(57)【要約】【課題】純度が高くかつ活性を維持したタンパク質を、簡便かつ大量に精製することができるタンパク質の精製方法を開発する。【解決手段】酸化ケイ素含有物質に吸着した、第１タンパク質と第２タンパク質との融合タンパク質を、２価カチオン含有溶液と接触させる工程を包含し、第１タンパク質が、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で酸化ケイ素含有物質と結合し得るタンパク質である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の精製方法であって、
酸化ケイ素含有物質に吸着した、第１タンパク質と第２タンパク質との融合タンパク質を、２価カチオン含有溶液と接触させる工程を包含し、
第１タンパク質が、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で酸化ケイ素含有物質と結合し得るタンパク質であることを特徴とする精製方法。
【請求項２】
前記融合タンパク質を酸化ケイ素含有物質に吸着させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
前記融合タンパク質を形質転換体内で発現させる工程をさらに包含する、請求項２に記載の精製方法。
【請求項４】
第１タンパク質をコードする第１のＤＮＡに、第２タンパク質をコードする第２のＤＮＡをインフレームで連結させる工程をさらに包含する、請求項３に記載の精製方法。
【請求項５】
前記２価カチオン含有溶液が、ＭｇＣｌ２溶液、ＣａＣｌ２溶液、またはＮｉＣｌ２溶液であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項６】
前記２価カチオン含有溶液中の２価カチオンの濃度が、０．２Ｍ以上であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項７】
前記第１タンパク質が、以下の（ａ）あるいは（ｂ）に記載のポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の精製方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項８】
前記第１タンパク質が、以下の（ｃ）あるいは（ｄ）に記載のポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
（ｃ）配列番号４５、４７または４９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
（ｄ）配列番号４５、４７または４９に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項９】
タンパク質の精製方法であって、
酸化ケイ素含有物質に吸着させたタンパク質を、２価カチオン含有溶液と接触させる工程を包含し、
該タンパク質が、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で酸化ケイ素含有物質と結合し得るタンパク質であることを特徴とする精製方法。
【請求項１０】
第２タンパク質が、前記タンパク質に融合されている、請求項９に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項１１】
タンパク質の精製用キットであって、
第１タンパク質をコードする第１のＤＮＡ、および第２タンパク質をコードする第２のＤＮＡを第１のＤＮＡにインフレームで連結させるための挿入部位を有している発現ベクターを備えており、
第１タンパク質が、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で酸化ケイ素含有物質と結合し得るタンパク質であることを特徴とするタンパク質の精製用キット。
【請求項１２】
シリカ粒子またはシリカ基板をさらに備えている、請求項１１に記載のタンパク質の精製用キット。
【請求項１３】
２価カチオン含有溶液をさらに備えている、請求項１１に記載のタンパク質の精製用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の精製方法に関するものであり、より詳細には、酸化ケイ素含有物質への吸着性を有する分子を用いた、アフィニティ精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は生体を形成する主要物質の一つであり、医薬品または医療用材料などとしても広く用いられている。用いられるべきタンパク質は、従来から様々な方法（例えば、天然の素材からのタンパク質精製）によって取得されている。近年では、各種細胞に目的のタンパク質を強制的に発現し、これによって得られたタンパク質を各種用途に用いている。しかしながら、上記従来の方法では、細胞から所望のタンパク質を精製するための複雑な工程が必要であるという問題点を有している。また、用途によっては、多量のタンパク質が必要とされる場合がある。しかし、古典的な手法ではタンパク質があまり多く取得できないという問題点を有している。
【０００３】
これまでに、各種細胞にて強制的に発現されたタンパク質を容易に精製することが可能な様々な方法の開発が進められてきた。例えば、上記従来のタンパク質の精製方法としては、各種タグが連結された融合タンパク質を各種細胞にて強制的に発現し、上記タグと当該タグに対してアフィニティを有する担体との吸着作用に基づいて、融合タンパク質を精製する方法が用いられている。現在までに多くの種類のタグが開発されており、当該タグとして、例えば、ＧＳＴタンパク質、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ、およびＨｉｓタグなどが挙げられる。
【特許文献１】WO 2007/055288 パンフレット（2007年5月18日公開）
【非特許文献１】Taniguchi, K. et al., The Si-tag for immobilizing proteins on a silica surface. Biotechnol. Bioeng. 96: 1023-1029 （2007）
【非特許文献２】Fuchs, S.M. and Raines, R.T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein. Sci. 14: 1538-1544 （2005）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、種々のタンパク質の機能解析が行われており、複数のタンパク質の相互作用を調べるために、上述したようなタグが用いられている。このような解析は多角的に行われる必要があり、タンパク質精製に利用されるタグの種類は多ければ多いほど好ましい。
【０００５】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、タンパク質精製に利用可能なさらなるタグを見出し、新たなタンパク質精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、酸化ケイ素系の基板上にタンパク質を吸着させる技術について研究を進めており、酸化ケイ素含有物質に特異的に結合するタンパク質が存在することを見出している（例えば、特許文献１および非特許文献１参照）。また、９個のアルギニン残基（ポリアルギニンタグ）を付加したタンパク質が、酵素活性を保ったまま、ガラス表面上やシリカ樹脂に直接吸着できることが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。これらの技術は、基板上へタンパク質を強固に吸着させる点において非常に優れたものである。しかし、「吸着」の面において優れているとはいえ、基板を再利用するためにタンパク質を酸化ケイ素含有物質から解離するには、強酸や強塩基を用いる必要があり、このような解離方法を採用した場合には、吸着させていたタンパク質を再利用することができなかった。すなわち、上記技術はいずれもタンパク質の回収技術として利用し得るものではなかった。
【０００７】
本発明者らは、独自の観点に基づいて、酸化ケイ素含有物質に吸着したタンパク質がカチオン溶液またはアニオン溶液にて酸化ケイ素含有物質から解離するか否かを検討した。しかし、カラムクロマトグラフィーにて頻繁に用いられるＮａＣｌ水溶液をどのような高濃度で用いても、酸化ケイ素含有物質に吸着したタンパク質を酸化ケイ素含有物質から解離させることができなかった。しかし、独自の観点に基づく鋭意検討を重ねた結果、２価カチオン含有溶液を用いれば、酸化ケイ素含有物質に吸着したタンパク質を酸化ケイ素含有物質から解離させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明に係るタンパク質の精製方法は、タンパク質の精製方法であって、酸化ケイ素含有物質に吸着した、第１タンパク質と第２タンパク質との融合タンパク質を、２価カチオン含有溶液と接触させる工程を包含し、第１タンパク質が、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で酸化ケイ素含有物質と結合し得るタンパク質であることを特徴としている。
【０００９】
本発明に係るタンパク質の精製方法では、前記融合タンパク質を酸化ケイ素含有物質に吸着させる工程をさらに包含することが好ましい。
【００１０】
本発明に係るタンパク質の精製方法では、前記融合タンパク質を形質転換体内で発現させる工程をさらに包含することが好ましい。
【００１１】
本発明に係るタンパク質の精製方法では、第１タンパク質をコードする第１のＤＮＡに、第２タンパク質をコードする第２のＤＮＡをインフレームで連結させる工程をさらに包含することが好ましい。
【００１２】
本発明に係るタンパク質の精製方法では、前記２価カチオン含有溶液が、ＭｇＣｌ２溶液、ＣａＣｌ２溶液、またはＮｉＣｌ２溶液であることが好ましい。
【００１３】
本発明に係るタンパク質の精製方法では、前記２価カチオン含有溶液中の２価カチオンの濃度が、０．２Ｍ以上であることが好ましい。
【００１４】
本発明に係るタンパク質の精製方法では、前記第１タンパク質が、以下の（ａ）あるいは（ｂ）に記載のポリペプチドであることが好ましい。つまり、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１５】
本発明に係るタンパク質の精製方法では、前記第１タンパク質が、以下の（ｃ）あるいは（ｄ）に記載のポリペプチドであることが好ましい。つまり、
（ｃ）配列番号４５、４７または４９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
（ｄ）配列番号４５、４７または４９に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１６】
本発明に係るタンパク質の精製方法は、タンパク質の精製方法であって、酸化ケイ素含有物質に吸着させたタンパク質を、２価カチオン含有溶液と接触させる工程を包含し、該タンパク質が、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で酸化ケイ素含有物質と結合し得るタンパク質であることを特徴としている。
【００１７】
本発明に係るタンパク質の精製方法では、第２タンパク質が、前記タンパク質に融合されていることが好ましい。
【００１８】
本発明に係るタンパク質の精製用キットは、タンパク質の精製用キットであって、第１タンパク質をコードする第１のＤＮＡ、および第２タンパク質をコードする第２のＤＮＡを第１のＤＮＡにインフレームで連結させるための挿入部位を有している発現ベクターを備えており、第１タンパク質が、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で酸化ケイ素含有物質と結合し得るタンパク質であることを特徴としている。
【００１９】
本発明に係るタンパク質の精製用キットでは、シリカ粒子またはシリカ基板をさらに備えていることが好ましい。
【００２０】
本発明に係るタンパク質の精製用キットでは、２価カチオン含有溶液をさらに備えていることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、新たなタンパク質精製方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明者らは、酸化ケイ素含有物質と特異的に結合するタンパク質をこれまでに見出している（特許文献１参照）。このようなタンパク質（第１タンパク質）を介することによって、さらなるタンパク質（第２タンパク質）をその構造および機能を改変することなく酸化ケイ素含有物質に固定化し得る。今回、第２タンパク質の構造および機能を損傷することなく、酸化ケイ素含有物質からタンパク質を解離する手法を見出した。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「第１タンパク質」、すなわち「酸化ケイ素含有物質に特異的に結合するタンパク質」は、「０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で酸化ケイ素含有物質と結合し得るタンパク質」であれば特に限定されない。また、このようなタンパク質の由来は特に限定されず、細菌、酵母、植物、動物など、いずれの生物に由来するタンパク質であってもよい。なお、説明の便宜上、第１タンパク質を、適宜「ＳＢＰ」（ＳＢＰはsilicon material binding proteinの略）とも称する。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「酸化ケイ素含有物質」は、少なくとも酸素（Ｏ）とケイ素（Ｓｉ）とを含有する物質であればよく、酸素およびケイ素以外の元素は特に限定されず、「酸素およびケイ素のみからなる物質」、であっても「酸素、ケイ素およびその他の元素からなる物質」であってもよい。「酸化ケイ素含有物質」としては、例えば、二酸化ケイ素（シリカ）、ガラス、石綿、石英、水晶、ケイ砂、角閃石、輝石、雲母、滑石、長石などが挙げられる。また、有機系酸化ケイ素含有物質（例えば、シリコーンなど）も「酸化ケイ素含有物質」に含まれる。
【００２５】
本発明に用いられる第１タンパク質は、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で酸化ケイ素含有物質と結合し得るタンパク質であればよく、例えば、タンパク質溶液（すなわち、１種以上のタンパク質を含む溶液）に酸化ケイ素含有物質を添加し、その後酸化ケイ素含有物質を回収して０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で洗浄し、洗浄後においても酸化ケイ素含有物質に結合しているタンパク質を単離することによって、取得され得る。
【００２６】
用いられるタンパク質溶液としては、例えば、細胞破砕液、ならびにファージライブラリー由来のランダムペプチドライブラリーおよび合成ペプチドライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。なお、このタンパク質溶液にはタンパク質以外の物質が含まれていてもよい。タンパク質溶液の調製は、用いる材料に応じて適宜公知の方法を選択すればよい。例えば細胞破砕液を調製する場合には、ホモジナイザー、超音波などにより物理的に細胞を破砕する方法、酵素や界面活性剤を用いて細胞を破砕する方法、酵素や界面活性剤と物理的方法を組み合わせて細胞を破砕する方法などを用いることができる。
【００２７】
添加する酸化ケイ素含有物質は特に限定されない。例えば本発明者は、細菌由来の細胞破砕液１ｍｌに対して１０ｍｇのケイ素粉末または５ｍｇの石綿（クリソタイル）を添加している（特許文献１参照）。また、本発明者らは、マウス肺由来の細胞破砕液０．６ｍｌに対して５ｍｇの石綿（クリソタイル）を添加している（特許文献１参照）。
【００２８】
タンパク質溶液に酸化ケイ素含有物質を添加した後は、当該タンパク質と酸化ケイ素含有物質との混合液を十分混和することが好ましい。混和する条件は特に限定されないが、例えば４℃で１５分〜３０分間転倒混和することが挙げられる。
【００２９】
酸化ケイ素含有物質の回収は、例えば上記混合液を酸化ケイ素含有物質のみが沈澱する程度の回転数で遠心分離し上清を除くことにより行うことができる。また、上記混合液を適当なポアサイズのフィルターを用いてろ過することにより行うことができる。ただし、これらの方法に限定されるものではない。回収操作を行うことにより酸化ケイ素含有物質と結合していないタンパク質を除くことができる。
【００３０】
洗浄は、酸化ケイ素含有物質と非特異的に結合しているタンパク質を除外するために行う。洗浄方法としては、例えば上記により回収した酸化ケイ素含有物質に０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液を加え、ピペッティング等により十分混和後、上記と同様に遠心分離やフィルターろ過を行う方法が挙げられる。この操作を数回繰り返すことにより洗浄効果が向上する。また、洗浄用の０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液を用いて上記タンパク質溶液を調製することで、洗浄効果（非特異的な結合を除外する効果）を向上させることができる。
【００３１】
洗浄用の０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液は、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むものであれば特に限定されないが、ｐＨが中性付近の緩衝液が好ましい。なお、「０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液」とは酸化ケイ素含有物質に非特異的なタンパク質の結合が見られる０．１Ｍ未満を排除する意図であり、少なくとも０．１Ｍ以上の塩化ナトリウムを含む溶液は「０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液」に該当する。
【００３２】
本発明に用いられる第１タンパク質は、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で酸化ケイ素含有物質と結合し得るタンパク質であればよいが、溶液の塩化ナトリウム濃度を高くすることにより、酸化ケイ素含有物質に対してより特異的に結合し得るタンパク質を取得することができる。例えば、シリカと特異的に結合するタンパク質を取得する場合には、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液を用いることが好ましく、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液を用いることがより好ましく、１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液を用いることがさらに好ましい。また、例えば石綿と特異的に結合するタンパク質を取得する場合には、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液を用いることが好ましく、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液を用いることがより好ましい。さらに、洗浄用溶液に界面活性剤を添加することで、結合特異性の高いタンパク質を取得することができる。
【００３３】
本発明者は、シリカと特異的に結合する細菌由来のタンパク質を取得する際に、１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．５％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含有する２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を洗浄用緩衝液として用いている。また、石綿に特異的に結合する細菌由来のタンパク質を取得する際に、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．５％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含有する２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を洗浄用緩衝液として用いている（実施例参照）。
【００３４】
酸化ケイ素含有物質と特異的に結合している状態のタンパク質を酸化ケイ素含有物質から遊離させる方法としては、例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を用いる方法、ｐＨを低下させる方法、溶液の塩濃度を上げる（塩化ナトリウム濃度を２Ｍ程度にする）方法などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明者は、１％ドデシル硫酸ナトリウムおよび２％メルカプトエタノールを含む液を用いている（実施例参照）。
【００３５】
取得した第１タンパク質の同定は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、上記により酸化ケイ素含有物質から遊離したタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にトランスファーし、膜をクマシーブリリアントブルーで染色した後、目的タンパク質のバンドを切り出す。切り出したバンドのトリプシン消化物をマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOFMS）により分析し、ペプチドマスフィンガープリント解析により同定することができ、公知のタンパク質データベースからアミノ酸配列を取得することができる。また、例えば、自動ペプチドシーケンサを用いてアミノ酸配列を決定することができる。
【００３６】
アミノ酸配列が決定すれば、当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、公知の遺伝子データベースから取得することができる。また、当該タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、プライマーまたはプローブを設計し、当該タンパク質コードするＤＮＡ断片をクローニングして、ＤＮＡシーケンサを用いて塩基配列を決定することができる。
【００３７】
本発明に好適に用いることができる第１タンパク質としては、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、４１または４３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。これらのタンパク質は、本発明者により第１タンパク質として同定されている。また、これらのタンパク質は全て公知のタンパク質であるが、酸化ケイ素含有物質と特異的に結合し得ることは本発明者が初めて見出した機能である。
【００３８】
上記１８種類のタンパク質のうち、配列番号１、３、５、７、９、１１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、本発明者がシリカと特異的に結合するタンパク質として同定したタンパク質であり、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、４１、４３に示されるアミノ酸配列らなるタンパク質は本発明者が石綿と特異的に結合するタンパク質として同定したタンパク質である。
【００３９】
また、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、４１または４３に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で酸化ケイ素含有物質と結合し得るタンパク質も、本発明に好適に用いることができる。「１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」については、後述する。
【００４０】
本発明に用いられる第１タンパク質は、その供給源となる細胞を培養し、単離、精製することにより生産できる。また、公知の遺伝子工学的手法により組み換え発現ベクター構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させることにより生産できる。
【００４１】
以下、酸化ケイ素含有物質としてシリカを用い、第１タンパク質（酸化ケイ素含有物質に特異的に結合するタンパク質）としてリボソームＬ２タンパク質を用いた一実施形態を例に本発明を説明するが、本発明がこの態様に限定されないことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【００４２】
本実施の形態のタンパク質の精製方法は、シリカに吸着した、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質との融合タンパク質を、２価カチオン含有溶液によってシリカから解離させる工程を有する方法である。つまり、本実施の形態のタンパク質の精製方法では、リボソームＬ２タンパク質のシリカへの吸着を２価カチオンによって特異的に解離させることによって、目的の融合タンパク質を精製している。以下に、各構成について説明する。
【００４３】
リボソームＬ２タンパク質は、本発明者らによってシリカ（二酸化ケイ素、ＳｉＯ２）に特異的に吸着することが見出されたタンパク質である。なお、本明細書において、「タンパク質」は、「ポリペプチド」または「ペプチド」と交換可能に使用される。用語「タンパク質」には、タンパク質の部分断片（フラグメント）が含まれるものとする。また、用語「タンパク質」には、融合タンパク質が含まれるものとする。用語「融合タンパク質」は、２つ以上の異種タンパク質の一部（フラグメント）または全部が融合されたタンパク質である。
【００４４】
上記リボソームＬ２タンパク質の由来は特に限定されず、細菌、酵母、植物、動物など、いずれの生物に由来するものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。具体的には、リボソームＬ２タンパク質は、以下の（ａ）あるいは（ｂ）に記載のポリペプチドであってもよい：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４５】
また、リボソームＬ２タンパク質は、以下の（ｃ）あるいは（ｄ）に記載のポリペプチドであってもよい：
（ｃ）配列番号４５、４７または４９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
（ｄ）配列番号４５、４７または４９に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４６】
なお、配列番号１にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、リボソームＬ２タンパク質の全長に相当するポリペプチドであり、配列番号４５または４７にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、シリカへの吸着に必要なリボソームＬ２タンパク質の部分領域（それぞれ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜６０位または第２０４〜２７３位）に相当するポリペプチドである。このように、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜６０位または第２０４〜２７３位を含んでいるタンパク質は、シリカへの吸着が保持される。すなわち、本発明に利用可能なリボソームＬ２タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントであって、該フラグメントはそれぞれ配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜６０位または第２０４〜２７３位を含んでいる、タンパク質であるといえる。また、本発明に利用可能なリボソームＬ２タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜６０位からなるポリペプチドと配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２０４〜２７３位からなるポリペプチドとの融合ポリペプチド（すなわち、配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）であってもよい。なお、本明細書中において、本発明に利用可能なリボソームＬ２タンパク質は、シリカへ特異的に吸着し得るポリペプチドが意図され、「シリカ結合性タグ」とも称する。また、タンパク質のシリカへの吸着を「結合」とも称する。
【００４７】
ここで「１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により置換、欠失、挿入および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法によって人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００４８】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた、当該分野において周知である。好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。
【００４９】
代表的に保存性置換と見られるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換を挙げることができる。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「第２タンパク質」は、主として精製対象のタンパク質が意図され、「目的のタンパク質」と交換可能に用いられる。第２タンパク質の具体的な構成としては特に限定されず、所望のタンパク質が適宜用いられ得る。
【００５１】
次いで、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質とを融合させる方法について説明する。
【００５２】
リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質とを融合させる方法は、リボソームＬ２タンパク質を強固に第２タンパク質に融合できる方法であればよく、その具体的な方法は特に限定されない。なお、融合部の具体的な結合様式としても特に限定されず、例えば、共有結合、疎水結合、イオン結合、水素結合、またはこれらの複数の結合様式を介して、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質とが融合し得る。より強固にリボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質とを融合させるという点においては、上記結合様式の中では共有結合がより好ましい。
【００５３】
例えば、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質とを融合させる方法としては、架橋剤を用いる方法を挙げることができる。なお、上記架橋剤としては特に限定されず、適宜公知の架橋剤を用いることが可能である。例えば、上記架橋剤としては、ジメチルスベロイミデート二塩酸塩（ＤＭＳ）、スベリン酸ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＳＳ）、酒石酸−Ｎ−ヒドロキシジスクシンイミドエステル（ＤＳＴ）、ｐ−フェニレンビスマレイミド（ｐＰＤＭ）、メチル４−メルカプトブチルイミデート塩酸塩（ＭＢＩ）、または、メチル４−アジドベンゾイミデート塩酸塩（ＡＢＩ）などを用いることが好ましいが、これらに限定されない。上記構成によれば、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質とを強固に融合させることができる。特に、リボソームＬ２タンパク質および第２タンパク質がいずれも入手容易なタンパク質である場合には、上記構成を採用することが好ましい。なお、上記架橋剤を用いてリボソームＬ２タンパク質を第２タンパク質に融合させる具体的な方法は、架橋剤の種類に応じて適宜公知の方法を用いればよい。
【００５４】
また、発現ベクターを用いて両タンパク質を融合タンパク質として発現させることによって、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質とを融合させてもよい。上記構成によれば、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質とが融合した融合タンパク質を容易に作製することができ、その結果、多種類かつ多量のタンパク質を容易に精製することができる。
【００５５】
上記発現ベクターの具体的な構成としては、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質とからなる融合タンパク質をコードする塩基配列を含めばよく、その他の具体的な構成は特に限定されず、宿主中で融合タンパク質を発現可能なベクターであればよい。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いて発現ベクターを作製することが可能である。
【００５６】
上記発現ベクターでは、上記融合タンパク質をコードする塩基配列中にリボソームＬ２タンパク質をコードするタグ配列が含まれている。当該タグ配列は、以下の（ｅ）もしくは（ｆ）に記載のポリヌクレオチドであってもよい：
（ｅ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｆ）配列番号２に示される塩基配列、あるいは配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００５７】
また、上記発現ベクターでは、上記融合タンパク質をコードする塩基配列中にリボソームＬ２タンパク質をコードするタグ配列が含まれている。当該タグ配列は、以下の（ｇ）もしくは（ｈ）に記載のポリヌクレオチドであってもよい：
（ｇ）配列番号４６、４８または５０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｈ）配列番号４６、４８または５０に示される塩基配列、あるいは配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００５８】
なお、配列番号２にて示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、リボソームＬ２タンパク質の全長に相当するポリヌクレオチドであり、配列番号４６または４８にて示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、シリカへの吸着に必要なリボソームＬ２タンパク質の部分領域（それぞれ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜６０位または第２０４〜２７３位）に対応するポリヌクレオチドである。また、配列番号５０にて示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、リボソームＬ２タンパク質の上記部分領域（配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜６０位と第２０４〜２７３位）の融合ポリペプチドに対応するポリヌクレオチドである。
【００５９】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００６０】
上記ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｌｌ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）」に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。
【００６１】
また、宿主に応じて適宜プロモーターを選択して発現ベクター中に挿入し、当該プロモーターの下流に、融合タンパク質をコードする塩基配列を挿入すればよい。
【００６２】
上記発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーターおよび／または複製起点等）を含有することが好ましい。例えば、細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）を使用することが好ましく、酵母用発現ベクターのプロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、またはＰＨ０５プロモーター等を使用することが好ましく、糸状菌用発現ベクターのプロモーターとしては、例えば、アミラーゼプロモーター、またはｔｒｐＣプロモーター等を使用することが好ましい。また動物細胞用発現ベクターのプロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）を使用することが好ましい。
【００６３】
発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【００６４】
上記発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては特に限定されないが、宿主として真核生物細胞を用いる場合には、ジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子を用いることが好ましく、宿主としてＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌を用いる場合には、テトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子を用いることが好ましい。
【００６５】
上記選択マーカーを用いれば、上記発現ベクターが宿主に導入されたか否か、さらには宿主中で融合タンパク質が発現しているか否かを確認することができる。
【００６６】
上記宿主としては特に限定されるものではなく、例えば、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などを挙げることができる。
【００６７】
上記発現ベクターを宿主に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、またはＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００６８】
第２タンパク質に対するリボソームＬ２タンパク質の融合位置は特に限定されない。例えば、第２タンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸、Ｃ末端に存在するアミノ酸、または、Ｎ末端とＣ末端との間に存在するアミノ酸に対してリボソームＬ２タンパク質を融合させることができる。上述したような発現ベクターを用いる場合には、第２タンパク質のＮ末端またはＣ末端に、リボソームＬ２タンパク質を融合させることが好ましい。上記構成であれば、発現ベクターの構造を簡略化させることができるとともに、当該発現ベクターに対して様々な第２タンパク質をコードする様々な塩基配列を、容易に挿入することができる。
【００６９】
以上のように作製された、リボソームＬ２タンパク質と融合した第２タンパク質は、シリカ（二酸化ケイ素、ＳｉＯ２）に強固に吸着する。タンパク質が吸着するシリカの形態としては特に限定されない。例えば、上記シリカは、粒子状、基板状の形態を有することが好ましい。なお、このとき、上記粒子および基板の全体がシリカによって形成されている必要はなく、少なくともその一部がシリカによって形成されていればよい。例えば、粒子状のシリカを用いてカラムを形成すれば、より容易に第２タンパク質を精製することができる。また、粒子状のシリカを用いれば、遠心分離処理によって、シリカに吸着した状態の第２タンパク質を容易に取得することができる。また、基板状のシリカを用いれば、タンパク質を精製できるのみならず、当該基板上にタンパク質が固定化された各種基板（例えば、シリコン基板を用いる半導体基板など）をより容易に作製することができる。
【００７０】
リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質との融合タンパク質がシリカに吸着している状態もまた、特に限定されない。例えば、融合タンパク質とシリカとを溶液中にて混合することによって、両者を吸着させることが好ましい。
【００７１】
上記溶液としては特に限定されないが、例えば、高濃度のＮａＣｌ溶液であることが好ましい。溶液中のＮａＣｌの具体的な濃度としては特に限定されないが、例えば、０．５Ｍ〜５Ｍであることが好ましく、０．５Ｍ〜２．５Ｍであることがより好ましく、１Ｍ〜２Ｍであることが最も好ましい。上記構成によれば、非常に高いＮａＣｌ濃度の条件下にて融合タンパク質とシリカとを結合させるので、融合タンパク質以外の物質がシリカに結合することを防止することができる。換言すれば、上記構成によれば、融合タンパク質を高純度にて精製することができる。
【００７２】
また、上記溶液には、界面活性剤が含まれていることが好ましい。上記界面活性剤としては特に限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸、またはデオキシコール酸などを用いることが好ましい。上記構成によれば、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質との融合タンパク質をより高純度にて精製することができる。
【００７３】
本実施の形態のタンパク質の精製方法は、シリカに吸着した、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質との融合タンパク質を２価カチオン含有溶液によって解離させる工程を有している。
【００７４】
上記２価カチオン含有溶液としては特に限定されないが、例えば、ＭｇＣｌ２溶液、ＣａＣｌ２溶液、ＮｉＣｌ２溶液であることが好ましく、ＭｇＣｌ２溶液またはＣａＣｌ２溶液であることが更に好ましく、ＭｇＣｌ２溶液であることが最も好ましい。上記構成によれば、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質との融合タンパク質を、シリカから特異的に解離させることができる。
【００７５】
上記２価カチオン含有溶液中の２価カチオンの濃度は特に限定されないが、例えば、０．２Ｍ以上であることが好ましく、１Ｍ以上の濃度であることが更に好ましく、２Ｍ以上の濃度であることが最も好ましい。上記構成によれば、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質との融合タンパク質を、シリカからより効果的に解離させることができる。
上記解離させる工程の更に具体的な方法としては、例えば、遠心分離法またはカラム法を用いることができる。例えば、上記遠心分離法では、まず、融合タンパク質が吸着したシリカを２価カチオン含有溶液中に分散させる。次いで、当該分散液を遠心分離すれば、上清中に、シリカから解離した融合タンパク質を得ることができる。また、上記カラム法では、融合タンパク質が吸着したシリカによってカラムを作製し、２価カチオン含有溶液を用いて、当該カラムから融合タンパク質を溶出させればよい。
【００７６】
以上のように、シリカから解離した状態の融合タンパク質を容易に入手することができる。
【００７７】
シリカから解離した状態の融合タンパク質には高濃度の２価カチオン（例えば、ＭｇＣｌ２）が含まれる。そこで、本実施の形態のタンパク質の精製方法では、目的に応じて２価カチオンを除去するための除去工程を備えることが好ましい。上記除去工程の具体的な方法としては特に限定されないが、例えば、透析によって２価カチオンを除去することが好ましい。したがって、上記構成によれば、より高純度のタンパク質を精製することができる。
【００７８】
また、本実施の形態のタンパク質の精製方法では、上述した解離工程の前に、リボソームＬ２タンパク質と第２タンパク質との融合タンパク質とシリカとの吸着を解離させない条件下において、当該シリカを洗浄する工程が含まれていることが好ましい。当該工程としては特に限定されないが、例えば、高濃度のＮａＣｌ溶液を用いてシリカを洗浄することが好ましい。溶液中のＮａＣｌの具体的な濃度としては特に限定されないが、例えば、０．５Ｍ〜５Ｍであることが好ましく、２Ｍ〜５Ｍであることがより好ましく、２Ｍであることが最も好ましい。上記構成によれば、シリカに対して吸着した第２タンパク質以外の物質を効果的に除去することができる。換言すれば、上記構成によれば、タンパク質を高純度にて精製することができる。
【００７９】
また、上記溶液には、界面活性剤が含まれていることが好ましい。上記界面活性剤としては特に限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸、またはデオキシコール酸などを用いることが好ましい。上記構成によれば、タンパク質をより高純度にて精製することができる。
【実施例】
【００８０】
〔１．シリカ結合性タグ融合プロテインＡ（SBP-protein A）発現ベクターの作製〕
Staphylococcus aureus subsp. aureus MW2株のプロテインＡ遺伝子（spa）の配列に基づいて、２種のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー１、プライマー２）を作製した。
【００８１】
プライマー１：5'  -ATCGAATTCTGCGCAACACGATGAAGCTCAAC-  3'（配列番号３３）
プライマー２：5'  -GTTGAGCTCGTGTTGTTGTCTTCCTCTTTTG -  3'（配列番号３４）
上記プライマー１、プライマー２、および、鋳型としてStaphylococcus aureus subsp. aureus MW2株の染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によってプロテインＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応にはKOD Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用い、具体的な反応条件などは添付のプロトコールに従った。なお、上記プライマーの塩基配列中、「GAATTC」は、Eco RI認識サイトであり、「GAGCTC」は、Sac I認識サイトである。
【００８２】
上記ＰＣＲ反応によって得られた増幅産物、および発現ベクターｐＥＴ２１−ｂ（Novagen社製）を、制限酵素EcoRIおよびSacIによって、３７℃にて２時間消化した。その後、アガロースゲル電気泳動によって、上記増幅断片およびｐＥＴ２１−ｂを精製した。精製した増幅断片とｐＥＴ−２１ｂとを、Ligation High（TOYOBO社製）を用いてライゲーションした。なお、ライゲーション反応は、１６℃にて２時間行った。
【００８３】
以上のようにして得られた発現ベクターを用いて、大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換した。得られた大腸菌コロニーから目的のＤＮＡ断片が挿入された発現ベクターを選択し、当該発現ベクターをｐＥＴ−ＳｐＡと命名した。
【００８４】
次いで、Escherichia coli K12株のリボソームＬ２タンパク質の遺伝子（rplB）の配列に基づいて、２種のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー３、プライマー４）を作製した。
【００８５】
プライマー３：5'  -GTTGTCGACATGGCAGTTGTTAAATGTAA -  3'（配列番号３５）
プライマー４：5'  -GTTGCGGCCGCTTTGCTACGGCGACGTACG-  3'（配列番号３６）
上記プライマー３、プライマー４、および、鋳型としてEscherichia coli K12株の染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によってリボソームＬ２タンパク質の遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応にはKOD Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用い、具体的な反応条件などは添付のプロトコールに従った。なお、上記プライマーの塩基配列中、「GTCGAC」は、Sal I認識サイトであり、「GCGGCCGC」は、Not I認識サイトである。
【００８６】
上記ＰＣＲ反応によって得られた増幅産物、および発現ベクターｐＥＴ−ＳｐＡを、制限酵素SalIおよびNotIによって、３７℃にて２時間消化した。その後、アガロースゲル電気泳動によって、上記増幅断片およびｐＥＴ−ＳｐＡを精製した。精製した増幅断片とｐＥＴ−ＳｐＡとを、Ligation High（TOYOBO社製）を用いてライゲーションした。なお、ライゲーション反応は、１６℃にて２時間行った。
【００８７】
以上のようにして得られた発現ベクターを用いて、大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換した。得られた大腸菌コロニーから目的のＤＮＡ断片が挿入された発現ベクターを選択し、当該発現ベクターをｐＥＴ−ＳｐＡ−Ｓｉｔａｇと命名した。
【００８８】
〔２．シリカ結合性タグ（SBP）発現ベクターの作製〕
Escherichia coli K12株のリボソームＬ２タンパク質の遺伝子（rplB）の配列に基づいて、２種のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー３、プライマー４）を作製した。
【００８９】
プライマー５：5'  -CATCGAATTCTATGGCAGTTGTTAAATGTAAA-  3'（配列番号３７）
プライマー６：5'  -AGTTGAGCTCGTTTTGCTACGGCGACGTACGA-  3'（配列番号３８）
上記プライマー５、プライマー６、および、鋳型としてEscherichia coli K12株の染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によってリボソームＬ２タンパク質の遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応にはKOD Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用い、具体的な反応条件などは添付のプロトコールに従った。なお、上記プライマーの塩基配列中、「GAATTC」は、Eco RI認識サイトであり、「GAGCTC」は、Sac I認識サイトである。
【００９０】
上記ＰＣＲ反応によって得られた増幅産物、および発現ベクターｐＥＴ２１−ｂ（Novagen社製）を、制限酵素Eco RIおよびSac Iによって、３７℃にて２時間消化した。その後、アガロースゲル電気泳動によって、上記増幅断片およびｐＥＴ２１−ｂを精製した。精製した増幅断片とｐＥＴ２１−ｂとを、Ligation High（TOYOBO社製）を用いてライゲーションした。なお、ライゲーション反応は、１６℃にて２時間行った。
【００９１】
以上のようにして得られた発現ベクターを用いて、大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換した。得られた大腸菌コロニーから目的のＤＮＡ断片が挿入された発現ベクターを選択し、当該発現ベクターをｐＥＴ−Ｌ２Ｎと命名した。
【００９２】
〔３．改変型シリカ結合性タグ（１−６０）発現ベクターの作製〕
Escherichia coli K12株のリボソームＬ２タンパク質の遺伝子（rplB）の配列に基づいて、２種のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー７、プライマー８）を作製した。
【００９３】
プライマー７：5'  -AGTAATGCTAGCGCAGTTGTTAAATGTAAACCG-  3'（配列番号３９）
プライマー８：5'  -ACAATCTCGAGTTACTGCTTGTGGCC       -  3'（配列番号４０）
上記プライマー７、プライマー８、および、鋳型としてEscherichia coli K12株の染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によってリボソームＬ２タンパク質の遺伝子のうちのＮ末端６０残基に相当する領域を増幅した。なお、当該領域は、配列番号４６にて示されるポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドは、配列番号４５にて示されるポリペプチドをコードしている。ＰＣＲ反応にはKOD Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用い、具体的な反応条件などは添付のプロトコールに従った。なお、上記プライマーの塩基配列中、「GCTAGC」は、Nhe I認識サイトであり、「CTCGAG」は、Xho I認識サイトである。
【００９４】
上記ＰＣＲ反応によって得られた増幅産物、および発現ベクターｐＥＴ２１−ｂ（Novagen社製）を、制限酵素Nhe IおよびXho Iによって、３７℃にて２時間消化した。その後、アガロースゲル電気泳動によって、上記増幅断片およびｐＥＴ２１−ｂを精製した。精製した増幅断片とｐＥＴ２１−ｂとを、Ligation High（TOYOBO社製）を用いてライゲーションした。なお、ライゲーション反応は、１６℃にて２時間行った。
【００９５】
以上のようにして得られた発現ベクターを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた大腸菌コロニーから目的のＤＮＡ断片が挿入された発現ベクターを選択し、当該発現ベクターをｐＥＴ−Ｌ２（１−６０）と命名した。
【００９６】
〔４．シリカ結合性タグ、改変型シリカ結合性タグ、およびシリカ結合性タグ融合プロテインＡのシリカを用いた精製〕
ｐＥＴ−Ｌ２Ｎ、ｐＥＴ−Ｌ２（１−６０）、ｐＥＴ−ＳｐＡ−Ｓｉｔａｇのそれぞれを用いて、シリカ結合性タグ、改変型シリカ結合性タグ、シリカ結合性タグ融合プロテインＡを作製し、シリカ粒子を用いて各タンパク質を精製した。以下に、その方法について説明する。
【００９７】
まず、各ベクターが導入された大腸菌を３７℃にて培養した。なお、各ベクターの大腸菌への導入は、公知の方法によって行った。ＯＤ６００が０．６になった時点で、最終濃度が０．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。そして、ＩＰＴＧを添加して４時間後に、遠心分離処理によって大腸菌を回収した。
【００９８】
各大腸菌を破砕液（２Ｍ：ＮａＣｌ、０．５％（ｖ／ｖ）：界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、２５ｍＭ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に懸濁した後、超音波処理によって大腸菌を破砕した。
【００９９】
大腸菌を破砕した後、当該破砕液に対して遠心分離処理（２４，０００×ｇ、１５分間）を行い、上清を回収した。なお、当該上清は、図１において「菌体抽出液（ＣＥ）」と記載する。また、図１中、「Ｍ」は、分子量マーカーを意図する。
【０１００】
上記上清に対してシリカ粒子（Silicon dioxide fine powder ca. ０．８μｍ、添川理化学株式会社製）を添加して、４℃にて３０分間混合した。
【０１０１】
上記混合の後、遠心分離処理（３，０００×ｇ、５分間）によってシリカ粒子を回収した。なお、この時の上清は、図１において「シリカ未結合画分（ＵＢ）」と記載する。回収したシリカ粒子を、上記破砕液にて更に２回洗浄した。
【０１０２】
洗浄後のシリカ粒子を２ＭのＭｇＣｌ２を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に懸濁し、４℃にて１０分間の攪拌を行った。そして、当該操作によって、シリカに結合した各タンパク質をシリカから解離させた。攪拌後、遠心分離処理（３，０００×ｇ、５分間）を行ってシリカ粒子を沈殿させた後、その上清を回収した。なお、このときの上清は、図１において「溶出タンパク質画分（Ｐ）」と記載する。
【０１０３】
図１に、シリカ結合性タグ、およびシリカ結合性タグ融合プロテインＡのシリカへの結合性を示す電気泳動図を示す。
【０１０４】
図１に示すように、シリカ結合性タグとシリカとの結合は、２ＭのＭｇＣｌ２によって解離することが明らかになった。また、溶出タンパク質画分（Ｐ）には、約９０％の高い純度にて、シリカ結合性タグ（ＳＢＰ）、またはシリカ結合性タグ融合プロテインＡ（ＳＢＰ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）が含まれていることが明らかになった。
【０１０５】
また、溶出タンパク質画分（Ｐ）中のＭｇＣｌ２を透析によって除去したところ、溶出タンパク質画分（Ｐ）中に含まれていたシリカ結合性タンパク質、または融合タンパク質は、再び、シリカに対して結合性を示した。つまり、シリカ結合性タグとシリカとの結合は、ＭｇＣｌ２の濃度を調節することによって、可逆的に調節し得ることが明らかになった。
【０１０６】
また、図２に、改変型シリカ結合性タグのシリカへの結合性を示す電気泳動図を示す。なお、図２において、レーン１は、菌体抽出液（ＣＥ）中の改変型シリカ結合性タグを示し、レーン２は、シリカ未結合画分（ＵＢ）中の改変型シリカ結合性タグを示し、レーン３は、溶出タンパク質画分（Ｐ）中の改変型シリカ結合性タグを示している。
【０１０７】
タンパク質精製用のタグとして利用するには、できるだけサイズが小さい方が望ましい。図２に示すように、改変型シリカ結合性タグのサイズは約６０アミノ酸であって、元々のシリカ結合性タグと比較して非常に小さい。しかしながら、図２に示すように、改変型シリカ結合性タグも高純度（約９０％）に精製されており、精製用のタグとして有効であることが明らかになった。
【０１０８】
〔５．シリカ充填カラムを用いたシリカ結合性タグの精製〕
市販の空カラム（Tricorn 5/20; GE Healthcare）にシリカ粒子（直径０．１μｍ、約８００ｍｇ、クォートロンSP-03B、扶桑化学工業株式会社製）を充填し、シリカ充填カラムとした。シリカ充填カラムをMilli-Q水、洗浄液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０にて十分に洗浄した後、シリカ結合性タグを発現させたEscherichia coliの菌体抽出液（湿菌体０．４５ｇ相当）を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎにてシリカ充填カラムに添加した。
【０１０９】
５ｍＬの洗浄液にて洗浄後、２Ｍ  ＭｇＣｌ２を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を添加してシリカ結合性タグを溶出させた。図３に、シリカ充填カラムによって精製されたシリカ結合性タグの電気泳動図を示す。
【０１１０】
図３に示すように、高純度（約９０％）にてシリカ結合性タグを精製することができた。
【０１１１】
〔６．シリカ結合性タグの解離条件の検討〕
シリカ粒子に結合したシリカ結合性タグを解離させるための条件を検討した。
【０１１２】
まず、カラムクロマトグラフィーによって精製したシリカ結合性タグ１０μｇとシリカ粒子１０ｍｇとを、１ｍＬの緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０）中に添加し、４℃にて３０分間混合した。
【０１１３】
その後、シリカ結合性タグが結合したシリカ粒子を遠心分離処理（１２，０００×ｇ、１分間、４℃）によって回収し、当該シリカ粒子を上記緩衝液にて更に２回洗浄した。洗浄後のシリカ粒子に対して各種溶出液を加えて、５分間混合した。その後、遠心分離処理を行って上清を除去した。
【０１１４】
残ったシリカ粒子に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーを３０μｌ添加し、１００℃にて５分間加熱した。これによって、シリカ粒子上に残存していたシリカ結合性タグをサンプルバッファー中に解離させた。その後、シリカ結合性タグが解離したサンプルバッファーを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）に供した。
【０１１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４に示す。なお、図４中、レーン１は、溶出液にて溶出させなかった場合にシリカ粒子上に結合しているシリカ結合性タグを示し（negative control）、レーン２は、５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を溶出液として用いた場合にシリカ粒子上に残存しているシリカ結合性タグを示し、レーン３は、２Ｍ  ＭｇＣｌ２を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を溶出液として用いた場合にシリカ粒子上に残存しているシリカ結合性タグを示し、レーン４は、ＣＨＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ１２）緩衝液を溶出液として用いた場合にシリカ粒子上に残存しているシリカ結合性タグを示し、レーン５は、１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を溶出液として用いた場合にシリカ粒子上に残存しているシリカ結合性タグを示し、レーン６は、ＣＨ３ＣＯＯＨ−ＮａＯＨ（ｐＨ４．２６）溶液を溶出液として用いた場合にシリカ粒子上に残存しているシリカ結合性タグを示し、レーン７は、１Ｎ  ＨＣｌ溶液を溶出液として用いた場合にシリカ粒子上に残存しているシリカ結合性タグを示し、レーン８は、本実験に用いた精製されたシリカ結合性タグを示している。
【０１１６】
図４に示すように、１ＮのＨＣｌ溶液や１ＮのＮａＯＨ溶液などの酸・アルカリ溶液を溶出液として用いた場合には、シリカ結合性タグはシリカ粒子から解離することが明らかになった（例えば、レーン５およびレーン７参照）。しかしながら、これらの条件下ではタンパク質の変性が起こり、その結果、活性を維持したタンパク質を精製することができない。活性を保持したままでシリカ結合性タグが連結したタンパク質をシリカ粒子から解離させるためには、中性条件下でシリカ結合性タグを解離させる必要がある。そこで、各種イオンを用いてシリカ結合性タグを解離させることができないか検討した。
【０１１７】
溶出液として従来から用いられている高濃度のＮａＣｌ溶液を用いた場合には、５Ｍにまで濃度を増加させても、シリカ結合性タグをシリカ粒子から解離させることはできなかった（レーン２参照）。
【０１１８】
一方、２Ｍ  ＭｇＣｌ２を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を溶出液として用いた場合には、シリカ結合性タグがシリカ粒子から解離することが明らかになった（レーン３参照）。
【０１１９】
〔７．溶出液のＭｇＣｌ２濃度の検討〕
ｐＥＴ−Ｌ２Ｎが導入されたEscherichia coliを２×ＹＴ培地中で培養し、ＯＤ６００が０．６になった時点で、終濃度が０．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。
【０１２０】
ＩＰＴＧを添加して４時間後に、遠心分離処理（６，０００×ｇ、１５分間、４℃）によって大腸菌を集菌した。得られた菌体を緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕した。
【０１２１】
上記菌体破砕液を遠心分離処理（４０，０００×ｇ、２０分間、４℃）し、これによって得られた上清を、菌体破砕液とした。５００μＬの菌体破砕液と１０ｍｇのシリカ粒子とを、１ｍＬの緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０）中に添加し、４℃にて３０分間混合した。
【０１２２】
その後、シリカ結合性タグが結合したシリカ粒子を遠心分離処理（１２，０００×ｇ、１分間、４℃）によって回収し、当該シリカ粒子を上記緩衝液にて更に２回洗浄した。洗浄後のシリカ粒子に対して各種溶出液を加えて、５分間混合した。その後、遠心分離処理を行って上清とシリカ粒子のペレットとを別々に回収した。
【０１２３】
上記上清およびシリカ粒子の一部にサンプルバッファーを加え、当該サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）に供した。
【０１２４】
また、上記上清の残りを再びシリカ粒子と混合して、シリカ粒子にシリカ結合性タグを吸着させた後、上述した方法と同じ方法にて、２回目の溶出を行った。つまり、２回の精製ステップを経ることによって、精製純度が上昇するか否かを確認した。
【０１２５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図５に示す。なお、図５中、レーン１は、大腸菌の菌体破砕液中に含まれるシリカ結合性タグを示し、レーン２〜５は、１ＭのＭｇＣｌ２を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を用いて溶出を行った場合のシリカ結合性タグを示し、レーン６〜９は、２ＭのＭｇＣｌ２を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を用いて溶出を行った場合のシリカ結合性タグを示している。更に詳細には、レーン２および６は、１回目の溶出画分（上清）中に含まれるシリカ結合性タグを示し、レーン３および７は、１回目の溶出時にシリカ粒子上に残留したシリカ結合性タグを示している。また、レーン４および８は、２回目の溶出画分（上清）中に含まれるシリカ結合性タグを示し、レーン５および９は、２回目の溶出時にシリカ粒子上に残留したシリカ結合性タグを示している。
【０１２６】
図５に示すように、１ＭのＭｇＣｌ２を用いた場合でも、シリカ結合性タグを解離させることが可能であることが明らかになった（レーン２参照）。また、この場合には、シリカ粒子上に一部のシリカ結合性タグが残留することも明らかになった（レーン３参照）。
【０１２７】
一方、２ＭのＭｇＣｌ２を用いた場合には、シリカ結合性タグはシリカ粒子上に残留することなく（レーン７参照）、ほぼ全てがシリカ粒子から解離することが明らかになった（レーン６参照）。
【０１２８】
また、１回の精製操作のみで９０％以上の純度でシリカ結合性タグを精製でき、２回の精製操作を行う必要がないことが明らかになった。
【０１２９】
〔８．Ｍｇ２＋以外の２価カチオンの解離効果〕
Ｍｇ２＋以外の２価カチオンが、シリカ結合性タグをシリカ粒子から解離させることができるか否か検討した。なお、具体的な実験は、上述した〔７．溶出液のＭｇＣｌ２濃度の検討〕に記載した方法に従って行った。また、ＣａＣｌ２溶液、ＮｉＣｌ２溶液、ＦｅＣｌ２溶液、ＺｎＣｌ２溶液、ＭｎＣｌ２溶液に関して解離効果を検討しようとしたが、２ＭのＦｅＣｌ２溶液、ＺｎＣｌ２溶液、およびＭｎＣｌ２溶液を調製しようとしたところ、Ｔｒｉｓ緩衝液中では沈殿を形成された。そこで、２ＭのＣａＣｌ２溶液およびＮｉＣｌ２溶液に関してのみ解離効果を検討した。
【０１３０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図６に示す。なお、図６中、レーン１は、溶出液としてＣａＣｌ２溶液を用いた場合にシリカ粒子上に残留するシリカ結合性タグを示し、レーン２は、溶出液としてＮｉＣｌ２溶液を用いた場合にシリカ粒子上に残留するシリカ結合性タグを示し、レーン３は、溶出液としてＣａＣｌ２溶液を用いた場合の溶出液中に含まれるシリカ結合性タグを示し、レーン４は、溶出液としてＮｉＣｌ２溶液を用いた場合の溶出液中に含まれるシリカ結合性タグを示している。
【０１３１】
図６に示すように、ＣａＣｌ２溶液、ＮｉＣｌ２溶液の何れを用いた場合でも、シリカ結合性タグがシリカ粒子から解離することが明らかになった。また、シリカ結合性タグの解離効果（溶出効果）は、ＭｇＣｌ２溶液に及ばないことが明らかになった。
【０１３２】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明は、シリカに結合することができるタンパク質を高純度にて大量に精製することができるので、プロテインチップ、ナノバイオデバイス、医薬品などを製造する広範な技術分野に用いることができる。特に、本発明の製造方法によって作製されたタンパク質はシリカに結合することができるので、本発明は半導体の製造に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】シリカ結合性タグ、およびシリカ結合性タグ融合プロテインＡのシリカへの結合性を示す電気泳動図である。
【図２】改変型シリカ結合性タグのシリカへの結合性を示す電気泳動図である。
【図３】シリカ充填カラムによって精製されたシリカ結合性タグの電気泳動図である。
【図４】各種溶出液によってシリカ粒子から解離したシリカ結合性タグを示す電気泳動図である。
【図５】様々な濃度のＭｇＣｌ２溶液によってシリカ粒子から解離したシリカ結合性タグを示す電気泳動図である。
【図６】様々な２価カチオンによってシリカ粒子から解離したシリカ結合性タグを示す電気泳動図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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