(57)【要約】      （修正有）【課題】ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマー、具体的にはＧＡＰＤＨの増幅を確認するための新規プライマーを提供する。【解決手段】ＧＡＰＤＨについて特定の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを選択し、組合せて使用することによる。具体的には、前記第一プライマーの配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、第二プライマーが、別の特定配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、第三プライマーが、更に別の特定配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、第四プライマーが、更に別の特定配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、プライマーセットの使用による。【選択図】図３
2010046078.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
LAMP法により検体中のグリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）のmRNAを検出するために用いられるプライマーセットであって、
第一プライマー、第二プライマー、第三プライマーおよび第四プライマーを含有し、
前記第一プライマーが、配列番号８０〜８７のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、
前記第二プライマーが、配列番号８８〜９６のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、
前記第三プライマーが、配列番号６２〜６４および６８のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、
前記第四プライマーが、配列番号７３および７５〜７７のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、プライマーセット。
【請求項２】
第五プライマーおよび第六プライマーをさらに含み、
前記第五プライマーが、配列番号７８の配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、
前記第六プライマーが、配列番号７９の配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記第一プライマーが、配列番号８３の配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、
前記第二プライマーが、配列番号８９の配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１または２記載のプライマーセット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１に記載のプライマーセットと、逆転写活性を有する酵素と、dNTPsと、鎖置換型の相補鎖合成を行うDNAポリメラーゼとを含む、GAPDH  mRNA検出用試薬キット。
【請求項５】
検体中のGAPDHのmRNAを検出する方法であって、
請求項１〜３のいずれか１に記載のプライマーセットと、逆転写活性を有する酵素と、dNTPsとを用いて、前記検体に含まれるGAPDHのmRNAからcDNAを合成する工程、
鎖置換型の相補鎖合成を行うDNAポリメラーゼと、dNTPsを用いて、LAMP法により前記cDNAを増幅する工程、および
増幅されたcDNAを検出することにより前記検体中のGAPDHを検出する工程
を含む、GAPDH  mRNAの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハウスキーピング遺伝子を検出するための核酸増幅用プライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学及び分子生物学などの分野の進歩により、感染症や遺伝子疾患などについて、DNA又はRNAレベルで診断することが可能になった。特に、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（PCR法、Science, 230: 1350-1354, 1985）やNASBA法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification 法、Nature, 350, 91-92, 1991、特許第2648802号公報及び特許第2650159号公報記載）などの核酸増幅方法により、従来困難であった生物検体中の極微量核酸量の検出が可能となり、遺伝子解析が飛躍的に容易なものとなった。
【０００３】
例えば、癌の分野では、リンパ節への癌転移診断が極めて重要な意義を有している。リンパ節への癌転移診断の１手法として、癌マーカーである例えばサイトケラチン（CK）のようなタンパク質を検出する方法がある。近年の遺伝子解析技術の発展により、癌マーカータンパク質に関するmRNAの発現を検出することで、効果的に癌診断が行われるようになった（北海道医学雑誌、p.135-141, Vol. 66(2), 1991）。RT-PCRにより、切除した組織からCKのmRNA発現の検出が可能となり、癌転移の見落としの問題はある程度回避されるようになった。腫瘍や癌の診断分野では、このような核酸増幅方法が実用化されている（臨床検査法提要、第31版、金原出版株式会社、1998年9月20日発行）。
【０００４】
上記に示す以外のDNA増幅方法として、LAMP法が報告されている（特許文献１）。LAMP法は、鎖置換反応が進行すると増幅産物の末端にヘアピン構造を形成するプライマーを含む複数のプライマーによる遺伝子増幅法である。まず、初期反応において、２種類のインナープライマー（FIP，RIP）と２種類のアウタープライマー（F3プライマー、R3プライマー）及び鎖置換型DNAポリメラーゼにより鋳型DNAから両端に一本鎖ループ部分をもつダンベル状の構造が合成される。この構造が増幅サイクルの起点構造となって、この構造の３’末端側から自己を鋳型としてDNAの伸長・合成反応が進む。増幅産物は多数の繰り返し構造からなり、繰り返し構造の単位はプライマーに挟まれた被増幅領域を構成する２本の核酸の塩基配列が逆向きになった同一鎖内の相補性領域からなる。LAMP法は、鋳型DNAの２本鎖から１本鎖への熱変性の操作を必要とせず、増幅反応はすべて等温で連続的に進行することが特徴である（非特許文献１及び２）。鋳型がRNAの場合には、鋳型がDNAの場合の反応液組成にさらに逆転写酵素を添加することで同様に起点構造を合成することができ、増幅を進めることができる（RT-LAMP法）。LAMP法では、30分程度で検出に十分な増幅産物が得られる。したがって、核酸検出に要する時間が短縮されるため、例えば迅速に治療方針を決定することを目的としたリンパ節への癌転移の診断に適用できる。また、迅速に結果が得られることから、術中診断への適用も期待できる。
【０００５】
mRNAを定量する際に、サンプル中の内部コントロールとして、つまり組織によって発現量に差のないと考えられるハウスキーピング遺伝子のmRNAを用いることができる。該ハウスキーピング遺伝子のmRNAを内部コントロールとして使用することにより、標的遺伝子のmRNAの抽出効率やcDNAの合成効率を考慮しなくても相対的な標的遺伝子のmRNAの検出が可能という利点がある。
【０００６】
ハウスキーピング遺伝子の例として、細胞骨格の構成成分であるβ-アクチンの遺伝子や解糖系の主要酵素であるグリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（以下、「GAPDH」という。）遺伝子が挙げられる。
【０００７】
内部コントロールの目的で使用されるハウスキーピング遺伝子に関し、より効果的な核酸増幅用プライマーの開発が望まれている。
【０００８】
（β-アクチン遺伝子について）
アクチンは全ての真核細胞に多量に見いだされるタンパク質である。このタンパク質は高等生物の細胞において有糸分裂における役割、運動性や構造の完全性を含む、多くの構造的及び調節的機能を提供する。脊椎動物では６つのアクチンのアイソフォームが同定されており、それらの内訳は４つの筋肉型（骨格筋、心筋、大動脈型平滑筋及び胃型平滑筋のアクチン）及び２つの非筋肉型（細胞質のβ-アクチン及びγ-アクチン）である。筋肉アクチンは存在が組織特異的であり、筋肉の収縮に関与する。対照的に、細胞質アクチンは基本的に全ての細胞に見いだされ、多くの細胞機能に関与する。細胞内に存在するアクチンはその多様性にもかかわらず、アミノ酸配列がアクチンの型及び真核生物の種間において高度に保存されている。
【０００９】
ヒトの細胞質β-アクチン遺伝子の配列は既に決定され、他種のβ-アクチン遺伝子と比較されている（Nakajima-Iijima, et. al. PNAS 82, p.6133-6137 (1985)、欧州特許出願第0174608号、Ponte et. al. 1984. Nucleic Acids Res. 12, p.1687-1696 (1984)）。ヒトβ-アクチン遺伝子の全体を増幅するためのプライマーは、クローンテックラボラトリーズ（Clontech Laboratories, Inc.）（Palo Alto, CA）からMAPPING Amplimershito ベータ−アクチン用の名で市販されている。また、ヒトβ-アクチンのヌクレオチド配列と種特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関し、これらのオリゴヌクレオチドを核酸増幅反応における内部コントロールとして、また核酸増幅反応に用いる試料の完全性の決定を行う手段として用いることが報告されている（特開平7-99981）。
【００１０】
（GAPDH遺伝子について）
ヒトグリセロアルデヒド-3-リン酸は、生体内の解糖系、ペントースリン酸サイクルなどの糖代謝や、脂質合成における重要な中間体のひとつであり、ヒトの生体内には広く分布している。また、この物質から脂質を合成するためには、ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)が必要であるため、当該酵素もヒトの生体内に広く分布している。
【００１１】
内部コントロールの目的で使用されるβ-アクチンやGAPDHに関し、より効果的な核酸増幅用プライマーの開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第WO 00/28082号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Bioベンチャー、2001年、Vol. 1, No. 1, p.109-115
【非特許文献２】BIO INDUSTRY、2001年、Vol. 18, No. 2, p.15-29
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ハウスキーピング遺伝子のmRNAを検出するための核酸増幅用プライマー、具体的にはGAPDH遺伝子のmRNAを増幅するための新規プライマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ハウスキーピング遺伝子用核酸増幅用プライマーを構築することができた。
【００１６】
即ち本発明は、以下よりなる。
１．LAMP法により検体中のグリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）のmRNAを検出するために用いられるプライマーセットであって、
第一プライマー、第二プライマー、第三プライマーおよび第四プライマーを含有し、
前記第一プライマーが、配列番号８０〜８７のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、
前記第二プライマーが、配列番号８８〜９６のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、
前記第三プライマーが、配列番号６２〜６４および６８のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、
前記第四プライマーが、配列番号７３および７５〜７７のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、プライマーセット。
２．第五プライマーおよび第六プライマーをさらに含み、
前記第五プライマーが、配列番号７８の配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、
前記第六プライマーが、配列番号７９の配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、前項１記載のプライマーセット。
３．前記第一プライマーが、配列番号８３の配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、
前記第二プライマーが、配列番号８９の配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、前項１または２記載のプライマーセット。
４．前項１〜３のいずれか１に記載のプライマーセットと、逆転写活性を有する酵素と、dNTPsと、鎖置換型の相補鎖合成を行うDNAポリメラーゼとを含む、GAPDH  mRNA検出用試薬キット。
５．検体中のGAPDHのmRNAを検出する方法であって、
前項１〜３のいずれか１に記載のプライマーセットと、逆転写活性を有する酵素と、dNTPsとを用いて、前記検体に含まれるGAPDHのmRNAからcDNAを合成する工程、
鎖置換型の相補鎖合成を行うDNAポリメラーゼと、dNTPsを用いて、LAMP法により前記cDNAを増幅する工程、および
増幅されたcDNAを検出することにより前記検体中のGAPDHを検出する工程
を含む、GAPDH  mRNAの検出方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のβ−アクチン用プライマーを用いたときの感度を示す図である。（実験例２）
【図２】LS180細胞及びRaji細胞の培養液中で、本発明のβ−アクチン用プライマーを用いて測定したときの結果を示す図である。（実験例３）
【図３】本発明のGAPDH用プライマーを用いたときの感度を示す図である。（実験例５）
【図４】LS180細胞及びRaji細胞の培養液中で、本発明のGAPDH用プライマーを用いて測定したときの結果を示す図である。（実験例６）
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（プライマーの設計）
本発明は、ハウスキーピング遺伝子の核酸増幅法、より具体的にはβ-アクチン遺伝子又はGAPDH遺伝子のmRNAに関する核酸増幅法に適用可能な核酸増幅用のプライマーを提供するものである。
【００１９】
LAMP法で用いるプライマーの基本的な考え方は、特許文献１に記載の通りである。
具体的には、増幅すべき標的DNAの、３’末端側から順にF3c、F2c、F1cという領域を、５’末端側から順にR3、R2、R1という領域を規定し、少なくともこの６つの領域に対し、実質的に同一な塩基配列、又は実質的に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖を選択し、少なくとも４種のプライマーを設計する。
【００２０】
実質的に同じ塩基配列とは、次のように定義される。すなわち、ある塩基配列を鋳型として合成された相補鎖が、目的の塩基配列に対してハイブリダイズし、相補鎖合成の起点を与えるとき、この配列は目的の塩基配列に対して実質的に同一である。例えば、F2に対して実質的に同一な塩基配列とは、F2と全く同一な塩基配列に加えて、F2にハイブリダイズして相補鎖合成の起点となりうる塩基配列を与える鋳型として機能する塩基配列を含む。
【００２１】
本発明に基づくオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列の特徴付けのために用いられる同一、あるいは相補的という用語はいずれも完全に同一、あるいは完全に相補的であることを要しない。すなわち、ある配列と同一とは、ある配列に対してハイブリダイズすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができる。他方、相補的とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、相補鎖合成の起点となる３’末端を提供することができる配列を意味する。
【００２２】
本発明のプライマーは、以下に述べる各種の核酸合成反応において与えられた環境のもとで必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長をもつ。具体的には5〜200塩基、より望ましくは10〜50塩基対とする。配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長は最低５塩基前後であることから、ハイブリダイズする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。加えて、塩基配列としての特異性を維持するためには、10塩基以上の長さを維持するのが望ましい。一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製することが困難となることから、前記のような鎖長が望ましい範囲として例示される。
【００２３】
本発明において用いられる鋳型という用語は、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ相補鎖は、鋳型にハイブリダイズしうる鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型になることができる。
【００２４】
本発明において、標的DNAの塩基配列から選択されるプライマーは、各々FIP（forward inner primer）、F3プライマー（forward outer primer）、RIP（reverse inner primer）及びR3プライマー（reverse outer primer）のいずれかを構成する。
【００２５】
FIPは、標的DNAのF2c領域と実質的に相補的なF2領域の塩基配列を３’末端にもち、５’末端に標的DNAのF1c領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。この場合において、F2及びF1cの配列間に標的DNAに依存しない配列が介在していても良い。この標的DNAに依存しない配列の長さは0〜50塩基、好ましくは0〜40塩基であれば許容しうる。
F3プライマーは、標的DNAのF3c領域と実質的に相補的なF3領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
RIPは、標的DNAのR2c領域と実質的に相補的なR2領域の塩基配列を3’末端にもち、5’末端に標的DNAのR1c領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。RIPもFIPと同様に、R2及びR1cの配列の間に標的DNAに依存しない配列が介在していても良い。
R3プライマーは、標的DNAのR3c領域と実質的に相補的なR3領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
【００２６】
また、LAMP法では、少なくとも１種以上のループプライマーを併用することで増幅時間を短縮することができる（国際公開WO 02/24902号公報）。ループプライマーとは、ダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分、具体的には例えばR1領域とR2領域の間、あるいはF1領域とF2領域の間に相補的な配列をもつプライマーをいう。ループプライマーを用いることによりDNA合成の起点を増やすことが可能となる。このループプライマーは、DNA合成過程でできたFIP又はRIPがハイブリダイズしないループ領域にハイブリダイズするように設計する。
【００２７】
上記プライマーを構築するために選択される遺伝子の領域は、塩基組成、GC含量、二次構造、Tm値などに注意し、DNA領域を認識する塩基配列の長さは、塩基数が少なくとも５塩基以上、好ましくは10〜30塩基、より好ましくは17〜25塩基のものを選択することができる。Tm値は、一般的にNearest Neighbor法で求めることができる。DNA領域は、Tm値が55〜65℃、好ましくは58〜64℃のものを選択し、GC含量が40〜70％、好ましくは50〜65％のものを選択することができる。
【００２８】
本発明のプライマーも、上記の原理に従った領域を選択し、設計する。
本発明で選択されるβ-アクチン遺伝子の領域は、配列番号1で表される塩基配列の第240〜1060番目及び／又はその相補鎖の領域、好ましくは第240〜380番目若しくは第401〜1060番目、より好ましくは第740〜990番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれる。
【００２９】
本発明におけるβ-アクチン検出用のプライマーは、１）配列番号1で表される塩基配列の第240〜1060番目、好ましくは第240〜380番目若しくは第401〜1060番目、より好ましくは第740〜990番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれ、塩基数が少なくとも５以上のオリゴヌクレオチド、２）配列番号2〜50で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、プライマーとして使用可能なものが選択され、設計される。
【００３０】
また、本発明で選択されるGAPDH遺伝子の領域は、配列番号51で表される塩基配列の第110〜450番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれる。
本発明におけるGAPDHのプライマーは、１）配列番号51で表される塩基配列の第110番目〜第450番目の領域及び／又はその相補鎖に含まれ、塩基数が少なくとも５以上のオリゴヌクレオチド、２）配列番号52〜96で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、プライマーとして使用可能なものが選択され、設計される。
【００３１】
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製  Expedite Model 8909 DNA合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はPCR法を単独又は適宜組合せて、例えば、Molecular Cloning; A Laboratory Manual、２版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、1988年；［PCRテクノロジー、DNA増幅の原理と応用］、Ehrlich, HE. 編、ストックトンプレス、1989年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばUlmerの技術（Science (1983) 219: 666）を利用することができる。
【００３２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができる。その一例としては、50％ホルムアミド、5×SSC（150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム、pH7.6、5×デンハーツ溶液、10％デキストラン硫酸、及び20μｇ/mlのDNAを含む溶液中、42℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で2×SSC・0.1％SDS中で一次洗浄し、次いで、約65℃において0.1×SSC・0.1％SDSで二次洗浄といった条件があげられる。
【００３３】
本発明において増幅されるべき核酸の鋳型はハウスキーピング遺伝子のmRNAであるから、使用するプライマーが、検体中に含まれるゲノムDNAを増幅しないように設計することが必要とされる。具体的には、本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの少なくとも１つは、例えばβ-アクチン又はGAPDHの遺伝子において複数のエクソンにまたがる領域を含むものであることが望ましい。このような工夫を行うことによって、ゲノムDNA由来の配列の増幅が排除され、β-アクチン又はGAPDHのmRNA由来の配列を選択的に増幅することが可能となる。
【００３４】
（プライマーセット）
本発明のプライマーを使用して核酸増幅を行う場合、少なくとも２種を組合せてプライマーセットとして使用する。LAMP法では、少なくとも４種のプライマー（FIP、F3プライマー、RIP、R3プライマー）を組合せてプライマーセットとして使用する。さらに、１種以上のループプライマーを組合せて、プライマーセットとして使用することもできる。
【００３５】
（RT-LAMP法）
RT-LAMP法は、RNAを鋳型とするLAMP法であり、LAMP法の基本的な考え方は特許文献１に記載の通りである。RT-LAMP法では一つの溶液中で、鋳型RNAからcDNAを合成しながら、LAMP法の起点構造が合成される。具体的には次の１）のステップを経た後、２）〜５）ステップの繰り返しにより、DNAの伸長が繰り返され、標的DNAの増幅が行われる。
１）鋳型RNA鎖にFIPが結合し、鋳型RNA鎖に相補的なDNA鎖が伸長する。この反応は逆転写酵素、例えばAMV由来の逆転写酵素等を用いる。
２）上記１）で合成したFIPからのDNA鎖を、F3プライマーが鋳型RNAから剥がしながら、鋳型RNA鎖に相補的なDNA鎖が伸長する。以降DNA鎖の伸長はDNAポリメラーゼによる。
３）上記２）で剥がされたDNA鎖に、RIPが結合してDNA鎖が伸長する。
４）上記３）で伸長したRIPからのDNA鎖をR3プライマーが剥がしながら、FIPからのDNA鎖に相補的なDNA鎖が伸長し、LAMP法の起点構造が合成される。
５）上記４）で剥がされたDNA鎖の両端の配列は、同じDNA鎖の配列中に相補的な配列を有するので、各々ハイブリダイズし、両端にループ構造を持つ。
なお、例えばBcaDNA polymeraseのように、逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素があり、このような酵素を使用する場合は、上記の反応は１つの酵素で実施することができる。
【００３６】
（測定方法）
LAMP法では、合成されたDNA鎖は自己の配列に対して相補的な配列をもつので、その大部分が塩基対結合を形成している。この特徴を利用して、増幅生成物の検出が可能である。エチジウムブロマイド、SYBER GREEN I、あるいはPico Greenのような２本鎖インターカーレーターである蛍光色素の存在下で本発明のプライマーを用いて核酸増幅を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍光強度の増大が観察される。これをモニターすれば、閉鎖系でDNAの増幅と蛍光の増加が同時に追跡可能である（臨床検査法提要、31版1318頁；特開2001-242169号公報参照。以下単に「リアルタイム法」という。）。
【００３７】
（試薬、試薬キット、その他）
本発明のプライマーを用いて核酸の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化することができる。具体的には、本発明の相補鎖合成のプライマーとして、あるいは置換用のプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、逆転写活性を有する酵素、相補鎖合成の基質となるdNTP、鎖置換型の相補鎖合成を行うDNAポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、さらに必要に応じて反応生成物の検出のために必要な試薬類がキットとして提供される。
本発明は、核酸増幅用プライマー及びプライマーセット、ならびにこれらのプライマーを用いた核酸検出方法、核酸検出方法に使用される検出試薬、核酸検出キットならびに核酸検出システム全体に及ぶ。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）β-アクチン遺伝子領域の選択
配列番号1に記載する塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いて、LAMP法に適切なβ-アクチンの遺伝子領域の位置を検討した。遺伝子領域の選択は、F1c及びR1cはTm値が58.5〜63.5℃、F2及びR2はTm値が61.5〜62.5℃、F3及びR3はTm値が58.5〜62.5℃により遺伝子領域を選択した結果、次に示す配列番号1に記載する塩基配列上の第240〜1060番目の領域及びその相補鎖の領域に含まれる配列が選択された。
【００４０】
F1c：配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
343-327  5'-tggccttgggttcagg-3'       （配列番号2）
400-381  5'-cgtacatggctggggtgttg-3'   （配列番号3）
822-803  5'-gatgccacaggactccatgc-3'   （配列番号4）
838-817  5'-tgaaggtagtttcgtggatgcc-3' （配列番号5）
922-904  5'-cagggtacatggtggtgcc-3'    （配列番号6）
【００４１】
F2：配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
265-284  5'-accttctacaatgagctgcg-3'   （配列番号7）
341-357  5'-ccaaccgcgagaagatg-3'      （配列番号8）
748-766  5'-attggcaatgagcggttcc-3'    （配列番号9）
750-766  5'-tggcaatgagcggttcc-3'      （配列番号10）
774-790  5'-tgaggcactcttccagc-3'      （配列番号11）
782-799  5'-tcttccagccttccttcc-3'     （配列番号12）
851-868  5'-agtgtgacgtggacatcc-3'     （配列番号13）
【００４２】
F3：配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
240-259  5'-cgacatggagaaaatctggc-3'   （配列番号14）
274-290  5'-aatgagctgcgtgtggc-3'      （配列番号15）
718-734  5'-tacgagctgcctgacgg-3'      （配列番号16）
750-766  5'-tggcaatgagcggttcc-3'      （配列番号10）
818-837  5'-gcatccacgaaactaccttc-3'   （配列番号17）
【００４３】
R1c：配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
346-366  5'-cgcgagaagatgacccagatc-3'  （配列番号18）
402-423  5'-tgctatccaggctgtgctatcc-3' （配列番号19）
848-868  5'-tgaagtgtgacgtggacatcc-3'  （配列番号20）
857-876  5'-acgtggacatccgcaaagac-3'   （配列番号21）
925-945  5'-attgccgacaggatgcagaag-3'  （配列番号22）
【００４４】
R2：配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
414-396  5'-agcctggatagcaacgtac-3'    （配列番号23）
461-444  5'-tccatcacgatgccagtg-3'     （配列番号24）
921-905  5'-agggtacatggtggtgc-3'      （配列番号25）
925-909  5'-tgccagggtacatggtg-3'      （配列番号26）
929-911  5'-gcaatgccagggtacatgg-3'    （配列番号27）
1011-994 5'-gtacttgcgctcaggagg-3'     （配列番号28）
【００４５】
R3：配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
454-438  5'-cgatgccagtggtacgg-3'      （配列番号29）
497-480  5'-tagatgggcacagtgtgg-3'     （配列番号30）
947-930  5'-tccttctgcatcctgtcg-3'     （配列番号31）
1059-1043 5'-ctggaaggtggacagcg-3'      （配列番号32）
【００４６】
loop F：配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
816-801 5'-acaggactccatgccc-3'        （配列番号33）
loop R：配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
878-895 5'-tgtacgccaacacagtgc-3'      （配列番号34）
【００４７】
（実施例２）β-アクチン用プライマーの設計
選択された領域の配列から、LAMP法に適用されるβ-アクチン用の次の核酸増幅用プライマーが得られた。
【００４８】
FIP：（領域F1cの塩基配列とF2の塩基配列を連結したもの）
AFA-1 （配列番号35） 配列番号2及び7の配列を連結
AFA-2 （配列番号36） 配列番号3及び8の配列を連結
AFA-4 （配列番号37） 配列番号5及び11の配列を連結
AFA-4a（配列番号38） 配列番号5及び12の配列を連結
AFA-4c（配列番号39） 配列番号5及び10の配列を連結
AFA-4d（配列番号40） 配列番号4及び9の配列を連結
AFA-4e（配列番号41） 配列番号4及び10の配列を連結
AFA-6 （配列番号42） 配列番号6及び13の配列を連結
【００４９】
RIP：（領域R1cの塩基配列とR2の塩基配列を連結したもの）
ARA-1 （配列番号43） 配列番号18及び23の配列を連結
ARA-2 （配列番号44） 配列番号19及び24の配列を連結
ARA-4 （配列番号45） 配列番号20及び25の配列を連結
ARA-4a（配列番号46） 配列番号20及び27の配列を連結
ARA-4b（配列番号47） 配列番号20及び26の配列を連結
ARA-4d（配列番号48） 配列番号21及び27の配列を連結
ARA-4e（配列番号49） 配列番号21及び26の配列を連結
ARA-6 （配列番号50） 配列番号22及び28の配列を連結
【００５０】
F3プライマー：（F3領域の塩基配列と同一の配列）
AF3-1  （配列番号14）
AF3-2  （配列番号15）
AF3-4  （配列番号10）
AF3-6  （配列番号17）
AF3-9  （配列番号16）
【００５１】
R3プライマー：（R3領域の塩基配列と同一の配列）
AR3-1  （配列番号29）
AR3-2  （配列番号30）
AR3-4  （配列番号31）
AR3-6  （配列番号32）
【００５２】
ループルライマー：
（loop F又はloop R領域の塩基配列と同一の配列）
AD-LPF1  （配列番号33）
AD-LPR1  （配列番号34）
【００５３】
（実施例３）GAPDHの遺伝子領域の選択
配列番号51に記載する塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いて、LAMP法に適切なGAPDHの遺伝子領域の位置を検討した。遺伝子領域の選択は、F1c及びR1CはTm値が58.5〜63.5℃、F2及びR2はTm値が61.5〜62.5℃、F3及びR3はTm値が58.5〜62.5℃により遺伝子領域を選択した結果、次に示す配列番号51に記載する塩基配列上の第110〜450番目の領域に含まれる配列が選択された。
【００５４】
F1c：配列番号51に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
213-192  5'-tccattgatgacaagcttcccg-3'    （配列番号52）
236-217  5'-tcctggaagatggtgatggg-3'      （配列番号53）
246-228  5'-gggatctcgctcctggaag-3'       （配列番号54）
284-265  5'-acgtactcagcgccagcatc-3'      （配列番号55）
335-316  5'-aaatgagccccagccttctc-3'      （配列番号56）
【００５５】
F2：配列番号51に記載する配列上の遺伝子領域
152-169  5'-ccacccatggcaaattcc-3'        （配列番号57）
163-180  5'-aaattccatggcaccgtc-3'        （配列番号58）
179-195  5'-tcaaggctgagaacggg-3'         （配列番号59）
217-235  5'-cccatcaccatcttccagg-3'       （配列番号60）
276-293  5'-tgagtacgtcgtggagtc-3'        （配列番号61）
【００５６】
F3：配列番号51に記載する配列上の遺伝子領域
103-120  5'-gaccccttcattgacctc-3'        （配列番号62）
159-176  5'-tggcaaattccatggcac-3'        （配列番号63）
163-180  5'-aaattccatggcaccgtc-3'        （配列番号58）
227-244  5'-tcttccaggagcgagatc-3'        （配列番号64）
【００５７】
R1c：配列番号51に記載する配列上の遺伝子領域
216-235  5'-tcccatcaccatcttccagg-3'      （配列番号65）
248-268  5'-ccaaaatcaagtggggcgatg-3'     （配列番号66）
254-271  5'-tcaagtggggcgatgctg-3'        （配列番号67）
305-323  5'-tcaccaccatggagaaggc-3'       （配列番号68）
338-354  5'-aggggggagccaaaagg-3'         （配列番号69）
【００５８】
R2  ：配列番号51に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
295-279  5'-tggactccacgacgtac-3'         （配列番号70）
305-289  5'-aagacgccagtggactc-3'         （配列番号71）
310-294  5'-tggtgaagacgccagtg-3'         （配列番号72）
324-308  5'-agccttctccatggtgg-3'         （配列番号73）
327-311  5'-cccagccttctccatgg-3'         （配列番号74）
365-346  5'-gagatgatgacccttttggc-3'      （配列番号75）
399-383  5'-catgacgaacatggggg-3'         （配列番号76）
【００５９】
R3  ：配列番号51に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
324-308  5'-agccttctccatggtgg-3'         （配列番号73）
365-346  5'-gagatgatgacccttttggc-3'      （配列番号75）
399-383  5'-catgacgaacatggggg-3'         （配列番号76）
445-426  5'-tgctgatgatcttgaggctg-3'      （配列番号77）
【００６０】
loop F：配列番号51に記載の配列の相補鎖における遺伝子領域
227-212 5'-atggtgatgggatttc-3'           （配列番号78）
loop R：配列番号51に記載の配列上の遺伝子領域
275-293 5'-ctgagtacgtcgtggagtc-3'        （配列番号79）
【００６１】
（実施例４）GAPDHプライマーの設計
選択された領域の配列から、LAMP法に適用されるGAPDH用の次の核酸増幅用プライマーが得られた。
【００６２】
FIP：（領域F1cの塩基配列とF2の塩基配列を連結したもの）
FA-2  （配列番号80）配列番号52及び57の配列を連結
FA-3  （配列番号81）配列番号54及び59の配列を連結
FA-3b （配列番号82）配列番号54及び58の配列を連結
FA-3d （配列番号83）配列番号53及び59の配列を連結
FA-3e （配列番号84）配列番号53及び58の配列を連結
FA-3g （配列番号85）配列番号53及び57の配列を連結
FA-5  （配列番号86）配列番号55及び60の配列を連結
FA-7  （配列番号87）配列番号56及び61の配列を連結
【００６３】
RIP：（領域R1cの塩基配列とR2の塩基配列を連結したもの）
RA-2  （配列番号88）配列番号65及び80の配列を連結
RA-3  （配列番号89）配列番号67及び83の配列を連結
RA-3a （配列番号90）配列番号67及び84の配列を連結
RA-3b （配列番号91）配列番号67及び82の配列を連結
RA-3c （配列番号92）配列番号67及び81の配列を連結
RA-3d （配列番号93）配列番号66及び83の配列を連結
RA-3e （配列番号94）配列番号66及び84の配列を連結
RA-5  （配列番号95）配列番号68及び75の配列を連結
RA-7  （配列番号96）配列番号69及び76の配列を連結
【００６４】
F3  ：（F3領域の塩基配列と同一の配列）
F3-3  （配列番号63）
F3-4  （配列番号68）
F3-6  （配列番号64）
F3-8  （配列番号62）
【００６５】
R3  ：（R3領域の塩基配列と同一の配列）
R3-2  （配列番号73）
R3-3  （配列番号75）
R3-5  （配列番号76）
R3-7  （配列番号77）
【００６６】
ループプライマー：
（loop F又はloop R領域の塩基配列と同一の配列）
GC-LPF1（配列番号78）
GC-LPR1（配列番号79）
【００６７】
（実験例１）
実施例２に記載するβ-アクチン用プライマーを、表１に記載する各組合せで用いた場合の、RT-LAMP法による反応開始後増幅の確認までに要する時間を調べた。
１）ヒトβ-アクチンのmRNA試料
ヒトβ-アクチンの鋳型として、市販のヒトトータル RNA（Raji 細胞由来、ABI社製）を使用した。
２）β-アクチン用プライマー
各プライマーは（表１）の組合せで使用した。
【表１】
2010046078.tif 000003
３）反応液組成
dNTPs  (GIBCO社製)                          0.4 mM
MgSO4                                         2 mM 
ジチオトレオトール（dithiothreitol）          5 mM
ベタイン (betaine) (Sigma社製)              640 mM
Thermopol buffer  (New  England  BioLabs社製) 
AMV 逆転写酵素(Promega社製)                   1.25U 
Bst DNA ポリメラーゼ (New England BioLabs社製) 16U
エチジウムブロマイド(ethidium bromide)    0.125mg/ml
各プライマー
FIP            40pmol、      RIP            40pmol
F3プライマー    5pmol、      R3プライマー    5pmol
４）RT-LAMP法
上記４種のプライマーを含む反応液23μlに、RNA試料を2μl（20ngのヒトトータルRNAを含む）添加し、65℃で１時間加温して行った。
５）増幅の確認
増幅産物は2本鎖構造をもつので、エチジウムブロマイドがインターカレートして蛍光を発する。その蛍光強度の増加を、ABI社製PRISM7700を用いてリアルタイム法により測定した。
６）結果
各プライマーセットを用いて反応させた場合のβ-アクチンの増幅確認までの時間を表１に示した。その結果、増幅は各プライマーセットにおいて最大45分で確認され、殆どの場合に30分以内に確認された。
【００６８】
（実験例２）
実験例１で検討したβ-アクチン用プライマーセットのうち、最も短時間で増幅が確認されたプライマーセットを選択し、さらにループプライマーを組合せたプライマーセットを用いてRT-LAMP法で測定した場合の感度を調べた。
１）ヒトβ-アクチンのmRNA試料
実験例１と同様にした。
２）プライマーセット
【表２】
2010046078.tif 000004
３）反応液組成
実験例１と同様の組成に、さらにF3ループプライマー及びR3ループプライマーを各々5pmolとなるように加えた。
４）RT-LAMP法
実験例１と同様に行った。上記６種のプライマーを含む反応液23μlに、RNA試料2μl（20ngのヒトトータルRNAを含む）添加し、65℃で１時間加温して行った。
５）増幅の確認
実験例１と同様に行った。
６）結果
その結果を第１図に示した。その結果、β-アクチン遺伝子のmRNA鋳型量が多いほうが、短時間で増幅の確認ができた。増幅は、鋳型量が0.02ngの場合でも30分以内に確認され、鋳型量が20ng場合では15分程度で確認された。
【００６９】
（実験例３）
LS180細胞（大腸癌細胞株）及びRaji細胞（バーキットリンパ腫細胞株）の培養細胞中におけるβ-アクチンの増幅を調べた。
つまり、サイトケラチンが陽性のLS180細胞溶液を、サイトケラチンが陰性のRaji細胞溶液で稀釈した場合の、各濃度のLS180細胞溶液試料でのβ-アクチンの増幅について調べ、サイトケラチンの腫瘍マーカーを測定する場合に、β-アクチンがデータ補正のコントロールとして使用可能か否かを検討した。
１）試料
LS180細胞及びRaji細胞の総細胞数が8000となるように試料を調製した。総細胞数8000のうち、LS180細胞数が8000、800、80、8及び0となるようにした。
２）β-アクチン用プライマー
実験例２と同様のプライマーを選択した。
３）反応液組成
実験例２と同様の組成の反応液を使用した。
４）RT-LAMP法
実験例２と同様に行った。
５）核酸の検出
実験例２と同様の６種のプライマーを含む反応液23μlに、細胞の懸濁液を2μl添加し、65℃で1時間加温して行った。
６）結果
その結果を第２図に示した。その結果、LS180細胞及びRaji細胞の比率が異なる場合でも、β-アクチンは15分程度で増幅が確認された。このことより、腫瘍マーカーの有無にかかわらず、ヒト細胞中にはβ-アクチンが構成的に発現していることが確認され、β-アクチンがLAMP法におけるデータ補正のコントロールとして使用可能であることが示された。
【００７０】
（実験例４）
実施例４に記載するGAPDH用プライマーを、表３に記載の各組合せで用いた場合の、RT-LAMP法による反応開始後増幅の確認までに要する時間を調べた。
１）GAPDHのmRNA試料
GAPDHの鋳型として、市販のヒトトータル RNA（Raji細胞由来、ABI社製）を使用した。
２）GAPDH用プライマー
各プライマーは（表３）の組合せのものを用いた。
【表３】
2010046078.tif 000005
３）反応液組成
実験例１と同様の組成の反応液を使用した。
４）RT-LAMP法
実験例１と同様に行った。上記４種のプライマーを含む反応液23μlに、RNA試料2μl（20ngのヒトトータルRNAを含む）添加し、65℃で１時間加温して行った。
５）増幅の確認
実験例１と同様に行った。
６）結果
各プライマーセットを用いて反応させた場合のGAPDHの増幅確認までの時間を表３に示した。その結果、増幅は各プライマーセットにおいて最大45分で確認され、殆どの場合に30分以内に確認された。
【００７１】
（実験例５）
実験例４で検討したGAPDH用プライマーセットのうち、最も短時間で増幅が確認されたプライマーセットを選択し、さらにループプライマーを組合せたプライマーセットを用いてRT-LAMP法で測定した場合の感度を調べた。
１）ヒトGAPDHのmRNA試料
GAPDHの鋳型として、市販のヒトトータルRNA（Raji細胞由来、ABI社製）を使用した。
２）プライマーセット
【表４】
2010046078.tif 000006
３）反応液組成
実験例２と同様の組成の反応液を使用した。
４）RT-LAMP法
実験例２と同様に行った。
５）核酸の検出
実験例２と同様に行った。
６）結果
その結果を第３図に示した。その結果、GAPDHのmRNAの鋳型量が多いほうが、短時間で増幅が確認された。しかし鋳型量が0.02ngの場合でも30分以内に増幅が確認され、鋳型量が20ng場合に10分程度で増幅が確認された。
【００７２】
（実験例６）
LS180細胞（大腸癌細胞株）及びRaji細胞（バーキットリンパ腫細胞株）の培養細胞中におけるGAPDHの増幅を調べた。
つまり、サイトケラチンが陽性のLS180細胞溶液を、サイトケラチンが陰性のRaji細胞溶液で稀釈した場合の、各濃度のLS180細胞溶液試料でのGAPDHの増幅について調べ、サイトケラチンの腫瘍マーカーを測定する場合に、GAPDHがデータ補正のコントロールとして使用可能か否かを検討した。
１）試料
LS180細胞及びRaji細胞の総細胞数が8000となるように試料を調製した。総細胞数8000のうち、LS180細胞数が8000、800、80、8及び0となるようにした。
２）GAPDH用プライマーセット
実験例５と同様のプライマーセットを選択した。
３）反応液組成
実験例２と同様の組成の反応液を使用した。
４）RT-LAMP法
実験例２と同様に行った。実験例５と同様の６種のプライマーを含む反応液23μlに、細胞の懸濁液を2μl添加し、65℃で1時間加温して行った。
５）核酸の検出
実験例２と同様に行った。
６）結果
その結果を第４図に示した。その結果、LS180細胞及びRaji細胞の比率が異なる場合でも、GAPDHは10分程度で増幅が確認された。このことより、腫瘍マーカーの有無にかかわらず、ヒト細胞中にはGAPDHが構成的に発現していることが確認され、GAPDHがLAMP法におけるデータ補正のコントロールとして使用可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
以上説明したように、本発明のプライマー又はプライマーセットを用いてLAMP法を行うと、速い場合で15分以内にβ-アクチン又はGAPDHの増幅が確認される。
また、サイトケラチンのような腫瘍マーカーの有無にかかわらず、ヒト細胞からβ-アクチンやGAPDHの存在が認められることにより、これらがLAMP法においてデータ補正のコントロールとして使用可能であることがわかった。
このことから、本発明のプライマー、又はプライマーセットを用いると、核酸増幅手段を用いた癌転移診断に際し、診断に要する時間が短縮され、信頼性のある診断が可能となった。
【図１】
2010046078.tif 000007
【図２】
2010046078.tif 000008
【図３】
2010046078.tif 000009
【図４】
2010046078.tif 000010
【配列表】
2010046078000001.app