(57)【要約】【課題】生物学的および形態学的基準によって特徴づけられた上述の培養物および単離物から出発すると、次の段階は、これらの培養物中に生成されたウイルス粒子に関連する核酸物質を特徴づける努力を行うことである。【解決手段】本発明は、最初に、単離または精製されたウイルス性物質に関し、種々の方法で認識もしくは特徴付けすることができる。【選択図】図２５
2010047604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を除いて、以下の配列、すなわち：
（ａ）５’−３’の方向で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド１８１で始まってヌクレオチド３３０で終わる配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９；
（ｂ）配列（ａ）と相補的な配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０から成る群から選択されるペプチド配列の全部または一部をコードする配列、
より成る群から選択されるコードヌクレオチド配列を含むかまたはそれから成る、多発性硬化症または慢性関節リウマチと関連するウイルスのヌクレオチドフラグメントによってコードされた抗原性ポリペプチド。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４から成る群から選択されるペプチド配列をコードすることを特徴とする、請求項１に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３から成る群から選択される、請求項３に記載の抗原性ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
診断、予防および治療のための多発性硬化症に関与するウイルス性物質およびヌクレオチドフラグメント 多発性硬化症（ＭＳ）は、原因不明の中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄疾患である。
【背景技術】
【０００２】
多くの研究が、ウイルスが原因と見られる疾患であるという説を支持しているが、調べられた既知のウイルスは、いずれも求める原因ではかった。ＭＳに関して数年間探されたウイルスの評価が、Ｅ．Ｎｏｒｒｂｙ（非特許文献１）とＲ．Ｔ．Ｊｏｈｎｓｏｎ（非特許文献２）によってまとめられている。
【０００３】
最近、既知のヒトレトロウイルスとは異なるレトロウイルスがＭＳ患者から単離された（非特許文献３、４および５）。これらの著者は、このレトロウイルスがin vitroで伝達され得ること、ＭＳ患者がこのレトロウイルスによる軟膜細胞の感染に関連するタンパク質を認識しうる抗体を産生すること、および、この抗体の発現が、あるヘルペスウイルスの即時型初期遺伝子によって強烈に刺激され得ることを示した（非特許文献６）。
上記結果の全てが、少なくとも一つの未知のレトロウイルス、Ｈ．Ｐｅｒｒｏｎ（非特許文献３）によって公開された方法に基づいて検出され“ＬＭ７様ＲＴ”活性として特徴付けされる逆転写酵素活性を備えたウイルスの、ＭＳにおける役割を示している。（非特許文献３）に特定された刊行物の内容を、参照として本明細書に取り込む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際特許公開第９３／２０１８８号公報
【特許文献２】仏国特許第２７１６１９８
【特許文献３】仏国特許出願第９５／０２９６０
【特許文献４】仏国特許出願第９２／０４３２２号
【特許文献５】仏国特許出願第９２／１３４４７号
【特許文献６】仏国特許出願第９２／１３４４３号
【特許文献７】仏国特許出願第９４／０１５２９号
【特許文献８】仏国特許出願第９４／０１５３１号
【特許文献９】仏国特許出願第９４／０１５３０号
【特許文献１０】仏国特許出願第９４／０１５３２号
【特許文献１１】仏国特許出願第９４／１４３２２号
【特許文献１２】仏国特許出願第９４／１５８１０号
【特許文献１３】欧州特許公開第０５６９２７２号公報
【特許文献１４】欧州特許公開第０５６９２７２号
【特許文献１５】仏国特許文献ＦＲ２６６３０４０
【特許文献１６】欧州特許公開第０５６９２７２号公報
【特許文献１７】国際特許公開第９３／２０１８９
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Norrby E., Prog. Med. Virol., 1978; 24, 1-39.
【非特許文献２】Johnson R. T., “Handbook of clinical neurologym, 47 Demyelinating diseases”, Vinken P. and Bruym G.W., eds. Amsterdam, Elsevier Science Publishing, 1985, 319-336.
【非特許文献３】Perron H. et. al.., Res. Virol. 1989, 140, 551-561.
【非特許文献４】Perron H. et. al., “Current concepts in multiple sclerosis” Wietholter et al., eds. Amsterdam, Elsevier 1991, 111-116.
【非特許文献５】Perron H. et al., The Lancet 1991, 337, 862-863.
【非特許文献６】Perron H. et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 65-72.
【非特許文献７】Fields and Knipe, Fondamental Virology 1986, Rev Press N.Y.
【非特許文献８】Nielsen P.E. et al., Science 1991; 254, 1497-1500.
【非特許文献９】Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, 1982.
【非特許文献１０】Southern. E.M., J. Mol. Biol. 1975, 98, 503.
【非特許文献１１】Dunn A.R. and Hassel J.A., Cell 1977, 12, 23.
【非特許文献１２】Shin et al., J. Virol. 1989, 63, 64-75.
【非特許文献１３】Perron H. et al., Res. Vir. 1992, 143, 337-350.
【非特許文献１４】Meyerhans et al., Cell 1989, 58, 901-910.
【非特許文献１５】Linial M.L. and Miller A.D., “Current topics in microbiology and immunology. Retroviruses, strategies of replication” vol. 157, 125-152; Swanstrom R. and Vogt P.K., editors, Spring-Verla-g, Heidelberg 1990.
【非特許文献１６】Lori F. et al., J. Virol. 1992, 66, 5067-5074.
【非特許文献１７】Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Molcular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.
【非特許文献１８】La Mantia et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1513-1520.
【非特許文献１９】Gonzales-Quintial R, Baccala R, Pope R M and Theofilopoulos N, J. Clin. Invest. vol. 97, Number 5, pp1335-1343, 1996.
【非特許文献２０】Chomzynski P. and N. Sacchi, Analytical Biochemistry 1987, 162, 155-159.
【非特許文献２１】F. Mallet et al., Journal of Clinical Microbiology 1993; 31, 1444-1449.
【非特許文献２２】G. Barany and R.B. Merrifielsd, 1980, In the Peptides, 2, 1-284, Gross E and Meienhofer J, Eds., Academic Press, New York.
【非特許文献２３】Poser et al., Gbers G.C. eds. The diagnosis of multiple sclerosisi Thieme Stratton Inc, New York 1984: 225-229.
【非特許文献２４】La Mantia et al., Nucleic Acid Research 1989, 17, 5913-22.
【非特許文献２５】PLAZA, A; KONO, D.H.; THEOFILOPOULOS, A.N. NEW HUMAN Vβ 12DD GENES AND POLYMORPHIC VARIANTS. J. Imm; 147(12): 4360-4365, 1991.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
最近、本出願人の研究により、二人の異なるＭＳ患者に由来する天然の単離物で感染された二つの連続する細胞系統が、国際特許公開第９３／２０１８８号公報に記載された培養方法から得られるようになった。この文献の内容を、参照として本明細書中に取り込む。これらの二つの系統は、ヒト脈絡叢細胞から誘導され、ＬＭ７ＰＣおよびＰＬＩ−２と称され、ブダペスト条約の規定により、それぞれ９２０７２２０１および９３０１０８１７の番号で、１９９２年７月２２日および１９９３年１月８日にＥＣＡＣＣに寄託された。さらに、ＬＭ７様ＲＴ活性を備えたウイルス単離物も、“株”の総称でＥＣＡＣＣに寄託された。ＰＯＬ−２と称される、ＰＬＩ−２系統に保有された“株”すなわち単離物は、１９９２年７月２２日にＶ９２０７２２０２の番号で寄託された。ＭＳ７ＰＧと称される、ＬＭ７ＰＣ系統に保有された“株”すなわち単離物は、１９９３年１月８日にＶ９３０１０８１６の番号でＥＣＡＣＣに寄託された。
【０００７】
生物学的および形態学的基準によって特徴づけられた上述の培養物および単離物から出発すると、次の段階は、これらの培養物中に生成されたウイルス粒子に関連する核酸物質を特徴づける努力を行うことである。
【０００８】
感染および／またはウイルス発現と関わるエピトープに向けられた免疫反応を検出するために、既に特徴付けされたゲノムの部位は、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を用いたウイルスゲノムの分子検出テストと免疫血清学テストを開発するために用いられている。
【０００９】
これらの道具により、既に、ＭＳと、後述する患者に同定された配列の発現との間の関係を確認することができた。しかしながら、出願人に見出されたウイルスシステムは、複合レトロウイルスシステムに関連する。実際に、ＭＳ患者の細胞の種々の培養によって生成された細胞外ウイルス粒子にエンキャプシデーションを受けた（encapsidated）ことが見出された配列は、関係はあるものの、感染ウイルス粒子を産生する“野生型”レトロウイルスゲノムとは異なるレトロウイルスゲノムのコエンキャプシデーション(coencapsidation)があることを明示した。この現象は、複製レトロウイルスと、同じファミリーに属する内在性レトロウイルス、もしくは非相同のレトロウイルスとの間にさえも観察された。ＭＳＲＶ−１の場合には、ＭＳＲＶ−１ゲノムに相同な配列を含む内在性レトロウイルス配列が、正常なヒトＤＮＡ中に存在することが確認されたので、我々の知見の脈絡において内在性レトロウイルスという観念は特に重要である。これらのゲノムの全てもしくは一部によるＭＳＲＶ−１に関する内在性レトロウイルス要素（ＥＲＶ）の存在は、ヒト細胞におけるＭＳＲＶ−１レトロウイルスの発現が、密接に関連する内在配列と相互作用し得るという事実を説明する。これらの相互作用は、病原性および／または感染性内在性レトロウイルスの場合に見出され（例えばマウス白血病ウイルスのある種のエコトロピック(ecotropic)株）、かつ、外因性レトロウイルスの場合には、そのヌクレオチド配列が、ＥＲＶの形態で、部分的もしくは全体的に宿主動物のゲノムに見出される（例えば、ミルクを介して伝達されるマウスの外因性哺乳動物腫瘍ウイルス）。これらの相互作用は、主に、（i）複製レトロウィルスによるＥＲＶのトランスアクティベーション(trans-activation)もしくはコアクティベーション(coactivation)、（ii）ＥＲＶと関連する、すなわちＥＲＶのＲＮＡ、もしくは細胞性ＲＮＡの“非正統的”エンキャプシデーション、− 複製株の発現によって産生されるレトロウイルス粒子における調和したエンキャプシデーション配列を単に所有し、時には伝達可能であって、時にはそれ自身の病原性を備える、および（iii）特に逆転写の段階における、ハイブリッドゲノムの形成を導く、コエンキャプシ
デーションを受けたゲノムの間の、時に伝達性で時にそれ自身が病原性を備える、多かれ少なかれ実質的な組換え、から構成される。
【００１０】
しかして、（i）ＭＳＲＶ−１に関連した種々の配列が、精製されたウイルス粒子に見出された；
（ii）ＭＳＲＶ−１レトロウイルス性ゲノムの種々の領域の分子分析は、ＭＳＲＶ−１の感染および／または発現によって生成された、コエンキャプシデーションを受けた、干渉および／または組み換えられた配列を系統的に分析することによって行われるべきであり；さらには、あるクローンは、レトロウイルス複製および鋳型のエラー、および／または逆転写酵素の転写エラーによって生成された不完全な配列部位を有することがある；
（iii）同じレトロウイルスゲノム領域に関連する配列のファミリーは、発現されたクローンの間の不変領域の同定によって、並びに、抗原性および／または病原性ポリペプチドの生成の原因である読み枠の同一性によって、最適化される総体的な診断検出手段を提供し、これは発現されたクローンの一部によってのみ、もしくはちょうど一つによってさえも生成され、そして、これらの条件下で、与えられた遺伝子の領域で発現されたクローンの総体的な分析により、この領域におけるＭＳＲＶ−１ゲノムの変化および／または組換えの頻度を評価することができ、特に診断において適用の最適配列を定義することができる；
（iv）ＭＳＲＶ−１等のレトロウイルスによって引き起こされる病理は、その発現およびその結果として生成されたタンパク質もしくはペプチドの直接的影響であるが、関連したもしくは非相同のゲノムの、並びにその結果として生成されたタンパク質もしくはペプチドの活性化、エンキャプシデーションもしくは組換えの影響でもある；しかして、ＭＳＲＶ−１の発現および／または感染に係るゲノムは、このウイルスの潜在的な病原性の不可欠な部分であって、しかして、診断検出および特別な治療標的の手段を構成する。同様に、仏国特許第２７１６１９８に公開された特許出願に記載されたＭＳＲＶ−２もしくはグリオトキシック(glyotoxic)ファクター等の問題の病気の原因であるこれらの相互作用と関連するあらゆる試薬もしくはコファクターは、特にＭＳであるが、同じ試薬と関わる他のあらゆる疾患の診断、予後、治療的観察および／または統合治療の総体的かつ非常に効果的な戦略の発展に関わる。
【００１１】
この文脈中で、並行的な知見が他の自己免疫疾患、慢性関節炎リウマチ（ＲＡ）でなされ、仏国特許出願第９５／０２９６０に記載されている。この知見は、ＭＳについて本出願人の研究で用いられたものと類似した方法的試みを適用することによって、ＭＳにおけるＭＳＲＶ−１に記載された配列を分けるＲＡに発現されたレトロウイルス、および、ＭＳにも記載された関連するＭＳＲＶ−２配列の共存も同定することができることを示す。ＭＳＲＶ−１について言えば、ＭＳおよびＲＡに共通して検出された配列は、ｐｏｌおよびｇａｇ遺伝子に関連する。現在の知識では、これら二つの疾患に発現されたＭＳＲＶ−１株で記載されたｇａｇおよびｐｏｌ配列を結びつけることができる。
【００１２】
本特許出願は、以下の仏国特許出願によって既に保護されたものに付随する種々の結果に関する。
−１９９２年４月３日の第９２／０４３２２号、公開第２６８９５１９号
−１９９２年１１月３日の第９２／１３４４７号、公開第２６８９５２１号
−１９９２年１１月３日の第９２／１３４４３号、公開第２６８９５２０号
−１９９４年２月４日の第９４／０１５２９号、公開第２７１５９３６号
−１９９４年２月４日の第９４／０１５３１号、公開第２７１５９３９号
−１９９４年２月４日の第９４／０１５３０号、公開第２７１５９３６号
−１９９４年２月４日の第９４／０１５３２号、公開第２７１５９３７号
−１９９４年１１月２４日の第９４／１４３２２号、公開第２７２７４２８号
および−１９９４年１２月２３日の第９４／１５８１０号、公開第２７２８５８５号。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、最初に、単離または精製されたウイルス性物質に関し、種々の方法で認識もしくは特徴付けすることができる。
− そのゲノムは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、これらの相補配列、およびこれらと等価の配列であって、特に、１００個連なるモノマーのどこの配列に対しても、前記配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含む群から選択されたヌクレオチド配列、およびこれらの相補配列を含む；
− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と同一もしくは等価の配列を含むサブ領域(subregion)を除く、ｅｎｖおよびｐｏｌ遺伝子を含むそのゲノムの領域およびｇａｇ遺伝子の部位は、少なくとも３０個連なるアミノ酸のどこの配列に対しても、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９およびこれらの相補配列を含む群から選択されたいずれかのヌクレオチド配列にコードされたペプチド配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％の相同性を示すあらゆるポリペプチドをコードする；
− ｐｏｌ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を除くＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７と部分的もしくは全体的に同一もしくは等価のヌクレオチド配列を含む。
− ｇａｇ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８と全体的もしくは部分的に同一もしくは等価のヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
上述したように、本願発明によれば、上記ウイルス性物質はＭＳと関連する。
ＭＳＲＶ−１のｐｏｌもしくはｇａｇ遺伝子、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５６、５７、５９、６０、６１、８８および８９に参照として定義されたように、このウイルス性物質はＲＡと関連する。
本発明は、もしこのヌクレオチドフラグメントがＬＡ ＭＡＮＴＩＡら（非特許文献１８）に記載された配列ＥＲＶ−９を含まない、もしくはＥＲＶ−９ではないならば、以下を含む群から選択されたヌクレオチド配列をそれぞれ含む種々のヌクレオチドフラグメントにも関する。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によって定義されたヌクレオチドフラグメントの全配列を除く、ＭＳＲＶ−１ウイルスの部分的もしくは全体的なｐｏｌ遺伝子の全てのゲノム配列；
（ｂ）ＭＳＲＶ−１の部分的もしくは全体的なｅｎｖ遺伝子の全てのゲノム配列；
（ｃ）ＭＳＲＶ−１のｇａｇ遺伝子の全ての部分的なゲノム配列；
（ｄ）ＭＳＲＶ−１ウイルスのｐｏｌ遺伝子とｅｎｖ遺伝子に重複する遺伝子配列の全て、および重複するｐｏｌ遺伝子とｇａｇ遺伝子。
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によって定義付けられた配列と同一もしくはこの配列に内在するあらゆるヌクレオチド配列を除く、クローンＦＢｄ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ｔ ｐｏｌ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）、ＪＬＢｃ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）、ＪＬＢｃ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）およびＧＭ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）、ＧＢｄ１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）、ＬＢ１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）、ＬＴＲＧＡＧ１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、ＦＰ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、Ｇ＋Ｅ＋Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）を含む群から選択される部分的および全体的なクローンの全ての配列；
（ｆ）前記ゲノム配列に相補的な配列；
（ｇ）前記配列（ａ）〜（ｅ）と同一の配列、特に、１００個連なるモノマーのどこの配列に対しても、前記配列（ａ）〜（ｄ）と少なくとも５０％、好ましくは７０％の相同性を示すヌクレオチド配列。
【００１５】
ゲノム配列という用語は、部分的もしくは全体的にコエンキャプシデーションもしくは共発現(coexpression)に関連する全ての配列、もしくは組換え配列を含む。
【００１６】
好ましくは、このようなフラグメントは以下を含む：− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に定義されたヌクレオチドフラグメントの全配列を除く、ＭＳＲＶ−１ウイルスのｐｏｌ遺伝子の部分的もしくは全体的なゲノム配列に等しいヌクレオチド配列、もしくは前記部分的もしくは全体的なゲノム配列と等価のあらゆる配列に等しいヌクレオチド配列、特にこれらに相同であるもの；
− または、ＭＳＲＶ−１ウイルスのｅｎｖ遺伝子の部分的もしくは全体的なゲノム配列に等しいヌクレオチド配列、もしくは前記ヌクレオチド配列に相補的なあらゆる配列に等しいヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列と等価のあらゆる配列に等しいヌクレオチド配列、特にこれらに相同であるもの。
特に、本発明は、以下を含む群から選択されたヌクレオチド配列に部分的もしくは全体的に等しいヌクレオチド配列を含むヌクレオチドフラグメントに関する。
− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９に定義されたヌクレオチド配列；
− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９に相補的な配列；
− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９に等価、および特に相同な配列；
− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に定義されたペプチド配列の全てまたは一部をコードする配列；
− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に等価、特に相同なペプチド配列の全てもしくは一部をコードする配列であって、ＭＳＲＶ−１ウイルスに感染した患者、あるいはＭＳＲＶ−１ウイルスが再活性化された患者の血清で認識されうるもの。
【００１７】
本発明は、前記病原性成分のゲノムに所属または内在し、上述したあらゆるフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができる、ＭＳに係る病原性および／または感染性成分の検出のためのあらゆる核酸プローブにも関連する。さらに、ｐｏｌおよびｇａｇ遺伝子として上述したあらゆるフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、特に配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、５１、５６、５９、６０、６１、６２、８９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、６３および９０に関する、ＲＡに係る病原性および／または感染性成分の検出のためのあらゆる核酸プローブにも関する。
また、本発明は、ウイルス性物質のＲＮＡもしくはＤＮＡの重合による増幅のためのプライマーにも関し、上記のあらゆるフラグメントのヌクレオチド配列の少なくとも一部に等しいまたは等価なヌクレオチド配列を含み、特に１０個連なるモノマーのどこの配列に対しても、前記フラグメントの少なくとも前記部位と少なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含む。好ましくは、このようなプライマーのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６を含む群から選択されたいずれか一つの配列に等しい。
【００１８】
一般的に、本発明はあらゆるＲＮＡもしくはＤＮＡ、特に上述されたウイルス性物質のゲノムフラグメントもしくはヌクレオチドフラグメントを含む複製ベクターを内包する。
また本発明は、上述したヌクレオチドフラグメントに属するあらゆる読み枠フレームにコードされた種々のペプチド、特に、ＭＳＲＶ−１ウイルスに感染した患者の血清および／またはＭＳＲＶ−１ウイルスが再活性化された患者の血清に認識される抗原決定基を形成もしくは含有するあらゆるオリゴヌクレオチド等のあらゆるポリペプチドにも関連する。好ましくは、このポリペプチドは抗原性であって、５’−３’の方向に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド１８１から始まってヌクレオチド３３０で終わる読み枠にコードされる。
【００１９】
特に、本発明は、ＭＳＲＶ−１ウイルスに感染した患者の血清および／またはＭＳＲＶ−１ウイルスが再活性化された患者の血清に認識される抗原性ポリペプチドに関し、そのペプチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７に定義された配列に、部分的もしくは全体的に同一もしくは等価である。このような配列は、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７を含む群から選択されたあらゆる配列と同一である。
【００２０】
また本発明は、ＭＳＲＶ−１ウイルスに対して向けられたモノクローナルもしくはポリクローナル抗体も提案する。これらは上記抗原性ポリペプチドからなる免疫原性成分に対するヒトもしくは動物の体の免疫学的反応によって得られる。
【００２１】
次いで、本発明は以下のことにも関する。
− ＭＳＲＶ−ウイルスの検出、もしくはこのウイルスに対する暴露の検出のための試薬であって、反応性物質として、上述したような抗原性ペプチド等のペプチド、もしくは前記ペプチドに対する抗体等の抗リガンドを含む；
− 特に上述したような抗原性ペプチド等の一つ以上のペプチド、もしくは上述したペプチドに対する抗体等の一つ以上の抗リガンドを含む、全ての診断、予防もしくは治療組成物；このような組成物としては、好ましくは、そして例示的にはワクチン組成物である。
本発明は、上述のヌクレオチドフラグメントあるいはオリゴヌクレオチド等のポリヌクレオチドを含むＭＳに係る少なくとも一つの病原性および／または感染性試薬の発現を阻害するための、あらゆる診断、予防もしくは治療組成物にも関する。これらの配列は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を備えたフラグメントの配列を除く、前記フラグメントの配列と部分的に同一である。同様に、ｐｏｌおよびｇａｇ遺伝子として上述された、特に配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、５１、５６、５９、６０、６１、６２および８９に関する、ヌクレオチドフラグメントを含むＲＡに係る少なくとも一つの病原性および／または感染性試薬の発現を阻害するための、あらゆる診断、予防もしくは治療組成物にも関する。
【００２２】
本発明によれば、オリゴヌクレオチド等のこれらの同じフラグメントもしくはポリヌクレオチドは、適切な工程もしくは方法で、生物学的サンプル中のＭＳおよびＲＡに係る病原性および／または感染性成分を検出するための全ての適切な組成物と関係してもよい。このような方法では、前記病原性および／または感染性成分に属すると考えられる、もしくはこれらに由来するＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、および／またはこれらの相補的ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを、このような組成物と接触させる。
【００２３】
本発明は、生物学的サンプルをペプチド、特に上述した抗原性ペプチド、もしくはこのペプチドに対する上述したような抗体等の抗リガンドと接触させることによって、生物学的サンプルにおける病原性および／または感染性成分の存在もしくは暴露を検出するあらゆる工程にも関する。
【００２４】
実際には、そして例示的には、ＭＳＲＶ−１ウイルスを検出するための装置は、免疫学的に適合する固相支持体に支持された上述の試薬、および、免疫学的反応が起こる条件下で、抗ＭＳＲＶ−１抗体を含みそうな血液もしくは脳脊髄液のサンプル等の生物学的サンプルをこの試薬と接触させる手段とを含む。上記の道具は、この試薬と共に形成された免疫複合体を検出する手段を含む。
【００２５】
最後に、本発明は、血液もしくは脳脊髄液のサンプル等の生物学的サンプル中の抗ＭＳＲＶ−１抗体の検出にも関し、この方法では、可能な免疫反応が起こる条件下で抗体からなる上記試薬とこのサンプルとを接触させ、それによって試薬と形成された免疫複合体の存在を検出する。
【００２６】
本発明を詳細に記載する前に、明細書および請求の範囲で用いられる種々の用語を以下に定義する： − 株もしくは単離物とは、例えば、ウイルス及び／又はバクテリア及び／又は寄生虫等を含むあらゆる感染性および／または病原性生物学的フラクションを指し、病原性及び／又は抗原性能を作りだし、培養物または生きた宿主に保有されている；例えば上記の定義に係るウイルス株は、病原性の原生生物等の共感染成分を含むことができる、 − 本明細書中で使用される“ＭＳＲＶ”という用語は、ＭＳに係るあらゆる病原性及び／又は感染性成分を示し、特にウイルス種、前記ウイルス種の弱毒化株、あるいは、この種から誘導されたコエンキャプシデーションを受けたゲノムもしくはＭＳＲＶ−１ゲノムの一部と組換えられたゲノムを含む欠陥干渉粒子もしくは粒子を示す。ウイルス、特にＲＮＡを有するウイルスは、特に比較的高い割合で自然変異（非特許文献７）による多様性を有することが知られており、これは等価物の観念を定義する上で考慮すべきことである、 − ヒトウイルスは、ヒトに感染する、もしくは保有されるウイルスを意味すると解する、 − 本発明を実施する際に遭遇する全ての天然あるいは誘導された変形物および／または組換えに鑑み、上記および請求の範囲に定義された発明の主題は、特に相同のヌクレオチドまたはペプチド配列の、以下に定義された種々の生物学的物質の等価物または誘導物を含むとされる、 − 本発明に係るウイルスまたは病原性及び／又は感染性の成分の変異体は、前記ウイルス及び／又は前記病原性及び／又は感染性の成分の少なくとも一つの対応する抗原向けの少なくとも一つの抗体によって認識される少なくとも一つの抗原、及び／又は、ゲノムであって、当業者によく知られた特定のハイブリダイゼーション条件下で、ゲノムのあらゆる部位が、前記ウイルスおよび／または病原性および／または感染性成分に特異的な少なくとも一つのハイブリダイゼーションプローブおよび／または少なくとも一つのヌクレオチド増幅プライマーによって検出され、例えばＭＳＲＶ−１ウイルスであれば、このプライマーおよびプローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５およびこれらの相補配列から選択されたヌクレオチド配列を有する、 − 本発明によれば、ヌクレオチドフラグメントまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、モノマーが並んだもの、もしくは生体高分子であって、天然の核酸の情報の配列によって特徴づけられ、予め決められた条件下でいかなる他のヌクレオチド断片ともハイブリダイズすることができ、この配列は、種々の化学構造のモノマーを含むように変更できるとともに、天然の核酸の分子から、およびまたは遺伝子組換え、および／または化学合成によって得ることができる；ヌクレオチドフラグメントは、本願発明に記載されたＭＳＲＶ−１ウイルスのゲノムフラグメントと同一であってもよく、このウイルスの場合には���ｐｏｌまたはｅｎｖ等のゲノムと同一でもよい。
【００２７】
− しかして、モノマーは、構成要素が、糖、リン酸基および窒素塩基とされた、核酸の天然ヌクレオチドとすることができる；ＲＮＡでは糖がリボースであり、ＤＮＡでは糖が２−デオキシリボースである；核酸がＤＮＡかＲＮＡかによって窒素塩基はアデニン、グアニン、ウラシル、シトシンおよびチミンから選択される；またヌクレオチドは、三つの構成要素の少なくとも一つを修飾することができ、例えば、塩基を修飾した場合には、イノシン、５−メチルデオキシシチジン、デオキシウリジン、５−（ジメチルアミノ）デオキシウリジン、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモデオキシウリジンおよびハイブリダイゼーションを促進する他の修飾された塩基等の修飾塩基を生じる；糖では、修飾は、少なくとも一つのデオキシリボースをポリアミドで置換すること（非特許文献８）からなる、および、リン酸基では、修飾は、特にジホスファート、アルキル−およびアリルホスホナートおよびホスホロチオアートエステルから選択されたエステルによって置換することからなる、 − “情報配列”は、モノマーが並んだ一連のものを意味し、その化学的特性および参照方向への並びは、天然の核酸と同質の機能情報の項目を構成すると否とに関わらない、 − ハイブリダイゼーションとは、適切な作用条件下で、十分相補的な配列を有する二つのヌクレオチド断片が対になって複合体構造、好ましくはヘリックスの形態で、特にダブルまたはトリプルの複合体構造を形成する間の工程を意味する、 − プローブとは、化学的に合成されたヌクレオチドフラグメント、あるいは長いヌクレオチドフラグメントを分解または酵素的に切断することによって得られたヌクレオチドフラグメントを含み、少なくとも６個のモノマー、有利的には１０〜１００個のモノマー、そして好ましくは１０〜３０個のモノマーを含み、特定の条件下でハイブリダイゼーションの特異性を有するもので；好ましくは、１０個より少ないモノマーを有するプローブは単独で使用せずに、同じくらい短い、もしくはそのほかの他のプローブの存在下で用いられる；ある特定の条件下では、１００個のモノマーより大きいサイズのプローブを使用することもできる；プローブは、特に診断の目的で使用することができ、このような分子は、例えば捕獲及び／又は検出プローブとされる、 − 捕獲プローブは、適切な手段、すなわち直接または間接的に、例えば共有結合または受動的な吸着によって固相支持体に固定することができる、 − 検出プローブは、特に放射性同位元素、特にペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼから選択された酵素、および発色性、蛍光性または発光性の基質を加水分解することができる酵素、発色性の化学化合物、発色性、蛍光性または発光性化合物、ヌクレオチド塩基のアナログおよびビオチンから選択された標識手段によって標識することができる、 − 本発明の診断目的に使用されるプローブは、特に、“ドットブロット”（ 非特許文献９）、“サザンブロット”（ 非特許文献１０）、標的にＲＮＡを用いる以外は“サザンブロット”技術と同じ“ノーザンブロット”、およびサンドウィッチ技術（非特許文献１１）と称される技術等の、既知のあらゆるハイブリダイゼーション技術に用いることができる；本発明では、捕獲プローブおよび検出プローブが少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を持たなければならないという理解の上で、特異的な捕獲プローブ及び／又は特異的な検出プローブを含むサンドウィッチ技術を用いることが有利である、 − 本発明に係るあらゆるプローブは、特に翻訳及び／又は転写等の複製現象を妨げ、及び／又はＤＮＡ及び／又はＲＮＡを分解するために、in vivoまたはin vitroでＲＮＡ及び／又はＤＮＡとハイブリダイズすることができる、 − プライマーは、少なくとも６個のモノマー、有利的には１０〜３０個のモノマーを有し、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）等の増幅技術、シークエンシング等の延長工程、逆転写方法等において、酵素による重合反応の開始のために特定の条件下でハイブリダイゼーションの特異性を有するプローブである、 − 関係する技術における適用または使用に関して、機能的に対応する生体高分子が、同一ではなくても、実質的に同じ役割を果たすことができるならば、二つのヌクレオチド配列またはペプチド配列は、互いにまたは基準の配列に対して等価もしくは誘導されたものと称される；自然の可変性、特に変異が同定される種の自然変異、もしくは誘導された可変性の結果として得られた場合には、二つの配列は等価であるとされる。二つの相同な配列である場合の相同性に関しては以下に記載する。
【００２８】
− “変異性”は、配列の自然または誘導された修飾を意味し、特にヌクレオチド及び／又はヌクレオチドフラグメントの置換及び／又は挿入及び／又は欠失、及び／又は一端または両端における配列の伸長または短縮を意味するものである：自然的でない変異性は、遺伝子工学技術によるもので、例えば、核酸の増幅用に選択された合成プライマーの選択、縮重物（デジェネレート）等である；この多様性は、対照と見なされるあらゆる出発配列の修飾に明らかにすることができ、前記対照配列に対する相同性の度合いで表すことができる。
【００２９】
− 相同性は、比較される二つのヌクレオチドまたはペプチドフラグメントが同一である度合いを特徴づける；参照のヌクレオチドまたはペプチド配列と、ヌクレオチドまたはペプチド配列を直接比較することによって決定される同一部のパーセントで測定される。
− この同一のパーセントは、本発明で扱われるヌクレオチドフラグメント、クローンに対して特に調べられており、これらは、ＭＳＲＶ−１ウイルスに関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に同定されたフラグメントに相同であり、また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７によって同定されたプローブおよびプライマーに相同なプローブおよびプライマーに関する。例えば、以下に詳述するプロトコルに基づいてＬＭ７ＰＣおよびＰＬＩ−２系を起源とするＭＳＲＶ−１ウイルスＲＮＡのフラグメントから得られた核酸の異なる遺伝的共通配列の間に観察される最小の同一の割合は、図１に記載された領域では６７％とされる。
【００３０】
− 参照フラグメントの配列に等価のヌクレオチド配列を所有するものであれば、どんなヌクレオチドフラグメントも、等価もしくは参照配列から誘導されたものと称する；この定義に基づけば、以下のものが参照のヌクレオチドフラグメントに等価である： ａ）参照フラグメントに相補的なものと少なくとも部分的にハイブリダイズすることができるフラグメント ｂ）参照フラグメントを備えた並びが、他の分類学上のグループに由来する他のあらゆるフラグメントを備えたものより、多数の同一の隣接塩基であることを論証するあらゆるフラグメント ｃ）種の天然の変異体から得られる、または得ることができるフラグメント ｄ）参照フラグメントに適用された遺伝子工学技術から得ることのできるフラグメント ｅ）参照フラグメントにコードされたペプチドに相同または同一であるペプチドをコードする少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含むフラグメント、 ｆ）少なくとも一つのモノマーの挿入、欠失または置換、もしくはその一方または両方の端における伸長または縮小により参照フラグメントと異なるフラグメント；例えば、ポリペプチドをコードしないヌクレオチド配列が、その一方または両方の端に隣接する参照フラグメントに対応したフラグメント、 − ポリペプチドは、少なくとも二つのアミノ酸のペプチド、人の介入によって、抽出され、分離され、本質的に単離され、もしくは合成されたオリゴペプチドまたはタンパク質、化学的合成または組換え生物体で発現することによって得られたものを意味すると解する、 − ヌクレオチドフラグメントに部分的にコードされたポリペプチドは、前記ヌクレオチドフラグメントに含まれた少なくとも９個の連続したモノマーによってコードされた少なくとも３個のアミノ酸を有するポリペプチドを意味する、 − 極性、疎水性及び／又は塩基性度及び／又は酸性度及び／又は中性度等の各物理化学的特性が実質的に同一であれば、アミノ酸を他方のアミノ酸の類似体（アナログ）と称する；しかして、ロイシンは、イソロイシンの類似体である。
【００３１】
− 比較されるポリペプチドが、特に同じ抗原性、免疫学的、酵素学的及び／又は分子認識特性等の同じ特性を実質的に有するならば、ポリペプチドを等価または参照のポリペプチドから誘導されたものと称する；特に以下に挙げるものは、参照のポリペプチドに等価である： ａ）少なくとも一つのアミノ酸が、類似のアミノ酸によって置換された配列を有するポリペプチド、 ｂ）前記参照ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドフラグメントの、自然のまたは誘導された変異によって得られた等価のペプチド配列を有するポリペプチド ｃ）前記参照ポリペプチドのミモトープ（mimotope）、 ｄ）一つ以上のアミノ酸が、Ｌ型から、逆のＤ型に置換されたポリペプチド、 ｅ）配列に、例えば、アミン基のアセチル化、チオール基のカルボキシル化、カルボキシル基のエステル化等のアミノ酸の側鎖の修飾が導入されたポリペプチド、 ｆ）配列内の一つ以上のペプチド結合が、例えばｃａｒｂａ、ｒｅｔｒｏ、ｉｎｖｅｒｓｏ、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ、還元されたおよびメチレンオキシ結合等で修飾されたポリペプチド、 ｇ）その少なくとも一つの抗原が、参照ポリペプチドに対して向けられた抗体に認識されるポリペプチド。
【００３２】
− 本発明では、比較された二つのペプチドフラグメントの相同性を特徴づける同一の割合が、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％である。
逆転写酵素活性を有するウイルスは、遺伝的にＲＮＡおよびＤＮＡの形態で同様に特徴づけられることから、ウイルスのＤＮＡおよびＲＮＡの両方を、本願発明ではＭＳＲＶ−１と称される逆転写酵素活性を有するウイルスに係る配列を決めるために調べる。
“第一ヌクレオチド配列”等の、本明細書および請求の範囲に用いられた順序表現は、特別な順序を表すためのものではなく、本発明をより明確に記載するためのものである。
基質もしくは試薬の検出(detection)とは、以下において、前記基質もしくは試薬の同定および定量の両方、もしくは分離または単離を意味するものと解する。
添付された図面を参照して記載された以下の詳細な説明により、本発明をよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ＬＭ７ＰＣおよびＰＬＩ−２系統を起源とするウイルスＤＮＡから、Ｓｈｉｈ（非特許文献１２）によって定義された“ｐｏｌ”領域においてＰＣＲ技術で増幅されたＭＳＲＶ−１Ｂクローンの一般的な核酸の共通配列を示し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に同定され、増幅プライマーと共通に一致するものはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を有する。
【図２】図２は、各ＭＳＲＶ−１Ｂ／“ＰＣＲ ｐｏｌ”型のファミリーに対する機能的な読み枠の定義を与えるもので、前記ファミリーＡ〜Ｄは、それぞれ図１記載のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のヌクレオチド配列によって与えられたものである。
【図３】図３は、ＭＳＲＶ−２Ｂ配列の共通配列の例を与えるもので、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に同定されている。
【図４】図４は、ＭＳ患者から得た培養物中のＢリンパ球にから作られたビリオンの精製勾配から得たスクロース画分中の逆転写酵素（ＲＴ）活性を、ｄｐｍ（１分当たりの崩壊）で示したものである。
【図５】図５は、図４と同じ実験条件下における、多発性硬化症ではない対照から得たＢリンパ球系統の培養物中の逆転写酵素活性の分析を示す。
【図６】図６は、クローンＰＳＪ１７のヌクレオチド配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。
【図７】図７は、Ｍ００３−Ｐ００４と称されるクローンのヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を示す。
【図８】図８は、クローンＦ１１−１のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を示し、プライマー領域の二つの矢印の間に位置する部分は、Ｆ１１−１のクローニングに用いられたプライマーの選択によって負わされた可変性に対応している；同図には、アミノ酸への翻訳が示されている。
【図９】図９は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の可能な機能的読み枠をアミノ酸で示しており、この配列では、ｐｏｌ遺伝子の共通配列に下線が施されている。
【図１０】図１０は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９によって同定されたプライマーから得られた増幅生成物のＰＣＲの結果を、エチジウムブロミドに浸したアガロースゲルの紫外線照射写真の形態で与えるものである。
【図１１】図１１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９によって同定されたプライマーから得られた増幅生成物のＰＣＲの結果を、エチジウムブロミドに浸したアガロースゲルの紫外線照射写真の形態で与えるものである。
【図１２】図１２は、ＭＳＲＶ−１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とＨＳＥＲＶ９と称される内在性レトロウイルスのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１との間の相同性のマトリックス形態での表示を与えるもので、相同性が、少なくとも６５％の箇所は連続した線で示され、線が欠けている箇所は６５％より低い相同性を意味する。
【図１３】図１３は、クローンＦＢｄ３のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６を示す。
【図１４】図１４は、クローンＦＢｄ３とＨＳＥＲＶ−９レトロウイルスとの間の配列相同性を示す。
【図１５】図１５は、クローンｔ ｐｏｌのヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１を示す。
【図１６】図１６は、クローンＪＬＢｃ１のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２を示す。
【図１７】図１７は、クローンＪＬＢｃ２のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３を示す。
【図１８】図１８は、クローンＪＬＢｃ１とクローンＦＢｄ３との間の配列相同性を示す。
【図１９】図１９は、クローンＪＬＢｃ２とクローンＦＢｄ３との間の配列相同性を示す。
【図２０】図２０は、クローンＪＬＢｃ１とＪＬＢｃ２との間の配列相同性を示す。
【図２１】図２１は、ＨＳＥＲＶ−９レトロウイルスとクローンＪＬＢｃ１との間の配列相同性を示す。
【図２２】図２２は、ＨＳＥＲＶ−９レトロウイルスとクローンＪＬＢｃ２との間の配列相同性を示す。
【図２３】図２３は、クローンＧＭ３のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６を示す。
【図２４】図２４は、ＨＳＥＲＶ−９レトロウイルスとクローンＧＭ３との間の配列相同性を示す。
【図２５】図２５は、研究された種々のクローンの、既知のレトロウイルスＥＲＶ９のゲノムに対する局在を示す。
【図２６】図２６は、以降ＭＳＲＶ−１ ｐｏｌ＊と称される領域におけるクローンＦ１１−１、Ｍ００３−Ｐ００４、ＭＳＲＶ−１ＢおよびＰＳＪ１７の位置を示す。
【図２７ａ】図２７ａは、３つの連続する図２７ａ、２７ｂおよび２７ｃの１つであり、３つの連続する図２７ａ、２７ｂおよび２７ｃはｐｏｌ遺伝子の全体をカバーする可能な読み枠を示す。
【図２７ｂ】図２７ｂは、３つの連続する図２７ａ、２７ｂおよび２７ｃの１つであり、３つの連続する図２７ａ、２７ｂおよび２７ｃはｐｏｌ遺伝子の全体をカバーする可能な読み枠を示す。
【図２７ｃ】図２７ｃは、３つの連続する図２７ａ、２７ｂおよび２７ｃの１つであり、３つの連続する図２７ａ、２７ｂおよび２７ｃはｐｏｌ遺伝子の全体をカバーする可能な読み枠を示す。
【図２８】図２８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に基づいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で同定されたアミノ酸配列を備えたペプチドフラグメントＰＯＬ２Ｂをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図２９】図２９は、抗ＩｇＧ抗体を用いて試験された、２９のＭＳ患者の血清と３２の健康な対照の血清に対して得られた４９２ｎｍにおけるＯＤ値（ＥＬＩＳＡ試験）を示す。
【図３０】図３０は、抗ＩｇＭ抗体を用いて試験された、３６のＭＳ患者の血清と４２の健康な対照の血清に対して得られた４９２ｎｍにおけるＯＤ値（ＥＬＩＳＡ試験）を示す。
【図３１】図３１は３つの連続する図３１、３２、および３３の１つであり、３つの連続する図３１、３２、および３３はスポットスキャン(Spotscan)技術に基づいて、ＭＳ血清、対照血清、および、対照血清を用いて少なくとも一つのオクタペプチドに検出された最大シグナルに対応するバックグラウンド（強度＝１）を差し引いた後のＭＳ血清を、それぞれ用いて、これらの血清が１／５０まで希釈されたという理解のもとに、アミノ酸配列６１−１１０をカバーする４３の重複オクタペプチドに対して得られた結果（スポットの相対強度）を示す。最右端に位置する棒は、血清学的試験とは無関係のグラフィックスケール基準を示す。
【図３２】図３２は３つの連続する図３１、３２、および３３の１つであり、３つの連続する図３１、３２、および３３はスポットスキャン(Spotscan)技術に基づいて、ＭＳ血清、対照血清、および、対照血清を用いて少なくとも一つのオクタペプチドに検出された最大シグナルに対応するバックグラウンド（強度＝１）を差し引いた後のＭＳ血清を、それぞれ用いて、これらの血清が１／５０まで希釈されたという理解のもとに、アミノ酸配列６１−１１０をカバーする４３の重複オクタペプチドに対して得られた結果（スポットの相対強度）を示す。最右端に位置する棒は、血清学的試験とは無関係のグラフィックスケール基準を示す。
【図３３】図３３は３つの連続する図３１、３２、および３３の１つであり、３つの連続する図３１、３２、および３３はスポットスキャン(Spotscan)技術に基づいて、ＭＳ血清、対照血清、および、対照血清を用いて少なくとも一つのオクタペプチドに検出された最大シグナルに対応するバックグラウンド（強度＝１）を差し引いた後のＭＳ血清を、それぞれ用いて、これらの血清が１／５０まで希釈されたという理解のもとに、アミノ酸配列６１−１１０をカバーする４３の重複オクタペプチドに対して得られた結果（スポットの相対強度）を示す。最右端に位置する棒は、血清学的試験とは無関係のグラフィックスケール基準を示す。
【図３４】図３４は、免疫優勢を含む二つのポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２を示すが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と４４は、ＭＳに特異的な免疫応答性ポリペプチドを表す。
【図３５】図３５は、クローンＬＢ１９のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９と、アミノ酸の見地からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９の３つの潜在的な読み枠を示す。
【図３６】図３６は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８（ＧＡＧ*）と、アミノ酸の見地からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８の潜在的な読み枠を示す。
【図３７】図３７は、クローンＦＢｄ１３とＨＳＥＲＶ−９レトロウイルスとの間の配列相同性を示す。この図では、連続な線は７０％以上の相同性を意味し、線の無いところは、相同性のパーセントがそれ以下であることを意味する。
【図３８ａ】図３８ａは、３つの連続する図３８ａ、３８ｂおよび３８ｃの１つであり、３つの連続する図３８ａ、３８ｂおよび３８ｃは、クローンＦＰ６のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１と、アミノ酸の見地からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１の３つの潜在的な読み枠を示す。
【図３８ｂ】図３８ｂは、３つの連続する図３８ａ、３８ｂおよび３８ｃの１つであり、３つの連続する図３８ａ、３８ｂおよび３８ｃは、クローンＦＰ６のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１と、アミノ酸の見地からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１の３つの潜在的な読み枠を示す。
【図３８ｃ】図３８ｃは、３つの連続する図３８ａ、３８ｂおよび３８ｃの１つであり、３つの連続する図３８ａ、３８ｂおよび３８ｃは、クローンＦＰ６のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１と、アミノ酸の見地からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１の３つの潜在的な読み枠を示す。
【図３９ａ】図３９ａは、４つの連続する図３９ａ、３９ｂ、３９ｃおよび３９ｄの１つであり、４つの連続する図３９ａ、３９ｂ、３９ｃおよび３９ｄは、クローンＧ＋Ｅ＋Ａのヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９と、アミノ酸の見地からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９の３つの潜在的な読み枠を示す。
【図３９ｂ】図３９ａは、４つの連続する図３９ａ、３９ｂ、３９ｃおよび３９ｄの１つであり、４つの連続する図３９ａ、３９ｂ、３９ｃおよび３９ｄは、クローンＧ＋Ｅ＋Ａのヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９と、アミノ酸の見地からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９の３つの潜在的な読み枠を示す。
【図３９ｃ】図３９ａは、４つの連続する図３９ａ、３９ｂ、３９ｃおよび３９ｄの１つであり、４つの連続する図３９ａ、３９ｂ、３９ｃおよび３９ｄは、クローンＧ＋Ｅ＋Ａのヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９と、アミノ酸の見地からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９の３つの潜在的な読み枠を示す。
【図３９ｄ】図３９ａは、４つの連続する図３９ａ、３９ｂ、３９ｃおよび３９ｄの１つであり、４つの連続する図３９ａ、３９ｂ、３９ｃおよび３９ｄは、クローンＧ＋Ｅ＋Ａのヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９と、アミノ酸の見地からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９の３つの潜在的な読み枠を示す。
【図４０】図４０は、領域Ｅに見出され、かつ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に同定されたＭＳＲＶ−１レトロウイルスのプロテアーゼをコードする読み枠を示す。
【図４１】図４１は、抗ＩｇＧ抗体を用いて試験され、４９２ｎｍにおける正味の光学密度として表された、記号（＋）で示されたＭＳ患者、および記号（−）で示された健康な患者の各血清の反応を示す。
【図４２】図４２は、抗ＩｇＭ抗体を用いて試験され、４９２ｎｍにおける正味の光学密度として表された、記号（＋）で示されたＭＳ患者、および記号（−）で示された健康な患者の各血清の反応を示す。
【実施例】
【００３４】
実施例１：ＬＭ７ＰＣおよびＰＬＩ−２系統を起源とするビリオン調製物のレトロウイルスの保存されたｐｏｌ領域の“重ね合わせ（NESTED）”ＰＣＲ増幅による、レトロウイルスＭＳＲＶ−１および共感染性成分ＭＳＲＶ２をそれぞれ定義づける、ＭＳＲＶ−１ＢおよびＭＳＲＶ−２Ｂと称されるクローンの調製 Ｓｈｉｈ（非特許文献１２）によって公開された技術から誘導されたＰＣＲ技術を使用した。この技術は、ＤＮアーゼで反応媒体の全ての構成要素を処理することによりわずかな混入ＤＮＡの全てを除去することができる。付随的に、異なるがオーバーラップするプライマーを二つの連続したＰＣＲ増幅サイクルに用いることにより、始めに少量であるとともに、ＲＮＡに対するＤＮアーゼの偽の作用が働くことによって試料中でさらに減少したＲＮＡ量から合成されたｃＤＮＡを増幅する機会を増すことができる。実際に、ＤＮアーゼは、８５℃で１０分間熱して、試料中に残ったこの酵素が不活性化する前に全ての少量の混入ＤＮＡを除去することができるような過剰な活性の条件下で用いられる。Ｓｈｉｈ（非特許文献１２）によって記載されたＰＣＲ技術のこの変形を、一方でＰＬＩ−２系統（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．９２０７２２０１）で生成された“ＰＯＬ−２”単離物（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．
Ｖ９２０７２２０２）、および一方でＭＳ７ＰＣ系統（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．９３０１０８１７）で生成されたＭＳ７ＰＧ単離物（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．Ｖ９３０１０８１６）からＨ．Ｐｅｒｒｏｎ（非特許文献１３）によって記載された技術に基づいてスクロース勾配で精製された感染性粒子の画分の核酸から合成されたｃＤＮＡに用いた。これらの培養物は、国際特許公開ＷＯ９３／２０１８８およびＷＯ９３／２０１８９の主題をなす方法に基づいて得られた。
【００３５】
ＴＡクローニングキット（商標）を用いた上記技術によって増幅された生成物をクローニングし、アプライド・バイオシステムズ・モデル３７３Ａ オートマティック・シークエンサーを用いた配列の分析を行った後に、最新の利用可能なバージョンのジーンバンク（商標）データバンクでジーンワークス（商標）ソフトウエアを用いて配列を分析した。
【００３６】
上記の試料からクローン化され、配列決定された配列は、特に二つの型の配列に対応する：第一の型の配列は、クローンの大半（ＰＬＩ−２培養物のＰＯＬ−２単離物を起源とするクローンの５５％、およびＬＭ７ＰＣ培養物のＭＳ７ＰＧ単離物を起源とするクローンの６７％）に見出され、ＥＲＶ−９またはＨＳＥＲＶ−９と称される内在性ヒトレトロウイルスに似ているが別の“ｐｏｌ”配列のファミリーに対応しており、第二の型の配列は、ＭＳＲＶ−２と称される別の感染性及び／又は病原性の成分に帰する配列に非常に強い相同性を有する配列に対応する。
【００３７】
クローンの大半を代表する第一の型の配列は、配列の可変性が、配列の４つのサブファミリーを定義することができる配列からなる。ＨＩＶ−１レトロウイルス（非特許文献１４）でよく知られているように、同じレトロウイルスを起源とする類似の種である、あるいは生産細胞内で共制御されたいくつかの内在性プロウイルスへの病変となった結果であると見なすことができるため、これらのサブファミリーは互いに十分に似ている。これらの多かれ少なかれ不完全な内在性の構成要素は、内在性レトロウイルスの同一のファミリーに属することから（非特許文献１５）、複製し得るプロウイルスによって生成される同一の制御シグナルに敏感である。内在性レトロウイルスのこの新規のファミリー、もしくは、類似の種の世代を培養物中に得ることができ、以下の共通配列を含むレトロウイルスのこの新規の種は、ＭＳＲＶ−１Ｂと称される。
【００３８】
図１は、この実験で配列決定された種々のＭＳＲＶ−１Ｂの配列の一般的な共通配列を示しており、これらの配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に同定されている。これらの配列はジーンバンク（商標）データベースにＸ５７１４７およびＭ３７６３８に示されたＨＳＥＲＶ９配列と７０％〜８８％の範囲の核酸の相同性を示す。おそらくは外因性のレトロウイルスＭＳＲＶ−１Ｂの種々の類似の種、もしくは内因性のレトロウイルスＭＳＲＶ−１Ｂの異なるサブファミリーを代表する４つの“共通”核酸配列が定義される。これらの代表的な共通配列は、アミノ酸への翻訳とともに図２に示されている。機能的な読み枠は、これらのＭＳＲＶ−１Ｂ配列の各サブファミリーに対して存在し、機能的な読み取り枠が、それぞれの場合において、核酸配列の下の二行目に示されたアミノ酸配列に対応しているのがわかる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に同定され、“ｐｏｌ”領域におけるＰＣＲ技術によって得られたＭＳＲＶ−１Ｂ配列の一般的な共通部分は、図１に示されている。
【００３９】
配列決定されたクローンの大半を示す第二の型の配列は、図５に図示された配列ＭＳＲＶ−２Ｂに示され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に同定されている。ＰＣＲプライマーに対応する配列に観察される違いは、異なる技術条件下で用いられた混合形態における退化プライマーの使用により説明される。
【００４０】
ＭＳＲＶ−２Ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）は、データバンクに既に記載されたレトロウイルスの配列とは十分に異なるため、この配列領域は、ＭＳＲＶ−２と称される新規の感染性の成分に属すると考えられる。この感染性の成分は、原則としては、得られた第一の配列の分析に基づいて、レトロウイルスに係るものであるが、この配列を得るために用いた技術から、例えばＢ型肝炎ウイルス、ＨＢＶ（非特許文献１２）のように、逆転写酵素活性を付随的に備えた酵素をコードするゲノムを備えたＤＮＡウイルスであるかもしれない。さらに、このＰＣＲ増幅技術に用いられた退化プライマーのランダムな性質は、予期せぬ配列の相同性または関連する酵素の遺伝子に保存された部位により、原核または真核の病原性及び／又は共感染性の成分（原生生物）を起源とする核酸の増幅を非常によく行うことができる。
【００４１】
実施例２：新規のＭＳからＢリンパ球の調製物のレトロウイルスの保存されたｐｏｌ領域の“重ね合わせ”ＰＣＲ増幅による、ファミリーＭＳＲＶ−１およびＭＳＲＶ２を定義づける、ＭＳＲＶ−１ＢおよびＭＳＲＶ−２Ｂと称されるクローンの調製 シクロスポリンＡの適切な濃度を有する適切な培養液に血液のリンパ系細胞を培養した後に、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）にセロポジティブなＭＳ患者のＢリンパ球の培養における自己不朽化によって得られた自発的リンパ芽球系からＨ．Ｐｅｒｒｏｎ（非特許文献１３）によって記載された技術、および実施例１に記載のプロトコルに基づいて、スクロース勾配の“ＬＭ７様”逆転写酵素活性のピークにおけるビリオンの精製された画分に存在するＲＮＡ核酸物質を増幅かつ配列決定するために、Ｓｈｉｈ（非特許文献１２）の技術に基づいて修飾された同じＰＣＲ技術を使用した。この系で生産されたビリオンの精製勾配から得られたスクロース画分中の逆転写酵素活性を図４に示す。同様に、多発性硬化症ではない対照から同じ条件下で得られたＢ系統の培養液の上清を同じ条件下で処理し、スクロース勾配の画分中の逆転写酵素活性の検定は、一貫して否定的（バックグラウンド）であって、図５に示されている。ＭＳ Ｂ系の勾配の３番目の画分と非ＭＳ対照の勾配の逆転写酵素活性のない３番目の画分を、Ｓｈｉｈ（非特許文献１２）によって導かれた上記と同じＲＴ−ＰＣＲ技術により分析し、実施例１に記載したものと同じクローニングおよび配列決定を行った。
【００４２】
ＭＳＲＶ−１およびＭＳＲＶ−２型の配列が、ＭＳ Ｂリンパ芽球系を起源とする“ＬＭ７様”逆転写酵素活性のピークに係る物質のみに見られるということは、特に注目するべきことである。これらの配列は、ランダムに選択された２６個の組換えクローンの対照の（非ＭＳ）Ｂリンパ芽球系の物質には見られない。ｃＤＮＡ合成段階に用いられた商業的な逆転写酵素を起源とするＭｏ−ＭｕＬＶ型混入配列、および特定のレトロウイルスの相似性が全くない配列のみが、このＰＣＲ技術によって生産された相同のポリメラーゼ配列の“共通の”増幅の結果として、この対照に見られた。さらに、対照試料中の増幅反応に競合する濃縮された標的が欠如しているために、わずかな混入物が増幅される。この結果の違いが、明らかに高い重要性を有する（カイ自乗、ｐ＜０．００１）。
【００４３】
実施例３：ＰＬＩ−２系を起源とするビリオン調製物と内在性逆転写酵素を反応させることによる、レトロウイルスＭＳＲＶ−１を定義するクローンＰＳＪ１７の調製 この試みは、これと同じ単離物に存在する逆転写酵素活性を用いて、単離物中のおそらくはレトロウイルスＲＮＡから逆転写されたＤＮＡ配列を得ることを意図したものである。この逆転写酵素活性は、理論的には、プライマーｔＲＮＡに結合したレトロウイルスＲＮＡの存在下、もしくはレトロウイルス粒子（非特許文献１６）
で既に逆転写された短い鎖のＤＮＡとハイブリダイズしたときのみに機能することができる。しかして、細胞性核酸が混入した物質中の特定のレトロウイルス配列の調製は、ウイルスの逆転写酵素活性でウイルスＲＮＡを特定の酵素的増幅することにより、作者らによって最適化された。最後に、作者らは、ウイルスに含まれるＲＮＡの逆転写のこの酵素活性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効果的になる、特別な物理化学的条件を決定した。これらの条件は、以下に示したプロトコルの技術的記載に対応する（内在性ＲＴ反応、精製、クローニングおよび配列決定）。
【００４４】
分子的な試みは、ＰＬＩ−２系統の培養物の上清から得られた濃縮されてはいるが未精製のビリオンの調製物を用いることに本領があり、調製は以下の方法に基づくものである：培養物の上清を毎週２度回収し、細胞の破片を除くために１００００ｒｐｍで３０分間予備遠心し、−８０℃で冷凍するか、以下の工程に用いる。新鮮もしくは解凍された上清を、４℃、２時間、１０００００ｇ（またはタイプ４５Ｔ ＬＫＢ−ＨＩＴＡＣＨＩローターで３００００ｒｐｍ）で３０％グリセロール−ＰＢＳの緩衝剤に遠心する。上清を除去した後、沈澱物を少量のＰＢＳにとり、濃縮されてはいるが未精製のビリオンの画分を構成する。濃縮されてはいるが未精製のウイルス試料を、以下に記載するように、いわゆる内在性逆転写酵素反応を行うために使用した。
【００４５】
上記のプロトコルに基づいて精製され、約１−５百万ｄｐｍの逆転写酵素活性を含む２００μｌのビリオンを、液相が現れるまで３７℃で溶解し、氷上に移した。５倍に濃縮されたバッファーを以下の組成で調製した：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．２；７５ｍＭ ＮａＣｌ；２５ｍＭ ＭｇＣｌ2；７５ｍＭ ＤＴＴおよび０．１０％のＮＰ４０。１００μｌの５Ｘバッファー＋２５μｌのｄＡＴＰの１００ｍＭ溶液＋２５ｍｌのｄＴＴＰの１００ｍＭ溶液＋２５ｍｌのｄＧＴＰの１００μＭ溶液＋２５μｌのｄＣＴＰの１００ｍＭ溶液＋１００ｍｌの滅菌蒸留水＋２００ｍｌのＰＢＳ中のビリオンの懸濁液（ＲＴ活性は５百万ＤＰＭ）を混合し、４２℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を、バッファー化されたフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物（Ｓｉｇｍａ、照合番号Ｐ３８０３）に直接添加し；水相を回収し、一定量の滅菌蒸留水を有機相に加えて残留した核酸物質を再抽出する。回収された水相を合わせて、３Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ５．２を１／１０体積＋２体積のエタノール＋１μｌのグリコーゲン（Boehringer-Hannheim 参照番号９０１３９３）を添加して、含まれている核酸を沈降させ、この試料を−２０℃で４時間または＋４℃で一晩放置する。遠心後に得られた沈澱物を、７０％エタノールで洗浄し、６０ｍｌの蒸留水に再懸濁した。この反応生成物を、以下に記載したプロトコルに基づいて精製、クローン化および配列決定した：端部に対を形成していないアデニンを備えた平滑末端ＤＮＡを生成した：“埋立”反応を最初に行った：予め精製された２５μｌのＤＮＡ溶液を、等モルのｄＡＴＰ＋ｄＧＴＰ＋ｄＴＴＰ＋ｄＣＴＰを含有する２μｌの２．５ｍＭ溶液／１μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer-Mannheim 参照番号１００４７８６）／５μｌの１０Ｘ“制限酵素用インキュベーションバッファー”（Boehringer-Mannheim 参照番号１４１７９７５）／１μｌの１％ウシ血漿アルブミン溶液／１６μｌの滅菌蒸留水と混合した。この混合物を、１１℃で２０分間インキュベートした。この混合物に５０μｌのＴＥバッファーと１μｌのグリコーゲン（Boehringer-Mannheim 参照番号９０１３９３）を添加し、核酸をフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（Ｓｉｇｍａ、照合番号Ｐ３８０３）で抽出し、上述のように酢酸ナトリウムで沈澱させた。遠心後のＤＮＡ沈澱物を、１０μｌの１０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．５に再懸濁した。５μｌのこの懸濁物を、２０μｌの５Ｘ Ｔａｑ ＤＮＡバッファー、２０μｌの５ｍＭ ｄＡＴＰ、１μｌ（５Ｕ）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉｔａｑTM）および５４μｌの滅菌蒸留水と混合した。この混合物を、溶液の表面上に油膜を張った状態で７５℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後に油膜下の水溶液に懸濁されているＤＮＡを、上述のようにして沈澱させ、２μｌの滅菌蒸留水に再懸濁した。得られたＤＮＡを、ＴＡクローニングキットTMを用いてプラスミドに挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液を、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０倍に濃縮されたリゲーションバッファー“１０Ｘリゲーションバッファー”、２μｌの“ｐＣＲTM ベクター”（２５ｎｇ／ｍｌ）および１μｌの“ＴＡ ＤＮＡリガーゼ”と混合した。この混合物を、１２℃で一晩インキュベートした。以下の段階を、ＴＡクローニングキット（商標）（British Biotechnology）の説明に従って行った。操作の終わりに、培養し、かついわゆる“ミニプレップ（miniprep）“操作（非特許文献１７）に基づいて取り込まれたプラスミドの抽出を行うために、組換えられた（白色）バクテリアの白色のコロニーを回収した。各組換えコロニーから抽出されたプラスミドを、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲルで分析した。ＴＡクローニングキットのクローニングプラスミドに存在するＳｐ６プロモーターに相補的なプライマーとハイブリダイゼーションさせた後に、ゲルをエチジウムブロミドに浸して紫外線照射下で検出された挿入物を所有するプラスミドを、挿入物の配列決定のために選択した。次いで、配列決定の前の反応を、シークエンシングキット“プリズム・レディー・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems、照合番号４０１３８４）の使用に推奨された方法によって行い、自動配列決定をApplied Biosystemsの“モデル３７３Ａオートマティック・シークエンサー”装置で、製造者の説明に従って行った。
【００４６】
反応混合物中に存在するＤＮＡフラグメントからクローン化された配列のコンピューター化されたデータバンクにおける識別により、レトロウイルス型の配列が示された。対応するクローンＰＳＪ１７が、完全に配列決定され、図６に示すＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に同定され、得られた配列をデータバンク、最新の“ジーンバンク”（商標）で“ジーンワークス”（商標）ソフトウエアを用いて分析した。上述の配列は、データバンクの分析からは見いだすことができなかった。ある既知のレトロウイルスの構成要素と、部分的のみの相同性が見いだされた。最も使用できる比較的相同性は、参考文献（非特許文献１８）に基づいて、ＥＲＶ−９、またはＨＳＥＲＶ−９と称される内在性レトロウイルスと関連している。
【００４７】
実施例４：クローン“ＰＯＬ ＭＳＲＶ−１Ｂ”によって定義された５’領域とクローンＰＳＪ１７によって定義された３’領域との間に含まれる核酸配列のＰＣＲ増幅 ５種のオリゴヌクレオチド、Ｍ００１、Ｍ００２−Ａ、Ｍ００３−ＢＣＤ、Ｐ００４およびＰ００５を、精製されたＰＯＬ−２ウイルスを起源とするＲＮＡを増幅するために定義した。基準対照反応を、混入物の存在をチェックするために行った（水での反応）。増幅は、実施例２に記載したプロトコルに従うＲＴ−ＰＣＲ段階からなり、次いで欧州特許公開第０５６９２７２号公報に記載のＰＣＲプロトコルに基づく“重ね合わせ”ＰＣＲを行う。最初のＲＴ−ＰＣＲサイクルにおいて、プライマーＭ００１およびＰ００４またはＰ００５を用いた。第二のＰＣＲサイクルにおいて、プライマーＭ００２−ＡまたはＭ００３−ＢＣＤおよびプライマーＰ００４を用いた。プライマーは、以下のように配置する。
【００４８】
【化１】
2010047604.tif 000003
【００４９】
これらの組成は以下の通りである。
【００５０】
【化２】
2010047604.tif 000004
【００５１】
得られた、Ｍ００３−Ｐ００４と称される“重ね合わせ”増幅産物は図７に示され、これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対応する。
【００５２】
実施例５：逆転写酵素活性のピークで精製されたウイルス試料における、既に同定された配列を用いたＭＳＲＶ−１レトロウイルスゲノムの一部の増幅およびクローニング Ｆｒｏｈｍａｎ（非特許文献１９）によって公開された技術から導かれたＰＣＲ技術を用いた。この誘導された技術は、増幅されるゲノムの３’末端における特定のプライマーを用いて、分析されるゲノムの５’領域への配列の伸長を可能にする。この変形した技術は、上記のように精製されたビリオンの画分に使用される製品“５'−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲTM ＲＡＣＥ Ｋｉｔ”を提供する会社“Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，（Ｐａｌｏ−ＡｌｔｏＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の文献に記載されている。
【００５３】
ｃＤＮＡの合成およびＰＣＲ増幅用のキットプロトコルで用いられた特定の３’プライマーは、それぞれ以下のＭＳＲＶ−１配列に相補的である：
【００５４】
【化３】
2010047604.tif 000005
【００５５】
ＰＣＲに由来する生成物は、従来の方法（非特許文献１７）に基づくアガロースゲルで精製した後に、１０ｍｌの蒸留水に再懸濁した。Ｔａｑポリメラーゼの特徴の一つは、二つのＤＮＡ鎖のそれぞれの３’末端にアデニンを添加することであるため、得られたＤＮＡをＴＡクローニングキットTM（British Biotechnology）を用いてプラスミドに直接挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液を、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０倍に濃縮されたリゲーションバッファー“１０’リゲーションバッファー”、２μｌの“ｐＣＲTM ベクター”（２５ｎｇ／ｍｌ）および１μｌの“ＴＡ ＤＮＡリガーゼ”と混合した。この混合物を、１２℃で一晩インキュベートした。以下の段階を、ＴＡクローニングキット（商標）（British Biotechnology）の説明に従って行った。操作の終わりに、培養し、かついわゆる“ミニプレップ”操作（非特許文献１７）に基づいて取り込まれたプラスミドの抽出を行うために、組換えられた（白色）バクテリアの白色のコロニーを選択した。各組換えコロニーからのプラスミド調製物を、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲルで分析した。ＴＡクローニングキット（商標）のクローニングプラスミドに存在するＳｐ６プロモーターに相補的なプライマーとハイブリダイゼーションさせた後に、挿入物の配列決定用に、ゲルをエチジウムブロミドに浸して紫外線照射下で検出された挿入物を所有するプラスミドを選択した。次いで、配列決定の前の反応を、シークエンシングキット“プリズム・レディー・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems、照合番号４０１３８４）の使用に推奨された方法によって行い、自動配列決定をApplied Biosystemsの“モデル３７３Ａオートマティック・シークエンサー”装置で、製造者の説明に従って行った。
【００５６】
この技術を、一方のＰＬＩ−２系統によって生成された“ＰＯＬ−２”単離物、および一方のＬＭ７ＰＣ系統によって生成されたＭＳ７ＰＧ単離物から、スクロースで以下に記載するように精製されたビリオンの二つの画分に最初に適用した。培養物の上清を毎週２度回収し、細胞の破片を除くために１００００ｒｐｍで３０分間予備遠心し、−８０℃で冷凍するか、以下の工程に用いる。新鮮もしくは解凍された上清を、４℃、２時間、１０００００ｇ（またはタイプ４５Ｔ ＬＫＢ−ＨＩＴＡＣＨＩローターで３００００ｒｐｍ）で３０％グリセロール−ＰＢＳの緩衝剤に遠心する。上清を除去した後、沈澱物を少量のＰＢＳにとり、濃縮されてはいるが未精製のビリオンの画分を構成する。濃縮されたウイルスを、滅菌されたＰＢＳバッファー（１５〜５０％ 重量／重量）におけるスクロース勾配に適用し、スウィングアウトローターで＋４℃、１２時間３５０００ｒｐｍ（１０００００ｇ）で超遠心した。１０個の画分を回収し、Ｈ．Ｐｅｒｒｏｎ（非特許文献３）に記載された技術に基づいて逆転写酵素活性を検定するために、ホモジェナイゼーション後に各画分から２０μｌを取り出した。“ＬＭ７様”ＲＴ活性のビークを含む画分を滅菌したＰＢＳに希釈し、ウイルス粒子を沈澱させるために３５０００ｒｐｍ（１０００００ｇ）で１時間超遠心した。得られた精製されたビリオンの沈澱物を、ＲＮＡの抽出に適した少量のバッファーに取り込む。上述のｃＤＮＡ合成反応を、精製された細胞外のビリオンから抽出されたこのＲＮＡに対して行った。上述の技術に係るＰＣＲ増幅は、クローンＦ１−１１を得ることを可能にし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に同定されたこのクローンの配列が、図８に示されている。
【００５７】
このクローンは、図９に示したように、以前に配列決定された別のクローンと、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスの“ｐｏｌ”遺伝子を表す相当な長さ（１．２ｋｂ）の領域を定義することができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と称されるこの配列は、その端部が互いに重複する種々のクローンから再構成され、プライマー、および全体の読み枠を人為的に妨げる増幅またはクローニング技術に係る人為産物を調整する。この配列を、以下では“ＭＳＲＶ−１ ｐｏｌ* 領域”と称する。ＨＳＥＲＶ−９配列との相同性の程度を図１２に示す。図９では、アミノ酸への翻訳と共に、可能な読み枠が核酸配列の下に示されている。
【００５８】
実施例６：ＭＳ患者もしくは基準対照の患者に由来する血漿の種々の試料における特定のＭＳＲＶ−１およびＭＳＲＶ−２配列の検出 ＥＤＴＡ上に、ＭＳ患者またはＭＳではない対照から血液試料を取って得られた血漿中のＭＳＲＶ−１およびＭＳＲＶ−２ゲノムを検出するために、ＰＣＲ技術を使用した。
【００５９】
血漿からのＲＮＡの抽出は、グアニジニウムチオシアナートを含む一定量のバッファーを、採取後−８０℃で冷凍保存された１ｍｌの血漿に添加した後に、Ｐ．Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ（非特許文献２０）によって記載された技術に基づいて行った。
ＭＳＲＶ−２に対して、同じ条件下で、以下のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。
【００６０】
− ５’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に同定されたもの
【００６１】
【化４】
2010047604.tif 000006
【００６２】
− ３’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に同定されたもの
【００６３】
【化５】
2010047604.tif 000007
【００６４】
しかしながら、ＤＮアーゼで処理していない核酸の試料に対する“重ね合わせ”ＰＣＲによる二つの連続した増幅における以下のＰＣＲプライマーを用いて類似の結果が得られた。
【００６５】
ハイブリダイゼーション温度４８℃の４０サイクルの第一段階に使用されたプライマーは、以下のものである。
【００６６】
− ５’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に同定されたもの
【００６７】
【化６】
2010047604.tif 000008
【００６８】
患者の試料における第一のＰＣＲ用であって、５’ＭＳＲＶ−２ ＰＣＲプライマーに対応する、 − ３’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に同定されたもの
【００６９】
【化７】
2010047604.tif 000009
【００７０】
患者の試料における第一のＰＣＲ用であって、３’ＭＳＲＶ−２ ＰＣＲプライマーに対応する。
【００７１】
この段階の後に、１０μｌの増幅生成物を得て、既に増幅された領域内に位置したプライマーで、第二のいわゆる“重ね合わせ”ＰＣＲ増幅を行う。この第二の段階を、プライマーハイブリダイゼーション（“アニーリング”）温度５０℃で、３５サイクル以上行う。反応液の体積は、１００μｌである。
【００７２】
この第二の段階に用いたプライマーは、以下のものである。
【００７３】
− ５’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に同定されたもの
【００７４】
【化８】
2010047604.tif 000010
【００７５】
患者の試料における重ね合わせＰＣＲ用であって、５’ＭＳＲＶ−２ ＰＣＲプライマーに対応する、 − ３’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に同定されたもの
【００７６】
【化９】
2010047604.tif 000011
【００７７】
患者の試料における重ね合わせＰＣＲ用であって、３’ＭＳＲＶ−２ ＰＣＲプライマーに対応する。
【００７８】
ＭＳＲＶ−１に対して、二段階で増幅を行った。さらに、核酸試料を、ＤＮアーゼで予め処理して、ＲＴ−ＰＣＲ増幅がＭＳＲＶ−１ＲＮＡから独占的に起こることを確かめるために、ＲＴを用いない対照のＰＣＲ（ＡＭＶ逆転写酵素）を二つの増幅段階に行った。ＲＴを用いない陽性（ポジティブ）の対照の場合には、ＲＮＡの最初の試料を再度ＤＮアーゼで処理し、再度増幅する。
【００７９】
ＲＮアーゼ活性のないＤＮアーゼで処理するプロトコルは、以下に示す通りである：抽出されたＲＮＡを、“ＲＮアーゼ阻害剤”（Boehringer-Mannheim）の存在下で、１０μｌ中に１μｇの終濃度となるようにＤＥＰＣで処理した水に分注する：これらの１０μｌに、１μｌの“ＲＮアーゼのないＤＮアーゼ”（Boehringer-Mannheim）と、０．１Ｍ／ｌの酢酸ナトリウムおよび５ｍＭ／ｌのＭｇＳＯ4を含む１．２μｌのｐＨ５バッファーを添加する；この混合物を２０℃で１５分間インキュベートし、９５℃で１５分間“サーモサイクラー”中に移す。
【００８０】
第一のＭＳＲＶ−１ ＲＴ−ＰＣＲ段階を、欧州特許公開第０５６９２７２号
公報に記載されたＲＮＡ増幅方法の変形に基づいて行う。特に、ｃＤＮＡ合成段階は、４２℃で１時間行い、ＰＣＲ増幅を５３℃のプライマーハイブリダイゼーション（“アニーリング”）温度で４０サイクル以上行う。反応液の体積は、１００μｌである。
この第一段階に使用されたプライマーは、以下のものである。
【００８１】
− ５’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に同定されたもの
【００８２】
【化１０】
2010047604.tif 000012
【００８３】
− ３’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に同定されたもの
【００８４】
【化１１】
2010047604.tif 000013
【００８５】
この段階の後に、１０μｌの増幅生成物を得て、既に増幅された領域内に位置したプライマーで第二のいわゆる“重ね合わせ”ＰＣＲ増幅を行う。この第二の段階を、プライマーハイブリダイゼーション（“アニーリング”）温度５３℃で、３５サイクル以上行う。反応液の体積は、１００μｌである。
【００８６】
この第二の段階に用いたプライマーは、以下のものである。
【００８７】
− ５’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に同定されたもの
【００８８】
【化１２】
2010047604.tif 000014
【００８９】
− ３’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に同定されたもの
【００９０】
【化１３】
2010047604.tif 000015
【００９１】
図１０および１１は、異なるウェルに別々に適用されたＰＣＲ増幅生成物の電気泳動を行ったエチジウムブロミドに浸したアガロースゲルの紫外線照射下における写真の形態のＰＣＲの結果を表している。
【００９２】
上の写真（図１０）は、特定のＭＳＲＶ−２増幅の結果を示している。
８番のウェルは、ＤＮＡ分子量マーカーの混合物を含み、１〜７番のウェルは、４人のＭＳではない健康的な対照（１〜４番のウェル）および病状が異なる段階の３人のＭＳ患者（５〜７番のウェル）を起源とする血漿の全体のＲＮＡから増幅された生成物をそれぞれ示す。
【００９３】
この一連において、ＭＳＲＶ−２核酸物質が、試験された３人の内の一人のＭＳの血漿に検出され、４人の対照の血漿には一人も検出されなかった。より広い範囲で得られた別の結果が、これらの結果を確証した。
【００９４】
下の写真（図１１）は、ＭＳＲＶ−１“重ね合わせ”ＲＴ−ＰＣＲによる特定の増幅の結果を示す。
【００９５】
１番のウェルは、ＡＭＶ逆転写酵素を添加せずに水だけで生成されたＰＣＲ生成物を含み；２番のウェルは、ＡＭＶ逆転写酵素を添加して水だけで生成されたＰＣＲ生成物を含み、３番のウェルは、ＤＮＡ分子量マーカーの混合物を含み；
４〜１３のウェルは、Ｐｅｒｒｏｎ（非特許文献１３）によって記載されたプロトコルに基づいて、ＭＳＲＶ−１およびＭＳＲＶ−２で感染した培養物の上清を起源とするビリオンの小球を遠心して平衡化したスクロース勾配画分（下方向へ向けて回収）から抽出された全体のＲＮＡから増幅された生成物を含み、１４番のウェルには何も添加せず、１５〜１７番のウェルには、異なる段階の病状の３人のＭＳ患者を起源とする血漿から抽出されたＲＮＡの増幅された生成物を添加した。
【００９６】
ＭＳＲＶ−１レトロウイルスゲノムは、Ｈ．Ｐｅｒｒｏｎ（非特許文献３）によって記載された技術に基づいて測定された逆転写酵素活性のピークを含むスクロース勾配画分に、非常に強い強度を伴って確かに見られる（勾配の画分５、８番のウェルに添加されたもの）。第一の画分（４番のウェル）には、勾配の表面に浮いた溶解された粒子から放出されたＲＮＡに対応すると思われるわずかな増幅が起こり、同様に、低い強度の増幅を起こすＭＳＲＶ−１ゲノムのいくつかのコピーを有する最後の画分（チューブの底）に沈澱した集合破片でも同じことが起こった。
【００９７】
この一連の試験における３人のＭＳ血漿の一つのＭＳＲＶ−１ＲＮＡが、非常に強力な増幅を起こすことがわかった（１７番のウェル）。
【００９８】
この一連の試験において、極端に小さい数で血漿中に存在する細胞外ウイルスの粒子に対応すると思われるＭＳＲＶ−１レトロウイルスＲＮＡゲノムが、試験された３人の内の一人のＭＳにおける“重ね合わせ”ＲＴ−ＰＣＲによって検出された。より広い範囲で得られた他の結果は、これらの結果を確証するものである。
【００９９】
さらに、これらのＰＣＲ技術によって増幅された配列の特異性を確認し、Ｆ．
Ｍａｌｌｅｔ（非特許文献２１）によって記載され、かつ仏国特許文献ＦＲ２６６３０４０に記載された“ＥＬＯＳＡ”技術によって評価した。
【０１００】
ＭＳＲＶ−１に関して、上述の重ね合わせＰＣＲの生成物を、実施例１および図１および２に記載のサブファミリーに対応する、ＭＳＲＶ−１の共通配列Ａと共通配列Ｂ＋Ｃ＋Ｄを分けて検出することができる二つのＥＬＯＳＡシステムにおいて試験してもよい。実際に、共通配列Ｂ＋Ｃ＋Ｄによく似た配列は、培養物から精製、あるいはＭＳ患者の細胞外の生物学的流体において増幅されたＭＳＲＶ−１ビリオンを起源とするＲＮＡ試料に必須に観察されるが、共通配列Ａによく似た配列は、正常なヒトの細胞性ＤＮＡに必須に観察される。
【０１０１】
サブファミリーＡのＰＣＲ生成物の捕捉および特定のハイブリダイゼーション用のＥＬＯＳＡ／ＭＳＲＶ−１システムは、５’末端にアミン結合を有するキャプチャーオリゴヌクレオチドｃｐＶ１Ａと、ビオチニル化された検出オリゴヌクレオチドｄｐＶ１Ａを使用し、これらは、それぞれ以下の配列を有する。
【０１０２】
− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に同定されたｃｐＶ１Ａ
【０１０３】
【化１４】
2010047604.tif 000016
【０１０４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７によって同定されたプライマーを用いて行われたＭＳＲＶ−１重ね合わせＰＣＲの生成物用のＥＬＯＳＡ捕捉オリゴヌクレオチドに対応し、任意に、患者の試料におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９によって同定されたプライマーとの増幅を行ってもよい。
【０１０５】
− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に同定されたｄｐＶ１Ａ
【０１０６】
【化１５】
2010047604.tif 000017
【０１０７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７によって同定されたプライマーを用いて行われたＭＳＲＶ−１重ね合わせＰＣＲの生成物のサブファミリーＡ用のＥＬＯＳＡ捕捉オリゴヌクレオチドに対応し、任意に、患者の試料におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９によって同定されたプライマーとの増幅を行ってもよい。
【０１０８】
サブファミリーＢ＋Ｃ＋ＤのＰＣＲ生成物の捕捉および特定のハイブリダイゼーション用のＥＬＯＳＡ／ＭＳＲＶ−１システムは、ビオチニル化された同じ検出オリゴヌクレオチドｄｐＶ１Ａと、５’末端にアミン結合を有し、以下の配列を有するキャプチャーオリゴヌクレオチドｃｐＶ１Ｂを使用する。
【０１０９】
− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に同定されたｄｐＶ１Ｂ
【０１１０】
【化１６】
2010047604.tif 000018
【０１１１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７によって同定されたプライマーを用いて行われたＭＳＲＶ−１“重ね合わせ”ＰＣＲの生成物のサブファミリーＢ＋Ｃ＋Ｄ用のＥＬＯＳＡ捕捉オリゴヌクレオチドに対応し、任意に、患者の試料におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９によって同定されたプライマーとの増幅を行ってもよい。
【０１１２】
このＥＬＯＳＡ検出システムにより、ＭＳ患者のＤＮアーゼ処理された血漿から増幅されたＰＣＲ生成物が、一つもサブファミリーＡの配列を含有しないこと、および全てがサブファミリーＢ、ＣおよびＤの共通配列に陽性であることを確認することができる。
ＭＳＲＶ−２に関して、以下のＰＣＲ増幅プライマーを用いて、感染した細胞培養物を起源とする単離物において類似のＥＬＯＳＡ技術を行った。
【０１１３】
− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に同定された５’プライマー、
【０１１４】
【化１７】
2010047604.tif 000019
【０１１５】
培養物からの試料のＰＣＲ用の５’ＭＳＲＶ−２ＰＣＲプライマーに対応する、 − ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に同定された３’プライマー、
【０１１６】
【化１８】
2010047604.tif 000020
【０１１７】
培養物からの試料のＰＣＲ用の３’ＭＳＲＶ−２ＰＣＲプライマーに対応する、 そして、５’末端にアミン結合を備えた捕捉オリゴヌクレオチドｃｐＶ２およびビオチニル化された検出オリゴヌクレオチドｄｐＶ２は、それぞれ以下の配列を有する： − ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に同定されたｃｐＶ２
【０１１８】
【化１９】
2010047604.tif 000021
【０１１９】
プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、または任意にＳｈｉｈ（非特許文献１２）によって記載された退化プライマーを用いて行われたＭＳＲＶ−２ ＰＣＲの生成物用のＥＬＯＳＡ捕捉オリゴヌクレオチドに対応する。
− ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に同定されたｄｐＶ２
【０１２０】
【化２０】
2010047604.tif 000022
【０１２１】
プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、または任意にＳｈｉｈ（非特許文献１２）によって記載された退化プライマーを用いて行われたＭＳＲＶ−２ ＰＣＲの生成物用のＥＬＯＳＡ検出オリゴヌクレオチドに対応する。
【０１２２】
患者からの試料における増幅用に前述したものと異なる一組のプライマーを用いたこのＰＣＲ増幅システムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養物および分子生物学の研究用に用いられた核酸の試料のＭＳＲＶ−２との感染を確かめることができる。
【０１２３】
病原性及び／又は感染性の成分のゲノムのＰＣＲ検出の第一の結果は、自由な“ウイルス”が、神経系の外側を、適切な毒性の段階で、患者の血流中を循環することができることを示す。これは、ＭＳの活性段階の患者の血液脳関門における“ギャップ”のほとんど不変的存在に適合する。
【０１２４】
実施例７：ＭＳＲＶ−１レトロウイルスゲノムの“ｅｎｖ”遺伝子の配列の取得 実施例５に既に記載したように、Frohman（非特許文献１９）によって開示された技術から誘導されたＰＣＲ技術を用いた。この誘導された技術は、増幅されるゲノムの３’末端に特異的なプライマーを用いて、分析されるゲノムの５’領域へ配列を伸ばすことを可能にする。この技術の変更は、“5'-AmpliFINDER RACE Kit”を与える“Clontech Laboratories Inc.，(米国、カリフォルニア、Palo-Alto)”の文書に記載されており、上述のように精製されたビリオンのフラクションに用いられた。
【０１２５】
“ｅｎｖ”遺伝子の領域を内包するＭＳＲＶ−１レトロウイルスゲノムの３’領域の増幅を行うために、不完全な内在性レトロウイルスＨＳＥＲＶ−９と同じタイプのＬＴＲ領域の共通配列を決定する研究を行った（非特許文献１８、２４）。これで、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスは部分的相同性を示した。
【０１２６】
これと同じ特異的３’プライマーを、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅のキットプロトコルに用いた。その配列は以下の通りである：
【０１２７】
【化２１】
2010047604.tif 000023
【０１２８】
上記プライマーを用いた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成および間接的でない(undirectional)ＰＣＲ増幅は、欧州特許公開第０５６９２７２号公報に記載された方法に基づいて一段階で行われた。
【０１２９】
ＰＣＲに由来する生成物は、従来の方法（非特許文献１７）に基づくアガロースゲルで精製した後に抽出し、１０ｍｌの蒸留水に再懸濁した。Ｔａｑポリメラーゼの特徴の一つは、二つのＤＮＡ鎖のそれぞれの３’末端にアデニンを添加することであるため、得られたＤＮＡをＴＡクローニングキットTM（British Biotechnology）を用いてプラスミドに直接挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液を、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０倍に濃縮されたリゲーションバッファー“１０ｘリゲーションバッファー”、２μｌの“ｐＣＲTM ベクター”（２５ｎｇ／ｍｌ）および１μｌの“ＴＡ ＤＮＡリガーゼ”と混合した。この混合物を、１２℃で一晩インキュベートした。以下の段階を、ＴＡクローニングキット（商標）（British Biotechnology）の説明に従って行った。操作の終わりに、培養し、かついわゆる“ミニプレップ”操作（非特許文献１７）に基づいて取り込まれたプラスミドの抽出を行うために、組換えられた（白色）バクテリアの白色のコロニーを選択した。各組換えコロニーからのプラスミド調製物を、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲルで分析した。ＴＡクローニングキット（商標）のクローニングプラスミドに存在するＳｐ６プロモーターに相補的なプライマーとハイブリダイゼーションさせた後に、挿入物の配列決定用に、ゲルをエチジウムブロミドに浸して紫外線照射下で検出された挿入物を所有するプラスミドを選択した。次いで、配列決定の前の反応を、シークエンシングキット“プリズム・レディー・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems、照合番号４０１３８４）の使用に推奨された方法によって行い、自動配列決定をApplied Biosystemsの“モデル３７３Ａオートマティック・シークエンサー”装置で、製造者の説明に従って行った。
【０１３０】
この技術的試みを、実施例２に記載したように、ＭＳ患者のリンパ球から得られたＢリンパ芽球系統によって産生される培養液上清の混合物から以下のようにして濃縮され、かつ、Perronら（非特許文献３）に記載された技術に基づいて検出されうる逆転写酵素活性を備えた、ビリオンのサンプルに適用した。
【０１３１】
培養物の上清を毎週２度回収し、細胞の破片を除くために１００００ｒｐｍで３０分間予備遠心し、−８０℃で冷凍するか、以下の工程に用いる。新鮮もしくは解凍された上清を、４℃、２時間、１０００００ｇで３０％グリセロール−ＰＢＳの緩衝剤で遠心する。上清を除去した後、沈澱したペレットは、濃縮されてはいるが未精製のビリオンのサンプルを構成する。得られたペレットを、ＲＮＡの抽出のために少量の適切なバッファーに取る。上記のｃＤＮＡ合成反応を、濃縮された細胞外ビリオンから抽出されたＲＮＡで行う。
【０１３２】
上記の技術に基づいたＲＴ−ＰＣＲ増幅は、クローンＦＢｄ３を得ることを可能にし、その配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６として、図１３に示されている。
【０１３３】
図１４には、クローンＦＢｄ３およびＨＳＥＲＶ−９レトロウイルス間の配列相同性が、６５％以上のあらゆる部分的相同性の連続的直線によって、マトリックスチャートに示されている。クローンの隣接領域に相同性があることがわかるが（５’末端のｐｏｌ遺伝子、および３’末端のｅｎｖ遺伝子およびＬＴＲ）、内部領域はまったく異なり、ＨＳＥＲＶ９の“ｅｎｖ”遺伝子との相同性を全く、弱いものでさえも示さない。さらに、クローンＦＢｄ３は、不完全な内在性のＨＳＥＲＶ−９を記述するものより長い“ｅｎｖ”領域を含むことは明白であり、しかして、内在する異なる領域が、ＨＳＥＲＶ−９不完全遺伝子と部分的相同性のある領域間の“挿入物”を構成すると理解できるかもしれない。
【０１３４】
実施例８：クローンＰＳＪ１７とＦＢｄ３との間に位置するＭＳＲＶ−１レトロウイルスゲノムの領域の増幅、クローニングおよび配列決定 ４種のオリゴヌクレオチド、Ｆ１、Ｂ４、Ｆ６およびＢ１を、ＰＯＬ２およびＭＳ７ＰＧ系統の濃縮されたビリオンに由来するＲＮＡを増幅するために定義した。基準対照反応を、混入物の存在をチェックするために行った（水での反応）。
【０１３５】
増幅は、欧州特許公開第０５６９２７２号公報に記載のプロトコルに基づくＲＴ−ＰＣＲの第一段階と、それに続く、増幅された第一領域の内部のプライマーを用いて第一段階の１０ｍｌの産物に行われる第二段階のＰＣＲからなる（“重ね合わせ”ＰＣＲ）。最初のＲＴ−ＰＣＲサイクルにおいて、プライマーＦ１およびＢ４を用いた。第二のＰＣＲサイクルにおいて、プライマーＦ６およびプライマーＢ１を用いた。プライマーは、以下のように配置する。
【０１３６】
【化２２】
2010047604.tif 000024
【０１３７】
これらの組成は以下の通りである。
【０１３８】
【化２３】
2010047604.tif 000025
【０１３９】
得られた、“ｔ ｐｏｌ”と称される“重ね合わせ”増幅産物は図１５に示されており、これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に対応する。
【０１４０】
実施例９：ＭＳＲＶ−１を産生する培養の細胞においてＲＮＡとして発現され、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスゲノムの“ｅｎｖ”領域を含む新規配列を得る ｃＤＮＡライブラリーを、実施例２に記載したように、ＭＳ患者の、Perronら（非特許文献３）によって記載された技術に基づいて検出されうる逆転写酵素活性を備えたリンパ球から得られたＢリンパ芽球系統の細胞から抽出されたｍＲＮＡから、“ｃＤＮＡ合成モジュール、ｃＤＮＡ急速適応リゲーションモジュール、ｃＤＮＡ急速クローニングモジュール、およびラムダｇｔ１０ in vitroパッケージングモジュール”キット（Amersham，ref PRN1256Y/Z，RPN1712，RPN1713，RPN1717，N334Z）の製造者が記載した方法に基づいて作製した。
【０１４１】
オリゴヌクレオチドは、クローンＰＳＪ１７の３’領域（ｐｏｌ）とクローンＦＢｄ３の５’（ＬＴＲ）領域との間の核酸ライブラリーにクローン化されたｃＤＮＡを増幅するために定義された。混入物の存在をチェックするために対照反応を行った（水を用いた反応）。異なるペアのプライマーを用いてライブラリーにクローン化された核酸に行われたＰＣＲ反応は、ＭＳＲＶ−１タイプのｅｎｖもしくはＬＴＲ配列にｐｏｌ配列を連結する一連のクローンが増幅されることを可能にした。
【０１４２】
二つのクローンは、細胞性ｃＤＮＡライブラリーに得られた配列を代表するものである： − クローンＪＬＢｃ１、その配列であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２は、図１６に示されている。
【０１４３】
− クローンＪＬＢｃ２、その配列であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３は、図１７に示されている。
【０１４４】
クローンＪＬＢｃ１およびＪＬＢｃ２の配列は、図１８および１９に示されているように、クローンＦＢｄ３の配列に相同である。クローンＪＬＢｃ１およびＪＬＢｃ２間の相同性は、図２０に示されている。
【０１４５】
クローンＪＬＢｃ１およびＪＬＢｃ２と、ＨＳＥＲＶ９配列との間の相同性は、図２１および２２に示されている。
【０１４６】
ＪＬＢ１、ＪＬＢ２およびＦＢｄ３間の相同領域は、図８に記載されているように、いくつかの配列および“挿入物”の大きさの変化を伴って、ＨＳＥＲＶ−９ ｅｎｖ配列におけるさらなる配列の欠失（“挿入された”）を含むことに注意すべきである。
【０１４７】
また、クローン化された“ｐｏｌ”領域はＨＳＥＲＶ−９に非常に相同であること、読み枠を持たないこと（自動シークエンサーさえも含む、用いた技術によって誘発された配列のエラーを覚えておく）、並びにビリオンから得られたＭＳＲＶ−１配列から分かれていることにも注意すべきである。これらの配列が、ＭＳＲＶ−１粒子を発現する細胞のＲＮＡからクローン化されるという観点から、それらは恐らくＥＲＶ９ファミリーに関連する内在性レトロウイルス成分に由来する。これは全て、ｐｏｌとｅｎｖ遺伝子が、明らかにＭＳＲＶ−１ゲノムＲＮＡではない同一のＲＮＡに存在するという事実によるものであろう。これらのＥＲＶ９成分のいくつかは、相同もしくは非相同のトランスアクチベーターをコードする複製ウイルスによって活性化される機能的ＬＴＲを所有する。このような条件下では、ＭＳＲＶ−１とＨＳＥＲＶ−９との関係は、相同、もしくは同一でさえある、ＭＳＲＶ−１トランス活性化タンパク質により、不完全な（あるいは他の）内在性ＥＲＶ９成分のトランスアクティベーションを起こす。
【０１４８】
このような現象は、ＭＳＲＶ−１の発現と、それに関連した内在性成分との間のウイルスの干渉を誘発するかもしれない。このような干渉は、一般的に、いわゆる“不完全干渉(defective-interfering)”発現を導き、このいくつかの特徴は、研究されたＭＳＲＶ−１感染培養物に見出される。さらに、このような現象は、ポリペプチド、もしくは免疫系で必ずしも慣用されない内在性レトロウイルスタンパク質でさえも、発現の発生を欠かない。ＭＳＲＶ−１に関連した、並びに、これに誘発された内在性成分の常軌を逸した発現のこのような機構は、常軌を逸した抗原を増大させやすく、ＭＳに観察されるような自己免疫工程の誘発に寄与しがちである。
【０１４９】
しかしながら、ＥＲＶ９とは全く異なるさらなる領域を含むより長いｅｎｖ領域を所有することにおいて、クローンＪＬＢｃ１とＪＬＢｃ２が、既に記載されたＥＲＶ９もしくはＨＳＥＲＶ９配列と異なることに注意するのは必須である。
内在性ＥＲＶ９ファミリーとのこれらの類似性は定義されるが、明らかに、これまでに記述されたことのない新規な成分を構成する。実際には、“Entrez”ソフトウェア（NCBI，NIH，Bethesda，米国）のバージョンＮｏ１５（１９９５）に利用できる核酸配列のデータバンクの疑問は、これらのクローンのｅｎｖ領域における既知の相同配列を同定することができなかった。
【０１５０】
実施例１０：ＭＳＲＶ−１レトロウイルスゲノムの５’ｐｏｌと３’ｇａｇ領域に位置する配列を得る 実施例５に記載したように、Ｆｒｏｈｍａｎ（非特許文献１９）によって公開された技術から導かれたＰＣＲ技術を用いた。この誘導された技術は、増幅されるゲノムの３’末端における特定のプライマーを用いて、分析されるゲノムの５’領域への配列の伸長を可能にする。この変形した技術は、上記のように精製されたビリオンの画分に使用される製品“５'−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲTM ＲＡＣＥ Ｋｉｔ”を提供する会社“Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，（Ｐａｌｏ−ＡｌｔｏＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の文献に記載されている。
【０１５１】
既に配列決定されたｐｏｌ配列（クローンＦ１１−１）から始まりｇａｇ遺伝子へ向かって伸びるＭＳＲＶ−１レトロウイルスゲノムの５’領域の増幅を行うため、ＭＳＲＶ−１特異的プライマーを定義した。
【０１５２】
ｃＤＮＡの合成およびＰＣＲ増幅用のキットプロトコルで用いられた特定の３’プライマーは、それぞれ以下のＭＳＲＶ−１配列に相補的である：
【０１５３】
【化２４】
2010047604.tif 000026
【０１５４】
ＰＣＲに由来する生成物は、従来の方法（非特許文献１７）に基づくアガロースゲルで精製した後に抽出し、１０ｍｌの蒸留水に再懸濁した。Ｔａｑポリメラーゼの特徴の一つは、二つのＤＮＡ鎖のそれぞれの３’末端にアデニンを添加することであるため、得られたＤＮＡをＴＡクローニングキットTM（British Biotechnology）を用いてプラスミドに直接挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液を、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０倍に濃縮されたリゲーションバッファー“１０ｘリゲーションバッファー”、２μｌの“ｐＣＲTM ベクター”（２５ｎｇ／ｍｌ）および１μｌの“ＴＡ ＤＮＡリガーゼ”と混合した。この混合物を、１２℃で一晩インキュベートした。以下の段階を、ＴＡクローニングキット（商標）（British Biotechnology）の説明に従って行った。操作の終わりに、培養し、かついわゆる“ミニプレップ”操作（１７）に基づいて取り込まれたプラスミドの抽出を行うために、組換えられた（白色）バクテリアの白色のコロニーを選択した。各組換えコロニーからのプラスミド調製物を、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲルで分析した。ＴＡクローニングキット（商標）のクローニングプラスミドに存在するＳｐ６プロモーターに相補的なプライマーとハイブリダイゼーションさせた後に、挿入物の配列決定用に、ゲルをエチジウムブロミドに浸して紫外線照射下で検出された挿入物を所有するプラスミドを選択した。次いで、配列決定の前の反応を、シークエンシングキット“プリズム・レディー・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems、照合番号４０１３８４）の使用に推奨された方法によって行い、自動配列決定をApplied Biosystemsの“モデル３７３Ａオートマティック・シークエンサー”装置で、製造者の説明に従って行った。
【０１５５】
この技術的試みを、実施例２に記載したように、ＭＳ患者のリンパ球から得られたＢリンパ芽球系統によって産生される培養液上清の混合物から以下のようにして濃縮され、かつ、Perronら（非特許文献３）に記載された技術に基づいて検出されうる逆転写酵素活性を備えた、ビリオンのサンプルに適用した。
【０１５６】
培養物の上清を毎週２度回収し、細胞の破片を除くために１００００ｒｐｍで３０分間予備遠心し、−８０℃で冷凍するか、以下の工程に用いる。新鮮もしくは解凍された上清を、４℃、２時間、１０００００ｇで３０％グリセロール−ＰＢＳの緩衝剤で遠心する。上清を除去した後、沈澱したペレットは、濃縮されてはいるが未精製のビリオンのサンプルを構成する。得られたペレットを、ＲＮＡの抽出のために少量の適切なバッファーに取る。上記のｃＤＮＡ合成反応を、濃縮された細胞外ビリオンから抽出されたＲＮＡで行う。
【０１５７】
上記の技術に基づいたＲＴ−ＰＣＲ増幅は、クローンＧＭ３を得ることを可能にし、その配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６として、図２３に示されている。
【０１５８】
図２４には、クローンＧＭＰ３およびＨＳＥＲＶ−９レトロウイルス間の配列相同性が、６５％以上のあらゆる部分的相同性の連続的直線によって、マトリックスチャートに示されている。
【０１５９】
要約すると、図２５は、既知のＥＲＶ９ゲノムと比較した、上述の種々のクローンの局在化を示す。図２５では、ＭＳＲＶ−１ ｅｎｖ領域が、対照のＥＲＶ９ ｅｎｖ遺伝子よりも長いので、付加領域が、“Ｖ”による挿入箇所の上に示されている。挿入物が一つの配列および示されたクローン（ＪＬＢｃ１、ＪＬＢｃ２、ＦＢｄ３）間のサイズの変化を示すと解する。図２６は、ＭＳＲＶ−１ｐｏｌ*領域において研究された種々のクローンの位置を示す。
【０１６０】
上述されたクローンＧＭ３によって、ｐｏｌ遺伝子の全体をカバーし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７と称され、連続する図２７ａ〜２７ｃに示された、可能な読み枠を定義することができる。
【０１６１】
実施例１１：ヒトの血清中の抗ＭＳＲＶ−１特異的抗体の検出 ＭＳＲＶ−１レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の配列およびこの遺伝子の読み枠（オープンリーディングフレーム）の配列の同定により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０と称する前記遺伝子の領域のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９を決定することができた（図２８参照）。
ｐｏｌ遺伝子にコードされたＭＳＲＶ−１逆転写酵素のタンパク質配列のフラグメントに対応する種々の合成ペプチドを、ＭＳ患者と健康な対照の血清に対する抗原特異性についてテストした。
【０１６２】
これらのペプチドは、Merrifield技術（Barany G と Meffifielsd R.B，1980, In the Peptides，2，1-284，Gross E と Meienhofer J，Eds.，Academin Press，ニューヨーク）に基づいた固相合成法によって化学的に合成した。実際的な詳細については以下に記載されている。
【０１６３】
ａ）ペプチド合成： これらのペプチドは、“Applied Biosystems 430A”自動合成装置を用いて、フェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）／ポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂（Applied Biosystems，Inc．Foster City，CA）に合成した。アミノ酸は、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）エステルの形態で連結される。用いられたアミノ酸は、Novabiochem(Lauflerlfingen，スイス)もしくはBachem(Bubendorf, スイス)から入手した。
【０１６４】
溶媒としてＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）を使用したダブルカップリングプロトコルを用いて化学合成を行った。適切な装置（タイプＩ切断装置、Peptide Institute，Osaka，Japan）でフッ化水素酸（ＨＦ）を用いて、ペプチドを、樹脂および側鎖保護基から同時に切断した。
【０１６５】
１ｇのペプチド樹脂に対して、１０ｍｌのＨＦ、１ｍｌのアニソール、および１ｍｌのジメチルスルフィド５ＤＭＳを用いた。この混合物を−２℃で４５分間攪拌した。エーテルでよく洗浄した後、このペプチドを１０％酢酸で樹脂から溶出し、凍結乾燥させた。
このペプチドを、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８型カラム（２５０ｘ２１ｍｍ）（The Separation Group，Hesperia，CA，USA）で分離用高性能液体クロマトグラフィーで精製した。２２ｍｌ／分の流速でアセトニトリル勾配を用いて溶出した。回収されたフラクションを、１ｍｌ／分の流速で、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８分析用カラム（２５０ｘ４．６ｍｍ）でイソクラティック(isocratic)条件下で溶出することによって観察した。同じ保持時間のフラクションを貯めて、凍結乾燥させた。上記の系を備えた分析用高性能液体クロマトグラフィーで、優勢なフラクションを分析した。許容できる純度であると考えられるペプチドは、クロマトグラムの９５％以上を示す単一のピークに現れる。
【０１６６】
次いで、精製されたペプチドを、Applied Biosystems 420H 自動アミノ酸分析装置を用いて、アミノ酸組成を調べる目的で分析した。ペプチドの（平均）化学分子量の測定を、ＤＥＶ−ＶＡＸ２０００獲得システムと連結したＶＧ．ＺＡＢ．ＺＳＥＱダブルフォーカシング装置（VG analytical Ltd，マンチェスター、イギリス）で、陽性イオンモードでＬＳＩＭＳ質量分析を用いて得た。
【０１６７】
種々のペプチドの反応性を、ＭＳ患者の血清と、健康な対照の血清に対して試験した。これによって、ＰＯＬ２Ｂと称されるペプチドを選択することができた。このペプチドは、図２８のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示され、ＭＳＲＶ−１のｐｏｌ遺伝子にコードされている（ヌクレオチド１８１〜３３０）。
ｂ）抗原性特性 ＰＯＬ２Ｂペプチドの抗原性特性を、以下に記載したＥＬＩＳＡプロトコルに従って証明した。
【０１６８】
凍結乾燥されたＰＯＬ２Ｂペプチドを、１ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌された蒸留水に溶解した。このストック溶液を分注し、使用のために二週間＋４℃に保ち、あるいは２ケ月以内で使用するために−２０℃で冷凍した。１μｇ／ｍｌの最終的なペプチド濃度を得るように、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液中に分注物を希釈した。１００μｌのこの希釈物を、ミクロタイトレーションプレート（“high-binding”plastic，COSTAR ref:3590）の各ウェルに添加した。このプレートを、“プレート-シーラー”型接着剤で被覆し、プラスチックにペプチドが吸着する間、オーバーナイトで＋４℃に維持した。この接着剤を除去し、このプレートを３００μｌの溶液Ａ（１ｘＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、吸収紙の上で逆さにした。しかして水を切ったプレートを、各ウェル当たり２００μｌの溶液Ｂ（溶液Ａ＋１０％のヤギ血清）で満たし、接着剤で被覆して、３７℃で４５分から１時間インキュベートした。このプレートを上述したように溶液Ａで３回洗浄した。
【０１６９】
試験血清サンプルを、事前に溶液Ｂで１／５０に希釈し、１００μｌの各希釈試験血清を各ミクロタイトレーションプレートのウェルに添加した。ネガティブな対照を、１００μｌのバッファーＢの形態として、各プレートの一つのウェルに配した。接着剤で被覆されたプレートを、３７℃で１〜３時間インキュベートした。このプレートを、上述したように溶液Ａで３回洗浄した。平行して、ヒトＩｇＧ（Sigma Immunochemicals ref.A6029）もしくはＩｇＭ（Cappel ref.55228）に向けられたペルオキシダーゼラベルされたヤギ抗体を、溶液Ｂに希釈した（抗ＩｇＧに対して１／５０００の希釈、並びに抗ＩｇＭに対して１／１０００の希釈）。１００μｌのラベルされた抗体の適切な希釈物を、ミクロタイトレーションプレートの各ウェルに添加し、接着剤で被覆されたプレートを３７℃で１〜２時間インキュベートした。上述したように、プレートをさらに洗浄した。平行して、ペルオキシダーゼの基質を、“Sigma fast OPD kit”(Sigma Immunochemicals，ref.P9187)の指示に従って調製した。１００μｌの基質溶液を各ウェルに添加し、プレートを室温で２０〜３０分間遮光した。
【０１７０】
発色反応が安定したら、プレートをすぐにＥＬＩＳＡプレート分光光度読み取り装置に配置して、各ウェルの光学密度（ＯＤ）を波長４９２ｎｍで読みとった。あるいは、３０μｌの１ＮのＨＣｌを各ウェルに添加して反応を止め、２４時間以内に分光光度計でプレートを読みとってもよい。
血清学上のサンプルを、二倍もしくは三倍となるように導入し、同じサンプルの同じ希釈に対して得られたＯＤ値の平均を取ることによって、試験血清に対応する光学密度（ＯＤ）を算出した。
【０１７１】
各血清の正味のＯＤは、血清の平均ＯＤ−ネガティブな対照（溶液Ｂ：ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１０％のヤギ血清）の平均ＯＤに対応する。
ｃ）ＥＬＩＳＡによる抗ＭＳＲＶ−１ ＩｇＧ抗体の検出： Ｐｏｓｅｒ（非特許文献２３）の基準により、確かにもしくは恐らくＭＳに罹患していると診断された２９人の患者、および３２人の健康な対照（血液提供者）の血清中における抗ＭＳＲＶ−１特異的ＩｇＧ抗体の存在を試験するために、ＰＯＬＢ２ペプチドを用いて、上記の技術を使用した。図２９は、抗ＩｇＧ抗体を用いて試験された各血清に対する結果を示す。各縦棒は、試験した血清の正味の光学密度（４９２ｎｍにおけるＯＤ）を示す。縦軸は、縦棒の頂点において正味のＯＤを与える。縦の点線の左側の最初の２９本の縦棒は、試験したＭＳの２９人のケースの血清を示し、かつ点線の右の３２本の縦棒は、３２人の健康な対照（血液提供者）の血清を示す。
【０１７２】
試験されたＭＳの血清に対する正味のＯＤ値の平均は、０．６２である。この図表は、５人の対照の正味のＯＤが、コントロールのグループの値より高くなることを示している。これらの値は、症状のない血清学的患者の特異的ＩｇＧの存在を示すのかもしれない。二つの方法は、陽性試験の統計学上の限界値を決定するために評価された。
【０１７３】
正味のＯＤの値が高い対照を含むコントロールの正味のＯＤ値の平均は、０．
３６である。正味のＯＤ値が０．５以上の５人の対照を除くと、“ネガティブ”な対照の平均は０．３３となる。ネガティブな対照の標準偏差は、０．１０である。陽性の理論的な限界値は式に従って算出される。
【０１７４】
限界値（セロネガティブな対照の正味のＯＤの平均）＋（２または３ｘセロネガティブな対照の正味のＯＤ値の標準偏差）。
【０１７５】
第一のケースでは、症状のないセロポジティブであると考えられる場合があり、限界値は、０．３３＋（２ｘ０．１０）＝０．５３に等しい。ネガティブな結果は、ペプチドのエピトープに対して特異的に向けられた抗体の存在の非特異的“バックグラウンド”を示す。
【０１７６】
第二のケースでは、一見してセロポジティブである血清を除外せずに、明らかに健康である血液提供者からなる対照群を対照の基礎としてとれば、“非ＭＳ対照”の標準偏差は０．１１６である。限界値は、０．３６＋（２ｘ０．１１６）
＝０．５９となる。
【０１７７】
この分析に基づけば、この試験はＭＳに特異的である。これについては、表１に示されているように、対照がこの限界値を超える正味のＯＤを持たないことから、この試験はＭＳに特異的であることがわかる。実際に、この結果は、ＭＳ患者の抗体価が、たいていの場合は、ＭＳＲＶ−１と接触したことのある健康な対照より高いという事実を反映している。
【０１７８】
【表１】
2010047604.tif 000027
【０１７９】
計算の第一の方法に基づいて、図２９に表１に対応させて示したように、２９人のＭＳ血清の２６が、ＰＯＬ２Ｂペプチドに対して、しかしてｐｏｌ遺伝子にコードされたＭＳＲＶ−１レトロウイルスの逆転写酵素の一部に対して、そして、結果的にはＭＳＲＶ−１レトロウイルスに対して特異的に向けられたＩｇＧの存在を示す陽性結果を与える（０．５０以上の正味のＯＤ）。しかして、試験されたＭＳ患者の約９０％が、ＰＯＬ２Ｂペプチドに保有されたエピトープに対して反応し、これに対して向けられた循環ＩｇＧを備えている。
【０１８０】
明らかに健康である３２人の血液提供者のうちの５人は、陽性結果を示す。しかして、症状のない人の約１５％が、特異的な血清ＩｇＧの持続性においてそれ自身を発現する能動免疫へと導く条件下でＰＯＬ２Ｂペプチドに保有されるエピトープと接触していたかもしれないことは明らかである。このような状態は、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスに感染（および／または再活性化）した際のＭＳＲＶ−１レトロウイルス逆転写酵素に対する免疫化と一致する。これらのセロポジティブな対照におけるＭＳを想起するはっきりした神経病理学がないことは、彼らが健康なキャリアーであって、感染ウイルスを免疫化した後にそれらを除去してしまったか、慢性キャリアーの危険性のある集団を構成することを示唆しているのかもしれない。実際に、ＭＳの普及率の高い領域の環境に存在する病原性の成分がこの疾患の原因であるかもしれないことを示す疫学的データは、ＭＳではない集団のフラクションが病原性の成分等と必須に接触したことを意味する。ＭＳＲＶ−１レトロウイルスが、ＭＳの源において、この“病原性の成分”の全部または一部を構成することが示されたので、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスの構成要素に対するＩｇＧ型抗体を有することは、健康な集団の対照にとって普通のことである。しかして、ＭＳと対照の集団との間のセロプレバレンス(seroprevalence)の差異は極めて重要であって、“カイ自乗”テストでｐ＜０．００１である。
【０１８１】
ゆえにこれらの結果は、ＭＳにおけるＭＳＲＶ−１の病因的(aetiopathogenic)役割を指し示す。
【０１８２】
ｄ）ＥＬＩＳＡによる抗ＭＳＲＶ−１ＩｇＭ抗体の検出： Ｐｏｓｅｒ（非特許文献２３）の基準により、確かにもしくは恐らくＭＳに罹患していると診断された３６人の患者、および４２人の健康な対照（血液提供者）の血清中における抗ＭＳＲＶ−１特異的ＩｇＭ抗体の存在を試験するために、ＰＯＬＢ２ペプチドを用いて、ＥＬＩＳＡ技術を使用した。図３０は、抗ＩｇＭ抗体を用いて試験された各血清に対する結果を示す。各縦棒は、試験した血清の正味の光学密度（４９２ｎｍにおけるＯＤ）を示す。縦軸は、縦棒の頂点において正味のＯＤを与える。横座標を分ける垂直な線の左側の最初の３６本の縦棒は、試験されたＭＳの３６ケースの血清を示し、垂直な点線の右側の縦棒は４２人の健康な対照（血液のドナー）の血清を示す。表の真ん中に引かれた水平な線は、陽性の結果（棒の頂点が上に位置する）と陰性の結果（棒の頂点が下方に位置する）の境界を定義する理論的な限界値を示す。
【０１８３】
試験されたＭＳの場合の正味のＯＤ値の平均は、０．１９である。
【０１８４】
対照の正味のＯＤ値の平均は、０．０９である。
【０１８５】
ネガティブな対照の標準偏差は０．０５である。
【０１８６】
対照の平均および標準偏差間の小さな差異という観点では、理論的陽性の限界値は、以下の式に従って計算することができる。
限界値＝（セロネガティブな対照の正味のＯＤの平均）＋（３ｘセロネガティブな対照の正味のＯＤ値の標準偏差）。
【０１８７】
従って、限界値は、０．０９＋（３ｘ０．０５）＝０．２６、あるいは実際には０．２５に等しい。
【０１８８】
ネガティブな結果は、ペプチドのエピトープに特異的な抗体の存在の非特異的な“バックグラウンド”を示す。
【０１８９】
この分析法によれば、そして、図３０および対応する表２に示されているように、どの対照も限界値を超えた正味のＯＤを持たないことから、ＩｇＭ試験はＭＳに特異的である。３６のＭＳ血清のうちの７つが、陽性ＩｇＭの結果を示し、現在、臨床データの研究が、ＭＳの最初の攻撃もしくは未処置の患者における急性攻撃の間にこれらの陽性の血清が得られることを示している。病原性の成分に向けられたＩｇＭは、前記病原性の成分の最初の感染、もしくは潜伏期間後の再活性化の間に産生されることが知られている。
【０１９０】
ＭＳと対照の集団との間のセロプレバレンスの差異は極めて重要であって、“カイ自乗”テストでｐ＜０．００１である。
【０１９１】
これらの結果は、ＭＳにおけるＭＳＲＶ−１の病因的役割を指し示す。
ＰＯＬ２Ｂペプチドに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の検出は、ＭＳＲＶ−１感染および／またはＭＳＲＶ−１のウイルスの再活性化のコースを評価可能にする。
【０１９２】
【表２】
2010047604.tif 000028
【０１９３】
ｅ）ＰＯＬ２Ｂペプチドの免疫優勢エピトープの調査： 非特異的バックグラウンドを低減し、かつ抗ＭＳＲＶ−１抗体の反応の検出を最適化するために、連続する一つのアミノ酸段階で進める、ＰＯＬ２Ｂによって決められた配列の全体をカバーする、オクタペプチドの合成を、以下に記載のプロトコルに従って行った。
【０１９４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されたアミノ酸配列６１−１１０をカバーする重複オクタペプチドの化学的合成を、Spotscanの商品名でCambridge Research Biochemicalsから市販されたＢＥＲＧらの技術に基づいて（1989．J．Ann．Chem．Soc.，111，8024-8026）、活性化されたセルロース膜で行った。この技術は、多数のペプチドの合成とその分析を同時に行うことができる。
【０１９５】
合成は、α-アミノ基がＦＭＯＣ基（Nova Biochem）で保護され、側鎖基がトリチル、ｔ-ブチルエステルもしくはｔ-ブチルエーテル等の保護基で保護された、エステル化されたアミノ酸を用いて行われる。このエステル化されたアミノ酸は、３００ｎＭの濃度でＮ-メチルピロリドン（ＮＭＰ）中に溶解され、０．９μｌをブロモフェノールブルーの堆積のスポットに適用する。１５分間インキュベーションした後に、アミノ酸をさらに適用し、さらに１５分間インキュベーションする。もし二つのアミノ酸の結合が正確に行われれば、発色変化（青から黄緑への変化）が観察される。ＤＭＦで３回洗浄した後に、無水酢酸を用いてアセチル化段階を行う。次いで、合成段階におけるペプチドの末端アミノ基を、ＤＭＦ中の２０％ピリジンを用いて保護基をはずす。堆積のスポットをＤＭＦ中の１％ブロモフェノールブルー溶液で再度染色し、メタノールで３回洗浄し、乾燥させる。この一連の操作が、一つのアミノ酸を付加する一つのサイクルを構成し、このサイクルを合成終了まで繰り返す。全てのアミノ酸が付加されたら、最後のアミノ酸のＮＨ２-末端基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて保護をはずし、無水酢酸でアセチル化した。側鎖を保護する基を、ジクロロメタン／トリフルオロ酢酸／トリイソブチルシラン（５ｍｌ／５ｍｌ／２５０ｍｌ）混合物で除去する。次いで、ペプチドの免疫応答性をＥＬＩＳＡで調べた。
【０１９６】
二つの異なる膜上に種々のオクタペプチドを二重に合成した後、これらをメタノールですすぎ、ＴＢＳ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２）で洗浄し、飽和バッファー中、室温、オーバーナイトでインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２ − ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で何度か洗浄した後に、一方の膜を、１／５０希釈のＭＳ患者由来の参照血清とインキュベートし、他方の膜を、１／５０希釈の健康な対照の血清とインキュベートした。これらの膜を、室温で４時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、β-ガラクトシダーゼ標識化抗ヒトイムノグロブリン複合体（Cambridge Research Biochemicalsから市販されている）を１／２００の希釈率で添加し、その混合物を室温で２時間インキュベートする。０．０５％のＴＢＳ−ＴとＰＢＳで膜を洗浄した後、種々のスポットにおける免疫応答性を、カリウム中の５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル β-Ｄ-ガラクトピラノシドを添加することによって視覚化する。
【０１９７】
スポットの発色強度を、添付図３１〜３３に示した０〜５の相対値で定性的に評価する。
このようにして、ＰＯＬ２Ｂペプチドの各末端における二つの免疫優勢領域を決定することができ、これらは図３４のアミノ酸配列６５−７５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）と９２−１０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）にそれぞれ対応し、それぞれ、オクタペプチドPhe-Cys-Ile-Pro-Val-Arg-Pro-Asp(FCIPVRPD)とArg-Pro-Asp-Ser-Gln-Phe-Leu-Phe(RPDSQFLF)との間、並びにThr-Val-Leu-Pro-Gln-Gly-Phe-Arg(TVLPQGFR)とLeu-Phe-Gly-Gln-Ala-Leu-Ala-Gln(LFGQALAQ)との間にあり、対照血清でバックグラウンドを何ら生じないので、反応性は弱いがより特異的な領域は、オクタペプチドLeu-Phe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu(LFAFEDPL)（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）とPhe-Ala-Phe-Glu-Asp-Pro-Leu-Asn(FAFEDPLN)（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）に示される。
これらの領域は、通常の技術に従って、より特異的かつより免疫応答性である新規のペプチドを定義することを可能にする。
【０１９８】
本発明によってなされた発見および開発された方法の結果として、ＭＳＲＶ−１感染および／または再活性化の診断を行うこと、および患者の生物学的流体中のこれらの成分の検出を“陰性化(negativing)”する効能に基づいてＭＳにおける治療を評価することが可能である。さらに、ＭＳの神経学的な兆候をまだ示していない個人の早期検出が、神経学的な疾患の開始に対応する病変期に先立つ事実に次ぐ臨床的コースに対応した、より効果的な治療を行うことができた。現在のところ、ＭＳの診断は、神経学的な疾患の症状が始まる前には確立されて折らず、重要な中枢神経系の病変を示唆する臨床的写真が得られる前には何の治療も行われない。ヒトにおけるＭＳＲＶ−１および／またはＭＳＲＶ−２感染および／または再活性化の診断は、明らかに重大であり、本発明は、これを行う手段を提供する。
【０１９９】
しかして、ＭＳＲＶ−１感染および／または再活性化の診断を行うこととは別に、患者の生物学的流体中の上記成分の検出を“陰性化”する効能に基づいて、ＭＳの治療を評価することができる。
【０２００】
実施例１２：ＭＳＲＶ−１レトロウイルスのＧＡＧ遺伝子の部位を含有するクローンＬＢ１９を得る Gonzalez-Quintial Rら（非特許文献１９）およびPLAZAら（非特許文献２５）によって公開された技術から誘導したＰＣＲ技術を用いた。上述したように精製されたビリオンの画分から抽出された全体のＲＮＡから、EXPANDTM REVERSE TRANSCRIPTASE(BOEHRINGER MANNHEIM)を用いて、増幅されるゲノムの３’末端に特異的プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）を用いてｃＤＮＡを合成した。
ｃＤＮＡ
【０２０１】
【化２５】
2010047604.tif 000029
【０２０２】
精製した後、製造元のプロトコルに従って、Boehringer Mannheim社から市販されている“Terminal transferases kit”を用いて、ポリ（Ｇ）テイルをｃＤＮＡの５’末端に付加した。
【０２０３】
以下の５’および３’プライマーを用いて、固定ＰＣＲ（anchoring PCR）を行った。
【０２０４】
【化２６】
2010047604.tif 000030
【０２０５】
次いで、以下の５’および３’プライマーを用いて半重ね合わせ固定ＰＣＲ(a semi-nested anchoring PCR)を行った。
【０２０６】
【化２７】
2010047604.tif 000031
【０２０７】
ＰＣＲに由来する生成物は、従来の方法（非特許文献１７）に基づくアガロースゲルで精製した後に抽出し、１０ｍｌの蒸留水に再懸濁した。Ｔａｑポリメラーゼの特徴の一つは、二つのＤＮＡ鎖のそれぞれの３’末端にアデニンを添加することであるため、得られたＤＮＡをＴＡクローニングキットTM（British Biotechnology）を用いてプラスミドに直接挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液を、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０倍に濃縮されたリゲーションバッファー“１０ｘリゲーションバッファー”、２μｌの“ｐＣＲTM ベクター”（２５ｎｇ／ｍｌ）および１μｌの“Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ”と混合した。この混合物を、１２℃で一晩インキュベートした。以下の段階を、ＴＡクローニングキット（商標）（British Biotechnology）の説明に従って行った。操作の終わりに、培養し、かついわゆる“ミニプレップ”操作（非特許文献１７）に基づいて取り込まれたプラスミドの抽出を行うために、組換えられた（白色）バクテリアの白色のコロニーを選択した。各組換えコロニーからのプラスミド調製物を、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲルで分析した。ＴＡクローニングキット（商標）のクローニングプラスミドに存在するＳｐ６プロモーターに相補的なプライマーとハイブリダイゼーションさせた後に、挿入物の配列決定用に、ゲルをエチジウムブロミドに浸して紫外線照射下で検出された挿入物を所有するプラスミドを選択した。次いで、配列決定の前の反応を、シークエンシングキット“プリズム・レディー・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems、照合番号４０１３８４）の使用に推奨された方法によって行い、自動配列決定をApplied Biosystemsの“モデル３７３Ａオートマティック・シークエンサー”装置で、製造者の説明に従って行った。
【０２０８】
上記技術に基づいたＰＣＲ増幅は、Ｈ．Ｐｅｒｒｏｎ（非特許文献１３）によって記載された技術に基づいて、Ｐｅｒｒｏｎら（非特許文献３）によって記載され、かつ、仏国特許出願ＭＳ１０、１１および１２に記載されているように、逆転写酵素活性と関連したレトロウイルス性粒子を発現し、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）株Ｂ９５で不死化されたＭＳ患者のＢリンパ球の培養上清の、スクロース勾配で精製された感染性粒子のフラクションの核酸から合成されたｃＤＮＡに用いられた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に同定されたクローンＬＢ１９は図３５に示されている。
【０２０９】
このクローンは、図３６に示されているように、先に配列決定されたクローンＧＭ３とクローンＧ＋Ｅ＋Ａ（実施例１５参照）を用いて、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスのｇａｇ遺伝子の重要な部位を代表する６９０塩基対の領域を定義するすることを可能にする。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８と呼ばれるこの配列は、それらの末端で重複する種々のクローンから再構成される。この配列は、ＭＳＲＶ−１“ｇａｇ*”領域の名称で同定される。図３６では、アミノ酸への翻訳をする潜在的な読み枠が、核酸配列の下に示されている。
実施例１３：ＭＳＲＶ−１レトロウイルスに関連するｐｏｌ遺伝子領域と糖タンパク質の潜在的な読み枠（ＯＲＦ）とを含む見かけ上不完全なＥＮＶ領域を含むクローンＦＢｄ１３を得るウイルスＲＮＡの抽出：ＲＮＡを、以下に簡単に記載する方法に基づいて抽出した。
【０２１０】
ＭＳ患者のＢリンパ球の培養上清（６５０ｍｌ）を、１００００ｇで３０分間遠心した。得られたウイルスペレットを、３００μｌのＰＢＳ／１０ｍＭ ＭｇＣｌ2に再懸濁した。この材料を、３７℃で３０分間、ＤＮアーゼ（１００ｍｇ／ｍｌ）／ＲＮアーゼ（５０ｍｇ／ｍｌ）混合物で処理し、次いで４６℃で３０分間プロテイナーゼＫ（５０ｍｇ／ｍｌ）で処理した。
【０２１１】
核酸を、６０℃まで熱した１ボリュームのフェノール／０．１％ＳＤＳ（Ｖ／Ｖ）で抽出し、１ボリュームのフェノール／クロロホルム（１：１、Ｖ／Ｖ）で再抽出した。
０．１Ｖの酢酸ナトリウムｐＨ＝５．２の存在下で、２．５Ｖのエタノールで材料を沈降させた。遠心後に得られたペレットを、５０μｌの無菌のＤＥＰＣ水に再懸濁した。
再び、このサンプルを、５０ｍｇ／ｍｌの“ＲＮアーゼを含まない”ＤＮアーゼで、室温で３０分間処理し、１ボリュームのフェノール／クロロホルムで抽出し、酢酸ナトリウムとエタノールの存在下で沈降させた。
【０２１２】
得られたＲＮＡを、２６０ｎｍでＯＤを読みとることによって定量した。ＭＳＲＶ−１が存在すること、および、ＤＮＡ混入物が存在しないことは、ＰＣＲおよびＭＳＲＶ−１ゲノムに特異的なＥＬＯＳＡと関連するＭＳＲＶ−１特異的ＲＴＰＣＲによって観察される。
【０２１３】
ｃＤＮＡの合成： ５ｍｇのＲＮＡを、いくらかの変更を加えた“cDNA Synthesis Module”キット（ref RPN 1256，Amersham）の指示に基づいてポリ（ＤＴ）オリゴヌクレオチドで開始されたｃＤＮＡを合成するために用いる。逆転写を、推奨された４２℃に代えて４５℃で行った。
【０２１４】
合成産物を、製造元の指示に従って、二回の抽出と二回の精製で精製した。
ＭＳＲＶ−１の存在は、ＭＳＲＶ−１ゲノムに特異的なＥＬＯＳＡと関連したＭＳＲＶ−１ ＰＣＲによって確認した。
【０２１５】
“長距離ＰＣＲ(Long Distance PCR)”（ＬＤ−ＰＣＲ）
５００ｎｇのｃＤＮＡをＬＤ−ＰＣＲ工程(Expand Long Template System; Boehringer(ref．1681 842))に用いた。
【０２１６】
いくつかの対のオリゴヌクレオチドを用いた。これらの中には、以下のプライマーに定義された対がある。
【０２１７】
【化２８】
2010047604.tif 000032
【０２１８】
増幅条件は以下の通りである。
９４℃ １０秒間 ５６℃ ３０秒間 ６８℃ ５分間 １０サイクル、次いで各サイクルにおいて延長時間につき２０秒間増加した２０サイクルを行った。最初の増幅の最後では、２μｌの増幅産物に、上記と同じ条件下で第二の増幅を行った。
【０２１９】
ＬＤ−ＰＣＲ反応を、薄壁マイクロチューブ(Boehringer)中で、Perkin model 9600ＰＣＲ装置で行った。
【０２２０】
増幅産物を、１％のアガロースゲルで増幅ボリュームの１／５（１０μｌ）を電気泳動することによって観察した。上記のプライマーの対に対して、約１．７ｋｂのバンドが得られた。
【０２２１】
増幅されたフラグメントのクローニング： ＰＣＲ産物を、提供者の指示に従って、調製用アガロースゲルおよびCostarカラム（Spin; D．Dutcher）を通過させて精製した。
２μｌの精製された溶液を、提供者の指示に従って５０ｎｇのベクターＰＣＲIIと混ぜた（ＴＡクローニングキット；British Biotechnology）。
得られた組換えベクターを、的確なＤＨ５ａＦ’バクテリアの形質転換によって単離した。バクテリアは、アンピシリンに対する耐性と、Ｘｇａｌの代謝の欠損（＝白色コロニー）を用いて選択された。組換えベクターの分子構造を、プラスミドミニプレパレーション(minipreparation)および酵素ＥｃｏＲ１を用いた加水分解によって確認した。
これらの基準の全てに対して陽性のクローンであるＦＢｄ１３を選択した。組換えプラスミドのスケールの大きな調製を、提供者の指示に従ってMidiprep Quiagen Kit(ref 12243)を用いて行った。
【０２２２】
クローンＦＢｄ１３の配列決定を、製造者の指示に従って、Perkin Prism Amplitaq FS 染料終結キット（ref．402119）の手段で行った。配列反応溶液を、Perkin ３７７型もしくは３７３Ａ型自動配列決定装置に導入した。この配列決定方法は、クローンＦｂｄ１３の両方の鎖に行われた遺伝子歩行からなる。
【０２２３】
クローンＦＢｄ１３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に同定される。図３７には、クローンＦＢｄ１３およびＨＳＥＲＶ−９レトロウイルス間の配列相同性が、７０％以上のあらゆる部分的相同性の連続的直線によって、マトリックスチャートに示されている。クローンの隣接領域に相同性があることがわかるが（５’末端のｐｏｌ遺伝子、および３’末端のｅｎｖ遺伝子およびＬＴＲ）
、内部領域はまったく異なり、ＨＳＥＲＶ９のｅｎｖ遺伝子との相同性を全く、弱いものでさえも示さない。さらに、クローンＦＢｄ１３は、不完全な内在性のＨＳＥＲＶ−９を記述するものより長い“ｅｎｖ”領域を含むことは明白であり、しかして、内在する異なる領域が、ＨＳＥＲＶ−９不完全遺伝子と部分的相同性のある領域間の“挿入物”を構成すると理解できるかもしれない。
【０２２４】
この付加配列は、ＯＲＦ Ｂ１３と称され、そのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７に示される潜在的なｏｒｆを決定する。
【０２２５】
クローンＦＢｄ１３の分子構造を、GeneWorkソフトウェアおよびGenebankおよびSwissProtデータバンクを用いて分析した。
【０２２６】
５つのグリコシル化部位を見出した。
【０２２７】
このタンパク質は、既知の配列と十分な相同性を持たない。
恐らく、このクローンは、ＭＳＲＶ−１の複製と関連した内在性レトロウイルス成分（ＥＲＶ）の組換えに由来する。
【０２２８】
このような現象は、ポリペプチド、あるいは免疫系に必ずしも寛容されない内在性レトロウイルス性タンパク質でさえ、発現の発生を欠かない。ＭＳＲＶ−１に関連した、および／または、これに誘発された内在性成分の常軌を逸した発現のこのような機構は、常軌を逸した抗原を増大させやすく、ＭＳに観察されるような自己免疫工程の誘発に寄与しがちである。明らかに、これまでに記述されたことのない新規な成分を構成する。実際には、“Entrez”ソフトウェア（NCBI，NIH，Bethesda，米国）のバージョンＮｏ１９（１９９６）に利用できる核酸配列のデータバンクの疑問は、このクローンのｅｎｖ領域全体を含む既知の相同配列を同定することができなかった。
【０２２９】
実施例１４：クローンＰＯＬ* ＭＳＲＶ−１に相同な逆転写酵素をコードする領域を備えたｐｏｌ遺伝子の一部、およびクローンＰＯＬ*、ｔｐｏｌ、ＦＢｄ３、ＪＬＢｃ１およびＪＬＢｃ２に記載の等価配列から分かれた３’ｐｏｌ領域を含むクローンＦＰ６を得る ３’ＲＡＣＥを、ＭＳ患者の血漿から抽出した全体のＲＮＡに行った。同じ条件で処理した健康な対照の血漿をネガティブな対照として用いた。ｃＤＮＡの合成を、以下の修飾オリゴ（ｄＴ）プライマー：
【０２３０】
【化２９】
2010047604.tif 000033
【０２３１】
および、Boehringer“Expand RT”逆転写酵素を用いて、会社が推薦する条件に基づいて行った。
【０２３２】
酵素Klentaq(Clontech)を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った。９４℃で５分間、９３℃で１分間、５８℃で１分間、６８℃で３分間を４０サイクル行い、６８℃で８分間行って、最終的な反応ボリュームが５０μｌである。
【０２３３】
ＰＣＲに用いられたプライマーは、 − ５’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９に同定されたもの
【０２３４】
【化３０】
2010047604.tif 000034
【０２３５】
− ３’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８に同定されたもの（ｃＤＮＡのと同じ）
第二の、いわゆる“半重ね合わせ(semi-nested)”ＰＣＲを、既に増幅された領域内に位置する５’プライマーを用いて行った。この第二のＰＣＲは、第一のＰＣＲに由来する１０μｌの増幅産物を用いて、最初のＰＣＲで用いられた条件と同じ実験的条件下で行われた。
半重ね合わせＰＣＲに用いられたプライマー： − ５’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０に同定されたもの
【０２３６】
【化３１】
2010047604.tif 000035
【０２３７】
− ３’プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８に同定されたもの（ｃＤＮＡのと同じ）。
プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０は、ｐｏｌ*領域、それぞれ、位置番号Ｎｏ．４０３〜Ｎｏ．４２２およびＮｏ．６４１〜Ｎｏ．６７０に特異的である。
【０２３８】
しかして、増幅産物を、ＭＳ患者の血漿から抽出した細胞外ＲＮＡから得た。
対応するフラグメントは、健康な対照の血漿に観察されなかった。この増幅産物を、以下の方法でクローン化した。
【０２３９】
増幅されたＤＮＡをＴＡクローニングTMキットを用いてプラスミドに挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液を、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０倍に濃縮されたリゲーションバッファー“１０ｘリゲーションバッファー”、２μｌの“ｐＣＲTM ベクター”（２５ｎｇ／ｍｌ）および１μｌの“ＴＡ ＤＮＡリガーゼ”と混合した。この混合物を、１２℃で一晩インキュベートした。以下の段階を、ＴＡクローニングキット（商標）（British Biotechnology）の説明に従って行った。操作の終わりに、培養し、かついわゆる“ミニプレップ”操作（非特許文献１７）に基づいて取り込まれたプラスミドの抽出を行うために、組換えられた（白色）バクテリアの白色のカラムを選択した。各組換えコロニーからのプラスミド調製物を、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲルで分析した。ＴＡクローニングキット（商標）のクローニングプラスミドに存在するＳｐ６プロモーターに相補的なプライマーとハイブリダイゼーションさせた後に、挿入物の配列決定用に、ゲルをエチジウムブロミドに浸して紫外線照射下で検出された挿入物を所有するプラスミドを選択した。次いで、配列決定の前の反応を、シークエンシングキット“プリズム・レディー・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems、照合番号４０１３８４）の使用に推奨された方法によって行い、自動配列決定をApplied Biosystemsの“モデル３７３Ａオートマティック・シークエンサー”装置で、製造者の説明に従って行った。
【０２４０】
ＦＰ６と称される得られたクローンは、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスのｐｏｌ*領域に８９％相同な４６７ｂｐの領域、および、ＥＲＶ−９のｐｏｌ領域に６４％相同な１１６７ｂｐ（Ｎｏ．１６３４〜２８５６）の領域を定義可能にした。
クローンＦＰ６は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に同定されたヌクレオチド配列によって、図３８に示されている。このクローンの３つの潜在的な読み枠は、ヌクレオチド配列の下のアミノ酸配列によって示されている。
【０２４１】
実施例１５：ＭＳ患者の血漿から抽出されたＲＮＡから、クローン“ＧＭ３”に定義される５’領域とクローンＰＯＬ*に定義される３’領域との間に含まれる核酸配列のＰＣＲ増幅によって、レトロウイルスのプロテアーゼのＯＲＦを含むＧ＋Ｅ＋Ａと称される領域を得る。
ＭＳ患者の血漿に存在するビリオンに由来するレトロウイルスのＲＮＡを増幅するために、出願人によって既に同定されたＭＳＲＶ−１配列に特異的なオリゴヌクレオチドが調べられた。混入物の存在を観察するために対照反応（水との反応）を行った。増幅は、ＲＴ−ＰＣＲと、それに次ぐ“重ね合わせ”ＰＣＲの工程からなる。上記のクローンＧＭ３とｐｏｌ*の配列に定義される領域に重複する３つの領域（Ｇ、ＥおよびＡと称される）を増幅するためにプライマーの対を定義した。
【０２４２】
領域Ｇを増幅するための半重ね合わせＲＴ−ＰＣＲ：− 最初のＲＴ−ＰＣＲサイクルでは、以下のプライマーを用いた。
プライマー１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１（センス）
プライマー２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２（アンチセンス）
− 第二のＰＣＲサイクルでは、以下のプライマーを用いた。
プライマー１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３（センス）
プライマー４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（アンチセンス）
領域Ｅを増幅するための重ね合わせＲＴ−ＰＣＲ：− 最初のＲＴ−ＰＣＲサイクルでは、以下のプライマーを用いた。
プライマー５：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５（センス）
プライマー６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（アンチセンス）
− 第二のＰＣＲサイクルでは、以下のプライマーを用いた。
プライマー７：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７（センス）
プライマー８：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８（アンチセンス）
領域Ａを増幅するための半重ね合わせＲＴ−ＰＣＲ：− 最初のＲＴ−ＰＣＲサイクルでは、以下のプライマーを用いた。
プライマー９：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９（センス）
プライマー１０：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０（アンチセンス）
− 第二のＰＣＲサイクルでは、以下のプライマーを用いた。
プライマー９：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１（センス）
プライマー１１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２（アンチセンス）
プライマーと領域Ｇ、ＥおよびＡは以下の通りに位置する。
【０２４３】
【化３２】
2010047604.tif 000036
【０２４４】
種々のクローンＧ、ＥおよびＡに定義された領域の配列は、“重ね合わせ”増幅産物のクローニングおよび配列決定の後に決定された。
【０２４５】
クローンＧ、ＥおよびＡは、フラグメントＧの５’末端でプライマー１と、また、フラグメントＡの３’末端でプライマー１１と、ＰＣＲによって組み合わされ、そのプライマー類は上述されている。約１５８０ｂｐフラグメントＧ＋Ｅ＋Ａを増幅して、ＴＡクローニング（商標）キットを用いてプラスミド中に挿入した。Ｇ＋Ｅ＋Ａに対応する増幅産物の配列を決定し、Ｇ＋ＥおよびＥ＋Ａの重複の分析を行った。この配列は図３９に示されており、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９に対応している。
【０２４６】
ＭＳＲＶ−１レトロウイルスのプロテアーゼをコードする読み枠は、領域Ｅに見出された。プロテアーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に示され、図４０に示されている。
【０２４７】
実施例１６：ビリオンを生成しＭＳＲＶ−１レトロウイルスを発現するＭＳリンパ芽球系のＤＮＡにおいて、ＭＳＲＶ−１に近い内在性レトロウイルス成分（ＥＲＶ）に関連するクローンＬＴＲＧＡＧ１２を得る。
【０２４８】
ＭＳＲＶ−１レトロウイルスを発現し、ＭＳ患者の末梢血液リンパ球に由来するリンパ芽球系（上述され、当業者によく知られているように、ＥＢＶウイルス株Ｂ９５で不死化されたＢリンパ球）から抽出されたＤＮＡに、重ね合わせＰＣＲを行った。
【０２４９】
最初のＰＣＲ工程では、以下のプライマーを用いた。
【０２５０】
【化３３】
2010047604.tif 000037
【０２５１】
この工程は、９４℃で１分間、５４℃で１分間、かつ７２℃で４分間の条件で３５増幅サイクルを含む。
【０２５２】
第二のＰＣＲ工程では、以下のプライマーを用いた。
【０２５３】
【化３４】
2010047604.tif 000038
【０２５４】
この工程は、９４℃で１分間、５４℃で１分間、かつ７２℃で４分間の条件で３５増幅サイクルを含む。
【０２５５】
ＰＣＲに由来する生成物は、従来の方法（非特許文献１７）に基づくアガロースゲルで精製した後に抽出し、１０ｍｌの蒸留水に再懸濁した。Ｔａｑポリメラーゼの特徴の一つは、二つのＤＮＡ鎖のそれぞれの３’末端にアデニンを添加することであるため、得られたＤＮＡをＴＡクローニングキットTM（British Biotechnology）を用いてプラスミドに直接挿入した。２μｌのＤＮＡ溶液を、５μｌの滅菌蒸留水、１μｌの１０倍に濃縮されたリゲーションバッファー“１０ｘリゲーションバッファー”、２μｌの“ｐＣＲTM ベクター”（２５ｎｇ／ｍｌ）および１μｌの“ＴＡ ＤＮＡリガーゼ”と混合した。この混合物を、１２℃で一晩インキュベートした。以下の段階を、ＴＡクローニングキット（商標）（British Biotechnology）の説明に従って行った。操作の終わりに、培養し、かついわゆる“ミニプレップ”操作（非特許文献１７）に基づいて取り込まれたプラスミドの抽出を行うために、組換えられた（白色）バクテリアの白色のコロニーを選択した。各組換えコロニーからのプラスミド調製物を、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲルで分析した。ＴＡクローニングキット（商標）のクローニングプラスミドに存在するＳｐ６プロモーターに相補的なプライマーとハイブリダイゼーションさせた後に、挿入物の配列決定用に、ゲルをエチジウムブロミドに浸して紫外線照射下で検出された挿入物を所有するプラスミドを選択した。次いで、配列決定の前の反応を、シークエンシングキット“プリズム・レディー・リアクション・キット・ダイ・デオキシターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット”（Applied Biosystems、照合番号４０１３８４）の使用に推奨された方法によって行い、自動配列決定をApplied Biosystemsの“モデル３７３Ａオートマティック・シークエンサー”装置で、製造者の説明に従って行った。
【０２５６】
しかして、ＬＴＲＧＡＧ１２と称されるクローンが得られ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に同定された内在配列によって示される。
このクローンは、おそらく、ヒトのＤＮＡ、特にＭＳ患者のＤＮＡに存在する、ＥＲＶ−９に近い内在成分を代表するものであり、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスの発現と抵触することができる。故に、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスと関連する病原に役割を持つことができ、問題の病理学における特異的な発現のマーカーとして扱うことができる。
実施例１７：ヒト血清における抗ＭＳＲＶ−１特異的抗体の検出 ＭＳＲＶ−１レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の配列およびこの遺伝子の読み枠（オープンリーディングフレーム）の配列の同定により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２と称する前記遺伝子の領域のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３を決定することができた。
ｐｏｌ遺伝子にコードされたＭＳＲＶ−１逆転写酵素のタンパク質配列のフラグメントに対応する種々の合成ペプチドを、ＭＳ患者と健康な対照の血清に対する抗原特異性についてテストした。
【０２５７】
これらのペプチドは、Merrifield技術（非特許文献２２）に基づいた固相合成法によって化学的に合成した。実際的な詳細については以下に記載されている。
【０２５８】
ａ）ペプチド合成： これらのペプチドは、“Applied Biosystems 430A”自動合成装置を用いて、フェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）／ポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂（Applied Biosystems，Inc．Foster City，CA）に合成した。アミノ酸は、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）エステルの形態で連結される。用いられたアミノ酸は、Novabiochem(Lauflerlfingen，スイス)もしくはBachem(Bubendorf, スイス)から入手した。
【０２５９】
溶媒としてＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）を使用したダブルカップリングプロトコルを用いて化学合成を行った。適切な装置（タイプＩ切断装置、Peptide Institute，Osaka，Japan）でフッ化水素酸（ＨＦ）を用いて、ペプチドを、樹脂および側鎖保護基から同時に切断した。
【０２６０】
１ｇのペプチド樹脂に対して、１０ｍｌのＨＦ、１ｍｌのアニソール、および１ｍｌのジメチルスルフィド５ＤＭＳを用いた。この混合物を−２℃で４５分間攪拌した。エーテルでよく洗浄した後、このペプチドを１０％酢酸で樹脂から溶出し、凍結乾燥させた。
このペプチドを、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８型カラム（２５０ｘ２１ｍｍ）（The Separation Group，Hesperia，CA，USA）で分離用高性能液体クロマトグラフィーで精製した。２２ｍｌ／分の流速でアセトニトリル勾配を用いて溶出した。回収されたフラクションを、１ｍｌ／分の流速で、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８分析用カラム（２５０ｘ４．６ｍｍ）でイソクラティック(isocratic)条件下で溶出することによって観察した。同じ保持時間のフラクションを貯めて、凍結乾燥させた。上記の系を備えた分析用高性能液体クロマトグラフィーで、優勢なフラクションを分析した。許容できる純度であると考えられるペプチドは、クロマトグラムの９５％以上を示す単一のピークに現れる。
【０２６１】
次いで、精製されたペプチドを、Applied Biosystems 420H 自動アミノ酸分析装置を用いて、アミノ酸組成を調べる目的で分析した。ペプチドの（平均）化学分子量の測定を、ＤＥＶ−ＶＡＸ２０００獲得システムと連結したＶＧ．ＺＡＢ．ＺＳＥＱダブルフォーカシング装置（VG analytical Ltd，マンチェスター、イギリス）で、陽性イオンモードでＬＳＩＭＳ質量分析を用いて得た。
【０２６２】
種々のペプチドの反応性を、ＭＳ患者の血清と、健康な対照の血清に対して試験した。これによって、Ｓ２４Ｑと称されるペプチドを選択することができた。
【０２６３】
この配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に示され、ＭＳＲＶ−１のｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列にコードされている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）。
【０２６４】
ｂ）抗原性特性 Ｓ２４Ｑペプチドの抗原性特性を、以下に記載したＥＬＩＳＡプロトコルに従って証明した。
【０２６５】
凍結乾燥されたＳ２４Ｑペプチドを、１ｍｇ／ｍｌの濃度の１０％酢酸に溶解した。このストック溶液を分注し、使用のために二週間＋４℃に保ち、あるいは２ヶ月以内で使用するために−２０℃で冷凍した。５μｇ／ｍｌの最終的なペプチド濃度を得るように、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液中に分注物を希釈した。１００μｌのこの希釈物を、Nunc Maxisorb（商標）ミクロタイトレーションプレートの各ウェルに添加した。このプレートを、“プレート-シーラー”型接着剤で被覆し、プラスチックにペプチドが吸着する間、２時間、＋３７℃に維持した。この接着剤を除去し、このプレートを３００μｌの溶液Ａ（１ｘＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、吸収紙の上で逆さにした。しかして水を切ったプレートを、各ウェル当たり２５０μｌの溶液Ｂ（溶液Ａ＋１０％のヤギ血清）で満たし、接着剤で被覆して、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを上述したように溶液Ａで３回洗浄した。
【０２６６】
試験血清サンプルを、事前に溶液Ｂで１／１００に希釈し、１００μｌの各希釈試験血清を各ミクロタイトレーションプレートのウェルに添加した。ネガティブな対照を、１００μｌのバッファーＢの形態として、各プレートの一つのウェルに配した。接着剤で被覆されたプレートを、３７℃で１時間３０分インキュベートした。このプレートを、上述したように溶液Ａで３回洗浄した。ＩｇＧ反応に関して、ヒトＩｇＧ（Jackson Immuno Research Inc.から市販されている）に向けられたペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗体を、溶液Ｂに希釈した（１／１００００の希釈）。１００μｌのラベルされた抗体の適切な希釈物を、ミクロタイトレーションプレートの各ウェルに添加し、接着剤で被覆されたプレートを３７℃で１時間インキュベートした。上述したように、プレートをさらに洗浄した。平行して、ペルオキシダーゼの基質を、bioMerieux kitの指示に従って調製した。１００μｌの基質溶液を各ウェルに添加し、プレートを室温で２０〜３０分間遮光した。
【０２６７】
発色反応が安定したら、反応を停止するために、５０μｌのColor 2(bioMerieux 商品名)を各ウェルに添加した。プレートをすぐにＥＬＩＳＡプレート分光光度読み取り装置に配置して、各ウェルの光学密度（ＯＤ）を波長４９２ｎｍで読みとった。
【０２６８】
血清学上のサンプルを、二倍もしくは三倍となるように導入し、同じサンプルの同じ希釈に対して得られたＯＤ値の平均を取ることによって、試験血清に対応する光学密度（ＯＤ）を算出した。
【０２６９】
各血清の正味のＯＤは、血清の平均ＯＤ−ネガティブな対照（溶液Ｂ：ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１０％のヤギ血清）の平均ＯＤに対応する。
【０２７０】
ｃ）ＥＬＩＳＡによる抗ＭＳＲＶ−１ ＩｇＧ抗体（Ｓ２４Ｑ）の検出： Ｐｏｓｅｒ（２３）の基準により、確かにＭＳに罹患していると診断された１５人の患者、および１５人の健康な対照（血液提供者）の血清中における抗ＭＳＲＶ−１特異的ＩｇＧ抗体の存在を試験するために、Ｓ２４Ｑペプチドを用いて、上記の技術を使用した。
【０２７１】
図４１は、抗ＩｇＧ抗体を用いて試験された各血清に対する結果を示す。各縦棒は、試験した血清の正味の光学密度（４９２ｎｍにおけるＯＤ）を示す。縦軸は、縦棒の頂点において正味のＯＤを与える。縦の点線の左側の最初の１５本の縦棒は、１５人の健康な対照（血液提供者）の血清を示し、かつ点線の右の１５本の縦棒は、試験したＭＳの１５人のケースの血清を示す。この図表は、２人の対照の正味のＯＤが、コントロールのグループの値より高くなることを示している。これらの値は、症状のない血清学的患者の特異的ＩｇＧの存在を示すのかもしれない。二つの方法は、陽性試験の統計学上の限界値を決定するために評価された。
【０２７２】
正味のＯＤの値が高い対照を含むコントロールの正味のＯＤ値の平均は、０．
１２９であり、標準偏差が０．０６である。正味のＯＤ値が０．２より上の２人の対照を除くと、“ネガティブ”な対照の平均は０．１０７となり、標準偏差は、０．０３である。陽性の理論的な限界値は式に従って算出される。
限界値（ネガティブな対照の正味のＯＤの平均）＋（２または３ｘネガティブな対照の正味のＯＤ値の標準偏差）。
【０２７３】
第一のケースでは、症状のないセロポジティブであると考えられる場合があり、限界値は、０．１１＋（３ｘ０．０３）＝０．２０に等しい。ネガティブな結果は、ペプチドのエピトープに対して特異的に向けられた抗体の存在の非特異的“バックグラウンド”を示す。
【０２７４】
第二のケースでは、一見してセロポジティブである血清を除外せずに、明らかに健康である血液提供者からなる対照群を対照の基礎としてとれば、“非ＭＳ対照”の標準偏差は０．１１６である。限界値は、０．１３＋（３ｘ０．０６）＝０．３１となる。
【０２７５】
この分析に基づけば、この試験はＭＳに特異的である。これについては、表１に示されているように、対照がこの限界値を超える正味のＯＤを持たないことから、この試験はＭＳに特異的であることがわかる。実際に、この結果は、ＭＳ患者の抗体価が、たいていの場合は、ＭＳＲＶ−１と接触したことのある健康な対照より高いという事実を反映している。
【０２７６】
計算の第一の方法に基づいて、図４１および表３に示したように、１５人のＭＳ血清の６が、Ｓ２４Ｑペプチドに対して、しかしてｐｏｌ遺伝子にコードされたＭＳＲＶ−１レトロウイルスの逆転写酵素の一部に対して、そして、結果的にはＭＳＲＶ−１レトロウイルスに対して特異的に向けられたＩｇＧの存在を示す陽性結果を与える（０．２以上のＯＤ）。
【０２７７】
しかして、試験されたＭＳ患者の約４０％が、Ｓ２４Ｑペプチドに保有されたエピトープに対して反応し、これに対して向けられた循環ＩｇＧを備えている。
明らかに健康である１５人の血液提供者のうちの２人は、陽性結果を示す。しかして、症状を示さない集団の約１３％が、特異的な血清ＩｇＧの持続性においてそれ自身を発現する能動免疫へと導く条件下でＳ２４Ｑペプチドに保有されるエピトープと接触していたかもしれないことは明らかである。このような状態は、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスに感染（および／または再活性化）した際のＭＳＲＶ−１レトロウイルス逆転写酵素に対する免疫化と一致する。これらのセロポジティブな対照におけるＭＳを想起するはっきりした神経病理学がないことは、彼らが健康なキャリアーであって、感染ウイルスを免疫化した後にそれらを除去してしまったか、慢性キャリアーの危険性のある集団を構成することを示唆しているのかもしれない。実際に、ＭＳの普及率の高い領域の環境に存在する病原性の成分がこの疾患の原因であるかもしれないことを示す疫学的データは、ＭＳではない集団のフラクションが病原性の成分等と必須に接触したことを意味する。
【０２７８】
ＭＳＲＶ−１レトロウイルスが、ＭＳの源において、この“病原性の成分”の全部または一部を構成することが示されたので、ＭＳＲＶ−１レトロウイルスの構成要素に対するＩｇＧ型抗体を有することは、健康な集団の対照にとって普通のことである。
【０２７９】
最後に、ここで試験した二つのＭＳケースのうちの一方のみに抗Ｓ２４Ｑ抗体が検出されたことは、このペプチドが免疫優勢ＭＳＲＶ−１エピトープを示さないこと、内在性個別株変異(inter-individual strain variations)が、同じ領域における分かれたペプチドモチーフに対する免疫化を誘導するかもしれないこと、あるいは、疾患のコースおよび処置がＳ２４Ｑペプチドに対して反応する抗体を経時的に調節できるかもしれないことを反映するかもしれない。
【０２８０】
【表３】
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【０２８１】
ｄ）ＥＬＩＳＡによる抗ＭＳＲＶ−１ＩｇＭ抗体の検出： 上述したものと同じ血清中の抗ＭＳＲＶ−１特異的ＩｇＭ抗体の存在を試験するために、Ｓ２４Ｑペプチドを用いて、ＥＬＩＳＡ技術を使用した。
【０２８２】
図４２は、抗ＩｇＭ抗体を用いて試験された各血清に対する結果を示す。各縦棒は、試験した血清の正味の光学密度（４９２ｎｍにおけるＯＤ）を示す。縦軸は、縦棒の頂点において正味のＯＤを与える。横座標を分ける垂直な線の左側の最初の１５本の縦棒は、１５人の健康な対照（血液のドナー）の血清を示し、垂直な点線の右側の縦棒は試験されたＭＳの１５のケースの血清を示す。
【０２８３】
試験されたＭＳの場合のＯＤ値の平均は、１．６である。
対照の正味のＯＤ値の平均は、０．７である。
ネガティブな対照の標準偏差は０．６である。
理論的陽性の限界値は、以下の式に従って計算することができる。
限界値＝（ネガティブな対照の正味のＯＤの平均）＋（３ｘネガティブな対照の正味のＯＤ値の標準偏差）。
【０２８４】
従って、限界値は、０．７＋（３ｘ０．６）＝２．５に等しい。
ネガティブな結果は、ペプチドのエピトープに特異的な抗体の存在の非特異的な“バックグラウンド”を示す。
【０２８５】
この分析法によれば、そして、図４２および対応する表４に示されているように、どの対照も限界値を超えた正味のＯＤを持たないことから、ＩｇＭ試験はＭＳに特異的である。１５のＭＳ血清のうちの６つが、陽性ＩｇＭの結果を示した。
ＭＳと対照の集団との間のセロプレバレンスの差異は極めて重要であって、“カイ自乗”テストでｐ＜０．００２である。
【０２８６】
これらの結果は、ＭＳにおけるＭＳＲＶ−１の病因的役割を指し示す。
Ｓ２４Ｑペプチドに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の検出は、単独であるいは他のＭＳＲＶ−１ペプチドと組み合わせて、ＭＳＲＶ−１感染および／またはＭＳＲＶ−１のウイルスの再活性化のコースを評価可能にする。
【０２８７】
【表４】
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【０２８８】
本願発明者らによってなされた新しい発見および開発された新規の方法の結果として、ＭＳＲＶ−１感染および／または再活性化を調べる診断テストを実施することができ、患者の生物学的流体中の成分の検出を“陰性化する(negativing)”ことにおける効能に基づいてＭＳおよび／またはＲＡの治療を評価することができる。さらに、ＭＳの神経学的な症状もしくはＲＡのリウマチ学的症状を未だ示していない患者における早期発見は、臨床的な疾患の開始に対応する病変期の前の事実に対する次の臨床的コースに関してより効果的な治療を始めることを可能にすることができた。現在のところ、ＭＳまたはＲＡの診断は、病変の症状が始まる前には確立されて折らず、既に深刻化した病変を示唆する臨床的写真が得られる前には何の治療も行われない。ヒトにおけるＭＳＲＶ−１および／またはＭＳＲＶ−２感染および／または再活性化の診断は、明らかに重要であり、本発明は、これを行う手段を提供する。
【０２８９】
しかして、ＭＳＲＶ−１感染および／または再活性化の診断を行うこととは別に、患者の生物学的流体中の上記成分の検出を“陰性化”する効能に基づいて、ＭＳの治療を評価することができる。
［配列表］
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８ａ】
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【図３８ｂ】
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【図３８ｃ】
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【図３９ａ】
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【図３９ｂ】
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【図３９ｃ】
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【図３９ｄ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【図２７ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図４２】
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