(57)【要約】      （修正有）【課題】側方流動アッセイの有利な局面を維持しつつ感度の改善を保証する、極めて感度の高いアッセイシステムを提供する。【解決手段】極めて感度の高いユーロピウム粒子を標識として用いるクロマトグラフィー試験システムに関し、クロマトグラフィーアッセイは、適当な感度で便利に、迅速な結果を得ることができる。マトリックス中に取り込まれた蛍光希土類キレートの使用により、極めて感度の高いアッセイをシステムとなる。少なくとも１つのリザーバ領域および１つのウイッキング膜を備える検体検出装置を開示し、ここで、標識した特異的結合パートナーは、このリザーバ領域；および少なくとも１つの化学成分が固定化されるウイッキング膜上の領域に含浸される。【選択図】図１
2010091576.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのリザーバ領域および１つのウイッキング膜を備え、特異的結合パートナー及び単一粒子中に３０，００００〜１，０００，０００個のユーロピウム（III）を含むランタニド（lanthanide）（III）キレートを含む標識粒子が、前記リザーバ領域に含浸されており、および少なくとも１つの化学成分又は生物学的成分が前記ウイッキング膜上に固定化されている、側方流動アッセイ形式の検体検出装置。
【請求項２】
前記標識が、ユーロピウム（europium）（III）、テルビウム（terbium）（III）、サマリウム（samarium）（III）、またはジスプロシウム（dysprosium）（III）、あるいはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記検体が、抗原、抗体、核酸およびハプテンよりなる群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記特異的結合パートナーが、抗原、抗体、核酸、ビオチンまたはビオチンアナログ、ストレプトアビジン、アビジンおよびハプテンよりなる群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
少なくとも１つの化学成分が、抗原、抗体、核酸、ビオチンまたはビオチンアナログ、ストレプトアビジン、アビジンおよびハプテンよりなる群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
試料中の検体の存在を決定する方法であって、ある量の試料を請求項１に記載の装置に充当する工程を含み、ここで、少なくとも１種類の検体が試料中に存在する場合、前記試料はウイッキング膜に移動してそこで化学反応が起こり、ここで、シグナルの存在は検体が前記試料中に存在することを示す、方法。
【請求項７】
前記ランタニド（III）が、ユーロピウム（III）、テルビウム（III）、サマリウム（III）、またはジスプロシウム（III）、あるいはそれらの組み合わせである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が生体試料である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、血液、血清、血漿、尿、唾液、汗、および生体試料または環境試料から加工処理した液体媒体よりなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記検体が、抗原、抗体、核酸およびハプテンよりなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記化学反応が、抗原、抗体、核酸、ビオチンまたはビオチンアナログ、ストレプトアビジン、アビジンおよびハプテンよりなる群から選択される化学物質との反応である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
試料中の複数のタイプの検体が検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記装置が側方流動アッセイ形式装置である、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記検体が病原体に特異的である、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の装置を含む容器およびキットの取扱説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野：
【０００２】
本発明は、分子（特に生体分子）の高感度検出の分野に関する。本発明はまた、蛍光標識の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．一般背景および技術水準：
【０００４】
超高感度免疫検定法は、臨床診断において、高度に複雑な試料中の極めて低濃度の特定化合物を測定するために開発され、かつ使用される。これらの方法の感度、信頼性、迅速性、単純性、および費用は着実に改善されてきているが、依然としてさらなる改善が必要とされており、かつ可能である（Ｈａｍｐｌ Ｊら、Ｕｐｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｓａｙｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１；２８８，１７６〜１８７；Ｕｎｇｅｒ Ｍ．ら、Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ｍｅｒｃｕｒｙ ｌａｍｐ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９９；２７：１００８−１０１４；およびＷｅｉｓｓ Ｓ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８３：１６７６−１６８３）。小型化した、多検体法への最新の傾向は、免疫検定技術のためのそれ自体の課題および必要性を持ち込んできた（Ｔａｙｌｏｒ ＪＲら、Ｐｒｏｂｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｗｉｔｈ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０００；７２：１９７９−１９８６；およびＺｉｊｌｍａｎｓら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ｕｐ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｓ：ａ ｎｅｗ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９９；２６７：３０−３６）。新しい標識技術への関心が、とりわけ高まってきている。なぜなら、一般に用いられる直接もしくは酵素増幅された放射活性レポーター、比色レポーター、ルミネセンスレポーター、または蛍光レポーターのいずれも、比活性、サイズ、無毒性、費用、安定性、局在性、および検出を含む、理想の標識の要件を全て満たすわけではないからである。フルオロフォアのような直接検出可能な標識は、感度に制限を受け、酵素増幅法または解離増強法は、空間的な情報に欠ける。
【０００５】
近年、高比活性の粒状標識（例えば量子ドット、ルミネセンス無機結晶、上方変換蛍燐光体、蛍光ナノ粒子、およびプラズモン共鳴粒子）に基づく新しい検出方法が導入され、臨床診断ならびに生物学的研究、ゲノム研究、および薬学的研究に関する将来に向けた要求に応えている。これらのμｍ未満のサイズの標識は、特異的結合試薬（例えば、核酸プローブ、レセプター、レクチン、酵素、および抗体）と結合して、利用可能な最善の従来の標識と同等かまたはより良好な感度を以て特定の分子を検出する。大きな分子サイズおよび明白なステアリンの問題にもかかわらず、これらの特定の標識はまた、固相免疫検定においても首尾よく用いられている。しかしながら、その生成、コロイド安定性、および粒子−タンパク質バイオコンジュゲートの非特異的結合が、依然としてさらに改善を必要とし得ることが認識されている。
【０００６】
時間分解蛍光測定法およびランタニド（lanthanide）標識は、２０年前に免疫検定に導入された。それ以来、解離増強ランタニド蛍光免疫検定（ＤＥＬＦＩＡ（登録商標））技術は、最も感度が高くかつ信頼できる免疫検定基準の１つとして知られている。本質的に蛍光性、不活性、かつ安定なランタニドキレートおよびクリプタート標識に関する研究は、日常の臨床診断への導入が期待される新規の均質および不均質アッセイの開発をもたらしている。さらに、ユーロピウム（europium）（III）、テルビウム（terbium）（III）、サマリウム（samarium）（III）、およびジスプロシウム（dysprosium）（III）の長寿命蛍光を増幅する、ランタニド共蛍光に基づく、高度な解離増強技術が知られている。ランタニドキレート蛍光の特有の特徴、すなわち多重標識由来の自己消光作用の欠如により、ランタニドキレート蛍光は、染色ラテックスナノ粒子のような高密度クラスタ標識にとって理想的なかつ適したものとなっている。ＤＥＬＦＩＡ技術に用いられる極めて蛍光性の高いキレートもまた、蛍光ランタニド（III）キレートナノ粒子に用いることができる。なぜなら、ラテックス内部の疎水性環境が、蛍光キレートを溶剤消光のような環境の影響から保護し、動力学的に弱い錯体を安定化するためである。４種類全てのランタニドに対して適切なキレートを適合させることにより、極めて低い検出限界を有するナノ粒子に基づく４重標識技術および直接的な表面読み出し測定が可能になるであろう。
【０００７】
古典的な蛍光色素を用いた、試料中の低レベルの標的マーカーの検出は、困難な場合があり、誤差が生じやすい。なぜなら、特異的な蛍光シグナルは低くなりがちであり、通常非特異的シグナルと混ざっているためである。さらに、検体から生成される自己蛍光は、干渉を引き起こし得る。ランタニド元素−例えばユーロピウム（ＥＵ）−の錯体キレートの蛍光半減期は、従来の蛍光標識よりも６桁程度長い。従って、ランタニドキレートからの発光は、適切な遅延、計数、およびサイクルタイムで時間分解蛍光光度計を用いることによって、バックグラウンドの蛍光（短い減衰半減期を有する）と区別され得る。この特有の色素は、代表的に５０ｎｓより短い減衰期間を有する従来の蛍光プローブまたは自己蛍光試料の減衰期間よりもはるかに長い、５００μｓより長い減衰期間を有するルミネセンスを与える。従って、時間分解蛍光測定法により、自己蛍光を事実上排除することができる。
【０００８】
これらのユーロピウムルミネセンス色素は、長波長の発光（〜６１０ｎｍ）を特徴とし、励起ピーク（〜３６５ｎｍ）から十分に分離される。この異常に大きなストークスシフトにより、所望のルミネセンスシグナルを効果的に分離するフィルターの組合わせの使用が可能になる（Ｈａｒｍａら、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ．２００１；４７：５６１−５６８）。ＤＥＬＦＩＡシステムにおいて、ランタニドイオンは、キレート構造から蛍光増強溶液中に解離する。この追加の増強工程は、ランタニドイオンにさらにエネルギーを転移するために、効率的に消光水を除去し、かつエネルギー吸収キレート化合物を含む環境を提供するのに必要である。ランタニド蛍燐光体は、防水結晶構造のため、増強工程なしに直接検出され得る。ランタニド蛍燐光体を用いることで不利な点は、吸収エネルギーをランタニドイオンへ効率的に転移する光吸収基の欠如である。ＦｒａｎｋおよびＳｕｎｄｂｅｒｇは、１９７０年代後半に、これらの性質をラテックス粒子中に組み込むことによって、非常に高い比活性を有する蛍光粒子を調製し得ることを見出した。彼らは、トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシドと複合体化したテノイルトリフルオロアセトンランタニドキレート（thenoyltrifluoroacetone lanthanide chelate）（ＤＥＬＦＩＡ技術において、トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド（tri-n-octylphosphine oxide）と複合体化したナフトイルトリフルオロアセトン（naphtoyltrifluoroacetone））を含むラテックス粒子を調製し、消光効果を有さないが光吸収基を粒子内部に有する粒子を得た。ポリマーシェルは、疎水性環境を作ることによってキレート近傍から蛍光−消光水を効率的に除去する。このような粒子標識を用いて、超高感度アッセイが行われ得る（Ｈaｒｍaら、２００１、Ｓｏｕｋｋａら、２００１ａ）。これらのナノサイズのポリマー標識は、既知のランタニドキレーターの中で最も高い量子収率の１つを有する、β−ジケトン（s-diketones）によって取り込まれた３０，０００〜２，０００，０００個のユーロピウム分子を含む（Ｈａｒｍａら、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ．２００１；４７：５６１−５６８）。このカプセル封入による蛍光効率への負の効果はない。１００ｎｍサイズのユーロピウム粒子について、蛍光収量は約３，０００分子のフルオレセインに相当する。フィコビリタンパク質Ｂ−ＰＥ（おそらく既知の最も蛍光が大きい物質）は、約３０フルオレセイン分子に相当する蛍光収量を有するが、１００ｎｍの粒子は、フィコビリタンパク質Ｂ−ＰＥの直径の約１０倍であり、容量／質量において１０００倍大きいので、これらのユーロピウム粒子は、Ｂ−ＰＥよりもモルベースで１００倍高い蛍光性である。この粒子は、その卓越した蛍光、広いストークシフトおよび長寿命ルミネセンスのために、アッセイに対して超��感度を示すであろう。カプセル封入：単一粒子中に３０，０００〜２，０００，０００ユーロピウム分子。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
【００１０】
本発明は、側方流動アッセイ形式に用いられる時間分解蛍光色素を包含するがこれに限定されない、側方流動アッセイの有利な局面を維持しつつ感度の改善を保証する、極めて感度の高いアッセイシステムに関する。
【００１１】
１つの観点において、本発明は、極めて感度の高いユーロピウム粒子を標識として用いるクロマトグラフィー試験システムに関する。クロマトグラフィーアッセイは、適当な感度で便利に（大抵ワンステップで）、迅速な結果を得ることができる。別の局面において、本発明は、感度の高い核酸検出デバイスおよびそのシステムに関する。マトリックス中に取り込まれた蛍光希土類キレートの使用により、極めて感度の高いアッセイを提供する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、非ポリメラーゼ連鎖反応またはポリメラーゼ連鎖反応のいずれかの核酸に基づく手法による、ＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルス、細胞成分のＲＮＡまたはＤＮＡのような検体の存在についての、遺伝物質検出システムに関する。この検出システムは、高速であり、使いやすく、かつ高い感度および特異性を有する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の利点としては、以下が挙げられる：
【００１４】
このシステムは極めて感度が高く、これは検体の検出に必須の条件である。
【００１５】
本発明の製品は、敷地外施設への試料の輸送の必要性が低く、現場で用いられ得る。
【００１６】
本発明の製品を用いて、試料調製後ほぼ約１５分以内に陽性結果の即時警告が可能である。本発明システムの利点の１つは検出システムの迅速さであるが、本発明は、結果を得る時間が特定の時間に何も限定されないことが理解されるべきである。これらの結果は、種々の条件に応じて、おおよそ２０分、３０分、４０分またはそれよりやや長い時間で得られる場合がある。
【００１７】
このワンステップ法のためのアッセイ手順は実施が簡単であり、試験結果はほぼ１５分以内に読み取られ、追加の工程を何も必要としない。
【００１８】
本発明の製品は、高度な教育および専門的な技能を持たない職員によって実施できる。
【００１９】
本発明の製品は、他の市販の製品が一般に冷蔵を必要とするのに対して、室温で保管できる。
【００２０】
本発明の別の局面において、本発明は、ポイント・オブ・ケア検査または種々の検体についての試験の種々の設定に関する。なぜなら、１）簡単な工程、２）現場で使用可能、３）安定な試薬を利用、４）特別な貯蔵が不要、および５）迅速な結果という理由のためである。
【００２１】
本発明は、少なくとも１つのリザーバ領域および１つのウイッキング膜を備える検体検出装置に関し、ここで、標識された特異的結合パートナーは、このリザーバ領域；および少なくとも１つの化学成分が固定化されるウイッキング膜上の領域に含浸される。この装置に用いられる場合、この標識は、希土類キレート、詳細にはランタニド（III）キレートであってもよく、そしてさらに詳細には、この標識はユーロピウム（III）、テルビウム（III）、サマリウム（III）、またはジスプロシウム（III）、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。
【００２２】
この装置において、検体は非限定的に、抗原、抗体、核酸またはハプテンであってもよい。この特異的結合パートナーは非限定的に、抗原、抗体、核酸、ビオチンもしくはビオチンアナログ、ストレプトアビジン、アビジンまたはハプテンであってもよい。そしてこの化学成分は、抗原、抗体、核酸、ビオチンもしくはビオチンアナログ、ストレプトアビジン、アビジンまたはハプテンであってもよい。
【００２３】
本発明の１つの局面において、この装置は側方流動アッセイ形式装置であってもよい。
【００２４】
本発明の別の局面において、本発明は、試料中の少なくとも１種類の検体の存在を決定する方法に関し、この方法は、ある量の試料を上述の装置に充当する工程を包含し、ここで、少なくとも１種類の検体が試料中に存在する場合は、この試料はウイッキング膜に移動してそこで化学反応が起こり、ここで、シグナルの存在は検体が試料中に存在することを示す。本発明の実践において、このシグナルは希土類キレート、詳細にはランタニド（III）キレートによって生成され得、そしてさらに詳細には、この標識はユーロピウム（III）、テルビウム（III）、サマリウム（III）、またはジスプロシウム（III）、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。
【００２５】
本方法において、この試料は生体試料であってもよい。さらに、この試料は非限定的に血液、血清、血漿、尿、唾液、汗および生体試料または環境試料から加工処理された液体媒体であってもよい。この検出される検体は、抗原、抗体、核酸またはハプテンであってもよい。そしてこの化学反応は、抗原、抗体、核酸、ビオチンもしくはビオチンアナログ、ストレプトアビジン、アビジンまたはハプテンとの反応であってもよい。試料中の複数の検体が検出され得る。本方法において用いられる装置は、非限定的に側方流動アッセイ形式装置であってもよい。そしてこの検体は、病原体に特異的であってもよい。
【００２６】
本発明はまた、上述の装置を収容する区画、および上述の装置を使用するための説明書を含むキットに関する。
【００２７】
本発明はまた、高感度核酸検出システムに関する。本発明の核酸に基づく検出システムは、生体試料由来の低濃度の特定のゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ配列からのシグナルを増幅させることができる。この方法はまた、ユニークであり、特異的であり、簡単であり、そしてこの増幅システムは、現場に配置可能な検出モジュールにおいて操作が容易である。
【００２８】
時間分解蛍光測定法技術は、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗原または抗体とコンジュゲートしたユーロピウム包埋微粒子に基づくシステムである。
【００２９】
検出に極めて感度の高い手段を必要とする任意の疾患マーカーまたは環境物質は、この技術を利用し得る。
【００３０】
本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の本発明の説明、本願書に添付の参照図面および本願書に添付の特許請求の範囲から、さらに十分に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本願において、「ａ」および「ａｎ」は、単数および複数の物の両方を言うのに用いられる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「ベース部材」とは、小片のための支持体および単一性を提供する、固体材料をいう。この支持体は、アッセイ内容物全体を含む一方で使用者にとって便利なように、適切なサイズに切断されているガラス、紙またはプラスチックの薄板から構成されて良い。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「乾燥多孔質担体」または「ウイッキング膜」とは、液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつフィルタエレメントに接触している物質をいう。乾燥多孔質担体に使用する代表的な材料としては、ナイロン（nylon）、セルロース（cellulose）、ポリスルホン（polysulfone）、二フッ化重合ポリビニリデン（polyvinylidene difluoride）、酢酸セルロース（cellulose acetate）、ポリウレタン（polyurethane）、ガラス繊維、およびニトロセルロース（nitrocellulose）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「フィルター」は任意の数のフィルター材料から形成されて良い。使用される代表的なフィルター材料としては、セルロース、ポリエステル、ポリウレタン、ナイロンおよびガラス繊維が挙げられるが、これらに限定されない。このようなフィルター領域は、リザーバパッドおよび吸収パッドを含んで良い。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「蛍光希土類キレート」は、米国特許第４，２５９，３１３号および同第４，２８３，３８２号に記載されているもので良く、これらの特許は、引用によりその全体を本明細書中に援用する。従って、本発明は、希土類金属（好ましくはユーロピウムおよびテルビウム）のキレートをラテックス粒子のような高分子マトリックス中に組み込むことによって調製される、長寿命蛍光組成物を利用する方法を記載する。このキレート剤は光を強力に吸収し、エネルギーを金属に効率よく転移する。このラテックス構造は、これまで水性液体中でクエンチングを受けていた蛍光希土類キレートに、水安定性を与える。次いで、ラテックスに由来し、希土類キレートをその中に組み込んで有する高分子ビーズを蛍光標識として用い、抗原、抗体、植物レクチン、炭水化物または他のこのようなタンパク質性化合物、脂質および核酸を、高分子ラテックスビーズの表面に吸着させるかまたは共有結合させることによって、標識試薬を生成させることができる。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「含浸された」とは、アッセイシステム中に組み込まれる試薬を指し、これらはアッセイシステムの上にまたは中に乾燥されるかあるいは凍結乾燥される。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「高分子粒子」とは、種々のサイズの球状またはほぼ球状のポリマー粒子をいう。好ましくは、このサイズは直径約０．０５〜０．５μｍである。しかしながら、本発明は、特定のタイプの高分子粒子の使用には何も限定されないことが理解される。最も広い意味において、蛍光色素をカプセル化し得る任意の物質または粒子が、本発明に包含される。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「特異的結合試薬」または「特異的結合剤」または「特異的結合パートナー」としては、抗体、抗原、ハプテン、ハプテン−高分子（例えば、ウシ血清アルブミン）コンジュゲート、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ビオチン−高分子（例えば、ウシ血清アルブミン）コンジュゲート、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および核酸遺伝物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「タグ」とは特異的結合試薬に標識される物質をいい、これは時間分解蛍光色素で標識される。このタグは、固相上に固定化された特異的結合剤に特異的に反応する。詳細には、固相上に固定化された特異的結合剤がアビジンまたはストレプトアビジンである場合、このタグはビオチンであってもよい。固相上に固定化された特異的結合剤がこのタグのハプテンに特異的な抗体である場合、このタグはハプテンであってもよい。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「時間分解蛍光光度計」とは、発光波長の関数として作り出すことも可能な、短い励起パルス後の蛍光強度の時間依存性を測定するための手段を言う。
【００４１】
クロマトグラフィー増幅
【００４２】
１つの局面において、本発明は、迅速なクロマトグラフィー試験に適した装置に関する。
【００４３】
本発明の試験は、最小限の訓練を受けた非専門家によって現場で実行され得、一方で、使い捨ての試験デバイスまたはカードまたは小片に１または２滴の試料を加えた後に、迅速な結果が得られる。これらの結果は、何も追加の操作なしに、視覚的に読み取られ得る。本発明の１つの局面において、試験案のための手順は以下のとおりであってもよい。単に議論の目的で、この試験を抗原／抗体反応の点から議論し得る。しかしながら、このアッセイが抗原／抗体複合体に限定されないことは理解されるべきである。特異的結合パートナーが既知である任意の目的の分子について、特異的結合剤を使用し、装置中に含浸して、目的の分子の存在をアッセイし得る。このような目的の分子およびその特異的結合パートナーとしては、非限定的に、抗原／抗体、リガンド／レセプター、核酸／核酸、核酸／抗体、脂質／抗体のような特異的結合パートナー、炭水化物／抗体のような特異的結合パートナーなどが挙げられる。特異的結合パートナーを用いる原理が任意の試料供給源由来の任意のタイプの分子に適用可能であるという了解の下で、以下の議論において、単に例示の目的で、抗原／抗体相互作用および核酸／核酸相互作用を主に議論する。
【００４４】
液体試料を、この試験デバイスまたはカードまたは小片に添加する。この流体がカードを横切って運ばれる／移動するにつれて、標的抗原が、色素パッド中に包埋された標識化特異的抗体と反応する。この物質は、一組の非標識化抗体が少なくとも１つの別個のゾーンに固定されている膜の中に流れ込む。この抗原−標識化抗体複合体は保持／捕捉され、読み取りのために明確な線を作り出す。この線は、時間分解蛍光または任意の他の適切な検出機構を備える読取り装置によって検出できる。別個のコントロールゾーンでは、試験中の過剰標識化抗体が包埋非特異的抗体と反応し、重要な試験成分が正しく機能しており、従って陽性コントロールとして有用であることを確約する。この試験の非限定的な原理を、図１にさらに示す。
【００４５】
液体試料を、この試験デバイスまたはカードまたは小片に添加する。この流体がカードを横切って運ばれる／移動するにつれて、標的抗原が、色素パッド中に包埋された標識化特異的抗体と反応する。この物質は、一組の非標識化抗体が少なくとも１つの別個のゾーンに固定されている膜の中に流れ込む。この抗原−標識化抗体複合体は保持／捕捉され、読み取りのために明確な線を作り出す。この線は、時間分解蛍光または任意の他の適切な検出機構を備える読取り装置によって検出できる。
【００４６】
例えば、側方流動アッセイの形式のクロマトグラフィーアッセイは、増幅システムである。液体試料中の標的抗原は、毛管力により膜を通って移動するとき、膜上に固定された高親和性抗体によって次第に濃縮される。その結果、この抗原が実際の試料中では極めて低い濃度であっても、試験ラインまたは試験ゾーンで捕捉される抗原の濃度は、試料中での濃度よりもずっと高い。また、毛管移動により、標的抗原が固定化抗体に連続的に供給される。
【００４７】
通常、捕捉抗体が、従来のアッセイにおけるように抗原と複合体を形成する場合、固相上に固定化された捕捉抗体を取り囲む微環境の抗原濃度が低下する。一般に、この固相上に固定化された抗体の周囲の抗原の枯渇は、アッセイ感度、特にマイクロプレートアッセイおよびチップに基づくアッセイでのアッセイ感度における重要な問題の１つである。なぜなら、これは抗体の周囲の抗原濃度の事実上の低下を引き起こすためである。
【００４８】
別の実施形態において、吸収膜（例えば、ニトロセルロース）の３次元構造は、抗体が固相に結合するためのより広い表面積を提供する。これにより、このクロマトグラフィーアッセイは、他の２次元アッセイシステム（例えば、マイクロプレートアッセイ）よりも顕著に大きい捕捉能力を有し得る。
【００４９】
本発明はまた、複数検体検出システムに関し、このシステムは、単回の試料採取のみで行われ、本発明のクロマトグラフィーアッセイを用いたこれ以上の手順上の工程はない。種々の抗体−色素コンジュゲートが色素パッド領域に包埋され、かつ各抗原に特異的な抗体が膜上の別個のゾーンにそれぞれ固定化されている場合、各試験ラインは、特定の薬剤に特異的な抗原の各々について特有の情報をもたらす（図２）。このデバイスが、２つ以上のタイプの検体を検出し得ることもまた意図される。例えば、例証として、図２を参照して、試験ゾーン１を抗体に含浸して抗原を検出し得；試験ゾーン２をレセプターに含浸してリガンドを検出し得；そして試験３を配列特異的結合のために核酸に含浸し得る。
【００５０】
１つの局面において、本発明は、単一粒子中に約３０，００００〜１，０００，０００個のユーロピウム原子を含む蛍光ユーロピウム粒子を用いる、シグナル増幅システムに関する。このシステムは、例えば１）簡単な試験手順、２）現場で使用可能、３）安定な試薬を利用、４）特別な貯蔵が不要、および５）迅速な結果といった有利な特徴を有する改良型クロマトグラフィーアッセイであってもよい。この増幅されたシグナルは、定量的または定性的結果をもたらす小型の携帯用読み取り装置によって検出できる。
【００５１】
この試験小片はケース内に封入され得、このケースは、好ましくは使い捨てのプラスチックケースであるが、任意の物質で作られていてもよく、内容物を安全に収容することができる。この試験キットは、複数の窓、好ましくは少なくとも２つの窓または開口部を含み得、少なくとも１つはコントロールおよび／または試験ラインもしくは試験バンドを表示し、他方は試料を受けるウェルを提供する（図３）。図４を参照して、デバイスの内部は、好ましくは２つのパッドを備える試験小片であってもよい。この第一パッド、リザーバ領域１または試料ウェルは、試料の取り込みおよび試料からの妨害物質の除去に用いられ得る。さらに、第一パッドは、ユーロピウム粒子−特異的結合パートナーコンジュゲート３を、特別に配合された緩衝系中に含み得る。このリザーバ領域中に含浸させた標識化特異的結合試薬は、試料中の検体に結合し得、そしてこの検体／特異的結合パートナー複合体は、試験バンド４が形成されるまでウイッキング膜６を通って運ばれ、そこでこの検体の別の特異的結合剤が、この検体／特異的結合パートナー複合体を捕捉し、このようにして試験バンドを形成する。この試料はさらに運ばれ、ウイッキング膜中に含浸させた特異的結合パートナーに対する結合パートナーに遭遇し、そしてコントロールバンド５が樹立される。第二パッド７は吸収パッドであり、反応膜を既に通過済みの過剰の流体を除去するのに用いられ得る。この第一パッド、第二パッドおよびウイッキング膜は、プラスチック板２につながっている。
【００５２】
２種類の試薬が、この膜上に細い線またはバンドとして別々に固定化され得る。このコンジュゲート抗体に特異的な抗体は、コントロール窓に固定化され得、一方、検体（例えば、生物脅威病原体または検出が望まれる任意の薬剤）に特異的な抗体は、試験窓に固定化される（図３および４）。
【００５３】
クロマトグラフィーアッセイ原理
【００５４】
本発明の試験キットは、自己実行デバイスであるように設計される。このキットは、図１に示すように、全ての試薬および成分を正確な量で含み、試料の添加後に試験結果を生じ得る。試料はまず、種々の物質を含むリザーバパッドを通過する。このリザーバパッドは、試料のｐＨを最適化するための緩衝液、試料中の全成分を懸濁するための界面活性剤、およびデバイスを通って適切な流動を生じるための多孔質フィルターを含み得る。続いて、この試料は、毛管現象または拡散によって色素領域または色素パッドに流動し、そこで試験薬剤が、好ましくはこの薬剤に特異的なユーロピウム粒子標識で標識された標識化特異的結合剤と反応する。次いで、この反応複合体は、ウイッキング膜を通って移動し、そこで薬剤の未反応結合部位が、固定化した特異的結合剤と反応して、試験窓に線またはバンドを生じる。枯渇した試料および結合していない色素複合体の残りは、コントロール窓へ移動し続け、そこでコンジュゲート抗体に特異的な抗体が固定化されて色素複合体を保持し、コントロール線を形成する。この反応複合体が、試験領域に到達する前に、コントロール領域に遭遇し得ることもまた意図される。
【００５５】
本発明の１つの局面において、この結果は、病原体の定性的または定量的検出のための固相クロマトグラフィーアッセイである。この試験手順において、約６０μＬの液体試料を試料適用エリアに添加し得、その結果は機器によってほぼ約１５分以内にもたらされ得る。このアッセイの迅速さが本発明システムの有利な特徴であるが、結果を得るための正確な時間は、条件および試料に応じて変化し得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、特定のアッセイ時間に何も限定されない。
【００５６】
実施形態１
【００５７】
検出装置の１つの実施形態において、この装置は以下の特徴を含む：
高分子粒子３の中に組み込まれた蛍光希土類キレートを含む蛍光標識で標識した一つ以上の特異的結合試薬を含浸している、少なくとも１つのフィルタエレメント１；および
液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつフィルタエレメントに接触している乾燥多孔質担体６（例えば、ニトロセルロース膜）であって、ここで
少なくとも１つの特異的結合試薬が、乾燥多孔質担体の少なくとも１つのゾーンに固定化される（図１０）。
【００５８】
実施形態２
【００５９】
検出装置の別の実施形態において、この装置は以下の特徴を含む：
高分子粒子３の中に組み込まれた蛍光希土類キレートを含む蛍光標識で標識した一つ以上の特異的結合試薬を含浸している、少なくとも１つの第一フィルタエレメント１；
第一フィルタエレメントと乾燥多孔質担体との間に挿入され、かつ液体の移動を可能にするのに十分に多孔質である、少なくとも１つの第二フィルタエレメント１１；および
液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ第二フィルタエレメントに接触している乾燥多孔質担体６（例えば、ニトロセルロース膜）であって、ここで
少なくとも１つの特異的結合試薬が、乾燥多孔質担体の少なくとも１つのゾーンに固定化される（図１１）。
【００６０】
実施形態３
【００６１】
検出装置の別の実施形態において、この装置は以下の特徴を含む：
第二フィルタエレメント１１と乾燥多孔質担体６との間に挿入され、かつ、液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ、高分子粒子３の中に組み込まれた蛍光希土類キレートを含む蛍光標識で標識した一つ以上の特異的結合試薬を含浸している、少なくとも１つの第一フィルタエレメント１；
第一フィルタエレメント１に接触し、かつ液体の移動を可能にするのに十分に多孔質である、少なくとも１つの第二フィルタエレメント１１；および
液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ第一フィルタエレメントに接触している乾燥多孔質担体６（例えば、ニトロセルロース膜）であって、ここで
少なくとも１つの特異的結合試薬が、乾燥多孔質担体の少なくとも１つのゾーンに固定化される（図１２）。
【００６２】
実施形態４
【００６３】
検出装置の別の実施形態において、この装置は以下の特徴を含む：
ベース部材２；
ベース部材２上に配置したアレイであって、以下を含むアレイ：
高分子粒子３の中に組み込まれた蛍光希土類キレートを含む蛍光標識で標識した一つ以上の特異的結合試薬を含浸している、少なくとも１つのフィルタエレメント１；および
液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつフィルタエレメントに接触している乾燥多孔質担体６（例えば、ニトロセルロース膜）であって、ここで
少なくとも１つの特異的結合試薬が、乾燥多孔質担体の少なくとも１つのゾーンに固定化される（図１３）。
【００６４】
実施形態５
【００６５】
検出装置の別の実施形態において、この装置は以下の特徴を含む：
ベース部材２；
ベース部材２上に配置したアレイであって、以下を含むアレイ：
高分子粒子３の中に組み込まれた蛍光希土類キレートを含む蛍光標識で標識した一つ以上の特異的結合試薬を含浸している、少なくとも１つの第一フィルタエレメント１；
第一フィルタエレメント１と乾燥多孔質担体６との間に挿入され、かつ液体の移動を可能にするのに十分に多孔質である、少なくとも１つの第二フィルタエレメント１１；および
液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ第二フィルタエレメントに接触している乾燥多孔質担体６（例えば、ニトロセルロース膜）であって、ここで
少なくとも１つの特異的結合試薬が、乾燥多孔質担体の少なくとも１つのゾーンに固定化される（図１４）。
【００６６】
実施形態６
【００６７】
検出装置の別の実施形態において、この装置は以下の特徴を含む：
ベース部材２；
ベース部材２上に配置したアレイであって、以下を含むアレイ：
第二フィルタエレメント１１の間に挿入され、かつ、液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ、高分子粒子３の中に組み込まれた蛍光希土類キレートを含む蛍光標識で標識した一つ以上の特異的結合試薬を含浸している、少なくとも１つの第一フィルタエレメント１；
第一フィルタエレメント１に接触し、かつ液体の移動を可能にするのに十分に多孔質である、少なくとも１つの第二フィルタエレメント１１；および
液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ第一フィルタエレメント１に接触している乾燥多孔質担体６（例えば、ニトロセルロース膜）であって、ここで
少なくとも１つの特異的結合試薬が、乾燥多孔質担体の少なくとも１つのゾーンに固定化される（図１５）。
【００６８】
実施形態７
【００６９】
検出装置の別の実施形態において、この装置は以下の特徴を含む：
高分子粒子３の中に組み込まれた蛍光希土類キレートを含む蛍光標識で標識した一つ以上の特異的結合試薬を含浸している、少なくとも１つの第一フィルタエレメント１；
乾燥多孔質担体６の中に固定化された特異的結合試薬と特異的に反応するタグで標識した、一つ以上の特異的結合試薬を含浸し、かつ、第一フィルタエレメント１と乾燥多孔質担体６との間に挿入され、かつ液体の移動を可能にするのに十分に多孔質である、少なくとも１つの第二フィルタエレメント１１；および
液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ第二フィルタエレメントに接触している乾燥多孔質担体６（例えば、ニトロセルロース膜）であって、ここで
少なくとも１つの特異的結合試薬が、乾燥多孔質担体の少なくとも１つのゾーンに固定化される（図１６）。
【００７０】
実施形態８
【００７１】
検出装置の別の実施形態において、この装置は以下の特徴を含む：
第二フィルタエレメント１１の間に挿入され、かつ、液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ、高分子粒子３の中に組み込まれた蛍光希土類キレートを含む蛍光標識で標識した一つ以上の特異的結合試薬を含浸している、少なくとも１つの第一フィルタエレメント１；
乾燥多孔質担体６の中に固定化された特異的結合試薬と特異的に反応するタグ３で標識した、一つ以上の特異的結合試薬を含浸し、かつ、第一フィルタエレメント１に接触し、かつ液体の移動を可能にするのに十分に多孔質である、少なくとも１つの第二フィルタエレメント１１；および
液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ第一フィルタエレメントに接触している乾燥多孔質担体６（例えば、ニトロセルロース膜）であって、ここで
少なくとも１つの特異的結合試薬が、乾燥多孔質担体の少なくとも１つのゾーンに固定化される（図１７）。
【００７２】
実施形態９
【００７３】
検出装置の別の実施形態において、この装置は以下の特徴を含む：
ベース部材２；
ベース部材上に配置したアレイであって、以下を含むアレイ：
高分子粒子３の中に組み込まれた蛍光希土類キレートを含む蛍光標識で標識した、一つ以上の特異的結合試薬を含浸している、少なくとも１つの第一フィルタエレメント１；
乾燥多孔質担体６の中に固定化された特異的結合試薬と特異的に反応するタグで標識した、一つ以上の特異的結合試薬を含浸し、かつ、第一フィルタエレメント１と乾燥多孔質担体６との間に挿入され、かつ液体の移動を可能にするのに十分に多孔質である、少なくとも１つの第二フィルタエレメント１１；および
液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ第二フィルタエレメントに接触している乾燥多孔質担体６（例えば、ニトロセルロース膜）であって、ここで
少なくとも１つの特異的結合試薬が、乾燥多孔質担体の少なくとも１つのゾーンに固定化される（図１８）。
【００７４】
実施形態１０
【００７５】
検出装置の別の実施形態において、この装置は以下の特徴を含む：
ベース部材２；
ベース部材２上に配置したアレイであって、以下を含むアレイ：
第二フィルタエレメント１１の間に挿入され、かつ、液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ、高分子粒子３の中に組み込まれた蛍光希土類キレートを含む蛍光標識で標識した一つ以上の特異的結合試薬を含浸している、少なくとも１つの第一フィルタエレメント１；
乾燥多孔質担体６の中に固定化された特異的結合試薬と特異的に反応するタグで標識した、一つ以上の特異的結合試薬を含浸し、かつ、第一フィルタエレメント１に接触し、かつ液体の移動を可能にするのに十分に多孔質である、少なくとも１つの第二フィルタエレメント１１；および
液体の移動を可能にするのに十分に多孔質であり、かつ、第一フィルタエレメント１に接触している乾燥多孔質担体６（例えば、ニトロセルロース膜）であって、ここで
少なくとも１つの特異的結合試薬が、乾燥多孔質担体の少なくとも１つのゾーンに固定化される（図１９）。
【００７６】
サンドイッチアッセイ
【００７７】
抗体−抗体サンドイッチ
【００７８】
固相上に固定化された特異的結合剤：モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体。蛍光色素で標識した特異的結合試薬：蛍光色素で標識したモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体。
【００７９】
抗体−抗原サンドイッチ
【００８０】
抗体−抗原サンドイッチ１
【００８１】
固相上に固定化された特異的結合剤：試料中の検体抗体に特異的な抗原（例えば、ヒト抗−ＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗体に対して特異的に反応性であるＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗原）
【００８２】
蛍光色素で標識した特異的結合試薬：蛍光色素で標識した２次モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体。この抗体は、試料中の１次抗体に特異的である。
【００８３】
抗体−抗原サンドイッチ２
【００８４】
固相上に固定化された特異的結合剤：２次モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体。この抗体は、試料中の１次抗体に特異的である。
【００８５】
蛍光色素で標識した特異的結合試薬：試料中の検体抗体に特異的な抗原（蛍光色素で標識）（例えば、ヒト抗−ＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗体に対して特異的に反応性であるＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗原）
【００８６】
抗原−抗原サンドイッチ
【００８７】
固相上に固定化された特異的結合剤：試料中の検体抗体に特異的な抗原（例えば、ヒト抗−ＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗体に対して特異的に反応性であるＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗原）
【００８８】
蛍光色素で標識した特異的結合試薬：試料中の検体抗体に特異的な抗原（蛍光色素で標識）（例えば、ヒト抗−ＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗体に対して特異的に反応性であるＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗原）
【００８９】
この形式は、以下を含む：
固相上に固定化された特異的結合剤（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）；固相上に固定化された特異的結合剤に特異的に反応するタグ（例えば、ビオチン）で標識した特異的結合試薬；蛍光色素で標識した特異的結合試薬。
【００９０】
この形式は、上記の全てのアッセイ形式に適用可能である；固相上に固定化された特異的結合剤を、固相上に固定化された特異的結合剤（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）およびタグで標識した特異的結合試薬に置き換えることによる。
【００９１】
競合アッセイ
【００９２】
形式１
【００９３】
蛍光色素で標識した特異的結合試薬（例えば、ハプテンに特異的な抗体）：試料中の目的の検体に結合して、反応複合体を形成可能である。
【００９４】
固相上に固定化された特異的結合剤（例えば、ハプテン）：蛍光色素で標識した遊離の特異的結合試薬と反応することが可能であり、かつ、反応複合体から検体を競合的に置換し、蛍光色素で標識した特異的結合試薬と反応することが可能である。
【００９５】
形式２
【００９６】
固相上に固定化された特異的結合試薬（例えば、ハプテンに特異的な抗体）：試料中の目的の検体または蛍光色素で標識した特異的結合剤（例えば、ハプテン）に競合的に結合可能である。
【００９７】
蛍光色素で標識した特異的結合剤（例えば、ハプテン）：試料中の目的の検体と競合可能である。
【００９８】
形式３
【００９９】
この形式は、以下を含む：
固相上に固定化された特異的結合剤（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）；固相上に固定化された特異的結合剤に特異的に反応する、タグ（例えば、ビオチン）で標識した特異的結合試薬；蛍光色素で標識した特異的結合試薬（ハプテン）。
【０１００】
この形式は、上記の全てのアッセイ形式に適用可能である；固相上に固定化された特異的結合剤を、固相上に固定化された特異的結合剤（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）およびタグで標識した特異的結合試薬に置き換えることによる。
【０１０１】
複数の検体の検出
【０１０２】
本発明の別の実施形態により、２以上の特定のタイプの標識化試薬および同数のタイプの対応する固定化試薬の存在によって、単一の液体試料中における複数の検体の検出が可能である。このデバイスは、フィルタエレメント全体に含浸された複数の標識試薬、および乾燥多孔質担体上のいくつかのアッセイ表示ゾーン中に画定された複数の対応する固定化物質を用いて、一方向性に組み立てることができる。この二方向性または多方向性の実施形態において、フィルタエレメントおよび乾燥多孔質担体のような２組以上の構成要素が、共通のリザーバに付随する。
【０１０３】
キットおよびこのキットの取扱説明書
【０１０４】
本発明は、本発明の検出装置を使用するためのキットを含む。このキットは、この検出装置を収容し得る、厚紙、プラスチックまたは任意の他の固体で作製された容器あるいはプラスチック袋を含み得る。このキットには、このキットの使用方法に関する説明書が含まれ得る。このような説明書は、この容器上に記載されていてもよく、紙の説明シートのようなこの容器の内部に収容された書面形式であってもよい。このキットおよび検出装置を使用するための説明書はまた、紙形式に加えて、または紙形式に代えて、ウェブサイト上の電子形式であってもよい。説明書はまた、このキットを販売するためのカタログ中に載せられていてもよい。
【実施例１】
【０１０５】
ユーロピウムキレートナノ粒子を用いたトロポニンI試験小片の調製
【０１０６】
抗−トロポニンI被覆ナノ粒子の調製
【０１０７】
ユーロピウムキレートナノ粒子のカルボキシル基を、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド（N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide）および１００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（N-hydroxysulfosuccinimide）で３０分間活性化した。この活性化粒子を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１）で１回洗浄した。２０ｍＭ／Ｌの抗−トロポニンI抗体を添加した。２時間インキュベーションの後、この抗体被覆粒子を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１）で３回洗浄した。
【０１０８】
色素パッドの調製
【０１０９】
大きさが８ｍｍ×３０５ｍｍのガラス繊維フィルターの長方形の小片に、抗−トロポニンI抗体被覆ナノ粒子、０．２％のトゥイーン−２０（ｔｗｅｅｎ−２０）、０．２５％ウシ血清アルブミン、０．５％スクロース（sucrose）、１０ｍＭリン酸ナトリウム（sodium phosphate）（ｐＨ７．５）を含む溶液を含浸させることによって、このガラス繊維フィルターを調製し、凍結乾燥機中で一定の減圧下で乾燥させた。このパッドを、使用するまでデシケーター中で乾燥保存した。
【０１１０】
フィルターパッドの調製
【０１１１】
このガラス繊維フィルターを、０．０５％のトゥイーン−２０、２％のスクロース、１％のＢＳＡおよび１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）の溶液で処理し、次いで室温で風乾した。
【０１１２】
膜上の抗体の固定化
【０１１３】
両面透明テープ（３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズ）を、薄いプラスチック板（３０５×６０ｍｍ）の底面から２０ｍｍのところに取り付けた。ニトロセルロース膜を３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズに切断し、この両面テープの表面上に直接取り付けた。トロポニンIについての固定化試験ラインのアッセイ表示ゾーンは、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．５）中の１ｍｇ／ｍｌヤギ抗−トロポニンI抗体の３０マイクロリットルの溶液を噴霧することによって、この膜の底面から９ｍｍ上に画定した。コントロールバンドとして、１ｍｇ／ｍｌのポリクローナル抗−マウスＩｇＧ抗体を、噴霧によってこの膜の底面から１３ｍｍ上に画定した。噴霧後、この膜を周囲温度で約１２時間乾燥させた。このベースおよびウイッキング膜を、さらに加工処理するまでデシケーター中に保存した。
【０１１４】
小片構築
【０１１５】
色素パッドをニトロセルロース膜の底面の真下のプラスチックベースに取り付け、フィルターパッドをこの色素パッドに隣接して取り付ける。次いで、このプラスチック板を６０ｍｍ長さで４ｍｍ幅の複数の小片に切断し、各々がニトロセルロース膜、色素パッドおよびフィルターパッドの直線アレイを含むようにした。
【０１１６】
アッセイ方法および結果：
【０１１７】
７０マイクロリットルの試料をフィルターパッド中に添加した場合、インキュベーション後にこの小片を紫外線に曝露すると、アッセイ表示ゾーンに検出可能なシグナルが出現し始めた。
【実施例２】
【０１１８】
コロイド金を用いたトロポニンI試験小片の調製
【０１１９】
金ゾルの調製
【０１２０】
１４００ｍｌの脱イオン水を沸騰させた。第２金水素酸（Hydroauric acid）（２９９〜３０５ｍｇ）を添加し、５分間沸騰を継続した。１０ｍｌの蒸留水中に溶解したクエン酸ナトリウム（Sodium citrate）（４４０ｍｇ）を、この金溶液に注ぎ込み、この溶液をもう１０分間沸騰させた。この溶液を周囲の室温まで冷ました。
【０１２１】
標識の調製
【０１２２】
金ゾルのｐＨを４０ｍＭ炭酸カリウム（potassium carbonate）で６．８に調整した。  実施例１で用いたのと同じモノクローナル抗体を５０ｍｌの金溶液に添加し、周囲温度で３０分間活発に攪拌した。１ｍｌの１５％ウシ血清アルブミンを添加し、この溶液を周囲温度で約１５分間連続的に攪拌した。コロイド金−モノクローナル抗体コンジュゲートを、ＧＳＡローター中で１０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、上清を捨て、得られたペレットを２５ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中の２％ウシ血清アルブミン中に懸濁することによって回収した。次いで、この懸濁液をＧＳＡローター中で１時間１０，０００ｒｐｍでスピンダウンした。この上清を再度捨て、このペレットを６ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中の２％ウシ血清アルブミン中に懸濁した。
【０１２３】
色素パッドの調製
【０１２４】
大きさが８ｍｍ×３０５ｍｍのガラス繊維フィルターの長方形の小片に、抗−トロポニンI抗体被覆コロイド金、０．２％のトゥイーン−２０、０．２５％ウシ血清アルブミン、０．５％スクロース、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含む溶液を含浸させることによって、このガラス繊維フィルターを調製し、凍結乾燥機中で一定の減圧下で乾燥させた。このパッドを、使用するまでデシケーター中で乾燥保存した。
【０１２５】
フィルターパッドの調製
【０１２６】
このガラス繊維フィルターを、０．０５％のトゥイーン−２０、２％のスクロース、１％のＢＳＡおよび１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）の溶液で処理し、次いで室温で風乾した。
【０１２７】
膜上の抗体の固定化
【０１２８】
両面透明テープ（３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズ）を、薄いプラスチック板（３０５×６０ｍｍ）の底面から２０ｍｍのところに取り付けた。ニトロセルロース膜を３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズに切断し、この両面テープの表面上に直接取り付けた。トロポニンIについての固定化試験ラインのアッセイ表示ゾーンは、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．５）中の１ｍｇ／ｍｌヤギ抗−トロポニンI抗体の３０マイクロリットルの溶液を噴霧することによって、この膜の底面から９ｍｍ上に画定した。コントロールバンドとして、１ｍｇ／ｍｌのポリクローナル抗−マウスＩｇＧ抗体を、噴霧によってこの膜の底面から１３ｍｍ上に画定した。噴霧後、この膜を周囲温度で約１２時間乾燥させた。このベースおよびウイッキング膜を、さらに加工処理するまでデシケーター中に保存した。
【０１２９】
小片構築
【０１３０】
色素パッドをニトロセルロース膜の底面の真下のプラスチックベースに取り付け、フィルターパッドをこの色素パッドに隣接して取り付けた。次いで、このプラスチック板を６０ｍｍ長さで４ｍｍ幅の複数の小片に切断し、各々がニトロセルロース膜、色素パッドおよびフィルターパッドの直線アレイを含むようにした。
【０１３１】
アッセイ方法および結果：
【０１３２】
７０マイクロリットルの試料をフィルターパッド中に添加した場合、検出可能なシグナルが、インキュベーション後にアッセイ表示ゾーンに出現し始めた。
【実施例３】
【０１３３】
各々の方法を用いて調製した小片の感度の比較
【０１３４】
実施例１で調製した小片および実施例２で調製した小片を試験して、感度を比較した。実施例１で調製した小片は、０．０２５ナノグラム／ｍｌの感度を示し、一方、実施例２で調製した小片は、０．５ナノグラム／ｍｌの感度を示した。ユーロピウムナノ粒子を用いて調製した小片は、コロイド金を用いて調製した小片よりも、約２０倍高感度の結果を示した。
【実施例４】
【０１３５】
ユーロピウムナノ粒子を用いたｈＣＧ試験小片の調製
【０１３６】
抗−ｈＣＧ被覆ナノ粒子の調製
【０１３７】
ユーロピウムキレートナノ粒子のカルボキシル基を、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミドおよび１００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドで３０分間活性化した。この活性化粒子を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１）で１回洗浄した。２０ｍＭ／Ｌの抗−ｈＣＧ抗体を添加した。２時間インキュベーションの後、この抗体被覆粒子を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１）で３回洗浄した。
【０１３８】
色素パッドの調製
【０１３９】
大きさが８ｍｍ×３０５ｍｍのガラス繊維フィルターの長方形の小片に、抗−ｈＣＧ抗体被覆ナノ粒子、０．２％のトゥイーン−２０、０．２５％ウシ血清アルブミン、０．５％スクロース、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含む溶液を含浸させることによって、このガラス繊維フィルターを調製し、凍結乾燥機中で一定の減圧下で乾燥させた。このパッドを、使用するまでデシケーター中で乾燥保存した。
【０１４０】
フィルターパッドの調製
【０１４１】
このガラス繊維フィルターを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、２％のスクロース、１％のＢＳＡおよび１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）の溶液で処理し、次いで室温で風乾した。
【０１４２】
膜上の抗体の固定化
【０１４３】
両面透明テープ（３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズ）を、薄いプラスチック板（３０５×６０ｍｍ）の底面から２０ｍｍのところに取り付けた。ニトロセルロース膜を３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズに切断し、この両面テープの表面上に直接取り付けた。ｈＣＧについての固定化試験ラインのアッセイ表示ゾーンは、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．５）中の１ｍｇ／ｍｌモノクローナル抗−ｈＣＧ抗体の３０マイクロリットルの溶液を噴霧することによって、この膜の底面から９ｍｍ上に画定した。コントロールバンドとして、１ｍｇ／ｍｌのポリクローナル抗−マウスＩｇＧ抗体を、噴霧によってこの膜の底面から１３ｍｍ上に画定した。噴霧後、この膜を周囲温度で約１２時間乾燥させた。このベースおよびウイッキング膜を、さらに加工処理するまでデシケーター中に保存した。
【０１４４】
小片構築
【０１４５】
色素パッドをニトロセルロース膜の底面の真下のプラスチックベースに取り付け、フィルターパッドをこの色素パッドに隣接して取り付ける。次いで、このプラスチック板を６０ｍｍ長さで４ｍｍ幅の複数の小片に切断し、各々がニトロセルロース膜、色素パッドおよびフィルターパッドの直線アレイを含むようにした。
【０１４６】
アッセイ方法および結果：
【０１４７】
７０マイクロリットルの試料をフィルターパッド中に添加した場合、インキュベーション後にこの小片を紫外線に曝露すると、アッセイ表示ゾーンに検出可能なシグナルが出現し始めた。
【実施例５】
【０１４８】
コロイド金を用いたｈＣＧ試験小片の調製
【０１４９】
金ゾルの調製
【０１５０】
１４００ｍｌの脱イオン水を沸騰させた。第２金水素酸（Hydroauric acid）（２９９〜３０５ｍｇ）を添加し、５分間沸騰を継続した。１０ｍｌの蒸留水中に溶解したクエン酸ナトリウム（４４０ｍｇ）を、この金溶液に注ぎ込み、この溶液をもう１０分間沸騰させた。この溶液を周囲の室温まで冷ました。
【０１５１】
標識の調製
【０１５２】
金ゾルのｐＨを４０ｍＭ炭酸カリウムで６．８に調整した。実施例４で用いたのと同じモノクローナル抗体を５０ｍｌの金溶液に添加し、周囲温度で３０分間強く攪拌した。１ｍｌの１５％ウシ血清アルブミンを添加し、この溶液を周囲温度で約１５分間連続的に攪拌した。コロイド金−モノクローナル抗体コンジュゲートを、ＧＳＡローター中で１０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、上清を捨て、得られたペレットを２５ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中の２％ウシ血清アルブミン中に懸濁することによって回収した。次いで、この懸濁液をＧＳＡローター中で１時間１０，０００ｒｐｍでスピンダウンした。この上清を再度捨て、このペレットを６ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中の２％ウシ血清アルブミン中に懸濁した。
【０１５３】
色素パッドの調製
【０１５４】
大きさが８ｍｍ×３０５ｍｍのガラス繊維フィルターの長方形の小片に、抗−ｈＣＧ抗体被覆コロイド金、０．２％のトゥイーン−２０、０．２５％ウシ血清アルブミン、０．５％スクロース、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含む溶液を含浸させることによって、このガラス繊維フィルターを調製し、凍結乾燥機中で一定の減圧下で乾燥させた。このパッドを、使用するまでデシケーター中で乾燥保存した。
【０１５５】
フィルターパッドの調製
【０１５６】
このガラス繊維フィルターを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、２％のスクロース、１％のＢＳＡおよび１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）の溶液で処理し、次いで室温で風乾した。
【０１５７】
膜上の抗体の固定化
【０１５８】
両面透明テープ（３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズ）を、薄いプラスチック板（３０５×６０ｍｍ）の底面から２０ｍｍのところに取り付けた。ニトロセルロース膜を３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズに切断し、この両面テープの表面上に直接取り付けた。ｈＣＧについての固定化試験ラインのアッセイ表示ゾーンは、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．５）中の１ｍｇ／ｍｌヤギ抗−トロポニンI抗体の３０マイクロリットルの溶液を噴霧することによって、この膜の底面から９ｍｍ上に画定した。コントロールバンドとして、１ｍｇ／ｍｌのポリクローナル抗−マウスＩｇＧ抗体を、噴霧によってこの膜の底面から１３ｍｍ上に画定した。噴霧後、この膜を周囲温度で約１２時間乾燥させた。このベースおよびウイッキング膜を、さらに加工処理するまでデシケーター中に保存した。
【０１５９】
小片構築
【０１６０】
色素パッドをニトロセルロース膜の底面の真下のプラスチックベースに取り付け、フィルターパッドをこの色素パッドに隣接して取り付けた。次いで、このプラスチック板を６０ｍｍ長さで４ｍｍ幅の複数の小片に切断し、各々がニトロセルロース膜、色素パッドおよびフィルターパッドの直線アレイを含むようにした。
【０１６１】
アッセイ方法および結果：
【０１６２】
７０マイクロリットルの試料をフィルターパッド中に添加した場合、検出可能なシグナルが、インキュベーション後にアッセイ表示ゾーンに出現し始めた。
【実施例６】
【０１６３】
各々の方法を用いて調製した小片の感度の比較
【０１６４】
実施例４で調製した小片および実施例５で調製した小片を試験して、感度を比較した。実施例４で調製した小片は、１．５ｍＩＵ／ｍｌの感度を示し、一方、実施例５で調製した小片は、１５ｍＩＵ／ｍｌの感度を示した。ユーロピウムナノ粒子を用いて調製した小片は、コロイド金を用いて調製した小片よりも、約１０倍高感度の結果を示した。
【実施例７】
【０１６５】
ユーロピウムキレートナノ粒子を用いたデング熱ウイルス試験小片の調製
【０１６６】
オリゴヌクレオチド被覆ナノ粒子の調製
【０１６７】
ユーロピウムキレートナノ粒子のカルボキシル基を、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミドおよび１００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドで３０分間活性化した。この活性化粒子を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１）で１回洗浄した。２０ｍＭ／Ｌのオリゴヌクレオチドを、ウシ血清アルブミンのような担体と共に添加した。２時間インキュベーションの後、このオリゴヌクレオチド被覆粒子を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１）で３回洗浄した。
【０１６８】
色素パッドの調製
【０１６９】
大きさが８ｍｍ×３０５ｍｍのガラス繊維フィルターの長方形の小片に、オリゴヌクレオチド被覆ナノ粒子、０．２％のトゥイーン−２０、０．２５％ウシ血清アルブミン、０．５％スクロース、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含む溶液を含浸させることによって、このガラス繊維フィルターを調製し、凍結乾燥機中で一定の減圧下で乾燥させた。このパッドを、使用するまでデシケーター中で乾燥保存した。
【０１７０】
フィルターパッドの調製
【０１７１】
このガラス繊維フィルターを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、２％のスクロース、１％のＢＳＡおよび１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）の溶液で処理し、次いで室温で風乾した。
【０１７２】
膜上のオリゴヌクレオチドの固定化
【０１７３】
両面透明テープ（３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズ）を、薄いプラスチック板（３０５×６０ｍｍ）の底面から２０ｍｍのところに取り付けた。ニトロセルロース膜を３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズに切断し、この両面テープの表面上に直接取り付けた。デング熱ウイルス特異的オリゴヌクレオチドについての固定化試験ラインのアッセイ表示ゾーンは、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．５）中の１ｍｇ／ｍｌオリゴヌクレオチド−ＢＳＡコンジュゲートの３０マイクロリットルの溶液を噴霧することによって、この膜の底面から９ｍｍ上に画定した。噴霧後、この膜を周囲温度で約１２時間乾燥させた。このベースおよびウイッキング膜を、さらに加工処理するまでデシケーター中に保存した。
【０１７４】
小片構築
【０１７５】
色素パッドをニトロセルロース膜の底面の真下のプラスチックベースに取り付け、フィルターパッドをこの色素パッドに隣接して取り付ける。次いで、このプラスチック板を６０ｍｍ長さで４ｍｍ幅の複数の小片に切断し、各々がニトロセルロース膜、色素パッドおよびフィルターパッドの直線アレイを含むようにした。
【０１７６】
アッセイ方法および結果：
【０１７７】
７０マイクロリットルの試料をフィルターパッド中に添加した場合、インキュベーション後にこの小片を紫外線に曝露すると、アッセイ表示ゾーンに検出可能なシグナルが出現し始めた。
【実施例８】
【０１７８】
ポリメラーゼ連鎖反応によるユーロピウムキレートナノ粒子を用いたデング熱ウイルス試験小片の調製
【０１７９】
ストレプトアビジン被覆ナノ粒子の調製
【０１８０】
ユーロピウムキレートナノ粒子のカルボキシル基を、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミドおよび１００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドで３０分間活性化した。この活性化粒子を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１）で１回洗浄した。２０ｍＭ／Ｌのストレプトアビジンを添加した。２時間インキュベーションの後、このストレプトアビジン被覆粒子を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１）で３回洗浄した。
【０１８１】
色素パッドの調製
【０１８２】
大きさが８ｍｍ×３０５ｍｍのガラス繊維フィルターの長方形の小片に、ストレプトアビジン被覆ナノ粒子、０．２％のトゥイーン−２０、０．２５％ウシ血清アルブミン、０．５％スクロース、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含む溶液を含浸させることによって、このガラス繊維フィルターを調製し、凍結乾燥機中で一定の減圧下で乾燥させた。このパッドを、使用するまでデシケーター中で乾燥保存した。
【０１８３】
フィルターパッドの調製
【０１８４】
このガラス繊維フィルターを、０．０５％のトゥイーン−２０、２％のスクロース、１％のＢＳＡおよび１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）の溶液で処理し、次いで室温で風乾した。
【０１８５】
膜上の抗−ハプテン抗体の固定化
【０１８６】
両面透明テープ（３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズ）を、薄いプラスチック板（３０５×６０ｍｍ）の底面から２０ｍｍのところに取り付けた。ニトロセルロース膜を３０５ｍｍ×２５ｍｍサイズに切断し、この両面テープの表面上に直接取り付けた。抗−ハプテン抗体についての固定化試験ラインのアッセイ表示ゾーンは、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．５）中の１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンオリゴヌクレオチド−ＢＳＡコンジュゲートの３０マイクロリットルの溶液を噴霧することによって、この膜の底面から９ｍｍ上に画定した。噴霧後、この膜を周囲温度で約１２時間乾燥させた。このベースおよびウイッキング膜を、さらに加工処理するまでデシケーター中に保存した。
【０１８７】
小片構築
【０１８８】
色素パッドをニトロセルロース膜の底面の真下のプラスチックベースに取り付け、フィルターパッドをこの色素パッドに隣接して取り付けた。次いで、このプラスチック板を６０ｍｍ長さで４ｍｍ幅の複数の小片に切断し、各々がニトロセルロース膜、色素パッドおよびフィルターパッドの直線アレイを含むようにした。
【０１８９】
アッセイ方法および結果：
【０１９０】
２マイクロリットルの試料および７０マイクロリットルの展開溶液をフィルターパッド中に添加した場合、インキュベーション後にこの小片を紫外線に曝露すると、アッセイ表示ゾーンに検出可能なシグナルが出現し始めた。
【０１９１】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、引用によりそれらの全体を援用する。
【０１９２】
当業者は、本明細書中に具体的に記載した本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識するであろうし、または日常の範囲を超えない実験を用いるだけで確認することができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
本発明は、本明細書中で上に示した詳細な説明、および添付の図面（これらは例証にすぎず、従って本発明を限定するものではない）から、さらに十分に理解される。
【図１】図１は、本発明デバイスの概略図を示す。
【図２】図２は、複数の検体を検出するための本発明デバイスを示す。
【図３】図３は、試験デバイスの像を示す。
【図４】図４は、迅速なクロマトグラフィー検出システムの構成を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、（Ａ）コロイド金抗体コンジュゲートの画像結果、（Ｂ）ユーロピウム粒子の画像結果を示す。
【図６】図６は、迅速な核酸検出システムの構成を示す。
【図７】図７は、試料中の特定のＤＮＡ配列（例えば生物病原体由来）の検出のためのアッセイ原理の図解を示す。
【図８】図８は、時間分解ランタニド発光を測定するための機器を示す（Ｘｉａｏ，ＭおよびＳｅｌｖｉｎ，ＰＲ．「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ．」Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ １９９９；７０（１０）：３８７７−８１）。
【図９】図９は、試験デバイスの像を示す。
【図１０】図１０は、試験小片の一実施形態を示す。
【図１１】図１１は、試験小片の一実施形態を示す。
【図１２】図１２は、試験小片の一実施形態を示す。
【図１３】図１３は、試験小片の一実施形態を示す。
【図１４】図１４は、試験小片の一実施形態を示す。
【図１５】図１５は、試験小片の一実施形態を示す。
【図１６】図１６は、試験小片の一実施形態を示す。
【図１７】図１７は、試験小片の一実施形態を示す。
【図１８】図１８は、試験小片の一実施形態を示す。
【図１９】図１９は、試験小片の一実施形態を示す。
【図１】
2010091576.tif 000003
【図２】
2010091576.tif 000004
【図３】
2010091576.tif 000005
【図４】
2010091576.tif 000006
【図５】
2010091576.tif 000007
【図６】
2010091576.tif 000008
【図７】
2010091576.tif 000009
【図８】
2010091576.tif 000010
【図９】
2010091576.tif 000011
【図１０】
2010091576.tif 000012
【図１１】
2010091576.tif 000013
【図１２】
2010091576.tif 000014
【図１３】
2010091576.tif 000015
【図１４】
2010091576.tif 000016
【図１５】
2010091576.tif 000017
【図１６】
2010091576.tif 000018
【図１７】
2010091576.tif 000019
【図１８】
2010091576.tif 000020
【図１９】
2010091576.tif 000021