(57)【要約】【課題】  ＤＮＡ精製を不要とする血液検体の前処理工程からＤＮＡ増幅反応工程の一連の工程において複数の温度設定を必要としないＤＮＡ増幅方法を提供する。【解決手段】  ＤＮＡを増幅すべき血液検体を、常温下においてアルカリ性水溶液で処理することによって、前記血液検体からの二本鎖ＤＮＡの取り出しと、前記二本鎖ＤＮＡの一本鎖化とを行い、一本鎖ＤＮＡを含む血液由来試料を得る前処理工程と、前記血液由来試料と、少なくともプライマー、ｄＮＴＰ、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩、及び緩衝剤とが混合した等温増幅反応液を調製して、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適条件を具備する等温増幅反応系を構築する工程と、前記等温増幅反応系中で前記一本鎖ＤＮＡを鋳型として増幅する等温増幅工程とを含む、血液検体からのＤＮＡ増幅方法。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを増幅すべき血液検体を、常温下においてアルカリ性水溶液と混合することによって、前記血液検体からの二本鎖ＤＮＡの取り出しと、前記二本鎖ＤＮＡの一本鎖化とを行い、一本鎖ＤＮＡを含む血液由来試料を得る前処理工程と、
前記血液由来試料と、少なくともプライマー、ｄＮＴＰ、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩、及び緩衝剤とが混合した等温増幅反応液を調製して、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適条件を具備する等温増幅反応系を構築する工程と、
前記等温増幅反応系中で前記一本鎖ＤＮＡを鋳型として増幅する等温増幅工程と
を含む、血液検体からのＤＮＡ増幅方法。
【請求項２】
前記血液検体と前記アルカリ性水溶液との混合液中、アルカリ濃度が５０ｍＭ以上となる量で前記アルカリ性水溶液が使用される、請求項１に記載のＤＮＡ増幅方法。
【請求項３】
前記緩衝剤が、前記等温増幅反応液中１００ｍＭ以上の濃度となる量で使用される、請求項１又は２に記載のＤＮＡ増幅方法。
【請求項４】
前記プライマー、前記ｄＮＴＰ、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩、及び前記緩衝剤が、水に含まれた状態で提供される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ増幅方法。
【請求項５】
前記プライマー、前記ｄＮＴＰ、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩、及び前記緩衝剤が、乾燥状態で提供される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ増幅方法。
【請求項６】
前記等温増幅反応系を構築する工程において、前記血液由来試料と、緩衝剤水溶液とを予め混合させ、さらに、乾燥状態である少なくともプライマー、ｄＮＴＰ、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩、及び緩衝剤を混合させて、前記等温増幅反応液を調製する、請求項５に記載のＤＮＡ増幅方法。
【請求項７】
前記緩衝剤がトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡ増幅方法。
【請求項８】
前記アルカリ性水溶液が水酸化ナトリウム水溶液である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡ増幅方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡ増幅方法を行うためのキットであって、
少なくとも前記プライマー、前記ｄＮＴＰ、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩及び前記緩衝剤を含むキット。
【請求項１０】
少なくとも前記プライマー、前記ｄＮＴＰ、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩及び前記緩衝剤が、乾燥状態で提供される、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液検体からのＤＮＡ増幅方法及びＤＮＡ増幅キットに関する。より具体的には、血液検体の前処理工程からＤＮＡ増幅反応工程の一連の工程において複数の温度設定を必要としないＤＮＡ増幅方法及びＤＮＡ増幅キットに関する。本発明は、ライフサイエンス系研究用途、及び医療診断薬関連分野において有用である。
【背景技術】
【０００２】
血液検体からのＤＮＡ増幅法として、一旦ゲノムＤＮＡの抽出及び精製を行い、その後、精製されたＤＮＡを合成に供する方法が一般的に行われている。
一方で、近年、血液検体をＤＮＡ精製しない前処理に供し、その後、前処理された試料を、鎖置換型ＤＮＡ増幅酵素を用いた等温増幅系でＤＮＡ増幅することによってＳＮＰタイピングを行う、ＳＭＡＰ（SMart Amplification Process）法が開発されている。
ＳＭＡＰ法で行われる前処理工程においては、５０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を用い、９８℃で３分間、熱変性が行われる（非特許文献１：Nature Methods, 2007, Mar;4(3):257-262）。
【０００３】
【非特許文献１】Yasumasa Mitani, Alexander Lezhava, Yuki Kawai, Takeshi Kikuchi, Atsuko Oguchi-Katayama, Yasushi Kogo, Masayoshi Itoh, Toru Miyagi, Hideki Takakura, Kanako Hoshi, Chiaki Kato, Takahiro Arakawa, Kazuhiro Shibata, Kenji Fukui, Ryoji Masui, Seiki Kuramitsu, Kazuma Kiyotani, Alistair Chalk, Katsuhiko Tsunekawa, Masami Murakami, Tetsuya Kamataki, Takanori Oka, Hiroshi Shimada, Paul E Cizdziel &  Yoshihide Hayashizaki著、Rapid SNP diagnostics using asymmetric isothermal amplification and a new mismatch suppression technology、「ネイチャー・メソッズ（Nature Methods）」、２００７年３月、第４巻、第３号、ｐ．２５７−２６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
鎖置換型ＤＮＡ増幅酵素は６０℃付近に至適温度を有する。このため、ＳＭＡＰ法においては、鎖置換型ＤＮＡ増幅酵素を用いた増幅工程を、ＰＣＲ法のように温度の上げ下げを繰り返す温度制御を行うことなく、等温（約６０℃）条件下で行うことができる。
【０００５】
しかしながら、ＳＭＡＰ法において、増幅工程に先立って行われる血液検体の前処理工程は、９８℃での熱処理を伴う。
すなわち、ＳＭＡＰ法は、前処理工程における熱変性を生じさせる温度と、増幅工程における鎖置換型ＤＮＡ増幅酵素の至適温度との２種類の温度設定を必要とする。従って、それぞれの温度を設定する２つの温調機器、或いは、温度設定を変化させることができる温調機器や、サーマルサイクラーといった機器が必要となる。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、ＤＮＡ精製を不要とする血液検体の前処理工程からＤＮＡ増幅反応工程の一連の工程において複数の温度設定を必要としないＤＮＡ増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、血液検体の前処理工程における変性処理を常温で行うことによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成させた。
本発明は、以下の発明を含む。
【０００８】
（１）
ＤＮＡを増幅すべき血液検体を、常温下においてアルカリ性水溶液と混合することによって、前記血液検体からの二本鎖ＤＮＡの取り出しと、前記二本鎖ＤＮＡの一本鎖化とを行い、一本鎖ＤＮＡを含む血液由来試料を得る前処理工程と、
前記血液由来試料と、少なくともプライマー、ｄＮＴＰ、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩、及び緩衝剤とが混合した等温増幅反応液を調製して、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適条件を具備する等温増幅反応系を構築する工程と、
前記等温増幅反応系中で前記一本鎖ＤＮＡを鋳型として増幅する等温増幅工程と
を含む、血液検体からのＤＮＡ増幅方法。
【０００９】
すなわち、上記（１）の方法においては、前処理として血液検体の変性処理を常温で行い、適切な等温増幅反応系を構築し、構築された等温増幅反応系でＤＮＡ増幅を行う。適切な等温増幅反応系を構築する際、特に、緩衝剤の使用により、前処理に用いられたアルカリ性水溶液を含む高ｐＨの血液由来試料から、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適条件までｐＨが好ましく下げられた増幅反応液を得る。
なお、本明細書においては、前記プライマー、前記ｄＮＴＰ、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、前記マグネシウム塩、及び前記緩衝剤からなる群から選ばれる成分を、増幅反応試薬成分又は便宜的に増幅反応試薬と記載することがある。
【００１０】
（２）前記血液検体と前記アルカリ性水溶液との混合液中、アルカリ濃度が５０ｍＭ以上となる量で前記アルカリ性水溶液が使用される、（１）に記載のＤＮＡ増幅方法。
【００１１】
アルカリ濃度とは、溶液中に存在する水酸基イオンの濃度を意味する。
アルカリ性水溶液を上述の濃度で用いることによって、血液検体の前処理を好ましく行うことができる。
【００１２】
（３）
前記緩衝剤が、前記等温増幅反応液中１００ｍＭ以上の濃度となるように使用される、（１）又は（２）に記載のＤＮＡ増幅方法。
【００１３】
上記（３）に記載の濃度となるように緩衝剤を用いることによって、前処理工程で常温での変性処理に用いられたアルカリ性水溶液が増幅工程で鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の活性を阻害しないよう、等温増幅系を十分に緩衝し、当該酵素の至適ｐＨをより安定的に維持することができる。
【００１４】
（４）
前記プライマー、前記ｄＮＴＰ、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩、及び前記緩衝剤が、水に含まれた状態で提供される、（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡ増幅方法。
【００１５】
上記（４）の方法においては、増幅反応試薬が液体状態で提供される。
【００１６】
（５）
前記プライマー、前記ｄＮＴＰ、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩、及び前記緩衝剤が、乾燥状態で提供される、（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡ増幅方法。
【００１７】
上記（５）の方法においては、増幅反応試薬が乾燥状態で提供される。この乾燥試薬は、上記（４）の方法における液体試薬の凍結乾燥物であってよい。
【００１８】
（６）
前記等温増幅反応系を構築する工程において、前記血液由来試料と、緩衝剤水溶液とを予め混合させ、さらに、乾燥状態である少なくともプライマー、ｄＮＴＰ、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩、及び緩衝剤を混合させて、前記等温増幅反応液を調製する、（５）に記載のＤＮＡ増幅方法。
【００１９】
上記（６）の方法は、増幅反応試薬が乾燥状態で提供される場合の一態様である。この方法において、予め血液由来試料と混合された緩衝剤水溶液（すなわち緩衝液）中の緩衝剤と、その後に加えられる緩衝剤とを足し合わせた量が、増幅反応液中において上記（３）に記載の１００ｍＭ以上となるようにすることが好ましい。
【００２０】
（７）
前記緩衝剤がトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩である、（１）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡ増幅方法。
【００２１】
（８）
前記アルカリ性水溶液が水酸化ナトリウム水溶液である、（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡ増幅方法。
【００２２】
（９）
（１）〜（８）のいずれかに記載のＤＮＡ増幅方法を行うためのキットであって、
少なくとも前記プライマー、前記ｄＮＴＰ、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩及び前記緩衝剤を含むキット。
【００２３】
（１０）
少なくとも前記プライマー、前記ｄＮＴＰ、前記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、マグネシウム塩及び前記緩衝剤が、乾燥状態で提供される、（９）に記載のキット。
上記（１０）のキットにおいては、上記（５）及び（６）の方法における乾燥試薬をアイテムとして含むことができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によると、ＤＮＡ精製を不要とする血液検体の前処理工程からＤＮＡ増幅反応工程の一連の工程において複数の温度設定を必要としないＤＮＡ増幅方法が可能になる。
すなわち、本発明によると、前処理工程から増幅反応工程の一連の工程において、温度設定は、一度、増幅工程を開始する際に、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適温度に設定するのみでよい。従って、当該一連の工程を自動制御した装置によって本発明の方法を行う場合、当該装置の温調手段は、特定の温度に設定し維持することができる機構のみを有していればよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の方法は、血液検体の前処理を常温で行う工程（すなわち前処理工程：下記項目１）と、得られた当該処理液から等温増幅反応系を構築する工程（すなわち等温増幅反応系構築工程：下記項目２）し、増幅反応を行う工程（すなわち等温増幅工程：下記項目３）とを含む。
【００２６】
［１．前処理工程］
前処理工程においては、血液検体がアルカリ性水溶液と混合され、常温で静置又は撹拌されることによって、血液由来試料を得る。当該血液由来試料は、ＤＮＡの精製を行うことなく、後述の増幅工程に供される対象となり得る。
本発明において、血液検体の前処理とは、核酸増幅反応を行うために予め行われる処理であり、具体的には、血液検体に含まれるＤＮＡ包含体からゲノムＤＮＡを取り出すことにより、当該包含体の外へゲノムＤＮＡを遊離させること、及び、ゲノムＤＮＡの二本鎖構造を一本鎖構造に解離することを含む。
血液検体に含まれ得るＤＮＡ包含体としては、特に限定されず、血液中に先天的又は後天的に含まれているもの、及び外部から感染などにより血液中に混入したものを問わない。例えば、白血球、細菌、真菌、ウイルスなどが挙げられる。
【００２７】
［１−１．血液検体］
血液検体には、通常全血が用いられる。全血は、抗凝血剤による処理の如何を問わない。また、血液検体は、ＤＮＡが含まれていれば、新鮮血、保存血液及び乾燥血液のいずれであっても良い。さらに、保存血液としては、冷蔵保存、冷凍保存を問わない。
血液検体の由来元となる個体としては、ヒト、及びその他の動物を含む。
【００２８】
［１−２．アルカリ性水溶液］
本発明においては、血液検体の前処理をアルカリ性水溶液中で行う。アルカリ性水溶液としては、水溶液状態でアルカリ性を呈する物質を溶質とするものであれば得に限定されないが、アルカリ金属水酸化物の水溶液やアルカリ土類金属水酸化物の水溶液などの、強アルカリ性を呈するものが好ましい。
本発明では、アルカリ金属水酸化物を用いることが好ましく、特に、水酸化ナトリウムを用いることが好ましい。しかしながら、これに限定されることなく、他のアルカリ金属水酸化物（例えば水酸化カリウム等）やアルカリ土類金属水酸化物等を用いることもできる。さらに、これら溶質は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００２９】
本発明で用いられるアルカリ性水溶液は、血液検体の常温での前処理が可能な濃度で用いられる。血液検体の常温での前処理が可能な濃度は、従来広く行われてきた、加熱条件下での血液検体の前処理において用いられる濃度よりも高いものである。
或いは、本発明で用いられるアルカリ性水溶液の濃度は、仮に本発明の前処理工程によって得られる前処理混合液を従来の等温増幅反応液と混合した場合に、当該従来の等温増幅反応液における鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の活性を阻害する程度の高濃度であるともいえる。
さらに言い換えれば、本発明で用いられるアルカリ性水溶液の濃度は、仮に本発明の前処理工程によって得られる前処理混合液を従来の等温増幅反応液と混合した場合に、当該従来の等温増幅反応液に含まれている緩衝剤（鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適条件を構築する濃度として、通常１０〜２０ｍＭの濃度で含まれている）の緩衝効果を発揮させない程度の高濃度である、ともいえる。
【００３０】
使用するアルカリ性水溶液のより具体的な濃度は、常温での前処理を可能にする比較的高い濃度であれば特に限定されないが、例えば１００ｍＭ以上、好ましくは１２５ｍＭ以上、更に好ましくは１５０ｍＭ以上のアルカリ濃度であることが好ましい。当該濃度が１００ｍＭを下回ると、常温での前処理が困難になりやすい傾向となる。ここで、アルカリ濃度とは、溶液中に存在する水酸基イオンの濃度を意味する。
アルカリ性水溶液濃度の上限は特に限定されないが、例えば５００ｍＭ程度のアルカリ濃度であることが好ましい。当該濃度が５００ｍＭを上回ると、後述の等温増幅反応系の構築が困難になりやすい傾向となる。
【００３１】
また、アルカリ性水溶液の使用量としては、血液検体とアルカリ性水溶液との混合液におけるアルカリ濃度が、常温での前処理を可能にする比較的高い濃度となるように使用されば特に限定されるものではないが、例えば５０ｍＭ以上、好ましくは６２．５ｍＭ以上、更に好ましくは７５ｍＭ以上；或いは例えば９０ｍＭ以上、好ましくは１１２．５ｍＭ以上、更に好ましくは１３５ｍＭ以上となる量で用いることができる。当該範囲を下回ると、常温での前処理が困難になりやすい傾向となる。
上記範囲の上限は特に限定されないが、例えば４５０ｍＭ、或いは２５０ｍＭとすることができる。当該範囲を上回ると、後述の等温増幅反応系の構築が困難になりやすい傾向となる。
一例としてアルカリ濃度が１５０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を用いる場合を挙げると、血液検体１μｌに対し、例えば１〜９μｌとなる量の当該水酸化ナトリウム水溶液を用いることができる。
【００３２】
常温での前処理を可能にするアルカリ濃度は、ターゲットとなる配列によって異なり得るため、上記に例示した量を目安とし、ターゲットとなる配列を考慮して適宜増減させる調整をすることができる。当該調整の際には、通常ターゲットとなる核酸配列固有の性質であって増幅効率に影響し得る要素、例えばＧＣ含量、塩基長、特定の特異的配列等の要素が当業者によって考慮される。
【００３３】
［１−３．前処理条件］
前処理の温度は、常温である。本発明において常温とは、血液検体において熱変性が起こらない温度であればよく、具体的には、約１５℃〜約４０℃、好ましくは、２０℃〜３５℃、より好ましくは２３℃〜３０℃である。通常、２５℃程度の温度である。
常温で行うことにより、血液検体の前処理工程からＤＮＡ増幅反応工程の一連の工程において複数の温度設定を必要としないＤＮＡ増幅方法が可能になる。
【００３４】
前処理の時間としては特に限定されない。例えば、１〜１５分、好ましくは３〜５分とすることができる。上記範囲を下回ると、常温での前処理が困難になりやすい傾向となる。上記範囲を上回ると、後述の等温増幅反応系の構築が困難になりやすい傾向となる。
【００３５】
［２．等温増幅反応系構築工程］
等温増幅反応系構築工程においては、前記の前処理工程で得られた血液由来試料から、当該試料のＤＮＡ精製処理を経ずに適切な等温増幅反応系を構築する。
【００３６】
適切な等温増幅反応系とは、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の活性が阻害されることなく等温増幅反応が開始・進行可能な系をいう。等温増幅反応系を構築するとは、適切な等温増幅反応系の構築のために、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適条件を具備するように、等温増幅反応系に含まれるべき各成分を当業者が質的及び量的観点に基づいて適宜決定し、等温増幅反応の開始・進行が可能な状態の等温増幅反応液を調製することをいう。
等温増幅反応液とは、血液由来試料と等温増幅反応試薬との混合物をいう。
【００３７】
至適条件には、少なくともｐＨ及び温度の要素が含まれる。必要に応じ、さらに塩濃度、及びその他の公知の要素を含んでも良い。
【００３８】
また、質的及び量的観点に基づくとは、ｐＨ、温度、塩濃度、緩衝剤の種類、塩の種類、ターゲットの配列、その他共存し得る成分（例えば界面活性剤、夾雑物等）の存在等を考慮することをいう。特に本発明においては、前処理工程において用いられた高濃度のアルカリ性水溶液の存在を考慮しなければならない。このことを考慮することによって、当該高濃度のアルカリ性水溶液によるｐＨの影響を受けることなく、増幅反応液が鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適ｐＨを維持することが可能な緩衝作用を十分発揮できる程度の緩衝剤の量（項目２−２−３に詳述）を決定しなければならない。
【００３９】
［２−１．等温増幅反応試薬の形態］
等温増幅反応試薬は、後述する成分、すなわち、少なくとも、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、プライマー、緩衝剤、ｄＮＴＰ、及びマグネシウム塩から選択される成分を含む液体試薬であっても良いし、乾燥試薬であっても良い。
【００４０】
［２−１−１．液体試薬］
液体試薬は、当該選択された成分を含む水溶液の状態で提供され得る。液体試薬は、すべての必要な成分を含む１種類の水溶液として調製されても良いし、適宜選択された成分をそれぞれ含む２種類以上の水溶液として調製され、それら水溶液が最終的に混合されることにより、必要な成分をすべて増幅反応液中に共存させるようにしても良い。２種類以上の水溶液として調製する場合、それぞれの水溶液にどのような成分を含ませるかは、水溶液における各成分の安定性、保存性、その他の物性、及び操作性の違い等を考慮して、当業者が適宜決定することができる。
【００４１】
［２−１−２．乾燥試薬］
乾燥試薬は、上記の成分が乾燥された状態で提供されるものである。例えば、上記の液体試薬にさらに凍結乾燥製剤を含むものを凍結乾燥して調製され得る。乾燥試薬であることは、各成分の保存性及び操作性に優れる点で好ましい。凍結乾燥製剤としては、トレハロース等の糖アルコールが挙げられる。乾燥試薬も、すべての必要な成分を含む１種類の凍結乾燥物として調製されても良いし、適宜選択された成分をそれぞれ含む２種類以上の凍結乾燥物として調製され、それら凍結乾燥物が最終的に混合されることにより、必要な成分をすべて増幅反応液中に共存させるようにしても良い。２種類以上の凍結乾燥物として調製される場合、それぞれの凍結乾燥物にどのような成分を含ませるかは、凍結乾燥工程及び凍結乾燥物における各成分の安定性、保存性、その他の物性、及び操作性の違い等を考慮して、当業者が適宜決定することができる。
【００４２】
乾燥試薬を用いる場合、乾燥状態で用いても良いし、適宜、水又は緩衝液（この場合、当該緩衝液中の緩衝剤は、本発明で用いられる緩衝剤の一部を成す）に溶解して、液体試薬に変換して用いても良い。
【００４３】
［２−２．等温増幅反応試薬の成分］
等温増幅反応試薬の成分は、前記の血液由来試料と共存させることで等温増幅反応系を構築するものであり、具体的には、少なくとも、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素、プライマー、緩衝剤、ｄＮＴＰ、及びマグネシウム塩が挙げられる。
【００４４】
［２−２−１．鎖置換型ＤＮＡ複製酵素］
鎖置換型ＤＮＡ複製酵素は、鎖置換活性を有する酵素、すなわち鋳型のＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成していく過程で、伸張方向に二本鎖ＤＮＡがあった場合に、当該二本鎖を解離しながら相補鎖合成を継続することができる酵素をいう。
【００４５】
鎖置換型ＤＮＡ複製酵素としては特に限定されないが、例えば、Bacillus stearothermophilus由来のBst大断片ＤＮＡポリメラーゼ（Exo(-)Bst（Aliotta et al., Genet. Anal., 12:185-195(1996)、www.nebj.jp/jp/products/M0275.html）、Bacillus pallidus由来のBpa ＤＮＡポリメラーゼ（US5,736,373）、Bacillus acidocaldarius 由来のＤＮＡポリメラーゼ（特開2003-274962号公報）、バクテリオファージ由来φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（US5,198,543、US5,001,050、Blanco et al.）、Exo(-)BcaDNAポリメラーゼ（Walker and Linn, Clinical Chemistry42:1604-1608(1996））、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ（Matsumoto et al., Gene 84:247 (1989)）、ファージφＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Jung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8287 (1987)）、ＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Kong et al., J. Biol. Chem. 268:1965-1975 (1993)）、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（Jacobsen et al., Eur. J. Biochem. 45:623-627 (1974)）、Ｔ５ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Chatterjee et al., Gene 97:13-19 (1991)）、シーケナーゼ（登録商標）（米国バイオケミカルズ社製）、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Zhu and Ito, Biochem. Biophys. Acta. 1219:267-276 (1994)）、及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（Kaboord and Benkovic, Curr. Biol. 5:149-157 (1995)）等が挙げられる。さらに、これら酵素は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００４６】
当業者は、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素に向けられた上述の文献（或いはそれらの関連文献）に記載の至適条件に基づいて、本発明の等温増幅系を構築することができる。
例えば、本発明において好ましい鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の一つであるBst大断片ＤＮＡポリメラーゼの至適条件を与える反応液の一例として、次の組成［：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８、２５℃）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（www.nebj.jp/jp/products/M0275.html）］と６０〜６５℃付近の温度とを具備する反応液が知られている。本発明においては、前述のとおり、前処理において従来とは異なる濃度のアルカリ性水溶液を用いているため、本発明の前処理工程によって得られる前処理混合液に上記公知の組成を有する反応液を混合すると、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の活性は阻害され、等温増幅系を構築することはできない。このため、本発明において等温増幅系を構築する際には、前処理に用いたアルカリ性水溶液の存在下であっても鎖置換型ＤＮＡ複製酵素が至適条件を具備することができるように、増幅試薬の各成分の量を適宜決定する。例えば、増幅試薬の成分のうち、マグネシウム塩、カリウム塩、或いは界面活性剤等については、従来の等温増幅反応液における量と同程度或いは同オーダーの量に設定することができる。一方、増幅試薬の成分のうち、緩衝剤については、本発明の前処理に用いたアルカリ性水溶液の存在を考慮して、等温増幅系を構築可能な量を適宜決定する（項目２−２−３に詳述）。
従って、Bst大断片ＤＮＡポリメラーゼを用いる例の場合は、ＫＣｌやＭｇＳＯ４、或いはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００については上記公知の量と同程度・同オーダーの量に設定し、一方、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの量は、上記公知の量とは大きく異なり、反応系が当該酵素の至適ｐＨを維持できる量（項目２−２−３に詳述）に設定することによって、Bst大断片ＤＮＡポリメラーゼの等温増幅系を構築することができる。
【００４７】
従って、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の使用量は、特に限定されるものではなく、適切な等温増幅反応系を構築する量が適宜用いられる。例えば、等温増幅反応液中２００〜１０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは４００〜８００Ｕ／ｍＬとなる量で用いることができる。上記範囲を下回ると、後述の等温増幅反応系の構築が困難になりやすい傾向となる。また、上記範囲を上回っても、後述の等温増幅反応系の構築が困難になりやすい傾向となる。
【００４８】
鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の使用量は、ターゲットとなる配列によって異なり得るため、上記に例示した量を目安とし、ターゲットとなる配列を考慮して適宜増減させる調整をすることができる。当該調整の際には、通常ターゲットとなる核酸配列固有の性質であって増幅効率に影響し得る要素、例えばＧＣ含量、塩基長、特定の特異的配列等の要素が当業者によって考慮される。より具体的な例を挙げると、例えばターゲットとなる配列のＧＣ含量が高い（当業者によって適宜判断されるが例えば７０％以上）場合、ＧＣ量が高くなるほど、上記に例示した範囲の上限を高濃度側にシフトさせる調整を行うことができる。
【００４９】
［２−２−２．プライマー］
プライマー設計は、当業者が適宜行うことができるものであるため、特に限定されるものではない。当業者がプライマー設計するにあたっては、公知の等温増幅法において用いられるプライマーに基づくことができる。公知の等温増幅法としては、例えば、ＳＭＡＰ（SMart Amplification Process）法、ＳＤＡ（Standard Displacement Amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法などが挙げられる。
【００５０】
なお、公知の等温増幅法において用いられるプライマーに基づいて当業者がプライマー設計する際、公知の等温増幅法において用いられるプライマーと同じプライマーを採用することができる。さらに、当該等温増幅法のプライマーの使用に付随して必要となる成分があれば、そのような成分も当業者が適宜選択することができる。
【００５１】
使用するプライマーの量としては特に限定されない。一つの反応でプライマーは複数用いられ得るが、個々の役割によってプライマーそれぞれの濃度は異なるため、所望する等温増幅反応系に応じ、当業者が適切な量を決定することができる。例えば、等温増幅反応液中０．１〜５μＭ、好ましくは０．２５〜２μＭとなる量で用いることができる。上記範囲を下回ると、後述の等温増幅反応系の構築が困難になりやすい傾向となる。また、上記範囲を上回っても、後述の等温増幅反応系の構築が困難になりやすい傾向となる。
【００５２】
［２−２−３．緩衝剤］
緩衝剤の種類としては特に限定されず、分子生物学、核酸関連化学分野において許容されるあらゆる緩衝剤を用いることができる。
例えば、クエン酸、コハク酸、リン酸、炭酸、乳酸、ホウ酸、カコジル酸、酢酸、ベロナール酢酸、コリジン、塩酸、グルタル酸、及びリンゴ酸からなる群から選ばれる酸の塩；ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）の塩基付加塩；及びＴｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）やＭＯＰＳの酸付加塩等が挙げられる。本発明においては、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）の酸付加塩を用いることが好ましい。
【００５３】
上記酸の塩の場合、具体的には、上記例示した酸と強塩基との塩（例えばナトリウム塩やカリウム塩等）が挙げられる。
上記塩基付加塩の場合、具体的には、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）に強塩基（例えば水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等）が付加したものが挙げられる。より具体的には、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨなどが挙げられる。
上記酸付加塩の場合、具体的には、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）に強酸（例えば塩酸等）及びまたは弱酸（例えば酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ホウ酸、リン酸等）が付加した酸付加塩、より具体的には、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩）、ＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ緩衝液）、ＴＮＥ（トリス−塩化ナトリウム−ＥＤＴＡ）等が挙げられる。
さらに、これら緩衝剤は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００５４】
前述のように、本発明の反応試薬は、液体試薬の形態であっても良いし、乾燥試薬の形態であっても良い。液体試薬の場合は、上記緩衝剤は、当該緩衝剤を成分とする緩衝液として提供され得る。上記緩衝剤を成分とする緩衝液は、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適条件から当業者が適宜決定したｐＨに調整したものを用いることができる。例えば、８〜９のｐＨに調整したものを用いることができる。
【００５５】
本発明で用いられる緩衝剤の濃度は、前処理工程において用いられた高濃度のアルカリ性水溶液の存在を考慮し、当該高濃度のアルカリ性水溶液によるｐＨの影響を受けることなく、増幅反応液が鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適ｐＨを維持することが可能な緩衝作用を十分発揮できる程度の十分な濃度でなくてはならない。すなわち、前処理に用いられたアルカリ性水溶液を含む血液由来試料は高ｐＨであるが、この血液由来試料と増幅反応試薬の混合によって得られる増幅反応液においては、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適条件までｐＨが十分に下げられてなければならない。本発明においては、このような増幅反応液を得るための十分な濃度の緩衝剤が用いられる。当該十分な濃度は、従来の増幅反応系で広く用いられてきた濃度よりも高いものである。
【００５６】
緩衝剤の具体的な量は特に限定されるものではなく、適切な等温増幅反応系を構築する量となるように当業者によって適宜決定される。例えば、上記の鎖置換型ＤＮＡ複製酵素を等温増幅反応液中４００〜６００Ｕ／ｍＬ使用すること、及び／又は、上記のアルカリ性水溶液を１００ｍＭ以上の濃度で使用することを前提とした場合、緩衝剤の使用量は、等温増幅反応液中、１００ｍＭ以上、好ましくは１５０ｍＭ以上、より好ましくは２００ｍＭ以上となる量を目安にすることができる。上記範囲の上限値は特に限定されるものではないが、例えば、４００ｍＭ或いは５００ｍＭ程度とすることができる。
上記範囲を下回ると、緩衝作用を発揮しにくい傾向となり、従って増幅反応液の条件が酵素の至適条件から逸脱しやすい傾向となる。また、上記範囲を上回っても、後述の等温増幅反応系の構築が困難になりやすい傾向となる。
【００５７】
上記項目２−２−１で記載したように、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の使用量は、ターゲットとなる配列によって異なるため、上記の前提はいかようにも変動し得る。従って、緩衝剤の使用量も、上記例示した範囲から変動し得る。例えば、上記鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の使用量が、上記前提とした範囲より少ない濃度で用いられる場合、緩衝剤の使用量は、前処理工程で使用したアルカリ性水溶液の濃度を考慮した上で、１００ｍＭより少ない量としても良い。
【００５８】
［２−２−４．ｄＮＴＰ］
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を総称したものである。また、デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、本発明の使用の目的により、当業者によって適宜行われる標識や修飾などの変更がされているものであっても良く、そのような変更されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸も、本発明ではｄＮＴＰに含むものとする。
それぞれのデオキシリボヌクレオチド三リン酸は、等量用いても良いし、例えば核酸配列等に応じて異なる量のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いても良い。
【００５９】
ｄＮＴＰの使用量は、特に限定されるものではなく、適切な等温増幅反応系を構築する量が適宜用いられる。例えば、等温増幅反応液中１〜３ｍＭ、好ましくは１〜２ｍＭとなる量で用いることができる。上記範囲を下回ると、後述の等温増幅反応系の構築が困難になりやすい傾向となる。また、上記範囲を上回っても、後述の等温増幅反応系の構築が困難になりやすい傾向となる。
【００６０】
［２−２−５．マグネシウム塩］
マグネシウム塩は、プライマーとＤＮＡテンプレートとの二重鎖の安定性に資するものであり、そのような目的で従前より用いられているものを特に限定することなく用いることができる。例えば、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどを用いることができる。さらに、これら塩は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００６１】
マグネシウム塩の使用量は、特に限定されるものではなく、適切な等温増幅反応系を構築する量が適宜用いられる。例えば、等温増幅反応液中６〜１０ｍＭ、好ましくは７．５〜８．５ｍＭとなる量で用いることができる。上記範囲を下回ると、プライマーがアニールしにくく増幅効率が下がる傾向となる。上記範囲を上回ると、ミスマッチの安定性もあがるため非特異増幅が起こりやすくなる傾向となる。
【００６２】
［２−２−６．その他の成分］
カリウム塩  −  等温増幅反応試薬に含まれてよいその他の成分として、カリウム塩が挙げられる。カリウム塩は、反応系の塩濃度調整等に用いることができ、このような目的で従前より用いられるものを特に限定することなく用いることができる。例えば、塩化カリウム、硫酸カリウムなどを用いることができる。さらに、これら塩は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００６３】
カリウム塩の使用量は、特に限定されるものではなく、適切な等温増幅反応系を阻害しない量で適宜用いられる。例えば、等温増幅反応液中５〜２０ｍＭ、好ましくは１０〜１２ｍＭとなる量で用いることができる。
【００６４】
検出用標識  −  また、検出用の標識を等温増幅反応試薬に含ませることができる。この標識は、上述の増幅反応試薬のいずれか（例えばプライマー）に結合させたものとして含ませても良いし、上記の増幅反応試薬の成分とは別個の成分として含ませても良い。
標識としては、シグナルの検出によって核酸又は特定の配列の存在を確認する核酸検出方法において従前より用いられるものを、特に限定することなく用いることができ、ＲＩ標識及び非ＲＩ標識を問わない。
【００６５】
ＲＩ標識においては、プライマー標識法、及び増幅産物へのＲＩヌクレオチドの取り込みによる標識法を問わない。
非ＲＩ標識においては、蛍光標識及び酵素標識を問わない。本発明においては、蛍光標識を用いることが好ましい。蛍光標識としては、例えばフルオレセイン系色素、シアニン系色素、ローダミン系色素などが挙げられる。
さらに、これら標識は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００６６】
界面活性剤  −  さらに、界面活性剤を等温増幅反応試薬に含ませることもできる。界面活性剤は、反応液の可溶化及び安定化のために用いることができ、このような目的で従前より用いられるものを特に限定することなく用いることができる。また、イオン性及び非イオン性を問わない。例えば、Ｔｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などを用いることができる。さらに、これら界面活性剤は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００６７】
界面活性剤の使用量は、特に限定されるものではなく、適切な等温増幅反応系を阻害しない量で適宜用いられる。例えば、等温増幅反応液中０．０１〜０．５％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．０５〜０．２％（ｖ／ｖ）となる量で用いることができる。
【００６８】
凍結乾燥製剤  −  さらに、等温増幅反応試薬が乾燥試薬として提供される場合、当該試薬には、凍結乾燥製剤が含まれる。凍結乾燥製剤としては、従前より用いられるものを特に限定することなく用いることができる。例えば、トレハロースなどの糖アルコールが挙げられる。さらに、凍結乾燥製剤は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００６９】
凍結乾燥製剤の使用量は、特に限定されるものではなく、増幅反応試薬の凍結乾燥を行うことができ、且つ増幅反応液中に共存した場合に適切な等温増幅反応系を阻害しない量で、適宜用いられる。例えば、等温増幅反応液中１〜５％（ｖ／ｖ）、好ましくは２〜３％（ｖ／ｖ）となる量が許容される。
【００７０】
［２−３．等温増幅反応液の調製］
増幅反応試薬の成分は、血液由来試料と混合され、等温増幅反応液となる。等温増幅反応試薬の成分は、当該等温増幅反応液において反応を開始する時点で、反応系に含まれるべき成分がすべて共存するように混合されればよい。従って、高濃度のアルカリ性水溶液を含む血液由来試料と、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素とが、緩衝剤の不存在下で混合されないようにすれば、等温増幅反応試薬の各成分を混合する順番は限定されることなく、当業者が適宜決定することができる。
なお、等温増幅反応液中における増幅反応試薬の成分の具体的な量は、上述のとおりである。一方、血液由来試料の混合量としては、使用した血液検体１μＬに対して増幅反応液全体が１０〜１００μＬ、好ましくは１０〜５０μＬとなる量とすることができる。
【００７１】
［２−３−１．液体試薬の使用］
増幅反応試薬が液体試薬である場合、等温増幅反応液中における血液由来試料の量及び増幅反応試薬の成分の量が上述の量となるように、血液由来試料と増幅反応試薬とを混合すればよい。
【００７２】
［２−３−２．乾燥試薬の使用］
増幅反応試薬が乾燥試薬である場合、例えば、当該乾燥試薬を水又は緩衝液（この場合、当該緩衝液中の緩衝剤は、増幅反応液中に存在すべき緩衝剤の一部を成す）に溶解して、上述の組成を有する液体試薬に変換して使用することができる。
【００７３】
或いは、例えば、血液由来試料と、緩衝剤水溶液とを予め混合させ、さらに乾燥試薬を混合させて、等温増幅反応液を調製することもできる。
この態様においては、予め血液由来試料と混合された緩衝剤水溶液（すなわち緩衝液）中の緩衝剤は、増幅反応液中に存在すべき緩衝剤の一部を成す。従って、予め血液由来試料と混合された緩衝剤水溶液中の緩衝剤と、その後に加えられる緩衝剤とを足し合わせた量が、上述の項目２−２−３に記載の濃度、例えば１００ｍＭ以上となるようにすることが好ましい。
また、この態様において、予め血液由来試料と混合される緩衝液の量は、血液由来試料のｐＨを予めある程度のｐＨ（鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適ｐＨに基づく）まで十分に下げることができる程度の量で用いることができる。例えば、予め混合される緩衝液と血液由来試料との混合物において、緩衝剤の濃度が１００〜３００ｍＭ、好ましくは１５００〜２００ｍＭとなる量で使用することができる。
【００７４】
［３．等温増幅工程］
等温増幅工程においては、上述のように構築された反応系にて、等温増幅反応によりＤＮＡ増幅を行う。
【００７５】
等温増幅反応とは、ほぼ一定温度で増幅反応を行うことをいい、ＰＣＲ法のようにＤＮＡ変性工程、プライマーアニール工程及びＤＮＡ鎖伸張工程の各工程で温度を変化させる増幅反応とは、複数の温度設定と温度制御とを必要としない点で異なる。
【００７６】
［３−１．反応温度］
増幅反応を行う温度は、適用する鎖置換型ＤＮＡ複製酵素特有の至適温度に依存するものであるため、特に限定されるものではない。増幅反応を行う温度は、適用する鎖置換型ＤＮＡ複製酵素に応じて当業者が適宜決定する。
鎖置換型ＤＮＡ複製酵素は、例えば約３０℃を下回ると活性を有さず、約７０℃を超えると失活するものが多い。すなわち、３０〜７０℃、或いは３５〜６５℃の範囲に至適温度を有するものが多い。
例えば、本発明において好ましい鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の一つであるBst大断片ＤＮＡポリメラーゼは、６０〜６５℃付近に至適温度を有する。
【００７７】
等温増幅反応工程においては、鎖置換型ＤＮＡ複製酵素の至適温度に保って等温で反応を行う。等温反応においては、温度変化させるための積極的な温度制御を行わなければ、至適温度範囲内での温度変化を許容する。
【００７８】
［３−２．反応時間］
増幅反応を行う時間としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。例えば、０．２５〜３時間、好ましくは０．５〜１時間とすることができる。
【００７９】
［４．増幅反応試薬キット］
本発明のキットは、上記項目２で述べた成分を含む。上記項目２−１−１で述べた液体試薬を含ませても良いし、上記項目２−１−２で述べた乾燥試薬を含ませても良い。それらはすでに述べたように、２種以上の液体試薬として、或いは２種以上の乾燥試薬としてキットに含ませて良い。乾燥試薬をキットに含ませる場合、さらに上記項目２−３−２で述べたような、予め血液由来試料と混合させる緩衝液を別途含ませても良い。
さらに、キットには、特定の増幅反応試薬成分については液体試薬の状態で、他の増幅反応試薬成分については乾燥試薬の状態で含ませても良い。
【実施例】
【００８０】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００８１】
［参考例１］
参考例１では、血液検体を、加熱条件下、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は３３．３ｍＭ）を用いた前処理、及び２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供した。
【００８２】
市販のＥＤＴＡ採血管に採取され、凍結保存されていた血液を５μＬと、５０ｍＭのＮａＯＨ水溶液を１０μＬとを混合し、前処理として、９８℃、５分間の加熱処理を行った。加熱処理の後、処理液を氷水中に浸すことによって冷却した。
【００８３】
上記のように前処理された血液検体１μＬに、増幅試薬４μＬを加え、増幅反応液を得た。
増幅試薬の組成は、次のとおりである。
０．４μＬ    プライマーセット            
２．５μＬ    反応バッファー              
０．２μＬ    Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（１２，０００Ｕ／ｍＬ）
０．９μＬ    水
【００８４】
上記増幅試薬におけるプライマーセットは、SmartAmp Warfarin Dosage Test Kit（（株）ダナフォーム）に含まれるCYP2C9*3（A）、CYP2C9*3（C）、VKORC1-1639（G）、及びVKORC1-1639（A）を用いた。
【００８５】
上記増幅試薬における反応バッファーは、次の組成を有するものを調製して用いた。（SmartAmp Warfarin Dosage Test Kitの反応バッファーは用いていない。）
４００ｍＭ            Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８．８）
２．４ｍＭ            ｄＮＴＰｓ
１６ｍＭ              ＭｇＳＯ４
２０ｍＭ              ＫＣｌ
０．００５％（ｖ／ｖ）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ
なお、増幅反応液全体におけるＴｒｉｓ・Ｃｌの濃度は２００ｍＭである。
【００８６】
上記増幅試薬におけるＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼは、ニュー・イングランド・バイオラボ社のものを水で１０倍希釈して調製したものである。
【００８７】
増幅反応液を、定量PCR用サイクラー（Ｍｘ３０００Ｐ、ストラータジーン社）にセットし、６０℃にて１分間隔で４０回の蛍光量を測定した。蛍光量の測定値の経時変化を示したグラフを図１に示す。図１においては、横軸に時間（分）、縦軸に蛍光量（実測値から、反応開始後１分における蛍光量を減じた量）を示す（以下のすべての図において同じ）。
図１より、この血液検体が、CYP2C9に関してはAのホモ型、VKORC1に関してはAのホモ型の遺伝子型を持つことが分かる。
【００８８】
［比較例１］
比較例１では、血液検体を、加熱条件下、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は３３．３ｍＭ）を用いた前処理、及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供した。
すなわち、増幅反応液全体におけるＴｒｉｓ・Ｃｌの濃度が２０ｍＭとなるように反応バッファーを調製した以外は、上記参考例１と同様の操作を行った。得られた結果を、図２に示す。
図２に示すように、遺伝子型の検出を行うことができなかった。従って、比較例１の条件では適切な増幅反応系を構築することができないことが分かる。
【００８９】
［比較例２］
比較例２では、血液検体を、室温条件下、１５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は１００ｍＭ）を用いた前処理、及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供した。
すなわち、前処理を、以下の方法に換えた以外は、参考例１と同様の操作を行った。
市販のＥＤＴＡ採血管に採取され、凍結保存されていた血液を５μＬと、１５０ｍＭのＮａＯＨ水溶液を１０μＬとを混合し、前処理として、室温で、５分間静置した。
得られた結果を、図３に示す。
図３に示すように、遺伝子型の検出を行うことができなかった。従って、比較例２の条件では適切な増幅反応系を構築することができないことが分かる。
【００９０】
［比較例３］
比較例３では、血液検体を、常温条件下、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は３３．３ｍＭ）を用いた前処理、及び２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供した。
すなわち、前処理を、以下の方法に換えた以外は、参考例１と同様の操作を行った。
市販のＥＤＴＡ採血管に採取され、凍結保存されていた血液を５μＬと、５０ｍＭのＮａＯＨ水溶液を１０μＬとを混合し、前処理として、室温で、５分間静置した。
得られた結果を、図４に示す。
図４に示すように、遺伝子型の検出を行うことができなかった。従って、比較例３の条件では適切な増幅反応系を構築することができないことが分かる。
【００９１】
［実施例１］
実施例１では、血液検体を、常温条件下、１００ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は６６．７ｍＭ）を用いた前処理、及び２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供した。
【００９２】
市販のＥＤＴＡ採血管に採取され、凍結保存されていた血液を５μＬと、１００ｍＭのＮａＯＨ水溶液を１０μＬとを混合し、室温（２５℃）で、５分間静置することにより前処理を行った。
【００９３】
上記のように前処理された血液検体１μＬに、増幅試薬４μＬを加え、増幅反応液を得た。
増幅試薬の組成は、次のとおりである。
０．４μＬ    プライマーセット            
２．５μＬ    反応バッファー              
０．２μＬ    Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（１２，０００Ｕ／ｍＬ）
０．９μＬ    水
【００９４】
上記増幅試薬におけるプライマーセットは、SmartAmp Warfarin Dosage Test Kit（（株）ダナフォーム）に含まれるCYP2C9*3（A）（：参考用）、CYP2C9*3（C）（：参考用）、VKORC1-1639（G）、及びVKORC1-1639（A）を用いた。
【００９５】
上記増幅試薬における反応バッファーは、次の組成を有するものを調製して用いた。（SmartAmp Warfarin Dosage Test Kitの反応バッファーは用いていない。）
４００ｍＭ            Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８．８）
２．４ｍＭ            ｄＮＴＰｓ
１６ｍＭ              ＭｇＳＯ４
２０ｍＭ              ＫＣｌ
０．００５％（ｖ／ｖ）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ
なお、増幅反応液全体におけるＴｒｉｓ・Ｃｌの濃度は２００ｍＭである。
【００９６】
上記増幅試薬におけるＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼは、ニュー・イングランド・バイオラボ社のものを水で１０倍希釈して調製したものである。
【００９７】
増幅反応液を、定量PCR用サイクラー（Ｍｘ３０００Ｐ、ストラータジーン社）にセットし、６０℃にて１分間隔で４０回の蛍光量を測定した。蛍光量の測定値の経時変化を示したグラフを図５に示す。図５においては、横軸に時間（分）、縦軸に蛍光量（実測値から、反応開始後１分における蛍光量を減じた量）を示す（以下のすべての図において同じ）。
図５より、この血液検体について、VKORC1に関してAのホモ型の遺伝子型が検出された。一方、CYP2C9に関しては遺伝子型は検出されなかった。なお、後述の実施例により、ＮａＯＨの濃度を上げると、CYP2C9の遺伝子型が検出可能であることが示されている。
すなわち、本実施例において採用された条件は、VKORC1の遺伝子型のみの検出を行うには十分であるが、CYP2C9の遺伝子型の検出を行うには後述の実施例程度のＮａＯＨ濃度設定（混合液中６６．７ｍＭを上回る濃度、例えば１００ｍＭ）が必要であることがわかる。また、ＮａＯＨ濃度が混合液中６６．７ｍＭであっても、その他の条件（例えば酵素濃度等）の設定を調整することにより、CYP2C9の検出が可能となる場合もある。
すなわち、図５は、遺伝子或いは標的領域の塩基配列によって、好ましい条件（一例としてＮａＯＨの濃度条件）が異なり得ることも示している。
【００９８】
［実施例２］
実施例２では、血液検体を、常温条件下、１５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は１００ｍＭ）を用いた前処理、及び２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供した。
【００９９】
市販のＥＤＴＡ採血管に採取され、凍結保存されていた血液を５μＬと、１５０ｍＭのＮａＯＨ水溶液を１０μＬとを混合し、室温（２５℃）で、５分間静置することにより前処理を行った。
【０１００】
上記のように前処理された血液検体１μＬに、増幅試薬４μＬを加え、増幅反応液を得た。
増幅試薬の組成は、次のとおりである。
０．４μＬ    プライマーセット            
２．５μＬ    反応バッファー              
０．２μＬ    Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（１２，０００Ｕ／ｍＬ）
０．９μＬ    水
【０１０１】
上記増幅試薬におけるプライマーセットは、SmartAmp Warfarin Dosage Test Kit（（株）ダナフォーム）に含まれるCYP2C9*3（A）、CYP2C9*3（C）、VKORC1-1639（G）、及びVKORC1-1639（A）を用いた。
【０１０２】
上記増幅試薬における反応バッファーは、次の組成を有するものを調製して用いた。（SmartAmp Warfarin Dosage Test Kitの反応バッファーは用いていない。）
４００ｍＭ            Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８．８）
２．４ｍＭ            ｄＮＴＰｓ
１６ｍＭ              ＭｇＳＯ４
２０ｍＭ              ＫＣｌ
０．００５％（ｖ／ｖ）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ
なお、増幅反応液全体におけるＴｒｉｓ・Ｃｌの濃度は２００ｍＭである。
【０１０３】
上記増幅試薬におけるＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼは、ニュー・イングランド・バイオラボ社のものを水で１０倍希釈して調製したものである。
【０１０４】
増幅反応液を、定量PCR用サイクラー（Ｍｘ３０００Ｐ、ストラータジーン社）にセットし、６０℃にて１分間隔で４０回の蛍光量を測定した。蛍光量の測定値の経時変化を示したグラフを図６に示す。図６においては、横軸に時間（分）、縦軸に蛍光量（実測値から、反応開始後１分における蛍光量を減じた量）を示す。
図６が示すように、CYP2C9に関してはAのホモ型が検出され、VKORC1に関しては図５の結果と同様に、Aのホモ型の遺伝子型が検出された。
【０１０５】
［実施例３］
実施例３では、血液検体を、常温条件下、１５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は１００ｍＭ）を用いた前処理、及び乾燥試薬を用いて調製された反応液中での増幅反応に供した。
【０１０６】
市販のＥＤＴＡ採血管に採取され、凍結保存されていた血液を５μＬと、１５０ｍＭのＮａＯＨ水溶液を１０μＬとを混合し、室温（２５℃）で、５分間静置することにより前処理を行った。
【０１０７】
上記のように前処理された血液検体に、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８．８）６０μＬを添加して混合した。
得られた処理液２．５μＬを下記の乾燥試薬に加え、増幅反応液を得た。
【０１０８】
乾燥試薬は、次の組成を有する溶液２μＬを反応チューブ内で凍結乾燥させることにより調製した。
０．２μＬ      プライマーセット            
１．２５μＬ    反応バッファー              
０．１μＬ      Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（１２，０００Ｕ／ｍＬ）
０．４５μＬ    水
【０１０９】
上記溶液におけるプライマーセットは、SmartAmp Warfarin Dosage Test Kit（（株）ダナフォーム）に含まれるCYP2C9*3（A）、CYP2C9*3（C）、VKORC1-1639（G）、及びVKORC1-1639（A）を用いた。
【０１１０】
上記溶液における反応バッファーは、次の組成を有するものを調製して用いた。（SmartAmp Warfarin Dosage Test Kitの反応バッファーは用いていない。）
４０ｍＭ              Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８．８）
２．４ｍＭ            ｄＮＴＰｓ
１６ｍＭ              ＭｇＳＯ４
２０ｍＭ              ＫＣｌ
４０％（Ｗ／Ｖ）      トレハロース
０．００５％（ｖ／ｖ）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ
なお、増幅反応液全体におけるＴｒｉｓ・Ｃｌの濃度は２００ｍＭである。
【０１１１】
上記溶液におけるＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼは、ニュー・イングランド・バイオラボ社のものを水で１０倍希釈して調製したものである。
【０１１２】
増幅反応液を、定量PCR用サイクラー（Ｍｘ３０００Ｐ、ストラータジーン社）にセットし、６０℃にて１分間隔で４０回の蛍光量を測定した。蛍光量の測定値の経時変化を示したグラフを図７に示す。図７において、蛍光量は、実測値から、反応開始後１分における蛍光量を減じた値として示している。
図７が示すように、図６の結果と同様に、CYP2C9に関してはAのホモ型が検出され、VKORC1に関しては図５及び図６の結果と同様に、Aのホモ型の遺伝子型が検出された。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】参考例１において、血液検体を、加熱条件下、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は３３．３ｍＭ）を用いた前処理、及び２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供することによって得られた、遺伝子型の検出結果である。
【図２】比較例１において、血液検体を、加熱条件下、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は３３．３ｍＭ）を用いた前処理、及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供することによって得られた、遺伝子型の検出結果である。
【図３】比較例２において、血液検体を、室温条件下、１５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は１００ｍＭ）を用いた前処理、及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供することによって得られた、遺伝子型の検出結果である。
【図４】比較例３において、血液検体を、常温条件下、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は３３．３ｍＭ）を用いた前処理、及び２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供することによって得られた、遺伝子型の検出結果である。
【図５】実施例１において、血液検体を、常温条件下、１００ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は６６．７ｍＭ）を用いた前処理、及び２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供することによって得られた、遺伝子型の検出結果である。
【図６】実施例２において、血液検体を、常温条件下、１５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は１００ｍＭ）を用いた前処理、及び２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌを含む反応液中での増幅反応に供することによって得られた、遺伝子型の検出結果である。
【図７】実施例３において、血液検体を、常温条件下、１５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液（血液とＮａＯＨ水溶液との混合液中のＮａＯＨ濃度は１００ｍＭ）を用いた前処理、及び乾燥試薬を用いて調製された反応液中での増幅反応に供することによって得られた、遺伝子型の検出結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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