(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩＬ−１βの抗原決定基に対する特異性を有する抗体分子、抗体分子の療法的使用、及び前記抗体分子を生成するための方法の提供。【解決手段】重鎖を含むヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体であって、前記重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３としてそれぞれ特定のアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む中和抗体と、その製造方法、および該抗体を含む薬剤組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖を含むヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体であって、前記重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５に与えられる配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号６に与えられる配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号７に与えられる配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、中和抗体。
【請求項２】
前記重鎖の前記可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号６に与えられる配列、及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号７に与えられる配列を含む、請求項１に記載の中和抗体。
【請求項３】
軽鎖を含むヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体であって、前記軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号８に与えられる配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号９に与えられる配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１０に与えられる配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、中和抗体。
【請求項４】
前記軽鎖の前記可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号８に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号９に与えられる配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１０に与えられる配列を含む、請求項３に記載の中和抗体。
【請求項５】
軽鎖をさらに含み、前記軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号８に与えられる配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号９に与えられる配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１０に与えられる配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、請求項１又は２に記載の中和抗体。
【請求項６】
前記軽鎖の前記可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号８に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号９に与えられる配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１０に与えられる配列を含む、請求項５に記載の中和抗体。
【請求項７】
前記重鎖の前記可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号６に与えられる配列、及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号７に与えられる配列を含み、前記軽鎖の前記可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号８に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号９に与えられる配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１０に与えられる配列を含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の中和抗体。
【請求項８】
前記中和抗体がＣＤＲ移植抗体分子である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の中和抗体。
【請求項９】
前記可変ドメインが、ヒトアクセプター枠組み領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む、請求項８に記載の抗体分子。
【請求項１０】
前記重鎖の枠組み領域が、ＪＨ４と共にヒト亜群配列３−１１（ＤＰ−３５）に由来する、請求項９に記載のＣＤＲ移植抗体分子。
【請求項１１】
前記重鎖の前記可変ドメインの位置４４及び８９の少なくとも１つにおける残基がドナー残基である、請求項１０に記載のＣＤＲ移植抗体分子。
【請求項１２】
前記重鎖の前記可変ドメインの少なくとも位置４４における残基がドナー残基である、請求項１０に記載のＣＤＲ移植抗体分子。
【請求項１３】
前記軽鎖の枠組み領域が、ＪＫ１と共にヒト亜群配列Ｏ１２（ＤＰＫ９）に由来する、請求項８から１２までのいずれか一項に記載のＣＤＲ移植抗体分子。
【請求項１４】
位置４０、４５、４８、７０及び８５の少なくとも１つにおける残基がドナー残基である、請求項１３に記載のＣＤＲ移植抗体分子。
【請求項１５】
位置４５、７０及び８５における残基がドナー残基である、請求項１４に記載のＣＤＲ移植抗体分子。
【請求項１６】
前記重鎖が配列ｇＨ３（配列番号１５）を含む、請求項８から１５までのいずれか一項に記載のＣＤＲ移植抗体分子。
【請求項１７】
前記軽鎖が配列ｇＬ３（配列番号２０）を含む、請求項８から１５までのいずれか一項に記載のＣＤＲ移植抗体分子。
【請求項１８】
前記重鎖が配列ｇＨ３（配列番号１５）を含み、前記軽鎖が配列ｇＬ３（配列番号２０）を含む、請求項８から１５までのいずれか一項に記載のＣＤＲ移植抗体分子。
【請求項１９】
ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体であって、配列番号３に与えられる配列を含む重鎖、及び配列番号４に与えられる配列を含む軽鎖を有する、中和抗体。
【請求項２０】
ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体であって、請求項２、４、１８又は１９のいずれか一項に記載の抗体と少なくとも９０％同一又は類似の可変ドメインを有する、中和抗体。
【請求項２１】
前記抗体分子が、完全長重鎖及び軽鎖を有する完全抗体分子、又はＦａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片などのその断片からなる群から選択される、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の中和抗体分子。
【請求項２２】
エフェクター又はレポーター分子が結合できるように修飾された、請求項２１に記載の中和抗体分子。
【請求項２３】
前記修飾が、エフェクター又はレポーター分子の結合を可能にするための、その重鎖のＣ末端への１つ又は複数のアミノ酸の付加である、請求項２２に記載の中和抗体分子。
【請求項２４】
前記追加のアミノ酸が、エフェクター又はレポーター分子が結合できる、１つ又は２つのシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を形成する、請求項２３に記載の抗体分子。
【請求項２５】
結合したエフェクター又はレポーター分子を有する、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載の中和抗体分子。
【請求項２６】
前記エフェクター分子が１つ又は複数のポリマーを含む、請求項２５に記載の中和抗体分子。
【請求項２７】
前記１つ又は複数のポリマーが、場合によっては置換された直鎖又は分岐鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー、或いは分岐又は非分岐多糖である、請求項２６に記載の中和抗体分子。
【請求項２８】
前記１つ又は複数のポリマーが、メトキシポリ（エチレングリコール）又はポリ（エチレングリコール）である、請求項２６に記載の中和抗体分子。
【請求項２９】
前記重鎖のＣ末端におけるシステイン残基の１つに、リシル−マレイミド又はリシルビス−マレイミド基が結合しており、前記リシル残基のそれぞれのアミノ基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基が共有結合している、請求項２５に記載の中和抗体分子。
【請求項３０】
ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体分子であって、配列番号１５に与えられる配列を含む重鎖、及び配列番号２０に与えられる配列を含む軽鎖を有し、その重鎖のＣ末端に、エフェクター又はレポーター分子が結合できる１つのシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を有する、修飾Ｆａｂ断片である中和抗体分子。
【請求項３１】
ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体分子であって、配列番号１５に与えられる配列を含む重鎖、及び配列番号２０に与えられる配列を含む軽鎖を有し、その重鎖のＣ末端に、エフェクター又はレポーター分子が結合する１つのシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を有する、修飾Ｆａｂ断片である中和抗体分子。
【請求項３２】
その重鎖が配列番号７１に与えられる配列のアミノ酸残基番号２２〜２５１を含むか、又はそれらからなり、その軽鎖が、配列番号７０に与えられる配列のアミノ酸残基番号２２〜２３５を含むか、又はそれらからなる、請求項３１に記載の中和抗体分子。
【請求項３３】
前記重鎖のＣ末端におけるシステイン残基に、リシル−マレイミド基が結合しており、前記リシル残基のそれぞれのアミノ基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基が共有結合している、請求項３１又は請求項３２に記載の中和抗体分子。
【請求項３４】
ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体分子であって、請求項１８に記載の抗体と同じエピトープと結合する、中和抗体分子。
【請求項３５】
請求項１から３４までのいずれか一項に記載の抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖をコードする、単離ＤＮＡ配列。
【請求項３６】
請求項３５に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニング又は発現ベクター。
【請求項３７】
配列番号６９に与えられる配列を含む、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
請求項３６又は３７に記載の１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３９】
請求項１から３４までのいずれか一項に記載の抗体分子を生成するための方法であって、請求項３８に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記抗体分子を単離することを含む方法。
【請求項４０】
薬剤として許容可能な媒体、希釈剤又は担体の１つ又は複数と組み合わせて、請求項１から３４までのいずれか一項に記載の抗体分子を含む、薬剤組成物。
【請求項４１】
他の活性成分をさらに含む、請求項４０に記載の薬剤組成物。
【請求項４２】
ＩＬ−１βによって仲介されるか、或いはＩＬ−１βレベルの増加に付随する病的障害の治療又は予防に使用するための、請求項１から３４までのいずれか一項に記載の抗体分子、又は請求項４０若しくは請求項４１に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１βの抗原決定基に対する特異性を有する抗体分子に関する。本発明は、抗体分子の療法的使用、及び抗体分子を生成するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
前炎症性サイトカイン、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は、ＩＬ−１遺伝子のファミリーのメンバーであり、ＩＬ−１α及びＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）も含む（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ、１９９６、Ｂｌｏｏｄ、８７、６、２０９５〜２１４７によって総説された）。ＩＬ−１βは炎症と主に関係があり、内皮細胞及びマクロファージ、並びにＴ細胞とＢ細胞の両方に対して直接的な影響がある。ＩＬ−１βは骨髄ストロマ細胞を刺激して、ＩＬ−６及び幾つかのコロニー刺激因子を生成し、ＴＮＦαの生成も誘導する。
【０００３】
ＩＬ−１βは、炎症と関係がある多くの病的状態と関連がある。これらは、感染（ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫）、内毒素性ショック、関節炎、慢性関節リウマチ、骨盤内炎症性疾患、多発性硬化症、喘息、骨関節症、乾癬、アルツハイマー病、クローン病、ペーロニー病、心臓病（アテローム性動脈硬化症など）、結腸癌、セリアック病、胆嚢病、毛巣病、腹膜炎、髄膜脳炎、他の自己免疫障害、膵炎、外傷（外科手術）、移植片対宿主疾患及び移植拒絶を含む。
【０００４】
ＩＬ−１βは、癌、骨粗しょう症及び痛みのシグナルとも関連がある。
【０００５】
炎症、痛み及び他の病的状態におけるＩＬ−１βの関与は、ＩＬ−１βが、これらの状態の予防及び／又は治療用の薬剤及び他の分子の、よい標的であることを示唆する。
【０００６】
成熟１７ｋＤａ形のＩＬ−１βは、ＩＬ−１受容体ＩＬ−１Ｒと結合することによって、その生物学的効果を発揮する。２つのタイプのＩＬ−１Ｒ：タイプＩ受容体ＩＬ−１ＲＩ及びタイプＩＩ受容体ＩＬ−１ＲＩＩが存在する。ＩＬ−１βとＩＬ−１ＲＩの結合によって、受容体補助タンパク質及びシグナルの漸増がもたらされる。一方ＩＬ−１ＲＩＩは、ＩＬ−１βの結合はシグナルを変換しないので、「おとり」受容体と呼ばれてきている。ＩＬ−１βと結合する少なくとも３タイプの抗体が存在すると、予想することができる：
（ｉ）ＩＬ−１βと結合するが、ＩＬ−１ＲＩの生物活性は中和しない抗体（非中和抗体）；
（ｉｉ）ＩＬ−１βと結合し、ＩＬ−１ＲＩとの結合を阻止することによってＩＬ−１ＲＩの生物活性を中和する抗体；及び
（ｉｉｉ）ＩＬ−１βと結合し、ＩＬ−１ＲＩの生物活性を中和するが、ＩＬ−１ＲＩとの結合は阻止しない抗体であって、ＵＳ２００３／００２６８０６中に記載のものなどの抗体。
【０００７】
抗ＩＬ−１β抗体が同定され、ＩＬ−１β仲介の疾患及び障害の治療における使用に提案されてきている；例えばＷＯ９５／０１９９７を参照のこと。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
我々は現在、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば本明細書に記載するｉｎ  ｖｉｖｏの炎症モデルにおいて特に有効な、改良型ＩＬ−１β抗体を同定している。この抗体は、前の選択肢（ｉｉ）で定義した中和抗体である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第一の態様では、本発明は、重鎖を含むヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体であって、重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５に与えられる配列を有するＣＤＲ（相補性決定領域）、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号６に与えられる配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号７に与えられる配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、中和抗体を提供する。
【００１０】
抗体の可変ドメイン中の残基は、Ｋａｂａｔ他によって考案されたシステムに従って、従来付番されている。このシステムは、Ｋａｂａｔ他、１９８７、「免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」中、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以後は「Ｋａｂａｔ他」（上記））中に述べられている。他に示す場合を除き、この付番システムを本明細書では使用する。
【００１１】
Ｋａｂａｔ残基の表示は、アミノ酸残基の直鎖状付番と常に直接対応するわけではない。実際の直鎖状アミノ酸配列は、基本的可変ドメイン構造の枠組みであろうとＣＤＲであろうと、構造要素の短縮、又は構造要素への挿入に対応して、厳密なＫａｂａｔの付番より少ない又は余分のアミノ酸を含むことができる。残基の正確なＫａｂａｔ付番は、「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列を有する抗体の配列中の相同残基のアラインメントによって、所与の抗体に関して決定することができる。
【００１２】
重鎖の可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔの付番システムによれば、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．及びＬｅｓｋ、Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、９０１〜９１７（１９８７））によれば、ＣＤＲ−Ｈ１と同等なループが、残基２６から残基３２まで広がる。したがって、本明細書で使用する「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔの付番システムとＣｈｏｔｈｉａの幾何学的ループの定義の組合せによって記載されたのと同様に、残基２６〜３５を含む。
【００１３】
軽鎖の可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔの付番システムによれば、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。本明細書で使用する、用語「中和抗体」は、ＩＬ−１βの生物学的シグナル活性を、特にＩＬ−１βとＩＬ−１ＲＩの結合を阻止することによって、中和することができる抗体を記載する。
【００１４】
好ましくは、本発明の第一の態様の抗体は重鎖を含み、重鎖の可変ドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも２つは、以下の：ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号６に与えられる配列、及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号７に与えられる配列から選択される。例えば抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号５に与えられる配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号６に与えられる配列を有する、重鎖を含むことができる。或いは抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号５に与えられる配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号７に与えられる配列を有する、重鎖を含むことができ、或いは抗体は、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号６に与えられる配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号７に与えられる配列を有する、重鎖を含むことができる。誤解を避けるために、すべての順列が含まれることは理解される。
【００１５】
より好ましくは、本発明の第一の態様の抗体は重鎖を含み、その可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号６に与えられる配列、及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号７に与えられる配列を含む。
【００１６】
さらにより好ましくは、本発明の第一の態様の抗体は、重鎖の可変ドメインが配列番号３に与えられる配列を含む、重鎖を含む。
【００１７】
或いは、本発明の第一の態様の抗体は重鎖を含み、その重鎖の可変ドメインは、配列番号３に与えられる配列と、少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００１８】
本明細書で使用する「同一性」は、アラインメントをとる配列中の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。本明細書で使用する「類似性」は、アラインメントをとる配列中の任意の特定の位置において、配列間でアミノ酸残基が類似の型であることを示す。例えばロイシンは、イソロイシン又はバリンと置換することができる。１つの他のアミノ酸としばしば置換することができる他のアミノ酸には：
−フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
−リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；及び
−システイン及びメチオニン（イオウ含有側鎖を有するアミノ酸）があるが、これらだけには限られない。同一性及び類似性の程度は、容易に計算することができる（「コンピュータによる分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．、ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８８；「バイオコンピュータ情報科学及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９３；「配列データのコンピュータ分析、パート１（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  １）」、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ  Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及び「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１）。好ましくは、本発明の第一の態様の抗体は重鎖を含み、その重鎖の可変ドメインは、配列番号３に与えられる配列と、少なくとも９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】マウスモノクローナル抗体ＩＣ８の重鎖の可変ドメインの、ヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１及び３）を示す図である。
【図１ｂ】マウスモノクローナル抗体ＩＣ８の軽鎖の可変ドメインの、ヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号２及び４）を示す図である。
【図２】ベクターＭＲＲ１４及びｐＭＲＲ１０を示す図である。
【図３】ＩＣ８重鎖（図３ａ；配列番号：１１〜１５）及び軽鎖（図３ｂ；配列番号：１６〜２０）配列に関する、移植設計を示す図である。記号（｜）は、ドナー：アクセプター：移植枠組み配列の間の違いを強調する。ＣＤＲは、ＩＣ８配列に関しては一本下線である。Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の両方を含むＣＤＲ−Ｈ１以外、これらはＫａｂａｔによって定義されたものと同様である。二本下線の配列は、移植片中に保持されるドナー残基である。星印（＊）の残基は、ヒト亜群ＶＨ３生殖細胞系配列に共通であるが、この特定の生殖細胞系中には存在せず、これらの残基が元のドナー配列中に存在するとしても、これらがマウスの残基であるとは考えられない。
【図４ａ】設計した遺伝子ｇＨ１のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す図である。
【図４ｂ】設計した遺伝子ｇＬ１のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す図である。
【図５】遺伝子の構築用に使用した、オリゴヌクレオチドを示す図である。
【図６】他の移植用に使用した、オリゴヌクレオチドカセットを示す図である。示すのは、ＩＣ８ｇＬ２センス鎖配列（配列番号５９）、逆鎖配列（配列番号７２）及び対応するアミノ酸配列（配列番号６０）；ＩＣ８ｇＬ３センス鎖配列（配列番号６１）、逆鎖配列（配列番号７３）及び対応するアミノ酸配列（配列番号６２）；ＩＣ８ｇＨ２センス鎖配列（配列番号６３）、逆鎖配列（配列番号６４）及び対応するアミノ酸配列（配列番号６５）、及びＩＣ８ｇＨ３センス鎖配列（配列番号６６）、逆鎖配列（配列番号６７）及び対応するアミノ酸配列（配列番号６８）である。下線の残基は、変化したアミノ酸を示す。
【図７】ＩＣ８移植片を用いたＩＬ−１β中和アッセイからの結果を示す図である。
【図８】ベクターｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’）の地図を示す図である。
【図９】ＩＣ８  Ｖ領域遺伝子の中間ベクターｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’）へのクローニングの、ステップ１〜４を示す図である。
【図１０】ベクターｐＴＴＯＤ（ｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’ＩＧＳ−２）の地図を示す図である。
【図１１】ｐＴＴＯＤ（ｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’ＩＧＳ−２）；配列番号６９のコード配列及び隣接配列を示す図である。
【図１２】ｎが約４２０であり、リシル残基上のそれぞれのアミノ基が、メトキシＰＥＧ残基と共有結合しており、リシル−マレイミド連結基とシステイン残基を介して共有結合したＩＬ−１βに対する抗体由来の、修飾Ｆａｂ断片の構造を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
第二の態様では、本発明は、軽鎖を含むヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体であって、軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号８に与えられる配列を有するＣＤＲ（相補性決定領域）、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号９に与えられる配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１０に与えられる配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、中和抗体を提供する。
【００２１】
好ましくは、本発明の第二の態様の抗体は軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも２つは、以下の：ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号８に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号９に与えられる配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１０に与えられる配列から選択される。例えば抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号８に与えられる配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号９に与えられる配列を有する、軽鎖を含むことができる。或いは抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号８に与えられる配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号１０に与えられる配列を有する、軽鎖を含むことができ、或いは抗体は、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号９に与えられる配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号１０に与えられる配列を有する、軽鎖を含むことができる。誤解を避けるために、すべての順列が含まれることは理解される。
【００２２】
より好ましくは、本発明の第二の態様の抗体は軽鎖を含み、その可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１の配列番号８に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｌ２の配列番号９に与えられる配列、及びＣＤＲ−Ｌ３の配列番号１０に与えられる配列を含む。
【００２３】
さらにより好ましくは、本発明の第二の態様の抗体は、軽鎖の可変ドメインが配列番号４に与えられる配列を含む、軽鎖を含む。
【００２４】
或いは、本発明の第二の態様の抗体は軽鎖を含み、その軽鎖の可変ドメインは、配列番号４に与えられる配列と、少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。好ましくは、本発明の第二の態様の抗体は軽鎖を含み、その軽鎖の可変ドメインは、配列番号４に与えられる配列と、少なくとも９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００２５】
本発明の第一及び第二の態様の抗体分子は、相補的軽鎖又は相補的重鎖をそれぞれ含むことが好ましい。
【００２６】
好ましくは、本発明の第一及び第二の態様のいずれかの抗体は、重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号６に与えられる配列、及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号７に与えられる配列を含む重鎖、及び軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号８に与えられる配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号９に与えられる配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１０に与えられる配列を含む軽鎖を含む。
【００２７】
本発明の第一及び第二の態様の最も好ましい実施形態では、抗体は、重鎖の可変ドメインが配列番号３に与えられる配列を含む重鎖、及び軽鎖の可変ドメインが配列番号４に与えられる配列を含む軽鎖を含む。
【００２８】
本発明の第三の態様では、本発明の第一及び第二の態様のいずれかの抗体を提供し、前記抗体はモノクローナル抗体である。
【００２９】
本発明の第三の態様の好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖の可変ドメインが配列番号３に与えられる配列を含む重鎖、及び軽鎖の可変ドメインが配列番号４に与えられる配列を含む軽鎖を含む。
【００３０】
本発明の第三の態様の他の好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体であり、このモノクローナル抗体は重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは配列番号３に与えられる配列を含み、軽鎖の可変ドメインが配列番号４に与えられる配列を含む。このマウスモノクローナル抗体は、本明細書では「ＩＣ８」又は「ドナー」抗体又は「マウスモノクローナル抗体」と呼ぶ。マウスモノクローナル抗体ＩＣ８の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの、完全ヌクレオチド及びアミノ酸配列は図１に示し、配列番号１〜４に与える。配列番号５〜１０に与えるＣＤＲは、マウスモノクローナル抗体ＩＣ８に由来する。
【００３１】
本発明の第四の態様では、１つ又は複数のＣＤＲをマウスモノクローナル抗体ＩＣ８から得た、ＣＤＲ移植抗体分子を提供する。本明細書で使用する、用語「ＣＤＲ移植抗体分子」は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域枠組みに移植された、ドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）由来の、１つ又は複数のＣＤＲ（望むならば、１つ又は複数の修飾型ＣＤＲを含む）を含む、抗体分子を指す。総説に関しては、Ｖａｕｇｈａｎ他、「ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１６、５３５〜５３９、１９９８を参照のこと。
【００３２】
ＣＤＲを移植するとき、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／型と関係がある、マウス、霊長類及びヒト枠組み領域を含めた、任意の適切なアクセプター可変領域の枠組み配列を使用することができる。好ましくは、本発明の第四の態様のＣＤＲ移植抗体は、ヒトアクセプター枠組み領域、及び前述のドナー抗体由来の１つ又は複数のＣＤＲを含む可変ドメインを有する。したがって、その可変ドメインがヒトアクセプター枠組み領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む、中和ＣＤＲ移植抗体を提供する。
【００３３】
本発明において使用することができるヒト枠組みの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔ他、上記）である。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖用に使用することができ、ＲＥＩは軽鎖用に使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは、重鎖及び軽鎖用に使用することができる。或いは、ヒト生殖細胞系配列を使用することができる。
【００３４】
本発明のＣＤＲ移植抗体中では、アクセプター重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、望むならば、異なる鎖に由来する枠組み領域を有する複合鎖を含むことができる。
【００３５】
本発明のＣＤＲ移植抗体の重鎖の好ましい枠組み領域は、図３中に示すヒト亜群ＶＨ３配列３−１１（ＤＰ−３５）（配列番号１２）及びＪＨ４に由来する。したがって、少なくとも１つの非ヒトドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲ移植抗体であって、重鎖の枠組み領域がヒト亜群ＶＨ３配列３−１１（ＤＰ−３５）（配列番号１２）及びＪＨ４に由来する抗体を提供する。ヒトＪＨ４の配列は以下の通りである：
．（ＹＦＤＹ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７４）。ＹＦＤＹモチーフはＣＤＲ−Ｈ３の一部であり、枠組み４の一部ではない（Ｒａｖｅｔｃｈ、ＪＶ他、１９８１、Ｃｅｌｌ、２７、５８３〜５９１）。ドナー配列は、図３ａ中に示すＩＣ８  ＶＨ配列（配列番号１１）である。
【００３６】
本発明のＣＤＲ移植抗体の軽鎖の好ましい枠組み領域は、図３中に示すヒト生殖細胞系亜群ＶＫ１配列Ｏ１２（ＤＰＫ９）（配列番号１７）及びＪＫ１に由来する。したがって、少なくとも１つの非ヒトドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲ移植抗体であって、軽鎖の枠組み領域がヒト亜群配列Ｏ１２（ＤＰＫ９）及びＪＫ１に由来する抗体を提供する。ＪＫ１の配列は以下の通りである：（ＷＴ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号７５）。ＷＴモチーフはＣＤＲ−Ｌ３の一部であり、枠組み４の一部ではない（Ｈｉｅｔｅｒ、ＰＡ．、他、１９８２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７、１５１６〜１５２２）。ドナー配列は、図３ｂ中に示すＩＣ８  ＶＬ配列（配列番号１６）である。
【００３７】
さらに、本発明のＣＤＲ移植抗体中では、枠組み領域は、アクセプター抗体の配列と全く同じ配列を有する必要はない。例えば、異常な残基は、そのアクセプター鎖のクラス又はタイプに関して、より頻繁に存在する残基に変えることができる。或いは、アクセプター枠組み領域中の選択した残基は、それらの残基が、ドナー抗体中の同じ位置で見られる残基に対応するように変えることができる（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ他、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、３３２、３２３〜３２４、１９８８を参照のこと）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するのに、必要最小限に留めなければならない。変えることが必要である可能性があるアクセプター枠組み領域中の残基を、選択するためのプロトコルは、ＷＯ９１／０９９６７中に述べられている。
【００３８】
好ましくは、本発明のＣＤＲ移植抗体分子中では、アクセプター重鎖がヒトＤＰ−３５＋ＪＨ４配列を有する場合、したがって重鎖のアクセプター枠組み領域は、１つ又は複数のドナーＣＤＲ以外に、位置４４にドナー残基を含む（Ｋａｂａｔ他（上記）による）。残基４４をドナー残基に変えた、親和性に対する驚くべき影響は、予想されなかった。したがって、任意の抗体ヒト化プロセスにおいて、ドナー又はアクセプター残基として残基４４を有する影響は、さらに調べる価値があろう。したがって、少なくとも重鎖の可変ドメインの位置４４における残基がドナー残基である、ＣＤＲ移植抗体を提供する。
【００３９】
代替的或いは追加的に、アクセプター重鎖がヒトＤＰ−３５＋ＪＨ４配列を有する場合、したがって重鎖のアクセプター枠組み領域は、１つ又は複数のドナーＣＤＲ以外に、位置８９にドナー残基を含むことが好ましい（Ｋａｂａｔ他（上記）による）。したがって、少なくとも重鎖の可変ドメインの位置４４及び／又は位置８９における残基がドナー残基である、ＣＤＲ移植抗体を提供する。
【００４０】
好ましくは、本発明のＣＤＲ移植抗体分子中では、アクセプター軽鎖がヒト亜群ＤＰＫ９＋ＪＫ１配列を有する場合、したがって軽鎖のアクセプター枠組み領域は、位置４５、７０及び８５にドナー残基を含み、位置４０及び４８にドナー残基をさらに含むことができる（Ｋａｂａｔ他（上記）による）。したがって、少なくとも位置４０、４５、４８、７０及び／又は８５における残基がドナー残基である、ＣＤＲ移植抗体を提供する。位置４５、７０及び８５における残基がドナー残基である、ＣＤＲ移植抗体も提供する。
【００４１】
ドナー残基は、ドナー抗体、即ちＣＤＲが本来由来した抗体由来の残基であり、それは本発明の場合、マウスモノクローナル抗体ＩＣ８である。
【００４２】
本発明の第一又は第四の態様の他の実施形態では、重鎖は、ｇＨ１（配列番号１３）、ｇＨ２（配列番号１４）又はｇＨ３（配列番号１５）の配列を含むことが好ましい。これらの移植重鎖の可変ドメインの配列は、図３ａ中に示す。
【００４３】
本発明の第二又は第四の態様の他の実施形態では、軽鎖は、ｇＬ１（配列番号１８）、ｇＬ２（配列番号１９）又はｇＬ３（配列番号２０）の配列を含むことが好ましい。これらの移植軽鎖の可変ドメインの配列は、図３ｂ中に示す。
【００４４】
より好ましくは、本発明の第二又は第四の態様の他の実施形態の抗体分子は、ｇＨ１（配列番号１３）、ｇＨ２（配列番号１４）又はｇＨ３（配列番号１５）の配列を含む重鎖、及びｇＬ１（配列番号１８）、ｇＬ２（配列番号１９）又はｇＬ３（配列番号２０）の配列を含む軽鎖を含む。
【００４５】
さらにより好ましくは、本発明の第二又は第四の態様の他の実施形態の抗体分子の重鎖は、可変ドメインｇＨ３（配列番号１５）を含み、本発明の抗体分子の軽鎖は、可変ドメインｇＬ３（配列番号２０）を含む。
【００４６】
本発明の第五の態様では、本発明の第一から第四までの態様のいずれか１つの抗体を提供し、この抗体はＩＣ８と同じエピトープと結合する。或いは、ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体であって、その重鎖が配列ｇＨ３（配列番号１５）を含み、その軽鎖が配列ｇＬ３（配列番号２０）を含む抗体と、同じエピトープと結合する、中和抗体を提供する。
【００４７】
本発明の抗体分子は、完全長重鎖及び軽鎖、又はＦａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖ断片などのそれらの断片を有する完全抗体分子を含むことができる。或いは、本発明の抗体分子は、軽鎖若しくは重鎖モノマー若しくはダイマー、又は単鎖抗体、例えば重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがペプチド連結基によって接合している、単鎖Ｆｖを含むことができる。同様に、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、適切に他の抗体ドメインと組み合わせることができる。
【００４８】
本発明の抗体分子は、それと結合したエフェクター又はレポーター分子を有することができる。例えば、本発明の抗体分子は、共有架橋構造によってそれと結合した、重金属原子、又はリシンなどの毒素をキレート化するための、マクロ環を有することができる。
【００４９】
本発明の抗体分子を修飾して、エフェクター又はレポーター分子を、それに結合させることができることが好ましい。本発明の抗体分子は、以下に記載する修飾Ｆａｂ断片であることが、最も好ましい。
【００５０】
或いは、組換えＤＮＡ技術の手順を使用して、Ｆｃ断片（ＣＨ２、ＣＨ３及びヒンジドメイン）、完全免疫グロブリン分子の、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、又はＣＨ３ドメインが、ペプチド連結基、機能的非免疫グロブリンタンパク質、酵素又は毒素分子などによって置換されているか、或いはそれらが結合している、抗体分子を生成することができる。或いは、本発明の抗体分子は修飾Ｆａｂ断片であり、その修飾は、エフェクター又はレポーター分子の結合を可能にするための、１つ又は複数のアミノ酸のその重鎖のＣ末端への付加であることが好ましい。他のアミノ酸は、エフェクター又はレポーター分子を結合させることができる、１つ又は２つのシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を形成することが好ましい。
【００５１】
結合したエフェクター又はレポーター分子を有する、本発明の中和抗体分子も提供する。エフェクター又はレポーター分子には、細胞毒性物質、放射性核種又は薬剤成分などの分子がある。結合させることができる他の分子には、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、又はジフテリア毒素など、タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノゲン活性化物質など、抗血栓剤又は抗血管新生剤、例えばアンギオスタチン又はエンドスタチン、生物学的応答調節剤、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）又は他の成長因子などがある。
【００５２】
好ましいエフェクター基はポリマー分子であり、これを修飾Ｆａｂ断片と結合させて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその半減期を増大させることができる。
【００５３】
ポリマー分子は、一般に、合成又は天然ポリマー、例えば場合によっては置換された直鎖又は分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分岐鎖若しくは非分岐鎖多糖、例えばホモ又はヘテロ多糖であってよい。
【００５４】
前述の合成ポリマー上に存在することができる、特定の任意選択の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基がある。
【００５５】
合成ポリマーの特定の例には、場合によっては置換された直鎖又は分岐鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はこれらの誘導体、特に場合によっては置換されたポリ（エチレングリコール）、メトキシポリ（エチレングリコール）など、又はこれらの誘導体がある。
【００５６】
特定の天然ポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はこれらの誘導体がある。
【００５７】
本明細書で使用する「誘導体」は、反応性誘導体、例えばチオール選択的反応基、例えばマレイミドなどを含むものとする。反応基はポリマーと直接、或いは連結部分を介して、連結することができる。このような基の残基は、幾つかの場合、抗体断片とポリマーの間の連結基として、生成物の一部分を形成することは理解されよう。
【００５８】
ポリマーの大きさは望むならば変えることができるが、一般には５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、好ましくは５０００〜４００００Ｄａ、及びより好ましくは２５０００〜４００００Ｄａの平均分子量の範囲内であろう。ポリマーの大きさは特に、生成物の目的とする用途に基づいて選択することができる。したがって、例えば、生成物を循環させ組織に浸透させることが目的である場合、例えば腫瘍の治療において使用するためには、例えば約５０００Ｄａの分子量を有する小分子量ポリマーを使用することが、有利である可能性がある。生成物が循環中の状態である適用例では、例えば２５０００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有する高分子量ポリマーを使用することが、有利である可能性がある。
【００５９】
特に好ましいポリマーには、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）又は、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体、及び特に約２５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーなどがある。
【００６０】
修飾抗体断片と結合したそれぞれのポリマー分子は、断片中に位置するシステイン残基のイオウ原子と共有結合することができる。共有結合は一般に、ジスルフィド結合、又は特に、イオウ−炭素結合であろう。
【００６１】
望ましい場合、抗体断片は、それに結合した１つ又は複数のエフェクター又はレポーター分子を有することができる。エフェクター又はレポーター分子は、断片中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して、抗体断片と結合することができる。
【００６２】
活性化ポリマーは、前に記載したポリマー修飾型抗体断片の調製において、出発物質として使用することができる。活性化ポリマーは、チオール反応基を含む任意のポリマー、α−ハロカルボン酸又はエステルなど、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドであってよい。このような出発物質は、商業的に得ることができ（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）、或いは従来の化学的手順を使用して、市販の出発物質から調製することができる。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）がある。
【００６３】
結合ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に関しては、「ポリ（エチレングリコール）の化学、生物学的技術及び生物医学的適用例（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９２、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク；「ポリ（エチレングリコール）の化学、生物学的適用例（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、及び「生物医学科学用の生物学的結合体タンパク質の結合技法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨークに言及されている。
【００６４】
エフェクター又はレポーター分子と連結した抗体断片を得ることが望ましい場合、活性化ポリマーとの反応前又は後に適切に、エフェクター又はレポーター分子と直接、或いはカップリング剤を介して抗体断片を連結させる、標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順によって、抗体断片を調製することができる。特定の化学的手順には、例えばＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５及びＷＯ８９／０１４７６中に記載された手順がある。或いは、エフェクター又はレポーター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５中に記載されたのと同様の組換えＤＮＡ手順を使用して、連結を得ることができる。
【００６５】
本発明の修飾Ｆａｂ断片は、ＥＰ−Ａ−０９４８５４４中に開示された方法に従い、ＰＥＧ化されている（即ち、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール）がそこに共有結合している））ことが好ましい。本発明の抗体分子は、図１２中に示すＰＥＧ化修飾Ｆａｂ断片であることが好ましい。修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域中の１つのチオール基と共有結合した、マレイミド基を有することが好ましい。リジン残基は、マレイミド基と共有結合することが好ましい。リジン残基上のアミン基のそれぞれに、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合することが好ましい。エフェクター分子全体の合計分子量は、それ故約４０，０００Ｄａである。したがって、中和抗体であって、重鎖のＣ末端におけるシステイン残基の１つに、リシル−マレイミド基又はリシルビス−マレイミド基が結合しており、リシル残基のそれぞれのアミノ基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基が共有結合している、中和抗体を提供する。例えば、分子量は１５，０００〜２５，０００Ｄａ、或いは好ましくは１８，０００〜２２，０００Ｄａ、及びさらにより好ましくは１９，０００〜２１，０００Ｄａであってよい。
【００６６】
好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体分子であって、配列番号１５に与えられる配列を含む重鎖、及び配列番号２０に与えられる配列を含む軽鎖を有し、その重鎖のＣ末端に、エフェクター又はレポーター分子が結合することができる１つのシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を有する修飾Ｆａｂ断片である、中和抗体分子を提供する。
【００６７】
他の好ましい実施形態では、ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体分子であって、配列番号１５に与えられる配列を含む重鎖、及び配列番号２０に与えられる配列を含む軽鎖を有し、その重鎖のＣ末端に、エフェクター又はレポーター分子が結合する１つのシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を有する修飾Ｆａｂ断片である、中和抗体分子を提供する。
【００６８】
より好ましくは、ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体分子であって、配列番号１５に与えられる配列を含む重鎖、及び配列番号２０に与えられる配列を含む軽鎖を有し、重鎖のＣ末端におけるシステイン残基に、リシル−マレイミド基が結合しており、リシル残基のそれぞれのアミノ基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基が共有結合している、中和抗体分子を提供する。
【００６９】
さらにより好ましくは、その重鎖が配列番号７１に与えられる配列のアミノ酸残基番号２２〜２５１を含むか或いはそれらからなり、その軽鎖が配列番号７０に与えられる配列のアミノ酸残基番号２２〜２３５を含むか或いはそれらからなる、中和抗体分子を提供する。配列番号７０及び７１に与えられる、アミノ酸残基番号１〜２１は、大腸菌リーダー配列を表し、これが切断されて本発明の中和抗体分子を与えることが最も好ましい。
【００７０】
最も好ましくは、その重鎖が配列番号７１に与えられる配列のアミノ酸残基番号２２〜２５１を含むか或いはそれらからなり、その軽鎖が配列番号７０に与えられる配列のアミノ酸残基番号２２〜２３５を含むか或いはそれらからなる中和抗体分子であって、重鎖のＣ末端におけるシステイン残基に、リシル−マレイミド基が結合しており、リシル残基のそれぞれのアミノ基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基が共有結合している、中和抗体分子を提供する。
【００７１】
ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する中和抗体分子であって、配列番号２０に与えられる配列を含む軽鎖を含む中和抗体と同じエピトープに結合する、中和抗体分子も提供する。
【００７２】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の示される機能、特に必要とされる可能性があるエフェクター機能に関して選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってよい。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン、抗体分子が治療用途を意図するものであり、抗体のエフェクター機能が必要とされるときは、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３イソ型を使用することができる。或いは、抗体分子が治療目的を意図するものであり、抗体のエフェクター機能が必要とされないとき、例えばＩＬ−１β活性を単に阻止するために、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４イソ型を使用することができる。
【００７３】
本発明の抗体分子は、少なくとも４．４×１０−１０Ｍの結合親和性を有することが好ましく、少なくとも３．２×１０−１０Ｍを有することがより好ましい。
【００７４】
本発明は、ＩＬ−１βに関して改善された親和性を有する、本発明の抗体分子の変異体にも関する。ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４、３９２〜４０３、１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ他、「バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１０、７７９〜７８３、１９９２）、大腸菌の突然変異菌株の使用（Ｌｏｗ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０、３５９〜３６８、１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８、７２４〜７３３、１９９７）、ファージディスプレー（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６、７７〜８８、１９９６）及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ他、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、３９１、２８８〜２９１、１９９８）を含めた、多数の親和性増強プロトコルによって、このような変異体を得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎ他（上記）は、親和性増強のこれらの方法を論じている。
【００７５】
本発明は、本発明の抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖をコードする、単離ＤＮＡ配列も提供する。ＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードすることが好ましい。本発明のＤＮＡ配列は、例えば化学的処理によって生成した合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組合せを含むことができる。
【００７６】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者によく知られている方法によって得ることができる。例えば、抗体重鎖及び軽鎖の一部分又は全体をコードするＤＮＡ配列は、決定したＤＮＡ配列から、或いは対応するアミノ酸配列に基づいて、望むように合成することができる。
【００７７】
アクセプター枠組み配列をコードするＤＮＡは、当業者には広く利用可能であり、それらの知られているアミノ酸配列に基づいて、容易に合成することができる。
【００７８】
分子生物学の標準的な技法を使用して、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を作製することができる。望ましいＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド合成技法を使用して、完全或いは部分的に合成することができる。部位特定突然変異導入法及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を、適切に使用することができる。
【００７９】
本発明は、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニング又は発現ベクターにも関する。したがって、本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニング又は発現ベクターを提供する。クローニング又は発現ベクターは、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする、２つのＤＮＡ配列を含むことが好ましい。本発明のベクターは、配列番号６９に与えられる配列を含むことが好ましい。
【００８０】
それによってベクターを構築することができる一般的方法、トランスフェクション法及び培養法は、当業者によく知られている。この点においては、「分子生物学における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって作製された「マニアティスのマニュアル（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌ）」に言及されている。
【００８１】
本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む、宿主細胞も提供する。任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を発現させるために、使用することができる。細菌、例えば大腸菌、及び他の微生物系を使用することができ、或いは真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系も使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞がある。
【００８２】
本発明は、本発明の抗体分子を生成するための方法であって、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ由来のタンパク質の発現をもたらすのに適した条件下において、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養すること、及び抗体分子を単離することを含む、方法も提供する。
【００８３】
抗体分子は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含むことができ、その場合、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみをコードする配列を、宿主細胞をトランスフェクトするために使用する必要がある。重鎖と軽鎖の両方を含む生成物を生成するために、２つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードする第一のベクター、及び重鎖ポリペプチドをコードする第二のベクターで、細胞系をトランスフェクトすることができる。或いは、１つのベクター、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含むベクターを使用することができる。
【００８４】
本発明の抗体は、病的状態の治療及び／又は予防において有用であるので、本発明は、１つ又は複数の薬剤として許容可能な媒体、希釈剤又は担体と組み合わせて、本発明の抗体分子を含む、薬剤又は診断用組成物も提供する。したがって、医薬品を製造するための、本発明の抗体の使用を提供する。本発明の組成物は通常、滅菌された、薬剤組成物の一部として供給され、薬剤として許容可能な担体を通常含む。本発明の薬剤組成物は、薬剤として許容可能なアジュバントをさらに含むことができる。
【００８５】
本発明は、薬剤又は診断用組成物を調製するための方法であって、本発明の抗体分子、及び１つ又は複数の薬剤として許容可能な媒体、希釈剤又は担体を加え混合することを含む方法も提供する。
【００８６】
抗体分子は薬剤又は診断用組成物中の唯一の活性成分であってよく、或いは他の抗体成分、例えば抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ又は抗ＬＰＳ抗体、又はキサンチンなどの非抗体成分を含めた、他の活性成分を伴ってよい。
【００８７】
薬剤組成物は、治療上有効量の本発明の抗体を含むことが好ましい。本明細書で使用する、用語「治療上有効量」は、標的とする疾患又は状態を治療、改善又は予防するため、或いは検出可能な治療又は予防効果を示すために必要とされる、治療剤の量を指す。任意の抗体に関して、細胞培養アッセイで、或いは動物モデルにおいて、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類において、治療上有効量を最初に推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与の経路を決定することもできる。したがって、このような情報を使用して、ヒト中の有用な用量及び投与の経路を決定することができる。
【００８８】
ヒト被験体に関する正確な治療上の有効量は、被験体の疾患状態の重度、一般的健康状態、被験体の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬剤の組合せ、療法に対する反応感受性及び耐性／応答性に依存するであろう。この量は通常の実験によって決定することができ、臨床医の判断内である。一般に、治療上の有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。薬剤組成物は、用量当たり所定量の本発明の活性物質を含む単位剤形で、好都合に表すことができる。
【００８９】
組成物は患者に個別に投与することができ、或いは他の物質、薬剤又はホルモンと組み合わせて（例えば同時に、逐次的或いは別々に）投与することができる。
【００９０】
本発明の抗体分子を投与する用量は、治療する状態の性質、存在する炎症の程度、抗体分子が予防的に、或いは既存の状態を治療するために使用されるかどうかに依存する。
【００９１】
投与の頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続に依存するであろう。抗体分子が短い半減期（例えば２〜１０時間）を有する場合、１日当たり１回又は複数回の投与を与えることが必要である可能性がある。或いは、抗体分子が長い半減期（例えば２〜１５日間）を有する場合、１日当たり１回、１週間当たり１回、或いはさらに１ヶ月又は２ヶ月毎に１回投与を与えることのみが、必要である可能性がある。
【００９２】
薬剤として許容可能な担体は、組成物を与える個体に有害な抗体の生成を自ら誘導してはならず、毒性であってはならない。適切な担体は、大きな、ゆっくりと代謝されるマクロ分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などであってよい。
【００９３】
薬剤として許容可能な塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸の塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。
【００９４】
治療組成物中の薬剤として許容可能な担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含むことができる。さらに、湿潤剤又は乳濁剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質が、このような組成物中に存在してよい。このような担体によって、患者によって摂取されるための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液として、薬剤組成物を配合するのが可能となる。
【００９５】
投与に関する好ましい形には、例えば注射又は注入による、例えば大量注射又は連続注入による、非経口投与に適した形がある。生成物が注射又は注入用である場合、それは油性又は水性媒体の懸濁液、溶液又は乳濁液の形をとることができ、懸濁剤、防腐剤、安定剤及び／又は分散剤などの配合剤を含むことができる。或いは抗体分子は、適切な滅菌液との使用前に還元するための、乾燥形であってよい。
【００９６】
ひとたび配合した後、本発明の組成物は、被験体に直接投与することができる。治療される被験体は、動物であってよい。しかしながら、ヒト被験体への投与用に、組成物を適合させることが好ましい。
【００９７】
本発明の薬剤組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、経皮的（例えばＷＯ９８／２０７３４を参照）、皮下、腹膜内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内又は直腸経路だけには限られないが、これらを含めた任意の数の経路によって投与することができる。ハイポスプレーを使用して、本発明の薬剤組成物を投与することもできる。典型的には、治療用組成物は、注射剤として、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、調製することができる。注射前の液媒体中の溶液又は懸濁液に適した固形も、調製することができる。
【００９８】
組成物の直接的な送達は一般に、注射によって、皮下、腹膜内、静脈内又は筋肉内に行われ、或いは組織の間質腔に送達される。組成物は病巣に投与することもできる。投与治療は、１回の投与スケジュール又は多数回の投与スケジュールであってよい。
【００９９】
組成物中の活性成分が、抗体分子であろうことは理解されよう。このように、それは胃腸管中で分解を受けやすいであろう。したがって、胃腸管を使用する経路によって組成物が投与される場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、ひとたび胃腸管から吸収されると抗体を放出する物質を、含むことが必要であろう。
【０１００】
薬剤として許容可能な担体の完全な考察は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＪ．１９９１）において入手可能である。
【０１０１】
本発明の抗体が、遺伝子療法を使用することによって、投与されることも想定される。これを実施するために、適切なＤＮＡ要素の調節下において、抗体分子の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、抗体鎖がそのＤＮＡ配列から発現され、ｉｎ  ｓｉｔｕで構築されるように、患者に導入する。
【０１０２】
本発明は、炎症の調節において使用するための抗体分子も提供する。抗体分子を使用して、炎症過程を減少させる、或いは炎症過程を予防することができることが好ましい。
【０１０３】
本発明は、ＩＬ−１βによって仲介されるか、或いは高レベルのＩＬ−１βと関係がある、病的障害の治療又は予防において使用するための、本発明の抗体分子も提供する。病的状態は、感染（ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫）、感染と関係がある内毒素性ショック、関節炎、慢性関節リウマチ、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、クローン病、ペーロニー病、セリアック病、胆嚢病、毛巣病、腹膜炎、髄膜脳炎、他の自己免疫障害、膵炎、外傷（外科手術）、移植片対宿主疾患、移植拒絶、癌（メラノーマ、肝芽腫、肉腫、扁平上皮細胞癌、移行細胞癌、卵巣癌などの固形腫瘍、及び血液悪性腫瘍、及び特に急性骨髄白血病、慢性骨髄白血病、胃癌及び結腸癌）、心筋梗塞などの虚血性心疾患を含めた心臓病、並びにアテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨の再突然変異、骨粗しょう症、歯周炎及び低塩酸症からなる群から選択されることが好ましい。
【０１０４】
本発明は、痛みの治療又は予防において使用するための、本発明の抗体分子も提供する。
【０１０５】
本発明は、ＩＬ−１βによって仲介されるか、或いは高レベルのＩＬ−１βと関係がある病的障害を、治療又は予防するための医薬品の製造における、本発明の抗体分子の使用をさらに提供する。
【０１０６】
本発明は、痛みを治療又は予防するための医薬品の製造における、本発明の抗体分子の使用をさらに提供する。
【０１０７】
本発明の抗体分子は、ヒト又は動物身体中のＩＬ−１βの影響を低下させることが望ましい、任意の療法において使用することができる。ＩＬ−１βは身体中を循環している可能性があり、身体中の特定部位、例えば炎症部位に局在する、望ましくない高レベルで存在する可能性がある。
【０１０８】
本発明の抗体分子は、炎症を調節するために使用することが好ましい。
【０１０９】
本発明は、ＩＬ−１βによって仲介される疾患に罹患しているか、或いはその危険がある、ヒト又は動物被験体を治療する方法も提供し、この方法は、本発明の抗体分子を有効量、被験体に投与することを含む。
【０１１０】
本発明の抗体分子は診断、例えばＩＬ−１βと関係がある病状のｉｎ  ｖｉｖｏ診断及び画像化においても使用することができる。
【０１１１】
本発明を、以下の実施例中に例示によってのみさらに記載し、以下の添付の図面中に言及する。
【０１１２】
ＤＮＡ操作及び一般的方法
大腸菌菌株ＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、形質転換及び通常の培養増殖用に使用した。ＤＮＡ制限酵素及び修飾酵素は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから得た。プラスミド調製は、Ｍａｘｉプラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２１６５）を使用して行った。ＤＮＡシークエンシング反応は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーターシークエンシングキット（カタログ番号４３０４１４９）を使用して行い、ＡＢＩ３１００自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で実施した。データは、プログラムＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。オリゴヌクレオチドは、ＯＳＷＥＬから得た。Ｆａｂ’の濃度は、Ｆａｂ’アセンブリＥＬＩＳＡを使用して測定した。
【実施例】
【０１１３】
（例１：マウスモノクローナル抗体ＩＣ８由来の可変領域の、遺伝子クローニング及び発現）
全ＲＮＡの調製
ＩＣ８を発現するハイブリドーマを、ヒトＩＬ−１βタンパク質を用いたマウスの免疫処置の後に、従来のハイブリドーマ技術を使用して、Ｃｉｓｔｒｏｎによって作製した。次いでハイブリドーマを、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｒ＆Ｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄによって得た。ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｌｔｄ、カタログ番号７４１０４）を使用して、ＩＣ８ハイブリドーマ細胞から、全ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡは、ＰＣＲキット（カタログ番号Ｋ１４０２）用のＣｌｏｎｔｅｃｈ  ｃＤＮＡ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴを使用してｃＤＮＡに逆転写した。
【０１１４】
ＩＣ８  ＶＨ及びＶＬ領域のＰＣＲクローニング
ハイブリドーマ細胞から調製したｃＤＮＡを、Ｖ領域配列を増幅させるために設計した一連の反応において、ＰＣＲ用の鋳型として使用した。これらの反応は、保存されたシグナル配列内のＤＮＡとアニーリングさせるために設計した一組の「正方向」縮重プライマー、及び枠組み４／定常領域接合部をコードするＤＮＡとアニーリングした逆方向プライマーを使用した。ＰＣＲは、Ｔａｑ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６００２１１）、及び０．２５ｍＭの濃度のｄＮＴＰを使用して行った。生成したＰＣＲ産物を、シークエンシングベクター（シークエンシング用のＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット、カタログ番号Ｋ２８７５）にクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。精製ＩＣ８抗体（ハイブリドーマ由来）のＮ末端タンパク質のシークエンシングを使用して、翻訳された配列が観察されたタンパク質配列と対応したことを確認した。Ｖ領域配列は、図１中及び配列番号１〜４中に示す。
【０１１５】
次いでマウスＶ領域遺伝子を、発現ベクターｐＭＲＲ１０及びｐＭＲＲ１４にサブクローニングした（図２）。これらは、それぞれ軽鎖及び重鎖の発現用の別のベクターであり、それぞれヒトκ軽鎖及びγ−４重鎖の定常領域遺伝子をコードするゲノムＤＮＡを含む。
【０１１６】
二重キメラＩＣ８抗体分子ｃＨｃＬを、前に記載した重鎖及び軽鎖発現ベクター（ＩＣ８  ＶＬ及びＶＨをそれぞれ含むｐＭＲＲ１０及びｐＩＶＳＲＲ１４）の、ＣＨＯ−Ｌ７６１細胞への一時的な同時トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクションは、製造者の教示書（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１８３２４）に従い、リポフェクタミン手順を使用して行った。
【０１１７】
（例２：ＩＣ８のＣＤＲ移植）
ＩＣ８由来のＣＤＲをヒト枠組みにＣＤＲ移植して、潜在的な免疫原性を低下させ、大腸菌の発現を容易にした。ヒト生殖細胞系アクセプター枠組みは、亜群ＶＨ３及びＶＫ１から選択した。図３は、ドナーマウス配列とアクセプターヒト枠組みの間の、アラインメントを示す。重鎖アクセプター枠組みは、ヒトＪＨ領域生殖細胞系ＪＨ４のこの部分に由来する枠組み４を有する、ヒト生殖細胞系配列ＶＨ３−１１（ＤＰ−３５）である。軽鎖アクセプター枠組みは、ヒトＪＫ領域生殖細胞系ＪＫ１のこの部分に由来する枠組み４を有する、ヒト生殖細胞系配列Ｏ１２（ＤＰＫ９）である。
【０１１８】
図３中のアラインメントは、（ＣＤＲを除いた）ドナー重鎖とアクセプター重鎖の間に、１３の枠組みの違いが存在することを示す。これらの位置のそれぞれにおいて、抗原との直接的な接触によって、ＣＤＲパッキングの役割によって、或いはＶＬ／ＶＨ界面における関与によって、抗原結合に貢献するその残基の可能性の分析を行い、重要であると考えられる場合、マウスのドナー残基を保持した。軽鎖のアラインメントは、（ＣＤＲを除いた）ドナー配列とアクセプター配列の間に、１５の枠組みの違いが存在することを示す。抗原結合に貢献するマウスの残基の可能性を、再度分析した。このようにして、３つのＶＨ移植片及び３つのＶＬ移植片を設計した。これらは図３にも示し、配列番号１３（ｇＨ１）、配列番号１４（ｇＨ２）、配列番号１５（ｇＨ３）、配列番号１８（ｇＬ１）、配列番号１９（ｇＬ２）及び配列番号２０（ｇＬ３）に対応する。
【０１１９】
（例３：移植配列用の遺伝子の設計及び構築）
大腸菌において高頻度で使用されるコドンを使用し、「希な」大腸菌コドン（Ｗａｄａ他、（１９９１）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９、１９８１〜８６）を避け、移植配列をコードするように遺伝子を設計した。制限部位をＤＮＡ配列中に一定間隔で導入して、さらなる遺伝的操作を容易にした。図４は、ｇＨ１及びｇＬ１の遺伝子の設計を示し、それらの配列は配列番号２１及び２２に与える。対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２３及び２４中に与える。
【０１２０】
完全に重複しているオリゴヌクレオチドを使用して、ｇＨ１及びｇＬ１をコードする遺伝子を構築した（図５；配列番号２７〜５８）。設計した遺伝子をコードするオリゴヌクレオチドを、バッファー（１２．５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．２５ｍＭのジチオエリスリトール）中において、１００ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度で混合し、１０秒毎に−０．０１℃の割合で３０℃に冷却するようにプログラムしたＰＣＲブロックにおいて、３分間で９５℃に加熱することによって、一緒にアニーリングさせた。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ）及びその適切な反応バッファーを加え、２５℃で１時間のインキュベーションによって、オリゴヌクレオチドを１つに連結させた。次いで連結した重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を、１０倍過剰な「末端」プライマーＴ１（配列番号２５）及びＢ１（配列番号２６）を加えた後に、ＰＣＲによって増幅させた。プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを、この増幅用に使用した（Ｔａｑ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。増幅産物は１．５％アガロースゲル上に施した。４００〜４５０のバンドを単離し、ゲルを精製し、次いで製造者の教示書（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、中間ベクターｐＣＲ４平滑ＴＯＰＯにクローニングした。これによって、中間プラスミドｐＣＲ４（ＩＣ８ｇＬ１）及びｐＣＲ４（ＩＣ８ｇＨ１）を作製した。次いでこれらのプラスミドを鋳型として使用して、他の移植形ｇＬ２、ｇＬ３、ｇＨ２及びｇＨ３を作製した。
【０１２１】
オリゴヌクレオチドカセット交換法を使用して、ヒト化移植片ｇＬ２及びｇＬ３を作製した。図６は、オリゴヌクレオチドカセットの設計を示す。それぞれの変異体を構築するために、ベクターｐＣＲ４（ＩＣ８ｇＬ１）を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｈｅＩで切断した。生成した大きなベクター断片は、アガロースから精製したゲルであり、オリゴヌクレオチドカセットと連結させて使用した。オリゴヌクレオチド対は、２００μｌ体積のバッファー（１２．５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．２５ｍＭのジチオエリスリトール）中において、０．５ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度で混合し、水浴（体積５００ｍｌ）中において３分間で９５℃に加熱し、次いで室温にゆっくりと冷却することによって、一緒にアニーリングさせた。次いでアニーリングさせたオリゴヌクレオチドカセットを、適切に切断されたベクターに連結させる前に、水中で１０倍に希釈した。ＤＮＡシークエンシングを使用して、正確な配列を確認し、プラスミドｐＣＲ４（ＩＣ８ｇＬ２）及びｐＣＲ４（ＩＣ８ｇＬ３）を作製した。
【０１２２】
変異体ｇＨ２は、ＰＣＲ戦略を使用してｐＣＲ４（ＩＣ８ｇＨ１）から構築した。図６に示すカセット（配列番号６４）の逆鎖を、ベクター特異的５’正方向プライマーを使用するＰＣＲにおいて、逆方向プライマーとして使用して、部分的なｇＨ２配列を表す産物を生成させた。これを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｐＥＩで消化し、次いでＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｐＥＩ制限型ｐＣＲ４（ＩＣ８ｇＨ１）にクローニングして、ｐＣＲ４（ＩＣ８ｇＨ２）を作製した。
【０１２３】
変異体ｇＨ３は、異なるＰＣＲ戦略を使用して構築した。図６に示す２つのｇＨ３オリゴを、ベクター特異的３’逆方向プライマーを使用し、センス鎖（配列番号６６）を正方向プライマーとして、ベクター特異的５’正方向プライマーを使用し、非センス鎖（配列番号６７）を逆方向プライマーとして、別のＰＣＲ反応で使用した。いずれの場合も、鋳型はｐＣＲ４（ＩＣ８ｇＨ１）であった。２つの生成した増幅産物を単離及び精製し、次いで５’及び３’ベクター特異的プライマーと共に加え、他のＰＣＲ増幅に循環させて、完全長ｇＨ３生成物を作製した。これを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩで制限されたｐＣＲ４（ＩＣ８ｇＨ１）中に挿入して、ｐＣＲ４（ＩＣ８ｇＨ３）を作製した。すべての変異体は、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１２４】
次いでそれぞれの重鎖移植片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩ断片として、発現ベクターｐＭＲＲ１４にサブクローニングした。３つの軽鎖移植片のそれぞれは、ＳｆｕＩ−ＢｓｉＷＩ断片として、軽鎖発現ベクターｐＭＲＲ１０にサブクローニングした。
【０１２５】
最適な移植変異体の選択
移植抗体を、前に記載した移植重鎖及び軽鎖発現ベクター（それぞれＩＣ８  ｇＬ１、ｇＬ２及びｇＬ３、並びにｇＨ１、ｇＨ２及びｇＨ３を含むｐＭＲＲ１０及びｐＭＲＲ１４）の、ＣＨＯ−Ｌ７６１細胞への一時的な同時トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクションは、製造者の教示書（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１８３２４）に従い、リポフェクタミン手順を使用して行った。
【０１２６】
移植鎖とキメラ鎖の全ての組合せを発現させ、二重キメラ抗体ｃＨｃＬに対して比較した。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ及びＩＬ−１β中和アッセイにおいて、結合を評価した。
【０１２７】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ
このアッセイ形式は、溶液相中での組換えヒトＩＬ−１βの滴定で抗ｈＦｃによって捕捉した、抗ＩＬ−１β抗体を使用した。マウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）を、アミン結合化学物質によって１２７５７ＲＵのレベルまで、ＣＭ５センサーチップのフローセル２上に固定した。阻止状態の参照表面を、フローセル２と同じ体積を使用して、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いた活性化及びエタノールアミンを用いた不活性化によって、フローセル１上に作製した。ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ）を、ランニングバッファーとして使用し、アッセイは２５℃で行った。抗ＩＬ−１β抗体はフローセル１及び２を通過させ、１０μｌ／分の流速を使用して固定抗ｈＦｃ表面上で捕捉した。４００〜０ｎＭのＩＬ−１βを、３分間３０μｌ／分の流速を使用して、阻止表面及び捕捉抗ＩＬ−１β抗体表面上に注射した。抗ｈＦｃ表面は、４０ｍＭのＨＣｌの３０μｌ注射によって再生した。ＢＩＡ評価３．１ソフトウェアを使用して、動的パラメータを計算した。
【０１２８】
ｇＩＣ８  Ｆａｂ’用に、このアッセイ形式は、抗ｈＦ（ａｂ’）２（前式で「ｈ」は、それがヒトＦ（ａｂ’）２であることを示す）によって捕捉し、次いでＩＬ−１βを滴定した、抗ＩＬ−１β抗体を使用した。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｄｅ  １０９−００５−０９７）を、アミン結合化学物質によって１３０２５ＲＵのレベルまで、ＣＭ５センサーチップのフローセル２上に固定した。阻止状態の参照表面を、フローセル２と同じ体積を使用して、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いた活性化及びエタノールアミンを用いた不活性化によって、フローセル１上に作製した。ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ）を、ランニングバッファーとして使用し、アッセイは２５℃で行った。抗ＩＬ−１β抗体はフローセル１及び２を通過させ、１０μｌ／分の流速を使用して固定抗ｈＦ（ａｂ’）２表面上で捕捉した。４００〜０ｎＭのＩＬ−１β（Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ）を、３分間３０μｌ／分の流速を使用して、阻止表面及び捕捉抗ＩＬ−１β抗体表面上に注射した。抗ｈＦ（ａｂ’）２表面は、４０ｍＭのＨＣｌの３０μｌ注射、次に５ｍＭのＮａＯＨの１５μｌ注射によって再生した。ＢＩＡ評価３．１ソフトウェアを使用して、動的パラメータを計算した。
【０１２９】
表１は、Ｂｉａｃｏｒｅの抗原親和性のデータの要約を示す。位置４４及び８９にドナー残基を有するｇＨ１移植片が、位置８９にのみドナー残基を有するｇＨ２より、高い親和性を有することは明らかである。したがって、ｇＨ２移植片は拒絶された。驚くことに、位置４４のみがドナー枠組み残基であるｇＨ３移植片において、高い親和性を観察した。
【表１】
2010246553.tif 000002
【０１３０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの中和アッセイ
９６ウエルプレート中において８０％の集密状態まで、線維芽細胞を増殖させた。１μｇ／ｍｌからの半対数希釈で抗体を滴定し、ＩＬ−１βを加えて、２０ｐｇ／ｍｌの最終濃度を与えた。室温で３０分間、プレートをインキュベートした。培養基を線維芽細胞培養物から除去し、１００μｌ抗体／ＩＬ−１β混合物を適切なウエルに加え、３７℃で一晩培養した。ＩＬ−１βに応答して生成したＩＬ−６の量を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  Ｄｕｏｓｅｔ  Ｋｉｔ  ＤＹ２０６を使用して、次いで評価した。
【０１３１】
中和アッセイの結果は図７中に示し、その中では移植形の抗体（ｇＨ２は除く）を、親マウス抗体と比較する。Ｂｉａｃｏｒｅの親和性データと同様に、任意の残りの移植片の間に、ほとんど違いはない。それ故ｇＬ３ｇＨ３を、最適活性及び最小数のマウス枠組み残基を有する変異体として選択した。図３に示すように、ｇＨ３配列は１つのドナー枠組み残基を有し、一方ｇＬ３配列は３つのドナー枠組み残基を有する。
【０１３２】
Ｉｎ  ｖｉｖｏの中和アッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’の中和効率を測定するために、ｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’を、２つのｉｎ  ｖｉｖｏ炎症モデルにおいて試験した。
【０１３３】
マウスの腹膜内ｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’−ＰＥＧ（４０Ｋ）／腹膜内ｈＩＬ−１β
Ｂａｌｂ／ｃ雄性マウス（１８〜２５ｇ）に、ｈＩＬ−１β（１５０ｎｇ／ｋｇ）又は媒体（１００μｌのＰＢＳ）を腹膜内注射する前に５分間、ｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’−ＰＥＧ（４０Ｋ）（ｌ００μｌ、ＰＢＳ媒体中）又は対照Ｆａｂ’−ＰＥＧ（４０Ｋ）（ｌ００μｌ、ＰＢＳ媒体中）を、腹膜内（ｉ．ｐ．）注射した。１２０分後、頚椎脱臼によってマウスを屠殺し、腹膜洗浄（３ｍｌのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩）＋０．２５％のＢＳＡ、１２ｍＭのＨＥＰＥＳ）を行った。合計白血球の計数を、コールターカウンターを使用して行った。好中球を同定するために、５０μｌの腹膜洗浄液を、１：３００希釈の抗−ＣＤ４５−ＣｙＣｈｒｏｍｅ  ｍＡｂ及び１：３００希釈の抗フィコエリトリン標識ＧＲ−１  ｍＡｂ（抗−Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ）で、２０分間（４℃、暗所中）染色した。白血球はＨＥＳＳ（０．２５％のＢＳＡ、１２ｍＭのＨＥＰＥＳ）中で一度洗浄し、３００μｌのＨＢＳＳ（０．２５％のＢＳＡ、１２ｍＭのＨＥＰＥＳ）に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。好中球はＣＤ４５＋ＧＲ−１ＨＩＧＨとして同定した。腹膜洗浄試料中の、マウス単球走化性タンパク質−１（ｍＭＣＰ−１）の濃度は、製造者の教示書（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＯＰＴ−ＥＩＡ  ｍＭＣＰ−１）に従い、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１３４】
マウスの静脈内ｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’−ＰＥＧ（４０Ｋ）／静脈内ｈＩＬ−１β
Ｂａｌｂ／ｃ雄性マウス（１８〜２５ｇ）にハロタンで麻酔をかけ、ｈＩＬ−１β（３７．５又は５０μｇ／ｋｇ）又は媒体（１００μｌのＰＢＳ）を静脈内注射する前に１５分間、ｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’−ＰＥＧ（４０Ｋ）（ｌ００μｌ、ＰＢＳ媒体中）又は対照Ｆａｂ’−ＰＥＧ（ｌ００μｌ、ＰＢＳ媒体中）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。９０分後、血液試料を心臓穿刺によって採取し、ヘパリン処理し（２０μｌ、１００Ｕ／ｍｌ）、血漿は遠心分離によって調製した（１４，０００×ｇ、２分間、室温）。血漿試料は−２０℃で保存した。血漿試料は、製造者の教示書（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＯＰＴ−ＥＩＡ  ｍＩＬ−６）に従い、サンドイッチＥＬＩＳＡによって、マウスインターロイキン−６（ｍＩＬ−６）に関してアッセイした。
【０１３５】
これらの結果によって、腹膜内用ｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’−ＰＥＧ（４０Ｋ）を用いたマウスの予備処置は、腹膜内のｈＩＬ−１β誘導型の好中球の蓄積（表２）及びｍＭＣＰ−１の生成（表３）を低下させる際に、有効であったことが実証される。静脈内用ｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’−ＰＥＧ（４０Ｋ）を用いたマウスの予備処置も、静脈内のｈＩＬ−１β誘導型のｍＩＬ−６の生成を低下させる際に有効であった。３つの別個の実験からのデータを、表４に要約する。
【０１３６】
いずれかのモデルで使用したいずれの用量においても、悪影響は観察されなかった。したがって、抗体ｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’は、炎症及び他のＩＬ−１β仲介型疾患の治療において、有用であると予想することができる。
【表２】
2010246553.tif 000003
【表３】
2010246553.tif 000004
【表４】
2010246553.tif 000005
【０１３７】
（例４：Ｆａｂ’断片のクローニング及び発現）
選択したＶ領域の大腸菌Ｆａｂ’発現プラスミドｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’）へのクローニング
ｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’）という名称の無関係なＦａｂ’を含む発現ベクターを、図８に示す。軽鎖と重鎖の両方をコードするＤＮＡの前に、大腸菌ＯｍｐＡシグナル配列をコードするＤＮＡが存在する（Ｍｏｖｖａ  ＮＲ、Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ及びＩｎｏｕｙｅ  Ｍ．「ｏｍｐＡタンパク質、大腸菌の主要な外膜タンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列（Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｏｍｐＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８０；２５５（１）：２７〜９）。ＩＣ８のＶ領域を、このシグナル配列が保たれ、両鎖の大腸菌周辺質への転座を指示するように、このベクターにクローニングした。シグナルペプチドは、それが生成物のＦａｂ’配列の一部分を形成しないように、転座によって切断される。（注；ＯｍｐＡシグナルペプチドの配列は、配列番号７０で与えられる配列のアミノ酸残基１〜２１である。プラスミドｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’）は制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＢｓｉＷＩ（ＢｓｉＷＩとＳｐｌＩはアイソシゾマーである）で消化して、無関係なＶＬ配列を除去し、ｐＭＲＲ１０（ＩＣ８ｇＬ３）からそれを単離した後に、ＩＣ８ｇＬ３Ｖ領域を挿入した。）これによって、クローニング中間体ｐＴＴＯＤ（ＩＣ８ｇＬ３）を作製した。ｐＴＴＯＤ（ＩＣ８ｇＬ３）は、次いでＢｓｉＷＩ及びＡｐａＩで切断し、２つの断片を３様の連結で挿入した；ｃ−κ／ＩＧＳ−断片（ＩＧＳ−２又はＩＧＳ−３のいずれか）及びＩＣ８ｇＨ３断片（図９中の概略図を参照のこと）。このようにして、２つのベクター変異体、ｐＴＴＯＤ（ＩＣ８ｇＬ３ｇＨ３  ＩＧＳ−２）及びｐＴＴＯＤ（ＩＣ８ｇＬ３ｇＨ３  ＩＧＳ−３）を構築した。これらは、軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子の間のヌクレオチド配列のみが異なり：ＩＧＳ−２は２つの遺伝子間の非常に強い翻訳結合をもたらし、迅速な重鎖の翻訳速度を与え、ＩＧＳ−３はゆっくりとした重鎖の翻訳速度をもたらす（英国特許出願Ｎｏ．０１２９１０５を参照のこと）。
【０１３８】
大腸菌中のＦａｂ’の発酵槽発現
プラスミドｐＴＴＯＤ（ＩＣ８ｇＬ３ｇＨ３ＩＧＳ−２）及びｐＴＴＯＤ（ＩＣ８ｇＬ３ｇＨ３ＩＧＳ−３）を、標準的なプロトコルを使用して、大腸菌菌株Ｗ３１１０に形質転換した。可溶性大腸菌周辺質Ｆａｂ’を、５０℃においてトリス−ＥＤＴＡバッファーを使用して抽出した。抽出及び冷却後、抽出物のｐＨを調整し、遠心分離及び濾過によって細胞を除去した。浄化した供給流体を水で希釈して（約２倍）、伝導度を低下させた。カチオン交換クロマトグラフィー（ＳＰセファロースＦＦ樹脂）を使用してＦａｂ’を捕捉し、結合Ｆａｂ’はＮａＣｌステップを使用して溶出させた。溶出した生成物流を濃縮し、限外濾過を使用してトリスバッファーに透析濾過し、アニオン交換クロマトグラフィー（ＳＰセファロースＦＦ樹脂）に施し、この場合Ｆａｂ’は、非結合分画中に含まれていた。精製したＦａｂ’を濃縮し、（限外濾過によって）還元バッファーに透析濾過し、次にヒンジチオールを活性化するために２−メルカプトエチルアミンを使用して還元した。次いで還元剤を、限外濾過バッファーの交換によって除去する。Ｎ末端シークエンシングによって、ＯｍｐＡリーダーの正確なアミノ酸配列及び切断を確認した。これら２つのプラスミドによるＦａｂ’の発現を比較した。
【０１３９】
表５は、ＩＧＳ−２及びＩＧＳ−３変異体に関する発酵槽Ｆａｂ’収率の比較を示す。ＩＧＳ−２構築体は、Ｆａｂ’の生産性に関してＩＧＳ−３より明らかに性能がよい。したがって、ＩＧＳ−２変異体を選択した。プラスミドの地図は図１０に示す。図１１は、ｐＴＴＯＤ（ｇＨ３ｇＬ３Ｆａｂ’ＩＧＳ−２）のＦａｂ’コード配列及び隣接配列を示す。
【表５】
2010246553.tif 000006
【０１４０】
大腸菌生成Ｆａｂ’の活性
精製した大腸菌生成Ｆａｂ’の幾つかを、表１に示すＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおける親和性に関して次いで分析した。見ることができるように、この物質は、このアッセイにおける完全な活性を有効に保持している。
【０１４１】
ＦａｂのＰＥＧ化
精製した修飾型Ｆａｂは、分岐ＰＥＧ分子と部位特異的に結合する。これは、以前に記載されたのと同様に（Ａ．Ｐ．Ｃｈａｐｍａｎ他、「ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１７、７８０〜７８３、１９９９）、修飾型Ｆａｂの切断ヒンジ領域中の１つのシステイン残基の活性化、次に（ＰＥＧ）−リシルマレイミドとの反応によって行われる。本発明のＰＥＧ化分子は、図１２に示す。使用したＰＥＧは、２０Ｋのメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）であった。生成したＦａｂ’−ＰＥＧは、直鎖状ＮａＣｌ勾配の溶出を使用する、カチオン交換クロマトグラフィー（ＳＰセファロースＨＰ）によって精製した。精製したＦａｂ’−ＰＥＧは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム＋１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５への限外濾過により濃縮及び調合して、本発明の治療用中和抗体を生成した。
【０１４２】
本発明を例によってのみ記載してきたが、それは決して制限を意味するものではなく、本明細書の以後の特許請求の範囲内で、詳細の変更を行うことができることは、当然ながら理解されよう。本発明のそれぞれの実施形態の好ましい特徴は、必要な変更を加えて、それぞれの他の実施形態と同様である。本明細書に引用した特許及び特許出願だけには限られないが、これらを含めたすべての刊行物は、それぞれ個々の刊行物が、完全に述べられているように参照として本明細書に組み込まれることが、詳細且つ個別に示されるかの如く、参照として本明細書に組み込む。
【図２】
2010246553.tif 000007
【図５ａ】
2010246553.tif 000008
【図５ｂ】
2010246553.tif 000009
【図７】
2010246553.tif 000010
【図１ａ】
2010246553.tif 000011
【図１ｂ】
2010246553.tif 000012
【図３】
2010246553.tif 000013
【図４ａ】
2010246553.tif 000014
【図４ｂ】
2010246553.tif 000015
【図６】
2010246553.tif 000016
【図８】
2010246553.tif 000017
【図９】
2010246553.tif 000018
【図１０】
2010246553.tif 000019
【図１１−１】
2010246553.tif 000020
【図１１−２】
2010246553.tif 000021
【図１１−３】
2010246553.tif 000022
【図１２】
2010246553.tif 000023
【配列表】
2010246553000001.app