(57)【要約】【課題】ＡＤを処置するための有効な免疫治療法を提供すること。【解決手段】一つの局面において、本発明は、アミロイドペプチドＡβ４２の残基４〜１０（ＦＲＨＤＳＧＹ）を含む免疫原性組成物およびペプチドに関する。本発明はさらに、Ａβ（４−１０）抗原決定基に結合する抗体に関する。本発明は、アルツハイマー病を処置するための方法、およびアルツハイマー病の患者におけるアミロイドの容量を減少するための方法を提供する。本発明はまた、アミロイド沈着物の低分子インヒビターを設計するための方法に関する。本発明の免疫原性組成物および抗体はまた、アルツハイマー患者におけるアミロイド負荷を減少することによって、アルツハイマー病の症状を改善するための方法において使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、アルツハイマー病のための免疫学的方法および組成物に関する。本発明はさらに、アミロイド斑形成を阻害し、そして／またはアルツハイマー病および他の神経変性疾患に関連する存在するアミロイド斑を排除する化合物を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の記載）
アルツハイマー病（「ＡＤ」）は、神経変性脳疾患であり、老年層の間の痴呆の主な原因である。ＡＤの症状は、学習機能および記憶機能の進行性の喪失、人格の変化、神経筋変化、痙攣およびときおり見られる精神病性の挙動が挙げられ得る。
【０００３】
アルツハイマー病は、以下の２つの異なる神経障害によって特徴付けられる：記憶機能および他の認知機能に重要な脳領域におけるアミロイド斑の沈着；ならびに神経細胞内の神経細線維もつれの発生。アミロイド斑の沈着は、脳のこれらの重要な領域において、脳機能を妨害すると考えられる。同様に、神経細線維もつれ（これは、ＡＤ患者の神経細胞内で蓄積している）により、ニューロン間の連絡が妨害されると提唱されている。
【０００４】
アルツハイマー病のさらなる特徴は、アミロイド斑の主な構成成分としての疎水性アミロイドβペプチド（Ａβ４２）の存在である。アミロイドβペプチド（Ａβ４２）は、アミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）として公知の、またはあるいはアルツハイマー病アミロイドＡ４タンパク質として公知の、正常な完全膜タンパク質のタンパク質分解プロセシングから形成されるフラグメントである。
【０００５】
アミロイドβペプチド（Ａβ）は、ＡＰＰからプロセシングされる、３９〜４３アミノ酸長のペプチドの群を含む。非特許文献１を参照のこと。Ａβペプチドは、一般に、ＡＰＰ膜貫通領域の１１〜１５残基を含み、従って、疎水性領域を含むが、Ａβペプチド全体は、両親媒性特徴を有し得る。非特許文献２を参照のこと。Ａβペプチドは、培養物中で細胞に対して毒性であることが示されている。非特許文献３；非特許文献４を参照のこと。アルツハイマー病におけるＡβペプチドの毒性は、可溶性Ａβペプチドが不溶性原線維へと凝集し、その後、原線維がアミロイド斑へと組み込まれるプロセスに関連すると考えられている。非特許文献３；非特許文献５；および非特許文献６を参照のこと。同様に、Ａβペプチドは、インビトロで原線維を形成し、このプロセスは、Ａβ凝集および原線維形成の阻害を測定するために利用され得る。
【０００６】
以前は、いくつかのグループが、アルツハイマー病のトランスフェニックマウスモデルを使用していた。そのモデルにおいて、トランスジェニックマウス（これは、脳におけるアミロイド沈着および認知欠損の両方を示す）が、Ａβ４２抗原調製物で免疫された。これらの研究からの結果により、Ａβ４２での免疫は、マウスのアルツハイマー病様神経障害および空間記憶の損傷両方の減少を生じ得ることが実証された。非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９および非特許文献１０を参照のこと。Ｂａｒｄらは、Ａβ４２ワクチンでの免疫が、おそらく、小グリア細胞の活性化、およびその後の小グリア細胞によるＡβ４２凝集物の飲み込みをもたらすと仮定した。非特許文献１１。不運なことに、アミロイド斑沈着の減少および改善された認知機能の根底にある免疫学的機構の全ては、未だ解明されていない。
【０００７】
抗体３Ｄ６および１０Ｄ５（そのエピトープは、それぞれ、Ａβ残基１〜５および３〜６である）の受動的投与の以前の研究は、トランスジェニックマウスにおけるＡβおよびアミロイド斑両方の負荷の減少において有効であった。非特許文献１１を参照のこと。マウスは、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の変異疾患関連形態についてトランスジェニックであり、血小板由来（ＰＤ）増殖因子プロモーターの制御下にあった。これらの（ＰＤＡＰＰ）マウスは、ヒトアミロイド前駆タイタンを過剰発現し、アルツハイマー病の病理学的症状の多くが現れる。非特許文献１１を参照のこと。
【０００８】
別の研究において、ｍ２６６（Ａβの残基１３〜２８に対する抗体）の末梢投与は、ＰＤＡＰＰマウスにおける血漿クリアランスを介して脳Ａβ荷重を減少することが示された。非特許文献１２を参照のこと。このｍ２６６抗体は、Ａβの第２の免疫原性部位に対して指向され、Ａβオリゴマー（プロトフィブリルおよび斑）に対する異なる結合特異性またはＣＮＳへの差次的な接近を示し得る。
【０００９】
Ａβ４２抗原およびＡＰＰは、自己タンパク質であり、従って、これらのタンパク質を発現する個体において通常は免疫原性でない。結論として、これらの抗原に基づくワクチンを作ろうとする試みは、必ず自己免疫を誘導する必要がある。さらに、自己免疫を誘導しようとするいずれの免疫プロトコールも、このような自己抗原によって誘導される免疫応答を注意深く試験しなければならない。この場合、Ａβ４２またはＡβ４２のエレメントを組み込む任意の自己抗原が、通常のＡＰＰタンパク質に対する自己免疫を誘導せず、その正常な細胞機能を破壊しないことは重要である。
【００１０】
ＡＤを処置するための有効な免疫治療法を開発するために、Ａβ４２型抗原での免疫後の、アミロイド斑負荷の免疫媒介性の減少の免疫学的機構が、決定され得ることは、望ましい。
【００１１】
有益な生物学的活性を有するエピトープのみを組み込む免疫原性組成物および抗原を設計するために、アミロイド斑減少の機構の知見を利用することは有利である。さらなる利点は、このような免疫原性組成物が、有害な免疫を誘導するエピトープを排除するように設計され得ることである。従って、Ａβ抗原の異常な形態のみに対する非常に特異的かつ制限された免疫応答を誘導する規定された抗原が必要である。
免疫療法において使用されて、Ａβ抗原の病的な形態に対してのみ、非常に特異的かつ限定された免疫応答を誘導し得る規定された抗原を含む、免疫原性組成物もまた必要である。さらに、受動免疫療法において使用するための有利な生物学的特性を有する、規定されたＡβエピトープに対する抗体を単離することは有利である。アルツハイマー病患者がＡβ抗原の免疫原性組成物での治療から利益を得ているか否かを、治療を開始してできるだけすぐに決定するための診断アッセイを開発することは、さらに有利である。アミロイド沈着および原線維形成のインヒビターを同定することがさらに必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｐａｌｌｉｔｔｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：３５７０−３５７８（１９９９）
【非特許文献２】Ｋａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：７３３−７３６（１９８７）
【非特許文献３】Ｐｉｋｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０７：３６７−３６８（１９９１）
【非特許文献４】Ｉｖｅｒｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１１：１−１６（１９９５）
【非特許文献５】Ｐｉｋｅら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６３：３１１−３１４（１９９１）
【非特許文献６】Ｐｉｋｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１６７６−１６８７（１９９３）
【非特許文献７】Ｓｃｈｅｎｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ４００：１７３−１７７（１９９９）
【非特許文献８】Ｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：９１６−９１９（２０００）
【非特許文献９】Ｊａｎｕｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９７９−９８２（２０００）
【非特許文献１０】Ｍｏｒｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９８２−９８２（２０００）
【非特許文献１１】Ｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：９１６−９１９（２０００）
【非特許文献１２】Ｄｅｍａｔｔｏｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：８８５０−８８５５（２００１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、アミロイドペプチドＡβ４２（配列番号２）の残基４〜１０（およびＡβ（４〜１０）（配列番号１）として公知）を含む免疫原性組成物を提供することによって、前述の必要性を満たす。本発明の抗原および免疫原性組成物は、アルツハイマー病を処置するにあたって、アミロイド沈着の低分子インヒビターを設計するために、および診断試薬として有用である。本発明はさらに、Ａβ（４〜１０）抗原決定基に結合する抗体を提供する。本発明の免疫原性組成物および抗体はまた、アルツハイマー患者におけるアミロイド負荷を減少することによって、アルツハイマー病の症状を改善するための方法において使用され得る。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
式
（Ａ）ｎ−−（Ｔｈ）ｍ−−（Ｂ）ｏ−−Ａβ（４−１０）−−（Ｃ）ｐ
によって表されるペプチドであって、ここで、
Ａ、ＢおよびＣの各々は、アミノ酸残基またはアミノ酸残基の配列であり；
ｎ、ｏおよびｐは、独立して、０〜約２０の範囲の整数であり；
Ｔｈは独立して、ヘルパーＴ細胞エピトープまたは免疫増強アナログまたはこれらのセグメントを含むアミノ酸残基の配列であり；
ｏが０に等しい場合、Ｔｈはいかなるスペーサー残基も介することなくペプチド結合でＢ細胞エピトープに直接接続されており；
ｍは１〜約５の整数であり；そして
Ａβ（４−１０）は、（配列番号１）または保存的アミノ酸置換を含むそのアナログである、
ペプチド。
（項目２）
項目１に記載のペプチドであって、前記Ｔｈが配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；および配列番号２１からなる群から選択される、ペプチド。
（項目３）
項目１に記載のペプチドであって、該ペプチドが配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９；配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；および配列番号４６からなる群から選択される、ペプチド。
（項目４）
式
（Ａ）ｎ−−（Ｔｈ）ｍ−−（Ｂ）ｏ−−Ａβ（４−１０）−−（Ｃ）ｐ
によって表される２つ以上のペプチドの混合物を含むペプチド組成物であって、ここで、
Ａ、ＢおよびＣの各々は、アミノ酸残基またはアミノ酸残基の配列であり；
ｎ、ｏおよびｐは、独立して０〜約２０の範囲の整数であり；
Ｔｈは独立して、ヘルパーＴ細胞エピトープまたは免疫増強アナログまたはこれらのセグメントを含むアミノ酸残基の配列であり；
ｏが０に等しい場合、Ｔｈは、いかなるスペーサー残基も介することなくペプチド結合でＢ細胞エピトープに直接接続されており；
ｍは１〜約５の整数であり；そして
Ａβ（４−１０）は、（配列番号１）または保存的アミノ酸置換を含むそのアナログである、
ペプチド組成物。
（項目５）
アミロイドβペプチド（配列番号２）に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための免疫原性組成物であって、以下：
（ａ）有効量のＴ細胞ヘルプ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ）を提供するＴ細胞エピトープおよびペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）からなるＢ細胞エピトープを含む、抗原；ならびに
（ｂ）アジュバント
を含む、免疫原性組成物。
（項目６）
項目５に記載の組成物であって、前記Ｔ細胞エピトープが、以下：
（ａ）同じタンパク質骨格上の前記Ｂ細胞エピトープに対してＮ末端に位置する１つ以上のＴ細胞エピトープ、
（ｂ）該同じタンパク質骨格上の該Ｂ細胞エピトープに対してＣ末端に位置する１つ以上のＴ細胞エピトープ、および
（ｃ）該Ｂ細胞エピトープを含むタンパク質骨格に共有結合を介して接着している異なるタンパク質骨格上に位置する１つ以上のＴ細胞エピトープ
からなる群から選択される、組成物。
（項目７）
項目５に記載の組成物であって、前記Ｔ細胞エピトープが、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、組成物。
（項目８）
項目５に記載の組成物であって、前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、Ｑｕｉｌｌ  Ａ、Ｑｕｉｌｌ  Ａ／ＩＳＣＯＭ、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド／アビジン（ａｒｖｉｄｉｎｅ）、ポリアニオン、フロイントの完全アジュバント、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン、フロイントの不完全アジュバントおよびリポソームからなる群から選択される１つ以上の物質を含む、組成物。
（項目９）
アルツハイマー病に罹患している個体を処置するための方法であって、項目５〜８のうちのいずれか１項に記載の免疫原性組成物の有効量を該個体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１０）
アルツハイマー病に罹患している個体の脳におけるアミロイド沈着物の量を減少させる方法であって、項目５〜８のうちのいずれか１項に記載の免疫原性組成物の有効量を該個体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１１）
アルツハイマー病に罹患している個体の脳におけるアミロイド原線維を脱凝集するための方法であって、項目５〜８のうちのいずれか１項に記載の免疫原性組成物の有効量を該個体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１２）
ペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）に結合し得る、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１３）
アミロイド沈着を阻害する、項目１２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
（項目１４）
アミロイド原線維を脱凝集する、項目１２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
（項目１５）
アルツハイマー病に罹患している個体を処置するための方法であって、ペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）を認識し、結合する抗体組成物の有効量を該個体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１６）
前記抗体組成物がポリクローナル抗体を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記抗体組成物がモノクローナル抗体を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
化合物がアミロイド沈着および原線維形成のインヒビターであるかどうかを決定する方法であって、以下：
（ｉ）該化合物をペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）と接触させる工程；および
（ｉｉ）該ペプチドとの該化合物の結合を検出する工程
を包含する、方法。
（項目１９）
前記化合物がインビトロでのアミロイド原線維形成を阻害するかどうかを評価する工程をさらに包含する、項目１８に記載の方法。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明は、式
（Ａ）ｎ−−（Ｔｈ）ｍ−−（Ｂ）ｏ−−Ａβ（４−１０）−−（Ｃ）ｐ
によって示されるペプチドを提供する。この式において、
Ａ、ＢおよびＣの各々は、アミノ酸残基またはアミノ酸残基の配列であり；
ｎ、ｏおよびｐは、独立して、０〜約２０の範囲の整数であり；
Ｔｈは、独立して、ヘルパーＴ細胞エピトープまたはその免疫増強アナログもしくはセグメントを含むアミノ酸残基の配列であり；
ｏが０に等しい場合、Ｔｈは、何のスペーサー残基もなしに、ペプチド結合を介してＢ細胞エピトープに直接接続され；
ｍは１〜約５の整数であり；そして
Ａβ（４−１０）は、（配列番号１）または保存的アミノ酸置換を含むそのアナログである。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明は、アミロイドβペプチド（配列番号２）特異的に結合する抗体を誘導するための免疫原性組成物を提供し、この組成物は、以下を含有する：有効量のＴ細胞ヘルプ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ）を提供するＴ細胞エピトープとペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）からなるＢ細胞エピトープとを含む、抗原；ならびにアジュバント。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明は、アミロイドβペプチドに特異的に結合する抗体集団を誘導するための免疫原性組成物を提供し、この組成物は、以下を含有する：有効量のＴ細胞ヘルプ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ）を提供するＴ細胞エピトープとペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）からなるＢ細胞エピトープとを含む、抗原；ならびにアジュバント。ここで、このＴ細胞エピトープは、以下からなる群より選択される：
（ａ）同じタンパク質骨格上のＢ細胞エピトープに対してＮ末端側に位置する、１つ以上のＴ細胞エピトープ、
（ｂ）同じタンパク質骨格上のＢ細胞エピトープに対してＣ末端側に位置する、１つ以上のＴ細胞エピトープ、および
（ｃ）Ｂ細胞エピトープを含むタンパク質骨格に共有結合を介して結合した異なるタンパク質骨格上に位置する１つ以上のＴ細胞エピトープ。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明は、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを有する免疫原性組成物を提供し、ここで、Ｔ細胞エピトープは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；および配列番号２１。
【００１８】
別の特定の実施形態において、本発明は、抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、ここで、このアジュバントは、以下からなる群より選択される１つ以上の物質を含む：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、Ｑｕｉｌｌ  Ａ、Ｑｕｉｌｌ  Ａ／ＩＳＣＯＭ、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム／アルビジン（ａｒｖｉｄｉｎｅ）、ポリアニオン、フロイント完全アジュバント、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン、フロイント不完全アジュバントおよびリポソーム。
【００１９】
別の好ましい実施形態において、本発明は、アルツハイマー病に罹患した個体を処置するための方法を提供し、この方法は、アミロイドβペプチド（配列番号２）に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための有効量の免疫原性組成物を個体に投与する工程を包含し、この組成物は、以下を含有する：（ａ）有効量のＴ細胞ヘルプ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ）を提供するＴ細胞エピトープとペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）からなるＢ細胞エピトープとを含む抗原；ならびに（ｂ）アジュバント。
【００２０】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、アルツハイマー病に罹患した個体の脳におけるアミロイド沈着の量を減少させるための方法もまた提供し、この方法は、アミロイドβペプチド（配列番号２）に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための有効量の免疫原性組成物を個体に投与する工程を包含し、この組成物は、以下を含有する：（ａ）有効量のＴ細胞ヘルプ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ）を提供するＴ細胞エピトープとペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）からなるＢ細胞エピトーとを含む抗原；ならびに（ｂ）アジュバント。
【００２１】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、アルツハイマー病に罹患した個体の脳におけるアミロイド線維を脱凝集させるための方法を提供し、この方法は、アミロイドβペプチド（配列番号２）に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための有効量の免疫原性組成物を個体に投与する工程を包含し、この組成物は、以下を含有する：（ａ）有効量のＴ細胞ヘルプ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ）を提供するＴ細胞エピトープとペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）からなるＢ細胞エピトープとを含む抗原；ならびに（ｂ）アジュバント。
【００２２】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、ペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）に結合し得る、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２３】
特定の実施形態において、本発明は、ペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）に結合し得る、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミロイド沈着を阻害する。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、ペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）に結合し得る、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミロイド線維を脱凝集させる。
【００２５】
別の好ましい実施形態において、本発明は、アルツハイマー病に罹患した個体を処置するための方法を提供し、この方法は、ペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）を認識しかつこれに結合する、有効量の抗体組成物を個体に投与する工程を包含する。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明は、アルツハイマー病に罹患した個体を処置するための方法を提供し、この方法は、ペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）を認識しかつこれに結合する、有効量の抗体組成物を個体に投与する工程を包含し、ここで、この抗体組成物は、ポリクローナル抗体を含有する。
【００２７】
特定の実施形態において、本発明は、アルツハイマー病に罹患した個体を処置するための方法を提供し、この方法は、ペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）を認識しかつこれに結合する、有効量の抗体組成物を個体に投与する工程を包含し、ここで、この抗体組成物は、モノクローナル抗体を含有する。
【００２８】
なお別の好ましい実施形態において、本発明は、ある化合物がアミロイド沈着またはアミロイド線維形成のインヒビターであるか否かを決定するための方法を提供し、この方法は、この化合物をペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）と接触させる工程；およびこの化合物とこのペプチドとの結合を検出する工程、を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、この化合物が、インビトロでアミロイド線維形成を阻害するか否かを評価する工程を包含する。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、本発明は、アルツハイマー病についての能動免疫治療の効力を予測するための診断方法を提供し、この方法は、ペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）に対する免疫応答の発生をモニタリングする工程を包含する。ここで、ペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）に対する受動的免疫応答は、治療が継続されるべきであることを示し、そして免疫応答の欠如または非常に弱い免疫応答は、治療が中断されるべきであることを示す。
【００３０】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、免疫原性組成物を提供し、この組成物は、抗原およびアジュバントを含有し、ここで、この抗原は、有効量のＴ細胞ヘルプ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ）を提供するＴ細胞エピトープとペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）からなるＢ細胞エピトープとを含み；この抗原は、アミロイドβペプチド（配列番号２）中に位置する免疫標的に結合する抗体を誘導するために有効なタンパク質の構造関係を提供する。
【００３１】
特定の実施形態において、本発明は、Ｂ細胞エピトープを含む抗原を提供し、ここで、免疫標的が見出された場合に、その免疫標的の二次構造の模倣をアミロイドβペプチド（配列番号２）に提供する、このＢ細胞エピトープのタンパク質の構造的な関係は、βシート、逆ターン、ヘリックス、ランダムコイルまたはこれらの組み合わせからなる群より選択される。特定のさらなる実施形態において、この抗原は、ペプチドＡβ（４−１０）（配列番号１）の模倣物を含むＢ細胞エピトープを含む。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（発明の詳細な説明）
（定義）
以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである：
（アジュバント）免疫原性組成物中の抗原の免疫原性を増強するために抗原と組み合わされる物質の混合物であり得る物質をいう。アジュバントは、通常、免疫系に対して直接作用することによって、そして抗原の緩徐な放出を提供することによって、抗原に対する免疫応答を増大させるように機能する。
【００３３】
（アミロイドβペプチド（Ａβ））アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）からプロセシングされた３９〜４３アミノ酸残基のペプチドの群の任意の１つをいう。本明細書中で使用される場合、Ａβ４２は、４２アミノ酸残基のＡβペプチドをいう。さらに、Ａβ（４〜１０）は、Ａβ４２の残基４〜残基１０までの、７アミノ酸残基のペプチドをいう。以下により詳細に考察されるように、ＡＰＰ遺伝子は、選択的スプライシングを受けて、３つの一般的なアイソフォーム（７７０アミノ酸（ＡＰＰ７７０）、７５１アミノ酸（ＡＰＰ７５１）および６９５アミノ酸（ＡＰＰ６９５）を含む）を生じる。慣例により、最長のアイソフォームＡＰＰ７７０のコドン番号付けを、より短いアイソフォームのコドン位置をいう場合にも使用する。
【００３４】
（抗原）本発明の抗原は、ヘルパーＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの組み合わせである。ヘルパーＴ細胞エピトープは、同じポリペプチド骨格上のＢ細胞エピトープに対して、Ｎ末端またはＣ末端に位置し得る。例えば、小さいペプチドが、キャリア分子（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）に共有結合して免疫原性を提供する場合、Ｔ細胞エピトープはまた、Ｂ細胞エピトープを含むポリペプチドに共有結合した異なるポリペプチド骨格上に位置し得る。あるいは、Ｔ細胞エピトープは、アジュバントを含む組成物中でＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープを組み合わせることによって、Ｂ細胞エピトープと非共有結合的に会合し得る。
【００３５】
（抗原プロセシング）細菌、ウイルスまたは免疫原性組成物由来の細胞外抗原が、エンドサイトーシスまたは食作用によって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれるプロセスをいう。引き続いて、この抗原は、エンドソームまたはリソソームによってフラグメント化され、そしてペプチドフラグメントは、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝へと装填（ｌｏａｄ）される。
【００３６】
（抗原提示）ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子が、プロセシングされた短いペプチドに結合し、そしてＴ細胞レセプターによって媒介される相互作用を介したＴ細胞によるスクリーニングのために、細胞表面上にこれらのペプチドを提示するプロセスをいう。
【００３７】
（Ｂ細胞エピトープ）抗体結合の標的であり、抗原性決定基としても公知の、抗原の一部をいう。タンパク質抗原性決定基について、Ｂ細胞エピトープは、通常はネイティブの構造に対応する、特定の３次元配置にあるアミノ酸残基をいう。Ｔ細胞エピトープとは異なり、Ｂ細胞エピトープは、タンパク質コンフォメーションに対して非常に感受性であり得る。
【００３８】
（有効量）規定された処置目的のいずれかを達成する、本発明の免疫原性組成物、抗体または抗原結合フラグメントの量をいう。有効量はまた、この組成物、抗体またはその抗原結合フラグメントの、予防的使用および治療的使用の両方を含むように意図される。
【００３９】
（ヘルパーＴ細胞エピトープ）ヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、そして抗原に対する抗体応答を発生させるために、ＣＤ４＋
Ｔ細胞を活性化して、サイトカインの形態で、Ｂ細胞に補助を提供するように働く、ペプチドである。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、細胞外環境と連絡する細胞区画中の、約７〜約３０残基長の、プロセシングされたペプチドフラグメントで装填される。従って、ヘルパーＴ細胞エピトープは、一般に、外来のタンパク質フラグメントを提示する。
【００４０】
（免疫標的）抗原内のＢ細胞エピトープが模倣を試みている、アミロイド沈着Ａβペプチドまたは循環Ａβペプチド中の、実際の３次元エピトープ（ネイティブ）をいう。抗タンパク質抗体は、一般に、特定の二次構造中のアミノ酸の特定の配列に対して特異的である。理想的には、エピトープの抗原模倣物に対する抗体を含むことにより、病的なアミロイド沈着Ａβペプチドまたは循環Ａβペプチド中に存在する場合、ネイティブなエピトープを認識し、そしてこれに結合する抗体の産生を生じる。
【００４１】
（免疫原）免疫原性であるとわかっている抗原をいう。
【００４２】
（免疫原性）抗原が免疫応答を惹起する能力をいう。一般に、抗原は、免疫原性であるために、抗原提示細胞と会合しなければならない。抗原のサイズ、構造、配列、外来性の程度、アジュバントの存在、患者の免疫状態ならびに他の遺伝的要因を含む多くの要因が、免疫原性に影響する。
【００４３】
（ペプチド）一緒に連結された小さい数（通常２以上）のアミノ酸をいう。
【００４４】
（ポリペプチド）一緒に連結されたより長い鎖のアミノ酸をいうが、配列または長さは一般に規定されない。用語タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドは、ときどき、相互交換可能に使用される。
【００４５】
（乱雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ヘルパーＴ細胞エピトープ）多様なＭＨＣハプロタイプを発現する多数の個体（すなわち、遺伝的に多様な集団）における、Ｔ細胞活性化応答（Ｔ細胞ヘルプ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ））を誘導し得る、ヘルパーＴ細胞エピトープをいう。このようなＴｈエピトープは、異種集団の多くの異なる個体において機能し、そして乱雑なＴｈエピトープであるとみなされる。
【００４６】
（タンパク質骨格またはポリペプチド骨格）タンパク質配列の一部としての、アミノ酸を提示する反復単位をいう。ポリペプチド骨格は、３原子の配列からなる：アミド窒素（Ｎ−Ｈ）；α炭素（Ｃ）；およびカルボニル炭素（Ｃ＝Ｏ）。これは一般に、以下−Ｎ−Ｃ−Ｃ−として示され得る。
【００４７】
（タンパク質）規定された配列、長さおよび折り畳まれたコンフォメーションを有する、アミノ酸の特定の鎖を一般にいうが、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、ときどき、相互交換可能に使用され得る。
【００４８】
（処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔまたはｔｒｅａｔｉｎｇ））以下の目的を含む：（１）所望でない症状または病理学的状態を有するとはまだ診断されていない被験体において、これらが発生するのを防ぐこと；（２）所望でない症状または病理学的状態を阻害すること（すなわち、それらの発症を停止させること）；あるいは（３）所望でない症状または病理学的状態を寛解または緩和させること（すなわち、所望でない症状または病理学的状態の後退を引き起こすこと）。
【００４９】
本発明の組成物および方法は、アミロイドプラーク沈着の免疫媒介性の減少および認識機能における対応する改善が、Ａβ４２中の特定の免疫標的またはＢ細胞エピトープに対する特異的抗体応答によって媒介され得るという本発明者らの発見に起因している。この重要な免疫標的は、最長のアイソフォーム（ＡＰＰ７７０）のコドン番号付けに従って、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の残基６７５〜６８１に対応する、Ａβ４２の残基４〜１０（ＦＲＨＤＳＧＹ）（配列番号１）として、本発明者らによって同定された。結果として、本発明者らは、Ａβ４２型抗原を用いた免疫後の、アミロイドプラーク装填の免疫媒介性の減少の、重要な免疫学的機構を解明した。
【００５０】
本発明者らは、Ａβ４２の残基４〜１０（ＦＲＨＤＳＧＹ）（配列番号１）を認識し、そしてこれに結合する抗体が、Ａβ原繊維形成およびＡβ神経毒性を阻害することを発見した。さらに、本発明者らは、Ａβ４２の残基４〜１０（ＦＲＨＤＳＧＹ）を認識し、そしてこれに結合する抗体が、Ａβ４２の既に形成された原繊維を分解することを発見した。さらに、本発明者らは、Ａβ４２による免疫の間に産生された抗体が、Ａβによって誘発されるインビトロの細胞死を排除したことを開示する。
【００５１】
本発明は、ヒトＡＤのモデルとしてＴｇＣＲＮＤ８マウスを使用して実施された。ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、ＡＤのモデルとして有用である。なぜなら、ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、プリオンタンパク質プロモーターの制御下に、ヒト二重変異体ＡＰＰ６９５導入遺伝子を保有し、そして進行性の認識傷害を伴う大脳皮質におけるＡβ４２ペプチドおよび神経炎性アミロイドプラークの進行性の蓄積（ＡＤの神経病理学的特徴）を示すからである。Ｃｈｉｓｈｔｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：２１５６２−５７０（２００１）を参照のこと。
【００５２】
本発明は、Ａβ４２の前原線維形態でのＣ５７ＢＬ６  ｘ  Ｃ３Ｈマウスの免疫の間に生成された、ＡβのＮ末端ペプチドに対して特異的な抗体を提供する。本発明はさらに、Ａβ（４−１０）に対応するＡβ配列ＦＲＨＤＳＧＹ（配列番号１）を提供し、これは、アルツハイマー病についての保護免疫に重要なエピトープを示す。さらに、本発明は、Ａβ（４−１０）エピトープを、アルツハイマー病に罹患した患者において有益な保護免疫を生じるための免疫標的として同定する。
【００５３】
（抗原提示）
抗原提示とは、タンパク質抗原が抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれ、そしてプロセシングされる、分子事象および細胞事象をいう。次いで、プロセシングされた抗原フラグメントは、エフェクター細胞（これは、引き続いて活性化され、免疫応答を開始する）に対して提示される。最も活性な抗原提示細胞は、マクロファージ（これは、単球からの直接的発達産物である）、樹状細胞および特定のＢ細胞として特徴付けられている。
【００５４】
抗原提示および免疫応答プロセスにおける重要な分子プレーヤーは、ＭＨＣ分子であり、これは、主要組織適合遺伝子複合体（Ｍｈｃ）として公知の領域中の染色体によりコードされた多型遺伝子ファミリーである。ヒトにおけるＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子と称される。特定のＭＨＣ分子は、細胞表面上に独自の分子フラグメントを提示し、そしてＴ細胞および他の免疫系エフェクター細胞によるそれらの認識を促進するように機能する。Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，「Ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ」，ｐｐ．２６３−２８５、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｗ．Ｆ．Ｐａｕｌ編，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔｏ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９９）を参照のこと。さらに、ＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子は、抗原提示細胞中のペプチドに結合し、次いで、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞レセプターと相互作用するように機能する。
【００５５】
より具体的には、ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞自身のペプチド（内因性の細胞質ゾルタンパク質、新規に翻訳されたウイルス抗原および腫瘍抗原が挙げられる）のサンプルに結合し、そしてそのサンプルを提示する。ＭＨＣクラスＩ分子は、一般に、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞によって認識される、約７〜約１６残基長のペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらすことに関与し、ここで、ウイルスに感染した細胞が殺傷される。
【００５６】
本発明は、抗原に対応する抗体応答の発生においてＢ細胞への補助を提供し得るＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するように作用するＴ細胞エピトープに主に関する。ヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、これには、細胞外環境と連絡する細胞区画において、約７〜約３０残基長のプロセシングされたペプチドフラグメントが取り付け（ｌｏａｄ）られる。Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，「Ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ」，ｐｐ．２６３−２８５、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｗ．Ｆ．Ｐａｕｌ編，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９９）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）を参照のこと。より具体的には、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ペプチドのサンプルに結合し、そしてそれを提示し、これは、すぐ細胞外の環境からＣＤ４＋  Ｔ細胞へ、抗原提示細胞によって摂取される。次いで、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は活性化され、次いで、抗体を産生するために、Ｂ細胞に対してサイトカインの形態での補助を提供する。ヒトにおいて、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ分子、ＨＬＡ−ＤＱ分子およびＨＬＡ−ＤＰ分子を含み、これらは、種々の遺伝的にコードされた対立遺伝子を生じる。
【００５７】
本発明の免疫原性組成物は、いわゆる「抗原提示細胞」の表面上のＭＨＣ分子によってタンパク質またはペプチドフラグメントとしてプロセシングおよび提示され、そしてエフェクター細胞としてのＣＤ４＋  Ｔリンパ球によって認識される、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを有する抗原を含む。
【００５８】
有効な免疫学的監視を確認するために、ＭＨＣ分子の生理学は、これらが、可能な限り広いスペクトルの抗原ペプチドを提示し得るように、設計される。結果として、抗原提示細胞の細胞表面上の規定された抗原性ペプチドのコピー数は、非常に低い（約１０５のペプチドレセプターの総集団について、１０２の強度の規定された抗原性ペプチド）。これは、ＭＨＣ分子に結合した抗原性ペプチド（「ペプチドリガンド」）の非常に不均一な混合物が、抗原提示細胞の細胞表面上に露出していることを意味する。
【００５９】
用語「Ｔ細胞エピトープ」は、抗原プロセシングおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の結合ポケット中のペプチドの提示後の、ＣＤ４＋  Ｔヘルパー（Ｔｈ）リンパ球の活性化をもたらす、タンパク質の配列をいう。Ｔ細胞の表面上のα／βＴ細胞レセプターは、ペプチドＭＨＣクラスＩＩ複合体と相互作用し、これは、活性化のための刺激として作用する。結果として、Ｔ細胞エピトープのネイティブのコンフォメーションは重要でなく、その一次配列よび特定のＭＨＣ分子に結合する能力のみが重要である。
【００６０】
本発明は、ペプチド、好ましくは合成ペプチドに関し、これらは、Ａβの病理学的形態（例えば、アミロイドプラークおよび原線維中に見出される形態）に対する抗体を誘導し得る。
【００６１】
ペプチドの免疫原性は、ペプチド内の「Ｂ細胞エピトープ」または「抗原決定基」を特異的に認識および結合する抗体を含む抗体応答を誘導する、ペプチドの能力をいう。Ｒ．Ｎ．Ｇｅｒｍａｉｎ，「Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ」，ｐｐ．２８７−３４０，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｗ．Ｆ．Ｐａｕｌ編，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９９）（Ｇｅｒｍａｉｎ）を参照のこと。免疫原性であるために、Ｂ細胞エピトープを含むペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原またはクラスＩＩ  Ｔ細胞エピトープと一緒に提示されなければならない。Ｔ細胞エピトープは、通常、抗原提示細胞による抗原プロセシングの間、免疫原からプロセシングされ、次いで、配列特異的様式でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。Ｇｅｒｍａｉｎを参照のこと。このＭＨＣクラスＩＩ  Ｔ細胞エピトープ複合体は、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球（Ｔｈ細胞）によって認識される。Ｔｈ細胞は、提示された免疫原から、会合したＢ細胞エピトープを認識し得る抗体分子を産生する、特異的Ｂ細胞の増殖を引き起こす能力を有する。従って、特定のＢ細胞エピトープに特異的な抗体の産生は、免疫原内または免疫原と会合したＴ細胞エピトープの存在と関連する。
【００６２】
抗原が外来タンパク質でない場合、別の合併症が生じる。Ａβは自己の分子なので、これは、リンパ球活性化、従って、自己に対する抗体応答を誘導する、どのようなＴｈエピトープも含まないはずである。従って、外来性Ｔ細胞エピトープは、強力な外来免疫原（破傷風毒素、百日咳毒素、麻疹ウイルスＦタンパク質およびＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）などを含む）に由来する特定の配列を含めることによって、提供されるべきである。このようなＴ細胞エピトープの配列は、Ａβ（４−１０）ペプチドであるＢ細胞エピトープと同じタンパク質骨格上に含まれ得る。Ｔ細胞エピトープの位置は、Ｂ細胞エピトープに対してＮ末端側であるかまたはＢ細胞エピトープに対してＣ末端側であるかのいずれかであり得る。あるいは、Ｔ細胞エピトープは、Ｂ細胞エピトープを含むペプチドに共有結合していてもしていなくてもよい、キャリア分子として公知の別個のタンパク質骨格上に提供され得る。
【００６３】
さらなるＴ細胞エピトープは、当該分野で周知の以下の手順によって（例えば、Ｒｕｄｅｎｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：６２２−６２７（１９９１）；Ｃｈｉｃｚら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：７６４−７６８（１９９２）およびＨｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１８１７−１８２０（１９９２）に開示されるような、免疫親和性精製されたクラスＩＩ分子由来のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの、酸溶出および質量分析配列決定によって）選択され得る。これらの文献の開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００６４】
理想的には、選択されたＴｈエピトープは、好ましくは、多様なＭＨＣハプロタイプを発現する多数の個体において、Ｔ細胞活性化応答（Ｔ細胞ヘルプ）を誘発し得る。これは、これらのエピトープが、異種集団の多数の異なる個体において機能し、そして乱雑なＴｈエピトープであるとみなされることを意味する。乱雑なＴｈエピトープは、遺伝的に多様な集団のほとんどのメンバーにおいて、強力な抗Ａβ抗体応答を誘発する利点を提供する。
【００６５】
本発明のＴヘルパーエピトープは、所定の集団のほとんどのメンバーにおいて免疫応答を引き起こす能力についてだけでなく、記憶／追想（ｒｅｃａｌｌ）応答を引き起こす能力についても、選択される。Ａβ免疫療法を受けている大多数のヒト患者は、既に、麻疹、耳下腺炎、風疹、ジフテリア、百日咳および破傷風の小児ワクチンで免疫されている。従って、これらの患者は、免疫原混合物中に存在するＴｈエピトープの１つより多くに、以前に曝されている。標準的なワクチンによる免疫を介したＴｈエピトープへの以前の暴露は、直ぐに応答し得、そして抗体応答に補助を提供し得るＴｈ細胞クローンを確立するはずなので、このような以前の暴露は有用である。
【００６６】
ヘルパーＴ細胞エピトープは、Ｔｈエピトープを含むアミノ酸（天然アミノ酸または非天然アミノ酸）の配列である。ヘルパーＴ細胞は、連続したエピトープまたは不連続のエピトープから構成される。従って、ヘルパーＴ細胞エピトープの全アミノ酸残基が、そのエピトープの必要とされた部分とは限らない。従って、Ｔｈエピトープ（Ｔｈエピトープのアナログおよびセグメントを含む）は、Ａβに対する免疫応答を促進または刺激し得る。免疫優性のヘルパーＴ細胞エピトープは、多岐にわたるＭＨＣ型を有する動物集団およびヒト集団において広く応答性である。Ｃｅｌｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１８０８−１８１５（１９８８）；Ｄｅｍｏｔｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３９４−４０２（１９８９）；Ｃｈｏｎｇら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４６４０−４６４７（１９９２）を参照のこと。被検体ペプチドのヘルパーＴ細胞エピトープは、約１０〜約５０アミノ酸、好ましくは約１０〜約４０アミノ酸残基、より好ましくは、約１０〜約３０アミノ酸残基、なおより好ましくは、約１０〜約２０アミノ酸残基、または好ましくは、約１０〜約１５アミノ酸残基を有する。多様なヘルパーＴ細胞エピトープが存在する場合（すなわち、ｎ＞２）、各ヘルパーＴ細胞エピトープは、独立して同じであるか、または異なる。
【００６７】
ヘルパーＴ細胞エピトープとしては、このヘルパーＴ細胞エピトープにおける１〜約１０アミノ酸残基のアナログ、置換体、欠損体および挿入体が挙げられ得る。これらのヘルパーＴ細胞エピトープセグメントは、Ａβに対する免疫応答を促進または刺激するのに十分な、ヘルパーＴ細胞エピトープの連続した部分である。このヘルパーＴ細胞エピトープは、１つ以上のスペーサーアミノ酸残基によってＢ細胞エピトープから分離され得る。
【００６８】
本発明のＴｈエピトープとしては、以下が挙げられる：Ｂ型肝炎表面抗原ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＨＢ−Ｔｈ）、百日咳毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＰＴ−Ｔｈ）、破傷風毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＴＴ−Ｔｈ）、麻疹ウイルスＦタンパク質ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＭＶ−Ｔｈ）、トラコーマクラミジア主要外膜タンパク質ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＣＴ−Ｔｈ）、ジフテリア毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＤＴ−Ｔｈ）、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイドヘルパーＴ細胞エピトープ（ＰＦ−Ｔｈ）、マンソン住血吸虫トリオースリン酸イソメラーゼヘルパーＴ細胞エピトープ（ＳＭ−Ｔｈ）、大腸菌Ｔｒａ  ＴヘルパーＴ細胞エピトープ（ＴｒａＴ−Ｔｈ）ならびにこれらのＴｈエピトープの任意の免疫促進アナログおよびセグメント。広範なＴｈエピトープの選択は、Ｌａｄｄらに対する米国特許第５，７５９，５５１号に記載され、これらの開示は、その全体が参考として本明細書によって援用される。ヘルパーＴ細胞エピトープ配列の例は、以下に提供される。
【００６９】
（表１．ヘルパーＴ細胞エピトープ）
【００７０】
【表１−１】
2010065046.tif 000002
【００７１】
【表１−２】
2010065046.tif 000003
特定の実施形態において、本発明は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＴ細胞エピトープを有する：配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；および配列番号２１。
【００７２】
（抗原設計）
本発明の免疫原性組成物には、抗原（有効量のＴ細胞ヘルプを提供するＴ細胞エピトープおよびペプチドＡβ（４−１０）からなるＢ細胞エピトープを含む）が挙げられる。
【００７３】
本発明の抗原ペプチドは、以下の式によって示される。
【００７４】
Ｉ．（Ａ）ｎ−−（Ｔｈ）ｍ−−（Ｂ）Ｏ−−Ａβ（４−１０）−−（Ｃ）ｐ
ＩＩ．（Ａ）ｎ−−Ａβ（４−１０）−−（Ｂ）Ｏ−−（Ｔｈ）ｍ−−（Ｃ）ｐ
ＩＩＩ．（Ｄ）ｑ−−Ａβ（４−１０）−−（Ｅ）ｒ
ここで、Ａ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、独立してアミノ酸残基またはアミノ酸残基の配列であり；
ここで、スペーサーであるＢは、アミノ酸残基またはアミノ酸残基の配列であり；ｏが０である場合、Ｔｈは、どのようなスペーサー残基も含まずペプチド結合を介してＢ細胞エピトープに直接結合され；
ここで、ｎ、ｏ、およびｐが独立して０〜約２０の範囲の整数であり；ｏが０である場合、Ｔｈはどのようなスペーサー残基も含まずＢ細胞エピトープに直接結合され；
ｍが、１〜約５の整数であり；
ここでｑおよびｒは、独立して、０〜約１００の範囲の整数であり；
Ｔｈは、独立して、ヘルパーＴ細胞エピトープまたはそれらの免疫促進アナログもしくはセグメントを含むアミノ酸残基の配列であるか；あるいは保存的アミノ酸置換を含むそれらのアナログであり；Ｔｈは、タンデムリピートされ得；
Ａβ（４−１０）は、Ａβ４２配列番号１の残基４−１０（ＦＲＨＤＳＧＹ）または保存的アミノ酸置換を含むそれらのアナログであり；Ａβ（４−１０）配列番号１は、タンデムリピートされ得るか、そうでなければ多重コピーに存在し得る。
【００７５】
本発明はまた、式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩによって示される２つ以上のペプチドの組成物を含む。式Ｉの１つ以上のペプチドは、組成物を形成するために組み合せられ得る。あるいは、式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ由来の１つ以上のペプチドは、混合物または組成物を形成するために組み合わせられ得る。
【００７６】
本発明の抗原ペプチドは、約２０〜約１００アミノ酸残基、代替的には、約２０〜約８０アミノ酸残基を有する。特定の実施形態において、本発明の抗原ペプチドは、約２０〜約６０アミノ酸残基、好ましくは、約２０〜約５０アミノ酸残基、そしてより好ましくは、約２５〜約４０アミノ酸残基を有する。別の好ましい実施形態において、抗原ペプチドは、約２０〜約３５アミノ酸残基を有する。
【００７７】
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、アミノ酸残基である場合、これらは、任意の天然に存在しないアミノ酸残基または任意の天然に存在するアミノ酸残基であり得る。天然に存在しないアミノ酸としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：βアラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンなど。天然に存在するアミノ酸としては、以下が挙げられる：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン。さらに、ｍが少なくとも１つであり、かつＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥの基のうち２つ以上がアミノ酸である場合、各アミノ酸は、独立して同じであるか、または異なる。
【００７８】
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥの基のアミノ酸は、脂肪酸によって改変され得る。例えば、１つ以上のε−パルミトイルリジンが、ＡβエピトープにＮ末端およびＣ末端で付加され得、そしてペプチド全体がビヒクルの表面上に固定され得る。これらのビヒクルは、免疫刺激因子である脂質Ａを含み得る。Ｎｉｃｏｌａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：２３３２−２３３７（２００２）を参照のこと、この開示は、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【００７９】
Ａβ（４−１０）エピトープは、タンパク質デンドリマーに、タンパク質抗原の構築のための直交カップリングストラテジー（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用することによって組み込まれ得る。特異的に構築されたデンドリマーは、有効なワクチン抗原のアセンブリ（例えば、Ｔａｍらに対する米国特許第６，３１０，８１０（この開示は、本明細書によってその全体が参考として援用される）に記載されるような多重抗原ペプチド構築物が挙げられる）の基礎をなし得る。
【００８０】
（抗原およびワクチンとしての合成ペプチド）
多くの場合、有効なワクチンおよびヒト疾患の免疫療法開発のために、免疫原ならびに病原菌としてタンパク質全体および糖タンパク質全体を使用することは、免疫原性の欠如に起因して効果がないか、または非保護的なエピトープを含むことに起因して感染および疾患を亢進させることが証明されている。Ｏｓｔｅｒｈａｕｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ，７：１３７−１４１（１９８９）；Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：４９−６７（１９８７）；Ｂｕｒｋｅ，Ｄ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３５：５１１−５３０（１９９２）を参照のこと。
【００８１】
ワクチンまたは免疫原性組成物における合成ペプチド抗原の使用は、組換えワクチンに関連する多くの問題を回避する。特定のタンパク質ドメインに対応する合成ペプチドを使用することの利点としては、以下が挙げられる：保護エピトープのみの選択および包含；疾患増強エピトープの排除；有害な自己免疫エピトープの排除；感染性物質の排除；そして、合成ペプチド抗原は、科学的によく規定され、かつ安価に生成され得る。ＡｒｎｏｎおよびＨｏｒｗｉｔｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：４４９−４５３（１９９２）を、参照のこと。
【００８２】
不利な点は、この低分子合成ペプチドは、免疫系を呈示するために、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ型およびＩＩ型タンパク質を加工するため、またはこれらに結合するために必須の、アミノ酸配列を正確に含まないことがあることである。Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：４５１−４６５，（１９９２）を、参照のこと。別の不利な点は、低分子ペプチドの三次元解析構造が、ネイティブなタンパク質において見出される構造と異なっており、従って、  このペプチドは、保護免疫を提供するための適切な特異性および親和性の体液性免疫を誘導しないことがあることである。Ｂｅｒｎａｒｄら，Ａｉｄｓ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，６：２４３−２４９（１９９０）を、参照のこと。
【００８３】
本発明のペプチド抗原は、広範な種々の方法において調製され得る。このペプチドは、その比較的サイズが小さいゆえに、従来技術に従い、溶液または固体支持体中で合成され得る。種々の自動合成および手動合成が、今日市販され、そして公知のプロトコールに従って使用され得る。例えば、米国特許第５，８２７，６６６（Ｆｉｎｎらに対する）；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版）Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，１９８４；およびＴａｍら，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８３）１０５：６４４２を参照のこと。これらの開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【００８４】
あるいは、ハイブリッドＤＮＡ技術が使用され得る。ここで、合成遺伝子は、そのポリペプチドをコードする一本鎖またはその実質的に相補な鎖を用いて調製され、かつ、この一本鎖は重複しており、ハイブリダイズのためにアニーリング培地中で一緒にされ得る。ハイブリダイズした鎖は、次いで連結されて完全な遺伝子を形成し得、そして、適切な末端の選択により、この遺伝子は、発現ベクター（その多くは今日市販されている）内に挿入され得、そして所望のペプチドを産生させる原核発現系または真核発現系において発現される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ（本明細書中の「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９」）を、参照のこと。
【００８５】
（キャリア）
本出願の範囲内で記載されるような、本発明のＡβ（４−１０）エピトープ抗原は、キャリア分子と結合されて、Ｔ細胞ヘルプを提供し得る。
【００８６】
本発明の抗原が共有的に連結（結合）されるキャリア分子は、有利で、非毒性で、薬学的に受容可能で、かつ哺乳類において免疫応答を起こすために十分なサイズである。適切なキャリア分子の例としては、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）が挙げられ、ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質のＴ細胞エピトープ（すなわち、Ｔ１およびＴ２）に対応するペプチドが、非ＡＩＤＳウイルス由来キャリア分子の代わりとなり得るペプチド（Ｃｅａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：４２４９，１９８７；Ｋｅｎｎｅｄｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：５７６９，１９８７）。ペプチドはまた、薬学的に受容可能なアジュバント（例えば、ミョウバン）と共に投与され得、または破傷風トキソイドより免疫原性の高い他のキャリア分子と結合され得る。
【００８７】
キャリア分子の本発明のペプチド抗原との連結は、直接であり得るか、またはスペーサー分子を介してもよい。スペーサー分子は、有利で、非毒性で、且つ反応性である。ペプチドのアミノ末端に付加される２つのグリシン残基は、Ａβ（４−１０）配列またはその一部を、キャリア分子と連結するための、適切なスペーサー分子を提供し得る；あるいは、Ａβ（４−１０）配列またはその一部は、例えば、別の免疫原性アミロイド配列に直接隣接して、例えば、合成され得る。システインは、キャリア分子への結合のために、Ａβ（４−１０）ペプチドの、Ｎ末端またはＣ末端のどちらかまたは両方に付加され、ジスルフィド結合形成を介した鎖間重合体化を容易にし、より大きな分子集合体を形成し得る。キャリア分子のペプチドへの結合は、結合剤を使用して達成され得る。有利には、ヘテロ機能性結合剤Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシミドエステル（ＭＢＳ）または水溶性化合物ｍ−マレイミドベンゾイルスルホサクシミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）が、Ｇｒｅｅｎら，Ｃｅｌｌ，２８：４７７（１９８２）；およびＰａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：２４７９（１９８７）に記載のように、使用される。多くの他の結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）が、ペプチドを他の分子に結合させるために使用され得る。結合方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｇ．Ｔ．ＨｅｒｍａｎｓｏｎによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  １９９６）の第９章（４１９頁〜４５５頁）および第１１章（４９４頁〜５２７頁）を、参照のこと（この開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【００８８】
（アジュバント）
抗原の２つの特性は、その免疫原性、すなわちインビボで免疫応答を誘導するその能力（特異的抗体の形成を含む）、およびその抗原性、すなわち配列および構造に特異的な抗体によって選択的に認識される能力である。
【００８９】
幾つかの抗原は、自身に投与された場合、弱くしか免疫原性でない。従って、弱い免疫原性抗原は、効果的な免疫治療または生物の保護を提供するために必須の免疫応答を、誘導し損なうことがある。
【００９０】
抗原の免疫原性は、さらなる物質（アジュバントと呼ばれる）との混合物として投与によって高められ得る。アジュバントは、免疫系に直接作用するかまたは抗原の徐放をもたらすことにより、抗原に対する免疫応答を高めるように作用する。従って、アジュバントは、抗原の治療動態学的（ｔｈｅｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ）特性を修正し、そして抗原と免疫応答との間の相互作用時間を延長する。アジュバントの使用は、当該分野で周知であり、そして多くの適切なアジュバントが、使用され得る。免疫原性組成物の調製およびアジュバントの使用は、概して、「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ−−Ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｅｄ．Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５において記載され、この開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【００９１】
最も広く知られているアジュバントは、フロイントアジュバント（鉱油中生理食塩水の中にミコバクテリアの死骸を含有する乳剤）およびフロイント不完全アジュバント（ミコバクテリアの死骸を含有しない）である。
【００９２】
アジュバントは、抗原に対する免疫応答の強度を増加し得るか、または免疫系の特定の活性化をもたらし得る。アジュバントの５つの一般的な分類が存在する。（１）水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩、（２）サポニンおよびＱｕｉｌｌ  Ａ、Ｑｕｉｌｌ  Ａ／ＩＳＣＯＭ、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド／アルビジン（ａｒｖｉｄｉｎｅ）のような界面活性剤、（３）ポリアニオン；（４）フロイント完全、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ムラミルジペプチド）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（トレオニルＭＤＰ）のような細菌性誘導体、（５）フロイントの不完全（油乳剤）、リポソームのようなビヒクルおよび徐放物質が、挙げられる。Ａ．Ｃ．ＡｌｌｉｓｏｎおよびＮ．Ｅ．ＢｙａｒｓによるＮｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第１１章、１２９頁〜１４０頁、「Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ａ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）を、参照のこと。
【００９３】
本発明の免疫原性組成物は、抗原およびアジュバントを含有する。適切なアジュバントとしては、ミョウバン（水酸化アルミニウムゲルまたはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩）が挙げられるが、カルシウムの塩、鉄の塩、亜鉛の塩もあり得る。他の適切なアジュバントとしては、アクリル化チロシンもしくはアクリル化糖類、カチオン誘導化多糖類もしくはアニオン誘導化多糖類、またはポリホスファゼンの不溶性懸濁物が、挙げられる。
【００９４】
アジュバント系を作成するのにアジュバントの組み合わせが使用され得る。適切なアジュバント系としては、例えば、モノホスホリルリピドＡ（好ましくは、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ）（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩の組み合わせが挙げられる。代替のアジュバント系は、例えば、ＲＩＢＩ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ  ＳＹＳＴＥＭＴＭ（モノホスホリルリピドＡ（好ましくは、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ）（３Ｄ−ＭＰＬ）、合成トレハロースジコリノミコレート、および細胞壁骨格物質の組み合わせ）を含む。強化系は、モノホスホリルリピドＡおよびサポニン誘導体の組み合わせ（特に、ＷＯ９４／００１５３に開示されるようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ）、またはＷＯ９６／３３７３９に開示されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされた低反応性組成物を含む。水中油エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ、およびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント処方物が、ＷＯ９５／１７２１０に記載されており、好ましい処方物である。ＷＯ９４／００１５３、ＷＯ９６／３３７３９、およびＷＯ９５／１７２１０の開示は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。
【００９５】
あるいは、本発明の免疫原性組成物は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号（その全体が本明細書中で参考として援用される）により記載されるようなリポソームまたはビヒクル中にカプセル化され得る。
【００９６】
（抗体構造）
本発明は、Ａβ（４−１０）エピトープに結合しアミロイド沈着および原線維形成を阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントを企図する。一般的に、基本抗体構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み得る。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定し得る。代表的には、ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、代表的に、μ、γ、α、またはεとして分類され、そしてそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖内では、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結されており、重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。Ｊ．Ｋ．ＦｒａｚｅｒおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」，ｐｐ．３７−７５，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｗ．Ｆ．Ｐａｕｌ編，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９９）（Ｆｒａｚｅｒ）を参照のこと（全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される）。
【００９７】
各軽／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成し得る。従って、一般的には、インタクトなＩｇＧ抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性または二特異性抗体を除いて、２つの結合部位は、一般的に同一である。
【００９８】
通常、全ての鎖は、３つの超可変領域により連結された、同じ一般構造の比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）（相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる）を示す。各対の２つの鎖由来のＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般的に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖の両方は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４のドメインを含む。一般的に、各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９））に従う。
【００９９】
（抗体のタイプ）
用語「抗体分子」は、抗体およびそのフラグメントを含むがこれらに限定されない。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二特異的抗体、、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントを含む。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。好ましくは、抗体分子は、モノクローナル完全ヒト抗体である。
【０１００】
本発明の抗Ａβ（４−１０）抗体分子は、好ましくは、ヒトアミロイドＡβタンパク質およびペプチドを認識する；しかし、本発明は、異なる種（好ましくは、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはイヌ））由来のアミロイドＡβタンパク質およびペプチドを認識する抗体分子を含む。
【０１０１】
さらに、本発明の抗Ａβ（４−１０）抗体分子は、ヒトモノクローナル抗体由来であり得る。このような抗体は、抗原チャレンジに応答して特定のヒト抗体を生成するよう「操作」されたトランスジェニックマウスから得られる。この技術において、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座のエレメントは、内因性重鎖および軽鎖の遺伝子座の標的化された破壊を含む胚性幹細胞から誘導されたマウス系統に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成し得、そしてマウスは、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを生成するために使用され得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、およびＴａｙｌｏｒら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に記載される。
【０１０２】
好ましい実施形態において、Ａβ（４−１０）に対する完全ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系のパーツを有するトランスジェニックマウスを用いて生成される。これらのトランスジェニックマウス（本明細書中で、「ＨｕＭＡｂ」マウスと称され得る）は、内因性μおよびκ鎖の遺伝子座を不活性させる標的化された変異と共に、再配置されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子小遺伝子座を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４（８５６−８５９）。従って、このマウスは、減少したマウスＩｇＭおよびκの発現を示し、そして免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラススイッチおよび、高親和性ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を生成する体細胞変異を起こす（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４），前出；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１において総説されている；およびＬｏｎｇｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）。ＨｕＭＡｂマウスの調製は、当該分野で一般的に公知であり、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら，（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に記載されている。米国特許第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号（全て、ＬｏｂｅｒｇおよびＫａｙ、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；米国特許第５，５４５，８０７号（Ｓｕｒａｎｉら）をさらに参照のこと（これらの全体が本明細書中で参考として援用される）。
【０１０３】
Ａβ（４−１０）に対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、ＨｕＭａｂマウスは、本発明のＡβ（４−１０）抗原を含む免疫原性組成物で免疫され得る。好ましくは、マウスは、第１免疫の際に６〜１６週齢である。例えば、本発明のＡβ（４−１０）抗原を含む免疫原性組成物は、ＨｕＭａｂマウスを腹腔内免疫するために使用され得る。マウスはまた、Ａβ（４−１０）含有遺伝子で安定に形質転換またはトランスフェクトされた全ＨＥＫ２９３細胞で免疫され得る。「抗原性Ａβ（４−１０）ポリペプチド」は、ＨｕＭａｂマウスにおいて抗Ａβ（４−１０）免疫応答を誘発するその任意のフラグメントのＡβ（４−１０）のことを言い得る。
【０１０４】
一般的に、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスは、完全フロイントアジュバント中の抗原で最初に腹腔内（ＩＰ）免疫し、その後、不完全フロイントアジュバント中の抗原で毎週ＩＰ免疫（通常、６週まで）する場合、最も応答する。マウスは、最初、Ａβ（４−１０）を発現する細胞（例えば、安定に形質転換されたＨＥＫ２９３細胞）で、次いで、Ａβ（４−１０）を含む抗原の可溶性フラグメント（例えば、本発明の免疫原性組成物）で免疫され得、そして２つの抗原による交互の免疫を連続的に受け得る。免疫応答は、眼窩の後部（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）または尾部の採血により得られた血漿サンプルを用いた免疫プロトコールの課程にわたってモニタリングされ得る。血漿は、抗Ａβ（４−１０）抗体の存在について、例えば、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングされ得、そして十分な免疫グロブリン力価を有するマウスは、融合のために使用され得る。マウスは、屠殺および脾臓採取の３日前に抗原で静脈内ブーストされ得る。各抗原について２〜３の融合が実施されることが必要であり得ると考えられる。数匹のマウスが、各抗原について免疫され得る。例えば、ＨＣ０７およびＨＣ０１２系統のＨｕＭａｂマウス合計１２匹が免疫され得る。
【０１０５】
モノクローナルの完全なヒト抗Ａβ（４−１０）抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、次いで、当該分野で一般に公知である方法により産生され得る。これらの方法は、制限されずに、当初、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５）によって開発されたハイブリドーマ技法；およびトリオーマ技法、Ｈｅｒｉｎｇら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４７：２１１〜２１６（１９８８）、およびＨａｇｉｗａｒａら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ４：１５（１９９３）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；およびＣｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８０：２０２６〜２０３０（１９８３）；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．，７７〜９６頁、１９８５）を含む。好ましくは、マウス脾細胞が単離され、そして標準的なプロトコールに基づき、ＰＥＧを用いて、マウス骨髄腫細胞株に融合される。得られるハイブリドーマを、次いで、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングされる。例えば、免疫化されたマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、１／６の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８０）に５０％ＰＥＧを用いて融合する。細胞を、約２×１０５細胞で平底マイクロタイタープレートに入れ、２０％ウシ胎児血清、１８％「６５３」調整培地、５％オリゲン（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；このＨＡＴは、融合後２４時間で添加される）を含む選択培地中、２週間インキュベーションする。２週間後、細胞を、ＨＡＴがＨＴで置換される培地中で培養する。次いで、個々のウェルを、ＥＬＩＳＡにより、ヒト抗Ａβ（４−１０）モノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてスクリーニングする。一旦、広範なハイブリドーマ成長が生じると、培地は、通常、１０〜１４日後に観察される。抗体分泌ハイブリドーマは、再びプレートに入れ、再びスクリーニングされ、そしてなお、ヒトＩｇＧについて陽性であれば、抗Ａβ（４−１０）モノクローナル抗体は、少なくとも２回の制限希釈によってサブクローンされ得る。次いで、安定なサブクローンがインビトロで培養され、特徴付けのために、組織培養培地中で少量の抗体を生成する。
【０１０６】
本発明の抗Ａβ抗体分子はまた、組換えにより産生され得る（例えば、上記のようなＥ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系中）。この実施形態では、本発明の抗体分子（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸は、ｐｅｔを基礎にしたプラスミド中に挿入され得、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｔ７系中で発現され得る。当該分野で周知である組換え抗体を生成するいくつかの方法がある。抗体の組換え産生のための方法の１つの例は、米国特許第４，８１６，５６７号中に開示され、これは、その全体が参考として本明細書中に援用される。抗体分子はまた、ＣＨＯまたはＮＳＯ細胞中で組換えにより産生され得る。
【０１０７】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体、すなわち、個々の抗体を含むこの集団が、少数存在し得る可能な天然に生じる変異を除いて同一である、抗体の集団から得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して惹起されており、高度に特異的である。モノクローナル抗体は、それらは、その他の免疫グロブリンによって本質的に汚染されていない、ハイブリドーマ培養によって合成され得るという点で有利である。修飾語「モノクローナルの」は、抗体の特徴が抗体の実質的に均一な集団から得られており、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。上記のように、本発明に従って用いられるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されるハイブリドーマ法によって作製され得る。
【０１０８】
ポリクローナル抗体は、１つ以上のその他の同一でない抗体の間または存在下で産生された抗体である。一般に、ポリクローナル抗体は、同一でない抗体を産生する、いくつかの他のＢリンパ球の存在下、Ｂリンパ球から産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫化された動物から直接得られる。
【０１０９】
用語「完全なヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。同様に、「マウス抗体」は、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。
【０１１０】
本発明は、「キメラ抗体」−別の非ヒト種（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ）から抗体領域（例えば、定常領域）と融合またはキメラ化された本発明の可変領域を含む抗体を含む。これら抗体は、非ヒト種において、Ａβ（４−１０）の発現または活性を調節するために用いられ得る。
【０１１１】
「ヒト化抗体」は、別のヒト抗体の定常領域に付着した、別のヒト抗体または非ヒト可変領域のフレームワーク内の非ヒトＣＤＲを含む抗体をいう。本発明は、非ヒト種からのＣＤＲまたは可変領域を含み、本発明の可変領域またはＣＤＲのアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体を企図する。
【０１１２】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。少なくとも５つの免疫グロブリンの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、そしてこれらのいくつかは、サブクラス（イソ形）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２にさらに分割され得る。好ましくは、本発明の抗体分子は、ＩｇＧ−１またはＩｇＧ−４である。
【０１１３】
本発明の抗体はまた、９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７ＣＵ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈ、および４０Ｋのような放射性同位体標識、ならびに１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒ、５６Ｆｅのような非放射性同位体標識と結合され得る。
【０１１４】
本発明の抗体はまた、希土類元素キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、アンベリフェロン、ルシフェリン、発光標識、イソ発光（ｉｓｏｌｕｍｉｎａｌ）標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジミウム塩標識、オキサレートエステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識および安定なフリーラジカルのような蛍光物質を含む、蛍光または化学発光標識と結合され得る。
【０１１５】
本発明の抗体分子を種々の成分に結合するために当該技術分野で公知の任意の方法が用いられ得、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ  Ｊ．、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．およびＣｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）によって記載されるような方法を含み、これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書により援用される。抗体を結合するための方法は、通常であり、そして当該分野で周知である。
【０１１６】
本発明はまた、Ａβ（４−１０）またはＡβペプチドに結合する分子を含む免疫原性組成物の投与に基づく特定の治療方法に関する。従って、Ａβ（４−１０）を含む抗原は、加齢におけるプラーク沈着、またはアルツハイマー病のようなヒト疾患を阻害またはこれらに対して薬効を増大するために投与され得る。
【０１１７】
本発明はまた、Ａβ（４−１０）抗原およびそのアナログを作製、同定、精製、特徴付ける方法；およびＡβ（４−１０）抗原およびそのアナログを用いる方法を包含する。Ａβ（４−１０）抗原は、天然の供給源から単離されたより大きなアミロイドペプチドのタンパク質分解切断を含む改変により、遺伝子操作技法、または化学的合成、例えば、固相ペプチド合成により産生され得るか；または遺伝子操作または固相ペプチド合成によってデノボで産生され得る。
【０１１８】
（分子生物学）
本発明に従って、当業者の技術範囲内の通常の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が用いられ得る。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｓｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編  １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｒｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照のこと。
【０１１９】
（ＣＲＮＤ８  マウス）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、三ヶ月齢までのＣＮＳにおけるＡβ合成およびアミロイド沈着の高いレベルを示すＡＤの動物モデルである。国際公開番号ＷＯ０１／９７６０７（１２／２７／０１に発行され、その開示が本明細書中にその全体において参考として援用されている）を参照のこと。さらに、ＴｇＣＲＮＤ８マウスが、アミロイド沈着が始まる期間中に認識の変化を示す。トランスジェニックＴｇＣＲＮＤ８マウスモデルが、ＣＮＳにおけるＡβアミロイドタンパク質の発現ならびに組織的分析、神経学および行動欠損に基づいて、自然に存在するアルツハイマー病表現型に対する大きな類似性によって特徴付けられる。
【０１２０】
ＡＰＰ遺伝子は、選択的なスプライシングを経て、３つの一般的なアイソフォームを生成する。７７０アミノ酸を含む最も長いアイソフォーム（ＡＰＰ７７０）および７５１アミノ酸を含む２番目に最も長いアイソフォーム（ＡＰＰ７５１）は、ほとんどの組織において発現される。６９５アミノ酸を含む、３番目の転写物（ＡＰＰ６９５）は、脳中で大部分が発現される。変換により、最も長いアイソフォーム（ＡＰＰ７７０）のコドン番号付けが、より短いアイソフォームのコドン位置をいう場合でさえ、使用される。
【０１２１】
ＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスは、脳特異的ＡＰＰ６９５アイソフォームの変異体形態を発現するトランスジーンを含む；このトランスジーンは、「Ｓｗｅｄｉｓｈ」および「Ｉｎｄｉａｎａ」ＡＰＰ変異の両方を有する。
【０１２２】
変異Ｋ５９５Ｎ／Ｍ５９６Ｌ（Ｓｗｅｄｉｓｈ変異）およびＶ６４２Ｆ（Ｉｎｄｉａｎａ変異）を含む（ＡＰＰ６９５のコドン番号付けを使用する）ＡＰＰ６９５  ｃＤＮＡが、生成される。これらのＡＰＰ変異および他のＡＰＰ変異が、より一般的なＡＰＰ７７０コドン番号付けシステムにより、本明細書中で言及される（すなわち、これら２つの変異については、Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ（Ｓｗｅｄｉｓｈ変異）およびＶ７１７Ｆ（Ｉｎｄｉａｎａ変異））。
【０１２３】
二重変異ＡＰＰ６９５  ｃＤＮＡカセットは、コスミド発現ベクター、ｃｏｓＴｅｔ中に挿入され、このベクターは、Ｓｙｒｉａｎハムスタープリオンタンパク質遺伝子プロモーターを含む。次いで、このベクターを、マウス卵母細胞中に微量注入して、ＴｇＣＲＮＤ８と呼ばれるトランスジェニック株を作製した。これらのマウスは、３ヵ月齢まで複数の広汎性アミロイド沈着物（ｄｉｆｆｕｓｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｄｅｐｏｓｉｔｓ）を示し、この時空間学習における欠損が、明らかになる。
【０１２４】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、ＡＤ関連変異を有する種々の他のトランスジェニックマウスと交配され、２重トランスジェニックマウス（ｂｉ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ）を作製し、このマウスはさらに、高められたＡＤ関連神経病理学を示す。
【０１２５】
（処置の投与および方法）
本発明はまた、Ａβ（４−１０）抗原を使用する方法を含み、Ａβ４２のプラークへの結合と干渉する薬物を同定する。１つのこのような局面は、Ａβ４２の効果を模倣し、そして／または補完する薬物を同定する薬物スクリーニングアッセイを包含する。１つのこのような実施形態において、薬物ライブラリーが、Ａβ（４−１０）を含むペプチドの、特異的な低分子に対する結合活性をアッセイすることにより、スクリーニングされる。プラークに対するＡβ４２の親和性に対する保護的薬物の効果が、モニタリングされる。薬物がＡβ４２のプラークに対する結合親和性を減少する場合、この薬物は、候補薬物となる。薬物は、プラーク形成を中断させ、原線維発生プロセスを阻害し、または実施された原線維を構成要素に分ける能力についてスクリーニングされ得る。
【０１２６】
抗原、抗体または他の本発明に有用な化合物が、薬学的組成物の成分として組み込まれ得る。薬学的組成物は、好ましくは、薬学的に有効なキャリアと、抗原、抗体またはその他の化合物の少なくとも１つの治療量または予防量とを含む。
【０１２７】
本発明の方法に有用な薬学的組成物を調製する際に、任意の適合性の、患者に対する本明細書中で開示される方法に従って同定される抗原、抗体またはその結合フラグメントあるいは治療化合物を送達するのに適切な、非毒性物質である、薬学的キャリアが使用されるべきである。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス、不活性固体、およびリポソームさえが、キャリアとして使用され得る。薬学的に受容可能なアジュバント（緩衝化剤、分散剤）がまた、薬学的組成物中に組み込まれ得る。抗体およびその薬学的組成物は、非経口投与（すなわち、静脈内、動脈内、筋肉内、または皮下）のために特に有用である。しかし、鼻内または他のエアロゾル処方物がまた、有用である。投与のための処方物における抗体のような化合物の濃度は、非常に広範、すなわち、約０．５重量％未満、普通少なくとも１重量％から、１５重量％または２０重量％以上まで、であり得、そして選択される投与の特定の様式に対して好ましい流体体積、粘度などに主に基づいて、主に選択される。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）に詳細に記載され、これは、参考として本明細書中に援用される。
【０１２８】
本発明の免疫原生組成物、抗体または抗原結合フラグメントが、被験体中のアミロイド沈着（またはアミロイド負荷）を調節するのに十分な治療有効投薬量で投与される。「治療的有効投薬量」は、処置されない被験体に対して、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、そしてなおより好ましくは少なくとも約８０％、アミロイド沈着を調節する。アミロイド沈着を調節する方法の能力は、ヒト疾患におけるアミロイド沈着を調節する効力を予測し得るモデル系（例えば、当該分野で公知の動物モデル系（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／２８１８７に記載される方法））において、またはインビトロの方法（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／０７４０２に記載されるＣｈａｒｋｒａｂａｒｔｔｙの方法）により、または本明細書中に記載されるＴｇＣＲＮＤ８モデル系において、評価され得る。さらに、被験体中のアミロイド沈着の量または分布は、例えば、アミロイド沈着物と結合し得る放射線標識されたトレーサーの使用、続くアミロイド沈着物を画像化するシンチグラフィーにより、インビボで非侵襲的にモニタリングされ得る（例えば、Ａｐｒｉｌｅ，Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２２：１３９３（１９９５）；Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｐ．Ｎ．，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．８：６３５（１９９４）およびここで引用される参考文献を参照のこと）。従って、例えば、被験体のアミロイド負荷は、本発明の方法に従う処置の期間の後に評価され、そして本発明の治療的化合物で治療を始める前に被験体のアミロイド負荷と比較されて、被験体中のアミロイド沈着物に対する治療化合物の効果を決定し得る。
【０１２９】
アミロイド沈着またはアミロイド負荷を調節する本発明の方法の能力が、特定の実施形態において、インビボでのアミロイド沈着またはアミロイド負荷と関連する症状または徴候を観察することにより、評価され得ることが理解される。従って、例えば、アミロイド沈着またはアミロイド負荷を減少させる本発明の方法の能力は、裏に隠されたアミロイド関連疾患状態または症状の臨床的な病気の症状、あるいは症状の徴候の進行を遅くまたは延期することにおける観察可能な改善と関連付けられ得る。従って、疾患の臨床的な病気の症状をモニタリングすることは、本発明の方法のアミロイド調節効力を評価する際に有用であり得る。
【０１３０】
本発明の方法は、アミロイド沈着が生じる他の疾患に関連するアミロイド症の処置に有用であり得る。臨床的に、アミロイド症は、原発性、続発性、家族性または孤立性であり得る。アミロイドは、アミロイド内に含まれるアミロイド形成性タンパク質のタイプによって分類されてきた。調節され得るアミロイドの非限定的な例は、そのアミロイド形成性タンパク質によって同定されるように、以下のとおりである（アミロイド形成性タンパク質の後ろの括弧内の関連の疾患である）：β−アミロイド（アルツハイマー病、ダウン症候群、遺伝性脳性出血性アミロイド症［オランダ］、脳血管障害）；アミロイドＡ（反応性［続発性］アミロイド症、家族性地中海熱、蕁麻疹および難聴を伴う家族性アミロイドニューロパシー［Ｍｕｃｋｌｅ−Ｗｅｌｌｓ症候群］）；アミロイドκＬ鎖またはアミロイドλＬ鎖（突発性［原発性］、骨髄腫またはマクログロブリン血症関連）；Ａβ２Ｍ（慢性血液透析）；ＡＴＴＲ（家族性アミロイド多発性ニューロパシー［ポルトガル、日本、スウェーデン］、家族性アミロイド心筋症［デンマーク］、孤立性心臓アミロイド、全身性老人性アミロイド症）；ＡＩＡＰＰまたはアミリン（成人発症糖尿病、インスリノーマ）；心房性ナトリウム利尿因子（孤立性心房性アミロイド）；プロカルシトニン（甲状腺の髄様癌）；ゲルソリン（家族性アミロイド症［フィンランド］）；シスタチンＣ（アミロイド症を伴う遺伝性小脳出血［アイスランド］）；ＡＡｐｏＡ−Ｉ（家族性アミロイド症多発性ニューロパシー［アイオワ］）；ＡＡｐｏＡ−ＩＩ（マウスにおける加速された老齢化）；フィブリノーゲン関連のアミロイド；リゾチーム関連のアミロイド；およびＡＳｃｒまたはＰｒＰ−２７（スクラピー、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ゲルストマン−シュトロイスラー症候群、ウシの海綿状脳症）。
【０１３１】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のためではない。
【実施例】
【０１３２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（実施例１）
（抗原合成および構造の特徴付け）
この実施例において、本発明者らは、合成Ａβペプチド免疫原をどのように合成し、精製しそして特徴付けするかを記載する。
【０１３３】
以下のＡβペプチド：Ａβ４２、Ａβ４０、Ａβ３０およびＮ末端エピトープペプチドの合成を、ＡＢＩＭＥＤ  ＥＰＳ−２２１半自動化ペプチド合成機を用い、ＮｏｖａＳｙｎ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）ＰＥＧグラフトポリマー樹脂およびＦｍｏｃＮ末端保護法を記載されるようにして使用して実施した。Ｍａｙｅｒ−Ｆｌｉｇｇｅら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．４：３５５−３６３（１９９８）を参照のこと。Ｆｍｏｃ−脱保護工程および最終の脱保護サイクルを分光学的にモニタリングした。これらの合成ペプチドを、半調製用逆相Ｃ１８μｂｏｎｄａｐａｋＨＰＬＣカラムを使用して精製した。
【０１３４】
次いで、精製した合成ペプチドの分子量を、プラズマ脱離質量分光法（ＭＡＬＤＩ）およびエレクトロスプレー質量分光法（ＥＳＩ）によって特徴付けした。推定質量に対応する分子量を有するペプチド画分のみを、後の免疫に使用した。
【０１３５】
溶液中のペプチドの二次構造を、円偏光二色性（ＣＤ）を使用して評価した。このＣＤスペクトルを、ＪＡＳＣＯ  Ｊ−５００分光計を使用して記録した。Ｍａｙｅｒ−Ｆｌｉｇｇｅら，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．４：３５５−３６３（１９９８）を参照のこと。さらに、ＮＭＲ研究を、以前に記載されるようなＢｒｕｋｅｒ−ＡＭＸ−６００機器を用いる２Ｄ−ＮＭＲ−ＮＯＥＳＹ分析を使用して実施した。Ｍｉｃｈｅｌｓら，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｓ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｇａｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓｃｒｙ−ｐｏｒｉｎ）」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２版）。
【０１３６】
（実施例２）
（Ａβ４２でのＣＲＮＤ８マウスの免疫）
この実施例において、本発明者らは、Ａβ４２ペプチドが、ＡＰＰ導入遺伝子を発現するマウスおよび非トランスジェニックマウスにおいて免疫原性であることを示す。
【０１３７】
（マウス）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、Ｃｈｉｓｈｔｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２１５６２−２１５７０（２００１）（この開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される）によって他の場所で記載されている。これらのマウスを、β−ＡＰＰ６９５転写物上でシスでβ−ＡＰＰＳｗｅｄｉｓｈおよびβ−ＡＰＰＶ７１７Ｆ変異を過剰発現する非近交系Ｃ３Ｈ／Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグランドに維持した。β−ＡＰＰＳｗｅｄｉｓｈ遺伝子およびβ−ＡＰＰＶ７１７Ｆ遺伝子を、シリアハムスタープリオン遺伝子プロモーターの制御下においた。Ｃ３Ｈ／Ｃ５７ＢＬ６（８２％／１８％）導入遺伝子陽性ヘミ接合性マウスとｗｔ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの交配により誘導されたＴｇＣＲＮＤ８マウスを離乳させ、β−ＡＰＰ導入遺伝子の存在についてゲノム型決定し、標準的なマウスケージ中に、２〜４匹の同性のグループを収容した。これらのマウスに、食餌ペレット、粉末食餌および水を自由に与えた。全てのマウスを１週間飼育し、その後、１回目の免疫をし、そしてそれらの体重を、免疫の前および全ての免疫の２日後に記録した。実験グループの全ては、同じ性別および体重であった。
【０１３８】
（免疫プロトコールおよび血清単離）
合成Ａβ４２および島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）ペプチドの残基８〜３７（ＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴＮＶＧＳＮＴＹ）（配列番号５２）から構成されるコントロールペプチドを、Ｃ１８μｂｏｎｄａｐａｋを用いる逆相ＨＰＬＣによって単離し、そしてこれらのペプチドの純度を、質量分析およびアミノ酸分析によって決定した。
【０１３９】
免疫プロトコールおよびスケジュールは、Ｓｃｈｅｎｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ４００：１７３−１７７（１９９９）（この開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に以前に記載された通りであった。次いで、抗体力価を、血清サンプル（２００μｌの血液）（１３週齢で、後脚静脈の穿刺により、そして２５週齢で、この手順の停止時に、心臓穿刺によって収集した）中で決定した。これらの研究で使用する前に、補体を、５６℃で３０分間インキュベートすることによって不活性化した。ＩＧ画分を、５ｍｌのプロテインＧカラムで単離した。サンプルを充填し、ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍのクエン酸Ｎａで溶出し、そして１ＭのＴｒｉｓで緩衝化した。全てのＩｇ画分を、使用前に濾過滅菌した。
【０１４０】
（免疫の結果）
血清を、非免疫マウス（Ｎ＝１８）から、ならびにＴｇＣＲＮＤ８マウスおよびその非トランスジェニック同腹子の両方から単離した。これらのマウスは、５ヶ月にわたって、Ａβ４２（ｎ＝３４、１８  ＴｇＣＲＮＤ８および１６  非Ｔｇ）または末梢アミロイドペプチド（島関連ポリペプチド（ＩＡＰＰ））のいずれかで繰返し免疫されており、ここで免疫されたマウスの数は、１７匹であり、１０匹がＴｇＣＲＮＤ８であり、７匹が非トランスジェニック（ｎｏｎ−ｔｇ）であった。これらのマウスは、Ａβ４２に対して（１：５０００〜１：５０，０００）、およびＩＡＰＰに対して（１：５０００〜１：３０，０００）有意な力価を発生した。興味深いことに、ＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスおよびそれらの非トランスジェニック同腹子の抗Ａβ４２力価における有意な差違は検出されなかった。Ａβ４２免疫マウス由来の血清の全てのサンプルは、２０週齢の非免疫ＴｇＣＲＮＤ８マウス由来の脳の組織学的切片中の成熟Ａβプラークをポジティブに染色し得た。対照的に、コントロールペプチドＩＡＰＰ免疫マウスおよび非免疫マウス由来の血清は、２０週齢の非免疫ＴｇＣＲＮＤ８マウス由来の脳の組織学的切片中の成熟Ａβプラークを染色し得なかった。従って、これらの結果は、Ａβを含む神経病理学的プラークを認識しそしてそれに結合し得る抗体自己免疫が誘導され得ることを示す。
【０１４１】
（実施例３）
（マウス免疫血清による原線維形成の阻害）
本実施例において、表２に示されるように、本発明者らは、ほとんどのＡβ４２免疫マウス由来の血清が、原線維形成を阻害したことを示す。
【０１４２】
低濃度のＡβペプチドの溶液において、１４日間のインキュベート期間にわたって、自発的に原線維へと集合する。これらの原線維は、５０〜７０Åという特徴的な直径を有し、これは、以下に記載されるように電子顕微鏡によってモニタリングされ得る。
【０１４３】
（電子顕微鏡）
１０ｍｇ／ｍｌのストック濃度の水中での可溶化後または成熟アミロイド原線維への集合後に、Ａβ４２を直接使用した。１００μｇ／ｍｌの最終ペプチド濃度の血清の存在下および非存在下において、Ａβ４２をインキュベートした。種々の血清の連続希釈液をＡβ４２に加え、室温（ＲＴ）で２週間までインキュベートした。ネガティブ染色電子顕微鏡にのために、炭素でコーティングしたピオロ型（ｐｉｏｌｏｆｏｒｍ）格子を、ペプチドの水溶液上に浮遊させた。格子をブロットし、風乾した後、これらのサンプルを１％（ｗ／ｖ）のリンタングステン酸により染色した。ペプチド集合体を、Ｈｉｔａｃｈｉ  ７０００電子顕微鏡（倍率６０，０００倍、７５Ｖで操作した）で観察した。
【０１４４】
（電子顕微鏡結果）
Ａβから原線維への集合に対するＡβ免疫マウス血清の効果を評価するために、Ａβ４２の存在下および非存在下において、上述のように３７℃で１４日まで血清をインキュベートした。各反応混合物からのアリコートを、ネガティブ染色電子顕微鏡によって、Ａβ４２原線維の存在下、１日目、３日目、７日目、１０日目および１４日目に試験した。
【０１４５】
血清の非存在下、または非免疫血清の存在下では、Ａβ４２は、５０〜７０Åという特徴的な直径を有する、長い原線維（約７５００Å）を形成した。従って、長い原線維は、正常な血清成分が現在のアッセイ条件下では、Ａβ原線維形成を阻害しないこを示した。ＩＡＰＰ免疫動物由来の血清の存在下では、より少ない長いＡβ４２原線維が生成されたが、形成した原線維は、５０〜７０Åという特徴的な直径を有した。対照的に、表２に示されるように、Ａβ４２免疫マウス血清（ｎ＝２７／３４）の大部分は、原線維形成を非常に阻害したが、幾つかの血清（ｎ＝７／３４）は、ほとんどまたは全く効果を有さなかった。さらに、ＴｇＣＲＮＤ８マウス由来または非トランスジェニック同腹子由来のＡβ免疫血清は、等しくＡβ原線維形成を阻害し、これは、抗体レパートリーが、免疫原のみに依存し、内因性Ａβ４２の充填には依存しないことを示す。
【０１４６】
表２にまとめられているように、非免疫マウス血清の存在下でインキュベートした場合、原線維の構造の差は、検出できなかった。ＩＡＰＰで免疫したマウス由来の血清は、原線維形成の程度を減少させたが、形成した原線維は、Ａβ４２単独によって形成された原線維に類似していた。最後に、Ａβ４２で免疫したマウス由来の血清は、完全な阻害から原線維密度のわずかな減少のみという種々の程度まで原線維形成を阻害した（表２を参照のこと）。
【０１４７】
表２  原線維形成、原線維分解および細胞毒性に対する、非免疫Ａβ４２免疫血清およびＩＡＰＰ免疫血清の効果のまとめ
【０１４８】
【表２】
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（実施例４）
（免疫血清による存在する原線維の破壊）
本実施例において、本発明者らは、Ａβ４２免疫マウス由来の血清が、以前に形成されたＡβ４２原線維を分解するが、以前に形成されたＡβ４２原線維は、非免疫コントロールマウス血清とのインキュベーションによっても、ＩＡＰＰ免疫マウス由来の血清によっても影響を受けなかったことを示す。
【０１４９】
Ａβ４２免疫マウス由来の血清が、以前に形成されたＡβ原線維を破壊し得るか否かを決定するために、Ａβ４２免疫マウス由来の血清を、以前に形成されたＡβ原線維と共に３０日までインキュベートした。明らかな凝集を有するＡβ４２原線維を、一定の攪拌を保ちながら、高濃度のＡβアリコートをインキュベートすることによって生成した。血清なし（Ａβ単独）、ＩＡＰＰ免疫血清または非免疫血清（データは示さず）とので以前に形成された原線維のインキュベーションは、３０日のインキュベーション後でさえも、効果を有さなかった。対照的に、Ａβ４２免疫マウス由来の血清（ｎ＝２６／３４）は、平均長が１００Åの直径３０Åの小さな短い原線維か、または無定型の凝集体のいずれかにまで、Ａβ４２原線維を分解した。この分解は、インキュベーションのたった３日後でも明らかであり、１４日目までには完全であった。さらに、分解は濃度依存性であり、抗体の濃度を増加させると、原線維の分解に必要な時間は減少した。最後に、１：１のＡβ４２に対する抗体の比は、分解には必要ではなかったので、抗Ａβ抗体は、Ａβ種のサブセット（例えば、原線維性オリゴマー（ｐｒｏｔｏｆｉｂｉｌｌａｒ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ）または他の前駆体）のみに結合した可能性がある。これらの結果を実施例４に記載されるように６０，０００倍の倍率で電子顕微鏡を使用して決定した。
【０１５０】
（実施例５）
（マウス抗血清によって認識されるＡβ４２の免疫標的エピトープの質量分析決定）
本実施例において、本発明者らは、アミロイド沈着疾患の治療での使用についての重大な生物学的有意性を有するエピトープを正確に同定する方法を示す。
【０１５１】
（一般的スキーム）
抗Ａβ４２血清によって認識されるエピトープを説明するために、ナノ電子スプレー（ｎＥＳＩ）およびＭＡＬＤＩ−イオン化の両方を使用する、高分解能フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ；Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．１７：１〜３５（１９９８））を、以下に論じられるエピトープ切除手順およびエピトープ抽出手順と組み合わせて適用した。Ｍａｃｈｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１５，６３３−１５，６３９（１９９６）；Ｓｕｃｋａｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９８４８−９８５２（１９９０）；Ｐｒｚｙｂｙｌｓｋｉら，「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ａｎｄ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｃｕｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄ．Ｐｕｂｌ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１７−４３ページ（１９９８）を参照のこと。
【０１５２】
エピトープ切除として公知の１つの手順において、本発明者らは、インタクトな固定化された免疫複合体と、放出された後の結合ペプチド上での質量分析ペプチドマッピングとを組み合わせた。特に、Ａβ４２免疫ＴｇＣＲＮＤ８マウスの抗血清、ＩＡＰＰ免疫マウス由来のコントロール抗血清、マウス（モノクローナル）Ａβ４２抗体およびウサギ（ポリクローナル）Ａβ４２抗体を、セファロースマイクロキャピラリー中に固定化した。次に、固定化された抗体をＡβ４２凝集体に曝し、Ａβ４２エピトープを結合させた。免疫複合体のエピトープ切除手順を種々のプロテアーゼおよびエキソペプチドプチダーゼを使用するか、またはこれらと酵素の組み合わせを用いて実施した。表２を参照のこと。
【０１５３】
あるいは、エピトープ抽出手順を使用した。エピトープ抽出について、Ａβ４２を種々のプロテアーゼにより予備消化し、続いて、プロテアーゼ処理したＡβ４２ペプチドの対応する混合物を、抗体カラムに適用し、抗体をエピトープと結合させた。エピトープを、結合ペプチドの溶出の際に、質量分析を使用して同定した。この手順はエピトープ抽出として公知であった。
【０１５４】
個々の手順を以下に詳細に記載する：
（抗体の固定化）
１００μｇのカップリング緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）の溶液を乾燥ＮＨＳ活性化６−アミノヘキサン酸−結合セファロース（Ｓｉｇｍａ）に加え、カップリング反応を２０℃で６０分実施した。次いで、セファロース材料を１００μｍのマイクロキャピラリーカラム上に移し、ここでは、材料の損失なく完全な洗浄を可能にした。Ｍａｃｈｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１５，６３３−１５，６３９（１９９６）を参照のこと。記載のように、ブロッキング緩衝液（エタノールアミン／ＮａＣｌ）および洗浄緩衝液（ＮａＡｃ／ＮａＣｌ）を交互に使用して、カラムを洗浄し、最後に、カラムをｐＨ７．５のＰＢＳ中、４℃で保存した。Ｍａｃｈｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１５，６３３−１５，６３９（１９９６）を参照のこと。
【０１５５】
（エピトープ切除）
エピトープ切除手順を、はじめの２〜５μｇのＡβ４２または他のＡβ抗原のその抗体微小カラムへの適用、および２０℃で６０分間の穏やかな振とうでインキュベートすることにより実施した。引き続いての５×４ｍｌ  ＰＢＳでの洗浄の後、プロテアーゼ消化を、２００μｌ  ＰＢＳの中の０．２μｇのプロテアーゼをインキュベートすることにより、３７℃で２時間そのカラム上で実施した。そのプロテアーゼとしては、トリプシン；Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ；Ａｓｐ−Ｎ−プロテアーゼ；α−キモトリプシン；およびＧｌｕ−Ｃプロテアーゼが挙げられた。その非結合ペプチドおよび消化されたペプチドまたは上清を、５×４ｍｌ  ＰＢＳでの洗浄により除去した。次に、その抗体に結合したエピトープペプチドを、５００μｌ  ０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡの添加により解離させて溶出させた（エピトープ溶出）。２０℃で１５分間のインキュベーションの後、そのエピトープ溶出画分を、凍結乾燥させて質量分析解析のために１０μｌ  ０．１％ＴＦＡの中で再構成させた。さらなるエキソペプチダーゼ消化による手順を、３０分間の０．１μｇのアミノペプチダーゼＭまたはカルボキシペプチダーゼＹとのインキュベーション、およびその後の５×４ｍｌ  ＰＢＳでの洗浄により実施した。
【０１５６】
（エピトープ抽出）
そのエピトープ抽出手順を、タンパク質分解消化物の混合物をその抗体カラムに適用して６０分間２０℃でインキュベートしたことを除き、エピトープ溶出と同じ手法で実施した。引き続いて、その非結合ペプチド（上清）を、５×４ｍｌ  ＰＢＳでの洗浄により除去した。次に、その抗体に結合したエピトープを、５００μｌ  ０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡの添加により解離させて溶出させた（エピトープ溶出）。２０℃で１５分間のインキュベーションの後、そのエピトープ溶出画分を、凍結乾燥しさらに質量分析解析のために１０μｌ  ０．１％ＴＦＡの中で再構成させた。
【０１５７】
（タンパク質分解消化）
遊離抗原のタンパク質分解消化を、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３に溶解した５〜５０μｇのペプチドにより、５０：１の基質対プロテアーゼ比にて３７℃で２時間実施した。その反応混合物を、質量分析解析のために凍結乾燥させるか、またはエピトープ抽出のために調製した。その使用したプロテアーゼは、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ）；Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）；α−キモトリプシン、アミノペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＹ（Ｓｉｇｍａ）であった。
【０１５８】
（質量分析）
ＦＴＩＣＲ−ＭＳを、７Ｔの超伝導磁石およびＩＣＲアナライザーセルを備えたＢｒｕｋｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ、Ｂｒｅｍｅｎ、ＦＲＧ）Ａｐｅｘ  ＩＩ  ＦＴＩＣＲスペクトロメータにより実施した。Ｂａｕｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８：２５−３１（２００１）を参照のこと。パルス化衝突Ａｐｏｌｌｏ−ｎａｎｏ−ＥＳＩ−ｓｏｕｒｃｅによるＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ供給源、ならびに機器条件および質量較正については、以前に記載されてある。Ｆｌｉｇｇｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３９：８４９１−８４９６（２０００）を参照のこと。質量定量精度は、約１ｐｐｍ（ＭＡＬＤＩ）であり、および典型的に、約２００，０００の質量分解能で０．５〜１ｐｐｍ（ＥＳＩ）であった。２，５−ジ−ヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ試料調製のためのマトリックスとして使用した。Ｂａｕｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８：２５−３１（２００１）を参照のこと。ＥＳＩ−ＭＳを、一般的に０．０１％ＴＦＡ水溶液で実施した。Ｆｌｉｇｇｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：８４９１−８４９６（２０００）を参照のこと。
【０１５９】
（質量分析の結果）
セファロース充填型マイクロキャピラリーに固定化した抗体によるエピトープの切除および抽出を、ＥＳＩ−質量分析およびＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−質量分析による解析とともに使用した。Ｍａｃｈｔら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１５６３３−３９（１９９６）；Ｆｌｉｇｇｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：８４９１−８４９６（２０００）を参照のこと；Ｂａｕｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８：２５−３１（２００１）；Ｐｒｚｙｂｙｌｓｋｉら，「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ａｎｄ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄ．Ｐｕｂｌ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．１７−４３（１９９８）を参照のこと。はじめに、遊離Ａβ４２抗原のトリプシン分解ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＭＳは、以下を含む予想されるＡβタンパク質分解ペプチドのすべてを示す：
【０１６０】
【表２Ａ】
2010065046.tif 000005
Ｌｙｓ−Ｃおよびトリプシンの消化を使用した場合では、エピトープ切除により、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ検出を使用した場合に単一のイオン種Ａβ（１−１６）  １９５４．８８０６を産生する単一のペプチドが溶出された。この事例では、ＡβのＲ５残基が、Ｌｙｓ−Ｃおよびトリプシンによる消化から保護された。
【０１６１】
ペプチドフラグメントＡβ（１−１１），１３２４．５３９５Ｄａは、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ  Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼによるエピトープ切除において溶出された。
【０１６２】
α−キモトリプシンおよびアミノペプチダーゼＭの切断の後のエピトープ抽出からの溶出液のＥＳＩ−スペクトルおよびＭＡＬＤＩスペクトルにより、フラグメントＡβ（１−１０）  １１９５．４９６８ＤａおよびＡβ（４−１０）  ８８０．３８２７Ｄａが産生された。
【０１６３】
中核エピトープを、抗体に結合したキモトリプシン分解フラグメントおよびＡβ（１−１０）免疫複合体のアミノペプチダーゼＭ消化を使用する工程により決定した。この二重消化により、Ａβ（４−１０）、ＦＲＨＤＳＧＹを、Ａβ４２の場合に匹敵するアフィニティーを有する最小エピトープとして同定した。そのＣ末端アミノ酸は、Ｙ１０である。なぜならカルボキシペプチダーゼＡを使用するＹ１０からのさらなるＣ末端消化により、Ａβ４２と比較して劇的に減少したアフィニティーを有するペプチドが産生されたからである。
【０１６４】
表３は、エピトープ切除の質量分析ならびにその抗Ａβ抗体およびＡβペプチドを使用する抽出手順により得られたペプチドフラグメントを示す。Ａβ４２ペプチド（表３、第１列）をトリプシンにより前消化した場合、その抗体結合部位から得られるペプチドは、表３、第１列に示される配列に相当する。トリプシンおよびＬｙｓ−Ｃプロテアーゼの組み合わせにより、同じ１６残基のペプチド（表３、第２列）を同定した。そのプロテアーゼがＳ．Ａｕｒｅｕｓ  Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼであって、それをエピトープ切除に使用した場合、第３列に示されるように、１１残基のペプチドが、その抗体結合部位から溶出された。１０残基のペプチドが、α−キモトリプシン単独の消化により観測された（表３、第４列）。表３、第５列に示されるように、そのプロテアーゼ消化がα−キモトリプシンおよびアミノペプチダーゼＭの２つの酵素により実施された場合に、その７アミノ酸中核エピトープが、観測された。
【０１６５】
【表３】
2010065046.tif 000006
（要旨）
ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳ解析により、Ｎ末端配列、Ａβ（１−１０）を含む直鎖状エピトープが、エピトープ切除における唯一の、特異的な産物として同定された。表３および表４を参照のこと。その遊離Ａβ４２抗原のトリプシン消化の質量分析により、すべての予想されるペプチド、（１−１６）、（６−１６）、（１７−２８）、（２９−４２）が産生された。表３および表４を参照のこと。トリプシンおよびＬｙｓ−Ｃ−プロテアーゼによるエピトープ切除により、単一のペプチド（１−１６）が提供された。Ｇｌｕ−Ｃ−プロテアーゼおよびα−キモトリプシンでは、それぞれフラグメント（１−１１）だけおよびフラグメント（１−１０）だけが産生された。表３および表４を参照のこと。対照的に、残基Ｒ５、Ｅ３、Ｆ４は、それぞれこれらのプロテアーゼによる消化から保護された。抗体に結合したエンドプロテアーゼフラグメントのさらなる消化を、エキソペプチダーゼにより実施してその中核エピトープを規定した。そのキモトリプシン消化フラグメントのアミノペプチダーゼＭ消化により、Ａβ（４−１０）；ＦＲＨＤＳＧＹを、Ａβ４２の場合に匹敵するアフィニティーを有する最小エピトープとして同定し、一方、Ｙ１０からのさらなるＣ末端消化（カルボキシペプチダーゼＡ）により、劇的に減少したアフィニティーが産生された。その質量分析エピトープ切除試験において得られたアフィニティーの差異は、Ｎ末端にてアルキルアミド−スペーサー基を通じてビオチン化された合成エピトープペプチドのＥＬＩＳＡにより定量されたアフィニティーと全体的に合致した。Ｇｉｔｌｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４２：９２３−９２６（１９８７）；Ｃｒａｉｇら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：６９７−７０１（１９９６）を参照のこと。そのエピトープを、その単一同位体分子イオンの高度な質量定量精度（０．５〜２ｐｐｍ）により明確に同定した。さらに、これらの結果を、ＩＲ−多光子レーザー分離によるＦＴＩＣＲスペクトルにおける選択された分子イオンの配列特異的なフラグメント化により、および配列変異体および相同なＡβ４２ペプチドによるコントロール試験により、確証した（データは示さず）。Ｆｌｉｇｇｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：８４９１−８４９６（２０００）を参照のこと。それゆえ、Ｒ５ＧおよびＹ１０Ｆの二重変異を含む、ラットＡβ４２では、エピトープ切除において溶出産物がまったく産生されなかった。対照的に、ヒトＡβ（１−４０）およびＡβ（１−３０）により、Ａβ４２と同じエピトープ（４−１０）が提供された。ＩＡＰＰ免疫化マウスからのコントロール抗体では、検出可能なエピトープペプチドがまったく得られなかった。表３および表４を参照のこと。
【０１６６】
【表４】
2010065046.tif 000007
（実施例６）
（Ａβペプチドの構造的特徴付け）
この実施例において、本発明者らは、固定された抗体に対する、同定された合成エピトープペプチドの親和性とＡβ４２の親和性とを比較し、そして溶液中における合成エピトープペプチドの二次構造を特徴付けた。
【０１６７】
質量分析法によって同定されたエピトープは、対応する信頼できる（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ペプチド（ビオチン−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａβ（１−１０）およびビオチン−Ａβ（４−１０））の合成ペプチド、二次構造分析および免疫分析特徴付けを使用して、さらに特徴付けた。最初に、抗Ａβ抗体についての種々のペプチドの親和性を、エピトープペプチドのＥＬＩＳＡおよびドット−ブロット分析を使用して推定した（データは示さず）。結果は、表３に示されたペプチド全てが、Ａβ４２に匹敵する親和性を示したことを示した。
【０１６８】
活性エピトープの可能なコンフォメーションの効果を評価するために、以前に報告されたＡβ４０およびＡβ４２の構造を用いて、Ｎ末端ペプチドの二次構造比較を行った。Ｎ末端、極性ペプチドＡβ（１−１０）およびＡβ（１−１６）のＣＤスペクトルおよび２Ｄ  ＮＭＲ−ＮＯＥＳＹスペクトル（データは示さず）は、Ａβフラグメントについての明確な溶液構造のいかなる証拠も示さない。しかし、このようなデータは、抗体認識についてのエピトープの特定の可撓性を示唆する。これは、Ａβ（４−１０）エピトープ領域の周りのα−ヘリックス形成の傾向の中断を示す、Ａβ４２配列についての二次構造予測と一致する。対照的に、α−ヘリックスの傾向およびヘリックス−コイル／β−シートのコンフォメーションの変化を、膜貫通領域（Ａβ（１８−４２））を含む配列について観察した。Ｃｏｌｅｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１１０６４−１１０７７（１９９８）；Ｋｏｈｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１６０９４−１６１０４（１９９６）を参照のこと。
【０１６９】
（実施例７）
（Ａβ誘導毒性に対する血清の効果）
この実施例において、本発明者らは、Ａβ免疫化血清がＡβ４２誘導細胞傷害性を阻害する能力を評価した。
【０１７０】
（一般的スキーム）
Ａβ免疫化後のＴｇＣＲＮＤ８マウスにおける記憶欠乏の予防が、Ａβの細胞傷害性に対して類似の効果を反映するか否かを調べるために、本発明者らは、ＰＣ−１２細胞を使用して、標準的なＡβ４２毒性アッセイを実施した。ＭｃＬａｕｒｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１８４９５−５０２（２０００）；Ｐａｌｌｉｔｔｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：３５７０−７８（１９９９）を参照のこと。最初に、ＰＣ１２細胞を、２４時間、血清の存在下または非存在下で、Ａβ４２とともにインキュベートした。次に、細胞傷害性を、Ａｌａｍａｒブルーアッセイ（Ａｈｍｅｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７０：２１１−２４（１９９４））（これは、代謝活性を示す）およびＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ（Ｐｉｋｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２３８９５−９８（１９９５））（これは、細胞内エステラーゼ活性および原形質膜完全性の両方を示す）の両方を使用して、測定した。
【０１７１】
（Ａβ毒性アッセイ）
ＰＣ−１２細胞を、９６ウェルプレート中に５００細胞／ウェルでプレートし、そしてＮ２／ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で希釈した３０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（Ａｌａｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ，Ｉｓｒａｅｌ）中に懸濁させた。細胞を、１０，０００〜１５，０００／ウェルの最終細胞数まで５〜７日間、分化させた。Ａβを、ＲＴで３日間、溶液（２５マイクロモル濃度）で維持して、培養物を加える前に、原線維発生を誘導した。このＡβ調製物は、電子顕微鏡によって決定されるように、多数のアセンブリオリゴマー（ＡＤＤＬおよびプロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ））（これまでに神経毒性として同定されているＡβ種）を含む（データは示さず）。Ｌａｍｂｅｒｔら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７９：５９５−６０５（２００１）；Ｗａｌｓｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２５９４５−５２（１９９９）；Ｈａｒｔｌｅｙら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９：８８７６−８８８４（１９９９）を参照のこと。さらに、ウェスタンブロット分析は、Ａβ４２免疫血清が、Ａβ４２モノマー、Ａβ４２テトラマー、Ａβ４２ヘキサマーおよび９８ｋＤａよりも大きなＡβ４２のオリゴマーを認識することを実証した（データは示さず）。３日間のプレインキュベーション後、Ａβを、０．１μｇ／μｌの最終濃度まで細胞培養物を添加し、そして３７℃で２４時間インキュベートした。次に、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ蛍光アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）およびＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｃ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を使用して、毒性をアッセイした。
【０１７２】
（結果）
非免疫マウスまたはＩＡＰＰ免疫マウス由来の血清は、Ａβ毒性アッセイに対して効果が無かった。対照的に、Ａβ４２免疫マウスから単離された血清は、濃度依存性の様式で、Ａβ４２細胞毒性を妨げたが、この効果の範囲において、顕著な可変性を示した。このアッセイにおいて、Ａβ４２誘導毒性と比較して、ｎ＝１８／２２（ｐ＜０．０１）およびｎ＝４／２２（ｐ＜０．００１）であった。細胞生存と原線維脱凝集との間の相関を、個々の血清についてプロットし、そして毒性を阻害する血清の有効性と原線維を脱凝集する血清の有効性との間の直接的な相関を明らかにした。さらに、原線維形成／脱凝集を阻害する際に最も効果的であった抗体はまた、毒性の減少において最も有効であった（不活性血清と比較して、３日、ｐ＜０．００１および７日、ｐ＜０．０００１）。
【０１７３】
細胞傷害性を妨げるのに必要なＡβに対する抗体の化学量論は、作用の機構についての見識を提供し得た。細胞傷害性の阻害を誘発するために必要なＡβに対する抗体の化学量論を決定するために、本発明者らは、１０個の反応性血清についてＥＣ５０を決定した。ＥＣ５０がＡβ誘導性細胞傷害性の５０％をレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）する血清の量として規定される場合、ＥＣ５０値は、２３４±３９の平均±ＳＤで、１：１００〜１：３００の範囲であった。結果として、本発明者らは、保護効果が、小さい抗体：Ａβ比（５０：１）で検出されたことが見出され、これは、抗体が、モノマーＡβまたはＡβ凝集物よりもむしろ、Ａβ−オリゴマー、プロトフィブリル、または前駆体タンパク質フラグメントのような少ない存在比の種のＡβに結合していることを示唆した。さらに、活性血清は、試験された全ての用量においてＡβ−細胞傷害性で有意な減少を引き起こした；これは、細胞死が、血清によって特異的にブロックされたプロセスによって誘導されたことを示唆する。Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ＊ｐ＜０．０１および†ｐ＜０．００１を用いて、一方向ＡＮＯＶＡを使用して、統計学的な分析を達成した。
【０１７４】
（実施例８）
（保護効果を媒介する血清成分）
この実施例において、本発明者らは、どの血清成分が、Ａβの細胞傷害性の減少を担うかを決定するための方法を示す。本発明者らは、活性成分が、血清由来の精製されたＩｇＧ画分に存在し、他の血清成分が、Ａβ媒介細胞死を阻害し得ないことを見出した。
【０１７５】
Ａβ免疫化が、いくつかの他の効果（例えば、他の血清タンパク質の発現の二次的変化）に起因するというよりもむしろ、Ａβ誘導抗体に起因したことを確認するため。従って、Ａβ（４−１０）エピトープを選択的に標的化する抗体のみが、有効であったことを確認するために、本発明者らは、Ａβ４２免疫化血清由来の精製ＩｇＧ画分を使用して、細胞傷害性実験を実行した。さらに、本発明者らは、Ａβの特定のエピトープに対する特異性を有する市販のモノクローナル抗体、４Ｇ８、６Ｅ１０およびＢａｍ１０を含んだ。
【０１７６】
結果は決定的であった。Ａβ４２を免疫した血清から精製した免疫グロブリンＧは、粗血清と同じ毒性阻害を示し、これは、他の血清成分が防御応答に寄与しなかったこと示唆する。さらに、これらのＩｇＧ画分は、全血清と同じ程度に、Ａβの原線維形成を阻害し、そしてＡβ原線維脱凝集を誘導した。４Ｇ８抗体および６Ｅ１０抗体（それぞれ、Ａβ配列の１７〜２４および１１〜１７を認識する）は、原線維形成を阻害しないが、総原線維の量を減少させる。これらの抗体は、溶液中の少量の遊離Ａβペプチドと結合するので、後者の効果が生じ得、その結果、原線維形成からそれを隔離する。対照的に、Ｂａｍ１０（Ａβ１〜１０内の配列を認識する）は、Ａβ４２を免疫した血清で示されたものと同様の原線維形成を阻害する。Ａβ配列のＮ端を認識する唯一の抗体は、原線維形成の効果的なインヒビターであり、そして、Ａβ４２を免疫した血清中の活性成分は、特定のＩｇＧであるということを、これらの結果はさらに示した。
【０１７７】
（実施例９〜２７）
（抗原設計）
表５および実施例９〜２７に示したペプチドを、以下に示した式に従って設計する：
Ｉ．（Ａ）ｎ−−（Ｔｈ）ｍ−−（Ｂ）ｏ−−Ａβ（４−１０）−−（Ｃ）ｐ（ここで、Ａβ（４−１０）の単一コピーが存在し、ｎは０、ｍは１、ｏは２、Ｂはグリシン、Ｃはグリシン、ｐは１、そして、ヘルパーＴ細胞のエピトープは配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１のいずれかである）。これらの結合したＢ細胞およびＴ細胞のエピトープ含有抗原は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２および４３に対応する。
【０１７８】
【表５−１】
2010065046.tif 000008
【０１７９】
【表５−２】
2010065046.tif 000009
（実施例２８）
（抗原設計）
実施例２８（表５）に示したペプチド（配列番号４４に対応する）は、一例である（ここで、ｎは０、ｍは１、ｏは１、Ｂはグリシン、Ｃはグリシン、ｐは１、そして、ヘルパーＴ細胞のエピトープは配列番号２１である）。結合したＢ細胞およびＴ細胞のエピトープ含有抗原は、配列番号４４に示したペプチドに対応する。
【０１８０】
（実施例２９）
（抗原設計）
実施例２９（表５）に示したペプチド（配列番号４５に対応する）は、一例である（ここで、ｎは０、ｍは１、ｏは０、そして、Ｔ細胞のエピトープはペプチド結合を通してＢ細胞のエピトープと直接結合し、Ｃはグリシン、ｐは１、また、ヘルパーＴ細胞のエピトープは配列番号２１である）。結合したＢ細胞およびＴ細胞のエピトープ含有抗原は、配列番号４５に示したペプチドに対応する。
【０１８１】
（実施例３０）
（抗原設計）
実施例３０（表５）に示したペプチド（配列番号４６に対応する）は、一例である（ここで、ｎは０、ｍは１、ｏは０、そして、Ｔ細胞のエピトープはペプチド結合を介してＢ細胞のエピトープと直接結合し、Ｃはグリシン、ｐは１、ヘルパーＴ細胞のエピトープは配列番号２１である）。結合したＢ細胞およびＴ細胞のエピトープ含有抗原は、配列番号４６に示したペプチドに対応する。
【０１８２】
（実施例３１〜３３）
（抗原設計）
実施例３１〜３３（表５）に示したペプチドは、以下に示した式ＩＩに従って設計する：
ＩＩ．（Ａ）ｎ−−Ａβ（４−１０）−−（Ｂ）ｏ−−（Ｔｈ）ｍ−−（Ｃ）ｐ（ここで、Ａβ（４−ｌ０）の単一コピーが存在し、ｎは２、ｍは１、ｏは２、ＡおよびＢはグリシン、そして、ｐは０、また、ヘルパーＴ細胞のエピトープは配列番号２１である）。これらの結合したＢ細胞およびＴ細胞のエピトープ含有抗原は、配列番号４７、４８および４９に対応する。
【０１８３】
（実施例３４および３５）
（抗原設計）
実施例３４（表５）に示したペプチドは、以下に示した式ＩＩに従って設計する：
ＩＩ．（Ａ）ｎ−−Ａβ（４−１０）−−（Ｂ）ｏ−−（Ｔｈ）ｍ−−（Ｃ）ｐ（ここで、Ａβ（４−ｌ０）の単一コピーが存在し、ｎは０、ｍは１、実施例３４ではｏは２、実施例３５ではｏは１、Ｂはグリシン、そして、ｐは０、また、ヘルパーＴ細胞のエピトープは配列番号２１である）。これらの結合したＢ細胞およびＴ細胞のエピトープ含有抗原は、配列番号５０および５１に対応する。
【０１８４】
（実施例３６）
（設計したペプチドの合成）
配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１およびコントロールペプチド（膵膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）（配列番号５２））に対応する設計したペプチドの固相ペプチド合成を、１００μモルのスケールで、マニュアルの固相合成を用いて実施し、そして、Ｆｍｏｃ保護化Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護化アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＮ−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＮ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）活性、ならびにＦｍｏｃ基のピペリジン脱保護を用いたＳｙｍｐｈｏｎｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで実施する（工程１）。必要な場合、Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的な脱保護を、マニュアルで実施し、そして、５ｍＬのＣＨＣｌ３：ＮＭＭ：ＨＯＡｃ（１８：１：０．５）中に溶解した３当量のＰｄ（ＰＰｈ３）４溶液で樹脂を２時間処置することによって達成する（工程２）。次いで、樹脂をＣＨＣｌ３（６×５ｍＬ）、２０％ＨＯＡｃ含有ジクロロメタン（ＤＣＭ）（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄する。ある場合に、次いで、１つのＡＥＥＡ（アミノエトキシエトキシ酢酸）基の添加、酢酸の添加または３−マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）の添加について、合成を再び自動化する（工程３）。８５％  ＴＦＡ／５％  ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノールを用いて、樹脂の切断および生成物の単離を実施し、その後、ドライアイスで冷やしたＥｔ２Ｏに沈殿させた（工程４）。Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）調製用バイナリーＨＰＬＣ系（３０〜５５％Ｂの勾配溶出（０．０４５％  ＴＦＡ含有Ｈ．ｓｕｂ．２  Ｏ（Ａ）および０．０４５％  ＴＦＡ含有ＣＨ３ＣＮ
（Ｂ））（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  １０μフェニルヘキシル、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよび２１４ｎｍと２５４ｎｍのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  ＵＶＤ  ＩＩ）を使用、９．５ｍＬ／分で１８０分以上）を用いて、調製用逆相ＨＰＬＣで生成物を精製する。ダイオードアレイ検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ＬＣＭＳ−１１００シリーズ分光器、および電気スプレーの電離（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を用いたＲＰ−ＨＰＬＣマススペクトロメータによって、純度および質量検定を９５％と決定する。
【０１８５】
（実施例３７）
（式Ｉおよび式ＩＩに従って設計したペプチド抗原を用いたＣＲＮＤ８マウスの免疫）
実施例２に記載するように、ＴｇＣＲＮＤ８マウスを離乳し、β−ＡＰＰトランスジーンの存在について遺伝子型を特定し、標準のマウスのケージの中に、２〜４匹（同性）のマウスの群に収容する。随時、食物ペレット、粉末食餌、および水をマウスに与える。最初の免疫前の１週間の間、全てのマウスを取り扱い、そして、免疫毎の前日および２日後、これらの体重を記録する。全ての実験群は、同一の性であり、体重も一致している。
【０１８６】
（免疫プロトコールおよび血清単離）
配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１およびコントロールペプチド（膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）ペプチド（配列番号５２））に対応する合成ペプチドを用いて、トランスジェニックＣＲＮＤ８マウスを免疫する。免疫プロトコールおよび免疫スケジュールは、以前にＳｃｈｅｎｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ４００：１７３−１７７（１９９９）で示された通りであり、この開示は、本明細書中においてその全体が参考として援用される。各々の注射のセットに対して、各ペプチドを凍結乾燥した粉末から新たに調製する。免疫に対して、０．９ｍｌの脱イオン水を含む別の容器に、２ｍｇの各ペプチドを添加し、そして、溶液を混ぜるために、その混合物をボルテックスする。次いで、１００μｌの１０×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１×ＰＢＳは、０．１５Ｍ  Ｎａｃｌ、０．０１リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５））を各ペプチド溶液に添加する。再度、各溶液をボルテックスし、３７℃で一晩置く。最初の免疫においては、完全Ｆｒｕｅｎｄアジュバントを用いて、そして、その後の追加免疫についてＦｒｕｅｎｄ不完全アジュバントを用いて、このペプチドを１：１（ｖ／ｖ）の割合で乳化する。最初の追加免疫は、初回免疫２週後であり、その後は月ごとである。１回の注射あたり、約１００μｇの抗原を用いて、各々の動物を免疫する。各々の免疫群は、６〜１０匹のマウスである。次いで、１３週齢で後肢静脈穿刺を介して回収した血清サンプル（２００μｌの血液）、また２５週齢で処置を中止し、心臓の穿刺によって回収した血清サンプルにおいて、抗体の力価を決定する。これらの研究に使用する前に、５６℃で３０分間インキュベートすることによって、補体を不活性化させる。Ｉｇ分画を５ｍｌのプロテインＧカラムを通して単離する。サンプルを充填し、ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウムで溶出し、そして、１Ｍ  Ｔｒｉｓで緩衝する。全てのＩｇ分画を使用前にフィルター滅菌する。
【０１８７】
（免疫結果）
配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１およびコントロールペプチド（膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）ペプチド（配列番号５２））に対応する合成ペプチドで免疫したマウス、ならびに非免疫化ＴｇＣＲＮＤ８マウスおよびそれらの非トランスジェニック同腹子から、血清を単離する。
【０１８８】
ほとんどのマウスは、Ａβ４２（免疫原）またはＩＡＰＰに対して、有意な力価を発現する。興味深いことに、ＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスおよびそれらの非トランスジェニック同腹子において、抗Ａβ４２の力価に有意な相違は検出されない。２０週齢の非免疫化ＴｇＣＲＮＤ８マウス由来の脳の組織学的切片について、免疫されたマウスからの血清を成熟Ａβプラークの陽性染色のために使用する。対照的に、２０週齢の非免疫化ＴｇＣＲＮＤ８マウス由来の脳の組織学的切片について、コントロールペプチドであるＩＡＰＰ免疫マウスおよび非免疫化マウスからの血清は、成熟Ａβプラークを染色し得ない。従って、Ａβを含む神経病理学的なプラークを認識し得、そして結合し得る自己免疫抗体が誘導され得ることを、この結果は示す。
【０１８９】
（実施例３８）
（マウス免疫血清による原線維形成の阻害）
実施例３で議論したように、Ａβペプチドは、１４日間のインキュベーション期間にわたって、自然に原線維を組み立て、この原線維は、特徴的に直径５０〜７０Åであり、これは、以下に記載するように、電子顕微鏡検査によってモニタリングされ得る。
【０１９０】
（電子顕微鏡検査）
Ａβ４２を、１０ｍｇ／ｍｌのストック濃度にて水中で可溶化した後または成熟なアミロイド原線維に組み立てられた後、直接用いる。Ａβ４２を、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１およびコントロールペプチドである膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）のペプチドに対応するペプチド抗原の１００μｇ／ｍｌの最終ペプチド濃度で免疫したマウスからの血清の存在下および不在下にてインキュベートする。この血清の段階希釈をＡβ４２に加え、２週間まで室温（ＲＴ）でインキュベートする。電子顕微鏡検査のネガティブ染色のために、炭素でコーティングしたピオロ型（ｐｉｏｌｏｆｏｒｍ）グリッドをペプチド水溶液上に浮かせる。グリッドをブロットし、風乾した後、このサンプルを１％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸で染色する。ペプチドの組み立てを、Ｈｉｔａｃｈｉ  ７０００電子顕微鏡（７５Ｖ、倍率６０，０００×にて操作する）で観察する。
【０１９１】
（電子顕微鏡検査の結果）
Ａβの原線維への組み立てについての、免疫されたマウス血清の効果を評価するために、上記のように、血清をＡβ４２の存在下または不在下で、３７℃で１４日までインキュベートする。各反応混合物からのアリコートを、電子顕微鏡検査のネガティブ染色によって、Ａβ４２原線維の存在について１、３、７、１０および１４日目に試験する。
【０１９２】
血清の不在下、または、非免疫化血清の存在下において、Ａβ４２は、特徴的な５０〜７０Åの直径を有する長い原線維（約７５００Å）を形成した。ＩＡＰＰ免疫した動物からの血清の存在下において、わずかに長いＡβ４２原線維が生成されるが、形成された原線維は特徴的な５０〜７０Åの直径を有した。対照的に、わずかに効果を示すか、または効果を示さない血清もあるが、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０および５１（これは、Ｂ細胞エピトープであるＡβ（４−１０）を含む）に対応するペプチド抗原で免疫されたマウスからのマウス血清の大部分は、原線維形成を概ねブロックした。
【０１９３】
さらに、原線維の構造に変化がないことは、原線維が非免疫化マウスの血清の存在下でインキュベートされる場合に検出可能である。ＩＡＰＰで免疫されるマウスからの血清は、原線維形成の程度を減少するが、実際に形成される原線維は、Ａβ４２単独によって形成される原線維に類似する。最後に、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０および５１に対応するペプチド抗原で免疫されるマウスからの血清は、多様な程度に原線維形成を阻害する。
【０１９４】
【表６−１】
2010065046.tif 000010
【０１９５】
【表６−２】
2010065046.tif 000011