(57)【要約】      （修正有）【課題】肺の細菌感染またはウイルス感染などの微生物感染による炎症を治療するための医薬組成物および、ｒＳＰＤ（サーファクタントタンパク質Ｄ）（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法を提供する。【解決手段】（ａ）特定配列番号のアミノ酸１７９−３５５、又は（ｂ）特定配列番号の配列からなるＳＰＤの組換えフラグメントであるＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドを含む組成物。また、（ａ）細胞又は生物を準備するステップと、（ｂ）細胞又は生物をｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体に暴露するステップと、（ｃ）細胞を候補分子に暴露するステップと、（ｄ）ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）媒介効果を検出するステップとを含むｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症を治療するための医薬組成物であって、該炎症が微生物感染に関連し、
（ａ）配列番号４のアミノ酸１７９−３５５、又は
（ｂ）配列番号１の配列
からなるＳＰＤの組換えフラグメントであるＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２】
前記微生物感染が、細菌感染またはウイルス感染である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記微生物感染が、肺の感染である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）細胞又は生物を準備するステップと、
（ｂ）前記細胞又は生物をｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体に暴露するステップと、
（ｃ）前記細胞を候補分子に暴露するステップと、
（ｄ）ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）媒介効果を検出するステップと
を含む、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法を使用して同定又は選択された分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドを含む炎症を治療するための医薬組成物またはＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、サーファクタントタンパク質Ｄの組換えフラグメントおよびこのタンパ
ク質をコードする核酸を開示する。本発明者らは、このフラグメントはサーファクタント
タンパク質Ｄの有利な性質を保持することを証明し、種々の疾患の治療に使用することが
できることを示す。これらの疾患には、慢性肺疾患、新生児慢性肺疾患、特にイエダニに
起因するアレルギー喘息を含む喘息ならびに他の疾患を含む炎症性疾患が含まれる。本発
明者らが開示する組換えサーファクタントタンパク質Ｄフラグメントを使用して、種々の
アレルギーを治療することもできる。
【発明の概要】
【０００３】
本発明者らは、ＳＰ−Ｄはその炭水化物結合活性を介して遊離核酸、特にＤＮＡに結合
すると判断した。遊離ＤＮＡの認識は、少なくともいくつかのＳＰ−Ｄの有利な効果を担
うと考えられる。さらに、本発明者らは、ＳＰ−ＤのＤＮＡ結合特性およびこの分子の他
の性質は、ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）と命名した組換えフラグメントで保持されると判断
した。したがって、本発明の第１の態様によれば、本発明者らは、疾患の治療方法または
予防方法で使用するためのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホ
モログ、変異体、または誘導体を提供する。
【０００４】
本発明の第２の態様によれば、治療または予防有効量のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペ
プチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップ
を含む、罹患個体の治療方法または個体の疾患の発症を予防する方法を提供する。
【０００５】
疾患には、好ましくは炎症性疾患、好ましくは湿疹が含まれる。
【０００６】
疾患には、炎症性疾患、好ましくは、新生児慢性肺疾患、新生児呼吸窮迫症候群（ＲＤ
Ｓ）、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、肺
線維症、気腫、間質性炎症性肺疾患、サルコイドーシス、肺炎、慢性炎症性肺疾患、新生
児慢性炎症性肺疾患からなる群から選択される炎症性肺疾患を含んでもよい。
【０００７】
好ましくは、疾患は、新生児慢性肺疾患、肺気腫、慢性閉塞性気道疾患、嚢胞性線維症
、および喘息からなる群から選択される。
【０００８】
疾患には、アレルギーを含み得る。アレルギーは、好ましくはイエダニ（ヒョウヒダニ
属：Dermatophagoides）、好ましくはヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssin
us）またはコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）、または菌類もしくは菌類胞
子、好ましくはアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）によるもので
ある。アレルギーは、好ましくは、季節性呼吸器アレルギー、アレルギー性鼻炎、花粉症
、非アレルギー性鼻炎、血管運動神経性鼻炎、刺激性鼻炎、草本の花粉、木本の花粉、ま
たは動物の鱗屑に対するアレルギー、アレルギー性喘息に関連するアレルギー、食品アレ
ルギー、およびアレルギー性眼疾患からなる群から選択される。
【０００９】
疾患は、細菌感染およびウイルス感染を含む微生物感染、好ましくは肺の微生物感染に
関連する疾患であり得る。
【００１０】
本発明者らは、本発明の第３の態様によれば、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、
そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップを含む、
個体の気道過敏症、血清ＩｇＥレベル、または好酸球増多症を軽減する方法を提供する。
【００１１】
本発明の第４の態様として、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント
、ホモログ、変異体、または誘導体を個体に投与するステップを含む、好ましくはアポト
ーシス肺胞マクロファージのクリアランスの増強もしくは壊死肺胞マクロファージのクリ
アランスの増強またはその両方による個体の肺胞マクロファージ数を減少させる方法を提
供する。
【００１２】
好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドが、配列番号１に記載の
配列を含むか、好ましくは配列番号１に記載の配列からなる。
【００１３】
好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変
異体、または誘導体をコードする核酸、好ましくは配列番号２に記載の配列を含む核酸を
個体に投与する。
【００１４】
本発明者らは、本発明の第５の態様によれば、疾患の治療方法または予防方法における
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、も
しくは誘導体の使用を提供する。
【００１５】
本発明は、第６の態様では、配列番号１に記載の配列、そのフラグメント、ホモログ、
変異体、または誘導体を有するＳＰ−Ｄフラグメントを含む組換えポリペプチドを提供す
る。
【００１６】
本発明の第７の態様では、本発明の第６の態様の組換えポリペプチドをコードする配列
を含む核酸を提供する。好ましくは、核酸は、配列番号２に記載の配列を含む。
【００１７】
本発明の第８の態様によれば、本発明者らは、本発明の第７の態様の核酸配列を含むベ
クター、好ましくは発現ベクターを提供する。
【００１８】
本発明者らは、本発明の第９の態様によれば、本発明の第８の態様のベクターで形質転
換された宿主細胞を提供する。
【００１９】
本発明の第１０の態様によれば、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と共に、本
発明の第６の態様の組換えポリペプチド、本発明の第７の態様の核酸、本発明の第８の態
様の核酸を含むベクター、または本発明の第９の態様の宿主細胞を含む医薬組成物を提供
する。
【００２０】
本発明の第１１の態様として、本発明者らは、候補分子にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリ
ペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、またはは誘導体を曝露するステップと
、前記候補分子がｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドなどに結合するかどうかを検出す
るステップとを含む、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドに結合する分子の識別方法を
提供する。
【００２１】
本発明の第１２の態様によれば、本発明者らは、（ａ）細胞または生物を得るステップ
と、（ｂ）前記細胞または生物をｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラ
グメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体に曝露するステップと、（ｃ）前記細胞を
候補分子に曝露するステップと、（ｄ）ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）媒介効果を検出するステ
ップとを含む、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト
を識別する方法を提供する。
【００２２】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）媒介効果は、好ましくは、末梢血好酸球増多症の軽減、血清Ｉ
ｇＥレベルの低下、血清ＩｇＧ１レベルの低下、気道過敏症の軽減、肺胞マクロファージ
数の減少、洗浄物中のリン脂質レベルの低下、エオタキシン発現のダウンレギュレーショ
ン、ＭＣＰ−１発現の減少、ＭＩＰ−１α発現のダウンレギュレーション、およびＭＩＰ
−２発現のダウンレギュレーションからなる群から選択される。この方法は、好ましくは
、選択または同定された分子を単離または合成するステップをさらに含む。
【００２３】
本発明の第１３の態様によれば、本発明の第１２の態様の方法を使用して同定または選
択された分子を提供する。
【００２４】
本発明者らは、本発明の第１４の態様によれば、１つまたは複数の以下の成分：肺抽出
物（好ましくは、ウシ、好ましくは子牛肺抽出物）もしくはその成分、リン脂質（好まし
くは、ホスファチジルコリンもしくは二飽和ホスファチジルコリン）、脂肪酸、サーファ
クタント関連タンパク質（好ましくは、サーファクタント関連タンパク質Ｂまたはサーフ
ァクタント関連タンパク質Ｃ）、セチルアルコール、長鎖反復アルコール、チロキサポー
ル、パルミチン酸コルホセリル（colfosceril palmitate、ジパルミトイルホスファチジ
ルコリン）、パルミチン酸、トリパルミチン、ポラクタントα（poractant alfa）、およ
び塩化ナトリウムと共にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント
、ホモログ、変異体、もしくは誘導体を含む組成物を提供する。
【００２５】
本発明の第１５の態様として、サーファクタント補充療法におけるｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲ
Ｄ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の使用を
提供する。
【００２６】
本発明者らは、本発明の第１６の態様によれば、サーファクタント補充療法で使用する
ためのサーファクタント補充療法におけるｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、
そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を提供する。
【００２７】
第１７の態様によれば、細胞表面上への遊離ＤＮＡの産生に関する病態の治療のための
組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用を提供する。ｒＳＰ−Ｄ（
ｎ／ＣＲＤ）を含むＳＰ−Ｄおよびそのフラグメントは、その炭水化物結合能力を介して
ＤＮＡに結合する。したがって、ＳＰ−Ｄのフラグメントは、天然のＳＰ−Ｄの炭水化物
結合活性を有利に保持する。本発明は、さらに、薬学的有効量のＳＰ−Ｄまたはそのフラ
グメントをこのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む、細胞表面上への
遊離ＤＮＡの産生に関する病態を罹患した患者の治療方法を提供する。
【００２８】
本発明は、肺内に遊離核酸が蓄積する慢性感染の治療のための組成物の製造におけるＳ
Ｐ−Ｄまたはそのフラグメントの使用を提供する。例えば、感染は、細菌、ウイルス、ま
たは菌類感染であり得る。
【００２９】
本発明は、さらに、嚢胞性線維症の治療のための組成物の製造におけるＳＰ−Ｄまたは
そのフラグメントの使用を提供する。嚢胞性線維症では、肺内の細菌細胞によって遊離核
酸が産生されて、細菌バイオフィルムの形成および持続的な細菌肺感染を起こす。ＳＰ−
Ｄおよびそのフラグメントはまた、嚢胞性線維症治療の有効性が増大する多数の肺病原体
をオプソニン化するように作用する。
【００３０】
さらなる態様では、壊死およびアポトーシス細胞のクリアランスのための組成物の製造
におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用を提供する。このような細胞は、その表
面に、食細胞媒介クリアランスのためのＳＰ−Ｄおよびそのフラグメントによって結合さ
れたＤＮＡを有する。したがって、本発明は、ＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントを使用し
たＣＯＰＤ、慢性炎症、および慢性喘息などの肺疾患および病態の治療のための組成物な
らびに薬学的有効量のＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントをこのような治療を必要とする患
者に投与するステップを含む、嚢胞性線維症、肺疾患、ＣＯＰＤ、慢性炎症、慢性細菌感
染、慢性ウイルス感染、慢性菌類感染、および慢性喘息からなる群から選択される疾患を
罹患した患者の治療方法に拡大される。
【００３１】
なおさらなる態様では、自己免疫疾患における自己抗体産生の治療のための組成物の製
造におけるＳＰ−Ｄまたはそのフラグメントの使用ならびに薬学的有効量のＳＰ−Ｄまた
はそのフラグメントをこのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む、自己
免疫疾患を罹患した患者の治療方法を提供する。
【００３２】
壊死またはアポトーシス細胞由来の遊離ＤＮＡまたはＤＮＡの破片は、自己抗体を産生
させる自己抗原として作用することができる。ＳＰ−Ｄおよびそのフラグメントによるこ
のような遊離ＤＮＡのクリアランスにより、自己抗体産生が減少する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】ヒトＳＰ−Ｄ（ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ））の組換えフラグメントの構造を示す図である。これは、ネック領域および炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）の三量体から構成され、オックスフォード大学のＭＲＣ免疫化学研究所（Ｕｎｉｔ）で発現、精製、およびキャラクタライズした。
【図１Ｂ】主に１８ｋＤａのバンドを示すアスペルギルス・フミガーツスの１週間培養濾過物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２Ａ】Ａｆｕ  １ｗｃｆでの鼻腔内攻撃誘発後および１週間後にＡｆｕのみでの再攻撃誘発後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）またはＰＢＳを５日間毎日鼻腔内投与する処置から３日後に測定したＡｆｕマウスモデルの血清ＩｇＥを示す図である。Ｐは、ＰＢＳ処置非感作マウス、ＡＰは、ＰＢＳ処置感作マウス、ＡＲは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置感作マウス、ＡＰｒｃは、ＰＢＳで処置したＡｆｕ再攻撃誘発マウス、ＡＲｒｃは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で処置したＡｆｕ再攻撃誘発マウスである。
【図２Ｂ】ＡｆｕマウスモデルにおけるＡｆｕ特異的ＩｇＥを示す図である。上記の図２Ａと同様であるが、Ａｆｕ特異的ＩｇＧ１を測定する。
【図３】Ａｆｕ  １ｗｃｆでの鼻腔内攻撃誘発後および１週間後にＡｆｕのみでの再攻撃誘発後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）またはＰＢＳを４日間毎日鼻腔内投与する処置から１日後に測定したＡｆｕマウスモデルの末梢血好酸球増多症を示す図である。Ｐは、ＰＢＳ処置非感作マウス、ＡＰは、ＰＢＳ処置感作マウス、ＡＲは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置感作マウス、ＡＰｒｃは、ＰＢＳで処置したＡｆｕ再攻撃誘発マウス、ＡＲｒｃは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で処置したＡｆｕ再攻撃誘発マウスである。
【図４Ａ．４Ｂ．４Ｃ】Ａｆｕ  １ｗｃｆでの鼻腔内攻撃誘発後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で２日間毎日鼻腔内投与する処置から１日後に測定したＡｆｕマウスモデルのサイトカインを示す図である。図４Ａ：脾臓中で測定したＩＬ−１２、図４Ｂ：脾臓中で測定したＩＦＮ−γ、図４Ｃ：脾臓中で測定したＩＬ−４。Ｐ＝ＰＢＳ処置非感作マウス、ＡＰは、ＰＢＳ処置感作マウス、ＡＲは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置感作マウス、ＡＡは、ｒｈＳＰ−Ａ処置感作マウス。
【図５Ａ．５Ｂ】Ａｆｕマウスモデルの気道過敏症。マウスに、Ａｆｕ  １ｗｃｆでの鼻腔内攻撃誘発後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で４日間毎日鼻腔内投与する処置を行う。処置の完了後にＡｆｕ  １ｗｃｆのみを３日間投与する鼻腔内攻撃誘発から２時間後にプレチスモグラフィを測定した。図Ａ：漸増用量のメタコリンに対する用量応答。図５Ｂ：Ａｆｕ  １ｗｃｆでの鼻腔内攻撃誘発後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）またはｒｈＳＰ−４を４日間毎日鼻腔内投与する処置後の３０ｍｇ／ｍｌメタコリンに対する応答。Ｐは、ＰＢＳ処置非感作マウス、ＡＰは、ＰＢＳ処置感作マウス、ＡＲは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置感作マウス、ＡＡは、ｒｈＳＰ−Ａ処置感作マウスである。
【図６】処置（図６Ａ：ＰＢＳ、図６Ｂ：ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）、またはｃ：ＰＢＳで処置した非感作マウス）後の感作マウスのＡｆｕマウスモデルのＨ＆Ｅ染色肺切片を示す図である。
【図７Ａ】細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＬ−１２陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの肺ホモジネート中のＩＬ−１２の分析を示す図である。ＰＢＳは、ＰＢＳで処置した非感作マウス。ＨＰは、ＰＢＳで処置した感作マウス。ＨＲは、１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウス。
【図７Ｂ】細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＬ−１２陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの脾臓ホモジネート中のＩＬ−１２の分析を示す図である。ＰＢＳは、ＰＢＳで処置した非感作マウス。ＨＰは、ＰＢＳで処置した感作マウス。ＨＲは、１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウス。ＨＢは、１０μｇのＢＳＡで処置した感作マウス。
【図７Ｃ】細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＦＮ−γ陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの脾臓ホモジネート中のＩＦＮ−γの分析を示す図である。ＰＢＳ＝ＰＢＳで処置した非感作マウス。ＨＰ＝ＰＢＳで処置した感作マウス。ＨＲ＝１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウス。
【図７Ｄ】細胞内サイトカイン染色およびその後のＴＦＮ−α陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感作マウスの脾臓ホモジネート中のＴＦＮ−αの分析を示す図である。ＰＢＳは、ＰＢＳで処置した非感作マウス。ＨＰは、ＰＢＳで処置した感作マウス。ＨＲは、１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウス。
【図８Ａ】（タイトル「処置４日目の２０ｍｇ／ｍｌメタコリンでの１分間の攻撃誘発に対する平均Ｐｅｎｈ応答」）は、処置の最後の４日間に測定したアレルギーマウスの気道過敏症（ＡＨＲ）に対するｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置の効果を示すグラフである。アレルギーマウスを、ヤケヒョウヒダニで感作する。ＰＢＳコントロールは、ＰＢＳで処置した非感作マウスを示す。処置４日目の２０ｍｇ／ｍｌメタコリンでの１分間の攻撃誘発に対する平均Ｐｅｎｈ応答を示す。Ｘ軸：左：ＰＢＳコントロール、中央：Ｄｅｒ  ｐ−ＰＢＳ、右：Ｄｅｒ  ｐ−ｒＳＰＤ；Ｙ軸：バックグラウンドを越えるＰｅｎｈの％。
【図８Ｂ】（タイトル「メタコリン攻撃誘発によって誘導されたアレルギーマウスの気道過敏症」）は、ＰＢＳまたはｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置から４日後のアレルゲンでの再攻撃誘発後のメタコリンに対する用量応答を示すグラフである。アレルギーマウスを、ヤケヒョウヒダニで感作する。ＰＢＳ−ＰＢＳコントロールは、ＰＢＳで処置した非感作マウスを示す。メタコリン攻撃誘発によって誘導されたアレルギーマウスで気道過敏症（ＡＨＲ）を測定する。Ｘ軸：メタコリン（ｍｇ／ｍｌ）；菱形：ＰＢＳ−ＰＢＳ、四角：Ｄｅｒ  ｐ−ＰＢＳ、三角：Ｄｅｒ  ｐ−ｒＳＰＤ。
【図９】洗浄後の肺胞マクロファージ数に対するｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置の効果を示すグラフである。Ｘ軸：週齢；Ｙ軸：肺胞マクロファージ数×１０4／マウス洗浄物。
【図１０Ａ】気管支肺胞洗浄物中の細胞のサイトスピンを示す図である。サイトスピン後に肺胞マクロファージをマラカイトグリーン（上のパネル）またはクリスタルバイオレット（下のパネル）で染色する。処置なし（左上のパネル）、ＢＳＡ処置（右上のパネル）、およびｒ−ＳＰ−Ｄ処置（下のパネル）についての形態学を示す。
【図１０Ｂ】気管支肺胞洗浄物中の細胞のサイトスピンを示す図である。左上：ＳＰ−Ｄ欠損マウス由来の非処置細胞；右上：野生型マウス由来の細胞；左下：ＢＳＡで処置したＳＰ−Ｄ欠損マウス由来の細胞；右下：ｒＳＰ−Ｄで処置したＳＰ−Ｄ欠損マウス由来の細胞。
【図１１】（タイトル「マウスあたりの無細胞洗浄物上清中のリン脂質」）は、総ＢＡＬリン脂質レベルに対するｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置の効果を示すグラフである。マウスあたりの無細胞洗浄液上清中のリン脂質を示す。Ｘ軸：週齢；Ｙ軸：リン脂質（μｇ）／マウス。
【図１２】（タイトル「ＷＴと比較したＳＰ−Ｄ  ＫＯマウスのケモカインｍＲＮＡレベルおよびｒＳＰ−Ｄ処置の効果」）は、野生型と比較したＳＰ−ＤノックアウトマウスのケモカインｍＲＮＡレベルおよびｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）処置の効果を示すグラフである。
【図１３Ａ】野生型マウスと比較したＳＰ−Ｄ欠損マウスにおける前方散乱（細胞サイズ）および側方散乱（粒度）フローサイトメトリーの代表的な結果を示す図である。
【図１３Ｂ】野生型マウスと比較したＳＰ−Ｄ欠損マウス由来のマクロファージの典型的なアネキシンＶおよびＰＩ染色パターンを示す図である。
【図１３Ｃ】アネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性細胞でのＦＩＴＣ標識ｒＳＰ−Ｄの同時標識範囲を示す図である。
【図１３Ｄ】非処置ＳＰ−Ｄノックアウトマウス、野生型マウス、ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）処置マウス、ＰＢＳ処置マウス、ＳＰ−Ａ処置マウス、およびＢＳＡ処置マウスの気管支肺胞洗浄物中のアポトーシス細胞（上のパネル）および壊死細胞（下のパネル）の割合を示すグラフである。
【図１４】野生型マウス、ＳＰ−Ｄノックアウトマウス、およびｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）で処置したＳＰ−Ｄノックアウトマウスの気管支肺胞洗浄物中のＧＭ−ＣＳＦ濃度を示すグラフである。
【図１５】ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰ（緑）で染色した野生型（パネルＡおよびＢ）およびノックアウトマウス（パネルＣおよびＤ）由来のマクロファージの共焦点顕微鏡法を示す図である。アポトーシスが進行した細胞は緑色に染色され、初期アポトーシス細胞を、末端標識ＤＮＡフラグメントの特徴的な点状染色によって同定する。
【図１６】新たに単離した緑色のマクロファージによるアポトーシス（橙色標識）マクロファージの貪食作用の増強を示す図である。
【図１７】野生型およびＳＰ−Ｄノックアウトマウスにおける血漿コレステロールレベル（ｍＭ）を示す図である。
【図１８】ゲノムＤＮＡおよびＳＰ−ＤとＤＮＡとの複合体の陰性染色された透過型電子顕微鏡画像を示す図である。Ａ：ゲノムＤＮＡ。ＢおよびＣ：ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）と複合体化したゲノムＤＮＡ。Ｄ：天然のＳＰ−Ｄと複合体化したゲノムＤＮＡ。
【図１９】ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）とマンナンとの間の結合が、デオキシリボヌクレオチドと競合することを示す図である。固定濃度のｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）（１００μｇ／ｍＬ）は、表示濃度のヘキソース（Ａ）またはｄＮＴＰ（Ｂ）を含む５ｍＭ  ＣａＣｌ2含有生理食塩水緩衝液の存在下でＳＡ  ＢＩＡｃｏｒｅチップ上に固定したビオチン化マンナンに結合した。
【図２０】ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）によるヨウ化プロピジウム結合の阻害を示す図である。
【図２１】ＳＰ−Ｄノックアウトマウスから単離した肺胞マクロファージがＤＮＡ除去で欠損することを示す図である。肺胞マクロファージを、野生型（Ａ、Ｄ）またはＳＰ−Ａノックアウトマウス（ＳＰ−Ａ(-/-)）（Ｂ、Ｅ）、またはＳＰ−Ｄノックアウトマウス（ＳＰ−Ｄ(-/-)）（Ｃ、Ｆ）の肺洗浄物から単離し、洗浄し、緩衝液（Ａ、Ｂ、Ｃ）またはＣｙ３標識（赤色）肺ＤＮＡ（Ｄ、Ｅ、Ｆ）のいずれかとインキュベートした。ＤＮＡ取り込みを、ＦＬ２−ＨでのＦＡＣＳによってモニターし、非特異的ＦＬ１−Ｈに対してグラフ化した。ＤＮＡを取り込んだ肺胞マクロファージの割合を、図に示した（Ｄ、Ｅ、Ｆ）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の他の態様を、以下の説明だけでなく、独立請求項および従属請求項に記載する。
【００３５】
本発明者らは、本明細書中で、「ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド」と呼ばれる組
換えＳＰ−Ｄフラグメントの配列、および産生方法を開示する。本発明者らが承知してい
る限りでは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドの配列および産生は、以前に公知では
なかった。本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、溶液中で互いに会合
して三量体を形成することができることを示す。
【００３６】
非常に好ましい実施形態では、本発明者らは、特に新生児のサーファクタント補充療法
として使用するための、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント
、ホモログ、変異体、または誘導体の使用を記載する。新生児肺疾患、特に新生児慢性肺
疾患の治療のために、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、
ホモログ、変異体、または誘導体を適切に使用することができる。
【００３７】
本発明者らは、サーファクタントタンパク質Ｄを欠くアレルゲンで攻撃誘発されたノッ
クアウトマウスに投与された場合、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは末梢血好酸球
増多症、総血清ＩｇＥレベル、およびＩｇＧ１レベルを減少させることを証明する。した
がって、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、個体のアレルギー性過敏反応のモジュ
レーターとしての使用に適切である。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドはまた、末梢
血好酸球増多症、血清ＩｇＥレベルの上昇、ＩｇＧ１レベルの上昇、またはこれらの任意
の組み合わせで特徴付けられる任意の疾患または症候群の治療での使用に適切である。
【００３８】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドを、肺のマクロファージ媒介炎症の制御、病原体
の侵入からの防御、ならびに感染およびアレルゲン性刺激に対する炎症反応の調整で使用
することもできる。
【００３９】
イエダニアレルゲンで感作および攻撃誘発したマウス（例えば、Ｃ５７Ｂ１１６野生型
マウス）は、アレルギー性喘息に特徴的な気道過敏症を示す。このようなマウスへのｒＳ
ＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドの投与により、気道過敏症が軽減する。したがって、ア
レルギー性喘息を含む気道過敏症を発症する任意の疾患または症候群を治療するためにｒ
ＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドを個体に投与することができる。
【００４０】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド処置を使用することができる他の疾患には、皮膚
病（例えば、湿疹（Ｔｈ２媒介疾患））および一般的なアレルギーが含まれる。このよう
なアレルギーには、食品アレルギー（例えば、卵、ナッツ類、ピーナッツ、およびミルク
などのアレルゲンに対するもの）が含まれる。他の一般的なアレルゲンには、花粉、塵、
カビ、白カビ、ならびに昆虫、ペット（イヌ、ネコ、トリ）、ならびに植物アレルゲンが
含まれる。一般に花粉症と呼ばれる季節性呼吸器アレルギー、空気アレルゲン（イエダニ
、菌類胞子、草本の花粉、木本の花粉、および動物の鱗屑が含まれる）に対するアレルギ
ーも含まれる。
【００４１】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で処置することができるアレルギーの他のカテゴリーは、アレ
ルギー症状を引き起こす主な要因である気道過敏症、血清ＩｇＥ、および好酸球増多症の
軽減から利益が得られるものである。これには、アレルギー性喘息の治療が含まれる。ｒ
ＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を、細胞媒介免疫系のアップレギュレーションから恩恵を受ける病
態のための有効な治療として使用することもできる。これには、抗細菌作用および肺感染
治療が含まれる。
【００４２】
ナチュラルキラー細胞の活性および免疫系細胞によるサイトカインＩＦＮγの分泌のア
ップレギュレーションから恩恵を受ける病態の有効な治療としてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）
を使用することができる。これには、肺癌および他の癌ならびに新生物の治療が含まれる
。
【００４３】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での内因性の天然ＳＰ−Ｄの補足から恩恵を受ける病態の有効
な治療としてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を使用することもできる。これには、内因性の天然
のＳＰ−Ｄレベルが異常に低い病態の治療が含まれる。また、これには、内因性の天然Ｓ
Ｐ−Ｄレベルが異常に低い肺サーファクタント系障害を有する新生児の治療が含まれる。
また、これには、内因性の天然の肺ＳＰ−Ｄレベルが異常に低い嚢胞性線維症患者の治療
も含まれる。また、これには、内因性の天然ＳＰ−Ｄレベルが異常に低い他の肺感染症患
者の治療も含まれる。
【００４４】
さらなる実施形態では、ＳＰ−Ｄの抗アレルギー性を利用して、アレルギー性眼疾患と
戦うことができる。したがって、本発明は、アレルギー性眼疾患の治療のためのＳＰ−Ｄ
、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）などのそのフラグメントを提供する。
【００４５】
本発明者らは、ヒトの涙液に含まれるサーファクタントタンパク質Ｄレベルを測定し、
これが１３２ｎｇ／ｍｌであることを見出した。ＳＰ−Ｄが本明細書中に記載のように抗
アレルギー性を有し、ヒト涙液に存在するという事実により、このタンパク質が涙液の天
然の抗アレルギー効果に関与することが示唆される。ＳＰ−ＤまたはｒＳＰ−Ｄ（ｎ／Ｃ
ＲＤ）を、例えば、コンタクトレンズによる刺激／炎症の補正を補助するためのコンタク
トレンズ用溶液添加することができる。さらに、例えば、シェーグレン症候群（（ヒト唾
液および涙腺成分に対する自己抗体によって生じる）ドライアイおよび口内乾燥によって
特徴付けられる自己免疫疾患）の治療に有益に付加される。現在、これは人工涙液の補足
（hypermellose eye dropsなど）で治療されており、このような製剤へのＳＰ−Ｄまたは
そのフラグメントの添加により眼感染症および角膜炎に対する人工涙液の保護効果が向上
する。
【００４６】
基準を上記のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）に合わせる場合、これを、ポリペプチド自体、そ
のフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を指称するように使用すべきである。
【００４７】
基準を疾患の治療に合わせる場合、これを、この疾患の症状の緩和の基準を含むように
使用すべきである。好ましくは、この疾患を有する個体の実質的に全ての症状を緩和また
は除去する。「疾患」は、個体の健康または健康状態（well-being）に影響を与える任意
の症状および任意の病態を含むように使用すべきである。好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／Ｃ
ＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を投与された
個体が、疾患または病態の少なくとも１つの症状が緩和する（すなわち、実質的に正常な
非罹患状態の個体に戻る）。これを、医師が関連する臨床パラメータを使用して評価する
ことができる。例えば、気道過敏症を、実施例に記載の方法を使用して測定することがで
きる。
【００４８】
本発明の実施には、特記しない限り、当業者の能力の範囲内の化学、分子生物学、微生
物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献中
に例示されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、１
〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；
Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９５および定期増補版、「現代の分子生物学プロトコ
ール」、第９、１３、および１６章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙ
ｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ、１９９
６、「ＤＮＡの単離と配列決定：基本的技術」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；
Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、「インサイ
チューハイブリッド形成：原理と実践」；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅ
ｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４、「オリゴヌクレオチド合成：実践アプローチ」、
Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；およびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅ
ｒｇ、１９９２、「酵素学方法論：ＤＮＡ構造パートＡ：ＤＮＡの合成と物理的分析」、
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（これら
の各一般書は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。
【００４９】
［サーファクタントタンパク質ＤのｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）］
サーファクタントタンパク質Ｄは、例えば、Ｒｕｓｔら、１９９１、「ヒトサーファク
タントタンパク質Ｄ：ＳＰ−ＤはＣ型レクチン炭水化物認識ドメインを含む」、Ａｒｃｈ
ｉｖｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２９０（
１）、１１６〜１２６；Ｌｕら、１９９２、「ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄの精
製、キャラクタリゼーションとｃＤＮＡクローニング」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８４
、７８５〜８０２；Ｃｒｏｕｃｈら、１９９３、「ヒトサーファクタントタンパク質Ｄ（
ＳＰ−Ｄ）のゲノム組織。ＳＰ−Ｄは染色体１０ｑ．２２．２−２３．１にコードされて
いる」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
２６８（４）、２９７６〜２９８３；Ｋｏｌｂｌｅら、１９９３、「ヒト肺サーファクタ
ントタンパク質Ｄ遺伝子（ＳＦＴＰ４）のサーファクタントタンパク質Ａ遺伝子クラスタ
ー付近の１０ｑ２２−ｑ２３への割り当て」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１７（２）、２９４〜
２９８、１９９３で以前に同定およびキャラクタライズされている。
【００５０】
用語「サーファクタントタンパク質Ｄ」、「ＳＰ−Ｄ」、「ｈＳＰ−Ｄ」、および「天
然のＳＰ−Ｄ」を使用する場合、これらを、任意のサーファクタントタンパク質Ｄのポリ
ペプチドまたは核酸をいうために使用すべきである（文脈により必要な場合）。しかし、
好ましくは、これらの用語を、ヒトサーファクタントタンパク質Ｄ（例えば、上記引例ま
たはＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００３０１９．１、ＸＭ＿００５７７６．２、Ｘ６５
０１８．１、およびＬ０５４８５．１に開示の配列）をいうために使用すべきである。よ
り好ましくは、サーファクタントタンパク質Ｄは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００３
０１９．１のヒトサーファクタントタンパク質Ｄである。このようなヒトＳＰ−Ｄの核酸
およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および配列番号４に示す。
【００５１】
［組換えサーファクタントタンパク質ＤのＲＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド］
本発明者らは、本発明者らがｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）と呼ぶサーファクタントタンパク
質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）のポリペプチドフラグメントを提供する。このようなｒＳＰＤ（ｎ／Ｃ
ＲＤ）ポリペプチドの配列を、配列番号１に示す。ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）を、本明細
書中で「ｒｈＳＰ−Ｄ」ともいい、２つの用語を同意語と見なすべきである。
【００５２】
用語ｒＳＰ−Ｄを使用する場合、これを、一般に、全長ＳＰ−Ｄに対応するかに関係な
く、組換えＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄ（組換え様式で発現する）またはこのフラ
グメントをいうために使用すべきである。好ましくは、用語ｒＳＰ−Ｄを、ＳＰ−Ｄ、好
ましくはヒトＳＰ−Ｄの組換えフラグメントをいうために使用すべきである。好ましくは
、文脈が必要な場合、「ｒＳＰ−Ｄ」を、上記の組換えＳＰ−ＤフラグメントｒＳＰＤ（
ｎ／ＣＲＤ）をいうために使用すべきである。
【００５３】
本明細書中に開示のポリペプチドは、配列番号１に記載の特定のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ
）配列に限定されないが、そのフラグメントも含むと理解される。特に好ましいフラグメ
ントには、１つまたは複数のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の生物活性を有するものが含まれる
。
【００５４】
さらに、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドには、一般に、Ｎ末端ドメインおよび／
またはコラーゲンドメイン、好ましくはその両方を欠くＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−
Ｄの任意の組換えフラグメントが含まれる。したがって、好ましい実施形態では、ｒＳＰ
Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、実質的に残基１〜１７８を欠く配列番号４に記載のＳ
Ｐ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄの組換えフラグメントである。さらに好ましい実施形態
では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、実質的に残基１７９〜３５５を含む配列
番号４に記載のＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄ配列の組換えフラグメントである。
【００５５】
好ましい実施形態では、ヒトＳＰ−Ｄ配列（配列番号４）の２００位に対応するプロリ
ン残基が別の残基に置換されている。好ましくは、プロリン残基を非荷電の極性残基（例
えば、システイン、セリン、トレオニン、またはメチオニン残基）に置換する。非常に好
ましい実施形態では、プロリン残基を、セリン残基に置換する。したがって、ｒＳＰＤ（
ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、配列番号１に記載の配列を含み得る。
【００５６】
上記の各配列のフラグメント、ホモログ、変異体、および誘導体もまた含まれる。
【００５７】
好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、実質的に以下の残基
を含む「ヘッド」領域または炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含む。
【化１】
2010090134.tif 000002
【００５８】
好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、別のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポ
リペプチドとの多量体化手段、好ましくは三量体化を含む。このような手段には、例えば
、別のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド上で、アビジンまたはストレプトアビジン部
分と相互作用および結合するビオチン部分を含み得る。
【００５９】
さらに好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、実質的に以下
の残基を含む「ネック」領域を含む。
【化２】
2010090134.tif 000003
【００６０】
好ましくは、このようなネック領域は、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）のＮ末端であ
る。
【００６１】
好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、少なくとも１つのＧ
ｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａストレッチ、好ましくは複数のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ反復を含む
配列、最も好ましくは８つのＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ反復を含む配列をさらに含む。好ま
しい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、実質的に
【化３】
2010090134.tif 000004
を含むＮ末端配列をさらに含む。
【００６２】
大いに好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドは、配列番号１に
記載の配列を含み、好ましくは配列番号１に記載の配列からなる。したがって、本明細書
中で使用される、用語「ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド」を、好ましくは、以下の
配列、
【化４】
2010090134.tif 000005
（配列番号１）、ならびにそのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体をいうた
めに使用すべきである。
【００６３】
開示のポリペプチドには、任意の供給源（例えば、関連ウイルス／細菌タンパク質）か
ら得た相同配列、細胞ホモログ、および合成ペプチド、ならびにその変異体または誘導体
も含まれる。したがって、ポリペプチドには、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、また
はウサギ）、詳細には霊長類、より詳細にはヒトなどの動物を含む他の種由来のｒＳＰＤ
（ｎ／ＣＲＤ）のホモログをコードするポリペプチドも含まれる。より詳細には、ホモロ
グには、ヒトホモログが含まれる。
【００６４】
したがって、本発明者らは、配列番号１に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）配列のアミノ
酸配列の変異体、ホモログ、または誘導体ならびにこのようなアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列の変異体、ホモログ、または誘導体を開示する。
【００６５】
好ましくは、本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、変異体、ホモ
ログ、フラグメント、および誘導体は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の１つまたは複数の性質
、好ましくはｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の１つまたは複数の生物活性を含む。したがって、
変異体などは、好ましくは、１つまたは複数の活性（炭水化物結合活性、多量体化活性（
三量体化活性を含む）、ケモカインのダウンレギュレーション、気道過敏症の軽減、肺胞
マクロファージ数の減少、リン脂質レベルの低下（ＳＰ−Ｄを欠く動物に投与した場合）
、アポトーシスおよび／または壊死マクロファージのクリアランスの増大、末梢血好酸球
増多症の軽減、血清ＩｇＥの減少、血清ＩｇＧ１の減少、および実施例に開示の任意の生
物活性または性質が含まれるが、これらに限定されない）を含む。
【００６６】
本明細書の文脈では、相同配列とは、配列番号１に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）配列
を含む少なくとも５０または１００超、好ましくは２００、３００、４００、または５０
０個のアミノ酸のアミノ酸レベルで少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６
０、７０、８０、または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９８％同一のア
ミノ酸配列を含むように使用する。特に、典型的には、必須ではない周辺配列よりもむし
ろタンパク質機能に必須であることが公知の配列領域に関して相同と見なすべきである。
遠縁の生物由来の相同配列を考慮する場合、これは特に重要である。
【００６７】
相同性を類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）という用
語で考慮することもできるが、本発明の文脈では、相同性は配列同一性の用語で示すこと
が好ましい。
【００６８】
目視、より一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの支援によって相同性比
較を行うことができる。このような公的に、および有料で利用可能なコンピュータプログ
ラムは、２つまたはそれ以上の配列の間の相同％を計算することができる。
【００６９】
連続した配列に対して相同性％を計算することができる（すなわち、一方の配列を他の
配列に整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と一度に１
残基ずつ直接比較する）。これを、「非ギャップ（ungapped）」アラインメントという。
典型的には、このような非ギャップアラインメントを、比較的少ない残基数（例えば、５
０個未満の連続するアミノ酸）に対してのみ行う。
【００７０】
これは非常に単純且つ一貫した方法であるにもかかわらず、例えば、同一の配列対でな
ければ１つの挿入または欠失以降のアミノ酸残基がアラインメントから除外されることを
考慮できないので、アラインメント全体で行った場合相同性％は大きく減少するかもしれ
ない。したがって、ほとんどの配列比較法は、全体の相同性スコアに過度にペナルティー
を科すことなく可能な挿入および欠失を考慮する至適アラインメントが得られるようにデ
ザインされている。局所相同性を最大にしようとするために配列アラインメントに「ギャ
ップ」を挿入することによってこれを行う。
【００７１】
しかし、これらのより複雑な方法では、同数の同一のアミノ酸について可能な限り少数
のギャップ（２つの比較配列間でより高い関連性を反映する）を含む配列アラインメント
が多数のギャップを含む配列アラインメントよりも高いスコアが得られるようにアライン
メント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てる。典型的には、ギ
ャップの存在に比較的高いコストを課し、ギャップ中のその後の各残基のペナルティーを
より小さくする「アフィンギャップコスト」を使用する。これは、最も一般的に使用され
ているギャップスコアリングシステムである。勿論、高いギャップペナルティーにより、
より少ないギャップを含む最適化アラインメントが得られる。ほとんどのアラインメント
プログラムは、ギャップペナルティーを修正可能である。しかし、このような配列比較ソ
フトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（以下を参照のこと）を使用した場合、
アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップについては−１２であり、
各伸長については−４である。
【００７２】
したがって、最大相同性％の計算には、ギャップペナルティーを考慮した最適なアライ
ンメントの作製が最初に必要である。このようなアラインメントを実行するための適切な
コンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｄｅｖｅｒｅｕｘら
、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，３８７）である。
それ以外の配列比較を行うことができるソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（
Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、前出、第１８章を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈ
ｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３〜４１０）、および比較ツールのＧ
ＥＮＥＷＯＲＫＳ総合ソフトウェアが含まれるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよ
びＦＡＳＴＡは共にオフラインおよびオンライン検索が可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、
１９９９、前出、７−５８〜７−６０頁を参照のこと）。しかし、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉ
ｔプログラムを使用することが好ましい。
【００７３】
最終相同性％を同一性に関して測定することができるにもかかわらず、アラインメント
プロセス自体は、典型的には全か無かの対比較に基づいていない。そのかわり、一般に、
化学的類似性または進化距離に基づく各対比較にスコアを割り当てる比較類似性スコア行
列を使用する。一般的に使用されるこのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列−ＢＬ
ＡＳＴプログラムパッケージのデフォルト行列である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプロ
グラムは、一般に、公表されたデフォルト値または供給されている場合はあつらえのシン
ボル比較を使用する（さらなる詳細についてはユーザマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧ
パッケージの公表されたデフォルト値または他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ
６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。
【００７４】
一旦ソフトウェアにより最適なアラインメントが得られると、相同性％、好ましくは配
列同一性％を計算可能である。典型的には、ソフトウェアは配列比較の一部としてこれを
行い、数値として結果を示す。
【００７５】
本発明のアミノ酸配列に関する用語「変異体」または「誘導体」には、得られたアミノ
酸配列が非改変配列と実質的に同一の活性を保持する（好ましくは、配列番号１に記載の
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドと同一の活性を有する）場合、配列からまたは配列
への１つ（または複数の）アミノ酸の任意の置換、変化、改変、置換、欠失、または付加
が含まれる。
【００７６】
実施例に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはホ
モログを、本明細書中に記載の方法および組成物で使用するために改変することができる
。典型的には、配列の生物活性が維持されるように改変を行う。改変配列が改変されてい
ない配列の生物活性を保持する場合、アミノ酸置換（例えば、１、２または３〜１０、２
０、または３０個の置換）を行うことができる。あるいは、本明細書中に記載のポリペプ
チドの１つまたは複数の機能ドメインを意図的に不活化させるように改変することができ
る。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の機能ドメインには、コラーゲンドメイン、ネック領域、お
よび炭水化物認識ドメインが含まれる。アミノ酸置換には、例えば、治療目的で投与した
ポリペプチドの血漿半減期を増大させるための非天然類似体の使用を含んでもよい。
【００７７】
例えば、以下の表にしたがって、保存的置換を行うことができる。第２列中の同一のブ
ロックおよび好ましくは第３列中の同一行中のアミノ酸を互いに置換することができる。
【表１】
2010090134.tif 000006
【００７８】
ポリペプチドには、サーファクタントタンパク質Ｄの全長配列のフラグメントも含まれ
る。好ましくは、フラグメントは、少なくとも１つのエピトープを含む。エピトープの識
別方法は、当分野で周知である。フラグメントは、典型的には、少なくとも６個のアミノ
酸、より好ましくは少なくとも１０、２０、３０、５０、または１００個のアミノ酸を含
む。
【００７９】
ｒ−ＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を
含む組換えＳＰ−Ｄを、典型的には、組換え手段（例えば、以下の実施例に記載の手段）
によって作製する。しかし、固相合成などの当業者に周知の技術を使用した合成手段によ
ってこれらを作製することもできる。タンパク質を、例えば、抽出および精製を補助する
ために融合タンパク質として産生することもできる。融合タンパク質パートナーの例には
、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結
合および／または転写活性化ドメイン）、およびβ−ガラクトシダーゼが含まれる。融合
タンパク質配列を除去するために、融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列と
の間にタンパク質分解部位を含むように変換することもできる。好ましくは、融合タンパ
ク質は、目的のタンパク質配列の機能を妨害しない。動物細胞由来の細胞抽出物の精製に
よってタンパク質を得ることもできる。
【００８０】
本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、その変異体、ホモログ、フ
ラグメント、および誘導体は、実施的に単離した形態であり得る。このようなポリペプチ
ドを、タンパク質の意図する目的を妨害しないキャリアまたは希釈剤と混合することがで
き、依然として実質的に単離されていると見なされると理解される。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲ
Ｄ）の変異体、ホモログ、フラグメント、または誘導体はまた、実質的に精製された形態
であり得る（この場合、一般に、調製物中に９０％を超える（例えば、調製物中に９５％
、９８％、または９９％のタンパク質がタンパク質である）タンパク質を含む）。
【００８１】
本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、その変異体、ホモログ、フ
ラグメント、および誘導体を、標示標識（revealing label）で標識することができる。
標示標識は、ポリペプチドなどを検出可能な任意の適切な標識であり得る。適切な標識に
は、放射性同位体（例えば、125Ｉ）、酵素、抗体、ポリヌクレオチド、ビオチンなどの
リンカーが含まれる。標識されたポリペプチドを、サンプル中のポリペプチドの量を決定
するための免疫アッセイなどの診断方法において使用することができる。ポリペプチドま
たは標識ポリペプチドを、標準的なプロトコールを使用した動物およびヒトでのポリペプ
チドに対する免疫反応の検出のための血清学的または細胞媒介免疫アッセイで使用するこ
ともできる。
【００８２】
任意選択的に標識された本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そ
の変異体、ホモログ、フラグメント、および誘導体を、固相（例えば、免疫アッセイウェ
ルまたはディップスティックの表面）に固定することもできる。このような標識ポリペプ
チドおよび／または固定ポリペプチドを、安定な試薬、コントロール、および説明書など
と共に適切な容器中のキットにパッケージングすることができる。このようなポリペプチ
ドおよびキットを、免疫アッセイによるポリペプチドまたはその対立遺伝子もしくは種変
異体に対する抗体の検出方法で使用することができる。
【００８３】
免疫アッセイ法は当分野で周知であり、一般に、（ａ）タンパク質に対する抗体によっ
て結合することができるエピトープを含むポリペプチドを得るステップと、（ｂ）抗体−
抗原複合体が形成する条件下で生体サンプルとポリペプチドをインキュベートするステッ
プと、（ｃ）ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを判断するステ
ップとを含む。
【００８４】
本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、その変異体、ホモログ、フ
ラグメント、および誘導体をインビトロまたはインビボ細胞培養系で使用して、疾患での
機能を含む細胞機能におけるその対応する遺伝子およびホモログの役割を研究することが
できる。例えば、短縮ポリペプチド（truncated polypeptide）または改変ポリペプチド
を、細胞に組み込んで、細胞で生じる正常な機能を破壊することができる。組換え発現ベ
クターからのポリペプチドのインサイチュー発現によって、ポリペプチドを細胞に組み込
むことができる（以下を参照のこと）。発現ベクターは、任意選択的に、ポリペプチド発
現を調節するための誘導プロモーターを含む。
【００８５】
組換え発現産物に対して最適な生物活性を付与することが必要であり得るので、昆虫細
胞または哺乳動物細胞などの適切な宿主細胞の使用により、このような翻訳後修飾（例え
ば、ミリストイル化、グリコシル化、短縮、脂質化、ならびにチロシン、セリン、または
トレオニンのリン酸化）が得られることが予想される。本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ
／ＣＲＤ）ポリペプチド、その変異体、ホモログ、フラグメント、および誘導体を発現す
るこのような細胞培養系をアッセイ系で使用して、細胞中のポリペプチドの機能を妨害ま
たは増強する候補物質を同定することができる。
【００８６】
［組換えサーファクタントタンパク質ＤのＲＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）核酸］
本発明者らは、本発明者らが「ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸」と呼ぶｒＳＰＤ（ｎ／Ｃ
ＲＤ）ポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明者らはまた、ｒＳＰＤ（ｎ／Ｃ
ＲＤ）の変異体、ホモログ、誘導体、およびフラグメントをコードする核酸、ならびにｒ
ＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸のフラグメント、ホモログ、誘導体、および変異体を提供する
。
【００８７】
好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、天然のＳＰ−Ｄ配列（例えば、配列番号
３に記載のヒトＳＰ−Ｄ配列）に由来する。より好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核
酸は、Ｎ末端ドメインおよび／またはコラーゲンドメイン、好ましくはそれらの両方をコ
ードする配列を欠く。好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、実質的に
残基１〜５９４、その任意のフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を欠く配列
番号３に記載のＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄの組換えフラグメントである。さらに
好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、実質的に残基５９５〜１１２８
を含む配列番号３に記載のＳＰ−Ｄ、好ましくはヒトＳＰ−Ｄ配列の組換えフラグメント
である。上記各配列のフラグメント、ホモログ、変異体、および誘導体もまた含まれる。
【００８８】
好ましい実施形態では、ヒトＳＰ−Ｄ配列（配列番号４）の２００位に対応するプロリ
ン残基をコードするトリプレットを、別の残基をコードするコドンに置換する。好ましく
は、プロリン残基を、非荷電の極性残基（例えば、システイン、セリン、トレオニン、ま
たはメチオニン残基）に置換する。非常に好ましい実施形態では、プロリン残基を、セリ
ン残基に置換する。したがって、好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、配列番号
３に記載のヒトＳＰ−Ｄ配列の５９８〜５６０位にセリンをコードするコドンを含み得る
。したがって、このような置換コドンは、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、お
よびＴＣＴを含み得る。最も好ましくは、置換コドンは、ＡＧＣを含む。
【００８９】
好ましくは、このようなｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は、配列番号１に記載の配列を有
するｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドをコードする。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸は
、好ましくは配列番号２に記載の配列を含み、より好ましくは配列番号２に記載の配列か
らなる。
【００９０】
本明細書中で使用される、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核
酸」は、互いに類義であることが意図される。「ポリヌクレオチド」は、一般に、改変さ
れていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい
任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「ポリヌクレ
オチド」には、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物で
あるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖領域と二本鎖領域との混合
物であるＲＮＡ、一本鎖、より典型的には二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域との混
合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定
されない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、あるいはＲＮＡと
ＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域をいう。用語「ポリヌクレオチド」はまた、１つまたは
複数の改変された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性もしくは他の理由のため
に改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「改変された」塩基には、例えば
、トリチル化塩基およびイノシンなどの通常でない塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡ
に対して種々の改変が行われているので、「ポリヌクレオチド」は、天然で典型的に見出
されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態ならびにウイ
ルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を含む。「ポリヌクレオチド
」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドを含む。
【００９１】
多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸は、遺伝コードの縮重の結果として同一のポ
リペプチドをコードすることができることが当業者に理解される。さらに、通常の技術を
使用して、当業者によって、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使
用頻度を反映するための本明細書中に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリ
ペプチド配列に影響を与えないヌクレオチドの置換が行われることが理解される。
【００９２】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸、変異体、フラグメント、誘導体、およびホモログは、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。これらは、一本鎖または二本鎖であり得る。これらは
また、合成ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドの範囲内に含まれるポリヌクレオチドで
あり得る。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なる改変型が当分野で公知である。これ
らには、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／ま
たは５’末端へのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的のため
に、ポリヌクレオチドを当分野で利用可能な任意の方法によって改変することができると
理解される。目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増大させるためにこの
ような改変を行うことができる。
【００９３】
ヌクレオチド配列に関する用語「変異体」、「ホモログ」、または「誘導体」には、配
列由来または配列に対するの１つ（または複数の）核酸の任意の置換、変形、改変、置換
、欠失、または付加が含まれる。好ましくは、変異体、ホモログ、または誘導体は、生物
活性を有するポリペプチドをコードする。
【００９４】
上記のように、配列相同性に関して、本明細書中の配列表に記載の配列と好ましくは少
なくとも５０％または７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なく
とも９０％相同である。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも
９８％相同である。上記のように、核酸相同性を比較することができる。好ましい配列比
較プログラムは、上記のＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。
デフォルトスコアリング行列は、各同一のヌクレオチドについては１０、各ミスマッチに
ついては−９の適合値を有する。各ヌクレオチドについてのデフォルトギャップ作製ペナ
ルティーは−５０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティーは−３である。
【００９５】
本発明者らは、本明細書中に示す配列またはその任意の変異体、フラグメント、もしく
は誘導体または任意の上記の相補物に選択的にハイブリッド形成することができるヌクレ
オチド配列をさらに記載する。ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオ
チド長、より好ましくは少なくとも２０、３０、４０、または５０ヌクレオチド長である
。
【００９６】
本明細書中で使用される、用語「ハイブリッド形成」は、「核酸の鎖が塩基の組み合わ
せ（pairing）によって相補鎖と連結するプロセス」ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術
で実施される増幅プロセスを含む。
【００９７】
本明細書中に記載のヌクレオチド配列またはその相補物と選択的にハイブリッド形成す
ることができるポリヌクレオチドは、本明細書中に記載の対応するヌクレオチド配列に対
して、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個または３０個、例えば少なくとも
４０個、６０個、または１００個またはそれ以上の連続したヌクレオチド領域に対して一
般に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または９０％、およびより好ましく
は少なくとも９５％または９８％相同である。
【００９８】
用語「選択的にハイブリッド形成可能な」は、プローブとして使用されるポリヌクレオ
チドを、標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドを有意に超えるレベルでプローブとハ
イブリッド形成することが見出される条件下で使用することを意味する。例えば、スクリ
ーニングされるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する他のヌクレオチド
のために、バックグラウンドハイブリッド形成が起こり得る。この事象では、バックグラ
ウンドは、標的ＤＮＡで認められる特異的相互作用の１／１０未満、好ましくは１／１０
０未満の強度のプローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用によ
って得られるシグナルレベルを意味する。相互作用の強度を、例えば、プローブの放射性
標識（例えば、32Ｐを使用する）によって測定することができる。
【００９９】
ハイブリッド形成条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７、「分子ク
ローニング技術ガイド」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、
Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で教示されている核酸結合
複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明のように「ストリンジェンシー」の定義
を参照のこと。
【０１００】
最大ストリンジェンシーは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い
）；高ストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低い温度、中程度のストリンジェン
シーはＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度、低ストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜
５０℃低い温度で得られる。当業者が理解するように、最大ストリンジェンシーハイブリ
ッド形成を使用して、同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出することができ、中
程度（または低）ストリンジェンシーハイブリッド形成を使用して、類似のまたは関連ポ
リヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
【０１０１】
好ましい態様では、本発明者らは、ストリンジェントな条件下（例えば、６５℃および
０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７．０）））で、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸、フラグメント、変異体、ホモロ
グ、または誘導体とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を提供する。
【０１０２】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二重鎖の両鎖（個別または組み合わせのいずれ
か）は、本明細書中に記載の方法および組成物に含まれる。ポリヌクレオチドが一本鎖の
場合、ポリヌクレオチドの相補配列も含まれると理解される。
【０１０３】
本発明の配列に１００％相同ではないが本発明の範囲内に含まれるポリヌクレオチドを
、多数の方法で得ることができる。配列の他の変異体を、例えば、一定範囲の個体（例え
ば、異なる集団由来の個体）から作製したＤＮＡライブラリーの探索によって得ることが
できる。例えば、ＳＰ−Ｄホモログを、他の個体または他の種から同定することができる
。さらなる組換えＳＰ−Ｄ核酸およびポリペプチドを、ホモログ中の対応する位置の同定
および本明細書中に記載の分子の合成または産生によって産生することができる。さらに
、このようなホモログ中のコラーゲン領域、ネック領域、および炭水化物結合ドメインを
、例えば、配列の目視またはコンピュータ支援比較によって同定し、非ヒトであるが１つ
または複数のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の生物活性を有する組換えＳＰ−Ｄへの組み合わせ
または産生について選択することができる。
【０１０４】
さらに、ＳＰ−Ｄの他のウイルス／細菌または細胞ホモログ、特に哺乳動物細胞（例え
ば、ラット、マウス、ウシ、および霊長類の細胞）で見出される細胞ホモログを得ること
ができ、このようなホモログおよびそのフラグメントは、一般に、ヒトＳＰ−Ｄと選択的
にハイブリッド形成することができる。このようなホモログを使用して、非ヒトｒＳＰＤ
（ｎ／ＣＲＤ）核酸、フラグメント、変異体、およびホモログをデザインすることができ
る。さらなる変種（variety）を産生するために、当分野で公知の手段によって変異誘発
を行うことができる。
【０１０５】
ＳＰ−Ｄホモログ配列を、中程度から高ストリンジェンシー条件下での他の動物種由来
のゲノムＤＮＡライブラリーから作製したｃＤＮＡライブラリーの探索およびｒＳＰＤ（
ｎ／ＣＲＤ）核酸、フラグメント、変異体、およびホモログの全部もしくは任意の一部、
またはＳＰ−Ｄの他のフラグメントを含むプローブでのこのようなライブラリーの探索に
よって得ることができる。
【０１０６】
類似の検討材料を適用して、本明細書に開示のポリペプチドまたはヌクレオチド配列の
種ホモログおよび対立遺伝子変異体を得る。
【０１０７】
変異体および株／種ホモログを、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸配列内の保存アミノ酸配
列をコードする変異体およびホモログ内の配列を標的するようにデザインしたプライマー
を使用する縮重ＰＣＲを使用しても得ることができる。例えば、アミノ酸配列のいくつか
の変異体／ホモログとの整列によって保存配列を予想することができる。当分野で公知の
コンピュータソフトウェアを使用して、配列アラインメントを行うことができる。例えば
、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵＰプログラムが広く一般に使用されている。
【０１０８】
縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは、１つまたは複数の縮重点を含み、既知の配列に
対して１つの配列プライマーを使用した配列のクローニングで使用したものよりも低いス
トリンジェンシー条件で使用される。遠縁の生物由来の配列間の総ヌクレオチド相同性が
非常に低いようなので、これらの条件下では、縮重ＰＣＲは、標識フラグメント（ｒＳＰ
Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）配列）を使用したライブラリーのスクリーニングよりもむしろ最適な方
法であり得る。
【０１０９】
さらに、ＢＬＡＳＴプログラムスーツなどの検索アルゴリズムを使用したヌクレオチド
および／またはタンパク質データベースの検索によって相同配列を同定することができる
。
【０１１０】
あるいは、このようなポリヌクレオチドを、特定決定された配列（例えば、ｒＳＰＤ（
ｎ／ＣＲＤ）核酸、またはその変異体、ホモログ、誘導体、またはフラグメント）の部位
特異的変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発
現される特定の宿主細胞のコドン優先度を至適化するために配列のサイレントなコドンを
変化させる必要がある場合に有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するためまたはポ
リヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質または機能を変化させるために
、他の配列の変化を所望することができる。
【０１１１】
本明細書中に記載のポリヌクレオチドを使用して、プライマー（例えば、ＰＣＲプライ
マー（別の増幅反応用のプライマー））、プローブ（例えば、放射性または非放射性標識
を使用して従来の手段によって標示標識を使用して標識）を産生することができるか、ポ
リヌクレオチドをベクターにクローン化することができる。このようなプライマー、プロ
ーブ、および他のフラグメントは、少なくとも８、９、１０、または１５、好ましくは少
なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０、または４０ヌクレオチド長であり、これら
もまた本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。
【０１１２】
ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドおよびプローブを、組換え、合成、ま
たは当業者が利用可能な任意の手段によって作製することができる。これらを、標準的な
技術によってクローン化することもできる。
【０１１３】
一般に、プライマーを、所望の核酸配列の一度に１ヌクレオチドの段階的製造を含む合
成手段によって産生する。自動化技術を使用してこの手段を行う技術は、当分野で容易に
利用可能である。
【０１１４】
一般に、組換え手段（例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術の使
用）を使用してより長いポリヌクレオチドを産生する。これは、クローン化を所望する脂
質ターゲティング配列領域に隣接するプライマー対（例えば、約１５〜３０ヌクレオチド
）を作製するステップと、プライマーを動物またはヒト細胞から得たｍＲＮＡまたはｃＤ
ＮＡと接触させるステップと、所望の領域を増幅する条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行
うステップと、増幅されたフラグメントを単離するステップ（例えば、アガロースゲルで
の反応混合物の精製）と、増幅されたＤＮＡを回収するステップとを含む。プライマーを
、増幅されたＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローン化することができる適切な
制限酵素認識部位を含むようにデザインすることができる。
【０１１５】
ポリヌクレオチドまたはプライマーは、標示標識を保有することができる。適切な標識
には、32Ｐおよび35Ｓなどの放射性同位体、酵素標識、ビオチンなどの他のタンパク質標
識が含まれる。このような標識をポリヌクレオチドまたはプライマーに付加し、それ自体
公知の技術を使用して検出することができる。当業者は、ヒトまたは動物体内のポリヌク
レオチドの検出または配列決定のための核酸ベースの試験において、標識または非標識の
ポリヌクレオチドもしくはプライマーまたはそのフラグメントを使用することができる。
【０１１６】
このような検出試験は、一般に、ハイブリッド形成条件下でＤＮＡまたはＲＮＡを含む
生体サンプルをポリヌクレオチドまたはプローブを含むプローブと接触させるステップと
、サンプル中でプローブと核酸との間に形成された任意の二重鎖を検出するステップとを
含む。ＰＣＲなどの技術を使用するか、固体支持体上のプローブの固定、サンプル中のプ
ローブとハイブリッド形成しない核酸の除去、およびプローブとハイブリッド形成した核
酸の検出によって、このような検出を行うことができる。あるいは、サンプル核酸を、固
体支持体に固定し、このような支持体に結合したプローブの量を検出することができる。
これの適切なアッセイ方法および他の形式を、例えば、ＷＯ８９／０３８９１およびＷＯ
９０／１３６６７で見出すことができる。
【０１１７】
ヌクレオチド（例えば、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸）の配列決定試験は、ハイブリッ
ド形成条件下で標的ＤＮＡまたはＲＮＡを含む生体サンプルをポリヌクレオチドまたはプ
ライマーを含むプローブと接触させるステップと、例えば、サンガーのダイデオキシ法（
Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）によって配列を決定するステップとを含む。
【０１１８】
このような方法は、一般に、適切な試薬の存在下で標的ＤＮＡまたはＲＮＡに相補的な
鎖の合成によってプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴ／Ｕ
残基で伸長反応を選択的に停止させるステップと、鎖伸長反応および停止反応を起こさせ
るステップと、伸長産物をサイズによって分離して選択的に終結したヌクレオチド配列を
決定するステップとを含む。適切な試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレ
オチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、緩衝液、ならびにＡＴＰが含ま
れる。ダイデオキシヌクレオチドを、選択的終結のために使用する。
【０１１９】
［核酸ベクター］
ポリヌクレオチド（例えば、本明細書中に記載のもの）を、組換え複製ベクターに組み
込むことができる。ベクターを使用して、適合する宿主細胞中で核酸を複製することがで
きる。したがって、さらなる実施形態では、本発明者らは、複製ベクターにポリヌクレオ
チドを移入するステップと、適合する宿主細胞にベクターを移入するステップと、宿主細
胞をベクターが複製する条件下で増殖させるステップとによってポリヌクレオチドを作製
する方法を提供する。ベクターを宿主細胞から回収することができる。適切な宿主細胞に
は、大腸菌などの細菌、酵母、哺乳動物細胞株、および他の真核細胞株（例えば、昆虫Ｓ
ｆ９細胞）が含まれる。
【０１２０】
好ましくは、ベクター中のポリヌクレオチドを、宿主細胞によってコード配列を発現す
ることができる調節配列に作動可能に連結する（すなわち、ベクターは発現ベクターであ
る）。用語「作動可能に連結された」は、記載の成分がその意図する様式で機能する関係
にあることを意味する。コード配列に、「作動可能に連結された」調節配列を、調節配列
に適合する条件下でコード配列が発現する方法でライゲーションする。
【０１２１】
例えば、さらなる転写調節エレメントの付加によって調節配列を改変して、転写モジュ
レーターに、より反応性を示す調節配列によって指示された転写レベルを得ることができ
る。
【０１２２】
ベクターを、以下に記載のように、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクト
して、タンパク質を発現させることができる。このプロセスは、タンパク質をコードする
コード配列のベクターによって発現する条件下で上記の発現ベクターで形質転換した宿主
細胞を培養するステップと、任意選択的に発現したタンパク質を回収するステップとを含
み得る。使用した宿主細胞に適合するベクターを選択する。
【０１２３】
ベクターは、例えば、複製起点、任意選択的にポリヌクレオチド発現用のプロモーター
、および任意選択的にプロモーターのレギュレーターを使用して得たプラスミドまたはウ
イルスベクターであり得る。ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子（例えば
、細菌プラスミドの場合は、アンピシリン耐性遺伝子または哺乳動物ベクターにはネオマ
イシン耐性遺伝子）を含み得る。例えば、ベクターを使用して、宿主細胞をトランスフェ
クトまたは形質転換することができる。
【０１２４】
ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された調節配列には、プロモーター／
エンハンサーおよび他の発現調節シグナルが含まれる。これらの調節配列を、発現ベクタ
ーが使用されるようにデザインされた宿主細胞に適合するように選択することができる。
用語「プロモーター」は、当分野で周知であり、最小プロモーターから上流エレメントお
よびエンハンサーを含むプロモーターまでの、サイズおよび複雑さの範囲の核酸配列を含
む。
【０１２５】
プロモーターは、典型的には、哺乳動物細胞において機能するプロモーターから選択さ
れるが、原核プロモーターおよび他の真核細胞（昆虫細胞など）において機能するプロモ
ーターを使用することができる。プロモーターは、典型的には、ウイルスまたは真核生物
遺伝子のプロモーター配列由来である。例えば、発現する細胞のゲノム由来のプロモータ
ーであり得る。真核プロモーターに関して、これらは普遍的様式（αアクチン、βアクチ
ン、チューブリンプロモーターなど）または組織特異的様式（ピルビン酸キナーゼ遺伝子
のプロモーターなど）で機能するプロモーターであり得る。これらはまた、特異的な刺激
に反応するプロモーター（例えば、ステロイドホルモン受容体に結合するプロモーター）
であり得る。ウイルスプロモーターも使用することができる（例えば、モロニーマウス白
血病ウイルス長末端反復（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳ
Ｖ）ＬＴＲプロモーター、またはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター
）。
【０１２６】
細胞の生存期間中に異種遺伝子の発現レベルを調節することができるように誘導可能な
こともまたプロモーターに有利であり得る。「誘導可能な」とは、プロモーターを使用し
て得られた発現レベルを調節することができることを意味する。
【０１２７】
さらに、任意のこれらのプロモーターを、さらなる調節配列（例えば、エンハンサー配
列）の付加によって改変することができる。上記の２つまたはそれ以上の異なるプロモー
ター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターを使用することもできる。
【０１２８】
アンチセンスＲＮＡを産生するために、ポリヌクレオチドを、アンチセンス方向で上記
のベクターに挿入することができる。合成手段によって、アンチセンスＲＮＡまたは他の
アンチセンスポリヌクレオチドを産生することもできる。このようなアンチセンスポリヌ
クレオチドを、本明細書中に記載の任意の１つのポリヌクレオチドを含む遺伝子から転写
されたＲＮＡのレベルを調製する方法に使用することができる。
【０１２９】
［宿主細胞］
ベクター／ポリヌクレオチドを複製し、そして／またはポリヌクレオチドによってコー
ドされるポリペプチドを発現する目的で、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）核酸、そのフラグメン
ト、ホモログ、変異体、または誘導体を含むかコードするベクターおよびポリヌクレオチ
ドを宿主細胞に移入することができる。宿主細胞として原核細胞を使用してポリペプチド
を産生することができるが、真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞（特に
、哺乳動物細胞など））を使用することが好ましい。
【０１３０】
ベクター／ポリヌクレオチドを、当分野で公知の種々の技術（トランスフェクション、
形質転換、およびエレクトロポレーションなど）を使用して適切な宿主細胞に移入するこ
とができる。ベクター／ポリヌクレオチドを動物に投与する場合、いくつかの技術が当分
野で公知である（例えば、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびアデノウイル
スなどの組換えウイルスベクターでの感染、核酸の直接注射、および遺伝子銃形質転換な
ど）。
【０１３１】
［タンパク質の発現および精製］
ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を使用して、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドな
どのポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を発現すること
ができる。宿主細胞を、タンパク質が発現する適切な条件下で培養することができる。ポ
リペプチドの発現は、これらが継続的に産生されるような構成性、または誘導性であって
、発現を開始させる刺激を必要とし得る。誘導発現の場合、例えば、培養培地へのインデ
ューサー物質（例えば、デキサメタゾンまたはＩＰＴＧ）の添加が必要な場合に、タンパ
ク質産生を開始することができる。
【０１３２】
ポリペプチドを、当分野で公知の種々の技術（酵素溶解、化学的および／または浸透圧
溶解、ならびに物理的破壊を含む）によって宿主細胞から抽出することができる。
【０１３３】
ポリペプチドを、ＴｎＴ（登録商標、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）ウサギ網状赤血球系などの
インビトロ無細胞系で組換え産生することもできる。
【０１３４】
［抗体］
本発明はまた、ポリペプチドまたはそのフラグメントに対するモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体を提供する。したがって、本発明は、さらに、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲ
Ｄ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体に対するモノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生プロセスを提供する。
【０１３５】
ポリクローナル抗体を所望する場合、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤ
ギ、ウマなど）を、ポリペプチド由来のエピトープを保有する免疫原性ポリペプチドで免
疫する。免疫動物由来の血清を回収し、公知の手順にしたがって処理する。ポリペプチド
由来のエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が他の抗原に対する抗体を含む
場合、ポリクローナル抗体を、免疫親和性クロマトグラフィによって精製することができ
る。ポリクローナル抗血清の産生および処理技術は、当分野で公知である。このような抗
体を作製することができるように、本発明はまた、動物またはヒトにおける免疫原として
使用するための別のポリペプチドに対してハプテン化したポリペプチドまたはそのフラグ
メントを提供する。
【０１３６】
ポリペプチド中のエピトープに対するモノクローナル抗体を、当業者は容易に産生する
こともできる。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の一般的な作製方法は周知であ
る。不死化抗体産生細胞株を、細胞融合、癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接的な形質転換
、またはエプスタイン・バーウイルスでのトランスフェクションなどの他の技術によって
も作製することができる。ポリペプチド中のエピトープに対して産生されたモノクローナ
ル抗体のパネルを、種々の性質（すなわち、イソ型およびエピトープ親和性）についてス
クリーニングすることができる。
【０１３７】
別の技術は、例えば、ファージがその外殻表面上にｓｃＦｖフラグメントを発現するフ
ァージディスプレイライブラリーを非常に多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）でスクリーニ
ングするステップを含む。この技術は、当分野で周知である。
【０１３８】
ポリペプチド由来のエピトープに対する抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナ
ル抗体の両方）は特に診断で有用であり、中和する抗体は、受動免疫治療で有用である。
特にモノクローナル抗体を使用して、抗イディタイプ抗体を惹起することができる。抗イ
ディオタイプ抗体は、保護が望まれる薬剤の抗原の「内部イメージ」を有する免疫グロブ
リンである。
【０１３９】
抗イディオタイプ抗体を惹起する技術は、当分野で公知である。これらの抗イディオタ
イプ抗体もまた、治療に有用であり得る。
【０１４０】
本発明の目的のために、用語「抗体」は、特記しない限り、標的抗原への結合活性を保
持する全抗体のフラグメントが含まれる。このようなフラグメントには、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ
’）、およびＦ（ａｂ’）2フラグメントならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。さ
らに、抗体およびそのフラグメントは、例えば、欧州特許第２３９４００号に記載のヒト
化抗体であり得る。
【０１４１】
（ａ）抗体を得るステップと、（ｂ）抗体−抗原複合体を形成する条件下で生体サンプ
ルを抗体とインキュベートするステップと、（ｃ）抗体を含む抗体−抗原複合体が形成さ
れたかを判断するステップとを含む方法による生体サンプル中に存在するポリペプチドの
検出方法で抗体を使用することができる。
【０１４２】
適切なサンプルには、脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉、および骨
組織などの組織由来の抽出物またはこのような組織由来の新生物成長物由来の抽出物が含
まれる。
【０１４３】
抗体を、固体支持体に結合させ、そして／または適切な試薬、コントロール、および説
明書などを含む適切な容器中のキットにパッケージングすることができる。
【０１４４】
［アッセイ］
本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、
変異体、または誘導体に結合する物質の同定に適切なアッセイを開示する。
【０１４５】
一般に、このような結合アッセイは、候補分子にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド
、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を曝露するステップと、ｒ
ＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、また
は誘導体と候補分子との間の相互作用または結合を検出するステップを含む。結合アッセ
イを、インビトロまたはインビボで行うことができる。
【０１４６】
本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドの活性を増強することができる物
質の同定アッセイを開示する。このような化合物を、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチ
ドのアゴニストとして使用することができ、例えば、任意の所望の効果を増強するために
個体に同時投与することができる。
【０１４７】
一般に、このような物質または化合物の同定アッセイは、細胞または生物を得るステッ
プと、細胞または生物をｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント
、ホモログ、変異体、もしくは誘導体に曝露するステップと、細胞を候補分子に曝露する
ステップと、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）に関連する効果を検出するステップとを含む。本明
細書中（特に、実施例）に開示の任意のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効果を
検出することができる。
【０１４８】
特に、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効果を、末梢血好酸球増多症の軽減、
血清ＩｇＥレベルの低下、血清ＩｇＧ１レベルの低下、気道過敏症の軽減、肺胞マクロフ
ァージ数の減少、洗浄物中のリン脂質レベルの低下、エオタキシン発現のダウンレギュレ
ーション、ＭＣＰ−１発現の減少、ＭＩＰ−１α発現のダウンレギュレーション、および
ＭＩＰ−２発現のダウンレギュレーションからなる群から選択することが好ましい。
【０１４９】
アゴニストを同定するために、さらなる効果、または好ましくは相乗効果を検出する。
したがって、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのみで、例えば、分子のレベルまたは
数を減少させるか分子発現をダウンレギュレーションすることができ、アッセイは分子の
レベルまたは数をさらに減少させるか分子発現をさらにダウンレギュレーションする分子
を同定する。したがって、好ましくは、候補分子は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチ
ド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体と共に、ｒＳＰＤ（ｎ
／ＣＲＤ）ポリペプチドのみと比較して、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５
０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、またはそれ以上の発現をダウンレギ
ュレーションするかレベルまたは数を減少させる。したがって、例えば、アゴニストとし
ての使用に適切な候補分子は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのみで達成される肺
胞マクロファージ数の減少を１０％超増強することができる分子である。
【０１５０】
逆に、アンタゴニストの同定アッセイは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効
果の減少の検出を含む。好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドによって達成
される発現のダウンレギュレーションまたは数もしくはレベルの低下は、適切な候補分子
の存在下で減少する。好ましくは、減少は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのみの
みと比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも
３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なく
とも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少
なくとも９０％、またはそれ以上である。したがって、例えば、アンタゴニストとしての
使用に適切な候補分子は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのみで達成される肺胞マ
クロファージ数の減少を１０％超減少することができる分子である。
【０１５１】
例示のように、Ｎ１が非処置生物中の肺胞マクロファージ数であり、Ｎ２はｒＳＰＤ（
ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導
体に曝露した生物中の数であり場合、肺胞マクロファージ数は、Ｒ＝（Ｎ１−Ｎ２）／Ｎ
１×１００％減少する。アゴニストはｘが１以上である因数ｘ（例えば、ｘ＝１、１．１
、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００など）
でＲを増加させ、アンタゴニストはｘが１未満である因数ｘ（例えば、ｘ＝０．９、０．
９、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１など）でＲを減少させる
。
【０１５２】
例えば、生物を、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホ
モログ、変異体、もしくは誘導体および候補分子に曝露し、末梢好酸球レベル、血清Ｉｇ
Ｅ、血清ＩｇＧ１、または任意の組み合わせを検出することができる。候補分子と共にｒ
ＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もし
くは誘導体に曝露した生物の気道過敏症または肺胞マクロファージ数を検出することもで
きる。
【０１５３】
好ましい候補分子は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）と組み合わせてさらなる効果または相乗
効果を提供する分子である。
【０１５４】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドのアンタゴニストを同定するためのアッセイもま
た開示する。このようなアッセイは、候補分子と組み合わせたｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポ
リペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体への細胞また
は生物の曝露に対する効果の減少を検出するステップを含む。
【０１５５】
好ましい実施形態では、細胞よりもむしろ生物全体に対してアッセイを行う。好ましく
は、生物は、本明細書中に開示の疾患を罹患しているか、このような疾患の１つまたは複
数の症状を示す生物である。非常に好ましい実施形態では、生物は、サーファクタントタ
ンパク質Ｄを発現しない生物である。好ましくは、このような生物は、ＳＰ−Ｄ遺伝子が
破壊または欠失している。より好ましくは、生物は、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
）、好ましくは、Ｂｏｔａｓ，Ｃ．ら、「サーファクタントタンパク質Ｄを欠くマウスの
サーファクタントのホメオスタシスの変化および肺胞ＩＩ型細胞の形態学」、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５（２０）、１１８６９〜７４頁に
記載のように作製したＳＰ−Ｄノックアウトマウスである。
【０１５６】
［候補分子］
上記アッセイで使用するための適切な候補分子には、特にアミノ酸サイズが約５〜３０
または１０〜２５のペプチドが含まれる。ランダムな配列または最大に多様なペプチドパ
ネルを一貫して得るために変化させた配列を含むペプチドパネル由来のペプチドを使用す
ることができる。
【０１５７】
適切な候補分子には、抗体産物（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、
単鎖抗体、キメラ抗体、およびＣＤＲグラフト抗体）も含まれる。さらに、コンビナトリ
アルライブラリー、ペプチド、ペプチド模倣物、定義された化学物質、オリゴヌクレオチ
ド、および天然物のライブラリーを活性についてスクリーニングすることができる。候補
分子を、例えば、反応あたり１０種の分子のバッチおよび個別に試験したｒＳＰＤ（ｎ／
ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効果の増強または減少を示すバッチの分子における最初のスク
リーニングで使用することができる。
【０１５８】
［ライブラリー］
ポリペプチドまたは核酸のライブラリーなどの候補分子のライブラリーを、本明細書中
に記載の方法および組成物で使用することができる。このようなライブラリーを、ｒＳＰ
Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは
誘導体の存在下で細胞または生物に曝露し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効
果を検出する。
【０１５９】
ファージディスプレイ技術に代表される巨大ライブラリーの所望のメンバーを単離する
ための選択プロトコールは当分野で公知である。種々のペプチド配列が糸状バクテリオフ
ァージの表面上にディスプレイされるような系（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９
９０，前出）は、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメントのインビトロ選択および増
幅のための抗体フラグメント（およびこれをコードするヌクレオチド配列）のライブラリ
ーの作製に有用であることが証明されている。ＶH領域およびＶL領域をコードするヌクレ
オチド配列は、大腸菌の原形質周囲の空間に指向させるリーダーシグナルをコードする遺
伝子フラグメントに連結し、結果として、典型的にはバクテリオファージ外殻タンパク質
（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）への融合物として得られた抗体フラグメントがバ
クテリオファージの表面上にディスプレイされる。あるいは、抗体フラグメントは、λフ
ァージのキャプシド（ファージボディ）の外面上にディスプレイされる。ファージベース
のディスプレイ系の利点は、生物系であるので、細菌細胞中に選択されたライブラリーメ
ンバーを含むファージの成長によって選択されたライブラリーメンバーを単純に増幅する
ことができるという点である。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードする
ヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクター上に含まれるので、配列決定、
発現、およびその後の遺伝子操作が比較的簡単である。
【０１６０】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリー
の構築方法は、当分野で周知である（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，１９９０，前出；Ｋａｎ
ｇら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４３６３；Ｃ
ｌａｃｋｓｏｎら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４；Ｌｏｗｍａｎら，１９９
１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎら，１９９１，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら
、１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，４１３３；Ｃｈａｎｇら，
１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，１９９１
，Ｇｅｎｅ，１０４，１４７；Ｍａｒｋｓら，１９９１，前出；Ｂａｒｂａｓら，１９９
２，前出；Ｈａｗｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
２２，８６７；Ｍａｒｋｓら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１６００
７；Ｌｅｒｎｅｒら，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８，１３１３（引用することによ
り本明細書の一部をなすものとする））。一般にポリペプチドライブラリーの発現のため
にこのような技術を必要に応じて修正することができる。
【０１６１】
１つの特に有利なアプローチは、ｓｃＦｖファージ−ライブラリーの使用であった（Ｂ
ｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３〜６；Ｈｕｓｔｏｎら
，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５，５８７９〜５８８
３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，８７，１０６６〜１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，１９９０，前出；Ｃｌａｃｋｓ
ｏｎら，１９９１，前出；Ｍａｒｋｓら，１９９１，前出；Ｃｈｉｓｗｅｌｌら，１９９
２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０，８０；Ｍａｒｋｓら，１９９２，前出）。
バクテリオファージ外殻タンパク質上にディスプレイされるｓｃＦｖライブラリーの種々
の実施形態が記載されている。ファージディスプレイアプローチの改良も公知である（例
えば、ＷＯ９６／０６２１３号およびＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌら）およびＷＯ９７／０８３２０号（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、前
出）（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載）。
【０１６２】
別のライブラリー選択技術には、バクテリオファージプラークまたは溶原菌コロニー（
共に以前に記載されている）として直接スクリーニングすることができるλバクテリオフ
ァージ発現系が含まれ（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５；Ｃ
ａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８７；Ｍｕｌｌｉｎａｘら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，８０９５；Ｐｅｒｓｓｏｎら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２４３２）、本発明で使用されている。これらの発現
系を使用して、ライブラリーの多数の異なるメンバーを約１０6またはそれ以上のオーダ
ーでスクリーニングすることができる。他のスクリーニング系は、例えば、ライブラリー
メンバーの直接的化学合成に依存する。１つの初期の方法は、ＷＯ８４／０３５６４号な
どに記載のピンまたはロッドのセットでのペプチド合成を含む。各ビーズが各ライブラリ
ーメンバーであるペプチドライブラリーを形成するビーズ上でのペプチド合成を含む類似
の方法は、米国特許第４，６３１，２１１号に記載されており、関連する方法は、ＷＯ９
２／０００９１号に記載されている。ビーズベースの方法の有意な改良は、各ライブラリ
ーメンバーのアミノ酸配列の同定を容易にするためのオリゴヌクレオチドなどの固有の識
別タグでの各ビーズのタグ化を含む。これらの改良されたビーズベースの方法は、ＷＯ９
３／０６１２１号に記載されている。
【０１６３】
別の化学合成法は、アレイ中の不連続の所定の位置にそれぞれ異なるライブラリーメン
バー（例えば、固有のペプチド配列）を位置付ける様式での表面上でのペプチドアレイ（
またはペプチド模倣物）の合成を含む。各ライブラリーメンバーの同一性を、アレイ中の
その空間的位置によって決定する。所定の分子（例えば、受容体）と反応性ライブラリー
メンバーとの間で結合相互作用が起こるアレイ中の位置を決定し、それにより、空間的位
置を基本として反応性ライブラリーメンバーの配列を同定する。これらの方法は、米国特
許第５，１４３，８５４号；ＷＯ９０／１５０７０号およびＷＯ９２／１００９２号；Ｆ
ｏｄｏｒら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，７６７；Ｄｏｗｅｒ  ａｎｄ  Ｆｏｄ
ｏｒ，１９９１，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２６，２７１に記載されている
。
【０１６４】
ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを作製するための他の系は、ライブラ
リーメンバーのインビトロ合成のための無細胞酵素機構の使用を含む。１つの方法では、
ＲＮＡ分子を、標的リガンドに対する別ラウンドの選択およびＰＣＲ増幅によって選択す
る（Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５；Ｅｌ
ｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８）
。類似の技術を使用して、所定のヒト転写因子に結合するＤＮＡ配列を同定することがで
きる（Ｔｈｉｅｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｈ，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒ
ｅｓ．，１８，３２０３；Ｂｅａｕｄｒｙ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２５７，６３５；ＷＯ９２／０５２５８およびＷＯ９２／１４８４３）。類似の方
法では、巨大ライブラリーの作製方法としてインビトロ翻訳を使用して、ポリペプチドを
合成することができる。一般に安定化ポリソーム複合体を含むこれらの方法は、ＷＯ８８
／０８４５３号、ＷＯ９０／０５７８５号、ＷＯ９０／０７００３号、ＷＯ９１／０２０
７６号、ＷＯ９１／０５０５８号、およびＷＯ９２／０２５３６号にさらに記載されてい
る。ＷＯ９５／２２６２５号およびＷＯ９５／１１９２２（Ａｆｆｙｍａｘ）などに開示
のファージベースではない別のディスプレイ系は、選択のためのポリペプチドのディスプ
レイのためにポリソームを使用する。これらおよび全ての上記の書類はまた、引用するこ
とにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１６５】
［コンビナトリアルライブラリー］
ライブラリー（特に、候補分子のライブラリー）は、コンビナトリアルライブラリー（
コンビナトリアル化合物ライブラリーとしても公知）の形態で適切に存在し得る。
【０１６６】
本明細書中で使用される、用語「コンビナトリアルライブラリー」は、ランダムに選択
されたサブユニットからなる多種の化合物の集団である。コンビナトリアルライブラリー
を、細胞または生物に曝露した場合にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド媒介効果を増
大、増強、減少、または最小化することができる分子についてスクリーニングすることが
できる。
【０１６７】
タンパク質分解もしくは非タンパク質分解酵素に活性なライブラリー、Ｇタンパク質共
役受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニストおよびアンタゴニストのライブラリー、非ＧＰＣＲ標
的（例えば、インテグリン、イオンチャネル、ドメイン相互作用、核受容体、および転写
因子）に活性なライブラリー、ならびにホールセル腫瘍学および抗感染性標的のライブラ
リーなどを含む化合物の種々のコンビナトリアルライブラリーが現在利用可能である。コ
ンビナトリアルライブラリーの概説、特にその構築および使用は、Ｄｏｌｌｅ  ａｎｄ  
Ｎｅｌｓｏｎ，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，第１巻，第４号，２３５〜２８２に記載されている。「コンビナトリアル
ペプチドライブラリープロトコール」（Ｓｈｍｕｅｌ  Ｃａｂｉｌｌｙ，Ｔｏｔｏｗａ，
Ｎ．Ｊ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｃ１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第８７巻）も参照のこと。
【０１６８】
コンビナトリアル化合物ライブラリー、その産生および使用を記載したさらなる引例に
は、「分子多様性の化学的作製」、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｐａｖｉａ，Ｓｐｈｉｎｘ  Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（１
９９５年７月公開）；「コンビナトリアルケミストリー：未来へのストラテジー  ＭＤＬ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓはそのプロジェクトライブラリーが多様性ラ
イブラリーを管理する役割を果たすと考察する」（１９９５年７月公開）；「リード化合
物の発見およびＳＡＲ組織化における固相コンビナトリアルケミストリー」、Ａｄｎａｎ
Ｍ．Ｍ．Ｍｊａｌｌｉ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｙ  Ｅ．Ｔｏｙｏｎａｇａ、Ｏｎｔｏｇｅｎ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９９５年７月公開）；「構造的に指示された非ペプチドラ
イブラリー由来の非ペプチドブラジキニン受容体アンタゴニスト」，Ｓａｒｖａｊｉｔ  
Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ，Ｂａｂｕ  Ｊ．Ｍａｖｕｎｋｅｌ，Ｒｏｂｉｎ  Ａｎｄｙ，Ｄ
ｏｎａｌｄ  Ｊ．Ｋｙｌｅ＊、Ｓｃｉｏｓ  Ｎｏｖａ  Ｉｎｃ．（１９９５年７月公開）
；「薬理作用団の多様性を使用したコンビナトリアルケミストリーライブラリーのデザイ
ン」、Ｋｅｉｔｈ  Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｖｅ  Ｂｒｉａｎｔ、Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．（１９９５年７月公開）；「組み合わせ合成実験のためのデ
ータベースシステム」、Ｃｒａｉｇ  Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗｅｉｎｉｎｇ
ｅｒ，Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ
，Ｉｎｃ．（１９９５年７月公開）；「コンビナトリアルケミストリーのための情報管理
機構」，Ｋｅｉｔｈ  Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｗｈｉｔｅ，Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．（１９９５年７月公開）；「化学的多様性に取り組
むための新規のソフトウェアツール」，Ｒ．Ｓ．Ｐｅａｒｌｍａｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ
Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ  Ｔｅｘａｓ（１９９６年６月／７月公開）；「創薬の新規のストラテジーによっ
て付与される計算機化学の機会：見解」、Ｙｖｏｎｎｅ  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  Ｍａｒｔｉ
ｎ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｐｒｏ
ｊｅｃｔ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９９６年６月／７月公開）；「
ルイビル大学でのコンビナトリアルケミストリーおよび分子多様性コース：説明」，Ａｒ
ｎｏ  Ｆ．Ｓｐａｔｏｌａ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ（１９９６年６月／７月公開）；「化学的
に作製したスクリーニングライブラリー：現在と未来」、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｐａｖｉ
ａ、Ｓｐｈｉｎｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ
ｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（１９９６年６月／７月公開）；「創薬プロセスへの炭水化物分子の多
様性を導入するための化学的ストラテジー」、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｓｏｆｉａ、Ｔｒａ
ｎｓｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（１９９６年６月／７月公開）；「
コンビナトリアルケミストリーのためのデータ管理」，Ｍａｒｙｊｏ  Ｚａｂｏｒｏｗｓ
ｋｉ，Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｉｌａ  Ｈ．ＤｅＷｉｔ
ｔ，Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９５年１１
月公開）；および「バイオベースの産業におけるＲ＆Ｄに対する高処理有機合成の影響」
，Ｊｏｈｎ  Ｐ．Ｄｅｖｌｉｎ（１９９６年３月公開）を含むＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｅｔｓｃｉ．ｏｒｇ／Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｃｏｍｂｉｃｈｅｍ／から利用可能な引
例が含まれる。
【０１６９】
コンビナトリアルケミストリーにおける技術は、新規の薬学的リード化合物の作製のた
めの現代的方法で広範に許容されつつある（Ｇａｌｌｏｐ，Ｍ．Ａ．ら，１９９４，Ｊ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７、１２３３〜１２５１；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、１９９４
、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７、１３８５〜１４０１）。１つのコンビナトリアルアプ
ローチの使用は、固相支持体の各粒子上に異なる構造を含むライブラリーの合成、ライブ
ラリーの可溶性受容体との相互作用、高分子標的と相互作用する「ビーズ」の同定、およ
び同定した「ビーズ」によって保有される構造の決定を含むストラテジーに基づく（Ｌａ
ｍ，Ｋ．Ｓ．ら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８２〜８４）。このアプローチの代
替法は、固体支持体からの定義された化合物アリコートの連続的放出、およびその後の溶
液中の活性の決定、活性な化合物が放出される粒子の同定、直接的配列決定によるその構
造の解明（Ｓａｌｍｏｎ，Ｓ．Ｅ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、９０、１１７０８〜１１７１２）、またはそのコードの解読（Ｋｅｒｒ，Ｊ
．Ｍ．ら、１９９３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５、２５２９〜２５３１；Ｎ
ｉｋｏｌａｉｅｖ，Ｖ．ら、１９９３、Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．，６、１６１〜１７０；Ｏｈ
ｌｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ、９０、１０９２２〜１０９２６）である。
【０１７０】
可溶性のランダムなコンビナトリアルライブラリーを、Ｆｕｒｋａ（Ｆｕｒｋａ，Ａ．
ら，１９８８，第１０回医薬品化学国際シンポジウム，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，１９８８；Ｆ
ｕｒｋａ，Ａ．ら，１９８８，第１４回国際生化学会議，Ｐｒａｇｕｅ，１９８８；Ｆｕ
ｒｋａ，Ａ．ら，１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，
３７，４８７〜４９３）によって最初に記載されたペプチドの等モル混合物の作製のため
の簡単な原理を使用して合成することができる。反復性スクリーニングのための可溶性ラ
イブラリーの構築も記載されている（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ら，１９９１，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３５４，８４〜８６）。Ｋ．Ｓ．Ｌａｍは、不溶性のランダムなコンビナトリア
ルライブラリーの新規且つ予想外に強力な使用技術を開示した。Ｌａｍは、固相支持体上
でランダムなコンビナトリアルライブラリーを合成し、その結果、各支持体は均一な分子
構造の試験化合物を有し、固相結合プロトコールによる支持体からの試験化合物の事前の
除去を行うことなくライブラリーをスクリーニングした（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、１９９１
、Ｎａｔｕｒｅ、３５４、８２〜８４）。
【０１７１】
したがって、候補分子のライブラリーは、合成コンビナトリアルライブラリー（例えば
、コンビナトリアル化合物ライブラリー）、細胞抽出物、体液（例えば、尿、血液、涙液
、汗、または唾液）、または合成産物もしくは天然産物の他の混合物（例えば、小分子ま
たは発酵混合物のライブラリー）であり得る。
【０１７２】
分子のライブラリーには、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパ
ク質、またはペプチドもしくはタンパク質のフラグメント；核酸（例えば、アンチセンス
；ＤＮＡ；ＲＮＡ；またはペプチド核酸、ＰＮＡ）；アプタマー；または炭水化物もしく
は多糖類を含み得る。ライブラリーの各メンバーは単独であるか、混合物の一部（例えば
、圧縮ライブラリー（compressed library））であり得る。ライブラリーは、精製化合物
を含み得るか、「汚れて」いてもよい（すなわち、有意な量の夾雑物を含む）。本明細書
中に記載の方法と共に市販のライブラリー（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＡｒＱｕｌ
ｅ、Ｎｅｏｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｒｃｏ、Ｃｉｄｄｃｏ、Ｏｘｆｏｒｄ
Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐａｎｌａｂｓ、Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、Ｓｉｇｍａ、またはＴｒｉｐｏｓｅ）を使用することもできる。
【０１７３】
上記のライブラリーに加えて、多様性ファイル（diversity file）と呼ばれる特定のラ
イブラリーを使用して、新規の方法の特異性、信頼性、または再現性を評価することがで
きる。多様性ファイルは、多数の化合物（例えば、１０００またはそれ以上の小分子）（
アッセイにおいて潜在的に非特異的に検出することができる多数のクラスの化合物の代表
）を含む。多様性ファイルは市販されているか、上記の業者から市販されている各化合物
から構築することもできる。
【０１７４】
［候補物質］
適切な候補物質には、特に、実施例に記載のポリペプチド配列に基づいて約５〜３０個
または１０〜２５個のアミノ酸サイズのペプチドまたは１つまたは複数の残基が置換され
たこのようなペプチドの変異体が含まれる。ランダムな配列または最大に多様なペプチド
パネルを一貫して得るために変化させた配列を含むペプチドパネル由来のペプチドを使用
することができる。
【０１７５】
適切な候補物質には、ポリペプチドに特異的な抗体産物（例えば、モノクローナル抗体
、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、およびＣＤＲグラフティング抗体）も含
まれる。さらに、コンビナトリアルライブラリー、ペプチド、ペプチド模倣物、定義され
た化学物質、オリゴヌクレオチド、および天然物のライブラリーを、細胞分裂周期機構（
例えば、分裂／減数分裂装置（微小管など））へのポリペプチド結合のインヒビターとし
ての活性についてスクリーニングすることができる。候補物質を、例えば、反応あたり１
０種の分子のバッチおよび個別に試験した阻害を示すバッチの物質において、最初のスク
リーニングで使用することができる。次いで、下記などのインビトロスクリーニングで活
性を示す候補物質を、インヒビターに曝露して細胞周期の任意の段階における阻害につい
て試験する哺乳動物細胞などのホールセル系で試験することができる。
【０１７６】
［ポリペプチド結合アッセイ］
ポリペプチドに結合する物質を同定するための１つのアッセイ型は、固体支持体上に固
定したポリペプチドを固定されていない候補物質に接触させるステップと、ポリペプチド
および候補物質が互いに結合したかどうかおよび／または結合範囲を決定するステップを
含む。あるいは、候補物質を固定し、ポリペプチドを固定しないことが可能である。これ
を使用して、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異
体、または誘導体に結合することができる物質を検出することができる。
【０１７７】
好ましいアッセイ法では、ポリペプチドをアガロースビーズなどのビーズに固定する。
典型的には、細菌、酵母、または高等真核細胞株中のＧＳＴ−融合タンパク質としてのｒ
ＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導
体の発現およびグルタチオン−アガロースビーズを使用した粗細胞抽出物からのＧＳＴ−
融合タンパク質の精製によってこれを行う（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９
８８）。コントロールとして、固定化ポリペプチドへのＧＳＴ−融合タンパク質ではない
候補物質の結合を、ポリペプチドの非存在下で決定する。次いで、固定化ポリペプチドへ
の候補物質の結合を決定する。このアッセイ型は、ＧＳＴプルダウンアッセイとして当分
野で公知である。また、候補物質を固定化し、ポリペプチドを固定化されないようにする
ことができる。
【０１７８】
１つの成分（例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよびヒスチジンタグ化成分）の固定化
のための異なる親和性精製系を使用して、このアッセイ型を実施することも可能である。
【０１７９】
候補物質へのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変
異体、または誘導体の結合を、当分野で周知の種々の方法によって決定することができる
。例えば、固定化されていない成分を、標識することがきる（例えば、放射性標識、エピ
トープタグ、または酵素−抗体抱合体を使用）。あるいは、免疫学的検出技術によって結
合を決定することができる。例えば、反応混合物をウェスタンブロッティングし、ブロッ
トを固定化されていない成分を検出する抗体で探索することができる。ＥＬＩＳＡ技術を
使用することもできる。
【０１８０】
候補物質を、典型的には、１〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは１〜１００ｎ
ｍｏｌ／ｍｌの最終濃度まで添加する。抗体の場合、使用最終濃度は、典型的には、１０
０〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２００〜３００μｇ／ｍｌである。
【０１８１】
［ＤＮＡ結合］
核環境から放出した場合、ＤＮＡなどの核酸により、周辺組織が炎症を起こし得る。い
くつかのＤＮＡ結合タンパク質が公知であるが、肺および他の組織からのＤＮＡのクリア
ランスに関連するタンパク質または受容体は、明確に確立されていない。本発明者らは、
ＳＰ−Ｄが細菌、バクテリオファージ、および染色体起源のＤＮＡ（および全ＲＮＡ）に
有効に結合することを発見した。
【０１８２】
電子顕微鏡法は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の組換えフラグメント（ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲ
Ｄ））が有効にＤＮＡに結合することができることを示す。理論に拘束されることを望ま
ないが、本発明者らは、ヌクレオチド（ＤＮＡの基礎単位）は、マンナンとｒＳＰＤ（ｎ
／ＣＲＤ）への結合を競合することができると判断し、これにより、このタンパク質はそ
の炭水化物結合活性を解してＤＮＡに結合することができることが示唆される。さらに、
この組換えフラグメント中の短いコラーゲン様フラグメントの存在により、ＤＮＡに有効
に結合するさらなる能力が得られる。さらに、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）は、ヨウ化プロピ
ジウムとアポトーシス細胞上のＤＮＡの結合を競合し、タンパク質がこれらの細胞表面上
で見出されるＤＮＡに結合することを示す。表面上のＤＮＡ認識は、肺からのアポトーシ
ス細胞の重要なクリアランス様式の１つのようである。
【０１８３】
ＳＰ−Ｄおよびそのフラグメント（詳細には、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ））へのいくつか
の適用は、これらの分子のＤＮＡ結合性を介して媒介される。例えば、
１）いくつかの疾患（その多くは慢性細菌、菌類、およびウイルス感染に関する）によ
り肺内の遊離核酸が蓄積される。嚢胞性線維症は、このような疾患の１つであり、細胞外
遊離ＤＮＡを必要とする細菌のバイオフィルム形成後のみに肺内の感染が持続する。天然
のＳＰ−ＤおよびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）は遊離ＤＮＡに結合するので、これらのタンパ
ク質はＤＮＡのクリアランスを増強し、バイオフィルム形成を最小にする。ｒＳＰＤ（ｎ
／ＣＲＤ）はまた、多数の肺内微生物をオプソニン化し、潜在的に嚢胞性線維症患者の病
原体コロニー形成を減少または排除するように作用する。
２）ＳＰ−ＤおよびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）は、ＤＮＡに結合することができる。した
がって、アポトーシス細胞および壊死細胞などのその表面上にＤＮＡを含む細胞はまた、
ＳＰ−ＤおよびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）によって認識される。これらの事実により、炎症
起因細胞がインビボでの食細胞媒介クリアランスについてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）によっ
て認識されるという機械的な説明が得られる。ＳＰ−Ｄおよびそのフラグメントを使用し
て、ＣＯＰＥ、慢性炎症、および慢性喘息などの肺疾患および病態を治療することができ
る。
３）壊死細胞およびアポトーシス細胞由来の遊離ＤＮＡまたはＤＮＡ破片は、自己抗原
として作用することができる。したがって、遊離ＤＮＡ（またはＲＮＡ）のクリアランス
では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）は、自己免疫疾患における自己抗原産生の減少を補助する
。
【０１８４】
［炎症性疾患］
用語「炎症」は、損傷に対する生きた組織の反応をいうために本明細書中で使用される
。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または
誘導体を使用して、このような疾患を罹患する個体へのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプ
チド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投与によって、炎症（炎症
性疾患を含む）を治療することができる。
【０１８５】
炎症の原因には、物理的損傷、化学物質、微生物、または他の作用因子が含まれる。好
ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモロ
グ、変異体、または誘導体を使用して、炎症性疾患を治療するが、これを使用して任意の
原因に起因する任意の炎症を治療することができる。
【０１８６】
炎症反応は、血流の変化、血管透過性の増加、および血液から組織への細胞の脱出から
なる。急性炎症は、持続時間が短く、数日間しか持続しない。しかし、持続時間がより長
い場合、慢性炎症という。認識することができる急性炎症の種々の例は、咽頭痛、擦過傷
または火傷もしくは虫刺されに対する皮膚の反応、および急性肝炎などである。しかし、
肺炎などの散発性の歴史的例外（historical exception）、肺炎および胸膜炎よりもむし
ろ肺の炎症、胸膜炎よりもむしろ胸膜の炎症が存在する。
【０１８７】
〈微生物感染〉
ウイルスは、細胞内増殖によって各細胞を死滅させる。細菌は、特異的外毒素（細菌に
よって合成される、特異的に炎症を引き起こす化合物）または細胞壁に結合する内毒素を
放出する。さらに、いくつかの生物は、過敏反応を介した免疫学的に媒介された炎症を引
き起こす。寄生虫感染および結核菌感染は、過敏症が重要な例である。
【０１８８】
〈過敏反応〉
免疫学的応答状態の変化により組織に損傷を与える不適切または過剰な免疫反応が引き
起こされた場合に過敏反応が起こる。全て炎症に関連するものに類似の細胞または化学的
メディエーターを有する。
【０１８９】
〈物理的作用因〉
炎症に対して誘導される組織損傷は、身体外傷、紫外線、または他の電離放射線、火傷
、または過剰な冷却（「凍傷」）を介して引き起こされる。
【０１９０】
〈刺激物および腐食性薬品〉
腐食性薬品（酸、アルカリ、酸化剤）は、全身的な組織損傷を介して炎症を引き起こす
。しかし、感染菌は、直接的に炎症を引き起こす特定の化学的刺激物を放出することがで
きる。
【０１９１】
炎症は、典型的には、少なくとも１つの以下の特徴を含む。
組織壊死：不適切な血流（梗塞）に起因する酸素および栄養素の欠如由来の組織の死滅
は、強力な炎症刺激である。新しい梗塞の端部は急性炎症反応を示す。赤み（紅潮）：急
性に炎症を起こした組織は赤くなる（例えば、日焼けに影響を受けた皮膚、細菌感染によ
る蜂巣炎、または急性結膜炎）。これは、損傷領域内の毛細血管の拡張による。熱（熱）
：身体の末梢部（皮膚など）のみで温度上昇が認められる。これは、血管が拡張して領域
に温血を送達させる領域を介した血流の増加（充血）による。炎症のいくつかの化学的メ
ディエーターに起因する全身性の熱もまた、局所温度に寄与する。腫脹（腫瘍）；腫脹は
、浮腫、滲出物の一部としての過剰な血管中の空間中の流動物の蓄積、さらにより狭い範
囲では、領域に移動する炎症細胞の物理的質量に起因する。痛み（痛覚）：患者について
、痛みは、急性炎症の最も公知の特徴の１つである。これは、炎症性浮腫による組織の拡
大および変形、特に、膿瘍の空洞中の圧力下での膿に部分的に起因する。ブラジキニン、
プロスタグランジン、およびセロトニンを含む急性炎症のいくつかの化学的メディエータ
ーは、痛みを誘導することが知られている。機能不全：炎症領域の移動は、痛みによって
故意且つ反射的に阻害され、重篤な浮腫は組織を物理的に固定化することができる。
【０１９２】
したがって、本発明者らは、炎症または炎症性疾患を罹患した固体へのｒＳＰＤ（ｎ／
ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投与によ
る、上記の症状を含む炎症の症状の緩和を提供する。
【０１９３】
［炎症性肺疾患］
非常に好ましい実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメン
ト、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、炎症性肺疾患を治療する。
【０１９４】
本明細書中で使用される、用語「炎症性肺疾患」は、肺、肺の任意の部分、または気道
、気管などの関連系の炎症を含む任意の疾患または病態を意味するために使用すべきであ
る。炎症性肺疾患は急性または慢性であってよく、いくつかの他の疾患または症候群の結
果またはこれらに伴って発症し得る。好ましい実施形態では、炎症性肺疾患は、慢性炎症
性肺疾患を含む。
【０１９５】
炎症性肺疾患の例には、新生児慢性肺疾患、新生児呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、成人呼
吸窮迫症候群、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、肺線維症、気腫
、間質性炎症性肺疾患、サルコイドーシス、肺炎、慢性炎症性肺疾患、新生児慢性炎症性
肺疾患が含まれる。
【０１９６】
個体へのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体
、または誘導体の投与によってこのような疾患を罹患した個体を治療するか、その症状を
緩和することができる。好ましくは、このような治療により、肺胞マクロファージ、好ま
しくはアポトーシス肺胞マクロファージがクリアランスされる。治療により、壊死マクロ
ファージもさらにまたは代わりにクリアランスすることができる。下記のアッセイによっ
て壊死およびアポトーシス細胞を検出および区別することができる。
【０１９７】
［新生児慢性肺疾患］
新生児慢性肺疾患は、早産後の再発性炎症および感染に関連する多因子病態である。早
産、換気、新生児期の再発性感染症、サーファクタント欠損、および新生児期の炎症マー
カーの増加（気管吸引サンプル中の肺胞マクロファージ数を含む）を含む、慢性肺疾患の
発症リスクを増大させる多数の因子が存在する。早産児は、ＳＰ−Ｄを含むサーファクタ
ントタンパク質の欠損が公知である。
【０１９８】
ヒト新生児慢性肺疾患は、典型的には早産後、長期間の補助換気後の炎症性損傷および
酸化ストレスから発症する。新生児呼吸窮迫症候群治療のための人工サーファクタント補
充療法の出現以来、早産後の生存率は劇的に増加したが、妊娠２８週未満での出生後に生
存した乳児の４０％までが慢性炎症性肺疾患を発症する。現在のサーファクタント補充ス
トラテジーは、サーファクタントタンパク質Ｄを含まない。この背景での肺損傷は、活性
化肺胞マクロファージによって媒介される。ＳＰ−Ｄ欠損マウスは、多数の活性化肺胞マ
クロファージの存在によって特徴づけられる肺内のマクロファージ媒介炎症モデルを提供
する。
【０１９９】
本発明者らは、実施例で、ＳＰ−Ｄ欠損マウスへのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の鼻腔内
投与よって、活性化マクロファージ数の減少およびその表現型の変化による肺の炎症プロ
セスを調整されることを証明する。この結果は、ｒＳＰ−Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）の強力な抗炎
症性を証明し、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の直接投与または現在のサーファクタント療法
の製剤へのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の含有によって、新生児の慢性炎症性肺疾患の予防
におけるｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の直接的臨床適用を示す。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を
コードする核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、および誘導体を使用することも
できる。気腫を発症する慢性肺炎症（例えば、天然のＳＰ−Ｄレベルの不十分な喫煙者）
を、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の投与によって治療することも可能である。
【０２００】
したがって、本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント
、ホモログ、変異体、または誘導体の投与による新生児慢性肺疾患またはこのような疾患
の任意の症状の治療を提供する。
【０２０１】
［サーファクタント補充療法］
本節は、本明細書中に開示のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグ
メント、ホモログ、変異体、または誘導体を適切に使用するサーファクタント補充療法を
記載する。特に、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモ
ログ、変異体、または誘導体を、新生児のサーファクタント補充療法に使用することがで
きる。
【０２０２】
サーファクタント補充療法は、Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃａｒｅ，１９９４，３９（８），８２
４〜８２９に記載されており、本節はこれに由来する。サーファクタント補充療法のガイ
ダンス（例えば、ＡＡＲＣ臨床的治療法ガイドライン）が発行されている。臨床医は、こ
のようなガイダンスにしたがって、サーファクタント補充療法プログラムの一部として、
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、ま
たは誘導体を投与することができる。
【０２０３】
天然の内因性サーファクタントは、肺胞表面と肺胞気との間に層を形成し、肺胞内の表
面張力の減少によって肺胞虚脱を軽減する（３〜５）、リン脂質、中性脂質、およびタン
パク質（１〜５）から構成される化合物である。サーファクタント欠損症は、そのほとん
どが未熟な肺の硝子膜の形成および呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）（未熟児の罹患および死亡
の主な原因）の発症に関連する（３）。サーファクタントがない場合、肺胞は決して膨張
することができないか、呼気時に虚脱し得るので、吸気時の再拡大に法外な力が必要とな
り、ＲＤＳを発症する（３、５）。ＲＤＳの罹患率は、在胎齢よりも肺の未熟さに関連す
る（６）。しかし、一般に、より未熟な乳児ほどサーファクタント産生が低く、ＲＤＳの
可能性が増大する（４、６）。サーファクタントの直接気管内点滴注入により、ＲＤＳ乳
児の死亡率および罹患率が減少することが示されている（７〜２５）。
【０２０４】
サーファクタントを、動物の肺洗浄物およびヒト羊水から抽出するか、合成物質から生
成することができる。本明細書中に記載の方法および組成物によれば、特に新生児のサー
ファクタント補充療法にｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント
、ホモログ、変異体、または誘導体を使用することができる。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポ
リペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を、単独または
公知のサーファクタント補充療法と組み合わせて使用することができる。
【０２０５】
以下の２つの基本的なサーファクタント補充ストラテジーが明らかとなっている。（１
）ＲＤＳ発症リスクの高い乳児の出生時または出生直後にサーファクタントを投与する予
防治療および（２）ＲＤＳが臨床的に確認された乳児における機械換気開始後にサーファ
クタントを投与する救助または治療の執行（２、１０〜１２、２６、２７）。
【０２０６】
サーファクタント補充療法を、典型的には、分娩室または新生児集中治療室で訓練され
た人材によって施す。
【０２０７】
〈サーファクタント補充療法の適応〉
（４．１）（４．１．１）肺の未熟が強く示唆される、短い妊娠期間（３２週未満）（
８、１０〜１２、２１、２５〜２９）または低出生時体重（１，３００ｇ未満）（２１〜
２５、２８）のためにＲＤＳ発症リスクが高い乳児、（４．１．２）レシチン／スフィン
ゴミエリン比が２：１未満（１１、１４、２８、３０、３１）、肺未熟を示すバブル安定
試験（１５，３２）、またはホスファチジルグリセロールの非存在（１１、１４、２２〜
２４、２８、３０）などのサーファクタント欠損の実験的証拠が存在する乳児に予防的投
与を指示することができる。（４．２）（４．２．１）（４．２．１．１）呼吸数の増加
、胸骨下および胸骨上の退縮、グランティング、および鼻発赤（８、１１、１４〜１６、
２９、３３〜３５）（４．２．１．２）青白い皮膚の色、動揺、および０を超えるＦＩＯ
２の増加を指示するＰａＯ２、ＳａＯ２、またはＳｐＯ２の減少（４０１１、１２、１５
、２６、３３、３６〜３８）によって示される酸素の必要性の増加のために気管内挿管お
よび機械換気が必要であり、（４．２．２）（４．２．２．１）ＲＤＳに特徴的な胸部Ｘ
線写真（８、１１〜１６、３３、３４、３６、３７、４０〜４２）、（４．２．２．２）
適切なＰａＯ２、ＳａＯ２、またはＳｐＯ２を維持するための７ｃｍ  Ｈ２Ｏを超える気
道内圧（１１、１４、１５、２６、４３）を含むＲＤＳの臨床的証拠（１３、３９）を有
する早産または満期産の乳児に救助または治療の執行を指示する。
【０２０８】
〈禁忌〉
以下の病態へのサーファクタント補充療法を禁忌する。（５．１）新生児期を超えた生
存に不適合な先天性奇形の存在（８、１４、１５、２６、２８、２９、３１、３３、３６
、４１、４４）、（５．２）肺未熟と実験で証明された乳児の呼吸窮迫（９、１４、２７
〜２９、３３、３６、４１）。
【０２０９】
サーファクタント補充療法から生じる危険性および厄介な問題には以下が含まれる。（
６．１）サーファクタント投与に起因する手順の複雑さには、（６．１．１）サーファク
タントによる気管内チューブ（ＥＴＴ）の挿入（２）；（６．１２）ヘモグロビン脱飽和
および追加Ｏ２の必要性の増加（１１、３３、４１）；（６．１．３）低酸素症による徐
脈（９、３３、４１、４５）；（６．１．４）ＥＴＴへのサーファクタントの逆流にとも
なう動揺による徐脈（３４、４１）；（６．１．５）サーファクタントの咽頭沈着；（６
．１．６）一方の肺のみへのサーファクタントの投与；（６．１．７）再構成における計
算ミスまたはエラーに対する最適下限用量の二次的投与が含まれる。（６．２）サーファ
クタント補充療法の生理学的に厄介な問題には、（６．２．１）無呼吸（７、１３、１５
）；（６．２．２）肺出血（１２、１５、１８、３２、３４、３８、４６、４７）；（６
．２．３）粘液栓（４８）；（６．２．４）ＰＤＡ治療の必要性の増大（１８、２９、３
０）；（６．２．５）未熟児の網膜症の限界的増加（１１）；（６．２．６）サーファク
タント補充後の肺コンプライアンスの増加およびそれによる人工呼吸器の設置の変化の失
敗に起因する気圧障害（３０、４９）が含まれる。
【０２１０】
ＲＤＳを発症していない数人の乳児にサーファクタントを予防的に投与することができ
る（１０、１２、２６、３３）。分娩室でサーファクタントを予防的に投与した場合、Ｅ
ＴＴの配置がＸ線写真によって確認することができず、その結果、肺の一方のみまたは胃
へ不注意に投与された（２６）。サーファクタントの予防投与は、患者の安定化を遅延し
得る（２６）。治療投与前にアテレクターゼおよび肺損傷が起こり得る（２６、３３）。
サーファクタント投与後は気管吸引を回避すべきである（９、１１、１３、１４、２７、
３３、３８、４４、５０）。サーファクタントの単回投与で処置した全ての乳児が正の反
応を示すわけでも（３９）、反応が一過性であるわけでもない。サーファクタント投与に
推奨される位置決めにより、乳児をさらに不安定にし得る（９、１１、１２、１４、１６
、２８、３３、３８〜４０）。
【０２１１】
臨床医は、適応が妥当であるかを決定するために必要な評価を行うことができる。典型
的には、これのために以下を行う。（８．１）妊娠期間および出生時体重ならびに／また
は気管もしくは胃の吸引の実験評価によるサーファクタントの予防的投与前の肺未成熟の
評価、（８．２）胸部Ｘ線写真の基準および短期の妊娠および／または低出生時体重にお
ける機械換気要件によるＲＤＳ診断の確立。
【０２１２】
以下に従って結果を評価する。（９．１）ＦＩＯ２要件の減少（１２、３３、３４、３
６〜３９、４１、４４）、（９．２）呼吸の減少（５１）、（９．３）胸部Ｘ線写真によ
って示された肺容量および肺野の改善（１３、１６、３３、４０）、（９．４）肺機構（
例えば、コンプライアンス、気道耐性、ＶＴ、ＶＥ、経肺圧）および肺容量（すなわち、
ＦＲＣ）の改善（４２、４３、５０、５２〜５９）、（９．５）換気要件（ＰＩＰ、ＰＥ
ＥＰ、Ｐａｗ）の減少（２、８、９、１２、１３、２７、３０、３３、３６〜３９、４１
、４４、５０、５２）、（９．６）動脈：肺胞ＰＯ２比（ａ／Ａ  ＰＯ２）の改善、酸素
指数（１３、１６、２８、３０、３３、３４、３７〜４１、４４）。
【０２１３】
〈供給源〉
サーファクタントの特定の調製物で推奨される投与手順は、以下に従うべきである。（
１０．１）装置（１０〜１４、１６、２６〜２８、３３、３４、３９、４０、５０、６０
）（（１０．１．１）投与装置（（１０．１．１．１）室温に加温した一定用量のサーフ
ァクタントを含むシリンジ（１１、１２、１６、３８、４０）、（１０．１．１．２）送
達ポートに接続した５−Ｆｒ栄養管またはカテーテルまたは気管内チューブ、（１０．１
．１．３）機械人工呼吸器または手動人工呼吸器（蘇生バッグ）（８、１６、３３、３６
、３８〜４０、４４、５０、５２））、（１０．１．２）蘇生装置（（１０．１．２．１
）咽頭鏡および気管内チューブ（１０〜１２、１４、１６、２６、３８）、（１０．１．
２．２）手動蘇生バッグ（９〜１２、１６、２６〜２８、３６、３９、４０、５０）、お
よび気道マノメーター、（１０．１．２．３）ブレンドした酸素供給源（９、１６、２８
、４４）、（１０．１．２．４）吸引装置（すなわち、カテーテル、滅菌グローブ、回収
ボトル、およびチュービング、真空発生装置）（９、３３、５０、６０）、（１０．１．
２．５）完成品の放射熱ウォーマー）、（１０．１．３）モニタリング装置（（１０．１
．３．１）利用可能な場合の１回換気量のモニター（５０））、（１０．１．３．２）気
道圧モニター、（１０．１．３．３）パルス酸素濃度計または経皮ＰＣＯ２モニター（１
１、２６、３４、３９〜４１、５２）、（１０．１．３．４）心臓性呼吸モニター）、（
１０．２）人材。サーファクタント補充療法を医師の指示の下で、以下を的確に証明する
認定された人材（例えば、ＣＲＴＴ、ＲＲＴ、ＲＮ）によって行われるべきである。（１
０．２．１）サーファクタント補充療法の装置および技術的知識を適切に使用、理解、お
よび精通している者、（１０．２．２）新生児人工呼吸器管理ならびに肺解剖学および病
態生理学の包括的知識および理解を有する者、（１０．２．３）副作用および／または手
順の厄介な問題を認識して対応する能力を含む、新生児患児評価スキルを有する者、（１
０．２．４）患者の病歴および臨床症状の知識および理解を有する者、（１０．２．５）
気道管理の知識および理解を有する者、（１０．２．６）モニターおよび測定された血液
ガスの変化および生命徴候を解釈する能力を有する者、（１０．２．７）救急蘇生装置お
よび手順を適切に使用、理解、および精通している者、（１０．２．８）結果を評価およ
び報告する能力を有する者（第９．０節）、（１０．２．９）普遍的予防手段を理解し、
適切に適用する者。
【０２１４】
〈モニタリング〉
サーファクタント補充療法の一部として、以下をモニターすべきである。（１１．１）
サーファクタント投与時にモニターすべき変数（（１１．１．１）送達デバイスの適切な
位置付けおよび位置、（１１．１．２）ＦＩＯ２および人工呼吸器の設定（８、９、１１
、１３〜１５、２７〜２９、３３、３６、３８、４４）、（１１．１．３）ＥＴＴへのサ
ーファクタントの逆流（３４、４１）、（１１．１．４）患者の位置（すなわち、頭部の
方向）（９、１１、１３）、（１１．１．５）胸壁の動き（６１）、（１１．１．６）パ
ルス酸素濃度計による酸素飽和（１１、２６、３４、３９〜４１、５２）、（１１．１．
７）心拍数、呼吸、胸部拡張、皮膚の色、および活力（１６、２６、２７、３４、４１、
４５、５２））、（１１．２）サーファクタント投与後にモニターすべき変数（（１１．
２．１）動脈血液ガスの侵襲性および非侵襲性の測定（８、９、１１、１２〜１６、２６
〜２９、３３、３６、３８、３９、４１、４４）、（１１．２．２）胸部Ｘ線写真（１１
〜１６、２８、３６、３８〜４０、４４）、（１１．２．３）人工呼吸器の設定（ＰＩＰ
、ＰＥＥＰ、Ｐａｗ）およびＦＩＯ２（８、９、１１、１３〜１６，２８、２９、３３、
３６、３８）、（１１．２．４）肺の機構および容量、（１１．２．５）心拍数、呼吸、
胸部拡張、皮膚の色、および活力（１６、２６、２７、３４、４１、４５、５２）、（１
１．２．６）呼吸音（１１、３８）、（１１．２．７）血圧（３、１６、３３、４０、４
４、４５））。
【０２１５】
〈頻度〉
サーファクタントの反復投与は、ＲＤＳの連続診断を条件とする。サーファクタント補
充を行う頻度は、患者の臨床状態および手順実施の指示に依存すべきである。６〜２４時
間間隔でのサーファクタントのさらなる投与を、人工呼吸器の必要性が増し、最初の投与
後にその病態を改善できない乳児に指示することができる（７、９、１１、１２、１４、
１５、２６、３０、３４、３７、３９、５２）。
【０２１６】
〈感染予防〉
（１３．１）普遍的な予防手段（６２）を実施すべきである。（１３．２）無菌法を実
施すべきである。（１３．３）患者のための適切な感染予防ガイダンスを入手してそれに
従うべきである。
【０２１７】
［嚢胞性線維症］
本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドが肺胞マクロファージ数を減少さ
せることができることを実施例に示す。したがって、肺胞マクロファージが炎症プロセス
で役割を果たす肺疾患（例えば、嚢胞性線維症、喘息、および気腫）にｒＳＰＤ（ｎ／Ｃ
ＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、もしくは誘導体を投
与することができる。ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）はまた、他の部位でのマクロファージ媒
介炎症プロセス（例えば、アテローム性動脈硬化症）で治療特性を有する。
【０２１８】
嚢胞性線維症は、小児および成人のほぼ両方で罹患する遺伝病である。
【０２１９】
嚢胞性線維症により、肺および膵臓などの器官の管壁細胞内からその外面へのナトリウ
ムおよび塩化物（塩）の誤った輸送により身体に異常に多量の粘液が産生される。多量の
嚢胞性線維症粘液はまた、膵臓を妨害し、食物の分解および消化を補助するための腸への
酵素の到達を妨害する。
【０２２０】
嚢胞性線維症は、種々の症状を有する。最も一般的には、非常に塩辛い皮膚；持続的な
咳、喘鳴、または肺炎；食欲は過剰であるが体重増加は軽微であること；および大量の排
泄物である。汗試験は、汗中の塩分を測定する嚢胞性線維症の標準的な診断試験である。
高塩レベルは、患者が嚢胞性線維症であることを示す。
【０２２１】
嚢胞性線維症治療は、疾患の段階および関連する器官に依存する。１つの治療手段であ
る胸部理学療法は、肺由来の多量の粘液を除去するための背中および胸部の（カップ状に
した手による）積極的な軽打按摩を必要とする。抗生物質を使用して、肺感染症を治療し
、これを静脈内、丸薬、および／または詰まった気道を開けるために吸入するための薬剤
混入蒸気で投与する。嚢胞性線維症が消化系に影響を与える場合、身体は十分な栄養分を
吸収しない。したがって、嚢胞性線維症患者は、栄養価を高めた食事を摂取し、代替ビタ
ミンおよび酵素の両方を摂取する必要があり得る。
【０２２２】
本明細書中に記載の方法および組成物によれば、嚢胞性線維症患者の症状を、ｒＳＰＤ
（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投
与によって緩和する。嚢胞性線維症の症状には、好ましくは、上記の任意の症状が含まれ
る。好ましくは、嚢胞性線維症患者を、このようなポリペプチド、ホモログ、フラグメン
ト、または誘導体の投与によって治療する。
【０２２３】
［アレルギー］
既存のアレルギー治療は、典型的には、免疫系を弱めるためのステロイドの長期使用を
含む。長期ステロイド治療には、望ましくない副作用が存在する。本発明者らは、ｒＳＰ
Ｄ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘
導体を使用して、アレルギーの症状を緩和するかアレルギーを治療することができること
を証明する。
【０２２４】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での治療では、マウスでは病的影響は認められないようであり
、ヒトでは望ましくない副作用は認められないようである。ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での
短期治療単位により、根本的なアレルギー感作を逆転して有効な免疫療法を得ることがで
きる。これは、典型的に何年にもわたる一連のアレルゲン注射を含む既存の感作免疫治療
プロトコールを有意に改良する。
【０２２５】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、
または誘導体での治療に適切なアレルギーには、季節性呼吸器アレルギー、アレルギー性
鼻炎、花粉症、非アレルギー性鼻炎、血管運動神経性鼻炎、刺激性鼻炎、草の花粉、木の
花粉、または動物の鱗屑に対するアレルギー、アレルギー性喘息に関連するアレルギー、
および食品アレルギーが含まれる。特に、本明細書中に記載のように、ｒＳＰＤ（ｎ／Ｃ
ＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用
して、イエダニ（ヒョウヒダニ属）、好ましくはヤケヒョウヒダニまたはコナヒョウヒダ
ニ、または菌類もしくは菌類胞子、好ましくはアスペルギルス・フミガーツスに対するア
レルギーを治療することができる。好ましくは、アレルギーは、ヒョウヒダニ属の排泄物
から構成される。
【０２２６】
［喘息］
喘息は、気管支の気道閉塞の発作によって特徴づけられる呼吸器疾患である。この閉塞
によって引き起こされる症状には、咳、胸苦しさ、喘鳴、および息切れが含まれる。問題
はしばしば無症状器官によって分けられるが、喘息は慢性疾患である。
【０２２７】
広範な種々の「要因」により、喘息が誘発され得る。最も一般的な要因は、アレルゲン
、アスピリン、およびタルトラジン、刺激物、食品添加物および防腐剤、ウイルスの呼吸
器感染、ならびに身体活動である。
【０２２８】
アレルゲンは、感受性個体がアレルギーを引き起こし得る物質である。これらは、小児
および成人における問題の主な原因である。一般的なアレルゲンには、植物の花粉（木、
草、および雑草）、動物の鱗屑、イエダニ類、カビ、および一定の食品が含まれる。アレ
ルギー個体がこれらのアレルゲンの１つに接触した場合、一連の事象により、一定の化学
物質類（メディエーター）が身体に放出され、喘息を誘発する。
【０２２９】
喘息患者の１０〜２０％が、アスピリンの摂取後に有意な肺機能の低下を経験し、非ス
テロイド系抗炎症薬と呼ばれる薬物の関連群およびタルトラジン（食用色素の黄色５号）
で類似の反応が起こり得る。冷気、煙、工業用化学薬品、香水、塗料、およびガソリンの
臭気は、全ておそらく気道での刺激物受容体の刺激によって喘息を引き起こし得る刺激物
の例である。これらの受容体は、その後、気道周囲の筋肉を収縮させて喘息発作を起こす
。稀に、亜硫酸塩などの食品添加物が喘息を誘発し得る。ウイルスの呼吸器感染は、急性
喘息発作の主な原因である。
【０２３０】
喘息発作時に、一定の誘発物に反応して喘息患者の過剰反応した気管支が狭まる。発作
時に、気管支周囲の筋肉が収縮し、気道を狭める。気道上皮が炎症も起こし、腫れてさら
に気道サイズが減少する。さらに、気道内部の粘膜腺から過剰な粘液が生成されて、既に
狭まった気道に蓄積する。最終的な結果として、呼吸、特に呼気が非常に困難になる。狭
まった気道の後ろに空気が捕捉され、身体が利用可能な酸素が減少する。
【０２３１】
気管支拡張薬は、喘息治療に最も一般的に処方されている薬物である。これらは、気道
周囲の筋肉を弛緩させて、気管支を拡張させる。気管支拡張薬を、吸入、経口、または注
射で投与することができる。例えば、口腔を介した運動中に吸入した乾いた冷気によって
も喘息を発症し得る。
【０２３２】
喘息症状の治療で使用されている現在の薬物には、持続性テオフィリン、吸入もしくは
経口βアゴニスト（クロモリン）、または吸入もしくは経口ステロイドが含まれる。アレ
ルギー性喘息患者のために、免疫療法（アレルギー注射）により、回避できないアレルゲ
ンを軽減することができる。免疫療法により、喘息症状を促す患者のアレルゲンへの耐性
が増大される。
【０２３３】
［アレルギー性喘息］
喘息を、アレルゲンへの曝露によって誘発することもできる（「アレルギー性喘息」）
。
アレルギー性喘息は、アレルゲン刺激に反応して初期および後期過敏反応を引き起こす
気道過敏症（ＡＨＲ）期によって特徴付けられる。初期反応は、ヒスタミンおよび他の気
管支収縮薬の放出と共に気道肥満細胞の脱顆粒によって媒介される。後期の反応は、好酸
球およびリンパ球などの炎症細胞の流入後に開始され、その後炎症メディエーターおよび
サイトカインが放出され、慢性ＡＨＲを発症する。
【０２３４】
イエダニは、アレルギー性喘息の主な原因の１つである（Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ，
Ｔ．Ａ．ａｎｄ  Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ，１９８７，「チリダニ類：免疫学、アレルギ
ー性疾患、および環境制御」，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８０
，７５５〜７５；Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ，Ｔ．Ａ．，Ｅ．Ｂ．Ｍｉｔｃｈｅｌ，Ｍ．
Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｗ．Ｈｅｙｍａｎｎ，１９８７，「チリダニアレルギ
ー；その臨床的有意性」，Ｈｏｐｓ  Ｐｒａｃｔ（Ｏｆｆ  Ｅｄ），２２，９１〜３，９
７〜１００；Ｐｏｌｌａｒｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ，ａｎｄ  Ｔ．Ａ．Ｐ
ｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ，１９８７，「ハウスダスト感受性および環境制御」，Ｐｒｉｍ
．Ｃａｒｅ、１４、５９１〜６０３）。
【０２３５】
例えば、本明細書中に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント
、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、アレルギー性喘息を治療することができ
る。好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、
変異体、または誘導体を使用して、イエダニに起因するアレルギーまたはアレルギー性喘
息を治療する。
【０２３６】
イエダニは、ヒョウヒダニ属の任意の生物をいう。好ましくは、ヒョウヒダニ属生物は
、ヤケヒョウヒダニまたはコナヒョウヒダニである。アレルギー性喘息はまた、個体への
菌類または菌類胞子への曝露の結果として発症することができ、本明細書中に記載の方法
および組成物には、アスペルギルス・フミガーツス抗原に対するアレルギーを含むこのよ
うな喘息またはアレルギーの治療が含まれる。
【０２３７】
［肺気腫および慢性閉塞性肺疾患］
特定の実施形態では、例えば、本明細書中に記載のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチ
ド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、肺気腫または慢性
閉塞性肺疾患を治療する。
【０２３８】
気腫は、満足に治療されない大きな公衆衛生上の問題である。タバコの煙は、インビト
ロ（Ａｏｓｈｉｂａ，Ｋ．，Ｔａｍａｏｋｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｎａｇａｉ，Ａ．，２００１
、「急性のタバコの煙への曝露により、肺胞マクロファージのアポトーシスが誘導される
」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８
１、Ｌ１３９２）およびインビボ（Ａｏｓｈｉｂａら、前出）で、肺胞マクロファージア
ポトーシスを誘導し、Ｍａｊｏらは、最近、喫煙者由来の肺組織サンプルのアポトーシス
は、気腫を有する喫煙者で急速に増加する喫煙量との双一次関係を示すことを報告してお
り、アポトーシスが気腫を発症する肺破壊機構の１つであり得ると結論付けている（Ｍａ
ｊｏ，Ｊ．，Ｇｈｅｚｚｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｏｓｉｏ，Ｍ．Ｇ．，２００１、「喫煙者
の肺におけるリンパ球の産生およびアポトーシスならびに気腫とのその関係」、Ｅｕｒ．
Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，１７，９４６）。本発明者らは、喫煙者でＳＰ−Ｄが欠損している
ことおよびこれによりアポトーシスが促進され、この患者群で気腫に寄与することを提案
する。本発明者らは、ＳＰ−Ｄ欠損マウスへのｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）の投与によりアポ
トーシス細胞数が減少するので、ヒトにおけるｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）治療により喫煙に
よって誘発される気腫に寄与する機構を阻害することができることを証明する。
【０２３９】
［サイトカイン］
さらなる実施形態では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメン
ト、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して、個体のサイトカインレベルを調整する
。好ましくは、炎症性サイトカインがダウンレギュレーションされる。炎症性サイトカイ
ンの例には、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および肺への
肺胞マクロファージの移動を媒介して細胞増殖を増加させるように作用する任意のサイト
カインが含まれる。
【０２４０】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、
または誘導体の投与によるＧＭ−ＣＳＦレベルの調整を、実施例９に示す（図１４）。
【０２４１】
用語「サイトカイン」を、免疫応答を調節するための特異的受容体を介して非酵素的に
作用する免疫系細胞によって放出される任意の多数の可溶性分子（例えば、糖タンパク質
）をいうために使用することができる。サイトカインは、低濃度で作用して特異的受容体
と高親和性で結合するという点でホルモンに類似する。好ましくは、用語「サイトカイン
」は、ナノモル濃度からピコモル濃度で体液性レギュレーターとして作用し、正常または
病理学的条件下で各細胞および組織の機能的活性を調整する多様な可溶性タンパク質およ
びペプチド群をいう。
【０２４２】
本発明に記載の方法および組成物での使用に適切なサイトカインの特定の例には、イン
ターロイキン、リンホカイン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ
）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、および顆粒−マクロファージコロ
ニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＧＳＦ、血小板活性
化因子（ＰＡＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。
【０２４３】
したがって、ＩＬ１、ＩＬ２、およびＩＬ４などのインターロイキンならびにＩＦＮ−
α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γなどのインターフェロンが含まれる。腫瘍壊死因子Ｔ
ＮＦα（カシェチン（cachetin））、ＴＮＦ−β（リンホトキシン）を、適切に使用する
こともできる。
【０２４４】
好ましいサイトカインは、免疫応答（例えば、樹状細胞または細胞傷害性Ｔ細胞活性の
刺激）を補強することができるか、マクロファージを標的部位に補強することができるも
のである。非常に好ましい実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ま
たはＧＳＦを含む。
【０２４５】
［アポトーシス］
本明細書中に記載の方法および組成物によれば、個体へのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリ
ペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の投与により、肺
胞マクロファージ数、特にアポトーシス肺胞マクロファージ数、もしくは壊死肺胞マクロ
ファージ数またはその両方を減少させることができる。特定の理論には拘束されることを
意図しないが、本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグ
メント、ホモログ、変異体、または誘導体は、個体の身体のアポトーシスおよび／または
壊死マクロファージのクリアランスの増強によってこれを達成すると予想する。
【０２４６】
好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモロ
グ、変異体、または誘導体での処置により、アポトーシスおよび／または壊死マクロファ
ージの少なくとも１０％を超えるクリアランス、好ましくは、少なくとも２０％超がクリ
アランスされる。より好ましくは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフ
ラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体での処置により、アポトーシスおよび／ま
たは壊死マクロファージの少なくとも４０％、６０％、８０％、またはそれ以上がクリア
ランスされる。
【０２４７】
２つの個別の機構（壊死またはアポトーシス）のいずれかによって細胞死が起こり得る
。さらに、一定の化合物および細胞が、細胞に細胞傷害性を示す、すなわち、その細胞死
を招くといわれている。
【０２４８】
「壊死」（「偶発的」細胞死ともいわれる）は、細胞が重篤な物理的または化学的損傷
に曝された場合に起こる病理学的プロセスをいう。細胞が原形質膜に損傷を与え得る生理
学的条件（例えば、低体温症、低酸素症）由来の極端な変化に曝された場合に壊死が起こ
る。生理学的条件下で、原形質膜への直接的損傷は、補体および溶菌ウイルスのような作
用因子によって誘発される。壊死は、水および細胞外イオンが流入する細胞のホメオスタ
シスの維持能力の欠陥から開始される。細胞内オルガネラ（最も顕著には、ミトコンドリ
ア）および細胞全体が膨張して破裂する（細胞融解）。原形質膜の決定的な破壊により、
リソソーム酵素を含む細胞質の内容物が、細胞外液に放出される。したがって、インビボ
では、壊死性細胞死は、しばしば強い炎症反応を起こす広範な組織損傷に関連する。
【０２４９】
「アポトーシス」（「通常の」または「プログラムされた」細胞死）は、発達および他
の正常な生物学的プロセスの間に望ましくないか、または無用の細胞を除去する生理学的
プロセスをいう。アポトーシスは、正常な生理学的条件下で起こす細胞死様式であり、細
胞は、細胞自体の死（「細胞自殺」）に積極的に関与する。これは、正常な細胞の代謝回
転および組織ホメオスタシス、胚形成、免疫寛容の誘導および維持、神経系の発達、およ
び内分泌腺依存性組織萎縮時に最も頻繁に認められる。アポトーシスを受けた細胞は、特
徴的な形態学的および生化学的特徴を示す。これらの特徴には、クロマチン凝集、核およ
び細胞質の濃縮、リボゾーム、形態学的にインタクトなミトコンドリア、および核物質を
含む膜結合小胞（アポトーシス体）への細胞質および核の分配が含まれる。インビボでは
、これらのアポトーシス体は容易に認識され、マクロファージまたは隣接する上皮細胞の
いずれかによって食菌される。この有効なインビボでのアポトーシス細胞の除去機構によ
り、炎症反応は誘発されない。インビトロでは、アポトーシス体および残存する細胞フラ
グメントは、最終的に膨張して最後に溶解する。インビトロ細胞死のこの終末過程は、「
二次的壊死」と呼ばれている。
【０２５０】
表１は、壊死およびアポトーシスの間の、種々の観察可能な相違をまとめている。細胞
死がアポトーシスまたは壊死のいずれかによって起こったかを決定するために、任意のこ
れらの相違（単独または組み合わせ）をアッセイすることができる。
【０２５１】
【表２】
2010090134.tif 000007
【０２５２】
アポトーシスおよびアポトーシスによる細胞死についての種々の測定アッセイを詳細に
記載している以下の文献を参照のこと。Ｓｃｈｗａｒｔｚｍａｎ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｃｉ
ｄｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ａ、１９９３，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．，１４、１３３；Ｖ
ｅｒｍｅｓ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈａａｎａｎ，Ｃ．，１９９４，Ａｄｖ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ
．，３１，１７７；Ｂｅｒｋｅ，Ｇ．，１９９１，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １２，
３９６；Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｅｈｌ，Ｏ．ａｎｄ  Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．，１９９１，Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１２，３９９；Ｖａｎ  Ｆｕｒｔｈ，Ｒ．ａｎｄ  Ｖａｎ  
Ｚｗｅｔ，Ｔ．Ｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０８、４５、
Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｊ．，１９９３，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  
１４，１２６；Ｓａｖｉｌｌ，Ｊ．Ｓ．ら，１９８９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，
８３、８６５；Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．，１９８０，Ｎａｔｕｒｅ，２８４，５５５；Ｌ
ｅｉｓｔ，Ｍ．ら，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，第３号，１８〜２０；Ｆｒａｓｅ
ｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｅｖａｎ，Ｇ．，１９９６、Ｃｅｌｌ，８５，７８１〜７８４；Ｄｕｋ
ｅ，Ｒ．Ｃ．，１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，６３
６１；Ｄｕｋｅ，Ｒ．Ｃ．＆Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｊ．，１９８６，Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  
Ｒｅｓ．，５，２８９；Ｔｒａｕｔｈ，Ｂ．Ｃ．ら、１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，６３，３２，増補４０；Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ｐ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ；Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，１８５；Ｋａｅｃｋ，Ｍ．Ｒ．，１９９３；Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０８，３９３；Ｐｒｉｇｅｎｔ，Ｐ．ら，１９９３，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６０、１３９；Ｈｕａｎｇ，Ｐ．＆Ｐｌｕｎｋｅｔｔ
，Ｗ．，１９９２；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０７，１６３，Ｂｏｒｔｎｅｒ，Ｃ
．Ｄ．ら，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５，２１；Ｇｏｌｄ，Ｒ．
ら，１９９４；Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７１、２１９。
【０２５３】
アポトーシスおよび細胞媒介細胞傷害性は、膜分解前のゲノムＤＮＡの個別のフラグメ
ントへの切断によって特徴づけられる。したがって、アポトーシスを、例えば、ＤＮＡラ
ダーの存在の観察によるＤＮＡ断片化の測定によってアッセイすることができる。ＤＮＡ
フラグメントを、例えば、細胞集団由来の「ラダー」（ラダーの「段」としての１８０ｂ
ｐの複合物）として、または例えばＥＬＩＳＡによるヒストン複合体化ＤＮＡフラグメン
トの定量化によってアッセイすることができる。このようなアッセイは、ヌクレオソーム
検出のためのワンステップサンドイッチ免疫アッセイに依存する。手順は、遠心分離によ
る細胞のペレット化および上清（インキュベーション中に膜から漏れた壊死細胞由来のＤ
ＮＡを含む）の破棄を含む。細胞は、溶解緩衝液にし懸濁し、インキュベートする。溶解
後、インタクトな核を、遠心分離によってペレット化する。上清のアリコートを、マイク
ロタイタープレートのストレプトアビジンで被覆されたウェルに移し、上清中のヌクレオ
ソームを、２つのモノクローナル抗体、抗ヒストン（ビオチン標識）および抗ＤＮＡ（ペ
ルオキシダーゼ抱合）に結合させる。抗体−ヌクレオソーム複合体を、ストレプトアビジ
ンによってマイクロタイタープレートに結合させる。固定化された抗体−ヒストン複合体
を、３回洗浄して免疫反応性を示さない細胞成分を除去し、サンプルをペルオキシダーゼ
基質（ＡＢＴＳ（登録商標））とインキュベートした。染色産物（固定化された抗体−ヒ
ストン複合体）の量を、分光光度法で測定する。
【０２５４】
いくつかのプロテアーゼは、初期アポトーシスに関連する。したがって、アポトーシス
を、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３）などのアポトーシス誘導プロテアーゼの存在の
検出、さらにまたはその代わりにその活性のアッセイによってアッセイすることもできる
。カスパーゼの活性化を、異なる方法（例えば、カスパーゼの捕捉による細胞溶解物のイ
ンビトロ酵素アッセイおよび適切な基質のタンパク質分解の測定）で分析することができ
る。さらに、カスパーゼを、ＰＡＲＰ（ポリ−ＡＤＰ−リボース−ポリメラーゼ）などの
インビボカスパーゼ基質の切断の検出によってアッセイすることができる。ＰＡＲＰの切
断フラグメントを、抗ＰＡＲＰ抗体などの適切な抗体を使用して検出することができる。
プロテアーゼアッセイおよびＤＮＡ断片化アッセイは、細胞集団のアポトーシスのアッセ
イに特に適切である。
【０２５５】
ＩＳＮＴおよびＴＵＮＥＬ酵素標識アッセイなどの各細胞のアポトーシスの研究方法も
利用可能である。上記のように、広範なＤＮＡ分解は、アポトーシスの初期段階でしばし
ば起こる特徴的な事象である。ＤＮＡの切断により、二本鎖の低分子量のＤＮＡフラグメ
ント（モノおよびオリゴヌクレオソーム）および高分子量ＤＮＡ中の一本鎖分解物（「ニ
ック」）が得られる。ＴＵＮＥＬでは、このようなＤＮＡ鎖の分解物を、適切な修飾ヌク
レオチド（Ｘ−ｄＵＴＰ、Ｘ＝ビオチン、ＤＩＧ、または蛍光色素など）での遊離３’−
ＯＨ末端の酵素標識によって検出する。適切な標識酵素には、ＩＳＮＴ（「インサイチュ
ーニック翻訳」）でのＤＮＡポリメラーゼ（ニック翻訳）およびＴＵＮＥＬ（「ＴｄＴ媒
介Ｘ−ｄＵＴＰニック末端標識」）での末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
（末端標識；Ｈｕａｎｇ，Ｐ＆Ｐｌｕｎｋｅｔｔ，Ｗ．，１９９２、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，２０７，１６３；Ｂｏｒｔｎｅｒ，Ｃ．Ｄ．ら，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃ
ｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５、２１）が含まれる。
【０２５６】
アポトーシスを、膜の変化（細胞表面糖タンパク質の側鎖由来の末端シアル酸残基の喪
失を含む）の測定、新規の糖残基の曝露、トロンボスポンジンなどのマクロファージ分泌
接着分子の受容体として作用することができる表面糖タンパク質の出現、および細胞膜リ
ン脂質の非対称性の喪失、膜表面の疎水性および電荷の変化によってアッセイすることも
できる。特に、ヒト抗凝結薬アネキシンＶは、３５〜３６ｋＤａで、ホスファチジルセリ
ン（ＰＳ）に対する親和性が高いＣａ２＋依存性リン脂質結合タンパク質である。正常な
生存細胞では、ＰＳは、細胞膜の細胞質表面に存在する。しかし、アポトーシス細胞では
、ＰＳは内部から原形質膜の外側の小葉状部分（ｏｕｔｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）に移行し
、それによりＰＳが外部細胞環境に曝される。したがって、アネキシンＶを使用して、ア
ポトーシス細胞表面上に非対称に曝露されたホスファチジルセリンを検出することができ
る（Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｃ．Ｈ．Ｅ．ら、１９９５、Ｂｌｏｏｄ、８５、５３２；Ｖｅｒｈ
ｏｖｅｎ，Ｂ．ら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２、１５９７）。さらに、分
染のためにＤＡＰＩ、臭化エチジウム、およびヨウ化プロピジウムなどのＤＮＡ色素を使
用して、生存細胞と非生存細胞とを区別することができる。ＤＮＡ含有率のプロフィール
を使用することができるので、透過アポトーシス細胞は低分子量のＤＮＡを漏出し、「サ
ブＧ１ピーク」または「Ａ０」細胞（Ｇ１細胞よりもＤＮＡ染色が低い細胞）を、例えば
、フローサイトメトリーによって検出することができる。アポトーシスに特徴的な形態学
的変化を、この様式で検出することもできる。
【０２５７】
抗体の使用によるアポトーシス関連タンパク質（ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−４、ｃｅｄ−９
（Ｅｌｌｉｓ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．，１９８６、Ｃｅｌｌ、４４
、８１７〜８２９；Ｙｕａｎ，Ｊ．Ｙ．ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．，１９９０、
Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１３８、３３〜４１；Ｈｅｎｔｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｌｌ
ｉｓ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．，１９９２、Ｎａｔｕｒｅ、３５６、
４９４〜４９９）、Ｆａｓ（ＣＤ９５／Ａｐｏ−１；Ｅｎａｒｉら、１９９６、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３８０、７２３〜７２６）、Ｂｃｌ−２（Ｂａｆｆｙ，Ｇ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８、６５１１〜６５１９；Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｔ，ａｎｄ  
Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．，１９９３、Ｂｌｏｏｄ、８１、１５１〜１５７；Ｏｌｔｖａｉ，Ｚ
．Ｎ．，Ｍｉｌｌｉｍａｎ，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ  Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｊ．，１９９３
、Ｃｅｌｌ、７４、６０９〜６１９）、ｐ５３（Ｙｏｎｉｓｈ−Ｒｏｕａｃｈ，Ｅ．ら、
１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、３４５〜３４７）など）の検出を使用して、アポトー
シスをアッセイすることもできる。
【０２５８】
［他の適応症］
実施例に示した所見は、アポトーシスおよび壊死肺胞マクロファージのクリアランスま
たは制御の欠損が慢性肺炎に寄与する疾患におけるｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の治療上の
役割を支持する。このような適応症の例（特に、慢性肺炎による気腫の発症リスクを有す
る未熟な新生児および喫煙者（ＳＰ−Ｄレベルが低下している）の慢性肺疾患などの相対
ＳＰ−Ｄ欠損の背景）を上で考察した。
【０２５９】
実施例に示したデータは、ＳＰ−Ｄがアポトーシス細胞の制御およびクリアランスに関
与し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異
体、または誘導体を使用して、アポトーシス肺胞マクロファージなどのアポトーシス細胞
のクリアランスを増強することができることを示す。したがって、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ
）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を使用して
、アテローム性動脈硬化症、成長異常（例えば、早産後の新生児肺疾患における異常な出
生後の肺発達）、炎症組織の再造形欠損に関連する疾患、細胞増殖、および癌を治療する
ことができる。
【０２６０】
〈アテローム性動脈硬化症〉
本発明の好ましい実施形態では、炎症性疾患は、アテローム性動脈硬化症を含む。
【０２６１】
アテローム性動脈硬化症は、適切な遺伝的背景に有効となる種々のリスク因子の作用に
基づく多因子疾患である。アテローム性動脈硬化症は、泡沫細胞（すなわち、化学修飾さ
れた例えば酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）を取り込んだマクロファージおよび
平滑筋細胞）の形成によって特徴付けられる。本発明者らは、特にマクロファージが非常
に異常且つ泡状であり、肺のリン脂質代謝回転が妨害されている、実施例に記載のＳＰ−
Ｄノックアウトマウスの肺表現型を証明した。特に、一定の疾患状態でＳＰ−Ｄが血清中
に大量に存在することが知られている。
【０２６２】
したがって、本発明者らは、血清中の脂質代謝回転の妨害によりアテローム性動脈硬化
症のリスクが増大することを提供する。したがって、ｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）を使用して
、アテローム性動脈硬化症を治療することができる。
【０２６３】
本発明者らは、野生型マウスおよびノックアウトマウスの血清コレステロールレベルを
測定し、ノックアウトマウスでコレステロールレベルが高いことを示す（図１７を参照の
こと）。高レベルのコレステロールは、アテローム性動脈硬化症の発症リスクを増大させ
ることが公知である。したがって、本発明者らは、組換えＳＰ−Ｄ（例えば、ｒＳＰＤ（
Ｎ／ＣＲＤ））を静脈内に補給することによりこの異常を矯正することを開示する。
【０２６４】
さらに、最近、アポトーシスが血管細胞のアテローム硬化性病変の発症を調整する役割
を果たすことが示されている（Ｍａｒｔｉｎｅｔ  Ｗ，Ｋｏｃｋｘ  ＭＭ．，「アテロー
ム硬化症のアポトーシス：酸化脂質および炎症の注目」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉ
ｄｏｌ．，２００１年１０月，１２（５），５３５〜４１；Ｋｏｃｋｘ  ＭＭ．，Ｈｅｒ
ｍａｎ  ＡＧ．，「アテローム性硬化症のアポトーシス：有利か有害か？」、Ｃａｒｄｉ
ｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，２０００年２月，４５（３），７３６〜４６）。アポトーシス体
が除去された場合、マクロファージのアポトーシスは、プラーク安定性に有利であり得る
。しかし、プラーク中で除去されないアポトーシス細胞は、トロンビンを活性化してプラ
ーク内血栓症をさらに誘導し得る。プラーク破裂および血栓症を引き起こし得るので原発
性アテローム性動脈硬化症のアポトーシスは有害であると結論付けることができる。本発
明者らは、実施例で組換えＳＰ−Ｄでの治療より、ＳＰ−Ｄノックアウトマウスの肺のア
ポトーシスマクロファージ数が減少することを示す。
【０２６５】
したがって、静脈内投与した組換えＳＰ−Ｄの潜在的適用は、アテローム性動脈硬化症
の発症リスクを減少させることができる血管内の有害なアポトーシス細胞（例えば、マク
ロファージ）の減少である。したがって、ｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）を使用して、アテロー
ム性動脈硬化症の１つまたは複数の任意の症状を治療または予防することができる。
【０２６６】
［医薬組成物］
本発明者らは、サーファクタント製剤を含むｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）またはエアゾー
ル適用、噴霧、鼻腔内または気管支内投与によるｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の個別の同時
投与を最初に開発可能にする、生物活性形態のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドを、
低コストで大量に産生することができることを示す。凍結乾燥および再懸濁後に調製物は
安定であり、生物活性が保持され、保存が容易である。望ましくない全身性副作用を有す
る副腎皮質ステロイドを使用した現在の治療と異なり、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）は、マ
ウスでは病的影響は認められないようであり、ヒトでは副作用は認められないようである
。
【０２６７】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドまたは核酸を含む組成物を単独で投与することが
可能であるが、医薬製剤として有効成分を処方することが好ましい。したがって、本発明
者らはまた、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ
、変異体、または誘導体を含む医薬組成物を開示する。このような医薬組成物は、記載の
症状の治療または緩和のための個体へのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そ
のフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体の送達に有用である。
【０２６８】
組成物は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ
、変異体、または誘導体、構造的に関連する化合物、またはその酸性塩を含んでもよい。
医薬製剤は、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアと共に有効量のｒＳＰＤ（ｎ
／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を
含む。「有効量」のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホ
モログ、変異体、または誘導体は、記載の疾患（例えば、炎症性疾患（好ましくは、湿疹
）、炎症性肺疾患、新生児慢性肺疾患、新生児呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、成人呼吸窮迫
症候群、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、肺線維症、気腫、間質
性炎症性肺疾患、サルコイドーシス、肺炎、慢性炎症性肺疾患、新生児慢性炎症性肺疾患
、イエダニ（ヒョウヒダニ属）に対するアレルギー、好ましくはヤケヒョウヒダニまたは
コナヒョウヒダニ、または菌類もしくは菌類胞子、好ましくはアスペルギルス・フミガー
ツスによる、季節性呼吸器アレルギー、アレルギー性鼻炎、花粉症、非アレルギー性鼻炎
、血管運動神経性鼻炎、刺激性鼻炎、草本の花粉、木本の花粉、または動物の鱗屑に対す
るアレルギー、アレルギー性喘息に関連するアレルギー、食品アレルギー、細菌感染およ
びウイルス感染を含む微生物感染（好ましくは肺の微生物感染））などの疾患の少なくと
も１つの症状の緩和に十分な量である。
【０２６９】
有効量は、治療または緩和すべき特定の疾患または症候群、患者の年齢および体重、疾
患などの病態がどのようにして進行するか、患者の身体全体の健康、症候群の重症度、お
よびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体
、または誘導体が単独または他の治療薬との組み合わせのいずれで投与されるかを含む他
の要因によって変化する。
【０２７０】
適切な薬学的に許容可能なキャリアは当分野で周知であり、医薬製剤の所望の投与形態
および様式によって変化する。例えば、これらは、希釈剤または充填剤、結合剤、湿潤剤
、崩壊剤、界面活性剤、および潤滑剤などの賦形剤を含み得る。典型的には、キャリアは
、固体、液体、または蒸発可能なキャリアまたはその組み合わせである。各キャリアは、
製剤中の他の成分と適合可能であり、且つ患者に有害でないという意味で「許容可能」で
なければならない。キャリアは、宿主に投与した場合に副作用（例えば、免疫応答）を誘
発しないで生物学的に許容可能でなければならない。
【０２７１】
本明細書中に記載の医薬組成物には、局所および経口投与に適切なものが含まれ、影響
を受ける組織が主に皮膚または表皮（例えば、乾癬、湿疹、および他の表皮疾患）である
局所用製剤が好ましい。局所製剤には、組成物を治療すべき皮膚表面との直接的接触によ
って外部から適用する薬学的形態が含まれる。局所適用のための従来の薬学的形態には、
浸漬（ｓｏａｋ）、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スティック、スプレ
ー、エアゾール、バスオイル、および溶液などが含まれる。局所治療薬を、種々の賦形剤
（賦形剤の選択は、重要であり、一般に治療される疾患が急性または慢性のいずれである
かに関連する）によって送達させる。例として、急性皮膚増殖疾患を、一般に、水性乾燥
調製物で治療し、慢性皮膚増殖疾患を、水和調製物で治療する。浸漬は、急性湿性発疹の
最も簡単な乾燥方法である。ローション（粉末を含む水性懸濁物）および溶液（溶媒中に
溶解させた薬物）は、被毛部および間擦部に理想的である。軟膏または油中水型乳濁液は
、最も有効な水和剤であり、乾燥発疹に適切であるが、ベタベタし、病変部位によっては
望ましくない場合がある。必要に応じて、特に、病変への薬剤組成物の浸透性を増大させ
ることが望ましい場合、これらを、包帯と組み合わせて適用することができる。クリーム
または水中油滴型乳濁液ならびにゲルは、吸収性を示し、患者に最も美容的に許容されて
いる（Ｇｕｚｚｏら、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ
ａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版，１５９３〜１５９５０，
１９９６）。クリーム製剤には、一般に、石油、ラノリン、ポリエチレングリコール、鉱
物油、グリセリン、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸グリセリル、セテアリルア
ルコール、酢酸トコフェロール、イソプロピルミリステート、ラノリンアルコール、シメ
チコン、カルボメン、メチルクロリソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、シクロメ
チコン、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにその混合物などの成分が
含まれる。
【０２７２】
他の局所適用製剤には、シャンプー、石鹸、およびシェイクローション（shake lotion
）など、特に、頭皮などの基礎となる皮膚上の残渣を除去するために処方された製剤が含
まれる（Ａｒｎｄｔら，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ，２，２８３８，１９９３）。
【０２７３】
一般に、局所用製剤中のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラグメン
ト、ホモログ、変異体、または誘導体の組成物濃度は、組成物の約０．５〜５０重量％、
好ましくは約１〜３０重量％、より好ましくは約２〜２０重量％、および最も好ましくは
約５〜１０重量％の量である。使用濃度は、上限からはじめ、治療を継続するにつれて濃
度を減少させるか、製剤の適用頻度を減少させることができる。１日２回局所適用する場
合もある。しかし、高用量を１日１回投与するか、低用量をより頻繁に投与すると有効で
あり得る。角質層は、貯蔵所として作用することができ、長期間にわたり生存している皮
膚層に薬物を段階的に浸透させることができる。
【０２７４】
局所適用では、所望の薬理的効果を得るために十分量の有効成分を患者の皮膚に浸透さ
せなければならない。一般に、皮膚への薬物の吸収は、薬物の性質、賦形剤の挙動、およ
び皮膚の機能であると理解される。以下の３つの主要な可変要素は、異なる局所用薬物ま
たは異なる賦形剤中の同一の薬物の吸収速度または流動速度の相違を説明する；賦形剤中
の薬物濃度、角質層と賦形剤との間の薬物の分配係数；角質層中の薬物の拡散係数。治療
に有効であるために、薬物は、皮膚のバリア機能を担う角質層を通過しなければならない
。一般に、高いインビトロ透過性を発揮する局所用製剤は、インビボで有効である。Ｏｓ
ｔｒｅｎｇａら、（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６０，１１７５〜１１７９，１９７１）
は、局所的に適用したステロイドのインビボでの有効性は、インビトロでの皮節化した（
dermatomed）ヒト皮膚へのステロイド浸透速度に比例することを証明した。
【０２７５】
皮膚表面から表皮角化細胞への活性な化合物の浸透を増大させるために、皮膚科学的に
許容可能且つ薬剤と適用可能な皮膚浸透増強剤を製剤に組み込むことができる。皮膚への
活性な化合物の吸収を増大させる皮膚増強剤により、有効な治療に必要な薬剤の量が減少
し、製剤の効果がより長く持続する。皮膚浸透増強剤は、当分野で周知である。例えば、
ジメチルスルホキシド（米国特許第３，７１１，６０２号）；オレイン酸、１，２−ブタ
ンジオールサーファクタント（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７３、１１５
３〜１１５６，１９８４）；エタノールとオレイン酸またはオレイルアルコールとの混合
物（欧州特許第２６７，６１７号）、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＷＯ８７
／０３４９０）；デシルメチルスルホキシドおよびＡｚｏｎｅ．ＲＴＭ（Ｈａｄｇｒａｆ
ｔ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，２１、１６５
〜１７３、１９９６）；アルコール、スルホキシド、脂肪酸、エステル、Ａｚｏｎｅ．Ｒ
ＴＭ、ピロリドン、尿素、およびポリオール（Ｋａｌｂｉｔｚら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，
５１，６１９〜６３７，１９９６）。
【０２７６】
１，８−シネオール、メンソン、リモネン、ネロリドール（Ｙａｍａｎｅ、Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｙ＆Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４７、９７８〜９８９、１９９５）；Ａｚｏｎ
ｅ．ＲＴＭおよびトランスクトール（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ  Ｒｅｓ．，１３、５４２〜５４６、１９９６）；ならびにオレイン酸、ポリエチレン
グリコール、およびプロピレングリコール（Ｓｉｎｇｈら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５１，
７４１〜７４４，１９９６）などのテルペンは、有効成分の皮膚浸透を改善することが公
知である。
【０２７７】
薬剤または組成物の浸透レベルを、当業者に公知の技術によって測定することができる
。例えば、当業者は、試験化合物の皮膚浸透を決定するいくつかの方法を使用して、活性
な化合物の放射性標識およびその後の皮膚によって吸収された放射性標識化合物の量の測
定によって吸収された組成物レベルを決定することができる。皮膚浸透研究に関する刊行
物には、Ｒｅｉｎｆｅｎｒａｔｈ，Ｗ．Ｇ．ａｎｄ  Ｇ．Ｓ．Ｈａｗｋｉｎｓ．，「経皮
浸透を測定するための動物モデルとしての離乳ヨークシャーブタ」、Ｓｗｉｎｅ  ｉｎ  
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍ．Ｅ．Ｔｕｍｂｌｅｓｏｎ編）、Ｐｌｅｎ
ｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６およびＨａｗｋｉｎｓ，Ｇ．Ｓ．，「インビトロ皮膚
浸透の実施方法」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｋｉｎ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｂ．Ｗ
．Ｋｅｍｐｐａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９０，６７〜８０頁；およびＷ．Ｇ．Ｒｅｉｆｅｎｒａ
ｔｈ，Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ＆Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ，１１０，３〜９，１９９５が含まれ
る。
【０２７８】
いくつかの応用のために、ポリマーなどの当分野で公知の製剤を使用した薬剤または組
成物の長期作用形態を投与することが好ましい。処置すべき領域への薬物の送達効率を増
大させるために、当分野で公知の方法にしたがって薬剤を皮膚パッチ（Ｊｕｎｇｉｎｇｅ
ｒ，Ｈ．Ｅ．，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｎｏｒｄｉｃａ，４，１１７，
１９９２；Ｔｈａｃｈｒｏｄｉら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１６，１４５〜１４８，
１９９５；Ｎｉｅｄｎｅｒ  Ｒ．，Ｈａｕｔａｒｚｔ，３９，７６１〜７６６，１９８８
）または包帯に組み込むことができる。
【０２７９】
任意選択的に、本発明の局所製剤は、さらなる賦形剤（例えば、メチルパラベン、ベン
ジルアルコール、ソルビン酸、または第四級アンモニウム化合物などの防腐剤；ＥＤＴＡ
などの安定剤；ブチル化ヒドロキシトルエンまたはブチル化ヒドロキシアニソールなどの
抗酸化剤；およびクエン酸塩およびリン酸塩などの緩衝液）を有することができる。
【０２８０】
医薬組成物を、錠剤、カプセル、または溶液の形態の経口製剤で投与することができる
。有効量の経口製剤を、疾患の症状が緩和するまで患者に１日１〜３回投与する。薬剤の
有効量は、患者の年齢、体重、および病態に依存する。一般に、薬剤の１日の経口投与量
は、１２００ｍｇ未満且つ１００ｍｇ超である。好ましい１日の経口用量は、約３００〜
６００ｍｇである。経口製剤は、単位投与形態で存在することが都合がよく、薬学分野で
公知の任意の方法によって調製することができる。組成物を、適切な薬学的に許容可能な
キャリアと共に任意の所望の投与形態に処方することができる。典型的な単位投与形態に
は、錠剤、丸薬、粉末、溶液、懸濁液、乳濁液、顆粒、カプセル、座剤が含まれる。一般
に、製剤を、薬剤組成物を液体キャリアまたは細かく砕いた固体キャリアまたはその両方
と均一且つ十分に合わせ、必要に応じて、生成物を成形することによって調製する。有効
成分を、液体、粉末、錠剤、またはカプセル形態の種々の基剤に組み込んで疾患を治療す
るための有効量の有効成分を得ることができる。
【０２８１】
本明細書中の使用に適切な他の治療薬は、意図する目的で有効な任意の適合可能な薬物
または薬製剤（agent formulation）に相補的な薬物である。併用療法で使用される製剤
を、組み合わせ効果が得られるように他の治療と同時または連続的に投与することができ
る。
【０２８２】
［サーファクタント治療組成物］
サーファクタント治療薬を含むｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の開発を、現在の製剤の代わ
りまたは現在の製剤と組み合わせて新生児呼吸窮迫症候群の治療に適用することができる
。
【０２８３】
新生児呼吸窮迫症候群のための現在のサーファクタント療法には、以下が含まれる。
【０２８４】
〈Ｂｅｒａｃｔａｎｔ（Ｓｕｒｖａｎｔａ）〉
Ｂｅｒａｃｔａｎｔ（Ｓｕｒｖａｎｔａ）は、リン脂質、脂肪酸、およびサーファクタ
ント関連タンパク質Ｂ（７ｍｃｇ／ｍＬ）およびＣ（２０３ｍｃｇ／ｍＬ）を含む半合成
ウシ肺抽出物である。Ｂｅｒａｃｔａｎｔは、１００ｍｇ（すなわち、４ｍＬ）／ｋｇの
小児用量を４つのアリコートに分けて少なくとも６時間あけて投与する（気管内）。
【０２８５】
〈Ｃａｌｆａｃｔａｎｔ（Ｉｎｆａｓｕｒｆ）〉
Ｃａｌｆａｃｔａｎｔ（Ｉｎｆａｓｕｒｆ）は、リン脂質、脂肪酸、およびサーファク
タント関連タンパク質Ｂを含む新生児ウシ肺抽出物である。Ｒｏｓｓが製造しており、（
２６０ｍｃｇ／ｍＬ）およびＣ（３９０ｍｃｇ／ｍＬ）で投与する。
【０２８６】
〈ＳＵＲＶＡＮＴＡ（登録商標）（ｂｅｒａｃｔａｎｔ）気管内用懸濁液〉
ＳＵＲＶＡＮＴＡ（登録商標）（ｂｅｒａｃｔａｎｔ）は、気管内使用を意図する滅菌
無発熱物質肺サーファクタントである。これは、組成物を標準化し、天然の肺サーファク
タントの表面張力低下性を模倣するために、パルミチン酸コルホセリル（ｃｏｌｆｏｓｃ
ｅｒｉｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、パルミチン
酸、およびトリパルミチンを添加した、リン脂質、中性脂質、脂肪酸、およびサーファク
タント関連タンパク質を含む天然のウシ肺抽出物である。得られた組成物から、２５ｍｇ
／ｍＬリン脂質（１１．０〜１５．５ｍｇ／ｍＬの二飽和ホスファチジルコリン）、０．
５〜１．７５ｍｇ／ｍＬトリグリセリド、１．４〜３．５ｍｇ／ｍＬ遊離脂肪酸、および
１．０ｍｇ／ｍＬ未満のタンパク質が得られる。これを、０．９％の塩化ナトリウム溶液
中に懸濁し、熱滅菌する。ＳＵＲＶＡＮＴＡは、防腐剤を含まない。そのタンパク質は、
一般にＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃとして公知の２種の疎水性で低分子量のサーファクタント
関連タンパク質からなる。ＳＰ−Ａとして公知の、親水性で高分子量のサーファクタント
関連タンパク質は含まない。
【０２８７】
〈ＩＮＦＲＡＳＵＲＦ気管内懸濁液（Ｆｏｒｅｓｔ）〉
Ｉｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）（ｃａｌｆａｃｔａｎｔ）気管内懸濁液は、気管内点滴
注入のみを意図する滅菌無発熱物質肺サーファクタントである。これは、リン脂質、中性
脂質、および疎水性サーファクタント関連タンパク質ＢおよびＣ（ＳＰ−ＢおよびＳＰ−
Ｃ）を含むウシ肺由来の天然サーファクタントの抽出物である。これは、防腐剤を含まな
い。
【０２８８】
Ｉｎｆａｓｕｒｆは、０．９％の塩化ナトリウム水溶液中にｃａｌｆａｃｔａｎｔを含
むオフホワイトの懸濁液である。ｐＨは５．０〜６．０である。各Ｉｎａｓｕｒｆは、３
５ｍｇの総リン脂質（２６ｍｇのホスファチジルコリンを含み、そのうちの１６ｍｇが二
飽和ホスファチジルコリンである）および０．２６ｍｇのＳＰ−Ｂを含む０．６５ｍｇの
タンパク質を含む。
【０２８９】
〈気管内懸濁液用のＥＸＯＳＵＲＦ  Ｎｅｏｎａｔａｌ（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ
）〉
気管内懸濁液用のＥＸＯＳＵＲＦ  ＮＥＯＮＡＴＡＬ（パルミチン酸コルホセリル、セ
チルアルコール、チロキサポール）は、滅菌凍結乾燥粉末として真空下で保存した無タン
パク質合成肺サーファクタントである。ＥＸＯＳＵＲＦ  ＮＥＯＮＡＴＡＬは、気管内点
滴注入による投与前に注射用無防腐剤滅菌水で再構成する。各１０ｍＬのバイアルは、１
０８ｍｇパルミチン酸コルホセリル（一般に、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄ
ＰＰＣ）として公知）、１２ｍｇセチルアルコール、８ｍｇチロキサポール、および４
７ｍｇ塩化ナトリウムを含む。ｐＨを調製するために、水酸化ナトリウムまたは塩酸を添
加することができる。８ｍＬの注射用滅菌水で再構成した場合、ＥＸＯＳＵＲＦ  ＮＥＯ
ＮＡＴＡＬ懸濁液は、０．１ＮのＮａＣｌ中に１３．５ｍｇ／ｍＬパルミチン酸コルホセ
リル、１．５ｍｇ／ｍｌセチルアルコール、および１ｍｇ／ｍＬチロキサポールを含む。
懸濁液は、ｐＨ５〜７で乳白色であり、浸透圧１８５ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【０２９０】
ＥＸＯＳＵＲＦ  ＮＥＯＮＡＴＡＬ化合物の化合物名は、以下である。パルミチン酸コ
ルホセリル：（Ｒ）−４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１０−オキソ−７−［
（１−オキソヘキサデシル）オキシ］−３，５，９−トリオキサ−４−ホスファペンタコ
サン−１−水酸化アルミニウム内部塩４−オキシド；セチルアルコール：（１−ヘキサデ
カノール）：およびチロキサポール：ホルムアルデヒドおよびオキシランを含む４−（１
，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノールポリマー。
【０２９１】
タンパク質を含まないＥＸＯＳＵＲＦ  ＮＥＯＮＡＴＡＬでは、セチルアルコールは、
気体−液体境界でのＤＰＰＣの展着剤として作用する。チロキサポール（高分子長鎖反復
アルコール）は、ＤＰＰＣおよびセチルアルコールの両方を分散させるように作用する非
イオン性サーファクタントである。浸透圧を調整するために塩化ナトリウムを添加する。
【０２９２】
〈ＣＵＲＯＳＵＲＦ（登録商標）〉
商標名：Ｃｕｒｏｓｕｒｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ：ｐｏｒａｃｔａｎ
ｔαの力価：１２０ｍｇリン脂質／１．５ｍＬまたは２４０ｍｇリン脂質／３ｍＬ、ウイ
ルス投薬形態：気管内懸濁液、会社名：Ｄｅｙ，ＬＰ、利用可能性：処方箋薬、業務用、
ＦＤＡ承認日：１９９９年１１月１８日。
【０２９３】
したがって、本発明者らは、サーファクタント治療薬として、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）
ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体と組み合わせ
た上記開示の治療薬の任意の成分（好ましくは、有効成分）を含む組成物の使用を開示す
る。したがって、本発明者らは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、核酸、そのフラ
グメント、ホモログ、変異体、または誘導体と組み合わせた肺抽出物を含む組成物を開示
する。肺抽出物は、リン脂質（ホスファチジルコリンおよび二飽和ホスファチジルコリン
）および／または脂肪酸を含むウシ、好ましくは子牛の肺抽出物を含み得る。組成物は、
さらに、サーファクタント関連タンパク質（例えば、サーファクタント関連タンパク質Ｂ
またはサーファクタント関連タンパク質Ｃ）を含み得る。セチルアルコール、長鎖反復ア
ルコール、チロキサポール、パルミチン酸コルホセリル（ジパルミトイルホスファチジル
コリン）、パルミチン酸、およびトリパルミチン、ｐｏｒａｃｔａｎｔα、および塩化ナ
トリウムなどの他の成分を添加することもできる。
【０２９４】
特に、本発明者らは、それぞれＢｅｒａｃｔａｎｔ（Ｓｕｒｖａｎｔａ）；Ｃａｌｆａ
ｃｔａｎｔ（Ｉｎｆａｓｕｒｆ）；ＳＵＲＶＡＮＴＡ（登録商標）（ｂｅｒａｃｔａｎｔ
）；ＩＮＦＲＡＳＵＲＦ；ＥＸＯＳＵＲＦ  Ｎｅｏｎａｔａｌ；およびＣＵＲＯＳＵＲＦ
に対応する組成物を開示し、各組成物は、さらに、治療有効量のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）
ポリペプチド、核酸、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または誘導体を含む。
【０２９５】
［さらなる態様］
さらなる態様には、以下が含まれる。
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または
誘導体を個体に投与するステップを含む、個体のＭＣＰ−１レベルまたはＭＩＰ１αレベ
ルまたはその両方を増加させる方法。
【０２９６】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または
誘導体を個体に投与するステップを含む、個体のサイトカインレベル、好ましくはＩＦＮ
γレベルを増加させる方法。
【０２９７】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体、または
誘導体の投与による、個体の細胞媒介免疫系の成分をアップレギュレーションする方法、
ナチュラルキラー細胞の活性をアップレギュレーションする方法、またはその両方も開示
する。
【実施例１】
【０２９８】
［材料と方法］
〈組換えサーファクタントタンパク質Ｄフラグメント（ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）〉
これらの実施例で使用される組換えサーファクタントタンパク質Ｄフラグメント（ｒＳ
Ｐ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）は、ヒトＳＰ−Ｄの短縮形態である。標準的な発酵手順を使用して
ｐＥＴベクターに挿入し、大腸菌に形質転換したヒトＳＰ−Ｄ（構築物）のフラグメント
のｃＤＮＡを含むプラスミド由来の大腸菌中のフラグメントを発現させる。
【０２９９】
構築物は、２位でプロリンがセリンに置換された８個のＮ末端Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ
トリプレット（斜体で示す）およびその後の２８残基のネック領域（太字で示す）および
ヒトＳＰ−Ｄの１２５残基の炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）の短ストレッチから構成さ
れる。
【化５】
2010090134.tif 000008
【０３００】
ｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）の構造を示す略図を、図１Ａに示す。（Ａ）はサーファクタン
トタンパク質Ｄの十二量体であり、（Ｂ）はＳＰ−Ｄの三量体であり、（Ｃ）はＳＰ−Ｄ
のヘッド−ネック領域の全構造のリボン図である。
【０３０１】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２に記載の配
列を有する。
【０３０２】
〈ｐＥＴベクターｐＥＴ２１ｄ中でのｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）の発現構築物の作製〉
ヒトＳＰ−Ｄ（ネック／ＣＲＤ）をコードし、８個のＮ末端Ｇｌｙ−Ｘａａ  Ｙａａト
リプレットをコードする短ストレッチを含む配列を、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄ−３での消
化によって前に作製したヒトＳＰ−ＤクローンｐＢＣＳＫ１（Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｕ．ら、
「ヒト肺サーファクタントタンパク質Ｄのαヘリックスネック領域はリポ多糖類およびリ
ン脂質への炭水化物認識ドメインの結合に不可欠である」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９
９６，３１８（Ｐｔ２），５０５〜１１頁）から切り出した。次いで、得られたフラグメ
ントを、アガロース電気泳動によって精製し、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄ３で消化したｐＥ
Ｔ−２１ｄベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ製）にライゲーションする。ｐＥＴ−２１ｄベクタ
ーは、Ｎｏｖｅｇｅｎ（カタログ番号６９７４３−３）から利用可能である。その配列は
当分野で公知であり、例えば、Ｎｏｖａｇｅｎの文献（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｎｏｖａｇｅｎ．ｃｏｍ／で見出される）に記載されている。
【０３０３】
〈ｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）の調製〉
このようにして作製した新規の構築物を使用して、コンピテント細胞（ＤＨ５α）と形
質転換した。ｒＳＰ−Ｄ（ネック／ＣＲＤ）についてこの構築物を含むプラスミドＤＮＡ
を、細胞成長後に標準的方法によって形質転換コロニーから精製する。
【０３０４】
ｐＥＴベクター中のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）（ネック／ＣＲＤ）のｃＤＮＡを含むプラ
スミドを、ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、１つのコロニーを選択し、１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＬＢ+）
を補足した１ｍｌのＬＢで希釈する。これを、１０００倍に希釈し、１００μｌをアガロ
ースプレート上に広げ、一晩インキュベートする。得られたコロニーのローンを、平たい
スパチュラでの掻爬によって回収し、５０ｍｌのＬＢ+に懸濁する。これの５ｍｌアリコ
ートを使用して、５００ｍｌのＬＢ+を含む２Ｌフラスコをインキュベートする。この手
順は、成長倍地中での成長および一晩の培養のより一般的な操作よりも優れていることが
見出された。静止期でのコロニー成長により、細胞間の接触が軽減され、摂取物中の発現
プラスミドを保有しない変異体の比率が減少する。
【０３０５】
至適発現レベルを達成するために、５００ｍｌ  ＬＢ／２Ｌフラスコを超えないことが
重要であることも見出された。
【０３０６】
培養物を、Ａ600で０．６〜０．８に成長させ、その後０．４ｍＭのＩＰＴＧと２〜３
時間インキュベートする。
【０３０７】
〈組換えサーファクタントタンパク質Ｄフラグメント（ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ））の精
製〉
遠心分離によって細胞を採取し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ｖ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ
（ｐＨ７．５）に溶解し、３分間超音波処理を行う。不溶性封入体中でｒＳＰＤ（ｎ／Ｃ
ＲＤ）を発現させ、１００００×ｇの遠心分離によって採取する。このステップを３回繰
り返し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を含む精製封入体ペレットを、１００ｍｌの８Ｍ尿素、
１００ｍＭの２−メルカプトエタノール（ｐＨ７．５）に溶解し、高速遠心分離によって
明澄化した。
【０３０８】
尿素溶液を、１Ｌの２０ｍＬ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈し、および５０ｍ
ｌのＱ−Ｓｅｐｈｅｒｏｓｅ陰イオン交換樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を添加し、２０
℃で３０分混合する。吸着した樹脂を、ＦＰＬＣカラムに詰め、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で十分に洗浄し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出する。
【０３０９】
ピーク画分由来のタンパク質を、４℃で３０分間のアセトンでの１０倍希釈によって沈
殿させる。沈殿物を、高速遠心分離で採取し、１００ｍｌの８Ｍ尿素に溶解し、１０Ｌの
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ2（ｐＨ７．４
）に対して４℃で一晩透析する。
【０３１０】
次いで、透析物を、２０ｍｌのマルトース−アガロースを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ2（ｐＨ７．４）と数時間から一晩混合する。この長時間イン
キュベーションステップにより、最終段階の活性タンパク質への再折りたたみが適切に促
進される。
【０３１１】
マルトース−アガロースをＦＰＬＣカラムに詰め、１ＭのＮａＣｌを含む同一の緩衝液
で洗浄して、非特異的タンパク質を除去する。高塩洗浄により、カラムに結合していた全
ＯＤ280吸着物質の約２５〜５０％が溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、おそらく正確な三
次元構造に完全に折りたたまれなかった低親和性ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）である微量（約
１０％）のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を示す。これらのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）調製物を、
マウスでの構造研究および実験で使用すべきであり、この画分を含まないことが望ましい
と見なされる。さらに、高塩中の全ＯＤ280吸着物質は、このｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）に
寄与することができるものよりもはるかに大量であり、おそらく細菌ＤＮＡおよび動物へ
の投与用調製物で望ましくないと考えられる他の物質による。
【０３１２】
次いで、結合したｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を、５ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム（ｐＨ
７．４）で溶離して、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）ＣＲＤ媒介結合に必要なＣａを除去した。
【０３１３】
ピーク画分を、１００００ＭＷＣＯメンブレンを具備したＡｍｉｃｏｎを使用して撹拌
細胞を５ｍｌに濃縮し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの
ＥＤＴＡ、００２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）の溶離緩衝液を含む、
１００ｍｌのＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にロードす
る。分子量６０ｋＤａに対応する単一ピークとしてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）が溶出された
。
【０３１４】
このステップにより、この段階で同時に精製されたと考えられる全ての夾雑物が最終的
に分離され、ＥＤＴＡの存在下で任意の炭水化物がｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）から分離され
、低分子量であるので、カラムの総封入体積（１００ｍｌ）に溶離されたと予想される。
【０３１５】
このステップにより、タンパク質ピークの対称性およびショルダーの非存在によるタン
パク質調製物の均一性も評価される。主ピークの外側の画分を破棄する。プールした画分
を回収し、２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、次のステップに進む。ゲル濾過後のｒＳＰＤ（ｎ／Ｃ
ＲＤ）の回収率は、典型的にはロードした全ＯＤ280吸収物質の８０％である。これは、
これの少なくとも２０％はｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）に起因せず、最終ステップとしてゲル
濾過を含める必要が強まることを示す。
【０３１６】
精製ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）の１０
ｍＭのＰｏｌｙｍｉｘｉｎＢカラム（Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）への通過に
よって内毒素レベルが減少する。
【０３１７】
〈ＦＩＴＣ標識によるｒＳＰ−Ｄの修飾〉
マウスのＢＡＬによって単離されたマクロファージへのインビトロ結合を評価するため
に、ｒＳＰ−Ｄを、製造者の説明書に従って、アミン反応性プローブＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍ
ａ）で標識する。簡単に述べれば、５０μｇのＦＩＴＣを、１ｍｇのｒＳＰ−Ｄを含む２
００ｍｌの０．１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）と室温で２時間インキュベ
ートする。
【０３１８】
次いで、標識したタンパク質を、Ｇ−２５カラムを使用してＦＩＴＣから分離する。Ｆ
ＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄ（２０μｇ／ｍｌ）を、野生型マウスおよびＳＰ−Ｄノックアウトマ
ウスから新たに単離した肺胞マクロファージと結合緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４
０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ2）中でインキュベートし、Ｃｏｎｓｏｒｔ３
２  ＦＡＣｓシステムでのフローサイトメトリーによって以下に概説するようにヨウ化プ
ロピジウムまたはＰＥ標識アネキシンＶとの同時標識について評価する。
【０３１９】
〈アスペルギルス・フミガーツス抗原の調製（Ａｆｕ  ｌｗｃｆ）〉
アスペルギルス・フミガーツス（Ａｆｕ）を、合成培地（Ｍ１９９、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）にて静置培養として３７℃で１週間成長させる。Ａｒｒｕｎｄａら（Ａ
ｒｒｕｄａ，Ｌ．Ｋ．，Ｂ．Ｊ．Ｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ，１９９２
，「アスペルギルス・フミガーツスにおける主要なアレルゲンおよび細胞毒素（Ａｓｆ  
ｆＩ）の選択的発現：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ関連疾患の免疫病原性の影響」、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，１４９、３３５４〜９）は、Ａｓｐ  ｆ１（主要なアレルゲン）の発現は
１週間後が最大であり、それより長いインキュベーションで減少する傾向があることを証
明している。
【０３２０】
１週間培養物は、１２時間の０．１％チメロサールの添加によって死滅する。培養物を
ガラスウールで濾過し、最終的に０．４５μｍのメンブレンで濾過して、全ての微粒子お
よび可能な胞子を除去し、その後、３回緩衝液を交換しながら水に対して透析した。透析
物を凍結乾燥して褐色粉末を得た。
【０３２１】
Ａｓｐ  ｆ１に対応する１８ｋＤａの主バンドが存在する。Ａｓｐ  ｆ２に対応するバ
ンド（３７ｋＤａ）も明白である。１８ｋＤａのバンドのＮ末端配列決定を行って、Ａｓ
ｐ  ｆ１のＮ末端配列に対応する配列ＡＴＷＴＣＩＮＱＱＬＮＰを得た。
【０３２２】
１週間培養物の濾過物（１ｗｃｆ）は、英国国立生物学的製剤研究所から入手したＡｆ
ｕアレルギー患者由来のヒト血清によって認識されることもＥＬＩＳＡによって証明され
た。
【０３２３】
〈トランスジェニック株〉
本発明者らは、以前に、遺伝子ターゲティングＳＰ−Ｄ欠損マウスの作製を報告してい
る（Ｂｏｔａｓ，Ｃ．，Ｐｏｕｌａｉｎ，Ｆ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ
．，Ａｌｌｅｎ，Ｌ．，Ｇｏｅｒｋｅ，Ｊ．，Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｊ．Ｃａｒｌｓｏｎ，
Ｅ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ａ．Ｍ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｃ．＆Ｈａｗｇｏｏｄ，Ｓ．，
１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、１１８６９〜７４）
。
【０３２４】
Ｃ５７Ｂ１６バックグラウンドに１０世代戻し交配したＳＰ−Ｄ欠損マウスに自由に餌
を与え、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｕｎｉｔ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙの無病原体環境下で隔離飼育器に格納する。コントロール実験のための無病
原体Ｃ５７Ｂ１６野生型マウスを、Ｈａｒｌａｎ−ＯＬＡＣ、Ｓｈａｗ’ｓ  ｆａｒｍ、
Ｂｉｃｅｓｔｅｒ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅから入手する。全実験プロトコールは、適切
なＵ．Ｋ．Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓおよ
びオックスフォード大学倫理委員会に承認されている。
【０３２５】
〈ｒＳＰ−Ｄ、ｒＳＰ−Ａ、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の投与〉
６週齢のＳＰ−Ｄ欠損マウスに、３つのプロトコールのうちの１つを使用して３〜６週
間にわたりタンパク質またはＰＢＳのみを複数鼻腔内投与した。
【０３２６】
各タンパク質投与のために、マウスをイソフルランで軽く麻酔し、その後ｒＳＰ−Ｄま
たはコントロールタンパク質（３０μｇ、２５μｇ、または１０μｇのｒＳＰ−Ｄ、ｒＳ
Ｐ−Ａ、またはＢＳＡを含む５０μｌのＰＢＳ）を、滅菌マイクロピペットを使用して鼻
孔に投与する。全流動物が吸入されるまでマウスを直立させたままにする。最初の処置プ
ロトコールでは、１２匹のマウスに６週齢から３０μｇのｒＳＰ−Ｄを３日間毎日投与し
た。３週間後に肺胞マクロファージ数および肺胞リン脂質含有量のアッセイのために６匹
のマウスを屠殺する。治療群の残りの６匹のマウスは６週間の治療を完了させ、その後屠
殺およびアッセイを行った。第２の治療プロトコールでは、マウスに１２週齢から１０μ
ｇのｒＳＰ−Ｄ、ｒＳＰ−Ａ、ＢＳＡで１週間に５回を３週間処置し、その後屠殺および
アッセイを行った。さらなるコントロールは非処置マウスであり、マウスをＰＢＳで処置
した。４週齢から処置効果を評価するために、肺胞マクロファージ数が有意に増加する前
に、第３のプロトコールにて６匹のマウスを３０μｇのｒＳＰ−Ｄで２週間処置する。リ
ン脂質および肺胞マクロファージ数のアッセイのためにこれらのマウスを６週齢で屠殺し
、非処置の年齢の適合したコントロールと比較した。
【０３２７】
〈気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）〉
肺胞マクロファージの単離のために（例えば、アポトーシスアッセイのため）、各治療
群の４〜６匹のマウスを二酸化炭素での窒息によって屠殺し、滅菌ＲＰＭＩを使用して気
管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行う。
【０３２８】
滅菌カニューレを気管に挿入し、縫合糸で所定の位置に連結する。２ｍｌシリンジを使
用して、１ｍｌの洗浄緩衝液で４回肺を洗浄して、全部で約３ｍｌの洗浄液を得る。次い
で、ＢＡＬ液を、室温にて５分間、２５０ｇで遠心分離して、肺胞マクロファージをペレ
ット化する。細胞を、１ｍｌのＰＢＳへの再懸濁によって洗浄し、ベンチトップ遠心分離
機での１０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって再度ペレット化する。次いで、細胞を
再懸濁し、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムと１０分間インキュベー
トする。次いで、サンプルを、ＦＡＣＳフローサイトメトリーによって染色について分析
する。
【０３２９】
〈肺胞マクロファージのサイトスピン調製物〉
０．２５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳを使用した気管支肺胞洗浄および２５０ｇでの遠
心分離によって単離した肺胞マクロファージを、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁する。標準的な
手順を使用したマラカイトグリーンまたはクリスタルバイオレットでの染色、およびサイ
トスピンスライドの調製後に、血球計による全細胞の計数のためにアリコートを採取する
。Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＭｃＧａｗ  Ｐａｒ
ｋ，ＩＬ）での染色後のサイトスピン調製物による細胞数の相違により、この方法で単離
された細胞の９８％が肺胞マクロファージであることが確認される。
【０３３０】
〈マウス肺胞マクロファージのインビトロ標識〉
野生型およびノックアウトマウスのＢＡＬから単離した肺胞マクロファージを、蛍光グ
リーンおよびオレンジ細胞追跡色素でインビトロ標識する。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（
商標）Ｏｒａｎｇｅは、ＣＭＴＭＲ（５−（および６−）−（（（４−クロロメチル）ベ
ンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン）混合異性体およびＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅ
ｒ（商標）からなる。
【０３３１】
ＣＭＦＤＡ（５−クロロメチルフルオレセイン二酢酸）からなるＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）は、穏やかなチオール反応性
クロロメチル基を含む。一旦細胞内に入ると、クロロメチル基が細胞内チオールと反応し
、プローブが細胞不透過性蛍光色素のエーテル付加物に変換される。過剰な非抱合試薬は
、細胞外培地に受動拡散する。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅは、蛍光性を示
すエステラーゼ活性を必要とせず、細胞内エステラーゼが切断されるまでｃｅｌｌ  ｔｒ
ａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎは無色である。
【０３３２】
〈気管支肺胞洗浄液の総リン脂質およびタンパク質の測定〉
各実験で示された測定点で、各治療群の４〜６匹のマウスを、二酸化炭素での窒息によ
って屠殺し、０．２５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳでの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行っ
た。１ｍｌで肺を４回洗浄して、全部で約３ｍｌの洗浄液を得る。ＢＡＬ液を、室温にて
５分間、２５０ｇで遠心分離する。無細胞上清中の総タンパク質濃度を、基質としてビシ
ンコニン酸を使用して測定する。無細胞ＢＡＬ液を、クロロホルム−メタノールに抽出し
、リン濃度から総リン脂質を測定した。
【０３３３】
〈マウスＢＡＬ液のｒＳＰ−Ｄレベル〉
ｒＳＰ−Ｄ処置マウス由来の無細胞ＢＡＬＦの連続希釈物を、組換えヒトＳＰ−Ｄに対
して生じたビオチン化および非ビオチン化単一特異性ポリクローナル抗体を使用した標準
的なサンドイッチＥＬＩＳＡ法によってｒＳＰ−Ｄ含有量について分析する。この抗体は
、マウスＳＰ−ＡやマウスＳＰ−Ｄと交差反応性を示さなかった。組換えヒトＳＰ−Ｄを
使用した検量線を使用して、投与後の特定の測定点で回収された肺胞ｒＳＰ−Ｄの絶対量
を計算する。
【０３３４】
〈アポトーシス細胞および壊死細胞のフローサイトメトリーおよび検出〉
ＲＰＭＩでＳＰ−Ｄ欠損マウスのＢＡＬから単離した細胞を、ＰＢＳに再懸濁し、サイ
ズおよび粒度によってマクロファージ集団をキャラクタライズするために、Ｃｏｎｓｏｒ
ｔ３２ＦＡＣｓシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍ
ｅｔｒｙ）で分析する。明らかに血液染色された細胞集団を破棄する。アポトーシス細胞
および壊死細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＬＵＯＳ染色キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したアネキシンＶおよびヨ
ウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって検出する。アポトーシス細胞および壊死細胞を、
通常は細胞内細胞膜の小葉状部分から外型の小葉状部分に存在するホスファチジルセリン
（ＰＳ）に曝露し、アネキシンＶが細胞表面でＰＳに結合する（Ｖｅｒｍｅｓ，Ｉ．，Ｈ
ａａｎｅｎ，Ｃ．，Ｓｔｅｆｆｅｎｓ−Ｎａｋｋｅｎ，Ｈ．＆Ｒｅｕｔｅｌｉｎｇｓｐｅ
ｒｇｅｒ，Ｃ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４，３９〜５１
）。細胞アリコートを、蛍光標識アネキシンＶで染色し、ＰＩで対比染色して、一次また
は二次壊死細胞を検出する。同時標識実験では、蛍光シグナルの重複についての補正後に
ＰＩまたはＰＥ標識アネキシンＶ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
で染色した細胞へのＦＩＴＣ標識ｒＳＰ−Ｄの結合も評価する。
【０３３５】
〈データ分析〉
結果を、平均±平均の標準誤差（ｘ±ＳＥ）として示す。不平等な分散（unequal vari
ance）を推測する両側ｔ検定を使用して、各測定点での動物群間の比較を行う。Ｐ＜０．
０５で有意と見なす。
【実施例２】
【０３３６】
［アスペルギルス・フミガーツスに対するアレルギー性過敏症のマウスモデルにおけるア
レルギー性過敏症の調整］
大腸菌で発現および精製され、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）と呼ばれるネックおよびＣＲＤ
ドメインの三量体から構成されるヒトＳＰ−Ｄの短縮形態は、マウスにおけるアレルギー
性過敏反応のモジュレーターとして機能的に活性である。本研究では、好酸球増多症、血
清ＩｇＥおよびＩｇＧ１の調整を、Ｃ５７ＢＬ／６で再現し、効果はＢＡＬＢ／ｃマウス
に固有でないことを証明した。
【０３３７】
本研究で測定したパラメータは、アスペルギルス・フミガーツスアレルゲンに対するア
レルギーのマウスモデル全てで有意に増加し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での鼻腔内処置に
よって全て有意に減少する血清ＩｇＥおよびＩｇＧ１ならびに末梢血好酸球増多症である
。
【０３３８】
任意の特定の理論に拘束されることを意図するわけではないが、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ
）は、Ｔｈ２からＴｈ１へのＴリンパ球集団の変化を促進すると提案する。これにより、
アレルギーの主な構成要素である血清ＩｇＥおよび好酸球増多症の減少が認められる。
【０３３９】
〈ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の調製〉
コラーゲンストーク（８−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）の短領域および成熟タンパク質配列の代表
的な残基１７９〜３５５を含むネック／ＣＲＤのｃＤＮＡを、ヒト肺ライブラリーＤＮＡ
からクローン化し、ｐＥＴ−２１ｄベクター（Novagen, Nottingham)に挿入する。プラス
ミドをＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、１つのコロニーを選択し、再プレ
ーティングして１００〜４００コロニー／プレートを得る。これらを掻き取り、これを使
用して１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補足
した５００ｍｌのＬＢ培地を含む震盪フラスコに接種し、０．６〜０．８のＯＤ６００ま
で成長させ、その後０．４ｍＭのＩＰＴＧで２〜３時間誘導する。細胞を遠心分離によっ
て回収し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０
．１％ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍＭのＰＭＳＦ（ｐＨ７．５）に溶解し、
３分間超音波処理を行う。不溶性封入体中でｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）が発現し、遠心分離
で回収し、１００００×ｇで４回洗浄した。ペレットを、１００ｍｌの８Ｍ尿素、１００
ｍＭの２−メルカプトエタノール（ｐＨ７．５）に溶解し、遠心分離によって明澄化し、
１０Ｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2（Ｔ
ＢＣ）に対する一晩の透析によって再折りたたみを行う。再折りたたみされたｒＳＰＤ（
ｎ／ＣＲＤ）を、マルトース−アガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、
ＵＫ）への吸着によって変性ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）から分離し、夾雑物を除去するため
の１ＭのＮａＣｌを含むＴＣＢでの第１のカラム洗浄後に５ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌで溶離する。最終精製は、２０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化
ナトリウム（ｐＨ７．４）（ＴＳＥ）の溶離緩衝液でのゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓ
ｅ１２、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＫ）による。分子量６０ｋＤａに対
応する単一のピークとしてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）が溶離された。精製ｒＳＰＤ（ｎ／Ｃ
ＲＤ）の１０ｍｌ  ＰｏｌｙｍｉｘｉｎＢカラム（Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ、Ｐｉｅｒｃｅ
＆Ｗａｒｒｉｎｅｒ、ＵＫ）への通過によって内毒素レベルが減少し、５ｐｇ／μｇ未満
のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を含む調製物のみを使用する。
【０３４０】
〈アスペルギルス・フミガーツス抗原（Ａｆｕ  １ｗｃｆ）〉
アスペルギルス・フミガーツス（Ａｆｕ）を、合成培地（Ｍ１９９，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）にて静置培養として３７℃で１週間成長させる。Ａｒｒｕｎｄａら（Ａ
ｒｒｕｄａ，Ｌ．Ｋ．，Ｍａｎｎ，ＢＪ，Ｃｈａｐｍａｎ  Ｍ．Ｄ．，「アスペルギルス
・フミガーツスにおける主要なアレルゲンおよび細胞毒素（Ａｓｆ  ｆＩ）の選択的発現
：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ関連疾患の免疫病原性の影響」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９
２，１４９，３３５４〜９）は、Ａｓｐ  ｆ１（主要なアレルゲン）の発現は１週間後が
最大であり、それより長いインキュベーションで減少する傾向があることを証明している
。１週間培養物を、４℃で１２時間の０．１％（ｗ／ｖ）チメロサールの添加によって死
滅させる。培養物をガラスウールで濾過し、最終的に０．４５μｍのメンブレンで濾過し
て、全ての微粒子および胞子を除去し、その後、３回緩衝液を交換しながら水に対して透
析した。透析物を凍結乾燥して褐色粉末を得た。１ｗｃｆのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１Ｂ）
によってＡｓｐ  ｆ１に対応する１８ｋＤａの主バンドが明らかとなった。Ａｓｐ  ｆ２
に対応するバンド（３７ｋＤａ）も明白である。１８ｋＤａのバンドのＮ末端配列決定を
行って、Ａｓｐ  ｆ１のＮ末端に対応する配列ＡＴＷＴＣＩＮＱＱＬＮＰを得た。１週間
培養物の濾過物（１ｗｃｆ）は、国立生物学的製剤研究所から入手したＡｆｕアレルギー
患者由来のヒト血清によって認識されることもＥＬＩＳＡによって証明された。
【０３４１】
〈感作〉
本研究では、６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によってミ
ョウバンと混合した２００μｇ  Ａｆｕ  １ｗｃｆ（１：４ｖ／ｖ）を含む１００μｌＰ
ＢＳで１週間に１回を４週間感作する。
【０３４２】
〈アレルゲンでの攻撃誘発および処置〉
感作マウスを、１０μｇのＡｆｕ  １ｗｃｆを含む５０μｌにて鼻腔内（ｉ．ｎ．）に
攻撃誘発する。これの後に、ＰＢＳまたは１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を含む５０
μｌのＰＢＳでｉ．ｎ．で処置する。結果に記載のように、攻撃誘発および処置を毎日行
う。いくつかの実験では、全長組換えヒトＳＰ−Ａのコントロールタンパク質（Ｂｙｋ  
Ｇｕｌｄｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌより贈与）を、１０μｇ／５０μｌの濃度
で使用する。個別の実験では、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の運命を、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ
）を含む５０μｌのＰＢＳでの鼻腔内適用後の種々の時間での異なるマウスからのＢＡＬ
の獲得およびマウスＳＰ−ＤまたはＳＰ−Ａを認識しないｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）に対し
て生じたポリクローナル抗体を使用したｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）のアッセイによってモニ
ターする。これらの結果は、投与から３０分後に採取したＢＡＬにおいてはｒＳＰＤ（ｎ
／ＣＲＤ）の少なくとも５０％を占め得るが、２４時間後では測定することができないこ
とを示す。
【０３４３】
〈末梢血好酸球〉
好酸球の評価のために、マウス（ｎ＝４〜６／群）の尾静脈から採血する。自動細胞計
数器で総白血球数を測定し、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色血液塗抹標本
の分画によって好酸球の比率を測定する。結果を、１０6細胞／ｍｌで示す。
【０３４４】
〈血清ＩｇＥおよびＡｆｕ特異的ＩｇＧ１〉
マウスＩｇＥの検量線に関して線形である値を得るために最大で２０倍に希釈した連続
希釈血液におけるサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｃｏｗｌｅｙ
、ＵＫ）によって総血清ＩｇＥを測定する。結果を、μｇ／ｍｌで示す。Ａｆｕ特異的Ｉ
ｇＧ１を、Ａｆｕアレルゲン抽出物で被覆した９６ウェルプレートを使用したＥＬＩＳＡ
によって測定する。抗体を、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ１で検出する。結果を、相対吸収
単位（ＯＤ４５０）として示す。
【０３４５】
〈肺内の内因性マウスＳＰ−ＤおよびＳＰ−Ａ〉
ＣＯ2窒息による無痛屠殺の直後に、３×１ｍｌ  ＰＢＳを使用して、気管支肺胞洗浄
を行い、これをプールし、全サンプルについてＰＢＳの添加によって体積を４ｍｌに調整
し、遠心分離して細胞を除去する。組換えマウスＳＰ−ＤおよびＳＰ−Ａに対して生じた
ポリクローナル抗体（Ｐ．Ｌａｗｓｏｎ博士から提供）を使用したＥＬＩＳＡによってＳ
Ｐ−ＤおよびＳＰ−Ａを測定する。これらの抗体は、ヒトＳＰ−ＤまたはＳＰ−Ａとの交
差反応性を示さず、それぞれマウスＳＰ−ＤまたはＳＰ−Ａに特異的である。結果を、μ
ｇ／ｍｌＢＡＬで示す。
【０３４６】
〈細胞内サイトカイン染色〉
処置後、マウスをＣＯ2窒息によって無痛屠殺し、その脾臓を取り出し、ＰＢＳ中でホ
モジナイズする。ホモジネートを濾過し、赤血球を塩化アンモニウム溶解試薬（ＢＤ  Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で溶解し、４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで２０分間固定す
る。細胞を、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む３％（ｖ／ｖ）熱変性ウシ胎児
血清を補足したＰＢＳ（ＦＳＢ）で洗浄し、１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含むＦＳＢに再
懸濁し、−８０℃で保存する。細胞を、Ｃｙｔｏｐｅｒｍ洗浄緩衝液（ＣＰＢ、ＢＤ  Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｗｌｅｙ、ＵＫ）にて４℃で１５分間浸透させ、１０6細胞
のアリコートを、５０μｇ／ｍｌラットＩｇＧを補足したＣＰＢとの４℃で３０分間のイ
ンキュベーションによってブロックする。細胞内サイトカインを、４℃で６０分間インキ
ュベートした１μｇ  ＰＥ抱合抗マウスサイトカインモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色する。細胞をＣＰＢで洗浄後、ＦＳＢで洗浄し、５００ｍｌの
ＦＳＢに再懸濁する。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用したＦＡＣＳｃａｎフロー
サイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、フローサイトメトリーを行う。２００００個の細胞
についてデータを収集する。脾臓細胞の平均ＦＳＣは、全ての場合で１００である。染色
細胞（ＦＳＣ＞１００、ＦＬ２＞１００）がゲーティングし、これらの細胞染色強度比（
ＰＥ＞１０００）を計算する。結果を、ラットＩｇＧ（％ＰＥ＞１０００）と共にインキ
ュベートした非染色細胞のバックグラウンド蛍光の差し引き後に強力に染色された細胞の
％として示す。
【０３４７】
〈肺組織学〉
処置直後、各治療群由来の２〜４匹の肺を、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝化ホルマリンで
固定し、個別の分析に供する。肺を、パラフィンに包埋し、区分化し、ヘマトキシリンお
よびエオシンで染色する。気管支周囲の炎症についてスライドを評価し、それぞれ正常か
ら重症までのスコアに対応する０〜４のスケールで割り当てる（Ｓｕｒ．Ｓ，Ｗｉｌｄ  
ＪＳ，Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ＢＫら、「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドによるマウス
喘息モデルのアレルギー性肺炎の長期予防」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１６２
，６２８４〜９３）。
【０３４８】
〈全身プレチスモグラフィ〉
この研究では、気道過敏症を、４つのチャンバーシステム（Ｂｕｘｃｏ、Ｓｈａｒｏｎ
、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を備えた非制御（ｕｎｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ）全身プレチス
モグラフ法（Ｈａｍｅｌｍａｎｎ  Ｅ．，Ｓｃｈｗａｒｚｅ  Ｊ．，Ｔａｋｅｄａ  Ｋ．
ら、「気圧プレチスモグラフィを使用したアレルギーマウスの気道反応の非侵襲性測定」
、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１９９７，１５６，７６６
〜７５）を使用して測定する。最初に、マウスを鼻腔内抗原で攻撃誘発し、２時間で回収
し、その後チャンバーに置き、その呼吸を１０分間モニターする。順応した時点で、その
ベースライン反応を５分間測定する。次いで、マウスにエアゾール化したＰＢＳに１分間
供し、その後メタコリンの用量を漸増させる（５、１０、２０、３０、４０ｍｇ／ｍｌ、
ＰＢＳ）。それぞれの場合においてベースラインＰｅｎｈに戻らせる短い間隔で反応を５
分間記録する。
【０３４９】
各群は、４〜８匹のマウスを含んでいた。結果を、メタコリンの攻撃誘発後のベースラ
インを超えるＰｅｎｈの平均上昇％として示す。
【０３５０】
〈統計〉
結果は、４〜８匹マウス／群の平均であり、エラーバーは、±ＳＥＭである。スチュー
デント両側ｔ検定によって有意性を決定する。Ｐ＜０．０５で有意ととみなす。
【０３５１】
［実施例２の結果］
組換えＳＰ−Ｄでの感作マウスの処置の結果を、図２、３、４、および５に示す。
【０３５２】
血清ＩｇＥ、Ａｆｕ特異的ＩｇＧ、および末梢血好酸球増多症は、異なる遺伝的背景で
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）によって軽減される。
【０３５３】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置が異なる遺伝的背景で有効であるかを決定するために
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＡＢＰＡモデルを確立し、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）がアレ
ルゲン攻撃誘発時にアレルギー性過敏症を調整することができるかを決定するために、感
作マウスを最初に１０μｇのＡｆｕ  １ｗｃｆで攻撃誘発し、１時間後に処置する。アレ
ルゲン攻撃誘発マウスへの１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での５日間の鼻腔内処置後
に３日間測定した血清ＩｇＥは有意に減少し（Ｐ＜０．００１）、この減少は、１週間後
に１０μｇのＡｆｕ  １ｗｃｆを３日間毎日投与する再攻撃誘発後に維持される（図２Ａ
）。アレルゲン攻撃誘発マウスの処置および１週間後のアレルゲンのみでの再攻撃誘発後
に（図３）Ａｆｕ特異的ＩｇＧ１（図２Ｂ）および末梢血好酸球増多症でも類似の有意な
減少が測定された。
【０３５４】
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置により、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γが上昇し、ＩＬ
−４が低下する
【０３５５】
ＩｇＥおよび末梢血好酸球増多症の減少により、サイトカインレベルの全身性調整が示
唆され、これらのサイトカインを細胞内染色によって測定する。アレルゲン攻撃誘発マウ
スへの１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での２日間の鼻腔内投与から１日後に脾臓中で
測定されたＩＬ−１２（図４Ａ）は、ＩＦＮ−γ（図４Ｂ）のように有意に減少する（Ｐ
＜０．０５）。ＩＬ−４の測定は、非感作マウスで測定されたレベルまでの減少を示した
（図４Ｃ）。ｒｈＳＰ−Ａ（組換えヒトサーファクタントタンパク質Ａ、ＳＰ−Ａ）での
同一の処置では、これらの効果は認められなかった。
【０３５６】
〈ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置により、気道過敏症が緩和する〉
アレルゲン攻撃誘発から１〜２時間後に１０μｇのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）で４日間毎
日処置したマウスは、試験した全てのメタコリン用量での処置（７日目）の完了後の３日
間のアレルゲンでの再攻撃誘発に対して気道過敏症の有意な軽減（Ｐ＜０．０５）を示し
た（図５Ａ）。同一の方法で１０μｇのｒｈＳＰ−Ａ（組換えヒトサーファクタントタン
パク質Ａ）で処置したマウスでは、ＡＨＲの有意な軽減は認められなかった（図５Ｂ）。
【０３５７】
〈ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置により肺炎が軽減する〉
本研究での感作マウスのうち、６匹のＰＢＳ処置マウスのうちの４匹のスコアは２＋で
あり、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）処置群の５匹のうち４匹のスコアが１であった。非感作マ
ウスのスコアは０である。肺切片は、肺への細胞侵襲の軽減を示す（図６）。
【０３５８】
〈内因性マウスＳＰ−ＤおよびＳＰ−４〉
アレルギーマウスのＢＡＬ中で測定されたＳＰ−Ｄの内因性レベルは、正常なマウス由
来のＢＡＬ中の０．２５±０．０１５μｇ／ｍｌから１．４±０．１５μｇ／ｍｌまでの
レベルに６倍上昇し、正常な感作および処置されたマウスＢＡＬで１．３±０．１μｇ／
ｍｌの測定された内因性ＳＰ−Ａレベルについての相違は認められない。１０μｇのｒＳ
ＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での５日間の毎日の処置では、内因性ＳＰ−ＤまたはＳＰ−Ａレベル
においていかなる変化も認められなかった。
【実施例３】
【０３５９】
［マウスアレルギー性過敏症モデルにおけるイエダニ（ヤケヒョウヒダニ）に対するアレ
ルギー性過敏症の調整］
〈Ｄｅｒｐ／ＩＬ−２／肺〉
図７Ａは、ｒＳＰＤ（Ｎ／ＣＲＤ）での鼻腔内処置により、Ｄｅｒ  ｐアレルギーマウ
スの肺におけるアレルゲン攻撃誘発に対するＩＬ−１２の応答が増強されることを示す。
【０３６０】
細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＬ−１２陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ
＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感
作マウスの肺ホモジネート中のＩＬ−１２の分析。ＰＢＳとは、ＰＢＳで処置した非感作
マウスである。ＨＰとは、ＰＢＳで処置した感作マウスである。ＨＲとは、１０μｇのｒ
ＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウスである。感作マウスを、最初に、５０ＡＵ
のＤｅｒ  ｐアレルゲン抽出物で鼻腔内に攻撃誘発した。処置は、攻撃誘発直後に投与し
た１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の鼻腔内点滴注入による。４日間連続して攻撃誘
発および処置を繰り返した。処置の４日後にマウスをＤｅｒ  ｐのみで再攻撃誘発し、翌
日に屠殺した。
【０３６１】
〈Ｄｅｒｐ／ＩＬ−２／脾臓〉
図７Ｂは、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での鼻腔内処置によりＤｅｒ  ｐアレルギーマウ
スの脾臓におけるアレルゲン攻撃誘発に対するＩＬ−１２の応答が増強されることの証拠
を示す。
【０３６２】
細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＬ−１２陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ
＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感
作マウスの脾臓ホモジネート中のＩＬ−１２の分析。ＰＢＳは、ＰＢＳで処置した非感作
マウスである。ＨＰは、ＰＢＳで処置した感作マウスである。ＨＲとは、１０μｇのｒＳ
Ｐ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウス。ＨＢ＝１０μｇのＢＳＡで処置した感作マ
ウスである。感作マウスを、最初に、５０ＡＵのＤｅｒ  ｐアレルゲン抽出物で鼻腔内に
攻撃誘発した。処置は、攻撃誘発直後に投与した１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の
鼻腔内点滴注入による。４日間連続して攻撃誘発および処置を繰り返した。処置の４日後
にマウスをＤｅｒ  ｐのみで再攻撃誘発し、翌日に屠殺した。（ｎ＝４〜８／群。１．７
倍上昇）。
【０３６３】
〈Ｄｅｒｐ／ＩＮＦ−α／脾臓〉
図７Ｃは、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での鼻腔内処置によりＤｅｒ  ｐアレルギーマウ
スの脾臓におけるアレルゲン攻撃誘発に対するＩＦＮ−γの応答が増強されることの証拠
を示す。
【０３６４】
細胞内サイトカイン染色およびその後のＩＦＮ−γ陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ
＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感
作マウスの脾臓ホモジネート中のＩＦＮ−γの分析。ＰＢＳとは、ＰＢＳで処置した非感
作マウスである。ＨＰとは、ＰＢＳで処置した感作マウスである。ＨＲとは、１０μｇの
ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウスである。感作マウスを、最初に、５０Ａ
ＵのＤｅｒ  ｐアレルゲン抽出物で鼻腔内に攻撃誘発した。処置は、攻撃誘発直後に投与
した１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の鼻腔内点滴注入による。４日間連続して攻撃
誘発および処置を繰り返した。処置の４日後にマウスをＤｅｒ  ｐのみで再攻撃誘発し、
翌日に屠殺した。（ｎ＝４〜８／群。Ｐ＜０．０５。２．７倍上昇）。
【０３６５】
〈Ｄｅｒｐ／ＴＮＦ−α／脾臓〉
図７Ｄは、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での鼻腔内処置によりＤｅｒ  ｐアレルギーマウ
スの脾臓におけるアレルゲン攻撃誘発に対するＴＦＮ−αの応答が増強されることの証拠
を示す。
【０３６６】
細胞内サイトカイン染色およびその後のＴＦＮ−α陽性の高度に染色された細胞（ＰＥ
＞１０００）の割合についてのＦＡＣＳ分析によって測定された、処置後のＤｅｒ  ｐ感
作マウスの脾臓ホモジネート中のＴＦＮ−αの分析。ＰＢＳとは、ＰＢＳで処置した非感
作マウスである。ＨＰとは、ＰＢＳで処置した感作マウスである。ＨＲとは、１０μｇの
ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）で処置した感作マウスである。感作マウスを、最初に、５０Ａ
ＵのＤｅｒ  ｐアレルゲン抽出物で鼻腔内に攻撃誘発した。処置は、攻撃誘発直後に投与
した１０μｇのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）の鼻腔内点滴注入による。４日間連続して攻撃
誘発および処置を繰り返した。処置の４日後にマウスをＤｅｒ  ｐのみで再攻撃誘発し、
翌日に屠殺した。（ｎ＝４〜８／群。１．５倍上昇）。
【実施例４】
【０３６７】
［マウスアレルギー性過敏症モデルにおけるイエダニ（ヤケヒョウヒダニ）に対する気道
過敏症に対するｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での治療効果］
アレルギー性喘息は、気道過敏症（ＡＨＲ）期間によって特徴付けられる。ＡＨＲは、
呼気時間の延長を含む呼吸パターンが変化することが公知である。この変化を、呼気停止
の増大の測定によって定量することができる（Ｐｅｎｈ）。
【０３６８】
この研究では、気道過敏症を、４つのチャンバーシステム（Ｂｕｘｃｏ、Ｓｈａｒｏｎ
、ＣＴ、ＵＳＡ）を備えた非制御全身プレチスモグラフ法を使用して測定する。ＣＯ2の
蓄積を防止するために、上記システムによって、一定の空気のバイアス流れを生じさせる
。マウスチャンバー中でマウスが呼吸するにつれて、トランスデューサによって圧力変動
を測定し、基準チャンバーと比較する。これらの変動は、呼吸周期の間の胸郭体積の変化
によって生じる。気管支収縮により、圧力可動域の形状の相違が生じ、呼気中に最も明ら
かである。これらの形状の変化を、呼気の困難さを示し、喘息における呼吸に特徴的であ
る休止増強（enhanced pause）アルゴリズム（Ｐｅｎｈ）によって定量することができる
。
【数１】
2010090134.tif 000009
（Ｔｅは、呼気時間であり、Ｔｒは弛緩時間であり、ＰＥＰはピーク呼気圧であり、ＰＩ
Ｐはピーク吸息圧である）
【０３６９】
ＡＨＲは、インサイチューでのマウスの噴霧メタコリンへの曝露によって誘発される。
メタコリン（アセチル−β−メチルコリンクロリド）は、神経伝達物質アセチルコリンの
代謝的に安定な類似体であり、平滑筋を収縮させて気管支収縮を誘発する。喘息マウスの
誘発されたＡＨＲを、正常なマウスと比較したＰｅｎｈの増加によって測定する。
【０３７０】
〈方法〉
感作。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ミョウバンを含む標準化Ｄｅｒ  ｐ抽出物（Ｇｒｅ
ｅｒ  Ｌａｂｓ．，ＵＳＡ）の４週間毎のｉ．ｐ．注射によって感作する。
【０３７１】
気道炎症の誘導および治療。感作マウスに、４日間連続して先にＰＢＳまたは１０μｇ
のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）をｉ．ｎ．投与し、その後、５０アレルギー単位のＤｅｒ  ｐ
抽出物を含むＰＢＳを鼻腔内投与する（連続的同時投与という）。動物を少なくとも３０
分間回復させ、その後、第２のｉ．ｎ．投与を行う。
【０３７２】
全身プレチスモグラフィ。マウスを４つのチャンバーに入れ、その呼吸を１０分間モニ
ターする。順応後、そのベースライン反応を、５分間測定する。次に、マウスにＰＢＳを
１分間噴霧し、その後メタコリン用量を段階的に増加させる。ベースラインに回復するま
で短期間の間隔をおいてそれぞれの場合の応答を５分間記録する。
【０３７３】
統計。各群は、４〜８匹のマウスを含む。Ｐｅｎｈを、各群のマウスのベースライン値
に対する増大％として示す。エラーバーは、±ＳＥＭである。両側ｔ検定によって有意性
を決定する。
【０３７４】
［実施例４の結果］
ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置により、処置終了時の全身プレチスモグラフィにおけ
るＰｅｎｈ応答によって測定したところ、ＡＨＲが有意に減少する（ｐ＜０．００１）（
図８Ａ；２０ｍｇ／ｍｌメタコリン）。図８Ｂに示すように、治療から４日後にアレルゲ
ンでマウスを再攻撃誘発した場合に、この有意な減少が維持された（ｐ＜０．００２）。
【０３７５】
マウスイエダニアレルギーモデルに対するこの研究は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の鼻腔
内投与により、喘息の主な特徴である気道過敏症が有意に軽減することをはじめて示す。
これは、アレルギー性喘息を含む呼吸器アレルギー性過敏反応の症状の治療でのｒＳＰＤ
（ｎ／ＣＲＤ）の有用性の証拠を提供する。
【０３７６】
Ｄｅｒ  ｐアレルゲンとの連続的同時投与時のその有効性によって証明されるように、
持続的なアレルゲンの曝露においてさえもｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）はＡＨＲを軽減するこ
とができることは有意である。これは、季節性アレルギーの被験体またはイエダニアレル
ギーの主な問題である空気アレルゲンに常に曝露された被験体が遭遇する条件を反映する
。
【０３７７】
最も顕著な所見は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置は、アレルゲンのみでの再攻撃誘
発に対するＡＨＲの有意な軽減によって示されるように、基礎となる機構に対して長期間
有効であることである。したがって、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）での処置により、アレルギ
ーおよびアレルギー性喘息患者のための有効な脱感作ストラテジーが得られる。
【実施例５】
【０３７８】
［ノックアウトマウスに対する組換えＳＰ−Ｄの効果］
以下の３つの実施例は、組換えヒトＳＰ−Ｄを使用してＳＰ−Ｄノックアウトマウスの
ＳＰ−Ｄ機能が置換されるのを記載する。
【０３７９】
ＳＰ−Ｄを発現しないＳＰ−Ｄノックアウトマウスは、マクロファージ数が増加し、そ
の多くの外観が異常である。肺胞空隙中に過剰なサーファクタントリン脂質が存在し、Ｓ
Ｐ−Ｄの非存在下で慢性的な低レベルの炎症過程を示す。これらのマウスは、肺損傷、線
維症、および気腫を発症し、ＳＰ−Ｄ欠損による肺損傷および肺炎モデルが得られる（そ
れぞれ先天性および後天性ＳＰ−Ｄ欠損症の患者群である早産児および喫煙者で認められ
る）。この炎症過程に対する組換え発現短縮フラグメント（ヒトｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ
））での治療効果を、ＳＰ−Ｄノックアウトマウスで評価する。
【０３８０】
Ｂｏｔａｓ，Ｃ．ら、「サーファクタントタンパク質Ｄ欠損マウスにおけるサーファク
タントホメオスタシスおよびＩＩ型肺胞細胞の形態学の変化」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５（２０），１１８６９〜７４に記載のように、
ＳＰ−Ｄノックアウトマウスを作製する。上記のように組換えヒトＳＰ−Ｄを作製する。
【０３８１】
組換えＳＰ−ＤまたはＢＳＡコントロールを、６週齢のマウスに鼻腔内投与する。動物
が１２週齢になるまで、６週間にわたり３０μｇを全部で７回投与する。処置３週間後に
４匹のマウスを屠殺し、肺胞マクロファージ数およびリン脂質の評価のために気管支肺胞
を洗浄した。記載の実験を、３回繰り返した。
【０３８２】
これらの実験は、炎症性肺疾患の有効な治療としてｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）を使用する
ことができることを証明する。
【実施例６】
【０３８３】
［肺胞マクロファージ数によってアッセイした、ノックアウトマウスに対する組換えＳＰ
−Ｄの効果］
マラカイトグリーンまたはクリスタルバイオレットで染色したマクロファージ数を血球
計で計数し、マクロファージの形態学をサイトスピン後に評価する。
【０３８４】
図９は、非処置マウスで計数された肺胞マクロファージ数を示し、６週間で細胞数は野
生型マウスの約３倍であり、９週間および１２週間では野生型のほぼ４倍であることを証
明する。非処置マウスでマクロファージ数は維持され、１６週での洗浄液から採取した細
胞数に匹敵する。しかし、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での処置後、ＳＰ−Ｄノックアウト
ＢＡＬ中の肺胞マクロファージ数は、約５０％減少する（匹敵する年齢の野生型マウスで
認められる数の約２倍のレベル）。図９はまた、ＳＰ−Ｄ欠損マウスの肺胞マクロファー
ジ数が１５週齢の野生型マウスと比較して増加することを示す。
【０３８５】
ＢＡＬ液から単離した肺胞マクロファージ数に対するｒＳＰ−Ｄでの処理効果を示す。
ｒｈＳＰ−Ａ、ＢＳＡ、またはＰＢＳでの処置と対照的に、マクロファージ数は、９、１
２、および１５週齢のｒＳＰ−Ｄ処置ＳＰ−Ｄ欠損マウスで有意に減少する。ｒＳＰ−Ｄ
処置動物におけるマクロファージ数は、全年齢の野生型マウスよりも高いままである。
【０３８６】
図１０Ａは、気管支肺胞洗浄における細胞のサイトスピンを示す。細胞を、マラカイト
グリーン（上のパネル）またはクリスタルバイオレット（下のパネル）で染色する。非処
置またはＢＳＡ処置マウスと比較してｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）処置マウスで肺胞マクロ
ファージ数はより少なく、より多数が正常な外観を有し、高倍率で非常に少数の拡大した
泡状のマクロファージが認められることが明らかである。
【０３８７】
図１０Ｂは、気管支肺胞洗浄における細胞のサイトスピンを示す。ＳＰ−Ｄ欠損マウス
由来の細胞は、巨大で、泡状で、しばしば多核である。ＢＳＡまたはＳＰ−Ａ処置マウス
と対照的に、ｒＳＰ−Ｄ処置マウス由来の肺胞マクロファージは、より多数の外観正常で
あり、巨大化した泡状の細胞はより少ない。この効果を、前記および側方散乱フローサイ
トメトリーによって定量する。
【実施例７】
【０３８８】
［サーファクタントリン脂質分析によってアッセイした、ノックアウトマウスに対する組
換えＳＰ−Ｄの効果］
ＢＡＬからリン脂質を抽出し、Ｂａｒｔｌｅｔｔリンアッセイ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｇ
．Ｒ．，「カラムクロマトグラフィでのリンアッセイ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１
９５９、２３４、４６６〜４６８）によってリン脂質を定量した。
【０３８９】
結果を図１１に示す。９週齢に達した治療３週間後のマウスで検出可能なリン脂質の相
違は認められず、処置６週間後の洗浄液中の回収可能なリン脂質の量は非常に減少する。
【０３９０】
無細胞ＢＡＬ中の総リン脂質およびタンパク質測定に関するさらなる結果を、図１１Ｂ
に示す。６週齢のＳＰ−Ｄ欠損マウスでＢＡＬリン脂質レベルの顕著な増加が認められる
。未処理の６週齢のマウスと比較して、４週齢マウス由来の２週間のｒＳＰ−Ｄ処理を受
けたマウスでリン脂質レベルの相違は認められない。
【０３９１】
６週齢から３週間または６週間処置する肺胞マクロファージ数実験（図９）で使用した
同一のマウスも、無細胞ＢＡＬリン脂質についてアッセイする。非処置の９週齢コントロ
ールと比較して、処置３週間後（屠殺年齢は９週齢）でＢＡＬリン脂質に相違は認められ
ない。しかし、６週間処置したマウス（アッセイ年齢１２週齢で屠殺）は、非処理の１２
週齢コントロールと比較して過剰なリン脂質の減少（５０％）を示す（Ｐ＜０．０５）。
いかなる年齢においても洗浄液の総タンパク質レベルに対して有意な処置効果は認められ
ない。
【０３９２】
図１７に示すように、ＳＰ−Ｄ欠損マウスにおける血漿コレステロールレベルを決定す
る。この図は、野生型マウスとＳＰ−Ｄ欠損マウスとの間で血漿コレステロール（ｍＭ）
を比較する。仮定した相違を０とする両側検定を行った。平均差は、０．９８８であり、
ＤＦは８であり、Ｔ値は−２．８８５であり、Ｐ値は０．０２０４である。
【実施例８】
【０３９３】
［ケモカインレベルによってアッセイした、ノックアウトマウスに対する組換えＳＰ−Ｄ
の効果］
肺胞マクロファージ数減少の所見を説明することができる機構を評価するために、ｒＳ
Ｐ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）処置ノックアウトマウス肺および非処置コントロールから総ＲＮＡ
を単離し、走化性因子数についてのｍＲＮＡレベルを、製造者の説明書に従ってＰｈａｒ
ｍｉｎｏｇｅｎから入手したｍＣＫ−５マルチプローブテンプレートを使用したリボヌク
レアーゼ保護アッセイによってアッセイした。総肺ＲＮＡについてリボヌクレアーゼ保護
アッセイを行う。
【０３９４】
Ｌ３２およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡシグナルを使用して総肺ＲＮＡの等しい負荷をチェ
ックするために、結果をサンプルに合わせて標準化する。各群あたり３匹のマウスを使用
して、各サンプルを２つの濃度で２回負荷する。
【０３９５】
結果を図１２に示す。ＳＰ−Ｄノックアウトマウスと野生型マウスとの間でベースライ
ンｍＲＮＡレベルの有意な相違が存在することが認められる。詳細には、エオタキシンレ
ベル（特異的な好酸球走化性因子）は、野生型と比較してノックアウトマウスで１００％
増加する。さらに、ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での処理によってこれが減少する。これら
の所見は、対応のないデータについてのｔ検定を使用した５％レベルで統計的に有意であ
る。ＭＣＰ−１  ｍＲＮＡレベルは、野生型と比較してノックアウトマウスで６倍に増加
し、これもｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での処理によって減少する。ＭＩＰ−２  ｍＲＮＡ
レベルについてｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）処置が有意な効果を示さないこと以外は、ＭＩ
Ｐ−１αレベルおよびＭＩＰ２に対して類似の効果が認められる。最終的な所見は、野生
型マウスに対してノックアウトマウスでＴＣＡ−３レベルが４倍に増加するが、ｒＳＰ−
Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での処置ではＴＣＡ−３発現の増加に効果がないことである。
【実施例９】
【０３９６】
［ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）はアポトーシス肺胞マクロファージのクリアランスを促進す
る］
アポトーシスによる細胞死の制御過程により、細胞壊死およびその後の炎症後の細胞内
容物の放出が回避される。ＳＰ−Ｄノックアウトマウスにおける過剰な肺胞マクロファー
ジ数が過剰である場合、ノックアウトマウスにおけるアポトーシスを受けた細胞数を測定
し、野生型と比較する。
【０３９７】
多数の肺胞マクロファージの存在によって媒介された肺損傷は、アポトーシス肺胞マク
ロファージのクリアランスの低下に一部起因し、その結果肺胞マクロファージ壊死の増加
によって炎症反応が誘発されると仮定した。
【０３９８】
〈アポトーシス細胞および壊死細胞のフローサイトメトリーおよび検出〉
上記の気管支肺胞洗浄によってマウスから肺胞マクロファージを単離する。
【０３９９】
図１３Ａは、野生型マウスと比較したＳＰ−Ｄ欠損マウスにおける前方散乱（細胞サイ
ズ）および側方散乱（粒度）フローサイトメトリーの代表的な結果を示す。各群（ｎ＝６
／群）由来の各マウスで１００００個の細胞を計数する。ヒストグラムは、野生型マウス
から単離されたものと比較したＳＰ−Ｄ欠損マウス中の巨大化した泡状マクロファージの
サイトスピンの外観と一致するＳＰ−Ｄ欠損マウスのより巨大且つ多数の顆粒細胞集団を
示す。
【０４００】
細胞集団の前方散乱および側方散乱に対するｒＳＰ−Ｄ処置の効果を代表的なヒストグ
ラムの重複を使用して示し、サイトスピンの外観と一致した異常に巨大且つ顆粒状の肺胞
マクロファージがより少ない細胞集団を示す。ｒｈＳＰ−Ａ、ＰＢＳ、またはＢＳＡでの
処置は、前方散乱および側方散乱ヒストグラムの形状に影響を与えなかった。
【０４０１】
〈肺胞マクロファージのアポトーシスおよび壊死〉
上記の気管支肺胞洗浄によってマウスから肺胞マクロファージを単離し、ＦＡＣＳ分析
によるＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（アポトーシス細胞上に曝された表面ホスファチジルセ
リンに結合する）およびヨウ化プロピジウム（壊死細胞に結合する）結合の測定によって
アポトーシスおよび壊死についてアッセイする。
【０４０２】
図１３Ｂ、１３Ｃ、および１３Ｄに示すように、野生型と比較してＳＰ−Ｄノックアウ
トマウス由来の洗浄液中のアポトーシスおよび壊死マクロファージの数に大きな相違が認
められる。
【０４０３】
〈新たに単離した肺胞マクロファージのアネキシンＶおよびＰＩ染色〉
図１３Ｂは、野生型マウスと比較したＳＰ−Ｄ欠損マウス由来のマクロファージのアネ
キシンＶおよびＰＩの典型的な染色パターンを示す。一貫して、アネキシンＶで染色され
たマクロファージ数は、野生型と比較してＳＰ−Ｄ欠損マウスで有意に多く、ＳＰ−Ｄ欠
損マウスにおいてアネキシンＶおよびＰＩの両方に染色された細胞数は３〜４倍である。
細胞集団を４つに分割した図に示す任意の分割により、それぞれの場合におけるＰＩまた
はアネキシンＶで染色された細胞の比率を計算する。
【０４０４】
〈アネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性細胞のＦＩＴＣ標識ｒＳＰ−Ｄでの同時標識〉
図１３Ｃは、アネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性細胞でのＦＩＴＣ標識ｒＳＰ−Ｄの
同時標識範囲を示す。結果は、３つの実験の代表である。ドットプロットは、初期アポト
ーシス（アネキシンＶ陽性）および壊死（ＰＩ陽性）細胞へのＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄ結合
の優先度を示す。概して、野生型と比較して、ノックアウトマウスから単離したより多く
の細胞集団がＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄに結合する（１５＋／−１．８％に対して４５＋／−
６％）。野生型マウスの少数のアネキシンＶ陽性細胞のうち、アネキシンＶ陰性細胞のた
った１＋／−０．５％と比較して８０＋／−６％がＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄに結合する。ノ
ックアウトマウスでは、アネキシンＶ陰性細胞のたった３．５＋／−１．７％と比較して
、５５＋／−４％のアネキシンＶ陽性ＡＭがＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄに結合する。野生型ま
たはノックアウトマウス由来のＰＩで染色された全ての細胞は、ＦＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄに
結合する。したがって、アネキシンＶまたはＰＩ陽性細胞への結合と比較して、野生型マ
ウスおよびノックアウトマウス由来の健常な細胞（ＰＩ陰性、アネキシンＶ陰性）へのＦ
ＩＴＣ−ｒＳＰ−Ｄの結合レベルは低い。新たに単離した細胞のＦＩＴＣ−アネキシンＶ
および非標識ｒＳＰ−Ｄとの同時インキュベーションでは、アネキシンＶ結合に有意に影
響を与えず（示さず）、アネキシンＶとｒＳＰ−Ｄとの間に直接的な相互作用もｒＳＰ−
ＤによるそのホスファチジルセリンリガンドへのアネキシンＶ結合のいかなる競合も存在
しないことを示す。
【０４０５】
〈ｒＳＰ−Ｄでの分析および処置〉
図１３Ｄは、ＳＰ−Ｄ欠損マウスは、野生型欠損マウスと比較して、気管支肺胞洗浄物
中のアポトーシス肺胞マクロファージの比率が１０倍であり（野生型６％＋／−２％に対
してノックアウトでは７４％＋／−８％）、壊死肺胞マクロファージの比率が６倍である
（野生型４％＋／−２％に対してノックアウトでは２５％＋／−８％）ことを示す。ｒＳ
Ｐ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での３〜６週間の鼻腔内補充療法により、ＳＰ−Ｄ欠損動物中の肺
胞空隙からのアポトーシスおよび壊死肺胞マクロファージのクリアランスが増加するが、
ウシ血清アルブミンまたはサーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）での類似の処置で
は効果がなかった。
【０４０６】
ＰＩまたはアネキシンＶのいずれかでの細胞染色率に対するｒＳＰ−Ｄでの処置効果も
図に示す。
【０４０７】
アポトーシスマクロファージの割合は、コントロールで７６％＋／−１０％であるのに
対してｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）処置マウスでは２５％＋／−４％である。ｒＳＰ−Ｄ（
Ｎ／ＣＲＤ）での処置により、ＳＰ−Ｄノックアウトマウスの洗浄物中の壊死マクロファ
ージの割合（約２５％）は、野生型に匹敵するレベルに減少する（４％に対して５％）。
ｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での全処置効果は、炎症性サイトカインレベルおよび５０％過
剰なサーファクタントリン脂質と共に肺内の肺胞マクロファージの絶対数が減少すること
である。
【０４０８】
アネキシンＶおよび／またはＰＩで染色された細胞の比率に対するｒｈＳＰ−Ａ、ＢＳ
Ａ、またはＰＢＳでの有意な処置効果は認められない。対照的に、ｒＳＰ−Ｄ処置により
、アネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性細胞数が依然として野生型より有意に多いにもか
かわらず、ＳＰ−Ｄ欠損マウスのＢＡＬ中のアネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性細胞数
は有意に減少する。
【０４０９】
〈気管支肺胞洗浄物中のＧＭ−ＣＳＦレベルの調整〉
気管支肺胞洗浄物中のＧＭ−ＣＳＦレベルの調整を、図１４に示す。認められるように
、野生型マウスの気管支肺胞洗浄物中のＧＭ−ＣＳＦ濃度は、ＳＰ−Ｄノックアウトマウ
スの約１８５ｐｇ／ｍｌと比較して５０ｐｇ／ｍｌである。このようなノックアウトマウ
スのｒＳＰ−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）での処置により、ＧＭ−ＣＳＦレベルが約１２０ｐｇ／ｍ
ｌに減少する。
【０４１０】
フローサイトメトリーおよび生化学的分析由来の結果は、気管支肺胞洗浄物から採取し
た肺胞マクロファージの肺組織学およびサイトスピン実験の結果と一致する。
【０４１１】
〈共焦点顕微鏡法〉
図１５は、ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰ（緑）で染色した野生型（パネルＡおよびＢ）およびノ
ックアウトマウス（パネルＣおよびＤ）由来のマクロファージの共焦点顕微鏡法を示す。
アポトーシスが進行した細胞は緑色に染色され、初期アポトーシス細胞を、末端標識ＤＮ
Ａフラグメントの特徴的な点状染色によって同定する。
【０４１２】
〈緑色に染色された新たに単離したマクロファージによる橙色染色壊死およびアポトーシ
スマクロファージの貪食作用の検出〉
細胞を、上記のようにノックアウトマウスから単離し、Ｏｒａｎｇｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒ
ａｃｋｅｒ色素と室温で一晩インキュベートする。アネキシンＶ−ＦＩＴＣでの同時標識
により、これらの細胞の８０〜９０％が橙色素と二重標識され、アネキシンＶ陽性である
ことが確認される。新たに単離された細胞を、製造者の説明書に従ってＣｅｌｌ  ｔｒａ
ｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎとインキュベートする。多数の細胞が生きた細胞に依存してＣｅｌ
ｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎで染色されず（図１６、四分割した左下、パネルＡ）、
細胞の集団（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）は首尾よく標識された（図１６、四分割した右下、
パネルＡ）。
【０４１３】
パネルＡは、橙色および緑色細胞集団の直接混合の結果を示す。非染色細胞およびバッ
クグラウンド二重蛍光（パネルＢに示す）を排除するために示したゲートを使用して、パ
ネルＣおよびＤは、３７度で１５分間、無ＳＰ−Ｄ（パネルＣ）および４ｍｃｇ／ｍｌの
ＳＰ−Ｄ（パネルＤ）との細胞の同時インキュベーション後の二重標識を示す。二重標識
細胞数は、ＳＰ−Ｄの存在下で８０％増加する。
【０４１４】
ＳＰ−Ｄノックアウトマウスにおけるこれらの結果によりアポトーシスおよび壊死マク
ロファージのクリアランスの制御におけるＳＰ−Ｄの重要な役割が明らかとなり、ｒＳＰ
−Ｄ（Ｎ／ＣＲＤ）ベースの処置により肺胞マクロファージ媒介炎症過程および他の疾患
を含む肺疾患領域における新規のアプローチが得られることを示す。
【０４１５】
しかし、アポトーシス細胞の制御およびクリアランスにおけるＳＰ−Ｄの関与に関して
示したデータはまた、異常発達（例えば、早産後の新生児肺疾患における異常な出生後肺
発達）、炎症組織の再造形、細胞増殖、および癌にも関与する。
【実施例１０】
【０４１６】
ＳＰ−ＤおよびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）（ＳＰ−Ｄの組換えフラグメント（ｒＳＰＤ（
ｎ／ＣＲＤ））という）のＤＮＡへの結合を、種々の方法で試験する。第１のアッセイで
は、電子顕微鏡法を使用して、ＤＮＡとＳＰ−Ｄとの間およびＤＮＡとｒｆ−ＳＰ−Ｄと
の間の複合体形成を示す。図１８を参照のこと。電子顕微鏡法から得た画像は、ＳＰ−Ｄ
およびｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）はＤＮＡに有効に結合することを証明する。
【０４１７】
図１９に示す第２のアッセイでは、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）と炭水化物であるマンナン
との結合はデオキシリボヌクレオチドと競合するので、ＳＰ−Ｄは炭水化物結合能力によ
ってＤＮＡに結合することが示唆される。デオキシリボヌクレオチドは、固定化マンナン
とＳＰ−Ｄへの結合を有効に競合し、溶液中でヌクレオチドが結合することを示す。
【０４１８】
図２０に示す第３のアッセイでは、ＳＰ−Ｄノックアウトマウスから単離した肺胞マク
ロファージ（主に、アポトーシス）を、表示濃度のｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）およびその後
ヨウ化プロピジウムとインキュベートし、細胞に結合した赤色ヨウ化プロピジウムを、Ｆ
ＡＣＳ分析で測定した。４および２０μｇ／ｍＬのｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）の存在下で、
タンパク質の非存在下での１６．８％と比較して、それぞれ１１．４％および２．１％の
細胞を含んでいた。これらの結果は、ｒＳＰＤ（ｎ／ＣＲＤ）がアポトーシス細胞上のＤ
ＮＡに結合することを示す。
【０４１９】
インビボでのＤＮＡのクリアランスの欠損を証明するために、本発明者らは、ＳＰ−Ｄ
ノックアウトマウス（ＳＰ−Ｄ(-/-)）から肺胞マクロファージを単離し、野生型および
ＳＰ−Ａノックアウトマウス（ＳＰ−Ａ(-/-)）とＤＮＡ取り込み能力について比較した
。データ（図２１）は、ＳＰ−Ｄ欠損マウスから単離した肺胞マクロファージのＤＮＡ除
去（４．０％）は、野生型（１０．５％）またはＳＰ−Ａ欠損マウス（１３．２）と比較
して低いことを示す。これらの結果により、ＳＰ−Ｄは肺内のＤＮＡ除去経路で重要な役
割を果たすことが示唆される。
【０４２０】
［参考文献］
【表３Ａ】
2010090134.tif 000010
【表３Ｂ】
2010090134.tif 000011
【表３Ｃ】
2010090134.tif 000012
【表３Ｄ】
2010090134.tif 000013
【表３Ｅ】
2010090134.tif 000014
【表３Ｆ】
2010090134.tif 000015
【表３Ｇ】
2010090134.tif 000016
【表３Ｈ】
2010090134.tif 000017
【表３Ｉ】
2010090134.tif 000018
【表３Ｊ】
2010090134.tif 000019
【０４２１】
本明細書中に記載の各特許出願および特許、これらの各特許出願および特許で引用また
は参照した書類（各特許出願および特許の実施中を含む）（「出願引用書類」）、ならび
に各特許出願および特許ならびに任意の出願引用書類に引用もしくは記載された任意の生
成物についての任意の製造者の説明書またはカタログは、本明細書中で引用することによ
り本明細書の一部をなすものとする。さらに、本明細書中で引用された全ての書類、本明
細書中で引用された書類で引用もしくは参照された全ての書類、ならびに本明細書中で引
用もしくは記載された任意の生成物についての任意の製造者の説明書もしくはカタログは
、本明細書中で引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０４２２】
本発明の記載の方法および系の種々の修正形態および変形形態は、本発明の範囲および
精神を逸脱することなく当業者に自明である。本発明は、特定の好ましい実施形態と共に
記載されているが、このような特定の実施形態に特許請求の範囲に記載の本発明が過度に
制限されないと理解すべきである。実際、分子生物学分野または関連分野の当業者に自明
の本発明の記載の実施様式の修正形態が特許請求の範囲の範囲内であることが意図される
。
【０４２３】
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2010090134.tif 000026
【図４Ｃ】
2010090134.tif 000027
【図５Ａ】
2010090134.tif 000028
【図５Ｂ】
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【図６】
2010090134.tif 000030
【図７Ａ】
2010090134.tif 000031
【図７Ｂ】
2010090134.tif 000032
【図７Ｃ】
2010090134.tif 000033
【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2010090134.tif 000039
【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2010090134.tif 000045
【図１４】
2010090134.tif 000046
【図１５】
2010090134.tif 000047
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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