(57)【要約】【課題】  結晶化の遅い生分解性を有するポリエステル樹脂の結晶化速度を向上させ、射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などの加工における加工性、加工速度を改善すること。【解決手段】  生分解性を有するポリエステルと、１種以上のアミノ酸が２個以上結合してなるペプチドとを含有する樹脂組成物を用いて成形体を作製すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性を有するポリエステルと、１種以上のアミノ酸が２個以上結合してなるペプチドとを含有する樹脂組成物。
【請求項２】
生分解性を有するポリエステルが、ブチレンサクシネート、カプロラクトン、ヒドロキシアルカノエート、グリコール酸、乳酸から選ばれる少なくとも１種の単位を重合してなるポリマーであることを特徴とする請求項１記載の樹脂組成物。
【請求項３】
生分解性を有するポリエステルが、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシナノエート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシドデカノエート、３−ヒドロキシドデセノエート、３−ヒドロキシテトラデカノエート、３−ヒドロキシヘキサデカノエート、３−ヒドロキシオクタデカノエート、３−ヒドロキシ−４−ペンテノエート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート及び６−ヒドロキシヘキサノエートからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位と、３−ヒドロキシブチレート単位とを重合してなるコポリマーである請求項２記載の樹脂組成物。
【請求項４】
生分解性を有するポリエステルが、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエートからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位と、３−ヒドロキシブチレート単位とを重合してなるコポリマーである請求項３記載の樹脂組成物。
【請求項５】
生分解性を有するポリエステルが、重量平均分子量３０万〜３００万であることを特徴とする請求項４記載の樹脂組成物。
【請求項６】
３−ヒドロキシブチレートの組成比が、コポリマー中に約７０〜９９モル％である請求項３〜５の何れかに記載の樹脂組成物。
【請求項７】
ペプチドの含有量が、生分解性を有するポリエステル１００重量部に対して０．０５重量部〜１０重量部である請求項１〜６の何れかに記載の樹脂組成物。
【請求項８】
ペプチドがグリシンを含むことを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載の樹脂組成物。
【請求項９】
ペプチドがグリシル−Ｌ−ロイシンである請求項１〜７の何れかに記載の樹脂組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性を有するポリエステル樹脂を含む樹脂組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年廃棄プラスチックが引き起こす環境問題がクローズアップされ、地球規模での循環型社会の実現が切望される中で、使用後微生物の働きによって分解される生分解性樹脂が注目を集めている。これまでに、生分解性を有する熱可塑性樹脂として、乳酸や多価アルコール、多価カルボン酸あるいはヒドロキシカルボン酸などを繰り返し単位とする重合体あるいは共重合体等のポリエステル樹脂が開発されている。しかし、これらポリエステル樹脂には、結晶化速度が遅いという欠点があり、なかでも脂肪族ヒドロキシカルボン酸の重合体であるポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと記す）は結晶化速度が特に遅いことが知られている（非特許文献１）。ＰＨＡはガラス転移温度も低いため、結晶化速度が遅いと成形加工時に溶融状態からの固化が遅くて加工が困難になり、加工できても、ラインスピードなどが遅くなり、成形加工の生産性が悪いという、工業生産において非常に重大な問題を抱えている。
【０００３】
従来より、ポリエステルの結晶化速度を改善する方法として種々の結晶核剤を添加することが検討されている。従来知られている結晶核剤として、例えば特許文献１には、生分解性樹脂に用いる結晶核剤として、天然または合成珪酸塩化合物、酸化チタン、硫酸バリウム、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸ソーダなどが挙げられ、珪酸塩化合物としては、カオリナイト、ハロイサイト、タルク、スメクタイト、バーミュライト、マイカなどが例示されている。また、ＰＨＡの結晶核剤として、タルク、微粒化雲母、窒化ホウ素、炭酸カルシウムが挙げられ、より効果的なものとして、有機ホスホン酸もしくは有機ホスフィン酸、またはそれらのエステル、あるいはそれらの酸もしくはエステルの誘導体、及び周期律表の第Ｉ〜Ｖ族の金属の酸化物、水酸化物、及び飽和または不飽和カルボン酸塩からなる群より選択される金属化合物（特許文献２）、ポリビニルアルコール、キチンおよびキトサン（特許文献３）、チロシン、フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸からなる化合物（特許文献４）などが開示されている。特許文献５には、熱可塑性ポリエステルの結晶核剤として、窒素含有ヘテロ芳香族核を含む化合物が開示されている。特許文献６には、熱可塑性樹脂の結晶核剤として、アミノ酸の金属塩が開示されている。しかしながら、実質的に効果の高い結晶核剤は未だ見出されていないのが現状である。
【特許文献１】特開２００５−３３６４４８号公報
【特許文献２】特開平３−２４１５１号公報
【特許文献３】特開２００７−７７２３２号公報
【特許文献４】米国特許第５，５１６，５６５号明細書
【特許文献５】特表２００７−５１７１２６号公報
【特許文献６】米国特許第６，５５５，６０３号明細書
【非特許文献１】“Biopolymers” Volume 4, Polyesters III Applications and Commercial Products, WILEY-VCH, p67
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、これら結晶化の遅い生分解性を有するポリエステル樹脂の結晶化速度を向上させ、射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などの加工における加工性、加工速度を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の化合物を結晶核剤として添加することにより、結晶化の遅い生分解性を有するポリエステル樹脂の結晶化速度が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明の第一は、
（１）生分解性を有するポリエステルと、１種以上のアミノ酸が２個以上結合してなるペプチドとを含有する樹脂組成物、
（２）生分解性を有するポリエステルが、ブチレンサクシネート、カプロラクトン、ヒドロキシアルカノエート、グリコール酸、乳酸から選ばれる少なくとも１種の単位を重合してなるポリマーであることを特徴とする上記記載の樹脂組成物、
（３）生分解性を有するポリエステルが、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシナノエート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシドデカノエート、３−ヒドロキシドデセノエート、３−ヒドロキシテトラデカノエート、３−ヒドロキシヘキサデカノエート、３−ヒドロキシオクタデカノエート、３−ヒドロキシ−４−ペンテノエート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート及び６−ヒドロキシヘキサノエートからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位と、３−ヒドロキシブチレート単位とを重合してなるコポリマーである上記記載の樹脂組成物、
（４）生分解性を有するポリエステルが、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエートからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位と、３−ヒドロキシブチレート単位とを重合してなるコポリマーである上記記載の樹脂組成物、
（５）生分解性を有するポリエステルが、重量平均分子量３０万〜３００万であることを特徴とする上記記載の樹脂組成物、
（６）３−ヒドロキシブチレートの組成比が、コポリマー中に約７０〜９９モル％である上記記載の樹脂組成物、
（７）ペプチドの含有量が、生分解性を有するポリエステル１００重量部に対して０．０５重量部〜１０重量部である上記記載の樹脂組成物、
（８）ペプチドがグリシンを含むことを特徴とする上記記載の樹脂組成物、
（９）ペプチドがグリシル−Ｌ−ロイシンである上記記載の樹脂組成物、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、結晶化の遅い生分解性を有するポリエステル樹脂の結晶化速度を著しく向上でき、射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などの加工におけるポリエステル樹脂の加工性、加工速度を改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明の樹脂組成物は、生分解性を有するポリエステルと、１種以上のアミノ酸が２個以上結合してなるペプチドとを含有する。
【０００９】
本発明の生分解性を有するポリエステル樹脂としては、自然界において微生物により分解されるものであれば特に限定されない。例えばポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネートアジペート、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシアルカノエート（略称：ＰＨＡ）、ポリグリコール酸、ポリ乳酸などが挙げられるが、このうちガラス転移点が低く、結晶化速度の遅いＰＨＡにおいて、本発明の樹脂組成物は特に加工性、加工速度を好適に改善することができる。なお前記ポリエステル樹脂には、本発明の効果を阻害しない限り、共重合可能な成分を含んでいても良い。
【００１０】
前記ＰＨＡとしては、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシノナノエート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシドデカノエート、３−ヒドロキシドデセノエート、３−ヒドロキシテトラデカノエート、３−ヒドロキシヘキサドデカノエート、３−ヒドロキシオクタドデカノエート、３−ヒドロキシ−４−ペンテノエート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート及び６−ヒドロキシヘキサノエートからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーと、３−ヒドロキシブチレートとのコポリマーが挙げられ、好ましくは３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート及び３−ヒドロキシオクタノエートの群から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位と、３−ヒドロキシブチレート単位とのコポリマーである。これらＰＨＡにおける３−ヒドロキシブチレートの組成比は、コポリマー中７０〜９９モル％が好ましい。７０モル％より少ないと成形が困難になる場合があり、９９モル％より多いと樹脂が硬く、脆くなって品質上の問題を生じる場合がある。
【００１１】
前記ＰＨＡの分子量は特に限定されないが、加工性の観点から重量平均分子量で３０万〜３００万であることが好ましく、より好ましくは４０万〜２５０万、さらに好ましくは５０万〜２００万である。ＰＨＡの重量平均分子量が３０万未満では、強度などの機械的特性が不十分である場合があり、３００万を超えると、成形性が劣る場合がある。
【００１２】
なお、ＰＨＡの重量平均分子量の測定方法は特に限定されないが、一例としては、クロロホルムを移動相として、システムとして、ウオーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）社製ＧＰＣシステムを用い、カラムに、昭和電工（株）製Ｓｈｏｄｅｘ  Ｋ−８０４（ポリスチレンゲル）を用いることにより、ポリスチレン換算での分子量として求めることができる。
【００１３】
本発明の樹脂組成物は前記生分解性を有するポリエステル樹脂のほか、デンプン、セルロースなどの天然高分子などを配合することもできる。また、上記以外の熱可塑性樹脂を必要に応じて配合することもできる。
【００１４】
本発明の樹脂組成物は、１種以上のアミノ酸が２個以上結合してなるペプチドを結晶核剤として含有する。アミノ酸には天然、あるいは非天然の化合物が数多く存在するが、天然由来であることが好ましい。その理由は、タンパク質を構成するような天然アミノ酸は、本樹脂組成物が土壌中などで微生物による分解される際に、環境汚染等の問題を全く発生させないからである。
【００１５】
前記タンパク質を構成するような天然のアミノ酸とは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、セレノシステイン、ピロリシンの２２種類を指す。そして、これらタンパク質を構成するような天然のアミノ酸から選ばれる少なくとも１種以上が２個以上結合してなるペプチドとは、例えばグリシルグリシン、グリシル−Ｌ−ロイシンのようなジペプチド、グリシルグリシルグリシン、Ｌ−ロイシルグリシルグリシンのようなトリペプチド、シクロ−ＤＬ−アラニルグリシルのような環状ペプチドなどが挙げられる。また、シスチンのようなアミノ酸の一部が修飾あるいは分解された化合物や、タンパク質を構成しないが天然に存在するアミノ酸、例えばサルコシン（Ｎ−メチルグリシン）を含むシクロトリサルコシルなども本発明のペプチドに含まれる。
【００１６】
また、タンパク質を構成するアミノ酸から選ばれる少なくとも１種以上のアミノ酸が２個以上結合してなるペプチドとしてはグリシンを含むことが好ましく、より好ましいのはグリシル−Ｌ−ロイシンである。その理由は、これらのペプチドは、上述した通り樹脂組成物が土壌中などで微生物により分解される際に樹脂とともに分解されるため、環境汚染等の問題が全く発生しないからである。
【００１７】
上記ペプチドは、予め粉砕等により粒径を小さくしてから添加することにより、結晶核剤としての効果をより高めることができる。粒径としては５００μｍ以下が好ましく、より好ましくは１００μｍ以下である。該粒径は、レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置により測定できる。
【００１８】
粒径を小さくする方法としては、乳鉢による粉砕のほか、衝突板式または粉体衝突式のジェットミル、ビーズミル、ハンマーミル等従来公知の方法が使用できる。また、粉砕によらず、例えば結晶核剤の溶液とポリエステル樹脂を混合し、その後溶媒を除去することによって、結晶核剤をポリエステル樹脂表面に析出させることもできる。
【００１９】
本発明における樹脂組成物中のペプチドの含有量は、結晶化速度向上および得られる樹脂組成物の物理的性質のバランスの観点から、生分解性を有するポリエステル樹脂１００重量部に対し、通常、０．０５重量部〜２０重量部以下であり、好ましくは０．１重量部〜１０重量部であり、より好ましくは０．１重量部〜５重量部である。
【００２０】
本発明の樹脂組成物は上記ペプチドを含有してなり、これによって結晶化速度を改善できるが、その他の添加剤、例えば酸化防止剤、紫外線吸収剤、染料・顔料などの着色剤、可塑剤、滑剤、無機充填剤、帯電防止剤、防カビ剤、抗菌剤、発泡剤、難燃剤等を必要に応じて配合、含有することができる。また、他の結晶核剤を含有してもよい。
【００２１】
以上のようにして得られる樹脂組成物を成形処理することにより成形体を製造することができる。成形処理方法としては従来公知の方法でよく、例えば射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などが挙げられる。
【００２２】
前記成形体は、例えば各種容器、包装材、農園芸用のフィルム、医療材料等に用いることが出来る。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、結晶化の評価は下記の通り行った。
【００２４】
＜結晶化の評価方法＞
ＤＳＣ（エスアイアイ・ナノテクノロジー（株）製ＤＳＣ２２０）を用い、２５℃から用いた樹脂の融点より十分に高い温度まで１０℃／ｍｉｎで昇温して樹脂を融解させたあと、１０℃／分で２５℃まで冷却した。その後再び１０℃／分で昇温し、この過程において見られる、結晶化を示すピークの温度と大きさ（結晶化熱量）により評価した。なお、昇温した温度の具体的な値については、各実施例中に示す。
【００２５】
（製造例１）  ３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）含有率１２ｍｏｌ％のポリ−３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート（ＰＨＢＨ）の作製
【００２６】
＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
挿入用ＤＮＡとしてA. caviaeのｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１および配列番号２で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＥｃｏＲＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ−５Ｐ＋Ｅｃｏとした。
【００２７】
次に、特開2008-029218号公報［0038］に記載のＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前をＤＮＡ挿入部位と設定し、以下の手順で該遺伝子の開始コドンより上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。
【００２８】
特開2008-029218号公報［0036］に記載のＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号３および配列番号４で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより上流の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片をＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏとした。
【００２９】
ＰＡｃ−５Ｐ＋ＥｃｏおよびＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号３および配列番号２で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で５０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＢａｍＨＩ消化した。このＤＮＡ断片をｂＰａｃ−５Ｐ＋Ｂａｍとした。
【００３０】
次に、該遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号５および配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した。このＤＮＡ断片をＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａとした。
【００３１】
ｂＰａｃ−５Ｐ＋ＢａｍとＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号３および配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分３０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをｂＡＯ／ｐＢｌｕとした。ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認した。
【００３２】
続いて、特開2008-029218号公報［0037］に記載のｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ｂＡＯ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。
【００３３】
＜遺伝子挿入株Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製＞
次に、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株としてｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。遺伝子挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換した。得られた形質転換体をＫＮＫ−００５ＡＳ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して２回目の組換えが生じた株を取得した。さらにＰＣＲによる解析により所望の遺伝子挿入株を単離した。
【００３４】
この遺伝子挿入株をＰａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株と命名し、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。
【００３５】
＜ｃｃｒ遺伝子のクローニング及び発現ユニット構築＞
クロトニル−ＣｏＡを、３ＨＨモノマーの前駆体であるブチリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードするｃｃｒ遺伝子を、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）Ｏｋａｍｉ株（ＤＳＭ  １０４２）の染色体ＤＮＡからクローニングした。配列番号７及び配列番号８記載のＤＮＡをプライマーとしＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で２０秒、６８℃で９０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩで切断した。ＥＥ３２ｄ１３断片（J. Bacteriol., 179, 4821 (1997)）を、ｐＵＣ１９ベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、このプラスミドをＢｇｌＩＩとＡｆｌＩＩで切断し、ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩ断片としたｃｃｒ遺伝子と断片を置換することによってｃｃｒ発現ユニットを構築した。
【００３６】
＜ｐｈａＣ遺伝子のクローニング及び発現ユニット調製＞
配列番号１１を含むｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製した。特開2007-228894号公報［0031］に記載のＨＧ：：ＰＲｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ／ｐＢｌｕを鋳型とし、配列番号９と配列番号１０に示すプライマーとしてＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＳｐｅＩで切断して発現ユニットを調製した。
発現ベクターｐＣＵＰ２−６３１は以下のようにして構築した。
【００３７】
C. necatorにおける発現ベクター構築用のプラスミドベクターとしては、国際公開公報WO/2007/049716号公報［0041］に記載のｐＣＵＰ２を用いた。まず実施例７で構築したｃｃｒ遺伝子発現ユニットをＥｃｏＲＩ処理により切り出し、この断片をＭｕｎＩで切断したｐＣＵＰ２と連結した。次に実施例８で作製したｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製し、ｃｃｒ遺伝子発現ユニットを含むｐＣＵＰ２のＳｐｅＩ部位に挿入してｐＣＵＰ２−６３１ベクターを構築した。
【００３８】
＜形質転換体の作製＞
ｐＣＵＰ２−６３１ベクターの種々の細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた形質転換体を取得した。
【００３９】
＜形質転換体の培養＞
上記で作製した形質転換体の培養を行った。前培地の組成は１％(w/v)Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１％(w/v)Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２％(w/v)Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、および、０．１５％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４で、ｐＨ６．７に調整した。
【００４０】
ポリエステル生産培地の組成は１．１％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４、０．６％(w/v)（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％(w/v)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％(v/v)微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６％(w/v)ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１％(w/v)ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２％(w/v)ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６％(w/v)ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２％(w/v)ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１％(w/v)ＣｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源としてＰＫＯＯ（Palm kernel olein、パーム核油オレイン画分）を流加する流加培養にて行った。
【００４１】
それぞれの形質転換体のグリセロールストックを前培地に接種して２０時間培養し、２．５Ｌのポリエステル生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤ−５００型）に１０％(v/v)接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量０．６ｖｖｍとし、ｐＨは６．６から６．８の間でコントロールした。コントロールには１４％のアンモニア水を使用した。培養は６５時間まで行った。培養後遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄後、凍結乾燥し、ＰＨＢＨを得た。
【００４２】
生産されたポリエステルの３ＨＨ組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ＰＨＢＨの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ＰＨＢＨ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のＰＨＢＨ分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度１００から２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００から２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、３ＨＨ比率が１２％のＰＨＢＨであった。
【００４３】
（実施例１）
３−ヒドロキシブチレートの繰り返し単位中に３−ヒドロキシヘキサノエート繰り返し単位を含有する共重合体（以下、この共重合体をＰＨＢＨと記す）を用いて、結晶化の評価をおこなった。ＰＨＢＨは、製造例１に示した方法で生産されたもので、共重合体中の３−ヒドロキシヘキサノエート繰り返し単位の含有率は１２ｍｏｌ％であり、Ｍｗ（重量平均分子量）が約６６万のものを使用した。ＰＨＢＨの塩化メチレン溶液（ＰＨＢＨ含量２．５％ｗ／ｖ）に、グリシル−Ｌ−ロイシン（和光純薬製特級試薬）を乳鉢ですりつぶした上、ＰＨＢＨ１００重量部に対して２重量部添加し、超音波をかけて分散させた後、ガラス上にキャストしてフィルムを作製した。このフィルムの一部をサンプリングして、ＤＳＣにより１８０℃まで昇温して結晶化の評価をおこなったところ、再昇温過程の６３℃において結晶化ピークが観察された。その際の結晶化熱量は３１Ｊ／ｇであった。
【００４４】
（比較例１）
ＰＨＢＨにグリシル−Ｌ−ロイシンを添加しなかった以外は、実施例１と同様にＤＳＣにより１８０℃まで昇温して評価をおこなったところ、いずれの過程においても結晶化ピークは全く観察されなかった。
【００４５】
（比較例２）
グリシル−Ｌ−ロイシンの代わりに、米国特許第６，５５５，６０３号明細書記載の結晶核剤であるＬ−（−）−フェニルアラニン（ナカライテスク製特級試薬）をＰＨＢＨ１００重量部に対して２重量部添加した以外は、実施例１と同様にして、ＤＳＣにより１８０℃まで昇温して結晶化の評価をおこなったところ、いずれの過程においても結晶化ピークは全く観察されなかった。
【配列表】
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