(57)【要約】【課題】本発明は、イチゴの重要病害で初期症状が似ている病原菌を早期に検出し、同定しうる検査方法を提供することを課題とする。より詳しくは、炭疽病、疫病および萎黄病等の病原菌の検出方法を提供することを課題とし、具体的には、検査に使用しうるオリゴヌクレオチド（プライマー）を提供することを課題とする。【解決手段】各病原菌の遺伝子特異的に増幅し、増幅産物の分子量が異なるように設計された各プライマーを混合したプライマーミックスを用いて遺伝子増幅操作を行い、増幅産物の分子量を測定することによる。【選択図】図２
2010046038.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イチゴ組織または土壌を試料とし、試料中に混入可能性のある遺伝子を分析することによるイチゴの重要病害の検出方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする検出方法：
１）イチゴの重要病害に関連する少なくとも２種以上の病原菌の遺伝子配列を各々特異的に増幅しうる複数のプライマーを用いて遺伝子増幅処理を行う工程；
２）上記遺伝子増幅処理工程により得られた増幅産物の分子量を測定する工程；
３）測定した分子量から、増幅産物に関連する病原菌を同定する工程。
【請求項２】
前記イチゴの重要病害が、炭疽病、疫病および／または萎黄病である請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記イチゴの重要病害に関連する病原菌が、糸状菌から選択される少なくとも２種以上である、請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記糸状菌が、グロメレラ(Glomerella)属、コレトトリカム(Colletotrichum)属、フィトフィトラ(Phytophthora)属、フザリウム(Fusarium)属のいずれかに属する請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
複数のプライマーが、各病原菌のリボソームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ(internal transcribed spacer)領域の部分を含む塩基配列を検出しうるプライマーである、請求項１〜４のいずれか１に記載の検出方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１に記載の検出方法に使用する遺伝子増幅用プライマー。
【請求項７】
請求項６に記載のプライマーであり、以下の１）〜１０）のいずれかに示す塩基配列、並びに各塩基配列のうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなり、病原菌の遺伝子配列を特異的に増幅しうるプライマー機能を有するオリゴヌクレオチドから選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドを含む、イチゴの重要病害検出用の遺伝子増幅用プライマー：
１）GTAGGGTCTCCGCGACCCT（配列番号１）；
２）CCTAAACTCTGTTTCTATATGTAAC（配列番号２）；
３）TTCCTACCTGATCCGAGGTCA（配列番号３）；
４）GCCGGCCCCACCACGGGGA（配列番号４）；
５）AAGGGCCCACGTGTGCCGTG（配列番号５）；
６）CTTCGGCCTGAGCTAGTAGCTTT（配列番号６）；
７）ATGCATACCGAAGTACACACACAT（配列番号７）；
８）CAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGC（配列番号８）；
９）ATGCATACCGAAGTACACATTAAG（配列番号９）；
１０）ctatatgtaacttctgagtaaaacc（配列番号１０）。
【請求項８】
プライマー機能を有する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを１対とし、以下のＡ）〜Ｅ）のいずれかの組み合わせからなるオリゴヌクレオチドのセットであって、請求項１〜５のいずれか１に記載の検出方法に使用するイチゴの重要病害検出用の遺伝子増幅用プライマーセット：
Ａ）配列番号１に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ；
Ｂ）配列番号４に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号５に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ；
Ｃ）配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ；
Ｄ）配列番号８に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号９に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ；
Ｅ）配列番号６に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号７に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項９】
請求項８のＡ）〜Ｅ）のいずれかのオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる遺伝子増幅用プライマーセットを、少なくとも２セット以上含む、イチゴの重要病害の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イチゴ重要病害に係る病原菌の早期診断のために各病原菌を検出するための各病原菌特異的ＤＮＡ配列を増幅しうるＤＮＡ増幅プライマーに関し、より詳しくは各種病原菌特異的ＤＮＡ配列を増幅する工程を含むイチゴ重要病害に係る病原菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イチゴの重要病害である炭疽病、疫病、萎黄病はいずれも糸状菌の感染により引き起こされ、初期症状が似ている。各重要病害に起因する病原菌を早期に同定し、適切な対策をとることが被害の拡大を防ぐことにつながる。しかしながら、従来は、病原菌を分離・培養して形態を比較することで、菌の同定が行われ、時間と熟練と菌の形態に関する深い知識が必要であった。
【０００３】
近年では、種特異的なＤＮＡ情報に基づいた手法による病原菌等の同定が実施可能である。種特異的なＤＮＡ情報に基づいた遺伝子反応を用いた検査法は、１）操作が簡便であり、高度に専門的な知識を要しない、２）きわめて微量のＤＮＡを対象とした検査ができ、培養法等と比較して病原菌をより高感度に検出できる、３）検査に要する時間が短い、などの利点があり、病原菌を同定する方法として幾つか報告されている。
【０００４】
例えば非特許文献１には、イチゴ、キク病原菌の核ｒＤＮＡ−ＩＴＳ領域のシークエンスと属特異的プライマーの設計について開示されており、非特許文献２には徳島県で最近話題になっているイチゴ炭疽病、キュウリ褐斑病における薬剤耐性菌の出現状況に関し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手法を用いてチトクロームｂ遺伝子変異の有無により検定を行ったことが開示されている。また、特許文献１には、真菌の病原体であるコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムの検出のためのＰＣＲ分析方法について開示がある。
【０００５】
しかしながら、複数の菌の由来する各種のイチゴの重要病害に関し、一度の検査で容易かつ正確に菌を検出し、同定しうる検出方法はなかった。なお、各重要病害に対し、とりうる対策が異なるので、その対策を誤ると被害の拡大を招くことになる（図１参照）。したがって、早期に病原菌を検出し、同定する方法が望まれている。
【非特許文献１】奈良県農業技術センター研究報告  第32号、9-18頁（2001年）
【非特許文献２】四国植物防疫研究  第41巻、49-50頁（2006年）
【特許文献１】特表２００４−５２０８４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、イチゴの重要病害で初期症状が似ている病原菌を早期に検出し、同定しうる検査方法を提供することを課題とする。より詳しくは、炭疽病、疫病および萎黄病等の病原菌の検出方法を提供することを課題とし、具体的には、検査に使用しうるオリゴヌクレオチド（プライマー）を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、各病原菌の遺伝子特異的に増幅し、増幅産物の分子量が異なるように設計された各プライマーを混合したプライマーミックスを用いて遺伝子増幅操作を行い、増幅産物の分子量を測定することにより、容易に病原菌を検出し、同定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．イチゴ組織または土壌を試料とし、試料中に混入可能性のある遺伝子を分析することによるイチゴの重要病害の検出方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする検出方法：
１）イチゴの重要病害に関連する少なくとも２種以上の病原菌の遺伝子配列を各々特異的に増幅しうる複数のプライマーを用いて遺伝子増幅処理を行う工程；
２）上記遺伝子増幅処理工程により得られた増幅産物の分子量を測定する工程；
３）測定した分子量から、増幅産物に関連する病原菌を同定する工程。
２．前記イチゴの重要病害が、炭疽病、疫病および／または萎黄病である前項１に記載の検出方法。
３．前記イチゴの重要病害に関連する病原菌が、糸状菌から選択される少なくとも２種以上である、前項１または２に記載の検出方法。
４．前記糸状菌が、グロメレラ(Glomerella)属、コレトトリカム(Colletotrichum)属、フィトフィトラ(Phytophthora)属、フザリウム(Fusarium)属のいずれかに属する前項３に記載の検出方法。
５．複数のプライマーが、各病原菌のリボソームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ(internal transcribed spacer)領域の部分を含む塩基配列を検出しうるプライマーである、前項１〜４のいずれか１に記載の検出方法。
６．前項１〜５のいずれか１に記載の検出方法に使用する遺伝子増幅用プライマー。
７．前項６に記載のプライマーであり、以下の１）〜１０）のいずれかに示す塩基配列、並びに各塩基配列のうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなり、病原菌の遺伝子配列を特異的に増幅しうるプライマー機能を有するオリゴヌクレオチドから選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドを含む、イチゴの重要病害検出用の遺伝子増幅用プライマー：
１）GTAGGGTCTCCGCGACCCT（配列番号１）；
２）CCTAAACTCTGTTTCTATATGTAAC（配列番号２）；
３）TTCCTACCTGATCCGAGGTCA（配列番号３）；
４）GCCGGCCCCACCACGGGGA（配列番号４）；
５）AAGGGCCCACGTGTGCCGTG（配列番号５）；
６）CTTCGGCCTGAGCTAGTAGCTTT（配列番号６）；
７）ATGCATACCGAAGTACACACACAT（配列番号７）；
８）CAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGC（配列番号８）；
９）ATGCATACCGAAGTACACATTAAG（配列番号９）；
１０）ctatatgtaacttctgagtaaaacc（配列番号１０）。
８．プライマー機能を有する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを１対とし、以下のＡ）〜Ｅ）のいずれかの組み合わせからなるオリゴヌクレオチドのセットであって、前項１〜５のいずれか１に記載の検出方法に使用するイチゴの重要病害検出用の遺伝子増幅用プライマーセット：
Ａ）配列番号１に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ；
Ｂ）配列番号４に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号５に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ；
Ｃ）配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ；
Ｄ）配列番号８に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号９に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ；
Ｅ）配列番号６に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号７に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
９．前項８のＡ）〜Ｅ）のいずれかのオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる遺伝子増幅用プライマーセットを、少なくとも２セット以上含む、イチゴの重要病害の検出用キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の検出方法によると、症状の似ているイチゴ重要病害について、簡便な操作で複数種の病原菌を同時に検査することができ、早期に検出し、同定することができる。検出に際し、従来の方法では病原菌を分離・培養することが必要であり、菌の形態を観察することを要するため、正確に判断するためには時間と熟練と菌の形態に関する深い知識が必要であったが、本発明の検出方法では、そのような経験が浅い場合でも、正確に検出し、同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のイチゴの重要病害の検出方法は、イチゴ組織または土壌を試料とし、試料中に混入可能性のある遺伝子を分析することにより行われる。遺伝子の分析による検出方法は、少なくとも以下の工程を含む。
１）イチゴの重要病害に関連する少なくとも２種以上の病原菌の遺伝子配列を各々特異的に増幅しうる複数のプライマーを用いて遺伝子増幅処理を行う工程；
２）上記遺伝子増幅処理工程により得られた増幅産物の分子量を測定する工程；
３）測定した分子量から、増幅産物に関連する病原菌を同定する工程。
【００１１】
上記において、本発明の検出方法は、イチゴの重要病害に起因する病原菌を同定するものであり、細菌、糸状菌、真菌やウイルスなど、遺伝子を有する病原菌に起因する重要病害に対して本発明の検出方法を適用することができる。特に、初期症状の似ているイチゴ重要病害としては、炭疽病、疫病および萎黄病が挙げられる。これらの重要病害は、いずれも糸状菌に起因するものである。糸状菌として、具体的には、グロメレラ(Glomerella)属、コレトトリカム(Colletotrichum)属、フィトフィトラ(Phytophthora)属、フザリウム(Fusarium)属が挙げられ、より具体的には炭疽病菌であるGlomerella cingulataおよびColletotrichum acutatum、疫病菌であるPhytophthora nicotianaeおよびPhytophthora cactorum、並びに萎黄病菌であるFusarium oxysporumが挙げられる。
【００１２】
本発明の検出方法に供する試料は、イチゴ組織または土壌から取得することができる。重要病害関連病原菌に感染可能性のあるイチゴ植物組織、またはイチゴ栽培に関連する土壌、例えばイチゴが過去、現在において栽培に供されている土壌若しくは今後供される可能性のある土壌を試料とし、これらの試料からＤＮＡを抽出することで、本発明の検出方法に供することができる。試料からのＤＮＡの抽出は、例えば、フェノール・クロロホルム法のような常法や、市販のＤＮＡ抽出キット（例えば、Nucleon PhytoPure TM(Nucleon Bioscience社)）を用いることができる。試料から抽出したＤＮＡを検体として、本発明のプライマーを用い、遺伝子を増幅することができる。
【００１３】
本発明の検出方法は、上記の病原菌の遺伝子配列を特異的に増幅しうる遺伝子増幅処理工程を含む。本発明における遺伝子増幅方法は、遺伝子を増幅可能であればよく、自体公知の増幅方法のいずれであっても良いし、今後開発される新たな増幅方法であっても良い。遺伝子増幅方法の例として、具体的にはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法、Science, 230:1350-1354,1985)やＬＡＭＰ法（特開2001-242169号公報）等などと適用することができる。最も一般的で簡便な遺伝子増幅方法として、ＰＣＲ法が挙げられる。
例えば、試料中に検出したい遺伝子の混入が極微量の場合は、微量の遺伝子であっても増幅可能な方法が好適である。ＰＣＲ法の場合、例えばリアルタイムＰＣＲ法などの手法により、感度よく検出することができる。
【００１４】
本発明の検出方法では、上記の病原菌のうち、２種以上の遺伝子配列を各々特異的に増幅しうる複数のプライマーを用いて、同時に遺伝子増幅処理を行うことを特徴とする。ここで、２種以上とは、少なくとも２種であればよく、それ以上であっても良い。つまり、各遺伝子の配列を個々に増幅処理するのではなく、一度の増幅処理において少なくとも２種以上の遺伝子を増幅処理でき、得られた増幅産物から遺伝子の種類を特定できることが必要である。そのような機能を有する複数のプライマーとは、各遺伝子特異的に増幅しうる複数のプライマーで、同様の増幅条件、例えば温度条件、時間条件等を共通にして各遺伝子の増幅処理可能な複数のプライマーであることをいう。また、本発明の検査方法に使用しうるプライマーを用いることにより得られた増幅産物は、遺伝子ごとに異なる分子量のものが検出されることが必要である。具体的には、例えばGlomerella cingulata、Colletotrichum acutatum、Phytophthora nicotianae、Phytophthora cactorum、Fusarium oxysporumなどから少なくとも２種、好ましくは５種の菌に各々特異的な遺伝子配列を増幅することができればよく、得られた増幅産物は、遺伝子の種類により分子量が各々異なればよい。
【００１５】
ここで、増幅される各遺伝子は、各病原菌特異的な配列を有する部分であることが必要である。特異的な配列を有する遺伝子としては、各病原菌のリボソームＲＮＡ（以下単に、「ｒＲＮＡ」という。）遺伝子が挙げられる。ｒＲＮＡの遺伝子は、そのコピー数の多さによって、分子プローブターゲットとして使用するのに好適である。糸状菌のｒＲＮＡ遺伝子は、ユニットとして組織化され、各ユニットは１８Ｓ、５．８Ｓおよび２６Ｓの３つの成熟したサブユニットをコードする。これらのサブユニットは、２つの内部転写スペーサーであるＩＴＳ(internal transcribed spacer)領域、すなわちＩＴＳ IおよびＩＴＳ IIに分離される。成熟したｒＲＮＡ配列間の高い保存性にもかかわらず、非転写領域およびスペーサー領域の配列は、通常保存性が低いため、各菌種の検出のためのターゲット配列として好適である。本発明の検査方法に使用可能なプライマーは、特に各病原菌に特異的な配列を検出できればよく、具体的にはｒＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ領域の部分を含む塩基配列を増幅できればよい。
【００１６】
本発明の検出方法に使用可能な遺伝子増幅用プライマーは、具体的には以下の１）〜１０）のいずれかに示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらには、各塩基配列のうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなり、病原菌の遺伝子配列を特異的に増幅しうるプライマー機能を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。
１）GTAGGGTCTCCGCGACCCT（配列番号１）
２）CCTAAACTCTGTTTCTATATGTAAC（配列番号２）
３）TTCCTACCTGATCCGAGGTCA（配列番号３）
４）GCCGGCCCCACCACGGGGA（配列番号４）
５）AAGGGCCCACGTGTGCCGTG（配列番号５）
６）CTTCGGCCTGAGCTAGTAGCTTT（配列番号６）
７）ATGCATACCGAAGTACACACACAT（配列番号７）
８）CAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGC（配列番号８）
９）ATGCATACCGAAGTACACATTAAG（配列番号９）
１０）ctatatgtaacttctgagtaaaacc（配列番号１０）。
【００１７】
反応系におけるプライマーの濃度は、所望のＤＮＡが増幅しうる条件であれば良く、特に制限されないが、各プライマーは一般的には０．１〜２μＭで使用することができ、特に約０．２５〜０．７５μＭで使用することが好ましい。反応系に加えるTaqポリメラーゼは、たとえばタカラ社製 Ex taqのような、増幅効率の優れたものが望ましいが、通常のTaqポリメラーゼによっても遺伝子増幅反応のサイクルを増すことにより増幅されるＤＮＡ断片の量を増加させることができる。
【００１８】
上記プライマーを用いた遺伝子増幅工程により得られた増幅産物は、上述したように病原菌由来の遺伝子ごとに分子量が異なるため、遺伝子断片の分子量を測定することにより遺伝子の種類を同定することができる。増幅産物としての遺伝子断片分子量の測定方法は、特に限定されないが、例えば電気泳動法を用いるのが好適である。具体的には、アガロースゲル電気泳動法により増幅産物を分離し、エチジウムブロマイド等ＤＮＡ染色試薬により染色し、検出することができる。
【００１９】
試料中に所望の病原菌由来の遺伝子が存在していれば、上記のようにして増幅された遺伝子断片が検出され得る。検出限界は、用いるプライマーの種類および組み合わせ、試料中の対象遺伝子の量、増幅反応条件、検出方法などの種々の要因によって異なり得る。適切な条件を選択すれば、微量の試料においても、高感度で遺伝子の存在を検出することができ、病原菌を検出し、同定することができる。
【００２０】
本発明は、上記プライマーのほか、プライマー機能を有する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを１対としたプライマーセットにも及ぶ。ここでは、プライマーの組み合わせが２種のみのものをプライマーペアといい、２種以上のプライマーを含むものを包括的にプライマーセットという。
具体的には以下のＡ）〜Ｅ）のいずれかの組み合わせからなるオリゴヌクレオチドのセットからなるイチゴの重要病害検出用の遺伝子増幅用プライマーセットが挙げられる。
【００２１】
Ａ）Glomerella cingulata特異的遺伝子検出用
配列番号１または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
【００２２】
Ｂ）Colletotrichum acutatum特異的遺伝子検出用
配列番号４に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号５に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
【００２３】
Ｃ）Fusarium oxysporum特異的遺伝子検出用
配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
【００２４】
Ｄ）Phytophthora nicotianae特異的遺伝子検出用
配列番号８に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号９に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
【００２５】
Ｅ）Phytophthora cactorum特異的遺伝子検出用
配列番号６に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかと、配列番号７に記載のオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドのうち、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、付加若しくは導入された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかから選択される、２種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
【００２６】
本発明は、イチゴの重要病害の検出用キットにも及ぶ。具体的には、上記Ａ）〜Ｅ）のいずれかのオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる遺伝子増幅用プライマーペアを、少なくとも２種以上含むキットが挙げられる。具体的には、上記Ａ）〜Ｅ）で特定される２種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーペアを５種含んでいてもよいし、例えばGlomerella cingulataおよびFusarium oxysporumを検出するためのプライマーは、いずれも配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドを用いることができるため、共用して用いることもできる。具体的には、配列番号１〜９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットのキットとして用いることができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、実施例においては、プライマーの塩基配列が特定されて示されているが、その塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに１もしくは複数個の塩基が置換し、欠失し、挿入し、あるいは付加されたオリゴヌクレオチドであって、ＤＮＡ増幅反応に供されることによって、特定のイチゴ重要病害に係る菌のＤＮＡを特異的に検出し得るプライマーもまた、本発明の範囲に含まれることはいうまでもない。
【００２８】
（実施例１）プライマーミックスの調製１
１）試料
試料としてイチゴに病原性を持つ培養菌株５種（Glomerella cingulata，Colletotrichum acutatum，Fusarium oxysporum, Phytophthora nicotianae, Phytophthora cactorum）および実験的にこれらの菌に病気に感染させたイチゴ苗を用いた。更に徳島県内のイチゴ栽培農家から病原菌に感染したと思われるイチゴ苗２８株を入手し、実験に用いた。
【００２９】
２）試料からのＤＮＡの抽出
ＤＮＡの抽出に、植物ＤＮＡ抽出キットNucleon PhytoPure TM(Nucleon Bioscience社)を用いた。操作はマニュアルに従って次のような手順で行った。
上記５種の病原菌の培養菌株を寒天プレート上に培養し、菌叢をヘラで約２５ｍｇ掻き取り、乳鉢中で蒸留水１０００μＬを加え、氷温で組織をすり潰した。上記キットに含まれる試薬１(reagent1)を１５００μＬ加え、乳鉢でさらにすり潰した後、７００μＬを採取し、マイクロチューブに移した。マイクロチューブ中の細胞破砕液に、上記キットに含まれる試薬２(reagent2)を２００μＬ加え、上下をよく反転し混合後、アルミバス中６５℃で２０分間保温し、２−３分ごとによく振って撹拌した。その後、氷中で２０分間静置し、−２０℃の冷クロロホルム５００μＬと上記キットに含まれる上記キットに含まれる精製試薬(Nucleon PhytoPure resin)を１００μＬ加え、室温で１０分間上下を反転させながら混合した。５０００ｒｐｍで遠心し、上層（ＤＮＡ層）を滅菌済の新しい１．５ｍＬチューブに移した。冷イソプロパノールを６００μＬ加えて、撹拌してＤＮＡを析出させた。ＤＮＡのペレットを得るため、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨てた。７０％エタノールを３００μＬ加え、再び１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を廃棄した。沈殿物を真空ポンプで２分間真空状態に置き、ＤＮＡを含む沈殿物を乾燥させた。乾燥した沈殿物は５０μＬの×０．１ ＴＥ緩衝液を加えてピペッティングにより溶解した後、−２０℃で保存した。
【００３０】
イチゴ苗に関しては、苗の組織（葉、クラウン）０．１５ｇをはさみで細かく切り、上述と同様の操作を行い、ＤＮＡを抽出した。
【００３１】
３）プライマーの作製
上記５種の菌種の遺伝子を、一度の遺伝子増幅処理（マルチプルＰＣＲ）で検出しうるように、プライマーを設計した。各プライマーは、各菌種特異的な遺伝子の配列部分を増幅可能であり、かつ、得られた増幅産物の分子量が異なるように考慮して設計した（図２参照）。
【００３２】
プライマーの設計にあたり、NCBIのデータベースに登録されている既知の配列を参考にした。１種類の菌につき、ヌクレオチド数が一番長い配列を抜粋し、解析ソフトウェアClustalXによりアライメントし、ｒＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ IおよびＩＴＳ IIの２領域上に菌特異的プライマーを設計した（表１）。各菌種の遺伝子を検出するためのプライマーペアを表２に示した。このとき、フォワードプライマーとリバースプライマーとで挟まれた配列の長さが、個々に異なるよう留意した（表２、図２）。プライマーとして利用されるオリゴヌクレオチドは、日本遺伝子研究所（仙台市）に受託して合成した。
【００３３】
【表１】
2010046038.tif 000003
【００３４】
【表２】
2010046038.tif 000004
【００３５】
４）ＤＮＡ量の確認
上記２により抽出、精製したＤＮＡ溶液中のＤＮＡ収量を測定するため、既知濃度のマーカーＤＮＡとともに電気泳動を行い、染色後のバンドの発色を比較して、ＤＮＡ濃度を計算した。ＤＮＡ溶液８μＬに染色液（０．２５％Bromphenol blue（BPB）、４０％スクロース、１００ｍＭ ＥＤＴＡ）を２μＬ加え、電気泳動を行った。マーカーＤＮＡとして、制限酵素Hind IIIで消化したλＤＮＡ（０．２５μＬ／１０μＬ）を１０μＬ添加した。電気泳動装置はMupid(R)-2（コスモ・バイオ、東京）を用い、２．０％のアガロースゲル、１×ＴＡＥ緩衝液中を５０Ｖで８０分泳動することにより、ＤＮＡ断片を展開した。アガロースは、核酸電気泳動用アガロース(Agarose for ≧1Kbp fragment（ナカライテスク、京都市）)を使用した。泳動終了後、１００ｍＬの蒸留水に５ｍｇ／ｍＬのエチジウムブロマイド（ＥＢ）を１２μＬ加えた染色液にゲルを移し、３０分おいて染色した。染色後、UVP Ultraviolet Transilluminator TDM-20（UVP, Inc., Uoland, CA, USA）により紫外線を照射し、写真撮影した。
【００３６】
５）遺伝子増幅（ＰＣＲ法）
ＰＣＲ法による遺伝子増幅はPuReTaq Ready-To-Go PCR Beads in strips（Amersham BioScience, Inc, Piscataway, NJ, USA）を使用し、サーマルサイクラーは、TaKaRa PCR Thermal Cycle Dice TP600 Gradient/TP650 Standard（タカラバイオ）を用いて行った。検体の調製は以下の手順で行った。
【００３７】
上記３）で作製した各プライマーについて、各々２．５ｐｍｏｌ／μＬ（２．５μＭ）に希釈したプライマー溶液を作製し、反応液中で１／１０量となるようにした。ただし、CacuR1のみ他のプライマーよりも３倍の濃度にして混合した。プライマー溶液に滅菌水を加え、各プライマーの最終濃度が０．２５μＭとなるようにした。ただし、プライマーCacuR1のみ最終濃度０．７５μＭとなるようにした。
各菌に対応する１対のプライマーペアおよびすべてのプライマーを混合したプライマーミックス溶液を、上記濃度に従い作製した。
【００３８】
ＰＣＲ用マイクロチューブ（PuReTaq Ready-To-Goシリーズ、ＧＥヘルスケア社）に、プライマー溶液、および上記２）で抽出したＤＮＡを加え、さらに反応液が２５μＬとなるように滅菌水を加えて混合し、ＰＣＲを行った。
各菌種のＤＮＡは、各々個別にＰＣＲを行う他、５種をすべて混合したＤＮＡ溶液を作製してＰＣＲを行った。
【００３９】
サーマルサイクラーで変性過程を９４ ℃で５分を１回、次に変性過程を９４℃で３０秒、アニーリングを５５℃または５３℃で３０秒、伸長反応を７２℃で３０秒のサイクルを３５回繰り返し、その後、伸長反応を７２℃で７分を１回行った後４℃に冷却して終了させた。
【００４０】
６）アガロース電気泳動
ＰＣＲ後のアガロース電気泳動は、核酸電気泳動用アガロース(Agarose for 50~800bp fragment（ナカライテスク、京都市）)を用い、１．０％の濃度で行った以外は４）と同手法により行った。電気泳動後、同様にＥＢ染色し、写真撮影した。
【００４１】
上記電気泳動の結果を図３に示した。各病原菌検出用のプライマーペアを単独で用いてＰＣＲを行ったときに検出された位置と、プライマーミックスを用いてＰＣＲを行った場合に、各病原菌由来遺伝子の増幅部位（バンド）は、各々同じ位置に認められた。このことから、プライマーミックスを用いた一度の増幅処理により、各病原菌の検出が可能であることが確認された。
【００４２】
（実施例２）４種のイチゴ苗についての病原菌の検査
イチゴ栽培農家から得た重要病害の可能性がある２８のイチゴの苗のうち４つ（苗番号３，２７，９，１１）について、実施例１で作製したプライマーミックスを用いて、ＰＣＲ法により、５種（Glomerella cingulata，Colletotrichum acutatum，Fusarium oxysporum, Phytophthora nicotianae, Phytophthora cactorum）の病原菌の検出を行った。ＤＮＡの抽出、ＰＣＲ条件および電気泳動の手法は、上記実施例１と同手法により行った。
【００４３】
上記電気泳動の結果を図４に示した。苗番号３はFusarium oxysporum、株番号２７はGlomerella cingulataに感染していることが確認された。苗番号９はFusarium oxysporumおよびGlomerella cingulataに感染していることが確認された。苗番号１１については、Phytophthora nicotianae、Glomerella cingulataおよびColletotrichum acutatumに感染していることが確認された。
【００４４】
（実施例３）土壌中の病原菌の検査
萎黄病を発病したイチゴ苗を栽培したときの土壌について、実施例１で作製したプライマーミックスを用いて、ＰＣＲ法により、５種（Glomerella cingulata，Colletotrichum acutatum，Fusarium oxysporum，Phytophthora nicotianae，Phytophthora cactorum）の病原菌の検出を行った。
【００４５】
土壌試料からのＤＮＡの抽出は、以下のとおりに行った。土を０．２ｇ秤量し、マイクロチューブに入れた。ＤＮＡ抽出キットNucleon PhytoPure TM（Nucleon Bioscience社）に含まれる試薬１（reagent1）を６００μＬ、試薬２（reagent2）を２００μＬ加えてから超音波細胞破砕装置Bio-ruptor UCD-200TM（バイオラッド社）で１０分処理して細胞を破砕した。その後、アルミバス中６５℃で２０分間保温し、実施例１に記載と同手法によりＤＮＡを抽出した。
【００４６】
ＰＣＲ条件は、サイクルを１００回繰り返したほかは、実施例１と同条件で行い、その後の電気泳動の手法も、実施例１と同様に行った。
【００４７】
上記電気泳動の結果、土壌試料中に、萎黄病菌Fusarium oxysporumが検出され、イチゴ苗で発病した病原菌が土壌においても確認された。その他、Colletotrichum acutatumと不明のバンドが検出された（図５）。
【００４８】
（実施例４）プライマーミックスの調製２
Fusarium oxysporumの検出のためのプライマーとして、FoxyF6（配列番号２）のかわりに以下に示すプライマー（FoxyF2）を用いたほかは、実施例１に記載の方法と同手法によりＰＣＲ法により病原菌の検出を行い、電気泳動を行った。本実施例で用いた各プライマーの位置を図６に示した。Fusarium oxysporumの検出のためのプライマーとして、FoxyF2およびFGC-Rを用いた場合の増幅産物の長さは368bpである。
FoxyF2  ctatatgtaacttctgagtaaaacc  （配列番号１０）
【００４９】
上記電気泳動の結果を図７に示した。各病原菌検出用のプライマーペアを単独で用いてＰＣＲを行ったときに検出された位置と、プライマーミックスを用いてＰＣＲを行った場合に、各病原菌由来遺伝子の増幅部位（バンド）は、各々同じ位置に認められた。このことから、プライマーミックスを用いた一度のＰＣＲにより、各病原菌の検出が可能であることが確認された。
【００５０】
（実施例５）５種のイチゴ苗についての病原菌の検査
イチゴ栽培農家から得た重要病害の可能性がある２８のイチゴの苗のうち５つ（苗番号２２，２３，１，９，６）について、実施例４で作製したプライマーミックスを用いて、５種（Glomerella cingulata，Colletotrichum acutatum，Fusarium oxysporum, Phytophthora nicotianae, Phytophthora cactorum）の病原菌の検出を行った。ＤＮＡの抽出、ＰＣＲ条件および電気泳動の手法は、上記実施例１と同手法により行った。
【００５１】
上記電気泳動の結果を図８に示した。苗番号２２および２３はFusarium oxysporum、苗番号１はGlomerella cingulataに感染していることが確認された。苗番号９は、実施例２の結果と同様に、Fusarium oxysporumおよびGlomerella cingulataに感染していることが確認されたほか、上記５種で検出される以外の場所にもバンドの検出が認められた。また、苗番号６については、Glomerella cingulataに感染しているほか、同様に上記５種で検出される以外の場所にも３種類のバンドの検出が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上詳述したように、本発明の検出方法によると、症状の似ているイチゴ重要病害について、簡便な操作で同時に検査することができ、早期に正確に病原菌を同定することができる。また、試料中に病原菌に起因する遺伝子が微量にしか混入していない場合であっても、本発明の方法によれば感度良く検出し、同定することができる。
【００５３】
このため、イチゴの重要病害については、熟練を要することなく一度の検査で早期に病原菌の検出が可能となり、早期に病原菌を同定することにより、早期に各重要病害に対する対策を講じることができる。早期に対策を講じることにより、イチゴ農家の被害の拡大防止を早期に図ることができる。さらには、イチゴ栽培のための土壌についても本発明の検出方法を用いて病原菌の検査を行うことで、発病前や栽培前であっても病原菌の感染のリスクを排除することができる。さらには、イチゴを栽培した後に土壌を再利用する場合にも、重要病害の病原菌について評価することができ、経済的に非常に大きな効果が期待される。
【００５４】
また、本発明の検出方法は、培養操作を要しないため、培養のための特別の実験施設も必要としないことから、汎用が可能である。このことからも、非常に経済効果が大きい。
【００５５】
さらに、本発明の検出方法に使用可能なプライマーセットや検出キットを用いると、一定の基準に基づき菌の同定を行うことができ、より正確な検査が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】イチゴ栽培の流れと重要病害の防除方法を示す図である。
【図２】各病原菌の遺伝子を検出するために設計したプライマーの位置を示す図である。（実施例１）
【図３】設計したプライマーを、１種の菌検出用にプライマーペアとしたもの、または５種の菌検出用にプライマーミックスとしたものを用いてＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動結果を示す図である。（実施例１）
【図４】実施例１で用いたプライマーミックスを用いて、農家からの持ち込みイチゴ株について分析した結果を示す図である。（実施例２）
【図５】実施例１で用いたプライマーミックスを用いて、土壌について分析した結果を示す図である。（実施例３）
【図６】各病原菌の遺伝子を検出するために設計したプライマーの位置を示す図である。（実施例４）
【図７】設計したプライマーを、１種の菌検出用にプライマーペアとしたもの、または５種の菌検出用にプライマーミックスとしたものを用いてＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動結果を示す図である。（実施例４）
【図８】実施例４で用いたプライマーミックスを用いて、農家からの持ち込みイチゴ株について分析した結果を示す図である。（実施例５）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010046038.tif 000011
【図８】
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【配列表】
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