(57)【要約】【課題】核酸を配列決定および遺伝子型決定するための改良された方法を提供する。【解決手段】本発明は、単一分子配置における核酸を配列決定および遺伝子型決定するための改良された方法に関する。この方法は、ポリメラーゼ伸長産物が作製される場合に、ＮＴＰから放出される蛍光標識ＰＰｉ部分の単一分子の検出を含む。４つ全てのヌクレオチドが同時に添加される場合、段階的なヌクレオチドの添加は、不必要である。ポリメラーゼが、伸長している核酸［ＮＡ］鎖の中へ４つ全てのヌクレオチドを連続的に取り込む場合、配列情報は、連続して生成される。本発明では、単一分子が別々に観察されるので、同期化の損失は無い。単一分子の分析はまた、生物から直接取り出したＮＡフラグメントの使用を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の、標的核酸の遺伝子型決定または配列決定の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、１９９８年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／１１２，０７８号、および１９９９年１月１１日に出願された同第６０／１１５，４９６号（これらの開示は、全ての目的のためにそれらの全体において、参考として本明細書により援用される）に対して優先権を請求する。
【０００２】
（連邦政府により援助された研究および開発下でなされる発明に対する権利に関する記載）
［該当なし］
（発明の分野）
本発明は、単一分子配置における核酸を配列決定および遺伝子型決定するための改良された方法に関する。この方法は、ポリメラーゼ伸長産物が作製される場合に、ヌクレオチド三リン酸［ＮＴＰ］から放出される蛍光標識ピロリン酸［ＰＰｉ］部分の単一分子の検出を含む。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
以前の非電気泳動的な配列決定方法および遺伝子決定方法は、組み込まれたヌクレオチドからのＰＰｉ放出の連続的検出を利用しなかった。ＰＰｉ配列決定の先行技術（ｗｗｗ．ｐｙｒｏｓｅｐｕｅｎｃｉｎｇ．ｃｏｍ）において、各々のヌクレオチド（アデノシン５’−リン酸「Ａ」、シチジン５’−リン酸「Ｃ」、グアノシン５’−リン酸、ウリジン５’リン酸「Ｕ」、およびチミジン５’−リン酸「Ｔ」）は、核酸標的およびポリメラーゼを含む反応混合物に別々に加えられた。現在のヌクレオチドは、次のヌクレオチドが加えられる前に除去される。ヌクレオチドの取り込みは、ＮＴＰからのＰＰｉの放出により達成され、ＰＰｉについての二次的なアッセイにより検出される。ＮＴＰのＰＰｉ部分は標識化されないので、二次的なアッセイが、必要とされる。１サイクルあたり、１つのヌクレオチドのみが試験され得；４つ全てのＮＴＰが、同時に存在するとする場合、重合反応は無制御で続き、そして配列情報は得られえない。読み取り長は、サンプル中の標的核酸分子の間での同期化の損失により制限される。
【０００４】
他の非電気泳動的な方法（例えば、マイクロビーズに結合されたＤＮＡフラグメント上でのプローブの段階的な連結および切断）は、各々のサイクルで必然的に減衰する、ＤＮＡ分子の同期化を必要とする。
【０００５】
本方法は、これらの問題を解決し、そして他の配列決定方法を越える利点を有する。４つ全てのヌクレオチドが同時に添加される場合、段階的なヌクレオチドの添加は、不必要である。ポリメラーゼが、伸長している核酸［ＮＡ］鎖の中へ４つ全てのヌクレオチドを連続的に取り込む場合、配列情報は、連続して生成される。単一分子が別々に観察されるので、同期化の損失は無い。単一分子の分析はまた、生物から直接取り出したＮＡフラグメントの使用を可能にする。本方法を用いて、クローニング工程または増幅工程を使用して、配列決定のためにＮＡを調製することは、もはや必要ないが、このように調製されたＮＡは、依然として配列決定され得る。さらに、単一の表面上の、多くの異なる核酸を、同時に配列決定および遺伝子型決定する可能性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、以下の工程を包含する標的核酸［ＮＡ］を遺伝子型決定または配列決定する方法を提供する：ｉ．単一分子配置における固体支持体上に核酸ポリメラーゼまたは標的核酸を固定化する工程；ｉｉ．以下を含む溶液と固体支持体を接触させる工程：（ａ）このポリメラーゼが固定化される場合は、標的核酸、またはこの標的核酸が固定化される場合は、ポリメラーゼ；（ｂ）配列決定される領域の下流の標的核酸の領域を相補するプライマー核酸；（ｃ）各々の型の塩基が、ホスフェート部分で示差的に標識化されるＮＴＰであって、ここでこれらの標識がポリメラーゼ伸長産物へのＮＴＰの取り込みに際して選択的に検出可能な固有のシグナルを提供する、ＮＰＴ；ｉｉｉ．ポリメラーゼに、プライマーを連続的に伸長させ、ＮＴＰを組み込ませて、標的核酸に対する相補体を作製する工程；およびｉｖ．標識ＮＴＰから固有のシグナルを検出することにより、プライマーの伸長を決定して、標的核酸を遺伝子型決定または配列決定する工程。この方法は、少なくとも２つの異なるＮＴＰの型を含む溶液を使用し得る。
【０００７】
γホスフェートがヌクレオシドから切除される場合、このＮＴＰが、示差的に蛍光発光する蛍光標識を用いてγホスフェート上に標識化されることは、好ましい。固定化部分はさらに、ポリメラーゼまたは標的核酸の単一分子を各々が保有する位置のアレイを含み得る。この固定化部分は、固体支持体上の個々の単一分子のアレイとして位置するポリメラーゼであり得る。遺伝子型決定のために、この標的核酸は、単一ヌクレオチド多型であり得る。このような環境において、単一型のＮＴＰを有する溶液を加えることだけを必要とする。配列決定に関して、決定は、異なるＮＴＰの型の連続的な決定を含み、標的核酸の配列を提供する。好ましい実施形態では、このｄＮＴＰは、γホスフェートおよび消光部分に、蛍光団を用いで標識化される。別の好ましい実施形態では、固体支持体に接触する溶液は、固定化ポリメラーゼまたは標的ＮＡを過ぎて流れる。このポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性もしくはＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり得る。このＮＴＰは、標的核酸および使用されるポリメラーゼに依存して、リボヌクレオチド三リン酸［ｒＮＴＰ］またはデオキシヌクレオチド三リン酸［ｄＮＴＰ］であり得る。
【０００８】
本発明はさらに、以下を含む標的ＮＡを遺伝子型決定または配列決定するためのシステムを含む：ｉ．単一分子配置における固定化核酸ポリメラーゼまたは固定化標的ＮＡを保有する表面を有する固体支持体；ｉｉ．以下を含む表面を接触するための溶液：（ａ）ポリメラーゼが固定化される場合は、標的ＮＡ、または標的ＮＡが固定化される場合は、ポリメラーゼ；（ｂ）ここで、このポリメラーゼがプライマー核酸の使用を必要とし、配列決定される領域の下流の標的ＮＡの領域を相補する添加されたプライマーが存在する；（ｃ）各々の型のＮＴＰ塩基が、ホスフェート部分で示差的に標識化され、そしてこの標識が、ポリメラーゼ伸長産物中へのＮＴＰの取り込みに際して選択的に検出される固有のシグナル提供するモル過剰なＮＴＰ。このシステムは、方法に関して上記で同定された同じ実施形態を包含する。このシステムが流れている溶液を含む場合、この流れによる力は、機械的に生成されるか、または電極を使用して電気浸透的に（ｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ）生成され得る。
【０００９】
本発明はさらに、表面を有する固体支持体を提供し、この表面は、表面に結合される核酸ポリメラーゼアレイを有し、このアレイのメンバーは、ポリメラーゼの個々の分子からなる。このアレイのメンバーは、その位置を規定するために、必要に応じて用意され、そして部位間の比較情報は、生成され得、そして光学的読み取り装置により記録され得る。固体支持体は、それに結合されるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を有し得る。好ましくは、この固定化部分は、単一分子配置においてある。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）  標的核酸の遺伝子型決定または配列決定の方法であって、以
下の工程：
ｉ．単一分子配置において、固体支持体上に核酸ポリメラーゼまたは該標的核酸を固定化する工程；
ｉｉ．該固体支持体を溶液と接触させる工程であって、該溶液は以下：
（ａ）該ポリメラーゼが固定化される場合は、標的核酸、または該標的核酸が固定化される場合は、ポリメラーゼ；
（ｂ）配列決定される領域の下流の該標的核酸の領域を相補する、プライマー核酸；
（ｃ）各々の型の塩基が、ホスフェート部分上に示差的に標識化されるヌクレオチド三リン酸［ＮＰＴ］であって、該標識が、該ポリメラーゼの伸長産物へのＮＴＰの取り込みに際して、選択的に検出可能な固有のシグナルを提供するヌクレオチド三リン酸［ＮＰＴ］、
を含む工程；
ｉｉｉ．該ポリメラーゼに、該プライマーを、連続的に伸長させ、ＮＴＰを取り込ませて、該標的核酸に対する相補体を作製する工程；および
ｉｖ．該標識化ＮＴＰからの該固有のシグナルを検出することにより、該プライマーの伸長を決定して、該標的核酸を遺伝子型決定または配列決定する工程、
を包含する、方法。
（項目２）  上記溶液が、少なくとも２つの異なる型のｄＮＴＰを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）  上記ｄＮＴＰが、γホスフェートが上記ヌクレオチドから切除される場合に、示差的に蛍光発光する蛍光標識を用いて該γホスフェート上に標識化される、項目１に記載の方法。
（項目４）  上記固体支持体の表面が、ポリメラーゼまたは標的ＤＮＡの単一分子を各々が保有する位置のアレイを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）  上記ポリメラーゼが、固体支持体上へ個々の単一分子のアレイとして固定化される、項目１に記載の方法。
（項目６）  上記標的ＤＮＡが、単一ヌクレオチド多型である、項目１に記載の方法。
（項目７）  上記溶液が単一ｄＮＴＰを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）  上記検出が、標的ＤＮＡの配列を提供するための異なる型のｄＮＴＰの連続的な検出である、項目１に記載の方法。
（項目９）  上記ＮＴＰが、γホスフェートおよび消光部分上に蛍光団で標識化される、項目１に記載の方法。
（項目１０）  上記検出器が光学的読み取り装置である、項目１に記載の方法。
（項目１１）  上記固体支持体に接触する上記溶液が上記固定化ポリメラーゼまたは標的ＤＮＡを通過して流れる、項目１に記載の方法。
（項目１２）  上記標的核酸がデオキシヌクレオチド酸であり、上記ポリメラーゼが、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのいずれかであり、そして上記ＮＴＰがｄＮＴＰである、項目１に記載の方法。
（項目１３）  上記標的核酸が二本鎖ＤＮＡであり、そして上記ポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼであり、そして上記ＮＴＰがｒＮＴＰである、項目１に記載の方法。
（項目１４）  標的核酸を遺伝子型決定または配列決定するためのシステムであって、以下：
ｉ．単一分子配置において固定化核酸ポリメラーゼまたは該標的核酸を保有する表面を有する固体支持体；
ｉｉ．該表面に接触させるための溶液であって、以下：
（ａ）該ポリメラーゼが固定化される場合は、標的核酸、または該標的核酸が固定化される場合は、ポリメラーゼ；
（ｂ）モル過剰のヌクレオチド三リン酸［ＮＴＰ］であって、各々の型のＮＴＰ塩基が、ホスフェート部分上に示差的に標識化され、そしてここで該標識が、ポリメラーゼ伸長産物中への該ＮＴＰの取り込みに際して選択的に検出され得る固有のシグナル提供する、モル過剰のヌクレオチド三リン酸［ＮＴＰ］を含む、溶液
を備える、システム。
（項目１５）  項目１４に記載のシステムであって、ここで上記ポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、上記標的核酸がＤＮＡであり、そして上記ＮＴＰがｄＮＴＰであり、該システムが、配列決定される領域の下流で該標的核酸の領域に相補的であるプライマー核酸をさらに備える、システム。
（項目１６）  上記表面が、固定化ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを保有する、項目１４に記載のシステム。
（項目１７）  上記溶液が、少なくとも２つの異なる型のｄＮＴＰを含む、項目１４に記載のシステム。
（項目１８）  上記固体支持体の表面が、単一分子のポリメラーゼまたは標的核酸を各々が保有する位置のアレイを備える、項目１４に記載のシステム。
（項目１９）  上記固体支持体の表面が、単一分子のポリメラーゼを各々が保有する位置のアレイを備える、項目１４に記載のシステム。
（項目２０）  γホスフェートが上記ヌクレオチドから切除される場合に、上記ＮＴＰが、示差的に蛍光発光する蛍光標識を用いて、該γホスフェートに標識化される、項目１４に記載のシステム。
（項目２１）  上記標的核酸がＤＮＡであり、そしてここで該ＤＮＡが、野生型ＤＮＡ由来の単一ヌクレオチド多型を有する、項目１４に記載のシステム。
（項目２２）  上記溶液が単一のｄＮＴＰを含む、項目１４に記載のシステム。
（項目２３）  上記ポリメラーゼがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、上記標的核酸がＲＮＡであり、そして上記ＮＴＰがｄＮＴＰである、項目１４に記載のシステム。
（項目２４）  上記ポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、上記標的核酸が二本鎖ＤＮＡであり、そして上記ＮＴＰがｒＮＴＰである、項目１４に記載のシステム。
（項目２５）  光学的読み取り装置をさらに備える、項目１４に記載のシステム。
（項目２６）  項目１４に記載のシステムであって、該システムは、電極をさらに備え、該電極は、上記溶液の流れを、上記固定化ポリメラーゼまたは標的核酸に接触させるために十分な、上記固体支持体を横切る電圧勾配を提供するように配置される、システム。
（項目２７）  表面を有する固体支持体であって、該固体支持体は、表面を有し、ここで該表面が、これに結合される核酸ポリメラーゼアレイを有し、ここで該アレイのメンバーがポリメラーゼの個々の分子からなる、固体支持体。
（項目２８）  上記アレイのメンバーがアドレス指定されている、項目２５に記載の固体支持体。
（項目２９）  上記ポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、項目２５に記載の固体支持体。
（項目３０）  上記ポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである、項目２５に記載の固体支持体。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、リンカーを介してウラシルに接続される消光部分の化学的構造である。
【図２】図２は、消光部分をも保有するヌクレオチドの、γホスフェートに連結される色素を記載する。
【図３−１】図３は、γホスフェート上に蛍光団を有しかつ塩基上に消光部分を有するヌクレオチドを生成するための、合成経路の概要である。
【図３−２】図３は、γホスフェート上に蛍光団を有しかつ塩基上に消光部分を有するヌクレオチドを生成するための、合成経路の概要である。
【図４】図４は、標的核酸のポリメラーゼ合成配列決定のためのシステムの概要である。
【図５】図５は、ＤＮＡポリメラーゼが固体支持体上に固定化され、そして標的核酸がＤＮＡである方法の概略図である。
【図６】図６は、ＲＮＡポリメラーゼが固体支持体上に固定化され、そして標的核酸が二本鎖ＤＮＡである方法の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（定義）
アレイの状況における「アドレス可能な」は、個別かつ規定される領域内に位置される、アレイのメンバーをいう。
【００１２】
「アレイ」は、標的核酸または固体支持体に結合する核酸ポリメラーゼのいずれかを有する１つより多い部位または位置を有する固体支持体をいう。
【００１３】
配列決定または遺伝子型決定の状況における「配列決定される領域の下流の標的核酸の領域を相補する」は、プライマーが、ポリメラーゼによって３’方向に伸長される事実をいう。従って、プライマーの３’末端として決定される標的配列に対する標的３’の部分配列（下流）に結合するプライマーが、伸長される。
【００１４】
「遺伝子型決定」は、必ずしも全体のＤＮＡの配列の内容を決定することなく、標的ＤＮＡの対立遺伝子の内容の決定することである。これは、配列決定のサブセットである。例えば、２つの既知の対立遺伝子の形態の間の、一塩基の差異の決定による単一ヌクレオチド多型の同定は、配列決定される全ての標的ＤＮＡを必要としない配列決定の形態である。
【００１５】
「固定化」は、反応溶液中で標的核酸またはポリメラーゼの放出を妨げる方法による、固体支持体への標的核酸またはポリメラーゼの結合をいう。この方法は、共有結合またはイオン結合または疎水結合であり得る。
【００１６】
「光学的読み取り装置」は、標識ｄＮＴＰから発する光を検出および記録し得るデバイスをいう。
【００１７】
「配列決定」は、核酸における塩基の順序および位置の決定をいう。
【００１８】
「単一分子配置」は、アレイのメンバーが規定される位置内に位置される個々の分子として提示される固体支持体上の分子のアレイをいう。このメンバーは、同じであるか、または異なり得る。
【００１９】
ヌクレオチド三リン酸［ＮＴＰ］の状況における「塩基の型」は、ポリメラーゼのための基質として認識され得るヌクレオチドをいう。典型的な塩基としては、アデニン塩基、シトシン塩基、グアニン塩基、ウラシル塩基、またはチミジン塩基が挙げられ、ここで、この型は、異なる塩基を保有するＮＴＰの集団内の塩基を有するヌクレオチドの部分集団をいう。他の稀な（ｒａｒｅｒ）塩基またはアナログは、キサンチンまたはヒポキサンチンまたはメチル化シトシンなどに置換され得る。
【００２０】
（詳細な説明）
（１．序論）
本発明は、核酸を遺伝子型決定および配列決定するための新規手段を提供する。本明細書中に記載されるこの方法は、伸長生成物中にそれらのそれぞれのＮＴＰを取り込むＲＮＡ依存性ポリメラーゼまたはＤＮＡ依存性ポリメラーゼとして、一度に同定される個々の蛍光発生的なＮＴＰ分子を使用する。このＮＴＰは、以下の２つの付加物を輸送する：γホスフェートに付加される蛍光色素、および塩基または糖または色素のいずれかに付加される蛍光消光体。この消光体が、塩基または糖に付加される場合、このＮＴＰは、伸長産物中へ取り込まれる際に加水分解され、そしてこの遊離ピロリン酸色素部分は、蛍光発光性になる。この現在非消光である遊離色素は蛍光になり、そしてこの発生は、顕微鏡下でビデオレートで画像化される。
【００２１】
流動する流れは、親分子から色素を払拭する。４つ全てのＮＴＰは、同時に存在する。ポリメラーゼが標的核酸に沿って移動し続ける場合、このヌクレオチド配列は、放出される色素の順序から読み取られる。
【００２２】
（２．標的核酸の供給源）
標的核酸は、重要ではなく、種々の標準の供給源から生じ得る。供給源は、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。この標的が生物学的供給源由来である場合、核酸を抽出するための種々の公知の手順が存在し、そして必要に応じて、遺伝子型決定作業または配列決定作業のために都合のよい濃度まで増幅される。核酸は、ヒト、動物または植物の任意の生細胞から得られうる。ヒト、病原菌およびウイルスは、特に興味深い供給源である。
【００２３】
核酸の増幅方法もまた、公知である。好ましくは、この増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われる（米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、および同第４，８８９，８１８号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｉｎら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７６５２−７６５６；Ｏｃｈｍａｎら、１９８８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２０：６２１−６２３；Ｌｏｈら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７−２２０；Ｉｎｎｉｓら、１９９０，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）。当該分野で公知の他の増幅方法は使用され得、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｑ−βレプリカーゼを用いるリガーゼ連鎖反応（ＥＰ３２０，３０８を参照のこと）、またはＫｒｉｃｋａら、１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，第１章、および表ＩＸ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに列挙される方法。
【００２４】
（３．固定化）
本発明において使用される単一分子アレイとしては、支持体、生物反応性層または生物接着性層、および生物耐性層が挙げられる。この支持体は、ガラス、シリカ、プラスチックまたは任意の他の従来の非反応性物質（これは、蛍光検出方法のために、有意なノイズまたはバックグラウンドを生じない）であり得る。この生物接着層は、金、ニッケルまたは銅のようなイオン吸着物質（ＭｏｎｔｅｍａｇｎｏおよびＢａｃｈａｎｄ（１９９９）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｎａｎｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｐｏｗｅｒｅｄ  ｂｙ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｔｏｒｓ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２２５−２３１）），タンパク質吸収性プラスチック（例えば、ポリスチレン（米国特許第５，８５８，８０１号）、または共有結合反応物（例えば、チオール基）であり得る。生物接着性層のパターン化アレイを作製するために、支持体上をコートされる電子感応性ポリマー（例えば、ポリメチルメタクリル酸（ＰＭＭＡ））は、電子線を用いて任意の所望のパターンで、エッチングされ得、続いて、増感ポリマーを除去するために現像される。次いで、ポリマー中の孔は、金属（例えば、ニッケル）でコートされ、そしてこのポリマーは、溶媒で除去され、基板上に金属ポストのパターンを残す。この電子線リソグラフィー法は、非常に高度な空間的分解、およびパターン化アレイにおける各々の点でちょうど１分子を固定化するのに必要とされる小さい造形サイズを提供する。高分解性のパターン化アレイを作製するための第二の手段は、原子間力顕微鏡である。第三の手段は、Ｘ線リソグラフィーである。
【００２５】
生物製剤は、金属製生物吸着パターンに結合する生物製剤上にポリヒスチジンタグを供給することにより、生物接着性パターンに付着され得る。付着のための他の慣用的な手段は、相同二官能性架橋剤および相異二官能性架橋試薬を使用する。相同二官能性試薬は、２つの同一の官能基を有する一方、異種二官能基試薬は、生物製剤を生物接着性物に連結するための２つの類似しない官能基を含む。膨大な量の異種二官能性架橋剤は、一級アミン反応性基およびチオール反応性基を含む。共有結合性架橋剤は、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）、グリコール（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−）、アゾ（−Ｎ＝Ｎ−）、スルホン（Ｓ＝（Ｏ2−）、エステル（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、またはアミド（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−）架橋を形成し得る試薬から選択される。
【００２６】
生物耐性層は、生物接着性層への生物製剤の結合の前または後のいずれかに、生物吸着性層上に置かれるか、または載せられ得る。この生物耐性層は、生物製剤に結合しない任意の物質である。例としては、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、リゾチーム、オクトキシノール、ブロックコポリマーを含むポリソルベート２０（ポリエテネソルビタンモノラウリン酸）およびポリエチレンオキシド、ならびに界面活性剤が挙げられる（米国特許第５，８５８，８０１号）。この層の堆積は、スプレー、浸漬および蒸着（金属）を含む従来の手段により行われる。
【００２７】
（４．ＮＴＰの標識化）
（Ａ．γホスフェート蛍光団の結合）
本発明の方法は、ポリメラーゼが単一核酸分子中へｄＮＴＰ分子を取り込む場合に、個々の蛍光発生的なｄＮＴＰ分子を検出および同定することに関する。特定の局面では、蛍光色素は、γホスフェートに結合され、そして消光剤は、核酸塩基に結合される。このように、本発明は、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）プローブを提供し、以下を含む：ＮＴＰに結合される蛍光団部分を有するγホスフェートを有するＮＴＰ；蛍光団部分の蛍光を妨げるために、蛍光団部分に十分に近位の消光部分；ここで、γホスフェートがＮＴＰに結合され、そしてこのγホスフェートがＮＴＰから解離される場合に消光される場合、蛍光団部分は、少なくとも約５倍の消光効果、好ましくは少なくとも１０倍の消光効果で消光される。
【００２８】
好ましい局面において、ＮＴＰプローブは、γ−ホスフェート部分に付着した蛍光色素および核酸塩基に付着した消光剤を有するｄＮＴＰプローブである。適切な核酸塩基は、以下を含むが、これらに限定されない：アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニンおよびデアザグアノシン。消光されたｄＮＴＰは、γ−ホスフェートがＮＴＰに付着される場合、非蛍光であり、その後、γ−ホスフェートがＮＴＰに付着されない場合、蛍光になる。
【００２９】
（Ｂ．蛍光消光）
一分子検出において、高い消光効果は、蛍光バックグラウンドを減少するとして有利であり、従って、より高いヌクレオチド濃度の使用が可能である。いくつかの消光機構が存在する（例えば、Ｇ．Ｇ．Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７３を参照のこと）。特定の場合において、消光は、蛍光団と消光剤との間に重複するスペクトルに依存し、そして長い範囲（蛍光共鳴エネルギー移動、ＦＲＥＴ）で機能する。他の場合において、蛍光団および消光剤は、分子軌道間で相互作用し、蛍光団と消光剤との間の接触（例えば、電子移動機構）を必要とする。さらに他の場合において、基底状態（ｇｒｏｕｎｄ−ｓｔａｔｅ）複合体消光機能が生じ得る。すべてのこのような消光機構は、本発明の範囲内である。
【００３０】
特定の局面において、蛍光団部分は、直接的かまたはリンカーを介するγ−ホスフェートへの付着のために誘導体化された蛍光有機色素である。好ましくは、消光剤部分はまた、有機色素であり、これは、蛍光であってもなくてもよく、本発明の特定の実施形態に依存する。例えば、本発明の１つの実施形態において、蛍光団および消光剤はともに蛍光である。１つの実施形態において、蛍光エネルギー移動機構が使用され得、ここで、第一の蛍光団（例えば、フルオレセイン）が励起され、発光が第二の蛍光団（例えば、ローダミン）に読み取られる。これらの系において、脱消光は、γ−ホスフェートに付着された蛍光団の加水分解によって達成される。
【００３１】
別の実施形態において、蛍光団および消光剤は、電子移動機構によって機能する。この局面において、非蛍光消光剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬまたはジニトロフェニル（図１を参照のこと））は、励起された蛍光団からのエネルギーを吸収するが、発光のエネルギーを放出しない。これらの消光剤は、発色体分子として言及され得る。
【００３２】
蛍光分子および発色体分子およびこれらの関連光学的特性の完全な表を提供するための文献中に、入手可能な多くの実際的ガイダンスが存在する（例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｃｏｌｏｕｒ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ編、Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、１９９２）Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９４９）などを参照のこと）。さらに、以下の参考文献によって例証されるようにヌクレオチドに付加され得る一般の反応基を介する、共有結合性の付着のための誘導体化蛍光団および消光剤分子に関する文献中に、広範なガイダンスが存在する：Ｈａｕｇｌａｎｄら（前出）、Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４，３５１，７６０号。
【００３３】
蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）の原理に基づいて操作する適切なドナーおよびアクセプターは、以下を含むが、これらに限定されない：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナートスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アミノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ；クマリンおよび誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミニジド−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン６酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル塩化物（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリトロシンおよび誘導体：エリトロシンＢ、エリトロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’、７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルソクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、酪酸ピレン、スクシンミニジル  １−ピレン；ブチレート定量ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）；Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（ＣｉｂａｃｒｏｎTM  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リスアミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンＢスルホニルクロライドローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロライド誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロソリック酸（ｒｏｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアン；およびナフタロシアン。
【００３４】
好ましい蛍光団−消光剤対は、フルオレセインを含むキサンテン色素、およびローダミン色素を含むが、これらに限定されない。これらの化合物の多くの適切な形態は、これらのフェニル部分に置換基を有して広範に市販されており、フェニル部分は、結合部位としてまたはγ−ホスフェートもしくは核酸塩基との付着のための結合官能基として使用され得る。蛍光化合物の別の基は、ナフチルアミンであり、これは、α位またはβ位にアミノ基を有する。以下は、このようなナフチルアミン化合物の中に含まれる：１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネート。他の色素は以下を含む：３−フェニル−７−イソシアネートクマリン、アクリジン（例えば、９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなど。
【００３５】
好ましくは、蛍光団／消光剤対は、フルオレセイン色素およびローダミン色素より選択される。これらの色素およびヌクレオチドへの付着のための適切な結合方法論は、多くの参考文献に記載される。（Ｋｈａｎｎａら（上記）；Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．、７：２９９−３０３（１９９５）；Ｍｅｎｃｈｅｎら、米国特許第５，１８８，９３４号；Ｍｅｎｃｈｅｎら、欧州特許出願第８７３１０２５６．０；およびＢｅｒｇｏｔらに対して発光された米国特許第５，３６６，８６０号を参照のこと）。
【００３６】
好ましい実施形態において、消光剤４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）が使用される。消光剤ＤＡＢＣＹＬ（図１を参照のこと）は、一般に蛍光発生的なプローブを使用して、ＤＮＡハイブリダイゼーション（分子ビーコン）またはプロテアーゼ活性を検出する。ＤＡＢＣＹＬは、４７５ｎｍと８０５ｎｍとの間で励起し、９０〜９９．９％の範囲の測定有効性を有する広範な種々の色素由来のフルオレセインを消光する（Ｓ．Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６、４９（１９９８）；およびＧ．Ｔ．Ｗａｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１、６４９３（１９９０）を参照のこと）。任意の特定の理論によって束縛されていないが、ＤＡＢＣＹＬの消光機構は、好ましくは、蛍光共鳴エネルギー移動よりも電子移動に関与すると考えられる。なぜなら、波長非依存的であるからである。等しく好ましい実施形態において、消光剤ジニトロフェニル（ＤＮＰ）またはトリニトロフェニル（ＴＮＰ）が使用される。
【００３７】
任意の特定の実験において測定される消光有効性は、以下に依存する：（夾雑遊離色素または切断された分子が蛍光を発する）色素−消光剤対の純度；色素と消光剤との間の電子結合および物理的距離（より近接するのが、通常よりよい）；および色素の励起状態持続時間（ｌｉｆｅｔｉｍｅ）（時間が長くなるにつれて、電子移動のための機会が大きくなる）。
【００３８】
特定の実施形態において、特定の可視色素およびほぼＩＲ色素は、十分な蛍光であり、そして単一分子として検出するのに写真安定性（ｐｈｏｔｏｓｔａｂｌｅ）であることが公知である。この局面において、可視色素であるＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ（５２５/５４５）、およびより大きい色素であるＬＩ−ＣＯＲの近赤外線の色素、ＩＲＤ−３８（７８０／８１０）は、単一分子感度を用いて検出され得、そして本発明を実行するために使用される。
【００３９】
以下の参考文献によって例示されるような、蛍光団または消光剤部分がヌクレオチドに付着するための多くの連結部分、および方法論が、存在する：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：５３０５−５３２１（１９８７）（オリゴヌクレオチド上の３’チオール基）；Ｓｈａｒｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９：３０１９（１９９１）（３’スルフヒドリル基）；Ｇｉｕｓｔｉら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２：２２３−２２７（１９９３）およびＦｕｎｇら、米国特許第４，７５７，１４１号（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能なＡｍｉｎｏｌｉｎｋTMＩＩを介する５’ホスホアミノ基）Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４，７３９，０４４号（３’アミノアルキルホスホリル基）；Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３１：１５４３−１５４６（１９９０）（ホスホラミデート結合を介する付着）；Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：４８３７（１９８７）（５’メルカプト基）；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：７１８７−７１９４（１９８９）（３’アミノ基）など。
【００４０】
図２を参照して、本発明の種々のｄＮＴＰの構造のいくつかの塩基への好ましいリンカーを示す。さらに、ＤＡＢＣＹＬは、本方法によって要求される範囲における消光有効性を有する波長非依存的なフルオレセイン消光剤である。よりよい消光は、より高いｄＮＴＰ濃度およびより速い代謝回転を可能にする。特定の局面において、消光剤は、色素を付加するために代表的に使用される同一の核酸塩基部位に連結される（図１を参照のこと）。ポリメラーゼがＤＮＡに沿って前進する場合、消光剤は、すべての組み込まれた塩基において残存する。特定の局面において、消光剤は、図１に示されるＣ５リンカーを用いてｄＮＴＰと共有結合的に付着される。特定の実施形態において、消光剤部分は、リンカーを介して蛍光団部分に付着される。特定の他の実施形態において、消光剤は、ｄＮＴＰの糖に付着され得る。
【００４１】
一般には、ヌクレオシド標識は、公知の結合、結合基、および関連相補官能基を用いる、任意の多くの公知のヌクレオチド標識技術を用いて達成され得る。消光剤部分およびヌクレオシドに結合する結合は、関連するポリメラーゼと互換性があるべきであり、蛍光団部分のフルオレセインを消光すべきではない。
【００４２】
好ましくは、消光剤は、ピリミジン塩基の５炭素および７−デアザプリン塩基の７炭素に共有結合される。本発明に用い得る、いくつかの適切な塩基標識手順は報告されている（例えば、Ｇｉｂｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：６４５５−６４６７（１９８７）；Ｇｅｂｅｙｅｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：４５１３−４５３５（１９８７）；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：４８５６−４８７６（１９８７）；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、５（３）２３３−２４１（１９８６）；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍら、ＪＡＣＳ、１１１、３７４−３７５（１９８９）；米国特許第４，８５５，２２５号、同５，２３１，１９１号および同５，４４９，７６７号、これらのそれぞれが本明細書中に参考として援用される）。好ましくは、結合は、アセチレンアミド（ａｃｅｔｙｌｅｎｉｃ  ａｍｉｄｏ）結合またはアルケンアミド（ａｌｋｅｎｉｃ  ａｍｉｄｏ）結合であって、消光剤とヌクレオチド塩基との間の結合は、色素の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルが、ヌクレオチドのアルキニルアミノ誘導体化塩基またはアルケニルアミノ誘導体化塩基と反応することによって形成される。より好ましくは、生じる結合は、図２に示される。
【００４３】
アルキニルアミノ誘導体化ヌクレオシドの合成は、Ｈｏｂｂｓらによる欧州特許出願第８７３０５８４４．０、およびＨｏｂｂｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：３４２０（１９８９）によって教示され、これは、本明細書中に参考として援用される。これらに教示されるように、アルキニルアミノ誘導体化ヌクレオチドは、適切なハロデオキシヌクレオシドを置換することによって形成される（通常、フラスコ中の５−ヨードピリミジンおよび７−ヨード−デアザプリンデオキシヌクレオシドおよびＣｕ（Ｉ）は、アルゴンをフラッシュして空気を除き、乾燥ＤＭＦを加えた後、アルキニルアミン、トリエチルアミンおよびＰｄ（０）を添加する）。反応混合物は、数時間または薄層クロマトグラフィーがハロデオキシヌクレオシドの消費を示すまで攪拌され得る。
【００４４】
Ｈｏｂｂｓらに対して１９９１年９月１９日に発行された米国特許第５，０４７，５１９号に教示されるように、アルキニルアミノリンカーは以下の構造：
【００４５】
【化１】
2010142250.tif 000002
を有し、ここでＲ1は置換されたか置換されていない１〜２０原子のジラジカル部分であり、Ｎｕｃは、プリン塩基またはピリミジン塩基であり、直鎖Ｒ1はアルキレンＣ1−Ｃ20であり、必要に応じて、鎖内に二重結合、三重結合、アリール基またはＮ、ＯまたはＳのようなヘテロ原子を含む。ヘテロ原子は、エーテル、チオエーテル、エステル、アミンまたはアミドのような官能基の一部であり得る。好ましくは、Ｒ1は直鎖アルキレンＣ1−Ｃ20であり；最も好ましくはＲ1はＣＨ2である。Ｒ1上の置換基は、Ｃ1−Ｃ6アルキル基、アリール基、エステル基、エーテル基、アミン基、アミド基またはクロロ基を含み得る。Ｒ2およびＲ3は、独立してＨ、アルキル、Ｃ1−Ｃ4、または保護基（例えば、アシル、アルコキシカルボニル、蛍光団、消光剤またはスルホニル）である。好ましくは、Ｒ2はＨであり、Ｒ3は消光剤である。アルキニルアミノリンカーは、好ましくは、ピリミジンヌクレオチドの５位およびプリンヌクレオチドの７位に付着される。
【００４６】
好ましい実施形態において、消光剤−スルホＮＨＳ誘導体（例えば、ＤＡＢＣＹＬ−スルホＮＨＳ）は、ＤＡＢＣＹＬを用いて、そして窒素大気下で、ＤＡＢＣＹＬをＮ−ヒドロキシスルホスクシニミドおよびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させることによって調製される（図１を参照のこと）。ＤＡＢＣＹＬ−スルホＮＨＳ誘導体は、アミノアリル−ｄＮＴＰ（例えば、アミノアリルーｄＮＴＰ）と反応されてＤＡＢＣＹＬ−ｄＮＴＰを産生する。ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰおよびシスタミンジヒドロクロリドを用いて、ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ−チオール誘導体が生成され得る。従って、蛍光団が付着したγ−ホスフェートを有するＮＴＰは、例えば、ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ−チオールをＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−ヨードアセトアミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｄ−６０１１から市販される）と反応させることによって産生されてＤＡＢＣＹＬ−ｄＮＴＰ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲを生成し得る。
【００４７】
（Ｃ．消光効果）
本発明は、そこに付着された蛍光団部分をγ−ホスフェートを有するＮＴＰ分子を提供する。蛍光団部分は、γ−ホスフェートがＮＴＰに付着される場合、少なくとも約５倍の消光効果を有する消光を示し、γ−ホスフェートがＮＴＰから解離する場合は消光しない、すなわち、蛍光である。好ましくは、蛍光団部分は、少なくとも約３倍の消光効果〜約１００倍の消光効果を有する消光を示す。より好ましい実施形態において、蛍光団部分は、少なくとも約１００倍の消光効果〜約１０００倍の消光効果を有する消光を示す。
【００４８】
本発明のＮＴＰの消光効果は、容易に決定される慣用的なパラメータである。当業者に明らかなように、消光効果は、必要に応じてレーザー励起光を有する蛍光光度計で測定され得る。Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ式の初期の議論に類似して、消光効果は、以下
【００４９】
【化２】
2010142250.tif 000003
に等しく、ここで、Ｆ0は消光しないＮＴＰの蛍光であり、Ｆは消光した蛍光である。消光したＮＴＰのサンプル中のすべての蛍光を排除する確実な方法がないので、非消光測定値Ｆ0は、色素単独を含む別のサンプル中で行われ得、そして消光測定値Ｆは、消光ｄＮＴＰと同一濃度で作製され得る。
【００５０】
本発明の化合物は、少なくとも３倍の消光効果を有する。完全な蛍光色素は、１のＦ0値を有する一方、９０％まで消光された色素は、０．１００のＦ値を有する。９０％まで消光された化合物は、０．９の消光効果を有するか、または１０倍消光される。従って、本発明の化合物について、Ｆは、以下のように特徴付けられる：０．６７０≦Ｆ≦０．９９９、すなわち、この化合物は、約３倍〜約１０００倍の間の消光効果を有する。好ましくは、本発明の化合物の消光効果は、少なくとも約５倍〜約１０００倍であり、そしてより好ましくは、消光効果は、少なくとも約１０倍〜１０００倍である。
【００５１】
本発明において、ピロリン酸の検出は、脱消光による蛍光シグナルの生成またはピロリン酸に応答して消光した蛍光色素を刺激することに依存する。効率的な消光は、より低いバックグラウンドを提示し、ピロリン酸による脱消光におけるシグナル対ノイズの比を増加する。不完全な消光は、各々の色素分子から低いレベルの蛍光バックグラウンドを生じる。さらなるバックグラウンド蛍光は、例えば、色素を消光部分に結合する結合の破損による偶然の（すなわち、ピロリン酸非依存的な）脱消光のために、十分な蛍光である色素分子のいくつかによって寄与される。従って、バックグラウンド蛍光は、２つの成分を有する：すべての色素分子からの低レベルの蛍光（本明細書中で「分散蛍光バックグラウンド」という）およびいくつかの分子からの完全な強度の蛍光（本明細書中で「局在蛍光バックグラウンド」という）。
【００５２】
多重標識スキームが利用される場合において、種々の候補標識の最大吸収の平均に近似する波長が、使用され得る。あるいは、多重励起が実施され得、各々の励起は、特定の標識の最大吸収に対応する波長を使用する。表Ｉは、種々の型の蛍光団およびこれらの対応する最大吸収の例を列挙する。
【００５３】
【表Ｉ】
2010142250.tif 000004
（５.種々の反応試薬）
本発明での使用のために選択されるポリメラーゼは、重要ではない。好ましいポリメラーゼは、核酸塩基上およびγ−ホスフェート上の両方の標識に寛容であり得る。ポリメラーゼは、少なくとも９９％の保障（組み込み精度）および少なくとも２０ヌクレオチドの進化性（酵素がＤＮＡから解離する前に組み込まれたヌクレオチドの数）を有するべきであり、より大きな進化性を有することが好ましい。例示は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼを含む。これらのポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ欠損バージョンが好ましい。
【００５４】
プライマー（ＤＮＡポリメラーゼ）またはプロモーター（ＲＮＡポリメラーゼ）は、従来の核酸合成技術を用いて合成的に作製される。プローブの相補鎖は、標準化学、例えば、ホスホラミダイト化学（例えば、以下の参考文献に開示される）を用いて、自動化ＤＮＡ合成器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ）のモデル３９２または３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で簡便に合成される：ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４８：２２２３−２３１１（１９９２）；Ｍｏｌｋｏら、米国特許第４，９８０，４６０号；Ｋｏｓｔｅｒら、米国特許第４，７２５，６７７号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４１５，７３２号；同４，４５８，０６６号；および同４，９７３，６７９号など。代替の化学（例えば、非天然骨格基（例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミデートなど）を生じる）はまた、生じるオリゴヌクレオチドがポリメラーゼと互換性があるという条件で利用され得る。これらは、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のようなオリゴヌクレオチド注文を専門にする種々の企業から商業的に購入し得る。
【００５５】
ポリメラーゼと組み合わせるプライマーは、標的ＤＮＡを配列決定するのに使用され得る。プライマー長は、相補的鋳型ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを提供するために選択される。プライマーは、一般に少なくとも１０ｂｐ長であり、通常は、少なくとも１０ｂｐ長と３０ｂｐ長との間である。プライマー長は、対象の標的ＤＮＡ上の公知の内部部位にハイブリダイズされるように設計される。あるいは、プライマーは、リガーゼによって標的ＤＮＡの末端に連結された合成オリゴヌクレオチドアダプターに結合し得る。プロモーターが用いられる場合に類似して、プライマーは、標的ＤＮＡの内部であり得るか、またはアダプターとして末端に連結され得る。
【００５６】
（６.反応条件）
配列決定のための反応混合物は、水溶性緩衝媒体を含み、これは、特定のポリメラーゼに最適化される。一般には、緩衝液は、一価イオンの原料、二価カチオンの原料および緩衝化剤を含む。一価イオンの任意の簡便な原料（例えば、Ｋｃｌ、Ｋ−酢酸、ＮＨ4−酢酸、Ｋ−グルタミン酸、ＮＨ4Ｃｌ、硫酸アンモニウムなど）が利用され得、ここで、緩衝液中に存在する一価イオンの原料の量は、代表的には、約５００〜２０，０００、通常は、約１０００〜１０，０００、そしてより通常には、約３，０００〜６，０００ｍｉｃｒｏｍｈｏｓの範囲の伝導度を提供するのに十分な量存在する。
【００５７】
二価カチオンは、マグネシウム、マンガン酵素（ｍａｎａｇａｎｅｓｅ）、亜鉛などであり得、カチオンは代表的にはマグネシウムである。ＭｇＣｌ2、Ｍｇ酢酸などを含むマグネシウムカチオンの任意の簡便な原料が使用され得る。緩衝液中に存在するＭｇイオンの量は、０．５〜２０ｍＭの範囲であり得るが、好ましくは、約１〜１２ｍＭの範囲で、さらに好ましくは、２〜１０ｍＭであり、そして理想的には約５ｍＭである。
【００５８】
緩衝液中に存在し得る代表的な緩衝化剤または塩としては、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳなどが挙げられ、ここでこの緩衝化剤の量は、代表的には、約５〜１５０ｍＭの範囲、通常、約１０〜１００ｍＭの範囲、およびより通常には、約２０〜５０ｍＭの範囲であり、ここで特定の好ましい実施形態において、この緩衝化剤は、約６．０〜９．５の範囲のｐＨ（ここで、最も好ましいのは、２５℃にて、ｐＨ７．６である）を提供するに十分な量で存在する。緩衝媒体中に存在し得る他の薬剤としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのようなキレート剤が挙げられる。
【００５９】
（７．サンプル収納）
固体支持体は、必要に応じて、固定化された部分を通って流れる反応物の再生を可能にする入口および出口を有するフローチャンバに収納される。このフローチャンバは、プラスチックまたはガラスから作製され得、そして顕微鏡または光学リーダーによって表示される平面において開放性または透明のいずれかであるべきである。電気浸透圧的フローは、固体支持体上に固定された電荷、およびこの固体支持体の反対側の末端に配置される２つの電極の間を通過する電圧傾度（電流）を必要とする。フローチャンバは、別々の順序のために複数のチャネルに分割され得る。マイクロフローチャンバの例が既存する。例えば、Ｆｕら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１７：１１０９）は、ソーティングのために電気浸透圧的フローを利用する３μｍ×４μｍのチャネルを備える微小組み立て（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）蛍光細胞分析分離装置を記載する。
【００６０】
（８．蛍光団の検出）
本発明は、溶液中の１分子の画像化を必要とする。この目的を達成する種々の公知の方法が存在する。この技術を記載する一般的な概説が入手可能である。概説としては、Ｂａｃｈｅら編、１９９６、Ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｉｍａｇｉｎｇ，ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＭ，およびＰｌａｋｈｏｔｎｉｋら、Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．４８：１８１−２１２が挙げられる。一般的に、これらの方法は、カメラを備えた顕微鏡を使用するレーザー活性化蛍光の検出を含む。これは、時には、高性能光子検出システム（ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｐｈｏｔｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）と称される。Ｎｉｅら、１９９４、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１０１８−１０１９。１分子の検出は、１つの分子のみが存在すると考えられる統計学的理由を有する視野（均質アッセイ）、または１つの実際の付着点のみが存在する視野（異質アッセイ）にその検出を限定することを含む。本発明の１分子蛍光検出は、光学セットアップを使用して実施され得、このセットアップとしては、近距離場（ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ）走査顕微鏡、遠距離場（ｆａｒ−ｆｉｅｌｄ）共焦点顕微鏡、広視野落射照明（ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ  ｅｐｉ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）、および全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡が挙げられる。二次元画像化蛍光検出のために、顕微鏡は、代表的には、全内部反射顕微鏡である。Ｖａｌｅら、１９９６、Ｄｉｒｅｃｔ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｋｉｎｅｓｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｍｏｖｉｎｇ  ａｌｏｎｇ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４５１、ＸｕおよびＹｅｕｎｇ  １９９７、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｒｅｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１１０６−１１０９。
【００６１】
適切な光子検出器としては、フォトダイオードおよび増感化ＣＣＤカメラが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態において、増感化電荷結合素子（ＩＣＣＤ）カメラが使用される。ガラススライドの表面近くの流体中の個々の蛍光色素分子を画像化するためのＩＣＣＤカメラの使用は、いくつかの理由により有利である。ＩＣＣＤ光学セットアップを用いることにより、蛍光団の一続きの画像（映像）を獲得することが可能である。特定の局面において、本発明のＮＴＰの各々は、それ自体と結合する独特の蛍光団を有し、４つのカメラおよび４つの励起レーザーを有する４色装置が使用され得る。従って、この光学セットアップを使用してＤＮＡを配列決定することが可能である。さらに、顕微鏡スライド上に広がる多くの異なるＤＮＡ分子は、同時に、画像化および配列決定され得る。さらに、画像分析アルゴリズムの使用によって、１つの色素の経路を追跡し、そしてこれらを、固定されたバックグラウンド蛍光、および本来の上流から視野に動く「偶発的に脱消光される（ａｃｃｉｄｅｎｔａｌｌｙ  ｄｅｑｕｅｎｃｈｅｄ）」色素と区別することが可能である。
【００６２】
特定の局面において、１分子のＩＣＣＤ検出に好ましい幾何学は、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡である。ＴＩＲＦにおいて、レーザービームは、ガラス−水界面で全反射する。光学視野は、この反射界面で急激に終わらないが、その強度は、距離とともに指数関数的に低下する。この界面での薄い「消えていく（ｅｖａｎｓｃｅｎｔ）」光学視野は、低いバックグラウンドを提供し、そして、可視波長で１２：１のシグナル対ノイズ比を有する１分子の検出を可能にする（Ｍ．Ｔｏｋｕｎａｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２３５，４７（１９９７）およびＰ．Ａｍｂｒｏｓｅ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３６、２４４（１９９９）を参照のこと）。
【００６３】
ガラスを越える視野の透過は、波長およびレーザービームの入射角に依存する。より深い透過は、より長い波長によりおよび臨界角の制限内の通常の表面に対するより小さな角度により得られる。代表的なアッセイにおいて、蛍光団は、表面から約２００μｍ以内で検出され、これは、ＤＮＡの約６００塩基対の輪郭長に対応する。好ましくは、ＸｕおよびＹｅｕｎｇによって記載されるような１分子画像化のためにプリズム型ＴＩＲＦ幾何学が使用される（Ｘ−Ｈ．Ｎ．Ｘｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１，１６５０（１９９８）を参照のこと）。
【００６４】
１分子検出は、フローサイトメトリーを使用して達成され得、ここでフローサンプルは、小容量を規定するために使用される空間的なフィルターで集中されたレーザーを通じて通過される。米国特許第４，９７９，８２４号は、この目的のためのデバイスを記載する。米国特許第４，７９３，７０５号は、フローセルにおいて粒子のフロートレイン中の個々の分子を同定するための検出システムを詳細に記載し、そして特許請求する。’７０５特許はさらに、異なる蛍光核酸塩基特異的標識を検出するために、複数のレーザー、フィルターおよび検出器を配置する方法を記載する。米国特許第４，９６２，０３７号はまた、本明細書中に記載されるように、ポリメラーゼを使用して合成するよりもむしろ、ヌクレアーゼを使用して塩基を切断して、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列を得るために、標識されたヌクレオチドの順序づけられたトレインを検出するための方法を記載する。固体支持体上での１分子検出は、Ｉｓｈｉｋａｗａら（１９９４）Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｈｏｔｏｎ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｊａｎ．Ｊ．Ａｐｐｌｅ．Ｐｈｙｓ．３３：１５７１−１５７６に記載される。Ｉｓｈｉｋａｗａは、蛍光顕微鏡に接続された光子計数カメラシステムを含む代表的な装置を記載する。Ｌｅｅら（１９９４）Ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６６：４１４２−４１２９は、水晶キャピラリーチューブ中の１分子を検出するための装置を記載する。レーザーの選択は、標識および必要な光の質に依存する。ダイオード、ヘリウムネオン、アルゴンイオン、アルゴン−クリプトン混合イオン、およびＮｄ：ＹＡＧレーザーが、本発明に有用である。
【００６５】
本発明は、ＰＰｉが放出されるような核酸の合成を検出するために設計された構成要素のシステムとして考えられ得る。図４は、このシステムの概略図を提供し、これは、実施例２に詳細に記載される。図５は、固体支持体（１５）の表面に、γ標識されたｄＴＮＰ（１７）の取り込みによって伸長される標的ＤＮＡ（１３）とともに固定されるポリメラーゼ（１４）の代表的な配置を例示する。より詳細には、この標的ＤＮＡは、プライマーにハイブリダイズされ、このプライマーは、束縛されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって生成される伸長産物となる。
【００６６】
図６は、固体支持体（１５）に固定された二本鎖ＤＮＡ依存性ＲＡＮポリメラーゼ（１９）を使用する、二本鎖ＤＮＡ分子（１８）の連続的な配列の読み取りを例示し、ここで伸長産物は、標識されたｒＮＴＰ（２１）から新たなＲＮＡ（２０）として転写される。より詳細には、二本鎖ＤＮＡテンプレートは、ポリメラーゼプロモーター配列の配列認識によって、ＲＮＡポリメラーゼに結合する。この配列は、新生ＲＮＡを生じる酵素によってＤＮＡトラベルとして読み取られる。ＲＮＡおよびＤＮＡが放出される後、この酵素は、通過する次のＤＮＡ分子の配列を読み取るように準備される。
【００６７】
これらのスキームは、活性部位が表面で消失する明視野に残り、その結果、消光したｄＮＴＰから放出されるどの色素も照射されることを保証する。標的核酸分子（テンプレート）よりもむしろポリメラーゼを束縛することが簡便である。なぜなら、これは、１つの固定された酵素が多くの異なるＤＮＡ分子の配列を読み取る連続配列読み取りプロセスを提供するからである。
【００６８】
本明細書において引用される全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許明細書の各々が、参考として援用されることを具体的かつ個々に示されるのと同様に、本明細書中で参考として援用される。
【００６９】
前述の本発明を、理解の明確化の目的のために例示および例によっていくらか詳細に記載してきたが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の思想または範囲を逸脱せずに、本発明に対してなされ得ることは、本発明の教示を顧て当業者に容易に明らかである。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、例示のためにのみ提供され、そして限定のためではない。当業者は本質的に類似の結果を得るために変化され得るかまたは改変され得る種々の非必須パラメーターを容易に認識する。
【００７１】
（実施例１．ポリメラーゼアレイ）
本実施例は、ニッケルナノドットのアレイを組み立て（ｆａｂｒｉｃａｔｅ）そして各ドットにポリメラーゼを付着させる方法を示す。必要な装置は、スピナー（ＰＷＭ２０２  Ｅビームレジストスピナー、Ｈｅａｄｗａｙ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｉｎｃ．）、エバポレーター（ＳＣ４５００温熱性電子銃（ｔｈｅｒｍａｌ  ｅ−ｇｕｎ）エバポレーター、ＣＶＣ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．）および走査型電子顕微鏡（Ｎａｂｉｔｙパターンジェネレーターを備えるＬｅｏ９８２、Ｌｅｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｉｎｃ．）を含む。
【００７２】
スピナー上の２５ｍｍの直径の顕微鏡用カバーガラスを、アセトンおよびイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を交互にスプレーし、そして最後のＩＰＡフィルムを、乾燥するまでスピンすることによって、清浄する。スピナー中のカバーガラスを、０．５ｍｌのＰＭＭＡ（ポリ（ポリメチルメチルアクリレート）、ＭＷ４９６ｋＤａ、クロロベンゼン中）でコーティングし、過熱板（ｈｏｐｌａｔｅ）上で１７０℃にて１０分間焼成し、０．５ｍｍのＰＭＭＡ（ＭＷ９５０ｋＤａ、メチルイソブチルケトン［ＭＩＢＫ］中２％）でコーティングし、そして再度焼成する。導電層を、１００Åの金をエバポレートすることによって、ＣＶＣ  ＳＣ４５００中のＰＭＭＡフィルムに適用する。電子顕微鏡を使用して、ＣＡＤ図（Ｄｅｓｉｇｎ  ＣＡＤ，５０ｎｍスポット、１０μのセンター間空間（ｃｅｎｔｅｒ−ｔｏ−ｃｅｎｔｅｒ）、２００×２００ドットアレイ）によって具体化されるように、Ｌｅｏ９８２上のパターンジェネレーターを使用して、ＰＭＭＡフィルムにアレイパターンをエッチングする。
【００７３】
金層を、曝露したカバーガラスをＧｏｌｄ  Ｅｔｃｈ（１５〜１７％ヨウ化ナトリウム）に７秒間置き、続いてＩＰＡおよび水でリンスすることによって、取り除く。タンタル（５０Å）およびニッケル（１００Å）をＣＶＣ  ＳＣ４５００中のカバーガラス上に蒸着させる。アセトンおよび塩化メチレンの１：１混合物中のＰＭＭＡを１０〜１５分間除去し、続いて数秒間超音波処理し、そしてＩＰＡおよび水でリンスする。
【００７４】
使用の直前に、ポリヒスチジンタグ化Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼｅｘｏ-の１０ｍｌの１５ｎＭ溶液（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．，Ｌａｎｅ  Ｄ．１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−１４−２）中で、ＴＯＰＯクローニングベクターおよびＰｒｏＢｏｎｄ  Ｒｅｓｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，を使用して調製した）を、カバーガラスに付着させ、２０分後に、ＰＢＳでカバーガラスを洗浄し、そして直ぐに使用する。
【００７５】
（実施例２．二色性１分子画像化顕微鏡）
図４に記載される顕微鏡を使用して、実施例１において得られたカバーガラスの表面上の１分子事象を検出する。顕微鏡を、整調可能な波長で光を発するマルチカラー混合ガスレーザー（１）に適合させる。このレーザービームを、最初に、レーザーラインフィルター（１０）に通過させて、所望でない波長を透過させる。焦点を合わせていない出力を、カバーガラス（３）の下に直接配置した融合シリカ直角プリズム（２）に通す。サンプル（４）分子を、カバーガラス上の緩衝溶液におく。
【００７６】
プリズムに進入するレーザー光を、融合シリカと緩衝溶液との間の臨界角度を超えるような角度で屈折させる。従ってその光は、プリズム内に完全に反射され、緩衝液中に全反射（ＴＩＲ）消失領域（９）を生じる。目的の領域を、緩衝液中に直接浸された対物レンズ（５）を有する顕微鏡（６）を使用して画像化する。顕微鏡出力における蛍光放射は、多重波長ビュアー（７）を通過し、これは異なる波長で空間的に画像を分離する。これは、異なる波長で生じる事象の区別を可能にする。
【００７７】
その画像が、増感化ＣＣＤ（ＩＣＣＤ）カメラ（８）のアレイ上に投射され、そこからデジタル化され、そして記憶装置（１１）に保存される。画像分析アルゴリズム（１２）を、記憶装置に保存された画像に対して実行する。これらのアルゴリズムは、バックグランド由来のシグナルを区別し、分子を追跡し、そして他のシグナル処理機能を実行し得る。記憶およびシグナル処理は、コンピューターまたはマイクロプロセッサーにより制御される特殊化デジタルシグナル処理（ＤＳＰ）チップにおいてオフラインで実行され得る。
【００７８】
（実施例３．二重標識ヌクレオチドの合成
（実施例３Ａ．ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲの合成（図３））。
【００７９】
（ａ．ＤＡＢＣＹＬ−スルホＮＨＳの調製）
ＤＡＢＣＹＬ（１０８ｍｇ、０．４ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ  ２５，０１９−８メチルレッド）を、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ；Ａｌｄｒｉｃｈ２２，７０５−６）および乾燥ピリジン（９６ｍｇ、１．２ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ２７，０９７−０）の混合物中に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（２６０ｍｇ、１．２ミリモル；Ｐｉｅｒｃｅ  ２４５１０）およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２５０ｍｇ、１．２ミリモル；Ｐｉｅｒｃｅ  ２０３２０）を添加し、そしてその混合物を５０℃で２時間、窒素大気下で攪拌した。反応を、ＴＬＣ（ＭＫＣ１８Ｆ逆相；Ｗｈａｔｍａｎ  ４８０３−１１０；０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７、８０％アセトニトリル中で展開した）によってモニターした。エーテルで希釈した後、上清をデカントし、生成物をフィルター上でエーテルを用いて洗浄し、乾燥し、そして−２０℃で乾燥保存した。
【００８０】
（ｂ．ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰの合成）
アミノアリル−ｄＵＴＰ（１０ｍｇ、２０μモル；Ｓｉｇｍａ  Ａ０４１０）を、３ｍＬの０．１Ｍ炭酸ナトリウムｐＨ８．３中ＤＡＢＣＹＬ−スルホＮＨＳ（３０ｍｇ、３０μモル；工程Ａ由来）と混合した。その混合物を、暗室において４時間、室温でインキュベートし、そしてこの反応をＴＬＣによってモニターした（工程Ａと同様）。そのＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ生成物を、緩衝液Ａに混合された０％〜１００％の緩衝液Ｂの２０分にわたる直線勾配を使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製した（緩衝液Ａは、水中０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７、４％アセトニトリル；緩衝液Ｂは、８０％のアセトニトリルを有する緩衝液Ａと同様）。
【００８１】
（ｃ．ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰチオール）
ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ（９ｍｇ、１２μモル；工程Ｂ由来）を１ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ５．７（Ｓｉｇｍａ  Ｍ  ３０２３）に溶かし、そしてｐＨを５．７５に調節した。シスタミンジヒドロクロリド（１０ｍｇ、４４μｍｏｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｃ８７０７）を２．５ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ５．７に溶解し、そしてｐＨを５．７５に調節した。ＥＤＣ（９ｍｇ、４７μｍｏｌ；Ｐｉｅｒｃｅ２２９８０）を、０．５ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ５．７に溶解し、そしてすぐにＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ溶液に添加した。１０分後、シスタミン溶液を添加し、そして室温で反応が進行する間ｐＨを５．５と５．８の間に維持した。２時間後、ｐＨを７．０に調節し、そしてサンプルを−２０℃で保存した。その生成物を、工程Ｂと同様に逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【００８２】
（ｄ．ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲの合成）
ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ−チオール（２．５ｍｇ、３μモル；工程Ｃ由来）を、５．４ｍＬの５ｍＭ  ＴＣＥＰ（Ｐｉｒｅｃｅ２０４９０）、ｐＨ７．５に調節された３０ｍＭリン酸ナトリウム中に溶解した。ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−ヨードアセトアミド（５ｍｇ、７．４μｍｏｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｄ−６０１１）を２．６ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、そしてＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ−チオール溶液に添加した。５時間、暗室において室温で静置した後、その生成物を、工程Ｂと同様に逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【００８３】
（ｅ．消失効率の決定）
ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲの消失効率を、以下のように決定した。第１に、色素ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲを含むサンプルの蛍光を測定する。第２に、付着した蛍光団部分（すなわち、ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ）をともなうγリン酸を有するヌクレオチド三リン酸の同じ濃度を含むサンプルを、測定する。その後、消失効率（これは、Ｆ0−Ｆ／Ｆ0と等しく、ここでＦ0は、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ単独の蛍光であり、そしてＦはＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲの蛍光である）を計算する。ＤＡＢＣＹＬ−ｄＵＴＰ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲの蛍光消失効率は、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ単独と比較して、少なくとも５倍である。
【００８４】
（実施例３Ｂ．Ｒｈｏ−ｄＵＴＰ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲおよびＲｈｏ−ｄＣＴ
Ｐ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲの合成）
（ａ．Ｒｈｏ−ｄＵＴＰの合成）
アミノアリル−ｄＵＴＰ（２０μモル；Ｓｉｇｍａ  Ａ０４１０）を、３ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム  ｐＨ８．３、２０％ＤＭＦ中に５−カルボキシローダミン６Ｇ、スクシンイミジルエステル（３０μモル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃ−６１２７）とともに混合した。その混合物を、室温で、暗室中でインキュベートし、そしてその反応物を、ＴＬＣ（ＭＫＣ１８Ｆ逆相；Ｗｈａｔｍａｎ  ４８０３−１１０；０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７、８０％アセトニトリル中で展開）によってモニターした。そのＲｈｏ−ｄＵＴＰ生成物を、緩衝液Ａに混合された０％〜１００％の緩衝液Ｂの２０分にわたる直線勾配を使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製した（緩衝液Ａは、水中０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７、４％アセトニトリル；緩衝液Ｂは、８０％のアセトニトリルを有する緩衝液Ａと同様）。
【００８５】
（ｂ．Ｒｈｏ−ｄＵＴＰ−チオールの合成）
Ｒｈｏ−ｄＵＴＰ（１２μモル；工程ａ由来）を、１ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ５．７（Ｓｉｇｍａ  Ｍ  ３０２３）に溶解し、そしてｐＨを５．７５に調節した。シスタミンジヒドロクロリド（４４μｍｏｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｃ８７０７）を２．５ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ５．７中に溶かし、そしてｐＨを５．７５に調節した。ＥＤＣ（４７μｍｏｌ；Ｐｉｅｒｃｅ２２９８０）を０．５ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ５．７中に溶かし、そしてすぐに、Ｒｈｏ−ｄＵＴＰ溶液に添加した。１０分後、このシスタミン溶液を添加し、そして反応が室温で進行する間、ｐＨを５．５と５．８の間に維持した。２時間後、ｐＨを７．０に調節し、そしてサンプルを−２０℃で保存した。その生成物を、逆相ＨＰＬＣによって、工程ａに記載されるように精製した。
【００８６】
（ｃ．Ｒｈｏ−ｄＵＴＰ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲの合成）
Ｒｈｏ−ｄＵＴＰ−チオール（３μモル；工程ｂ由来）を５．４ｍｌの５ｍＭ  ＴＣＥＰ（Ｐｉｅｒｃｅ２０４９０）、ｐＨ７．５に調節された３０ｍＭリン酸ナトリウム中に溶かした。ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−ヨードアセトアミド（７．４μｍｏｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｄ−６０１１）を２．６ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶かし、そしてＲｈｏ−ｄＵＴＰ−チオール溶液に添加した。暗室において５時間、室温で静置した後、その生成物を、工程ａのように逆相ＨＰＬＣによって、精製した。
【００８７】
（ｄ．Ｒｈｏ−ｄＵＴＰ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲの合成）
標識ｄＣＴＰを、ｄＵＴＰをアミノアリル−ｄＣＴＰに置換した以外は、本質的にｄＵＴＰについて記載されたように、作製した。アミノアリル−ｄＣＴＰを、ｄＵＴＰの代わりにｄＣＴＰを使用したこと以外は、米国特許第５，４７６，９２８号に従って、合成した。
【００８８】
（実施例４．遺伝子型決定）
この実施例は、１個のＤＮＡ分子に対する、配列ベースの遺伝子型決定アッセイを例示する。標的は、嚢胞性線維症膜内外伝導性調節遺伝子（Ｗｅｌｓｈ  ＭＪら、１９９３．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０６Ｓ：２３５−２３９）の（Δ）Ｆ５０８欠失である。ゲノムＤＮＡを、ＣＦＴＲホモ接合性個体の全血から単離する（Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１１２０、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）。ＣＦＴＲ遺伝子の５４ヌクレオチドセグメントを、プライマー５’ＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴ（プライマー１配列番号１）および５’−ビオチニル−ＣＴＧＴＡＴＣＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧ（プライマー２配列番号２）を使用して、ＰＣＲによって増幅する。
【００８９】
カスタムプライマーを、商業上の供給源（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）から得る。プライマー１は、（Δ）Ｆ５０８欠失に隣接するＣＦＴＲ配列にハイブリダイズする；プライマー１に対する第１の３’ヌクレオチドは、正常な対立遺伝子内のシトシンまたは欠失変異体内のチミンである（以下の表２を参照のこと；Ｖａｕｇｈａｎ  Ｐ、ＭｃＣａｒｔｈｙ  Ｔ．１９９８  Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６：８１０−８１５から）。増幅条件は、５０μｌの最終容量内に、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ、０．２μＭの各プライマー、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９、２５℃）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（９４℃３０秒間、５２℃３０秒間、７２℃１５秒間の３０サイクル；使用されるサーマルサイクラーデバイスの特定の特徴に依存して、Ｍｇ濃度およびサイクリングパラメーターの最適化が必要であり得る）。
【００９０】
ストレプトアビジン被膜磁気ビーズ（ＤＹＮＡＰＵＲＥ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｋｉｔ、Ｄｙｎａｌ  Ａ．Ｓ．）上のＰＣＲ産物を精製し、そしてゲノムＤＮＡを２μｌの精製された増幅産物と置換すること、およびプライマー１に相補的な一本鎖ＤＮＡ産物を過剰に産生するために、プライマー１を除外すること以外は、上記と同じ条件下で１５サイクル、再増幅する。ｄＮＴＰを、上記の磁気ビーズを使用して、増幅産物（「テンプレートプライマー」）から除去する。
【００９１】
１０μｌの反応混合物（３０ｎＭテンプレートプライマー、１００ｎＭプライマー１、１ｎＭ  Ｒｈｏ−ｄＣＴＰ−ＢＴＲ（実施例３）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７．５ｍＭジチオスレイトール）を実施例２の２色１分子画像処理顕微鏡上のポリメラーゼアレイ上に配置し、２０分間の一連の画像を取得する。同様に、第１サンプルのＲｈｏ−ｄＣＴＰ−ＢＴＲがＲｈｏ−ｄＵＴＰ−ＢＴＲ（実施例３）で置き換えられている以外は、第１サンプルと同一である第２サンプルを分析する。２つの結合した色素が互いに分離することによって示される取り込み事象についての画像セットを分析する。ｄＣＴＰ（サンプル１）およびｄＵＴＰ（サンプル２）を使用して観察された事象の数を、試験ＣＦＴＲ遺伝子が正常対立遺伝子か、または欠失対立遺伝子かを決定するために比較する。
【００９２】
【表２】
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プライマーには、下線を引いてある（左側がプライマー１、右側がプライマー２）。３つの欠失塩基対は、正常な配列内の太字で示されている。
【００９３】
（実施例５．配列決定）
配列決定は、遺伝子型決定（実施例４）に関して達成され、プライマーの１ヌクレオチド下流よりも多くを読み取ることを伴う。
【００９４】
（ａ）ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−ｄＵＴＰ−ローダミンの合成）
ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−ｄＵＴＰを作製するために、実施例３ａの手順に従って、実施例３ａのローダミンをＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ  ＳＴＰエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｂ−１０００３）と置換する。実施例３ｂのように、チオールを有するＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−ｄＵＴＰを誘導体化し、そして、テトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミドジヒドロヨージド（Ｍｏｌｅｃｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｔ−６００６）を、実施例３ｃのようなそのチオールに結合させる。
【００９５】
（ｂ）配列決定）
同じ正常な対立遺伝子ＤＮＡテンプレートを、実施例４において調製されるように使用する。１０μｌの反応混合物（３０ｎＭのテンプレート−プライマー、１００ｎＭのプライマー１、１ｎＭのＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−ｄＵＴＰ−Ｒｈｏ（実施例５ａ）、１ｎＭのＲｈｏ−ｄＣＴＰ−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ（実施例３ｄ）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７．５ｍＭのジチオスレイトール）を、実施例２の２色１分子画像処理顕微鏡上のポリメラーゼアレイ上に配置し、そして画像シリーズを獲得する。ｄＵＴＰの組み込みは、ローダミンの放出を伴う、２つの色素の分離によって観察される。ｄＣＴＰの組み込みは、同じ２つの色素の分離によって検出されるが、ＢＯＤＩＰＹに代わり、ローダミンの放出を伴う。
【数１】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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