(57)【要約】【課題】表面プラズモン共鳴励起蛍光を利用した、高感度かつ定量精度の高い生体分子の検出方法を提供する。【解決手段】表面プラズモン共鳴励起蛍光を用いた生体分子の検出方法であって、色素分子含有シリカ粒子の表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することを特徴とする生体分子の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴励起蛍光を用いた生体分子の検出方法であって、色素分子含有シリカ粒子の表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することを特徴とする生体分子の検出方法。
【請求項２】
前記色素分子含有シリカ粒子の表面に、生体分子捕捉物質が結合していることを特徴とする請求項１に記載の生体分子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴励起蛍光を用いた、高感度かつ定量精度の高い生体分子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の相互作用を調べる方法、またそれによって特定の生体分子を検出する方法として、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、以下「ＳＰＲ」とも記す。）を使用した分光分析法が知られている。例えば、特許文献１には、表面プラズモン共鳴測定及び蛍光測定によって得られた信号を個別に分析することによって、被検体の固相への結合を判定する装置及びその方法が開示されている。
【０００３】
また、下記特許文献２、３、及び５には、表面プラズモン共鳴を用いた２次元イメージング装置が開示され、特許文献４には、表面プラズモン共鳴測定、及び発生した蛍光が生じる第２のプラズモン共鳴を用いた表面プラズモン蛍光顕微鏡が開示され、特許文献６にはプラズモン共鳴蛍光を用いた生体分子相互作用検出装置及び検出方法が開示されている。
【０００４】
これら表面プラズモン共鳴励起蛍光法では、金属基板上に担体や生体分子捕捉物質等を介して固定された蛍光物質に対し、表面プラズモン共鳴によって生じた増強励起光が照射され、発する蛍光を検出する。この方法は伝播励起光を用いた一般的な蛍光分析法に比べ、局所的に強い励起エネルギーを与えることができる優れた方法であるが、それがゆえに得られる蛍光量のばらつきが大きくなり、定量精度が低下するという問題を孕んでいた。
【０００５】
また強いエネルギーを与えることによる色素の褪色が、感度および定量精度の低下を引き起こすという問題があり、これについても改善が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】特開２００１−２５５２６７号公報
【特許文献３】特開２００２−１１６１４９号公報
【特許文献４】特開２００４−１５６９１１号公報
【特許文献５】特開２００４−２７１３３７号公報
【特許文献６】特開２００６−２０８０６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、表面プラズモン共鳴励起蛍光を利用した、高感度かつ定量精度の高い生体分子の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る上記課題は、以下の手段によって解決される。
【０００９】
１．表面プラズモン共鳴励起蛍光を用いた生体分子の検出方法であって、色素分子含有シリカ粒子の表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することを特徴とする生体分子の検出方法。
【００１０】
２．前記色素分子含有シリカ粒子の表面に、生体分子捕捉物質が結合していることを特徴とする前記１に記載の生体分子の検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の上記手段により、表面プラズモン共鳴励起蛍光を利用した、高感度かつ定量精度の高い生体分子の検出方法生体分子の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の生体分子検出方法に用いる装置の概略構成を示すブロック図
【図２】本実施の生体分子検出方法に用いる装置で使用される検出部の構成の一例を示す断面図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の生体分子の検出方法は、表面プラズモン共鳴励起蛍光を用いた生体分子の検出方法であって、色素分子含有シリカ粒子の表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することを特徴とする。この特徴は、請求項１及び２に共通する技術的特徴である。
【００１４】
本発明の実施態様としては、前記色素分子含有シリカ粒子の表面に、生体分子捕捉物質が結合している態様であることが好ましい。
【００１５】
以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための最良の形態・態様について詳細な説明をする。
【００１６】
〔生体分子の検出方法〕
本発明の生体分子の検出方法を詳細に説明する。
【００１７】
本発明では、表面プラズモン共鳴励起蛍光法（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下「ＳＰＦＳ」とも記す。）を利用して生体分子（以下「被検体」とも記す。）の検出を行うことを特徴とする。
【００１８】
表面プラズモン共鳴励起蛍光法の一般的なプロトコルを以下に示す。この方法は、プリズム（Ａ）と、プリズム表面の金属薄膜及び被検体検出層を有する被検体検出手段（Ｂ）と、レーザー発生手段（Ｃ）と、第１及び第２光検出手段（Ｄ、Ｅ）とを備えた装置を用い、レーザー発生手段（Ｃ）から薄膜に入射されたレーザー光の反射強度を第１光検出手段（Ｄ）で検出し、レーザー発生手段（Ｃ）から薄膜に入射されたレーザー光によって薄膜裏面に生じるプラズモン光によって励起された蛍光分子が出力する蛍光を、第２光検出手段（Ｅ）で検出する、という手順で行われる。
【００１９】
次にプラズモン光の特性について以下に説明する。
【００２０】
プラズモン光は、レーザー光が金属薄膜に対し全反射条件で照射されたときに、第１光検出手段（Ｄ）によって検出される反射光の強度が減衰する入射角領域で薄膜裏面に発生し、その強度はレーザー光の入射角度に依存して変動する。反射光強度の減衰が最大となるときのレーザー光入射角度を第１の入射角度とすると、その近傍でプラズモン光の強度が最大となるが、厳密にはプラズモン光の強度が最大となるときのレーザー光の入射角度（第２の入射角度）は、第１の入射角度よりわずかに低角度となる。この理論値の算出にあたっては、文献：Ｔ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ，Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，Ｓｕｒｆａｃｅ−ｐｌａｓｍｏｎ  ｆｉｅｌｄ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ  １７１（２０００）１１５−１３０やその引用文献等を参考にして算出することができる。
【００２１】
また、プラズモン光は近接場光であり、その電場強度は金属薄膜からの距離が離れるほど減衰するという特性を有している。プラズモン光によって蛍光分子を励起するときは、この近接場光が届く範囲に蛍光分子が存在する必要がある。それに加え、蛍光分子が金属薄膜のごく近傍に位置する場合、金属薄膜へと励起エネルギーの遷移が起きてしまう。
【００２２】
従って、プラズモン光によって蛍光分子を効率的に励起するためには、蛍光分子の金属基板からの距離を制御する必要があることが分かる。
【００２３】
〔色素分子含有シリカ粒子を結合した生体分子捕捉物質〕
表面プラズモン共鳴励起蛍光法によって生体分子（被検体とも表現する）を検出するためには、一般に生体分子を特異的に認識して吸着する物質（Ｆ）（「生体分子捕捉物質」あるいは「被検体捕捉物質」ともいう。例えば抗原に対する抗体等が挙げられる。）を利用する。生体分子捕捉物質（Ｆ）に蛍光色素分子を結合することで、蛍光を測定することによって被検体の検出が可能となる。本発明では、蛍光色素分子がシリカ粒子中に含有されてなる色素分子含有シリカ粒子（Ｇ）を生体分子捕捉物質（Ｆ）に結合して用いることが好ましい。
【００２４】
生体分子としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖鎖あるいはこれらの分解物等が挙げられる。「生体分子捕捉物質」とは、これらを特異的に認識し捕捉することのできる相補的なＤＮＡやＲＮＡ、抗体、レクチン、あるいはインプリントポリマー等が挙げられる。
【００２５】
生体分子を捕捉する方法としては、従来公知のアッセイに従えばよく、文献：バイオ検査薬の開発（株式会社シーエムシー出版）、バイオ診断薬の開発・評価と企業（株式会社シーエムシー出版）やその引用文献、イムノアッセイ講義（ＷＥＢ情報、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｉｂａｙａｇｉ．ｃｏ．ｊｐ／ＩＡ−ＬＥＣＴＵＲＥ／Ｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｈｔｍ）等が参考になる。本発明においては、イムノアッセイが好ましい。
【００２６】
例えば、検出層に用いるセンサー基板として金基板を選び、サンドイッチイムノアッセイを行う場合には、金基板にカルボキシル基やアミノ基等の反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有するアルカンチオールを作用させてＳＡＭ膜（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：「自己組織化単分子膜」ともいう。）を形成し、これに適宜ポリマー等を介し、一次抗体を作用させ固定化する。また、一次抗体に対する反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を備えたポリマーを直接金基板上に固定化し、その上に一次抗体を固定化してもよい。各種反応性基を利用して抗体やポリマーを結合させる際には、スクシンイミジル化を経たアミド化縮合反応や、マレイミド化を経た付加反応等が一般的である。このようにして構成した検出層に抗原を含む溶液を流すことで、固定化した一次抗体によって抗原を捕捉することが可能である。これに対し、さらに標識した二次抗体を含む溶液を作用させることで捕捉された抗原を標識することができる。なお予め抗原と二次抗体とを反応させておいてから一次抗体を作用させてもよい。
【００２７】
［色素分子含有シリカ粒子］
色素分子含有シリカ粒子としては、従来公知の方法で作られる色素分子含有シリカ粒子でよい。公知の該粒子の製法としては、例えばＡ．Ｉｍｈｏｆ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）  Ｄｙｅｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｓｐｈｅｒｅｓ”，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９９，１０３，１４０８−１４１５にあるように、予め３−（アミノプロピル）トリエトキシシラン〔ＡＰＳ：３−（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ〕に直接Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７イソチオシアネート〔ＦＩＴＣ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ〕を結合させたＡＰＳ−ＦＩＴＣ〔Ｎ−１−（３−ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ′−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｙｌ  ｔｈｉｏｕｒｅａ〕を、アンモニアを含むエタノール水溶液中でＮ−ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＥＳ）と反応させる方法などである。
【００２８】
本発明として好ましいのは、下式で示される色素分子含有アルコキシ珪素化合物を用いて調製される色素分子含有シリカ粒子である。
【００２９】
Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｓｉ−（Ｃ２Ｈ５Ｏ）３
（式中、Ｒ−ＣＯ−は、色素分子（Ｒ−ＣＯＯＨ）からＯＨ基が脱離した基を示す。）
ここで、色素分子（Ｒ−ＣＯＯＨ）としては、例えば、５−カルボキシ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、６−カルボキシ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、５，６−ジカルボキシ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ナフトＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７等のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７系色素分子；５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ６Ｇ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ６Ｇカルボン酸、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ  ｄｙｅ（カルボン酸型）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ  ｄｙｅ（カルボン酸型）、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅカルボン酸、Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅカルボン酸等のローダミン系色素分子；ビオチン等の色素；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０  カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５  カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０  カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２  カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８  カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０  カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５カルボン酸、３Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０  カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００  カルボン酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０  カルボン酸等のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ系色素分子；ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡカルボン酸等のＡＭＣＡ系色素分子；Ｂｉｍａｎｅ、Ｂｉｍａｎｅカルボン酸等のＢｉｍａｎｅ系色素分子；ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩ���Ｙ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３カルボン酸、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬカルボン酸、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇカルボン酸、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０カルボン酸、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲカルボン酸、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８カルボン酸、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０カルボン酸、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９カルボン酸、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１カルボン酸、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲカルボン酸、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０カルボン酸、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５カルボン酸等のＢＯＤＩＰＹ系色素分子；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ  ｄｙｅ  （カルボン酸型）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ  ｄｙｅ（カルボン酸型）等のＣａｓｃａｄｅ系色素分子；Ｄａｎｓｙｌ、Ｄａｎｓｙｌカルボン酸、Ｄａｎｓｙｌ  ｄｙｅ  （カルボン酸型）等のＤａｎｓｙｌ系色素分子；Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ、Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎカルボン酸、Ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ、Ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎカルボン酸、Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ、Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎカルボン酸等のｃｏｕｍａｒｉｎ系色素分子；Ｅｏｓｉｎ、Ｅｏｓｉｎカルボン酸等のＥｏｓｉｎ系色素分子；Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎカルボン酸等のＥｒｙｔｈｒｏｓｉｎ系色素分子
Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ（カルボン酸型）；Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ  Ｄｙｅ（カルボン酸型）；ＮＢＤ、ＮＢＤカルボン酸等のＮＢＤ系色素分子；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８カルボン酸、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４カルボン酸等のＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ系色素分子；Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ  ｄｙｅ（カルボン酸型）；ＰｙＭＰＯ、ＰｙＭＰＯカルボン酸等のＰｙＭＰＯ系色素分子；Ｐｙｒｅｎｅ、Ｐｙｒｅｎｅカルボン酸等のＰｙｒｅｎｅ系色素分子；ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、ＱＳＹ３５、ＱＳＹ７カルボン酸、ＱＳＹ９カルボン酸、ＱＳＹ２１カルボン酸、ＱＳＹ３５カルボン酸等のＱＳＹ系色素分子；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ｄｙｅ（カルボン酸型）、ＥＣＤ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ｘ）（カルボン酸型）などのＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ系色素分子（カルボン酸型）（以上、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｐｒｉｎｔ／０１０１．ｈｔｍｌの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ’ａｍｉｎｅ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅｓ」の欄参照）
ＰＥ−Ｃｙ５（ＰＥ−Ｃｙａｎｉｎ５）、ＰＥ−Ｃｙ５．５（ＰＥ−Ｃｙａｎｉｎ５．５）、ＰＥ−Ｃｙ５（ＰＥ−Ｃｙａｎｉｎ７）、ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＡＰＣ−Ｃｙａｎｉｎ  ７、ＰｈａｒＲｅｄ）、及びＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｐｅｒ−ＣＰ−Ｃｙａｎｉｎ５．５）等のシアニン系色素分子；３−ｃａｒｂｏｘｙ  ＴＥＭＰＯ（４−ｃａｒｂｏｘｙ−２，２，６，６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ  １−ｏｘｙ）、３−ｃａｒｂｏｘｙ  ＰＲＯＸＹＬ［３−（ｃａｒｂｏｘｙ）−２，２，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌｏｘｙ］等のフリーラジカル；ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，  ｉｒｏｎ（III）ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅ、ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ｉｒｏｎ（II）ａｃｅｔａｔｅ等を挙げることができる。
【００３０】
また、上記色素分子として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７系の色素分子、ローダミン系の色素分子、テキサスレッド系の色素分子、及びシアニン系の色素分子などのイオン性蛍光色素を使用することもできる。なお、かかるイオン性蛍光色素として、例えばフナコシ（株）製のＤＹ−４９５（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ系色素、［ＦＩＴＣ  ｏｒ  ＦＡＭ］）、ＤＹ−５５０（Ｃｙ３、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ系色素、［ＴＲＩＴＣ  ｏｒ  ＴＡＭＲＡ］）、ＤＹ−５５５（Ｃｙ３、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ系色素、［ＴＲＩＴＣ  ｏｒ  ＴＡＭＲＡ］）、ＤＹ−６１０（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ系色素）、ＤＹ−６３５〜ＤＹ−６５１（Ｃｙ５系色素）、ＤＹ−６７５〜ＤＹ−６８１（Ｃｙ５．５系色素）等の市販のイオン性蛍光色素を使用することもできる。
【００３１】
色素分子含有シリカ粒子は、例えば、下記（ｉ）及び（ii）の工程を経由することにより製造される。
【００３２】
（ｉ）エステル結合（−ＣＯ−Ｏ−）を介して色素分子とスクシンイミドとが結合してなるスクシンイミジルエステル化合物とアミノ基を有するアルコキシ珪素化合物とを反応させて、色素分子含有アルコキシ珪素化合物を生成する工程、及び
（ii）上記（ｉ）で得られた色素分子含有アルコキシ珪素化合物を、アルコキシ珪素化合物と反応させて色素分子含有シリカ粒子を形成する工程。
【００３３】
上記（ｉ）の工程において使用されるスクシンイミジルエステル化合物（１）としては、下記の一般式で示される化合物を例示することができる。
【００３４】
【化１】
2010091553.tif 000002
【００３５】
上記式中、Ｒ−ＣＯ−は、上述するように色素分子（Ｒ−ＣＯＯＨ）からＯＨ基が脱離した基を示す。より詳細には、Ｒは、下式に示すように、エステル結合（−ＣＯ−Ｏ−）を介してスクシンイミドと結合することができるものである。
【００３６】
【化２】
2010091553.tif 000003
【００３７】
（式中、Ｒ−ＣＯ−は前記に同じ。Ｒ′は水素原子または任意の基を意味する。）
なお、上記の工程（ｉ）で用いるスクシンイミジルエステル化合物（１）は、上記式に示すように、色素分子〔化合物（０）〕とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを定法に従ってエステル化反応することによって調製することができる。但し、簡便には商業的に入手することも可能である。
【００３８】
スクシンイミジルエステル化合物（１）としては、前述する各種の色素分子（Ｒ−ＣＯＯＨ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとがエステル化反応することによって得られるものを広く挙げることができる。その例として、５−スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、６−スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、５（６）−スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、６−スクシンイミジルエステル−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、６−スクシンイミジルエステル−２′，４，７，７′−テトラクロロＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、６−スクシンイミジルエステル−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、５−スクシンイミジルエステル−ローダミン、６−スクシンイミジルエステル−ローダミン、５（６）−スクシンイミジルエステル−ローダミン、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、スクシンイミジルエステル−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６３３、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、スクシンイミジルエステル−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、スクシンイミジルエステル−ビオチン；３−スクシンイミジルエステル−ＴＥＭＰＯ、３−スクシンイミジルエステル−ＰＲＯＸＹＬ；Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ｉｒｏｎ（III）ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒａｔｅ、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ｉｒｏｎ（II）ａｃｅｔａｔｅ等を挙げることができる。
【００３９】
アミノ基を有するアルコキシ珪素化合物（２）としては、特に制限されないが、例えば３−（アミノプロピル）トリエトキシシラン、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシランを挙げることができる。
【００４０】
スクシンイミジルエステル化合物（１）とアミノ基を有するアルコキシ珪素化合物（２）との反応は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）や水等の溶媒に溶解した後、室温条件下で攪拌しながら反応することによって行うことができる。
【００４１】
反応に使用するスクシンイミジルエステル化合物（１）とアルコキシ珪素化合物（２）との割合は特に制限されないが、好適にはスクシンイミジルエステル化合物（１）：アルコキシ珪素化合物（２）＝１：０．５〜４（モル比）の範囲、より好適には１：１〜２（モル比）の割合を挙げることができる。
【００４２】
斯くして、スクシンイミジルエステル化合物（１）のカルボニル基と、アミノ基を有するアルコキシ珪素化合物（２）のアミノ基とが、アミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）して、色素分子含有アルコキシ珪素化合物（３）が生成する。すなわち当該色素分子含有アルコキシ珪素化合物（３）は、アミド結合を介して色素分子とアルコキシ珪素化合物が結合してなる態様を有している。
【００４３】
次いで工程（ii）で、当該色素分子含有アルコキシ珪素化合物（３）をアルコキシ珪素化合物（４）と反応させる。ここで使用されるアルコキシ珪素化合物（４）としては、特に制限はされないが、テトラエトキシシラン、γ−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。
【００４４】
色素分子含有アルコキシ珪素化合物（３）とアルコキシ珪素化合物（４）の割合は、特に制限されないが、色素分子含有アルコキシ珪素化合物（３）１モルに対するアルコキシ珪素化合物（４）のモル比として、１００〜４００００、好ましくは３００〜２００００、より好ましくは５００〜１００００、さらに好ましくは６００〜７０００を挙げることができる。
【００４５】
この反応は、アルコール、水及びアンモニアの存在下で行われる。ここで、アルコールとしてはメタノール、エタノール、プロパノール等の炭素数１〜３の低級アルコールを挙げることができる。
【００４６】
かかる反応系における水とアルコールの割合は、特に制限されないが、好ましくは水１容量部に対してアルコールを０．５〜８容量部、好ましくは１〜５容量部、より好ましくは１〜２容量部の範囲を挙げることができる。アンモニアの量も特に制限されないが、例えば、反応させる色素分子含有シラン化合物１モルに対して、モル比で、２００〜２５００００、好ましくは４００〜１５００００、より好ましくは２５００〜２５０００の割合を挙げることができる。
【００４７】
この反応は室温で行うことができ、また攪拌しながら行うことが好ましい。通常、数十分〜数十時間の反応で、目的の色素分子を含有するシリカ粒子（５）を調製することができる。
【００４８】
なお、当該工程（ii）において、使用するアルコキシ珪素化合物（４）の濃度を調整したり、反応時間を調整することにより、調製するシリカ粒子の大きさ（直径）を適宜調節することができる。使用するアルコキシ珪素化合物（４）の濃度を多くしたり、また反応時間を長くすることにより、より大きいシリカ粒子を調製することができる（例えば、Ｂｌａａｄｅｒｅｎｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｙｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｃｏｌｌｉｄａｌ  Ｏｒｇａｎｏ−ｓｉｌｉｃａ  Ｓｐｈｅｒｅｓ”，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５６，１−１８．１９９３参照）。また工程（ii）を複数回、繰り返し行うことによっても、より大きなシリカ粒子を調製することができる。このように本発明の方法によれば、得られる色素分子含有シリカ粒子のサイズ（直径）を、所望の大きさに、例えばｎｍオーダーからμｍオーダーへと自在に調整することができる。具体的には、本発明の方法によれば、後述の参考例１に示すように、数〜数十ｎｍサイズ、具体的には３〜３０ｎｍといった微小な大きさを有する色素分子含有シリカ粒子を調製することも可能である。また必要に応じて、その後の処理により希望する粒子径分布となるように調整することもでき、斯くして所望の粒子径分布範囲にあるシリカ粒子を得ることもできる。
【００４９】
このようにして得られる色素分子含有シリカ粒子は、必要に応じて、限界濾過膜などの慣用の方法を利用して共存イオンや共存する不要物を除いて精製してもよい。
【００５０】
後述する参考例１に示すように、上記方法を用いて色素分子をシリカ粒子内に固定若しくは包含させると、フリーの色素分子よりも感度を上げることができる。また、上記の方法によると、蛍光色素分子が自己消光を起こすことなく、多くの蛍光色素分子をシリカ粒子内に固定もしくは包含させることができる。このため、上記の方法によると、微小な領域でも使用可能な、高発光の検出試薬を提供することが可能である。
【００５１】
［色素分子含有シリカ粒子の表面修飾］
シリカは、一般に、化学的に不活性であると共に、その修飾が容易であることが知られている。上記で説明した色素分子含有シリカ粒子もまた、容易に所望の分子を表面に結合させることが可能である。本発明では色素分子含有シリカ粒子として、こうした所望の分子を表面に結合させてなる色素分子含有シリカ粒子（表面修飾−色素分子含有シリカ粒子）を用いることが好ましい。
【００５２】
表面修飾−色素分子含有シリカ粒子は、上記工程（ii）で使用するアルコキシ珪素化合物（４）の種類を適宜選択して用いることによって、所望の分子と結合可能なアクセプター基を表面に有する形態で調製することができる。反応に使用するアルコキシ珪素化合物（４）と、それによって得られる色素分子含有シリカ粒子の表面に形成されたアクセプター基との関係を表１に示す。
【００５３】
【表１】
2010091553.tif 000004
【００５４】
なお、上記の方法によって得られる色素分子含有シリカ粒子（５）について、反応に使用したアルコキシ珪素化合物（４）によって表面に導入されるアクセプター基とは異なるアクセプター基を導入したい場合には、当該色素分子含有シリカ粒子（５）を、さらに工程（ii）で使用したアルコキシ珪素化合物（４）とは異なるアルコキシ珪素化合物で処理する。この処理は、工程（ii）で使用したアルコキシ珪素化合物（４）とは異なるアルコキシ珪素化合物を用いて、上記工程（ii）と同様な操作を行うことにより実施することができる。
【００５５】
また、色素分子含有シリカ粒子として、色素分子の強度を高めるように工夫された色素分子含有シリカ粒子の多重結合物を用いることもできる。当該色素分子含有シリカ粒子の多重結合物は、上記の方法で得られた色素分子含有シリカ粒子に、色素分子含有シリカ粒子のアクセプター基に応じたカップリング剤を用いて、さらに色素分子含有シリカ粒子を結合させることによって調製することができる（工程（iv））。また、色素分子含有シリカ粒子のアクセプター基を、当初のアクセプター基とは異なる所望のものに変更する場合には、工程（iv）の前に、前述する工程（ii）で用いたアルコキシ珪素化合物（４）とは異なる、所望のアクセプター基を有するアルコキシ珪素化合物（４）での処理を実施してもよい〔工程（iii）〕。
【００５６】
ここで使用できるカップリング剤としては、色素分子含有シリカ粒子が表面に有するアクセプター基に応じて、表２に記載するものを挙げることができる。
【００５７】
【表２】
2010091553.tif 000005
【００５８】
カップリング剤との反応は、カップリング剤の存在下で、本発明に係る色素分子含有シリカ粒子を反応することによって行うことができる。通常、室温下で数十分〜数十時間攪拌反応する方法を用いることができる。使用するカップリング剤の割合は、色素分子含有シリカ粒子１モルに対して、モル比で３００〜６０００倍、好ましくは６００〜５４００倍、より好ましくは２１００〜３０００倍である。
【００５９】
斯くして色素分子含有シリカ粒子がカップリング剤を介して多重的に結合し、色素分子含有シリカ粒子の多重結合物を得ることができる。かかる多重結合物の調製は、色素分子含有シリカ粒子に由来する色素分子（例えば、蛍光色素など）の強度を高める手段として有効に利用することができる。なお、多重結合によって形成される粒状物は、特に制限されないが、粒径６０〜１５０ｎｍの範囲の大きさを有することができる。
【００６０】
本発明に係る色素分子含有シリカ粒子の表面修飾法としてはさらに交互吸着法を用いることが出来る（参考文献：
（Ａ）Ｓ．Ｓ．Ｓｈｉｒａｔｏｒｉ，Ｔ．Ｉｔｏ，ａｎｄ  Ｔ．Ｙａｍａｄａ：“Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｕｌｔｒａ−ｔｈｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ／ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｂｙ  ｍａｓｓ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ‘ｎｍ’ｓｃａｌｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ”，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ，１９８−２００（２００２），４１５．
（Ｂ）Ｚ．Ｌｉ，Ｄ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｆ．Ｒｕｂｎｅｒ，ａｎｄ  Ｒ．Ｅ．Ｃｏｈｅｎ：  “Ｌａｙｅｒ−ｂｙｌａｙｅｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｊａｎｕｓ  Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３８（２００５），７８７６．
（Ｃ）Ｄ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｆ．Ｒｕｂｎｅｒ，ａｎｄＲ．Ｅ．Ｃｏｈｅｎ：“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｍｕｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−Ｂｏｎｄｅｄ  Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｓ，”Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１７（２００５），１０９９．）。
【００６１】
例えば負の電位を持っている色素分子含有シリカ粒子に対し、１層目にカチオン性高分子であるポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）、２層目にアニオン性高分子であるポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＡ）を積層することにより、粒子表面に静電的引力を利用した交互吸着処理を行うことができる。さらにＰＡＨは高分子鎖の側鎖にアミノ基を、ＰＡＡはカルボキシル基を持つので、これらを縮合しアミド結合で結合すれば、高分子の網に覆われた構造を形成し、強固な修飾が可能となる。具体的にはＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）などの縮合剤を用いて高分子の縮合処理を行いシリカ粒子上に網構造を形成させれば、塩の添加等による表面修飾層の脱離を抑制することができる。またこれは表面にカルボキシル基を有していることから、このカルボキシル基を利用して、抗体、アミノ基末端を持つオリゴヌクレオチドあるいは酵素などを結合することが可能である。
【００６２】
本発明に係る色素分子含有シリカ粒子の調製に際しては、水溶性カチオニックポリマー又は水溶性水酸基含有ポリマーを分散剤として使用することができる。水溶性カチオニックポリマーとしては、公知のものを広く使用できる。例えば、ポリエチレンアミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリビニルピリジン、ジアリルアミンアクリルアミドの単独共重合体、ジアリルアミンアクリルアミドとこれを共重合可能なモノマーとの共重合体、及びカチオン性ポリアクリルアミド等の１〜３級アミン基を有するカチオニックポリマー：ポリジアリルジメチルアンモニウム塩〔ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）（ＰＤＡＤＭＡＣ）〕、ポリスチレン系樹脂のスルホン酸塩〔例えば、ポリ（ソディウム４−スチレンスルホネート）〕、アクリル系樹脂の四級アンモニウム塩、ジメチルアミノエチルメタクリレートの単独共重合体〔例えば、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）〕、ジメチルアミノエチルメタクリレートとこれと共重合可能なモノマーとの共重合体、下式で示されるポリマー：
【００６３】
【化３】
2010091553.tif 000006
【００６４】
（式中、Ｚは一価または二価の対イオンである。）
または、下式で示されるポリマー：
【００６５】
【化４】
2010091553.tif 000007
【００６６】
（式中、Ｚは一価または二価の対イオンである。）
等の第四級アンモニウム基を有するカチオン性のポリマーを例示することができる。好ましくはポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）である。
【００６７】
水溶性水酸基含有ポリマーとしては、公知のものを広く使用できる。水溶性水酸基含有ポリマーの具体例を示せば、ポリビニルアルコール樹脂、水酸基含有アクリル系樹脂、セルロース系樹脂がある。好ましくはポリビニルアルコール樹脂である。
【００６８】
これら水溶性カチオニックポリマー及び水溶性水酸基含有ポリマーは、１種単独で使用するのが望ましいが、これらを２種以上組み合わせて使用しても何ら差し支えない。
【００６９】
〔生体分子検出装置〕
以下、本発明に係る生体分子検出装置の構成例を示すが、本発明はこれに限定されない。
【００７０】
図１は、本発明の実施の形態に係る生体分子検出装置の概略構成を示すブロック図である。本実施の形態に係る生体分子検出装置は、プリズム１、プリズム１の上に形成された、検出対象の生体分子（以下「被検体」と記す。）を含む試料を保持する被検体検出部（以下「検出部」と記す。）２と、レーザー発生装置３と、レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌの光路上に配置された偏光板４１、絞り４２、シャッタ４３、回転ミラー４４及びレンズ４５で構成される光制御部４と光検出手段である第１及び第２ＣＣＤカメラ５、６と、第１及び第２フィルター７、８とを備えている。
【００７１】
図２は、プリズム１の上に形成される検出部２の構成の一例を示す断面図である。プリズム１には、高屈折率の４５度直角プリズムを用いることができる。検出部２は、プリズム１の表面にスパッター法あるいは蒸着法により３０〜６０ｎｍ（望ましくは４０〜６０ｎｍ、より望ましくは４３〜５３ｎｍ）の厚さに形成された金薄膜２１と、金薄膜２１表面上にスペーサ２３によって周囲を囲まれて形成された、抗原と反応させる抗体を含む被検体検出層（以下「検出層」ともいう。）２４と、石英基板２５と、これらを固定する固定具２２とを備えている。ここで、スペーサ２３、検出層２４及び石英基板２５によって、バッファ空間２７が形成されており、石英基板２５には貫通孔によって流路２６ａ、２６ｂが形成されている。流路２６ａ、２６ｂは、試料溶液をバッファ空間２７に注入するために使用され、例えば、試料溶液を、流路２６ａからチューブ（図示せず。）を介してバッファ空間２７に注入し、流路２６ｂから別のチューブ（図示せず。）を介してバッファ空間２７から排出させる。検出層２４には、抗体を結合させたＳＡＭ膜や高分子材料を用いることができる。抗体はＳＡＭ膜や高分子材料の一方の端部に結合されており、ＳＡＭ膜や高分子材料の他方の端部は、直接若しくは間接に金薄膜２１表面に固定されている。高分子材料は複数種類が介在していてもよい。ＳＡＭ膜としては例えばＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜、高分子材料としては例えばポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、以下「ＰＥＧ」と記す。）やＭＰＣポリマー等が挙げられる。これは用時に調製しても、予めこれらを結合させた基板を用いてもよい。
【００７２】
第１ＣＣＤカメラ５は、金薄膜による反射レーザー光を観測するためのものであり、第１フィルター７を介して反射レーザー光を受光可能な位置に配置されている。一方、第２ＣＣＤカメラ６は、検出層２４に含まれている蛍光分子からの蛍光を検出するためのものであり、観測波長に適した蛍光用高感度ＣＣＤカメラと第２フィルター８とが、検出部２の上方に設置されている。ここで、第１ＣＣＤカメラ５は、少なくとも反射光強度を測定することができればよく、２次元撮像ができなくてもよく、フォトダイオードであってもよい。
【００７３】
レーザー発生装置３には、例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザーを使用することができる。また、回転ミラー４４は、ミラーの角度を変更することが可能であり、レーザー光Ｌの金薄膜２１への入射角θを、例えば、θ＝２８〜６２度の範囲で変化させることができる。なお、図１において、レーザー光Ｌが通過するプリズム表面での光路の屈曲は省略している。
【００７４】
レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌは、偏光板４１によってＰ偏光され、絞り４２を通過し、シャッタ４３が開いている間、回転ミラー４４、レンズ４５及びプリズム１を介して検出部２の金薄膜２１に入射され、その反射光が、レンズ４５及びフィルター７を介して第１ＣＣＤカメラ５で測定される。また、検出層２４内の蛍光分子からの蛍光は、第２ＣＣＤカメラ６で測定される。
【００７５】
〔生体分子の検出方法の詳細な説明〕
次に、本生体分子の検出装置を用いた生体分子の検出方法を、具体例を挙げて説明するが本発明はこれに限定されない。
【００７６】
まず検出部２のバッファ空間２７に、ＰＢＳ（あるいはその他の緩衝液）溶液を注入する。
【００７７】
レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌを、回転ミラー４４のミラー表面の角度を固定し、上記のようにプリズム１を介して検出部２の金薄膜２１に入射させ、その反射光を第１ＣＣＤカメラ５で測定し、反射強度を記録する。周知のように、偏光板４１を介してＰ偏光されたレーザー光Ｌは、金薄膜２１中の電子振動とカップリングしてＳＰＲ現象を生じた場合、反射光の強度が減少する。この反射光の強度が最低値になるように回転ミラーの角度を調整する（ここからプラズモン光が最大となる入射角となるようにミラー角度を変更しても構わない。）。
【００７８】
バッファ空間２７中の検出層２４には予め抗体を固定しておき、これに対する抗原を含む溶液を流した後、色素分子含有シリカ粒子を結合させた二次抗体を含む溶液を流す。
【００７９】
これによって、ＳＰＲによるプラズモン光によって、検出層２４内の蛍光分子が励起され、蛍光を発生する。
【００８０】
発生した蛍光を、検出部２の上方に位置する第２ＣＣＤカメラ６で測定、即ち２次元撮像する。得られた２次元画像における各画素の輝度が、検出層上の各場所での蛍光強度に対応する。
【００８１】
以上のように、第２ＣＣＤカメラ６による蛍光強度の測定によって、検出層２４に注入した溶液中の抗原を検出することができる。
【００８２】
なおこの測定においてシリカ粒子に含有させる色素分子としては、レーザー光の波長等を考慮して適切な色素分子を使用すればよい。例えば、光源として波長６３２．８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを使用する場合、色素分子としてはＣｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７等を使用することができる。
【００８３】
なお、プリズム表面に形成される薄膜は、金薄膜に限定されず、その他の金属（銀等）や、金属酸化物（ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ａｇ２Ｏ等）の薄膜であってもよい。
【００８４】
また、上記では、流路を有する石英基板及びスペーサを備えた検出部を説明したが、これに限定されない。金薄膜表面上に被検体検出層が形成され、被検体の生体分子を保持することができる構造であればよい。
【００８５】
また、上記では１つの検出層を備える場合を説明したが、金薄膜上に、異なる抗体を含む複数の検出層をアレイ状に配列して検出部を形成してもよい。
【００８６】
また、上記においては、１種類の蛍光分子を用いる場合を説明したが、これに限定されず、複数種類の抗体と、抗体の種類毎に、蛍光波長の異なる蛍光分子を結合させて検出部を形成してもよい。この場合、ＳＰＲ測定及びＳＰＦＳ測定は、蛍光分子の種類に応じた波長の異なる複数のレーザー光あるいは各種フィルターを挿入したランプを用いて行う。
【００８７】
また、第一光検出手段はＣＣＤカメラに限定されず、所定の波長のレーザー光を測定可能なものであればよい。例えばフォトダイオード等を用いることができる。同様に第２光検出手段も、上記したＣＣＤカメラに限定されず、所定の波長の蛍光を測定可能なものであればよい。例えば光電子増倍管等を用いてもよい。
【００８８】
照射する光源としては直進性のある形で光線を取り出せる光源であればよく、半導体レーザーでもＬＥＤでもランプでも構わない。
【００８９】
照射光を走査する方法としては、回転ミラーに限定されず、光源そのものをステージコントローラー等で走査させてもかまわない。
【００９０】
プリズムの形状としては、９０度の三角プリズムに限定されず、６０度の三角プリズムや半円柱のプリズムを用いてもよい。
【実施例】
【００９１】
本発明を、具体例を挙げて説明するが、本発明はこれに限定されない。
（１）ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９（色素分子）含有アルコキシ珪素化合物の調製
下式に従って、色素分子としてＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含有するアルコキシ珪素化合物を調製した。
【００９２】
【化５】
2010091553.tif 000008
【００９３】
〔式中、Ｒ１はＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９（色素分子）を意味する。またＲ１中、＊はエステル基との結合部を意味する。〕
具体的には、まずスクシンイミジルエステル化合物として、エステル結合を介して通じてＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９（色素分子：式中、Ｒ１で示す。）とスクシンイミドとが結合してなる、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９スクシンイミジルエステル（１）（約３ｍｇ）を１ｍｌのＤＭＳＯ溶液に溶解した後、アミノ基を有するアルコキシ珪素化合物として３−（アミノプロピル）トリエトキシシラン〔３−（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ：以下、「ＡＰＳ」ともいう。〕（２）を上記ＤｙＬｉｇｈｔＦｌｕｏｒ６４９スクシンイミジルエステルと等モルになるように加え、約１時間スターラーピースを用いて攪拌して反応させて、スクシンイミジルエステル化合物のカルボニル基とアルコキシ珪素化合物〔ＡＰＳ（２）〕のアミノ基がアミド結合してなるＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９（色素分子）含有アルコキシ珪素化合物（３）を調製した。
【００９４】
（２）色素分子含有シリカ球の調製
次いで、下式に従って、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９（色素分子）含有アルコキシ珪素化合物（３）からＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９（色素分子）含有シリカ球（５）を調製した。
【００９５】
ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９（色素分子）含有アルコキシ珪素化合物の調製、及びこれを用いたシリカ球（ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９含有シリカ球）の調製
【００９６】
【化６】
2010091553.tif 000009
【００９７】
具体的には、上記で得られたＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９（色素分子）含有アルコキシ珪素化合物（３）を含む反応溶液から８０μｌを採取し、エタノール３．９２ｍｌに加えた。これに、さらにアルコキシ珪素化合物としてテトラエトキシシラン（４）（Ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ：以下、「ＴＥＯＳ」ともいう。）５０μｌ、蒸留水１ｍｌ、及び２７質量％のアンモニア水溶液を約１００μｌ加えて、スターラーピースを用いて室温で約２４時間撹拌して反応した。このとき、反応液中のエタノールと蒸留水の容量比が４：１となるようにした。
【００９８】
得られた反応終了液を、限外ろ過装置〔アミコン（登録商標）攪拌式セル〕（フィルター；ＵＦディスクＹＭ１００ウルトラセルＲＣ１００ＫＮＭＷＬ）（販売会社：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）〔Ｎｏｍｉｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅ  ｉｇｈｔ  Ｌｉｍｉｔ（ＮＭＷＬ）：１００ｋＤａ〕を使用してろ過し、蒸留水を使用したろ過洗浄を数回繰り返して、２ｍｌのサンプル分散液Ａを得た（ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ６４９（色素分子）含有シリカ球（５）を含む。このシリカ球を「シリカ球Ａ」という）。
【００９９】
サンプル分散液Ａ中のシリカ球Ａの、ＴＥＭ，ＳＥＭでの観察から、シリカ球Ａの直径は約２０ｎｍであると判断された。
【０１００】
なお、粒子カウンターによる粒子数測定と蛍光光度計による蛍光強度測定からシリカ球Ａ１粒子あたりの蛍光強度はＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９  １色素当たりの蛍光強度の約１０倍であった。
【０１０１】
また、上記の反応により形成されたＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９（色素分子）含有シリカ球の表面は、反応に用いたアルコキシ珪素化合物（テトラエトキシシラン）（４）に基づいて、アクセプター基としてＯＨ基を有していた（ＯＨ基表層修飾シリカ球）。
（３）表面に生体分子捕捉物質を有する色素分子含有シリカ球の作製
参考例１で調製したＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９（色素分子）含有シリカ球Ａ（粒径２０ｎｍ）の水分散液０．５ｍｌを、４．５ｍｌの４ｍＭ  ３−（メルカプトプロピル）トリエトキシシラン〔ＡＰＳ〕とともに、室温下で一晩反応させた。これにより、シリカ球にＡＰＳを付着させて表面にアクセプター基としてＳＨ基を有するシリカ球（ＳＨ基表層修飾シリカ球）を作製することができた。
＜抗体修飾＞
下記、ＳＭＣＣ、０．１ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液１０μｌを抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体（６Ｄ２）（日本臨床医学検査研究所販売）２．５ｍｇ／ｍｌを８μｌと、１Ｍ重曹水溶液を１０μｌと、サンプル分散液Ａの０．５μＭ希釈液を６０μｌとを混和し、３時間攪拌し、本発明の標識抗体溶液Ａを得た。
【０１０２】
【化７】
2010091553.tif 000010
【０１０３】
吸光光度計による測定で、抗体と色素の吸光度（Ａｂｓ）を比較することにより、１抗体当たりの色素数は約１２個と算出できた。
【０１０４】
また、サンプル分散液Ａの０．５μＭ希釈液を６０μｌの代わりに、０．２μＭ希釈液を６０μｌ加えて、同様の反応を行い、本発明の標識抗体溶液Ｂを得た。この溶液の１抗体あたりの色素数は約４個と算出できた。
（４）色素単体標識抗体溶液の調製（比較例）
また、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９のスクシンイミジルエステルのＤＭＦ溶液０．１μｇ／ｍｌを３μｌと抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体（６Ｄ２）（日本臨床医学検査研究所販売）２．５ｍｇ／ｍｌを８μｌと１Ｍ重曹水溶液を１０μｌとＰＢＳ緩衝液を７９μｌとを混和し、時々攪拌しながら１時間静置した。その後、サイズ排除クロマトグラフィにより低分子色素成分を除き、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９色素で標識された抗体溶液を得た。（比較標識抗体溶液Ａ）
吸光光度計による測定で、抗体と色素の吸光度（Ａｂｓ）を比較することにより、１抗体当たりの色素数は約９個と算出できた。
【０１０５】
また、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９のスクシンイミジルエステルのＤＭＦ溶液０．１μｇ／ｍｌを３μｌ添加する代わりに、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９のスクシンイミジルエステルのＤＭＦ溶液０．１μｇ／ｍｌを１μｌとＰＢＳ緩衝液を２μｌとを添加し、同様の反応を行うことで比較標識抗体溶液Ｂを得た。１抗体あたりの色素数は約３個であった。
（５）表面プラズモン共鳴蛍光を利用した免疫測定
（検出部の作製）
図２に示したように、プリズム１として、高屈折率の４５度直角プリズムであるＳＣＨＯＴＴ  ＧＬＡＳＳ社製のＬａＳＦＮ９（屈折率ｎ＝１．８５）を用い、その底面にスパッター法により膜厚約４８ｎｍの金薄膜２１を形成し、流路２６ａ、２６ｂが形成された石英基板２５を、厚さ２ｍｍのシリコンゴムのスペーサ２３で挟んで金薄膜２１の上に設置した。これに、ポンプを用いて、ＰＢＳ緩衝液（りん酸緩衝液、ｐＨ＝７．２）を注入した。このときのセル容積はおよそ１６０μｌであった。
【０１０６】
次にＨＳ−（ＣＨ２）１０−ＣＯＯＨの０．５ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液を調製し、このＰＢＳ緩衝液をポンプにより、石英基板２５を形成した段階の検出部に注入して１夜放置し、金薄膜２１の表面に自己組織化膜を形成させた。
【０１０７】
（実施例１）
サンプルの測定について説明する。なおレーザーは６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを用いた。
【０１０８】
前述のとおりに検出部の作製を行った後に、第１ＣＣＤに照射される反射光強度が最小となるようにレーザー入射光角度を調整して、第２ＣＣＤを用いて上方から検出部のレーザー照射範囲中心部の０．２ｍｍ角を観察し、このときの第２ＣＣＤのカウント値を０点として調整した。
【０１０９】
その後、検出部にＮ−ヒドロキシスクシンイミドが２５ｍＭ、ＷＳＣが５０ｍＭとなるように調製したＰＢＳ緩衝液を注入し３０分作用させた後、抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体（１Ｄ５）（日本臨床医学検査研究所販売）５μｇ／ｍｌを注入し、３０分作用させた。その後１％ＢＳＡ−ＰＢＳ緩衝液を４０分作用させ、ブロッキングを行ったのち、ＰＢＳ緩衝液を注入し３０分洗浄した。
【０１１０】
次に、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）１００ｎｇ／ｍｌ、２．５ｍｌを循環させながら３０分間反応させて、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ緩衝液で５分洗浄したのち、本発明の標識抗体溶液Ａ、８．５μｇ／ｍｌ、２．５ｍｌを循環させながら２０分作用させた。その後ＰＢＳ緩衝液にて洗浄し、１０分後第２ＣＣＤから観察したときのカウント値を計測した。このときのカウント値（アッセイシグナル）は２１３０００ａｕ（任意単位）であった。（なお、第２ＣＣＤは５０００００ａｕまでは光強度とカウント値が正比例となることを事前に確認した。）またこの時点から５分間のカウント値の最大値と最小値の差を算出したところ１０００ａｕであった。これはアッセイシグナルに対して０．５％のばらつきである。
【０１１１】
次にアッセイシグナルを観測した時点から３０分後の第２ＣＣＤのカウント値を観測したところ２０８０００ａｕであった。これにより３０分露光し続けた時の有効な色素の残存率が９８％と算出できる。
【０１１２】
（実施例２）
本発明の標識抗体溶液Ａの代わりに本発明の標識抗体溶液Ｂを用いた以外は実施例１と同様の実験を行ったところ、第２ＣＣＤのカウント値（アッセイシグナル）は７５０００ａｕを示した。またこの時点から５分間のカウント値の最大値と最小値の差を算出したところ８００ａｕであった。これはアッセイシグナルに対して１％のばらつきである。
【０１１３】
次にアッセイシグナルを観測した時点から３０分後の第２ＣＣＤのカウント値を観測したところ７３５００ａｕであった。これにより３０分露光し続けた時の有効な色素の残存率が９８％と算出できる。
【０１１４】
（比較例１）
本発明の標識抗体溶液Ａの代わりに比較の標識抗体溶液Ａを用いた以外は実施例１と同様の手法で計測を行った。
【０１１５】
このときのカウント値（アッセイシグナル）は１５６０００ａｕであった。またこの時点から５分間のカウント値の最大値と最小値の差を算出したところ４６００ａｕであった。これはアッセイシグナルに対して３％のばらつきである。
【０１１６】
次にアッセイシグナルを観測した時点から３０分後の第２ＣＣＤのカウント値を観測したところ１３８０００ａｕであった。これにより３０分露光し続けた時の有効な色素の残存率が８８％と算出できる。
【０１１７】
（比較例２）
本発明の標識抗体溶液Ａの代わりに比較の標識抗体溶液Ｂを用いた以外は実施例１と同様の手法で計測を行った。
【０１１８】
このときのカウント値は５５０００ａｕ（アッセイシグナル）であった。またこの時点から５分間のカウント値の最大値と最小値の差を算出したところ１８００ａｕであった。これはアッセイシグナルに対して３％のばらつきである。
【０１１９】
次にアッセイシグナルを観測した時点から３０分後の第２ＣＣＤのカウント値を観測したところ５００００ａｕであった。これにより３０分露光し続けた時の有効な色素の残存率が９０％と算出できる。
【０１２０】
以上のように、本発明を用いることで１つの生体分子当たりの蛍光強度を大幅に上げることができ、色素単体で蛍光強度増大をはかるよりも、そのばらつきを抑えることができる。つまり従来のＳＰＦＳ法に比べて高感度、高精度に生体分子の検出を行うことが可能となった。また本発明を用いることでプラズモン光による励起条件下でも、色素単体での標識に比べ、有効な色素の残存率を向上させることが出来た。
【符号の説明】
【０１２１】
１  プリズム
２  被検体検出部
３  レーザー発生装置
４  光制御部
５  第１ＣＣＤカメラ
６  第２ＣＣＤカメラ
７  第１フィルター
８  第２フィルター
２１  金薄膜
２２  固定具
２３  スペーサ
２４  被検体検出層
２５  石英基板
２６ａ、２６ｂ  流路
２７  バッファ空間
４１  偏光板
４２  絞り
４３  シャッタ
４４  回転ミラー
４５  レンズ
【図１】
2010091553.tif 000011
【図２】
2010091553.tif 000012