(57)【要約】      （修正有）【課題】糸状菌宿主細胞における発現クローニングにより、興味の対象となる特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離する方法が提供する。【解決手段】（ａ）興味の対象となる特性をもつ１つまたは２つ以上の蛋白質を産生する能力を有すると想定される生物からＤＮＡライブラリーを適切なクローニングベクターとして調製し；（ｂ）前記ＤＮＡライブラリーで糸状菌ホスト細胞を形質転換し；（ｃ）前記ＤＮＡライブラリーのＤＮＡ配列の発現を誘導する条件下で（ｂ）で得られた形質転換細胞を培養し；さらに（ｄ）興味の対象となる特性をもつ蛋白質を発現している前記形質転換細胞クローンを（ｃ）で産生された蛋白質の分析によってスクリーニングする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、興味の対象となる特性をもつ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を単離する方法：
（ａ）興味の対象となる特性をもつ１つまたは２つ以上の蛋白質を産生する能力を有すると想定される生物からＤＮＡライブラリーを適切なクローニングベクターとして調製し；
（ｂ）前記ＤＮＡライブラリーで糸状菌ホスト細胞を形質転換し；
（ｃ）前記ＤＮＡライブラリーのＤＮＡ配列の発現を誘導する条件下で（ｂ）で得られた形質転換細胞を培養し；さらに
（ｄ）興味の対象となる特性をもつ蛋白質を発現している前記形質転換細胞クローンを（ｃ）で産生された蛋白質の分析によってスクリーニングする。
【請求項２】
前記クローニングベクターが、前記糸状菌ホスト細胞ゲノムの予め定めた標的遺伝子座中のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡフラグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予め定めた標的遺伝子座が、高発現遺伝子を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記糸状菌ホスト細胞が、予め定めた標的遺伝子座の１つより多いコピーを含む請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記クローニングベクターが、糸状菌ホスト細胞内で自律的に維持する能力を有するベクターである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記自律的維持能力をもつベクターが、ＡＭＡ−１配列を含むベクターである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記興味の対象となる特性をもつ蛋白質をコードするＤＮＡ配列が、高発現糸状菌遺伝子に由来するプロモータから発現される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記糸状菌ホスト細胞がアスペルギルス属またはトリコデルマ属の１つの種である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記糸状菌ホスト細胞が、アスペルギルス・ニジュランス、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソジェ、アスペルギルス・ニガー群の種、およびトリコデルマ・レーシから成る群から選ばれる種である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
興味の対象となる特性をもつ１つまたは２つ以上の蛋白質を産生する能力を有すると想定される生物が真核細胞である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記真核細胞が真菌、好ましくは糸状菌である、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記興味の対象となる特性をもつ蛋白質が酵素である請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
適切なホスト細胞で興味の対象となる特性をもつ蛋白質を製造する方法であって、前記方法が、請求項１から１２のいずれかの方法によって単離された興味の対象となる特性をもつ蛋白質をコードするＤＮＡ配列でホスト細胞を形質転換する工程、前記蛋白質をコードするＤＮＡ配列の発現を誘導する条件下で前記形質転換細胞を培養する工程、および前記蛋白質を回収する工程を含む前記興味の対象となる特性をもつ蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
興味の対象となる特性をもつ蛋白質を製造する方法であって、前記方法が前記蛋白質をコードするＤＮＡ配列の発現を誘導する条件下で形質転換細胞を培養する工程、および前記蛋白質を回収する工程を含み、前記形質転換細胞が、請求項１から１２のいずれかの方法によって得られる興味の対象となる特性をもつ蛋白質を発現するクローンである前記蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホストとして糸状菌を用いる発現クローニングによって興味の対象となる蛋白質をコードするＤＮＡ配列を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術
興味をそそる特性をもつますます多くの蛋白質成分がリコンビナントＤＮＡ技術によって製造されている。リコンビナントＤＮＡ製造技術では、興味の対象となる蛋白質成分をコードするＤＮＡ配列を手にいれることが必要である。興味の対象となる蛋白質をコードするＤＮＡ配列をクローニングする通常の方法は、蛋白質成分の（部分的）アミノ酸配列を決定するために、また別には特異的抗体を作製するために各蛋白質成分を精製しなければならないという欠点をもつ。続いてこの（部分的）アミノ酸配列を用いて、ハイブリダイゼーションスクリーニングのためのオリゴヌクレオチドプローブをデザインすることができる。また別には、特異的抗体は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ)、例えばラムダ−ｇｔ１１での発現ライブラリーの免疫スクリーニングに用いられる。両方法ともに興味の対象となる蛋白質の精製および性状決定を必要とし、これは時間を要する過程である。新規な蛋白質成分のクローニングは、したがって所望の蛋白質活性を発現しているクローンを選別することを含むスクリーニング方法を用いることによって極めて迅速に処理できるであろう。
【０００３】
発現クローニングをベースにするそのようなスクリーニング方法は、原核細胞遺伝子生成物を例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば米国特許第４４６９７９１号参照）および大腸菌（例えばＷＯ９５／１８２１９号およびＷＯ９５／３４６６２号）で特定するために以前に用いられ成功した。いくつかの例では、真核細胞遺伝子生成物もまた大腸菌のような細菌で発現クローニングを用いて特定された。しかしながら、一般に原核細胞は真核細胞遺伝子の発現クローニングにはより不適切である。なぜならば、これらの遺伝子の多くは細菌では正確に発現されないからである。例えば、真核細胞遺伝子はしばしばイントロンを含みこれらは細菌内ではスプライスされない。このスプライスの問題は、細菌での発現クローニングに真核細胞遺伝子のｃＤＮＡを用いることによって回避することができるが、多くの真核細胞遺伝子生成物は細菌では活性形として産生されない。なぜならば真核細胞蛋白質は細菌内では正確に折りたたまれないか、またはこれらの蛋白質は細菌のプロテアーゼによって急速に分解されるからである。さらにまた、一般に細菌は真核細胞分泌蛋白質を活性形として効率的に分泌することができず、さらに真核細胞とは対照的に細菌は蛋白質を糖化する能力をもたない。
【０００４】
さらに最近になって、これらの問題の多くは、真核細胞遺伝子の発現クローニングのホストとして酵母を用いることによって克服された。Ｓｔｒａｓｓｅｒら（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４：６９９−７０６（１９８９））は、ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で真菌ゲノムＤＮＡの発現クローニングによって真菌のα−アミラーゼを特定したことを報告した。同様に、ＷＯ９３／１１２４９号は、ビール酵母での真菌ｃＤＮＡの発現クローニングによる真菌セルラーゼの特定を報告している。酵母は、しかしながら特に糸状菌と比較したとき分泌能力が貧弱であることが知られている。多数の分泌性異種蛋白質は、全くではないにしても酵母からはわずかしか分泌されない（例えば以下を参照されたい：Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：５３−５７（１９８７））。さらに酵母は異種蛋白質を過剰に糖化することが知られている（Ｉｎｎｉｓ（１９８９），“Ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ｂａｒｒ，Ｂｒａｋｅ＆Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ（Ｅｄｓ），Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ２３２−２４６）。おそらく貧弱な分泌および過剰な糖化はともに酵母での発現クローニングを妨害するであろう。なぜならば、それによって興味の対象となる特性をもつ蛋白質をコードするあるＤＮＡ配列を検出するチャンスは大きく減少させるられるからである。このことは、特に、糸状菌のような真核細胞によって産生され、さらにしばしば分泌および糖化される多くの有用な酵素をコードするＤＮＡ配列に当てはまるであろう。したがって、分泌され、さらにはおそらく糖化される蛋白質をコードするＤＮＡ配列を検出するチャンスを最適化させ、さらに真核細胞、特に糸状菌によって産生される蛋白質および酵素をコードするＤＮＡ配列の特定に適した発現クローニング系が必要とされている。また別には、この発現クローニング系は、分泌されない真核細胞または糸状菌蛋白質をコードするＤＮＡ配列の特定にも応用されるはずである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明が解決しようとする課題
本発明は、興味の対象となる特性をもつ１つまたは２つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を単離する方法に関する。本方法は、好ましくは以下の工程を含む：（ａ）適切なクローニングベクターで、興味の対象となる特性をもつ１つまたは２つ以上の蛋白質を産生することができると思われる生物からＤＮＡライブラリを調製し；（ｂ）このＤＮＡライブラリーで糸状菌ホスト細胞を形質転換し；（ｃ）ＤＮＡライブラリーに存在する、興味の対象となる特性を持つ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の発現を誘導できる条件下で（ｂ）で得られた形質転換ホスト細胞を培養し；さらに（ｄ）（ｃ）で産生された蛋白質を分析することによって、興味の対象となる特性をもつ蛋白質を発現している形質転換ホスト細胞のクローンをスクリーニングする。
【０００６】
糸状菌ホスト細胞を形質転換し、さらにＤＮＡライブラリーに由来するＤＮＡフラグメントを受容することができるいずれのクローニングベクターも本発明の方法での使用に適している。したがって、本発明で使用するクローニングベクターには、糸状菌ホスト細胞の染色体の任意の位置または予め定められた標的遺伝子座に組み込まれる組込み型クローニングベクターだけでなく、自律的に維持されるクローニングベクター（例えばＡＭＡ１−配列をベースにしたベクター）も含まれる。本発明の好ましい特徴では、この組込み型クローニングベクターは、糸状菌ホスト細胞のゲノムの予め定めた標的遺伝子座のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡフラグメントを、この予め定めた遺伝子座にクローニングベクターの組込みを誘導するために含んでいる。誘導組込みを促進するために、クローニングベクターは、ホスト細胞の形質転換の前に好ましくは直線化される。直線化は好ましくは、少なくとも１つの、好ましくはクローニングベクターの一方の端が標的遺伝子座と相同な配列と接するように実施される。標的遺伝子座と接する相同な配列の長さは好ましくは少なくとも０．５ｋｂ、より好ましくは少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。クローニングベクターの予め定められた遺伝子座への組込みはライブラリーの個々のクローンの発現レベルの均一化を促進し、したがってライブラリーの各クローンが検出可能なレベルで発現するチャンスを高める。本発明のより好ましい特徴では、標的遺伝子座と相同なクローニングベクター中のＤＮＡ配列は、糸状菌ホスト細胞での高レベル発現が可能な遺伝子に由来する。高レベル発現が可能な遺伝子、すなわち大量に発現される遺伝子は、（例えば誘発条件下で）そのｍＲＮＡが全細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）を構成することができる遺伝子、また別にはその遺伝子生成物が全細胞蛋白質の少なくとも１％（ｗ／ｗ）を構成できる遺伝子、または分泌遺伝子生成物の場合には少なくとも０．１ｇ／ｌのレベルで分泌される遺伝子と本明細書では定義される。
【０００７】
本発明のまた別の好ましい特徴では、クローニングベクターは、興味の対象となる特性をもつ蛋白質をコードするＤＮＡ配列のライブラリーでの発現のためのプロモーターを含み、したがって、このプロモーターは好ましくは高発現糸状菌遺伝子に由来する。標的誘導のための前述の相同なＤＮＡ配列とこのプロモーター配列は１つのＤＮＡフラグメント内で同一の空間を占める可能性があることは当業者には理解されよう。
【０００８】
多数の好ましい高発現真菌遺伝子は例えば以下の例によって提供される：アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に由来するアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒド−ホスフェートデヒドロゲナーゼまたはセロビオヒドラーゼ遺伝子。これらの目的のための最も好ましい高発現遺伝子は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｇｐｄＡ遺伝子またはトリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドラーゼ遺伝子である。これらの高発現遺伝子は、クローニングベクターの組込みのための標的遺伝子座としても、高発現プロモーター（そこからこのライブラリーフラグメントが発現される）としても適している。
【０００９】
別の好ましい実施態様では、個々のライブラリークローンの発現レベルの均一性は、糸状菌内で自律的に維持されるクローニングベクターを使用することによって提供される。そのような自律的に維持されるクローニングベクターの例は、ＡＭＡ−１配列を含むクローニングベクターの構築および使用を説明する実施例８に開示されている。ＡＭＡ−１はアスペルギルス・ニジュランスから単離された６．０ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントで、これは、アスベルギルスでの自律的維持（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ＡＭＡ）が可能である（例えば以下のを参照のこと：Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ＆Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｂｉｏｌ．２１：３７３−３９７（１９９７））。本発明の方法で使用するＡＭＡ−１系クローニングベクターは、組込み型クローニングベクターと比較してより高い形質転換頻度という利点を提供する。ＡＭＡ−１系クローニングベクターはまた、個々のライブラリークローンの相応なレベルでの均一な発現を提供し、このことは興味の対象となる特性をもつ蛋白質をライブラリーで検出するのを容易にする。しかしながら、ＡＭＡ−１系クローニングベクターは、ＡＭＡ−１系クローニングベクターの貧弱な形質分離によるこのベクターの損失を避けるために、形質転換細胞の増殖中に選別圧力を維持する必要がある。
【００１０】
さらに場合によって、クローニングベクターは、クローニング部位に挿入されているライブラリーのＤＮＡフラグメントによってコードされた蛋白質の分泌を可能にするために、プロモーターに機能的にかつクローニング部位の上流に連結されたシグナル配列を含む。分泌は蛋白質の検出を容易にすることができる。本発明の別の実施態様では、クローニングベクターは大量に分泌される蛋白質をコードする遺伝子、例えばＡ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子を含む。クローニングベクターの大量に分泌される遺伝子は、ライブラリーフラグメントの挿入のためのクローニング部位を含む。このクローニング部位は、ライブラリーフラグメントによってコードされる蛋白質がこの大量分泌蛋白質との融合蛋白質として産生されるように配置されている。これは、ＥＰ−Ａ−０４２９６２８号のようにそれら蛋白質の分泌を改善するであろう。
【００１１】
クローニングベクターの選別マーカー遺伝子は、糸状菌の形質転換で有用な多数のマーカー遺伝子から選択できる。例えばこれらのマーカーにはａｍｄＳ（アセトアミド）遺伝子、栄養要求マーカー遺伝子（例えばａｒｇＢ、ｔｒｐＣまたはｐｙｒＧ）、および抗生物質耐性遺伝子（例えばフレオマイシン、ヒグロマイシンＢまたはＧ４１８に対する抵抗性を提供する）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明の好ましい特徴では、ホスト細胞のゲノムに組み込まれた多コピーのクローニングベクターをもつ形質転換体に対する偏りを避けるために、クローニングベクターは、形質転換体の選別中に十分なレベルで真菌ホスト細胞に発現される選別マーカー遺伝子を含む。この目的のために好ましい選別マーカー遺伝子は、Ａ．ニジュランスｇｐｄＡプロモータに融合させたＡ．ニジュラスａｍｄＳコード配列である。
【００１２】
本発明のホスト細胞は、クローニングベクターで形質転換することができる糸状菌である。これまでテストしたほとんどの糸状菌の場合、それらは、アスペルギルス属のために開発された形質転換プロトコル（とりわけ以下の文献に由来するもの：Ｔｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ２６：２０５−２２１（１９８３））を用いて形質転換できることが分かった。当業者には、糸状菌種の形質転換の成功は本明細書で特に例示したベクター、選別マーカー系、プロモーターおよび形質転換プロトコルに限定されないことは理解されよう。
本明細書では、糸状菌とは糸状形態をもつ（すなわちその増殖が菌糸の伸長によって生じる）下位分類ユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する真核細胞系微生物と定義される。好ましい糸状菌ホスト細胞は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）およびアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）から成る群から選ばれる。別の好ましい実施態様では、例えば興味の対象となる蛋白質が好熱性蛋白質である場合は、好ましい糸状菌ホスト細胞は、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、シーラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、ケトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、クテノミセス属（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ）およびシタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）から成る好熱性真菌群から選択される。
【００１３】
本発明のより好ましい実施態様では、糸状菌ホスト細胞は、Ａ．ニジュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．オリゼ（ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．ソジェ（ｓｏｊａｅ）、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）群のアスペルギルスおよびトリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）から成る群から選択される。本明細書ではＡ．ニガー群はＲａｐｅｒ＆Ｆｅｎｎｅｌｌ（１９６５  ｉｎ“Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ”，  Ｔｈｅ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ,  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ｐｐ２９３−３４４）にしたがって定義され、著者らがその中に包含させた全ての（黒色）アスペルギルスを含む。
【００１４】
本発明のさらに別の好ましい特徴では、糸状菌ホスト細胞は予め定めた標的遺伝子座の多コピーを含む（ただしこれは少なくとも、予め定めた標的遺伝子座のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡフラグメントを含む組込み型クローニングベクターと組み合わせた本発明の方法で用いられる場合である）。より好ましくは、ホスト細胞は、高発現遺伝子（例えば上記で例示した高発現真菌遺伝子）を含む標的遺伝子座の多コピーを含む。多コピー標的遺伝子座を含むホスト細胞の利点は、これらのホスト細胞の使用によって組み込み型の標的誘導形質転換の頻度が高められ、したがってライブラリーの個々のクローンについて効率的な発現を示す形質転換体を得るチャンスが増すということである。
【００１５】
興味の対象となる特性をもつ１つまたは２つ以上の蛋白質を産生すると予想される当該生物は、通常真核細胞、好ましくは真菌、もっとも好ましくは糸状菌である。これらの生物は、工業的利用に有用な極めて多様な蛋白質を産生することが知られている。
【００１６】
本発明の方法では、興味の対象となる特性をもつ１つまたは２つ以上の蛋白質を産生すると予想される生物に由来するＤＮＡフラグメントライブラリーは、ゲノムライブラリーでもｃＤＮＡライブラリーでもよい。しかしながら、ホスト生物のプロモータまたはスプライスシグナルの認識に関する問題を回避するために、好ましくはｃＤＮＡライブラリーが用いられる。ｃＤＮＡライブラリーは、好ましくは供給源生物から単離したｍＲＮＡから調製される。この時、供給源生物は興味の対象となる特性をもつ蛋白質の発現を誘導する条件下で増殖させる。
【００１７】
本発明の方法は、真菌ホスト細胞によって発現されているとき該当蛋白質の検出に利用できるアッセイが存在する場合には、興味の対象となる特性をもつ任意の蛋白質をコードするＤＮＡ配列の単離に適用できる。好ましくは興味の対象となる特性をもつ蛋白質は酵素である。本発明の方法によって特定できる酵素の例は、カルボヒドラーゼ、例えばセルラーゼ（エンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、セロビオヒドラーゼもしくはβ−グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼ）、またはペクチン分解酵素（キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼ）、またはデンプン分解酵素；フィターゼのようなホスファターゼ、リパーゼのようなエステラーゼ、蛋白分解酵素、オキシダーゼのようなオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼである。
【００１８】
糸状菌ホスト細胞のＤＮＡライブラリーによる形質転換後、形質転換クローンを興味の対象となる特性をもつ蛋白質の発現についてスクリーニングする。興味の対象となる特性をもつ蛋白質の検出に必要なアッセイに応じて、形質転換クローンを増殖させ、寒天平板のような固形培地または液体培地でコロニーとして保存し、それによって個々のライブラリークローンを増殖、保存および／またはマイクロタータープレートのウェルでアッセイする。
【００１９】
興味の対象となる特性をもつ蛋白質の検出のための多様なシステムが当業者に知られている。ライブラリークローンは液体培地と同様に固形培地で増殖できるので、検出システムには酵素または酵素活性の検出のためのいずれの可能なアッセイも含まれる。例示すれば、これらのアッセイシステムには、固形培地上のコロニー周囲の透明ゾーンを基にしたアッセイの他に比色計、光度計、濁度計、濃度計によるアッセイ、免疫学的、生物学的、クロマトグラフィーアッセイ、および他の利用可能なアッセイが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２０】
当業者には、当技術分野で既知のクローニング方法で用いられる通常の応用を本発明の方法に同様に適用できることは理解されよう。このような応用には、例えばライブラリークローンプールのスクリーニング、多数の異なる蛋白質について同じライブラリーのスクリーニング、さらに陽性クローンの再スクリーニング、再単離および再クローニングによるより正確な結果の担保が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２１】
スクリーニング手段で特定された形質転換ホスト細胞から得られた興味の対象となる特性をもつ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の単離のため、およびそれに続く単離ＤＮＡ配列の性状決定のために、多様な方法が当業者には利用可能である。
【００２２】
上記のような本発明のスクリーニング方法によって単離されたＤＮＡ配列を用いて、このＤＮＡ配列によってコードされる興味の対象となる特性をもつ蛋白質を産生、またはその産生を改善する。都合のよいことには、上記のスクリーニング方法で単離した形質転換糸状菌ホスト細胞は、興味の対象となる特性をもつ蛋白質の発現を誘導する条件下でこの形質転換ホスト細胞を培養し、場合によってこの蛋白質を回収することによって興味の対象となる特性をもつ蛋白質の製造プロセスで直接用いられる。しかしながら、本発明のスクリーニング方法で単離した最初の形質転換細胞は、しばしばスクリーニングのためには十分であるが経済的製造目的には甚だしく改善されねばならない発現レベルをもつであろう。この目的のために、ＤＮＡ配列は発現ベクターに挿入され、このベクターは続いて適切なホスト細胞の形質転換に用いられる。発現ベクターでは、ＤＮＡ配列は、適切な発現シグナル（例えばプロモータ）、場合によってシグナル配列およびターミネータ（これらはホスト生物で蛋白質の発現を誘導することができる）に機能的に連結される。蛋白質の産生に適したホスト細胞は好ましくは酵母または糸状菌である。好ましくは酵母ホスト細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）おびハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）から成る群から選択される。好ましい糸状菌ホスト細胞は、スクリーニング方法で好ましいホスト細胞として上記に挙げた同じ属から選択される。もっとも好ましい糸状菌ホスト細胞は、Ａ．ニガー群のアスペルギルス、Ａ．オリゼおよびトリコデルマ・レ−シから成る群から選択される。適切なホスト細胞は、当業者が利用できる多様なプロトコルのいずれによってもこの発現ベクターで形質転換できる。続いて、蛋白質をコードするＤＮＡ配列の発現を誘導する条件下でこの形質転換ホスト細胞を培養し、さらにこの蛋白質を回収することによって、形質転換ホスト細胞を興味の対象となる蛋白質を製造する工程で用いる。
本発明をさらに以下の例で説明する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
課題を解決するための手段
実施例：
用語体系：
ｐｈｙＡ      フィターゼをコードするＡ．フィクム（ｆｉｃｕｕｍ）のｐｈｙＡ遺伝子
ｘｙｌＡ      キシラナーゼをコードするＡ．チュビゲンシス（ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）のｘｙｌＡ遺伝子
ａｍｄＳ      アセトアミダーゼをコードするＡ．ニジュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｍｄＳ遺伝子（Ｃｏｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ５３：６３−７１（１９８７））
ｇｌａＡ      グルコアミラーゼをコードするＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）のｇｌａＡ遺伝子
ｇｐｄＡ      グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードするＡ．ニジュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｇｐｄＡ遺伝子(Ｐｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ６９：４９−５７（１９８８）)
ＰｇｐｄＡ      ｇｐｄＡプロモータ
ＰｇｌａＡ      ｇｌａＡプロモータ
ＴａｍｄＳ      ａｍｄＳターミネータ
ＴｇｌａＡ      ｇｌａＡターミネータ
ＧＬＡ        Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ蛋白質
略語：
ｋｂ          キロ塩基
ｂｐ          塩基対
ｏｌｉｇｏ    オリゴヌクレオチド
ＰＣＲ        ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤＡ        ジャガイモデキストロース寒天
使用オリゴヌクレオチド：
実施例１−３で用いたオリゴヌクレオチドは配列表に記載されている。
【００２４】
材料と方法：
一般的手順：
標準的な分子クローニング技術（例えばＤＮＡ単離、ゲル電気泳動、核酸の酵素による制限修飾、サザン分析、大腸菌の形質転換など）は以下の文献の記載にしたがって実施する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）“ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ)。合成オリゴデオキシヌクレオチドはＩＳＯＧＥＮバイオサイエンス社（Ｍａａｒｓｓｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。ＤＮＡ配列分析はアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７３ＡＤＮＡ配列決定装置で製造元の指示に従いながら実施した。
【００２５】
ＤＮＡ標識とハイブリダイゼーション：
ＤＮＡ標識およびハイブリダイゼーションは、ＥＣＬ（登録商標）直接核酸標識および検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，イギリス）またはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）が記載したように標準的放射能標識技術にしたがった。
【００２６】
アスペルギルス・ニガーの形質転換：
Ａ．ニガーの形質転換は、文献（Ｊ．  Ｔｉｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ２６：２０５−２２１（１９８３）およびＪ．  Ｋｅｌｌｙ＆Ｍ．  Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４：４７５−４７９（１９８５））に記載された方法に以下の改変を加えて実施した：回転シェーカーで３００ｒｐｍ、１６時間、３０℃でアスペルギルス最少培地で胞子を増殖させた。アスペルギルス最少培地は１リットルにつき以下のものを含んでいる：６ｇのＮａＮＯ３、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．１２ｍｌの４Ｍ  ＫＯＨ、０．５２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｇグルコース、１ｇカザミノ酸、２２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１１ｍｇのＨ３ＢＯ３、５ｍｇのＦｅＳＯ３・７Ｈ２Ｏ、１．７ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．６ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、５ｍｇのＭｇＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．５ｍｇのＮａ２ＭｏＯ２・２Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＥＤＴＡ、２ｍｇのリボフラビン、２ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、２ｍｇのニコチンアミド、１ｍｇのピリドキシン−ＨＣｌ、０．２ｍｇのパントテン酸、４ｇのビオチン、１０ｍｌのペニシリン（５０００ＩＵ／ｍｌ）ストレプトマイシン（５０００ＵＧ／ｍｌ）溶液（Ｇｉｂｃｏ）。
【００２７】
プロトプラストの調製にはヘリカーゼの代わりにノボジム２３４（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍ  ２３４，Ｎｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いた。プロトプラスト形成後（６０−９０分）、ＫＣ緩衝液（０．８ＭのＫＣｌ、９．５ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．２）を最終容積４５ｍｌまで加え、プロトプラスト懸濁液を４℃で１０分、３０００ｒｐｍでスィングバケットローターで遠心した。プロトプラストを２０ｍｌのＫＣ緩衝液に再懸濁し、続いて２５ｍｌのＳＴＣ緩衝液（１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＣａＣｌ２）を加えた。
このプロトプラスト懸濁液を４℃、１０分、３０００ｒｐｍでスィングバケットローターで遠心し、ＳＴＣ緩衝液で洗浄してＳＴＣ緩衝液に１０８プロトプラスト／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【００２８】
このプロトプラスト懸濁液２００Ｌに、１０ＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解したＤＮＡフラグメントおよび１０ＬのＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ４０００（Ｍｅｒｃｋ）、０．８Ｍのソルビトール、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＣａＣｌ２）を加えた。
【００２９】
ＤＮＡ−プロトプラスト懸濁液を１０分保温した後で、１．５ｍｌのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００（Ｍｅｒｃｋ）、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＣａＣｌ２）を試験管の混合を繰り返しながらゆっくりと加えた。室温で２０分保温した後、懸濁液を１．２Ｍのソルビトール５ｍｌで希釈し、逆さにして混合し、さらに４０００ｒｐｍで１０分、室温で遠心した。プロトプラストを１．２Ｍのソルビトール１ｍｌに穏やかに再懸濁させ、選別再生培地で平板培養した。選別再生培地は、アセトアミド選別の場合には唯一の窒素源として１０ｍＭアセトアミド並びに浸透圧調製物質およびＣ供給源として１Ｍスクロースを補充したアスペルギルス最少培地（リボフラビン、チアミン−ＨＣｌ、ニコチンアミド、ピリドキシン、パントテン酸、ビオチン、カザミノ酸およびグルコース非含有）から成るか、またはフレオマイシン選別の場合には、１−３０μｇ／ｍｌのフレオマイシンおよび浸透圧調製物質としてスクロースを補充したＰＤＡから成る。再生平板は２％オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）Ｎｏ．１寒天を用いて固めた。３０℃で６−１０日保温した後、形質転換体の分生子スポアをアスペルギルス選別培地から成る平板に移し、３０℃で５−１０日保温した。上記の選別培地は、スクロースの代わりに２％グルコースおよび寒天の代わりに１．５％アガロースを含み、アセトアミド選別の場合には唯一の窒素源としてアセトアミドを、フレオマイシン選別の場合には１−３０μｇ／ｍｌのフレオマイシンを含む最少培地である。ただ１つの形質転換体を単離し、この選別精製工程をもう１回繰り返し、精製形質転換体を保存した。
【００３０】
真菌菌糸上での直接ＰＣＲ：
形質転換体をＰＤＡ含有平板で３０℃２日間保温した。コロニーの約１／３を、５ｍｇ／ｍｌのノボジム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）２３４（登録商標）を補充した５０ＬのＫＣ緩衝液（６０ｇ／ｌのＫＣｌ、２ｇ／ｌのクエン酸、ｐＨ６．２）で３７℃２時間保温した。続いて１００Ｌの溶液（１０ｍＭトリス、５０ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、ｐＨ８）および４００ＬのＱＩＡクイック（登録商標）ＰＢ緩衝液（Ｑｉａｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＵＳＡ）を添加した。抽出物を穏やかに再懸濁し、ＱＩＡクイック（登録商標）スピンカラムにロードした。カラムをミクロ遠心器で１３０００ｒｐｍで１分遠心し、５００ＬのＱＩＡクイック（登録商標）ＰＥ緩衝液で一回洗浄した。微量のエタノールを最後の迅速遠心によって除去した。染色体ＤＮＡ（ＰＣＲ鋳型）を５０ＬのＨ２Ｏを加えてカラムから溶出させ、続いて１３０００ｒｐｍで１分遠心した。ＰＣＲ反応は、１０Ｌのエロンガーゼ（ｅＬＯＮＧａｓｅ，登録商標）Ｂ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、１４ＬのｄＮＴＰ（各々１．２５ｍＭ）、１Ｌのエロンガーゼ（ｅＬＯＮＧａｓｅ，登録商標）酵素混合物、１Ｌの鋳型および１０−３０ｐｍｏｌの各オリゴを最終容積５０Ｌ中に含んでいた。オリゴの最適量は各購入バッチについて実験で求めた。平均して１０から３０ｐｍｏｌを用いた。反応を以下のサイクル条件で実施した：１ｘ（２分）９４℃、１０ｘ（１５秒９４℃、３０秒５５℃、４分６８℃）、２０ｘ（１５秒９４℃、３０秒、５５℃４分、各サイクルにつき２０秒のインクライン、６９℃で開始）、１ｘ１０分６８℃）。ＰＣＲ生成物の分析のためにサンプルをアガロースゲルにロードした。
【００３１】
アスペルギルス・ニガーのシェークフラスコ醗酵：
リコンビナントおよびコントロールのＡ．ニガー株で、胞子または菌糸を選別培地平板またはＰＤＡ平板で平板培養して大量の胞子を製造した。ＰＤＡ平板（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ，Ｏｘｏｉｄ）は供給元の指示にしたがって調製した。３０℃で３−７日間増殖させた後、平板に０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加してから胞子を採集した。滅菌した脱ミネラル水で洗浄した後、選別形質転換体およびコントロール株の約１０７の胞子を２０ｍｌの予備培養液を含むシェークフラスコに接種した。予備培養液は、１リットル当たり以下の成分を含む：３０ｇのマルトース・Ｈ２Ｏ、５ｇの酵母抽出物、１０ｇの水和カゼイン、１ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇのＺｎＣｌ２、０．０２ｇのＣａＣｌ２、０．０１ｇのＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３ｇのＴｗｅｅｎ８０、１０ｍｌのペニシリン（５０００ＩＵ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（５０００ＵＧ／ｍｌ）、ｐＨ５．５およびフレオマイシン選別の場合は１−３０μｇ／ｍｌのフレオマイシン。これらの培養は３４℃で１０−２４時間増殖させた。この培養の１０ｍｌを１００ｍｌのＡ．ニガー醗酵培養液に接種した。醗酵培養液は１リットル当たり以下の成分を含んでいた：７０ｇグルコース、２５ｇの水和カゼイン、１２．５ｇの酵母抽出物、１ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＫ２ＳＯ４、０．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇのＺｎＣｌ２、０．０２ｇのＣａＣｌ２、０．０１ｇのＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｌのペニシリン（５０００ＩＵ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（５０００ＵＧ／ｍｌ）、４ＮのＨ２ＳＯ４でｐＨ５．６に調整し、さらにフレオマイシン選別の場合は１−３０μｇ／ｍｌのフレオマイシンを含んでいた。これらの培養を３４℃で６日間増殖させた。醗酵ブロスから採取したサンプルを遠心し（スィングバケット遠心機で５０００ｒｐｍ、１０分）、上清を採取した。キシラナーゼおよびフィターゼ活性アッセイ（下記参照）をこれらの上清で実施した。
【００３２】
フィターゼ活性アッセイ：
シェークフラスコのアスペルギルス・ニガー醗酵物から得た２０μｌの上清（必要な場合は希釈）（リファレンスとして２０Ｌの脱ミネラル水）を、９６穴（ウェル）マイクロタイタープレート中の３０Ｌの基質混合物（０．２５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、１ｍＭのフィチン酸（ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ  Ｐ−３１６８）を含む）に加え、室温で２５分保温した。１５０Ｌの停止混合物（３００ｍｌの０．６７％（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ中の１４．６ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％Ｈ２ＳＯ４、３．３％のトリクロロ酢酸）を加えて反応を停止させた。室温で５分保温した後、青色の吸収をアントスリーダー（Ａｎｔｈｏｓｒｅａｄｅｒ，Ｐｒｏｔｏｎ＆Ｗｉｌｔｏｎ）分光光度計によって６９０ｎｍで測定した。測定値は、０−１７５Ｕ／ｍｌの範囲のフィターゼ活性を表示する。フィターゼ活性はＥＰＯ４２０３５８Ａ号に記載されたように測定した。
【００３３】
キシラナーゼ活性アッセイ：
上清（必要な場合は予備希釈）を０．２５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で５倍希釈する。希釈した上清２０μｌをマイクロタイタープレートに移し、５０μｌの基質（脱ミネラル水で７０℃で溶解させた４％ｗ／ｖレマゾールブリリアントブルー（Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）ＲＢＢ−キシラン）を加え、ピペットで吸引吹き出しを繰り返し十分に混合した。反応物を３０分室温で保温した。９６％エタノール２００Ｌのを添加して反応を停止させ、室温で１０分保温した。反応が停止した後、マイクロタイタープレートをベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＰＧＫ遠心機で２５００ｒｐｍ、室温、１０分遠心する。１００Ｌの上清を新しいマイクロタイタープレートに移し、青色の吸収をアントスリーダー（Ｐｒｏｔｏｎ＆Ｗｉｌｔｏｎ）分光光度計によって６２０ｎｍで測定した。比活性は、０．２５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解したキシラナーゼ標準物質を用いてカリブレーション曲線から算出する。測定値は、０−１５０ＥＸＵ／ｍｌの範囲のキシラナーゼ活性を表示する。キシラナーゼ活性単位はＥＰ４６３７０６Ａ号のように規定される。
【００３４】
ＲＮＡの単離：
Ａ．チュビゲンシス（ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）株ＤＳ１１６８１３（ＣＢＳ３２３．９０）を、０．１％酵母抽出物および３％エンバクスペルトキシラン（Ｓｅｒｖａ）を補充した以下を含むアスペルギルス最少培地で培養した：１リットルにつき以下を含む：６ｇＮａＮＯ３、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．１２ｍｌの４Ｍ  ＫＯＨ、０．５２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１１ｍｇのＨ３ＢＯ３、５ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．６ｍｇのＣｕＳＯ２・５Ｈ２Ｏ、５ｍｇのＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．５ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＥＤＴＡ、１０ｇのグルコース。１００ｍｌの培地に２ｘ１０８の胞子を接種し、３０℃、３００ｒｐｍで４８時間回転振盪インキュベーターで培養した。ミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）ろ過ラップを用いてろ過によって菌糸を採集し、脱ミネラル水で十分に洗浄し、ペーパータオルで絞って余分な水を除去した。菌糸を液体窒素で直ちに凍結し、乳鉢と乳棒で微細粉末にした。得られた粉末を滅菌した５０ｍｌの試験管に移し、重量を測定し、粉砕菌糸１−１．２ｇずつに１０ｍｌのトリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を加えた（試験管当たり最大２５ｍｌ）。菌糸粉末を直ちに激しく混合して（ボルテックスミキサーで１分混合）可溶化し、その後ときどき混合しながら室温で５分放置した。クロロホルム０．２容（最初のトリゾールに対して）を加えた（したがって、最初に用いた１０ｍｌのトリゾール毎に２ｍｌのクロロホルム）。さらに、ボルテックスミキサーで攪拌し、室温で１０分間放置した。続いて、混合物を４℃で６０００ｇ、３０分遠心した。もっとも上部の水相を新しい試験管に移し、０．５容（最初のトリゾールに対して）のイソプロピルアルコールを添加して（したがって最初に用いたトリゾール１０ｍｌ毎に５ｍｌのイソプロピルアルコール）全ＲＮＡを沈澱させた。室温で１０分沈澱させた後、ＲＮＡを６０００ｇで３０分遠心して回収した。上清の除去に際してＲＮＡペレットを１容の７０％エタノールで洗浄した。エタノールを除去した後、ＲＮＡペレットを風乾した。乾燥ＲＮＡペレットを３ｍｌＧＴＳ緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４Ｍのグアニジウムチオシアネート、０．５％ナトリウムラウリルサルコシネート）に溶解した。１０μｌのＲＮＡ溶液を用いて核酸の品質および濃度を決定した。
【００３５】
ＣｓＣｌ溶液中での遠心によるＲＮＡ精製：
単離ＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）の方法を改変した方法でさらに精製した。ＣｓＣｌ／ＥＤＴＡ溶液は、７０ｍｌの１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に９６ｇのＣｓＣｌを溶解して調製した。ＤＥＰＣを最終濃度０．１％に加えた。この溶液を室温で３０分放置し、続いて１．０３ｘ１０５Ｐａ（１５ｐｓｉ）で２０分、液体循環中でオートクレーブした。溶液を冷却し、容積をＤＥＰＣ処理水で１００ｍｌに調整した。このＣｓＣｌ／ＥＤＴＡ溶液１．５ｍｌをそれぞれのポリアロマー超遠心管（５．０８ｃｍｘ１２．７ｃｍ（２インチｘ５インチ）、５ｍｌ容量）に加えた。３ｍｌのＲＮＡサンプル（ＧＴＳ中）を１．５ｍｌのＣｓＣｌ／ＥＤＴＡのクッション上に重層した。超遠心管に上から５ｍｍ以内までＧＴＳを満たした。充填超遠心管をＧＴＳで正確にバランスさせ、適合する超遠心バケットに静置した。超遠心管を２０℃、３５０００ｒｐｍで１８時間、緩慢加速で遠心し、減速ブレーキはＯＦＦにした。遠心後、ＣｓＣｌクッション上の上部層およびクッション部分を清浄なパスツールピペットでそれぞれ除去した（０．５ｃｍのＣｓＣｌクッションは遠心管に残した。遠心管の底を熱した剃刀の刃で切断し、残りの液を除去した。室温で遠心管の底に７０％エタノールを満たした。遠心管の底を逆にして風乾した。ＲＮＡペレットを１ｍｌのＴＥ（ファルマシア（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）ｍＲＮＡ精製キットの溶出緩衝液；ｍＲＮＡ単離の項参照）に溶解させた。再び１０μｌを取り、質および量をチェックした。
【００３６】
ｍＲＮＡ単離：
ｍＲＮＡの単離では、ファルマシア精製キット（Ｃａｔ＃２７−９２５８−０２）の改変プロトコル（遠心の代わりに重力による流れを用いる）を用いた。ファルマシアカラムを繰り返し逆さにして完全に再懸濁させ、重力による流れによってカラムを詰めた。カラムを５０℃に置き、１ｍｌの高塩緩衝液で洗浄した。ＲＮＡ溶液（ＴＥ中）を６５℃に５分加熱し、２００μｌのサンプル緩衝液を添加し、ＲＮＡ溶液をカラムにロードした。フロースルーを集め、再度カラムにロードした。カラムを０．５ｍｌの高塩緩衝液で３回洗浄し、続いて低塩緩衝液０．５ｍｌで数回、もはやＵＶ吸収物質がカラムから溶出されなくなるまで洗浄した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを予め加温した（６５℃）溶出緩衝液で溶出させ、０．２５ｍｌの４−５フラクションを集めた。種々のフラクションの濃度を分光時計で決定し、Ｏ．Ｄ．２６０／２８０比が少なくとも１．５であるフラクションをプールした。０．１容のサンプル緩衝液および２容の絶対アルコールを添加し、この溶液を−２０℃で一晩保温した。
【００３７】
ノザン分析：
電気泳動緩衝液として１ｘＭＯＰＳ（２０ｍＭのＭＯＰＳ／ｐＨ７．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用い、６％ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで電気泳動してＲＮＡを分離した。サンプル（約１０Ｇの全ＲＮＡまたは１ＧのｍＲＮＡ）を総容積２０Ｌのローディング緩衝液（最終濃度：２０ｍＭ  ＭＯＰＳ／ｐＨ７．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、６％ホルムアルデヒド、５０％ホルムアミド、０．０５Ｇエチジウムブロマイド）に溶解し、６８℃で１０分加熱して変性させた。３−４時間１００Ｖで電気泳動した後、ＵＶイルミネーターを用いてＲＮＡを可視化した。ノザン分析の場合は、ゲルを脱ミネラル水で２０分洗浄し、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に毛細管現象ブロッティングによって移した。８０℃で２時間オーブンで加熱してＲＮＡを膜に固定した。ＥＣＬ（登録商標）システムまたは文献に記載された標準的放射能標識技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９））によって固有の転写物が検出された。
【００３８】
アルカリ性アガロースゲルでの電気泳動によるｃＤＮＡの分析：
このコントロール分析工程は合成されたｃＤＮＡのサイズを明らかにし、ヘアピン構造の潜在的存在のチェックとして用いられた。第二鎖合成の比活性は第一鎖合成の比活性よりもはるかに低いので、使用した第二鎖合成の容積は第一鎖合成の容積の１０倍であった。５４ｍｌの水に０．６ｇのアガロースを融解し、５５℃に冷却し、６ｍｌの１０ｘアルカリ緩衝液（０．３ＭのＮａＯＨ、２０ｍＭのＥＤＴＡ）を加え、混合して型に入れ薄い１％アガロースゲルを調製した。サンプルを２ｘアルカリゲルローディング緩衝液（３０ｍＭのＮａＯＨ、２０％グリセロール、１／１０容積の飽和ブロモフェノールブルー）と混合（１：１）した。サンプルを１ｘのアルカリ緩衝液中で泳動した（３２Ｐ標識分子量マーカーを平行して泳動）。ゲルを７％酢酸で３０分固定し、ワットマン３ＭＭペーパーにブロットして乾燥させた。乾燥ゲルでＸ線フィルムを感光させ、このフィルムを自動フィルムプロセッサーで現像した。
【００３９】
ｃＤＮＡ合成：
ｃＤＮＡ合成にはスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）（登録商標）チョイスシステム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）およびストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）ｃＤＮＡ合成キットの両方を用いた。ｃＤＮＡをスーパースクリプト（登録商標）チョイスシステムで合成する場合は、５μｇのｍＲＮＡを製造元の指示に従い用いた。ただしオリゴヌクレオチド６９６７は第一鎖合成に用い、オリゴヌクレオチド７６７６（５'−燐酸化）および７６７７（非燐酸化）はアダプターとして用いた。オリゴヌクレオチド７６７６および７６７７のアニーリングは、等モル量の両オリゴヌクレオチド（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２中）を混合することによって実施した。混合物は８０℃の温浴中で１０分保温し、その後で温浴水を室温にゆっくりと冷却した。
【００４０】
ストラタジーンｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを合成する場合は、プロトコルは開示のｐＧＢＦＩＮでのクローニングのために最適にした。主要な違いは以下のとおりであった：１）合成ｃＤＮＡ量は沈澱によって定量した。２）ｃＤＮＡの末端の燐酸化は省略し、ｃＤＮＡはベクターＤＮＡに燐酸化末端で連結した。３）ｃＤＮＡはフェノール／クロロホルムでＸｈｏＩによる消化の後で（サイズ分画後ではなく）抽出する。４）第一鎖合成でＭＭＬＶ−ＲＴ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）およびサーモスクリプト（ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）の両方を使用することによっていずれか一方の酵素のみを用いた場合よりも常に長いｃＤＮＡが得られた。５）〔α３２Ｐ〕ｄＡＴＰ（合成との干渉を防ぐために８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識したコントロール反応を品質制御のために一緒に実施した。
【００４１】
第一鎖成分およびポリ（Ａ）＋ＲＮＡを一緒にしプロトコルにしたがって混合し、１０分室温で放置してプライマーと鋳型をアニーリングさせた。１．５μｌのＭＭＬＶ−ＲＴ（５０Ｕ／μｌ）および１μｌのサーモスクリプト（１５Ｕ／μｌ）（ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を第一鎖の反応に加え、５０μｌの最終反応容積を得た。混合しながら５μｌの反応混合物を取り、０．５μｌの〔α３２Ｐ〕ｄＡＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に加え、放射性第一鎖のコントロール反応を得た。第一鎖合成反応を３７℃で０．５時間保温し、続いて５５℃で０．５時間保温した。
非放射性第一鎖合成反応を氷上に静置し、２０μｌの１０ｘ第二鎖緩衝液、６μｌの第二鎖ｄＮＴＰ混合物、１１４μｌの滅菌蒸留水、２μｌの〔α３２Ｐ〕ｄＡＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、２μｌのリボヌクレアーゼＨ（１．５Ｕ／μｌ）および１１μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ（９．０Ｕ／μｌ）を加えた。反応混合物を混合しながら１６℃で２．５時間保温した。保温後、１０μｌを取り出し凍結した。
【００４２】
ＴＣＡ沈澱によって合成されたｃＤＮＡ概算量：
第一鎖放射性（コントロール）反応の１μｌを２０μｌの水と混合した。このようにして得た５μｌの溶液でワットマンガラス線維ろ紙（ＧＦ／ＣまたはＧＦ／Ａ、直径２３ｍｍ）にスポットを付け（各コントロール溶液について４ｘ）、風乾した。このフィルターを２００ｍｌの氷冷５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）および２０ｍＭのピロリン酸ナトリウムに移した。氷冷ＴＣＡ／ピロリン酸ナトリウム溶液を２分毎に３−４回交換した。フィルターを７０％エタノールで室温で２分洗浄した。各フィルターをシンチレーションバイアルに入れ、１０ｍｌのシンチラントを加えて放射性物質を計測し、ｃＤＮＡの比活性を算出した。
【００４３】
ｃＤＮＡ末端の平滑端形成とアダプターの連結：
第二鎖合成反応物に、２３μｌの平滑端形成ｄＮＴＰ混合物および２μｌのｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）を加え、反応混合物を７２℃で３０分保温した。反応混合物をフェノール／クロロホルム（２００μｌ溶液１：１（ｖ／ｖ）、ｐＨ７−８）、クロロホルム（２００μｌ）で抽出し、さらに２０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび４００μｌの絶対エタノールを添加し、続いて−２０℃で一晩保温してｃＤＮＡを沈澱させた。遠心によってｃＤＮＡを採集し、７０％エタノールで洗浄し、得られたｃＤＮＡペレットを風乾し、８μｌのアダプター溶液に再懸濁した。１μｌの１０ｘリガーゼ緩衝液、１μｌのｒＡＴＰおよび１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、この連結混合物を８℃一晩または４℃２日間保温した。次に、このリガーゼを７０℃３０分保温して不活化した。
【００４４】
ｃＤＮＡの制限酵素消化およびサイズ分画：
１０μｌの滅菌水（省略した燐酸化工程の容積を埋め合わせるため）、２８μｌの制限酵素緩衝液および３μｌの制限酵素（４０Ｕ／μｌ）をｃＤＮＡに加えた。反応物を３７℃で１．５時間保温した。３０μｌの滅菌水および１０μｌの１０ｘＳＴＥを加え、反応混合物を１００μｌのフェノール／クロロホルム、続いて１００μｌのクロロホルムで抽出した。２００μｌの絶対エタノールを添加後（さらに−２０℃で一晩沈澱）遠心によってｃＤＮＡを採集し、風乾して１４μｌの１ｘＳＴＥに再懸濁し、これに３．５μｌのカラムローディング染料を添加した。
【００４５】
セファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＣＬ−２Ｂ）マトリックスおよびＳＴＥ緩衝液を室温で平衡化し、再懸濁して１ｍｌガラスピペットのカラムに充填するために用いた。セファロースマトリックスを落ち着かせた後で、カラムを１０−１５ｍｌのＳＴＥで洗浄した。サンプルをロードし、その後３ｍｌのＳＴＥを添加し、０．３ｍｌの分画を採集した（全工程をガイガーカウンターでモニターした）。各分画の放射能活性をシンチレーションカウンターでの測定によって概算した。
【００４６】
非変性ゲル電気泳動による分析：
３ｍｌの１０ｘＴＢＥ、５ｍｌの３０％アクリルアミド〔（ｗ／ｖ）、アクリルアミド：ビス−アクリルアミド＝２９：１〕、および２２ｍｌの水を混合し、脱気し、新しく作製した１０％過硫酸アンモニウム１５０μｌ、および２０μｌのＴＥＭＥＤを添加した。この溶液をゲル型作製に用い、固まるまで放置した。放射能活性を含む８μｌの各分画（カラムから採集）を取り、２μｌの５ｘローディング緩衝液と混合した。放射能標識分子量マーカーを横に並べてサンプルをロードし、電気泳動を実施した。電気泳動後、１００ｍｌの７％酢酸で２０−３０分固定し、ワットマン３ＭＭペーパー上で乾燥させ、Ｘ線フィルムを感光させた。
【００４７】
ｃＤＮＡ分画のプロセッシング：
非変性ゲル電気泳動の結果を基にして、所望サイズの分布をもつ分画をプールした（通常、０．５ｋｂ以上のｃＤＮＡを含む分画を集める。所望の場合は、選別した種々のサイズの分画をベクターと連結してサブライブラリーを構築してもよい）。
【００４８】
プールした分画の２μｌを取り、ワットマンＧＦ／Ｃフィルターにスポットした。フィルターを１０ｍｌの氷冷ＴＣＡ／ピロリン酸溶液で３回洗浄し、１０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ液体シンチラントで計測して存在するｃＤＮＡ量を概算した。２容の絶対アルコールを添加して−２０℃で一晩プールした分画を沈澱させ、遠心して沈澱物を集めた。沈殿物に精製ｔＲＮＡを担体として１０μｇ／ｍｌ添加して補強した。洗浄し、ペレットを風乾し、１０−２０ｎｇ／μｌの濃度で滅菌ＴＥまたは水に再懸濁した。過剰モル比（５：１）でｃＤＮＡをＤＮＡベクターに連結した。続いてこの連結混合物でＸＬ１０−ゴールド細菌細胞（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を対応するプロトコルにしたがって形質転換させた。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１−１】図１−１は、中間発現ベクター、ｐＧＢＴＯＰ８の構築を示す。この構築の詳細は本文に提示されている。
【図１−２】図１−２は、中間発現ベクター、ｐＧＢＴＯＰ８の構築を示す。この構築の詳細は本文に提示されている。
【図２Ａ】図２Ａは、発現ベクター、ｐＧＢＦｉｎ２の構築を示す。この構築の詳細は本文に提示されている。
【図２Ａ−１】図２Ａ−１は、発現ベクター、ｐＧＢＦｉｎ２の構築を示す。この構築の詳細は本文に提示されている。
【図２Ａ−２】図２Ａ−２は、発現ベクター、ｐＧＢＦｉｎ２の構築を示す。この構築の詳細は本文に提示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、発現ベクター、ｐＧＢＦｉｎ５の構築を示す。この構築の詳細は本文に提示されている。
【図３】図３は、ｐＧＢＦｉｎ１２の物理的地図を示す。
【図４】図４は、ｐＧＢＦｉｎ１１の物理的地図を示す。
【図５】図５は、ｐＧＢＦｉｎ１３の物理的地図を示す。
【図６】図６は、ｐＧＢＦｉｎ１７の物理的地図を示す。
【図７】図７は、ｐＧＢＦｉｎ１８の物理的地図を示す。
【図８】図８は、ｐＧＢＦｉｎ２２の物理的地図を示す。
【図９】図９は、ｐＧＢＦｉｎ１９の物理的地図を示す。
【図１０】図１０は、ｐＧＢＦｉｎ２３の物理的地図を示す。
【図１１】図１１は、ｐＧＢＦｉｎ６の物理的地図を示す。
【図１２】図１２は、ｐＡＮ８−１の物理的地図を示す。
【図１３】図１３は、ｐＧＢＦｉｎ１４の物理的地図を示す。
【図１４】図１４は、ｐＧＢＦｉｎ１５の物理的地図を示す。
【実施例】
【００５０】
実施例１
１．１  発現ベクターｐＧＢＦｉｎ２の説明及び構築
１．１．ａ  原理
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における発現スクリーニングを、組み合わせて使用するときに最適の結果を生じる多数の因子により改善することができた。効果的な形質転換系が、十分な数の真菌の形質転換体を得るために好ましい。クローニング手順の間、ライブラリー中のｃＤＮＡを無傷に維持することに注意すべきである。更にｃＤＮＡの遺伝子産物の発現レベルが十分に高くなるときに、スクリーニングは最も成功するだろう。それゆえ、発現クローニング構築物において、ｃＤＮＡの発現を駆動するために使用する機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）は、高度に発現する遺伝子に由来した。組み込み系において、発現カセットは、好ましくは高度に発現し、より好ましくはゲノム内で増幅した遺伝子座に向けられる。本実施例においては、アスペルギルス・ニガー株ＤＳ２９７８（ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｒｎ  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓに１９９７年４月８日に寄託。受託番号ＣＢＳ  ６４６．９７)のゲノム内に３コピーが存在するｇｌａＡ遺伝子座を選択した。この遺伝子座を効率的にターゲティングし、かつ異なるｃＤＮＡクローニングストラテジーを許容するように設計された幾つかの発現ベクターを構築し、試験した（実施例１−７参照）。
【００５１】
１．１．ｂ  組込型発現ベクターの基本設計
糸状菌ゲノムへのターゲティングされた組み込みには直線状ＤＮＡ分子が好ましい。更に５’及び３’末端（フランキング）は好ましくは所望の組み込み部位に対して相同なＤＮＡから構成されている。それゆえ形質転換断片は、発現カセット（興味の対象となる遺伝子は適切なプロモーター及びターミネーターにより制御される）及び５’及び３’ターゲティングドメインにより隣接される選択マーカーを含んでいる。これらの断片をエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターへクローニングし、プラスミドを増殖させた。得られた発現ベクターは、形質転換断片の直線化及び単離の間にエシェリキア・コリ配列が除去されるように設計されていた。
【００５２】
形質転換体の選択のために、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡプロモーターにより発現が制御されるａｍｄＳ選択マーカーを使用した。強力なｇｐｄＡプロモーターの使用は、１コピーの形質転換体において優勢な結果を生じるだろう。
【００５３】
高い発現レベルを達成するために、ｃＤＮＡをｇｐｄＡプロモーターに融合した。（希な切断（ｒａｒｅ  ｃｕｔｔｉｎｇ））酵素（例えば、ＰａｃＩ及びＡｓｃＩ［実施例１],ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ［実施例４及び６］又はＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ[実施例７])に対する唯一の制限部位の幾つかの組み合わせを１対の組込型発現ベクターのｇｌａＡプロモーターの提案されている転写開始点に導入した。
ｒＤＮＡ分子のゲノムへの定方向挿入（ターゲティング）は相同組換えにより起こるので、ｒＤＮＡカセットは好ましくはゲノムの標的部位に相同なＤＮＡ断片によって隣接されている。
【００５４】
それゆえ、組み込みカセットは、５’及び３’末端において、ｇｌａＡ遺伝子座に相同な約２ｋｂのＤＮＡに隣接されている。構築物からのエシェリキア・コリＤＮＡの除去を促進するために、唯一のＮｏｔＩ部位を導入した（ＮｏｔＩ制限部位は希であり、それゆえ導入したｃＤＮＡの好ましくない分解の危険性を最小化する）。
【００５５】
１．１．ｃ  中間体発現ベクターｐＧＢＴＯＰ８の構築
オリゴヌクレオチドＡＢ５３５８及びＡＢ５３５９を等モル量でアニールし、ｐＴＺ１８ＲのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に結合した。このようにしてＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ−ＳｎａＢＩ−ＨｉｎｄＩＩＩポリリンカー（ＥｃｏＲＩ部位は回復しなかった）を導入した。得られたプラスミドをｐＧＢＴＯＰ１と命名した。ｇｌａＡ遺伝子のプロモーター領域を含む１．８ｋｂ  ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドｐＡＢ６−１（１５．５ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片上に全アスペルギルス・ニガーｇｌａＡ遺伝子座を含み、本発明者等の以前の特許の１つであるＥＰ−Ａ−０６３５５７４に記載されるようにしてｐＵＣ１９にクローニングしたもの）から単離し、プラスミドｐＧＢＴＯＰ１のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位へクローニングし、プラスミドｐＢＧＴＯＰ２を得た。
【００５６】
ｇｌａＡの３’非コード領域に対する構築物のターゲティングを媒介するために、この領域の２つの異なる部分を、発現カセットのいずれかの側にクローニングした。これらの部分を３’ｇｌａＡ及び３’’ｇｌａＡと命名した。後者はこの領域の最も下流部分に存在する。
【００５７】
３’’ｇｌａＡ断片を、オリゴヌクレオチドＡＢ５２９１及びＡＢ５２９２（オリゴＡＢ５２９１は好ましくないＥｃｏＲＩ部位を崩壊するように設計された）を使用してＰＣＲにより生成した。生成したＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドＡＢ５３６１及びＡＢ５２９２を使用した第2のPCR反応おいて鋳型として使用して、断片内にＮｏｔＩ部位を形成した。ＰＣＲ断片をＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＧＢＴＯＰ２の対応の制限部位へクローニングし、ｐＧＢＴＯＰ５を得た。
【００５８】
３’非コード領域における好ましくないＥｃｏＲＩ部位を、ＰＣＲアプローチを使用して崩壊させた。融合ＰＣＲ反応を、オリゴＡＢ５２８８（５’），ＡＢ５２９３（３’リバース），ＡＢ５２９０（内部、リバース）及びＡＢ５２８９（内部、コーディング）を使用して行った。オリゴＡＢ５２９０及び５２８９は、その位置におけるＥｃｏＲＩ部位の崩壊のために設計されたオリゴと相補的であった。一方、オリゴＡＢ５２９３は第２のＥｃｏＲＩ部位を崩壊するように設計されていた。得られた融合ＰＣＲ生成物をＳｎａＢＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＧＢＴＯＰ２の対応の部位へクローニングし、ｐＧＢＴＯＰ６を得た。ｐＧＢＴＯＰ６を、オリゴヌクレオチドＡＢ５３６３及びＡＢ５５６７を使用した第２のＰＣＲ反応において鋳型として使用した。得られたＰＣＲ生成物をＳｎａＢＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＧＢＴＯＰ５の対応の部位へクローニングし、プラスミドｐＧＢＴＯＰ８を得た(図１参照)。
【００５９】
１．１．ｄ  ｐＧＢＦｉｎ２の構築
オリゴヌクレオチド６９６３及び７２６６、１０ｎｇのベクターｐＡＢ６−１（ＥＰ−Ａ−０６３５５７４）を鋳型として使用して、ＰｇｌａＡ特異的ＰＣＲ断片を生成した。この断片をＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで消化して、ＥｃｏＲＩ及びＳｎａＢＩで消化したベクターｐＧＢＴＯＰ−８へ導入し、ベクターｐＧＢＦｉｎ１を得た。導入されたＰＣＲ断片の配列を配列分析により確認した。
【００６０】
ＸｈｏＩ部位をＰｇｐｄＡ−ａｍｄＳ断片へＰＣＲにより導入した。オリゴヌクレオチド７４２３及び７４２４並びにプラスミドｐＧＢＡＡＳ１（ＥＰ−Ａ−０６３５５７４）を鋳型として使用して、３．１ｋｂ断片を生成した。この断片をＥｃｏＲＩで消化し、ｐＴＺ１９ＲのＥｃｏＲＩ部位へ導入し、プラスミドｐＴＺａｍｄＳＸ−１を得た。ｐＴＺａｍｄＳＸ−１の２．６ｋｂ  ＸｈｏＩ−ＣｌａＩを、プラスミドｐＧＢＡＡＳ−１由来の対応の断片で置換し、ＰＣＲ過程により生じる変異を回避した。ｐＴＺａｍｄＳＸ−１の０．５ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＣｌａＩを、プラスミドｐＴＺａｍｄＳＸ−１由来の対応の断片で置換し、ＰＣＲ過程により生じる変異を回避した。得られたプラスミドｐＴＺａｍｄＳＸ−２の残りの０．５ｋｂ断片の配列分析により、ＰｇｐｄＡ断片における単一の変異が明らかになった。
【００６１】
ＰｇｐｄＡ−ａｍｄＳ選択カセットを含む３．１ｋｂ  ＸｈｏＩ断片をベクターＰＴＺａｍｄＳＸ−２から単離し、ｐＧＢＦｉｎ１の唯一のＸｈｏＩ部位に導入し、ベクターｐＧＢＦｉｎ２を得た(図２参照)。
【００６２】
１．２  発現ベクターｐＧＢＦｉｎ２を使用したフィターゼの発現
１．２．ａ  原理
アスペルギルス・ニガーＤＳ２９７８のｇｌａＡ遺伝子座に対する発現構築物の効率的なターゲティング及び興味の対象となるｃＤＮＡの十分に高い発現レベルは、アスペルギルス・ニガーの発現スクリーニングの最適な適用にとって好ましい。それゆえ、発現構築物の性質を、ｇｌａＡ遺伝子座に組み込まれた遺伝子コピーあたりの予想されるタンパク質生産が過去に確立されているモデル遺伝子ｐｈｙＡを使用して試験した。
【００６３】
１．２．ｂ  フィターゼ発現ベクターｐＧＢＩＦｉｎ５の構築
ｐｈｙＡ断片を、オリゴヌクレオチド６９６４及び６９６５並びにプラスミドｐＡＦ２−２Ｓ（ＥＰ−Ａ−０４２０３５８に記載)を鋳型として使用したＰＣＲにより生成した。
ＰＣＲ断片をベクターｐＴＺ１８ＲのＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＴＺＦｙｔ１を得た。ｐＴＺＦｙｔ１挿入物の配列分析により、ｐＡＦ２−２Ｓに存在する配列に由来する偏差（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）が無いことが明らかになった。完全なｐｈｙＡ配列を含む１．７ｋｂ  ＡｓｃＩ−ＰａｃＩ断片をｐＴＺＦｙｔ１から単離し、ＡｓｃＩ−ＰａｃＩで消化したｐＧＢＦｉｎ２にクローニングし、ベクターｐＧＢＦｉｎ５を得た(図２参照)。
【００６４】
１．２．ｃ  アスペルギルス・ニガーＤＳ２９７８のｐＧＢＦｉｎ５による形質転換
プラスミドｐＧＢＦｉｎ５（１００ｇ）をＮｏｔＩ  １５０単位を用いて３７℃で４時間消化した。等容量のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：２３：１）による抽出によりタンパク質を除去した。アルコール沈殿によりＤＮＡを濃縮し、記載されるようにしてアスペルギルス・ニガーＤＳ２９７８の形質転換に使用した。形質転換体を選択的最小培地プレートで精製し、続いて保存した。
【００６５】
１．２．ｄ  ｐＧＢＦｉｎ５形質転換体の分析
ｇｌａＡ遺伝子座に対する組み込みカセットのターゲティングを、オリゴヌクレオチド５４５４及び５４５６を使用して、２４の独立した形質転換体に対して分析し、更にｐｈｙＡ特異的オリゴヌクレオチド６９６４及び６９６５を使用して、ｐｈｙＡ遺伝子の存在について分析した。
【００６６】
ｇｌａＡ遺伝子座に対するｐＧＢＦｉｎ５組み込みカセットの正確なターゲティングのＰＣＲ産物表示を、多数の形質転換体（２４のうちの１２＝５０％）で見いだされたが、すべての形質転換体がそのゲノム内のｐｈｙＡコピーの存在についてのＰＣＲ産物表示を示した。
【００６７】
６つの陽性形質転換体を、振盪フラスコ発酵試験におけるフィターゼ生産について分析した。すべての形質転換体についてのフィターゼ活性は１４０−１８０Ｕ／ｍｌであった。このような生産レベルは、各形質転換体のｐＧＢＦｉｎ５の１コピーの組み込みの指標となる。
【００６８】
ターゲティング頻度及び発現レベルは、発現クローニング実験における設計した発現系の使用に十分であると結論付けた。
【００６９】
実施例２
２．１  ｃＤＮＡライブラリーの構築及び分析
２．１．ａ  原理
発現ライブラリーを、興味の対象となる転写物を含んでいると予想されるｍＲＮＡのプールから構築した。このため、誘導条件下で増殖させた培養から単離した菌糸体に由来するｍＲＮＡを単離することが好ましい。但し、通常は必要ない。単離したｍＲＮＡを興味の対象となる転写物の存在及びｍＲＮＡの質について分析した。ｍＲＮＡが無傷かつ興味の対象となる転写物を含んでいる場合、ｃＤＮＡの合成に使用することができる。発現ベクターｐＧＢＦｉｎ２におけるｃＤＮＡのクローニングは、ｃＤＮＡの５’末端におけるＰａｃＩ部位の存在及び３’末端におけるＡｓｃＩ部位の存在を要求する。それゆえ、第１の鎖プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）オリゴヌクレオチド及び使用するアダプター配列をこれらの要求を満たすように設計した。アダプターを、ｐＧＢＦｉｎ２におけるＰａｃＩ部位と適合するが、一方ＰａｃＩ部位はベクターのｃＤＮＡの結合後は回復しないように設計した。これにより、ｃＤＮＡ挿入物を含むベクター分子と可能な挿入物を含まないベクター分子との区別が可能になった。
【００７０】
２．２  エイ・チュビゲンシス（Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）由来のｃＤＮＡライブラリーの製造。キシラナーゼ活性について誘導されたｍＲＮＡ
エイ・チュビゲンシスＤＳ１１６８１３（ＣＢＳ  ３２３．９０）を誘導条件下で増殖させた。培養サンプルを異なる時点で採取し、キシリナーゼ活性について分析した。培養６６時間後に最大活性に達したが、キシリナーゼ活性レベルは実験開始７日後まで一定を維持した。菌糸体サンプルを異なる時点で採取し、全ＲＮＡをこれらのサンプルから単離した。ｘｙｌＡ特異的転写物の存在を、キシリナーゼ特異的プローブを使用したノーザンブロット実験において分析した。誘導48時間後に、最大ｘｙｌＡ  ｍＲＮＡレベルが測定されたが、ｘｙｌＡ  ｍＲＮＡは６６時間後も検出可能であった。
【００７１】
誘導培地中の菌糸体の延長したインキュベート後では、ｘｙｌＡ  ｍＲＮＡは検出されなかった。すべての場合において、ｘｙｌＡ特異的転写物は明らかに無傷であった。誘導４８時間後に単離した全ＲＮＡより、mRNAを単離した。ｘｙｌＡ  ｍＲＮＡが無傷であることが示されたノーザン分析後、このｍＲＮＡをオリゴヌクレオチド６９６７を第１鎖合成用のプライマーとして使用したｃＤＮＡ合成（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭｃｈｏｉｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ［Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ］に従う)に使用した。ＰａｃＩ特異的リンカーのアニール後、ｃＤＮＡをＡｓｃＩで消化し、ｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭｃｈｏｉｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ［Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ］）を備えたセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）カラムを使用してサイズ分離した。ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを、サンプル中の完全ｘｙｌＡの存在について、ノーザン及びサザンブロット分析並びにＰＣＲ分析により分析した。得られたｃＤＮＡをＡｓｃＩ−ＰａｃＩで消化したｐＧＢＦｉｎ２と結合し、エレクトロポレーションによりエシェリキア・コリへ導入し、約１７０００の形質転換体からなる一次ライブラリーを得た。ランダムの２４のコロニーの分析により、挿入物のない５つのプラスミドが明らかになったが、残りのプラスミドは０．５〜２ｋｂの大きさの挿入物を有していた。エシェリキア・コリライブラリーを、全容積２５ｍｌ  ２ｘＴＹの培地中、プレートを擦過することにより保存した。１０ｍｌ培地を使用してグリセロールストックを調製し、２ｘＴＹを残りのエシェリキア・コリ懸濁液に添加して最終容積を１００ｍｌとした。３７℃で２時間の増殖後、プラスミドＤＮＡを培地から単離した。
【００７２】
実施例３
３．１  アスペルギルス・ニガーにおける発現ライブラリーの構築及び分析
３．１．ａ  原理
アスペルギルス・ニガーＤＳ２９７８を、エシェリキア・コリにおけるｃＤＮＡライブラリーから単離したＤＮＡを使用し、前記実施例２．２に記載されるようにしてて形質転換した。形質転換体を、唯一のN源としてのアセトアミド中での増殖により、ａｍｄＳ選択マーカーの存在について選択した。ａｍｄＳ選択マーカー及びｃＤＮＡ発現カセットは組み込み断片に存在するので、アセトアミド中での増殖はｃＤＮＡ発現カセットの存在についての指標となった。ａｍｄＳ陽性形質転換体の分生子柄を選択培地プレートに移し、偽陽性形質転換体の分離を回避し、続いて凝固したＰＤＡ斜面培養を含むマイクロタイタープレートに移した。このマスターライブラリーを使用して興味の対象となる酵素、例えばキシラナーゼの生成についてスクリーニングした。酵素生成形質転換体を大規模酵素生産に直接使用することについて有用であるので、振盪フラスコ発酵における酵素生成レベルを測定することは興味の対象となる。
【００７３】
３．２  アスペルギルス・ニガーＤＳ２９７８の形質転換
ＤＮＡを、記載されるようにして増幅したエシェリキア・コリｃＤＮＡライブラリーから単離した。全プラスミドＤＮＡ（１００ｇ）をＮｏｔＩ（１５０Ｕ）により３７℃で４時間消化してエシェリキア・コリ由来プラスミド配列を除去し、ＰａｃＩ（３０Ｕ）により消化した。等容積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：２３：１）による抽出によりＤＮＡを精製した後、ＤＮＡをアルコール沈殿により回収し、１００ｌ滅菌純水に溶解した。
【００７４】
複数のアスペルギルス・ニガーＤＳ２９７８形質転換を、２ｘ１０７プロトプラスト及び１０gのプラスミドＤＮＡを使用して行った。３０℃で約１０日間のインキュベート後、１９００の形質転換体を選抜し、分生子柄を選択培地を含むプレートへ移した。３０℃で３日間のインキュベート後、各形質転換体の分生子柄を９６ウェルマイクロタイター皿の個々のウェルに移した。各ウェルは約１００ｌ凝固したＰＤＡを含んでいた。
【００７５】
３．３  アスペルギルス・ニガー発現ライブラリーの分析
個々の形質転換体の分生子柄を、２％カラスムギスペルト小麦キシラン及び２％細菌用寒天＃１（Ｏｘｏｉｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を補充したアスペルギルス最小培地（リットルあたり６ｇ  ＮａＮ０３，０．５２ｇ  ＫＣｌ，１．５２ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，１．１２ｍｌ４Ｍ  ＫＯＨ，０．５２ｇ  ＭｇＳ０４・７Ｈ２Ｏ，２２ｍｇ  ＺｎＳ０４・７Ｈ２０，１１ｍｇ  Ｈ３ＢＯ３，５ｍｇ  ＦｅＳ０４・７Ｈ２０，１．７ｍｇ  ＣｏＣ１２・６Ｈ２０，１．６ｍｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０，５ｍｇ  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２０，１．５ｍｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２０，５０ｍｇ  ＥＤＴＡ，１０ｇ  グルコース）から作成したキシリナーゼ検出プレートに移した。これは未溶解のキシランの存在により濁った外観を有していた。３０℃で２日間のインキュベート後、ハロー（ｈａｌｏ）の形成が１０コロニーで観察された。これはキシランのキシラナーゼによる分解を示している。
【００７６】
陽性形質転換体の分生子柄を単離し、ＰＤＡプレートの接種に使用した。ＤＮＡを単一のコロニーから単離し、オリゴヌクレオチド５４５４及び５４５６を使用してｇｌａＡ遺伝子座（「ターゲティング」）における発現プラスミドの組み込みについてＰＣＲにより分析した。
【００７７】
１７コロニーのうちの８つが、ｇｌａＡ遺伝子座の１つについてターゲティングされることを示した（４７％）。
【００７８】
３．４  形質転換体におけるキシリナーゼ生産
キシラナーゼプレートアッセイにおいて同定されたようにして、キシリナーゼ生産形質転換体を振盪フラスコ発酵中で増殖させた。発酵５日後、培地サンプルを採取し、キシラナーゼ活性について分析した。結果を表１に示す。
【００７９】
３．５  キシラナーゼ生産株の遺伝的分析
３．５．ａ  原理
キシラナーゼをコードする複数の遺伝子が真菌において見いだされている。それゆえ、発現クローニング実験において同定される各キシラナーゼ生産株が同一のｃＤＮＡを含んでいるかどうかを決定することは興味深い。更に個々のキシラナーゼ生産株の間で明瞭な差異が見いだされた。
【００８０】
キシラナーゼをコードする異なる遺伝子の存在又はｃＤＮＡの５’−非コード領域における差異によって差異が生じるだろう。後者はＲＮＡ又はｍＲＮＡ単離手順の間のｍＲＮＡの部分的な破壊又はｃＤＮＡの不完全な合成によるものであろう。このことを調査するために、導入したｃＤＮＡの５’−配列を決定した。
【００８１】
３．５．ｂ  キシラナーゼ生産クローンの分析
記載されるようにして、各キシラナーゼ生産形質転換体用のＰＣＲ鋳型を調製した。形質転換体を、オリゴヌクレオチド６８５６（ｘｙｌＡ内部）及び６９６３（ＰｇｌａＡ）を使用したＰＣＲ実験において、ｘｙｌＡ  ｃＤＮＡを含む発現構築物の存在について分析した。形質転換体＃５Ｃ２及び＃７Ａ８が、ＰｇｌａＡに融合したｘｙｌＡ遺伝子を有する発現カセットを含むことが示された。
【００８２】
オリゴヌクレオチド６９６３（ＰｇｌａＡ特異的）及び６９６７（３’末端ｃＤＮＡ特異的）を使用して、ｃＤＮＡの全体及び２００ｂｐのＰｇｌａＡを含むことが期待されるＰＣＲ断片を生成した。ＰＣＲ断片の部分的ＤＮＡ配列を、６つの形質転換体についてオリゴヌクレオチド６９６３を使用して決定した。
【００８３】
ｘｙｌＡ遺伝子（２クローン）及びｘｙｌＢ（４クローン）の存在の指標となる配列を検出した（ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢＤＮＡ配列は、本発明者等の以前の特許出願ＥＰ−Ａ−０４６３７０６及びＷＯ９４／１４９６５にそれぞれ記載されている）。異なる長さの５’−非翻訳領域を見いだした。しかしながら、ｃＤＮＡの５’−非翻訳領域の長さと異なるｘｙｌＢ形質転換体のキシラナーゼ生産レベルとの間に関係は見いだされなかった。対照的に、短い５’−非翻訳領域が、ＸＹＬＡ活性が有意に減少したｘｙｌＡ陽性形質転換体＃５Ｃ２において見いだされた。しかしながら、生産レベルはプレートアッセイにおけるこの形質転換体の同定に十分であったことは明らかである。
【００８４】
表１．キシラナーゼ生産形質転換体の分析。陽性の形質転換体を、発酵実験におけるキシラナーゼ生産レベルについて分析した。キシラナーゼをコードする遺伝子の同一性を、ｃＤＮＡ挿入物の部分的配列決定により決定した。詳細をテキストに記載する。
【００８５】
【表１】
2010046080.tif 000002
ｎｄ＝検出せず
【００８６】
実施例４
４．１  ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ媒介ｃＤＮＡクローニングに適用可能な組込型発現ベクター（ｐＧＢＦＩＮ１１）の構築及び分析
４．１．ａ  原理
発現ライブラリーをｃＤＮＡのプールから構築した。所望の活性をコードするｃＤＮＡを、前記のスクリーニングフォーマットによりスクリーニング（検出）した。ほとんどの場合において、ｃＤＮＡに制限部位が存在しないことの実際の同定の前には、ｃＤＮＡの正確な特徴（例えば、ｃＤＮＡ内に存在する制限酵素部位）は不明であった。したがって、実施例２に記載する構築物において、所望のｃＤＮＡが内部ＡｓｃＩ部位を含み、スクリーニングすることができない非完全長不活性クローンとしてクローニングされる可能性が存在する。
【００８７】
結果としてプラスミドｐＧＢＦＩＮ１１は、内部制限部位の危険を回避することなしにＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ粘着末端を有するｃＤＮＡのクローニングは許容するように構築された。第１の鎖のｃＤＮＡ合成に使用する３’プライマーは（非−メチル化）ＸｈｏＩ部位を含んでいるが、ｃＤＮＡの合成の間はメチル化ｄＣＴＰを使用した。内部ＸｈｏＩ部位（これらのＸｈｏＩ部位はメチル化され、消化されない）により、結果としてｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの断片化を回避しながらＸｈｏＩで消化するすることができた。ｐＧＢＦＩＮ１１はｐＧＢＦＩＮ２に由来するベクターであり、存在するＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位が、ｃＤＮＡクローニング部位がＰａｃＩ−ＡｓｃＩからＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩへ変化している部位において除去されている。したがって、発現ベクターの全ての特徴及び機能性は、ｃＤＮＡのクローニングに使用する制限部位を除いて同一である。
【００８８】
４．１．ｂ  ｐＧＢＦＩＮ１１ベクターの構築
最初の工程において、ｇｐｄＡプロモーターの５’末端に存在する現存のＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｃａＩ及びＥｃｏＲＩをＰＣＲにより除去し、（希な）カッター部位（ｃｕｔｔｅｒｓｉｔｅ）ＳｎａＢＩを導入して、中間体構築物ｐＧＢＦＩＮ１２を得た。第２のＰＣＲ工程において、現存するｇｌａＡプロモーター及びｃＤＮＡクローニング部位を下記のようにして調節した。Ｉ）現存するＰａｃＩ−ＡｓｃＩ  ｃＤＮＡクローニング部位をＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩクローニング部位へ変化させ、ＩＩ）同時に、プロモーター内のEcoRI部位を不活性化し、ＩＩＩ）同時に、プロモーターを短縮し（ｐＧＢＦＩＮ２の部位５２８９におけるＸｈｏＩ部位から開始する代わりに、ｐＧＢＦＩＮ２の部位６０８４におけるＳａｌｌ部位から出発）及びＩＶ）同時に、部位５２８９に存在するＸｈｏＩ部位を不活性化し、（第２の）希なカッター制限酵素を導入した。得られたプラスミド（ｐＧＢＦＩＮ１１）を図３に示す。
【００８９】
４．２  ベクターｐＧＢＦＩＮ１１を使用したフィターゼの発現
４．２．ａ  原理
ｐＧＢＦＩＮ１１ベクターにおいて、試験する遺伝子（例、フィターゼ）を、ｐＧＢＦＩＮ２ベクターについて実施例１．２に記載されたものと同様の態様で導入した。得られたベクターｐＧＢＦＩＮ１３を、ｐＧＢＦＩＮ５ベクターと平行して試験して、このｐＧＢＦＩＮ１１型ベクターの機能性を証明した。
【００９０】
４．２．ｂ  フィターゼ発現ベクターｐＧＢＦＩＮ１３の構築
ｐＧＢＦＩＮ２ベクター（実施例１；１．２．ｂ）について記載した状況と同様にして、ｐＧＢＦＩＮ１１ベクターの機能性を、モデル遺伝子ｐｈｙＡの使用により試験した。
【００９１】
４．２．ｃ  ｐＧＢＦＩＮ１３を用いたアスペルギルス・ニガーの形質転換
ｐＧＢＦＩＮ２ベクター（実施例１：１．２．ｃ）について記載した状況と同様にして、ｐＧＢＦＩＮ１３ベクターをＮｏｔＩで消化して、形質転換の間にターゲティングに使用することができる直線状断片を生成した。形質転換後、ランダムに選択した形質転換体を精製し、続く分析を許容した。
【００９２】
４．２．ｄ  ｐＧＢＦＩＮ１３形質転換体の分析
更に、ｐＧＢＦＩＮ２ベクター（実施例１；１．２．ｄ）に記載した状況と同様にして、精製したｐＧＢＦＩＮ１３形質転換体を、フィターゼの正確な遺伝子座及び発現のターゲティングについて試験した。ターゲティング頻度及びフィターゼの発現は、ｐＧＢＦＩＮ２形質転換体についての既述の範囲内にあった。したがって、ｐＧＢＦＩＮ１１ベクターについて、頻度及び発現レベルは共に、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ粘着末端を用いたｃＤＮＡの発現クローニングにおける設計した発現システムの使用に十分であると結論付けた。
【００９３】
実施例５
５．１．ａ  原理
ｐＧＢＦＩＮ１１ベクターの機能性を証明するときに、この型のベクター（ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ粘着末端）に基づく完全な発現クローニング系を試験した。ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ  ｃＤＮＡクローニング部位の導入がＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ  ｃＤＮＡクローニングキットの使用を許容するので、新規のｐＧＢＦＩＮ１１ベクターと組み合わせたこの系の適用性（制限消化の間の無傷のｃＤＮＡの消化を回避して３’粘着末端を生成する利益を有する）を試験した。実施例２及び３に記載のものと同様にして、材料及び方法の欄に詳述されるようにして、ｐＧＢＦＩＮベクターのクローニングに最適化したＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥにより、アスペルギルス・ニガー由来のＲＮＡのプールを使用してｃＤＮＡのプール（ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ粘着末端を有する）を生成した。このｃＤＮＡのプールをｐＧＢＦＩＮ１１ベクターにクローニングしてエシェリキア・コリライブラリーを生成した。続いて、クローニング効率をｐＧＢＦＩＮ２ベクターにおける過去のライブラリー構築物と比較した。
【００９４】
５．１．ｂ．  キシラナーゼ誘導アスペルギルス培養由来のｃＤＮＡライブラリーの調製
収穫に際してキシラナーゼを発現することが知られているミセリウム（Ｍｙｃｅｌｉｕｍ）（前記）を使用し、材料及び方法の欄に詳述されているようにして、全ＲＮＡを取り去った（ｓｕｂｓｔｒａｃｔ）。続いて、全ＲＮＡプールをＣｓＣｌクッションを通した遠心分離により更に精製した。ＲＮＡの質をチェックするときに、Ｐｈａｒｍａｃｉａ生成キットを用いた修飾プロトコルによりｍＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成のために、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ  ｃＤＮＡ合成キットを使用した。対応のｃＤＮＡ合成プロトコルを、ｐＧＢＦｉｎベクターへのクローニングの最適化に対して適合させた。主要な適合は下記のものを含んでいた。１）ｃＤＮＡの量を、ＴＣＡによる沈殿により定量化した。２）ｃＤＮＡ末端のリン酸化を省略し、ｃＤＮＡを脱リン酸化されていないベクターＤＮＡに結合した。これにより、１つのベクターへの複数の挿入物の結合を防止した。（全ての挿入物がベクター中に存在しない場合でも、幾つかの発現が妨げられた）。３）サイズ分画化の後ではなくＸｈｏＩを用いた消化の後にｃＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出した。４）ＭＭＬＶ−ＲＴ及びＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔを第１の鎖の合成に使用して、いずれかの酵素単独を使用したときよりも長くないｃＤＮＡを得た。５）対照反応を、[α３２Ｐ]ｄＡＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，合成との干渉を避けるため）を用いて品質について追跡した。修飾プロトコルにしたがいｃＤＮＡのプールを構築した。
【００９５】
ｐＧＢＦｉｎ１１について、十分に二重に消化（ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ）したｐＧＢＦｉｎ１１ベクター（バックグラウンドの結合＜１％）を調製した。生成したｃＤＮＡプールをｐＧＢＦｉｎ１１ベクターへ結合し、エシェリキア・コリＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細菌細胞へ形質転換して、ライブラリーを生成した。
【００９６】
５．１．ｃ  エシェリキア・コリｃＤＮＡライブラリー（ｐＧＢＦｉｎ１１ベクター内）の分析
本実施例においてここまでに記載した手順により、結合及び形質転換の効率の有意な増加が起きた。最適化された手順にしたがい単離したｃＤＮＡのプールを用いて、十分に二重消化したｐＧＢＦｉｎ１１ベクターのプールと組み合わせて、１μｇのｐＧＢＦｉｎ１１から出発して、大きさ１０６−１０７のエシェリキア・コリのライブラリーを得ることができた。
【００９７】
次に、ハイブリダイゼーション実験により、エシェリキア・コリｃＤＮＡライブラリー内のｇｐｄＡ及びｘｙｌＢ  ｃＤＮＡを確立した。ｇｐｄＡ遺伝子は比較的長く、ｘｙｌＢは比較的短いので、完全長クローンの百分率の比較により、生成したｃＤＮＡの質を明らかにし、短い又は長いｍＲＮＡ間において完全長ｃＤＮＡの生成の効率に差異があるか否かを同定することができた。
【００９８】
陽性ｘｙｌＢ及びｇｐｄＡクローンの同定において、選択した数を配列決定して、特定の遺伝子から生ずるｃＤＮＡ集団内の完全長クローンの百分率を決定した。ｇｐｄＡ及びｘｙｌＢ  ｃＤＮＡ共に、完全長クローンの百分率は８５％より高かった。更に配列決定により、複数の挿入物を含んでいるクローンは存在しないことが示された。
【００９９】
したがって、最適化されたＲＮＡ精製、ｃＤＮＡ合成及びクローニングプロトコルは、ｃＤＮＡライブラリーの構築を（ライブラリーの大きさ及び頻度の点、完全長の百分率の点並びに発現ベクター内におけるわずか1つのｃＤＮＡ挿入物のクローニングの点において）かなり改善した。
【０１００】
５．１．ｄ．  ｘｙｌＢ含有ｐＧＢＦｉｎ１１構築物によるアスペルギルス・ニガーの形質転換及びキシラナーゼ活性のスクリーニング
同定し（５．１．ｃで分析した）多数のｘｙｌＢクローンで、アスペルギルス・ニガー（ｐＧＢＦｉｎ５及びｐＧＢＦｉｎ１３ベクターについて記載されたものと同様にして）を形質転換した。選択した数の形質転換体の精製の後、これらの形質転換体をキシラナーゼ活性についてプレート上でスクリーニングした。試験した全ての形質転換体はキシラナーゼプレートアッセイにおいて陽性であり、このことはｐＧＢＦｉｎ１１ベクターのアスペルギルス・ニガーにおける発現クローニング目的に対する適用性を証明している。
【０１０１】
実施例６
６．１  ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ媒介ｃＤＮＡクローニングに適用可能な第２の組込型発現ベクター（ｐＧＢＦｉｎ２２）の構築
６．１．ａ  原理
ｐＧＢＦｉｎ１１ベクターの構築の間、第２のＰＣＲ断片（実施例４に列挙したその他の修飾の中で、グルコアミラーゼプロモーターのＥｃｏＲＩ部位を不活性化するために使用した）を配列決定して、正確な修飾を証明した。このことは、示された制限部位の正確な修飾を証明しただけではなく、グルコアミラーゼプロモーターのより上流部分における多数の小さいPCRエラーをも示した。それゆえ、ｐＧＢＦｉｎ１２の非変化グルコアミラーゼプロモーター領域に基づいて、導入されたPCRエラーが存在せず、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ粘着末端を用いたｃＤＮＡのクローニングに適した新規なベクターを構築した。
【０１０２】
６．１．ｂ  発現ベクターｐＧＢＦｉｎ２２の構築
ｐＧＢＦｉｎ１２（図３）において、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いたエンドフィリング（Ｅｎｄ−ｆｉｌｌｉｎｇ）及びバックライゲーション（ｂａｃｋｌｉｇａｔｉｏｎ）によるＸｈｏＩ消化の後に、残りのＸｈｏＩ部位を不活性化してｐＧＢＦｉｎ１７を得た（図６参照）。ｐＧＢＦｉｎ１７において、残りのＥｃｏＲＩ部位を同様にして除去（ＥｃｏＲＩ消化、続くＴ４ＤＮＡポリメラーゼによるエンドフィリング及びバックライゲーション）して、プラスミドｐＧＢＦｉｎ１８を得た（図７参照）。ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限部位並びに（一緒にアニールしたときに）ＰａｃＩ及びＡｓｃＩに対する粘着末端を含む2つのプライマーをアニールした。プライマーを、アニールしたプライマーをＰａｃＩ及びＡｓｃＩ消化ｐＧＢＦｉｎ１８へクローニングしたときに（外（ｅｘｔｒａ））ＡＴＧがｃＤＮＡのクローニング部位に生成しないように構築した。したがって、ＰａｃＩ及びＡｓｃＩ消化ｐＧＢＦｉｎ１８における記載したアニールしたプライマーのクローニングにより、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ粘着末端を有するｃＤＮＡ用のクローニング部位が生成した。得られたプラスミドをｐＧＢＦｉｎ２２と命名した（図８参照）。
【０１０３】
６．２  ベクターｐＧＢＦｉｎ２２を使用したフィターゼの発現
６．２．ａ  原理
ｐＧＢＦｉｎ２２ベクターにおいて、試験した遺伝子（例えば、フィターゼ）を、ｐＧＢＦｉｎ１１ベクターについて記載した実施例４と同様にして挿入した。
得られたベクターｐＧＢＦｉｎ２５を、その機能性に対するフィターゼ生産について試験した。
【０１０４】
６．２．ｂ  フィターゼ発現ベクターｐＧＢＦｉｎ２５の構築
ｐＧＢＦｉｎ１３をＥｃｏＲＩで消化して、フィターゼ遺伝子を遊離させた。このフィターゼをコードするＥｃｏＲＩ遺伝子断片をｐＧＢＦｉｎ２２にクローニングした。フィターゼ遺伝子の正確な配向についてクローンを同定したとき、このクローンをｐＧＢＦｉｎ２５と命名した。
【０１０５】
６．２．ｃ  ｐＧＢＦｉｎ２５を用いたアスペルギルス・ニガーの形質転換及びｐＧＢＦｉｎ２５形質転換体の分析
ｐＧＢＦｉｎ２５を、それぞれｐＧＢＦｉｎ５及びｐＧＢＦｉｎ１３形質転換体についての実施例１及び４に詳述するようにして、アスペルギルス・ニガーの形質転換及び続く形質転換体の分析に使用した。結果はｐＧＢＦｉｎ１３形質転換体の結果と同様であり、ｐＧＢＦｉｎ２２ベクターの発現クローニング目的についての適用性が証明された。
【０１０６】
実施例７
７．１  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ媒介ｃＤＮＡクローニングに適用可能な組込型発現ベクターｐＧＢＦｉｎ２３の構築
７．１．ａ  原理
これまでに記載した組込型発現ベクターのセットを得るときに、ＨｉｎｄＩＩＩ  ５’粘着末端を用いたｃＤＮＡのクローニングに使用可能な発現クローニングベクターの利用可能性は有用であることを認識した。共にＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ粘着末端を用いてのその他の目的で既に構築されたｃＤＮＡのプールを使用することができた。なぜなら、このアプローチにおいてはグルコアミラーゼプロモーターに対して変化を加えていないからである。
【０１０７】
７．１．ｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ媒介ｃＤＮＡクローニングに適用可能なフィターゼ発現ベクターｐＧＢＦＩＮ２３の構築
ｐＧＢＦｉｎ１７において、残りのＨｉｎｄＩＩＩ部位を除去（ＨｉｎｄＩＩＩ消化、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼエンドフィリング及びバックライゲーション）して、プラスミドｐＧＢＦｉｎ１９を得た（図９参照）。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限部位並びに（互いにアニールしたときに）ＰａｃＩ及びＡｓｃＩに対する粘着末端を含む２つのプライマーをアニールした。プライマーを、アニールしたプライマーをＰａｃＩ及びＡｓｃＩ−消化ｐＧＢＦｉｎ１９へクローニングしたときに（外）ＡＴＧがｃＤＮＡのクローニング部位に生成しないように構築した。
【０１０８】
したがって、ＰａｃＩ及びＡｓｃＩ消化ｐＧＢＦｉｎ１９における記載したアニールしたプライマーのクローニングにより、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ粘着末端を有するｃＤＮＡ用のクローニング部位が生成した。得られたプラスミドをｐＧＢＦｉｎ２３と命名した（図１０参照）。
【０１０９】
７．２  ベクターｐＧＢＦｉｎ２３を使用したフィターゼの発現
７．２．ａ  原理
ｐＧＢＦｉｎ２３ベクターにおいて、試験した遺伝子（例えば、フィターゼ）を、ｐＧＢＦｉｎ１１ベクターについて記載した実施例４と同様にして挿入した。
得られたベクターｐＧＢＦｉｎ２６を、その機能性に対してフィターゼ生産について試験した。
【０１１０】
７．２．ｂ  フィターゼ発現ベクターｐＧＢＦｉｎ２６の構築
本実施例において、フィターゼ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む５’オリゴ及びＸｈｏＩ部位を含む３’オリゴを用いてＰＣＲに付した。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩを用いた消化時に、この断片をｐＧＢＦｉｎ２３に直接クローニングして、ｐＧＢＦｉｎ２６を生成した。フィターゼ遺伝子を含む多数のクローンを単離するときに、フィターゼ挿入物を配列決定して推定のＰＣＲエラーの導入についてチェックした。最後に、正確なｐＧＢＦｉｎ２６プラスミド（コードされるタンパク質配列に変化なし）を選択して、形質転換及び続く分析に使用した。
【０１１１】
７．２．ｃ  ｐＧＢＦｉｎ２６を用いたアスペルギルス・ニガーの形質転換及びｐＧＢＦｉｎ２６形質転換体の分析
ｐＧＢＦｉｎ２６を、それぞれｐＧＢＦｉｎ５、ｐＧＢＦｉｎ１３及びｐＧＢＦｉｎ２５形質転換体についての実施例１、４及び６に詳述するようにして、アスペルギルス・ニガーの形質転換及び続く形質転換体の分析に使用した。結果はｐＧＢＦｉｎ１３形質転換体の結果と同様であり、ｐＧＢＦｉｎ２３ベクターの発現クローニング目的についての適用性が証明された。
【０１１２】
実施例８
８．１  ｃＤＮＡ発現クローニングに適切なＡＭＡ１を基本とするプラスミド発現ベクターの構築（ｐＧＢＦｉｎ６及びｐＧＢＦｉｎ１５）
８．１．ａ  原理
別の実施例において、クローニングしたｃＤＮＡ及び選択マーカーの高度の発現を駆動する機能性をプラスミドに使用して、いわゆるAMA1配列を更に含ませた。結果として、発現クローニングプラスミドが生成し、アスペルギルス内で自律的に維持された。
このタイプのクローニングベクターにおいて、ＡＭＡ１タイプを基本とするベクターを用いて入手可能な高度に効率的な形質転換頻度及びクローニングしたｃＤＮＡの高度な発現を駆動する機能性を組み合わせた。アスペルギルスにおける形質転換体の選択に使用する選択マーカー遺伝子が異なり、ＡＭＡ１を基本とする発現クローニング系のために設計された２つの発現ベクターを構築した。
【０１１３】
８．１．ｂ  ｐＧＢＦｉｎ６ベクターの構築
ｐＴＺａｍｄＳＸ−２（図２参照）をＨｉｎｄＩＩＩで直線化して、アスペルギルス・ニジュランス由来の５．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ＡＭＡ１断片（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ及びＣｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ，１９９８に記載）をそこへクローニングし、中間体プラスミドｐＡＭＡａｍｄＳを得た。次にｐＡＭＡａｍｄＳをＫｎｐ１及びＢｇｌＩＩで消化して、約９ｋｂ  ＡＭＡ１含有断片を単離した。ＫｎｐＩ及びＢｇ１ＩＩを用いたｐＧＢＦｉｎ２ベクターの消化時（図２参照）に、５．２ｋｂグルコアミラーゼプロモーター含有断片を単離した。ｐＧＢＦｉｎ２由来の５．２ｋｂ断片を、ｐＡＭＡａｍｄＳ由来の９ｋｂ断片にクローニングして、ＡＭＡ１−及びアセトアミド−選択を基本とする発現クローニングプラスミドｐＧＢＦｉｎ６（図１１参照）を得た。
【０１１４】
８．１．ｂ  ｐＧＢＦｉｎ１５ベクターの構築
ｐＧＢＦｉｎ６をＸｈｏＩで消化し、グルコアミラーゼプロモーター含有断片を単離した。次に、アスペルギルス・ニジュランスｇｐｄＡプロモーターにより駆動し、ｔｒｐＣターミネーターにより停止する機能性ｂｌｅ遺伝子（フレオマイシン（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ）耐性をコード）を含むプラスミドｐＡＮ８−１（図１２参照）をＰＣＲ反応における鋳型として使用した。ＰＣＲプライマーは、生成する断片が切断された（しかし、完全に機能性の）ｇｐｄＡプロモーター、ｂｌｅ遺伝子及び切断された（しかし、完全に機能性の）ｔｒｐＣターミネーターを含み、更に断片の両端に機能性ＸｈｏＩ部位を含むように設計した。更に５’プライマーは更なるクローニング工程（ｐＧＢＦｉｎ１５の構築において詳述）に必要なＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいた。約１．９ｋｂのＰＣＲ生成物のＸｈｏＩ消化のとき、以前にｐＧＢＦｉｎ２から単離したＸｈｏＩ断片へクローニングした。得られたプラスミド（ｐＧＢＦｉｎ１４、図１３参照）を、制限分析により正確な配向についてチェックし、配列決定によりＰＣＲエラーについてチェックした。ｐＧＢＦｉｎ１４をＨｉｎｄＩＩＩで直線化し、５．２ｋｂ  ＡＭＡ１  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を挿入し、プラスミドｐＧＢＦｉｎ１５（図１４参照）を得た。
【０１１５】
８．２  ＡＭＡ１を基本とするベクターにおけるフィターゼの発現
８．２．ａ  原理
AMA1を基本とする発現構築物を、組込型発現ベクターについての記載と同様にしてフィターゼ発現について試験した。更に試験遺伝子（例えば、フィターゼ）を、ｐＧＢＦｉｎ５ベクターについての実施例１の記載されるのと同様の態様で挿入した。得られたベクターをフィターゼ生産について試験し、ＡＭＡ１を基本とする発現ベクターの機能性及び適用性を証明した。
【０１１６】
８．２．ｂ  ｐＧＢＦｉｎ７及びｐＧＢＦｉｎ１６の構築
ｐＧＢＦｉｎ６及びｐＧＢＦｉｎ１５ベクターを、ＰａｃＩ及びＡｓｃＩを用いた、二重の消化により直線化した。次にｐＧＢＦｉｎ５プラスミドをＰａｃＩ及びＡｓｃＩで消化し、フィターゼ遺伝子をコードする断片（ＰａｃＩ及びＡｓｃＩ粘着末端と共に）遊離させた。このフィターゼ断片を、消化したｐＧＢＦｉｎ６及びｐＧＢＦｉｎ１５ベクターへ直接クローニングして、それぞれｐＧＢＦｉｎ７及びｐＧＢＦｉｎ１６を生成した。
【０１１７】
８．２．ｃ  ｐＧＢＦｉｎ７及びｐＧＢＦｉｎ１６を用いたアスペルギルス・ニガーの形質転換
実施例に記載され並びに材料及び方法の欄に詳述される手順にしたがいｐＧＢＦｉｎ７及びｐＧＢＦｉｎ１６でアスペルギルス・ニガーを形質転換した。ｐＧＢＦｉｎ７形質転換体を、唯一の窒素源としてアセトアミドを含む培地中で選択した。ｐＧＢＦｉｎ１６形質転換体はフレオマイシンを含む培地中で選択した。両方のプラスミドは、組込型発現ベクターと比較して形質転換頻度が有意に増加したことを証明した。ＡＭＡ１を基本とするプラスミドの形質転換頻度は、プラスミド１μgあたり最高１０５形質転換体であった。
陽性の形質転換体を、選択培地中、単一コロニーについて再画線することにより精製して、最後に保存した。
【０１１８】
８．２．ｄ  ｐＧＢＦｉｎ１６形質転換体におけるフィターゼの発現の分析
２０のランダムに選択したｐＧＢＦｉｎ１６を精製した後、形質転換体を、組込型ベクターについて記載したのと同一の培地（フレオマイシンを補充した場合）を使用して振盪フラスコ中で発酵させた。発酵サンプルをフィターゼ生成についてアッセイして、全てのケース（１つを除く）において約４０Ｕ／ｍｌ〜６０Ｕ／ｍｌの範囲を証明した。１つの特定のケースにおいて、発現は１１７Ｕ／ｍｌであった。これはおそらくｐＧＢＦｉｎ１６プラスミドのゲノムへの組み込みの結果であろう（実施例１；１．２．ｄのコメントも参照）。
【０１１９】
これらの結果は、本実施例に記載のＡＭＡ１を基本とするプラスミドをアスペルギルスにおける直接の発現クローニングに使用することができることを証明している。高度な発現遺伝子座における組み込み後の発現と比較して減少しているけれども、クローニングしたｃＤＮＡ生産の高レベルの発現を駆動することができるｇｌａＡ機能性の使用により、発現は、ＡＭＡ１を含む発現ライブラリーにおける効率的なスクリーニングにとって、特に有意に増加した形質転換頻度を考慮するときにも十分に高い。ＡＭＡ１を基本とするベクターの更なる利点は、糸状菌発現宿主からのこれらのプラスミドの回収（再単離）が組込型プラスミドと比較して単純であることである。問題の宿主から単離した全ＤＮＡを用いたエシェリキア・コリの直接の形質転換はこの点に関して十分であろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2010046080000001.app
【外国語明細書】
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