(57)【要約】      （修正有）【課題】感染、炎症および腫瘍の処置および予防を意図した薬用製品、該製品を含む食料品、たとえば幼児配合食品を提供する。【解決手段】人ラクトフェリンを構成する配列にてＮ−末端から数え位置１２〜４０におけるアミノ酸の少なくとも７つの順次のアミノ酸で形成される新規なペプチド、および好ましくはその改変物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ３１（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９９）を含有するペプチドであって、ここでＸ１がＧｌｎもしくはＡｌａであり；Ｘ２がＴｒｐもしくはＬｅｕであり；Ｘ３がＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＡｌａもしくはＮｌｅであり；Ｘ４がＡｒｇ、ＬｙｓもしくはＡｌａであり；Ｘ５がＡｓｎ、Ｏｒｎ、ＡｌａもしくはＮｌｅであり；Ｘ６がＭｅｔもしくはＬｅｕであり；およびＸ７がＡｒｇもしくはＬｙｓであり、且つ該ペプチドは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２−５，８，３１−３２，３４−３８，４７，４９，５１，６３，６５，６７，７０、７２−７６および８０−８３、および８７−９７から選択されるペプチド。
【請求項２】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、３７および９３からなる群から選択される請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７０、７２−７６および８０−８３、および８７−９７からなる群から選択される請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８、３１−３２，３４−３８、４７、４９、５１、６３、６５および６７からなる群から選択される請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２−５からなる群から選択される請求項１記載のペプチド。
【請求項６】
２０Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ３１（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９９）を含有するペプチドであって、ここでＸ１がＧｌｎもしくはＡｌａであり；Ｘ２がＴｒｐもしくはＬｅｕであり；Ｘ３がＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＡｌａもしくはＮｌｅであり；Ｘ４がＡｒｇ、ＬｙｓもしくはＡｌａであり；Ｘ５がＡｓｎ、Ｏｒｎ、ＡｌａもしくはＮｌｅであり；Ｘ６がＭｅｔもしくはＬｅｕであり；およびＸ７がＡｒｇもしくはＬｙｓであり、且つ該ペプチドは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２、４−５，８，３１−３２，３４−３８，４７，４９，５１，６３，６５，６７，７０、７２−７６および８０−８３、および８７−９７から選択され、且つ該システインはアセタミドメチル−システインにより置換されるペプチド。
【請求項７】
２０Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ３１（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９９）を含有するペプチドであって、ここでＸ１がＧｌｎもしくはＡｌａであり；Ｘ２がＴｒｐもしくはＬｅｕであり；Ｘ３がＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＡｌａもしくはＮｌｅであり；Ｘ４がＡｒｇ、ＬｙｓもしくはＡｌａであり；Ｘ５がＡｓｎ、Ｏｒｎ、ＡｌａもしくはＮｌｅであり；Ｘ６がＭｅｔもしくはＬｅｕであり；およびＸ７がＡｒｇもしくはＬｙｓであり、且つ該ペプチドの配列は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７０、７２−７６および８０−８３、および８７−９７から選択され、且つこのアミノ酸末端をアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓあるいはアミノ酸配列Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓにより進められるペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドを含む薬用製品。
【請求項９】
感染および／または炎症の処置および／または予防のための請求項８に記載の薬用製品。
【請求項１０】
尿路感染の処置および／または予防のための請求項９に記載の薬用製品。
【請求項１１】
結腸炎の処置および／または予防のための請求項９に記載の薬用製品。
【請求項１２】
粘膜におけるカンジダ感染の処置のための請求項９に記載の薬用製品。
【請求項１３】
経口投与につき処方される請求項８〜１２のいずれか一項に記載の薬用製品。
【請求項１４】
非経口投与につき処方される請求項８〜１２のいずれか一項に記載の薬用製品。
【請求項１５】
局所投与につき処方される請求項１４に記載の薬用製品。
【請求項１６】
粘膜への投与につき処方される請求項８〜１５のいずれか一項に記載の薬用製品。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドを含む食料品。
【請求項１８】
幼児配合食品である請求項１７に記載の食料品。
【請求項１９】
感染および／または炎症の処置および／または予防のための薬用製品を製造する請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項２０】
薬用製品が尿路感染の処置および／または予防を意図する請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
薬用製品が結腸炎の処置および／または予防を意図する請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
薬用製品が粘膜におけるカンジダ感染の処置を意図する請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
薬用製品が経口投与につき処方される請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
薬用製品が非経口投与につき処方される請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
薬用製品が局所投与につき処方される請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
薬用製品が粘膜への投与につき処方される請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
薬用製品が食料品を構成し、または食料品に含まれる請求項２３に記載の使用。
【請求項２８】
食料品が幼児配合食品である請求項２７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特に感染、炎症および／または腫瘍を処置および／または予防するための新規なペプチドおよびその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幾つかの面にて人乳は炎症のイニシエータおよびメジエーターに乏しいが、抗炎症剤に豊むという事実に基づき、抗炎症性であるということが古くから知られている［たとえばＡ．Ｓ．ゴールドマン等、人乳の抗炎症特性、アクタ・ペジアトリックス・スカジナビア、第７５巻、第６８９〜６９５頁、１９８６参照］。さらに人乳はたとえばラクトフェリンのような数種の可溶性抗感染成分を含有する［たとえばＬ．Ａ．ハンソン等、ミルクにおける保護因子および免疫系の発現、ペジアトリックス、第７５巻、第１７２〜１７６頁、１９８３参照］。
【０００３】
ラクトフェリンは、７７ｋｄの分子量を有する一本鎖金属結合性グリコ蛋白である。殺細菌特性をもたらしうるラクトフェリンの構造ドメインはラクトフェリシンと呼ばれるペプシン開裂断片であることが判明している［Ｗ．ベラミー等、ラクトフェリンの殺細菌ドメインの同定、バイオヒミカ・バイオフィジカ・アクタ、第１１２１巻、第１３０〜１３６頁、１９９２およびＷ．ベラミー等、ラクトフェリシンＢ、すなわち牛ラクトフェリンのＮ−末端領域から生ずる有力な殺細菌性ペプチドの抗細菌スペクトル、ジャーナル・アプライド・バクテリオロジー、第７３巻、第４７２〜４７９頁、１９９２参照］。
【０００４】
ラクトフェリンリセプタはモノサイトおよびマクロファージ、レクチン刺激ヒト末梢血液リンパ球、刷子縁細胞および腫瘍細胞ラインを包含する多くの種類の細胞に見られる。
【０００５】
幾つかの特許公報は、感染もしくは炎症を処置するためのラクトフェリンの使用可能性を記載している。ＷＯ９８／０６４２５号パンフレットには、たとえばラクトフェリンおよびラクトフェリシンを用いて感染、炎症および腫瘍を処置および予防しうることが開示されている。
【０００６】
ＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号明細書は、（Ａ）ラクトフェリン加水分解物および／またはラクトフェリンから得られる抗微生物ペプチドの１種もしくはそれ以上および（Ｂ）金属キレート化蛋白、トコフェロール、サイクロデキストリン、グリセリン−脂肪酸エステル、アルコール、ＥＤＴＡもしくはその塩、アスコルビン酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、ポリ燐酸もしくはその塩、キトサン、システインおよびコリン酸よりなる群から選択される１種もしくはそれ以上の化合物をその有効成分として含有する抗微生物剤を記載している。この抗微生物剤は製品の処理を意図し、特にたとえば食品および医薬品を安全に処理することを意図する。この特許公報による薬剤は従って新規な保存料である。公報には数種のペプチド配列が示されており、その幾種かは本発明によるペプチドに類似するが、下記するように幾つかの重要な相違点が存在する。
【０００７】
天然人ラクトフェリンおよびラクトフェリシンは所望の抗炎症性、抗感染性および抗腫瘍性を有することも示されているが、これらは広範囲の基準で臨床的に使用することができない。何故なら、これらは高い製造コストに基づき極めて高価な物質となるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ９８／０６４２５号パンフレット
【特許文献２】ＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａ．Ｓ．ゴールドマン等、人乳の抗炎症特性、アクタ・ペジアトリックス・スカジナビア、第７５巻、第６８９〜６９５頁、１９８６
【非特許文献２】Ｌ．Ａ．ハンソン等、ミルクにおける保護因子および免疫系の発現、ペジアトリックス、第７５巻、第１７２〜１７６頁、１９８３
【非特許文献３】Ｗ．ベラミー等、ラクトフェリンの殺細菌ドメインの同定、バイオヒミカ・バイオフィジカ・アクタ、第１１２１巻、第１３０〜１３６頁、１９９２
【非特許文献４】Ｗ．ベラミー等、ラクトフェリシンＢ、すなわち牛ラクトフェリンのＮ−末端領域から生ずる有力な殺細菌性ペプチドの抗細菌スペクトル、ジャーナル・アプライド・バクテリオロジー、第７３巻、第４７２〜４７９頁、１９９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ラクトフェリンおよび／またはラクトフェリシンと同じ目的につき使用しうると共に、ずっと安く製造されるが同じまたは一層良好な作用を示す新規なペプチドを提供することにある。
【００１１】
本発明に到る研究の目的は、腸から吸収しうる新規なペプチドを設計することである。ヒトはその刷子縁膜に、人ラクトフェリンに結合しうるリセプタを有することが示されている［たとえばＢ．レンネルダール、腸刷子縁膜におけるラクトフェリンリセプタ、アドバンスト・エクスペリメンタル・メジカル・バイオロジー、１９９４、第３５７巻、第１７１〜１７５頁参照］。さらに、牛ラクトフェリンはこれらリセプタに結合しないことも示されている。従って新規なペプチドは人ラクトフェリンもしくは人ラクトフェリシンに類似するが、これらは製造が一層容易かつ特に安価でなければならない。さらに、これらは感染、炎症および腫瘍の処置および予防にて人ラクトフェリンもしくは人ラクトフェリシンと実質的に同じ効率または好ましくは一層高い効率を持たねばならない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
Ｎ−末端から数えて人ラクトフェリンのアミノ酸１２〜４０の全部もしくは幾つかで構成された配列により形成されるペプチド、好ましくは以下さらに説明するその改変物は所望の特性を有することが突き止められた。
【００１３】
本発明の第１実施形態によれば、人ラクトフェリンのＮ−末端からアミノ酸１６〜４０およびアミノ酸１８〜４０で構成された配列より形成されるペプチド（その幾つかの改変物については以下さらに説明する）は所望の性質を有することが示される。さらにＣ−２０がＡにより置換され、Ｑ−２２がＫにより置換され、さらにＮ−２６がＤにより置換される人ラクトフェリンの残基１８〜３１に大凡対応する１４個のみの残基を有する配列も同じまたは一層良好な性質を有することが判明した。
【００１４】
本発明の第２実施形態によれば、人ラクトフェリンを構成する配列にてＮ−末端から数え位置１２〜３１におけるアミノ酸により形成されるペプチド、並びにその改変物は所望の性質を有することが示される。さらに少なくとも７つのアミノ酸よりなるこの配列の断片も同じまたは一層良好な性質を有することが示される。
【００１５】
本発明の第３実施形態によれば、位置１５〜２１におけるアミノ酸の１つで始まると共にＮ−末端から数えて位置３１のアミノ酸で終端する配列に対する人ラクトフェリンを構成する配列における１１〜１７個のアミノ酸よりなるペプチド、並びにその改変物も所望の性質を有することが示される。
【００１６】
本発明の第４実施形態によれば、Ｎ−末端から数えて人ラクトフェリンにおける位置２０〜３１のアミノ酸よりなる配列に基づく１２個のアミノ酸よりなる改変ペプチドは本発明の目的につき一層良好な結果を与えることが示される。
【００１７】
人体におけるこれら新規なペプチドの吸収に関する驚異的メカニズムは、ペプチドが上記特定ラクトフェリンリセプタへの結合を介し腸にて吸収され、次いで循環を介し輸送されることである。しかしながら、本発明はこのメカニズムのみに限定されない。
【００１８】
従って本発明は、添付配列リストに示した配列を有する新規なペプチドおよびその機能上均等なホモログもしくはアナログに関するものである。
【００１９】
さらに本発明は、前記ペプチドを含む薬用製品および食料品、特に幼児配合食品に関するものである。
【００２０】
さらに本発明は感染、炎症および腫瘍を処置および予防するための薬用製品を製造する前記ペプチドの使用にも関するものである。
【００２１】
本発明のよるペプチドは殺真菌性および殺細菌性であり、従ってこの種の性質を有する物質が所望される他の用途についても使用することができる。たとえば、これらは保存料として使用することができる。
【００２２】
本発明の特徴については以下の説明およびクレームから明らかとなるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
従って本発明は蛋白、人ラクトフェリシン（ｈＬＦ）の断片に基づくアミノ酸を含むペプチドに関するものである。本発明の基礎として用いられるｈＬＦの断片は位置１２〜４０におけるアミノ酸により構成され、その配列は次の通りである：Ｖ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ａ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｆ−Ｑ−Ｗ−Ｑ−Ｒ−Ｎ−Ｍ−Ｒ−Ｋ−Ｖ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｓ−Ｃ−Ｉ−Ｋ−Ｒ  （ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１００）
【００２４】
説明において、単文字記号はアミノ酸を示すべく用いられ、三文字記号は添付配列リストで使用される。当業者に周知されたこれら記号は次の意味を有する：Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン、Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、およびＸ＝Ｘａａ＝可変アミノ酸。幾つかの配列におけるＡｃおよびＮＨ２はアセチル基（ＣＨ３ＣＯ−）基およびアミノ基をそれぞれ示し、これらはペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端を改変すべく使用される。
【００２５】
本発明によるペプチドは、以下さらに説明するように、線状もしくは環式の形態のいずれかを有することができる。
【００２６】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１〜９９でここに挙げる全ての配列を添付配列リストに示す。
【００２７】
本発明の第１実施形態は配列が次の通りであるペプチドに関する：Ａｃ−Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｋ−Ｘ−Ｆ−Ｘ−Ｗ−Ｑ−Ｒ−Ｘ−Ｍ−Ｒ−Ｋ−Ｖ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ＮＨ２  （ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）
［位置１におけるＸはＥもしくはアミノ酸無しであり、位置２におけるＸはＡもしくはアミノ酸無しであり、位置５におけるＸはＣもしくはＡであり、位置７におけるＸはＱもしくはＫであり、位置１１におけるＸはＮもしくはＤであり、位置１７〜２５におけるＸはアミノ酸が全く存在しないか或いは−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｓ−Ｃ−Ｉ−Ｋ−Ｒのいずれかである］。
本発明の第１実施形態によるペプチドの配列は添付配列リストにおけるＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１〜７である。
【００２８】
本発明の第１実施形態の好適例において、位置１におけるＸはＥであり、位置２におけるＸはＡであり、位置５におけるＸはＣであり、位置７におけるＸはＱであり、位置１１におけるＸはＮであり、位置１７〜２５におけるＸは−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｓ−Ｃ−Ｉ−Ｋ−Ｒであり、これはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２である配列をペプチドに与える。線状型は、アセタミドメチル基（ＣＨ３ＣＯＮＨＣＨ２−）によるシステイン側鎖の保護により得られる。
【００２９】
本発明の第１実施形態の他の好適例はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２の環式型であり、これは位置５と２２とにおける２つのシステイン間にジスルフィド架橋を形成させて配列がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３である環式ペプチドをもたらすことにより得られる。ジスルフィド架橋の形成は、ポリマーの形成を回避すべく制御して行わねばならない。
【００３０】
本発明の第１実施形態における他の好適例は若干短いペプチドであり、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１における位置１のＸは無しであり、位置２におけるＸは無しであり、位置５におけるＸはＣであり、位置７におけるＸはＱであり、位置１１におけるＸはＮであり、位置１７〜２５におけるＸは−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｓ−Ｃ−Ｉ−Ｋ−Ｒであって、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４である配列のペプチドをもたらす。
【００３１】
本発明の第１実施形態におけるさらに他の好適例はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４の環式型であり、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３と同様にジスルフィド架橋を形成させてＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５をもたらすことにより得られる。
【００３２】
本発明のこの第１実施形態におけるさらに他の好適例は、位置１におけるＸが無しであり、位置２におけるＸが無しであり、位置５におけるＸがＡであり、位置７におけるＸがＫ、Ｘ５Ｄであり、位置１７〜２５におけるＸが無しである短いペプチドであって、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６をもたらす。
【００３３】
さらに、このペプチドは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６における位置５の残基Ｋおよび位置９におけるＤが各残基の側鎖間におけるラクタムの形成により結合されてループを形成するよう改変することもできる。このペプチドの配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７である。この配列にて４個の残基だけ離間するアミノ酸連鎖間のこのペプチドにおけるラクタム形成はペプチドが天然産人ラクトフェリンの断片１８〜３１に類似する三次元構造をペプチドを持つと共に一層良好にリセプタに結合するよう設計される。ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７を有するこのペプチドが本発明の第１実施形態による最も好適なペプチドである。
【００３４】
本発明の第１実施形態による他のペプチドと比較したＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７を有するペプチドの１つの利点は、これらが一層合成容易であると共に、これらがより短いので１ｇ当たり一層安価となる点である。
【００３５】
これら７種のペプチドの全てにおいて、アミノ末端およびカルボキシ末端はキャップされており、すなわちアミノ末端における遊離ＮＨ２基はアセチルイミダゾールと反応してアミドＣＨ３ＣＯＮＨ−もしくはＡｃＮＨ−を形成しており、カルボキシ末端における遊離ＣＯＯＨはＣＯＮＨ２まで変換されている。
【００３６】
本発明の第１実施形態による上記７種のペプチドの全ては、配列から明らかなように、カルボキシ末端に残基ＫおよびＲを含む。これら残基は生理学的条件下で陽帯電し、リセプタに対し強力かつ特異的に相互作用することができる。従って、これらは本発明によるペプチドの重要な部分である。さらに本発明による全ペプチドのアミノ末端におけるＴ残基もリセプタ結合にて重要な役割を演ずることができる。
【００３７】
本発明の第２実施形態は、配列が：Ｖ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ａ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｆ−Ｑ−Ｗ−Ｑ−Ｒ−Ｎ−Ｍ−Ｒ−Ｋ−Ｖ−Ｒ  （ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８）
を有するペプチド、および少なくとも７つのアミノ酸よりなるその断片に関するものである。本発明の第２実施形態によるペプチドの配列は添付配列リストにおけるＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８〜４２である。
【００３８】
本発明のこの第２実施し形態によるペプチドは少なくとも７つのアミノ酸を含有する。より短いペプチドは所望の効果を持たない。
【００３９】
本発明の第２実施形態によるペプチドの好適群は、添付配列リストに示したＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９〜２２を有するペプチドである。７つのアミノ酸だけで構成されるこれらペプチドの利点はこれらが比較的短い点であって、本発明による長いペプチドよりも一層安価かつ容易に製造しうることを意味する。
【００４０】
本発明のこの第２実施形態による他の好適群のペプチドは添付配列リストにおけるＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２３〜３１を有するペプチドであって、Ｎ−末端から数え人ラクトフェリンの位置１６におけるアミノ酸から位置２２〜３１におけるアミノ酸まで得られる改変配列に対応する。
【００４１】
この実施形態によるさらに他の好適群のペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２２およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３１〜４２を有する好適配列リストにおけるペプチドであって、Ｎ−末端から数え人ラクトフェリンの位置１３〜２５におけるアミノ酸から位置３１におけるアミノ酸まで得られる改変配列に対応する。
【００４２】
本発明の第２実施形態によるペプチドの利点はこれらが人ラクトフェリン蛋白またはその改変物のラクトフェリシン断片の部分を形成する点であり、本発明者等は本発明に関し活性であることを突き止めた。
【００４３】
発明の第３実施形態は、配列：Ｆ−Ｘ−Ｗ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｍ−Ｒ−Ｋ−Ｘ−Ｒ  （ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４３）
からなる１１〜１７つのアミノ酸よりなるペプチドまたはその機能上均等なホモログもしくはアナログに関するものである。本発明の第３実施形態によるペプチドの配列は添付配列リストにおけるＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４３〜６７およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９７である。
【００４４】
この配列において、ＸもしくはＸａａにより示されるアミノ酸は、好ましくは互いに独立してグルタミン（ＱもしくはＧｌｎ）、リジン（ＫもしくはＬｙｓ）、アスパラギン酸（ＤもしくはＡｓｐ）、アスパラギン（ＮもしくはＡｓｎ）またはバリン（ＶもしくはＶａｌ）である。
【００４５】
本発明の第２実施形態による好適群のペプチドは１４のアミノ酸で構成される。これらペプチドは、人ラクトフェリンを構成する配列にてＮ−末端から数え位置１８〜３１におけるアミノ酸により形成される配列に実質的に対応し、ここでアミノ酸の幾つかは改変されている。この群におけるペプチドは配列ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６、７、５０〜６１および９８を有する。
【００４６】
殆ど人ラクトフェリンのこの部分に対応するこの実施形態によるペプチドは、添付配列リストに示したＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５０を有するペプチドである。この配列のキャップド物はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５１を有する。
【００４７】
この配列における位置３のアミノ酸（すなわちシステイン（ＣもしくはＣｙｓ））はアラニン（ＡもしくはＡｌａ）またはリジンにより置換することができ、位置５におけるアミノ酸（グルタミン）はリジンにより置換することができ、位置９におけるアミノ酸（アスパラギン）はアスパラギン酸もしくはリジンにより置換することができ、位置１３におけるアミノ酸（バリン）はアスパラギン酸により置換することができる。
【００４８】
この実施形態によるペプチドがＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４６〜５１および６２〜６７を有するペプチドのようにシステインを含めば、このシステインをアセタミドメチル−システインにより置換して、ペプチドがシステインを含む他のペプチドとのジスルフィド架橋を形成するのを回避するのが有利である。しかしながら、このアミノ酸、グルタミンおよびバリンは上記のように置換することができない。
【００４９】
この実施形態によるペプチドの主たる利点は、これらが人ラクトフェリン蛋白のラクトフェリシン断片の１部またはその改変物を形成する点であり、本発明者等は本発明に関し活性であることを突き止めた。
【００５０】
この実施形態によるペプチドの他の利点はこれらが比較的短い点であって、これらがたとえばラクトフェリン自身のような長いペプチドよりも一層安価かつ容易に製造しうることを意味する。
【００５１】
本発明の第４実施形態は、１２のアミノ酸よりなるペプチドに関するものである。これらペプチドは、Ｎ−末端から数えて人ラクトフェリンにおける位置２０〜３１のアミノ酸よりなる配列の改変に基づくものであり、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４６に相当する。本発明の第３実施形態によるペプチドの配列は添付配列リストにおけるＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６８〜９９である。一般的配列ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９９において、位置３におけるＸａａは好ましくはＧｌｎもしくはＡｌａであり、位置４におけるＸａａは好ましくはＴｒｐもしくはＬｅｕであり、位置５におけるＸａａは好ましくはＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＡｌａもしくはＮｌｅであり、位置６におけるＸａａは好ましくはＡｒｇ、ＬｙｓもしくはＡｌａであり、位置７におけるＸａａは好ましくはＡｓｎ、Ｏｒｎ、ＡｌａもしくはＮｌｅであり、位置８におけるＸａａは好ましくはＭｅｔもしくはＬｅｕであり、位置９におけるＸａａは好ましくはＡｒｇもしくはＬｙｓである。或る種の場合、この配列を配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓもしくはそれより長い配列Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓにより進めるのが有利である。
【００５２】
本発明の第４実施形態により好適ペプチドは、それぞれＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４６にて位置３および位置７におけるアミノ酸がアラニンにより置換されているＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７０およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７４、それぞれＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４６における位置６および位置９におけるアミノ酸がリジンにより置換されているＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８１およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８３、並びにそれぞれＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４６における位置５および位置７のアミノ酸がオルニチンにより置換されているＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８７およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８９である。さらに本発明によるこれら配列のキャップド物を使用することも可能であり、或る場合には一層好適である。
【００５３】
本発明によるペプチドは天然源のもの、たとえば人ラクトフェリンから得られるものであるか或いは合成的に製造することができる。
【００５４】
本発明によるペプチドはしばしば「キャップ」され、これらペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端が上記したようにアミドまで変換される。キャップド物（すなわちアミノ末端およびカルボキシ末端がアセチルイミダゾールと反応してアミドＣＨ３ＣＯＮＨ−もしくはＡｃＮＨ−を形成していると共にカルボキシ末端における遊離ＣＯＯＨがＣＯＮＨ２まで変換されている配列）の利点は、これらペプチドが中性かつ未帯電であって、劇的に変化した静電気特性を有する点である。Ｎ−およびＣ−末端電荷が存在しない人ラクトフェリンの対応配列をリセプタが結合すると仮定して、キャップドペプチドはこの点に関しこれらが非キャップドペプチドよりも天然蛋白に類似するので一層良好に結合する筈である。約７のｐＨにおける生理学的条件下に、遊離アミノ末端およびカルボキシ末端はイオン化されると共に、ペプチドは陽電荷および陰電荷を有するであろう。
【００５５】
或る種の例においては、キャップド型の配列のみが添付配列リストに示されている。しかしながら本発明によれば、非キャップド型も使用することができる。
【００５６】
この実施形態によるペプチドが３つのアミノ酸によりアスパラギン酸もしくはグルタミン酸から分離されたリジンからなる場合、リジンおよびアスパラギン酸もしくはグルタミン酸はそれぞれＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５４におけるようにラクタムを形成することができ、ここでラクタムは位置５におけるリジンと位置９におけるアスパラギン酸との間で形成され、或いはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５５におけるようにラクタムが位置５におけるリジンと位置９におけるグルタミン酸との間で形成される。さらにラクタムが位置３におけるリジンと位置７におけるアスパラギン酸との間で形成されると共に他のラクタムが位置８におけるリジンと位置１３との間におけるアスパラギン酸との間で形成される、たとえばＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６０およびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６１におけるようなジラクタムを得ることも可能である。ラクタム形成はペプチドが人ラクトフェリンの対応断片に類似する三次元構造を取り得るようにすると共に、これはラクトフェリンリセプタに対するペプチドの一層良好な結合を達成することができる。
【００５７】
上記ペプチドの他に、たとえばラクタム架橋または他の化学的拘束のような構造的拘束の導入に基づき人ラクトフェリンにおける対応セグメントの三次元構造に類似するものを含め、機能上均等なホモログもしくはアナログを使用することも可能である。
【００５８】
本発明によるペプチドは感染、炎症および／または腫瘍の処置および／または予防に適している。ここで用いる用語「処置」とは病気状態、病気進行または他の異常状態の悪作用を治癒、逆転、弱化、軽減、最小化、抑制もしくは停止させることを意味し、ここで用いる用語「予防」とは病気状態もしくは進行または他の異常状態もしくは悪性状態を発展する危険性を最小化、減少または抑制することを意味する。本発明によるペプチドもしくは薬用製品により処置しうる感染は全ゆる種類の病原体（たとえば細菌、ウィルス、真菌類など）により引き起こされる感染を包含する。
【００５９】
本発明によるペプチドもしくは薬用製品により処置しうる感染は全ゆる種類の病原体（たとえば細菌、ウィルス、真菌類など）により引き起こされる感染を包含する。
【００６０】
種々異なる種類の炎症を処置することも可能である。炎症は、特に組織および器官の異常な「赤色化」および腫れ、感染領域における疼痛および発熱、毛細管拡張、白血球浸潤などを特徴とする複合現象である。炎症は主として細菌や他の有毒剤および物理的外傷に露出して生ずる。炎症は多くの形態を有し、各種の異なるサイトキンおよび他の化学シグナルにより媒介される。炎症のこれら媒介物は腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）および各種のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）を包含する。
【００６１】
上記したように、本発明によるペプチドは腫瘍の処置にも適している。
【００６２】
本発明によるペプチドは、これらを薬用製品または医薬製剤に含ませて使用することができる。本発明による薬用製品もしくは医薬製剤は、医薬製剤の製造または製剤の投与を容易化させるべく使用される物質をも含むことができる。この種の物質は当業者に周知されており、たとえば医薬上許容しうるアジュバント、キャリヤおよび保存料とすることができる。
【００６３】
本発明によるペプチドまたは薬用製品は患者に全身的また局部的に投与することができる。ここで用いる用語「患者」とは病気状態、病気進行または他の異常もしくは悪性状態の危険性を有する或いはそれに罹患した人間を意味する。
【００６４】
全身的投与がたとえば尿路感染、結腸炎および腫瘍の処置に適している。全身的投与は経口、鼻腔内、静脈内、動脈内、空腔内、筋肉内、皮下、経皮、座薬（経腸を含む）、または当業者に知られた他のルートにより行うことができる。経口投与が好適である。
【００６５】
局部投与は、たとえば皮膚感染、粘膜における全ての感染および炎症などを処置するのに適している。局部投与は局所、経口、鼻腔内、膣内または口腔頭ルートにより行うことができる。皮膚もしくは粘膜における局部感染もしくは炎症を処置するには、本発明によるペプチドまたは薬用製品をたとえばゲル、クリーム、軟膏またはペーストに含ませることができる。
【００６６】
本発明による方法においては、本発明による有効量のペプチドを患者に投与する。ここで用いる用語「有効量」とは病気状態、病気進行または他の異常もしくは悪化状態を処置もしくは予防するのに充分な量を意味する。
【００６７】
本発明によるペプチドもしくは薬用製品および方法は尿路感染および結腸炎の処置および／または予防に特に適しているが、幾種かの他の炎症および感染病も本発明により処置することができ、たとえば炎症性腸病、リューマチ性関節炎、ウィルスＨＩＶ−により引き起こされる症状、ウィルスＣＭＶにより引き起こされる症状、並びに真菌、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイおよびクリプトコッカス・ネオホルマンスにより引き起こされる症状がある。このリストは決して本発明の範囲を限定するものでない。
【００６８】
本発明によるペプチド、薬用製品および方法は、尿路感染または他の炎症病もしくは感染病の危険性を、この種の合併症をもたらす危険性増大を持った患者にて減少させることにより、予防薬用処置にも適している。
【００６９】
本発明によるペプチド、薬用製品および方法は単独でまたは互いに組み合わせて或いは慣用の療法と組み合わせて用いることができる。
【００７０】
本発明によれば、ペプチドを有効量にて病気体質、低出産体重もしくは薬用処置に基づくこの種の症状の危険性増大を持った患者にて感染および／または炎症を減少させることを意図した全ゆる種類の食品もしくは飲料に含ませることもできる。たとえば、ペプチドを有効量にてたとえば幼児で細菌、ウィルスもしくは真菌類により誘発される炎症により引き起こされる体重ロスのような細菌の有害作用を抑制することを意図した幼児配合食品に含ませることができる。本発明によるペプチドを食料品にて使用する場合（たとえば栄養目的につき使用する場合）は、天然源のペプチドを使用するのが特に好適である。
【００７１】
本発明によるペプチドは抗微生物作用を有するので、これらは種々異なる食料品およびたとえばゲル、クリーム、軟膏、ペースト、溶液、乳液などの薬用製品にも保存料として使用することができる。
【００７２】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。これら実施例は単に本発明を例示する目的であり、決して本発明の範囲を限定すると考えてはならない。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明による２種のペプチド（ペプチド３およびペプチド４）、人ラクトフェリン（ｈＬＦ）および水によりそれぞれ処理された尿路感染を有するマウスにおける腎臓に存在する細菌の個数（ＣＦＵ）を示す。
【図２】線状もしくは環式型におけるペプチド３、線状および環式型におけるペプチド４、および線状もしくは環式型における基準ペプチドと比較したペプチド７の、異なるｐＨにてＣ．アルビカンスの９９％を死滅させるのに要する濃度を示す。
【図３】本発明による２種のペプチド（ペプチド３およびペプチド４）、人ラクトフェリン（ｈＬＦ）および水（比較）により、それぞれＣ．アルビカンスの胃内投与の後に、経口処理したマウスにおける胃内に存在するＣ．アルビカンスの個数（ＣＦＵ）を示す。
【図４】ペプチド３およびペプチド４、並びにｈＬＦにより実験的結腸炎を有するマウスを経口処理した、水（比較）での処理と比較する結果を示し、図４Ａは糞における潜血の発生を示し、図４Ｂは血清におけるＩＬ−１βの量を示し、図４Ｃは肛門出血の発生を示し、図４Ｄは結腸長さを示す。
【図５】図５Ａは図４により処理されたマウスからの遠隔結腸の組織セクションにおけるＣＤ８陽性細胞の個数を示し、図５Ｂは図４により処理したマウスからの遠隔結腸の組織セクションにおけるＭＨＣクラスＩＩの発現を示す。
【実施例】
【００７４】
以下の実施例において、ペプチド２はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２を有する本発明によるペプチドを示し、ペプチド３はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３を有する本発明によるペプチドを示し、以下同様である。
【００７５】
モリナガ１０、モリナガ１１、モリナガ１２、モリナガ１３、モリナガ２４およびモリナガ２５はＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号に記載されたペプチドを示し、モリナガ１０はＦ−Ｑ−Ｗ−Ｑ−Ｒ−Ｎ（ＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号における配列Ｎｏ．１０）であり、モリナガ１１はＦ−Ｑ−Ｗ−Ｑ−Ｒ（ＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号における配列Ｎｏ．１１）であり、モリナガ１２はＱ−Ｗ−Ｑ−Ｒ（ＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号における配列Ｎｏ．１２）であり、モリナガ１３はＷ−Ｑ−Ｒ（ＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号における配列Ｎｏ．１３）であり、モリナガ２４は配列Ｋ−Ｃ−Ｆ−Ｑ−Ｗ−Ｑ−Ｒ−Ｎ−Ｍ−Ｒ−Ｋ−Ｖ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｓ−Ｃ−Ｉ（ＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号における配列Ｎｏ．２４）を有する環式ペプチドであり、モリナガ２５はＫ−Ｃ−Ｆ−Ｑ−Ｗ−Ｑ−Ｒ−Ｎ−Ｍ−Ｒ−Ｋ−Ｖ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｓ−Ｃ−Ｉ（ＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号における配列Ｎｏ．２５）である。
【００７６】
ｈＬＦは人ラクトフェリンを示す。
【００７７】
各実施例において、最小殺微生物濃度（ＭＭＣ）および最小抑制濃度（ＭＩＣ）は、各実施例にて特記しない限り次のように決定した。細菌もしくは真菌ストレインを３７℃にて１晩にわたりＢＨＩ培地にて培養した。培地の所定容量をＢＨＩを有する新たなチューブに移し、さらに２時間にわたり培養した。その後、細胞を遠心分離すると共に、１／１００希釈されたＢＨＩ培地（１％ＢＨＩ）に懸濁させた。細菌もしくは真菌細胞の濃度を６５０ｎｍにて分光測定法により決定した。微生物濃度も生存カウント数により決定した。２段階または１０段階により１％ＢＨＩにてシリーズ希釈されたペプチドを３反復にて微小滴定プレート（１ウェル当たり２００μｌ）のウェルに添加した。細菌もしくは真菌細胞溶液を１０μｌ容積で添加して、ウェル中１ｍｌ当たり約１〜５ｘ１０５細胞の最終濃度を得た。微小プレートを２時間にわたり湿潤室内で３７℃にて培養した。その後、５μｌを各ウェルから採取し、血液寒天プレートへの点滴として添加し、３７℃にて１晩にわたり培養した。微小プレートを３７℃にてさらに２０時間にわたり培養し、その後にマイクロプレートリーダー（Ｅｍａｘ、モレキュラデバイス社、ＵＳＡ）にて６５０ｎｍで分光測定により分析した。２時間の培養後に接種物の９９％減少をもたらすペプチドの濃度をＭＭＣ９９％として規定した。ＭＩＣ値は、２０時間の培養後にバックグランドレベルよりも高い吸光値における増加を示さない濃度として規定した。
【００７８】
（実施例１）
この実施例は、本発明によるペプチド２、ペプチド３、ペプチド４およびペプチド５、並びに以下の実施例で使用したモリナガ２４およびモリナガ２５の各ペプチドの固相合成を示す。
【００７９】
合成は、バイオサーチ・パイオニア自動化ペプチド合成装置にてＦｍｏｃ連続流動手段により行った。各ペプチドは、樹脂ＰＡＣ−ＰＥＧ−ＰＳ（ペプチド酸につき０．２１ミリモル／ｇ）にて０．１〜０．２ミリモル尺度で合成すると共にＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（ペプチドアミドにつき０．２０ミリモル／ｇ）の尺度で合成した。
【００８０】
本発明によるペプチドの側鎖はピペリジン−安定性ｔ−ブチル（セリンおよびスレオニンにつき）、ｔ−ブチルエステル（グルタミン酸につき）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（リジンおよびトリプトファンにつき）、トリフェニルメチル（アスパラギン、システイン、グルタミンおよびヒスチジンにつき）、アセタミドメチル（システインにつき）および２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（アルギニンにつき）の各基により保護した。
【００８１】
モリナガ２４およびモリナガ２５の各ペプチドにつき、ＰＡＣ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂へのイソロイシンの付着をイソロイシン対称無水物を用いて行った。樹脂（１ｇ、０．２１ミリモル）を３ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で膨潤させた。Ｆｍｏｃ−１（１０当量、２．１ミリモル）を５ｍｌのジクロルメタン（ＤＭＣ）および５滴のＤＭＦに溶解させた。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）（５当量、１．０５ミリモル）をアミノ酸溶液に添加し、その後にこれを０℃にて２０分間静置させた。ＤＣＭを減圧下に除去すると共に残留油をＤＭＦに溶解させて樹脂に添加した。ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１当量）を樹脂に添加し、スラリーを室温にて時々回動させながら１時間にわたり静置させた。ＤＣＭで洗浄した後、樹脂はペプチド合成の準備が整った。
【００８２】
α−アミノ保護基（Ｆｍｏｃ）の除去をＤＭＦにおける２０％ピペリジンにより７分間行った。全てのカップリングをＤＭＦ中で行い、ペプチドより４倍過剰の活性化アミノ酸および４当量のベンゾトリアゾリル  テトラメチルブロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＢＴＵ）：ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１：２、モル／モル）を使用した。６倍過剰のヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をシステイン残基（アセタミドメチルおよびトリフェニルメチル）のカップリング物に添加した。
【００８３】
ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４およびペプチド５を、ＤＭＦにおける無水酢酸の０．３Ｍ溶液を用いてアミノ末端にてアシル化した。
【００８４】
樹脂からのペプチドの最終的な保護解除および開裂を、９．２５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と２５０μｌの水と２５０μｌのエタンジチオールと２５０μｌのトリイソプロピルシランとの混合物をペプチド樹脂１ｇ当たりに用いて室温で２時間にわたり行った。この樹脂を濾過により除去した。ペプチドを低温ジエチルエタノールを用いて沈殿させ、遠心分離し、次いで新たなジエチルエーテルにさらに２回にわたり再懸濁させてスカベンジャーおよびＴＦＡを抽出した。各ペプチドを水に溶解させると共に凍結乾燥させた。
【００８５】
ジスルフィド結合したペプチド（ペプチド３およびペプチド５）の環化を未精製材料にて行った。約２００ｍｇのペプチドを１リットルの脱ガス水に溶解させた。炭酸水素アンモニウムをｐＨが６〜７の範囲になるまで添加し、混合物を撹拌および空気接触させながら約１日間にわたり放置し、最終的に凍結乾燥させた。
【００８６】
各ペプチドはイソプロパノール（１２〜１６％ＩＰＡ）と０．１％ＴＦＡとのイソクラチック混合物で溶出させる逆相高圧液体クロマトグラフィーにより精製した。一方がマイクロソルブ、Ｃ−８４１．４ｘ２５０ｍｍ、８μｍ（カラムＡ）であり、他方はハイクロムＣ−８、２５ｘ２５０ｍｍ、７μｍ（カラムＢ）である２種の異なるカラムを使用した。各ペプチドは、表１に示す保持時間（Ｒ）でブロードピークとして溶出した。同定はＥＳ−ＭＳにより行った。表におけるＭＷは分子量を示す。
【００８７】
（実施例２）
この実施例は本発明によるペプチド６およびペプチド７の固相合成を示す。
【００８８】
合成は実施例１に記載したように行ったが、ただし合成手順の次の改変を加えた。位置５におけるアミノ酸Ｋおよび位置９におけるＤを形成するラクタムの側鎖を１（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）および４−｛Ｎ−［１（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキシリデン）−３−メチルブチル］−アミノ｝ベンジルエステル（ＯＤｍａｂ）によりそれぞれ保護した。
【００８９】
キャップド配列の合成を完了した後、Ｄｄｅ基およびＯＤｍａｂ基を１０分間にわたりＤＭＦにおける２％ヒドラジン（ｖ／ｖ）により除去した。樹脂をＤＭＦ、ＤＭＦにおける１Ｍ  ＤＩＰＥＡおよび最終的にＤＭＦにより洗浄した。
【００９０】
ペプチド７の場合、各側鎖間のラクタム形成を、４倍過剰のアザベンゾトリアゾリル  テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）：ＤＩＥＰＥＡ、１：２のＤＭＦにおける添加の後に、８時間にわたり進行させた。樹脂を次の溶剤／溶液で洗浄した：ＤＭＦ、ＤＭＦにおける２０％ピペリジン、メタノールおよびＤＣＭ。樹脂を減圧下に乾燥させ、ペプチドを上記と同様に樹脂から開裂させた。
【００９１】
ペプチド７は下表１に示す保持時間（Ｒ）でブロードピークとして溶出した。
【００９２】
【表１】
2010090162.tif 000003
【００９３】
（実施例３）
この実施例においては、本発明による各ペプチドの殺細菌活性を試験し、人ラクトフェリンの殺細菌活性と比較した。
【００９４】
人ラクトフェリン（ｈＬＦ）、ペプチド３およびペプチド４をそれぞれイー・コリ、すなわちイー・コリ  Ｏ１４（実験Ｉ）およびＯ６Ｋ５（実験ＩＩ）の２種の異なる菌株と共に希釈増殖培地（１／１００  ＢＨＩ−脳心臓インフュージョン）にて２時間にわたり培養した。各ペプチドをさらに０．０５ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ７）にてイー・コリ  Ｏ１４と共に増殖培地なしに培養した（実験ＩＩＩ）。種々異なる濃度のペプチドを試験した。
【００９５】
培養の後、各試料を細菌塗沫につき採取した。５回および４回工程の一連の希釈物をそれぞれ実験ＩおよびＩＩにそれぞれ使用し、２回工程を実験ＩＩＩにて使用した。
【００９６】
細菌の１００％（実験ＩおよびＩＩ）または９０％（実験ＩＩＩ）を死滅させるのに要する異なるペプチドの濃度を表２に示す。
【００９７】
【表２】
2010090162.tif 000004
【００９８】
表２から明らかなように、本発明によるペプチドは人ラクトフェリンよりもずっと殺細菌剤として効率的であった。
【００９９】
（実施例４）
この実施例においては、本発明による各ペプチドの殺真菌活性を試験し、人ラクトフェリンの殺真菌活性と比較した。種々異なる濃度のｈＬＦ、ペプチド３およびペプチド４を異なる菌株のキャンジダ・アルビカンスおよびキャンジダ・クルセイと共にｐＨ７．０の０．０５ｍＭ  ＫＣｌにて３７℃で１〜２時間にわたり２つの異なる場合（実験ＩおよびＩＩ）にてそれぞれ培養した。培養の後、各試料をサボラウドプレートへの塗沫につき採取した。真菌類の９９％を死滅させるのに要する異なるペプチドの濃度を表３に示す。
【０１００】
【表３】
2010090162.tif 000005
【０１０１】
表３における結果は、本発明による各ペプチドが人ラクトフェリンよりもずっと効率的な殺真菌剤であったことを示す。
【０１０２】
（実施例５）
この実施例においては、インビトロ試験を行って本発明による各ペプチドの抗炎症活性を検討した。より正確には、単核細胞ライン（ＴＨＰ−１）におけるＬＰＳ−誘発ＩＬ−６応答に対する本発明の各ペプチドの抑制効果を検討すると共に、Ｉ．マッツビー−バルツァー等、ペディアトリックス・リサーチ、第４０巻、第２５７〜２６２頁（１９９６）により記載された方法を用いて人ラクトフェリンの効果と比較した。ＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−６応答はＬＰＳの添加により誘発させた。それぞれｈＬＦ、ペプチド３およびペプチド４はＬＰＳの３０分間後に添加した。下表４に示すようにペプチド４により顕著な抑制が得られた。ペプチド３の抑制活性は人ラクトフェリンの抑制活性と同様であった。
【０１０３】
【表４】
2010090162.tif 000006
【０１０４】
（実施例６）
本発明によるペプチド３およびペプチド４をインビボでも試験し、尿路感染に対するその作用を示した。
【０１０５】
イー・コリ  Ｏ６Ｋ５をマウスの膀胱中へ注入した。注入の３０分間後、表５に特定した種々異なる薬剤をマウス１匹当たり５００μｇの量にて経口投与し、注入の２４時間後に膀胱および腎臓に存在する細菌の個数（ＣＦＵ）を測定した。結果を表５に示す。
【０１０６】
比較群は実験Ｉにて１０匹の動物で構成し、実験ＩＩでは２３匹の動物で構成した。比較群における各動物には、ペプチドもしくはｈＬＦの代わりに水道水を与えた。
【０１０７】
【表５】
2010090162.tif 000007
【０１０８】
実験ＩＩからの結果を図１にも示す。
【０１０９】
すなわち、本発明による各ペプチドは腎臓における細菌数を減少させることができる。
【０１１０】
（実施例７）
この実施例においては、本発明による各ペプチドの殺細菌および殺真菌活性をＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号に記載された各ペプチドと比較すべくインビトロ試験を行った。使用した本発明によるペプチドはペプチド４とし、ＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号による各ペプチドはモリナガ１０、モリナガ１１、モリナガ１２およびモリナガ１３とした。
【０１１１】
各ペプチドをイー・コリ  Ｏ１４およびカンジダ・アルビカンスと共に培養した。Ｃ．アルビカンス酵母細胞の濃度を試験し、１ｍｌ当たり５・１０６および５・１０３であった。種々異なる濃度のペプチドを試験した。
【０１１２】
培養の後、各試料を細菌塗沫につき採取した。１０倍工程のシリーズ希釈を表５におけるＩで標識した実験に使用し、各実験における２倍工程のシリーズ希釈物はＩＩで標識した。
【０１１３】
細菌の１００％を死滅させるのに要する種々異なる薬剤の濃度を表６に示す。
【０１１４】
【表６】
2010090162.tif 000008
【０１１５】
表６から明らかなように、本発明によるペプチドはＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号に記載された短いペプチドおよび人ラクトフェリンよりもずっと効率的な殺細菌剤である。
【０１１６】
（実施例８）
本発明によるペプチド２、ペプチド３、ペプチド４およびペプチド７の殺真菌活性および抑制活性を、本発明によるペプチドに最も類似するＥＰ−Ａ−０  ６２９  ３４７号に記載されたペプチド、すなわちモリナガ２１およびモリナガ１５と比較した。
【０１１７】
キャンジダ・カルビカンスＡＴＣＣ  ６４５４９（１・１０５／ｍｌ）をペプチドの存在下に２時間にわたり３７℃にて希釈増殖培地（ＢＨＩ、５０μｇ／ｍｌから出発する２倍シリーズ希釈）で培養した。殺真菌活性は、各培養ウェルからの５μｌをサボラウド寒天プレートで培養することにより測定した。細菌の１００％を死滅させるのに要する異なる薬剤の濃度を表７に示す。
【０１１８】
増殖の抑制を２０時間の培養後に分光測定した。増殖抑制につき必要とされる薬剤の濃度を表７に示す。
【０１１９】
【表７】
2010090162.tif 000009
【０１２０】
この実施例は、本発明によるペプチドにペプチド３およびペプチド４が線状ペプチドであるモリナガ２４よりも殺真菌および抑制活性に関し一層効率的であると共に、本発明によるペプチド７が真菌類の増殖に関しずっと良好な殺真菌剤および抑制剤であることを示す。
【０１２１】
（実施例９）
さらに本発明によるペプチド２、ペプチド３、ペプチド４およびペプチド７の殺細菌活性および抑制活性をモリナガ２４およびモリナガ２５の活性と比較した。
【０１２２】
イー・コリ  Ｏ１４を上記したと同様に各ペプチドの存在下に２時間にわたり培養した。殺細菌活性は上記と同様に測定した。細菌の１００％を死滅させるのに要する種々異なる薬剤の濃度を表８に示す。
【０１２３】
増殖の抑制は２０時間にわたる培養の後に分光測定した。増殖の抑制につき必要とされる薬剤の濃度を表８に示す。
【０１２４】
【表８】
2010090162.tif 000010
【０１２５】
この実施例は、本発明によるペプチド２、ペプチド３およびペプチド４がモリナガ２４およびモリナガ２５とほぼ同じである殺細菌および抑制作用を有するが、ペプチド７は細菌の増殖抑制に関しずっと効率的であることを示す。
【０１２６】
（実施例１０）
この実施例においては本発明による各ペプチドの殺微生物および制細菌活性を試験し、２種の比較ペプチドと比較した。
【０１２７】
それぞれＣ．アルビカンス（ＡＴＣＣ６４５４９）およびイー・コリ  Ｏ６を種々異なるペプチドと共に培養した。各実験は１、１０、２５および１００μｇ／ｍｌのペプチドを用いて行った。結果を表９に示す。
【０１２８】
【表９】
2010090162.tif 000011
【０１２９】
表から明らかなように、本発明による各ペプチドは極めて良好な殺微生物活性および制微生物活性を有し、ただし最も短いペプチドであるペプチド４０および最も長いペプチドであるペプチド３３は他のペプチドと同様な良好な結果を与えない。
【０１３０】
（実施例１１）
この実施例においては、Ｃ．アルビカンスの死滅およびＣ．アルビカンスの増殖抑制に対する本発明による各ペプチドの活性を検討した。
【０１３１】
Ｃ．アルビカンス酵母細胞（ＡＴＣＣ  ６４５４９）を２時間にわたりｐＨ４．５にて、２５μｇ／ｍｌのペプチドを含有する初期濃度の１％まで希釈されたＢＨＩ培地にて培養した。その後、真菌溶液を血液寒天プレートで培養した。ＯＤ６５０を、さらに１８時間にわたる培養の後に測定した。
【０１３２】
Ｃ．アルビカンスに対する各ペプチドの殺真菌効果をそれぞれ真菌の１００％および９９％を死滅させるペプチドの能力として決定しする一方、増殖抑制効果はＯＤ６５０を測定して決定した。ＯＤ６５０における増加が記録されない場合、抑制作用が存在した。その結果を表１０に示す。
【０１３３】
【表１０】
2010090162.tif 000012
【０１３４】
表から明らかなように、本発明によるペプチド、特にペプチド４６、４８、５０、５１および５７はＣ．アルビカンスの死滅および増殖抑制に対し比較ペプチドよりも良好な効果を有する。
【０１３５】
（実施例１２）
この実施例においては、本発明による各ペプチドを用いて種々異なる細菌の死滅に対する効果を検討した。使用した異なる細菌を表１１に示す。
【０１３６】
各ペプチドは２５μｇ／ｍｌの濃度にて使用した。
【０１３７】
結果を表１１に示す。
【０１３８】
【表１１】
2010090162.tif 000013
【０１３９】
表から明らかなように、本発明によるペプチド、特にペプチド４６〜６２は細菌の死滅に対し極めて良好な効果を有するが、最も短いペプチドであるペプチド４０および最も長いペプチドであるペプチド３３は他のペプチドと同様に良好な結果を与えない。
【０１４０】
（実施例１３）
この実施例においては、異なるｐＨにてＣ．アルビカンスの９９％を死滅させるための本発明による３種のペプチドにつき必要とされる濃度を比較ペプチドと対比した。本発明によるペプチドはペプチド２（線状）、ペプチド３（環式）、ペプチド４（線状）、ペプチド５（環式）およびペプチド７（ラクタム架橋）とし、全てをキャップした。使用した比較ペプチドはモリナガペプチド、すなわちモリナガ２４および２５の非キャップド環式型および非キャップド線状型とした。その結果を図２に示す。図から明らかなように、キャップド線状ペプチド３および４，並びにラクタム架橋含有ペプチド７は本発明によるキャップド環式ペプチドよりも良好な効果を有し、さらに本発明による全てのキャップド線状ペプチドはペプチド７の他に線状および環式非キャップド比較ペプチド（モリナガ２４および２５）よりもｐＨ４．５にて良好な効果を有する。全ての異なるｐＨにて最も効果的なペプチドはペプチド７であった。
【０１４１】
（実施例１４）
この実施例においては、胃内のＣ．アルビカンス集落化の防止を、マウスに経口的に人ラクトフェリン（ｈＦＬ）、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３を有するペプチドおよびＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を有するペプチドを投与することにより検討した。Ｃ．アルビカンスの１０８の投入量をマウスに胃内投入した。３日間の後、ｈＬＦもしくはペプチドを３日間にわたり１日２回ずつ（全部で１日当たり１ｍｇ）投与し、４日目にマウスを殺した。胃におけるＣ．アルビカンスの個数をコロニー形成単位（１ｍｌ当たりのＣＦＵ）の培養および計数により測定した。結果を図３に示す。これら結果から明らかなように、各ペプチドは胃内のＣ．アルビカンスの増殖を効果的に減少させる。
【０１４２】
（実施例１５）
この実施例においては、マウスにおける実験的結腸炎に対する本発明による各ペプチドの抗炎症作用を検討した。急性結腸炎を、飲料水（アドリブ）を介しデキストランサルフェート（５％）を与えることにより、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスにて誘発させた。ペプチド３およびペプチド４，並びに人ラクトフェリン（ｈＬＦ）をマウスにデキストランサルフェート処理の開始時点で経口投与した。各動物を２日目に殺した。
【０１４３】
本発明による各ペプチドで処理されたマウスの糞における血液は、処理の２日後に水処理比較群と対比して、より少ない動物にて生じたことが判明した（図４Ａに示す）。
【０１４４】
本発明による各ペプチドが抗炎症性であるという事実の他の示唆は、本発明により処理されたマウスからの血清に存在する炎症性サイトキンＩＬ−１βの減少濃度（これを図４Ｂに示す）および肛門出血の発生減少である（図４Ｃに示す）。
【０１４５】
結腸における炎症の他の測定は結腸長さであり、短くなった結腸は炎症の誘発である。図４Ｄに示されるように、本発明により処理されたマウスの結腸は比較群におけるマウスの結腸よりも長かったことが判明した。
【０１４６】
その後、マウスからの遠位結腸の組織セクションにおけるＣＤ８−およびＭＨＣクラスＩＩ−陽性細胞の個数を検討し、その結果を図５に示す。図５Ａから明らかなように、本発明の各ペプチドで処理されたマウスからの遠位結腸の組織セクションにおけるＣＤ８−陽性Ｔ−細胞の個数は水処理された比較群の場合よりも顕著に低い。
【０１４７】
図５Ｂから明らかなように、本発明による各ペプチドで処理されたマウスからの遠位結腸の組織セクションにおけるＭＨＣクラスＩＩを発現する細胞（マクロファージ、デントリチックス細胞およびＢ細胞）の発生は未処理比較群の場合よりも高く、急性結腸炎を持たない健康動物のそれと同様であった。これら結果は、本発明による各ペプチドで処理されたマウスがその局部的細胞反応を減少もしくは遅延させることを示す。
【０１４８】
従って本発明による各ペプチドは、炎症自身および臨床的徴候を減少させるのに効果的である。
【０１４９】
（実施例１６）
この実施例においては、本発明による各ペプチドの１種、すなわちＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７を有するペプチドの殺真菌活性を慣用の抗真菌剤フルシトシンおよびフルコナゾール並びに人ラクトフェリン（ｈＬＦ）と比較した。抗真菌剤は２ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度にてＣ．アルビカンス（ＡＴＣＣ  ６４５４９）につき試験した。各試験は１／１００希釈されたＢＨＩ培地で行った。結果を表１２に示す。
【０１５０】
【表１２】
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【０１５１】
表１２における結果から明らかなように、本発明によるペプチドは他の物質よりも明らかに効果的である。
【０１５２】
（実施例１７）
この実施例においても、本発明による各ペプチドの１種（今回はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４を有するペプチド）を慣用の殺真菌剤アンフォテリシンと比較した。Ｃ．アルビカンスに対する抗真菌活性を検討した。２０μｇ／ｍｌの出発濃度にて２倍シリーズ希釈物を使用した。１／１００希釈されたＢＨＩを増殖培地として使用した。
【０１５３】
【表１３】
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【０１５４】
表１３から明らかなように、本発明によるペプチドの活性は慣用の殺真菌剤に匹敵する。
【０１５５】
（実施例１８）
この実施例においては、本発明による各ペプチドの２種の殺細菌活性を多耐性Ｓ．アウレウスでの試験にて検討した。１ｍｌ当たり５．０ｘ１０５  Ｓ．アウレウス細菌の濃度を有する細菌溶液を使用した。細菌の９９％を死滅させるのに要する各ペプチドの濃度（ＭＭＣ９９％）を３７℃における培養の２時間後および２４時間後に測定した。結果を下表１４に示す。
【０１５６】
【表１４】
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【０１５７】
（実施例１９）
この実施例においては、本発明による各ペプチドの３種の殺細菌活性をＳ．アウレウスの比較菌株での試験にて検討した。１ｍｌ当たり５．０ｘ１０５  Ｓ．アウレウス細菌の濃度を有する細菌溶液を使用した。細菌の９９％を死滅されるのに要する各ペプチドの濃度（ＭＭＣ９９％）を３７℃における培養の２時間後に測定した。試験した最小濃度は６．２５μｇ／ｍｌであった。その結果を下表１５に示す。
【０１５８】
【表１５】
2010090162.tif 000017
【０１５９】
（実施例２０）
この実施例においては、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４６を有するペプチド、すなわちＣ−Ｆ−Ｑ−Ｗ−Ｑ−Ｒ−Ｎ−Ｍ−Ｒ−Ｋ−Ｖ−Ｒの、いわゆるアラニンスキャンを行った。このアラニンスキャンにおいて、各アミノ酸を次いでアラニンで置換して下表１６に示すペプチドを得た。
【０１６０】
【表１６】
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【０１６１】
（実施例２１）
この実施例における各実験のそれぞれにおいて、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４６を有するペプチドにおける位置４、６、８および９のアミノ酸の１種を同様なアミノ酸により置換した。実験１において位置４おけるトリプトファンはロイシンにより置換し、実験２において位置６におけるアルギニンはリジンにより置換し、実験３において位置８におけるメチオニンはロイシンにより置換し、実験４においては位置９におけるアルギニンはリジンにより置換した。得られたペプチドを表１７に示す。
【０１６２】
【表１７】
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【０１６３】
（実施例２２）
この実施例における各実験において、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４６を有するペプチドにおける位置５、６および７のアミノ酸の１種を陰帯電アミノ酸により置換した。実験１においては位置５におけるグルタミンをグルタミン酸により置換し、実験２においては位置６におけるアルギニンをグルタミン酸により置換し、実験３においては位置７におけるアスパラギンをグルタミン酸により置換した。得られたペプチドを表１８に示す。
【０１６４】
【表１８】
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【０１６５】
（実施例２３）
この実施例における各実験においては、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４６を有するペプチドにおける中性アミノ酸を陽帯電アミノ酸または中性アミノ酸のいずれかで置換した。実験１においては位置５におけるグルタミンをオルニチンにより置換し、実験２においては位置５おけるグルタミンをノルロインにより置換し、実験３においては位置７におけるアスパラギンをオルニチンにより置換し、実験４においては位置７におけるアスパラギンをノルロイシンにより置換した。得られたペプチドを表１９に示す。
【０１６６】
【表１９】
2010090162.tif 000021
【０１６７】
（実施例２４）
この実施例の各実験においては、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４６を有するペプチドにおける１種もしくは数種のアミノ酸を他のアミノ酸により置換した。実験１においては位置５におけるグルタミンをリジンにより置換し、実験２においては位置５におけるグルタミンをリジンにより置換すると共に位置７におけるアルギニンをアラニンにより置換し、実験３においては位置３におけるグルタミンをアラニンで置換すると共に位置５におけるグルタミンをリジンにより置換し、実験４においては位置３におけるグルタミンおよび位置７におけるアスパラギンをアラニンにより置換し、実験５においては位置４におけるトリプトファンをロイシンにより置換すると共に位置６および位置９におけるアルギニンをリジンにより置換し、実験６においては位置３におけるグルタミンおよび位置７におけるアスパラギンをアラニンにより置換し、位置４におけるトリプトファンをロイシンにより置換し、さらに位置５におけるグルタミン、並びに位置６および９におけるアルギニンをリジンにより置換した。得られたペプチドを表２０に示す。
【０１６８】
【表２０】
2010090162.tif 000022
【０１６９】
（実施例２５）
この実施例においては、実施例１８〜２１にて得られた種々異なるペプチドの殺真菌効果および殺細菌効果を検討した。それぞれＣ．アルビカンス、イー・コリおよびＳ．アウレウスを、約６．７〜６．９のｐＨを有する１／１００希釈されたＢＨＩ培地で培養した。微生物の９９％を死滅させるのに要する各ペプチドの濃度（ＭＭＣ９９％）を測定した。結果を下表２１に示す。
【０１７０】
【表２１】
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【０１７１】
（実施例２６）
この実施例においては、実施例２２にて得られた種々異なるペプチドの殺真菌効果および殺細菌効果を検討した。それぞれＣ．アルビカンス、イーコリおよびＳ．アウレウスを、約６．７〜６．９のｐＨを有する１／１００希釈されたＢＨＩ培地で培養した。微生物の９９％を死滅させるのに要する各ペプチドの濃度（ＭＭＣ９９％）を測定した。結果を下表２２に示す。
【０１７２】
【表２２】
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【０１７３】
（実施例２７）
この実施例においては、本発明による各ペプチドの３種の殺真菌活性を検討すると共に、３種の異なる真菌類に対し試験した。真菌類を１／１００希釈されたＢＨＩ培地にて培養した。真菌類の９９％を死滅させるのに要する各ペプチドの濃度（ＭＭＣ９９％）を決定した。結果を下表２３に示す。
【０１７４】
【表２３】
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【０１７５】
（実施例２８）
この実施例においては、本発明による各ペプチドの８種の殺微生物活性を検討すると共に、イー・コリ  Ｏ６Ｋ５およびＣ．アルビカンスに対し試験した。
【０１７６】
この実施例においては、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５５を有するペプチドを使用し、これは上記したものでない。このペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７を有するペプチドの改変物であり、位置９におけるＡｓｐがＧｌｕで置換されたものである。
【０１７７】
微生物の９９％を死滅させるのに要する各ペプチドの濃度（ＭＭＣ９９％）を測定した。結果を下表２４に示す。
【０１７８】
【表２４】
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【０１７９】
表２１〜２４の結果の結論は、ペプチド配列を幾つかの位置にて改変させることができ、それにより天然配列と比較して殺微生物活性を増大もしくは保持しうる点である。さらに、これら改変配列は各ペプチドを合成するためのコストを軽減させる。アミノ酸を一層良好または等しい結果を持って変化させうる位置は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９９にてＸａａで示した位置である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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