(57)【要約】【課題】各画素周期において均一な条件で標本からの蛍光を検出して、定量性のある画像を取得することができるレーザ走査型顕微鏡を提供する。【解決手段】所定の周期でピークをとるように強度が変化するレーザ光を出射するレーザ光源１１と、レーザ光源１１から出射されたレーザ光を走査するスキャナ１３と、スキャナ１３により走査されたレーザ光を標本Ａに照射する対物レンズ２３と、レーザ光の照射によって生じる標本Ａからの蛍光を光強度信号に光電変換する光電変換素子２５と、光電変換素子２５により光電変換された光強度信号を画素周期毎に積算して画像情報を生成する画像情報生成部３３と、画素周期毎に、同数のピークに対応する蛍光の光強度信号が積算されるよう画像情報生成部３３を制御する制御部３２とを備えるレーザ走査型顕微鏡１を採用する。【選択図】図１
2010113062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の周期でピークをとるように強度が変化するレーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源から出射されたレーザ光を走査するスキャナと、
該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、
前記レーザ光の照射によって生じる標本からの反射光、蛍光または透過光を光強度信号に光電変換する光検出部と、
前記標本からの反射光、蛍光または透過光を光検出部へ導く検出光学系と、
前記光検出部により光電変換された光強度信号を画素周期毎に積算して画像情報を生成する画像情報生成部と、
前記画素周期毎に、同数の前記ピークに対応する反射光、蛍光または透過光の光強度信号が積算されるよう前記画像情報生成部を制御する制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記制御部が、最短の画素周期と、前記レーザ光の隣接する前記ピーク間の時間間隔とに基づいて、前記画像情報を生成するために積算する光強度信号の積算時間を設定する請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記制御部が、前記積算時間にわたる連続的な光強度信号を積分して画像情報を生成するよう前記画像情報生成部を制御する請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記制御部が、前記積算時間内に所定の周期でサンプリングされた複数の光強度信号を加算して画像情報を生成するよう前記画像情報生成部を制御する請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記制御部が、各画素周期内に所定の周期でサンプリングされた複数の信号を加算した結果に、前記画素周期に対する前記積算時間の割合を乗算して画像情報を生成するよう前記画像情報生成部を制御する請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記制御部が、前記積算時間を、前記画素周期内において複数回に分割して設定する請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記制御部が、隣接する画素周期に跨って前記積算時間を設定する請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
所定の周期でピークをとるように強度が変化するレーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源から出射されたレーザ光を走査するスキャナと、
該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、
前記レーザ光の照射によって生じる標本からの反射光、蛍光または透過光を光強度信号に光電変換する光検出部と、
前記標本からの反射光、蛍光または透過光を光検出部へ導く検出光学系と、
前記光検出部により光電変換された光強度信号を画素周期毎に積算して画像情報を生成する画像情報生成部と、
前記画素周期毎に、同数の前記ピークに対応する反射光、蛍光または透過光の光強度信号が積算されるよう前記画素周期を調整する制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記制御部は、前記画素周期および前記スキャナによる走査周期が、前記レーザ光の前記ピークの周期の整数倍となるように前記画素周期を調整する請求項８に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１０】
所定の周期でピークをとるように強度が変化するレーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源から出射されたレーザ光を走査するスキャナと、
該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、
前記レーザ光の照射によって生じる標本からの反射光、蛍光または透過光を光電変換する光検出部と、
前記標本からの反射光、蛍光または透過光を光検出部へ導く検出光学系と、
前記光検出部により光電変換された光強度信号を各画素周期毎に積算して画像情報を生成する画像情報生成部と、
前記画素周期毎に、同数の前記ピークに対応する反射光、蛍光または透過光の光強度信号が積算されるよう前記レーザ光源を制御する制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１１】
前記制御部は、前記画素周期が前記レーザ光の前記ピークの周期の整数倍となるように前記レーザ光源を制御する請求項１０に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１２】
前記制御部は、前記スキャナによる走査周期を前記レーザ光の前記ピークの周期の整数倍となるようにスキャナを制御する前後における画素数が等しくなるように、前記スキャナの走査角度を制御する請求項９または請求項１１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１３】
前記制御部は、前記スキャナによる走査周期を前記レーザ光の前記ピークの周期の整数倍となるようにスキャナを制御する前後における視野範囲の大きさが等しくなるように、前記スキャナの走査速度を制御する請求項９または請求項１１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１４】
前記制御部は、前記レーザ光の前記ピークの時刻において前記画素周期が開始するよう前記画素周期を制御する請求項１３に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１５】
前記制御部は、スキャナによる走査周期が前記レーザ光の前記ピークの周期の整数倍となるように、帰線期間の所要時間を調節する請求項９または請求項１１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、光源からのレーザ光の出射タイミングに同期させて蛍光のサンプリングを行う顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この顕微鏡によれば、ピークを含む蛍光信号を確実にサンプリングすることができる。
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−１５９７３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、画像を形成する１画素あたりのサンプリング時間（画素周期）は観察条件（例えば、観察範囲、走査速度、画像の解像度）等によって変化し、必ずしもレーザ光の出射周期と、画素周期とが同期するとは限らない。パルスレーザの出射周期と画素周期とが同期しない場合には、画素周期毎にサンプリング数が変化してしまい、同質で均一な蛍光体であっても、画素毎に輝度が異なってしまうという問題が発生する。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、各画素周期において均一な条件で標本からの反射光、蛍光または透過光を検出して、定量性のある画像を取得することができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１の態様は、所定の周期でピークをとるように強度が変化するレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、前記レーザ光の照射によって生じる標本からの反射光、蛍光または透過光を光強度信号に光電変換する光検出部と、前記標本からの反射光、蛍光または透過光を光検出部へ導く検出光学系と、前記光検出部により光電変換された光強度信号を画素周期毎に積算して画像情報を生成する画像情報生成部と、前記画素周期毎に、同数の前記ピークに対応する反射光、蛍光または透過光の光強度信号が積算されるよう前記画像情報生成部を制御する制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡である。
【０００７】
第１の態様によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光がスキャナおよび対物レンズを介して標本に照射されると、標本からの反射光、蛍光または透過光が検出光学系により導光されて光検出部により光電変換される。反射光、蛍光または透過光は、周期的に現れるレーザ光のピークの周期に同期して発生する。光電変換されることにより生成された光強度信号は、画像情報生成部において各画素の光強度を決定する画素周期毎に積算され、画像情報が生成される。この場合において、レーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係にない場合には、画素周期毎にレーザ光がピークとなる回数が相違するが、制御部が画像情報生成部を制御して、レーザ光のピークに対応する反射光、蛍光または透過光が各画素周期において同数ずつ積算されるようにするので、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
【０００８】
ここで、すべての画素周期において同数のレーザ光のピークに対応する反射光、蛍光または透過光が積算されるようにするためには、例えば、全ての画素周期において照射されるレーザ光のピークの数が最小となる画素周期のピーク数に合わせて、それより多いピーク数のレーザ光が照射される画素周期においては、いずれかのピークに対応する反射光、蛍光または透過光の光強度信号を積算しないこととする方法が挙げられる。また、最小のピーク数より１つ多いピーク数に合わせて積算する方法を採用してもよい。
【０００９】
第１の態様においては、前記制御部が、最短の画素周期と、前記レーザ光の隣接する前記ピーク間の時間間隔とに基づいて、前記画像情報を生成するために積算する光強度信号の積算時間を設定することとしてもよい。
このようにすることで、画素周期が変動する場合においても、最短の画素周期において積算される反射光、蛍光または透過光に合わせて他の全ての画素周期においても同数のレーザ光のピーク数に対応する反射光、蛍光または透過光を積算することにより、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
【００１０】
また、第１の態様においては、前記制御部が、前記積算時間にわたる連続的な光強度信号を積分して画像情報を生成するよう前記画像情報生成部を制御することとしてもよい。
このようにすることで、アナログ的に積分されることによっても、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
【００１１】
また、第１の態様においては、前記制御部が、前記積算時間内に所定の周期でサンプリングされた複数の光強度信号を加算して画像情報を生成するよう前記画像情報生成部を制御することとしてもよい。
このようにすることで、ディジタル的にサンプリングされた光信号強度を加算することによっても、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
【００１２】
また、第１の態様においては、前記制御部が、各画素周期内に所定の周期でサンプリングされた複数の信号を加算した結果に、前記画素周期に対する前記積算時間の割合を乗算して画像情報を生成するよう前記画像情報生成部を制御することとしてもよい。
このようにすることで、いずれかの画素周期に対して設定された積算時間が十分に短い場合であっても、特定の時間における反射光、蛍光または透過光がその画素周期における画像情報として積算されるのではなく、画素周期全体における反射光、蛍光または透過光を平均した画像情報を生成することができる。
【００１３】
また、第１の態様においては、前記制御部が、前記積算時間を、前記画素周期内において複数回に分割して設定することとしてもよい。
このようにすることで、いずれかの画素周期に対して設定された積算時間が十分に短い場合であっても、反射光、蛍光または透過光を検出する時間帯を分散させて、画素周期全体における反射光、蛍光または透過光の傾向を表す画像情報を生成することができる。
【００１４】
また、第１の態様においては、前記制御部が、隣接する画素周期に跨って前記積算時間を設定することとしてもよい。
このようにすることで、レーザ光の全てのピークに対応する反射光、蛍光または透過光の全てを間引くことなく利用して積算することができ、取りこぼしなく検出することができる。
【００１５】
また、本発明の第２の態様は、所定の周期でピークをとるように強度が変化するレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、前記レーザ光の照射によって生じる標本からの反射光、蛍光または透過光を光強度信号に光電変換する光検出部と、前記標本からの反射光、蛍光または透過光を光検出部へ導く検出光学系と、前記光検出部により光電変換された光強度信号を画素周期毎に積算して画像情報を生成する画像情報生成部と、前記画素周期毎に、同数の前記ピークに対応する反射光、蛍光または透過光の光強度信号が積算されるよう前記画素周期を調整する制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡である。
【００１６】
第２の態様によれば、レーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係にない場合には、画素周期毎にレーザ光がピークとなる回数が相違するが、制御部がレーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係となるように画像周期を調整し、レーザ光のピークに対応する反射光、蛍光または透過光が各画素周期において同数ずつ画像情報生成部によって積算されるようにするので、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
【００１７】
第２の態様においては、前記制御部は、前記画素周期および前記スキャナによる走査周期が、前記レーザ光の前記ピークの周期の整数倍となるように前記画素周期を調整することが好ましい。
このようにすることで、全ての走査期間においてレーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係となるように調整することができる。
【００１８】
また、本発明の第３の態様は、所定の周期でピークをとるように強度が変化するレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、前記レーザ光の照射によって生じる標本からの反射光、蛍光または透過光を光電変換する光検出部と、前記標本からの反射光、蛍光または透過光を光検出部へ導く検出光学系と、前記光検出部により光電変換された光強度信号を各画素周期毎に積算して画像情報を生成する画像情報生成部と、前記画素周期毎に、同数の前記ピークに対応する反射光、蛍光または透過光の光強度信号が積算されるよう前記レーザ光源を制御する制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡である。
【００１９】
第３の態様によれば、レーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係にない場合には、画素周期毎にレーザ光がピークとなる回数が相違するが、制御部がレーザ光源を制御して、レーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係となるように画像周期を調整し、レーザ光のピークに対応する反射光、蛍光または透過光が各画素周期において同数ずつ画像情報生成部によって積算されるようにするので、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
【００２０】
第３の態様においては、前記制御部は、前記画素周期が前記レーザ光の前記ピークの周期の整数倍となるように前記レーザ光源を制御することとしてもよい。
このようにすることで、制御部がレーザ光源を制御してレーザ光のピークの周期が画素周期と整数倍の関係とすることにより、各画素周期において同数ずつレーザ光のピークに対応する反射光、蛍光または透過光を画像情報生成部によって積算されるようにすることができる。
【００２１】
また、第２の態様および第３の態様においては、前記制御部は、前記スキャナによる走査周期を前記レーザ光の前記ピークの周期の整数倍となるようにスキャナを制御する前後における画素数が等しくなるように、前記スキャナの走査角度を制御することとしてもよい。
このようにすることで、走査範囲を拡大または縮小して、画素数を同じにすることができる。
【００２２】
また、第２の態様および第３の態様においては、前記制御部は、前記スキャナによる走査周期を前記レーザ光の前記ピークの周期の整数倍となるようにスキャナを制御する前後における視野範囲の大きさが等しくなるように、前記スキャナの走査速度を制御することとしてもよい。
このようにすることで、走査範囲の大きさを変化させることなく、レーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係となるように調整することができる。
【００２３】
また、第２の態様および第３の態様においては、前記制御部は、前記レーザ光の前記ピークの時刻において前記画素周期が開始するよう前記画素周期を制御することとしてもよい。
このようにすることで、走査範囲の位置を変化させることなく、レーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係となるように調整することができる。
【００２４】
また、第２の態様および第３の態様においては、前記制御部は、スキャナによる走査周期が前記レーザ光の前記ピークの周期の整数倍となるように、帰線期間の所要時間を調節することとしてもよい。
このようにすることで、走査期間における画素周期、走査範囲の大きさおよび位置を調節した後に、帰線期間の所要時間の調整によって、全ての走査期間においてレーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係となるように調整することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、各画素周期において均一な条件で標本からの反射光、蛍光または透過光を検出して、定量性のある画像を取得することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
図１は、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１の概略構成を示している。図１に示すように、レーザ走査型顕微鏡１は、レーザ光を射出するレーザ光源装置２と、レーザ光源装置２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体３と、レーザ光源装置２および顕微鏡本体３を制御する制御装置４とを主な構成要素として備えている。
【００２７】
レーザ光源装置２は、レーザ光を射出するレーザ光源１１と、レーザ光源１１から出射されたレーザ光の強度を調節する調光部１２と、調光部１２により調光されたレーザ光を走査するスキャナ１３とを備えている。
【００２８】
レーザ光源１１は、例えばフェムト秒パルスレーザ光や高周波重畳ＬＤ（半導体レーザ）のように、所定の周期でピークをとるように強度が変化するレーザ光を射出するとともに、レーザ光の射出と同期したレーザパルス信号を制御装置４に出力するようになっている。
【００２９】
調光部１２は、例えば、音響光学素子、シャッター、減光フィルタ等であり、制御装置４からの指示により、スキャナ１３に入射させるレーザ光の周波数を調節するようになっている。
【００３０】
スキャナ１３は、例えば、ガルバノミラー、共振スキャナ、音響光学偏向素子等である。スキャナ１３は、例えばアルミコートされた一対のガルバノミラー１５ａ，１５ｂを有しており、制御装置４からの指示により、ガルバノミラー１５ａ，１５ｂの角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、レーザ光源１１からのレーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させることができるようになっている。
【００３１】
顕微鏡本体３は、レーザ光源１１から射出されスキャナ１３により走査されたレーザ光を対物レンズ２３へリレーするレンズ２２，２４と、レーザ光を標本Ａに照射する一方、標本Ａから戻る反射光または蛍光を集光する対物レンズ２３と、レーザ光の光路と標本Ａからの反射光または蛍光の光路とを分岐するダイクロイックミラー２１と、ダイクロイックミラー２１により分岐された標本Ａからの反射光または蛍光を検出する光電変換素子（光検出部）２５と、標本Ａを透過した透過光を集光する集光レンズ２６と、集光レンズ２６により集光された透過光を検出する透過光検出器（ＰＭＴ：Photo Multiplier Tube）２７とを備えている。
【００３２】
ダイクロイックミラー２１は、レーザ光源装置２からのレーザ光を対物レンズ２３に向けて反射させる一方、対物レンズ１５により集光された標本Ａからの反射光または蛍光を透過させることで、レーザ光の光路から標本Ａからの反射光または蛍光の光路を分岐するようになっている。なお、以降では説明を簡略化するために、ダイクロイックミラー２１は、標本Ａからの蛍光のみを透過させ、標本Ａからの反射光については透過させないこととして説明する。また、標本Ａを透過した透過光を観察する場合には、標本Ａからの蛍光を観察する場合と同様の処理を行えばよいため、ここでは説明を省略し、以降では標本Ａからの蛍光を観察する場合を例として説明する。
【００３３】
光電変換素子２５は、例えばＰＭＴ（Photo Multiplier Tube）やＡＰＤ（Avalanche Photo Diode）であり、ダイクロイックミラー２１を透過してきた標本Ａからの蛍光を光電変換し、得られた光強度信号を制御装置４に出力するようになっている。
【００３４】
制御装置４は、光電変換素子２５からの光強度信号にＡ／Ｄ変換等の処理を施す光検出回路３１と、Ａ／Ｄ変換された光強度信号から画像情報を生成する画像情報生成部３３と、画像情報生成部３３により生成された画像情報を画面に表示する表示モニタ３４と、これら各部を制御する制御部３２とを備えている。
【００３５】
画像情報生成部３３は、例えばＰＣ（Personal Computer）であり、レーザ光の標本Ａ面上での集光位置の座標と光電変換素子２５からの光強度信号とを対応付けて記憶するとともに、記憶した光強度信号を画素周期毎に積算して画像情報を生成するようになっている。
【００３６】
以下に、制御部３２において実行される処理について図２および図３を参照して説明する。
制御部３２は、レーザ光源１１からレーザパルス信号Ｌを受信し、このレーザパルス信号Ｌに基づいてレーザパルス間隔ＴＬＤを算出する。なお、ここではレーザパルス間隔ＴＬＤは一定であるとして説明する。また、制御部３２は、画像情報生成部３３からスキャナ１３の走査速度や解像度等の走査条件Ｍを受信し、この走査条件Ｍに基づいて１画素の周期を示す画素周期ｔＳを算出して、この画素周期ｔＳの開始および終了のタイミングを決定するピクセル同期信号Ｐを生成する。
【００３７】
制御部３２は、画素周期ｔＳをレーザパルス間隔ＴＬＤで除算することで、画素周期ｔＳの間に射出されるレーザ光のパルス数を算出する。このレーザ光のパルス数は、レーザ光により励起され標本Ａにおいて発生する蛍光Ｆのパルス数と同数である。
【００３８】
制御部３２は、ピクセル同期信号Ｐを検出してから時間的に最初のレーザパルス信号Ｌを検出した際に、蛍光Ｆの取り込みを開始する開始パルスＱを生成する。また、この開始パルスＱを検出してから、ｔＳ／ＴＬＤの整数部分の数のレーザパルス信号Ｌが入力された際に、蛍光Ｆの取り込みを終了する終了パルスＲを生成する。この開始パルスＱから終了パルスＲまでの間を蛍光取り込み範囲（積算時間）とし、蛍光取り込み範囲の間のサンプリングクロックＣをサンプリング有効範囲とする。
【００３９】
制御部３２は、予め設定された一定間隔のサンプリングクロックＣで光電変換素子２５により取得された光強度信号、すなわちサンプリングデータＳを光検出回路３１を介して受信する。制御部３２は、上述のサンプリング有効範囲の間に取得したサンプリングデータＳに対して積算や平均化等の演算処理を行い、１画素の輝度データＤとして画像生成部３３に出力する。これにより、全ての画素について同数の光強度信号が積算または平均化されることとなる。そして、制御部３２は、画像情報生成部３３により１画素の輝度データＤを積算して画像情報Ｉを生成させ、表示モニタ３４に画像を表示させる。
【００４０】
上記構成を有するレーザ走査型顕微鏡１の作用について以下に説明する。
レーザ光源１１を作動させると、レーザ光源１１から射出されたレーザ光は、その周波数が調光部１２により調節されてスキャナ１３に導光される。スキャナ１３では、レーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させる。このように走査されたレーザ光は、レンズ２４を透過してダイクロイックミラー２１により反射され、レンズ２２を透過した後に、対物レンズ２３により標本Ａ上に照射される。
【００４１】
標本Ａ上の対物レンズ５の焦点面においては、レーザ光の光子密度が高くなり、多光子励起効果により標本Ａ内の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ２３により集光され、レンズ２４およびダイクロイックミラー２１を透過して光電変換素子２５に導光される。光電変換素子２５では、標本Ａからの蛍光が光電変換されて光強度信号が生成される。生成された光強度信号は、光検出回路３１によりＡ／Ｄ変換され、制御部３２に出力される。
【００４２】
制御部３２では、レーザ光源１１からのレーザパルス信号Ｌに基づいてレーザパルス間隔ＴＬＤが算出されるととともに、画像情報生成部３３からの走査条件Ｍに基づいて画素周期ｔＳが算出される。そして、画素周期ｔＳをレーザパルス間隔ＴＬＤで除算することで、画素周期ｔＳの間に発生する蛍光Ｆのパルス数が算出され、蛍光取り込み範囲およびサンプリング有効範囲が設定される。
【００４３】
ここで、上記の処理について具体的な例を挙げて以下に説明する。
図３に示すように、画素周期ｔＳを５２．６ｎｓ、レーザパルス間隔ＴＬＤを１２．５ｎｓとすると、画素周期ｔＳにおけるレーザ光（蛍光）のパルス数ｔＳ／ＴＬＤは、４．２パルスと算出される。したがって、画素周期ｔＳにおける蛍光Ｆのパルス数を４パルスとして蛍光取り込み範囲およびサンプリング有効範囲が設定される。
【００４４】
また、図３の符号Ｂに示すように、画素周期ｔＳ２の間に３パルスの蛍光Ｆしか検出できない場合には、次の画素の画素周期ｔＳ３における蛍光ＦＢを４パルス目として検出する。なお、この蛍光ＦＢは、画素周期ｔＳ３における１パルス目の蛍光としても検出される。したがって、この場合には、蛍光ＦＢが２つの画素周期において重複することとなる。
【００４５】
このようにして設定されたサンプリング有効範囲の間に光電変換素子２５により取得されたサンプリングデータＳは、制御部３２により積算や平均化等の演算処理が行われ、１画素の輝度データＤとして画像生成部３３に出力される。画像情報生成部３３では、レーザ光の標本Ａ面上での集光位置の座標と、光電変換素子２５により検出された蛍光Ｆの光強度とを対応付けて輝度データＤを積算して画像情報Ｉが生成される。このように蛍光Ｆのパルス数が各画素周期において同数となるように生成された画像情報Ｉは、画像として表示モニタ３４に表示される。
【００４６】
以上のように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１では、制御部３２により、レーザ光のピークに対応する蛍光Ｆが各画素周期において同数ずつ積算されるように画像情報生成部３３が制御される。ここで、従来のレーザ走査型顕微鏡１では、図１５に示すように、レーザパルス間隔ＴＬＤと画素周期ｔＳとが整数倍の関係にない場合には、画素周期毎にレーザ光がピークとなる回数が相違する。この場合においても、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１によれば、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
【００４７】
［第１の変形例］
本実施形態の第１の変形例として、図４に示すように、例えばスキャナ１３による走査が等角速度で行われ、ピクセル同期信号Ｐが不等間隔となる場合について説明する。
この場合、制御部３２は、複数の画素周期ｔＳ１〜ｔＳ１０のうち画素周期ｔＳ１を最短の画素周期ｔＳminとして算出し、この最短の画素周期ｔＳminとレーザパルス間隔ＴＬＤとに基づいて蛍光取り込み範囲およびサンプリング有効範囲を設定する。
【００４８】
このようにすることで、複数の画素周期のうち最短の画素周期ｔＳminにおいて積算される蛍光に合わせて、他の全ての画素周期においても同じパルス数の蛍光Ｆを積算することができる。これにより、画素周期ｔＳが変動する場合においても、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
【００４９】
また、上記の第１の変形例において、図４の符号Ｇに示すように、ｎを最短の画素周期ｔＳminにおけるサンプリング有効範囲、Ｎを所定の周期におけるサンプリング有効範囲とした場合に、制御部３２が、各画素周期内に所定の周期でサンプリングされた複数の信号を加算した結果に、画素周期に対する積算時間の割合ｎ／Ｎを乗算して画像情報を生成するよう画像情報生成部３３を制御することとしてもよい。
【００５０】
このようにすることで、いずれかの画素周期に対して設定されたサンプリング有効範囲が十分に短い場合であっても、特定の時間における蛍光がその画素周期における画像情報として積算されるのではなく、画素周期全体における蛍光を平均した画像情報を生成することができる。
【００５１】
また、上記の第１の変形例において、図４の符号Ｈに示すように、制御部３２が、積算時間を、画素周期内において複数回に分割して設定することとしてもよい。
このようにすることで、いずれかの画素周期に対して設定された積算時間が十分に短い場合であっても、蛍光を検出する時間帯を分散させて、画素周期全体における蛍光の傾向を表す画像情報を生成することができる。
【００５２】
［第２の変形例］
本実施形態の第２の変形例として、図５に示すように、制御部３２が、隣接する画素周期に跨ってサンプリング有効範囲を設定することとしてもよい。なお、図５に示す例において、蛍光取り込み範囲は、その間に検出される蛍光のピークが５パルスとなるように設定されている。
このようにすることで、レーザ光の全てのピークに対応する蛍光の全てを間引くことなく利用して積算することができ、取りこぼしなく検出することができる。
【００５３】
［第３の変形例］
本実施形態の第３の変形例として、図６および図７に示すように、光検出回路３１に入力信号をアナログ積分する積分器（図示略）を設け、制御部３２が、蛍光取り込み範囲（積分器動作区間）にわたる連続的な光強度信号を積分して画像情報を生成するよう画像情報生成部３３を制御することとしてもよい。
【００５４】
この場合には、制御部３２は、レーザパルス信号Ｌとピクセル同期信号Ｐから積分器の積分動作期間を算出するとともに、積分器の動作開始信号Ｖおよび動作終了信号Ｗをレーザパルス信号Ｌと同期させ、光検出回路３１に出力する。また、制御部３２は、積分器の積分動作により得られた積分波形のデータＸを光検出回路３１から受信する。
このようにすることで、アナログ的に積分されることによっても、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
【００５５】
また、上記の第３の変形例においては、制御部３２が、積算時間内に所定の周期でサンプリングされた複数の光強度信号を加算して画像情報を生成するよう画像情報生成部３３を制御することとしてもよい。
このようにすることで、ディジタル的にサンプリングされた光信号強度を加算することによっても、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
【００５６】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について図面を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡が第１の実施形態と異なる点は、レーザ光源１１から射出されるレーザ光を間引くことで、レーザ光のピークに対応する蛍光を各画素周期において同数ずつ積算する点である。以下、本実施形態のレーザ走査型顕微鏡について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００５７】
図８に示すように、制御部３２は、各画素周期においてレーザ光のパルス数を同数とするために、画素周期ｔＳをレーザパルス間隔ＴＬＤで除算し、除算値ｔＳ／ＴＬＤから所定値を減じた値を各画素周期におけるレーザ光のパルス数として設定する。
【００５８】
制御部３２は、各画素周期において上記のパルス数となるようにレーザ光を間引く間引き信号Ｊを算出する。そして、制御部３２は、この間引き信号Ｊを調光器１２に出力して調光器１２を駆動させ、レーザ光源１１から射出されたレーザ光を間引く。
【００５９】
上記構成を有するレーザ走査型顕微鏡の作用について図９を参照して以下に説明する。なお、レーザ光源１１を動作させてから光電変換素子２５が蛍光を検出するまでの処理については第１の実施形態と同様であるため、その後の処理について主に説明する。
制御部３２は、レーザパルス間隔ＴＬＤおよび画素周期ｔＳを用いて、ｔＳ／ＴＬＤから所定値を減じた値を各画素周期におけるレーザ光のパルス数として設定する。この所定値は、各画素周期においてレーザ光のパルス数が同数となるように設定される。なお、ここでは一例として、所定値を１と設定した場合について説明する。
【００６０】
図９に示す具体例において、画素周期ｔＳを５２．６ｎｓ、レーザパルス間隔ＴＬＤを１２．５ｎｓとすると、ｔＳ／ＴＬＤは、４．２パルスと算出される。したがって、画素周期ｔＳにおけるレーザ光のパルス数は３パルスと設定される。
【００６１】
このようにして設定されたレーザ光Ｌ’に対応して発生する蛍光Ｆは、光電変換素子２５によりサンプリングデータＳとして取得され、画像生成部３３により２次元的な画像情報Ｉとして生成される。このようにして生成された画像情報Ｉは、画像として表示モニタ３４に表示される。
【００６２】
以上のように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、制御部３２によりレーザ光源１１を制御してレーザ光源１１から射出されるレーザ光を間引くことで、レーザパルス間隔ＴＬＤを画素周期ｔＳと整数倍の関係とし、各画素周期において同数の蛍光Ｆを画像情報生成部３３によって積算されるようにすることができる。これにより、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
また、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡において、第１の実施形態と同様にレーザ光に同期してサンプリングを行うことで、画像の定量性を向上させることができる。
【００６３】
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について図面を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡が前述の各実施形態と異なる点は、レーザ光のピークに対応する蛍光が各画素周期において同数となるように画素周期を調整する点である。以下、本実施形態のレーザ走査型顕微鏡について、前述の各実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００６４】
図１０に示すように、制御部３２は、各画素周期においてレーザ光のパルス数を同数とするために、例えば走査速度信号やズーム信号等のスキャナ１３の走査条件を変更する走査条件変更信号Ｋを算出し、この走査条件変更信号Ｋに基づいてスキャナ１３を制御する。具体的には、図１１に示すように、制御部３２は、走査速度、解像度、ガルバノズーム倍率等の画像取得条件に基づいて画素周期ｔＳを算出する。そして、制御部３２は、レーザパルス間隔ＴＬＤと画素周期ｔＳとが倍数の関係となるように各画素周期を決定し、各画素周期の開始および終了タイミングを決定するピクセル同期信号Ｐをピクセル同期信号Ｐ’に修正する。これにより、図１２（ａ）の変更後のレーザの画素と照射されるレーザパルスとの関係に示すように、各画素周期においてレーザ光のパルス数が同数となる。
【００６５】
以上のように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、制御部３２がスキャナ１３を制御して、全ての走査期間においてレーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係となるように画像周期を調整し、レーザ光のピークに対応する蛍光が各画素周期において同数ずつ画像情報生成部３３によって積算されるようにする。これにより、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。
【００６６】
また、図１２（ｂ）に示すように、制御部３２は、画素周期がレーザ光のピークの周期の整数倍となるように画素周期を調整する前後における画素数が等しくなるように、スキャナ１３の走査角度を制御することとしてもよい。
このようにすることで、スキャナ１３の走査範囲を拡大または縮小して、画素数を同じにすることができる。
【００６７】
また、図１２（ｃ）に示すように、制御部３２は、画素周期がレーザ光のピークの周期の整数倍となるように画素周期を調整する前後における視野範囲の大きさが等しくなるように、スキャナ１３の走査速度を制御することとしてもよい。
このようにすることで、スキャナ１３の走査範囲の大きさを変化させることなく、レーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係となるように調整することができる。
【００６８】
また、図１３（ａ）に示すように、制御部３２は、レーザ光のピークの時刻において画素周期が開始するように、すなわち、レーザパルスとP’を同期する際にP’をずらした時間だけ画素周期の開始をずらすように、スキャナ１３を制御することとしてもよい。
このようにすることで、スキャナ１３の走査範囲の位置を変化させることなく、レーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係となるように調整することができる。すなわち、走査中心位置をオフセットさせることで、観察位置のズレを補正して所望の画像を得ることができる。
【００６９】
また、図１３（ｂ）に示すように、制御部３２は、スキャナ１３による走査周期がレーザ光のピークの周期の整数倍となるようにスキャナの走査速度又は振幅を変化させて、帰線期間を含む画像化しない区間の所要時間を調節することとしてもよい。
このようにすることで、スキャナ１３の走査期間における画素周期、走査範囲の大きさおよび位置を調節した後に、帰線期間の所要時間の調整によって、全ての走査期間においてレーザ光のピークの周期と画素周期とが整数倍の関係となるように調整することができる。
【００７０】
〔第４の実施形態〕
次に、本発明の第４の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について図面を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡が前述の第３の実施形態と異なる点は、レーザ光のピークに対応する蛍光が各画素周期において同数となるようにレーザ光源１１を制御する点である。以下、本実施形態のレーザ走査型顕微鏡について、前述の各実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００７１】
図１４に示すように、制御部３２は、射出するレーザ光の周波数を変調させる周波数変調信号Ｚをレーザ光源１１に出力する。
具体的には、レーザパルスＬの周期をピクセル同期信号Ｐの倍数となるようにレーザ光のパルス周期を変更してもよい。パルス数の増倍は、例えば、レーザ光源１１を同時に循環する複数のパルスを設けることによって実現可能である。
【００７２】
また、レーザ光のスイッチング周期を変更してもよい。例えば、半導体レーザは、利得スイッチングによってパルス化でき、半導体レーザのパルス繰返し数をＨｚ領域からＧＨｚ領域まで調整することができる。
また、ＯＰＯ（光学パラメータ式発振器）やＯＰＡ（光学パラメータ式増幅器）を用いてもよい。このようにすることで、レーザ光の波長およびパルス数が連続して変更することができ、蛍光物質の吸収波長領域に対してほぼ理想的に適合させることができる。
【００７３】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、各実施形態において制御部３２による異なる制御方法を独立して説明したが、これら複数の制御方法を組み合わせて行うこととしてもよい。
また、ダイクロイックミラー２１は、標本Ａからの蛍光のみを透過させ、標本Ａからの反射光については透過させないこととして説明したが、標本Ａからの反射光についても透過させて光電変換素子２５により検出することとしてもよい。
また、標本Ａを透過した透過光を観察する場合には、透過光検出器２７により標本Ａからの透過光を検出し、前述の各実施形態と同様の処理を行うことで、各画素周期において均一な条件で標本Ａからの透過光を検出して、定量性のある画像を取得することができる
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図２】第１の実施形態に係る制御装置のブロック図である。
【図３】図２の制御装置における各信号のタイミングチャートである。
【図４】第１の変形例に係る各信号のタイミングチャートである。
【図５】第２の変形例に係る各信号のタイミングチャートである。
【図６】第３の変形例に係る制御装置のブロック図である。
【図７】第３の変形例に係る各信号のタイミングチャートである。
【図８】第２の実施形態に係る制御装置のブロック図である。
【図９】図８の制御装置における各信号のタイミングチャートである。
【図１０】第３の実施形態に係る制御装置のブロック図である。
【図１１】図１０の制御装置における各信号のタイミングチャートである。
【図１２】図８の制御装置の制御方法を説明する図であって、（ａ）は走査周期を変更する場合、（ｂ）は走査角度を変更する場合、（ｃ）は走査速度を変更する場合である。
【図１３】図８の制御装置の制御方法を説明する図であって、（ａ）は走査開始タイミングを変更する場合、（ｂ）は帰線期間の所要時間を変更する場合である。
【図１４】第４の実施形態に係る制御装置のブロック図である。
【図１５】従来のレーザ走査型顕微鏡における各信号のタイミングチャートである。
【符号の説明】
【００７５】
Ａ  標本
１  レーザ走査型顕微鏡
２  レーザ光源装置
３  顕微鏡本体
４  制御装置
１１  レーザ光源
１２  調光部
１３  スキャナ
２１  ダイクロイックミラー
２２，２４  レンズ
２３  対物レンズ
２５  光電変換素子
２６  集光レンズ
２７  透過光検出器
３１  光検出回路
３２  制御部
３３  画像情報生成部
３４  表示モニタ
【図１】
2010113062.tif 000003
【図２】
2010113062.tif 000004
【図３】
2010113062.tif 000005
【図４】
2010113062.tif 000006
【図５】
2010113062.tif 000007
【図６】
2010113062.tif 000008
【図７】
2010113062.tif 000009
【図８】
2010113062.tif 000010
【図９】
2010113062.tif 000011
【図１０】
2010113062.tif 000012
【図１１】
2010113062.tif 000013
【図１２】
2010113062.tif 000014
【図１３】
2010113062.tif 000015
【図１４】
2010113062.tif 000016
【図１５】
2010113062.tif 000017