(57)【要約】【課題】  保存安定性に優れた可溶性インターロイキン−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）定量用標準品を提供することにある。【解決手段】  水性媒体中に既知濃度の可溶性インターロイキン−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）及びキレート剤を含有する、ｓＩＬ−２Ｒ定量用標準品；当該ｓＩＬ−２Ｒ定量用標準品を用いることを特徴とする、検体中のｓＩＬ−２Ｒの定量方法；当該ｓＩＬ−２Ｒ定量用標準品と、ｓＩＬ−２Ｒ定量用試薬とを含むことを特徴とする、検体中のｓＩＬ−２Ｒの定量用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性媒体中に既知濃度の可溶性インターロイキン−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）及びキレート剤を含有する、ｓＩＬ−２Ｒ定量用標準品。
【請求項２】
キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である請求項１記載の標準品。
【請求項３】
請求項１又は２記載の標準品を用いることを特徴とする、検体中の可溶性インターロイキン−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）の定量方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載の標準品と、可溶性インターロイキン−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）定量用試薬とを含むことを特徴とする、検体中の可溶性インターロイキン−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）の定量用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶性インターロイキン−２受容体定量用標準品に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−２の受容体（以下、ＩＬ−２Ｒと記す）はα鎖、β鎖、γ鎖から構成されているが、α鎖の一部が細胞上から遊離した可溶性インターロイキン−２受容体（以下、ｓＩＬ−２Ｒと記す）が血中に存在することが知られている（特許文献１、非特許文献１参照）。ｓＩＬ−２Ｒは活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞によって産生されるために、生体の免疫防御機構の活性化、Ｔ細胞系及びＢ細胞系などの活性化に伴い血中のｓＩＬ−２Ｒが上昇することが報告されている。血清中のｓＩＬ−２Ｒ濃度は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患や、ウイルス性肝炎、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などのウイルス感染症の患者で高値を示し、体内の活性化リンパ球量の指標の１つとなることが報告されている（非特許文献２参照）。また腫瘍細胞がｓＩＬ−２Ｒを産生し、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）や非ホジキンリンパ腫の進行と血清中のｓＩＬ−２Ｒ濃度の変動が良く相関することが知られている（非特許文献３、非特許文献４参照）。このようにｓＩＬ−２Ｒに関して、様々な免疫系の疾患や病態との関連が報告されており、なかでも造血疾患の有望な血液中のマーカーと認識されている。血清中のｓＩＬ−２Ｒ濃度は成人Ｔ細胞白血病においては病態モニタリング、非ホジキンリンパ腫においては治療効果の判定、寛解後のモニタリング、再発の早期発見等の指標として臨床的に有効活用されている。
【０００３】
血清又は血漿中のｓＩＬ−２Ｒ定量用試薬としては、「セルフリーＩＬ−２Ｒメデックス」（協和メデックス社製）、「シーメンス・イムライズ  ＩＬ−２Ｒ  ＩＩ」（シーメンス社製）等があり、臨床の現場で使用されている。
【０００４】
血清又は血漿中のｓＩＬ−２Ｒを定量するに際しては、ｓＩＬ−２Ｒ濃度と測定値とを関連付ける検量線の作成が必須であり、検量線作成には、ｓＩＬ−２Ｒの標準品が必要である。
【０００５】
ｓＩＬ−２Ｒ定量用の標準品としては、タンパク質であるｓＩＬ−２Ｒを長期間安定に保持できることが必要であるが、タンパク質の安定化方法としては一般的に、タンパク質を凍結乾燥させる方法が知られている（特許文献２参照）。ｓＩＬ−２Ｒについても、凍結乾燥された標準品が知られている［例えば、「セルフリーＩＬ−２Ｒメデックス」（協和メデックス社製）の標準試薬］。凍結乾燥された標準品は、その製造において凍結乾燥操作が必要であり、製造が煩雑である。また、凍結乾燥された標準品の場合は、検量線の作成に際しては、指定された量の精製水もしくは溶解液で溶解して使用するのが一般的であるが、加える精製水もしくは溶解液の量の誤差や、使用者が誤った量を加えることなどによって、標準品の濃度が変化しやすい。またそのことが原因で安定した測定を達成することが難しくなり、日常における測定精度管理に影響を与える。
【０００６】
また、これまでに、タンパク質の安定化方法について、凍結乾燥以外の種々の方法が報告されており、キレート剤を共存させる方法も報告されている（特許文献３〜５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６２−７０７６１号公報
【特許文献２】国際公開第００／０７５１８９号パンフレット
【特許文献３】特開平１０−１９１９７２号公報
【特許文献４】特開２０００−２２１１９０号公報
【特許文献５】特開２００４−１２９５３１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】The Journal of Immunology, vol.135, No.5, p.3172〜3177 (1985).
【非特許文献２】Clinical immunology and immunopathology, vol.50, No.3, p.321〜332 (1989).
【非特許文献３】臨床病理，vol.42, No.8, p.834-842 (1994).
【非特許文献４】臨床検査，vol.35, No.1, p.87-91 (1991).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
標準品が溶液の場合は、製造上の煩雑さが少なく、且つ測定精度管理が容易になるが、溶液の場合は凍結乾燥された標準品と比較して、保存安定性が劣るという問題がある。本発明の目的は、保存安定性に優れたｓＩＬ−２Ｒ定量用標準品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、水溶液中のｓＩＬ−２Ｒが、キレート剤共存下で安定に保持される、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の［１］〜［４］である。
［１］  水性媒体中に既知濃度の可溶性インターロイキン−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）及びキレート剤を含有する、ｓＩＬ−２Ｒ定量用標準品。
［２］  キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である［１］記載の標準品。
［３］  ［１］又は［２］記載の標準品を用いることを特徴とする、検体中の可溶性インターロイキン−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）の定量方法。
［４］  ［１］又は［２］記載の標準品と、可溶性インターロイキン−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）定量用試薬とを含むことを特徴とする、検体中の可溶性インターロイキン−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）の定量用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、保存安定性に優れたｓＩＬ−２Ｒ定量用標準品が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のｓＩＬ−２Ｒ標準品は、水性媒体中に既知濃度のｓＩＬ−２Ｒとキレート剤とを含む。本発明の標準品において既知濃度で含まれるｓＩＬ−２Ｒは、遺伝子組換え方法により製造されたものでも、生体試料から採取されたものであってもよい。遺伝子組換え方法によりｓＩＬ−２Ｒを製造する場合に用いられる遺伝子組換え方法としては、例えば、宿主として大腸菌、動物細胞を用いて得られた形質転換体にｓＩＬ−２Ｒを産生させる方法［例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)］等が挙げられる。生体試料からｓＩＬ−２Ｒを採取する方法としては、例えばｓＩＬ−２Ｒが含まれる可能性がある血液、血漿、血清等の生体試料から、ｓＩＬ−２Ｒを分離、精製する方法等が挙げられる。生体試料からのｓＩＬ−２Ｒの分離、精製方法としては、例えばポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、「タンパク質実験ハンドブック」2003年、羊土社参照）等が挙げられる。
【００１３】
本発明の標準品において使用されるキレート剤としては、本発明の標準品におけるｓＩＬ−２Ｒを水性媒体中で安定に保持し得るキレート剤であれば特に制限はなく、例えばＢｉｃｉｎｅ［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］、ＣｙＤＴＡ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＥＤＤＰ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二プロピオン酸）、ＥＤＴＡ−ＯＨ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸］、ＥＧＴＡ［Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸］、ＨＩＤＡ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸］、ＩＤＡ（イミノ二酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＮＴＰＯ［ニトリロトリス（メチレンホスフィン酸）］、ＴＰＥＮ［Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン］、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸）、グルコン酸、クエン酸、ＡＤＡ［Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸］、Ｔｒｉｃｉｎｅ｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン｝、Ｔｒｉｓ｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン｝等が挙げられ、ＥＤＴＡが好ましい。これらのキレート剤は、水和物、塩を形成していてもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等が挙げられる。
【００１４】
キレート剤の濃度は、本発明において水性媒体中でｓＩＬ−２Ｒを安定に保持し得る濃度であれば特に制限はなく、例えば０．０５〜１０．０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．１〜５．０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１５】
本発明の標準品において使用される水性媒体としては、ｓＩＬ−２Ｒを安定に保持し得る水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばリン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等があげられる。
【００１６】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｔｒｉｓ、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
【００１７】
緩衝液のｐＨとしては、ｐＨ４．０〜１０．０であり、ｐＨ６．０〜８．０が好ましい。緩衝液の濃度は、本発明において水性媒体中でｓＩＬ−２Ｒを安定に保持し得る濃度であれば特に制限はなく、例えば０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。
【００１８】
本発明の標準品には、無機塩、糖類、タンパク質、防腐剤、界面活性剤等が含有されてもよい。無機塩としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸カルシウム、又は、これらの塩類の付加物等が挙げられる。付加物としては、例えば水和物等が挙げられる。
【００１９】
糖類としては、例えばシュークロース、デキストラン、アルギン酸若しくはその塩等が挙げられる。タンパク質としては、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、セリシン等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、バイオエース（クミアイ化学工業社製）、プロクリン（シグマアルドリッチジャパン社製）、プロキシル（アビシア社製）等が挙げられる。界面活性剤としては、例えばカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
【００２０】
本発明の検体中のｓＩＬ−２Ｒの定量方法は、本発明の標準品を用いる方法であり、以下の工程を含む。
［１］本発明の標準品とｓＩＬ−２Ｒ定量用試薬とを用いて、ｓＩＬ−２Ｒの濃度と測定値とを関連付ける検量線を作成する工程；
［２］検体と、［１］で用いたｓＩＬ−２Ｒ定量用試薬とを用いて、検体中のｓＩＬ−２Ｒを測定し、検体中のｓＩＬ−２Ｒ濃度に対する測定値を得る工程；
［３］工程［２］で得られた測定値と工程［１］で作成された検量線とから、検体中のｓＩＬ−２Ｒ濃度を決定する工程。
【００２１】
ここで、ｓＩＬ−２Ｒ定量用試薬としては、ｓＩＬ−２Ｒを定量することができる試薬であれば特に制限はないが、例えばｓＩＬ−２Ｒに対する抗体を含有する免疫学的定量用試薬等が挙げられる。ｓＩＬ−２Ｒ定量用試薬の市販品としては、例えば「セルフリーＩＬ−２Ｒメデックス」（協和メデックス社製）や「シーメンス・イムライズ  ＩＬ−２Ｒ  ＩＩ」（シーメンス社製）等が挙げられる。検体としては、ｓＩＬ−２Ｒが含まれる可能性がある検体であれば特に制限はなく、例えば全血、血清、血漿等が挙げられる。
【００２２】
本発明のｓＩＬ−２Ｒ定量用キットは、本発明の標準品とｓＩＬ−２Ｒ定量用試薬とを含む。ｓＩＬ−２Ｒ定量用試薬としては、上記のｓＩＬ−２Ｒ定量用試薬等が挙げられる。本発明のｓＩＬ−２Ｒ定量用キットは、本発明のｓＩＬ−２Ｒの定量方法に用いることができる。
【００２３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬を使用した。尚、ｓＩＬ−２Ｒは、遺伝子組換え方法により製造されたものを使用した。
【００２４】
リン酸水素二カリウム（リン酸緩衝液；和光純薬工業社製）、リン酸二水素カリウム（リン酸緩衝液；和光純薬工業社製）、ＥＤＴＡ・２Ｎａ（同仁化学研究所社製）、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、ＢＳＡ［プロリアント(Proliant)社製］、シュークロース（関東化学社製）、プロキシル［アビシア（Avecia）社製］。
【実施例１】
【００２５】
以下の組成からなる標準品を調製した。
リン酸緩衝液                １０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．５）
ｓＩＬ−２Ｒ                ２００Ｕ／ｍＬ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ            ０、０．１、１．０、２．５、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム              １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ                      １％
シュークロース              ０．８％
プロキシル                  ０．１％
【実施例２】
【００２６】
以下の組成からなる標準品を調製した。
リン酸緩衝液                １０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．５）
ｓＩＬ−２Ｒ                ６００Ｕ／ｍＬ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ            ０、０．１、１．０、２．５、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム              １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ                      １％
シュークロース              ０．８％
プロキシル                  ０．１％
【実施例３】
【００２７】
以下の組成からなる標準品を調製した。
リン酸緩衝液                １０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．５）
ｓＩＬ−２Ｒ                １０８００Ｕ／ｍＬ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ            ０、０．１、１．０、２．５、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム              １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ                      １％
シュークロース              ０．８％
プロキシル                  ０．１％
【実施例４】
【００２８】
実施例１〜３の標準品を用いて、その安定性を評価した。実施例１〜３で調製した標準品を４０℃で０日、６日、１２日保存した後、ｓＩＬ−２Ｒ定量試薬「セルフリーＩＬ−２Ｒ」（協和メデックス株式会社製）を用いて測定し、吸光度を求めた。次に、標準品の調製直後（４０℃、０日）の吸光度を１００％とし、調製直後（４０℃、０日）の吸光度に対する保存後の標準品の吸光度を、標準品中のｓＩＬ−２Ｒの残存率として算出した。調製直後（４０℃、０日）の吸光度及び残存率を表１〜表３に示す。
【００２９】
【表１】
2010230660.tif 000002
【００３０】
【表２】
2010230660.tif 000003
【００３１】
【表３】
2010230660.tif 000004
【００３２】
表１〜３から明らかな様に、ＥＤＴＡ・２Ｎａが含まれていないｓＩＬ−２Ｒ定量用標準品においては、４０℃で１２日間放置すると残存率が７５．２〜８８．１％まで低下したが、ＥＤＴＡ・２Ｎａを０．１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む標準品においては８５．０〜１０２．０％、ＥＤＴＡ・２Ｎａを１．０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む標準品においては８４．１〜９８．０％、ＥＤＴＡ・２Ｎａを２．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む標準品においては９４．０〜１００．４％、ＥＤＴＡ・２Ｎａを５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む標準品においては９３．４〜１０３．３％となり、ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む標準品においては、ＥＤＴＡ・２Ｎａを含まない標準品と比較して、残存率が高いことが分かった。以上の結果より、ＥＤＴＡ・２Ｎａを含有する本発明のｓＩＬ−２Ｒ定量用標準品においては、ｓＩＬ−２Ｒが安定に保持されることが示された。
【００３３】
アレニウスの法則を用いると、化学反応速度の温度依存性からタンパク質の安定性（寿命）を予測することができる。即ち、４０℃６日間の保存は１０℃で約１２ヵ月間での保存に相当し、４０℃１２日間の保存は１０℃で約２４ヵ月間での保存に相当する。ＥＤＴＡ・２Ｎａを含まないｓＩＬ−２Ｒ定量用標準品は、１０℃で２４ヵ月が経過するとｓＩＬ−２Ｒ量が約１２〜２５％低下し、正確なｓＩＬ−２Ｒの定量が出来なくなる。一方、ＥＤＡＴ・２Ｎａを２．５ｍｍｏｌ／Ｌ含む標準品は、ｓＩＬ−２Ｒ量の低下は最大でも１０％未満であり、ｓＩＬ−２Ｒの定量への影響が少ないことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明により、保存安定性に優れたｓＩＬ−２Ｒ定量用標準品が提供される。