(57)【要約】      （修正有）【課題】心房リモデリングによりイオンチャンネルであるＫｖ１．５蛋白が減少して抗不整脈薬が効かなくなる慢性心房細動の予防および治療のための心房リモデリング抑制剤の提供。【解決手段】心筋におけるＫｖ１．５蛋白を増加させる、低用量のエイコサペンタエン酸を含む心房リモデリング抑制剤であって、エイコサペンタエン酸が患者に経口的に慢性投与されるもので、心房細動から生じる心収縮力低下、血栓や塞栓、あるいは脳卒中などを防止することもできる心房リモデリング抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋におけるＫｖ１．５蛋白を増加あるいはＫｖ１．５蛋白の減少を抑制する心房リモデリング抑制剤であって、血中エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）濃度を１２０μＭ〜８００μＭ増加させる量のＥＰＡを含み、かかる血中ＥＰＡ濃度の増加が維持されるように患者に経口的に慢性投与されるものである、心房リモデリング抑制剤。
【請求項２】
血中ＥＰＡ濃度を１２０μＭ〜５００μＭ増加させる量のＥＰＡを含む請求項１記載の心房リモデリング抑制剤。
【請求項３】
心筋におけるＫｖ１．５蛋白を増加あるいはＫｖ１．５蛋白の減少を抑制する心房リモデリング抑制剤であって、１回分の投与量として、患者体重１ｋｇあたり３ｍｇ〜４５ｍｇのＥＰＡを含み、患者に経口的に慢性投与されるものである、心房リモデリング抑制剤。
【請求項４】
１回分の投与量として、患者体重１ｋｇあたり３ｍｇ〜３０ｍｇのＥＰＡを含む請求項３記載の心房リモデリング抑制剤。
【請求項５】
半日〜２日に１回投与される、請求項１〜４のいずれか１項記載の心房リモデリング抑制剤。
【請求項６】
ＤＨＡを含まない請求項１〜５のいずれか１項記載の心房リモデリング抑制剤。
【請求項７】
薬剤不応性心房細動の予防のために用いられる、請求項１〜６のいずれか１項記載の心房リモデリング抑制剤。
【請求項８】
薬剤不応性心房細動の治療のために、抗不整脈薬と組み合わせて用いられる、請求項１〜７のいずれか１項記載の心房リモデリング抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は心房リモデリング抑制剤に関する。詳細には、本発明は、心房リモデリングによりイオンチャンネルであるＫｖ１．５蛋白が減少して抗不整脈薬が効かなくなる慢性心房細動の予防および治療のための、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含む心房リモデリング抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
不整脈は多くのタイプがあり、多種多様な薬剤や治療方法が開発されている。不整脈のなかでも心房細動は６０歳代の全人口の１〜２％、７０歳代の全人口の５〜７％、８０歳代の全人口の１０％に発症し、発症から１０年以内に約５０％の患者が、慢性的に抗不整脈薬が効かない心房細動（薬剤不応性心房細動）に移行する。その原因は、心房リモデリングによる電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１．５蛋白（６回膜貫通型の蛋白である）の減少である（非特許文献１）。上述のような薬剤不応性心房細動ではＫｖ１．５チャンネル蛋白が減少しているために、単にチャンネルの活性を上昇させるのでは効果が無く、Ｋｖ１．５チャンネル蛋白そのものを根本的に増加させる技術が必要である。
【０００３】
心房リモデリングにより生じる慢性的な薬剤不応性心房細動に対する典型的な処置としては、ワーファリンのような抗凝固薬を投与して、不整脈に起因する脳卒中を予防することであるが、これは不整脈自体の根本的な処置ではない。そのうえ、抗凝固薬で処置を継続している場合には、青物野菜や納豆などのビタミンＫを含む食品の摂取を控えなくてはならず、患者への負担も大きい。
【０００４】
Ｋｖ１．５蛋白のような機能性蛋白を増加させる薬剤の概念として化学シャペロンがある。化学シャペロンは小胞体での蛋白プロセッシング過程に作用して蛋白を持続的に安定化させるものである。しかし、これまでに種々の化学シャペロンが報告されているが人に使用できる有効なものは明らかにされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Varro A et al. Curr Med Chem 2004;11:1-11
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、心房リモデリングを抑制することによりＫｖ１．５チャンネル蛋白を増加させ、あるいはその減少を抑制する薬剤、特に化学シャペロンを開発して、心房細動、特に薬剤不応性心房細動の予防および治療に資することが必要である。しかも、安全で、副作用の問題がない薬剤が望まれている。かかる必要性を満たすことが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、特定の用量でしかも低用量のＥＰＡを慢性投与すると、ＥＰＡが化学シャペロン作用を発揮して心房リモデリングを抑制し、Ｋｖ１．５蛋白を増加させることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、心房リモデリング抑制剤が提供され、従来治療不可能であった薬剤不応性心房細動を治療および予防することができる。具体的には、安全性の高い物質であるＥＰＡを低用量で慢性的に経口投与することによりＫｖ１．５蛋白が増加し、あるいはＫｖ１．５蛋白の減少が抑制され、心房リモデリングが抑制される。したがって、本発明は、患者に対して安全性が高く効果的な慢性心房細動の予防および治療に資するものである。かかる予防および治療に伴って、心房細動から生じる心収縮力低下、血栓や塞栓、あるいは脳卒中などを防止することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、病気のない心臓および不整脈（心房細動）のある心臓の心筋におけるＫｖ１．５蛋白およびアクチンの量を調べた結果を示す図である。上パネルは心筋のＫｖ１．５蛋白量およびアクチン量を調べた結果である。Ｓ１〜Ｓ４は正常対象、Ａｆ１〜Ａｆ４は不整脈を有する患者のサンプルである。下パネルは正常（洞調律）および不整脈（僧帽弁膜疾患合併心房細動）の心筋におけるＫｖ１．５蛋白の相対量を調べた結果を示す図である。
【図２】図２は、ＥＰＡの急性効果をパッチクランプ法にて調べた結果を示す図である。図２ａは、ＥＰＡならびにＤＨＡ（いずれも５０μＭ）による、ＩＫｕｒのピーク電流と脱分極パルス中の電流をパッチクランプ法にて調べた結果である。図２ｂは、ＥＰＡならびにＤＨＡ（いずれも５０μＭ）の、ＩＫｕｒ電流−電圧関係に及ぼす効果を示す。図２ｃは、ＥＰＡの用量反応曲線である。ｃｏｎｔｒｏｌはＥＰＡあるいはＤＨＡを添加しなかったことを意味する。
【図３】図３は、高濃度のＥＰＡおよびＤＨＡのＫｖ１．５蛋白量に対する慢性効果を調べた結果を示す図である。左パネルはＥＰＡ、左パネルはＤＨＡの場合の結果である。正規化Ｋｖ１．５−ＦＬＡＧ蛋白量はウェスタンブロットで分析後にデンシトメトリーにより算出した。
【図４】図４は、低濃度のＥＰＡおよびＤＨＡのＫｖ１．５蛋白量のＫｖ１．５蛋白量に対する慢性効果を調べた結果を示す図である。
【図５】図５は、シクロヘキシミド存在下における低濃度のＥＰＡによるＫｖ１．５蛋白の安定化を調べた結果を示す図である。上パネルは細胞中のＫｖ１．５蛋白量を経時的（０時間後、３時間後、６時間後、１２時間後）に調べたものである。下パネルは細胞中のＫｖ１．５タンパク量を経時的に定量し、プロットしたものである。横軸は反応時間（時）、縦軸はＫｖ１．５の蛋白量を示す。ｖｅｃｈｉｃｌｅはＥＰＡでの前処理なしを意味する。白四角は１μＭのＥＰＡでの前処理なし、黒四角は１μＭのＥＰＡでの前処理ありの場合を示す。
【図６】図６は、低濃度ＥＰＡによるＫｖ１．５蛋白の安定化の局在性を示す、共焦点レーザー顕微鏡での観察結果である。左パネルは、ＥＲ（小胞体）での結果を示す。右パネルはＧｏｌｇｉ（ゴルジ体）での結果を示す。ＶｅｃｈｉｃｌｅはＥＰＡを投与しなかった系である。
【図７】図７は、低濃度ＥＰＡによるＫｖ１．５蛋白の安定化の結果、細胞膜表面のＫｖ１．５蛋白が経時的に増加したことを示す、共焦点レーザー顕微鏡での観察結果である。上段は、ＥＰＡ非存在下での結果を示す。下段は、１μＭのＥＰＡを投与した場合の結果である。上段、下段とも、左から、１２時間後のＫｖ１．５蛋白の局在、１２時間後の細胞膜マーカーの局在、１２時間後のＫｖ１．５蛋白と細胞膜マーカーの局在を示す。
【図８】図８は、低濃度ＥＰＡによる、ゴルジ体（ａ）、小胞体（ｂ）および細胞膜表面（ｃ）におけるＫｖ１．５蛋白の増加効果を示すグラフである。Ｋｖ１．５蛋白量は各パネルの縦軸に示す蛋白に対する密度の比で示す。Ｇｏｌｇｉ−ＥＹＦＰはゴルジ体のマーカー、ＥＲ−ＥＹＦＰは小胞体のマーカー、ＡｃＧＦＰ−Ｍｅｍは細胞膜のマーカーである。ＶｅｃｈｉｃｌｅはＥＰＡ未処理群である。＊はＰ＜０．０５であることを示す。
【図９】図９は、低濃度のＥＰＡのＫｖ１．５蛋白活性に対する慢性効果を示す図である。上パネルは、ＥＰＡ添加および対照（ＥＰＡ無添加）による、ＩＫｕｒのピーク電流と脱分極パルス中の電流をパッチクランプ法にて調べた結果である。下パネルは、ＥＰＡの、ＩＫｕｒ電流−電圧関係に及ぼす効果を示す。ｃｏｎｔｒｏｌはＥＰＡ未処理群である。
【図１０】図１０は、低用量のＥＰＡおよびＤＨＡのＫｖ１．５蛋白量をラットに内服させた場合の心房筋のＫｖ１．５蛋白およびアクチン量をウェスタンブロットにて調べた結果を示す。Ｖｅｃｈｉｃｌｅ群はＥＰＡを内服していないラットである。
【図１１】図１１は、魚油のＫｖ１．５蛋白量に及ぼす影響を調べた結果を示すウェスタンブロットである。
【図１２】図１２は、低濃度のＥＰＡがＳＡＰ９７蛋白を増加させることによりＫｖ１．５蛋白を増加させることを示すウェスタンブロットである。図１２Ａは、培養ＣＯＳ７細胞に内在性に存在するＳＡＰ９７蛋白の発現を抗ＰＳＤ９５抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した結果を示す。図１２Ｂは、ＳＡＰ９７遺伝子を導入したＣＯＳ７細胞に発現したＳＡＰ９７蛋白の発現を抗ＰＳＤ９５抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した結果を示す。図１２Ｃは、Ｋｖ１．５遺伝子とＳＡＰ９７遺伝子を共に遺伝子導入したＣＯＳ７細胞に発現したＫｖ１．５蛋白とＳＡＰ９７蛋白の発現を抗ＦＬＡＧ抗体と抗ＰＳＤ９５抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した結果を示す。
【図１３】図１３は、高濃度（６０ｍｇ／ｋｇ）のＥＰＡをラット（ｎ＝３）に経口摂取させ、４８時間後にラット心房筋を摘出してそのＫｖ１．５蛋白量およびアクチン量をウェスタンブロットにより確認した結果を示す。
【図１４】図１４は、アプリジン６０ｍｇを投与したが心房細動が持続した症例に、ＥＰＡを２００ｍｇ追加投与した場合の効果を示す心電図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ｋｖ１．５、蛋白の減少が心房細動、特に薬剤不応性心房細動の原因であることはわかっていたが、これまで根本的な予防および治療手段がなかった。しかも上述のごとく、このタイプの不整脈の患者数は多い。しかも、人種や地域を問わず同様の頻度で、このタイプの不整脈が発症する。かかる状況下において、本発明者らは、ＥＰＡを低用量で慢性投与した場合に、小胞体やゴルジ体でＥＰＡの効果が発揮されることによりＫｖ１．５蛋白が安定化され、細胞膜表面のＫｖ１．５が増加することを見出した。したがって、本発明は、１の態様において、心筋におけるＫｖ１．５蛋白を増加あるいはＫｖ１．５蛋白の減少を抑制する心房リモデリング抑制剤であって、低用量のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含み、ＥＰＡが患者に経口的に慢性投与されるものである、心房リモデリング抑制剤を提供する。
【００１１】
このようなＥＰＡのシャペロンとしての効果、すなわち、低用量で経口的に慢性投与されるＥＰＡのＫｖ１．５蛋白減少防止効果および増加効果は、本発明者らが初めて見出したものである。
【００１２】
本発明において、患者は心房リモデリングによってＫｖ１．５蛋白が減少した者、および心房リモデリングによってＫｖ１．５蛋白が減少するおそれのある者の両方を包含する。さらに、本明細書において患者とは、ヒトはもちろん、他の哺乳動物も包含する。例えば、イヌ、ネコなどのペット、家畜なども患者に包含されるが、本明細書において特に断らないかぎり、患者はヒト患者である。
【００１３】
本発明の心房リモデリング抑制剤の有効成分はＥＰＡである。本発明の心房リモデリング抑制剤の特徴は低用量のＥＰＡを含有することであり、しかも、ＥＰＡが慢性的に投与されることである。低用量のＥＰＡとは、患者血中ＥＰＡ濃度（自然摂取の場合には約１２０μＭは通常レベルである）を約１２０μＭ〜約８００μＭ増加させる量のＥＰＡである。好ましい低用量のＥＰＡは、患者血中ＥＰＡ濃度を約１２０μＭ〜約５００μＭ増加させる量のＥＰＡである。血中ＥＰＡ濃度の上昇幅濃度が上記範囲に維持されるように、本発明のリモデリング抑制剤を慢性的に投与することができる。
【００１４】
例えば、患者血中ＥＰＡ濃度を約１２０μＭ〜約８００μＭ増加させるＥＰＡ経口用量は、患者にもよるが、通常、１回分の投与量として、患者体重１ｋｇあたり約３ｍｇ〜４５ｍｇである。また例えば、患者血中ＥＰＡ濃度を約１２０μＭ〜約５００μＭ増加させるＥＰＡ経口用量は、患者にもよるが、通常、１回分の投与量として、患者体重１ｋｇあたり約３ｍｇ〜約３０ｍｇである。かかる量のＥＰＡを含む本発明の心房リモデリング抑制剤を患者に慢性投与することができる。これらのＥＰＡ経口用量は、常套的な検査方法にて患者血中ＥＰＡ濃度を測定することにより、容易に決定することができる。なお、このような検査の際には、ＥＰＡ摂取前後で患者に同様あるいは同一の食事を与えることが好ましい。
【００１５】
本発明の心房リモデリング抑制剤の有効成分はＥＰＡであり、主に魚油に含まれている安全性の高い物質である。しかしながら、ＥＰＡを含む食品を摂取することによってＥＰＡを摂取したのでは、食品に含まれるＤＨＡなどの不純物によって所望のＥＰＡの効果が得られない。実施例５に示したように、ＤＨＡを含む魚油を投与した場合、ＤＨＡがＫｖ１．５蛋白を減少させるのでＥＰＡの効果が相殺される。したがって、食品からではなく、なるべく純度の高いＥＰＡを経口投与によって患者に摂取させることが必要である。本発明の心房リモデリング抑制剤に用いるＥＰＡの純度は、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９９％以上であり、最も好ましくは、本発明の心房リモデリング抑制剤に用いるＥＰＡはＤＨＡ等の他の成分が検出されないものである。したがって、好ましい本発明の心房リモデリング抑制剤としてはＤＨＡを含まないものが挙げられる。本発明の心房リモデリング抑制剤がＤＨＡを含まないとは、ガスクロマトグラフ法などの通常用いられる分析手段にて本発明の心房リモデリング抑制剤において検出されないことを意味する。
【００１６】
慢性投与とは、医学および薬学分野で通常に使用される意味に解される。すなわち、慢性投与とは、投与後一定時間（例えば１２時間またはそれ以上）を経過した時点で所望の効果が現れるような投与を意味する。本発明の心房リモデリング抑制剤を約半日〜約２日に１回の割合にて、例えば１日１回の割合にて、数日、数週間、数ヶ月、数年あるいはそれ以上にわたって慢性的に投与することにより効果を発揮しうる。
【００１７】
本発明の心房リモデリング抑制剤の剤形は、経口投与に用いられるものであればいずれの剤形であってもよく、例えば、錠剤、顆粒、粉末などの固形の剤形、溶液、懸濁液などの液体の剤形、あるいは練り物のような半固形の剤形であってもよい。これらの経口投与用の剤形の製造には、製薬分野でよく知られた担体または賦形剤を用いることができる。
【００１８】
本発明の心房リモデリング抑制剤の患者における効果は、患者心筋のＫｖ１．５蛋白が増加したかどうか、あるいはその減少が抑制されたかどうかを調べることにより確認することができる。このような確認は、当業者に公知の手段・方法、例えば、通常使用される抗不整脈薬の効果が改善または増強することを、例えば心電図などで確認することによって行うことができる。
【００１９】
本発明の心房リモデリング抑制剤の効果は、ＥＰＡが心筋細胞中の小胞体やゴルジ体で作用してＫｖ１．５蛋白を安定化させて分解を防止し、その結果、心筋細胞膜表面のＫｖ１．５蛋白が増加することにより発揮される。未だ心房リモデリングが起こっていない患者に本発明の心房リモデリング抑制剤を慢性投与することにより、心筋におけるＫｖ１．５蛋白の減少が抑制され、あるいはＫｖ１．５蛋白が増加し、心房細動、特に薬剤不応性心房細動が予防される。かかる予防的使用において、患者は約６０歳以上の者であってもよい。また、心房リモデリングによりＫｖ１．５蛋白が減少し、心房細動、特に薬剤不応性心房細動を発症している患者に本発明の心房リモデリング抑制剤を慢性投与することにより、心筋におけるＫｖ１．５蛋白が増加することにより、心房リモデリングが抑制される。このようにして本発明の心房リモデリング抑制剤によりＫｖ１．５蛋白が増加すれば抗不整脈薬が効く状態となり、抗不整脈薬を投与することにより心房細動、特に薬剤不応性心房細動を治療することができる。
【００２０】
このように、本発明の心房リモデリング抑制剤を、他のリモデリング治療薬または予防薬（例えば、アンジオテンシン受容体拮抗薬など）や不整脈治療薬または予防薬（例えば、アプリンジンなどの第一群抗不整脈薬など）と組み合わせて用いることができる。組合せはいずれの様式であってもよい。好ましくは上述のように、慢性投与によりＫｖ１．５蛋白量が増加した時点で不整脈治療薬を投与し、薬剤不応性心房細動を効果的に治療することができる。
【００２１】
また本発明は、低用量のＥＰＡを含み、慢性的に患者に摂取されるサプリメントであって、Ｋｖ１．５蛋白を増加させることにより心房モデリングを抑制するサプリメントを提供する。該サプリメントは錠剤、カプセル、ドリンクなどの剤形とすることができる。該サプリメントに関し、ＥＰＡの用量に関する説明のほか、上記説明があてはまる。
【００２２】
本発明は、もう１つの態様において、心筋におけるＫｖ１．５蛋白を増加させることによる心房リモデリングの抑制方法であって、ＥＰＡを低用量で慢性的に患者に投与することを特徴とする、心房リモデリングの抑制方法を提供する。ＥＰＡの用量に関する説明のほか、上記説明は本発明の心房リモデリングの抑制方法にもあてはまる。さらに、上記の本発明の心房リモデリングの抑制方法において、他のリモデリング治療薬または予防薬あるいは不整脈治療薬または予防薬を組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
本発明は、さらにもう１つの態様において、心筋におけるＫｖ１．５蛋白を増加させる心房リモデリング抑制用医薬であって、低用量のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含み、ＥＰＡが患者に経口的に慢性投与されるものである医薬の製造における、ＥＰＡの使用を提供する。本発明は、さらにもう１つの態様において、心筋におけるＫｖ１．５蛋白を増加させて心房リモデリングを抑制するために低用量で慢性投与されるＥＰＡに関する。ＥＰＡの用量に関する説明のほか、上記説明はこれらの発明にもあてはまる。さらに、上記の本発明のＥＰＡの使用において、他のリモデリング治療薬または予防薬あるいは不整脈治療薬または予防薬を組み合わせて用いてもよい。
【００２４】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明を限定するものと解してはならない。
【００２５】
なお、実施例２〜４における一般的実験手法は以下のとおりである。ＣＯＳ細胞にＦＬＡＧのｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇをＮ末端につけたＦＬＡＧ−Ｋｖ１．５を発現させ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ、免疫沈降、免疫組織染色、共焦点レーザー顕微鏡、パッチクランプ法を用いてＥＰＡの作用を膜蛋白Ｋｖ１．５チャンネルの安定化作用に関して検討した。
【実施例１】
【００２６】
実施例１：心房細動患者と正常対象の心筋におけるＫｖ１．５蛋白量の比較
ヒト心房細動患者（４人、Ａｆ１〜Ａｆ４）および正常な心臓を有する洞調率ヒト対象（Ｓ１〜Ｓ４）の心筋のＫｖ１．５蛋白およびアクチンの量を比較した。実験は、同意を得た開心術手術を受けた心房細動を有する患者と有さない患者心房筋を摘出し蛋白を抽出してＫｖ１．５とアクチンに対する抗体を使用してその発現量を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を用いて測定した。
図１の上パネルに示すように、病気のない心臓ではＫｖ１．５およびアクチンともに十分量が存在していた。しかし、不整脈（心房細動）のある心臓ではアクチンの量は正常対象の心臓と変わらないのに対し、Ｋｖ１．５の量が極めて少ないか、あるいは検出不可能なレベルであった。
【００２７】
さらに正常な心臓（洞調律）を有する対象７人および僧帽弁膜疾患合併心房細動を有する患者７人の心臓におけるＫｖ１．５蛋白の相対量を比較した。実験は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を用いて測定したそれぞれの蛋白の発現量をデンシトメーターを用いて定量化してグラフに表した。
図１の下パネルに示すように、僧帽弁膜疾患合併心房細動を有する患者の心臓におけるＫｖ１．５蛋白は正常な心臓の３分の１以下であった。
これらの結果から、心房細動の心臓ではＫｖ１．５蛋白が減少あるいは消失していることが判明した。したがって、Ｋｖ１．５蛋白を増加させること、あるいはＫｖ１．５蛋白の減少を抑制することが心房細動の予防および治療のために必要であることがわかった。
【実施例２】
【００２８】
実施例２：Ｋｖ１．５蛋白を安定化させるＥＰＡ濃度の検討
ＣＯＳ細胞にＫｖ１．５を発現させた系での高濃度（５０μＭ）のＥＰＡならびにＤＨＡのＫｖ１．５電流（ＩＫｕｒ）におよぼす急性効果を調べた。実験は、Ｋｖ１．５チャンネルの遺伝子（Roberds, S.L. and Tamkun, M.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(5), 1798-1802 (1991))を培養ＣＯＳ細胞にリポフェクタミン法を用いて導入し、その発現したＫｖ１．５電流（ＩＫｕｒ）をパッチクランプ法により測定した（Kato M et al., Biochem Biophys Res Commun. 2005 Nov 11; 337(1):343-8）。なお、以下の実施例におけるＣＯＳ細胞へのＫｖ１．５チャンネルの遺伝子の導入はこの方法にて行った。
図２ａに示すように、ＥＰＡならびにＤＨＡ（いずれも５０μＭ）はＩＫｕｒのピーク電流と脱分極パルス中の電流の減少を引き起こすことが確認された。図２ｂはＥＰＡならびにＤＨＡ（いずれも５０μＭ）の、ＩＫｕｒ電流−電圧関係に及ぼす効果を示す。０ｍＶより脱分極側でＩＫｕｒの電流が抑制されることがわかった。ＥＰＡの用量反応曲線を図２ｃに示す。ＥＰＡはＫｄ値が３０μＭでＩＫｕｒ電流を抑制することがわかった。
【００２９】
次に、ＥＰＡならびにＤＨＡをＣＯＳ細胞に１２時間作用させたときのＫｖ１．５蛋白に対する濃度依存的な慢性作用を検討した。実験は、ＣＯＳ細胞にＫｖ１．５を遺伝子導入により発現させ、特定の濃度のＥＰＡならびにＤＨＡを１２時間作用させた後、蛋白を抽出してＫｖ１．５とアクチンに対する抗体を使用してその発現量を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を用いて測定した。
図３に結果を示す。ＥＰＡは慢性投与（１２時間作用）した場合、１０μＭでは有意にＫｖ１．５蛋白を増加させるが３０μＭ以上ではＫｖ１．５蛋白を減少させることがわかった。一方、ＤＨＡは用量依存性にＫｖ１．５蛋白量を減少させることがわかった。
【実施例３】
【００３０】
実施例３：低濃度のＫｖ１．５蛋白の慢性効果
ＣＯＳ細胞にＫｖ１．５を発現させた系において、低濃度のＥＰＡを１２時間作用（慢性投与）させたときのＫｖ１．５蛋白に対する濃度依存的な作用を検討した。実験は、ＣＯＳ細胞にＫｖ１．５を遺伝子導入により発現させ、特定の濃度のＥＰＡならびにＤＨＡを１２時間作用させた後、蛋白を抽出してＫｖ１．５とアクチンに対する抗体を使用してその発現量を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を用いて測定した。
結果を図４に示す。０．１μＭ〜２０μＭのＥＰＡの慢性投与によりＫｖ１．５蛋白が増加することがわかった。ＥＰＡ濃度を上昇させる好ましいＥＰＡ濃度は０．３μＭ〜１０μＭであった。上記のような濃度範囲のＤＨＡでは、Ｋｖ１．５蛋白の増加効果は見られなかった。
【００３１】
次に、１μＭのＥＰＡをＣＯＳ７細胞に慢性的に前投与し、Ｋｖ１．５蛋白を発現させその後シクロヘキシミド（濃度６０ｍｇ／ｄｌ）で処理して、一度合成されたＫｖ１．５蛋白が分解される過程を観察した。実験は、ＣＯＳ細胞にＫｖ１．５を遺伝子導入により発現させ、Ｋｖ１．５蛋白の分解速度を測定するためにサイクロフォスファミドにより蛋白合成を遮断し、時間経過中のＫｖ１．５蛋白量の減少速度をＥＰＡ添加群と非添加群でＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法により測定した。
ＶｅｈｉｃｌｅはＥＰＡ無添加系である。結果を図５に示す。図５上パネルおよび下パネルに示すように、Ｖｅｈｉｃｌｅに比べて１μＭのＥＰＡを慢性的に前投与するとＫｖ１．５蛋白の時間依存的な減少が遅延することがわかった。図５下パネルにＫｖ１．５蛋白の減衰過程を示すが、低用量のＥＰＡによる処理で減衰時定数が増加し蛋白分解が遅延することがわかった。
【実施例４】
【００３２】
実施例４：ＥＰＡをＣＯＳ細胞に慢性投与した場合のＫｖ１．５蛋白の細胞内局在および量の検討
ＣＯＳ細胞にＫｖ１．５と細胞小器官マーカーを発現させた系を用いてＫｖ１．５蛋白の細胞内局在とその蛋白量を定量化した。実験は、ＣＯＳ細胞にＫｖ１．５を遺伝子導入により発現させ、ＥＰＡ添加群と非添加群で抗体により細胞内ならびに細胞膜のＫｖ１．５蛋白を染色し、その様子を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。さらに細胞小器官のマーカーとの比較を行うことでＫｖ１．５蛋白の細胞内での局在を定量化した。
図６および図７は共焦点レーザー顕微鏡での観察結果を示す。
次に、ＣＯＳ細胞にＫｖ１．５を遺伝子導入により発現させ、ＥＰＡ添加群と非添加群で抗体により細胞内ならびに細胞膜のＫｖ１．５蛋白を染色し、その様子を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。さらに細胞小器官のマーカーとの比較を行うことでＫｖ１．５蛋白の細胞内での局在を定量化した。
図６左パネルではＫｖ１．５蛋白はＥＲマーカーと共発現し、１μＭ  ＥＰＡ処理でそのシグナルは増加した。図６右パネルではＫｖ１．５蛋白はゴルジマーカーと共発現し、１μＭ  ＥＰＡの処理によりそのシグナルは増加した。これらの結果より、低濃度ＥＰＡによるＫｖ１．５蛋白の安定化は小胞体やゴルジ体で発揮されることがわかった。図７の上段からわかるように、Ｋｖ１．５蛋白は細胞膜マーカーとはほとんど共局在していなかったが、図７の下段に示すように、ＥＰＡを１μＭ投与するとＫｖ１．５蛋白が細胞膜で経時的に増加した。図８はＥＰＡ（１μＭ）未処理群と処理群でそれぞれの細胞内局在を定量的に比較したものである。ＥＰＡは小胞体、ゴルジ、細胞膜でのＫｖ１．５蛋白の局在を有意に増加させた。以上より、低濃度のＥＰＡにより小胞体やゴルジ体においてＫｖ１．５蛋白が安定化され、その結果、細胞膜表面のＫｖ１．５蛋白量が増加することがわかった。
【００３３】
次に、低用量（１μＭ）のＥＰＡの慢性投与が細胞膜のチャンネル活性を増加させるかどうか検討した。実験は、ＣＯＳ細胞にＫｖ１．５を遺伝子導入により発現させ、ＥＰＡ添加群と非添加群で抗体により細胞内ならびに細胞膜のＫｖ１．５蛋白を染色し、その様子を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。さらに細胞小器官のマーカーとの比較を行うことでＫｖ１．５蛋白の細胞内での局在を定量化した。
図９の上パネルに示すようにパッチクランプ法により細胞膜でのＫｖ１．５チャンネルの活性であるＩＫｕｒ電流を観察すると１μＭ  ＥＰＡの慢性投与により各電位でのＩＫｕｒ電流が有意に増加したことが確認された。図９の下パネルに示すように、電位が０ｍＶから＋８０ｍＶの範囲で１μＭ  ＥＰＡの慢性投与によりＩＫｕｒ電流が有意に増加した。これらの結果から、低用量のＥＰＡの慢性投与がＫｖ１．５蛋白をＥＲ（小胞体）で安定化させ、その後にゴルジ体を経て細胞膜への輸送を促進することで機能的なＩＫｕｒを増加させることが明らかとなった。
【実施例５】
【００３４】
実施例５：インビボでのＥＰＡのＫｖ１．５蛋白増加作用と魚油の作用との比較
体重１ｋｇあたり３０ｍｇ（３０ｍｇ／ｋｇ）のＥＰＡをラット（ｎ＝３／群）に経口摂取させ、４８時間後にラット心房筋を摘出してそのＫｖ１．５蛋白の増加をウェスタンブロットにより確認した。３０ｍｇ／ｋｇのＥＰＡの経口摂取により、ラット血中ＥＰＡ濃度は摂取前よりも５００μＭ増加した。３０ｍｇ／ｋｇのＥＰＡはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて慢性効果としてＫｖ１．５蛋白を安定化し増加できることが判明した（図１０）。一方、ＥＰＡはアクチン量に対しては影響しなかった。
【００３５】
同様の効果が魚油の経口摂取で再現できるかを検討した。実験は、ＣＯＳ細胞にＫｖ１．５を遺伝子導入により発現させ、０．０１％のエタノールにそれぞれの濃度の魚油を１２時間作用させた後、蛋白を抽出してＫｖ１．５とアクチンに対する抗体を使用してその発現量を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を用いて測定した。実験に用いた魚油の濃度は培養液中０％（図１１ではＣと表示）、０．１％および０．２％であった。
図１１に示すようにサバやシルバの魚油ではＥＰＡのＫｖ１．５蛋白増加作用を再現できなかった。その理由として、サバやシルバの魚油に含まれるＤＨＡがＥＰＡの効果を相殺するためと考えられた。以上の結果から魚の摂取でＫｖ１．５蛋白の増加を期待することはできず、ＥＰＡの純度の高いもの（最も好ましくは、少なくともＤＨＡが存在しないもの）を摂取する必要があると考えられる。
【実施例６】
【００３６】
実施例６：ＥＰＡによる心筋におけるＫｖ１．５蛋白の増加
ＳＡＰ９７はＰＤＺドメインを持ったタンパク質でイオンチャンネルを細胞膜に固定するのみならず、細胞内のシグナルをイオンチャンネルに伝達する作用や受容体からのシグナル伝達の役割を担っている。ＳＡＰ９７はシャペロンとしてＫｖ１．５に作用することが知られている。
そこで、低濃度のＥＰＡがＳＡＰ９７蛋白を増加させることによりＫｖ１．５蛋白を増加させるかどうかについて、ウェスタンブロットを用いて調べた。実験は、ＳＡＰ９７蛋白が内在性に存在するＣＯＳ７細胞、ＳＡＰ９７遺伝子を導入したＣＯＳ７細胞、およびＫｖ１．５遺伝子とＳＡＰ９７遺伝子を共に導入したＣＯＳ７細胞をＤＭＥＭ培地（１０％牛胎児血清添加）中０μＭ、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭおよび３００μＭのＥＰＡ存在下で培養し、１２時間後に抗ＰＳＤ９５抗体および抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、それぞれＫｖ１．５蛋白およびＳＡＰ９７蛋白量を調べた。
結果
図１２Ａに示すように、ＳＡＰ９７蛋白が内在性に存在する培養ＣＯＳ７細胞において、ＥＰＡ  １０μＭまではＳＡＰ９７蛋白が増加したが、それ以上のＥＰＡ濃度ではＳＡＰ９７蛋白が減少した。
図１２Ｂに示すように、ＳＡＰ９７遺伝子を導入した培養ＣＯＳ７細胞において、ＥＰＡ  １０μＭまではＳＡＰ９７が増加したが、それ以上のＥＰＡ濃度ではＳＡＰ９７蛋白が減少した。
図１２Ｃに示すように、Ｋｖ１．５遺伝子とＳＡＰ９７遺伝子を共に導入した培養ＣＯＳ７細胞において、ＥＰＡ  １０μＭまではＫｖ１．５とＳＡＰ９７蛋白が増加したが、それ以上のＥＰＡ濃度ではＫｖ１．５、ＳＡＰ９７蛋白がともに減少した。
【実施例７】
【００３７】
実施例７：高濃度ＥＰＡによってはＫｖ１．５蛋白は増加しない
体重１ｋｇあたり９０ｍｇ（９０ｍｇ／ｋｇ）のＥＰＡをラット（ｎ＝３／群）に経口摂取させ、４８時間後にラト心房筋を摘出してそのＫｖ１．５蛋白の増加をウェスタンブロットにより調べた。ＥＰＡを蒸留水で溶解し、ゾンデを用いてラットの胃内に経口的に投与した。
９０ｍｇ／ｋｇのＥＰＡの経口摂取により、ラット血中ＥＰＡ濃度は摂取前よりの１０００μＭ増加した。しかし、９０ｍｇ／ｋｇのＥＰＡはインビボにおいて慢性効果としてＫｖ１．５蛋白に対して影響しなかった（図１２）。
【実施例８】
【００３８】
実施例８：ヒト心房細動患者への本発明のＥＰＡの適用
アプリンジン６０ｍｇを投与したが心房細動が持続した症例に、ＥＰＡを２００ｍｇ（４ｍｇ／ｋｇ）追加投与することにより、図１３の心電図に示すように心房細動の波形が正常洞調律の波形に変化した。この結果は、薬剤不応性心房細動の患者に、抗不整脈薬と組み合わせて本発明のＥＰＡを含むリモデリング剤を投与することにより、薬剤不応性不整脈を治療できることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、不整脈治療薬の開発および製造の分野ならびに不整脈研究試薬の開発および製造などの分野において利用可能である。
【図１】
2010013440.tif 000002
【図２】
2010013440.tif 000003
【図３】
2010013440.tif 000004
【図４】
2010013440.tif 000005
【図５】
2010013440.tif 000006
【図６】
2010013440.tif 000007
【図７】
2010013440.tif 000008
【図８】
2010013440.tif 000009
【図９】
2010013440.tif 000010
【図１０】
2010013440.tif 000011
【図１１】
2010013440.tif 000012
【図１２】
2010013440.tif 000013
【図１３】
2010013440.tif 000014
【図１４】
2010013440.tif 000015