(57)【要約】【課題】  本発明はキチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）活性を検知するためのセット及びその方法を提供するものである。【解決手段】  本発明はテストサンプルをポリアクリルニトリルゲルにより電気泳動分解した後、肉眼で認識できるクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）染料によりキチナーゼの活性を検知する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）キチナーゼを含む蛋白質電気泳動ゲルを提供する工程と、
（２）電気泳動水溝に所定程度のテストサンプルを入れる工程と、
（３）肉眼で検知できるキチナーゼ染料により工程１のゲルを染色する工程であって、キチナーゼの作用領域は白くなり、残り部分は染料の色となることを順に含むことを特徴とするキチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）活性を検知するための方法。
【請求項２】
前記蛋白質電気泳動ゲルはポリアクリルニトリルゲルであることを特徴とする請求項１に記載するキチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）活性を検知するための方法。
【請求項３】
前記所定程度のテストサンプルのキチナーゼの活性単位は１．５×１０―５より大きいか或いは等しいであることを特徴とする請求項１に記載するキチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）活性を検知するための方法。
【請求項４】
前記キチナーゼ染料はクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ、略称ＣＢＢ）であることを特徴とする請求項１に記載するキチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）活性を検知するための方法。
【請求項５】
キチナーゼを含む蛋白質電気泳動ゲルと、
肉眼で検知できるキチナーゼ染料を含むことを特徴とする請求項１に記載するキチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）活性を検知するためのセット。
【請求項６】
前記蛋白質電気泳動ゲルはポリアクリルニトリルゲルであることを特徴とする請求項５に記載するキチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）活性を検知するためのセット。
【請求項７】
前記キチナーゼ染料はクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ、略称ＣＢＢ）であることを特徴とする請求項５に記載するキチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）活性を検知するためのセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、テストサンプルをポリアクリルアミドゲルで電気泳動分離させてから、クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）染料を利用してキチナーゼの活性を検知する方法である。
【背景技術】
【０００２】
キチナーゼはキチン質の加水分解反応を促進する。キチン質はＮ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）がβ−１，４で結合形成されたポリマーで、真菌細胞壁と節足動物の外骨格を構成する主要成分である。キチナーゼはキチン質を加水分解してキトオリゴ糖（ｃｈｉｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）と２個から６個のＮ−アセチルグルコサミン分子（Ｋｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＸＳ，  １９９９；  ８７，１１１−１２３）を作る。キチン質分解酵素は、細菌、真菌、植物、人を含む多種の生物の体内に存在する。
植物体の中のキチナーゼは抗病原体機能と関連がある（Ｓｔｉｎｔｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  １９９３；  ７５，６８７−７０６）と考えられている。人体のキチナーゼは食用するとアレルギーを起こす植物と関連があると（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．，  ２００２；３０，９３０−９３５  ＆  Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ，  １９９９；  ２９，  ６７３−６８０）と考えられている。人体のキチナーゼはマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）から発生し、アテローム性粥状動脈硬化の塊（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅｓ）にも見られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明はキチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）の活性を検知するセットとその使用方法を提供する。
本発明のキチナーゼの活性を検知する方法は、
（１）含有キチン質を含む蛋白質電気泳動ゲル；
（２）電気泳動槽に入れる一定量のテストサンプル；
（３）肉眼で判別できるキチン質染料を利用して手順１のゲルを染色する。
等の手順を含む。
本発明は、キチン質の蛋白質電気泳動ゲルと肉眼で検知できるキチン質染料を含むキチナーゼの活性を検知するセットも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明はキチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）の活性を検知するセット及びその使用方法を提供する。本発明は簡単で迅速なグリコールキチン（ｇｌｙｃｏｌ  ｃｈｉｔｉｎ）の検知方法を公開する。主な実験方法は放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）のキチナーゼを材料として使用し、キチン質を含む１２％ポリアクリルアミドゲルを使ってサンプルの電気泳動の分析を行う。
【０００５】
実験を行う手順は、先ずキチナーゼのサンプルと装填緩衝溶液（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を混合し、それからさらに１４０ボルトで１時間電気泳動分離させる。各電気泳動槽に積載する蛋白質量は１０ｍｇ以上にしなければ、クマシーブリリアントブルー染料で色が出ない。電気泳動槽にそれぞれ異なる活性単位のキチナーゼを入れ、：第１第２欄は５．０  ×  １０−４、第３第４欄は２．５  ×  １０−４，第５第６欄は１．３  ×  １０−４，第７第８欄は６．５  ×  １０−５とする。そのうち第２、４、６と８欄の電気泳動槽にはＳＤＳ緩衝液と混合したサンプルを入れ、混合液を沸騰水の中に入れて１５分加熱してから電気泳動分析を行う。また、第１、３、５と７はサンプルとβ−メルカプトエタノールを含まないＳＤＳ緩衝液を混合し、過熱せずにそのまま電気泳動分析を行う。
【０００６】
電気泳動でサンプルを分離させた後、分離したゲルを０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝溶液に浸し、この溶液には重量の百分比が１％の脱イオン処理Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含める。続けて、ゲルを室温で浸して、１５分軽く揺すり、ゲル中のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を除去する。その後さらにゲルを３７℃の培養箱に入れ、酢酸ナトリウム緩衝液に１２〜２４時間浸し、ゲル中のキチナーゼを十分に反応させる。
反応が完了したら、ゲルをクマシーブリリアントブルー染料で１０分染色し、その後さらに脱色溶液で余分な染料を洗い落とす。染料の成分は、重量百分比が０．０２５％のクマシーブリリアントブルー、重量百分比が２５％のイソプロパノールと重量百分比が１０％の酢酸である。最後にゲルを３ＭＭの試験紙に上に置き、ゲル乾燥機で乾燥させる。キチナーゼに分解された部分は白色に、その他の部分は青色になる。
【０００７】
１９６３年にクマシーブリリアントブルーが蛋白質染料として使用できることが発見された。そのうちＣＢＢ−Ｇ２５０はＣＢＢ−Ｒ２５０より水に溶けにくいが、明るい青色になる。その水に溶けにくい性質により、ＣＢＢ−Ｇ２５０を利用して、電気泳動ゲル中の蛋白質と結合させることができるが、ポリアクリルアミドゲルとは結合させることができない。ＣＢＢ−Ｇ２５０は亜硫酸の静電引力と疏水性の交互作用を利用して蛋白質と結合させることができる。
【０００８】
グリコールキチン（ｇｌｙｃｏｌ  ｃｈｉｔｉｎ）は正電性があり、クマシーブリリアントブルーで染色できる。キチナーゼの活性を測定する時、ゲルの電気泳動中の乙二醇キチン質はキチナーゼに分解されてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の単体分子或いは低分子量ポリマーとなり、分解されたものはゲル洗浄の段階で除去される。キチナーゼはキチン質を分解した後、ゲル上に退色の痕跡を残し、肉眼でも観察できる。
【０００９】
本発明のクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）染料を利用してキチナーゼ活性を検知する方法は、銀染色法とＣａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ（Ｃｗ−Ｍ２Ｒ）染色法の代替案である。クマシーブリリアントブルー染料は低価格で、使用便利性がよく、無毒である等の特長があり、銀染色法固定液の問題が解決できる。
【実施例】
【００１０】
実施例１
電気泳動ゲル中のキチン質の染色
本発明では放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）のキチナーゼを材料として採用し、キチナーゼを１２％的ポリアクリルアミドゲルで電気泳動分析した。このゲルには重量百分比０．０１％のキチン質が含まれる。キチナーゼを含むサンプルとβ−メルカプトエタノールを含まないラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）緩衝溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ，  ２％重量百分比  ＳＤＳ，  ｐＨ  ６．８）を混合してから、１４０ボルトで１時間電気泳動処理した。
【００１１】
電気泳動した後、ポリアクリルアミドゲルの分離したゲルを取り出して、０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に浸した。この溶液には重量百分比１％の脱イオン処理Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含まれる。ゲルを室温下で浸して１５分軽く揺すり、ゲル中のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を除去した。その後さらにゲルを３７℃の培養箱に入れ、酢酸ナトリウム緩衝液に浸しゲル中のキチナーゼを十分に反応させた。
反応が完了したら、ゲルをクマシーブリリアントブルー染料で１０分染色し、その後さらに脱色溶液で余分な染料を洗い落とした。最後にゲルを３ＭＭの試験紙に上に置き、ゲル乾燥機で乾燥させた。キチナーゼに分解された部分は白色に、その他の部分は青色になった。
【００１２】
実施例２
異なる酢酸質のキチナーゼ活性
電気泳動ゲルを異なるｐＨ値の酢酸ナトリウム溶液中（ｐＨ５，ｐＨ６和ｐＨ７）に浸して、さらにキチナーゼの活性を測定した。図１Ａのように、キチン質を含むＳＤＳポリアクリルアミドゲルを異なる酸・アルカリ質で電気泳動させ、反応させた。
サンプルの調製で、第２、４、６と８欄の電気泳動槽に緩衝液と混合したサンプルを入れて、混合液を沸騰水に入れて１５分加熱してから電気泳動分析をした。この緩衝液には５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、重量百分比２％の  ＳＤＳと１００ｍＭ  のβ−メルカプトエタノールが含まれ、ｐＨは  ６．８だった。
第１、３、５と７に同様のサンプルを入れるが、沸騰水での加熱はせず、緩衝液はβ−メルカプトエタノールを含まないものとした。
【００１３】
結果からわかるように、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）のキチナーゼはｐＨ６とｐＨ７の反応効果がはっきりとしている。図１Ｂで電気泳動が完了後さらに１２時間反応したキチナーゼが見え、その電気泳動ゲルの白色の色帶が比較的はっきりとしており、２４時間反応させたキチナーゼは、その電気泳動ゲルの白色の色帶がはっきりと見えることがわかる。
実施例３
２種のキチナーゼ検知染料の比較
【００１４】
図２は２種のキチナーゼ染色染料の効果を比較したものである。図２ＡとＢの実験は、１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを利用して電気泳動させることにより、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）のキチナーゼを分析したものである。電気泳動槽中に入れたそれぞれのキチナーゼの活性単位は以下のとおりである。第１第２欄は５．０×１０−４，第３第４欄は２．５×１０−４，第５第６欄は１．３×１０−４，第７第８欄は６．５×１０−５。図２Ａはクマシーブリリアントブルー染料（ＣＢＢ−Ｇ２５０）を利用して染色した結果で、図２はＣａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ（Ｃｗ−Ｍ２Ｒ）染料を利用して染色した結果である。図１Ａの黒い矢印はキチナーゼが電気泳動槽中で移動した位置を示す。
【００１５】
図２ＣとＤの実験は、ＳＤＳを含まない１０％のポリアクリルアミドゲルを利用してサンプルを電気泳動分析するもので、実験方法は同上である。図２Ｃはクマシーブリリアントブルー染料（ＣＢＢ−Ｇ２５０）を利用して染色した結果で、図２ＤはＣａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ（Ｃｗ−Ｍ２Ｒ）染料を利用して染色した結果である。
【００１６】
両者の染色効果を比較すると、図２ＡとＢの実験中、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ（Ｃｗ−Ｍ２Ｒ）染料を利用して染色してから、第５と第７欄の電気泳動槽での結果はクマシーブリリアントブルー染料（ＣＢＢ−Ｇ２５０）を利用して染色した結果よりぼやけていることがわかるが、まだ肉眼で見ることができる。図２の結果この２種の染色方法による効果が優劣つけがたいことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図Ａは異なるｐＨにおいてキチナーゼのの活性染色したものを示す。電気泳動が終了したゲルを０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）と０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０和７．０）に３７℃で  ２４時間浸し、それからさらにクマシーブリリアントブルー染料で染色する（ＣＢＢ−Ｇ２５０）。電気泳動槽にそれぞれ入れるキチナーゼの活性単位は以下のとおりとした。第１第２欄は５．０×１０−４、第３第４欄は２．５×１０−４、第５第６欄は１．３×１０−４、第７第８欄は６．５×１０−５。第２  、４  、６と第８欄に別途加熱処理をしたラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプル緩衝液を入れた。図Ｂにクマシーブリリアントブルー染料（ＣＢＢ−Ｇ２５０）で染色した結果を示す。第１欄に入れるキチナーゼの活性濃度は６．５×１０−５である。第２欄は対照組で、加熱処理をしたラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプル緩衝液を入れた。電気泳動が終了したゲルをそれぞれ３７℃の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．０）中に２時間、６時間、１２時間、２４時間浸した。
【図２】この実験ではＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動とＳＤＳを含まない他ポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用してキチナーゼの活性を検知した。電気泳動槽にそれぞれ異なる活性単位のキチナーゼを入れた。第１第２欄は５．０×１０−４、第３第４欄は２．５×１０−４、第５第６欄は１．３×１０−４、第７第８欄は６．５×１０−５とした。そのうち第２、４、６と第８欄は別途１００℃で１５分加熱処理をし、キチナーゼの活性を除去した。図２ＡとＢの実験では１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用して放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）のキチナーゼを分析した。そのうち図２Ａはクマシーブリリアントブルー染料（ＣＢＢ−Ｇ２５０）を利用して染色した結果で、図２ＢはＣａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ（Ｃｗ−Ｍ２Ｒ）染料を利用して染色した結果である。図２ＣとＤの実験では１０％のＳＤＳを含まないポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用してサンプルを分析した。図２Ｃはクマシーブリリアントブルー染料（ＣＢＢ−Ｇ２５０）による染色の結果で、図２ＤはＣａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ（Ｃｗ−Ｍ２Ｒ）染料を利用して染色した結果である。
【図１】
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【図２】
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