるという問題もある。また、特許文献１に記載されている保持ピペットを複数本配置することで、複数の対象細胞に連続して穿孔を形成することも考えられるが、保持ピペットの構造上、保持ピペットの保持部と、隣接する保持ピペットの保持部との間隔が大きくなるため、対象細胞を観察するための顕微鏡の視野から外れてしまう。そのため、他の対象細胞を観察しつつ、穿孔をするためには、視野の移動を行う必要があるため、この点においても、作業効率を高くすることができない。
【０００７】
また、特許文献２に記載されている装置のように対象細胞にレーザを照射して穿孔を形成する方法では、レーザを貫通させて穿孔を形成するため、穿孔を形成した部分はスリット状の穴となる。そのため、穿孔を一定の大きさよりも小さくすることが困難であるという問題がある。また、特許文献１に記載されているようにマイクロピペットで穿孔を形成する場合も、マイクロピペットの構造上、穿孔を一定の大きさよりも小さくすることが困難である。また、対象細胞にマイクロピペットを差し込むため、操作者の熟練度によって成功率が大きく変化し、熟練度の低い操作者が捜査すると、対象細胞を使用不可能な状態にしてしまうこともある。
【０００８】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、対象細胞に効率よくかつ好適に穿孔を形成することができる細胞保持機構を提供することを目的とする。また、本発明は、操作者の熟練度によらず、より小さい穿孔を形成することができ、かつ、穿孔時に対象細胞に与える影響をより小さくできる穿孔形成機構を提供することを他の目的とする。また、これらを有する細胞穿孔装置、マニピュレータ、マニピュレーションシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明は、細胞保持機構であって、複数の微小穴が列上に形成された板状部材と、該微小穴を負圧にする吸引機構とを備え、それぞれ前記微小穴で、前記対象細胞を吸引して、前記対象細胞を保持することを特徴とする。ここで、前記微小穴は、一列に配列されていることが好ましい。
【００１０】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明は、穿孔形成機構であって、基板と、前記基板に配置され、前記基板の先端側の部分が尖鋭に形成されている電極と、前記電極に所定周期でオンオフを繰り返す電流を送る電源とを備え、前記電源から前記電極にオンオフが繰り返された電流を供給することで、前記電極の尖鋭な先端部分の周囲にミクロ制御の発熱乱流を発生させることを特徴とする。ここで、前記基板は、先端部が、先端に向かうに従って幅が狭くなる形状であることが好ましい。
【００１１】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明は、細胞穿孔装置であって、対象細胞を含有する試料を保持する試料保持部材と、上記のいずれかに記載の細胞保持機構、及び、上記のいずれかに記載の穿孔形成機構との少なくとも一方を有することを特徴とする。
【００１２】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明は、マニピュレータであって、上記のいずれかに記載の細胞保持機構、及び、上記のいずれかに記載の穿孔形成機構の少なくとも一方と、前記細胞保持機構及び穿孔形成機構の少なくとも一方を移動させ操作する操作機構とを有することを特徴とする。
【００１３】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明は、マニピュレーションシステムであって、対象細胞を含有する試料を保持する試料保持部材と、上記のいずれかに記載の細胞保持機構、及び、上記のいずれかに記載の穿孔形成機構の少なくとも一方と、前記細胞保持機構及び穿孔形成機構の少なくとも一方を移動させ操作する操作機構とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明にかかる穿孔形成機構は、若しくは、操作者の熟練度、技術によらず、より小さい穿孔を形成することができるという効果を奏する。また、本発明にかかる細胞保持機構は、対象細胞を効率よく短時間で検出することができ、かつ対象細胞に好適に穿孔を形成することができるという効果を奏する。また、本発明に係る細胞穿孔装置、マニピュレータ、マニピュレーションシステムは、これらの少なくとも一方の効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明にかかる細胞保持機構、穿孔形成機構及び、それを有する細胞穿孔装置、マニピュレータ、マニピュレーションシステムの一実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施形態によりこの発明が限定されるものではない。例えば、以下に示す実施形態では、細胞を保持する機能、及び、細胞に穿孔を形成する機能を特に有するマニピュレーションシステムとして説明するが、細胞を保持する機能及び／または細胞に穿孔を形成する機能以外の機能も有するマニピュレーションシステムにも用いることができる。つまり、細胞を保持する、及び／または、細胞に穿孔を形成する以外の機能も有しており、使用目的に応じて、使用する機能を切り換える、多機能なマニピュレーションシステムとしても用いることができる。
【００１６】
図１は、本発明のマニピュレーションシステムの一実施形態の概略構成を模式的に示す正面図であり、図２は、図１に示すマニピュレーションシステムの概略構成を示す斜視図である。また、図３−１は、図１に示すマニピュレーションシステムの試料保持部材の概略構成を示す斜視図であり、図３−２は、図３−１に示す試料保持部材の概略構成を示す上面図であり、図３−３は、図３−１に示す試料保持部材の概略構成を示す断面図である。図１及び図２に示すマニピュレーションシステム１０は、試料保持部材１１と、画像取得手段１２と、細胞保持手段１４と、穿孔形成手段１６と、第１操作手段１８と、第２操作手段２０と、移動手段２４と、これらの各手段を支持する支持体２６とを有する。
【００１７】
試料保持部材１１は、試料５４を保持する皿状の部材である。なお、試料保持部材１１は、保持している試料５４の状態を撮影できるように、透明の部材で構成されている。ここで、試料保持部材１１としては、シャーレを用いることができる。また、試料（ドロップ）５２は、図３−２及び図３−３に示すように内部に対象細胞Ｃが分散された液体、またはゲル状の物質である。ここで、対象細胞Ｃとしては、卵細胞、体細胞等が例示される。
【００１８】
画像取得手段１２は、撮影手段３０と、焦点合わせ機構３２とを有し、視野内の状態を拡大して観察することができる顕微鏡システムであり、試料保持部材１１に保持された試料５４の画像を取得する。また、画像取得手段１２は、上記構成以外にも、顕微鏡システムとしての種々の機構を備えており、例えば、撮影手段３０で撮影した画像を表示させるモニタ、また、撮影手段３０で観察する領域と同じ領域を肉眼で、モニタを介さずに確認するための接眼レンズも有する。撮影手段３０は、一定の視野を有するカメラであり、試料保持部材１１の視野内に配置された部分を撮影し画像として取得する。また、撮影手段３０は、操作者からの入力、予め決められた設定等に応じて、撮影した画像をモニタに表示させる。なお、撮影手段３０は、試料保持部材１１に保持された試料５４を観察する際の倍率を複数の倍率の中から選択することができる。焦点合わせ機構３２は、撮影手段３０の焦点合わせを行う機構であり、電動のアクチュエータで構成されている。ここで、電動のアクチュエータとしては、焦点合わせのつまみを電動で回転させ、レンズの位置、レンズ間の距離を調整する機構が例示される。
【００１９】
次に、図４、図５−１から図５−３とともに細胞保持手段１４について説明する。ここで、図４は、図１に示すマニピュレーションシステムの細胞保持手段の概略構成を示す斜視図である。また、図５−１は、図４に示す細胞保持手段の冶具の概略構成を示す上面図であり、図５−２は、図４に示す細胞保持手段の冶具の概略構成を示す側面図であり、図５−３は、図４に示す細胞保持手段の冶具の概略構成を示す正面図である。図４、図５−１から図５−３に示すように、細胞保持手段１４は、加工板３４と、スペーサ３６と、冶具３８と、吸引ポンプ４０とを有し、試料保持部材１１に保持されている試料５４の対象細胞Ｃを支持する。
【００２０】
加工板３４は、板状部材であり、正面（面積が最も広い面）の鉛直方向下側には、複数の貫通孔（微小穴）３４ａが列上に複数個形成されている。この貫通孔３４ａは、水平方向に一列に形成されている。ここで、この貫通孔３４ａは、開口径が対象細胞Ｃの直径よりも小さい孔である。また、貫通孔３４ａと隣接する貫通孔３４ａとの間隔は、対象細胞Ｃの直径よりも長い。また、貫通孔３４ａは、種々の形成方法で形成すればよい。例えば、微小ドリルで穴加工することで加工板３４に貫通孔３４ａを形成してもよいし、加工板３４にシリコン基板を用い、半導体プロセスにより加工板３４に貫通孔３４ａを形成してもよい。
【００２１】
スペーサ３６は、加工板３４の一方の面に接合された、枠状の部材であり、加工板３４の縁の近傍を支持している。なお、スペーサ３６は、加工板３５の貫通孔３４ａが形成されている部分は、スペーサ３６の中空の部分と重なるように中空部分が形成されている。また、スペーサ３６は、加工板３４と接合されている面以外の面は、後述する冶具３８に覆われている。
【００２２】
冶具３８は、図５−１から５−３に示すように、内部に空洞３８ａが形成された箱型の部材であり、スペーサ３６、加工板３４と接合される部分が凸部となっている。この冶具３８の空洞は、冶具３８の表面に形成された２つの開口３８ｂ、３８ｃと連結されており、一方の開口３８ｂには、後述する吸引ポンプと連結され、他方の開口３８ｃは、スペーサ３６と加工板３４とで形成される空洞３８ａに連結されている。また、冶具３８は、上述したようにスペーサ３６の加工板３４と接合されている面以外の面を覆った形状であり、冶具３８とスペーサ３６と加工板３４とで囲まれた空間は、貫通孔３４ａと開口３８ｃ以外の部分は、各部材により閉じられた形状となっている。また、細胞保持手段１４の冶具３８は、後述する第１操作手段１８により支持されている。
【００２３】
吸引ポンプ４０は、冶具３８の空洞３８ａと連結されており、冶具３８内の空気、液体を吸引して、冶具３８に形成された空洞３８ａを負圧にする。ここで、吸引ポンプ４０としては、空気及び／または液体を吸引する種々のインジェクタ、ポンプを用いることができ、例えば、注射器のような構成の吸引器を用いることができる。また、吸引ポンプ４０は、電動で吸引できる機構とすることが好ましいが、手動で吸引する機構でもよい。さらに吸引ポンプ４０は、より適切に装置を制御できるため、吸引する圧力を調整できる機構であることが好ましい。
【００２４】
細胞保持手段１４は、以上のような構成であり、吸引ポンプ４０により冶具３８内の空気、液体を吸引して、空洞３８ａを負圧にすることで、空洞３８ａと開口３８ｃを介して繋がっている冶具３８とスペーサ３６と加工板３４とで囲まれた空間を負圧（陰圧）にする。冶具３８とスペーサ３６と加工板３４とで囲まれた空間が負圧になることで、各貫通孔３４ａには、一定の吸引力（外部の物質を吸引する力）が発生する。この貫通孔３４ａに発生させた吸引力により、試料５４内の対象細胞Ｃを吸引することで保持する。また、吸引ポンプ４０を駆動し、空洞３８ａ内を陽圧とすることで、貫通孔３４ａで保持していた対象細胞Ｃを解放（リリース）する。
【００２５】
また、細胞保持手段１４は、１つの貫通孔３４ａに、１つの対象細胞Ｃのみを保持し、複数の対象細胞Ｃは保持しない。また、複数の貫通孔３４ａの全てに対象細胞Ｃを保持させることが好ましいが、複数の貫通孔３４ａのうちいくつかの貫通孔３４ａに対象細胞Ｃが保持されている状態になる場合もある。また、本実施形態では、冶具３８を２つの直方体を連結させた形状としたが、冶具３８は、吸引ポンプ４０と、加工板３４の貫通孔３４ａとを繋げていればよく、形状は特に限定されない。また、本実施形態では、冶具３８とスペーサ３６と加工板３４とを別々の部材としたが、一体として設けてもよい。
【００２６】
次に、図６−１から図６−３とともに穿孔形成手段１６について説明する。ここで、図６−１は、図１に示すマニピュレーションシステムの穿孔形成手段の概略構成を示す正面図であり、図６−２は、図６−１に示す穿孔形成手段の基板の概略構成を示す側面図であり、図６−３は、図６−１に示す穿孔形成手段の基板の概略構成を示す上面図である。図６−１から図６−３に示すように、穿孔形成手段１６は、基板４２と、電極４４と、電源４６とを有し、細胞保持手段１４に保持された対象細胞に穿孔を形成する。
【００２７】
基板４２は、基部４２ａと、基部４２ａの先端に設けられた先端部４２ｂとで構成されている。なお、本実施形態では、基部と先端部とは一体で成型されている。基部４２ａは、細長い角柱であり、先端部４２ｂは、基部４２ａよりも厚みが薄く、かつ、厚みに直交する方向の辺の長さが先端に向かうに従って徐々に短くなる形状である。つまり、基板４２の先端部は、図６−１に示すように一方の面（厚みに直交する方向の面）が三角形となり、図６−２に示すように他方の面（厚みを示す方向の面）が基部４２ａよりも厚みが薄い長方形形状となる。基板４２には、シリコンで作製した基板や、その他、電気を通さない材料で作製した種々の基板を用いることができる。
【００２８】
電極４４は、基板４２の厚みに直交する面、つまり先端部４２ｂが三角形となる方向の面の外縁に沿って形成されている線状の電極である。電極４４は、基板４４の基部４２ａの先端部４２ｂとは反対側の端部から一方の縁に沿って先端部４２ｂに向かって伸び、先端部４２ｂの三角形の頂点を通り、基部４２ｂの頂点を通るまでとは反対側の縁にそって、基部４２ａの先端部４２ｂとは反対側の端部まで形成されている。つまり、電極４４は、線状の両端部が、基部４２ａの先端部４２ｂとは反対側の端部に設けられている。ここで、電極４４には、白金、銀種々の金属を用いることができる。
【００２９】
電源４６は、電極４４の両方の端部にそれぞれ接続されており、電極に一定電圧かつ一定電流の電気を流す。なお、電源４６は、電極４４に電気を流すことと電気を流さないことを繰り返す。つまり、方形波状の電流電圧を流すことができる電源である。なお、穿孔形成手段１６の基板４２と電極４４とは、後述する第２操作手段２０により支持されている。
【００３０】
穿孔形成手段１６は、以上のような構成であり、電源４６から電極４４に方形波状の電流電圧を流すことで、電極４４は、電気が流れている状態と、流れていない状態が繰り返される。ここで、電極４４は、電気が流れている状態では、加熱され、電気が流れていない状態では断熱される。これを試料５４内で繰り返すことにより、電極４４の周囲に乱流波を発生させることができ、この乱流波が発生した状態の電極４４の先端を対象細胞Ｃに近づけることで、対象細胞Ｃに穿孔を形成することができる。
【００３１】
第１操作手段１８は、細胞保持手段１４の冶具３８、スペーサ３６、加工板３４の位置、特に加工板３４に形成されている貫通孔３４ａの位置を３次元で操作する機構であり、支持体２０に設けられている。また、第２操作手段２０は、穿孔形成手段１６の基板４２と、電極４４の位置、特に電極４４の先端の位置を３次元で操作する機構であり、試料保持部材１１を介して、第１操作手段１８とは反対側に設けられている。ここで、操作手段としては、ＸＹＺステージ、ロボットアーム等種々の操作機構を用いることができる。また、第１操作手段１８は、細胞保持手段１４の冶具等を着脱可能な状態で支持しており、第２操作手段２０は、穿孔形成手段１６の基板等を着脱可能な状態で支持している。なお、第１操作手段１８及び第２操作手段２０は、手動で駆動する機構でも電動で駆動する機構でもよいが、より正確かつ精密に細部保持手段１４及び穿孔形成手段１６の位置を制御できるため、電動で駆動する機構とすることが好ましい。
【００３２】
移動手段２４は、試料台５０と、ステージ移動機構５２とを有し、試料保持部材１１を水平方向に移動させる。なお、移動手段２４は、電動で試料保持部材１１を移動させる手段である。
【００３３】
試料台５０は、試料保持部材１１を支持する板状部材であり、試料保持部材１１を支持する領域のうち、中心部近傍には開口が形成されている。試料台５０は、試料保持部材１１の側面と底面の外周部分を支持し、試料保持部材１１を試料台５０の所定位置に固定する。
【００３４】
ステージ移動機構５２は試料台５０を水平方向に移動させるＸＹステージである。ステージ移動機構５２は、試料台５０を支持し、試料台５０を水平方向において所定の１方向（以下「Ｙ軸方向」とする。）に移動させるＹ軸移動機構と、Ｙ軸移動機構を介して試料台５０を支持し、試料台５０及びＹ軸移動機構を水平方向においてＹ軸方向に直交する方向（以下「Ｘ軸方向」とする）に移動させるＸ軸移動機構とで構成されている。なお、移動機構としては、ステージに固定されたナット、ナットと螺合したボールねじ、ボールねじを回転させる回転モータ、ステージの移動方向に延びて配置されたレール上の部材でありステージを案内する案内部材とを有し、回転モータによりボールねじを回転させてナット及びステージを案内部材に沿って移動させる機構を用いることができる。また、移動機構としては、この他、種々の移動機構を用いることができ、例えば、超音波リニアモータを用いる移動機構、静電アクチュエータを用いる移動機構等も用いることができる。マニピュレーションシステム１０は、基本的に以上のような構成である。
【００３５】
次に、図７−１から図７−３、図８−１から図８−５及び図９−１から図９−４を用いて、マニピュレーションシステム１０の動作、つまり、マニピュレーションシステム１０の作用について説明する。ここで、図７−１は、細胞保持手段と穿孔形成手段と対象細胞との関係を示す上面図であり、図７−２は、細胞保持手段と穿孔形成手段と対象細胞との関係を示す断面図であり、図７−３は、細胞保持手段と穿孔形成手段と対象細胞との関係を示す部分拡大図である。また、図８−１から図８−５及び図９−１から図９−４は、それぞれ、マニピュレーションシステム１０の動作を説明するための説明図である。
【００３６】
まず、準備として、試料保持部材１１に、対象細胞Ｃを含有する試料５４を滴下し、試料保持部材１１上に試料５４が載置された状態とする。その後、試料保持部材１１を試料台５０の所定位置に設置する。なお、試料５４の載置と、試料台５０への設置との順序は逆でもよい。
【００３７】
マニピュレーションシステム１０は、試料５４が載置された試料保持部材１１が試料台５０に設置されたら、第１操作手段１８に細胞保持手段１４を装着し、第２操作手段２０に穿孔形成手段１６を装着する。その後、細胞保持手段１４の加工板３４と、穿孔形成手段１６の電極４４の先端が、画像取得手段１２で撮影できる視野内に入るように、第１操作手段１８で細胞保持手段１４を移動させ、第２操作手段２０で穿孔形成手段１６を移動させる（図３−１参照）。
【００３８】
マニピュレーションシステム１０は、細胞保持手段１４と穿孔形成手段１６を所定の位置に移動させたら、細胞保持手段１４の吸引ポンプ４０を作動させ、冶具３８の空洞３８ａを負圧にし、各貫通孔３４ａに吸引力を発生させる。貫通孔３４ａに吸引力を発生させることで、試料５４の液体が吸引され、対象細胞Ｃが貫通孔３４ａ側に移動される。貫通孔３４ａ側に移動され、貫通孔３４ａと接触した対象細胞Ｃは、貫通孔３４ａで発生している吸引力により、貫通孔３４ａに保持される。このようにして、各貫通孔３４ａのそれぞれで対象細胞Ｃが保持され、図７−１から図７−３に示すように複数の対象細胞Ｃが加工板３４の貫通孔３４ａにそれぞれ保持された状態となる。ここで、図７−１及び図７−３に示すように、細胞保持手段１４の加工板３４と、穿孔形成手段１６の電極４４の先端は、画像取得手段１２で撮影できる視野５６内に配置されている。マニピュレーションシステム１０は、貫通孔３４ａに対象細胞Ｃを保持させたら、電極４４の先端と対象細胞Ｃとを鮮明に認識できるように、焦点合わせ機構３２により撮影手段３０の焦点を調整する。
【００３９】
その後、マニピュレーションシステム１０は、穿孔を形成する対象細胞Ｃ（本実施形態では、図７−３中一番上側の対象細胞Ｃ）を決定する。そして、第１操作手段１８により細胞保持手段１４を移動させ、図８−１に示すように、穿孔を形成する対象細胞Ｃを穿孔形成手段１６に対向させる。その後、マニピュレーションシステム１０は、第２操作手段２０により穿孔形成手段１６を移動させ、穿孔形成手段１６の電極４４の先端を対象細胞Ｃに近づける。ここで、対象細胞Ｃが卵細胞の場合は、電極４４の先端を対象細胞Ｃの透明帯に近づける。
【００４０】
マニピュレーションシステム１０は、電極４４の先端を対象細胞Ｃに近づけたら、電源４６を作動させ、電極４４に方形波状の電圧電流を流す、つまり、電極４４に電界をかける。このように、電極４４に方形波状の電圧電流を流すことで、電極４４が発熱、断熱を繰り返し、電極４４の周りに対流、乱流が発生し、この対流、乱流により、電極４４の先端に対向した位置に配置された対象細胞Ｃに穿孔を形成する。
【００４１】
マニピュレーションシステム１０は、対象細胞Ｃに穿孔を形成したら、次に、第１操作手段１８により細胞保持手段１４を貫通穴３４ａのピッチ分移動させる。つまり、穿孔形成手段１６を、今まで対向していた貫通孔３４ａに隣接している貫通孔３４ａと対向するように細胞保持手段１４を移動させる。これにより、図８−２に示すように、穿孔を形成した対象細胞Ｃに隣接した対象細胞Ｃ（本実施形態では、図８−２中上から２番目の対象細胞Ｃ）が、穿孔形成手段１６に対向した状態となる。また、必要に応じて、第２操作手段２０により穿孔形成手段１６を移動させ、穿孔形成手段１６の電極４４の先端と対向する対象細胞Ｃとの距離を調整する。具体的には、電極４４の先端と、電極に対向する対象細胞Ｃとの距離が所望の範囲にない場合に調整する。マニピュレーションシステム１０は、電極４４の先端を対象細胞Ｃに近づけたら、電源４６を作動させ、電極４４に方形波状の電圧電流を流し、電極４４の先端に対向する位置の対象細胞Ｃに穿孔を形成する。
【００４２】
マニピュレーションシステム１０は、対象細胞Ｃに穿孔を形成したら、次に、第１操作手段１８により細胞保持手段１４を貫通穴３４ａのピッチ分移動させ、図８−３に示すように、穿孔を形成した対象細胞Ｃに隣接した対象細胞Ｃ（本実施形態では、図８−３中上から３番目の対象細胞Ｃ）が、穿孔形成手段１６に対向した状態とし、上述と同様の操作で、図８−３中上から３番目の対象細胞Ｃに穿孔を形成する。マニピュレーションシステム１０は、このような操作を繰り返し、図８−４、図８−５に示すように、貫通孔３４ａに保持されている対象細胞Ｃを、順番に穿孔形成手段１６の電極４４の先端と対向する位置に移動させ、穿孔形成手段１６により各対象細胞に穿孔を形成する。
【００４３】
マニピュレーションシステム１０は、細胞保持手段１４で保持している全ての対象細胞Ｃに穿孔を形成したら、移動手段２４により試料保持部材１１を移動させ、細胞保持手段１４を試料５４が配置されている領域のうち穿孔が形成されていない対象細胞Ｃがない領域に移動させる。つまり、移動手段２４により、試料保持部材１１を図９−１の位置から図９−２に示す位置に移動させる。その後、マニピュレーションシステム１０は、図９−３に示すように、吸引ポンプ４０を駆動して陽圧にして、貫通孔３４ａから対象細胞Ｃを解放、つまりリリースする。これにより、穿孔が形成された対象細胞Ｃと、穿孔が形成されていない対象細胞Ｃとを試料５４中に別々の領域に配置することができる。
【００４４】
その後、マニピュレーションシステム１０は、図９−４に示すように、試料５４が配置されている領域のうち穿孔が形成されていない、つまり、未穿孔の対象細胞Ｃがある領域に細胞保持手段１４が配置されるように、移動手段２４により試料保持部材１１を移動させる。その後、細胞保持手段１４を駆動させ、未穿孔の対象細胞を貫通孔３４ａに吸引して保持し、穿孔形成手段１６により対象細胞Ｃに穿孔を形成する。さらに、細胞保持手段１４で保持している全ての対象細胞Ｃに穿孔を形成したら、移動手段２４により試料保持部材１１を移動させ、穿孔が形成された対象細胞Ｃのみがある領域に細胞保持手段１４が保持している対象細胞Ｃを解放する。細胞穿孔手段１０は、試料５４に分散された全ての対象細胞Ｃに穿孔を形成するまで、上記動作を繰り返すことにより、試料５４に分散された対象細胞Ｃに穿孔を形成する。
【００４５】
このように、マニピュレーションシステム１０は、複数の貫通孔３４ａが列状に形成された細胞保持手段１４により、複数の対象細胞Ｃを保持し、保持した対象細胞Ｃに穿孔を形成することで、複数の対象細胞Ｃに連続して穿孔を形成することができる。これにより、短時間で効率よく対象細胞Ｃに穿孔を形成することができる。また、加工板に一定間隔で複数の貫通孔を形成することで、撮影手段３０の視野５６内により多くの対象細胞Ｃを表示させることができる。これにより、各貫通孔に対象細胞Ｃが保持されているか否かの確認を容易に行うことができ、操作性を向上させることができる。また、第１操作手段１８、第２操作手段２０、移動手段２４による移動量も小さくすることができる。
【００４６】
また、マニピュレーションシステム１０は、先端を尖鋭化させた形状、また、線形状ではなく点形状（つまりアスペクト比が高くない形状）とした電極４４に方形波状の電圧電流を与え、電極４４の先端の周辺に発生させた発熱乱流により対象細胞Ｃに穿孔を形成することで、対象細胞Ｃにより小さい穿孔を形成することができる。また、対象細胞Ｃと電極４４の先端との距離を調整することのみで、対象細胞Ｃに穿孔を形成することができ、穿孔形成手段１６を複雑に移動させる必要がないため、操作者の熟練度によらず適切な穿孔を形成することができる。
【００４７】
ここで、マニピュレーションシステム１０では、穿孔形成手段１６の基板４２、電極４４の形状を長方形の先端に三角形を繋げた形状としたが、本発明はこれに限定されない。基板４２の形状は特に限定されず、また、電極は先端が尖鋭な形状であれば種々の形状とすることができる。以下、図１０−１から図１０−３を用いて、穿孔形成手段の基板及び電極の他の形状について説明する。ここで、図１０−１から図１０−３は、それぞれ穿孔形成手段の基板及び電極の他の一例の概略構成を示す正面図である。なお、図１０−１から図１０−３には、電極及び基板の先端部分のみを示している。
【００４８】
例えば、図１０−１に示すように基板１０２の先端部を細長い長方形形状とし、電極１０４をその長方形の外周に沿って形成した形状としてもよい。なお、基板１０２は、基板４２と同様に、図示している先端部は、先端部よりも厚みが厚く及び幅が広い基部によって支持されている。また、この基板１０２の先端部は、十分に細い形状となっている。この点は、図１０−２及び図１０−３に示す例でも同様である。このように先端に配置される電極を幅のある形状としても、基板１０２及び電極１０４の先端部の幅を十分に狭い形状とすることで、小さい穿孔を形成することができる。
【００４９】
また、図１０−２に示すように、基板１１２の先端部を三角形形状とし、電極１１４を三角形の外周に沿って形成され、かつ、先端に向かうにしたがって徐々に幅が薄くなる形状としてもよい。つまり、先端部の電極１１４を最先端が最も幅が短く、最先端から離れるに従って幅が広くなる形状としてもよい。このように電極１１４の先端を細くすることで、先端で発生する乱流波の大きさを小さくすることができ、より小さな穿孔を対象細胞に形成することができる。
【００５０】
また、図１０−３に示すように基板１２２の先端部を先端に向かうに従って幅が狭くなる台形形状とし、電極１２４をその台形の下底以外の面に沿って形成した形状としてもよい。このように先端に配置される電極を幅のある台形形状としても、基板１２２及び電極１２４の先端部の幅を十分に狭い形状とすることで、小さい穿孔を形成することができる。
【００５１】
また、試料保持部材の対象細胞の操作時に細胞保持手段が移動する領域には、溝を形成することが好ましい。以下、図１１−１から図１１−３を用いて説明する。ここで、図１１−１は、試料保持部材の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、図１１−２は、図１１−１に示す試料保持部材の概略構成を示す拡大斜視図であり、図１１−３は、図１１−１に示す試料保持部材の概略構成を示す部分拡大図である。図１１−１から図１１−３に示すように、試料保持部材７０は、対象細胞Ｃの操作時に細胞保持手段１４の冶具３８、加工板３４等が移動する領域に溝７２が形成されている。ここで、対象細胞Ｃの操作時とは、対象細胞Ｃを細胞保持手段１４で吸引、保持している時や、移動させている時である。溝７２は、図１１−３に示すように、細胞保持手段１４の下面が溝７２にはめ込まれた際に、貫通孔３４ａが試料保持部材７０の溝７２以外の部分の面よりも上となる、つまり溝７２により貫通孔３４ａが隠れない深さとなっている。このように、試料保持部材７０に溝７２を形成することで貫通孔３４ａと対象試料Ｃとの鉛直方向の距離をより近づけることができ、貫通孔３４ａにより対象細胞Ｃをより保持しやすくすることができる。
【００５２】
ここで、マニピュレーションシステム１０は、上述した各種動作、つまり、対象細胞の保持、穿孔形成、移動等を操作者の操作により行ってもよいし、設定されたプログラム、処理条件に基づいて自動で行うようにしてもよい。
【００５３】
操作者の操作で行う場合、操作者による指示入力方法、操作方法は特に限定されず、ジョイスティック、ボタン、スイッチ、キーボード、マウス等種々の操作手段、入力手段を用いることができる。マニピュレーションシステム１０は、入力された指示に基づいて、制御装置で演算を行い、各部を操作する。また、マニピュレータや、移動手段は、上述したように電動で操作する機構とすることが好ましいが、手動で操作するような機構としてもよい。
【００５４】
また、マニピュレーションシステム１０が、自動で各種操作を行う場合は、撮影手段３０で試料５４を撮影して、試料５４の画像を取得し、取得した画像を画像処理することで、試料５４内に含まれる対象細胞の数、対象細胞の位置等を検出することができる。例えば、画像を２値化し、閾値の設定により、試料の溶媒と対象細胞Ｃとを分離し、対象細胞Ｃを検出する。このとき、対象物質Ｃとして検出する大きさや形状の基準を設定しておくことで、試料中に混入している対象細胞Ｃ以外の物質は、対象細胞Ｃとして検出しないようにすることができる。また、細胞保持手段１４により対象細胞が所望位置に保持されているか否かも撮影手段３０により画像を収録し、取得した画像に基づいて判定すればよい。穿孔形成手段１４による穿孔形成時も同様に画像を取得し、その画像を処理することで、穿孔が形成されたか否かを検出し、その結果に基づいて、穿孔形成手段１４の位置を制御すればよい。また、自動化した処理は、画像に基づいて判定することに限定されず、例えば、細胞保持手段１４で対象細胞を保持しているか否かは、吸引ポンプにかかる圧力や、冶具に流れる液体の流量に基づいて判定することもできる。また、穿孔形成手段１４は、対象細胞の大きさにかかわらず、貫通孔との相対位置を設定し、その設定された位置で電極に電圧電流を与え、対象細胞に穿孔を形成するようにしてもよい。
【００５５】
また、マニピュレーションシステム１０の移動手段２４は、上述したように種々の移動機構を用いることができるが、上記移動機構に加え、特開２００８−２３３５４５号公報に記載されているような、圧電素子を使用した微細機構（「ナノポジショナ」ともいう。）を組み合わせることが好ましい。上述した移動機構により、試料保持部材１１の大まかな位置を調整し、微細機構により、試料保持部材１１の微細な位置を調整することで、対象細胞と照射位置との位置合わせをより精密に行うことができる。
【００５６】
また、上記実施形態では、穿孔形成手段の電極を先端部が１つとなる形状とし、１つずつの対象細胞に穿孔を形成したが、本発明はこれに限定されず、電極を、加工板の貫通孔、つまり、対象細胞の保持位置の間隔に対応した複数の先端部を有する形状とし、貫通孔に対応した複数個所で、同時に乱流波を発生させ、複数の対象細胞に同時に穿孔を形成するようにしてもよい。つまり、貫通孔に対応して、穿孔を形成する機構を複数設け、同時に複数の対象細胞に穿孔を形成するようにしてもよい。これにより、より短時間で効率よく、対象細胞に穿孔を形成することができる。
【００５７】
また、より小さい穿孔を形成できるという効果を得ることができなくなるが、穿孔形成手段としては、先端が尖鋭な電極に方形波的な電圧電流を供給し、電極の周囲で発生させる乱流波により穿孔を形成する手段以外の手段を用いてもよい。例えば、穿孔形成手段として、レーザ光発射機構を有し、試料保持部材１１が設置される領域の所定位置（以下「照射位置」という。）に配置された対称細胞に向けてレーザ光を発射することで、対象細胞に穿孔を形成する手段を用いることもできる。なお、レーザ光発射機構としては、ＸＹＣｌｏｎｅ（商品名、株式会社メトラン製）を用いることができる。
【００５８】
また、上記実施形態では、操作性が高くなり、作業効率もよくなるため、貫通孔を１列に形成したが、本発明はこれに限定されず、撮影手段で撮影した際に、対象細胞が重ならないように保持できればよい。例えば、細胞保持手段の冶具を階段形状とし、その階段の側面に貫通孔を形成し、各階段に対象細胞を保持させるようにしてもよい。
【００５９】
また、マニピュレーションシステムは、人間以外の細胞に穿孔を形成する場合に用いることが好ましいが、人間から取り出した細胞に穿孔を形成する場合にも用いることができる。
【００６０】
また、細胞保持手段（細胞保持機構）、穿孔形成手段（穿孔形成機構）は、操作手段に着脱可能としてもよい。さらに、細胞保持手段と操作手段を一体として、及び／または、穿孔形成手段と操作手段を一体としてマニピュレーションシステムに対して着脱可能としてもよい。また、本発明の細胞穿孔装置は、細胞保持機構と穿孔形成機構と試料保持部材とで構成される。また、本発明のマニピュレータは、細胞保持機構とその操作機構、穿孔形成機構とその操作機構、または、その両方とで構成される。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
以上のように、本発明にかかる細胞保持機構、穿孔形成機構及び、それを有する細胞穿孔装置、マニピュレータ、マニピュレーションシステムは、卵細胞や体細胞等の種々の細胞に穿孔を形成するのに有用であり、特に、複数の細胞に連続して穿孔を形成するのに適している。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明のマニピュレーションシステムの一実施形態の概略構成を模式的に示す正面図である。
【図２】図１に示すマニピュレーションシステムの概略構成を示す斜視図である。
【図３−１】図１に示すマニピュレーションシステムの試料保持部材の概略構成を示す斜視図である。
【図３−２】図３−１に示す試料保持部材の概略構成を示す上面図である。
【図３−３】図３−１に示す試料保持部材の概略構成を示す断面図である。
【図４】図１に示すマニピュレーションシステムの細胞保持手段の概略構成を示す斜視図である。
【図５−１】図４に示す細胞保持手段の冶具の概略構成を示す上面図である。
【図５−２】図４に示す細胞保持手段の冶具の概略構成を示す側面図である。
【図５−３】図４に示す細胞保持手段の冶具の概略構成を示す正面図である。
【図６−１】図１に示すマニピュレーションシステムの穿孔形成手段の概略構成を示す正面図である。
【図６−２】図６−１に示す穿孔形成手段の基板の概略構成を示す側面図である。
【図６−３】図６−１に示す穿孔形成手段の基板の概略構成を示す上面図である。
【図７−１】細胞保持手段と穿孔形成手段と対象細胞との関係を示す上面図である。
【図７−２】細胞保持手段と穿孔形成手段と対象細胞との関係を示す断面図である。
【図７−３】細胞保持手段と穿孔形成手段と対象細胞との関係を示す部分拡大図である。
【図８−１】マニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。
【図８−２】マニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。
【図８−３】マニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。
【図８−４】マニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。
【図８−５】マニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。
【図９−１】マニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。
【図９−２】マニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。
【図９−３】マニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。
【図９−４】マニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。
【図１０−１】穿孔形成手段の基板及び電極の他の一例の概略構成を示す正面図である。
【図１０−２】穿孔形成手段の基板及び電極の他の一例の概略構成を示す正面図である。
【図１０−３】穿孔形成手段の基板及び電極の他の一例の概略構成を示す正面図である。
【図１１−１】試料保持部材の他の一例の概略構成を示す斜視図である。
【図１１−２】図１１−１に示す試料保持部材の概略構成を示す拡大斜視図である。
【図１１−３】図１１−１に示す試料保持部材の概略構成を示す部分拡大図である。
【符号の説明】
【００６３】
１０  マニピュレーションシステム
１１、７０  試料保持部材
１２  画像取得手段
１４  細胞保持手段
１６  穿孔形成手段
１８  第１操作手段
２０  第２操作手段
２４  移動手段
２６  支持体
３０  撮影手段
３２  焦点合わせ機構
３４  加工板
３６  スペーサ
３８  冶具
４０  吸引ポンプ
４２、１０２、１１２、１２２  基板
４４、１０４、１１４、１２４  電極
４６  電源
５０  試料台
５２  ステージ移動機構
５４  試料
５６  視野
７２  溝
Ｃ  対象細胞
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
2010148461.tif 000024
【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
2010148461.tif 000028
【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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