(57)【要約】【課題】NF-κBに対する公知のオリゴヌクレオチドデコイよりもNF-κBとの結合能が高い、NF-κBデコイとして有用な新規なオリゴヌクレオチド及びその医薬用途を提供すること。【解決手段】オリゴデヌクレオチドは、コンセンサス配列の両端に特定の塩基配列を有する5'側付加配列及び3'側付加配列が付加された塩基配列を有する二本鎖から成るステム構造部分の両端に２つのループ構造を備える環状ステイプル型のオリゴデオキシヌクレオチドである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つのステム構造の両端に２つのループ構造を備える環状ステイプル型オリゴデオキシヌクレオチドであって、該ステム構造部分が下記一般式[I]で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとその相補鎖とから成るオリゴヌクレオチド。
Ａ-Ｘ-Ｂ   [I]
（一般式[I]中、Ｘはgggatttccc又はgggactttccで示されるコンセンサス配列、Ａはcgc、ccc、gga、cgca、ccct及びggctから成る群より選択される5'側付加配列、Ｂはagc、acc、ggg、gcg、gcc及びgcggから成る群より選択される3'側付加配列を示す）。
【請求項２】
前記コンセンサス配列がgggatttcccである請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記ステム構造部分が、cgcgggatttcccagc、cccgggatttcccacc、ggagggatttcccggg、cgcagggatttcccgcg、ccctgggatttcccgcc又はggctgggatttcccgcggで示される塩基配列の何れかとその相補的配列とからなる請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記ループ構造部分が１つのループあたり１〜１０塩基からなる請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記ループ構造部分が１または複数個のアデニン（Ａ）からなる請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
隣接する少なくとも２個のヌクレオチド間の結合が、耐ヌクレアーゼ修飾されている請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記コンセンサス配列を構成する９組の隣接ヌクレオチド間結合のうち、少なくとも５組の隣接ヌクレオチド間の結合が耐ヌクレアーゼ修飾されている請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
全ヌクレオチド間の結合が、耐ヌクレアーゼ修飾されている請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記コンセンサス配列を構成するヌクレオチド間の結合のみが耐ヌクレアーゼ修飾され、他のヌクレオチド間の結合は修飾されていない請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記耐ヌクレアーゼ修飾が、ホスホロチオエート化である請求項６ないし９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドからなるNF-κBデコイ。
【請求項１２】
前記NF-κBがp65タンパクを含む請求項１１記載のNF-κBデコイ。
【請求項１３】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬。
【請求項１４】
虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移・浸潤、または悪液質の予防、改善または治療剤である請求項１３記載の医薬。
【請求項１５】
血管再狭窄、急性冠症候群、脳虚血、心筋梗塞、虚血性疾患の再潅流障害、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎症、糸球体硬化症、アルブミン尿症、腎炎、腎不全、慢性関節リウマチ、変形性関節症、椎間板変性症、喘息、慢性閉塞性肺疾患または嚢胞性線維症の予防、改善または治療剤である請求項１３記載の医薬。
【請求項１６】
経皮的冠動脈形成術、経皮的血管形成術、バイパス手術、臓器移植または臓器の手術後におこる血管の再狭窄の予防、改善または治療剤である請求項１３記載の医薬。
【請求項１７】
前記血管再狭窄が、人工血管、カテーテル、ステントの使用または静脈移植に起因する再狭窄である請求項１６記載の医薬。
【請求項１８】
前記血管再狭窄が、閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、大動脈乖離、急性冠症候群、脳虚血、マルファン症候群、プラークラプチャーに対する外科的治療に起因する再狭窄である請求項１６記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な環状ステイプル型オリゴヌクレオチド及びそれから成るNF-κBデコイに関する。本発明のNF-κBデコイは、虚血性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、癌の転移、浸潤等の予防、改善又は治療等に有用である。
【背景技術】
【０００２】
NF-κB(nuclear factor kappa B)は、サイトカインや接着因子等、免疫反応に関する遺伝子の発現を調節する役割を持つ一群の転写因子の総称であり、NF-κBがゲノム遺伝子上の結合部位に結合すると、免疫反応に関する遺伝子が過剰に発現する。このため、NF-κBは、免疫反応が原因となるアトピー性皮膚炎や関節リウマチ等のアレルギー性疾患、自己免疫疾患、さらには心筋梗塞等の虚血性疾患や動脈硬化等の各種疾患に関与することが知られている。
【０００３】
一方、転写因子に対するデコイを投与することにより、対象となる転写因子の活性を低下させ、該転写因子に起因して起きる疾患の治療や予防を行なうことが知られている。デコイ(decoy)とは、英語で「おとり」の意味であり、ある物質が本来結合あるいは作用すべきものと似せた構造を有するものをデコイと呼んでいる。ゲノム遺伝子上の結合領域に結合する転写因子のデコイとしては、主として該結合領域と同じ塩基配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが用いられている（特許文献１〜３)。このようなオリゴヌクレオチドから成るデコイの共存下では、転写因子の分子のうちの一部は、本来結合すべきゲノム遺伝子上の結合領域に結合せずに、オリゴヌクレオチドデコイに結合する。このため、本来結合すべきゲノム遺伝子上の結合領域に結合する転写因子の分子数が減少し、その結果、転写因子の活性が低下することになる。この場合、オリゴヌクレオチドは、本物のゲノム遺伝子上の結合領域の偽物（おとり)として機能して転写因子を結合するため、デコイと呼ばれる。NF-κBに対するオリゴヌクレオチドデコイも種々知られており、それらの薬理効果も種々知られている（特許文献４〜１２)。
【０００４】
細胞内に送達されたデコイオリゴヌクレオチドが細胞内でいかに長時間安定して存在し得るかも、上記機序を効率よく作用させるための重要な鍵となりうることは、周知の事実である。オリゴヌクレオチドは、細胞内のヌクレアーゼにより分解されるため、細胞内および核内で安定して存在させることは難題であるが、この難題を克服するために、オリゴヌクレオチドに種々の修飾を施す方法が試みられてきた（例えば非特許文献１、特許文献１３)。その中でも最もよく用いられる修飾は、ホスホロチオエート（ＰＳ）化による修飾であり、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する抵抗性が高いことから、治療用オリゴヌクレオチドとして注目されている(例えば、非特許文献２)。なお、ホスホロチオエート化とは、隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を構成するリン原子に結合している２個の非架橋酸素原子のうちの１個をイオウ原子に変換することである。
【０００５】
しかしながら、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは、天然型のホスホジエステルオリゴヌクレオチドに比べて顕著に高いヌクレアーゼ抵抗性を有する一方で、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドに比べて、標的分子との結合能が低下すること、および標的分子への特異性が低下することなどの不利益が認められる場合が多い（非特許文献１、非特許文献３）。さらにまた、ホスホロチオエート基は毒性を有するため、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドに比べて、細胞毒性が高い場合が多く（非特許文献４）、これもまた、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドの治療薬としての用途における不利益となっている。
【０００６】
また、オリゴヌクレオチドの生体内での安定性を高めるために、二本鎖オリゴヌクレオチドの両端が、それぞれ一本鎖のループで連結された（すなわち、二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖の5'末端が、その相補鎖の3'末端と一本鎖のループで連結され、前記一方の鎖の3'末端が、その前記相補鎖の5'末端と一本鎖のループで連結された）、環状のオリゴヌクレオチドを形成することが知られている（非特許文献８〜１０）。このような環状オリゴヌクレオチドは、環状ダンベル型、リボン型、環状ステイプル型等と呼ばれ、直鎖状のオリゴヌクレオチドデコイを環状にすることにより、生体内での安定性が高まり、デコイとしての活性が高まることも知られている。
【０００７】
【特許文献１】特再表96/035430号公報
【特許文献２】特許3392143号公報
【特許文献３】WO95/11687号公報
【特許文献４】特開2005-160464号公報
【特許文献５】国際公開公報WO96/35430
【特許文献６】国際公開公報WO02/066070
【特許文献７】国際公開公報WO03/043663
【特許文献８】国際公開公報WO03/082331
【特許文献９】国際公開公報WO03/099339
【特許文献１０】国際公開公報WO04/026342
【特許文献１１】国際公開公報WO05/004913
【特許文献１２】国際公開公報WO05/004914
【特許文献１３】特表平０８−５０１９２８号公報
【非特許文献１】Milliganら、J．Med．Chem．1993，36，1923
【非特許文献２】Marwick, C.,(1998) J. Am. Med. Assoc., 280, 871
【非特許文献３】Stein & Cheng，Science 1993，261，1004
【非特許文献４】Levinら、Biochem. Biophys. Acta, 1999, 1489, 69
【非特許文献５】Neish ASら、J. Exp. Med. 1992, Vol. 176, 1583-1593.
【非特許文献６】Leung Kら、Nature. 1988 Jun 23;333(6175):776-778.)
【非特許文献７】Marina A.ら、The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol.270, Number 6, pp. 2620-2627
【非特許文献８】Yasuo Kunugizaら、Arthritis Research & Therapy 2006, 8:R103(http://arthritis-research.com/content/8/4/R103)
【非特許文献９】JD Ahnら、Gene Therapy (2002) 9, 1682-1692
【非特許文献１０】Curr Drug Targets. 2003 Nov;4(8):619-23
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のようにNF-κBに対するオリゴヌクレオチドデコイは公知であるが、公知のオリゴヌクレオチドデコイよりもNF-κBに対する結合能が高いオリゴヌクレオチドデコイを提供することが望ましいことは言うまでもない。従って、本発明の目的は、NF-κBに対する公知のオリゴヌクレオチドデコイよりもNF-κBとの結合能が高い、NF-κBデコイとして有用な新規なオリゴヌクレオチド及びその医薬用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従来技術では、NF-κBが結合する領域の改良に力が注がれていた。本願発明者らは、NF-κBが結合する領域に隣接する領域の塩基配列が、NF-κBとの結合能に重要な役割を果たしているのではないかと考えた。そして、下記参考例に具体的に記載するように、同一の結合領域に隣接する領域について、１００種類ものオリゴヌクレオチドを作製し、そのNF-κBとの結合能を試験し、NF-κBとの結合能が高いオリゴヌクレオチドを見出し、特許出願した(PCT/JP2006/325502)。そして、これらの阻害活性が高いオリゴヌクレオチドをステイプル型の環状構造とすることにより、NF-κBとの結合能がさらに高まることを見出し本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、１つのステム構造の両端に２つのループ構造を備える環状ステイプル型オリゴデオキシヌクレオチドであって、該ステム構造部分が下記一般式[I]で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとその相補鎖とから成るオリゴヌクレオチドを提供する。
Ａ-Ｘ-Ｂ   [I]
（一般式[I]中、Ｘはgggatttccc又はgggactttccで示されるコンセンサス配列、Ａはcgc、ccc、gga、cgca、ccct及びggctから成る群より選択される5'側付加配列、Ｂはagc、acc、ggg、gcg、gcc及びgcggから成る群より選択される3'側付加配列を示す）。
また、本発明は、上記本発明のオリゴヌクレオチドからなるNF-κBデコイを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、公知のデコイオリゴヌクレオチドよりもNF-κBとの結合能が高い新規なオリゴヌクレオチドが提供された。本発明のオリゴヌクレオチドは、NF-κBとの結合能が高いので、公知のオリゴヌクレオチドよりもNF-κBに対するデコイとして優れた性能を発揮し、NF-κBの生理活性をより大きく低下させることができる。従って、本発明のデコイを有効成分として含む各種医薬は、優れた薬効を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上記の通り、本発明のオリゴヌクレオチドは、環状ステイプル型の構造を有する。本明細書及び特許請求の範囲において、「ステム構造」とは相補的二本鎖DNAが直鎖を形成した構造をいう。「ループ構造」とは、ステム構造をつなぎ、一本鎖DNAがループを形成する構造をいう。「ステム構造」と「ステム」は、同義に用いられる。また、「ループ構造」と「ループ」は同義に用いられる。「環状ステイプル型の構造」とは、環状一本鎖から構成され、相補的な二本鎖オリゴヌクレオチドであるステム構造部分と、その両末端に非相補的なヌクレオチドからなるループ構造部分を有している構造をいう。すなわち、二本鎖オリゴヌクレオチドの＋鎖の5'末端が、その相補鎖（−鎖）の3'末端と一本鎖のループ（ループ鎖１）で連結され、前記＋鎖の3'末端が、その相補鎖の5'末端と一本鎖のループ（ループ鎖２）で連結された構造をいう（下記表８参照）。
【００１３】
「ステイプル型」は、非特許文献９及び非特許文献１０に記載されているように「ダンベル型」と呼ばれることもある。また、非特許文献８に記載されているように「リボン型」とも呼ばれている。従って、本明細書における「ステイプル型」は、公知の「リボン型」または「ダンベル型」と同義に用いられる。
【００１４】
上記の通り、本発明の環状ステイプル型オリゴヌクレオチドは、そのステム構造部分の＋鎖が、上記一般式[I]で表される塩基配列を有する。なお、本発明において、「塩基配列を有する」とは、オリゴヌクレオチドの塩基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「cgcgggatttcccagcで示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド」とは、cgcgggatttcccagcの塩基配列を持つ１６塩基のサイズのオリゴヌクレオチドを意味する。上記の通り、ステイプル型構造のステム構造部分は二本鎖であり、上記一般式[I]で表される塩基配列を有する＋鎖と、その相補鎖から構成される。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシヌクレオチドである。
【００１５】
一般式[I]中、Ｘで表されるコンセンサス配列は、gggatttccc（配列番号１、非特許文献５)又はgggactttcc（配列番号２、非特許文献６)であり、配列番号１の配列がより好ましい。これらのコンセンサス配列は、NF-κBファミリーが共通して結合するゲノム遺伝子の結合領域の塩基配列を有する。
【００１６】
一般式[I]中のＡは、Ｘで表されるコンセンサス配列の5'側末端に付加されている配列であるので、本発明において「5'側付加配列」と呼び、cgc、ccc、gga、cgca、ccct及びggctから成る群より選択される。一般式[I]中のＢは、Ｘで表されるコンセンサス配列の3'側末端に付加されている配列であるので、本発明において「3'側付加配列」と呼び、agc、acc、ggg、gcg、gcc及びgcggから成る群より選択される。
【００１７】
一般式[I]で表されるオリゴヌクレオチドの好ましい例としては、cgcgggatttcccagc（配列番号３)、cccgggatttcccacc（配列番号４)、ggagggatttcccggg(配列番号５)、cgcagggatttcccgcg(配列番号６)、ccctgggatttcccgcc(配列番号７)及びggctgggatttcccgcgg（配列番号８）を挙げることができる。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、隣接する少なくとも２個のヌクレオチド間の結合を、耐ヌクレアーゼ修飾してヌクレアーゼに対する耐性を増大させることが好ましい。好ましくは、前記コンセンサス配列を構成する９組の隣接ヌクレオチド間の結合（上記コンセンサス配列はいずれも１０塩基であるから、隣接するヌクレオチドの組は９組である）のうち、５組以上、好ましくは７組以上の隣接ヌクレオチド間の結合が耐ヌクレアーゼ修飾されている。ここで、「耐ヌクレアーゼ修飾」とは、ヌクレアーゼによる分解を天然のDNAよりも受けにくくする修飾のことを意味し、このようなDNAの修飾自体は周知である。耐ヌクレアーゼ修飾の例としては、ホスホロチオエート化（本明細書において「Ｓ化」と呼ぶことがある)、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化等を挙げることができる。これらのうち、Ｓ化が好ましい。Ｓ化は、上記の通り、隣接するヌクレオチド間のリン酸エステル結合を構成するリン原子に結合している２個の非架橋酸素原子のうちの１個をイオウ原子に変換することを意味する。任意の隣接するヌクレオチド間の結合をＳ化する手法自体は周知であり、例えば、非特許文献７に記載された方法により行なうことができ、Ｓ化オリゴヌクレオチドは商業的にも合成されている。本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、全てのヌクレオチド間の結合がＳ化されたオリゴヌクレオチド（以下、本明細書において「完全Ｓ化オリゴヌクレオチド」と呼ぶことがある）も好ましいが、コンセンサス配列を構成するヌクレオチド同士の間の結合のみがＳ化され、他のヌクレオチド間（コンセンサス配列の末端のヌクレオチドと、5'付加配列又は3'付加配列の末端のヌクレオチドとの間も包含する）は修飾されていないオリゴヌクレオチド（以下、このようなオリゴヌクレオチドを本明細書において「部分Ｓ化オリゴヌクレオチド」と呼ぶことがある）はより好ましい。下記参考例に具体的に示されるように、部分Ｓ化オリゴヌクレオチドは、同一の配列を有する完全Ｓ化オリゴヌクレオチドと比較して、NF-κBに対する結合能が約３〜５倍高く、一方、オリゴヌクレオチドの中央部分を占めるコンセンサス配列はＳ化によりヌクレアーゼに対する耐性が付与されているので、ヌクレアーゼに対する耐性は完全Ｓ化オリゴヌクレオチドと比較してそれほど低下しない。このため、部分Ｓ化オリゴヌクレオチドは、生体内においてNF-κBデコイとして優れた性能を発揮すると考えられる。なお、上記した各耐ヌクレアーゼ修飾は、ステム構造部分を構成する二本鎖のうち、どちらか一方の鎖にのみ行なってもよいが、二本鎖とも修飾することが好ましい。
【００１９】
環状ステイプル型構造では、ステム構造部分の両端にそれぞれループ構造が存在する。ループ構造を構成するヌクレオチドの数は、通常、１個から１０個程度、好ましくは３個から６個程度である。ループ構造は、二本鎖を形成せずにループとなるものであればその塩基配列は限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドでは、ステム構造の末端及び末端から２個目の塩基としてチミンが来る場合がないので、ループ構造の塩基は全てアデニン（Ａ）とすれば、確実にループを形成しやすく、簡便で好ましい。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、市販の核酸合成装置を用いて合成することができる。また、PCR等の核酸増幅法により大量調製することも可能である。オリゴヌクレオチドを、環状ステイプル型とする方法も非特許文献８〜１０に記載されているように周知であり、例えば、アニーリングにより所定の環状ステイプル型構造をとるように設計した２種類の一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングし、ニックの部分をT4 DNAリガーゼ等のDNAリガーゼで連結することにより調製することができる。
【００２１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、NF-κBデコイとしての用途を有する。従って、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドから成るNF-κBデコイをも提供する。ここで、「NF-κB」とは、NF-κB／Relファミリーメンバーのタンパク質のホモあるいはヘテロ二量体のことをいう。「NF-κBファミリー」は、NF-κB／Relファミリーメンバーのタンパク質をいう。例えばP50, P52, P65(Rel-A), c-Rel, Rel-Bのことである。「ホモあるいはヘテロ二量体」は、NF-κBファミリーメンバーのタンパク質のすべての組み合わせを含む。また、ここで、「実質的に二本鎖から成る」とは、完全な二本鎖か又は少なくともいずれか一方の末端の１塩基若しくは２塩基が一本鎖となっているものを意味する。NF-κBデコイとしては、実質的に二本鎖から成るオリゴヌクレオチドであれば用いることができるが、完全な二本鎖が好ましい。また、一本鎖のオリゴヌクレオチドは、核酸増幅法における鋳型や、本発明のオリゴヌクレオチドをアフィニティクロマトグラフィーで精製する際のリガンドとしての用途を有する。また、部分的な二本鎖オリゴヌクレオチドは、実質的に二本鎖から成るオリゴヌクレオチドを生成させたり、変性させて一本鎖オリゴヌクレオチドを生成させる出発物質としての用途を有する。
【００２２】
上記のようにNF-κBデコイは、既に種々のものが公知であり、それらの医薬用途も種々知られている。従って、本発明のNF-κBデコイも、公知のNF-κBデコイと同様、医薬としての用途を有する。より詳細には、本発明のNF-κBデコイは、虚血性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移・浸潤、または悪液質の予防、改善または治療剤；血管再狭窄、急性冠症候群、脳虚血、心筋梗塞、虚血性疾患の再潅流障害、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎症、糸球体硬化症、アルブミン尿症、腎炎、腎不全、慢性関節リウマチ、変形性関節症、椎間板変性症、喘息、慢性閉塞性肺疾患または嚢胞性線維症の予防、改善または治療剤；並びに経皮的冠動脈形成術、経皮的血管形成術、バイパス手術、臓器移植または臓器の手術後におこる血管の再狭窄の予防、改善または治療剤等としての医薬用途を有する。ここで、前記血管再狭窄としては、人工血管、カテーテル、ステントの使用または静脈移植に起因する再狭窄；並びに閉塞性動脈硬化症、動脈瘤、大動脈乖離、急性冠症候群、脳虚血、マルファン症候群、プラークラプチャーに対する外科的治療に起因する再狭窄を挙げることができる。
【００２３】
これらの医薬用途に用いる場合、オリゴヌクレオチドの投与経路は、特に限定されないが、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、対象臓器ないしは組織への直接投与等の非経口投与が好ましい。投与量は、対象疾患、患者の症状、投与経路等により適宜設定されるが、通常、成人１日当たり0.1〜10000nmol、好ましくは1 〜1000 nmol、より好ましくは10〜100 nmolを投与することができる。製剤は、常法により行なうことができ、例えば、注射剤の場合には、生理食塩水中に本発明のオリゴヌクレオチドを溶解した溶液の形態とすることができる。製剤中には、保存剤、緩衝剤、溶解補助剤、乳化剤、希釈剤、等張化剤などの、製剤分野で常用される添加剤が適宜混合されていてもよい。また、他の薬効成分を含んでいてもよい。
【００２４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
参考例    ステム構造部分のみから成る二本鎖直鎖状オリゴヌクレオチド
１．  オリゴヌクレオチドの調製
NF-κBの公知のコンセンサス配列である配列番号１の配列の両端に付加配列が結合された１００種類のオリゴデオキシリボヌクレオチド(以下、「ODN」と呼ぶことがある)を常法のアミダイト重合法により作製した。ホスホロチオエート化は、ホスホロチオエート化するアミダイトの重合反応の後、脱トリチル反応および硫黄を含む化学物質により酸化反応させた後、次のアミダイトを添加して重合反応に供した。互いに相補的な２本の鎖をそれぞれ化学合成し、ハイブリダイズさせて完全な二本鎖ODNとした。なお、各ODNは、両鎖とも、全ヌクレオチド間の結合をＳ化した（以下、「SODN」と呼ぶことがある）ものであった。そのSODN番号、塩基配列、配列番号、長さ、融解温度(Tm)を表１−１から表１−３に示す。なお、表１−１から表１−３に示される１００種類のオリゴヌクレオチドのうち、一般式[I]で表されるオリゴヌクレオチドは、SODN7（配列番号３)、SODN8（配列番号４)、SODN9（配列番号５)、SODN16（配列番号６)、SODN17（配列番号７)及びSODN30（配列番号８)の６種類である。
【００２６】
【表１−１】
2010130900.tif 000002
【００２７】
【表１−２】
2010130900.tif 000003
【００２８】
【表１−３】
2010130900.tif 000004
【００２９】
２．  NF-κBとの結合能の測定（一次スクリーニング）
各SODNのNF-κBとの結合能は、各SODNとNF-κB(p65)とを反応させた後、残存する遊離のNF-κBを、市販のNF-κB測定用キット(TransAM Kit(NF-κB, p65、ACTIVE MOTIF社)を用い、キットに含まれるJurkat, TPA and CI-Stimulated, Nuclear Extract（フォルボールエステル (TPA)及びカルシウムイオノフォア (CI)で刺激したJurkat細胞の核抽出物）のNF-κB分子を使用して評価した。測定は、キットの説明書に従って行なった。なお、該キットは、NF-κB(p65タンパク)が結合するコンセンサス配列を不動化したウェルにNF-κB溶液を加え、洗浄後、固相に結合されたNF-κBをELISAにより定量するものである。この測定方法によれば、オリゴヌクレオチドのNF-κBとの結合能が高いほど、ELISAにより定量されるNF-κBの量が少なくなる。
【００３０】
上記の測定は、具体的には次のようにして行った。各SODN溶液をキットに含まれるComplete Binding Bufferを用いて段階希釈し、測定検体とした（公比３、4段階、n=3）。測定検体を30μLずつウェルに加え、コントロール及びブランクのウェルにはComplete Binding Bufferを加えた。キットに含まれるComplete Lysis Bufferで125μg/mLになるように希釈した、キットに含まれるJurkat, TPA and CI-Stimulated, Nuclear Extractを20μLずつ各ウェルに加え、ブランクのウェルにはComplete Lysis Bufferを加えた。1時間振とうしながらインキュベートした後、ウェルをキットに含まれる1X Wash Bufferにて洗浄し、抗NF-κB(p65タンパク)抗体を加えて1時間インキュベートした。ウェルを1X Wash Bufferにて洗浄し、抗ウサギHRP-結合IgGを加えて1時間インキュベートした。1X Wash Bufferにて洗浄し、キットに含まれる現像液(Developing Solution)を加えて10分間発色後、停止液(Stop Solution)を加えて反応を停止し、450nmおよび630nmの吸光度を測定した。
【００３１】
450nmの吸光度から630nmの吸光度を差し引き、さらにブランクの平均値を差し引き、コントロールの平均値を100％とした時の各濃度の平均値のコントロールに対する割合(％)を算出し、50％を挟む2点間の回帰直線より値が50％となる（結合を50％阻害する）濃度を算出した（解析ソフト（Graph Pad PRISM 4, GraphPad SOFTWARE）を使用)。コントロールに用いたオリゴヌクレオチドの塩基配列は、公知のNF-κBデコイオリゴヌクレオチドである完全Ｓ化ccttgaagggatttccctcc(配列番号１０３)を用いた。測定した100種類のSODNのうち、活性の高かった10種類のSODN（SODN6,7,8,9,16,17,27,30,36,91）及び活性の低かった2種類のSODN (SODN82,83)についての結果を表２に示す。なお、表２において、対照デコイのIC50値にばらつきがあるのは、100種類のSODNを１８群に分けて実験し、各実験(run)において、それぞれ対照値を測定したためである。
【００３２】
【表２】
2010130900.tif 000005
【００３３】
３．  NF-κBとの結合能の測定（二次スクリーニング）
１次スクリーニングで活性の高かった10種類のSODN（SODN6,7,8,9,16,17,27,30,36,91）及び活性の低かった2種類のSODN (SODN82,83)について、公比3、6段階、n=3で1次スクリーニングと同様の試験方法でNF-κB（p65タンパク)への結合阻害活性を比較した。比較対照として公知のNF-κBデコイオリゴヌクレオチドである完全Ｓ化ccttgaagggatttccctcc(配列番号１０３)を用いた。結果を表３−１及び表３−２に示す。
【００３４】
【表３−１】
2010130900.tif 000006
【００３５】
【表３−２】
2010130900.tif 000007
【００３６】
表３−１及び表３−２に示されるように、SODN7,8,9,16,17,30（本発明のオリゴヌクレオチド）で対照デコイオリゴヌクレオチドと比較して2.5倍から3倍の阻害活性がみられた。最も活性の低かったSODN82と最も活性の高かったSODN7を比較すると、5.2倍の差があった。
【００３７】
４．  部分Ｓ化オリゴヌクレオチドの結合能
本発明のオリゴヌクレオチドであるSODN7,8,9,16,17及び30の部分Ｓ化オリゴヌクレオチド（両鎖とも、コンセンサス配列を構成するヌクレオチド間のみをＳ化したもの、以下、「PSODN」と呼ぶことがある)のNF-κB(p65タンパク)との結合能を上記と同様に調べた。結果を表４及び表５に示す。なお、表５は、SODNの結合能とPSODNの結合能を並べて比較した表である。また、これらの表中、対照デコイは、配列番号１０３で示される塩基配列を有する完全Ｓ化オリゴヌクレオチドである。また、例えば、SODN7とPSODN7のように、番号が同じオリゴヌクレオチドは、同じ塩基配列を有し、その塩基配列は上記したとおりである。
【００３８】
【表４】
2010130900.tif 000008
【００３９】
【表５】
2010130900.tif 000009
【００４０】
上記表４及び表５に示すように、PSODNは、同じ塩基配列を有するSODNと比較して、NF-κB(p65タンパク)に対する結合能が3.2倍〜4.8倍高かった。
【００４１】
５．  他の各種NF-κB ファミリータンパク質に対する結合阻害試験
コンセンサス配列のみS化したデコイ核酸(PSODN7,8,9,16,17および30)について、他のNF-κBファミリータンパク質（p50, p52, Rel-B）についても同様に阻害がみられるかどうか検討した。上記検討の方法は基本的に前記１次スクリーニングの実験手法と同様である。公比3、6段階、n=2で各種NF-κB ファミリータンパク質のNF-κB コンセンサス結合部位への結合阻害活性を比較した。比較対照として公知のNF-κBデコイオリゴヌクレオチドである完全Ｓ化ccttgaagggatttccctcc(配列番号１０３)を用いた。各種NF-κB ファミリータンパク質に対する結合阻害試験は、NF-κB Family TransAM Kit(ACTIVE MOTIF社製)を用い、p50についてはJurkat, TPA and CI-Stimulated, Nuclear Extract(ACTIVE MOTIF社製)、Rel-B、p52についてはRaji nuclear extract(ACTIVE MOTIF社製)の各種NF-κB ファミリータンパク質分子を使用して評価した。また、1次抗体は、それぞれ抗NF-κB p50抗体、抗NF-κB p52抗体または抗Rel-B抗体を使用し、2次抗体はすべてHRP標識抗ウサギIgGを使用した。
【００４２】
上記の測定は、具体的には次のようにして行った。各オリゴ核酸溶液をComplete Binding Bufferを用いて段階希釈し、測定検体とした。測定検体を30μLずつウェルに加え、コントロール及びブランクのウェルにはComplete Binding Bufferを加えた。Complete Lysis Bufferで希釈した核抽出液（nuclear extract）を20μLずつ各ウェルに加え、ブランクのウェルにはComplete Lysis Bufferを加えた。1時間振とうしながらインキュベートした後、ウェルを1X Wash Bufferにて洗浄し、1次抗体を加えて1時間インキュベートした。ウェルを1X Wash Bufferにて洗浄し、2次抗体を加えて1時間インキュベートした。1X Wash Bufferにて洗浄し、Developing Solutionを加えて10分間発色後、Stop Solutionを加えて反応を停止し、450nmおよび630nmの吸光度を測定した。
【００４３】
解析方法は、450nmの吸光度から630nmの吸光度を差し引き、さらにブランクの平均値を差し引いた後、コントロールの平均値を100％とした時の各濃度の平均値のコントロールに対する割合(％)を算出し、解析ソフト（Graph Pad PRISM 4, GraphPad SOFTWARE）を用いて50％阻害濃度(IC50)を算出した。結果を表６に示す。なお、p65は2次スクリーニングでの値（上記表４）を援用している。
【００４４】
【表６】
2010130900.tif 000010
【００４５】
従来型のNF-κB デコイ（完全Ｓ化配列番号１０３、以下同じ）とIC50値を比較した場合、Rel-Bに関しては4.2〜10.3倍、p52に関しては5.4〜2.0倍、p50については12.2〜7.8倍強い結合阻害活性がみられた。従って、コンセンサス配列のみS化した新規配列デコイ核酸はp65タンパク質だけでなく、その他の各種NF-κBファミリータンパク質に対しても強い結合阻害活性をもつことが示された。
【００４６】
５．  S化位置を変えたデコイ核酸のNF-κB p65タンパク質に対する結合阻害試験
オリゴヌクレオチド配列上のS化の位置の影響について、付加配列のみS化したデコイ核酸（FSODN）、S化なしのデコイ核酸（ODN）を同配列について合成し、公比3、6段階、n=2でNF-κB コンセンサス結合部位への結合阻害活性を比較した。NF-κB p65タンパク質に対する結合阻害試験は、NF-κB, p65 TransAM Kit(ACTIVE MOTIF社製)を用い、Jurkat, TPA and CI-Stimulated, Nuclear Extract(ACTIVE MOTIF社製)のNF-κBタンパク質分子を使用して評価した。試験方法は上記実施例５と同様に行った。なお、「付加配列のみS化」とは、付加内および付加とコンセンサス配列の間がS化されているものを意味しており、例えば配列７なら  CsGsCsGGGATTTCCCsAsGsCとなる。比較した結果を表７に示す。また、PSODNは2次スクリーニングでの値（上記表４）を援用している。
【００４７】
【表７】
2010130900.tif 000011
【００４８】
コンセンサス配列のみS化したデコイ核酸（PSODN）と比較した結果、FSODNおよびODNによる阻害活性は、IC50値が100nM以上と低くなった。ただし、FSODN16については従来型のNF-κBデコイよりも約3.9倍強い結合阻害活性がみられた。従って、同じ配列でも、S化の位置により、結合阻害活性が大きく異なることが示唆された。
【００４９】
実施例
上記参考例に記載した、2本鎖デコイ核酸において、コンセンサス配列のみをS化したときに最も強いNF-κB  p65タンパク結合阻害活性を示したという結果に基づき、コンセンサス配列のみをS化した、新規配列の環状ステイプル型デコイを合成し、その阻害活性を比較した。
【００５０】
１．  環状ステイプル型オリゴヌクレオチドの合成
下記表８に示す構造の環状ステイプル型オリゴヌクレオチドを合成した。２個のループはそれぞれ４個のＡから成っている。表８中、小文字のｓは、Ｓ化された結合を示す。表８から明らかなように、合成した環状ステイプル型オリゴヌクレオチドは、ステム構造部分のコンセンサス配列を構成する全オリゴヌクレオチド間のみがＳ化され、それ以外の部分はＳ化されていないものであった。環状ステイプル化は、非特許文献８や非特許文献９に記載されている周知の方法により行なった。
【００５１】
【表８】
2010130900.tif 000012
【００５２】
２．  NF-κBとの結合能
合成した各環状ステイプル型デコイのNF-κBとの結合能を参考例と同様にして測定した。ただし、測定検体の段階希釈は６段階で、各濃度の検体数は２であった(n=2)。結果を下記表９に示す。
【００５３】
【表９】
2010130900.tif 000013
＊従来型の完全Ｓ化NF-κBデコイ（配列番号１０３）のIC50値を１としたときの各種ステイプル型デコイの阻害活性比
【００５４】
表９から明らかなように、本発明の環状ステイプル型デコイは、従来型のNF-κBデコイと比較して、NF-κBへの結合能がはるかに高かった。
【００５５】
３．  ステイプル型デコイ核酸におけるコンセンサス配列S化によるNF-κB p65タンパクに対する結合阻害活性への影響
ステイプル型デコイにおけるコンセンサス配列Ｓ化の影響を調べるため、従来型のNF-κBデコイ（配列番号１０３）をステイプル型にし、それぞれS化なし（Staple original no_S）およびコンセンサス配列のみS化（Staple original core _S）したものを合成した。これらの配列を下記に示す。さらに新規配列ステイプル型デコイ核酸の中で活性の高かった2つ(Staple 8およびStaple 17)についても、それぞれ、S化なし（no_S）およびコンセンサス配列のみS化(core_S)（上記表８）のステイプル型デコイを合成し、その結合阻害活性を比較した。なお、ループ部の構成は、上記表８に示すものと同じである。
【００５６】
【化１】
2010130900.tif 000014
Staple original no_S
【００５７】
【化２】
2010130900.tif 000015
Staple original core_S
【００５８】
結果を下記表１０に示す。ステイプル型デコイにおいても、コンセンサス配列をS化することにより、結合阻害活性が強くなる結果となった。S化なしのステイプル型デコイは従来型のNF-κB デコイと比較した場合、1／66〜1／175と阻害活性は低かったが、同じ配列でもコンセンサス配列をS化することにより、阻害活性は従来型より強くなり、従来配列では4.4倍、新規配列8および17ではそれぞれ7.1および7.0倍強かった。
【００５９】
【表１０】
2010130900.tif 000016
＊従来型の完全Ｓ化NF-κBデコイ（配列番号１０３）のIC50値を１としたときの各種ステイプル型デコイの阻害活性比
【配列表】
2010130900000001.app