(57)【要約】【課題】ガラクチュロン酸を資化する酵母を提供し、ポリガラクチュロン酸の分解産物であるガラクチュロン酸を資化してペクチンの再資源化に貢献する。【解決手段】本発明は、タイ地酒オウ（Ou）の酒もと（Cocha）から単離された低温適応酵母（受託番号：NITE P-611、寄託日：平成２０年７月１８日）由来であって、（１）２０〜４５℃及びｐＨ６.０〜８.４の環境下で安定であり、（２）４０℃付近の至適温度、６.３付近の至適ｐＨ、（３）ガラクチュロン酸、グルクロン酸に作用するが、ガラクトース、グルコース、マンノース、ソルビトール、グルコン酸には作用せず、（４）各１ｍＭのＣｕ2+、Ｆｅ2+、Ｐｂ2+によって阻害を受けるが、各１ｍＭのＭｇ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｎａ+、Ｃａ2+、Ｎｉ2+、Ｋ+、Ｂａ2+、Ｚｎ2+によっては阻害を受けず、ＮＡＤＰＨ特異的であるガラクチュロン酸還元酵素を産生する酵母を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母由来であって、下記の性質を有する分子量約４５ｋＤａのガラクチュロン酸還元酵素。
（１）温度安定性及びｐＨ安定性
２０〜４５℃及びｐＨ６.０〜８.４の環境下で安定である。
（２）至適温度及び至適ｐＨ
至適温度は４０℃付近、至適ｐＨは６.３付近である。
（３）基質特異性
ガラクチュロン酸、グルクロン酸に作用するが、ガラクトース、グルコース、マンノース、ソルビトール、グルコン酸には作用しない。
（４）金属による影響
各１ｍＭのＣｕ2+、Ｆｅ2+、Ｐｂ2+によって阻害を受ける。
（５）電子供与体
ＮＡＤＰＨ特異的である。
【請求項２】
ガラクチュロン酸資化酵母C. diffluens FC11株（受託番号：NITE P-611、寄託日：平成２０年７月１８日）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なガラクチュロン酸還元酵素及びガラクチュロン酸を資化する酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペクチンは野菜や果実に多く含まれているが、その再利用に関して、例えばりんご搾汁残渣に含まれるペクチンは、その約７０％が農作物の肥料、家畜の飼料、増粘多糖類、ゲル化剤、乳タンパク安定剤などの食品添加物に再利用されるにすぎず、残る約３０％のペクチンが廃棄されているとの報告がある。また、ペクチンはりんご以外の果物、特に柑橘類の搾汁残渣にも多く含まれるが、その再利用率はりんごの場合よりもさらに低いといわれている。このようにペクチンの再利用は肥料等の安価な利用かつ食品産業など限られた産業における利用にとどまっており、ペクチンを幅広い産業でバイオマス資源として再利用することは天然資源の確保の面からも、ごみ処理という環境浄化の面からも注目に値する。
【０００３】
ペクチンは植物細胞壁・特に果実の細胞壁に多く含まれる非セルロース性多糖であり、ホモガラクツロナン、ラムノガラクツロナン−I、ラムノガラクツロナン−IIという３つの特徴的な構造ドメインから形成される複合多糖である。このうち、ホモガラクツロナンはペクチンの主要構成糖として知られており、ペクチンの約７０%を占める。ホモガラクツロナンの中でもっとも一般的な構造はガラクチュロン酸のみがα−１,４−結合したポリガラクチュロン酸であり、一部のガラクチュロン酸にはそのカルボキシル基がメチルエステル化されたものやその水酸基がアセチル化されたものが存在している。
【０００４】
ポリガラクチュロン酸は様々な微生物によって分解される。例えば、植物寄生性を示すバクテリア、例えば一部の糸状菌は、ガラクチュロン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド３リン酸にまで代謝する。この代謝は、真性細菌によく見られる代謝系であるエントナードウトロフ（ＥＤ）経路を利用することによって行われている。また、Kluyveromyces属酵母など、酵母においても、ポリガラクチュロン酸のグルコシド結合を加水分解するポリガラクチュロン酸分解酵素（ポリガラクチュロナーゼ）を生産する種はいくつか知られている（例えば非特許文献１や２参照）。
【０００５】
しかしながら、ガラクチュロン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド３リン酸にまで代謝するＥＤ経路は真核生物では確認されておらず、酵母ではポリガラクチュロン酸から分解されたガラクチュロン酸を利用することはできないと考えられていた。事実、Kluyveromyces属酵母をはじめとしたポリガラクチュロナーゼ生産酵母において、ポリガラクチュロナーゼ分解産物であるガラクチュロン酸が資化されたという報告例はない。そして、ガラクチュロン酸を資化する酵母を利用することができれば、ペクチンの再資源化においても有効な手段を与えると考えられる。
【０００６】
ガラクチュロン酸を還元する酵素として、これまでのところカビの一種であるHypocreajecorina株から得られたＬ−ガラクチュロン酸脱水素酵素が報告されているが（非特許文献３）、酵母を起源とするものは知られていない。しかも、低温においても活性を維持するものは知られていない。
【０００７】
一方、近年では、食品の熟成等に用いられている低温機能性酵素への期待が高まっており、その低温適応性微生物が着目されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hirose, N., Kishida, K., Kawasaki, H. and Sakai, T. (1999) Purification and characterization of an endo-polygalacturonase from a mutant of Saccharomyces cerevisiae., Bioscience Biotechnology and Biochemistry vol.63, 1100-1103
【０００９】
【非特許文献２】Sienkstele, R., Bartkeviciute, D. and Sasnauskas K. (1999) Cloning,targeted disruption and heterologous expression of the Kluyveromyces marxianus endo-polygalacturonase gene (EPG1). Yeast vol.15, 311-322
【００１０】
【非特許文献３】Kuorelahti, S., Kalkkinen, N., Penttila, M., Londesborough, J., Richard, P., Identification in the mold Hypocrea jecorina of the first fungal D-galacturonic acid reductase, Biochemistry vol. 44: 11234-11240 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明はガラクチュロン酸を資化する酵母及びそれを分解する酵素を提供し、ポリガラクチュロン酸の分解産物であるガラクチュロン酸を資化してペクチンの再資源化に貢献することを課題としている。
【００１２】
このような背景技術のもと、本願発明者は種々の研究を重ねたところ、タイ地酒オウ（Ou）の酒もと（Cocha）から単離された低温適応酵母が、ガラクチュロン酸を資化していることを見いだし、本願発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の酵母は、タイ地酒オウ（Ou）の酒もと（Cocha）から単離された酵母C. diffluens FC11株であり、本発明のガラクチュロン酸還元酵素は、酵母C. diffluens FC11株によって産生され、以下の性質を有する。
（１）温度安定性及びｐＨ安定性
２０〜４５℃及びｐＨ６.０〜８.４の環境下で安定である。
（２）至適温度及び至適ｐＨ
至適温度は４０℃付近、至適ｐＨは６.３付近である。
（３）基質特異性
ガラクチュロン酸、グルクロン酸に作用するが、ガラクトース、グルコース、マンノース、ソルビトール、グルコン酸には作用しない。
（４）金属による影響
各１ｍＭのＣｕ2+、Ｆｅ2+、Ｐｂ2+によって阻害を受ける。
（５）電子供与体
ＮＡＤＰＨ特異的である。
（６）分子量
約４５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による）である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の酵素によるとペクチンの分解産物であるガラクチュロン酸をＬ−ガラクトン酸に低温で資化することができる。また、この酵素を有する酵母の利用により、ペクチンを低温でＬ−ガラクトン酸まで分解利用できるために、ペクチンの利用範囲が広がる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ゲノムＤＮＡの抽出手順を示す図である。
【図２】プライマーＤ１を用いて決定された酵母ＦＣ１１株の２６ＳｒＤＮＡと酵母C. diffluens標準株との相同性を示す図である。
【図３】プライマーＤ２を用いて決定された酵母ＦＣ１１株の２６ＳｒＤＮＡと酵母C. diffluens標準株との相同性を示す図である。
【図４】酵母ＦＣ１１株の培養（振蕩培養）中における培地中ガラクチュロン酸の減少を示す図である。
【図５】酵母ＦＣ１１株の増殖を示す培養（振蕩培養）曲線である。
【図６】酵母ＦＣ１１株の培養（静置培養）中における培地中ガラクチュロン酸の減少を示す図である。
【図７】酵母ＦＣ１１株の増殖を示す培養（静置培養）曲線である。
【図８】無細胞抽出液によるガラクチュロン酸変換反応を調べるための操作手順を示す図である。
【図９】透析した無細胞抽出液によるガラクチュロン酸変換反応を調べるための操作手順を示す図である。
【図１０】ＮＡＤＰＨの酸化反応を調べるための操作手順を示す図である。
【図１１】無細胞抽出液によるガラクチュロン酸変換反応におけるクロマトグラムであって、上のクロマトグラムは加熱した無細胞抽出液による場合を、下のクロマトグラムは非加熱の細胞抽出液による場合を示す。
【図１２】透析後の無細胞抽出液（ＮＡＤＰＨ添加）によるガラクチュロン酸変換反応におけるクロマトグラムであって、上のクロマトグラムは非加熱の透析した無細胞抽出液による場合を、下のクロマトグラムは加熱処理後の透析した無細胞抽出液による場合を示す。
【図１３】精製された酵素によるガラクチュロン酸の還元反応を調べるための操作手順を示す図である。
【図１４】酵素精製途中におけるDEAE-toyopearlカラムによるクロマトグラムである。
【図１５】酵素精製途中における第１回目のRed-toyopearlカラムによるクロマトグラムである。
【図１６】酵素精製途中における第２回目のRed-toyopearlカラムによるクロマトグラムである。
【図１７】酵素精製途中におけるMono Q HRカラムによるクロマトグラムである。
【図１８】分画により得られた酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図１９】精製された酵素の温度安定性を示す図である。
【図２０】精製された酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図２１】精製された酵素の至適温度を示す図である。
【図２２】精製された酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図２３】精製された酵素反応における金属塩の影響を調べるための操作手順を示す図である。
【図２４】還元糖量の測定方法を示す図である。
【図２５】酵素反応による反応産物のＮＭＲチャートである。チャート上の角枠内にその一部が拡大されている。
【図２６】Ｄ−ガラクトノ１，４ラクトンのＮＭＲチャートである。
【図２７】Ｄ−ガラクトノ１，４ラクトンアルカリ開環産物のＮＭＲチャートである。チャート上の角枠内にその一部が拡大されている。
【図２８】ガラクチュロン酸のＮＭＲチャートである。チャート上の角枠内にその一部が拡大されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の酵素は、タイ地酒オウ（Ou）の酒もと（Cocha）から単離された低温適応酵母由来の分子量約４５ｋＤａのガラクチュロン酸酸化酵素であって、次の理化学的性質を有する。
（１）温度安定性及びｐＨ安定性
２０〜４５℃及びｐＨ６.０〜８.４の環境下で安定である。
（２）至適温度及び至適ｐＨ
至適温度は４０℃付近、至適ｐＨは６.３付近である。
（３）基質特異性
ガラクチュロン酸、グルクロン酸に作用するが、ガラクトース、グルコース、マンノース、ソルビトール、グルコン酸には作用しない。
（４）金属による影響
各１ｍＭのＣｕ2+、Ｆｅ2+、Ｐｂ2+によって阻害を受けるが、各１ｍＭのＭｇ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｎａ+、Ｃａ2+、Ｎｉ2+、Ｋ+、Ｂａ2+、Ｚｎ2+によって阻害を受けない。
（５）電子供与体
ＮＡＤＰＨ特異的である
【００１７】
本発明の酵素は、低温適応酵母であるCryptococcus diffluens FC11株（寄託番号：NITE P-611、寄託日：平成２０年７月１８日）によって産生される。この酵母は、タイの地酒オウ（Ou）の酒もとを分離源とする培養から単離された酵母である。この酵母は、一般的な酵母があまり増殖を示さない４℃で顕著に増殖し、１５〜３０℃で良好に増殖するが、３５℃以上ではほとんど増殖しない。この酵母はガラクチュロン酸を資化し、好気性条件下では、ガラクチュロン酸を含有しない培地よりも、それを含有する培地において増殖速度が速い。
【００１８】
この酵母は、他の酵母では認められないガラクチュロン酸資化能を有するという特徴を有する他、次の形態学的特徴や生理学的性質を有する。なお、形態学的特徴や生理学的性質は他のCryptococcus diffluens属に属する菌株とほぼ変わりがなく、低温での増殖に特徴があると言える。
（１）形態学的特徴
球形、単極出芽であるが、偽菌糸については不明。
（２）温度特性
４〜３０℃で増殖し、約２５℃が最適増殖温度であって、１５℃以下においても旺盛に増殖する。
（３）菌学的特徴
好気性菌で発酵性はなく、嫌気条件では生育しない。
（４）酵素生産
ガラクチュロン酸還元酵素の他にポリガラクチュロン酸（ペクチンの主要構成糖）分解酵素及びアミラーゼ、オーツスペルトキシランの分解酵素を生産する。また、ガラクチュロン酸還元酵素以外のこれらの酵素も低温適応酵素であって、ガラクチュロン酸還元酵素の酵素活性（分解活性）の至適温度は３０℃であり、１５℃での活性が最大活性の活性の約８０％、４℃でも最大活性の約２０％程度である。
（５）資化性
スクロース、マルトース、トレハロース、ラクトース、ルフィノース、可溶性デンプン、キシロース、アラビノース、ラムノース、ガラクチュロン酸を資化するがガラクトース、リボースを資化しない。また、その他の資化性について、Cryptococcus diffluens strain CBS8985と相違はない。
【００１９】
酵母を培養するための培地は、他の酵母を培養するための培地と変わるところがなく、種々の酵母培養用の培地が用いられる。ただし、本発明の酵母はガラクトースやリボースを資化できないので、培地にはガラクトースやリボース以外の糖が用いられ、スクロース、マルトース、トレハロース、ラクトース、ルフィノース、可溶性デンプン、キシロース、アラビノース、ラムノースが好ましく用いられる。また、上記のとおり、ガラクチュロン酸を資化し、ガラクチュロン酸を用いることにより増殖速度が高くなるので、ガラクチュロン酸を前記糖に替えて、あるいは前記糖に加えて用いるのが好ましい。
【００２０】
培養条件、特に培養温度については他の酵母とは異なり、３５℃を超えると生育はほとんど認められず、３５℃以下の低温度における好気的条件下、具体的には４〜１５℃の温度において培養するのが好ましい。培地のｐＨについては他の酵母と同様に中性付近で培養を行わせることもできるが、ｐＨ５.０〜６.０の条件下で培養をするのが好ましい。ｐＨ７.０付近になると増殖速度が低下する傾向にあり、他の酵母に比べると最適生育ｐＨは低いと考えられる。
【００２１】
本発明の酵素はガラクチュロン酸を還元してＬ−ガラクトン酸を生成する。酵素反応は、至適ｐＨであるｐＨ６.３付近で行わせるのが望ましいが、ｐＨ６〜８の範囲で反応を行わせることができる。また、至適温度である４０℃付近で行わせるのが望ましいが、１０〜５０℃の温度範囲で行わせることもできる。特に１０〜３０℃の低温においても、至適温度における活性の６０％程度の活性効率で反応を行わせることができ、室温条件でもガラクチュロン酸をＬ−ガラクトン酸に変換することができる。
【００２２】
得られた、Ｌ−ガラクトン酸は、例えば加熱調理用食品の添加剤として使用される他（特開２００５−２１１５３号公報参照）、種々の工業用薬品として使用されうる。
【実施例１】
【００２３】
次に、本発明の酵母及び酵素について、以下の実施例に基づき、さらに詳細に説明する。
〔酵母の単離〕
タイ地酒オウ（Ou）の酒もと（Cocha）を滅菌生理食塩水に懸濁し、ＹＰＤ培地に接種後、４℃で１４日間静置した。その培養液を、アンピシリン（５０μg/ml）含有ＹＰＤプレート培地に塗布して２５℃で培養した。プレート培地に生育したコロニーを再度ＹＰＤ培地で４℃、７日間培養し、生育した菌株から酵母菌（ＦＣ１１株）を選別した。
【００２４】
選別した酵母菌を、ＹＰＤ培地を用いて各種温度（４℃、１５℃、２５℃、３５℃）で７日間培養したところ、４℃で顕著に増殖し、１５〜２５℃で良好な生育が認められた。また、３５℃以上では生育が認められなかったので、選別された酵母は低温適応性であることが判別した。
【００２５】
〔菌株の同定〕
（ａ）２６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列の解析
酵母の２６ＳｒＤＮＡの塩基配列解析を行った。
ｉ）ＤＮＡの塩基配列の確認
ＰＣＲの鋳型とするために菌体からゲノムＤＮＡの抽出を行った。その抽出法を図１に示す。次にＰＣＲに用いるプライマーを合成した。その塩基配列が表１に示される。２６ＳＤ１で示されるプライマー（配列番号１）はForward側、２６ＳＤ２で示されるプライマー（配列番号２）はReverse側である。また、相同性を調べるために用いられた菌株を表２に示した。
【００２６】
【表１】
2010130998.tif 000002
【００２７】
塩基配列決定はDye termination法を用いた。ゲノムＤＮＡの抽出に用いた試料はBECKMAN COULTER社製のCEQTM DTCS-Quick Start Kitを用いて作製した。実験手法は付属説明書に従った。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記表１に示すプライマーを用いた。反応はBIO-RAD社製のi Cyclerにより行った。反応溶液の調製は東洋紡社のBlend Taq ポリメラーゼの付属説明書を参考にした。反応は、変性９４℃、３０秒、アニーリング４９.１℃, １分、伸長７２℃ １.５分で３５サイクル行った。シークエンサーは、BECKMAN COULTER社製のCEQ 2000XLF DNA Analysis Systemを使用した。塩基配列の解析は、遺伝子解析ソフトGENETYX（ソフトウェア開発社製）によって行った。
【００２８】
ii）ＤＮＡの塩基配列
上記により決定された酵母２６ＳｒＤＮＡの塩基配列の相同性が表２に示された。また、本発明の単離された酵母ＦＣ１１株と酵母C. diffluens CBS8985株、UWFP株（以下においては、両者を「標準株」として説明する）との相同性が図２及び図３に示された。各図上段はC. diffluens標準株の２６ＳｒＤＮＡを、各図下段は本発明の単離された酵母ＦＣ１１株の２６ＳｒＤＮＡを示している。Forward側のＤ１プライマーの使用により決定された酵母C. diffluens標準株の塩基配列が配列表の配列番号３で、Ｄ１プライマーの使用により決定された酵母ＦＣ１１株の塩基配列が配列番号４で示される。また、Ｄ２プライマーの使用により決定された酵母C. diffluens標準株の塩基配列が配列表の配列番号５で、Ｄ２プライマーの使用により決定された酵母ＦＣ１１株の塩基配列が配列番号６で示される。配列番号７で示されたものは酵母２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の全塩基配列である。この塩基配列は、Kurutzman、Robnettの方法（1998）により決定されたものである。
【００２９】
【表２】
2010130998.tif 000003
【００３０】
（ｂ）糖の資化性
次に選別された酵母ＦＣ１１株における糖の資化性について調べた。酵母の前培養にはＧＹＰ培地（酵母エキス０.５w/v%、Peptone ０.５w/v%、Glucose ０.５w/v％含有）を使用し、資化性の確認にはＳＣ糖添加培地（糖２.０w/v％、Yeast nitrogen base ０.７w/v％、Casamino acid ０.５w/v％含有）とＳＣ糖無添加培地（Yeast nitrogen base ０.７w/v％、Casamino acid ０.５w/v％含有）を使用した。糖の資化性は、「The yeasts; a taxonomic study(Elsevier)(9)」を参考にして調べられた。
【００３１】
（ｃ）ガラクチュロン酸の資化性
ガラクチュロン酸（GalA）の資化性は、ＳＣ糖添加培地とＳＣ糖無添加培地を用いて酵母を培養した時の菌体の増殖と培養液中の糖の減少の経時変化を比較することによって調べられた。糖の資化は、ＳＣＧａｌＡ添加培地（GalA０.５w/v％、Yeast nitrogen base ０.７w/v％、Casamino acid ０.５w/v％含有）とＳＣ糖無添加培地（Yeast nitrogen base ０.７w/v％、Casamino acid ０.５w/v％含有）を使用した振蕩培養（好気的環境下）と静置培養（嫌気的環境下）とで行った。菌体の増殖はＯＤ660によって計測し、糖の定量が高性能陰イオンクロマトグラフィ（以下「ＨＰＡＥＣ」と言う）によって行われた。その結果が表３及び図４〜図７に示された。図４及び図５は振蕩培養による場合を、図６及び図７は静置培養による場合を示し、各図とも培地がガラクチュロン酸を含む場合を示している。ＨＰＡＥＣの条件が表４に示される。なお、表３にはこれまで各種の文献で知られている種々の酵母（C. diffluens株）の資化性を参考に記した。表３中に示されるvariableは、菌株によって資化性が確定できないことを示しているが、そのほとんどは資化性があると考えられている。
【００３２】
【表３】
2010130998.tif 000004
【００３３】
【表４】
2010130998.tif 000005
【００３４】
上記２６ＳｒＤＮＡの相同性検索と糖の資化性の調査の結果、選別された菌株ＦＣ１１株は、C. diffluens標準株の有する性質とよく一致した。また、赤みがかったコロニーをＧＹＰ寒天培地に形成し、この形態からもC. diffluens標準株と一致した。これらのことより、選別された菌株はC. diffluens（C. diffluensＦＣ１１株）であると結論づけられた。
【００３５】
〔ガラクチュロン酸の酵素変換〕
次に、C. diffluensＦＣ１１株の無細胞抽出液（粗酵素）を用いて、ガラクチュロン酸の酵素変換について検討した。
【００３６】
（ａ）酵母の培養
ＧＹＰ寒天培地に菌をまきコロニーを形成させた。このコロニーをＧＹＰ培地３mlに植菌し、３０℃で１８時間振盪培養したものを種培養として用いた。
【００３７】
まず、培地炭素源の酵素発現に及ぼす影響及び反応液のｐＨ条件の検討を行った。その検討には、ガラクチュロン酸、シトラスペクチン、グルコース、ガラクトースの４種類の炭素源を用い、炭素源１w/v％、酵母エキス０.５w/v％、ペプトン０.５w/v％を含み、所定のｐＨ５.０に調製された４種類の本培養用の培地を使用した。本培養用の培地２０mlを太試験管に入れ、種培養を１００μlを植菌し、３０℃４８時間振蕩培養した。
【００３８】
上記培養により酵素発現条件を確定した後、ガラクチュロン酸１w/v％、酵母エキス０.５w/v％、ペプトン０.５w/v％含有、ｐＨ５.０に調製された本培養の培地を使用し、太試験管に２０mlの培地を入れ、種培養の１００μlを植菌し、３０℃で４８時間振蕩培養した。
【００３９】
（ｂ）無細胞抽出液（粗酵素）の調製
培養菌体を遠心分離（15,000rpm、１０分間）により集菌し、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（以後「ＫＰＢ」と称する。）ｐＨ７.０で洗菌後、１０ｍＭＫＰＢｐＨ７.０に懸濁した。懸濁菌体はビーズビーダーを用いて破砕し（2,500rpm、１分間、３回繰り返し）、遠心分離（15,000rpm、１０分間）により上清画分と沈殿（細胞残渣）画分に分離した。得られた上清画分を無細胞抽出液とした。
【００４０】
（ｃ）無細胞抽出液によるガラクチュロン酸変換反応
図８に示す方法に従い、４種類の炭素源を用いて培養した菌体から得られた無細胞抽出液を用いて１８時間酵素反応を行った。コントロールとして５分間加熱した無細胞抽出液を用いた。活性の有無は反応液１０μlをDionex DXc-500システム・ＨＰＡＥＣに供し、ガラクチュロン酸の定量によって確認した。高速液体クロマトグラフィの条件は前記表４に示す条件と同じである。また、変換反応のｐＨ条件はｐＨ５.０，６.０，７.０とし、ｐＨ５.０は酢酸バッファー、ｐＨ６.０とｐＨ７.０はＫＰＢによって調製した。
【００４１】
（ｄ）透析した無細胞抽出液によるガラクチュロン酸変換反応
無細胞抽出液２５ｍｌを１０ｍＭＫＰＢ１０００ｍｌで２時間透析をした。ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭ酵素反応液に添加する場合にはこの操作を２回繰り返した。反応組成及び操作、活性の確認方法は図９に示された。活性の有無は反応液１０μｌをDionex DXc-500システム・ＨＰＡＥＣに供し、ガラクチュロン酸の定量によって確認した。ＨＰＡＥＣの条件は、上記（ｃ）無細胞抽出液と同じ条件である。なお、比較例として透析後の無細胞抽出液を加熱処理して、同様の試験を行った。
【００４２】
（ｅ）ガラクチュロン酸依存性ＮＡＤＰＨの酸化反応
ガラクチュロン酸の酵素反応におけるＮＡＤＰＨの関与を確認するため、図１０に示された方法でＮＡＤＰＨの酸化反応を調べた。ガラクチュロン酸の酵素反応におけるＮＡＤＰＨの酸化は、ＮＡＤＰＨに特異的な吸収波長（ＯＤ340）の初速度変化を測定することによって求めた。
【００４３】
（ｆ）試験結果
酵素発現条件として、上記したように、４種類の炭素源を用いてガラクチュロン酸変換酵素の発現に及ぼす影響を調べた。その結果、ガラクチュロン酸を炭素源として培養した菌の無細胞抽出液でのみガラクチュロン酸のピークの減少を確認することができた（図１１）。また、図１１にはｐＨが７.０の場合を示しているが、反応液のｐＨが６.０のときにもガラクチュロン酸の減少を確認することができた（図示せず）。しかしながら、ｐＨ５.０の場合はピークの減少を確認することはできなかった（図示せず）。
【００４４】
次に、無細胞抽出液を十分に透析したのち、図８に示された反応条件で同じ反応を行ったところガラクチュロン酸の減少は見られなかった。そこで補酵素が関与している可能性を考慮し、ＮＡＤＰとＮＡＤＰＨを添加して図９に示された条件で反応を行ったところ、ＮＡＤＰＨを添加した場合に活性が復活し、ガラクチュロン酸のピークは消失していた（図示せず）。このことよりガラクチュロン酸変換反応はＮＡＤＰＨを補酵素とする還元反応であることが確認された。また、ＮＡＤＰＨを加え反応時間１０分で反応を行ったところ、図１２に示されたようにGalA（ガラクチュロン酸）のピークの減少が確認できた。また、反応産物と思われる新たなピークが現れた。次に、ガラクチュロン酸の酵素反応におけるＮＡＤＰＨの関与を調べた結果、ガラクチュロン酸の添加に基づくＯＤ340の減少を確認することができた（図示せず）。
【００４５】
このようにガラクチュロン酸の変換反応がＮＡＤＰＨの酸化と連動していることより、ガラクチュロン酸の還元反応が起っていると考えられた。
【００４６】
〔ガラクチュロン酸還元酵素の精製〕
C. diffluensＦＣ１１株から、ガラクチュロン酸還元酵素の精製を行った。
（ａ）種培養及び本培養
種培養にはＧＹＰ培地（Yeast extract ０.５%、Peptone ０.５%、Glucose ０.５％含有）を用いた。また、本培養には、ガラクチュロン酸変換反応の際に用いた本培養用の培地を改良したガラクチュロン酸０.２w/v％、酵母エキス０.５w/v％、ペプトン０.５w/v％含有、ｐＨ５.０の培地を使用した。培養は１００ｍｌの培地を５００ｍｌコルベンに入れたものを１０本、合計１Ｌで４４時間振蕩培養を行った。
【００４７】
（ｂ）酵素活性の測定
本酵素の活性はガラクチュロン酸の還元に伴うＮＡＤＰＨ酸化で測定した。この測定は図１３に示す方法で行った。また、タンパク質の定量は２８０ｎｍの吸光度から算出した。
【００４８】
（ｃ）還元酵素の精製
培養菌体を遠心分離（10,000rpm、１０分間）で集菌し、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で洗菌後、１０ｍＭＫＰＢに懸濁した。懸濁菌体はOHTAKE WORKSのFRENCH PRESSを用いて1,500kg/cm2で１回破砕を行った。破砕した菌体を遠心分離（10,000rpm、１０分間）により、上清画分と沈殿（細胞残渣）画分に分離した。上清画分を１０ｍＭＫＰＢで十分に透析したものを粗酵素液とした。
【００４９】
得られた粗酵素液を１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で平衡化したDEAE-toyopearlカラム（φ４×６ｃｍ）に供し、０〜０.５ＭＮａＣｌの直線濃度勾配法により溶出した。流速は４.０ml/min（１０ml/fraction）で行った。このときのクロマトグラムが図１４に示された。
【００５０】
DEAE-toyopearlカラムクロマトにより得られた活性画分を回収し、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で透析した後、１０ｍＭＫＰＢで平衡化したRed-toyopearlカラム（φ１×２０ｃｍ）に供し、０.３ＭのＮａＣｌで洗浄後０.３〜０.８ＭＮａＣｌの直線濃度勾配法により溶出した。１.０ml/min（５ml/fraction）で行った。このときのクロマトグラムが図１５に示された。
【００５１】
さらに、Red-toyopearlカラムクロマトにより得られた活性画分を回収し、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で透析した後、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で平衡化したRed-toyopearlカラム（φ１×２０ｃｍ）に再び供し、０〜０.５ＭＮａＣｌの直線濃度勾配法により溶出した。１.０ml/min（５ml/fraction）で行った。このときのクロマトグラムを図１６に示された。
【００５２】
２回目のRed-toyopearlカラムクロマトにより得られた活性画分を回収し、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で透析した後、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で平衡化したAmersham Pharmacia Biotech 社製のMono Q HR 5/5カラムに供し、０〜０.４ＭＮａＣｌの直線濃度勾配法により溶出した。１.０ml/min（１ml/fraction）で行った。このときのクロマトグラムが図１７に示された。
【００５３】
Mono Qカラムにより得られた活性画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって精製度を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、「細胞工学  別冊目で見る実験ノートシリーズ  バイオ実験イラストレイテッド５」（秀潤社）の方法に従った。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの組成が表５に、２×サンプルバッファーの組成が表６に示される。サイズマーカーにはXL-Lader Broad（APRO）を用いた。酵素液と等量のサンプルバッファーを混合し、１００℃、３分間熱処理して調製したサンプルを２０ｍＡで電気泳動後、クマシーブルー染色を行ってタンパク質のバンドを検出した。その結果が図１８に示された。
【００５４】
図１８に示すレーン７、８、９はそれぞれMono QカラムによるフラクションＮｏ.５０、５１、５３に対応する。これらのレーンはほぼ単一のバンドを示し、精製度が高いことが確認された。また、これらのバンドから、ガラクチュロン酸の還元酵素の分子量は約４５ｋＤａであると確定された。
【００５５】
【表５】
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【００５６】
【表６】
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【００５７】
〔ガラクチュロン酸還元酵素の性質〕
次に精製された酵素の性質が調べられた。
（ａ）温度安定性及びｐＨ安定性
温度安定性は酵素をｐＨ７.０において各温度で３０分間放置した後、残存する活性を反応温度３０℃で測定することにより調べた。また、ｐＨ安定性は４℃において各ｐＨで１２時間放置した後、残存する活性をｐＨ７.０で測定することにより調べた。測定は図１３に示す方法に準じて行われた。各ｐＨの調整は、ｐＨ４.０とｐＨ５.０は酢酸バッファー、ｐＨ６.０とｐＨ７.０及びｐＨ８.０はＫＰＢ、ｐＨ９.０はグリシンバッファー、ｐＨ１０.０はＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３を用いた。これらの結果は図１９及び図２０に示された。
【００５８】
これらの結果、この酵素は４５℃まで安定であり、ｐＨ６.０〜８.４で比較的安定であることが判った。これらの保存環境下においても、６０％以上の相対活性を有し、失活することはなかった。
【００５９】
（ｂ）至適温度及び至適ｐＨ
酵素反応における温度とｐＨの影響を調べた。至適温度の測定は、図１３に示した方法と同様の方法で行われ、反応液を各温度で１分間インキュベートした後に活性測定が実施された。至適ｐＨの測定において、ｐＨ４.０とｐＨ５.０は酢酸バッファー、ｐＨ６.０とｐＨ７.０及びｐＨ８.０はＫＰＢ、ｐＨ９.０はグリシンバッファー、ｐＨ１０.０はＮａ2ＣＯ3−ＮａＨＣＯ3を用いてｐＨ調整を行った。各バッファーは５０ｍＭに調製した。これらの結果は図２１及び図２２に示された。
【００６０】
その結果、至適温度は約４０℃、至適ｐＨはｐＨ６.３であることがわかった。また、本酵素は１０℃においても最大活性の約６０％の相対活性を示し、好冷性酵素であると結論づけられる。
【００６１】
（ｃ）酵素反応における金属塩の影響
金属塩の影響は次に示すＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＢａＣｌ2、ＺｎＣｌ2、ＮｉＣｌ2、ＣｏＣｌ2、ＭｎＣｌ2、ＨｇＣｌ2、ＣｕＣｌ2、ＣｄＣｌ2、ＦｅＣｌ2、ＡｇＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＰｂＣｌ2を各々１ｍＭ添加することにより調べた。反応条件が図２３に示された。また、それらの結果は表７に示された。
【００６２】
【表７】
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【００６３】
本酵素のガラクチュロン酸の還元活性は１ｍＭのＣｕ2+、Ｆｅ2+、Ｐｂ2+で完全な阻害を受けた。Ｃｄ2+、Ｚｎ2+に若干の阻害が認められた。１ｍＭのＭｇ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｎａ+、Ｃａ2+、Ｎｉ2+、Ｋ+、Ｂａ2+、Ｚｎ2+は活性を阻害することはなかった。また、活性を促進する金属は確認できなかった。
【００６４】
（ｄ）基質特異性
基質特異性の検討には、基質にガラクチュロン酸、ガラクトース、グルクロン酸、グルコース、マンノース、ソルビトール、グルコン酸を各５０μｇ/ml用い、図１３に示す方法に従った。その結果が表８に示された。
【００６５】
【表８】
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【００６６】
本酵素はガラクチュロン酸に対してもっとも強い活性を示した。しかし、６位が水酸基であるガラクトースに対してまったく活性を示さなかった。また、ウロン酸であるグルクロン酸に対してはガラクチュロン酸に対する活性の２／３の活性を示した。アルドン酸であるグルコン酸に対してはまったく活性を示さなかった。これらのことより本酵素は糖の６位のカルボキシル基を認識して反応することが示唆された。
【００６７】
（ｄ）補酵素要求性
補酵素要求性はＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを各０.２５ｍＭ用いて、図１３に示す方法に準じて行った。その結果が表９に示される。
【００６８】
【表９】
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【００６９】
ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨを補酵素として添加し、反応を行った結果、表９に示されたようにＮＡＤＰＨ添加時にＯＤ340の減少が確認できた。この減少はガラクチュロン酸依存的であった。しかし、ＮＡＤＨ添加時には確認できなかった。このことから、本酵素はＮＡＤＰＨを補酵素（電子供与体）として利用していると言える。
【００７０】
〔ガラクチュロン酸還元酵素による反応産物の同定〕
（ａ）ソモギーネルソン法による定量
ガラクチュロン酸の１位のアルデヒド基が還元されているのではないかと仮定し、酵素反応による還元末端糖量の変化を測定した。還元糖量の定量はソモギーネルソン法に従い、ガラクチュロン酸の吸収ピークであるＯＤ660における検量線からガラクチュロン酸の濃度を測定した。その測定方法が図２４に示された。コントロールとして煮沸処理した酵素を用いて反応させた反応溶液を用いた。その結果が表１０に示された。
【００７１】
【表１０】
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【００７２】
結果、コントロールとして煮沸処理した酵素を用いた反応液よりも酵素反応液の還元末端糖量が減少しており、本酵素が１位のアルデヒド基を還元していることが理解された。
【００７３】
（ｂ）反応産物の精製
ガラクチュロン酸０.０５ｍＭを含む５０ｍＭＫＰＢの基質溶液に、酵素とＮＡＤＰＨを徐々に加えていき酵素反応を行った。ＮＡＤＰＨの減少をＯＤ340によって計測し、減少が見られなくなった時の反応液と反応前の基質溶液をＨＰＡＥＣによって測定しガラクチュロン酸のピークの消失を確認した。酵素反応の終了後、反応液を遠心濃縮により８０倍に濃縮した。その後、不溶化した酵素タンパクを遠心分離（15,000rpm、１０分間）により取り除いた。その後、Bio-Gel P-2 Gelに供し、ＮＡＤＰＨと反応産物を分離した。ＨＰＡＥＣで目的とする反応産物ピークを確認した。その後、エバポレーターにより乾固し、精製物を得た。
【００７４】
（ｃ）ＮＭＲ（核磁気共鳴）による解析
ＮＭＲ日本電子JMTC-400/54/SS400MHzを用いてガラクチュロン酸、Ｄ−ガラクトノ１，４ラクトン、Ｄ−ガラクトノ１，４ラクトンアルカリ開環産物（Ｄ−ガラクトン酸）、反応産物の解析を行った。得られた13Ｃ ＮＭＲのスペクトルとChemDraw Ultra 6.0によって示されたスペクトルの比較によってその確認を行った。解析に用いた反応産物は、得られた反応産物をＤ2Ｏに溶解し凍結乾燥させたものを用いた。その結果が図２５〜２８に示される。図２５は反応産物を、図２６はＤ−ガラクトノ１，４ラクトンを、図２７はＤ−ガラクトノ１，４ラクトンアルカリ開環産物を、図２８はガラクチュロン酸を示す。
【００７５】
その結果、図２５〜２８に示されるように、開環させたＤ−ガラクトノ１，４ラクトンのスペクトルと反応産物のスペクトルが一致した。このことから本酵素による反応産物は、Ｄ−ガラクトノ１，４ラクトンが開環した化合物であると同定した。ＮＭＲではＤ体とＬ体はほぼ同じスペクトルを与えるので、反応産物はＬ−ガラクトン酸であることが理解された。
【００７６】
なお、非特許文献３で開示されているＬ−ガラクトン酸脱水素酵素はガラチュロン酸の酸化反応（逆反応）も触媒するが、本発明のガラクチュロン酸還元酵素はこの逆反応の作用はほとんどなく、また、至適温度が低温域にあるため、酵素としては全く異なる酵素であると言える。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明による酵母及び酵素はガラクチュロン酸を資化して、Ｌ−ガラクトン酸を生成するので、ペクチンの分解産物であるガラクチュロン酸がバイオマスとして容易に利用されうる。特にガラクチュロン酸還元酵素は１０〜２０℃ないし３０℃という比較的低温環境下でも優れた活性を示す。従って、室温での還元反応も可能となり、エネルギーコストが軽減される。また、酵母も低温下で増殖可能なために、ペクチンを炭素源とする種々の発酵食品やバイオマスへの応用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図１８】
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【配列表】
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