(57)【要約】【課題】歯根膜又は靭帯の新たな再生治療手段を提供する。【解決手段】ＧＤＦ−５を有効成分とする歯根膜又は靭帯再生治療薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＦ−５を有効成分とする歯根膜、靭帯又は腱再生治療薬。
【請求項２】
歯周靭帯再生治療薬である請求項１記載の再生治療薬。
【請求項３】
ＧＤＦ−５及び歯槽骨再生促進物質を含有する歯周組織再生治療薬。
【請求項４】
歯根膜及び歯槽骨の再生治療薬である請求項３記載の歯周組織再生治療薬。
【請求項５】
歯槽骨再生促進物質がＢＭＰ−２、ＯＰ−１又はＰＤＧＦ−ＢＢである請求項３又は４記載の歯周組織再生治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病や靭帯・腱断裂等によって失なわれた歯根膜、靭帯又は腱を再生するための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患や手術によって失われた組織や臓器を治療するためには、組織移植や臓器移植が行われている。しかしながら、移植のためには組織採取や臓器提供のドナーが必要となる。たとえ僅かな組織採取でも、健常な部位への外科的侵襲は望ましいことではなく、ドナーを必要としない再生医療が注目されている。再生の方法として細胞や増殖因子、そして細胞を入れる担体などを利用して、人間が本来持つ再生能力を高める方法が考えられている。なかでも再生の主体となるのが細胞であり、患者本人の僅かな組織を採取し、培養して移植する方法が現在の再生治療研究の中心となっている。皮膚の再生は１９８０年代から多くの臨床応用が行われ、それ以外にも関節軟骨の再生はすでに海外で実用化されている。
【０００３】
従来歯科の分野では、骨や歯周組織の再生を中心として再生医療の研究が進められてきた。歯周組織再生のためのスペースを膜を用いて確保する方法は、ＧＴＲ法（組織再生誘導法、Guided Tissue Regeneration）と呼ばれ、手技の難しさはあるものの臨床効果は繰り返し証明されている。これは歯周疾患によって失われた骨や歯根膜の部分を十分に清掃し、感染組織を取り除いた後、ゴアテックスなどの素材で作られたＧＴＲ膜を設置する方法である。このＧＴＲ膜が、周囲からの上皮や線維性組織の侵入を防ぐとともに、内部からの幹細胞や前駆細胞の遊走を助け、失われた歯周組織の再生を促すと考えられている。ＧＴＲ法は歯周組織のみでなく歯槽骨の欠損にも使用され、Guided bone regeneration（ＧＢＲ法）と呼ばれて、広く臨床応用されている。近年では、ＧＴＲ法以外にもブタ歯胚由来のマトリックス成分による歯周組織の再生誘導療法が開発された。アメロジェニンというタンパクを含むこの製剤は、歯の発生過程を模倣することで歯周組織の再生を図るものであり、セメント質を含めた歯周組織の再生に有用と考えられている。ＧＴＲ法と比較して手術手技が容易であり術後の合併症も少ないことから、歯周組織の再生治療として多く用いられるようになった。
【０００４】
軟骨由来の形態形成タンパク１（ＣＤＭＰ１）として知られる成長分化因子５（ＧＤＦ−５）は、骨形成タンパク（ＢＭＰ）ファミリーの１つであり、形質転換細胞増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属する。ＢＭＰは、発育中、骨格の役割だけでなく骨外の役割をすると考えられている（非特許文献１〜３）。特に、軟骨、アキレス腱及び靭帯を含む様々なタイプの関連組織への間葉細胞の分化にとって、ＢＭＰは重要である（非特許文献４〜６）。ＧＤＦ−５は、四肢骨格構造の発育に重要な制限因子に関係があるとされている（非特許文献７〜１１）。歯以外においては、ＧＤＦ−５ｍＲＮＡ発現は、四肢の硬化性間葉組織や関節腔に局在化している（非特許文献９〜１２）。過剰発現の研究においては、ＧＤＦ−５が骨の長さや太さを増加し、軟骨形成を向上し、関節が融合することが示された（非特許文献１３〜１５）。さらに、ＧＤＦ−５遺伝子の突然変異により、四肢骨格の短い構成を生じる（つまり、マウスにおける短肢症やヒトにおけるハンタートンプソン骨異形成症）（非特許文献７、８、１６）。
【０００５】
ＧＤＦ−５のｍＲＮＡが歯根の形段階で歯乳頭や歯小嚢において発現することは知られている（非特許文献１７〜１９）。またＧＤＦ−５が歯胚細胞の再生に有用であることも知られている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００４−３３１５５７号公報
【非特許文献１】Acta. Odontol. Scamd., 1955:53:129-134.
【非特許文献２】Curr. Opin. Genet. Dev. 1996:6:432-438.
【非特許文献３】Genes. Dev. 1996:10:1580-1594.
【非特許文献４】Cell Biol. 1993:12:871-880.
【非特許文献５】J. Bone Miner. Res. 1994:9:1759-1768.
【非特許文献６】J. Clin. Invest. 1997:100:321-330.
【非特許文献７】Nature 1994:368:639-643.
【非特許文献８】Nat. Genet. 1996:12:315-317.
【非特許文献９】Dev. Biol. 1999:206:33-45.
【非特許文献１０】Dev. Biol. 1999:209:11-27.
【非特許文献１１】J. Biol. Chem. 1994:269:28227-28234.
【非特許文献１２】Arthirits Rheum. 1998:41:263-273.
【非特許文献１３】Development 1996:122:3969-3979.
【非特許文献１４】Development 1999:126:1305-1315.
【非特許文献１５】Mech. Dev. 2003:120:823-836.
【非特許文献１６】Nat. Genet. 1997:17:18-19.
【非特許文献１７】Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998:224:85-90.
【非特許文献１８】J. Hard Tissue Biol. 1997:6:16-20.
【非特許文献１９】J. Dent. Res. 2003:82:166-171.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
歯槽骨や骨自体の再生については、アメロジェニンやＢＭＰ−２等が有用であることが知られている。しかし、例えば歯周組織の再生を考えた場合、歯槽骨のみの再生を促進した場合、歯根膜が骨化してしまうため、正常な歯周組織再生にならず、逆に悪化してしまう。従って、歯周組織の正常な再生を行うためには、骨槽量だけでなく歯根膜、特に歯周靭帯の再生が必要である。前記ＧＴＲでも歯根膜の再生はするが、その再生能力は十分ではなかった。従って、従来、歯根膜を積極的かつ正常に再生する手段は知られていなかった。
一方、関節等の再生を考えた場合にも、骨自体の再生には、ＤＦＤＢＡ（ウシ由来）、ハイドロキシアパタイトの利用が行われており、関節の周囲で関節の動きを司る靭帯や腱の再生には、非吸収性材料等による人工靭帯の利用が行われているが、その効果は十分とはいえなった。
従って、本発明の目的は歯根膜、靭帯又は腱の新たな再生治療手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、歯胚の再生に有用であることが知られているＧＤＦ−５を歯根膜細胞に作用させたところ、全く意外にも、歯根膜組織のうち、歯乳頭細胞におけるＡＬＰ活性、すなわち歯周靭帯再生活性は亢進するが、歯嚢細胞におけるＡＬＰ活性、すなわち硬組織再生活性は抑制することを見出した。すなわち、ＧＤＦ−５は、歯根膜、特に歯周靭帯を特異的に再生する能力を有し、歯根膜中の骨化は抑制することを見出した。より詳細には、ＢＭＰ−２は骨化が必要な細胞にも、骨化を抑制する必要のある細胞にも双方に作用して、どちらも骨化を促進させるのに対し、ＧＤＦ−５では骨化を促進すべき細胞に対しては骨化を促進し、骨化を抑制すべき細胞（歯根膜細胞）に対しては、選択的に骨化を抑制する。またさらに、ＧＤＦ−５とＢＭＰ−２等の歯槽骨再生促進物質とを併用すると、ＢＭＰ−２の歯槽骨再生効果及び歯根膜中の骨化促進効果と、ＧＤＦ−５の前記歯周靭帯再生活性とが相乗的に作用し、優れた歯周組織再生治療が可能になることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ＧＤＦ−５を有効成分とする歯根膜（特に歯周靭帯）、靭帯又は腱再生治療薬を提供するものである。
また本発明は、ＧＤＦ−５及び歯槽骨再生促進物質を含有する歯周組織再生治療薬を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
ＧＤＦ−５は、歯根膜中の歯周靭帯のみを選択的に再生する能力を有するため、従来の歯周組織では再生できなかった歯根膜の再生治療薬として有用である。またＧＤＦ−５は、歯周靭帯だけでなく、他の靭帯や腱の再生治療薬としても有用である。また、ＧＤＦ−５とＢＭＰ−２等の歯槽骨再生促進物質とを併用すれば、歯根膜と歯槽骨の両方が同時に再生されるので歯周病によって失なわれた歯周組織の再生治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に用いられるＧＤＦ−５は、ＴＧＦファミリーに属するタンパクの一つであり、骨形成や軟骨形成時にそのｍＲＮＡが発現することが知られている。また、ＧＤＦ−５は歯胚の形成時期に発現すること及び歯胚の形成を促進する作用を有することは知られているが、歯根膜中の細胞である歯乳頭細胞や歯嚢細胞の成長時期における発現は知られておらず、ましてや、これらの細胞の成長時期に添加した場合にどのような作用をするかについては全く知られていない。
【００１１】
ＧＤＦ−５としては、治療対象となる哺乳類由来のものを使用するのが好ましく、ヒトを対象した場合にはヒト由来のＧＤＦ−５を用いるのが好ましい。ＧＤＦ−５は、細胞から得られたものでもよく、リコンビナントでもよい。
【００１２】
ヒトＧＤＦ−５のアミノ酸配列は公知であり、（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ−０２８３９２，４に記載されている。また、リコンビナントヒトＧＤＦ−５は例えば、特開２００６−４２７３５号に記載の方法によって製造することができる。
【００１３】
ＧＤＦ−５は、歯根膜組織中の歯乳頭細胞の再生を選択的に促進する作用を有し、かつ歯嚢細胞の再生を促進する作用を有さない。従って、ＧＤＦ−５は、歯根膜中の歯周靭帯のみを選択的に再生し、歯根膜の骨化（硬化）を促進しないので、歯根膜の正常な再生治療薬、すなわち歯周靭帯の選択的な再生治療薬として有用である。また、ＧＤＦ−５は靭帯再生治療薬としても有用である。
【００１４】
また、本発明に用いられる歯槽骨再生促進物質としては、ＢＭＰ−２、ＰＤＧＦ−ＢＢ、アメロジェニン、ＯＰ−１等が用いられるが、ＢＭＰ−２が特に好ましい。ＢＭＰ−２は、歯根膜細胞のうち、歯乳頭細胞及び歯嚢細胞の両方において、ＡＬＰ活性を上昇させるので、ＧＤＦ−５とＢＭＰ−２とを併用すれば、歯根膜における歯周靭帯の再生と骨化が同時にでき、かつ歯槽骨も再生されるため、歯周組織全体がバランスよく再生されるため、特に好ましい。
【００１５】
ＢＭＰ−２としては、治療対象となる哺乳類由来のものを使用するのが好ましく、ヒトを対象にした場合にはヒト由来のＢＭＰ−２を用いるのが好ましい。ＢＭＰ−２は、細胞から得られたものでもよく、リコンビナントでもよい。
【００１６】
ＧＤＦ−５及び歯槽骨再生促進物質とを併用すれば、歯根膜及び歯槽骨の両方が同時に再生できるので、歯周組織再生治療薬として有用である。
【００１７】
ＧＤＦ−５、又はＧＤＦ−５及び歯槽骨再生促進物質を、上記再生治療薬として使用する場合は、それ自体公知の手段により製剤化して使用することができる。
【００１８】
上記有効成分は、局所投与するのが好ましく、特に歯周病患者の歯周病組織を取り除いた後、当該部位に局所投与するのが好ましい。局所投与用の剤形としては、粉末剤、液剤、ゲル剤、注射剤が挙げられる。このうち、局所投与用粉末、ゲル剤又は液剤が特に好ましい。人工骨に含有させて投与することもできる。
【００１９】
上記製剤化にあたっては、賦形剤、防腐剤、安定剤、結合剤などを配合することができる。
【００２０】
粉末剤、液剤、人工骨含有剤等の固形製剤の製造にあたっては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤などが用いられる。
【００２１】
注射剤等の液状製剤の製造にあたっては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例：エタノール）、ポリアルコール（例：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例：ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などを配合してもよい。
【００２２】
また、本発明の再生治療薬は、単独で行ってもよいし、インプラント施術との併用を行ってもよい。すなわち、本発明の再生治療を行った後にインプラント施術を行ってもよい。
【００２３】
本発明再生治療薬のうち、ＧＤＦ−５の投与量は、損傷している患部の状態にもよるが、成人１回あたり０．１mg〜１０００mg、特に０．１mg〜１００mgが好ましい。ＢＭＰ−２の投与量は、成人１回あたり０．１mg〜１０００mg、特に０．１〜１００mgが好ましい。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
＜材料と方法＞
（１）歯乳頭及び歯嚢由来細胞の合成
動物実験のプロトコルは、名古屋大学医学部の動物実験委員会にて検討され、また承認された。また、このプロトコルは名古屋大学動物実験指針に従って行われた。歯乳頭及び歯嚢は、食肉処理場から購入した生後６ヶ月のブタから抽出した歯胚から得た（各々ｎ＝３）。生後６ヶ月のブタの第３臼歯は鐘状期であった。歯乳頭及び歯嚢を別々にし、これらは、６０ユニット／mLのディスパーゼ（disperse, Roche, Indianapolis, IN, USA）と２mg／mLコラゲナーゼ（Wako、Tokyo, JAPAN）を含むＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩、Gibco Invitrogen, Grand Island, NY, USA）中で、３７℃、６０分間インキュベーションすることにより酵素的に及び機械的に解離した。続いて、単離した細胞をＨＢＳＳで３回洗浄し、１０％ＦＢＳと２％抗生剤・抗真菌剤（Sigma, St. Louis, MO, USA）を添加したダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）（Sigma、St.Louis,MO, USA）に再懸濁した。両細胞は、２５cm2フラスコに初代培養細胞として、それぞれ播種した。培地は２ヶ月ごとに交換した。
【００２６】
（２）ＧＤＦ−５とＢＭＰ−２の処理
第３期の歯乳頭及び歯嚢由来細胞は、５×１０4セル／wellの濃度で６穴プレートに播種した。培養した細胞が７０％のコンフルエントに到達したときに、細胞を、組み換えマウスＧＤＦ−５（ｒｍＧＤＦ−５；濃度１０、１００、１０００ng／mL）又は組み換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２；濃度１０、１００、２００ng／mL）（両者ともＲ＆Ｄ systems, Inc., Minneapolis, MN, USA）を含む無血清培地、あるいは、これを含まない無血清培地でそれぞれ継代培養した。さらに、ＧＤＦ−５の影響を調べるために、２００ng／mLのｒｈＢＭＰ−２の存在下で、ｒｍＧＤＦ−５の各種濃度（０，１０，１００，１０００ng／mL）で培養した。対照として、これらの因子を含まない無血清培地を用いた。
【００２７】
（３）全細胞数とアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性解析
細胞増殖とＡＬＰ活性は、成長因子による培養の５日後に評価した。細胞増殖は、製造プロトコルに従って、ＷＳＴ−８キット（Wako、 TOKYO, JAPAN）を使用して測定した。この測定は、ミトコンドリア内酵素によって、水溶性の２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２Ｈ  テトラゾリウム塩（WST-8、 Dojindo, Kumamoto, Japan）を、それに相当する不溶性のホルマリン顔料に還元することによって行い、顔料の量は分光光度法により決定した。つまり、細胞を数えるために、１００μｌ／mLのＷＳＴ−８を含む培地で１時間培養し、それから、波長４５０nmの分光光度計（SmartSpeckTM3000, BIO-RAD, Tokyo Japan）において、吸光度を読み取った。ＡＬＰ活性は、Ｌｏｗｒｙ法（１９５５年）に基き測定した（Methods. Enzymol. 1995:4:371-372）。上澄みの５μｌを、１mM ＭｇＣｌ2（Sigma, St.Louis, Mo, USA）を含む５０mM ｐ−ニトロフェニルホスフェートの１mLに添加し、その混合物を３７℃、６分間培養した。その後、０．２Ｎ ＮａＯＨの１mLを酵素反応を停止させるために加え、分光光度計（SmartSpeckTM3000, BIO-RAD, Tokyo Japan）の波長４１５nmにおける吸光度を読み取った。それぞれの実験は、３つの歯髄と歯嚢のサンプルの各々に対して３回行った。
【００２８】
（４）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ法）及び定量ＰＣＲ解析
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ法）解析は、ｒｍＧＤＦ−５（１０，１００，１０００ng／mL）で培養した、もしくは培養しない、５日目のブタの歯乳頭由来細胞において、象牙芽細胞マーカー遺伝子の発現を確認するために使用した。全細胞のＲＮＡは、添付のプロトコールに基き、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で抽出した。一本鎖ｃＤＮＡ合成は、Super Script一本鎖ｃＤＮＡ合成（Invitrogen, Carlsbad, CA USA）によって、製造会社の指針に基き、２μｇの全ＲＮＡにおいて行った。ｃＤＮＡは、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（TaKaRa Bio Inc., Siga, Japan）で増幅し、ブタ特有のプライマーセットを以下のように設計した。
【００２９】
象牙質シアロリンタンパク質（ｄｓｐｐ）
(forward 5'-CAGCCGCTGATTAATATTCCTAAA-3'（配列番号１），
reverse 5'-TAACATGGGACGTGCAGAAGAACT-3')（配列番号２）(328 bp)
象牙質基質タンパク質１（ｄｍｐ１）
(forward 5'-TGTCCTGTGCTCTCCCAGT-3'（配列番号３），
reverse 5'-TCGCCCAAGGTGTCATCTCC-3')（配列番号４）(310 bp)
骨シアロタンパク質（ｂｓｐ）
(forward, 5'-ACTGAAGCCCAAGGAACCAC-3'（配列番号５），
reverse, 5'-TCCAACGTGGTCTTCTGGAC-3')（配列番号６）(480 bp)
コア結合因子１（ｃｂｆａ１）
(forward, 5'-GACCCTGGAAGGAAACACAA-3'（配列番号７），
reverse, 5'-CGCTGGTCCATGCTTAGAGT-3')（配列番号８）(303 bp)
オステオカルシン（ｏｃ）
(forward 5'-TCAACCCCGACTGCGACGAG-3'（配列番号９），
reverse 5'-TTGGAGCAGCTGGGATGATGG-3')（配列番号１０）(204 bp)
β−アクチン
(forward 5'-GACCGACTACCTCATGAAG-3'（配列番号１１），
reverse 5'-CCGTGATCTCCTTCTGCAT-3')（配列番号１２）(518 bp)
【００３０】
Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＧＰ（TaKaRa Bio Inc.）内で、９５℃で２分間、試料を培養し（１回培養）、その後、９５℃で６０秒、５６℃で６０秒、７２℃で６０秒を２０サイクル行い、最後に７２℃で５分延長して、試料を培養した。増幅後、各々の生成物（１０μｌ）をアガロースゲル電気泳動法で解析し、臭化エチジウム染色法によって目視により評価した。
【００３１】
さらに、培養された歯乳頭由来細胞のｄｓｐｐ  ｍＲＮＡ発現量におけるｒｍＧＤＦ−５の効果も、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システム（Applied Biosystems, CA, USA）を使用して、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲで評価した。最終体積５０μｌで、９６穴プレート中で２回反応を行った。反応混合物には、２５μｌのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Applied Biosystems, CA, USA）、１μｌのＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ，２１μｌの水、１μｌの順方向のプライマー、１μｌの逆方向のプライマー、及び１μｌのｃＤＮＡ（４０ng  ＲＮＡ／μｌからの）が含まれる。ＰＣＲ反応は、酵素活性化の段階として、９５℃、１０分間の初期酵素活性化段階を含み、続いて、９５℃で１５分、６０℃で１分の４０サイクルの反応を行った。サイクルの閾値（Ｃｔ）は、各サンプルに対して得られ、２つのサンプルの閾値の平均を算出した。２−△△Ｃｔ法は、ターゲット遺伝子の相対的な発現を計測するために用いられた。つまり、各サンプル中のターゲット遺伝子のＣｔ平均値は、その平均化されたハウスキーピング遺伝子のＣｔ値（平均ＧＡＰＤＨ値の平均）に標準化され、△Ｃｔ値を得る。この値は、対照サンプル（△△Ｃｔ）に標準化され、２−△△Ｃｔ値が得られた。実験中に使用されたブタ特有のプライマーセットは以下の通り。
【００３２】
ｄｓｐｐ
(forward 5'-AAAATCGAAAGCGCCAGTACA-3'（配列番号１３），
reverse 5'-TCCTGCTGCCTTCCTATGTCA-3')（配列番号１４）(99 bp)
グリセロアルデヒド−３−ホスフェート  デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）
(forward 5'-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3'（配列番号１５），
reverse 5'-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3')（配列番号１６）(106 bp)
【００３３】
統計
全ての実験値は、平均値±標準偏差で示した。スチューデント  ｔ  テストをすべての統計学解析に対して行った。
【００３４】
＜結果＞
（１）外因性ＧＤＦ−５の歯乳頭及び歯嚢由来細胞における効果
各濃度（１０，１００，１０００ng／mL）のｒｍＧＤＦ−５を、ブタの歯乳頭及び歯嚢由来細胞の増殖と分化の効果を調べるために、培養培地に添加した。歯乳頭由来細胞において、全細胞数について、培養５日目の全ての濃度について、全細胞数に有意な差は見られなかった（図１Ａ）。一方で、ｒｍＧＤＦ−５は投与量に依存してＡＬＰ活性が増え、１０ng／mL（**ｐ＜０．０５）及び１００ng／mL（**ｐ＜０．０１）の濃度において、対照群（ｒｍＧＤＦ−５無し）と比較して、その差は有意であった（図１Ｂ）。歯嚢由来細胞において、ｒｍＧＤＦ−５は細胞増殖を促進し、対照群（ｒｍＧＤＦ−５無しの）と１００、１０００ng／mL（**ｐ＜０．０５）間の差は有意であった（図１Ｃ）。しかしながら、ｒｍＧＤＦ−５は投与量に依存してＡＬＰ活性を減少させ、対照群と１０−１０００ng／mL（*ｐ＜０．０１）間において差は有意であった（図１Ｄ）。
【００３５】
（２）外因性ＢＭＰ−２の歯乳頭及び歯嚢由来細胞における効果
ブタの歯乳頭及び歯嚢由来細胞の増殖と分化の効果を調べるために、各種濃度（１０，１００，１０００ng／mL）のｒｈＢＭＰ−２を培養培地に添加した。歯乳頭由来細胞において、１０−２００ng／mLの濃度においてはｒｈＢＭＰ−２を添加しても細胞増殖に変化は見られなかった（図２Ａ）。一方で、ｒｈＢＭＰ−２は投与量に依存してＡＬＰ活性を増加させ、対照群（*ｐ＜０．０１）と比較して濃度１０，１００，２００ng／mLにおいて有意な差が見られた（図２Ｂ）。歯嚢由来細胞において、ｒｈＢＭＰ−２は１０−２００ng／mLの濃度で細胞分化に影響はなかったが（図２Ｃ）、ｒｈＢＭＰ−２は投与量に依存してＡＬＰ活性を増加させ、対照群（*ｐ＜０．０１）と比較して、濃度１０，１００，２００ng／mLにおいて有意な差が見られた（図２Ｄ）。
【００３６】
（３）歯乳頭由来細胞における骨芽細胞／象牙芽細胞マーカー遺伝子の発現
次に、ｒｍＧＤＦ−５存在下の培養された歯乳頭由来細胞において、骨芽細胞／象牙芽細胞マーカー遺伝子の発現を調べた。ｄｍｐｌ，ｏｃ及びｃｄｆａ１の発現は、ｒｍＧＤＦ−５が存在しない対照群において観測された。ｒｍＧＤＦ−５を培養培地に添加すると、細胞はｄｓｐｐ及びｂｓｐを発現し始める。ｄｓｐｐ及びｄｍｐ１のｍＲＮＡ発現は、投与量に依存して上昇した（図３Ａ）。
象牙芽細胞マーカー遺伝子の発現に対する外因性ｒｍＧＤＦ−５の効果を調べるために、定量ＰＣＲ法をｄｓｐｐに対して行った。対照群に比べて、１０，１００ng／mL（**ｐ＜０．０５）と１０００ng／mL（*ｐ＜０．０１）の濃度でｒｍＧＤＦ−５を添加することによって投与量に依存して、ｄｓｐｐのｍＲＮＡ発現は、有意に上昇した（図３Ｂ）。
【００３７】
（４）ＧＤＦ−５とＢＭＰ−２の併用効果
次に、歯牙形成中にｒｍＧＤＦ−５とｒｈＢＭＰ−２の因子は歯乳頭及び歯嚢において、共局在化することが知られていることから、ｒｍＧＤＦ−５とｒｈＢＭＰ−２の併用効果について評価した。歯乳頭由来細胞においては、ｒｍＧＤＦ−５を含まない対照群と比較して、ｒｍＧＤＦ−５が２００ng／mLのｒｈＢＭＰ−２存在下で、（培養）５日目において細胞増殖を抑制した（*ｐ＜０．０１）（図４Ａ）。２００ng／mLのｒｈＢＭＰ−２をｒｍＧＤＦ−５を含まない培養培地に添加した場合に、培養歯乳頭由来細胞のＡＬＰ活性は最も高かった。興味深いことに、ｒｍＧＤＦ−５を１０ng／mL添加した場合、ＡＬＰ活性を有意に抑制した（*ｐ＜０．０１）。
ｒｍＧＤＦ−５の濃度を増加するにつれて、ＡＬＰ活性は増加したが、１０００ng／mLのｒｍＧＤＦ−５（２００ng／mLのｒｈＢＭＰ−２存在下）におけるＡＬＰ活性は、２００ng／mLのｒｈＢＭＰ−２（ｒｍＧＤＦ−５を含まない）におけるＡＬＰ活性よりもずっと低かった（*ｐ＜０．０１）（図４Ｂ）。
【００３８】
次に、ブタの歯嚢由来細胞において、ｒｍＧＤＦ−５とｒｈＢＭＰ−２の併用効果を調べた。全細胞数は、ｒｍＧＤＦ−５の各種濃度（１０００ng／mLは除く）において有意な変化を示さなかった（図５Ｃ）。２００ng／mLのｒｈＢＭＰ−２がｒｍＧＤＦ−５を含まない培養培地に添加された場合、培養された歯嚢由来細胞のＡＬＰ濃度は最も高かった。ＡＬＰ活性は、２００ng／mLのｒｈＢＭＰ−２存在下、ｒｍＧＤＦ−５の各種濃度（１０，１００，１０００ng／mL）で有意な減少を示した。ｒｍＧＤＦ−５は投与量に依存してＡＬＰ活性を減少させ、１００ng／mL（**ｐ＜０．０５）あるいは１０００ng／mL（*ｐ＜０．０１）の濃度で有意な差を示した。ｒｍＧＤＦ−５の濃度が１０００ng／mL、ｒｈＢＭＰ−２の濃度が２００ng／mLのときのＡＬＰ活性が、ｒｈＢＭＰ−２を有する全ての群中で最も低かったが、両方の因子を含まない対照群に比べると、ＡＬＰ活性は高かった（*ｐ＜０．０１）（図５Ｄ）。
【００３９】
以上結果から、ＧＤＦ−５は培養５日目で、ブタ歯乳頭由来細胞と歯嚢由来細胞に対し分化効果を示した。ブタ歯乳頭由来細胞においてｒｍＧＤＦ−５はＡＬＰ活性を上昇させた一方、ブタ歯嚢由来細胞ではＡＬＰ活性は低下した。これらのブタ歯乳頭由来細胞と歯嚢由来細胞は、６ヵ月齢ブタの第３臼歯由来の、歯牙が鐘状期であるものである。双方の組織とも神経堤の外胚葉性間葉由来であるが、細胞運命はこのステージで決定したものと考えられる。ＧＤＦ−５の双方の細胞種における分化効果は、最終発育段階において象牙質及び歯周組織を形成するために必要であると思われる。特に、象牙質／セメント質と歯周靭帯の間に絶対的な境界を形成する過程で重要である。
【００４０】
実施例により、ブタ歯乳頭及び歯嚢由来細胞の分化において、組み換えマウスＧＤＦ−５がどのような効果を示すかを検討した。この因子を歯乳頭由来細胞で使用することにより、ＢＭＰ−２と同様に、象牙芽細胞分化のマーカー遺伝子が高く発現する傾向がある。その一方、ＢＭＰ−２とは異なり、歯嚢由来細胞では、セメント芽細胞／骨芽細胞表現型への分化は抑制される。これらの因子のシグナル伝達経路が歯由来間葉細胞の分化に影響を及ぼしているかどうかについては明らかではないが、上記の結果はＧＤＦ−５が他の成長因子と共同して歯由来間葉細胞の分化を制御していることを示唆している。
【００４１】
実施例２
ヒト歯根膜の幹細胞における歯根靭帯に関する遺伝子（ＴｅＭ）及び骨形成に関する遺伝子（ｃｂｆａ１）の発現に対するＧＤＦ−５及びＢＭＰ−２の添加効果を検討した。
ヒト歯根膜細胞中から幹細胞分画と考えられるＳＴＲＯ−１分画をＭＡＣＳを用いて分離し、選択的に培養を行なった。得られた細胞をそれぞれＢＭＰ−２，ＰＤＧＦ−ＢＢ、デキサメタゾン、ＧＤＦ−５を加えた培地で７日間培養し、細胞数とＡＬＰ活性を測定した。次にｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを用いて、骨系のマーカー遺伝子であるｃｂｆａ１，及び靭帯のマーカー遺伝子であるｓｃｌｅｒａｘｉｘの発現量をリアルタイムＰＣＲにて測定した。各サンプル中のターゲット遺伝子のＣｔ平均値は、その平均化されたハウスキーピング遺伝子のＣｔ値（平均ＧＡＰＤＨ値の平均）に標準化され、△Ｃｔ値を得る。この値は、対照サンプル（△△Ｃｔ）に標準化され、２−△△Ｃｔ値が得られた。
その結果を図６及び図７に示す。その結果、ＧＤＦ−５は歯周靭帯に関する遺伝子の発現を促進したが、骨形成に関する遺伝子の発現には影響を及ぼさなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＧＤＦ−５の歯乳頭細胞に対する作用を示す図である。Ａ：ＧＤＦ−５添加濃度と歯乳頭由来細胞数との関係を示す。Ｂ：ＧＤＦ−５添加濃度と歯乳頭由来細胞のＡＣＰ活性との関係を示す。Ｃ：ＧＤＦ−５添加濃度と歯嚢由来細胞数との関係を示す。Ｄ：ＧＤＦ−５添加濃度と歯嚢由来細胞のＡＣＰ活性との関係を示す。
【図２】ＢＭＰ−２の歯乳頭細胞に対する作用を示す図である。Ａ：ＢＭＰ−２添加濃度と歯乳頭由来細胞数との関係を示す。Ｂ：ＢＭＰ−２添加濃度と歯乳頭由来細胞のＡＣＰ活性との関係を示す。Ｃ：ＢＭＰ−２添加濃度と歯嚢由来細胞数との関係を示す。Ｄ：ＢＭＰ−２添加濃度と歯嚢由来細胞のＡＣＰ活性との関係を示す。
【図３】歯乳頭細胞の各種遺伝子の発現に及ぼすＧＤＦ−５の効果を示す図である。Ａ：歯乳頭細胞における骨芽細胞／象牙芽細胞マーカー遺伝子の発現を示す。Ｂ：ｄｓｐｐ発現量とＧＤＦ−５濃度との関係を示す。
【図４】ＧＤＦ−５とＢＭＰ−２の併用効果を示す図である。Ａ：歯乳頭細胞の細胞数。Ｂ：歯乳頭細胞のＡＬＰ活性。
【図５】ＧＤＦ−５とＢＭＰ−２の併用効果を示す図である。Ｃ：歯嚢細胞の細胞数。Ｄ：歯嚢細胞のＡＬＰ活性。
【図６】ヒト歯根膜の幹細胞におけるｓｃｌｅｒａｘｉｓ遺伝子（歯周靭帯発現遺伝子）の発現に対するＧＤＦ−５の作用を示す図である。Ｃｏｎｔ．はコントロール、Ｄｅｘはジキサメタゾンを示す。
【図７】ヒト歯根膜の幹細胞におけるｃｂｆａ１遺伝子（骨形成遺伝子）の発現に対するＧＤＦ−５の作用を示す図である。Ｃｏｎｔｒｏｌはコントロール、Ｄｅｘはデキサメタゾンを示す。
【図１】
2010090071.tif 000002
【図２】
2010090071.tif 000003
【図３】
2010090071.tif 000004
【図４】
2010090071.tif 000005
【図５】
2010090071.tif 000006
【図６】
2010090071.tif 000007
【図７】
2010090071.tif 000008
【配列表】
2010090071000001.app