(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞膨張化致死毒（cdt）遺伝子を利用した、カンピロバクター属細菌の新規検出方法の提供。【解決手段】複数のカンピロバクター属細菌（Campylobacter jejuni，Campylobacter coli，Campylobacter fetus）の、cdt遺伝子を菌種特異的に増幅できるプライマーを用いたマルチプレックスPCRによる、高い特異性をもって、複数のカンピロバクター属細菌を同時に検出可能な方法。家畜やヒトが複数のカンピロバクター属細菌種に混合感染している場合に、一回の操作によって菌種レベルでカンピロバクターを同定できる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）および（ｂ）記載のプライマー対のうちいずれか１以上のプライマー対を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法。
（ａ）配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｂ）配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項２】
前記核酸増幅反応を前記（ａ）および（ｂ）記載のプライマー対、および下記（ｃ）記載のプライマー対を用いて行う、請求項１記載の方法。
（ｃ）配列番号：５および６記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項３】
前記核酸増幅反応を行う工程の前または後に、カンピロバクター属細菌のcdtA〜CのいずれかのゲノムDNAまたはｍRNAに共通に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる共通プライマー対を用いて核酸増幅反応を行う工程を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記共通プライマー対が、配列番号：７および８に記載の配列からなるプライマー対、配列番号：９および１０に記載の配列からなるプライマー対、配列番号：１１、１２、配列番号：１３、および１４に記載の４配列から２つの配列を組み合わせてなるプライマー対、配列番号：１５および１６に記載の配列からなるプライマー対、配列番号：１７および１８に記載の配列からなるプライマー対のいずれかである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法に用いるためのキットであって、使用説明書と、カンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）および（ｂ）記載のプライマー対のうち少なくとも１のプライマー対を含むキット。
（ａ）配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｂ）配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項６】
さらに下記（ｃ）のプライマー対を含む、請求項５記載のキット。
（ｃ）配列番号：５および６記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項７】
被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記プライマー対（ａ）を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法。
（ａ）配列番号：１９および２０記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項８】
前記核酸増幅反応を、前記プライマー対（ａ）、および下記プライマー対（ｂ）および（ｃ）を用いて行う、請求項７記載の方法。
（ｂ）配列番号：２１および２２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：２３および２４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項９】
請求項７記載の方法に用いるためのキットであって、使用説明書と、カンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）のプライマー対を含むキット。
（ａ）配列番号：１９および２０記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項１０】
さらに下記（ｂ）および（ｃ）のプライマー対を含む、請求項９記載のキット。
（ｂ）配列番号：２１および２２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：２３および２４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項１１】
被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記プライマー対（ａ）を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法。
（ａ）配列番号：２５および２６記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項１２】
前記核酸増幅反応を、前記プライマー対（ａ）、および下記プライマー対（ｂ）および（ｃ）を用いて行う、請求項１１記載の方法。
（ｂ）配列番号：２７および２８記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：２９および３０記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項１３】
請求項１１記載の方法に用いるためのキットであって、使用説明書と、カンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）のプライマー対を含むキット。
（ａ）配列番号：２５および２６記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項１４】
さらに下記（ｂ）および（ｃ）のプライマー対を含む、請求項１３記載のキット。
（ｂ）配列番号：２７および２８記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：２９および３０記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項１５】
被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）から（ｃ）に記載のプライマー対のうちいずれか１以上のプライマー対を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法。
（ａ）配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｂ）配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項１６】
核酸増幅反応が定量的PCR法またはリアルタイム定量的PCR法を用いて行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載の工程をのうちいずれか１以上の工程をさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
（ｉ）配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片を、配列番号：３９に記載のプローブを用いて検出する工程
（ｉｉ）配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片を、配列番号：４２に記載のプローブを用いて検出する工程
（ｉｉｉ）配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片を、配列番号：４５に記載のプローブを用いて検出する工程
【請求項１８】
請求項１５記載の方法に用いるためのキットであって、使用説明書と、カンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）および（ｂ）記載のプライマー対のうち少なくとも１のプライマー対を含むキット。
（ａ）配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｂ）配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
【請求項１９】
配列番号３９、４２、および４５のうち、少なくとも１の検出用プローブをさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンピロバクター（Campylobacter）属に属する細菌の細胞膨張化致死毒を標的とした、検体中のカンピロバクター属細菌の存在の有無を判定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンピロバクター属細菌の菌種同定には、通常培養検査が用いられるが、本属菌が微好気性であること、菌種によっては異なる温度での培養が必要であることに加え、生化学的性状を調べるだけでは困難な菌株があり、煩雑かつ多大な労力を要する。通常、カンピロバクター属細菌の培養検査は、分離、同定まで含めると7から10日という長い時間を要する。
【０００３】
現在、下痢症患者から分離されるカンピロバクター属細菌は約94%がカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni、以下において「C. ジェジュニ」と称す）、4%がカンピロバクター・コリ（Campylobacter coli、以下において「C. コリ」と称す）と両菌種でそのほとんどを占めている。よって、通常、検査現場で行っているカンピロバクター属細菌の検査は、食中毒細菌に指定されているC. ジェジュニとC. コリのみを対象にしていることがほとんどである。また、検査によく使用されている選択培地も、主としてC. ジェジュニおよびC. コリ用に開発された物であり、通常42℃で培養している。その為、温度感受性が異なるカンピロバクター・フィータス（Campylobacter fetus、以下において「C. フィータス」と称す）や他のカンピロバクター属細菌すべてを対象としているとは言い難い。一方、2005年に大阪においてC. フィータスによる集団食中毒も発生している。C. フィータスによる感染はヒトに対して下痢等の胃腸炎のみではなく敗血症や髄膜炎などの重篤な症状を引き起こし、また、動物の感染症においてもウシなどの不妊や流産などの原因となる。そのため、C. フィータスも含めたカンピロバクター属細菌の検査体制を整えることが重要である。
【０００４】
生化学的性状に基づくカンピロバクター属細菌の菌種同定は、迅速性に欠けるだけでなく、カンピロバクター属細菌の生化学的性状は菌種間で酷似しているため、生化学的性状での鑑別は困難なことが多い。特にC. ジェジュニとC. コリの鑑別は、馬尿酸水解酵素活性の有無で行っている為、酵素活性が弱い場合など、C. ジェジュニをC. コリと誤判定しやすいなどの問題がある。そのため検査現場では、PCR法で馬尿酸水解酵素遺伝子の有無を調べる方法が採り入れられている。遺伝子レベルで菌種同定を行う方法として、近年、16S rRNA遺伝子の解析がよく用いられている。しかしながら、16S rRNA遺伝子の解析においても、C. ジェジュニとC. コリでは、極めて相同性が高く、鑑別できない場合が多い。
【０００５】
上記問題を解決すべく、本願発明者等は、カンピロバクター属細菌の細胞膨張化致死毒（Cytolethal Distending Toxin: CDT）に着目してCDTの学術的研究を進めるとともに（非特許文献１、２）、細胞膨張化性致死毒遺伝子（cdtA、cdtB、およびcdtC）を利用したカンピロバクター属細菌の検出方法を開発した（特許文献１）。しかし、カンピロバクター属細菌の発生件数、患者数がともに増加傾向にあることから（厚生労働省「病因物質別食中毒発生状況」）、カンピロバクター属細菌の簡便かつ迅速な同定法について、さらなる開発が期待される。
【特許文献１】WO2005/054472
【非特許文献１】Asakura M. et al., Microbial Pathogenesis 42（2007） 174-183
【非特許文献２】Yamasaki S. et al., Toxin Reviews, 25:61-88, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記状況を鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、cdt遺伝子を利用したカンピロバクター属細菌の新規検出方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく、本発明者等は鋭意研究を行った。C. ジェジュニ、C. コリ、およびC. フィータスのcdt遺伝子を菌種特異的に増幅できるマルチプレックスPCR用プライマーを作製し、多くの臨床分離株を含むカンピロバクター属細菌および他のcdt遺伝子陽性細菌、また、代表的な腸管感染症起因菌を用いてマルチプレックスPCRの評価を行った。また本発明者等は、cdtB増幅用プライマーを用いたマルチプレックスPCRによって、複数のカンピロバクター属細菌を同時に検出することを試みた。その結果、本発明者等によるcdtB増幅用プライマーを用いたマルチプレックスPCRは、高い特異性をもって、複数のカンピロバクター属細菌を同時に検出可能なことが証明された。本発明の方法は、家畜やヒトが複数のカンピロバクター属細菌種に混合感染している場合に、一回の操作によって菌種レベルでカンピロバクター属細菌を同定できる。すなわち本発明は、カンピロバクター属細菌のcdt遺伝子増幅によるカンピロバクター属細菌の検出方法に関し、具体的には以下の発明を提供するものである。
（１）被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）および（ｂ）記載のプライマー対のうちいずれか１以上のプライマー対を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法
（ａ）配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｂ）配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（２）前記核酸増幅反応を前記（ａ）および（ｂ）記載のプライマー対、および下記（ｃ）記載のプライマー対を用いて行う、上記（１）記載の方法
（ｃ）配列番号：５および６記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（３）前記核酸増幅反応を行う工程の前または後に、カンピロバクター属細菌のcdtA〜CのいずれかのゲノムDNAまたはｍRNAに共通に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる共通プライマー対を用いて核酸増幅反応を行う工程を含む、上記（１）または（２）記載の方法、
（４）前記共通プライマー対が、配列番号：７および８に記載の配列からなるプライマー対、配列番号：９および１０に記載の配列からなるプライマー対、配列番号：１１、１２、配列番号：１３、および１４に記載の４配列から２つの配列を組み合わせてなるプライマー対、配列番号：１５および１６に記載の配列からなるプライマー対、配列番号：１７および１８に記載の配列からなるプライマー対のいずれかである、上記（３）記載の方法、
（５）上記（１）記載の方法に用いるためのキットであって、使用説明書と、カンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）および（ｂ）記載のプライマー対のうち少なくとも１のプライマー対を含むキット
（ａ）配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｂ）配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（６）さらに下記（ｃ）のプライマー対を含む、上記（５）記載のキット
（ｃ）配列番号：５および６記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（７）被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記プライマー対（ａ）を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法
（ａ）配列番号：１９および２０記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（８）前記核酸増幅反応を、前記プライマー対（ａ）、および下記プライマー対（ｂ）および（ｃ）を用いて行う、上記（７）記載の方法
（ｂ）配列番号：２１および２２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：２３および２４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（９）上記（７）記載の方法に用いるためのキットであって、使用説明書と、カンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）のプライマー対を含むキット
（ａ）配列番号：１９および２０記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（１０）さらに下記（ｂ）および（ｃ）のプライマー対を含む、上記（９）記載のキット
（ｂ）配列番号：２１および２２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：２３および２４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（１１）被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記プライマー対（ａ）を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法
（ａ）配列番号：２５および２６記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（１２）前記核酸増幅反応を、前記プライマー対（ａ）、および下記プライマー対（ｂ）および（ｃ）を用いて行う、上記（１１）記載の方法
（ｂ）配列番号：２７および２８記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：２９および３０記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（１３）上記１１記載の方法に用いるためのキットであって、使用説明書と、カンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）のプライマー対を含むキット
（ａ）配列番号：２５および２６記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（１４）さらに下記（ｂ）および（ｃ）のプライマー対を含む、上記（１３）記載のキット
（ｂ）配列番号：２７および２８記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：２９および３０記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（１５）被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）から（ｃ）に記載のプライマー対のうちいずれか１以上のプライマー対を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法
（ａ）配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｂ）配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（１６）核酸増幅反応が定量的PCR法またはリアルタイム定量的PCR法を用いて行われる、上記（１５）に記載の方法、
（１７）以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載の工程をのうちいずれか１以上の工程をさらに含む、上記（１５）または（１６）に記載の方法
（ｉ）配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片を、配列番号：３９に記載のプローブを用いて検出する工程
（ｉｉ）配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片を、配列番号：４２に記載のプローブを用いて検出する工程
（ｉｉｉ）配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片を、配列番号：４５に記載のプローブを用いて検出する工程、
（１８）上記（１５）記載の方法に用いるためのキットであって、使用説明書と、カンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる下記（ａ）および（ｂ）記載のプライマー対のうち少なくとも１のプライマー対を含むキット
（ａ）配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｂ）配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対
（ｃ）配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対、
（１９）配列番号３９、４２、および４５のうち、少なくとも１の検出用プローブをさらに含む、上記（１８）に記載のキット。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本明細書において「細胞膨張化致死毒」とは、cytolethal distending toxin （CDTまたはCLDT）と呼ばれる、蛋白性のA-B型ホロトキシンのグループに属する毒素因子を指す。このものは、ほかに細胞膨化致死毒（素）、細胞膨潤化致死毒（素）などと称されることもある。細胞膨張化致死毒は、A,B,Cの３ユニットからなるサブユニット構造を有し、Bサブユニットが毒素活性中心ユニットであり、AおよびBサブユニットが細胞接着に関わっていると考えられている。細胞に作用すると細胞が大きく膨らむ等の変形が生じ、最終的に細胞死を引き起こす。毒素原性大腸菌が産生する易熱性エンテロトキシン（LT）などを実験的に細胞に作用させた場合にも細胞が大きく膨らむ等の変形が見られるが、毒素を取り除いた場合、細胞は回復し、致死することはない。しかしながら、CDTを除去しても細胞は回復せず、死に至る。
【０００９】
本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」とは、複数の塩基または塩基対からなるリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドの重合体を意味する。ポリヌクレオチドは、RNA、一本鎖型および二本鎖型のDNAを含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む意である。修飾された塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。
【００１０】
本明細書において用いられる「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸からなる重合体を意味する。従って、オリゴペプチドおよびタンパク質もまた、ポリペプチドの概念に含まれる。ポリペプチドは、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む意である。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、ユビキチン化などが含まれる。
【００１１】
本明細書において用いられる「変異」とは、アミノ酸配列におけるアミノ酸の変化または塩基配列における塩基の変化（すなわち単一または複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換、欠失、付加または挿入）を指す。従って、本明細書において用いられる「変異体」は、一つ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列または一つ以上の塩基が変化している塩基配列を指す。この変異体の塩基配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。変異体はアレリック変異体のように天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。変異体は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する保存的変化を有しうる。まれに、変異体は、非保存的置換を有しうる。生物学的または免疫学的活性を阻害することなく、いずれの、およびどれほど多くのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失するかを決定する手引きは、当技術分野において周知のコンピュータープログラム、例えばDNAスター・ソフトウェアを用いて発見することができる。
【００１２】
「欠失」はその中で１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基がそれぞれ、天然に存在する細胞膨張化致死毒ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して存在しない、アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれかの変化である。
【００１３】
「挿入」または「付加」は、天然に存在する細胞膨張化致死毒ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、それぞれアミノ酸またはヌクレオチド残基１つ以上が付加されたアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。
【００１４】
「置換」とは、天然に存在する細胞膨張化致死毒ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、アミノ酸またはヌクレオチド１つ以上がそれぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドに入れ替えられたアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。
【００１５】
本明細書において用いられる「ハイブリダイズ」とは、核酸鎖が塩基対形成を通じて相補鎖と結合するプロセスを意味する。
【００１６】
本明細書において「検出」とは、定性および定量の両方の意味を含む。また、「定量」には半定量も含まれる。
【００１７】
<被検試料中のカンピロバクター属細菌の存在の検出>
本発明は、被検試料中のカンピロバクター属細菌の存在の検出方法を提供する。被検試料中のカンピロバクター属細菌の存在の検出は、カンピロバクター感染症の診断、カンピロバクター属細菌に汚染された食品の迅速診断、食品加工工程のバリデーション、食中毒発生時における起因菌の同定など種々の目的において有用である。
【００１８】
本発明の検出方法の第一の態様は、被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる「（ａ）配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」および「（ｂ）配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」のうちいずれか1以上のプライマー対を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法である。
【００１９】
上記方法は、C.ジェジュニおよびC.フィータスについて、それぞれのcdtBゲノムDNAまたはｍRNAに特異的な領域を増幅することにより、細菌を検出する方法である。上記方法において使用するプライマーとしては、C.ジェジュニについては、第一に「配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cj-CdtBU5およびCj-CdtBR6）」を挙げることができるが、上記配列そのものに限られず、C.ジェジュニのcdtBゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなるプライマー対であって、C.ジェジュニのcdtBゲノムDNAを鋳型として「配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対」によって増幅される領域または相当するｍRNA領域を増幅可能なプライマー対であれば、他の配列であっても使用することができる。本明細書において「特異的に結合」とは、「結合」から、偶発的な結合（非特異的な結合）を排除する意図である。「配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対」が結合するC.ジェジュニ 81−176株のcdtBゲノムDNA（配列番号：３１）の位置を図５に示す。また配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対によって、C.ジェジュニ ATCC33560株（DDBJ Accession No.：AB274783）またはC.ジェジュニ ATCC43432株（DDBJ Accession No.：AB274784）のゲノムDNAを増幅すると、714bpの増幅産物が得られる。
【００２０】
また、C.フィータスについては、第一に「配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cf-CdtBU6およびCf-CdtBR3）」を挙げることができるが、上記配列そのものに限られず、C.フィータスのcdtBゲノムDNAを鋳型として「配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対」によって増幅される領域または相当するｍRNA領域を増幅可能なプライマー対であれば、他の配列であっても使用することができる。「配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対」が結合するC.フィータス Co1−187株のcdtBゲノムDNA（配列番号：３２）の位置を図６に示す。また配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対によって、C.フィータス ATCC27374株（DDBJ Accession No.：AB274802）、ATCC19438株（DDBJ Accession No.：AB274803）のゲノムDNAを増幅すると、553bpの増幅産物が得られる。
【００２１】
本発明の方法は、「（ａ）配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」と「（ｂ）配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」とを別々に用いてもよいが、単一の核酸増幅反応において両方のプライマー対を同時に使用することもできる。実施例のように、複数のPCRプライマーを単一の反応系で使用するPCRは、マルチプレックスPCR法と呼ばれ、PCR産物を電気泳動し、バンドのサイズを見ることで複数の菌種を同時に鑑別することができる。本発明は、このマルチプレックスPCR法を代表とする、複数の核酸領域の増幅に好適に用いられるプライマーおよびその組み合わせを用いた核酸増幅法によるカンピロバクター属細菌の検出方法を提供する。本発明における核酸増幅の方法は、目的とする増幅物が得られる限り種類は問わない。PCR法は、本発明において好ましい核酸増幅法の具体例である。本発明の方法は、リアルタイムPCR法などによって、定量法として実施してもよい。
【００２２】
本発明の方法は、上記「（ａ）配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」および／または「（ｂ）配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」とともにC.コリのcdtBゲノムDNAに特異的な領域を増幅するプライマー：「（ｃ）配列番号：５および６記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」を単一の核酸増幅反応系において使用することができる。すなわち本発明は、被験試料中のC.ジェジュニ、C.フィータス、およびC.コリの3種カンピロバクター属細菌を同時に検出可能な方法を提供する。本発明者等は、上記3種のプライマーを同時に用いて核酸増幅反応を行い、C.ジェジュニ、C.フィータス、およびC.コリの3種カンピロバクター属細菌を一度に検出可能であることを確認した。実施例に示すように、本発明の方法は、目的とするカンピロバクター属細菌を確実に検出する一方、他の種のカンピロバクター属細菌を誤検出することなく、極めて特異性が高い方法である。「配列番号：５および６記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cc-CdtBU5およびCc-CdtBR5）」が結合するC.コリ Co1−243株のcdtBゲノムDNA（配列番号：３３）の位置を図７に示す。
【００２３】
本発明の方法は、上述した、C.ジェジュニ、C.フィータス、C.コリに対する特異的プライマーを用いて核酸増幅反応を行う工程の後に、「カンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAまたはｍRNAの増幅断片の有無または該増幅断片の分子量から、カンピロバクター属細菌の存在を判定する工程」または「カンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAまたはｍRNAの増幅断片量を定量する工程」を含む。
【００２４】
また本発明の方法は、C.ジェジュニ、C.フィータス、C.コリに対する特異的プライマーを用いて核酸増幅反応を行う工程の前または後に、「カンピロバクター属細菌のcdtA〜CのいずれかのゲノムDNAまたはｍRNAに共通に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる共通プライマー対を用いて核酸増幅反応を行う工程」を行うことができる。上記「カンピロバクター属細菌のcdtA〜CのいずれかのゲノムDNAまたはｍRNAに共通に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる共通プライマー対」とは、C.ジェジュニ、C.フィータス、およびC.コリの全ての細菌について、cdtA、cdtB、およびcdtCのいずれかのcdtをコードするゲノムDNAを増幅しうるプライマー対、またはC.ジェジュニ、C.フィータス、およびC.コリの全ての細菌について、cdtA、cdtB、およびcdtCのいずれかのcdtをコードするｍRNAを増幅しうるプライマー対を意味する。このようなプライマーの具体例としては、本願実施例で使用した配列番号：７および８に記載の配列からなるプライマー対（実施例cdtB共通プライマー：C-CdtBcom1および（C-CdtBcom2）を挙げることができる。上記プライマー対のほか、配列番号：９（WO2005/054472 配列番号：7）および１０（WO2005/054472 配列番号：8）に記載の配列からなるプライマー対（cdtB共通プライマー対）、配列番号：１１（WO2005/054472 配列番号：47）、１２（WO2005/054472 配列番号：48）、配列番号：１３（WO2005/054472 配列番号：49）、および１４（WO2005/054472 配列番号：50）に記載の４配列から２つの配列を組み合わせてなるプライマー対（cdtB共通プライマー対）、配列番号：１５（WO2005/054472 配列番号：64）および１６（WO2005/054472 配列番号：65）に記載の配列からなるプライマー対（cdtA共通プライマー対）、配列番号：１７（WO2005/054472 配列番号：66）および１８（WO2005/054472 配列番号：67）に記載の配列からなるプライマー対（cdtC共通プライマー対）、も好適に使用できる共通プライマー対である。上記共通プライマー対がC.ジェジュニ、C.フィータス、およびC.コリの全ての細菌について、cdtA、cdtB、およびcdtCのいずれかのcdtをコードするゲノムDNAを増幅しうることについては、WO2005/054472において詳細に説明されている。上記「カンピロバクター属細菌のcdtA-CゲノムDNAまたはｍRNAに共通に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなる共通プライマー対」を用いた核酸増幅反応を、C.ジェジュニ、C.フィータス、C.コリに対する特異的プライマーを用いた核酸増幅反応と組み合わせて行うことにより、カンピロバクター属細菌検出における感度向上が期待できる。上述したとおり、上記プライマー対は少なくともC.コリ、C.ジェジュニ、およびC.フィータス３菌種の細胞膨張化致死毒をコードするゲノムDNAまたはｍRNAを共通して増幅する共通プライマー対である。上記共通プライマー対は、上記３菌種のみならず、その他のカンピロバクター属細菌の細胞膨張化致死毒をコードするゲノムDNAまたはｍRNAを増幅すると期待できる。また同様に、該プライマー対と同一のゲノムDNA領域または相当するｍRNA領域を増幅しうるプライマー対についても、上記３菌種を共通して該ゲノム領域または相当するｍRNA領域を増幅することができ、その他のカンピロバクター属細菌の該ゲノム領域または相当するｍRNA領域を増幅することができると考えられる。
【００２５】
本発明の方法の第二の態様は、被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなるプライマー対「（ａ）配列番号：１９および２０記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法、である。上記方法は、C.コリのcdtAゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合するプライマー対によってcdtAゲノムDNAまたはｍRNAの一部を増幅し、増幅断片の有無または増幅断片の分子量から、C.コリの検出を可能とする。上記プライマーの具体例は、「配列番号：１９および２０に記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cc-CdtAU1およびCc-CdtAR1）」である。上記第二の態様の方法は、上記プライマー対（ａ）に加え、カンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなるプライマー対「（ｂ）配列番号：２１および２２記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cj-CdtAU2およびCj-CdtAR2）によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」、および／または「（ｃ）配列番号：２３および２４記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー： Cf-CdtAU1およびCf-CdtAR1）によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」を同時に使用することにより、C.コリと同時に、C.ジェジュニおよびC.フィータスのいずれかまたは両方をも検出することが可能である。
【００２６】
本発明の方法は、上述した、C.ジェジュニ、C.フィータス、C.コリに対する特異的プライマーを用いて核酸増幅反応を行う工程の後に、「カンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAまたはｍRNAの増幅断片の有無または該増幅断片の分子量から、カンピロバクター属細菌の存在を判定する工程」または「カンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAまたはｍRNAの増幅断片量を定量する工程」を含む。本発明における増幅断片は、DNAでもRNAでもよい。
【００２７】
本発明の方法の第三の態様は、被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなるプライマー対「（ａ）配列番号：２５および２６記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cc-CdtCU1およびCc-CdtCR1）によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法、である。上記方法は、C.コリのcdtCゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合するプライマー対によってcdtCゲノムDNAまたはｍRNAの一部を増幅し、増幅断片の有無または増幅断片の分子量から、C.コリの検出を可能とする。上記第三の態様の方法は、上記プライマー対（ａ）に加え、カンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなるプライマー対「（ｂ）配列番号：２７および２８記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cj-CdtCU1およびCj-CdtCR2）によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」、および／または「（ｃ）配列番号：２９および３０記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cf-CdtCU2およびCf-CdtCR1）によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」を同時に使用することにより、C.コリと同時に、C.ジェジュニおよびC.フィータスのいずれかまたは両方をも検出することが可能である。
【００２８】
本発明の方法は、上述した、C.ジェジュニ、C.フィータス、C.コリに対する特異的プライマーを用いて核酸増幅反応を行う工程の後に、「カンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAまたはｍRNAの増幅断片の有無または該増幅断片の分子量から、カンピロバクター属細菌の存在を判定する工程」または「カンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAまたはｍRNAの増幅断片量を定量する工程」を含む。
【００２９】
本発明の方法の第四の態様は、被験試料中のカンピロバクター属細菌を検出する方法であって、カンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなるプライマー対「（ａ）配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」、「（ｂ）配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」および「（ｃ）配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」のうちいずれか１以上のプライマー対を用いて被験試料に対し核酸増幅反応を行う工程を含む方法である。
【００３０】
上記方法は、C.ジェジュニ、C.コリおよびC.フィータスについて、それぞれのcdtCゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合するプライマー対によってcdtCゲノムDNAまたはｍRNAの一部を増幅し、増幅断片の有無または増幅断片の分子量から、細菌を検出する方法である。
【００３１】
上記方法において使用するプライマーとしては、C.ジェジュニについては、第一に「配列番号：３７および３８に記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cj cdtRTU2およびCj cdtRTR2）」を挙げることができるが、上記配列そのものに限られず、C.ジェジュニのcdtCゲノムDNAまたはｍRNAに特異的に結合しうる２つのポリヌクレオチドからなるプライマー対であって、C.ジェジュニのcdtCゲノムDNAを鋳型として「配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対」によって増幅される領域または相当するｍRNA領域を増幅可能なプライマー対であれば、他の配列であっても使用することができる。「配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対」が結合するC.ジェジュニ 計11株のcdtCゲノムDNAの位置を図１２に示す。また配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって、C.ジェジュニの変異欠損型cdt遺伝子（アクセッション番号：AY442300）についても増幅産物が得られる。
【００３２】
また、C.コリについては、第一に「配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cc cdtRTU5およびCc cdtRTR5）」を挙げることができるが、上記配列そのものに限られず、C.コリのcdtCゲノムDNAを鋳型として「配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対」によって増幅される領域または相当するｍRNA領域を増幅可能なプライマー対であれば、他の配列であっても使用することができる。「配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対」が結合するC.コリ 計18株のcdtCゲノムDNAの位置を図１３に示す。
【００３３】
さらに、C.フィータスについては、第一に「配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cf cdtRTU1およびCf cdtRTR1）」を挙げることができるが、上記配列そのものに限られず、C. フィータスのcdtCゲノムDNAを鋳型として「配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対」によって増幅される領域または相当するｍRNA領域を増幅可能なプライマー対であれば、他の配列であっても使用することができる。「配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対」が結合するC. フィータス 計12株のcdtCゲノムDNAの位置を図１５に示す。また配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって、タイで分離されたC.フィータスC 90株のcdt遺伝子についても増幅産物が得られる。
【００３４】
本発明の方法は、「（ａ）配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」、「（ｂ）配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」および「（ｃ）配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」とを別々に用いてもよいが、単一の核酸増幅反応において３種のプライマー対を組み合わせて、同時に使用することもできる。本発明は、マルチプレックスPCR法を代表とする、複数の核酸領域の増幅に好適に用いられるプライマーおよびその組み合わせを用いた核酸増幅法によるカンピロバクター属細菌の検出方法を提供する。本発明における核酸増幅の方法は、目的とする増幅物が得られる限り種類は問わない。PCR法は、本発明において好ましい核酸増幅法の具体例である。
【００３５】
本発明の方法は、上述した、C.ジェジュニ、C.フィータス、C.コリに対する特異的プライマーを用いて核酸増幅反応を行う工程の後に、「カンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAまたはｍRNAの増幅断片の有無または該増幅断片の分子量から、カンピロバクター属細菌の存在を判定する工程」または「カンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAまたはｍRNAの増幅断片量を定量する工程」を含む。
【００３６】
増幅断片量を定量する工程は、リアルタイムPCR法などによって実施してもよい。リアルタイムPCR法とは、PCRの増幅量をリアルタイムでモニターし解析する方法であり、核酸断片増幅後の電気泳動が不要で、迅速性と定量性に優れている。本発明における、リアルタイムPCR法による菌体量の定量の一例として、まず段階希釈した既知量の菌体サンプルから調整したDNAをスタンダードとしてPCRを行い、増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（threshold;Ct値）を横軸に、初発のDNA量を縦軸にプロットし、検量線を作成する。その後、被検試料についても同様の条件下で反応を行いCt値を求め、検量線から被検試料におけるDNAを測定し、菌体の定量を行う。
【００３７】
リアルタイムPCRのモニターは一般的に蛍光試薬を用いて行われ、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置にて行う。蛍光モニター法には、インターカレーターを用いる方法や、TaqManプローブ法など既知の方法が挙げられるが、これに限定されない。
本発明における、リアルタイムPCR法を用いた本発明の核酸増幅断片の検出には、例えば、「（ｉ）配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片の検出に使用できる、配列番号：３９に記載のプローブ（実施例プローブ：Cj RTP2）」、「（ｉｉ）配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片の検出に使用できる、配列番号：４２に記載のプローブ（実施例プローブ：Cc RTP5）」および「（ｉｉｉ）配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片の検出に使用できる、配列番号：４５に記載のプローブ（実施例プローブ：Cf RTP1）」のうちいずれか１以上のプローブを用いることができる。
【００３８】
これらのプローブは、適宜検出可能な標識が付加されていることが好ましい。標識成分としては蛍光物質、放射性同位元素、発光物質、酵素活性物質、あるいは磁気的に観察可能な物質などが用いられる。本発明において最も好ましい標識としては、蛍光標識が挙げられる。
【００３９】
リアルタイムPCRの検出に用いる場合には、プローブの5’末端を蛍光物質、3’末端をクエンチャー物質で修飾する。PCRの伸長反応ステップの際にDNAポリメラーゼの5'→3’エキソヌクレアーゼ活性により、PCRの鋳型となるDNA領域にハイブリダイズしたプローブが分解されることで、クエンチャーにより抑制されていた蛍光が発せられ、増幅断片の定量が可能となる。本発明において修飾に用いる蛍光物質の例としては、FAM、TAMRA、Orange560などが挙げられるがこれに限定されない。また、クエンチャー物質の例としてはBHQ（ブラックホールクエンチャー）などが挙げられるが、これに限定されない。実施例のように、それぞれのプローブに異なる蛍光標識を付加することによって、同時に複数の核酸増幅断片を検出することが可能である。
【００４０】
本発明の方法により、ヒトまたは動物の各種生体試料（例えば、糞便、直腸等のスワブ検体）、食品中のC.コリ、C.ジェジュニ、およびC.フィータスの存在について、簡便かつ迅速に、菌種毎に知ることができる。本発明の方法を実施する際は、カンピロバクター属細菌の存在が疑われる生体試料や食品等から当業者に周知のポリヌクレオチド調製方法（ボイル法等）によってポリヌクレオチドを調製し、得られたポリヌクレオチドを本発明の被験試料とすることができる。
【００４１】
<キット>
本発明は、上記本発明の検出方法に用いるためのキットを提供する。これらキットは、本発明のプライマー対の他、使用説明書を含むものである。さらなる他の要素、例えば、蛍光プローブ、インターカレーター、ポリヌクレオチド調製用の試薬、陽性または陰性プライマー対などを含んでいてもよい。
【００４２】
本発明のキットの第一の態様は、「（ａ）配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」、および「（ｂ）配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」のうち、少なくとも１のプライマー対を含むキットである。上記プライマー対（ａ）はC.ジェジュニについて、上記プライマー対は（ｂ）C.フィータスについて、それぞれのcdtBゲノムDNAまたはｍRNAに特異的な領域（特徴的に存在する領域）を増幅する。
【００４３】
上記プライマーとしては、C.ジェジュニについては、第一に「配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cj-CdtBU5およびCj-CdtBR6）」を挙げることができるが、上記配列そのものに限られず、C.ジェジュニのcdtBゲノムDNAまたはｍRNAを鋳型として「配列番号：１および２記載の配列からなるプライマー対」によって増幅される領域または相当するｍRNA領域を増幅可能なプライマー対であれば、他の配列のポリヌクレオチドであっても使用することができる。
【００４４】
同様に、C.フィータスについては、第一に「配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cf-CdtBU6およびCf-CdtBR3）」を挙げることができるが、上記配列そのものに限られず、C.フィータスのcdtBゲノムDNAまたはｍRNAを鋳型として「配列番号：３および４記載の配列からなるプライマー対」によって増幅される領域または相当するｍRNA領域を増幅可能なプライマー対であれば、他の配列のポリヌクレオチドであっても使用することができる。
【００４５】
このような本発明のプライマー対を構成する「他の配列のポリヌクレオチド」は、C.ジェジュニまたはC.フィータスのcdtBゲノムDNAまたはmRNAに相補的な、少なくとも15塩基または20塩基以上の鎖長を有するポリヌクレオチド、例えば、15〜100塩基、20〜100塩基、15〜35塩基長、20〜35塩基長のポリヌクレオチドである。ここで「相補鎖」とは、A:T（ただしRNAの場合は U）、G:Cの塩基対からなる2本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものの他、当業者が相同性を決定するために通常使用するアルゴリズムを使用することができる。上記「本発明のプライマー対を構成する他のポリヌクレオチド」は、ハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、cdtBゲノムDNAとハイブリダイズし、他のポリペプチドをコードするDNAとはハイブリダイズしない。また本発明のプライマー対は、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、各種カンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAに共通する領域にはハイブリダイズしない。上記「本発明のプライマー対を構成する他の配列のポリヌクレオチド」は、例えば、配列番号：１、２、配列番号：３および４のいずれかの記載の塩基配列に１または複数の塩基（例えば１〜１０個または１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個の塩基）が付加、欠失、置換および／または挿入した塩基配列からなる、少なくとも15塩基または20塩基以上の鎖長を有するポリヌクレオチドである。
【００４６】
上記「本発明のプライマー対を構成する他の配列のポリヌクレオチド」は、当業者であれば、上記配列番号に記載のポリヌクレオチド配列、および／または公知cdtBゲノムDNA配列にもとづき、適宜設計し、合成により調製することができる。また、上記のように調製したポリヌクレオチドが、変異前のプライマー対と同一のゲノムDNA領域を増幅しうるかは、該調製した変異プライマーを用いて核酸増幅反応を行い、その増幅産物を分析することにより、簡便に評価することができる。
【００４７】
本発明のキットは、C.ジェジュニcdtBゲノムDNAまたはｍRNAに特異的な領域を増幅する上記プライマー対（ａ）、およびC.フィータスcdtBゲノムDNAまたはｍRNAに特異的な領域を増幅する上記プライマー対に加え、C.コリcdtBゲノムDNAまたはｍRNAに特異的な領域を増幅するプライマー対を含むことができる。このように、C.ジェジュニ、C.フィータス、C.コリの3種それぞれについて特異的なプライマー対をすべて含む本発明のキットは、マルチプレックスPCR法等により、上記カンピロバクター属細菌の混合感染を一度に検出することができる。上記C.コリcdtBゲノムDNAに特異的な領域を増幅するプライマー対としては、「配列番号：５および６記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cc-CdtBU5およびCc-CdtBR5）」、および該「配列番号：５および６記載の配列からなるプライマー対」によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtBゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるその他のプライマー対を挙げることができる。
【００４８】
本発明のキットの第二の態様は、本発明のプライマー対として、「（ａ）：配列番号：１９および２０記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cc-CdtAU1およびCc-CdtAR1）によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」を含むキットである。上記プライマー対（ａ）は、C.コリのcdtAに特異的に結合する。上記第二の態様のキットは、上記プライマー対（ａ）に加え、プライマー対「（ｂ）配列番号：２１および２２記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cj-CdtAU2およびCj-CdtAR2）によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」、および／または「（ｃ）配列番号：２３および２４記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cf-CdtAU1およびCf-CdtAR1）によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtAゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」を含むことができる。上記プライマー対（ａ）に加え、プライマー対（ｂ）および／または（ｃ）を含むキットは、マルチプレックスPCR法等により、上記カンピロバクター属細菌の混合感染を一度に検出することができると考えられる。
【００４９】
本発明のキットの第三の態様は、本発明のプライマー対として、「（ａ）配列番号：２５）および２６記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cc-CdtCU1およびCc-CdtCR1）によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」を含むキットである。上記プライマー対（ａ）は、C.コリのcdtCに特異的に結合する。上記第三の態様のキットは、上記プライマー対（ａ）に加え、プライマー対「（ｂ）配列番号：２７および２８記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cj-CdtCU1およびCj-CdtCR2）によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」、および／または「（ｃ）配列番号：２９および３０記載の配列からなるプライマー対（実施例プライマー：Cf-CdtCU2およびCf-CdtCR1）によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtCゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対」を含むことができる。上記プライマー対（ａ）に加え、プライマー対（ｂ）および／または（ｃ）を含むキットは、マルチプレックスPCR法等により、カンピロバクター属細菌の混合感染を一度に検出することができると考えられる。
【００５０】
本発明のキットの第四の態様は、本発明のプライマー対として、「（ａ）配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対（実施例プライマー：Cj cdtRTU2およびCj cdtRTR2）」、「（ｂ）配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対（実施例プライマー：Cc cdtRTU5およびCc cdtRTR5）」および「（ｃ）配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるカンピロバクター属細菌のcdtゲノムDNAの領域、または増幅される前記ゲノムDNAの領域に相当するｍRNAの領域を増幅しうるプライマー対（実施例プライマー：Cf cdtRTU1およびCf cdtRTR1）」のうち、少なくとも１のプライマー対を含むキットである。上記プライマー対（ａ）、プライマー対（ｂ）および／または（ｃ）を含むキットは、マルチプレックスPCR法等により、カンピロバクター属細菌の混合感染を一度に検出することができると考えられる。
さらに、上記キットには、「（ｉ）配列番号：３７および３８記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片の検出に使用できる、配列番号：３９に記載のプローブ（実施例プローブ：Cj RTP2）」、「（ｉｉ）配列番号：４０および４１記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片の検出に使用できる、配列番号：４２に記載のプローブ（実施例プローブ：Cc RTP5）」および「（ｉｉｉ）配列番号：４３および４４記載の配列からなるプライマー対によって増幅される核酸断片の検出に使用できる、配列番号：４５に記載のプローブ（実施例プローブ：Cf RTP1）」のいずれか１以上の検出用プローブが含まれていてもよい。
【００５１】
さらに本発明のキットは、上述した共通プライマー対のいずれか1つ以上を含むことができる。
【００５２】
本発明のキットを用いて行う核酸増幅反応の種類は、目的とする増幅産物が得られる限り、特に制限はない。例えば、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法（RT-PCR法を含む）、ICAN法、LAMP法、SDA法、LCR法、NASBA法等、公知の核酸増幅反応の中から選択することができる。好適な方法としては、PCR法を示すことができる。
【００５３】
本発明のキットは、上記プライマー対および使用説明書の他に、他の構成要素を含むことができる。他の構成要素として、たとえば、陽性プライマー、陰性プライマー、ポリヌクレオチド調製用試薬、蛍光標識プローブ等を含むことができるが、これらに限定されない。陽性プライマーは、当業者であればカンピロバクター属細菌の公知配列から適宜設計して作ることができる。カンピロバクター属細菌の公知配列はデータベースから容易に入手でき、例えば、C.ジェジュニ ATCC 33560株の16SrRNA配列はアクセッション番号：M59298（配列番号：３４）によって、C.コリ ATCC 33559株16SrRNA配列はアクセッション番号：M59073（配列番号：３５）によって、C.フィータス ATCC 27374株16SrRNA配列はアクセッション番号：M65012（配列番号：３６）によって、入手可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００５５】
［１.材料と方法］
（１−１  菌株）
ATCC、患者および動物由来のカンピロバクター属細菌、カンピロバクター属細菌以外のcdt遺伝子陽性菌およびその他の腸管感染症菌を使用した（表１）。また、PCRの陽性コントロールとしてC.ジェジュニ（C. jejuni）Co1-008株、C.コリ（C. coli） Co1-243株、C.フィータス（C. fetus Co1-187株）を使用し、陰性コントロールとして大腸菌 E. coli C600株を使用した。
【００５６】
［表１］
（CdtB遺伝子を標的としたマルチプレックスPCRの評価に用いたカンピロバクター属細菌、カンピロバクター属細菌以外のCdt陽性細菌、およびその他の腸管感染症菌）
2010130901.tif 000003
2010130901.tif 000004
【００５７】
（１−２  培地および培養条件、試薬、酵素）
カンピロバクター属細菌および大腸菌、Shigella属細菌の培養は、以下のように行った。カンピロバクター属細菌の培養には、CM271 BLOOD AGAR BASE  No.2 （Oxoid、Basingstoke、UK） [7.5 g Proteose peptone、1.25 g Liver digest、2.5 g Yeast extract、2.5 g NaCl、6.0 g Agar/500 mL distilled water (DW)、pH 7.4±0.2 at 25℃] に馬無菌脱繊血（日本生物材料センター、東京）を5%となるように添加した馬血液寒天培地およびCampylobacter selective supplement (Skirrow) (OXOID) (5 mg Vancomycin、2.5 mg Trimethoprim Lactate、1,250 i.u. Polymyxin B/500 mL) を加えた培地 （以下Skirrow培地） を用いた。カンピロバクター属細菌の培養は37℃で2から 4日間、LOW TEMPERATURE O2/CO2 INCUBATER MODEL-9200（和研薬、東京）を用いた微好気条件下（10%CO2、5%O2、85%N2）で行った。大腸菌は、LB-Lenox液体培地 (Difco Laboratories、Detroit、MI、USA) (5.0 g Bacto tryptone、2.5 g Bacto yeast extract、2.5 g NaCl/500 mL DW) 、LB-Lenox寒天培地 (Difco Laboratories) (5.0 g Bacto tryptone、2.5 g Bacto yeast extract、2.5 g NaCl、Agar 7.5 g/500 mL DW) を使用し、37℃で16から20時間培養した。
【００５８】
ヘリコバクター・ へパティカス（H. hepaticus）は、Brucella Agar (Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ、 USA) (5 g Proteose peptone、5 g Pancreatic digest of casein、0.5 g Dextrose、1 ｇ Yeast extract、2.5 ｇ NaCl、6.0 g Agar/500 mL DW、 pH 7.4±0.2 at 25℃) に終濃度が5%となるように羊無菌脱繊血（日本生物材料センター）を添加した羊血液寒天培地を用いて、37℃で12日間、微好気条件下（10%CO2、5%O2、85%N2）で行った。
【００５９】
軟性下疳菌 Haemophilus ducreyi（H. ducreyi）は、Solution A [25 g Heart infusion broth (Difco Laboratories)、15 g Agar /500 mL DW、 pH 7.4±0.2 at 25℃] とSolution B [10 g Hemoglobin (Becton Dickinson) /500 mL DW] を121℃ 15分間高圧蒸気滅菌した物とSolution C [Fetal bovine serum 100 mL (Invitrogen)、IsoVitaleX (Becton Dickinson) 10 mL] をフィルター濾過した物を混合して調製した培地を用いて37℃で7日間、微好気条件下（10%CO2、5%O2、85%N2）で行った。
【００６０】
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス Actinobacillus actinomycetemcomitans（A. actinomycetemcomitans ）は、 Trypticace soy agar (Becton Dickinson) (2.5 g Papaic digest of soybean meal、7.5 g Pancreatic digest of casein、2.5 ｇ NaCl、7.5g Agar/500 mL DW、 pH 7.3±0.2 at 25℃) に0.6% Yeast extract (Difco Laboratories) を加えた培地で 10%CO2 と90%の空気を含む条件下で37℃、2日間培養した。 
【００６１】
サルモネラ菌（Salmonella spp.） は、Trypticace soy broth (Becton Dickinson) (1.5 g Papaic digest of soybean meal、8.5 g Pancreatic digest of casein、2.5 ｇ NaCl、1.25g K2HPO4、1.25 g Dextrose/500 mL DW、 pH 7.3±0.2 at 25℃) を用いて37℃ で16から20時間振とう培養した。
【００６２】
またエルシニア エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）はTrypticace soy broth (Becton Dickinson) で30℃、2日間振とう培養した。
【００６３】
コレラ菌（Vibrio chorelae）は、LB-Lenox Broth (Difco Laboratories) で37℃、24時間培養した。
【００６４】
腸炎ビブリオ菌Vibrio parahaemolyticus（V. parahaemolyticus） は3%NaClを含むアルカリペプトン水  「ニッスイ」 （日水製薬、東京）(5g Peptone、5g NaCl/500 mL DW、pH8.8±0.2 at 25℃) を用いて37℃で24時間培養した。
【００６５】
（１−３  PCRおよびアガロースゲル電気泳動、塩基配列の解析）
PCRの鋳型DNAは、ボイル法にて調製した。具体的には、プレートから掻き取ったコロニーをTE 200 μLに加え、10 分間加熱処理し、12,800 × gで 10分間遠心して(Himac CT13R、HITACHI、以下、特に記載のないものは本機器を使用した)得られた上清をPCR用の鋳型DNAとして用いた。
【００６６】
PCRはすべてGeneamp PCR System 2400 (PerkinElmer、Wellesley、MA、USA) もしくはGeneamp PCR System 9700 (PerkinElmer) を用いて行った。なお、PCRプライマー及びPCR条件は、表２に示した。すなわち、Degenerated PCRプライマー GNW、LPF-D (10 pmol/μL) 各 5 μL、調製したゲノムDNA 40 ng、2.5 mM dNTP 4 μL、10×Ex Taq Buffer 5 μL、Takara Ex Taq (5 U/μL) 0.25 μLを滅菌DWで50 μLにし、PCRを行った。PCR産物は、１％アガロースゲルで電気泳動した。アガロースゲル電気泳動は、ミューピッド(アドバンス、東京)を用いて1X TAE Buffer  [40 mM Tris-acetate (pH8.5) 、1 mM EDTA]、100Vの条件で行った。電気泳動後、1.0 μg/mL のエチジウムブロマイド (Sigma) で15分間染色し、DWで脱色した後、ゲルドキュメンテーション解析システム Gel Doc 2000 (Bio-Rad、Hercules、CA、USA) を用いて、PCR産物を紫外線下(260 nm)で撮影した。
【００６７】
塩基配列の解析は以下のとおりに行った。プラスミドDNA 100 ngに、表4に示した塩基配列解析用プライマー (3.2 pmol) を各1 μL、Big Dye terminator 4 μL、5× sequence buffer 2 μLを加え、DWで20 μLにメスアップした。96℃ 5分間反応後、96℃ 30 秒、50℃ 15 秒、60℃ 4分の反応を25回繰り返した。PCR産物をCENTRI SPIN 20 Spin Columns (Princeton Separations、Adelphia、NJ、USA) によって精製し、TOMY CENTRIFUGAL CONCENTRATOR CC-105（トミー精工、東京）にて減圧乾燥させ、Template Suppression Reagent (Applied Biosystems、Foster City、CA、USA) 20 μLに溶解した。これを3分間煮沸後氷上で急冷し、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) を用いて塩基配列の解析を行った。得られた塩基配列は、DNASIS （HitachiSoft、東京）、Lasergene software (DNAstar、WI、USA) を用いて解析した。また、相同性検索はBLAST (DDBJ、http://www.ddbj.nig.ac.jp /search/blast- j.html) を用いて行った。
【００６８】
［表２］
（C. ジェジュニ、C. コリ、およびC. フィータスのcdtA、cdtB、およびcdtC遺伝子に対するマルチプレックスPCRプライマーとcdtB遺伝子に対する共通プライマーおよびそれらのPCR条件）
2010130901.tif 000005
【００６９】
［実施例１］cdt遺伝子のマルチプレックスPCR
cdtA遺伝子に対するマルチプレックスPCRでは、陽性コントロールと同様、C. ジェジュニ、C. コリ、およびC. フィータスで約630 bp、330 bpおよび490 bpの菌種特異的な断片がそれぞれ増幅された。cdtB遺伝子に対するマルチプレックスPCRでも、陽性コントロールと同様、C. ジェジュニ、C. コリ、およびC. フィータスで約710 bp、410 bpおよび550 bpの菌種特異的な断片がそれぞれ増幅された。さらにcdtC遺伝子に対するマルチプレックスPCRでも、陽性コントロールと同様、C. ジェジュニ、C. コリ、およびC. フィータスで約500 bp、300 bpおよび400 bpの菌種特異的な断片がそれぞれ増幅された（図１）。一方、cdt遺伝子陽性のC. hyointestinalis、C. lari、C. upsaliensis、C. helveticus等の他のカンピロバクター属細菌や、H. へパティカス、軟性下疳菌（H. ducreyi）、A. アクチノミセテムコミタンス、Shigella spp. や異なる5種類のcdt遺伝子 (I、II、III、IV、V) をそれぞれ保有する大腸菌のcdtA、cdtB、cdtC遺伝子のいずれも増幅されず、C. ジェジュニ、C. コリ、およびC. フィータスの3菌種のcdt遺伝子にのみ特異的であった（図１、表３）。さらに、その他の代表的な腸管感染症菌であるSalmonella spp.、エルシニア エンテロコリチカ、Vibrio spp.でも増幅バンドは見られなかった（表３）。
【００７０】
［表３］
（患者および動物から分離したcdt遺伝子陽性菌およびその他の腸管感染症菌のマルチプレックスPCRと共通プライマーによるPCRの結果）
2010130901.tif 000006
【００７１】
［実施例２］cdtB遺伝子に対する共通プライマーによるカンピロバクター属細菌の検出
カンピロバクター属細菌をcdt遺伝子を標的とした一度のPCRで検出できるかどうかについて、菌種間を越えて最も相同性が高かったcdtB遺伝子を標的とした共通プライマーを設計し、検討した。共通プライマーでPCRを行ったところ、C. ジェジュニ、C. コリ、およびC. フィータスのcdtB遺伝子由来の約720 bpの特異的なバンドが増幅された。さらに、C. ジェジュニ、C. コリ、C. フィータス以外の他のカンピロバクター属細菌、すなわち、C. hyointestinalis、C. lari、C, upsaliensisおよびC. helveticusにおいても、約720 bpの断片が増幅された（図２）。C. ジェジュニ、C. コリ, C. フィータス以外のカンピロバクター属細菌で得られたPCR産物の塩基配列を解析した結果、それぞれC. ジェジュニのcdtB遺伝子に相同性の高い遺伝子が確認された。一方、カンピロバクター属細菌以外のcdt遺伝子陽性細菌及びその他の腸管感染症菌においては、カンピロバクター属細菌と最も高い相同性を有するcdt遺伝子を保持していたH. ヘパティカスにおいても、共通プライマーで増幅断片は得られなかった（図２、表３）。以上の結果から、カンピロバクター属細菌のcdtB遺伝子には菌種間を越えて保存されている領域があり、カンピロバクター属細菌のcdtB遺伝子を標的することによって、少なくとも７菌種のカンピロバクター属細菌を一度のPCRで検出することが可能であった。
【００７２】
［実施例３］cdtB遺伝子を標的としたマルチプレックスPCRによる複数のカンピロバクター属細菌の同時検出
混合感染を想定して、複数菌種のカンピロバクター属細菌を一度に検出できるかどうかについてcdtB遺伝子を標的としたマルチプレックスPCRの評価を行った。前項において、cdtA、cdtB、およびcdtC遺伝子を対象としたマルチプレックスPCRすべてにおいて、その特異性は確認できたが、各サブユニット遺伝子の保存性はcdtB遺伝子が最も高かったので、以後の実験ではcdtB遺伝子を標的としたマルチプレックスPCRを用いた。
【００７３】
C. ジェジュニ、C. コリ、およびC. フィータスのゲノムDNAをそれぞれ2種類、あるいは3種類混ぜた系で、cdtB遺伝子に対するマルチプレックスPCRを行った。その結果、図３に示したように、C. ジェジュニ、C. コリ、およびC. フィータス単独の場合のみならず、それぞれ２菌種、３菌種存在した場合でもそれぞれに対して特異的なバンドを増幅することができた。よって、cdtB遺伝子を対象としたマルチプレックスPCRは混合感染の検査にも適用出来ると考えられた。
【００７４】
［実施例４］cdtB遺伝子を標的としたマルチプレックスPCRのC. ジェジュニ、C. コリ、およびC. フィータスの検出限界
cdtB遺伝子を標的としたマルチプレックスPCRの検出限界をC. ジェジュニ、C. コリ、およびC. フィータスを用いて調べた。その結果、C. ジェジュニとC. コリにおいては、特異的な増幅断片を検出するにPCRチューブあたり、101 colony forming unit (cfu) の菌数が必要であった。一方、C. フィータスでは、特異的な増幅断片を検出するにPCRチューブあたり、102 cfuの菌数が必要であった（図４）。
【００７５】
本願のプライマーは、設計した他のプライマー（WO2005/054472 配列番号：11-16）と比較して、感度および特異性の向上が確認された。以前のプライマーセットで非特異的な増幅が認められた9検体のboil templateを用いて本願のプライマーセットでPCRを行ったところ、全ての検体において非特異的な増幅が見られなくなった。また、116検体の健常小児便を本願のプライマーセットでPCRを行ったところ、1検体にのみ非常に弱い非特異的増幅が認められたのみであった。
【００７６】
［実施例５］C. ジェジュニ, C. コリ, およびC. フィータスにおけるリアルタイムPCR検出用プライマーおよびプローブの設計
C. ジェジュニのプライマー、及びプローブはcdtB遺伝子欠損株を含む計11株について、 C. コリのプライマー、及びプローブはcdt遺伝子変異株を含む計18株について、C. フィータスのプライマー、及びプローブはthaiで分離されたcdt遺伝子変異株を含む計12株について、それぞれのcdt遺伝子配列を菌種ごとに比較し、各菌種ごとに全ての菌株で検出が可能となる領域を調べ、かつ特異性を検査し、最も良好な組み合わせを選んだ。
【００７７】
（１）C. ジェジュニ
C. ジェジュニの変異欠損型cdt遺伝子（AY442300）と81-176株のcdt遺伝子と比較した場合、変異欠損型cdt遺伝子はcdtAからcdtBの前半および、cdtBの中央部を大きく欠損しており、また、cdtB遺伝子についても多くの塩基置換が認められた（図１１）。そこで、比較的保存性の高いcdtC遺伝子領域に着目し、この領域でのリアルタイムPCR用プライマー、及びプローブのデザインを試みた。
リアルタイムPCR用プライマー、及びプローブのデザインの為、欠損型を含むいくつかのcdtC遺伝子を比較し、最も変異が少なく、かつリアルタイムPCR用プライマー、及びプローブに使用できる領域を検索した。その後、各プライマーセットを用いてPCRを行い、最も適したプライマーセットを設定した（図１２）。
塩基配列解析用プライマー
Cj cdtRTU2: 5’ GCAAAATCTTGTCAAGATGATCTAAAAG 3’（配列番号：３７）
Cj cdtRTR2: 5’ TCCAAAACTAAAGAACGAATTTGCA 3’（配列番号：３８）
検出用プローブ
Cj RTP2: 5’ (FAM)-AAACTGTATTTTCTATAATGCCAACAACAACTTCAG-(BHQ-1) 3’（配列番号：３９）
BHQ: ブラックホールクエンチャー（蛍光吸収色素）
【００７８】
（２）C. コリ
リアルタイムPCR用プライマー、及びプローブのデザインの為、いくつかのC. コリのcdt遺伝子を比較し、最も変異が少なく、かつリアルタイムPCR用プライマー、及びプローブに使用できる領域を検索した。その後、各PCRプライマーを用いてPCRを行い、最も適したプライマーセットを設定した（図１３）。
塩基配列解析用プライマー
Cc cdtRTU5: 5’ TTTAACCAATGGTGGCAATCAAT 3’（配列番号：４０）
Cc cdtRTR5: 5’ ATTCTCCTAAACCAAAGCGATTTTC 3’（配列番号：４１）
検出用プローブ
Cc RTP5: 5’ (TAMRA)-CATGAGCACTTTTCCTGACTCTAGTATCGCCA-(BHQ-2) 3’（配列番号：４２）
【００７９】
（３）C. フィータス
C. fetusの複数の菌株についてcdt遺伝子の配列決定を行ったが、Thaiで分離されたC. fetus C90株のcdt遺伝子が国内の株のcdt遺伝子と若干異なる事がわかった。そこで、両者を比較し、保存性の高い領域を検索した（図１４）。
リアルタイムPCR用プライマー、及びプローブのデザインの為、いくつかのC. コリのcdt遺伝子を比較し、最も変異が少なく、かつリアルタイムPCR用プライマー、及びプローブに使用できる領域を検索した。その後、各PCRプライマーを用いてPCRを行い、最も適したプライマーセットを設定した（図１５）。
塩基配列解析用プライマー
Cf cdtRTU1: 5’ CTTTTCCTTTTGGATACGTGCAA 3’（配列番号：４３）
Cf cdtRTR1: 5’ AAAAATCCGCTAGGAGCGATCTG 3’（配列番号：４４）
検出用プローブ
Cf RTP1: (Orange560)-CAAGTAGCAGCCGACGTAAAAATGTGCCT-(BHQ-1) 3’（配列番号：４５）
【００８０】
［実施例６］Real-Time PCRによるC. ジェジュニ, C. コリ, およびC. フィータスの検出および検出限界
テンプレートの調製は、C. ジェジュニ: 81-176株、C. コリ: Col-243株、C. フィータス: Co1-187株、それぞれの菌種を1, 10, 102, 103, 104, 105 cfu/μLとなるように菌液を調製し、ボイル法 (10 min煮沸後、遠心分離して上清を得る）にて作製した。すなわち、1PCR チューブあたり、それぞれ1個から105個の菌量となる。
リアルタイムPCRは以下のとおりに行った。調整したテンプレート 各1 μLに、TaqMan Master Mix (Applied Biosystems) 10μL、上述の塩基配列解析用プライマー (900 nM) を各2 μL、検出用プローブ (250 nM) を各10 μL加え、DWで20 μLにメスアップした。95℃ 5分間反応後、95℃ 15 秒、60℃ 60 秒の反応を40回繰り返し、4℃で保存した。検出は、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system(Applied Biosystems)を用いて行った。
【００８１】
C. ジェジュニにおいて105 cfu/tubeの濃度では22サイクル目から立ち上がりが認められた。103 cfu/tubeの濃度では30サイクル目から立ち上がりが認められたが、102 cfu/tubeでは有意な蛍光発光が認められなかった。検出限界は103 cfu/tubeであった（図８）。
C. コリでは105 cfu/tubeの濃度では20サイクル目から立ち上がりが認められた。102 cfu/tubeでは34サイクル目から立ち上がりが認められた。検出限界は102 cfu/tubeであった（図９）。
C. フィータスにおいても105 cfu/tubeの濃度では21サイクル目から立ち上がりが認められた。102 cfu/tubeでは35サイクル目から立ち上がりが認められた。検出限界は102 cfu/tubeであった（図１０）。
【００８２】
3菌種とも、良好な結果を示し、実用に十分な性能を持っていると考えられた。
各菌種の検出にはC. ジェジュニはFAM、C. コリはTAMRA、C. フィータスはOrange560と、それぞれ蛍光波長の異なる蛍光物質でラベルされたプローブを使用しており、 多蛍光を検出できるApplied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systemを用いた場合、1チューブで3菌種が検出できるMultiplex Real-Time PCRが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によって、カンピロバクター属細菌の新規検出方法および該検出方法用キットが提供された。本発明の方法は、従来法と比べ、簡便かつ迅速な検査を可能とする。特に、本発明の方法は、複数種のカンピロバクター属細菌存在下においてマルチプレックスPCRを行い、各種細菌を菌種まで同定できることが確認された。上述のとおり、カンピロバクター属細菌は食中毒の起因菌として公衆衛生上重要な細菌である。実際の感染患者や食品汚染では、複数種の細菌が混合して存在している場合が少なくない。本発明の方法は、各菌種毎に分離せず一度に検出できるため、簡便かつ迅速に食中毒等の起因菌をいち早く突き止めることを可能にする。本発明の方法は、臨床上のみならず、食品等の製造工程管理、工場衛生管理などにおいて極めて有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】cdtA、cdtB、およびcdtC遺伝子を標的としたマルチプレックスPCRの結果を示す写真である。各菌株のボイルテンプレートを用いてcdtA遺伝子（Ａ）、cdtB遺伝子（B）、およびcdtC遺伝子（C）のマルチプレックスPCRを行い、PCR産物を2% アガロースゲル電気泳動で解析した。PCR産物及び分子量マーカーはそれぞれ5 μLアプライした。レーン1, 16: 100 bp Ladder marker、レーン2: C. ジェジュニ ATCC33560、レーン3: C. ジェジュニ ATCC43432、レーン4: C. コリ ATCC33559、レーン5: C. コリ ATCC43478、レーン6: C. フィータス ATCC27374、レーン7: C. フィータス ATCC19438、レーン8: C. hyointestinalis ATCC35217、レーン9: C. lari ATCC43675、レーン10: C.upsaliensis ATCC43954、レーン11: C. helveticus ATCC51209、レーン12: H. へパティカス ATCC51449、レーン13: 軟性下疳菌（H. ducreyi） ATCC700724、レーン14: A. アクチノミセテムコミタンス S01、レーン15: E. coli C600。
【図２】cdtB遺伝子を標的とした共通プライマーによる各種カンピロバクター属細菌に対するPCRの結果を示す写真である。各菌株のボイルテンプレートを用いてcdtB遺伝子を標的とした共通プライマーを用いてPCRを行った。PCR産物は2% アガロースゲル電気泳動にて解析した。PCR産物及び分子量マーカーは、それぞれ5 μLアプライした。
【図３】複数菌種を鋳型DNAとして用いたcdtB遺伝子を標的としたマルチプレックスPCRの結果を示す写真である。C. ジェジュニ Co1-008、C. コリ Co1-192、C. フィータス Co1-187のボイルテンプレートを1 μLずつ様々な組み合わせで混合したものを用いて、cdtB遺伝子を標的としたマルチプレックスPCRを行った。PCR産物は2% アガロースゲル電気泳動にて解析した。PCR産物及び分子量マーカーはそれぞれ5 μLアプライした。
【図４】cdtB遺伝子を標的としたマルチプレックスPCRの検出限界を示す写真である。1PCRチューブ当たり100 colony forming unit (cfu) から103 cfu になるように調製した各菌株のボイルテンプレートを用いて、cdtB遺伝子を標的としたマルチプレックスPCRを行った。PCR産物は2% アガロースゲル電気泳動にて解析した。PCR産物及び分子量マーカーはそれぞれ5 μLアプライした。
【図５−１】C.ジェジュニ81-176のcdtBゲノムDNA配列上の、配列番号：１記載の配列からなるプライマー（プライマー名：Cj-CdtBU5）および配列番号：２記載の配列からなるプライマー（プライマー名：Cj-CdtBR6）が結合する位置を示す図である。各プライマーが結合する位置を下線で示した。アスタリスク（＊）は終止コドンを示す。塩基配列の下のアミノ酸配列は、それぞれ順に、cdtA、cdtB、cdtCによってコードされるCDTサブユニットのアミノ酸配列である。
【図５−２】図５−１の続きを示す図である。
【図５−３】図５−２の続きを示す図である。
【図６−１】C.フィータス Co1−187のcdtBゲノムDNA配列上の、配列番号：３記載の配列からなるプライマー（プライマー名：Cf-CdtBU6）および配列番号：４記載の配列からなるプライマー（プライマー名：Cf-CdtBR3）が結合する位置を示す図である。各プライマーが結合する位置を下線および各プライマー名で示した。プライマー名の付いていない下線はSD配列を示す。アスタリスク（＊）は終止コドンを示す。塩基配列の下のアミノ酸配列は、それぞれ順に、cdtA、cdtB、cdtCによってコードされるCDTサブユニットのアミノ酸配列である。矢印はコードされたポリペプチドの翻訳の方向を示す。
【図６−２】図６−１の続きを示す図である。
【図７−１】C.コリCo1−243のcdtBゲノムDNA配列上の、配列番号：５記載の配列からなるプライマー（プライマー名：（Cc-CdtBU5）および配列番号：６記載の配列からなるプライマー（プライマー名：Cc-CdtBR5）が結合する位置を示す図である。各プライマーが結合する位置を下線および各プライマー名で示した。プライマー名の付いていない下線はSD配列を示す。アスタリスク（＊）は終止コドンを示す。塩基配列の下のアミノ酸配列は、それぞれ順に、cdtA、cdtB、cdtCによってコードされるCDTサブユニットのアミノ酸配列である。矢印はコードされたポリペプチドの翻訳の方向を示す。
【図７−２】図７−１の続きを示す図である。
【図８】Real-Time PCRによるC. jejuniの検量線を示す図である。
【図９】Real-Time PCRによるC. coliの検量線を示す図である。
【図１０】Real-Time PCRによるC. fetusの検量線を示す図である。
【図１１−１】C. ジェジュニ81-176株のcdt遺伝子（配列番号：３１）およびC. ジェジュニ cdt遺伝子欠損株のcdt遺伝子（Genbankアクセッション番号：AY442600）の配列比較の図である。鎖線（−・−）はcdtA遺伝子領域、実線はcdtB遺伝子領域、点線はcdtC遺伝子領域を示す。(1) 遺伝子欠損変異型cdt遺伝子（AY442300）のcdtC遺伝子3’末端領域は報告されていないため不明。ドット「.」は81-176株の塩基と相同な塩基、バー「-」はギャップを示す。
【図１１−２】図１１−１の続きを示す図である。
【図１２−１】C. ジェジュニcdtC遺伝子とC. ジェジュニ cdt遺伝子欠損変異株のcdtC遺伝子（Genbankアクセッション番号：AY442300）の比較とリアルタイムPCR用プライマー、及びプローブの位置を示す図である。
【図１２−２】図１２−１の続きを示す図である。
【図１２−３】図１２−２の続きを示す図である。
【図１２−４】図１２−３の続きを示す図である。
【図１３−１】C. コリ Col-243株 cdt遺伝子（配列番号：３３）およびその他のC. コリ cdt遺伝子の比較とリアルタイムPCR用プライマー、及びプローブの位置を示す図である。鎖線（−・−）はcdtA遺伝子領域、実線はcdtB遺伝子領域、点線はcdtC遺伝子領域を示す。ドット「.」はCo1-243株の塩基と相同な塩基、バー「-」はギャップを示す。
【図１３−２】図１３−１の続きを示す図である。
【図１３−３】図１３−２の続きを示す図である。
【図１３−４】図１３−３の続きを示す図である。
【図１３−５】図１３−４の続きを示す図である。
【図１３−６】図１３−５の続きを示す図である。
【図１３−７】図１３−６の続きを示す図である。
【図１３−８】図１３−７の続きを示す図である。
【図１３−９】図１３−８の続きを示す図である。
【図１３−１０】図１３−９の続きを示す図である。
【図１３−１１】図１３−１０の続きを示す図である。
【図１３−１２】図１３−１１の続きを示す図である。
【図１３−１３】図１３−１２の続きを示す図である。
【図１３−１４】図１３−１３の続きを示す図である。
【図１４−１】C. フィータス Co1-187株cdt遺伝子（配列番号：３２）とThai由来C. フィータス C90株のcdt遺伝子の配列比較の図である。鎖線（−・−）はcdtA遺伝子領域、実線はcdtB遺伝子領域、点線はcdtC遺伝子領域を示す。ドット「.」はCo1-187cdt株の塩基と相同な塩基、バー「-」はギャップを示す。
【図１４−２】図１４−１の続きを示す図である。
【図１４−３】図１４−２の続きを示す図である。
【図１５−１】C. フィータス cdtC遺伝子とThai由来C. フィータス C90株 のcdtC遺伝子の比較とリアルタイムPCR用プライマー、及びプローブの位置を示す図である。
【図１５−２】図１５−１の続きを示す図である。
【図１５−３】図１５−２の続きを示す図である。
【図１５−４】図１５−３の続きを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１３−１０】
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【図１３−１１】
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【図１３−１２】
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【図１３−１３】
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【図１３−１４】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【配列表】
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