(57)【要約】【課題】ハプトグロビンβサブユニットの凝集を抑制しつつリフォールディングさせることができる、活性を有するハプトグロビンβサブユニットの製造方法を提供すること。【解決手段】（１）ハプトグロビンβサブユニットおよび変性剤を含むタンパク質溶液を準備し、（２）準備したタンパク質溶液から透析により変性剤を除去して、変性状態のハプトグロビンβサブユニットをリフォールディングさせる。このとき、陰イオン性界面活性剤をその臨界ミセル濃度未満の濃度で含む透析液を用いて透析を行い、タンパク質溶液から変性剤を除去する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハプトグロビンβサブユニットおよび変性剤を含むタンパク質溶液を準備するステップと、
第１の溶液を用いて透析または希釈を行うことにより前記タンパク質溶液中の前記変性剤の濃度を低下させて、変性状態の前記ハプトグロビンβサブユニットをリフォールディングさせるステップと、を含み、
前記第１の溶液は、ドデシル硫酸ナトリウムをその臨界ミセル濃度未満の濃度で含む、
活性を有するハプトグロビンβサブユニットの製造方法。
【請求項２】
第２の溶液を用いて透析または希釈を行うことにより、前記変性剤の濃度を低下させたタンパク質溶液中の前記ドデシル硫酸ナトリウムの濃度を低下させるステップをさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記第１の溶液は、ドデシル硫酸ナトリウムを０.０２〜０.２５％の濃度で含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ハプトグロビンβサブユニットは、野生型ハプトグロビンβサブユニットの１０５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換されている変異型ハプトグロビンβサブユニットである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記他のアミノ酸残基はセリン残基である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記変異型ハプトグロビンβサブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
野生型ハプトグロビンβサブユニットの１０５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換されている、変異型ハプトグロビンβサブユニット。
【請求項８】
前記他のアミノ酸残基はセリン残基である、請求項７に記載の変異型ハプトグロビンβサブユニット。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の変異型ハプトグロビンβサブユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性を有するハプトグロビンβサブユニットの製造方法および変異型ハプトグロビンβサブユニットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ハプトグロビン（haptoglobin；以下「Ｈｐｔ」と略記する）は、主に肝臓で合成される血漿タンパク質であり、ヘモグロビンの代謝に関与している。溶血によりヘモグロビンが血中に遊離すると、Ｈｐｔは遊離ヘモグロビンに結合して強固な複合体を形成し、肝臓の細網内皮系細胞に取り込まれてヘモグロビンとともに分解される。Ｈｐｔは、αサブユニット（α鎖）およびβサブユニット（β鎖）から構成される４量体または多量体の構造をとる。このαサブユニットおよびβサブユニットは、１つのオープンリーディングフレームにコードされている。αサブユニットはＨｐｔの分子種の多様性を決定しており、βサブユニットはヘモグロビンとの結合に関与している。
【０００３】
Ｈｐｔは、高比重リポタンパク質（以下「ＨＤＬ」と略記する）の主要構成要素であるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（以下「ＡｐｏＡ−Ｉ」と略記することもある）に対する結合能を有することが報告されている。ＨｐｔはＡｐｏＡ−Ｉをヒドロキシラジカルによる酸化ダメージから保護していると推測されているが、ＨｐｔのＡｐｏＡ−Ｉ結合部位は明らかになっていない。今後、Ｈｐｔの生体内における機能を明らかにするとともに、Ｈｐｔを産業上利用するためには、活性を有するＨｐｔαサブユニットおよびＨｐｔβサブユニットの調製方法を開発することが必要である。
【０００４】
一方、凝集しやすいタンパク質を精製する技術として、タンパク質凝集体から変性タンパク質を解離させ、この変性タンパク質をリフォールディングさせる方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。特許文献１に記載の方法では、還元剤およびカオトロピック剤の存在下で高圧処理を行うことにより、タンパク質凝集体から変性タンパク質を解離させ、高圧下で透析して還元剤を除去することにより、変性タンパク質をリフォールディングさせている。
【０００５】
また、無細胞タンパク質合成系を用いて難溶性タンパク質を凝集させることなく合成する技術が開示されている（例えば、特許文献２参照）。特許文献２に記載の技術では、タンパク質を変性させない緩和な界面活性剤を、その臨界ミセル濃度の１〜５０倍程度の濃度になるように合成系に加えることで、難溶性タンパク質を凝集させることなく合成することを実現している。
【特許文献１】特表２００４−５３０６５１号公報
【特許文献２】特開２００３−０１８９９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、組み換えＤＮＡ技術を用いて大腸菌で発現させることにより、ＨｐｔαサブユニットおよびＨｐｔβサブユニットを調製することを試みた。その結果、Ｈｐｔαサブユニットは可溶性タンパク質の状態で回収することができたが、Ｈｐｔβサブユニットは封入体（不溶性のタンパク質凝集体）の状態でしか回収することができなかった。
【０００７】
Ｈｐｔβサブユニットのように目的タンパク質が封入体を形成してしまう場合、（１）変性剤を用いて変性（可溶化）させた目的タンパク質を封入体から解離させた後、（２）希釈または透析により変性剤の濃度を低下させて目的タンパク質をリフォールディングさせ、活性を有する可溶性タンパク質を回収する方法が一般的である。しかしながら、本発明者がこの方法を用いてＨｐｔβサブユニットを回収することを試みたところ、リフォールディングさせる際にタンパク質が再度凝集してしまい、活性を有する可溶性タンパク質としてほとんど回収することができなかった。
【０００８】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、Ｈｐｔβサブユニットの凝集を抑制しつつリフォールディングさせることができる、活性を有するＨｐｔβサブユニットの製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、凝集を抑制しつつ容易にリフォールディングさせることができる変異型Ｈｐｔβサブユニットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、低濃度の陰イオン性界面活性剤を含む溶液を用いて透析または希釈を行うことにより変性剤の濃度を低下させることで上記第一の課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。すなわち、本発明の第一は、以下の活性を有するＨｐｔβサブユニットの製造方法に関する。
【００１１】
［１］ハプトグロビンβサブユニットおよび変性剤を含むタンパク質溶液を準備するステップと、第１の溶液を用いて透析または希釈を行うことにより前記タンパク質溶液中の前記変性剤の濃度を低下させて、変性状態の前記ハプトグロビンβサブユニットをリフォールディングさせるステップと、を含み、前記第１の溶液は、ドデシル硫酸ナトリウムをその臨界ミセル濃度未満の濃度で含む、活性を有するハプトグロビンβサブユニットの製造方法。
［２］第２の溶液を用いて透析または希釈を行うことにより、前記変性剤の濃度を低下させたタンパク質溶液中の前記ドデシル硫酸ナトリウムの濃度を低下させるステップをさらに含む、［１］に記載の製造方法。
［３］前記第１の溶液は、ドデシル硫酸ナトリウムを０.０２〜０.２５％の濃度で含む、［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］前記Ｈｐｔβサブユニットは、野生型Ｈｐｔβサブユニットの１０５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換されている変異型Ｈｐｔβサブユニットである、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記他のアミノ酸残基はセリン残基である、［４］に記載の製造方法。
［６］前記変異型Ｈｐｔβサブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列を有する、［５］に記載の製造方法。
【００１２】
また、本発明者は、分子内でジスルフィド結合を形成しないシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換することで上記第二の課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。すなわち、本発明の第二は、以下の変異型Ｈｐｔβサブユニットに関する。
【００１３】
［７］野生型Ｈｐｔβサブユニットの１０５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換されている、変異型Ｈｐｔβサブユニット。
［８］前記他のアミノ酸残基はセリン残基である、［７］に記載の変異型Ｈｐｔβサブユニット。
［９］配列番号２のアミノ酸配列を有する、［８］に記載の変異型Ｈｐｔβサブユニット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、Ｈｐｔβサブユニットを凝集を抑制しつつリフォールディングさせることができるため、活性を有するＨｐｔβサブユニットを高い収率で製造することができる。例えば、本発明によれば、Ｈｐｔβサブユニットの機能解析やＨｐｔβサブユニットを用いたバイオセンサの開発などを促進させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本明細書において「ハプトグロビン（Ｈｐｔ）βサブユニット」には、既知のＨｐｔβサブユニット（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＨｐｔβサブユニット）だけでなく、既知のＨｐｔβサブユニットのアミノ酸配列において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＨｐｔβサブユニットの活性（例えば、ヘモグロビンに対する結合能）を有するタンパク質（例えば、本発明の変異型Ｈｐｔβサブユニット）も含まれる。
【００１６】
また、本明細書において「活性を有するＨｐｔβサブユニット」とは、非変性状態のＨｐｔβサブユニット、すなわち（リ）フォールディング後のＨｐｔβサブユニットを意味する。
【００１７】
１．本発明のＨｐｔβサブユニットの製造方法
本発明のＨｐｔβサブユニットの製造方法は、（１）Ｈｐｔβサブユニットおよび変性剤を含むタンパク質溶液を準備する第１のステップと、（２）透析または希釈により第１のステップで準備したタンパク質溶液中の変性剤の濃度を低下させて、変性状態のＨｐｔβサブユニットをリフォールディングさせる第２のステップとを含む。本発明のＨｐｔβサブユニットの製造方法は、第２のステップで透析または希釈する際に使用する溶液（緩衝液）が陰イオン性界面活性剤をその臨界ミセル濃度未満の濃度で含むことを主たる特徴とする。
【００１８】
第１のステップでは、変性（可溶化）状態のＨｐｔβサブユニットおよび変性剤を含むタンパク質溶液を準備する。
【００１９】
タンパク質溶液に加えられるＨｐｔβサブユニットは、例えば通常の組み換えＤＮＡ技術を用いて調製すればよい（実施例参照）。このとき、Ｈｐｔβサブユニットは、不溶性の封入体であってもよい。
【００２０】
変性剤は、Ｈｐｔβサブユニットを変性（可溶化）させることができれば特に限定されず、当業者に公知のものから適宜選択すればよい。変性剤の例には、尿素やグアニジウム塩（例えば、塩酸グアニジン）などのカオトロピック試薬が含まれる。タンパク質溶液中の変性剤の濃度は、Ｈｐｔβサブユニットを変性（可溶化）させることができれば特に限定されず、通常はその変性剤について一般的に用いられている濃度範囲から適宜選択すればよい。例えば、尿素の濃度は４〜８Ｍの範囲内が好ましく、塩酸グアニジンの濃度は２〜８Ｍの範囲内が好ましい。
【００２１】
例えば、不溶性のＨｐｔβサブユニット（封入体）を懸濁させた緩衝液（懸濁液）に所定の量の変性剤を添加することで、変性状態のＨｐｔβサブユニットおよび変性剤を含むタンパク質溶液を調製することができる（実施例参照）。調製されたタンパク質溶液中のＨｐｔβサブユニットの多くは変性剤により可溶化状態となり、封入体から解離するが、Ｈｐｔβサブユニットと変性剤の量比によっては不溶性の封入体が残ることもある。この場合は、変性剤を添加した後に、遠心分離などにより不溶性の封入体を除去することが好ましい。タンパク質溶液中の変性状態のＨｐｔβサブユニットの濃度は、特に限定されないが、１０００μｇ／ｍＬ以下が好ましく、５００〜１０００μｇ／ｍＬの範囲内が特に好ましい。変性状態のＨｐｔβサブユニットの濃度が高すぎる場合、製造過程において沈殿が生じてしまう可能性がある。
【００２２】
変性状態のＨｐｔβサブユニットを溶解させる緩衝液（不溶性Ｈｐｔβサブユニットを懸濁させる緩衝液）は、当業者に公知の緩衝液から適宜選択すればよい。緩衝液の例には、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）やリン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）が含まれる。また、タンパク質溶液は、上記陰イオン性界面活性剤に加えて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分の例には、βメルカプトエタノールなどの還元剤が含まれる。
【００２３】
第２のステップでは、第１のステップで準備したタンパク質溶液中の変性剤の濃度を透析または希釈により低下させる。
【００２４】
前述の通り、本発明の製造方法は、第２のステップで透析または希釈に使用する溶液（緩衝液）が陰イオン性界面活性剤をその臨界ミセル濃度未満の濃度で含むことを主たる特徴とする。溶液に含まれる陰イオン性界面活性剤は、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」と略記する）であるが特に限定されない。溶液がＳＤＳを含む場合、溶液中のＳＤＳの濃度は０.０２〜０.２５％の範囲内が好ましく、０.０２〜０.１％の範囲内がより好ましい。
【００２５】
透析または希釈に使用する溶液は、上記陰イオン性界面活性剤を含む溶液であれば特に限定されない。通常、透析または希釈に使用する溶液は、陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液である。陰イオン性界面活性剤を溶解させる緩衝液は、当業者に公知の緩衝液から適宜選択すればよい。緩衝液の例には、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）やリン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）が含まれる。また、透析または希釈に使用する溶液（緩衝液）は、上記陰イオン性界面活性剤に加えて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分の例には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤が含まれる。
【００２６】
透析により変性剤の濃度を低下させる方法は、分画分子量がＨｐｔβサブユニットの分子量よりも小さい透析膜を使うこと以外は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、第１のステップで準備したタンパク質溶液を透析膜を介して緩衝液（陰イオン性界面活性剤を含む）と接触させて、タンパク質溶液から変性剤を除去すればよい。
【００２７】
希釈により変性剤の濃度を低下させる方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、第１のステップで準備したタンパク質溶液に１００倍量の緩衝液（陰イオン性界面活性剤を含む）を加えればよい。必要に応じて、分画分子量がＨｐｔβサブユニットの分子量よりも小さい限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、得られた希釈液を濃縮してもよい。限外ろ過を行うことで、透析と同様にタンパク質溶液から変性剤を除去することもできる。透析や限外ろ過などにより変性剤を除去することで、各種用途にそのまま使用可能な溶液を得ることができる。
【００２８】
第１のステップで準備したタンパク質溶液中の変性剤の濃度を低下させることにより、タンパク質溶液に含まれる変性状態のＨｐｔβサブユニットをリフォールディングさせることができる。このとき、陰イオン性界面活性剤を含まない溶液（緩衝液）を用いて透析または希釈を行うと（従来の方法）、Ｈｐｔβサブユニットがリフォールディングする前に再び凝集してしまうため、活性を有するＨｐｔβサブユニットをほとんど回収することができない。一方、陰イオン性界面活性剤をその臨界ミセル濃度未満の濃度で含む溶液（緩衝液）を用いて透析または希釈を行うと（本発明の方法）、Ｈｐｔβサブユニットを凝集させることなくリフォールディングさせることができる。陰イオン性界面活性剤の濃度がその臨界ミセル濃度未満であることから、陰イオン性界面活性剤がＨｐｔβサブユニットを大きく変性させることなく（したがって、リフォールディングを阻害することなく）、Ｈｐｔβサブユニット間の相互作用を弱めることで凝集を抑制していると考えられるが、凝集抑制のメカニズムはこれに限定されない。
【００２９】
このように、変性状態のＨｐｔβサブユニットを含むタンパク質溶液を準備し（第１のステップ）、陰イオン性界面活性剤をその臨界ミセル濃度未満の濃度で含む溶液（緩衝液）を用いて透析または希釈を行い、タンパク質溶液中の変性剤の濃度を低下させる（第２のステップ）ことにより、活性を有するＨｐｔβサブユニットを含む溶液を得ることができる。
【００３０】
また、本発明のＨｐｔβサブユニットの製造方法は、上記第２のステップの後に、（３）透析または希釈により、第２のステップで変性剤の濃度を低下させたタンパク質溶液中の陰イオン性界面活性剤の濃度を低下させる第３のステップをさらに含むことが好ましい。
【００３１】
第３のステップで使用する溶液は、陰イオン性界面活性剤を含まなければ特に限定されないが、通常は緩衝液である。第３のステップで使用する緩衝液は、当業者に公知の緩衝液から適宜選択すればよい。緩衝液の例には、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）やリン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）が含まれる。
【００３２】
透析により陰イオン性界面活性剤の濃度を低下させる方法は、分画分子量がＨｐｔβサブユニットの分子量よりも小さい透析膜を使うこと以外は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、第２のステップで変性剤の濃度を低下させたタンパク質溶液を透析膜を介して緩衝液（陰イオン性界面活性剤を含まない）と接触させて、タンパク質溶液から陰イオン性界面活性剤を除去すればよい。
【００３３】
希釈により陰イオン性界面活性剤の濃度を低下させる方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、第２のステップで変性剤の濃度を低下させたタンパク質溶液に１００倍量の緩衝液（陰イオン性界面活性剤を含まない）を加えればよい。必要に応じて、分画分子量がＨｐｔβサブユニットの分子量よりも小さい限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、得られた希釈液を濃縮してもよい。限外ろ過を行うことで、透析と同様にタンパク質溶液から陰イオン性界面活性剤を除去することもできる。
【００３４】
第３のステップを行うことにより、第２のステップで得られた活性を有するＨｐｔβサブユニットを含む溶液から陰イオン性界面活性剤を除去することができ、各種用途にそのまま使用可能な溶液を得ることができる。
【００３５】
以上のように、本発明の製造方法によれば、陰イオン性界面活性剤をその臨界ミセル濃度未満の濃度で含む溶液を用いた透析または希釈を行うことにより、変性状態のＨｐｔβサブユニットを凝集させることなくリフォールディングさせることができるため、活性を有するＨｐｔβサブユニットを高い収率で製造することができる。
【００３６】
２．本発明の変異型Ｈｐｔβサブユニット
本発明の変異型Ｈｐｔβサブユニットは、ヒトＨｐｔβサブユニット（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨｐｔβサブユニット）の１０５位（シグナルペプチドを含むハプトグロビン２ポリペプチド鎖では２６６位に相当）のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする。
【００３７】
ヒトＨｐｔβサブユニットには、５つのシステイン残基（１０５位、１４８位、１７９位、１９０位、２２０位）が含まれている。これら５つのシステイン残基のうち、１４８位のシステイン残基と１７９位のシステイン残基との間でジスルフィド結合が形成され、また１９０位のシステイン残基と２２０位のシステイン残基との間でジスルフィド結合が形成される。一方、１０５位のシステイン残基については、分子内でジスルフィド結合を形成せず、他の分子（Ｈｐｔαサブユニット）とジスルフィド結合を形成すると考えられている。
【００３８】
本発明者は、分子内でジスルフィド結合を形成しない１０５位のシステイン残基が凝集の一要因となりうることに着目し、このシステイン残基を他の残基に置換することでＨｐｔβサブユニットの凝集が抑制されることを見出した。
【００３９】
システイン残基に代わって１０５位に挿入されるアミノ酸残基の種類は、システイン以外のアミノ酸（ＳＨ基を持たない）であれば特に限定されないが、タンパク質の立体構造を維持する観点から分子サイズが近いセリンやアラニンなどが好ましい。配列番号２のアミノ酸配列は、本発明の変異型Ｈｐｔβサブユニットのアミノ酸配列の一例であり、野生型ヒトＨｐｔβサブユニット（配列番号１）の１０５位のシステイン残基をセリン残基に置換した変異型Ｈｐｔβサブユニットのアミノ酸配列である。
【００４０】
本発明の変異型Ｈｐｔβサブユニットは、すべてのシステイン残基が分子内でジスルフィド結合を形成しており、他の分子とジスルフィド結合を形成しないため、凝集しにくい。したがって、本発明の変異型Ｈｐｔβサブユニットは、上記本発明の製造方法によりＨｐｔβサブユニットを製造する際に、野生型Ｈｐｔβサブユニットに比べてより高い収率で活性を有するＨｐｔβサブユニットを製造することができる。
【００４１】
また、本発明の変異型Ｈｐｔβサブユニットは、野生型Ｈｐｔβサブユニットに比べて凝集しにくいため、保存安定性が顕著に高い。したがって、本発明の変異型Ｈｐｔβサブユニットは、界面活性剤や還元剤などを添加しなくても長期に亘り活性を維持することが可能であり、長期保存や凍結保存をした後も使用することができる。
【００４２】
以下、本発明を実施例を参照してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００４３】
［実施例１］
本実施例では、野生型ヒトＨｐｔβサブユニット（以下「野生型Ｈｐｔβ」という）と、野生型Ｈｐｔβの１０５位のシステイン残基をセリン残基に置換した変異型Ｈｐｔβサブユニット（以下「変異型Ｈｐｔβ」という）を本発明の方法により調製した例を示す。また、本実施例では、変異型Ｈｐｔβのリフォールディング条件を比較検討した結果、ならびに野生型Ｈｐｔβおよび変異型Ｈｐｔβの収率を測定した結果も示す。
【００４４】
１．野生型Ｈｐｔβ発現ベクターの構築
QUICK-Clone cDNAHuman Liver（クロンテック）をテンプレートとし、フォワードプライマーとして配列番号３に示される塩基配列を有するプライマー（Hpt_forward_TA）を、リバースプライマーとして配列番号４に示される塩基配列を有するプライマー（Hpt_reverse_TA）を用いてＰＣＲ増幅を行った。９５℃で１分間インキュベートした後、９５℃で１分間（変性）、６０℃で１分間（アニーリング）、７２℃で１分２４秒間（伸長）を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。ハプトグロビン２（Ｈｐｔ２：１３９７塩基）をコードするＤＮＡ断片と思われるバンドを切り出し、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）にＴＡクローニングして、ｐＧＥＭＨｐｔ２を構築した。
【００４５】
次に、ｐＧＥＭＨｐｔ２をテンプレートとし、フォワードプライマーとして配列番号５に示される塩基配列を有するプライマー（hptb_pCold_Fw）を、リバースプライマーとして配列番号６に示される塩基配列を有するプライマー（hptb_pCold_Rv）を用いて、AmpliTaq Gold（アプライドバイオシステムズ）を用いてＰＣＲ増幅を行い、野生型ＨｐｔβをコードするＤＮＡ断片の５’末端に開始コドンおよびＮｄｅＩ部位を付加し、３’末端に終始コドンおよびＸｈｏＩ部位を付加した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−ＴベクターにＴＡクローニングしてベクターを構築し、このベクターを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。任意に選択した白色コロニーからプラスミドを抽出し、シークエンス解析を行った。得られた野生型Ｈｐｔβのアミノ酸配列を配列表に示す（配列番号１）。
【００４６】
次いで、選択した白色コロニーから得られたベクター（ｐＧＥＭｈｐｔβ（ｐＣｏｌｄ））をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて切断し、断片を精製した。ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＣｏｌｄIIベクター（タカラバイオ）に精製した断片をライゲーションしてベクターを構築し、このベクターを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。任意に選択したコロニーからプラスミドを抽出してシークエンス解析を行い、発現ベクターｐＣｏｌｄｈｐｔβが構築されていることを確認した。
【００４７】
２．変異型Ｈｐｔβ発現ベクターの構築
前述のｐＣｏｌｄｈｐｔβをテンプレートとし、野生型Ｈｐｔβの１０５位（シグナルペプチドを含むＨｐｔ２ポリペプチド鎖では２６６位に相当）のシステイン残基をセリンに置換しうるように設計したプライマー（Hptb_Ser_Fw（配列番号７）およびHptb_Ser_Rv（配列番号８））を用いて、QuickChange法により部位特異的変異導入を行った。電気泳動で目的の断片が増幅されたことを確認した後、この断片を組み込んだベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。任意に選択したコロニーからプラスミドを抽出してシークエンス解析を行い、Ｈｐｔβの１０５位のシステイン残基がセリンに置換されていることを確認した。得られた変異型Ｈｐｔβのアミノ酸配列を配列表に示す（配列番号２）。
【００４８】
得られたベクターをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて切断し、断片を精製した。ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＣｏｌｄIIベクターに精製した断片をライゲーションして発現ベクターｐＣｏｌｄｈｐｔβ（Ｃｙｓ２６６Ｓｅｒ）を構築した。
【００４９】
３．可溶化サンプルの調製
（野生型Ｈｐｔβの可溶化サンプル）
ｐＣｏｌｄｈｐｔβを用いて形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン）をＬＢ寒天培地（ミラー；５０μｇ／ｍＬアンピシリンナトリウム（和光純薬工業）含有）（メルク）で一晩培養した。得られたコロニーをＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリンナトリウム含有）３.０ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。ＯＤ６００の値が０.４〜０.５付近になったところで培地の温度を１５℃に下げ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（和光純薬工業）を終濃度が０.１ｍＭとなるように添加し、１５℃でさらに２４時間培養した。培養後、集菌および洗浄を行い、湿菌体を得た。
【００５０】
得られた湿菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に懸濁し、超音波破砕した。遠心分離（２００００×ｇ、４℃、２０分間）により得られたペレットを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）（５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有）に懸濁し、再び超音波破砕した。遠心分離（２００００×ｇ、４℃、２０分間）により得られたペレットを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）で洗浄し、結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、１ｍＭ βメルカプトエタノール、ｐＨ８.０）に懸濁した。得られた懸濁液を４℃で一晩攪拌した。遠心分離（２００００×ｇ、４℃、２０分間）により不溶物を除去した後、上清をシリンジフィルター（０.４５μｍ孔）でろ過し、変性状態の野生型Ｈｐｔβおよび尿素（変性剤）を含む可溶化サンプルを得た。
【００５１】
（変異型Ｈｐｔβの可溶化サンプル）
ｐＣｏｌｄｈｐｔβの代わりにｐＣｏｌｄｈｐｔβ（Ｃｙｓ２６６Ｓｅｒ）を用いて同様の処理を行い、変性状態の変異型Ｈｐｔβおよび尿素（変性剤）を含む可溶化サンプルを得た。
【００５２】
４．Ｈｉｓタグ精製
（野生型Ｈｐｔβの精製）
結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、１ｍＭ βメルカプトエタノール、ｐＨ８.０）で平衡化したカラム（Ni-NTA Superflow）に野生型Ｈｐｔβの可溶化サンプルを添加した。洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、１ｍＭ βメルカプトエタノール、３０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８.０）で洗浄した後、溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、１ｍＭ βメルカプトエタノール、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８.０）で野生型Ｈｐｔβを溶出させて、変性状態の野生型Ｈｐｔβおよび尿素（変性剤）を含む溶出画分（タンパク質溶液）を得た。
【００５３】
（変異型Ｈｐｔβの精製）
野生型Ｈｐｔβの可溶化サンプルの代わりに変異型Ｈｐｔβの可溶化サンプルを用いて同様の処理を行い、変異型Ｈｐｔβおよび尿素（変性剤）を含む溶出画分（タンパク質溶液）を得た。
【００５４】
５．リフォールディング条件の検討
変異型Ｈｐｔβおよび尿素（変性剤）を含む溶出画分（タンパク質溶液）を表１に示す透析液を用いて一晩透析し、溶出画分から尿素を除去して変異型Ｈｐｔβをリフォールディングさせた。
【表１】
2010047537.tif 000003
【００５５】
透析後のサンプルを遠心分離（１５０００×ｇ、４℃、２０分間）して変異型Ｈｐｔβの凝集状態を確認した。表２は、各透析液についての変異型Ｈｐｔβの凝集状態を示す表である。
【表２】
2010047537.tif 000004
【００５６】
表２の結果から、０.０２％以上臨界ミセル濃度（約０.２５％）未満のＳＤＳを透析液に添加することで、変性状態の変異型Ｈｐｔβを凝集を抑制しつつリフォールディングさせうることがわかる。
【００５７】
６．野生型Ｈｐｔβと変異型Ｈｐｔβのリフォールディング効率の比較
野生型Ｈｐｔβおよび尿素（変性剤）を含む溶出画分（タンパク質溶液）を０.１％ＳＤＳを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）で透析して、野生型Ｈｐｔβをリフォールディングさせた（尿素の除去）。次いで、活性を有する野生型Ｈｐｔβを含むサンプルを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）（ＳＤＳ非含有）で透析して、このサンプルからＳＤＳを除去した。透析後のサンプルを遠心分離（１５０００×ｇ、４℃、２０分間）して凝集物を除去し、上清中のタンパク質（野生型Ｈｐｔβ）の濃度をブラッドフォード法（プロテインアッセイキット；バイオ・ラッド）により測定した。
【００５８】
同様に、変異型Ｈｐｔβおよび尿素（変性剤）を含む溶出画分（タンパク質溶液）を０.１％ＳＤＳを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）で透析して、変異型Ｈｐｔβをリフォールディングさせた（尿素の除去）。次いで、活性を有する変異型Ｈｐｔβを含むサンプルを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）（ＳＤＳ非含有）で透析して、このサンプルからＳＤＳを除去した。透析後のサンプルを遠心分離して凝集物を除去し、上清中のタンパク質（変異型Ｈｐｔβ）の濃度を測定した。
【００５９】
図１は、透析後のサンプル中の野生型Ｈｐｔβおよび変異型Ｈｐｔβの濃度を示すグラフである。野生型Ｈｐｔβおよび変異型Ｈｐｔβのいずれについても、縦軸は透析前の溶出画分中のタンパク質（Ｈｐｔβ）の濃度を１００としたときの相対濃度を示している。
【００６０】
図１のグラフに示されるように、０.１％ＳＤＳを含む緩衝液を用いて透析を行うことで、変性剤を除去してリフォールディングさせても、６８％という高い収率でリフォールディング後の野生型Ｈｐｔβ（活性を有する野生型Ｈｐｔβ）を回収することができた。また、変異型Ｈｐｔβの場合には、８４％とさらに高い収率でリフォールディング後の変異型Ｈｐｔβを回収することができた（３８.７ｍｇ／Ｌ培地）。
【００６１】
以上のことから、本発明の製造方法は、活性を有する野生型Ｈｐｔβサブユニットを高い収率で製造しうることがわかる。また、本発明の変異型Ｈｐｔβサブユニットを用いることで、さらに高い収率でＨｐｔβサブユニットを製造しうることがわかる。
【００６２】
［実施例２］
本実施例では、野生型Ｈｐｔβおよび変異型Ｈｐｔβの保存安定性を調べた結果を示す。
【００６３】
１．長期保存に対する安定性試験
実施例１と同様の手順で調製したリフォールディング後の野生型Ｈｐｔβを含むサンプル（ＳＤＳを除去したもの）を４℃で７日間または１３日間静置した。静置後のサンプルを遠心分離（１５０００×ｇ、４℃、２０分間）して凝集物を除去し、上清中のタンパク質（野生型Ｈｐｔβ）の濃度をブラッドフォード法により測定した。
【００６４】
同様に、実施例１と同様の手順で調製したリフォールディング後の変異型Ｈｐｔβを含むサンプルを４℃で７日間または１３日間静置した。静置後のサンプルを遠心分離して凝集物を除去し、上清中のタンパク質（変異型Ｈｐｔβ）の濃度をブラッドフォード法により測定した。
【００６５】
図２は、静置後のサンプル中の野生型Ｈｐｔβおよび変異型Ｈｐｔβの濃度を示すグラフである。野生型Ｈｐｔβおよび変異型Ｈｐｔβのいずれについても、縦軸は静置前（０日）のサンプル中のタンパク質（Ｈｐｔβ）の濃度を１００としたときの相対濃度を示している。
【００６６】
図２のグラフに示されるように、野生型Ｈｐｔβおよび変異型Ｈｐｔβのいずれについても、７日間静置してもほとんど変性することはなかったが、１３日間静置すると、野生型Ｈｐｔβは２９％が変性してしまったのに対し、変異型Ｈｐｔβはわずか１３％しか変性しなかった。以上のことから、本発明の変異型Ｈｐｔβサブユニットは、野生型Ｈｐｔβサブユニットに比べて長期保存に対する安定性が顕著に高いことがわかる。
【００６７】
２．凍結融解に対する安定性試験
実施例１と同様の手順で調製したリフォールディング後の野生型Ｈｐｔβを含むサンプルを−３５℃で凍結させた。凍結したサンプルを室温で融解させた後、融解させたサンプルを遠心分離（１５０００×ｇ、４℃、２０分間）して凝集物を除去し、上清中のタンパク質（野生型Ｈｐｔβ）の濃度をブラッドフォード法により測定した。
【００６８】
同様に、実施例１と同様の手順で調製したリフォールディング後の変異型Ｈｐｔβを含むサンプルを−３５℃で凍結させた。凍結したサンプルを室温で融解させた後、融解させたサンプルを遠心分離して凝集物を除去し、上清中のタンパク質（変異型Ｈｐｔβ）の濃度をブラッドフォード法により測定した。
【００６９】
図３は、凍結前および融解後のサンプル中の野生型Ｈｐｔβおよび変異型Ｈｐｔβの濃度を示すグラフ（Ｎ＝３）である。
【００７０】
図３のグラフに示されるように、野生型Ｈｐｔβは凍結融解により９６％が変性してしまったが、変異型Ｈｐｔβは凍結融解をしてもわずか４２％しか変性しなかった。以上のことから、本発明の変異型Ｈｐｔβサブユニットは、野生型Ｈｐｔβサブユニットに比べて凍結融解に対する安定性が顕著に高いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、活性を有するＨｐｔβサブユニットを高い収率で製造することができるため、例えば、Ｈｐｔβサブユニットを用いたバイオセンサの製造および開発などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】野生型Ｈｐｔβおよび変異型Ｈｐｔβの収率を示すグラフ
【図２】野生型Ｈｐｔβおよび変異型Ｈｐｔβの長期保存に対する安定性を示すグラフ
【図３】野生型Ｈｐｔβおよび変異型Ｈｐｔβの凍結融解に対する安定性を示すグラフ
【図１】
2010047537.tif 000005
【図２】
2010047537.tif 000006
【図３】
2010047537.tif 000007
【配列表】
2010047537000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月25日(2009.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハプトグロビンβサブユニットおよび変性剤を含むタンパク質溶液を準備するステップと、
第１の溶液を用いて透析または希釈を行うことにより前記タンパク質溶液中の前記変性剤の濃度を低下させて、変性状態の前記ハプトグロビンβサブユニットをリフォールディングさせるステップと、を含み、
前記第１の溶液は、ドデシル硫酸ナトリウムをその臨界ミセル濃度未満の濃度で含む、
活性を有するハプトグロビンβサブユニットの製造方法。
【請求項２】
第２の溶液を用いて透析または希釈を行うことにより、前記変性剤の濃度を低下させたタンパク質溶液中の前記ドデシル硫酸ナトリウムの濃度を低下させるステップをさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記第１の溶液は、ドデシル硫酸ナトリウムを０.０２〜０.２５％の濃度で含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ハプトグロビンβサブユニットは、野生型ハプトグロビンβサブユニットの１０５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換されている変異型ハプトグロビンβサブユニットである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記他のアミノ酸残基はセリン残基である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記変異型ハプトグロビンβサブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
野生型ハプトグロビンβサブユニットの１０５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換されている、変異型ハプトグロビンβサブユニット。
【請求項８】
前記他のアミノ酸残基はセリン残基である、請求項７に記載の変異型ハプトグロビンβサブユニット。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の変異型ハプトグロビンβサブユニット。
【請求項１０】
活性を有するハプトグロビンβサブユニットと、臨界ミセル濃度未満の濃度のドデシル硫酸ナトリウムとを含む、高比重リポタンパク質測定用溶剤。
【請求項１１】
前記ドデシル硫酸ナトリウムの濃度は、０.０２〜０.２５％である、請求項１０に記載の高比重リポタンパク質測定用溶剤。
【請求項１２】
前記ハプトグロビンβサブユニットは、野生型ハプトグロビンβサブユニットの１０５位のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換されている変異型ハプトグロビンβサブユニットである、請求項１０に記載の高比重リポタンパク質測定用溶剤。
【請求項１３】
前記他のアミノ酸残基はセリン残基である、請求項１２に記載の高比重リポタンパク質測定用溶剤。
【請求項１４】
前記変異型ハプトグロビンβサブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の高比重リポタンパク質測定用溶剤。