(57)【要約】【課題】本発明は、抗体医薬の開発における前臨床実験の前段階で、in vitroのアッセイ系によって容易にキメラ抗体やヒト化抗体等の安全性やその治療効果をあらかじめ評価し得る手段を提供する。【解決手段】本発明はヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上を含む抗体試料のリスクを評価する方法であって、上記抗体試料と、ＨＡＭＡやＨＡＣｈＡ等のヒト由来異好性抗体とを反応させる反応工程を含む評価方法である。上記ヒト由来異好性抗体としては、ＨＡＭＡ陽性血清やＨＡＣｈＡ陽性血清が利用可能である。上記反応工程において、抗体試料がヒト由来異好性抗体に対して陽性を示した場合に、当該抗体試料はリスク有りと評価し、抗体試料がヒト由来異好性抗体に対して陰性を示した場合に、当該抗体試料はリスク無しと評価する。【選択図】図１
2010169483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上を含む抗体試料のリスクを評価する方法であって、
上記抗体試料と、ヒト由来異好性抗体とを反応させる反応工程を含むことを特徴とする評価方法。
【請求項２】
上記反応工程において、抗体試料がヒト由来異好性抗体に対して陽性を示した場合に、当該抗体試料はリスク有りと評価し、
抗体試料がヒト由来異好性抗体に対して陰性を示した場合に、当該抗体試料はリスク無しと評価することを特徴とする請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
上記ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上がマウス由来の場合に、上記ヒト由来異好性抗体が、ヒト抗マウス抗体である、請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
上記ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上がニワトリ由来の場合に、上記ヒト由来異好性抗体が、ヒト抗ニワトリ抗体である、請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項５】
ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上を含む抗体試料のリスクを評価するためのキットであって、
ヒト由来異好性抗体を少なくとも含むことを特徴とするキット。
【請求項６】
上記ヒト由来異好性抗体は、ヒト抗マウス抗体およびヒト抗ニワトリ抗体のいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上を含む抗体試料のリスクを評価する方法、および当該方法を実施するために好適に用いられるキットに関するものである。
【０００２】
より具体的には、抗体医薬の開発において、高価なアカゲザル等の実験動物を用いた前臨床実験の前段階で、in vitroのアッセイ系によって容易にキメラ抗体やヒト化抗体等の安全性やその治療効果をあらかじめ評価し得る手段に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、ヒトに対して化学合成薬よりもはるかに安全性が確保できることから、抗体医薬の開発が急速に進められている。例えば、マウスを用いた細胞融合法で得た抗体産生ハイブリドーマから抗体遺伝子をクローニングし、これを用いて作製されたマウス抗体のヒトキメラ抗体やヒト化抗体等が各種疾患の抗体治療薬として活用されている。
【０００４】
マウスを始めとするヒト以外の動物由来の抗体（「動物由来抗体」という）は、ヒトにとっては外来抗原となるため、動物由来抗体の投与によって治療薬としての一時的な効果が期待されるものの、頻回投与によってヒト体内に抗体産生が誘導されるため、治療薬としての長期的な効果が低減されるばかりでなく、アナフィラキシーショックを引き起こす危険性がある。このため、有用なマウス抗体については、その抗体遺伝子を利用してキメラ抗体やヒト化抗体を構築して、ヒトへの安全性を確保する手段が取られている。またマウス抗体と同様に、ニワトリが各種ヒト抗原に特異的なモノクローナル抗体を作製する上で有用であることに着目され、ニワトリ抗体のキメラ抗体化やヒト抗体化も進められている。
【０００５】
ただし、キメラ抗体やヒト化抗体が抗体医薬として安全に使用されるためには、これらの抗体がヒト体内で異物として認識されないことが重要である。従来、キメラ抗体やヒト化抗体を抗体医薬として開発する場合、in vitroでの薬効試験の後に、前臨床実験として実験動物、特にヒトに近縁なアカゲザルへの投与実験を行って安全性を評価している。かかる前臨床実験には高価なアカゲザルが用いられることが一般的であるため、設備や材料等にかかる費用は莫大なものになる。また比較的大型のアカゲザルが前臨床実験に用いられているため、前臨床実験の結果が出るまでには、ある程度の長い期間を要する。
【０００６】
ところで、ヒト血清中には、異好性抗体としてヒト抗マウス抗体（human anti-mouse antibody：ＨＡＭＡ）やヒト抗ニワトリ抗体（human anti-chicken antibody：ＨＡＣｈＡ）が比較的高い頻度で存在することが知られている（例えば非特許文献１および２を参照のこと）。上記ＨＡＭＡやＨＡＣｈＡは、マウス抗体やニワトリ抗体を用いた各種免疫学的測定法における非特異的反応の原因であることが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ines Socher, Oliver Meyer, Tunay Aslan, Stephane Bombard, Holger Kiesewetter, and Abdulgabar Salama, Human Antibodies, 15, 2006, 133-137.
【非特許文献２】臨床病理  第５５巻補冊／臨床化学  第３６巻補冊２号  ２００７、第１９０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の通り、抗体医薬開発における前臨床実験には莫大な費用や時間がかかる。よって、膨大な費用や時間をかけたにもかかわらず、前臨床実験の結果如何によっては、抗体医薬として利用することができず、開発にかけた費用や労力を回収できない場合がある。
【０００９】
したがって、開発されたキメラ抗体やヒト化抗体について前臨床実験に入る前の段階であらかじめ当該キメラ抗体等の効果や危険性等のリスクを評価することができれば、無駄な経費や労力を節約することができ、より効率よく抗体医薬の開発を行うことができる。
【００１０】
しかし、現状では前臨床実験の前段階でキメラ抗体やヒト化抗体のリスクを容易に評価することができる手段が存在していない。
【００１１】
そこで、本発明は、抗体医薬の開発において、高価なアカゲザル等の実験動物を用いた前臨床実験の前段階で、in vitroのアッセイ系によって容易にキメラ抗体やヒト化抗体等の安全性やその治療効果をあらかじめ評価し得る手段を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＨＡＭＡやＨＡＣｈＡをはじめとする異好性抗体と、キメラ抗体やヒト化抗体との反応性を検討することによって、キメラ抗体やヒト化抗体の安全性やその治療効果をあらかじめ評価し得るという技術的思想を見出し本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明にかかる評価方法は、ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上を含む抗体試料のリスクを評価する方法であって、上記抗体試料と、ヒト由来異好性抗体とを反応させる反応工程を含むことを特徴としている。
【００１４】
また本発明にかかる評価方法は、上記反応工程において、抗体試料がヒト由来異好性抗体に対して陽性を示した場合に、当該抗体試料はリスク有りと評価し、抗体試料がヒト由来異好性抗体に対して陰性を示した場合に、当該抗体試料はリスク無しと評価することを特徴とする方法であってもよい。
【００１５】
また本発明にかかる評価方法は、上記ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上がマウス由来の場合に、上記ヒト由来異好性抗体がヒト抗マウス抗体であることが好ましい。
【００１６】
また本発明にかかる評価方法は、上記ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上がニワトリ由来の場合に、上記ヒト由来異好性抗体が、ヒト抗ニワトリ抗体であることが好ましい。
【００１７】
一方、本発明にかかるキットは、ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上を含む抗体試料のリスクを評価するためのキットであって、ヒト由来異好性抗体を少なくとも含むことを特徴としている。
【００１８】
本発明にかかるキットに含まれる上記ヒト由来異好性抗体は、ヒト抗マウス抗体およびヒト抗ニワトリ抗体のいずれか１つ以上であってもよい。
【００１９】
なおＨＡＭＡやＨＡＣｈＡは、マウス抗体やニワトリ抗体を用いた各種免疫学的測定法における非特異的反応の原因であることが知られているのみであり、その用途については研究されておらず、また一切知られていない。よってＨＡＭＡやＨＡＣｈＡなどの異好性抗体を用いることによって、抗体医薬の開発における前臨床実験の前段階で、容易にキメラ抗体やヒト化抗体等の安全性やその治療効果をあらかじめ評価し得るなどということは当然知られておらず、また当業者であっても予想し得ることではない。
【発明の効果】
【００２０】
上記のように本発明によれば、抗体医薬の開発において、キメラ抗体やヒト化抗体について前臨床実験に入る前の段階であらかじめ当該キメラ抗体等の効果や危険性等のリスクをin vitroのアッセイ系によって容易に評価することができる。よって、抗体医薬開発にかかる無駄な経費や労力を節約することができ、より効率的に抗体医薬の開発を行うことができる。換言すれば、本発明は以下の効果を奏する。
【００２１】
(1)キメラ抗体やヒト化抗体等のある抗体試料について、抗体医薬としての前臨床実験の動物投与実験に入るか否かを判定するための効果的な簡易抗体評価手段を提供することができる。
【００２２】
(2)本発明にかかる評価方法およびキットは費用対効果に優れているため、キメラ抗体やヒト化抗体の安全性および抗体医薬としての効果を、極めて安価に確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明にかかる評価方法の一実施形態を説明するための概略図である。異好性抗体としてＨＡＭＡ陽性血清またはＨＡＣｈＡ陽性血清を用いた場合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りである。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。
【００２５】
＜１．本発明にかかる評価方法＞
本発明にかかる評価方法は、ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上を含む抗体試料のリスクを評価する方法であって、上記抗体試料と、ＨＡＭＡやＨＡＣｈＡ等のヒト由来異好性抗体とを反応させる反応工程を含む評価方法である。
【００２６】
ここで本発明の説明において「ヒトキメラ抗体」とは、ヒト以外の動物由来の抗体（「動物由来抗体」という）の抗体可変領域（Ｖ領域）と、ヒト由来抗体の抗体定常領域（Ｃ領域）とからなる抗体を意味する。例えば、マウス−ヒトキメラ抗体は以下のようにして作製される。(1)抗原をマウスに免疫し、そのマウスのモノクローナル抗体を取得する。(2)マウスのモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合するＶ領域をコードする遺伝子を切り出すとともに、ヒト骨髄腫由来のＣ領域をコードする遺伝子と結合させてキメラ遺伝子を取得する。(3)かかるキメラ遺伝子を適当な宿主細胞で発現させることによって、マウス−ヒトキメラ抗体が作製される。なお、ヒトキメラ抗体としてはマウス−ヒトキメラ抗体が一般的ではあるが、本発明はこれに限定されず、ニワトリ−ヒトキメラ抗体、ラット−ヒトキメラ抗体、ウサギ−ヒトキメラ抗体等も利用可能である。マウス等の哺乳動物では抗体を取得できない抗原に対する抗体を取得することができるという理由から、ニワトリ由来の抗体が近年着目されている。よって、ニワトリ−ヒトキメラ抗体は、本発明の評価方法の対象としてより好ましいといえる。なお、本発明の説明においては、マウス−ヒトキメラ抗体を「マウス由来ヒトキメラ抗体」と称し、ニワトリ−ヒトキメラ抗体を「ニワトリ由来ヒトキメラ抗体」と称する場合がある（他の動物由来のＶ領域を有するヒトキメラ抗体についても同様である）。
【００２７】
また本発明の説明において「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の動物由来の抗体（「動物由来抗体」という）の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列だけをヒトの抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）して作製された抗体のことを意味する。なお、ヒト化抗体としてはマウス由来抗体のＣＤＲが移植されたヒト化抗体（本発明の説明においては「マウス由来ヒト化抗体」という）が一般的ではあるが、本発明はこれに限定されず、ニワトリ由来のＣＤＲが移植されたヒト化抗体（本発明の説明においては「ニワトリ由来ヒト化抗体」という）、ラット由来ヒト化抗体、ウサギ由来ヒト化抗体等も利用可能である。マウス等の哺乳動物では抗体を取得できない抗原に対する抗体を取得することができるという理由から、ニワトリ由来の抗体が近年着目されている。よって、ニワトリ由来ヒト化抗体は本発明の評価方法の対象としてより好ましいといえる。
【００２８】
また本発明の説明において「ヒト由来異好性抗体」とは、ヒト以外の動物由来免疫グロブリンに結合するヒトの免疫グロブリンを意味する。ヒト由来異好性抗体としては、例えばＨＡＭＡやＨＡＣｈＡ等が知られている。ＨＡＭＡは、マウスに対する異好性抗体であり、マウス由来の免疫グロブリンに結合するヒト由来の免疫グロブリンのことである。ＨＡＭＡは、正常または異常にかかわらず、抗マウスＩｇＧ抗体は数％から数十％のかなり高い頻度で、ヒト血清中に存在することが知られている。またＨＡＣｈＡは、ニワトリに対する異好性抗体であり、ニワトリ由来の免疫グロブリンに結合するヒト由来の免疫グロブリンのことをいう。ＨＡＣｈＡについても、高い頻度でヒトの血清中に含まれていることが知られている。
【００２９】
また本発明の説明において「抗体試料のリスクを評価する」とは、(1)抗体試料に含まれるヒトキメラ抗体やヒト化抗体をヒトに対して投与した場合にアナフィラキシーショック等を誘引する危険性をある程度評価すること、および(2)抗体試料に含まれるヒトキメラ抗体やヒト化抗体の抗体医薬としての薬理効果が、一過性のではなく長期間期待されるかどうかを評価することを含む意味である。ある抗体試料に関する評価結果が「リスクあり」であった場合には、当該抗体試料についてアカゲザル等を用いた前臨床実験に移行したとしても良好な結果が得られないということがある程度予測される。よってこの場合には、当該抗体試料を前臨床実験に移行させない方がよいと判断することができる。
【００３０】
次に、図１を用いて本発明にかかる評価方法の一実施形態を説明する。ただし本発明にかかる評価方法は、この実施形態に限定されるものではない。図１に示される本発明にかかる評価方法の一実施形態では、抗体試料としてマウス由来またはニワトリ由来のヒトキメラ抗体、およびマウス由来またはニワトリ由来のヒト化抗体のいずれかが含まれている場合を説明する。また図１に示される本発明にかかる評価方法の一実施形態では、ヒト由来異好性抗体としてＨＡＭＡ陽性血清またはＨＡＣｈＡ陽性血清が用いられている。本発明にかかる評価方法においては、ヒト由来異好性抗体として精製された抗体が用いられてもよいし、図１に示すごとく未精製の血清（ＨＡＭＡ陽性血清またはＨＡＣｈＡ陽性血清）が用いられてもよい。血清がＨＡＭＡ陽性（またはＨＡＣｈＡ陽性）であるかの判断は、当該ヒト血清がマウス免疫グロブリンやニワトリ免疫グロブリンと抗原抗体反応を示すか否かによって判断される。
【００３１】
反応系としては、ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体を含む抗体試料と、ＨＡＭＡ陽性血清またはＨＡＣｈＡ陽性血清とを反応させる。反応の方法は、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンブロット法、またはこれらの方法の改変法等、通常の免疫反応の評価に用いられる各種免疫学的測定法が採用され得る。抗体試料や血清の希釈条件、反応温度、反応時間、検出方法等の具体的な反応条件については、適宜検討の上、好適な条件を設定すればよい。
【００３２】
上記反応を行った結果、抗体試料がＨＡＭＡ陽性血清またはＨＡＣｈＡ陽性血清に対して陽性（図１中「＋」で示す）を示した場合に、当該抗体試料はリスク有りと評価し、抗体試料がヒト由来異好性抗体に対して陰性（図１中「−」で示す）を示した場合に、当該抗体試料はリスク無し（安全）と評価することができる。抗体試料がＨＡＭＡ陽性血清またはＨＡＣｈＡ陽性血清に対して陽性かどうかの判断は、抗体試料を含む反応系の結合シグナルが、抗体試料が含まれていない反応系（すなわち陰性対象）の結合シグナルに比して強いシグナルを示した場合に陽性であると判断し、逆に抗体試料を含む反応系の結合シグナルが、抗体試料が含まれていない反応系（すなわち陰性対象）の結合シグナルに比して弱いシグナルないしはシグナル無しを示した場合に陰性であると判断すればよい。
【００３３】
抗体試料がＨＡＭＡ陽性血清またはＨＡＣｈＡ陽性血清に対して陽性（図１中「＋」で示す）を示した場合に、当該抗体試料はリスク有りと評価し、抗体試料がヒト由来異好性抗体に対して陰性（図１中「−」で示す）を示した場合に、当該抗体試料はリスク無し（安全）と評価することができる理由は以下の通りである。ＨＡＭＡやＨＡＣｈＡなどの異好性抗体は、ヒト血清中に高い頻度で含まれている。このようにＨＡＭＡやＨＡＣｈＡを有するヒトに対して、ＨＡＭＡやＨＡＣｈＡに結合し得るヒトキメラ抗体またはヒト化抗体を投与した場合、ＨＡＭＡやＨＡＣｈＡによって当該ヒトキメラ抗体等がトラップされてしまい所望の薬理効果を示さない可能性が高い。またＨＡＭＡやＨＡＣｈＡを有するヒトに対して、ＨＡＭＡやＨＡＣｈＡに結合し得るヒトキメラ抗体またはヒト化抗体を投与した場合、ＨＡＭＡやＨＡＣｈＡとヒトキメラ抗体との免疫応答によって、アナフィラキシーショック等を誘発することが予測できる。それゆえ、抗体試料がＨＡＭＡ陽性血清またはＨＡＣｈＡ陽性血清に対して陽性（図１中「＋」で示す）を示した場合に、当該抗体試料はリスク有りと評価し、抗体試料がヒト由来異好性抗体に対して陰性（図１中「−」で示す）を示した場合に、当該抗体試料はリスク無し（安全）と評価することができるのである。
【００３４】
本発明にかかる評価方法において用いられるヒト由来異好性抗体としては、抗体試料中に含まれるヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上がマウス由来の場合には、ＨＡＭＡが用いられることが好ましい。また抗体試料中に含まれるヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上がニワトリ由来の場合には、ＨＡＣｈＡがヒト由来異好性抗体として用いられることが好ましい。なお、本発明にかかる評価方法において用いられるヒト由来異好性抗体としては、１種類のヒト由来異好性抗体（例えばＨＡＭＡまたはＨＡＣｈＡのいずれか１つ）であっても、複数種類のヒト由来異好性抗体の混合物（例えばＨＡＭＡとＨＡＣｈＡとの混合物）であってもよい。
【００３５】
＜２．本発明にかかるキット＞
次に、本発明にかかるキットについて説明する。本発明にかかるキットは、ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体のいずれか１つ以上を含む抗体試料のリスクを評価するためのキット、すなわち前述の本発明にかかる評価方法を実施するために好適に用いられるキットである。よって、本発明にかかるキットの説明は、前項「１．本発明にかかる評価方法」の説明を援用することができる。
【００３６】
本発明にかかるキットは、ヒト由来異好性抗体を少なくとも含むことを特徴とするものである。上記ヒト由来異好性抗体は、１種類のヒト由来異好性抗体（例えばＨＡＭＡまたはＨＡＣｈＡのいずれか１つ）であっても、複数種類の異好性抗体の混合物（例えばＨＡＭＡおよびＨＡＣｈＡの混合物）であってもよい。上記ヒト由来異好性抗体は、精製されたものであっても、未精製の異好性抗体陽性の血清（例えばＨＡＭＡ陽性血清またはＨＡＣｈＡ陽性血清）であってもよい。
【００３７】
なお本発明にかかるキットには、ヒト由来異好性抗体以外の構成が含まれていてもよい。例えば、ＥＬＩＳＡ等の免疫反応を行うために必要な部材（２次抗体、発色試薬、ブロッキング試薬等）、プレート（９６ウェルプレート等）、チューブ等が含まれていてもよい。またウエスタンブロット法を行うために必要なメンブレン、電気泳動用ゲル、電気泳動装置、ブロッティング装置、ブロッティング用試薬等が含まれていてもよい。
【００３８】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上のように本発明によれば、抗体医薬の開発において、キメラ抗体やヒト化抗体について前臨床実験に入る前の段階であらかじめ当該キメラ抗体等の効果や危険性等のリスクをin vitroのアッセイ系によって容易に評価することができる。よって、抗体医薬開発にかかる無駄な経費や労力を節約することができ、より効率的に抗体医薬の開発を行うことができる。
【００４０】
それゆえ本発明は、抗体医薬開発に関連する産業において特に有用である。
【図１】
2010169483.tif 000003