(57)【要約】      （修正有）【課題】食作用を増強し、コロニー形成を阻止し、および/またはペプチドグリカン（PepG）によって誘発または促進される毒性を抑制する、PepGに対する防御性モノクローナル抗体(MAb)を含む治療用組成物の提供。さらにはヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体も提供する。【解決手段】グラム陽性細菌のペプチドグリカンに結合する防御性モノクローナル抗体を含む組成物。この抗体はまた、細菌全体に結合し、in vitroで細菌に対する食作用および死滅作用を増強し、in vivoでグラム陽性細菌による鼻腔でのコロニー形成を阻止する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性細菌のペプチドグリカン(PepG)に結合する治療上有効量の少なくとも1つのMAbを含み、該MAbが、患者への投与の際に治療上有益な結果をもたらす医薬。
【請求項２】
投与によって患者のグラム陽性細菌数が低減される、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
少なくとも1つのMAbが、ELISAにおいて背景と比べて少なくとも2倍大きいレベルでグラム陽性細菌PepGを結合する、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
少なくとも1つのMAbが、グラム陽性細菌に対するオプソニン食作用を少なくとも50%増強する、請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
医薬上許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
少なくとも1つの抗ブドウ球菌薬をさらに含む、請求項１に記載の医薬。
【請求項７】
グラム陽性細菌のリポテイコ酸(LTA)に結合する少なくとも1つのMAbをさらに含む、請求項１に記載の医薬。
【請求項８】
少なくとも1つのMAbが、患者の鼻孔への点滴注入の際にグラム陽性細菌によるコロニー形成を阻止する、請求項１に記載の医薬。
【請求項９】
少なくとも1つのMAbが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）、およびリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）から選択されたグラム陽性細菌のPepGと特異的に結合する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１０】
少なくとも1つのMAbが、MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、MAb-11-569.3、MAb-11-232.3IE9、MAb99-110FC12IE4、A130、およびM130から選択される、請求項１に記載の医薬。
【請求項１１】
少なくとも1つのMAbが、配列番号1および配列番号3から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む可変領域を含む、請求項１に記載の医薬。
【請求項１２】
少なくとも1つのMAbが、配列番号1および配列番号3から選択されたアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含む可変領域を含む、請求項１に記載の医薬。
【請求項１３】
少なくとも1つのMAbが、キメラMAb、ヒト化MAb、およびヒトMAbから選択される、請求項１に記載の医薬。
【請求項１４】
少なくとも1つのMAbが、改変されたFc部分を含み、該改変によって、該Fc部分を介する該Mabの非特異的結合が低減される、請求項１に記載の医薬。
【請求項１５】
少なくとも1つのMAbが、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、SFv、およびscFvから選択される、請求項１に記載の医薬。
【請求項１６】
患者に請求項１〜15のいずれかに記載の医薬を治療上有効量投与することを含む、患者の治療方法。
【請求項１７】
前記患者が、入院中の乳幼児、早産児、火傷被害者、高齢の患者、免疫無防備状態の患者、免疫抑制状態の患者、侵襲性の処置を受けている患者、および保健医療従事者から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
防御性モノクローナル抗体を、静脈内、腹腔内、体内注射、関節内、心室内、クモ膜下内、筋肉内、皮下、鼻腔内、膣内、および経口から選択された経路によって投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ATCCに受託番号PTA-2492で寄託されているハイブリドーマ細胞系。
【請求項２０】
ATCCに受託番号PTA-3659で寄託されているハイブリドーマ細胞系。
【請求項２１】
医薬上許容可能な担体中に少なくとも1つの精製PepG、ペプチド、その断片およびエピトープを含むワクチン。
【請求項２２】
請求項21記載のワクチンを治療上有効量投与することを含む、患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、2001年12月21日出願の米国仮出願第60/343,444号(代理人整理番号07787.6004)に基づくものであり、またその利益を請求するものである。本出願はこの仮出願の全開示に依拠するが、この開示を本明細書に参考として取り込むものとする。本出願は、参考として本明細書に特に取り込まれる1998年6月15日出願の米国特許出願第09/097,055号と関連しており、また米国特許出願第60/341,806号であって「Methods for Blocking or Alleviating Staphylococcal Nasal Colonization by Intranasal Application of Monoclonal Antibodies」を発明の名称とする2001年12月21日に先に出願された出願、ならびに米国特許第5,571,511号および同第5,955,074号にも関連しており、これらの出願の開示のすべてを参考として本明細書に特に取り入れるものとする。
【０００２】
発明の説明
発明の分野
本発明は、免疫学および感染疾患の分野におけるものであり、グラム陽性細菌、特にペプチドグリカンが表面に露出している細菌に特異的な防御性抗体に関する。本発明は、モノクローナル抗体、ならびにその断片、領域および誘導体を含む。
【背景技術】
【０００３】
序
人類は、細菌、特にグラム陽性細菌によって引き起こされる感染と長い間闘ってきた。グラム陽性細菌の表面構造および細胞壁は、複雑なマトリックスを形成しており、それによって細菌と宿主との相互作用に必須の機能が実現される。細胞壁は、(N-アセチルグルコサミンとN-アセチルムラミン酸の単位が繰り返される)ペプチドグリカン巨大分子と、それに結合したテイコ酸、リポテイコ酸および炭水化物を含むアクセサリー分子とからなる(たとえば、非特許文献１および非特許文献２を参照のこと)。加えて、細菌の細胞壁に固定された多くの表面タンパク質が存在する (たとえば、非特許文献３を参照のこと)。
【０００４】
身体は、そのような細菌からの防御のため、様々な手段を利用する。皮膚や粘膜などの機械的なバリアは、身体の最初の防御線である。病原体がこれらのバリアをすり抜け、増殖し始めることができた場合には、多形核白血球すなわちPMNと呼ばれる白血球が、感染に応答するための身体が使用する次の機構である。最後に、獲得免疫の機構が介入し、そこで、循環する抗体および補体(外来の標的に非特異的に結合することができる可溶性血漿タンパク質)が、侵入する病原体に結合し、食細胞を引き寄せ、次に食細胞が病原体を飲み込み、消化する。この後者の機構は、食作用と呼ばれ、また病原体に結合し、食作用を促進する抗体および補体は、オプソニンと呼ばれる。オプソニンによる食作用の増強は、オプソニン化と呼ばれる。オプソニン化では、抗体と補体の組合せ(「古典的経路」)が利用されることもあるし、または補体のみ(「副経路」)が利用されることもある。ブドウ球菌(および他のグラム陽性細菌)に対する食作用および死滅作用が不完全であると、宿主への侵入、感染、時には死がもたらされるので、オプソニン化および食作用の系は重要である。
【０００５】
この種の細菌は、皮膚および他の表面に蔓延するので、大部分の哺乳類は、グラム陽性細菌に曝されている。したがって、ヒトを含む哺乳動物からのポリクローナル血清は、グラム陽性細菌の数多くの異なる細胞壁および細胞表面成分に結合するIgGを含んでいるようである。そのようなIgGの集合物は、グラム陽性細菌に対する防御に役立つかもしれない。なぜなら、多くの、表面の抗原上のエピトープまたは(ペプチドグリカン、テイコ酸、リポテイコ酸、タンパク質、炭水化物などの)細胞壁分子に結合するポリクローナルIgGは、まとまってオプソニン性になり、グラム陽性細菌に対する食作用を促進し得るからである。したがって、ポリクローナル血清中の抗体の複合機能が、その血清の機能活性となっているかもしれない。しかし、この種の細菌による感染が絶えず存在することことによって証明されるように、このようなポリクローナルIgGが必ずしも防御性でないことは明らかである。臨床医は、グラム陽性細菌に対する抗体のレベルを高めるために、この種の細菌に基づくワクチンを投与する。しかし、免疫感作に使用される多くの細菌細胞抽出物は、１つのエピトープまたは抗原について純粋でないので、得られる抗体の活性が、数種の異なる細胞壁成分に対する活性を示すこともある。細胞壁を抗体の標的とし、かつ細胞壁調製物の純度を確認することができない場合、このことは特に問題となる。
【０００６】
さらに、ポリクローナル血清は、ある個体では防御性であるかもしれないが、単一のエピトープに対する抗体の機能上の役割を解明するためには使用できない。なぜなら、ポリクローナル血清は、当然、多くの異なる抗体を含み、多数の抗原およびエピトープに結合するからである。それぞれの抗体が、複合機能の活性に寄与し得る。したがって、細胞壁上の特定のエピトープに対する抗体がグラム陽性細菌に対するオプソニン因子として働く能力は、明確に定まらない。
【０００７】
加えて、あるエピトープに対する抗体には、食作用を促進するものもあれば、細胞への細菌の付着を阻止するなど、別の機能を有するものもあると思われる。したがって、食作用の増強、細菌付着の阻止、毒性活性の中和など、特定の抗体の潜在的な機能を解明に導き、それによって、予想どおりの防御を行う治療の基盤を築くことができるのは、特定のエピトープに対するモノクローナル抗体しかない。
【０００８】
また、最近まで、ペプチドグリカンまたはペプチドグリカンに対する抗体の役割を決めることは、ペプチドグリカン調製物が不純であるために困難であった。テイコ酸およびリポテイコ酸は、細胞壁ペプチドグリカンと密接に関連している。さらに、表皮ブドウ球菌などのある種の細菌については、テイコ酸とリポテイコ酸は、同じグリセロールリン酸主鎖をもっている。このようなテイコ酸部分は、細胞壁抽出物から調製したペプチドグリカン調製物を容易に混入し得る。したがって、このような調製物に対する血清の活性は、ペプチドグリカンに対する抗体の活性でなく、汚染物質に対する抗体の活性によるものであるかもしれない(たとえば、非特許文献４を参照のこと)。最近、我々は、グラム陽性細菌に対するオプソニン活性を含む複数の機能活性を有するLTAに対するモノクローナル抗体を開発した。このような抗体を使用すると、ペプチドグリカン調製物がLTA汚染物質を含まないことを確認することができる。
【０００９】
さらに、ペプチドグリカンは、細菌界に遍在しているので、ペプチドグリカンに対する特異性の高いオプソニンまたは防御性抗体はありそうもない。加えて、防御性抗体の役割についても疑問が残る。Petersonと共同研究者らは、正常なヒト血清が、細胞壁抽出物およびペプチドグリカンをオプソニン化することを示している（非特許文献５）。しかし、血清中に多くの異なるエピトープに対する多くの異なる抗体が存在していたことは明らかである。ペプチドグリカン・マトリックス上で少なくとも３つの異なる抗原部位が識別されている。Petersonと共同研究者らがペプチドグリカンをリソスタフィンで切断して小さな可溶性の断片にしたとき、その断片は、正常なヒト血清の存在下でもはやオプソニン化されなかった。小さな断片では十分な数の異なる抗体の結合を支えられなかった、またペプチドグリカン上の単一のエピトープに対する抗体がオプソニンでなかったという説明がつく。したがって、ペプチドグリカンは、黄色ブドウ球菌のオプソニン化および食作用を補体のみによって促進する副経路を活性化し得るものの、オプソニン化および食作用における抗体の役割および古典的経路については、未だ理解し難い。
【００１０】
このような過程における抗体の役割は、同じグループによる研究で、IgG欠損血清が完全にオプソニン性であることが判明したとき、さらに不確かになった。この結果は、抗体が除去された血清で好中球のIgG Fcレセプターをブロックした後の該血清を使用して、PMNによる正常なレベルの死滅作用が示されたという他のグループによる研究と一致していた。多くの細胞壁エピトープが表面下深くにあり、生きた増殖する細菌においてはタンパク質および莢膜多糖体に覆われていることもあるという事実は、さらなる複雑さをはらんでいる（非特許文献６及び７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Hancock, I.C. 1997. Biochem. Soc. Trans.25:183-187
【非特許文献２】Salton, M.R.J. 1994. The Bacterial Cell Envelopw - A Histrical Perspective, in j.-M. Ghuyson and R.Hakenbeck(ed.), Bacterial Cell Wall, Elsevier Science BV, Amsterdam, pp.1-22
【非特許文献３】Navarrem Microbiology and Molecular Biology Reviews 63:174-229
【非特許文献４】Waldvogel, Francis A.2000. Staphylococcus Aureus (including toxic Shock Syndrome), Mandell, G.L. et al. (ed.) Principles and Practice of infectious Diseases, Fifth Edition, Churchill Livingstone, Philadelphia, PA, pp.1760-1775
【非特許文献５】Peterson, Phillip K., The Journal of Clinical Investigation 61: 597-609
【非特許文献６】Peterson, Phillip K., Infection and Immunity 15:760-764
【非特許文献７】Peterson, Phillip K., Infection and Immunity 19: 943-949
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、特定のエピトープに結合するペプチドグリカンに対するモノクローナル抗体が、他の抗原特異性もしくはエピトープ特異性を有する別の抗体と協調して働かずに機能活性をもち得るかどうかはわかっていなかった。単一の特異性を有する抗体が、宿主の免疫および防御にとって重要ないくつかの機能を実現することができるかどうかもわかっていなかった。そのようなモノクローナル抗体は、グラム陽性感染の予防または治療に有用となるはずであり、さらにこれらが結合するエピトープまたは抗原類は、宿主において防御免疫を誘発するワクチンとして有用となるはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、食作用を増強し、コロニー形成を阻止し、および/またはペプチドグリカン（PepG）によって誘発または促進される毒性を抑制する、PepGに対する防御性モノクローナル抗体(MAb)を含む治療用組成物に関する。上述のとおり、食作用は、グラム陽性細菌に対する有効な免疫にとって重要である。本発明は、グラム陽性細菌に対する食作用およびその死滅作用を強化し、したがって、全身の感染を阻止または治療し得る、PepGに対する防御性オプソニンMAbを提供する。鼻腔でのコロニー形成は、ブドウ球菌の主たる貯蔵所であることがわかっており、ブドウ球菌の鼻腔でのコロニー形成とその後のブドウ球菌感染との強い相関が立証されている。本発明は、ブドウ球菌などのグラム陽性細菌による鼻腔でのコロニー形成を阻止および/または軽減し、それによってそれに伴う感染の発生率および/または重症度を低減する防御性抗PepG MAbを提供する。防御性抗PepG MAbは、静脈内、皮下、筋肉内、または他の投与経路によって投与されていれば、細胞壁成分の毒性作用を低減し得る。したがって、この種の治療用組成物は、グラム陽性細菌による感染を予防もし、治療もする。
【００１４】
本発明の防御性モノクローナル抗体には、IgGとIgM両方のPepG特異的抗-PepG MAbが含まれ、またPepG特異的な、マウス、マウス/ヒトキメラ、ヒト化、または完全なヒトMAbが含まれる。本発明の防御性モノクローナル抗体は、PepG上のどの複数エピトープも対象とする。本発明の抗体は、複数の結合特性および機能活性を示す。
【００１５】
これらの防御性モノクローナル抗体は、正常またはコロニー形成のあるヒト被験者または他の哺乳動物の鼻孔内に単一または併用で投与して、鼻粘膜での細菌のコロニー形成を阻止または軽減し、それによって全身の感染を防止し、またはグラム陽性細菌の広がりを縮小することができる。
【００１６】
本発明は、食作用を増強し、鼻粘膜でのコロニー形成の結果として生じ得る細菌感染を阻止し、さらにPepGおよび他の細胞壁成分または毒素の毒性作用を低減するために、単一の防御性抗PepG MAbを使用する方法およびMAbを併用する方法も含む。
【００１７】
さらに、PepGエピトープまたはPepG抗原や、そのようなエピトープおよび抗原を模倣するペプチドは、グラム陽性細菌に対するオプソニン抗体を誘い出すワクチンとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】M130の重鎖可変領域および軽鎖可変領域についてのcDNAクローン化戦略を示す図である。
【図２−１】(A)M130抗体軽鎖可変領域(配列番号1および配列番号2)および(B)M130抗体重鎖可変領域(配列番号3および配列番号4)のポリペプチド配列および核酸配列を示す図である。
【図２−２】(A)M130抗体軽鎖可変領域(配列番号1および配列番号2)および(B)M130抗体重鎖可変領域(配列番号3および配列番号4)のポリペプチド配列および核酸配列を示す図である（図２-１のつづき）。
【図３】pJSB22重鎖発現プラスミドを示す図である。
【図４】pJSB6軽鎖発現プラスミドを示す図である。
【図５】pLG1 ビ-シストロン性発現プラスミドを示す図である。
【図６】抗ヒトIgGのマウス/ヒトキメラ抗体A130への結合を示す図である。
【図７】マウス/ヒトキメラ抗体A130の黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンに対する結合活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用される用語「抗体」には、全長抗体およびその部分が含まれる。全長抗体は、1対、またはより一般には2対のポリペプチド鎖をもち、各対は、軽鎖と重鎖とを含む。それぞれの重鎖または軽鎖は、2つの領域、すなわち (抗原に対する認識および結合を付与する) 可変領域と(局在化および細胞間相互作用と関連のある)定常領域とに分けられる。したがって、全長抗体は、一般に、2つの重鎖定常領域(HCまたはCH)、2つの重鎖可変領域(HVもしくはVH)、2つの軽鎖定常領域(LCまたはCL)、および2つの軽鎖可変領域(LVまたはVL)を含む(図2)。1つまたは複数の軽鎖は、λ鎖でもκ鎖でもよい。したがって、本発明の実施形態では、抗体は、少なくとも1つの重鎖可変領域および1つの軽鎖可変領域を含み、抗体が抗原を結合するようになっている。
【００２０】
本発明の別の態様は、相補性決定領域すなわちCDRと、フレームワーク領域すなわちFRとを交互に含む可変領域を含む。CDRは、可変領域内の配列であり、一般に抗原特異性を付与する。
【００２１】
本発明は、抗原結合を付与するのに十分な可変領域配列を含む抗体部分も含む。抗体部分には、以下のものに限定されないが、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、SFv, scFv(1本鎖Fv)が含まれ、パパイン切断やペプシン切断など、完全抗体のタンパク分解切断によって生成されるものも、あるいは完全な重鎖および軽鎖のcDNAを操作して、重鎖および軽鎖の断片を別々に、または同じポリペプチドの部分として生成する組換え法によって生成されるものも含まれる。
【００２２】
本発明のMAbは、ヒト抗体、非ヒト動物の抗体、およびそのハイブリッドに対応する抗体配列を含む。本明細書で使用される用語「キメラ抗体」には、ラットやマウスの抗体など、動物の抗体由来のその可変領域が、別の分子、たとえばヒトIgG、IgA、もしくはIgM抗体由来の定常領域ドメインと融合している抗体が含まれる。
【００２３】
キメラ抗体の1種である「ヒト化抗体」は、既知のヒト可変領域配列と(できる限り)一致するように(突然変異誘発またはCDR移植によって)変更された可変領域を有する。CDR移植は、所望の特異性を備えた抗体からのCDRをヒト抗体のFR上に移植し、それによって大部分の非ヒト配列をヒト配列と交換するものである。したがって、ヒト化抗体は、(そのアミノ酸配列が)既知のヒト抗体の配列としっかりと一致する。マウスモノクローナル抗体のヒト化によって、ヒト抗マウス抗体、すなわちHAMAへの応答の程度が低減される。本発明はまた、HAMA応答を可能な限り回避する完全なヒト抗体も含む。
【００２４】
本発明は、「改変抗体」も含むが、それには、たとえば、切断(truncated)または改変された抗体をコードする遺伝子によってコードされるタンパク質またはペプチドが含まれる。そのようなタンパク質またはペプチドは、本発明の抗体と同様に機能し得る。ブドウ球菌による鼻腔でのコロニー形成を阻止または軽減する能力を含むエフェクター機能を強化し得る、別の配列の付加などの他の改変も本発明の範囲内である。そのような改変には、たとえば、抗体のアミノ酸配列へのアミノ酸の付加、抗体のアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、抗体アミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸の代替アミノ酸による置換、アイソタイプスイッチ、およびクラススイッチが含まれる。
【００２５】
ある実施形態では、抗体のFc領域を、細菌タンパク質に結合しないように改変してもよい。Fc領域は通常、免疫系の補助細胞(accessory cells)に対する結合部位となる。抗体が細菌に結合し、細菌を覆うと、そのような補助細胞が、覆われた細菌を認識し、感染に応答する。細菌タンパク質が、補助細胞の結合位置の近くでFc領域に結合すると、補助細胞の正常な機能が阻害される。たとえば、黄色ブドウ球菌の細胞膜に見られる細菌タンパク質であるプロテインAは、補助細胞結合部位付近のIgGのFc領域に結合する。プロテインAは、そうする際に、こうした補助細胞の機能を阻害し、したがってこの細菌の一掃が妨害される。この抗細菌免疫応答の妨害を回避するために、補助細胞への結合を失うことなく、プロテインAの非特異的な結合を妨げるように本発明の抗体のFc部分を改変することができる(たとえば、(10)を参照のこと)。
【００２６】
このような様々な形態に照らして、本発明の抗体には、全長抗体、抗体部分、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および改変抗体が含まれ、別段の指示がない限り、一まとめにして「MAb」と呼ぶ。
【００２７】
本明細書で使用される用語「エピトープ」とは、抗体がPepGに結合する、PepGの１つまたは複数の領域を指す。結合される領域は、その分子と連続する部分であってもよいし、そうでなくてもよい。
【００２８】
本明細書で使用される用語「抗原」とは、ポリペプチド配列、非タンパク質性分子、または免疫系が認識することのできる任意の分子を指す。抗原は、完全な大きさのブドウ球菌タンパク質もしくはその分子でも、またはその断片でもよく、断片は全長に満たないタンパク質をコードしている組換えcDNAから、あるいは完全な大きさの分子もしくはタンパク質、またはその断片に由来する断片から生成される。そのような断片は、タンパク質分解によって生成することができる。抗原は、ブドウ球菌タンパク質のエピトープを含むポリペプチド配列でもよく、エピトープは、そのタンパク質の線状のポリペプチド配列と連続していなくてもよい。抗原をコードするDNA配列は、当業者によく知られている手順によって同定、単離、クローン化し、原核生物または真核生物細胞に形質移入して、発現させることができる(25)。抗原は、ブドウ球菌分子もしくはそのタンパク質のアミノ酸配列の領域と100%同一であってもよく、あるいは少なくとも95%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも85%同一であってもよい。抗原は、ブドウ球菌分子もしくはそのタンパク質のアミノ酸配列との同一性が100%、95%、90%、または85%未満でもよいが、ただし、それでも天然のブドウ球菌分子もしくはそのタンパク質に結合する抗体を誘い出すことができるものとする。
【００２９】
ペプチド抗原の％同一性は、たとえば、Devereuxら(Nucl. Acids Res. 12: 387、1984)による記載があり、University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)から入手できるGAPコンピューター・プログラム、バージョン6.0を使用し、標的抗原もしくはエピトープの配列とブドウ球菌配列の類似部分を比較して決定することができる(40)。このGAPプログラムは、SmithおよびWaterman(Adv. Appl. Math 2: 482、1981)によって改定されたNeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. 48: 443、1970)のアラインメント法を利用するものであり、本明細書に載せたタンパク質もしくは核酸配列の％同一性の決定に応用できる(41,42)。GAPプログラム用の好ましいデフォルト・パラメーターは、以下のもの、すなわち、(1)SchwartzおよびDayhoff編、「Atlas of Protein Sequence and Structure」、National Biomedical Research Foundation、353〜358ページ、1979年に記載されているような、(同一について1の値、非同一について0の値を含む)ヌクレオチド用単項比較行列と、GribskovおよびBurgessのNucl. Acids Res. 14: 6745、1986の加重比較行列;(2)ギャップ毎の3.0のペナルティーおよび各ギャップ中の記号毎の追加の0.10ペナルティー;ならびに(3)末端のギャップについてはペナルティーなし、を含む(43、44)。
【００３０】
あるいは、最高で10もしくは20単位の短い領域、または、たとえば抗体配列間もしくはその相同的な部分間の比較的相同性の高い領域の簡単な比較では、ペプチドもしくはヌクレオチド配列の定められた領域についての％同一性は、一致するアミノ酸またはヌクレオチドの数を、並べ合わせた配列の全長で割り、100%を掛けて決定することができる。MAb鎖中、たとえばCDR内またはその隣に1個、2個、または3個のアミノ酸の挿入またはギャップが存在する場合では、その挿入またはギャップを単一のアミノ酸ミスマッチとしてカウントする。
【００３１】
抗原は、細菌表面抗原および/または病原性抗原および/または付着性抗原であってよい。表面抗原は、抗原が無傷の全細菌(whole bacterium)の形態を取っている、すなわち抗原が細胞質の内側にないときに、抗体に接近できる抗原である。病原性抗原は、発病過程に関与し、宿主に疾患を引き起こす抗原である。病原性抗原には、たとえば、LTA、ペプチドグリカン、毒素、線毛、鞭毛、および付着性抗原が含まれる。付着性抗原は、ブドウ球菌細菌が鼻孔表面に付着する能力を媒介する。抗原は、炭水化物や脂質など、ブドウ球菌の非タンパク質成分でもよい。たとえば、ペプチドグリカンおよびリポテイコ酸は、ブドウ球菌の細胞壁に見られる2種の非タンパク質抗原である。抗原は、それが免疫応答を惹起する限り、非タンパク質分子の断片を含み、または包含していてよい。
【００３２】
本明細書で使用される抗原には、PepGに対する抗体応答を惹起し得る分子が含まれる。抗原は、PepG分子でも、またはその断片でもよく、断片は、分子全体またはその断片から酵素によって、または別な方法で得ることができる。抗原は、PepGのエピトープを含むPepG断片でもよく、エピトープは、分子の高分子構造と連続していなくてもよい。抗原は、PepGの領域に対する同一性が100%でもよいし、その同一性が95%、90%、または85%でもよい。抗原のPepG分子との同一性は、それよりも低くてもよいが、ただし、PepGに結合する抗体を誘い出すことができるものとする。抗原は、若干の構造上の類似性によって、PepGに結合する抗体を誘い出すことのできる無関係な分子でもよい。本発明のある実施形態では、抗原は、細菌表面のPepGに結合する抗体を誘い出す。ある実施形態では、抗原は、PepGに結合する抗体を誘い出し、かつcDNAによってコード化することのできるペプチドである。諸手順は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2版に一般に記載されており、いかなる目的にせよこの文献を参照により本明細書に援用する(25)。
【００３３】
本発明の特定の抗原には、本明細書に記載のハイブリドーマ11-232.3、11-248.2、11-569.3、11-232.3 IE9、99-110FC12 IE4(MAb-11 232.3、MAb-11-248.2、MAb-11-569.3、MAb-11-232.3 IE9、およびMAb-99-110FC12 IE4とも呼ぶ)、A130、またはM130によって産生されたモノクローナル抗体のいずれかに結合する抗原が含まれる。
【００３４】
抗体は、タンパク質ELISAまたは他のアッセイによって、背景シグナルと比べて少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、さらに少なくとも10倍大きい、すなわち、非特異的結合に対して得られるシグナルの少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍大きいシグナルが抗体から得られる場合、抗原、エピトープ、またはタンパク質に特異的に結合するとされる。抗体は、たとえばメタノール−固定化細菌ELISAまたは生細菌ELISAによって、背景シグナルと比べて少なくとも1.5倍、2倍、または3倍大きいシグナルが抗体から得られる場合、細菌に特異的に結合するとされる。
【００３５】
「増強された食作用」とは、本明細書では、この適用例の方法または他の同等のアッセイによって分析したところの、背景レベルを上回る食作用の増大を意味する。価値があるとみなされるレベルは、細菌の種類や感染の重症度を含む特定の感染状況に応じてかなり様々であろう。たとえば、増強された食作用活性は、背景の食作用を75%、80%、85%、90%、95%、または100%と同程度またはそれ以上に上回るものとすることができる。増強された食作用は、背景の食作用を50%、55%、60%、65%、または70%と同程度またはそれ以上に上回るものとしてもよい。本明細書では、好中球を媒介とするオプソニン性貪食殺菌活性を測定するアッセイによって、オプソニン活性を評価してもよい。
【００３６】
本発明のMAbは、全身および局所のブドウ球菌感染の予防および他の治療に有用である。この点で、意図的なブドウ球菌の点滴注入によって曝そうが、全身に曝そうが、ブドウ球菌に曝す前、それと同時、またはその後にMAbを投与するとき、哺乳動物の鼻孔中のコロニー数を減少させることができれば、本発明のMAbは、ブドウ球菌の鼻腔コロニー形成を「軽減」するという。たとえば、以下に記載の鼻腔コロニー形成動物モデルでは、MAbまたはMAb集合体は、コロニー形成の程度、または鼻腔組織のサンプルから成長し得る細菌コロニーの数が、MAbまたはMAb集合体の投与後に低減される場合、コロニー形成を軽減するとみなされる。MAbまたはMAb集合体は、本明細書に記載の鼻腔コロニー形成アッセイにおいて、コロニー数を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%に減少させるとき、コロニー形成を軽減する。100%の軽減は、根絶と呼んでもよい。
【００３７】
意図的な点滴注入によってであろうが、他の方法によってであろうが、ブドウ球菌に曝す前またはそれと同時に鼻孔に投与するとき、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の鼻腔コロニー形成を妨げることができれば、MAbは、ブドウ球菌のコロニー形成を「阻止」するという。本明細書に記載の鼻腔コロニー形成アッセイでは、本発明のMAbで処置した哺乳動物から取った鼻腔組織サンプルからのブドウ球菌コロニーが、対照哺乳動物と比較して、12時間以上や24時間以上などの長期間にわたり増殖し得ない場合、MAbは、コロニー形成を阻止する。MAbは、本明細書に記載の鼻腔コロニー形成アッセイにおいて、コロニー形成のある動物の数が対照動物より減少する場合も、コロニー形成を阻止する。たとえば、物質およびグラム陽性細菌を投与した後、コロニー形成のある動物の数が対照動物の少なくとも25%、少なくとも50%、および少なくとも75%に減少する場合、あるいは処置した個体から取ったサンプルからのコロニーが、12時間以上や24時間以上などのより長い期間にわたり増殖しない場合、MAbは、コロニー形成を阻止するとみなされる。
【００３８】
臨床的には、鼻腔スワブ(nasal swab)を適切な細菌用培地で培養して、ヒトの患者における鼻腔コロニー形成の有無を判定する。これらの培養物に、ブドウ球菌コロニーの有無によって評点をつける。この種の定性アッセイ系では、ブドウ球菌コロニー形成の阻止と軽減とが区別し難いかもしれない。したがって、鼻腔スワブなどの定性アッセイの目的では、コロニー形成前の徴候を示さないヒト患者において、12時間以上または24時間以上などのより長い期間にわたりその後のコロニー形成を防止する場合、MAbはコロニー形成を「阻止」する。本発明のMAbの投与前にすでにブドウ球菌陽性であるヒト患者から取った陽性培養物の数が識別可能に減少する場合、MAbは、コロニー形成を「軽減」する。
【００３９】
したがって、本発明のMAbの鼻腔内投与を行って、ブドウ球菌の鼻腔コロニー形成を阻止および/または軽減することができる。「有効量」のMAbを投与(点滴注入)すると、哺乳動物は、1)投与後少なくとも12時間ブドウ球菌による鼻腔コロニー形成がない、2)鼻孔中のグラム陽性菌数もしくはブドウ球菌コロニー数の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な減少、または3)鼻孔から取られた培養グラム陽性菌もしくはブドウ球菌の出現率(frequency)の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な減少、または4)グラム陽性菌もしくはブドウ球菌感染出現率の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な減少のいずれかを示す。
【００４０】
「点滴注入」は、哺乳動物の鼻孔に有効量のMAbを供給することのできる任意の送達系を含む。
【００４１】
本発明の目的は、院内感染を含むブドウ球菌感染の出現率を低減することである。有効量の投与には、鼻孔以外の身体部位が関与するブドウ球菌感染、たとえば、全身感染や外傷部位もしくは手術部位感染の可能性が、識別可能に、医学的に意味のある、または統計的に有意に低減されることが十分に証明されたものが含まれる。そのような証明法は、たとえば、動物研究、または早産児、入院もしくは外来外科治療を受けている者、火傷被害者、留置カテーテル、ステント、関節置換などを受けている患者、老年患者、遺伝的に、化学物質によって、もしくはウイルスによって免疫系が抑制されている患者を含むがこれらに限定されないグラム陽性細菌感染の恐れのある患者の臨床治験を含む。
【００４２】
本明細書で使用される、患者の「治療」は、「治療上有益な結果」をもたらす本発明の組成物の投与を含み、これによって、1)存在するグラム陽性細菌感染もしくはコロニー形成の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な低減、寛解、または軽減、あるいは2)その後の細菌による攻撃、感染、またはコロニー形成に対する、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な阻止作用または予防、あるいは3)院内感染の可能性の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な低減であると定義される。したがって、治療は、コロニー形成または感染のある患者におけるグラム陽性細菌数の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な減少、ならびにその後のコロニー形成または感染の可能性の低減を含む。本明細書で使用される「コロニー形成」とは、患者の、特に鼻孔における症状を伴わないグラム陽性細菌の存在を指し、「感染」とは、任意の身体部位における症状を伴う感染を指す。
【００４３】
本明細書で使用される「医学的に意味のある」とは、患者の状態を改善し、患者の予後を改善し、患者の罹患率または死亡率を低減し、または患者集団の中での、ここで取り組む細菌感染に起因する疾患発生率または死亡率を低減するどんな治療も含む。「統計的に有意」な結果であるかどうかは、用いられる厳密な統計検定に応じて特に判定または確認される。当業者ならば、用いたどの統計検定においても、その検定そのもののパラメーターによって判定して、統計的に有意な結果であるかどうかが容易にわかるであろう。そのような周知の統計検定の例には、X2検定(カイ二乗検定)、Studentのt検定、F検定、M検定、Fisherの精密検定、二項精密検定、Poissonの精密検定、反復測定一方向もしくは二方向分散分析、および相関係数の算出(PearsonおよびSpearman)が含まれるがこれらに限定されない。
【００４４】
本発明のMAbは、「防御性MAb」を含む。防御性MAbは、1)PepGに対する強い結合を示し、2)グラム陽性細菌のオプソニン化および死滅作用(オプソニン食作用死滅)を強化し、さらに3)細菌のコロニー形成を弱める。このようなMAbは、PepGによって誘発または促進される毒性も抑制する。別の実施形態では、このような防御性MAbは、グラム陽性細菌感染を治療するための治療用組成物を含む。
【００４５】
ワクチンは、グラム陽性細菌に対する防御性オプソニン抗体の産生を刺激する場合、防御免疫応答を付与すると考えられる。防御性オプソニン抗体の産生は、ワクチンを投与された被験者の血清中にそのような抗体が存在しているかどうかを、ワクチンを投与していない対照と比べることによって、測定することができる。血清中に防御性オプソニン抗体が存在するかどうかは、本明細書に記載の活性アッセイ、または他の同等のアッセイによって測ることができる。オプソニン食作用殺菌アッセイを使用する場合、試験血清によって対照血清より少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも100%多く細菌が死滅していれば、免疫が強化されたとみなす。
【００４６】
本発明の実施形態
本発明の一態様は、全細菌(whole bacteria)に結合する防御性抗PepG MAbに関する。細菌には、すべてのグラム陽性細菌、特にブドウ球菌および連鎖球菌が含まれる。PepGエピトープの多くは、グラム陽性細菌の表面で利用されないことがあるので、本発明は、全細菌だけでなく単離されたPepGにも結合する防御性MAｂを提供する。このような防御性MAｂは、PepGを結合することによって、そうした分子の毒性作用を中和することができる。
【００４７】
本発明のもう1つの態様は、食細胞との相互作用が可能になるような仕方で結合し、それによって食作用を促進する、オプソニンとして機能する防御性MAｂに関する。そのような防御性MAｂは、グラム陽性細菌感染を阻止または軽減するものでよい。そうした防御性抗PepG MAbを単独で使用しても、または特異性の異なるMAb、たとえばLTA特異的なMAbと併用してもよく、これによってグラム陽性細菌および/または他の生物によって引き起こされる疾患を治療することができる。本発明の別の態様は、細菌の鼻腔コロニー形成を阻止または軽減し得る防御性抗PepG MAbである。
【００４８】
本発明の特定の実施形態には、本明細書に記載のモノクローナル抗体MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、MAb-11-569.3、MAb-11-232.3IE9、MAb-99-110FC12IE4、A130、またはM130の抗原結合ドメインを含む防御性MAｂが含まれる。
【００４９】
本発明は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域をヒト定常領域に融合させた防御性キメラ抗PepG MAbも含み、このキメラ抗体は、哺乳動物細胞の培養中に産生される。
【００５０】
たとえば、キメラ重鎖は、本発明の防御性マウス抗PepG MAbの重鎖可変領域の抗原結合領域を、ヒト重鎖定常領域の少なくとも一部分に連結したものを含むことができる。このキメラ重鎖は、防御性マウス抗PepG MAbの軽鎖可変領域の抗原結合領域をヒト軽鎖定常領域の少なくとも一部分に連結したものを含むキメラ軽鎖と組み合わせてもよい。
【００５１】
本発明の特定の実施形態では、防御性キメラ抗体は、本明細書に記載のヒト/マウスキメラA130抗体である。別の実施形態では、防御性キメラ抗体は、本明細書に記載のモノクローナル抗体MAb-11-232.3、MAb-11 248.2、MAb-11-569.3、MAb-11-232.3IE9、MAb-99-110FC12IE4、A130、またはM130のいずれかの抗原結合ドメインを含む。
【００５２】
防御性抗PepGモノクローナル抗体によって結合されるエピトープおよび抗原も、本発明の態様である。本発明の別の態様には、脊椎動物においてグラム陽性細菌のPepGに結合するオプソニン抗体を誘い出すエピトープおよび抗原が含まれる。このようなエピトープおよび抗原は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、またはニワトリに導入されたとき、防御性のオプソニン抗体を誘い出す。このようなエピトープおよび抗原を模倣し、かつグラム陽性細菌のPepGに対するオプソニン抗体を誘い出すことのできるペプチドも、本発明に含まれる。こうしたPepGのエピトープ、抗原、ペプチド、および断片をワクチンとして使用して、グラム陽性細菌によって引き起こされる感染を防御または軽減することもできる。
【００５３】
本発明は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体である本発明の防御性抗PepG MAb、ならびにその断片、領域、および誘導体を含む治療用組成物も開示する。このような組成物は、医薬上許容可能な担体を含んでいてもよい。本発明の治療用組成物は、あるいは、単離された抗原、エピトープ、またはその一部を、医薬上許容可能な担体と共に含むことができる。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明の治療用組成物には、以下のものに限定されないが、本明細書に記載のモノクローナル抗体MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、MAb-11-569.3、MAb-11-232.3IE9、MAb-99-110FC12IE4、A130、またはM130のいずれかの抗原結合ドメインを含む防御性抗体が含まれる。
【００５５】
医薬上許容可能な担体には、水や、石油系の油、動物性の油、植物油、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む油など、無菌の液体が含まれるがこれに限らない。生理食塩水、水性デキストロース、およびグリセロール溶液も、液体担体として使用することができる。適切な薬剤用担体は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第18版(8)に記載されており、この文献をいかなる目的でも参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００５６】
さらに、本発明は、種々の送達用賦形剤および/もしくは担体を用いて実施してもよい。そのような賦形剤は、貯蔵中および、粘膜への適用を含むがこれに限定されない投与の際に、たとえば鼻孔への吸入もしくは点滴注入の際に、MAbの半減期を延長することができる。この種の担体は、天然の重合体、半合成重合体、合成重合体、リポソーム、および半固体剤形(8、16、22、26、29、30、37)を含む。天然の重合体には、たとえば、タンパク質および多糖体が含まれる。半合成重合体は、天然の多糖体であるキチンの脱アセチル型であるキトサンなど、天然重合体を改変したものである。合成重合体には、たとえば、ポリリン酸エステル、ポリエチレングリコール、ポリ(乳酸)、ポリスチレンスルホン酸塩、およびポリ(ラクチドコグリコリド)が含まれる。半固体剤形には、たとえば、デンドリマー、クリーム、軟膏、ゲル、およびローションが含まれる。このような担体を使用して、MAbをマイクロカプセル化することも、またはMAbに共有結合させることもできる。
【００５７】
一実施形態では、本発明のMAbは、鼻孔または感染部位への適用向けに粉末、スプレー、エアロゾル、クリーム、ゲルなどとして処方することのできる担体粒子を含み、またはその担体粒子の外側に共有結合もしくは非共有結合している。一実施形態では、担体粒子コアに、粘膜付着性物質を含んでいてもよい溶解性フィルム状のMAbをコートする。担体粒子コアは、不活性でも溶解性でもよい。
【００５８】
本発明はさらに、哺乳動物の鼻孔または他の感染部位に有効量のMAbを供給することのできる送達系を含む。代表例となる非限定的な方式には、滴剤、スプレー、粉末、エアロゾル、ミスト、カテーテル、チューブ、シリンジ;微粒子、ペレット、クリーム用塗布具などが含まれる。本発明の範囲には、その組成物に適する送達デバイスまたは塗布具、たとえば、カテーテル、チューブ、スプレー、シリンジ、噴霧器、またはクリーム、微粒子、ペレット、粉末、液体、ゲル用の他の塗布具などと結合して、本発明の1つまたは複数のMAbを含有する組成物を含むキットも含まれる。
【００５９】
最後に、本発明は、グラム陽性細菌に感染し、またはその感染の疑いのある患者を治療する方法を提供する。この方法は、患者に、1つまたは複数の(モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、その断片、領域、および誘導体を含む)防御性抗PepG MAbと、医薬上許容可能な担体とを含む治療上有効量の治療用組成物を投与することを含む。患者は、予防または他の治療を必要とする任意のヒトまたは非ヒト動物でよい。代表例となる患者には、ヒト、ならびにマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、霊長類、肉牛、乳牛、水牛、ラクダを含む反芻動物、毛皮獣、群れをなす動物(herd animal)、実験室、動物園および農場の動物、犬小屋および畜舎の動物、家庭用愛玩動物、および家畜などの非ヒト動物を含む、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、ブドウ球菌、またはグラム陽性細菌に感染しているか、またはその保菌者である哺乳動物対象が含まれる。
【００６０】
治療上有効量とは、感染の治療において測定可能な軽減、補助、予防、もしくは防止効果をもたらすことが妥当に考えられる量である。上記または以下に記載の治療は、グラム陽性細菌感染、異なる病原体によって引き起こされる感染、または無関係の疾患のための抗生物質療法など、追加の治療に対し、主治療としても、捕捉治療としてもよい。他の抗体との併用療法は、特に本発明の範囲内に含まれる。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、そのような感染を阻止または軽減する方法であって、防御性抗PepG MAb(その断片、領域、および誘導体を含む、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体)と、医薬上許容可能な担体とを含む有効量の治療用組成物の投与を含む方法である。
【００６２】
有効量は、グラム陽性細菌による感染をある程度阻止または軽減することが妥当に考えられる量でよい。上記または以下に記載の治療は、ブドウ球菌感染、異なるグラム陽性細菌病原体によって引き起こされた感染、または無関係の疾患のための抗生物質療法など、追加の治療に対し、主治療としても、捕捉治療としてもよい。実際、他の抗体との併用療法は、特に本発明の範囲内に含まれる。
【００６３】
もう1つの実施形態では、いずれかのPepGエピトープを模倣するペプチドは、グラム陽性細菌が上皮細胞に結合するのを阻止し、それによってコロニー形成を抑制するのに有用である。たとえば、1つまたは複数のそのようなペプチドを含有する治療用組成物を鼻腔内投与して、コロニー形成を阻止または抑制し、したがって更なる感染を防止または軽減することができる。
【００６４】
本発明のさらに別の実施形態は、1つまたは複数のPepG抗原エピトープ、またはPepGエピトープを模倣する1つまたは複数のペプチドを、医薬上許容可能な担体中に含むワクチンである。ワクチンは、宿主に導入されると、グラム陽性細菌に対して広く防御性かつオプソニン性である抗体を誘い出す。ワクチンは、エピトープ、エピトープを模倣するペプチド、エピトープとエピトープを模倣するペプチドとの混合物、その抗原、別の抗原、またはエピトープ、エピトープを模倣するペプチド、および抗原の任意の組合せを含んでいてよい。免疫感作、およびその後の抗体応答の分析についての標準の技術は、「Antibodies: A Laboratory Manual」、(Harlow & Lane編、1988年)、Cold Spring Harbor Laboratory Press;「Conjugate Vaccines」、(J. M. Cruse、R. E. Lewis, Jr.編、1989年)、Karger、Basel;米国特許第5,955,079号および同第6,432,679号に出ており、これらをそれぞれ、参考として本明細書に取り入れる。
【００６５】
本発明の防御性抗PepG MAbs、ワクチン、および治療用組成物は、乳幼児および高齢者の患者、免疫無防備状態の患者、侵襲性の処置を受けている患者、化学療法を受けている患者、放射線療法を受けている患者、保健医療従事者など、グラム陽性細菌による感染の恐れがあることが知られている、またはその疑いのある個体にとって、特に有益である。これには、免疫系が未成熟な乳幼児、弁などの生体移植片を受け入れている患者、留置カテーテルを有する患者、皮膚または粘膜組織の破損または損傷を伴う外科処置を控えた患者、ある種の保健医療従事者、および化学療法や放射線療法などのある形態の治療のために免疫系が害されると予想される患者が含まれる。ヒトでない患者の中で、その恐れのあるものには、動物園の動物、群れをなす動物、および狭苦しい所で管理される動物が含まれる。
【００６６】
本発明のMAbは、ムピロシンやバシトラシンのような抗生物質;リソスタフィン、リソザイム、ムタノリシン、セロジルムラミダーゼ(cellozyl muramidase)のような抗ブドウ球菌剤;ナイシン(nisin)のような抗菌ペプチド;およびランチビオティクス(lantibiotics)またはナイシンやスブチリンなどの他のランチオン含有分子を含む、他の抗ブドウ球菌抗生物質薬と共に投与してもよい。
【００６７】
提供する開示から考えて、本発明のMAbの投与では、選択される特定の処方および送達方法は、当業者の実際的知識および経験の範囲内である。特に、必要なMAbの量、適切な担体との組合せ方、投与スケジュール、および投与量は、特許を請求するこの発明から逸脱することなく、この分野の標準の知識に基づき、広い範囲で様々であってよい。一実施形態では、本発明のMAbは、静脈内点滴によって投与しても、または数回分に分けて投与してもよく、回数は、1日1回〜4回以上の範囲とし、1回あたり0.1〜20mgを与えてよい。一実施形態では、投与するMAbの量は、動物モデルにおいて確実に100%コロニーが形成されることがわかっている細菌の量である108個の黄色ブドウ球菌からなる接種物で有効であることがわかっている用量である、1回0.1〜3mgで1日2〜4回であろう。このような投与計画は、外科的処置のために入院が認められた患者、ブドウ球菌感染の素因をつくる様々な条件下にある患者、回復期の患者、免疫系が未成熟な乳幼児に有効となり、または患者の退院前に有効となるはずである。
【００６８】
本発明の防御性抗PepG抗体、ワクチン、および治療用組成物は、静脈内、腹腔内、体内注射、関節内、心室内、クモ膜下内、筋肉内、皮下、鼻腔内、経皮、皮内、膣内、経口、または他の有効な投与方法によって投与することができる。この組成物は、感染した特定の部位への筋肉内または皮下注射などによって、局所的に投与されてもよい。投与は、塗布、液浸、浸漬、拭取りによる、治療用組成物の患者への直接の投与を含み得る。この処置は、留置カテーテル、心臓弁、脳脊髄液シャント、人工関節、身体への他の移植物、グラム陽性細菌によって汚染される恐れがあるか、またはそのような汚染を患者に持ち込む恐れのある他の物体、機器、器具など、患者体内に入れる物体に適用することもできる。
【００６９】
ここで、本発明の詳細な態様を、以下の「材料および方法」、ならびに特定の実施例の形で示す。当然、これらは単なる例示目的で含まれており、本発明を限定するものでない。
【００７０】
材料および方法
細菌
5型黄色ブドウ球菌は、受託番号49521でATCCに寄託されている。
【００７１】
8型黄色ブドウ球菌は、受託番号12605でATCCに寄託されている。
【００７２】
表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)株Hayは、1990年12月19日に受託番号55133でATCCに寄託されている。
【００７３】
溶血性連鎖球菌(S. hemolyticus)は、受託番号43252でATCCに寄託されている。
【００７４】
ハイブリドーマ
ハイブリドーマ96-105CE11 IF6(M110)は、1997年6月13日に受託番号HB-12368でATCCに寄託されている。
【００７５】
ハイブリドーマ99-110 FC12 IE4は、2000年9月21日に特許寄託PTA-2492でATCCに寄託されている。
【００７６】
ハイブリドーマ11-232.3 IE9(M130)は、2001年8月21日にPTA-3659でATCCに寄託されている。
【００７７】
アイソタイプ決定アッセイ
アイソタイプは、Zymed Laboratories(カタログ番号90-6550)から入手したマウス免疫グロブリンアイソタイプ・キットを使用して決定した。
【００７８】
結合アッセイ
本発明の結合アッセイでは、免疫グロブリンは、ブドウ球菌全細胞(whole cell)調製物またはLTAやPepGなどの細菌細胞壁成分調製物と共にインキュベートされる。結合アッセイは、凝集アッセイ、凝固アッセイ、比色アッセイ、蛍光結合アッセイ、または当業者に知られている他の適切な結合アッセイでよい。特に適切なアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)またはラジオイムノアッセイ(RIA)である。結合は、直接的に検出されてもよいが、当業者に知られている競合もしくは非競合結合法を使用して間接的に検出することもできる。
【００７９】
ブドウ球菌全細胞調製物、LTA調製物、PepG調製物、またはこれら調製物の組合せは、標準の技術を使用して、プレート、ウェル、ビーズ、マイクロビーズ、パドル、プロペラ、または棒状物を含むがこれに限定されない適切な固体担体に固定することができる。固体担体は、たとえば、ガラスまたはプラスチックで構成されていてよい。本発明の特定の実施形態では、固体担体は、マイクロタイタープレートである。
【００８０】
一般に、結合アッセイには、次の段階が必要である。まず、固定した調製物を免疫グロブリン供給源と共にインキュベートする。アッセイの一実施形態では、免疫グロブリン供給源は、たとえば、組織培養上清や、腹水、血漿、血清、全血、体組織などの生物学的サンプルである。別の実施形態では、当業者に知られている手段によって、その供給源から免疫グロブリンをさらに単離または精製してもよく、精製または単離した免疫グロブリンをその後のアッセイで使用する。結合の量は、試験サンプルで観察される結合を陰性対照の結合と比較して決定する。陰性対照は、抗原特異的な免疫グロブリンを含まない任意のサンプルであると定める。結合アッセイでは、試験サンプルで認められた結合の量が陰性対照の結合量を上回るとき、結果が陽性結合反応となる。陽性の結合であることは、単一の陽性/陰性の結合反応から判定してもよいし、一連の結合反応の平均から判定してもよい。一連の結合反応に、固定された抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを測定量含有するサンプルを含め、それによって検量線を作成することができる。この検量線を使用して、未知のサンプル中の抗原特異的な免疫グロブリンの量を定量化することができる。
【００８１】
アッセイの代替実施形態では、抗体を固体担体に固定し、細菌調製物への結合能によって未知の免疫グロブリンサンプルの特徴付けを行う。上で論じたアッセイの別の態様を適宜利用する。
【００８２】
実施例で使用した特定の結合アッセイを以下で述べる。
【００８３】
生細菌ELISA(LBE):抗体の生細菌への結合能を測定するために、LBEアッセイを実施した。黄色ブドウ球菌5型、5-USU型、8型、表皮ブドウ球菌株Hay、および溶血連鎖球菌を含む、様々な種類の細菌をアッセイに使用してよい。終夜培養したプレート培養物からの細菌を35mlのTryptic Soy Broth(TSB)に移し、穏やかに振盪させながら37℃で1.5〜2.0時間増殖させた。次いで、室温で15分間、1800〜2000×gの遠心分離にかけて、細菌をペレット状にした。上清を除去し、細菌を、0.1%のウシ血清アルブミンを含有する35〜45mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS/BSA)に再懸濁した。細菌を遠心分離によって再びペレット状にし、上清を破棄し、細菌をPBS/BSAに再懸濁して、透過率(%T)を650nmで65%〜70%とした。その懸濁液から、細菌を0.9%の無菌塩化ナトリウム(Sigmaカタログ番号S8776、または等価物)中にさらに15倍に希釈し、この懸濁液100μlを平底無菌96ウェルプレートの一連のウェルに加えた。
【００８４】
試験する各抗体は、Tween-20を0.05%および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合プロテインA(プロテインA-HRP、Zymed Laboratories)を1：10000希釈で含有するPBS/BSA(PBS/BSA/Tween/Prot A-HRP)に加えて所望の濃度に希釈した。プロテインA-HRPを、使用前に室温で30〜60分間かけて抗体に結合させ、それによって抗体-プロテインA-HRP複合体を生成して、黄色ブドウ球菌の表面上に見られるプロテインAに抗体が非特異的に結合し得る可能性を最小限に抑えた。一般に、各アッセイにおいて数種類の希釈度の試験抗体を使用した。各抗体希釈度のものから、50μlの抗体-プロテインA-HRP複合体を一連のウェルに加え、細菌と抗体-プロテインA-HRP複合体の混合物を、回転式振盪機で穏やかに回転させながら(50〜75rpmで)37℃で30〜60分間インキュベートした。
【００８５】
インキュベートした後、1800〜2000×gの遠心分離にかけて、細菌をプレート中でペレット状にした。ウェルの上清を慎重に除去し、0.05%のTween-20を含有するPBS/BSA(PBS/BSA/Tween)200μlをすべてのウェルに加えて、結合していない試薬を希釈した。遠心分離によって細菌を再びペレット状にし、上清を除去した。100マイクロリットルのTMB基質(BioFx, Inc.カタログ番号TMBW-0100-01)を各ウェルに加え、室温で15分間反応を進行させた。100μlのTMB停止試薬(450nm Stop Reagent、BioFx, Inc.カタログ番号STPR-0100-01)を加えて反応を停止させた。450nmフィルターを装着したマイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を求めた。
【００８６】
このアッセイでは、発色の強度が、抗体の細菌への結合に正比例した。対照ウェルは、細菌およびプロテインA-HRPを抗体なしで含んでいた。
【００８７】
メタノール-固定化細菌でのイムノアッセイ:熱で死滅させた細菌を、0.9%の無菌塩化ナトリウム(Sigmaカタログ番号S8776、または等価物)に、650nmでの透過率(%T)70〜75%で懸濁させた。10ミリリットルの細菌懸濁液を、0.9%の無菌塩化ナトリウム中に15倍希釈し、次いで10〜15℃で15分間、1800×gの遠心分離にかけてペレット状にした。上清を破棄し、ペレットを1500mlのメタノール(MeOH)に再懸濁した。100マイクロリットルの細菌-MeOH懸濁液を、Nunc Maxisorpストリップウェル(Nuncカタログ番号469949)の各ウェルに分注した。MeOHを蒸発させ、細菌をプラスチック製ウェルに固定した。細菌でコートされたストリップウェルをプラスチック製の袋に入れて室温の暗所で保管し、調製して2カ月以内に使用した。
【００８８】
抗体を評価するため、細菌でコートされたプレートを、0.05%のTween20を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS-T)で4回、以下のように洗浄した。約250μlのPBS-Tを各ウェルに加えた。プレートの緩衝液を流しの上ではじいて除去し、残りの緩衝液を、プレートを逆さにし、吸収紙の上で叩いて除去した。抗体をPBS-T中に希釈し、次いでウェルに加えた。上清、腹水、または精製した抗体を、実施例で示す希釈物で試験した。対照ウェルにはPBS-Tのみを入れた。抗体を加えた後、ウェルを室温の無ドラフト環境で30〜60分間インキュベートした。ウェルを再度PBS-Tで4回洗浄した。次いで、95マイクロリットルの検出抗体を各ウェルに加えた。検出抗体は、次のもの、すなわち、どれも西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合し、PBS-T中に6千倍に希釈されている、ウサギ抗マウスIgG3、ウサギ抗マウスIgM、またはヤギ抗ヒトIgG(γ特異的)(それぞれ、Zymedカタログ番号61-0420、61-6820、62-8420)のうちの1つである。
【００８９】
室温でさらに30〜60分間インキュベートした後、ウェルをPBS-Tで4回洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質溶液(BioFx#TMBW-0100-01)を入れた。プレートを室温の暗所で15分間インキュベートし、100μlのTMB停止溶液(BioFx #STPR-0100-01)を加えて反応を停止させた。Molecular Devices Vmaxプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を450nmで測定した。
【００９０】
プロテインAを用いるイムノアッセイ:MAbの黄色ブドウ球菌への結合を評価するために、イムノアッセイ法を、上述のメタノール-固定化細菌用に改変した。黄色ブドウ球菌は、表面にプロテインAを発現しており、プロテインAは、γグロブリン重鎖の定常領域に強力に結合するので、抗体とプロテインAとの非特異的な結合が、偽陽性の結果を生じる可能性がある。イムノアッセイ用ウェルは、上述のように細菌でコートしたが、この難点を克服するために、細菌でコートしたウェルに抗体を加える前に、MAbを、HRPに結合させ組換え型プロテインAの溶液(Zymed Laboratoriesカタログ番号10-1123)と共にインキュベートし、PBS-T中に8千倍に希釈した。結合反応を室温で30分間進行させた。ウェルをPBS-Tで4回洗浄し、各プロテインA-HRP-MAb混合物の溶液100μ1をそのウェルに加えた。前処理によって得られるプロテインA-HRPの存在は、MAbが黄色ブドウ球菌上のプロテインAに結合するのを阻止した。さらに、プロテインA-HRPの重鎖定常領域への結合は、MAb上の抗体結合部位を妨害せず、それによって黄色ブドウ球菌または他の細菌についてMAbを評価することが可能になる。
【００９１】
プロテインA-HRP-MAbの溶液を、コートされたウェルの中で、室温で30〜60分間結合させた。次いで、上述のように、ウェルをPBS-Tで洗浄し、TMB基質溶液を加え、アッセイを完了した。
【００９２】
LTAおよびPepGでのイムノアッセイ:MAbのLTAへの結合は、黄色ブドウ球菌LTA(Sigmaカタログ番号2515)でコートしたウェルを用いるイムノアッセイによって測定した。PBS中1μg/mlのLTA溶液100マイクロリットルを一連のNunc Maxisorpストリップウェルに分注し、室温で終夜インキュベートした。PBS-Tで4回洗浄して、結合していない物質をウェルから除去した。次いで、PBS-T中に希釈された抗体をウェルに加え、上のメタノール-固定化細菌でのイムノアッセイで述べたようにアッセイを続行した。
【００９３】
PepGについてのイムノアッセイでは、Nunc Maxisorpストリップウェルのプレートを、0.1Mの炭酸塩緩衝液(pH9.2〜9.6)中5μg/mlのPepG溶液(S. Foster、実施例2に記載の手順によっても調製できる)100μlを用い、室温で一晩かけてコートした。PBS-Tで4回洗浄して、結合していない抗原をプレートから除去した。PBS-T中に希釈されたサンプルの上清、腹水、または抗体をウェルに加えて一連のウェルを複製した。プレートをプレートシーラーで覆い、室温の無ドラフト環境で30〜60分間インキュベートした。プレートを再度PBS-Tで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合させたγ特異的ウサギ抗マウスIgG(Zymed Laboratories)95μlをすべてのウェルに加えた。プレートに再び覆いをかけ、室温の無風環境で30〜60分間インキュベートした。プレートをPBS-Tで洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質溶液を加えた。室温、暗所で15分間インキュベートした後、すべてのウェルに100μlのTMB停止溶液を加え、450nmフィルターを装着したMolecular Devices Vmaxプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を測定した。
【００９４】
活性アッセイ
抗原に結合する抗体は、必ずしもオプソニン化を強化しまたは感染からの防御を増強するものではない。したがって、オプソニン化アッセイを使用して、抗体の機能活性を判定した。
【００９５】
オプソニン化アッセイは、比色アッセイ、化学発光アッセイ、蛍光もしくは同位元素標識取込みアッセイ、細胞性殺菌アッセイ、または物質の潜在的なオプソニン性を測定し、それによって反応性の免疫グロブリンを同定する、当業者に知られている他の適切なアッセイでよい。オプソニン化アッセイでは、感染性の病原および真核生物細胞と、試験しようとするオプソニン性物質、もしくはオプソニン性を増強するとされる物質を加えたオプソニン性物質とを共にインキュベートする。
【００９６】
特定の実施形態では、オプソニン化アッセイは、細胞性殺菌アッセイである。このin vitroアッセイでは、細菌などの感染性病原、食細胞、および免疫グロブリンなどのオプソニン性物質を共にインキュベートする。貪食能または結合能を有する真核生物細胞を細胞性殺菌アッセイに使用してもよい。特定の実施形態では、食細胞は、マクロファージ、単球、好中球、またはこれらの細胞の組合せである。古典的経路と副経路の両方によるオプソニン化を促進するために補体タンパク質を含めてもよい。
【００９７】
インキュベートした後に残る感染性病原体の量または数が、抗体のオプソニン化能力を決定する。インキュベートした後に残る感染性病原体の数が少ないほど、試験した抗体のオプソニン活性は大きい。細胞性殺菌アッセイでは、オプソニン活性は、試験される抗体をその一方のみが含む2つの類似アッセイの生存細菌数を比較することによって測定する。あるいは、オプソニン活性は、サンプル抗体と共にインキュベートする前後の生存生物体の数を測定して決定する。抗体存在下でインキュベートした後の細菌数の減少は、陽性のオプソニン化活性を示す。細胞性殺菌アッセイでは、適切な細菌増殖条件下でインキュベート混合物を培養して、オプソニン化が陽性であることを判定する。インキュベート前とインキュベート後のサンプル、または免疫グロブリンを含有するサンプルとそれを含まないサンプルとを比較して、生存細菌が減少していれば、陽性反応である。
【００９８】
好中球媒介オプソニン食作用殺菌アッセイ:このアッセイは、PMN分離培地(Robbins Scientificカタログ番号1068-00-0)を使用する沈降によって成体静脈血から単離した好中球を使用して実施した。40マイクロリットルの抗体、血清、または他の免疫グロブリン供給源を、様々な希釈度で加えて丸底マイクロタイタープレートのウェルを複製した。次いで、40マイクロリットルの好中球(ウェルあたり約106細胞)を各ウェルに加えた後、直ちに約3×104個の対数増殖中期の細菌(表皮ブドウ球菌株Hay、ATCC 55133、または5型黄色ブドウ球菌、ATCC 49521)の入った10μlのTryptic Soy Broth(Difcoカタログ番号906374、または等価物)を加えた。最後に、免疫グロブリンを除去したヒト血清10μlを活性補体の供給源として加えた。(免疫グロブリンは、アッセイに使用する前に、血清をプロテインGアガロースおよびプロテインLアガロースと共にプレインキュベートすることによって、ヒト血清補体から除去した。このように免疫グロブリンを除去すると、補体中の抗ブドウ球菌抗体の濃度が最小限に抑えられ、それによって補体溶液中にもともと存在する抗体によって引き起こされる細菌の死滅が低減される。)
プレートを一定に激しく振盪させながら37℃でインキュベートした。ゼロ時間目、すなわちサンプル抗体を最初に加えたとき、および2時間のインキュベーション後に、10μlのアリコートを各ウェルから採取した。各サンプル・ウェルから収集した各アリコート中の生存細菌数を決定するために、各アリコートを、0.1%のBSA水溶液に加えて20倍希釈し(PMNを溶解するため)、すばやいピペット操作によって激しく混合し、血液寒天プレート(Remel、カタログ番号01-202、または等価物)上で、37℃で終夜培養した。オプソニン活性は、2時間で採取したサンプルから観察された細菌コロニー数と、0時間で採取したサンプルから観察された細菌コロニー数とを比較して測定した。IPI ミニカウントコロニーカウンターを使用してコロニーを数えた。
【００９９】
この細胞性殺菌アッセイは、米国特許第5,571,511号の実施例11および12で述べられているように、in vivoでの有効性との相関関係が明らかにされている。
【０１００】
鼻腔コロニー形成アッセイ:黄色ブドウ球菌のマウス鼻腔コロニー形成モデルは、Kiserらの研究に基づくものであった(11)。簡潔に述べれば、ストレプトマイシン耐性5型黄色ブドウ球菌を高塩分コロンビア寒天(Difco)上で増殖させて、莢膜の形成を促進する。細菌を無菌生理食塩水(0.9%のNaCl水溶液)で洗浄して培地成分を除去し、様々な濃度および組合せの抗ブドウ球菌MAbまたは無関係の対照MAbを含有する生理食塩水(0.9%のNaCl水溶液)に、約108細菌/動物投与量で再懸濁する。1時間プレインキュベートした後、細菌をペレット状にし、最終体積を動物投与量あたり10μlとして生理食塩水または抗体含有生理食塩水のどちらかに再懸濁する。ストレプトマイシン含有水で24時間飼育したマウスを麻酔によって鎮静する。鼻に接触させないピペット操作によって、ブドウ球菌をマウスの鼻孔に点滴注入する。
【０１０１】
動物をストレプトマイシン含有水で飼育しながら4〜7日経過後、動物を犠牲にし、鼻を外科的に取り出し、解剖する。鼻腔組織を0.5%のTween-20を加えた食塩水(0.9%のNaCl水溶液)中で激しくボルテックスして、付着性細菌を遊離させ、この生理食塩水を、ストレプトマイシンを含有するコロンビア血液寒天(Remel)およびtryptic soy agar(Difco)上に播いて、コロニー形成があるかを判定する。
【０１０２】
これまで述べてきた本発明は、実施例を参照することによってより深く理解されよう。以下の実施例は、単なる例示目的のためであり、いかようにも本発明の範囲を限定しないものと解釈されるべきである。
【実施例１】
【０１０３】
黄色ブドウ球菌PepGによるマウスの免疫感作に対するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の産生
黄色ブドウ球菌PepGに対するモノクローナル抗体を産生させるために、Harlan Sprague Dawley(インディアナ州インディアナポリス)から入手した5〜6週齢のメスBALB/cマウスを使用して免疫感作を実施した。一次免疫感作の免疫原は、黄色ブドウ球菌PepG(Roman Dziarski氏より贈与されたもの;PepGは、実施例2に記載のとおりに調製することもできる)とした。5μlのPepG(7mg/ml懸濁液)を、345μlのPBSおよび350μlのRIBIアジュバント(RIBI Immunochemicals、ニューハンプシャー州ハミルトン)と混合した。得られる懸濁液は、50μg/mlのPepGを含んでいた。それぞれのマウスを、0.1ml(マウス1匹あたり5μg)の皮下(sc)投与によって免疫感作した。
【０１０４】
最初の免疫感作から約4週間後に、追加免疫感作を施した。PBS(873μl)を7.1μlのPepG(7mg/ml懸濁液)および120μlのAlhydrogel(Accurate Chemical and Scientific, Co.、ニューヨーク州ウェストベリー)と混合した。それぞれのマウスに、0.1ml(マウス1匹あたり5μgのPepG)を皮下投与した。
【０１０５】
さらに8週間後、50%のAlumアジュバント(Pierceカタログ番号77161)を含有する50μg/mlのPBS溶液(0.2ml/マウス)を用いてマウスを免疫感作した。免疫感作したマウスの血清を上述のようにELISAによって試験した。表1に示すように、マウス8813の血清がPepGに最も強く結合した。ハイブリドーマを作製する3日前に、このマウスに、融合前の最後の追加免疫としてPBS中10μgのPepGを腹腔内投与した。
【表１】
2010013454.tif 000002
【０１０６】
ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマは、Shulman、Wilde、およびKohler、ならびにBartal, A. H.およびHirshautの一般法(2、28)によって調製した。マウス8813の脾臓細胞とSP2/0マウス骨髄腫細胞(ATCC番号CRL1581)を、SP2/0細胞1個あたり10個の脾臓細胞の比率で混合し、遠心分離(400×g、室温で10分間)によってペレット状にし、血清を含まないDMEM(Hycloneカタログ番号SH30081.01、または等価物)中で洗浄した。上清を除去し、無菌の50ml容遠心円錐容器において、ポリエチレングリコール(PEG、分子量1500、Boehringer Mannheimカタログ番号783641)の50%w/v溶液1mlを60〜90秒間かけて加えることによって、細胞混合物の融合を完結した。次いで、血清を含まない培地を、1、2、4、8、16、および19mlの体積で順次ゆっくりと加えた。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を培地に穏やかに再懸濁し、遠心分離(500×g、室温で10分間)によって細胞をペレット状にした。上清を除去し、細胞は、10%の熱失活ウシ胎児血清、0.05mMのヒポキサンチン、および16μMのチミジンを補充したRPMI 1640(HT培地;Life Technologiesカタログ番号11067-030、または等価物)に再懸濁した。100μlの懸濁ハイブリドーマ細胞を、96穴組織培養プレートに播いた。8個のウェル(プレートAの列1)に、約2.5×104個のSP2/0細胞の入った液100μlを入れた。このSP2/0細胞は、24時間後に加える選択培地による死滅作用についての対照として利用した。
【０１０７】
ハイブリドーマを調製してから24時間後に、10%の熱失活ウシ胎児血清、0.1mMのヒポキサンチン、0.8μMのアミノプテリン、および32μMのチミジンを補充したRPMI 1640(HAT培地、Life Technologiesカタログ番号11067-030、または等価物)100μlを各ウェルに加えた。
【０１０８】
ハイブリドーマを調製してから96時間後に、プレートA列1のSP2/0細胞が死滅し、HAT選択培地が、融合していないSP2/0細胞を首尾よく死滅させたことが示された。ハイブリドーマを調製してから12日後に、PepGに結合した抗体が存在するかどうか、すべてのウェルの上清をELISAによって試験した。
【０１０９】
この予備アッセイの結果に基づき、もとの760ウェルのうち28ウェルからの細胞を24穴培養皿に移した。4日後、アイソタイプ特異的な試験試薬を使用して、PepGに結合した抗体が存在するかどうか、これら培養物の上清をELISAによって再試験した。簡潔に述べると、培養物の上清をPepGでコートした96穴プレートに加え、結合するようにした。抗体のPepGへの結合と抗体のアイソタイプを同時に検出するために、一連のウェルを、HRP結合ウサギ抗マウスIgA、HRP結合ウサギ抗マウスIgG、およびHRP結合ウサギ抗マウスIgMと共にインキュベートした。次いで、ウェルを洗浄し、標準の方法によって発色させた。表2に示すように、IgG抗体を産生した培養物の1つ(99-110CF10)をさらに継代した。また、IgM抗体を生じた他の15個の培養物もさらに継代した。
【表２】
2010013454.tif 000003
【０１１０】
培養物99-110CF10および99-110FC12を、以下のように限界希釈によってサブクローニングした。血球計数器を使用してハイブリドーマを数え、225細胞/mlの濃度に調整した。次いで、1mlの細胞溶液を、RPMI 1640培地36ml、熱不活化ウシ胎児血清7.5ml、10mg/mlのカナマイシン溶液(GIBCO BRLカタログ番号15160-054)0.5ml、およびHybridoma Serum Free培地(Life Technologiesカタログ番号12045-084)5mlと混合した。得られる懸濁液は、4.5細胞/mlを含んでいた。次いで、この懸濁液200μlを、2枚の96穴培養皿の各ウェルに加えた。表2および表3に示すように、培養物99-110CF10は、PepGに結合した抗体を産生しなかった。培養物99-110CF10のその後のサブクローンも同様に、PepG特異的な抗体を誘発しなかった。
【表３】
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【０１１１】
表4に示す、培養物99-110FC12からのクローンは、PepGに結合したIgM抗体を産生し続けた。99-110FC12からの32種のクローンを、PepGでコートしたプレート上でのELISAによって試験した。そのうち、31種は、3.159以上の値の吸光度を生じ、強い陽性であった。99-110FC12 IE4、ID3、IIH5、およびIIC6と称した4種のクローンを増殖させ、凍結保存した。更なる分析のためにクローンIE4を選択した。
【表４】
2010013454.tif 000005
【０１１２】
培養上清中で大量の免疫グロブリンを産生するように設計したIntegra Biosystems培養系で、クローン99-110FC12 IE4を増殖させた。IE4クローンの上清を、メタノール-固定化表皮ブドウ球菌株Hay、PepG、およびLTAでコートされたウェル上でのELISAによって試験した。表5に示すように、この抗体は、黄色ブドウ球菌PepGには強く結合したものの、メタノール-固定化細菌または黄色ブドウ球菌LTAには結合しなかった。
【表５】
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【実施例２】
【０１１３】
枯草菌PepGに対するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の調製
ペプチドグリカンの精製
枯草菌(B. subtilis)HR(英国University of KentのHoward Roger氏より贈与されたもの)の栄養細胞壁を、リポ多糖を含まない材料を使用し、ストリンジェントな条件下で、これまでに述べられているように作製した(6、38、これら文献をいかなる目的でも本明細書に取り入れる)。プロナーゼ処理によって、ペプチドグリカンからタンパク質を除去し、テイコ酸および他の付着した重合体を、4℃で24時間、HF(48%v/v)処理して除去した。遠心分離(13,000g、4℃で5分間)によって不溶性のペプチドグリカンをペレット状にし、蒸留水に再懸濁して、2mg/ml PepGとした。このステップを1回繰り返した。次いで、そのペプチドグリカンをペレット状にし、50mMのpH7.5トリスHClに再懸濁して、2mg/ml PepGとし、このステップを1回繰り返した。最後に、もう3回、そのペプチドグリカンをペレット状にし、蒸留水に再懸濁して、2mg/ml PepGとした。ペプチドグリカンを蒸留水に約10mg/mlで再懸濁し、-20℃で保管した。
【０１１４】
ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって、これまでに述べられているようにPepG調製物を分析すると、汚染しているタンパク質の形跡がないことが明らかになった(39)。加水分解したPepGのアミノ酸分析で予想されたアミノ酸のみが得られたことよって、また酵素によって消化した材料を逆相クロマトグラフィーで分析することによって、ペプチドグリカンの純度をさらに確認したが、どちらのアッセイもこれまでに述べられているとおりに実施した(1)。抗ペプチドグリカン抗体を生成する際、このレベルの純度が確保されたことはこれまでになかった。
【０１１５】
免疫感作のためのムロペプチド・コンジュゲートの調製
ペプチド用Imject SuperCarrier EDCシステム(Pierceカタログ番号77152)の製造者のプロトコルどおりに、ペプチドグリカン・コンジュゲートを作製した。
【０１１６】
ムロペプチドは、セロシル(Cellosyl)消化によって生成した。セロシルは、PepGのグリカン主鎖のN-アセチルムラミン酸とN-アセチルグルコサミンの間の結合を切断するムラミダーゼである。PepGを完全にセロシル消化すると、小さい可溶性のムロペプチドが得られる。遠心分離(13,000g、5分間、4℃)によって、11.5mg/mlの精製ペプチドグリカン1mlを収集し、ペプチド用Imject SuperCarrier EDCシステム(Pierce、カタログ番号77152)を補充した1mlの結合緩衝液に再懸濁した。25μlのセロシル(2mg/ml、Hoechst)をこのPepG懸濁液に加え、回転混合しながら37℃で7時間インキュベートした。次いで、サンプルを10分間煮沸し、上述のような遠心分離によって不溶性の材料を除去した。セロシル消化したPepG 300μlを200μlの結合緩衝液に加えた。
【０１１７】
SuperCarrier(Pierce、カタログ番号77152)の調製、結合、およびコンジュゲートの精製を、製造者のプロトコルどおりに実施した。PepGコンジュゲートは、-20℃で保管した。
【０１１８】
マウスの免疫感作
枯草菌PepGに対するモノクローナル抗体を産生するために、Sheffield University Field Laboratoriesから入手した4匹の8〜12週齢BALB/Cマウスを使用して、免疫感作を実施した。一次免疫感作の免疫原は、ムロペプチド・コンジュゲート(上記)として調製した枯草菌PepGであった。各マウスについて、50μgのコンジュゲートの入った50μLのPBSを50μlのフロイント完全アジュバントと混合し、この混合物を皮下注射した。
【０１１９】
一次免疫感作を行ってから約14日、29日、113日、および232日目に、それぞれのマウスに、50μgのコンジュゲートの入った50μLのPBSを50μlのフロイント不完全アジュバントと混合しておいたものを腹腔内注射した。ハイブリドーマは、PepGコンジュゲートの最後の追加免疫から4日後に作製した。
【０１２０】
ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマは、Shulman、Wilde、およびKohler、ならびにBartalおよびHirshautの一般法(2、28)によって調製した。免疫感作したマウス1および2の脾臓細胞をプールし、SP2/0マウス骨髄腫細胞と、SP2/0細胞1個あたり5個の脾臓細胞の比率で混合し、遠心分離(770×g、30℃で5分間)によってペレット状にし、血清を含まないRPMI中で洗浄した。1mlのPEG 1500(75mMのHEPES中50%、Boehringerカタログ番号783641)を1分間かけて加えた後、1mlのRPMIを1分間かけて加え、次いで9mlのRPMIを2分間かけて加えた。次いで30℃で15分間、430×gの遠心分離にかけて、細胞をペレット状にした。細胞を、20%のFCSを含有するRPMI-1640/HAT(1mlの50ｘHAT濃縮物(Invitrogenカタログ番号21060-017)を50mlのRPMI-1640に入れたもの)に約1×106細胞/mlで再懸濁した。100mlの細胞懸濁液を10枚の96穴プレートの各ウェルに加え、37℃で増殖させた。融合していないSP2/0細胞を選択対照として使用したが、播いてから5日後に死滅した。
【０１２１】
ハイブリドーマを調製してから13日後に、PepGを結合する抗体が存在するかどうか、すべてのウェルの上清をELISAによって検定した。試験した829ウェルのうち13ウェルが陽性であった。
【０１２２】
ELISAの結果に基づき、陽性の細胞を24穴培養プレートで増殖させ、安定な抗体の分泌があるかどうかELISAによって再試験した。6系列がPepGに対する抗体を分泌することがわかった。系列BB4は、枯草菌細胞壁に対する親和性の最も高い抗体を産生することが判明した。約75%の集密さで、BB4を限界希釈によってクローン化し、サブクローンを、抗PepG抗体の分泌があるかどうか再試験した。2種のクローンBB4/A4およびBB4/A5は、枯草菌PepGに対する抗体を分泌することがわかった。Isotype Strips(Roche Diagnostics、カタログ番号1493027)を使用するアイソタイプ判定では、どちらの抗体もIgGであることが示された。
【実施例３】
【０１２３】
PepG抗体の基質親和性
PepGのセロシル消化
Bacillus subtilis(枯草菌)、Staphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)、Streptococcus mutans（ストレプトコッカス・ミュータンス）、Bacillus megaterium（バチルス・メガテリウム）、Enterococcus faecalis（エンテロコッカス・ファエカリス）、Staphylococcus epidermidis(表皮ブドウ球菌)、およびListeria monocytogenes（リステリア・モノサイトゲネス）由来のPepGを実施例2に記載のとおりに精製した。1mlの各PepG(10mg/ml)を25mMのpH5.6リン酸ナトリウム緩衝液に入れ、37℃で15時間、250μg/mlのセロシル(Hoechst AG)で消化した。サンプルを3分間煮沸して、反応を停止させ、遠心分離(14,000×g、室温で8分間)によって不溶性材料を除去した。可溶性のセロシル消化PepGを-20℃で保管した。
【０１２４】
ブドウ球菌PepGは、独特なペンタグリシン架橋をもっており、これは、グリシン-グリシン・エンドペプチダーゼであるリソスタフィンによって切断することができる。黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌PepGのセロシル消化物にリソスタフィン(25μg/ml、Sigmaカタログ番号L0761)を加えて、このペプチド架橋を切断した。黄色ブドウ球菌は、リソスタフィンなしでも消化した。
【０１２５】
PepGおよびセロシル消化PepGに対する抗体の親和性を判定するためのELISA
UVで不活化した完全黄色ブドウ球菌でマウスに免疫感作することによって、11-232.3、11-248.2、および11569.3であると同定された3種のハイブリドーマ系列(QED Biosciences)を作製し、これら系列が産生するMAbが、その後PepGに結合することが示された。11-232.3(精製されたときには、このMAbを702PGと呼ぶ)、11-248.2、および11-569.3、BB4/A4およびBB4/A5によって産生されたMAbの、種々の細菌由来のPepGに対する親和性と、種々の細菌由来のセロシル消化PepGに対する親和性を、ELISAによって次のように比較した。96穴イムノアッセイ・プレート(NUNC Immunoplate Maxisorp)を、100μg/mlのポリ-L-リシン(Sigma Chemicals、カタログ番号P6407)の入った0.05MのpH9.6炭酸塩/重炭酸塩緩衝液(0.015MのNa2CO3、0.035MのNaHCO3、pH9.6、以下では炭酸塩緩衝液と呼ぶ)を用い、室温で1時間時間かけてコートした。炭酸塩緩衝液を除去し、ウェルを炭酸塩緩衝液で1回洗浄した。次いで、炭酸塩緩衝液中5μg/mlの精製したPepG基質またはセロシル消化PepG基質100μlを用い、4℃で一晩かけてウェルをコートした。基質溶液を除去し、ウェルをPBS-Tで2回洗浄した。次いで、0.2%w/vのウシゼラチンを含有するPBS-T(Sigmaカタログ番号A7030、ブロック用緩衝液)150μlで、37℃で2時間かけてウェルをブロックした。ブロック用緩衝液を除去し、ウェルをPBS-Tで4回洗浄した。
【０１２６】
上で挙げたMAbのうちの1種(ブロック用緩衝液に加えて適切に希釈したもの)を各ウェルに50μl加え、結合反応液を37℃で2時間インキュベートした。モノクローナル抗体を除去し、ウェルをPBS-T中で3回洗浄した。ブロック用緩衝液中に2万倍に希釈したHRP結合ヤギ抗マウスIgG(Biorad)50μlを各ウェルに加え、結合反応液を37℃で1時間インキュベートした。2次抗体を除去し、ウェルをPBS-Tで3回洗浄した。50μlのTMB酵素基質(Bioradカタログ番号172-1068)を各ウェルに加え、室温で15分間かけて発色させた。50μlの2M H2SO4を各ウェルに加えて反応を停止させ、VICTORプレートリーダー(Wallac)で450nmの吸光度を読み取った。このELISAの結果を表6に示す。
【０１２７】
表6では、記載のPepG抗体が種々のPepG基質に対して異なる範囲の特異性および親和性を示しているので、それぞれが同一でないことが実証される。詳細には、702PG、MAb-11-232.3、およびMAb-11-248.2は、黄色ブドウ球菌PepGに対する親和性が高く、枯草菌PepGに対する親和性が低いのに対し、BB4/A4およびBB4/A5(MAb-BB4/A4およびMAb-BB4/A5とも呼ぶ)によって産生された抗体は、逆の特異性を示す。MAb-BB4/A4およびMAb-BB4/A5はまた、表皮ブドウ球菌に対しても高い親和性を示したものの、他の細菌に対しては示さなかった。
【表６】
2010013454.tif 000007
【０１２８】
Bacillus subtilis 168 HRは、英国University of KentのHoward Roger氏より贈与を受けた。
【０１２９】
Staphylococcus aureus 8325/4は、米国ニューヨーク州Skirball InstituteのRichard Novick氏より贈与を受けた。
【０１３０】
Streptococcus mutans LTIIは、英国University of NewcastleのRoy Russell氏より贈与を受けた。
【０１３１】
Bacillus megaterium KMは、英国ケンブリッジ大学のKeith Johnstone氏から贈与を受けた。
【０１３２】
Staphylococcus epidermidis 138は、英国University of NottinghamのPaul Williams氏より贈与を受けた。
【０１３３】
Listeria monocytogenes EGDは、ドイツUniversity of WurzburgのW. Goebel氏より贈与を受けた。
【０１３４】
グリカン鎖を切断するセロシル消化にかけると、どんなPepG基質も、抗体702PG、MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、MAb-BB4/A4、およびMAb-BB4/A5によって結合されにくくなる。したがって、これらの抗体は、完全グリカン鎖を要するエピトープと相互に作用するのかもしれない。一方、MAb-11-569.3の親和性は、セロシル消化による影響を受けず、切断される結合と関係のないエピトープと相互に作用し得ることが示唆される。セロシル/リソスタフィンの結果は、単一の消化の結果をさらに確実にするものである。
【０１３５】
最後に、黄色ブドウ球菌PepGは、そのグルコサミン残基でのO-アセチル化のレベルが枯草菌由来のPepGよりも高く、このO-アセチル化が、抗体702PG、MAb-11-232.3、およびMAb-11-248.2による結合にとって重要であり、MAbBB4/A4およびMAb-BB4/A5による結合にはマイナスの影響を及ぼし得ることが示唆される。
【実施例４】
【０１３６】
モノクローナル抗体のLTA、PepG、およびブドウ球菌への結合
MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、MAb-11-569.3、およびMAb-99-110FC12 IE4が、黄色ブドウ球菌PepG、黄色ブドウ球菌LTA、メタノール-固定化黄色ブドウ球菌、およびメタノール-固定化表皮ブドウ球菌に結合するかどうかを検定した。これらのMAbに加えて、A110と称するヒト/マウスキメラ抗LTA抗体を、LTAおよび表皮ブドウ球菌の結合に対する陽性対照としてこのアッセイに含めた。A110の生成およびキメラ化についての記載は、1998年6月15日に出願の米国特許出願第09/097,055号中に見ることができる。
【０１３７】
表7に示すように、MAb-11-232.3、11-248.2腹水、および99-110FC12IE4上清はすべて、黄色ブドウ球菌PepGに強く結合した。予想どおり、抗LTA抗体であるA110は、PepGに結合していない。
【表７】
2010013454.tif 000008
【０１３８】
LTAについて試験した際には、表8に示すように、A110のみが強い結合を示した。MAb-11-232.3、MAb-11-569.3、および99-110FC12IE上清では、結合が得られなかった。100倍希釈の11-248.2腹水では、若干の交差反応性が得られたが、これは、腹水中に非特異的免疫グロブリンが高濃度で存在するためであるかもしれない。
【表８】
2010013454.tif 000009
【０１３９】
これらのデータは、UVで死滅させた完全黄色ブドウ球菌に対して産生されたMAb-11-232.3およびMAb-11-248.2が、細菌表面上のPepGに特異的であることを示した。同じくUVで死滅させた黄色ブドウ球菌に対して産生されたMAb-11-569.3は、PepGへの結合がはるかに弱い上、LTAにも結合しないので、PepGに特異的であるかもしれないが、別の表面抗原にも特異的であり、PepGと交差反応しているのかもしれないことが示された。予想どおり、精製した黄色ブドウ球菌PepGに対して産生されたMAb-99110FC12IE4は、LTAには結合せず、PepGにかなり強く結合する。
【０１４０】
それぞれのMAbを、表9および10にそれぞれ示すように、メタノール-固定化表皮ブドウ球菌株Hayおよびメタノール-固定化黄色ブドウ球菌でコートしたプレートでも試験した。
【０１４１】
MAb-99-110FC12IE4を除くすべての抗体が、表皮ブドウ球菌株Hayに結合した。興味深いことに、MAb-11-569.3は、表皮ブドウ球菌株HayにMAb-11-232.3よりも強く結合したが、MAb-11-569.3は、PepGおよび黄色ブドウ球菌にはMAb-11-232.3ほど強く結合しなかった。この結果は、MAb-11569.3の産生の対象となった黄色ブドウ球菌表面上の抗原が、PepGであろうがPepGでなかろうが、おそらくは黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とに保存されているために、MAb-11569.3によって両方の細菌が強く結合されることを示唆している。IgM抗体(ハイブリドーマ11-248.2および99-110FC12IE4由来)については、黄色ブドウ球菌に対しての試験は行われなかった。なぜなら、黄色ブドウ球菌でコートしたプレート向けに使用されるイムノアッセイのプロテインA法が、タンパク質に結合しないIgM抗体では機能しないためである。
【表９】
2010013454.tif 000010
【表１０】
2010013454.tif 000011
【０１４２】
上述のように、ペプチドグリカンは、グラム陽性細菌に見られる細胞壁成分である。これらのアッセイは、MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、およびMAb-99-110FC12IE4がPepGを強く結合し、グラム陽性細菌に共通する別の細胞壁成分であるLTAに結合しないことを示している。ELISA(表7)でのMAb-11-569.3によるPepGの結合は、メタノール-固定化ELISA(表10)での5型黄色ブドウ球菌の結合ほど強くない。MAbによる結合の中で認められた差は、そのMAbによって結合される特定のエピトープがあり、タンパク質ELISAと完全細菌ELISAとにおいてその特定のエピトープが提示されるためであるかもしれない。あるいは、MAb-11-569.3は、異なる抗原に結合するものの、PepGと交差反応するのかもしれない。MAb-11-232.3、11-248.2腹水、およびMAb-11-569.3は、ELISAアッセイにおいて表皮ブドウ球菌株Hayにも結合する。さらに、MAb-11-232.3およびMAb-11-569.3は、ELISAアッセイにおいて黄色ブドウ球菌にも結合する(11-248.2のELISAにおける黄色ブドウ球菌への結合は測定できなかった)。ELISAにおいて99-110FC12IE4上清による表皮ブドウ球菌株Hayへの結合がなかったことは、この抗体が黄色ブドウ球菌PepG上に見られるエピトープには結合するが、表皮ブドウ球菌株Hayでは発現されないか、または結合に利用できないことを示唆している。
【実施例５】
【０１４３】
モノクローナル抗体のオプソニン食作用活性
抗原に結合する抗体が、必ずしもオプソニン化を増強しまたは感染からの防御を強化するとは限らない。したがって、好中球を媒介とする殺菌アッセイを利用して、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌株Hayに対する抗PepG MAbの機能活性を判定した。好中球（PMN）分離培地(Robbins Scientificカタログ番号1068-00-0)を使用して、成体静脈血から好中球(PMN)を単離した。マイクロタイタープレートの丸底のウェルに、約3×104個の対数増殖中期の細菌と共に40μlのPMNを加えた(ウェルあたり約2×106細胞)。プロテインGおよびプロテインLで処理して、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌株Hayに結合する抗体を除去したヒト血清を活性補体源として使用した。40μlの抗体を様々な希釈度でウェルに加え、プレートを一定に激しく振盪させながら37℃でインキュベートした。ゼロ時間目および2時間のインキュベート後に各ウェルから10μlのサンプルを採取した。それぞれを希釈し、激しくボルテックスして細菌を分散させ、血液寒天プレートに載せ37℃で終夜培養して、生存細菌数を定量化した。
【０１４４】
結果は、観察された細菌コロニー数の減少を対照サンプルに対する百分率として示す。オプソニン食作用殺菌アッセイでは、表11に示すように、99-110FC12IE4上清は5型黄色ブドウ球菌に対して活性であったが、表皮ブドウ球菌株Hayに対しては活性でなかった。
【表１１】
2010013454.tif 000012
【０１４５】
PepGでマウスを免疫感作して、ハイブリドーマ99-110FC12IE4を作製し、UVで不活化した完全黄色ブドウ球菌でマウスを免疫感作して、ハイブリドーマ11-232.3、11-248.2、および11-569.3を作製した。ハイブリドーマ系列由来のそれぞれの抗PepG MAbの活性を、オプソニン食作用殺菌アッセイで試験した。さらに、LTAを結合するA110もアッセイに含めた。11-232.3および11-569.3によって産生されたMAbは、マウスIgG3のκ軽鎖抗体であり、精製してから使用した。ヒトIgG1とκ軽鎖とのヒト/マウスキメラ抗体であるA110も、精製してから使用した。MAb-99-110FC12IE4およびMAb-11-248.2は、マウスIgM、κ軽鎖抗体であり、細胞培養上清(99-110FC12IE4)または腹水(11-248.2)として使用した。オプソニン研究を実施して、MAbが両方の群のブドウ球菌への食作用および死滅作用を増強するかどうか判定した。
【０１４６】
表12Aに示すように、抗PepG抗体はそれぞれ、黄色ブドウ球菌の死滅作用を増強したことを示した。PMNを抗体なしで補体と混合したとき、黄色ブドウ球菌の死滅は20%未満であった。しかし、MAb-11-232.3またはMAb-11-569.3を100μg/mlで加えると、それぞれ76%および82%が死滅した。11-248.2(マウスIgM)由来の未希釈の腹水を使用すると、89%が死滅し、99-110FC12IE4(これもマウスIgM)由来の未希釈の上清では、75%が死滅した。驚くべきことに、A110は、黄色ブドウ球菌LTA(表8)およびメタノール-固定化黄色ブドウ球菌(表10)に強く結合するものの、このアッセイで示される黄色ブドウ球菌のオプソニン化は、非常に弱い。
【表１２Ａ】
2010013454.tif 000013
これまでのアッセイでは、A110が由来するマウス・モノクローナル抗体M110によって黄色ブドウ球菌がより強力にオプソニン化されることが示されている(表12Bおよび米国特許出願第09/097,055号)。本発明者らは、A110とM110との間の活性における差が、キメラ抗体と非キメラ抗体間の活性の差というよりも、アッセイにおける用量の影響によるものであると考える。表13に示されるように、A110は、表皮ブドウ球菌に対する活性を失っていない。
【表１２Ｂ】
2010013454.tif 000014
表皮ブドウ球菌株Hayを標的生物体として使用したとき、MAb-11-232.3、11-248.2腹水、およびMAb-11-569.3についての結果は、表13に示すように、5型黄色ブドウ球菌で得られた結果と同様であった。300μg/mlでは、MAb-11-232.3およびMAb-11-569.3でそれぞれ、66%および83%が死滅した。ハイブリドーマ11-248.2由来の未希釈の腹水では、95%が死滅した。しかし、99-110FC12 IE4由来の上清では死滅が起こらず、このことは、表9においてメタノール-固定化表皮ブドウ球菌への結合が非常に弱かったことと一致する。最後に、A110では、試験したすべての用量(11.1μg/ml〜300μg/ml)で強力な死滅(>98%)が起こり、抗体なしでPMNと補体を混合して得られた背景死滅は、22%であった。
【表１３】
2010013454.tif 000015
【０１４７】
これらのデータは、MAb-11-232.3、11-248.2腹水、およびMAb-11-569.3が、5型黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌株Hayに対する食作用および死滅作用を増強し得ることを示している。このデータは、A110が、黄色ブドウ球菌に対してはMAb-11-232.3、11-248.2腹水、およびMAb-11-569.3ほど有効でないものの、表皮ブドウ球菌株Hayに対する活性が高いことも示している。99-110FC12IE4上清は、黄色ブドウ球菌に対しては活性であるが、表皮ブドウ球菌株Hayに対しては活性でない。メタノール-固定化黄色ブドウ球菌に強く結合するものの生きた黄色ブドウ球菌に対しては弱いオプソニン性しかもたないA110の留意すべき例外はあるが、これらのデータは、メタノール−固定化細菌への結合とそうした細菌へのオプソニン化を強化する能力との相関を実証するものである。
【実施例６】
【０１４８】
鼻腔コロニー形成アッセイ
マウスのブドウ球菌鼻腔コロニー形成モデルを使用し、MAb-11-232.3の鼻腔内点滴注入が、鼻腔でのコロニー形成を有意に低減することを実証した。
【０１４９】
試験MAbによって起こる鼻腔コロニー形成の阻止作用が抗ブドウ球菌抗体に特異的であることを保証するために、無関係の対照キメラIgGがブドウ球菌の鼻腔コロニー形成を阻止する能力を調べた。対照は、RSVに対するキメラIgG1 MAbであるMedi 493(Medimmune, Inc.)とした。同じ実験において、MAb-11-232.3がコロニー形成を阻止する能力も試験した。
【０１５０】
ストレプトマイシン耐性5型黄色ブドウ球菌(SA5、1〜3×108細菌/マウス)を、生理食塩水(0.9%のNaCl水溶液)、MAb-11-232.3含有生理食塩水(13×108細菌のマウス用量あたり2〜3mgの精製IgG)、またはMedi 493含有生理食塩水(2〜3mgの精製IgG/1〜3×108細菌のマウス用量)中で1時間プレインキュベートした。プレインキュベートした後、細菌をペレット状にし、生理食塩水(10μl/マウス用量)、MAb-11-232.3含有生理食塩水(10μl/マウス用量)、またはMedi 493含有生理食塩水(10μl/マウス用量)に再懸濁した。それぞれ8匹または9匹のマウスに生理食塩水中SA5、MAb-11-232.3中SA5、またはMedi 493中SA5を点滴注入した。7日後、マウスを犠牲にし、鼻腔組織を解剖し、ストレプトマイシンを含有するコロンビア血液寒天およびトリプシン処理ダイズ寒天上に播いて、コロニー形成があるかどうか判定した。表14は、MAb-11-232.3は、マウスにおいてブドウ球菌の鼻腔コロニー形成を低減したが、抗RSV MAbであるMedi 493は効果をもたなかったことを示している。
【表１４】
2010013454.tif 000016
【０１５１】
詳細には、表14は、コロニー形成のあったマウスの数およびコロニー数が共に、抗黄色ブドウ球菌表面抗原に特異的なMAb-11-232.3によって抗体特異的に減少することを示している。生理食塩水および無関係のキメラIgGの対照群では、すべてのマウスに黄色ブドウ球菌によるコロニー形成があったが、MAb-11-232.3の群では、8匹中3匹のマウスにしかコロニー形成がなかった。コロニー形成のあったマウス数のこの減少は、8匹のうち5匹のマウスが細菌のコロニー形成を免れているので、投与されたMAb-11-232.3が防御性であることを実証している。MAb-11-232.3の群では、マウス1匹あたりの回収されたコロニー数も他の2群と比べて劇的に減少した。生理食塩水対照群では、コロニー形成のあった9匹のマウスの平均コロニー数が70であり、無関係抗体の対照群では、コロニー形成のあったマウスの平均コロニー数がいっそう多い187であった。それとは対照的に、処置した群では、8匹のうち3匹の動物しかコロニー形成の徴証を示さず、コロニー形成のレベルは大きく低下し、マウス1匹の鼻腔あたり平均8コロニーであった。回収されたコロニーのこのような減少は、in vivoでも同じく予防に有益である。したがって、抗PepG MAbの投与は、黄色ブドウ球菌による鼻腔コロニー形成からの防御となる。これらのデータは、この効果が、抗ブドウ球菌表面抗原MAbに特異的であり、また抗体がそのFc部分を介してブドウ球菌上の表面プロテインAに結合するという単なる一般的な結果に陥っていないことも実証している。黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンに対する追加のMAbであるMAb-11-248.2およびMAb-11-569.3も同じく、上述のような黄色ブドウ球菌によるコロニー形成に対する類似の抑制効果を示すであろう。上述のin vivoマウスモデルにおけるMAb-11-248.2およびMAb-11-569.3の有効性を断言するために、研究を進めている。
【実施例７】
【０１５２】
ハイブリドーマ11-232.3 IE9を生成するためのハイブリドーマ11-232.3のサブクローニング
QED細胞培養物11-232.3を限界希釈によってクローン化した。簡潔に述べると、細胞を希釈して、濃度を1mlあたり生存細胞225個とした。この懸濁液1mlを36mlのRPMI 1640に加えた。FBS 7.5ml、10mg/mlのカナマイシン溶液(Gibco BRLカタログ番号15160-054)0.5ml、およびHybridoma SFM培地(Gibco BRLカタログ番号12045-084)5mlを加えて、細胞懸濁液をさらに希釈した。懸濁液の最終体積を50mlとし、細胞濃度は4.5細胞/mlとなった。2枚の96穴組織培養皿の各ウェルに200μlの細胞懸濁液を加えた。空気中C02 5%の加湿雰囲気中で、培養物を37℃で10日間インキュベートした。個々のウェルに入った細胞の一焦点(foci)を顕微鏡観察して、クローンの存在を確認した。全ウェルの約40%が、11-232.3の増殖性クローンを含んでいた。ELISAによって試験したとき、すべての上清がペプチドグリカンを結合した。4種の培養物11232.3-IG9、-IE9、-IH7、および-IB6を増殖させ、凍結保存した。これら4種のクローンの、ペプチドグリカンおよびLTAへの結合を表15に示す。ハイブリドーマ11-232.3IE9によって産生されたMAbをその後M130と称した。
【表１５】
2010013454.tif 000017
【０１５３】
表15に示すように、ハイブリドーマ11-232.3IE9によって産生されたモノクローナル抗体M130は、LBEアッセイにおいて黄色ブドウ球菌を結合した。驚くべきことに、M130は、表皮ブドウ球菌株Hayに対してオプソニン活性を示すのであるが(表7)、このアッセイでは表皮ブドウ球菌株Hayを結合しなかった。オプソニンアッセイでは最高で300μg/mlの濃度の抗体を使用するが、LBEアッセイでは最高で3μg/mlの濃度を用いるので、使用した濃度の差が大きいために、2種のアッセイにおいてM130の活性に差が生じるのかもしれない。
【表１６】
2010013454.tif 000018
【実施例８】
【０１５４】
M130可変領域のクローン化および配列決定
Midi RNA単離キット(Qiagen)を使用し、製造者のプロトコルに従いながら、2×106個の凍結したIE9(232-3)ハイブリドーマ細胞から総RNAを単離した。0.25μg/glのPrime Rnase阻害剤(0.03U/μg、Sigma)を含む10mMのトリスおよび0.1mMのEDTA(pH8.4)にRNAを溶解させた。
【０１５５】
図1は、可変領域の遺伝子をクローン化するための戦略を示す。表17は、その手順に使用したオリゴヌクレオチド・プライマーの配列(配列番号5〜12)を示す。Superscript II-MMLV逆転写酵素(Life Technologies)、マウスκ鎖特異的プライマー(JSBX-18、配列番号8、Sigma-Genosys)、およびマウス重鎖特異的プライマー(JSBX-25A、配列番号9、Sigma-Genosys)を使用し、製造者の手順に従いながら、総RNA(2μg)をcDNAに変換した(プライマーの配列については表12を参照のこと)。第1鎖のcDNA合成産物を、Centricon-30濃縮装置(Amicon)を使用して精製した。回収した40μlのcDNAのうち5μlをPCR用鋳型DNAとして使用した。PCR増幅反応液(50μl)は、鋳型DNA、30ピコモルの適切なプライマー(軽鎖用のJSBX-11 A、-12Aおよび-18、配列番号6〜8;重鎖用のJSBX-5および-25A、配列番号5および配列番号9)、2.5単位のExTaqポリメラーゼ(PanVera)、1ｘExTaq反応緩衝液、200μMの各dNTP、2mMのMgCl2を含んでいた。最初に96℃で3分間インキュベートして鋳型を変性させた。96℃で1分間、60℃で30秒間、72℃で30秒間からなる温度サイクルを30回繰り返して産物を増幅した。Nucleospin PCR精製系(Clontech)を製造者の手順どおりに使用して、成功裏に終わった反応からのPCR産物を精製した。
【表１７】
2010013454.tif 000019
【０１５６】
次いで、製造者の手順に従いながら、用いる挿入配列対ベクターのモル比を3:1として、PCR産物(約400塩基対)をT/A型のクローンニング・ベクターである細菌性ベクターpGEM T(Promega)にクローン化した。ライゲーション反応液の2分の1(5μl)を使用して、製造者の手順どおりにUltracompetent XL1 Blue細胞(Stratagene)を形質転換した。DraIIIおよびBsiWI(重鎖クローン用)またはDraIIIおよびEcoRV(軽鎖クローン用)(New England Biolabs)による診断向け制限酵素消化を利用して、DNA挿入物を有するプラスミドを含む細菌クローンを同定した。次いで、適切な大きさ(約400bp)の挿入配列を含むプラスミドの配列決定を行った。M130重鎖可変領域を含むPGEMベクターをpJSB18-6と称し、M130軽鎖可変領域を含むpGEMベクターをpJSB4-4と称する。軽鎖および重鎖可変領域の最終的な共通DNA配列を図2に示す(それぞれ、配列番号2および配列番号4)。
【実施例９】
【０１５７】
マウス/ヒトキメラ抗体A130のクローン化
次いで、M130の重鎖および軽鎖可変領域を哺乳動物性発現プラスミドベクターにサブクローニングして、CMV転写プロモーターの制御下で、組換え型マウス/ヒトキメラ抗体分子を生成した。M130の可変領域は、ヒトIgG1定常領域に直接に融合している。一方、M130の軽鎖は、可変領域コード配列の3'側にマウスκイントロンドメインを有する。スプライシングの後、この可変領域は、ヒトκ定常領域のエキソンに融合するようになる。哺乳動物細胞における両方のベクターのための選択可能マーカーは、ネオマイシン(G418)である。
【０１５８】
発現ベクターへのクローン化向けに断片を適合させてあるプライマーを使用するPCRによって、可変領域の遺伝子断片を再増幅した。(図1、表17)。重鎖正方向プライマー(JSBX-44、配列番号11)は、重鎖リーダーのC末端をコードする5'尾部と、クローン化のためのBsiWI制限部位とを含み、重鎖逆方向プライマー(JSBX-45、配列番号12)には、クローン化のための3'側EcoRI制限部位が加わっている。これによって、重鎖可変領域とヒトIgG1定常領域の間にグルタミン(E)およびフェニルアラニン(F)の2個のアミノ酸が付加される。
【０１５９】
軽鎖正方向プライマー(JSBX-11A、配列番号6)には、軽鎖リーダーの2個のC末端アミノ酸をコードする5'尾部と、クローン化の目的のためのAgeI制限部位が付加される。軽鎖逆方向プライマー(JSBX-27、配列番号10)には、連結領域-κエキソンのスプライス接合部のための3'側DNA配列と、それに続く、クローン化のためのBstBI制限部位とが加わっている。pJSB18-6を重鎖の鋳型として、pJSB4-4を軽鎖の鋳型として使用して、PCRを上述のように実施した。PCRパラメーターは、96℃で3分間インキュベートした後、58℃で30秒間、70℃で30秒間、および96℃で1分間の温度サイクルを30回とした。
【０１６０】
重鎖PCR産物をBsiWIおよびEcoRI(New England Biolabs)で消化し、Nucleospin PCR精製カラム(Clontech)を使用して製造者の指示どおりに精製し、Takaraライゲーション・キット(Panvera)を使用して、製造者の手順どおりにBsiWI/EcoRI/PflMI消化およびゲル精製済みpJRS383に連結した。次いで、ライゲーション混合物をXL1 Blue細胞(Stratagene)に形質転換し、クローンを選択し、正しく挿入されているものをスクリーニングして、哺乳動物性ベクターpJSB22を得た(図3)。
【０１６１】
軽鎖PCR産物(約350塩基対)をAgeIおよびBStBI(New England Biolabs)で消化し、Nucleospin PCR精製カラム(Clontech)を使用して製造者の記載どおりに精製した。次いで、Takaraライゲーション・キット(Panvera)を使用して、AgeI/BstBI/XcmIで消化しゲル精製しておいたpJRS384に、この断片を製造者の手順どおりに連結した。次いで、ライゲーション混合物をXL1 Blue細胞(Stratagene)に形質転換し、クローンを選択し、正確に挿入されているものをスクリーニングし、哺乳動物性発現プラスミドpJSB6.1(図4を参照のこと)を得た。
【０１６２】
次いで、2種の個々のプラスミドを合体させて、軽鎖および重鎖両方の発現カセットを含む単一の発現構築物を作製した。プラスミドpJSB6.1をBamHおよびNheI(New England Biolabs)で消化し、Nucleospin PCR精製カラム(Clontech)を使用して製造者の記載どおりに精製した。プラスミドpJSB22をBglIIおよびNheI(New England Biolabs)で消化し、アガロースゲル上で分離し、Nucleospin Gel Fragment DNA精製カラム(Clontech)を使用して、重鎖発現ドメインを含む断片を単離した。Takaraライゲーション・キット(Panvera)を使用し、製造者の手順に従って、これら断片を一緒に連結し、XL1 Blue細胞(Stratagene)に形質転換した。次いで、得られるジ-シストロン性発現ベクターpLG1-MEGAを、可変領域の配列を確認した後、A130キメラ抗体を産生させるための哺乳動物細胞に形質移入した(図5)。
【実施例１０】
【０１６３】
組換え型マウス/ヒトキメラA130抗体の一過性の生成
Superfect(Oiagen)を使用して、製造者が記載するとおりに、6穴組織培養皿において、プラスミドpLG1-MEGAをCOS-7(ATCC番号CRL 1651)細胞に形質移入した。2日後、キメラ抗体の産生、および発現された抗体の黄色ブドウ球菌ペプチドグリカン抗原への結合能について、上清を以下のように検定した。
【０１６４】
8穴ストリップ(Maxisorp F8、Nunc, Inc.)を、PBS中に5百倍に希釈したヤギ抗ヒトFc(Pierce)でコートした。次いで、プレートを感圧性フィルムで覆い、4℃で終夜インキュベートした。次いで、プレートを1ｘWash溶液(KPLカタログ番号50-63-01)で1回洗浄した。次いで、100μlの各培養上清希釈物を二重のウェルに添加し、プレート回転板に載せて室温で60分間インキュベートした。プレートをWash溶液で7回洗浄した。ヤギ抗ヒトκHRP(Zymed)コンジュゲートをサンプル/コンジュゲート希釈剤(0.02MのpH7.4トリス、0.25MのNaC12、2%のゼラチン、0.1%のTween-20)に加えて8百倍に希釈した。100μlをサンプルに加え、次いでプレート回転板に載せて室温で60分間インキュベートした。サンプルを上記のように7回洗浄し、次いで100μL/ウェルのTMB基質(BioFx、カタログ番号TMBW-0100-01)と共に室温で1分間未満インキュベートした。100μL/ウェルのTMB停止試薬(BioFx、カタログ番号STPR0100-01)で反応を停止させ、自動化されたマイクロタイタープレートELISAリーダー(Spetramax Plus、Molecular Devices, Inc.)を使用して、450nmの吸光度の値を決定した。図6は、マウス/ヒトキメラA130抗体が、ヤギ抗ヒトIgGκ抗体によって結合されることを示し、細胞へのpLG1-MEGAプラスミドの形質移入によって、ヒトIgGとκの両方のドメインを含む分子を産生する細胞が得られることを示している。
【０１６５】
次いで、発現された抗体がペプチドグリカンに結合する能力について、上清を検定にかけた。(実施例2に記載の方法によって調製した)黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンをpH9.5炭酸塩コーティング緩衝液(0.1Mの炭酸ナトリウム)に溶かした5μg/mlの溶液を用い、8穴ストリップ(Maxisorp F8、Nunc, Inc.)を4℃で一晩かけてコートした。プレートをPBSで1回洗浄した。100μlの各培養上清希釈物を二重ののウェルに添加し、プレート回転板に載せて室温で60分間インキュベートした。プレートをWash溶液で7回洗浄した。サンプル/コンジュゲート希釈剤に加えて4千倍に希釈したヤギ抗ヒトIgG H+L-HRP(Zymed)100μlをサンプルに加え、プレートをプレート回転板に載せて室温で60分間インキュベートした。サンプルをWash緩衝液で7回洗浄し、次いで、プレート回転板上で100μL/ウェルのTMB基質(BioFx)と共に室温で10〜15分間インキュベートした。反応を100μL/ウェルのTMB停止試薬(BioFx)で停止させ、自動化されたマイクロタイタープレートELISAリーダー(Spectramax Plus、Molecular Devices)を使用して、450nmの吸光度の値を決定した。
【０１６６】
陽性対照として、もともとのマウスモノクローナル抗体M130を使用し、2千倍希釈したヤギ抗マウスFcHRPコンジュゲートを用いて検定した。図7は、細胞へのpLG1 MEGAプラスミドの形質移入によって、黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンに結合する分子を産生する細胞が得られることを示している。これらの結果は、マウス/ヒトキメラ抗体A130が、それが由来するマウスモノクローナル抗体M130のペプチドグリカン結合能を保持していることを示唆する。
【実施例１１】
【０１６７】
モノクローナル抗体のPepGへの特異的結合
モノクローナル抗体がPepGに特異的であり、表7に示したELISAアッセイに使用したPepG調製物中の汚染物質に結合しないことを確認するため、サンドイッチアッセイを実施した。簡潔に述べると、マルチウェルプレートを、PepG、LTA、または未知の抗原に特異的な「捕捉(capture)」抗体でコートし、次いでPepGをウェルに加え、抗体によって結合させ、次いで「検出」抗体を加えて、捕捉抗体によって捕捉されたPepGに対する親和性を測定した。
【０１６８】
詳細には、モノクローナル抗体M110、M130、MAb-11-230.3、MAb-11-232.3、MAb-11-391.4、MAb-11-557.3、MAb-11-564.4、MAb-11-580.5、およびMAb-11-586.3を、PBSに加えて3μg/mlに希釈した。ハイブリドーマ11-230.3、11-232.3、11-391.4、11-557.3、11-564.4、11-580.5、および11-586.3は、UVで死滅させた完全黄色ブドウ球菌で免疫感作したマウスから得た。上述のように、MAb-11-230.3、MAb-11-232.3、MAb-11-557.3、MAb-11-564.4、およびMAb-11-586.3はPepGに結合し、MAb11-391.4はLTAに結合し、MAb-11-580.5は黄色ブドウ球菌上の未知のエピトープに結合することが予めわかっている。これらのMAbは、Nunc Maxisorpストリップウェル(Nuncカタログ番号469949)の縦4列をコートするのに使用したが、これらを「捕捉」抗体と呼ぶ。各捕捉抗体によるコーティングは、3μg/mlの溶液100μlを適切なウェルに加え、室温で終夜(18〜26時間)インキュベートして実施した。次いで、PBS-Tで4回洗浄して、結合していない物質をウェルから除去した。各捕捉抗体につき、PBS-T中に10μg/mlに希釈した(実施例2に記載のとおりにS. Fosterによって調製された)黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンを、縦4列のうち2列のウェルに加え、ペプチドグリカンを含まないPBS-Tを別の2列のウェルに加えた。
【０１６９】
ウェルを室温で30〜60分間インキュベートし、PBS-Tで4回洗浄した。次いで、表17に示した濃度(5μg/mlから0.078μg/mlまでの2倍希釈)のA130 100μlをウェルに入れた。上述の抗PepGモノクローナル抗体A130は、「検出」抗体であり、0.1%ヒト血清を含み、IgG、IgA、およびIgMを含まないPBS-T(Axell Cat BYA20341、Lot H2415)に加えて希釈した。この検出抗体は、コーティングに使用した捕捉MAbに結合したどんなPepGとも反応することが予想された。それと共に、LTAに特異的なMAb M110および391.4でコートされたウェルや、特異性が未知のMAbであるMAb-11-580.5でコートされたウェルでは、PepGは捕捉されていないはずであることが予想された。
【０１７０】
さらに30〜60分間インキュベートした後、ウェルをPBS-Tで洗浄し、各ウェルに、PBS-Tに加えて6千倍に希釈したHRP結合γ特異的ヤギ抗ヒトIgG(Zymed Cat 62-8420)95μlを入れた。30〜60分後、ウェルをPBS-Tで洗浄し、100μlのTMB基質溶液(BioFX Cat TMBW-0100-01)を各ウェルに加えた。室温、暗所で15分間反応を進行させ、100μlのTMB停止試薬(BioFX Cat STPR-0100-01)を各ウェルに加えて反応を停止させた。450nmフィルターを装着したMolecular Devices Vmaxマイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を測定した。
【０１７１】
表18は、一連の捕捉MAbを使用した後PepGを使用し、次いで検出MAbとしてA130を使用する捕捉アッセイの結果を示す。ウェルをMAb-11-230.2、MAb-11-232.3、MAb-11-557.3、MAb-11-564.4、またはMAb-11-586.3でコートし、PepGと共にインキュベートした後、検出抗体A130が、プレート上に捕捉されたPepGに結合する。ハイブリドーマ391.4によって産生されたものまたはM110などの抗LTA抗体を使用して捕捉する場合、おそらく捕捉抗体がPepGを結合しないので、A130は結合しない。さらに、特異性が未知であるMAb-11-580.5も、A130による結合が不十分であることから明らかなように、PepGをそれほど捕捉しない。陽性対照として、A130と同一の可変領域を有するM130を使用してPepGを捕捉する場合、A130はプレートに強く結合する。これらの結果は、PepGに結合すると考えられる一連の異なる抗体でPepGを捕捉すると、A130と捕捉された物質とが結合するので、A130がPepGに結合し、かつPepG調製物中の汚染物質に結合しないことを示唆している。
【表１８】
2010013454.tif 000020
【０１７２】
抗PepG抗体が、PepG調製物中の可能なLTA汚染物質に結合しないことを確認するために、LTAに結合するA110を捕捉抗体として使用し、LTAを捕捉抗体に結合させ、次いで検出抗体を加えて捕捉されたLTAへの結合を測定した、同様のサンドイッチアッセイを実施した。
【０１７３】
Nunc Maxisorpストリップウェル(Nuncカタログ番号469949)をPBS中3μg/mlのA110 100μlでコートし、室温で終夜(18〜26時間)インキュベートした。終夜インキュベートした後、PBS-Tで4回洗浄して結合していない物質をウェルから除去した。次いで複製ウェルに100μlのLTA溶液(Sigmaカタログ番号2515、PBS-Tに加えて1μg/mlに希釈したもの)またはPBS-Tのみを入れた。次いで、ウェルを室温で30〜60分間インキュベートし、PBS-Tで4回洗浄した。
【０１７４】
0.1%のヒト血清を含み、IgG、IgA、およびIgMを含まないPBS-T(Axell Cat BYA20341、Lot H2415)中に5μg/mlから0.078μg/mlまでの2倍希釈に滴定された、モノクローナル抗体M110、M130、MAb-11-230.3、MAb-11-232.3、MAb-11-391.4、MAb-11-557.3、MAb-11-564.4、MAb-11-580.5、およびMAb-11-586.3から選択された抗体100μlをウェルに入れた。
【０１７５】
それぞれのMabは、2列にLTAを入れ、もう2列にPBS-Tのみを入れておいた縦4列で滴定された。これらマウスMAbを、表18で使用したA130検出抗体と同様の検出抗体として利用した。
【０１７６】
さらに30〜60分間インキュベートした後、ウェルをPBS-Tで再度洗浄し、各ウェルに、PBS-T中に1万倍に希釈したHRP結合γ特異的抗マウスIgG(Jackson Immunoresearch Cat 115-035-164)95μlを入れた。30〜60分後、ウェルをPBS-Tで洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質溶液(BioFX Cat TMBW-0100-01)を加えた。室温の暗所で15分間反応を進行させ、各ウェルに100μlのTMB停止試薬(BioFX Cat STPR-0100-01)を加えて反応を停止させた。450nmフィルターを装着したMolecular Devices Vmaxマイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を測定した。
【０１７７】
表19は、A110を捕捉抗体として使用した後LTAを使用し、次いで一連の検出MAbを使用するサンドイッチアッセイの結果を示す。このアッセイでは、PepGに結合すると考えられる抗体が、PepG調製物中の可能なLTA汚染物質に実際に結合しないことが確認される。プレート上のLTAを捕捉する捕捉抗体としてA110を使用した。MAb-11-230.2、MAb-11-232.3、MAb-11-557.3、MAb-11-564.4、MAb-11-586.3、およびM130は、すべてPepGに結合するが、プレート上に捕捉されたLTAに結合しない。予想されたように、ハイブリドーマ391.4によって産生されたものおよびM110を含む抗LTA抗体は、捕捉されたLTAに強く結合する。最後に、特異性が未知であるMAb-11-580.5は、捕捉されたLTAに結合しない。これらの結果から、M130を含む抗PepGモノクローナル抗体がLTAに結合しないことがさらに確認される。
【表１９】
2010013454.tif 000021
【０１７８】
最後に、M110が、M130によって認識されるPepG調製物中の汚染物質を捕捉しないことをさらに確認するために、以下のサンドイッチアッセイを実施した。M110を捕捉抗体としてプレートに結合させ、次いで、LTAまたはPepGをプレートに結合させた後、A110またはA130のいずれかを検出抗体として結合させた。
【０１７９】
Nunc Maxisorpストリップウェル(Nuncカタログ番号469949)を3μg/mlのM110 100μlでコートし、室温で終夜(18〜26時間)インキュベートした。PBS-Tで4回洗浄して結合していない物質をウェルから除去した。次いで、100μl/ウェルのLTA溶液(Sigmaカタログ番号2515、PBS-Tに加えて1μg/mlに希釈したもの)を縦4列のウェルに入れ、100μl/ウェルのPepG溶液(PBS-T中10μg/ml)を縦4列のウェルに入れ、さらにPBS-Tのみを縦4列のウェルに入れた。ウェルを室温で30〜60分間インキュベートし、次いでPBS-Tで4回洗浄した。LTA結合、PepG結合、およびPBS-tのそれぞれの2列に、0.1%のヒト血清を含み、IgG、IgA、およびIgMを含まないPBS-T(Axell Cat BYA20341、Lot H2415)中に5μg/mlから0.078μg/mlまでの2倍希釈に滴定されたA130 100μlを入れた。同様に希釈および滴定されたA110を、LTA結合、PepG結合、およびPBS-tのそれぞれの2列に入れた。これらのキメラ抗体は、表18で使用したA130検出抗体と同様の「検出」抗体として使用した。
【０１８０】
30〜60分間インキュベートした後、ウェルをPBS-Tで洗浄し、各ウェルに、PBS-T中に6千倍に希釈したHRP結合γ特異的ヤギ抗ヒトIgG(Zymed Cat 62-8420)95μlを加えた。30〜60分後、ウェルをPBS-Tで洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質溶液(BioFX Cat TMBW-0100-01)を加えた。室温、暗所で15分間反応を進行させ、各ウェルに100μlのTMB停止試薬(BioFX Cat STPR-0100-01)を加えて反応を停止させた。450nmフィルターを装着したMolecular Devices Vmaxマイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を測定した。
【０１８１】
表20は、M110を捕捉抗体として使用した後、PepGまたはLTAを使用し、次いでA110またはA130を検出抗体として使用するサンドイッチアッセイの結果を示す。これらの結果は、M110が、A130によって結合され得る抗原を捕捉しないことをここでも実証している。さらに、抗-LTA M110抗体でPepG調製物を捕捉しても、A110の背景レベルを上回る結合を示すのに十分なLTAが捕捉されないので、この結果は、これらアッセイで使用したPepG調製物がLTAをそれほどのレベルで含んでいないことを実証している。
【表２０】
2010013454.tif 000022
【実施例１２】
【０１８２】
PepGを結合するヒト抗体
上述のような処理の際のHAMA応答を最小限に抑えるのにマウス抗体をヒト化するよりも、当業者ならば、完全にヒトである防御性抗PepG抗体を単離することができる。完全にヒトの組換え抗体を生成するのに当業者が使用してよい代替戦略のいくつかがよく知られている。その1つは、ファージディスプレイ技術を使用する抗体の生成である(50、54)。詳細には、ヒトRNAを使用して、バクテリオファージの表面上に発現される抗体の重鎖および軽鎖断片のcDNAライブラリーを作製する。そのようなライブラリーを使用して、関心のある抗原(すなわちPepG)を探索することができ、次いで、表面に抗体が発現されているために結合するファージを単離する。可変領域をコードするDNAの配列を決定し、抗体を発現させるためのクローン化を行う。
【０１８３】
ヒト抗体を生成する別の方法は、「ヒト化」マウスを利用する。そのようなトランスジェニックマウスは、自身の抗体遺伝子がヒト抗体遺伝子複合体の一部と入れ替わっているので、抗原を接種すると、ヒト抗体を産生する(48、50、51、52、54)。その結果得られる抗体産生細胞は、次いで、特定のモノクローナル抗体を産生する細胞系統を樹立するための標準のハイブリドーマ技術に組み入れることができる。
【０１８４】
組換えヒト抗体は、抗PepG応答の強いヒトのボランティアから抗体産生B細胞を単離することによっても生成される。蛍光活性化細胞選別法(FACS)および蛍光標識したPepGを使用して、抗PepG抗体を産生する細胞を他の細胞から分離することができる。次いでRNAを抽出し、反応性抗体の可変領域の配列を決定することができる(49、53)。その機能し得る可変領域のDNA配列は、組換えヒト抗体の大規模生産のために、合成してもよいし、哺乳動物性発現ベクターにクローン化してもよい。
【０１８５】
結論
モノクローナル抗体は、マウスにおいて、グラム陽性細菌上の豊富な細胞表面分子である黄色ブドウ球菌PepGに対して産生させた。ハイブリドーマ・クローンの1つ99-110FC12IE4は、ELISAアッセイにおいてPepGに強く結合するが、表皮ブドウ球菌株Hay、またはグラム陽性細菌に共通の別の表面分子であるLTAに結合しないIgM抗体を産生する(実施例1、表5)。
【０１８６】
モノクローナル抗体を、枯草菌PepGに対しても産生させた。ハイブリドーマBB4/A4およびBB4/A5は、枯草菌PepGに結合するIgG抗体を産生する(実施例2)。BB4/A4、BB4/A5、11-232.3、11-248.2、11-569.3によって産生されたモノクローナル抗体、およびハイブリドーマ11-232.3から精製された抗体702PGの親和性について、数種の異なる細菌由来のPepGへの結合をELISAアッセイで試験した。同じマウスから産生されたMAb-BB4/A4およびMAb-BB4/A5は、枯草菌および表皮ブドウ球菌由来のPepGに強く結合し、MAb-11-232.3およびMAb-11-248.2は、PepG黄色ブドウ球菌に強く結合した(実施例3、表6)。これらの結果は、あるグラム陽性細菌由来のPepGに対するモノクローナル抗体が、別のグラム陽性細菌由来のPepGと結合し得ることを示しており、このことは、PepG上の保存されたエピトープとの結合を示しているのかもしれない。
【０１８７】
A110、MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、MAb-99-110FC12IE4、およびMAb-11-569.3が黄色ブドウ球菌PepGに結合するかどうかをELISAアッセイで試験した。UVで死滅させた完全黄色ブドウ球菌、または黄色ブドウ球菌PepGのどちらかに対して産生されたMAb-11-232.3、MAb-11-248.2、およびMAb-99-110FC12IE4は、黄色ブドウ球菌PepGに強く結合した。MAb-11-569.3は、これもUV死滅完全黄色ブドウ球菌に対して産生されたのであるが、PepGへの結合が弱く、この抗体が黄色ブドウ球菌表面上のPepG以外のエピトープに結合する可能性が示唆された。抗LTA抗体であるA110は、黄色ブドウ球菌PepGに結合しなかった(実施例4、表7)。抗体の黄色ブドウ球菌LTAへの結合を測定する同様のアッセイでは、かなりの結合を示したのがA110だけであった(実施例4、表8)。こうした結果は、UV死滅完全黄色ブドウ球菌に対して産生された抗体が実際に黄色ブドウ球菌表面上のPepGに特異的であるかもしれないことを実証している。
【０１８８】
次いで、それぞれの抗体がメタノール-固定化表皮ブドウ球菌株Hayに結合するかどうかを試験した。表皮ブドウ球菌LTAに対して産生されたA110は、メタノール-固定化表皮ブドウ球菌に最も強く結合した。MAb-11-569.3およびMAb-11-248.2も、UV死滅黄色ブドウ球菌に対して産生されたにもかかわらず、メタノール−固定化表皮ブドウ球菌に強く結合した。このことは、これらの抗体が、2種の細胞株の表面上の保存されたエピトープに結合する可能性を示唆している。MAb-11-232.3は、これもUV死滅黄色ブドウ球菌に対して産生されたものであるが、メタノール−固定化表皮ブドウ球菌にそれほど強く結合しなかった。同様に、黄色ブドウ球菌PepGに対して産生されたMAb99-110FC12IE4は、メタノール−固定化表皮ブドウ球菌に結合しなかった(実施例4、表9)。
【０１８９】
最後に、A110、MAb-11-232.3、およびMAb-11-569.3がメタノール−固定化黄色ブドウ球菌に結合するかどうかを試験した。驚くべきことではないが、MAb-11-232.3およびMAb-11-569.3は、UV死滅完全黄色ブドウ球菌に対して産生されているので強く結合した。熱死滅表皮ブドウ球菌に対して産生されたものであるが、A110もメタノール−固定化黄色ブドウ球菌に結合し、この抗体が、2種の細菌間に保存されたエピトープに結合できることが示された(実施例4、表10)。
【０１９０】
黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌に対する抗体を除去してあるヒト血清由来の補体およびPMNの存在下で、ハイブリドーマ99-110FC12IE4の上清の、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌に対するオプソニン活性を試験した。MAb-99-110FC12IE4は、黄色ブドウ球菌に対してオプソニン性であったが、表皮ブドウ球菌に対してはオプソニン性でなかった(実施例5、表11)。これまでの段落で論じたように、MAb-99-110FC12IE4は、黄色ブドウ球菌PepGに結合したが、完全表皮ブドウ球菌には結合せず、結合能とオプソニン活性の相関が示唆された。
【０１９１】
それぞれUV死滅完全黄色ブドウ球菌に対して産生されたMAb-11-232.2、MAb-11-569.3、MAb-11-248.2、精製黄色ブドウ球菌PepGに対して産生されたMAb-99-110FC12IE4、ならびにA110を、5型黄色ブドウ球菌に対する類似のオプソニン食作用アッセイで試験した。UV死滅黄色ブドウ球菌に対して産生された抗体MAb-11-232.2、MAb-11-569.3、およびMAb-11-248.2、ならびに黄色ブドウ球菌PepGに対して産生されたMAb-110FC12IE4は、このアッセイにおいて黄色ブドウ球菌を少なくとも75%死滅させた。表皮ブドウ球菌由来のLTAに対して産生された抗LTA抗体であるA110は、23%の死滅しか示さなかった(実施例5、表12)。驚くべきことに、A110は、黄色ブドウ球菌LTAおよびメタノール−固定化完全黄色ブドウ球菌の両方に強く結合したものの、黄色ブドウ球菌に対するオプソニン性が強くなかった。キメラでない型のA110であるM110は、前述のアッセイにおいて黄色ブドウ球菌に対するオプソニン性が若干強かった(実施例5、表12B)。しかし、このばらつきは、A110が表皮ブドウ球菌に対する活性を失わないでいるので、キメラ抗体と非キメラ抗体間の活性の差というよりも、アッセイ間の差異および用量の影響のためであると思われる(実施例5、表13)。一方、黄色ブドウ球菌PepGに対して、またUV死滅完全黄色ブドウ球菌に対して産生された抗体は、予想どおりその細菌に対して強いオプソニン活性を示した。
【０１９２】
表皮ブドウ球菌株Hayに対する同様のアッセイでは、MAb-11-232.2、MAb-11-569.3、およびMAb-11-248.2は、少なくとも66%の死滅を示したが、MAb-99-110FC12IE4は、ほとんどまたはまったく死滅を示さなかった。A110は、前述のアッセイとは対照的に、表皮ブドウ球菌株Hayを少なくとも98%死滅させた(実施例5、表13)。これらの結果および上で論じた結果は、メタノール−固定化細菌に結合できる能力と、その細菌に対するオプソニン活性との強い相関を示すものである。しかし、A110は、メタノール−固定化黄色ブドウ球菌に結合することができるが、生きた黄色ブドウ球菌に対してオプソニン性でないので、留意すべき例外である。さらに、これらの結果は、UV死滅黄色ブドウ球菌に対して産生されたモノクローナル抗体が、表皮ブドウ球菌に対してオプソニン活性を示し得ることを実証しており、一方に対して産生されたMAbを他方に対してオプソニン性にする、2種の細菌間の保存された決定基の存在を示唆する。MAb-11.232.3は、メタノール−固定化細菌ELISAにおいて表皮ブドウ球菌に対する結合が弱いにもかかわらず、それでもこの細菌に対して若干オプソニン性であったので、これらの結果は、オプソニン活性にとっては弱い結合で十分であるかもしれないことも示している。
【０１９３】
MAb-11-232.3が鼻腔でのコロニー形成を阻止する能力を、マウスにおいて試験した。対照群では9匹中9匹のマウスに黄色ブドウ球菌によるコロニー形成があったのに対し、5型黄色ブドウ球菌をMAb-11-232.3と共にプレインキュベートした後では、8匹中3匹のマウスだけに黄色ブドウ球菌のコロニー形成があった。さらに、コロニー形成のあったマウスのうちで、MAb-11232.3と共にプレインキュベートした黄色ブドウ球菌を受容したマウスの細菌コロニー数は、対照マウスの10分の1であった(実施例6、表14)。これらの結果は、黄色ブドウ球菌に結合し、かつそれに対してオプソニン性であるMAb-11-232.3が、細菌による鼻腔でのコロニー形成を阻止でき、またコロニー形成のあるマウスにおける細菌数も低減できることを示唆している。
【０１９４】
ハイブリドーマ11-232.3をサブクローニングし、サブクローン11-232.3IE9によって産生された抗体M130をさらに分析した。M130が数種の異なる細菌に結合するかどうかを生細菌ELISAアッセイで試験した。M130は、生きた黄色ブドウ球菌の3種の異なる株に結合したが、溶血性連鎖球菌または表皮ブドウ球菌には結合しなかった(実施例7、表16)。これらの結果は、MAb-11-232.3が黄色ブドウ球菌に強く結合したが、表皮ブドウ球菌には弱くしか結合しなかったメタノール−固定化化細菌ELISAと一致している。したがって、MAb-11.232.3およびM130は黄色ブドウ球菌に特異的であるとはいえ、MAb-11-232.3が、表皮ブドウ球菌に対して、結合の強さは劣るにもかかわらず若干はオプソニン性であるように、種々の細菌株に対して幅広い反応性を有する。
【０１９５】
M130の可変領域をクローン化し、M130可変領域とヒト定常領域を有するヒト/マウスキメラ抗体を作製した(実施例8および9)。A130と称したこのようなキメラ抗体は、黄色ブドウ球菌PepGへの結合能を保持していた(実施例10、図7)。こうしたヒト/マウスキメラ抗体は、ヒトにおけるHAMA応答が低減されていることが予想され、治療上有利であるかもしれない。
【０１９６】
最後に、サンドイッチアッセイを実施して、本発明の抗PepG抗体が実際にPepGに特異的であり、PepG調製物中の汚染物質に結合しないことを確認した。最初のアッセイでは、一連の抗体を使用してプレート上のPepGを捕捉し、次いでA130を検出抗体として使用して、捕捉されたPepGを検出した(実施例11、表18)。予想どおり、PepGに結合することがわかっている抗体は、A130抗体の結合よって検出されるように、PepGを捕捉することができた。LTAに結合する抗体は、A130によって検出できた抗原を捕捉せず、A130がLTAに結合しないことが示唆された。第２のアッセイでは、抗LTA A110抗体を使用してプレート上のLTAを捕捉し、次いでそれを、最初のアッセイで捕捉用に用いたものと同じ一連の抗体で検出した(実施例11、表19)。予想どおり、抗LTA抗体は、A110によって捕捉されたLTAを検出することができた。一方、抗PepG抗体は、A110によって捕捉された抗原を検出することができず、この種の抗体がLTAに結合しないことが示唆された。最後に、M110を使用して、プレート上のLTAまたはPepGのどちらかを捕捉し、次いで捕捉された抗体をA110またはA130で検出した(実施例11、表20)。予想どおり、M110は、PepG調製物またはLTA調製物由来の、A130によって検出可能であった抗原を捕捉できなかった。しかし、M110は、A110によって検出可能であったLTAを捕捉することができた。重要なことに、M110は、PepG調製物由来のLTAを、A110によって測定可能に検出されるのに十分なだけ捕捉することができず、PepG調製物がLTAをほとんど含んでいないことが示唆された。PepG調製物の純度がこのレベルであることは、これまで実証されていなかった。
【０１９７】
これまでは、使用されたポリクローナル血清が、細菌表面上の多くの異なるエピトープに結合する多くの異なる抗体を含んでおり、そのまとまった結合および活性の総和が血清全体としての活性になっているかもしれないので、モノクローナル抗体がグラム陽性細菌の食作用を増強することができるかどうかは不明であった。そこで本発明者らは、細菌表面上の単一のエピトープに結合するモノクローナル抗体が、その細菌に対してオプソニンになり得ることを実証した。また、PepGに対するモノクローナル抗体がそうした活性をもち得ること、ならびにこの種の抗体がいくつかの異なる型のグラム陽性細菌に対してオプソニンであり得ることも実証した。
【０１９８】
本発明の抗体は、鼻腔コロニー形成を阻止または軽減することができる。したがって、本発明の抗体は、抗生物質耐性のグラム陽性細菌感染と闘う際の有用な防御分子となり得る。
【０１９９】
参考文献
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上記のとおり本発明を完全に説明したが、当業者ならば、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、過度の実験を要することもなく、本発明を均等および条件の範囲内で実施できることがわかるであろう。また特定の実施形態および実施例に照らして本発明を説明してきたが、本発明者らは、それらはさらに変更可能なものであると考える。本出願は、上述の一般原理に従う本発明の変形、使用または改変にまで及ぶことを意図している。
【０２００】
本明細書は、参考文献の列挙を含むが、その参考文献を参考として本明細書中に特に取り入れるものとする。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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