(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩＬ−８と構造的相同性を有する新規ポリペプチド、及びそれらポリペプチドをコードする核酸分子の提供。【解決手段】ＩＬ−８と構造的相同性を有する新規ポリペプチド、ＰＲＯ８４２、及びそれらポリペプチドをコードする核酸分子。また、それら核酸配列を含むベクター及び宿主細胞。異種ポリペプチドと融合しているポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子。該ポリペプチドと結合する抗体、及び該ポリペプチドを生産する方法。さらには、炎症性弛緩の治療及び診断のための方法が含まれる。【選択図】図１
2010046065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）図２（配列番号：２）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列；
（ii）その付随するアミノ酸１−２２のシグナルペプチドを欠失している、図２（配列番号：２）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列；又は
（iii）図１（配列番号：１）に示されるヒトタンパク質ｃDNAによってコードされるアミノ酸配列；
を含むPRO842ポリペプチドに特異的に結合し、かつ、トランスウェル移動アッセイにおいてPRO842ポリペプチドに対する単球および樹状細胞の移動を阻害する、単離されたアンタゴニスト抗体。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は単鎖抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体が、非ヒト相補性決定領域(CDR)残基及びヒトフレームワーク領域(FR)残基を有する、請求項２に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９８年６月２５日に出願された米国仮出願第60/090696号に対して優先権の主張を行い；及び米国特許法第１１９条に基づいて米国仮出願に対して優先権主張を行い；また、国際ＰＣＴ出願：１９９９年２月２日に出願されたPCT/US99/12252；２０００年３月３０日に出願されたPCT/US00/08439；２０００年８月２４日に出願されたPCT/US00/23328；２００１年２月２８日に出願されたPCT/US00/06520に対して優先権の主張を行い；及び米国特許法第１２０条に基づいて国際ＰＣＴ出願に対して優先権主張を行い；また、米国特許出願番号：１９９９年８月２５日に出願された09/380137；２０００年１１月８日に出願された09/709238；２００１年８月２８日に出願された09/941992に対して優先権の主張を行い；及び米国特許法第１２０条に基づいて米国特許出願に対して優先権主張を行う継続出願（米国特許法第１２０条に基づく）であり、その全体の開示はここに出典として取り込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に、新規なＤＮＡの同定及び単離、及びケモカインであるインターロイキン−８と構造的相同性を有する新規なポリペプチドの組換え生産に関する。
発明の背景
細胞外タンパク質は、とりわけ、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直近の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、翻って多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。また、膜タンパク質であるこれらレセプターは、治療又は診断薬剤としての潜在力を有する。
【０００３】
膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は直近の環境から受け取られる情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞-細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼはまた成長因子レセプターとしても作用する。具体例には、線維芽細胞増殖因子及び神経成長因子レセプターが含まれる。
分泌タンパク質と同様に、膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。また、膜結合タンパク質も、関連するレセプター／リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。
新規な天然のレセプター又は膜結合タンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプター又は膜結合タンパク質のコード配列を同定するために、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Kleinら, Proc. Natl. Acad. Sci. 93;7108-7113(1996)；米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【０００４】
かかる観点から、本発明は、免疫媒介及び炎症性疾患に関連することが示されているインターロイキン−８（ＩＬ−８）ファミリーの新規分泌ポリペプチドを同定することに関する。免疫関連及び炎症性疾患は、かなり複雑で、正常な生理状態では発作又は傷害に応答し、発作又は傷害からの回復を開始し、外来生物に対する先天的な及び獲得した防御を組込むために不可欠である、しばしば多様に関連した生物学的経路の症状又は結果である。疾患又は病理は、これら正常な生理学的経路が付加的な発作又は傷害を、応答の強度との直接的関連として、異常な制御又は過剰な刺激の結果として、自己応答として、又はこれらの組合わせのいずれかとして引き起こす場合に生じる。
免疫関連疾患の起源は、しばしば複数段階、しばしば複数の異なる生物学的システム／経路に関与するが、これらの経路の一又は複数における重要なポイントにおける介入は、寛解的又は治療的な効果をもち得る。治療的介入は、有害なプロセス／経路のアンタゴナイズ又は有益なプロセス／経路の刺激のいずれかにより、生じ得る。
多くの免疫関連疾患が知られており、広く研究が行われてきた。そのような疾患には、免疫媒介炎症性疾患（関節リウマチ、免疫媒介腎臓疾患、肝胆道疾患、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬、及び喘息など）、非免疫媒介炎症性疾患、感染性疾患、免疫不全疾患、腫瘍形成などが含まれる。
免疫関連疾患は、免疫応答を抑制することにより治療される。免疫刺激活性を持つ分子を阻害する中和抗体の使用は、免疫媒介及び炎症性疾患の治療において有益であろう。免疫応答を阻害する分子は、免疫応答を阻害し、従って、免疫関連疾患を寛解させるために利用（タンパク質を直接又は抗体アゴニストの使用を介して）され得る。
【０００５】
本発明は、インターロイキン−８（ＩＬ−８）と構造的相同性を有する新規ケモカインの同定に関する。２つのタンパク質間のアミノ酸配列においては低いが、それらは、両方とも、ＣＸＣケモカインファミリーのメンバーとしてＩＬ−８を分類するＣＸＣモチーフを持つ。インターロイキン−８は急性の炎症性応答において役割を果たすことが示されてきた。この応答はＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６によって第一次的媒介される。局所的な効果には、循環する白血球細胞の血管内皮細胞への増大した接着及びそれらの組織空間への血管外遊走が含まれる。ＩＬ−１及びＴＮＦ−αの双方は、細胞接着分子（ＣＡＭｓ）の内皮細胞上での増大した発現を誘導する。また、これら２つのサイトカインはマクロファージ及び内皮細胞によるインターロイキン−８の産生も誘導する。ＩＬ−８は走化性的に好中球を誘因し、それらの内皮細胞への接着を促進する。特に、ＩＬ−８は、単球と樹状細胞を化学誘因する。両方の細胞型は、免疫応答の開始において重要な役割を担っている。
１３年前のインターロイキン−８（ＩＬ−８）の潜在的な好中球走化因子としての発見以来、証拠の蓄積により、それは好中球依存的急性炎症の重要な媒介因子として確立されてきた。実際に、白血球の浸潤は炎症の証である。多くの観察により、種々のタイプの細胞が、種々の刺激への応答として又は癌化後構成的に大量のＩＬ−８を生産することができることが示されてきた（Mukaida, N., International Journal of Hematology, 72(4):391-398 (2000)）。ＩＬ−８の放出は種々の細胞からの炎症性シグナルによってトリガーされる。細胞内ソースにおける多様化は、その機能の多面性を示す。ＩＬ−８は宿主防御機構において、好中球活性化におけるその効果を通じて重要な役割を果たすが、炎症状態に応答して血中にＩＬ−８が存在し続けることにより、様々な程度の組織傷害が誘導される。様々な生理学的状態におけるＩＬ−８の存在は、その作用の阻止は治療目的で利用し得ることを意味する（Atta-ur-Rahman等, Current pharmaceutical Design, 5(4):241-153 (1999)）。最近、ＩＬ−８はヒト卵巣癌に対する自己分泌成長因子として示されてきた。ＩＬ−８は卵巣癌細胞の進行性の成長において直接的役割を果たす（Xu, L.及びFildler, I. J., Oncology Research, 12(2):97-106 (2000)）。さらに、ＩＬ−８の増大したレベルは急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の患者由来の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中に見出されていた。ＡＲＤＳ患者のＢＡＬ液中の抗ＩＬ−８：ＩＬ−８複合体の存在は、ＡＲＤＳの進行及び結果に対する重要な予後の指標である（Kurdowska, A.等, American Journalof Respiratory & Critical Care Mecicine, 163(2):463-468 (2001)）。
【０００６】
上述したように、ケモカインとして知られる分子のクラスは、構造的に保存されたモチーフ及び白血球の走化性を媒介する能力によって特徴付けられる低分子量（８−１１ｋＤａ）の炎症誘発性サイトカインのファミリーであり、白血球の輸送における重要な役割並びに制御における機能を演じている。現在、これらの小サイトカインが、進行、造血、アレルギー、血管形成、及び腫瘍形成を含む様々な恒常的及び疾患性過程において重要な役割を担っていることは明らかである（Broxmeyer, H. E.等, J. Exp. Med., 170: 1583 (1989); Cao, Y.等, J. Exp. Med., 182: 2069 (1995); 及び Strieter, R. M.等, J. Biol. Chem., 270: 27348 (1995)を参照のこと）。ケモカインの多くは、ある刺激に応答して発現されるが、幾つかのものは構成的に発現される（Wang, J. M.等, J. Immunol. Methods, 220: 1-17 (1998) ; Baggiolini, M., Annu. Rev. Immunol., 15: 675-705 (1997); 及び Gale, L. M., 及び McColl, S. R., Bioessays, 21: 17-28 (1999)）。さらに、ＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）４−１α、及びＭＩＰ−β１を含む幾つかのＣＣケモカインは、ＨＩＶ感染を阻害し得ることが見出されている（Cocchi, F.等., Science, 270:1811 (1995)）。
ケモカインファミリーは、アミノ末端のシステイン残基の位置に基づいて４つの主要なサブファミリーに分けることができる。ＣＸＣケモカイン中、最初の２つのシステインは非保存的アミノ酸によって分離されるが、ＣＣケモカインサブファミリーにおいて、これら２つのシステインはお互いに隣接している。リンフォタクチンが唯一のメンバーであるＣケモカインサブファミリーは、２番目及び４番目のシス点を欠いているが、ＣＸＣ及びＣＣケモカイン中では保存されている。ＣＸ３Ｃ膜結合ケモカインは最初の２つのシステイン間に３つのアミノ酸を、長いムチン様ストーク、及び短い膜貫通ドメインを持つ（Bazan, J. F.等, Nature, 385: 640 (1997); Pan, Y.等, Nature, 387 : 611 (1997)）。一般に、ＣＸＣケモカインは主として好中球をリクルートするが、ＣＣケモカインは、変わり得る選択制を持ち、単球及び白血球、好塩基球、及び／又は好酸球も誘因する。リンフォタクチンのＣケモカインは特にＴリンパ球及びＮＫ細胞に作用するようである（Kelner, G. S.等, Science, 266: 1395 (1994) 及び Kennedy, J. G.等., J. Immunol., 155: 203 (1995)）。
【０００７】
樹状細胞（ＤＣ）は、比類なく強力な免疫応答に関与するＡＰＣｓである（Banchereau, J., 及びSteinman, R. M., Nature, 392: 245 (1998)）。Ａｇ送達のアジュバントとして、未成熟樹状細胞は末梢にてＡｇｓをピックアップし、免疫応答を初回刺激するためにリンパ節器官中のＴ細胞領域へそれらを運び、その間に成熟する。従って、ケモカインは樹状輸送、成熟、及び機能において重要な役割を果たす。
さらに、多くのサイトカインは遅延型高感受性（ＤＴＨ）応答の発生において役割を演じる。ＤＴＨ応答と関連づけられるサイトカインのパターンは、活性化Ｔ細胞が主としてＴｈ１サブセットであることを示唆する。ＩＬ−２は、サイトカイン産生Ｔ細胞の集団を増幅するために自己分泌様式で機能する。中でも、これらの細胞によって生み出されるサイトカインは、マクロファージを活性化し、Ｔｈ１活性化部位へ誘因するために役立つ数になる。ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦは顆粒球−単球系統の局在化した造血を誘導する。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−β（ＴＮＦ−α及びＩＬ−１と共に）は内皮細胞の近くで作用し、単球及び他の非特異的血管外遊走を促進する多くの変化を誘導する。中でも、誘導された変化はＩＣＡＭｓ、ＶＣＡＭｓ及びＥＬＭｓを含む細胞接着分子の発現が増大し；血管外遊走を促進するための血管内皮細胞の形の変化；及びＩＬ−８及び単球走化性因子の分泌である。循環する好中球及び単球は血管内皮細胞上に提示される接着分子と接着し、組織空間へ血管外遊走する。好中球は反応の初期に現れるが、単球の浸潤は後で起こる。（ Immunology, Second Edition, Chapter 15, pgs. 363-364 (copyright 1994) W. H. Freeman and Company publishersを参照のこと）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,536,637号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ケモカインが免疫機能に関連した多くの重要な病状に貢献することが明らかになってきたため、この分子ファミリーに対する興味が増大してきた：関節リウマチ、免疫媒介腎臓疾患、肝胆道疾患、炎症性腸疾患、乾癬、喘息、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化、腫瘍成長の促進、又は変性関節疾患を含む。免疫機能における重要な役割を占めるケモカイン関連分子の可能性が与えられると、このファミリーの他のメンバー及び特定の標的細胞集団を介したこれらの分子の作用を導くレセプターの同定に興味が生じる。この観点から、本発明は、ＩＬ−８に構造的に類似し、その活性な変異体である新規タンパク質（ここでは「ＰＲＯ８４２」ポリペプチドと称する）のクローニング及び性質決定について述べる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
Ａ．実施態様
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における免疫関連疾患の診断と治療に有用な組成物と方法に関する。本発明は、哺乳動物における免疫反応を刺激又は阻害するタンパク質(アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む)の同定に基づいている。免疫関連疾患は免疫反応を抑制又は増強することで治療することができる。免疫反応を増強する分子は、抗原に対する免疫反応を刺激又は強化する。免疫反応の増強が有益である場合には、免疫反応を刺激する分子が治療に使用可能である。あるいは、免疫反応の鎮静が有用である場合(例えば炎症)には、抗原に対する免疫反応を鎮静又は低減するといった、免疫反応を抑制する分子(例えば中和抗体)を治療的に使用することができる。従って、ＰＲＯ８４２ポリペプチド、そのアゴニスト及びアンタゴニストは、免疫関連及び炎症疾患の治療のための医薬及び薬物の調製に有用である。特定の態様では、このような医薬及び薬物は、薬学的に許容可能な担体と共に、治療的有効量のＰＲＯ８４２ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストを含有する。好ましくは、混合物は滅菌される。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯ８４２ポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含んでなる、ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。好ましくは、ＰＲＯ８４２ポリペプチドは天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチドである。特定の態様では、ＰＲＯ８４２アゴニスト又はアンタゴニストは抗ＰＲＯ８４２抗体である。
【００１１】
他の実施態様では、本発明は、担体又は賦形剤と混合されてＰＲＯ８４２ポリペプチド又は該ポリペプチドと結合するアゴニスト又はアンタゴニスト抗体を含んでなる組成物に関する。一態様では、組成物は治療に有効な量のポリペプチド又は抗体を含む。他の態様では、組成物が免疫刺激分子を含むとき、組成物は、(ａ)その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を増大させ、(ｂ)その必要とする哺乳動物における免疫反応を刺激又は増強し、(ｃ)抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるＴ-リンパ球の増殖を増加させ、(ｄ)Ｔ-リンパ球の活性を刺激し、又は(ｅ)血管透過性を増加させるのに有用である。さらなる態様では、組成物が免疫阻害分子を含むとき、組成物は、(ａ)その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を減少させ、(ｂ)その必要とする哺乳動物における免疫反応を阻害又は低減させ、(ｃ)Ｔ-リンパ球の活性を低減し、又は(ｄ)抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるＴ-リンパ球の増殖を減少させるのに有用である。他の態様では、組成物は、例えばさらなる抗体又は細胞障害又は化学療法剤であり得るさらなる活性成分を含有する。好ましくは、組成物は滅菌されている。
【００１２】
他の実施態様では、本発明は有効量のＰＲＯ８４２ポリペプチド、そのアゴニスト又はそのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む、その必要とする哺乳動物における免疫関連疾患を治療する方法に関する。好ましい態様では、免疫関連疾患は、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、骨関節症、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、特発性炎症ミオパシー、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少、甲状腺炎、真性糖尿病、免疫媒介腎疾患、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群、及び慢性炎症脱随性多発神経障害、感染性、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎などの肝胆道疾患、炎症性腸疾患、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹などのアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎などの肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患からなる群から選択される。
【００１３】
他の実施態様では、本発明は上述の又は下記のポリペプチドの何れかに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、該抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は単鎖抗体である。一態様では、本発明は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。他の態様では、抗体はＰＲＯ８４２ポリペプチドの活性を模倣し(アゴニスト抗体)、又は逆に抗体がＰＲＯ８４２ポリペプチドの活性を阻害又は中和する(アンタゴニスト抗体)。他の態様では、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域(ＣＤＲ)残基及びヒトフレームワーク領域(ＦＲ)残基を有する。抗体は標識されていても固体支持体上に固定化されていてもよい。さらなる態様では、抗体は抗体断片、モノクローナル抗体、単鎖抗体、又は抗イディオタイプ抗体である。
さらなる他の実施態様では、本発明は製薬的に許容可能な担体と混合して、抗ＰＲＯ８４２抗体を含有する組成物を提供する。一態様においては、該組成物は製薬的有効量の抗体を含む。好ましくは該組成物は滅菌されている。組成物は、貯蔵時の安定性の延長が達成されるように保存できる、液状製薬用製剤の形態で投与されてもよい。あるいは、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体、又は単鎖抗体である。
【００１４】
さらなる実施態様では、本発明は：
(ａ)ＰＲＯ８４２ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含有する組成物；
(ｂ)該組成物を収容する容器；及び
(ｃ)免疫関連疾患の治療における該ＰＲＯ８４２ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの使用に言及した、該容器に添付されたラベル又は該容器に含められた包装挿入物を具備する製造品を提供する。該組成物は、治療的有効量のＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含んでいてもよい。
【００１５】
さらなる他の実施態様では、本発明は、(ａ)哺乳動物から得た組織細胞の試験試料における、及び(ｂ)同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料における、ＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含む、哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法に関し、ここで、対照試料と比較して試験試料の発現レベルが高い又は低いと、試験組織細胞を得た哺乳動物に免疫関連疾患が存在することを示す。
他の実施態様では、本発明は(ａ)抗ＰＲＯ８４２抗体を哺乳動物から得た組織細胞の試験試料に接触させ、(ｂ)試験試料中における、ＰＲＯ８４２ポリペプチドと抗体との複合体形成を検出することを含む哺乳動物における免疫疾患の診断方法に関し、ここで、該複合体の形成は、該疾患の有無を示す。検出は、定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料における複合体形成をモニターして比較することで実施してもよい。試験試料中に生成される多量の複合体は、試験組織細胞が得られた哺乳動物における免疫疾患の有無を示す。抗体は、好ましくは検出可能な標識を有する。複合体生成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光測定、又は他のこの分野で知られた技術によりモニターすることができる。通常、試験試料は、免疫システムに欠陥又は異常があると疑われる個体から採取される。
【００１６】
他の実施態様では、本発明はＰＲＯ８４２ポリペプチドを含有すると思われる細胞の試験試料を抗ＰＲＯ抗体に暴露し、該細胞試料に対する該抗体の結合性を測定することを含んでなる、試料中におけるＰＲＯ８４２ポリペプチドの有無を決定する方法を提供する。特定の態様では、試料は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドを含有すると思われる細胞と、細胞に結合する抗体を含む。抗体は、好ましくは検出可能に標識化され、及び／又は固体支持体に結合される。
他の実施態様では、本発明は適当なパッケージ中に抗ＰＲＯ８４２抗体と担体を含んでなる免疫関連疾患の診断キットに関する。キットは好ましくはＰＲＯ８４２ポリペプチドの有無を検出するために抗体を使用するための説明書を含む。好ましくは、担体は製薬的に許容可能なものである。
他の実施態様では、本発明は適当なパッケージに抗ＰＲＯ８４２抗体を含んでなる診断キットに関する。好ましくはキットはＰＲＯ８４２ポリペプチドを検出するための抗体を使用するための説明書を含む。
【００１７】
他の実施態様では、本発明は哺乳動物から得た組織細胞の試験試料におけるＰＲＯ８４２ポリペプチドの有無を検出することを含む、哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法を提供し、ここで、該試験試料におけるＰＲＯ８４２ポリペプチドの有無が該哺乳動物に免疫関連疾患が存在することを示す。
他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供し、それは：（ａ）細胞とスクリーニングされる試験化合物とを、ＰＲＯ８４２ポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ；及び（ｂ）前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定することを含んでなり、前記細胞性反応の誘発が前記試験化合物が有効なアゴニストであることを示す。
【００１８】
他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドに候補化合物を、これら２つの成分を互いに作用させるのに十分な時間と条件の下で接触させ、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの活性が阻害されているかどうかを決定することを含んでなる、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの活性を阻害可能な化合物を同定する方法に関する。特定の態様では、候補化合物又はＰＲＯ８４２ポリペプチドのどちらかは固体支持体上に固定される。他の態様では、非固定成分は検出可能な標識を保有する。好ましい態様では、この方法は：（ａ）細胞とスクリーニングされる試験化合物とを、ＰＲＯ８４２ポリペプチドが存在し、ＰＲＯ８４２ポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ；及び（ｂ）前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアンタゴニストであるか否かを決定する過程を含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、通常はＰＲＯ８４２ポリペプチドを発現する細胞におけるＰＲＯ８４２ポリペプチドの発現を阻害する化合物の同定方法を提供し、該方法は、細胞と試験化合物とを接触させ、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの発現が阻害されるか否かを測定することを含む。好ましい態様では、この方法は：(ａ)細胞とスクリーニングされる試験化合物とをＰＲＯ８４２ポリペプチドを発現させるのに適した条件下で接触させ；及び(ｂ)前記ポリペプチドの発現の阻害を測定する過程を含んでなる。
【００１９】
さらなる他の実施態様において、本発明は免疫関連疾患を患っている哺乳動物の該疾患の治療方法に関し、それは、(ａ)ＰＲＯ８４２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアンタゴニストのいずれかをコードする核酸分子を哺乳動物に投与することを含んでなり、ここで前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗ＰＲＯ８４２抗体であってよい。好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。他の好ましい実施態様では、核酸はエキソビボでの遺伝子療法を介して投与される。さらなる好ましい実施態様では、核酸はベクター、より好ましくはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス又はレトロウイルスベクター内に包含される。
また、他の態様において、本発明は、プロモータ、(ａ)ＰＲＯ８４２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(ｃ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるウイルスベクターを含有する組換えウイルス粒子を提供し、ここでウイルスベクターはウイルス構造タンパク質に付随している。好ましくは、シグナル配列は哺乳動物、例えば天然ＰＲＯ８４２ポリペプチドからのものである。
また、さらなる実施態様では、本発明は、レトロウイルス構造タンパク質を発現する核酸構築物を含有し、またプロモータ、(ａ)ＰＲＯ８４２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(ｃ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターをさらに含むエキソビボ産生細胞に関し、ここで該産生細胞は、組換えレトロウイルス粒子を生産させるための構造タンパク質に関連するレトロウイルスベクターを包含している。
【００２０】
さらなる実施態様では、本発明は、(ａ)ＰＲＯ８４２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物組織への脈管構造からの炎症細胞の浸潤を増加させる方法を提供し、ここで哺乳動物において脈管組織からの炎症細胞の浸潤が増加する。
またさらなる実施態様では、本発明は、(ａ)ＰＲＯ８４２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物組織への脈管構造からの炎症細胞の浸潤を減少させる方法を提供し、ここで哺乳動物において脈管構造からの炎症細胞の浸潤が減少する。
またさらなる実施態様では、本発明は、(ａ)ＰＲＯ８４２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＴ-リンパ球の活性を増加させる方法を提供し、ここで哺乳動物におけるＴ-リンパ球の活性が増加する。
またさらなる実施態様では、本発明は、(ａ)ＰＲＯ８４２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＴ-リンパ球の活性を低減させる方法を提供し、ここで哺乳動物におけるＴ-リンパ球の活性が低減する。
またさらなる実施態様では、本発明は、(ａ)ＰＲＯ８４２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＴ-リンパ球の増殖を増加させる方法を提供し、ここで哺乳動物におけるＴ-リンパ球の増殖が増加する。
またさらなる実施態様では、本発明は、(ａ)ＰＲＯ８４２ポリペプチド、(ｂ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＴ-リンパ球の増殖を低減させる方法を提供し、ここで哺乳動物におけるＴ-リンパ球の増殖が低減する。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ８４２、又はそのアゴニスト又はアンタゴストを薬学的に受容可能な坦体と混合して含んでなる組成物；前記組成物を収納する容器；及び変性軟骨疾患の治療において、前記組成物の用途に言及する前記容器に固着されたラベルを含んでなるキットに関する。
【００２１】
Ｂ．さらなる実施態様
他の実施態様では、本発明はＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸分子は、(ａ)ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の他に特別に定められた任意の断片を有するＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２２】
他の態様では、単離された核酸分子は、(ａ)ここに開示された全長ＰＲＯ８４２ポリペプチドｃＤＮＡのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯ８４２ポリペプチドのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通ＰＲＯ８４２ポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列、又はここに開示された全長アミノ酸配列の他に特別に定められた任意の断片のコード配列を含むＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、(ａ)ここに開示されたＡＴＴＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【００２４】
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されているか膜貫通ドメインが不活性化されているＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的であるものを含んでなる単離された核酸分子を提供し、ここでそのようなポリペプチドの膜貫通ドメインがここに開示される。従って、ここに記載されたＰＲＯ８４２ポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
他の実施態様は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドコード配列の断片、又はその相補鎖に関し、それらは、例えば、場合によっては抗ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするＰＲＯポリペプチドの断片をコードする、ハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。そのような核酸断片は通常少なくとも約２０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１００のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１１０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１３０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１４０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１６０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１７０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１９０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２００のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２５０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３５０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４００のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５００のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７００のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８００のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１０００のヌクレオチド長であり、ここで、「約」という用語は、その参照している長さのプラス又はマイナス１０％の参照ヌクレオチド配列長を意味する。ＰＲＯ８４２ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くのよく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用して、ＰＲＯ８４２ポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのＰＲＯ８４２ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片(類)が新規であるかを決定することにより常套的な形で決定することができることに留意される。そのようなＰＲＯ８４２ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子断片によりコードされるＰＲＯ８４２ポリペプチド断片、好ましくは抗ＰＲＯ８４２抗体に対する結合部位を含んでなるそれらのＰＲＯ８４２ポリペプチド断片である。
【００２５】
他の実施態様では、本発明は、上記で同定された単離された核酸配列の任意のものにコードされる単離されたＰＲＯ８４２ポリペプチドを提供する。
ある態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するＰＲＯ８４２ポリペプチドに対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯ８４２ポリペプチドに関する。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、ここに開示されたＡＴＴＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯ８４２ポリペプチドに関する。
【００２７】
特定の態様では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たない単離されたＰＲＯ８４２ポリペプチドを提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯ８４２ポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養物からＰＲＯ８４２ポリペプチドを回収することを含んでなる。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されたか膜貫通ドメインが不活性化された単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯ８４２ポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養物からＰＲＯ８４２ポリペプチドを回収することを含んでなる。
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで定められる天然ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗ＰＲＯ８４２抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、ＰＲＯ８４２ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯ８４２ポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含む。好ましくは、ＰＲＯ８４２ポリペプチドは天然ＰＲＯ８４２ポリペプチドである。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチド、又はここに記載するＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗ＰＲＯ８４２抗体を、担体と組み合わせて含有する物質の組成物に関する。場合によっては、担体は薬学的に許容される担体である。
本発明の他の実施態様は、ＰＲＯ８４２ポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗ＰＲＯ８４２抗体の、ＰＲＯ８４２ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗ＰＲＯ８４２抗体に起因する病状の治療に有用な医薬の調製のための使用に関する。
【００２８】
本発明のさらなる実施態様では、本発明は、ここに記載の任意のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例としては、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、酵母、又はバキュロウィルス感染昆虫細胞であってもよい。ここに記載の任意のポリペプチドの製造方法がさらに提供されており、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収することを含む。
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載の任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。
さらに他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
好適な実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（つまり、ＰＲＯ／番号）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。「数字」がここで使用される実際の数値符号である、ここで使用される「ＰＲＯ／番号ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／番号」という用語は、天然配列ポリペプチド及び変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ここで記載されているＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。「ＰＲＯポリペプチド」という用語は、ここで開示されている各個々のＰＲＯ／番号ポリペプチドに指す。「ＰＲＯポリペプチド」を指すこの明細書中の全ての開示は、各ポリペプチドを個別にも組み合わせとしても言及する。例えば、調製の、精製の、誘導の、抗体の形成、投与の、含有する組成物、疾患の治療、などの記述は、本発明の各ポリペプチドに個別に関係する。また、「ＰＲＯポリペプチド」という用語は、ここに開示されているＰＲＯ／番号ポリペプチドの変異体を含む。
【００３０】
「天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯ８４２ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯ８４２ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチドは、関連する図に示されている完全長アミノ酸配列を含有する成熟又は完全長天然配列ポリペプチドである。開始及び終止コドンは、太い書体及び下線で図中に示さている。しかし、関連する図に開示されているＰＲＯ８４２ポリペプチドがメチオニン残基で開始すると図のアミノ酸位置１において示されている一方で、図のアミノ酸位置１より上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基が、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられることが考えられるし可能である。
【００３１】
ＰＲＯ８４２ポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯ８４２ポリペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯ８４２ポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯ８４２ポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、ＰＲＯ８４２ポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又明細書おいてに同定された膜貫通ドメインのいずれかの末端から約５を越えないアミノ酸を含みうるし、付着のシグナルペプチドを有する又は有しないそのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明において考慮される。
【００３２】
ここに開示する種々のＰＲＯ８４２ポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書と添付の図面に示される。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ-末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ-末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ-末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる（例えば、Nielsenら, Prot. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinjeら, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、１つ以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのＣ-末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【００３３】
「ＰＲＯ８４２ポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される完全長天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く完全長天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯ８４２の細胞外ドメイン又はここに開示された完全長ＰＲＯ８４２ポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯ８４２ポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯ８４２ポリペプチド変異体には、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯ８４２ポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯ８４２ポリペプチド変異体は、ここに開示される完全長天然アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く完全長天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示されたＰＲＯ８４２の細胞外ドメイン又はここに開示された完全長ＰＲＯ８４２ポリペプチドの特に同定された他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ８４２変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０アミノ酸長、あるいは少なくとも約３０アミノ酸長、あるいは少なくとも約４０アミノ酸長、あるいは少なくとも約５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約６０アミノ酸長、あるいは少なくとも約７０アミノ酸長、あるいは少なくとも約８０アミノ酸長、あるいは少なくとも約９０アミノ酸長、あるいは少なくとも約１００アミノ酸長、あるいは少なくとも約１５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２００アミノ酸長、あるいは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３４】
ここに定義されるＰＲＯ８４２ポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX（登録商標） V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００３５】
アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、「ＰＲＯ８４２」が対象となる仮説的ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象となる「比較」タンパク質が比較されているアミノ酸配列を表し、そして「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ８４２」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００３６】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480(1996)）を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。WU-BLAST2が用いられた場合には、、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯ８４２ポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＰＲＯ８４２ポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、対象とするＰＲＯ８４２ポリペプチドが比較されるＰＲＯ８４２ポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯ８４２ポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象である比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象であるＰＲＯ８４２ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００３７】
また、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００３８】
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００３９】
「ＰＲＯ８４２変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ８４２変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する完全長天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた完全長天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示するＰＲＯ８４２ポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長ＰＲＯ８４２ポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくはあるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
【００４０】
通常は、ＰＲＯ８４２変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００４１】
ここで同定されるＰＲＯ８４２コード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＰＲＯ８４２配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所,ワシントン D.C.，20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX（登録商標） V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００４２】
核酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さがアミノ酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例として、「ＰＲＯ−ＤＮＡ」が対象となる仮説的ＰＲＯコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象となる「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表４及び５が「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
【００４３】
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。WU-BLAST-2が用いられた場合、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象とする比較核酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子が比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一核酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【００４４】
また、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００４５】
核酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００４６】
他の実施態様では、ＰＲＯ８４２変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに開示する完全長ＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。ＰＲＯ８４２変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ８４２変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００４７】
「単離された」ＰＲＯ８４２ポリペプチドコード化核酸又は他のポリペプチドコード化核酸は、同定され、該ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在する特定のポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるポリペプチド核酸分子を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００４８】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み枠にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-ＰＲＯ８４２ポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗-ＰＲＯ８４２抗体組成物、一本鎖抗-ＰＲＯ８４２抗体、及び抗-ＰＲＯ８４２抗体の断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
【００４９】
ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００５０】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
【００５１】
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘSSC（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯ８４２ポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするＰＲＯ８４２ポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００５２】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００５３】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯ８４２ポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯ８４２ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯ８４２ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。ＰＲＯ８４２ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、ＰＲＯ８４２ポリペプチドに通常は関連している１つ又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
【００５４】
ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又はしっかんを防止又は低下（減少）させられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
１つ又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００５５】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEENTM、ポリエチレングリコール（PEG）、及びPLURONICSTMを含む。
【００５６】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（Zapataら, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬに量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００５７】
また、Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ’断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びIｇＡ２に分類される。
【００５８】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合とって望ましい構造の形成を可能にする、ＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP404,097；WO93/11161；及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
【００５９】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「特異的に結合する」抗体、又は特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ特異的な抗体とは、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。
【００６０】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直接又は間接的に抱合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯ８４２ポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
「調節」という用語は、シグナル伝達経路の反応に影響する（例えば、上方制御、下方制御又は他の制御のいずれか）を意味する。シグナル伝達の制御下での細胞性プロセスは、限定するものではないが、特定遺伝子の転写、通常の細胞機能、例えば代謝、増殖、分化、付着、アポトーシス、及び生存、並びに異常なプロセス、例えば形質転換、脱分化及び転移を含む。
【００６１】
ここでの目的に対する「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯ８４２ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯ８４２ポリペプチドの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯ８４２ポリペプチドによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生ＰＲＯ８４２ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯ８４２ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯ８４２ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力のみを意味する。
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病理学的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語に含まれるものは、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、免疫欠損症、腫瘍形成などである。
「Ｔ細胞媒介疾患」という用語は、Ｔ細胞が直接的又は間接的に哺乳動物の病的状態を媒介するか又は寄与等する疾患を意味する。Ｔ細胞媒介疾患は細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等に、また例えばＴ細胞により分泌されるリンホカインによりＢ細胞が刺激されるならばＢ細胞に関連した効果にさえも関連している。
【００６２】
本発明により治療可能で、そのいくつかは免疫又はＴ細胞媒介性である免疫関連及び炎症疾患の例には、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫媒介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、多発性硬化症、特発性脱随性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群、及び慢性炎症脱随性多発神経障害などの中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、感染性肝炎(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性(nonhepatotropic)ウィルス)、自己免疫慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎などの肝胆道疾患、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎；クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹などのアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎などの肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。ＡＩＤＳ(ＨＩＶ感染)、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型肝炎、ヘルペス等などのウイルス性疾患、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染等の感染症も含まれる。
【００６３】
「有効量」という用語は、特に記載した目的の達成をもたらすＰＲＯ８４２ポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの濃度又は量のことである。ＰＲＯ８４２ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの「有効量」は経験的に決定することができる。さらに「治療的有効量」は、記載した治療効果の達成に有効なＰＲＯ８４２ポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの濃度又は量のことである。この量もまた経験的に決定することができる。
ここで用いられる「細胞障害薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び／又は細胞破壊を生ずる物質を称する。この用語は、放射性同位体(例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６)、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとされる。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ａｒａ−Ｃ」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド類、例えばパクリタキセル(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)及びドキセタキセル(Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)、タキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン(米国特許第4,675,187号を参照のこと)、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を称する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ期でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)ブロックする薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができる。
【００６４】
「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体化ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン(ＥＰＯ)；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子(ＣＳＦｓ)、例えばマクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)；及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；インターロイキン(ＩＬｓ)、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２又はＩＬ−１７；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及び白血病阻害因子（ＬＩＦ）及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質を含み、天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物である。
「ケモカイン」なる用語は、構造上保存されたモチーフと白血球の走化性をメディエートし、その結果、白血球輸送における役割並びに白血球制御における役割を演じるそれらの能力により特徴付けられる、低分子量（８−１１kDa）炎症誘発性サイトカインのファミリーに属するクラスのことを意味する。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
【表２】
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【００６７】
【表３】
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【００６８】
【表４】
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【００６９】
【表５】
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【００７０】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
Ａ．完全長ＰＲＯ８４２ポリペプチド
本発明は、本出願でＰＲＯ８４２ポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は全ての与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した完全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のＰＲＯの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＰＲＯ／番号」で呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯ８４２ポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【００７１】
Ｂ．ＰＲＯ８４２ポリペプチド変異体
ここに記載した完全長天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチドに加えて、ＰＲＯ８４２変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ８４２変異体は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＰＲＯ８４２ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯ８４２ポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
【００７２】
天然完全長配列ＰＲＯ８４２又はここに記載したＰＲＯ８４２ポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯ８４２と比較してＰＲＯ８４２ポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯ８４２ポリペプチドの１つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意のもので活性について試験することにより決定される。
【００７３】
ＰＲＯ８４２ポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、完全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＰＲＯ８４２断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰＲＯ８４２断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＰＲＯ８４２ポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＰＲＯ８４２ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００７４】
【表６】
2010046065.tif 000024
【００７５】
ＰＲＯ８４２ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発(Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 [1986])等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ８４２変異体ＤＮＡを作成することもできる。
【００７６】
また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The ＰＲＯ８４２teins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００７７】
Ｃ．ＰＲＯ８４２の修飾
ＰＲＯ８４２ポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の１つの型は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯ８４２を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ＰＲＯ８４２抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸とのエステル、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
【００７８】
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯ８４２ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯ８４２に見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯ８４２に存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
【００７９】
ＰＲＯ８４２ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ８４２（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯ８４２アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
ＰＲＯ８４２ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行された国際公開８７／０５３３０、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【００８０】
ＰＲＯ８４２ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdgeら, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
ＰＲＯ８４２の共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯ８４２ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のＰＲＯ８４２ポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯ８４２ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
【００８１】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯ８４２ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯ８４２ポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯ８４２ポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯ８４２ポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210(1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martinら, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397(1990)］を含む。
【００８２】
それに代わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯ８４２の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯ８４２ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
またさらなる実施態様において、本発明のＰＲＯ８４２のポリペプチドは、ロイシンジッパーと融合されたＰＲＯ８４２のポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法により修飾されてもよい。種々のロイシンジッパーポリペプチドは当該技術分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science, 240:1759(1988);WO94/10308;Hoppe等, FEBS Letters, 344:1991(1994);Maniatis等, Nature 341:24(1989)を参照のこと。ＰＲＯ８４２に融合したロイシンジッパーの使用は、溶液中において可溶性ＰＲＯ８４２を二量体化又は三量体化させる補助に望ましいと考えられる。当業者であれば、ロイシンジッパーをＰＲＯ８４２の−又はＣ−末端に融合させてもよいことを理解するであろう。
【００８３】
Ｄ．ＰＲＯ８４２の調製
以下の説明は、主として、ＰＲＯ８４２核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯ８４２を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯ８４２を調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ８４２配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター  シティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯ８４２の種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて完全長ＰＲＯ８４２を生産してもよい。
【００８４】
１．ＰＲＯ８４２をコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯ８４２をコードするＤＮＡは、ＰＲＯ８４２ｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯ８４２ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＰＲＯ８４２-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＰＲＯ８４２に対する抗体又は少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＰＲＯ８４２をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００８５】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookらに示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbankなどの公的なデータベース又は私的な配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらに記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られる。
【００８６】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ８４２生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。
【００８７】
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらに記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００８８】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌などの腸内細菌科、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６，７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスを含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ-ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００８９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯ８４２コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日発行の欧州特許第１３９，３８３号）；クルベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４，９４３，５２９号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクルベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol.154(2): 737-742 [1983]）、クルベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、クルベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、クルベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ ２４,１７８）、クルベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、クルベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ  ３６，９０６； Van den Bergら, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クルベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクルベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２，２２６号）；ピチア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３，０７０号； Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４，２３４号）；アカパンカビ（Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日発行の欧州特許第３９４，５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日発行の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルスニダランス（Ballanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルスニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００９０】
グリコシル化ＰＲＯ８４２の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９又はスポドスペラＨｉｇｈ５等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, ＰＲＯ８４２c. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ  ８０６５); 及びマウス乳房腫瘍細胞 （ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００９１】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯ８４２をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯ８４２は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ８４２-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００９２】
発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【００９３】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのようにＰＲＯ８４２-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaubらにより Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282：39(1979)；Kingsmanら, Gene, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ８４２-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Changら, Nature, 275:615 (1978)； Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯ８４２をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【００９４】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess ら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許第７３，６５７号に更に記載されている。
【００９５】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ８４２転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０４)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＰＲＯ８４２をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯ８４２コード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００９６】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯ８４２をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯ８４２の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979)；欧州特許第１１７，０６０号；及び欧州特許第１１７，０５８号に記載されている。
【００９７】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, ＰＲＯ８４２c. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯ８４２ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯ８４２ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００９８】
５．ポリペプチドの精製
ＰＲＯ８４２の形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯ８４２の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯ８４２を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯ８４２のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯ８４２の性質に依存する。
【００９９】
Ｅ．ＰＲＯ８４２の用途
ＰＲＯ８４２をコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＰＲＯ８４２核酸も、ここに記載される組換え技術によるＰＲＯ８４２ポリペプチドの調製に有用である。
【０１００】
完全長天然配列ＰＲＯ８４２遺伝子又はその一部は、全長ＰＲＯ８４２ｃＤＮＡの単離又はここに開示した天然ＰＲＯ８４２配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他のｃＤＮＡ（例えば、ＰＲＯ８４２の天然発生変異体又は他の種からのＰＲＯ８４２をコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に完全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＰＲＯ８４２のプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＰＲＯ８４２遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＰＲＯ８４２遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【０１０１】
本出願で開示する任意のＥＳＴはプローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
ＰＲＯ８４２核酸の他の有用な断片は、標的ＰＲＯ８４２ ｍＲＮＡ（センス）又はＰＲＯ８４２ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＰＲＯ８４２ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する可能性は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48: 2659: [1988]）及び van der Krolら,（BioTechniques 6: 958, [1988]）に記載されている。
【０１０２】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＲＯ８４２タンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、国際公開９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、国際公開９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【０１０３】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（国際公開９０／１３６４１参照）を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【０１０４】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は一般に少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、あるいはそれよりも長い。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＰＲＯ８４２コード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＰＲＯ８４２をコードするヌクレオチド配列は、そのＰＲＯ８４２をコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【０１０５】
ＰＲＯ８４２のコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＰＲＯ８４２がレセプターである場合）、ＰＲＯ８４２は、結合相互作用に関与している他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＰＲＯ８４２は関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＰＲＯ８４２又はＰＲＯ８４２のレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【０１０６】
また、ＰＲＯ８４２又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＰＲＯ８４２をコードするｃＤＮＡは、ＰＲＯ８４２をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、ＰＲＯ８４２をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号や第４，８７０，００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＰＲＯ８４２導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＰＲＯ８４２コード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＰＲＯ８４２をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。
【０１０７】
あるいは、ＰＲＯ８４２の非ヒト相同体は、動物の胚幹細胞に導入されたＰＲＯ８４２をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯ８４２をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＰＲＯ８４２をコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＰＲＯ８４２「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＰＲＯ８４２をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯ８４２をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＰＲＯ８４２をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択された［例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照のこと］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。  
【０１０８】
また、ＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【０１０９】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である（Dzauら, Trends in Biotechnology 11, 205-210(1993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagnerら, ＰＲＯ８４２c. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【０１１０】
ここに記載したＰＲＯ８４２ポリペプチドをタンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよく、単離された核酸配列を、これらのマーカーを組み換え発現に用いてもよい。
ここに記載したＰＲＯ８４２ポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定が必要である。本発明の各ＰＲＯ８４２核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また、本発明のＰＲＯ８４２ポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のＰＲＯ８４２ポリペプチドは、好ましくは同じ型の正常組織に比較して疾患性組織において、一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。ＰＲＯ８４２核酸分子には、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【０１１１】
ここに記載したＰＲＯ８４２ポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のＰＲＯ８４２ポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、これにより、このＰＲＯ８４２生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed., [1980])、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物；EDTA等のキレート剤、マンニトール又はソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はPEG等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１１２】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【０１１３】
ＰＲＯ８４２ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
ＰＲＯ８４２ポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＰＲＯ８４２ポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＰＲＯ８４２ポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（rhGH）、インターフェロン-（rhIFN-）、インターロイキン-２、及びMN rgp120で成功裏に実施されている。Johnsonら, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Horaら, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p.439-462; 国際公開９７／０３６９２，国際公開９６／４００７２，国際公開９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【０１１４】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
本発明は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドに類似する（アゴニスト）又はＰＲＯ８４２ポリペプチドの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるＰＲＯ８４２ポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリのハイスループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＰＲＯ８４２ポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【０１１５】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＰＲＯ８４２ポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＰＲＯ８４２ポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＰＲＯ８４２ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０１１６】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＰＲＯ８４２ポリペプチドに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られている方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans［Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されているように、Fields及び共同研究者ら［Fields及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chienら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母ベースの遺伝子系を用いることによってモニターすることができる。酵母ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前出の文献に記載された酵母発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用し、並びに２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。また、この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれら相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定へ拡大適用することができる。
ここで同定されたＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常、反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、これら２つの生成物の相互作用及び結合が可能な条件下及び時間に渡って含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のようにモニターされる。試験化合物を含有する反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【０１１７】
アンタゴニストをアッセイするためには、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともにＰＲＯ８４２ポリペプチドを細胞へ添加してもよく、ＰＲＯ８４２ポリペプチド存在下における対象活性を阻害する化合物の能力は、化合物がＰＲＯ８４２ポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、ＰＲＯ８４２ポリペプチドと膜結合ＰＲＯ８４２ポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを有する潜在的アンタゴニストを競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることによって、アンタゴニストを検出してもよい。放射活性などでＰＲＯ８４２ポリペプチドを標識することが可能であり、潜在的アンタゴニストの有効性を判断するためにレセプターに結合したＰＲＯ８４２ポリペプチドの数を利用することができる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びFACSソートによって同定できる。Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2): 第５章(1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯ８４２ポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯ８４２ポリペプチドに対して反応性ではない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を、標識したＰＲＯ８４２ポリペプチドで暴露する。このＰＲＯ８４２ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の封入を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１１８】
レセプター同定の代替的方法として、標識ＰＲＯ８４２ポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をＰＡＧＥで溶解させ、Ｘ線フィルムへ暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片へ分解し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする縮重オリゴヌクレオチドプローブの一組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他のアッセイでは、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＰＲＯ８４２ポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯ８４２ポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＰＲＯ８４２ポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯ８４２ポリペプチドの変異形態であってもよい。
【０１１９】
他の潜在的なＰＲＯ８４２ポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら, Science, 241: 456 (1988); Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＰＲＯ８４２ポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＰＲＯ８４２ポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１２０】
潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＰＲＯ８４２ポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いで内ヌクレオチド結合分解性切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、上掲のRossi, Current Biology 4:469-471 (1994)及びＰＣＴ公報番号、国際公開９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
【０１２１】
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報番号、国際公開９７／３３５５１、上掲を参照。
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの１つ又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
また、ここで開示されている分子の診断的及び治療的利用は、下記に開示及び記載のポジティブ機能アッセイヒットに基づいている。
【０１２２】
Ｆ．組織分布
ＰＲＯ８４２を発現する組織の位置は、種々のヒト組織でのｍＲＮＡの発現を測定することにより同定可能である。このような遺伝子の位置により、ＰＲＯポリペプチドの活性の刺激又は阻害の影響を最も受けていると思われる組織の情報が提供される。また、特異的組織における遺伝子の位置により、以下で論議される活性阻止アッセイについての試料組織も提供される。
上述したように、種々の組織における遺伝子発現は、従来の、ｍＲＮＡの転写の定量化のためのノーザンブロット(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980])、サザンブロット、ドットブロット(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成により、ここに提供する配列にもとづいて適切な標識プローブを用いて測定できる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ-タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識可能な抗体を用いてもよい。
あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するための、組織断片の免疫組織学的染色、及び細胞培地又は体液のアッセイ等の免疫学的方法によっても測定できる。免疫組織学的染色又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。便利には、抗体は天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、又は特異的抗体エピトープをコードし、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡに融合した外因性配列に対して調製され得る。抗体を生成する一般的技術、及びノーザンブロット及びインサイツハイブリッド形成の特定のプロトコールは以下に提供する。
【０１２３】
Ｇ．抗体結合性の研究
遺伝子増幅実験の結果は、それぞれ、組織細胞上でのＰＲＯ８４２ポリペプチドの効果を阻害する、抗-ＰＲＯ８４２抗体の能力が試験される抗体結合性の研究によって更に証明できる。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロ抱合体抗体を含み、その調製は以下に記載する。
抗体結合性の研究は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)。
競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について試験分析物と競合する能力による。試験試料中の標的タンパク質の量は、抗体に結合する標準物の量に逆比例する。結合する標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは競合の前又は後に不溶化し、抗体に結合した標準品及び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。
サンドウィッチアッセイは２つの抗体の使用を含み、各々、検出されるタンパク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセイにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第１の抗体に結合し、その後第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３成分複合体が形成される。例えば米国特許第4,376,110号参照。第２の抗体は検出可能部分で標識され(直接サンドウィッチアッセイ)、あるいは検出可能部分で標識された抗-免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい(間接サンドウィッチアッセイ)。例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合の検出可能部分は酵素である。
免疫組織化学のために、組織試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。
【０１２４】
Ｈ．細胞ベースアッセイ
細胞ベースアッセイ及び免疫関連疾患の動物モデルは、ここで同定されたポリペプチドと遺伝子との関係、及び免疫関連疾患の進行及び病理との関係をさらに理解するために使用するすることができる。
異なる方法では、特定の免疫関連疾患に含まれることが知られた細胞型の細胞をここに記載のｃＤＮＡで形質移入し、これらのｃＤＮＡの免疫機能を刺激又は阻害する能力を分析する。適当な細胞を所望の遺伝子で形質移入し、免疫機能活性を監視できる。このような形質移入株化細胞は、次いで、例えばＴ細胞増殖又は炎症細胞の侵入を調節するといった、免疫機能を刺激又は阻害するポリ-又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の能力を試験するのに使用できる。ここに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、さらに、免疫関連疾患治療用の候補薬の同定に使用できる。
さらに、(下記のような)トランスジェニック動物から誘導された一次培地は、ここでの細胞ベースアッセイに使用できるが、安定な株化細胞が好ましい。トランスジェニック動物から連続株化細胞を誘導する技術はこの分野で良く知られている(Small等, Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 [1985]参照)。
一つの適切な細胞ベースアッセイは混合リンパ球反応(ＭＬＲ)である。Current Protocols in Immunology, unit3.12；J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, W.Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版。このアッセイでは、試験化合物が活性化したＴ細胞の増殖を刺激又は阻害する能力をアッセイする。レスポンダーＴ細胞の懸濁液を同種刺激細胞で培養し、トリチウム化チミジンの取込によりＴ細胞の増殖度合いを測定する。このアッセイはＴ細胞反応性の一般的な測定法である。多くのＴ細胞が応答し、ＩＬ-２の活性化をもたらすため、このアッセイにおける応答性の差異は、応答細胞によるＩＬ-２生産の差異に部分的に反映する。ＭＬＲの結果を、標準的なリンホカイン(ＩＬ-２)検出アッセイにより証明することができる。上掲のCurrent Protocols in Immunology, 3.15, 6.3.。
ＭＬＲアッセイにおける増殖性Ｔ細胞応答は、アッセイされる分子の直接的な有糸分裂促進特性又は外的な抗原誘発活性化による可能性がある。ＰＲＯポリペプチドのＴ細胞刺激活性のさらなる証明は、同時刺激アッセイにより得ることができる。Ｔ細胞活性化にはＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)を通して媒介される抗原に特異的なシグナル、及び第２のリガンド結合相互作用、例えばＢ７(ＣＤ８０、ＣＤ８６)／ＣＤ２８結合相互作用を通して媒介される同時刺激シグナルが必要である。ＣＤ２８の架橋により、活性化Ｔ細胞によるリンホカインの分泌が増加する。Ｔ細胞活性化はネガティブ又はポジティブ効果を有するリガンドの結合を通してネガティブ及びポジティブコントロールの双方を有する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ-４はＢ７に結合するＩｇスーパーファミリーの糖タンパク質に関連している。Ｂ７に結合するＣＤ２８は、ポジティブなＴ細胞活性化同時刺激効果を有し；逆にＢ７に結合するＣＴＬＡ-４はネガティブなＴ細胞非活性化効果を有する。Chambers. C.A. and Allison. J.P., Curr. Opin. Immunol. (1997)9：396。Schwartz, R.H., Cell(1992)71：1065；Linsey, P.S. and Ledbetter. J.A. Annu. Rev. Immunol.(1993)11：191；June, C.H.等 Immunol. Today(1994)15：321；Jenkins. M.K., Immunity(1994)1：405。同時刺激アッセイにおいて、ＰＲＯ８４２ポリペプチドはＴ細胞同時刺激又は阻害活性をアッセイするものである。
【０１２５】
ＰＲＯ８４２ポリペプチド、並びにＴ細胞の増殖の刺激剤(同時刺激剤)である本発明の他の化合物及びアゴニスト、例えばアゴニスト抗体で、例えばＭＬＲ及び同時刺激アッセイで決定されるようなものは、免疫機能の貧弱さ、最適下限又は不適切さに特徴付けられる免疫関連疾患の治療に有用である。これらの疾患はＴ細胞(及びＴ細胞媒介免疫性)の増殖及び活性化を刺激し、刺激化合物、例えば刺激性ＰＲＯポリペプチドの投与により哺乳動物における免疫反応を増強することにより治療される。刺激性ポリペプチドは、例えばＰＲＯ８４２ポリペプチド又はそのアゴニスト抗体であり得る。
本発明の刺激化合物の直接的用途は、プライムＴ細胞上で発現するリガンド(４-ＩＢＢＬ)に結合し、Ｔ細胞活性化及び成長の信号を発する腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーである４-ＩＢＢ糖タンパク質を用いる実験において確認されている。Alderson, M.E.等，J.Immunol.24：2219(1994)。
また、アゴニスト刺激化合物の用途は実験的に確認されている。アゴニスト抗-４-ＩＢＢ抗体を用いた治療による４-ＩＢＢの活性化は腫瘍の根絶化を増強する。Hellstrom. I.及びHellstrom, K.E., Crit. Rev. Immunol.18:1(1998)。以下により詳細に記載する腫瘍治療のための免疫アジュバント治療は、本発明の刺激化合物の用途の他の例である。
さらに、免疫刺激又は増強効果はＭＬＲアッセイにおいて阻害することが見出されたＰＲＯの活性に拮抗又はこれをブロックすることにより達成することができる。化合物の阻害活性を無効にすることで、ネットの刺激効果が生じる。適切なアンタゴニスト／ブロック化合物は阻害タンパク質を認識し、これに結合する抗体及びその断片であり、それにより該タンパク質とそのレセプターとの効果的な相互作用がブロックされ、レセプターを通したシグナル化が阻害される。この効果は、おそらくＣＴＬＡ-４結合による阻害シグナルの除去することにより、Ｔ細胞増殖を増強する抗-ＣＴＬＡ-４抗体を使用する実験で確認されている。Walunas, T.L.等, Immunity1：405(1994)。
あるいは、免疫刺激又は増強効果は、血管透過性増強特性を有するＰＲＯの投与により達成することもできる。増強した血管透過性は炎症及び免疫細胞(例えば単球、好酸球、ＰＭＮ)の局部的浸潤により緩和可能な疾患に有益である。
他方、Ｔ細胞増殖／活性化、リンホカイン分泌、及び／又は血管透過性の直接阻害剤であるＰＲＯ８４２ポリペプチド並びに本発明の他の化合物は、免疫反応の抑制に直接使用することができる。これらの化合物は、過剰活性、最適上限(superoptimal)又は自己免疫反応により特徴付けられる免疫関連疾患の治療、及び免疫反応の程度を低減するのに有用である。本発明の化合物のこの用途は、レセプターＢ７に結合するＣＴＬＡ-４がＴ細胞を非活性化するという上述の実験により確認されている。本発明の直接阻害化合物は類似した方法で機能する。血管透過性を抑制する化合物の用途は炎症を低減することが期待される。このような用途は過度の炎症に関連した病状の治療に有益である。
あるいは、刺激ＰＲＯ８４２ポリペプチドに結合し、これらの分子の刺激効果をブロックする化合物、例えば抗体により、ネットの阻害効果が生じ、Ｔ細胞の増殖／活性化及び／又はリホカイン分泌を阻害することにより、Ｔ細胞媒介免疫反応を抑制するために使用することができる。ポリペプチドの刺激効果をブロックすると、哺乳動物の免疫反応が抑制される。この用途は抗-ＩＬ２抗体を使用する実験において確認されている。これらの実験において、抗体はＩＬ２に結合し、そのレセプターへのＩＬ２の結合が阻害され、よってＴ細胞阻害効果が達成される。
【０１２６】
Ｉ．動物モデル
さらに、インビトロにおける細胞ベースアッセイの結果は、インビボ動物モデル及びＴ細胞機能アッセイにより証明することができる。免疫関連疾患の進行及び病因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アンタゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、ヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入することにより作成される。
移植片対宿主疾患は、免疫適格細胞が免疫抑制され又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は宿主抗原を認識しそれに反応する。反応は生命に危険性のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度のケースまで多様である。移植片対宿主疾患モデルはＭＨＣ抗原及び少量の移植抗原に対するＴ細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順は上記のCurrent Protocols in Immunology, unit4.3.に詳細に記載されている。  
皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、Ｔ細胞がインビボで組織の破壊を媒介する能力を試験する手段であり、移植拒絶におけるそれらの役割の指標である。最も一般的で容認されているモデルではマウスの尾の皮膚の移植片が使用される。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶がＴ細胞、ヘルパーＴ細胞及びキラー-エフェクターＴ細胞により媒介されるが、抗体では媒介されないことが分かった。Auchincloss, H. Jr.及びSachs, D.H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W.E.Paul ed., Raven Press, NY, 889-992(1989) 。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.4.に詳細に記載されている。本発明の化合物の試験に使用可能な他の移植拒絶モデルは、Tanabe, M.等, Transplantation58：23(1994)及びTinubu, S.A.等,  J. Immunol.4330-4338(1994)により記載されている同種心臓移植片モデルである。
【０１２７】
遅発型過敏症の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイをまた提供する。遅発型過敏反応は、抗原投与後の経過した時間まで、ピークに達しない炎症により特徴付けられるＴ細胞媒介インビボ免疫反応である。これらの反応はまた組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(ＭＳ)及び実験的自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ、ＭＳ用のモデル)で生じる。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit4.5.に詳細に記載されている。
ＥＡＥは、Ｔ細胞及び単核細胞の炎症と、続いての中枢神経系における軸索の脱髄により特徴付けられるＴ細胞媒介自己免疫疾患である。ＥＡＥは、一般的にヒトにおけるＭＳの関連動物モデルであると考えられている。Bolton. C., Multiple Sclerosis1：143(1995)。急性及び再発性弛緩モデルの双方が開発されている。本発明の化合物は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit15.1及び15.2.に記載されているプロトコールを使用して、免疫媒介脱髄疾患に対するＴ細胞刺激又は阻害活性を試験することができる。また、Duncan. I.D.等, Molec. Med. Today554-561(1997)に記載されているようにして、オリゴデンドロサイト又はシュワン細胞が中枢神経系に移植されたミエリン疾患のモデルも参照されたい。
接触性過敏症は、細胞媒介免疫機能の単純な遅発型過敏インビボアッセイである。この手順において、遅発型過敏反応を生じさせる外因性ハプテンに皮膚を暴露し、反応を測定して定量する。接触過敏症は最初の感作段階に顕在化段階が続く。顕在化段階はＴリンパ球が過去に接触したことのある抗原に遭遇したときに生じる。腫れと炎症が生じ、ヒトアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルが作成される。適切な手順は、Current Protocols in Immunology, J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, 及びW.Strober編, John Wiley & Sons, Inc, unit4.2(1994)に詳細に記載されている。また、Grabbe, S.及びSchwarz, T. Immun. Today 19(1)：37-44(1998)も参照のこと。
【０１２８】
関節炎の動物モデルは、コラーゲン-誘発関節炎である。このモデルはヒト自己免疫慢性関節リウマチの臨床的、組織的及び免疫学的特徴を共有し、ヒト自己免疫関節炎の許容可能なモデルである。マウス及びラットモデルは滑膜炎、軟骨の腐食及び軟骨下(subchondral)骨により特徴付けられる。本発明の化合物は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit15.5.に記載されているプロトコールを使用し、自己免疫関節炎に対する活性を試験することができる。また、Issekutz, A.C.等, Immunology88：569(1996)に記載されているＣＤ１８及びＶＬＡ-４インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用するモデルも参照のこと。
抗原誘発性気道反応亢進、肺好酸球増加症及び炎症が卵白アルブミンで動物を感作させ、エアゾールにより送達される同様のタンパク質に動物を暴露することで誘発される喘息モデルが記載されている。いくつかの動物モデル(モルモット、ラット、非ヒト霊長類)では、エアゾール抗原への暴露時にヒトのアトピー性喘息に類似した徴候が示された。マウスモデルはヒト喘息の多くの特徴を有している。喘息治療における活性と有効性について本発明の化合物を試験するのに適した手順は、Wolyniec, W.W.等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.18：777(1998)とそこに引用されている文献に記載されている。
さらに、本発明の化合物は乾癬用疾患の動物モデルにおいて試験することができる。ある証拠によりＴ細胞が乾癬の病原であることを示唆されている。本発明の化合物は、Schon. M.P.等, Nat. Med.3：183(1997)により記載されているscid／scidマウスモデルにおいて試験することができ、そのモデルではマウスは乾癬に類似した組織病理学的皮膚病巣を示す。他の適切なモデルはNickoloff, B.J.等, Am. J. Path.146：580(1995)に記載されているようにして調製されたヒトskin／scidマウスキメラである。
【０１２９】
組換え(トランスジェニック)動物モデルは、ここで同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象の動物ゲノムに導入することにより設計することができる。遺伝子組換え操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、前核マイクロインジェクション(Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号)；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移(例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985])；胚性肝細胞での遺伝子標的化(Thompson等, Cell 56, 313-321 [1989])；胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983])；精子媒介遺伝子転移(Lavitrano等, Cell 57, 717-73 [1989])を含む。概説のためには、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみ導入遺伝子を有するもの(「モザイク動物」)を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によってモニターできる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学等の技術を用いて分析できる。
【０１３０】
動物は、さらに、特定の組織中への免疫細胞の湿潤を測定するために例えば組織学的検査により、免疫疾患の病原の徴候を検査してもよい。またトランスジェニック動物を本発明の化合物で処理して、化合物のＴ細胞増殖刺激又は阻害の度合いを測定するブロック実験も実施することができる。これらの実験では、上述のようにして調製したＰＲＯ８４２ポリペプチドに結合するブロック抗体が動物に投与され、免疫機能に対する効果が測定される。
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、その同じポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えの結果、ここに同定するポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、特定のポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って当該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みをモニターするために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは変更が加えられていないフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターの記述についてはThomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入され、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell,69:915 (1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ポリペプチドが存在しないことによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【０１３１】
Ｊ．免疫アジュバント治療
一実施態様では、本発明の免疫刺激化合物は腫瘍(癌)治療における免疫アジュバント治療に使用することができる。Ｔ細胞がヒト腫瘍特異的抗原を認識することは十分に確立されている。遺伝子のＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーによりコードされる腫瘍抗原の一グループは全ての成人の正常組織においてサイレントであるが、腫瘍、例えばメラノーマ、肺腫瘍、頭部及び頸部の腫瘍、膀胱癌においては有意の量で発現している。DeSmet. C.等, Proc. Natl. Acad. Sci.93：7149(1996)。Ｔ細胞の同時刺激により、インビトロ及びインビボの双方において、腫瘍の退行及び抗腫瘍反応が誘発されることが示されている。Melero. I.等, Nature Medicine3：682(1997)；Kwon. E.D.等,  Proc. Natl. Acad. Sci.USA94：8099(1997)；Lynch. D.H.等, Nature Medicine3：625(1997)；Finn. O.J.及びLotze. M.T., J. Immunol.21：114(1998)。本発明の刺激化合物はアジュバントとして単独で又は成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤と共に投与することができ、Ｔ細胞増殖／活性化及び腫瘍抗原に対する抗腫瘍反応を刺激する。成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤は既知の投与方法で使用されている従来からの量で投与することができる。本発明の化合物による免疫刺激活性により、成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤の量を減らすことができ、よって、潜在的に患者に対する毒性を低下させることができる。
【０１３２】
Ｋ．候補薬についてのスクリーニングアッセイ
候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定される遺伝子にコードされるポリペプチド、又はその生物学的に活性な断片と結合又は複合体を形成する化合物、あるいはコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含む。考慮される小分子とは、合成有機又は無機化合物を含み、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、(ポリ)ペプチド-免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチド、即ち候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０１３３】
候補化合物がここで同定される遺伝子にコードされる特定のタンパク質と相互作用するが結合しない場合、そのタンパク質との相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、共免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることによりモニターすることができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化因子は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。既刊の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKER(商品名))は、Clontechから購入可能である。また、この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定される遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物を見出すために、通常、反応混合物は、２つの生成物の相互作用及び結合を可能ならしめる条件及び時間の下、遺伝子の生成物及び細胞内又は外成分を含むように調製される。試験化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物有り又は無しで実施する。さらに、第３の反応混合物にプラシーボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は外成分との結合(複合体形成)は上記のようにモニターする。対照反応において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物では形成されないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【０１３４】
Ｌ．免疫関連疾患の治療のための組成物及び方法
免疫関連疾患の治療に有用な組成物は、限定するものではないが、例えば、Ｔ細胞の増殖／活性化、リンホカインの放出、又は免疫細胞の浸潤等の免疫機能を阻害又は刺激するタンパク質、抗体、有機小分子、ペプチド、リン酸化ペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重鎖へリックス分子等々を含む。
例えば、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接的に阻止するように作用する。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列のおよそ−１０から＋１０位置の間から取り出されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551(1997年9月18日公開)を参照のこと。
転写阻害に用いられる三重鎖へリックス形成における核酸分子は単鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重鎖へリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照のこと。
これらの分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組合せにより、及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０１３５】
Ｍ．抗ＰＲＯ８４２抗体
本発明はさらに抗ＰＲＯ８４２抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ結合体抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
抗ＰＲＯ８４２抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで産生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯ８４２ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０１３６】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗ＰＲＯ８４２抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはＰＲＯ８４２ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬｓ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培養培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１３７】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現をサポートし、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯ８４２に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合アッセイによって測定される。このような技術及びアッセイは、当該分野において既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１３８】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に組込むことができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０１３９】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の断片、特にＦａｂ断片を生成するための抗体の消化は、当該分野において知られている定法的技術を使用して達成できる。
【０１４０】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗ＰＲＯ８４２抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりWinter及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１４１】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる(Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化してマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
また、抗体は上述した既知の選択及び／又は突然変異誘発法を使用し、親和成熟させてもよい。好ましい親和成熟抗体は、成熟抗体が調製された(一般的にマウス、ヒト化又はヒトの)出発抗体のものよりも、５倍、より好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０又は３０倍の親和性を有する。
【０１４２】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースにおいて、結合特異性の一方はＰＲＯに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づく[Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539(1983)]。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行われる。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１４３】
WO 96/27011に記載された他のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖が小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えられた第２の抗体分子の界面に作り出される。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ'断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０１４４】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＰＲＯ８４２ポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗ＰＲＯ８４２ポリペプチドアームは、特定のＰＲＯポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球上のトリガー分子又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＰＲＯポリペプチドを発現する細胞に細胞障害薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＰＲＯ８４２-結合アーム及び細胞障害薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。対象の他の二重特異性抗体はＰＲＯ８４２ポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子(ＴＦ)に結合する。
【０１４５】
５．ヘテロ結合体抗体
ヘテロ結合抗体も本発明の範囲内に入る。ヘテロ結合抗体は２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが含まれる。
【０１４６】
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌の治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成されたホモダイマー抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体は、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１４７】
７．免疫結合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性結合)に結合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫結合体の生成に有用な化学療法剤は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性断片、(緑膿菌からの)エクソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、ツルレイシインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性結合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
抗体及び細胞障害薬の結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に結合されてもよく、抗体-レセプター結合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合結合体を循環から除去し、次に細胞障害薬(放射性ヌクレオチド等)に結合された「リガンド」(アビジン等)を投与する。
【０１４８】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示するタンパク質、抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び同第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、定められた孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合され得る。化学療法剤(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【０１４９】
９．抗ＰＲＯ８４２抗体の用途
本発明の抗ＰＲＯ８４２抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗ＰＲＯ８４２抗体は、ＰＲＯ８４２の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、滑液、血漿／血清又は尿における発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら, Nature 144:945 (1962)；Davidら, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Painら, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981)；及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
また、抗ＰＲＯ８４２抗体は、組換え細胞培地又は天然の供給源からのＰＲＯ８４２の親和性精製に利用できる。この方法において、ＰＲＯ８４２に対する抗体を、当分野でよく知られた方法を用いてSephadex樹脂又は濾紙等の適した支持体に固定化する。次いで、固定化した抗体をＰＲＯ８４２を含む試料と接触させて精製し、その後、固定化した抗体と結合したPRO21074以外の試料中の実質的には全ての物質を取り除きうる適した溶媒で、支持体を洗浄する。最後に、支持体を抗体からＰＲＯ８４２を引き離しうる他の適した溶媒で洗浄する。
以下の実施例は例示的な目的のためにのみ提供されるものであり、いかなる点においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本発明の明細書中に引用された全ての特許及び学術文献は、全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１５０】
Ｎ．製薬組成物
本発明の活性ＰＲＯ８４２分子(例えばＰＲＯ８４２ポリペプチド、抗ＰＲＯ８４２抗体、及び／又はその変異体)、並びに上述のスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、免疫関連疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
本発明の活性ＰＲＯ８４２分子、好ましくはポリペプチド又は抗体の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ活性分子を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロイド；ヘキサメトニウムクロイド；ベンズアルコニウムクロイド；ベンズエトニウムクロイド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又は又はトゥイーンTWEENTM、プルロニクスPLURONICSTM、及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１５１】
ここで開示されたスクリーニングアッセイで同定された化合物は、同様の方式でこの分野で知られた標準技術を用いて製剤することができる。
リポフェクション又はリポソームもＰＲＯ８４２分子を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。(例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]を参照のこと)。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性ＰＲＯ８４２分子は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１５２】
徐放性製剤又はＰＲＯ８４２分子を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１５３】
Ｏ．治療方法
本発明のポリペプチド、抗体及び他の活性物質は、組織への炎症細胞の浸潤、Ｔ細胞の増殖の刺激、Ｔ細胞の増殖の阻害、血管透過性の増加又は低減又はその阻害によって特徴付けられるものを含む、Ｔ細胞媒介疾患等の種々の免疫関連疾患及び病状を治療するために使用できると考えられる。
本発明のポリペプチド、抗体及び他の化合物で治療される病状又は疾患の例には、限定するものではないが、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、骨関節症、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫媒介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、多発性硬化症、特発性脱随性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群、及び慢性炎症脱随性多発神経障害などの中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、感染性肝炎(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性ウィルス)、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎などの肝胆道疾患、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎；クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹などのアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎などの肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
全身性紅斑性狼瘡では、疾患の中心的な媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産生と、続いての免疫媒介炎症の発生である。抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。Ｔリンパ球は組織損傷に直接的には関与していることは示されていないが、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発育に必要である。よって、疾患の発生はＴリンパ球に依存している。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的に冒される。
【０１５４】
リウマチ様関節炎(ＲＡ)は、主に複数の関節の滑膜に関連する慢性全身性自己免疫炎症疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成に付随し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体を生成する。関節中のこれらの複合体は、滑膜中へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発し；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば、関節空間／液でもしかりである。冒されている組織は、多くの場合対称的なパターンで、主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患もまた生じる。一形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の典型的病巣、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発生である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、これは、ＲＡ疾患過程の末期、時には関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これには、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う複数の器官において血管炎が付随する。多くの場合、患者には、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；その小結節は、末期には混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡにおいて生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６歳未満で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子が陽性である患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は３つの主要なカテゴリー：小関節(pauarticular)、多関節及び全身性に細分類される。関節炎は重度で典型的には破壊的であり、関節強直症及び遅延成長に至る。他の徴候には慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
【０１５５】
脊椎関節症は、いくつかの共通した臨床的特徴とＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子産物の発現との共通の関連性を持つ疾患のグループである。該疾患には：Bechterew氏病（ankylosing sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。顕著な特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；炎症非対称性関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７(クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある血清学的に定義された対立遺伝子)との関連；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導に対する鍵として最も関わっている細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球で、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７に対して反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原性エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋細胞の反応を誘発すると仮定されている。
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。疾患の顕著な特徴は皮膚の硬結であり；これは活性な炎症プロセスにより誘発されると思われる。強皮症は局部的又は全身性であり：血管病巣が共通しており、微小血管系における内皮細胞傷害が全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準は、皮膚病巣における単核細胞浸潤の存在と、多くの患者において抗細胞核抗体の存在によって導かれる。多くの場合、ＩＣＡＭ-１が皮膚病巣の線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレーションされ、これらの細胞とのＴ細胞の相互作用が疾患の病因においてある役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：結果的に異常なぜん動／運動性となる平滑筋萎縮症及び線維症：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
【０１５６】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対照的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症と、涙腺及び唾液腺の続く機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患に関連するか又はそれに伴なう場合がある。この疾患は、双方とも小さいＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する自己抗体産生に関連している。病巣は乾性角結膜炎、口内乾燥症で、胆汁性硬変、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病を含む他の徴候又は関連を伴うものに至る。
全身性血管炎症は一次病巣が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として冒された脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、いくつかのケースでは最終的な末端器官機能障害になるといった疾患である。また、血管炎(vasculitides)は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の生成に関連した疾患等の続発症として又は二次病変として生じる場合がある。原発性全身性血管炎症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。その他の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、隔離されたＣＮＳ血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の発病メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
サルコイドーシスは、体内のほとんど全ての組織中における類上皮細胞肉芽腫の存在により特徴づけられる病因がよく知られていない病状であり；肺の関与が最も一般的である。病因は疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞型より放出される局部的又は全身的活性産物の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、及び発作性夜間血色素尿を含む自己免疫溶性血性貧血は、赤血球(いくつかの場合においては血小板もまた含む他の血液細胞)表面で発現した抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
【０１５７】
他の臨床的環境における血小板減少性紫斑病及び免疫媒介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、血小板破壊／除去が、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-媒介メカニズムにより除去される結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に存在し多くの場合甲状腺に特異的なタンパク質と反応する抗体の産生を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。自然のモデル：ラット(ＢＵＦ及びＢＢラット)及びチキン(肥満チキン種)；誘導性モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)のいずれかでの動物の免疫化を含む実験用モデルが存在する。
Ｉ型真性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は膵臓ランゲルハンス島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリン様レセプターに対する抗体は、インスリン-非反応性の表現型をつくりだすことができる。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫媒介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産生される結果として直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応性である、腎臓中の抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果として間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の生成をもたらす他の免疫媒介疾患により、間接的続発症として免疫媒介腎疾患も誘発しうる。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として、器官機能が損なわれ、いくつかの場合では腎臓機能不全に進行する、病巣発達を腎組織に生じさせ／誘発する炎症反応が生じる。体液及び細胞免疫メカニズムの双方が障害の発病に関与しうる。
多発性硬化症；特発性脱随性多発神経障害又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱随性多発神経障害を含む中枢及び末梢神経系の脱髄疾患は、自己免疫に原因を有し、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に引き起こされる損傷の結果として神経脱髄が生じると考えられている。ＭＳにおいては、疾患の誘発及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。病巣は優勢なＴ細胞媒介小膠細胞の湿潤と、浸潤しているマイクロファージを含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病巣における優勢な細胞型である。オリゴデンドロサイトの細胞死と続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球により推進されていると思われる。
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。その反応の阻害は治療的に有益であろう。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発病はＴリンパ球依存性である。
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。病巣にはＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
【０１５８】
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴリンパ球依存性である。これらの疾患はTリンパ球誘発性炎症、ＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
拒絶反応及び移植片対宿主疾患(ＧＶＨＤ)を含む移植関連疾患はＴリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及びヘルペス)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(ＭＬＲを刺激する分子(又は誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)を含む感染疾患、ＭＬＲを刺激し、治療に利用し、遺伝子し、獲得し、感染誘発された(例えばＨＩＶ感染)状態に対する免疫反応を増強するために治療上用いることが可能な免疫欠損疾患（分子／誘導体／アゴニスト)又は医原性(即ち、化学療法からのもの)免疫欠損、及び異常増殖である。      
ヒト癌患者の中には、異常増殖細胞上の抗原に反応する抗体及び／又はＴリンパ球を発生させるものもいることが証明されている。また、異常増殖のある動物モデルにおいても、免疫反応を増強することで、特定の異常増殖が拒絶又は退行する結果になることも示されている。ＭＬＲにおけるＴリンパ球反応を増強する分子は、異常増殖に対する免疫反応を増強するインビボでの利用性を有している。ＭＬＲにおけるＴリンパ球増殖反応を増強する分子(又は拮抗的に同じレセプターに影響を及ぼした小分子アゴニスト又は抗体)は、癌の治療に治療的に使用することができる。また、ＭＬＲにおいてリンパ球反応を阻害する分子は、異常増殖中に、新生物に対する免疫反応を抑制するように、インビボで機能し；このような分子は新生物細胞自体により発現されうるか、又はその発現は他の細胞中の新生物により誘発されうる。このような阻害分子(抗体、小分子アンタゴニスト又は他の手段による)の拮抗作用により免疫媒介腫瘍拒絶が増強される。
さらに、炎症誘発性特性を有する分子を阻害することは、再灌流傷害；脳卒中；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化；急性肺傷害；出血性ショック；火傷；敗血症／敗血症ショック；急性尿細管壊死；子宮内膜症；変性関節疾患及び膵炎(pancreatis)の治療に有益である。
本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入(鼻孔内、肺内)経路などにより投与される。ポリペプチド及び抗体の静脈内又は吸入投与が好ましい。
【０１５９】
免疫アジュバント治療において、抗癌剤の投与などの他の投薬計画は、本発明のタンパク質、抗体又は化合物の投与と組み合わされてもよい。例えば、本発明の免疫アジュバントで治療される患者は、抗癌剤(化学療法剤)又は放射線治療を受けてもよい。このような化学療法剤の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service Ed. M.C. Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、免疫アジュバントの投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。加えて、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン(EP 616812参照)を、それらの分子について知られた用量で付与してもよい。
【０１６０】
また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、ＰＲＯポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いてＰＲＯポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とＰＲＯポリペプチドとの組み合わせ(相乗)効果により減少させ得る。
重篤な免疫関連疾患の治療又は低減のための、本発明の化合物の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ(例えば、０．１-２０ｍｇ／ｋｇ)のポリペプチド又は抗体が、例えば、一又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０１６１】
Ｐ．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質(例えばＰＲＯ分子を含有するもの)を含む製造品が提供される。この製造品は容器と使用説明書とを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤は通常、本発明のポリペプチド又は抗体である。容器上又は添付される使用説明書又はラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１６２】
Ｑ．免疫関連疾患の診断及び予知
ある種の免疫関連疾患で過剰発現されるタンパク質等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は疾患治療の優れた標的である。同じタンパク質は免疫関連疾患で増幅された遺伝子にコードされる分泌タンパク質とともに、これらの疾患の診断及び予知における付加的な用途が見出される。例えば、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、又は他の免疫関連疾患で増幅された遺伝子のタンパク質産物に対する抗体は診断又は予知として使用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅又は過剰発現された遺伝子にコードされるタンパク質(「マーカー遺伝子産物」)の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によってモニターできる。これらの技術は、過剰発現した遺伝子が細胞表面タンパク質をコードする場合に特に適切である。このような結合アッセイは、本質的に上述したように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を重層することにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１６３】
実施例
実施例中で言及される市販の試薬は、特に指示がない限り製造者の取扱説明書の従って使用された。以下の実施例、及び本明細書全体において、ＡＴＣＣ登録番号によって同定された細胞のソースは、American Type Culture Collection, Manassas, VA.である。
実施例１
ヒトＰＲＯ８４２ポリペプチドコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＰＲＯ８４２ポリペプチドコード化核酸配列は、Genentech Inc.(South San Francisco, CA)によって開発された自社独自のシグナル配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は私的（LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceutics, Inc., Palo Alto, CA）データベースからＥＳＴｓ並びにのクラスター化し、アセンブルしたＥＳＴ断片に対して適用することによって同定された。シグナル配列アルゴリズムは、検討中の配列又は配列断片の５’−末端における１番目及び場合によっては２番目のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取巻くＤＮＡヌクレオチドの性質に基づいて分泌シグナルスコアーを計算する。１番目のＡＴＧに続くヌクレオチドは、いずれのストップコドンもなく、少なくとも３５の明確なアミノ酸をコードする。１番目のＡＴＧが必要なアミノ酸をコード場合、２番目は検討しない。いずれも要件を満たさない場合には、候補配列はスコアー化されない。ＥＳＴ配列が真のシグナル配列を含んでいるか否かを決定するために、そのＡＴＧコドンを取巻くＤＮＡ及びそれに対応するアミノ酸は分泌シグナルと関連することが知られている１セットの７つのセンサー（評価パラメーター）を用いてスコアー化される。このアルゴリズムを使用した結果、Incyte ESTクラスター配列番号69572としてここで命名された単一のIncyte ESTが同定された。次に、このＥＳＴクラスター配列は、存在する相同性を同定するために、公的なデータベース（例えば、GenBank）及び自社のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceutics, Inc., Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較された。ホモロジーサーチはコンピュータプログラムのＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２(Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))を用いて実行された。既知のタンパク質をコードしない７０又はそれを超えるＢＬＡＳＴスコアーを生じるこれらの比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seatle, Washington)を用いてコンセンサスにクラスター化されアセンブルされた。それにより得られたコンセンサス配列は、ここではＤＮＡ５４２３０と称する。
【０１６４】
コンセンサス配列とメルクのＥＳＴクローン番号ＡＡ４７７０９２内に含まれるＥＳＴ配列との間に見出され配列相同性を考慮して、メルクＥＳＴクローン番号ＡＡ４７７０９２を購入し、ｃＤＮＡインサートを得、配列決定を行った。このインサートは全長タンパク質をコードすることが分かった。このｃＤＮＡインサートの配列は、図９８中に示され、ここではＤＮＡ５６８５５−１４４７と称される。
図９８中に示される全長クローンは、ヌクレオチド位置１５３−１５５に見かけの翻訳開始サイトを持ち、ヌクレオチド位置５１０−５１２の停止コドンで終了する単一のオープンリーディングフレームを含んでいた（図９８；配列番号：１６４）。予想されるポリペプチド前駆体（図９９、配列番号：１６５）は、１１９アミノ酸長である。ＰＲＯ８４３はおよそ１３，８１９ダルトンの計算上の分子量を持ち、およそ１１．１６の評価上のｐＩを持つ。ＰＲＯ８４２の他の特徴には、約アミノ酸１−２２のシグナル配列、約アミノ酸３９−４１の潜在的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位、及び約アミノ酸２７−３２及び約アミノ酸４６−５１の２つの潜在的なＮ−ミリストイル化部位を含まれる。
図９８（配列番号：１６４）中に示されるWU-BLAST-2配列アライメント解析を用いて、Dayhoffデータベース（バージョン35.45SwissProt35）の解析ＰＲＯ８４２アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の相同性を明らかにした。：CEZK131_11, P_R80843, RAT5HT2X_1, S81882, A60912, MCU60315_137MC137L, U93422_1, p_P91996, U93462_1及びZN18_HUMAN
【０１６５】
実施例２
大腸菌におけるＰＲＯ８４２の発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるＰＲＯ８４２の非グリコシル化型の調製を例証する。
ＰＲＯ８４２コード化DNA配列は選択されたPCRプライマーを利用して最初に増幅される。このプライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むpBR322(大腸菌由来;Bolivarら, Gene, 2:95 (1997)を参照のこと)がある。ベクターは制限酵素によって消化され、脱リン酸化される。次いで、PCR増幅配列がベクターにライゲーションされる。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、ポリhisリーダー、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、ＰＲＯ８４２コード領域、ラムダ転写集結因子及びargU遺伝子をコードする配列を含む。
【０１６６】
次いで、Sambrookら, 上記に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換するために、このライゲーション混合物を利用した。形質転換体をLBプレート上でのその増殖能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、それを制限酵素分析及びDNA配列決定によって確認することができる。
選択されたクローンを、抗生物質が補填されたLBブロスのような液体培地で一晩かけて増殖させることができる。この一晩の培養を、引き続きより大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。細胞を所望の光学密度になるまで増殖させると、その間に発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したＰＲＯ８４２タンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。
【０１６７】
以下の手法を用いて、ポリ-Hisタグ形態でＰＲＯ８４２を大腸菌で発現させてもよい。ＰＲＯ８４２をコードするDNAを選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いで、PCR増幅されたポリ-Hisタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株52(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体を、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中で、30ECで振盪しながら3-5のO.D.600に達するまで増殖させた。ついで培養液をCRAP培地(3.57gの(NH4)2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのSheffield hycase SF、並びに110mMのMPOS、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコース及び7mMのMgSO4の混合で調製)中にて50-100倍希釈し、30℃で振盪によって約20-30時間増殖させた。SDS-PAGEにより発現を確認するために試料を取り出し、細胞がペレットとなるようにバルク培地を遠心分離した。精製及びリフォールディングまで、細胞ペレットを凍結させた。
【０１６８】
0.5から1Lの発酵(6-10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をBeckman Ultracentifuge中で40,000rpmで30分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3-5容量で希釈し、透明にするために0.22ミクロンフィルターを通して濾過する。透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに充填した。カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む更なるバッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。
【０１６９】
試料を20mMのトリス、pH8.6、0.3MのNaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのEDTAからなる新たに調製した再生バッファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50~100マイクログラム/mlとなるように選択した。リフォールディング溶液を4℃で12-36時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はTFAを採取濃度0.4%(約3のpH）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2-10%で添加した。再生したタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%TFAの移動バッファーと10~80%のアセトニトリル勾配での溶離を行うことでクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質形態は、これらの形態が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の再生したＰＲＯ８４２ポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのHepes、pH6.8に調製した。
上述のようにして、ＰＲＯ８４２ポリペプチドは成功裏に発現された。
【０１７０】
実施例３
哺乳動物細胞におけるＰＲＯ８４２の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のＰＲＯ８４２の調製を例証する。
発現ベクターとしてベクターpRK5(1989年3月15日公開のEP307,247参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯ８４２ DNAを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、上記のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＰＲＯ８４２ DNAを挿入させる。得られたベクターは、pRK5-ＰＲＯ８４２と呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞でもよい。ヒト293細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したDMEMなどの培地中で組織培養プレートにおいて増殖させて集密化した。約10μgのpRK5-ＰＲＯ８４２DNAを約1μgのVA RNA遺伝子コード化DNA［Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、500μlの1mM トリス-HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaCl2に溶解させた。この混合物に、500μlの50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPO4を一滴づつ添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、293細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30秒間添加した。293細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
【０１７１】
形質移入の約24時間後、培地を除去し、培地（のみ）又は200μCi/ml35S-システイン及び200μCi/ml35S−メチオニンを含む培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに代わる技術において、ＰＲＯ８４２は、Somparyracら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて293細胞に一過的に導入される。293細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで増殖させ、700μgのpRK5-ＰＲＯ８４２ DNAを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。DNA-デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯ８４２を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯ８４２をCHO細胞で発現させることができる。pRK5-ＰＲＯ８４２は、CaPO4又はDEAE-デキストランなどの公知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は35S-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯ８４２ポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯ８４２を含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
【０１７２】
また、エピトープタグＰＲＯ８４２は、宿主CHO細胞において発現させてもよい。ＰＲＯ８４２はpRK5ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-hisタグＰＲＯ８４２挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-hisタグＰＲＯ８４２を含む培地は、次いで濃縮し、Ni2+-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
またＰＲＯ８４２は、一過性発現法によりCHO及び／又はCOS細胞で、他の安定な発現方法によりCHO細胞で発現させてもよい。
CHO細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列（例えば、細胞外ドメイン）がIgG1のヒンジ、CH2及びCH2ドメインを含む定常領域配列に融合したIgG作成物（イムノアドヘシン）、又はポリ-Hisタグ形態として発現された。
【０１７３】
PCR増幅に続いて、対応するDNAを、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてCHO発現ベクターにサブクローニングした。CHO発現ベクターは、対象とするDNAの5'及び3'に適合する制限部位を有し、cDNAの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにCHO細胞での発現を用い、対象とするcDNA及びジヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR）の発現の制御にSV40初期プロモーター／エンハンサーを用いる。DHFR発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドDNAの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Qiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）約1千万のCHO細胞に導入する。細胞は、上記のLucas等に記載されているように増殖させた。約3x107細胞を、下記のような更なる増殖及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
【０１７４】
プラスミドDNAを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで5分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地(0.2μm濾過PS20、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mLスピナーに分ける。1-2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートする。さらに2-3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x105細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なCHO培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1．2x106細胞／mLで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、30mLの500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤（例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）をとった。生産を通して、pHは7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
【０１７５】
ポリ-Hisタグ作成物について、タンパク質はNi-NTAカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes,pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi-NTAカラムへ4-5ml/分の流速によって4℃でポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトール, pH6.8を含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、-80℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Fc含有）作成物を、以下の通りに条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー，pH6.8で平衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）へポンプ注入した。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μLの1Mトリスバッファー，pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はSDSポリアクリルアミドゲルとエドマン（Edman）分解によるN-末端アミノ酸配列決定により評価した。
ＰＲＯ８４２ポリペプチドは上述のようにして成功裏に発現された。
【０１７６】
実施例４
酵母菌でのＰＲＯ８４２の発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯ８４２の組換え発現を記載する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのＰＲＯ８４２の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＰＲＯ８４２をコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯ８４２の細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯ８４２をコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、天然ＰＲＯ８４２シグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯ８４２の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株AB110酵母菌株は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びSDS-PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯ８４２は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯ８４２を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１７７】
実施例５
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ８４２の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯ８４２の組換え発現を記載する。
ＰＲＯ８４２コードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-hisタグ及び免疫グロブリンタグ（IgGのFc領域など）を含む。pVL1393（Novagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ８４２又はＰＲＯ８４２コード配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、5'及び3'領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5'プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスDNA（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Sf9」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4-5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【０１７８】
次に、発現されたポリ-hisタグＰＲＯ８４２は、例えばNi2+-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出物は、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製した。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mLのHepes, pH7.9;12.5mMのMgCl2;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1%のNP-40;0.4MのKCl）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を充填バッファー（50mMリン酸塩、300mMのNaCl、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。Ni2+-NTAアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mLの総容積で調製し、25 mLの水で洗浄し、25 mLの充填バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5 mLでカラムに充填した。カラムを、分画回収が始まる点であるA280のベースラインまで充填バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMリン酸塩；300mMのNaCl、10%グリセロール、pH6.0）で洗浄した。A280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収し、SDS-PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したNi2+-NTAでのウェスタンブロットで分析した。溶離したHis10-タグＰＲＯ８４２を含む画分をプールして充填バッファーで透析した。
あるいは、IgGタグ（又はFcタグ）ＰＲＯ８４２の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ＰＲＯ８４２ポリペプチドは上述のようにして成功裏に発現された。
【０１７９】
実施例６
ＰＲＯ８４２に結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯ８４２に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ８４２、ＰＲＯ８４２を含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯ８４２を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入したＰＲＯ８４２免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL-TDMアジュバント（Ribi Immunochemical Research, ハミルトン, モンタナ）に乳化し、動物の後フットパッドに注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＰＲＯ８４２抗体の検出のためのエライザアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１８０】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＰＲＯ８４２静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（35%ポリエチレングリコールを用いて）、ATCCから番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ８４２に対する反応性についてのエライザでスクリーニングされる。ＰＲＯ８４２に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗ＰＲＯ８４２モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで増殖させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１８１】
実施例７
特異的抗体を用いたＰＲＯ８４２ポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯ８４２ポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、pro-ＰＲＯ８４２ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はpre-ＰＲＯ８４２ポリペプチドは、対象とするＰＲＯ８４２ポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＰＲＯ８４２ポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr-活性化SEPHAROSETM（Pharmacia LKB Biotechnology）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
【０１８２】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯ８４２ポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰＲＯ８４２ポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、界面活性剤の添加又はこの分野で公知の方法により分画遠心法を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により得られる。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯ８４２ポリペプチドは、細胞が増殖する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯ８４２ポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯ８４２ポリペプチドの好ましい吸着を可能ならしめる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯ８４２ポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約2-3といった低pH、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、ＰＲＯ８４２ポリペプチドが回収される。
【０１８３】
実施例８
薬物スクリーニング
本発明は、ＰＲＯ８４２ポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングにとって特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯ８４２ポリペプチド又は断片は、溶液中に遊離した状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法では、ＰＲＯ８４２ポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、ＰＲＯ８４２ポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯ８４２ポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成における減少を試験することもできる。
従って、本発明は、ＰＲＯ８４２ポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で良く知られている手法により、その試薬をＰＲＯ８４２ポリペプチド又は断片に接触させ、(i)試薬とＰＲＯ８４２ポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)ＰＲＯ８４２ポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯ８４２ポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、遊離なＰＲＯ８４２ポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、遊離又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯ８４２ポリペプチドに結合する又はＰＲＯ８４２ポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０１８４】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についてのハイスループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に公開されたWO84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯ８４２ポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯ８４２ポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯ８４２ポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＰＲＯ８４２ポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドに結合可能な中和抗体がＰＲＯ８４２ポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、ＰＲＯ８４２ポリペプチドで、１つ又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１８５】
実施例９
合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＰＲＯ８４２ポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＰＲＯ８４２ポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯ８４２ポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)）。
１つの方法において、ＰＲＯ８４２ポリペプチド、又はＰＲＯ８４２ポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ-線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯ８４２ポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯ８４２ポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthaudaら,J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０１８６】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体（抗-ids）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗-idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のＰＲＯ８４２ポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯ８４２ポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【０１８７】
実施例１０
癌性腫瘍でのＰＲＯポリペプチドの過剰発現を検出するためのマイクロアレイ分析
何千もの遺伝子配列を殆ど場合において含む核酸マイクロアレイは、組織の正常な対応物と比較して、疾患組織において差次的に発現している遺伝子を同定するために有用である。核酸マイクロアッセイを用いると、試験及びコントロール組織試料からの試験及びコントロールｍＲＮＡ試料が逆転写され、ｃＤＮＡプローブを生成するために標識される。次いで、このｃＤＮＡプローブは、固体支持体上に固定化さた多くの核酸とハイブリダイズされる。このアレイは、アレイの各メンバーの配列と位置がわかるように構成されている。例えば、ある疾患段階で発現することが知られている遺伝子から選ばれたものを固体支持体上に整列してもよい。標識プローブとある特定のアレイのメンバーとのハイブリダイゼーションは、プローブが誘導された試料がその遺伝子を発現していることを示す。試験（疾患組織）からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが、コントロール（正常組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルより大きい場合は、疾患組織において過剰発現している遺伝子又は複数遺伝子が同定される。この結果の意味は、疾患組織で過剰発現しているタンパク質は、疾患症状の存在のための診断的マーカーとしてだけではなく、疾患症状の治療のための治療上の標的としても有用であるということである。
核酸のハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ技術の方法論は、当業者には良く知られている。本実施例では、ハイブリダイゼーション及びプローブ、スライドのための核酸の特別な調製、並びにハイブリダイゼーションの条件は、２０００年３月３１日に出願された米国仮出願一連番号 ６０／１９３，７６７にすべて詳述されており、ここにおいて文献として取り入れられている。
【０１８８】
本実施例では、癌牲腫瘍で過剰発現しているＰＲＯ８４２ポリペプチドを同定するための試みとして、非癌牲ヒト組織に関連するＰＲＯ８４２ポリペプチドコード化遺伝子発現のために、種々のヒト組織から誘導された癌牲腫瘍が研究された。２セットの実験データーが作成された。１つのセットでは、同じ患者からの癌牲ヒト結腸腫瘍組織、及び適合した非癌牲ヒト結腸腫瘍組織（「適合した直腸コントロール」）を得て、そして上記で記載したマイクロアレイ技術を用いてＰＲＯ８４２ポリペプチド発現について分析した。二番目のセットのデーターでは、任意の種々の異なるヒト腫瘍を得て、肝臓、腎臓、及び肺を含む上皮由来の非癌牲ヒト組織をプールすることによって調製される「普遍的」上皮コントロール試料と比較した。プールされた組織から単離されたｍＲＮＡは、これら異なる組織での発現遺伝子産物の混合物を示す。プールされたコントロール試料を用いたマイクロアレイハイブリダイゼーション実験は、二色分析において直線的なプロットを生じた。次いで、二色分析において生じたこの線の傾斜を、各実験の（試験：コントロール検出）の比率を標準化するために用いた。次いで、種々の実験の標準化された比率を比較し、そして遺伝子発現の集積牲を同定するために用いた。従って、プール化された「普遍的なコントロール」試料は、単純な二つの試料の比較における有効で相対的遺伝子発現の判定を可能にするだけではなく、幾つかの実験に渡る複数の試料の比較をも可能にする。
本実験では、ここに記載のＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列から誘導された核酸プローブをマイクロアレイの作製に用い、上記に列挙した腫瘍組織のＲＮＡをさらにハイブリダイゼーションに用いた。標準化比：実験比に基づく値は、「カットオフ」と命名された。このカットオフを上回る値のみを重要であると判定した。下記の表８は、これらの実験の結果を示しており、本発明の種々のＰＲＯポリペプチドが非癌牲ヒト組織コントロールと比べて種々のヒト腫瘍組織において著しく過剰発現していることを示している。上記にて記載のように、これらのデーターは、本発明のＰＲＯポリペプチドが一つ以上の癌牲腫瘍の存在を示す診断マーカーとしてだけではなく、これら腫瘍の治療のための治療上の標的としての機能も果たすことを示している。
【０１８９】
（表７）
表７
分子 過剰発現される対象 比較されるもの
ＰＲＯ８４２      大腸腫瘍              一般的な正常なコントロール
ＰＲＯ８４２      肺腫瘍                一般的な正常なコントロール
ＰＲＯ８４２      乳房腫瘍              一般的な正常なコントロール
【０１９０】
実施例１１
インサイツハイブリダイゼーション
インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び局在化、特定ｍＲＮＡ合成及び染色体マッピングにおける追跡に有用である。
インサイツハイブリダイゼーションは、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコールの最適な変形に従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ-標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリダイゼーションする。［３３Ｐ］ＵＴＰ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリダイゼーションする。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
【０１９１】
３３Ｐ-リボプローブ合成
６．０μｌ（125mCi）の３３Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmol）をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ-ＵＴＰを含む管に以下の成分を添加した：
２．０μｌの５ｘ転写バッファー
１．０μｌのＤＴＴ（100mM）
２．０μｌのＮＴＰ混合物（2.5mM: 10μ; 10mMのGTP, CTP & ATP+10μlのH2O）
１．０μｌのＵＴＰ（50μM）
１．０μｌのＲＮＡｓｉｎ
１．０μｌのＤＮＡテンプレート（1μg）
1．０μｌのＨ２Ｏ
１．０μｌのＲＮＡポメラーゼ（ＰＣＲ産物についてT3＝AS, T7=S,通常）
【０１９２】
チューブを３７℃で１時間インキュベートし、１．０μｌのＲＱ１ＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス ｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を添加し、混合物をＤＥ８１紙にピペットした。残りの溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ-５０限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いてスピンさせた（６分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（３分間）。最終回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終生成物をＤＥ８１紙にピペットし６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒ IIで数えた。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。１-３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ ＭｒｋIIIを３μｌの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で９５℃に３分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、１８０-２５０ボルトで４５分間走らせた。ゲルをプラスチックラップ（SARAN（商品名）ブランド）でラップし、−７０℃のフリーザー内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から終夜露出した。
【０１９３】
３３Ｐ-ハイブリダイゼーション
Ａ．凍結切片の前処理
スライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（２５ｍｌ ２０ｘＳＳＣ ＋  ９７５ｍｌ  ＳＱ  Ｈ２Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（２５０ｍｌの予備加熱ＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の１０ｍｇ／ｍｌストック１２．５μｌ）、切片を０．５ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中、各２分間脱水した。
Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理
スライドを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ２Ｏ中に配置し、２ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅバッファー中１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く０．５ｘＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
【０１９４】
Ｃ．プレハイブリッド化
スライドをＢｏｘバッファー（4ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を５０μｌのハイブリダイゼーションバッファー（３．７５ｇデキストラン硫酸＋６ｍｌＳＱ Ｈ２Ｏ）で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して２分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、１８．７５ｍｌのホルムアミド、３．７５ｍｌの２０ｘＳＳＣ及び９ｍｌのＳＱ Ｈ２Ｏを添加し、組織を良くボルテックスし、４２℃で１-４時間インキュベートした。
Ｄ．ハイブリダイゼーション
スライド当たり１．０ｘ１０６ｃｐｍのプローブ及び１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり４８μｌのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスの後、５０μｌの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド５０μｌに添加した。スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
【０１９５】
Ｅ．洗浄
洗浄は、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで２ｘ１０分間、室温で実施し（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（２５０ｍｌ ＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２ｘ１０分間、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
Ｆ．オリゴヌクレオチド
ここに開示したＤＮＡ５９２９４−１３８１配列に関してインサイツハイブリダイゼーションを実施した。これらの分析に用いたオリゴヌクレオチドを、添付図面に示した核酸（又はその相補鎖）と相補的になるように得た。
【０１９６】
Ｇ．結果
インサイツ分析がここで開示されたＤＮＡ５９２９４−１３８１に対して実施された。これらの分析の結果は次の通りである。
組織スクリーン中のＤＮＡ５６８５５の発現：炎症性成体肺及び卵巣
切片は、正常、及び喘息、間質性肺炎ブロックを含む炎症性成体肺中の気管支性上皮に関連した強いシグナルを示す。肺腫瘍の複数ブロックは、腫瘍を含む腺状構造を裏打ちする上皮細胞上に強いシグナルを示す。胎児肺はネガティブな結果を示した。卵巣の切片中において、卵巣ストローマに隣接する卵管上皮はポジティブである。
【０１９７】
実施例１２
ＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）のスレッディング解析はインターロイキン−８との相同性を示唆する。
スレッディング法は、新規配列の構造予測において高い感度を示してきた。これらの技術は、タンパク質配列が配列比較に頼らずに、既知の構造と類似するかどうか検出することが可能であり、そのため、たとえそれらの間における配列類似性が低い場合でもタンパク質間の関係を同定することができる。本研究はスレッディング技術は、特にＤＮＡ５６８５５−１４４７にコードされる新規ケモカインＰＲＯ８４２（ＣＫ２７と称する）に対して、標準的な配列類似法よりも低い配列類似性を検出することができることを示した。
フォールディング認識プログラムProCeryonはこの解析に対して使用された（ProCeryon Biosciences Inc）。使用されたフォールディングライブラリーは、タンパク質データバンクから９５％の配列同一性でフィルターをかけて得られた４，７４９の既知の３Ｄ構造から構成された。フォールディングの残基間のエネルギー力間、及びフォールディングの残基と、それを取巻く溶媒との間のエネルギー力を表す２つの平均力ポテンシャルは、配列−構造適合を計算するために使用された（Domingues, 等, Proteins, 37:112-120 (1990)；Sippl, M.J., J. Comput Aided Mol. Des, 7:472-501(1993)；及びSippl, M.J., Curr Opin Struct Biol, 5:229-235 (1995)）。ギャップ制限は、クエリー配列中の欠失及び挿入の数、サイズ及び置換と、フォールディングライブラリーのエントリーをコントロールするために使用された：折り畳みと配列欠失のペナルティー、３００；折り畳みと配列ペナルティー、１５；及び折り畳みと配列の最大ギャップ長、３０。フォールディングの情報はギャップの拘束として使用された：ギャップは二次構造エレメント及びフォールディングのコアの部分に置くことは許容されなかった。配列中の隣接残基間のギャップは、構造中のそれらの距離が７Å未満である場合にのみ受容される。配列−構造アライメントにおける断片化を抑制するために、２つの隣接するギャップ間における３残基の最小断片サイズが使用された。BLOSUMO40アミノ酸置換マトリクスは配列比較及びスコアー化のために使用された（Henrikoff, S.及びHinrikoff, J.G., Proc. Natl. Acad.Sci USA, 89:10915-10919 (1995)）。
【０１９８】
４つ異なるスコアー化の方針が、最終的なスコアー化及びランキングに対して使用された：ｉ）残基−残基間及び残基−溶媒間相互作用（pari/surf）由来の組合わされたエネルギー；ｉｉ）配列類似性スコアー（seq）；ｉｉｉ）両方の標準化組合わせ、pair/surf ands seq(スレッディングインデックス；Th Idx)；及びｉｖ）フォールディングの長さ（foldlength）と配列−構造アライメントに関与した整列された残基数（pathlenght）との間の割合。
高いスコアーのヒットとそれら各々配列−配列アライメントに対して作製された３Ｄモデルは、ProCeryon(ProCeryon Biosciences, Inc)のPeepモデルを使用することによりグラフィカルに解析された。構造分類模式図SCOP（Murzin等, J. Mol. Biol., 247:536-540 (1995)）及びCATH（Orengo等, Structure, 5:1093-1108 (1997)）は、フォールディングの全てのメンバーを見出し、ProFit出力におけるこれらのスコアー化を見るために使用された。フォールディングの類似な構造はフォールディングのアノテーションを確認し、構造に基づくタンパク質機能仮説を生み出すために、トップランキングヒットにおいてチェックされた。
上述されたスレッディング解析を使用して、ＤＮＡ５６８５５−１４４７によってコードされるＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）は、ケモカインであるインターロイキン−８との構造的相同性を示唆した。２つのタンパク質間のアミノ酸配列同一性は低いが、それらは両方ともＣＸＣモチーフを持ち、ＩＬ−８をＣＸＣケモカインファミリーのメンバーとして分類する。
【０１９９】
実施例１３
新規サイトカインＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）は炎症性応答において役割を担う
Ａ．ＤＮＡ５６８５５（ＣＫ２７）の発現パターン
ＣＫ２７の発現パターンはヒトとマウスの両方の複数組織において検討された。図３及び４はヒトの複数組織発現アレイに対するハイブリダイゼーションによって示されたＣＫ２７の発現パターンを示す。ＣＫ２７は肺、胃、及び気管において高度に発現された。卵巣、前立腺、大腸及び胎児肺においては、ＣＫ２７の弱い発現が検出された。インサイツ分析において、正常肺においてＣＫ２７の高い発現が確認され、また、炎症を起こした肺及び喘息の患者由来の組織サンプルにおいても発現が示された。マウスＤＮＡ５６８５５（ＣＫ２７）の発現パターンは図５に示される。マウスにおいて、発現の有意なレベルが肺、甲状腺、顎下腺及び子宮において観察された。
Ｂ．ＰＲＯ８４２化学誘因単球及び樹状細胞
（１）方法
ＰＲＯ８４２（ＣＫ２７とここでは称する）のスレッディング解析によって、ＩＬ−８に類似するこの新規ケモカインの機能的役割が示唆された。インターロイキン−８は、長きにわたって炎症誘発性サイトカイン及び好中球の化学誘因物質として特徴づけられてきた。それ故、トランスウェル（transwell）移動アッセイがＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）の潜在的ケモカインとして役割を示すために実施された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Hypaque-Ficoll密度遠心によってヒト末梢血から単離された。ＰＭＢＣのＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）へ向かう移動は、５μｍ孔のフィルターを含む２４−ウェルのトランスウェル移動プレート中で試験された。１ウェルあたり１０６ＰＢＭＣが使用された。２．５時間、３７℃、５％ＣＯ２におけるのインキュベーション後、移動した細胞及び細胞集団の数がフローサイトメトリーによって解析された。
ＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）のスレッディング解析はＣＸＣモチーフを有することを示したが、このことはＣＫ２７がＣＸＣサイトカイン（実施例１３を参照のこと）ファミリーに属することを示唆するものである。また、構造的な相同性も、樹状細胞も誘因する新規ケモカイン（ＭＩＰ２−γと名付けられた）として公表されていたＤＮＡ３９５２３に対して見出された（Cao等, Journal of Immunology, 165:2588-2595 (2000)）。  ここで同定されたケモカインＰＲＯ８４２に加え、ＭＩＰ２−γ及びＳＤＦ−αとして知られる他の関連ケモカインは樹状細胞を誘因する唯一のＣＸＣケモカインである。
【０２００】
（２）結果
上述のごとく、ＣＫ２７のスレッディング解析は、ＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）の化学誘因物質としての特徴の調査を促した。トランスウェル移動アッセイの結果は図６から８に示される。これらの研究はＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）が単球及び樹状細胞を特異的に化学誘因することを示す（図６を参照のこと）。ＣＫ２７の異なるロットは類似の化学誘因物質活性を示す（図７）。熱処理は、ＣＤ１１ｃ＋（樹状細胞）及びＣＤ１４＋（単球）の化学誘因性を減少させる（図８）。これらのデータは、ＣＫ２７が特異的に単球及び樹状細胞を誘因することを示す。しかし、Ｔ細胞、Ｂ細胞又は好中球の類似の誘因は観察されなかった。単球及び樹状細胞は、抗原を貪食し、それらの細胞表面に抗原を提示し、直接的な細胞−細胞相互作用及びサイトカインの分泌によりＴ細胞を活性化する能力を有する。本研究は、ここで同定された新規ケモカインＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）が白血球輸送において重要な役割を担い、また、炎症性の応答の制御においても機能することを示す。さらに、ＣＫ２７は、進行、造血、アレルギー、血管形成及び腫瘍形成を含む、種々の止血性及び疾患性プロセスにおいてインターロイキン−８と類似の役割を果たす。後で述べるように、ヒトＤＮＡ５６８５５トランスジェニックマウスに関与する研究は、ＣＫ２７が子宮の嚢胞性病理の進行において重要な役割を果たすことを示唆する。
【０２０１】
Ｃ．ヒトＤＮＡ５６８５５（ＣＫ２７）トランスジェニックマウスモデル進行性嚢胞性子宮
ヒト５６８５５ｃＤＮＡは、ミオシン軽鎖が先行するｐＲＫのスプライスドナー／アクセプター部位に対する３’に、Shani,M., Nature, 314:283-286 (1985)によって記述された手法を用いてライゲーションされた。また、５６８５５ｃＤＮＡはヒト成長ホルモンの４番目と５番目のエキソン間に存在するドナー／アクセプター部位にも先行した（Strewart, T.A.等, Endocrinology, 130:405-14 (1992)）。全体の発現断片は、夾雑するベクター配列から遊離して精製され、ＦＶＢｘＦＶＢ交雑由来の一細胞マウス卵にインジェクトされた。ＣＫ２７トランスジェニックマウスは尻尾のバイオプシーから抽出されたＤＮＡのＰＣＲ解析によって同定された。発現は実時間ＲＴ−ＰＣＲ（Taqman(登録商標);Perkin Elmer）により、骨格筋バイオプシーからの全ＲＮＡにおいて測定された。
ＭＬＣＨプロモーターのコントロール化において、導入遺伝子としてヒトＤＮＡ５６８５５（ＣＫ２７）を発現するマウスは、１２週齢まで、嚢胞性の子宮を進行させた（図９を参照のこと）。インサイツ解析により、比較的特異的な発現が肺の気管支性上皮に示されたが（実施例１２を参照のこと）、ＣＫ２７トランスジェニックマウスは組織学的に正常肺を有していた。さらに、卵巣（ヒト組織）に隣接する尿細管上皮中の発現は、インサイツにおいて観察され、ＣＫ２７トランスジェニックマウス中に見られる変化と関連しているかもしれない。
【０２０２】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 10801  ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア20110-2209米国(ATCC)へ寄託した：
材料                  ATCC登録番号         寄託日
DNA56855-1447        203004                  1998年6月23日
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死滅もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】図１は、天然配列ＰＲＯ８４２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示し、配列番号：１はここにおいて「ＤＮＡ５６８５５−１４４７」と命名されたクローンである。
【図２】図２は、図１に示された配列番号：１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【図３】図３は、ヒト複数組織発現アレイに対するハイブリダイゼーションによって示されるＤＮＡ５６８５５（ＣＫ２７）の発現パターンを示す。有意の発現が、肺（Ａ８）、胃（Ｂ５）、及び気管（Ｈ７）中で観察された。卵巣、前立腺、大腸及び胎児肺において、ＣＫ２７の弱い発現が検出された。
【図４】図４は、ヒト複数組織ノザンブロットに対する１５０ｂｐプローブのハイブリダイゼーションによって示されるＤＮＡ５６８５５（ＣＫ２７）の発現パターンを示す。有意な発現が、胃、甲状腺、リンパ節及び気管において観察された。
【図５】図５は、マウスＲＮＡブロットにおけるマウスＣＫ２７の組織発現パターンを示す。有意な発現が、肺（Ａ４）、甲状腺（Ｃ２）、顎下腺（Ｃ４）及び子宮（Ｄ５）中で観察された。
【図６】図６は、ＣＤ３＋細胞又はＣＤ１６＋細胞と比較して、ＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）が特異的に樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋細胞）を誘因することを示す。
【図７】図７は、ＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）の異なるロットが類似の化学誘因物質活性を示すことを示す。
【図８】図８は、ＰＲＯ８４２（ＣＫ２７）の熱処理が樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋細胞）及び単球細胞（ＣＤ１４＋細胞）のＰＲＯ８４２に対する化学誘因性を減少させることを示す。
【図９】図９は、ヒトＤＮＡ５６８５５（ＣＫ２７）トランスジェニックマウスにおける卵巣嚢胞の形成を示す。左上図はコントロール（非トランスジェニックマウスの正常卵巣）に相当する；左下図はＣＫ２７トランスジェニックマウスにおける嚢胞性変性及びヘモシデリンを示す；右上図はＣＫ２７トランスジェニックマウス中において隣接する脂肪組織へ伸長するヘモシデリンの変化を呈する卵巣を示す；及び右下の高倍率の図は、色素を含んだマクロファージの存在を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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