(57)【要約】【課題】セレン酸の還元方法の提供。【解決手段】本発明によって、セレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、それらを使用するセレン酸の還元方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択されるタンパク質：
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質。
【請求項２】
以下からなる群より選択されるタンパク質：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項４】
以下からなる群より選択される、請求項３記載の核酸：
（ａ）配列番号７のヌクレオチド配列からなる核酸；
（ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質をコードする核酸。
【請求項５】
請求項２記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項６】
以下からなる群より選択される、請求項５記載の核酸：
（ａ）配列番号９のヌクレオチド配列からなる核酸；
（ｂ）配列番号９のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
請求項１記載のタンパク質および請求項２記載のタンパク質を宿主細胞において発現させることを含む、セレン酸の還元方法。
【請求項８】
請求項１記載のタンパク質および請求項２記載のタンパク質の発現が、請求項３記載の核酸および請求項４記載の核酸を宿主細胞に導入することによって行われる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質を宿主細胞において発現させることをさらに含む、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、それらを使用するセレン酸の還元方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微量金属（レアメタル）の一種であるセレンは、生物にとって必須元素であるが、水溶性のセレン化合物（セレン酸、亜セレン酸など）は生物に対する毒性を有する。セレンは、コピー機、ガラスの着色など幅広い用途に使用されているので、その供給源の確保は重要である。また、廃水、廃棄物中のセレン化合物の人の健康および生態系への影響が問題となっている。セレン酸の無毒化および除去の方法としては、樹脂吸着、電気化学的方法などが従来より検討されているが、効率、コストなどの問題から実用には至っていなかった。また、このような方法によってセレンを回収して再利用することはできなかった。
【０００３】
本発明者らは、セレン化合物の生物学的処理方法の開発を目指して、ガラス工場の汚泥からグラム陽性細菌Bacillus selenatarsenatis SF-1株（以下、「ＳＦ−１株」）を単離した（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。ＳＦ−１株は、セレン酸を亜セレン酸に効率的に還元し、さらに亜セレン酸を元素態セレンへ還元する能力を有する。元素態セレンは水に不溶性であり、無毒であるので、ＳＦ−１株を使用すれば、比較的安価に、セレン化合物を含有する廃水などを無毒化し、そこからセレンを回収して再利用できる可能性がある。
【０００４】
微生物を利用したセレン化合物の処理およびセレンの回収をより効率的に行うためには、処理条件の検討や設備の開発に加えて、セレン化合物の還元に関与する分子機構を明らかにする必要がある。しかし、現在までにセレン化合物の還元に関与する酵素およびそれをコードする遺伝子に関する知見はほとんど得られていない。本発明者らは、ＳＦ−１株のセレン化合物還元機構を解明するために、セレン化合物の還元に関与する遺伝子の解析を行い（非特許文献３）、Escherichia coliに導入した際にセレン酸から亜セレン酸への還元活性を示すタンパク質をコードする３つのオープンリーディングフレームを（ＯＲＦ）含むＤＮＡフラグメントをＳＦ−１株から単離した（非特許文献４）。しかし、これらはセレン化合物の還元に関与する遺伝子群の一部に過ぎず、さらなる解析が必要であった。
【特許文献１】特開平９−２４８５９５号公報
【非特許文献１】Fujita, M. et al., J. Ferment. Bioeng., 83:517-522 (1997)
【非特許文献２】Yamamura, S. et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 57:1060-1-64 (2007)
【非特許文献３】黒田真史ら、第５７回日本生物工学会大会講演要旨集、３Ａ１０−２（２００５）
【非特許文献４】永野公太ら、第６０回日本生物工学会大会講演要旨集、１Ｂｐ０９（２００８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、セレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、それらを使用するセレン酸の還元方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、
［１］以下からなる群より選択されるタンパク質：
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質；
［２］以下からなる群より選択されるタンパク質：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質；
［３］［１］のタンパク質をコードする核酸；
［４］以下からなる群より選択される、［３］の核酸：
（ａ）配列番号７のヌクレオチド配列からなる核酸；
（ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質をコードする核酸；
［５］［２］のタンパク質をコードする核酸；
［６］以下からなる群より選択される、［５］の核酸：
（ａ）配列番号９のヌクレオチド配列からなる核酸；
（ｂ）配列番号９のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質をコードする核酸；
［７］［１］のタンパク質および［２］のタンパク質を宿主細胞において発現させることを含む、セレン酸の還元方法；
［８］［１］のタンパク質および［２］のタンパク質の発現が、［３］の核酸および［４］の核酸を宿主細胞に導入することによって行われる、［７］の方法；
［９］配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質を宿主細胞において発現させることをさらに含む、［７］の方法
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によって、セレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、それらを使用するセレン酸の還元方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本明細書において使用する「セレン化合物」なる用語は、セレンを含有する化合物を指す。セレン化合物の例としてはセレン酸、亜セレン酸などが挙げられる。本明細書において使用する「元素態セレン」なる用語は、他の元素と化合物を形成していない元素の形態のセレンを指す。
【０００９】
本明細書において使用する「セレン酸還元活性」なる用語は、セレン酸を亜セレン酸に還元する活性を指す。本明細書において使用する「セレン酸還元酵素」なる用語は、セレンの亜セレン酸への還元を触媒するタンパク質を指す。本明細書において使用する「亜セレン酸還元活性」なる用語は、亜セレン酸を元素態セレンに還元する活性を指す。本明細書において使用する「亜セレン酸還元酵素」なる用語は、亜セレン酸の元素態セレンへの還元を触媒するタンパク質を指す。
【００１０】
Bacillus selenatarsenatis SF-1株（ＳＦ−１株）は、セレン酸還元活性、および亜セレン酸還元活性を有することが知られている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。セレン酸還元活性は、セレン酸から生成される亜セレン酸を定量することによって測定することができる。亜セレン酸還元活性は、亜セレン酸から生成される元素態セレンを定量することによって測定することができる。核酸にコードされるタンパク質が有するセレン酸還元活性は、例えば、この遺伝子を、亜セレン酸還元活性を有することが知られているEscherichia coli（Bebien, M. et al., Microbiology, 148:3865-3872 (2002)）に導入した際に元素態セレンが生成することを、セレン酸含有培地上でのコロニーによる赤色の呈色を観察することによって確認することができる。
【００１１】
本明細書において使用する「セレン酸還元活性を増強する能力」または「セレン酸還元活性増強能」なる用語は、セレン酸還元活性を増強することができる能力を指す。セレン酸から生成される亜セレン酸を定量した際に、対照と比較して活性が有意に増加した場合に、セレン酸還元活性は増強している。単離された核酸にコードされるタンパク質が有するセレン酸還元活性増強能は、この遺伝子を、セレン酸還元酵素をコードする遺伝子を含むEscherichia coliに導入した際に生成される元素態セレンのレベルを、セレン酸含有培地上でのコロニーによる赤色の呈色強度の増加を観察することによって確認することができる。
【００１２】
セレン酸還元酵素としては、本発明者らによってＳＦ−１株から単離された３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｍｐｏＡ（配列番号１）、ｍｐｏＢ（配列番号３）およびｍｐｏＣ（配列番号５）によってコードされるタンパク質ＭｐｏＡ（配列番号２）、ＭｐｏＢ（配列番号４）およびＭｐｏＣ（配列番号６）から構成されるものが例示される（非特許文献４）。ＭｐｏＡ、ＭｐｏＢおよびＭｐｏＣはそれぞれ、種々の公知のモリブドプテリンオキシドレダクターゼ鉄−硫黄結合サブユニット（鉄・硫黄クラスター）、モリブドプテリンオキシドレダクターゼ膜サブユニット（膜結合サブユニット）およびモリブドプテリンジヌクレオチド結合領域（リン酸基結合部位）との相同性を有する。
【００１３】
また、ＭｐｏＡ、ＭｐｏＢ、ＭｐｏＣは、Salmonella typhimurium由来テトラチオン酸還元酵素と類似性を有する（Hensel, M. et al., Mol. Microbiol., 32:275-287 (1999)）。Salmonella typhimurium由来テトラチオン酸還元酵素遺伝子はクラスターを形成しており、モリブドプテリングアニンジヌクレオチド補因子を持つ活性中心部分サブユニットをコードするｔｔｒＡ遺伝子の上流に膜結合サブユニットであるｔｔｒＣ遺伝子、鉄・硫黄クラスターを含むサブユニットであるｔｔｒＢ遺伝子が位置する構造となっている。この位置関係はｍｐｏＡ、ｍｐｏＢ、ｍｐｏＣの位置関係と非常に類似している。この文献にはｔｔｒＡ、ｔｔｒＢおよびｔｔｒＣがテトラチオン酸還元酵素の構造遺伝子であると記載されている。従って、本発明者らが得たｍｐｏＡ、ｍｐｏＢ、ｍｐｏＣも同様にモリブドプテリンオキシドレダクターゼの構造遺伝子を構成していることが示唆される。また、ｍｐｏＢが膜結合サブユニットをコードすることは、ＳＦ−１株のセレン酸還元酵素が膜結合型であるという以前の報告と一致する（Jpn. J. of Wat. Treat. Biol., 40:161-168 (2004)）。
【００１４】
セレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質としては、本発明者らによってＳＦ−１株から単離された２つのＯＲＦ、ｄｃｐＡ（配列番号７）およびｍｕｔＴ（配列番号９）によってコードされるタンパク質ＤｃｐＡ（配列番号８）およびＭｕｔＴ（配列番号１０）の組み合わせが例示される。これらのタンパク質をセレン酸還元酵素（例えば、ＭｐｏＡ、ＭｐｏＢおよびＭｐｏＣから構成されるもの）とともにEscherichia coli中で発現させると、セレン酸還元酵素のみを発現させた場合に比較してセレン酸還元活性が増強される。
【００１５】
ＤｃｐＡのアミノ酸配列（配列番号８）は、種々の公知のジグアニレートシクラーゼ／ホスホジエステラーゼとの相同性を有する。ジグアニレートシクラーゼは、２分子のＧＴＰからのサイクリックジグアニル酸（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）の合成を触媒する酵素であり、ホスホジエステラーゼはｃ−ｄｉ−ＧＭＰの分解を触媒する酵素である。一般にジグアニレートシクラーゼ／ホスホジエステラーゼにはＧＧＤＥＦ（Gly-Gly-Asp-Glu-Phe）配列およびＥＡＬ（Glu-Ala-Leu）配列が存在することが知られており、これらを含む領域はそれぞれＧＧＤＥＦドメインおよびＥＡＬドメインと呼ばれている（Mendez-Ortiz, M.M. et al., J. Biol. Chem., 281-8090-8099 (2006)）。また、前者はｃ−ｄｉ−ＧＭＰの合成を担い、後者はｃ−ｄｉ−ＧＭＰの分解を担うことが示唆されている（Tamayo, R. et al., Infection and Immunity, 76:1617-1627 (2008)）。ＤｃｐＡにはＧＧＤＥＦ配列は見出されるが（配列番号８、２３８〜２４２位）ＥＡＬ配列は見出されない。従って、ＤｃｐＡはｃ−ｄｉ−ＧＭＰの合成を担うジグアニレートシクラーゼ活性のみを有する可能性がある。
【００１６】
ＭｕｔＴのアミノ酸配列（配列番号１０）は、種々の公知のＭｕｔＴ／ｎｕｄｉｘ（nucleoside diphosphates linked to other moieties, X）ファミリータンパク質との相同性を有する。ＭｕｔＴ／ｎｕｄｉｘファミリータンパク質は、他の分子に結合したヌクレオシド二リン酸の加水分解を触媒する酵素の総称であり、ＭｕｔＴはＧＴＰを分解してＧＭＰを生成する反応を触媒する酵素である。
【００１７】
ＤｃｐＡおよびＭｕｔＴがセレン酸還元活性を増強する機構は不明であるが、ＳＦ−１株から得られたセレン酸還元酵素がモリブドプテリンを補因子として含むモリブドプテリンオキシドレダクターゼとの相同性を有すること、モリブドプテリンがＧＴＰから合成されること（Cell Mol. Life Sci., 62:2792-2810 (2005)）を考慮すると、ＤｃｐＡおよびＭｕｔＴは、セレン酸還元酵素の補因子の合成に関与している可能性がある。また、ＭｐｏＡ、ＭｐｏＣはＴａｔ（Twin-arginine translocation）経路シグナルとも高い相同性を有している。グラム陽性細菌Bacillus subtilisは、タンパク質分泌経路として、Ｓｅｃ経路およびＴａｔ経路を有することが知られている。Ｓｅｃ経路では、細胞膜を通過する際に、輸送されるタンパク質の構造がほどかれる。一方、Ｔａｔ経路では、細胞質内で折りたたまれたタンパク質が折りたたまれたまま細胞膜を通過する。モリブドプテリンなどの補因子を含むタンパク質はこのＴａｔ経路を介して輸送されると言われている（van Dijil, J.M. et al., J. Biotechnol., 98:243-254 (2002)）。このことも、ＳＦ−１株由来のセレン酸還元酵素が補因子を含む可能性を示唆する。
【００１８】
本発明者らは、３つのＯＲＦ、ｍｐｏＡ、ｍｐｏＢ、ｍｐｏＣをEscherichia coliに導入した際に、セレン酸還元活性が示されることを報告した（非特許文献４）。このことから、セレン酸の還元にはこれらのＯＲＦによってコードされるタンパク質で十分であることが示唆されていた。従って、ｄｃｐＡおよびｍｕｔＴをさらに導入することによってセレン酸還元活性がさらに増強されるという知見は予想外であった。ＳＦ−１株においては、ｍｐｏＡ、ｍｐｏＢおよびｍｐｏＣをコードする領域、ならびにｄｃｐＡおよびｍｕｔＴをコードする領域のいずれにトランスポゾンＴｎ９１６が挿入された場合でもセレン酸還元活性が失われることから、ＳＦ−１株においてはこれら両方の領域の遺伝子がセレン酸還元活性に必要とされると考えられる。ｄｃｐＡおよびｍｕｔＴの非存在下でもEscherichia coli中でセレン酸還元活性が観察された理由は明らかではないが、宿主として使用したEscherichia coli中にｄｃｐＡおよびｍｕｔＴの機能的代替物として作用するタンパク質が存在している可能性がある。
【００１９】
配列番号８のアミノ酸配列と最高の相同性を示す公知の配列（diguanylate cyclase with PAS/PAC sensor [Geobacillus sp. G11MC16]、GenBank Accession No. ZP_03149864）との配列同一性は４８％であり、配列番号１０のアミノ酸配列と最高の相同性を示す公知の配列（MutT/nudix family protein, putative [Bacillus cereus G9241]、GenBank Accession No. ZP_00238672）との配列同一性は５６％である。アミノ酸配列の同一性の算出にはBLAST program（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）を使用した。配列番号８または１０のアミノ酸配列とこれらより高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつそれぞれ配列番号１０または８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質の組み合わせも、本発明において好適に使用することができる。そのような配列同一性は、配列番号８のアミノ酸配列との、例えば５０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％の配列同一性、配列番号１０のアミノ酸配列との、例えば６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％の配列同一性である。
【００２０】
また、本発明において、配列番号８または１０のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつそれぞれ配列番号１０または８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質の組み合わせを使用することができる。
【００２１】
本発明において、上記のようなセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質をコードする核酸が使用される。１つの実施態様において、この核酸は配列番号７または９のヌクレオチド配列からなる核酸である。別の実施態様において、本発明の核酸は、配列番号７または９のヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれぞれ配列番号１０または８のアミノ酸配列からなるタンパク質と組み合わせた場合にセレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質をコードする核酸である。本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」なる用語は、緊縮なハイブリダイゼーションの条件をさす。このような条件は、例えばSambrook, J. et al. (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)などに記載されている。１００ヌクレオチド以上の長いプローブを使用する場合のストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬、１００μｇ／ｍＬ変性断片化サケ精子ＤＮＡ中６８℃でのインキュベーション、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温での洗浄（ＳＳＣ濃度を０．１まで下げる、および／または温度を６８℃まで上げる）が挙げられる。
【００２２】
本発明のセレン酸の還元方法において、セレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質を宿主細胞において発現させる。宿主細胞としては、任意の細胞を使用することができるが、セレン化合物の存在下で生存できる細菌が好ましい。１つの実施態様において、セレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質の発現は、このタンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入することによって行われる。この目的のためには、組換えＤＮＡ技術が確立されている細菌を宿主として使用することが好ましい。そのような細菌の例としては、限定するものではないが、Escherichia coli、Bacillus subtilisなどが挙げられる。核酸の導入には、選択された宿主細胞において複製可能なベクターが使用される。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスなどに由来するものが使用できる。核酸を含むベクターには目的の遺伝子の転写の開始および終結を担う配列（プロモーター、ターミネーターなど）、翻訳の開始に必要とされる配列（リボソーム結合部位など）が含まれる。当業者は、宿主細胞に適切なこれらの配列を選択することができる。例えば、セレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質をコードする配列の上流に本来存在するプロモーターが宿主細胞中で機能する場合はそのプロモーターを利用することができ、あるいは宿主細胞において機能する別のプロモーターの制御下に目的の遺伝子を配置して発現させることもできる。宿主細胞がセレン酸還元酵素を有していない場合は、セレン酸還元酵素を宿主細胞においてさらに発現させてもよい。
【００２３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
参考例１：元素態セレン生成能欠損変異株の取得
元素態セレン生成能を欠損した変異株を得るために、接合伝達により、Enterococcus faecalis CG110株（以下、「ＣＧ１１０株」）から、テトラサイクリン耐性遺伝子を保持するトランスポゾンＴｎ９１６（Scott, J.R., et al., Annu. Rev. Microbiol., 49:367-397 (1995)）を、Bacillus selenatarsenatis SF-1株（ＪＣＭ１４３８０、ＤＳＭ１８６８０）の自然ストレプトマイシン耐性変異株（以下、「Ｓｍｒ株」）に導入した。Ｔｎ９１６は導入された細菌ゲノム中に挿入される。従って、Ｔｎ９１６導入株の中に、Ｔｎ９１６の挿入によってセレン酸の還元または亜セレン酸の還元に関与する遺伝子が破壊された結果、セレン酸からの元素態セレンの生成能を欠損した株が存在する可能性がある。
【００２５】
ストレプトマイシン５００μｇ／ｍＬを含有するＴＳＢ（Trypticase Soy Broth）培地（１７．０ｇ／Ｌカゼイン、３．０ｇ／Ｌダイズペプトン、２．５ｇ／Ｌデキストロース、５．０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、２．５ｇ／Ｌリン酸二カリウム）３ｍＬ中３７℃で２０時間振とう培養したＳｍｒ株を７，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離することによって、集菌した。ＣＧ１１０株をＬＢ（１０ｇ／Ｌバクトトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）寒天培地上で３７℃で２０時間培養した。このプレートに上記のＳｍｒ株の懸濁液を加え、２種の菌を混合し、３７℃で一晩培養した。生育した菌体をＴＳＢ培地１０ｍＬに懸濁し、その１００倍希釈液２００μＬを重層セレン酸選択培地（ストレプトマイシン５００μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＬ、セレン酸０．５ｍＭを含むＬＢ寒天培地に流し固めた後、等量のストレプトマイシン５００μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地を流し固めた培地）に植菌し、３７℃で一晩培養した。Ｔｎ９１６導入株をテトラサイクリンおよびストレプトマイシンに耐性を示すコロニーとして得た。
【００２６】
上記プレートを３０℃でインキュベートした。このプレート上で、元素態セレン生成能を有する株は赤色のコロニーを形成するのに対して、元素態セレン生成能を欠損した株は白色のコロニーを形成する。白色の相対的に小さなコロニーを選択した（一次スクリーニング）。これらのコロニーを、ストレプトマイシン５００μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＬ、セレン酸ナトリウム１ｍＭを含有するＬＢ寒天培地上で３７℃で一晩好気的に培養した後、AnaeroPouch・ケンキ（三菱ガス化学）を使用して３０℃で２日間嫌気的に培養した。培養後、元素態セレン生成能の指標となる赤色を呈しない株および赤色が低下した株を得た（二次スクリーニング）。
【００２７】
参考例２：インバースＰＣＲ法およびＬＡ  ＰＣＲ法によるＴｎ９１６挿入部位周囲のＤＮＡ配列の決定
参考例１において得られた元素態セレン生成能欠損株からAquaPure Genomic DNA Kit（BIO-RAD）を使用してゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いたセルフライゲーションに供した。この反応混合物を鋳型としてＴｎ９１６特異的プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応を実施することによって、Ｔｎ９１６挿入部位周辺のＤＮＡを増幅し、そのヌクレオチド配列を決定した。このようにして得られたヌクレオチド配列に基づいて合成したプライマーを使用し、鋳型としてＴｎ９１６が挿入されていないＳＦ−１株のゲノムＤＮＡを使用し、LA PCR（商標）in vitro Cloning Kit（タカラバイオ）を使用したＤＮＡの増幅（ＬＡ  ＰＣＲ）によって、Ｔｎ９１６が挿入された位置の周辺のＤＮＡを増幅し、そのヌクレオチド配列を決定した。ＬＡ  ＰＣＲにおいて、ＤＮＡポリメラーゼとしては、キットに添付のTaKaRa LA TaqまたはPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ）を使用した。
【００２８】
上記の操作によって決定されたヌクレオチド配列についてオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を検索し、さらにそこにコードされるアミノ酸配列と公知のタンパク質のアミノ酸配列とを比較することによって、セレン化合物の還元に関与する可能性のあるタンパク質をコードする２つの領域を同定した。
【００２９】
参考例３：ｍｐｏＡＢＣオペロンの解析
参考例２に記載の手順によって、公知のモリブドプテリンオキシドレダクターゼ鉄−硫黄結合サブユニット（鉄・硫黄クラスター）、モリブドプテリンオキシドレダクターゼ膜サブユニット（膜結合サブユニット）およびモリブドプテリンジヌクレオチド結合領域（リン酸基結合部位）との相同性を有するタンパク質をコードする３つのＯＲＦを含む領域が見出された。これらのＯＲＦは上流から下流に上記の順で、同じ方向で存在していた（図１中に数字「３」、「４」、「５」で示す）。これらをそれぞれｍｐｏＡ、ｍｐｏＢ、ｍｐｏＣと名づけた。ｍｐｏＡ、ｍｐｏＢ、ｍｐｏＣのヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１、３、５に、それらによってコードされるタンパク質ＭｐｏＡ、ＭｐｏＢ、ＭｐｏＣのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、４、６に示す。ｍｐｏＡの終止コドンとｍｐｏＢの開始コドンとの間の長さが１７ｂｐと非常に近接していること、およびｍｐｏＢとｍｐｏＣとが約４０ｂｐ重複していることから、これら３つのＯＲＦはオペロンを形成しており、その転写はｍｐｏＡの上流に存在するプロモーター様領域によって開始され、ｍｐｏＣの下流に存在するターミネーター様領域において終結すると考えられた。なお、参考例１で得られた元素態セレン生成能欠損変異株において、Ｔｎ９１６は、ｍｐｏＣ領域内に挿入されていた（図１中に「Ｔｎ９１６」で示す）。
【００３０】
プライマーOPERON1F（配列番号１１）およびOPERON1R（配列番号１２）を使用してプロモーターおよび３つのＯＲＦ  ｍｐｏＡ、ｍｐｏＢ、ｍｐｏＣを含む領域を増幅し、ＴＡクローニングベクターｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Promega）のマルチクローニング部位に挿入して、プラスミドｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣを得た（図３Ａ）。このプラスミドを用いてEscherichia coli DH5αコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換株ＤＨ５α／ｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣを、ｍｐｏＡ、ｍｐｏＢ、ｍｐｏＣを含まないプラスミドで形質転換したコントロール株ＤＨ５α／ｐＧＥＭとともにセレン酸０．５ｍｍｏｌ／Ｌを添加したＬＢ培地に植菌した。コントロールとしてセレン酸を添加しない培地も使用した。なお、Escherichia coliは本来亜セレン酸を還元する能力を有しているので（Bebien, M. et al., Microbiology, 148:3865-3872 (2002)）、形質転換体がセレン酸を亜セレン酸に還元する能力を有すれば、セレン酸添加培地上で元素態セレンを生成することができ、その結果コロニーが赤色になる。この結果、ＤＨ５α／ｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣ株は赤色を呈したので、３つのＯＲＦを導入したEscherichia coli内でセレン酸を亜セレン酸に還元する活性が示されることが示された（図４のＤＨ５α／ｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣ）。
【００３１】
実施例１：ｄｃｐＡｍｕｔＴオペロンの解析
参考例２に記載の手順によって、公知のジグアニレートシクラーゼ／ホスホジエステラーゼおよびＭｕｔＴ  ｎｕｄｉｘファミリータンパク質との相同性を有するタンパク質をコードする２つのＯＲＦを含む領域が見出された。これらのＯＲＦは上流から下流に上記の順で、同じ方向で存在していた（図２中に数字「３」、「４」で示す）。これらをそれぞれｄｃｐＡ、ｍｕｔＴと名づけた。ｄｃｐＡ、ｍｕｔＴのヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号７、９に、それらによってコードされるタンパク質ＤｃｐＡ、ＭｕｔＴのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号８、１０に示す。ｄｃｐＡの終止コドンとｍｕｔＴの開始コドンとの間の長さが約３０ｂｐと非常に近接していることから、これら２つのＯＲＦはオペロンを形成しており、その転写はｄｃｐＡの上流に存在するプロモーター様領域によって開始され、ｍｕｔＴの下流に存在するターミネーター様領域において終結すると考えられた。なお、参考例１で得られた元素態セレン生成能欠損変異株において、Ｔｎ９１６は、ｄｃｐＡ領域内に挿入されていた（図２中に「Ｔｎ９１６」で示す）。
【００３２】
プライマーALLGGDEFFW（配列番号１３）およびALLGGDEFRV（配列番号１４）を使用してプロモーターおよび２つのＯＲＦ  ｄｃｐＡ、ｍｕｔＴを含む領域を増幅し、ＴＡクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）のマルチクローニング部位に挿入して、プラスミドｐＧＥＭ−ｄｃｐＡｍｕｔＴを得た（図３Ｂ）。このプラスミドを用いてEscherichia coli DH5αコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換株ＤＨ５α／ｐＧＥＭ−ｄｃｐＡｍｕｔＴを、ｄｃｐＡ、ｍｕｔＴを含まないプラスミドで形質転換したコントロール株ＤＨ５α／ｐＧＥＭとともにセレン酸０．５ｍｍｏｌ／Ｌを添加した培地に植菌した。この結果、いずれの株も赤色を呈しなかったので、２つのＯＲＦは直接的にセレン酸を亜セレン酸に還元する活性を示さないことが示された（図４のＤＨ５α／ｐＧＥＭ−ｄｃｐＡｍｕｔＴ）。
【００３３】
次に、プライマーUPALLGGDEFFW（配列番号１５）およびUPALLGGDEFRV（配列番号１６）、またはプライマーDOWNALLGGDEFFW（配列番号１７）およびDOWNALLGGDEFRV（配列番号１８）を使用して２つのＯＲＦ  ｄｃｐＡ、ｍｕｔＴを含む領域を増幅し、参考例３で得られたプラスミドｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣ中のｍｐｏＡ、ｍｐｏＢ、ｍｐｏＣの上流または下流に同じ方向で挿入したプラスミドｐＧＥＭ−ｄｃｐＡｍｕｔＴ−ｍｐｏＡＢＣおよびｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣ−ｄｃｐＡｍｕｔＴを得た（図３ＣおよびＤ）。ｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣ−ｄｃｐＡｍｕｔＴを含むＤＨ５α／ｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣ−ｄｃｐＡｍｕｔＴ株を上記と同様にセレン酸添加培地に植菌したところ、ＤＨ５α／ｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣ株よりも強い赤色が観察された（図４のＤＨ５α／ｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣ−ｄｃｐＡｍｕｔＴ）。ｐＧＥＭ−ｄｃｐＡｍｕｔＴ−ｍｐｏＡＢＣを導入した株についても同様の結果が得られた（データは示さず）。このように２つの遺伝子ｄｃｐＡ、ｍｕｔＴは、Escherichia coliにおいてｍｐｏＡ、ｍｐｏＢ、ｍｐｏＣによって示されるセレン酸還元活性を増強する能力を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によって、セレン酸還元活性を増強する能力を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、それらを使用するセレン酸の還元方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】３つのＯＲＦ、ｍｐｏＡ（数字「３」で示す）、ｍｐｏＢ（数字「４」で示す）、ｍｐｏＣ（数字「５」で示す）の配置、転写／翻訳方向（矢印で示す）および元素態セレン生成能欠損変異株におけるＴｎ９１６挿入部位（「Ｔｎ９１６」で示す）を示す図である。
【図２】２つのＯＲＦ、ｄｃｐＡ（数字「３」で示す）、ｍｕｔＴ（数字「４」で示す）の配置、転写／翻訳方向（矢印で示す）および元素態セレン生成能欠損変異株におけるＴｎ９１６挿入部位（「Ｔｎ９１６」で示す）を示す図である。
【図３】ｍｐｏＡ、ｍｐｏＢおよびｍｐｏＣならびにｄｃｐＡおよびｍｕｔＴ発現用ベクターの構造を示す図である。Ａ：ｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣ；Ｂ：ｐＧＥＭ−ｄｃｐＡｍｕｔＴ；Ｃ：ｐＧＥＭ−ｄｃｐＡｍｕｔＴ−ｍｐｏＡＢＣ；およびＤ：ｐＧＥＭ−ｍｐｏＡＢＣ−ｄｃｐＡｍｕｔＴ。
【図４】ｍｐｏＡ、ｍｐｏＢおよびｍｐｏＣならびにｄｃｐＡおよびｍｕｔＴのEscherichia coliにおけるセレン酸還元に対する効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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