(57)【要約】【課題】標識化合物及びこれを用いた検出方法を提供すること。【解決手段】標識化合物は、芳香族第三アミン化合物が生体分子と結合可能に構成されてなり、Ｓ1、Ｓ2の一方に、生体分子に結合可能な分子鎖１０（例えば、オリゴヌクレオチド）が結合された基、又は、生体分子に含まれる反応性基と共有結合する反応性基を含み、ｎは０又は１であり、Ｒ3はフェニル基又はナフチル基、Ａｒ1はフェニレン基又はナフチレンル、Ａｒ2はフェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントレン基の何れかである。生体分子に結合した標識化合物を励起して発生する蛍光を検出することによって、生体分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができる。【選択図】図１
2010048735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式［I］で示された芳香族第三アミン化合物が検査対象分子と結合可能なように構成されてなる標識化合物。
一般式［I］：
【化１】
2010048735.tif 000011
（但し、前記一般式［I］において、
ｎは０又は１であり、
Ｓ1、Ｓ2の一方は、主鎖部に下記ＧＰ１から選択された二価の基を含んでもよいアルキル鎖を含む二価のスペーサに、検査対象分子に結合可能な分子鎖が結合された分子鎖結合基、又は、下記ＧＰ３から選択された反応性基を含み、Ｓ1、Ｓ2の他方は下記Ｇｐ２から選択された基であり、
Ｒ1、Ｒ2は、同一又は異なってもよく、ヒドロ基、アルキル基、ヘテロ原子を含んでもよいアリール基から選択された基であり、
Ｒ3は、ヒドロ基、下記Ｇｐ２から選択された基を置換基として有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいビニル基から選択された基であり、
Ａｒ1、Ａｒ2は二価の基であり、同一又は異なってもよく、アリーレン基又はビニレン基であり、Ａｒ2は、アルキル基、アリール基、シアノ基、トリフルオロメチル基、ハロ基から選択された置換基を少なくとも一箇有し、ｎが１の場合、Ａｒ1とＲ1、又は／及び、Ａｒ2とＲ2が相同して環を形成していてもよく、
Ｇｐ１は二価の基であり、ヘテロ原子を含んでもよいアリーレン基、ビ二レン基、カルボニル基、オキシ基、オキシカルボニル基、チオ基、スルフィニル基、スルホニル基、イミノ基、ウリレン基、アミド基、シリレン基であり、
Ｇｐ２は一価の基であり、ヒドロ基、アルキル基、アリール基、置換基を含んでもよいビニル基、アミノ基、メルカプト基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、スルフィノ基、スルホ基、カルボキシ基、ハロ基であり、
Ｇｐ３は一価の基であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル基、イミドエステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、マレイミド基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリオキザル基、イミドエステル基、オキシラン基、トリアジン基、カルボジイミド基、アジリジン基、ハロゲン化アシル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化スルホニル基、ビニルスルホン基である。）
【請求項２】
Ａｒ1がフェニレン基であり、Ａｒ2が、フェニレン基、ナフチレン基、フェナントリレン基、アントリレン基の何れかであり、Ｒ1、Ｒ2がヒドロ基であり、前記一般式［I］が下記一般式［II］で示される、請求項１に記載の標識化合物。
一般式［II］：
【化２】
2010048735.tif 000012
【請求項３】
Ｓ2が前記分子鎖結合基である、請求項２に記載の標識化合物。
【請求項４】
Ｓ2が前記分子鎖結合基、Ｓ1が４−アミノスチリル基であり、前記一般式［I］が下記一般式［III］で示される、請求項２に記載の標識化合物。
一般式［III］：
【化３】
2010048735.tif 000013
（但し、Ｒ4、Ｒ5は、同一又は異なってもよく、ヒドロ基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基から選択された基である。）
【請求項５】
Ｓ2が前記分子鎖結合基であり、前記分子鎖結合基は、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10で置換されたフェニル基を含み、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10の何れか一つに前記Ｇｐ１を介して前記スペーサが結合しており、前記スペーサに前記Ｇｐ１を介して前記分子鎖が結合されてなり、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10の残りがヒドロ基であり、Ｒ3が、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15で置換されたフェニル基を含むアリール基であり、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15が前記Ｇｐ２から選択された基であり、これらのうち隣り合う基同士が相同して環を形成していてもよく、前記一般式［II］が下記一般式［IV］で示される、請求項２に記載の標識化合物。
一般式［IV］：
【化４】
2010048735.tif 000014
【請求項６】
Ｓ2が前記分子鎖結合基であり、前記分子鎖結合基は、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10で置換されたフェニル基を含み、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10の何れか一つに前記Ｇｐ１を介して前記スペーサが結合しており、前記スペーサに前記Ｇｐ１を介して前記分子鎖が結合されてなり、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10の残りがヒドロ基であり、Ｒ3が、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15で置換されたフェニル基を含むアリール基であり、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15が前記Ｇｐ２から選択された基であり、これらのうち隣り合う基同士が相同して環を形成していてもよく、Ｒ4が、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19、Ｒ20で置換されたフェニル基を有するアリール基であり、Ｒ5が、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ25で置換されたフェニル基を有するアリール基であり、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19、Ｒ20、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ25が前記Ｇｐ２から選択された基でありこれらのうち隣り合う基同士が相同して環を形成していてもよく、前記一般式［III］が下記一般式［V］で示される、請求項４に記載の標識化合物。
一般式［V］：
【化５】
2010048735.tif 000015
【請求項７】
Ｓ1が前記分子鎖結合基である、請求項２に記載の標識化合物。
【請求項８】
Ｓ2が、Ｒ26、Ｒ27、Ｒ28、Ｒ29、Ｒ30で置換されたフェニル基を有するアリール基であり、Ｒ3が、Ｒ31、Ｒ32、Ｒ33、Ｒ34、Ｒ35で置換されたフェニル基を有するアリール基であり、Ｒ26、Ｒ27、Ｒ28、Ｒ29、Ｒ30、Ｒ31、Ｒ32、Ｒ33、Ｒ34、Ｒ35が前記Ｇｐ２から選択された基であり、これらのうち隣り合う基同士が相同して環を形成していてもよく、前記一般式［III］が下記一般式［VI］で示される、請求項７に記載の標識化合物。
一般式［VI］：
【化６】
2010048735.tif 000016
【請求項９】
前記アルキル鎖の炭素数が３以上、２０以下である、請求項１に記載の標識化合物。
【請求項１０】
前記検査対象分子が生体由来分子である、請求項１に記載の標識化合物。
【請求項１１】
前記分子鎖がオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の標識化合物。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドの長さが５ｍｅｒ以上、４０ｍｅｒ以下である、請求項１１に記載の標識化合物。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドがその相補鎖配列を有する前記生体由来分子の相補鎖オリゴヌクレオチドを検出するためのプローブとして使用される、請求項１０に記載の標識化合物。
【請求項１４】
前記ＧＰ３がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基であり、これが前記検査対象分子に含まれるアミノ基と結合する、請求項１に記載の標識化合物。
【請求項１５】
前記ＧＰ３がマレイミド基であり、これが前記検査対象分子に含まれるメルカプト基と結合する、請求項１に記載の標識化合物。
【請求項１６】
Ｒ3が、フェニル基又はナフチル基である、請求項１に記載の標識化合物。
【請求項１７】
Ａｒ1が、フェニレン基又はナフチレン基である、請求項１に記載の標識化合物。
【請求項１８】
Ａｒ2が、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントレン基の何れかである、請求項１に記載の標識化合物。
【請求項１９】
前記一般式［I］におけるＡｒ1−（ＣＲ1＝ＣＲ2）n−Ａｒ2（ｎは０又は１）は、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）を含み、この繰り返し単位の繰り返し数をｍとする時、ｍ≧６であるＮ−（Ｃ＝Ｃ−）mを有する、請求項１に記載の標識化合物。
【請求項２０】
請求項１から請求項１９の何れか１項に記載の標識化合物を、検査対象分子に結合さ
せる工程と、
光の照射によって、前記検査対象分子と結合した前記標識化合物から発する蛍光を検
出する工程と
を有する標識化合物を用いた検査対象分子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検査対象分子を検出するための標識化合物であり、特に、芳香族第三アミン化合物が検査対象分子と結合可能に構成されてなる標識化合物及びこれを用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸、タンパク質、糖、酵素、ホルモン、抗原、抗体等の各種の生体分子の検査対象分子を蛍光標識し、蛍光を検出する生体分子の解析手法がある。この解析手法は、生命現象の解析、遺伝子診断、再生医療等の分野において欠かせない手法であり、医用薬品のスクリーニングにおいても欠かせない手法である。例えば、特定の遺伝子やタンパク質を蛍光色素によって標識するによって、検体中の特定の遺伝子やタンパク質を高感度に検出することが可能である。
【０００３】
例えば、オリゴヌクレオチドやペプチドの各種類を蛍光色素によって標識し、これをマイクロアレイに固定したＤＮＡチップやタンパク質チップを使用して、検体を網羅的に解析することも行なわれている。また、特定の生体分子、例えば、糖、タンパク等を蛍光色素によって標識して、蛍光を発生させて蛍光顕微鏡を用いて観察する免疫染色や分子イメージングでは、細胞内や細胞間の生体分子の動態解析も可能となっている。
【０００４】
また、ＤＮＡ、ＤＮＡ塩基誘導体、ＤＮＡオリゴヌクレオチド等を蛍光色素によって標識した標識プローブは、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、インサイチュー（in situ）ハイブリダイゼーション、ＤＮＡ配列決定反応等に使用されている。蛍光色素によって標識された抗体又は抗原は、抗体−抗原反応を利用したイムノアッセイに使用されている。アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチン間の結合を応用し、蛍光色素で修飾されたアビジンを用いて酵素免疫測定法も知られている。
【０００５】
検出対象とする生体分子を標識するために、例えば、ＦＩＴＣ（Fluorescein isochiocyanate）、ＴＲＩＴＣ（Tetramethylrhodamine isochiocyanate）、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、シアニン色素等の芳香族色素化合物が、蛍光標識試薬として用いられている。
【０００６】
生体分子を検出に関する技術、生体分子を検出するために使用される種々の蛍光標識化合物が知られており、以下の報告がある。
【０００７】
「生体分子の検出方法及びそれに用いる標識色素並びに標識キット」と題する後記の特許文献１には、次の記載がある。
【０００８】
特許文献１の発明の生体分子の検出方法は、生体分子試料と有機ＥＬ色素とを反応させ、該有機ＥＬ色素で標識された該生体分子試料の蛍光を測定することを特徴とし、有機ＥＬ色素には、共役系を有する５員環化合物を含む化合物であって、その５員環化合物が１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含む化合物を用いることができるとしている。さらに、その５員環化合物と共役系を有する６員環化合物とからなる縮合多環化合物を用いることもでき、さらに、その５員環化合物には、アゾール誘導体又はイミダゾール誘導体を用いることができるとしている。
【０００９】
また、生体分子と反応させるに先立って、有機ＥＬ色素に、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択された何れか１種の官能基を導入することができるとしている。
【００１０】
また、特許文献１の発明の標識色素は、蛍光測定による生体分子の検出に用いる標識色素であって、生体分子と結合する反応性基を有する有機ＥＬ色素から成ることを特徴とし、その反応性基としては、カルボン酸基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択された何れか１種の官能基を用いることができるとしている。
【００１１】
また、有機ＥＬ色素には、共役系を有する５員環化合物を含む化合物であって、その５員環化合物が１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含む化合物を用いることができ、さらに、その５員環化合物と共役系を有する６員環化合物とからなる縮合多環化合物を用いることもでき、さらに、その５員環化合物には、アゾール誘導体又はイミダゾール誘導体を用いることができるとしている。
【００１２】
なお、有機ＥＬ色素は、特許文献１に記載されるもの他に各種のものが知られており、例えば、種々の構造を有するスチリル化合物からなる有機ＥＬ色素が報告されている（例えば、後記の特許文献２〜特許文献２０を参照。）。
【００１３】
【特許文献１】特開２００５−２０８０２６号公報（段落０００４〜００１１）
【特許文献２】特許３８５２５１７号明細書（段落００１７〜００２０）
【特許文献３】特許３８５２５１８号明細書（段落００１７〜００２０）
【特許文献４】特許３８５２５２０号明細書（段落００１５〜００１８）
【特許文献５】特許３５５５７３６号明細書（段落００１７〜００２０）
【特許文献６】特許３８２０７５２号明細書（段落００１７〜００２０）
【特許文献７】特開２０００−２３０１３２号公報（段落０００８〜００２１）
【特許文献８】特開２００１−１０６６５７号公報（段落０００８〜００１９）
【特許文献９】特開２００１−１０６６５８号公報（段落０００８〜００１２）
【特許文献１０】特許３８５２５５２号明細書（段落００１７〜００３７）
【特許文献１１】特開２００１−１３１１２８号公報（段落０００８〜００１２）
【特許文献１２】特開２００１−２８８３７７号公報（段落０００７〜００２０）
【特許文献１３】特開２００２−２２６７２２号公報（段落０００７〜００１４）
【特許文献１４】特開２００４−８７４６３号公報（段落００２１〜００２６）
【特許文献１５】特許４００１１１８号明細書（段落００１３〜００６５）
【特許文献１６】特開２００５−５２２６号公報（段落００１３〜００５７）
【特許文献１７】特開２００５−３５９２７号公報（段落００１３〜００４２）
【特許文献１８】特開２００６−１２４３３３号公報（段落００１１〜００５４）
【特許文献１９】特開２００６−１２８４３７号公報（段落０００９〜００２４）
【特許文献２０】特開２００６−２７３７３７号公報（段落０００９〜００２７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
蛍光色素によって標識された標的分子、例えば、生体分子を励起光によって励起して、蛍光色素から放射された蛍光を光検出器で検出し生体分子の検出を行なう場合、一般に、所望の波長域以外の光を遮断し、所望の波長域の蛍光を光検出器へ透過させるためのフィルタが使用され、光検出器への励起光その他の迷光の入射を遮断するようになされる。励起光が、フィルタによって十分に遮断されない場合には、フィルタによって遮断されなかった励起光は、蛍光を測定するための光路における回折、反射によって生じる迷光の原因となり、蛍光検出におけるノイズの原因となる。
【００１５】
蛍光検出におけるノイズを低減するためには、なるべく弱い励起光で蛍光色素を励起することが望ましい。微量分子の検出するために、励起光の強度を高くして蛍光色素に照射して、蛍光強度を高めて感度を大きくしようとすると、ノイズも同時に増大してしまうため、ＳＮ比を向上させることは困難となる。また、励起光の強度を高くして蛍光色素に照射すると、蛍光色素によっては耐光性が十分ではなく光劣化を生じてしまうものもある。
【００１６】
一般に、蛍光色素によって標識された標的分子、例えば、生体分子の検出感度は、蛍光色素を励起する励起光の波長（励起波長）と、蛍光色素から放射される蛍光の波長（蛍光波長）の差（ストークスシフト：the Stokes shift）に依存し、ストークスシフトが大きく、即ち、励起波長と蛍光波長の差が大きく、検出しようとする蛍光が励起光から離れた波長域にある程、フィルタによって迷光の除去率が高まりノイズが減少する。ストークスシフトが小さい場合には、励起光の散乱光によるバックグラウンドノイズや標的分子を含むサンプル中に存在する共存物質の蛍光に由来するバックグラウンドノイズにより、蛍光色素からの蛍光の検出が大きく妨害され、高感度の測定が困難となる。
【００１７】
本発明は、上述したような課題を解決するためになされたものであって、その目的は、芳香族第三アミン化合物が検査対象分子と結合可能に構成されてなり、検査対象分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができる標識化合物及びこれを用いた検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
即ち、本発明は、下記一般式（１）で示された芳香族第三アミン化合物が検査対象分子と結合可能なように構成されてなる標識化合物に係るものである。
一般式（１）：
【００１９】
【化１】
2010048735.tif 000003
【００２０】
但し、前記一般式（１）において、ｎは０又は１であり；、Ｓ1、Ｓ2の一方は、主鎖部に下記ＧＰ１から選択された二価の基を含んでもよいアルキル鎖を含む二価のスペーサに、検査対象分子に結合可能な分子鎖が結合された分子鎖結合基、又は、下記ＧＰ３から選択された反応性基を含み、Ｓ1、Ｓ2の他方は下記Ｇｐ２から選択された基であり；、Ｒ1、Ｒ2は、同一又は異なってもよく、ヒドロ基、アルキル基、ヘテロ原子を含んでもよいアリール基から選択された基であり；、Ｒ3は、ヒドロ基、下記Ｇｐ２から選択された基を置換基として有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいビニル基から選択された基であり；、Ａｒ1、Ａｒ2は二価の基であり、同一又は異なってもよく、アリーレン基又はビニレン基であり、Ａｒ2は、アルキル基、アリール基、シアノ基、トリフルオロメチル基、ハロ基から選択された置換基を少なくとも一箇有し、ｎが１の場合、Ａｒ1とＲ1、又は／及び、Ａｒ2とＲ2が相同して環を形成していてもよく；、Ｇｐ１は二価の基であり、ヘテロ原子を含んでもよいアリーレン基、ビ二レン基、カルボニル基、オキシ基、オキシカルボニル基、チオ基、スルフィニル基、スルホニル基、イミノ基、ウリレン基、アミド基、シリレン基であり；、Ｇｐ２は一価の基であり、ヒドロ基、アルキル基、アリール基、置換基を含んでもよいビニル基、アミノ基、メルカプト基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、スルフィノ基、スルホ基、カルボキシ基、ハロ基であり；、Ｇｐ３は一価の基であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル基、イミドエステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、マレイミド基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリオキザル基、イミドエステル基（エポキシ基、グリシジルエーテル基）、オキシラン基、トリアジン基、カルボジイミド基、アジリジン基）、ハロゲン化アシル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化スルホニル基、ビニルスルホン基である。
【００２１】
また、本発明は、上記の標識化合物を、検査対象分子に結合させる工程と、光の照射によって、前記検査対象分子と結合した前記標識化合物から発する蛍光を検出する工程とを有する標識化合物を用いた検査対象分子の検出方法に係るものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ストークスシフトが大きく蛍光収率の高い骨格を有し、検査対象分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができる標識化合物を提供することができ、従来の標識化合物に比べて耐光性が高く、標識化合物を光励起して微量分子を検出する際に励起光の強度を高めても、標識化合物の光劣化によって生じるデータばらつきは殆んど生じない。
【００２３】
また、本発明によれば、検査対象分子を、高感度、高ＳＮ比で検出することができる検出方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の標識化合物では、Ａｒ1がフェニレン基であり、Ａｒ2が、フェニレン基、ナフチレン基、フェナントリレン基、アントリレン基の何れかであり、Ｒ1、Ｒ2がヒドロ基であり、前記一般式（１）が下記一般式（２）で示される構成とするのがよい。このような構成によれば、フェニルアミンのフィルスマイヤー反応（アルデヒド基導入反応）に続くヴィッティヒ反応（二重結合形成反応）などによって容易に一般式（２）の化合物を合成することができる。一般式（２）の化合物はフェニレン基と（ＣＨ＝ＣＨ）n部の平面性が保たれることで共鳴構造が安定化され高い蛍光収率の化合物となる。また（ＣＨ＝ＣＨ）部の回転自由度に由来して励起状態の分子構造は基底状態のそれから大きく変化し、そのためにストークスシフトが大きくなる。
【００２５】
一般式（２）：
【００２６】
【化２】
2010048735.tif 000004
【００２７】
また、Ｓ2が前記分子鎖結合基である構成とするのがよい。このような構成によれば、市販の試薬から少ない工程で容易に合成することができる。
【００２８】
また、Ｓ2が前記分子鎖結合基、Ｓ1が４−アミノスチリル基であり、前記一般式（１）が下記一般式（３）で示される構成とするのがよい。このような構成によれば、分子内にアミノスチリル部が２箇所存在することになり、一箇所しかない場合に比べてモル吸光係数が約２倍になるので励起光の利用効率が高いことになる。
【００２９】
一般式（３）：
【００３０】
【化３】
2010048735.tif 000005
【００３１】
但し、Ｒ4、Ｒ5は、同一又は異なってもよく、ヒドロ基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基から選択された基である。
【００３２】
また、Ｓ2が前記分子鎖結合基であり、前記分子鎖結合基は、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10で置換されたフェニル基を含み、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10の何れか一つに前記Ｇｐ１を介して前記スペーサが結合しており、前記スペーサに前記Ｇｐ１を介して前記分子鎖が結合されてなり、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10の残りがヒドロ基であり、Ｒ3が、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15で置換されたフェニル基を含むアリール基であり、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15が前記Ｇｐ２から選択された基であり、これらのうち隣り合う基同士が相同して環を形成していてもよく、前記一般式（２）が下記一般式（４）で示される構成とするのがよい。このような構成によれば、アリールアミノ部周囲のかさ高さを増すことができるので、使用時に共存する他の化学物質との相互作用に由来する消光過程を減じ、結果として高い蛍光収率の化合物を提供することができる。
【００３３】
一般式（４）：
【００３４】
【化４】
2010048735.tif 000006
【００３５】
また、Ｓ2が前記分子鎖結合基であり、前記分子鎖結合基は、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10で置換されたフェニル基を含み、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10の何れか一つに前記Ｇｐ１を介して前記スペーサが結合しており、前記スペーサに前記Ｇｐ１を介して前記分子鎖が結合されてなり、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10の残りがヒドロ基であり、Ｒ3が、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15で置換されたフェニル基を含むアリール基であり、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15が前記Ｇｐ２から選択された基であり、これらのうち隣り合う基同士が相同して環を形成していてもよく、Ｒ4が、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19、Ｒ20で置換されたフェニル基を有するアリール基であり、Ｒ5が、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ25で置換されたフェニル基を有するアリール基であり、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19、Ｒ20、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ25が前記Ｇｐ２から選択された基でありこれらのうち隣り合う基同士が相同して環を形成していてもよく、前記一般式（３）が下記一般式（５）で示される構成とするのがよい。このような構成によれば、分子内にアミノスチリル部が２箇所存在することになり、一箇所しかない場合に比べてモル吸光係数が約２倍になるので励起光の利用効率が高く、かつアリールアミノ部周囲のかさ高さを増すことができるので、使用時に共存する他の化学物質との相互作用に由来する消光過程を減じ、結果として高い蛍光収率の化合物を提供することができる。
【００３６】
一般式（５）：
【００３７】
【化５】
2010048735.tif 000007
【００３８】
また、Ｓ1が前記分子鎖結合基である構成とするのがよい。このような構成によれば、疎水性であるフルオロフォア（蛍光色素骨格）を、親水性の生体分子から遠ざけることができるので、色素と生体分子との相互作用による消光や化学反応を減じることができる。
【００３９】
また、Ｓ2が、Ｒ26、Ｒ27、Ｒ28、Ｒ29、Ｒ30で置換されたフェニル基を有するアリール基であり、Ｒ3が、Ｒ31、Ｒ32、Ｒ33、Ｒ34、Ｒ35で置換されたフェニル基を有するアリール基であり、Ｒ26、Ｒ27、Ｒ28、Ｒ29、Ｒ30、Ｒ31、Ｒ32、Ｒ33、Ｒ34、Ｒ35が前記Ｇｐ２から選択された基であり、これらのうち隣り合う基同士が相同して環を形成していてもよく、前記一般式（３）が下記一般式（６）で示される構成とするのがよい。このような構成によれば、アリールアミノ部周囲のかさ高さを増すことができるので、使用時に共存する他の化学物質との相互作用に由来する消光過程を減じ、結果として高い蛍光収率の化合物を提供することができる。
【００４０】
一般式（６）：
【００４１】
【化６】
2010048735.tif 000008
【００４２】
また、前記アルキル鎖の炭素数が３以上、２０以下である構成とするのがよい。このような構成によれば、疎水性であるフルオロフォア（蛍光色素骨格）と親水性の生体分子との距離が適度に保たれ、色素と生体分子との相互作用による消光や化学反応を減じることができる。一方、アルキル鎖が長すぎる場合には標識化合物として疎水性が高まり、検査対象分子との相互作用が抑制されてしまうことがある。
【００４３】
また、前記検査対象分子が生体由来分子である構成とするのがよい。このような構成によれば、生体由来分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができ、かつこれまで色素の光に対する耐久性が十分でないために困難であったような繰り返し光照射や長時間光照射による検出が可能となる。
【００４４】
また、前記分子鎖がオリゴヌクレオチドである構成とするのがよい。このような構成によれば、前記オリゴヌクレオチドと相補鎖結合（ハイブリダイゼーション）する相補鎖オリゴヌクレオチドを有する核酸を高感度、高ＳＮ比で検出することができる。
【００４５】
また、前記オリゴヌクレオチドの長さが５ｍｅｒ以上、４０ｍｅｒ以下である構成とするのがよい。このような構成によれば、前記オリゴヌクレオチドと前記相補鎖オリゴヌクレオチドの間で安定な相補鎖結合を形成することができる。
【００４６】
また、前記オリゴヌクレオチドがその相補鎖配列を有する前記生体由来分子の相補鎖オリゴヌクレオチドを検出するためのプローブとして使用される構成とするのがよい。このような構成によれば、前記相補鎖オリゴヌクレオチドを高感度、高ＳＮ比で検出することができる。
【００４７】
また、前記ＧＰ３がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基であり、これが前記検査対象分子に含まれるアミノ基と結合する構成とするのがよい。このような構成によれば、アミノ基を含む前記検査対象分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができる。
【００４８】
また、前記ＧＰ３がマレイミド基であり、これが前記検査対象分子に含まれるメルカプト基と結合する構成とするのがよい。このような構成によれば、メルカプト基を含む前記検査対象分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができる。
【００４９】
また、Ｒ3が、フェニル基又はナフチル基である構成とするのがよい。このような構成によれば、アリールアミノ部周囲のかさ高さを増すことができるので、使用時に共存する他の化学物質との相互作用に由来する消光過程を減じ、結果として高い蛍光収率の化合物を提供することができる。
【００５０】
また、Ａｒ1が、フェニレン基又はナフチレン基である構成とするのがよい。このような構成によれば、市販の試薬から少ない工程で容易に合成することができ、フェニルアミノ部周囲のかさ高さを増すことができるので、使用時に共存する他の化学物質との相互作用に由来する消光過程を減じ、結果として高い蛍光収率の化合物を提供することができる。
【００５１】
また、Ａｒ2が、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントレン基の何れかである構成とするのがよい。このような構成によれば、フルオロフォア（色素骨格部）の共鳴構造が安定化され、高い蛍光収率を達成することができる。
【００５２】
また、前記一般式［I］におけるＡｒ1−（ＣＲ1＝ＣＲ2）n−Ａｒ2（ｎは０又は１）は、Ａｒ1部の二重結合から（ＣＲ1＝ＣＲ2）nを経てＡｒ2の二重結合へと続く繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）を含むとみなすこともでき、この繰り返し単位の繰り返し数をｍとする時、ｍ≧６であるＮ−（Ｃ＝Ｃ−）mを有する構成とするのがよい。標識化合物の光励起による蛍光の極大波長を所望の波長領域にすることができ、ストークスシフトを大きなものとすることができる。
【００５３】
本発明による標識（ラベル）化合物は、光励起によって蛍光を放射する蛍光標識化合物であり、芳香族第三アミン化合物（単に、芳香族アミン化合物と呼ぶことがある。）が生体分子と結合可能に構成されている。標識化合物は、検査対象分子、例えば、生体分子に結合可能な分子鎖（例えば、オリゴヌクレオチド）が結合された分子鎖結合基、又は、生体分子に含まれる反応性基（例えば、アミノ基、メルカプト基）と共有結合する反応性基（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、マレイミド基）を含んでおり、この分子鎖結合基、又は、反応性基は、直接的、又は、間接的にアミノＮ（窒素）に結合されている。
【００５４】
本発明による蛍光標識化合物において、上記の分子鎖をオリゴヌクレオチドとすることによって、このオリゴヌクレオチドを、その相補鎖配列を有する生体分子の相補鎖オリゴヌクレオチドを検出するためのプローブとして使用することができ、この相補鎖オリゴヌクレオチドを高感度、高ＳＮ比で検出することができる。このようなプローブを、以下の説明では、芳香族第三アミン蛍光プローブ（略して、芳香族アミン蛍光プローブ、蛍光プローブ）、オリゴヌクレオチドプローブと呼ぶことがある。
【００５５】
本発明による蛍光標識化合物が、検査対象分子、例えば、生体分子に結合可能な反応性基を有する芳香族第三アミン化合物として構成される場合、この芳香族第三アミン化合物は、生体分子と結合可能な反応性基Ａを有している。生体分子が本来有している、又は、生体分子に予め付加されている反応性基Ｂと、蛍光標識化合物が有する反応性基Ａが共有結合を形成して、蛍光標識化合物と生体分子が結合される。生体分子に結合された蛍光標識化合物を励起して放射された蛍光を検出することによって、標的とする生体分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができる。
【００５６】
本発明による標識化合物は、アミノＮに結合するフェニル基又はナフチル基、アミノＮに結合するフェニレン基又はナフチレン基、及び、アミノＮに結合するフェニレン基又はナフチレン基に直接的又は間接的に結合されるフェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントレン基の何れかを有し、上述の一般式（１）におけるＡｒ1−（ＣＲ1＝ＣＲ2）n−Ａｒ2（ｎは０又は１）は、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）を含み、この繰り返し単位の繰り返し数をｍとする時、ｍ≧６であるＮ−（Ｃ＝Ｃ−）mを有する。
【００５７】
なお、上記の分子鎖結合基、又は、反応性基は、アミノＮに結合するフェニル基又はナフチル基、或いは、アミノＮに結合するフェニレン基又はナフチレン基に直接的又は間接的に結合されるフェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントレン基の何れかに結合されている。
【００５８】
上記の繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）を有しているため、標識化合物の光励起による蛍光の極大波長を所望の波長領域にすることができ、ストークスシフトを大きなものとすることができ、かつ耐光性を十分なものとすることができる。生体分子と結合した標識化合物を、光照射によって励起して放射された蛍光を検出することによって、標的とする生体分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができる。
【００５９】
本発明の標識化合物による蛍光プローブ、又は、検査対象分子と共有結合する蛍光標識化合物を使用する検査方法では、検出しようとする検査対象分子（標的分子）は、例えば、生体由来分子、生理活性分子等の生体分子であり、生体分子を高感度、高いＳＮ比で検出することができる。
【００６０】
生体分子は、例えば、酵素、タンパク質、糖、核酸、オリゴヌクレオチド、脂肪類、アミノ酸等である。タンパク質は、例えば、抗体及びその誘導体、抗原及びその誘導体、アビジン（ストレプトアビジンを含む）、血清アルブミン、ハプテン、ホルモン等である。また、診断用薬品や治療用薬品等の化学物質、アレルギー等の疾病の原因となる環境物質等の検出にも適用することができる。
【００６１】
以下、図面を参照しながら本発明による実施の形態について詳細に説明する。
【００６２】
実施の形態
図１は、本発明の実施の形態における、標識化合物の構成を説明する図であり、図１（Ａ）は、Ｓ1、又は、Ｓ2が、生体分子に結合可能な分子鎖が結合された分子鎖結合基、或いは、生体分子の有する反応性基に共有結合する反応性基を有する標識化合物の構成、図１（Ｂ）は、Ｓ1がスペーサ（リンカー）Ｚ1に生体分子に結合可能な分子鎖１０が結合された分子鎖結合基である標識化合物（プローブ）の構成、図１（Ｃ）は、Ｓ2がスペーサ（リンカー）Ｚ2に生体分子に結合可能な分子鎖１０が結合された分子鎖結合基である標識化合物（プローブ）の構成を示す図である。
【００６３】
図１（Ａ）に示す標識化合物において、ｎは０又は１であり、Ｓ1、Ｓ2の一方は、主鎖部に下記ＧＰ１から選択された二価の基を含んでもよいアルキル鎖を含む二価のスペーサに、生体分子に結合可能な分子鎖が結合された分子鎖結合基、又は、下記ＧＰ３から選択された反応性基を含み、Ｓ1、Ｓ2の他方は下記Ｇｐ２から選択された基である。
【００６４】
Ｒ1、Ｒ2は、同一又は異なってもよく、ヒドロ基、アルキル基、ヘテロ原子を含んでもよいアリール基から選択された基であり、Ｒ3は、ヒドロ基、下記Ｇｐ２から選択された基を置換基として有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいビニル基から選択された基である。
【００６５】
Ａｒ1、Ａｒ2は二価の基であり、同一又は異なってもよく、アリーレン基又はビニレン基であり、Ａｒ2は、アルキル基、アリール基、シアノ基（−ＣＮ）、トリフルオロメチル基（−ＣＦ3）、ハロ基から選択された置換基を少なくとも一箇有し、ｎが１の場合、Ａｒ1とＲ1、又は／及び、Ａｒ2とＲ2が相同して環を形成していてもよい。
【００６６】
例えば、Ｒ3が、フェニル基（phenyl基、−Ｃ6Ｈ5）又はナフチル基（naphthyl基、−Ｃ10Ｈ7）であり、Ａｒ1が、フェニレン基（phenylene基、−Ｃ6Ｈ4−）又はナフチレン基（naphthylene基、−Ｃ10Ｈ6−）であり、Ａｒ2が、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基（anthrylene基、−Ｃ14Ｈ8−）、フェナントレン基（phenanthrylene基、−Ｃ14Ｈ8−）の何れかであり、Ｒ1、Ｒ2がヒドロ基（−Ｈ）である。
【００６７】
Ｇｐ１は二価の基であり、ヘテロ原子を含んでもよいアリーレン基（アリール基から１個の水素原子を引き抜いて形成された基、単環又は多環芳香環の芳香族化合物、複素芳香族化合物から１個の水素原子を引き抜いて形成された基である。）、ビ二レン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、オキシ基（−Ｏ−）、オキシカルボニル基（−Ｏ−ＣＯ−）、チオ基（−Ｓ−）、スルフィニル基（−ＳＯ−）、スルホニル基（−ＳＯ2−）、イミノ基（−ＮＨ−）、ウリレン基（−ＮＨＣＯＮＨ−）、アミド基（Ｈ2ＮＣ（＝ＮＨ）−）、シリレン基（−ＳｉＨ2−）である。Ｇｐ１は、好ましくは、アリーレン基、ビニレン基、カルボニル基である。
【００６８】
Ｇｐ２は一価の基であり、ヒドロ基（−Ｈ）、アルキル基（−ＣnＨ2n+1）、アリール基、置換基を含んでもよいビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ2）、アミノ基（−ＮＨ2）、メルカプト基（−ＳＨ）、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、カルバモイル基（Ｈ2ＮＣＯ−）、スルフィノ基（−ＳＯ2Ｈ）、スルホ基（−ＳＯ3Ｈ）、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、ハロ基（ハロゲン基、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）である。Ｇｐ２は、好ましくは、ヒドロ基、アルキル基、ビニル基である。
【００６９】
Ｇｐ３は一価の基であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル基、イミドエステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、マレイミド基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリオキザル基、イミドエステル基、オキシラン基（エポキシ基、グリシジルエーテル基）、トリアジン基、カルボジイミド基、アジリジン基、ハロゲン化アシル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化スルホニル基、ビニルスルホン基である。Ｇｐ３は、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、マレイミド基である。
【００７０】
図１（Ｂ）に示す標識化合物は、図１（Ａ）に示す標識化合物において、−Ｓ1を、−Ｚ1−（生体分子に結合可能な分子鎖１０）に置き換えた蛍光プローブであり、Ｚ1は、主鎖部に上記ＧＰ１から選択された二価の基を含んでもよいアルキル鎖を含む二価のスペーサ（リンカー）である。
【００７１】
図１（Ｃ）に示す標識化合物は、図１（Ａ）に示す標識化合物において、−Ｓ2を、−Ｚ2−（生体分子に結合可能な分子鎖１０）に置き換えた蛍光プローブであり、Ｚ2は、主鎖部に上記ＧＰ１から選択された二価の基を含んでもよいアルキル鎖を含む二価のスペーサ（リンカー）である。
【００７２】
図１（Ｂ）、図１（Ｃ）に示すように、蛍光プローブは、生体分子に結合可能な分子鎖１０が結合されてなる芳香族第三アミン化合物であり、生体分子に結合可能な分子鎖１０は、リンカー基Ｚ1又はＺ2に結合されている。
【００７３】
図１（Ｂ）、図１（Ｃ）に示す構造を有する標識化合物おいて、生体分子に結合可能な分子鎖１０は、例えば、長さが５ｍｅｒ以上、４０ｍｅｒ以下のヌクレオチドからなる。
【００７４】
図１（Ａ）に示す標識化合物において、Ｓ1、Ｓ2の一方が、反応性基Ａを含む場合、生体分子が反応性基Ａと結合し得る反応性基Ｂを本来的に有するか、又は、生体分子に反応性基Ｂが導入されていればよい。検査対象とする生体分子、例えば、タンパク質又は核酸と結合させるために必要な反応性基Ａを、標識化合物が有しており、反応性基Ａと反応する反応性基Ｂが、生体分子が本来有しているものか、生体分子に予め付加されているものである構成とすることによって、生体分子と標識化合物が、公知の方法に従って共有結合を形成して結合される。
【００７５】
共有結合を形成できる反応性基Ａと反応性基Ｂの組み合わせとして、例えば、アミノ基／カルボキシル基、アミノ基／ハロゲン化アシル基、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基／アルデヒド基、メルカプト基／マレイミド基、メルカプト基／ビニルスルホン基、水酸基／カルボキシル基等が可能である。反応性基Ｂ／反応性基Ａの組み合わせは、好ましくは、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基／マレイミド基である。
【００７６】
図１に示す構造を有する標識化合物は、Ａｒ1−（ＣＲ1＝ＣＲ2）n−Ａｒ2（ｎは０又は１）は、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）を含み、この繰り返し単位の繰り返し数をｍとする時、ｍ≧６であるＮ−（Ｃ＝Ｃ−）mを有している。
【００７７】
以下、図１（Ａ）に示す標識化合物が蛍光プローブ（図１（Ｂ）、図１（Ｃ）に示す。）として構成された場合について、説明する。
【００７８】
図２、図３は本発明の実施の形態における芳香族アミン蛍光プローブ（第１の蛍光プローブ）の例を示す図である。
【００７９】
図２の左側に示す第１の蛍光プローブは、図１（Ｂ）に示す標識化合物である。この第１の蛍光プローブでは、ｎが１であり、Ｓ2はオキシ基が結合したフェニル基を含み、オキシ基にオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結合されている。Ｒ3はフェニル基又はナフチル基、Ａｒ1はフェニレン基である。Ａｒ2は、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントリレン基の何れかの骨格を有し、無置換であるか置換基Ｓ1を有しており、Ｓ1はメチル基又は／及びシアン基である。Ｒ1及びＲ2はヒドロ基である。
【００８０】
図２の右側に示す第１の蛍光プローブは、図１（Ｃ）に示す標識化合物である。この第１の蛍光プローブでは、ｎが１であり、Ｓ2はオキシ基が結合したフェニル基を含み、Ｒ3がフェニル基又はナフチル基、Ａｒ1はフェニレン基である。Ａｒ2は、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントリレン基の何れかの骨格を有し、無置換であるか置換基としてシアン基を有し、且つ、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結合される二価の基−ＣＨ2Ｏ−（オキシメチレン基）又はオキシ基を有している。また、Ｒ1及びＲ2がヒドロ基である。
【００８１】
図３に示す第１の蛍光プローブは、図１（Ｂ）に示す標識化合物である。この第１の蛍光プローブでは、ｎが１であり、Ｓ2はオキシ基が結合したフェニル基を含み、オキシ基にオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結合されている。Ｒ3はフェニル基又はナフチル基、Ａｒ1はフェニレン基である。Ａｒ2は、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントリレン基の何れかの骨格を有し、無置換であるか置換基としてシアン基を有しており、且つ、Ａｒ2に−ＣＨ＝ＣＨ−が結合されこれに更に、アミノＮに結合するフェニル基、或いは、フェニル基及びナフチル基を有する芳香族第三アミン化合物のフェ二ル基が結合されている。Ｒ1及びＲ2がヒドロ基である。
【００８２】
図４は本発明の実施の形態における芳香族アミン蛍光プローブ（第２の蛍光プローブ）の例を示す図である。
【００８３】
図４の左側上部に示す２個の第２の蛍光プローブは、図１（Ｂ）に示す標識化合物である。この第２の蛍光プローブでは、ｎが０であり、Ｓ2はオキシ基が結合したフェニル基を含み、オキシ基にオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結合されている。Ｒ3はナフチル基、Ａｒ1はナフチレン基である。Ａｒ2はアントリレン基又はフェナントリレン基であり、置換基Ｓ1を有しており、Ｓ1がメチル基又は／及びシアン基である。
【００８４】
図４の右側上部に示す２個の第２の蛍光プローブは、図１（Ｃ）に示す標識化合物である。この第２の蛍光プローブでは、ｎが０であり、Ｓ2はオキシ基が結合したフェニル基を含み、Ｒ3はナフチル基、Ａｒ1はナフチレン基である。Ａｒ2はアントリレン基又はフェナントリレン基であり、置換基としてシアン基を有し、且つ、オキシ基にオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結合される二価の基−ＣＨ2Ｏ−（オキシメチレン基）又はオキシ基を有している。
【００８５】
図４の左側下部に示す２個の第２の蛍光プローブは、図１（Ｂ）に示す標識化合物である。この第２の蛍光プローブでは、ｎが０であり、Ｓ2はオキシ基が結合したフェニル基を含み、オキシ基にオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）が間接的に結合されている。Ｒ3はナフチル基、Ａｒ1はナフチレン基である。Ａｒ2はアントリレン基又はフェナントリレン基であり、置換基としてシアン基を有し、且つ、アミノＮに結合するフェニル基及びナフチル基を有する芳香族第三アミン化合物のナフチル基が結合されている。
【００８６】
図２、図３、図４では、図中に示すアルファベット文字及び数字からなる略号によって芳香族アミン化合物の名称を表わすと共に、蛍光プローブの名称にこの略号を取込んで使用し、蛍光プローブに用いられている芳香族アミン化合物の構造を示している（図２、図３、図４以外の後述する各図とこれらに関する説明においても同様とする。）。
【００８７】
また、図２、図３、図４において、Ｒ36〜Ｒ51は、ヒドロ基、アルキル基、アリール基、置換基を含んでもよいビニル基、アミノ基、メルカプト基（チオール基）、ヒドロキシ基、カルバモイル基、スルフィノ基、スルホ基、カルボキシ基、ハロ基から選択される置換基である。
【００８８】
図２、図３に示す蛍光プローブの例では、一般式（１）に示すＡｒ1はフェニレン基、Ｒ3はフェニル基、ナフチル基、Ｒ1、Ｒ2はヒドロ基、Ａｒ2はフェニレン基、ナフチレン基、フェナントリレン基、アントリレン基である。また、図４に示す蛍光プローブの例では、一般式（２）に示すＡｒ3はナフチレン基、Ｒ4はナフチル基、Ａｒ4はフェナントリレン基、アントリレン基である。
【００８９】
図２、図３、図４において、ｏｌｉｇｏは、生体分子が結合可能な分子鎖であるオリゴヌクレオチドを示し、ｏｌｉｇｏの５’端又は３’端が、芳香族アミン化合物のＳ1又はＳ2に結合されている。
【００９０】
次に、上記の略号について説明する。図２、図３、図４において、略号の第１番目の文字がＢで始まる場合はジアミンであることを示し、それ以外はモノアミンであることを示している。
【００９１】
図２、図３に使用している略号において、Ｓはトリフェニルアミン（triphenylamine、（Ｃ6Ｈ5）3Ｎ）骨格において、第１のフェニル基（phenyl基、−Ｃ6Ｈ5）の１箇のヒドロ基（−Ｈ）がオキシ基（−Ｏ−）によって置換され、第２のフェニル基の１箇のヒドロ基がビニレン基（vinylene基、−ＣＨ＝ＣＨ−）によって置換された構造を示している。このトリフェニルアミン骨格の第３のフェニル基は、ナフチル基（naphthyl基、−Ｃ10Ｈ7）で置換されていてもよく、これはトリフェニルアミン誘導体とみなせるので、上記と同様に、トリフェニルアミン骨格と呼ぶものとする。蛍光プローブは、上記のビニレン基に結合された次に説明するＢ、Ｎ、Ａ、Ｐを有する構造を備えている。
【００９２】
Ｂはスチリレン基（styrylene基、−Ｃ6Ｈ4ＣＨ＝ＣＨ−）、Ｎは置換基を有するナフチル基（naphthyl基、−Ｃ10Ｈ7）、Ａは置換基を有してもよいアントリル基（anthryl基、−Ｃ14Ｈ9）、Ｐは置換基を有するフェナントリル基（phenanthryl基、−Ｃ14Ｈ9）をそれぞれ示す。
【００９３】
図４に示す芳香族アミン蛍光プローブは、トリフェニルアミン（（Ｃ6Ｈ5）3Ｎ）において、第１のフェニル基の１箇のヒドロ基（−Ｈ）がオキシ基（−Ｏ−）に置換され、第２のフェニル基がナフチル基（naphthyl基、−Ｃ10Ｈ7）に置換され、第３のフェニル基がナフチレン基（naphthylene基、−Ｃ10Ｈ6−）に置換された構造を有し、生体分子に結合可能な分子鎖（オリゴヌクレオチド、ｏｌｉｇｏ）が付加（結合）されている第三アミン化合物である。この第三アミン化合物のナフチレン基に結合されたアントリレン基を有する蛍光プローブをＡＮＮＰＡ、また、ナフチレン基に結合されたフェナントリレン基を有する蛍光プローブをＤＮＰＡによって示している。
【００９４】
図２、図３、図４に示すように、ベンゼン環のヒドロ基が置換されたオキシ基或いはオキシメチレン基（−ＣＨ2Ｏ−）、又は、ナフタレン環のヒドロ基が置換されたオキシメチレン基（−ＣＨ2Ｏ−）、又は、アントラセン環のヒドロ基が置換されたオキメチレン基（−ＣＨ2Ｏ−）、又は、フェナントレン環のヒドロ基が置換されたオキシ基の何れかにアルキル基が結合され、これにｏｌｉｇｏが結合されている。
【００９５】
図２、図３、図４に示す蛍光プローブは、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）を含むが、この繰り返し単位の繰り返し数ｍは、蛍光プローブの構造によって異なっている。
【００９６】
図２に示す芳香族モノアミン蛍光プローブおいて、略号ＳＢを有する蛍光プローブは、ビニレン基が結合されたトリフェニルアミン骨格のビニレン基にベンゼン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは６である。
【００９７】
略号ＳＮを有する蛍光プローブは、ビニレン基が結合されたトリフェニルアミン骨格のビニレン基にナフタレン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは７である。
【００９８】
略号ＳＡを有する蛍光プローブは、ビニレン基が結合されたトリフェニルアミン骨格のビニレン基にアントラセン環が結合された骨格を備え、ＳＡ−１、ＳＡ−２、ＳＡ−５、ＳＡ−６では、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは９であり、ＳＡ−３、ＳＡ−４では、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは１０である。
【００９９】
略号ＳＰを有する蛍光プローブは、ビニレン基が結合されたトリフェニルアミン骨格のビニレン基にフェナントレン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは９である。
【０１００】
図３に示す芳香族アミン蛍光プローブおいて、ＢＳＢ、ＢＳＮは、ビニレン基が結合された２個のトリフェニルアミン骨格のビニレン基にそれぞれ、ベンゼン環、ナフタレン環が結合された骨格を備え、ＢＳＢ、ＢＳＮはそれぞれ、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは８、１０である。
【０１０１】
略号ＢＳＡを有する蛍光プローブは、ビニレン基が結合された２個のトリフェニルアミン骨格のビニレン基にアントラセン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは１１である。
【０１０２】
蛍光プローブＢＳＰ−１は、ビニレン基が結合された２個のトリフェニルアミン骨格のビニレン基にフェナントレン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは１２である。
【０１０３】
図４に示す芳香族モノアミン蛍光プローブおいて、略号ＡＮＮＰＡは、２個のベンゼン環がナフチル環に置換されたトリフェニルアミン骨格とこれにアントラセン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは９である。
【０１０４】
略号ＤＮＰＡを有する蛍光プローブは、２個のベンゼン環がナフチル環に置換されたトリフェニルアミン骨格とこれにフェナントレン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは９である。
【０１０５】
蛍光プローブＢＡＮＮＰＡは、２個のベンゼン環がナフチル環に置換された２個のトリフェニルアミン骨格の間にアントラセン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは１１である。
【０１０６】
蛍光プローブＢＤＮＰＡは、２個のベンゼン環がナフチル環に置換された２個のトリフェニルアミン骨格の間にフェナントレン環が結合された骨格を備え、繰り返し単位（Ｃ＝Ｃ−）の繰り返し数ｍは１２である。
【０１０７】
図５は、本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。
【０１０８】
図５に示す蛍光プローブは図１（Ａ）の構造を有し、芳香族第三アミン化合物に、生体分子に結合可能な分子鎖１０が結合された、図２に示すＳＰ−１であり、後述する図１０に示すＡ１７である。
【０１０９】
この分子鎖１０はｎ個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含み、このオリゴヌクレオチドは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃから選択されたＢａｓｅ（塩基）を有するヌクレオチド（アナログヌクレオチドであってもよい。）が結合されたものである。なお、図５において、（ｎ−２）は、Ｎ（＝２，３，…，（ｎ−１））番目のヌクレオチド（塩基Ｎ（＝２，３，…，（ｎ−１）））を示している（後述する図６〜図１２に関しても同様である。）。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドはその５’端に−（ＰＯ4-）(ＣＨ2)6ＮＨ−を有し、３’端に−（ＰＯ4-）(ＣＨ2)12（ＰＯ4-）(ＣＨ2)ＣＨ(ＣＨ2ＯＨ)（ＣＨ2）4ＮＨ2を有している。分子鎖１０のオリゴヌクレオチドの５’端側のＮＨ−は芳香族第三アミン化合物ＳＰ−１に結合され、３’端側はＮＨ2で終端している。
【０１１１】
図５において、図１（Ａ）に示すＳ1、Ａｒ2、Ａｒ1、Ｒ3、Ｓ2は、次に示す通りである。（Ａｒ2−Ｓ1）は−Ｃ14Ｈ6（ＣＮ）2ＣＨ3、Ａｒ1は−Ｃ6Ｈ4−、Ｒ3は−Ｃ10Ｈ7、Ｓ2は−Ｃ6Ｈ4Ｏ（ＣＨ2）4ＣＯ−である。
【０１１２】
図５に示す３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの合成については、図８、図９、図１０によって後述する。
【０１１３】
図６は、本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり、５’−ＤＮＰＡ−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。
【０１１４】
図６に示す蛍光プローブは、図１（Ｄ）の構造を有し、芳香族アミン化合物（図４に示すＤＮＰＡ−２、但し、−ＯＲ43を−Ｈに置き換えている。）に、生体分子に結合可能な分子鎖１０が結合されたものである。
【０１１５】
この分子鎖１０は、図５と同様に、ｎ個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含んでいる。オリゴヌクレオチドはその５’端に−（ＰＯ4-）(ＣＨ2)6ＮＨ−を有し、３’端は−ＯＨである。分子鎖１０のオリゴヌクレオチドの５’端側のＮＨ−は芳香族アミン化合物ＤＮＰＡ−２に結合され、３’端側はＯＨで終端している。
【０１１６】
図６において、図１（Ｄ）に示すＳ4、Ｒ4、Ａｒ3、Ａｒ4、Ｓ3は、次に示す通りである。Ｓ4は−Ｃ6Ｈ5、Ｒ4は−Ｃ10Ｈ7、Ａｒ3は−Ｃ10Ｈ6−、Ａｒ4は−Ｃ14Ｈ6（ＣＮ）2−、Ｓ3は−ＣＯ（ＣＨ2）4ＣＯ−である。
【０１１７】
図７は、本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり、３’−ＢＳＡ−２−５’−チオ−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。
【０１１８】
図７に示す蛍光プローブは、図１（Ａ）の構造を有し、芳香族アミン化合物（図３に示すＢＳＡ−２、但し、Ｒ47＝ＣＨ3である。)に、生体分子に結合可能な分子鎖１０が結合されたものである。芳香族アミン化合物ＢＳＡ−２は、アントリレン基（anthrylene基、−Ｃ14Ｈ8−）の両端に−（Ｃ6Ｈ4）Ｎ（Ｃ6Ｈ5）（Ｃ6Ｈ4）−が結合された構造を有している。
【０１１９】
この分子鎖１０は、図５と同様に、ｎ個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含んでいる。オリゴヌクレオチドはその３’端に−（ＰＯ4-）(ＣＨ2）12（ＰＯ4-）(ＣＨ2）ＣＨ(ＣＨ2ＯＨ）（ＣＨ2）4ＮＨ−を有し、５’端に−（ＰＯ4-）(ＣＨ2）6ＳＨ−有している。分子鎖１０のオリゴヌクレオチドの３’端側のＮＨ−は芳香族アミン化合物ＢＳＡ−２に結合され、５’端側はＳＨで終端している。
【０１２０】
図７において、図１（Ａ）に示すＳ1、Ａｒ2、Ａｒ1、Ｒ3、Ｓ2は、次に示す通りである。Ｓ1は−ＣＨＣＨＣ6Ｈ4Ｎ（Ｃ6Ｈ5）（Ｃ6Ｈ4ＯＣＨ3）、Ａｒ2は−Ｃ14Ｈ8−、Ａｒ1は−Ｃ6Ｈ4−、Ｒ3は−Ｃ6Ｈ5−、Ｓ2は−Ｃ6Ｈ4Ｏ（ＣＨ2）4ＣＯＮＨ−である。
【０１２１】
図８、図９、図１０は、本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの合成スキーム例を示す図であり、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの合成スキームを説明する図である。図９は、図８に示す合成スキームに続く図であり、図１０は、図９に示す合成スキームに続く図である。
【０１２２】
以下の反応は一般的にはＤＮＡ固相合成装置によって行う。
【０１２３】
先ず、図８に示すように、反応｛Ａ１＋Ａ２→Ａ３｝から始める。Ａ１は 3'-Amino-modifier C7 CPG（図１４（Ａ）を参照。）、Ａ２はスペーサホスホンアミダイト（グレンリサーチ社製、Spacer C12 CE Phosphoramidite）である。
【０１２４】
次に、反応｛Ａ３＋Ａ４→Ａ５｝を行ない、１番目のヌクレオチドをＡ３に結合する。Ａ４（以下のＡ６、Ａ８も同じである。）６は dN-CE Phosphoramidite（グレンリサーチ社製）であり、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣである。続いて、反応｛Ａ５＋Ａ６→Ａ７｝を行ない、同様に２番目のヌクレオチドをＡ５に結合する。以下、同様の反応｛Ａ７＋Ａ８→Ａ９｝を繰り返して行ない、所望の塩基種の順に所望の数ｎ番目までのヌクレオチドを結合する。
【０１２５】
次に、反応｛Ａ９＋Ａ１０→Ａ１１｝を行なう。Ａ９は5'-Amino-modifier C6（図１４（Ｄ）を参照。）である。続いて、反応｛Ａ１１＋Ａ１２→Ａ１３｝を行ない、５'アミノを脱保護して５'側末端をＮＨ2とする。以上のようにして、固相ＣＰＧに所望の塩基配列を有し、５'側末端がＮＨ2であるオリゴヌクレオチドが形成される。
【０１２６】
次に、反応｛Ａ１３＋Ａ１４→Ａ１５｝を行ない、Ａ１３とＳＰ−１−ＯＳｕ（中間体（活性化エステル化合物）Ａ１４、図１５を参照。）を結合させる。続いて、反応｛Ａ１５＋Ａ１６→Ａ１７｝を行ない、３'アミノの脱保護及びＣＰＧからの分離を行なって、５'側末端にＳＰ−１が結合され、３'側末端がＮＨ2であるＡ１７、即ち、図５に示す３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブが得られる。
【０１２７】
なお、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide、Ｃ4Ｈ5ＮＯ3）をＨＯＳｕと表わし、−ＯＳｕによって、−Ｃ4Ｈ4ＮＯ3を表わしている（以下の各図に関する説明においても同様である。）。
【０１２８】
なお、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの３'側末端に、５'側末端に結合されたものと異なる色素を結合して修飾することも可能であり、５'及び３'側末端が異なる色素によって修飾されたオリゴヌクレオチドプローブを得ることもできる。このような構成によれば、例えば、アクセプタ色素とドナー色素が所定の間隔を置いて結合され、共鳴による励起エネルギーの移動（ＦＲＥＴ：Fluorescence Resonance Energy Transfer）が生じるプローブを得ることができ、各種のアッセイに使用することができる。
【０１２９】
図１１、図１２は、本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの合成スキーム例を示す図であり、３’−ＢＳＡ−２−５’−チオ−オリゴヌクレオチドプローブの合成スキームを説明する図である。図１２は、図１１に示す合成スキームに続く図である。
【０１３０】
先ず、図１１に示すように、反応｛Ｂ１＋Ｂ２→Ｂ３｝を行なう。Ｂ１は図８において得られたＡ９と同じものであり、Ｂ２は 5'-Amino-modifier C6（図１４（Ｃ）を参照。）であり。続いて、反応｛Ｂ３＋Ｂ４→Ｂ５｝を行ない、３'アミノの脱保護及びＣＰＧからの分離を行なって、５'側末端にＳＴ（Ｔはトリフェニルメチル基である。）が結合され、３'側末端がＮＨ2であるＢ５が得られる。
【０１３１】
続いて、反応｛Ｂ５＋Ｂ６→Ｂ７｝を行なう。Ｂ６は、芳香族アミン化合物ＢＳＡ−２（図３に示すＢＳＡ−２、但し、Ｒ47＝ＣＨ3である。）と、ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｃ4Ｈ5ＮＯ3）の反応によって予め調製された中間体（活性化エステル化合物）ＢＳＡ−２−ＯＳｕである。
【０１３２】
次に、反応｛Ｂ７＋Ｂ８→Ｂ９｝を行ない、５'チオールの酸化的脱保護を行なって、５'側末端がＳＨであり、３'側末端にＢＳＡ−２が結合されたＢ９、即ち、図７に示す３’−ＢＳＡ−２−５’−チオ−オリゴヌクレオチドプローブが得られる。
【０１３３】
図８〜図１２において使用可能な固相支持体、試薬の例として、図１３、図１４にグレンリサーチ社製のものを示す。
【０１３４】
図１３は、本発明の実施の形態における、オリゴヌクレオチドプローブの合成に使用される固相支持体の例を説明する図である。
【０１３５】
図１３に示すように、オリゴヌクレオチドの合成に必要な化合物は、ポリスチレン微小ビーズ、ＣＰＧに担持された形で入手することができる。図１３（Ａ）、図１３（Ｃ）に示す固相支持体を使用すれば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意のものを有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの１番目のヌクレオチドとすることができる。
【０１３６】
また、図１３（Ｂ）、図１３（Ｄ）に示す固相支持体を使用すれば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのうち特定のものを有するヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの１番目のヌクレオチドとすることができる。なお、図１３（Ｂ）ではＩｃａａが結合されているＣＰＧは図示していない。なお、図１３において、ＣＰＧ（Controlled Porous Glass）は多孔性ガラスビーズであり、Ｍｅはメチル基、protected baseは保護基によって保護された塩基、ＤＭＴはジメトキシトチリル基、Ｉｃａａは長鎖アルキルアミノ（long chain alkylamino）基である。
【０１３７】
図１４は、本発明の実施の形態における、オリゴヌクレオチドプローブの合成に使用される固相支持体、試薬の例を説明する図である。
【０１３８】
図１４（Ａ）及び図１４（Ｂ）は固相支持体の例を示し、図１４（Ａ）、図１４（Ｂ）は３’末端側のアミノ修飾に使用される。図１４（Ｃ）及び図１４（Ｄ）は試薬の例を示し、図１４（Ｃ）は５’末端側のチオール修飾、図１４（Ｄ）は５’末端側のアミノ修飾にそれぞれ使用される。なお、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシ基、ＤＭＴはジメトキシトチリル基、Ｉｃａａは長鎖アルキルアミノ（long chain alkylamino）基、ＣＰＧは多孔性ガラスビーズ、Ｐｒiはイソプロピル基、ＳＴはＳ−トチリル基、ＭＭＴはモノメトキシトチリル基である。
【０１３９】
先述したように、オリゴヌクレオチドプローブは、固相支持体を使用したオリゴヌクレオチドの調製、ＢＳＡ−２−ＯＳｕ、ＳＰ−１−ＯＳｕ等の中間体化合物の調製、及び、これら調整された２つ分子の結合反応によって合成される。
【０１４０】
次に、中間体化合物としてＳＰ−１−ＯＳｕを例にとりその合成方法及びその結果について説明し、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの合成について説明する。
【０１４１】
実施例
中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの合成
図１５は、本発明の実施例における、オリゴヌクレオチドプローブ（３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブ）の合成に使用される中間体ＳＰ−１−ＯＳｕを説明する図である。
【０１４２】
（１）化合物１の合成
アルゴン雰囲気下で、p-anisidine（Ｃ１（図１５）、ｐ‐メトキシアニリン、ＣＨ3ＯＣ6Ｈ4ＮＨ2）５０５ｇ（４．１２ｍｏｌ）、1-iodonaphthalene（Ｃ２（図１５）、１‐ヨードナフタレン、Ｃ10Ｈ7Ｉ）１０５ｇ（０．４１ｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）2（二酢酸パラジウム（II）、Ｐｄ（ＯＣＯＣＨ3）2）１．８５ｇ（８．２４ｍｍｏｌ）、tri-tert-butylphosphine（トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチルホスフィン、（ＰＣ（ＣＨ3）3）3）５．００ｇ（２４．７ｍｍｏｌ）、sodium tert-butoxide（tri-tert-butylphosphinesodium tert-butoxide、ナトリウムｔｅｒｔ‐ブトキシド、Ｃ4Ｈ9ＯＮａ）４７．５ｇ（０．４９ｍｏｌ）の、脱水キシレン５００ｍＬ懸濁溶液を２１時間穏やかに還流した。冷却後、塩酸を加え、酢酸エチルにて抽出した。有機層を希塩酸で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧乾燥した。濃縮残渣をシリカゲルカラム精製（トルエン）し粗体をメタノールで洗浄し、無色の化合物１ ６８．９ｇ（収率６６％）を得た。
【０１４３】
（２）化合物２の合成
アルゴン雰囲気下で、化合物１ １９．６ｇ（７８．６ｍｍｏｌ）、2-(p-bromophenyl)-1,3-dioxolane（Ｃ３（図１５）、２‐（４‐ブロモフェニル）‐１，３‐ジオキソラン、Ｃ9Ｈ9ＢｒＯ2））１９．７ｇ（８６．４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）2 ０．３５ｇ（１．５７ｍｍｏｌ）、tri-tert-butylphosphine ０．９５ｇ（４．７ｍｍｏｌ）、sodium tert-butoxide ９．０６ｇ（９４．３ｍｍｏｌ）、の脱水キシレン７８ｍＬ懸濁溶液を１９時間穏やかに還流した。冷却後、水に注ぎ、トルエンにて抽出した。有機層を水洗し無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラム精製（トルエン）し黄色粘性液体の化合物２ ２５．２ｇ（収率８０％）を得た。
【０１４４】
（３）化合物３の合成
化合物２ １４．５ｇ（３６．５ｍｍｏｌ）と３０％ＨＢｒ−ＨＯＡｃ（酢酸、ＣＨ3ＣＯＯＨ）１４５ｇの混合溶液を３時間還流した。冷却後、水と塩化メチレンを加え、不溶物をろ別した。ろ液を分液し、有機層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラム精製（塩化メチレン〜酢酸エチル／ヘキサン＝１／２）し、黄色アモルファスの化合物３ ３．７１ｇ（収率３０％）を得た。
【０１４５】
（４）化合物４の合成
アルゴン雰囲気下で、p-xylyl cyanide（Ｃ４（図１５）、ｐ‐キシレンジシアニド、Ｃ10Ｈ8Ｎ2）５０．２ｇ（０．３８ｍｏｌ）の脱水エーテル溶液７６０ｍＬに、ヨウ素 ９７．１ｇ（０．３８ｍｏｌ）を加え、水冷しながら sodium methoxide（ナトリウムメトキシド、ＣＨ3ＯＮａ）１４８ｇ（０．７７ｍｏｌ ２８％ in ＭｅＯＨ）を１５分間にて滴下した。室温で３０分攪拌後、減圧下で溶媒を溜去した。濃縮残渣をメタノールで数回洗浄し、深緑色結晶の化合物４ ４０．５ｇ（収率８２％）を得た。
【０１４６】
（５）化合物５の合成
化合物４ １５．０ｇ（５８．１ｍｍｏｌ）のトルエン溶液４．５Ｌを高圧水銀灯の照射の下で、酸素をバブリングしながら７時間攪拌した。減圧下で、反応混合液を濃縮し、スラリー状態となって析出した固体をろ過した。得られた粗体をトルエンで洗浄し、淡山吹色結晶の化合物５ １３．３ｇ（収率８９％）を得た。
【０１４７】
（６）化合物６の合成
化合物５ １１．０ｇ（４２．９ｍｍｌ）のクロロホルム溶液８５８ｍＬに、ＮＢＳ（2-nitrobenzenesulfenyl chloride、２‐ニトロベンゼンスルフェニルクロリド、Ｃ6Ｈ4ＮＯ2ＳＣｌ）２２．９ｇ（１２９ｍｍｏｌ）とＡＩＢＮ（azobisisobutyronitrile, azobisisobutylonitrile、アゾビスイソブチロニトリル、ＮＣＣ（ＣＨ3）2ＮＮ（ＣＨ3）ＣＣＮ））１．０５ｇ（６．４５ｍｍｏｌ）をそれぞれ、３時間毎に１／５ずつ加え、合計１５時間還流した。減圧下で濃縮し、スラリー状態となって析出した固体をろ過した。得られた粗体をエタノールとヘキサンで洗浄し、淡褐色結晶の化合物６を含む混合物１４．１ｇを得た。
【０１４８】
（７）化合物７の合成
化合物６を含む混合物 １３．５ｇと亜リン酸トリエチル（トリエトキシホスフィン、Ｐ（ＯＣ2Ｈ5)3）４０．５ｇの混合物を１４５℃にて２４時間攪拌した。減圧下で、余剰の亜リン酸トリエチルを溜去し、ヘキサンで洗浄した。得られた残渣をシリカゲルカラム精製（塩化メチレン〜ＴＨＦ／塩化メチレン＝１／８）し、鮮黄色結晶の化合物７ ６．５８ｇを得た。化合物５からの２段階収率は３９％であった。
【０１４９】
（８）化合物８の合成
アルゴン雰囲気下で、６０％油性水素化ナトリウム（ヒドリドナトリウム、ＨＮａ）０．６４ｇ（１５．９ｍｍｏｌ）からオイル除去した後、脱水ＴＨＦ１００ｍＬと化合物７ ２．１９ｇ（５．５７ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて１０分攪拌した後、０℃以下にて化合物３ １．８０ｇ（５．３０ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ溶液５０ｍＬを２０分かけて滴下した。同温にて４時間攪拌後、過剰の水素化ナトリウムをエタノール、続いて、水でクエンチさせ、有機層を食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。濃縮残渣をメタノールで数回洗浄し、赤色結晶の化合物８ ２．６８ｇ（収率８７％）を得た。
【０１５０】
（９）化合物９の合成
アルゴン雰囲気下で、６０％油性水素化ナトリウム ０．１５０ｇ（３．７４ｍｍｏｌ）からオイル除去した後、脱水ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド、（ＣＨ3）2ＮＣＨＯ）２５ｍＬを加え、攪拌しつつ化合物８ ０．９０ｇ（１．５６ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ １００ｍＬ溶液を滴下した。５℃以下にてEthyl 5-bromopentanoate（Ｃ５（図１５）、Ethyl 5-bromovalerate、エチル５‐ブロモバレラート、ＣＨ2Ｂｒ（ＣＨ2）3ＣＯＯＣ2Ｈ5）１．９５ｇ（９．３３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌後、６５℃にて１５時間攪拌した。過剰の水素化ナトリウムをエタノール、続いて水でクエンチさせ、有機層をトルエンに溶解して水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で、濃縮した。濃縮残渣をメタノールで数回洗浄し、オレンジ結晶の化合物９ １．０６ｇ（収率９６％）を得た。
【０１５１】
（１０）化合物１０の合成
化合物９ ０．９８ｇ（１．３９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液 ２０ｍＬに１０％水酸化ナトリウム水溶液（４．１６ｍｍｏｌ）を加え、５０℃にて１時間攪拌した。さらに、ＴＨＦ ２０ｍＬ、エタノール ４ｍＬ、１０％水酸化ナトリウム水溶液（１１．１ｍｍｏｌ）を加え、６０℃にて３時間攪拌した。析出結晶をろ別し、ＴＨＦで洗浄した。得られた固体にＴＨＦと塩酸を加えて溶解し、不溶物をろ過にて除去した。ろ液を減圧下で濃縮し、こげ茶色結晶の化合物１０ ０．６９ｇ（収率７３％）を得た。この化合物１０は、第三アミン化合物ＳＰ−１である（より正確に言えば、図２に示す蛍光プローブＳｐ−１において、分子鎖ｏｌｉｇｏ（オリゴヌクレオチド）が結合される前の状態の芳香族第三アミン化合物である。）。
【０１５２】
（１１）ＳＰ−１−ＯＳｕの合成
化合物１０ ０．６９ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液 ２０ｍＬに N,N'-dicyclohexylcarbodiimide（Ｎ，Ｎ’‐ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＣＣ、Ｃ（ＮＣ6Ｈ11）2）０．４３ｇ（２．０４ｍｍｏｌ）、N-hydroxysuccinimide（Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド、ＨＯＳｕ、Ｃ4Ｈ5ＮＯ3)０．２４ｇ（２．０４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１６時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、濃縮残渣にメタノールを加えて洗浄し、赤色結晶のＳＰ−１−ＯＳｕ ０．７０ｇ（収率８８％、純度９７．２％、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography、高速液体クロマトグラフィー））を得た。
【０１５３】
以上のように、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕは、反応｛（第三アミン化合物ＳＰ−１）＋ＨＯＳｕ→ＳＰ−１−ＯＳｕ＋Ｈ2Ｏ｝によって、合成することができる。より正確に言えば、図２に示す蛍光プローブＳｐ−１において、分子鎖ｏｌｉｇｏ（オリゴヌクレオチド）が結合される前の状態の第三アミン化合物をＤｙ−ＯＨとする時、反応｛（Ｄｙ−ＯＨ＋ＨＯＳｕ→Ｄｙ−ＯＳｕ＋Ｈ2Ｏ）によって、中間体化合物Ｄｙ−ＯＳｕを合成することができる。
【０１５４】
図１２において使用されるＢ６、即ち、ＢＳＡ−２−ＯＳｕも、ＳＰ−１−ＯＳｕの合成と同様にして、分子鎖ｏｌｉｇｏが結合される前の状態のアミン化合物ＢＳＡ−２（図３に示すＢＳＡ−２、Ｒ47＝ＣＨ3である。）と、ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の反応によって、合成することができる。
【０１５５】
図２、図３、図４に示す蛍光プローブにおいて、分子鎖ｏｌｉｇｏ（オリゴヌクレオチド）が結合される前の状態の芳香族第三アミン化合物をＤｙ−ＯＲと表わし、Ｒを、−Ｈ、又は、アルキル基、例えば、−ＣＨ3とする時、反応｛（Ｄｙ−ＯＲ＋ＨＯＳｕ→Ｄｙ−ＯＳｕ＋ＲＯＨ）によって、中間体化合物Ｄｙ−ＯＳｕを合成することができる。
【０１５６】
図１６は、本発明の実施例において、合成された中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの1Ｈ ＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトルを説明する図である。
【０１５７】
図１６において、横軸はケミカルシフト（ｐｐｍ）、縦軸は核磁気共鳴信号強度を示し、各信号ピークのケミカルシフト値を上部に示し、信号ピークの近傍に信号強度を示している。なお、ＮＭＲスペクトルは、日本電子株式会社の型番ＪＮＭ−ＡＬ４００  ＦＴ  ＮＭＲ装置を用いて測定した。
【０１５８】
δｐｐｍ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）；１．９８（ｍ，４Ｈ），２．７１（ｍ，５Ｈ），２．８４（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｍ，２Ｈ），６．８４（ｍ，４Ｈ），７．１４−７．４９（ｍ，１０Ｈ），７．６５（ｄ，１Ｈ），７．７９（ｄ，１Ｈ），７．８９−８．００（ｍ，３Ｈ），８．７２−８．２９（ｍ，２Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ）
１．９〜４．０ｐｐｍに脂肪族水素が１５個、６．８〜８．６ｐｐｍに芳香族水素が２３個観測されており、ＳＰ−１−ＯＳｕの分子構造と一致する。
【０１５９】
図１７は、本発明の実施例において、合成された中間体ＳＰ−１−ＯＳｕのＭＳスペクトルを説明する図である。
【０１６０】
図１７に示すＭＳスペクトルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization−Time Of Flight−Mass Spectrometer、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型−質量分析計）によって測定されたスペクトルであり、島津製作所製の型番ＫＲＡＴＯＳ  ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲの装置を用いて測定した。
【０１６１】
図１７に示すように、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕ（化学式Ｃ50Ｈ38Ｎ4Ｏ5）の分子量の計算値７７４．２８に対して、測定された各ピークに関するｍ／ｚ（ｍ：分子量、ｚ：電荷数）とパターン係数（出現頻度係数）から求めた分子量は７７４．８６であった。
【０１６２】
図１６、図１７に示したＮＭＲスペクトル、ＭＳスペクトルは、合成された中間体化合物ＳＰ−１−ＯＳｕが所望のものであることを示していた。
【０１６３】
中間体化合物ＳＰ−１−ＯＳｕの吸収、発光特性
次に、合成された中間体化合物ＳＰ−１−ＯＳｕの吸収、発光特性について説明する。吸収スペクトル、発光スペクトルは、日立製作所製の型番Ｕ−３３１０分光光度計およびＦＬ―４５００蛍光光度計を用いて測定した。
【０１６４】
図１８は、本発明の実施例において、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの吸収及び蛍光スペクトルを説明する図であり、図１８（Ａ）は溶液状態でのスペクトル、図１８（Ｂ）は乾燥状態でのスペクトルを示す図である。
【０１６５】
図１８において、横軸は波長（ｎｍ）、縦軸は、吸収及び蛍光スペクトルの極大値を１．０に規格化した強度を示す。
【０１６６】
先ず、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの溶液状態における吸収スペクトル（図１８（Ａ）中（ａ））、蛍光スペクトル（図１８（Ａ）中（ｂ））について説明する。
【０１６７】
１０％ＥｔＯＨ：５ｘＳＳＣバッファーを溶媒とする中間体ＳＰ−１−ＯＳｕ溶液の吸収スペクトルの極大位置は４７４ｎｍであり、モル吸光係数は１２０，０００Ｍ-1ｃｍ-1であった。また、蛍光スペクトルの極大位置は６５０ｎｍであり、蛍光収率は０．００８１であった。吸収及び蛍光スペクトルの極大位置から求めたストークスシフトは、１７６ｎｍであった。なお、蛍光収率は、基準物質としてローダミン１０１（絶対蛍光収率が０．９６）を用いて、次式によって相対蛍光収率を算出する相対蛍光収率測定によった。
ＱＹf（ｓ）／ＱＹf（ｒ）＝［Ａｒｅａ（ｓ）／Ａｂｓ（ｓ）］／［Ａｒｅａ（ｒ）／Ａｂｓ（ｒ）］
ＱＹf（ｓ）：サンプルの相対蛍光収率
ＱＹf（ｒ）：標準物質の絶対蛍光収率、文献値
Ａｒｅａ（ｓ）：サンプルの蛍光スペクトル面積
Ａｒｅａ（ｒ）：標準物質の蛍光スペクトル面積
Ａｂｓ（ｓ）：サンプルの吸光度
Ａｂｓ（ｒ）：標準物質の吸光度
【０１６８】
次に、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの乾燥状態における吸収スペクトル（図１８（Ｂ）中（ａ））、蛍光スペクトル（図１８（Ｂ）中（ｂ））について説明する。
【０１６９】
オゾン処理したガラス基板上にエポキシ樹脂ＳＵ−８（ＳＵ−８−３０３５−Ｎ−０２、化薬マイクロケム製）をシクロペンタノンで５０％に希釈して、スピンコート（まず、５００ｒｐｍで１５秒、次に、１５００ｒｐｍで３０秒保持）した後に、２分間１００℃で乾燥した。５０ｍＷ／ｃｍ2のキセノンランプで６秒紫外線照射して光硬化させ、１５０℃で１０分アニールした。エポキシ樹脂付き基板を、３−アミノプロピルトリエトキシシランと共に１２０℃のオーブン中で加熱し、基板上にアミノ基を導入した。ＤＭＦに１０ｍＭの濃度でＳＰ−１−ＯＳｕを溶解し、アミノ基付き基板を２時間浸漬して基板上にＳＰ−１−Ｏｓｕを担持させた。基板上の乾燥状態にあるフイルム状中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの励起スペクトルの極大位置は４８４ｎｍであった。また、蛍光スペクトルの極大位置は５５６ｎｍであった。吸収及び蛍光スペクトルの極大位置から求めたストークスシフトは、７２ｎｍであった。
【０１７０】
以上のように、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕは、溶液状態、乾燥状態の何れにおいても、大きなストークスシフトを示した。このことは、所望の領域外の光を遮断し所望の領域内の光を透過させ試料に照射される励起光を通過させる励起フィルタの光通過波長領域が、蛍光スペクトルが存在する波長領域と重畳しないように、且つ、励起光を遮断すると共に蛍光スペクトルが存在する波長領域の大部分からの光を透過させるような蛍光フィルタの設計が、容易となる。即ち、励起フィルタの光通過波長領域と、蛍光フィルタの光通過波長領域が十分に分離するようにできるので、試料から放射された蛍光とその他の不要な迷光等とを分離することが容易となる。
【０１７１】
図１９は、本発明の比較例における吸収及び蛍光スペクトルを説明する図であり、図１９（Ａ）は、５ｘＳＳＣバッファー液で測定されたＩＣ３−ＯＳｕ（Ｃｙ３）に関するスペクトル、図１９（Ｂ）は、ＴＨＦ液中で測定されたＦＩＴＣ−Ｉに関するスペクトルである。
【０１７２】
図１９（Ａ）、図１９（Ｂ）において、（ａ）は励起スペクトルと励起フィルタを示し、（ｂ）は蛍光スペクトルと蛍光フィルタを示す。図１９（Ａ）、図１９（Ｂ）に示す例では、励起フィルタと蛍光フィルタは非常に近接した波長域の通過帯域をもつものとなっている。励起フィルタと蛍光フィルタの透過率データはセムロック社公開のデータである。
【０１７３】
ＩＣ３−ＯＳｕ（Ｃｙ３）は、同仁同化学研究所製のラベル化剤であり、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製のＣｙ３に類似するものである。ＦＩＴＣ−Ｉは、フルオロセインにイソチオシオナート基を結合させたものである。
【０１７４】
式（ａ）：ＩＣ３−ＯＳｕの分子構造
【０１７５】
【化７】
2010048735.tif 000009
【０１７６】
式（ｂ）：ＦＩＴＣ−Ｉの分子構造
【０１７７】
【化８】
2010048735.tif 000010
【０１７８】
図１９（Ａ）に示すようにＩＣ３−ＯＳｕでは、ストークスシフトは約１０ｎｍであり、図１９（Ｂ）に示すようにＦＩＴＣ−Ｉでは、ストークスシフトは約２５ｎｍである。
【０１７９】
図１８と図１９の比較から明らかなように、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕは、乾燥状態、溶液状態の何れにおいても、ＩＣ３−ＯＳｕ、ＦＩＴＣ−Ｉよりもはるかに大きなストークスシフトを有している。
【０１８０】
なお、Ｃｙ３、ＳＰ−１の各色素溶液をガラス容器に保存し、蛍光灯下に放置したところ、Ｃｙ３は１ヶ月で色が消失したが、ＳＰ−１では変化が生じなく、耐光性に優れていることが確認された。
【０１８１】
Ｃｙ３やフルオロセインの誘導体は、例えば、レーザやハイパワーの光源で容易に劣化して、再現性のある繰り返し測定を困難なものするが、ＳＰ−１はこのよう劣化をせず、再現性のある繰り返しの測定にも使用可能である。
【０１８２】
次に、色素の分子構造とスペクトルとの関係、光酸化耐性の違いを、分子軌道計算によって検討した結果について説明する。
【０１８３】
オレフィン（エチレン）二重結合を２個有し、分子式Ｃ25Ｈ26Ｎ2Ｃｌで示される色素Ｃｙ３（上述の式（ａ）において、Ｎ+−Ｃ10Ｈ14Ｏ4Ｎの部分をＮ−ＣＨ3と変更し、ＮＣ2Ｈ5の部分をＮ−ＣＨ3と変更した色素である。）と、分子式Ｃ42Ｈ29Ｎ3で示される色素ＳＰ（図１５に示す化学式８において−ＯＨを−ＣＨ3で置換された構造を有する色素である。）を検討の対象とした。
【０１８４】
色素Ｃｙ３、色素ＳＰのそれぞれについて、分子軌道計算によって、基底状態の構造最適化を行い基底状態におけるＨＯＭＯ（Highest occupied molecular orbital、最高被占分子軌道）、ＬＵＭＯ（Lowest occupied molecular orbital、最低被占分子軌道）のエネルギー準位を求め、次に、基底状態におけるＨＯＭＯから１電子をそのスピンを反転させてＬＵＭＯに移して励起状態の始状態として、励起状態の構造最適化がなされた核再安定化後におけるＨＯＭＯ、ＬＵＭＯのエネルギー準位を求めた。また、基底状態と励起状態における構造の変化を調べた。
【０１８５】
色素Ｃｙ３では、分子軌道計算によって求められた基底状態及び励起状態におけるＨＯＭＯとＬＵＭＯのエネルギー準位ギャップはそれぞれ、６．２６ｅＶ、２．５６ｅＶであり、ストークスシフトは３．７ｅＶであった。
【０１８６】
色素ＳＰでは、分子軌道計算によって求められた基底状態及び励起状態におけるＨＯＭＯとＬＵＭＯのエネルギー準位ギャップはそれぞれ、７．２２ｅＶ、２．３９ｅＶであり、ストークスシフトは４．８３ｅＶである。色素ＳＰのストークスシフトは、色素Ｃｙ３のストークスシフトよりも大きな値である。
【０１８７】
色素Ｃｙ３では、ＨＯＭＯ、ＬＵＭＯは共に、中心のオレフィン二重結合のπ電子共役が関係しており、励起に伴う構造の変化、即ち、基底状態と励起状態における構造の変化は小さい。色素Ｃｙ３は、励起されても電子雲の広がりが基底状態とあまり変わらないので、構造の変化が小さくストークスシフトが小さい。
【０１８８】
また、色素Ｃｙ３においては、ＨＯＭＯでは電子がオレフィン二重結合部に局在し、るオレフィン二重結合の電子密度が高いので、求電子反応を起し易く、酸素の攻撃を受け酸化され易い。
【０１８９】
色素ＳＰにおける、励起に伴う構造の変化、即ち、基底状態と励起状態における構造の変化は、（１）フェナントレン環の上面から見た時、フェナントレン環とフェニル環を結ぶオレフィン（エチレン）二重結合周りの捩れ角が異なっている点、（２）上記のオレフィン二重結合の軸方向から見た時、アミン窒素（Ｎ）周りの角度が異なっている点、（３）アミン窒素（Ｎ）と上記のオレフィン二重結合の間のフェニル環の側面から見た時、フェンアントレン環とフェニル環（アミン窒素（Ｎ）と上記のオレフィン二重結合の間の環）がそれぞれなす平面間の角度が異なり、フェナントレン環の平面性、即ち、フェニル環のなす平面に対するフェナントレン環のなす平面の位置関係が異なっている点に認められた。
【０１９０】
色素ＳＰにおいては、ＨＯＭＯでは電子供与性のアミン部に電子が局在し、ＬＵＭＯでは電子吸引性のフェナントレン部に電子が局在しており、基底状態から励起状態への遷移は電荷移動型であり、上記のオレフィン二重結合の電子密度は小さい。ＨＯＭＯとＬＵＭＯでは電子分布の状態が異なる結果、上記（２）及び（３）に示した構造的相違が生じている。
【０１９１】
色素ＳＰでは、励起によって、電子は、アミン部からフェナントレン部へ移動し、上記のオレフィン二重結合が大きく捩れて構造変化するため、励起状態の構造と基底状態の構造の差は大きく、ストークスシフトが大きくなる。また、上記のオレフィン二重結合の電子密度は小さいので、求電子反応を起し難く、酸素の攻撃を受け酸化され難い。
【０１９２】
本発明による標識化合物は、スチリル部のオレフィン（エチレン）二重結合に、電荷の偏りを大きくするアミン部（例えば、アミン窒素にフェニル環、ナフチル環が結合してなるアミン部であり、電子を押出すドナー部である。）と、シアノアレーン（例えば、シアノ基で置換されたフェナントレン環であり、電子を吸引するアクセプタ部である。）が結合されているため、分子内に電荷の偏りが生じ分子内の電荷移動に由来する吸収帯を長波長側に生じ、このため、蛍光波長は長波長化される。
【０１９３】
この長波長化された蛍光を感度よく検出するためには、長波長域、例えば、５００ｎｍ以上の波長域で検出感度が改善された光電子増倍管（ＰＭＴ）、例えば、光電陰極にＧａＡｓＰを使用したＰＭＴ等を使用すればよい。
【０１９４】
以上説明したように、本発明の標識化合物は、従来の標識化合物に比べて、ストークスシフトが大きく、しかも、耐光性が高い。従って、励起フィルタの光通過波長領域と、蛍光フィルタの光通過波長領域が十分に分離することができるので、試料から放射された蛍光とその他の不要な迷光等とを分離することができ、検査対象分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができる。また、耐光性が優れているので、微量分子を検出する際に励起光の強度を高めても、標識化合物の光劣化によって生じるデータばらつきは殆んど生じなく、安定した繰り返し測定が可能であり、繰り返し測定の再現性を改善することができる。
【０１９５】
３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの合成
上記の中間体化合物ＳＰ−１−ＯＳｕ（Ａ１４）と、ＤＮＡ固相合成機を使用して合成されたオリゴヌクレオチド（塩基数はｎ＝３０である。）（Ａ１３）を、図９、図１０に示したスキームに従って反応させて、３’アミノ基の脱保護を行い、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１オリゴヌクレオチドプローブ（Ａ１７）を合成した。
【０１９６】
３’−アミノ−５’−ＳＰ−１オリゴヌクレオチドプローブの合成結果は、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによってその純度、構造を確認した。
【０１９７】
なお、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕは、図５に示す３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの合成スキーム（図８〜図１０を参照。）に使用される化合物であるが、この中間体ＳＰ−１−ＯＳｕを、生体分子と共有結合可能である化合物、即ち、先述した蛍光標識化合物として使用することもできる。
【０１９８】
なお、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕは、活性エステル化したカルボニル基（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル基、（ＮＨＳ基、ＯＳｕ基のように呼ばれている。）を有しているエステルであり、アミノ酸、タンパク質におけるアミノ基との間で共有結合を生じる。従って、中間体ＳＰ−１−ＯＳｕを蛍光標識化合物として使用することができる。
【０１９９】
例えば、ＳＰ−１−ＯＳｕを、アミノ酸、タンパク質のようにアミノ基を有する生体分子に結合させて標識し、光励起によって蛍光を発生させることができ、生体分子を検出することができるので、生体分子のための蛍光標識化合物として使用することができる。
【０２００】
以上、本発明を実施の形態について説明したが、本発明は上述の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想に基づいて各種の変形が可能である。
【０２０１】
例えば、本発明による標識化合物を、抗原分子、リガンド分子、糖タンパク分子にそれぞれ結合させて、これら分子にそれぞれ結合する抗体分子、レセプタ分子、レクチン分子を検出することもできる。
【産業上の利用可能性】
【０２０２】
以上説明したように、本発明は、生体由来分子を高感度、高ＳＮ比で検出することができる標識化合物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】本発明の実施の形態における、芳香族アミン蛍光プローブの構成を説明する図である。
【図２】同上、芳香族アミン蛍光プローブ（第１の蛍光プローブ）の例を示す図である。
【図３】同上、芳香族アミン蛍光プローブ（第１の蛍光プローブ）の例を示す図である。
【図４】同上、芳香族アミン蛍光プローブ（第２の蛍光プローブ）の例を示す図である。
【図５】同上、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。
【図６】同上、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり、５’−ＤＮＰＡ−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。
【図７】同上、芳香族アミン蛍光プローブの例を示す図であり、３’−ＢＳＡ１−５’−チオ−オリゴヌクレオチドプローブを説明する図である。
【図８】同上、芳香族アミン蛍光プローブの合成スキーム例を示す図であり、３’−アミノ−５’−ＳＰ−１−オリゴヌクレオチドプローブの合成スキームを説明する図である。
【図９】同上、図８に示す合成スキームに続く図である。
【図１０】同上、図９に示す合成スキームに続く図である。
【図１１】同上、芳香族アミン蛍光プローブの合成スキーム例を示す図であり、３’−ＢＳＡ−２−５’−チオ−オリゴヌクレオチドプローブの合成スキームを説明する図である。
【図１２】同上、図１１に示す合成スキームに続く図である。
【図１３】同上、オリゴヌクレオチドプローブの合成に使用される固相支持体の例を説明する図である。
【図１４】同上、オリゴヌクレオチドプローブの合成に使用される固相支持体、試薬の例を説明する図である。
【図１５】本発明の実施例において、オリゴヌクレオチドプローブの合成に使用される中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの吸収及び蛍光スペクトルを説明する図である。
【図１６】同上、合成された中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを説明する図である。
【図１７】同上、合成された中間体ＳＰ−１−ＯＳｕのＭＳスペクトルを説明する図である。
【図１８】同上、合成された中間体ＳＰ−１−ＯＳｕの吸収及び蛍光スペクトルを説明する図である。
【図１９】同上、比較例における吸収及び蛍光スペクトルを説明する図である。
【符号の説明】
【０２０４】
１０…生体分子に結合可能な分子鎖
【図１】
2010048735.tif 000017
【図２】
2010048735.tif 000018
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2010048735.tif 000027
【図１２】
2010048735.tif 000028
【図１３】
2010048735.tif 000029
【図１４】
2010048735.tif 000030
【図１５】
2010048735.tif 000031
【図１８】
2010048735.tif 000032
【図１９】
2010048735.tif 000033
【図１６】
2010048735.tif 000034
【図１７】
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