(57)【要約】      （修正有）【課題】C型肝炎ウイルス(HCV)は感染したヒトの中で旺盛に複製するが、培養細胞中でのこのウイルスの旺盛な増殖方法はまだ確立されていない。細胞培養系でHCVを感染および複製させる方法、培養系でHCV産生を阻害する化合物を決定する迅速かつ有効な方法の提供。【解決手段】HCVを効果的に再生産し得る細胞を含む組成物、細胞の組成物を作製する方法、細胞を培養する培地、細胞にHCVを感染させる方法、HCV感染をアッセイするする方法、および本組成物および方法を用いてHCVの産生に作用する化合物の能力を評価する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受胎後3ヶ月以上のヒト肝臓から遊離させた肝細胞および造血細胞を含む細胞混合物を含む組成物であって、該組成物は、さらにフィーダー細胞を含み、4×105細胞からなる細胞混合物に対してC型肝炎ウイルス(HCV)RNA898(「RNA898」は2001年3月27日にAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託、ATCC受託番号PTA-3237)を投与した72時間後に培地中に5000コピーを超えるHCVウイルスRNAを産生し得、そして、該細胞混合物は、
(a)受胎後3ヶ月以上のヒト肝臓をEGTAを含むバッファー中で切開し；
(b)切開した肝臓をコラゲナーゼを含むバッファー中でインキュベートして肝臓から細胞を分離し；
(c)分離した細胞から40ミクロン以上のものを除き；
(d)分離した細胞から赤血球細胞を除き；
(e)ステップ(d)の細胞を、カルシウム、遊離脂肪酸(FFA)、高密度リポタンパク質(HDL)、ニコチンアミド、微量元素、表皮成長因子(EGF)、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾン、ならびに所望によりグルカゴン、肝成長因子、エタノールアミンおよび甲状腺刺激ホルモン放出因子からなる群から選択されるいずれか1つの成分を含む血清フリー培地に再懸濁させ、さらに
(f)ステップ(e)の血清フリー培地で細胞を培養する、
ステップによって調製されるものである、組成物。
【請求項２】
4×105細胞からなる細胞混合物に対してRNA898を投与して72時間後に10,000コピーを超えるHCV RNAを産生し得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
4×105細胞からなる細胞混合物に対してRNA898を投与して72時間後に50,000コピーを超えるHCV RNAを産生し得る、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
(a)受胎後3ヶ月以上のヒト肝臓をEGTAを含むバッファー中で切開し；
(b)切開した肝臓をコラゲナーゼを含むバッファー中でインキュベートして肝臓から細胞を分離し；
(c)分離した細胞から40ミクロン以上のものを除き；
(d)分離した細胞から赤血球細胞を除き；
(e)ステップ(d)の細胞を、カルシウム、遊離脂肪酸(FFA)、高密度リポタンパク質(HDL)、ニコチンアミド、微量元素、表皮成長因子(EGF)、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾン、ならびに所望によりグルカゴン、肝成長因子、エタノールアミンおよび甲状腺刺激ホルモン放出因子からなる群から選択されるいずれか1つの成分を含む血清フリー培地に再懸濁させ、さらに
(f)ステップ(e)の血清フリー培地で細胞を培養する
ステップによって調製される細胞混合物を含み、さらにフィーダー細胞を含む、組成物。
【請求項５】
フィーダー細胞がSTO(Reid-99)細胞(「STO Reid-99」は2001年3月27日にAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託、ATCC受託番号PTA-3236)である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
フィーダー細胞がSTO(Reid-99)細胞(「STO Reid-99」は2001年3月27日にAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託、ATCC受託番号PTA-3236)を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
細胞混合物中の細胞が40ミクロンフィルターを通過可能である、請求項１または４に記載の組成物。
【請求項８】
細胞混合物がαフェトタンパク質を発現する細胞、アルブミンを発現する細胞、およびグリコホリンを発現する細胞を含むが、CD34タンパク質を発現する細胞は実質的に含まない、請求項１または４に記載の組成物。
【請求項９】
受胎後3ヶ月以上のヒト肝臓から遊離させた肝細胞、造血細胞を含む細胞混合物およびフィーダー細胞を含む組成物であって、αフェトタンパク質を発現する細胞、アルブミンを発現する細胞、およびグリコホリンを発現する細胞を含むが、CD34タンパク質を発現する細胞は実質的に含まない組成物。
【請求項１０】
組成物が、以下の成分：血清フリー培地、カルシウム、FFA、HDL、ニコチンアミド、微量元素、EGF、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む培地をさらに含み、その培地が、所望によりグルカゴン、肝成長因子、エタノールアミンおよび甲状腺刺激ホルモン放出因子からなる群から選択されるいずれか1つの成分を含む培地をさらに含む、請求項１、４または９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
培地が低密度リポタンパク質(LDL)を含まない、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
細胞外マトリックスをさらに含む、請求項１、４または９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
CD34タンパク質の存在が免疫蛍光または免疫ペルオキシダーゼ染色からなる群から選択される手法によって検出される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
HCVをさらに含む、請求項１、４または９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
HCVがRNA898(「RNA898」は2001年3月27日にAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託、ATCC受託番号PTA-3237)である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
細胞混合物を単離および培養する方法であって、
(a)受胎後3ヶ月以上のヒト肝臓をEGTAを含むバッファー中で切開し；
(b)切開した肝臓をコラゲナーゼを含むバッファー中でインキュベートして肝臓から細胞を分離し；
(c)分離した細胞から40ミクロン以上のものを除き；
(d)分離した細胞から赤血球細胞を除き；
(e)ステップ(d)の細胞を、カルシウム、FFA、HDL、ニコチンアミド、微量元素、EGF、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾンを含み、さらに所望によりグルカゴン、肝成長因子、エタノールアミンおよび甲状腺刺激ホルモン放出因子からなる群から選択されるいずれか1つの成分を含む血清フリー培地に再懸濁させ、さらに
(f)ステップ(e)の血清フリー培地で細胞を培養する
ステップを含む方法。
【請求項１７】
赤血球細胞が懸濁細胞を低速(50xg)で3〜4分間遠心分離して大きな細胞をペレットとし、ペレット細胞を洗浄し、遠心分離および洗浄ステップを繰り返すことによって除去される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
血清フリー培地が低密度リポタンパク質(LDL)を含まない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１、４または９のいずれか１項に記載の組成物または請求項１６または１８に記載の方法に従って調製された細胞混合物とHCVとを接触させるステップを含む、細胞にHCVを感染させる方法。
【請求項２０】
HCVを組成物に加え、その組成物中の細胞を洗浄する前に、そのHCVを加えた組成物を、24時間、37℃で0.52ml/cm2の量でインキュベートする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
a. 請求項１、４または９のいずれか１項に記載の組成物または請求項１６または１８に記載の細胞混合物をフィーダー細胞とともにインキュベートし；
b. 組成物中の細胞とHCVとを接触させ；
c. 組成物の細胞、またはその細胞を培養した培地、または細胞および培地の双方に会合しているHCV RNAの存在を測定する
ステップを含む、HCV感染のアッセイ方法。
【請求項２２】
フィーダー細胞がSTO(Reid-99)細胞(「STO Reid-99」は2001年3月27日にAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託、ATCC受託番号PTA-3236)である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
HCV RNAの量が(a)細胞またはその細胞を培養した培地と会合して存在するHCV RNAの量と(b)内部対照として用いた第二のウイルスに由来するRNAの量とを比較することで測定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
第二のウイルスRNAがウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)由来のものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
HCVの産生に作用する化合物の能力を評価する方法であって、
a. 請求項１、４または９のいずれか１項に記載の組成物または請求項１６または１８に記載の細胞混合物をフィーダー細胞とともにインキュベートし；
b. 組成物中の細胞とHCVとを接触させ；
c. 細胞をHCVと接触させる前または接触させた後に組成物中にその化合物を投じ；
d. 細胞、またはその細胞を培養した培地、または細胞および培地の双方と会合しているHCVを測定する
ステップを含む方法。
【請求項２６】
化合物がHCVの産生を阻害する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
複数の化合物がそれらのHCV産生阻害能に関して同時にスクリーニングされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ(d)の測定値を対照細胞、またはその対照細胞を培養した培地、または対照細胞および培地の双方と会合しているHCVの量と比較するさらなるステップを含む、請求項２５に記載の方法(なおこの対照細胞は、化合物を投じなかったか、または既知の不活性化合物を投じたこと以外はステップ(a)〜(d)を経たものである)。
【請求項２９】
フィーダー細胞がSTO(Reid-99)細胞(「STO Reid-99」は2001年3月27日にAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託、ATCC受託番号PTA-3236)である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
HCVの存在が細胞またはその細胞を培養した培地と会合しているHCV RNAの量を求めることによって測定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
HCV RNAの量が逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって測定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
HCV RNAの量が(a)細胞またはその細胞を培養した培地と会合しているHCV RNAの量と(b)内部対照として用いた第二のウイルスに由来するRNAの量とを比較することによって測定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第二のウイルスがウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
HCVがRNA898(「RNA898」は2001年3月27日にAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託、ATCC受託番号PTA-3237)である、請求項１９ないし３３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本願は2001年3月27日出願の米国仮出願第60/279,174号の利益を主張するものである。
C型肝炎ウイルス(HCV)は感染したヒトの中で旺盛に複製するが、培養細胞中でのこのウイルスの旺盛な増殖方法はまだ確立されていない。感染性血清を用いて培養ヒト肝細胞にin vivo感染させた場合には、転写物酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によってしか検出できないほどの少量のHCVしか複製しない。
【０００２】
培養細胞にHCVを感染させる試みは末梢血単球細胞、ヒトBおよびT細胞系統、ヒト肝細胞系統、およびヒト胎児および成人一次細胞に関して報告されている。しかし、これまでに報告されている結果は満足のいくものではない。多くの場合、ウイルス複製は非常に低く、感染した細胞集団から生じたHCVは存在するとしてもRT-PCRで検出できるに過ぎず、低コピー数のHCV RNAが見られるだけである。さらにウイルス産生は同じウイルスおよび細胞であっても同日でも、また種々の日数でも散発的であってウェルごとに再現性がない。さらにまた、ウイルス投与後、感染ピークが見られるまでに数日かかり、一ヶ月もかかる場合さえある(例えば、Iacovacci et al., Hepatology 26(5):1328-1337(1997))。これらの問題はHCVに罹患した患者の治療および／またはHCV感染に関する研究に有用な化合物の同定および迅速スクリーニングをくじくものである。
【０００３】
このように細胞培養系でHCVを感染および複製させる方法が必要とされている。また、培養系でHCV産生を阻害する化合物を決定する迅速かつ有効な方法の必要性もある。本願はHCVを効果的に再生産し得る細胞を含む組成物、細胞の組成物を作製する方法、細胞を培養する培地、細胞にHCVを感染させる方法、HCV感染をアッセイするする方法、および本発明の組成物および方法を用いてHCVの産生に作用する化合物の能力を評価する方法を提供することによりこれらの問題を克服するものである。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は高HCV産生培養細胞を含む組成物を作製する方法を提供する。本発明はHCVに効率的かつ効果的に感染し得る、受胎後3ヶ月以上のヒト肝臓由来細胞を含む細胞混合物を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって調製される細胞を含む組成物を提供する。ある実施形態では本発明の組成物はαフェトタンパク質を発現する細胞、アルブミンを発現する細胞、およびグリコホリンを発現する細胞を含むが、CD34タンパク質を発現する細胞は実質的に含まない細胞混合物を含む。本発明のもう1つの実施形態では、この細胞混合物中の細胞は約40ミクロンのフィルターを通過することができる。本発明のもう1つの実施形態では、組成物はフィーダー細胞と組み合わせて使用するか、またはさらにフィーダー細胞を含む。本発明のさらにもう1つの実施形態では、フィーダー細胞はSTO(Reid-99)細胞である。
【０００５】
本発明は細胞培養用組成物を提供する。本発明のある実施形態では、細胞培養用組成物はカルシウム、遊離脂肪酸(FFA)、高密度リポタンパク質(HDL)、ニコチンアミド、微量元素、表皮成長因子(EGF)、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む血清フリー培地を含む。本発明のもう1つの実施形態によれば、上記組成物は低密度リポタンパク質を含まない。本発明のもう1つの実施形態によれば、組成物はさらに以下の成分：グルカゴン、肝成長因子、エタノールアミンおよび甲状腺刺激ホルモン放出因子のいずれか1つ、その組合せまたはその全てを含む。
【０００６】
本発明は本発明の組成物へHCVを投与することによる、細胞混合物感染法を提供する。本発明のある実施形態によれば、HCVはRNA898である。本発明のもう1つの実施形態によれば、HCVウイルスはその組成物中の細胞を洗浄する前、または組成物(接種物)を細胞培養培地と交換する前に、まず約24時間、約37℃で約0.52ml/cm2の量で接種物とともにインキュベートする。
【０００７】
本発明は本発明の組成物をフィーダー細胞とともにインキュベートし、組成物中の細胞とHCVを接触させ、さらに細胞および／またはその細胞を培養した培地と会合しているHCVを測定することにより、HCV感染をアッセイする方法を提供する。
【０００８】
さらに本発明は、本発明の組成物をフィーダー細胞とともにインキュベートし、組成物中の細胞をHCVウイルスと接触させ、さらにHCVと接触させる前または接触させた後に化合物を投与するステップを含む、HCVの産生に作用する化合物の能力、すなわち、より多くのHCVを産生する細胞の組成物の能力に作用する能力を評価する方法を提供する。ある実施形態ではこの方法はHCV産生を阻害する細胞をスクリーニングするために用いる。さらなる実施形態ではこの方法はHCV産生を阻害するそれらの能力に関して複数の化合物を同時にスクリーニングするために用いる。
【０００９】
もう1つの実施形態では、HCVの存在は転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によりHCV RNAの量を測定することによって求められる。ある実施形態ではサンプル中のHCV RNAを内部対照として用いる第二のウイルス由来のRNA量と比較する。さらなる実施形態ではこの第二のウイルスはウシウイルス性下痢ウイルス(「BVDV」)である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】培養上清中に存在するHCV RNAのレベルによって測定したRNA898感染後のヒト胎児肝細胞の感染(-□-)または血清フリー対照(●)の経時的分析を示す。上清サンプルに関するRT-PCRアッセイの定量限界(----LOQ)は600HCV RNAコピー/サンプルであった。3回の培養の平均HCV RNA/ml値およびそれらの標準偏差を示している。
【図２】培養上清中に存在するHCV RNAのレベルによって測定したRNA898感染後のヒト胎児肝細胞の感染(-□-)または陰性対照血清(-×-)の経時的分析を示す。陰性対照血清はHCVに感染していない患者から得たものである。上清サンプルに関するRT-PCRアッセイの定量限界(----LOQ)は600HCV RNAコピー/サンプルであった。3回の培養の平均HCV RNA/ml値およびそれらの標準偏差を示している。
【図３】培養上清中に存在するHCV RNAのレベルによって測定したRNA898感染後のヒト胎児肝細胞の感染(-□-)または陰性対照血清(-×-)の経時的分析を示す。陰性対照血清はHCVに感染していない患者から得たものである。上清サンプルに関するRT-PCRアッセイの定量限界(----LOQ)は600HCV RNAコピー/サンプルであった。3回の培養の平均HCV RNA/ml値およびそれらの標準偏差を示している。
【図４】HCV RNAと会合した細胞のレベルによって測定した感染後のヒト胎児肝細胞の感染の経時的分析を示す。陰性対照血清のデータは示されていない。接種後、ウイルスの投与後1、2、3、6および8日目に培養細胞を洗浄および回収した。細胞と会合したRNAサンプルに関するRT-PCRアッセイの定量限界(----LOQ)は100HCV RNAコピー/サンプルであった。3回の培養の平均HCV RNA/ウェル値およびそれらの標準偏差を示している。
【図５】一定の濃度範囲にわたる抗ウイルス薬VRT-106866による、ヒト胎児肝細胞のHCV感染の阻害を示す。サンプル中のHCV RNAは定量的多重HCV特異的RT-PCRアッセイを用いて測定した。細胞と会合したRNAサンプルに関するRT-PCRアッセイの定量限界は100HCV RNAコピー/サンプルであった。3回の培養の「対照HCV RNAの％」(サンプルの値/陽性対照値の平均)の平均値およびそれらの標準偏差を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の組成物は受胎後3ヶ月以上のヒト肝臓から遊離させた細胞を含む細胞混合物を含む。ある実施形態によれば、このヒトは受胎後3ヶ月以上、生後１年までである。本発明のもう1つの実施形態では、このヒトは受胎後3ヶ月〜6ヶ月である。もう1つの実施形態では、このヒトは受胎後18〜22週目である。本発明のある実施形態では、この細胞は胎児肝細胞および造血細胞を含む。本発明のある実施形態によれば、肝細胞および造血細胞はαフェトタンパク質、アルブミンおよび／またはグリコホリンを発現し得る。ある好ましい実施形態によれば、ヒトが成人である場合、ヒト肝臓は健常なものである。
【００１２】
もう1つの実施形態によれば、本発明の組成物はαフェトタンパク質を発現する細胞、アルブミンを発現する細胞、およびグリコホリンを発現する細胞を含むが、CD34タンパク質を発現する細胞は実質的に含まない。この細胞混合物中の細胞はαフェトタンパク質、アルブミンまたはグリコホリンに特異的に向けられた抗体で免疫染色可能であるが、この細胞混合物はCD34タンパク質に特異的に向けられた抗体で免疫染色可能な細胞は実質的に含まない。本発明によれば、「CD34タンパク質を発現する細胞を実質的に含まない」とは、アルカリ性ホスファターゼ検出系(例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 349,406-407; DAKO CorporationのLSAB2キット)を用いて免疫結合を検出した場合に細胞混合物中の細胞がCD34抗体で検出可能な免疫染色をほとんど示さないか、全く示さないことを意味する。本発明の組成物のある実施形態によれば、抗CD34特異的抗体によっては細胞混合物の細胞集団の2%未満しか染色されない。もう1つの実施形態によれば、抗CD34特異的抗体によっては細胞混合物の細胞集団の1%未満しか染色されない。
【００１３】
本発明はHCVウイルスRNA898(以下、「RNA898」)の感染および複製にとって著しく良好な宿主細胞である細胞を含む組成物を含む。RNA898はブタペスト条約の下、2001年3月27日にAmerican Type Culture Collection(「ATCC」), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されたものである(ATCC受託番号PTA-3237)。ある実施形態によれば、本発明の組成物は、組成物中に4×105細胞が存在すれば、ウイルスを投与して72時間後に培地中に約5,000コピーを超える、約10,000コピーを超える、あるいは約50,000コピーを超えるC型肝炎ウイルスRNAを産生することができる。例えば本発明の方法によって調製された組成物は、実施例２および４に記載される方法に従ってアッセイした場合、ウイルスを投与して72時間後に培地中に約5,000コピーを超える、約10,000コピーを超える、あるいは約50,000コピーを超えるC型肝炎ウイルスRNAを産生することができる。
【００１４】
当業者ならば、組成物中の細胞数が4×105細胞よりも多ければ産生されるウイルスRNAコピー総数は組成物中の細胞の増加数に比例した量だけ増えることが容易に理解できるであろう。同様に当業者ならば、組成物中の細胞数が4×105細胞よりも少なければ産生されるウイルスRNAコピー総数は組成物中の細胞の減少数に比例した量だけ少なくなることも容易に理解できるであろう。従って同じコピー数のHCV RNAを比例産生する4×105細胞よりも多いまたは少ない細胞を含む組成物が考えられる。本発明の組成物は組成物にウイルスを投与して72時間後に5,000〜55,000コピーのHCV RNA、10,000〜55,000コピーのHCV RNAおよび25,000〜55,000コピーのHCV RNAを産生することができる。
【００１５】
本発明の免疫染色に有用な抗体の例としては当技術分野では公知のものである。例えばDAKO Corporation, Carpinteria, CAからの抗αフェトタンパク質抗体、PharMingen, San Diego, CAからの抗グリコホリン抗体(32591)、PharMingen, San Diego, CAからの抗ヒトCD34抗体(34371A)およびAccurate Chemical Corp., Westbury, NYからの抗アルブミン抗体(YM5024)が使用できる。
【００１６】
本発明のもう1つの実施形態では、本発明の組成物中の細胞混合物は約40ミクロンのフィルターを通過することができる。
【００１７】
本発明のある実施形態では、本発明の組成物はフィーダー細胞と組み合わせて用いられるか、またはフィーダー細胞をさらに含む。フィーダー細胞細胞は細胞外マトリックスを提供し、成長因子などの因子を拡散できるようにする。ある実施形態では、フィーダー細胞はHCV感染能がほとんどないか、または全くない。もう1つの実施形態では、フィーダー細胞は繊維芽細胞である。別の実施形態では、フィーダー細胞は胚間葉繊維芽細胞である。
【００１８】
本発明のフィーダー細胞の例としてはSTO細胞などのマウス胚繊維芽細胞(MEF)、ラット胚繊維芽細胞(REF)がある(例えば、Brigid Hogan et al., Manipulating The Mouse Embryo : A Laboratory Manual, 2nd ed. Plainview, N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994; Robertson, E. J. (1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, ed. Robertson, E. J. (IRS, Oxford), pp. 71-112)。STO(Reid-99)細胞は有用なフィーダー細胞の一種である。STO(Reid-99)細胞はブダペスト条約の下、2001年3月27日にAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されたものである(ATCC受託番号PTA-3236)。フィーダー細胞を培養維持する方法は当技術分野で公知である。例えば、Methods for Tissue Engineering, Ed. Robert Lanza, Academic Press, NY (2002), pp. 151-202参照。
【００１９】
フィーダー細胞は当技術分野で公知の方法に従って増殖停止させることができる。例えばSTO細胞は細胞培養プレートに2〜48時間付着させればよい。次にこのSTO細胞をインキュベートしている培地を取り出し、2μg/mlのマイトマイシンCを含有する培地に交換する。その後、STO細胞を約37℃で2時間インキュベートする。インキュベーション後、マイトマイシンCを含有する培地を取り出す。細胞を2回洗浄した後、このSTO細胞培養系を本発明の細胞混合物を加えるまで0〜48時間維持する。
【００２０】
本発明の組成物の細胞混合物は、
a. 受胎後3ヶ月以上のヒト肝臓をEGTAを含むバッファー中で切開し；
b. 切開した肝臓をコラゲナーゼを含むバッファー中でインキュベートして肝臓から細胞を分離し；
c. 分離した細胞から40ミクロン以上のものを除き；
d. 分離した細胞から赤血球細胞を除き；
e. ステップ(d)の細胞を、0.1mM〜0.6mMカルシウム、ウシ血清アルブミン、遊離脂肪酸(FFA)、高密度リポタンパク質(HDL)、ニコチンアミド、微量元素、上皮成長因子(EGF)、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む血清フリー培地に再懸濁させ、さらに
f. ステップ(e)の血清フリー培地で細胞を培養する
ことを含むステップに従って調製することができる。
【００２１】
ステップ(e)または(f)の培地は所望によりグルカゴン、肝成長因子、エタノールアミンおよび甲状腺刺激ホルモン放出因子のいずれか1つ、その組合せまたはその全てをさらに含み得る。ある実施形態では、培地はさらにグルカゴン、肝成長因子、エタノールアミンおよび状腺刺激ホルモン放出因子を含む。もう1つの実施形態では、培地は低密度リポタンパク質(LDL)を含まない。
【００２２】
ある実施形態では、EGTAバッファーは0.1mM〜1.0mMのエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)を含む。本発明のもう1つの実施形態では、EGTA濃度は0.5mMである。
【００２３】
ある実施形態では、コラゲナーゼバッファーは0.1〜5.0mg/mlのコラゲナーゼを含む。本発明のもう1つの実施形態では、コラゲナーゼの濃度は2mg/mlである。
【００２４】
本発明のサイズ排除ステップとは、組織、残渣および細胞凝集塊など約40ミクロンのフィルターを通過することができないものを除去することを意味する。従って例えば約40ミクロンから100ミクロンまでのフィルターの使用、および40ミクロンより大きな残渣を除く他の方法も意図される。ある実施形態では、この濾過ステップでは約40ミクロンよりも大きい、フィルターを通過できないものを除去する。本発明のフィルターの例としてはナイロンフィルターがある(例えば、Falconeからの「Cell strainer」(カタログ番号2034、2350または2360))。
【００２５】
本発明の組成物を調製する方法は細胞混合物から赤血球細胞を除くステップを含む。赤血球細胞は肝臓から細胞を分離した後の調製工程中のどの段階で除去してもよいと考えるべきである。赤血球細胞を除く方法は当技術分野で公知である。本発明のある実施形態によれば、赤血球細胞は遠心分離機にて一連の低速回転により除去する。例えばフィルターを通した分離細胞を50xg(450rpm)で4分間回転させ、細胞ペレットを再懸濁させ、同じ工程を数回繰り返せばよい。
【００２６】
動物およびヒトの一次細胞、細胞系統および組織は本発明の培地で培養することができる。ある実施形態では、培養培地は血清フリー培地、カルシウム、FFA、HDL、ニコチンアミド、微量元素、EGF、インスリン、トランスフェリンおよびヒドロコルチゾンを含む。もう1つの実施形態によれば、培養培地はさらに以下の成分：グルカゴン、肝成長因子、エタノールアミンおよび甲状腺刺激ホルモン放出因子のいずれか1つ、その組合せまたはその全てを含む。さらなる実施形態では、培養培地は低密度リポタンパク質(LDL)を含まない。
【００２７】
上記工程に従って細胞混合物を調製した後は、これらの細胞は細胞および必要であればフィーダー細胞の維持に好適な培地で培養すべきである。本発明のある実施形態によれば、この培地はHCV感染に用いる細胞混合物について至適化されている。この目的で有用な培地の1つは、カルシウム、ウシ血清アルブミン(BSA)、遊離脂肪酸(FAA)、高密度リポタンパク質(HDL)、ニコチンアミド、微量元素、表皮成長因子(EGF)、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、および所望により以下の成分：グルカゴン、肝成長因子、エタノールアミンおよび甲状腺刺激ホルモン放出因子のいずれか1つ、その組合せまたはその全てを含む血清フリー培地(例えば、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM))を含む。本発明のある実施形態によれば、培養培地は低密度リポタンパク質(LDL)を含まない。
【００２８】
ある実施形態では、培養培地のカルシウム濃度は0.1mM〜0.6mMの間である。もう1つの実施形態では、カルシウム濃度は約0.5mMである。ある実施形態では、BSA濃度は500μg/mlである。もう1つの実施形態では、ニコチンアミド濃度は5mMである。ある実施形態では、インスリン濃度はl0ng/mlである。ある実施形態では、遊離脂肪酸濃度は7.6μ当量/Lである。ある実施形態では、EGF濃度は100ng/mlである。ある実施形態では、肝成長因子濃度は20μg/mlである。ある実施形態では、エタノールアミン濃度は10-6Mである。ある実施形態では、甲状腺刺激ホルモン放出因子濃度は10-6Mである。ある実施形態では、HDL濃度は5μg/mlである。ある実施形態では、ヒドロコルチゾン濃度は10-6Mである。
【００２９】
ある実施形態では、培地はIM-HDM培地であり、DMEM(高グルコース)、500μg/ml BSA、7.6μ当量/L遊離脂肪酸(FAA)、5μg/ml HDL、5mMニコチンアミド、1×微量元素[1×10-7M銅、5×10-11M亜鉛、3×10-10Mセレン]、100ng/ml EGF、10ng/mlインスリン、5μg/mlトランスフェリン、10-6Mヒドロコルチゾン、2μg/mlグルカゴン、20μg/ml肝成長因子、10-6Mエタノールアミン、10-6M甲状腺刺激ホルモン放出因子を含む。ある実施形態では、全FFA 7.6μ当量/Lには2.36μMパルミチン酸(16:0)、0.21μMパルミトレイン酸(cis-16:1 n-7)、0.88μMステアリン酸(18:0)、1.02μMオレイン酸(cis-18:1 n-9)、2.71μMリノール酸(cis-18:2 n-6)、および0.43μMリノレン酸(cis18:3 n-3)を含む。この培地はまた細菌の増殖を抑える抗生物質、例えば1×ペニシリン/ストレプトマイシンを含んでもよい。
【００３０】
本発明の組成物の細胞混合物は細胞外マトリックスでコーティングしたプラスチック支持体にプレーティングしてもよい。細胞外マトリックス成分の例としては、限定されるものではないが、例えばIV型コラーゲンなどのコラーゲン、または接着タンパク質のフィブロネクチンおよびラミニン、またはマトリゲル(ICN Biochemicals Inc.)が挙げられる。コラーゲンを用いる場合、単独で用いてもよいし、あるいはラミニンまたはフィブロネクチンと組み合わせて、あるいはプロテオグリカンと組み合わせて、あるいは細胞外マトリックス物質富化組織抽出物を組み合わせて用いてもよい。細胞外マトリックスはまた上記のフィーダー細胞によって提供することもできる。このような細胞混合物および組合せ細胞外マトリックスは本発明のHCVアッセイ方法で用いることができる。
【００３１】
本発明の組成物はRNA898またはRNA898と同等の感染力のあるHCVと接触させることができる。RNA898の感染力のある同等物とは、本発明の方法に従って調製した組成物の4×105細胞をHCVウイルスと接触させて72時間後に約5,000コピーを超える、約10,000コピーを超える、または約50,000コピーを超えるHCV RNAを産生し得るRNA898以外のHCV株である。ある実施形態によれば、本発明の組成物とRNA898またはその感染力のある同等物とを37℃にて24時間、約0.52ml/cm2の量で接触させることにより細胞に感染させる。本発明のある実施形態によれば、HCVに感染した細胞は細胞外マトリックスを用いて培養する。本発明のもう1つの実施形態では、細胞外マトリックスはフィーダー細胞(例えば、STO-(Reid-99)細胞)によって提供される。
【００３２】
本発明の組成物中の細胞から産生されたHCVの量は例えばHCVタンパク質または核酸産生を測定することで求めることができる。例えば細胞と会合して(すなわち、細胞中または細胞に付着して)見られる、かつ／またはその細胞を培養した培地中に見られるHCV RNAのコピー数を定量することができる。HCVタンパク質または核酸分子が産生されたかどうかを調べるのに使用できる当技術分野で公知の技術がある。例えばHCVタンパク質に対する抗体でプロービングしたタンパク質のウエスタンブロットまたはHCV核酸配列に相補的な核酸分子を標識したものでプロービングしたゲルブロットがある。細胞および細胞培養培地からタンパク質および核酸分子を抽出する方法は当技術分野で周知であり、これを目的としたキットが市販されている。
【００３３】
本発明に従って産生されたHCV粒子のコピー数をより高い精度で定量するには逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)が有用である。本発明のある実施形態によれば、RT-PCR法は、第二のウイルスまたは第二の核酸分子のいずれかの形態でアッセイする細胞、細胞抽出液および／または培地のサンプルに加えた既知量の第二の核酸分子と値を比べることによってHCV RNAのコピー数が求められるように改変する。第二のウイルスがHCVと近縁であるか、第二の核酸分子がHCV RNAと近縁(すなわち、長さ、核酸組成およびウイルスキャプシドの構造が同じ)であるのが望ましい。ある実施形態では、第二の核酸分子はフラビウイルスキャプシドのものである。ある実施形態では、第二のRNA分子はウシウイルス性下痢ウイルス(「BVDV」)、例えばBVDV NADL株(ATCC受託番号VR-534)由来のRNAである。
【００３４】
第二のウイルスまたは核酸分子が存在すると、第一の核酸分子の定量のための内部対照として役立つという利点がある。この内部対照によりランダムな変動およびアッセイの変動性のモニタリングおよび修正が可能となる。
【００３５】
例えば本発明は
(a)HCVと、本発明の組成物とともに第二の核酸分子を含む既知量のウシウイルス性下痢ウイルス(「BVDV」)とを合し；
(b)組成物の細胞またはその細胞を培養した培地からHCVに由来する第一の核酸分子とBVDVに由来する第二の核酸分子を抽出して混合核酸抽出液を形成し；
(c)この混合核酸抽出液に、第一の核酸に特異的な第一の検出プローブと第二の核酸分子に特異的な第二の検出プローブを加え；
(d)混合核酸抽出液をPCRの手段で増幅し；
(e)増幅中の種々のサイクルの時点で第一の検出プローブおよび第二の検出プローブから独立に放出された検出シグナルを定量し；
(f)ステップ(e)の結果を外挿してHCV中の第一の核酸分子の量とBVDV中の第二の核酸分子の量を算出し；さらに
(g)ステップ(f)の第二の核酸分子の算出量とステップ(a)で用いた第二の核酸の既知量とを比べることで、ステップ(f)で求められた第一の核酸分子の算出量の精度を評価する
ステップを含む方法を提供する。
【００３６】
もう1つの実施形態によれば、上記の方法は、ステップ(f)の第二の核酸の算出量とステップ(a)で用いた第二の核酸の既知量を比較することで求められる係数によりステップ(f)で求められた第一の核酸分子の算出量を調整するさらなるステップを含む。
【００３７】
もう1つの実施形態によれば、本発明はHCVの産生に対する化合物の作用を調べる方法であって、本発明の組成物にHCVを投与する前または投与した後に化合物を加え、次にその組成物中の細胞および／またはその感染細胞を培養した培地に会合しているHCVの存在を測定するステップを含む。HCVを組成物と接触させた後に化合物を投与するのが望ましい場合には、HCVを組成物と接触させた後10日以内に化合物を投与するのが好ましい。本発明の試験化合物はHCVの産生を阻害または活性化するものであり得る。従って、化合物はその作用を達成するためHCVの生活環のどの段階を阻害するものであってもよい。このような化合物の例としては、限定されるものではないが、合成または精製化学化合物、タンパク質および核酸分子が挙げられる。化合物を加えたサンプルは、化合物に曝さなかった、またはHCV産生にほとんどまたは全く作用を持たないことが分かっている別の化合物に曝したこと以外は同じ条件下で処理した他のサンプルと比較すればよい。
【００３８】
ある実施形態によれば、上記の方法を用いてHCV産生に対する複数の化合物の作用を同時にスクリーニングする。例えば96ウェルプレートの各ウェルに本発明の方法に従ってスクリーニングする種々の化合物を入れることができる。さらなる実施形態では、本発明の方法を用いてHCVの産生を阻害する化合物を同定する。
【００３９】
ある実施形態では、本発明の方法で用いるプライマーおよびプローブはHCV株の最も保存性の高い領域に基づいてデザインする。このプローブはまた、a)プローブの融点がプライマーの融点よりも8〜10℃高いこと；b)5'末端にGが存在しないこと；4を超えるGのストレッチがないこと;および／またはd)そのプローブが融点の高い内部構造を形成しない、またはそれ自体またはいずれかのプライマーと二重らせんを形成しないというさらなる基準に基づいて構築することもできる。ある実施形態では、全PCR領域は約150bpである。
【００４０】
BVDVの5'UTRに有用なプライマーおよびプローブは同じセットの基準に基づいてデザインすることができる。また、HCVのプライマーおよびプローブはBVDVのそれらに対して確実に最少量の相同性を持つよう留意した。改変された核酸分子を合成および調製するプライマーおよびプローブは商業ソースから入手することができる(例えば、Oligo and PE Applied Biosystems)。BVDVはMDBK細胞の感染によって維持することができる。
【００４１】
本発明のある実施形態では、各々HCV核酸分子および第二の核酸分子の一方に特異的であって他方には特異的でない2種の異なる二重標識蛍光性プローブを用いる。さらなる実施形態では、各蛍光性プローブは典型的には5'末端にリポーター色素、3'末端に消光性色素を持つ。この2つの異なる蛍光性プローブは、2つのピークの間に交差干渉がなく検出できる明瞭な蛍光ピークを示すように選択する。例えば上記で論じたように、第一の検出プローブの5'末端は6-カルボキシ-フルオレセイン(「6-FAM」)などのリポーター色素で標識し、第二の検出プローブの5'末端はVICなどのリポーター色素で標識することができる。両検出プローブの3'末端は6-カルボキシメチルローダミン(「6-TAMRA」)などの消光性色素で標識すればよい。従って第一の核酸と第二の核酸分子とに結合させた場合、プローブの5'末端のリポーター色素と3'末端の消光性色素が近接すると蛍光が抑えられる。増幅中にTthポリメラーゼが核酸配列に沿って移動すると消光剤は5'-3'エキソの作用によってプローブから外れ、蛍光性プローブは分解される。この結果蛍光が生じ、その増幅サイクルに対する作用として記録される。このように蛍光をモニタリングすることでリアルタイムの増幅動態を測定する基礎が得られる。
【００４２】
HCV遺伝子型1に有用なプライマーおよびプローブの例としては、(配列番号1)5'-CCATGAATCACTCCCCTGTG-3'(フォワードプライマー)、(配列番号2)5'-CCGGTCGTCCTGGCAATTC-3'(リバースプライマー)、およびHCVプローブ(配列番号5)5'-6-FAMCCTGGAGGCTGCACGACACTCA-TAMRA-3'がある。BVDVのプライマーおよびプローブはフォワードプライマー(配列番号3)5'-CAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCG-3'、リバースプライマー(配列番号4)5'-GGCCTCTGCAGCACCCTATC-3'、およびプローブは5'-VIC(配列番号6)CCCTCGTCCACGTGGCATCTCGA-TAMRA-3'である。
【００４３】
RTおよびPCR反応は蓋付き96ウェルプレートオプティカルトレー(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)の同じウェル中で行うことができる。本発明のある実施形態では、多重RT-PCR反応(すなわち、2種の異なるRNA種、例えばHCV RNAとBVDV RNAを同じ試験管で同時に増幅および測定するRT-PCR反応)を用いる。この多重反応は、実施者がHCV陰性結果が培養物が本当に陰性であるためか、あるいは抽出またはRT-PCR工程に何らかの技術的失敗があったからかを判定できるという利点を持つ。ウイルスRNAまたはRNA標品10または20μlを、1×Taqman EZバッファー(PE Applied Biosystems)、3mM酢酸マンガン、各300mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdUTP、5単位のTthポリメラーゼ(Epicentre)、4.0%促進剤(Epicenter)、一定濃度のプローブおよびプライマーを含む50μlのRT-PCR反応液中で増幅させればよい。Taqman RT-PCRアッセイは60℃で25分(RT)、95℃で5分、次いで2段階PCR反応(60℃で1分および95℃で15秒)を45サイクルにて実施することができる。HCVおよび別の核酸を用いたアッセイ(多重Taqmanアッセイ)では、HCVおよびBVDVプライマーの量は種々の濃度の両プライマー対のマトリックス混合物を用いて至適化することができる。最終アッセイ条件としては、6-FAM標識HCVプローブおよびVIC標識BVDVプローブいずれも200nM、両HCVプライマー400nM、および両BVDVプライマー45nMを含む。
【００４４】
本明細書およびクレームを通じて「含む(comprise)」、または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変形は示された整数または整数群を含むが他の整数または整数群を除外するものではないことを意味するものとする。
【００４５】
2001年3月27日出願の米国仮出願第60/279,174号およびそこに挙げられている文献は出典明示により本明細書の一部とする。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態を示してきたが、基本構成を変更して本発明の組成物および方法を利用する別の実施形態を提供することもできることは明らかである。従って、本発明の範囲はここに例示される特定の実施形態ではなくクレームおよび明細書によって定義されるものと考えられる。
【実施例１】
【００４７】
ヒト胎児肝細胞および造血細胞の単離および培養
受胎後18〜22週齢のヒト胎児からの肝組織は解剖まで氷上のRPMI中で保存した。この組織をPBS溶液で洗浄した。この組織を50mlの解剖バッファー[HBSS(Cellgroカタログ番号21-022-cv)、0.5mM EGTA、0.2mM MgSO4、10mM HEPES]中にてメスで細断した。細断した組織を37℃の水浴で10分間インキュベートした。解離して細断組織上に懸濁した細胞を取り出した。この細断組織をコラゲナーゼ溶液(コラゲナーゼバッファー[HBSS、1mM CaCl2、10mM HEPES]中2mg/mlコラゲナーゼ(Sigma C-5138))中、37℃で30分間インキュベートした。解離して細断組織上に懸濁した細胞を回収し、40ミクロンのナイロンフィルター(Falcon 2034、2350または2360番)に通した。この細断組織をIM洗浄溶液[DMEM(高グルコースJRH-51444)、500μg/ml BSA(Sigma A8806)、7.6μ当量/L全遊離脂肪酸(FAA)、１×ペニシリン/ストレプトマイシン、10ng/mlインスリン、5μg/mlトランスフェリン]で洗浄した。
【００４８】
フィルターを通過した細胞を含む溶液をプールし、1000rpmで8分間回転させた。上清を廃棄した。ペレットを50mlのIM洗浄溶液中に再懸濁させ、50xg(450rpm)で4分間回転させた。上清を廃棄した。ペレットをIM洗浄溶液に再懸濁させ、50xgで4分間回転させ、上清を廃棄するというプロセスを2、3回繰り返した。次にペレットを20mlのIM-HDM培地[DMEM(高グルコースJRH-51444)、500μg/ml BSA(Sigma A8806)、7.6μ当量/Lの遊離脂肪酸(FFA)[2.36μMパルミチン酸(16:0, Sigma, P0500)、0.21μMパルミトレイン酸(cis-16:1 n-7, Sigma, P9417)、0.88μMステアリン酸(18:0, Sigma, S4751)、1.02μMオレイン酸(cis-18:1 n-9, Sigma, O1008)、2.71μMリノール酸(cis-18:2 n-6, Sigma, L1376)、および0.43μMリノレン酸(cis 18:3 n-3, Sigma, L2376)]、5μg/ml HDL(Sigma L2014)、5mMニコチンアミド(Sigma N0636)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco 1×)、1×微量元素[1×10-7M銅(C8027)、5×10-11M亜鉛(Sigma 4750)、3×10-10Mセレン(Sigma S6663)]、100ng/ml EGF(Peprotech 100-15)、10ng/mlインスリン(Sigma I5500)、5μg/mlトランスフェリン(Sigma T0665)、10-6Mヒドロコルチゾン(Sigma I5500)、2μg/mlグルカゴン(Sigma G3157)、20μg/ml肝成長因子(Sigma G1887)、10-6Mエタノールアミン(Sigma E0135)、10-6M甲状腺刺激ホルモン放出因子(Sigma T9146)]に懸濁させた。
【００４９】
ペレット細胞を3×105細胞/cm2の密度でIM-HDM培地に入れた。このペレット細胞は細胞外マトリックスでよく増殖した。このペレット細胞はコラーゲンをコーティングしたプレート上で増殖可能である。Salas-Prato, Invitro Cell. Dev. Biol 24:230, 1988の方法を用いてプレートをコーティングした。一般にはプレートをI型コラーゲン原液(DMEM中30μg/ml)中、37℃で30分間〜1時間インキュベートし、PBSで2回すすぎ、PBSでカバーし、必要となるまでPBS下で保存した。
【００５０】
あるいはペレット細胞を加える前にプレートをフィーダー細胞でコーティングすることもできる。例えば、マイトマイシンCをコーティングしたSTO(Reid-99)細胞をフィーダー細胞として用いた。マイトマイシンCはSTO細胞を生きたまま増殖停止させ、肝細胞が接着可能な表面を与える。
【００５１】
STO細胞を用いる場合は、通常のSTO培地(RPMI-1640、10% FCS)に1.9cm2細胞(24ウェルプレートでは1.2×105/ウェル、96ウェルプレートでは2.2×104/ウェル)でプレーティングし、2〜48時間接着させた。培地を除去して2μg/mlのマイトマイシンCを含有する培地に交換した後、37℃で2時間インキュベートした。培地を除去し、STO細胞を通常のSTO培地で2回洗浄し、胎児細胞を加えるまで0〜48時間培養を維持する。
【００５２】
24〜48時間後、接着していない胎児細胞をピペットで静かに吸引することで除去した。培地は通常2〜7日ごとに交換する。細胞は少なくとも28日間は固相に接着し良好な細胞形体を呈した状態で維持されていた。
【００５３】
細胞混合物の免疫染色はHCV感染後11日目に24ウェルプレートまたは96ウェルプレートで行った。α-1-フェトタンパク質抗体および陰性対照抗体はDAKO Corporation (DAKO), Carpinteria, CAから入手した。抗ヒトCD34(34371A)および抗グリコホリン(32591A)マウスモノクローナル抗体はPharMingen, San Diego CAから入手し、DAKOからのマウス陰性対照(N1537)とともに用いた。染色は製造業者の説明書に従いDAKOのLSAB2またはK0676(アルカリ性ホスファターゼ)キットを用いて行った。この免疫染色により、本細胞混合物はαフェトタンパク質を発現する細胞、グリコホリンを発現する細胞、アルブミンを発現する細胞を含むが、CD34を発現する細胞は含まないことが示された。
【実施例２】
【００５４】
HCV感染
96または24ウェルプレートを実施例１のSTO(Reid-99)フィーダー細胞でコーティングした。実施例１に記載のようにして調製した細胞を24ウェルプレートのSTO(Reid-99)細胞上にプレーティングした。細胞にProMed Dxから購入したC型肝炎ウイルスRNA898l 9.3×106 Chiron bDNA当量/ml力価/ウェルを感染させた。この接種量はウェル中の最終濃度が加える血清の20〜30%、すなわち1.2×106〜2.8×106 Chiron bDNA当量/mlとなるように選択した。HCVの感染および複製は通常20日間観察した。HCV産生アッセイ前のインキュベーション中は2、3日ごとに培地を交換した。HCV感染および複製の量は細胞および培地中のHCV RNAのコピー数をRT-PCRにより測定することで定量した。
【００５５】
RT-PCRアッセイ
HCV RNAは細胞からはRneasy-96法を用いて、また細胞培養上清からはQIAamp 96抽出法(試薬はQiagen, Valencia CAから)を用いて抽出した。両手法とも、カオトロピック剤をシリカガラス(カオトロピック塩の存在下で核酸と結合することができる)を用いたウイルスRNAの小スケール単離および濃縮を利用するものである。カオトロピック溶液を加える前にウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)を細胞溶解液(約106 BVDVコピー/サンプル)を加える。ガラス繊維カラムは96ウェル形式で準備する。RNアーゼフリー水でウェル中に核酸分子を溶出させる(約70〜100μl)。BVDV原株はATCC(ATCC受託番号VR-534)から得たものである。BVDV対照はこれらのプロトコールを用いるアッセイ間で一定とした。
【００５６】
これらの実験には多重RT-PCR反応、すなわち2以上の異なるRNA種を同じ試験管で同時に増幅および測定するRT-PCR反応を用いた。本明細書で用いたHCV RT-PCRアッセイは反応当たり10コピー未満の感度で、100〜107コピーにの範囲では直線状であった。各RT-PCRアッセイでは10〜20μlのHCV RNA抽出サンプルを試験した。
【００５７】
RT-PCRは以下の試薬：EZ RT-PCRコア試薬キット(Applied Biosystems)、3mM酢酸マンガン、各300μMのdATP、dCTP、dGTP、dUTP、400nM HCVフォワードプライマー(配列番号1)5'-ccatgaatcactcccctgtg-3'、400nM HCVリバースプライマー(配列番号2)5'-ccggtcgtcctggcaattc-3'、45μM BVDVフォワードプライマー(配列番号3)5'-cagggtagtcgtcagtggttcg-3'、および45μM BVDVリバースプライマー(配列番号4)5'-ggcctctgcagcaccctatc-3'、および0.1単位/μlのTthポリメラーゼ(Epicentre)を用いて行った。色素タグを付け、HCV RNAとBVDV RNA由来の核酸配列を含有するDNAオリゴを、RT-PCRから生じた核酸産物のプローブとして用いた(すなわち200μM FAM HCVプローブ(配列番号5)5'-FAM cctggaggctgcacgacactca-TAMRA-3'および200μM VIC BVDVプローブ(配列番号6)5'-VIC-ccctcgtccacgtggcatctcga-TAMRA-3')。逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応はABI 7700サーマルサイクラー(Applied Biosystems)にて同じウェル内で行った。RT-PCRによりアッセイするこれらサンプルと同時に既知量のHCV RNAセットでRT-PCRアッセイを行い、それらの結果から標準曲線を作成した。
【００５８】
各実験に対して定量限界を調べた。定量限界は抽出およびRT-PCR法での解析後、標準曲線の直線部分内にある出力値が得られるRNAの最低濃度を測定することで求めた。一般に全ての陰性対照(すなわちHCV産生をほとんど、または全く示さない)はLOQより低くなければならない。
【００５９】
蛍光はABI 7700シーケンスデテクター(Applied Biosystems)で測定した。全てのサンプルに対照RNAであるBVDVが存在することで、そのアッセイのRNA抽出およびRT-PCR工程が上手く行ったことが確認される。BVDVの結果は陽性であった。従ってHCV陰性の結果を信頼を持って解釈することができる。
【実施例３】
【００６０】
感染後の培地におけるHCVの経時的分析
ヒト胎児細胞培養物を実施例１に記載のように調製し、マイトマイシンCで処理したSTO(Reid-99)細胞のフィーダー層の上にプレーティングした。プレーティングした細胞の数は2×105/ウェルであった。HCV(RNA898)に感染したヒト患者由来の血清はProMed Dxから購入した。対照として、試験するもう一方の細胞サンプルには血清を加えなかった。HCV患者血清の300μlアリコートを別の0.7ml培地に加えた。培養物を37℃で24時間ウイルスとともにインキュベートした。接種物を取り出し、培養物を培地1mlで洗浄した後、新鮮培地で培養した。毎回培地を交換する(2、3日ごと)前に培養上清をサンプリングし、実施例２に記載のような定量的多重HCV特異的RT-PCRアッセイを用いてHCV RNAを測定した。上清サンプルについてのRT-PCRアッセイの定量限界(----LOQ)は600HCV RNAコピー/サンプルであった。
【００６１】
図１は細胞培養上清のRT-PCRアッセイの結果を示す。図１はRNA898が高い感染結果を示したことを示している。陰性対照血清ではHCV RNAの産生は見られなかった。陰性対照は全てLOQより小さかった。
【実施例４】
【００６２】
感染後の培地におけるHCVの経時的分析
ヒト胎児細胞培養物を実施例１に記載のように調製し、マイトマイシンCで処理したSTO(Reid-99)細胞のフィーダー層の上にプレーティングした。プレーティングした細胞の数は4×105/ウェルであった。HCV(RNA898)に感染したヒト患者および感染してない（陰性対照血清）ヒト由来の血清はProMed Dxから購入した。HCV患者血清の200μlアリコートを別の0.8ml培地に加えた。これは約1.9×106 Chiron bDNA当量/ウェルに相当する。細胞培養物を37℃で24時間ウイルスとともにインキュベートした。接種物を取り出し、培養物を培地1mlで洗浄した後、新鮮培地で培養した。毎回培地を交換する(2、3日ごと)前に培養上清をサンプリングし、実施例２に記載のような定量的多重HCV特異的RT-PCRアッセイを用いてHCV RNAを測定した。上清サンプルについてのRT-PCRアッセイの定量限界(----LOQ)は600HCV RNAコピー/サンプルであった。
【００６３】
図２および図３は細胞培養上清のRT-PCRアッセイの結果を示す。RNA898は高い感染結果を示した。陰性対照培養物はHCV RNAの産生を示さなかった。図２および３はこのHCVアッセイの、同等のHCVアッセイを用いた場合には得られない高いレベルの再現性を示す例である。
【実施例５】
【００６４】
HCV感染後の細胞に会合しているHCV RNAの経時的分析
ヒト胎児細胞培養物を実施例１に記載のように調製し、マイトマイシンCで処理したSTO(Reid-99)細胞のフィーダー層の上にプレーティングした。プレーティングした細胞の数は4×105/ウェルであった。これは約1.9×10６ Chiron bDNA当量/ウェルに相当する。RNA898血清(または示していないが陰性対照血清)の200μlアリコートを0.8ml培地に加えた。培養物を37℃で24時間ウイルスとともにインキュベートした。接種物を取り出し、培養物をIM洗浄培地1mlで2回洗浄した後、培養物に新鮮なIM-HCM培地を供給するか、または溶解バッファーで破壊することにより回収した。培養物を同様に洗浄した後、感染後2、3、6および8日目に培地供給するか、回収した。保存していた溶解液からRneasy法(Qiagen)を用いて全RNAを抽出した。サンプル中のHCV RNAは定量的多重HCV特異的RT-PCRアッセイを用いて測定した。細胞に会合しているRNAサンプルについてのRT-PCRアッセイの定量限界(----LOQ)は100HCV RNAコピー/サンプルであった。陰性対照培養物は全てHCV RNAは示さなかった(データは示されていない)。
【００６５】
図４は細胞に会合しているRNAのRT-PCRアッセイの結果を示す。感染後2および3日目では最も高いレベルの細胞会合HCV RNAが見られ、感染後6日目でもまだ有意なHCV RNAが存在していた。このように外からの接種物を除いた後に見られる1〜3日目のHCV RNAの増加はHCVが細胞内で複製していることを示している。
【実施例６】
【００６６】
抗ウイルス薬VRT-106866によるヒト胎児肝細胞のHCV感染の阻害
ヒト胎児細胞培養物を実施例１に記載のように調製し、マイトマイシンCで処理したSTO(Reid-99)細胞のフィーダー層の上にプレーティングした。プレーティングした細胞の数は4×105/ウェルであった。RNA898血清(または示していないが陰性対照血清)の200μlアリコートを0.8ml培地に加え、37℃で24時間インキュベーションを行った。24時間後、培地を取り出し、培養物を洗浄し、培地を種々の濃度の化合物VRT-106866(0〜10μM)を含有するIM-HDMに交換した。各阻害剤濃度は3回試験し、陽性対照(阻害剤なし)は6回行った。阻害剤の存在下で48時間インキュベートした後、上清を除き、同濃度の阻害剤を含有する新鮮培地に交換した。さらに3日後、培地を除き、培養物を洗浄し、細胞単層を溶解バッファーで破壊し、実施例２に記載のようにRneasy法(Qiagen)を用いて全RNAを抽出した。サンプル中のHCV RNAは定量的多重HCV特異的RT-PCRアッセイを用いて測定した。細胞に会合しているRNAサンプルについてのRT-PCRアッセイの定量限界は100HCV RNAコピー/サンプルであった。
【００６７】
図５は結果をグラフで示したものであり、3回の培養からの「対照HCV RNAに対する%」(サンプル値／陽性対照値の平均)の平均値および標準偏差である。図５はVRT-106866がHCV感染の有効な阻害剤であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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