(57)【要約】【課題】高分子基質を結合する高分子基質結合部位を有する酵素について高活性変異体を効率的に取得できるスクリーニング方法を提供する。【解決手段】高分子基質に結合するトンネル状又は溝状の基質結合部位を有する酵素につき、基質相互作用を有する可能性のある部位のアミノ酸をアラニン置換した２種類以上の一次変異体を調製する工程と、前記一次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前より酵素活性が上昇した前記一次変異体のアラニン置換部位を変異導入候補部位として選択する工程と、を備える、スクリーニング方法とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子基質を結合するトンネル状又は溝状の基質結合部位を有する酵素につき、基質相互作用を有する可能性のある部位のアミノ酸をアラニン置換した２種類以上の一次変異体を調製する工程と、
前記一次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前より酵素活性が上昇した前記一次変異体のアラニン置換部位を変異導入候補部位として選択する工程と、
を備える、変異体のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記基質相互作用を有する部位は、前記プロセッシブ酵素の前記基質結合部位の入口又は出口もしくはこれらの近傍に位置される部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、
前記変異導入候補部位のそれぞれにつき、当該部位の本来のアミノ酸残基を２種類以上の他のアミノ酸に置換して得られる２種類以上の二次変異体を調製する工程と、
前記二次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前より酵素活性が上昇した前記二次変異体の変異導入部位のアミノ酸及び部位を置換アミノ酸候補及び置換候補部位として選択する工程と、
を備える、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記高分子基質は、セルロースである、請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記酵素は、セロビオヒドロラーゼである、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記Phanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼである、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記セロビオヒドロラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列を有し、前記変異導入候補部位は、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＷ３８位、Ｗ４０位及びＹ４７位又はこれに相当する部位から選択される、請求項５又は６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記酵素は、エンドグルカナーゼである、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記エンドグルカナーゼは、Phanerocaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼである、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記エンドグルカナーゼは配列番号４で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列を有し、前記前記変異導入候補部位は、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるＹ７位及びＰ１３４位又はこれらに相当する部位から選択される、請求項８又は９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異又はこれに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
前記変異は、W40N、W40D、W40E、W40I、W40S、W40T、W40V、W40M、W40K及びW40A並びにこれらに相当する変異からなる群から選択されるいずれである、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異又はこれに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異体のスクリーニング方法に関し、特に、高分子基質に作用するプロセッシブ酵素について高活性な変異体を効率的に取得するスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの酵素の基質結合部位は鍵穴状であり、酵素のごく一部に限定されていることが多い。一方、セルロースなどの高分子基質に作用する酵素の中には、高分子基質の鎖がはまり込むトンネル状又は溝状の相対的に長い基質結合部位を有する酵素があることが知られている。さらに、当該基質結合部位に高分子基質を保持しつつ触媒反応を行う酵素（プロセッシブ酵）があることも知られている。こうした酵素における広範囲にわたる基質結合部位においては、その一部が活性部位として機能していると考えられる。
【０００３】
鍵穴状の基質結合部位を有する酵素について高活性な変異体を得る方法としては、たとえば、ある程度ランダムに複数の部位に部位特異的に各種のアミノ酸置換変異を導入する方法や、立体構造から活性に影響を及ぼす変異導入候補部位を選抜し部位特異的にアミノ酸変異を導入する方法等が一般に採用される。そして、こうした方法によりある程度高活性な変異体を取得できることが期待される。
【０００４】
また、酵素活性部位を特定するのにアラニンスキャニングという手法がある（非特許文献１）。この手法は、活性部位周辺のアミノ酸をアラニンに置換した変異体を作製して、当該変異体のタンパク質の特異的活性が低下するかどうか検出し、活性が低下する場合には、当該部位は、酵素活性に強く関与する部位であると判定する手法である。
【０００５】
【非特許文献１】Cunningham，B. C. and J. A. Wells, Science 244(4908):1081-1085,1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、トンネル状等の基質結合部位を有する酵素につき、上記のような手法を試みても高活性変異体を取得するのは困難であった。すなわち、各種のアミノ酸置換変異の導入を試みる場合、広い範囲の基質結合部位にわたって多数の部位を置換対象としなければならず、かかる作業は膨大な時間と労力を有するものであった。また、基質結合部位が広い範囲にわたるため、置換導入部位を決定することも困難であった。
【０００７】
以上のように、高分子基質を結合するトンネル状又は溝状の基質結合部位を有する酵素において高活性変異体を得るのはきわめて困難であった。
【０００８】
そこで、本発明は、トンネル状又は溝状の基質結合部位を有する酵素について高活性変異体を効率的に取得できるスクリーニング方法を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題について種々検討したところ、まず、大まかに予め選択した基質と相互作用する可能性のある部位に対してアラニンスキャニングを実施し、当該アラニンスキャニングにより活性上昇傾向のある部位を変異導入候補部位として選抜し、当該変異導入候補部位に各種アミノ酸置換を導入することにより、高活性な変異体を極めて効率的に取得できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
【００１０】
本発明によれば、高分子基質を結合するトンネル状又は溝状の基質結合部位を有する酵素につき、基質相互作用を有する可能性のある部位のアミノ酸をアラニン置換した２種類以上の一次変異体を調製する工程と、前記一次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前より酵素活性が上昇した前記一次変異体のアラニン置換部位を変異導入候補部位として選択する工程と、を備える、変異体のスクリーニング方法が提供される。
【００１１】
本発明によれば、前記基質相互作用を有する部位は、前記酵素の前記基質結合部位の入口又は出口もしくはこれらの近傍に位置される部位を含む、前記スクリーニング方法も提供される。さらに、前記変異導入候補部位のそれぞれにつき、当該部位の本来のアミノ酸残基を２種類以上の他のアミノ酸に置換して得られる２種類以上の二次変異体を調製する工程と、前記二次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前より酵素活性が上昇した前記二次変異体の変異導入部位のアミノ酸及び部位を置換アミノ酸候補及び置換候補部位として選択する工程と、を備える、前記スクリーニング方法も提供される。
【００１２】
前記高分子基質は、セルロースであってもよく、前記酵素は、セロビオヒドロラーゼであってもよく、Phanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼであってもよい。また、セロビオヒドロラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列を有し、前記変異導入候補部位は、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＷ３８位、Ｗ４０位及びＹ４７位又はこれらに相当する部位から選択されるものであってもよい。前記酵素は、エンドグルカナーゼであってもよく、Phanerocaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼであってもよい。前記エンドグルカナーゼは配列番号４で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列を有し、前記変異導入候補部位は、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるＹ７位及びＰ１３４位又はこれらに相当する部位から選択されるものであってもよい。
【００１３】
本発明によれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異又はこれに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が提供される。前記変異は、W40N、W40D、W40E、W40I、W40S、W40T、W40V、W40M、W40K及びW40A並びにこれらに相当する変異からなる群から選択されるいずれであってもよい。
【００１４】
本発明によれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異又はこれに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、高分子基質を結合する基質結合部位を有する酵素の高活性変異体を取得するスクリーニング方法及び変異体に関する。本発明のスクリーニング方法によれば、高分子基質を結合するトンネル状又は溝状の基質結合部位を有する酵素であっても、アラニン置換により酵素活性が上昇傾向にある部位を変異導入候補部位とし、当該変異導入候補部位にアミノ酸置換を導入した変異体を取得することで、ランダムな変異導入や多数に渡る部位特異的変異導入を回避でき、効率的に高活性な変異体を得ることができる。
【００１６】
部位特異的にアラニン置換するアラニンスキャニングは、活性部位の特定に一般的に用いられる。すなわち、アラニン置換により活性が低下する部位は活性に寄与することがわかる。一方、アラニン置換により活性が向上する部位の位置づけは明らかではない。本発明者らは、高分子基質に結合するトンネル状や溝状等の基質結合部位を有する酵素において、基質相互作用を有する可能性の部位をアラニン置換し、アラニン置換により酵素活性が上昇する部位を、トンネル状の基質結合部位に対する基質の通過性に関与する変異導入候補部位として特定し、さらに当該部位に他のアミノ酸残基を導入することにより、高活性な変異体が得られることがわかった。以下、本発明の各種実施形態について詳細に説明する。
【００１７】
（高分子基質結合部位を有する酵素の変異体のスクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、高分子基質結合部位を有する酵素につき、基質相互作用を有する可能性のある部位をアラニン置換した２種類以上の一次変異体を取得する工程を備えている。
【００１８】
高分子基質結合部位を有する酵素は、トンネル状又は溝状の基質結合部位を有している。こうした基質結合部位は、高分子鎖がはまり込む構造となっているため、比較的細長い構造を有している。こうした酵素としては、例えば、セルロースを基質とするグリコシドヒドロラーゼファミリー（ＧＨＦ）６、７、４８に属するセルローゼであるセロビオヒドロラーゼが挙げられる。これらの酵素は、セルロースあるいはセロオリゴ糖などの高分子基質を結合するトンネル状の基質結合部位を有するプロセッシブ酵素であるとされている。また、ＧＨＦ５，９に属するセロビオヒドロラーゼも溝状の基質結合部位を有しているとされている。さらにまた、ＧＨＦ５、８、９、１０、１２、２６、４４、４５、４５、５１、６１及び７４に属するエンドグルカナーゼも挙げられる。さらに、ＧＨＦに分類されるほかの高分子基質を分解する酵素としては、ヘミセルラーゼ及びアミラーゼが挙げられる。さらにまた、ＧＨＦに属さないが高分子基質を結合するトンネル状又は溝状の高分子基質結合部位を有する酵素としては、プロテアーゼ、エステラーゼ、リアーゼ及びトランスフェラーゼが挙げられる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法は、高分子基質結合部位を有する酵素のなかでもプロセッシブ酵素のスクリーニングに適している。プロセッシブ酵素においては、高分子基質と強く相互作用が酵素活性に影響が大きいと考えられるからである。なお、プロセッシブ酵素とは、より詳細には、酵素反応を通じて酵素が基質をと分離することを要しない酵素である。例えば、プロセッシブ酵素としては、セルロースを基質とするグリコシドヒドロラーゼファミリー６、７、４８に属するセルローゼであるセロビオヒドロラーゼが挙げられる。
【００２０】
こうした酵素としては、例えば、各種菌に由来するセルラーゼが挙げられる。なかでも、ＧＨＦ６に属する、Cellulomonas fimiなどのCellulomonas属、Humicola insolens、Humicola insolensなどのHumicola属、Trichoderma virideなどのTrichoderma属；ＧＨＦ７に属するAspergillus aculeatus、Aspergillus nigar、Aspergillus oryzaeなどのAspergillus属、Phanerochaete chrysosporiumなどのPhanerocaete属、Acremonium thermophilumなどのAcremonium属、 Chaetomium thermophilumなどのChaetomium属、Trichoderma属；ＧＨＦ４８に属するClostridium acetobutylicum、Clostridium cellulolyticum、Clostridium cellulovorans、Clostridium josui、Clostridium thermocellumなどのClostridium属の菌由来のセロビオヒドロラーゼを含むセルラーゼが挙げられる。
【００２１】
(一次変異体の調製工程)
まず、高分子基質結合部位を有する酵素において、基質相互作用を有する可能性のある部位をアラニン置換して一次変異体を調製する。基質相互作用を有する可能性のある部位（アラニン置換部位）は、立体構造が解明されている適当な他の参照用の高分子基質結合部位を有する酵素を選択し、その立体構造等から高分子基質と相互作用してその安定化に寄与していると考えられるアミノ酸残基を選択し、さらに、改変対象の高分子基質結合部位を有する酵素のアミノ酸配列から当該アミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を抽出することにより決定できる。
【００２２】
参照用の酵素は、アミノ酸配列において一定以上の同一性を有し同種活性を有する酵素とすることが好ましい。参照用酵素としては、例えば、改変対象がセルラーゼであれば、同一のＧＨＦに属するセルラーゼが挙げられる。なお、参照用酵素としては、以下に記載するように、立体構造及び活性部位等が研究されている酵素等を用いることができる。
【００２３】
参照用酵素の立体構造においてトンネル状又は溝状等の高分子基質結合部位において基質との相互作用に関与するアミノ酸残基（アラニン置換部位）を特定するには、立体構造モデルを構築する方法と既知の立体構造モデルを用いる方法とが挙げられる。立体構造モデルを構築する方法は、改変対象の酵素のアミノ酸配列をＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ等のプログラムに入力し、類似性の高いアミノ酸配列の酵素を検索する。最も類似の酵素の構造を参照し、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｓｔｕｄｉｏ等のソフトにより、ホモロジーモデリングを行うことにより、構造を予測する。予測した構造モデルを見ながら基質結合部位周辺のアミノ酸を抽出し、これらのアミノ酸を、アラニン置換部位とすることができる。
【００２４】
また、立体構造モデルを構築しないで基質との相互作用に関与するアミノ酸残基を特定するには、例えば、同じGHFの酵素のうち、ＰＤＢ等の立体構造データベースに構造がある酵素を検索する。選んだ構造既知の酵素のアミノ酸配列と、ターゲット酵素のアミノ酸配列をＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、ＧＥＮＥＴＹＸ等のソフトに入力しアライメントする。構造既知の酵素の構造を見ながら基質結合部位周辺のアミノ酸を抽出し、そのアミノ酸とアライメントされた改変対象酵素のアミノ酸を、アラニン置換部位とすることができる。
【００２５】
アラニン置換部位の個数は、特に限定しないが、必要に応じた数とすればよい。典型的には、数個以上、好ましくは１０個以上から３０個程度以下とすることができる。
【００２６】
アラニン置換部位は、トンネル状又は溝状の基質結合部位の中央寄りの部分よりも入り口又は出口もしくはこれらの近傍から選択することが好ましい。本発明者らによる知見によれば、高分子基質結合部位を有する酵素におけるかかる部位のアミノ酸残基をアラニン置換することで、置換前に比べて基質結合部位への基質のアクセシビリティが大きく変化する可能性が高いと考えられる。そして、アラニン置換により酵素活性が向上するとき、当該部位の本来のアミノ酸残基は触媒作用を抑制している可能性があると考えられ、当該部位の他のアミノ酸への置換により活性が向上する可能性が高いと考えられる。
【００２７】
決定したアラニン置換部位から選択される１種又は２種以上の部位をアラニン置換して一次変異体を調製する。それぞれの一次変異体は、複数のアラニン置換がなされていてもよいが、好ましくは、それぞれの一次変異体につき、一つのアミノ残基についてのみアラニン置換がなされている。部位特異的にアラニン置換された一次変異体を得るには、公知の部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、部位特異的にアラニン置換を導入するための変異型遺伝子は、Kunkel法やGapped duplex法などの公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば変異 導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製)やMutant-G(TAKARA社製)など）を用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて作製することができる。また、遺伝子の塩基配列を参照すれば、Molecular Cloning [Sambrookら編集, 15, Site-directed Mutagenesis of Cloned DNA, 15.3〜15.113, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York (1989)]等の文献の記載に従って、当業者であれば格別の困難性なしに選択し実施することができる。また、当業者であれば、遺伝子の塩基配列を基にして、当該塩基配列から１以上（１又は数個以上）の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を人為的に行う技術（部位特異的突然変異誘発）については、実施例に示すように、オーバーラップＰＣＲを用いるほか、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666 (1984); WO85/00817; Nature, 316, 601-605 (1985); Gene, 34, 315-323 (1985); Nucleic Acids Res., 13, 4431-4442 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409-6413 (1982); Science, 224, 1431-1433 (1984) 等に記載の技術に従って実施することができる。
【００２８】
また、部位特異的変異導入法により鋳型ＤＮＡを取得後は、大腸菌等を用いた各種タンパク質の合成方法によりＤＮＡ上の情報に基づくタンパク質を取得できるが、好ましくは公知の無細胞タンパク質合成法を用いる。無細胞タンパク質合成系を用いることで、著しく作業時間と労働強度を低下させることができる。無細胞タンパク質合成系としては、公知の各種キットを用いて実施できるほか、特開２００３−１１６５９０号公報、特開２００６−６１０８０号公報等に記載の方法を利用できる。無細胞タンパク質合成系を用いることにより、例えば、同時にスキャンするアラニン置換部位が１０個〜１００個程度のとき、従来なら５日から２週間程度要していたのを、０．５日〜２日程度で終了させることができる。さらに、同時スキャン部位が４００個程度の場合、大腸菌による菌体生産による場合には６０日間程度要するところを、無細胞タンパク質合成系によれば４日程度で達成することができる。
【００２９】
（一次変異体のスクリーニング工程）
次に、一次変異体についてのスクリーニング工程（一次スクリーニング工程）を実施する。一次スクリーニング工程では、得られた一次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前よりも活性が上昇した前記一次変異体におけるアラニン置換部位を変異導入候補部位として決定することができる。アラニン置換により酵素活性が向上したとき、当該部位は置換前のアミノ酸残基が酵素活性に抑制的に作用している可能性があり、当該アラニン置換部位をさらに他のアミノ酸残基に置換することにより、酵素活性の向上が期待できる。なお、酵素活性の測定方法は、改変対象酵素の種類によって適宜決定される。また、活性の上昇程度は、特に限定しないが、好ましくは３０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは１００％以上、いっそう好ましくは２００％以上である。
【００３０】
以上の工程により、高分子基質結合部位を有する酵素における変異導入候補部位が迅速に決定される。従来、一次的な変異導入候補部位の決定に、多大な時間と労力を費やしており、基質結合部位が広範囲にわたるプロセッシブ酵素の場合、多数個のアミノ酸残基につき部位特異的変異導入を試みる必要があった。しかしながら、アラニンスキャニングをこうした酵素の基質結合部位の変異導入候補部位の決定に利用することで従来の作業を著しく簡素化して導入候補部位を決定できるようになった。
【００３１】
本発明においては、一次スクリーニング工程を実施した上、抽出した置換変異導入候補部位に各種のアミノ酸を導入した二次変異体を調製し、これら二次変異体につき二次スクリーニング工程を実施する。このため、高活性な変異体のスクリーニングのための二次変異体を調製する作業及びスクリーニングサ行を著しく省力化し短時間化することができる。例えば、高分子基質結合部位が数十個のアミノ酸残基を含むとき、これらの全てのアミノ酸残基につき飽和アミノ酸変異を導入すると数百〜千数百程度の変異遺伝子及び変異体タンパク質を調製し、これらにつき酵素活性を測定することになる。これに対し、本発明の一次変異体のスクリーニング工程で数十個のアミノ酸残基から例えば数分の１から数十分の１程度に置換変異導入候補部位を絞ることができる。そして、これらの候補部位に飽和アミノ酸変異を導入することにより、変異遺伝子及び変異体のライブラリーサイズも数分の１〜数十分の１程度に縮小される。このようなライブラリ縮小効果は、広範囲にわたる高分子基質結合部位を有する酵素において極めて有効である。このようなライブラリーサイズの縮小効果に加えて、一次変異体及び二次変異体の調製に無細胞タンパク質合成系を用いることで、より一層スクリーニングを省力化することができる。
【００３２】
（二次変異体の調製工程）
一次スクリーニング工程実施後には、さらに、二次変異体の調製工程と二次変異体についてのスクリーニング工程（二次スクリーニング工程）を備えることで、より具体的に置換アミノ酸候補及び置換候補部位を決定できる。二次変異体の調製工程では、一次スクリーニング工程において決定した変異導入候補部位に、ランダムにあるいは一定の規則に従い、本来のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を導入した二次変異体を調製することができる。決定された各変異導入候補部位につき、置換するアミノ酸は、本来のアミノ酸残基以外の全てのアミノ酸残基（全１９種類）の全部又は一部であるが、少なくとも２種類以上の他のアミノ酸に置換することが好ましい。一部のアミノ酸に置換するとき、例えば、保存的アミノ酸置換の手法を採用できる。
【００３３】
それぞれの二次変異体は、複数の変異導入候補部位において他のアミノ酸に置換されていてもよいが、各二次変異体は、それぞれ一つの変異導入候補部位においてのみ置換がなされていることが好ましい。二次変異体は、一つの置換候補部位につき複数種類のアミノ酸置換がなされた複数種類とすることが好ましい。さらに、こうした置換候補部位毎に複数種類の二次変異体を調製することが好ましい。
【００３４】
二次変異体を調製するには、一次変異体の調製時と同様、公知の部位特異的変異導入法から適宜選択した手法を用いればよく、タンパク質合成にあたっては無細胞タンパク質合成系を用いることが好ましい。
【００３５】
（二次変異体のスクリーニング工程）
次に、二次スクリーニング工程を実施する。二次スクリーニング工程では、得られた二次変異体につき、変異による酵素活性の上昇の有無をスクリーニングして、変異前よりも活性が上昇した前記二次変異体における置換アミノ酸及び置換部位を、置換アミノ酸候補及び置換候補部位として決定できる。酵素活性の測定方法は、改変対象酵素の種類によって適宜決定される。
【００３６】
こうして得られた置換アミノ酸候補及び置換候補部位を、２種類以上組み合わせるなどの進化分子工学的手法を用いることで、より高活性な高分子基質結合部位を有する酵素を得ることができる。
【００３７】
例えば、改変対象酵素が、Phanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼなどのセロビオヒドロラーゼの場合、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列（相当アミノ酸配列）を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるＷ３８位、Ｗ４０位及びＹ４７位から選択される１種又は２種以上又は当該相相当するアミノ酸配列これらに相当する部位から選択される１種又は２種以上を置換候補部位として二次変異体を調製し、二次変異体のスクリーニングを実施することができる。
【００３８】
また、改変対象酵素は、Phanerocaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼなどのエンドグルカナーゼである場合、配列番号４で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列（相当アミノ酸配列）を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるＹ７位及びＰ１３４位から選択される１種又は２種以上又は当該相相当するアミノ酸配列におけるこれらに相当する部位から選択される１種又は２種以上を置換候補部位として二次変異体を調製し、二次変異体のスクリーニングを実施することもできる。
【００３９】
改変対象酵素は上記のとおり、必ずしも配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と完全に一致するアミノ酸配列を有していなくともよく、これらに相当するアミノ酸配列（相当アミノ酸配列）を有していればよい。相当アミノ酸配列とは、ＢＬＡＳＴなどの配列相同性検索において配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と同一性が４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、一層好ましくは７０％以上、より一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のアミノ酸配列である。改変対象酵素が、こうしたアミノ酸配列を有する場合、ペアワイズアラインメントなどの手法により配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、上記置換候補部位に対応するものとして検出される部位を置換候補部位として二次変異体を調製することができる。
【００４０】
本明細書において同一性とは、当該技術で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の適合によって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間の適合によって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味する。“同一性 ”および“類似性”は、既知の方法により容易に決定できる。同一性 を決定する好ましい方法は、試験する配列間で最も長く適合するように設計される。同一性 および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。相同性決定には、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りであるが、これに限定されない。
【００４１】
（変異体タンパク質）
本発明のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質である。これらのタンパク質は、親タンパク質である配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、すなわち、Phanerocaete chrysosporium由来のＣＢＨ Iよりもよりもセルロースを分解する活性が高い。したがって、セルロース系バイオマスなどのセルロース含有材料の有効利用に有利に用いることができる。これらの変異体のなかでも、特に、W40N、W40D、W40E、W40I、W40S、W40T、W40V、W40M、W40K及びW40Aのいずれかがより高い活性を有している。これらの変異体は、親タンパク質よりも還元糖量に基づく酵素活性測定系において約２倍以上の活性を有している。
【００４２】
変異体タンパク質は、配列番号２に相当するアミノ酸配列（相当アミノ酸配列）において、配列番号２で表されるアミノ酸配列において上記各変異に相当する変異のいずれかを有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。すなわち、変異体タンパク質は、必ずしも配列番号２で表されるアミノ酸配列と完全に一致するアミノ酸配列において上記変異のいずれかを有するものでなくてもよい。すなわち、変異体タンパク質は、ＢＬＡＳＴなどの配列相同性検索において、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一性が４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、一層好ましくは７０％以上、より一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を、上記の相当アミノ酸配列とし、この配列をペアワイズアラインメントなどの手法により配列番号２で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、上記変異部位に対応するものとして検出される部位のいずれかにおいて対応するアミノ酸置換を有するものであってもよい。
【００４３】
こうした変異体タンパク質は、公知の方法によって取得できる。例えば、大腸菌、酵母等を用いた菌体によるタンパク質発現系、無細胞タンパク質合成系、形質転換した動植物を用いたタンパク質発現系などを用いて取得することができる。酵母等の細胞表層に提示させる形態で発現させることもできる。タンパク質の細胞表層提示技術は、当業者であれば、Cell surface engineering of yeast: construction of arming yeast with biocatalyst. J. Biosci. Bioeng., 90, 125-136 (2000)等に基づき実施することができる。
【００４４】
（本発明のポリヌクレオチド）
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の変異体タンパク質をコードしている。すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれに相当するアミノ酸配列において、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aからなる群から選択されるいずれかの変異又はこれに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードしている。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態(たとえば、ｃＤＮＡおよびクローニングによって得られるか、あるいは合成的に生成されるゲノムＤＮＡを含む)であってもよく、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）の形態であってもよい。該ポリヌクレオチドは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドであってもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（コード鎖としても知られる）であっても、アンチセンス鎖（非コード鎖としても知られる）であってもよい。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドは、すでに説明したように、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする配列番号１で表される塩基配列のＤＮＡ等の特定箇所に公知の各種方法によって変異を導入すること等によって得ることができる。また、配列番号１で表される塩基配列に対して、配列番号１とは異なるコドン用法を用いて得られる同一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して変異を導入してもよい。
【００４７】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
（アラニン置換導入部位の決定）
白色腐朽菌Phanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIであるＣＢＨ Ｉ（ＰｃＣＢＨ７Ｃ）とエンドグルカナーゼであるＥＧ（ＰｃＥＧIII）に種々の変異を導入して、そのセルロース分解活性を向上させるため、まず、変異導入に適した箇所を探索した。すなわち、ＰｃＣＢＨ７Ｃのアミノ酸配列（配列番号２ ）とＰｃＥＧIIIのアミノ酸配列（配列番号４）それぞれに類似構造を持つ別のセルラーゼの立体構造から推測された、酵素活性を示す際にセルロース鎖と相互作用しその安定化に寄与していると考えられるアミノ酸残基を選択した。そして、選択した部位のアミノ酸残基をまずアラニンに置換し、それらの中でも特に変異導入による活性変化への影響が大きいと思われるアミノ酸残基の位置を特定することとした。
【００４９】
ＰｃＣＢＨ７Ｃの参照構造として、同じPhanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼＩであるＣＢＨ I（図１Ａ参照）とした。また、ＰｃＥＧ IIIについては、Aspergillus nigar由来のＥＧIII（図１Ｂ参照）を参照構造とした。これらについてはいずれもＰＤＢ（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）において立体構造を取得できる。参照の結果、これより、ＰｃＣＢＨ７Ｃについては、以下の表（表１）に示す２４個のアミノ酸残基をアラニン置換することとした。また、ＰｃＥＧＩｌｌについては、以下の表（表２）に示す１０個のアミノ酸残基をアラニンに置換することとした。
【００５０】
【表１】
2010046034.tif 000002
【表２】
2010046034.tif 000003
【実施例２】
【００５１】
（オーバーラッピングＰＣＲによるセルラーゼ遺伝子へのアラニン変異の導入）
（ＰｃＣＢＨ７Ｃ遺伝子）
オーバーラッピングＰＣＲによるセルラーゼ遺伝子へのアラニン変異の導入のスキームを図２に示す。プラスミドｐＲＰｃｃｅｌ７Ｃ（Ｐｃｃｅｌ７Ｃ遺伝子、配列番号１）の両端をＮｄｅｌおよびＥｃｏＲｌで切断し、ｐＲＳＥＴＢにクローニングして作成）を鋳型とし、表３に示すＦ３−Ｋ４プライマーと各変異導入部位につき個別のリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによりＴ７プロモーターとＲＢＳを含んだ断片を増幅した。また、表３に示すＲ３−Ｋ４（と各変異導入部位につき個別のフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより各変異導入部位へのアラニン変異とＴ７ターミネーターを含む断片を増幅した。なお、ＰＣＲの反応液組成は、以下の通りとした。反応条件は、９４℃で３分後、９４℃で１０秒、６０℃で１０秒及び７２℃で３０秒を１サイクルとして２５サイクル実施し、７２℃で７分とした。
【００５２】
【表３Ａ】
2010046034.tif 000004
【表３Ｂ】
2010046034.tif 000005
【００５３】
（ＰＣＲ反応液）
１０×ＰｆｕＵＩｔｒａ（登録商標）IIバッファー   ２．０μ１
２．５ｍＭｄＮＴＰｓ                             ２．０μ１
鋳型ＤＮＡ（１ｎｇ／μ１）                       １．０μ１
１０μＭフォワードプライマー                     １．０μ１
１０μＭリバースプライマー                       １．０μｌ
５Ｕ／μｌＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標）II Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ製）                               ０．２μｌ
Ｓ．Ｗ．                                         １２．８μｌ
合計                                             ２０μｌ
【００５４】
（ＰｃＥＧIII遺伝子）
プラスミドｐＥＴ−ＰｃＥＧ（ｐｐＥＴ」ＰｃＥＧ（ｐＥＴ２３ｂ（＋）ｖｅｔＱｒのＮｄｅｌ、ＸｈｏサイトにＰｃＥＧIII（配列番号３）の全長遺伝子を挿入したもの）を鋳型とし、ＰｃＣＢＨ７Ｃの場合と同様にＦ３−Ｋ４プライマーと表４に示した各変異導入部位につき個別のリバースプラィマーを用いてＰＣＲを行うことによりＴ７プロモーターとＲＢＳを含んだ断片を増幅し、Ｒ３−Ｋ４と表４に示した各変異導入部位につき個別のフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより各変異導入部位へのアラニン変異とＴ７ターミネーターを含む断片を増幅した。ＰＣＲ条件は、ＰｃＣＢＨ７Ｃ遺伝子の場合と同様とした。
【００５５】
【表４】
2010046034.tif 000006
【００５６】
得られた各ＰＣＲ産物につき、アガロースゲル電気泳動を行い、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてアガロースゲルから精製した。アガロースゲルから精製した２種類の断片を、図２に示すオーバーラッピングＰＣＲを行うことにより連結させた。ＰＣＲ反応液の組成は、以下のとおりとした。反応条件は、９４℃で３分後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で９０秒を１サイクルとして１０サイクル実施後に、プライマーＫ４を添加し、引き続き、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルとして１０サイクル実施後、７２℃で７分の条件でＰＣＲを行った。この際、オーバーラップさせる各断片の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）ＮＤ−１０００分光光度計によって測定し、各々が１０ｎｇずつＰＣＲ反応系に含まれるよう調整した。こうして作製したアラニン変異導入セルラーゼ遺伝子につき、表５に示すプライマーを用いて塩基配列の確認を行った。
【００５７】
（オーバーラッピングＰＣＲ反応液の組成）
１０ｘＬＡ Ｔａｑ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ ２．０μｌ
２．５ｍＭｄＮＴＰｓ                      ３．２μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2                        ２．０μｌ
フォワード断片（１０ｎｇ／μｌ）          １．０μｌ
リバース断片（１０ｎｇ／μｌ）                   １．０μｌ
２０μＭＫ４プライマー                           １．０μｌ
５Ｕ／μｌ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）
０．２μｌ
Ｓ．Ｗ．                                  ９．６μｌ
合計                                      ２０μｌ
【００５８】
【表５】
2010046034.tif 000007
【００５９】
また、ＰｃＣＢＨ７Ｃ及びＰｃＥＧＩＩｌの各野生型遺伝子は、それぞれプラスミドｐＲＰｃｃｅｌ７Ｃ及びｐＥ下ＰｃＥＧを鋳型とし、プライマーにＦ３−Ｋ４とＲ３−Ｋ４を用いてＰＣＲを行うことによって作成した。ＰＣＲ反応液の組成は、以下のとおりとした。
反応条件は、９４℃で３分後、９４℃で１５秒、５５℃で１５秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして２５サイクル実施後、７２℃で７分とした。作製した各変異遺伝子と野生型遺伝子は、Ｑｕｂｉｔ（商標）ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いてそのＤＮＡ濃度を測定した。
【００６０】
（ＰＣＲ反応液）
１０×ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）IIバッファー２．０μ１
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ                            ２．０μ１
鋳型（１ｎｇ／μ１）                      １．０μ１
１０μＭ Ｆ３Ｋ４プライマー               １．０μ１
１０μＭ Ｒ３Ｋ４プライマー               １．０μ１
５Ｕ／μｌ ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）II ＦｕｓｉｏｎＨＳＤＮＡポリメラーゼ
０．２μ１
Ｓ．Ｗ．                                  １２．８μ１
合計                                      ２０μｌ
【実施例３】
【００６１】
（無細胞タンパク質合成系によるセルラーゼの発現）
実施例２で作製したＰｃＣＢＨ７Ｃの野生型のＰＣＲ産物を、大腸菌由来無細胞蛋白質合成の鋳型とし、その鋳型量を０ｎｇ，１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、及び４００ｎｇと変化させた。そして、それぞれの鋳型量で合成した蛋白質の酵素活性を測定し、無細胞蛋白質合成系に必要な鋳型量を決定した。鋳型量は、約２００〜３００ｎｇが最適であった（図３）。さらに、ＰＤ１（Humicola insolens由来）及び還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を、以下の組成の転写・翻訳共役反応液に加えて混合し、２６℃で、６時間無細胞蛋白質合成を行った。
【００６２】
（転写・翻訳共役反応液）
ＰＤＩ                                    ０．１５μ１
１０ｍＭ ＧＳＨ                           ０．３μ１
０．４Ｍ 酢酸マグネシウム                 ０．６μ１
５Ｍ 酢酸カリウム                         ０．６μｌ
０．１ｍｇ／ｍｌリファンピシリン          ３．０μ１
ＬＭ（２０ａ．ａ．）                      ７．５μ１
１０ｍｇ／ｍｌ ＣＫ                       ０．４５μ１
２．３ｍｇ／ｍｌ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ   １．０μ１
（ｐＡＲ１２１９；Ｄａｖａｎｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，１９８４で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１から精製）
１００ｍＭＧＳＳＧ                        ０．３μ１
Ｓ３０抽出物（特開２００６−６１０８０）  ８．５μ１
鋳型＋Ｓ．Ｗ．                            ７．６μ１
合計                                      ３０μ１
【００６３】
なお、無細胞合成反応試薬の終濃度は、ＬＭ；ＬｏｗＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍｉｘｔｕｒｅ（５６．４ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ７．４）、１．２２ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７．０）、各０．８５ｍＭ ＧＵＣ ミックス（ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ）、５０ｍＭ クレアチンリン酸２ナトリウム、各０．３２ｍＭ ２０アミノ酸ミックス、４％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００、３４．６μｇ／ｍｌ 葉酸、３５．９ｍＭ 酢酸アンモニウム、０．１７ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ、２８．３％（ｖ／ｖ）Ｓ３０抽出物）、０．１５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、７．７μｇ／ｍｌ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、１０μｇ／ｍ１リファンピシリン、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００ｍＭ 酢酸カリウムであった。
【００６４】
また、オートラジオグラフィによる蛋白質発現量の確認を行った。無細胞蛋白質合成系の組成液の１つであるＬＭに含まれる２０種類のアミノ酸を、ロイシン以外の１９アミノ酸に１４Ｃ−ロイシンを加えたものに変更し、２６℃で６時間無細胞蛋白質合成を行った。合成反応液の組成は、以下のとおりとした。
【００６５】
（無細胞タンパク質合成反応液の組成）
ＰＤＩ                                    ０．１５μｌ
１０ｍＭ ＧＳＨ                                  ０．３μｌ
０．４Ｍ 酢酸マグネシウム                 ０．６μｌ
０．５Ｍ 酢酸カリウム                     ０．６μｌ
０．１ｍｇ／ｍ１リファンピシリン          ３．０μｌ
ＬＭ（１９アミノ酸）                      ７．５μｌ
１０ｍｇ／ｍｌＣＫ                        ０．４５μｌ
２．３ｍｇ／ｍｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼ           １．０μｌ
１００ｍＭ ＧＳＳＧ                       ０．３μ１
１４Ｃ−ロイシン                                 ２．０μ１
（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ製）
Ｓ３０抽出物                              ８．５μｌ
鋳型ＤＮＡ＋Ｓ．Ｗ                        ５．６μｌ
合計                                      ３０μｌ
【００６６】
無細胞蛋白質合成反応終了液に対し１５，０００ｒｐｍで５分間遠心を行い、反応終了液を上清画分と沈澱画分に分けた。この上清画分と沈殿画分の各々に６０％アセトンを９倍量加え、氷上で５分間静置した後、４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心を行い、上清を除いた上で７．５μ１のＳ．Ｗ．に再懸濁した。等量の２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合し、煮沸したものをサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後のゲルを、ゲルドライヤーを用いて８０℃、１時間乾燥させた後、イメージングプレートに挟み１２時間以上置いてＲＩを転写させた。転写後のイメージングプレートをＢＡＳ ＩＰ ＭＡＧＡＺＩＮＥにセットし、ＢＡＳ２０００で１４Ｃ−ロイシンの取り込み量を解析した。
【００６７】
ＰｃＣＢＨ７Ｃ及びＰｃＥＧIIIのアラニン変異導入遺伝子と野生型遺伝子の無細胞蛋白質合成系による発現と、オートラジオグラフィによる発現量の確認を行った。結果を図４、図５及び図６に示す。ＰｃＣＢＨ７Ｃではいずれの変異体及び野生型についてもその大部分が上清画分に発現されており、発現量の差もほとんど見られなかった。上清画分には可溶性の蛋白質が見出されるので、発現されたＰｃＣＢＨ７Ｃの大部分はフォールディングの不具合等は起こらずに、活性を持った正常な構造で発現されているものと考えられる。一方ＰｃＥＧｌｌｌについては、各変異体間でやや大きな差が見られ、上清画分と沈殿画分への発現量の比率が各変異体によって異なっていた。発現量には差がないことから、発現後の蛋白質のフォールディング過程が原因ではないかと考えられた。
【実施例４】
【００６８】
（ＰｃＣＢＨ７Ｃ及びＰｃＥＧＨIIIの酵素活性の測定）
実施例３で得られた反応終了液につき、酵素活性を測定した。ＰｃＣＢＨ７Ｃの酵素活性の基質として、不溶性の高分子セルロースであるＰＡＳＣ（リン酸膨潤アビセル）と、可溶性のセロビオースに４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌが付加された蛍光基質であるＭＵＣ（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅ）を用いた。ＰＡＳＣは高分子セルロースであるため、セルロース鎖は基質結合ポケットの溝の全域に入り込む形で結合し反応する。よって、アラニン置換によるポケット全域への影響を見ることができる。ＭＵＣは低分子であるため、Ｇ１〜Ｇ３結合部位周辺への影響のみを見ることができる。また、ＰｃＥＧＩＩＩの酵素活性の基質として、可溶性基質のＣＭＣ（力ルボキシメチル化セルロース；ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）とＲｅｓｏｒｕｆｉｎｃｅＩＩｏｂｉｏｓｉｄｅ（ＭａｒｋｅｒＧｅｎｅＴＭＦＩｕｏｒｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌｕｌａｓｅＡｓｓａｙＫｉｔ；ＭＧＴＩｎｃ．社製）を用いた。詳細を以下に示す。
【００６９】
ＰＡＳＣによる酵素反応系は、１％ＰＡＳＣ ５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）２５０μｌ，５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）２２５μｌ、無細胞蛋白質合成反応終了液２５μｌ，計５００μｌの組成で、４５℃、２４時間酵素反応を行った。ＰＡＳＣとの反応性を上げるためアシストチューブを横にし、振邊しながら反応させた。その後、反応液を用いて生成した還元糖の定量（ソモギーネルソン法又はＴＺ assay法）を行った。ソモギー・ネルソン法は、反応液サンプル２５μ１にソモギー銅液５０μ１を加えよく混合させた。サンプルとは別に０〜１ｍｇ／ｍｌのグルコース水溶液を調製し同様に以下の操作を行った。サーマルサイクラーを用いて、１０ｇ℃で３０分間反応させた後、ネルソン液５０μ１を加えよく混合した。３，０００ｒｐｍ、３分間遠心した後、上清５０μ１を１５０μ１のＳ．Ｗ．を入れた９６穴プレートに加え、プレートリーダーＦｕｓｉｏｎで５４０ｎｍの吸光度を測定した。測定結果からグルコース検量線を作成し、生成した還元糖量をグルコース濃度に換算し求めた。また、ＴＺassay法は（Chong, K. et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 111 - 109(1985)）は、以下のとおりとした。すなわち、ＴＺassayバッファ１９５μｌを分注し、反応液サンプル５μｌを加えてゆっくり混合した。これを１００℃で３分間ヒート処理した後に氷冷し、６６０ｎｍの吸光度を測定した。グルコースの検量線を作製し、グルコース換算の還元糖量を得た。
【００７０】
ＭＵＣによる酵素反応系は、２ｍＭＭＵＣ／５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５０μ１、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５０μｌ、無細胞蛋白質合成反応終了液２０μｌ、計１００μｌの組成で、９６穴プレートにおいて４０℃、１時間酵素反応を行った。その後、プレートリーダーＦｕｓｉｏｎでＥｘ／Ｅｍ＝３３０／５１５ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００７１】
ＣＭＣによる酵素反応系は、エッペンドルフチューブを用いて、１％ＣＭＣ／５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５０μ１，５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．Ｏ）４５μ１，無細胞蛋白質合成反応終了液５μ１、計１００μ１の組成で、４５℃で１時間酵素反応を行った。ＣＭＣとの反応性を上げるためエッペンドルフチューブを横にし、振とうしながら反応させた。その後、反応液を用いて生成した還元糖の定量を、前述のソモギー・ネルソン法によって行った。
【００７２】
Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅによる酵素反応系は、０．５ｍＭ Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅ／１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）５０μ１、１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）２５μｌ、無細胞蛋白質合成反応終了液２５μ１、計１００μｌの組成で、９６穴プレートにおいて４０℃で１時間酵素反応を行った。その後、プレートリーダーＦｕｓｉｏｎでＥｘ／Ｅｍ＝５４０／５９０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００７３】
（ＰｃＣＢＨ７Ｃ及びそのアラニン置換変異体の酵素活性）
無細胞タンパク質合成系によって発現させたＰｃＣＢＨ７Ｃの野生型と各アラニン変異体２４サンプルの酵素活性をＰＡＳＣとＭＵＣを基質として用いて行った。その活性測定結果を図７に示す。図７に示すように、大部分のアラニン変異体ではその酵素活性が野生型よりも低下した。ここで、ＰＡＳＣに対する活性測定結果とＭＵＣに対する活性測定結果の傾向が若干異なっていることがわかるが、これはおそらくこの二つの基質の構造の違いに起因するものと考えられる。ＰＡＳＣが非晶性のβ−１，４−グリコシド結合で連結したグルコースの鎖状の構造を持つのに対し、ＭＵＣは２分子のグルコースがβ−１，４−グリコシド結合でつながった２糖のセロビオシドに分子量１７６の大きな蛍光基であるメチルウンベリフェロンが結合した構造を持つ。ＰｃＣＢＨ７Ｃは２枚のβシートからなるトンネル構造の中央に活性中心を持っている。このトンネルにセルロース鎖が入り、トンネルの内側に面するアミノ酸残基との相互作用により安定化されつつ活性中心に移動し、グリコシド結合を切断されるのであるが、ＭＵＣはその蛍光基の存在の為にこのトンネルヘの侵入及びトンネル内でのアミノ酸残基との相互作用に基づく安定化に通常とは異なる寄与が生まれ、ＰＡＳＣに対する酵素活性測定結果との間に相違が生じたのではないかと考えている。
【００７４】
さらに、３８位のＴｒｐ、４０位のＴｒｐ、４７位のＴｙｒをアラニンに置換した変異体では、その酵素活性が野生型よりも向上した。これらの３個のアミノ酸残基は、立体構造においては上述したセルロース鎖と相互作用するトンネル構造の入りロ付近に存在している。ＴｒｐやＰｈｅ、Ｔｙｒのような芳香族の側鎖を持ったアミノ酸は、このトンネル構造の内部によく見られ、疎水性相互作用や水素結合によってセルロース鎖と相互作用する。今回これらの酵素活性に重要であると思われるアミノ酸残基をアラニンに置換したのであるが、Ｔｒｐ３８、Ｔｒｐ４０、Ｔｙｒ４７の３つの変異体の酵素活性が野生型よりも向上したのは、アラニンに置換することで側鎖による影響が著しく減少し、その結果としてトンネル構造の入りロを広めることとなり、セルロース鎖がトンネル構造に侵入しやすくなったためではないかと考えられる。しかし、これらの芳香族側鎖をもつアミノ酸残基がトンネル構造内での相互作用に重要な働きをしていることは間違いないようであり、この３つ以外の、よりトンネル構造の内部に存在するＴｙｒ１４２やＴｒｐ３６４のようなアミノ酸残基をアラニンに置換した変異体では、その酵素活性は野生型に比べて著しく低下していた。また、これ以外にトンネル構造の出ロ付近にも芳香族側鎖を持つアミノ酸残基が存在しており、これらはセルロース鎖の分解によって生じたセロビオースの酵素外への迅速な排出に関与し、このセロビオースによる酵素活性の阻害を防ぐ働きをしていると考えられている。今回の結果からもこの説にあてはまる傾向が見られ、Ｔｒｐ３７３やＴｙｒ３７８をアラニンに置換した変異体では酵素活性が著しく低下していた。
【実施例５】
【００７５】
（ＰｃＥＧIII及びそのアラニン置換変異体の酵素活性）
ＰｃＥＧIIIは、図６の結果のように各変異体間で蛋白質の発現量に差が見られたので、まずＢＡＳ２０００に付属の画像解析ソフトＩｍａｇｅ Ｇｏｕｇｅでその放射線強度を計測し、その値を元に各変異体の比活性を算出した。その結果が図８である。Ｔｙｒ７を除くほぼ全ての変異体で、その酵素活性がいずれの基質に対しても激減した。ＣＢＨの結果とは異なる、このような大幅な酵素活性の減少の原因について考察を加えた。ＥＧの立体構造は２枚のβシートからなるものの、上述のＣＢＨのトンネル構造とは異なりＵ字型の構造をとっている。このＵ字型構造により、ＥＧはＣＢＨには無いセルロース鎖へのエンド型の分解作用を持つことが可能となっている。Ｕ字型であるため、ＥＧにはトンネル構造のような密閉感は無く、セルロース鎖との相互作用に働くアミノ酸残基たちもある程度外部にさらされた状況にある。つまりこれらのアミノ酸残基はその多くが協同的に、外部からの酵素内へのセルロース鎖の取り込みに関与しているのではないかと考えることができ、この理由により各部位における１残基のアミノ酸変異でも大幅な酵素活性の低下が生じたのではないかと考えている。この仮説に基づくと、このＵ字型の雨どい構造の両端部分へのアラニン変異導入ならば、活性中心からはかなり離れた位置に存在し、ＣＢＨのように活性中心へとセルロース鎖を送り届ける必要もないため、それほど酵素活性に影響を与えないのではないかと推測されるが、実際に活性測定結果を見るとこのＵ字構造の両末端に位置するＴｙｒ７とＰｒｏ１３４ヘアラニン変異を導入したものでは、その酵素活性の低下が他の８部位ほど大幅でないことがわかった。
【実施例６】
【００７６】
（Phanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼの３８位、４０位及４７位に対する飽和変異）
セロビオヒドロラーゼのアラニンスキャニングの結果より、ｐｃ由来のＣＢＨの３８位、４０位及び４７位の変異体で酵素活性が向上したことから、これら３部位に対して、実施例２に準じてオーバーラッピングＰＣＲによって飽和変異を導入し、実施例３に準じて各変異体を作製した。変異導入のために使用したプライマーを表６に示した。変異導入部位は大文字で表記し、変異アミノ酸は１文字表記で示した。表６のプライマーを用いた各変異導入断片作製のためのＰＣＲ反応液の組成を表７を示す。ＰＣＲ反応条件は、実施例２の断片作製時と同様に条件とした。オーバーラッピングＰＣＲ反応液の組成及び反応条件は、実施例のオーバーラッピングＰＣＲと同様の条件とした。また、ｐｃＣＢＨ７ｃ野生型の遺伝子は、実施例２と同様にして作製した。
【００７７】
【表６】
2010046034.tif 000008
［表７］
（ＰＣＲ反応液）
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）バッファーII   ２．０μ１
２．５ｍＭｄＮＴＰｓ                             ２．０μ１
鋳型ＤＮＡ（１ｎｇ／μ１）                       １．０μ１
１０μＭ  フォワードプライマー                          １．０μ１
１０μＭ  リバースプライマー                     １．０μｌ
５Ｕ／μｌＰｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ
０．４μｌ
Ｓ．Ｗ．                                         １２．６μｌ
合計                                             ２０μｌ
【００７８】
得られたＰＣＲ産物の各１μｌのアガロースゲル電気泳動結果を図９に示す。Ｗ３０、Ｗ４０、Ｙ４７変異体のオーバーラップＰＣＲ産物は、鋳型量が２００〜３００ｎｇになるように調製し、実施例３に記載の大腸菌由来無細胞タンパク合成系で発現させた。発現させた変異体を、実施例５と同様にして基質（０．５％ＰＡＳＣ）と反応させ、ソモギー・ネルソン法によって活性測定を行い、野性型（ＷＴ）との酵素活性を比較した。各変異体の活性測定結果をそれぞれ図１０〜図１２に示した。
【００７９】
図１０〜図１２に示すように、各位の飽和変異体中、野生型よりも高活性を示す変異体を高頻度で見出すことができた。すなわち、W38F、W40N、W40D、W40E、W40I、W40G、W40R、W40Q、W40S、W40Y、W40T、W40V、W40H、W40F、W40P、W40M、W40K、W40L、W40A、Y47N、Y47D、Y47E、Y47I、Y47R、Y47Q、Y47S、Y47W、Y47T、Y47H、Y47F、Y47P、Y47M、Y47K、Y47L及びY47Aであった。Ｗ３８位については、アラニン変異型であるＷ３８Ａが野生型よりも低い酵素活性を呈していたが、Ｗ４０位及びＹ４７位においては、多くの変異体について野生型よりも高活性であった。特に、W40N、W40D、W40E、W40I、W40S、W40T、W40V、W40M、W40K及びW40Aにおいて野生型の約２倍以上の活性を認めた。
【００８０】
以上のことから、セルロースなどの高分子を基質とする酵素、特に、プロセッセッシブ酵素に分類される酵素等、予想される基質結合部位が多数にわたるときには、効率的に変異体を得るには、あらかじめアラニンスキャニングにより、アラニン変異によって前記高分子基質に対する酵素活性が少なくとも低下しない箇所を変異候補部位としてスクリーニングし、当該変異候補部位を標的として複数のアミノ酸変異を導入した複数種類の変異体を作製することにより、きわめて効率的に高活性な変異体が得られることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１Ａ】ＰｃＣＢＨ７Ｃの参照構造としたPhanerocaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼＩであるＣＢＨ Iの立体構造を示す図である。
【図１Ｂ】ＰｃＥＧ IIIの参照構造としたAspergillus nigar由来のＥＧIIIの立体構造を示す図である。
【図２】オーバーラッピングＰＣＲによるセルラーゼ遺伝子へのアラニン変異の導入のスキームを示す図である。
【図３】無細胞タンパク質合成系における鋳型量の検討結果を示す図である。
【図４】ＰｃＣＢＨ７Ｃの上清画分のオートラジオグラフィによる発現量の測定結果を示す図である。
【図５】ＰｃＣＢＨ７Ｃの沈殿画分のオートラジオグラフィによる発現量の測定結果を示す図である。
【図６】ＰｃＥＧIIIの上清画分と沈殿画分のオートラジオグラフィによる発現量の測定結果を示す図である。上段に上清画分の結果を示し、下段に沈殿画分の結果を示す。
【図７】ＰｃＣＢＨ７Ｃのアラニン置換変異体の酵素活性を比較する図である。
【図８】ＰｃＥＧIIIのアラニン置換変異体の酵素活性を比較する図である。
【図９】ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１０】Ｗ３８位における各種アミノ酸置換変異体の活性を比較する図である。
【図１１】Ｗ４０位における各種アミノ酸置換変異体の活性を比較する図である。
【図１２】Ｙ４７位における各種アミノ酸置換変異体の活性を比較する図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８２】
配列番号５〜１４３：プライマー
【図１Ａ】
2010046034.tif 000009
【図１Ｂ】
2010046034.tif 000010
【図２】
2010046034.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
2010046034.tif 000014
【図６】
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【図７】
2010046034.tif 000016
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2010046034.tif 000020
【図１２】
2010046034.tif 000021
【配列表】
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