(57)【要約】【課題】癌（特に、食道扁平上皮癌）の治療に用いられる化学療法や放射線療法、およびこれらを組み合わせた化学放射線療法（ＣＲＴ）のオーダーメイド医療化の推進に貢献しうるマーカー（遺伝子）を探索し、これにより、癌の診断や、治療効果および予後の判定に有用な手段を提供する。【解決手段】癌細胞の治療感受性の判定方法が提供される。この判定方法は、被検組織または被検細胞における、ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子の発現量（Ａ１）を測定する工程と、発現量（Ａ１）と所定の発現量（Ａ０）とを比較する工程と、比較した結果、発現量（Ａ１）が発現量（Ａ０）よりも有意に多いか否かを判断することによって、放射線または抗癌剤に対する前記被検組織または前記被検細胞の感受性を予測する工程とを含む。【選択図】図１
2010046057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検組織または被検細胞における、ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子の発現量（Ａ１）を測定する工程と、
前記発現量（Ａ１）と、所定の発現量（Ａ０）とを比較する工程と、
比較した結果、前記発現量（Ａ１）が前記発現量（Ａ０）よりも有意に多いか否かを判断することによって、前記被検組織または前記被検細胞の治療感受性を予測する工程と、
を含む、癌細胞の治療感受性の判定方法。
【請求項２】
前記発現量（Ａ１）を、前記遺伝子から発現するｍＲＮＡ量を測定することにより測定する、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡ量をノーザンブロット法により測定する、請求項２に記載の判定方法。
【請求項４】
前記発現量（Ａ１）を、前記遺伝子から発現するタンパク質量を測定することにより測定する、請求項１に記載の判定方法。
【請求項５】
前記タンパク質量をウェスタンブロット法により測定する、請求項４に記載の判定方法。
【請求項６】
前記治療感受性が、放射線および／または化学療法剤に対する感受性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項７】
前記癌が扁平上皮癌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項８】
前記扁平上皮癌が食道扁平上皮癌である、請求項７に記載の判定方法。
【請求項９】
請求項２または３に記載のｍＲＮＡ量を測定するための核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられる、以下の（ａ）または（ｂ）の核酸：
（ａ）配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列の一部またはこれと相補的な塩基配列を有する核酸；
（ｂ）配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列からなる核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸またはこれと相補的な塩基配列を有する核酸。
【請求項１０】
請求項４または５に記載のタンパク質量を測定するために用いられる、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドあるいはその薬学的に許容されうる塩に対する抗体。
【請求項１１】
ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、
前記遺伝子の発現を検出する発現検出手段と、
を含む、癌細胞の治療感受性判定キット。
【請求項１２】
前記発現測定手段が、マイクロアレイまたはＰＣＲ用プライマーである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
被検動物または被検細胞に対して、被検化合物を投与しまたは接触させる工程と、
前記被検動物または被検細胞における、ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子の発現量（Ｂ１）をインビトロで測定する工程と、
前記発現量（Ｂ１）を、被検化合物の投与または接触前における発現量（Ｂ０）と比較する工程と、
比較した結果、前記発現量（Ｂ１）が前記発現量（Ｂ０）に対して有意に多いか否かを判断することによって、癌細胞の治療感受性の改善に対する前記被検化合物の有効性を評価する工程と、
を含む、癌細胞の治療感受性の改善に有効な化合物の評価方法。
【請求項１４】
配列番号：１または配列番号：３で表される塩基配列を有する核酸を有効成分とする、癌細胞の治療感受性増強剤。
【請求項１５】
配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を有効成分とする、癌細胞の治療感受性増強剤。
【請求項１６】
配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドあるいはその薬学的に許容されうる塩を有効成分とする、癌細胞の治療感受性増強剤。
【請求項１７】
前記治療感受性が、放射線および／または化学療法剤に対する感受性である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の治療感受性増強剤。
【請求項１８】
前記癌が扁平上皮癌である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の治療感受性増強剤。
【請求項１９】
前記扁平上皮癌が食道扁平上皮癌である、請求項１８に記載の治療感受性増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞の治療感受性増強剤、癌細胞の治療感受性の判定方法、および癌細胞の治療感受性判定キットなどに関する。より詳細には、本発明は、ＲＥＧ１遺伝子（具体的には、ＲＥＧ１Ａ遺伝子およびＲＥＧ１Ｂ遺伝子）を用いた前記増強剤、当該遺伝子の発現量を指標とした前記判定方法／判定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌（悪性腫瘍）に対する治療法は、外科的療法、化学療法、免疫療法、温熱療法、および放射線療法に大別される。これらのうち、化学療法と放射線療法とを組み合わせた化学放射線療法（ＣＲＴ）は、ある種の癌に対して良好な治療成績を示すことが知られている。ＣＲＴにおいて用いられる一方の治療法である化学療法は、患者に対して化学療法剤（抗癌剤）を投与するというものであるが、あらゆる薬剤における一般的な課題として、効果／副作用の発現に個人差が存在するという問題がある。
【０００３】
近年、ヒトゲノム計画の進展により、薬剤に対する感受性の個人差を遺伝子レベルで理解し、医薬の開発に応用する薬理ゲノミクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）に関する研究が盛んに行われている。薬剤に対する感受性の個人差を遺伝子レベルで判断できるようになれば、副作用の強い医薬を真に薬効の期待できる患者だけに投与することや、試行錯誤的な投薬を実施することなく、治療の初期から適切な投薬を実施する、いわゆるオーダーメイド医療が可能となる。その結果、患者に無用の肉体的負担を負わせることもなくなり、また、近年高騰する傾向にある医療費の削減にも寄与することとなる。なかでも、抗癌剤は非常に強い副作用をもたらす場合が多く、オーダーメイド医療の適用が強く望まれている。
【０００４】
例えば、ある種の癌細胞のある種の抗癌剤に対する感受性を、遺伝子発現を制御することによって増強させることができれば、遺伝子レベルでの真のオーダーメイド医療が実現されることとなる。
【０００５】
その一方で、ＣＲＴにおいて用いられる他方の治療法である放射線療法についても、これに対する感受性には個人差が存在することが知られている。このような放射線感受性における個人差の存在もまた、各人間の遺伝子レベルの差異によってもたらされることが強く推定されている。したがって、薬理ゲノミクスの趣旨・思想は、放射線感受性の個人差の解明にも同様に適用可能であり、より適切な治療方針の決定に貢献しうるものと考えられる。
【０００６】
ところで、食道扁平上皮癌は予後が非常に悪く、急速な進行過程をたどる悪性度の高い癌の１つである。しかし近年、食道扁平上皮癌には上述した化学放射線療法（ＣＲＴ）が良好な治療成績を示すことが報告され、化学放射線療法（ＣＲＴ）が功を奏した患者には外科的手術に匹敵する効果と予後の改善が得られるようになった。その一方で、化学放射線療法（ＣＲＴ）に対する感受性の低い患者にとっては、治療効果を得ないばかりか重篤な副作用が発現する結果となり、根治手術の可能性を逸する場合もあるという問題があった。このように、例えば食道扁平上皮癌のみに着目しても、個々の患者に適した治療選択を行う個別治療の研究の進展が望まれているのが現状である。
【０００７】
このようなオーダーメイド医療の実現に貢献すべく、病変の診断やこれに対する治療効果、予後などを判定するための各種マーカーが提案されている。例えば、急性冠状動脈症候群に対するＢ型ナトリウム排泄増加性ペプチドの濃度を決定する方法が提案されている（特許文献１を参照）。また、ケモカインＣＸＣＬ１６を検出することにより腫瘍を診断し、抗癌剤の抗癌作用を評価する手法が提案されている（特許文献２を参照）。
【０００８】
なお、ヒトＲＥＧ（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ）遺伝子は糖尿病に関連して膵ランゲルハンス島Ｂ細胞の再生増殖を担っている遺伝子の探索から見出されたものであり、ラットおよびマウスのｒｅｇ遺伝子がこれに対応する。ヒトＲＥＧ遺伝子の塩基配列は、例えば特許文献３において報告されている。ヒトＲＥＧ遺伝子には、コードされるタンパク質の１次構造に応じてＲＥＧ１、ＲＥＧ２、ＲＥＧ３、およびＲＥＧ４の４つのサブクラスに分類される多重遺伝子ファミリーが存在することが知られている。ここで、ＲＥＧ１遺伝子は、９０％膵切除後にニコチンアミド投与したラットの再生ランゲルハンス島で特異的に発現する遺伝子として発見された膵β細胞再生増殖因子（ＲＥＧ１タンパク質）をコードする遺伝子として発見されたものである。そして、ＲＥＧ１遺伝子にはＲＥＧ１Ａ遺伝子およびＲＥＧ１Ｂ遺伝子などがあるが、これらは膵外分泌腺から分泌されるタンパク質をコードしており、２番染色体短腕（２ｐ１２）に位置している。より詳細には、ＲＥＧ１Ａ遺伝子は、８２１ｂｐからなる遺伝子（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２９０９、配列番号：１）であり、１６６アミノ酸からなるタンパク質（ＲＥＧ１Ａタンパク質；ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＨ０５３５０、配列番号：２）をコードしている。また、ＲＥＧ１Ｂ遺伝子は、８１２ｂｐからなる遺伝子（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５０７、配列番号：３）であり、１６６アミノ酸からなるタンパク質（ＲＥＧ１Ｂタンパク質；ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＨ２７８９５、配列番号：４）をコードしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２３４８２３号公報
【特許文献２】特開２００８−３５８３６号公報
【特許文献３】特開平１−１３２３８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、癌（特に、食道扁平上皮癌）の治療に用いられる化学療法や放射線療法、およびこれらを組み合わせた化学放射線療法（ＣＲＴ）のオーダーメイド医療化の推進に貢献しうるマーカー（遺伝子）を探索し、これにより、癌の診断や、治療効果および予後の判定に有用な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った。その過程で、ある種のヒト食道扁平上皮癌由来の細胞株が、他の細胞株と比較して抗癌剤や放射線に対する感受性が有意に高いことを見出した。また、前者の細胞株において有意に高発現している遺伝子として、ＲＥＧ１遺伝子（ＲＥＧ１Ａ遺伝子およびＲＥＧ１Ｂ遺伝子）を同定し、当該遺伝子の発現が癌治療（化学療法および放射線療法）に対する高い感受性に寄与していることを確認した。さらに、当該遺伝子を強制的に導入して高発現を誘導すると、癌治療に対する感受性を増強することができることをも見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の第１の形態によれば、癌細胞の治療感受性の判定方法が提供される。前記判定方法は、被検組織または被検細胞における、ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子の発現量（Ａ１）を測定する工程と、前記発現量（Ａ１）と所定の発現量（Ａ０）とを比較する工程と、比較した結果、前記発現量（Ａ１）が前記発現量（Ａ０）よりも有意に多いか否かを判断することによって、前記被検組織または前記被検細胞の治療感受性を予測する工程とを含む。
【００１３】
この際、発現量（Ａ１）は、例えば、ＲＥＧ１遺伝子から発現するｍＲＮＡ量をノーザンブロット法によって測定したり、当該遺伝子から発現するタンパク質量をウェスタンブロット法により測定したりすることにより、測定されうる。また、被検組織・被検細胞は、食道扁平上皮癌などの扁平上皮癌由来の組織・細胞であることが好ましい。
【００１４】
本発明の第２の形態によれば、上記判定方法において、ＲＥＧ１遺伝子から発現するｍＲＮＡ量を測定する場合に、当該ｍＲＮＡ量を測定するための核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられる核酸も提供される。この際、前記核酸は、以下の（ａ）または（ｂ）である：
（ａ）配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列の一部またはこれと相補的な塩基配列を有する核酸；
（ｂ）配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列からなる核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸またはこれと相補的な塩基配列を有する核酸。
【００１５】
本発明の第３の形態によれば、上記判定方法において、ＲＥＧ１遺伝子から発現するタンパク質量を測定する場合に、当該タンパク質量の測定に用いられる抗体も提供される。当該抗体は、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドあるいはその薬学的に許容されうる塩に対する抗体である。
【００１６】
本発明の第４の形態によれば、癌細胞の治療感受性を判定するためのキットが提供される。当該キットは、ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、前記遺伝子の発現を検出する発現検出手段とを含む。前記キットにおいて、発現測定手段は、例えば、マイクロアレイまたはＰＣＲ用プライマーでありうる。
【００１７】
本発明の第５の形態によれば、癌細胞の治療感受性の改善に有効な化合物の評価方法が提供される。前記評価方法は、被検動物または被検細胞に対して、被検化合物を投与しまたは接触させる工程と、前記被検動物または被検細胞における、ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子の発現量（Ｂ１）をインビトロで測定する工程と、前記発現量（Ｂ１）を、被検化合物の投与または接触前における発現量（Ｂ０）と比較する工程と、比較した結果、前記発現量（Ｂ１）が前記発現量（Ｂ０）に対して有意に多いか否かを判断することによって、癌細胞の治療感受性の改善に対する前記被検化合物の有効性を評価する工程とを含む。
【００１８】
本発明の第６の形態によれば、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを有効成分とする、癌細胞（好ましくは、食道扁平上皮癌などの扁平上皮癌の細胞）の治療感受性（例えば、放射線および／または抗癌剤に対する感受性）増強剤が提供される；
（ａ）配列番号：１または配列番号：３で表される塩基配列を有する核酸；
（ｂ）配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドあるいはその薬学的に許容されうる塩。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、癌（特に、食道扁平上皮癌）の治療のオーダーメイド医療化の推進に貢献しうるマーカー（遺伝子）としてＲＥＧ１遺伝子が提供される。ＲＥＧ１遺伝子をマーカーとして用いることにより、癌の診断や、治療効果および予後の判定に有用な種々の手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１において、ＲＴ−ＰＣＲ法により各細胞系におけるＲＥＧ１α  ｍＲＮＡの発現を確認した結果を示す図である。
【図２】放射線療法を想定した単独環境に各細胞系を曝露した結果を示すグラフである（実施例１）。
【図３】化学療法を想定した単独環境に各細胞系を曝露した結果を示すグラフである（実施例１）。
【図４】化学放射線療法(ＣＲＴ）を想定した併用環境に各細胞系を曝露した結果を示すグラフである（実施例１）。
【図５】実施例１において、カスパーゼ−３アッセイを行った結果を示すグラフである。
【図６】化学放射線療法を行ったＲＥＧ１α陽性患者および化学放射線療法を行ったＲＥＧ１α陰性患者のそれぞれの生存率の変化を表すグラフである（実施例３）。縦軸はすべての死因の総計（総合的死因）に対する生存率（Overall survival rate）であり、横軸は月数（Time(months)）である。
【図７】化学放射線療法を行ったＲＥＧ１α陽性患者および化学放射線療法を行ったＲＥＧ１α陰性患者のそれぞれの生存率の変化を表すグラフである（実施例３）。縦軸は死因が食道扁平上皮癌である場合のみに対する生存率（Esophageal cancer-specific survival rate）であり、横軸は月数である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることはない。
【００２２】
本発明において用いられるタンパク質（「本発明のタンパク質」とも称する）は、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。本発明のタンパク質は、ヒトや他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉（例、平滑筋、骨格筋）、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、白色脂肪組織、褐色脂肪組織）など］等から単離・精製されるタンパク質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成されたタンパク質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換えタンパク質であってもよい。
【００２３】
配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性（ホモロジー；ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（すなわち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
【００２４】
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられうる。
【００２５】
より好ましくは、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性（アイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ））を有するアミノ酸配列である。
【００２６】
本発明で用いられるタンパク質は、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、かつ配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質である。
【００２７】
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などが挙げられる。ここで「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、本発明のタンパク質の活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）や、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。なお、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、それ自体公知の方法に準じて行うことができる。
【００２８】
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、（ｉ）配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１個または２個以上（例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列に１個または２個以上（例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列に１個または２個以上（例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１個または２個以上（例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
【００２９】
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、特に限定されない。
【００３０】
本発明で用いられるタンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有するヒトＲＥＧ１Ａ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＨ０５３５０）、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するヒトＲＥＧ１Ｂ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＨ２７８９５）などが挙げられる。
【００３１】
本明細書において、タンパク質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号：２または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質を初めとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。
【００３２】
ここで、Ｃ末端がエステル（−ＣＯＯＲ）である場合におけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００３３】
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
【００３４】
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００３５】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、かつ該タンパク質と実質的に同質の活性を有する限り、いずれのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同義である。また、「実質的に同質の活性」の測定は、前記した本発明で用いられるタンパク質の場合と同様に行うことができる。
【００３６】
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは１５０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
【００３７】
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１個または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１個または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１個または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１個または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
【００３８】
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここで、Ｃ末端がエステル（−ＣＯＯＲ）である場合におけるＲとしては、本発明で用いられるタンパク質について前記したと同様のものが挙げられる。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、Ｃ末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
【００３９】
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断されて生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００４０】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは遊離体であってもよいし、塩であってもよい（以下、特に断らない限り同様である）。かような塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００４１】
本発明で用いられるタンパク質は、前述したヒトや他の温血動物の細胞または組織から、それ自体公知のタンパク質の精製方法を用いて精製することにより、製造されうる。具体的には、例えば、哺乳動物の組織または細胞を界面活性剤の存在下でホモジナイズし、得られる組織の粗抽出物画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことにより、本発明で用いられるタンパク質が調製されうる。
【００４２】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
【００４３】
ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。すなわち、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドを構成しうる部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のタンパク質（ペプチド）を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
このようにして得られたタンパク質（ペプチド）は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などが挙げられる。
【００４４】
上記方法で得られるタンパク質（ペプチド）が遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質（ペプチド）が塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００４５】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチド、あるいはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、それ自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
【００４６】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。
【００４７】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用されうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適当な混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用されうることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜約５０℃の範囲である。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００４８】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択されうる。
【００４９】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００５０】
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
【００５１】
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
【００５２】
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
【００５３】
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００５４】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜約４０℃の温度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００５５】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
【００５６】
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
【００５７】
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
【００５８】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドは、本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
【００５９】
さらに、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、それをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から該タンパク質または該部分ペプチドを分離精製することによって製造することもできる。本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
【００６０】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターなど）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（以下、「ＰＣＲ法」とも称する）および逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法によって直接増幅することもできる。あるいは、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
【００６１】
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであればよい。
【００６２】
配列番号：１または配列番号：３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性（ホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ））を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。相同性が前記範囲の下限値より小さいと、対応する遺伝子と同じかまたは類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、相同性が前記範囲の下限値未満であっても、対応する遺伝子に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合には同じかまたは類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子（ＤＮＡ）は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。
【００６３】
本明細書における塩基配列の相同性は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
【００６４】
ハイブリダイゼーションは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。
【００６５】
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件を意味する。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
【００６６】
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡは、好ましくは、配列番号：１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２９０９）、配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５０７）などが挙げられる。
【００６７】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれであってもよい。
【００６８】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列の部分塩基配列、または配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ本発明で用いられるタンパク質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとは、前記と同義である。また、ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６９】
本発明で用いられるタンパク質およびその部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に「本発明のタンパク質」とも称する場合がある）をコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全部の領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００７０】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等のそれ自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。
【００７１】
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００７２】
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００７３】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
【００７４】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
【００７５】
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００７６】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、「ＳＶ４０ｏｒｉ」とも称する）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、「ｄｈｆｒ」とも称する）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、「Ａｍｐｒ」とも称する）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、「Ｎｅｏｒ」とも称する、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
【００７７】
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ末端側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
【００７８】
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
【００７９】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
【００８０】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５，８７（１９８４）〕などが用いられる。
【００８１】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
【００８２】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｖｏ，１３，２１３−２１７（１９７７）〕などが用いられる。
【００８３】
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
【００８４】
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−１，ＣＯＳ−３，ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、「ＣＨＯ細胞」とも称する），ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞とも称する），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，マウスＡＴＤＣ５細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞，ヒト２９３細胞、ヒトＨｅＬａ細胞などが用いられる。
【００８５】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行うことができる。
【００８６】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行うことができる。
【００８７】
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行うことができる。
【００８８】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行うことができる。
【００８９】
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行うことができる。
【００９０】
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００９１】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜約８が望ましい。
【００９２】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００９３】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜約４３℃で約３〜約２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
【００９４】
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜約４０℃で約６〜約２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
【００９５】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜約８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜約３５℃で約２４〜約７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００９６】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜約６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜約５日間行い、必要に応じて通気（例えば、５％ＣＯ２）や撹拌を加える。
【００９７】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜約２０％の胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜約８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜約４０℃で約１５〜約６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００９８】
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成させることができる。
【００９９】
上記培養物からの本発明のタンパク質の分離精製は、例えば、下記の方法により行うことができる。
【０１００】
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
【０１０１】
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、それ自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【０１０２】
このようにして得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、それ自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合にはそれ自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
【０１０３】
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【０１０４】
このようにして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。
【０１０５】
さらに、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞タンパク質（転写／）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はＰｒａｔｔ Ｊ．Ｍ．ら，“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ”，Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓＳ．Ｊ．編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ １７９−２０９（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）やＲＴＳ ５００ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ Ｆ．Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１（１９５７）あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ Ａ．Ｈ．ら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０（１９９６）等に記載の方法を用いることができる。
【０１０６】
タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ら（１９８４）前述）や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ Ａ．Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川ら，第２１回日本分子生物学会，ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭＷｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３）等を用いることができる。
【０１０７】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体（以下、「本発明の抗体」とも称する）は、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡであり、特に好ましくはＩｇＧである。
【０１０８】
また、本発明の抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等のフラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
【０１０９】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチド（以下、抗体の説明においては、これらを単に「本発明のタンパク質」とも称する）に対する抗体は、それ自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【０１１０】
以下に、本発明の抗体の免疫原調製法、および当該抗体の製造法について説明する。
【０１１１】
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、上記した本発明のタンパク質またはその部分ペプチド、あるいはそれと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど、いずれのものも使用されうる（以下、これらを単に「本発明の抗原」とも称する）。
【０１１２】
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドは、上記した通り、例えば、（ａ）ヒト、サル、ラット、マウス、ニワトリなどの温血動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（ｃ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養、あるいは（ｄ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。
【０１１３】
（ａ）温血動物の組織または細胞から本発明のタンパク質を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例えば、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、得られる抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られた本発明のタンパク質をそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。
【０１１４】
（ｂ）化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述の（ａ）の方法を用いて天然材料より精製した本発明のタンパク質と同一の構造を有するもの、具体的には、該タンパク質のアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
【０１１５】
（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法〔例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法としては、（１）本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブを用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により該抗原をコードするＤＮＡを単離するか、（２）本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により該抗原をコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを宿主に適合する発現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望の抗原を得ることができる。
【０１１６】
（ｄ）無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記（ｃ）と同様の方法により調製した抗原をコードするＤＮＡを挿入した発現ベクター（例えば、該ＤＮＡがＴ７、ＳＰ６プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼおよび基質（ＮＴＰｓ）を含む転写反応液を用いてｍＲＮＡを合成した後、該ｍＲＮＡを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例えば、大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行なわせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応とを同一反応液中で一括して行うこともできる。
【０１１７】
免疫原としては、本発明のタンパク質の完全な分子やその部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば３個以上の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上、いっそう好ましくは６個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。あるいは、該アミノ酸配列としては、例えば２０個以下の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは１８個以下、より好ましくは１５個以下、いっそう好ましくは１２個以下の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例えば、１個〜数個）は置換可能な基（例えば、Ｃｙｓ残基、水酸基等）によって置換されていてもよい。免疫原として用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を１個〜数個含むアミノ酸配列を有する。
【０１１８】
あるいは、本発明のタンパク質を発現する温血動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。温血動物細胞としては、上記（ａ）項で述べたような天然の細胞、上記（ｃ）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、ニワトリなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７、ＣＨＯ−Ｋ１、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｂａｌｂ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、Ｌ９２９、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｕ１、Ｂ１６、またはＰ３８８などが好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現する天然の温血動物細胞または形質転換した温血動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０）または緩衝液（例えば、ハンクス緩衝塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｌｕｔｉｏｎ；ＨＢＳＳ））に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であればいずれの方法でもよく、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
【０１１９】
本発明の抗原は、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、分子内に１個〜数個の抗原決定基しか有しない低分子量（例えば、分子量約３，０００以下）の抗原（すなわち、本発明のタンパク質の部分ペプチド）を用いる場合には、これらの抗原は通常、免疫原性の低いハプテン分子であるため、適当な担体（キャリアー）に結合または吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然または合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。
【０１２０】
該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対する抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。
【０１２１】
また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基どうしを架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
【０１２２】
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独で、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常１〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリが挙げられる。抗Ｉｇ抗体産生の問題を回避するためには、投与対象と同一種の哺乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおよびラットが好ましく用いられる。
【０１２３】
ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒトを投与対象とする場合には、（ｉ）後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（例えば、マウス）を免疫してヒト抗体を得る、（ｉｉ）後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体を作製する、あるいは（ｉｉｉ）体外免疫法とウイルスによる細胞不死化、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等とを組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。なお、体外免疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制される抗原に対する抗原を取得できる可能性があることや、ｎｇ〜μｇオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了することなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられうる。
【０１２４】
体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましくはマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくはＢリンパ球等が挙げられる。例えば、マウス細胞やラット細胞の場合、４〜１２週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、ハムＦ１２培地等）で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清（ＦＣＳ；５〜２０％程度）添加培地に浮遊させて４〜１０日間程度ＣＯ２インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば０．０５〜５μｇが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物（１〜２週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。
【０１２５】
ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難であるため、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質（例えば、ムラミルジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。
【０１２６】
モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例えば、マウス、ラット）もしくは動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット）から抗体価の上昇が認められた個体もしくは細胞集団を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後４〜１０日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。
【０１２７】
骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイブリドーマを産生しうるものであれば特に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましく、また、細胞融合効率が高いものがより好ましい。また、ハイブリドーマの選択を容易にするために、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性の株を用いることが好ましい。例えばマウス骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１等が、ラット骨髄腫細胞としてはＲ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３等が、ヒト骨髄腫細胞としてはＳＫＯ−００７、ＧＭ１５００−６ＴＧ−２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、ＵＣ７２９−６等が挙げられる。
【０１２８】
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。ＰＥＧの分子量は特に制限はないが、低毒性でかつ粘性が比較的低いＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００が好ましい。ＰＥＧ濃度としては例えば１０〜８０％程度、好ましくは３０〜５０％程度が例示される。ＰＥＧの希釈用溶液としては無血清培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０）、５〜２０％程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望によりＤＭＳＯ（例えば、１０〜２０％程度）を添加することもできる。融合液のｐＨとしては、例えば４〜１０程度、好ましくは６〜８程度が挙げられる。
【０１２９】
抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常１〜１０分間インキュベート（例えば、ＣＯ２インキュベート）することにより効率よく細胞融合を実施できる。
【０１３０】
抗体産生細胞株はまた、リンパ球を形質転換しうるウイルスに抗体産生細胞を感染させて該細胞を不死化することによっても得ることができる。そのようなウイルスとしては、例えばエプスタイン−バー（ＥＢ）ウイルス等が挙げられる。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてこのウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のＥＢウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウイルス混入の可能性のないＥＢシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えＥＢウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。
【０１３１】
マーモセット由来のＢ９５−８細胞はＥＢウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にＢリンパ球を形質転換することができる。この細胞を例えば血清およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）添加培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例えば、約１０７細胞／ｍＬ）で浮遊させて、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常０．５〜２時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はＥＢウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、形質転換の頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とＥロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面にＩｇＧを提示しなくなるので、抗ＩｇＧ抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なＢリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Ｂリンパ球を選別することができる。
【０１３２】
形質転換によって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられうる。
【０１３３】
ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、５〜２０％ＦＣＳを含む動物細胞用培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約０．１ｍＭ、約０．４μＭおよび約０．０１６ｍＭ等が挙げられる。ヒト−マウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いため、１０−７〜１０−３Ｍ程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
【０１３４】
ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生しうる細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたものなどが用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が挙げられ、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。
【０１３５】
また、ハイブリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選択することができるため、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。
【０１３６】
標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには、種々の方法が用いられうる。
【０１３７】
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するため、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は１０〜１４日以内に死滅するため、融合２週間後からはアミノプテリンを除去することができる。ただし、ヒトハイブリドーマについては通常融合後４〜６週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後１週間以上後に除去するのが望ましい。すなわち、マウス細胞の場合、例えば融合７〜１０日後にヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）添加完全培地（例えば、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０）の添加または交換を行う。融合後８〜１４日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径が１ｍｍ程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
【０１３８】
抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ）、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例えば、フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネート）、発光物質（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のＩｇＧに対する抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法、抗ＩｇＧ抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。
【０１３９】
クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングやＦＡＣＳを用いたクローニング（上述）も可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行うことができるが、これに限定されない。
【０１４０】
上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して９６ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例えば、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓ添加ＲＭＰＩ１６４０）中に３０細胞／ｍＬの密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに０．１ｍＬ（３細胞／ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を１０細胞／ｍＬに希釈して別のウェルに同様にまき（１細胞／ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を３細胞／ｍＬに希釈して別のウェルにまく（０．３細胞／ウェル）。目視可能なクローンが出現するまで２〜３週間程度培養し、抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難であるため、１０細胞／ウェルのプレートも調製しておく。通常２回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ヶ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。
【０１４１】
ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。インビトロでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞密度を例えば１０５〜１０６細胞／ｍＬ程度に保ちながら、また、ＦＣＳ濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。
【０１４２】
インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（ＭＯＰＣ）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、５〜１０日後に１０６〜１０７細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、２〜５週間後に麻酔下で腹水を採取する方法が挙げられる。
【０１４３】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、それ自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ、ＱＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行うことができる。
【０１４４】
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。
【０１４５】
本発明の抗体を癌の予防・治療に利用する場合、該抗体は抗腫瘍活性を持つものでなければならないため、得られたモノクローナル抗体の抗腫瘍活性の程度について調べる必要がある。抗腫瘍活性は、抗体の存在下および非存在下における癌細胞の増殖、細胞接着、アポトーシス誘導などを比較することにより測定することができる。
【０１４６】
好ましい実施形態において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用される。このため、本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体（具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体など）であり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、上記したヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定にかつ低コストで提供するためには、後述するヒト抗体産生動物（例えば、マウス）またはファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
【０１４７】
（ｉ）キメラ抗体の作製
本明細書において「キメラ抗体」とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）の配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域（ＣＨおよびＣＬ）の配列が他の哺乳動物種に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。
【０１４８】
キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第６，３３１，４１５号明細書に記載の方法あるいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（例えば、マウス−マウスハイブリドーマ）から、常法に従ってｍＲＮＡもしくは全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。次いで、該ｃＤＮＡを鋳型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマーとしてＶＨおよびＶＬの各Ｎ末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴＤＮＡ、アンチセンスプライマーとしてＣＨおよびＣＬのＮ末端配列をコードする塩基配列とハイブリダイズするオリゴＤＮＡ（例えばＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８８−８９，１９９１参照））を用い、常法に従ってＰＣＲでＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを増幅・精製する。同様の方法により、他の哺乳動物（例えば、ヒト）のリンパ球等より調製したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを増幅・精製する。常法を用いてＶＨとＣＨ、ＶＬとＣＬをそれぞれ連結し、得られたキメラＨ鎖ＤＮＡおよびキメラＬ鎖ＤＮＡを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等）を含むベクターなど）に挿入する。両鎖をコードするＤＮＡは別個のベクターに挿入してもよいし、１個のベクターにタンデムに挿入してもよい。得られたキメラＨ鎖およびキメラＬ鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル由来のＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ラット由来のＧＨＳ細胞などが挙げられる。形質転換には、動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてウシ、ヤギ、ニワトリ等のトランスジェニック技術が確立し、かつ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジェニック動物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易にかつ大量にキメラモノクローナル抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タバコなどのトランスジェニック技術が確立し、かつ主要作物として大量に栽培されている植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、無傷細胞へのパーティクルガン法やＴｉベクター法などを用いてトランスジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量にキメラモノクローナル抗体を得ることも可能である。
【０１４９】
得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すればＦａｂが、ペプシンで分解すればＦ（ａｂ’）２がそれぞれ得られる。
【０１５０】
また、マウスＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを適当なリンカー、例えば１〜４０アミノ酸、好ましくは３〜３０アミノ酸、より好ましくは５〜２０アミノ酸からなるペプチド（例：［Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）ｍ］ｎもしくは［（Ｇｌｙ）ｍ−Ｓｅｒ］ｎ（ｍは０〜１０の整数、ｎは１〜５の整数）等）をコードするＤＮＡを介して連結することによりｓｃＦｖとすることができ、さらにＣＨ３をコードするＤＮＡを適当なリンカーを介して連結することによりｍｉｎｉｂｏｄｙモノマーとしたり、ＣＨ全長をコードするＤＮＡを適当なリンカーを介して連結することによりｓｃＦｖ−Ｆｃとすることもできる。このような遺伝子工学的に修飾（共役）された抗体分子をコードするＤＮＡは、適当なプロモーターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、大量に抗体分子を生産することができる。
【０１５１】
マウスＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを１つのプロモーターの下流にタンデムに挿入して大腸菌に導入すると、モノシストロニックな遺伝子発現によりＦｖと呼ばれる二量体を形成する。また、分子モデリングを用いてＶＨおよびＶＬのＦＲ中の適当なアミノ酸をＣｙｓに置換すると、両鎖の分子間ジスルフィド結合によりｄｓＦｖと呼ばれる二量体が形成される。
【０１５２】
（ｉｉ）ヒト化抗体
本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）以外のすべての領域（すなわち、定常領域および可変領域中のフレームワーク領域（ＦＲ））の配列がヒト由来であり、ＣＤＲの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種が好ましい。
【０１５３】
ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号および第５，６９３，７６２号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺乳動物種（例えば、マウス）由来のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを単離した後、常法により自動ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製等）を用いてシークエンスを行い、得られる塩基配列もしくはそこから推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列データベース［例えば、Ｋａｂａｔ ｄａｔａｂａｓｅ（Ｋａｂａｔら，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ編，第５版，１９９１参照）等］を用いて解析し、両鎖のＣＤＲおよびＦＲを決定する。決定されたＦＲ配列に類似したＦＲ配列を有するヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖をコードする塩基配列［例：ヒトκ型Ｌ鎖サブグループＩおよびヒトＨ鎖サブグループＩＩもしくはＩＩＩ（Ｋａｂａｔら，１９９１（上述）を参照）］のＣＤＲコード領域を、決定された異種ＣＤＲをコードする塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を２０〜４０塩基程度のフラグメントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバーラップするように２０〜４０塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントをＤＮＡシンセサイザーを用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダイズさせ、ライゲーションすることにより、ヒト由来のＦＲと他の哺乳動物種由来のＣＤＲを有するＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを構築することができる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来ＣＤＲをヒト由来ＶＨおよびＶＬに移植するには、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平５−２２７９７０号公報に記載の逐次ＣＤＲ移植法等が挙げられる。このようにして得られるＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。
【０１５４】
ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を用いてｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、Ｆｖなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌や酵母などの微生物でも生産させることができる。
【０１５５】
ヒト化抗体作製技術は、例えばハイブリドーマの作製技術が確立していない他の動物種に好ましく投与しうるモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。
【０１５６】
（ｉｉｉ）ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製
内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウト（ＫＯ）した非ヒト温血動物に機能的なヒトＩｇ遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイブリドーマ作製技術が確立している動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。まず、ヒトＩｇのＨ鎖およびＬ鎖のミニ遺伝子を通常のトランスジェニック（Ｔｇ）技術を用いて導入したマウスと、内因性マウスＩｇ遺伝子を通常のＫＯ技術を用いて不活性化したマウスとを交配して得られたヒト抗体産生マウス（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１７，３９１−３９７（１９９６）を参照）を用いて作製されたヒトモノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段階にあり、現在までのところ抗ヒトＩｇヒト抗体（ＨＡＨＡ）の産生は報告されていない。
【０１５７】
その後、Ａｂｇｅｎｉｘ社［商品名：ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６−１５６（１９９７）；米国特許第５，９３９，５９８号等を参照）］やＭｅｄａｒｅｘ社［商品名：Ｈｕ−Ｍａｂ Ｍｏｕｓｅ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，８４５−８５１（１９９６）；米国特許第５，５４５，８０６号等を参照）］が酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを用いてより大きなヒトＩｇ遺伝子を導入したＴｇマウスを作製し、よりレパートリーに富んだヒト抗体を産生し得るようになった。しかしながら、ヒトＩｇ遺伝子は、例えばＨ鎖の場合、約８０種のＶ断片、約３０種のＤ断片および６種のＪ断片が様々に組み合わされたＶＤＪエクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現しているため、その全長はＨ鎖が約１．５Ｍｂ（１４番染色体）、κＬ鎖が約２Ｍｂ（２番染色体）、λＬ鎖が約１Ｍｂ（２２番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レパートリーを他の動物種で再現するためには、各Ｉｇ遺伝子の全長を導入することが望ましいが、従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ等）に挿入可能なＤＮＡは通常数ｋｂ〜数百ｋｂであり、クローニングしたＤＮＡを受精卵に注入する従来のトランスジェニック動物作製技術では全長の導入は困難であった。
【０１５８】
Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１６，１３３−１４３（１９９７））は、Ｉｇ遺伝子を担持するヒト染色体の自然断片（ｈＣＦ）をマウスに導入して（染色体導入（ＴＣ）マウス）、完全長ヒトＩｇ遺伝子を有するマウスを作製した。すなわち、まず、Ｈ鎖遺伝子を含む１４番染色体およびκＬ鎖遺伝子を含む２番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有するヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間程度紡錘糸形成阻害剤（例えば、コルセミド）で処理して、１本〜数本の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、微小核融合法によりマウスＥＳ細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒトＩｇ遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイブリッドＥＳ細胞を選択し、通常のＫＯマウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られるキメラマウスからコートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト１４番染色体断片を伝達するＴＣマウス系統（ＴＣ（ｈＣＦ１４））およびヒト２番染色体断片を伝達するＴＣマウス系統（ＴＣ（ｈＣＦ２））を樹立する。常法により内因性Ｈ鎖遺伝子およびκＬ鎖遺伝子をＫＯされたマウス（ＫＯ（ＩｇＨ）およびＫＯ（Ｉｇκ））を作製し、これら４系統の交配を繰り返すことにより、４種の遺伝子改変をすべて有するマウス系統（ダブルＴＣ／ＫＯ）を樹立することができる。
【０１５９】
上記のようにして作製されるダブルＴＣ／ＫＯマウスに、通常のマウスモノクローナル抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することができる。しかしながら、κＬ鎖遺伝子を含むｈＣＦ２がマウス細胞内で不安定なため、ハイブリドーマ取得効率は通常のマウスの場合に比べて低いという欠点がある。
【０１６０】
一方、前記Ｈｕ−Ｍａｂ ＭｏｕｓｅはκＬ鎖遺伝子の約５０％を含むが、可変領域クラスターが倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等のκ鎖の多様性を示し（他方、Ｈ鎖遺伝子は約１０％しか含まないのでＨ鎖の多様性は低く、抗原に対する応答性が不十分である）、かつＹＡＣベクター（Ｉｇκ−ＹＡＣ）によりマウス染色体中に挿入されているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、ＴＣ（ｈＣＦ１４）マウスとＨｕ−Ｍａｂ Ｍｏｕｓｅとを交配してｈＣＦ１４とＩｇκ−ＹＡＣとを安定に保持するマウス（商品名：ＫＭマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイブリドーマ取得効率および抗体の抗原親和性を得ることができる。
【０１６１】
さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、λＬ鎖遺伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記と同様の方法でλＬ鎖遺伝子を担持するヒト２２番染色体もしくはその断片を導入したＴＣマウス（ＴＣ（ｈＣＦ２２））を作製し、これと上記ダブルＴＣ／ＫＯマウスやＫＭマウスとを交配することにより得ることもできるし、あるいは、例えばＨ鎖遺伝子座とλＬ鎖遺伝子座とを含むヒト人工染色体（ＨＡＣ）を構築してマウス細胞に導入することにより得ることもできる（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，１０８６−１０９０（２０００））。
【０１６２】
本発明の抗体を医薬品として利用する場合はモノクローナル抗体であることが好ましいが、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体がポリクローナル抗体である場合には、ハイブリドーマの利用を要しないので、ハイブリドーマ作製技術は確立されていないがトランスジェニック技術は確立されている動物種、好ましくはウシ等の有蹄動物を用いて、上記と同様の方法によりヒト抗体産生動物を作製すれば、より大量のヒト抗体を安価に製造することも可能である（例えば、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，８８９−８９４（２００２）を参照）。得られるヒトポリクローナル抗体は、ヒト抗体産生動物の血液、腹水、乳汁、卵など、好ましくは乳汁、卵を採取し、上記と同様の精製技術を組み合わせることによって精製することができる。
【０１６３】
（ｉｖ）ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体を作製するもう１つのアプローチは、ファージディスプレイを用いる方法である。この方法はＰＣＲによる変異がＣＤＲ以外に導入される場合があり、そのため臨床段階で少数のＨＡＨＡ産生の報告例があるが、その一方で宿主動物に由来する異種間ウイルス感染の危険性がない点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能）等の利点を有している。
【０１６４】
ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
【０１６５】
用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ（Ｆｆバクテリオファージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来タンパク質を提示する方法としては、ｇ３ｐ、ｇ６ｐ〜ｇ９ｐのコートタンパク質のいずれかとの融合タンパク質として該コートタンパク質上で発現・提示させる方法が挙げられるが、よく用いられるのはｇ３ｐもしくはｇ８ｐのＮ末端側に融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、１）ファージゲノムのコートタンパク質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示されるコートタンパク質をすべて外来タンパク質との融合タンパク質として提示させるものの他、２）融合タンパク質をコードする遺伝子を野生型コートタンパク質遺伝子とは別に挿入して、融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現させるものや、３）融合タンパク質をコードする遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コートタンパク質遺伝子を有するヘルパーファージを感染させて融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、１）の場合は大きな外来タンパク質を融合させると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のためには２）または３）のタイプが用いられる。
【０１６６】
具体的なベクターとしては、Ｈｏｌｔら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，４５−４４９（２０００））に記載されるものが例示される。例えば、ｐＣＥＳ１（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１８２１８−１８２３０（１９９９）を参照）は、１つのラクトースプロモーターの制御下にｇ３ｐのシグナルペプチドの下流にκＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡとｇ３ｐシグナルペプチドの下流にＣＨ３をコードするＤＮＡ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）を介してｇ３ｐコード配列とが配置されたＦａｂ発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に導入するとｇ３ｐコートタンパク質上にＦａｂを提示するが、アンバー変異を持たないＨＢ２１５１株などで発現させると可溶性Ｆａｂ抗体を産生する。また、ｓｃＦｖ発現型ファージミドベクターとしては、例えばｐＨＥＮ１（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，５８１−５９７（１９９１））等が用いられる。
【０１６７】
一方、ヘルパーファージとしては、例えばＭ１３−Ｋ０７、ＶＣＳＭ１３等が挙げられる。
【０１６８】
また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の３’末端とコートタンパク質遺伝子の５’末端にそれぞれシステインをコードするコドンを含む配列を連結し、両遺伝子を同時に別個に（融合タンパク質としてではなく）発現させて、導入されたシステイン残基同士によるＳ−Ｓ結合を介してファージ表面のコートタンパク質上に抗体を提示しうるようにデザインされたもの（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社のＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ技術）等も挙げられる。
【０１６９】
ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ／非免疫（ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ライブラリー、合成ライブラリー、免疫ライブラリー等が挙げられる。
【０１７０】
ナイーブ／非免疫ライブラリーは、正常なヒトが保有するＶＨおよびＶＬ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲ法により取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイベクターにクローニングして得られるライブラリーである。通常、正常人の末梢血、骨髄、扁桃腺などのリンパ球由来のｍＲＮＡ等が鋳型として用いられる。疾病履歴などのＶ遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススイッチが起こっていないＩｇＭ由来のｍＲＮＡのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的なものとしては、ＣＡＴ社のライブラリー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，５８１−５９７（１９９１）；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，３０９−３１４（１９９６９を参照）、ＭＲＣ社のライブラリー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，４３３−４５５（１９９４）を参照）、Ｄｙａｘ社のライブラリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９（上述）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１４，７９６９−７９７４（２０００）を参照）等が挙げられる。
【０１７１】
合成ライブラリーは、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片の、例えばＣＤＲ３等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするＤＮＡで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的なｓｃＦｖやＦａｂを産生するＶＨおよびＶＬ遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社のＨｕＣＡＬライブラリー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９６，５７−８６（２０００）を参照）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ社のライブラリー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，８５２（２０００）を参照）、Ｃｒｕｃｅｌｌ社のライブラリー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，３９３８（１９９５）；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７２，２１９−２３３（２００３）を参照）等が挙げられる。
【０１７２】
免疫（ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ライブラリーは、癌、自己免疫疾患、感染症等の患者やワクチン接種を受けた者など、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリンパ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等から、上記ナイーブ／非免疫ライブラリーの場合と同様にしてｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法によってＶＨおよびＶＬ遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリー中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーからでも目的の抗体を得ることができる。
【０１７３】
ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンニング操作で取り扱えるファージ数（１０１１〜１０１３ファージ）と通常のパンニングでクローンの単離および増幅に必要なファージ数（１００〜１，０００ファージ／クローン）を考慮すれば、１０８〜１０１１クローン程度が適当であり、約１０８クローンのライブラリーで通常１０−９オーダーのＫｄ値を有する抗体をスクリーニングすることができる。
【０１７４】
標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンニングという。具体的には、例えば、抗原を固定化した担体とファージライブラリーとを接触させ、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体から溶出させ、大腸菌に感染させて該ファージを増殖させる、という一連の操作を３〜５回程度繰り返すことにより抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体としては、通常の抗原抗体反応やアフィニティークロマトグラフィーで用いられる各種担体、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を用いてもよく、また、通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えばビオチン−（ストレプト）アビジン系等が好ましく用いられる。標的抗原である内因性リガンドがペプチドなどの小分子である場合には、抗原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されないように特に注意する必要がある。非結合ファージの洗浄には、ＢＳＡ溶液などのブロッキング液（１−２回）、Ｔｗｅｅｎ等の界面活性剤を含むＰＢＳ（３−５回）などを順次用いることができる。クエン酸緩衝液（ｐＨ５）などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸（例えば、０．１Ｍ塩酸など）が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断（例えば、抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コートタンパク質が提示されるので、コートタンパク質のすべてが融合タンパク質として発現しても大腸菌への感染・増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいはＳ−Ｓ結合の還元（例えば、前記したＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭでは、パンニングの後、適当な還元剤を用いて抗体とコートタンパク質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。
【０１７５】
パンニングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行う。再度ファージを回収し、上述の抗体価測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ等）やＦＡＣＳあるいはＳＰＲを利用した測定により抗原結合活性を確認する。
【０１７６】
選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローンからの抗体の単離・精製は、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子の連結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをアンバー変異を持たない大腸菌（例えば、ＨＢ２１５１株）に感染させると、可溶性抗体分子が産生されペリプラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。Ｈｉｓ−ｔａｇやｃ−ｍｙｃ ｔａｇを導入しておけば、ＩＭＡＣや抗ｃ−ｍｙｃ抗体カラムなどを用いて容易に精製することができる。また、パンニングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分離されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。
ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライブラリーの利用がより有効である。
【０１７７】
（３）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質もしくはペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
【０１７８】
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアータンパク質とハプテンとの混合比は、キャリアータンパク質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜約２０、好ましくは約１〜約５の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
【０１７９】
また、ハプテンとキャリアータンパク質のカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
【０１８０】
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体として、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約１〜約６週毎に１回ずつ、計約２〜約１０回程度行なわれる。
【０１８１】
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
【０１８２】
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【０１８３】
以下に、本発明のタンパク質またはその部分ペプチド（以下、単に「本発明のタンパク質」とも称する）、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸（以下、単に「本発明の核酸」とも称する）、上述の本発明の抗体の用途を説明する。以下の用途はいずれも、「ＲＥＧ１遺伝子（ＲＥＧ１Ａ遺伝子およびＲＥＧ１Ｂ遺伝子）の発現が癌治療（化学療法および放射線療法）に対する高い感受性に寄与している」という、本発明者らによって初めて見出された知見に基づくものである。なお、ＲＥＧ１遺伝子の発現が癌治療に対する高い感受性に寄与するメカニズムは完全には明らかとはなっていない。ただし、放射線照射や化学療法剤（抗癌剤）の投与による癌細胞の死滅は、当該癌細胞におけるアポトーシス経路の活性化によるものであることが知られており、このことから、ＲＥＧ１遺伝子は癌細胞におけるアポトーシス経路の活性化に何らかの影響を及ぼすことで高い治療感受性に貢献していることが強く推測される。
【０１８４】
（１）癌細胞の治療感受性の判定方法
第１に、ＲＥＧ１遺伝子をマーカーとして用いて、癌細胞の治療感受性を判定することができる。すなわち、本発明の第１の形態によれば、癌細胞の治療感受性の判定方法が提供される。なお、本願において「治療感受性」とは、癌を治療する目的で癌細胞に対して施される任意の処置（例えば、放射線の照射や化学療法剤（抗癌剤）の投与など）に対する感受性を意味する。より具体的には、放射線の照射に対する感受性（放射線感受性）とは、放射線によって癌細胞がどの程度殺傷されるかを意味する。同様に、化学療法剤（抗癌剤）の投与に対する感受性（化学療法感受性）とは、化学療法剤（抗癌剤）の投与によって癌細胞がどの程度殺傷されるかを意味する。なお、本願において、「治療感受性」は、１種の治療（処置）のみに対する感受性であってもよいし、２種以上の治療（処置）に対する感受性であってもよい。また、本明細書において「癌細胞」とは、将来的に癌化するように方向づけられている細胞をも含む概念として用いられる。
【０１８５】
本形態の「癌細胞の治療感受性の判定方法」は、被検組織または被検細胞における、ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子（以下、単に「ＲＥＧ１Ａ遺伝子」とも称する）またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子（以下、単に「ＲＥＧ１Ｂ遺伝子」とも称する）（これらの遺伝子をすべて総称して「ＲＥＧ１遺伝子」とも称する）の発現量（Ａ１）を測定する工程と、前記発現量（Ａ１）と所定の発現量（Ａ０）とを比較する工程と、比較した結果、前記発現量（Ａ１）が前記発現量（Ａ０）よりも有意に多いか否かを判断することによって、前記被検組織または前記被検細胞の治療感受性を予測する工程とを含む。以下、工程順に詳細に説明する。
【０１８６】
本形態の「癌細胞の治療感受性の判定方法」では、まず、被検組織または被検細胞における、ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子の発現量（Ａ１）を測定する。
【０１８７】
遺伝子発現量の測定にあたっては、測定対象となる被検組織／被検細胞を生体（例えば、ヒトの生体）から採取することとなるが、被検組織／被検細胞を生体から採取するための具体的な手法については特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。
【０１８８】
ここで、「被検組織」とは、治療感受性の判定の対象となる生体から抽出可能な組織であり、治療感受性の判定の必要のある癌組織であればその種類は特に限定されない。かかる組織の例としては、例えば、扁平上皮癌（食道扁平上皮癌など）、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の組織が挙げられる。なかでも、扁平上皮癌由来の組織であることが好ましく、食道扁平上皮癌由来の組織であることが特に好ましい。
【０１８９】
また、本発明における「被検細胞」も同様に、治療感受性の判定の対象となる生体から抽出可能な組織であり、治療感受性の判定の必要のある癌組織由来の細胞であればその種類は特に限定されない。かかる細胞の例としては、例えば、扁平上皮癌（食道扁平上皮癌）、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の細胞が挙げられる。なかでも、扁平上皮癌由来の細胞であることが好ましく、食道扁平上皮癌由来の細胞であることが特に好ましい。
【０１９０】
次に、本発明において被検対象となる遺伝子であるＲＥＧ１遺伝子について説明する。
【０１９１】
ＲＥＧ遺伝子には、コードされるタンパク質の１次構造に応じてＲＥＧ１、ＲＥＧ２、ＲＥＧ３、およびＲＥＧ４の４つのサブクラスに分類される多重遺伝子ファミリーが存在することが知られている。そして、ＲＥＧ１遺伝子にはＲＥＧ１Ａ遺伝子およびＲＥＧ１Ｂ遺伝子などがあるが、これらは膵外分泌腺から分泌されるタンパク質をコードしており、２番染色体短腕（２ｐ１２）に位置している。より詳細には、ＲＥＧ１Ａ遺伝子は、８２１ｂｐからなる遺伝子（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２９０９、配列番号：１）であり、１６６アミノ酸からなるタンパク質（ＲＥＧ１Ａタンパク質；ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＨ０５３５０、配列番号：２）をコードしている。また、ＲＥＧ１Ｂ遺伝子は、８１２ｂｐからなる遺伝子（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６５０７、配列番号：３）であり、１６６アミノ酸からなるタンパク質（ＲＥＧ１Ｂタンパク質；ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＨ２７８９５、配列番号：４）をコードしている。本形態の判定方法において使用される遺伝子は、ＲＥＧ１遺伝子（ＲＥＧ１Ａ遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子）と機能的に等価な遺伝子であってもよい。
【０１９２】
ここで、「ＲＥＧ１遺伝子（ＲＥＧ１Ａ遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子）と機能的に等価な遺伝子」とは、ＲＥＧ１遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、ＲＥＧ１遺伝子によりコードされるタンパク質と同じかまたは類似の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。具体的には、「配列番号：１または配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」として上述したＤＮＡが、「ＲＥＧ１遺伝子と機能的に等価な遺伝子」として用いられうる。
【０１９３】
本工程においては、被検組織または被検細胞における、ＲＥＧ１遺伝子の発現量（Ａ１）を測定する。ＲＥＧ１遺伝子の発現量の測定手法について特に制限はない。本工程において、ＲＥＧ１遺伝子の発現量（Ａ１）は、当該遺伝子から発現するｍＲＮＡ量を測定することにより測定されうる。この際、前記ｍＲＮＡ量は、例えば、配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列またはそれらの一部を含有する核酸をプローブとして用いるノーザンブロット法やマイクロアレイ法、配列番号：１もしくは配列番号：３またはそれらの一部を含有する核酸をＰＣＲプライマーとして用いるＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法またはそれに準じる方法により測定されうる。一方、本工程において、ＲＥＧ１遺伝子の発現量（Ａ１）を、当該遺伝子から発現するタンパク質量を測定することにより測定してもよい。この際、前記タンパク質量は、配列番号：２もしくは配列番号：４で表されるアミノ酸配列またはそれらの一部を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学法などの方法またはそれに準じる方法により測定されうる。ここで、遺伝子の「発現量」とは、遺伝子転写産物の絶対量または相対量をいい、相対量の場合は、後述する比較対象（例えば、正常組織／正常細胞）における発現量との相対的な比較において当該遺伝子の発現量を決定すればよい。なお、本工程において、発現量を測定する遺伝子はＲＥＧ１Ａ遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子のいずれか一方のみであってもよいし、双方について発現量を測定し、癌細胞の治療感受性を総合的に判断してもよい。
【０１９４】
本形態の「癌細胞の治療感受性の判定方法」では、続いて、上記工程において測定された発現量（Ａ１）を、所定の発現量（Ａ０）と比較する。ここで、「所定の発現量（Ａ０）」とは、被検組織または被検細胞の治療感受性を判定する際の基準となる発現量であって、予め任意に設定可能な値である。「所定の発現量（Ａ０）」を予め設定するにあたっては、本発明者らによって初めて見出された、「ＲＥＧ１遺伝子の発現量が癌細胞の治療感受性（例えば、放射線の照射や化学療法剤（抗癌剤）の投与など）に対して正の相関関係を示す」という知見が考慮される。すなわち、後述する工程において被検組織／被検細胞の治療感受性の有無・高低を判断する際に基準となるような、「この程度の発現量であれば『治療感受性がある』または『治療感受性が高い』」と判断される発現量を、所定の発現量（Ａ０）として予め設定することができる。より具体的には、ある特定の組織や当該組織由来の細胞について、予めＲＥＧ１遺伝子の発現量と治療感受性（放射線感受性および／または化学療法剤感受性）との相関関係を求めておき、これに基づいて所望の「所定の発現量（Ａ０）」を設定することができる。
【０１９５】
本形態の「癌細胞の治療感受性の判定方法」では、続いて、上記で行った比較の結果、発現量（Ａ１）が発現量（Ａ０）よりも有意に多いか否かを判断する。有意差の有無の判断手法について特に制限はなく、当業者に周知の統計学的手法が用いられうる。一例として、統計学的に「有意に多い」とは、有意水準０．０５（５％）で帰無仮説Ｈ０が棄却されることを意味することが多い。そして、この判断の結果に基づき、前記被検組織または前記被検細胞の治療感受性を予測する。すなわち、発現量（Ａ１）が発現量（Ａ０）よりも有意に多い場合には、判定の対象となった被検組織／被検細胞について、「治療感受性がある」または「治療感受性が高い」と予測される。一方、発現量（Ａ１）が発現量（Ａ０）よりも有意に多くはない場合には、判定の対象となった被検組織／被検細胞について、「治療感受性があるとはいえない」または「治療感受性が高いとはいえない」と予測される。このような判定に基づくことで、より適切な治療方針の決定が促進されうる。例えば、本形態の判定方法によって化学療法および／または放射線治療に対する感受性が「ある（高い）」と判定された組織／細胞が由来とする癌病変を有する患者に対しては、化学療法および／または放射線治療を第１選択とした治療方針が決定されることになる。これにより、かような患者に対しては、肉体的・精神的負担を伴う外科的切除術を回避することが可能となり、当該患者にとってより負担や副作用リスクが少なくしかも有効な治療を提供することが可能となる。一方、本形態の判定方法によって化学療法および／または放射線治療に対する感受性が「ない（低い）」と判定された組織／細胞が由来とする癌病変を有する患者に対しては、化学療法／放射線治療以外の選択肢（例えば、外科的切除術）による治療を施すことで、有効ではないために副作用をもたらすばかりの無駄な投薬・放射線照射を回避することが可能となる。
【０１９６】
（２）核酸プローブ／ＰＣＲプライマー
本発明の核酸は、上述した「癌細胞の治療感受性の判定方法」において、ｍＲＮＡ量を測定するための核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられうる。すなわち、本発明の第２の形態によれば、上述した判定方法においてｍＲＮＡ量を測定するための核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられる、以下の（ａ）または（ｂ）の核酸が提供される：
（ａ）配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列の一部またはこれと相補的な塩基配列を有する核酸；
（ｂ）配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列からなる核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸またはこれと相補的な塩基配列を有する核酸。
【０１９７】
ここで、上記（ａ）または（ｂ）の核酸は、上述した判定方法において、ＲＥＧ１遺伝子の発現量を当該遺伝子から発現するｍＲＮＡ量を測定することにより測定する場合に用いられうる。上記核酸は、例えば、ノーザンブロット法やマイクロアレイ法における核酸プローブとして用いられうる。この際、上記核酸は、放射性同位元素などにより標識されたものであってもよい。また、上記核酸は、ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法におけるＰＣＲプライマーとしても用いられうる。ＲＥＧ１遺伝子の発現量を測定するためのこれらの手法は、本技術分野において周知の知見を参照することにより、行われうる。
【０１９８】
（３）抗体
本発明のタンパク質に対する抗体は、上述した「癌細胞の治療感受性の判定方法」において、タンパク質量を測定するのに用いられうる。すなわち、本発明の第３の形態によれば、上述した判定方法においてタンパク質量を測定するために用いられる、配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドあるいはその薬学的に許容されうる塩に対する抗体が提供される。
【０１９９】
ここで、上記抗体は、上述した判定方法において、ＲＥＧ１遺伝子の発現量を当該遺伝子から発現するタンパク質量を測定することにより測定する場合に用いられうる。上記抗体を用いてＲＥＧ１遺伝子の発現量を測定する具体的な手法について特に制限はなく、本技術分野において周知の知見が適宜参照されうる。一例としては、例えば、ウェスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、「サンドイッチ」免疫検定法、免疫組織化学法、免疫沈降検定法、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散検定法、凝集検定法、補体結合検定法、免疫放射線検定法、蛍光免疫検定法、プロテインＡ免疫検定法などの各種の競合的・非競合的な検定法な手法が挙げられる。
【０２００】
（４）癌細胞の治療感受性判定キット
本発明によれば、上述した第１の形態として提供される判定方法を実施するための、癌細胞の治療感受性判定キット（「本発明のキット」とも称する）もまた、提供されうる（第４の形態）。本発明の第４の形態に係る治療感受性判定キットは、ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、前記遺伝子の発現を検出する発現検出手段とを含む。
【０２０１】
本発明のキットにおいて、所定の遺伝子の発現を測定する発現測定手段としては特に制限はないが、例えば、上記所定の遺伝子の発現を測定するノーザンブロット法に用いられる核酸プローブ、上記所定の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマー、または、上記所定の遺伝子がプロットされてなるマイクロアレイが挙げられる。また、上記所定の遺伝子の発現を検出する発現検出手段についても特に制限はないが、例えば、ノーザンブロット用の核酸プローブを可視化するための蛍光標識試薬やラジオアイソトープ（ＲＩ）標識試薬などが挙げられる。その他、本技術分野において周知の知見が適宜参照されうる。
【０２０２】
かようなキットを用いると、被検組織や被検細胞からゲノムＤＮＡを抽出して塩基配列を確認することによって癌細胞の治療感受性を判定するという工程を経ることなく、簡易かつ迅速に癌細胞の治療感受性を判定することが可能となる。
【０２０３】
（５）癌細胞の治療感受性の改善に有効な化合物の評価方法
上述したように、本発明者らによって、「ＲＥＧ１遺伝子（ＲＥＧ１Ａ遺伝子およびＲＥＧ１Ｂ遺伝子）の発現が癌治療（化学療法および放射線療法）に対する高い感受性に寄与している」という知見が初めて見出されている。かような知見に基づき、本発明によれば、癌細胞の治療感受性の改善に有効な化合物を評価するための方法もまた、提供されうる。すなわち、本発明の第５の形態に係る、癌細胞の治療感受性の改善に有効な化合物の評価方法は、被検動物または被検細胞に対して、被検化合物を投与しまたは接触させる工程と、前記被検動物または被検細胞における、ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子の発現量（Ｂ１）をインビトロで測定する工程と、前記発現量（Ｂ１）を、被検化合物の投与または接触前における発現量（Ｂ０）と比較する工程と、比較した結果、前記発現量（Ｂ１）が前記発現量（Ｂ０）に対して有意に多いか否かを判断することによって、癌細胞の治療感受性の改善に対する前記被検化合物の有効性を評価する工程とを含む。以下、工程順に詳細に説明する。
【０２０４】
まず、被検動物または被検細胞に対して、被検化合物を投与しまたは接触させる。ここで、被検化合物としては、癌の治療、予防または診断を目的とする薬剤の候補化合物であれば、その構造や性質は特に問われず、化合物種も限定されない。また、被検化合物を被検動物に投与する方法に特に制限はなく、その都度好適な投与方法を選択すればよい。例えば、経口投与、非経口投与（例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射）が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法についても特に制限はなく、例えば、細胞と被検化合物とを培養液や緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）等の溶液中で混合し、両者を接触させる方法が挙げられる。
【０２０５】
続いて、被検動物または被検細胞における、ＲＥＧ１Ａ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子またはＲＥＧ１Ｂ遺伝子もしくはこれと機能的に等価な遺伝子の発現量（Ｂ１）をインビトロで測定する。当該遺伝子の発現量の測定方法について特に制限はなく、上記「（１）癌細胞の治療感受性の判定方法」の欄において上述した形態が同様に採用されうる。
【０２０６】
その後、上記で測定した投与／接触後の発現量（Ｂ１）を、被検化合物の投与／接触前における発現量（Ｂ０）と比較する。すなわち、本工程では、測定対象の遺伝子の発現量について、投与／接触後の発現量（Ｂ１）が、投与／接触前の発現量（Ｂ０）よりも優位に多いか否かを判断する。有意差の有無の判断手法について特に制限はなく、当業者に周知の統計学的手法が用いられうる。そして、この判断の結果に基づき、癌細胞の治療感受性の改善に対する前記被検化合物の有効性を評価する。すなわち、発現量（Ｂ１）が発現量（Ｂ０）よりも有意に多い場合には、判定の対象となった被検化合物について、「癌細胞の治療感受性の改善に有効である」と予測される。一方、発現量（Ｂ１）が発現量（Ｂ０）よりも有意に多くはない場合には、判定の対象となった被検化合物について、「癌細胞の治療感受性の改善に有効であるとはいえない」と予測される。このような判定に基づくことで、簡易かつ迅速な手法により、癌細胞の治療感受性の改善に有効な化合物をスクリーニングすることが可能となる。
【０２０７】
（６）癌細胞の治療感受性増強剤
上記（１）〜（５）では、被検組織／被検細胞の治療感受性を判定する目的で、ＲＥＧ１遺伝子をマーカーとして用いる技術が提供された。
【０２０８】
ここで、本発明者らは、「ＲＥＧ１遺伝子（ＲＥＧ１Ａ遺伝子およびＲＥＧ１Ｂ遺伝子）の発現が癌治療（化学療法および放射線療法）に対する高い感受性に寄与している」という知見をさらに一歩発展させて、ＲＥＧ１遺伝子を被検組織／被検細胞に強制的に導入して高発現を誘導することを試みた。そして、かような高発現の誘導によって被検組織／被検細胞の癌治療に対する感受性を増強することができることをも見出したのである。そこで、以下では、かような知見に基づき提供されることとなった、本発明のタンパク質または本発明の核酸の治療感受性増強剤としての用途について、詳細に説明する。
【０２０９】
本発明の第６の形態によれば、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを有効成分とする、癌細胞（好ましくは、食道扁平上皮癌などの扁平上皮癌の細胞）の治療感受性（例えば、放射線および／または抗癌剤に対する感受性）増強剤が提供される；
（ａ）配列番号：１または配列番号：３で表される塩基配列を有する核酸；
（ｂ）配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドあるいはその薬学的に許容されうる塩。
【０２１０】
これらの治療感受性増強剤に有効成分として含まれる上記（ａ）〜（ｃ）の具体的な形態については、上述したとおりであるため、ここでは詳細な説明を省略する。
【０２１１】
本形態の治療感受性増強剤を用いる際には、上記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを含む組成物を、治療を要する患者に対して、癌の治療（放射線治療および／または化学療法）前に、有効量（すなわち、適当な投与量）投与する。この際、配列番号：１で表される塩基配列を有する核酸および配列番号：３で表される塩基配列を有する核酸は、それぞれ単独で医薬組成物に含有されて投与されてもよいし、両方の合剤として医薬組成物に含有されて投与されてもよい。同様に、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸、および配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸は、それぞれ単独で医薬組成物に含有されて投与されてもよいし、両方の合剤として医薬組成物に含有されて投与されてもよい。さらに、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドあるいはその薬学的に許容されうる塩、および配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドあるいはその薬学的に許容されうる塩は、それぞれ単独で医薬組成物に含有されて投与されてもよいし、両方の合剤として医薬組成物に含有されて投与されてもよい。
【０２１２】
上記の目的で本発明の核酸を放射線感受性増強剤として用いる場合には、当該核酸を遺伝子運搬に使用されるベクターに導入して、任意の発現プロモーターにより導入遺伝子として治療を要する患者の体内で発現させればよい。この際、配列番号：１で表される塩基配列を有する核酸および配列番号：３で表される塩基配列を有する核酸は、それぞれ単独で前記ベクターに導入されてもよいし、両方同時に導入されてもよい。前記核酸を導入するベクターは、好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスをもとに作製される。このようなウイルスベクターの種類は特に限定されないが、ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられる。
【０２１３】
また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質で置換する、あるいは、遺伝子情報を構成する核酸配列のうち一部を異種ウイルスの核酸配列で置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも用いられうる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが用いられうる（Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２  ２６３−（１９９６））。
【０２１４】
さらに、遺伝子導入を可能にするウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス由来でないベクターとしては、リン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。さらに、遺伝子導入系としてはエレクトロポレーション、遺伝子銃等も使用可能である。
【０２１５】
上述したようなベクターに本発明の核酸を導入して遺伝子発現させるためには、発現プロモーターを備えた発現カセットを用いることが好ましい。用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば特に制限されない。当業者であればそのような発現カセットを容易に選択することができるが、好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットが選択される。前記発現カセットには、本発明の核酸のほか、遺伝子を転写するためのプロモーターやエンハンサー、ポリＡシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識および／または選別のためのマーカー遺伝子、細胞のゲノムＤＮＡ配列内に効率よく該遺伝子を挿入するためのウイルス由来の遺伝子配列、遺伝子発現により産生されるタンパク質を細胞外に分泌および／または細胞内の局所に滞留させるためのシグナル配列等、いかなる配列も用いられうる。
【０２１６】
発現カセットに用いられるプロモーターとしては、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーター等が挙げられる。
【０２１７】
本発明の核酸およびタンパク質は、上述した治療感受性増強剤として用いられる場合、適当な医薬組成の形態として構成されうる。このため、該核酸等を下記の調剤方法に従い、製剤化し、好ましい投与経路を設定して、所望の治療感受性増強効果を達成するように投与量を決定することができる。
【０２１８】
本発明の核酸またはタンパク質を含む医薬組成物は、特に限定されないが、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への被包、組換え細胞による発現、レセプター媒介飲食法、レトロウイルスまたは他のベクターの部分として医薬品への構築が可能である。
【０２１９】
より具体的には、例えば、本発明の核酸を含む組換えウイルスベクターを、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで本発明の核酸を含む組成物が調製されうる。また、本発明のタンパク質を、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで本発明のタンパク質を含む組成物が調製されうる。この際、ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護材として添加して、組成物を調製してもよい。さらに、前記組成物は、所望により薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、安定化剤等を含み、これが好ましい場合が多い。これらの製剤化の助剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６（１９８０）（Ｍａｃｋ出版社）に詳細に記載されている。
【０２２０】
本発明の核酸および／またはタンパク質を有効成分として含む医薬組成物は、適切な投与経路を設定して、患者に投与されると所望の治療線感受性増強効果をもたらす。医薬組成物を生体へ投与する際の投与方法については、特に制限はない。しかし、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内へ注射投与することが好ましい。または、連続して、血流内に投与できるように注入等の他の投与方法も好ましく採用されうる。特に好ましい投与の形態は、静脈内への投与である。本発明の医薬組成物の投与量は、投与経路、投与を受ける患者の状態、年齢、体重、性別、その他により異なるが、処置する医者は、該患者に最適な投与量を決定することが可能である。例えば、注射投与する場合には、１日用量約０．１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇを投与することが好ましく、より好ましくは、１日用量約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【０２２１】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ＲＥＧ１Ａタンパク質をコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
ＲＥＧ１Ａタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
ＲＥＧ１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
ＲＥＧ１Ｂタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
ヒトＲＥＧ１α遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ヒトＲＥＧ１α遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
【実施例】
【０２２２】
以下、実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されない。
【０２２３】
実施例１：インビトロでの基礎的検討
インビトロでの基礎的検討として、食道扁平上皮癌細胞系であるＴＥ−４、ＴＥ−５、ＴＥ−９、およびＴＥ−１２の４種の細胞系を用い、ＲＥＧ１α遺伝子の発現と、化学療法および／または放射線療法後の生存率との相関性の有無を検討した。なお、これらの細胞系はいずれも、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより入手したものである。
【０２２４】
本実施例においては、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法）により各細胞系におけるＲＥＧ１α  ｍＲＮＡの発現量を測定し、また、免疫組織化学法により各細胞系におけるＲＥＧ１αタンパク質の発現量を測定した。具体的な手法は以下の通りである。
【０２２５】
（ＲＴ−ＰＣＲ法）
各細胞系から、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン社製）を用いて全ＲＮＡを単離した。次いで、当該全ＲＮＡの１μｇのサンプルからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを逆転写した。その後、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの際に用いたプライマーの塩基配列は以下の通りである：
（ヒトＲＥＧ１α）
フォワード：５’−ＡＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＡＡＣＣ−３’（配列番号：５）
リバース：５’−ＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＧＴＣＴＴＣＡＣＡＡ−３’（配列番号：６）
（ヒトＧＡＰＤＨ）
フォワード：５’−ＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴ−３’（配列番号：７）
リバース：５’−ＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号：８）
増幅物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供し、臭化エチジウムを用いて染色することで、各細胞系におけるＲＥＧ１α  ｍＲＮＡの発現を確認した。その結果を図１に示す。図１に示すように、陽性対照であるＡＧＳ以外ではＴＥ−１２のみでＲＥＧ１α  ｍＲＮＡの発現が確認された。
【０２２６】
（免疫組織化学法）
ＴＥ−５、ＴＥ−９、およびＴＥ−１２、並びにＡＧＳ（陽性対照）の各細胞系におけるＲＥＧ１αタンパク質の発現を確認する目的で、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（ダコ社製）を用いて免疫組織化学染色を行った。具体的には、これらの各細胞系を２４プレート中で４８時間培養し、次いで４％パラホルムアルデヒドを含有するＴＢＳで１０分間固定した。この細胞を３％過酸化水素溶液中で１０分間インキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼの活性をブロックし、さらにこの細胞を１％ＢＳＡ中で６０分間インキュベートすることにより非特異的なタンパク質の結合をブロックした。その後、細胞を抗ヒトＲＥＧ１モノクローナル抗体（ＴＢＳで１：１００に希釈、１７．２μｇ／ｍＬ）とともに４℃にて一晩インキュベートし、次いでＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ試薬（ダコ社製）とともに６０分間インキュベートした。次いで、この細胞を基質−クロモゲン溶液中で１０分間インキュベートすることにより、シグナルを現像した。最後に、封入剤を数秒間アプライした（ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ、ベクター  ラボラトリーズ社製）。得られた免疫複合体を、共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＭＲＣ−２０００、バイオラッド社製）を用いて観察した。その結果、陽性対照であるＡＧＳ以外ではＴＥ−１２のみにおいて、ＲＥＧ１タンパク質の発現が確認された。
【０２２７】
（化学療法剤／放射線処理）
上記で分類されたＴＥ−５、ＴＥ−９、およびＴＥ−１２の各細胞系に対して、化学療法および／または放射線療法を模した環境に曝露し、それに対する感受性を評価した。具体的には、まず、９６ウェルプレートに細胞を１×１０３細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、放射線療法を想定した単独環境として、放射線を５Ｇｙまたは１０Ｇｙ照射した。一方、化学療法を想定した単独環境として、化学療法剤（抗癌剤）であるシスプラチン（ＣＤＤＰ）を１μＭまたは１０μＭの濃度で添加した。さらに、化学放射線療法（ＣＲＴ）を想定した併用環境として、放射線を５Ｇｙ照射し、ＣＤＤＰ１μＭまたは１０μＭを放射線照射と同時に添加した。
【０２２８】
（細胞増殖の評価；ＭＴＴアッセイ）
上記で処理された各細胞系およびそれぞれについて上記処理を行なわなかったコントロールについて、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖（生存率）を評価した。
【０２２９】
具体的には、上記処理後７２時間さらにインキュベーションを行った後、培地に５．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）を１０μＬ添加し、３７℃にて４時間インキュベートした。その後、抽出溶液（４０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２％酢酸、２０％ＳＤＳ、および０．０３Ｎ  ＨＣｌ）９０μＬを添加し、室温にて２時間インキュベートした。そして、マイクロプレートリーダー（モデル５５０、バイオラッド社製）により波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定することで、細胞の増殖（生存率）を評価した。
【０２３０】
（結果）
以上の手法により評価を行った結果を図２〜図４に示す。図２は、放射線療法を想定した単独環境に各細胞系を曝露した結果を示すグラフである。図２に示すように、ＲＥＧ１α陽性細胞であるＴＥ−１２は、同陰性細胞であるＴＥ−５およびＴＥ−９のそれぞれに対して、５Ｇｙおよび１０Ｇｙの２水準ともに、有意水準１％で有意に高い感受性を示した。
【０２３１】
図３は、化学療法を想定した単独環境に各細胞系を曝露した結果を示すグラフである。図３に示すように、ＲＥＧ１α陽性細胞であるＴＥ−１２は、同陰性細胞であるＴＥ−５およびＴＥ−９のそれぞれに対して、ＣＤＤＰの濃度が１μＭの場合に、有意水準５％で有意に高い感受性を示した。
【０２３２】
図４は、化学放射線療法(ＣＲＴ）を想定した併用環境に各細胞系を曝露した結果を示すグラフである。図４に示すように、ＲＥＧ１α陽性細胞であるＴＥ−１２は、同陰性細胞であるＴＥ−５およびＴＥ−９のそれぞれに対して、ＣＤＤＰの濃度が１μＭの場合に、有意水準５％で有意に高い感受性を示した。
【０２３３】
このように、ＲＥＧ１α陽性細胞は、放射線療法および化学療法のそれぞれの単独環境下、並びにこれらの併用環境下のいずれに対しても、ＲＥＧ１α陰性細胞と比較して高い生存率を示し、治療感受性が高いことが確認された。
【０２３４】
（放射線処理によるアポトーシス活性の評価；カスパーゼ−３アッセイ）
上述した４種の細胞系について、５Ｇｙの放射線照射処理によるアポトーシスの活性化の程度を評価することを目的として、以下の手法によりカスパーゼ−３アッセイを行った。
【０２３５】
ＣＰＰ３２ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（クローンテック社製）を改変したキットを用いて、アポトーシス経路における重要な初期のイベントであるＣＰＰ３２プロテアーゼ（カスパーゼ−３）の活性を測定した。溶解バッファ（５ｍＬ／１００ｍｇ肝）中で細胞を超音波処理し、氷上で１０分間インキュベートし、次いで、４℃にて１５０×ｇで３分間遠心分離した。上清をインキュベートし、１０ｍＭのジチオスレイトールおよび５μＭの基質を含有する反応バッファ５０μＬと混合して、３７℃にて１時間インキュベートした。得られたサンプルの光学濃度を４０５ｎｍでの分光光度法により測定した。その結果を図４に示す。図４に示すように、ＲＥＧ１α陽性細胞であるＴＥ−１２においては、同陰性細胞であるＴＥ−５およびＴＥ−９のそれぞれと比較して、有意水準０．５％で有意にカスパーゼ−３の活性が亢進していることが示された。このことから、ＲＥＧ１α陽性細胞が示す高い治療感受性は、アポトーシス活性の亢進によるものであることが推測される。
【０２３６】
実施例２：インビトロでのＲＥＧ１α遺伝子の導入
上記と同様のＴＥ−５細胞系およびＴＥ−９細胞系にＲＥＧ１α遺伝子を導入（トランスフェクション）し、当該遺伝子の発現を強制的に誘導した。具体的には、配列番号：１で表される塩基配列を有するｃＤＮＡ断片を、ｐＣＩ−ｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（プロメガ社製）のＸｈｏＩ／ＸＢａＩ部位に挿入し、発現ベクターを構築した。次いで、上記で構築した発現ベクターまたは挿入ｃＤＮＡを含まないコントロールベクターをそれぞれエレクトロポレーション法により上記細胞系に導入し、次いで２週間インキュベートして、ＲＥＧ１α遺伝子を安定発現する細胞系を得た。
【０２３７】
得られたＲＥＧ１α陽性細胞およびコントロール細胞について、上述した実施例１と同様の手法により、ＭＴＴアッセイを用いた細胞増殖（生存率）の評価を行った。
【０２３８】
その結果、ＲＥＧ１α遺伝子を強制的に導入したＲＥＧ１α陽性細胞は、放射線療法および化学療法のそれぞれの単独環境下、並びにこれらの併用環境下のいずれに対しても、コントロール細胞と比較して有意に高い生存率を示した。このことから、ＲＥＧ１α遺伝子を強制発現させることは、癌細胞の治療感受性を増強させることにつながることが示された。
【０２３９】
実施例３：インビボでの臨床的検討
本実施例では、インビボでの臨床的検討を行った。なお、本検討は、秋田大学医学部倫理委員会で承認され、実施されたものである。
【０２４０】
対象患者は、２００３年から２００５年の間に秋田大学病院において継続的に化学放射線療法を施した６２名の患者のうち、化学療法および４５Ｇｙ（総量の７５％）以上の放射線療法を同時に施行し、生検標本からパラフィン標本を良好な状態で得られた４２名の患者である。なお、すべての患者は内視鏡下での生検組織に基づいて扁平上皮細胞食道扁平上皮癌であると診断された。すべての患者に関して、食道扁平上皮癌のステージおよび治療方針は、放射線研究者、医師、および外科医からなる検討会で決定された。なお、ステージの分類は、Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｔｕｍｏｒｓ（第６版）のＵＩＣＣ国際対癌連合の腫瘍ノード転移（ＴＮＭ）分類に従った。
【０２４１】
まず、パラフィン標本の作製にあたり、治療前段階で内視鏡的組織摘出を施行した。次いで、得られた食道扁平上皮癌脱パラフィン標本を、１２１℃にて１５分間オートクレーブ処理した。次いで、０．３％の過酸化水素を含むメタノール溶液を用いて室温にて３０分間、さらに１０％ＢＳＡ／ＴＢＳを用いて室温にて３０分間ブロックした。その後、ＰＢＳ中の抗ヒトＲＥＧ１αポリクローナル抗体（１：４００希釈、２．５μｇ／ｍＬ、バイオベンダー  ラボラトリー  メディスン、チェコ）とともに４℃にて一晩インキュベートした。その後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、デンマーク）とともに３０分間インキュベートし、ＤＡＢ（株式会社同仁科学研究所社製）と２分間反応させた。最後に、切片を３０秒間、マイヤーのヘマトキシリンで対比染色した。なお、コントロールとして、抗ヒトＲＥＧ１αポリクローナル抗体による処理を行なわないサンプルを作製した。染色の結果、目視による観察において染色領域が１０％以上のサンプルをＲＥＧ１α陽性と分類し、１０％未満のサンプルをＲＥＧ１α陰性と分類した。この染色領域の判定は、１名の病理学者および２名の外科医によって行われた。
【０２４２】
下記の表１に、化学放射線療法（ＣＲＴ）を行った症例におけるＲＥＧ１αの発現と臨床所見との相関性を示す。表１に示すように、免疫組織化学法による評価の結果、４２名の患者のうち２３名がＲＥＧ１α陽性（ＲＥＧ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であり、１９名がＲＥＧ１α陰性（ＲＥＧ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）であった。なお、これらの２つのグループ（ＲＥＧ１α陽性およびＲＥＧ１α陰性）間で各種の病態パラメーター（年齢（Age (years, Averages±SD)）から追加化学療法（Additional Chemotherapy）まで）を比較したが、有意確率（P value）が０.７９０７〜０.０５５４であり、いずれも０．０５よりも大きく、有意水準５％で有意差はないと判断された。
【０２４３】
一方、それらの化学放射線療法感受性（化学放射線療法によって引き起こされた完治比＝Clinical response for CRT）については、有意確率（P value）が０.０２６８であり、０．０５よりも小さいため帰無仮説は棄却され、有意水準５％で有意差ありと判断された。つまり、ＲＥＧ１α陽性の患者については、化学放射線療法が奏功する確率が有意に高いことが示されたのである。
【０２４４】
【表１】
2010046057.tif 000003
【０２４５】
その詳細は、表１から明らかなように、２３名のＲＥＧ１α陽性患者のうち、８名（３５％）は根治的化学放射線療法によって完治（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＣＲ））に至った。一方、１９名のＲＥＧ１α陰性患者では、完治（ＣＲ）に至ったのは１名（５％）のみであった。
【０２４６】
図５および図６に、化学放射線療法を行ったＲＥＧ１α陽性患者および化学放射線療法を行ったＲＥＧ１α陰性患者のそれぞれの生存率の変化を表すグラフを示す。なお、図５において、縦軸はすべての死因の総計（総合的死因）に対する生存率（Overall survival rate）であり、横軸は月数（Time(months)）である。また、図６において、縦軸は死因が食道扁平上皮癌である場合のみに対する生存率（Esophageal cancer-specific survival rate）であり、横軸は月数である。
【０２４７】
この図５および図６を比較すると、総合的死因に対する生存率および食道扁平上皮癌のみの死因による生存率のいずれにおいても、ＲＥＧ１α陽性患者の生存率はＲＥＧ１α陰性患者の生存率よりも有意に高かった。実際に、ＲＥＧ１α陰性患者のほとんど（９５％）は診断後１２カ月以内に死亡したが、ＲＥＧ１α陽性患者２３名のうち１０名（４３％）は診断後少なくとも２年間生存していた。
【０２４８】
さらに表１においてこれらの調査結果と、年齢・腫瘍部位（Tumor location (上部対中間部または下部）)・侵潤の深度（Depth of invasion (T2-3対T4)）、リンパ節転移（Lymph node metastasis (N1対N0)）、遠隔転移（Distant metastasis (M０対M１)）・腫瘍分化度（Tumor differentiation（低分化対非低分化（中・高分化）)）・臨床病期（Clinical stage (ステージII-III対IV)）、およびＲＥＧ１αの発現（陽性対陰性）の一変量および多変量解析と一致していた。以上のことから、ＲＥＧ１αの発現が、化学放射線療法を施行した食道扁平上皮癌患者の重要な予後因子であることが示される。
【０２４９】
参考例：外科的手術とＲＥＧ１α発現との関係
表１、図５〜図６には直接記載されてはいないが、外科的摘出術を施された７６名の食道扁平上皮癌患者を対象として、外科的手術の予後とＲＥＧ１α発現との関係を検討した。なお、上述した患者７６名のうち、外科的摘出術のみを施された患者は２１名（２８％）であり、癌再発のために補助的に化学療法または追加化学療法を施された患者は５５名（７２％）であった。
【０２５０】
これらの患者７６名を、上述したのと同様の免疫組織化学法によって分類したところ、ＲＥＧ１α陽性患者が５４名（７１％）、ＲＥＧ１α陰性患者が２２名（２９％）であった。これらの２つの群間で、臨床病態パラメーターにおける有意な差は見られなかった。また、総合的死因や食道扁平上皮癌のみの死因による生存率からも、ＲＥＧ１α陽性患者とＲＥＧ１α陰性患者との間で有意な差は見られなかった。
【図２】
2010046057.tif 000004
【図３】
2010046057.tif 000005
【図４】
2010046057.tif 000006
【図５】
2010046057.tif 000007
【図１】
2010046057.tif 000008
【図６】
2010046057.tif 000009
【図７】
2010046057.tif 000010
【配列表】
2010046057000001.app