(57)【要約】【課題】簡便且つ効率良く精製し得るフラクトースデヒドロゲナーゼを提供する。また、当該フラクトースデヒドロゲナーゼの代表的な利用例として、当該タンパク質を用いたフラクトースの測定方法、フラクトースやイヌリンの測定キット、フラクトース測定バイオセンサーおよびバイオ電池を提供する。【解決手段】単一のサブユニットから成り、可溶性である、フラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一のサブユニットから成り、可溶性である、フラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の理化学的性質を有する、請求項１に記載のタンパク質。
（ａ）作用：Ｄ−フラクトースを酸化してケト−Ｄ−フラクトースを生成する。
（ｂ）基質特異性：Ｄ−フラクトースを良好な基質として作用する。
（ｃ）分子量：約６００００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【請求項３】
以下の（１）〜（３）のいずれかにより示される、請求項１または２に記載のタンパク質。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するタンパク質
【請求項４】
グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属細菌由来である、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の（１）〜（２）のいずれかにより示される、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
（１）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（２）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１または数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列から成るポリヌクレオチド
【請求項７】
請求項５または６に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、フラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドミドを含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を培養する工程を含む、フラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質をフラクトースに作用させる工程を含む、フラクトースの測定方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を備えることを特徴とする、フラクトース測定キット。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を備えることを特徴とする、フラクトース測定センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一のサブユニットから成り、可溶性タンパク質として生産される、フラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、および該タンパク質の製造方法、ならびに該タンパク質の利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラクトースは、果実中の糖分であり、食品中の甘味成分として広く使用されているため、食品分析において主要な分析対象となっている糖である。このフラクトースの定量法として、フラクトース  に特異的に作用する酵素であるグルコノバクター属由来細菌のフラクトースデヒドロゲナーゼを用いる方法が見出された（特許文献１）。その後、フラクトースデヒドロゲナーゼはイヌリン測定試薬用としても実用化されている（特許文献２〜４）。イヌリン測定により、腎機能の指標である糸球体濾過値を得ることができる。また、本酵素は、所謂バイオ電池の用途にも活用されている（非特許文献１）。酵素をバイオ電池、バイオセンサー等のバイオデバイスに応用する際に、電極と直接電子の授受を行う直接電子移動型の酵素は、電極への電子移動にメディエーター物質を必要としないなど様々な利点を有しているが、現在利用できる酵素の種類は限られている。フラクトースデヒドロゲナーゼは、直接電子移動型酵素の数少ない報告例のひとつとして貴重な存在である。
フラクトースデヒドロゲナーゼは複数のサブユニットからなる膜酵素であり、酵素番号（ＥＣ１．１．９９．１１）に分類される。膜酵素とは、膜結合酵素とも呼ばれ、生体膜に種々の強さで結び付けられている酵素の総称である。膜酵素の膜への結合の強さは、イオン強度のわずかな変化で遊離するものから、膜の中にも埋もれているものまで様々である。この様な膜酵素は通常の酵素とは異なり、その製造方法において可溶化工程が必要となる。可溶化工程とは、生物細胞の細胞膜に埋もれた状態にある膜酵素を膜から切り出して分画する工程である。通常この工程は生物細胞を物理的な手法で破砕したのち、種々の界面活性剤を添加することによって行なわれ、その後高速遠心分離より、可溶化した膜酵素を膜残渣から分画する（非特許文献２、３）。
フラクトースデヒドロゲナーゼの精製に関わる根本的な課題として、可溶性酵素と異なり可溶化工程が必要であること、可溶化した膜酵素を効率良く且つ安定に膜残渣から分画することが一般に困難であること、複数のサブユニットからなるため取扱いが難しいことが挙げられる。可溶化された膜酵素は通常の濾過操作、低速の遠心分離では膜残渣と分離できず、分離するためには２０万Ｇ程度の高速遠心分離操作が必要となり、数キログラムの生物細胞を材料とした場合、界面活性剤処理後の試料を高速遠心分離する様な大規模な高速遠心分離機は非常に高価であり、また運転時の危険性も非常に高くなる（特許文献１）。更に、複数の特許文献、非特許文献に、フラクトースデヒドロゲナーゼの活性発現には少なくとも２つのサブユニットの存在が必要となる、と記載されている（特許文献５，非特許文献４、５）。また、特許文献６では、フラクトースデヒドロゲナーゼの活性発現には、フラクトースと直接反応しＤ−フラクトース  をケト−Ｄ−フラクトース  に酸化する脱水素酵素と、この脱水素酵素から電子を受け取り適当な電子受容体に受け取った電子を供与する２つのタンパク質が活性発現に必要であり、これらの必須２成分を分離することなく菌体から精製する必要があるため、収量が２０％程度と低い、と記載されている。
従って、フラクトースデヒドロゲナーゼの実用性を高めるために、より簡便且つ効率良く精製できる酵素が望まれていた。
【特許文献１】特許２５０８８０８号
【特許文献２】特開２００２−９５４９８号
【特許文献３】特開２００２−１１９２９８号
【特許文献４】特開２００２−１４２７９８号
【特許文献５】特公昭６０−３３４７２号
【特許文献６】特開平７−３１３１５４号
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，３６，２１８−２１９（２００７）
【非特許文献２】生化学実験講座５−酵素研究法（上）（東京化学同人）２１７−２３１
【非特許文献３】生物化学実験法１７−生体膜成分の構造と機能（学会出版センター）４９−１１３）
【非特許文献４】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４５，８１４−８２３（１９８１）
【非特許文献５】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８９，１５４−１５９（１９８２））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、上記諸問題を解決するため、簡便且つ効率良く精製し得るフラクトースデヒドロゲナーゼを造成し、これを提供することである。また、当該フラクトースデヒドロゲナーゼの代表的な利用例として、当該タンパク質を用いたフラクトースの測定方法、フラクトースやイヌリンの測定キット、フラクトース測定バイオセンサーおよびバイオ電池を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、単一のサブユニットから成り、可溶性タンパク質として生産することが可能なフラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を見出すことに成功した。更に本発明者らは、当該タンパク質を遺伝子組換え技術により可溶性タンパク質として精製することに成功し、実用的な酵素を提供する手段を確立した。
【０００５】
すなわち本発明は、以下発明を包含する。
［項１］
単一のサブユニットから成り、可溶性である、フラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
［項２］
以下の理化学的性質を有する、項１に記載のタンパク質。
（ａ）作用：Ｄ−フラクトースを酸化してケト−Ｄ−フラクトースを生成する。
（ｂ）基質特異性：Ｄ−フラクトースを良好な基質として作用する。
（ｃ）分子量：約６００００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
［項３］
以下の（１）〜（３）のいずれかにより示される、項１または２に記載のタンパク質。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するタンパク質
［項４］
グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属細菌由来である、項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
［項５］
項１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［項６］
以下の（１）〜（２）のいずれかにより示される、項５に記載のポリヌクレオチド。
（１）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（２）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１または数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列から成るポリヌクレオチド
［項７］
項５または６に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、フラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［項８］
項５〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドミドを含むベクター。
［項９］
項８に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
［項１０］
項９に記載の形質転換体を培養する工程を含む、フラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
［項１１］
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質をフラクトースに作用させる工程を含む、フラクトースの測定方法。
［項１２］
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を備えることを特徴とする、フラクトース測定キット。
［項１３］
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を備えることを特徴とする、フラクトース測定センサー。
【０００６】
なお、本発明のタンパク質は、フラクトースデヒドロゲナーゼを構成するサブユニットのひとつとして見出されたものである。このように、複数のサブユニットからなる膜タンパク質である本酵素が、その構成サブユニットのひとつのみで酵素活性を有する可溶性タンパク質として単離し得るということは、当業者にとって想定外であった。すなわち、単一のサブユニットから成り可溶性タンパク質として生産することが可能なフラクトースデヒドロゲナーゼを得ることは、技術的に困難であった。本発明は、本発明者らの鋭意努力によって上記技術的困難を克服することによって完成された。したがって、本発明は当業者が予想し得ない顕著且つ有利な効果を有するといえる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、単一サブユニットからなる可溶性のフラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が提供され、フラクトースデヒドロゲナーゼを簡便且つ効率良く精製することが可能となる。また、可溶性のフラクトースデヒドロゲナーゼを、フラクトースの測定方法、フラクトースやイヌリンの測定キット、フラクトース測定バイオセンサーおよびバイオ電池に提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【０００９】
＜１．本発明にかかるタンパク質＞
本発明にかかるタンパク質は、以下の（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）を特徴とするタンパク質である。
（Ｉ）単一のサブユニットから成り、可溶性である、フラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（ＩＩ）上記（Ｉ）のタンパク質において、以下の理化学的性質を有するフラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）作用：Ｄ−フラクトースを酸化してケト−Ｄ−フラクトースを生成する。
（ｂ）基質特異性：Ｄ−フラクトースを良好な基質として作用する。
（ｃ）分子量：約６００００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
（ＩＩＩ）上記（Ｉ）、（ＩＩ）のタンパク質において、以下の（１）〜（３）のいずれかにより示されるタンパク質。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するタンパク質
【００１０】
上記単一のサブユニットとは、他のタンパク質と会合して多量体タンパク質やオリゴマータンパク質を形成する単一のタンパク質分子のことを指す。自然界に存在する多くのタンパク質や酵素は多量体であり、多量体タンパク質の各サブユニットは、お互いに全く同一であったり、相同的であったり、全く異なる個々が全く異なる仕事を担ったりする。単一のサブユニットは１本のポリペプチド鎖から成り、１本のポリペプチド鎖は１つの遺伝子によってコードされている。つまり、単一のサブユニットには必ずそのタンパク質をコードする１つの遺伝子が存在する。
【００１１】
上記可溶性タンパク質とは、具体的には水溶液として得られるタンパク質のことを指す。ただし、膜タンパク質などのように元々水系に不溶で、可溶化剤等の処理により可溶性となるタンパク質とは区別される。
【００１２】
上記配列番号１に示されるアミノ酸配列は、本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列であり、具体的にはグルコノバクター属細菌グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）由来タンパク質のアミノ酸配列である。本発明者らは、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｔｅｕｒｉｉ由来フラクトースデヒドロゲナーゼの遺伝子クローニングを行い、塩基配列を決定した。配列番号１のアミノ酸配列は、本フラクトースデヒドロゲナーゼのサブユニットのうち最大のもの（以降サブユニットＩと記載する）のアミノ酸配列である。
【００１３】
また本発明には、上記で説示した本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をも包含するが、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加される部位は、欠失、置換および／または付加後のタンパク質がフラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有していれば、該アミノ酸配列中のどの部位であってもよい。ここで「１または数個のアミノ酸残基」とは、具体的には１０個以内の範囲のアミノ酸残基数をいう。
【００１４】
また本発明には、上記で説示した本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列において、高い相同性を有し、且つフラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をも包含する。具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性、好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質が挙げられる。なお、本願において「相同性」は、ＣｌｕｓｔａｌＷ法（非特許文献６）により算出した値である。
【非特許文献６】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２２，  ４６７３−４６８０（１９９４）
【００１５】
本発明におけるフラクトースデヒドロゲナーゼ活性は、後述する実施例の「活性測定法」の項において説明した方法によって測定される。なお、本発明の説明において「フラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有する」とは、好ましくはフラクトースを基質として０．０１Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ以上を意味し、さらに好ましくは０．１Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ以上を意味する。
【００１６】
上記本発明にかかるタンパク質は、例えば遺伝子組み換え技術を用いて生産されてもよいし、アミノ酸合成機などを用いて化学合成されてもよい。遺伝子組み換え技術において、好適に用いられる各種組換えタンパク質発現系は、例えば、大腸菌発現系、昆虫細胞発現系、哺乳類細胞発現系、および無細胞発現系を用いてもよく、これらに限定されない。本発明のタンパク質等の製造方法については後述する。
【００１７】
また本発明にかかるタンパク質等は、例えば、分子間および／または分子内架橋（例えば、ジスルフィド結合など）が施されたもの、化学修飾（例えば、糖鎖、リン酸もしくはその他の官能基など）されたもの、標識（例えば、ヒスチジンタグなど）が付与されたもの、または融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、およびＧＦＰなど）を付与されたものなどが含まれるが、特にこれらに限定されない。さらに、本発明にかかるタンパク質等は、フラクトースデヒドロゲナーゼ活性が実質的に維持される限り、数種のタンパク質の断片を組み合わせて構成したキメラタンパク質も含み得る。
【００１８】
本発明にかかるタンパク質と、血清タンパク質や有機酸、デキストランをはじめとする賦形剤等とからフラクトースデヒドロゲナーゼ剤を構成してもよい。上記フラクトースデヒドロゲナーゼ剤には、酵素剤の構成物品として公知の物品が含まれていてもよい。
【００１９】
本発明に用いる細菌細胞とは、通常フラクトースデヒドロゲナーゼを取得する細菌細胞であれば、いかなる細菌細胞であっても好適に実施できるが、特に好適なものとしては、グルコノバクター属細菌、例えばＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｔｅｕｒｉｉ、グルコノバクター・セリヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｎｕｓ），グルコノバクター・インダストリウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｕｓ），アセトバクター属、例えば、アセトバクター・キシリヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ）等がある。
【００２０】
＜２．本発明にかかるポリヌクレオチド等＞
本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるタンパク質をコードすることを特徴としている。
【００２１】
ここで、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
【００２２】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変更してもよい。
【００２３】
本発明にかかるポリヌクレオチドを改変する方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、および／または付加することで組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製してよい。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。
【００２４】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記本発明にかかるタンパク質をコードしていればその塩基配列は特に限定されるものではない。よって本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列に応じた塩基配列からなる全てのポリヌクレオチドが本発明に含まれる。
【００２５】
本発明にかかるポリヌクレオチドの一実施形態としては、例えば配列番号２に示される塩基配列を有するヌクレオチド、または配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１または数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列から成るポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２６】
本発明の一実施形態では、本発明にかかるポリヌクレオチドは化学的に合成された塩基で置換されてもよい。また、本発明にかかるポリヌクレオチドが置換される部位は特に限定されず、置換後の塩基配列から発現するタンパク質が好適な性質を有していればよい。
【００２７】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもいてもよい。付加される塩基配列としては、限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、およびＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴおよびＭＢＰなど）、プロモーター配列（例えば、酵母由来プロモーター配列、ファージ由来プロモーター配列、および大腸菌由来プロモーター配列など）、およびシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列、および分泌配列など）をコードする塩基配列などが挙げられる。これらの塩基配列が付加される部位は特に限定されるものではなく、翻訳されるタンパク質のＮ末端であっても、Ｃ末端でもあってもよい。
【００２８】
また本発明にかかるポリヌクレオチドには、上記本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）、またはこれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれる。
【００２９】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍ値から１５℃、好ましくは１０℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。具体例としては、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。
【００３０】
本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列は、非特許文献７に記載されたジデオキシ法により決定され得る。
【非特許文献７】Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１４：  １２０５  （１９８１）
【００３１】
一方、本発明にかかるベクターは、上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものである。上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、その他の構成は特に限定されるものではない。本発明にかかるベクターを構成するベースとなるベクターとしては、宿主細胞において好適なベクターが適宜選択され得る。本発明にかかるベクターとしてプラスミドベクターを用いる場合、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、ｐＵＣ１８などが使用できる。この場合、ベクターが導入される宿主微生物としては、例えば、酵母、大腸菌（エシェリヒア・コリーＷ３１１０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α）、昆虫細胞、哺乳類細胞などに利用可能である。
【００３２】
上記宿主微生物に本発明にかかるベクターを導入する方法としては特に限定されるものではないが、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物にベクターを導入する場合は、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡを導入する方法や、エレクトロポレーション法を用いる方法が適用され得る。その他、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いて遺伝子導入が行われても良い。
【００３３】
本発明にかかるベクターを構築するには、本発明にかかるポリヌクレオチドを分離および精製した後、制限酵素処理などを用いて切断した該ポリヌクレオチドの断片と、ベースとなるベクターを制限酵素で切断して得た直鎖ポリヌクレオチドを結合閉鎖させて構築することができる。結合閉鎖する際にはＤＮＡリガーゼなどがベクターおよび該ポリヌクレオチドの性質に応じて使用され得る。本発明のベクターを複製可能な宿主に導入した後、ベクターのマーカーおよび酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、本発明のポリヌクレオチドを含有する形質転換体を得ることができる。よって、本発明にかかるベクターには薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。
【００３４】
なお本発明は、上記本発明にかかるベクターで形質転換された形質転換体を包含する。本発明にかかるベクターによって形質転換される宿主細胞は、特に限定されないが、酵母、大腸菌、昆虫細胞、および哺乳類細胞などが挙げられる。
【００３５】
＜３．本発明にかかるタンパク質の製造方法＞
本発明にかかるタンパク質の製造方法は、上記本発明にかかる形質転換体を培養する工程（「培養工程」という）を含むことを特徴としている。本発明にかかるタンパク質の製造方法には、上記培養工程の他、形質転換体を用いたタンパク質生産において含まれ得るその他の工程が含まれていてもよい。その他の工程としては、例えば、培養工程後に本発明にかかる形質転換体が生産したタンパク質を回収する工程や、当該タンパク質を精製する工程が挙げられる。
【００３６】
（３−１）培養工程
上記培養工程では、本発明にかかる形質転換体が栄養培地で培養されることにより、多量の組換えタンパク質を安定して生産し得る。形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
培養工程で用いられる栄養培地の栄養源としては、培養に通常用いられるものが広く使用されてよい。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、およびピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、および大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。これらに加えて、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて培地に添加されてよい。
本発明にかかる形質転換体の培養温度は、当該形質転換体が本発明にかかるタンパク質を生産可能な範囲内であれば適宜変更し得るが、例えば、エシェリヒア・コリーを宿主として利用する場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は、本発明にかかるタンパク質が最高収量に達する適当な時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは本発明にかかる形質転換体が好適に発育し、且つ本発明にかかるタンパク質を生産可能な範囲内で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００３７】
（３−２）回収工程
本発明にかかる形質転換体がタンパク質を細胞外に分泌する場合、その培養物には本発明のタンパク質が含まれている。よって培養物を本発明にかかるタンパク質としてそのまま利用することが可能である。この時、例えばろ過や遠心分離などにより、培養液と本発明にかかる形質転換体とを分離してもよい。
また本発明にかかるタンパク質が形質転換体内に存在する場合、形質転換体を培養して得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段を用いて形質転換体を採取し、該形質転換体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊後、目的のタンパク質を回収すればよい。また、必要に応じて、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）および界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００など）を添加して、分離採取してもよい。
【００３８】
（３−３）精製工程
精製工程は、上記回収工程によって得られたタンパク質を精製する工程である。精製工程の具体的な方法は特に限定されるものではないが、例えば、本発明にかかるタンパク質を含む溶液を、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムなどを用いる）、または親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトンなど）による分別沈殿法に供すればよい。上記操作によって、目的である本発明にかかるタンパク質を沈殿させ、精製することができる。
また、前記精製工程では、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを用いて精製工程を行ってもよい。
上記手法を用いて得られた目的のタンパク質を含む精製酵素は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
上記の精製酵素は、例えば凍結乾燥、真空乾燥、およびスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。また、精製酵素を使用する際は、その用途によって適宜緩衝液に溶解した状態で使用することができる。緩衝液としては、例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびＧＯＯＤ緩衝液などが目的のタンパク質の性質、および／または実験条件もしくは環境に応じて好適に選択されてよい。さらに、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グルタミン、またはリジンなど）、および血清アルブミンなどを精製酵素に添加することにより安定化することができる。
なお、本発明は上記の各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種種の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３９】
＜４．本発明にかかるフラクトースの測定方法＞
本発明にかかるフラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質は、フラクトースの測定方法に用いることが可能である。
本発明のフラクトースの測定方法は、少なくともフラクトースに本発明にかかるタンパク質を作用させることを特徴としている。
その際に、例えば適切な電子供与体を介在させることにより、生成する５−ケト−Ｄ−フルクトースまたは還元型電子受容体の増加あるいは酸化型電子受容体または酸素の減少を測定することにより、フラクトースを測定することができるが、これに限定されるものではない。
【００４０】
また上記フラクトースの測定方法は、イヌリンの測定に適用され得る。
本発明にかかるイヌリンの測定方法の一実施形態は、（１）試料とイヌリナーゼとを反応させて、試料中のイヌリンを分解し、フラクトースを生成せしめる工程と、（２）前記（１）の工程によって得られたフラクトースに本発明にかかるタンパク質を作用させる工程とを含む。
その際に、例えば適切な電子供与体を介在させることにより、生成する５−ケト−Ｄ−フルクトースまたは還元型電子受容体の増加あるいは酸化型電子受容体または酸素の減少を測定することにより、イヌリンを測定することができるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
＜５．本発明にかかるフラクトース測定キットおよびフラクトースセンサー＞
（５−１）フラクトース測定キット
本発明にかかるフラクトース測定キット（以下「本発明のキット」という）は、少なくとも上記本発明にかかるタンパク質を含むことを特徴としている。本発明のキットに含まれる、本発明にかかるタンパク質の形態は特に限定されるものではないが、例えば、水溶液、懸濁液または凍結乾燥粉末など形態が採用され得る。上記凍結乾燥粉末は常法に従って作製され得る。
【００４２】
（５−２）フラクトースセンサー
本発明にかかるフラクトースセンサー（以下「本発明のセンサー」）は、フラクトースを検出するために用いられるセンサーであり、少なくとも本発明にかかるタンパク質を備えている。本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる。よって、本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。
【００４３】
なお、本発明は上記の各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種種の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。下記に、実施例において使用した活性測定試薬及び測定条件を示した。なお、実施例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク社より購入したものを用いた。
＜試薬＞
試薬Ａ：１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０；７３ｍＭ ＫＣｌ を含む）
試薬Ｂ：１Ｍ  フルクトース溶液（試薬Ａで溶解）
試薬Ｃ：６．６ｍＭ ２，６-ジクロロインドフェノール（和光純薬）溶液（試薬Ａで溶解）
試薬Ｄ：６ｍＭ １−メトキシフェナジンメトサルフェート（和光純薬）溶液（試薬Ａで溶解）
＜測定条件＞
まず試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ、試薬Ｄ、試薬Ｅを２５０：１：１．７：３．３の割合で混合して試薬混液を調製する。上記反応混液２．６５ｍｌをキュベット（ｄ＝１ｃｍ）に取り、３０℃で約３分間予備加温する。次に粗酵素液０．１５ｍｌを加え、試薬Ａを対照に３０℃に制御された分光光度計で５４０ｎｍの吸光度変化を１５分間記録し、その吸光度変化を求める。
盲検は酵素溶液の代わりに試薬Ａを０．１５ｍｌを加え上記と同様に操作を行って、１分間当たりの吸光度変化を求める。
【００４５】
＜実施例１．フラクトースデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング＞
グルコノバクター・フラテウリの染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌体を３ｍｌのＬＢ培地（０．５％酵母エキス、１．０％トリプトン、０．１％ＮａＣｌ）で１３時間培養し、続いて、そのうちの１００μｌを接種し、３ｍＬのＭＢ培地（２．５％マンニトール、０．５％酵母エキス、０．３％ポリペプトン）で１００時間、３０℃で振盪培養した。その後、市販のＤＮＡ抽出キット（ＡｑｕａＰｕｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  キット；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてゲノムＤＮＡを分離した。
市販のフルクトースデヒドロゲナーゼ（東洋紡製）に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）を行い、ウェスタンブロッティングを行った。それによって得られたフルクトースデヒドロゲナーゼのサブユニットタンパク質断片からサブユニット１のＮ末端アミノ酸配列情報を得た（表１、配列番号３）。
【００４６】
【表１】
2010148368.tif 000002
【００４７】
上記操作にて得られたゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、サブユニット１のＮ末端アミノ酸配列情報を基に設計したプライマーと縮重プライマー（表２、配列番号４〜１７）を用いて、ＫＯＤ−Ｄａｓｈポリメラーゼ（東洋紡製）を用いたＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。
【００４８】
【表２】
2010148368.tif 000003
【００４９】
ＰＣＲ産物はアガロース電気泳動で精製し、市販のキット（ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ  Ｖｅｃｔｏｒ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドベクターとライゲーション反応を行い、組換えプラスミドｐＧＥＭ−ｆｄｈＬを作製した。なお、ライゲーション反応の詳細な方法については、キット添付のプロトコールに準拠した。
連結したプラスミドＤＮＡはエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセルを用いて形質転換し、β―ガラクトシダーゼ活性検出用寒天培地（０．５％酵母エキス、０．５％トリプシン、０．１％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（和光純薬）、０．５ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（シグマ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（和光純薬）、１．５％寒天）に塗布した。β―ガラクトシダーゼ活性を有するコロニーからゲノムＤＮＡを分離し、フルクトースデヒドロゲナーゼ・サブユニット遺伝子の塩基配列情報（配列表の配列番号２）を得た。
【００５０】
＜実施例２．フラクトースデヒドロゲナーゼ・サブユニット遺伝子の可溶性タンパク質としての発現、酵素アッセイ＞
実施例１で得られたフルクトースデヒドロゲナーゼ・サブユニット１の遺伝子配列情報を基にＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ切断部位を付加したプライマー（表３、配列番号１８、１９）を設計した。実施例１で得られたゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、ＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（東洋紡製）を用いて、９８℃で変性（５秒）、６０℃でアニーリング（５秒）、６８℃で伸長反応（１分４２秒）を３０サイクル繰り返す増幅条件でＰＣＲ反応を行った。
【００５１】
【表３】
2010148368.tif 000004
【００５２】
ＰＣＲ産物はアガロース電気泳動で精製し、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてポリＡ付加を行った。
ｐＥＴ―２６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を挿入ＤＮＡの制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）とＸｈｏＩ（タカラバイオ社製）にて切り出した。
市販のライゲーションキット（Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてライゲーション反応を行い、ｐＥＴ―２６ｂ（＋）−ｆｄｈＬを作成した。
連結したプラスミドＤＮＡはエシェリヒア・コリーＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセルを用いて形質転換し、該形質転換体をカナマイシン（２０μｌ／ｍｌ；シグマ製）とクロラムフェニコール（３０μｌ／ｍｌ；シグマ製）を含んだＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に塗布した。３７℃で一晩培養して得られたコロニーを３ｍｌのＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。更にその培養液０．１ｍｌを１００ｍｌのＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で８時間振とう培養した。その後、リボフラビン（０．２５μｇ／ｍｌ；シグマ）及びイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（０．０４ｍＭ；シグマ）を添加し、２０℃で一晩発現誘導した。遠心分離によって培養液から菌体を回収し、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で超音波破砕した後、超遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分に分離し、粗酵素液を得た。
可溶性画分にサブユニット１と見られるタンパク質の発現がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された（図１）。
【００５３】
＜実施例３．フラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有する可溶性タンパク質の精製、酵素アッセイ＞
実施例２で得られた可溶性画分の酵素アッセイを行い、フラクトースデヒドロゲナーゼ・サブユニット遺伝子の可溶性タンパク質がフルクトースデヒドロゲナーゼ活性を有することを確認した（図２）。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によって、フラクトースやイヌリンの測定、バイオデバイスへの使用などに有用な、可溶性フラクトースデヒドロゲナーゼを新たに創出し、これを提供することが可能となる。したがって、フラクトースデヒドロゲナーゼの分析分野への更なる普及、及びバイオセンサーやバイオ電池の産業利用に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】フラクトースデヒドロゲナーゼ・サブユニットI遺伝子の可溶性タンパク質としての発現を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、サブユニットIの発現が確認される。
【図２】フラクトースデヒドロゲナーゼ・サブユニットI可溶性タンパク質の酵素アッセイ結果を示す。フラクトースデヒドロゲナーゼ・サブユニットI可溶性タンパク質がフルクトースデヒドロゲナーゼ活性を有することが確認される。
【図１】
2010148368.tif 000005
【図２】
2010148368.tif 000006
【配列表】
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