(57)【要約】      （修正有）【課題】軟体動物の植食海洋種、Elysia rufescensから単離されたペプチドであるカハラリドＦに関する、新規な製剤及び新規な使用を提供。【解決手段】再構成に適したカハラリドＦの凍結乾燥形態を与えるため、スクロース及びマンニトールを含む膨張剤に、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートなどの非イオン性界面活性剤、ヒドロキシカルボン酸などの有機酸を含む、前立腺ガンなどのためのカハラリドＦ製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カハラリドＦ、非イオン性界面活性剤、有機酸、及び膨張剤の凍結乾燥混合物を含む、カハラリドＦの製剤。
【請求項２】
乳化溶解剤、アルカノール、及び水の混合物の再構成溶液での希釈のための説明書を伴う、請求項１記載の製剤を含むキット。
【請求項３】
再構成溶液の提供を伴う、請求項２のキット。
【請求項４】
請求項１記載の製剤または請求項２または３記載のキットから調製される再構成溶液。
【請求項５】
乳化溶解剤、アルカノール、及び水の混合物を再構成溶液を使用して再構成された場合の、請求項４記載の再構成溶液。
【請求項６】
０．９％塩水で、カハラリドＦの点滴に適した濃度に希釈された場合の、請求項４または５記載の再構成溶液を含む希釈再構成溶液。
【請求項７】
ガンの治療における、請求項６記載の希釈再構成溶液の使用。
【請求項８】
前立腺ガン、乳ガン、大腸ガン、非小細胞肺ガン、卵巣ガンに対する、神経芽腫の治療のための、または脱分化した間充織の軟骨肉腫または骨肉腫に対する、カハラリドＦの使用。
【請求項９】
カハラリドＦが、３週間ごとに５日連続で約１時間点滴によって投与される、請求項７または８記載の使用。
【請求項１０】
カハラリドＦが、別の薬剤と組み合わされて投与される、請求項７，８，または９記載の使用。
【請求項１１】
カハラリドＦが、難治性患者に投与される、請求項７から１０のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟体動物の植食海洋種、Elysia rufescensから単離されたペプチドであるカハラリドＦに関する
【背景技術】
【０００２】
カハラリドＦは、欧州特許出願第６１０，０７８号の主題である。この特許出願は、ヒト肺癌腫Ａ−５４９及びヒト大腸癌腫ＨＴ−２９のin vitro細胞培養物に対する活性を報告する。
【０００３】
カハラリドＦに関するさらなる情報は、例えば以下の文献に見出される：
［参考文献］
2010047601.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許出願第６１０，０７８号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
我々は、カハラリドＦの新規な製剤及び新規な使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
非イオン性界面活性剤及び有機酸の組み合わせは、再構成に適したカハラリドＦの凍結乾燥形態を与えるための膨張剤での使用に適している。再構成は好ましくは、乳化溶解剤、アルカノール、及び水の混合で達成される。
【０００７】
凍結乾燥組成物は好ましくは、少なくとも９０％または少なくとも９５％の膨張剤のような膨張剤を特に含む。膨張剤の例は周知であり、スクロース及びマンニトールを含む。他の膨張剤も使用できる。
【０００８】
凍結乾燥組成物中の非イオン性界面活性剤は、好ましくはソルビタンエステル、より好ましくはポリエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンアルカノアート、特にポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、例えばポリソルバート８０である。非イオン性界面活性剤は典型的には、組成物の数％、例えば組成物の０から５％、例えば組成物の２から３％を占める。
【０００９】
凍結乾燥組成物中の有機酸は典型的に、脂肪酸、好ましくはヒドロキシカルボン酸、より好ましくはヒドロキシポリカルボン酸、特にクエン酸である。有機酸は典型的に、組成物の数％、例えば組成物の０から５％、例えば組成物の２から３％を占める。
【００１０】
凍結乾燥組成物中のカハラリドＦの量は典型的に、混合物の１％未満、またはしばしば混合物の０．１％未満である。適切な量は、組成物の１００ｍｇ当たり５０から２００μｇ、つまり約１００μｇの範囲である。
【００１１】
再構成剤のために乳化溶解剤は適切には、ポリエチレングリコールエステル、特に脂肪酸のエステル、より好ましくはＰＥＧオレアート、例えばＰＥＧ−３５オレアートを含む。乳化溶解剤は適切には、再構成剤の０から１０％、典型的には約３から７％、つまり約５％である。アルカノールは通常エタノールであり、適切には再構成剤の０から１０％、典型的には約３から７％、つまり約５％である。再構成剤の残りの部分は水であり、静脈注射に適切な再構成溶液を与える。
【００１２】
０．９％塩水での再構成溶液のさらなる希釈は、カハラリドＦの点滴に適しているであろう。
【００１３】
特に好ましい実施態様では、再構成組成物は、１００μｇのカハラリドＦ；７５から１２５ｍｇ、特に１００ｍｇの膨張剤；１から３ｍｇ、特に約２ｍｇの酸；及び１から３ｍｇ、特に約２ｍｇの非イオン性界面活性剤を含む。
【００１４】
次いで好ましい再構成剤は、２から７％、つまり約５％の乳化溶解剤；２から７％、つまり約５％のアルコール；及び残部の水を含む。
【００１５】
本発明はさらに、凍結乾燥組成物及び再構成剤を含む別個の容器を含むキットを提供する。再構成の方法もまた提供される。
【００１６】
本発明はさらに、ガンに罹患したいずれかの動物、特にヒトの治療方法を提供し、その方法は、本発明の凍結乾燥組成物の再構成によって調製された製薬組成物の治療上の有効量を、罹患患者に投与することを含む。本発明は特に、他の治療に好ましい反応を示さない難治性のガンを有する患者の治療のために使用できる。特に本発明の組成物は、他の化学療法を試して効かなかった後に使用できる。
【００１７】
一つの実施態様では、再構成溶液は点滴用に調製され、約２０または２５μｇ／ｍｌまで、典型的に１５μｇ／ｍｌまでの濃度での３時間の点滴で投与される。適切な点滴装置は好ましくは、ポリエチレン製のものよりもガラス容器を含む。チュービングは好ましくはシリコーン製である。
【００１８】
本発明のさらなる特徴点は、カハラリドＦの新規な使用に関する。特に我々は、前立腺ガン、特にアンドロゲン非依存性前立腺ガン、乳ガン、大腸ガン、非小細胞肺ガン、卵巣ガンに対する使用、及び神経芽腫の治療のための使用を考慮する。カハラリドＦはまた、脱分化した間充織の軟骨肉腫及び骨肉腫に対しても活性である。本発明によって提供される新規な再構成製剤は新規な使用のために使用されて良いが、他の組成物も可能である。
【００１９】
製薬組成物の例は、適切な組成物を含む、または経口、局所用、または全身性投与のための、いずれかの固体（錠剤、丸薬、カプセル、顆粒等）、または液体（溶液、懸濁液、またはエマルション）を含み、それらは純粋な化合物を含んでも良く、またはいずれかのキャリアー若しくは他の薬理学的に活性な化合物と組み合わされても良い。これらの組成物は、全身性で投与される場合滅菌される必要があって良い。
【００２０】
本発明の化合物または組成物の投与は、いずれかの適切な方法によって良く、例えば静脈点滴、経口調製物、腹膜内及び静脈投与であって良い。我々は、２４時間まで、より好ましくは２から１２時間の点滴を使用することを好むが、２−６時間の点滴が最も好ましい。治療が一晩の滞在の必要なく実施できる短い点滴時間が特に所望される。しかしながら１２から２４時間、または必要であればより長い点滴であっても良い。点滴は、およそ２から４週間の適切な間隔で実施されて良い。代替的な投与プロトコールでは、カハラリドＦは３週間ごとの連続した５日で約１時間投与される。他のプロトコールも変形例として使用できる。
【００２１】
本発明の化合物を含む製薬組成物は、リポソームまたはナノスフェアカプセル化によって、持続放出製剤において、または他の標準的な輸送手段によって輸送されて良い。
【００２２】
前記化合物の正確な投与量は、特定の製剤、適用の態様、及び特定の部位、宿主、及び処理される腫瘍に従って変化するであろう。年齢、体重、性別、食事、投与の時間、排出速度、宿主の状態、薬剤の組み合わせ、反応感度、及び疾患のひどさのような他の因子も考慮されるであろう。投与は、最大の寛容投与量の範囲内で連続的にまたは周期的に実施できる。
【００２３】
本発明の化合物及び組成物は、組み合わせ治療を提供する他の薬剤と共に使用されても良い。他の薬剤は、同じ組成物の一部を形成しても良く、または同時または異時での投与のための別個の組成物として提供されても良い。他の薬剤の同定は特に制限されず、適切な候補は以下のものを含む：
ａ）抗細胞分裂効果を有する薬剤、特に細胞骨格エレメントを標的とするもの、タキサン薬剤（タクソール、パンクリタクセル、タクソテレ、ドセタクセルのような）、ポドフィロトキシン、またはビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン）のような微小管調節剤を含む；
ｂ）代謝拮抗剤（5-フルオロウラシル、シタラビン、ゲンシタラビン、ペントスタチンのようなプリン類似体、メトトレキセートのような）；
ｃ）アルキル化剤、例えば窒素マスタード（シクロホスファミド、またはイフォスファミドのような）：
ｄ）ＤＮＡを標的とする薬剤、例えばアントラサイクリン薬剤、アドリアマイシン、ドクソルビシン、ファルモルビシン、またはエピルビシン；
ｅ）トポイソメラーゼを標的とする薬剤、例えばエトポシド；
ｆ）ホルモン及びホルモンアゴニストまたはアンタゴニスト、例えばエストロゲン、アンチエストロゲン（タモキシフェン及び関連化合物）及びアンドロゲン、フルタミド、ロイプロレリン、ゴセレリン、シプロトロン、またはオクトレオチド；
ｇ）ヘルセプチンのような抗体類似体を含む、腫瘍細胞においてシグナル伝達を標的とする薬剤；
ｈ）アルキル化薬剤、例えば白金薬剤（シスプラチン、カルボンプラチン、オキサリプラチン、パラプリジンアチン）、またはニトロソウレア；
ｉ）腫瘍の転移に強力に影響する薬剤、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター；
ｊ）遺伝子治療及びアンチセンス薬剤；
ｋ）抗体治療薬；
ｌ）海洋起源の他の生体活性化合物、特にアプリジンのようなジデミンまたはｅｔ−７４３のようなエクチナサイジン。
【実施例】
【００２４】
本発明の基礎となる実験作業が、以下の実施例に記載される。
【００２５】
実施例１：カハラリドＦ、ＫＦの凍結乾燥全身性製薬製剤の開発
この実験の目的は、早期の臨床試験で使用されるＫＦの安定な全身性製剤を開発することであった。
方法：ＫＦの溶解製及び安定性を、実験的デザインアプローチを使用したポリソルバート８０（Ｐ８０；０．１−０．５％ｗ／ｖ）及びクエン酸一水和物（ＣＡ；５−１５ｍＭ）の濃度の関数として研究した。結晶（マンニトール）及び非晶質（スクロース）膨張剤を含むＫＦ凍結乾燥製品の安定性を、暗所で＋５℃及び＋３０℃で試験した。凍結乾燥製品を、赤外線（ＩＲ）分光測定及び示差走査熱量測定によって特徴付けした。ＫＰ凍結乾燥製品の再構成と点滴液でのさらなる希釈の後の回復の研究を、最適な再構成ビヒクルを選択するために実施した。
結果：Ｐ８０及びＣＡの組み合わせは、ＫＦを溶解するのに必要であることが見出された。凍結乾燥製品は、増大するＰ８０及びＣＡ濃度と共にかなり不安定となり、Ｐ８０濃度が主要なエフェクターであった。０．１％ｗ／ｖＰ８０及び５ｍＭ ＣＡの組み合わせが、さらなる調査のために選択された。膨張剤としてスクロースを含む凍結乾燥製品は、マンニトールを含む製品と比較してより安定であった。スクロースベースの製品のガラス転移温度は、＋４６℃であると測定された。製品の非晶質状態を、ＩＲ分析によって確認した。Cremophor ELエタノール及び注射水（５／５／９０％ ｖ／ｖ／ｖＣＥＷ）からなる溶液は、再構成と０．９％ＮａＣｌ（通常塩水）でのさらなる０．５μｇ／ｍＬへの希釈の後に、溶液中にＫＦを維持した。
結論：１００μｇのカハラリドＦ、１００ｍｇのスクロース、２．１ｍｇのＣＡ、及び２ｍｇのＰ８０を含み、５／５／９０％ ｖ／ｖ／ｖＣＥＷからなるビヒクルで再構成され、通常塩水でさらに希釈される、安定な凍結乾燥製剤が提供された。
【００２６】
実施例２：点滴装置中のカハラリドＦの適合性と安定性
カハラリドＦを、投与量単位当たり５０−１５０μｇの活性物質を含む凍結乾燥製品として製薬学的に製剤化する。静脈内投与の前に、Cremophor EL、無水エタノール、及び注射水（ＣＥＷ、５／５／９０％ ｖ／ｖ／ｖ）からなる溶液で再構成し、点滴のために０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウムでさらに希釈する。この研究の目的は、臨床試験を開始する前に、各種の点滴システムでのカハラリドＦの適合性と安定性を調査することであった。点滴溶液中のCremophor ELの存在のため、ポリビニルクロリド点滴容器（ＰＶＣ、Add-a-Flex(登録商標)）からのジエチルへクスフタラートの浸出が見出された。表面と接触する収着の結果としてのカハラリドＦの損失は、低密度ポリエチレン（ＬＤ−ＰＥ、Miniflac(登録商標)）からなる点滴容器で示された。カハラリドＦは、ガラス容器とシリコーンチュービングからなる投与セットを使用して、０．５μｇ／ｍＬから１４．７μｇ／ｍＬの濃度で３時間の点滴で投与されなければならないと、我々は結論付ける。５／５／９０％ ｖ／ｖ／ｖＣＥＷで再構成された点滴のためのカハラリドＦの１５０μｇバイアルパウダーは、室温（＋２０−２５℃）及び周囲の明環境で少なくとも２４時間元の容器中で安定である。室温（＋２０−２５℃、暗所）または冷蔵条件（＋２−８℃、暗所）のいずれかでのガラス点滴容器中に貯蔵された点滴溶液は、調製後少なくとも５日間安定である。
【００２７】
実施例３：カハラリドＦのin vitro安全性毒性
我々は、前立腺及びｎｅｕ〜１（Ｈｃｒ２過剰発現）乳ガン細胞に対する強力な化学毒性効果を有することが示される、ハワイの軟体動物、Ellysia rubefescensから由来する化合物であるカハラリドＦの毒性に対する強さを評価した。
CellTiter96(MTS, Promega)in vitro毒性アッセイを使用して、カハラリドは、心筋細胞（Ｈｐ ｃ２（２−１））及び骨格筋細胞（Ｌ８）に対してほとんど毒性を示さない（それぞれＬＤ５０＝５ｍＭ、０．６ｍＭ）。これに対してカハラリドは、肝細胞（ＡＭＬ−１２）及び腎細胞（ＮＲＸ−５２Ｅ）に対して毒性であり（それぞれＬＤ５０＝０．１７μＭ、１．６μＭ）、骨髄性幹細胞に対して中間的な毒性を示す（ＦＤＣ−Ｐｌ、ＬＤ５０＝１４μＭ）。これらのデータは、in vivo毒性データと緊密に一致する。
我々はまた、この薬剤が、我々のアッセイシステムにおいて高濃度で神経毒性を有することを見出し、これは最大寛容投与量（ＭＴＤ）を超えると神経毒性を示す動物データと一致する。免疫細胞化学と結びついた蛍光生存能力染色（エチジウムホモダイマー及びカルシンＡＭ, Molecular Probes）を使用して、我々は〜１０μＭのカハラリドが、中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンに毒性である（神経線維ポジティブ）が、星状細胞（グリア線維酸性タンパク質ポジティブ）、並びに脊髄における感覚ニューロン（サブスタンスＰ発現）及び運動ニューロン（コリンアセチルトランスフェラーゼポジティブ）には寛容であることを測定した。
カハラリドＦは、その神経毒性がＭＴＤ濃度以下で比較的穏やかであるため、前立腺ガンの治療のための有望な薬剤であると結論付ける。さらに予備的データは、カハラリドＦが、もし輸送可能であれば、ＣＮＳニューロン選択性のため、神経芽腫の治療のための理想的な薬剤であること示す。
【００２８】
実施例４：カハラリドＦの選択的抗腫瘍活性
カハラリドＦは、ホルモン非依存性前立腺ガン、ｎｅｕ＋（Ｈｅｒ２過剰発現）乳ガン細胞、及び神経芽腫に対するin vitro選択性を有するリソゾーム毒である。拡張したＭｏＡは、ｅｒｂＢ２の阻害及びＥＧＦレセプターのブロッキング、並びにＴＧＦ遺伝子発現の阻害を含む。臨床前のin vivoモデルは、３００μｇ／ｋｇＢＷの齧歯類ＭＴＤを有するホルモン非依存性前立腺ガン（ＰＣ−３及びＤＵ−１４５）の選択性及び感受性を確認した。in vitro抗増殖実験は、特定の前立腺腫瘍の間で等しいＩＣ５０活性を示す（０．２７μＭ ＰＣ−３；０．２５μＭ ＤＵ−１４５；０．７３μＭ Ｔ−１０；０．２４μＭ ＤＨＭ；及び０．１９μＭ ＲＢ）が、ホルモン感受性ＬｎＣＡＰに対しては活性を有さない。他の研究は、ｎｅｕ＋乳ガン細胞（２．５μＭ ＳＫ−ＢＲ−３；２μＭ ＢＴ−４７４）及び神経芽腫細胞系（１μＭ ＢＥ（２）Ｃ）に対して選択的ではあるがわずかに強力でないＩＣ５０活性を示す。in vitro曝露実験は、ＫＦがスケジュール依存的ではないことを示す。１時間の最小の曝露は、ほとんどの場合で４８時間と同様に強力である。さらに、毒性の迅速な効果及び遅延した効果は同じ薬物動態学を有し、治療の継続時間と共に増大しない。毎日５回毎週のスケジュールを取り込んだフェーズ１試験は、固形腫瘍に対する強力な化学療法試薬としてのＫＦの評価においてまもなく開始するであろう。
【００２９】
実施例５：患者から直接採取されたヒト腫瘍標本に対するカハラリドＦ（ＰＭ９２１０２）の効果の調査
in vitro試験は、細胞の膨張と究極的な死を引き起こすＫＦの活性を示した(Garcia-Rocha等, Can Letters 99: 43-50)。この研究では、新鮮なヒト腫瘍標本がＫＦで処理され、ヒト腫瘍クローニングアッセイを使用して活性を測定した。１０４の患者の腫瘍の標本を、０．０１、０．１、及び１．０μＭで１４日間連続的にＫＦで曝露して処理した。標本は、３７℃で２層ソフトアガークローニングシステムでインキュベートし、コロニーカウントのため１４日目で取り出した。処理されたプレートにおいて形成されたコロニーを、非処理コントロールプレートで形成されたコロニー数と比較し、各濃度で生存しているコロニーのパーセントを計算した。ポジティブコントロールプレートは、細胞毒オルトナトリウムバナダート（２００μｇ／ｍｌ）を含んだ。これらの標本の中では、約３０％が適切なネガティブ及びポジティブコントロールで評価可能であった。in vitro応答（５０％生存によって示される阻害応答）は、０．０１、０．１及び１．０μｇ／Ｍのそれぞれで、標本の１６％（５／３１）、１９％（６／３１）、及び８１％（２５／３１）で観察された。より高い濃度で処理されると（１．０＞０．１＞０．０１）有意な応答（８１％）で、濃度及びＫＦに対する応答の間でポジティブな関係が存在した。顕著な応答は、乳（１００％）、大腸（７５％）、非小細胞肺（１００％）、及び卵巣ガン標本（９１％）で観察された。ＫＦは有望な抗ガン剤であり、それに対して広範囲のガンの標本が応答した。
【００３０】
実施例６：進行性アンドロゲン難治性前立腺ガンを有する患者におけるカハラリドＦのフェーズＩ及び薬物動態学研究
ＫＦは、乳、大腸、非小細胞肺、及び特に前立腺ガンを含む各種の固形腫瘍モデルにおいてin vitro及びin vivoの両者の抗腫瘍活性を示す。その選択性に基づいて、ＫＦは現在、アンドロゲン非依存性前立腺腫瘍に対する効力な抗ガン剤としてさらに開発されている。
目的：このフェーズＩ臨床試験及び薬物動態学（ＰＫ）試験では、ＫＦの毒性プロフィールＰＫ及び抗腫瘍活性が調査される。
方法：進行性または転移性のアンドロゲン難治性前立腺ガンを有する患者に、三週間後と５日の連続した間で１時間かけて静脈点滴としてＫＦを投与した。マウスで定義されたＭＴＤ値に基づいて、２０μｇ／ｍ２／日の開始投与量を選択し、それは１００μｇ／ｍ２の全投与量に等しい。ＫＦのＰＫを、第一の過程の間で血漿で測定した。ＫＦの生体分析を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって実施した。各患者のＬＤＨ、ＡＦ、及び特にＰＳＡレベルもまた、ＫＦの活性を測定する研究の間で評価した。
結果及び議論：現在７の患者を記録している。患者は６６歳の平均年齢を有した（５４−７５歳の範囲）。濃度当たり一人の患者が、２０、４０、８０、及び１６０μｇ／ｍ２／日でエントリーされた。トランスアミナーゼ上昇のため、４の患者が現在の投与レベル、３２０μｇ／ｍ２／日でエントリーされた。この実験の第一の患者は、この投与レベルで再エントリーされた。観察された副作用は迅速に可逆的な穏やかな頭痛、疲労、痛み、及び局所的浮腫であった。今日まで薬剤のみと関連する毒性は、３２０μｇ／ｍ２／日で生じる迅速に可逆的なＣＴＣグレード３ＡＳＡＴであった。ＰＫは、全投与量範囲に亘って、投与量及びＡＵＣの間で直線関係を表した。全血漿クリアランスは２６７ｍＬ／分（±１１５）であり、これらの患者における静脈内ＫＦの最終半減期は０．４６ｈ（±０．１３）であった。現在の投与量レベル（３５−５０ｍｇ／ｍＬ）で到達する最大血漿濃度は、試験管内腫瘍細胞感受性試験において前立腺ガンに強力に活性である（１５ｎｇ／ｍＬから活性）。かくしてこのスケジュールは十分に寛容である。一人の患者は、臨床上の改良（痛みの緩和）と関連するＰＳＡレベル（＞５０％）の有意な減少を示した。二人のさらなる患者は、マイナーなＰＳＡ減少を経験し、一人はまだ２のサイクルの後継続している。最大寛容投与量は、まだ到達しておらず、研究は継続中である。
【００３１】
実施例７
カハラリドＦは、脱分化した間充織の軟骨肉腫、ＣＨＳＡ、及び骨肉腫、ＯＳＡに対して毒性であり、並びに肝細胞及び前立腺癌腫細胞に対しても毒性である。それはＣＨＳＡ及びＯＳＡの増殖を有意に阻害せず、細胞に１０分のような短時間曝された場合でさえ、毒性効果を引き出すことができた。