(57)【要約】【課題】従来のマイクロキャリアでの継代培養における問題点を解決することを目的とする。具体的には、培養した細胞を新たなマイクロキャリアに継代する際に、細胞増殖能の低下を防ぐことを目的とする。【解決手段】接着性細胞の培養方法において、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる工程で使用する継代用培地であって、カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が０〜２．３ｍＭである継代用培地（Ｂ）、及びこれを用いた洗浄工程及び継代工程を含む細胞の生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着性細胞の培養方法において、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる工程で使用する継代用培地であって、カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が０〜２.３ｍＭである継代用培地（Ｂ）。
【請求項２】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体を用いて接着性細胞を培養した後、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる継代工程を含む細胞の生産方法であって、下記の洗浄工程及び継代工程を含み、洗浄工程、継代工程の順で各工程を行う細胞の生産方法。
洗浄工程：細胞培養により得られた細胞の付着した細胞培養担体を培養液から取り出し、この細胞の付着した細胞培養担体に請求項１に記載の継代用培地（Ｂ）を添加した後、細胞の付着した細胞培養担体を洗浄し、その後、継代用培地（Ｂ）を除去する工程。
継代工程：洗浄工程で得た細胞が付着した細胞培養担体に継代用培地（Ｂ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、継代後、継代用培地（Ｂ）を培養用培地（Ｃ）に置換する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、継代用培地に関する。さらに詳しくは、細胞培養の分野において長期間にわたり細胞の培養を続ける際に、細胞密度が過剰になったとき、細胞数を減じて新しい細胞培養担体に移す必要があり、この操作を継代といい、本発明はこの継代に用いる培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の接着性細胞の継代の手順としては、以下のようになる。先ず、細胞培養担体で細胞を培養し増殖させる。細胞培養担体の全体に細胞が増殖したら、トリプシンやコラゲナーゼ等の蛋白分解酵素を作用させ、細胞培養担体から細胞を剥離させ、培地を加える。培地中に細胞を分散させた後、この細胞浮遊液を遠沈管に回収する。このとき細胞浮遊液中にはトリプシン等の酵素が含まれているため、これらの酵素を取り除く目的で、遠心分離により細胞を遠沈し、上清の培地を除く。その後、新たな培地を加えて細胞を再度分散させ、この細胞浮遊液を適度に希釈し、新しい細胞培養担体で培養を行う。
【０００３】
この方法では、細胞を剥離させる工程があるが、この工程におけるトリプシン等の蛋白質分解酵素の作用やピペッティングの条件が、細胞の生存率に大きく影響し、細胞の増殖能の回復に多大な時間を要する。
トリプシン等の蛋白質分解酵素を作用させない継代方法としては、細胞培養担体としてマイクロキャリアを用いた場合、マイクロキャリア間の継代方法として、細胞が新しいマイクロキャリアに乗り移ることを促進させるために、撹拌培養と静置培養を交互に行う間欠撹拌培養方法（非特許文献１）やカルシウムイオン濃度を通常培養の濃度の５０％に下げた培地での継代方法（非特許文献２）がある。しかし、これらの方法においても新しいマイクロキャリアに効率よく、均一に継代することは難しく、細胞増殖能が低下する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２１，２１１−２１３，１９９９
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２３，９８３−９９３，１９８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記のマイクロキャリアでの継代培養における問題点を解決することを目的とする。具体的には、培養した細胞を新たなマイクロキャリアに継代する際に、細胞増殖能の低下を防ぐことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の継代用培地は、接着性細胞の培養方法において、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる工程で使用する継代用培地であって、カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が０〜２.３ｍＭであることを要旨とする。
【０００７】
また、本発明の細胞の生産方法は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体を用いて接着性細胞を培養した後、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる継代工程を含む細胞の生産方法であって、下記の洗浄工程及び継代工程を含み、洗浄工程、継代工程の順で各工程を行うことを要旨とする。
洗浄工程：細胞培養により得られた細胞の付着した細胞培養担体を培養液から取り出し、この細胞の付着した細胞培養担体に請求項１に記載の継代用培地（Ｂ）を添加した後、細胞の付着した細胞培養担体を洗浄し、その後、継代用培地（Ｂ）を除去する工程。
継代工程：洗浄工程で得た細胞が付着した細胞培養担体に継代用培地（Ｂ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、継代後、継代用培地（Ｂ）を培養用培地（Ｃ）に置換する工程。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の継代用培地を用いて細胞を生産（好ましくは、間欠撹拌培養方法による）すると、細胞が新しいマイクロキャリアに効率よく、均一に乗り移りやすくなる。また、細胞増殖能を低下させることなく継代することができ、細胞増殖能を低下させることなく継代培養を実施することが可能となる。
【０００９】
また、本発明の細胞の生産方法で細胞を生産（好ましくは、間欠撹拌培養方法による）すると、細胞が新しいマイクロキャリアに効率よく、均一に乗り移りやすくなる。また、細胞増殖能を低下させることなく継代することができ、細胞増殖能を低下させることなく継代培養を実施することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において接着性細胞とは、固体表面に接着して増殖する細胞であれば特に限定されないが、例えば、上皮細胞（Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｍＬｕ細胞など）、腫瘍細胞（Ｈｅｌａ細胞、ＶＡＣＯ細胞など）、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞、ＤＢＡＥ細胞など）、白血球（ＨＩＴ−Ｔ１５細胞など）、線維芽細胞（ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＳＦＭＥ細胞など）、筋肉細胞（ＨＬ１細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞など）、神経／内分泌腺細胞（ＲＯＣ−１細胞、ＩＭＲ−３２細胞など）及び初代細胞（鶏胚初代細胞、ウズラ胚初代細胞及びウサギ腎初代細胞等）などが挙げられる。これらのうち、細胞増殖能を低下させないという観点から、好ましくは、上皮細胞及び初代細胞、さらに好ましくは、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞及び初代細胞、特に好ましくＶｅｒｏ細胞、ＨｍＬｕ細胞及びＭＤＣＫ細胞である。
【００１１】
「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
【００１２】
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の中で、Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列、Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ配列、Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ配列、Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｖａｌ配列、Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ配列（１）、Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ配列（２）、Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ配列（３）、Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ配列（４）、Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（５）、Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ配列（６）、Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ配列（７）、Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  配列（８）、Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ配列（９）、Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ配列（１０）、Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ配列（１１）、Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ配列（１２）、Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ配列（１３）、Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ配列（１４）、Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ（１５）及びＰｒｏ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｎ（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはＡｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列、Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ配列（２）、Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ配列（７）、Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ（１５）及びＰｒｏ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｎ（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはＡｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列である。
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の両端には、他のアミノ酸｛アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）等｝を含んでなる介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましい。
【００１３】
介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端には、細胞接着性の観点から、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ配列（６５）、Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列（６６）、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ配列（６７）、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ配列（６８）、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（６９）、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（７０）、Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（７１）、Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（７２）、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（７３）、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（７４）、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（７５）、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（７６）及びＧｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｓｅｒ配列（７７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ配列（６５）、Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列（６６）、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ配列（６７）及びＡｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ配列（６８）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ配列（６５）が特に好ましい。
【００１４】
介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端には、細胞接着性の観点から、Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（７８）、Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ配列（７９）、Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ配列（８０）、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ配列（８１）、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ配列（８２）、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ配列（８３）、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ配列（８４）、Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ配列（８５）、Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（８６）、Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ配列（８７）及びＳｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（８８）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（７８）、Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ配列（７９）、Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ配列（８０）、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ配列（８１）、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ配列（８２）、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ配列（８３）、Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ配列（８４）及びＳｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ配列（８５）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（７８）が特に好ましい。
【００１５】
ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性の観点等から、１分子中に１〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは２〜５０個、次に好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個、最も好ましくは５〜１５個有するものである。なお、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ）が一分子中に含まれてもよい。
【００１６】
ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外に、ポリペプチド（Ｐ）の熱安定性向上の観点等から、補助アミノ酸配列（Ｙ）を有することが好ましい。
【００１７】
補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外のアミノ酸配列が使用でき、ポリペプチド（Ｐ）の熱安定性の観点等から、Ｇｌｙ及び／又はＡｌａを有する配列が好ましい。
【００１８】
補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、（Ｇｌｙ  Ａｌａ）a  配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）b配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ）c配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ）d配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）e配列、｛Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （Ａｌａ）f  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｌａ｝g配列、（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）h配列、（Ｇｌｙ）i配列、（Ａｌａ）j配列、（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｌａ）k配列、（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ）m配列、（Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ）n配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ）o配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ）p配列及び／又は（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ）q配列を有する配列等が含まれる。これらのうち、（Ｇｌｙ  Ａｌａ）a配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）b配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ）c配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ）d配列、（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）e、｛Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （Ａｌａ）f  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｌａ｝g配列、（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）h配列、（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ）m配列及び／又は（Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ）n配列を有するものが好ましく、さらに好ましくは（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）b配列、（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）h配列、（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ）m配列及び／又は（Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ）n配列を有するもの、特に好ましくは（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）b配列を有するものである。
【００１９】
なお、ａは５〜１００の整数、ｂは１〜３３の整数、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、ｆは１〜１９４の整数、ｇは｛１｝〜｛２００／（６＋ｆ）｝の小数点以下を切り捨てした整数、ｈは２〜４０の整数、ｉ及びｊは１０〜２００の整数、ｋは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数、ｏは１〜２２の整数、ｐ及びｑは１〜１３の整数である。
【００２０】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、グリシン（Ｇｌｙ）及び／又はアラニン（Ａｌａ）を含むことが好ましい。グリシン（Ｇｌｙ）及びアラニン（Ａｌａ）を含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
【００２１】
グリシン（Ｇｌｙ）及びアラニン（Ａｌａ）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Ｇｌｙ／Ａｌａ）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
【００２２】
補助アミノ酸配列（Ｙ）には、以上の例示の他に、他のアミノ酸｛アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）等｝を含んでいてもよい。
【００２３】
（Ｇｌｙ  Ａｌａ）a配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１７）〜（１９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２０）〜（２２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ）c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２３）〜（２５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ）d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２６）〜（２８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２９）〜（３１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （Ａｌａ）f  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｌａ｝g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３２）〜（３４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３５）〜（３８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ）i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３９）〜（４１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ａｌａ）j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４２）〜（４４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｌａ）k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４５）〜（４７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ）m配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４８）〜（５０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ）n配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５１）〜（５３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ）o配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５４）〜（５６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ）p配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５７）〜（５９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ）q配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（６０）〜（６２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
【００２４】
これらの補助アミノ酸配列のうち、熱安定性の観点等から、配列番号（１７）、（１８）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２６）、（２７）、（２９）、（３０）、（３２）、（３３）、（３４）、（３５）、（３６）、（３８）、（３９）、（４０）、（４２）、（４３）、（４５）、（４６）、（４８）、（４９）、（５１）、（５２）、（５４）、（５５）、（５７）、（５８）、（６０）又は（６１）で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号（１８）、（２０）、（２１）、（２２）、（２４）、（２７）、（３０）、（３４）、（３５）、（３６）、（３７）、（３８）、（４０）、（４３）、（４６）、（４９）、（５２）、（５５）、（５８）又は（６１）で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号（２０）、（２１）又は（３８）で表されるアミノ酸配列である。
【００２５】
補助アミノ酸配列（Ｙ）を含む場合、（Ｙ）の含有個数は、熱安定性の観点等から、ポリペプチド（Ｐ）１分子中に、２〜５０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは４〜２０、最も好ましくは５〜１５である。また、ポリペプチド（Ｐ）は、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）を含んでもよい。
【００２６】
ポリペプチド（Ｐ）は、分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよい。しかし、ポリペプチド（Ｐ）は、細胞のポリペプチドの認識しやすさという観点から、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００２７】
ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが、必要により（Ｘ）と（Ｙ）の間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることがさらに好ましい。これらの場合、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）の数（個）は、細胞接着性の観点等から、１〜５０が好ましく、さらに好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、最も好ましくは４〜２０である。
【００２８】
また、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数は同じでも異なっていてもよい。異なっている場合は、いずれかの含有個数が他方の含有個数より１個少ないことが好ましい｛この場合、補助アミノ酸配列（Ｙ）が少ないことが好ましい｝。ポリペプチド（Ｐ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数割合（Ｘ／Ｙ）は、０．５〜２が好ましく、さらに好ましくは０．９〜１．４、特に好ましくは１〜１．３である。
【００２９】
また、ポリペプチド（Ｐ）の末端部分（最小アミノ酸配列（Ｘ）又は補助アミノ酸配列（Ｙ）からペプチド末端まで）に他のアミノ酸を含んでもよい。他のアミノ酸を含む場合、その含有個数は、細胞のポリペプチドの認識しやすさという観点から、ポリペプチド（Ｐ）１個当たり、１〜１０００個が好ましく、さらに好ましくは３〜３００、特に好ましくは１０〜１００である。
【００３０】
ポリペプチド（Ｐ）は、アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）でさらに修飾されていてもよい。（ＡＭ）で修飾されていると、本発明のポリペプチド（Ｐ）の細胞接着性がさらに良好となる。
【００３１】
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）としては、ポリアミン、アミノアルコール、アミノ基を有するハロゲン化物、アミノ基含有モノマー及びアミノ基含有モノマーを構成単量体とする重合体、並びにこれらの４級化物等が使用できる。
ポリアミンとしては、少なくとも１個の１級アミノ基又は２級アミノ基を有するポリアミン（炭素数２〜５６）等が用いられ、脂肪族ポリアミン、脂環式ポリアミン、複素環式ポリアミン及び芳香族ポリアミン等が用いられる。
【００３２】
脂肪族ポリアミンとしては、アルキレンジアミン（エチレンジアミン、プロピレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン及びヘキサメチレンジアミン等）、アルキレン基の炭素数が２〜６であるポリアルキレンポリアミン（ジエチレントリアミン、イミノビスプロピルアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン及びペンタエチレンヘキサミン等）、及びこれらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体（ジメチルアミノプロピルアミン、ジエチルアミノプロピルアミン、ジプロピルアミノプロピルアミン、メチルエチルアミノプロピルアミン、トリメチルヘキサメチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルエチレンジアミン、トリオクタデシルエチレンジアミン及びメチルイミノビスプロピルアミン等）等が挙げられる。
【００３３】
脂環式ポリアミンとしては、１，３−ジアミノシクロヘキサン、１，３−ビス（メチルアミノ）シクロヘキサン、１，３−ビス（ジヒドロキシアミノ）シクロヘキサン、イソホロンジアミン、メンタンジアミン及び４，４’−メチレンジシクロヘキサンジアミン等が挙げられる。
【００３４】
複素環式ポリアミンとしては、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、Ｎ−アミノエチルピペラジン及び１，４−ジアミノエチルピペラジン等が挙げられる。
【００３５】
芳香族ポリアミンとしては、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチルフェニレンジアミン、ジフェニルメタンジアミン及び２，６−ジアミノピリジン、トリレンジアミン、ジエチルトリレンジアミン、４，４’−ビス（メチルアミノ）ジフェニルメタン及び１−メチル−２−メチルアミノ−４−アミノベンゼン等が挙げられる。
【００３６】
アミノアルコールとしては、炭素数２〜５８のアミノアルコール等が用いられ、炭素数２〜１０のアルカノールアミン［モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、モノブタノールアミン、トリエタノールアミン、トリプロパノールアミン、トリブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン等］、これらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体［Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−オクタデシルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’−トリオクタデシル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミン等］等が挙げられる。
【００３７】
アミノ基を有するハロゲン化物としては、炭素数２〜１７のアルキルアミンのハロゲン（塩素及び臭素等）化物等が用いられ、アミノエチルクロリド、Ｎ−メチルアミノプロピルクロリド、ジメチルアミノエチルクロリド、ジエチルアミノエチルクロリド、ジベンジルアミノエチルブロミド、ジメチルアミノプロピルブロミド、ジエチルアミノプロピルクロリド及びジベンジルアミノプロピルクロリド等が挙げられる。
【００３８】
アミノ基含有モノマーとしては、炭素数５〜２１のアミノ基含有ビニル化合物、エチレンイミン及び炭素数２〜２０のアミノ酸等が用いられる。
アミノ基含有ビニル化合物としては、アミノ基含有（メタ）アクリレート、アミノ基含有（メタ）アクリルアミド、アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素及びアミノ基含有アリルエーテル等が用いられる。なお、（メタ）アクリ・・・は、アクリ・・・及び／又はメタクリ・・・を意味する。
【００３９】
アミノ基含有（メタ）アクリレートとしては、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノプロピル（メタ）アクリレート、モルホリノエチル（メタ）アクリレート及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００４０】
アミノ基含有（メタ）アクリルアミドとしては、アミノエチルアクリルアミド、Ｎ−メチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、モルホリノエチル（メタ）アクリルアミド及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
【００４１】
アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素としては、アミノエチルスチレン、Ｎ−メチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノスチレン及びＮ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノスチレン等が挙げられる。
【００４２】
アミノ基含有アリルエーテルとしては、アミノエチルアリルエーテル、Ｎ−メチルアミノエチルアリルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアリルエーテル及びＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアリルエーテル等が挙げられる。
【００４３】
アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、システイン、リシン、セリン、グリシン、３−アミノプロピオン酸、８−アミノアクタン酸及び２０−アミノエイコサン酸等が挙げられる。
【００４４】
アミノ基含有モノマーの重合体としては、アミノ基含有ビニル化合物からなるビニルポリマー、ポリエチレンイミン及びポリペプチド（直鎖状ポリペプチド（Ｐ）は含まない。）等が挙げられる。
アミノ基含有モノマーの重合体の重量平均分子量は、５００〜１００万が好ましく、さらに好ましくは１，０００〜８０万、特に好ましくは２，０００〜５０万である。なお、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定することができる｛基準物質：分子量４２０〜２０,６００,０００のポリスチレンスタンダード（東ソー製）等｝。
【００４５】
これらの４級化物としては、これらのアミノ基を４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化したもの等が挙げられる。
【００４６】
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）で修飾する方法としては、（１）アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）と、修飾前のポリペプチドとを化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる方法、並びに、（２）アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）を修飾前のポリペプチドに物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）させる方法等が適用できる。
これらのうち、結合強度の観点等から、（１）の化学結合させる方法が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。
【００４７】
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）と修飾前のペプチド（Ｐ）とを共有結合させる具体例としては、ペプチド（Ｐ）中の側鎖に水酸基を含有するアミノ酸（例えば、Ｓｅｒ及びＴｙｒ）をアミノ基及び／又はアンモニオ基を有するアルキルハロゲン化物でアルキルエーテル化する方法、及び側鎖にカルボキシル基を含有するアミノ酸（例えば、Ａｓｐ及びＧｌｕ）をアミノ基及び／又はアンモニオ基を有するアルコールでエステル化する方法が挙げられる。
【００４８】
ポリペプチド（Ｐ）の重量平均分子量（以下、Ｍｗ）は、１，０００〜１，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは２，０００〜７００，０００、特に好ましくは３，０００〜４００，０００、最も好ましくは４，０００〜２００，０００である。
【００４９】
なお、ポリペプチド（Ｐ）のＭｗは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプル｛ポリペプチド等｝を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法等の公知の方法によって求められる（以下、同じ）。
【００５０】
好ましいポリペプチド（Ｐ）の一部を以下に例示する。
（１）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＡｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列（ｘ１）の場合
Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列（ｘ１）の１３個と（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）9配列（２１）（ｙ１）の１２個とを有し、（ｘ１）のＮ末端にＧｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ配列（６５）、（ｘ１）のＣ末端にＳｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（７８）を有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１１万のポリペプチド｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；（ｘ１）の５個と（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）3配列（２０）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約２万のポリペプチド（「プロネクチンＦ２」）；（ｘ１）の３個と（Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ）2  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）3配列（３８）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１万のポリペプチド（「プロネクチンＦ３」）等。
【００５１】
（２）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＩｌｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ配列（ｘ２）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のＡｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列（ｘ１）をＩｌｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ配列（７）（ｘ２）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端に結合するＧｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ配列（６５）をＧｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｓｅｒ配列（７７）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端に結合するＳｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（７８）をＳｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（８８）に変更した「プロネクチンＬ」、「プロネクチンＬ２」、又は「プロネクチンＬ３」等。
【００５２】
（３）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＴｙｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ配列（ｘ３）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のＡｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列（ｘ１）をＴｙｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ配列（ｘ３）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端に結合するＧｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ配列（６５）をＧｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ配列（６９）に、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端に結合するＳｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（７８）をＣｙｓ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（８６）に変更した「プロネクチンＹ」、「プロネクチンＹ２」、又は「プロネクチンＹ３」等。
【００５３】
（ＡＭ）で修飾されたペプチド（Ｐ）の具体例としては、上記「プロネクチンＦ」を塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリドでエーテル化したペプチドが挙げられる。
【００５４】
また、（１）〜（３）のポリペプチドの他、宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ−２９６）｛最小アミノ酸配列（Ｘ）としてＡｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列（ｘ１）及びＬｅｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ配列を含有するＭｗ約６万のポリペプチド｝、同ＲＧＤＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ｛最小アミノ酸配列（Ｘ）としてＡｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列（ｘ１）を含有するＭｗ約３万のポリペプチド｝も好ましく使用できる｛ただし、これらのポリペプチドは天然に由来し、補助アミノ酸配列（Ｙ）が含まれていない。よって、熱安定性等が上記の（１）〜（３）よりも劣る。また、これらのポリペプチドのアミノ酸配列は特開平２−３１１４９８号に開示されている。｝。
【００５５】
ポリペプチド（Ｐ）は、人工的に合成される人工ポリペプチドあってもよく、人工ポリペプチドである場合は、例えば、有機合成法（固相合成法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換え微生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって製造する。すなわち、人工ポリペプチドは、動物由来のコラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着性蛋白質を含まない。
ポリペプチド（Ｐ）は、動物由来成分を含まないという観点から、人工ポリペプチドであることが好ましい。
【００５６】
有機合成法に関しては、例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が用いられる。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が用いられる。人工ポリペプチドを容易に合成できる点で、遺伝子組換え微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ましくは遺伝子組換え大腸菌を用いて合成する方法である。
【００５７】
マイクロキャリア（Ａ）の材質としては、接着性細胞が接着できる材質であれば特に限定されないが、細胞毒性の観点等から以下の物質を主成分とすることが好ましい。なお、主成分とは、材質の重量を基準として、以下の物質の含有量が９０重量％以上であることを意味する。
（１）合成高分子：ポリ（メタ）アクリル酸（塩）、ビニル樹脂、ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ樹脂、ナイロン及びポリカーボネート等。
（２）天然高分子：セルロース、セルロース誘導体（セルロースジアセテート及びセルローストリアセテート等）及びデキストラン等。
（３）無機物：酸化アルミニウム、ハイドロキシアパタイト、酸化チタン、シリカ及びガラス等。
【００５８】
これらのうち、細胞親和性の観点から、合成高分子、天然高分子及びハイドロキシアパタイトが好ましく、さらに好ましくは合成高分子及び天然高分子、特に好ましくは合成高分子、最も好ましくはポリ（メタ）アクリル酸（塩）である。
【００５９】
ポリ（メタ）アクリル酸（塩）としては、下記（１）〜（３）のポリマー等が含まれる。
（１）特開昭５５−１３３４１３号公報等に記載の水溶液重合（断熱重合、薄膜重合又は噴霧重合等）により得られる架橋ポリアクリル酸（塩）。
（２）特公昭５４−３０７１０号公報、特開昭５６−２６９０９号公報又は特開平１１−５８０８号公報等に記載の逆相懸濁重合により得られる架橋ポリアクリル酸（塩）。
（３）特開２００１−２９３５号公報、特開２００３−０５２７４２号公報、特開２００３−０８２２５０号公報、特開２００３−１６５８８３号公報、特開２００３−１７６４２１号公報、特開２００３−１８３５２８号公報、特開２００３−１９２７３２号公報、特開２００３−２２５５６５号公報、特開２００３−２３８６９６号公報、特開２００３−３３５９７０号公報、特開２００４−０９１６７３号公報、特開２００４−１２１４００号公報、特開２００４−１２３８３５号公報、特開２００５−０７５９８２号公報、特開２００５−０９５７５９号公報、特開２００５−０９７５６９号公報、特開２００５−１８６０１５号公報、特開２００５−１８６０１６号公報、特開２００５−２４７９３１号公報等に記載された架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）。
【００６０】
これらのうち、細胞の担体への接着性等の観点から、（２）及び（３）が好ましい。すなわち、カルボキシル基を有するモノマーを重合して得られる架橋重合体が好ましく、さらに好ましくは架橋ポリ（メタ）アクリル酸（塩）である。
なお、（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸及び／又はメタクリル酸を意味し、酸（塩）とは、酸及び／又は酸塩を意味する。
【００６１】
マイクロキャリア（Ａ）の形態としては中実型と多孔質型とが含まれ、いずれも使用できるが、細胞への栄養、酸素の供給効率及び細胞の回収率の観点等から、中実型が好ましい。また、マイクロキャリアの形状としては、球状及び扁平（楕円）等のいずれも使用できる。
【００６２】
マイクロキャリア（Ａ）の粒子径（μｍ）は、中実型の場合、２０〜２，０００が好ましく、さらに好ましくは４０〜１，０００、特に好ましくは８０〜５００である。一方、多孔質型の場合、粒子径（μｍ）は、３０〜２５，０００が好ましく、さらに好ましくは６０〜１２，０００、特に好ましくは１２０〜６，０００である。扁平状の場合、最大径（μｍ）が２０〜２０，０００が好ましく、さらに好ましくは５０〜１０，０００、特に好ましくは１００〜５，０００である。これらの範囲内であると、細胞の増殖量がさらに高くなる。
（Ａ）の粒子径又は最大径の分布は、細胞増殖の均一性の観点から、上記粒子径又は最大径の範囲の粒子径又は最大径を有する粒子の重量が、マイクロキャリア（Ａ）の重量を基準として、９０〜１００重量％となることが好ましく、さらに好ましくは９５〜１００重量％である。
【００６３】
マイクロキャリア（Ａ）の真比重は特に制限ないが、（Ａ）を培地とともに撹拌しながら培養する一般的な方法において、撹拌中は（Ａ）が浮遊し、撹拌を止めると沈降することが好ましい。このような観点から、（Ａ）の真比重（ｇ／ｃｍ3）は、１．００〜１．１０が好ましく、さらに好ましくは１．０１〜１．０８、特に好ましくは１．０１〜１．０５である。
【００６４】
ポリペプチド（Ｐ）を有するマイクロキャリア又はポリペプチドを有しないマイクロキャリア支持体は、市場から容易に入手でき、以下のような商品等が使用できる。
（１）ポリスチレン製：ナルジェヌンク社製バイオシロン（Ｂｉｏｓｉｌｏｎ）、ソロヒル社製プラスチックビーズ（Ｐｌａｓｔｉｃ  ｂｅａｄｓ）及びラックス社製サイトスフェア（Ｃｙｔｏｓｐｈｅｒｅ）等。
（２）ポリアクリルアミド製：バイオラッド（株）製バイオキャリア（Ｂｉｏｃａｒｒｉｅｒ）等。
（３）ポリウレタン製：イノアック（株）製ＰＵＦ等。
（４）セルロース製：バイオマテリアル（株）製セルスノウ（Ｃｅｌｌｓｎｏｗ）等。
（５）デキストラン製：アムシャムファルマシア社製サイトデックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）等。
（６）ガラス製：スコット社製シラン（ＳＩＲＡＮ）等。
【００６５】
マイクロキャリアにポリペプチド（Ｐ）を含有させるには、（Ｐ）は、支持体の表面に含有していればよく、（Ｐ）は化学結合（イオン結合、水素結合及び／又は共有結合等）及び／又は物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）によって、支持体の表面に結合されている。これらのうち、ポリペプチドがマイクロキャリアから脱離しないという観点から化学結合が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。
【００６６】
マイクロキャリアにポリペプチド（Ｐ）を共有結合させる反応は公知の方法で行うことができる。例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成９年１０月５日、丸善株式会社発行」に記載の方法が挙げられ、具体的には、以下の（１）〜（３）の通りである。
【００６７】
（１）ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものとポリペプチド（Ｐ）を含有しないマイクロキャリアの支持体（以下、Ｐ未含有支持体）のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ’−Ｎ＝Ｃ（ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ’（−ＯＣＯＲが支持体に由来する部分）｝を得た後、ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをアミド結合できる。
【００６８】
カルボジイミド化合物としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。
【００６９】
（２）ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものとＰ未含有支持体のうちヒドロキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のヒドロキシル基を予めカルボニルジイミダゾール化合物と反応させ、イミダゾール誘導体｛Ｒ−Ｉｍ、Ｉｍはイミダゾリン環、Ｒが支持体に由来｝を得た後、ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものをこのイミダゾール誘導体に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをＮ−Ｃ結合できる。
【００７０】
カルボニルジイミダゾール化合物としては、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。
【００７１】
（３）ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものとＰ未含有支持体のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、Ｐ未含有支持体のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素を得た後、ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものをこのアシルイソ尿素に加えることによって、Ｐ未含有支持体とポリペプチドとをエステル結合できる。
【００７２】
ポリペプチド（Ｐ）をＰ未含有支持体に、物理吸着、イオン結合及び／又は水素結合させる方法としては、溶媒等にポリペプチド（Ｐ）とＰ未含有支持体とを投入し、混合して作製する方法等が挙げられる。溶媒としては特に制限はないが、無機塩、有機酸塩、酸及び／又は塩基を０．００１〜５０重量％（好ましくは０．００５〜３０重量％、さらに好ましくは０．０１〜１０重量％）含有する水溶液等（特開２００３−１８９８４８等に記載）が使用できる。
これらの溶媒の中で、ポリペプチドの結合効率の観点から、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液、並びに水が好ましく、さらに好ましくは無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液、並びにイオン交換蒸留水、特に好ましくは無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液である。
【００７３】
細胞培養担体は、マイクロキャリア（Ａ）を含んでなるものであれば特に制限が無い。
【００７４】
ポリペプチド（Ｐ）の含有量は、細胞接着性等の観点から、細胞培養担体１ｇ当たり、５ｎｇ／ｇ〜５００ｍｇ／ｇが好ましく、さらに好ましくは５０ｎｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ、次に好ましくは５００ｎｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ、次に好ましくは５００ｎｇ／ｇ〜２０ｍｇ／ｇ、特に好ましくは５００ｎｇ／ｇ〜５ｍｇ／ｇ、最も好ましくは５μｇ〜５ｍｇ／ｇである。
【００７５】
なお、ポリペプチド（Ｐ）の含有量は、ポリペプチド（Ｐ）の含有量が５００μｇ／ｇを超える場合、Ｂｉｕｒｅｔ法（たとえば、日本生化学会編「生化学実験講座１、タンパク質の化学Ｉ」第４５〜５５頁（１９７９年１２月１１日；株式会社東京化学同人発行）等により求められる。
【００７６】
一方、ポリペプチド（Ｐ）の含有量が５００μｇ／ｇ以下の場合、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法（たとえば、日本生化学会編「生化学実験講座１、タンパク質の化学Ｉ」第４５〜５５頁（１９７９年１２月１１日；株式会社東京化学同人発行）等により求められる。
【００７７】
また、免疫学的測定法（特開２００４−０４９９２１号公報等に記載）を利用して測定することもできる。具体的には、（１）ポリペプチド（Ｐ）の含有量が既知である細胞培養用担体｛Ｂｉｕｒｅｔ法やＫｊｅｌｄａｈｌ法等でポリペプチド（Ｐ）の含有量が既知になった細胞培養用担体｝を生理食塩水に浸漬し、ポリプチド（Ｐ）と結合する抗体に酵素を標識したもの（以下、酵素標識抗体）とを反応させ、この反応した酵素標識抗体の酵素量を吸光度測定し、検量線（ポリペプチド（Ｐ）の含有量とそれに対する吸光度）を作成する。（２）同様に検体（ポリペプチド（Ｐ）の含有量が未知である細胞培養用担体）の吸光度を測定する。（１）で得られた検量線と（２）で得られた吸光度から、検体のポリペプチド（Ｐ）の含有量を求めることができる。
なお、測定試料は、減圧乾燥機｛１２０℃、０．１ｋＰａ以下｝で１時間乾燥したものを用いる。
【００７８】
継代用培地（Ｂ）とは、細胞培養担体を用いて細胞を培養した後、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる時に使用する培地を意味する。通常、継代用培地（Ｂ）は培養用培地（Ｃ）と同じものを使用するが、本発明の継代用培地の特徴は、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる観点から、カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度０〜２．３ｍＭであることであり、好ましくは０〜１．５ｍＭ、特に好ましくは０〜０．１ｍＭである。
【００７９】
カルシウムイオンの濃度は、継代用培地に可溶性のもの、例えば塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）又は硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ3）2）等を添加することで調整できる。細胞毒性の観点から、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）を用いることが好ましい。
マグネシウムイオンの濃度は、継代用培地に硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）又は塩化マグネシウム６水和物（ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ）等を添加することで調整できる。細胞毒性の観点から、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）を用いることが好ましい。
カルシウムイオンの濃度（ｍＭ）は、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる観点から、０〜２．０ｍＭが好ましく、さらに好ましくは０〜０．５ｍＭである。
マグネシウムイオンの濃度（ｍＭ）は、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる観点から、０〜２．０ｍＭが好ましく、さらに好ましくは０〜０．５ｍＭである。
カルシウムイオンの濃度と、マグネシウムイオンの濃度の比（カルシウムイオン濃度／マグネシウムイオン濃度）は、細胞培養担体に付着した細胞を新たな細胞培養担体に付着した細胞として継代させる観点から、１／１〜１／３が好ましく、さらに好ましくは１／１〜１／２．５である。
【００８０】
継代用培地（Ｂ）と培養用培地（Ｃ）に用いる培地としては、上記記載のカルシウムイオンとマグネシウムイオン濃度の合計濃度以外に制限はなく、血清培地及び無血清培地のいずれも使用可能である。血清培地としては、用いる細胞の種類に応じて、一般の培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、ＯＰＴＩ  ＰＲＯTM  ＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM  ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＴＧTM培地及びこれらの混合培地が挙げられる。
これらの培地の中で、培地の調製の観点から、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地が好ましい。
【００８１】
培養条件としては、特に制限なく、二酸化炭素（ＣＯ2）濃度１〜２９体積％、５〜４５℃で１時間〜１００日間、必要に応じて１〜１０日毎に培地交換しながら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、ＣＯ2濃度３〜１０体積％、３０〜４０℃、１〜２０日間、１〜３日毎に培地交換しながら培養する条件である。
【００８２】
播種する細胞の量としては、用いる細胞培養担体の種類や、細胞の種類等によって異なるが、細胞培養担体の培養表面積１ｃｍ2当たり、１０〜１，０００万個が好ましく、さらに好ましくは１００〜１００万個、特に好ましくは１，０００〜１０万個である。
【００８３】
本発明の継代用培地（Ｂ）は、本発明の細胞の生産方法において好ましく用いられる。本発明の洗浄工程及び継代工程を含み、洗浄工程、継代工程の順で各工程を行う細胞の生産方法は、細胞培養により得られた細胞の付着した細胞培養担体を培養液から取り出し、この細胞の付着した細胞培養担体に請求項１に記載の継代用培地（Ｂ）を添加した後、細胞の付着した細胞培養担体を洗浄し、その後、継代用培地（Ｂ）を除去する洗浄工程と、洗浄工程で得た細胞が付着した細胞培養担体に継代用培地（Ｂ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、継代後、継代用培地（Ｂ）を培養用培地（Ｃ）に置換する継代工程からなる。以下、各工程について順次説明する。
【００８４】
＜洗浄工程＞
培養液から分離した、細胞の付着したマイクロキャリア（Ａ）を含む細胞培養担体（以下、細胞付着担体と記載することがある。）が入った容器内に継代用培地（Ｂ）を添加し、静置又は穏やかに攪拌する。次いで、静置することにより、細胞付着担体を容器内に沈降させ、上澄みの（Ｂ）を除去して廃棄する。静置又は攪拌時の温度としては、細胞の生存環境の観点から、２５〜４０℃が好ましく、さらに好ましくは３０〜３８℃である。静置又は攪拌時間としては、細胞への負荷という観点から、１０〜６０分が好ましく、さらに好ましくは１０〜３０分である。上澄みの（Ｂ）の除去方法としては、特に制限はなく、デカンテーションでの除去、ピペットでの吸引除去等、細胞付着担体と分離できる方法であればよい。
【００８５】
洗浄工程は、必要に応じて複数回繰り返して行うことができる。細胞への損傷の観点から、洗浄工程の回数は１〜１０回が好ましく、さらに好ましくは１〜３回である。この洗浄工程の回数の範囲であると、（Ａ）に残存する培養液成分をより確実に除去することができる。
洗浄工程時の細胞付着担体と洗浄液との重量比率（ｇ／Ｌ）は、０．０１〜１０（ｇ／Ｌ）が好ましく、さらに好ましくは０．１〜５（ｇ／Ｌ）特に好ましくは０．１〜３（ｇ／Ｌ）である。
【００８６】
＜継代工程＞
洗浄工程と継代工程は続けて行うことが好ましく、洗浄工程後の細胞付着担体の入った容器内に、継代用培地（Ｂ）に浸漬させた新たな細胞培養担体を添加し、穏やかに撹拌する。継代用培地（Ｂ）に浸漬させた新たな細胞培養担体の細胞培養担体と継代用培地（Ｂ）との重量比率（ｇ／Ｌ）は、細胞増殖の観点から、０．０１〜１０（ｇ／Ｌ）が好ましく、さらに好ましくは０．１〜５（ｇ／Ｌ）特に好ましくは０．１〜３（ｇ／Ｌ）である。浸漬時間は、細胞増殖の観点から、１０〜６０分が好ましく、さらに好ましくは１０〜３０分である。浸漬温度は、細胞培養担体の性能保持と培地の劣化の観点から、２５〜４０℃が好ましく、さらに好ましくは３０〜３８℃である。
必要に応じて、この工程において攪拌と静置を繰り返し行う間欠撹拌方法を実施してもよい。間欠撹拌方法の攪拌時間は、継代の観点から、１〜３０分が好ましく、さらに好ましくは１〜２０分、特に好ましくは１〜１０分である。間欠攪拌方法の静置時間は、継代の観点から、５〜１２０分が好ましく、さらに好ましくは５〜９０分、特に好ましくは５〜６０分である。間欠撹拌時間としては、継代の観点から、３〜９６時間が好ましく、さらに好ましくは５〜７２時間、特に好ましくは８〜４８時間である。間欠攪拌時の温度としては、細胞への損傷の観点から、５〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは１５〜４５、特に好ましくは２５〜４０である。
なお、洗浄工程及び継代工程での処理温度は、同一でも異なっていてもかまわない。
【００８７】
継代工程期間としては、細胞が新しい細胞培養担体に均一に乗り移るまで実施するが、細胞への損傷の観点から、３〜９６時間が好ましく、さらに好ましくは５〜７２時間、特に好ましくは８〜４８時間である。
【００８８】
継代工程時の細胞付着担体と新しい細胞培養担体の比率（重量比）は、細胞増殖の観点から、１：１〜１００が好ましく、さらに好ましくは１：１〜３０、特に好ましくは１：１〜１０である。
【００８９】
継代後、継代用培地（Ｂ）を培養用培地（Ｃ）に置換する。継代用培地（Ｂ）の置換方法としては、特に制限はなく、デカンテーションでの除去、ピペットでの吸引除去等、細胞付着担体と分離できる方法であればよい。
【００９０】
継代工程が終了後、通常の細胞培養を実施する。細胞培養担体のコンフルエント率が８０〜１００％に到達すると、必要総細胞数に到達していなければ、上記継代方法を再度実施する。
【実施例】
【００９１】
以下に実施例として本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を、％は重量％を意味する。
【００９２】
＜製造例１＞
＜マイクロキャリア（Ａ）の調製＞
攪拌機、モノマー供給管、窒素ガス導入管、温度計、還流冷却器を備えた反応容器にシクロヘキサン６２４部、重合分散剤としてソルビタンモノステアレート３．１部を仕込み、窒素バブリングを３０分以上行って、溶存空気を追い出し７５℃まで昇温した。
別の反応器に８０％アクリル酸水溶液１７３部を仕込み、冷却しながら２８％水酸化ナトリウム水溶液２０７部を加えて中和した。この水溶液に架橋性単量体｛エチレングリコールジグリシジルエーテル｝０．９０部及び重合開始剤｛過硫酸カリウム｝０．２７８部、連鎖移動剤｛次亜リン酸ナトリウム｝０．０５３部を添加した後、窒素バブリングを行い、溶存空気を追い出しモノマー水溶液を得た。
得られたモノマー水溶液を上記の重合反応器のモノマー供給管より６．５部／分の割合で連続的に重合反応器内の撹拌中（撹拌速度は５００ｒｐｍ）のシクロヘキサン液中に約１時間かけて供給してシクロヘキサン還流下で重合を行った。
次に共沸脱水によって１６０部の水を抜き出した後、含水ゲルポリマーを取り出し、更に１２０℃で２時間乾燥して、乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を得た。
乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を、目開きが７５μｍのふるい及び１０６μｍのふるい（ＪＩＳ  Ｚ８８０１−１：２０００）により分級して、粒子径７５〜１０６μｍの粒子｛架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩粒子｝（Ｇ）を得た。吸水性樹脂（Ｇ）１ｇ、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩３．８３ｇ及びアミノエタノール・塩酸塩３．９０ｇに、塩化ナトリウムを０．８５％で含有する０．０２Ｍ、ｐＨ５．２のリン酸緩衝液（以下、ｐＨ５．２のＰＢＳ）２５ｍＬを加え、２５℃で撹拌し、４時間反応させた後、反応溶液を吸引除去した。イオン交換水の１００ｍＬを添加し１時間撹拌後、吸引除去する洗浄操作を５回行い、引き続き、減圧乾燥機｛４０℃、０．１ｋＰａ以下｝で、４時間減圧乾燥して吸水性樹脂（Ｈ）を得た。吸水性樹脂（Ｈ）１ｇ、Ｎ−ジエチルアミノエチルクロライド・塩酸塩８．６ｇ及び４８％水酸化ナトリウム水溶液４．３５ｇに、イオン交換水１０ｍＬを加え、６０℃で撹拌し、５時間反応させた後、反応溶液を吸引除去した。イオン交換水の１００ｍＬを添加し１時間撹拌後、吸引除去する洗浄操作を５回行い、引き続き、減圧乾燥機｛４０℃、０．１ｋＰａ以下｝で、４時間減圧乾燥して吸水性樹脂（Ｉ−１）を得た。（Ｉ−１）の保水量は１０ｇ／ｇであった。
【００９３】
＜ポリペプチド（Ｐ１）の調製＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ配列（ｘ１）１３個と（Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）9配列（２１）１２個とを有し、（ｘ１）のＮ末端にＧｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ配列（６５）、（ｘ１）のＣ末端にＳｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ配列（７８）を有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１１万のペプチド「プロネクチンＦ」を製造し、ポリペプチド（Ｐ１）とした。
【００９４】
＜ポリペプチド（Ｐ１−１）の調製＞
ポリペプチド（Ｐ１）５０ｍｇと塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド（特級試薬）１５０ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液  １．５ｍＬに２０〜４０℃で溶解した後、その溶液を２０〜４０℃で攪拌しながら、水酸化ナトリウム（特級試薬）１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを４５〜５０秒間かけて一定速度で滴下した。室温（２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を分画分子量１２，０００〜１４，０００の透析膜を用いて、脱イオン水１０Ｌに対して４８時間透析し、副生成物を除去した。なお、最初の１２時間は、４時間経過毎に脱イオン水を交換した。得られた水溶液を、−２０℃、０．１ｋＰａ以下の条件で、２４時間凍結乾燥して、ポリペプチド（Ｐ１）を塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリドでエーテル化したＭｗ約１１万のポリペプチド（Ｐ１−１）を得た。
【００９５】
＜ポリペプチド（Ｐ１）が結合した吸水性樹脂の調製＞
吸水性樹脂（Ｉ−１）１ｇに、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩）を６０ｍＭの濃度で含む、０．０２Ｍ、ｐＨ５．２のＰＢＳ溶液の１５ｍＬを加え、２５℃で攪拌し、０．５時間反応させて、変性吸水性樹脂を得た。
次に、この変性吸水性樹脂に、ポリペプチド（Ｐ１）を２．４ｍｇ／ｍＬの濃度で含む０．２Ｍ、ｐＨ７．２のＰＢＳ溶液の１ｍＬを加え、２５℃で攪拌し、２時間反応させた後、反応溶液を吸引除去し、ＰＢＳの４０ｍＬを添加、吸引除去する洗浄操作を５回行い、さらにイオン交換水の４０ｍＬを添加、吸引除去する洗浄操作を２回行い、引き続き、減圧乾燥機｛４０℃、０．１ｋＰａ以下｝で、４時間減圧乾燥してマイクロキャリア（ポリペプチド結合吸水性樹脂）（Ａ−１）を得た。Ａ−１の真比重は、１．０３であった。
【００９６】
＜ポリペプチド（Ｐ１−１）が結合した吸水性樹脂の調製＞
吸水性樹脂（Ｉ−１）１ｇに、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩）を６０ｍＭの濃度で含む、０．０２Ｍ、ｐＨ５．２のＰＢＳ溶液の１５ｍＬを加え、２５℃で攪拌し、０．５時間反応させて、変性吸水性樹脂を得た。
次に、この変性吸水性樹脂に、ポリペプチド（Ｐ１−１）を２．４ｍｇ／ｍＬの濃度で含む０．２Ｍ、ｐＨ７．２のＰＢＳ溶液の１ｍＬを加え、２５℃で攪拌し、２時間反応させた後、反応溶液を吸引除去し、ＰＢＳの４０ｍＬを添加、吸引除去する洗浄操作を５回行い、さらにイオン交換水の４０ｍＬを添加、吸引除去する洗浄操作を２回行い、引き続き、減圧乾燥機｛４０℃、０．１ｋＰａ以下｝で、４時間減圧乾燥してマイクロキャリア（ポリペプチド結合吸水性樹脂）（Ａ−２）を得た。Ａ−１の真比重は、１．０３であった。
【００９７】
＜Ｖｅｒｏ細胞を用いた継代評価＞
＜実施例１＞
スピンナーフラスコへ、マイクロキャリア（Ａ−１）０．０３ｇ及びｐＨ＝７．２に調製したリン酸緩衝液（リン酸水素二ナトリウム０．０２％、リン酸二水素カリウム０．０７６％及び塩化ナトリウム０．８５％を含む。以下、ＰＢＳと略記する。）１０ｍＬを仕込み、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した。オートクレーブ滅菌後、ＰＢＳをアスピレータで吸引除去した後、ＭＥＭ培地に抗菌剤（商品名：ゲンタマイシン／アンフォテリシン  Ｂ、カスケード社製）を０．２重量％で含有させた培地を２ｍＬ添加し、１時間静置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ無血清培地を１０ｍＬ添加した。スピンナーフラスコを３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中に１時間静置した後、予めプレ培養していたＶＥＲＯ細胞を細胞濃度が２０万個／ｍＬになるように無血清培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、６０ｒｐｍの攪拌をしながら、（Ａ−１）のほぼ全面が細胞で覆われるまで７日間培養を行い細胞が付着した（Ａ−１）を得た。培養液から分離した、細胞の付着した（Ａ−１）が入った容器内にカルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ−１）を１０ｍｌ添加し、１０分間、３７℃で静置した。次いで、静置することにより、細胞付着担体を容器内に沈降させ、上澄み（Ｂ−１）をマイクロピペットで除去した。ＭＥＭ培地（Ｂ−１）９０ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．３ｇが入ったスピンナーフラスコへ細胞付着担体を投入した。その後、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を３０時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。間欠攪拌終了後、細胞付着担体を容器内に沈降させ、上澄み（Ｂ−１）をマイクロピペットで除去し、培養用培地（Ｃ−１）｛ＭＥＭ培地に抗菌剤（商品名：ゲンタマイシン／アンフォテリシン  Ｂ、カスケード社製）を０．２重量％で含有させた培地｝を１００ｍｌ投入して、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、６０ｒｐｍの攪拌をしながら培養した。培養７日目にサンプリングし、マイクロキャリアへの接着率を後述の「マイクロキャリアへの細胞接着率評価」に記載の方法で測定した。なお、培養４日目、５日目及び６日目に培地の半分を新しい培養用培地（Ｃ−１）と交換した。
【００９８】
＜マイクロキャリアへの細胞接着率評価＞
マイクロキャリアへの細胞接着率評価は次のように実施した。継代工程終了後の細胞培養担体含有培養液０．５ｍＬを取り、顕微鏡にて細胞が１つ以上接着しているマイクロキャリアの数と細胞が接着していないマイクロキャリアの数を測定する。測定後、以下の式からマイクロキャリアへの細胞接着率を算出し、結果を表１に示した。
マイクロキャリアへの細胞接着率（％）＝｛（細胞が１つ以上接着しているマイクロキャリアの数）／（細胞が１つ以上接着しているマイクロキャリアの数＋細胞が接着していないマイクロキャリアの数）｝×１００
【００９９】
＜細胞増殖性評価＞
継代工程終了して培養７日後の細胞培養液を０．５ｍＬ採り、培地を除去し、クリスタルバイオレット０．１％及びクエン酸を１．９２％含む水溶液０．５ｍＬを添加し３７℃で６０分間保持後、赤血球計数板を用いて細胞核数を計数し、培地中の細胞濃度（万個／ｍＬ）を測定し、結果を表１に示した。
【０１００】
＜実施例２＞
実施例１において、カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ−１）をカルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が２．３ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ−２）に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【０１０１】
＜実施例３＞
実施例１において、カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ−１）をカルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が０ｍＭのＭＥＭ培地（Ｂ−３）に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【０１０２】
＜実施例４＞
実施例１において、カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ−１）をカルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：５のＭＥＭ培地（Ｂ−４）に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【０１０３】
＜実施例５＞
実施例１において、洗浄工程の洗浄回数を２回にした以外は、実施例１と同様にして評価した。
【０１０４】
＜実施例６＞
実施例１において、マイクロキャリア（Ａ−１）をデキストランビーズ（アマシャム製、商品名Ｃｙｔｏｄｅｘ１）に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【０１０５】
＜ＨｍＬｕ細胞を用いた継代評価＞
＜実施例７＞
スピンナーフラスコへ、マイクロキャリア（Ａ−１）０．０３ｇ及びｐＨ＝７．２に調製したＰＢＳ１０ｍＬを仕込み、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した。オートクレーブ滅菌後、ＰＢＳをアスピレータで吸引除去した後、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有イーグル−ＭＥＭ培地に抗菌剤（商品名：ゲンタマイシン／アンフォテリシン  Ｂ、カスケード社製）を０．２重量％で含有させた培地を２ｍＬ添加し、１時間静置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ無血清培地を１０ｍＬ添加した。スピンナーフラスコを３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中に１時間静置した後、予めプレ培養していたＨｍＬｕ細胞を細胞濃度が２０万個／ｍＬになるように培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、６０ｒｐｍの攪拌をしながら、（Ａ−１）のほぼ全面が細胞で覆われるまで４日間培養を行い細胞が付着した（Ａ−１）を得た。培養液から分離した、細胞の付着した（Ａ−１）が入った容器内にカルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：２．２５のイーグル−ＭＥＭ培地（Ｂ−１）を１０ｍｌ添加し、１０分間、３７℃で静置した。次いで、静置することにより、細胞付着担体を容器内に沈降させ、上澄み（Ｂ−１）をマイクロピペットで除去した。ＭＥＭ培地（Ｂ−１）９０ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．３ｇが入ったスピンナーフラスコへ細胞付着担体を投入した。その後、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を３０時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。間欠攪拌終了後、細胞付着担体を容器内に沈降させ、上澄み（Ｂ−１）をマイクロピペットで除去し、培養用培地（Ｃ−１）｛２％ＦＢＳ含有イーグル−ＭＥＭ培地に抗菌剤（商品名：ゲンタマイシン／アンフォテリシン  Ｂ、カスケード社製）を０．２重量％で含有させた培地｝を１００ｍｌ投入して、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、６０ｒｐｍの攪拌をしながら培養した。培養６日目にサンプリングし、実施例１と同様にしてマイクロキャリアへの細胞接着率及び細胞増殖性を測定した。
【０１０６】
＜ＭＤＣＫ細胞を用いた継代評価＞
＜実施例８＞
スピンナーフラスコへ、マイクロキャリア（Ａ−１）０．０３ｇ及びｐＨ＝７．２に調製したＰＢＳ１０ｍＬを仕込み、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した。オートクレーブ滅菌後、ＰＢＳをアスピレータで吸引除去した後、ＭＥＭ培地に抗菌剤（商品名：ゲンタマイシン／アンフォテリシン  Ｂ、カスケード社製）を０．２重量％で含有させた培地を２ｍＬ添加し、１時間静置した後、培地を吸引除去し、再度、同じ無血清培地を１０ｍＬ添加した。スピンナーフラスコを３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中に１時間静置した後、予めプレ培養していたＭＤＣＫ細胞を細胞濃度が２０万個／ｍＬになるように培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、６０ｒｐｍの攪拌をしながら、（Ａ−１）のほぼ全面が細胞で覆われるまで４日間培養を行い細胞が付着した（Ａ−１）を得た。培養液から分離した、細胞の付着した（Ａ−１）が入った容器内にカルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ−１）を１０ｍｌ添加し、１０分間、３７℃で静置した。次いで、静置することにより、細胞付着担体を容器内に沈降させ、上澄み（Ｂ−１）をマイクロピペットで除去した。ＭＥＭ培地（Ｂ−１）９０ｍｌで予め１時間、３７℃で浸漬したマイクロキャリア（Ａ−１）０．３ｇが入ったスピンナーフラスコへ細胞付着担体を投入した。その後、間欠攪拌（攪拌２分、静置２８分）を３０時間、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％ＣＯ2インキュベーター内で実施した。間欠攪拌終了後、細胞付着担体を容器内に沈降させ、上澄み（Ｂ−１）をマイクロピペットで除去し、培養用培地（Ｃ−１）｛ＭＥＭ培地に抗菌剤（商品名：ゲンタマイシン／アンフォテリシン  Ｂ、カスケード社製）を０．２重量％で含有させた培地｝を１００ｍｌ投入して、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ2インキュベーターの中で、６０ｒｐｍの攪拌をしながら培養した。培養６日目にサンプリングし、実施例１と同様にしてマイクロキャリアへの細胞接着率及び細胞増殖性を測定した。
【０１０７】
＜実施例９＞
実施例１において、マイクロキャリア（Ａ−１）をマイクロキャリア（Ａ−２）に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【０１０８】
＜比較例１＞
カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ−１）をカルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が２．４ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ’−１）に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【０１０９】
＜比較例２＞
実施例１において、マイクロキャリア（Ａ−１）を（Ｐ１）を含まない吸水性樹脂（Ｉ−１）に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【０１１０】
＜比較例３＞
カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ−１）をカルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が２．４ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ’−１）に変更した以外は、実施例７と同様にして評価した。
【０１１１】
＜比較例４＞
カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ−１）をカルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が２．４ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ’−１）に変更した以外は、実施例８と同様にして評価した。
【０１１２】
＜比較例５＞
カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ−１）をカルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が２．４ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ’−１）に変更した以外は、実施例９と同様にして評価した。
【０１１３】
＜比較例６＞
カルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が１．１５ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ−１）をカルシウムイオンとマグネシウムイオンの合計濃度が２．４ｍＭ、比率が１：２．２５のＭＥＭ培地（Ｂ’−１）に変更し、マイクロキャリア（Ａ−１）をデキストランビーズ（アマシャム製、商品名Ｃｙｔｏｄｅｘ１）に変更した以外は、実施例１と同様にして評価した。
【０１１４】
【表１】
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【０１１５】
表１より、本発明の実施例１〜６の細胞接着率及び細胞増殖性が、比較例１及び２の結果よりもはるかに優れることが分かる。ポリペプチドを有するマイクロキャリアを使用し、本発明の継代用培地を使用することで、細胞接着率及び細胞増殖性が比較例に比べて飛躍的に向上しており、細胞増殖能を低下させることなく継代することができていることが分かる。また、本発明の継代方法を実施することで、マイクロキャリアに均一に細胞を継代することができ、比較例に比べて細胞増殖性が向上しており、細胞増殖能を低下させることなく継代することができ、細胞増殖能を低下させることなく継代培養を実施できていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明の継代用培地を用いて細胞を生産（好ましくは、間欠撹拌培養方法による）すると、細胞が新しいマイクロキャリアに効率よく、均一に乗り移りやすくなる。また、細胞増殖能を低下させることなく継代することができ、細胞増殖能を低下させることなく継代培養を実施することが可能となる。
また、本発明の細胞の生産方法で細胞を生産（好ましくは、間欠撹拌培養方法による）すると、細胞が新しいマイクロキャリアに効率よく、均一に乗り移りやすくなる。また、細胞増殖能を低下させることなく継代することができ、細胞増殖能を低下させることなく継代培養を実施することが可能となる。
したがって、本発明はウイルス培養用細胞の生産、有用タンパク質発現細胞の生産等、あらゆる接着性細胞の培養生産に有効である。
【配列表】
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