(57)【要約】【課題】比較精度を向上し得る遺伝子発現量正規化方法、遺伝子発現量正規化プログラム及び遺伝子発現量正規化装置を提案する。【解決手段】比較対象とすべき２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を、該２以上のデータのいずれかのデータを基準として比率に変換し、当該比率の個数分布のピークが基準とすべき比率に平行移動するように、２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を補正する。【選択図】図１１
2010046011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
比較対象とすべき２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を、該２以上のデータいずれかのデータを基準として比率に変換する変換ステップと、
上記比率の個数分布のピークが基準とすべき比率に平行移動するように、上記２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を補正する補正ステップと
を有する遺伝子発現量正規化方法。
【請求項２】
上記補正ステップは、
上記比率の個数分布と、上記正規分布とが近似しているとの評価が得られた場合、上記２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を補正する
請求項１に記載の遺伝子発現量正規化方法。
【請求項３】
上記補正ステップは、
上記比率の個数分布と、上記正規分布との確率プロットに対して、当該比率の個数分布と、正規分布とが近似していることを示す入力が行われた場合、上記２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を補正する
請求項２に記載の遺伝子発現量正規化方法。
【請求項４】
上記補正ステップは、
上記比率の個数分布のピークと、上記正規分布のピークとの比率方向へのずれ量が、該ずれ量に対して与えられる閾値以上となる場合、上記２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を補正する
請求項２に記載の遺伝子発現量正規化方法。
【請求項５】
補正された発現量のうち、「０」以下の値を呈する発現量を破棄する破棄ステップ
をさらに有する請求項３又は請求項４に記載の遺伝子発現量正規化方法。
【請求項６】
比較対象とすべき２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量のうち、該発現量に対して与えられる閾値未満となる発現量を除去する除去ステップ
をさらに有し、
上記変換ステップでは、
上記２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量のうち上記閾値以上の発現量を、上記２以上のデータのいずれかのデータを基準として比率に変換する
請求項５に記載の遺伝子発現量正規化方法。
【請求項７】
上記複数遺伝子は、標的細胞で発現され得る全遺伝子である
請求項６に記載の遺伝子発現量正規化方法。
【請求項８】
コンピュータに対して、
比較対象とすべき２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を、該２以上のデータのいずれかのデータを基準として比率に変換すること、
上記比率の個数分布のピークが基準とすべき比率に平行移動するように、上記２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を補正すること
を実行させる遺伝子発現量正規化プログラム。
【請求項９】
比較対象とすべき２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を、該２以上のデータのいずれかのデータを基準として比率に変換する変換手段と、
上記比率の個数分布のピークが基準とすべき比率に平行移動するように、上記２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を補正する補正手段と
を有する遺伝子発現量正規化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオアッセイ用の基盤などを用いて得られた遺伝子発現量に係る技術分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】
サンプル細胞から抽出されたｍＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡと、核酸プローブとの相補鎖の形成量の強度を指標として、該サンプル細胞に発現している遺伝子発現量を測定する技術がある。
【０００３】
遺伝子発現の解析では、同一の組織におけるサンプル細胞について単位時間ごとの遺伝子発現量の相違の調査や、異なる組織におけるサンプル細胞について遺伝子発現量の相違の調査などといったように、対象とすべき遺伝子発現量を比較することが重要な事項の１つとなる。
【０００４】
しかしながら、遺伝子発現量の測定実験では、抽出対象のサンプル細胞に対する外部ストレスや、該サンプル細胞からｍＲＮＡを抽出するときの条件又は技量等の外的要因による相違が生じるものであり、該相違に起因したばらつきが測定結果に反映されてしまうことから、基準となる測定値を用いてデータを正規化するといったことが行われる。
【０００５】
この正規化手法として、例えば、比較対象とすべき一方の発現量の対数を横軸にとるとともに、他方の発現量の対数を縦軸にとった対数座標を作成し、傾き１の直線により近似して得られる近似直線の縦軸における切片の値から係数を求め、該係数で横軸にとった発現量を割るといったものが提案されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００４−１１７３２６公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところがこの正規化手法では、外的要因が含まれた状態のまま比較対象とすべき発現量を補正するため、該補正後の発現量が真に比較可能であるものに値するのかについては疑問があり、信頼性に乏しい。
【０００７】
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、比較精度を向上し得る遺伝子発現量正規化方法、遺伝子発現量正規化プログラム及び遺伝子発現量正規化装置を提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため本発明は、遺伝子発現量正規化方法であって、比較対象とすべき２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を、該２以上のデータのいずれかのデータを基準として比率に変換する変換ステップと、比率の個数分布のピークが基準とすべき比率に平行移動するように、２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を補正する補正ステップとを経る。
【０００９】
また本発明は、遺伝子発現量正規化プログラムであって、コンピュータに対して、比較対象とすべき２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を、該２以上のデータのいずれかのデータを基準として比率に変換すること、比率の個数分布のピークが基準とすべき比率に平行移動するように、２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を補正することを実行させる。
【００１０】
また本発明は、遺伝子発現量正規化装置であって、比較対象とすべき２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を、該２以上のデータのいずれかのデータを基準として比率に変換する変換手段と、比率の個数分布のピークが基準とすべき比率に平行移動するように、２以上のデータそれぞれに示される複数遺伝子の発現量を補正手段とをもつ。
【発明の効果】
【００１１】
基準との比率に変換された遺伝子発現量（発現比率）の個数分布はおおよそ正規分布を呈するということが、本発明者が作製した発現量数理モデル（（６）式）からも、実験結果（図６及び図９）からも得られた。したがって、比率個数分布のピークが基準に近いほど、抽出対象のサンプル細胞に対する外部ストレスや、該サンプル細胞からｍＲＮＡを抽出するときの条件又は技量等の外的要因に起因するノイズ成分の含有量が小さいという理論の信頼性は高いといえる。
【００１２】
このことからも明らかなように、本発明は、比較対象とすべき発現量を、その比率の個数分布のピークが基準とすべき比率に平行移動するように補正することで、外的要因に起因するデータばらつきを大幅に低減し、標的細胞における遺伝子の挙動を反映した真の値に近似したものとして得ることができ、この結果、比較精度を向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下図面について本発明の一実施の形態を詳述する。
【００１４】
（１）遺伝子解析システムの全体構成
図１において、本実施の形態による遺伝子解析システム１の全体構成を示す。この遺伝子解析システム１では、蛍光強度読取装置３と、正規化検定装置４とが含まれた構成とされる。
【００１５】
蛍光強度読取装置３は、測定ステージを有し、該測定ステージには核酸チップＣＰがセットされる。核酸チップＣＰは、標的細胞における遺伝子に対応する核酸プローブが配される基盤である。
【００１６】
この核酸チップＣＰでは、例えば図２に示すように、核酸プローブ（長波線で示す部分）に対して、標的細胞から抽出され、標識物質（黒丸で示す部分）を付加された標的核酸（短波線で示す部分）が与えられ、相補鎖の形成反応（以下、これをハイブリダイゼーションとも呼ぶ）が行われる。
【００１７】
核酸プローブは、一般には、特定の遺伝子における全塩基配列に対となるヌクレオチドではなく、当該遺伝子において特異的とされる複数の塩基配列部分にそれぞれ対となるヌクレオチド断片（以下、これをプローブセットとも呼ぶ）としてデザインされる。また、各プローブセットに対するコントロールもデザインされる。プローブセットとコントロールとは、対ごとに、核酸チップＣＰに割り当てられた所定の領域に配列される。ちなみに、プローブ断片は、具体的には、１８〜６０[mer]程度のＤＮＡ(deoxyribonucleic  acid) 断片、ｃＤＮＡ(complementary  DNA) 断片又はＰＮＡ(peptide  nucleic  acid)などが適用される。
【００１８】
一方、標的核酸は、核酸プローブとのハイブリダイゼーション対象とされる１本鎖のヌクレオチドである。一般に、標的核酸は、ｍＲＮＡ（pre-ｍＲＮＡを含む）又はその断片そのものが用いられるのではなく、該ｍＲＮＡ又はその断片を逆転写酵素により変換したものが用いられる。
【００１９】
他方、標識物質は、一般に、ビオチンまたはＦＩＴＣ(fluorescein  isothiocyanate)等の蛍光色素とされるが、これに限定されるものではなく、例えば放射性同位元素等としてもよい。
【００２０】
蛍光強度読取装置３（図１）は、読取指令が与えられた場合、測定ステージにセットされる核酸チップＣＰに対して、標的核酸に付加される標識物質の励起光を照射する。核酸チップＣＰに配される各遺伝子に対応する核酸プローブが標的核酸と相補鎖を形成している場合、該標的核酸に付加された標識物質が励起光により蛍光する。この蛍光量は、標的核酸と核酸プローブとの相補鎖の形成量と相関があり、該核酸プローブと相補鎖が形成される標的核酸の量が多いほど強くなる。
【００２１】
また蛍光強度読取装置３は、励起光を照射した後に核酸プローブ及びコントロールでの蛍光量を読み取り、該蛍光量を示すデータ（以下、これを蛍光強度データと呼ぶ）を出力するようになされている。
【００２２】
正規化検定装置４は、例えば図３に示すように、継代した標的細胞から所定期間ごとに抽出される標的核酸と、核酸チップＣＰに配される核酸プローブとのハイブリダイゼーション結果（蛍光強度データ）から、測定時間ｔｍ（ｍは自然数）ごとに標的細胞での遺伝子Ｇｎ（ｎは自然数）の発現量ＧＥｎを取得する。
【００２３】
また正規化検定装置４は、取得した発現量ＧＥｎのうち、比較対象とすべき発現量が比較対象に値するものであるか否かを評価し、該値する発現量である場合には、その発現量を適宜正規化するようになされている。
【００２４】
（２）正規化検定装置の回路構成
次に、正規化検定装置４の構成について説明する。この正規化検定装置４は、図４に示すように、該正規化検定装置４全体の制御を司るＣＰＵ(Central  Processing  Unit)１０に対して各種ハードウェアを接続することにより構成される。
【００２５】
具体的には、例えば、ＲＯＭ(Read  Only  Memory)１１、ＣＰＵ１０のワークメモリとなるＲＡＭ(Random  Access  Memory)１２、操作部１３、記憶部１４、インターフェース１５及び表示部１６がバス１７を介して接続される。
【００２６】
ＲＯＭ１１には、遺伝子発現量の正規化に関する検定プログラム（以下、これを正規化検定プログラムとも呼ぶ）が格納され、またインターフェイス１５は、蛍光強度読取装置３に対して有線又は無線を通じてデータ授受し得るようになされている。
【００２７】
ＣＰＵ１０は、ＲＯＭ１１に格納された正規化検定プログラムをＲＡＭ１２に展開した場合、該正規化検定プログラムに基づいて記憶部１４、インターフェース１５及び表示部１６を適宜制御し、正規化検定処理を実行するようになされている。
【００２８】
（３）正規化検定プログラムに基づくＣＰＵの処理内容
正規化検定プログラムをＲＡＭに展開したＣＰＵ１０は、機能的には、図４に示したように、蛍光強度取得部２１、発現量演算部２２、比率変換部２３、評価部２４及び正規化部２５の各部に分けることができる。
【００２９】
蛍光強度取得部２１は、操作部１３から、核酸チップＣＰに対する蛍光強度の読取要求を待ち受け、該読取要求を受けた場合、インターフェース１５を用いて、該インターフェース１５に接続される蛍光強度読取装置３に対して読取要求する。
【００３０】
また蛍光強度取得部２１は、読取要求の応答として、蛍光強度読取装置３から蛍光強度データを取得した場合、例えば取得日付及び取得番号を、当該核酸チップＣＰに関する識別子のデータ（以下、これをチップ識別データと呼ぶ）として生成するようになされている。
【００３１】
発現量演算部２２は、蛍光強度取得部２１が蛍光強度データを取得した場合、該蛍光強度データに基づいて、プローブセットごとに遺伝子発現量を算出し、該算出した各プローブセットでの遺伝子発現量を示すデータ（以下、これを発現量データと呼ぶ）をチップ識別データと関連付けて、記憶部１４に保存するようになされている。
【００３２】
遺伝子発現量は、標的細胞内において発現している遺伝子を示す推定量であり、例えば、標的核酸と核酸プローブとの相補鎖の形成量に相関する発光量から、該発光量の割合として算出される。
【００３３】
この実施の形態の場合、遺伝子発現量は、Affymetrix社のＭＡＳ(Micro  Array  Suite)と呼ばれるデータ解析ソフトウェアのバージョン５を用いて算出される。
【００３４】
ここで、このＭＡＳ５を、１つのプローブセットに着目して簡単に説明する。ＭＡＳ５では、（１）プローブセットにおける各プローブ断片での発光量から、局所的な物理的影響（バックグランド）が排除される。（２）各プローブ断片（パーフェクトマッチプローブと呼ばれる）の発光量が、当該プローブ断片と対応する断片コントロール（ミスマッチプローブと呼ばれる）との差に応じて適宜補正される。（３）各プローブ断片（パーフェクトマッチプローブと呼ばれる）の発光量が対数変換等により遺伝子発現量として算出される。
【００３５】
このＭＡＳ５では、基準とすべきプローブセットと同じ平均蛍光強度をもつように他のプローブセットをスケーリングする正規化が行われるが、該正規化については、この実施の形態では正規化部２５で新規の正規化が行われるため除かれる。
【００３６】
なお、ＭＡＳ５における処理内容の詳細については、Ｉ．Ｓ．Ｋｏｈａｎｅ／Ａ．Ｔ．Ｋｈｏ／Ａ．Ｊ．Ｂｕｔｔｅ  星田有人著、統合ゲノミクスのためのマイクロアレイデータアナリシス、シュプリンガー・ジャパン出版、ｐ．５８−７４を参照されたい。
【００３７】
比率変換部２３は、比較対象とすべき遺伝子発現量の比較要求を待ち受け、該比較要求を受けた場合、その比較要求の対象とされる例えば各測定時間ｔｍの遺伝子発現量ＧＥｎを、記憶部１４におけるチップ識別データ及び発現量データに基づいて認識する。
【００３８】
そして比率変換部２３は、遺伝子発現量ＧＥｎのうち、遺伝子解析に不要とされる閾値未満の低発現量をカットした後、例えば図５に示すように、各測定時間ｔｍのうち基準とすべき例えば測定時間ｔ１を決定し（図５（Ａ））、各測定時間ｔｍの遺伝子発現量ＧＥｎを、基準として決定した測定時間ｔ１の遺伝子発現量との比率に変換する（図５（Ｂ））。
【００３９】
この結果、初期の遺伝子発現量を基準としたときの、当該遺伝子Ｇｎでの変化の割合が得られることとなる。ちなみに、図５における各遺伝子発現量ＧＥｎの値は便宜的に示したものであり、実際の数値ではない。
【００４０】
ところで、本発明者はランジュバン方程式に近似した数理モデル（以下、これを発現量数理モデルと呼ぶ）を作製した。
【００４１】
ランジュバン方程式は統計力学において、ブラウン運動を記述する確率微分方程式である。具体的には、ブラウン粒子の加速度が、粒子の速度に比例する粘性力（ストークスの法則）と、ある確率過程でのランダム力との和として表現される。
【００４２】
従来、遺伝子の発現量はｍＲＮＡの濃度もしくは個数を反映した量を測定することによって決められる。ｍＲＮＡの濃度に関する数理モデルの代表的なものとして、以下の３つのケースに示される決定論的微分方程式がある。
【００４３】
【表１】
2010046011.tif 000003
【００４４】
【表２】
2010046011.tif 000004
【００４５】
【表３】
2010046011.tif 000005
【００４６】
これらのモデルにおける決定論的微分方程式を簡略化すると、次式
【００４７】
【数１】
2010046011.tif 000006
【００４８】
として表現することができる。この（１）式における「ｍ(t)」はある時間での発現量を意味し、「γ」は上記ケースでは「ｋ」「δＭ」として表されるもので、ｍＲＮＡの分解係数（ｍＲＮＡが分解される割合）を意味し、「ＴＦ」は遺伝子が発現活性や発現抑制を受ける量を意味する。
【００４９】
この（１）式は特定の一の遺伝子に着目したものである。したがって遺伝子ごとに「γ」及び「ＴＦ」の値は異なる。
【００５０】
本発明者は、定常の状態とすべき発現量からランダムな発現活性抑制制御を受けるものと考え、次式
【００５１】
【数２】
2010046011.tif 000007
【００５２】
のように、（１）式の「ＴＦ」項を代えた。この（２）式における「ｍ0」は定常の状態とすべき発現量を意味し、「Γ(t)」は、遺伝子が活性又は抑制をランダムに受ける量(以下、これをランダム活性抑制量と呼ぶ)を意味する。このΓ(t)はランジュバン方程式におけるランダム力（ランダムな揺らぎ）に相当する部分であり、次式
【００５３】
【数３】
2010046011.tif 000008
【００５４】
の条件を満たすものとしている。この（３）式における「ｑ」はランダム活性抑制量の相関の特徴を示す係数を意味し、「δ(t−t´)」はディラックのデルタ関数である。
【００５５】
ここで、「ｑ」は遺伝子ごとに異なる値となるので、ｉ番目の遺伝子の場合、次式
【００５６】
【数４】
2010046011.tif 000009
【００５７】
となる。この（４）式では、ｉ番目の遺伝子に対するランダム活性抑制量の特徴「ｑ」が「ｑｉ」となるが、全ての遺伝子におけるランダム活性抑制量が一様に働くと仮定して（４）式を変形すると、次式
【００５８】
【数５】
2010046011.tif 000010
【００５９】
となる。また、全ての遺伝子は同一のｍＲＮＡを合成すると仮定すると、次式
【００６０】
【数６】
2010046011.tif 000011
【００６１】
となる。この（６）式のとおり、全ての遺伝子が同一のランダム活性抑制量をもつ同一の種であるものとして本発明者がたてた発現量数理モデルは、定常時に対するある時間での発現量の変化度が、分解係数に比例する発現量と、該時間でのランダム活性抑制量との和として表現される。
【００６２】
また、定常時に対するある時間での発現量の変化量「ｍ／ｍ０」の分布「Ｗ」は、（６）式から、次式
【００６３】
【数７】
2010046011.tif 000012
【００６４】
に展開することができる。ちなみに、（６）式から（７）式の導出の詳細については、例えば、Ｈ．Ｒｉｓｋｅｎ著、Ｔｈｅ  Ｆｏｋｋｅｒ−Ｐｌａｎｃｋ  Ｅｑｕａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版、ｐ．３２−６２を参照されたい。
【００６５】
この（７）式のとおり、全ての遺伝子が同一のランダム活性抑制量をもつ同一の種であるものとして、ランジュバン方程式に近似させると、相対遺伝子量の分布は中心を「１」とする正規分布をとることになる。
【００６６】
厳密にいうと、ｍ0は本来ｍ(t)の平均値を表すものとして定義される。時間t´の任意の初期値もしくは定常状態ｍ(t´)に対してｍ(t)／ｍ(t´)−１を考えるとき、Γ(t)はの前のｍ0はランダムな揺動力を示すものなので近似的にｍ(t´)においてもよいとした上で、さらに時間tが時間t´よりも十分に大きいとすると、ｍ(t)／ｍ(t´)の分布は中心が１、分散がｑ／γの正規分布に近似されることを示すことができる。すなわち、次式
【００６７】
【数８】
2010046011.tif 000013
【００６８】
となる。
【００６９】
以上のことからも分かるように、比率変換部２３によって基準との比率に変換された遺伝子発現量の個数分布（以下、これを比率個数分布とも呼ぶ）は中心が「１」に近いほど、抽出対象のサンプル細胞に対する外部ストレスや、該サンプル細胞からｍＲＮＡを抽出するときの条件又は技量等の外的要因に起因するノイズ成分（以下、これを外的ノイズ成分とも呼ぶ）の含有量が小さいということを意味することになる。
【００７０】
ここで、実験結果を図６に示す。これら図はＥ−ＧＥＯＤ−５２６４をサンプルとし、測定時間ｔｍ（図中、ＥＸＰ０〜ＥＸＰ７）ごとにヒト気管支上皮細胞から、ＲＭＡ(Robust  Multi  chip  Analysis)により得た遺伝子発現量ＧＥｎにおける比率個数分布（図６（Ａ））と、ＭＡＳ（バージョン５）により得た遺伝子発現量ＧＥｎにおける比率個数分布（図６（Ｂ））とを示すものである。
【００７１】
測定時間ｔｍは０，１，４，８，１０，１４，２１，２８〔ｄａｙｓ〕であり、図６ではＥＸＰ０，ＥＸＰ１，……，ＥＸＰ６，ＥＸＰ７に相当する。また比率の割当幅（レンジ）は０．１である。つまり、図６における１，２，……，１０，１１，……，２７，２８は、それぞれ、０．１以上０．２未満，０．２以上０．３未満，……，１以上１．１未満，１．１以上１．２未満，……，２．７以上２．８未満，２．８以上２．９未満である。
【００７２】
この実験結果からも明らかなように、初期の測定時間ＥＸＰ０との比率に変換された測定時間ＥＸＰ１〜ＥＸＰ７（ＥＸＰ１／ＥＸＰ０，ＥＸＰ２／ＥＸＰ０，……，ＥＸＰ６／ＥＸＰ０，ＥＸＰ７／ＥＸＰ０）における比率個数分布は、ＲＭＡ及びＭＡＳのいずれも、おおよそ正規分布を呈した。また、これら個数分布のピークはＲＭＡではおおよそ１以上１．１未満の範囲内もしくはその範囲の近傍となり、ＭＡＳでは全て１以上１．１未満の範囲内となった。
【００７３】
なお、ＥＸＰ１／ＥＸＰ０の比率個数分布と、中心を「１」とする正規分布との確率プロット（Ｑ−Ｑプロット）を図７に示す。この確率プロットでは、直線に近似するほど、比率個数分布が正規分布と強い相関があることを意味する。この図７における全体の上位１０パーセントを、相関性の弱い部分として除いた場合、残りの９０パーセント部分（図中における一点鎖線の部分）の確率プロットは、図８となる。
【００７４】
ＥＸＰ２／ＥＸＰ１，ＥＸＰ３／ＥＸＰ２，……，ＥＸＰ６／ＥＸＰ５，ＥＸＰ７／ＥＸＰ６についても同様にして、全体の上位１０パーセントを除くと、図６に対応する比率個数分布は図９に示すように、中心を「１」とする正規分布に一段と近似したものとなった。
【００７５】
以上のように、基準との比率に変換された遺伝子発現量（発現比率）の個数分布はおおよそ正規分布を呈するということが、発現量数理モデル（（６）式）からも、実験結果（図６及び図９）からも得られた。したがって、比率個数分布のピークが「１」に近いほど外的ノイズ成分の含有量が小さいという理論の信頼性は高いといえる。
【００７６】
評価部２４は、比較対象とすべき遺伝子発現量を比率変換部２３が比率に変換した場合、初期の測定時間ｔ１を基準としたときの各測定時間ｔ２〜ｔｎにおける比率個数分布と、中心を「１」とする正規分布との相関の程度に基づいて、当該遺伝子発現量ＧＥｎが正規化対象に値するものであるか否かの評価を得るようになされている。
【００７７】
具体的には、比率個数分布ごとに、中心を「１」とする正規分布との確率プロット（Ｑ−Ｑプロット）を表示部１６（図４）に提示する。この確率プロットの直線の程度を指標として、正規化対象に値するものであるか否かがユーザにより判断され、評価部２４は、当該判断結果として操作部１３（図４）から入力される評価データを取得する。
【００７８】
ここで、比較対象とされる遺伝子発現量ＧＥｎが正規化対象に値しないものである場合、このことは、当該遺伝子発現量ＧＥｎには外的ノイズ成分の含有量が多いため、正規化した後に比較してもその結果の信頼性は乏しいものであることを意味する。
【００７９】
正規化部２５は、評価データに示される内容として、比較対象とされる遺伝子発現量ＧＥｎが正規化対象に値するものであった場合、例えば図１０に示すように、初期の測定時間ｔ１を基準としたときの各測定時間ｔ２〜ｔｎにおける比率個数分布のピークが基準の比率「１」に平行移動するように、当該遺伝子発現量ＧＥｎを補正する。
【００８０】
この結果、遺伝子発現量ＧＥｎは、標的細胞における遺伝子の挙動を反映した真の値に近似するものとして得られ、その後の比較結果も信頼性が高いものとして得ることができる。
【００８１】
（４）正規化検定処理手順
次に、正規化検定プログラムに基づくＣＰＵ１０の処理手順について、図１１に示すフローチャートを用いて説明する。
【００８２】
すなわちＣＰＵ１０は、例えば電源投入操作をトリガーとしてこの正規化検定処理手順を開始し、ステップＳＰ１において核酸チップＣＰでの蛍光強度の読取要求を待ち受け、ステップＳＰ２において比較対象とすべき遺伝子発現量の選択を待ち受ける。
【００８３】
ＣＰＵ１０は、蛍光強度の読取要求を受けた場合、ステップＳＰ３に進んで、蛍光強度取得部２１（図４）として動作し、蛍光強度読取装置３（図１）に対して測定を開始させてその蛍光強度読取装置３での測定結果を待ち受ける。そしてＣＰＵ１０は、測定結果として蛍光強度データを受けた場合には発現量演算部２２（図４）として動作する。この場合、ＣＰＵ１０は、蛍光強度データから遺伝子発現量を示す発現量データを生成し、これを記憶部１４に保存した後にステップＳＰ１に戻る。またＣＰＵ１０は、蛍光強度読取装置３（図１）に対して測定を開始させてから一定の時間が経過するまでに蛍光強度データを受けない場合、発現量データを生成することなくステップＳＰ１に戻る。
【００８４】
一方、ＣＰＵ１０は、比較対象とすべき遺伝子発現量の選択を受けた場合、ステップＳＰ４に進んで、比率変換部２３（図４）として動作し、選択対象とされた例えば各測定時間ｔｍの遺伝子発現量ＧＥｎのうち、閾値未満となる低発現量を必要に応じてカットし、続くステップＳＰ５において、当該遺伝子発現量ＧＥｎを、指定対象とされた例えば測定時間ｔ１を基準として（図５（Ａ））比率に変換する（図５（Ｂ））。
【００８５】
そしてＣＰＵ１０は、ステップＳＰ６に進んで、評価部２４（図４）として動作し、初期の測定時間ｔ１を基準としたときの各測定時間ｔ２〜ｔｎにおける比率個数分布と、中心を「１」とする正規分布との相関の程度を、例えば確率プロット（Ｑ−Ｑプロット）を用いて表示させ、当該遺伝子発現量ＧＥｎが正規化対象に値するものであるか否かの評価を得る。
【００８６】
ここで、操作部１３（図４）から入力される評価データが正規化対象に値するものではないことを示す場合、このことは、外的ノイズ成分の含有量が大きく、遺伝子発現量ＧＥｎを比較しても信頼性に乏しいこと意味する。
【００８７】
この場合、ＣＰＵ１０は、ステップＳＰ７に進んで、比較対象としての信頼性が乏しいこと及びその信頼性に乏しい遺伝子発現量の測定時間ｔｍを例えば表示部１６（図４）を介して通知し、この正規化検定処理手順を終了する。
【００８８】
これに対して、操作部１３（図４）から入力される評価データが正規化対象に値するものであることを示す場合、ＣＰＵ１０は、ステップＳＰ８に進んで、正規化部２５（図４）として動作し、初期の測定時間ｔ１を基準としたときの各測定時間ｔ２〜ｔｎにおける比率個数分布のピークが基準の比率「１」に平行移動するように、当該遺伝子発現量ＧＥｎを補正する（図１０）。
【００８９】
そしてＣＰＵ１０は、続くステップＳＰ９に進んで、補正後の遺伝子発現量のなかに「０」以下となるものがあるか否かを判定し、否定結果を得た場合にはこの正規化検定処理手順を終了する。
【００９０】
一方、肯定結果を得た場合、このことは、比率個数分布のピークを基準に平行移動する前（補正する前）において既に、比較対象として信頼性に乏しい低い値の遺伝子発現量が存在していたことを意味する。この場合、ＣＰＵ１０は、ステップＳＰ１０に進んで、補正後の遺伝子発現量のうち、「０」以下となる遺伝子発現量を破棄した後に、この正規化検定処理手順を終了する。
【００９１】
このようにしてＣＰＵ１０は、正規化検定プログラムにしたがって正規化検定処理を実行するようになされている。
【００９２】
（５）動作及び効果
以上の構成において、この正規化検定装置４は、比較対象とすべき測定時間ｔｍの発現量データそれぞれに示される遺伝子発現量ＧＥｎを、例えば初期の測定時間ｔ１の発現量データを基準として比率に変換する（図５）。
【００９３】
そして正規化検定装置４は、比率個数分布のピークが基準の比率「１」に平行移動するように、当該遺伝子発現量ＧＥｎを補正する（図１０）。
【００９４】
基準との比率に変換された遺伝子発現量（発現比率）の個数分布はおおよそ正規分布を呈するということが、発現量数理モデル（（６）式）からも、実験結果（図６及び図９）からも得られた。したがって、比率個数分布のピークが「１」に近いほど外的ノイズ成分（抽出対象のサンプル細胞に対する外部ストレスや、該サンプル細胞からｍＲＮＡを抽出するときの条件又は技量等の外的要因に起因するノイズ成分）の含有量が小さいという理論の信頼性は高いといえる。
【００９５】
このことからも明らかなように、この正規化検定装置４は、比較対象とすべき遺伝子発現量ＧＥｎを、その比率個数分布のピークが基準の比率「１」に平行移動するように補正することで、標的細胞における遺伝子の挙動を反映した真の値に近似したものとして得ることができ、この結果、比較精度を向上することができる。
【００９６】
また、この正規化検定装置４は、発現量データとして、複数の核酸プローブごとに、標的核酸との相補鎖形成量がセンサ（蛍光強度読取装置３）によって読み取られ、該読み取られた物理量（発光量）が、当該核酸プローブに対するコントロールでの物理量（発光量）の差に応じて補正された後に割合として変換されたものを対象とする。
【００９７】
センサ（蛍光強度読取装置３）から読み取られた物理量（発光量）そのものを対象とする場合に比して、バックグラウンド（局所的な物理的影響）等が排除されるので、発現量データは要求される相補鎖形成量に近似した信頼性の高いものとなる。
【００９８】
したがって、この正規化検定装置４は、センサ（蛍光強度読取装置３）から読み取られた物理量（発光量）そのものを対象とする場合に比して、極めて正確に正規化することが可能となり、信頼性が高い比較結果を得ることが可能となる。このことは、本発明者による実験結果からも確認されている。
【００９９】
なお、遺伝子発現量ＧＥｎは標的細胞での遺伝子の発現動向を調べる上で得るものであるから、その標的細胞において発現され得る遺伝子数の数が多いほど、比較対象とすべき遺伝子発現量ＧＥｎを、その比率個数分布のピークが基準の比率「１」に平行移動するように補正した結果は、標的細胞における遺伝子の挙動を反映した真の値に近似したものとして得ることができる。したがって、遺伝子発現量ＧＥｎは標的細胞において発現され得る総遺伝子に対応する数とすれば、当該補正結果の信頼性については最も高いものとして得ることができる。
【０１００】
以上の構成によれば、比較対象とすべき遺伝子発現量ＧＥｎを、その比率個数分布のピークが基準の比率「１」に平行移動するように補正するようにしたことにより、外的ノイズ成分の含有量が小さく、標的細胞における遺伝子の挙動を反映した真の値に近似したものとして得ることができ、かくして、比較精度を向上し得る正規化検定装置４を実現できる。
【０１０１】
（６）他の実施の形態
上述の実施の形態では、測定時間ｔｍごとの発現量データ（発現量ＧＥｎ）が、比較対象とすべき２以上のデータとされた。しかしながら、比較対象はこの実施の形態に限定されるものではない。
【０１０２】
例えば、ある刺激を標的細胞に与えた場合における発現量ＧＥｎを示すデータと、該刺激とは異なる刺激を標的細胞に与えた場合における発現量ＧＥｎを示すデータとを比較対象とすることも可能である。もっとも、ある刺激を標的細胞に与えた場合における測定時間ｔｍあたりの発現量ＧＥｎを示す発現量データと、該刺激とは異なる刺激を標的細胞に与えた場合における測定時間ｔｍあたりの発現量ＧＥｎを示すデータとを比較対象とすることもできる。
【０１０３】
また例えば、ある標的細胞に刺激を与えた場合における発現量ＧＥｎを示すデータと、該標的細胞とは異なる細胞に該刺激と同じ刺激を与えた場合における発現量ＧＥｎを示すデータとを比較対象とすることも可能である。なお、標的細胞は、異生物の同一組織であっても、同生物の異組織であってもよい。
【０１０４】
また上述の実施の形態では、蛍光強度読取装置３から読み取られた蛍光強度から遺伝子発現量を算出することにより発現量データが取得された。しかしながら、この形態に限定されるものではない。
【０１０５】
例えば、標的細胞で発現される各ｍＲＮＡを抽出し、これらをリアルタイムＰＣＲ(Polymerase  Chain  Reaction)を用いて、一定量に増殖することにより直接的に取得するといった形態も適用可能である。
【０１０６】
また例えば、データ格納媒体から蛍光強度を示すデータを読み取り、該データから発現量データを算出することにより発現量データを取得するようにしてもよい。また例えば、データ格納媒体から遺伝子発現量を示すデータを取得するようにしてもよい。またこれらの取得手法の組み合わせであってもよい。なお、データ格納媒体からデータを取得する場合、例えば遠方となる様々な実験場所で得られたデータを比較することが可能となり、この結果、より一段と網羅的な解析を行うことが可能となる。
【０１０７】
ところで、データ格納媒体から取得された２以上の発現量データを比較対象とする場合、該発現量データの演算手法が異なる場合がある。例えば、比較対象とされる一方の発現量データがＭＡＳにより得られたものであり、他方の発現量データがＲＭＡにより得られたものである場合がある。ＭＡＳとＲＭＡとでは正規化がその演算手法のなかで大きく異なる部分の１つとなる。ＭＡＳでは上述したように基準に対して同じ平均蛍光強度をもつようにスケーリングする正規化が採用され、ＲＭＡでは分位数正規化（Quantile  normalization）が採用される。
【０１０８】
すなわち、図１１で上述したステップＳＰ２において、データ格納媒体から取得された２以上の発現量データが比較対象とされた場合、該発現量データが異なる演算手法により得られたものであることが想定される。このような場合、比較対象とすべき発現量データに示される発現量がばらつく。
【０１０９】
ここで、ＭＡＳにより得られた発現量データと、ＲＭＡにより得られた発現量データとの相関を示すグラフを図１２に示す。図１２（Ａ）におけるグレー部分は、ＭＡＳ５で規定されるｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃａｌｌが「Ａ」と判定されたデータ群であり、該データ群を除いたものが図１２（Ｂ）である。この図１２からも明らかなように、ＲＭＡではＭＡＳ５により捨てられるはずのデータ群が残っているため、ＲＭＡにより得られた発現量データとＭＡＳ５により得られた発現量データとの比較結果は信頼性が高いものとはいえないことになる。
【０１１０】
しかしながら、異なる演算手法により得られた発現量データが比較対象とされた場合であっても、図１１で上述したステップＳＰ４〜ステップＳＰ１０の各処理を経ることによって、標的細胞における遺伝子の挙動を反映した真の値に近似するもの同士の比較が可能となり、当該比較結果の信頼性を向上することができる。
【０１１１】
ちなみに、上述のデータ格納媒体としては、例えばフレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ（Compact  Disk-Read  Only  Memory）、ＤＶＤ（Digital  Versatile  Disc）等のパッケージメディアや、データが一時的若しくは永続的に格納される半導体メモリや磁気ディスク等がある。またこれらデータ格納媒体からデータを取得する方法としては、ローカルエリアネットワークやインターネット、ディジタル衛星放送等の有線又は無線の通信媒体を利用することができる。
【０１１２】
また上述の実施の形態では、比率個数分布と、中心を「１」とする正規分布との相関の程度を、例えば確率プロット（Ｑ−Ｑプロット）を用いて表示させ、当該遺伝子発現量ＧＥｎが正規化対象に値するものであるか否かの評価を得る検定手法が適用された。しかしながら、検定手法はこの実施の形態に限定されるものではない。例えば、シャピーロ−ウィルク検定手法や、コルモゴロフ−スミルノフ検定手法等を適用するようにしてもよい。
【０１１３】
また例えば、比率個数分布のピークと、正規分布のピークとの比率方向へのずれ量が、該ずれ量に対して与えられる閾値未満となる場合、当該遺伝子発現量ＧＥｎが正規化対象に値するものであるとしてその後の処理を実行するようにしてもよい。このようにすれば、ユーザ評価を得ずに自動的に検定を行うことが可能となり、当該ユーザの意図が反映されないのでより正確となる。ちなみに、この検定と、ユーザ評価を得る検定との双方を行うようにしてもよい。
【０１１４】
また上述の実施の形態では、比較対象とすべき遺伝子発現量ＧＥｎが、その比率個数分布のピークが基準の比率「１」に平行移動するように補正された。基準とすべき比率は「１」以外を適用することができる。このようにしても、比較対象とすべき遺伝子発現量ＧＥｎを、外的ノイズ成分の含有量が小さく、標的細胞における遺伝子の挙動を反映した真の値に近似したものとして得ることができる。ただし、基準とすべき比率を「１」以外とした場合には、実測値ではなく、遺伝子発現量ＧＥｎに対して線形となる値に変換されたものとなるため留意を要する。
【０１１５】
また上述の実施の形態では、標的核酸と、核酸プローブとの相補鎖の形成量の強度が、光学的に発光量として読み取られた。しかしながら、読取手法はこの実施の形態に限定されるものではない。例えば、電磁学的に電気量又はインピーダンス量等として読み取るようにしてもよい。要は、所定の物理量を読み取るセンサによって読み取られた標的核酸と、核酸プローブとの相補鎖の形成量の強度であればよい。なお、核酸チップＣＰとしては、例えば、Affymetrix社製、スタンフォード型等を適用することができ、これら以外のものを適用することもできる。
【０１１６】
また上述の実施の形態では、標的核酸と、核酸プローブとの相補鎖の形成場所として核酸チップＣＰが対象とされた。しかしながら、形成場所はこれに限定されるものではない。例えば、組織切片や、試験管等を形成場所とすることができ、これ以外の形成場所も適用するようにしてもよい。
【０１１７】
また、遺伝子発現量の演算手法として、上述の実施の形態ではＭＡＳに規定される各種処理のうち、正規化処理を除く処理（上述の（１）〜（３））を用いて遺伝子発現量が算出された。しかしながら、演算手法はこれに限定されるものではない。標的核酸と、核酸プローブとの相補鎖の形成量を統計学的手法を用いてデータ化するものであれば、この他種々の演算手法を適用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明は、遺伝子実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】遺伝子解析システムの全体構成を示す概略図である。
【図２】核酸チップでのハイブリダイゼーションの説明に供する略線図である。
【図３】標的細胞における各測定時間での遺伝子発現量の取得の説明に供する略線図である。
【図４】正規化検定装置の構成を示すブロック図である。
【図５】各遺伝子における発現量に対する基準との比率への変換の説明に供する略線図である。
【図６】実験結果（１）を示すグラフである。
【図７】確率プロット（Ｑ−Ｑプロット）−（１）を示すグラフである。
【図８】確率プロット（Ｑ−Ｑプロット）−（２）を示すグラフである。
【図９】実験結果（２）を示す度数分布である。
【図１０】正規化前（Ａ）と正規化後（Ｂ）を示すグラフである。
【図１１】正規化検定処理手順を示すフローチャートである。
【図１２】ＭＡＳとＲＭＡとの相関の程度を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１２０】
１……遺伝子解析システム、３……蛍光強度読取装置、４……正規化検定装置、１０……ＣＰＵ、１１……ＲＯＭ、１２……ＲＡＭ、１３……操作部、１４……記憶部、１５……インターフェイス、１６……表示部、２１……蛍光強度取得部、２２……発現量演算部、２３……比率変換部、２４……評価部、２５……正規化部、ＣＰ……核酸チップ、Ｇ１〜Ｇｎ……遺伝子、ＧＥ１〜ＧＥｎ……遺伝子発現量。
【図１】
2010046011.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2010046011.tif 000023
【図１１】
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【図１２】
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