(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞培養におけるウイルス増殖のための新規な方法を提供する。【解決手段】細胞はウイルスで感染され、感染後にウイルスの増殖を可能にし、かつ少なくとも２倍の細胞の増殖を目的とする条件下で培養される。また、得られたウイルス及び発現されたタンパク質は薬物および診断剤の製造のために使用される。対象となるウイルスは、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＤＮＡウイルス、ＲＮＡ（＋）ウイルス、ＲＮＡ（−）ウイルスまたはｄｓＲＮＡウイルスであり、使用される細胞株はＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓細胞）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養物中のウイルス増殖のための方法に関し、ここで細胞はウイルスに
感染し、そして感染後、これらの細胞は、ウイルス増殖が可能でかつ同時に、少なくとも
２倍の、標的されたさらなる細胞増殖が可能な条件下で、細胞培養物中で培養される。本
発明はまた、薬物および診断剤の製造のための、そのように得られるウイルスまたはそれ
らのウイルスによって発現されるタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症、特にウイルス感染は、依然として医薬においてかなり重要である。従って、培
養物中でウイルスを増殖することができるよりよい方法を利用可能にして、ウイルスに関
する研究およびワクチンの製造を可能にする必要性は、不変的なままである。特に、ウイ
ルス感染に対するワクチンの製造は、通常、多量の対応するウイルスの増殖および単離を
必要とする。
【０００３】
この対応するウイルスに依存して、ウイルス増殖のための種々の宿主系および培養条件
が、先行技術において使用されている。標準的な宿主動物、ニワトリ胚性卵、初代組織細
胞培養物または株化細胞系統が、宿主系として使用される（非特許文献１〜３）。
【０００４】
ニワトリ胚性卵におけるウイルス増殖は、高コストおよび時間の損失につながっている
。この卵は、感染前にインキュベートされ、次いで、その胚の生存度について試験されな
ければならない。生存している胚のみが、ウイルスを増殖し得る。ウイルス感染後、増殖
が起こり、さらにインキュベートして、この胚は最終的に殺傷される。この卵から単離さ
れたウイルスは、汚染物質を含まず、濃縮されている。インキュベートした卵におけるウ
イルス増殖は、厳密に滅菌した条件下では不可能であるので、医薬用途または診断用途の
ために利用可能であるべきならば、汚染した病原性微生物が、その単離物から取り除かれ
なければならない。
【０００５】
ニワトリの卵におけるウイルス増殖に対する代替物が、規定された細胞株の真核生物宿
主細胞によって提供される（Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓ
ｃｈｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，ＫａｙｓｅｒおよびＭｕｌｌｅｒ（編）、２０
００、２５７〜２８１）。しかし、多数の細胞株は、残留する外来性ウイルス汚染物質に
起因してか、またはウイルス実証がないこと、不明確な起源および経歴に起因して、ワク
チンまたは類似の医薬的に利用可能な調製物の製造に適していない。
【０００６】
細胞培養物中でのウイルス増殖のために先行技術において使用される方法は全て、同じ
基本的なスキームを有し、ここで細胞は、ウイルスの非存在下で最初に増殖され、次いで
、細胞の有意な増殖が生じない条件下で、ウイルスが添加および増殖され、そしてその培
養物が、ウイルスの最大増殖後に回収される。
【０００７】
例えば、サルの腎臓細胞由来のＶｅｒｏ細胞は、ワクチン製造用の個々のウイルス（ポ
リオウイルス、狂犬病ウイルス）の増殖のために使用された。これらの細胞は、（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣのような）種
々の細胞バンクにおいて利用可能であり、そしてまた、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒ
ｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）によって、医薬研究用の試験細胞バンクからも利用可能
になっている。
【０００８】
これらのＶｅｒｏ細胞は、接着系統であり、ガラスボトル、プラスチック培養プレート
またはプラスチックフラスコのような細胞増殖用の支持体表面を必要とする。いわゆるマ
イクロキャリアの増殖は、発酵槽（すなわち一般に、プラスチック製の小球体（この表面
上で、細胞が増殖し得る））中の対応する細胞の培養物中で生じる。
【０００９】
接着性ＢＨＫ（ベビーハムスターの腎臓）細胞および接着性ＭＤＣＫ（Ｍａｎｄｉｎｅ
Ｄａｒｂｙのイヌ腎臓）細胞、ならびに他の細胞もまた、前述のＶｅｒｏ細胞に加えて
、活発にウイルスを増殖し、これらは、薬学的生成物の生成のための基質として使用され
るか、またはそれらの使用が考慮される。インフルエンザウイルスに加えて、ＭＤＣＫ細
胞株ＡＴＣＣ  ＣＲＬ３４（ＮＢＬ−２）において、水疱性口内炎ウイルス、コクサッキ
ーウイルスＢ５（Ｂ３でもＢ４でもない）、レオウイルス２型および３型、アデノウイル
ス４型および５型、ならびにワクシニアウイルスもまた、実験によって増殖されている。
しかし、全ての対応する刊行物は、排他的に、接着性培養物に適合させている（ＡＴＣＣ
製品情報を参照のこと）。しかし、懸濁培養物が、多量の細胞増殖に好ましく、従って、
リンパ球および多数の形質転換細胞のみが、この系においてかなり増殖され得る（Ｌｉｎ
ｄｌ（編）、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，２０００，ｐｐ．１７
３ｆｆ）。タンパク質を含まない培養培地における懸濁物中で増殖し得るＭＤＣＫ細胞株
が、ＷＯ  ９７／３７０００に開示される。対応する宿主細胞を使用するインフルエンザ
ウイルスの増殖もまた、記載される。
【００１０】
適切な細胞または宿主系の選択に加えて、ウイルス系統が増殖される培養条件もまた、
受容可能に高い収率を達成するために、かなり有意である。従って、所望のウイルス系統
の収率を最大にするために、宿主系と培養条件との両方が、所望のウイルス系統のために
有利な環境条件を達成するために、特に適応されなければならない。従って、種々のウイ
ルス系統の高収率を達成するために、最適の増殖条件を生じる系が、必要とされる。多数
のウイルスは、特定の宿主系に制限され、これらのうちのいくらかは、ウイルス収率に関
して非常に非効率的である。効率的な生成系はしばしば、対応する培養系のウイルス集団
の適応に基づき、しばしば他の宿主系との中間状態を使用し、そしてタンパク質添加物（
大部分は、動物またはヒト起源の血清）を用いる。
【００１１】
血清または他の増殖因子の添加を用いた初期増殖後のほとんど全ての培養物は、血清も
タンパク質添加物もなしで少なくとも特定の時間保たれ得ることがまた、研究者によって
知られている。例えば、任意の細胞培養物は、ウイルス感染の時点または回収直前に、血
清もタンパク質添加物も含まない培地に取り換えられ得（ｓｗｉｔｃｈｅｄ）、回収まで
保たれる。これは、外来性タンパク質を回避するかまたは低下させながら、ワクチンまた
は診断試験用のウイルス材料を得るための、長期にわたる慣習である。血清を添加した感
染段階の間に、この実施を行わずに保たれたワクチンおよび細胞培養物は、ヒトまたは動
物における使用を可能にする際の重要な問題を有する。なぜなら、この血清成分は、あま
り十分には排除され得ないからである（ＷＨＯ奨励「Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｒｅｑｕｉｒｅ
ｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖａｃｃｉｎｅ」（Ｌｉｖｅ），Ｒｅｑｕｉｒｅ
ｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  Ｎｏ．１２，１９
７８年改訂を参照のこと）。
【００１２】
多くのウイルスは、タンパク質含有培地中でほとんどわずかにしか増殖され得ないかま
たは全く培養され得ないこともまた、知られている。培養系での増殖のためにタンパク質
分解酵素（プロテアーゼ）の活性化に頼るウイルスが、含まれる。これらのプロテアーゼ
は、培地へのタンパク質の添加によって競合的に阻害されるので、少なくとも感染期間ま
たは生成段階におけるタンパク質の添加は、ここで理論的に問うまでもない。プロテアー
ゼの添加によって通常増殖されるはずであり、それによって、可能ならば感染培地へのタ
ンパク質の添加なしで良好な収率を達成するウイルスの例は、インフルエンザウイルスお
よびロタウイルスである。パラミクソウイルスおよびレオウイルスのような他の型のウイ
ルスもまた、できる限りタンパク質の少ない培地からの増殖の間、有利である。（Ｗａｒ
ｄら（１９８４），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４８−７５３、「Ｅｆｆｉｃ
ｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  
ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ」）。ＷＯ  ９６／１５２３１は、通常のタンパク質添加物を
使用しない培養物が使用される細胞培養物中でのＶｅｒｏ細胞または他の細胞の培養を提
唱している。
【００１３】
他のウイルス（例えば、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肺炎ウイルスまたはＡ型肝炎
ウイルス）は、培養組成物および培地条件に関わらず、不十分に増殖されることが知られ
ている（ＰｒｏｖｏｓｔおよびＨｉｌｌｅｍａｎｎ、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ
．Ｍｅｄ．，１６０：２１３−２２１（１９７９）；ならびにＲｏｌｌｅおよびＭａｙｒ
（前出））。
【００１４】
ウイルスの増殖後、これは通常、培養物から単離される。多数の方法が、先行技術で知
られており、これによって、ウイルス、ウイルス発現産物または他のタンパク質が、増殖
後に培養物および／または細胞から単離され得る（Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ（前出）；Ｒｅｉ
ｍｅｒ，Ｃら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９６７年１２月、１２０７
−１２１６頁；Ｎａｖａｒｒｏ  ｄｅｌ  Ｃａｎｉｚｏ，Ａら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６１巻、１９９６、３９
９；Ｐｒｉｏｒ．Ｃら、ＢｉｏＰｈａｒｍ、１９９６年１０月２２日；Ｊａｎｓｏｎ，Ｊ
ａｎ−Ｃ．およびＲｙｄｅｎ  Ｌ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
，１９９７；ならびにＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻、１９９０）。
【００１５】
しかし、この方法のスキーム過程（細胞増殖、ウイルス増殖、回収）に基づいて、先行
技術において既知の方法は、制限されたウイルス増殖およびウイルス回収を可能にするの
みである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】ＲｏｌｌｅおよびＭａｙｒ（編）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７８
【非特許文献２】Ｍａｈｙ（編）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１９８５
【非特許文献３】Ｈｏｒｚｉｎｅｋ（編）、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、本発明の根底にあるこの問題は、より大きいウイルス増殖および単純化された
多量の回収を可能にする、細胞培養物中のウイルス増殖のための方法を提供することから
なる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
細胞培養におけるウイルスの増殖のための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）細胞をウイルスに感染させる工程；
（ｂ）感染後に、該ウイルスの増殖を可能にし、かつ同時に、さらに少なくとも２倍の
該細胞の増殖を目的とした条件下で、該細胞を細胞培養において培養する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
感染後に、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍の前記細胞の増殖を引き起こす
条件下で、該細胞が培養される、項目１に記載の方法。
（項目３）
感染後に、少なくとも７日間、２１日間、または２８日間、好ましくは少なくとも３５日
間、細胞培養において前記細胞が培養される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ウイルスおよび細胞の目的とした増殖の間に、新鮮な培地、培地濃縮物または培地成
分が少なくとも１回添加されるか、あるいは該ウイルスおよび細胞の少なくとも一部分が
、新鮮な培地、培地濃縮物または培地成分を含む培養容器に移される、項目１〜３のい
ずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記培地、培地濃縮物もしくは培地成分の添加、または前記細胞およびウイルスの、別の
培養容器への移転が少なくとも１回繰り返される、項目１〜４のいずれか１項に記載の
方法。
（項目６）
前記培地、培地濃縮物もしくは培地成分の添加、または前記細胞およびウイルスの、別の
培養容器への移転が少なくとも数回繰り返される、項目１〜５のいずれか１項に記載の
方法。
（項目７）
前記培地が、前記ウイルスおよび細胞の増殖の間に取り除かれる、項目１〜６のいずれ
か１項に記載の方法。
（項目８）
前記ウイルスおよび細胞の増殖の間に、培地が連続的に取り除かれ、そして新鮮な培地、
培地濃縮物または培地成分が添加される、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記細胞がＭＤＣＫ細胞である、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
感染前に、前記細胞が、接着培養されるか、または懸濁培養物として培養される、項目
１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
感染後に、前記細胞が、接着培養されるか、または懸濁培養物として培養される、項目
１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記ＭＤＣＫ細胞が、細胞株ＭＤＣＫ３３０１６に由来する、項目１〜１１のいずれか
１項に記載の方法。
（項目１３）
前記ウイルスが、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＤＮＡウイルス、ＲＮＡ（＋）ウイルス、Ｒ
ＮＡ（−）ウイルスまたはｄｓＲＮＡウイルスである、項目１〜１２のいずれか１項に
記載の方法。
（項目１４）
前記ウイルスが、アデノウイルス、オルトミクソウイルスもしくはパラミクソウイルス、
レオウイルス、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス
、ヘルペスウイルスまたはポックスウイルスから選択される、項目１〜１３のいずれか
１項に記載の方法。
（項目１５）
アデノウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、中央ヨーロッ
パ脳炎ウイルスおよび関連東部（ロシアまたは他の）形態、デングウイルス、黄熱病ウイ
ルス、Ｃ型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳ
ウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、ラブドウイル
ス、肺炎ウイルス、レオウイルス、１型ヘルペス単純ウイルスまたは２型ヘルペス単純ウ
イルス、サイトメガロウイルス、水痘‐帯状疱疹ウイルス、イヌアデノウイルス、エプス
タイン‐バーウイルス、およびウシヘルペスウイルスもしくはブタヘルペスウイルス、Ｂ
ＨＶ−１様ウイルス、または仮性狂犬病ウイルスが、前記細胞の感染のために使用され、
ここで、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肺炎ウイルスまたはＡ型肝炎ウイルスが特に好
ましい、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ウイルスゲノムが少なくとも１０ｋｄのサイズの異種機能性タンパク質をコードする配列
を有する、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記培地が、血清を含まない、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記培地が、化学的に規定された培地である、項目１〜１７のいずれかに一項に記載の
方法。
（項目１９）
前記培地が、タンパク質を含まない、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記ウイルスの増殖が、灌流システムにおいて行なわれる、項目１〜１９のいずれか１
項に記載の方法。
（項目２１）
前記ウイルスの増殖が、バッチシステムにおいて行なわれる、項目１〜２０のいずれか
１項に記載の方法。
（項目２２）
前記ＭＤＣＫ細胞が、前記ウイルスの増殖のために３０℃と４０℃との間の温度で培養さ
れる、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記ＭＤＣＫ細胞が、前記ウイルスの増殖のために３５％と６０％との間の酸素分圧で培
養される、項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記培地のｐＨ値が、前記ウイルスの増殖のためにｐＨ６．８とｐＨ７．８との間である
、項目１〜２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ウイルスが、１０−８と１０との間のＭＯＩ値での感染によって前記ＭＤＣＫ細胞に
導入される、項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記ウイルスまたはそれらによって発現されるタンパク質が、前記培養物の上清または回
収された細胞から単離される、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記培養培地の少なくとも１部分が、前記ウイルスまたはタンパク質の単離のために、前
記ＭＤＣＫ細胞の少なくとも一部分から分離される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記分離が、ディープベッドフィルタまたは分離器によって起こる、項目２７に記載の
方法。
（項目２９）
精製が、前記ウイルスの濃縮のための超遠心分離法を包含する、項目２６〜２８のいず
れか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記精製が、クロマトグラフィーを包含する、項目２６〜２９のいずれか１項に記載の
方法。
（項目３１）
前記ウイルスが精製の間、不活性である、項目２６〜３０のいずれか１項に記載の方法
。
（項目３２）
項目１〜３２のいずれか１項に記載の方法を含む、薬物または診断剤の製造方法。
（項目３３）
単離されたウイルスまたはタンパク質が、適切なアジュバント、補助剤、緩衝剤、希釈剤
または薬物キャリアと混合される、項目３３に記載の薬物または診断剤の製造方法。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ここで、この問題は、ウイルス増殖のための方法によって解決されており、この方法に
おいて；
（ａ）細胞をウイルスに感染させ；
（ｂ）感染後に、該ウイルスの増殖を可能にし、かつ同時に、さらに少なくとも２倍の
該細胞の増殖を目的とした条件下で、該細胞を細胞培養において培養する。
【００２０】
驚くべきことに、細胞培養物中でのウイルス増殖のための、有意に改善された方法は、
この方法の過程が根本的に変更される（すなわち、細胞増殖がまた、ウイルスの増殖の間
にも可能となる）場合に、得られる。このことは、有意により多くのウイルスがより短い
時間で得られ得るという利点を有する。細胞培養用の設備の産出量もまた、改善される。
【００２１】
本発明に従って、細胞培養は、感染後に細胞が、少なくとも２倍または５倍、好ましく
は、少なくとも１０倍増加するように、行われる。
【００２２】
細胞増殖とはまた、培養が少なくとも感染後７日間にわたって行われ得ることを意味す
るが、好ましくは、細胞およびウイルスは、少なくとも２１日間、２８日間または３５日
間にわたって細胞培養物中で増殖される。
【００２３】
この方法に依存して、ウイルスおよび細胞の増殖の間に、新鮮な培地、培地濃縮物もし
くは培養成分を少なくとも１回、または少なくともウイルスおよび細胞の転移部分を、新
鮮な培地、培地濃縮物もしくは培養成分を含む培養容器に加えることが、有利であり得る
。しかし、ウイルスおよび細胞の増殖の間に少なくとも１回、新鮮な培地、培地濃縮物も
しくは培養成分を加えることが、好ましい。
【００２４】
この培地、培地濃縮物または培養成分の添加は、好ましくは、少なくとも１回または少
なくとも数回、繰り返される。
【００２５】
本発明の別の好ましい実施形態に従って、感染した細胞の培養の間、その培養培地は、
新鮮な培養培地に置き換えられるか、またはその培養容量は、新鮮な培養培地を加えるこ
とによって増加される。培養培地の交換または置き換えはまた、培地濃縮物または培養成
分（アミノ酸、ビタミン、脂質画分、リン酸および他の物質など）によって生じ得る。こ
れらの工程はまた、細胞培養の間、繰返し行われ得る。
【００２６】
このことは、培養上清からの多重ウイルス回収によって、特に総培養容量を増加させる
ことによって、ウイルス収率の増加を可能にし、かつ新鮮な培地を加えることによる細胞
数の増加もまた可能にする。この系の収率は有意に改善されるので、対応する多重回収は
、本発明に従う方法の有意な利点を表わす。
【００２７】
本発明の方法において、ＭＤＣＫ細胞は、好ましくは、ウイルス増殖のために使用され
る。
【００２８】
本発明に従う方法において使用される細胞において、懸濁培養物中で増殖する特性を有
する細胞が含まれる。工業規模の発酵槽中で支持体粒子の非存在下でもまた増殖し得る細
胞は、他の細胞に対して、培養の操作、培養のスケールアップおよびウイルス増殖の間、
有意な利点を有することによって示される。ＭＤＣＫ細胞を懸濁培養物に適合させるため
の方法は、先行技術において公知である（ＷＯ  ９７／３７０００）。このＭＤＣＫ細胞
は、細胞株ＭＤＣＫ  ３３０１６に由来し得る。
【００２９】
本発明の別の実施形態に従って、感染前および感染後、接着性である特性および懸濁培
養物として増殖する特性の両方を有する細胞が、使用される。この実施形態は、細胞培養
系、従って研究室規模から工業的製造までの細胞の発育のための培地が使用され得るとい
う特別な利点を有する。個々の細胞培養系の安全性のみをチェックする必要があるので、
対応する系は、医薬品登録を有意に単純化する。
【００３０】
ウイルスは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓ
ＤＮＡ）、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または一本鎖リボ核酸由来のゲノムを有し得る
。この時、この一本鎖リボ核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡの極性（ＲＮＡ（＋））、
または反対の極性（ＲＮＡ（−））を有し得る。
【００３１】
ウイルスは、先行技術で公知の任意のウイルスであり得る。本発明に従う方法の文脈に
おいて使用されるウイルスは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）またはＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）のような種々の収集物から得られ得
る。細胞培養物中ですでに予め増殖されている、存在している産生系統またはウイルス系
統が、一般に用いられる。特定の単離体もまた、樹立され得るが、これらは、対応する用
途により適している。１つの実施形態に従って、この方法において使用されるウイルスは
、以下からなる群より選択される：アデノウイルス、オルトミクソウイルスおよびパラミ
クソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、フラビウイルス、
アレナウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス。アデノウイルス、ポリオ
ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、中央ヨーロッパ脳炎ウイルス、および
関連する東洋（ロシアまたは他国）形態、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、Ｃ型肝炎
ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、ワク
シニアウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、ラブドウイルス、肺炎ウイル
ス、レオウイルス、単純疱疹ウイルス１または単純疱疹ウイルス２、サイトメガロウイル
ス、水痘帯状疱疹ウイルス、イヌアデノウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ならび
にウシヘルペスウイルスまたはブタヘルペスウイルス、類似のＢＨＶ−１または仮性狂犬
病ウイルスが使用され、ここで、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肺炎ウイルスまたはＡ
型肝炎ウイルスが、特に好ましい。
【００３２】
本発明の別の実施形態によると、ウイルスのゲノムは、少なくとも１０ｋｄのサイズを
有する、異種の機能性タンパク質をコードする核酸配列を含み得る。異種タンパク質の発
現のための多数のベクターが、先行技術において公知であり、それらは、例えば、ヘルペ
スゲノム、ワクシニアゲノムまたはアデノウイルスゲノム上のウイルス性ゲノムに基づく
（Ｇａｌｌｅｒ，Ｒら、Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，１９９７年２月、
３０（２）：１５７〜６８；Ｗｉｌｌｅｍｓｅ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９６
年１１月、１４（６）：１５１１〜６；Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕ，Ｓ．，Ｍｉｎｓｏｎ，Ａ
．Ｃ．，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．，１９９５年１月、５１（１）：４５〜５５；Ｈａｍ
ｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０００年１
０月、２（５）：５３２〜９；Ｇｒａｈａｍ，Ｆｌ．，Ｐｒｅｖｅｃ，Ｌ．，Ｍｏｌ，Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９５年６月、３（３）：２０７〜２０；Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｍ
．Ｗ．，Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７年１
０月，８（５）：５７３〜７；Ｗｏｊｃｉｋ，Ｊ．，Ａｃｔａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐ
ｏｌ．，１９９５，４４（２）：１９１〜６；Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．，２０００年８月、７４（１６）：７６５１〜５；Ｈａｇｅｎ，Ａｎｎａら、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１９９６，１２，４０６〜４０８；Ｈｕｙｇｈｅ，Ｂｅ
ｒｎａｒｄら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９５年１１月、６：１４０
３〜１４１６）。
【００３３】
本発明の状況において、ウイルス性ゲノムが、配列の付加または置換によって改変され
た結果、このゲノムが、少なくとも１０ｋｄのサイズを有する異種の機能性タンパク質（
すなわち、ウイルスに元来属さない）をコードするそれらのウイルスの増殖のための方法
がまた、含まれる。本発明によると、タンパク質が、このタンパク質に対して免疫反応を
誘発することが少なくとも可能である場合に、タンパク質は、機能性タンパク質として参
照される。本来、タンパク質は、免疫学的活性に加えて付加的な生物学的活性（例えば、
酵素またはサイトカインとしての作用）を有し得る。
【００３４】
本発明による方法において使用されるウイルスはまた、ウイルス性ゲノムにおける個々
の遺伝子の欠失を有し得る。例えば、病原性因子をコードするワクチンとして使用される
ウイルスの遺伝子は、故意に欠失され得る。対応する欠失は、好ましくは、多くても５０
０個または多くても１０００個のヌクレオチドを含む。
【００３５】
本来、本発明に従う方法によって使用されるウイルスはまた、完全ウイルス性ゲノムを
含み得る。
【００３６】
懸濁培養におけるウイルスの増殖は、培地において、血清の存在下または非存在下で本
発明の方法によって生じ得る。これらの細胞培養条件は、このように産生された産物の医
学的使用の登録をかなり簡易化するので、特別な利点は、血清の不在によって得られる。
培養培地へ血清を添加して調剤することによって、培地汚染を排除するための高価な精製
工程がまた、避けられる。産物の品質に対する改善が、それゆえにまた、達成され、そし
てコストはこの理由で避けられる。
【００３７】
培地は、本発明の状況において、人または動物起源の血清に由来する添加物が全くない
、無血清培地として参照される。
【００３８】
培養およびその後の使用への干渉効果を有さない特定のタンパク質が、対応する培養に
対して規定された量で添加され得る。この型の培養培地は、化学的に規定された培地とし
て参照される。マイトジェンペプチド、インシュリン、トランスフェリンまたはリポタン
パク質のような選択されたタンパク質が、この培地に添加され、これらは、当業者に公知
の異なるプロデューサーから得られ得る。本発明の状況におけるマイトジェンペプチドは
、好ましくは、植物性加水分解物（例えば、大豆タンパク質加水分解物または他の有用な
植物のタンパク質由来の溶解産物）を意味すると理解される。
【００３９】
しかし、特定の好ましい実施形態によると、培地は、タンパク質を全く含まない。タン
パク質を全く含まないとは、細胞の増殖が、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加
物および非血清タンパク質を排除して生じる培養を意味すると理解される。このような培
養において増殖する細胞は、本来的に、タンパク質自身を含む。
【００４０】
公知の無血清培地としては、Ｉｓｃｏｖｅ培地、Ｕｌｔｒａ−ＣＨＯ培地（Ｂｉｏ  Ｗ
ｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられ
る。一般的な血清含有培地としては、以下が挙げられる：イーグル基礎培地（ＢＭＥ）ま
たは最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９
））あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）（これらは、１０％
までの胎児ウシ血清または類似の添加物とともに、一般的に使用される）。ＰＦ−ＣＨＯ
（ＪＨＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のようなタンパク質を全く含まない培地、ＰｒｏＣＨ
Ｏ  ４ＣＤＭ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＳＭＩＦ７（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のような化学的に規定された培地、およびＰｒｉ
ｍａｃｔｏｎｅ、ＰｅｐｔｉｃａｓｅまたはＨｙＰｅｐＴＭ（全てＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌから得られる）あるいはラクトアルブミン加水分解物（Ｇｉｂｃｏお
よび他の製造者）のようなマイトジェンペプチドはまた、当該分野において周知である。
植物性加水分解物に基づく培地添加物は、ウイルス、マイコプラズマまたは未知の感染物
質による汚染が排除され得るという特別な利点を有する。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態によると、感染されたＭＤＣＫ細胞の培養の間に、新鮮な培
地、培地濃縮物、あるいはアミノ酸、ビタミン、脂肪画分またはリン酸塩のような培地成
分が添加される。
【００４２】
次いで、本発明による方法は、灌流システムまたはバッチシステムにおいて実施され得
る。培地が連続的に供給および排出される培養システムは、灌流システムとして参照され
る。これに代わるようなものとして、細胞はまた、システムが、接種から回収までの培地
を供給しないほぼ閉鎖されたシステムとして運転されるバッチシステムにおいて培養され
得る。
【００４３】
所望の適用のために使用される細胞培養条件（温度、細胞密度、ｐＨ値など）は、本発
明に従って使用される細胞株の適合性に従って、非常に広範囲で変化し得、そしてその適
用の要件に適合され得る。以下の情報は、それゆえに、単にガイドラインを示すに過ぎな
い。
【００４４】
感染前の細胞の増殖は、遠心分離またはろ過のような従来の支持方法を使用する灌流シ
ステムにおいて、種培養または小培養管から開始して実施され得る。このようなシステム
における細胞の初期培養の間に、培養培地を、発酵槽充填物を１日あたり３回までの割合
で交換することが有利であると証明されている。細胞は、２×１０７の細胞密度までこれ
らの条件下で増殖され得る。灌流速度の制御は、好ましくは、細胞数、グルタミン含有量
、グルコース含有量または乳酸塩含有量のような当業者に公知のパラメータによって、培
養の間に行われる。
【００４５】
バッチシステムが使用される場合、約８×１０５〜２５×１０５細胞／ｍＬまでの細胞
密度は、３７℃の温度および２０〜３０時間の生成時間で達成され得る。
【００４６】
さらに、細胞は、感染の前に、供給バッチシステムにおいて、本発明に従って増殖され
得る。本発明の状況において、培養システムは、細胞が、バッチシステムにおいて初期に
培養され、そして培地中の栄養分（または栄養分の一部）の枯渇が、濃縮された栄養分の
制御された供給によって補われる供給バッチシステムとして参照される。供給バッチシス
テムにおいて、細胞は、約１×１０６〜１０×１０６の細胞密度まで増殖され得る。
【００４７】
感染前の細胞の増殖の間に、培地のｐＨ値を、ｐＨ６．６〜ｐＨ７．８の間の値、そし
て特にｐＨ７．２〜ｐＨ７．３の間の値に調節することが有利である点がまた証明されて
いる。
【００４８】
感染前の細胞の培養は、好ましくは、３０℃と４０℃の間の温度、そして特に３３℃と
３７℃の間の温度で行われる。感染前の培養の間、酸素分圧は、好ましくは、２５％と９
５％との間の値、そして特に３５％と６０％の間の値に調節される。本発明の状況におい
て記載される酸素分圧についての値は、空気中の飽和量に基づく。
【００４９】
細胞の感染は、バッチシステムにおいては、好ましくは、約８×１０５〜２５×１０５
細胞／ｍＬの細胞密度で行うか、または灌流システムにおいては、好ましくは、約５×１
０６〜２０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で行うことが、本発明に従う方法に関して有利
であると証明されている。細胞は、１０−８と１０の間のウイルス投与量、好ましくは、
０．０００１と０．５との間のウイルス投与量（ＭＯＩ値、「感染多重度」；感染時にお
ける細胞あたりのウイルスユニットの数に対応する）で感染され得る。
【００５０】
感染後の細胞の培養はまた、灌流システム、バッチシステムまたは供給バッチシステム
において行い得る。前記で使用された培養条件と同じ培養条件が、使用され得る（３０℃
と４０℃の間の温度、５％と１００％との間の酸素分圧、ｐＨ６．６とｐＨ７．８との間
の培地のｐＨ値）。
【００５１】
ウイルスまたはそれによって生成されたタンパク質の回収および単離を包含する方法は
また、本発明に従って利用可能となる。ウイルスまたはタンパク質の単離の間に、細胞は
、分離、ろ過または限外ろ過のような標準的な方法によって培養培地から分離される。次
いで、ウイルスまたはタンパク質は、勾配遠心分離、ろ過、沈殿、クロマトグラフィーな
どのような当業者に周知の方法に従って濃縮され、次いで、精製される。また、本発明に
従って、ウイルスは、精製中または精製後に不活性化されることが好ましい。ウイルスの
不活性化は、例えば、精製プロセス中の任意の時点で、β−プロピオラクトンまたはホル
ムアルデヒドによって行われ得る。
【００５２】
本発明に従う方法は、薬物の生成に特に適しており、特に、ワクチン薬および診断薬の
生成に適している。
【００５３】
薬物の生成は、ウイルスまたはそれによって産生されたタンパク質の増殖および単離、
ならびに、適当なアジュバント、補助剤、緩衝剤、希釈剤および／または薬物キャリアと
の混合を包含し得る。本発明の状況におけるアジュバントは、免疫応答を増強させる物質
を意味すると理解される。これらは、種々の金属の水酸化物（例えば、水酸化アルミニウ
ム）、細菌細胞壁の成分、オイルまたはサポニンを含む。ワクチンは、ウイルス感染の予
防処置または治療処置に特に適している。
【００５４】
免疫原性および／または対応するワクチンの効能は、感染を負荷を伴う防御実験または
中和に必要な抗体力価の決定のような、当業者に公知の方法によって決定され得る。産生
されたウイルス量または抗体量の決定は、ウイルス力価測定、血球凝集試験、種々の型の
抗体決定またはタンパク質決定のような、当業者に周知の標準的な方法に従って、抗原の
力価または量の決定によって行われ得る。
【００５５】
本発明に従う方法はまた、診断用組成物の生成に適している。組成物は、本発明の方法
から得られるウイルスまたは本発明の方法によって産生されるタンパク質を含み得る。先
行技術において一般的な添加物および検出剤との組み合わせにおいて、これらの組成物は
、ウイルス抗体またはアンチウイルス抗体の検出に適した診断試験として使用され得る。
【００５６】
以下の実施例における全てのウイルス力価は、当業者に公知のＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａ
ｅｒｂｅｒによる最終希釈法および統計的５０％終沫点決定に従って決定した（Ｈｏｒｚ
ｉｎｅｋ，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版、
１９８５，Ｐａｒｅｙ  Ｖｅｒｌａｇ，ｐｐ．２２〜２３を参照のこと）。８つの試験培
養物を、１００μＬ量のウイルス希釈液でマイクロタイタープレートにおいて感染させ、
ここで、１０−１〜１０−８のウイルス物質の希釈を使用した。ウイルス力価測定の評価
を、試験培養物としての細胞変性効果によって顕微鏡的に、またはウイルス特異的抗体を
使用する免疫学的検出のいずれかによって行った。ウイルス特異的抗体の結合は、フルオ
レセイン標識された抗体を用いた免疫蛍光として可視化されるか、またはビオチン標識さ
れた二次的抗体およびストレプトアビジン／ビオチン／ペルオキシダーゼ増幅複合体、な
らびに沈殿可能な色素（Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎら、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．，１７７：９１〜１００）を使用して可視化される。ウイルス力価の単位は、培
養感染投与量５０％（ＣＩＤ５０）である。種々の型のウイルスに対して使用されるウイ
ルス特異的検出細胞および、適用可能であるならば、免疫学的検出法が、ウイルス特異的
な例において言及される。
【実施例】
【００５７】
（実施例１：初期作業工程および研究室規模での懸濁系としての、細胞培養物系の取り
扱い）
液体窒素中に保存された種細胞由来のＭＤＣＫ細胞を、水浴中での浸漬によって迅速に
解凍し、そして直後に、約１×１０５細胞／ｍＬの細胞数で、培養培地（補充したＵｌｔ
ｒａ  ＣＨＯ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、標準培地）を用いて、一般に約１：１００で
希釈した。次いで、これらの細胞を培地から分離し、再度の遠心分離（８００Ｇで１０分
間）によって新鮮な培養培地中にとり、そして攪拌培養ビン（１００ｍＬの作業容積、Ｂ
ｅｌｌｃｏまたはＴｅｃｈｎｅ）中に注いだ。これらの培養物ロットを、磁気スターラー
を５０〜６０ｒｐｍで用いて３７℃でインキュベートした。細胞増殖を、細胞数をチェッ
クすることによってモニタリングした。１．６×１０６細胞／ｍＬの最大について、８×
１０５細胞／ｍＬの細胞数に達したところで、この培養物を、新鮮な標準培地での細胞の
希釈によって移し、そして１００〜１０００ｍＬの作業容積の新たな攪拌培養ビンに播種
し、そして最大の細胞密度または所望の細胞密度が上記のような攪拌の間に到達されるま
で、インキュベートした。これらの細胞継代において、最大の細胞数が、必要に応じて、
３〜５日間以内に達成されるように、１：４〜１：１０の範囲で、対応する培養物の希釈
を細胞増殖の型に適合させた。あるいは、この型の細胞培養を、培地への補充物の添加な
しに試行し、そして少なくとも１０継代にわたって、問題なく維持し得た。
【００５８】
（実施例２：接着性培養物としての、細胞培養物系の取り扱い）
確立された懸濁培養物（実施例１を参照のこと）を、細胞数が約１×１０５細胞／ｍＬ
になるように、異なる培地で希釈し、次いで、種々の細胞培養容器に注いだ（表１を参照
のこと）。次いで、この細胞培養物容積を、対応する培養容器についての通常量（すなわ
ち、播種表面にわたって約４ｍｍの培養培地、または培養物表面２．５ｃｍ２について約
１ｍＬの培地）に対応させた。これらの培養物を、一般に、ほとんどの細胞培養物につい
て一般的な３７℃の温度でインキュベートしたが、インキュベーション温度の有意な偏差
もまた、顕著な損失なしに可能であった（表１を参照のこと）。試験した培養物系、なら
びにこれらによって活性化される細胞増殖における結果は、表１に示され、これらの細胞
系が、種々の培地および培養物系において、ほぼ同じに、そして確実に挙動することを示
す。
【００５９】
この方法で生成される単層培養物を、マイクロタイタープレート中でのウイルス収集物
の力価決定のため、および顕微鏡制御下でのウイルスの培養のために、または懸濁培養物
中よりも接着性単層培養物中でより良好に実施され得る免疫蛍光調査、血球吸着試験およ
び他のウイルス学的な標準方法もしくは免疫学的な標準方法のために、使用した。さらに
、このような培養物は、プラーク精製または希釈によって、純粋なウイルス株を回収する
ために、特に適切であった。最後に、接着性培養物をまた、小規模および大規模（ローラ
ービンでは、好ましくはより多い量）でのウイルス増殖のために使用した。
【００６０】
（表１．種々の接着性培養物系における細胞増殖）
【００６１】
【表１】
2010246559.tif 000002
ＢＭＥ：基本培地イーグル；炭酸水素塩補充（５％ストック溶液の２〜２．５％）
ＭＥＭ：最小必須培地；炭酸水素塩補充（５％ストック溶液の２〜２．５％）
ＥＤＭ：ダルベッコ改変イーグル培地；炭酸水素塩補充（５％ストック溶液の２〜２．５
％）
ＦＣＳ：胎仔ウシ血清
Ｓｕｐｐ．：Ｕｌｔｒａ  ＣＨＯ補充
＃：調節した値；＋２℃および−３℃の偏差を有する、実際に測定した値
＊：製造業者：Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ
（実施例３：ウイルスの単離、回収、および種ウイルス調製物の生成）
初代単離体（ウイルス含有器官、組織または組織流体サンプル、咽喉スワブまたは便サ
ンプルなど）を、標準的な培地（任意の他の培地またはリン酸緩衝液も同様に可能である
）中で、氷浴中にて懸濁し、抗生物質（ＰＳＮ：１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μ
ｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのネオマイシン）を添加し、必要に応じ
てホモジェナイズした（乳鉢、外科用メスの刃、あるいはいわゆるＤｏｕｎｃｅｒホモジ
ェナイザーまたはＰｏｔｔｅｒホモジェナイザーで微細に破砕した）。得られた懸濁物を
、０．４５μｍ（より小さい被覆を有さないウイルスの単離については、０．２μｍも）
の細孔サイズを有する通常の実験室シリンジフィルタアダプタを用いて濾過した。濾液を
、新鮮な培養培地を含む小さい培養フラスコ（２５ｃｍ２、実施例２を参照のこと）中に
接種した。収率を増大させるために、１００μＬ〜１ｍＬの接種材料と共に提供し、次い
で３７℃でインキュベートした。上部気道からのウイルスの単離のために、３３℃のより
低いインキュベーション温度にて、さらなる培養物を調製することが推奨される。
【００６２】
培養物中ですでに増殖した純粋なウイルス単離体を、実施例１または２に従って、本発
明に従う培養物系における直接的な感染のために使用した。しかし、より高いウイルス含
量のウイルス調製物が本明細書中で想定され得たので、１００μＬ以下のより小さい接種
材料量を、一般に使用した。０．１および０．０１のＭＯＩ（感染多重度）が、本発明に
従う培養物系におけるこのような第一の感染のために好んだ；１０のファクターだけ減少
させる工程における１０から０．０００１までのＭＯＩを用いた感染を、結果が不満足の
場合に、反復した。
【００６３】
次いで、感染培養物をウイルス関連細胞損傷（ＣＰＥ、細胞変性効果）について顕微鏡
で毎日試験し、そしてコントロール培養物と比較した。ＣＰＥを引き起こさないウイルス
における代替として、この培養物を、特定のウイルス抗原またはその遺伝子の存在につい
て試験した（例えば、ウイルスの型に依存する特定のＨＡ試験；ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ）。
３〜４日後、または陽性の知見（細胞の収縮、細胞死、接着性培地中の細胞層（ｌａｗｎ
）の円形化（ｒｏｕｎｄｉｎｇ）および解離、プラーク形成）の後、無細胞遠心分離培養
物上清をサンプルとして凍結し、そして他方で、陰性または疑わしい知見の場合、培養物
全体を、１×１０５細胞の細胞数まで、新鮮な培地で調節し（懸濁培地の希釈、または接
着性培養物のトリプシン処理および引き続く個々の細胞の希釈）、そしてさらにインキュ
ベートして新たな培養物へと分配した。これは、１：４〜１：２０の培養物の希釈まで、
ほとんどの培地において一致して、培養物の数の対数増殖を回避したので、第二のこのよ
うな培養物継代の後に、少なくとも可能な培養物の一部だけを、さらに維持した。３〜４
継代後、ウイルス単離体を、適切なウイルス含有出発物質から、首尾よく単離および検出
し得た。
【００６４】
ほとんどのウイルス型について、出発物質のウイルス含量および品質に依存して、ウイ
ルス関連ＣＰＥが、インキュベーションの２〜７日後に見出された（ウイルス特異的な実
施例も参照のこと）。しかし、いくつかのウイルスは、非常にゆっくりと増殖するか、ま
たはＣＰＥを示さず、従って、延長した継代およびインキュベーション時間または特定の
試験（必要な方法は、特定のウイルス実施例の下に列挙する）によって、検出されるはず
である。特別な検出系もまた必要とする、ゆっくりとした増殖を有する、ＣＰＥを有さな
いウイルスについての例として、Ａ型肝炎ウイルスの特定の例が言及される。対応する血
清が使用される場合に、他のウイルス、特に、特定のＣＰＥを有さないウイルスの検出に
適切な、記載された検出試験もまた存在する。
【００６５】
具体的には、新たに単離されたウイルスは、３倍のプラーク精製、またはいわゆる限界
希釈技術による、純粋な単離体の調製の後にのみ、使用されるべきである。このために必
要な方法は、先行技術に従う専門教科書から取られ得る（例えば、Ｂ．Ｗ．Ｍａｈｙ：Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ−Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏ
ｘｆｏｒｄ、１９８５を参照のこと）。
【００６６】
適切なウイルス調製物が、初代単離体から入手可能であるかまたは確立された株として
入手可能である場合、これらを、生成目的のための同種の種ウイルスを回収するために、
攪拌培養物の感染のために使用する。本発明の目的を本発明者らが限定することなく、第
一の感染は、１０〜０．００００１、好ましくは０．１〜０．０００１のＭＯＩを有する
１００ｍＬの培養培地を用いた、小さい攪拌培養物で、最初に推奨される。より迅速かつ
より高いウイルス値または収率を達成するために最も好ましい条件（特に、ＭＯＩおよび
回収時間に関して）を、規定された生成規模および生成試行の数に従って、さらなるウイ
ルス継代において、必要なサイズの培養物系で種ウイルスを生成するために、選択した。
達成されるウイルス収率および規定された生成時間に依存して、この種ウイルス継代につ
いての規模は、いくつかの攪拌培養物〜１０００ｍＬの規模〜小さい発酵槽〜ほぼ１０Ｌ
以上の容積までであり得る。回収したウイルスを、濾過または遠心分離によって、任意の
細胞残留物を除去し、そして生成および可能な場合−７０℃未満の温度での保存のために
適切な少量へと、分割した。
【００６７】
（実施例４：生成目的のための、接着性マイクロキャリア培養物としての系の取り扱い
）
接着性ＭＤＣＫ細胞の培養を、実施例２、表１に従って、ＢＭＥ＋３％胎仔ウシ血清（
ＦＣＳ）を用いて、ローラービン中で実施した。この系における培養後、細胞を、ローラ
ービンの表面から分離した。これは、当業者に公知の通常の方法を用いて、適切なトリプ
シン溶液を用いて、酵素的に実施した。代替として、実施例１に従って、懸濁細胞を、攪
拌培養物中で培養し、そしてマイクロキャリアを被覆するために直接使用した。
【００６８】
生成発酵槽を、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３型のマイクロキャリア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で満
たした。このマイクロキャリア（単位体積当たりの重量５ｇ／Ｌ）をオートクレーブし、
そして栄養培地で馴化した。この方法は、マイクロキャリアの表面への細胞の接着を保証
した。この様式で回収した細胞を、細胞密度が１×１０５細胞／ｍＬになるように、生成
系に移した。細胞は、マイクロキャリアに接着し、そしてコンフルエンスになるまで、ま
たは３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に達するまで、培養した。
【００６９】
細胞培養期の後、存在する栄養培地を、新たな栄養培地で置換した。この目的のために
、タンパク質を含まない栄養培地を使用した。２回の洗浄サイクルを行った。洗浄サイク
ルは、攪拌器の停止、マイクロキャリアの設置、消費された栄養培地の除去、新たな栄養
培地の添加、およびマイクロキャリアの再懸濁からなった。洗浄工程の後、細胞培養物を
、トリプシン（２．５ｍｇ／Ｌ）と混合した。
【００７０】
種ウイルスを用いた細胞培養物の感染を、次いで実施した。この種ウイルスを、実施例
３に従って獲得および使用した。次いで、ＭＯＩは、ウイルス特異的であり、そして０．
１と０．０００００１との間、好ましくは０．０１と０．００１との間にのぼった。一方
、感染期の終了後、その時間は、特定のウイルス（特定の実施例を参照のこと）によって
決定され、そして他方、選択されたＭＯＩによっても決定され、攪拌器を停止させ、そし
てマイクロキャリアを堆積させた。ウイルス含有上清を取り出し、そして細胞残渣から、
適切な分離方法によって精製した。細胞分離のために、当業者に公知の通常の遠心分離ま
たは分離器、フィルタおよびクロスフロー濾過単位を、使用した。
【００７１】
（実施例５：無血清培地を使用する、１０００Ｌ規模での生成容積までの、懸濁培養物
としての系の取り扱い）
１０００Ｌの生成容積についての懸濁培養物の培養を、１０００ｍＬの培養容積までの
小規模で、攪拌ビン（Ｔｅｃｈｎｅ  Ｃｏ．）を用いて実施した（実施例１を参照のこと
）。攪拌器中の細胞密度は、１×１０５細胞／ｍＬであった。これらの細胞を、バッチプ
ロセスで培養し、そして１：１０の比で新鮮な培地に単に希釈することによって、１×１
０６細胞／ｍＬの細胞密度で移した。無血清培地（Ｕｌｔｒａ  ＣＨＯ、ＢｉｏＷｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を細胞培養のための培地として使用した。攪拌発酵器（１分当たり３０回の
攪拌器回転数）の１０Ｌの容積から、持続的な空気混和（ａｌｒａｔｉｏｎ）および温度
制御（細胞培養物について制御温度３７℃）、ｐＨ値（制御範囲７．１〜７．３）、およ
び酸素分圧（４５％〜５５％のｐＯ２）を使用した（技術的詳細は表２中）。スケールア
ップ容積は、１：１０の転移比（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒａｔｉｏ）に従って、１０Ｌ、１
００Ｌ、１０００Ｌであった。発酵器が１×１０６細胞／ｍＬの最終細胞密度に、１×１
０５細胞／ｍＬの開始細胞密度にて、３〜４日の時間で到達した。１０００Ｌの規模で、
流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）を、細胞密度を３×１０６細胞／ｍＬまで増大させるた
めに、グルコース溶液（１００〜２００ｇ／Ｌ）を用いてさらに実施した。達成された細
胞収率を、表２に比較して示す。
【００７２】
（実施例６：化学的に規定された培地を用いる、１０００Ｌの容積までの生成容積につ
いての懸濁培地としての、この系の取り扱い）
１０００Ｌの生成容積についての懸濁培養物の培養を、実施例５に記載されるように実
施した。他方、化学的に規定された培地（ＰｒｏＣＨＯ４ＣＤＭ）を、細胞培養のための
代替として使用した。この培地中での適合のために、３〜５継代を実施することが有利で
あることを証明した。達成された細胞収率を、表２において比較する。
【００７３】
（実施例７：タンパク質を含まない培地を使用する、１０００Ｌ規模についての生成容
積までの、懸濁培養物としてのこの系の取り扱い）
１０００Ｌの生成容積についての懸濁培養物の培養を、実施例５に記載されるように実
施した。タンパク質を含まない培地（ＳＭＩＦ７、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）を、細胞培養のための培地として使用した。この培地中での適合のために、５〜１０継
代を行うことが有利であることを証明した。達成された細胞収率を、表２において比較す
る。
【００７４】
（表２．種々の方法および培地を使用する、発酵器中での生成規模についての細胞（Ｍ
ＤＣＫ３３０１６）の培養）
【００７５】
【表２】
2010246559.tif 000003
Ｘ０：開始細胞密度
Ｘ１：最終細胞密度
Ｎ／Ｔ／ｐＯ２／ｐＨ：攪拌速度、温度、酸素分圧、ｐＨ値。
【００７６】
（実施例８：無血清培地での発現期における系操作）
実施例５に従って、発現スケールまで懸濁培地を培養した後、細胞を、等容積の３つの
発酵槽（３×１０００Ｌ）に分配し、新鮮な培地で満たした。各発酵槽は、１／３容積の
前培養液および２／３容積の新鮮な培地を受容した。培養期と同じ培地を使用した（Ｕｌ
ｔｒａＣＨＯ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）。充填の後、細胞培養液を、１０ｍｇ／Ｌの
トリプシンと混合した。次いで、種ウイルス（インフルエンザＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９
４）での細胞培養液の感染を、０．００１のＭＯＩで生じ、さらに、細胞培養中と同じ発
酵条件下であるが、３３℃で９６時間を超えて、インキュベーションした。次いで、細胞
含有上清を取り除き、次いで、細胞を、分離機で分離した。さらなる濾過工程を、０．４
５μｍの孔径のカートリッジフィルタを通して生じ、さらに微小な粒子を分離した。
【００７７】
ウイルス採取物を、０．５％ニワトリ赤血球を用いたＨＡ試験における標準的方法で、
接着性ＭＤＣＫ細胞におけるウイルス滴定によって、ウイルス含量について試験した。測
定されたＨＡ含量は、１０２４Ｕであり、ウイルス力価は、１０８．２ＣＩＤ５０／ｍｌ
であった。
【００７８】
（実施例９：化学的に規定された培地での発現期における系の操作）
発現細胞の調製を、実施例８に記載されるように生じた。しかし、化学的に規定された
培地（ＰｒｏＣＨＯ４ＣＤＭ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を、新鮮な培地として使用し
た。充填後、細胞培養液を、２．５ｍｇ／Ｌのトリプシンと混合した。続いての感染を、
実施例８に記載されるように実施した。
【００７９】
測定されたＨＡ含量は、１０２４Ｕであり、ウイルス力価は、１０７．５ＣＩＤ５０／
ｍｌであった。
【００８０】
（実施例１０：無タンパク質培地での発現期における系の操作）
発現細胞の調製は、実施例８に記載されるように生じた。しかし、無タンパク質培地（
ＳＭＩＦ７，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、新鮮な培地として使用した。充
填後、細胞培養液を、２．５ｍｇ／Ｌのトリプシンと混合した。
【００８１】
続いての感染を、実施例８に記載されるように実施した。測定されたＨＡ含量は、１０
２４Ｕであり、ウイルス力価は、１０７．９ＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００８２】
（実施例１１：化学的に規定された培地での培養および感染）
細胞の培養を、実施例６に記載されるように生じ、感染を実施例９に記載されるように
生じた。従って、培養から感染の採取への全細胞培養物は、化学的に規定された培地中で
生じた。
【００８３】
（実施例１２：化学的に規定された培地での培養および無タンパク質培地中での感染）
細胞の培養は、実施例６に記載されるように化学的に規定された培地中で生じ、感染は
、実施例１０に記載されるように無タンパク質培地中で生じた。
【００８４】
（実施例１３：無タンパク質培地中での培養および感染）
細胞の培養は、実施例７に記載されるように生じ、感染は、実施例１０に記載されるよ
うに生じた。培養から感染の採取までの全細胞培養物は、無タンパク質培地中で生じた。
【００８５】
（実施例１４：ウイルス精製の一般的な記載）
ウイルス増殖期の終了後、細胞培養物の採取を０．４５または０．５μｍの孔径を有す
るディープベッドフィルタ（Ｔｉｅｆｅｎｆｉｌｔｅｒｓ）を通して濾過し、細胞および
細胞フラグメントを分離した。代替として、この分離を、分離機を用いて実施した。浄化
された採取物に含まれるウイルスを、濃縮し、必要に応じて限外濾過によって精製し、こ
こで、５０，０００と１，０００，０００との間（好ましくは、１００，０００〜５００
，０００）の排除限界を有する膜を使用した。得られたウイルス濃縮物を、ＣＳ（Ｃｅｌ
ｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を充填したクロマトグラフィーカ
ラム上にロードした。緩衝液での洗浄による夾雑物の除去後、このウイルスを、０．３〜
３ＭのＮａＣｌ溶液で溶出した。溶出物を、限外濾過で脱塩し、さらに濃縮した。クロマ
トグラフィー精製の代替として、またはクロマトグラフィー精製と組み合わせて、さらな
る精製効果を、限外濾過によって達成し得た。ほとんどのウイルスをまた、スクロース勾
配中の超遠心分離によるこれらの浮遊密度に従って精製し得、続いて、この勾配によって
分画した。ホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンでウイルス不活性化を、精製プ
ロセス内の任意の点で実施し得るが、好ましくは、濃縮または精製後に使用する。なぜな
ら、この容積は、不活性化され、次いで、既に実質的に減少されるからである。
【００８６】
（実施例１５：ワクチンの処方のための不活性化ウイルス調製物の回収）
フラビウイルス（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｅｎｃｅｌｐｈａｌｉｔｉｓ  
ｖｉｒｕｓ、Ｋ２３株）を、実施例５、６および７に従って、０．２ＭＯＩの播種量（詳
細は、実施例２２を参照のこと）で異なる培地中で培養した。
【００８７】
採取されたウイルス含有培養培地を、遠心分離によって存在する任意の細胞残存物を除
去し、０．４５μｍの孔径を有するフィルタを用いて濾過した。安全性のために、濾過後
に、１：２０００または１：２５００の希釈度でβ−プロピオラクトンを添加し、そして
２〜８℃で２４時間インキュベーションすることによって、この物質を、既に不活性化し
た。３７℃での不活性化剤の加水分解の２時間後の不活性化された調製物の細胞培養試験
は、０．０３感染単位／ｍＬ未満の検出限界まで活性なウイルスが存在しないことを示し
た。
【００８８】
続いて記載される精製工程の分析について、ＢＣＡ［ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈ
ｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）］アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、使用して総タンパク質含量を
決定した。特定の抗原含量を、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、Ｅ−糖タンパク質に対
する特定のモノクローナル抗体を使用して決定し（Ｎｉｅｄｒｉｇら、１９９４，Ａｃｔ
ａ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ  ３８：１４１−１４９）、内部ポリクローナル抗血清を、ウ
サギから精製されたウイルスに対して産生した。次いで、不活性化された開始物質に対す
る値を、参照値（１００％に対応）として使用した。
【００８９】
（勾配遠心分離による精製：）
不活性化された細胞調製物を、公知の方法に従って、８０，０００Ｇでの密度勾配超遠
心分離（１５〜６０％スクロース）によって精製した。次いで、勾配を分画し、画分のサ
ンプルにおける、２８０ｎｍの吸光度を決定し、ウイルスのピークを同定した。吸光度の
急激な上昇を、３０％と４０％との間のスクロース濃度の領域に見出し、そして、最大値
は、３４％および３５％であった。この領域から、特定のウイルスタンパク質の最大含量
および最大純度（ウイルスタンパク質の全タンパク質に対する比として決定される）をま
た、測定した。全体的に、開始物質中に測定された５０％より多くの特定の抗原含量が、
これらのピーク画分に回収された。
【００９０】
（クロマトグラフィー精製：）
不活性化されたウイルス調製物（上記を参照のこと）を、あらかじめ、５カラム容量の
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した、ＣＳカラムに適用した。次いで、こ
のカラムを、結合しない材料を除去するために、１０カラム容積のリン酸緩衝液で洗浄し
た。次いで、結合した材料を、連続的に３Ｍ  ＮａＣｌを添加した漸増量の同じ緩衝液と
混合された、同じリン酸緩衝液で溶出した。３．２％と３．９％との間の特定の抗原およ
び７９〜８３％の全タンパク質を、ウイルス物質の適用の間、流れ中に分析的に回収した
。洗浄緩衝液において、６〜１１％の全タンパク質および０〜２．３％の抗原を見出した
。従って、９５％を超える抗原を、カラム物質に結合する。０．６〜１．８ＭのＮａＣｌ
での溶出の間、約６０．０％の抗原を回収し、最大純度を、１．２Ｍ  ＮａＣｌの溶出の
間達成した。３Ｍ  ＮａＣｌまでのより高い塩濃度は、さらに、少量（＜１５％）のより
小さい比純度を有する抗原を溶出した。
【００９１】
（クロマトグラフィーと超遠心との組み合わせによる精製：）
０．６および１．２ＭのＮａＣｌの溶出後の合わせた溶出物を、上記のようにクロマト
グラフィー精製から８０，０００Ｇで２．５時間、超遠心分離に供した。ウイルスペレッ
トを、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁し、そして分析した。この調製物
の全タンパク質濃度を、初期含量の０．７％まで減少し、純度を、この工程によって１０
倍増加した。
【００９２】
このウイルス調製物を、上記のように勾配精製に供した。直接勾配精製の後に達成され
るように、分画後、非常に類似した勾配プロフィールを見出した。しかし、ウイルスピー
クの先端は、わずかにシフトし、ここでそれは、３７％スクロースであった。
【００９３】
（実施例１６：ヒトヘルペスウイルスのウイルス単離物の回収およびウイルス増殖）
ツベルクリンシリンジでの水疱段階（陰唇ヘルペス水疱）における新鮮なヘルペス風解
の滅菌穿刺によって、最少量の組織液を得、実施例３に従って抗生物質を添加した標準培
地中に懸濁し、そして０．４５μｍの孔径を有するフィルタを使用して濾過した。濾過物
を、標準培地中の接着性ＭＤＣＫ３３０１６細胞で、２５ｃｍ２の培養表面を有する培養
フラスコ中に播種し、３７℃で培養した。４日後に上清のサンプルを取り、７日後に、培
養物の全上清を取り、−７０℃未満で凍結した。４日後に取られたサンプルを、１：１０
に希釈し、次いで、１０μｇ／ｍＬトリプシンを含む標準培地中の１０の工程において；
１００μＬのこれらの希釈物を、標準培地中のＭＤＣＫ３３０１６細胞に導入した。３７
℃でのインキュベーションの１３日後、ＣＰＥを、第１の希釈工程のわずかな培養物中に
見出した。これらの培養物の上清を採取し、再度希釈し、そして新規の培養液に播種した
。６〜９日後、漸増的な、より異なるＣＰＥを、代表的なヘルペスウイルスプラークとし
て、この第３ウイルス継代の種々の希釈工程において見出した。１７５ｃｍ２の培養表面
での同じ開始物質と平行の直接感染培養物はまた、排他的に同じ代表的なプラークを示し
た。ウイルスのさらなるクローニングのために、希釈プロセスを繰り返し、ここで、最後
のポジティブな希釈物の細胞培養物中の上清を使用した。細胞培養物の採取に加えて、残
存細胞を、３％ホルムアルデヒド溶液で１６時間固定し、次いで、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  
Ｘ−１００で３０分間インキュベートし、次いで、特定の、ＨＳＶ−１に対するＦＩＴＣ
標識モノクローナル抗体（Ｂｉｏｓｏｆｔ  製品番号１７−０８８）を用いて、標準的な
方法に従って、免疫蛍光調査に供した。プラークの近傍の細胞のみが免疫蛍光を有するこ
とを見出した。この実証および特定のＰＣＲの実証によって、単離物は、単純疱疹ウイル
スＩとして明確に同定した。
【００９４】
クローン化したウイルスを、さらに、懸濁培養物中の標準培地中で増加し、実施例３に
記載されるような十分なウイルス力価（＞１０６感染単位／ｍＬ）で、種ウイルス産生に
使用した。種ウイルス調製物は、１０７ＣＩＤ５０／ｍＬと１０８ＣＩＤ５０／ｍＬとの
間のウイルス力価を規則的に含んだ。ウイルス力価の決定は、ＨＥＰ−２またはＶｅｒｏ
細胞の当業者に公知である標準的な方法に従って生じたが、接着性ＭＤＣＫ細胞において
もまた生じ得、ここで、力価の評価は、代表的なプラークを参照して実施される。種ウイ
ルス調製物を、−７０℃でアリコート化するか、またはそれ未満で凍結され、発現細胞の
感染のために使用した。後の発現のために、同じＭＤＣＫ細胞ならびに培地および添加物
が同じ培養条件を使用する可能性は、重要な利点である。なぜなら、対応する生成物の記
録の間の文書化の必要性が、有意に減少し、種ウイルスの受容性が改善されるからである
。
【００９５】
（実施例１７：ヒトヘルペスウイルスの産生）
実施例８〜１３に従う単純疱疹ウイルス１（前記実施例に記載される単離物）を用いる
発現細胞の感染について、０．１または０．０１のＭＯＩおよび採取後４８〜９６時間の
インキュベーション時間を選択する。しかし、より長いインキュベーション時間またはよ
り短いインキュベーション時間に対応して、より低いＭＯＩまたはより高いＭＯＩがまた
使用され得、ここで収率は、いくらか変化する。なぜなら、最適な採取時間は、いつも見
いだされないからである。しかし、通常、前述の条件が、好ましく、その結果、経済的な
理由のために続いてのワークアップの容易さのために培養収率は、１０８の５０％培養物
感染単位／ｍＬ（ＣＩＤ５０／ｍＬ）未満には有意に見出されない。このこと以上に、こ
の時間スキームは、正常な仕事のリズムに好ましく適合され得る。０．０００１未満の過
度に低いＭＯＩおよび延ばされたインキュベーション時間は、ほとんどいつも、より低い
収率をもたらし、従って、最適下限である。
【００９６】
（実施例１８：フラビウイルスの増幅）
１〜１．５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を有するＭＤＣＫ３３０１６の細胞の懸濁細
胞培養液を、標準条件（標準培地、３７℃の培養温度および感染温度）下で、Ｃｅｎｔｒ
ａｌ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｋ２３株、Ｎｉｅｄ
ｒｉｇら、１９９４，Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ  ３８：１４１−１４９）で感染
した。以前の実施例から外れて、強く変化するＭＯＩを感染のために使用した。さらに、
感染培養物を、化学的に規定された培地中に一部維持したか、またはタンパク質含有添加
物を有さない培地中に一部維持した。異なる培養物および採取方法を使用し、これは、種
々のパラメーターが変化される場合でさえ、高い収率が、この系を用いて達成され得、さ
らに複数の採取が可能であることを示す。これらの変化は、表３に要約される。ウイルス
滴定をＡ５４９細胞（ＥＣＡＣＣ第８６０１２８０４）において生じ、そしてＣＰＥを参
照して５日後に評価した。同じ培養物の繰り返しの採取が、培養培地の交換によって達成
され、その結果、各採取の間、細胞に新規の培地を供給し、従って、さらに増殖されると
いう事実は、注目に値する。これらの採取なしに、培養物は、より長い期間にわたって、
生存せずそして生産的のままではない。短い間隔での頻繁な培地交換は、培養物の高い代
謝生産を補償しないので、さらなる培地の補充および培養物の増加が、感染時間の４また
は５日後に生じた。
【００９７】
（表３．種々のＭＯＩを使用する標準培地および代替培地中でのＣＥＥウイルス／ＭＤ
ＣＫ  ３３０１６培養液中のＫ２３の増殖ならびに改変体の回収）
【００９８】
【表３】
2010246559.tif 000004
＋（Ｍ＋３０）は、示された日の培養液体積の＋３０％の培地の補充を意味する。
【００９９】
（実施例１９：ピコルナウイルスの増殖）
接着性ＭＤＣＫ  ３３０１６培養物を、５％ウシ胎児血清および重炭酸塩を添加したＭ
ＥＭ培地中で、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ、ＨＭ１７５株、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３５８）
での感染のために培養した（実施例２を参照のこと）。この実験の文脈において、さらな
る「Ｍｕｎｉｃｈ」ウイルス単離物を、使用した（Ｆｒｏｓｎｅｒら、１９７９、Ｉｎｆ
ｅｃｔｉｏｎ  ７：３０３−３０５）。希釈ウイルスを、新たに調製された培養液に播種
し、培養液を３７℃でインキュベートした。培養液を、３〜４日の交互回転中で、１：４
のさらなる継代に供した。
【０１００】
ＭＤＣＫ  ３３０１６の懸濁培養物を、実施例１に従う標準培養液中で培養し、ＨＭ１
７５を播種し、３３℃でインキュベートし、次いで、毎週１：１０の継代に供した。懸濁
培養液中の接着細胞を、感染後３５日間までさらに維持した。次いで、活性なウイルス複
製の検出は、ＣＰＥ（株ＨＭ１７５）によってか、または既に記載された方法（Ｇｒｅｇ
ｅｒｓｅｎら、１９８８；Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：９１
−１００におけるＶｉｒｕｓ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ、第９３頁を参照のこと）に従って生
じた。精製されたＩｇＧとしてのヒト抗ＨＡＶ抗体（名称Ｆ８６０１２、Ｄａｄｅ  Ｂｅ
ｈｒｉｎｇによって親切に供給された）を、異常物としてのウイルス特異的抗体として使
用した。製品番号３９０１５（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．）を、ビオチン標識を有する抗ヒトＩ
ｇＧ抗体として使用した。この系を用いる活性なウイルス増殖の特異的検知によって、顕
微鏡において低倍率で容易に認識される茶色がかったピンク色の細胞が得られる。他方、
ウイルス陰性細胞は、無色に見えるかまたはほんのわずかな色を有する。調製３週間後に
おけるウイルス滴定はまた、同じ検出法で評価され、この方法のために、ヒト二倍体細胞
（ＭＲＣ−５）を、培養系として使用した。
【０１０１】
上記の感染ロットの全てにおいて、そして使用される両方のウイルス単離物で、活性な
ＨＡＶ複製は、ＭＤＣＫ細胞において検出され得る。驚くべき迅速なウイルス増殖を、懸
濁培養液中のＨＭ１７５株で検出した。感染後７日目に、上清中で測定されたウイルス力
価は、１０５．４ＣＩＤ５０／ｍＬであった；この培養物を、毎週、単純な希釈によって
１：１０の継代に供し、７日後に得られた培養物において同様のウイルス力価を得た。培
養の最後および２回のさらなる細胞継代の後に、無細胞培地の１つのサンプル中のウイル
ス力価を決定した。全培養物のサンプルをまた取り、その中に含まれる細胞を、−２０℃
での２回の凍結によって破砕し、そして解凍した。細胞成分を、遠心分離によって除去し
、その後、サンプルを滴定した。このロットから得られたウイルス収量は、表４に要約さ
れ、このウイルス収量は、特定の収量に対する有害な効果なしに、毎週１０倍の培養物の
増殖が可能であり、ここで、体積単位当たりの良好なウイルス力価が、かなりの量の増加
に関わらず、回収され得る。従って、有意な割合のウイルスが上清中に見出され得、この
ことはまた、この強力な細胞結合ウイルスに対して驚くべきことである（表４を参照のこ
と）。
【０１０２】
（表４．連続的増殖および培養液量の増加に対するＭＤＣＫ  ３３０１６懸濁培養液中
のＡ型肝炎ウイルス（ＨＭ１７５株）の増殖）
【０１０３】
【表４】
2010246559.tif 000005
ｎ．ｄ．決定されず
（実施例２０：ラブドウイルスの増殖）
細胞培養フラスコにおいて、実施例１に従う標準培地中の懸濁培養物を、培地１ｍＬ当
たり１×１０６細胞の細胞密度で播種した。培養物の増殖の後、２つの培養物を、０．０
１のＭＯＩを有する狂犬病ウイルス（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ株、ワクチンウイルス株
）で感染し、１つの培養物を、０．００１のＭＯＩを有する狂犬病ウイルスで感染した。
これらの培養物を３７℃でインキュベートし、４日ごとまたは３日ごとにトリプシンを用
いて解離し、そして１：１０比（４日後）または１：８比（３日後）で継代に供し、この
方法で１８日間維持した（表５を参照のこと）。感染の成功を、各継代で追跡した。培養
物に、３．５％のホルマリン溶液を提供し、この溶液中で、室温で３日間インキュベート
し、ウイルスの不活性化を達成した。ホルマリン溶液の除去後、培養物をＰＢＳで洗浄し
、ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００と共に、室温で２５分間インキュベーションし
た。溶液の除去後、この培養物を、ＰＢＳで３回洗浄し、狂犬病ウイルスに対するＦＩＴ
Ｃ標識抗体（５０μＬ  １：４００希釈狂犬病抗体ＩｇＧ  ＦＩＴＣ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈ
ｒｉｎｇ，ＯＳＨＹ  ００５）を適用した。３７℃での９０分のインキュベーション後、
この培養物を、ＰＢＳで再び洗浄し、そしてこの培養物を、倒立蛍光顕微鏡下で評価した
。
【０１０４】
代替として、培養上清のウイルス滴定を、ＭＲＣ−５細胞における標準的方法に従って
実施し、この培養上清をまた、ホルマリン／Ｔｒｉｔｏｎ前処理の後、上記のような免疫
蛍光によって評価した。この系で達成されるウイルス力価によって、対応する生成法にお
いての収量に対する大まかな補正を、認定されたヒトワクチン（Ｒａｂｉｖａｃ）に対す
るＭＲＣ−５培養物を使用して実施し、このワクチンは、どれだけの量のワクチン抗原が
、１ｍＬ当たりの培養収集物に含まれるかについての方向付けを可能にする（表５を参照
のこと）。
【０１０５】
ほんの４日後、両方のロット（ＭＯＩ０．０１および０．００１）が、ポジティブな結
果を示し、次いで同様の感染経路を示したが、低いＭＯＩで、感染経路（１１日目まで、
約１．２〜０．５ｌｏｇＣＩＤ５０までのより低いウイルス力価において認識され得る）
は、わずかに遅らされた。１１日目の培養物の第３の継代から、初期細胞破砕に伴う非常
に強い特定の免疫蛍光が全ての培養物において見出され、次いで、ほとんどの細胞が、１
８日目の第５継代によって完全に破砕され、感染が終了するまで、この免疫蛍光は、さら
に増加した。特定のウイルス含量は、１４日目まで連続的に増加し、次いで、細胞破砕の
増加の結果として再び減少する。この感染経路の結果は、以下の表において要約され、そ
して（狂犬病ウイルスの公知の遅いウイルス増殖において測定される）調節されない非常
に迅速なウイルス増殖が、これらの細胞において予測され、ここで良好な抗原収量が、規
則的な間隔で繰り返し、細胞が継続的に再増殖するにも関わらず、回収され得る。
【０１０６】
（表５．培養体積の連続的増加の間のＭＤＣＫ  ３３０１６培養液中の狂犬病ウイルス
の増殖）
【０１０７】
【表５】
2010246559.tif 000006
類似する様式で、同じウイルスを、実施例１に従う懸濁培養液中に直接播種し、ここで
、０．０００１のＭＯＩを、さらに使用する。標準培地を、全感染経路について再び独占
的に使用し、培養物をまた、１：８または１：１０で１週間に２回移した。移動は、細胞
の新鮮な培地中への単純な希釈および新たな播種によってのみ生じた。ここで、感染の成
功を、上記のように、ＭＲＣ−５細胞中でのウイルス力価滴定のみを参照して追跡した。
３つ全てのＭＯＩでのほんの４日後の感染は、培養上清におけるポジティブなウイルス力
価を生じた。ウイルス力価は、継代の間の７日目の後の最初の希釈損失の後、指数関数的
希釈が再び継続的に実施されたにも関わらず、上昇したが、懸濁培養液中での大量の細胞
破砕物をもたらさなかった。感染を、第８継代（感染後、２８日目）まで追跡し、次いで
、中断した。
【０１０８】
これらの感染由来のウイルスサンプルを、種ウイルスとして凍結し、１００ｍＬから始
められる懸濁培養液の新規の感染のために使用され、標準培地において、そして上記され
る同じ継代条件下で使用された。この場合、ＭＯＩは、０．００００２５まで減少される
。感染を、６細胞継代（２１日）にわたって維持した。転換され、培養上清１ｍＬ当たり
約０．３ワクチン用量を与えるウイルス力価は、かなりの継代希釈に関わらず、この感染
経路の終わりに、ゆっくりとウイルス力価を上昇することによって測定される。ほんの一
部ではなく全培養体積がさらなる継代に供される場合、培養液の約５００Ｌは、６回の継
代後、回収され得、これは、約１５０，０００ワクチン用量に対応するウイルス収量であ
る。
【０１０９】
（実施例２１：パラミクソウイルスの増殖）
パラミクソウイルスの代表として、ＡＴＣＣ  ＶＲ−２８８株を使用した。第３日目を
、回収時間として選択した。なぜなら、ウイルス複製が非常に迅速であるからである。Ｍ
ＤＣＫ  ３３０１６細胞はまた、血清もタンパク質も有さないが、重炭酸塩を添加したＭ
ＥＭ培地中でのより効率的なウイルス複製を伴うパラミクソウイルスについての非常に適
切な滴定系として示された。
【０１１０】
評価および滴定は、５日後に生じた。３７℃での感染後にさらにインキュベーションさ
れた培養物は、１０７．４ＣＩＤ５０／ｍＬを生じた；感染温度が感染時点から３３℃ま
で低下された場合、同じ力価が測定された。
【０１１１】
このウイルスを用いた、接着性培養物と懸濁培養物との間の直接の比較を、実施した。
接着系における最大収率は、感染時の９６時間後で１０６．６ＣＩＤ５０／ｍＬあり、懸
濁培養系は、７２時間後に、比較的、より良好かつより迅速な収量を、１０７．３ＣＩＤ
５０／ｍＬ生じた。
【０１１２】
代替として、実施例２に従う接着性ＭＤＣＫ  ３３０１６細胞を、同じファミリーの別
のウイルス（ＰＩ−３，ＡＴＣＣ  ＶＲ−９３）で、５％ＦＣＳを含むＭＥＭで感染した
。３７℃での１週間のインキュベーションの後、上清は、滴定後、ＣＶ−１細胞（ＥＣＡ
ＣＣ  ８７０３２６０５）中に、少なくとも１０６ＣＩＤ５０／ｍＬを含み、モルモット
赤血球を用いてポジティブな赤血球凝集反応を示し、特定の抗体（Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｃｏ
．製の抗ＰＩ−３  ＭＡｂ−ＦＩＴＣ）でポジティブな免疫蛍光を示した。
【０１１３】
同じウイルス株（ＰＩ−３，ＡＴＣＣ  ＶＲ−９３）をまた、ＭＤＣＫ  ３３０１６培
地中での感染のために、実施例１２と類似した様式での化学的に規定された培地および無
タンパク質培地下で使用した。感染３日目、５日目、９日目および１２日目において、培
養体積の２２％を除去し、そして新鮮な培地と入れ換えた。７日目において、細胞を含む
培養堆積の５０％を除去し、新鮮な培地で置換する。感染の間の全培養体積を、１回より
多く完全に入れ換え、そして希釈に従って、培地の補充による、さらなる細胞の増殖のた
めの機会を提供した。使用された方法は、培養液の全部から大体１：２．４継代までに対
応し、ここでわずかな超過量を除去した。非常により高い培養液の継代または希釈は、特
に開始期において可能であり、ここではっきりと完全に使用されたわけではなかった。
【０１１４】
以下のウイルス収率を測定した。
感染日             ：  ３        ５        ７        ９      １２  １４
ｌｏｇＣＩＤ５０／ｍＬ：７．９  ８．０５  ８．２５  ７．４５  ６．７  ７．０
（２連の試験からの平均値）
（実施例２２：レオウイルスの増殖）
標準培地において、ＭＤＣＫ  ３３０１６細胞の懸濁培養物を、３型レオウイルス（Ｂ
ｉｏ  Ｄｏｃ，Ｈａｎｎｏｖｅｒから得た）を用いて０．０１のＭＯＩで感染し、そして
３３℃または３７℃で３日間または５日間さらにインキュベートした。培養上清のサンプ
ルを、５日後および７日後に取り、３％  ＦＣＳを含むＭＥＭ培地中のＢＨＫ細胞を使用
して供給された系において滴定した。滴定の評価は、７日後に生じた。
【０１１５】
５日後の懸濁培養物のウイルス収量は、３７℃で１０８．１ＣＩＤ５０／ｍＬであり、
３３℃で１０８．０ＣＩＤ５０／ｍＬであった。７日後の、両温度ロットにおける滴定は
、１０８．０ＣＩＤ５０／ｍＬであった。
【０１１６】
同じウイルス株を、０．０１のＭＯＩでの感染のために、ＭＤＣＫ  ３３０１６培養物
中で、実施例１２に類似した化学的に規定された培地および無タンパク質培地下で使用し
た。感染３日目、７日目、および１０日目において、培養体積の２２％を除去し、新鮮な
培地によって入れ換えた。７日目において、細胞を含む培養体積の５０％を、除去し、新
鮮な培地で置換した。従って、感染の間の全培養体積を、ほぼ完全に交換し、希釈に従っ
て、培地補充によってさらに増幅するための機会を細胞に提供した。使用された方法は、
培養液の大体１：２継代に対応し、ここでわずかな超過量を除去した。非常により高い培
養液の継代または希釈は、特に開始期において可能であり、ここではっきりと完全に使用
されたわけではなかった。
【０１１７】
以下のウイルス収率を測定した。
感染日             ：  ３      ７    １０    １４
ｌｏｇＣＩＤ５０／ｍＬ：５．４  ７．１  ６．６  ６．６
（２連の試験からの平均値）
（実施例２３：肺炎ウイルス属の増殖）
５％ＦＣＳおよび重炭酸塩の添加されたＭＥＭ培地中の接着性ＭＤＣＫ３３０１６培養
物（実施例２を参照のこと）を、ヒトＲＳＶ−Ａ（株Ａ−２；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３０２
）での感染のために使用した。このウイルスを、１：１００に希釈し、そして新しく調製
した培地に播種し、次いでその培地を３７℃でインキュベートした。１週間後、１ｍＬの
培養上清を新しい培地に取替え、そして再び７日間インキュベートした。ＭＡ−１０４細
胞（ＥＣＡＣＣ  ８５１０２９１８）の、回収した培養上清は、ＣＰＥによる力価評価の
間に、１０５．５ＣＩＤ５０／ｍＬのウイルス力価を示す。
【０１１８】
ＭＤＣＫ−３３０１６培養物において、ウイルス株Ａ−２（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３０２
）を、実施例１２と類似した、化学的に規定されかつタンパク質を含まない培地での感染
のために使用した。感染の３日目、５日目、７日目、９日目および１２日目に、培養物体
積の２２％をとり、そして新鮮な培地と交換した。７日目に、細胞を含む培養物体積の５
０％を取り出し、そして新しい培地と交換した。全てにおいて、感染の間の培養物の体積
は、完全に一回より多く交換され、これらの細胞が希釈によってさらに増えるように培地
補充の機会を与えた。使用した方法は、培養物のおおよそ１：２．４の継代に全体的に一
致し、ここで、過剰な量だけを除去した。特に開始段階において可能性のある、有意に高
い培養物の継代または希釈は、ここでは十分に活用されなかった。
【０１１９】
以下のウイルス収量を測定した：
【０１２０】
【表６】
2010246559.tif 000007
（二重の試験からの平均値）ｎ．ｔ．：試験していないサンプル、いくぶん非滅菌
ウイルス株ＲＳＶ−Ｂ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１４０１）を、同じロットにおいて試験した
。ウイルス力価測定のために、Ｈｅｐ−２細胞（亜株Ｈｅｐ−２Ｃ、Ｐａｕｌ  Ｅｈｒｌ
ｉｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（以前は、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔによって好意で提供された）
を使用した。なぜなら、代表的なウイルス合胞体は、力価測定により良く開発され、従っ
て評価が容易であるからである。
【０１２１】
以下のウイルス収量を測定した：
【０１２２】
【表７】
2010246559.tif 000008
（二重の試験からの平均値）