(57)【要約】      （修正有）【課題】従来のＬ−アミノ酸生産菌よりも、高収率なＬ−グルタミン酸生産菌を育種する。【解決手段】Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニンからなる群より選ばれる１又は２以上のアミノ酸生産能を有し、かつα−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物を培地で培養して、前記Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニンからなる群より選ばれる１又は２以上のＬ−アミノ酸の生産能を有し、かつ、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物。
【請求項２】
α−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、同遺伝子の翻訳量を増大させることにより、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大した、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
α−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大した、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
α−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）、及び、（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチドをコードする、請求項２又は３に記載の微生物：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチドと共にα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有するタンパク質を構成するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｄ）配列番号４において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドと共にα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有するタンパク質を構成するポリペプチド。
【請求項５】
α−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ、及び（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む、請求項２又は３に記載の微生物：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡによりコードされるポリペプチドと共にα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有するタンパク質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡによりコードされるポリペプチドと共にα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有するタンパク質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性が増大するように改変された、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項８】
フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変された、請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項９】
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
微生物が、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属からなる群より選ばれる属に属する細菌である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
微生物が、コリネ型細菌である請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニンからなる群より選ばれる１又は２以上のＬ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項１３】
前記微生物を好気的条件で培養することを特徴とする、請求項１２に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項１４】
前記培地が炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させた培地であり、前記微生物を嫌気的又は微好気条件で培養することを特徴とする、請求項１２に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を生産する微生物及びＬ−グルタミン酸系アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられている。また、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、及びＬ−アルギニンは、調味料、肝機能促進薬、アミノ酸輸液、および総合アミノ酸製剤等として有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントテア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献５〜７参照）。
【０００３】
また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−グルタミン酸の生合成酵素の活性が増大することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の導入が、コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献８参照）。またコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子のエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、又はエシェリヒア属に属する腸内細菌への導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献９参照）。
【０００４】
Ｌ−グルタミン酸以外のＬ−グルタミン酸系アミノ酸、例えばオルニチン及びシトルリン（非特許文献２〜４）、Ｌ−グルタミン酸（特許文献１０）、Ｌ−プロリン（特許文献１１）、及びＬ−アルギニン（特許文献１２、１３）等も、Ｌ−グルタミン酸と同様に、上記のような微生物を用いた発酵法により製造されている。
【特許文献１】米国特許第３，２２０，９２９号明細書
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号明細書
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号公報
【特許文献４】特開平５−２４４９７０号公報
【特許文献５】特開２０００−１０６８６９号公報
【特許文献６】特開２０００−１８９１６９号公報
【特許文献７】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献８】特公平７−１２１２２８号公報
【特許文献９】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献１０】特開２００２−３００８８７号
【特許文献１１】欧州特許第１１７２４３３号
【特許文献１２】特開２０００−２８７６９３
【特許文献１３】特開２００１−０４６０８２
【非特許文献１】明石邦彦ら著  アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
【非特許文献２】Lee, Y.-J. and Cho, J.-Y. 2006, Biotechnol. Lett. 28: 1849-1856
【非特許文献３】Choi, D. K., Ryu, W. S., Choi, C. Y., and Park, Y. H. 1996, J. Ferment. Bioeng. 81: 216-219
【非特許文献４】Plachy, J. 1987, Kvasny Prumysl 33: 73-75
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を効率よく生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−グルタミン酸系アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記のようなＬ−グルタミン酸生産能を高める技術は、主としてＴＣＡサイクルの酵素の活性を増強するものであるが、ＴＣＡサイクルを経由させてＬ−グルタミン酸発酵を行う際、イソクエン酸デヒドロゲナーゼによる脱炭酸を伴うため、必ず１分子のCO2が放出される。従って、さらに生産性を上昇させるためには、この脱炭酸を減少することが必要であると本発明者は考えた。そして、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、還元型ＴＣＡサイクルの酵素であるα−ケトグルタル酸シンターゼの酵素活性を上昇させることにより、さらには、α−ケトグルタル酸シンターゼの酵素活性に必要な還元型フェレドキシン又は還元型フラボドキシンをそれぞれの酸化型から生成する活性を有するフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ又はピルビン酸シンターゼの酵素活性を強化すること、あるいはフェレドキシン又はフラボドキシン産生能を向上させることにより、Ｌ−グルタミン酸の生産性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニンからなる群より選ばれる１又は２以上のＬ−アミノ酸の生産能を有し、かつ、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物。
（２）α−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、同遺伝子の翻訳量を増大させることにより、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大した、前記微生物。
（３）α−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大した、前記微生物。
（４）α−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）、及び、（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチドをコードする、前記微生物：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチドと共にα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有するタンパク質を構成するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｄ）配列番号４において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドと共にα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有するタンパク質を構成するポリペプチド。
（５）α−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ、及び（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む、前記微生物：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡによりコードされるポリペプチドと共にα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有するタンパク質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡによりコードされるポリペプチドと共にα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有するタンパク質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（６）フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性が増大するように改変された、前記微生物。
（７）ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された、前記微生物。
（８）フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変された、前記微生物。
（９）α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された、前記微生物。
（１０）微生物が、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属からなる群より選ばれる属に属する細菌である、前記微生物。
（１１）微生物が、コリネ型細菌である前記微生物。
（１２）前記微生物を培地で培養して、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニンからなる群より選ばれる１又は２以上のＬ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（１３)前記微生物を好気的条件で培養することを特徴とする、前記方法。
（１４）前記培地が炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させた培地であり、前記微生物を嫌気的又は微好気条件で培養することを特徴とする、前記方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微生物を用いることにより、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸を効率よく発酵生産することができる。また、本発明の方法は、脱炭酸を抑制し、炭酸固定反応を利用することで、炭酸ガスの排出が低減できる、環境に配慮した方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、又はＬ−アルギニンから選ばれるＬ−アミノ酸生産能を有し、かつ、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物である。
【００１０】
本発明において「Ｌ−アミノ酸」とは、特記しない限り前記Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、又はＬ−アルギニンを意味する。これらのアミノ酸は、Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸とも呼ばれ、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ−グルタミン酸を前駆体として生合成され得る。
【００１１】
「Ｌ−アミノ酸生産能」とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、Ｌ−アミノ酸を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生成、蓄積する能力をいう。本発明の微生物が生産するＬ−アミノ酸は、１種であってもよく、２種またはそれ以上のＬ−アミノ酸であってもよい。Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸生産能を有するものであってもよいが、以下に示すような微生物を、変異法や
組換えDNA技術を利用してＬ−アミノ酸生産能を有するように改変したものや、本発明の遺伝子を導入することによってＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物であってもよい。
【００１２】
また、「α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大する」とは、もともとα−ケトグルタル酸シンターゼを有している微生物において、同酵素の活性が増大すること、及び、α−ケトグルタル酸シンターゼを有していない微生物に同酵素の活性を付与することの両方を含む。
【００１３】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物を親株とし、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変することによって得ることができる。また、本発明の微生物は、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物を親株とし、Ｌ−アミノ酸生産能を付与又は増強することによって得ることができる。
【００１４】
以下に、微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明で使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。
【００１５】
本発明に用いる微生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌や、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等に属する微生物が挙げられる。γ−プロテオバクテリアは、NCBI（National Center for Biotechnology Information）タキソノミーデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=1236&lvl=3&p=mapview&p=has_linkout&p=blast_url&p=genome_blast&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlock）に開示されている分類により微生物に属するものが利用出来る。
【００１６】
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。エシェリヒア・コリを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、エシェリヒア・コリK-12株及びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC 47076）、及びW3110株（ATCC 27325）を用いることができる。エシェリヒア・コリK-12株は、1922年にスタンフォード大学で分離されたものであり、λファージの溶原菌であるとともに、F因子を持ち、接合等遺伝的組み換え体の作成が可能である汎用性の高い菌株である。またエシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列は既に決定されており、遺伝子情報も自由に利用出来る。エシェリヒア・コリK-12株や、誘導株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。
【００１７】
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J. Gen. Appl. Microbiol. 1997, 43: 355-361; Int. J. Syst. Bacteriol. 1997, 47: 1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある(Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39: 337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（Int. J. Syst. Bacteriol. 1993, 43: 162-173 参照）。
【００１８】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
【００１９】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２０】
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２１】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２２】
エルビニア・アミロボーラ  ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ  ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
【００２３】
本発明でいうコリネ型細菌は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であって、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., and Schleifer, K. H. 1991, Int. J. Syst. Bacteriol. 41: 255-260）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。
【００２４】
Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌としては、例えば以下に示すものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）  
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００２５】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス  ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）  ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）  ＡＴＣＣ６８７１
【００２６】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように改変する方法を挙げることができる。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう（gdhA））、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（edd）、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（eda）、トランスヒドロゲナーゼなどが挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。
【００２７】
以下に、上記Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように微生物を改変する方法について説明する。
１つ目の方法は、目的遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、得られたベクターを用いて宿主細菌を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高めることができる。目的遺伝子は、例えばエシェリヒア属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌において、既に塩基配列が明らかにされている場合は、その塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体DNAを鋳型にしてPCR法により取得することが可能である。グルタミン酸デヒドロゲナーゼとしては、エシェリヒア・コリgdhA遺伝子（Vallea, F., Becerrila, B., Chenb, E., Seeburgb, P., Heynekerb, H. and Bolivar, F. 1984. Gene 27: 193-199）、コリネバクテリウム・グルタミカムgdh遺伝子（Bormann, E. R., Eikmanns, B. J., and Sahm, H. 1992. Mol. Microbiol. 6: 317-326）が知られており、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとしては、エシェ
リヒア・コリppc遺伝子（Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K., and Katsuki, H. 1984. J. Biochem. (Tokyo) 95: 909-916）、コリネバクテリウム・グルタミカムppc遺伝子（Eikmanns, B. J., Follettie, M. T., Griot, M. U., Sinskey, A. J. 1989. Mol Gen Genet. 218: 330-339）が知られている。
【００２８】
形質転換に用いるベクターとしては、使用する微生物で自律複製可能なプラスミドが挙げられる。例えば、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）等が挙げられる。また、コリネ型細菌用のプラスミドとしては、pAM330(特開昭58-67699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pSFK6 (特開2000-262288号公報参照）、pVK7(米国特許出願公開明細書2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特開昭58-192900号公報)、pCG1(特開昭57-134500号公報)、pCG2（特開昭58-35197号公報）、pCG4、pCG11（特開昭57-183799号公報）、pHK4（特開平5-7491号公報）などが挙げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つDNA断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。なお、プラスミドの代わりにファージDNAをベクターとして用いてもよい。
【００２９】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.
Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
【００３０】
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（MillerI, J.
H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。染色体上に目的遺伝子が転移したことの確認は、その遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００３１】
コピー数は、目的遺伝子の産物の活性を増強できればいずれでもよいが、2コピー以上であることが望ましい。
【００３２】
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を適切な強さのものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強
させる方法である。例えば、thrプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター、tacプロモーター等がよく用いられるプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、GoldsteinとDoiの論文（Goldstein, M. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128）等に記載されている。
【００３３】
また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、適切な強度のものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載の温度感受性プラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F.
J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
【００３４】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。
【００３５】
以上のような方法によりＬ−グルタミン酸生産に関与する遺伝子の発現が増大するように改変された微生物としては国際公開WO99/07853号パンフレット、欧州特許第1352966号等に記載された微生物が例示できる。
【００３６】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターは使用する微生物において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。使用する微生物で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような方法により、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子等の発現が増強するように改変された微生物が、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００３７】
上記したような遺伝子の発現を増強する方法は、後述のα−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子にも同様に適用することができる。
【００３８】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。この中では特に、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
【００３９】
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。
【００４０】
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と比較することによって確認することができる。例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Reedらの方法（Reed, L. J. and Mukherjee, B. B. 1969. Methods in Enzymology 13: 55-61）に従って測定することができる。
【００４１】
エシェリヒア属細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、特開平5-244970号公報及び特開平7−203980号公報などに記載されている。また、コリネ型細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、国際公開95/34672号パンフレットに記載されている。さらに、エンテロバクター属細菌については、特開2001-333769号公報に開示されている。
【００４２】
例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるには該酵素のE1oサブユニットをコードするsucA（odhA）遺伝子を用いて改変すればよい。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、例えば、以下の株が挙げられる。
【００４３】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP−4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174；フランス特許公報9401748号明細書参照) 
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869 OAGN、OA2-2、OAGN2-2 （国際公開パンフレット2006/028298号参照）
エシェリヒア・コリAJ12624（FERM BP-3853）
エシェリヒア・コリAJ12628（FERM BP-3854）
エシェリヒア・コリAJ12949（FERM BP-4881）
ブレビバクテリム・ラクトファーメンタム  ΔS株  （国際公開95/34672号パンフレット参照）
パントエア・アナナティス  AJ13601 (FERM BP-7207  欧州特許公開明細書1078989)
パントエア・アナナティス  AJ13356 (FERM BP-6615 米国特許6.331,419号)
パントエア・アナナティス  SC17sucA (FERM BP-8646  WO2005/085419)
クレブシエラ・プランティコーラ  AJ13410 (FERM BP-6617 米国特許6,197,559号)
【００４４】
パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄
託センター（住所  〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【００４５】
また、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【００４６】
さらに、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、実施例に記載したように、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００４７】
さらにコリネ型細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 1221；NP_600492. Reports  small-conductance...[gi:19552490]）を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である（WO2006/070944）。
【００４８】
Ｌ−グルタミン酸生産能は、Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子を増幅することによっても付与することができる（WO2005/085419）。
【００４９】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を
付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
【００５０】
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949  (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
【００５１】
Ｌ−グルタミン生産菌
Ｌ−グルタミン生産能を有する微生物として好ましい例は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を強化した細菌、グルタミンシンセターゼ（glnA）活性を強化した細菌、グルタミナーゼ遺伝子を破壊した細菌である（欧州特許出願公開1229121号、1424398号明細書）。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ（glnE）の破壊、PII制御タンパク質（glnB）の破壊によっても達成できる（EP1229121）。また、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適なＬ−グルタミン生産菌として例示できる（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）。
【００５２】
Ｌ−グルタミン生産能を付与または増強する方法として、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法 (特開平3-232497)、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法(特開昭61-202694)、α-ケトマレイン酸耐性を付与する方法(特開昭56-151495)などが挙げられる。Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例として、以下の微生物が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573 (FERM P-5492、特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11576 (FERM BP-10381、特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212 (FERM P-8123、特開昭61-202694)
【００５３】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産能を有する微生物としては、例えば、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持する細菌や、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌が挙げられる。Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼをコードするDNAを用いて細菌を改変する方法は、DandekarとUratsuの文献（J. Bacteriol. 170, 12: 5943-5945 (1988)）に開示されている。また、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌を得る方法としては、例えば、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に酵素活性を低下させる変異を導入する方法が挙げられる。Ｌ−プロリン生産能を有する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ NRRL B-12403株及びNRRL B-12404株 (英国特許 2075056)、エシェリヒア・コリVKPM B-8012株 (米国特許公開2002-0058315)、および、ドイツ特許3127361号に開示されたプラスミド変異体や、Bloom F.R. らの文献 (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) に開示されたプラスミド変異体などを保持す
る菌株が挙げられる。
【００５４】
また、Ｌ−プロリン生産能を有する微生物として好ましいものは、3,4-デヒドロキシプロリン、アザチジン−２−カルボキシレート耐性株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPMB-8011）や、702のilvA欠損株である702ilvA株（VKPMB-8012株）や、b2682、b2683、b1242又はb3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強したE. coli等も挙げられる（特開2002−300874号公報）。
【００５５】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭56-106598号公報参照）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ237株（ロシア特許出願第2000117677号）も、好適なＬ−アルギニン生産株である。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ） にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。237株の誘導体で、酢酸資化能を向上させたＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ382株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ382株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の受託番号で寄託されている。
【００５６】
またＬ−アルギニン生産能が付与された微生物として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）は、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
【００５７】
コリネ型細菌のＬ−アルギニン生産菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するものであれば特に制限されないが、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭54-44096号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭57-18989号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭62-24075号）；または、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平2-186995号）等が挙げられる。
【００５８】
また、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌は、５−アザウラシル、６−アザウ
ラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−アザシトシン、６−アザシトシン等に耐性な変異株；アルギニンヒドロキサメート、２−チオウラシルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシルに耐性な変異株（特開昭49-126819号）；ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性な変異株（特開昭52-114092号）、メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有する変異株（特開昭52-99289号参）；アルギニンヒドロキサメートに耐性な変異株（特公昭51-6754号）；コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な変異株（特開昭58-9692号）；アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株（特開昭52-8729号）；アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、カナバニン耐性、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性の変異株（特開昭53-143288号）；及び、カナバニン耐性の変異株（特開昭53-3586号）等として育種することができる。
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
【００５９】
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM P-4161）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM P-7273）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM P-4939）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM P-4948）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
【００６０】
さらにアルギニンリプレッサーであるArgRを欠損した株(米国特許出願公開2002-0045223号、細胞内のグルタミンシンテターゼ活性を上昇させた株（米国特許出願公開2005-0014236号公報）を使用することが出来る。
【００６１】
Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチンもＬ−アルギニンと生合成経路が共通しており、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによって、これらの生産能を付与することができる（国際公開2006-35831号パンフレット）。
【００６２】
また、本発明に用いるＬ−アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝（解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されていてもよい。
【００６３】
糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;  欧州出願公開877090号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（pfkBfbp;国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。
【００６４】
エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米
国特許 5,830,716号明細書）、チトクロムbo型オキシダーゼ（cytochromoe bo type oxidase）遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。
【００６５】
また、炭素源としてグリセロールを使用する場合、グリセロールの資化性を高めるために、glpR遺伝子（EP1715056）の発現が弱化されているか、glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa及びtalC遺伝子等のグリセロール代謝遺伝子（EP1715055A）の発現が強化されていてもよい。
【００６６】
＜１−２＞α−ケトグルタル酸シンターゼ活性の増強
本発明の微生物は、上述したようなＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変した微生物である。α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変するには、α−ケトグルタル酸シンターゼ活性が親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することが好ましい。尚、前記したように、微生物が元来α−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有していない場合、同酵素活性を有するように改変された微生物は、α−ケトグルタル酸シンターゼ活性が非改変株に比べて増大している。
【００６７】
本発明における「α−ケトグルタル酸シンターゼ」とは、上述のようにスクシニル-CoAとCO2からα−ケトグルタル酸を生成する反応を、電子供与体存在下、例えばフェレドキシン存在下で触媒する酵素（EC 1.2.7.3）を意味する。α−ケトグルタル酸シンターゼは、α−ケトグルタル酸オキシドレダクターゼあるいは、α−ケトグルタル酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、２−オキソグルタル酸シンターゼ、２−オキソグルタル酸オキシドレダクターゼ、２−オキソグルタル酸フェレドキシンオキシドレダクターゼと命名されている場合もある。電子供与体としては、フェレドキシンあるいはフラボドキシンを用いることが出来る。
【００６８】
なお、α−ケトグルタル酸シンターゼが増大するような改変を施す親株は、本来内在的にα−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子を有さないが、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子を導入することにより同酵素の活性が付与され、Ｌ−グルタミン酸生産能が向上するものであってもよい。
【００６９】
先にα−ケトグルタル酸シンターゼの酵素活性を高めるように改変を行った後に、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与してもよい。なお、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性の増強は、前記したような、遺伝子の発現を増強する方法によって行うことができる。すなわち、プロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる、内因性α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子の発現増強によるものであってもよいし、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子の発現増強であってもよい。
【００７０】
α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増強されたことの確認は、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を比較することにより達成される。α−ケトグルタル酸シンターゼの活性は、例えば、Yunらの方法（Yun, N. R., Arai, H., Ishii, M. and Igarashi Y. 2001. Biochem. Biophy. Res. Commum. 282: 589-594）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとCoAと粗酵素液を用い、α−ケトグルタル酸を添加した際にα−ケトグルタル酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は、１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。α−ケトグルタル酸シンターゼの活性の増強は、野生株
と比較して向上していればよいが、親株がα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有している場合は、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有していない場合には、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、α−ケトグルタル酸シンターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に改変されていることが好ましく、菌体タンパク質に対して、好ましくは0.001U/mg以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。
【００７１】
α−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子は、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌である、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌のα−ケトグルタル酸酸シンターゼ遺伝子あるいはそのホモログを使用することができる。具体的には、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）のα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子等が挙げられる。
【００７２】
α−ケトグルタル酸シンターゼは、複数のペプチドの複合体として機能することが知られている。クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のゲノム配列（Genbank Accession No. NC_002932）は決定されており（Eisen, J. A., Nelson, K. E., Paulsen, I. T., Heidelberg, J. F., Wu, M., Dodson, R. J., Deboy, R., Gwinn, M. L., Nelson, W. C., Haft, D. H., Hickey, E. K., Peterson, J. D., Durkin, A. S., Kolonay, J. L., Yang, F., Holt, I., Umayam, L. A., Mason, T., Brenner, M., Shea, T. P., Parksey,
D., Nierman, W. C., Feldblyum, T. V., Hansen, C. L., Craven, M. B., Radune, D.,
Vamathevan, J., Khouri, H., White, O., Gruber, T. M., Ketchum, K. A., Venter, J. C., Tettelin, H., Bryant, D. A. and Fraser, C. M. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 99: 9509-9514）、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子としては、配列番号１、３に示す塩基配列を例示することができる。配列番号１はクロロビウム・テピダムのゲノム配列の塩基番号170164〜172047（相補鎖）に位置するα−ケトグルタル酸シンターゼのαサブユニット遺伝子の塩基配列、配列番号３はクロロビウム・テピダムのゲノム配列の塩基番号169132〜170160（相補鎖）に位置するβサブユニット遺伝子の塩基配列を示している。配列番号２はα−ケトグルタル酸シンターゼのαサブユニットのアミノ酸配列（Genbank Accession No. NP_661069）、配列番号４はβサブユニットをアミノ酸配列（Genbank
Accession No. NP_661068）である。
【００７３】
ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）のα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子（AB046568）は、クローニングされており（Yun, N. R., Arai, H., Ishii, M. and Igarashi Y. 2001. Biochem. Biophy. Res. Commum. 282: 589-594）、αサブユニット（Genbank Accession No. BAB21494）及びβサブユニット（Genbank Accession No. BAB21495）が同定されている。さらに、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC_00091）の塩基番号620219〜623070番に位置するHP0588、HP0589、HP0590、HP0591の４つの遺伝子でコードされるα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002754）の塩基番号2575303〜2578105番に位置するSSO2815、 SSO2816の2つの遺伝子でコードされるα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子を例示することができる。さらに、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバ
キュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【００７４】
本発明の微生物は、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性に必要な電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することによって、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性としては、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性やピルビン酸シンターゼ活性を挙げることができる。また、電子供与体のリサイクル活性の増強に加えて、α−ケトグルタル酸シンターゼ活性が増大するように改変することによって、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。なお、上記親株は、本来内在的に電子供与体のリサイクル活性をコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来は電子供与体のリサイクル活性を有さないが、当該活性をコードする遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ−グルタミン酸生産能が向上するものであってもよい。
【００７５】
「フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ」とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素（EC 1.18.1.2）をいう。
【００７６】
還元型フェレドキシン + NADP+ = 酸化型フェレドキシン + NADPH + H+
【００７７】
本反応は、可逆反応であり、NADPHと酸化型フェレドキシン存在下で、還元型フェレドキシンを産生することが可能である。フェレドキシンはフラボドキシンと代替可能でありフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼと命名されているものも同等の機能を有する。フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼは微生物から高等生物まで幅広く存在が確認されており（Carrillo, N. and Ceccarelli, E. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270: 1900-1915; Ceccarelli, E. A., Arakaki, A. K., Cortez, N., Carrillo, N. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698: 155-165参照）、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ-フェレドキシンオキシドレダクターゼと命名されているものもある。
【００７８】
フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性が増強されたことの確認は、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を比較することにより達成される。フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性は、例えば、Blaschkowskiらの方法（Blaschkowski, H. P., Neuer, G., Ludwig-Festl, M., and Knappe, J. 1982. Eur. J. Biochem. 123: 563-569）に従って測定できる。例えば、基質としてフェレドキシンを用い、減少するNADPH量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのNADPHの酸化量で表される。親株がフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を有している場合、親株の活性が十分高ければ、増強する必要はないが、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。
【００７９】
フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼをコードする遺伝子は、多くの生物種で見出されており、目的のＬ−アミノ酸生産株中で活性を有するものであれば使用することが可能である。エシェリヒア・コリではフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼとしてfpr遺伝子が同定されている（Bianchi, V., Reichard, P., Eliasson, R., Pontis, E., Krook, M., Jornvall, H., and Haggard-Ljungquist, E. 1993. J. Bacteriol. 175:1590-1595）。また、シュードモナス・プチダ(Psuedomonas putida)には、ＮＡＤＰＨ−プチダレドキシンレダクターゼ（Putidaredoxin reductase）遺伝子とプチダレドキシン（Putidaredoxin）遺伝子がオペロンとして存在することが知られている(Koga, H., Yamaguchi, E., Matsunaga, K., Aramaki, H., and Horiuchi, T. 1989. J. Biochem. (Tokyo) 106: 831-836）。
【００８０】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼとしては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号4111749〜4112495（相補鎖）に位置する、配列番号５に示す塩基配列を有するfpr遺伝子を例示することができる。配列番号６にはFprのアミノ酸配列を示した（Genbank Accession No. AAC76906）。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（Genbank Accession No.
BA00036）の塩基番号2526234〜2527211にフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子が見出されている（Genbank Accession No. BAB99777）。
【００８１】
「ピルビン酸シンターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記反応を触媒する酵素（EC 1.2.7.1）をいう。
【００８２】
還元型フェレドキシン + アセチル-CoA + CO2 = 酸化型フェレドキシン + ピルビン酸
【００８３】
本反応は、可逆反応であり、ピルビン酸と酸化型フェレドキシン存在下で、還元型フェレドキシンを産生することが可能である。ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシン（フラボドキシン）レダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼと命名されているものもある。本酵素活性をα−ケトグルタル酸シンターゼ活性と組み合わせることにより、α−ケトグルタル酸シンターゼ活性により消費された還元型フェレドキシンをピルビン酸シンターゼの逆反応の活性により再生することが可能となる。
【００８４】
ピルビン酸シンターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸シンターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸シンターゼの活性は、例えば、Yoonらの方法（Yoon, K. S., Ishii, M., Kodama, T., and Igarashi, Y. 1997. Arch. Microbiol. 167: 275-279）に従って測定できる。測定原理は上述のα−ケトグルタル酸シンターゼの活性測定と同じであり、例えば、基質としてピルビン酸を用い、ピルビン酸脱炭酸反応の際に還元されるメチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸シンターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸シンターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。
【００８５】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のピルビン酸シンターゼ遺伝子、ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのピルビン酸シンターゼ遺伝子等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌の遺伝子を利用することが可能である。
【００８６】
具体的には、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）のピルビン酸シンターゼ遺伝子として、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（Genbank Accession No. NC_002932）の塩基番号1534432〜1537989に位置する、配列番号７に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号８には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（Genbank Accession No. AAC76906）。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのピルビン酸シンターゼは、δサブユニット（Genbank Accession No. BAA95604）、αサブユニット（Genbank Accession No. BAA95605）、βサブユニット（Genbank Accession No. BAA95606）、γサブユニット（Genbank Accession No. BAA95607）の４つのサブユ
ニットによる複合体を形成していることが知られている（Ikeda, T., Ochiai, T., Morita, S., Nishiyama, A., Yamada, E., Arai, H., Ishii, M. and Igarashi, Y. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340: 76-82）。さらに、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 000915）の塩基番号1170138〜1173296番に位置するHP1108、HP1109、HP1110、HP1111の4つの遺伝子でコードされるピルビン酸シンターゼ遺伝子、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 002754）の塩基番号1047593〜1044711番で示されるSSO1208、SSO7412、SSO1207、SSO1206の4つの遺伝子でコードされるピルビン酸シンターゼ遺伝子を例示することができる。さらに、ピルビン酸シンターゼ遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【００８７】
α−ケトグルタル酸シンターゼの活性には、フェレドキシン又はフラボドキシンが電子供与体として存在することが必要である。従って、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変することによって、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物であってもよい。また、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性の増強、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼあるいは、ピルビン酸シンターゼ活性が増強するように改変することに加えて、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変してもよい。
【００８８】
本発明における「フェレドキシン」とは、非ヘム鉄原子（Fe）と、硫黄原子を含み、4Fe-4S、3Fe-4S、あるいは、2Fe-2Sクラスターと呼ばれる鉄−硫黄クラスターを結合したタンパク質で1電子の伝達体として機能するものを指す。「フラボドキシン」とはFMN（Flavin-mononucleotide）を補欠分子属として含む1あるいは2電子の伝達体として機能するものタンパク質を指す。フェレドキシンとフラボドキシンについては、McLeanらの文献に記載されている（McLean, K. J., Sabri, M., Marshall, K. R., Lawson, R. J., Lewis,  D. G., Clift, D., Balding, P. R., Dunford, A. J., Warman, A. J., McVey, J. P., Quinn, A. M., Sutcliffe, M. J., Scrutton, N. S., and Munro, A. W. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33: 796-801）。
【００８９】
なお、改変に用いる親株は、本来内在的にフェレドキシン又はフラボドキシンをコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はフェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を有さないが、フェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ−グルタミン酸生産能が向上するものであってもよい。
【００９０】
フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、フェレドキシン又はフラボドキシンのmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認できる。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【００９１】
また、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、SDS-PAGEや二次元電気泳動あるいは、抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and 
Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。生産量については、野生株あるいは非改変株と比較して、向上していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【００９２】
フェレドキシン及びフラボドキシンの活性は、適切な酸化還元反応系に加えることで測定することが可能である。例えば、Boyerらにより、産生されたフェレドキシンをフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼにより還元し、生じた還元型フェレドキシンによるチトクロームCの還元を定量する方法が開示されている（Boyer, M. E., Wang, C. W., and Swartz, J. R. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94: 128-138）。また、フラボドキシンの活性は、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼを用いることで、同じ方法で測定が可能である。
【００９３】
フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードする遺伝子は、広く分布しており、α−ケトグルタル酸シンターゼと電子供与体再生系が利用可能なものであれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリには、2Fe-2Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてfdx遺伝子が存在し（Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-11125）、4Fe-4Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてyfhL遺伝子が予想されている。また、フラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子（Osborne, C., Chen, L. M., and Matthews, R. G. 1991. J. Bacteriol. 173: 1729-1737）とfldB遺伝子（Gaudu, P. and Weiss, B. 2000. J. Bacteriol. 182:1788-1793）の存在が知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（Genbank Accession No. BA00036）においては、塩基番号562643〜562963番に複数のフェレドキシン遺伝子fdx（Genbank Accession No. BAB97942）及び塩基番号1148953〜1149270番にfer（Genbank Accession No. BAB98495）が見出されている。また、クロロビウム・テピダムにおいては、多くのフェレドキシン遺伝子が存在するが、ピルビン酸シンターゼの電子受容体となる4Fe-4S型のフェレドキシン遺伝子としてフェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIが同定されている（Yoon, K. S., Bobst, C., Hemann, C. F., Hille, R., and Tabita, F. R. 2001. J. Biol. Chem. 276: 44027-44036）。ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのフェレドキシン遺伝子等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌由来のフェレドキシンあるいはフラボドキシンを用いることもできる。
【００９４】
具体的には、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子として、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号2654770〜2655105番（相補鎖）に位置する配列番号９に示すfdx遺伝子、及び塩基番号2697685〜2697945番に位置する配列番号１１に示すyfhL遺伝子を例示することができる。配列番号１０及び配列番号１２には、Fdx及びYfhLのアミノ酸配列を示した（それぞれ、Genbank Accession No. AAC75578及びAAC75615）。エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子としては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号710688〜710158番（相補鎖）に位置する配列番号１３に示すfldA遺伝子、及び塩基番号3037877〜3038398 番に位置する配列番号１５に示すfldB遺伝子を例示することができる。配列番号１４及び配列番号１６には、fldA遺伝子及びfldB遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（それぞれ、Genbank Accession No. AAC73778及びAAC75933）。
【００９５】
クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のフェレドキシン遺伝子としては、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（Genbank Accession No. NC_002932）の塩基番号1184078〜1184266番に位置する配列番号１７に示すフェレドキシンＩ遺伝子、及び塩基番号1184476〜1184664番に位置する配列番号１９に示すフェレドキシンII遺伝子を例示することができる。配列番号１８及び配列番号２０には、フェレドキシンＩ及びフェレドキシンII
がコードするアミノ酸配列を示した（それぞれ、Genbank Accession No. AAM72491及びAAM72490）。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）のフェレドキシン遺伝子（Genbank Accession No. BAE02673）やスルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列中の塩基番号2345414〜2345728番で示されるスルフォロバス・ソルファタリカスのフェレドキシン遺伝子を例示することができる。さらに、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよく、さらにはエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ−プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【００９６】
これらのα−ケトグルタル酸シンターゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ、ピルビン酸シンターゼ、フェレドキシン、フラボドキシンをコードする遺伝子（以後、総称して、本発明の遺伝子という）は、コードされるタンパク質の活性、すなわち、機能が損なわれない限り、１若しくは数個の位置で１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有する保存的バリアントをコードするものであってもよい。ここで、数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
【００９７】
上記置換は、機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である
【００９８】
より具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、本発明の遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００９９】
また、それぞれ本発明の遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様に本発明の遺伝子は、機能を有する限り、コードされるタンパク質のＮ末端側、及び／又は、C末端側が延長又は、削られていてもよい。例えば延長する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。
【０１００】
上記のような保存的バリアントをコードする遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように塩基配列を改変することによって取得することができる。また、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては本発明の遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、本発明の遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。これらの遺伝子がα−ケトグルタル酸シンターゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ、ピルビン酸シンターゼ、フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードしているかどうかは、例えば、これらの遺伝子をＬ−アミノ酸生産能を有する微生物に導入し、各タンパク質の活性を測定することによって確認できる。
【０１０１】
本発明の遺伝子は、上述の塩基配列を有するDNA、またはこれらの塩基配列を有するDNAから調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−ケトグルタル酸シンターゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ、ピルビン酸シンターゼ、フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードするDNAであってもよい。
【０１０２】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば70％以上、好ましくは80％以上、より好ましく90％以上、特に好ましくは95％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
【０１０３】
プローブは、本発明の遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCR反応により作製することができる。なお、プローブに300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、上記の条件でハイブリダイズさせた後の洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられる。
【０１０４】
上記の保存的バリアントに関する記載は、前記のＬ−アミノ酸生産能の付与について記載した酵素及び遺伝子にも適用される。
【０１０５】
上述のような本発明の遺伝子の発現を増強するための改変は、Ｌ−アミノ酸生産能の付与について記載した目的遺伝子の発現を増強する方法と同様にして行うことができる。本発明の遺伝子は、それらを保持する微生物の染色体DNAを鋳型にして、PCR法により取得することができる。
【０１０６】
例えば、クロロビウム・テピダムのα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子は、配列番号１及び３の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号２１、２２に示すプライマーを用いて、クロロビウム・テピダムの染色体DNAを鋳型とするPCR（polymerase
chain reaction）法（White, T. J., Arnheim, N., and Erlich, H. A. 1989. Trends Genet. 5: 185-189参照）によって、取得することができる。
【０１０７】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子は、配列番号５の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号３２、３３に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【０１０８】
クロロビウム・テピダムのピルビン酸シンターゼ遺伝子は、配列番号７の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号２３、２４に示すプライマーを用いて、クロロビウム・テピダムの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【０１０９】
エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子fdxは、配列番号９の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号３８、３９に示すプライマーを用いて、フェレドキシン遺伝子yfhLは、配列番号１１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号４０、４１に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、各々取得することができる。
【０１１０】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子fldAは、配列番号１３の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号３４、３５に示すプライマーを用いて、フラボドキシン遺伝子fldBは、配列番号１５の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号３６、３７に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、各々取得することができる。
【０１１１】
また、クロロビウム・テピダムのフェレドキシンＩ遺伝子は、配列番号１７の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号２５、２６に示すプライマーを用いて、クロロビウム・テピダムの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。
【０１１２】
他の微生物に由来する本発明の遺伝子も、上記の各遺伝子の配列情報、又は、その微生物において公知の遺伝子又はタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体DNA又は染色体DNAライブラリーから、取得することができる。なお、染色体DNAは、DNA供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（Saito, H. and Miura, K. I. 1963. Biochem. Biophys. Acta, 72, 619-629; 生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【０１１３】
本発明の遺伝子の発現の増強は、上述したような方法により、形質転換や相同組み換えによって本発明の遺伝子のコピー数を高めたり、本発明の遺伝子の発現調節配列を改変したりすることによって達成することができる。また、本発明の遺伝子の発現の増強は、本発明の遺伝子の発現を上昇させるようなアクチベーターを増幅させるか、及び／又は、本発明の遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成出来る。
【０１１４】
尚、遺伝子のコピー数を高める場合、目的遺伝子の産物の活性を増強できれば、コピー数は特に制限されないが、微生物がもともと目的遺伝子を有している場合は、２以上であることが好ましい。また、微生物が本発明の遺伝子をもともと有していない場合は、導入される遺伝子のコピー数は１であってもよいが、２以上であってもよい。
【０１１５】
α−ケトグルタル酸シンターゼのように、複数のサブユニットからなる場合は、各々のサブユニットをコードする遺伝子の発現は、別個に増強してもよく、ポリシストロンとして同時に増強してもよい。また、遺伝子をベクターを用いて微生物に導入する場合、各サ
ブユニットをコードする遺伝子は、単一のベクター分子に同時に担持させてもよく、異なるベクター分子に別個に担持させてもよい。また、遺伝子を染色体に挿入する場合も、各サブユニットをコードする遺伝子は、染色体上の同一部位に同時に挿入してもよく、異なる位置に別個に挿入してもよい。
【０１１６】
また、本発明の微生物は、α−ケトグルタル酸シンターゼ活性の増強に加えて、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下していることが好ましい。このような微生物は、例えば上述する方法により、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が破壊された微生物を、本発明の遺伝子を含む組換えベクターでそれぞれ形質転換することにより得ることができる。
【０１１７】
本発明において、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「α-KGDH」ということがある）活性とは、α−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸）を酸化的に脱炭酸し、サクシニル−CoA(succinyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記反応は、α-KGDH（E1o：α−ketoglutarate dehydrogenase, EC:1.2.4.2）、ジヒドロリポアミドＳ−サクシニルトランスフェラーゼ（E2o：dihydrolipoamide-S-succinyltransferase; EC:2.3.1.61）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3：dihydrolipoamide dehydrogenase; EC:1.8.1.4）の３種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの３種類のサブユニットはそれぞれ以下の反応を触媒し、これら３つの反応を合わせた反応を触媒する活性をα-KGDH活性という。α-KGDH活性の確認は、Shiioらの方法（Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980）に従って測定することができる。
【０１１８】
E1o: 2-oxoglutarate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine = [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] S-succinyldihydrolipoyllysine + CO2
E2o：CoA + enzyme N6-(S-succinyldihydrolipoyl)lysine = succinyl-CoA + enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine
E3: protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ = protein N6-(lipoyl)lysine + NADH
+ H+
【０１１９】
なお、α-KGDHは、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（oxoglutarate dehydrogenase）、２-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（2-oxoglutarate dehydrogenase）とも呼ばれる。
【０１２０】
腸内細菌科、例えばパントエア・アナナティスでは、この３種それぞれの酵素活性を有するサブユニットタンパク質が複合体を形成している。そして、各サブユニットは各々sucA、sucB及びlpdによってコードされ、sucA、sucB遺伝子は、サクシネートデヒドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイン遺伝子（sdhB）の下流に存在している（米国特許第6,331,419号）。尚、同特許には、これらの遺伝子はエンテロバクター・アグロメランスAJ13355の遺伝子として記載されているが、同菌株は、後にパントエア・アナナティスに再分類されている。
【０１２１】
腸内細菌のα-KGDHをコードする遺伝子として、パントエア・アナナティスのsucA、sucB及び下流に存在するsucC遺伝子の塩基配列及びの塩基配列及び各サブユニットのアミノ酸配列を、配列番号４６〜５０に示す。また、エシェリヒア・コリのα-KGDHをコードするsucA、sucBは、それぞれGenbank NP_415254, NP_415255に開示されている。
【０１２２】
また、コリネ型細菌では、E1oサブユニットはodhA遺伝子（sucA遺伝子とも呼ばれるGenBank Accession No. NC_003450のNCgl1084として登録されている）によってコードされ、
E3サブユニットはlpd遺伝子（GenBank Accession No. Y16642）によってコードされている。一方、E2oサブユニットは、E1oサブユニットとともに２機能性タンパク質としてodhA遺伝子にコードされているか（Usuda et al., Microbiology 1996 142, 3347-3354参照）、あるいはodhA遺伝子とは別のGenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126として登録されている遺伝子によってコードされていると推測されている。従って、本発明においては、odhA遺伝子は、E1oサブユニットをコードする遺伝子であるが、併せてE2oをコードしていてもよい。
【０１２３】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのodhA遺伝子の塩基配列及びE1oサブユニットのアミノ酸配列（GenBank Accession No. NC_003450のNCgl1084、WO2006/028298）を、配列番号５１、５２に示す。また、上記GenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126の塩基配列及び同配列によりコードされるE2oサブユニットのアミノ酸配列を、配列番号５３、５４に示す。
【０１２４】
また、本発明の微生物は、嫌気または微好気の条件で培養を行う場合には、α−ケトグルタル酸シンターゼ活性の増強に加えて、嫌気または微好気の条件で有機酸またはエタノールを産生しないように改変された微生物であってもよい。ここで有機酸としては、乳酸、ギ酸、酢酸が挙げられる。有機酸またはエタノールを産生しないように改変する方法としては、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を破壊する方法が挙げられる（Verumi, G. N., Eiteman, M. A., and Altman, E. 2002. J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 28: 325-332; 特開2005-95169）。
【０１２５】
＜２＞本発明のＬ−グルタミン酸の製造方法
本発明の方法は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニンからなる群より選ばれる１又は２以上のＬ−アミノ酸の生産能を有し、かつ、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物を培地で培養して、前記Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法である。本発明の方法は、好気的条件下で培養してもよく、嫌気的又は微好気条件下で培養してもよい。通常、培地に酸素を含む気体を通気するか、又は培地を攪拌すれば、好気的条件となる。また、通常、通気及び攪拌を行わないか、通気量又は攪拌頻度を低くすれば、嫌気的又は微好気条件となる。
【０１２６】
微生物を培地で培養するに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接液体培地に接種しても良いが、微生物を予め液体培地で培養（種培養）したものを本培養用の培地（発酵培地）に接種するのが好ましい。
【０１２７】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。
【０１２８】
炭素源としては、微生物が資化してＬ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、又はＬ−アルギニンを生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース、脂肪酸等の炭水化物がよく用いられ、グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール、エタノール等のアルコール類等糖質も用いられる。このうちグルコース、フルクトース、シュークロース、グリセロール、エタノールが好ましく、特にグルコースとグリセロールが好ましい
。粗グリセロールがバイオディーゼル燃料生産において産生される粗グリセロールを使用することが好ましい。炭素源は、１種でもよく、２種以上の混合物であってもよい。
【０１２９】
また、上記糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜、粗グリセロールなども使用される。上記炭素源の濃度は特に限定されないが、Ｌ−アミノ酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、5から30％（W/V）、好ましくは10〜20％（W/V）の範囲内で発酵が行われる。また、発酵の進行に伴う上記炭素源の減少にあわせ、炭素源の追加添加を行っても良い。
【０１３０】
また、窒素源としては、微生物が資化してＬ−アミノ酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【０１３１】
培養液のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本培養におけるpHは、通常、pH5〜10、好ましくはpH6〜9.5であることが好ましいので、培養中も必要に応じて培養液のpHはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
【０１３２】
本発明で用いる培地には、上記した炭素源と、炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、好気または微好気・嫌気的条件で培養することができる培地が好ましい。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸あるいは重炭酸、またはこれらの塩あるいは炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、0.001〜5M、好ましくは0.1〜3M、さらに好ましくは1〜2Mの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液1L当たり50mg〜25g、好ましくは100mg〜15g、さらに好ましくは150mg〜10gの炭酸ガスを含有させる。
【０１３３】
通常、微生物の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給する好気的条件で培養することが好ましい。一方、本発明の方法では、通気、攪拌して好気的条件で培養を行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気・微好気の条件で培養を行ってもよい。例えば、通気量や攪拌を低下させる、容器を密閉して無通気で反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法により、様々な溶存酸素濃度条件を設定することができる。
【０１３４】
培養温度は、通常、25℃〜40℃、好ましくは30℃〜37℃である。培養時間は1時間〜168時間が好ましく、3時間〜72時間がより好ましい。
【０１３５】
培養期間を、微生物を増殖させる培養と、Ｌ−アミノ酸を生産させる培養に分け、それぞれ異なる培地又は条件で培養を行ってもよい。例えば、通気又は攪拌下で微生物を増殖させた後、嫌気又は微好気の条件下でＬ−アミノ酸を生産させてもよい。
【０１３６】
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調製された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、pH5.0〜4.0、好ましくはpH4.5〜4.0、さらに好ましくはpH4.3〜4.0、特に好ましくはpH4.0を挙げることができる。
【０１３７】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【実施例】
【０１３８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
【０１３９】
〔実施例１〕＜クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、フェレドキシン遺伝子発現プラスミドの構築＞
クロロビウム・テピダムは、至適生育温度が48℃の中高温性独立栄養細菌であり、TLS株のゲノム配列がEisenらによって明らかにされている（Eisen, J. A. et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 9509-9514）。この菌株からα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、フェレドキシン遺伝子を単離し、３つの遺伝子を同時に発現するプラスミドを構築した。
【０１４０】
＜１−１＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築
クロロビウム・テピダムTLS株（ATCC49652）の染色体を鋳型として、配列番号２１、２２に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、α−ケトグルタル酸シンターゼのαサブユニット及びβサブユニットを含む遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片をBamHIで切断し、pSTV28（タカラバイオ社製）のBamHI部位に挿入し、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現用プラスミドを構築し、pSTV-KGSと名付けた。本プラスミドでは、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子はpSV28由来のlacプロモーターの下流に位置して、そのプロモーターから発現させることが出来る。
【０１４１】
＜１−２＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築
クロロビウム・テピダムTLS株（ATCC49652）の染色体を鋳型として、配列番号２３、２４に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、ピルビン酸シンターゼ遺伝子断片を増幅した。この遺伝子断片をXbaIで切断し、pSTV-KGSをXbaIで処理したものと連結しα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子及びピルビン酸シンターゼ遺伝子発現用プラスミドを構築し、pSTV-KGS-PSと名付けた。
【０１４２】
＜１−３＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、フェレドキシン遺伝子発現プラスミドの構築
クロロビウム・テピダムTLS株（ATCC49652）の染色体を鋳型として、配列番号２５、２６に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、フェレドキシンＩ遺伝子断片を増幅した。遺伝子断片をSmaIで切断し、pSTV-KGS-PSをSmaIで処理したものと連結しα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子及びフェレドキシンＩ遺伝子発現用プラスミドを構築し、pSTV-FdI-KGS-PSと名付けた。本プラスミドでは、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子及びフェレドキシンＩ
はpSTV28のlacプロモーターの下流に位置して、そのプロモーターから発現させることが出来る。
【０１４３】
〔実施例２〕＜エシェリヒア・コリα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損株の構築＞＜２−１＞エシェリヒア・コリのsucA遺伝子破壊用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655株より、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニットをコードするsucA遺伝子が破壊された株を作製した。ゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号757929〜760730に位置するsucA遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを鋳型として、sucA遺伝子のN末およびC末断片をPCR法により増幅した。エシェリヒア・コリのsucA遺伝子の配列番号を配列番号xxに示す。N末端断片増幅用PCR用プライマーには配列番号４２、４３のオリゴヌクレオチドを、C末端断片増幅用PCR用プライマーには配列番号４４、４５のオリゴヌクレオチドを用いた。配列番号４２のオリゴヌクレオチドには、HindIIIサイトが、配列番号４５のオリゴヌクレオチドにはXbaIサイトがそれぞれデザインされている。
【０１４４】
PCR後の増幅DNA断片は、それぞれ、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社製）にて精製し、精製したN末端DNA断片およびC末端DNA断片、配列番号４２及び４５のプライマーを用いて、クロスオーバーPCR法（Link, A. J., Phillips, D. and Church, G. M. 1997. J. Bacteriol. 179: 6228-6237）により、欠損型sucA断片を得た。精製したDNA断片を、HindIII及びXbaI（タカラバイオ社製）にて切断した後、同様にHindIII及びXbaIで切断した温度感受性プラスミドpMAN997（Matsui, H., Kawasaki, H., Shimaoka, M., and Kurahashi, O. 2001. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65: 570-578、WO99/03988）にクローニングすることで、sucA破壊用プラスミドを構築し、pMANΔsucAと名付けた。
【０１４５】
＜２−２＞エシェリヒア・コリMG1655株由来α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損株の構築
プラスミドpMANΔsucAでエシェリヒア・コリMG1655株を形質転換し、LB＋アンピシリンプレート（アンピシリンを25μg/mL含むLB寒天プレート）で30℃にてコロニーを選択した。選択したクローンを30℃で一晩液体培養した後、培養液を1000倍希釈してLB＋アンピシリンプレートにまき、42℃でコロニーを選択した。選択したクローンをLB＋アンピシリンプレートに塗り広げて30℃で培養した後、プレートの1/8の菌体をLB培地 2 mLに懸濁し、42℃で4〜5時間振とう培養した。10000倍希釈した菌体培養液をLBプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋アンピシリンプレートに植菌し、生育を確認することで、アンピシリン感受性株を選択した。アンピシリン感受性株の数株についてコロニーPCRを行い、sucA遺伝子の欠失を確認した。こうしてエシェリヒア・コリMG1655株由来のsucA欠失株MG1655ΔsucA株を得た。
【０１４６】
〔実施例３〕＜エシェリヒア・コリ乳酸デヒドロゲナーゼ欠損株の構築＞
乳酸デヒドロゲナーゼはNADHを補酵素としてピルビン酸から乳酸を生成する反応を行う酵素である。エシェリヒア・コリの酸素制限下での培養において、乳酸の生成を抑えるために乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子の欠損株を構築した。本遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203）によって実施した。本手法により目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組み合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。
【０１４７】
＜３−１＞乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子欠損株の構築
WO2005/010175の記載に従って、ldhA遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に、λファージのattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、それぞれ有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてプラスミドpMW118-attL-Cm-attRを鋳型としてPCRを行った。プライマーに用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を配列番号２７、２８に示す。増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655ΔsucA株にエレクトロポレーションにより導入した。次に、プラスミドpKD46が脱落したアンピシリン感受性株を取得し、ldhA遺伝子の欠失をPCRによって確認した。さらに、ldhA遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、アンピシリン耐性株を選択した。尚、前記pMW-intxis-tsは、λファージ由来のインテグラーゼ（Int）遺伝子と切出し酵素（excisionase、Xis）遺伝子を有し、複製が温度感受性のプラスミドである。
【０１４８】
その後、アンピシリン感受性、かつクロラムフェニコール感受性により、att-cat及びpMW-intxis-tsが脱落しているldhA破壊株を取得した。得られたldhA欠損候補株より染色体DNAを調製し、配列番号２９、３０に示されるオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、MG1655ΔsucA株より調製した染色体DNAを鋳型としてPCRを行った場合よりも約1.0kb小さいバンドが認められたldhA欠損株を、MG1655ΔsucAΔldhA株と名付けた。
【０１４９】
〔実施例４〕＜クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現株のα−ケトグルタル酸シンターゼ活性の測定＞
クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子がエシェリヒア・コリにおいて活性発現していることを確認するため、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現ベクターを構築し、MG1655ΔsucAに導入して、活性を測定した。
【０１５０】
＜４−１＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築
クロロビウム・テピダムTLS株（ATCC49652）の染色体を鋳型として、配列番号２１、２２に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片をBamHIで切断し、pUC18（タカラバイオ製）のBamHI部位に挿入し、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現用プラスミドを構築し、pUC-KGSと名付けた。本プラスミドでは、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子はpUC18のlacプロモーターの下流に位置して、そのプロモーターから発現させることが出来る。また、pUC18のコピー数はpSTV28よりも高いことから、酵素活性の検出が容易である。
【０１５１】
＜４−２＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現株の粗酵素液の調製
MG1655ΔsucAに、pUC-KGS、比較対照用のベクターpUC18をエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を得た。プラスミドの導入を確認後、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現株をMG1655ΔsucA/pUC-KGS、 対照株をMG1655ΔsucA/pUC18と名付けた。
【０１５２】
上述の株を1mMのIPTGを含んだLB培地に植菌し、37℃で一晩前培養した。10ml分の菌体を遠心分離により回収し、300μlの50mM HEPES緩衝液（pH 8.0）で懸濁した。懸濁液を超音波破砕機で破砕し、15000rpmで15分間遠心した後、得られた上清を粗酵素液とした。
【０１５３】
＜４−３＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現株の粗
酵素液のα−ケトグルタル酸シンターゼ活性の測定
【０１５４】
下に示す反応溶液1mlに粗酵素液50μlを加えて反応を行った。まず基質となるα−ケトグルタル酸以外を全て含んだ反応溶液を分光測定用セルに加え、ゴム栓とアルミキャップを用いてセルを密閉した。シリンジを用いてアルゴンガスを5分間セルの中に吹き込みセル内の酸素濃度を低くした。セルを分光光度計（日立社製U-3210 Spectrophotometer）にセットし、シリンジを用いてα−ケトグルタル酸溶液を添加して反応を開始した。37℃で30分反応を行い、定時的に578nmの吸光度を測定して還元型メチルビオロゲンの量の変化を追った。
【０１５５】
〔反応液〕
MgCl2                    1mM
Dithiothreitol           1mM
メチルビオロゲン         5mM
CoA                      0.25mM
α−ケトグルタル酸      10mM (測定開始直前に添加)
HEPES (pH8.0)           50mM
【０１５６】
結果を表１に示す。上記の反応系において、α−ケトグルタル酸シンターゼによるα−ケトグルタル酸の脱炭酸反応によって還元型メチルビオロゲンが増大する。還元型メチルビオロゲンの578nmにおける吸光係数はε578 = 9.8/mM/cmであり、酵素活性１Uは１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表した。対照株MG1655ΔsucA/pUC18ではα−ケトグルタル酸シンターゼ活性は確認されなかったが、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現株MG1655ΔsucA/pUC18-KGSでは0.1U/mgの活性が確認された。
【０１５７】
【表１】
2010130899.tif 000002
【０１５８】
〔実施例５〕＜クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、フェレドキシン遺伝子発現株の酸素濃度制限下でのＬ−グルタミン酸生産能への効果＞
α−ケトグルタル酸シンターゼ活性の発現が、酸素濃度制限下でのＬ−グルタミン酸生産に与える影響を検討するため、上述のクロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、フェレドキシン遺伝子発現用プラスミドpSTV-KGS-PS-FdIをMG1655ΔsucAΔldhAに導入して、培養を行った。
【０１５９】
MG1655ΔsucAΔldhAに、pSTV-FdI-KGS-PS、比較対照用のベクターpSTV28を、エレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を得た。プラスミドの導入を確認後、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、フェレドキシン遺伝子発現株をMG1655ΔsucAΔldhA/pSTV-FdI-KGS-PS、対照株をMG1655ΔsucAΔldhA/pSTV28と名付けた。
【０１６０】
上記で作製した株を用いて培養を行い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討した。
MG1655ΔsucAΔldhA/pSTV-FdI-KGS-PS及び対照株MG1655ΔsucAΔldhA/pSTV28をLB培地に植菌し、37℃で一晩前培養した。プレート1/6枚分の菌体を500ml容三角フラスコ中50ml
の下記組成のグルコース培地に植菌し、37℃にて31時間培養した。酸素制限を行うため攪拌速度は100rpmで培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸を、バイオテックアナライザー（旭化成工業）により測定した。
【０１６１】
〔グルコース培地組成〕
グルコース             40g/L
MgSO4・7H20              1.0 g/L
(NH4)2SO4              20 g/L
KH2PO4                  1.0g/L
酵母エキス              2.0g/L
FeSO4・7H20              0.01g/L
MnSO4・5H20              0.01g/L
Thiamine HCl            0.01g/L
クロラムフェニコール   25mg/L
炭酸カルシウム         50g/L
pH7.0 (KOHで調整)  殺菌条件：120℃、20分
【０１６２】
結果を表２に示す。対照のMG1655ΔsucAΔldhA/pSTV28に比べ、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、フェレドキシン遺伝子発現用ベクターを導入したMG1655ΔsucAΔldhA/pSTV-FdI-KGS-PSは、消費グルコースに対するＬ−グルタミン酸収率が0.6%向上した。
【０１６３】
【表２】
2010130899.tif 000003
【０１６４】
〔実施例６〕＜クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、フェレドキシン遺伝子発現株のグリセロールを炭素源でのＬ−グルタミン酸生産能への効果＞
クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、フェレドキシン遺伝子発現株MG1655ΔsucAΔldhA/pSTV-FdI-KGS-PSと対照株MG1655ΔsucAΔldhA/pSTV28を用いて、グリセロールを炭素源としたときのＬ−グルタミン酸生産能を調べた。
【０１６５】
MG1655ΔsucAΔldhA/pSTV-FdI-KGS-PS及び対照株MG1655ΔsucAΔldhA/pSTV28をLB培地に植菌して、37℃で一晩前培養した。プレート1/2枚分の菌体を500ml容坂口フラスコ中20mlの下記組成のグリセロール培地に植菌し、37℃にて攪拌速度120rpmで好気的に29時間培養した。培養終了後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸を、バイオテックアナライザー（旭化成工業）により測定した。
【０１６６】
〔グリセロール培地組成〕
グリセロール            50g/L
MgSO4・7H20               1.0 g/L
(NH4)2SO4               20 g/L
KH2PO4                   1.0g/L
酵母エキス               2.0g/L
FeSO4・7H20               0.01g/L
MnSO4・5H20               0.01g/L
Thiamine HCl             0.01g/L
クロラムフェニコール    25mg/L
炭酸カルシウム          30g/L
pH7.0 (KOHで調整)  殺菌条件：120℃、20分
【０１６７】
結果を表３に示す。対照のMG1655ΔsucAΔldhA/pSTV28に比べ、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子及び、フェレドキシン遺伝子発現用ベクターを導入したMG1655ΔsucAΔldhA/pSTV-FdI-KGS-PSは、消費グリセロールに対するＬ−グルタミン酸収率が6%向上した。
【０１６８】
【表３】
2010130899.tif 000004
【０１６９】
〔実施例７〕＜クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン・フラボドキシン遺伝子発現プラスミドの構築＞
α−ケトグルタル酸シンターゼ活性に必要な補酵素再生系として、エシェリヒア・コリ由来のフラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子とエシェリヒア・コリ由来のフラボドキシン・フェレドキシンを用いて、３つの遺伝子を同時に発現するプラスミドを構築した。エシェリヒア・コリのフェレドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子としてはfpr遺伝子、エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子及びfldB遺伝子、フェレドキシン遺伝子としてはfdx遺伝子及びyfhL遺伝子を用いた。
【０１７０】
＜７−１＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドの構築
実施例１にて構築したpSTV-KGS をBamHIで切断し、得られたα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子断片をpMWPthrのBamHI部位に挿入し、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現用ベクターpMWPthr-KGSを構築した。pMWPthrはベクターpMW118（ニッポンジーン社製）のHindIIIサイトとXbaIサイトの間に配列番号３１に示したエシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号183〜330番に位置するスレオニンオペロン（thrABC）のプロモーター領域（Pthr）を有しており、このプロモーターの下流に遺伝子をクローニングすることによって遺伝子発現が可能なプラスミドである。
【０１７１】
＜７−２＞エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅ベクターの構築
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体を鋳型として、配列番号３２、３３に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子断片を増幅した。遺伝子断片をSmaIで切断し、pMWPthrのSmaI部位に挿入し、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅用プラスミドを構築し、pMWPthr-fprと名付けた。
【０１７２】
＜７−３＞エシェリヒア・コリ由来フラボドキシンfldA遺伝子増幅ベクターの構築
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体を鋳型として、配列番号３４、３５に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、フラボドキシンfldA遺伝子断片を増幅した。遺伝子断片をEcoRIで切断し、pMWPthrのEcoRI部位に挿入し、フラボドキシンfldA遺伝子
増幅用プラスミドpMWPthr-fldAを構築した。
【０１７３】
＜７−４＞エシェリヒア・コリ由来フラボドキシンfldB遺伝子増幅プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体を鋳型として、配列番号３６、３７に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、フラボドキシンfldB遺伝子断片を増幅した。遺伝子断片をEcoRIで切断し、pMWPthrのEcoRI部位に挿入し、フラボドキシンfldB遺伝子増幅用プラスミドpMWPthr-fldBを構築した。
【０１７４】
＜７−５＞エシェリヒア・コリ由来フェレドキシンfdx遺伝子増幅プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体を鋳型として、配列番号３８、３９に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、フェレドキシンfdx遺伝子断片を増幅した。遺伝子断片をEcoRIで切断し、pMWPthrのEcoRI部位に挿入し、フェレドキシンfdx遺伝子増幅用プラスミドpMWPthr-fdxを構築した。
【０１７５】
＜７−６＞エシェリヒア・コリ由来フェレドキシンyfhL遺伝子増幅プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体を鋳型として、配列番号４０、４１に示されているオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、フェレドキシンyfhL遺伝子断片を増幅した。遺伝子断片をEcoRIで切断し、pMWPthrのEcoRI部位に挿入し、フェレドキシンyfhL遺伝子増幅用プラスミドpMWPthr-yfhLを構築した。
【０１７６】
＜７−７＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現、エシェリヒア・コリ由来フェレドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フラボドキシンfldA遺伝子増幅用プラスミドの構築
pMWPthr-fldAをEcoRIで切断し、得られたfldA遺伝子断片を、pMWPthr-KGSをEcoRIで処理したものと連結してpMWPthr-KGS-fldAを得た。次にpMWPthr-fprをSmaIで切断し、得られたfpr遺伝子断片を、pMWPthr-KGS-fldAをSmaIで処理したものと連結して、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フラボドキシンfldA遺伝子発現増強プラスミドpMWPthr-KGS-fpr-fldAを構築した。
【０１７７】
＜７−８＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フラボドキシンfldB遺伝子増幅用プラスミドの構築
pMWPthr-fldBをEcoRIで切断して得られたfldB遺伝子断片を、pMWPthr-KGSをEcoRIで処理したものと連結してpMWPthr-KGS-fldBを得た。次にpMWPthr-fprをSmaIで切断し、得られたfpr遺伝子断片を、pMWPthr-KGS-fldBをSmaIで処理したものと連結して、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フラボドキシンfldB遺伝子発現増強プラスミドpMWPthr-KGS-fpr-fldBを構築した。
【０１７８】
＜７−９＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンfdx遺伝子増幅用プラスミドの構築
pMWPthr-fdxをEcoRIで切断して得られたfdx遺伝子断片を、pMWPthr-KGSをEcoRIで処理したものと連結してpMWPthr-KGS-fdxを得た。次にpMWPthr-fprをSmaIで切断し、得られたfpr遺伝子断片を、pMWPthr-KGS-fdxをSmaIで処理したものと連結して、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンfdx遺伝子発現増強ベクターpMWPthr-KGS-fpr-fdxを構築した。
【０１７９】
＜７−１０＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンy
fhL遺伝子増幅用プラスミドの構築
pMWPthr-yfhLをEcoRIで切断して得られたyfhL遺伝子断片を、pMWPthr-KGSをEcoRIで処理したものと連結してpMWPthr-KGS-yfhLを得た。次にpMWPthr-fprをSmaIで切断し、得られたfpr遺伝子断片を、pMWPthr-KGS-yfhLをSmaIで処理したものと連結して、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンyfhL遺伝子発現増強プラスミドpMWPthr-KGS-fpr-yfhLを構築した。
【０１８０】
上記の各プラスミドにおいて、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子はPthrによって、他の遺伝子もPthrからのリードスルーによって転写される。
【０１８１】
〔実施例８〕＜クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン・フェレドキシン遺伝子発現増強株の酸素濃度制限下でのＬ−グルタミン酸生産能への効果＞
エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン遺伝子又はフェレドキシン遺伝子の増幅によるクロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ活性の増強が酸素濃度制限下でのＬ−グルタミン酸生産に与える影響を検討するため、上述のクロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、及びエシェリヒア・コリ由来フラボドキシン又はフェレドキシン遺伝子発現増強用ベクターを、それぞれMG1655ΔsucAΔldhAに導入して培養を行った。
【０１８２】
＜８−１＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン・フェレドキシン遺伝子増幅用プラスミドのMG1655ΔsucAΔldhA株への導入
MG1655ΔsucAΔldhAに、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現用ベクターpMWPthr-KGSと、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、及びエシェリヒア・コリ由来フラボドキシン・フェレドキシン遺伝子発現増強用プラスミドpMWPthr-KGS-fpr-fldA、pMWPthr-KGS-fpr-fldB、pMWPthr-KGS-fpr-fdx、又はpMWPthr-KGS-fpr-yfhLと、比較対照用プラスミドpMWPthr及びエシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅プラスミドpMWPthr-fprをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を得た。プラスミドの導入を確認後、それぞれのプラスミド導入株をMG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS、 MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthrKGS-fpr-fldB、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhL、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-fprと名付けた。
【０１８３】
＜８−２＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン・フェレドキシン遺伝子発現増強株のグリセロール炭素源でのＬ−グルタミン酸生産能への効果
＜８−１＞にて作製したクロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン・フェレドキシン遺伝子発現増強株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthrKGS-fpr-fldB、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhL、対照株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr及びエシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−Ｎ
ＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-fprを用いて、グリセロールを炭素源としたときの、好気条件でのＬ−グルタミン酸生産能を調べた。
【０１８４】
LB培地にて37℃で一晩前培養したプレート1/2枚分の各菌株の菌体を、500ml容坂口フラスコ中の20mlの培地（実施例６に記載のグリセロール培地にクロラムフェニコールの変わりに40mg/lのカナマイシンを加えたもの）に植菌し、37℃にて攪拌速度120rpmで29時間培養した。培養終了後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸を、バイオテックアナライザー（旭化成工業社製）により測定した。
【０１８５】
結果を表４に示す。対照のMG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-fprに比べ、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子発現株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGSは消費グリセロールに対するＬ−グルタミン酸収率が3%向上し、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン・フェレドキシン遺伝子発現増強株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthrKGS-fpr-fldB、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhLでは、いずれも8〜9%の収率の向上が認められた。
【０１８６】
【表４】
2010130899.tif 000005
【０１８７】
〔実施例９〕＜クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン・フェレドキシン遺伝子増幅プラスミドの導入株の酸素制限培養＞
＜８−１＞にて構築した対照のMG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン・フェレドキシン遺伝子発現増強株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthrKGS-fpr-fldB、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhLをLB培地にて37℃で一晩前培養した。プレート1/6枚分の菌体を500ml容三角フラスコ中50mlの培地（実施例５に記載のグルコース培地にクロラムフェニコールの変わりに40mg/lのカナマイシンを加えたもの）に植菌し、37℃で38時間培養した。酸素制限を行うため攪拌速度は100rpmで培養した。培養終了後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸をバイオテックアナライザー（旭化成工業）により測定した。
【０１８８】
結果を表５に示した。対照のMG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthrに比べ、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン・フェレドキシン遺伝子発現増強株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA、MG1655ΔsucAΔldhA/
pMWPthrKGS-fpr-fldB、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx、MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhLでは、いずれもＬ−グルタミン酸の収率が向上した。
【０１８９】
【表５】
2010130899.tif 000006
〔実施例１０〕＜α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン遺伝子発現増強株のグルコース炭素源での好気条件でのＬ−グルタミン酸生産能への効果＞
実施例８にて作製したクロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン遺伝子発現増強株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldAと対照株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthrを用いて、グルコースを炭素源としたときの、好気条件でのＬ−グルタミン酸生産能を調べた。
【０１９０】
LB培地にて37℃で一晩前培養したプレート1/4枚分の各菌株の菌体を、500ml容坂口フラスコ中の20mlのグルコース＋メチオニン培地（実施例５に記載のグルコース培地にクロラムフェニコールの変わりに40mg/lのカナマイシンを加え、さらに0.2g/lのDL-メチオニンを添加したもの）に植菌し、37℃にて攪拌速度120rpmで25時間培養した。培養終了後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸を、バイオテックアナライザー（旭化成工業社製）により測定した。
【０１９１】
結果を表６に示す。対照のMG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthrに比べ、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン遺伝子発現増強株MG1655ΔsucAΔldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldAでは、約6%の収率の向上が認められた。
【０１９２】
【表６】
2010130899.tif 000007
【０１９３】
〔実施例１１〕＜パントエア・アナナティスにおけるクロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン遺伝子発現増強株のグリセロール炭素源でのＬ−グルタミン酸生産能への効果＞
パントエア・アナナティスにおいてα−ケトグルタル酸シンターゼ活性の増強がL-グルタミン酸生産へ与える効果を検討するため、実施例７にて作製したクロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン遺伝子発現プラスミドpMWPthr-KGS-fpr-fldAと対照プラスミドpMWPthrをパントエア・アナナティスＬ−
グルタミン酸生産菌に導入し、培養を行った。
【０１９４】
＜１１−１＞パントエア・アナナティスＬ−グルタミン酸生産菌の構築
エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を搭載するプラスミドRSFCPG（欧州出願公開1233068号明細書参照）をBglII、KpnIで処理し、平滑末端化後、ライゲーションして、gltA遺伝子を除いた。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109株を形質転換した。出現した株よりプラスミドを抽出し、これをpRSF-ppc-gdhAとした。Ｌ−グルタミン酸生産菌であるパントエア・アナナティスNP106株に前記プラスミドpRSF-ppc-gdhAを導入し、Ｌ−グルタミン酸生産菌NP106/pRSF-ppc-gdhAを構築した。
【０１９５】
NP106株は、以下のようにして得られた。先に例示したパントエア・アナナティスAJ13601株を、LBGM9液体培地で34℃にて終夜振とう培養を行い、１プレートにつき100〜200コロニーとなるよう希釈し、テトラサイクリン12.5mg/Lを含むLBGM9プレートに塗布した。出現したコロニーについて、テトラサイクリン12.5mg/L、及びクロラムフェニコール25mg/Lを含むLBGM9プレートにレプリカし、クロラムフェニコール感受性となった株を選択し、pSTVCBが脱落した菌株を取得し、G106Sと命名した。さらに、G106S株を、LBGM9液体培地で34℃にて終夜振とう培養を行い、１プレートにつき100〜200コロニーとなるよう希釈し、薬剤を含まないLBGM9プレートに塗布した。出現したコロニーについて、テトラサイクリン12.5mg/Lを含むLBGM9プレート及び薬剤を含まないLBGM9プレートにレプリカし、テトラサイクリン感受性となった株を選択し、RSFCPGが脱落した菌株を取得し、NP106と命名した。こうして得られたNP106株はAJ13601株が保持する２つのプラスミドRSFCPGとpSTVCBの両方を持たない株である。
【０１９６】
＜１１−２＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンyfhL遺伝子発現用プラスミドのNP106/pRSF-ppc-gdhA株への導入
NP106/pRSF-ppc-gdhAに、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、及びエシェリヒア・コリ由来フラボドキシン・フェレドキシン遺伝子発現増強用プラスミドpMWPthr-KGS-fpr-fldAと、比較対照用プラスミドpMWPthrをエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、カナマイシンかつテトラマイシン耐性を指標に形質転換体を得た。プラスミドの導入を確認後、それぞれのプラスミド導入株をNP106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA、NP106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthrと名付けた。
【０１９７】
＜１１−２＞クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、フェレドキシンyfhL遺伝子増幅プラスミドの導入株のグリセロールを炭素源とした好気条件での培養
＜１１−１＞にて構築した2株をLBMG培地（LB培地に、グルコース0.5g/L、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g/L、塩化ナトリウム0.5g/L、塩化アンモニウム1g/L、リン酸2ナトリウム6g/Lを添加したもの）にて37℃で一晩前培養した。プレート1/4枚分の菌体を500ml容坂口フラスコ中20mlの下記組成のパントエア用グリセロール培地に植菌し、120rpmにて34℃で48時間培養した。培養終了後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸をバイオテックアナライザー（旭化成工業）により測定した。
【０１９８】
〔パントエア用グリセロール培地組成〕
グリセロール            40g/L
MgSO4・7H20               1.0 g/L
(NH4)2SO4               20 g/L
KH2PO4                   2.0g/L
酵母エキス               2.0g/L
FeSO4・7H20               0.02g/L
MnSO4・5H20               0.02g/L
Thiamine HCl             0.01g/L
カナマイシン            40mg/L
テトラサイクリン         2.5mg/L
炭酸カルシウム          20g/L
pH7.0 (KOHで調整)  殺菌条件：120℃、20分
【０１９９】
結果を表７に示す。対照のNP106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthrに比べ、クロロビウム・テピダム由来α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来フラボドキシン遺伝子発現増強株NP106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldAは、約3%のＬ−グルタミン酸収率の向上が認められた。
【０２００】
【表７】
2010130899.tif 000008
【０２０１】
〔配列表の説明〕
配列番号１：C. tepidumα−ケトグルタル酸シンターゼα−サブユニット遺伝子の塩基配列
配列番号２：C. tepidumα−ケトグルタル酸シンターゼα−サブユニットのアミノ酸配列配列番号３：C. tepidumα−ケトグルタル酸シンターゼβ−サブユニット遺伝子の塩基配列
配列番号４：C. tepidumα−ケトグルタル酸シンターゼβ−サブユニットのアミノ酸配列配列番号５：E. coli fpr遺伝子の塩基配列
配列番号６：E. coli fpr遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号７：C. tepidumピルビン酸シンターゼ遺伝子の塩基配列
配列番号８：C. tepidumピルビン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号９：E. coli fdx遺伝子の塩基配列
配列番号10：E. coli fdx遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号11：E. coli yfhL遺伝子の塩基配列
配列番号12：E. coli yfhL遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号13：E. coli fldA遺伝子の塩基配列
配列番号14：E. coli fldA遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号15：E. coli fldB遺伝子の塩基配列
配列番号16：E. coli fldB遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号17：C. tepidumフェレドキシンＩ遺伝子の塩基配列
配列番号18：C. tepidumフェレドキシンＩ遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号19：C. tepidumフェレドキシンII遺伝子の塩基配列
配列番号20：C. tepidumフェレドキシンII遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号21：C. tepidumα−ケトグルタル酸シンターゼ増幅プライマー１
配列番号22：C. tepidumα−ケトグルタル酸シンターゼ増幅プライマー２
配列番号23：C. tepidumピルビン酸シンターゼ増幅プライマー１
配列番号24：C. tepidumピルビン酸シンターゼ増幅プライマー２
配列番号25：C. tepidumフェレドキシンＩ遺伝子増幅プライマー１
配列番号26：C. tepidumフェレドキシンＩ遺伝子増幅プライマー２
配列番号27：ldhA欠損用プライマー 1
配列番号28：ldhA欠損用プライマー２
配列番号29：ldhA欠損確認用プライマー１
配列番号30：ldhA欠損確認用プライマー２
配列番号31：スレオニンオペロンプロモーター配列
配列番号32：E. coliフラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅用プライマー１配列番号33：E. coliフラボドキシン−ＮＡＤＰ+リダクターゼ遺伝子増幅用プライマー２配列番号34：E. coli fldA遺伝子増幅用プライマー１
配列番号35：E. coli fldA遺伝子増幅用プライマー２
配列番号36：E. coli fldB遺伝子増幅用プライマー１
配列番号37：E. coli fldB遺伝子増幅用プライマー２
配列番号38：E. coli fdx遺伝子増幅用プライマー１
配列番号39：E. coli fdx遺伝子増幅用プライマー２
配列番号40：E. coli yhfL遺伝子増幅用プライマー１
配列番号41：E. coli yfhL遺伝子増幅用プライマー２
配列番号42：sucA遺伝子N末端断片増幅用PCR用プライマー
配列番号43：sucA遺伝子N末端断片増幅用PCR用プライマー
配列番号44：sucA遺伝子C末端断片増幅用PCR用プライマー
配列番号45：sucA遺伝子C末端断片増幅用PCR用プライマー
配列番号46：パントエア・アナナティスのα-KGDHサブユニット遺伝子と近傍遺伝子の塩基配列
sdhB：   2〜 121
sucA： 322〜3129
sucB：3145〜4368
sucC：4437〜4556
配列番号47：サクシネートデヒドロゲナーゼアイロン−スルファープロテインのアミノ酸配列（部分）
配列番号48：α-KGDH E1oサブユニットのアミノ酸配列
配列番号49：α-KGDH E2oサブユニットのアミノ酸配列
配列番号50：succinyl-CoA シンセターゼβサブユニットの一部
配列番号51：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのodhA遺伝子の塩基配列
配列番号52：odhAがコードするE1oサブユニットのアミノ酸配列
配列番号53：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのE2oサブユニットをコードする遺伝子（GenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126）の塩基配列
配列番号54：NCgl2126がコードするE2oサブユニットのアミノ酸配列
【配列表】
2010130899000001.app