(57)【要約】【課題】  眼の状態を処置するための光力学的治療において、処置の有効性および選択性を増大させる改善されたＰＤＴベースの方法を提供すること。【解決手段】  望ましくない脈絡膜新血管構造により特徴づけられる哺乳類の眼球状態、例えば、血管新生ＡＭＤ、眼ヒストプラズマ症候群、病的近視、網膜色素線条、突発性障害、脈絡膜炎、脈絡膜破裂、被覆する脈絡膜の母斑、および特定の炎症性の疾患の処置における、同時の、別々の、または連続した使用のためのアポトーシス調節因子および光増感剤の組合せ剤を提供することにより上記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
望ましくない脈絡膜新血管構造により特徴づけられる哺乳類の眼球状態の処置における、同時の、別々の、または連続した使用のためのアポトーシス調節因子および光増感剤の組合せ剤。
【請求項２】
光増感剤が、ルテチウムテキサフィリン、ベンゾポルフィリン、ベンゾポルフィリン誘導体、ヘマトポルフィリンまたはヘマトポルフィリン誘導体を含む、前記使用のための請求項１に記載の組合せ剤。
【請求項３】
アポトーシス調節因子が、アポトーシス促進因子、アポトーシス刺激因子またはアポトーシス抑制因子である、請求項１に記載の使用のための請求項１または２に記載の組合せ剤。
【請求項４】
アポトーシス調節因子が、アポトーシス抑制因子である、請求項１に記載の使用のための請求項３に記載の組合せ剤。
【請求項５】
望ましくない脈絡膜新血管構造により特徴づけられる眼球状態の処置における、組合せでの使用のための、第１および第２医薬の製造でのアポトーシス調節因子および光増感剤、各々の使用であって、アポトーシス調節因子が、請求項１、３または４のいずれか１項に記載したものであり、光増感剤が、請求項１または２に記載したものである、使用。
【請求項６】
望ましくない脈絡膜新血管構造により特徴づけられる眼球状態の処置用医薬の製造でのアポトーシス調節因子および光増感剤の使用であって、アポトーシス調節因子が、請求項１、３または４のいずれか１項に記載したものであり、光増感剤が、請求項１または２に記載したものである、使用。
【請求項７】
望ましくない脈絡膜新血管構造により特徴づけられる眼球状態の処置における、光力学的治療と組合せた使用のための医薬の製造でのアポトーシス調節因子の使用であって、アポトーシス調節因子が、請求項１、３または４のいずれか１項に記載したものである、使用。
【請求項８】
望ましくない脈絡膜新血管構造により特徴づけられる眼球状態の処置における、アポトーシス調節因子と組合せた光力学的治療での使用のための医薬の製造での光増感剤の使用であって、光増感剤が、請求項１または２に記載したものである、使用。
【請求項９】
アポトーシス調節因子および光増感剤を含むキットであって、アポトーシス調節因子が、請求項１、３または４のいずれか１項に記載したものであり、光増感剤が、請求項１または２に記載したものであって、所望により、使用のための指示書を含む、キット。
【請求項１０】
アポトーシス調節因子および光増感剤を含む組成物であって、アポトーシス調節因子が、請求項１、３または４のいずれか１項に記載したものであり、光増感剤が、請求項１または２に記載したものである、組成物。
【請求項１１】
アポトーシス調節因子および光増感剤が、望ましくない脈絡膜新血管構造の処置において相乗的な効果を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の組合せ剤。
【請求項１２】
アポトーシス調節因子および光増感剤が、望ましくない脈絡膜新血管構造の処置において相乗的な効果を有する、請求項５から８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
アポトーシス調節因子および光増感剤が、望ましくない脈絡膜新血管構造の処置において相乗的な効果を有する、請求項９に記載のキット。
【請求項１４】
アポトーシス調節因子および光増感剤が、望ましくない脈絡膜新血管構造の処置において相乗的な効果を有する、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０００年２月１０日に出願された米国仮出願番号６０／１８１，６４１への優先権を主張し、この開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は一般的に、光力学的治療ベースの方法および眼の状態を処置するための組成物に関し、そしてより詳細には、本発明は、光力学的治療ベースの方法および、望ましくない脈絡膜新血管構造によって特徴付けられる眼の状態の処置のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
脈絡膜の血管新生は、出血および線維症を引き起こし得、眼の多くの状態（例えば、加齢性横斑変性、眼ヒストプラズマ症候群、病的近視、網膜色素線条、突発性障害、脈絡膜炎、脈絡膜破裂、被覆する脈絡膜母斑、および特定の炎症性の疾患を含む）における視力障害を生じる。これらの障害の１つ、すなわち、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、６５歳以上の人々における重篤な失明の主な原因である（Ｂｒｅｓｓｌｅｒら（１９９８）ＳＵＲＶ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．３２、３７５−４１３、Ｇｕｙｅｒら（１９８６）ＡＲＣＨ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１０４、７０２−７０５、Ｈｙｍａｎら（１９８３）ＡＭ．Ｊ．ＥＰＩＤＥＭＩＯＬ．１８８、８１６−８２４、Ｋｌｅｉｎ＆Ｋｌｅｉｎ（１９８２）ＡＲＣＨ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１００、５７１−５７３、Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚら（１９８０）ＳＵＲＶ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．２４、３３５−６１０）。臨床病理学的な説明はなされてきたが、この疾患の病因および病原については、ほとんど理解されていない。
【０００４】
乾性ＡＭＤは、この疾患のより一般的な形態であり、これは、結晶腔、斑における色素変化および萎縮性の変化によって特徴付けられ、中心視力のゆっくりとした進行性の喪失を伴う。湿性ＡＭＤまたは血管新生ＡＭＤは、網膜下の出血、線維症および脈絡膜新血管構造（ＣＮＶ）の形成に二次的な液体によって特徴付けられ、そしてより迅速かつ明白な失明をともなう。乾性ＡＭＤよりは一般的ではないが、血管新生ＡＭＤは、ＡＭＤに起因する重篤な失明の約８０％を占める。米国においてだけで、約２００，０００症例の血管新生ＡＭＤが毎年診断される。
【０００５】
現在、乾性ＡＭＤのための処置は存在しない。最近まで、レーザー光凝固術が、血管新生ＡＭＤの選択された症例に対して利用可能な唯一の治療であった。不運にも、血管新生ＡＭＤを有する患者の大多数は、レーザー光凝固術治療のための基準を満たさない。血管新生ＡＭＤを有する患者の約８５％は、十分に規定されないか、潜在的であるか、または比較的広範な窩下の（ｓｕｂｆｏｖｅａｌ）脈絡膜血管新生形成を有し、これらの患者は誰も、レーザー治療を受け入れられない。さらに、レーザー光凝固術は、ＣＮＶ組織への熱損傷に依存し、これは、被覆する神経感覚性網膜を損傷し、結果的に、視覚機能の喪失を伴う。レーザー光凝固術はまた、約５０％の症例において生じる再発によって悩まされる。
【０００６】
光力学的治療（ＰＤＴ）は、望ましくないＣＮＶを除去し、そして血管新生ＡＭＤを処置するための新たな処置として、有望な結果を示した（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９９）ＡＲＣＨＩＶＥＳ ＯＦ ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬＯＧＹ １１７：１１６１−１１７３、Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｅｒｆｕｒｔｈら（１９９９）ＡＲＣＨＩＶＥＳ ＯＦ ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬＯＧＹ １１７：１１７７−１１８７、ＴＡＰ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ（１９９９）ＡＲＣＨＩＶＥＳ ＯＦ ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬＯＧＹ １１７：１３２９−４５、Ｈｕｓａｉｎら（１９９９）ＰＨＩＬＡＤＥＬＰＨＩＡ：ＭＯＳＢＹ；２９７−３０７）。ＰＤＴは、腫瘍および新規に形成された血管のような増殖組織に蓄積する光増感剤またはＰＤＴ色素（光増感剤）の全身性投与；続く、この色素の吸光ピークに対応する波長での、低強度、非熱性の光による標的組織の照射を含む（Ｏｌｅｉｎｉｃｋら（１９９８）ＲＡＤＩＡＴＩＯＮ ＲＥＳＥＡＲＣＨ：１５０：Ｓ１４６−Ｓ１５６）。この色素の励起は、一重項酸素および活性酸素種として周知のフリーラジカルの形成を導き、これが標的組織に対する光化学的な損傷を引き起こす（Ｗｅｉｎｓｈａｕｐｔら（１９７６）ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．３６：２３２６−２３２９）。
【０００７】
ＣＮＶの処置のためにＰＤＴを使用した研究は、光増感剤の用量、レーザー光用量、および照射のタイミングの適切な処置パラメーターを用いて、実験的ＣＮＶへの比較的選択的な損傷が（網膜の脈管、大きい脈絡膜の脈管を容認し、そして神経感覚性網膜において最小限の変化で）達成され得ることを実証した（Ｈｕｓａｉｎら（１９９６）ＡＲＣＨ ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１１４：９７８−９８５、Ｈｕｓａｉｎら（１９９７）ＳＥＭＩＮＡＲＳ ＩＮ ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬＯＧＹ １２：１４−２５、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９５）ＡＲＣＨ ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１１３：８１０−８１８、Ｋｒａｍｅｒら（１９９６）ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬＯＧＹ １０３（３）：４２７−４３８）。さらに、緑色ポルフィリン色素を使用したＰＤＴベースの手順は、最近、血管新生ＡＭＤの処置における使用のために種々の国で承認されている。
【０００８】
しかし、臨床研究の間、漏出の再発が処置後１〜３ヶ月までにＣＮＶの少なくとも一部においてあらわれることが見出されてきた。光増感剤または光用量の漸増は、この再発を予防しないようであり、そして網膜の脈管への望ましくない非選択的損傷を引き起こしさえし得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９９）ＡＲＣＨＩＶＥＳ ＯＦ ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬＯＧＹ １１７：１１６１−１１７３）。いくつかの多施設臨床第３相試験が、３ヶ月ごとに適用される反復されるＰＤＴ処置を研究するために進行中である。中間データは、中程度の失明の減少率の点で有望なように見える（ＴＡＰ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ（１９９９）ＡＲＣＨＩＶＥＳ ＯＦ ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬＯＧＹ １１７：１３２９−４５）。それにもかかわらず、反復されるＰＤＴ処置についての必要性は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）および脈絡毛細管への累積的な損傷を引き起こすと予想され得、これらの損傷は、処置に関連した失明の進行を引き起こし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、処置の有効性および選択性を増大させる、改善されたＰＤＴベースの方法の必要性がいまだ存在し、そしてこの改善された方法は、障害の再発を減少させるかまたは遅延させる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＰＤＴベースの方法、および望ましくない眼の血管新生に関連する眼の状態を処置するため組成物に方向付けられる。このような眼の状態としては、例えば、血管新生ＡＭＤ、眼ヒストプラズマ症候群、病的近視、網膜色素線条、突発性障害、脈絡膜炎、脈絡膜破裂、被覆する脈絡膜の母斑、および特定の炎症性の疾患が挙げられる。本発明は、望ましくないＣＮＶを処置するためのより効果的なＰＤＴベースの方法を提供し、これは以下の利点の１以上を有する：処置の効力の増大；ＣＮＶに対する選択性の増大；およびＰＤＴに続く、状態の再発の減少または遅延。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、哺乳動物において望ましくないＣＮＶを処置する方法を提供し、ここで、このＣＭＶは、内皮細胞（例えば、毛細管の内皮細胞）を含む。この方法は：（ａ）哺乳動物、例えば、霊長類、好ましくはヒトに、抗血管新生因子を、有効量がＣＮＶ内に局在することを可能にするために十分な量で投与する工程；（ｂ）哺乳動物に、有効量がＣＮＶ内に局在することを可能にするために十分な量の光増感剤（ＰＤＴ色素）を投与する工程；および（ｃ）、レーザー光が光増感剤によって吸収されるような、レーザー光をＣＮＶに照射して、ＣＮＶを閉塞させる、工程を含む。この方法の実施の間、脈絡膜新血管構造内に配置される内皮細胞に対する損傷は、抗血管新生因子の投与を欠いた類似の処置における内皮細胞によって経験される損傷よりも大きい。さらに、抗血管新生因子は、ＰＤＴの細胞毒性を増強し得る。例えば、抗血管新生因子およびＰＤＴは、相乗的に作用して毛細管の内皮細胞を選択的に殺し得るが、一方、同時に、網膜細胞（例えば、網膜色素上皮細胞および神経感覚性網膜中に配置される細胞（例えば、光受容細胞およびＭｕｌｌｅｒ細胞））を容認する。
【００１２】
抗血管新生因子は、例えば、ＣＮＶを閉塞させるが同時に周辺の血管（例えば、正常な脈絡膜血管系および網膜血管系、および／または組織（例えば、被覆する神経感覚性網膜））を容認することによって、ＰＤＴの選択性を増強し得る。従って、抗血管新生因子の包含は、ＰＤＴ方法を、毛細管内皮細胞に対して、より選択的にする。さらに、本発明の実施は、脈絡膜新血管構造の再発を遅くするかまたは遅延させ得る。
【００１３】
種々の抗血管新生因子が、本発明に使用され得る。有用な抗血管新生因子としては、例えば：アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）；エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）；ＲＧＤトリペプチド配列を含み、そしてαｖβインテグリンに結合し得るペプチド；ＣＯＸ−２選択的インヒビター；ハロフギノン；酢酸アネコターブ（ａｎｅｃｏｔａｖｅ）；血管内皮増殖因子レセプターに結合する抗体および他のペプチド；血管内皮増殖因子に結合して、それと同系のレセプターへの結合を妨げるかまたは減少させる抗体、他のペプチド、および核酸；チロシンキナーゼインヒビター；トロンボスポンジン−１；抗上皮増殖因子；肝細胞増殖因子；トロンボキサン；ならびに色素上皮由来の増殖因子が挙げられる。好ましい抗血管新生因子としては、アンギオスタチン、エンドスタチン、および色素上皮由来の増殖因子が挙げられる。
【００１４】
抗血管新生因子は、特定の状況下で、光増感剤と同時に共投与され得る。しかし、好ましい実施形態においては、この抗血管新生因子は、光増感剤の投与前に哺乳動物に投与される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、哺乳動物において望ましくないＣＮＶを処置する方法を提供する。本方法は、（ａ）哺乳動物、例えば、霊長類、好ましくはヒトに、有効量がＣＮＶ内に局在することを可能にする量の光増感剤（内皮細胞（例えば、ＣＮＶ中に存在する毛細管内皮細胞）上に配置された細胞表面リガンドに優先的に結合する標的化成分を含む）を、投与する工程、；および（ｂ）レーザー光が光増感剤によって吸収されるような、レーザー光をＣＮＶに照射して、ＣＮＶを閉塞させる工程を含む。標的化部分は、優先的にＣＮＶに結合するので、周辺の細胞および組織に比べて、ＣＮＶにおける光増感剤の有効濃度を増大させ得る。従って、このような方法は、ＣＮＶに対するＰＤＴ方法の選択性を増大させるが、一方で周辺の網膜および大きい脈絡膜血管、ならびに被覆する神経感覚網膜を容認する。
【００１６】
この標的化成分は、ＣＮＶ内の内皮細胞に対する親和性を有する任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチジル核酸、有機分子または無機分子）であり得る。しかし、標的化タンパク質およびペプチドが、好まれる。例えば、標的化ペプチドは、αｖβインテグリン（例えば、αｖβ３インテグリンまたはαｖβ５インテグリン）を標的化するペプチドであり得る。あるいは、この標的化ペプチドは、ＣＮＶにおいて上昇した濃度または密度で配置された細胞表面リガンドに優先的に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント、ポリクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント、あるいは生合成抗体結合部位）であり得る。実施例に関して、この標的化成分は、血管内皮増殖因子レセプターに特異的に結合する抗体であり得る。
【００１７】
別の局面において、本発明は、哺乳動物における望ましくないＣＮＶを処置する方法を提供する。本方法は、（ａ）哺乳動物、例えば、霊長類、そしてより好ましくはヒトに、アポトーシス調節因子を、ＣＮＶまたはＣＮＶの周辺の組織に有効量が局在することを可能にするために十分な量で投与する工程；（ｂ）哺乳動物に、ＣＮＶにおける有効量の局在を可能にするために十分な量の光増感剤を投与する工程；および（ｃ）レーザ光が光増感剤によって吸収されるような、レーザー光をＣＮＶに照射して、ＣＮＶを閉塞させる、工程を含む。ＰＤＴの細胞毒性は、増強され得、そして／またはアポトーシス調節因子を欠いた類似の処置と比較して、ＣＮＶに対してより特異的にされ得る。
【００１８】
アポトーシス調節因子は、ＣＮＶの細胞または組織においてアポトーシスを増強するかまたは刺激するか、あるいはＣＮＶの周辺の細胞または組織においてアポトーシスを抑制する任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチジル核酸、有機分子または無機分子）であり得る。好ましい実施形態において、このアポトーシス調節因子は、ＣＮＶ中に存在する細胞（例えば、内皮細胞）におけるアポトーシスを誘導し得るペプチドである。このペプチドは、例えば、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号１）（細胞の外側では毒性はないが、ミトコンドリア膜を破壊することに起因して、標的細胞中に内部移行した場合に毒性があるように設計される）を含むアミノ配列を含み得る。さらに、このペプチドは、標的化アミノ酸配列（例えば、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＲＧＤ−４Ｃとしてまた公知の、ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号２））の包含によって内皮細胞に対して標的化され得る。
【００１９】
このアポトーシス調節因子は、光増感剤と同時に共投与され得る。しかし、好ましい実施形態においては、このアポトーシス調節因子は、光増感剤の投与および／または照射の前に霊長類に投与される。
【００２０】
上記の方法の全てにおいて、ＰＤＴにおいて有用な任意の光増感剤が、本発明の実施において有用であり得ることが意図される。好ましい光増感剤としては、例えば、アミノ酸誘導体、アゾ色素、キサンテン誘導体、クロリン、テトラピロール誘導体、フタロシアニン、および他の各種光増感剤が挙げられる。しかし、好ましい光増感剤としては、例えば、ルテチウムテキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）、ベンゾポルフィリンおよびその誘導体、ならびにヘマトポルフィリンおよびその誘導体が挙げられる。
【００２１】
本発明の上記および他の目的、特徴、および利点、ならびに本発明自体は、添付の図面と共に読まれた場合、上記の好ましい実施形態の記載からより完全に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａは、アンギオスタチンの存在下または非存在下における、ルテニウムテキサフィリン（Ｌｕ−Ｔｅｘ）／ＰＤＴへの曝露に対するウシ網膜毛細管内皮（ＢＲＣＥ）細胞（図１Ａ）のインビトロ生存率を示す棒グラフである。細胞を配置し、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの前１８時間、アンギオスタチンに曝露させた。この生存している画分を、１週間の増殖アッセイを使用して計測した。データは、三回の実験の平均値±標準偏差である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、アンギオスタチンの存在下または非存在下における、ルテニウムテキサフィリン（Ｌｕ−Ｔｅｘ）／ＰＤＴへの曝露に対する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞（図１Ｂ）のインビトロ生存率を示す棒グラフである。細胞を配置し、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの前１８時間、アンギオスタチンに曝露させた。この生存している画分を、１週間の増殖アッセイを使用して計測した。データは、三回の実験の平均値±標準偏差である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＢＲＣＥ（ひし形）およびＲＰＥ（四角）におけるＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ後の、カスパーゼ３様活性の反応速度論を示すグラフである。ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞を、１０Ｊ／ｃｍ２（図２Ａ）、２０Ｊ／ｃｍ２（図２Ｂ）、および４０Ｊ／ｃｍ２（図２Ｃ）の流速量でＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴに曝露させた。その後、示された時間で細胞を回収し、溶解させた。アリコート（タンパク質５０μｇ）を、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣと共に、３７℃で３０分間インキュベートした。放出された蛍光色素の量を、溶解緩衝液における検量線と比較することによって決定し、そしてこのデータは、３回の独立した実験の平均値を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＢＲＣＥ（ひし形）およびＲＰＥ（四角）におけるＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ後の、カスパーゼ３様活性の反応速度論を示すグラフである。ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞を、１０Ｊ／ｃｍ２（図２Ａ）、２０Ｊ／ｃｍ２（図２Ｂ）、および４０Ｊ／ｃｍ２（図２Ｃ）の流速量でＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴに曝露させた。その後、示された時間で細胞を回収し、溶解させた。アリコート（タンパク質５０μｇ）を、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣと共に、３７℃で３０分間インキュベートした。放出された蛍光色素の量を、溶解緩衝液における検量線と比較することによって決定し、そしてこのデータは、３回の独立した実験の平均値を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＢＲＣＥ（ひし形）およびＲＰＥ（四角）におけるＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ後の、カスパーゼ３様活性の反応速度論を示すグラフである。ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞を、１０Ｊ／ｃｍ２（図２Ａ）、２０Ｊ／ｃｍ２（図２Ｂ）、および４０Ｊ／ｃｍ２（図２Ｃ）の流速量でＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴに曝露させた。その後、示された時間で細胞を回収し、溶解させた。アリコート（タンパク質５０μｇ）を、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣと共に、３７℃で３０分間インキュベートした。放出された蛍光色素の量を、溶解緩衝液における検量線と比較することによって決定し、そしてこのデータは、３回の独立した実験の平均値を示す。
【図３】図３は、アンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ対Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ単独後の、ＢＲＣＥにおけるカスパーゼ３様活性を示すグラフである。ＢＲＣＥを、アンギオスタチン（５００ｎｇ／ｍｌ）単独（ひし形）、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ（２０Ｊ／ｃｍ２（四角）、および４０Ｊ／ｃｍ２（バツ印）））単独、ならびにアンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの組み合わせ（三角）に曝露させた。その後、示された時間で細胞を回収し、溶解させた。アリコート（タンパク質５０μｇ）を、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣと共に、３７℃で３０分間インキュベートした。放出された蛍光色素の量を、溶解緩衝液における検量線と比較することによって決定し、そしてこのデータは、３つの独立した実験の平均を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、望ましくないＣＮＶを有することで特徴付けられる眼の状態を処置するための、改善されたＰＤＴベースの方法に関する。このような状態としては、例えば、血管新生ＡＭＤ、眼ヒストプラスマ症候群、病的近視、網膜色素線条、特発性障害、脈絡膜炎、脈絡膜断裂、被覆する（ｏｖｅｒｌｙｉｎｇ）脈絡膜母斑、および特定の炎症性疾患が挙げられる。本発明は、以下の利点の１つ以上を提供する：処置の増大した効力；ＣＮＶに対する増大した選択性；およびＰＤＴ後の状態の減少または遅延した再発。
【００２４】
本発明の方法は、望ましくない標的ＣＮＶを処置するためのＰＤＴベースの方法に関する。この方法は、このような処置が必要な哺乳動物へ、有効量の光増感剤が標的ＣＮＶに局在化することを可能にするのに十分な量（すなわち、ＰＤＴを促進するのに十分な量）の光増感剤の投与を必要とする。次いで、光増感剤の投与後に、ＣＮＶは、この光増感剤によってレーザー光が吸収されるような条件下で、レーザー光が照射される。光によって活性化された場合、この光増感剤は、一重項酸素およびフリーラジカル（例えば、活性酸素種）を生成し、これは周辺組織に損傷を生じる。例えば、内皮細胞のＰＤＴ誘導損傷は、血小板の付着および脱顆粒化を生じ、血行停止および血球凝集、ならびに血管の閉塞を引き起こす。
【００２５】
効力および／またはＰＤＴの選択性における増大、ならびに／あるいはＣＮＶの再発の減少または遅延は、以下：（ｉ）光増感剤の投与の前または投与と同時に、この哺乳動物に抗血管新生因子を投与すること、（ｉｉ）光増感剤をＣＮＶに対して標的化する標的分子と共に光増感剤を使用すること、（ｉｉｉ）光増感剤の投与の前または投与と同時に、この哺乳動物にアポトーシス調節因子を投与すること、（ｉｖ）上記のうちの任意の２つの組合せ（例えば、抗血管新生因子と標的化された光増感剤との組合せ、抗血管新生因子とアポトーシス調節因子との組合せ、または標的化された光増感剤とアポトーシス調節因子との組み合わせ）、あるいは（ｖ）上記の３つ全ての組合せ、によって達成され得る。
【００２６】
ＰＤＴにおいて有用な種々の光増感剤は、本発明の実施において有用であり得ることが意図され、これらとしては、例えば、アミノ酸誘導体、アゾ色素、キサンテン誘導体、クロリン、テトラピロール誘導体、フタロシアニン、および類別される他の光増感剤が挙げられる。
【００２７】
アミノ酸誘導体としては、例えば、５−アミノレブリン酸（Ｂｅｒｇら（１９９７）ＰＨＯＴＯＣＨＥＭ．ＰＨＯＴＯＢＩＯＬ ６５：４０３−４０９；Ｅｌ−Ｆａｒら（１９８５）ＣＥＬＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．ＦＵＮＣＴＩＯＮ ３，１１５−１１９）が挙げられる。アゾ色素としては、例えば、Ｓｕｄａｎ Ｉ、Ｓｕｄａｎ ＩＩ、Ｓｕｄａｎ ＩＩＩ、Ｓｕｄａｎ ＩＶ、Ｓｕｄａｎ Ｂｌａｃｋ、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｏｒａｎｇｅ、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｒｅｄ、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ、Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ、β−カロテン（Ｍｏｓｋｙら（１９８４）Ｅｘｐ．ＲＥＳ．１５５，３８９−３９６）が挙げられる。キサンテン誘導体としては、例えばローズベンガルが挙げられる。
【００２８】
クロリンとしては、例えば、リシルクロリンｐ６（Ｂｅｒｇら（１９９７）前出）およびエチオベンゾクロリン（Ｂｅｒｇら（１９９７）前出）、５，１０，１５，２０−テトラ（ｍ−ヒドロキシフェニル）クロリン（Ｍ−ＴＨＰＣ）、Ｎ−アスパルチルクロリンｅ６（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙら（１９９８）Ｊ．ＮＡＴＬ．ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴ．９０：８８９−９０５）、ならびにバクテリオクロリン（Ｋｏｒｂｅｌｉｋら（１９９２）Ｊ．ＰＨＯＴＯＣＨＥＭ．ＰＨＯＴＯＢＩＯＬ．１２：１０７−１１９）が挙げられる。
【００２９】
テトラピロール誘導体としては、例えば以下が挙げられる：ルテニウムテキサフリン（ｔｅｘａｐｈｒｉｎ）（Ｌｕ−Ｔｅｘ，ＰＣＩ−０１２３）（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙら（１９９８）前出、Ｙｏｕｎｇら（１９９６）ＰＨＯＴＯＣＨＥＭ．ＰＨＯＴＯＢＩＯＬ．６３：８９２−８９７）；ベンゾポルフィルン誘導体（ＢＰＤ）（米国特許第５，１７１，７４９号、同第５，２１４，０３６号、同第５，２８３，２５５号、および同第５，７９８，３４９号、Ｊｏｒｉら（１９９０）ＬＡＳＥＲＳ ＭＥＤ．ＳＣＩ．５，１１５−１２０）、ベンゾポルフィリン誘導体一酸（ＢＰＤ−ＭＡ）（米国特許第５，１７１，７４９号、同第５，２１４，０３６号、同第５，２８３，２５５号、および同第５，７９８，３４９号、Ｂｅｒｇら（１９９７）前出、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙら（１９９８）前出）、ヘマトポルフィリン（Ｈｐ）（Ｊｏｒｉら（１９９０）前出）、ヘマトポルフィリン誘導体（ＨｐＤ）（Ｂｅｒｇら（１９９７）前出、Ｗｅｓｔら（１９９０）ＩＮ．Ｊ．ＲＡＤＩＡＴ．ＢＩＯＬ．５８：１４５−１５６）、ポルフィマー（ｐｏｒｆｉｍｅｒ）ナトリウムまたはＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（ＰＨＰ）（Ｂｅｒｇら（１９９７）前出）、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ（ＰＩＩ）（Ｈｅら（１９９４）ＰＨＯＴＯＣＨＥＭ．ＰＨＯＴＯＢＩＯＬ．５９：４６８−４７３）、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙら（１９９８）前出、Ｈｅら（１９９４）前出）、メソ−テトラ（４−カルボキシフェニル）ポルフィン（ＴＣＰＰ）（Ｍｕｓｓｅｒら（１９８２）ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．ＣＨＥＭ．ＰＡＴＨＯＬ．ＰＨＡＲＭＡＣＯＬ．２，２５１−２５９）、メソ−テトラ（４−スルホナトフェニル）ポルフィン（ＴＳＰＰ）（Ｍｕｓｓｅｒら（１９８２）前出）、ウロポルフィリンＩ（ＵＲＯＰ−Ｉ）（Ｅｌ−Ｆａｒら（１９８５）ＣＥＬＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．ＦＵＮＣＴＩＯＮ ３，１１５−１１９）、ウロポルフィリンＩＩＩ（ＵＲＯＰ−ＩＩＩ）（Ｅｌ−Ｆａｒら（１９８５）前出）、エチルエチオプルプリンスズ（ＳｎＥＴ２）、（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙら（１９９８）前出 ９０：８８９−９０５）および１３，１７−ビス［１−カルボキシプロピオニル］カルバモイルエチル−８−エテニル−２−ヒドロキシ−３−ヒドロキシイミノエチリデンｅ−２，７，１２，１８−テトラネチル（ｔｅｔｒａｎｅｔｈｙｌ）６ポルフィリンナトリウム（ＡＴＸ−Ｓ１０（Ｎａ））Ｍｏｒｉら（２０００）ＪＰＮ．Ｊ．ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．９１：７５３−７５９、Ｏｂａｎａら（２０００）ＡＲＣＨ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１１８：６５０−６５８、Ｏｂａｎａら（１９９９）ＬＡＳＥＲＳ ＳＵＲＧ．ＭＥＤ．２４：２０９−２２２）。
【００３０】
フタロシアニンとしては、例えば以下が挙げられる：クロロアルミニウムフタロシアニン（ＡｌＰｃＣＩ）（Ｒｅｒｋｏら（１９９２）ＰＨＯＴＯＣＨＥＭ．ＰＨＯＴＯＢＩＯＬ．５５，７５−８０）、２−４スルホネート基を有するアルミニウムフタロシアニン（ＡｌＰｃＳ２−４）（Ｂｅｒｇら（１９９７）前出、Ｇｌａｓｓｂｅｒｇら（１９９１）ＬＡＳＥＲＳ ＳＵＲＧ．ＭＥＤ．１１，４３２−４３９）、クロロ−アルミニウムスルホン酸化フタロシアニン（ＣＡＳＰｃ）（Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９１）Ｊ．ＮＡＴＬ．ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴ．８３，１８−３２）、フタロシアニン（ＰＣ）（Ｊｏｒｉら（１９９０）前出）、ケイ素フタロシアニン（Ｐｃ４）（Ｈｅら（１９９８）ＰＨＯＴＯＣＨＥＭ．ＰＨＯＴＯＢＩＯＬ．６７：７２０−７２８、Ｊｏｒｉら（１９９０）前出）、マグネシウムフタロシアニン（Ｍｇ２＋−ＰＣ）（Ｊｏｒｉら（１９９０）前出）、亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰＣ）（Ｂｅｒｇら（１９９７）前出）。他の光増感剤としては、例えば、チオニン、トルイジンブルー、ニュートラルレッドおよびアズールｃが挙げられる、しかし、好ましい光増感剤としては、例えば、ルテニウムテキサフリン（Ｌｕ−Ｔｅｘ）が挙げられ、その有利な臨床特性（深組織浸透および迅速なクリアランスを可能にする、約７３０ｎｍでの吸収を含む）のために、新世代の光増感剤が、現在ＣＮＶに対する臨床試験中にあり、これはＡｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸから入手可能である。他の好ましい光増感剤としては、ベンゾポルフィリンおよびベンゾポルフィリン誘導体（例えば、ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＤＡ、ＱＬＴ Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａから入手可能）が挙げられる。
【００３１】
この光増感剤は、好ましくは、高濃度の光増感剤をＣＮＶに送達する送達系に処方される。このような処方としては、例えば、光増感剤と、高濃度の光増感剤をＣＮＶに送達するキャリアとの組合せ、および／または光増感剤と、ＣＮＶの特定の細胞表面成分に優先的に結合する特異的結合リガンドとの結合が挙げられ得る。
【００３２】
１つの好ましい実施形態において、この光増感剤は、脂質ベースのキャリアと組合され得る。例えば、リポソーム処方物は、光増感剤、グリーンポルフィリン、およびより詳細にはＢＰＤ−ＭＡの、血漿の低密度リポタンパク質成分への送達において特に有効であることが見出され、これは次いで、光増感剤をより効率的にＣＮＶへと送達するキャリアとして働く。増加した数のＬＤＬレセプターがＣＮＶと会合することが示され、そして血液のリポタンパク質相への光増感剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｔｉｚｅｒ）の分配の増加によって、これはＣＮＶへとより効率的に送達され得る。特定の光増感剤（例えば、グリーンポルフィリン、およびより詳細にはＢＰＤ−ＭＡ）は、リポタンパク質と強く相互作用する。ＬＤＬ自体はキャリアとして使用され得るが、ＬＤＬは、相当より高価であり、そしてリポソーム処方物よりも実用的ではない。したがって、ＬＤＬ、または好ましくはリポソームは、グリーンポルフィリンについての好ましいキャリアである。なぜなら、グリーンポルフィリンは、リポタンパク質と強く相互作用し、そしてこれはリポソーム中に容易にパッケージ化されるためである。リポソームを含むリポ複合体（ｌｉｐｏｃｏｍｐｌｅｘ）として処方されるグリーンポルフィリンの組成物は、例えば、米国特許第５，２１４，０３６号、同第５，７０７，６０８号および同第５，７９８，３４９に記載されている。グリーンポルフィリンのリポソーム処方物は、ＱＬＴ Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａから入手され得る。他の特定の光増感剤が、同様に脂質キャリア（例えば、リポソームまたはＬＤＬ）と共に処方され得、光増感剤をＣＮＶへと送達することが意図される。
【００３３】
さらに、光増感剤は、ＣＮＶの細胞表面成分に優先的に結合する特異的結合リガンド（例えば、血管新生内皮ホーミングモチーフ）と結合され得る。種々の細胞表面リガンドは、他の細胞または組織と比較して、新しい血管において高レベルで発現されるようである。
【００３４】
新しい血管における内皮細胞は、樹立した血管において存在しないかまたはほとんど検出可能ではないいくつかのタンパク質を発現し（Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９５）ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ １：２７−３１）、そして特定の血管新生因子様血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のためのインテグリン（Ｂｒｏｏｋｓら（１９９４）ＳＣＩＥＮＣＥ ２６４：５６９−５７１；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら（１９９５）ＳＣＩＥＮＣＥ ２７０：１５００−１５０２）およびレセプターを含む。ファージペプチドライブラリーのインビボ選択はまた、器官特異的な血管系によって発現されるペプチドを同定し、多くの組織が血管の「アドレス」を有することを暗示する（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら（１９９６）ＮＡＴＵＲＥ ３８０：３６４−３６６）。適切なターゲティング部分は、光増感剤をＣＮＶ内皮に配向し得、これによって効力が増大し、そしてＰＤＴの毒性を低減することが意図される。
【００３５】
いくつかの標的分子は、光増感剤を血管新生内皮に対して標的化するために使用され得る。例えば、α−ｖインテグリン（特に、α−ｖ β３およびα−ｖ β５）は、臨床検体および実験モデルの両方において、脈絡膜新血管構造組織において発現されるようである（Ｃｏｒｊａｙら（１９９７）ＩＮＶＥＳＴ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．ＶＩＳ．ＳＣＩ．３８，Ｓ９６５；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら（１９９５）前出）。従って、α−ｖインテグリンに優先的に結合する分子は、光増感剤をＣＮＶに標的化するために使用され得る。例えば、これらのインテグリンの環状ペプチドアンタゴニストは、実験モデルにおいて血管新生形成を阻害するために使用されてきた（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら（１９９６）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９３：９７６４−９７６９）。Ｎ末端からＣ末端方向にＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号２）のアミノ酸配列を有するペプチドモチーフ（ＲＧＤ−４Ｃとしてもまた公知である）は、ヒトα−ｖインテグリンに対する選択的結合および腫瘍の新血管構造（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）における蓄積が、他の新脈管形成ターゲティングペプチドよりも、より効率的であることが同定された（Ａｒａｐら（１９９８）ＮＡＴＵＲＥ ２７９：３７７−３８０；Ｅｌｌｅｒｂｙら（１９９９）ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ５：１０３２−１０３８）。アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）はまた、光増感剤のための標的分子として使用され得る。研究は、例えば、アンジオスタチンが、ヒト内皮細胞の表面上に配置したＡＴＰシンターゼに特異的に結合することを示した（Ｍｏｓｅｒら（１９９９）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９６：２８１１−２８１６）。
【００３６】
別の潜在的な標的分子は、血管内皮増殖因子レセプター（ＶＥＧＦ−２Ｒ）に対する抗体である。臨床的および実験的証拠は、脈絡膜新血管構造形成、特に、虚血関連血管新生形成におけるＶＥＧＦについての役割を強く支持する（Ａｄａｍｉｓら（１９９６）ＡＲＣＨ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１１４：６６−７１；Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏら（１９９６）ＡＲＣＨ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１１４：９６４−９７０；Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏら（１９９６）ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬＯＧＹ １０３：１８２０−１８２８）。ＶＥＧＦレセプターに対する抗体（ＶＥＧＦＲ−２、またＫＤＲとしても公知）はまた、血管新生内皮に優先的に結合し得る。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、例えば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または（Ｆａｂ’）２分子）、ポリクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは標的リガンドに特異的に結合する生合成抗体結合部位（例えば、ｓＦｖ（米国特許第５，０９１，５１３号；同第５，１３２，４０５号；同第５，２５８，４９８号；および同第５，４８２，８５８号））を含む。本明細書中で使用される場合、用語「特異的な」結合または「優先的な」結合は、標的分子（例えば、抗体）が、少なくとも１０５、そしてより好ましくは１０７Ｍ−１の結合親和性で、相補的なリガンドまたは標的リガンドに結合することを意味することが理解される。
【００３７】
この標的分子は、当該分野で公知でありかつ使用される方法論を用いて合成され得る。例えば、タンパク質およびペプチドは、慣習的な合成ペプチド化学を使用して合成され得るか、あるいは組換え発現系において組換えタンパク質またはペプチドとして発現され得る（例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを参照のこと）。同様に、抗体は、慣習的な方法論（例えば、「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．編，１９８４ Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよび「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｈａｒｌｏｗら編（１９８８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓに記載されるような）を使用して調製および精製され得る。一旦生成されると、このターゲティング因子は、例えば、通常の架橋試薬（例えば、ヘテロ二官能性架橋試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能）を使用する標準的なカップリング化学を使用して、光増感剤と結合され得る。
【００３８】
一旦処方されると、この光増感剤は、広範な種々の手段（例えば、経口的、非経口的、または直腸的に）のいずれかで投与され得る。非経口的投与（例えば、静脈内、筋肉内、または皮下）は好ましい。静脈内注入が、特に好ましい。光増感剤の用量は、処置される組織；これが運ばれる物理学的送達系（例えば、リポソームの形態）；または標的特異的リガンド（例えば、抗体または免疫学的に活性なフラグメント）に結合するか否か、に依存して広範に変化し得る。
【００３９】
本発明における効果的な、選択的光力学的治療について用いられる種々のパラメータは、相互関係を有することに注意すべきである。従って、この用量はまた、他のパラメータ（例えば、フルエンス、照射量、ＰＤＴにおいて用いられる光の持続時間、およびこの用量の投与と治療照射との間の時間間隔）に関して調節されるべきである。これらのパラメータの全ては、周辺組織に有意な損傷を与えることなく、ＣＮＶに有意な損傷を生じるように調節されるべきである。
【００４０】
代表的に、使用される光増感剤の用量は、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１５〜約５．０ｍｇ／ｋｇ、およびなおより好ましくは約０．２５〜約２．０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。さらに、光増感剤の投薬量が減少する場合（例えば、グリーンポルフィリンまたはＢＰＤ−ＭＡの場合は約２から約１ｍｇ／ｋｇへと）、ＣＮＶを閉塞（ｃｌｏｓｅ）するために必要なフルエンスは、増加し得る（例えば、約５０から約１００ジュール／ｃｍ２）。同様の傾向が、本明細書中で議論される他の光増感剤について観察され得る。
【００４１】
光増感剤が投与された後、ＣＮＶは、代表的には光増感剤の最大吸光度の周りの波長（通常は、約５５０ｎｍ〜約７５０ｎｍの範囲）で照射される。この範囲の波長は、身体組織への増大した浸透のために特に好ましい。特定の光増感剤のために使用される好ましい波長としては、例えば、ベンゾポルフィリン誘導体一酸については約６９０ｎｍ、ヘマトポルフィリン誘導体については約６３０ｎｍ、クロロアルミニウムスルホン化フタロシアニンについては約６７５ｎｍ、エチルエチオプルプリンスズについては約６６０ｎｍ、ルテニウムテキサフリンについては約７３０ｎｍ、ＡＴＸ−Ｓ １０（ＮＡ）については約６７０ｎｍ、Ｎ−アスパルチルクロリンｅ６については約６６５ｎｍ、および５，１０，１５，２０−テトラ（ｍ−ヒドロキシフェニル）クロリンについては約６５０ｎｍが挙げられる。
【００４２】
照射の結果として、三重項状態の光増感剤は、酸素および他の化合物と相互作用して、反応性中間体（例えば、一重項酸素および活性酸素種）を形成し、これが細胞構造を崩壊させ得ると考えられる。可能な細胞標的としては、細胞膜、ミトコンドリア、リソソーム膜、および核が挙げられる。腫瘍および血管新生モデルからの証拠は、血管系の閉塞が光力学治療の主な機構であり、これは内皮細胞への損傷によって起こり、引き続いて血小板の付着、脱顆粒、および血栓の形成が生じることを示す。
【００４３】
照射処置の間のフルエンスは、使用される光増感剤の型、組織の型、標的組織の深さ、および被覆する流体または血液の量に依存して、広範に変化し得る。フルエンスは、好ましくは、約１０〜約４００ジュール／ｃｍ２で変化し、そしてより好ましくは約５０〜約２００ジュール／ｃｍ２で変化する。照射は、代表的には約５０ｍＷ／ｃｍ２〜約１８００ｍＷ／ｃｍ２、より好ましくは約１００ｍＷ／ｃｍ２〜約９００ｍＷ／ｃｍ２、そして最も好ましくは約１５０ｍＷ／ｃｍ２〜約６００ｍＷ／ｃｍ２の範囲で変化する。多くの実用的な用途について、この照射は、約３００ｍＷ／ｃｍ２〜約９００ｍＷ／ｃｍ２の範囲内であることが意図される。しかし、効果的でありかつ処置時間を短くするという利点を有する場合、より高い照射の使用が選択され得る。
【００４４】
光増感剤の投与後の光照射の時間は、処置の選択性を最大にする（従って、標的組織以外の構造への損傷を最小にする）手段の１つとして重要であり得る。光増感剤の投与後の光処置までの最適の時間は、投与の様式、投与の形態（例えば、リポソームの形態またはＬＤＬとの複合体として）、および標的組織の型に依存して、広範に変化し得る。例えば、ベンゾポルフィリン誘導体は、代表的に、投与後１分以内に標的新血管構造内に存在し、そして約５０分維持する。ルテニウムテキサフリンは、代表的に投与後１分以内に標的新血管構造内に存在し、そして約２０分持続する。Ｎ−アセチルクロリンｅ６は、代表的に、投与後１分以内に標的新血管構造内に存在し、そして約２０分持続する。そしてローズベンガルは、代表的に投与後１分以内に標的血管系に存在し、そして約１０分間持続する。
【００４５】
効率的な血管の閉塞は、一般に、光増感剤の投与後、約１分〜約３時間の範囲内の時点で起こる。しかし、グリーンポルフィリンの場合、なお比較的高濃度の光増感剤を含む網膜血管の過度の損傷を防止するために、投与後最初の５分以内にＰＤＴを行うのは望ましくない。
【００４６】
ＰＤＴの効力は、従来の方法論を使用して（例えば、眼底撮影法または血管造影法を介して）、モニターされ得る。閉塞は、通常、処置された領域での初期血管造影フレームにおける低蛍光（ｈｙｐｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）によって血管造影的に観察され得る。後期の血管造影フレームの間に、過剰蛍光（ｈｙｐｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の冠が現れ始め得、これは次いで処置した領域を満たし、これは処置された領域における損傷した網膜色素上皮を通る、隣接する脈絡毛細管板からの漏出をおそらく意味する。処置された領域の大きな網膜血管は、代表的に、光力学治療の後に灌流する。
【００４７】
最小の網膜損傷は、一般に、組織病理学的な相関において見出され、そしてこれはフルエンスおよび照射後の光増感剤が投与される時間間隔に依存する。適切な光増感剤、投薬量、投与の様式、処方、投与後照射前のタイミング、および照射パラメータの選択は、経験的に決定され得ることが意図される。
【００４８】
望ましくないＣＮＶを処置するために、種々の抗血管新生因子がＰＤＴと組合され得ることが意図される。この抗脈環形成因子は、ＰＤＴ治療の細胞傷害性を増強し得、これによって脈絡膜の新血管構造の閉塞を増大する。さらに、この抗血管新生因子は、例えば、ＣＮＶを閉塞し、同時に、周辺血管（例えば、網膜および大きな脈絡膜の血管）および／または周辺組織（例えば、網膜上皮）を容認する（ｓｐａｒｉｎｇ）ことによって、ＰＤＴの選択性を増大し得る。さらに、この抗血管新生因子は、この状態の再発を減少または遅延するために使用され得る。
【００４９】
用語「抗血管新生因子」は、哺乳動物における新しい血管の形成を減少または阻害する、任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸（リボース核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ））、ペプチジル核酸、有機化合物または無機化合物）を意味することが理解される。有用な新脈管形成インヒビター（既に公知でない場合）は、当該分野で周知でありかつ使用される種々のアッセイを使用して同定され得ることが意図される。このようなアッセイとしては、例えば、ウシ毛細管内皮細胞増殖アッセイ、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ、またはマウス角膜アッセイが挙げられる。しかし。ＣＡＭアッセイが好ましい（例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）ＣＥＬＬ ７９：３１５−３２８およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）ＣＥＬＬ ８８：２７７−２８５を参照のこと）。手短にいうと、インタクトな卵黄を有する胚が、受精した３日齢の白色卵から取り出され、そしてペトリ皿に置かれる。３７℃、３％ＣＯ２で３日間インキュベートした後、推定新脈管形成インヒビターを含むメチルセルロースディスクを、個々の胚の絨毛尿膜に適用する。約４８時間インキュベート後、この絨毛尿膜は、顕微鏡下で阻害の区域の証拠について観察される。
【００５０】
多数の抗血管新生因子は周知であり、そして当該分野において完全に文書に示されている（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０８３３５を参照のこと）。本発明の実施において有用な抗血管新生因子の例としては、例えば、抗新脈管形成のタンパク質／ペプチドインヒビターが挙げられ、これは例えば、以下である：プラスミノゲンのタンパク質分解性フラグメントであるアンギオスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）ＣＥＬＬ ７９：３１５−３２８、ならびに米国特許第５，７３３，８７６号；同第５，８３７，６８２号；および同第５，８８５，７９５号）（アンギオスタチンの全長アミノ酸配列、その生物活性フラグメント、およびそのアナログを含む）；コラーゲンＸＶＩＩＩのタンパク質分解性フラグメントである、エンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）ＣＥＬＬ ８８：２７７−２８５，Ｃｉｒｒｉら（１９９９）ＩＮＴ．ＢＩＯＬ．ＭＡＲＫＥＲ １４：２６３−２６７、および米国特許第５，８５４，２０５号）（エンドスタチンの全長アミノ酸配列、その生物活性フラグメント、およびそのアナログを含む）；ＲＧＤトリペプチド配列を含み、そしてαｖβ３インテグリンを結合し得るペプチド（Ｂｒｏｏｋｓら（１９９４）ＣＥＬＬ ７９：１１５７−１１６４，Ｂｒｏｏｋｓら（１９９４）ＳＣＩＥＮＣＥ ２６４：５６９−５７１）；腫瘍血管上皮細胞において見出されるαｖβ３インテグリンに優先的に結合する、特定の抗体およびその抗原結合フラグメントならびにペプチド（Ｂｒｏｏｋｓら、前出、Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら（１９９６）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９３：９７６４−９７６９）；上皮増殖因子レセプターに優先的に結合する、特定の抗体およびその抗原結合フラグメントならびにペプチド（Ｃｉａｒｄｅｌｌｏら（１９９６）Ｊ．ＮＡＴＬ．ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴ．８８：１７７０−１７７６，Ｃｉａｒｄｅｌｌｏら（２０００）ＣＬＩＮ．ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．６：３７３９−３７４７）；血管内皮増殖因子に優先的に結合し、そして中和する、抗体、タンパク質、ペプチドおよび／または核酸（Ａｄａｍｉｓら（１９９６）ＡＲＣＨ ＯＰＴＨＡＬＭＯＬ １１４：６６−７１）、内皮増殖因子レセプターに優先的に結合し、そして中和する、抗体、タンパク質、および／またはペプチド；抗線維芽細胞増殖因子、抗上皮増殖因子（Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら（２０００）ＣＬＩＮ．ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．６：３７３９−３７４７）（全長アミノ酸配列、その生物活性フラグメントおよびアナログを含む）；ならびに色素上皮由来増殖因子（Ｄａｗｓｏｎ（１９９９）ＳＣＩＥＮＣＥ ２０３５：２４５−２４８）（全長アミノ酸配列、その生物活性フラグメントおよびアナログを含む）。生物活性フラグメントとは、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の、インタクトなタンパク質の生物活性を有する、インタクトなタンパク質の部分をいう。アナログとは、インタクトなタンパク質の種および対立遺伝子改変体、または少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも７０％、そして最も好ましくは９０％の、インタクトなタンパク質の生物活性を有する、そのアミノ酸置換物、挿入物また���欠失物をいう。
【００５１】
他の新脈管形成インヒビターとしては、例えば、以下が挙げられる：ＣＯＸ−２選択インヒビター（Ｍａｓｆｅｒｒｅｒら（１９９８）ＰＲＯＣ．ＡＭＥＲ．ＡＳＳＯＣ．ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．３９：２７１；Ｅｒｓｈｏｖら（１９９９）Ｊ．ＮＥＵＲＯＳＣＩ．ＲＥＳ．１５：２５４−２６１；Ｍａｓｆｅｒｒｅｒら（２０００）ＣＵＲＲ．ＭＥＤ．ＣＨＥＭ．７：１１６３−１１７０）；チロシンキナーゼインヒビター（例えば、ＰＤ １７３０７４）（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆら（１９９９）ＩＮＶＥＳＴ．ＮＥＷ ＤＲＵＧＳ １７：１２１−１３５）、ハロフギノン（Ａｂｒａｍｏｖｉｔｃｈら（１９９９）ＮＥＯＰＬＡＳＩＡ １：３２１−３２９；Ｅｌｋｉｎら（１９９９）ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．５：１９８２−１９８８）、ＡＧＭ−１４７０（Ｂｒｅｍら（１９９３）Ｊ．ＰＥＤ．ＳＵＲＧＥＲＹ ２８：１２５３−１２５７）、脈管形成ステロイド（例えば、ヒドロコルチゾンおよびアネコルタブ（ａｎｅｃｏｒｔａｖｅ）アセテート（Ｐｅｎｎら（２０００）ＩＮＶＥＳＴ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．ＶＩＳ．ＳＣＩ．４２：２８３−２９０）、トロンボスポンジン−１（Ｓｈａｆｉｅｅら（２０００）ＩＮＶＥＳＴ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．ＶＩＳ．ＳＣＩ．８：２３７８−２３８８；Ｎｏｒら（２０００）Ｊ．ＶＡＳＣ．ＲＥＳ．３７：０９−２１８）、ＵＣＮ−０１（Ｋｒｕｇｅｒら（１９９８−１９９９）ＩＮＶＡＳＩＯＮ ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ １８：２０９−２１８）、ＣＭ １０１（Ｓｕｎｄｅｌｌら（１９９７）ＣＬＩＮ．ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．３：３６５−３７２）；フマギリンおよびアナログ（例えば、ＡＧＭ−１４７０）（Ｉｎｇｂｅｒら（１９９０）ＮＡＴＵＲＥ ３４８：５５５−５５７）、ならびに他の低分子（例えば、サリドマイド）（Ｄ’Ａｍａｔｏら（１９９４）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９１：４０８２−４０８５）。
【００５２】
いくつかのサイトカイン（その生物活性フラグメントおよびそのアナログを含む）もまた、抗新脈管形成活性を有することが報告されており、従って、本発明の実施において有用であり得る。例としては、例えば、以下が挙げられる：ＩＬ−１２（これは、報告によれば、ＩＦＮ−γ依存性機構を介して作用する）（Ｖｏｅｓｔら（１９９５）Ｊ．ＮＡＴＬ．ＣＡＮＣ．ＩＮＳＴ．８７：５８１−５８６）；ＩＦＮ−α（これは、単独でかまたは他のインヒビターとの組み合わせにおいて、抗新脈管形成性であることが示されている）（Ｂｒｅｍら（１９９３）Ｊ．ＰＥＤＩＡＴＲ．ＳＵＲＧ．２８：１２５３−１２５７）。さらに、インターフェロンＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γは、報告によれば、免疫学的効果、および抗新脈管形成特性を有し、これらの特性は、これらのインターフェロンの抗ウイルス活性に依存しない。しかし、好ましい抗血管新生因子としては、エンドスタチンおよびアンギオスタチンが挙げられる。
【００５３】
抗血管新生因子は、当該分野において公知であり、そして使用される方法論を使用して、合成され得る。例えば、タンパク質およびペプチドは、従来の合成ペプチド化学および精製プロトコルを使用して合成および精製され得るか、または組換え発現系において組換えタンパク質または組換えペプチドとして発現され得る（例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを参照のこと）。同様に、抗体は、例えば「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．編、１９８４ Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよび「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｈａｒｌｏｗら編（１９８８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓに記載されるように、従来の方法論を使用して、調製および精製され得る。
【００５４】
抗血管新生因子が核酸またはペプチジル核酸である場合には、このような化合物は、当該分野において公知の化学的なオリゴヌクレオチドおよびペプチジル核酸の合成の方法論のいずれかによって合成され得（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９２／２０７０２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０１３５２３を参照のこと）、そしてアンチセンス治療において使用され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列およびペプチジル核酸配列は、通常、１０〜１００ユニット長、より好ましくは１５〜５０ユニット長であり、遺伝子および／またはｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得、従って、標的タンパク質の転写および／または翻訳を阻害するために使用され得る。しかし、オリゴヌクレオチド配列は一般に、デオキシリボヌクレオチド配列より、リボヌクレアーゼによる酵素的攻撃に対してより感受性が高いことが、理解されている。従って、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、インビボでの使用に関して、オリゴリボヌクレオチドより好ましい。ヌクレオチド配列の場合には、ホスホジエステル結合が、チオエステル結合で置換され得、得られる分子をヌクレアーゼ分解に対してより耐性にする。さらに、ペプチジル核酸配列は、規則的な核酸配列とは異なり、ヌクレアーゼ分解に対して感受性ではなく、従って、インビボにおいてより卓越した寿命を有するようである。さらに、ペプチジル核酸配列は、対応するＤＮＡ配列よりも強く、相補的な一本鎖ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖と結合することが見出されている（ＰＣＴ／ＥＰ９２／２０７０２）。さらに、抗血管新生因子が有機化合物または無機化合物である場合には、このような化合物は、当該分野において公知の標準的な手順によって、合成され、抽出され、そして／または精製され得る。
【００５５】
投与されるべき抗血管新生因子の型および量は、ＰＤＴおよび処置されるべき細胞型に依存し得る。しかし、最適な抗血管新生因子、投与の様式および投薬量は、実験的に決定され得ることが考慮される。抗血管新生因子は、薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクル中で投与され得、これによって、投与が、レシピエントの電解質および／または容量のバランスに他に不利な影響を与えない。キャリアは、例えば、生理食塩水を含み得る。
【００５６】
タンパク質、ペプチドまたは核酸に基づく新脈管形成インヒビターは、例えば、約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、そして最も好ましくは約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、投与され得る。例えば、血管上皮増殖因子を結合する抗体は、２〜４週間ごとに１回、約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、静脈内投与され得る。例えば、エンドスタチンは、毎日を基礎として、１日あたり約１〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量で、静脈内投与され得る。硝子体内投与に関して、抗血管新生因子（例えば、血管上皮増殖因子を結合する抗体）は、代表的に、周期的にボーラスとして、約１０μｇ〜約５ｍｇ／眼の範囲、そしてより好ましくは約１００μｇ〜約２ｍｇ／眼の範囲の投薬量で、投与される。
【００５７】
抗血管新生因子は、好ましくは、ＰＤＴの前に、哺乳動物に投与される。従って、抗血管新生因子を、光増感剤の投与の前に投与することが、好ましい。抗血管新生因子は、光増感剤と同様に、広範な種々の様式（例えば、経口、非経口、または直腸）のいずれかで投与され得る。しかし、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、および硝子体内）が好ましい。投与は、周期的なボーラスとして（例えば、静脈内または硝子体内）、あるいは内部貯蔵所から（例えば、眼内または眼外の位置に配置された、生体腐食性移植物から）または外部貯蔵所から（例えば、静脈内バッグから）の連続的な注入として、提供され得る。抗血管新生因子は、例えば、眼の内壁に固定された徐放性薬物送達デバイスからの連続的な放出によってか、または脈絡膜への標的化された経強膜制御放出を介して、局所的に投与され得る（ＰＣＴ／ＵＳ００／００２０７を参照のこと）。
【００５８】
従って、本発明は、眼の状態（これは好ましくは、脈絡膜の血管新生に関連する）を、好ましくはＰＤＴに基づく方法で処置するための、医薬品の調製における、抗血管新生因子の使用を包含する。この抗血管新生因子は、キットにおいて提供され得、このキットは、このような状態を処置する方法に関する指示が書かれたパッケージインサートを、必要に応じて含み得る。光増感剤と抗血管新生因子との両方を含む組成物が、本発明における使用のために提供され得る。この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含有し得る。従って、本発明は、光増感剤および抗血管新生因子を含有する、薬学的に受容可能な組成物；ならびに医薬品における使用のための組成物を包含する。しかし、より好ましくは、本発明は、抗血管新生因子および光増感剤が別個に投与される、組み合わせ治療における使用のためのものである。好ましくは、抗血管新生因子は、光増感剤の投与の前に投与される。このような投与に関する指示が、抗血管新生因子および／または光増感剤に関して提供され得る。所望である場合には、抗血管新生因子および光増感剤が、１つのキットに一緒に提供され得、このキットは、必要に応じて、使用説明書を書かれたパッケージインサートを含む。抗血管新生因子および光増感剤は、好ましくは、別個の容器内に提供される。各投与に関して、抗血管新生因子および／または光増感剤は、単一投薬量形態または複数投薬量形態で提供され得る。しかし、光増感剤および抗血管新生因子の好ましい投薬量は、上記のとおりである。
【００５９】
さらに、ＰＤＴ方法の効力および選択性が、ＰＤＴをアポトーシス調節因子と組み合わせることによって、増強され得る。アポトーシス調節因子は、特定の細胞型においてアポトーシスを誘導または抑制する、任意の因子であり得、例えば、タンパク質（例えば、増殖因子または抗体）、ペプチド、核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ペプチジル核酸（例えば、アンチセンス分子）、有機分子または無機分子であり得る。例えば、ＣＮＶ内皮細胞のアポトーシス機構を、アポトーシスの誘発因子で、ＰＤＴの前にプライムし、これによってこれらの細胞のＰＤＴに対する感受性を増加させることが、有利であり得る。この様式でプライムされる内皮細胞は、ＰＤＴに対してより感受性であるとみなされる。このアプローチはまた、ＣＮＶ閉塞を達成するために必要とされる光用量（フルエンス）を減少させ得、そしてこれによって、ＲＰＥのような周囲の細胞に対する損傷のレベルを低下させ得る。あるいは、ＣＮＶの外側の細胞が、アポトーシスの抑制因子でプライムされ得、これによって、これらの細胞のＰＤＴに対する感受性を低下させ得る。このアプローチにおいて、特定のフルエンスにおけるＰＤＴが、ＣＮＶに対してより選択的になり得る。
【００６０】
アポトーシスは、遺伝子的に決定された細胞自殺プログラムの活性化を包含し、これは、細胞の縮小、核凝縮、ＤＮＡ断片化、膜の再構築および小疱形成によって特徴付けられる、形態的に異なる形の細胞死を生じる（Ｋｅｒｒら（１９７２）ＢＲ．Ｊ．ＣＡＮＣＥＲ ２６：２３９−２５７）。このプロセスの中核は、前酵素の保存されたセット（カスパーゼと呼ばれる）にあり、そしてこのファミリーの２つの重要なメンバーは、カスパーゼ３および７である（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら（１９９７）ＴＩＢＳ ２２：２９９−３０６）。これらの活性のモニタリングを使用して、進行中のアポトーシスを評価し得る。
【００６１】
アポトーシスは、活性酸素種の発生に関連すること、およびＢｃｌ−２遺伝子の産物が、活性酸素種の発生または作用を阻害することによって、細胞をアポトーシスに対して保護することが、示唆されている（Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｙら（１９９３）ＣＥＬＬ ７５：２４１−２５１，Ｋａｎｅら（１９９３）ＳＣＩＥＮＣＥ ２６２：１２７４−１２７７，Ｖｅｉｓら（１９９３）ＣＥＬＬ ７５：２２９−２４０，Ｖｉｒｇｉｌｉら（１９９８）ＦＲＥＥ ＲＡＤＩＣＡＬＳ ＢＩＯＬ．ＭＥＤ．２４：９３−１０１）。Ｂｃｌ−２は、アポトーシス調節遺伝子産物の増殖ファミリーに属し、これらは、死アンタゴニスト（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬなど）または死アゴニスト（Ｂａｘ、Ｂａｋ）のいずれかであり得る（Ｋｒｏｅｍｅｒら（１９９７）ＮＡＴ．ＭＥＤ．３：６１４−６２０）。細胞死の制御は、これらの相互作用および種々のファミリーメンバーの構成的活性によって、調節されるようである（Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｙら（１９９３）ＣＥＬＬ ７５：２４１−２５１）。いくつかのアポトーシス経路が、刺激特異的、段階特異的、状況特異的、かつ細胞型特異的な様式で優先的に活性化された哺乳動物細胞において、共存し得る（Ｈａｋｅｍら（１９９８）ＣＥＬＬ ９４：３３９−３５２）。
【００６２】
アポトーシス誘導因子は、好ましくは、ＣＮＶに位置する細胞（例えば、内皮細胞）においてアポトーシスを誘導し得る、タンパク質またはペプチドである。１つのアポトーシス誘導ペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号１）を有するアミノ酸配列を含む。このペプチドは、報告によれば、細胞の外側では非毒性であるが、ミトコンドリア膜を破壊することによって、標的化細胞に内在化する場合に、毒性となる（Ｅｌｌｅｒｂｙら、（１９９９）前出）。この配列は、架橋剤またはペプチド結合のいずれかによって、標的化ドメイン（例えば、ＲＧＤ−４Ｃとして公知のアミノ酸配列（Ｅｌｌｅｒｂｙら（１９９９）前出）（これは、報告によれば、アポトーシス誘導ペプチドを内皮細胞に指向し得る））に結合され得る。他のアポトーシス誘導因子としては、例えば、コンスタチン（ｃｏｎｓｔａｔｉｎ）（Ｋａｍｐｈａｕｓら（２０００）Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．１４：１２０９−１２１５）、組織壊死因子α（Ｌｕｃａｓら（１９９８）ＢＬＯＯＤ ９２：４７３０−４７４１）（その生物活性フラグメントおよびアナログを含む）、シクロヘキシミド（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら（２０００）ＡＭ．Ｊ．ＰＡＴＨＯＬ．１５６：３９３−３９８）、ツニカマイシン（Ｍａｒｔｉｎｅｚら（２０００）ＡＤＶ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．ＢＩＯＬ．４７６：１９７−２０８）、アデノシン（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら（２０００）ＡＭ．Ｊ．ＰＨＹＳＩＯＬ．ＬＵＮＧ ＣＥＬＬ ＭＯＬ．ＰＨＹＳＩＯＬ．２７９：７３３−７４２）が挙げられる。さらに、他のアポトーシス誘導因子としては、例えば、１つ以上の死アンタゴニスト（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ）の発現を減少または停止させる、アンチセンス核酸またはペプチジル核酸配列が挙げられ得る。Ｂｃｌ−２に対するアンチセンスヌクレオチドは、ＰＤＴの間に、光毒性およびアポトーシスに対する感受性の増加とともに、特定の株におけるＢｃｌ−２タンパク質の発現を低下させることが示されている（Ｚｈａｎｇら（１９９９）ＰＨＯＴＯＣＨＥＭ ＰＨＯＴＯＢＩＯＬ ６９：５８２−５８６）。さらに、Ｂｃｌ−２のオープンリーディングフレームの最初の６つのコドンに相補的であり、そしてＦ３１３９として公知の、１８マーホスホロチエートオリゴヌクレオチドが、非ホジキンリンパ腫に対する処置として、ヒトにおいて試験されている。
【００６３】
アポトーシス抑制因子としては、サービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）（その生物活性フラグメントおよびアナログを含む）（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら（２０００）Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２７５：９１０２−９１０５）、ＣＤ３９（Ｇｏｅｐｆｅｒｔら（２０００）ＭＯＬ．ＭＥＤ．６：５９１−６０３）、ＢＤＮＦ（Ｃａｆｆｅら（２００１）ＩＮＶＥＳＴ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．ＶＩＳ．ＳＣＩ．４２：２７５−８２）、ＦＧＦ２（Ｂｒｙｃｋａｅｒｔら（１９９９）ＯＮＣＯＧＥＮＥ １８：７５８４−７５９３）、カスパーゼインヒビター（Ｅｋｅｒｔら（１９９９）ＣＥＬＬ ＤＥＡＴＨ ＤＩＦＦＥＲ ６：１０８１−１０６８）および色素上皮由来増殖因子（その生物活性フラグメントおよびアナログを含む）が挙げられる。さらに、他のアポトーシス抑制因子としては、例えば、１つ以上の死アゴニスト（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ）の発現を減少または停止させる、アンチセンス核酸またはペプチジル核酸配列が挙げられ得る。
【００６４】
アポトーシス調節因子がタンパク質またはペプチド、核酸、ペプチジル核酸、有機化合物または無機化合物である場合には、これは、抗血管新生因子の合成に関して記載した１つ以上の方法論によって、合成および精製され得る。
【００６５】
投与されるべきアポトーシス調節因子の型および量は、ＰＤＴおよび処置されるべき細胞型に依存し得る。しかし、最適なアポトーシス調節因子、投与の様式および投薬量は、実験的に決定され得ることが考慮される。アポトーシス調節因子は、薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクル中で投与され得、これによって、投与が、レシピエントの電解質および／または容量のバランスに他に不利な影響を与えない。キャリアは、例えば、生理食塩水を含み得る。
【００６６】
タンパク質、ペプチドまたは核酸に基づくアポトーシス調節因子は、例えば、約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、そして最も好ましくは約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、投与され得る。例えば、核酸に基づくアポトーシス誘導因子（例えば、Ｇ３１８）は、毎日約１〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与され得る。さらに、抗体は、２〜４週間ごとに１回、約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、静脈内投与され得る。硝子体内投与に関して、アポトーシス調節因子（例えば、抗体）は、代表的に、周期的にボーラスとして、約１０μｇ〜約５ｍｇ／眼、そしてより好ましくは約１００μｇ〜約２ｍｇ／眼の範囲の投薬量で、投与され得る。
【００６７】
アポトーシス調節因子は、好ましくは、ＰＤＴの前に、哺乳動物に投与される。従って、アポトーシス調節因子を、光増感剤の投与の前に投与することが、好ましい。アポトーシス調節因子は、光増感剤および抗血管新生因子と同様に、広範な種々の様式（例えば、経口、非経口、または直腸）のいずれかで投与され得る。しかし、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、および硝子体内）が好ましい。投与は、周期的なボーラスとして（例えば、静脈内または硝子体内）、あるいは内部貯蔵所（例えば、眼内または眼外の位置に配置された、生体腐食性移植物）から、または外部貯蔵所（例えば、静脈内バッグ）からの連続的な注入によって、提供され得る。アポトーシス調節因子は、例えば、眼の内壁に固定された徐放性薬物送達デバイスからの連続的な放出によってか、または標的化された経強膜制御放出を介して、脈絡膜に局所的に投与され得る（ＰＣＴ／ＵＳ００／００２０７を参照のこと）。
【００６８】
本発明の上記方法および組成物は、所望でない脈絡膜血管新生形成の処置において有用であり得、これによって、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、眼のヒストプラスマ症候群、病的近視、網膜色素線条、突発性障害、脈絡膜炎、脈絡膜破裂、被覆する脈絡膜母斑、および炎症性疾患を含む）の症状を軽減するが、同じ方法および組成物がまた、他の形態の眼の新脈管形成を処置する際に有用であり得ることが、考慮される。より具体的には、本発明の方法および組成物は、同様に、角膜の新脈管形成、虹彩の新脈管形成、網膜の新脈管形成、網膜の血管腫および脈絡膜の血管腫の処置および除去または減少において、有用であり得る。
【００６９】
本発明を、以下の非限定的な実施例を参照して、さらに説明する。
【実施例】
【００７０】
（実施例１．抗血管新生因子は、内皮細胞においてＰＤＴの効果を増強する）
実験を、ＰＤＴから生じる細胞毒性が、抗血管新生因子の添加によって増強され得るかどうかを決定するために実施した。目的の細胞を、ＰＤＴ単独でか、または抗血管新生因子と組み合わせて処置し、そしてＰＤＴの細胞毒性に及ぼす影響を、細胞増殖アッセイによって評価した。
【００７１】
ウシ網膜毛細管内皮（Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ（ＢＲＣＥ））細胞（Ｐａｔｒｉｃｉａ Ａ．Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｓｃｈｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）およびヒト網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｎｔｈｅｌｉａｌ（ＲＰＥ））細胞（Ａｎｔｈｏｎｙ Ｐ．Ａｄａｍｉｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｅｙｅ ＆ Ｅａｒ Ｉｎｆｉｒｍａｒｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補充した、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で、３７℃、５％のＣＯ２で増殖させた。ルテチウムテキサフィリン（Ｌｕ−Ｔｅｘ）を、４℃の暗室で安定な２ｍｇ／ｍｌのストック溶液として、Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）から入手し、そして製造業者の指針に従って使用した。
【００７２】
細胞の生存率を、細胞の増殖アッセイを使用して測定した。簡潔には、ＢＲＣＥまたはＲＰＥ細胞を、５％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に１０５個の細胞密度で配置し、そして５％のＣＯ２中で３７℃でインキュベートした。１８時間後、そして所望の場合、組換えヒトアンギオスタチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を、５００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。１８時間後、この培地を除去し、そして完全培地中の３μｇ／ｍｌのＬｕ−Ｔｅｘによって置き換えた。３０分後、この培養物を、アルゴン／色素光凝固器（７３２ｎｍ）およびレーザー送達系（モデル９２０、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用する時限照射に曝露した。照射を、１０ｍｗ／ｃｍ２の速度で送達し、５〜２０Ｊ／ｃｍ２の総用量を、７〜２８分の範囲の照射時間で与えた。照射後に、この培地を除去し、そして完全培地で置き換えた。培養物を７日間、インキュベータに戻し、その後、この細胞をトリプシン中に分散させ、マスク様式で計数し、そして生存している画分を決定した。これらの結果を、３回の平均±ＳＤとして報告し、表１に要約した。培養物をＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの後の種々の時間において、逆位相差顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ，Ｎｉｃｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）の１６×−０．３２計算装置を使用して撮影した。
【００７３】
（表１：処置の関数としての細胞生存率（％）の要約＊）
【００７４】
【表１】
2010065057.tif 000002
＊アンギオスタチンおよびＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴとの組み合わせ処置の、インビトロでの相互作用的抗内皮効果は、各処置単独での期待される効果の合計と比較した場合、加算したものよりも大きい。ＢＲＣＥにおけるＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ効果の増強は、アンギオスタチンのみへの予備曝露で効果的である。ＲＰＥにおいて、アンギオスタチンの効果は認められなかった。データは、細胞の平均生存率％±ＳＤである。
【００７５】
ＢＲＣＥ細胞の生存率において、アンギオスタチンとＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの組み合わせ効果を評価するために、細胞を、５００ｎｇ／ｍｌのアンギオスタチンを用いて１８時間予備処置し、その後に、種々のフルエンスでＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴを用いて処置した。細胞の生存率を、１週間の細胞増殖アッセイによって測定した。アンギオスタチン単独に曝露する場合に、この増殖アッセイは、使用されるアンギオスタチン用量でＢＲＣＥ細胞の１２．６１％の死滅を実証した（表１）。アンギオスタチンへのＢＲＣＥ細胞の予備曝露は、Ｌｕ−Ｔｅｘの引き続く細胞取り込みを干渉するようではなかった。より重要なことに、この結果は、使用される全フルエンス（５、１０、および２０Ｊ／ｃｍ２）において、ＢＲＣＥ細胞でアンギオスタチンおよびＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの相乗的細胞毒性の効果を示し、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ単独、アンギオスタチン単独から得られる細胞毒性またはそれらの各々の細胞毒性の演算合計を一貫して超える（表１、図１Ａ）。暗室での毒性は、使用されるＬｕ−Ｔｅｘの濃度において観測されなかったので、コントロールは、光にのみ曝露された細胞からなった。さらに、アンギオスタチンは、ＰＤＴ後に送達された場合、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの効果を増強するのに効果的でないことが観測された。
【００７６】
ＢＲＣＥ細胞から得られた結果と比較して、細胞毒性は、ヒトＲＰＥ細胞をヒトアンギオスタチンで処置した場合に観測され、そしてアンギオスタチンおよびＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴに曝露した後に、相互作用的な死滅は観測されなかった（図１Ｂ、表１）。アンギオスタチンと組み合わせた場合、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴは、ＢＲＣＥ細胞に対して２０Ｊ／ｃｍ２の致死用量（ＬＤ１００）を有する一方で、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ単独では、ＢＲＣＥ細胞において同一の効果を達成するために４０Ｊ／ｃｍ２を必要とした。以前の研究では、２０および４０Ｊ／ｃｍ２のフルエンスにおいて、ＲＰＥ細胞の生存率は、それぞれ、約４３％および２１％であることを示した。
【００７７】
このデータは、１週間の増殖アッセイにおいて、細胞の数の減少によって実証されるように、ＢＲＣＥ細胞においてアンギオスタチンの特定の抗増殖効果を示した。対照的に、アンギオスタチンの効果は、ＲＰＥ細胞において観測されなかった。従って、ＢＲＣＥ細胞は、アンギオスタチンによって特異的に標的にされる、別の内皮細胞株、ならびにウシ副腎皮質微小管細胞、ウシ副腎皮質毛細管細胞、ウシ大動脈細胞、ヒト臍静脈細胞およびヒト皮膚微小管内皮細胞、であるようである（Ｍａｕｃｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＮＡＴＵＲＥ ３９４：２８７−２９１，Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＢＬＯＯＤ ９２：４７３０−４１）。この研究において、アンギオスタチンの抗新脈管形成効果を試験するために、ＢＲＣＥ細胞に、後方セグメントの個々のキャピラリー内皮株を使用した。アンギオスタチンが、ＢＲＣＥ細胞のアポトーシスを誘導するという発見は、この細胞死が、細胞の数の全体の減少に寄与し得ることを示唆している。しかし、アンギオスタチンの正確な抗脈管形成機構に関してはほとんど知られていない（Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ（１９９８）ＢＬＯＯＤ ９２：４７３０−４７４１）。
【００７８】
要約すると、この研究により、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴおよびアンギオスタチンが、（色素内皮細胞ではなく）網膜毛細管内皮細胞において組合された細胞毒性効果を有することが示される。しかし、アンギオスタチンがＰＤＴ後に投与される場合、この組み合わせは、ＰＤＴの効果を保持しなかった。Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＥＤの前のアンギオスタチンの組み合わせにおいて、２０Ｊ／ｃｍ２のフルエンスで、ＢＲＣＥのほぼ１００％の死亡度を達成するに十分であった。アンギオスタチンが存在しない場合において、４０Ｊ／ｃｍ２の光用量が、細胞毒性のレベルを達成するのに必要とされた。２０Ｊ／ｃｍ２の光用量において、ＲＰＥ細胞のＰＤＴ後の生存率は、２０％まで改善された。従って、この結果は、ＣＮＶの根絶を改善し、そしてＲＰＥにおよぼす有害な影響を減少させるために、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴとアンギオスタチンを組み合わせる潜在性を支持する。
【００７９】
（実施例２．抗血管新生因子を用いたＰＤＴ後の細胞形態）
実験を、ＰＤＴが、ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞の細胞形態にどのように影響を与えるかを確立するために実施した。細胞を、処置しそして実施例１で記載したように、ＰＤＴ単独で、またはアンギオスタチンと組み合わせて曝露した。細胞は、ＰＤＴ直後に激しく損傷されたようだが、特定の状況下で、引き続いて回復した。ＰＤＴの１週間後に、いくらかの細胞が消滅したが、残った細胞は、紡錘形状およびそれらの接着能力を回復した。
【００８０】
ＰＤＴの後にアンギオスタチンで最初にプライムしたＢＲＣＥ細胞において、広範かつ大量の細胞死が、１週間で観測された。細胞の残余物および色素細胞の高密度に屈折した本体のみが、培地中に浮遊した状態で観測された。粒子を回収し、そして新鮮な完全培地中に配置したが、新しい皿の上での再接着または増殖のいずれのサインも示さなかった。従って、アンギオスタチンおよびＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの組み合わせは、使用される条件下で、ＢＲＣＥに対して致命的であるようである。
【００８１】
１８時間にわたってアンギオスタチンのみで処置された、コントロールのＢＲＣＥ細胞およびＲＰＥ細胞を、増殖し続け、そしてコンフルーエンスに達した。Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴに対するアンギオスタチンのさらなる効果は、ＲＰＥ細胞中で観測されなかった。Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ単独でまたはアンギオスタチンと共に曝されたＲＰＥ細胞は、これらの形態によって明示されるような変化はみられなかった。
【００８２】
（実施例３．ＰＤＴ後のＢＲＣＥおよびＲＰＥにおけるカスパーゼ３様（ＤＥＶＤアーゼ）活性化）
ＢＲＣＥおよびＲＰＥ中でのＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ媒介細胞死におけるアポトーシスの役割を調査するために、カスパーゼ３様（ＤＥＶＤアーゼ）プロテアーゼの活性化、アポトーシスの特徴（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ（１９９７）ＴＩＢＳ ２２：２９９−３０９）をモニタリングした。活性化の動態学を、カスパーゼ３様プロテアーゼファミリーメンバーによってのみ切断され得る基質の加水分解をアッセイすることによって、分光蛍光分析学的に測定した。
【００８３】
Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ後の種々の時間に、１０６個の細胞を、遠心分離により回収して、そして洗浄した細胞ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭ ＮａＰｉ、１０ｍＭ ＮａＰＰｉ、１６μｇ／ｍｌ ベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌ フェナントロリン、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１０μｇ／ｍｌ ペプスタチンおよび４ｍＭ ４（２−アミノエチル）−ベンゼン−スルファニルフルオリドヒドロクロリド（ＡＥＢＳＦ）を含む氷冷溶解緩衝液（ｐＨ７．５）（５００μｌ）中に再懸濁した。細胞溶解物を、後のプロテアーゼ活性アッセイまたはウエスタンブロット分析のために、−８４℃のアリコート中で保存した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準を用いたタンパク質アッセイ（クマシー＋タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を使用して、細胞抽出でタンパク質の濃度をアッセイした。
【００８４】
プロテアーゼ活性を測定するために、５０μｇの細胞のタンパク質を含むアリコートを、１４μＭとともに３７℃にて１時間インキュベートした（最終濃度Ｎ−アセチル（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号３）−（７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ）；（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（１ｍｌのプロテアーゼアッセイ緩衝液ｐＨ７．２中）（２０ｍＭのピペラジン−Ｎ−Ｎ１−ビス（２−エタン硫酸）（ＰＩＰＥＳ）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、および１０％スクロース））。蛍光を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＭＰＦ−４４Ａ分光蛍光光度計（λ（励起）４００ｎｍ；λ（発光）５０５ｎｍ）を使用して測定した。細胞のタンパク質を、ブランクとして使用した。結果を、ＡＦＣ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から構築された検量線と比較し、そして図２示した。
【００８５】
図２は、ＢＲＣＥおよびＲＰＥ中における、３つの異なる光用量でのＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ後のＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ切断の時間経過を例示する。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、１０、２０および４０Ｊ／ｃｍ２の光用量をそれぞれ使用して生じたデータを示す。これらの結果は、ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞の両方および使用される全用量において、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ後１０分程度の初期段階で、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの直後にカスパーゼ３−様活性の迅速な上昇を示し、そして４０分後にピークに達する。アポトーシスになる速度は、各細胞株中で、時間および用量に依存した。しかし、カスパーゼ３様活性化の量は、ＲＰＥ細胞に比べてＢＲＣＥ細胞において常に顕著に高かった。さらに、１０Ｊ／ｃｍ２および２０Ｊ／ｃｍ２において、カスパーゼ３様活性化の量が、ＲＰＥ細胞と比較した場合に、ＢＲＣＥ細胞中で約５０％まで上昇し；４０Ｊ／ｃｍ２（ＢＲＣＥ細胞に関してＬＤ１００に等しい）において、ＢＲＣＥのレベルは、ＲＰＥ細胞の５倍のレベルであった。
【００８６】
ＢＲＣＥ細胞中のＤＥＶＤアーゼ活性化でのアンギオスタチンおよびＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴを組み合わせる効果を試験するために、細胞を、アンギオスタチン単独、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ単独およびアンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴで処置し、その後、カスパーゼ３様活性化を、上記のようにアッセイした。この結果を、図３に要約する。アンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの組み合わせおよびＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ単独のそれぞれのＬＤ１００に対応して、２０および４０Ｊ／ｃｍ２のフルエンスを使用した。結果は、アンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの組み合わせが、２０Ｊ／ｃｍ２フルエンスを使用するＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ単独と比較した場合に、カスパーゼ３様活性の統計学的に顕著な増加を誘導することを実証した（図３）。しかし、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ（４０Ｊ／ｃｍ２）およびアンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの組み合わせ（２０Ｊ／ｃｍ２）の両方は結果として、ＢＲＣＥ細胞の１００％の死亡率となるが、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ（４０Ｊ／ｃｍ２）は結果として、アンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ（２０Ｊ／ｃｍ２）と比較して、カスパーゼ３様活性の増加したレベルとなった。Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ単独で処置したＢＲＣＥ細胞の場合において、アンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの組み合わせで処置したＢＲＣＥ細胞のアポトーシスになる速度は、時間に依存した。しかし、時間経過は、顕著に異なり、カスパーゼ３様活性化の誘導は、アンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの結果として急激かつより迅速に生じ、３０分でピークに達し、そして処置の９０分後に最低レベルに達した。
【００８７】
（実施例４．Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ後のＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞中でのＢｃｌ−２ファミリーメンバーの転形（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ））
Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ後のＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞中でのＢｃｌ−２ファミリーメンバーの発現を評価するために、ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞を、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴに供し、そして得られた細胞溶解物を、抗アポトーシスＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬマーカー、およびプロアポトーシスのＢａｘおよびＢａｋマーカーの検出のためのウエスタンブロット分析に供した。
【００８８】
細胞溶解物を、実施例３に記載されるように産生した。タンパク質のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を、１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて実施した。全サンプルを煮沸して、サンプル緩衝液を変性させ、そしてタンパク質の等量を、１レーンあたりにロードした。タンパク質を、１２０Ｖの還元条件下で室温で分離した。分離したタンパク質のウエスタンブロット移動を、１時間かけて、５０ｍＡにおいてポリビニリデンフルオリド膜を使用して、室温で実施した。等しいタンパク質のローディングを確認するために、ブロットを、５％の酢酸中で希釈した０．１％のポンソーレッド（ｐｏｎｃｅａｕ ｒｅｄ）（Ｓｉｇｍａ）で染色した。後に、ブロットを、５％の乾燥脱脂乳を含む、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で１時間、ブロックした。次に、この膜を、１時間半の間、２．５％の乾燥脱脂乳を含む、ＴＢＳ中の一次抗体の適切な希釈液（１：２５０〜１：１０００）でプローブした。Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＢａｘおよびＢａｋに対する、マウスポリクローナル抗体は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。一次抗体とともにインキュベーション後、このブロットを、ＴＢＳの頻繁な交換により３０分間洗浄し、ＴＢＳ中の１％の乾燥脱脂乳で３０分間ブロックし、続いて、１％の乾燥脱脂乳を含むＴＢＳ中で、１時間の間、ペルオキシダーゼ結合二次抗体とともにインキュベートした。このブロットを、ＴＢＳＴ（ＴＢＳ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ）の頻繁な交換により１時間の間、洗浄した。イムノブロット分析を、増強した化学発光＋ウエスタンブロット検出剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して実施し、続いて、ｘ線フィルム（ＭＬ Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に曝露した。
【００８９】
結果は、ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞においてＢｃｌ−２ファミリーメンバーの異なる発現を示した。具体的には、Ｂｃｌ−２およびＢａｘは、ＢＲＣＥ細胞中で検出されたが、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢａｋは、ＲＰＥ細胞中で検出された（表２）。Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ（ＬＤ５０）後に、Ｂｃｌ−２の下方制御およびＢａｘの上方制御は、ＢＲＣＥ細胞中で観測され、Ｂｃｌ−２タンパク質に対するＢａｘの細胞比の増加を生じた。ＲＰＥ細胞中で、ＰＤＴの４時間後までに、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢａｋの上方制御が存在し、その後に、Ｂｃｌ−ｘＬレベルは、プラトーに達し、そしてＢａｋレベルは、減少し始めた。ＢＲＣＥ細胞中のＢａｘの上方制御は、用量依存性であり得るが、しかし、ＲＰＥ中のプロアポトーシスカウンターパートＢａｋの上方制御は、２０Ｊ／ｃｍ２までのみ用量依存性を示し、その後、減少し始めた。
【００９０】
（表２．ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞中のＢｃｌ２ファミリーメンバーの免疫検出の要約）
【００９１】
【表２】
2010065057.tif 000003
検出可能（＋）または検出不可能（−）
Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴは、用量および時間依存性様式で、ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞の両方においてカスパーゼ３様活性化を誘導し、これは、アポトーシスがこれらの細胞株中のＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの細胞毒性のメディエータであることを示唆する。さらに、このデータは、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴが、用量および時間依存性様式でＢｃｌ−２およびＢａｘの転形を通じて、ＢＲＣＥ細胞中でアポトーシスを誘導し、そしてＢｃｌ−ｘＬおよびＢａｋの転形を通じてＲＰＥ細胞中でアポトーシスを誘導したことを示す。結果として、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴは、異なる細胞型の各々において、異なるモードの死を引き起こす。
【００９２】
漸増性ＰＤＴ投薬後に、プロアポトーシスＢａｋは、２０Ｊ／ｃｍ２までＲＰＥ細胞中で上方制御され、その後に、Ｂａｋレベルが、４０Ｊ／ｃｍ２までのＰＤＴ投与の増加にも係わらず、減少し始めた。理論に束縛されることを好まないが、保護性生存応答が、アポトーシスの誘因を相殺するために、これらの致死用量でＲＰＥ細胞中にマウントされることが可能である。このような仮説は、インビボでのＰＤＴ後のＲＰＥ細胞の回復の組織学的証拠によってさらに支持されており（Ｋｒａｍｅｒら（１９９６）ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬＯＧＹ １０３（３）：４２７４３８、Ｈｕｓａｉｎら（１９９９）ＩＶＥＳＴ ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ ＶＩＳＬ ＳＣＩ．４０：２３２２−３１）、そして他の研究者から報告では、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーの過剰発現により、ＰＤＴに対して部分的に耐性である細胞を提供すること（Ｈｅら（１９９６）ＰＨＯＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＰＨＯＴＯＢＩＯＬＯＧＹ ６４：８４５−８５２）およびＰＤＴ後にカスパーゼ３の活性を阻害すること（Ｇｒａｎｖｉｌｌｅら（１９９８）ＦＥＢＳ ４２２：１５１−１５４）が示されている。
【００９３】
ＢＲＣＥ細胞中において、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴに対するアンギオステインの組み合わせの結果として、同一用量のＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴのみが適用されたものと比較して、ＤＥＶＤアーゼ活性の増加を生じることが示される。このことは、ＢＲＣＥ細胞におけるＬｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの影響でアンギオスタチンの増強した作用が、アポトーシスを介して進むことを示唆している。しかし、アンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴのカスパーゼ３様活性の時間経過は、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ単独のものとは異なり、待ち時間なしでより速く進み、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ後２０分するとすぐにピークに達した。後者は、恐らくアポトーシスカスケードが、最初にアンギオスタチンで予めインキュベートすることによって既にプライムされて、従って、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴの適用が、既に引き下げら
れた活性化の閾値によって益を得てアポトーシス応答を迅速に増幅することに基づいて説明され得る。しかし、このことは、１つより多いのアポトーシス経路の関係の可能性を排除しない。なぜならば、特に、ＰＤＴは、活性酸素種の発生を介して細胞毒性を惹起することで公知であるが（Ｗｅｉｓｈａｕｐら（１９７６）前出）、アンギオスタチンは、細胞表面に存在するアデノシントリホスフェートシンターゼのα−サブユニットに結合することによって、ヒト内皮細胞において作用することが最近示された（Ｍｏｓｅｒら（１９９９）ＰＲＯＣ ＮＡＴＬ ＡＣＡＤ ＳＣＩ ＵＳＡ ９６：２８１１−２８１６）、さらに、アンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ（２０Ｊ／ｃｍ２）は、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴ（４０Ｊ／ｃｍ２）単独で実施したのと同様に、ＢＲＣＥ細胞の１００％の死亡率を生じたが、ＤＥＶＤアーゼ活性化のレベルは、上述のレジメンにおいて顕著により高かった。このことは、Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴおよびアンギオスタチン／Ｌｕ−Ｔｅｘ／ＰＤＴが、ＢＲＣＥ細胞中で異なるアポトーシス経路を介して作用するという理論を支持する。
【００９４】
（実施例５−脈絡膜新血管構造への光増感剤の標的送達）
効果を上げそしてＰＤＴの毒性を下げるために、光増感剤を新血管内皮結合部分に結合することによって、この光増感剤がＣＮＶ内皮に指向され得ることが企図される。いくつかの標的分子は、新血管内皮に光増感剤を標的化するために使用され得る。α−ｖインテグリン、特に、α−ｖ β−３およびα−ｖ β−５インテグリンは、臨床標本および実験モデルの両方において、眼の新血管組織で発現されるようである（Ｃｏｒｊａｙら（１９９７）前出；Ｆｒｉｅｄｌａｄｅｒら（１９９５）前出）。これらのインテグリンの環状ペプチドアンタゴニストは、実験モデルにおいて、新血管形成を阻害するために使用されている（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら、（１９９６）、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９３：９７６４−９７６９）。ヒトα−ｖインテグリンに選択的に結合し、そして他の新脈管形成標的ペプチドより効率的に腫瘍新血管構造内に蓄積する、ペプチドモチーフのＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号２）（ＲＧＤ−４Ｃとも呼ばれる）が同定された（Ａｒａｐら（１９９８）、ＮＡＴＵＲＥ ２７９：３７７−３８０）。別の強力な標的分子は、血管内皮増殖因子レセプター（ＶＥＧＦ−２Ｒ）に対する抗体である。臨床的証拠および実験的証拠は、眼の新血管形成、特に、虚血関連性新血管形成におけるＶＥＧＦの役割を強く支持する（Ａｄａｍｉｓら、（１９９６）、ＡＲＣＨ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１１４：６６−７１；Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏら、（１９９６）、ＡＲＣＨ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１１４：９６４−９７０；Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏら、（１９９６）、ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬＯＧＹ １０３：１８２０−１８２８）。ＶＥＧＦレセプター（ＫＤＲとしてもまた公知のＶＥＧＦＲ−２）に対する抗体は、新血管内皮に優勢に結合することが予測され得る。
【００９５】
（実験計画）
光増感剤のＶｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ（ＱＬＴ Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ ＢＣ）またはＬｕｔｅｔｉｕｍ Ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）を、標準的なカップリング化学を使用して、標的部分（例えば、ＲＧＤ−４Ｃペプチドまたは抗ＶＥＧＦレセプター抗体）にカップリングする。得られる光増感剤複合体のスペクトル特性（発光および励起）をインビトロで測定し得る。続いて、ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞を使用して、インビトロ研究を行って、ＰＤＴ後の細胞の取込みおよび光毒性を評価し得る。実験は、インビトロにおける選択的光毒性に対する最適なタイミング、ならびに薬物および光線量を含むＰＤＴ処置パラメーターをアドレスし得る。次いで、ＣＮＶのラットモデルにおける、結合光増感剤をインビボで使用して、ＰＤＴの有効性および選択性を試験し得る。次いで、標的分子を含む光増感剤を用いるＰＤＴの結果を、標的分子を欠く同じ光増感剤を用いるＰＤＴの結果と比較し得る。
【００９６】
ＣＮＶは、動物においてクリプトンレーザーを使用して誘導され得、そしてデジタル眼底フルオレセイン血管造影法によって実証され得る。より詳細には、ラットにおけるレーザー損傷モデルは、サルにおける同様のモデルの改変である（Ｄｏｂｉら（１９８９）、ＡＲＣＨ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１０７：２６４−２６９；Ｒｙａｎ（１９８２）ＡＲＣＨ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１００：１８０４−１８０９；Ｔｏｂｅら（１９９４）Ｊ．ＪＰＮ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．ＳＯＣ．９８：８３７−８４５）。簡潔には、５〜６の高強度クリプトンレーザーバーン（ｂｕｒｎ）（１００μｍ スポットサイズ、０．１秒の継続時間、１６０ｍＷ）は、乳頭周囲様式で配置され得る。過剰蛍光（ｈｙｐｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）および遅発型漏出により証明されるようなＣＮＶは、デジタルフルオレセイン血管造影法を使用して実証され得、そしてレーザー損傷の２〜３週間以内に、この病変の少なくとも６０％で生じることが予測される。
【００９７】
次いで、ＰＤＴを、ＣＮＶおよび正常な脈絡膜の領域にわたって実施し得、そしてその効果を、血管造影法で、および組織学的に評価する。より詳細には、ＰＤＴは、標的分子を含有する光増感剤または標的分子を欠く光増感剤のいずれかの尾静脈注射、続く処置領域のレーザー照射を使用して行われ得る。ＰＤＴはまた、一方の眼のＣＮＶ領域、および他方の眼の正常な脈絡膜領域に適用され得る。光増感剤およびレーザーパラメーターは、サルモデルにおけるＶｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎおよびＬｕ−Ｔｅｘを使用する以前の実験、ならびにラットモデルにおけるある予備線量に依存する。
【００９８】
ＰＣＴの有効性は以下のように評価し得る：
（ａ）ＣＮＶ閉塞の有効性。ＣＮＶの効果的な閉塞は、ＰＤＴの２４時間後のフルオレセイン血管造影法により、ＣＮＶからの漏出がないことによって評価され得る。この方法論は、サルにおけるレーザー損傷において十分に確立されている。組織病理学は光学顕微鏡を使用して実施され得る。
（ｂ）効果の選択性。このモデルにおけるＣＮＶは、レーザー損傷の領域において発生するため、ＣＮＶの領域が処置される場合、網膜および脈絡膜に対するＰ
ＤＴの効果を評価することは困難である。従って、ＣＮＶに対するＰＤＴの選択性を証明するために、ＰＤＴをまた、正常な網膜および脈絡膜の領域に適用し得、そして公表された組織病理学的類別スキームを使用して、ＲＰＥ、光受容体、網膜および脈絡膜血管に対する損傷を定量する（Ｋｒａｍｅｒら（１９９６）、ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬＯＧＹ １０３：４２７−４３８）。
（ｃ）ＰＤＴ 対 組み合わせＰＤＴレジメンの効果の比較。ＰＤＴの効果を、光増感剤のみを用いるＰＤＴで処置したＣＮＶ動物の群と、改変したＰＤＴ（すなわち、標的化光増感剤）を受けた群との間で比較し得る。ＰＤＴを、ＣＮＶおよび正常な領域に適用し得る。初めに、ＣＮＶ閉塞が、改変ＰＤＴを使用するＰＤＴのみを用いる場合と同じ光用量（フルエンスＪ／ｃｍ２）において生じるか否かが決定され得る。次いで、特定された光用量において、改変ＰＤＴおよびＰＤＴのみの、正常な網膜に対する効果が比較され得る。例として、標的化光増感剤を使用して、未結合の光増感剤を用いる場合より低いフルエンスで、ＣＮＶの閉塞を達成することが可能であり、そしてこのフルエンスにおいて、標的光増感剤を使用するＰＤＴで処置された正常な領域におけるＲＰＥに対するかなり少ない損傷を見出し得る。
【００９９】
（実施例６−脈絡膜新血管形成処置のための標的プロアポトーシスペプチドとＰＤＴとの組み合わせ効果）
実験により、ＰＤＴは、アポトーシスにより内皮細胞において細胞死を引き起こし、そしてそのＲＰＥに対する毒性はまた、プログラムされた細胞死によって進行することが示された。異なるアポトーシス経路は、ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞において、ＰＤＴによって誘引されるようである。ＰＤＴの前に新血管毛細管内皮細胞のアポトーシス機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を特異的にプライムすることによって、ＰＤＴに対するそれらの感受性を増加することが可能となり得る。このアプローチは、ＣＮＶ閉塞を達成するのに必要な光用量（フルエンス）を減少し得、それにより、ＲＰＥ細胞のような周辺細胞に対する影響を軽減し得る。
【０１００】
研究は、腫瘍サイズを有意に減少する際の、抗癌活性における標的化プロアポトーシスペプチドの有効性を示した（Ｅｌｌｅｒｂｙら、（１９９９）前出）。これらの標的化プロアポトーシス結合体は、２つの機能的ドメイン：低い哺乳動物毒性を有する抗菌ペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ；配列番号１）、および新脈管形成ホーミングペプチド（ＲＧＤ−４Ｃ）を含んだ。抗菌ペプチドは、真核生物形質膜よりむしろ、原核生物形質膜および真核生物ミトコンドリア膜を優勢に崩壊する（Ｅｌｌｅｒｂｙら（１９９９）前出）。従って、キメラペプチドは、標的細胞のサイトゾルに侵入する手段を有し得、ここで標的細胞において、このキメラペプチドは、ミトコンドリア依存性アポトーシスを引き起こす。これらの結合体によりプライムされた内皮細胞は、ＰＤＴに対してより感受性であることが予測される。
【０１０１】
（実験計画）
目的のペプチドを、初めに、ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞においてインビトロで試験して、特異性および有効性を確認する。次いで、プロアポトーシスペプチド／ＰＤＴレジメンをインビトロで評価し得、次いで、ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞の両方において、ＰＤＴのみおよびペプチドのみと比較する。ＢＲＣＥおよびＲＰＥ細胞を、標準的な組織培養技術を使用して増殖させ得る。ＡｐｏＡｌｅｒｔアッセイキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用して、処置後の細胞におけるカスパーゼ−３様活性についてアッセイし得る。この比色アッセイは、基質のＤＥＶＤ−ｐＮＡの切断から生じる発色団のｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）を追跡する。ＤＥＶＤ−ｐＮＡは、活性なカスパーゼ−３に対する公知の基質であり、そして処置後の異なる時点で調製された細胞抽出物に添加され得、そしてサンプルは、カスパーゼ−３活性を評価するために分析され得る。
【０１０２】
その後、ＣＮＶのラットモデルにおけるインビボでの標的プロアポトーシスペプチドの有効性および選択性を試験するために、実験が行われ得る。標的プロアポトーシスペプチドを、ＰＤＴの４時間前に、静脈内注射し得る。ＰＤＴをＤＮＶの領域にわたっておよび正常な眼において行い得、ＣＮＶ閉塞に対するＰＤＴのみの効果をプロアポトーシスペプチドの後のＰＤＴと比較し、そして実施例５に記載されるように、正常な脈絡膜における選択性を比較する。
【０１０３】
本発明は、本発明の精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。従って、上記の実施形態は全て、本明細書中に記載される本発明を制限するよりむしろ例示の観点であると考えられるべきである。従って、本発明の範囲は、上記の説明によるよりむしろ添付の特許請求の範囲により示され、そして特許請求の範囲の等価物の意味および範囲内にある全ての変更は、本発明に包含されることが意図される。
【０１０４】
本明細書中上記に開示される特許書類および特定の刊行物の各々は、本明細書中で参考として明確に援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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