(57)【要約】【課題】被検試料における核酸の分離・精製等の前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得る特定遺伝子、具体的には、特定ウイルスまたは特定微生物の検出方法を提供することである。【解決手段】表面処理された不溶性担体の上にキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させてチューブ状のＤＮＡ固定化担体を作製する第１工程と、被検試料のなかで、被検試料から微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、遺伝子溶解溶液を作製する第２工程と、ＤＮＡ固定化担体の上に遺伝子溶解溶液を添加し、キャプチャーＤＮＡ鎖と遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせて、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を分離する第３工程と、ＤＮＡ固定化担体に対して直接、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を増幅する第４工程とを備える特定遺伝子の検出方法に関する。【選択図】図１
2010046042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質で被覆された不溶性担体の上にキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させてチューブ状のＤＮＡ固定化担体を作製する第１工程と、
被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料から微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、遺伝子溶解溶液を作製する第２工程と、
前記ＤＮＡ固定化担体の上に前記遺伝子溶解溶液を添加し、前記キャプチャーＤＮＡ鎖と前記遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせて、前記キャプチャーＤＮＡ鎖と相補的な配列を有するＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を分離する第３工程と、
前記ＤＮＡ固定化担体に対して直接、前記ＤＮＡ鎖断片または前記ＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して前記ＤＮＡ鎖断片または前記ＲＮＡ鎖断片で増幅する第４工程と、
を備える特定遺伝子の検出方法。
【請求項２】
ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基を有する高分子物質で被覆された不溶性担体の上に抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかを固定化させてチューブ状の生体高分子固定化担体を作製する工程と、
被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料を前記生体高分子固定化担体の上に添加し、前記抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかで前記微生物または前記ウイルスを捕捉する工程と、
前記微生物または前記ウイルスにおける微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を含む遺伝子溶解溶液を作製する工程と、
前記生体高分子固定化担体に対して直接、前記ＤＮＡ鎖断片または前記ＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施して前記ＤＮＡ鎖断片もしくは前記ＲＮＡ鎖断片で増幅する工程と、
を備える特定遺伝子の検出方法。
【請求項３】
被検試料が、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、全血、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、精液、細胞組織または食品である請求項１または２に記載の特定遺伝子の検出方法。
【請求項４】
前記第３工程において、４〜７０℃で５分〜９０分間、ハイブリダイズする請求項１または３に記載の特定遺伝子の検出方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡ鎖断片を逆転写するための逆転写反応のプライマーとして、ランダムプライマー、ｄＴプライマーまたは１個以上の配列特異的なスペシフィックプライマーから合成されたｃＤＮＡを使用する請求項１〜４のいずれかに記載の特定遺伝子の検出方法。
【請求項６】
前記第４工程、または、前記ＤＮＡ鎖断片もしくは前記ＲＮＡ鎖断片で増幅する工程の後に増幅したＤＮＡ鎖断片を検量して、被検試料中の微生物遺伝子またはウイルス遺伝子の存在の有無を判定する第５工程をさらに備える請求項１〜５のいずれかに記載の特定遺伝子の検出方法。
【請求項７】
前記キャプチャーＤＮＡ鎖は、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列または１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に相補的な配列から選択される請求項１または請求項３〜６のいずれかに記載の特定遺伝子の検出方法。
【請求項８】
前記微生物がグラム陽性菌またはグラム陰性菌である請求項１〜７のいずれかに記載の特定遺伝子の検出方法。
【請求項９】
前記ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイルス、ペスチウイルス、ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペストウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、オルソクソウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ラブドウイルス、狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウシライノウイルス、ウマライノウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、コロナウイルス、ヒトコロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓国型出血熱ウイルス、レトロウイルス、ヒト成人白血病ウイルス、エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、ノーウオークウイルス、ノロウイルス、ブンヤウイルス、腎症候性出血熱ウイルス、フィロウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス、パルボウイルス、ヒトパルボウイルス、豚パルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウイルス、パポーバウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルスおよびアフリカ豚コレラウイルスよりなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜８のいずれかに記載の特定遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定遺伝子の検出方法に関する。より詳細には、生体試料中に存在するウイルス、または、食品や臨床試料中に含まれる微生物を特異的に検出することのできる特定遺伝子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス病の診断を確実に行なうこと、又未知の流行病を新しいウイルス病として同定することは、当該ウイルス病の地域分布と流行時期を知り、当該疾患に対する予防と治療対策を立てる上で重要なことである。しかも、ウイルス病は速やかにしかも正確に診断されないと、適切な対策処理が手遅れとなることが多い。
【０００３】
臨床検体中の特定ウイルスを直接検出する方法としては、たとえば検体中に存在するウイルス抗原を蛍光等で標識した抗体と反応させて検出する方法が挙げられる。当該方法は２〜３時間程度で結果が得られるという利点はあるが、検体中の夾雑物質との非特異反応による偽陽性反応の可能性や検体中に一定以上のウイルス抗原がないと検出できないという検出感度の問題が指摘されている。また最近では、生体試料から、生体に潜在しているウイルス核酸やｍＲＮＡの存在を証明して診断する方法が開発されている。当該方法によると、ＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５））やＲＴ−ＰＣＲ法を利用することによって生体試料中に微量存在するウイルス遺伝子でも高感度に検出できるが、この場合検査結果の取得に１日以上要する。
【０００４】
また、たとえば、輸血用血液や血液製剤の安全性を確保するため、献血血液に対して、通常、ウイルス検査が行なわれる。このような検査としては、血液中のウイルス抗原やウイルス関連抗体の有無を調べる血清学的検査が主に行われている。１９９９年から、血清学的検査で陰性となった血液に対して、２次検査として核酸増幅検査（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ：  ＮＡＴ）が行われている。ＮＡＴとは、ウイルス遺伝子の一部の核酸を取り出し（抽出）、その核酸を増やし（増幅）、増えた核酸を検出することでウイルス遺伝子の有無を確認する検査法のことである。ＮＡＴを使用したウイルス検査法は、ウイルスの持つ遺伝子を数万倍以上に増幅して検出するため、従来の血清学的な検査法に比べ、極めて感度の高い検査法である。この検査で再度陰性になった献血血液が、輸血用血液および血液製剤の原料などとして使用される。
【０００５】
このようなＮＡＴの導入により、献血血液を原料とした輸血用血液や血液製剤等の安全性は以前よりも向上してきたが、輸血後の感染症発生率は依然として０％に達していない。通常、ＮＡＴを用いた２次検査では１人からたとえば約４μＬといった微少量の血液を採取し、約５０人分を１つにまとめて分析を行なっている。このため、感染直後のようにウイルス量が極端に少ない場合などには、検査に回した血液約４μＬ中にウイルスが含まれない確率が高い。その場合、献血によって集められた血液中にウイルスが存在していても検出されずに輸血感染する恐れがある。
【０００６】
また、食品や臨床試料、または環境中などの特定微生物の有無を調べる場合には、従来、被検試料中の微生物を分離培養し、コロニーについて視覚的観察（コロニーの色素反応、コロニー形態等）、顕微鏡観察、グラム染色、生化学的性状の検査等を行なっていた。特定微生物の有無が判明するまでに少なくとも２日間を要する。したがって、この方法は、微生物が検出されたとしてとしてもそれに対する対応が遅くなることから、食品メーカーによる食品出荷前の自主検査には採用し難い。
【０００７】
食品の殺菌技術や加工技術が向上したことにより、微量であっても被検試料中に存在する微生物の生死の状態を識別するニーズが高まっている。特に、食品衛生検査や臨床検査領域においては、微生物の迅速検出法として、ＰＣＲ法により各微生物の特異遺伝子を視覚的に捉えられる量まで増幅し、各微生物の存在の有無を判別および定量する試みがなされている。しかし、微生物のＤＮＡにターゲットを当てた場合、被検試料に元来含まれている死菌のバックグラウンドまで検出されるため、ＰＣＲ法で陽性判定がでた場合、必ずしも生きた微生物の存在を示唆しているとは限らなかった。
【０００８】
一方、生きた微生物（生菌）の存在を確認するためには、食品から微生物を分離培養し、得られたコロニーについて、特定微生物のＤＮＡに対応したプライマーを用いたＰＣＲ法により特定微生物のＤＮＡを迅速に検出する方法が開発されている。しかし、この方法によっても、食品から微生物を分離培養するのに少なくとも１日間を要する。そのために、食品衛生や臨床検査の分野では、ＰＣＲ法は高感度・迅速でありながら普及していないのが現状であった。
【０００９】
ここで、特許文献１、特許文献２および非特許文献１には、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面にＤＮＡ鎖を固定化した不溶性担体に検出対象遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含有する溶液を添加し、該ＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせ、溶液中の遺伝子断片の含有状況を判定することを特徴とする遺伝子の検出方法が開示されている。
【００１０】
また、最近では、ｍＲＮＡをターゲットにして、逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製後、各微生物の特異プライマーを用いてＰＣＲを行い、被検試料中の生菌のみを検出・定量する試みがなされている。しかし、この方法では、死菌のバックグラウンドを検出してしまうため、生死の判別法としては十分なものとは言えなかった。具体的には、ＰＣＲ法を利用した微生物等の生死を判別する方法としては、特許文献４に記載の方法が開示されている。
【００１１】
また、非特許文献２には、ノロウイルスの検出法が開示されており、特許文献３には微生物等の検出等に利用されるＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が開示されており、非特許文献３には、微生物等の検出等に利用されるＲＴ−ＬＡＭＰ法が開示されている。
【特許文献１】特開２００６−１８７２７０号公報
【特許文献２】特開２００６−３２２７３９号公報
【特許文献３】特開２００４−１５４００８号公報
【特許文献４】特表２００３−５３０１１８号公報
【非特許文献１】Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００７，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１  ｅ３
【非特許文献２】ノロウイルスの検出法（平成１５年１１月５日付け食安監発第１１０５００１号）
【非特許文献３】Ｆｕｋｕｄａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．４：  １３７６-１３８１  （２００６）  （ＲＴ−ＬＡＭＰ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記のように、特定ウイルスの検出および特定微生物の検出には、さまざまな問題が未
だ解決されていない。そして、特許文献１、特許文献２および非特許文献１には、微量の核酸を迅速にかつ簡便に測定することができる方法については開示されていない。
【００１３】
そしてさらに、患者から採取した生体試料を対象として、該生体試料中に含まれるウイルス遺伝子の検出を目的としてハイブリダイゼーションが広く行われてきているが、１個の不溶性担体内でウイルス遺伝子を捕捉し、洗浄後、分離した遺伝子を増幅してウイルスを検出する方法は知られていなかった。
【００１４】
また、試料中の微量の核酸を増幅するためにはＰＣＲ法が広く普及している。しかしながら、ＰＣＲ法では試料中に含まれる夾雑物により遺伝子の増幅反応を阻害してしまう場合がある。したがって、ＰＣＲ法を用いた場合には、増幅反応の前に分離・精製等の煩雑な前処理を行なう必要がある。
【００１５】
このような背景から、本発明者らは、特定ウイルスの検出において、血液中に含まれるウイルス数が極端に少ない場合でも、簡便かつ短時間にウイルスを検出できる検査法の開発を行なってきた。また、本発明者らは、特定微生物の検出において、食品や臨床試料中に含まれる特定の複数の微生物または微生物群の生菌の有無を死菌に比べて選択的、簡単かつ迅速に検出する方法の開発を行なってきた。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、被検試料における核酸の分離・精製等の前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得る特定遺伝子、具体的には、特定ウイルスまたは特定微生物の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、上記課題の解決を目的として種々検討していたところ、ウイルスに感染した患者の生体試料を公知のグアニジンイソチオシアネート、ＳＤＳ、ＮａＯＨなどを含む緩衝溶液でウイルスを溶解させ、次いでＤＮＡ鎖を固定化した不溶性担体にハイブリダイゼーションを行なうことにより、生体試料中に存在するウイルス遺伝子の捕捉、分離を簡便かつ迅速に行なうことができ、しかも遺伝子断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、逆転写ＬＡＭＰ法（ＲＴ−ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅などの遺伝子増幅法を用いて特異的に検出することができることを見出し、増幅することによって得られた結果が患者検体の臨床状態を的確に反映した結果であることを確認した。本発明は、かかる知見に基づいて開発されたものである。
【００１８】
ウイルスを含み得る被検試料中のウイルス遺伝子の存在の有無を判定することを特徴とするウイルス感染の診断方法である。なお、当該診断方法には、ウイルス感染成立を診断する方法だけでなく、ウイルス感染の経過や治療経過を診断する方法もまた含まれる。
【００１９】
つまり、本発明は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質で被覆された不溶性担体の上にキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させてチューブ状のＤＮＡ固定化担体を作製する第１工程と、被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料から微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、遺伝子溶解溶液を作製する第２工程と、ＤＮＡ固定化担体の上に遺伝子溶解溶液を添加し、キャプチャーＤＮＡ鎖と遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせて、キャプチャーＤＮＡ鎖と相補的な配列を有するＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を分離する第３工程と、ＤＮＡ固定化担体に対して直接、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施してＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片で増幅する第４工程とを備える特定遺伝子の検出方法に関する。
【００２０】
また、本発明は、ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基を有する高分子物質で被覆された不溶性担体の上に抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかを固定化させてチューブ状の生体高分子固定化担体を作製する工程と、被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料を生体高分子固定化担体の上に添加し、抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかで微生物またはウイルスを捕捉する工程と、微生物またはウイルスにおける微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を含む遺伝子溶解溶液を作製する工程と、生体高分子固定化担体に対して直接、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施してＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片で増幅する工程とを備える特定遺伝子の検出方法に関する。
【００２１】
また、本発明においては、被検試料が、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、全血、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、精液、細胞組織または食品であることが好ましい。
【００２２】
また、本発明においては、第３工程において、４〜７０℃で５分〜９０分間、ハイブリダイズすることが好ましい。
【００２３】
また、本発明においては、第４工程において、ＲＮＡ鎖断片を逆転写するための逆転写反応のプライマーとして、ランダムプライマー、ｄＴプライマーまたは１個以上の配列特異的なスペシフィックプライマーから合成されたｃＤＮＡを使用することが好ましい。
【００２４】
また、本発明においては、第４工程、または、ＤＮＡ鎖断片もしくはＲＮＡ鎖断片で増幅する工程の後に増幅したＤＮＡ鎖断片を検量して、被検試料中の微生物遺伝子またはウイルス遺伝子の存在の有無を判定する第５工程をさらに備えることが好ましい。
【００２５】
また、本発明においては、キャプチャーＤＮＡ鎖は、１０〜５０塩基からなり、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列または１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に相補的な配列から選択されることが好ましい。
【００２６】
また、本発明においては、キャプチャーＤＮＡ鎖のターゲット配列領域がさらに、トポイソメラーゼ、または、ＤＮＡジャイレースを含む微生物特異的な配列であることが好ましい。
【００２７】
また、本発明においては、微生物がグラム陽性菌またはグラム陰性菌であることが好ましい。
【００２８】
また、本発明においてはウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、トガウイルス（アルファウイルス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイルス）、ペスチウイルス（ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペストウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）、オルソクソウイルス（ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウシライノウイルス、ウマライノウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（ヒトコロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓国型出血熱ウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、レオウイルス（ロタウイルス）、カリシウイルス（ノーウオークウイルス）、ノロウイルス、ブンヤウイルス（腎症候性出血熱ウイルス）、フィロウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイルス、豚パルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウイルス）、パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルス）およびアフリカ豚コレラウイルスよりなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の方法によると、被検試料における核酸の分離・精製等の前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得る特定遺伝子、具体的には、特定ウイルスまたは特定微生物の検出をすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の特定遺伝子の検出方法においては、少なくとも第１工程〜第４工程を備える。第１工程は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質で被覆された不溶性担体の上にキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させてチューブ状のＤＮＡ固定化担体を作製する工程である。第２工程は、微生物またはウイルスを含む被検試料から微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、遺伝子溶解溶液を作製する工程である。第３工程は、ＤＮＡ固定化担体の上に遺伝子溶解溶液を添加し、キャプチャーＤＮＡ鎖と遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせて、キャプチャーＤＮＡ鎖と相補的な配列を有するＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を分離する工程である。第４工程は、ＤＮＡ固定化担体に対して直接、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施してＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片で増幅する工程である。
【００３１】
また、本発明の別の形態における特定遺伝子の検出方法においては、抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかが固定化されたチューブ状の生体高分子固定化担体を用いる。そして、該特定遺伝子の検出方法においても４つの工程を備える。これらの工程は、ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基等の生体適合性の高い官能基を有する高分子物質で被覆された不溶性担体の上に抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかを固定化させてチューブ状の生体高分子固定化担体を作製する工程と、被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料を生体高分子固定化担体の上に添加し、抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかで微生物またはウイルスを捕捉する工程と、微生物またはウイルスにおける微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を含む遺伝子溶解溶液を作製する工程と、生体高分子固定化担体に対して直接、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片をポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施してＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片で増幅する工程とからなる。なお、ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基等の生体適合性の高い官能基を有する高分子物質については、特開２００８−１２８８５４号公報に記載されているものを挙げることができる。
【００３２】
［第１実施形態］
以下、各工程について詳細に説明する。
【００３３】
＜第１工程＞
本工程においては、チューブ状のＤＮＡ固定化担体を作製する。より具体的には、チューブ状の不溶性担体の少なくとも内側を高分子物質で被覆して、その上にキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させることによってチューブ状のＤＮＡ固定化担体を作製する。
【００３４】
まず、本実施形態の本工程における「高分子物質」は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含み、ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーを示す。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基は鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はキャプチャーＤＮＡ鎖を化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、キャプチャーＤＮＡ鎖は、このコーティング層の活性エステル基の部位で共有結合して、当該不溶性担体の表面に固定化される。具体的には、住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ  ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブを例として挙げることができる。なお、チューブ状のＤＮＡ固定化担体の作製方法については、特許文献２に詳細が記載されている。
【００３５】
次に、本発明における「不溶性担体」は、プラスチック、ガラス等からなるチューブのほか、９６穴ウェル等を挙げることができる。
【００３６】
チューブ状とは、中空状態のものをいい、底があるＰＣＲチューブや、エッペンドルフチューブのような形状であってもよい。
【００３７】
そして、本発明における「キャプチャーＤＮＡ鎖」は、後述する被検試料に含まれる微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子におけるターゲット配列領域の一部と相補的な配列を有するＤＮＡ鎖をいう。なお、キャプチャーＤＮＡ鎖は、ターゲット配列領域の相補的な配列と相同性が５０％以上であればよい。キャプチャーＤＮＡ鎖には、塩基数が１００以下より好ましくは８０以下のＤＮＡ鎖を用いることが好ましい。これは、キャプチャーＤＮＡの長さが１００以下である場合には、合成が容易であり、また、後述するハイブリダイゼーションを安定して行なうことができるためである。また、キャプチャーＤＮＡ鎖には、修飾されたオリゴＤＮＡを用いることが好ましいが、無修飾のオリゴＤＮＡを用いても固定化が可能である。さらには、キャプチャーＤＮＡ鎖がアミノ基が導入されたオリゴＤＮＡである場合には、固定化効率が高くなる。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、キャプチャーＤＮＡ鎖として、アミノ基が導入されたオリゴＤＮＡを用いることにより、該キャプチャーＤＮＡ鎖は、効率よくかつ強固に該高分子物質上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はキャプチャーＤＮＡ鎖の分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的なＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片とのハイブリダイズをより一層効率よく行なうことができるという観点からは、好ましい。
【００３８】
本発明において「ターゲット配列領域」とは、微生物またはウイルスにおける全遺伝子のうち、本発明に用いるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅され得る配列領域であり、検出対象のウイルスまたは微生物を検出することができるものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。
【００３９】
たとえば、被検試料に検出対象のウイルスまたは微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット配列領域は、検出対象のウイルスまたは微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種のウイルスまたは微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ターゲット配列領域は単一であっても、複数であってもよい。
【００４０】
キャプチャーＤＮＡ鎖のターゲット配列領域がさらに、トポイソメラーゼ、または、ＤＮＡジャイレースを含む微生物特異的な配列であってもよい。
【００４１】
ターゲット配列領域の長さとしては、通常２０〜数十万塩基程度まで適用できるが、５００〜３０００塩基であることが好ましい。検出対象が微生物である場合には、具体的には、ターゲット配列領域は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。これは、広汎な微生物に応用して使用することができるためである。
【００４２】
＜第２工程＞
本工程は、特定遺伝子の検出がされるかどうか検査したい被検試料、具体的には、微生物の特定遺伝子またはウイルスの特定遺伝子の検出がされるかどうか検査したい被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料から微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、遺伝子溶解溶液を作製する工程である。
【００４３】
本発明において、「被検試料」が「ウイルスを含む被検試料」である場合においては、該被検試料は、ウイルス感染によってウイルスが存在しえる生体試料であれば特に制限されることなく任意に使用することができる。
【００４４】
ウイルスの特定遺伝子の検出がされるかどうか検査したい被検試料は、対象とする被験者から、たとえば滅菌綿棒などの滅菌器具および容器を用いることにより無菌的に採取することが好ましい。得られた該被検試料は、採取後、なるべく速やかにグアニジンイソチオシアネート、ＳＤＳ、ＮａＯＨなどを含む緩衝溶液でウイルスを溶解させることができる。このような操作によって、遺伝子溶解溶液を得ることができる。
【００４５】
また、後述する第３工程でＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を捕捉するために、希ＮａＯＨ溶液で被検試料を溶解した場合には、希ＨＣｌ溶液で中和するなど溶解後生体内の組成を大きく変化させないような工夫を加えることが好ましい。また、該遺伝子溶解溶解液をＰＢＳなどの緩衝液に希釈して−２０℃で長期間保存することも可能である。
【００４６】
本発明において、「被検試料」が「微生物を含む被検試料」である場合においては、該被検試料は、その中に存在する微生物の生菌を検出する対象であり、ＰＣＲ法による染色体ＤＮＡの特定領域の増幅によって存在を検出することが可能なものであれば特に制限されない。
【００４７】
微生物の特定遺伝子の検出がされるかどうか検査したい被検試料は、食品原材料付着の製品または生体試料そのものであってもよく、これを希釈もしくは濃縮したもの、または本発明の方法による処理以外の前処理をしたものであってもよい。前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等が挙げられる。得られた被検試料は、採取後、なるべく速やかにグアニジンイソチオシアネート、ＳＤＳ、ＮａＯＨなどを含む緩衝溶液で微生物を溶解させることができるが、次工程のハイブリダイゼーションで対象ＲＮＡ遺伝子を捕捉するためには、希ＮａＯＨ溶液で生体試料を、希ＨＣｌ溶液で中和するなど溶解後生体内の組成を大きく変化させないような工夫を加えたほう好ましい。溶解液をＰＢＳなどの緩衝液に希釈して−２０℃で長期間保存することも可能である。
【００４８】
また、被検試料は、鼻汁、粘膜ぬぐい液（たとえば鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液等）、喀痰、糞便、全血、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、精液等の各種体液、または各種組織（細胞組織）または食品を例示することができる。本発明方法の対象となる食品は、特に制限されない。本発明方法は、飲料、麺製品、食肉、魚介類、野菜、穀類、乳製品およびこれらの加工物等の広い範囲の食品を対象にすることができる。
【００４９】
また、被検試料としての食品からＲＮＡを抽出する場合において、食品から分離培養した微生物からＲＮＡを抽出してもよいが、食品から直接ＲＮＡを抽出することもできる。また、微生物を含むかもしれない食品を遠心処理することにより、微生物を含むかもしれない画分を食品と分離した後に、微生物を含むかもしれない画分からＲＮＡを抽出することもできる。
【００５０】
＜第３工程＞
本工程は、キャプチャーＤＮＡ鎖と相補的な配列を有する遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を分離する工程である。具体的には、チューブ状のＤＮＡ固定化担体の内側（内部）に遺伝子溶解溶液を添加し、キャプチャーＤＮＡ鎖と遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせ、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を捕捉する。以上の工程によって、遺伝子溶解溶液中の遺伝子のなかからキャプチャーＤＮＡ鎖と相補的な配列を有する遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を分離することができる。
【００５１】
本工程においては、４〜７０℃、より好ましくは１５〜３７℃（室温）で静置または攪拌状態でキャプチャーＤＮＡ鎖と遺伝子溶解溶液中のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせる。本工程は、５分〜９０分間で完了できる。９０分間超過の時間をかけてハイブリダイズさせることもできるが、本発明においては、１時間程度のハイブリダイズで十分であり、結果として迅速に特定遺伝子の検出を行なうことができる。
【００５２】
＜第４工程＞
本工程は、キャプチャーＤＮＡ鎖に捕捉されたＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を増幅する工程である。本工程においては、上述のチューブ状のＤＮＡ固定化担体に対して直接、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施すことができる。具体的な操作は以下のとおりである。
【００５３】
まず、第３工程の後のチューブ状のＤＮＡ固定化担体から被検試料を除去する。そして、該ＤＮＡ固定化担体の表面をＰＢＳにて１〜数回洗浄することが好ましい。本発明において、被検試料中に存在する微生物や夾雑物質等による検出誤差を回避するためである。これにより、チューブ状のＤＮＡ固定化担体の内部における核酸はキャプチャーＤＮＡ鎖とキャプチャーＤＮＡ鎖に捕捉されたＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片が残る。
【００５４】
次に、ＤＮＡ固定化担体の内部に所定の物質（ｄＮＴＰ等）を添加して核酸の増幅を行なう。
【００５５】
キャプチャーＤＮＡ鎖に捕捉された核酸がＤＮＡ鎖断片の場合においては、直接ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法等を行なうことができる。また、キャプチャーＤＮＡ鎖に捕捉された核酸がＲＮＡ断片の場合においては、ＲＮＡ鎖断片の場合は逆転写反応を行なった後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、逆転写酵素鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、逆転写ＬＡＭＰ法（ＲＴ−ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル型増幅などの遺伝子増幅法を用いて増幅することができる。
【００５６】
検出対象の微生物に特異的なターゲット配列領域に対応するプライマーセットと、広汎なウイルスまたは微生物のＤＮＡに対応するプライマーセットを用いると、検出対象の微生物の生菌量と、多数種の微生物の生菌量を、同時に測定することができる。該ターゲット配列領域の長さとしては、通常２０〜数十万塩基程度まで適用できるが、５００〜３０００塩基であることが好ましい。検出対象が微生物である場合には、具体的には、ターゲット配列領域は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。
【００５７】
本発明においてＰＣＲ法に用いるプライマーは、上記ターゲット配列領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。検出対象が微生物である場合に、具体的には、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号１、２および３に示すプライマーセット（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４２  １０４８-１０５７（２００４））が挙げられる。また、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号４および５に示すプライマー（ＭｉｃｒｏＳｅｑ５００）セット、配列番号６および７に示すプライマーセット（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３２：３３５−３５１（１９９４）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４３：３３９０−３３３９７（２００５）、  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，７：５７５５８１−３３３９７（２００５））、および配列番号８および９に示すプライマーセット（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２３０：５８７−５９１（２００５））が挙げられる。
配列番号１：５’−ＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＧＣ−３’（４３ａ２）
配列番号２：５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＣＣＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＧ−３’（６９ａｒ２）
配列番号３：５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＣ−３’（６９ａｒｒｈ）
配列番号４：５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（１６Ｓ−９Ｆ）
配列番号５：５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３’（１６Ｓ−５３６Ｒ）
配列番号６：５’−ＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＹ−３’（ＲＷ０１＆ＲＤＲ０８０、１１７０−１１８９）
配列番号７：５’−ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡ−３’（ＤＧ７４、１５２２−１５４０）
配列番号８：５’−ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−３’（Ｐｂａ１、３５８-３７８）
配列番号９：５’−ＴＣＡＣＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧ−３’（Ｐｂａ２、１４４４-１４２５）
ＬＡＭＰ法は、栄研化学（株）社が開発した核酸増幅法である。ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子の６箇所の領域に対して４種類のプライマーを設定して、鎖置換反応を利用し一定温度で反応させることを特徴とする。反応はサンプルとなる遺伝子、ＬＡＭＰプライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質核酸等を同一の反応チューブに混合し、一定温度（６５℃付近）で保温することにより、遺伝子の増幅から検出までを１ステップの工程で行なうことができる。増幅効率が高く、ＤＮＡを１５分〜１時間で１０9〜１０10倍に増幅することが可能である。その極めて高い特異性から、増幅産物の有無で目的とする標的遺伝子配列の有無を判定することができる。また、増幅副産物であるピロリン酸マグネシウムＭｇ2Ｐ2Ｏ7（白色沈殿物質）の白濁の有無によっても標的遺伝子配列の有無を判別できる。また、過剰のインターカレーターＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩをＬＡＭＰ反応液の核酸増幅産物に添加することによって、標的核酸の有無を特別な光源や検出装置を用いることなく目視確認するする方法でも標的遺伝子配列の有無を判別できる。さらには、電気泳動によって、アガロースゲルのウェルから尾を引いたようなバンドが確認できれば、遺伝子が増幅されたことを示している（特許文献３参照）。
【００５８】
ＲＴ−ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法は、ＬＡＭＰ法を応用し、ノロウイルスのように標的遺伝子であるＲＮＡから逆転写酵素反応よりｃＤＮＡを合成して増幅して検出する方法である。サンプルとなるＲＮＡに対して、ＤＮＡを標的遺伝子とする場合と同様の試薬（プライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質核酸等）に逆転写酵素を追加して混合することによって、一定温度（６０〜６５℃）下で増幅から検出までの工程を１ステップで行なうことができる。増幅から検出までを１ステップで行なうことができる特徴を有する（非特許文献３参照）。
【００５９】
＜第５工程＞
本工程は、第４工程の後にさらに加えられることが好ましい工程である。本工程では、第４工程の後に増幅したＤＮＡ鎖断片（ＰＣＲ増幅産物）を検量して、被検試料中の微生物遺伝子またはウイルス遺伝子の存在の有無を判定する。
【００６０】
本工程における解析法は、ＰＣＲ増幅産物の検出または定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法等が挙げられる。電気泳動法によれば、ＰＣＲ増幅産物の量、およびその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行なうことができる。リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出しその１０を乗じた蛍光値をスレッショード値とし、そのスレッショード値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショード値（Ｃｔ値）という。したがって、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲのターゲット配列領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
【００６１】
また、複数種の微生物に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の生菌を検出することができる。また、特定の微生物に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の菌種の生菌を検出することができる。
【００６２】
ＰＣＲの条件は、ＰＣＲの原理にのっとった特異的な増幅が起る限り特に制限されず、適宜設定することができる。
【００６３】
本発明の方法によって生菌を検出する場合、ＰＣＲ増幅産物の解析は、同定されている微生物の標準試料を用いて作成された微生物量および増幅産物との関連を示す標準曲線を用いると、生菌の有無または定量の精度を高めることができる。標準曲線は予め作成しておいたものを用いることができるが、被検試料と同時に標準試料について本発明の各ステップを行なって作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め微生物量とＲＮＡ量との相関を調べておけば、その微生物から単離されたＤＮＡを標準試料として用いることもできる。
【００６４】
＜各用語＞
本発明においては、「ウイルス」という用語は、たとえば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、トガウイルス（アルファウイルス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイルス）、ペスチウイルス（ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペストウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）、オルソクソウイルス（ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウシライノウイルス、ウマライノウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（ヒトコロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓国型出血熱ウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、レオウイルス（ロタウイルス）、カリシウイルス（ノーウオークウイルス）、ノロウイルス、ブンヤウイルス（腎症候性出血熱ウイルス）、フィロウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイルス、豚パルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウイルス）、パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルス）およびアフリカ豚コレラウイルスよりなる群から選択される。
【００６５】
本発明においては、「微生物」という用語は、原核生物、細菌、真菌、寄生生物、または原生動物を意味するのに使用する。「微生物」としては、グラム陽性菌およびグラム陰性菌のいずれもが含まれ、ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））のスタフィロコッカス属細菌、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等のストレプトコッカス属細菌、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア属細菌、バチラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）等のバチラス属細菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、マイコバクテリウム属細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）等のエンテロバクター属細菌、シトロバクター・コーセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ）等のシトロバクター属細菌、クレブシェラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）等のクレブシェラ属細菌に代表される腸内細菌群、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、シュードモナス属細菌等ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカスゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エンテロコッカスデュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスアガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉｃａｅ）、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびエンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）などが挙げられる。
【００６６】
本発明において、微生物における「生菌」の検出とは、被検試料中の生菌の有無の判別および生菌の量の決定のいずれをも含む。また、生菌の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に対する相対的な量であってもよい。得られる菌数が少なすぎるために十分量のＲＮＡを得ることができない場合や、死菌がＰＣＲ反応の結果に影響を与えると考えられる場合には、被験試料に滅菌した微生物用液体培地を添加し、３０〜３７℃程度で培養することにより菌数を増加させればよい。これによりＲＮＡ検出感度を向上させることができ、また死菌の影響を抑えることができる。液体培地の種類は特に制限されず、ブレインハートインフィージョン培地、トリプトソーヤ培地等の一般微生物用培地を広い範囲から適宜選択して使用することができる。ビブリオ属細菌の場合は、これらの培地において食塩濃度を１〜３％程度に調製したものまたはアルカリ性ペプトン培地を使用すればよい。
【００６７】
また、検出対象の微生物が病原性微生物である場合には、ターゲット配列領域としては病原遺伝子が挙げられる。病原遺伝子としては、リステリア属細菌のリステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子、サルモネラ属細菌のエンテロトキシン遺伝子やｉｎｖＡ遺伝子、病原性大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素遺伝子、エンテロバクター属細菌のＭＭＳ遺伝子（エンテロバクター・サカザキ菌）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。
【００６８】
［第２実施形態］
＜チューブ状の生体高分子固定化担体を作製する工程＞
本工程においては、チューブ状の生体高分子固定化担体を作製する。より具体的には、チューブ状の不溶性担体の少なくとも内側を高分子物質で被覆して、その上に抗体、レクチンおよび複合糖質のいずれかを固定化させることによってチューブ状の生体高分子固定化担体を作製する。
【００６９】
まず、本実施形態の本工程における「高分子物質」は、ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基など生体適合性の高い官能基を有するような高分子物質であり、生体成分の非特異的吸着抑制するモノクローナル抗体、タンパク質、レクチン、複合糖質などの生体分子を固定する性質を持つポリマーを示す。具体的には、住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ  ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブ、ビーズ単体、プレートを例として挙げることができる。なお、固定化担体の作製方法については、特開２００８−１２８８５４号公報に記載されている。
【００７０】
次に、本発明における「不溶性担体」は、プラスチック、ガラス等からなるチューブのほか、９６穴ウェル等を挙げることができる。
【００７１】
チューブ状とは、中空状態のものをいい、底があるＰＣＲチューブや、エッペンドルフチューブのような形状であってもよい。
【００７２】
そして、本発明における「抗体」、「レクチン」、「複合糖質」は、後述する被検試料に含まれる微生物またはウイルスの一部をエピトープ部位または認識部位として感知できるものであれば特に限定されない。抗体には、免疫グロブリンのようなものを用いることができる。
【００７３】
本発明において「エピトープ部位」または「認識部位」には、微生物の表面構造（鞭毛、夾膜、細胞壁糖鎖など）またはウイルスのカプシドおよびエンベロープ部分を設定することができる。
【００７４】
たとえば、被検試料に検出対象のウイルスまたは微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット配列領域は、検出対象のウイルスまたは微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種のウイルスまたは微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ターゲット配列領域は単一であっても、複数であってもよい。
【００７５】
＜微生物またはウイルスを捕捉する工程＞
本工程は、被検試料のなかで、微生物またはウイルスを含む被検試料を生体高分子固定化担体の上に添加し、該微生物またはウイルスを分離する工程である。具体的には、チューブ状の生体高分子固定化担体の内側（内部）に被検試料を添加し、該生体高分子固定化担体を２時間程度、静置することで、該微生物またはウイルスを捕捉する。
【００７６】
＜遺伝子溶解溶液を作製する工程＞
本工程は、微生物またはウイルスにおける微生物由来遺伝子またはウイルス由来遺伝子を遊離して、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を含む遺伝子溶解溶液を作製する。
【００７７】
上記微生物またはウイルスを捕捉した生体高分子固定化担体を前処理する。該生体高分子固定化担体に、グアニジンイソチオシアネート、ＳＤＳ、ＮａＯＨなどを含む緩衝溶液で微生物を溶解させることができるが、次工程のハイブリダイゼーションで対象ＲＮＡ遺伝子を捕捉するためには、希ＮａＯＨ溶液で生体試料を、希ＨＣｌ溶液で中和するなど溶解後生体内の組成を大きく変化させないような工夫を加えたほう好ましい。溶解液をＰＢＳなどの緩衝液に希釈して−２０℃で長期間保存することも可能である。
【００７８】
＜ＤＮＡ鎖断片もしくはＲＮＡ鎖断片で増幅する工程＞
本工程は、ＤＮＡ鎖断片またはＲＮＡ鎖断片を増幅する工程である。本工程においては、上述のチューブ状のＤＮＡ固定化担体に対して直接、ポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法を施すことができる。具体的な操作は上述した方法をとることができる。
【００７９】
その他、被検試料等については、上述のものと同様のものを応用することができる。
［応用］
本発明は、特に、食品衛生検査や臨床検査において、穏和な加熱処理や抗生物質投与により、損傷菌の状態を呈した微生物の検出が注目されており、本発明においては、生菌の検出のみならず、生菌または死菌との識別も可能な微生物の検出方法を提供するものである。
【００８０】
本発明により、ウイルスの感染判定または微生物（細菌）の感染判定を迅速・簡便に行なうことが可能なキットを提供される。試験に要する時間は、患者からの被検試料受領後約２時間であり、従来技術とは完全に区別される迅速診断法である。本発明のキットを用いれば、検査担当者の２次感染を防止でき、ウイルス感染の伝播防止と感染者への迅速な対応と効果的な治療が可能になり、公衆衛生上大きく寄与するものと考えられる。
【００８１】
そして、本発明の特定遺伝子の検出方法を用いることによって、ウイルス感染症および細菌感染の診断に関して、患者の臨床状態を迅速にしかも的確に反映することのできる治療法を提供することができる。該特定遺伝子の検出方法は、ウイルス感染症のまたは細菌感染の診断および治療に有効であるだけでなく、他者への感染のリスクの予測、それによる院内感染の防止、治療効果の追跡による現行処置の適否判断やさらなる治療対策の検討が可能となる。
【００８２】
そして、本発明の特定遺伝子の検出方法では、生体試料権対中のウイルス溶解処理から遺伝子増幅および検出までに要する時間はわずか２時間程度で実施可能である。この短時間の操作により迅速かつ簡便にウィルスを検出することができる。
【００８３】
すなわち、本発明の特定遺伝子の検出方法によると、短時間で且つ高感度にウイルスまたは微生物を検出できるため、ウイルス感染症患者の病態および細菌感染症患者の病態を的確に反映することができる。さらに、本発明は、従来の分離および精製等の前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得るウイルスの検出方法を提供することで遺伝子検査作業者の２次感染予防の効果が期待できる。
【００８４】
さらに本発明の特定遺伝子の検出方法によると、主要な食中毒細菌の食品中への混入の可能性を簡単かつ高感度に調べることができる。食品メーカーによる製品出荷前の自主細菌検査に好適に利用できる。また、本発明の細菌の検出方法において、食品の破砕工程と遠心分離操作とを行なう場合には、細菌を食品から効率よく分離採取できるため、細菌を食品から分離培養する必要がなくなり、その分検査時間が短縮される。
【００８５】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００８６】
＜実施例１＞
≪第１工程（ａ）：ノロウイルスＧ１型検出用ＰＣＲチューブの作製≫
非特許文献２（ノロウイルスの検出法）記載の公知のノロウイルスＧ１型特異的ＤＮＡ塩基配列５’−ＣＴＴＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＹＡＣ−３’（２２塩基）（配列番号１０）を含み、５’末端がアミノ基修飾したキャプチャーＤＮＡ鎖としての合成ＤＮＡプローブを５Ｍ  Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ９．０）に溶解し、０．１μＭのキャプチャーＤＮＡ鎖溶液を調製した。キャプチャーＤＮＡ鎖溶液２０μＬを住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ  ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブの内部底面に添加し、室温で１時間静置することで、キャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させてＤＮＡ固定化担体としてのＰＣＲチューブを作製した。その後、ＰＣＲチューブ内を３００μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨでブロッキング処理を施し、ＲＮａｓｅフリー水３００μＬで２回洗浄したＰＣＲチューブを以下の実験に使用した。
【００８７】
≪第１工程（ｂ）：ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブの作製≫
非特許文献２（ノロウイルスの検出法）記載の公知のノロウイルスＧ２型特異的ＤＮＡ塩基配列５’−ＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＡ−３’（２１塩基）（配列番号１１）を含み、５’末端がアミノ基修飾したキャプチャーＤＮＡ鎖としての合成ＤＮＡプローブを５Ｍ  Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ９．０）に溶解し、０．１μＭのキャプチャーＤＮＡ鎖溶液を調製する。キャプチャーＤＮＡ鎖溶液２０μＬを住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ  ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブの内部底面に添加し、室温で１時間静置してキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させてＤＮＡ固定化担体としてのＰＣＲチューブを作製した。その後、ＰＣＲチューブ内を３００μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨでブロッキング処理を施し、ＲＮａｓｅ  フリー水３００μＬで２回洗浄したＰＣＲチューブを以下の実験に使用した。
【００８８】
≪第２工程：ノロウイルス感染患者糞便検体の処理≫
ノロウイルス感染患者糞便検体にＰＢＳを加え、１０％乳剤を作製し、この１０％乳剤を激しく攪拌した後、１２，０００ｒｐｍで２０分間冷却遠心分離して得られた遠心上清をノロウイルスを含有するサンプルとして使用した。
【００８９】
≪第３工程：ノロウイルス遺伝子の分離≫
１５μＬのサンプルを、作製したノロウイルスＧ１型およびＧ２型検出用ＰＣＲチューブそれぞれに添加し、５μＬのウイルス溶解バッファー（４Ｍ  ＧｕＳＣＮ、２５ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ７．０）、０．５％ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ（ｗ／ｖ））をさらに加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌し、簡易卓上遠心機で遠心分離後、室温で該チューブを３０分間静置してノロウイルス遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内の「ノロウイルスを含有するサンプル」を、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＣＲチューブ内をＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。上記操作にて、ノロウイルス遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＬＡＭＰ法による遺伝子検出法に供した。
【００９０】
≪第４工程、第５工程：ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるノロウイルス遺伝子の増幅および検出≫
ノロウイルス遺伝子の検出は、栄研化学（株）社製ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットおよびＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩＩ検出試薬キットを使用して行なった。反応条件は添付のプロトコールにしたがって実施した。具体的には、上述したようにノロウイルス感染患者糞便検体からノロウイルス遺伝子をオリゴＤＮＡが固定化されたロウイルスＧ１およびＧ２検出用ＰＣＲチューブでそれぞれ分離し、ノロウイルスＧ１検出用ＰＣＲチューブには、ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットより調整された反応液を添加し、ノロウイルスＧ２検出用ＰＣＲチューブには、ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩＩ検出試薬キットより調整された反応液を添加した。そして、それぞれのＰＣＲチューブに対してＲＴ−ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅反応を６３℃、６０分間で行ない、遺伝子増幅反応終了後、８０℃、５分間にて酵素を失活させた。
【００９１】
図１は、実施例１のＬＡＭＰ法反応の増幅副産物であるピロリン酸マグネシウムＭｇ2Ｐ2Ｏ7（白色沈殿物質）の白濁の有無による標的遺伝子配列の有無を判別した図である（（上）：目視濁度結果、（下）：栄研化学（株）社製Ｌｏｏｐａｍｐエンドポイント濁度測定装置（ＬＡ−１００）による濁度測定結果。レーン番号１および２は、水またはコントロールＲＮＡを栄研化学（株）社製ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットを用いて行なったＬＡＭＰ法のコントロール反応）。なお、図１の濁度測定結果の縦軸は濁度（単位：ＯＤ660値（透過率））を示す。
【００９２】
図２は、実施例１のＬＡＭＰ法反応液に約１μＬの１０００×の濃度のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ添加（最終濃度：１００×）によるＬＡＭＰ法反応液の核酸増幅産物の目視確認結果を示す図である。
【００９３】
図１、図２におけるレーン番号１〜８は、以下のとおりである。
１：ネガティブコントロール（水添加による通常ＬＡＭＰ法）
２：ポジティブコントロール（Ｇ１コントロールＲＮＡ添加による通常ＬＡＭＰ法）
３：ノロウイルスＧ１型検出用ＰＣＲチューブ（水添加）
４：ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブ（水添加）
５：ノロウイルスＧ１型検出用ＰＣＲチューブ（Ｇ１コントロールＲＮＡ添加）
６：ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブ（Ｇ２コントロールＲＮＡ添加）
７：ノロウイルスＧ１型検出用ＰＣＲチューブ（Ｇ１糞便検体処理液添加）
８：ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブ（Ｇ２糞便検体処理液添加）
［結果］
ポジティブコントロールと同様にレーン番号５〜８においてもノロウイルスを検出することができた。
【００９４】
＜確認実験１＞
ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲ法、並びにＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法のスイフトジーンノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ「カイノス」（株式会社カイノス製）、ＴＲＣ  （Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法のノロウイルスＲＮＡ検出試薬ＴＲＣＲｔｅｓｔ  Ｎｏｒｏ  （東ソー株式会社製）の各キットを用いた増幅反応を同一のノロウイルス感染患者由来の糞便サンプルを用いて行なった。いずれの結果も、ＬＡＭＰ法と同等の結果を得ることができた。
【００９５】
＜確認実験２：ＬＡＭＰ法の感度＞
本発明の検出方法にＬＡＭＰ法を導入したことにより、まずＬＡＭＰ法の遺伝子増幅の限界を確認する必要がある。
【００９６】
そこで、１００００〜１０コピー／チューブのノロウイルスＧ２コントロールＲＮＡ並びにノロウイルスＧ２感染患者糞便サンプルから通知法（非特許文献２）に従い抽出した３種類のＲＮＡ（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３）を用いてＬＡＭＰ法の遺伝子増幅の限界を確認した。ノロウイルスＧ２ＲＮＡをノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブに添加してノロウイルス遺伝子を分離後、ＬＡＭＰ法の増幅反応液に添加し、６３℃、６０分の増幅反応後、アガロースゲル電気泳動を行なった。コントロールとして、ノロウイルスＧ２  ＲＮＡをＬＡＭＰ法の増幅反応液に添加し、添付プロトコールに従い実施した。結果は図３に示した。図３は、実施例１のコントロールのノロウイルスＲＮＡとノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ１〜３）を用いたＬＡＭＰ法反応結果を示す図であり、図３Ａは、ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブを用いてノロウイルス遺伝子を分離後、ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧ２検出試薬キットを用いて行なったＬＡＭＰ法遺伝子増幅反応産物を電気泳動した図である。図３Ｂは、ノロウイルス遺伝子を直接ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットに添加して行なったＬＡＭＰ法のコントロールの結果である。
【００９７】
図３の各レーン番号は以下のとおりとなっている。
Ｍ：マーカー
１：１０コピー／チューブ  （Ｇ２コントロールＲＮＡ添加）
２：１００コピー／チューブ  （Ｇ２コントロールＲＮＡ添加）
３：１０００コピー／チューブ  （Ｇ２コントロールＲＮＡ添加）
４：１００００コピー／チューブ  （Ｇ２コントロールＲＮＡ添加）
５：ノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ１）
６：ノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ２）
７：ノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ３）
Ｂ：ネガティブコントロール（水添加）
なお、電気泳動によって、アガロースゲルのウェルから尾を引いたようなバンドが確認できれば、遺伝子が増幅されたことを示している。
【００９８】
図３に示すようにノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブを使用してウイルス遺伝子を分離後、ＬＡＭＰ法を実施した増幅限界は１００００コピー／チューブまでであった。この検出限界は、一般的に広く用いられているＰＣＲ法と同程度以下ではある。また、ノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３）から抽出したＲＮＡを用いた場合には、いずれも検出可能であった。コントロールの通常のＬＡＭＰ反応液に直接ノロウイルスＲＮＡを添加したＬＡＭＰ法の結果は、非特許文献３の結果とほぼ同等の結果であった。この非特許文献３においては、ＬＡＭＰ法の増幅時間はＰＣＲ法が約２時間かかるのに対し、本実施例においてＬＡＭＰ法は１時間であった。これより、核酸増幅にＬＡＭＰ法を用いることで検査時間の短縮が可能であると考えられた。また、ノロウイルスＧ１に関しても同様の実験を行い、同等の検出感度であることを確認した。
【００９９】
＜確認実験３：再現性について＞
繰り返して１００回、上記同様の測定した結果、毎回ほぼ同程度の結果が検出された。これにより、ＬＡＭＰ法ではほぼ決まった長さの生成物が同程度増幅されることが確認された。
【０１００】
＜実施例２＞
≪第１工程：ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブの作製≫
公知のＨＩＶ−１特異的ＤＮＡ塩基配列５’−ＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣ−３’（２８塩基）を含み、５’末端がアミノ基修飾したキャプチャーＤＮＡ鎖としての合成ＤＮＡプローブを５Ｍ  Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ９．０）に溶解し、０．１μＭのキャプチャーＤＮＡ鎖溶液を調製する。キャプチャーＤＮＡ鎖溶液２０μＬを住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ  ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブの底面に添加し、室温で１時間静置してキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させることで、ＤＮＡ固定化担体としてのＰＣＲチューブを作製した。その後、ＰＣＲチューブ内を３００μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨでブロッキング処理を施し、ＲＮａｓｅ  フリー水３００μＬで２回洗浄したＰＣＲチューブを以下の実験に使用した。
【０１０１】
≪第２工程：ＨＩＶ−１コントロールＲＮＡの作製≫
ＨＩＶ−１より作製された公知のプラスミドＤＮＡ（ｐＮＬ４３２）のｇａｇ遺伝子領域をＰＣＲ法で遺伝子増幅し、ｐＳＴＢｌｕｅ−１  ＡｃｃｅｐＴｏｒ（ＴＭ）  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔｓを使用して常法によりクローニングを行い、ｉｎ  ＶｉｔｒｏでＨＩＶ−１コントロールＲＮＡを作成した。その遺伝子配列は、以下の通りである。
ｃａｇｃａｇｃｔｇａｃａｃａｇｇａａａｃａｇｃａａｃａａｇｇｔｃａｇｃｃａａａａｔｔａｃｃｃｔａｔａｇｔｇｃａｇａａｃａｔｃｃａｇｇｇｇｃａａａｔｇｇｔａｃａｔｃａｇｇｃｃａｔａｔｃａｃｃｔａｇａａｃｔｔｔａａａｔｇｃａｔｇｇｇｔａａａａｇｔａｇｔａｇａａｇａｇａａｇｇｃｔｔｔｔａｇｃｃｃａｇａａｇｔａａｔａｃｃｃａｔｇｔｔｔｔｃａｇｃａｔｔａｔｃａｇａａｇｇａｇｃｃａｃｃｃｃａｃａａｇａｔｔｔａａａｃａｃｃａｔｇｃｔａａａｃａｃａｇｔｇｇｇｇｇｇａｃａｔｃａａｇｃａｇｃｃａｔｇｃａａａｔｇｔｔａａａａｇａｇａｃｃａｔｃａａｔｇａｇｇａａｇｃｔｇｃａｇａａｔｇｇｇａｔａｇａｔｔｇｃａｔｃｃａｇｔｇｃａｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｔｃｇｃａｃｃａｇｇｃｃａｇａｔｇａｇａｇａａｃｃａａｇｇｇｇａａｇｔｇａｃａｔａｇｃａｇｇａａｃｔａｃｔａｇｔａｃｃｃｔｔｃａｇｇａａｃａａａｔａｇｇａｔｇｇａｔｇａｃａａａｔａａｔｃｃａｃｃｔａｔｃｃｃａｇｔａｇｇａｇａａａｔｃｔａｔａａａａｇａｔｇｇａｔａａｔｃｃｔｇｇｇａｔｔａａａｔａａａａｔａｇｔａａｇｇａｔｇｔａｔａｇｃｃｃｔｇｃｃａｇｃａｔｔｃｔｇｇａｃａｔａａｇａｃａａｇｇａｃｃａａａｇｇａａｃｃｃｔｔｔａｇａｇａｔｔａｔｇｔａｇａｃｃｇｇｔｔｃｔａｔａａａａｃｔｃｔａａｇａｇｃｃｇａｇｃａａｇｃｔｔｃａｃａ（配列番号１２）
≪第３工程：市販ヒト血清へコントロールＨＩＶ−１  ＲＮＡの添加およびＨＩＶ−１遺伝子の分離回収）
作製したＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブに１０μＬの市販ヒト血清を４μＬのＰＢＳ希釈して添加し、ＨＩＶ−１コントロールＲＮＡを１０6〜１０2コピー／チューブ加えた。このヒト血清とＨＩＶ−１コントロールＲＮＡとの混合物からなるサンプルは、実質的にＨＩＶ感染患者の血清と同様なものとして利用した。さらに、該サンプルに５μＬのウイルス溶解バッファー（４Ｍ  ＧｕＳＣＮ、２５ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ７．０）、０．５％ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ（ｗ／ｖ））を加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌して、簡易卓上遠心機でスピンダウン後、室温で３０分間静置してＨＩＶ−１遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＨＩＶ−１溶解液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。操作にてＨＩＶ−１遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による増幅に供した。
【０１０２】
≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法による増幅≫
ＲＴ−ＰＣＲ法の条件設定を行なった。これは、目的のＲＮＡを増幅するための条件設定のために行なった。
【０１０３】
（ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲ条件調整）
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（東洋紡績）を１００Ｕ／μｌの原液を専用の希釈バッファーで１０Ｕ／μｌ（１０倍希釈）希釈する。この希釈液を下記の表に従い、逆転写反応液試薬（ＲＴ反応液）を調整した。
【０１０４】
【表１】
2010046042.tif 000003
【０１０５】
次に下記のプロトコールに従い、ワンステップのＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲ反応液を調整した。
【０１０６】
【表２】
2010046042.tif 000004
【０１０７】
ＳＫ１４５（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’−ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴ−３’（配列番号１３）
ＳＫＣＣ１Ｂ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’−ＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号１４）
ＳＫ１０２−ＴＰ（ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅ）：５’−ＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴ−３’（配列番号１５）
（ＲＴ−ＰＣＲプログラム）
４８℃，２０分→９５℃，５分→９４℃，１５秒⇔５４℃，４５秒、４５サイクル
（結果）
ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行なった。表３に示すようにＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを使用してウイルス遺伝子を分離後、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ法を実施した増幅限界は１００コピー／チューブまでであることが分かった。
【０１０８】
【表３】
2010046042.tif 000005
【０１０９】
（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲ反応液に調整したＲＴ反応液を使用して、次に下記のプロトコールに従い、ＲＴ−ＰＣＲ反応液の調整を行なった。
【０１１０】
【表４】
2010046042.tif 000006
【０１１１】
Ｇ６０（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’−ＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１６）
ＳＫ３９（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１７）
（ＲＴ−ＰＣＲプログラム）
４８℃，２０分→９５℃，１分→９４℃，１５秒⇔５４℃，１分、４０サイクル
（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。図４は、コントロールＨＩＶ−１  ＲＮＡを添加した市販血清から、ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを用いてウイルス遺伝子を分離、ＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し、電気泳動（４５８ｂｐ）法で検出した結果を示す図である。そして、具体的には、図４Ａは、上述したヒトヒト血清とＨＩＶ−１コントロールＲＮＡとの混合物からなるサンプルを用いて第１工程〜第４工程までした結果を示し、図４Ｂは、ＨＩＶコントロールＲＮＡのみを第１工程〜第４工程までした結果を示す。
【０１１２】
図４における各レーン番号は以下のとおりとなっている。
Ｍ：マーカー
１：１００コピー／チューブ  （コントロールＨＩＶ−１  ＲＮＡ添加）
２：１０００コピー／チューブ  （コントロールＨＩＶ−１  ＲＮＡ添加）
３：１００００コピー／チューブ  （コントロールＨＩＶ−１  ＲＮＡ添加）
Ｂ：ネガティブコントロール（水添加）
図４に示すようにＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを使用してウイルス遺伝子を分離後、ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した増幅限界は１００００コピー／チューブまでであった。
【０１１３】
［まとめ］
以上から、このヒト血清とＨＩＶ−１コントロールＲＮＡとの混合物からなるサンプル（実質的にＨＩＶ感染患者の血清と同様なもの）に対して、本発明のＤＮＡ固定化担体を用いた特定遺伝子の検出方法を有効に利用することができることが分かった。
【０１１４】
＜実施例３＞
≪第３工程：市販ヒト血清へＨＩＶ−１  ＬＡＩ株の添加およびＨＩＶ−１遺伝子の分離回収≫
実施例２で作製したＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブに１０μＬの市販ヒト血清を４μＬのＰＢＳ希釈して添加し、ＨＩＶ−１  ＬＡＩ株  ウイルスを１０5コピー／チューブ加えた。さらに、５μＬのウイルス溶解バッファー（４Ｍ  ＧｕＳＣＮ、２５ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ７．０）、０．５％ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ（ｗ／ｖ））を加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌して、簡易卓上遠心機でスピンダウン後、室温で３０分間静置してＨＩＶ−１遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＨＩＶ−１溶解液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。操作にてＨＩＶ−１遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子増幅に供した。
【０１１５】
≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法による増幅≫
（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲ反応液に調整したＲＴ反応液を使用して、次に下記のプロトコールに従い、ＲＴ−ＰＣＲ反応液の調整を行なった。
【０１１６】
【表５】
2010046042.tif 000007
【０１１７】
Ｇ６０（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’−ＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１８）
ＳＫ３９（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１９）
（ＲＴ−ＰＣＲプログラム）
４８℃，２０分→９５℃，１分→９４℃，１５秒⇔５４℃，１分、４０サイクル
（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。実施例３のＨＩＶ−１  ＬＡＩ株を添加した市販血清から、ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを用いてウイルス遺伝子を分離、ＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し、電気泳動（４５８ｂｐ）法で検出した結果を示す図である。なお、図５の各レーンは、以下のとおりである。
レーン番号１と３：ネガティブコントロール
レーン番号２：ポジティブコントロール（コントロールＨＩＶ−１  ＬＡＩ  ＲＮＡ添加）
レーン番号４：ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブ使用したＲＴ−ＰＣＲ法の結果
［まとめ］
図５から、ＨＩＶ−１  ＬＡＩ株  ウイルス（市販）に対しても本発明のＤＮＡ固定化担体を用いた特定遺伝子の検出方法を有効に利用することができることが分かった
［考察］
表１、図４、５に示すようにＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを使用して血清中に浮遊するウイルス粒子を溶解し、溶出するウイルス遺伝子を分離後、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ法を実施した増幅限界は１００コピー／チューブまでであった。この検出限界は、一般的に広く用いられているＰＣＲ法と同程度であり、ＨＩＶ−１感染患者の血清中ウイルス（約１０6コピー／ｍＬ）を直接遺伝子検査できる範囲にあることを確認した。これより、血清からウイルス遺伝子を抽出する操作が省略でき、検査時間の短縮が可能であると考えられた。
【０１１８】
＜実施例４：大腸菌全ＲＮＡ標準液による反応性の確認＞
≪第１工程：細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブの作製≫
公知の大腸菌ゲノムＤＮＡの１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする配列中の細菌全般に保存されているＤＮＡ塩基配列５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３’（１８塩基、５１９−５３６）（配列番号５）を含み、５’末端がアミノ基修飾したキャプチャーＤＮＡ鎖としての合成ＤＮＡプローブを５Ｍ  Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ９．０）に溶解し、０．１μＭのキャプチャーＤＮＡ鎖溶液を調製する。キャプチャーＤＮＡ鎖溶液２０μＬを住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ  ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブの底面に添加し、室温で１時間静置してキャプチャーＤＮＡ鎖を固定化させることで、ＤＮＡ固定化担体とてのＰＣＲチューブを作製した。その後、ＰＣＲチューブ内を３００μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨでブロッキング処理を施し、ＲＮａｓｅフリー水３００μＬで２回洗浄したＰＣＲチューブを以下の実験に使用した。
【０１１９】
≪第２工程および第３工程：大腸菌全ＲＮＡからの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の分離≫
大腸菌全ＲＮＡ標準液（ロシュ社製）を水で希釈して１，１０，１００，１０００ｐｇ／μＬの各溶液を調整した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブに各濃度ＲＮＡ溶液１μＬにおよびＰＢＳ１９μＬを加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌して、簡易卓上遠心機で遠心分離後、室温で３０分間静置して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＲＮＡ溶液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。
【０１２０】
≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅≫
操作にて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子検出法に供した。
【０１２１】
（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （ＴＯＹＯＢＯ）添付書類に従い、ワンステップのＲＴ−ＰＣＲ反応液の調整を行なった。
【０１２２】
【表６】
2010046042.tif 000008
【０１２３】
（ＲＴ−ＰＣＲプログラム）
【０１２４】
【表７】
2010046042.tif 000009
【０１２５】
１６Ｓ−９Ｆ  （Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’−  ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号２０）
１６Ｓ−５３６Ｒ  （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号２１）
（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。図６は、大腸菌全ＲＮＡ標準液（ロシュ社製）をチューブ当り１，１０，１００，１０００ｐｇ／μＬ添加して、ＲＴ−ＰＣＲを行なった結果を示す図（ＲＴ−ＰＣＲ電気泳動（５２８ｂｐ））である。図６に示すように細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブを使用して細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を分離後、ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。増幅限界は１ピコグラム／チューブまでであった。なお、図６の各レーンは以下のとおりである。
レーン０：ネガティブコントロール
レーン番号１：１ｐｇ／μＬ
レーン番号１０：１０ｐｇ／μＬ
レーン番号１００：１００ｐｇ／μＬ
レーン番号１０００：１０００ｐｇ／μＬ
以上から、本発明においては、微生物特異的な配列キャプチャーＤＮＡが高感度で微生物を検出できることが分かった。
【０１２６】
＜実施例５：複数の逆転写プライマーによる効果の確認＞
≪第２工程および第３工程：大腸菌全ＲＮＡからの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の分離≫
本実施例においては、実施例４で作製したＰＣＲチューブを使用した（第１工程）。水で希釈しての各溶液を調整する。１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブに濃度１ｐｇ／μＬの大腸菌全ＲＮＡ標準液（ロシュ社製）を１μＬおよびＰＢＳ１９μＬを加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌して、簡易卓上遠心機で遠心分離後、室温で３０分間静置して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＲＮＡ溶液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。
【０１２７】
≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅≫
操作にて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子検出法に供した。
【０１２８】
（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （ＴＯＹＯＢＯ）添付書類に従い、ワンステップのＲＴ−ＰＣＲ反応液の調整を行なった。
【０１２９】
【表８】
2010046042.tif 000010
【０１３０】
１６Ｓ−９Ｆ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５‘−  ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号２２）
１６Ｓ−５３６Ｒ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号２３）
（逆転写プライマー（ＲＴ  Ｐｒｉｍｅｒ））
Ｐｂａ２：５’−ＴＣＡＣＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧ−３’（配列番号２４）
Ｍｉｃｒｏｂｉｏ：５’−ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴ−３’（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １４８：  ２５７−２６６  （２００２））（配列番号２５）
（ＲＴ−ＰＣＲプログラム）：実施例４と同一条件で行なった。
【０１３１】
（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。図１に示すように細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブを使用して細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を分離後、逆転写プライマーを追加した条件下でＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。図７は、複数の逆転写プライマーによる効果の確認結果を示す図（ＲＴ−ＰＣＲ  電気泳動  （５２８ｂｐ））である。２種類のプライマーを用いたときにバンドが濃くなることから、プライマーが１つより２つの方が検出感度が上がることことから、逆転写プライマーを追加の効果は明白に確認できた。なお、図７の各レーンは以下のとおりである。
Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｕｂｅ：対象となるコントロール実験結果
ＧｅｎｅＴｕｂｅ：本発明の実験結果
レーン番号１：逆転写プライマー添加なし
レーン番号２：Ｐｂａ２
レーン番号３：Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
レーン番号４：Ｐｂａ２＋Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
＜実施例６：標準菌株培養における反応性の確認＞
本実施例においては、実施例４の第１工程で作製したＰＣＲチューブを用いた。
【０１３２】
≪第２工程（ａ）：大腸菌標準菌株の培養および溶菌≫
培養は通常液体培地あるいは普通寒天培地を用い、３７℃、一昼夜（１４−１８時間）行なう。培地はインスタント培地である「普通ブイヨン栄研」を用い、液体培地は「普通ブイヨン栄研」の指示量を脱塩水に溶かし、寒天培地はそれに１．６％の寒天末を加え、それぞれオートクレーブ後、使用した。
【０１３３】
１Ｌあたりの培地組成は以下の通りとした。
肉エキス３ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ（ｐＨ７．０）
そして、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２）被検リボゾームＲＮＡを以下のようにして調製した。被検菌を白金耳などで上記液体培地に懸濁し、３７℃で一晩培養した。なお、生菌数は１０μｌの懸濁液をとり適当に希釈して栄養寒天培地に塗抹し、３７℃で一晩培養し、出現したコロニー数と希釈率とから求め、生菌数は約１０9ｃｆｕ／ｍｌであった。菌体培養液２０μｌを１００００×ｇで５分間遠心し、沈殿を採取した。沈殿にＰＢＳ１８μｌを加え、溶菌液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ，０．５％  ＳＤＳ，５％ポリエチエングリコール１０００）１μｌを混合し、１０分間室温で静置した後、氷冷し、中和液（０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５Ｎ  ＨＣｌ）１μｌを加えて中和し、これを被検ＲＮＡ溶液とした。
【０１３４】
≪第２工程（ｂ）：大腸菌標準菌株の添加食品の培養操作後にＲＴ−ＰＣＲ反応を行なう方法≫
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２）を小麦粉に１ｇ当たり１０個程度となるように添加した。菌が添加された小麦粉重量の９倍量の通常液体培地（普通ブイヨン栄研）を加え、３７℃で一晩培養した。培養前の小麦懸濁中の菌密度は、１個／ｍｌであったが、４時間培養後には約１×１０3個／ｍｌ増殖した。培養液１ｍｌを採取し、１００×ｇで１分間遠心し、上清を１００００×ｇで５分間遠心し、沈殿を採取した。この沈殿を洗うためＴＥ緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、１００００×ｇで５分間遠心し、沈殿を採取した。沈殿にＰＢＳ１８μｌを加え、溶菌液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ，０．５％ＳＤＳ，５％ポリエチエングリコール１０００）１μｌを混合し、１０分間室温で静置した後、氷冷し、中和液（０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５Ｎ  ＨＣｌ）１μｌを加えて中和し、これを被検ＲＮＡ溶液とした。
【０１３５】
≪第３工程：被検ＲＮＡ溶液からの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の分離＞
１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブに被検ＲＮＡ溶液をそれぞれ加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌し、簡易卓上遠心機で遠心分離後、室温で３０分間静置して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＲＮＡ溶液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。
【０１３６】
≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅≫
操作にて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子検出法に供した。
【０１３７】
（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応液は実施例４と同一条件で行なった。
【０１３８】
（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。図８（ＲＴ−ＰＣＲ電気泳動（５２８ｂｐ））に示すように細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブを使用して、大腸菌標準株培養から得た被検ＲＮＡ溶液から細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を分離後、ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。大腸菌の場合には、小麦１ｇ当たり１０個程度の細菌が存在している場合には、前述の操作による培養時間を４時間以上にすれば、ＰＣＲ反応によりその１６Ｓ  ｒＲＮＡを検出できることが分かる。また、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３）、緑脳菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３）およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２８）から選ばれる微生物の各被検リボゾームＲＮＡからも同一のプライマーの組み合わせを用いることにより同様の結果が得られた。なお、図８における各レーンは以下のとおりである。
レーン番号１：大腸菌標準株培養から得た被検ＲＮＡ溶液
レーン番号２：大腸菌標準菌株の添加食品の培養から得た被検ＲＮＡ溶液
＜実施例７：大腸菌ＤＨ５α株の培養経過における１６Ｓ  ｒＲＮＡの確認＞
≪第２工程：被検ＲＮＡ溶液の作製≫
大腸菌ＤＨ５α（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｉｅｓ製）１０2〜１０3ｃｆｕをＬＢ培地１０ｍＬに懸濁し、３７℃で培養した。培養液５０μｌを１、２、４時間経過後にそれぞれサンプリングし、１００００×ｇで５分間遠心し、沈殿を採取した。各沈殿にＰＢＳ１８μｌを加え、溶菌液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ，０．５％  ＳＤＳ，５％  ポリエチエングリコール１０００）１μｌを混合し、１０分間室温で静置した後、氷冷し、中和液（０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５Ｎ  ＨＣｌ）１μｌを加えて中和し、これを被検ＲＮＡ溶液とした。
【０１３９】
≪第３工程：被検ＲＮＡ溶液からの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の分離≫
１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブ（実施例４で作製したＰＣＲチューブ）に被検ＲＮＡ溶液を加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌し、簡易卓上遠心機で遠心分離後、室温で３０分間静置して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をハイブリダイゼーションで捕捉した。ＰＣＲチューブ内のＲＮＡ溶液は、マイクロピペットで完全に除去後、ＰＢＳ１５０μＬで洗浄した。
【０１４０】
≪第４工程：ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅≫
操作にて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を分離したＰＣＲチューブを使用して以下のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子検出法に供した。
【０１４１】
（ＲＴ−ＰＣＲ条件）
逆転写反応：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  （Ｔａｋａｒａ，  ＰＲ０３７Ａ）を使用して以下の条件で行なった。
【０１４２】
【表９】
2010046042.tif 000011
【０１４３】
【表１０】
2010046042.tif 000012
【０１４４】
ＰＣＲ反応は以下の条件で実施した。
【０１４５】
【表１１】
2010046042.tif 000013
【０１４６】
【表１２】
2010046042.tif 000014
【０１４７】
（結果）
ＲＴ−ＰＣＲ測定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ９７００ＰＣＲシステムを使用して行い、アガロースゲル電気泳動にて増幅された遺伝子断片の確認を行なった。図９は、大腸菌ＤＨ５α株の培養時間（ｈ）経過における１６Ｓ  ｒＲＮＡの確認した結果を示す図（ＲＴ−ＰＣＲ  電気泳動  （５２８ｂｐ））である。細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブを使用して、大腸菌標準株培養から得た被検ＲＮＡ溶液から細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を分離後、ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。２時間経過した培養液中から明白な１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子増幅産物が確認できた。
【０１４８】
［考察］
図６〜９に示すように１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用ＰＣＲチューブを使用して、様々なサンプル形態に応じて細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を分離後、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ法を実施した増幅限界は細菌１０個／チューブであった。この検出限界は、一般的に広く用いられているＰＣＲ法と同程度であることを確認した。これより、サンプルから１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を抽出する操作が省略でき、検査時間の短縮が可能であると考えられる。本発明の微生物検出法では、被検試料検体中の微生物溶解処理から遺伝子増幅・検出までに要する時間はわずか２時間程度で実施可能である。この短時間の操作により迅速・簡便に微生物を検出することができ、公衆衛生上大きく寄与するものと考えられた。
【０１４９】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】実施例１のＬＡＭＰ法反応の増幅副産物であるピロリン酸マグネシウムＭｇ2Ｐ2Ｏ7（白色沈殿物質）の白濁の有無による標的遺伝子配列の有無を判別した図である（（上）：目視濁度結果、（下）：栄研化学（株）社製Ｌｏｏｐａｍｐエンドポイント濁度測定装置（ＬＡ−１００）による濁度測定結果。レーン番号１および２は、水またはコントロールＲＮＡを栄研化学（株）社製ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットを用いて行なったＬＡＭＰ法のコントロール反応）。
【図２】実施例１のＬＡＭＰ法反応液に約１μＬの１０００×の濃度のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ添加（最終濃度：１００×）によるＬＡＭＰ法反応液の核酸増幅産物の目視確認結果を示す図である。
【図３】実施例１のコントロールのノロウイルスＲＮＡとノロウイルス感染患者糞便サンプル（Ｓ１〜３）を用いたＬＡＭＰ法反応結果を示す図である（Ａ：ノロウイルスＧ２型検出用ＰＣＲチューブを用いてノロウイルス遺伝子を分離後、ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧ２検出試薬キットを用いて行なったＬＡＭＰ法遺伝子増幅反応産物を電気泳動。Ｂ：ノロウイルス遺伝子を直接ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キットに添加して行なったＬＡＭＰ法のコントロールの結果）。
【図４】実施例２のコントロールＨＩＶ−１  ＲＮＡを添加した市販血清から、ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを用いてウイルス遺伝子を分離、ＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し、電気泳動法で検出した結果を示す図である。
【図５】実施例３のＨＩＶ−１  ＬＡＩ株を添加した市販血清から、ＨＩＶ−１検出用ＰＣＲチューブを用いてウイルス遺伝子を分離、ＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し、電気泳動法で検出した結果を示す図である。
【図６】実施例４の大腸菌全ＲＮＡ標準液（ロシュ社製）をチューブ当り１，１０，１００，１０００ｐｇ／μＬ添加して、ＲＴ−ＰＣＲを行なった結果を示す図である。
【図７】実施例５の複数の逆転写プライマーによる効果の確認結果を示す図である（Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｕｂｅ：対象となるコントロール実験結果、ＧｅｎｅＴｕｂｅ：本発明の実験結果。レーン番号１：逆転写プライマー添加なし、レーン番号２：Ｐｂａ２、レーン３：Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、レーン４：Ｐｂａ２＋Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）。
【図８】実施例６の標準菌株培養における反応性の確認結果を示す図である（レーン番号１：大腸菌標準株培養から得た被検ＲＮＡ溶液、レーン番号２：大腸菌標準菌株の添加食品の培養から得た被検ＲＮＡ溶液）。
【図９】実施例７の大腸菌ＤＨ５α株の培養時間経過における１６Ｓ  ｒＲＮＡの確認した結果を示す図である。
【図１】
2010046042.tif 000015
【図２】
2010046042.tif 000016
【図３】
2010046042.tif 000017
【図４】
2010046042.tif 000018
【図５】
2010046042.tif 000019
【図６】
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【図７】
2010046042.tif 000021
【図８】
2010046042.tif 000022
【図９】
2010046042.tif 000023
【配列表】
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