(57)【要約】【課題】新規なシアニン色素の提供。【解決手段】本発明は、NIR範囲において蛍光法及び透視法による診断の造影剤として特定の光物理的性質又は薬理化学的性質を有する水溶性色素及びそれらの生体分子付加物を使用する近赤外線（NIR線）による生体内診断用の新規な色素並びにこのような色素を含有する診断薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式Ｉ：
Bk−（F−Wn）m          （Ｉ）
［式中、ｋは０〜６の数を表し；
ｎは０〜10の数を表し；
ｍは１〜100の数を表し；
Ｂは、特定の細胞集団に結合するか、受容体に選択的に結合するか、組織もしくは腫瘍に蓄積するか、又は全身的に血液中にとどまる分子量が30000以下の生物学的検出ユニット、あるいは非選択的に結合する巨大分子であり；
Ｆは650〜1200nmの範囲に極大吸収を示す色素であって、下記一般式IIａ：
【化１】
2010065036.tif 000011
で示されるシアニン色素又はその生理的に許容される塩を表し、
式中、
ｒは０、１又は２の数を表すが、但し、ｒ＝２の場合、一双のフラグメントL6及びL7は同一でも異なっていてもよく、
L1〜L7は同一又は異なり、各々独立してフラグメントCH又はCRであり、
ここで、Ｒはハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、スルホン酸基、又は炭素数６以下のアルキル基、アルケニル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、スルホアルキル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基若しくはハロゲンアルキル基、又は炭素数９以下のアリール基、アルキルアリール残、ヒドロキシアリール基、カルボキシアリール基、スルホアリール基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基、ニトロアリール基若しくはハロゲンアリール基であるか、或いは
Ｒは別の基Ｒに結合して散在する基L1〜L7とともに４員環〜６員環を形成する結合を表すか、或いは
Ｒは−CO−フラグメントを介して結合した２つの異なる位置での一つの結合を表す）を表し；
R3 〜R12は同一又は異なり、各々独立して水素原子、前記の基Ｂ若しくは後記のＷ、炭素数６以下のアルキル基若しくはアルケニル基、又は炭素数９以下のアリール基若しくはアラルキル基であり、前記アルキル基、アルケニル基、アリール基又はアラルキル基は任意に後記の追加の基Ｗを担持しており、或いは飽和、不飽和又は芳香族でもよく且つ任意に前記の追加の基Ｒを担持していてもよい５員〜６員環が、点在するＣ原子に相応の配慮をした上で各対の隣接残基R3〜R10にアニーリングしており；
Ｘ及びＹは同一又は異なり、各々独立してＯ、Ｓ、Se若しくはTe、又は−C(CH3)2−、−CH＝CH−又は−CR13R14−フラグメントであり、
ここで、R13及びR14は独立して水素原子、前記の基Ｂ又は後記のＷ、炭素数６以下のアルキル基若しくはアルケニル基又は炭素数９以下のアリール基若しくはアラルキル基であり、前記アルキル基、アルケニル基、アリール基又はアラルキル基は任意の後記の追加の残基Ｗを担持していともよく、ここで、
Ｗは、一般式Ｉにおいて、カルボキシル基もしくはスルホン酸基又は12個までの炭素原子を含むカルボキシアルキル、アルコキシカルボニルもしくはアルコキシオキソアルキル基であり、そして、ＷはR4とR8、及び／又はR6とR10、及び／又はR11とR12の位置を占めることを特徴とする〕
で表される化合物を含んで成る、NIR照射に基礎を置く生体内診断薬。
【請求項２】
請求項１に記載のシアニン色素を含んで成る生体内診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NIR範囲において蛍光法及び透視法による診断の造影剤として特定の光物理的性質又は薬理化学的性質を有する水溶性色素及びそれらの生体分子付加物を使用する近赤外線（NIR線）による生体内診断法、新規な色素並びにこのような色素を含有する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の診断性は、本来接近できない深層の組織の構造だけでなくそれらの組織の変化についての情報が得られるかに大きく依存している。これらの組織を触診、露出又は穿刺したりする他に、このような情報は、Ｘ線撮影、磁気共鳴トモグラフィー又は超音波診断等の高度な画像法を用いて得ることができる。
生物学的組織は、650〜1000nmの範囲の長波光に対して比較的高い透過性を示すので、診断者は、したがって完全に異なる組織画像形成方法を使用できる。近赤外範囲の光は数cmの組織を透過することができることから、透視画像形成に利用される。この手法により、現時点では、副鼻腔及び上顎洞の炎症だけでなく、組織の表在性帯域における蓄積液又は血液の検出が容易となる（Beduthan J.、Muller G.;Infrarotdiaphanoskopie、Med.Tech.1(1992)13〜17)。
【０００３】
胸部腫瘍を検出する試みはいままで不十分であったが（Navarro、G.A.;Profio、A.E.;Contrast in diaphanography of the breast、Med.Phys.150(1988)181〜187、Aspegren、K;Light Scanning Versus Mammography for the Detection of Breast Cancer in Screening and Clinical Practice、Cancer65(1990)1671〜77）、最も最近のエンジニアリングプロセス（Klingenbeck J.;Laser-Mammography with NIR-Light、Gynaekol.-Geburtsch.-Randsch.33Suppl.1(1993)299〜300;Benaron D.A.;Optical Imaging reborn with technical advances、Diagnostic Imaging(1994)69〜76）により、将来にはよりよい結果が得られるかもしれない。
【０００４】
近赤外光処理後に放出される蛍光線により、非吸収放射線を検出する他に、組織特異的情報を得ることができる。このいわゆる「自己蛍光」は、アテローム硬化組織と正常組織（Henry、P.D.等、Laser-Induced Autofluorescence of Human Arteries、Circ.Res.63(1988)1053〜59）とを区別するのに使用される。
近赤外線の照射に伴う主要な問題は、光が異常に広く散乱して、光物理的特性が異なるにもかかわらず明瞭な輪郭の物体のかなりぼやけた画像しか得られないことである。この問題は、表面からの距離が大きいほど大きくなり、透視法及び蛍光線検出法の両方において主要な限定要因と考えることができる。
【０００５】
疾患組織（特に、腫瘍において）に蓄積し且つ特異的吸収及び放出挙動を示す適当な蛍光色素は、健康組織を疾患組織からの識別性を高めるのに役立つことがある。照射（散乱）光を吸収することにより生じる変化、又は放射線を励起することにより誘発される蛍光を検出し、実際の組織特異的情報を提供する。
ヒトにおける生体内診断に色素を用いる例としては、血液を光度法によりトレースして、分布領域、血流又は代謝及び排泄機能を測定し、眼の透明構造を可視化（眼科学）することが挙げられる。このような用途に用いられる好ましい色素は、インドシアニングリーン及びフルオレセインである（Googe、J.M.等、Intraoperative Fluorescein Angiography;Ophthalmology、100(1993)1167〜70）。
【０００６】
インドシアニングリーン（カルジオグリーン）は、肝機能、心拍出量及び心拍血液量だけでなく、器官を通過する血流及び末梢血流を測定するのに使用される（I.Med.24(1993)10〜27）。さらに、腫瘍検出のための造影剤としても試験されている。
インドシアニングリーンは、アルブミンに100%結合し、肝臓で可動である。蛍光定量効率は、含水環境中では低い。そのLD50（0.84mmol／kg）は十分高く、強力なアナフィラキシー反応が生じることがある。インドシアニングリーンは、溶解したときに不安定であり、析出が生じることから生理食塩水媒体には適用できない。
【０００７】
光力学療法（PDT）に使用するのに構成される光増感剤（ヘマトポルフィリン誘導体、ホトフリンII、ベンゾポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、クロリン、フタロシアニンを含む）が、腫瘍を局在化及び可視化するのにいままで使用されてきた（Bonnett R.;New photosensitizers for the photodynamic therapy of tumours、SPIE Vol.2078(1994))。650〜1200nmの波長範囲での吸収が中程度でしかないことが、挙げた化合物に共通の欠点である。PDTに必要とする光毒性は、純粋な診断目的の妨害となる。これらについて取り扱っている他の特許には、U.S.-PS4945239、WO84/04665、WO90/10219、DE-OS4136769、DE-PS2910760がある。
【０００８】
U.S.-PS4945239は、透視法を用いて乳癌を検出するための非常に数多くの装置構成を記載し、公知の蛍光、フルオレスカミン及びリボフラビンをコントラスト向上吸収色素として述べている。これらの色素は、共通して、組織の光透過能が極めて低い可視波長範囲400〜600nmを吸収するという欠点がある。
【０００９】
DE-OS4136769は、蛍光物質濃度が高い組織領域の蛍光を検出するための装置を記載している。これらの物質は、バクテリアクロロフィル及びその誘導体並びにナフタロシアニンである。これらの構造では、吸光度指数が70000lmol-1cm-1以下である700〜800nmの範囲で吸収を示す。それらの蛍光特性の他に、ここで述べられている化合物は、放射線によりシングレット酸素を発生できるので、細胞障害効果を有する（光力学療法のための光増感剤）。この光増感活性は、純粋な不活性診断剤にとっては非常に望ましくない。
【００１０】
さらに、バクテリアクロロフィル化合物の合成は、天然物を親物質として使用しなければならないので高価であり且つ多大な努力を必要とする。しかしながら、ナフタロシアニンは、極めて低い光安定性を示すことがある。これらの種類の公知の化合物は、ほとんど水に溶解せず、均一な親水性誘導体を合成することは高価である。
【００１１】
WO84/04665は、以下の光増感剤を用いた腫瘍の蛍光検出の生体内法を記載している：ヘマトポルフィリン及びその誘導体（Hp及びHpD）、ウロ−及びコプロ及びプロトポルフィリン並びに非常に数多くのメソ置換ポルフィリン及び色素、例えば、リボフラビン、フルオレスセイン、アクリジンオレンジ、ベルベリンスルフェート及びテトラサイクリン。上記した光物理的及び薬化学的要件は、前記物質によっては満たされない。
【００１２】
Foil等、Cancer Research 54、2643〜2649(1994)は、皮下に移植した腫瘍を検出するために使用したシアニン色素に接続したモノクローナル抗体を記載している。しかしながら、深部病的プロセスの検出は、はるかに向上した色素を必要とする。色素の投与量が大きいほど、キャリアとして抗体を使用することが予測される副作用の点で不適当となる。
【００１３】
これらに関連するシアニン色素及びポリメチン色素も、写真層として使用される。このような色素は、発光性を必要としない。発光性（蛍光性）を有するシアニン色素が、蛍光鏡検法及びフローサイトメトリーに使用するために合成され、タンパク質のスルフヒドリル基の特異的標識試薬としてヨウ素アセチル基を含有する化合物等の生体分子と結合された（Waggoner、A.S.等;Cyanine dye Labeling Reagents for Sulfhydryl Groups、Cytometry、10、(1989)、3〜10）。このようにしてタンパク質を標識し、単離することを記載しているさらなる文献には以下のものがある：Cytometry 12(1990)723〜30;Anal.Lett.25(1992)415〜28;Bioconjugate Chem.4(1993)105〜11。
【００１４】
DE-OS3912046（Waggoner、A.S.）は、シアニン及びメロシアニン及びスチリル等の関連色素（少なくとも一つのスルホネート基又はスルホン酸基を含有）を用いて生体分子を標識する方法を記載している。この明細書は、タンパク質又は他の生体分子上での色素とアミン、ヒドロキシ、アルデヒド又はスルフヒドリル基との間で生じる共有反応を用いた、含水環境における一工程又は二工程標識法を記載している。
【００１５】
DE-OS3828360は、眼科目的のために、フルオレセイン及びインドシアニングリーンを用いて、抗腫瘍抗体、特にメラノーマ及び結腸癌に特異的な抗体を標識する方法を記載している。インドシアニングリーンの生体分子への結合は、共有結合ではない（色素−抗体組み合わせ、混合物）。
このように、公知のNIR線を用いた生体内診断の現状の方法には、数多くの欠点があり、このために、医療診断に広く使用されるのが妨げられている。
可視光又はNIR線を直接使用するのは、入射光が大きく散乱するために、表在体帯域に限られている。
【００１６】
しかしながら、コントラストと解像度を向上させるために色素を添加すると、数多くの問題が生じる。即ち、色素は、一般的に診断用医薬に適用される要件を満たさなければならない。これらの物質はほとんどより高投与量及びより長い診断時間投与されるので、毒性が低くなければならない。さらに、診断目的に適当な色素は、十分な水溶性があり、且つ化学的及び光物理的な面で、少なくとも診断が継続する期間は十分に安定でなければならない。系における代謝に関して安定であることも望ましい。
【００１７】
いままでは、NIR線を用いた生体内診断のための色素も適当な方法もなかった。
したがって、本発明の目的は、従来技術の欠点を克服する生体内診断法を提供することである。
【発明の概要】
【００１８】
上記問題は、本発明により、NIR線を用いた生体内診断方法であって、一般式Ｉ
Bk−（F−Wn）m          （Ｉ）
（式中、ｋは０〜６の数を表し、ｎは０〜10の数を表し、ｍは１〜100の数を表し；
Ｂは特異的細胞集団に結合するか、受容体に選択的に結合するか、組織又は腫瘍に蓄積するか、一般的に血液中にとどまるか、あるいは非選択的に結合する巨大分子である、分子量が30000以下である生物学的検出単位であり；
Ｆは650〜1200nmの範囲に極大吸収を示す色素を表し；
Ｗは式Ｉで表される化合物のｎ−オクタノール−水分布係数がｋ＝０に関して2.0以下であるときに水に対する溶解度を向上させる親水基を表す）で表される化合物及びそれらの生理学的に許容される塩を用いる生体内診断方法を提供することにより解決される。
【００１９】
本発明による方法に特によく適している一般式Ｉで表される化合物は、例えばＢが、アミノ酸、ペプチド、CDR（相補性決定領域）、抗原、ハプテン、酵素基質、酵素コファクター、ビオチン、カロチノイド、ホルモン、神経ホルモン、神経伝達物質、成長因子、リンホカイン、レクチン、トキシン、炭水化物、オリゴ糖、多糖、デキストラン、オリゴヌクレオチド又は受容体結合薬である化合物である。
【００２０】
さらに、一般式Ｉで表されるこのような化合物は、例えば、Ｆが
式IIa
【化１】
2010065036.tif 000002
【００２１】
〔式中、ｒは０、１又は２の数を表すが、但し、ｒ＝２の場合、一双のフラグメントL6及びL7は同一でも異なっていてもよく、
L1〜L7は同一又は異なり、各々独立してフラグメントCH又はCR
（但し、Ｒはハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、スルホン酸基、又は炭素数６以下のアルキル残基、アルケニル残基、ヒドロキシアルキル残基、カルボキシアルキル残基、アルコキシ残基、アルコキシカルボニル残基、スルホアルキル残基、アルキルアミノ残基、ジアルキルアミノ残基若しくはハロゲンアルキル残基、又は炭素数９以下のアリール残基、アルキルアリール残基、ヒドロキシアリール残基、カルボキシアリール残基、スルホアリール残基、アリールアミノ残基、ジアリールアミノ残基、ニトロアリール残基若しくはハロゲンアリール残基であるか、
【００２２】
Ｒは別の残基Ｒに結合し点在する残基L1〜L7とともに４員環〜６員環を形成する結合を表すか、
Ｒは−CO−フラグメントを介して結合した２つの異なる位置での一つの結合を表す）を表し、
R3 〜R12は同一又は異なり、各々独立して水素原子、前記残基Ｂ若しくはＷ、炭素数６以下のアルキル残基若しくはアルケニル残基、又は炭素数９以下のアリール残基若しくはアラルキル残基であり、前記アルキル残基、アルケニル残基、アリール残基又はアラルキル残基は任意に前記した追加の残基Ｗを担持しているか、
【００２３】
飽和、不飽和又は芳香族でもよく且つ任意に前記の追加の残基Ｒを担持していてもよい５員〜６員環が、点在するＣ原子に相応の配慮をした上で各対の隣接残基R3〜R10にアニーリングしており、
Ｘ及びＹは同一又は異なり、各々独立してＯ、Ｓ、Se若しくはTe、又は−C(CH3)2−、−CH＝CH−又は−CR13R14−フラグメント（式中、R13及びR14は独立して水素原子、前記残基Ｂ又はＷ、炭素数６以下のアルキル残基若しくはアルケニル残基又は炭素数９以下のアリール残基若しくはアラルキル残基であり、
前記アルキル残基、アルケニル残基、アリール残基又はアラルキル残基は任意の前記した追加の残基Ｗを担持している）である〕で表されるシアニン色素を表すか、
【００２４】
一般式IIb
【化２】
2010065036.tif 000003
（式中、ｓ及びｔは独立して数０又は１を表すが、但し、ｓ及びｔは同時には数１を表さず、
R3〜R12、ｘ及びｙは前記した通りである）で表されるスクアレイン色素か、
【００２５】
一般式IIc
【化３】
2010065036.tif 000004
（式中、ｒ、L1〜L6、R3〜R11及びｘは前記した通りである）で表されるスチリル色素か、
【００２６】
一般式IId
【化４】
2010065036.tif 000005
（式中、ｒ、L1〜L6、R3〜R8、R11及びＸは前記した通りであり、Ｇは酸素原子又はイオウ原子を表す）で表されるメロシアニン色素を表す本発明の方法に特に適当である。
【００２７】
一般式Ｉで表されるこのような化合物は、例えば、Ｗがカルボキシ基若しくはスルホン酸基又は炭素数12以下のカルボキシアルキル基、アルコキシカルボニル基若しくはアルコキシオキソアルキル基であるか、
一般式III
−(CH2）a−Ｏ−Ｚ又は（−CH2−CH2−Ｏ）a−Ｚ  （III）
【００２８】
〔式中、ａは０〜６の数を表し、
Ｚは水素原子か、２〜ｎ−１（但し、ｎは炭素原子数である）個のヒドロキシ基を含む炭素数３〜６のアルキル残基か、炭素数６〜10であり且つ２〜４個の追加のヒドロキシ基を担持しているアリール残基若しくはアラルキル残基か、炭素数１〜６であり且つ１〜３個の追加のカルボキシ基を担持しているアルキル残基か、炭素数６〜９であり且つ１〜３個の追加のカルボキシル基を担持しているアリール残基であるか、炭素数６〜15のアラルキル残基、ニトロアリール−残基若しくはニトロアラルキル残基か、１〜３個の追加のカルボキシ基を担持している炭素数２〜４のスルホアルキル残基を含んでなるか、
【００２９】
一般式IIIa若しくはIIIb
【化５】
2010065036.tif 000006
で表される残基か、
【００３０】
一般式IIIc
−(CH2)o−(CO)p−NR1−(CH2)s−(NH−CO)q−R2
（IIIc）
（式中、ｏ及びｓは独立して０、１、２、３、４、５又は６の数を表し、
ｐ及びｑは独立して０又は１を表し、
R1及びR2は独立して一般式IIIa及びIIIbの置換基を除いて前記した残基Ｚを表すか、独立して一般式IIId又はIIIe
【００３１】
【化６】
2010065036.tif 000007
で表される残基を表す（但し、ｐ及びｑは１である))〕か、
前記した一般式IIIcで表される残基を表す本発明による方法に特に適当である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、２−〔７−〔１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−（メトキシカルボニル）−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−５−（メトキシカルボニル）−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、ナトリウム塩を体重1kg当り3.8mmolを静脈内投与した後の種々の時点でのマウス（スイスヌード）の蛍光画像（白黒）である。  Ａ〜Ｅ：右横方向画像、Ｆ：後部画像、Ａ：投与前、Ｂ：30秒、Ｃ：１分、Ｄ：10分、Ｅ：投与１時間後、Ｆ：投与18時間後。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明による方法に使用される化合物は、波長範囲650〜1200nmにおいて吸収を示し且つ蛍光を発し、吸収係数が約100,000 l mol-1cm-1以上であり、蛍光が望ましい場合には、蛍光定量効率が5%を超え、十分に水溶性であり、生体外及び生体内で許容され且つ安定であるだけでなく光安定性を有する特徴がある。これらは、最短短時間で最大限完全に排出される。本発明で使用される化合物は、市販されている親物質から数工程のみで、容易に且つ好ましい価格で合成される。
【００３４】
本発明の方法を生体内診断に適用するときには、一般式Ｉで表される一種又は数種の物質を、例えば、静脈内注射により組織に投与した後、可視〜近赤外線範囲650〜1200nmの光に当てる。吸収されない放射線及び蛍光線は、別個若しくは同時にか、互いに遅延させて記録する。合成画像を、得られたデータから生成する。
【００３５】
蛍光画像は、種々の方法を用いて記録できる。好ましい方法としては、組織に広範に照射し、蛍光情報をCCDカメラにより局部解像で可視化するか、画像形成されるべき組織セクターを光ファイバー導波管で集光した光線により走査し、得られた信号を演算により画像に変換する。この光は、本発明の化合物の極大吸収付近の波長又は蛍光励起波長での狭帯範囲で当てる。吸収されなかった放射線は、上記したようにして記録でき、得られた信号を処理する。
【００３６】
照射角及び観察角を、場合に応じて、解剖学的及び最適コントラスト要件を満たすように選択する。この方法の感度は、色素投与前後の画像を減じることにより向上できる。色素に関連した変化の時間曲線の評価により、診断に有用なさらなる情報が明らかとなる。
使用される測定法は、当業者に公知のものである。また、専門家も、本発明で使用される一般式Ｉで表される色素の一定吸収又は蛍光波長での最適な記録及び評価条件を得るのに、どの装置パラメータを設定すべきかがわかるであろう。
【００３７】
本発明の方法で使用される一般式Ｉで表される化合物は、色素系Ｆの構造が変更できるので、広範囲な励起及び放出波長をカバーする。特定ソースの励起、例えば、ダイオードレーザーユニットでの励起に相当する励起波長を有する生成物を得ることが可能であり、したがって、一定の測定系又は装置要素に適合される。
上記の方法では、組織の深層で数mm3 しか容積のない小対象物又は非透明体液での局在化さえ可能である。必然的に伴う光散乱及び限定された解像度のため、このような対象の正確な形状及び大きさを測定することはまだ困難であるが、ある種の重要な診断上の問題を解決するにはこのことは必要とされない。
驚くべきことに、シアニン色素を投与後にCCDカメラを用いて撮影したマウス（スイスヌード）のＸ線透視画像は、同様に投与したポルフィリンと比較して、蛍光強度が1000倍であった。
【００３８】
本発明の化合物を使用する上記で説明した方法は、病的変化、全身疾患、腫瘍、血管、アテローム硬化プラーク、灌流及び拡散なしに組織を可視化するのに特に適当である。
本発明に使用される化合物は、種々の方法で組織に適用される。色素の静脈内投与が、特に好ましい。
【００３９】
投与量は、適用目的により大きく異なってよい。達成すべきことは、診断されるべき組織帯域における色素の濃度が検出可能なことであり、このためには、組織又は体液中に１〜100μｇ／mlの濃度がたいていの場合十分である。この濃度は、小体腔、小血管又は小リンパ管に、通常ビヒクル液体0.1〜10mlにそれぞれの色素を0.1〜100mg直接注射することにより到達する。この場合、色素１〜10mgが好ましい。静脈内注射（100mg以上）後に、血管を染色したり特定の組織又は構造を検出するのには、ほとんどの場合、投与量がもっと高くなければならない。投与量の上限は、それぞれの物質及び製剤の許容度によってのみ設定される。
【００４０】
したがって、本発明は、B1−（F−Wn）m（式中、Ｆはポリメチン色素から選択される色素、特にシアニン色素を表す）。メロシアニン色素、スチリル、オキソノール及びスクアリリウム色素も使用できる。Ｗは、分子全体の親水性に実質的に寄与する構造要素である。特に好ましいものは、１が０の数を表し、ｎ−オクタノール／水分布係数が２より小さい（ｎ−オクタノール／塩化ナトリウム0.9%含有0.01M TRIS緩衝液（pH7.4に設定）（両相は互いに飽和）ものである。
【００４１】
生物学的検出単位Ｂは、例えば、アミノ酸、ペプチド、CDR（相補性決定領域）、抗原、ハプテン、酵素基質、酵素コファクター、ビオチン、カロチノイド、ホルモノ、神経ホルモン、神経伝達物質、成長因子、リンホカイン、レクチン、トキシン、炭水化物、オリゴ糖、多糖、デキストラン、ヌクレアーゼ耐性化オリゴヌクレオチド又は受容体結合薬である。
【００４２】
上記グループからの化合物としては、例えば、オキシトシン、バソプレッシン、アンジオテンシン、メランニン細胞刺激ホルモン、ソマトスタチン、チロトロピン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、テストステロン、エストラジオール、プロゲステロン、コルチゾル、アルドステロン、ビタミンＤ、ガストリン、セクレチン、ソマトロピン、インシュリン、グルカゴン、カルシトニン、STH（成長ホルモン）放出ホルモン、プロラクチン、エンセファリン、ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン、エピネフリン、インターロイシン、アンジオゲニン、サイモポイエチン、エリスロポイエチン、フィブリノゲン、アンギオテンシノゲン、メカミルアミン、ラニチジン、シメチジン、ロバスタチン、イソプロテレノール誘導体又はトランスフェリンなどがある。
【００４３】
これらの物質は、ある種の機構を介して生物学的検出単位に目標を定めることにより、身体の特定の部分での蓄積が容易となる。これらの機構には、細胞外構造への結合、種々の生物学的輸送系を介しての蓄積、細胞表面の認識又は細胞内成分の認識などがある。
Ｂが、ポリリシン、ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、カルボキシデキストラン又はＦに共有結合するカスケード様構造等の非選択的結合巨大分子である他の化合物は、本発明に準じて使用できる。
【００４４】
本発明により使用される一般式Ｉで表される化合物に含まれるヒドロキシ基を有するアルキル、アリール又はアラルキル基は、例えば、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、１，３−ジヒドロキシプロピル−２−イル基、トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル基、１，３，４−トリヒドリキシブチル−２−イル−グルコシル基、４−（１，２−ジヒドロキシエチル）フェニル基又は２，４−、２，５−、３，５−若しくは３，４−ジヒドロキシフェニル基である。
【００４５】
１〜３個のカルボキシ基を有するアルキル基、アリール基又はアラルキル基は、例えば、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルボキシブチル基、１，２−ジカルボキシエチル基、１，３−ジカルボキシプロピル基、３，５−ジカルボキシフェニル基、３，４−ジカルボキシフェニル基、２，４−ジカルボキシフェニル基又は４−（１，２−ジカルボキシエチル）−フェニル基でよい。
スルホアルキル基は、好ましくは２−スルホエチル基、３−スルホプロピル基及び４−スルホブチル基である。
【００４６】
ＷがR4又はR8、R6又はR10及びR11又はR12をとり、且つ位置R3／R5又はR7／R9に一双で存在する化合物が、特に好ましい。
本発明により使用される色素は、スペクトル範囲650〜1200nmの範囲で吸収を示す。これらの化合物の吸収係数は、色素１分子について約100000 l mol-1cm-1以上である。蛍光定量効率は、蛍光画像形成に使用される全ての色素について5%を超える。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、一般式Ｖ
【化７】
2010065036.tif 000008
【００４８】
〔式中、Ｑはフラグメント
【化８】
2010065036.tif 000009
【００４９】
（式中、R30は水素原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、炭素数１〜４のアルコキシ残基又は塩素原子を表し、ｂは２又は３の整数であり、R31は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル残基を表す）、
Ｘ及びＹは各々独立して−Ｏ−、−Ｓ−、−CH＝CH−又は−C(CH2R32)(CH2R33)−フラグメントを表し、
R20〜R29、R32及びR33は独立して水素原子、ヒドロキシ基、カルボキシ残基、スルホン酸残基、炭素数10以下のカルボキシアルキル残基、アルコキシカルボニル残基若しくはアルコキシオキソアルキル残基、又は炭素数４以下のスルホアルキル残基を表すか、
【００５０】
非選択的結合巨大分子か、
一般式VI
−(O)v−(CH2)o−CO−NR34−(CH2)s−(NH−CO)q−R35
（VI）
で表される残基であるが、但し、Ｘ及びＹはＯ、Ｓ、−CH＝CH−又は−C(CH3)2 −であり、残基R20〜R29の少なくとも一つは非選択的結合巨大分子か、一般式VI
（式中、ｏ及びｓは０又は独立して１〜６の整数を表し、
ｑ及びｖは独立して０又は１を表し、
R34は水素原子又はメチル残基を表し、
R35は炭素数３〜６であり且つ２〜ｎ−１（ｎは炭素数）個のヒドロキシ基を含んでなるアルキル残基か、１〜３個の追加のカルボキシ基を担持する炭素数１〜６のアルキル残基か、炭素数６〜９のアリール残基か、炭素数７〜15のアリールアルキル残基か、式IIId又はIIIe
【００５１】
【化９】
2010065036.tif 000010
で表される残基（但し、ｑは１）であるか、
【００５２】
非選択的結合巨大分子を表す）で表される化合物に相当し、
R20とR21、R21とR22、R22とR23、R24とR25、R25とR26、R26とR27は、点在する炭素原子と５員又は６員芳香族又は飽和アニーニング環を形成する〕で表されるシアニン色素及びそれらの生理学的に許容される塩が提供される。
一般式Ｖで表される本発明による化合物では、ヒドロキシ基又はカルボキシ基を含有するアルキル残基、アリール残基又はアラルキル残基は、上記した好ましい組成を有する。
【００５３】
以下に、特に好ましいシアニン色素を示す：
５−〔２−〔（１，２−ジカルボキシエチル）アミノ〕−２−オキソエチル〕−２−〔７−〔５−〔２−（１，２−ジカルボキシエチル）アミノ〕−２−オキソエチル〕−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、分子内塩、カリウム水素塩、
【００５４】
２−〔７−〔５−〔２−〔（11−カルボキシ−２−オキソ−１，４，７，10−テトラアザ−４，７，10−トリ（カルボキシメチル）−１−ウンデシル）アミノ〕−２−オキソエチル〕−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−エチル−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、分子内塩、
２−〔７−〔１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−〔２−〔（メトキシポリオキシエチレン）−アミノ〕−２−オキソエチル〕−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−５−〔２−〔（メトキシポリオキシエチレン）アミノ〕−２−オキソエチル〕−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、ナトリウム塩、
【００５５】
２−〔７−〔１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−５−（メトキシポリオキシエチレン）アミノカルボニル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、ナトリウム塩、
３−（３−カルボキシプロピル）−２−〔７−〔３−（３−カルボキシプロピル）−１，３−ジヒドロ−３−メチル−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３−メチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、ナトリウム塩、
【００５６】
２−〔〔３−〔〔３−（３−カルボキシプロピル）−１，３−ジヒドロ−３−メチル−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕メチル〕−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−シクロブテン−１−イリデン〕メチル〕−１，１−ジメチル−３−エチル−1H−ベンズ（ｅ）インドリウム、分子内塩、
２−〔７−〔１，３−ジヒドロ−５−〔２−〔（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミノ〕−２−オキソエチル〕−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−５−〔２−〔（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミノ〕−２−オキソエチル〕−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、ナトリウム塩。
【００５７】
本発明の化合物及び本発明により使用される化合物の別の重要な特性は、ｎ−オクタノール／水分布係数が２より小さい（分布係数ｎ−オクタノール／塩化ナトリウム0.9%含有0.01M TRIS緩衝液（pH7.4に設定）（両相は互いに飽和）ことにより特徴付けられる親水性にある。これらの化合物は、診断試薬において望ましくないであろう明確な光増感性又は光毒性を有さず、十分に許容され且つ排出される。
【００５８】
本発明の化合物の親水性挙動の点で、生体内診断のために提案された色素とは異なる。とりわけ、シアニン色素の場合、凝集のため、蛍光定量効率値が含水環境で大きく低下し、非極性溶媒で測定される値に相当するものとなり、水に対する溶解度の増加及び親水性基の空間要件により凝集体及びミセルの形成が抑制される。
好ましい化合物群は、タンパク質への親和性をほとんど示さず、その薬物動力学的挙動は、例えば、インシュリン又はサッカロースと同様である。
【００５９】
驚くべきことに、これらの化合物は、分子構造が単純であるにもかかわらず、特定の構造体、例えば、腫瘍において、十分な蓄積を示した。色素が生体全体に均一に広がると、その除去は、周囲組織と比較して、腫瘍帯域において遅延する。
物質の許容度は、極めて良好である。LD50値が単一色素分子について体重1kg当り0.5mmolを超える物質が、特に好ましい。
【００６０】
本発明の化合物及び本発明で使用される化合物は、生体外及び生体内安定性だけでなく光安定性が大きい特徴がある。水溶液を昼間の部屋に静置すると、特に好ましい化合物の各々の98%が２日後に何ら変化を示さず、70%が12日後でも変化を示さない。
本発明の化合物及び本発明で使用される化合物について説明した光物理的及び薬物動力学的性質も、ヒトにおける適用が承認された唯一のシアニン色素であるインドシアニングリーン（カルディオグリーン）とは異なる。
本発明の別の態様によれば、一般式Ｉ（但し、Ｂのｋ値が１以上、好ましくは１又は２である）で表される化合物が提供される。
【００６１】
波長650〜1200nmの光を吸収するときに大きな吸光率を示し、且つ大きな効率で蛍光を発するシアニン色素を合成できる。本発明のシアニン色素及び本発明で使用されるシアニン色素は、主に、文献、例えば、F.M.Hamer、The Cyanine Dyes and Related Compounds、John Wiley and Sons、New York、1964;Cytometry、10(1989)3〜10;11(1990)418〜430;12(1990)723〜30;Bioconjugate Chem.4(1993)105〜11、Anal.Biochem.217(1994)197〜204;Tetrahedron45(1989)4845〜66、ヨーロッパ特許出願第0,591,820A1号から公知の方法により合成される。
【００６２】
本発明で使用される一般式Ｉで表される色素−生体分子付加物は、上記した方法により調製される公知の化合物Ｆ−Wnを生物学的検出単位Ｂと反応させることにより調製される。
したがって、化合物Ｆ−Wnは、生物学的検出単位上でアミン、ヒドロキシ、アルデヒド又はスルフヒドリル基に共有結合できる基を少なくとも一つ、好ましくは正確に一つ含有する。このような基は、文献から公知であり、例えば、DE-OS3912046にある程度詳細に記載されている。
【００６３】
特に好ましいものは、アミノ官能に対して反応性があり、チオウレア、ウレア及びアミドブリッジを形成するイソチオシアネート、イソシアネート及びヒドロキシスクシンイミドエステル若しくはヒドロキシスルホスクシンイミドエステル基だけでなく、スルフヒドリル基に対して反応性があり、チオエーテルブリッジを形成するハロゲンアセチル及びスクシンイミド基がある。
さらに、アルコール系官能を有するカルボキシ基は、適当な活性試薬（例えば、DCC）を用いたエステル結合又はエーテル構造を形成してよく、アルデヒド官能はヒドラジンと結合してイミン構造を形成してもよい。
【００６４】
上記した反応基を、一般式Ｉで表される本発明の色素若しくは本発明で使用される色素又はそれらの合成前駆体に付加させるか、存在する官能基を反応基に転化する。反応基は、いわゆる「リンカー構造」（例えば、アルキル鎖、アラルキル構造）を介して色素系に直接結合してよい。
Ｆ−Wn化合物を、好ましくは、生物学的検出単位Ｂと、DMF中か、含水環境中か、DMF／水混合物中で、pH値7.4〜10で反応させる。色素と生体分子のモル割合（仕込み比）を、吸収分光測定を用いて測定する。結合しない成分は、クロマトグラフィー又は濾過により分離する。
【００６５】
適当な官能基を有する巨大分子は、同様の方法で色素にカプリングしてよい。
これらの物質は、全く異なる性質を有していてもよい。また、これらの分子量は、数百〜100000以上でよい。物質は、中性でも、帯電してもよい。酸性色素並びにナトリウム、メチルグルタミン、リシン等の生理学的に許容される塩基の塩、又はリチウム、カルシウム、マグネシウム、カチオンの形態のガドリニウムを含有する塩の形態でもよい。
【００６６】
このように得られた色素−生体分子付加物は、上記の光物理的、毒物学的、化学的及び経済的要件を非常によく満たす。
本発明の別の態様によれば、一般式Ｉで表される化合物の使用と類似した一般式Ｖで表されるシアニン色素のNIR線を用いた生体内診断のための使用が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、一般式Ｖ又はＩで表される化合物を含有する診断試薬が提供される。
【００６７】
これらの試薬は、当業者にとって公知の方法に準じて、任意に一般的なアジュバント、希釈剤等を添加することにより製造される。これには、生物学的に許容される電解質、緩衝液、洗浄剤並びに容量オスモル濃度の調整するための物質及びシクロデキストリン等の安定性及び溶解度を向上させるための物質などがある。製造中及び特に適用する前の無菌性は、製剤学に共通の工程を行うことにより確保されるべきである。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明を実施例により説明する。
実施例
実施例１
５−〔２−〔（１，２−ジカルボキシエチル）アミノ〕−２−オキソエチル〕−２−〔７−〔５−〔２−（１，２−ジカルボキシエチル）アミノ〕−２−オキソエチル〕−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、分子内塩、カリウム水素塩の調製
【００６９】
ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、公知の方法（Cytometryll(1990)418〜430）に準じて、５−カルボキシメチル−２−〔７−〔５−カルボキシメチル−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、分子内塩、カリウム水素塩から調製する。
【００７０】
アスパラギン酸0.16g（1.22mmol）をDMF1ml添加したものを、ジスクシンイミジルエステル0.5g（0.51mmol）をDMF5mlに溶解した溶液に添加する。反応混合物を、室温で48時間攪拌する。生成物にエーテルを添加して析出させ、RP-18（LiChroprep、15〜25μ、H2O：MeOH＝99：１〜１：１）で精製し、凍結乾燥する。50℃／0.01mbarで24時間乾燥して生成物0.27g（51%）を得る。
分析：
理論値：C54.43、H5.54 、N5.40 、O24.68、S6.18 、K3.77
実測値：C54.04、H5.81 、N5.22 、        S6.13 、K3.85
【００７１】
実施例２
２−〔７−〔５−〔２−〔（11−カルボキシ−２−オキソ−１，４，７，10−テトラアザ−４，７，10−トリ（カルボキシメチル）−１−ウンデシル）アミノ〕−２−オキソエチル〕−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−エチル−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、分子内塩の調製
【００７２】
85%ヒドラジン水和物43mg（0.65mmol）をメタノール1mlに添加したものを、２−〔７−〔５−（カルボキシメチル）−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−エチル−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム−Ｎ−スクシンイミジルエステル、分子内塩をメタノール5mlに溶解した溶液0.5g（0.73mmol)(Cytometryll(1990)418〜430）に、−10℃でゆっくりと滴下し、この温度で２時間攪拌する。反応混合物を真空下で約3mlまで蒸発させ、イソプロパノール1mlと混合し、−20℃で一晩保つ。析出した結晶を、オイルポンプを用いて吸引乾燥する。収量は、トリカルボシアニントカーボニックアシッドヒドラジド0.27g（61%）である。
【００７３】
このヒドラジド0.27g（0.45mmol）を、攪拌下、ジエチレントリアミン五酢酸モノエチルエステル−無水物0.21g（0.51mmol）をDMF20mlとトリエチルアミン0.2mlに溶解した溶液に添加する。この混合物を、室温で48時間攪拌したままにしておく。濾過後、溶媒を0.2mbarで蒸発させ、残留物をCH2Cl2と混合し、濾過し、高真空下で乾燥する。得られた生成物を、3MNaOH水溶液5mlに添加して室温で４時間攪拌する。次に、半濃HClを用いて、pH値2.0とした。イソプロパノール1mlを添加する。混合物を４℃で18時間静置後、析出した結晶を、高真空下、60℃で24時間吸引乾燥する。
【００７４】
収量：わずかに暗赤色がかった粒物0.23g（52%）
分析：
理論値：C59.32、H6.60 、N9.88 、O20.96、S3.23
実測値：C54.15、H6.70 、N9.50 、        S3.19
【００７５】
実施例３
２−〔７−〔１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−〔２−〔（メトキシポリオキシエチレン）−アミノ〕−２−オキソエチル〕−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−５−〔２−〔（メトキシポリオキシエチレン）アミノ〕−２−オキソエチル〕−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、ナトリウム塩の調製
【００７６】
実施例１で調製したＮ，Ｎ−ジスクシンイミジルエステル0.08mmolをDMF1mlに溶解した溶液を、メトキシポリオキシエチレンアミン800mg（約0.16mmol；平均分子量約5000）をCH2Cl2 10mlに溶解した溶液に添加し、室温で24時間攪拌したままにする。エーテルを添加して析出した固体生成物を濾取し、クロマトグラフィー（媒体Sephadex G50、溶離剤H2O）で精製し、凍結乾燥及びP2O5で乾燥して、緑青色粉末が収率約58%で得られる。
平均分子量：理論値10771、実測値10820
【００７７】
実施例４
２−〔７−〔１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−５−（メトキシポリオキシエチレン）アミノカルボニル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、ナトリウム塩の調製
【００７８】
２−〔７−〔１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−５−カルボキシ−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム−Ｎ−スクシンイミジルエステル、ナトリウム塩0.41g（0.5mmol）を、アルゴン雰囲気中、メトキシポリオキシエチレンアミン（0.46mmol；平均分子量5000）2.3gをCH2Cl2 70mlに添加したものとともに、室温で18時間攪拌する。真空下で溶媒量を半分とし、生成物を実施例３に記載のようにして単離する。収量は、緑青色粉末生成物2.1gである。
平均分子量：理論値  5701、実測値：5795
【００７９】
実施例５
３−（３−カルボキシプロピル）−２−〔７−〔３−（３−カルボキシプロピル）−１，３−ジヒドロ−３−メチル−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３−メチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、ナトリウム塩の調製
【００８０】
フェニルヒドラジン塩酸塩6.5g（50mmol）と５−メチル−６−オキソヘプタン酸8.7g（55mmol）とを濃酢酸50mlに添加し、室温で１時間及び120℃で５時間攪拌する。蒸発により容積を減少させた後、残留物を水20mlと混合し、析出した結晶を濾取し、オイルポンプを用いて乾燥する。これにより褐色がかった結晶9.6g（83%）が得られ、これをジクロロベンゼン60mlに懸濁し、１，４−ブタンスルトン11.6g（85mmol）を添加後、８時間150℃で加熱した。混合物を室温に冷却後、アセトン200mlを添加し、析出物を濾取する。これをエーテルに懸濁し、18時間攪拌後再び濾取し、オイルポンプを用いて乾燥する。クロマトグラフィー（RP-18、LiChroprep、15〜25μ、溶離剤MeOH：水）で精製して、３−（３−カルボキシプロピル）−２，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドレニンを、収量10.7g（70%）得る。
【００８１】
インドレニン5.0g（13.6mmol）とグルタコンアルデヒドジアニルヒドロクロリド1.9g（6.8mmol）とを無水酢酸100mlに添加したものに、濃酢酸25mlと無水酢酸ナトリウム2.3g（27.6mmol）とを添加しながら120℃で30分間加熱することにより、インドトリカルボシアニン色素を調製する。エーテル500mlを得られた析出物に添加し、クロマトグラフィー（1.0gに分割、RP-18、LiChroprep、15〜25μ、溶離剤MeOH：水）で精製し、最終的に凍結乾燥した。最終生成物の収量は、2.5g（45%）である。
【００８２】
分析：
理論値：C60.13、H6.28 、N3.42 、O19.54、S7.83 、Na2.81
実測値：C59.90、H6.34 、N3.39 、        S7.72 、Na2.78
【００８３】
実施例６
２−〔〔３−〔〔３−（３−カルボキシプロピル）−１，３−ジヒドロ−３−メチル−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕メチル〕−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−シクロブテン−１−イリデン〕メチル〕−１，１−ジメチル−３−エチル−1H−ベンズ（ｅ）インドリウム、分子内塩の調製
【００８４】
３−エチル−１，１，２−トリメチル−1H−ベンゾ（ｅ）インドリウムヨウ化物3.65g（10.0ml）を、スクエア酸ジエチルエステル1.36g（8.0mmol）とトリエチルアミン1.6mlとを70℃に加熱したエタノール12mlに溶解した溶液に添加する。80℃で10分間攪拌後、混合物を０℃に冷却する。析出した赤色結晶を濾取し、エーテルで洗浄し、真空下で乾燥する。シリカゲルクロマトグラフィー（CH2Cl2：AcOH＝９：１〜７：３）により精製して、２−エトキシ−１−〔（３−エチル−１，１−ジメチル−1H−ベンズ（ｅ）インドール−２−イリデン）−メチル〕−シクロブテン−３，４−ジオン1.33g（46%）を得る。
【００８５】
この物質を熱エタノール15mlに懸濁し、攪拌下、40%NaOH0.5mlと混合する。得られた溶液を80℃で５分間攪拌し、室温に冷却後2N HCl5mlと混合する。蒸発後に析出した１−〔（３−エチル−１，１−ジメチル−1H−ベンズ（ｅ）インドール−２−イリデン）−メチル〕−２−ヒドロキシシクロブテン−３，４−ジオン（1.30g）を濾過し、乾燥し、精製することなく次の合成工程に使用する。
【００８６】
スクエア酸誘導体1.30g（3.9mmol）を３−（３−カルボキシプロピル）−２，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドレニン1.43g（3.9mmol）と反応することにより、スクアレイン色素を調製する。得られた成分を、水分離器で、トルエン80mlと１−ブタノール80mlに添加して18時間加熱後、真空下で溶媒から分離する。残留物をエーテルと混合し、室温で16時間攪拌後形成した結晶を濾取し、クロマトグラフィー（RP-18、LiChroprep、15〜25μ、溶離剤MeOH：水）で精製する。収量：0.95g（36%）。
【００８７】
分析：
理論値：C68.60、H6.20 、N4.10 、O16.40、S4.70
実測値：C68.25、H6.35 、N4.04 、        S4.59
【００８８】
実施例７
２−〔７−〔１，３−ジヒドロ−５−〔２−〔（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミノ〕−２−オキソエチル〕−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−５−〔２−〔（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミノ〕−２−オキソエチル〕−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、ナトリウム塩の調製
【００８９】
２，３，３−トリメチル−3H−インドール−５−イル酢酸スクシンイミジルエステル2.0g（6.4mmol）をCH2Cl2 50mlに添加したものを、４−アミノメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン0.84g（6.4mmol）と混合する。室温で５時間攪拌後、混合物を水100mlに注ぎ、CH2Cl2で抽出し、有機相を蒸発させる。クロマトグラフィーで精製（シリカゲルCH2Cl2：MeOH＝98：２）してアミド1.86g（88%）を得て、それをジクロロベンゼン20ml及び１，４−ブタンスルトン1.36g（10.0mmol）に添加して室温で12時間及び100℃で攪拌する。
【００９０】
混合物をアセトン50mlと混合攪拌して形成した粒物を濾取し、クロマトグラフィー（RP-18、LiChroprep、15〜25μ、溶離剤MeOH：水）で精製する。収量は、５−〔２−〔（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサ−４−シクロペンチル）メチル〕アミノ−２−オキソエチル〕−２，３，３−トリメチル−１−（４−スルホブチル−3H−インドレニン0.85g（親化合物に対して28%）である。
【００９１】
この色素を製造する反応は、実施例４と同様である。上記物質は、120℃で10分間加熱する。粗生成物を、MeOH 5ml中で、トルエン−ｐ−スルホン酸100mgを添加して室温で16時間攪拌し、不溶分を分離する。次に、濾液にイソプロパノール3mlを添加後、−20℃に保つ。析出した粉末を、クロマトグラフィー（RP-18、LiChroprep、15〜25μ、溶離剤MeOH：水）で精製し、凍結乾燥し、そして50℃／0.01mbarで24時間乾燥する。
【００９２】
収量：0.32g（37%）
分析：
理論値：C56.70、H6.45 、N5.88 、O20.14、S6.73 、K4.10
実測値：C56.39、H6.88 、N5.67 、        S6.58 、K3.93
【００９３】
実施例８
２−〔７−〔１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−（メトキシカルボニル）−１−（４−スルホブチル）−2H−インドール−２−イリデン〕−１，３，５−ヘプタトリエニル〕−３，３−ジメチル−５−（メトキシカルボニル）−１−（４−スルホブチル）−3H−インドリウム、ナトリウム塩を、麻酔した腫瘍を有するマウス（スイスヌード、右後脚腫瘍LS174T）に、体重1kg当り3.8μmolを静脈内投与した。
【００９４】
レーザ誘発蛍光画像を、蛍光イメージャー（Physikalisch-Technische Bundesanstalt、Berlin Charlottenburg）を有する物質を投与前及び投与後の種々の時点で撮影した。放射線を、光ファイバー導波システムを介して放射線をデカップリングにより、740nmの単色レーザを用いて励起した。カットオフフィルターを用いて、740nm未満の励起放射線を除去した。740nmを超えるレーザー誘発蛍光を、CCD（チャージカップルドデバイス）カメラを用いて記録し、データを白黒画像として保存した。
【００９５】
図１に示した一連の写真から、一般的に上記物質を投与後に蛍光強度が増加することが明らかである（Ａ、Ｂ）。30秒後に均一分布強度が観察でき、値が、肝臓及び肺領域並びに腫瘍部（Ｂ）で増加する。さらに時間が経過すると（１時間以下）（Ｃ、Ｄ、Ｅ）、物質が次第に動物全体に広がる。18時間後、腫瘍部（右後脚）の蛍光強度が身体の残部と比較して明らかに増加しているのが観察される。
【図１】
2010065036.tif 000012