(57)【要約】【課題】  ある種のキノコ類の子実体や菌糸体の抽出エキス成分にＡＤＰ受容体、特にＰ２Ｙ１受容体を特異的に阻害する効果を有する物質を見つけ出し、これを血栓症予防のサプリメントとして、また、血栓症治療の抗血栓薬として利用できるＰ２Ｙ１受容体の阻害剤を提供することにある。【解決手段】  カンゾウタケ、シイタケ、ハナビラタケ、ヒメマツタケ、ヤマブシタケ、冬虫夏草及び鹿角霊芝の中から選択された１種又は２種以上の子実体及び菌糸体、又はこれらの子実体及び菌糸体の抽出エキスを有効成分として含むキノコ由来のＰ２Ｙ１受容体阻害剤である。また、前記抽出エキスは熱水により抽出されることが望ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンゾウタケ、シイタケ、ハナビラタケ、ヒメマツタケ、ヤマブシタケ、冬虫夏草及び鹿角霊芝の中から選択された１種又は２種以上の子実体及び菌糸体、又はこれらの子実体及び菌糸体の抽出エキスを有効成分として含むことを特徴とするキノコ由来のＰ２Ｙ１受容体阻害剤。
【請求項２】
前記抽出エキスは、前記子実体及び菌糸体の粉末を熱水により抽出し、この抽出液をクロロホルムで処理したものである請求項１記載のキノコ由来のＰ２Ｙ１受容体阻害剤。
【請求項３】
前記抽出液は、前記子実体及び菌糸体の粉末を約９０℃の熱水で約２時間抽出したものである請求項２記載のキノコ由来のＰ２Ｙ１受容体阻害剤。
【請求項４】
前記抽出液をクロロホルムで処理したのち、水溶性成分を限外ろ過膜で分子量分画される請求項２記載のキノコ由来のＰ２Ｙ１受容体阻害剤。
【請求項５】
前記抽出エキスは、Ｐ２Ｙ１受容体へのＡＤＰ（アデノシン二リン酸）結合を抑制する作用を有する請求項１記載のキノコ由来のＰ２Ｙ１受容体阻害剤。
【請求項６】
前記抽出エキスは、Ｐ２Ｙ１受容体へのＡＤＰ結合による血小板形態変化を抑制する作用を有する請求項１記載のキノコ由来のＰ２Ｙ１受容体阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血小板凝集の原因物質として知られているＡＤＰ受容体（Ｐ２Ｙ１受容体およびＰ２Ｙ１２受容体）のうち、特にＰ２Ｙ１受容体を特異的に阻害するＰ２Ｙ１受容体阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血小板は血小板血栓の形成に寄与することから、血栓症に対する創薬の重要なターゲットとして、大学及びその関連機関、製薬会社などで広く研究されてきた。代表的な医薬品の一つであるアスピリンは、血小板内のシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１）阻害剤であり、また近年頻用されるチクロピジンやクロピドグレルは、Ｐ２Ｙ１２受容体（ＡＤＰ受容体の一つ）の阻害剤である。この他に、ＰＤＥ阻害による細胞内ｃＡＭＰ上昇作用を発揮するジピリダモール及びシロスタゾールなどが知られているが、動脈血栓形成の進展や発症には前記のＡＤＰ受容体が重要な役割を果たすことが明らかになってきた。
【０００３】
ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）は血小板凝集に寄与することが知られており、血小板膜に発現されたＡＤＰ受容体への結合によって血小板凝集が引き起こされる。また、血小板には２種類のＡＤＰ受容体、いわゆるＰ２Ｙ１受容体とＰ２Ｙ１２受容体とが存在し、一方のＰ２Ｙ１受容体はＧαｑ型のＧ蛋白共役受容体で、細胞内カルシウムの増加、血小板形態変化、早期の血小板凝集に寄与する。また、他方のＰ２Ｙ１２受容体はＧαｉ２型の蛋白共役受容体で、アデニリルシクラーゼの阻害及びＰｌ３Ｋの活性化と、血小板活性化後期の凝集安定化に寄与する。
【０００４】
最近、ＡＤＰによって引き起こされる血小板凝集は、Ｐ２Ｙ１受容体とＰ２Ｙ１２受容体の両方が同時に活性化することが重要であり、いずれかの受容体の遮断によって部分的に抑制されることが知られている。また、Ｐ２Ｙ１受容体を欠損するノックアウトマウスに、Ｐ２Ｙ１２受容体阻害物を投与すると抗血栓性が増加することから、Ｐ２Ｙ１２受容体阻害剤との併用効果が期待できる。
【０００５】
上記のように、Ｐ２Ｙ１受容体阻害物は、Ｐ２Ｙ１２受容体阻害剤との併用効果が十分期待でき、血栓症治療に有用であることから、Ｐ２Ｙ１受容体阻害剤の開発が望まれていた。
【０００６】
従来、血小板凝集抑制剤として、キノコ類の子実体や菌糸体からの抽出物を利用したものが知られている（特許文献１，２参照）が、これらの特許文献にはある種のキノコ類から得られた抽出エキスがＰ２Ｙ１受容体阻害剤として特異的に作用することを示唆するような記載はない。
【特許文献１】特開平８−８１３８５号公報
【特許文献２】特開２００２−３４８２４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、ある種のキノコ類の子実体や菌糸体の抽出エキス成分にＡＤＰ受容体、特に血小板のＰ２Ｙ１受容体を特異的に阻害する効果を有する物質を見つけ出し、これを血栓症予防のサプリメントとして、また、血栓症治療の抗血栓薬として利用できるＰ２Ｙ１受容体の阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明に係るキノコ由来のＰ２Ｙ１受容体阻害剤は、カンゾウタケ、シイタケ、ハナビラタケ、ヒメマツタケ、ヤマブシタケ、冬虫夏草及び鹿角霊芝の中から選択された１種又は２種以上の子実体及び菌糸体、又はこれらの子実体及び菌糸体の抽出エキスを有効成分として含むことを特徴としている。
【０００９】
また、前記抽出エキスは、一例では前記子実体及び菌糸体の粉末を熱水により抽出し、この抽出液をクロロホルムで処理することで得られる。熱水での抽出条件としては、例えば前記子実体及び菌糸体の粉末を約９０℃の熱水で約２時間抽出する。また、前記抽出液は、クロロホルムで処理したのち、水溶性成分を限外ろ過膜で分子量分画されることで分子量の調整が行なわれる。
【００１０】
また、前記抽出エキスは、Ｐ２Ｙ１受容体へのＡＤＰ（アデノシン二リン酸）結合を抑制する作用を有すると共に、Ｐ２Ｙ１受容体へのＡＤＰ結合による血小板形態変化を抑制する作用を有する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るキノコ由来のＰ２Ｙ１受容体阻害剤は、血小板のＡＤＰ受容体を構成する一方のＰ２Ｙ１受容体を特異的に阻害することから、血小板凝集阻害効果を持つ薬剤やサプリメントとして有用であり、血小板のＡＤＰ受容体を構成する他方のＰ２Ｙ１２受容体の阻害剤として知られているチクロピジンやクロピドグレル等との併用が可能となるなどの効果を奏する。
【００１２】
また、本発明に係るキノコ由来のＰ２Ｙ１受容体阻害剤は、ある種のキノコから得られた抽出エキスなどを有効成分とすることから、毒性の少ないことが予想され、薬剤やサプリメントして利用する際にも副作用の危険性が少ないなどの効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明において適用されるキノコは、カンゾウタケ、シイタケ、ハナビラタケ、ヒメマツタケ、ヤマブシタケ、冬虫夏草または鹿角霊芝である。本発明では、これらキノコ類の中から選択された１種又は２種以上のキノコの子実体および菌糸体の粉砕物、又は選択されたキノコの子実体や菌糸体から得られた抽出エキスなどをＰ２Ｙ１受容体阻害剤の有効成分としている。
【００１４】
抽出エキスは、先ずキノコの子実体や菌糸体を乾燥し、次いでミキサーなどで粉砕した後、抽出工程に移すことで効率的に得ることができる。粉砕方法は特に限定されず、公知の粉砕機を用いて行うことができる。粒径が数十μｍ〜数千μｍの範囲となるように粉砕するのが望ましい。キノコの子実体は、公知の栽培方法によって得ることができ、また、菌糸体は固体培養および液体培養のいずれの培養方法によって得ることができる。培養後の菌糸体は、遠心分離などの手段で培養液と分離してから利用される。
【００１５】
本発明におけるキノコの抽出エキスは、例えば以下の方法によって得ることができる。抽出溶媒としては、水又は熱水、或いはメタノールやエタノールなどのアルコールを用いることができる。これらの抽出溶媒を用いて、キノコの子実体または菌糸体の乾燥粉砕物を室温又は加熱しながら還流することで有効成分の抽出を行ったのち、抽出溶媒を凍結乾燥、噴霧乾燥、又は減圧留去等の方法で除去することによって抽出エキスを得ることができる。中でも、子実体や菌糸体を約９０℃の熱水を用いて約２時間還流抽出し、抽出液を遠心分離、ろ過後にそのろ液を凍結乾燥し、再度水に溶解後にクロロホルムを混ぜて処理し、不要な成分を取り除いた後の水溶性成分を限外ろ過膜で分子量分画し、得られた分子量１万以下の粗精製エキスを有効成分として利用するのが望ましい。このように熱水で抽出することで殺菌効果が得られ、また、熱水抽出によって分解されたエキス内の内在性ＡＤＰをクロロホルムで取り除くことができるといった効果があり、ＡＤＰ受容体阻害剤としての作用効果を発揮し易くなる。
【００１６】
上記キノコの粉砕物や酸性処理物、あるいは上記の方法などによって得られた抽出エキスは、公知の方法によって顆粒剤、錠剤、カプセル剤などに製剤化することができ、製剤化に際して添加される増量剤の種類や量は公知の範囲内である。このようにして得られる製剤は、Ｐ２Ｙ１受容体阻害剤として有効であり、血栓症などの治療薬や予防薬として利用できる。また、上記のキノコの有効成分は血栓症などの予防効果をもたらすサプリメントとしても利用することができる。なお、前記薬剤やサプリメントとして服用する場合、その服用量は、病状によって、また服用者の年齢や性別、体重、体調などによって適宜決定することが望ましい。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されないことは勿論である。
【００１８】
実施例１：ヒメマツタケの抽出エキスの調製
ヒメマツタケ（学名：アガリクス・ブラゼイ）の子実体の乾燥粉末（粒径：数十μｍ〜数千μｍ）１００ｇを蒸留水１０００ｍｌに懸濁し、湯煎中において９０℃で２時間の抽出を行なう。その後、遠心分離４０００ｒｐｍで３０分間行い、上清を濾過した後、その濾液を凍結乾燥して、抽出率１２．８％のエキスを得た。
【００１９】
実施例２：ＡＤＰによる血小板凝集に対する評価試験−１
ヒト多血小板血漿３００μｌをキュベットに入れ、血小板凝集能測定装置（Platelet Analyzer，ＰＡ−２００，ＫＯＷＡ社製）にセットする。１分間のモニター後、終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのヒメマツタケの抽出エキス溶液をヒト血小板血漿に前処理し、その５分後に血小板惹起物質としてＡＤＰを終濃度５μＭとなるように添加する。この試験での血小板凝集に対する評価は、ＡＤＰ添加後の光透過率の変化により行なった。なお、前記抽出エキス溶液の代わりに生理食塩水を用いてコントロールとした。
【００２０】
評価の結果を図１に示す。図１Ａは生理食塩水を添加した場合の光透過率を示したものであり、血小板の最大凝集率は８１％であった。それに対して図１Ｂは抽出エキスを添加した場合の光透過率を示したものであり、血小板の最大凝集率は約９％であり、凝集が顕著に阻害されていることが分かった。即ち、ヒメマツタケの抽出エキスはコントロールに対して８８．９％のＡＤＰによる血小板凝集抑制率作用が認められた。
【００２１】
実施例３：ＡＤＰによる血小板凝集に対する評価試験−２
上記実施例２におけるヒメマツタケの代わりに、カンゾウタケ、シイタケ、ハナビラタケ、ヤマブシタケ、冬虫夏草及び鹿角霊芝の６種類のキノコについて、ＡＤＰによる血小板凝集に対する評価を行なった。試験方法は実施例２と同様であり、ＡＤＰ添加後の光透過率の変化により評価した。それによれば、６種類のキノコは、約７７．４〜９２．７％の範囲でＡＤＰによる血小板集抑制率作用が認められた。
【００２２】
実施例４：ＡＤＰによる血小板形態変化に対する評価試験
ヒト乏血小板血漿で３倍に希釈したヒト多血小板血漿を、終濃度１ｍＭのＥＧＴＡ（O,O’-Bis (2-aminoethyl) ethyleneglycol-N,N,N’,N’-tetracetic acid）で凝集阻害処理した後、処理したヒト多血小板血漿をキュベットに入れ、血小板凝集能測定装置（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＡＡ−１００，ＳＹＳＭＥＸ社製）にセットする。試験開始から２分間のモニターを行った後、生理食塩水、ＭＲＳ２１７９（シグマ社製の特異的なＰ２Ｙ１受容体阻害剤）、２ＭｅＳ−ＡＭＰ（シグマ社製の特異的なＰ２Ｙ１２受容体阻害剤）、実施例１で調製したヒメマツタケの抽出エキスを添加して２分間モニターする。開始から４分後に終濃度１μMのＡＤＰをそれぞれに添加し、血小板形態変化を誘導した。なお、開始から終了までの８分間において、２０秒間隔でスターラスイッチのオン／オフを繰り返した。血小板形態変化の評価は、ＡＤＰ添加後の透過率の振幅の変化により行なった。なお、生理食塩水は多血小板血漿に対して１／１００量を添加し、ＭＲＳ２１７９は終濃度２００μＭを添加し、２ＭｅＳ−ＡＭＰは終濃度１ｍＭを添加し、抽出エキスは終濃度１ｍｇ／ｍｌを添加した。
【００２３】
評価の結果を図２に示す。図２Ａは生理食塩水を、図２ＢはＭＲＳ２１７９を、図２Ｃは２ＭｅＳ−ＡＭＰを、そして図２Ｄは抽出エキスをそれぞれ添加したときの透過率の変化を示したものである。図２Ａに示したように、生理食塩水の場合はＡＤＰを添加することで血小板形態変化（ＰＳＣ）が惹起され、その結果として透過率が低下した。一方、図２Ｂに示すように、ＭＲＳ２１７９の場合にはＡＤＰを添加しても振幅が維持されて透過率が低下しないことから、ＰＳＣの抑制効果が認められた。これに対して、図２Ｃに示すように、２ＭｅＳ−ＡＭＰの場合にはＡＤＰを添加すると透過率が低下することから、ＰＳＣが惹起されたものと考えられる。ＰＳＣはＰ２Ｙ１受容体経由のシグナルであり、Ｐ２Ｙ１２受容体には関与しないとする従来の報告と一致した結果が得られた。図２Ｄに示すように、抽出エキスの場合は前記ＭＲＳ２１７９と同様にＡＤＰを添加しても透過率が低下せず、ＰＳＣを抑制することが認められた。これらの結果から、抽出エキスにはＰ２Ｙ１受容体のシグナルを抑制する成分が含有していると考えられる。
【００２４】
実施例５：血小板のＡＤＰ受容体へのＡＤＰ結合量に対する評価試験
様々な濃度のヒメマツタケの抽出エキスと、終濃度２００μＭのＭＲＳ２１７９あるいは終濃度１ｍＭの２ＭｅＳ−ＡＭＰを混合した。この混合液に３．５ｎＭ放射標識ＡＤＰを混合した後、血小板膜画分を添加した。ヒメマツタケの抽出エキスは実施例１で調製したものを使用した。３０分経過後に結合していない放射標識ＡＤＰを洗浄除去し、ＡＤＰの結合活性（％）を算出した。
【００２５】
評価の結果を図３に示す。血小板のＡＤＰ受容体はＰ２Ｙ１受容体とＰ２Ｙ１２受容体の２種類であり、後者のＰ２Ｙ１２受容体を特異的に阻害する２ＭｅＳ−ＡＭＰが過剰に存在する場合には、混合した放射標識ＡＤＰはＰ２Ｙ１２受容体には結合できず、もっぱらＰ２Ｙ１受容体に結合する。ここで、ヒメマツタケの抽出エキスの終濃度を次第に高くしていくと、ＡＤＰ結合活性が低下する傾向が見られる。このことからヒメマツタケの抽出エキスは、ＡＤＰがＰ２Ｙ１受容体に結合することを抑制する成分を含有していることが判明した。換言すれば、ヒメマツタケの抽出エキスの中にはＰ２Ｙ１受容体に対してＭＲＳ２１７９と同じような効果を有する化合物が含有されていると考えられる。これに対して、前者のＰ２Ｙ１受容体を特異的に阻害するＭＲＳ２１７９が過剰に存在する場合には、混合した放射標識ＡＤＰはもっぱらＰ２Ｙ１２受容体に結合する。しかし、ヒメマツタケの抽出エキスが存在しても、しなくてもＡＤＰ結合活性に大きな変化が見られない。このことからヒメマツタケ抽出エキス中にはＡＤＰとＰ２Ｙ１２受容体との結合に影響を及ぼす成分を含有していないことが判明した。
【００２６】
即ち、ヒメマツタケ抽出エキス中にはＰ２Ｙ１２受容体ではなく、Ｐ２Ｙ１受容体に特異的に作用してＡＤＰの結合を抑制する化合物が含まれていることが判明した。
【００２７】
実施例６：ヒメマツタケの抽出エキスの経口摂取による生体での効果試験
ＢＡＬＢ／ｃ  ６週齢の雄のマウスに実施例１で調製したヒメマツタケの抽出エキスを７日間連続で経口投与し、最終投与の翌日にマウスの尾部先端を切断し、止血までに要した出血量を測定した。この出血量を指標として、生体での血小板機能の抑制作用を検討した。
【００２８】
ヒメマツタケの抽出エキスの投与に際しては、抽出エキスの濃度を高濃度群と低濃度群とに分け、濃度による抑制効果の違いを見た。高濃度群は１日当り２５０ｍｇ／ｋｇマウス重量であり、低濃度群は１日当り２５ｍｇ／ｋｇマウス重量である。また、コントロール群は、１日当り２００μｌの生理食塩水を与えたマウスが対象である。
【００２９】
効果試験の結果を図４に示す。出血量はコントロール群が約２０μｌ、低濃度群が約５０μｌ、高濃度群が約７０μｌであった。これら出血量の違いからマウスの生体内において、ヒメマツタケの抽出エキスを投与することで血小板機能が抑制されることが認められた。また、この抑制作用はヒメマツタケの抽出エキス溶液の濃度が高い方が大きいものであった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明のＰ２Ｙ１受容体阻害は、キノコ由来の有効成分からなるので、食しても毒性の少ないことが予想され、Ｐ２Ｙ１受容体阻害作用を介する血栓症の予防を目的とするサプリメントとしての応用が期待される。また、血小板のＡＤＰ受容体を標的とした市販の治療薬との併用により、血栓症治療や予防を効果的に進める抗血栓薬としての応用が期待される。更にＰ２Ｙ１受容体は血小板のみならず、心筋や血管内皮細胞、前立腺、卵巣、胎盤 (Pharmacol Rev 50.  1998  413-92)などに分布していることから、それらの細胞や臓器の機能調節に関わっており、キノコ由来の有効成分は血栓症治療や予防だけに限定して使用されるものではなく、その応用範囲が広いものである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＡＤＰによる血小板凝集に対する評価試験の結果を示す図である。
【図２】ＡＤＰによる血小板形態変化に対する評価試験の結果を示す図である。
【図３】血小板のＡＤＰ受容体へのＡＤＰ結合量に対する評価試験の結果を示す図である。
【図４】ヒメマツタケの抽出エキスの経口摂取による生体での効果試験の結果を示す図である。
【図１】
2010037260.tif 000002
【図２】
2010037260.tif 000003
【図３】
2010037260.tif 000004
【図４】
2010037260.tif 000005