(57)【要約】【課題】  医薬品の中間体として有用な光学活性３−キヌクリジノールの効率的かつ工業的な製造方法を提供することにある。【解決手段】  ３−キヌクリジノンに、該化合物を不斉還元する能力を有する微生物、その処理物、酵素、または該酵素を産生する能力を有する形質転換体及びその処理物を作用させて還元することにより、光学活性３−キヌクリジノールを製造する方法を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−キヌクリジノンもしくはその塩にカルボニル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させる光学活性３―キヌクリジノールの製造方法において、前記酵素源がアンボロシオジマ（Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ）、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、シテロマイセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、クラビスポラ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ）、キストフィロバシディウム（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ディポダスカス（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ）、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）、ハンセニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ）、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、ロデロマイセス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ）、メシュニコワ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）、サツルニスポラ（Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ）、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）、ウィッカーハミア（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、ヤマダジマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、アシドフィラム（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバシラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デセムジア（Ｄｅｓｅｍｚｉａ）、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、 ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ルテオコッカス（Ｌｕｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、オエルスコフィア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、 セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シモンシェラ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈ���ｍｏｎａｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）、アエジェリタ（Ａｅｇｅｒｉｔａ）、アミロステレウム（Ａｍｙｌｏｓｔｅｒｅｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カエトミディアム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、コリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、コリネスポラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ）、クリプトフィアレ（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｉａｌｅ）、クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、グロエオフィルム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）、レンチヌラ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ）、マクロフォマ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍａ）、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、ピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、ベルティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属からなる群より選ばれた微生物の、菌体、培養液、それらの処理物、及び、それら微生物から得られる酵素のいずれかであることを特徴とする、光学活性３−キヌクリジノールの製造方法。
【請求項２】
前記酵素源がメシュニコワ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバシラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、デセムジア（Ｄｅｓｅｍｚｉａ）、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトフィアレ（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｉａｌｅ）、ピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ベルティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、オエルスコフィア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記生成物が（Ｒ）−３−キヌクリジノールであり、前記酵素源がメシュニコワ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバシラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、デセムジア（Ｄｅｓｅｍｚｉａ）、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトフィアレ（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｉａｌｅ）、ピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ベルティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記生成物が（Ｒ）−３−キヌクリジノールであり、前記酵素源がメシュニコワ・ビクスピダタ・バー・ビクスピダタ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ  ｂｉｃｕｓｐｉｄａｔａ  ｖａｒ．ｂｉｃｕｓｐｉｄａｔａ）、オガタエア・ミヌタ・バー・ノンファーメンタス（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ピキア・ロダネンシス（Ｐｉｃｈｉａ  ｒｈｏｄａｎｅｎｓｉｓ）、ピキア・ウイッカーハミー（Ｐｉｃｈｉａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・サケ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓａｋｅ）、サッカロマイコプシス・ジャバネンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｊａｖａｎｅｎｓｉｓ）、サッカロマイコプシス・リポリティカ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、サッカロマイコプシス・セレノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｅｌｅｎｏｓｐｏｒａ）、スポロボロマイセス・サルモニカラー（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、アエロバクター・クロアカエ（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、ブレビバシラス・パラブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバクテリウム・イオジナム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｏｄｉｎｕｍ）、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）、セルロモナス・フラビジエナ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｉｇｅｎａ）、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）、デセムジア・インセルタ（Ｄｅｓｅｍｚｉａ  ｉｎｃｅｒｔａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａ  ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ジェンセニア・カニクルリア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ  ｃａｎｉｃｒｕｒｉａ）、マイコバクテリウム・アウストロアフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｓｔｒｏａｆｒｉｃａｎｕｍ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ラルストニア・ピケッティ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｋｅｔｔｉｉ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・ロドコラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、アスペルギルス・パラシティカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ホォエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、クリプトフィアレ・ガダルカナレンセ（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｉａｌｅ  ｇｕａｄａｌｃａｎａｌｅｎｓｅ）、ピクノポラス・コシネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、リゾプス・ニヴェウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、シゾフィラム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）、ベルティシリウム・ニベオストラトサム（��ｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｉｖｅｏｓｔｒａｔｏｓｕｍ）からなる群より選ばれた微生物由来のものである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項５】
前記生成物が（Ｓ）−３−キヌクリジノールであり、前記酵素源がデバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、オエルスコフィア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項６】
前記生成物が（Ｓ）−３−キヌクリジノールであり、前記酵素源がデバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、オガタエア・グルコザイマ（Ｏｇａｔａｅａ  ｇｌｕｃｏｚｙｍａ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ウィリオプシス・サツルヌス・バー・マラキイ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ  ｖａｒ．ｍｒａｋｉｉ）、ウィリオプシス・サツルヌス・バー・シュアベリレンス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ  ｖａｒ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）、ウィリオプシス・サツルヌス・バー・サツルヌス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ  ｖａｒ．ｓａｔｕｒｎｕｓ）、モルガネラ・モルガニ・サブエスピー・モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ｓｕｂｓｐ． ｍｏｒｇａｎｉｉ）、オクロバクトラム・エスピー（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｓｐ．）、オエルスコフィア・ジエネンシス（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ  ｊｅｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、キサントモナス・エスピー（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）からなる群より選ばれた微生物由来のものである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項７】
前記生成物が（Ｒ）−３−キヌクリジノールであり、前記酵素源が、以下の（ａ）又は（ｂ）で表されるポリペプチドである、請求項１または２に記載の製造方法。
（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−キヌクリジノンのカルボニル基を還元し、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成するポリペプチド。
【請求項８】
前記生成物が（Ｓ）−３−キヌクリジノールであり、前記酵素源が、以下の（ｃ）又は（ｄ）で表されるポリペプチドである、請求項１または２に記載の製造方法。
（ｃ）配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ）配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−キヌクリジノンのカルボニル基を還元し、（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生成するポリペプチド。
【請求項９】
酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド、及び／または、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を、共存させることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド、及び／または、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸をそれぞれの還元型へ還元する酵素がグルコース脱水素酵素もしくはギ酸脱水素酵素である、請求項９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学活性３−キヌクリジノールの製造方法に関する。光学活性な３−キヌクリジノールは、医薬品、農薬等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
光学活性な３−キヌクリジノールは、医薬品、農薬等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。光学活性な３−キヌクリジノールの製造方法としては、３−キヌクリジノンのカルボニル基を微生物もしくは酵素により不斉還元する方法が知られている。しかし、これらの方法で使用されている微生物及び酵素は、以下の微生物もしくは植物由来のものしか知られていない。
【０００３】
３−キヌクリジノンのカルボニル基を立体選択的に還元して（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生成する微生物還元反応としては、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物によるものが知られている（特許文献１、２、３）。
【０００４】
また、３−キヌクリジノンのカルボニル基を立体選択的に還元して（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生成する酵素としてはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のものが知られている（特許文献４）。
【０００５】
また、３−キヌクリジノンのカルボニル基を立体選択的に還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する微生物還元反応としては、ナカザワエア（Ｎａｋａｚａｗａｅａ）、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎiａ）、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、フィロバシディウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、クルシア（Ｋｕｒｔｈｉａ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）に属する微生物によるものが知られている（特許文献１、２、３、５）。
【０００６】
また、３−キヌクリジノンのカルボニル基を立体選択的に還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する酵素としてはミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属の微生物及びダチュラ（Ｄａｔｕｒａ）、ヒヨス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）属の植物由来のものが知られている（特許文献６、７、８）。
【特許文献１】特開平１０−２４３７９５
【特許文献２】特許第３８９１５２２
【特許文献３】特開２００２−１５３２９３
【特許文献４】特開２００３−０９３０８９
【特許文献５】特許第３８５８５０５
【特許文献６】特開２００３−３３４０６９
【特許文献７】特開２００７−１２４９２２
【特許文献８】特開２００３−２３０３９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、医薬品の中間体として有用な光学活性３−キヌクリジノールの効率的かつ工業的な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、光学活性３−キヌクリジノールの簡便かつ効率的な製造方法を開発すべく検討を重ねた結果、これまでに知られていない３−キヌクリジノンを光学活性３−キヌクリジノールに変換する微生物及び酵素を新たに発見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、以下の１又は複数の特徴を有する。
【００１０】
即ち、本発明は、３−キヌクリジノンもしくはその塩にカルボニル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させる光学活性な３―キヌクリジノールの製造方法において、生成物が（Ｒ）−３−キヌクリジノールであり、前記酵素源がメシュニコワ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバシラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、デセムジア（Ｄｅｓｅｍｚｉａ）、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトフィアレ（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｉａｌｅ）、ピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ベルティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属からなる群より選ばれた微生物の、菌体、培養液、それらの処理物、及び、それら微生物から得られる酵素のいずれかであるか、もしくは、生成物が（Ｓ）−３−キヌクリジノールであり、前記酵素源がデバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、オエルスコフィア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属からなる群より選ばれた微生物の、菌体、培養液、それらの処理物、及び、それら微生物から得られる酵素のいずれかであることを特徴とする、光学活性３−キヌクリジノールの製造方法である。
【００１１】
また、別の好ましい実施態様としては、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と省略する）及び／または酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドりん酸（以下、ＮＡＤＰ＋と省略する）をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を共存させることを特徴とする上記製造方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、医薬品の中間体として有用な光学活性３−キヌクリジノールの効率的かつ工業的な製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を実施形態で詳細に説明する。本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等の成書に記載されている方法により実施できる。また、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。
【００１４】
本発明は３−キヌクリジノンもしくはその塩にカルボニル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させる光学活性な３―キヌクリジノールの製造方法に関する。光学活性な３−キヌクリジノールには（Ｒ）−３−キヌクリジノール（Ｒ体）と（Ｓ）−３−キヌクリジノール（Ｓ体）の２種類がある。
【００１５】
なお、ここでいう「光学活性」とは、考えられる各種光学異性体のうち、ひとつの光学異性体の光学純度が高いことをいう。
【００１６】
本発明において光学活性３−キヌクリジノールの光学純度は５０％ｅｅ．以上が好ましく、より好ましくは７０％ｅｅ．以上である。最も好ましくは９０％ｅｅ．以上である。
【００１７】
なお、光学活性３−キヌクリジノールの光学純度は高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー分析し、下記式より求めることができる。
（Ｒ体の光学純度（％ｅｅ．）＝｛（Ｒ体のピーク面積）−（Ｓ体のピーク面積）｝÷｛（Ｒ体のピーク面積）＋（Ｓ体のピーク面積）｝×１００
（Ｓ体の光学純度（％ｅｅ．）＝｛（Ｓ体のピーク面積）−（Ｒ体のピーク面積）｝÷｛（Ｓ体のピーク面積）＋（Ｒ体のピーク面積）｝×１００
【００１８】
反応に用いる３−キヌクリジノンはそのものでもよく、また、有機酸塩、無機酸塩としても用いることができる。前記塩の形成に用いる酸としては、塩フッ化水素、塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の無機酸；蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ピバル酸、クロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、Ｌ−酒石酸、Ｄ−酒石酸、マンデル酸等のカルボン酸；メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸等のスルホン酸が挙げられる。好ましくは塩化水素、臭化水素、硫酸、酢酸、ピバル酸、シュウ酸、Ｌ−酒石酸、Ｄ−酒石酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、又はカンファースルホン酸を用いることができる。さらに好ましくは塩化水素である。
【００１９】
本発明で使用される酵素源は、上記３−キヌクリジノンを光学活性３−キヌクリジノールに不斉還元する能力を有する微生物由来のものを用いることが出来る。
【００２０】
ここでいう「微生物由来のもの」としては、該微生物の菌体そのもの、微生物の培養液、あるいは菌体処理物、または該微生物から得られる酵素であってもよいし、さらには該微生物由来の上記還元活性を有する酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体も含む。
【００２１】
上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、例えば、アセトンや五酸化二リンによる脱水処理またはデシケーターや扇風機を利用した乾燥によって得られる乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出標品などをあげることができる。更に、培養物より不斉還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。
【００２２】
これらを単独で用いても、２種以上組み合わせて用いても良い。また、これら微生物は周知の方法で固定化して用いても構わない。
【００２３】
本発明に使用しうる酵素源としては、３−キヌクリジノンを（Ｒ）−３−キヌクリジノールに変換しようとする場合には、前記酵素源がメシュニコワ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバシラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、デセムジア（Ｄｅｓｅｍｚｉａ）、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトフィアレ（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｉａｌｅ）、ピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ベルティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のものであることが好ましい。
【００２４】
更に好ましくは、メシュニコワ・ビクスピダタ・バー・ビクスピダタ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ  ｂｉｃｕｓｐｉｄａｔａ  ｖａｒ．ｂｉｃｕｓｐｉｄａｔａ）、オガタエア・ミヌタ・バー・ノンファーメンタス（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ピキア・ロダネンシス（Ｐｉｃｈｉａ  ｒｈｏｄａｎｅｎｓｉｓ）、ピキア・ウイッカーハミー（Ｐｉｃｈｉａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・サケ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓａｋｅ）、サッカロマイコプシス・ジャバネンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｊａｖａｎｅｎｓｉｓ）、サッカロマイコプシス・リポリティカ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、サッカロマイコプシス・セレノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｅｌｅｎｏｓｐｏｒａ）、スポロボロマイセス・サルモニカラー（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、アエロバクター・クロアカエ（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、ブレビバシラス・パラブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバクテリウム・イオジナム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｏｄｉｎｕｍ）、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）、セルロモナス・フラビジエナ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｉｇｅｎａ）、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）、デセムジア・インセルタ（Ｄｅｓｅｍｚｉａ  ｉｎｃｅｒｔａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａ  ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ジェンセニア・カニクルリア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ  ｃａｎｉｃｒｕｒｉａ）、マイコバクテリウム・アウストロアフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｓｔｒｏａｆｒｉｃａｎｕｍ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ラルストニア・ピケッティ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｋｅｔｔｉｉ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・ロドコラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、アスペルギルス・パラシティカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ホォエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、クリプトフィアレ・ガダルカナレンセ（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｉａｌｅ  ｇｕａｄａｌｃａｎａｌｅｎｓｅ）、ピクノポラス・コシネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、リゾプス・ニヴェウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、シゾフィラム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）、ベルティシリウム・ニベオストラトサム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｉｖｅｏｓｔｒａｔｏｓｕｍ）由来のものである。
【００２５】
また、３−キヌクリジノンを（Ｓ）−３−キヌクリジノールに変換しようとする場合には、酵素源がデバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、オエルスコフィア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物由来であることが好ましい。
【００２６】
更に好ましくは、デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、オガタエア・グルコザイマ（Ｏｇａｔａｅａ  ｇｌｕｃｏｚｙｍａ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ウィリオプシス・サツルヌス・バー・マラキイ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ  ｖａｒ．ｍｒａｋｉｉ）、ウィリオプシス・サツルヌス・バー・シュアベリレンス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ  ｖａｒ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）、ウィリオプシス・サツルヌス・バー・サツルヌス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ  ｖａｒ．ｓａｔｕｒｎｕｓ）、モルガネラ・モルガニ・サブエスピー・モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ｓｕｂｓｐ． ｍｏｒｇａｎｉｉ）、オクロバクトラム・エスピー（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｓｐ．）、オエルスコフィア・ジエネンシス（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ  ｊｅｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、キサントモナス・エスピー（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）由来のものである。
【００２７】
これら微生物は一般に、入手または購入が容易な保存株から得ることができるが、自然界から分離することもできる。なお、これらの微生物に変異を生じさせて、より本反応に有利な性質を有する菌株を得ることもできる。
【００２８】
３−キヌクリジノンを光学活性３−キヌクリジノールに不斉還元する能力を有する微生物は、以下に説明する方法によって見いだすことができる。
【００２９】
例えば、以下のようにして行う。グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛七水和物６０ｍｇ、硫酸鉄七水和物９０ｍｇ、硫酸銅五水和物５ｍｇ、硫酸マンガン四水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを試験管に入れて殺菌後、無菌的に微生物を接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する。
【００３０】
その後、菌体を遠心分離により集め、グルコース２〜１０％を含んだリン酸緩衝液１〜５ｍｌに懸濁し、あらかじめ３−キヌクリジノンもしくはその塩を２．５〜２５ｍｇいれた試験管に加えて、２〜３日間３０℃で振とうする。この際、遠心分離により得た菌体をデシケーター中またはアセトンにより乾燥したものを用いることもできる。更に、これら微生物もしくはその処理物と３−キヌクリジノンを反応させる際に、ＮＡＤ＋及び／またはＮＡＤＰ＋と、グルコース脱水素酵素及びグルコース、もしくはギ酸脱水素酵素及びギ酸、を添加してもよい。また、反応系に有機溶媒を共存させてもかまわない。変換反応ののち適当な有機溶媒で抽出を行ない、生成する光学活性３−キヌクリジノールをガスクロマトグラフィーなどにより分析する。
【００３１】
これらの微生物の培養には、通常これらの微生物が資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用しうる。例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、エタノール、グリセリン等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源；更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源；を適宜混合・配合した通常の培地を用いることが出来る。これら培地は用いる微生物の種類によって適宜選択すればよい。また、目的の還元酵素を誘導させるために、各種カルボニル化合物を培地に添加すると優れた結果が得られるため、好ましい。例えば、３−キヌクリジノンを０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）培地に添加する。
【００３２】
微生物の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ４．０〜９．５、温度範囲２０℃〜４５℃の範囲で、好気的に１０〜９６時間培養するのが好ましい。３−キヌクリジノンに微生物を反応させる場合においては、通常、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用することもできるが、培養液の濃縮物も用いることができる。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用することもできる。
【００３３】
還元反応の際には、基質である３−キヌクリジノンを反応の初期に一括して添加してもよく、反応の進行にあわせて分割して添加してもよい。反応時の温度は通常１０〜６０℃、好ましくは、２０〜４０℃であり、反応時のｐＨは２．５〜９、好ましくは、５〜９の範囲である。反応液中の微生物の量はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよい。また、反応液中の基質濃度は０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ）である。反応は通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。反応時間は基質濃度、微生物の量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。
【００３４】
還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を０．５〜３０％の割合で加えると優れた結果が得られるので好ましい。一般に生物学的方法による還元反応に必要とされている還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（以降ＮＡＤＨと省略する）、還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸（以降ＮＡＤＰＨと省略する）等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることもできる。この場合、具体的には、反応液に直接これらを添加する。
【００３５】
また、還元反応を促進させるために、ＮＡＤ＋及び／またはＮＡＤＰ＋をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を共存させて反応を行うと優れた結果が得られるので好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素としてグルコース脱水素酵素、還元のための基質としてグルコースをそれぞれ共存させるか、または、還元型へ還元する酵素としてギ酸脱水素酵素、還元のための基質としてギ酸をそれぞれ共存させる。
【００３６】
また更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。更に、基質及び／または還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液に添加してもよい。更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。
【００３７】
還元反応により生成した光学活性３−キヌクリジノールの採取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ｎ−ブタノール、ジクロロメタン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度の光学活性３−キヌクリジノールを容易に得ることができる。
【００３８】
本発明の還元反応を触媒する酵素源として、キヌクリジノンのカルボニル基を立体選択的に還元する酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用すると、より効率的に光学活性３−キヌクリジノールを製造することができる。好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来の還元酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体である。（Ｒ）−キヌクリジノールを得る酵素としては最も好ましくは配列表の配列番号１に示すポリペプチドである。（Ｓ）−キヌクリジノールを得る酵素としては最も好ましくは配列表の配列番号２に示すポリペプチドである。また、配列表の配列番号１または２に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば、４０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下）のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、キヌクリジノン還元活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００３９】
配列表の配列番号１または２に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、キヌクリジノンを立体選択的に還元する能力を有する限り上記ポリペプチドに包含される。
【００４０】
配列表の配列番号１または２に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素ついて、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、前述した他の微生物由来のアミノ基転移酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。
【００４１】
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
【００４２】
また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ, Ａｌａ,  Ｖａｌ，  Ｌｅｕ，  Ｉｌｅ， Ｍｅｔ，  Ｃｙｓ，  Ｐｒｏ，  Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，  Ｔｈｒ，  Ｇｌｎ，  Ａｓｎ，  Ｔｒｐ，  Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，  Ａｓｐ
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，  Ｌｙｓ，  Ａｒｇ
【００４３】
置換、挿入、欠失及び／または付加されるアミノ酸の数としては、改変後のポリペプチドがアミノ基転移酵素（Ａ）の活性を有する限り、特に制限されないが、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と、配列同一性が８５％以上であることが好ましい。配列同一性９０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９９％以上が最も好ましい。配列同一性は、前記の高度保存領域の確認と同様にして、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と改変されたアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除し、さらに１００を乗じた値で表される。
【００４４】
キヌクリジノン還元活性を有する限り、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、キヌクリジノン還元活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
【００４５】
上記の形質転換体に用いるベクターとしては、適当な宿主生物内でキヌクリジノン還元酵素をコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
【００４６】
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（実施例２参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号パンフレット）などが挙げられる。
【００４７】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００４８】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００４９】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学」（共立出版、１９８７）などに詳細に記述されている。
【００５０】
各酵素を発現させるために用いる宿主生物は、各酵素をコードするＤＮＡを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)属、バチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)属、シュードモナス(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)属、セラチア(Ｓｅｒｒａｔｉａ)属、ブレビバクテリウム(Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、コリネバクテリイウム(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、ストレプトコッカス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ)属、及びラクトバチルス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ)属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ)属及びストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、クライベロマイセス(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ)属、シゾサッカロマイセス(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、チゴサッカロマイセス(Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、ヤロウイア(Ｙａｒｒｏｗｉａ)属、トリコスポロン(Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ)属、ロドスポリジウム(Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ)属、ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)属、及びキャンディダ(Ｃａｎｄｉｄａ)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ(Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ)属、アスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属、セファロスポリウム(Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ)属、及びトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ，３１５,５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
【００５１】
キヌクリジノン還元酵素するＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。
【００５２】
キヌクリジノン還元酵素をコードするＤＮＡを含むベクターの例としては、参考例に示すｐＮＳＣ１が挙げられる。また、キヌクリジノン還元酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体の例としては、ベクターｐＮＳＣ１でＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換して得られる、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＳＣ１）が挙げられる。
【００５３】
また、キヌクリジノン還元酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を本発明に用いることにより、より効率的にカルボニル化合物を製造することができる。キヌクリジノン還元酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、キヌクリジノン還元酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。
【００５４】
補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、ＮＡＤ+もしくはＮＡＤＰ+をＮＡＤＨ、もしくはＮＡＤＰＨに変換する能力を有している酸化還元酵素が好ましい。
【００５５】
このような酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素などが挙げられる。好適には、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素が使用される。
【００５６】
ギ酸脱水素酵素としては、例えば、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クロイッケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、ハイホマイクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アンシロバクター（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、などの微生物、特にチオバシラス・エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から得られる酵素が挙げられる。
【００５７】
グルコース脱水素酵素としては、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの微生物、特にバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から得られる酵素が挙げられる。
【００５８】
得られた形質転換体の培養は、通常これらの微生物が資化できる栄養源を含む培地であれば何でも使用しできる。例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、エタノール、グリセリン等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源；更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源；を適宜混合・配合した通常の培地を用いることが出来る。これら培地は用いる微生物の種類によって適宜選択すればよい。
【００５９】
形質転換体を用いたキヌクリジノンの還元反応や反応液からのキヌクリジノールの採取については前述した方法と同様にして実施することができる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。
【００６１】
（実施例１）（Ｒ）又は（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造
グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛七水和物６０ｍｇ、硫酸鉄七水和物９０ｍｇ、硫酸銅五水和物５ｍｇ、硫酸マンガン四水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。
【００６２】
これらの液体培地に表１に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で７２時間振とう培養した。培養後、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、７ｍＭキヌクリジノン塩酸塩、グルコース４％を含んだ０．５Ｍリン酸緩衝液１ｍｌ（ｐＨ６．５）に菌体を懸濁し、３０℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液を５Ｎ  ＮａＯＨにてｐＨ１２に調整した後、酢酸エチル２ｍｌを加えよく混合した。この混合液を遠心分離後、有機層を下記条件でガスクロマトグラフィー分析し、変換率及び生成したキヌクリジノールの光学純度を求めた。
【００６３】
＜ガスクロマトグラフィー分析条件＞
カラム：γ−ＤＥＸ２２５キャピラリーカラム
（０．２５ｍｍ（内径）×３０ｍ；Ｓｐｅｌｃｏ社製）
検出器：水素炎イオン化検出器
注入部温度：２２０℃、カラム温度：１５０℃、
検出器温度：２２０℃
キャリアーガス：ヘリウム、流量７０ＫＰａ
結果を表１に示す。
【００６４】
【表１】
2010130912.tif 000002
【００６５】
（実施例２）（Ｒ）又は（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造
肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表２に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、２８℃で７２時間振とう培養した。また、還元酵素を誘導するため、無菌的にキヌクリジノン塩酸塩を終濃度０．５％になるように添加して培養した。
【００６６】
培養後、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、実施例１と同条件で反応及び抽出、分析した。
【００６７】
結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
2010130912.tif 000003
【００６９】
（実施例３）（Ｒ）又は（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造
ＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ製）５５ｇ（１Ｌ当たり）を含む液体培地１０ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表３に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で５日間静置培養した。培養後、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、実施例１と同条件で反応及び抽出、分析した。
【００７０】
結果を表３に示す。
【００７１】
【表３】
2010130912.tif 000004
【００７２】
（実施例４）（Ｒ）又は（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造  
肉エキス１ｇ、グルコース１０ｇ、酵母エキス１ｇ、ＮＺアミン２ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表４に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、２８℃で７２時間振とう培養した。
【００７３】
培養後、各培養液を吸引ろ過により菌体を分離し、実施例１と同条件で反応及び抽出、分析した。
【００７４】
結果を表４に示す。
【００７５】
【表４】
2010130912.tif 000005
【００７６】
（実施例５）（Ｒ）又は（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造  
肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１０ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）７ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表５に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、２８℃で７２時間振とう培養した。
【００７７】
培養後、各培養液を吸引ろ過により菌体を分離し、実施例１と同条件で反応及び抽出、分析した。
【００７８】
結果を表５に示す。
【００７９】
【表５】
2010130912.tif 000006
【００８０】
（参考例１）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ由来還元酵素発現組換え大腸菌の作製
３−キヌクリジノンのカルボニル基を立体選択的に還元し、（Ｒ）−キヌクリジノールを生成するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来還元酵素ＲＳＣ１（配列表の配列番号１）を発現する組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＳＣ１）の作製の方法を以下に示す。プライマー１（配列表の配列番号３）：５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＧＴＡＧＡＡＡＡＧ−３’、プライマー２（配列表の配列番号４）：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＡＴＧＡＴ−３’を用い、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ２６１０８）株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、還元酵素ＲＳＣ１遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
【００８１】
上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＣＭを構築した。この組換えベクターｐＮＣＭを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＳＣ１）を得た。
【００８２】
また、３−キヌクリジノンのカルボニル基を立体選択的に還元し、（Ｓ）−キヌクリジノールを生成するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来還元酵素ＲＳＣ２（配列表の配列番号２）を発現する組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＳＣ２）も同様の方法で作製した。二本鎖ＤＮＡの増幅にはプライマー３（配列表の配列番号５）：５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＡＴ−３’、プライマー４（配列表の配列番号６）：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＴＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＣ−３’を用いた。その他はＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＳＣ１）の作製と同様に操作した。
【００８３】
（実施例６）還元酵素組換え大腸菌を用いた（Ｒ）又は（Ｓ）−３−キヌクリジノールの製造  
トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ＝７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表６に示す各種組み換え大腸菌を無菌的にそれぞれ一白金耳接種して、３７℃で２４時間振とう培養した。
【００８４】
培養後、超音波ホモジナイザーによる菌体破砕を実施し、各菌体破砕液０．９ｍｌ、キヌクリジノール塩酸塩１０ｍｇ、ＮＡＤ・ＮＡＤＰ各１ｍｇ、グルコース２０ｍｇ、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム社製）５Ｕ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍｌを加えて、３０℃で２４時間反応させた。      
【００８５】
反応終了後、実施例１と同様に分析し、変換率と生成物の光学純度を分析した。
【００８６】
結果を表６に示す。
【００８７】
【表６】
2010130912.tif 000007
【００８８】
（実施例７）還元酵素組換え大腸菌を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造  
トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ＝７）５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地にＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＳＣ１）を無菌的に一白金耳接種して、３７℃で２４時間振とう培養した。
【００８９】
培養後、超音波ホモジナイザーによる菌体破砕を実施し、菌体破砕液２０ｍｌにキヌクリジノール塩酸塩２．５ｇ、ＮＡＤＰ １ｍｇ、グルコース３．２ｇ、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム社製）１０Ｕを加えて、３０℃で３０時間反応させた。反応中は５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５を維持した。
【００９０】
反応終了後、反応液を１０Ｎ  ＮａＯＨにてｐＨ１２に調整し、反応液の２倍量のｎ−ブタノールで３回抽出した。減圧下で溶媒を留去後、乾燥して２ｇの結晶を得た。実施例１と同様に分析し、キヌクリジノール含量と生成物の光学純度を分析した。その結果、キヌクリジノール含量８８％、Ｒ体光学純度９３．１％ｅｅ．であった。
【配列表】
2010130912000001.app