(57)【要約】【課題】  慢性腎臓病の遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法等を提供すること。【解決手段】  ４，５８７人の日本人について、１７６個の候補遺伝子に関し２２２個の遺伝子多型をＰＣＲ、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ、およびサスペンション・アレイ・テクノロジー（ＳＡＴ）を用いて検出し、慢性腎臓病に有意に関連する遺伝子多型を検出した。本発明のリスク検出法は、慢性腎臓病の発症予測およびその予防に有用であることが示された。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＣＰ３の−３５位Ｃ／Ｔ、ＰＥＣＡＭ１の３６２２２位Ａ／Ｇ、ＨＭＯＸ１の９８位Ｇ／Ｃ、ＡＰＯＥの−２０３位Ｔ／Ｇ、ＡＧＴＲ１の４３６５１位Ｇ／Ａ、ＰＩＫ３Ｒ１の７５６８６位Ｇ／Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂの２３３７５位Ａ／Ｃ、ＡＢＣＡ１の−１４位Ｃ／Ｔ、ＩＲＳ１の３９３１位Ｇ／Ａ、ＲＯＳ１の１２４７８５位Ｇ／Ａ、ＢＣＨＥの６３９７３位Ｇ／Ａ、ＡＮＸＡ５の４３１位Ｃ／Ｔ、ＭＭＰ１の−１６０２位２Ｇ／１Ｇ、ＰＡＬＬＤの２５９１７５位Ａ／Ｇ、ＫＣＮＪ１１の６３４位Ａ／Ｇ、ＣＸＣＬ１６の４６６０位Ｃ／Ｔ、ＦＯＸＣ２の−５１２位Ｃ／Ｔ、ＭＭＰ３の７２２位Ａ／Ｇ、ＣＯＭＴの２１９６２位Ｇ／Ａ、ＰＤＥ４Ｄの９１９４７５位ＴＡＡＡ／−、ＧＣＫの−３０位Ｇ／Ａ、ＡＰＯＡ５の−１１２３位Ｃ／Ｔのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、性別、年齢とを評価因子とし、各評価因子のオッズ比を乗じた発症リスクを計算し、この発症リスクを平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群を作成し、各群に応じて発症のリスクを検出することを特徴とする慢性腎臓病のリスク検出法。
【請求項２】
ＵＣＰ３の−３５位Ｃ／Ｔ、ＰＥＣＡＭ１の３６２２２位Ａ／Ｇ、ＨＭＯＸ１の９８位Ｇ／Ｃ、ＡＰＯＥの−２０３位Ｔ／Ｇ、ＡＧＴＲ１の４３６５１位Ｇ／Ａ、ＰＩＫ３Ｒ１の７５６８６位Ｇ／Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂの２３３７５位Ａ／Ｃ、ＡＢＣＡ１の−１４位Ｃ／Ｔ、ＩＲＳ１の３９３１位Ｇ／Ａ、ＲＯＳ１の１２４７８５位Ｇ／Ａ、ＢＣＨＥの６３９７３位Ｇ／Ａ、ＡＮＸＡ５の４３１位Ｃ／Ｔ、ＭＭＰ１の−１６０２位２Ｇ／１Ｇ、ＰＡＬＬＤの２５９１７５位Ａ／Ｇ、ＫＣＮＪ１１の６３４位Ａ／Ｇ、ＣＸＣＬ１６の４６６０位Ｃ／Ｔ、ＦＯＸＣ２の−５１２位Ｃ／Ｔ、ＭＭＰ３の７２２位Ａ／Ｇ、ＣＯＭＴの２１９６２位Ｇ／Ａ、ＰＤＥ４Ｄの９１９４７５位ＴＡＡＡ／−、ＧＣＫの−３０位Ｇ／Ａ、ＡＰＯＡ５の−１１２３位Ｃ／Ｔのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする慢性腎臓病のリスク検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性腎臓病の遺伝的リスク検出法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
慢性腎臓病（chronic kidney disease（ＣＫＤ））は、糸球体腎炎に加え、高血圧、糖尿病、脂質代謝異常（高脂血症）、肥満、喫煙などが危険因子であり、生活習慣病の一つとなっている。日本の高齢者人口比率は、今後２０年、増え続けるといわれており、加齢と共に衰える腎機能により、慢性腎臓病および末期腎不全（end-stage renal disease（ＥＳＲＤ））の発生率は増え続けることが予想される（非特許文献１）。慢性腎臓病は、末期腎不全のみならず、心血管障害の危険因子であり（非特許文献２-３）、心筋梗塞、心不全、脳梗塞および死亡の原因になっている。したがって、慢性腎臓病の危険因子を特定することは、慢性腎臓病や末期腎不全の発症を予防し、透析患者数を減少させるのみならず、心血管障害を減少させるために重要である（非特許文献４）。
連鎖解析（非特許文献５ー６）および候補遺伝子関連解析（非特許文献７−９）によって、慢性腎臓病との関連が示唆されるいくつかの染色体領域および遺伝子が特定されている。しかしながら、慢性腎臓病の遺伝要因については、未だ十分に解明されていない。更に、人種間におけるライフスタイルや環境要因ならびに遺伝要因の違いを考慮し、各人種において、慢性腎臓病に関連する遺伝子多型を検討することが重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、慢性腎臓病について、遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、慢性腎臓病に関し、４,５８７人の日本人について、１７６遺伝子中の２２２カ所の遺伝子多型に関する大規模研究である。
我々は、慢性腎臓病と遺伝子多型との関係を調査した。本研究の目的は、慢性腎臓病に関与する遺伝子多型を同定し、この知見に基づいて、ある者に対して慢性腎臓病を予防するための有用な情報を与えることである。
【０００５】
上記課題を解決するための慢性腎臓病のリスク検出法は、ＵＣＰ３の−３５位Ｃ／Ｔ、ＰＥＣＡＭ１の３６２２２位Ａ／Ｇ、ＨＭＯＸ１の９８位Ｇ／Ｃ、ＡＰＯＥの−２０３位Ｔ／Ｇ、ＡＧＴＲ１の４３６５１位Ｇ／Ａ、ＰＩＫ３Ｒ１の７５６８６位Ｇ／Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂの２３３７５位Ａ／Ｃ、ＡＢＣＡ１の−１４位Ｃ／Ｔ、ＩＲＳ１の３９３１位Ｇ／Ａ、ＲＯＳ１の１２４７８５位Ｇ／Ａ、ＢＣＨＥの６３９７３位Ｇ／Ａ、ＡＮＸＡ５の４３１位Ｃ／Ｔ、ＭＭＰ１の−１６０２位２Ｇ／１Ｇ、ＰＡＬＬＤの２５９１７５位Ａ／Ｇ、ＫＣＮＪ１１の６３４位Ａ／Ｇ、ＣＸＣＬ１６の４６６０位Ｃ／Ｔ、ＦＯＸＣ２の−５１２位Ｃ／Ｔ、ＭＭＰ３の７２２位Ａ／Ｇ、ＣＯＭＴの２１９６２位Ｇ／Ａ、ＰＤＥ４Ｄの９１９４７５位ＴＡＡＡ／−、ＧＣＫの−３０位Ｇ／Ａ、ＡＰＯＡ５の−１１２３位Ｃ／Ｔのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、年齢、性別とを評価因子とし、各評価因子より発症リスク値を推算し、この発症リスク値を平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群に分け、各群に応じて発症のリスクを検出することを特徴とする。
このとき、群を形成するときに使用する分散については、統計上の分散値、或いは標準偏差値（ＳＤ）、パーセントによる区分などを用いることができる。なお、遺伝子多型については、必ずしも上記２２個には限られず、これら２２個の多型のうちの任意の１個−２１個、或いは本明細書中で示される上記２２個の他の多型を含む２３個以上で実施することもできる。
【０００６】
本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置（位）、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）／多型塩基」と記載した。例えば、「ＵＣＰ３の−３５位Ｃ／Ｔ」は、ＵＣＰ３の遺伝子について、５’上流３５位のＣがＴとなっている多型を意味している。各遺伝子の多型が生じている位置の情報は、ＮＣＢＩ遺伝子データベースの参照配列（contig reference）に基づいた。なお、ＰＤＥ４Ｄの９１９４７５位ＴＡＡＡ／−多型、およびＭＭＰ３の−１６１０位５Ａ／６Ａ多型については、データベースの遺伝子方向からは、ＴＴＴＡ／−多型、および５Ｔ／６Ｔ多型との表記となるが、多くの論文で逆方向より読んだＴＡＡＡ／−多型、および５Ａ／６Ａ多型として記載されているため、本明細書においても上記の通り記載した。
【０００７】
一般に多型は、集団（例えば、日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なることが知られている。このため、日本人以外の集団において、慢性腎臓病との関係が指摘されている多型であっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、国または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人における多型および慢性腎臓病との関連が裏付けられるわけではない。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、慢性腎臓病について、遺伝的リスクおよび発症リスクを予測するための検出法等が提供される。この発明を用いることにより、慢性腎臓病に対する予防が可能となり、透析患者数の減少、慢性腎臓病が危険因子となる心血管障害の減少、さらに、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・寝たきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１０】
＜試験方法＞
研究対象
研究対象は、２つの集団からなる４,５８７名（男性２，５３２名、女性２，０５５名）であった。１つは、研究参加施設（岐阜県総合医療センター、岐阜県立多治見病院、弘前大学病院、黎明郷リハビリテーション病院、弘前脳卒中センター）に、２００２年１０月から２００８年３月までに、様々な症状または毎年の健康診断のために来院した者であった。また、もう１つの集団は、群馬県と東京都における老化・老年病の疫学研究に参加した高齢者であった。
研究プロトコールはヘルシンキ宣言に従い、三重大学医学部、弘前大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、東京都老人総合研究、および参加病院の倫理委員会によって承認された。各参加者に対しては書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００１１】
慢性腎臓病は、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症、腎硬化症など原疾患に関わらず、微量アルブミン尿を含むたんぱく尿などの尿異常、片腎や多発性嚢胞腎などの画像異常、血液、病理で腎障害の存在を示す所見がある、または、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ（estimated glomerular filtration rate））数値で、中等度以上の腎機能低下（ｅＧＦＲ＜６０ｍＬ／ｍｉｎ／１.７３ｍ２）が３ケ月以上持続する場合に診断される。また、ＮＫＦ−ＫＤＯＱＩTM（National Kidney Foundation-Kidney Disease Outcomes Quality Initiative）では、ｅＧＦＲ値が６０ｍＬ／ｍｉｎ／１.７３ｍ２未満で慢性腎臓病と診断することを提唱している（非特許文献４）。
【００１２】
慢性腎臓病の診断基準となるｅＧＦＲは、日本腎臓学会が提唱した、下記の改訂版ＭＤＲＤ（the Modification of Diet in Renal Disease）式により血清クレアチニン値より推算した。 
ｅＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１.７３ｍ２）
＝１９４×［年齢］−０．２８７×［血清クレアチニン値 (ｍｇ/ｄＬ)］−１．０９４
×[０.７３９ 女性の場合].
【００１３】
ｅＧＦＲ値と心血管障害や入院必要性との関連は、ｅＧＦＲ値が６０ｍＬ／ｍｉｎ／１.７３ｍ２未満で増大し、４５ｍＬ／ｍｉｎ／１.７３ｍ２以下ではその危険性が顕著となる（非特許文献１０）。さらに、日本人では、７０歳以下でｅＧＦＲ値が５０ｍＬ／ｍｉｎ／１.７３ｍ２未満になると、その後のｅＧＦＲ値の低下率が増大するため、予後が悪いことが明らかになっている（非特許文献１１）。
したがって、本研究では、５０ｍＬ／ｍｉｎ／１.７３ｍ２未満を慢性腎臓病の診断基準とし、７１４名（男性４３０名、女性２８４名）を慢性腎臓病群として解析した。また、３，８７３名（男性２，１０２名、女性１，７７１名）のコントロール群は、ｅＧＦＲ値が６０ｍＬ／ｍｉｎ／１.７３ｍ２以上の者とした。ただし、慢性腎臓病群、コントロール群共に、高血圧（最大血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または最低血圧が９０ｍｍＨｇ以上の者、或いは降圧剤を服用している者）、高脂血症（血清総コレステロール値が５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、または脂質降下薬を服用している者）、糖尿病（空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％以上の者、或いは糖尿病治療薬を服用している者）に罹患している者を含む。
【００１４】
多型の選択
公開データベースの使用、および本発明者の鋭意検討により、１７６個の候補遺伝子を選択した。本発明者は、従来の知見およびデータベースに基づき、これら１７６個の遺伝子について、２２２個の多型を選択した。これらの多型の多くは、プロモーター領域、エクソン、イントロンのスプライシングの供与部位或いは受容部位に多く位置しており、多型の結果として、コードされたタンパク質の機能または発現に変化を与える可能性があるものであった。これら２２２個の多型は、下記表１−表６に示した。表は、左欄から順に、座位（Locus）、遺伝子名（Gene）、簡易記載（Symbol）、多型（Polymorphism）、多型データベース登録番号（dbSNP rs No.）を示している。なお、多型データベース登録番号が無い場合には、ＮＣＢＩ遺伝子バンクに登録されている番号およびその登録配列での多型の位置を示した。また、この表中での多型の表記に関しては、本研究での遺伝子多型検出および解析の便宜上、各対立遺伝子をアリル１，アリル２と設定し、「アリル１の塩基配列／アリル２の塩基配列」と記載した。このアリル１，アリル２への振り分けは、必ずしもデータベースの参照配列の塩基配列をアリル１としたものではなく、候補遺伝子を選択する際の情報源に基づいた。よって、多型データベース登録のＳＮＰ表記が、例えばＡ／Ｇのものでも、情報源での記載に基づき、Ａ／Ｇ、Ｇ／Ａ、Ｔ／Ｃ、Ｃ／Ｔのいずれかに設定している。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
【表２】
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【００１７】
【表３】
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【００１８】
【表４】
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【００１９】
【表５】
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【００２０】
【表６】
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【００２１】
遺伝子多型の検出方法
７ｍＬの静脈血を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ(ジナトリウム塩)を含むチューブに採取し、ゲノムＤＮＡをキット(ゲノミックス社製)によって分離した。２２２個の多型の遺伝子型は、ＰＣＲと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブをサスペンジョン・アレイ・テクノロジー（ＳＡＴ：Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００）と組み合わせて使用する方法によって決定した（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社）。プライマー、プローブの配列は、下表７に示した。表７は左から順に、遺伝子（Gene Symbol）、多型（Polymorphism）、検出アリル（allele 1、allele 2）、センスプライマー（Sense primer）、アンチセンスプライマー（Anti-sense primer）、プローブ１（Probe 1）、プローブ２（Probe 2）を示した。遺伝子多型検出の詳細な方法については、既報のもの（非特許文献１２）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、慢性腎臓病との関連が認められなかった多型を検出するための条件については記載を省略した。
【００２２】
【表７】
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【００２３】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献１２に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面には、特異的な塩基配列を認識するプローブが結合されている。各ビーズには、一種類のプローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との割合を変化させることにより、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
【００２４】
図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
＜増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチンでラベルしたプライマーを用いた。１.５ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、及び０.１μＭ−１０μＭプライマーセットを混合し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）と５０ｎｇ−１００ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００２５】
＜ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（３.７５Ｍ  ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ  ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.１２５％  Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、及び５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。
【００２６】
＜ストレプトアビジン−フィコエリスリン反応（ＳＡ−ＰＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリダイゼーション反応の後、各ウエルに１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。
【００２７】
＜測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）−（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。
【００２８】
統計解析
臨床データは、慢性腎臓病の患者群とコントロール群との間で、対応のないスチューデントt検定により比較した。カテゴリーデータは、カイ二乗検定によって比較した。対立遺伝子頻度は遺伝子カウント法によって概算し、ハーディ・ワインベルク平衡にあてはまるかどうかを判断するためにカイ二乗検定を行った（Ｘ染色体上の遺伝子の場合は、女性の遺伝子型分布で検定した）。遺伝子型分布は、２つの群から構成される遺伝モデルを用い慢性腎臓病の患者群とコントロール群との間でカイ二乗検定(２ｘ２)によって比較した。遺伝モデルは、優性モデル（dominant）が「アリル２のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」対「アリル１のホモ接合体」（２２＋１２対１１）、劣性モデル（recessive）が「アリル２のホモ接合体」対「アリル１のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」（２２対１１＋１２）である。各遺伝子型は、優性、劣性遺伝モデルに従って解析し、危険率（ｐ値）を計算した。
【００２９】
カイ二乗検定でｐ値が５％未満（ｐ＜０.０５）で慢性腎臓病と関連した多型の遺伝モデルについては、慢性腎臓病の発症に関連する他の要因（交絡因子）の影響を含め検討するため、遺伝子モデル（優性モデルは、１＝「アリル２のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」、０＝「アリル１のホモ接合体」、劣性モデルは１＝「アリル２のホモ接合体」、０＝「アリル１のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」）と交絡因子（年齢（age：連続値）、性別（sex：１＝男性、０＝女性））を、ステップワイズ変数増加法によるロジスティック回帰分析により解析した。このとき、慢性腎臓病（１＝疾患群、０＝コントロール群）を従属変数とし、各遺伝子型および交絡因子を独立変数とした。同じ多型で優性モデル（２２＋１２対１１）と劣性モデル（２２対１１＋１２）の両者のｐ値が５％未満であった場合は、低いｐ値の遺伝子型モデルを採用した。対象の選択基準は組み入れ規準（entering significance level）を０.１５とし、除外規準（removing significance level）を０.２とした。統計的有意性は、両側検定によって行った。
【００３０】
＜試験結果＞
４，５８７名の研究対象に関する背景データを表８に示した。表には、左欄より順に、特徴（Characteristic）、疾患群（ＣＫＤ）、および対照群（Controls）を示している。また、特徴欄は、上より順に、症例数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（男性／女性）（Sex(male/female)）を示している。年齢（Age）データは、平均±ＳＤで示した。
【００３１】
【表８】
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【００３２】
検査した各遺伝子型について、コントロール群の遺伝子型を遺伝子カウント法によって概算し、カイ二乗検定をしたところ、ハーディ・ワインベルク平衡の法則にあてはまっていた。
【００３３】
前記対象集団において検査した遺伝子多型の、慢性腎臓病のリスク予測因子としての有意性を確認するために、遺伝子多型を優性、劣性モデルとしてカイ二乗検定により評価し、さらに年齢、性別を含むステップワイズ法によるロジスティック回帰分析を行った。
【００３４】
表９には、対象集団において検査した遺伝子多型を優性、劣性モデルとしてカイ二乗検定により評価し、危険率５％未満（ｐ＜０.０５）であった遺伝子多型モデルを示した。表には、左欄より順に、遺伝子表記（Gene Symbol）、多型（Polymorphism）、ＳＮＰのデータベース番号（dbSNP rs No.）、遺伝子モデル（dominant/ recessive）、その遺伝子モデルの多型（Polymorphism）、その多型のＣＫＤ群とコントロール群における症例数、および群における比率（CKD(%)、control(%)）、ｐ値（p-value）を示した。
【００３５】
【表９】
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【００３６】
カイ二乗検定で出現頻度が危険率５％未満（ｐ＜０.０５）であった遺伝子多型を、他の背景因子（年齢、性別）とともに、独立変数の交絡因子として、ステップワイズ変数増加法でロジスティック回帰解析を実施した結果を表１０に示した。これら交絡因子は独立したものであり、オッズ比の積（かけ算）により、総合的な慢性腎臓病に関するリスクを予測できることが分かった。また、解析によって得られたロジスティック回帰モデルにより、リスク値の推定が可能となる。表には、左欄より順に、因子（Variable）、ｐ値（p-value）、回帰モデルの偏回帰係数（β）、オッズ比（Odds-ratio）、オッズ比の９５％信頼区間（OR-95%CI）を示した。また、この解析で得られた回帰モデル式の定数は、−６.１９９９１であった。
【００３７】
【表１０】
2010142187.tif 000011
【００３８】
このステップワイズ変数増加法によるロジスティック回帰解析の結果、遺伝因子としては、ＵＣＰ３、ＰＥＣＡＭ１、ＨＭＯＸ１、ＡＰＯＥ、ＡＧＴＲ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＡＢＣＡ１、ＩＲＳ１、ＲＯＳ１、ＢＣＨＥ、ＡＮＸＡ５、ＭＭＰ１、ＰＡＬＬＤ、ＫＣＮＪ１１、ＣＸＣＬ１６、ＦＯＸＣ２、ＭＭＰ３、ＣＯＭＴ、ＰＤＥ４Ｄ、ＧＣＫ、ＡＰＯＡ５の各遺伝子多型が、慢性腎臓病に有意に関連した。また、これら遺伝因子を組み合わせると、最小オッズ比が０.０１で最大オッズ比が９８.４６となった。これは、従来の危険因子である、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、年齢、性別のみで予測するオッズ比と比べて、幅広く評価することが可能であった（参考文献１３）。
【００３９】
＜慢性腎臓病のリスク予測システム＞
リスク予測システムを開発するに至った統計解析の手法と、実際の臨床的活用の例として、リスクを５段階（Ａ−Ｅ）に判断した方法および結果を説明する。
【００４０】
統計解析で慢性腎臓病と有意に関連した遺伝因子および交絡因子のロジスティック回帰解析によって、各因子の偏回帰係数からなるロジスティック回帰モデルが得られ、そこで算出されるロジット値より、対象者における疾患発症確率のリスク値が推算される。受診者ごとに予測されたリスク値を低い順に並べた場合、値が大きいほど対象者における発症リスクは高くなる。したがって、疾患との関連が示された遺伝因子および交絡因子の検査結果から、本モデルにより慢性腎臓病の発症リスクを推定することが可能となる。
【００４１】
このリスク値を推定するロジスティック回帰モデルを得るため、カイ二乗検定でｐ値が５％未満（ｐ＜０.０５）で慢性腎臓病と関連した多型の遺伝モデルを、交絡因子である年齢、性別と共に、ステップワイズ変数増加法によるロジスティック回帰分析を実施した。実際のリスク予測に使用する遺伝子多型は２０個以内であるほうが運用しやすいため、ロジスティック回帰モデルに含まれる遺伝子多型の個数が最大で２０個となるように制限を加えたステップワイズ変数増加法を用いることにより、交絡因子として利用する遺伝子多型を絞り込んだ。
【００４２】
上記ステップワイズ変数増加法によるロジスティック回帰分析により選抜した遺伝子多型をリスク予測のための最終的な因子として採用した。また、リスク予測システムに必要な数値を決定した。結果を表１１に示す。表中には、左欄より順に、因子（Variable）、ｐ値（p-value）、回帰モデルの偏回帰係数（β）、オッズ比（Odds-ratio）、オッズ比の９５％信頼区間（OR-95%CI）を示した。また、この解析で得られた回帰モデル式の定数は、−６.０２１１１であった。
【００４３】
【表１１】
2010142187.tif 000012
【００４４】
慢性腎臓病の罹患に対し、統計的有意性が高い順に、ＵＣＰ３の−３５位Ｃ／Ｔ（劣性モデル）、ＰＩＫ３Ｒ１の７５６８６位Ｇ／Ａ（劣性モデル）、ＰＥＣＡＭ１の３６２２２位Ａ／Ｇ（優性モデル）、ＨＭＯＸ１の９８位Ｇ／Ｃ（優性モデル）、ＡＰＯＥの−２０３位Ｔ／Ｇ（優性モデル）、ＡＧＴＲ１の４３６５１位Ｇ／Ａ（優性モデル）、ＩＲＳ１の３９３１位Ｇ／Ａ（優性モデル）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂの２３３７５位Ａ／Ｃ（劣性モデル）、ＡＢＣＡ１の−１４位Ｃ／Ｔ（劣性モデル）、ＲＯＳ１の１２４７８５位Ｇ／Ａ（優性モデル）、ＡＮＸＡ５の４３１位Ｃ／Ｔ（劣性モデル）、ＢＣＨＥの６３９７３位Ｇ／Ａ（優性モデル）、ＫＣＮＪ１１の６３４位Ａ／Ｇ（優性モデル）、ＭＭＰ１の−１６０２位２Ｇ／１Ｇ（優性モデル）、ＰＡＬＬＤの２５９１７５位Ａ／Ｇ（優性モデル）、ＣＸＣＬ１６の４６６０位Ｃ／Ｔ（優性モデル）、ＦＯＸＣ２の−５１２位Ｃ／Ｔ（劣性モデル）、ＭＭＰ３の７２２位Ａ／Ｇ（優性モデル）、ＣＯＭＴの２１９６２位Ｇ／Ａ（優性モデル）、ＰＤＥ４Ｄの９１９４７５位ＴＡＡＡ／−（劣性モデル）が有意であり、各要因が独立して慢性腎臓病に関連することが分かった。
【００４５】
本研究成果の臨床的な意義について述べる。病院、クリニックまたは健診センターにおいて、希望者に対して従来の危険因子と今回の遺伝因子に関する検査を行い、慢性腎臓病の発症リスクの予測を行う。これは、本研究で疾患の発症に関連が認められた遺伝因子および交絡因子（年齢、性別）により、受診者のリスク値を推定し、その分布からリスクの程度を３段階以上（例えば、５段階）に分けることによって、実施することができる。
【００４６】
慢性腎臓病のリスクを５段階に判断する例を説明する。上記ロジスティック回帰分析によって得られた、ロジスティック回帰式でリスク値を推定する。コントロール群のリスク値を、大きい順に全体を５％、２０％、５０％、２０％、５％に区分し、順に、リスクが高い群、やや高い群、平均的な群、やや低い群、低い群と区分できる。しかし、本研究のコントロール群が、日本人全体の遺伝子型分布とかけ離れている可能性もある。したがって、それを検証するため、群を任意に１対９にわけ、コントロール群と疾患群の分布を確認し、各群がそのリスク値分布区分に過剰適合していないか確認することを１０回繰り返し行った。このクロスバリデーションにより、リスク値の分布区分の境界値（閾値）の補正を行った。クロスバリデーションによるリスク値分布区分の閾値補正によって、実際に本研究における慢性腎臓病群の分布は、リスクが高い群は１７.４％（コントロール群は４.４％）、リスクがやや高い群は３４.０％（コントロール群は１８.４％）、平均的リスクの群は４０.６％（コントロール群は５０.５％）、リスクがやや低い群は７.３％（コントロール群は２１.２％）、リスクが低い群は０.７％（コントロール群は５.５％）であった。
【００４７】
結果については、医師等の有資格者の判断を含めてカウンセリングを行い、とりわけ高リスク群またはやや高リスク群に属する場合には生活習慣の改善（禁煙・飲酒の減量・食事療法即ち塩分摂取の制限や低タンパク食など）または早期の薬物治療を行うことにより慢性腎臓病の一次・二次予防を積極的に推進する。特に慢性腎臓病の家族歴のある人への適用が有効である。本システムにより慢性腎臓病のオーダーメイド予防が可能になり、慢性腎臓病に起因する種々の疾患、即ち末期腎不全、心筋梗塞、脳梗塞などの予防につながる。ひいては、透析患者数の減少、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止や今後の医療費削減などにつながり、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００４８】
＜考察＞
本発明者は、４,５８７名の日本人からなる集団において、１７６個の候補遺伝子中の２２２個の多型と、慢性腎臓病との関連を調べた。今回の大規模研究によって、ＵＣＰ３の−３５位Ｃ／Ｔ多型、ＰＥＣＡＭ１の３６２２２位Ａ／Ｇ多型、ＨＭＯＸ１の９８位Ｇ／Ｃ多型、ＡＰＯＥの−２０３位Ｔ／Ｇ多型、ＡＧＴＲ１の４３６５１位Ｇ／Ａ多型、ＰＩＫ３Ｒ１の７５６８６位Ｇ／Ａ多型、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂの２３３７５位Ａ／Ｃ多型、ＡＢＣＡ１の−１４位Ｃ／Ｔ多型、ＩＲＳ１の３９３１位Ｇ／Ａ多型、ＲＯＳ１の１２４７８５位Ｇ／Ａ多型、ＢＣＨＥの６３９７３位Ｇ／Ａ多型、ＡＮＸＡ５の４３１位Ｃ／Ｔ多型、ＭＭＰ１の−１６０２位２Ｇ／１Ｇ多型、ＰＡＬＬＤの２５９１７５位Ａ／Ｇ多型、ＫＣＮＪ１１の６３４位Ａ／Ｇ多型、ＣＸＣＬ１６の４６６０位Ｃ／Ｔ多型、ＦＯＸＣ２の−５１２位Ｃ／Ｔ多型、ＭＭＰ３の７２２位Ａ／Ｇ多型、ＣＯＭＴの２１９６２位Ｇ／Ａ多型、ＰＤＥ４Ｄの９１９４７５位ＴＡＡＡ／−多型、ＧＣＫの−３０位Ｇ／Ａ多型、ＡＰＯＡ５の−１１２３位Ｃ／Ｔ多型が慢性腎臓病と有意に関連することが明らかになった。
【００４９】
最後に、慢性腎臓病では上記２２個の多型のうち、統計解析により特に疾患との関連が強い２０個の多型と年齢・性別の情報をロジスティック回帰式に投入し、これらの遺伝子型の組み合わせにより遺伝的リスクをＡ−Ｅの５段階で評価した。結果を表１２に示す。表中においては、左より順に、因子（Variable）として各多型の遺伝子表記（Gene Symbol）と遺伝子型（polymorphism）、年齢（Age）、性別（Sex）、ロジット値（logit）、リスク値（Pseudo Probability）、オッズ比（Odds-ratio）、５段階評価（estimate A,B,C,D,E）を示す。５段階評価は、受診者の発症確率のリスク値を推定し、コントロール群のリスク値分布を、研究対象群のクロスバリデーションにより補正した閾値で区分したところ、リスク値の大きい順に４.４％がリスクの高い群、次の１８.４％がリスクのやや高い群、次の５０.５％が平均的リスクの群、次の２１.２％がリスクのやや高い群、リスク値の最も小さい５.５％がリスクの低い群に評価された。本発明においては、遺伝的リスクを５段階評価で提示することにより、発症リスクが容易に推定可能となる。
【００５０】
【表１２】
2010142187.tif 000013
【００５１】
ＭＭＰ１（Matrix metallopeptidase 1）
マトリックス金属結合タンパク分解酵素1（ＭＭＰ１）は、ほとんどのタンパク質分解酵素に抵抗性をもつタンパク質である原繊維コラーゲン（特にタイプIとIII）を分解する（非特許文献１４）。アテローム動脈硬化性プラークのマクロファージで発現し、破裂しやすいと思われるプラークの片鱗部に、分解される原繊維コラーゲンと共に存在している（非特許文献１５、１６）。ＭＭＰ１の発現の増加は、アテローム動脈硬化性プラークの破裂を促進する（非特許文献１７）。ＭＭＰ１の−１６０２位２Ｇ／１Ｇ多型は、プロモーター領域に位置し、ＭＭＰ１の他の多型も含めて心筋梗塞のリスクに関与している（非特許文献１８）。アテローム性動脈硬化に対するこの多型の影響が、慢性腎臓病にも関連する理由であると推測される。
【００５２】
ＡＰＯＥ（Apolipoprotein E）
アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）はカイロミクロンと超低密度リポタンパク質残差の構成要素であり、低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）レセプターとＬＤＬ受容体様タンパク質を介したこれらの粒子の結合と取り込みに関わっている（非特許文献１９、２０）。ＡＰＯＥの−２０３位Ｔ／Ｇ多型は、フランスと北アイルランドで、男性の心筋梗塞と関係したと報告された（非特許文献２１）。この多型のＴアリルは、日本人の低リスク男性において冠動脈疾患（coronary heart disease）の危険因子であると報告された（非特許文献２２）。本研究において、ＡＰＯＥの−２０３位Ｔ／Ｇ多型は、Ｔアリルにおいて、慢性腎臓病に関連が示された。この多型は、ＡＰＯＥのプロモーター領域にあり、ＡＰＯＥの血漿内濃度（ＴアリルでＡＰＯＥ濃度が減少）との関連が示されている（非特許文献２１）。リポタンパク質の代謝異常は、アテローム性動脈硬化症の進展および糸球体硬化症の進展に重要な役割を果たすが（非特許文献２３、２４）、慢性腎臓病におけるＡＰＯＥの−２０３位Ｔ／Ｇ多型の役割は不明である。
【００５３】
ＭＭＰ３（Matrix metallopeptidase 3）
マトリックス金属結合タンパク分解酵素３は、アテローム（動脈内膜の脂肪沈着）で発現し、広い基質特異性をもち、コラーゲン分解酵素やゼラチン分解酵素といった他のＭＭＰ（マトリックス金属結合タンパク分解酵素）を活性化させる（非特許文献２５）。アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスでのＭＭＰ３の不活化は、損傷マトリックスタンパク質の量も、アテローム動脈硬化性プラークのサイズも増大させる（非特許文献２６）。冠状動脈アテローム性動脈硬化症のプラークでは、破裂しやすいと思われる場所で最も顕著に、ＭＭＰ３のｍＲＮＡの存在がin situハイブリダイゼーションで確認されている（非特許文献２７）。ＭＭＰ３の発現は主に転写のレベルで調節されており、この遺伝子のプロモーターは様々な刺激に反応する（非特許文献２８）。われわれは、以前、日本人女性における心筋梗塞の罹患率と、ＭＭＰ３の−１６１０位５Ａ／６Ａ多型に関連があることを示した（非特許文献２９）。また、重篤な狭窄となるアテローム動脈硬化性プラークは、このＭＭＰ遺伝子多型と関連があることも報告された（非特許文献３０、３１）。これらの知見より、ＭＭＰ３はアテローム性動脈硬化に関与する候補遺伝子であることが示唆される。今回、我々は、慢性腎臓病疾患発症とＭＭＰ３の７２２位Ａ／Ｇ（Ｌｙｓ４５Ｇｌｕ）多型の関連を示したが、そのメカニズムは不明である。
【００５４】
ＵＣＰ３（Uncoupling protein 3）
ミトコンドリア脱共役タンパク質３（ＵＣＰ３）はミトコンドリア膜輸送タンパク質で、主に骨格筋で発現しており、エネルギー代謝調節の役割をしている（非特許文献３２）。ＵＣＰ３の−３５位Ｃ／Ｔは、この遺伝子のプロモーター領域に位置しており、肥満（非特許文献３３）、心筋梗塞（非特許文献３４）との関連が示されている。この多型のＴアリルは２型糖尿病の進行のリスクを増大させた（非特許文献３５）。本研究では、ＵＣＰ３の−３５位Ｃ／Ｔ多型のＴアリルが慢性腎臓病の疾患リスクと関わっていることを示した。この多型の、肥満と２型糖尿病の進行に対する影響が、慢性腎臓病と関連する可能性がある。
【００５５】
ＰＥＣＡＭ１（Platelet-endothelial cell adhesion molecule 1）
ＰＥＣＡＭ１は、１３０ｋＤのイムノグロブリンスーパーファミリーであり、内皮細胞表面、血小板、白血球と血液前駆細胞で発現しているタンパク質である（非特許文献３６）。ＰＥＣＡＭ１は、インテグリンの親和性を調節することによる白血球の接着（非特許文献３７）、刺激分子に反応した内皮透過輸送（非特許文献３８）の両方に重要な役割を果たす。ＰＥＣＡＭ１の３６２２２位Ａ／Ｇ（Ｇｌｎ６６８Ａｒｇ）多型は、このタンパク質の、シグナル伝達の主要な役割を果たす細胞質ドメインをコードしているエクソン１２に位置している（非特許文献３６）。Ａアリル（Ｇｌｎ）の多型は、日本人において、心筋梗塞のリスクを増大させる因子として関与が示されている（非特許文献３９）。今回我々は、ＰＥＣＡＭ１の３６２２２位Ａ／Ｇ多型のＡアリル（Ｇｌｎ）が、慢性腎臓病のリスクに抑制因子として関わっていることを示した。この多型のＡアリル（Ｇｌｎ）が、心筋梗塞の危険因子、慢性腎臓病の抑制因子の両方に関与しているメカニズムは明らかではない。
【００５６】
＜結論＞
我々の研究によれば、日本人においては、ＵＣＰ３、ＰＥＣＡＭ１、ＨＭＯＸ１、ＡＰＯＥ、ＡＧＴＲ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＡＢＣＡ１、ＩＲＳ１、ＲＯＳ１、ＢＣＨＥ、ＡＮＸＡ５、ＭＭＰ１、ＰＡＬＬＤ、ＫＣＮＪ１１、ＣＸＣＬ１６、ＦＯＸＣ２、ＭＭＰ３、ＣＯＭＴ、ＰＤＥ４Ｄ、ＧＣＫ、ＡＰＯＡ５の多型が慢性腎臓病に関連した。この結果に基づき、遺伝子多型を調べることにより、慢性腎臓病発症の危険性を知ることができる。
このように本実施形態によれば、慢性腎臓病について、遺伝的リスクを予測するための検出法を提供することができる。この実施形態を用いることにより、慢性腎臓病の予防が可能となり、透析患者数の減少、心血管障害の減少、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００５７】
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【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。
【図２】ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。
【図１】
2010142187.tif 000014
【図２】
2010142187.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月8日(2009.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010142187000001.app