(57)【要約】【課題】キシランを含むセルロース資源の分解能力に優れたセルラーゼを低コストで製造すること。【解決手段】（ａ）炭素源として加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類由来のパルプ、及び（ｂ）窒素源としてアンモニア態窒素またはアミノ態窒素を含む液体培地を用いて、トリコデルマ属に属する微生物を培養する工程を包含するβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）炭素源として加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類由来のパルプ、及び（ｂ）窒素源としてアンモニア態窒素またはアミノ態窒素を含む液体培地を用いて、トリコデルマ属に属する微生物を培養する工程を包含するβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
【請求項２】
前記パルプの前記液体培地中における初期濃度が２％Ｗ/Ｖ以上である請求項１に記載のβ−グルカナーゼ及びキラナーゼの製造方法。
【請求項３】
前記パルプの前記液体培地中における初期濃度が２〜７％Ｗ/Ｖである請求項１又は２に記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
【請求項４】
前記アンモニア態窒素またはアミノ態窒素の前記液体培地中における初期濃度が３５〜６６０ｍＭ以上である請求項１〜３のいずれかに記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
【請求項５】
前記アンモニア態窒素またはアミノ態窒素の前記液体培地中における初期濃度が５０〜５８０ｍＭである請求項１〜４のいずれかに記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
【請求項６】
前記紙類が上質紙、更紙、コピー用紙、新聞紙及びダンボール紙からなる群から選択される少なくとも一種である請求項１〜５のいずれかに記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
【請求項７】
前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイである請求項１〜６のいずれかに記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
【請求項８】
培養の過程において前記液体培地に対してパルプを追加する請求項１〜７に記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
【請求項９】
（ａ）炭素源として加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類由来のパルプ、及び（ｂ）窒素源としてアンモニア態窒素またはアミノ態窒素を含む液体培地であって、トリコデルマ属に属する微生物を培養するために用いられる液体培地。
【請求項１０】
前記パルプを２％Ｗ/Ｖ以上含有する請求項９に記載の液体培地。
【請求項１１】
アンモニア態窒素またはアミノ態窒素を３５〜６６０ｍＭ含有する請求項９又は１０に記載の液体培地。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により製造されたβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼ。
【請求項１３】
請求項１２記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼを用いることを特徴とするセルロース資源の分解または糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法及び液体培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース資源を有効利用するために、近年、セルロースを効率的に分解する方法が探索されている。自然界ではセルロースは主として微生物によって分解されており、細菌や糸状菌などの様々な微生物がセルロース分解酵素を生産することが知られている。
【０００３】
これらの微生物は菌体外にセルロース分解酵素を分泌し、セルロースはその作用により、主に、セロオリゴ糖、セロビオースを経てグルコースへと分解される。セルロース分解酵素は、一般に、セルラーゼと呼ばれている。
【０００４】
人工的にセルラーゼを製造しようとする場合、セルラーゼを分泌する微生物としては、トリコデルマ属が知られており、広く利用されている。そして、トリコデルマ属に属する微生物を炭素源及び窒素源などの栄養を含む培地を用いて培養し、セルラーゼを分泌させる方法も知られている。
【０００５】
しかしながら、セルラーゼを製造するための従来の方法は、炭素源として使用できる材料に制限があり、高価な結晶セルロースであったり、仮に安価なセルロース資源であっても、加熱処理やアルカリ処理などの前処理を行う必要があり、比較的高いコストを要するものである。
【０００６】
例えば、特許文献１は、古紙を硫酸第１鉄溶液中で蒸煮し、セルラーゼ生産菌を摂種可能なセルラーゼ生産用基質を開示している。また、特許文献２は、微粉砕したバガスを苛性アルカリで蒸煮し、次亜塩素酸塩溶液で処理し、セルラーゼ生産菌であるトリコデルマ・リーセイを摂種可能なセルラーゼ生産用基質の製造方法を開示している。
【０００７】
また、これら従来の方法で得られるセルラーゼは主としてβ−グルカナーゼを含み、キシラナーゼ活性は低く、バガス及び稲わら等のような、キシランが含まれるセルロース資源の分解能力に劣っている。そのため、天然に存在する多様なセルロース資源の有効利用という目的のためには効果が低い。
【０００８】
特許文献３は、固形構成成分の除去や非揮発成分の濃縮、濃縮物のオートクレーブ処理等の予備処理を行ったライムギの希薄アルコール蒸留廃液を用い、トリコデルマ属に属する微生物を培養してキシラナーゼを製造する方法を開示している。
【０００９】
しかし、本技術で炭素源として用いられるライムギは入手が困難であり、更に複雑な前処理が必要であるために高いコストを要し、また、この方法ではβ−グルカナーゼの生成量が却って低下してしまう。
【００１０】
尚、非特許文献１には、熱処理やアルカリ処理などの前処理を行わない紙類（新聞紙やオフィスペーパー）を用いたトリコデルマ・リーセイによる酵素産生の試験では、セルラーゼの生産性が低いことが示されている。
【００１１】
加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類をセルロース資源として用いβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼを同時に高生産する成功例は今まで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2003-137901
【特許文献２】特公平5-33984号公報
【特許文献３】特開平11-113568号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Applied Biochemistry and Biotechnology pp. 237-245, Vol. 84-86, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は上記従来の問題を解決するものであり、その目的とするところは、キシランを含むセルロース資源の分解能力に優れたセルラーゼを低コストで製造することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、（ａ）炭素源として加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類由来のパルプ、及び（ｂ）窒素源としてアンモニア態窒素またはアミノ態窒素を含む液体培地を用いて、トリコデルマ属に属する微生物を培養する工程を包含するβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法を提供する。
【００１６】
ある一形態においては、前記パルプの前記液体培地中における初期濃度が２％Ｗ/Ｖ以上である。
【００１７】
ある一形態においては、前記パルプの前記液体培地中における初期濃度が２〜７％Ｗ/Ｖである。
【００１８】
ある一形態においては、前記アンモニア態窒素またはアミノ態窒素の前記液体培地中における初期濃度が５０ｍＭ以上である。
【００１９】
ある一形態においては、前記アンモニア態窒素またはアミノ態窒素の前記液体培地中における初期濃度が５０〜６６０ｍＭである。
【００２０】
ある一形態においては、前記紙類が上質紙、更紙、コピー用紙、新聞紙及びダンボール紙からなる群から選択される少なくとも一種である。
【００２１】
ある一形態においては、前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイである。
【００２２】
ある一形態においては、培養の過程において前記液体培地に対してパルプが追加される。
【００２３】
また、本発明は、（ａ）炭素源として加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類由来のパルプ、及び（ｂ）窒素源としてアンモニア態窒素またはアミノ態窒素を含む液体培地であって、トリコデルマ属に属する微生物を培養するために用いられる液体培地を提供する。
【００２４】
ある一形態においては、前記パルプは２％Ｗ/Ｖ以上含有される。
【００２５】
ある一形態においては、前記アンモニア態窒素またはアミノ態窒素は５０〜６６０ｍＭ含有される。
【００２６】
また、本発明は、前記のいずれかに記載の方法により製造されたβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼを提供する。
【００２７】
また、本発明は、上記β−グルカナーゼ及びキシラナーゼを用いることを特徴とするセルロース資源の分解または糖化方法を提供する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明では、液体培地の炭素源として未処理の紙類を用いることができるので、低コスト、低エネルギーであり、環境にかかる負荷が少ない。また、セルラーゼとしてβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼが同時に高生産されるため、バガスや稲わら等のキシランを含む天然セルロース資源の糖化に極めて有用である。特に、セルロース資源からエタノールを製造するバイオマスエタノール製造に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】コピー紙３％の培地における、硫酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図２】ダンボール紙３％の培地における、硫酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図３】新聞紙３％の培地における、硫酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図４】コピー紙３％の培地における、塩化アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図５】コピー紙３％の培地における、燐酸二アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図６】コピー紙３％の培地における、硝酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図７】コピー紙３％の培地における、アンモニアの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図８】コピー紙３％の培地における、尿素の濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図９】硫酸アンモニウム８０ｍＭの培地における、コピー紙の濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図１０】硫酸アンモニウム１６０ｍＭの培地における、コピー紙の濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図１１】硫酸アンモニウム３２０ｍＭの培地における、コピー紙の濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図１２】硫酸アンモニウム４８０ｍＭの培地における、コピー紙の濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図１３】アビセル１％の培地における、硫酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図１４】硫酸アンモニウム１６０ｍＭの培地における、アビセルの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図１５】コピー紙１％の培地における、硫酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図１６】コピー紙３％の培地における、硝酸カリウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図１７】硫酸アンモニウム２００ｍＭの培地における、炭素源の種類に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図１８】使用済みコピー紙６％の培地における、硫酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図１９】使用済みコピー紙６％及び硫酸アンモニウム４５ｍＭの培地における、ｐＨ調整用薬液の種類に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図２０】コピー紙３％の培地における、硫酸アンモニウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図２１】コピー紙３％の培地における、グルタミン酸ナトリウムの濃度に対する培養上清液の酵素活性の変化を表すグラフである。
【図２２】実施例１３で得られたコピー紙６％の培地及び結晶セルロース３％の培地のそれぞれの上清液を用いてバガスを糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を比較したグラフである。
【図２３】実施例１３で得られたコピー紙６％の培地及び結晶セルロース３％の培地のそれぞれの上清液を用いて稲わらを糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を比較したグラフである。
【図２４】実施例１３で得られたコピー紙６％の培地及び結晶セルロース３％の培地のそれぞれの上清液を用いてビール粕を糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を比較したグラフである。
【図２５】実施例１３で得られたコピー紙６％の培地及び結晶セルロース３％の培地のそれぞれの上清液を用いてセルロース粉末を糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
液体培地
本発明の液体培地はトリコデルマ属に属する微生物が生育する栄養を含む材料である。かかる液体培地は、以下の培地組成を水１００ｍｌに溶解及び懸濁した液体培地（一般に、マンデル培地と呼ばれる）を基に調整され、炭素源としてパルプ、及び窒素源としてアンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含むものである。好ましい培地組成の一例を以下に示す。
【００３１】
結晶セルロース（Fluka BioChemika製、商品名アビセルＰＨ101）：１ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：０．１４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：１．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：０．０３ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０３ｇ、コーンスティープリカー：２ｍＬ、ツイーン８０：０．１ｍＬ、微量元素液（Ｈ３ＢＯ４  ６ｍｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ  ２６ｍｇ、ＦeＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、ＣuＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ４０ｍｇ、ＭnＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ８ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇ液）：０．１ｍＬ、水：１００ｍＬを含む（燐酸または水酸化ナトリウムでｐＨ４．８に調整）
【００３２】
パルプとは紙類の製造原料に用いられる繊維をいう。パルプの種類は化学パルプ及び古紙パルプのようなセルロース純度が高いものが好ましい。好ましいパルプは、紙類を分解、切断などして得られる紙類由来のパルプである。
【００３３】
好ましい紙類の具体例としては、上質紙、更紙、コピー用紙、新聞紙及びダンボール紙などが挙げられる。紙類は好ましいパルプが含まれているものであればよく、印刷や筆記がなされたものや一般に古紙と呼ばれているものでもよい。例えば古書、雑誌及び使い古したノートの頁、チラシ、封筒、便箋、葉書、ティッシュ紙なども使用できる。
【００３４】
パルプの液体培地中における濃度は２％Ｗ/Ｖ以上であることが好ましい。パルプの濃度が２％Ｗ/Ｖ未満であるとセルラーゼ、特にβ−グルカナーゼの生成量があまり増大しない場合がある。
【００３５】
液体培地中のパルプの濃度は高ければ高いほどよい。すなわち、その上限は、液体培地の撹拌混合を行なうことができる限度の量である。なお、液体培地の攪拌混合を容易にするために、紙類はシュレッダーにより、裁断して用いることが好ましい。例えば、液体培地中のパルプの初期濃度の上限は、攪拌装置の性能に応じて２０、１５又は１０％Ｗ／Ｖでありうる。一般的には、パルプの初期濃度の好ましい範囲は２〜７％Ｗ／Ｖ、好ましくは３〜５％Ｗ／Ｖである。
【００３６】
アンモニア態窒素とはアンモニア又はアンモニア由来のアンモニウム塩に含まれている窒素をいう。また、アミノ態窒素とはアミン又はアミン由来のアミノ化合物に含まれている窒素をいう。アンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含む化合物は、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸二アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニア水、尿素、アミノ酸およびその塩（例えば、グルタミン酸ナトリウム）である。
【００３７】
これらのうち、窒素源として本発明の液体培地に用いるのに特に好ましい化合物は、硫酸アンモニウムである。その理由は、コストが低く入手が容易だからである。
【００３８】
アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の液体培地中における濃度は、アンモニウムのモル数として３５〜６６０ｍＭである。好ましくは、５０〜５８０ｍＭである。濃度が３５ｍＭ未満であるとセルラーゼ、特にβ−グルカナーゼの生成量があまり増大しない場合がある。また、この初期濃度が６６０ｍＭを超えると酵素の生産性が低下する。また、アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の液体培地中における濃度は、液体培地中のパルプの濃度に応じて、増減させることが好ましく、例えば、パルプの濃度が３％Ｗ／Ｖである場合は、コスト等を考慮すると５０ｍＭが好ましい。
【００３９】
β−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法
トリコデルマ属糸状菌はセルロースの糖化に必要なセルラーゼの生産菌として知られている。本発明に使用するトリコデルマ属に属する微生物はセルラーゼを生産するものであれば特に限定されない。好ましいトリコデルマ属に属する微生物はトリコデルマ・リーセイ又はトリコデルマ・ビリデである。特に好ましくは、トリコデルマ・リーセイである。
【００４０】
糸状菌トリコデルマ・リーセイおよびトリコデルマ・ビリデの菌学的性質は、例えば、イー・ジー・シモンズ，アブストラクト・セカンド・インターナショナル・マイコロジカル・コングレス（E.G. Simmons, Abst. 2nd International Mycological Congress） 米国フロリダ州タンパ，１９７７年８月，６１８頁）に記載されている。
【００４１】
液体培養には通常の通気撹拌培養装置が用いられ、上記液体培地を使用して、培養温度２０〜３３℃好ましくは、２８〜３０℃、培養ｐＨ４〜６で、４〜１０日間培養する。培養の過程において液体培地に対してパルプを追加してもよい。培養の進行と共に培地中のパルプは分解されるため、炭素源を補うことによりセルラーゼの生成効率が向上する場合があるからである。パルプを追加する場合、追加の形態は連続式でも回分式でもよく、パルプの追加後も攪拌混合が可能であるように、追加の時期及び量を調節すればよい。
【００４２】
パルプを追加する場合、アンモニア態窒素またはアミノ態窒素を必要に応じて、適宜追加してもよい。
【００４３】
ついで、要すればこの培養液から遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去して、トリコデルマ属糸状菌培養上清液が得られる。トリコデルマ属糸状菌培養液または培養上清液には目的とするセルラーゼ、すなわちβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼが高濃度で含まれている。
【００４４】
得られる培養液または培養上清液のβ−グルカナーゼ活性は３０Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは５０Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは６０Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは７０Ｕ／ｍｌ以上である。また、この培養液または培養上清液のキシラナーゼ活性は２５Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは３０Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは４０Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは５０Ｕ／ｍｌ以上である。培養液または培養上清液のβ−グルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性のいずれかが上記下限より低下すると、天然に存在する多様なセルロース資源の有効利用という目的に対する効果が低くなる。
【００４５】
尚、上記ヘミセルラーゼ活性は、oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をDNSと反応させ、５４０ｎｍの吸光度の増加で定量することができる。
【００４６】
より具体的には１％キシラン基質溶液（シグマ社製 Xylan, from oat spelts を２００ｎＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解）１．９ｍｌに培養液または培養上清液0.1ｍｌを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（０．７５％ジニトロサリチル酸、１．２％水酸化ナトリウム、２２．５％酒石酸ナトリウムカリウム４水和物、０．３％乳糖１水和物を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止する。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱する。続いて、室温まで冷却した後、５４０ｎｍの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量する。１単位のヘミセルラーゼ活性は、４０℃、１０分間の反応条件下で、1分間に１μｍｏｌのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表す。
【００４７】
セルロース資源の分解または糖化方法
本発明の方法により得られたβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼは、セルロース資源を分解または糖化するのに有用である。ここでいうセルロース資源は、合成セルロースもしくは天然セルロース資源のどちらでも良い。合成セルロースとは、セルロース粉末として、流通しているものを表す。天然セルロース資源とは、バガス、稲わら、麦わら、ビール粕、木材などが挙げられる。本発明は、β-グルカナーゼおよびキシラナーゼを同時に高生産できるため、特に、バガス、稲わら、麦わら、ビール粕などの天然セルロース資源の糖化に優れている。
【００４８】
セルロース資源の分解または糖化方法は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、一例としては、基質としてセルロース資源を水性媒体中に懸濁させ、上記培養液または培養上清液を添加し、攪拌または振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。セルロース分解活性を示す上記培養液または培養上清液の代わりにその乾燥物、または乾燥物を水に分散もしくは溶解した液を用いてもよい。
【００４９】
セルロース原料は、予め脱リグニンしておくことが好ましい。懸濁方法、攪拌方法、上記混合液の添加方法、添加順序、それらの濃度等の反応条件は、グルコースがより高収率で得られるよう適宜調整される。
【００５０】
その際の、反応液のｐＨ及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は３０〜７０℃、ｐＨは３〜７の範囲でよい。また、この圧力、温度、ｐＨについても、上記同様、グルコースがより高収率で得られるよう適宜調整されるものであるが、常圧で、酢酸またはリン酸緩衝液中で、温度５０〜６０℃、ｐＨ４〜６の範囲で行うことが好ましい。反応時間は一般に６〜１４７時間、好ましくは２４〜７２時間である。
【００５１】
セルロースの糖化により、グルコースを含有する水溶液が得られる。得られた水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩、酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理、晶析処理等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００５２】
上記の方法で精製されたグルコースを主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５４】
実施例１
トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させた。マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー用紙３％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ１５ｍＭ、３５ｍＭ、５０ｍＭ、６５ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭまたは１１５ｍＭになるように添加して燐酸及び水酸化ナトリウムでｐＨ４．８に調整した１００ｍｌの液体培地を５００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに用意した。培養したトリコデルマ・リーセイの１白金耳をこの液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、上清液のβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。なお、コピー用紙はアルカリ処理や熱処理等の前処理をせず、シュレッダー（カール社デスクパーサーＤＳ−４１００）で２ｍｍＸ７ｍｍに裁断したのみで使用した。
【００５５】
（酵素活性の測定）
前記で得られた培養液について酵素活性を測定した。
β-グルカナーゼ活性は、メガザイム社製のβ‐グルカナーゼ測定キットを用い、色素標識したβ-グルカンを基質とした酵素分解によって生じた染色断片を吸光度測定した。具体的には、アゾ大麦グルカン基質溶液０．１ｍｌに培養液０．１ｍｌを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、停止液〔４％酢酸ナトリウム、０．４％酢酸亜鉛、８０％メチルセルソルブを含む（ｐＨ５）〕０．６ｍｌを加えて5分放置し、反応を停止した。続いて遠心分離した後、上澄液を５９０ｎｍの吸光度測定した。１単位のβ-グルカナーゼ活性は、４０℃、１０分間の反応条件下で、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
【００５６】
次に、キシラナーゼ活性は、oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をDNSと反応させ、５４０ｎｍの吸光度の増加で定量した。より具体的には１％キシラン基質溶液［シグマ社製Xylan, from oat speltsを２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解］１．９ｍｌに培養液０．１ｍｌを加えて、４０℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（０．７５％ジニトロサリチル酸、１．２％水酸化ナトリウム、２２．５％酒石酸ナトリウムカリウム４水和物、０．３％乳糖１水和物を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、５４０ｎｍの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量した。１単位のキシラナーゼ活性は、４０℃、１０分間の反応条件下で、１分間に１μｍｏｌのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。結果を図１に示す。
【００５７】
実施例２
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをダンボール３％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて、実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図２に示す。
【００５８】
実施例３
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを新聞紙３％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて、実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図３に示す。
【００５９】
実施例４
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙３％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムを塩化アンモニウムに置き換えてアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ２０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭまたは１２０ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図４に示す。
【００６０】
実施例５
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙３％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムを燐酸二アンモニウムに置き換えてアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ１５ｍＭ、３５ｍＭ、５０ｍＭ、６５ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭまたは１１５ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図５に示す。
【００６１】
実施例６
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙３％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムを硝酸アンモニウムに置き換えてアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ１２ｍＭ、２４ｍＭ、３６ｍＭ、４８ｍＭ、６０ｍＭ、７２ｍＭまたは８４ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図６に示す。
【００６２】
実施例７
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙３％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムをアンモニア水に置き換えてモル濃度がそれぞれ１５ｍＭ、３０ｍＭ、４５ｍＭ、６５ｍＭ、７５ｍＭ、９０ｍＭまたは１０５ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図７に示す。
【００６３】
実施例８
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙３％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムを尿素に置き換えてアミノ態窒素のモル濃度がそれぞれ１７ｍＭ、３３ｍＭ、５０ｍＭ、６７ｍＭ、８３ｍＭまたは１００ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図８に示す。
【００６４】
実施例９
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙に置き換えて濃度が１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％になるように添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が８０ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図９に示す。
【００６５】
実施例１０
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙に置き換えて濃度が１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％になるように添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が１６０ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図１０に示す。
【００６６】
実施例１１
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙に置き換えて濃度が１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％になるように添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が３２０ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図１１に示す。
【００６７】
実施例１２
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙に置き換えて濃度が１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％になるように添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が４８０ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図１２に示す。
【００６８】
参考例１
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースの濃度を１％とし、窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ１５ｍＭ、３５ｍＭ、５０ｍＭ、６５ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭまたは１１５ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図１３に示す。
【００６９】
参考例２
マンデル培地の炭素源である結晶セルロース濃度が１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％または４％になるように添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が１６０ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図１４に示す。
【００７０】
参考例３
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙１％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ１５ｍＭ、３５ｍＭ、５０ｍＭ、６５ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭまたは１１５ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図１５に示す。
【００７１】
参考例４
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙３％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムを硝酸カリウムに置き換えてモル濃度が１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭまたは７０ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図１６に示す。
【００７２】
実施例１３
トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させた。その１白金耳を、マンデル培地１００ｍｌを含む５００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、４日間振とう培養した。マンデル培地１５０ｍｌを含む５００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、２日間振とう培養して培養液を得た。マンデル培地の炭素源である結晶セルロースに置き換えて、コピー紙３％（３０ｇ/ｌ）、６％（６０ｇ/ｌ）又は結晶セルロース（アビセルＰＨ１０１）３％を添加し、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が２００ｍMになるように添加し、ツイーン８０のかわりにアデカノールＬＧ-１２６（株式会社ＡＤＥＫＡ製）６ｇ/ｌを用いた培地３Ｌ及び本培養液を５Ｌ発酵槽（マルビシ製）に添加して、２８℃で培養した。通気は１ＶＶＭ、撹拌は４５０ｒｐｍで、またｐＨは２Ｎ水酸化ナトリウムおよび５倍希釈の燐酸によって培養期間中ｐＨ４．８に一定になるよう調整した。７日目に培養液を遠心分離し、その上清液のβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。その結果を図１７に示す。
【００７３】
なお、コピー紙は、シュレッダー（明光商会社製プリモ１４００）で４ｍｍＸ３０ｍｍに裁断して使用した。また、コピー紙６％（６０ｇ/ｌ）は、一度に全量添加すると撹拌が不十分であったため、コピー紙と硫酸アンモニウムを培養１日目と３日目に半分ずつ分けて加えた。
【００７４】
実施例１４
実施例１３と同様の方法で５Ｌ発酵槽に、コピー紙６％（６０ｇ/ｌ）を添加し、硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が４４ｍＭ、１００ｍＭ、１３４ｍＭまたは２２４ｍＭになるように添加し、酵素生産を調べた。その結果を図１８に示す。
【００７５】
実施例１５
実施例１３と同様の方法で５Ｌ発酵槽に、コピー紙６％（６０ｇ/ｌ）と硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が４５ｍＭを添加し、培養期間中のｐＨ調整用薬液を２Ｎ水酸化ナトリウムを使用した場合と、１８％アンモニア水を使用した場合の酵素生産を比較した。このときのアンモニア水の培養期間中の投入量は１２３ｍＭであった。その結果を図１９に示す。
【００７６】
実施例１６
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙３％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ３３０ｍＭ、４２０ｍＭ、５００ｍＭ、５８０ｍＭ、６６０ｍＭ、７２０ｍＭまたは８００ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図２０に示す。
【００７７】
実施例１７
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースをコピー紙３％（３ｇ／１００ｍｌ）に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムをグルタミン酸ナトリウムに置き換えてアミノ態窒素のモル濃度がそれぞれ１７ｍＭ、３３ｍＭ、５０ｍＭ、６７ｍＭ、８３ｍＭまたは１００ｍＭになるように添加して実施例１と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させ、この１白金耳を液体培地に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、実施例１と同様にしてβ-グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図２１に示す。
【００７８】
実施例１８
実施例１３で得られたコピー紙６％の培地及び結晶セルロース３％の培地のそれぞれの上清液を用いて、セルロース資源の糖化試験を行った。糖化に供するセルロース資源は、セルロース粉末（日本製紙ケミカル製  商品名ＫＣフロックＷ−５０）、バガス、稲わらおよびビール粕を用いた。また、バガス、稲わらおよびビール粕は、それぞれ微粉砕し、０．３ＮのＮａＯＨに懸濁して、１２０℃、１５分間処理し、水で充分に洗浄後、乾燥し、脱リグニン処理を行い、糖化に供した。セルロース粉末は、そのまま糖化に供した。セルロース資源：０．８ｇ、培養上清液：９ｍｌ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．８）：０．２ｍｌからなる液（セルロース資源８％液）を５０℃、ｐＨ４．８、４８時間、振とうさせて糖化し、生成したグルコースをグルコースＣII-テストワコー（和光純薬工業）で測定した。結果を図２２〜図２５に示す。
【００７９】
実施例及び参考例の結果から、炭素源として未処理の紙類を含み、窒素源としてアンモニア／アンモニウム塩を含む液体培地を用いて、トリコデルマ・リーセイを培養することにより、β−グルカナーゼ及びキシラナーゼが同時に高生産されることが示された。また、培地中の紙類の濃度を通常用いられる炭素源より上げるか、又は媒地中のアンモニア／アンモニウム塩濃度を特定範囲に調節することで、これらセルラーゼの生成量が顕著に増大することも示された。更に、得られた培養上清を用いて種々のセルロース資源を分解及び糖化できることも示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
セルロース資源、特にバガスや稲わら等の天然セルロース資源の糖化に極めて有用なβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼを同時に高生産でき、セルロース資源からエタノールを製造するバイオマスエタノール製造に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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