(57)【要約】【課題】筋肉および骨の変性障害の治療方法を提供すること。【解決手段】成長分化因子８（ＧＤＦ−８）に対する新規の抗体（特にヒト抗体）および抗体フラグメント（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ−８活性を阻害するものが含まれる）を開示する。筋肉もしくは骨の変性障害またはインスリン代謝障害の診断、防止、または治療方法も開示する。Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、およびＭｙｏ２２と呼ばれる新規のヒト抗ＧＤＦ−８抗体およびこれ由来の抗体および抗原結合フラグメントも提供する。本発明の抗体は、多数の有用な特性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年１０月２２日提出の米国特許仮出願番号６０／４１９，９６４号（その全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
技術分野は、成長分化因子８（ＧＤＦ−８）に対する抗体（特にヒト抗体）および抗体フラグメント（詳細には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ−８活性を阻害するもの）に関する。分野は、さらに、筋肉もしくは骨の変性障害またはインスリン代謝障害の診断、予防、または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ミオスタチンとしても公知の成長分化因子８（ＧＤＦ−８）は、分泌タンパク質であり、構造的に関連する成長因子の形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリー（その全てが生理学的に重要な成長調節特性および形態形成特性を有する）のメンバ−である（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，８：１３３−１４６；Ｈｏｏｄｌｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２８：２３５−２７２）。ＴＧＦ−βと同様に、  ヒトＧＤＦ−８は、３７５アミノ酸長前駆体タンパク質として合成される。前駆体ＧＤＦ−８タンパク質は、ホモ二量体を形成する。プロセシング時に、アミノ末端プロペプチドは、Ａｒｇ−２６６で切断される。「潜伏期関連ペプチド（ｌａｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」（ＬＡＰ）として公知の切断されたプロペプチドは、ホモ二量体への非共有結合を保持し、それにより複合体を不活化することができる（Ｍｉｙａｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：６４０７−６４１５；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：７６４６−７６５４；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：３５−４３；およびＴｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１８：２５１−２５９）。成熟ＧＤＦ−８とプロペプチドとの複合体は、一般に、「小潜在複合体（ｓｍａｌｌ−ｌａｔｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」と呼ばれる（Ｇｅｎｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：６８５１−６８５７；Ｄｅｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ，３１６：７０１−７０５；およびＭａｓｓａｇｕｅ（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２：５９７−６４１）。成熟ＧＤＦ−８に結合してその生物活性を阻害する他のタンパク質も公知である。このような阻害タンパク質には、フォリスタチンおよびフォリスタチン関連タンパク質が含まれる（Ｇａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０８：２２２−２３２）。
【０００４】
種々の種由来の推定アミノ酸配列のアラインメントにより、進化を通してＧＤＦ−８が高度に保存されていることが証明されている（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：１２４５７−１２４６１）。実際、ヒト、マウス、ラット、ブタ、およびニワトリのＧＤＦ−８配列はＣ末端領域が１００％同一であり、ヒヒ、ウシ、およびヒツジでは３アミノ酸しか異ならない。ゼブラフィッシュＧＤＦ−８が最も異なるが、以前としてヒトと８８％同一である。
【０００５】
この保存の高さにより、ＧＤＦ−８は不可欠な機能を有することが示唆される。ＧＤＦ−８は、発達中および成体の骨格筋で高度に発現し、筋肉および骨形成における重要な生体プロセスの調節に関与することが見いだされた。たとえば、ＧＤＦ−８ノックアウトトランスジェニックマウスは、骨格筋量の顕著な肥大および過形成（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８７：８３−９０）および皮質骨構造の変化（Ｈａｍｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｏｎｅ，２７（３）：３４３−３４９）によって特徴づけられる。骨格筋の類似の増大は、ウシのＧＤＦ−８の天然に存在する変異で明らかである（Ａｓｈｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｇｒｏｗｔｈ，３８：５０１−５０７；Ｓｗａｔｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，３８：７５２−７５７；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：１２４５７−１２４６１；およびＫａｍｂａｄｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，７：９１０−９１５）。研究により、ＨＩＶ感染に関連する筋肉の消耗に伴ってＧＤＦ−８発現が増大することが示されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：１４９３８−１４９４３）。ＧＤＦ−８はまた、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生および筋芽細胞の増殖（ＷＯ  ００／４３７８１）に関与する。その成長調節および形態形成特性に加えて、ＧＤＦ−８は、多数の他の生理学的プロセス（２型糖尿病の発症におけるグルコースホメオスタシス、耐糖能障害、代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）、外傷によるインスリン抵抗性（火傷または窒素不均衡など）、および脂肪組織障害（例えば、肥満症）が含まれる）にも関与すると考えられる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＢＢＲＣ，２８１：９０２−９０６）。
【０００６】
多数のヒトおよび動物の障害が、機能障害筋肉組織に関連する（例えば、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィーが含まれる）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋萎縮症、組織萎縮症、脆弱性、鬱血性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、ならびに他の疾患および病態に起因する筋消耗症候群）。今日まで、これらの障害を治療するための信頼がおける、又は有効な治療法はほとんどなかった。
【０００７】
特に高齢者および／または閉経後の女性における骨量の低下に関連する病態（骨粗鬆症または変形性関節症が含まれる）も多数存在する。さらに、代謝性骨疾患および障害には、慢性糖質コルチコイド療法に起因する低骨量、若年性性腺不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠損症、二次性副甲状腺機能亢進症、栄養失調、および拒食症が含まれる。これらの病態のための現在利用可能な治療法は、骨吸収の阻害によって作用する。これらの治療法に代わる新規の骨形成を促進する治療法が望ましい。
【０００８】
したがって、特にヒトにおける筋肉量および／または強度および／または骨密度の全体的増加に寄与する新規の治療法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
（要旨）
本発明の１つの目的は、筋肉および／または骨関連障害のための安全且つ有効な治療方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、脊椎動物の筋肉量および／または骨の強度および／または密度を増大させる方法を提供することである。
【００１１】
本発明のなおさらなる目的は、ｉｎ  ｖｉｖｏで安全且つ有効なＧＤＦ−８のインヒビターを提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、高い特異性および親和性でＧＤＦ−８と結合するヒト抗体およびそのフラグメントを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、筋肉および骨の変性障害の治療方法を提供する。方法はまた、正常な動物の筋肉量および骨密度の増加に有用である。Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、およびＭｙｏ２２と呼ばれる新規のヒト抗ＧＤＦ−８抗体およびこれ由来の抗体および抗原結合フラグメントも提供する。本発明の抗体は、多数の有用な特性を有する。第１に、本抗体は、高親和性で成熟ＧＤＦ−８と結合することができる。第２に、本開示の抗体は、証明するように、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ結合の阻害およびレポーター遺伝子アッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ−８活性を阻害する。第３に、本開示の抗体は、骨格筋の量および骨密度の負の調節に関連するＧＤＦ−８活性を阻害することができる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
実質的に配列番号ｎ（ｎは２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８である）に記載のアミノ酸配列を含む単離抗体において、前記抗体がＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１と特異的に結合することができる、単離抗体。
（項目２）
配列番号ｎ（ｎは、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８である）のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４７４１、ＰＴＡ−４７４０、またはＰＴＡ−４７３９のＥ．ｃｏｌｉによって発現するｓｃＦｖフラグメントである、項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記抗体が、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と特異的に結合することができる、項目１に記載の抗体。
（項目５）
互いに独立して少なくとも（ａ）配列番号５４のＮ末端由来の第２のアミノ酸がメチオニンであるか、（ｂ）Ｎ末端由来の第３のアミノ酸がセリンであるか、（ｃ）Ｎ末端由来の第５のアミノ酸がイソロイシンである、項目４に記載の抗体。
（項目６）
前記抗体がヒトである、項目１に記載の抗体。
（項目７）
前記抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、項目１に記載の抗体。
（項目８）
前記抗体のアミノ酸配列が、エフェクター機能を減少または変化させるように修飾された、項目１に記載の抗体。
（項目９）
前記アミノ酸配列が、配列番号５３のアミノ酸１１７またはアミノ酸１２０に対応する残基で修飾された、項目８に記載の抗体。
（項目１０）
前記抗体がＩｇＧ１λまたはＩｇＧ１κである、項目１に記載の抗体。
（項目１１）
項目１に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
（項目１２）
有効用量の項目１１に記載の薬学的組成物と投与する工程を含む、治療方法。
（項目１３）
前記薬学的組成物を、筋肉障害、神経筋障害、および骨変性障害から選択される障害の治療または防止が必要な哺乳動物に投与する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記薬学的組成物を、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋萎縮症、組織萎縮症、手根管症候群、鬱血性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、筋消耗症候群、および筋萎縮性側索硬化症から選択される障害の治療または防止が必要な哺乳動物に投与する、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記薬学的組成物をデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療または防止が必要な哺乳動物に投与する、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記薬学的組成物を、肥満症および脂肪組織障害から選択される障害の治療または防止が必要な哺乳動物に投与する、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記薬学的組成物を、Ｘ症候群、グルコース寛容減損、外傷誘導性インスリン抵抗性、および２型糖尿病から選択される障害の治療または防止が必要な哺乳動物に投与する、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記薬学的組成物を、２型糖尿病の治療または防止が必要な哺乳動物に投与する、項目１２に記載の方法。
（項目１９）
前記薬学的組成物を、肥満症の治療または防止が必要な哺乳動物に投与する、項目１２に記載の方法。
（項目２０）
前記薬学的組成物を、損傷した筋肉の修復が必要な哺乳動物に投与する、項目１２に記載の方法。
（項目２１）
前記損傷した筋肉が心筋である、項目２１に記載の方法。
（項目２２）
前記損傷した筋肉が横隔膜である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記抗体を、１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇから選択される有効用量で投与する、項目１２に記載の方法。
（項目２４）
項目１に記載の抗体をコードする単離核酸。
（項目２５）
項目２４に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目２６）
項目２５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目２７）
前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４７４１、ＰＴＡ−４７４０、またはＰＴＡ−４７３９のＥ．ｃｏｌｉである、項目２６に記載の宿主細胞。
（項目２８）
前記核酸が、配列番号ｎ（ｎは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、または２９である）のヌクレオチド配列を含む、項目２４に記載の核酸。
（項目２９）
ＧＤＦ−８と特異的に反応する抗体の作製方法において、
（ａ）置換すべきＣＤＲ３を含むかＣＤＲ３コード領域を欠く可変ドメインをコードする核酸の出発レパートリーを得る工程と
（ｂ）可変ドメインをコードする核酸の産物レパートリーを得るために前記レパートリー中のＣＤＲ３領域にドナ−核酸が挿入されるように前記レパートリーと実質的に配列番号ｎ（ｎは３１〜４８の整数である）に記載のアミノ酸配列をコードするドナ−核酸とを組み合わせる工程と
（ｃ）前記産物レパートリーの核酸を発現する工程と、
（ｄ）ＧＤＦ−８に特異的な特異的抗原結合フラグメントを選択する工程と、
（ｅ）前記特異的抗原結合フラグメントまたは前記結合フラグメントをコードする核酸を回収する工程とを含む、方法。
（項目３０）
項目２９に記載の方法によって産生された抗体。
（項目３１）
（ａ）項目１に記載の抗体およびＧＤＦ−８を含む第１の結合混合物を調製する工程と、
（ｂ）該第１の混合物中の該抗体と該ＧＤＦ−８との間の結合量を測定する工程と、
（ｃ）抗体、ＧＤＦ−８、試験化合物を含む第２の結合混合物を調製する工程と、
（ｄ）該第２の混合物中の該抗体と該ＧＤＦ−８との間の結合量を測定する工程とを含む、ＧＤＦ−８のインヒビターの同定方法。
（項目３２）
治療有効量の項目１に記載の抗体を哺乳動物に投与し、それにより筋肉の強度または量が増大する工程を含む、筋肉の強度または量を増大させる方法。
（項目３３）
前記抗体が、ＧＤＦ−８のＡｃｔＲＩＩＢへの結合を阻害することができる、ＧＤＦ−８に対する単離抗体。
（項目３４）
実質的に配列番号ｎ（ｎは、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８である）に記載のアミノ酸配列を含む、項目３３に記載の抗体。
（項目３５）
配列番号ｎ（ｎは、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８である）に記載のアミノ酸配列を含む、項目３３に記載の抗体。
（項目３６）
治療有効量の項目３３に記載の抗体を哺乳動物に投与し、それにより筋肉の強度が増大する工程を含む、筋肉の強度を増大させる方法。
（項目３７）
前記抗体が、ＢＭＰ−１１と特異的に結合することができる、項目３３に記載の抗体。
（項目３８）
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４７４１、ＰＴＡ−４７４０、またはＰＴＡ−４７３９のＥ．ｃｏｌｉを培養する工程と、抗体を回収する工程を含む、抗体の作製方法。
（項目３９）
Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、またはＭｙｏ２２のｓｖＦｖをコードする核酸を免疫グロブリンのＦｃ部分をコードする核酸と融合する工程と、細胞中で前記融合核酸を発現させる工程とをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）する工程を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
項目４０に記載の方法を使用して作製された抗体。
（項目４２）
配列番号５４に記載のアミノ酸配列によって特徴づけられたエピトープと特異的に結合することができる抗体。
（項目４３）
哺乳動物の筋肉、骨、またはグルコースホメオスタシスの少なくとも１つの障害の治療または防止のための薬物の調製のための項目１〜項目１０、項目３１、項目３４、項目３５、項目３６、項目３８、項目４１、および項目４２のいずれか１項に記載の抗体の使用。
（項目４４）
前記哺乳動物がヒトである、項目４３に記載の使用。
（項目４５）
前記障害が神経筋障害である、項目４３に記載の使用。
（項目４６）
前記障害が、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋萎縮症、組織萎縮症、手根管症候群、鬱血性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、筋消耗症候群、または筋萎縮性側索硬化症である、項目４３に記載の使用。
（項目４７）
前記障害が肥満症または脂肪組織障害である、項目４３に記載の使用。
（項目４８）
前記障害がＸ症候群、グルコース寛容減損、外傷誘導性インスリン抵抗性、または２型糖尿病である、項目４３に記載の使用。
（項目４９）
（ａ）筋肉損傷の修復、（ｂ）筋肉の量または強度の増大、および（ｃ）哺乳動物におけるグルコース耐性の増大の少なくとも１つのための薬物の調製のための項目１〜項目１０、項目３１、項目３４、項目３５、項目３６、項目３８、項目４１、および項目４２のいずれか１項に記載の抗体の使用。
（項目５０）
前記（ａ）の損傷した筋肉が、心筋または横隔膜である、項目４９に記載の使用。
（項目５１）
前記抗体を、１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇから選択される有効用量で投与する、項目４６〜５１のいずれか１項に記載の使用。
【００１４】
本発明の一定の実施形態は、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、またはＭｙｏ２２のＦｖフラグメントのＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。さらなる実施形態は、これらの任意のＶＨおよびＶＬドメインの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。他の実施形態は、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、またはＭｙｏ２２のＶＨドメインのＨ３フラグメントを含む。
【００１５】
他の態様は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物およびＧＤＦ−８の阻害または中和方法（ヒトまたは動物の治療方法が含まれる）でのその使用を提供する。本発明の抗体を使用して、筋組織または骨密度の増加が望ましい病態を治療または予防することができる。例えば、本発明で開示の抗体を、損傷した筋肉（例えば、心筋、横隔膜など）を修復する治療法で使用することができる。疾患および障害の例には、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィーが含まれる）；筋萎縮性側索硬化症；筋萎縮症；組織萎縮症；脆弱性；管症候群；鬱血性閉塞性肺疾患；サルコペニア，悪液質、および他の筋肉消耗症候群などの筋障害および神経筋障害；脂肪組織障害（例えば、肥満症）；２型糖尿病；耐糖能障害；代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）；外傷によるインスリン抵抗性（火傷または窒素不均衡など）；および骨変性疾患（例えば、変形性関節症および骨粗鬆症）が含まれる。
【００１６】
さらに、本発明で開示の抗体を、生体サンプル中のＧＤＦ−８またはそのフラグメントを定量的または定性的に検出するための診断ツ−ルとして使用することができる。ＧＤＦ−８の存在または検出量は、上記に列挙した１つまたは複数の医学的症状に相関し得る。
【００１７】
別の態様は、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、またはＭｙｏ２２のＦｖフラグメント由来のＶＨまたはＶＬドメインをコードする配列を含む単離核酸を提供する。任意の本発明で開示のＶＨおよびＶＬドメイン由来の少なくとも１つのＣＤＲをコードする配列を含む単離核酸も開示する。別の態様は、このような核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００１８】
さらに別の態様は、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、またはＭｙｏ２２の新規のＶＨおよびＶＬドメインおよび／またはＶＨおよび／またはＶＬドメイン由来のドメインの全てまたは一部を含む機能的抗体の産生方法を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる目的を以下の説明に一部記載し、且つこれらの一部は説明から明らかであるか、本発明の実施によって得ることができる。本発明の種々の目的、態様、および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘されている要素および組み合わせによって実現および達成される。
上記の一般的説明および以下の詳細な説明の両方は例示および説明のみを目的とし、特許請求の範囲のように本発明を制限しないと理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ビオチン化ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１がそれぞれ１５ｎｇ／ｍｌおよび４０ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０でＡｃｔＲＩＩＢ受容体と結合することを示す。
【図２】図２は、本発明のｓｃＦｖフラグメントによるＧＤＦ−８のＡｃｔＲＩＩＢ受容体への結合の阻害を示す。例示するように、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、およびＭｙｏ２２のｓｃＦｖのＩＣ５０は、それぞれ２．４ｎＭ、１．７ｎＭ、および６０ｎＭである。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、Ｍｙｏ２９の１０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１とのプレインキュベーションにより、ＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイにおいて０．２〜０．４ｎＭのＩＣ５０でＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１のＡｃｔＲＩＩＢへの結合を阻害することを示す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、Ｍｙｏ２９の１０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１とのプレインキュベーションにより、ＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイにおいて０．２〜０．４ｎＭのＩＣ５０でＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１のＡｃｔＲＩＩＢへの結合を阻害することを示す。
【図４Ａ】図４Ｂおよび４Ｃは、Ｍｙｏ２９を試験したｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２受容体遺伝子アッセイの結果を示す。図４Ａは、ベースライン条件（すなわち、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１、およびアクチビンによるレポーター遺伝子活性の誘導）を証明する。図４Ｂおよび４Ｃは、Ｍｙｏ２９により用量反応様式にて１５〜３０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０でＧＤＦ−８活性を減少し、ＢＭＰ−１１の生物活性を同一の程度に阻害することを示す。図４Ｄは、このアッセイではＭｙｏ２９がアクチビン活性に影響を与えないことを例示する。
【図４Ｂ】図４Ｂおよび４Ｃは、Ｍｙｏ２９を試験したｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２受容体遺伝子アッセイの結果を示す。図４Ａは、ベースライン条件（すなわち、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１、およびアクチビンによるレポーター遺伝子活性の誘導）を証明する。図４Ｂおよび４Ｃは、Ｍｙｏ２９により用量反応様式にて１５〜３０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０でＧＤＦ−８活性を減少し、ＢＭＰ−１１の生物活性を同一の程度に阻害することを示す。図４Ｄは、このアッセイではＭｙｏ２９がアクチビン活性に影響を与えないことを例示する。
【図４Ｃ】図４Ｂおよび４Ｃは、Ｍｙｏ２９を試験したｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２受容体遺伝子アッセイの結果を示す。図４Ａは、ベースライン条件（すなわち、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１、およびアクチビンによるレポーター遺伝子活性の誘導）を証明する。図４Ｂおよび４Ｃは、Ｍｙｏ２９により用量反応様式にて１５〜３０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０でＧＤＦ−８活性を減少し、ＢＭＰ−１１の生物活性を同一の程度に阻害することを示す。図４Ｄは、このアッセイではＭｙｏ２９がアクチビン活性に影響を与えないことを例示する。
【図４Ｄ】図４Ｂおよび４Ｃは、Ｍｙｏ２９を試験したｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２受容体遺伝子アッセイの結果を示す。図４Ａは、ベースライン条件（すなわち、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１、およびアクチビンによるレポーター遺伝子活性の誘導）を証明する。図４Ｂおよび４Ｃは、Ｍｙｏ２９により用量反応様式にて１５〜３０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０でＧＤＦ−８活性を減少し、ＢＭＰ−１１の生物活性を同一の程度に阻害することを示す。図４Ｄは、このアッセイではＭｙｏ２９がアクチビン活性に影響を与えないことを例示する。
【図５】図５は、Ｍｙｏ２２、Ｍｙｏ２８、およびＭｙｏ２９のエピトープマッピングの結果を示す。Ｍｙｏ２９のエピトープを、成熟ＧＤＦ−８のアミノ酸７２からアミノ酸８８までをマッピングし、Ｍｙｏ２２については、アミノ酸１からアミノ酸４４までをマッピングし、Ｍｙｏ２８については、アミノ酸１からアミノ酸９８までをマッピングした。
【図６】図６は、Ｍｙｏ２９エピトープの置換分析の結果を示す。成熟ＧＤＦ−８中の残基Ｌｙｓ−７８、Ｐｒｏ−８１、およびＡｓｎ−８３は、Ｍｙｏ２９のＧＤＦ−８への結合に重要なようである。
【図７】図７は、Ｍｙｏ２９およびＭｙｏ２８を使用して実施した免疫沈降実験の結果を示す。３５Ｓ−メチオニン／システインで放射性標識したＧＤＦ−８を発現するＣＨＯ細胞由来の馴化培地を、Ｍｙｏ２９またはＭｙｏ２８での免疫沈降に供した。次いで、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって免疫沈降物を分析した。ゲル上のバンドを、成熟ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−８プロペプチド、および非プロセシングＧＤＦ−８と同定した。
【図８】図８は、Ｍｙｏ２９の単回静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）投与として１ｍｇ／ｋｇの用量をＣ５７Ｂ６／ＳＣＩＤマウスに投与する薬物動態学研究の結果を示す。Ｍｙｏ２９は、約１週間の長期末端半減期および約１ｍｌ／時間／ｋｇの低クリアランスを示す。ＩＰ注射後に吸収された画分は約７７％である。
【図９】図９は、種々の用量のＭｙｏ２９（６０、１０、および１ｍｇ／ｋｇ）または賦形剤（ＰＢＳ）で毎週処置した雄Ｃ５７Ｂ６／ＳＣＩＤマウスにおける大腿四頭筋量の比較を示す。１０および６０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで４週間のＭｙｏ２９での処置により、筋肉量がそれぞれ１９％および２３％統計的に有意に増加する。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、種々の用量のＭｙｏ２９（１０、５、２．５、および１ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで４週間毎週処置した雌ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにおける腓腹筋量および大腿四頭筋量を示す。筋肉量は、賦形剤コントロールと比較してＭｙｏ２９で処置したマウスで１０％〜２０％増加する。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、種々の用量のＭｙｏ２９（１０、５、２．５、および１ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで４週間毎週処置した雌ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにおける腓腹筋量および大腿四頭筋量を示す。筋肉量は、賦形剤コントロールと比較してＭｙｏ２９で処置したマウスで１０％〜２０％増加する。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、種々の用量のＭｙｏ２９（１０、５、２．５、および１ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで１２週間毎週処置した雌ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにおける腓腹筋量および大腿四頭筋量をそれぞれ示す。Ｍｙｏ２９で処置したマウスの筋肉量は１２％〜２８％の範囲で増加する。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、種々の用量のＭｙｏ２９（１０、５、２．５、および１ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで１２週間毎週処置した雌ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにおける腓腹筋量および大腿四頭筋量をそれぞれ示す。Ｍｙｏ２９で処置したマウスの筋肉量は１２％〜２８％の範囲で増加する。
【図１２】図１２は、Ｍｙｏ２９（１０および５ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで１２週間毎週処置した雌ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにおける握力計によって測定した前肢の筋肉の強度を示す。前肢強度は、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＭｙｏ２９で処置したマウスでそれぞれ１７％および２３％増加する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（詳細な説明）
（１．定義）
本明細書中で使用される、用語「抗体」は、免疫グロブリンまたはその一部をいい、その供給源、起源となる種、産生方法、および特徴と無関係に抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む。非限定的な例として、用語「抗体」には、ヒト、オランウータン、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、およびニワトリの抗体が含まれる。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体、非特異性抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、およびＣＤＲグラフティング抗体が含まれるが、これらに限定されない。本発明の目的のために、他で記載しない限り、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなどの抗体フラグメントおよび抗原結合機能を保持した他の抗体フラグメントも含まれる。
【００２２】
抗体を、例えば、伝統的なハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９９）、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを使用したファージディスプレイ技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７）によって作製することができる。種々の他の抗体産生技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ
ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。
【００２３】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部または全部と特異的に結合するか相補的である領域を含む抗体分子の一部をいう。抗原が巨大な場合、抗体は抗原の特定の部分のみと結合することができる。「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体の抗原結合ドメインとの特異的相互作用を担う抗原分子の一部である。１つまたは複数の抗体可変ドメイン（例えば、いわゆるＶＨドメインからなるＦｄ抗体フラグメント）によって抗原結合ドメインを得ることができる。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００２４】
用語「レパートリー」は、発現した免疫グロブリンをコードする配列の全体または一部に由来するヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）配列の遺伝的に多様な集団をいう。例えば、Ｈ鎖についてはＶ、Ｄ、およびＪセグメント、Ｌ鎖についてはＶおよびＪセグメントのｉｎ  ｖｉｖｏ再編成によって配列を作製する。あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激および再編成が起こる応答によって細胞株から配列を作製することができる。あるいは、例えば、非再編成ＶセグメントとＤおよびＪセグメントとの組み合わせ、ヌクレオチド合成、無作為化変異誘発、および米国特許第５，５６５，３３２号に開示の他の方法によって配列の一部または全部を得ることができる。
【００２５】
用語「特異的相互作用」または「特異的に結合する」などは、２つの分子が生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成することを意味する。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが多数の抗原によって保有される特定のエピトープに特異的である場合に適用可能であり、この場合、抗原結合ドメインを保有する抗体はエピトープを保有する種々の抗原に結合することができる。したがって、抗体は、例えば、その両方が保有するエピトープに結合する限り、ＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８と特異的に結合することができる。
【００２６】
高親和性および低〜中程度の能力によって特異的結合を特徴づける。非特異的結合は、通常、親和性が低く、中程度から高い能力を有する。典型的には、親和性定数Ｋａが１０６Ｍ−１より高い、好ましくは１０８Ｍ−１より高い場合、結合は特異的と見なされる。必要に応じて、結合条件の変化によって実質的に特異的結合に影響を与えることなく非特異的結合を減少させることができる。このような条件は当該分野で公知であり、当業者は日常的技術を使用して適切な条件を選択することができる。条件は、通常、抗体濃度、溶液のイオン強度、温度、結合時間、非関連分子（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などに関して定義される。条件の例を、実施例４、７、および１０に示す。
【００２７】
句「実質的に記載の」は、関連するＣＤＲ、ＶＨ、またはＶＬドメインが記載の配列の特定の領域と同一であるか類似性が高いことを意味する。例えば、このような置換には、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、またはＬ３）の配列中の任意の５個のアミノ酸のうちの１個または２個が含まれる。
【００２８】
用語「ＴＧＦ−βスーパーファミリー」は、構造的に関連した成長因子のファミリ−をいう。関連する成長因子のこのファミリ−は、当該分野で周知である（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ
ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，８：１３３−１４６；Ｈｏｏｄｌｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２８：２３５−７２）。ＴＧＦ−βスーパーファミリーには、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、インヒビン、ミューラー阻害物質、グリア由来の神経栄養因子、以前として増加している成長分化因子（ＧＤＦ）（ＧＤＦ−８（ミオスタチン）など）が含まれる。多数のこのようなタンパク質は、構造的および／または機能的にＧＤＦ−８と関連する。例えば、ＧＤＦ−１１としても公知のヒトＢＭＰ−１１は、アミノ酸レベルでＧＤＦ−８と９０％同一である（Ｇａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０８，２２２−２３２；Ｎａｋｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，８０：１８５−１８９）。
【００２９】
用語「ＧＤＦ−８」は、特異的な成長分化因子−８をいい、必要に応じて、ＧＤＦ−８と構造的または機能的に関連する因子（例えば、ＢＭＰ−１１およびＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する他の因子）をいう。この用語は、ＧＤＦ−８の全長非プロセシング前駆体形態ならびに翻訳後切断に起因する成熟およびプロペプチド形態をいう。この用語はまた、本明細書中で考察された成熟ＧＤＦ−８に関連する少なくともいくつかの生物活性を保持するＧＤＦ−８の任意のフラグメントおよび変異型（修飾された配列が含まれる）をいう。成熟ヒトＧＤＦ−８のアミノ酸配列を、配列番号４９に提供する。本発明は、全ての脊椎動物種（ヒト、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚類が含まれるが、これらに限定されない）由来のＧＤＦ−８に関する（配列情報については、例えば、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：１２４５７−１２４６１を参照のこと）。
【００３０】
用語「成熟ＧＤＦ−８」は、ＧＤＦ−８前駆体タンパク質のカルボキシル末端ドメインから切断したタンパク質をいう。成熟ＧＤＦ−８は、単量体、ホモ二量体として存在するか、ＧＤＦ−８潜在複合体中に存在し得る。条件によって、成熟ＧＤＦ−８は、任意または全てのこれらの異なる形態の間で平衡になり得る。その生物活性形態では、成熟ＧＤＦ−８は、「活性ＧＤＦ−８」ともいう。
【００３１】
用語「ＧＤＦ−８プロペプチド」は、ＧＤＦ−８前駆体タンパク質のアミノ末端ドメインから切断されたポリペプチドをいう。ＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８上のプロペプチド結合ドメインと結合することができる。
【００３２】
用語「ＧＤＦ−８潜在複合体」は、成熟ＧＤＦ−８ホモ二量体とＧＤＦ−８プロペプチドとの間で形成されたタンパク質複合体をいう。２つのＧＤＦ−８プロペプチドがホモ二量体中の成熟ＧＤＦ−８の２分子と会合して不活性四量体複合体を形成すると考えられている。潜在複合体は、１つまたは複数のＧＤＦ−８プロペプチドの代わりまたはそれに加えて他のＧＤＦ−８インヒビターを含み得る。
【００３３】
用語「ＧＤＦ−８活性」は、活性ＧＤＦ−８タンパク質に関連する１つまたは複数の生理学的成長調節活性または形態形成活性をいう。例えば、活性ＧＤＦ−８は、骨格筋量の負のレギュレーターである。活性ＧＤＦ−８はまた、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生を調整し、筋芽細胞増殖を刺激し、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を調整することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＤＦ−８活性の測定手順の例を、実施例２、３、６、および１３に記載する。
【００３４】
用語「ＧＤＦ−８インヒビター」には、ＧＤＦ−８の活性、発現、プロセシング、または分泌を阻害することができる任意の薬剤が含まれる。このようなインヒビターには、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣物、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、およびＧＤＦ−８を特異的に阻害する他の小分子が含まれる。このようなインヒビターは、ＧＤＦ−８の生物活性を「阻害」、「中和」、または「減少」すると言われる。
【００３５】
用語「中和する」、「中和」、「阻害」、およびその同族語は、ＧＤＦ−８インヒビターの非存在下でのＧＤＦ−８活性と比較したＧＤＦ−８インヒビターによるＧＤＦ−８活性の減少をいう。活性の減少は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。
【００３６】
用語「治療」は、本明細書中の用語「治療方法」と交換可能に使用され、治療上の処置および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）／予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。治療を必要とする者には、特定の内科的疾患を既に罹患している個体および最終的に障害を獲得し得る個体（すなわち、予防手段を必要とする個体）が含まれ得る。
【００３７】
用語「単離された」は、その天然の環境を実質的に含まない分子をいう。例えば、単離タンパク質は、そのタンパク質が由来する細胞もしくは組織供給源由来の細胞物質または他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、単離タンパク質が治療組成物としての投与のために十分に純粋であるか、純度が少なくとも７０％〜８０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも８０％〜９０％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは純度が９０〜９５％、最も好ましくは純度が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）である調製物をいう。
【００３８】
用語「哺乳動物」は、哺乳動物として分類された任意の動物（ヒト、家畜、動物園の動物、競技用動物、またはペット動物（イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなど）が含まれる）をいう。
【００３９】
用語「有効用量」または「有効量」は、患者の症状を改善するか所望の生物学的結果（例えば、骨格筋量および／または骨密度の増加）が得られる化合物の量をいう。このような量は、骨格筋量および骨密度の負の制御に関連するＧＤＦ−８活性の減少に十分なはずである。以下の節に記載のように有効量を決定することができる。
【００４０】
（ＩＩ．ＧＤＦ−８に対する抗体および抗原結合フラグメント）
Ａ．ヒト抗体Ｍｙｏ２８、Ｍｙｏ２９、およびＭｙｏ２２
本開示は、ＧＤＦ−８に対する新規の抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。このような抗体の非限定的な実施形態を、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、およびＭｙｏ２２と呼ぶ。これらの例示的実施形態を、ヒトＩｇＧ１抗体の形態で提供する。
【００４１】
本発明の抗体は、固有且つ有益な特徴を有する。第１に、これらの抗体は、高親和性で成熟ＧＤＦ−８と結合することができる。第２に、本発明の抗体は、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ結合の阻害およびレポーター遺伝子アッセイによって証明されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ−８活性を阻害することができる。本発明の抗体はまた、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ結合の阻害およびレポーター遺伝子アッセイによって証明されるように、ＢＭＰ−１１に特異的に結合し、そして／またはその活性を阻害することができる。第３に、本開示の抗体は、骨格筋量および骨密度の負の制御に関連するＧＤＦ−８活性を阻害することができる。
【００４２】
例示的実施形態では、本発明に開示の抗体は、ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１の両方に特異的に結合することができる。抗体は他のタンパク質（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するもの（ミューラー阻害物質、グリア由来の神経栄養因子など）またはＧＤＦ−８以外の成長分化因子）とも反応することができることが意図される。一定の実施形態では、Ｍｙｏ２９は、配列番号４９のアミノ酸７２〜８８と同一の配列を含むタンパク質と反応する。さらなる実施形態では、Ｍｙｏ２９は、配列Ｌｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ａｓｎ（配列番号５４）（式中、Ｘａａ１，Ｘａａ２，およびＸａａ３はそれぞれ任意のアミノ酸である）を含むタンパク質と結合する。さらなる実施形態では、少なくとも１つの以下の条件を満たす：（１）Ｘａａ１  ＝  Ｍｅｔ、（２）Ｘａａ２＝Ｓｅｒ、および（３）Ｘａａ３  ＝  Ｉｌｅ（全て互いに独立している）。他の実施形態では、Ｍｙｏ２２は、成熟ＧＤＦ−８配列中の最初の４４個のＮ末端アミノ酸（配列番号４９のアミノ酸１〜４４）内のエピトープを認識する。
【００４３】
当業者は、本発明の抗体を使用して、上記と異なるタンパク質を検出、測定、および阻害することができると認識する。一般に、本発明の抗体を、配列番号４９に記載のＧＤＦ−８の成熟形態の配列中の少なくとも１００個、８０個、６０個、４０個、または２０個の連続するアミノ酸の任意の配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上同一である配列を含む任意のタンパク質とともに使用することができる。このようなタンパク質の非限定的な例には、本明細書中に記載の種々の種由来のＧＤＦ−８配列が含まれる。標準的なアラインメントアルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ
ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ
ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７のアルゴリズムなど）によって同一率を決定する。
【００４４】
Ｂ．可変ドメイン
免疫グロブリンとしても公知のインタクトな抗体は、典型的には、それぞれ約２５ｋＤａの２つの軽鎖（Ｌ）およびそれぞれ約５０ｋＤａの２つの重鎖（Ｈ）から構成される四量体のグリコシル化タンパク質である。λおよびκと呼ばれる２つの軽鎖型が抗体中で見いだされる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを以下の５つの主なクラス（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭ）に割り当てることができ、これらのいくつかをサブクラス（イソ型）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）にさらに分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元高次構造は当該分野で周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８を参照のこと。簡単に述べれば、各軽鎖は、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）から構成される。各重鎖は、Ｎ末端Ｖドメイン、３つまたは４つのＣドメイン、およびヒンジ領域から構成される。ＶＨドメインに最も近いＣＨドメインを、ＣＨ１と命名する。ＶＨおよびＶＬドメインは、超可変配列（相補性決定領域、ＣＤＲ）の３つの領域のための足場を形成するフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と呼ばれる比較的保存された配列の４つの領域からなる。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を担うほとんどの残基を含む。ＣＤＲを、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３という。したがって、重鎖上のＣＤＲ構成要素を、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３といい、軽鎖上のＣＤＲ構成要素を、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３という。ＣＤＲ３は、抗体結合部位内の分子多様性の最も巨大な供給源である。例えば、Ｈ３は、２アミノ酸残基ほどの短さであり得るか、２６個より長くあり得る。最も小さな抗原結合フラグメントは、ＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖである。Ｆａｂフラグメント（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）は、定常領域間のジスルフィド結合によって共有結合したＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬドメインからなる。宿主細胞中で同時発現した場合にＦｖ中の非共有結合したＶＨドメインとＶＬドメインとが解離する傾向を克服するために、可動性があり且つ適切な長さのポリペプチドによりＶＨのＣ末端がＶＬのＮ末端と結合するかＶＬのＣ末端がＶＨのＮ末端と結合するいわゆる単鎖（ｓｃ）Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）を構築することができる。最も一般的に使用されているリンカーは、１５残基の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドであったが、他のリンカーも当該分野で公知である。
【００４５】
可変領域をコードする複数の生殖系列遺伝子および種々の体細胞事象の使用によって抗体が多様化する。体細胞事象には、完全なＶＨ領域を作製するための多様性（Ｄ）遺伝子セグメントおよび連結（Ｊ）遺伝子セグメントでの可変遺伝子セグメントの組換えならびに完全なＶＬ領域を作製するための可変遺伝子セグメントおよび連結遺伝子セグメントの組換えが含まれる。組換えプロセス自体の不正確さにより、Ｖ（Ｄ）Ｊ連結点でアミノ酸が喪失または付加される。これらの多様性の機構は、抗原曝露前の発達中のＢ細胞で起こる。抗原刺激後、Ｂ細胞中の発現抗体遺伝子は体細胞変異を受ける。予測生殖系列遺伝子セグメント数、これらのセグメントのランダム組換え、およびランダムＶＨ−ＶＬ対合に基づいて、１．６×１０７個までの異なる抗体を産生することができる（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３）。抗体多様性に寄与する他のプロセス（体細胞変異など）を考慮した場合、１×１０１０個以上の異なる抗体を作製することができると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。抗体多様性の作製に関与する多数のプロセスにより、同一の抗原特異性を有する独立して誘導されたモノクローナル抗体が同一のアミノ酸配列を有する可能性は低い。
【００４６】
したがって、本発明は、さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリー由来の新規のＣＤＲを提供する。本発明のＣＤＲを保有するための構造は、一般に、天然に存在するＶＨおよびＶＬのＣＤＲに対応する位置にＣＤＲが存在する抗体重鎖配列もしくは軽鎖配列またはその実質的部分である。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ｅｄｓ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１に記載のように決定することができる。
【００４７】
本発明に開示された抗体のＤＮＡおよびアミノ酸（ＡＡ）配列、そのｓｃＦｖフラグメント、ＶＨおよびＶＬドメイン、ならびにＣＤＲを配列表に記載し、表１に列挙する。便宜上、ＶＨおよびＶＬドメイン内の各ＣＤＲの位置を表２に列挙する。ＶＨおよびＶＬドメインを除く重鎖および軽鎖の配列は、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、およびＭｙｏ２２で同一である。
【００４８】
【表１】
2010148513.tif 000002
【００４９】
【表２】
2010148513.tif 000003
本発明で開示された抗体は、抗体定常領域またはその一部をさらに含み得る。例えば、ＶＬドメインのそのＣ末端を、抗体軽鎖定常ドメイン（ヒトＣκ鎖またはＣλ鎖が含まれ、好ましくはＣλ鎖）に結合させることができる。同様に、ＶＨドメインに基づいた特異的抗原結合フラグメントのそのＣ末端に、任意の抗体イソ型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ）および任意のイソ型サブクラス（特に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４）由来の免疫グロブリン重鎖の全部または一部を結合させることができる。例示的実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１λのＣ末端フラグメントの重鎖および軽鎖を含む。軽鎖λのＣ末端フラグメントのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５０および配列番号５１に記載する。ＩｇＧ１重鎖のＣ末端フラグメントのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５２および配列番号５３に記載する。
【００５０】
本発明の一定の実施形態は、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、またはＭｙｏ２２のＦｖフラグメントのＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。さらなる実施形態は、任意のこれらのＶＨおよびＶＬドメインの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。１つの実施形態は、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、またはＭｙｏ２２のＶＨドメインのＨ３フラグメントを含む。一定の実施形態では、本発明のＶＨおよびＶＬドメインは、生殖系列化されている（すなわち、これらのドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）が、ヒト生殖系列遺伝子産物のコンセンサスアミノ酸配列に適合するように従来の分子生物学技術を使用して変化している）。他の実施形態では、フレームワーク配列は、生殖系列と異なったままである。
【００５１】
Ｃ．修飾抗体およびそのフラグメント
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ−８に特異的な抗体抗原結合ドメインを得る方法を提供する。当業者は、本発明の抗体が表１に記載のＶＨおよびＶＬの特異的配列に限定されず、抗原結合能力を保持するこれらの配列の変異型も含まれることを認識する。このような変異型は、当該分野で公知の技術を使用して提供した配列に由来し得る。ＦＲまたはＣＤＲのいずれかのアミノ酸を、置換、欠失、または付加することができる。通常、抗体の安定性を改良して免疫原性を減少させるようにフレームワーク領域の変化をデザインする一方で、通常、抗体のその標的に対する親和性を増大させるようにＣＤＲの変化をデザインする。このような親和性が増大する変化を、典型的に、ＣＤＲ領域の変更および抗体の試験によって経験的に決定する。このような変更を、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ．ｅｄ．，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載の方法にしたがって行うことができる。
【００５２】
本明細書中に記載のＶＨドメインのアミノ酸配列変異型であるＶＨドメインの作製方法は、本明細書中に開示のＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸を付加、欠失、置換、または挿入する工程と、任意選択的にこのようにして得られたＶＨドメインと１つまたは複数のＶＬドメインと組み合わせる工程と、ＧＤＦ−８への特異的結合についてＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬ組み合わせを試験する工程と、任意選択的にこのような抗原結合ドメインがＧＤＦ−８活性を中和する能力を試験する工程とを含む。ＶＬドメインは、実質的に本明細書中に記載のアミノ酸配列を有し得る。
【００５３】
本明細書中に開示のＶＬドメインの１つまたは複数の配列変異型を１つまたは複数のＶＨドメインと組み合わせた類似の方法を使用することができる。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、ＧＤＦ−８と特異的に反応する抗原結合フラグメントの調製方法を提供する。この方法は、
（ａ）置換すべきＣＤＲ３を含むかＣＤＲ３コード領域を欠くＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを得る工程と、
（ｂ）ＶＨドメインをコードする核酸の産物レパートリーを得るためにレパートリー中のＣＤＲ３領域にドナー核酸が挿入されるように前記レパートリーと実質的に本明細書中に記載のＶＨＣＤＲ３（すなわち、Ｈ３）のアミノ酸配列をコードするドナー核酸とを組み合わせる工程と、
（ｃ）前記産物レパートリーの核酸を発現する工程と、
（ｄ）ＧＤＦ−８に特異的な特異的抗原結合フラグメントを選択する工程と、
（ｅ）前記特異的抗原結合フラグメントまたはこれをコードする核酸を回収する工程とを含む。
【００５５】
さらに、本発明のＶＬＣＤＲ３（すなわち、Ｌ３）を置換すべきＣＤＲ３を含むかＣＤＲ３コード領域を欠くＶＬドメインをコードする核酸レパートリーと組み合わせた類似の方法を使用することができる。
【００５６】
本発明のコード配列ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＤＮＡテクノロジ−を使用してＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリーに移入することができる。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０：７７９−７８３）は、可変ドメイン領域の５’末端に指向するか隣接するコンセンサスプライマーをヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと組み合わせて使用してＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーが得られる、抗体可変ドメインのレパートリーの産生方法を記載している。レパートリーを、特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせることができる。類似の技術を使用して、本発明のＣＤＲ３由来の配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーで組み替え（ｓｈｕｆｆｌｅ）、組み替えられた完全なＶＨまたはＶＬドメインを同族ＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて本発明の特異的抗原結合フラグメントを得ることができる。次いで、適切な抗原結合フラグメントを選択することができるように、レパートリーを、ＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイ系などの適切な宿主系にディスプレイすることができる。
【００５７】
類似の組み替えまたは組替え技術は、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３８９−３９１）によっても開示されており、これはβ−ラクタマーゼ遺伝子に関する技術を記載しているが、このアプローチを抗体作製のために使用することができる。
【００５８】
さらなる代替法は、全可変ドメイン内に変異を作製するための１つまたは複数の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を使用した本発明のＣＤＲ由来の配列を保有する新規のＶＨまたはＶＬ領域を作製することである。このような技術は、変異性ＰＣＲを使用したＧｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：３５７６−３５８０）に記載されている。
【００５９】
使用することができる別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対する直接的変異誘発である。このような技術は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）９１：３８０９−３８１３）およびＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６３：５５１−５６７）に開示されている。
【００６０】
同様に、１つまたは複数または３つ全てのＣＤＲをＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーにグラフティングし、その後ＧＤＦ−８に特異的な特異的結合パートナーまたは結合フラグメントについてスクリーニングすることができる。
【００６１】
免疫グロブリン可変ドメインの実質的部分は、少なくともＣＤＲ領域および選択的に本明細書中に記載のｓｃＦｖフラグメント由来の介在フレームワーク領域を含む。この部分はまた、少なくとも約５０％のＦＲ１およびＦＲ４のいずれかまたは両方（５０％はＦＲ１のＣ末端の５０％であり、５０％はＦＲ４のＮ末端のである）を含む。可変ドメインの実質的部分のＮ末端またはＣ末端のさらなる残基は、通常は天然に存在する可変ドメイン領域に関連しない残基であり得る。例えば、組換えＤＮＡ技術によって作製された本発明の特異的抗原結合フラグメントの構築によって、導入されたリンカーによってコードされるＮ末端またはＣ末端残基が導入されて、クローニングまたは他の操作工程を容易にすることができる。他の操作工程は、本発明の可変ドメインを免疫グロブリン重鎖を含むさらなるタンパク質配列、（例えば、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）の産生における）他の可変ドメイン、または以下により詳細に記載したタンパク質標識に連結するためのリンカーの導入を含む。
【００６２】
実施例に例示の実施形態はＶＨおよびＶＬドメインの「マッチング」対を含んでいるが、本発明は、ＶＨまたはＶＬドメイン配列のいずれか（特に、ＶＨドメイン）由来の１つの可変ドメインを含む結合フラグメントも含む。一本鎖特異的結合ドメインのいずれかの場合、これらのドメインを使用して、ＧＤＦ−８に結合することができる２ドメイン特異的抗原結合ドメインを形成することができる相補性ドメインについてスクリーニングすることができる。ＨまたはＬ鎖クローンのいずれかを含む各コロニーを使用して他の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーに感染させ、ＷＯ９２／０１０４７に開示されるファージディスプレイ技術などにしたがって、得られた二鎖特異的抗原結合ドメインを選択する、ＷＯ９２／０１０４７に開示のいわゆる階層的二重組み合わせアプローチを使用したファージディスプレイスクリーニング法によってこれを行うことができる。この技術は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａにも開示されている。
【００６３】
放射性核種、薬物、高分子、または他の薬剤を使用した化学的方法によって抗体を抱合することができるか、１つまたは複数の本発明のＣＤＲを含む融合タンパク質として作製することができる。
【００６４】
抗体融合タンパク質は、ＶＨ−ＶＬ対を含み、これらの鎖の１つ（通常ＶＨ）および別のタンパク質を１つのポリペプチド鎖として合成する。これらの産物型は、一般にさらなる機能的エレメント（小分子の活性部分）を有するかまたは抱合または融合高分子の主な分子構造の特徴を有するという点で抗体と異なる。
【００６５】
上記概説のアミノ酸配列の変化に加えて、抗体を、グリコシル化するか、ペグ化するか、アルブミンもしくは非タンパク質性ポリマーに結合させることができる。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に記載の様式で、本発明で開示の抗体を、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンなどの種々の非タンパク質性ポリマーの１つに結合させることができる。例えば、循環半減期を増大させるために、ポリマーへの共有結合による抱合によって、抗体を化学修飾する。典型的なポリマーおよびポリマーのペプチドへの結合方法は、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号；および同第４，６０９，５４６号にも示されている。
【００６６】
他の実施形態では、グリコシル化パターンが変化するように（すなわち、元のまたは天然のグリコシル化パターンと異なる）抗体を修飾することができる。本明細書中で使用される、「変化した」は、１つまたは複数の炭水化物部分の欠失および／または元の抗体への１つまたは複数のグリコシル化部位の付加を意味する。グリコシル化部位のコンセンサス配列を含めるためのアミノ酸配列の変化によって達成された本発明で開示の抗体へのグリコシル化部位の付加は当該分野で周知である。抗体上の炭水化物部分の数の別の増加方法は、抗体のアミノ酸残基へのグリコシドの化学的または酵素的結合によるものである。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２５９−３０６に記載されている。Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２；Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１；およびＴｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０に記載のように、抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去を化学的または酵素的に行うことができる。  
【００６７】
本発明の抗体を、検出可能な標識または機能的標識でタグ化することもできる。検出可能な標識には、当該分野で公知の従来の化学的性質を使用して本発明の抗体に結合することができる１３１Ｉまたは９９Ｔｃなどの放射性標識が含まれる。標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ−ゼなどの酵素標識も含まれる。標識には、さらに、特異的同族検出可能部分（例えば、標識ビオチン）への結合を介して検出することができるビオチンなどの化学的部分が含まれる。
【００６８】
ＣＤＲ配列が配列番号ｎ（ｎは、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、また４８である）に記載のＣＤＲ配列と非本質的にのみ異なる抗体は、本発明の範囲内に含まれる。非実質的相違には、ＣＤＲ配列中の任意の５個のアミノ酸のうちの１個または２個の置換などのアミノ酸の小さな変化が含まれる。典型的には、アミノ酸を、類似の電荷、疎水性、または立体化学的性質を有する関連アミノ酸と置換する。このような置換は、当業者の範囲内である。ＣＤＲ中と異なり、抗体の結合特性に悪影響を与えることなく構造フレームワーク領域（ＦＲ）中のより実質的な変化を行うことができる。ＦＲの変化には、非ヒト由来のフレームワークのヒト化または抗原接触または結合部位の安定化に重要な一定のフレームワーク残基の操作（例えば、定常領域のクラスまたはサブクラスの変化、Ｆｃ受容体結合などのエフェクター機能を変化させることができる特異的アミノ酸残基の変化（Ｌｕｎｄ  ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎ ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９−３２４）、または定常領域が由来する種の変化）が含まれるが、これらに限定されない。抗体は、重鎖のＣＨ２領域にエフェクター機能が低下または変化する（例えば、Ｆｃ受容体結合および補体活性化）変異を有し得る。例えば、抗体は、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号などに記載の変異を有し得る。例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２重鎖では、ＩｇＧ１のＦｃ部分を示す配列番号５３のアミノ酸残基１１７および１２０にこのような変異を作製することができる（これらの残基は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の全長配列中のアミノ酸２３４および２３７に相当する）。抗体は、免疫グロブリンの２つの重鎖の間のジスルフィド結合を安定化する変異（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８に開示のＩｇＧ４のヒンジ領域の変異など）も有し得る。
【００６９】
Ｄ．核酸、クローニング系、および発現系
本発明は、さらに、本発明の抗体または結合フラグメントをコードする単離核酸を提供する。本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができ、且つ全体または部分的に合成であり得る。本明細書中に記載のヌクレオチド配列の基準は、特定の配列を有するＤＮＡ分子を含み、且つ、他で特記しない限り、ＴがＵに置換された特定の配列を有するＲＮＡ分子を含む。
【００７０】
本発明の核酸は、本明細書中に記載の本発明のＣＤＲまたはＶＨもしくはＶＬドメインのコード配列を含む。
【００７１】
本発明はまた、上記の、少なくとも１つの本発明の核酸を含むプラスミド、ベクター、転写もしくは発現カセットの形態の構築物を提供する。
【００７２】
本発明はまた、上記の１つまたは複数の構築物を含む宿主細胞を提供する。コードされた産物の産生方法と同様に、本明細書中に提供する任意のＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、またはＬ３）、ＶＨもしくはＶＬドメイン、または特異的抗原結合フラグメントをコードする核酸は、本発明の態様を形成する。この方法は、コード核酸からの発現を含む。核酸を含む組換え宿主細胞の適切な条件下での培養によって発現させることができる。発現による産生後、ＶＨもしくはＶＬドメイン、または特異的抗原結合フラグメントを、任意の適切な技術を使用して単離および／または精製し、必要に応じて使用することができる。
【００７３】
本発明の特異的抗原結合フラグメント、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびにコード核酸分子およびベクターを、例えば、その天然の環境から単離および／または精製するか、実質的に純粋もしくは均一な形態で提供するか、核酸の場合、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の元の核酸または遺伝子を含まないか実質的に含まずに提供することができる。
【００７４】
種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング系および発現系が周知である。適切な宿主細胞には、細菌系、哺乳動物細胞系、ならびに酵母およびバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチド発現のために当該分野で利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、および多くの他の細胞が含まれる。一般的な細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。抗体産生に適切な細胞については、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｅｄｓ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと。本発明に適合する任意の細胞を本発明で開示の抗体の産生に使用することができる。
【００７５】
適切な調節配列（プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じて他の配列が含まれる）を含む適切なベクターを選択または構築することができる。必要に応じて、ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクター（例えば、ファージまたはファージミド）であり得る。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質分析における核酸操作のための多数の公知の技術およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。
【００７６】
したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書中に開示の核酸を含む宿主細胞を提供する。なおさらなる態様は、このような核酸を宿主細胞に導入する工程を含む方法を提供する。導入は、任意の利用可能な技術を使用することができる。真核細胞のための適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソ−ム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス（例えば、ワクシニアまたは昆虫細胞についてはバキュロウイルス）を使用した形質導入が含まれ得る。細菌細胞のための適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用したトランスフェクションが含まれ得る。
【００７７】
移入後に、例えば、遺伝子発現条件下での宿主細胞の培養によって核酸から発現させることができる。
【００７８】
Ｅ．微生物寄託
非生殖系列化ｓｃＦｖのＭｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、またはＭｙｏ２２をコードするファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ６でそれぞれ形質転換したＥ．ｃｏｌｉ培養物を、２００２年１０月２日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にそれぞれ受託番号ＰＴＡ−４７４１、ＰＴＡ−４７４０、およびＰＴＡ−４７３９で寄託した。寄託機関の住所は、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０，Ｕ．Ｓ．Ａ．である。
【００７９】
（ＩＩ．疾患の治療方法および他の用途）
本発明の抗体は、ヒトまたは動物の種々の内科的疾患の予防、診断、または治療に有用である。抗体を使用して、ＧＤＦ−８または関連タンパク質に関連する１つまたは複数の活性を阻害または減少させることができる。より好ましくは、抗体は、抗体に結合していないＧＤＦ−８と比較して１つまたは複数のＧＤＦ−８活性を阻害または減少させることができる。一定の実施形態では、１つまたは複数の本発明に開示の抗体と結合した場合、ＧＤＦ−８活性は、１つまたは複数の本発明に開示の抗体に結合していない成熟ＧＤＦ−８タンパク質と比較して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７２、７６、７８、８０、８２、８４、８６、または８８％、より好ましくは少なくとも９０、９１、９２、９３、または９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％〜１００％阻害される。ＧＤＦ−８活性の阻害を、Ｔｈｉｅｓ  ｅｔ
ａｌ．（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ（２００１）１８：２５１−２５９）に記載され、且つ実施例２および９に例示のｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）または実施例３および６に例示のＡｃｔＲＩＩＢ受容体アッセイで測定することができる。
【００８０】
本発明に開示の抗体によって診断、治療、または予防される内科的疾患は、筋肉または神経筋障害；肥満症などの脂肪組織障害；２型糖尿病；耐糖能障害；代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）；火傷または窒素不均衡などの外傷によるインスリン抵抗性；または骨粗鬆症などの骨変性疾患である。
【００８１】
本発明に開示の抗体によって診断、治療、または予防される他の内科的疾患は、骨の喪失に関連する障害（骨粗鬆症（特に高齢者および／または閉経後の女性）、糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症、オステオペニア、変形性関節症、および骨粗鬆症関連骨折が含まれる）である。他の標的代謝性骨の疾患または障害には、慢性糖質コルチコイド療法に起因する低骨量、若年性性腺不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠損症、二次性副甲状腺機能亢進症、栄養失調、および拒食症が含まれる。好ましくは、抗体を使用して、哺乳動物、特にヒトにおけるこのような内科的疾患を予防、診断、または治療する。
【００８２】
本発明の抗体または抗体組成物を、治療有効量で投与する。一般に、治療有効量は、被験体の年齢、病態、および性別ならびに被験体の病状の重症度によって変化し得る。医師が投薬量を決定し、必要に応じて認められた治療効果に適合するように調整することができる。このような化合物の毒性および治療効率を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致命的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％の治療有効量）の決定のための細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。有毒と治療効果との間の用量の比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。高い治療指数を示す抗体が好ましい。
【００８３】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトで使用するための投薬量範囲の処方において使用することができる。このような化合物の投薬量は、毒性がほとんどないか全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内であることが好ましい。投薬量は、使用した投薬形態および使用した投与経路によってこの範囲内で変化させることができる。本発明で使用した任意の抗体について、最初に細胞培養アッセイから治療有効用量を評価することができる。細胞培養において決定したＩＣ５０（すなわち、最大の症状の阻害の半分を達成する試験抗体の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおける投与量を処方することができる。例えば、高速液体クロマトグラフィによって血漿レベルを測定することができる。任意の特定の投薬量の効果を、適切なバイオアッセイによってモニタリングすることができる。適切なバイオアッセイの例には、ＤＮＡ複製アッセイ、転写ベースのアッセイ、ＧＤＦ−８タンパク質／受容体結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前脂肪細胞の分化に基づいたアッセイ、脂肪細胞におけるグルコース取り込みに基づいたアッセイ、および免疫学的アッセイが含まれる。
【００８４】
一般に、抗体またはその結合フラグメントが、１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるように組成物を投与する。好ましくは、投与後最も長時間循環抗体レベルを最大にするために、抗体をボーラス投与として投与する。ボーラス投与後、連続的注入を使用することもできる。
【００８５】
本発明に開示の抗体を使用した上記病状の治療、診断、または予防方法を、ＴＧＦ−βスーパーファミリー中の他のタンパク質で使用することもできる。多数のこれらのタンパク質は、ＢＭＰ−１１などのＧＤＦ−８の構造と類似している。したがって、別の実施形態は、ＢＭＰ−１１またはアクチビンを阻害することができる抗体の単独または他のＴＧＦ−βインヒビター（ＧＤＦ−８に対する中和抗体など）との組み合わせの被験体への投与による上記障害の治療方法を提供する。本発明の抗体を使用して、ＢＭＰ−１１と関連するか媒介される疾患または病態を治療することもできる。例えば、米国特許第５，６３９，６３８号および同第６，４３７，１１１号を参照のこと。
【００８６】
本発明の抗体を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８などのＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質の存在を検出することができる。これらのタンパク質の存在またはレベルと病状との相関により、当業者は関連する病状を診断することができる。本発明に開示の抗体によって診断することができる病状を上に記載する。
【００８７】
このような検出方法は当該分野で周知であり、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロット、ウェスタンブロット、免疫蛍光、免疫沈降、および他の類似の技術が含まれる。タンパク質（例えば、ＧＤＦ−８）を検出するための１つまたは複数のこれらの技術を組み込んだ診断キット中に抗体をさらに提供することができる。このようなキットは、他の構成要素、輸送容器、説明書、またはタンパク質の検出およびキットの使用を補助するための他の材料を含むことができる。
【００８８】
抗体が診断を目的とする場合、例えば、リガンド基（ビオチンなど）または検出可能なマーカー基（蛍光基、放射性同位体、または酵素など）で修飾することが望ましい。所望ならば、従来技術を使用して抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれか）を標識することができる。適切な標識には、フルオロフォア、ケモフォア、放射性原子、高電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが含まれる。酵素は、典型的には、その活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を分光光度計で定量可能な青色色素に変換する能力によって検出することができる。他の適切な標識には、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびタンパク質Ａ、ならびに当該分野で公知の多数の受容体−リガンド結合物が含まれ得る。他の順列および可能性は当業者に容易に明らかであり、本発明の範囲内で等価物と見なされる。
【００８９】
本発明のなおさらなる態様は、筋肉および骨の障害の治療で有用な治療薬の同定方法を提供する。適切なスクリーニングアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ）は当該分野で公知である。このようなスクリーニングアッセイでは、第１の結合混合物を、本発明の抗体とリガンド（例えば、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１、アクチビン）との組み合わせによって形成し、第１の結合混合物中のリガンドと抗体との間の結合量（Ｍ０）を測定する。第２の結合混合物も抗体と、リガンドと、スクリーニングすべき化合物または薬剤との組み合わせによって形成し、第２の結合混合物中のリガンドと抗体との間の結合量（Ｍ１）を測定する。次いで、例えば、Ｍ１／Ｍ０比の計算によって第１および第２の結合混合物の結合量を比較する。第１の結合混合物と比較して第２の結合混合物で結合の減少が認められる場合、化合物または薬剤はＧＤＦ−８活性を阻害することができると見なされる。結合混合物の処方および至適化は当業者のレベルの範囲内であり、このような結合混合物はまた、結合の強化または至適化に必要な緩衝液および塩を含むことができ、本発明のスクリーニングアッセイにさらなるコントロールアッセイが含まれ得る。
【００９０】
したがって、少なくとも約１０％（すなわち、Ｍ１／Ｍ０＜０．９）、好ましくは約３０％を超えて抗体−リガンド結合が減少することが見いだされた化合物を同定することができ、所望ならば、ＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイ（実施例２）ならびに実施例１３、１５、および１６に記載の他の細胞ベースのアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイなどの他のアッセイでＧＤＦ−８活性を阻害する能力について二次的にスクリーニングすることができる。
【００９１】
（ＩＩＩ．薬学的組成物および投与方法）
本発明は、本発明に開示の抗体を含む組成物を提供する。このような組成物は、薬学的使用および患者への投与に適切であり得る。組成物は、典型的には、１つまたは複数の本発明の抗体および薬学的に許容可能な賦形剤を含む。本明細書中で使用される、句「薬学的に許容可能な賦形剤」には、薬学的投与に適合する任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗生物質および抗真菌薬、ならびに等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような溶剤および薬剤の使用は当該分野で周知である。組成物は、補足的、付加的、または強化された治療機能を提供する他の活性化合物も含み得る。薬学的組成物を、投与説明書とともにコンテナ、パック、またディスペンサーに含めることもできる。
【００９２】
本発明の薬学的組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与方法は、当業者に公知である。局所的または経口投与することができるか、粘膜を通過することができる組成物を得ることも可能である。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、または経皮であり得る。
【００９３】
皮内または皮下投与で使用される溶液または懸濁液には、典型的には、１つまたは複数の以下の構成要素が含まれる：注射用の水、生理食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張化剤。塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基でｐＨを調整することができる。このような調製物を、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアルに同封することができる。
【００９４】
注射に適切な薬学的組成物には、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）ＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易にシリンジで使用できる範囲の流動物であるべきである。製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されるべきである。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオ−ル（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌薬および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノ−ル、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなど）によって微生物作用を防止することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤（例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、および塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射用組成物は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによって長期間吸収され得る。
【００９５】
経口組成物には、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアが含まれる。これらをゼラチンカプセルに封入するか、打錠することができる。治療のための経口投与の目的で、抗体を賦形剤に組み込み、錠剤またはカプセル形態で使用することができる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、およびカプセルなどは、任意の以下の成分または類似の性質の化合物を含み得る：微結晶性セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（商標）、またはコーンスターチなどの崩壊薬；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ（商標）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーなどの矯味矯臭薬。
【００９６】
吸入による投与のために、適切な高圧ガス（例えば、二酸化炭素などのガス）を含む加圧コンテナもしくディスペンサーまたはネブライザーからエアゾールスプレーの形態で抗体を送達させる。
【００９７】
経粘膜または経皮手段によって全身投与を行うこともできる。例えば、Ｆｃ部分を含む抗体の場合、組成物は、ＦｃＲｎ受容体媒介経路を介して粘膜（例えば、腸、口腔、または肺）を通過することができる（米国特許第６，０３０，６１３号）。例えば、ロゼンジ、鼻腔用スプレー、吸入器、または坐剤の使用によって経粘膜投与を行うことができる。経皮投与のために、活性化合物を、当該分野で公知の軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに処方する。経粘膜投与または経皮投与のために、処方物に通過すべきバリアに適切な浸透剤を使用する。このような浸透剤は一般に当該分野で公知であり、例えば、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。
【００９８】
本発明に開示の抗体を、徐放性処方物などの身体からの急速な排除から化合物を保護するキャリア（移植片およびマイクロカプセル化した送達システムが含まれる）を使用して調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような処方物の調製方法は、当業者に自明である。本発明に開示の抗体を含むリポソーム懸濁液を、薬学的に許容可能なキャリアとして使用することもできる。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の当業者に公知の方法にしたがって、これらを調製することができる。
【００９９】
投与を容易にするためおよび投薬量の均一性のために、単位投薬形態で経口または非経口組成物を処方することが有利であり得る。本明細書中で使用される、「単位投薬形態」は、処置すべき被験体のための単一投薬量として適切な物理的に個別の単位をいい、必要な薬学的キャリアと共同して所望の治療効果が得られるように所定量の活性化合物を含む単位を計算した。本発明の単位投薬形態の仕様は、活性化合物の固有の特徴および達成すべき特定の治療効果、および個体治療のためのこのような活性化合物の処方分野が本来有する制限について言及しているか、これらに直接依存する。
【０１００】
以下の実施例は、本発明の例示的実施形態を提供し、本発明を決して限定しない。当業者は、多数の他の実施形態が本発明の範囲内に含まれることを認識する。
【０１０１】
本願で引用された全ての引用文献、特許、および公開された特許出願の内容全体が本明細書中で参考として援用される。
【実施例】
【０１０２】
（実施例１：ＧＤＦ−８の精製）
組換えヒトＧＤＦ−８タンパク質（成熟ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−８プロペプチド）を発現する選択細胞株由来の馴化培地をｐＨ６．５に酸性化し、８０×５０ｍｍＰＯＲＯＳ（商標）ＳＰ陽イオン交換カラムと縦に並べた８０×５０ｍｍＰＯＲＯＳ（商標）ＨＱ陰イオン交換カラムにアプライした（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。通過物（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）をｐＨ５．０に調整し、７５×２０ｍｍＰＯＲＯＳ（商標）ＳＰ陽イオン交換カラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にアプライし、ＮａＣｌ勾配を使用して溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認したＧＤＦ−８潜在複合体を含む画分をプールし、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でｐＨ２〜３に酸性化し、粘度を低下させるために０．１％ＴＦＡで２００ｍｌにした。次いで、プールを、６０×２１．２ｍｍのガードカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を取りつけた２５０×２１．２ｍｍのＣ５カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライし、ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用して溶離し、ＧＤＦ−８プロペプチドから成熟ＧＤＦ−８を分離した。アセトニトリルを除去するために成熟ＧＤＦ−８を含むプール画分を凍結乾燥によって濃縮し、２０ｍｌの０．１％ＴＦＡを添加した。次いで、サンプルを、分離を補助するために６０℃に加熱した２５０×１０ｍｍのＣ５カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。もはやさらに分離することができなくなるまでこれを繰り返した。次いで、成熟ＧＤＦ−８を含む画分をプールし、４０％アセトニトリルで増量し（ｂｒｉｎｇ  ｕｐ）、６０×２１．２のガードカラムを取りつけた６００×２１．２のＢｉｏＳｅｐ（商標）Ｓ−３０００サイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。精製成熟ＧＤＦ−８を含む画分をプールし、その後の実験での使用のために濃縮した。
【０１０３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、精製成熟ＧＤＦ−８は、非還元条件下で２５ｋＤａおよび還元条件下で１３ｋＤａの広いバンドとして移動した。ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９７）９４：１２４５７−１２４６１）によってマウスＧＤＦ−８について類似のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィ−ルが報告されており、成熟タンパク質の二量体特性を反映する。活性成熟ＢＭＰ−１１二量体を、類似の様式で組換えヒトＢＭＰ−１１を発現する細胞株由来の馴化培地から精製した。
【０１０４】
活性成熟ＢＭＰ−１１を、組換えヒトＧＤＦ−８プロペプチド／成熟ＢＭＰ−１１キメラタンパク質を発現する細胞株由来の馴化培地から精製した。馴化培地を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍｌのＴＡＬＯＮ（商標）カラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に１ｍｌ／分でロードした。結合したタンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールで溶離した。ＧＤＦ−８プロペプチド／ＢＭＰ−１１潜在複合体を含むプール画分を、１０％ＴＦＡでｐＨ３に酸性化した。次いで、プールを、成熟ＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８プロペプチドのより良好な分離のために６０℃に加熱した２５０×４．６ｍｍのＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）にアプライし、ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用して溶離した。成熟ＢＭＰ−１１を含むプール画分を、凍結乾燥によって濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、精製成熟ＢＭＰ−１１は、非還元条件下で２５ｋＤａおよび還元条件下で１２ｋＤａに移動した。
【０１０５】
（実施例２：精製組換えヒトＧＤＦ−８の生物活性）
ＧＤＦ−８の活性を証明するために、ルシフェラーゼを発現するレポーターベクターｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２を使用してレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を開発した。ＣＡＧＡ配列は、ＴＧＦ−β誘導性遺伝子ＰＡＩ−１のプロモーター内のＴＧＦ−β応答配列であることが以前に報告されていた（Ｄｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：３０９１−３１００）。
【０１０６】
基本ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、１２個のＣＡＧＡボックスを含むレポーターベクターを作製した。アデノウイルス主要後期プロモーター（−３５／＋１０）由来のＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位を、ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。ＣＡＧＡボックスＡＧＣＣＡＧＡＣＡの１２回反復を含むオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ＸｈｏＩ部位にクローン化した。ＦｕＧＥＮＥ（商標）６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ヒト横紋筋肉腫細胞株Ａ２０４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８２）をｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌペニシリン、および１０％ウシ胎児血清を補足したＭｃＣｏｙの５Ａ培地を含む４８ウェルプレートに細胞を１６時間培養した。次いで、細胞を、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地中の１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−８の存在下又は非存在下で、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリン、および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンで、３７℃にて６時間処理した。ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、処置した細胞中のルシフェラーゼを定量した。
【０１０７】
図４Ａは、ＧＤＦ−８は、１０ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０でレポーター構築物を最大で１０倍活性化し、精製組換えＧＤＦ−８が生物学的に活性であることを示す。ＢＭＰ−１１およびアクチビンは類似の生物学的応答を誘発した。
【０１０８】
（実施例３：ＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイにおける精製ＧＤＦ−８の結合特性）
ＧＤＦ−８潜在複合体を、１モルのＧＤＦ−８複合体に対して２０モルのＥＺ結合スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２１２１７）の比で氷上で２時間ビオチン化した。０．５％ＴＦＡを使用したｐＨの低下によって反応を停止させ、複合体をＣ４  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ２５０×４．６ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）におけるクロマトグラフィに供してＧＤＦ−８プロペプチドから成熟ＧＤＦ−８を分離した。ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ勾配を使用して溶離したビオチン化成熟ＧＤＦ−８画分をプールし、濃縮し、ＭｉｃｒｏＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２３２３５）によって定量した。
【０１０９】
上記と同一の様式で、ＢＭＰ−１１潜在複合体からビオチン化成熟ＢＭＰ−１１を調製した。１μｇ／ｍｌの組換えＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３３９−ＲＢ／ＣＦ）を含む０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液を、４℃で一晩９６ウェルの平底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＮＹ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５９０）にコートした。次いで、プレートを１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンでブロッキングし、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールにしたがって洗浄した。種々の濃度の１００μアリコートのビオチン化ＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１を、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ，ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１３０４７Ｅ）およびその後のＴＭＢ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５０−７６−０４）の添加によってＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１の結合量を検出した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎＭで比色測定を行った。
【０１１０】
図１に示すように、ビオチン化ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１はＡｃｔＲＩＩＢ（ＥＤ５０が１５および４０ｎｇ／ｍｌである推定ＧＤＦ−８ＩＩ型受容体）にそれぞれ結合し、ＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイがｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイでＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１に感受性を示すことを示す。
【０１１１】
（実施例４：ｓｃＦｖライブラリーにおけるＧＤＦ−８のパニングによるＭｙｏ２２の単離）
記載の１．３８×１０１０個のライブラリー（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３０９−３１４）の拡大バ−ジョンであるｓｃＦｖファージミドライブラリーを使用して、ＧＤＦ−８に特異的な抗体を選択した。可溶性ＧＤＦ−８タンパク質（１０μｇ／ｍｌを含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６））でマイクロタイタープレートのウェルを４℃で一晩コートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、ＭＰＢＳ（３％Ｍａｒｖｅｌ（商標）脱脂粉乳を含むＰＢＳ）にて３７℃で２時間ブロッキングした。精製したファージ（１０１２形質導入単位（ｔｕ））を含む１００ｌの３％ＭＰＢＳをブロッキングしたウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ（０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ（商標）２０を含むＰＢＳ）で１０回洗浄し、次いでＰＢＳで１０回洗浄した。結合したファージ粒子を、１００μｌの１００ｍＭトリエチルアミンにて室温で１０分間溶離し、その直後に５０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和した。溶離したファージを使用して、指数関数的に成長した１０ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１に感染させた。感染細胞を、２ＴＹブロス中で静置にて３７℃で３０分間およびその後曝気しながら３７℃で３０分間成長させ、２ＴＹＡＧプレート上に画線し、３０℃で一晩インキュベートした。コロニーをプレートから１０ｍのｌ２ＴＹブロスに掻き取り、−７０℃での保存のために１５％グリセロールを添加した。
【０１１２】
第１ラウンドのパニング選択由来のグリセロールストック培養物にヘルパーファージを重感染させ、レスキューして第２のパニングラウンドのためのｓｃＦｖ抗体発現ファージ粒子を得た。このようにして、全部で３ラウンドのパニングを行った。
【０１１３】
（実施例５：ｓｃＦｖライブラリーからのＭｙｏ２８およびＭｙｏ２９の選択）
ビオチン化ＧＤＦ−８タンパク質（ｂｉｏＧＤＦ−８）を使用して、可溶性選択（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ）を行った。１μｇ／ｍｌの濃度でｂｉｏＧＤＦ−８を使用した。実施例４に記載するように、ｓｃＦｖライブラリーを使用した。精製ｓｃＦｖファージ（１０１２ｔｕ）を１００μｌの３％ＭＰＢＳで３０分間ブロッキングし、ビオチン化抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ファージ／抗原を、１ｍｌの３％ＭＰＢＳ中にて３７℃で１時間ブロッキングした５０μｌのＤｙｎａｌ（商標）Ｍ２８０ストレプトアビジン磁性ビーズに添加し、室温でさらに１５分間インキュベートした。磁性ラックを使用してビーズを補足し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含む１ｍｌの３％ＭＰＢＳで４回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した。最後のＰＢＳでの洗浄後、ビーズを１００μｌのＰＢＳ中で再懸濁し、５ｍｌの指数関数的に成長したＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞を感染させるのに使用した。細胞およびファージを、３７℃で１時間（静置で３０分間および２５０ｒｐｍで震盪しながら３０分間）インキュベートし、２ＴＹＡＧプレートに広げた。プレートを３０℃で一晩インキュベートし、翌日にコロニーを視覚化した。産生されたコロニーをプレートから掻き取り、上記のようにファージをレスキューした。上記のように第２ラウンドの可溶性選択を行った。
【０１１４】
（実施例６：ＡｃｔＲＩＩＢ受容体阻害アッセイおよびスクリーニング）
実施例４および５に記載のようにして得た産生コロニーを、１００μｌの２ＴＹＡＧを含む９６ウェルプレートに採取した。指数関数的に成長した培養物への１ｍＭのＩＰＴＧの添加および３０℃で一晩のインキュベーションによってｓｃＦｖ産生を誘導した。本質的に実施例３に記載のように、粗ｓｃＦｖ含有培養物上清を、ｂｉｏＧＤＦ−８のＡｃｔＲＩＩＢへの結合を阻害する能力についてスクリーニングした。ｂｉｏＧＤＦ−８の結合をユウロピウム標識ストレプトアビジンで検出し、時間分解蛍光アッセイ（ＴＲＦ）でＤＥＬＦＩＡ（商標）試薬キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用するという点でアッセイをわずかに修正した。無関係のクローンを超える結合シグナルの阻害を示す正のクローンを採取し、活性を確認するためにアッセイした。
【０１１５】
受容体阻害スクリーニングから同定された正のクローン由来の精製ｓｃＦｖを、上記の阻害アッセイで試験した。アッセイにおけるＩＣ５０値によって測定したクローンの能力を確立するために、ｓｃＦｖ濃度の滴定を使用した。実験結果を図２に示す。これらのアッセイで決定したところ、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、およびＭｙｏ２２のｓｃＦｖについてのＩＣ５０は、それぞれ２．４ｎＭ、１．７ｎＭ、および６０ｎＭである。したがって、これらの抗体は、ＧＤＦ−８活性の強力なインヒビターである。
【０１１６】
（実施例７：ファージＥＬＩＳＡによる特異性の特徴づけ）
抗体の特異性を決定するために、ＧＤＦ−８および無関係のタンパク質に対するＡｃｔＲＩＩＢスクリーニング由来の正のクローンについてファージＥＬＩＳＡを行った。ファージミドを含む各Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを、ウェルあたり１００μｌの２ＴＹＡＧ培地を含む９６ウェルプレートに接種した。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを、１０の感染多重度（ｍｏｉ）の指数関数的に成長した培養物に添加し、プレートを３７℃でさらに１時間インキュベートした。プレートを、ベンチトップ遠心分離機にて２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを１００μｌの２ＴＹＡＫに再懸濁し、震盪しながら３０℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各ウェル由来の１００μｌのファージ含有上清を新鮮な９６ウェルプレートに移した。ファージサンプルを、ＥＬＩＳＡ前に最終濃度３％のＭＰＢＳにて室温で１時間ブロッキングした。
【０１１７】
１μｇ／ｍｌのＧＤＦ−８または無関係のタンパク質を、９６ウェルマイクロタイタープレートに４℃で一晩コートした。コーティング後、ウェルから溶液を取り出し、プレートを３％ＭＰＢＳにて室温で１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳでリンスし、各ウェルに５０μｌのプレブロッキングファージを添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、その後ＰＢＳで３回洗浄した。各ウェルに、５０μｌの５，０００倍希釈の抗Ｍ１３−ＨＲＰ抱合体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。各プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、その後ＰＢＳで３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、発色するまでインキュベートした。２５μｌの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させた。作製されたシグナルを、マイクロタイタープレートリーダーを使用した４５０ｎｍの吸光度の読み取りによって測定した。ＧＤＦ−８の特異的結合を確認した。
【０１１８】
（実施例８：ｓｃＦｖの配列決定、ＩｇＧへの変換、および生殖系列化）
中和ｓｃＦｖ  Ｅ．ｃｏｌｉクローンを２ＴＹＡＧプレートに画線し、３０℃で一晩インキュベートした。ｓｃＦｖクローン由来のＶＨおよびＶＬ領域を増幅するために、これらのプレート由来の三連のコロニーをｐＣＡＮＴＡＢ６ベクター配列オリゴを使用して配列決定した。Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８、およびＭｙｏ２２のＩｇＧの作製に使用したｓｃＦｖフラグメントのＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１３、配列番号７、および配列番号１に示す。
【０１１９】
ＰＣＲおよびクローン特異的プライマーを使用して、ｓｃＦｖクローン由来の重鎖および軽鎖のＶ領域を増幅した。適切な制限酵素でＰＣＲ産物を消化し、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ＶＨドメインについて）を含むベクターまたは必要に応じてヒトλ軽鎖定常ドメイン（ＶＬドメインについて）を含むベクターにサブクローン化した。各Ｅ．ｃｏｌｉコロニー由来のプラスミドＤＮＡの配列決定によってプラスミドへのＶ領域ドメインの正確な挿入を確認した。標準的技術によってＥ．ｃｏｌｉ培養物からプラスミドを調製し、標準的な技術を使用して重鎖および軽鎖構築物をＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトした。プロテインＡセファロ−ス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）を使用して分泌ＩｇＧを精製し、緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０１２０】
ｓｃＦｖクローンの配列データを使用して、各クローンの重鎖および軽鎖の最も近い生殖系列配列を同定した。適切な変異誘発プライマーを使用した標準的な部位特異的変異誘発技術を使用して適切に変異させた。配列分析によってｓｃＦｖ配列の変異を確認した。Ｍｙｏ２８およびＭｙｏ２９の生殖系列化ｓｃＦｖならびにＶＨおよびＶＬドメイン配列を、配列番号１９および配列番号２５にそれぞれ示す。
【０１２１】
（実施例９：抗体の生物活性）
図３Ａは、実施例３に記載のＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイにおいてＭｙｏ２９の１０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＧＤＦ−８とのプレインキュベーションにより、０．２〜０．４ｎＭのＩＣ５０にてＡｃｔＲＩＩＢへのＧＤＦ−８結合が阻害されることを示す。同様に図３Ｂでは、Ｍｙｏ２９は同一のＩＣ５０でのＡｃｔＲＩＩＢへのビオチン化ＢＭＰ−１１結合を阻害した。
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイにおいてＭｙｏ２９はＧＤＦ−８活性も遮断した。例として、ＧＤＦ−８をＭｙｏ２９と室温で１時間プレインキュベートした場合、本質的に実施例２に記載のように実施したＲＧＡアッセイで決定したところ、ＧＤＦ−８の生物活性が減少した。図４Ｃは、Ｍｙｏ２９の存在下におけるＧＤＦ−８のＥＤ５０（２０ｎｇ／ｍｌ）でのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター活性の誘導を示す。Ｍｙｏ２９は、１５〜３０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０（０．１〜０．２ｎＭ）にて用量応答様式でＧＤＦ−８誘導を減少させた。Ｍｙｏ２９は、同程度にＢＭＰ−１１の生物活性も阻害した（図４Ｂ）。対照的に、本アッセイのアクチビン活性は、ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１と比較してＭｙｏ２９に影響を受けず（図４Ｄ）、これはおそらくＧＤＦ−８とアクチビンとの間の相同性が相対的に低いためである。
【０１２３】
ＲＧＡおよびＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイにおいてＭｙｏ２２およびＭｙｏ２８も試験した。両抗体は、ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１活性を遮断する。Ｍｙｏ２８のＩＣ５０は、例えば、０．２〜０．３５ｎＭである。
【０１２４】
（実施例１０：Ｍｙｏ２２、Ｍｙｏ２８、およびＭｙｏ２９のエピトープのマッピング）
抗体の正確なエピトープをマッピングするために、配列番号４９に記載の成熟ＧＤＦ−８の全配列を示す４８の重複する１３残基のペプチドを、スポット合成技術を使用してセルロースペーパー上で直接合成した（Ｍｏｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：１５１−１５５；Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：９２１７−９２３２）。ペプチドの重複は１１アミノ酸であった。このアレイでは、システインの存在によって生じる化学的な複雑さを減少させるために、システイン残基をセリンに置換した。ポリエチレングリコールで修飾したセルロースメンブレンおよびＦｍｏｃ保護アミノ酸を、Ａｂｉｍｅｄ（Ｌａｇｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。以前に記載のように、β−アラニンスペーサーのカップリングによってメンブレン上でアレイを定義し、ペプチドを標準的なＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）カップリング化学を使用して合成した（Ｍｏｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：１５１−１５５；Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：９２１７−９２３２）。
【０１２５】
活性化アミノ酸を、Ａｂｉｍｅｄ  ＡＳＰ  ２２２ロボットを用いてスポットした。洗浄および脱保護工程を手動で行い、最終合成サイクル後にペプチドのＮ末端をアセチル化した。ペプチド合成後、メンブレンをメタノールで１０分間洗浄し、ブロッカー（ＴＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）および１％（ｗ／ｖ）カゼイン）で１０分間洗浄した。次いで、メンブレンを、２．５μｇ／ｍｌの抗ＧＤＦ−８抗体を含むブロッカーと穏やかに撹拌しながら１時間インキュベートした。ブロッカーでの１０分間で３回の洗浄後、メンブレンをＨＲＰ標識二次抗体（０．２５μｇ／ｍｌを含むブロッカー）と３０分間インキュベートした。次いで、メンブレンをブロッカーにて１０分間ずつ３回およびＴＢＳＴにて１０分間ずつ２回洗浄した。結合した抗体をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）およびデジタルカメラ（Ａｌｐｈａｎａｎｏｔｅｃｈ  Ｆｌｕｏｒｏｍａｇｅｒ）を使用して視覚化した。結果を図５に示す。特に、図５で認められるように、Ｍｙｏ２９のエピトープは、成熟ＧＤＦ−８のアミノ酸７２と８８との間にマッピングされた。それに対して、Ｍｙｏ２２は、成熟ＧＤＦ−８配列の最初の４４個のＮ末端アミノ酸（配列番号４９のアミノ酸１〜４４）内のエピトープを認識する。最後に、Ｍｙｏ２８のエピトープは、成熟ＧＤＦ−８の最初の９８個のＮ末端アミノ酸内に存在する残基を含む。
【０１２６】
Ｍｙｏ２９エピトープをさらに特徴づけるために、スポット合成を使用して削除および置換分析を行った。置換分析では、ペプチドの各残基を個別にシステイン以外の２０種の天然アミノ酸にそれぞれ置換した。上記のように、合成および結合アッセイを行った。結果を図６に示し、最初の行、最初の２つの列、および最後の３つの列は、野生型ペプチドコントロールを示す。結果は、Ｌｙｓ−７８、Ｐｒｏ−８１、およびＡｓｎ−８３を個別に別のアミノ酸に変異させた場合、ペプチドに対するＭｙｏ２９の結合親和性を有意に減少させることを示している。したがって、Ｍｙｏ２９は、Ｌｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ａｓｎ（配列番号５４）（Ｘａａ１、Ｘａａ２、およびＸａａ３はそれぞれ任意のアミノ酸のいずれかであるか、互いに独立して、Ｘａａ１＝Ｍｅｔ、Ｘａａ２＝Ｓｅｒ、およびＸａａ３＝Ｉｌｅ）を含む配列を認識する。
【０１２７】
（実施例１１：ＧＤＦ−８の免疫沈降）
成熟ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−８複合体へのＭｙｏ２９およびＭｙｏ２８の結合を評価するために、免疫沈降研究を行った。ＧＤＦ−８を発現するＣＨＯ細胞を、３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインで標識した。ＧＤＦ−８タンパク質（成熟ＧＤＦ−８および潜在複合体）を含む１００μｌのこれらの細胞由来の馴化培地を、２０μｇ／ｍｌのＭｙｏ２９またはＭｙｏ２８と４℃で１時間インキュベートした。プロテインＡ−セファロ−ス（商標）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。免疫沈降物を回収し、還元サンプル緩衝液中に再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ゲルを固定し、オ−トラジオグラフィ増強溶液で増強し、乾燥させ、オ−トラジグラム（ａｕｔｏｒａｄ）を現像した。図７は、Ｍｙｏ２９およびＭｙｏ２８は成熟ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−８潜在複合体、および非プロセシングＧＤＦ−８を免疫沈殿させることができることを示す。ウェスタンブロッティングによって決定したところ、両抗体は、非還元条件下でＧＤＦ−８二量体と結合する。
【０１２８】
（実施例１２：薬物動態学）
単回静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）投与後のＣ５７Ｂ６／ＳＣＩＤマウスにおける１ｍｇ／ｋｇの用量でのＭｙｏ２９の薬物動態学（ＰＫ）を評価した。上記用量での非標識および１２５Ｉ標識Ｍｙｏ２９の混合物を動物に投与し、血清中の１２５Ｉ放射能および注射用量の比活性に基づいて血清濃度を決定した。図８は、ＩＶまたはＩＰのいずれかで投与したＭｙｏ２９の時間に体する血清濃度のプロットを示す。
【０１２９】
Ｍｙｏ２９は、約１週間の長期末端半減期および約１ｍｌ／時間／ｋｇの低クリアランスを示した。初期分布体積は、約８３ｍｌ／ｋｇであった。外見上の分布体積は、約２２７ｍｌ／ｋｇであった。Ｍｙｏ２９は、注射後約６時間でピーク濃度に達した。ＩＰ注射後に吸収した画分は、約７７％であった。
【０１３０】
（実施例１３：筋肉量および強度に対するＭｙｏ２９のｉｎ  ｖｉｖｏ効果）
Ｍｙｏ２９がｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ−８活性を遮断するかどうかを決定するために、成体ＳＣＩＤマウスにおいてＭｙｏ２９を試験した。ＳＣＩＤマウスは、重症複合型免疫不全を罹患しているので、Ｍｙｏ２９などのヒト抗体の注射後に免疫反応を起こさない。筋肉量は、Ｍｙｏ２９で処置したマウスのＧＤＦ−８活性の指標として使用した。
【０１３１】
８週齢の雄Ｃ５７Ｂ６  ＳＣＩＤマウスを秤量し、体重に関して均一に８つの群に分配した。Ｍｙｏ２９を含むＰＢＳ緩衝液を、種々の用量（６０、１０、および１ｍｇ／ｋｇ）で毎週マウスに腹腔内注射した。最初の週は二重用量を投与した。賦形剤（ＰＢＳ）で処置した、あるいは処置を行わなかったマウスをコントロールとして用いた。処置を４週間継続した。処置後に腓腹筋および大腿四頭筋を解剖および秤量することによって筋肉量を評価した。処置から４週間後、Ｍｙｏ２９で処置した全ての群で筋肉量が１０％〜２３％の範囲で増加し、より高用量で処置した群は有意なレベルに達した（図９、ｐ＜０．０１）。
【０１３２】
別の実験では、雌ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスを、種々の用量（１０、５、２．５、および１ｍｇ／ｋｇ）のＭｙｏ２９で４週間または１２週間毎週処置した。さらに、Ｍｙｏ２９での４週間の処置により、腓腹筋および大腿四頭筋の重量が１０％〜２０％の範囲で増加した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。より長い処置（１２週間）により、筋肉量がより増加し（１２％〜２８％）、Ｍｙｏ２９で処置した全ての群は統計的に有意なレベルに達した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。
【０１３３】
筋肉量の増加により筋肉がより強くなるかどうかを決定するために、前肢の筋肉の強度を、握力計（ｍｏｄｅｌ  １０２７  ｃｓｘ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）で測定した。処置から１２週間後、前肢強度は、賦形剤コントロールと比較して５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＭｙｏ２９で処置したマウスでそれぞれ１７％および２３％高かった（ｐ＜０．０１、図１２）。この研究結果は、Ｍｙｏ２９がｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＦ−８活性を阻害して筋肉量および筋肉の強度を有意に増加させることを証明する。
【０１３４】
（実施例１４：代謝疾患の治療）
ＧＤＦ−８のインヒビター（例えば、阻害抗体など）は、２型糖尿病、耐糖能障害、代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）、外傷によるインスリン抵抗性（例えば、火傷または窒素不均衡）、および脂肪組織障害（例えば、肥満症）などの代謝障害の治療に有用である。本発明の抗ＧＤＦ−８抗体を使用して、疾患を発症している被験体または確立された代謝疾患を有する被験体を治療する。
【０１３５】
代謝障害（例えば、２型糖尿病および／肥満症）の治療のための抗ＧＤＦ−８抗体の有効性を、肥満症、インスリン抵抗性、および２型糖尿病の確立されたマウスモデル（ｏｂ／ｏｂ、ｄｂ／ｄｂ、および致死性黄色症変異を有する株が含まれる）を使用して確認する。インスリン抵抗性を、一定のマウス株（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊが含まれる）の高脂肪または高カロリー飼料によって誘導することもできる。ヒトと同様に、これらのげっ歯類は、インスリン抵抗性、高インスリン血症、異常脂質血症、および高血糖症を発症するグルコースホメオスタシスの悪化を発症する。結果の評価は、血清中のグルコース、インスリン、および脂質の測定に基づく。インスリン抵抗性試験およびグルコース負荷試験によってインスリン感度の改良を測定することができる。より感度の高い技術には、血糖コントロールおよびインスリン感度の改善を評価するためのオイグリセミック高インスリン血症クランプの使用が含まれる。さらに、クランプ技術により、改良された血糖コントロールにおける主なグルコース処理組織（筋肉、脂肪、および肝臓）の役割が定量的に評価可能である。
【０１３６】
１つの研究では、１週間から６ヶ月間Ｍｙｏ２９（ＩＰ注射）などの抗ＧＤＦ−８抗体または賦形剤での処置を行う。治療プロトコールは、異なる用量の試験および治療計画（例えば、毎日、毎週、２週間毎の注射）によって変化し得る。抗ＧＤＦ−８抗体で処置したマウスは、プラシーボ処置を受けたマウスと比較して、グルコース取り込みが増加し、解糖およびグリコーゲン合成が増加し、血清中の遊離脂肪酸およびトリグリセリドが低下すると予想される。
【０１３７】
また、ＧＤＦ−８に対する阻害抗体を使用して、疾患の重症度および／または症状を予防および／または軽減する。抗ＧＤＦ−８抗体を１日１回の頻度および１ヶ月に１回の頻度の皮下注射として投与することが予想される。治療継続期間は、１ヶ月から数年までの範囲であり得る。
【０１３８】
ヒトにおける抗ＧＤＦ−８の臨床効果を試験するために、２型糖尿病を罹患しているかリスクのある被験体を同定し、無作為に治療群に分けた。治療群は、プラシーボ群および抗体（異なる用量）を投与された１〜３つの群を含む。個体のグルコース代謝の変化を評価するために１ヶ月〜３年間予測的に追跡する。処置を受けた個体は改善すると予想される。
【０１３９】
唯一の活性化合物として、又は別の化合物または組成物と組み合わせて、抗体を投与する。唯一の活性化合物として、又は別の化合物または組成物と組み合わせて投与した場合、投薬量は、好ましくは、疾患の症状の重症度および進行に依存して約１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。適切な有効用量を、治療を行う医師によって以下の範囲から選択される：１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ。治療計画の例および結果を表３にまとめる。
【０１４０】
【表３】
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本明細書中で引用された引用文献（その全体が本明細書中で参考として援用される）の教示に照らして、明細書がほぼ完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例示であり、本発明の範囲を制限すると解釈すべきではない。当業者は、多数の他の実施形態が特許請求の範囲に含まれ、本明細書および実施例は例示のみを目的とし、本発明の真の範囲および精神を以下の特許請求の範囲に示すことが意図されることを認識する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
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