(57)【要約】      （修正有）【課題】コアグラーゼ陽性細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）ならびにコアグラーゼ陰性細菌（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）の両方を認識するモノクローナル抗体を提供する。【解決手段】コアグラーゼ陽性ブドウ球菌細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ならびにコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来の特定の表面蛋白質、その活性フラグメント、例えば、これらの蛋白質のＡドメイン、または該全蛋白質を認識する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９および２１からなる群から選択されるブドウ球菌表面蛋白質へ結合する、単離抗体。
【請求項２】
該抗体が表面蛋白質のＡドメインに対して惹起される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
該抗体がヒトまたは動物におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を処置または予防する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
該抗体がヒトまたは動物における非経口、経口、鼻内、皮下、エアゾール化または静脈内投与に好適である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、マウス、キメラ、ヒト化およびヒトモノクローナル抗体からなる群から選択されるタイプのものである、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
該抗体が一本鎖モノクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９および２１からなる群から選択される配列を有するブドウ球菌表面蛋白質へ結合する抗体と同一の結合特異性を有する抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して惹起される、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記表面蛋白質が、核酸配列 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、２０およびＡａｐ蛋白質のＡドメインまたはその縮重物をコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体を含有する、単離抗血清。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体およびその抗体による結合を検出するための手段を含む、診断キット。
【請求項１４】
前記結合を検出するための手段が、前記抗体へ連結される検出可能な標識を含む、請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに感染していると疑われるサンプルへ添加すること、および抗体が該サンプルへ結合したかどうかを測定することを包含する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染を診断するための方法。
【請求項１６】
有効量の請求項１の抗体および薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染を処置または予防するための薬学的組成物。
【請求項１７】
有効量の請求項１に記載の抗体をヒトまたは動物患者へ投与することを包含する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染を処置または予防するための方法。
【請求項１８】
アミノ酸配列 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９および２１からなる群から選択される免疫原性量の単離蛋白質を、ヒトまたは動物へ投与することを包含する、免疫学的応答を誘発させる方法。
【請求項１９】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、２０の核酸配列およびＡａｐ蛋白質のＡドメインまたはその縮重物をコードする核酸配列によってコードされるアミノ酸へ結合する能力を有する、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項２０】
ＤｓｑＡ蛋白質のＡドメイン由来の単離された活性フラグメント。
【請求項２１】
生理学的に許容される抗生物質を更に含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項２２】
免疫応答を誘発するに有効な量の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９および２１からなる群から選択される蛋白質配列、ならびに薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染を処置または予防するためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本願は、２００１年６月１５日に出願された米国仮出願第６０／２９８，０９８の利益を主張する。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、一般的に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）由来の表面蛋白質およびそれらの活性領域（例えば、それらのＡドメイン）［これは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）における相同蛋白質（homologue proteins）を有する］、ならびに該蛋白質を認識する抗体に関し、そして特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌由来の特定の蛋白質を認識し、そしてＳ．ａｕｒｅｕｓおよびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌に対して交差反応性であり、そして従ってブドウ球菌細菌によって引き起こされる広範囲の感染を予防または処置するために有用なワクチンおよび方法において使用され得る、単離されたモノクローナルおよびポリクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
〔発明の背景〕
宿主の成功的定着（colonization）は、動物およびヒトにおいて感染を生じさせる大抵の微生物について必要とされるプロセスである。微生物付着（microbial adhesion）は、最終的に疾患へと導き得る一連の事象における第一の重要な工程である。病原性微生物は、細菌の表面上に存在する特定の付着因子を介して、宿主組織または血清条件化された（conditioned）インブラントされた生体材料（例えば、カテーテル、人工関節、および脈管移植片）へ付着することによって、宿主に定着する（colonize）。ＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（付着性マトリックス分子を認識する細菌性表面成分））は、宿主細胞外マトリックス中の個々の成分を認識しそしてこれに特異的に結合する、細胞表面付着因子のファミリーである。一旦該細菌が宿主組織に首尾良く付着し（adhered）そして定着する（colonized）と、それらの生理学は劇的に変化され、そして有害な成分（例えば、毒素および蛋白質分解酵素）が分泌される。更に、付着している細菌は、しばしば、バイオフィルムを作製し、そして迅速に大抵の抗生物質の殺傷効果に対してより耐性となる。
【０００４】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、皮膚病巣（例えば、創傷感染、膿痂疹、およびフルンケル）から、生命を脅かす状態（肺炎、敗血性関節炎（septic arthritis）、敗血症（sepsis）、心内膜炎、および生体材料関連感染（biomaterial related infections）を含む）にわたる、広範囲な感染を引き起こす。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、特定の宿主組織成分への細菌付着を促進するように個々にまたは協力して作用し得る、異なるＭＳＣＲＡＭＭのレパートリーを発現することが知られている。更に、別のタイプのブドウ球菌細菌が、コアグラーゼ陰性細菌として同定されており、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのような種を含み、これらはまた、ＭＳＣＲＡＭＭを発現することが知られておりそして広範囲の細菌感染および関連疾患を担う。この点で、ＭＳＣＲＡＭＭは、一般的に、抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方）による免疫学的攻撃のための優れた標的を提供する。
【０００５】
しかし、抗体は本質的に非常に特異的であるので、そして異なるタイプのブドウ球菌の場合［例えば、一方でＳ．ａｕｒｅｕｓ（コアグラーゼ陽性）および他方でＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（コアグラーゼ陰性）］、異なるタイプの細菌に渡って交差反応性を示す抗体を開発することは、依然として重要な課題のままである。ヒトおよび動物患者を免疫化し、そして両タイプのブドウ球菌細菌［即ち、コアグラーゼ陽性細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびコアグラーゼ陰性細菌（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）］によって引き起こされる感染に対する保護を提供することにおけるそれらの可能性のために、このような交差反応性抗体は特に望ましい。従って、このような抗体は、ブドウ球菌細菌によって引き起こされる広範囲の感染を予防または処置することにおいて極めて有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
〔発明の要旨〕
従って、コアグラーゼ陽性細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）ならびにコアグラーゼ陰性細菌（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）の両方を認識するモノクローナル抗体を提供することが、本発明の主題である。
【０００７】
ブドウ球菌細菌由来のＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）、ならびにそれらの活性領域（例えば、Ａドメイン）を同定および単離することがまた、本発明の主題であり、これらは、コアグラーゼ陽性およびコアグラーゼ陰性の両方のブドウ球菌に対して交差反応性であるモノクローナルおよびポリクローナル抗体を産生するために使用され得る。
【０００８】
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌由来の表面蛋白質（例えば、ＤｇｓK蛋白質）のＡドメイ
ンを認識しそして同時にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来の表面蛋白質（例えば、ＳａｓＡ蛋白質）を認識し得る単離抗体を提供することが、本発明のなお更なる主題である。
【０００９】
本発明の単離蛋白質、Ａドメインおよび抗体を使用してブドウ球菌感染の処置または予防に有用なワクチンを作製すること、ならびに本発明のワクチンおよび抗体を使用してブドウ球菌感染を予防または処置する方法を提供することが、本発明のなお別の主題である。
【００１０】
これらおよび他の主題は本発明によって提供され、これは、両タイプのブドウ球菌の表面蛋白質を認識し得、従って広範囲のブドウ球菌感染を処置または予防するワクチンおよび方法において使用され得る、交差反応性抗体を惹起させ得る、１タイプのブドウ球菌細菌（例えば、コアグラーゼ陰性またはコアグラーゼ陽性ブドウ球菌）由来の表面蛋白質の同定および単離を含む。本発明はまた、これらの表面蛋白質からのポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方の産生、ならびにブドウ球菌感染を予防または処置することにおけるそれらの使用に関する。
【００１１】
これらの実施形態ならびに開示される本発明の精神および範囲内の他の変形および修飾は、本明細書および／または本明細書中で引用される参考文献（これら全てが参考として援用される）を読むことにより、当業者に容易に明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
〔好ましい実施形態の詳細な説明〕
本発明によれば、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ならびにコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈｅ
ｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来の特定の表面蛋白質［その活性フラグメント、例えば、これらの蛋白質のＡドメイン、または該全蛋白質を認識する抗体を産生し得る他のエピトティック（epitotic）領域を含む］が、提供される。本発明によれば、候補ペプチド配列および蛋白質の同定および単離は、多くの場合において細胞壁ペプチドグリカンへ共有結合されている、ＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の共通特徴のいくつかに基づいて行われた。これらの表面蛋白質は以下の共通特徴を有し、これらは本発明の配列を同定および単離する際に使用された、即ち：（ｉ）Ｓｅｃ−依存分泌（Sec-dependent secretion）に必要とされる、Ｎ末端シグナルペプチ
ド（約４０残基長）、（ｉｉ）プロリンおよびグリシン残基に富んでいるかまたはセリンおよびアスパルテートジペプチド繰り返しから構成される、壁スパニングドメイン（wall
spanning domain）、（ｉｉｉ）ペプチドグリカンにおけるペンタグリシン架橋への該蛋白質の共有結合的固定（covalent anchoring）のために必要とされる、ＬＰＸＴＧモチーフ、（ｉｖ）疎水性膜スパニングドメイン（hydrophobic membrane-spanning domain）、続いて（ｖ）いくつかの正に帯電した残基。
【００１３】
本発明によれば、上述のような特性の点でＳ．ａｕｒｅｕｓの全ゲノムを利用することによって、ＭＳＣＲＡＭＭの指標である分泌（secretion）および固定（anchorage）モチーフを有する（即ち、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端ＬＰＸＴＧモチーフ続いて疎水性ドメインおよび正に帯電したテイル（tail）を有する）蛋白質をコードする、少なくとも８つの新規のオープンリーディングフレームを同定した。以下の表は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓゲノムにおけるそれらの分布、それらの蛋白質サイズおよびＣ末端細胞壁ソーティング配列（C-terminal cell wall sorting sequence）を含む、同定された蛋白質のリスト
を示す。
【００１４】
【表１】
2010047581.tif 000002
略字：ｅＭＲＳＡ−１６；Ｎ，８３２５；Ｃ，ＣＯＬ；Ｓ，ＭＳＳＡ；Ｊ，Ｎ３１５，Ｍ，Ｍｕ５０。
８つのうち６つは、現在配列決定されている６つのブドウ球菌ゲノムの全てにおいて保存されており、そして残りの２つは、これらのゲノムの５／６において存在している。
【００１５】
本発明によれば、上記蛋白質をコードするアミノ酸および核酸配列が得られ、そしてこれらは以下の通りであった：Ｅｋｅｓ  ＭＲＳＡ−配列番号１（ＤＮＡ配列）；  Ｅｋｅ
Ｓ ＭＲＳＡ−配列番号２（蛋白質配列）；  ＤｓｑＡ（８３２５）−配列番号３（ＤＮＡ配列）；  ＤｓｑＡ（８３２５）−配列番号４（蛋白質配列）；  ＫｅｓＫ１（８３２５）−配列番号５（ＤＮＡ配列）；  ＫｅｓＫ１（８３２５）−配列番号６（蛋白質配列）；  ＫｒｋＮ２（８３２５）−配列番号７（ＤＮＡ配列）；  ＫｒｋＮ２（８３２５）−配列番号８（蛋白質配列）；  ＫｒｋＮ（８３２５）−配列番号９（ＤＮＡ配列）；  ＫｒｋＮ（８３２５）−配列番号１０（蛋白質配列）；  ＲｋａＳ（ＣＯＬ）−配列番号１１（ＤＮＡ配列）；  ＲｋａＳ（ＣＯＬ）−配列番号１２（蛋白質配列）；  ＲｒｋＮ（８３２５）−配列番号１３（ＤＮＡ配列）；  ＲｒｋＮ（８３２５）−配列番号１４（蛋白質配列）；  ＫｎｋＡ（８３２５）−配列番号１５（ＤＮＡ配列）；  ＫｎｋＡ（８３２５）−配列番号１６（蛋白質配列）。
【００１６】
本発明によれば、単離された抗体は、該蛋白質および／または該ドメインを認識し得るように、上記蛋白質またはそれらの活性領域（例えば、Ａドメイン）から産生され得る。これらの抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得る。ポリクローナル抗体が望ましい場合、これらは、当該分野に周知の多数の慣用的様式で産生され得る。典型的なプロセスにおいて、所望の表面蛋白質またはその活性領域は、好適な宿主動物（例えば、マウスまたはウサギ）へ注射され得、そして好適な時間後、抗体が、宿主動物から単離および回収され得る。モノクローナル抗体に関して、本発明によれば、これらは、多数の好適な様式［例えば、Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975) の
周知の方法、または当該分野において公知の他の好適な様式（例えば、米国特許6，331，415；5,981,216；5,807,715；および4,816,567；欧州特許出願519,596；ならびにＰＣＴ
公開公報WO 00/71585に開示されている方法）を含む；これらの特許公開公報の全ては、
本明細書中で参考として援用される］で、作製され得る。これらの方法は、当該分野に周知である様式での、キメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体としてのそれらの製造を含む。なお更に、モノクローナル抗体は、軽鎖または重鎖のような一本鎖から製造され得、そして更に、全抗体の結合特徴（例えば、特異性および／または親和性）を保持する抗体活性フラグメントから製造され得る。活性フラグメント（active fragments）とは、異なるタイプのブドウ球菌細菌（即ち、コアグラーゼ陰性またはコアグラーゼ陽性）由来の特定の表面蛋白質またはその相同体（homologue）へ結合する完全抗体と同一の結合
特異性を有する、抗体フラグメントを意味し、そして用語“抗体”は、本明細書中で使用される場合、該フラグメントを含むように意味される。更に、本発明に従うモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用して作製される抗血清がまた意図され、そして当業者に認識されるような多数の好適な様式で作製され得る。
【００１７】
上述されるように、本発明に従う単離された表面蛋白質および／またはそれらの活性領域に対する抗体は、当該分野において周知である多数の好適な様式、例えば、モノクローナル抗体を産生するために使用され得る、上述の十分確立されたＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法で作製され得る。例えば、このようなプロセスで使用される予備工程において、マウスに、本発明に従う精製組換えＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）またはその活性部分が、長期間にわたって一週間に一回腹腔内注射され得、続いて該精製蛋白質に対する反応性を測定するために、該免疫化マウスから得た血液の検査が行われる。該蛋白質に反応性であるマウスの同定に続いて、マウス脾臓から単離したリンパ球をマウスメラノーマ細胞と融合させて、本発明の表面蛋白質に対する抗体について陽性であるハイブリドーマを作製し、これを次いで単離および培養し、続いて精製およびアイソタイピング（isotyping）する。
【００１８】
本発明に従うモノクローナル抗体を産生するために、これらが、本発明に従う組換えで作製されたＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）を使用して産生されることが好ましく、そしてこれらの組換え体は、当該分野に周知の多数の標準方法を使用して産生および単離され得る。例えば、このような方法の１つは、組換え蛋白質およびペプチドをクローン化および発
現するために発現ベクターとしてＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＱＥ−３０を使用する。１つの好ましい方法において、ＰＣＲを使用して、ＤｇｓＫまたはＳａｓＡと同定された表面蛋白質のＡドメインを上述の配列から増幅し、そしてＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターＰＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）［これは、６つのヒスチジン残基を含有する組換え融合蛋白質の発現を可能にする］ヘサブクローン化する。引き続いて、このベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ５５１５１へ形質転換し、０．７の光学密度（ＯＤ600）まで１５リットル発
酵槽において増殖させ、そして４時間０．２ｍＭイソプロピル−１−ベータ−Ｄガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。細胞を、ＡＧ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｈｏｌｌｏｗ−ｆｉｂｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（細孔サイズ（pore size）０．４５μｍ）を使用して
収獲し、そして細胞ペーストを−８０℃で凍結させた。細胞を、１１００ｐｓｉでｔｈｅ
Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓを通過させる２回パスを使用して１×ＰＢＳ（１０ｍＬ緩衝液／１ｇ細胞ペースト）において溶解させた。溶解した細胞を、３０分間１７，０００ｒｐｍでスピンダウンさせて（spun down）、細胞残骸を除去した。上清みを、０．１Ｍ  
ＮｉＣｌ2を充填させた５−ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）カラムに通過させた。ローディング（loading）後、カラムを、１０ｍＭ  Ｔｒｉ
ｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（緩衝液Ａ）の５カラム容積で洗浄した。蛋白質を、３０カラム容積に渡って、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  イミダゾール（緩衝液Ｂ）の０〜１００％勾配を使用して溶出した。ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３またはＳｄｒＧＮ２Ｎ３は、〜１３％緩衝液Ｂ（〜２６ｍＭイミダゾール）で溶出した。２８０ｎｍでの吸光度をモニタリングした。ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３またはＳｄｒＧＮ２Ｎ３を含有する分画を、１×ＰＢＳで透析した。
【００１９】
次に、各蛋白質を、次いで、内毒素除去プロトコル（endotoxin removal protocol）に通した。このプロトコルの間に使用した緩衝液は、５−ｍＬ  Ｍｏｎｏ−Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを通過させることによって、内毒素フリーにさせた。蛋白質を、４×１５ｍＬチューブに等しく分割した。各チューブの容積は、緩衝液Ａを用いて９ｍＬにされた。１ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を各チューブに添加し、そして４℃で１時間回転しながらインキュベートした。チューブを３７℃水浴に配置して相分離させた。チューブを１０分間２，０００ｒｐｍでスピンダウンさせ、そして各チューブからの上部の水相を回収し、そして洗剤抽出（detergent extraction）を繰り返した。第２番目の抽出からの水相を合わせ、そして０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2をチャージした
５−ｍＬ  ＩＤＡ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ）カラムを通過させて、残っている洗剤を除去した。カラムを緩衝液Ａの９カラム容積で洗浄し、その後、該蛋白質を緩衝液Ｂの３カラム容積で溶出した。溶離液（eluant）を、５−ｍＬ  Ｄｅｔｏｘｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）カラムを通過させ、フロースルー（flow-through）を回収し、そしてカラムへ再適用した。第２通過からのフロースルーを回収し、そして１×ＰＢＳにおいて透析した。精製産物を、濃度、純度および内毒素レベルについて分析し、その後マウスへ投与した。
【００２０】
好ましいプロセスにおいて、本発明に従うモノクローナル抗体は、以下の様式において上記に同定される組換え蛋白質から作製され得る。このプロセスにおいて、Ｅ．ｃｏｌｉ発現および精製された組換えＳａｓＡおよびＤｓｇＫ蛋白質は、マウスモノクローナル抗体のパネル（panel）を産生するために使用し、一方、マウス血清は、ポリクローナル抗
体のソース（source）として使用した。手短に言えば、Ｂａｌｂ／ＣまたはＳＪＬマウスのグループに、表２において以下に記載されるように溶液状態のまたはアジュバントと混合されている１〜１０ｍｇの蛋白質の一連の皮下免疫化（subcutaneous immunizations）を受容させた。
【００２１】
【表２】
2010047581.tif 000003
【００２２】
犠牲（sacrifice）（ＲＩＭＭＳ）時またはブースト（boost）（慣用的）後７日目に、血清を回収し、そしてＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）蛋白質に対するまたは全細胞（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ａｕｒｅｕｓ）についてのＥＬＩＳＡアッセイにおいて力価を滴定した。最終ブースト３日後に、脾臓またはリンパ節を除去し、単一細胞懸濁へ掻き裂き（teased）、そしてリンパ球を収獲した。次いで、リンパ球をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３メラノーマ細胞系（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８０）へ融合させた。細胞融合、引き続いてプレート化（plating）および栄養補給（feeding）を、Current Protocols in Immunologyからのthe Production of Monoclonal Antibodies protocol（Chapter 2, Unit
2）［本明細書中で参考として援用される］に従って行った。
【００２３】
次いで、該融合から産生された任意のクローンを、標準ＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異的抗−ＳａｓＡ抗体産生についてスクリーンした（screened）。陽性クローンを増やしそしてフローサイトメトリーにより全細菌細胞結合アッセイにおける活性についてそしてＢｉａｃｏｒｅ分析によりＳａｓＡ結合について更に試験した。Ｂｉａｃｏｒｅ分析の間、流速（flow rate）は１０ｍｌ／分で一定のままであった。ＳａｓＡまたはＤｇｓＫ
注射の前に、試験抗体を、ＲＡＭ−Ｆｃ結合を介してチップ（chip）へ吸着させた。時間０の際、３０ｍｇ／ｍｌの濃度のＳａｓＡまたはＤｇｓＫを、３分間チップ上に注射し、続いて２分間解離した（dissociation）。この段階の分析によって、Ｍａｂ／ＳａｓＡまたはＤｇｓＫ相互作用の相対的結合および解離動力学（the relative association and disassociation kinetics）が測定された。
【００２４】
次に、上述のように作製された抗体を、全細菌（whole bacteria）への結合について試験した。この試験において、細菌サンプルＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ６７−０、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ３９７（Ｓａｌ６）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｗｏｏｄ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ８３２５−４、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ  １６、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  ３５９８４、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
ＨＢ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＣＮ−８９９およびＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ４３２５３を回収し、洗浄し、そしてウサギＩｇＧ（５０ｍｇ／ｍｌ）でブロッキングした後の２μｇ／ｍｌの濃度のＭａｂまたはＰＢＳのみ（コントロール）と共にインキュベートした。抗体と共のインキュベーション後、細菌細胞を、ヤギ−Ｆ(ab')2−抗−マウス−Ｆ(ab')2−ＦＩＴＣ（これは、検出抗体として役立った）と共にインキュベーションした。抗体標識後、細菌細胞を、ＦＡＣＳカリバーフローサイトメーター（FACScaliber flow cytometer）を介して吸引して、蛍光放出を分析した（励起：４８８、放出：５７０）。各細菌株について、１０，０００事象（events）を回収しそして測定し
た。これらのデータは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳａｓＡに対する抗体がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の表面上の相同な蛋白質を認識し得たことを示す。該データは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳａｓＡに対するウサギポリクローナル抗体がＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＨＢの細胞表面から放出された蛋白質ならびにＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからクローン化されたＤｓｇＫ由来の組換えＡ−領域と交差反応することを実証するウェスタンブロット分析を支持する（下記の表３および図６を参照のこと）。
【００２５】
【表３】
2010047581.tif 000004
【００２６】
本発明の表面蛋白質の組換え形態を使用しての抗体の産生が好ましいが、抗体は、これらの蛋白質またはそれらの活性領域（例えば、Ａドメイン）の天然の単離および精製されたバージョンから産生され得、そしてモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、このような抗体を得るための上述の同一様式でこれらの蛋白質または活性領域を使用して産生され得る。なお他の慣用的な様式が、当業者に認識されるように、組換えまたは天然の精製された蛋白質またはそれらの活性領域を使用して、本発明の抗体を産生するために利用可能である。
【００２７】
当業者に認識されるように、本発明の抗体はまた、ブドウ球菌細菌によって引き起こされる感染を処置または予防するために、ヒトまたは動物患者への投与に好適な薬学的組成物に形成され得る。本発明の抗体（または、その有効なフラグメント）を含有する薬学的組成物は、当該分野において一般的に使用される任意の好適な薬学的ビヒクル（vehicle
）、賦形剤または担体（例えば、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールを含む）、他の治療化合物、ならびにそれらの組み合わせと組み合わせて処方され得る。当業者に認識されるように、使用される特定のビヒクル、賦形剤または担体は、患者および患者の状態に依存して変化し、そして様々な投与様式が、当業者に認識されるように、本発明の組成物に好適である。本願に開示される任意の薬学的組成物を投与する好適な様式としては、局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内および皮内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
局所投与について、組成物は、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、ドロップ（例えば、点眼剤および点耳剤（ear drops））、または溶液（例えば、マウスウォッシュ）の形
態で処方される。創傷または手術包帯（dressings）、縫合糸およびエアゾール（aerosols）が、該組成物で含浸され得る。該組成物は、保存剤、浸透を促進するための溶媒、お
よび軟化剤（emollients）のような慣用の添加物を含有し得る。局所製剤はまた、クリームもしくは軟膏ベース、エタノール、またはオレイルアルコールのような慣用の担体を含有し得る。抗体組成物の更なる形態、ならびに他のＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）について
の組成物、ワクチン、方法および適用に関する他の情報がまた、一般的に、上述のＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）およびそれらの活性領域ならびにそれらに対する抗体を包含する本発明に適用可能であり得、そしてこれらの他のＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）は、例えば、米国特許5,175,096; 5,320,951; 5,416,021; 5,440,014; 5,571,514; 5,652,217; 5,707,702; 5,789,549; 5,840,846; 5,980,908; 6,086,895; 6,008,341; 6,177,084; 5,851,794
および 6,288,214において開示されており；これらの特許の全ては、本明細書中で参考
として援用される。
【００２９】
本発明の抗体組成物はまた、免疫原性応答を増強するに有効な量の好適なアジュバントと共に投与され得る。例えば、好適なアジュバントとしては、ミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）（これは、ヒトにおいて広く使用される）、ならびに他のアジュバント、例えば、サポニンおよびその精製成分Ｑｕｉｌ  Ａ、フロイント完全アジュバント、ＲＩＢＢＩアジュバント、ならびに研究および獣医学適用において使用される他のアジュバントが挙げられ得る。なお他の化学的に規定される調製物、例えばムラミールジペプチド、モノホスホリルリピドＡ、リン脂質複合体（例えば、Goodman-Snitkoff et al. J. Immunol. 147: 410-415 (1991) によって記載されそして本明細書中で参考として援用されるもの）、Miller et al., J. Exp. Med. 176: 1739-1744 (1992) によって記載されそして本明細書中で参考として援用されるようなプロテオリポソーム（proteoliposome）中の該複合体の封入物（encapsulation）、ならびに脂質小胞中の該蛋白質の
封入物［例えば、ＮｏｖａｓｏｍｅTM脂質小胞（Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH）］もまた、有用であり得る。
【００３０】
任意の事象において、上述の蛋白質またはそれらの活性領域を認識する本発明の抗体組成物は、ブドウ球菌感染を予防または処置する方法において、ならびに宿主組織および／または細胞へのブドウ球菌細菌の結合を阻害することにおいて有用である。本発明によれば、ブドウ球菌感染を処置または予防するために本明細書に開示された表面蛋白質またはそれらの活性サブ領域（subregions）に対する有効量の抗体を投与することを包含する、ブドウ球菌感染を予防または処置するための方法が提供される。更に、これらのモノクローナル抗体は、宿主細胞へのブドウ球菌細菌の結合を弱める（impairing）ことにおいて
有用である。
【００３１】
従って、本発明によれば、上記の任意の慣用的な様式（例えば、局所、非経口、筋肉内など）での本発明の抗体の投与は、有効量の該抗体組成物がヒトまたは動物患者に投与されると、ヒトまたは動物患者におけるブドウ球菌感染を処置または予防する極めて有用な方法を提供するであろう。有効量とは、細菌の付着を予防するか、宿主細胞へのブドウ球菌細菌の結合を阻害するに十分であり、そして従ってブドウ球菌感染の処置または予防に有用である、使用のレベル（例えば、抗体力価）を意味する。当業者に認識されるように、ブドウ球菌感染を処置または予防することにおいて有効であるために必要とされる抗体力価のレベルは、患者の性質および状態、ならびに／あるいは既存のブドウ球菌感染の重篤度に依存して変化する。
【００３２】
ブドウ球菌感染を処置または予防する方法における使用に加えて、本発明の抗体はまた、ブドウ球菌蛋白質の特異的検出のために、または研究ツールとして、使用され得る。用語“抗体”は、本明細書中で使用される場合、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本鎖（single chain）、二重特異的（bispecific）、サル化（simianized）、およびヒト化または霊長類化（primatized）抗体ならびにＦａｂフラグメント［例えば、上記に特定される表面蛋白質に対する該抗体の結合特異性を保持しているフラグメント、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーのプロダクトを含む］を含む。従って、本発明は、該抗体の可変重鎖および軽鎖のような一本鎖（single chain）の使用を意図する。これらのタイプのいずれの抗体または抗体フラグメントの産生も、当業者に周知である。この場合に
おいて、上記へ参照されるような表面蛋白質またはそれらの活性領域に対する抗体が、産生、単離および／または精製され、そして次いでブドウ球菌感染に対して処置または保護するために使用され得る。
【００３３】
上述の抗体のいずれもが、ブドウ球菌細菌の同定および定量のために、検出可能な標識で直接標識化され得る。イムノアッセイにおける使用のための標識は、一般的に、当業者に公知であり、そして酵素、ラジオアイソトープ、および蛍光、発光および色素産生性物質（コロイダルゴールドまたはラテックスビーズのような着色された粒子を含む）を含む。好適なイムノアッセイとしては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００３４】
あるいは、抗体は、免疫グロブリンについて親和性を有する標識化物質との反応によって、間接的に標識化され得る。抗体は、第２物質と複合体化されて、そして抗体へ複合体化された第２物質について親和性を有する標識化された第３物質で検出され得る。例えば、抗体はビオチンへ複合体化され、そして抗体−ビオチン複合体が、標識化されたアビジンまたはストレプトアビジンを使用して検出され得る。同様に、抗体はハプテンへ複合体化され、そして抗体−ハプテン複合体が、標識化された抗−ハプテン抗体を使用して検出され得る。抗体およびアッセイ複合体を標識するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である。
【００３５】
本発明によれば、ブドウ球菌感染に対して処置または保護するために設計された能動または受動免疫化のためのワクチンがまた提供され、そしてこれらのワクチンは、当該分野に周知の多数の慣用的ワクチン調製方法を使用して、上述の表面蛋白質またはそれらの活性領域から作製され得る。典型的なワクチンにおいて、免疫原性量の好適な表面蛋白質またはその活性フラグメントは、好適な薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤と組み合わされ、そしてヒトまたは動物患者を免疫化するに有効な量のこのワクチンが、必要に応じて投与され得る。免疫原性量（immunogenic amount）とは、これが、ヒトまたは動物患者において免疫原性応答（immunogenic response）を惹起させ得る該蛋白質またはその活性フラグメントもしくはサブ領域の任意の量をいうことが、当業者によって理解される。
【００３６】
本発明に従う免疫原性量の蛋白質または活性フラグメントの導入または投与により患者において抗体が産生される、能動ワクチン（active vaccines）に加えて、本発明の単離
抗体（または、その活性フラグメント）はまた、ブドウ球菌感染に対する受動免疫化のためのワクチン開発において使用され得る。このような場合、上述のような抗体組成物、即ち、有効量の抗体および薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤が、必要に応じて、ヒトまたは動物患者へ投与され得る。
【００３７】
従って、本発明によれば、該蛋白質またはその活性フラグメントは、能動ワクチンとして使用され得、そして本発明の抗体は、ブドウ球菌感染を処置または予防する好適な抗体を提供することにおいて有用である受動ワクチンとして使用され得る。当業者に認識されるように、ワクチンは、多数の好適な様式での投与、例えば非経口（即ち、筋肉内、皮内または皮下）投与または鼻咽頭（即ち、鼻内）投与のために包装され得る。１つのこのような様式は、ワクチンが筋肉内に（例えば、三角筋へ）注射される場合であるが、投与の特定のモードは、扱われる細菌感染の性質および患者の状態に依存する。ワクチンは、好ましくは、投与を促進するために薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤と組み合わされ、そして担体は、通常、保存剤を含むかまたは含まない、水または緩衝化生理食塩水である。ワクチンは、投与時の再懸濁のために凍結乾燥されるかまたは溶液状態であり得る。
【００３８】
更に、特定の場合において、本発明の抗体は、それが投与される患者において必要であるならばそれらがより少ない免疫原性であるように、必要である場合には修飾され得る。例えば、患者がヒトである場合、抗体は、例えばJones et al., Nature 321:522-525 (1986) またはTempest et al. Biotechnology 9:266-273 (1991) によって記載されるように、ハイブリドーマ由来抗体の相補性決定領域をヒトモノクローナル抗体へ移植することによって“ヒト化”され得、あるいは、例えばPadlan, Molecular Imm. 28: 489-498 (1991) によって記載されるように、免疫グロブリン可変領域における表面曝露マウスフレームワーク残基を、対応の相同ヒトフレームワークを模倣するように変化させることによって“化粧張り（veneered）”され得、これらの文献は本明細書中で参考として援用される。なお更に、そのように望まれる場合、本発明のモノクローナル抗体は、必要である場合には細菌感染と戦う本発明の組成物の能力を更に増強するために、好適な抗生物質と組み合わせて投与され得る。
【００３９】
ヒトまたは動物患者を処置することに加えて、本発明の組成物はまた、医療装置または他の生体材料（例えば、インプラント）の感染を停止（halt）または予防するために使用され得る。ここで記載される抗体、蛋白質および活性フラグメントでコーティングされる医療装置またはポリマー性生体材料としては、ステープル（staples）、縫合糸、代替心
臓弁（replacement heart valves）、心臓補助装置（cardiac assist devices）、ハードおよびソフトコンタクトレンズ、眼内レンズインプラント（前房（anterior chamber）または後房）、他のインプラント、例えば、角膜インレー（corneal inlays）、人工角膜（kerato-prostheses）、脈管ステント、エピケラトファリア（epikeratophalia）装置、緑内障シャント（glaucoma shunts）、網膜ステープル（retinal staples）、強膜バックル（scleral buckles）、歯科プロテーゼ（dental prostheses）、甲状腺軟骨形成装置、喉頭形成装置、脈管グラフト、軟および硬組織プロテーゼ（ポンプを含むが、これに限定されない）、電気装置（スティミュレーターおよびレコーダーを含む）、耳プロテーゼ、ペースメーカー、人工喉頭、歯科インプラント、乳房インプラント、陰茎インプラント、頭蓋／顔の腱、人工関節、腱、靭帯、半月板、および円板、人工骨、人工器官（人工膵臓、人工心臓、人工肢、および心臓弁を含む）、ステント、ワイヤー、ガイドワイヤー、静脈内および中心静脈カテーテル、レーザーおよびバルーン血管形成装置、脈管および心臓装置（チューブ、カテーテル、バルーン）、心室補助器（ventricular assists）、血液透
析コンポーネント、血液オキシジェネ−ター、尿道／尿管／尿装置（Ｆｏｌｅｙカテーテル、ステント、チューブおよびバルーン）、気道カテーテル（気管内および気管開口チューブおよびカフ（cuffs））、経腸供給チューブ（経鼻胃管、胃内および空腸チューブを
含む）、創傷ドレナージチューブ、体腔（例えば、胸膜、腹膜、頭蓋、および心膜腔）を空にするために使用されるチューブ、血液バック、試験管、採血チューブ、ヴァキュテイナー（vacutainers）、注射器、針、ピペット、ピペットチップ、および血液チュービン
グが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
用語“コーティングされた（coated）”または“コーティング（coating）”は、本明
細書中で使用される場合、抗体または活性フラグメント、あるいはそれから誘導される薬学的組成物を、装置の表面、好ましくはブドウ球菌細菌感染へ曝される外部表面に適用することを意味することが、当業者に理解される。装置の表面は、該蛋白質、抗体または活性フラグメントによって完全にカバーされる必要はない。
【００４１】
本発明に従う抗体組成物の投与のために好ましい用量は、量がブドウ球菌感染を予防または処置することにおいて有効であることであり、そしてこの量は、感染の性質および患者の状態に依存して大いに変化することが容易に認識されるだろう。上述のように、本発明に従って使用される“有効量”の抗体または薬学的薬剤は、所望の予防または治療効果が引き起こされるような、非毒性であるが十分な量の薬剤を意味するように意図される。以下に指摘されるように、必要とされる抗体または特定の薬剤の正確な量は、被験体の種
、年齢、および一般的状態、処置される状態の重篤度、使用される特定の担体またはアジュバントおよびその投与モードなどに依存して、被験体ごとに変化する。従って、任意の特定の抗体組成物の“有効量”は、特定の状況に基づいて変化し、そして好適な有効量は、ルーチンの実験のみを使用して、当業者によって、適用の各場合において決定され得る。用量は、組成物が投与される個体に合うように調節されるべきであり、そして個体の年齢、体重および代謝で変化する。組成物はまた、安定剤または薬学的に許容される保存剤（例えば、チメロサール（エチル（２−メルカプトベンゾエート−Ｓ）水銀ナトリウム塩）（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO））を含有し得る。
【００４２】
好適な標識または他の好適な検出可能な生体分子または化学物質と共に使用される場合、ここで記載されるモノクローナル抗体は、ブドウ球菌感染のインビボおよびインビトロ診断あるはブドウ球菌細菌の検出のような目的のために有用である。実験室研究はまた、このような抗体の使用によって促進され得る。例えば以下に記載されるものような、種々のタイプの標識および本発明の抗体へ該標識を複合体化させる方法が、当業者に周知である。
【００４３】
例えば、抗体は、これらに限定されないが32Ｐ、3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、125Ｉ、または131
Ｉのような放射標識へ複合体化され得る。標識の検出は、シンチレーションカウンティング、ガンマ線分光法またはオートラジオグラフィーのような方法により可能である。生物発光標識（例えば、ホタルルシフェリンの誘導体）がまた有用である。生物発光物質が、慣用方法で該蛋白質へ共有結合され、そして該標識化された蛋白質は、ルシフェラーゼのような酵素がＡＴＰとの反応を触媒して生物発光分子に光の光子を放出させる際に、検出される。フルオロゲン（fluorogen）がまた、蛋白質を標識するために使用され得る。フ
ルオロゲンの例としては、フルオレセインおよび誘導体、フィコエリトリン、アロ−フィコシアニン（allo-phycocyanin）、フィコシアニン、ローダミン、およびテキサスレッドが挙げられる。フルオロゲンは、一般的に、蛍光検出器によって検出される。
【００４４】
細胞中のリガンドの位置は、上述の抗体を標識しそして当業者に周知の方法［例えば、Ｗａｒｒｅｎら（Mol. Cell. Biol., 7:1326-1337, 1987）によって記載されるもののよ
うな手順を使用する免疫蛍光顕微鏡検査法］に従って標識を検出することによって測定され得る。
【００４５】
上述のように、本発明のモノクローナル抗体（またはその活性な部分またはフラグメント）は、感染を担うブドウ球菌病原体と哺乳動物宿主との間の初期物理的相互作用を妨害するために特に有用であり、そして該物理的相互作用のこの妨害は、患者を処置することおよび使用をより安全にするために留置（in-dwelling）医療装置における細菌感染を予
防または軽減することの両方に、有用であり得る。
【００４６】
本発明の別の実施形態において、ブドウ球菌細菌および感染を単離および同定することに有用であり得るキットが提供され、これは、単一容器に凍結乾燥されて次いでブドウ球菌細菌を含有すると疑われる水性サンプルの添加によって活性となるような、好適な形態で本発明の抗体を含む。このようなキットは、典型的に、本発明の表面蛋白質または抗体へ結合する複合体（complexes）の同定を可能にする好適な免疫検出試薬と共に、好適な
形態の抗体を収容するための好適な容器を含む。一般的に、これらのキットは、本発明に従う抗体と、患者由来のサンプルが該抗体に導入された場合に該抗体の結合を同定するための手段とを含み得る。例えば、好適な免疫検出試薬は、好適な検出可能なシグナルまたは標識（例えば、ビオチンまたは検出可能な色を生成する酵素など）を含み得、これは、通常、抗体へ結合され得るか、または抗体が抗原へ結合する場合に検出可能な結果を提供するような他の好適な様式で使用され得る。
【００４７】
手短に言えば、本発明の表面蛋白質（またはその活性フラグメント）を認識しそしてこれに結合する本発明の抗体は、従って、ヒトおよび動物患者ならびに医療または他の留置装置における、広範囲のブドウ球菌感染を処置することに有用である。本発明によれば、これらの蛋白質の性質、ならびにそれらが他のタイプのブドウ球菌細菌の蛋白質と共通するエピトープを含有する、即ち、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌由来の蛋白質がＳ．ａｕｒｅｕｓ由来の相同蛋白質を認識する抗体を惹起する（逆も同様）という事実のために、本発明の抗体は、交差反応性を示し、そして広範囲のブドウ球菌感染に対して有効である。従って、本発明は、広範囲のブドウ球菌感染に対して処置または保護する改善された方法のための方法および組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本発明に従うインシリコ予測される蛋白質の一次構造の描写である。
【図２】図２は、本発明のｏｒｆｓを発現する精製Ｎ末端組換えＨｉｓ−タグ蛋白質のクマシーゲルを示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ぞれぞれ抗−ＫｅｓＫ抗体（図３Ａ）、抗−ＫｎｋＡ抗体（図３Ｂ）および抗−ＤｓｑＡ抗体（図３Ｃ）でのプロービング（probing）を示す、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞壁抽出物のウェスタンブロッティングを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）、即ちＫｎｋＡ（図４Ａ）およびＫｅｓＫ（図４Ｂ）を発現するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓのドットブロッティングおよびウェスタンイムノブロッティングを示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、ＲｒＫｎおよびＲｒＫＮ２（図５Ａ）、Ｋｅｓｋ１およびＫｅｓｋ２Ａ（図５Ｂ）、ＫｎｋＡ（図５Ｃ）ならびにＤｓｑＡ２（図５Ｄ）を含む、インビボ発現を検査する回復期血清を用いての、本発明に従う組換えＬＰＸＴＧ蛋白質のプロービングを示す。
【図６】図６は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳａｓＡに対するウサギポリクローナル抗体は、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＨＢの細胞表面から放出される蛋白質ならびにＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからクローン化されたＤｓｇＫ由来の組換えＡ−領域と交差反応することを実証する、ウェスタンブロット分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
〔実施例〕
以下の実施例が提供され、これは本発明の好ましい実施形態の局面を例証する。続く実施例において開示される技術は、本発明者らによって本発明の実施において十分に機能すると発見された技術を示し、そして従ってその実施のために好ましいモードを構成すると考えられ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、多くの変化が、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、開示される特定の実施形態においてなされて、そして依然として同様または類似の結果を得ることができるを認識すべきである。
【００５０】
〔実施例１．Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ由来のＭＳＣＲＡＭＭ’ｓの単離および配列決定〕
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、細菌が宿主防衛を回避することを可能にしてそして付着因子として作用することにより病原性において重要な役割を果たす、表面結合蛋白質のクラスを発現することが公知である。これらの蛋白質は、ＭＳＣＲＡＭＭｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（付着性マトリックス分子を認識する細菌性表面成分））として公知であり、そして大抵の場合において、細胞壁ペプチドグリカンに共有結合的に固定されている。それらは、いくつかの共通の特徴を有する：（ｉ）Ｓｅｃ−依存分泌に必要とされる、Ｎ末端シグナルペプチド（約４０残基長）、（ｉｉ）プロリンおよびグリシン残基に富んでいるかまたはセリンおよびアスパルテートジペプチド繰り返しから構成される、壁スパニングドメイン、（ｉｉｉ）ペプチドグリカンにおけるペンタグリシン架橋への該蛋白質の共有結合的固定のために必要とされる、ＬＰＸＴＧモチーフ、（ｉｖ）疎水性膜スパニングドメイン、続いて（ｖ）いくつかの正に帯電した残基。
【００５１】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの全ゲノム配列を利用することによって、ＭＳＣＲＡＭＭの指標である分泌および固定モチーフを有する（即ち、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端ＬＰＸＴＧモチーフ続いて疎水性ドメインおよび正に帯電したテイル（tail）を有する）蛋白質をコードする、８つの新規のオープンリーディングフレームを同定した。以下の表は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓゲノムにおけるそれらの分布、それらの蛋白質サイズおよびＣ末端細胞壁ソーティング配列を含む、同定された蛋白質のリストを示す。
【００５２】
【表４】
2010047581.tif 000005
略字：ｅＭＲＳＡ−１６；Ｎ，８３２５；Ｃ，ＣＯＬ；Ｓ，ＭＳＳＡ；Ｊ，Ｎ３１５，Ｍ，Ｍｕ５０。
【００５３】
８つのうち６つは、現在配列決定されている６つのブドウ球菌ゲノムの全てにおいて保存されており、そして残りの２つは、これらのゲノムの５／６において存在している。
【００５４】
以下は、ＤＮＡおよび蛋白質配列のリストである：
【００５５】
【数１】
2010047581.tif 000006
【００５６】
【数２】
2010047581.tif 000007
【００５７】
【数３】
2010047581.tif 000008
【００５８】
【数４】
2010047581.tif 000009
【００５９】
【数５】
2010047581.tif 000010
【００６０】
【数６】
2010047581.tif 000011
【００６１】
【数７】
2010047581.tif 000012
【００６２】
【数８】
2010047581.tif 000013
【００６３】
【数９】
2010047581.tif 000014
【００６４】
【数１０】
2010047581.tif 000015
【００６５】
【数１１】
2010047581.tif 000016
【００６６】
【数１２】
2010047581.tif 000017
【００６７】
【数１３】
2010047581.tif 000018
【００６８】
【数１４】
2010047581.tif 000019
【００６９】
〔一次構造分析：〕
バイオインフォマティクス的なアプローチを、一次構造および機能予測のために使用した（図１）。蛋白質ＲｒｋＮおよびＤｓｑＡは、前述のＭＳＣＲＡＭＭと類似した構造組織（structural organization）を有した。ＲｒｋＮは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅ
ｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓそれぞれのＰｌｓ／Ａａｐ蛋白質と構造において類似していた。それは、ＰｌｓおよびＡａｐと４０％同一性を示す２００残基ドメインをそのＮ末端に含む。該蛋白質のＣ末端は、主に、１２８残基繰り返しドメイン（repeat domain）（これは
、株ごとに繰り返し数が変化する）から構成されている。これらの繰り返しはまた、ＰｌｓおよびＡａｐに存在している。推定ｓａｒ相同体ならびにｆｎｂｐＡおよびｆｎｂｐＢは、該ゲノムにおいてＲｒｋＮから直接上流に位置している。
【００７０】
ＤｓｑＡは、蛋白質のＳｄｒファミリーと構造組織において類似している。それは、典型的なＡドメイン、続いてＴＹＹＦＴＤＶＫモチーフ（これは、Ｓｄｒ蛋白質の全てにおいて見られる保存されたＴＹＴＦＴＶＹＶＤモチーフに類似している）を含んでいる。このモチーフの機能は、まだ、決定されなければならない。２つの８８残基繰り返しドメインが、該蛋白質の中央に存在し、これに、Ｓｄｒ蛋白質において見られるＳＤ−繰り返しモチーフと類似したＣ−末端ＳＸ−繰り返しモチーフが続く。この繰り返しのサイズは、株ごとに変化する。ＤｓｑＡは、該ゲノムにおいてｓｅｃＹおよびｓｅｃＡに隣接している。ＤｓｑＡ相同体（＞９０％同一）はまた、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおいて見られる。
【００７１】
ＫｎｋＡは、その配列に繰り返しドメインを含まない。二次構造予測分析は、この蛋白質が、主としてアルファ−ヘリックスから構成されることを示す。
【００７２】
ＲｋａＳは、その配列に繰り返しドメインを含まない。ＢＬＡＳＴ分析は、それが、５’ヌクレオチダーゼＵＤＰ−糖ヒドロラーゼと類似していることを示す。ＲｋａＳをコードする遺伝子は、ｏｒｆＸ（ｍｅｃエレメントの挿入部位）から直接上流に位置する。
【００７３】
ＫｅｓＫは、３８％同一である２つの１４０残基繰り返しドメインを該蛋白質のＮ末端
に含む。ヒドロパシープロット分析（hydropathy plot analysis）（Kyte and Doolittle, 1982）は、該蛋白質の中央に大きな親水性ドメインが存在することを示す（残基５００−５６０）。
【００７４】
ＥｋｅＳは、３８％同一である２つの３００残基繰り返しドメインを該蛋白質の中央に含む。ブラスト分析（Blast analysis）は、該蛋白質のＮ末端（残基１−１２６８、両方の繰り返しを有する）がＦｍｔＢ［１７タンデム繰り返し（tandem repeats）を有するＬＰＸＴＧ蛋白質］と４９％同一であることを示す。ｆｍｔＢの不活性化がメチシリン耐性を撤廃する（abolishes）ために、ＦｍｔＢは、メチシリン耐性に間接的に関与している
と提案されている。これは、細胞壁前駆体グルコサミン−１−ホスフェートの産生を増加させることによってメチシリン感受性が緩和され得るので、細胞壁組成に影響を与えることに起因するようである（Komatsuzawa et al., 2000）。
【００７５】
ＫｒｋＮおよびＫｒｋＮ２は、ゲノムにおいて互いに隣接している。
【００７６】
〔発現分析：〕
蛋白質データベースに配列相同性が不足しているために、これらの蛋白質の各々についての推定機能を予測することができず、そして従って、分子的アプローチを行った。ｏｒｆｓの４つの特有の領域を、Ｑｉａｇｅｎ  ｐＱＥ−３０発現系を使用して、組換えｈｉｓ−タグ融合蛋白質（recombinant his-tagged fusion proteins）として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。図２は、精製Ｎ末端ｈｉｓタグ融合蛋白質のクマシー染色された（Coomassie stained）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。組換え蛋白質ＲｒｋＮ１、ＤｓｑＡ
２、ＫｅｓＫ１およびＫｎｋＡを使用し、ウサギにおいて抗体を産生させた。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞壁抽出物のウェスタンブロッティング分析は、ＫｅｓＫ、ＫｎｋＡおよびＤｓｑＡが発現されそして細胞壁結合されている（cell wall-associated）ことを示した（図３）。株ｅＭＲＳＡ−１６は、ｋｎｋＡ遺伝子を欠いているために、ｋｎｋＡ陰性株を示す。６５ｋＤａの免疫反応性バンドは、株８３２５−４の指数増殖期および定常期の両方の細胞由来の細胞壁分画と反応する（図３、Ｂ）。株ｅＭＲＳＡ−１６においてこのバンドが存在しないことは、それがｋｎｋＡの遺伝子産物を示すことを示唆している。
【００７７】
抗−ＫｅｓＫ抗体を使用しての株８３２５−４の細胞壁分画のウェスタンイムノブロッティングは、指数増殖期および定常期の両方の培養物において１５０ｋＤａ免疫反応性バンドを同定した。発現プラスミド（ｐＫＳ８０）において全長ＫｅｓＫを発現するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓの細胞壁分画から放出された同様なサイズの免疫反応性蛋白質は、１５０ｋＤａバンドがｋｅｓＫ遺伝子産物を示すことを示唆する（データを示していない）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおけるｋｅｓＫノックアウト突然変異体が、細胞壁放出されるＫｅｓＫ蛋白質のサイズを確認するために必要とされるだろう。
【００７８】
抗−ＤｓｑＡ抗体を使用してのＳ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＳＳＡおよびｅＭＲＳＡ−１６の細胞壁分画のウェスタンイムノブロッティングは、１３０ｋＤａ免疫反応性バンドを同定した。発現レベルは、定常期細胞においてより高い。
【００７９】
〔Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓにおける異種発現：〕
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ表面蛋白質の異種発現は、蛋白質機能を研究するためのツールとして既に使用されている（Sinha et al., 2000）。この研究において、この代替系（surrogate system）は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの表面において、インシリコ予側された（in silico-predicted）ＭＳＣ
ＲＡＭＭの各々を発現させて、機能を探るために使用される。ＫｅｓＫおよびＫｎｋＡは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓへクローン化され、そしてドットブロッティング（dot blotting）によって表面発現されることが示された（図４）。交差反応は、ネガティブコントロール（
挿入物（insert）を含まないｐＫＳ８０プラスミド）を用いて観察されず、これが特異的反応であることを示す。ｐＫＳ−ＫｎｋＡおよびｐＫＳ−ＫｅｓＫを有するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓの細胞壁およびプロトプラスト分画を、リゾチームおよびムタノリシン（mutanolysin）を用いての細胞の消化によって作製し、そしてそれぞれ、抗−
ＫｎｋＡおよび抗−ＫｅｓＫ抗体を使用してのウェスタンブロッティング研究において使用した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいて観察されたものとは異なり、ＫｎｋＡは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの細胞壁分画において検出されなかったが、プロトプラスト分画と結合されることが判った。ＫｎｋＡの固着モチーフ（anchoring motif）は、それがスレオニンの代わり
にアラニン残基を含有する（即ち、ＬＰＫＡＧ）という点で、コンセンサスＬＰＸＴＧ配列とは異なる（表１）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは２つのソルターゼ（sortase）遺伝子、ｓｒ
ｔＡおよびｓｒｔＢを含むことが、最近発表された（Pallen, 2001）。ＬＰＸＴＧモチーフのこの変異形態は第二ソルターゼ遺伝子（これは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓには存在しない）によって処理されることが可能である。これはまた、細胞壁ソーティングシグナル（cell
wall sorting signal）は切断されていなかったので、プロトブラスト分画において観察されたＫｎｋＡ蛋白質のサイズの僅かな増加を説明する。
【００８０】
ＫｅｓＫは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの細胞壁分画において検出されたが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの細胞壁から放出されたＫｅｓＫ蛋白質よりも少ない分子量で移動した。Ｌ．ｌａｃｔｉｓの表面において発現されるＭＳＣＲＡＭＭの大部分は、細胞壁抽出手順の間に、蛋白質分解の傾向がある（Louise O'Brien, personal communication）。従って、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの表面から放出されたＫｅｓＫ蛋白質がＫｅｓＫの先を切り取った形態（truncated form）を示すことが可能である。リゾチームおよびムタノリシンでのより短い消化時間が、蛋白質分解の程度を制限することが示された。
【００８１】
〔インビボにおけるインシリコ予測されるＭＳＣＲＡＭＭの発現：〕
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染から回復した３３患者からの回復期（convalescent-phase）血清を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて精製Ｎ末端ｈｉｓタグ融合蛋白質（purified N-terminal his-tag fusion proteins）を認識するそれらの能力を試験した。子供および健康な血
液ドナーからのプールした血清を、ネガティブコントロールとして使用した。陽性反応は、該ネガティブコントロールの値の二倍に等しいか又はそれ以上の値の場合に採用した。図５Ａ〜５Ｄは、全ての蛋白質が、患者の２７〜４２％によって認識されたことを示し、これらの蛋白質がインビボで発現されそして宿主の感染の間に免疫原性であることを示す。
【００８２】
〔参考文献：〕
【００８３】
【表５】
2010047581.tif 000020
【００８４】
〔実施例２：Ｓ．Ａｕｒｅｕｓおよびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からの交差反応性蛋白質の単離および配列決定〕
Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）蛋白質と構造的に関連する表面蛋白質を含有することが、最近示された（US 09/386,962）。Ｓ
．ａｕｒｅｕｓ由来の１つの蛋白質は、それがＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおけるものに近い相同体を有するので、特に興味深い。該蛋白質は、ＤｓｑＡまたはＳａｓＡ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ならびにＤｇｓＫ（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）と呼ばれる。それらは、約５００アミノ酸残基の典型的な“Ａ”ドメイン、続いて８８残基の２つのＢ繰り返し（これらは、〜４０％同一である）、および特有のＳＸＳＸジペプチド繰り返し（これは、株に依存して長さが変化し得る）によって特徴付けられる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤｓｑＡ／ＳａｓＡのＡドメイン内に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ蛋白質ＲｒｋＮ、ＰｌｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ蛋白質Ａａｐの領域Ａ内の類似のサイズのドメインとの〜４０％同一性を有する１８０残基領域が含まれる。ＤｓｑＡ／ＳａｓＡおよびＤｇｓＫ蛋白質のＡ領域は、アミノ酸レベルで４６％同一であり、ＢＢ繰り返しは５０％同一である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌蛋白質の両方を認識する、ワクチン、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む、能動および受動免疫化戦略は、本発明の主題である。
【００８５】
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌およびＳ．ａｕｒｅｕｓと交差反応する抗体の具体例。
【００８６】
【数１５】
2010047581.tif 000021
【００８７】
Ａａｐ蛋白質およびそれをコードするＤＮＡの全配列を（Ａドメインの存在を示しながら）、以下に示す：
【００８８】
【数１６】
2010047581.tif 000022
【００８９】
【数１７】
2010047581.tif 000023
【００９０】
【数１８】
2010047581.tif 000024
【００９１】
【数１９】
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【００９２】
〔蛋白質産生および精製〕
ＰＣＲを使用して、ＤｇｓＫまたはＳａｓＡのＡドメインを、上記の配列から増幅させ、そしてＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターＰＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）［これは、６つのヒスチジン残基を含む組換え融合蛋白質の発現を可能にする］へサブクローン化した。引き続いて、このベクターをＥ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ  ５５１５１へ形質転換し、０．７の光学密度（ＯＤ600）まで１５リットル発酵槽において増殖させ、そして４時間０．２ｍＭイ
ソプロピル−１−ベータ−Ｄガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。細胞を、ＡＧ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ中空糸アッセンブリ（細孔サイズ（pore size）０．４５□ｍ）を
使用して収獲し、そして細胞ペーストを−８０℃で凍結させた。細胞を、１１００ｐｓｉでｔｈｅ  Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓを通過させる２回パスを使用して１×ＰＢＳ（１０ｍＬ緩衝液／１ｇ細胞ペースト）において溶解させた。溶解した細胞を、３０分間１７，０００ｒｐｍでスピンダウンさせて（spun down）、細胞残骸を除去した。上清みを、０
．１Ｍ  ＮｉＣｌ2を充填させた５−ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）カラムに通過させた。ローディングした（loading）後、カラムを、１０
ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（緩衝液Ａ）の５カラム容積で洗浄した。蛋白質を、３０カラム容積に渡って、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  イミダゾール（緩衝液Ｂ）の０〜１００％勾配を使用して溶出した。ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３またはＳｄｒＧＮ２Ｎ３は、〜１３％緩衝液Ｂ（〜２６ｍＭイミダゾール）で溶出した。２８０ｎｍでの吸光度をモニターした。ＳｄｒＧＮ１Ｎ２Ｎ３またはＳｄｒＧＮ２Ｎ３を含有する分画を、１×ＰＢＳで透析した。
【００９３】
次いで、各蛋白質を、エンドトキシン除去プロトコル（endotoxin removal protocol）に通した。このプロトコルの間に使用した緩衝液は、５−ｍＬ  Ｍｏｎｏ−Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを通過させることによって、内毒素フリーにさせた。蛋白質を、４×１５ｍＬチューブに等しく分割した。各チューブの容積は、緩衝液Ａを用いて９ｍＬにされた。１ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を各チューブに添
加し、そして４℃で１時間回転しながらインキュベートした。チューブを３７℃水浴に配置して相分離させた。チューブを１０分間２，０００ｒｐｍでスピンダウンさせ、そして各チューブからの上部の水相を回収し、そして洗剤抽出（detergent extraction）を繰り返した。第２番目の抽出からの水相を合わせ、そして０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2をチャージし
た５−ｍＬ  ＩＤＡ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ）カラムを通過させて、残っている洗剤を除去した。カラムを緩衝液Ａの９カラム容積で洗浄し、その後、該蛋白質を緩衝液Ｂの３カラム容積で溶出した。溶離液（eluant）を、５−ｍＬ  Ｄｅｔｏｘｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）カラムを通過させ、フロースルー（flow-through）を回収し、そしてカラムへ再適用した。第２通過からのフロースルーを回収し、そして１×ＰＢＳにおいて透析した。精製産物を、濃度、純度およびエンドトキシンレベルについて分析し、その後マウスへ投与した。
【００９４】
〔モノクローナル抗体産生〕
Ｅ．ｃｏｌｉ発現および精製された組換えＳａｓＡおよびＤｓｇＫ蛋白質を、マウスモノクローナル抗体のパネル（panel）を産生するために使用し、一方、マウス血清を、ポ
リクローナル抗体のソース（source）として使用した。手短に言えば、Ｂａｌｂ／ＣまたはＳＪＬマウスのグループに、以下の表において以下に記載されるように溶液状態のまたはアジュバントと混合されている１〜１０ｍｇの蛋白質の一連の皮下免疫化（subcutaneous immunizations）を受容させた。
【００９５】
〔免疫化スキーム〕
【００９６】
【表６】
2010047581.tif 000026
【００９７】
犠牲（sacrifice）（ＲＩＭＭＳ）時またはブースト（boost）（慣用的）後７日に、血清を回収し、そしてＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）蛋白質に対するまたは全細胞（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ａｕｒｅｕｓ）についてのＥＬＩＳＡアッセイにおいて力価を測定した。最終ブースト３日後に、脾臓またはリンパ節を除去し、単一細胞懸濁へ掻き裂き（teased）、そしてリンパ球を収獲した。次いで、リンパ球をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３メラノーマ細胞系（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８０）へ融合させた。細胞融合、引き続いてプレート化（plating）および栄養補給（feeding）を、Current Protocols in Immunologyからのthe Production of Monoclonal Antibodies protocol（Chapter 2, Unit 2）［本明細書中で参考として援用される］に従って行った。
【００９８】
次いで、該融合物から産生されたクローンを、標準ＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異的抗−ＳａｓＡ抗体産生についてスクリーンした（screened）。陽性クローンを増やしそしてフローサイトメトリーにより全細菌細胞結合アッセイにおける活性についてそしてＢ
ｉａｃｏｒｅ分析によりＳａｓＡ結合について更に試験した。
【００９９】
〔Ｂｉａｃｏｒｅ分析〕
該分析の間、流速（flow rate）は１０ｍｌ／分で一定のままであった。ＳａｓＡまた
はＤｇｓＫ注射の前に、試験抗体を、ＲＡＭ−Ｆｃ結合を介してチップ（chip）へ吸着させた。時間０の際、３０ｍｇ／ｍｌの濃度のＳａｓＡまたはＤｇｓＫを、３分間チップ上に注射し、続いて２分間解離した（dissociation）。この段階の分析によって、Ｍａｂ／ＳａｓＡまたはＤｇｓＫ相互作用の相対的結合および解離動力学（the relative association and disassociation kinetics）が測定された。
【０１００】
〔全細菌への結合〕
細菌サンプルＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ６７−０、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ３９７（Ｓａｌ６）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｗｏｏｄ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ８３２５−４、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ  １６、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  ３５９８４、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＨＢ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＣＮ−８９９およびＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ４３２５３を回収し、洗浄し、そしてウサギＩｇＧ（５０ｍｇ／ｍｌ）でブロッキングした後の２μｇ／ｍｌの濃度のＭａｂまたはＰＢＳのみ（コントロール）と共にインキュベートした。抗体と共のインキュベーション後、細菌細胞を、ヤギ−Ｆ(ab')2−抗−マウス−Ｆ(ab')2−ＦＩＴＣ（これは、検出抗体として役立った）と共にインキュベーションした。抗体標識後、細菌細胞を、ＦＡＣＳカリバーフローサイトメーター（FACScaliber flow cytometer）を介して吸引して、蛍光放出を分析した（励起：４８８、放出：５７０）。各細菌株について、１０，０００事象（events）を回収しそして測定した。これらのデータは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳａｓＡに対する抗体がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の表面上の相同な蛋白質を認識し得たことを示す。該データは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳａｓＡに対するウサギポリクローナル抗体がＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＨＢの細胞表面から放出された蛋白質ならびにＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからクローン化されたＤｓｇＫ由来の組換えＡ−領域と交差反応することを実証するウェスタンブロット分析を支持する（下記の表および図６を参照のこと）。
【０１０１】
【表７】
2010047581.tif 000027
【図１−１】
2010047581.tif 000028
【図１−２】
2010047581.tif 000029
【図２】
2010047581.tif 000030
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2010047581.tif 000034
【図５Ｃ】
2010047581.tif 000035
【図５Ｄ】
2010047581.tif 000036
【図６】
2010047581.tif 000037
【配列表】
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