(57)【要約】      （修正有）【課題】糖脂質アシル基転移酵素変異体を製造する方法の提供。【解決手段】（ａ）アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個又は複数である）を含むことを特徴とする糖脂質アシル基転移酵素である親酵素を選択するステップと、（ｂ）１個又は複数のアミノ酸を改変して糖脂質アシル基転移酵素変異体を製造するステップと、（ｃ）前記糖脂質アシル基転移酵素変異体をガラクト脂質基質並びに場合によりリン脂質基質及び／又は場合によりトリグリセリド基質に対する転移酵素活性場合により加水分解活性について試験するステップと、（ｄ）ガラクト脂質に対して前記親酵素よりも活性が高い酵素変異体を選択するステップと、場合により（ｅ）多量の前記酵素変異体を調製するステップを場合により含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質転移酵素活性が向上した脂質アシル基転移酵素変異体であって、前記酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、ただしＸが、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１又は複数であり、前記酵素変異体が、親配列と比較して以下のアミノ酸残基：
Ｓ３Ｎ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｐ又はＭ；
Ｄ１５７Ｓ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、Ｑ、Ｋ又はＣ；
Ｓ３１０Ｔ；
３１８Ｅ；
Ｅ３０９Ｒ、Ｅ、Ｌ、Ｒ又はＡ；
Ｙ１７９Ｄ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、Ｑ又はＳ；
Ｎ２１５Ｓ、Ｌ、Ｒ又はＹ；
Ｋ２２Ｅ、Ｒ、Ｃ又はＡ；
Ｑ２８９Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｐ又はＮ；
Ｍ２３Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ又はＳ；
Ｈ１８０Ｑ、Ｒ又はＫ；
Ｍ２０９Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、Ｖ又はＬ；
Ｌ２１０Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｗ又はＭ；
Ｒ２１１Ｔ；
Ｐ８１Ｇ；
Ｖ１１２Ｃ；
Ｎ８０Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｐ、Ｔ、Ｅ、Ｖ、Ａ又はＧ；
Ｌ８２Ｎ、Ｓ又はＥ；
Ｎ８８Ｃ；
Ｎ８７Ｍ又はＧ
の１又は複数において１又は複数のアミノ酸改変を含み、
アミノ酸残基の番号付与が前記変異体配列と配列番号２の基準配列とのアラインメントから得られる、変異体。
【請求項２】
食料品を調製する方法であって、請求項１に記載の脂質アシル基転移酵素変異体を食料品の１又は複数の成分に添加するステップを含む方法。
【請求項３】
焼いた生成物を生地から調製する方法であって、請求項１に記載の脂質アシル基転移酵素変異体を前記生地に添加するステップを含む方法。
【請求項４】
卵又は卵を主成分とする生成物を処理してリゾリン脂質を製造する方法における、請求項１に記載の脂質アシル基転移酵素変異体の使用。
【請求項５】
植物油又は食用油の酵素精練方法であって、極性脂質（例えば、リン脂質及び／又は糖脂質）の主要な部分を加水分解するために、請求項１に記載の脂質アシル基転移酵素変異体で前記食用油又は植物油を処理するステップを含む方法。
【請求項６】
食用油のリン脂質含有量を削減する方法における請求項１に記載の脂質アシル基転移酵素変異体の使用であって、前記リン脂質の主要な部分を加水分解するために前記脂質アシル基転移酵素変異体で前記油を処理するステップと、加水分解されたリン脂質を含む水相を前記油から分離するステップとを含む使用。
【請求項７】
炭水化物エステル及び／又はタンパク質エステル及び／又はタンパク質サブユニットエステル及び／又はヒドロキシ酸エステルなどの高価な生成物を製造するための極性脂質（好ましくは糖脂質）の生物変換における、請求項１に記載の脂質アシル基転移酵素変異体の使用。
【請求項８】
請求項１に記載の固定化脂質アシル基転移酵素変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素変異体の製造方法に関する。本発明は、さらに、新規酵素変異体及びこれらの新規酵素変異体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の関連出願を参照されたい。１９９９年７月２０日に出願された米国出願第０９／７５０，９９０号、米国出願第１０／４０９，３９１号、２００３年７月２３日に出願された米国出願第６０／４８９，４４１号、２００３年１２月２４日に出願された英国出願第０３３００１６．７号及び２００４年１月１５日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００６５５号。本文中又はこれらの出願手続き中のこれら各出願、これらの各出願において引用された各文献（「出願引用文献」）及び出願引用文献において参照又は引用された各文献、並びにかかる手続き中に提出された特許性を支持するすべての意見書を参照により本明細書に援用する。本文においてはさまざまな文献も引用される（「本願引用文献」）。本願引用文献の各々及び本願引用文献中で引用又は参照された各文献を参照により本明細書に援用する。
【０００３】
脂質：コレステロール アシル基転移酵素はかねてから知られている（例えば、Buckley - Biochemistry 1983, 22, 5490-5493を参照されたい）。特に、植物及び／又は哺乳動物のＬＣＡＴ（lecithin:cholesterol acyltransferase）のように、ホスファチジルコリンとコレステロール間の脂肪酸の移動を触媒するＧＣＡＴ（glycerophospholipid:cholesterol acyl transferase）が見出された。
【０００４】
Upton and Buckley (TIBS 20, May 1995, p178-179)及びBrumlik and Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996, p2060-2064)は、水性媒体中でアルコール受容体へのアシル基転移を起こすことができる、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）由来のリパーゼ／アシル基転移酵素を教示している。
【０００５】
この酵素に対して、アエロモナス・ヒドロフィラ アシル基転移酵素の推定上の基質結合ドメイン及び活性部位が特定された（例えば、Thornton et al 1988 Biochem. et Biophys. Acta. 959, 153-159及びHilton & Buckley 1991 J. Biol. Chem. 266, 997-1000参照）。
【０００６】
Buckley et al (J. Bacteriol 1996, 178(7) 2060-4)は、Ｓｅｒ１６、Ａｓｐ１１６及びＨｉｓ２９１が、酵素活性を維持するために保持されなければならない必須アミノ酸であることを示した。
【０００７】
Robertson et al (J. Biol. Chem. 1994, 269, 2146-50)は、アエロモナス・ヒドロフィラ アシル基転移酵素のいくつかの特定の変異、すなわちＹ２２６Ｆ、Ｙ２３０Ｆ、Ｙ３０Ｆ、Ｆ１３Ｓ、Ｓ１８Ｇ、Ｓ１８Ｖを教示した。これらは本発明に包含されない。
【特許文献１】米国出願第０９／７５０，９９０号
【特許文献２】米国出願第１０／４０９，３９１号
【特許文献３】米国出願第６０／４８９，４４１号
【特許文献４】英国出願第０３３００１６．７号
【特許文献５】国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００６５５号
【非特許文献１】Buckley - Biochemistry 1983, 22, 5490-5493
【非特許文献２】Upton and Buckley (TIBS 20, May 1995, p178-179)
【非特許文献３】Brumlik and Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996, p2060-2064)
【非特許文献４】Thornton et al 1988 Biochem. et Biophys. Acta. 959, 153-159
【非特許文献５】Hilton & Buckley 1991 J. Biol. Chem. 266, 997-1000
【非特許文献６】Buckley et al (J. Bacteriol 1996, 178(7) 2060-4)
【非特許文献７】Robertson et al (J. Biol. Chem. 1994, 269, 2146-50)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、脂質アシル基転移酵素を含むＧＤＳｘの特定の変異体の発見に基づく。この変異体は転移酵素活性が親酵素よりも高い。特に、本発明による変異体は、アシル供与体としてガラクト脂質を用いた転移酵素活性が親酵素よりも高い。これらの脂質アシル基転移酵素を本明細書では糖脂質アシル基転移酵素と称する。本発明による変異体は、さらに、アシル供与体としてガラクト脂質を用いた転移酵素活性とリン脂質転移酵素活性の比（ＧＬ：ＰＬ比）及び／又はアシル供与体としてガラクト脂質を用いた転移酵素活性とガラクト脂質加水分解活性の比（ＧＬｔ：ＧＬｈ比）が親酵素よりも高い場合がある。
【０００９】
第１の態様によれば、本発明は、糖脂質アシル基転移酵素変異体を製造する方法であって、（ａ）アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個又は複数である）を含むことを特徴とする脂質アシル基転移酵素である親酵素を選択するステップと、（ｂ）１個又は複数のアミノ酸を改変して脂質アシル基転移酵素変異体を製造するステップと、（ｃ）前記脂質アシル基転移酵素変異体をガラクト脂質基質並びに場合によりリン脂質基質及び／又は場合によりトリグリセリド基質に対する活性について試験するステップと、（ｄ）ガラクト脂質に対して前記親酵素よりも活性が高い酵素変異体を選択するステップと、場合により（ｅ）多量の前記酵素変異体を調製するステップを含む方法を提供する。
【００１０】
別の態様においては本発明は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個又は複数である）を含むことを特徴とする糖脂質アシル基転移酵素変異体であって、（以下に規定される）セット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されるアミノ酸残基の任意の１個又は複数において、親配列と比較して１個又は複数のアミノ酸改変を含む変異体を提供する。
【００１１】
さらに別の態様においては、本発明は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個又は複数である）を含むことを特徴とする糖脂質アシル基転移酵素変異体であって、Ｐ１０４８０結晶構造座標と本明細書に教示される１ＩＶＮ．ＰＤＢ及び／又は１ＤＥＯ．ＰＤＢとの構造アラインメントによって好ましくは得られる、本明細書に規定されるＰ１０４８０の構造モデルと親配列が構造的にアラインメントさせることによって特定される（以下に規定される）セット２又はセット４又はセット６又はセット７に詳述されるアミノ酸残基の任意の１個又は複数において、親配列と比較して１個又は複数のアミノ酸改変を含む、糖脂質アシル基転移酵素変異体を提供する。
【００１２】
本発明は、さらに、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個又は複数である）を含むことを特徴とする糖脂質アシル基転移酵素変異体であって、親配列がｐｆａｍコンセンサス配列（配列番号１）とアラインメントさせたときに特定され、教示されるとおりに最も良く一致するようにＰ１０４８０の構造モデルに従って改変される（図５５参照）セット２に教示されるアミノ酸残基の任意の１個又は複数において親配列と比較して１個又は複数のアミノ酸改変を含む、糖脂質アシル基転移酵素変異体を提供する。
【００１３】
別の態様によれば、本発明は、配列番号２との配列アラインメントによって特定される（以下に規定される）セット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されるアミノ酸残基の任意の１個又は複数における１個又は複数のアミノ酸改変を除いて、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、又は配列番号４５のアミノ酸配列を含む糖脂質アシル基転移酵素変異体を提供する。
【００１４】
さらに別の態様においては本発明は、Ｐ１０４８０結晶構造座標と本明細書に教示される１ＩＶＮ．ＰＤＢ及び／又は１ＤＥＯ．ＰＤＢとの構造アラインメントによって好ましくは得られる、本明細書に規定されるＰ１０４８０の構造モデルと親配列が構造的にアラインメントさせることによって特定されるセット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されるアミノ酸残基の任意の１個又は複数における１個又は複数のアミノ酸改変を除いて、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３又は配列番号４５のアミノ酸配列を含む糖脂質アシル基転移酵素変異体を提供する。
【００１５】
別の態様によれば、本発明は、親配列がｐｆａｍコンセンサス配列（配列番号１）とアラインメントさせたときに特定され、教示されるとおりに最も良く一致するようにＰ１０４８０の構造モデルに従って改変される（図５５参照）セット２に教示されるアミノ酸残基の任意の１個又は複数における１個又は複数のアミノ酸改変を除いて、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３又は配列番号４５のアミノ酸配列を含む糖脂質アシル基転移酵素変異体を提供する。
【００１６】
本発明は、さらに、本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体を用いて糖脂質（例えば、ＤＧＤＧ（digalactosyl diglyceride）又はＭＧＤＧ（monogalactosyl diglyceride））を処理して部分加水分解生成物、すなわちリゾ糖脂質を生成することによってリゾ糖脂質、例えばＤＧＭＧ（digalactosyl monoglyceride）又はＭＧＭＧ（monogalactosyl monoglyceride）を調製するために、本発明による糖脂質分解（glycolipolytic）酵素変異体又は本発明による方法によって得られる糖脂質分解酵素変異体を基質（好ましくは食料品）の製造に使用することを提供する。
【００１７】
さらに別の態様においては、本発明は、本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体を用いてリン脂質（例えば、レシチン）を処理して部分加水分解生成物、すなわち、リゾリン脂質を製造することによって、リゾリン脂質、例えばリゾレシチンを調製するために、本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体を基質（好ましくは食料品）の製造に使用することを提供する。
【００１８】
一態様においては本発明は、食料品を調製する方法であって、本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体を食料品の１個又は複数の成分に添加するステップを含む方法に関する。
【００１９】
本発明の別の態様は、焼いた生成物を生地から調製する方法であって、本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体を生地に添加するステップを含む方法に関する。
【００２０】
本発明の別の態様においては、リゾリン脂質を製造するための卵を主成分とする生成物の製造における本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体の使用が提供される。
【００２１】
別の態様においては、本発明による脂肪分解酵素変異体を卵又は卵を主成分とする生成物に添加してリゾリン脂質を製造するステップを含む、卵又は卵を主成分とする生成物を処理する方法が提供される。
【００２２】
本発明の変異体は、国際公開第０２／０６５８５４号と同様に、即席めん類などのスナック食品の製造方法に使用することができる。
【００２３】
本発明は、例えば（本明細書の「技術的効果」に記載されるものなどの）食料品において好ましい技術的効果又は技術的効果の組み合わせをもたらす本発明による脂質アシル基転移酵素変異体の使用に関する。
【００２４】
本発明の別の態様は、植物油又は食用油の酵素精練方法であって、極性脂質（例えば、リン脂質及び／又は糖脂質)の主要な部分を加水分解するために、本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体を用いて食用油又は植物油を処理するステップを含む方法を提供する。
【００２５】
別の態様においては本発明は、脂肪アシル基を加水分解するためにリン脂質を処理するステップを含む方法であって、本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体と前記リン脂質を混合するステップを含む方法を提供する。
【００２６】
別の態様においては本発明は、食用油のリン脂質含有量を削減する方法であって、前記リン脂質の主要な部分を加水分解するために、本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体を用いて前記食用油を処理するステップと、加水分解されたリン脂質を含む水相を前記食用油から分離するステップとを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体を調製する方法であって、前記脂肪分解酵素変異体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸によって、前記脂肪分解酵素のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現することができる宿主細胞を形質転換するステップと、前記核酸が発現される条件下で形質転換宿主細胞を培養するステップと、前記脂肪分解酵素変異体を収集するステップとを含む方法も提供する。
【００２８】
さらに別の態様においては本発明は、炭水化物エステル及び／又はタンパク質エステル及び／又はタンパク質サブユニットエステル及び／又はヒドロキシ酸エステルなどの高価な生成物を製造するための極性脂質（好ましくは糖脂質）の生物変換における、本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体の使用に関する。
【００２９】
極性脂質（好ましくは糖脂質）を高価な生成物に生物変換する方法であって、本発明による脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる脂肪分解酵素変異体と前記極性脂質を混合するステップを含む方法。
【００３０】
本発明は、さらに、本発明による固定化脂肪分解酵素変異体又は本発明による方法によって得られる固定化脂肪分解酵素変異体に関する。
【００３１】
本発明の態様は特許請求の範囲及び以下の注解にある。
【００３２】
本発明に使用することができるヌクレオチド配列に関する他の態様としては、本発明の配列を含む構築体、本発明に使用される配列を含むベクター、本発明に使用される配列を含むプラスミド、本発明に使用される配列を含む形質転換細胞、本発明に使用される配列を含む形質転換組織、本発明に使用される配列を含む形質転換器官、本発明に使用される配列を含む形質転換宿主、本発明に使用される配列を含む形質転換生物などが挙げられる。本発明は、それを移す方法を含めて、宿主細胞中での発現など、それを使用して本発明に使用されるヌクレオチド配列を発現させる方法も包含する。本発明は、さらに、宿主細胞からの単離などヌクレオチド配列を単離する方法も包含する。
【００３３】
本発明に使用されるアミノ酸配列に関する他の態様としては、本発明に使用されるアミノ酸配列をコードする構築体、本発明に使用されるアミノ酸配列をコードするベクター、本発明に使用されるアミノ酸配列をコードするプラスミド、本発明に使用されるアミノ酸配列を発現する形質転換細胞、本発明に使用されるアミノ酸配列を発現する形質転換組織、本発明に使用されるアミノ酸配列を発現する形質転換器官、本発明に使用されるアミノ酸配列を発現する形質転換宿主、本発明に使用されるアミノ酸配列を発現する形質転換生物などが挙げられる。本発明は、それを移し、次いでアミノ酸配列を精製する方法を含めて、宿主細胞中での発現など、それを使用して本発明に使用されるアミノ酸配列を精製する方法も包含する。
【００３４】
参照を容易にするために、本発明のこれらの態様及び別の態様を適切な項の表題のもとで以下に考察する。しかし、各項の教示は各個別の項に必ずしも限定されない。
【００３５】
セットの定義
アミノ酸セット１：
アミノ酸セット１（これらは１ＩＶＮ中のアミノ酸であることに留意されたい−図５７及び図５８）。
Ｇｌｙ８、Ａｓｐ９、Ｓｅｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｔｙｒ１５、Ｇｌｙ４４、Ａｓｐ４５、Ｔｈｒ４６、Ｇｌｕ６９、Ｌｅｕ７０、Ｇｌｙ７１、Ｇｌｙ７２、Ａｓｎ７３、Ａｓｐ７４、Ｇｌｙ７５、Ｌｅｕ７６、Ｇｌｎ１０６、Ｉｌｅ１０７、Ａｒｇ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｐｒｏ１１０、Ｔｙｒ１１３、Ｐｈｅ１２１、Ｐｈｅ１３９、Ｐｈｅ１４０、Ｍｅｔ１４１、Ｔｙｒ１４５、Ｍｅｔ１５１、Ａｓｐ１５４、Ｈｉｓ１５７、Ｇｌｙ１５５、Ｉｌｅ１５６、Ｐｒｏ１５８
【００３６】
ＧＤＳｘ、触媒作用残基などの高度に保存されたモチーフはセット１から除外された（下線を引いた残基）。不確かさを回避するために、セット１は、１ＩＶＮモデルの活性部位中のグリセリンの中心炭素原子の１０Å以内にあるアミノ酸残基を規定する。
【００３７】
アミノ酸セット２：
アミノ酸セット２（アミノ酸の番号付与は、Ｐ１０４８０成熟配列中のアミノ酸を参照したものであることに留意されたい）。
Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９及びＶａｌ２９０。
【００３８】
セット２と比較したセット１中の選択された残基の表：
【００３９】
【表１】
2010142243.tif 000002
2010142243.tif 000003
【００４０】
アミノ酸セット３：
アミノ酸セット３はセット２と同一であるが、アエロモナス サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）（配列番号２８）コード配列を指す。すなわち、アミノ酸残基番号は、シグナル配列を含むタンパク質（配列番号２８）と比較した成熟タンパク質（配列番号２）中のアミノ酸番号付与の差を反映して、セット３が１８大きい。
【００４１】
アエロモナス サルモニシダＧＤＳＸ（配列番号２８）とアエロモナス ヒドロフィラＧＤＳＸ（配列番号２６）の成熟タンパク質は５アミノ酸だけ異なる。これらは、Ｔｈｒ３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１８２Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３０９Ａｌａ、Ｓｅｒ３１０Ａｓｎ、Ｇｌｙ３１８−である。サルモニシダ残基は最初に、ヒドロフィラ残基は最後に記載されている（図５９）。ヒドロフィラタンパク質は、わずか３１７アミノ酸長であり、３１８位の残基を欠いている。アエロモナス サルモニシダＧＤＳＸは、ガラクト脂質基質などの極性脂質に対してアエロモナス ヒドロフィラタンパク質よりもかなり高い活性を有する。全５個のアミノ酸位置に対して部位走査（site scanning）が実施された。
【００４２】
アミノ酸セット４：
アミノ酸セット４はＳ３、Ｑ１８２、Ｅ３０９、Ｓ３１０及び−３１８である。
【００４３】
アミノ酸セット５：
Ｆ１３Ｓ、Ｄ１５Ｎ、Ｓ１８Ｇ、Ｓ１８Ｖ、Ｙ３０Ｆ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｅ、Ｄ１５７ Ｎ、Ｙ２２６Ｆ、Ｄ２２８Ｎ Ｙ２３０Ｆ。
【００４４】
アミノ酸セット６：
アミノ酸セット６は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、−３１８である。
【００４５】
セット６におけるアミノ酸の番号付与は、Ｐ１０４８０（配列番号２）におけるアミノ酸残基を参照したものである。他の配列骨格における対応するアミノ酸は、Ｐ１０４８０及び／又は１ＩＶＮに対する相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントによって求めることができる。
【００４６】
アミノ酸セット７：
アミノ酸セット７は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、−３１８、Ｙ３０Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｙ２２６Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｙ２３０Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｓ１８Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ又はＹから選択される）、Ｄ１５７Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹから選択される）である。
【００４７】
セット７におけるアミノ酸の番号付与は、Ｐ１０４８０（配列番号２）におけるアミノ酸残基を参照したものである。他の配列骨格における対応するアミノ酸は、Ｐ１０４８０及び／又は１ＩＶＮに対する相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントによって求めることができる）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
親脂質アシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列、すなわち、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３又は配列番号４５のいずれか１つ又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３又は配列番号４５の配列のいずれか１つと７５％以上が同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００４９】
適切には、本発明による親脂質アシル基転移酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３又は配列番号４５の配列のいずれか１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より少なくとも９８％相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５０】
適切には、親脂質アシル基転移酵素は、以下のヌクレオチド配列、すなわち、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４又は配列番号４６又は配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４又は配列番号４６の配列のいずれか１つと少なくとも７５％以上同一であるヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードすることができる。
【００５１】
適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４又は配列番号４６の配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上同一にすることができる。
【００５２】
親酵素は、基準配列（配列番号２）とアラインメントさせたとき、又はＰ１０４８０の構造モデルと構造的にアラインメントさせたとき、又はｐｆａｍコンセンサス配列とアラインメントさせＰ１０４８０の構造モデルに従って改変されたときに、セット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されるアミノ酸残基の１個又は複数において改変されることが好ましい。
【００５３】
適切には、本酵素変異体は、ガラクト脂質に対する活性とリン脂質及び／又はトリグリセリドに対する活性との比が親酵素よりも高くすることができる。
【００５４】
適切には、本発明による方法は、
（ｉ）ガラクト脂質基質からの転移酵素活性、及び
（ii）リン脂質基質からの転移酵素活性、
について脂質アシル基転移酵素変異体を試験するステップと、
親酵素と比較したときに、ガラクト脂質からの転移酵素活性とリン脂質からの転移酵素活性との比が大きい酵素変異体を選択するステップと
を含むことができる。１個又は複数
【００５５】
適切には、本発明による酵素変異体のガラクト脂質からの転移酵素活性とリン脂質からの転移酵素活性との比は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５とすることができる。
【００５６】
適切には、本発明による方法は、
（ａ）ガラクト脂質基質からの転移酵素活性、及び
（ｂ）ガラクト脂質基質に対する加水分解活性
について脂質アシル基転移酵素変異体を試験するステップと、
ガラクト脂質からの転移酵素活性と糖脂質に対するその加水分解活性との比が親酵素よりも大きい酵素変異体を選択するステップ
を含むことができる。
【００５７】
適切には、ガラクト脂質に対する転移酵素活性とガラクト脂質に対する加水分解活性との比は１を超え、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも４又は少なくとも５とすることができる。
【００５８】
ガラクト脂質及び／又はリン脂質から転移酵素及び加水分解活性を求めるアッセイは、例えば実施例８に教示されている。
【００５９】
「ガラクト脂質に対する高い活性」という用語は、脂質アシル供与体がガラクト脂質であるときに、酵素が親酵素よりも増大された（すなわちより高い）転移酵素活性を有すること（ガラクト脂質転移酵素活性）及び／又はリン脂質転移酵素活性と比較したときにガラクト脂質転移酵素活性の比が親酵素よりも大きいこと（ＧＬｔ：ＰＬｔ比）及び／又はガラクト脂質加水分解活性と比較したときにガラクト脂質転移酵素活性の比が親酵素よりも大きいこと（ＧＬｔ：ＧＬｈ比）を意味する。
【００６０】
適切には、親酵素と比較した本酵素変異体は、高いガラクト脂質転移酵素活性及び同じ又はそれ以下のガラクト脂質加水分解活性を有することができる。換言すれば、適切には、本酵素変異体は、そのガラクト脂質加水分解活性と比較したガラクト脂質転移酵素活性を親酵素よりも高くすることができる。適切には、本酵素変異体は、ガラクト脂質を単純に加水分解するのではなく、ガラクト脂質からアシル受容体にアシル基を優先的に移行することができる。
【００６１】
一実施形態においては、本発明による酵素は、リン脂質に対して親酵素よりも高い転移酵素活性（すなわち、高いリン脂質転移酵素活性）を有することができる。この高いリン脂質転移酵素活性は、ガラクト脂質に対する高い活性とは無関係であり得る。しかし、適切には、本酵素変異体は、高いガラクト脂質転移酵素活性及び高いリン脂質転移酵素活性を有することができる。
【００６２】
一実施形態においては本発明は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個又は複数である）を含むことを特徴とする脂質アシル基転移酵素変異体であって、リン脂質に対して親酵素よりも高い活性、好ましくは高いリン脂質転移酵素活性を有し、セット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されるアミノ酸残基の任意の１個又は複数において親配列と比較して１個又は複数のアミノ酸改変を含む、脂質アシル基転移酵素変異体を提供する。
【００６３】
本明細書では「改変」という用語は、付加、置換及び／又は欠失を意味する。好ましくは「改変」という用語は「置換」を意味する。
【００６４】
不確かさを回避するために、アミノ酸が親酵素において置換されるときには、アミノ酸は親酵素中のその位置に最初に存在したものとは異なるアミノ酸で好ましくは置換されて、酵素変異体を生成する。換言すれば、「置換」という用語は、あるアミノ酸の同じアミノ酸による置換を包含するものではない。
【００６５】
親酵素は、配列番号２及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を含む酵素であることが好ましい。
【００６６】
本酵素変異体は、セット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されるアミノ酸残基の任意の１個又は複数における１個又は複数のアミノ酸改変を除いて、配列番号２のアミノ酸配列を含む酵素であることが好ましい。
【００６７】
一実施形態においては、本酵素変異体は、セット４に規定されるアミノ酸残基の少なくとも１個において親配列と比較した１個又は複数のアミノ酸改変を含むことが好ましい。
【００６８】
適切には、酵素変異体は、親酵素と比較して以下のアミノ酸改変、すなわち、
Ｓ３Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｎ、Ｔ又はＧ
Ｅ３０９Ｑ、Ｒ又はＡ、好ましくはＱ又はＲ
−３１８Ｙ、Ｈ、Ｓ又はＹ、好ましくはＹ
の１個又は複数を含む。
【００６９】
ＧＤＳＸモチーフのＸはＬであることが好ましい。したがって、親酵素は、アミノ酸モチーフＧＤＳＬを含むことが好ましい。
【００７０】
脂質アシル基転移酵素変異体の製造方法は、さらに、以下のステップ、すなわち、
１）構造的相同性マッピング、又は
２）配列相同性アラインメント
の１個又は複数を含むことが好ましい。
【００７１】
適切には、構造的相同性マッピングは、以下のステップ、すなわち、
ｉ）親配列を図５２の構造モデル（１ＩＶＮ．ＰＤＢ）とアラインメントさせるステップ、
ii）（セット１又はセット２に規定されるアミノ酸残基の１個又は複数などの）活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く１０Åの球内の１個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ（図５３参照）、及び
iii）前記親配列においてステップ（ii）に従って選択された１個又は複数のアミノ酸を改変するステップ
の１つ又は複数を含むことができる。
【００７２】
一実施形態においては、選択されるアミノ酸残基は、活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く９Åの球内、好ましくは８、７、６、５、４又は３Åの球内に存在することができる（図５３参照）。
【００７３】
適切には、構造的相同性マッピングは、以下のステップ、すなわち、
ｉ）親配列を図５２の構造モデル（１ＩＶＮ．ＰＤＢ）とアラインメントさせるステップ、
ii）（セット１又はセット２に規定されるアミノ酸残基の１個又は複数などの）活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く１０Åの球内の１個又は複数のアミノ酸を選択するステップ（図５３参照）、
iii）ステップ（ii）によって選択された１個又は複数のアミノ酸残基が高度に保存されている（特に、活性部位残基及び／又はＧＤＳｘモチーフの一部及び／又はＧＡＮＤＹモチーフの一部である）かどうかを求めるステップ、並びに
iv）前記親配列中のステップ（iii）によって特定された保存領域を除いて、ステップ（ii）によって選択された１個又は複数のアミノ酸を改変するステップ
の１つ又は複数を含むことができる。
【００７４】
一実施形態においては、選択されるアミノ酸残基は、活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く９Åの球内、好ましくは８、７、６、５、４又は３Åの球内に存在することができる（図５３参照）。
【００７５】
上記構造的相同性マッピングとは別に、又はそれと組み合わせて、構造的相同性マッピングは、Ｐ１０４８０モデル及び１ＩＶＮが重ね合わされたｐｆａｍアラインメント（アラインメント２、図５６）から誘導される特定のＬＲ（loop region）又はＩＶＲ（介在領域；intervening region）を選択することによって実施することができる。ＬＲ（loop region）又はＩＶＲ（intervening region）は下表に規定されている。
【００７６】
【表２】
2010142243.tif 000004
【００７７】
本発明の一部の実施形態においては、アシル基転移酵素変異体は、セット１〜４及び６〜７のいずれか１個に規定されるアミノ酸の１個又は複数におけるアミノ酸改変を含むだけでなく、上記ＩＶＲ（intervening region）１〜６の１個又は複数における（好ましくはＩＶＲ３、５及び６の１個又は複数における、より好ましくはＩＶＲ５又はＩＶＲ６における）、且つ／又は上記ＬＲ（loop region）１〜５の１個又は複数における（好ましくはＬＲ１、ＬＲ２又はＬＲ５の１個又は複数における、より好ましくはＬＲ５における）少なくとも１個のアミノ酸改変も含む。
【００７８】
一実施形態においては、本発明によるアシル基転移酵素変異体又は本発明による方法によって得られるアシル基転移酵素変異体は、セット２、４、６及び７の１個又は複数によって規定されるだけでなくＩＶＲ１〜６の１個又は複数内（好ましくはＩＶＲ３、５又は６内、より好ましくはＩＶＲ５又はＩＶＲ６内）或いはＬＲ１〜５の１個又は複数内（好ましくはＬＲ１、ＬＲ２又はＬＲ５内、より好ましくはＬＲ５内）にある１個又は複数のアミノ酸改変を含むことができる。
【００７９】
適切には、本発明によるアシル基転移酵素変異体又は本発明による方法によって得られるアシル基転移酵素変異体は、セット１又は２内だけでなくＩＶＲ３内の１個又は複数のアミノ酸改変を含むことができる。
【００８０】
適切には、本発明によるアシル基転移酵素変異体又は本発明による方法によって得られるアシル基転移酵素変異体は、セット１又は２内だけでなくＩＶＲ５内の１個又は複数のアミノ酸改変を含むことができる。
【００８１】
適切には、本発明によるアシル基転移酵素変異体又は本発明による方法によって得られるアシル基転移酵素変異体は、セット１又は２内だけでなくＩＶＲ６内の１個又は複数のアミノ酸改変を含むことができる。
【００８２】
適切には、本発明によるアシル基転移酵素変異体又は本発明による方法によって得られるアシル基転移酵素変異体は、セット１又は２内だけでなくＬＲ１内の１個又は複数のアミノ酸改変を含むことができる。
【００８３】
適切には、本発明によるアシル基転移酵素変異体又は本発明による方法によって得られるアシル基転移酵素変異体は、セット１又は２内だけでなくＬＲ２内の１個又は複数のアミノ酸改変を含むことができる。
【００８４】
同様に、本発明の一部の実施形態においては、アシル転移酵素変異体は、活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く１０Åの球内、好ましくは９、８、７、６、５、４又は３Åの球内に存在する１個又は複数のアミノ酸残基におけるアミノ酸改変を含むだけでなく（図５３参照)、上記ＩＶＲ（intervening region）１〜６の１個又は複数における（好ましくはＩＶＲ３、５及び６の１個又は複数における、より好ましくはＩＶＲ５又はＩＶＲ６における）、且つ／又は上記ＬＲ（loop region）１〜５の１個又は複数における（好ましくはＬＲ１、ＬＲ２又はＬＲ５の１個又は複数における、より好ましくはＬＲ５における）少なくとも１個のアミノ酸改変も含む。
【００８５】
一実施形態においては、アミノ酸改変は、１０Åの球内に存在し、ＬＲ５内にも存在する１個又は複数のアミノ酸残基におけるものであることが好ましい。
【００８６】
したがって、構造的相同性マッピングは、以下のステップ、すなわち、
ｉ）親配列を図５２の構造モデル（１ＩＶＮ．ＰＤＢ）とアラインメントさせるステップ、
ii）（セット１又はセット２に規定されるアミノ酸残基の１個又は複数などの）活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く１０Åの球内で１個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ（図５３参照）及び／或いはＩＶＲ１〜６内で（好ましくはＩＶＲ３、５又は６内で、より好ましくはＩＶＲ５又はＩＶＲ６内で）１個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ）及び／或いはＬＲ１〜５内で（好ましくはＬＲ１、ＬＲ２又はＬＲ５内で、より好ましくはＬＲ５内で）１個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ、並びに
iii）前記親配列においてステップ（ii）に従って選択された１個又は複数のアミノ酸を改変するステップ
の１つ又は複数を含むことができる。
【００８７】
一実施形態においては、選択されるアミノ酸残基は、活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く９Åの球内、好ましくは８、７、６、５、４又は３Åの球内に存在することができる（図５３参照）。
【００８８】
適切には、構造上の相同性マッピングは、以下のステップ、すなわち、
ｉ）親配列を図５２の構造モデル（１ＩＶＮ．ＰＤＢ）とアラインメントさせるステップ、
ii）（セット１又はセット２に規定されるアミノ酸残基の１個又は複数などの）活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く１０Åの球内で１個又は複数のアミノ酸を選択するステップ（図５３参照）及び／或いはＩＶＲ１〜６内で（好ましくはＩＶＲ３、５又は６内で、より好ましくはＩＶＲ５又はＩＶＲ６内で）１個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ）及び／或いはＬＲ１〜５内で（好ましくはＬＲ１、ＬＲ２又はＬＲ５内で、より好ましくはＬＲ５内で）１個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ、
iii）ステップ（ii）によって選択された１個又は複数のアミノ酸残基が高度に保存されている（特に、活性部位残基及び／又はＧＤＳｘモチーフの一部及び／又はＧＡＮＤＹモチーフの一部である）かどうかを求めるステップ、並びに
前記親配列中のステップ（iii）によって特定された保存領域を除いて、ステップ（ii）によって選択された１個又は複数のアミノ酸を改変するステップ
の１つ又は複数を含むことができる。
【００８９】
適切には、上で詳述された方法において選択された１個又は複数のアミノ酸は、（セット１又はセット２に規定されるアミノ酸残基の１個又は複数などの）活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く１０Åの球内だけでなく（図５３参照）、ＩＶＲ１〜６の１個又は複数内（好ましくはＩＶＲ３、５又は６内、より好ましくはＩＶＲ５又はＩＶＲ６内）或いはＬＲ１〜５の１個又は複数内（好ましくはＬＲ１、ＬＲ２又はＬＲ５内、より好ましくはＬＲ５内）にもある。
【００９０】
一実施形態においては、１個又は複数のアミノ酸改変はＬＲ５内であることが好ましい。改変がＬＲ５内である場合には、改変はセット５に規定されるものではない。適切には、１個又は複数のアミノ酸改変は、ＬＲ５によって規定される領域内にあるだけでなく、セット２、セット４、セット６又はセット７の１個又は複数内のアミノ酸も構成する。
【００９１】
適切には、配列相同性アラインメントは、以下のステップ、すなわち、
ｉ）第１の親脂質アシル基転移酵素を選択するステップ、
ii）望ましい活性を有する第２の関連脂質アシル基転移酵素を特定するステップ、
iii）前記第１の親脂質アシル基転移酵素と前記第２の関連脂質アシル基転移酵素とをアラインメントさせるステップ、
iv）前記２つの配列間で異なるアミノ酸残基を特定するステップ、及び
ｖ）前記親脂質アシル基転移酵素中のステップ（iv）によって特定されたアミノ酸残基の１個又は複数を改変するステップ
の１つ又は複数を含むことができる。
【００９２】
適切には、配列相同性アラインメントは、以下のステップ、すなわち、
ｉ）第１の親脂質アシル基転移酵素を選択するステップ、
ii）望ましい活性を有する第２の関連脂質アシル基転移酵素を特定するステップ、
iii）前記第１の親脂質アシル基転移酵素と前記第２の関連脂質アシル基転移酵素とをアラインメントさせるステップ、
iv）前記２つの配列間で異なるアミノ酸残基を特定するステップ、
ｖ）ステップ（iv）によって選択された１個又は複数のアミノ酸残基が高度に保存されている（特に、活性部位残基及び／又はＧＤＳｘモチーフの一部及び／又はＧＡＮＤＹモチーフの一部である）かどうかを求めるステップ、並びに
vi）前記親配列中のステップ（ｖ）によって特定された保存領域を除いて、ステップ（iv）によって特定されたアミノ酸残基の１個又は複数を改変するステップ
の１つ又は複数を含むことができる。
【００９３】
適切には、前記第１の親脂質アシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列、すなわち、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３又は配列番号４５のいずれか１個を含むことができる。
【００９４】
適切には、前記第２の関連脂質アシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列、すなわち、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３又は配列番号４５のいずれか１個を含むことができる。
【００９５】
本酵素変異体は、親酵素と比較して少なくとも１個のアミノ酸改変を含まなければならない。一部の実施形態においては、本酵素変異体は、親酵素と比較して少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、好ましくは少なくとも６個、好ましくは少なくとも７個、好ましくは少なくとも８個、好ましくは少なくとも９個、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸改変を含むことができる。
【００９６】
適切には本発明による方法は、パン改質（bread improving）組成物などの酵素組成物及び／又は食料品組成物中に本酵素変異体を処方するさらなるステップを含むことができる。
【００９７】
ＧＤＳｘポリペプチド配列（親配列）を配列番号２（Ｐ０１４８０）とアラインメントさせるためには、対アラインメント（pairwise alignment）などの配列アラインメントを使用することができる HYPERLINK http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) ( HYPERLINK http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)。それによって、配列番号２に関してセット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されたアミノ酸の１個又は複数に対応する代替親ＧＤＳｘポリペプチド中の等価なアミノ酸を決定し、改変することができる。当業者には容易に理解できるように、エンボス対アラインメント（emboss pairwise alignment）を使用するときには、標準設定で通常は十分である。対応する残基は、両方の配列の全長にわたるアラインメントをするために「針（needle）」を用いて特定することができる。しかし、２つの配列間の類似度の最適領域を「水」を用いて発見することもできる。
【００９８】
或いは、特に、親ＧＤＳｘポリペプチドと配列番号２との相同性が低い場合には、配列番号２に関してセット２、セット４、セット６又はセット７に規定されたアミノ酸の１個又は複数に対応する代替親ＧＤＳｘポリペプチド中の対応するアミノ酸は、（ HYPERLINK http://www.expasy.org/spdbv/ www.expasy.org/spdbv/から入手される)「Deep View Swiss-PDB viewer」を用いてＰ１０４８０由来の構造モデルと１ＩＶＮ．ＰＤＢ及び１ＤＥＯ．ＰＤＢの構造座標との比較によって得られる、Ｐ１０４８０の構造モデルに対する構造アラインメントによって決定することができる（図５３及び実施例１）。等価な残基は、セット１とセット２を比較した表に示されるように、得られたＰ０１０４８０構造モデル中の残基と重なる残基又は最も近い残基として特定される（上記「セットの定義」参照）。このようにして、他のＧＤＳＸポリペプチドを１ＩＶＮ．ＰＢＤ結晶座標と比較し、セット１に等価な残基を決定することができる。
【００９９】
或いは、特に、親ＧＤＳｘポリペプチドと配列番号２との相同性が低い場合には、配列番号２に関してセット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されたアミノ酸の１個又は複数に対応する代替親ＧＤＳｘポリペプチド中の等価なアミノ酸は、アラインメント１（図５５）に示される構造アラインメントに基づいて改変されたＰＦＡＭデータベース（ＰＦＡＭコンセンサス）から得られるアラインメントから決定することができる。構造モデルに基づく改変は、最適な一致を確実にするためにアラインメントをわずかにシフトさせるのに必要となり得る。アラインメント１（図５５）はこの点で指標となる。
【０１００】
本発明による酵素変異体は、セット５に規定されるアミノ酸改変の１個又は複数を含まないことが好ましい。
【０１０１】
適切には、本酵素変異体は、部位特異的変異誘発によって調製することができる。
【０１０２】
或いは、例えば、Stratagene社製GeneMorph PCR変異誘発キット、Clontech社製Diversify PCR無作為変異誘発キットなどの市販キットを用いて変異を無作為に導入することができる。ＥＰ ０ ５８３ ２６５は、ＰＣＲに基づく変異誘発を最適化する方法に言及している。この方法は、ＥＰ ０ ８６６ ７９６に記載されたものなどの変異原性ＤＮＡアナログの使用と組み合わせることもできる。誤りを犯しやすいＰＣＲ技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシル基転移酵素の変異体の生成に適している。国際公開第０２０６４５７号は、リパーゼの分子進化について言及している。
【０１０３】
新規配列を得る第３の方法は、任意の数のDnase Iなどの制限酵素又は酵素を用いて、異なるヌクレオチド配列を断片化し、機能タンパク質をコードする完全なヌクレオチド配列を再び組み立てることである（以下「シャフリング」と記述する）。或いは、完全ヌクレオチド配列の再組み立て中に、１個又は複数の異なるヌクレオチド配列を用い、変異を導入することができる。ＤＮＡシャフリング及びファミリーシャフリング技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシル基転移酵素変異体の製造に適している。「シャフリング」を実施する適切な方法は、ＥＰ ０ ７５２ ００８、ＥＰ １ １３８ ７６３、ＥＰ １ １０３ ６０６にある。シャフリングは、ＵＳ ６，１８０，４０６及び国際公開第０１／３４８３５号に記載された別の形のＤＮＡ変異誘発と組み合わせることもできる。
【０１０４】
したがって、多数の部位特異的又は無作為な変異をヌクレオチド配列中にインビボ又はインビトロで生成させ、続いて、コードされたポリペプチド変異体の機能が改善されたかどうかを様々な手段によってスクリーニングすることができる。
【０１０５】
さらに、非限定的な例として、ポリヌクレオチド配列の変異体又は自然変異体は、野生型又は他の変異体若しくは自然変異体と組み換えて新しい変異体を生成することもできる。かかる新しい変異体も、コードされたポリペプチドの機能が改善されたかどうかによってスクリーニングすることができる。
【０１０６】
以下の領域、すなわち、ＩＶＲ３、ＩＶＲ５、ＩＶＲ６、ＬＲ１、ＬＲ２及び／又はＬＲ５、最も好ましくはＬＲ５は、局在化された無作為変異誘発及び／又はシャフリングのために選択されることが好ましい。
【０１０７】
変異体ライブラリを作成するために、微生物真核生物又は原核生物発現宿主を使用することができる。変異体ライブラリ内での均一な発現を確実にするために、低コピー数、好ましくは単回の染色体発現系が好ましいことがある。無作為変異誘発及び／又はシャフリング技術を用いて調製されるものなど、大きい変異体ライブラリ（＞１０００コロニー）の発現の場合には特に、形質転換頻度の高い発現系も好ましい。
【０１０８】
酵素の生成における真核生物発現宿主、すなわち酵母の使用に適切な方法は、ＥＰ １１３１４１６に記載されている。酵母などの微生物真核生物発現宿主は、真核生物アシル基転移酵素親遺伝子を用いて作成される変異体ライブラリの発現に好ましいことがある。
【０１０９】
酵素の生成における発現宿主としてバチルス、すなわちバチルス サブチリス（Bacillus subtilis）を用いた適切な方法は、国際公開第０２／１４４９０号に記載されている。バチルスなどの微生物原核生物発現宿主は、原核生物アシル基転移酵素親遺伝子、例えばＰ１０４８０基準配列（配列番号２）を用いて作成された変異体ライブラリの発現に好ましいことがある。
【０１１０】
適切には、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、親酵素と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を保持する。
【０１１１】
適切な親酵素としては、エステラーゼ又はリパーゼ活性を有する任意の酵素などが挙げられる。
【０１１２】
親酵素は、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整合することが好ましい。
【０１１３】
好ましい実施形態においては、脂質アシル基転移酵素変異体は、ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロック中のｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列アミノ酸残基の少なくとも１個若しくは複数を保持し、又は含む。
【０１１４】
水系環境において脂質アシル基転移酵素活性がない又は低いリパーゼなどの酵素は、分子進化ツールを用いて変異させて転移酵素活性を導入し又は高めることができ、それによって本発明の組成物及び方法に使用するのに適切なかなりの転移酵素活性を有する脂質アシル基転移酵素変異体が生成される。
【０１１５】
適切には、本発明に使用される脂質アシル基転移酵素は、極性脂質、好ましくは糖脂質に対する酵素活性が親酵素よりも高い変異体とすることができる。かかる変異体は、リゾ極性脂質に対しても低い活性を有するか、又は活性を持たないことが好ましい。極性脂質、好ましくは糖脂質に対する高い活性は、加水分解及び／又は転移酵素活性或いは両方の組み合わせの結果かもしれない。
【０１１６】
本発明に使用される脂質アシル基転移酵素変異体は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対して親酵素よりも低い活性を有することができる。
【０１１７】
適切には、本酵素変異体は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対して活性を持たなくすることができる。トリグリセリドに対する低い活性は、製パン用途、卵又は卵を主成分とする生成物の処理及び／又は油の精練に使用される酵素変異体において好ましい。
【０１１８】
一実施形態においては、適切には、本酵素変異体は、ジグリセリドに対して高い活性を有し、トリグリセリドに対して活性を持たない又は低い活性を有することができる。
【０１１９】
本明細書において特定のアミノ酸残基に言及するときには、番号付与は、変異体配列と配列番号２の基準配列とのアラインメントから得られるものである。
【０１２０】
一態様においては、酵素変異体は、以下のアミノ酸置換、すなわち、
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又はＬ１７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｓ１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｋ２２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｍ２３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｙ３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ；及び／又は
Ｇ４０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｋ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｗ１１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；及び／又は
Ｖ１１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ａ１１４Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｙ１１７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ；及び／又は
Ｌ１１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｐ１５６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｄ１５７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｇ１５９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｑ１６０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ１６１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｐ１６２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｓ１６３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ａ１６４Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｒ１６５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｓ１６６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｑ１６７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｋ１６８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｖ１６９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｖ１７０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｅ１７１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ａ１７２Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ；及び／又は
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ１８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｑ１８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＫ；及び／又は
Ｍ２０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｌ２１０ Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｒ２１１ Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ２１５ Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｙ２２６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ；及び／又は
Ｙ２３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷ；及び／又は
Ｋ２８４Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｍ２８５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｖ２９０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｅ３０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｓ３１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ
の１個又は複数を含むことが好ましい。
【０１２１】
それに加えて又はそれとは別に、１個又は複数のＣ末端伸長があり得る。好ましくは、追加のＣ末端伸長は、１個又は複数の脂肪族アミノ酸、好ましくは非極性アミノ酸、より好ましくはＩ、Ｌ、Ｖ又はＧを含む。したがって、本発明は、さらに、以下のＣ末端伸長、すなわち、３１８Ｉ、３１８Ｌ、３１８Ｖ、３１８Ｇの１個又は複数を含む酵素変異体を提供する。
【０１２２】
Ｐ１０４８０及び／又は１ＩＶＮに対する相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントによって判定して、親骨格中の残基がＰ１０４８０（配列番号２）中のそれと異なる場合には、Ｐ１０４８０ （配列番号２）中の以下のアミノ酸残基、すなわち、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９ 又はＳｅｒ３１０の任意の１個又は複数と整合する残基をそれぞれＰ１０４８０中の残基で置換することが望ましいことがある。
【０１２３】
Ｐ１０４８０の以下の野生型残基、すわなち、Ｌ１７、Ｗ１１１、Ｒ２２１、Ｓ３、Ｇ４０、Ｎ８８、Ｋ２２、Ｙ１１７、Ｌ１１８、Ｎ１８１、Ｍ２０９、Ｍ２８５、Ｅ３０９、Ｍ２３は、良好な活性、特にガラクト脂質からの良好な転移酵素活性を保持するために好ましいことが判明した。したがって、本酵素変異体は、これらの部位の任意の１個又は複数においてＰ１０４８０中に存在するアミノ酸残基を含むことが好ましい。
【０１２４】
極性脂質に対して高い加水分解活性を有する酵素変異体は、極性脂質からの高い転移酵素活性も有することができる。
【０１２５】
ＰＣ（phosphatidylcholine）などのリン脂質に対して高い加水分解活性を有する酵素変異体は、リン脂質からの高い転移酵素活性も有することができる。
【０１２６】
ＤＧＤＧなどのガラクト脂質に対して高い加水分解活性を有する酵素変異体は、ガラクト脂質からの高い転移酵素活性も有することができる。
【０１２７】
ＰＣ（phosphatidylcholine）などのリン脂質からの高い転移酵素活性を有する酵素変異体は、リン脂質に対する高い加水分解活性も有することができる。
【０１２８】
ＤＧＤＧなどのガラクト脂質からの高い転移酵素活性を有する酵素変異体は、ガラクト脂質に対する高い加水分解活性も有することができる。
【０１２９】
極性脂質からの高い転移酵素活性を有する酵素変異体は、極性脂質に対する高い加水分解活性も有することができる。
【０１３０】
適切には、以下の部位、すなわち、Ｌｅｕ１７、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０の１個又は複数は、基質の結合に関与することができる。
【０１３１】
本発明による酵素変異体は、親酵素と比較して以下の機能、すなわち、
１）（実施例８に示される）％ＴDG／ＴPCとして計算される、ＰＣよりもガラクト脂質（ＤＧ）に対する高い相対転移酵素活性
２）（実施例８に示される）ガラクト脂質（ＤＧ）に対する高い絶対転移酵素活性
３）（実施例８に示される）ガラクト脂質（ＤＧ）に対する加水分解活性ＨDGに比べてガラクト脂質を供与体として用いた高い転移酵素活性（ＴDG）
４）（実施例８に示される）ＰＣに対する高い絶対転移酵素活性
の１個又は複数を有することができる。
【０１３２】
ここで、ＤＧはガラクト脂質（例えば、ＤＧＤＧ）であり（本明細書ではＧＬとも記述される）、ＰＣはリン脂質（例えば、レシチン）である。ガラクト脂質に対して高い活性を有する変異体としては、上記カテゴリー１）、２）及び３）の変異体などが挙げられる。ガラクト脂質に対して高い活性を有する変異体は、（上記カテゴリー４）に従って）リン脂質において高い活性を有することもできる。
【０１３３】
１．以下の残基、すなわち、−３１８、Ｎ２１５、Ｌ２１０、Ｓ３１０、Ｅ３０９、Ｈ１８０、Ｎ８０、Ｖ１１２、Ｙ３０Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｖ２９０、Ｑ２８９、Ｋ２２、Ｇ４０、Ｙ１７９、Ｍ２０９、Ｌ２１１、Ｋ２２、Ｐ８１、Ｎ８７、Ｙ１１７、Ｎ１８１、Ｙ２３０Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｑ１８２の１個又は複数を改変すると、％ＴDG／ＴPCとして計算される、ＰＣよりもＤＧに対して高い相対転移酵素活性を有する酵素変異体がもたらされ得る。
【０１３４】
一般に、以下の置換、すなわち、
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＭ、Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｙ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、Ｗ、最も好ましくはＱ
Ｋ２２Ａ、Ｅ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＡ、Ｃ、Ｅ又はＲ
Ｙ３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、Ａ、Ｒ又はＥ、好ましくはＨ、Ｔ、Ｗ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、Ａ、Ｒ又はＥ
Ｇ４０ Ｌ、Ｎ、Ｔ、Ｖ又はＡ
Ｎ８０Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＨ、Ｉ、Ｙ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、Ｓ、Ｗ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｄ又はＦ
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＩ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、Ｖ、Ｙ、Ｄ、Ｃ又はＡ
Ｋ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＨ、Ｋ、Ｓ又はＲ
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＩ、Ｙ、Ｍ、Ｔ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、Ｆ、Ｖ又はＰ
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＣ、Ｖ、Ａ又はＦ
Ｖ１１２Ｃ
Ｙ１１７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｔ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ又はＷ、好ましくはＡ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｔ、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｐ又はＳ
Ｌ１１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＦ
Ｖ１１２Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ又はＹ、好ましくはＩ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｑ、Ｈ又はＰ
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷ、好ましくはＦ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ又はＷ
Ｈ１８０Ｋ、Ｑ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＭ、Ｆ、Ｃ、Ｋ又はＱ
Ｎ１８１Ａ又はＶ
Ｑ１８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＫ
Ｍ２０９Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＩ、Ｆ、Ｔ、Ｄ、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ又はＰ
Ｌ２１０ Ｇ、Ｉ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｓ、Ｗ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｆ、Ｋ、Ｐ又はＹ、好ましくはＧ、Ｉ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｓ、Ｗ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｔ、Ｙ又はＦ
Ｒ２１１Ｇ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＧ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｃ、Ｌ又はＷ
Ｎ２１５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＩ、Ｆ、Ｐ、Ｔ、Ｗ、Ｈ又はＡ
Ｙ２３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷ、好ましくはＩ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｅ、Ｖ、Ｍ又はＳ、最も好ましくはＩ、Ｄ、Ｒ又はＥ
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＦ、Ｗ、Ｈ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｅ、Ｇ、Ｒ、Ｎ又はＰ、より好ましくはＲ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｎ又はＰ
Ｖ２９０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ又はＹ；
Ｅ３０９Ｓ、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＦ、Ｗ、Ｎ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｒ、Ａ又はＹ
Ｓ３１０Ａ、Ｐ、Ｔ、Ｈ、Ｍ、Ｋ、Ｇ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＦ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｋ、Ａ、Ｐ、Ｔ、Ｈ、Ｍ、Ｋ又はＧ
−３１８ Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｈ又はＳ
の１個又は複数が好ましいことがある。
【０１３５】
好ましくは、以下の改変、すなわち、
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＭ、Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｙ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、Ｗ、最も好ましくはＱ
Ｇ４０ Ｌ、Ｎ、Ｔ、Ｖ又はＡ
Ｋ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＨ、Ｋ、Ｓ又はＲ
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＣ、Ｖ、Ａ又はＦ
Ｙ２３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷ、好ましくはＩ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｅ、Ｖ、Ｍ又はＳ、最も好ましくはＤ、Ｒ又はＥ
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＦ、Ｗ、Ｈ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｅ、Ｇ又はＰ、より好ましくはＲ、Ｔ、Ｄ、Ｋ又はＰ
の１個又は複数は、％ＴDG／ＴPCとして計算される、ＰＣよりもＤＧに対して高い相対転移酵素活性を有する酵素変異体をもたらし得る。
【０１３６】
以下の改変、すなわち、
−３１８ Ｙ、Ｈ又はＳ
Ｎ２１５Ｈ
Ｌ２１０Ｇ、Ｉ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｓ、Ｗ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ又はＴ
Ｓ３１０Ａ、Ｐ、Ｔ、Ｈ、Ｍ、Ｋ又はＧ
Ｅ３０９Ｓ、Ｑ、Ａ又はＲ
Ｈ１８０Ｋ、Ｔ又はＱ
Ｎ８０Ｎ、Ｒ又はＤ
Ｖ１１２Ｃ
Ｙ３０Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、Ａ、Ｒ又はＥ、より好ましくはＹ３０Ｍ、Ａ又はＲ
Ｖ２９０Ｒ、Ｅ、Ｈ又はＡ
Ｑ２８９Ｒ、Ｔ、Ｄ又はＮ
Ｋ２２Ｅ
Ｇ４０Ｌ
Ｙ１７９Ｖ又はＲ
Ｍ２０９Ｌ、Ｋ又はＭ
Ｌ２１１Ｇ、Ｑ、Ｋ又はＤ
Ｙ２３０Ｖ
Ｇ４０Ｑ、Ｌ又はＶ
Ｎ８８Ｗ
Ｎ８７Ｒ又はＤ
の１個又は複数を改変すると、％ＴDG／ＴPCとして計算される、ＰＣよりもＤＧに対して高い相対転移酵素活性を有する酵素変異体がもたらされる。
【０１３７】
一部の実施形態では、以下の置換、すなわち、
Ｋ２２Ａ又はＣ
Ｐ８１Ｇ
Ｎ８７ Ｍ
Ｙ１１７Ａ、Ｎ、Ｅ、Ｈ又はＴ
Ｎ１８１Ａ又はＶ
Ｙ２３０Ｉ
Ｖ２９０Ｈ
Ｎ８７Ｒ、Ｄ、Ｅ又はＭ
Ｑ１８２Ｔ
も適切であり得る。
【０１３８】
ガラクト脂質転移酵素とリン脂質転移酵素活性の比を増大させるために改変される残基は、−３１８、Ｎ２１５、Ｌ２１０、Ｅ３０９、Ｈ１８０、Ｎ８０の１個又は複数であることが好ましい。
【０１３９】
一般に、以下の置換、すなわち、
−３１８ Ｙ、Ｈ又はＳ、最も好ましくはＹ
Ｎ２１５Ｈ
Ｌ２１０Ｄ、Ｑ又はＴ
Ｅ３０９Ｑ又はＲ
Ｈ１８０Ｋ又はＱ
Ｎ８０Ｎ、Ｒ又はＤ
の１個又は複数が好ましい。
【０１４０】
２．以下の残基、すなわち、
−３１８、Ｎ２１５、Ｌ２１０、Ｓ３１０、Ｅ３０９、Ｈ１８０、Ｎ８０、Ｖ１１２、Ｙ３０Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｖ２９０、Ｑ ２８９、Ｋ２２、Ｇ４０、Ｙ１７９、Ｍ２０９、Ｌ２１１、Ｋ２２、Ｐ８１、Ｎ８７、Ｙ１１７、Ｎ１８１、Ｙ２３０Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｖ２９０、Ｎ８７、Ｑ１８２、Ｓ３、Ｓ３１０、Ｋ８２、Ａ３０９の１個又は複数を改変すると、ＤＧに対して高い絶対転移酵素活性を有する変異体がもたらされ得る。
【０１４１】
特に、以下の改変、すなわち、
−３１８Ｙ、Ｈ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＷ、好ましくはＹ、Ｈ、Ｓ又はＩ
Ｎ２１５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＨ、Ｉ、Ｆ、Ｐ、Ｔ、Ｗ又はＡ、最も好ましくはＨ、Ｓ、Ｌ、Ｒ、Ｙ
Ｌ２１０Ｇ、Ｉ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｓ、Ｗ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｆ、Ｋ、Ｐ又はＹ、好ましくはＤ、Ｑ、Ｔ、Ｙ又はＦ
Ｓ３１０Ａ、Ｐ、Ｔ、Ｈ、Ｍ、Ｋ、Ｇ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＦ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｋ又はＰ、
Ｅ３０９Ｓ、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＳ、Ｑ、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｈ、Ｉ、Ｍ又はＹ、最も好ましくはＳ、Ｑ、Ｒ、Ｎ、Ｐ又はＡ
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｑ Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＫ、Ｑ、Ｍ、Ｆ又はＣ、最も好ましくはＴ、Ｋ又はＱ
Ｎ１８１Ａ又はＶ
Ｎ８０Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＨ、Ｉ、Ｙ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、Ｓ、Ｗ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｄ又はＦ、最も好ましくはＮ、Ｒ、Ｄ、Ｐ、Ｖ、Ａ又はＧ
Ｖ１１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ又はＹ；好ましくはＩ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｑ、Ｈ又はＰ
Ｙ３０Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＷ、好ましくはＨ、Ｔ、Ｗ、Ｎ、Ｄ、Ｃ又はＱ
Ｖ２９０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ又はＹ；
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＲ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｎ又はＲ
Ｋ２２Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＣ
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷ；好ましくはＦ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ又はＷ、より好ましくはＥ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、Ｓ
Ｍ２０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＲ、Ｎ、Ｙ、Ｅ又はＶ
Ｒ２１１Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＨ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｃ、Ｌ又はＷ、最も好ましくはＲ
Ｓ３１０ Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＦ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｋ又はＰ
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＭ、Ｒ、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｙ又はＳ 最も好ましくはＱ又はＮ
Ｋ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＨ、Ｋ、Ｓ、Ｅ又はＲ
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ，Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＩ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｄ、Ｃ又はＡ
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＬ、Ｇ又はＡ
Ｙ１１７Ａ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ又はＷ；好ましくはＩ、Ｆ、Ｃ、Ｐ又はＳ
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＩ、Ｙ、Ｔ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、Ｆ、Ｖ又はＰ
Ｑ１８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＤ又はＫ
Ｙ２３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷ、好ましくはＷ、Ｈ、Ｑ、Ｌ、Ｐ又はＣ、最も好ましくはＴ又はＧ
Ｄ１５７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＣ
Ｇ４０Ｌ
Ｙ２２６Ｉ
の１個又は複数は、ＤＧに対して高い絶対転移酵素活性を有する変異体をもたらし得る。
【０１４２】
一般に、以下の置換、すなわち、
−３１８ Ｙ、Ｈ又はＳ
Ｎ２１５Ｈ
Ｌ２１０Ｇ、Ｉ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｓ、Ｗ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ又はＴ
Ｓ３１０Ａ、Ｐ、Ｔ、Ｈ、Ｍ、Ｋ又はＧ
Ｅ３０９Ｓ、Ｑ又はＲ
Ｈ１８０Ｋ又はＱ
Ｎ８０Ｎ、Ｒ又はＤ
Ｖ１１２Ｃ
Ｙ３０Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、Ａ、Ｒ又はＥ、より好ましくはＹ３０Ｍ、Ａ又はＲ
Ｖ２９０Ｒ、Ｅ、Ｈ又はＡ
Ｑ２８９Ｒ又はＮ
Ｋ２２Ｅ
Ｇ４０Ｌ
Ｙ１７９Ｖ
Ｍ２０９Ｌ、Ｋ又はＭ
Ｌ２１１Ｇ、Ｑ、Ｋ又はＤ
の１個又は複数が好ましい。
【０１４３】
一部の実施形態では、以下の置換、すなわち、
Ｋ２２Ａ又はＣ
Ｐ８１Ｇ
Ｎ８７ Ｍ
Ｙ１１７Ａ、Ｎ、Ｅ、Ｈ又はＴ
Ｎ１８１Ａ又はＶ
Ｙ２３０ Ｉ
Ｖ２９０Ｈ
Ｎ８７Ｒ、Ｄ、Ｅ又はＭ
Ｑ１８２Ｔ
も適切であり得る。
【０１４４】
ガラクト脂質基質（ＤＧＤＧ）からの転移酵素活性を増加させるために改変される残基は、−３１８、Ｎ２１５、Ｌ２１０、Ｅ３０９、Ｈ１８０、Ｎ８０の１個又は複数であることが好ましい。
【０１４５】
一般に、以下の置換、すなわち、
−３１８ Ｙ、Ｈ又はＳ、最も好ましくはＹ
Ｎ２１５Ｈ
Ｌ２１０Ｄ、Ｑ又はＴ
Ｅ３０９Ｑ又はＲ
Ｈ１８０Ｋ又はＱ
Ｎ８０Ｎ、Ｒ又はＤ
の１個又は複数が好ましい。
【０１４６】
３．以下の残基、すなわち、
Ｙ２３０、Ｓ３１０、Ｈ１８０、Ｑ２８９、Ｇ４０、Ｎ８８、Ｙ１７９、Ｎ２１５、Ｌ２１０、Ｎ８０、Ｙ３０Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｎ８７、Ｍ２０９、Ｒ２１１、Ｓ１８Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ又はＹから特異的に選択される）
の１個又は複数における改変は、ＤＧに対して加水分解活性ＨDGよりも高い転移酵素活性ＴDGを有する酵素変異体をもたらし得る。
【０１４７】
好ましくは、以下の改変、すなわち、
Ｙ２３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ又はＷ、好ましくはＷ、Ｈ、Ｑ、Ｌ、Ｐ又はＣ
Ｓ３１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＦ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｋ又はＰ
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ、好ましくはＦ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ又はＷ
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＭ、Ｆ又はＣ
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＦ、Ｗ、Ｈ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｅ、Ｇ又はＰ
Ｇ４０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ又はＹ；好ましくはＩ、Ｐ、Ｗ又はＹ
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＹ；好ましくはＩ又はＨ
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＩ、Ｙ、Ｔ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、Ｆ、Ｖ又はＰ
の１個又は複数は、ＤＧに対して加水分解活性ＨDGよりも高い転移酵素活性ＴDGを有する酵素変異体をもたらし得る。
【０１４８】
一般に、以下の置換、すなわち、
Ｙ１７９ Ｅ、Ｒ、Ｎ又はＱ
Ｎ２１５Ｇ
Ｌ２１０Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｅ、Ａ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、Ｉ、Ｖ又はＳ
Ｎ８０Ｇ
Ｙ３０Ｌ
Ｎ８７Ｇ
の１個又は複数が好ましい（かかる酵素変異体は、低い加水分解活性（ガラクト脂質及び／又はリン脂質）及び／又はガラクト脂質からの高い転移酵素活性を有することができる。
【０１４９】
一般に、以下の置換、すなわち、
Ｙ１７９ Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
Ｎ２１５ Ｇ
Ｌ２１０ Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｅ、Ａ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、Ｉ、Ｖ及びＳ
Ｎ８０ Ｇ
Ｙ３０ Ｌ
Ｎ８７ Ｇ
Ｈ１８０ Ｉ、Ｔ
Ｍ２０９ Ｙ
Ｒ２１１ Ｄ、Ｔ及びＧ
Ｓ１８ Ｇ、Ｍ及びＴ
Ｇ４０ Ｒ及びＭ
Ｎ８８ Ｗ
Ｎ８７ Ｃ、Ｄ、Ｒ、Ｅ及びＧ
の１個又は複数が好ましい（かかる酵素変異体は低い加水分解活性（ガラクト脂質及び／又はリン脂質）を有しつつ、ガラクト脂質からのかなりの転移酵素活性を保持することができる。
【０１５０】
４．以下の残基、すなわち、
Ｓ３、Ｄ１５７、Ｓ３１０、Ｅ３０９、Ｙ１７９、Ｎ２１５、Ｋ２２、Ｑ２８９、Ｍ２３、Ｈ１８０、Ｍ２０９、Ｌ２１０、Ｒ２１１、Ｐ８１、Ｖ１１２、Ｎ８０、Ｌ８２、Ｎ８８；Ｎ８７
の１個又は複数を改変すると、リン脂質に対して高い絶対転移酵素活性を有する酵素変異体がもたらされ得る。
【０１５１】
リン脂質からの改善された転移酵素活性を有する酵素変異体を提供することができる特定の改変は、以下、すなわち、
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＮ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｐ又はＭ、最も好ましくはＳ３Ａ
Ｄ１５７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ ；好ましくはＤ１５７Ｓ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、Ｑ、Ｋ又はＣ
Ｓ３１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＳ３１０Ｔ
−３１８ Ｅ
Ｅ３０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＥ３０９ Ｒ、Ｅ、Ｌ、Ｒ又はＡ
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷ；好ましくはＹ１７９ Ｄ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、Ｑ又はＳ、より好ましくはＥ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ又はＱ
Ｎ２１５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＮ２１５ Ｓ、Ｌ、Ｒ又はＹ
Ｋ２２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＫ２２ Ｅ、Ｒ、Ｃ又はＡ
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＱ２８９ Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｐ又はＮ
Ｍ２３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＭ２３ Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ又はＳ
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＨ１８０ Ｑ、Ｒ又はＫ
Ｍ２０９ Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＭ２０９ Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、Ｖ又はＬ
Ｌ２１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＬ２１０ Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｗ又はＭ
Ｒ２１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＲ２１１Ｔ
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＰ８１Ｇ
Ｖ１１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ又はＹ；好ましくはＶ１１２Ｃ
Ｎ８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＮ８０ Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｐ、Ｔ、Ｅ、Ｖ、Ａ又はＧ
Ｌ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＬ８２Ｎ、Ｓ又はＥ
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＮ８８Ｃ
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＮ８７Ｍ又はＧ
の１個又は複数から選択することができる。
【０１５２】
以下の残基、すなわち、
Ｓ３ Ｎ、Ｒ、Ａ、Ｇ
Ｍ２３ Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｓ
Ｈ１８０ Ｒ
Ｌ８２ Ｇ
Ｙ１７９ Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ又はＱ
Ｅ３０９ Ｒ、Ｓ、Ｌ又はＡ
の１個又は複数を改変すると、リン脂質に対して高い絶対転移酵素活性を有する酵素変異体がもたらされる。
【０１５３】
５．その改変によってガラクト脂質基質（ＤＧＤＧ）からの高い転移酵素活性及びガラクト脂質転移酵素とリン脂質転移酵素活性の比の増加がもたらされる残基としては、−３１８、Ｎ２１５、Ｌ２１０、Ｓ３１０、Ｅ３０９、Ｈ１８０、Ｎ８０、Ｖ１１２、Ｙ３０Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｖ２９０、Ｑ ２８９、Ｋ２２、Ｇ４０、Ｙ１７９、Ｍ２０９、Ｌ２１１、Ｋ２２、Ｐ８１、Ｎ８７、Ｙ１１７、Ｎ１８１、Ｙ２３０Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｑ１８２の１個又は複数などが挙げられる。
【０１５４】
一般に、以下の置換、すなわち、
−３１８ Ｙ、Ｈ又はＳ
Ｎ２１５Ｈ
Ｌ２１０Ｇ、Ｉ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｓ、Ｗ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ又はＴ
Ｓ３１０Ａ、Ｐ、Ｔ、Ｈ、Ｍ、Ｋ又はＧ
Ｅ３０９Ｓ、Ａ、Ｑ又はＲ
Ｈ１８０Ｋ又はＱ
Ｎ８０Ｎ、Ｒ又はＤ
Ｖ１１２Ｃ
Ｙ３０Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、Ａ、Ｒ又はＥ、より好ましくはＹ３０Ｍ、Ａ又はＲ
Ｖ２９０Ｒ、Ｅ、Ｈ又はＡ
Ｑ２８９Ｒ又はＮ
Ｋ２２Ｅ
Ｇ４０Ｌ
Ｙ１７９Ｖ
Ｍ２０９Ｌ、Ｋ又はＭ
Ｌ２１１Ｇ、Ｑ、Ｋ又はＤ
の１個又は複数が好ましい。
【０１５５】
一部の実施形態では、以下の置換、すなわち、
Ｋ２２Ａ又はＣ
Ｐ８１Ｇ
Ｎ８７ Ｍ
Ｙ１１７Ａ、Ｎ、Ｅ、Ｈ又はＴ
Ｎ１８１Ａ又はＶ
Ｙ２３０Ｉ
Ｖ２９０Ｈ
Ｎ８７Ｒ、Ｄ、Ｅ又はＭ
Ｑ１８２Ｔ
も適切であり得る。
【０１５６】
ガラクト脂質基質からの転移酵素活性（ＤＧＤＧ）及び／又はガラクト脂質転移酵素とリン脂質転移酵素活性との比を増大させるために改変される残基は、−３１８、Ｎ２１５、Ｌ２１０、Ｅ３０９、Ｈ１８０、Ｎ８０の１個又は複数であることが好ましい。
【０１５７】
一般に、以下の置換、すなわち、
−３１８ Ｙ、Ｈ又はＳ、最も好ましくはＹ
Ｎ２１５Ｈ
Ｌ２１０Ｄ、Ｑ又はＴ
Ｅ３０９Ｑ又はＲ
Ｈ１８０Ｋ又はＱ
Ｎ８０Ｎ、Ｒ又はＤ
の１個又は複数が好ましい。
【０１５８】
６．Ｐ１０４８０の以下の野生型残基、すなわち、Ｗ１１１、Ｒ２１１、Ｎ１８１、Ｓ３、Ｌ１７、Ｇ４０、Ｎ８８、Ｙ１１７、Ｌ１１８、Ｎ１８１、Ｋ２２、Ｍ２０９、Ｍ２８５、Ｍ２３は、良好な活性、特にガラクト脂質からの良好な転移酵素活性を保持するのに好ましいことが判明した。
【０１５９】
これらの残基は本酵素変異体中に保持されることが好ましい。
【０１６０】
ＧＤＳｘアシル転移酵素変異体をガラクト脂質基質からの高活性転移酵素にする場合、親酵素が位置Ｗ１１１、Ｒ２１１、Ｎ１８１、Ｓ３、Ｌ１７、Ｇ４０、Ｎ８８、Ｙ１１７、Ｌ１１８、Ｎ１８１、Ｋ２２、Ｍ２０９、Ｍ２８５、Ｍ２３においてＰ１０４８０の残基以外のＰ１０４８０配列の残基に対応する残基を有するときには、好ましくは、変異体は、対応する位置における置換を含み、Ｐ１０４８０配列中のアミノ酸残基を含むことができる。
【０１６１】
Ｌ１７は好ましくは疎水性アミノ酸残基である。
【０１６２】
７．以下の組み合わせは、ガラクト脂質基質（ＤＧＤＧ）からの高い転移酵素活性を有することができ、且つ／又はガラクト脂質転移酵素活性とリン脂質転移酵素活性の比が増加し得る。
Ｎ２１５Ｈ ＆ −３１８Ｙ
Ｎ２１５Ｈ ＆ Ｌ２１０Ｄ、Ｑ、又はＴ
−３１８Ｙ ＆ Ｌ２１０、Ｄ、Ｑ、又はＴ
Ｎ２１５Ｈ ＆ −３１８Ｙ ＆ Ｌ２１０Ｄ、Ｑ、又はＴ
【０１６３】
上記組み合わせは、−３１８Ｙ、Ｈ又はＳ、好ましくは−３１８ＹなどのＣ末端アミノ酸付加を場合により含んでいてもよい。
【０１６４】
上記組み合わせは、以下の改変を場合により含んでいてもよい。
【０１６５】
適切には、以下の組み合わせ、すなわち、
Ｅ３０９Ａ、Ｑ又はＲ。
Ｎ２１５Ｈ ＆ −３１８Ｙ、Ｈ、又はＳ、好ましくはＹ。
Ｌ２１０Ｄ、Ｑ又はＴ ＆ −３１８Ｙ、Ｈ、又はＳ、好ましくはＹ。
Ｎ２１５Ｈ ＆ Ｅ３０９Ａ、Ｑ又はＲ
Ｌ２１０Ｄ、Ｑ又はＴ ＆ Ｅ３０９Ａ、Ｑ又はＲ
−３１８Ｙ ＆ Ｅ３０９Ａ、Ｑ又はＲ
の１個又は複数は、ガラクト脂質基質（ＤＧＤＧ）からの高い転移酵素活性を有することができ、且つ／又はガラクト脂質転移酵素活性とリン脂質転移酵素活性の比が増加し得る。
【０１６６】
上記組み合わせは、位置Ｑ１８２、好ましくはＱ１８２Ｋにおいて置換を場合により含んでいてもよい。
【０１６７】
以下の組み合わせは、ガラクト脂質基質（ＤＧＤＧ）からの高い転移酵素活性を有することができ、且つ／又はガラクト脂質転移酵素活性とリン脂質転移酵素活性の比が増加することがあり、且つ／又はガラクト脂質転移酵素と加水分解活性の比が増加することがある。
Ｎ２１５Ｈ ＆ Ｎ８０Ｇ
−３１８Ｙ ＆ Ｎ８０Ｇ
Ｌ２１０Ｄ又はＱ ＆ Ｎ８０Ｇ
Ｎ２１５Ｈ ＆ Ｎ８８Ｎ
−３１８Ｙ ＆ Ｎ８８Ｎ
Ｌ２１０Ｄ又はＱ ＆ Ｎ８８Ｎ
Ｎ２１５Ｈ ＆ Ｙ３０Ｌ
−３１８Ｙ ＆ Ｙ３０Ｌ
Ｌ２１０Ｄ又はＱ ＆ Ｙ３０Ｌ
Ｎ２１５Ｈ ＆ Ｎ８７Ｇ
−３１８Ｙ ＆ Ｎ８７Ｇ
Ｌ２１０Ｄ又はＱ ＆ Ｎ８７Ｇ
Ｎ２１５Ｈ ＆ Ｙ１７９Ｅ、Ｒ、Ｎ又はＱ
−３１８Ｙ ＆ Ｙ１７９ Ｅ、Ｒ、Ｎ又はＱ
Ｌ２１０Ｄ又はＱ ＆ Ｙ１７９ Ｅ、Ｒ、Ｎ又はＱ
【０１６８】
上述したように、本明細書において特定のアミノ酸残基に言及するときには、番号付与は、変異体配列と配列番号２の基準配列とのアラインメントから得られるものである。
【０１６９】
不確かさを回避するために、特定のアミノ酸が特異的な部位、例えばＬ１１８において教示されるときには、これは配列番号２中の残基番号１１８における特異的アミノ酸を指す。しかし、異なる親酵素中の部位１１８におけるアミノ酸残基はロイシンと異なっていてもよい。
【０１７０】
したがって、残基１１８におけるアミノ酸置換が教示されたときには、Ｌ１１８に言及され得るものではあるが、親酵素が配列番号２に示されるもの以外であるときには、置換されるアミノ酸はロイシンでなくてもよいことが当業者には容易に理解されるはずである。したがって、配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素ではない親酵素においてアミノ酸配列を置換するときには、新しい（置換）アミノ酸は、配列番号２に教示されるものと同じものにすることができる。これは、例えば、残基１１８のアミノ酸がロイシンではなく、したがって配列番号２における残基１１８のアミノ酸とは異なる場合でもよい。換言すれば、例えば残基１１８において、親酵素がその位置においてロイシン以外のアミノ酸を有する場合には、このアミノ酸は本発明に従ってロイシンで置換することができる。
【０１７１】
本明細書では「脂質アシル基転移酵素」という用語は、（一般に、国際生化学分子生物学連合の命名委員会の酵素命名法推奨（１９９２）に従ってＥ．Ｃ．２．３．１．ｘに分類される）アシル基転移酵素活性を有する酵素を意味し、それによってこの酵素は、脂質からステロール、スタノール、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、グリセリンの１個又は複数などの１個又は複数の受容体基質にアシル基を転移させることが可能である。
【０１７２】
脂質アシル基転移酵素は、脂質から少なくともステロール及び／又はスタノール、例えばコレステロールにアシル基を転移できることが好ましい。
【０１７３】
本発明による脂質アシル基転移酵素変異体及び／又は本方法に使用される脂質アシル基転移酵素変異体及び／又は本発明の使用による脂質アシル基転移酵素変異体は、（本明細書に規定される）脂質から、以下のアシル受容体基質、すなわち、ステロール、スタノール、炭水化物、タンパク質若しくはそのサブユニット又はグリセリンの１個又は複数にアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
【０１７４】
一部の態様では、本発明による「アシル受容体」は、例えば、グリセリンを含めた多価アルコール；ステロール；スタノール；炭水化物；フルーツ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸及びアスコルビン酸を含めたヒドロキシ酸；タンパク質又は例えばアミノ酸、タンパク水解物、ペプチド（部分加水分解タンパク質）などのそのサブユニット；それらの混合物及び誘導体などのヒドロキシ基（−ＯＨ）を含む任意の化合物とすることができる。本発明による「アシル受容体」は水ではないことが好ましい。
【０１７５】
一実施形態においては、アシル受容体はモノグリセリド及び／又はジグリセリドではないことが好ましい。
【０１７６】
一態様においては、本酵素変異体は、脂質からステロール及び／又はスタノールにアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
【０１７７】
一態様においては、本酵素変異体は、脂質から炭水化物にアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
【０１７８】
一態様においては、本酵素変異体は、脂質からタンパク質又はそのサブユニットにアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。適切には、タンパク質サブユニットは、以下、すなわち、アミノ酸、タンパク水解物、ペプチド、ジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドの１個又は複数とすることができる。
【０１７９】
適切には、タンパク質又はタンパク質サブユニットにおいては、アシル受容体は、タンパク質又はタンパク質サブユニットの以下の構成物質、すなわち、セリン、トレオニン、チロシン又はシステインの１個又は複数とすることができる。
【０１８０】
タンパク質サブユニットがアミノ酸であるときには、適切には、そのアミノ酸を任意の適切なアミノ酸とすることができる。適切には、前記アミノ酸は、例えば、セリン、トレオニン、チロシン又はシステインの１個又は複数とすることができる。
【０１８１】
一態様においては、本酵素変異体は、脂質からグリセリンにアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
【０１８２】
一態様においては、本酵素変異体は、脂質からヒドロキシ酸にアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
【０１８３】
一態様においては、本酵素変異体は、脂質から多価アルコールにアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
【０１８４】
一態様においては、本脂質アシル基転移酵素変異体は、脂質からステロール及び／又はスタノールにアシル基を転移させることができるとともに、さらに、脂質から、以下、すなわち、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、グリセリンの１個又は複数にアシル基を転移させることができる。
【０１８５】
本発明による脂質アシル基転移酵素変異体が作用する脂質基質は、以下の脂質、すなわち、レシチン、例えばホスファチジルコリンなどのリン脂質、トリアシルグリセリド、カルジオリピン、ジグリセリド又は例えばＤＧＤＧ（digalactosyl diglyceride）、ＭＧＤＧ（monogalactosyl diglyceride）などの糖脂質の１種類又は複数であることが好ましい。より好ましくは、本発明による酵素変異体は、ＤＧＤＧ及びＭＧＤＧの一方又は両方に作用する。本発明による酵素変異体は、ＤＧＭＧ（digalactosyl monoglyceride）及びＭＧＭＧ（monogalactosyl monoglyceride）に対する活性を持たない（又は限られた活性しか持たない）ことが好ましい。したがって、脂質基質はＤＧＭＧ又はＭＧＭＧの一方又は両方ではないことが好ましい。この脂質基質は、本明細書では「脂質アシル供与体」と記述することができる。本明細書において使用されるレシチンという用語は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン及びホスファチジルグリセロールを包含する。
【０１８６】
本明細書では「ガラクト脂質」という用語は、ＤＧＤＧ又はＤＧＭＧの１個又は複数を意味する。
【０１８７】
本明細書では「リン脂質」という用語は、ホスファチジルコリンを含めたレシチンを意味する。
【０１８８】
本明細書では「極性脂質」という用語は、リン脂質及び／又はガラクト脂質、好ましくはリン脂質及びガラクト脂質を意味する。
【０１８９】
一部の態様では、本脂質アシル基転移酵素変異体が作用する脂質基質は、レシチン、例えばホスファチジルコリンなどのリン脂質であることが好ましい。
【０１９０】
一部の態様では、脂質基質は、例えばＤＧＤＧ、ＭＧＤＧなどの糖脂質であることが好ましい。
【０１９１】
脂質基質は、食品脂質、すなわち食料品の脂質成分であることが好ましい。
【０１９２】
一部の態様では、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリド及び／又は２−モノグリセリドに対して作用することができない或いは実質的に作用することができないことが好ましい。
【０１９３】
適切には、脂質基質又は脂質アシル供与体は、以下の基質、すなわち、ラード、タロー及びバター脂肪を含めた脂肪；パーム油、ヒマワリ油、大豆油、サフラワー油、綿実油、落花生油、コーン油、オリーブ油、落花生油、ヤシ油及びなたね油から抽出又は誘導される油を含めた油の１種類又は複数の中に存在する１種類又は複数の脂質とすることができる。大豆、なたね又は卵黄から得られるレシチンも適切な脂質基質である。脂質基質は、オートムギ脂質、又はガラクト脂質を含む他の植物系材料とすることができる。
【０１９４】
一態様においては、脂質アシル供与体は、好ましくは、卵黄中の（ホスファチジルコリンなどの）レシチンである。
【０１９５】
本発明の一部の態様では、脂質は、８個から２２個の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質から選択することができる。
【０１９６】
本発明の一部の態様では、脂質は、１６個から２２個の炭素、より好ましくは１６個から２０個の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質から選択することができる。
【０１９７】
本発明の一部の態様では、脂質は、１４個以下の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質、適切には、４個から１４個の炭素、適切には４個から１０個の炭素、適切には４個から８個の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質から選択することができる。
【０１９８】
適切には、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、以下のリパーゼ活性、すなわち、グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、ホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）又はホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）の１つ又は複数を示すことができる。本明細書では「グリコリパーゼ活性」という用語は「ガラクトリパーゼ活性」を包含する。
【０１９９】
適切には、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、以下の活性、すなわち、グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）及び／又はホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）及び／又はホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）の少なくとも１つ又は複数を有することができる。
【０２００】
一部の態様では、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、少なくともグリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）を有することができる。
【０２０１】
適切には、一部の態様では、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、糖脂質及び／又はリン脂質から、以下の受容体基質、すなわち、ステロール、スタノール、炭水化物、タンパク質、グリセリンの１個又は複数にアシル基を転移させることができる。
【０２０２】
一部の態様では、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、糖脂質及び／又はリン脂質からステロール及び／又はスタノールにアシル基を転移させて、少なくともステロールエステル及び／又はスタノールエステルを形成できることが好ましい。
【０２０３】
一部の態様では、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、糖脂質及び／又はリン脂質から炭水化物にアシル基を転移させて、少なくとも炭水化物エステルを形成できることが好ましい。
【０２０４】
一部の態様では、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、糖脂質及び／又はリン脂質からタンパク質にアシル基を転移させて、少なくともタンパク質エステル（又はタンパク質脂肪酸縮合物)を形成できることが好ましい。
【０２０５】
一部の態様では、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、糖脂質及び／又はリン脂質からグリセリンにアシル基を転移させて、少なくともジグリセリド及び／又はモノグリセリドを形成できることが好ましい。
【０２０６】
一部の態様では、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を示さないことが好ましい。
【０２０７】
一部の態様においては、本脂質アシル基転移酵素変異体は、アシル基を脂質からステロール及び／又はスタノールに転移させることができる。したがって、一実施形態においては、本発明による「アシル受容体」は、ステロール、スタノール又はステロールとスタノールの組み合わせとすることができる。
【０２０８】
一実施形態においては、適切には、ステロール及び／又はスタノールは、以下の構造上の特徴、すなわち、
ｉ）３−ベータヒドロキシ基若しくは３−アルファヒドロキシ基、及び／又は
ii）シス位におけるＡ：Ｂ環若しくはトランス位におけるＡ：Ｂ環若しくはＣ5−Ｃ6が不飽和である
の１つ又は複数を含むことができる。
【０２０９】
適切なステロールアシル受容体としては、コレステロール及び植物ステロール、例えば、アルファ−シトステロール、ベータ−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、カンペステロール、５，６−ジヒドロステロール、アブラナステロール、アルファ−スピナステロール、ベータ−スピナステロール、ガンマ−スピナステロール、デルタスピナステロール、フコステロール、ディモステロール（dimosterol）、アスコステロール（ascosterol）、セレビステロール（serebisterol）、エピステロール（episterol）、アナステロール（anasterol）、ハイポステロール（hyposterol）、コンドリラステロール（chondrillasterol）、デスモステロール、カリノステロール（chalinosterol）、ポリフェラステロール、クリオナステロール、ステロールグリコシド、他の天然又は合成異性体及び誘導体などが挙げられる。
【０２１０】
本発明の一態様においては、適切には１個を超えるステロール及び／又はスタノールがアシル受容体として働くことができ、適切には２個を超えるステロール及び／又はスタノールがアシル受容体として働くことができる。換言すれば、本発明の一態様においては、適切には１個を超えるステロールエステル及び／又はスタノールエステルを生成することができる。適切には、コレステロールがアシル受容体であるときには、１個若しくは複数のさらなるステロール又は１個若しくは複数のスタノールもアシル受容体として働くことができる。したがって、一態様においては、本発明は、コレステロールエステルと少なくとも１個のステロール又はスタノールエステルを組み合わせてｉｎ ｓｉｔｕ製造する方法を提供する。換言すれば、脂質アシル基転移酵素は、本発明の一部の態様では、アシル基を脂質からコレステロールと少なくとも１個のさらなるステロール及び／又は少なくとも１個のスタノールに転移させることができる。
【０２１１】
一態様においては、ステロールアシル受容体は、以下、すなわち、アルファ−シトステロール、ベータ−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール及びカンペステロールの１個又は複数であることが好ましい。
【０２１２】
一態様においては、ステロールアシル受容体はコレステロールであることが好ましい。コレステロールが本脂質アシル基転移酵素変異体に対するアシル受容体である場合には、食料品中の遊離コレステロール量は、本脂質アシル基転移酵素変異体に暴露される前の食料品よりも、且つ／又は本脂質アシル基転移酵素変異体で処理されていない同等の食料品よりも減少する。
【０２１３】
適切なスタノールアシル受容体としては、植物スタノール、例えば、ベータ−シトスタノール、ｓｓ−シトスタノールなどが挙げられる。
【０２１４】
一態様においては、ステロール及び／又はスタノールアシル受容体は、コレステロール以外のステロール及び／又はスタノールであることが好ましい。
【０２１５】
一部の態様においては、本発明によって調製された食料品を使用して、血清コレステロールを減少させ、且つ／又は低密度リポタンパク質を減少させることができる。血清コレステロール及び低密度リポタンパク質はともに、例えばアテローム性動脈硬化症及び／又は心疾患などのヒトにおけるある種の疾患に関連している。したがって、本発明によって調製された食料品を使用してかかる疾患のリスクを軽減することができると予見される。
【０２１６】
したがって、一態様においては、本発明は、アテローム性動脈硬化症及び／又は心疾患の治療及び／又は予防に使用される本発明による食料品の使用を提供する。したがって、一態様においては、この食料品を機能性食品とみなすことができる。
【０２１７】
別の態様においては、本発明は、本発明による食料品を含む医薬品を提供する。
【０２１８】
別の態様においては、本発明は、本発明による食料品の有効量をヒト又は動物患者に投与することを含む、前記患者における疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。
【０２１９】
適切には、ステロール及び／又はスタノール「アシル受容体」は、食料品中に天然に存在することができる。或いは、ステロール及び／又はスタノールは、食料品に添加することができる。ステロール及び／又はスタノールを食料品に添加する場合には、ステロール及び／又はスタノールは、本発明による脂質アシル基転移酵素の添加前、添加と同時及び／又は添加後に添加することができる。適切には、本発明は、本発明による酵素変異体の添加前又は添加と同時に、外来性ステロール／スタノール、特に植物ステロール／植物スタノールを食料品に添加することを包含することができる。
【０２２０】
一部の態様では、食料品中の１種類若しくは複数のステロールは、本脂質アシル基転移酵素変異体を本発明によって添加する前に又は添加するのと同時に、１種類若しくは複数のスタノールに転化することができる。ステロールをスタノールに転化する任意の適切な方法を使用することができる。例えば、この転化は、例えば化学水素化によって実施することができる。この転化は、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体の添加前に又は本発明による脂質アシル基転移酵素変異体の添加と同時に実施することができる。適切には、スタノールへのステロールの転化用酵素は、国際公開第００／０６１７７１号に教示されている。
【０２２１】
適切には、本発明は、植物スタノールエステルを食料品中で生成させるために使用することができる。植物スタノールエステルは、脂質膜を通る高い溶解性、生物学的利用能及び健康上の優れた利点を有する（例えば、国際公開第９２／９９６４０参照）。
【０２２２】
本発明の一部の実施形態においては、スタノールエステル及び／又はステロールエステルは、香味料及び／又は食感付与剤（texturiser）とすることができる。この場合、本発明は、香味料及び／又は食感付与剤のｉｎ ｓｉｔｕ製造を包含する。
【０２２３】
一実施形態においては、本発明は、本発明による酵素変異体を用いて油を処理することによって、遊離脂肪酸を形成せずに（例えばダイズ油などの植物油などの）食用油中で植物ステロールエステル及び／又はスタノールエステル及びリゾレシチンを製造する方法を提供する。かかる場合において、かくして製造されたリゾレシチンは、精練プロセスによって除去することができる。公知の精練プロセスの１つ又は複数など任意の精練プロセスを使用することができる。遊離脂肪酸は、必要に応じて、脱臭によって除去することができる。特に、油中で生成されるスタノール／ステロールエステルは、脱臭プロセスによって除去されない。したがって、製造される食用油は、血液コレステロールレベルの低下などの有益な栄養及び／又は機能性食品効果を有し得るステロールエステル及び／又はスタノールエステルを含む。
【０２２４】
この方法を実施することができる適切な油は、とりわけレシチン及びステロール／スタノールを含む油である。適切には、油は、処理されるときには粗製油（crude oil）である。適切には、食用油は、以下、すなわち、トウモロコシ胚芽油、綿実油、亜麻仁油、パーム油、落花生油、菜種油、ゴマ油、ダイズ油、ヒマワリ油及びコムギ胚芽油の１種類又は複数である。
【０２２５】
本発明の一部の態様では、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、アシル受容体として炭水化物を利用することができる。炭水化物アシル受容体は、以下、すなわち、単糖、二糖、オリゴ糖又は多糖の１種類又は複数とすることができる。炭水化物は、以下、すなわち、グルコース、フルクトース、無水フルクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、ガラクトース、キシロース、キシロオリゴ糖、アラビノース、マルトオリゴ糖、タガトース、ミクロセシン（microthecin）、アスコピロン（ascopyrone）Ｐ、アスコピロンＴ、コータルセロン（cortalcerone）の１個又は複数であることが好ましい。
【０２２６】
適切には、炭水化物「アシル受容体」は、食料品中に天然に存在することができる。或いは、炭水化物は食料品に添加することができる。炭水化物を食料品に添加する場合には、炭水化物は、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体の添加前、添加と同時及び／又は添加後に添加することができる。
【０２２７】
炭水化物エステルは、食料品中の貴重な乳化剤として機能することができる。したがって、酵素がアシル基を糖に転移させる機能を果たす場合には、本発明は、食料品中の第２のｉｎ ｓｉｔｕ乳化剤の生成を包含する。
【０２２８】
一部の実施形態においては、本脂質アシル基転移酵素変異体は、ステロール及び／又はスタノール及び炭水化物をアシル受容体として利用することができる。
【０２２９】
炭水化物並びにステロール及び／又はスタノールにアシル基を転移させることができる脂質アシル基転移酵素変異体を利用することは、卵を含む食料品では特に有利である。特に、卵及び卵製品中に糖、特にグルコースが存在することは、欠点と見られることが多い。卵黄は、最高１％のグルコースを含むことができる。一般に、卵又は卵を主成分とする製品は、このグルコースの一部又は全部を除去するために、グルコースオキシダーゼで処理することができる。しかし、本発明によれば、この望ましくない糖は、糖を「エステル化」して糖エステルを形成することによって容易に除去することができる。
【０２３０】
本発明の一部の態様では、本発明による脂質アシル基転移酵素変異体は、アシル受容体としてタンパク質を利用することができる。適切には、タンパク質は、食料製品中、例えば、乳製品及び／又は肉製品中に存在するタンパク質の１種類又は複数とすることができる。単なる例として、適切なタンパク質は、ラクトグロブリンなどの凝乳又は乳清中に存在するタンパク質とすることができる。他の適切なタンパク質としては、卵の卵白アルブミン、グリアジン、グルテニン、プロインドリン（puroindoline）、穀物の脂質転移タンパク質、肉のミオシンなどが挙げられる。
【０２３１】
本発明による親脂質アシル基転移酵素は、以下の判定基準を用いて特徴づけできることが好ましい。
（ｉ）本酵素は、脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
（ii）本酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（ここで、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個又は複数である）を含む。
【０２３２】
ＧＤＳＸモチーフのＸはＬであることが好ましい。すなわち、本発明による酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＬを含むことが好ましい。
【０２３３】
ＧＤＳＸモチーフは、４個の保存アミノ酸からなる。このモチーフ内のセリンは、脂質アシル基転移酵素の触媒作用性セリンであることが好ましい。適切には、ＧＤＳＸモチーフのセリンは、Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064)に教示されたアエロモナス ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のＳｅｒ−１６に対応する位置に存在することができる。
【０２３４】
タンパク質が本発明によるＧＤＳＸモチーフを有するかどうかを判定するために、配列をｐｆａｍデータベースのＨＭＭ（hidden markov model）プロファイルと比較することが好ましい。
【０２３５】
Ｐｆａｍは、タンパク質ドメインファミリーのデータベースである。Ｐｆａｍは、各ファミリーに対して検証された（curated）複数の配列アラインメント及び新しい配列中のこれらのドメインを特定するためのプロファイルＨＭＭ（hidden Markov model）を含む。Ｐｆａｍの序論は、Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280にある。隠れマルコフモデルは、タンパク質を分類するためのいくつかのデータベースにおいて使用されている。総説として、Bateman A and Haft DH (2002) Brief Bioinform 3; 236-245を参照されたい。
HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=12230032&dopt=Abstract" 
HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=11752314&dopt=Abstract" 
【０２３６】
隠れマルコフモデルの詳細な説明及びそのモデルをＰｆａｍデータベースに適用する方法については、Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4を参照されたい。Hammerソフトウェアパッケージは、Washington University, St Louis, ＵＳＡから入手することができる。
【０２３７】
或いは、ＧＤＳＸモチーフは、Hammerソフトウェアパッケージを用いて特定することができる。その説明は、Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4及びその中の参考文献にある。ＨＭＭＥＲ２プロファイルは本明細書に記載されている。
【０２３８】
ＰＦＡＭデータベースには、例えば、現在は以下のウェブサイトにあるいくつかのサーバーを介して接続することができる。
HYPERLINK "http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml"
HYPERLINK "http://pfam.wustl.edu/" 
HYPERLINK "http://pfam.jouy.inra.fr/"
HYPERLINK "http://pfam.cgb.ki.se/"
【０２３９】
このデータベースは、タンパク質配列を入力することができる検索機能を提供している。次いで、データベースのデフォルトパラメータを用いて、タンパク質配列をＰｆａｍドメインの有無について解析する。ＧＤＳＸドメインは、このデータベースにおいて確立されたドメインであり、したがってあらゆる検索配列中にその存在が認められる。データベースは、検索配列に対してＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列のアラインメントを返す。
【０２４０】
アエロモナス サルモニシダ又はアエロモナス ヒドロフィラを含めて、複数のアラインメントは、
ａ）手引書
上記手順に従って、目的タンパク質とＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列とのアラインメント及びＰ１０４８０とＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列とのアラインメントを得る；
又は
ｂ）データベースによって
データベースは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列の特定後に、検索配列のアラインメントをＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列のシードアラインメントに示す選択肢を提供する。Ｐ１０４８０はこのシードアラインメントの一部であり、ＧＣＡＴ＿ＡＥＲＨＹで示される。検索配列とＰ１０４８０の両方は同じ枠内に示される。
によって得ることができる。
【０２４１】
アエロモナス ヒドロフィラ基準配列：
アエロモナス ヒドロフィラＧＤＳＸリパーゼの残基は、ＮＣＢＩファイルＰ１０４８０中で番号付与されている。本文中の番号は、好ましい実施形態において本発明の脂質アシル基転移酵素中に存在する特定のアミノ酸残基を求めるために本発明において使用されるファイル中の番号である。
【０２４２】
Ｐｆａｍアラインメントを実施した（図３３及び図３４）。
【０２４３】
以下の保存残基は認識することができ、好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される酵素変異体中に存在することができる。
ブロック１ − ＧＤＳＸブロック
hid hid hid hid Gly Asp Ser hid
28  29  30  31  32  33  34  35
ブロック２ − ＧＡＮＤＹブロック
hid Gly hid Asn Asp hid
130 131 132 133 134 135
ブロック３ − ＨＰＴブロック
His
309
【０２４４】
ここで、「ｈｉｄ」は、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅから選択される疎水性残基を意味する。
【０２４５】
本発明の組成物／方法に使用される親脂質アシル基転移酵素及び／又は脂質アシル基転移酵素変異体は、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を用いてアラインメントさせることができることが好ましい。
【０２４６】
ｐｆａｍ００６５７ドメインファミリーのＨＭＭ（hidden markov model）プロファイルとの正の一致（positive match）によって、本発明によるＧＤＳＬ又はＧＤＳＸドメインの存在が示されることが好ましい。
【０２４７】
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列とアラインメントさせたとき、本発明の組成物／方法に使用される親脂質アシル基転移酵素及び／又は脂質アシル基転移酵素変異体は、ＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック、ＨＰＴブロックの少なくとも１個、好ましくは２個以上、好ましくは３個以上を有する。適切には、親脂質アシル基転移酵素及び／又は脂質アシル基転移酵素変異体は、ＧＤＳｘブロック及びＧＡＮＤＹブロックを有することができる。或いは、親酵素及び／又は酵素変異体は、ＧＤＳｘブロック及びＨＰＴブロックを有することができる。親酵素及び／又は酵素変異体は、少なくともＧＤＳｘブロックを含むことが好ましい。
【０２４８】
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列とアラインメントさせたときに、本発明の組成物／方法に使用される親酵素及び／又は酵素変異体は、基準Ａ．ヒドロフィラポリペプチド配列、すなわち配列番号２６と比較したときに、以下のアミノ酸残基、すなわち、２８ｈｉｄ、２９ｈｉｄ、３０ｈｉｄ、３１ｈｉｄ、３２ｇｌｙ、３３Ａｓｐ、３４Ｓｅｒ、３５ｈｉｄ、１３０ｈｉｄ、１３１Ｇｌｙ、１３２Ｈｉｄ、１３３Ａｓｎ、１３４Ａｓｐ、１３５ｈｉｄ、３０９Ｈｉｓの少なくとも１個、好ましくは２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは５個以上、好ましくは６個以上、好ましくは７個以上、好ましくは８個以上、好ましくは９個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１１個以上、好ましくは１２個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１４個以上、好ましくは１５個以上を有する。
【０２４９】
ｐｆａｍ００６５７ ＧＤＳＸドメインは、このドメインを有するタンパク質を他の酵素から識別する一義的な識別子である。
【０２５０】
ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を図１に配列番号１として示す。この配列は、本明細書ではｐｆａｍ００６５７．６と記述されることもあるｐｆａｍファミリー００６５７、データベースバージョン６の識別子から誘導される。
【０２５１】
このコンセンサス配列は、今後公開されるｐｆａｍデータベースを使用して更新することができる。
【０２５２】
例えば、図３３及び３４に、本明細書ではｐｆａｍ００６５７．１１と記述されることもあるデータベースバージョン１１由来のファミリー００６５７のｐｆａｍアラインメントを示す。
【０２５３】
ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロックは、公開された両方のデータベースのｐｆａｍファミリー００６５７に存在する。将来公開されるｐｆａｍデータベースを使用して、ｐｆａｍファミリー００６５７を特定することができる。
【０２５４】
本発明による親脂質アシル基転移酵素は、以下の判定基準を用いて特徴づけできることが好ましい。
（ｉ）本酵素は、脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
（ii）本酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（ここで、Ｘは以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個又は複数である）を含む。
（iii）本酵素は、Ｈｉｓ−３０９を含み、又は図２（配列番号２又は配列番号２６）に示されるアエロモナス ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む。
【０２５５】
ＧＤＳＸモチーフのアミノ酸残基はＬであることが好ましい。
【０２５６】
配列番号２６においては、最初の１８アミノ酸残基はシグナル配列を形成する。完全長配列、すなわち、シグナル配列を含むタンパク質のＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＨｉｓ−２９１に一致する。
【０２５７】
本発明による親脂質アシル基転移酵素は、以下の触媒作用の３つ組、すなわち、Ｓｅｒ−１６、Ａｓｐ−１１６及びＨｉｓ−２９１を含むことが好ましく、或いは図２（配列番号２）に示されるアエロモナス ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のＳｅｒ−１６、Ａｓｐ−１１６及びＨｉｓ−２９１に対応する位置又は図２８（配列番号２６）に示される完全長配列のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９に対応する位置において、それぞれ、セリン残基、アスパラギン酸残基及びヒスチジン残基を含むことが好ましい。上述したように、配列番号２６の配列においては、最初の１８アミノ酸残基はシグナル配列を形成する。完全長配列、すなわち、シグナル配列を含むタンパク質のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＳｅｒ−１６、Ａｓｐ−１１６及びＨｉｓ−２９１に一致する。ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列においては、図１（配列番号１）に示されるように、活性部位残基は、Ｓｅｒ−７、Ａｓｐ−１５７及びＨｉｓ−３４８に対応する。
【０２５８】
本発明による親脂質アシル基転移酵素は、以下の判定基準を用いて特徴づけできることが好ましい。
（ｉ）本酵素は、第１の脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
（ii）本酵素は、図２８（配列番号２６）における位置Ｇｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９にそれぞれ等しい図２（配列番号２）のアエロモナス ヒドロフィラ酵素に対応する位置において、少なくともＧｌｙ−１４、Ａｓｐ−１５、Ｓｅｒ−１６、Ａｓｐ−１１６及びＨｉｓ−１９１を含む。
【０２５９】
適切には、本発明による親脂質アシル基転移酵素は、以下の属、すなわち、アエロモナス、コリネバクテリウム、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）、テルモビフィダ（Termobifida）、ストレプトミセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ（Vibrionaceae）、キシレラ（Xylella）、スルフォロブス（Sulfolobus）、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム（Mesorhizobium）、ラルストニア（Ralstonia）、ザントモナス及びカンジダの１種類又は複数に由来する生物から得ることができ、好ましくは得られる。
【０２６０】
適切には、本発明による親脂質アシル基転移酵素は、以下の生物、すなわち、アエロモナス ヒドロフィラ、アエロモナス サルモニシダ、ストレプトミセス コエリコラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトミセス リモサス（Streptomyces rimosus）、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ラクトコッカス ラクチス（Lactococcus lactis）、ストレプトコッカス ピオゲネス、ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ラクトバチルス ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、デサルフィトバクテリウム デハロゲナンス（Desulfitobacterium dehalogenans）、バチルス種、カンピロバクター ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ビブリオナシエ、キシレラ ファスチジオサ（Xylella fastidiosa）、スルフォロブス ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルギルス テレウス（Aspergillus terreus）、シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、リステリア イノキュア（Listeria innocua）、リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ナイセリア メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、メソルヒゾビウム ロティ（Mesorhizobium loti）、ラルストニア ソラナセアルム（Ralstonia solanacearum）、ザントモナス カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ザントモナス アクソノポディス（Xanthomonas axonopodis）、コリネバクテリウム エフィシエンス（Corynebacterium efficens）、ノボスフィンゴビウム アロマティシボランス（Novosphingobium aromaticivorans）、テルモビフィダ フスカ（Termobifida fusca）及びカンジダ パラプシロシス（Candida parapsilosis）の１種類又は複数から得ることができ、好ましくは得られる。
【０２６１】
一態様においては、好ましくは、本発明による親脂質アシル基転移酵素は、アエロモナス ヒドロフィラ又はアエロモナス サルモニシダの１種類又は複数から得ることができ、好ましくは得られる。
【０２６２】
一態様においては、本発明による親脂質アシル基転移酵素は、ＬＣＡＴ（lecithin:cholesterol acyltransferase）又はその変異体（例えば、分子進化によって造られた変異体）とすることができる。
【０２６３】
適切なＬＣＡＴは当分野で公知であり、例えば以下の生物、すなわち、哺乳動物、ラット、マウス、ヒヨコ、キイロショウジョウバエ、アラビドプシス（Arabidopsis）及びオリザ サティバ（Oryza sativa）を含めた植物、線虫、真菌並びに酵母の１種類又は複数から得ることができる。
【０２６４】
本発明による方法を実施するときには、生成物（すなわち、食料品）は、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに又は実質的に増加させずに生成されることが好ましい。
【０２６５】
本明細書では「転移酵素」という用語は、「脂質アシル基転移酵素」という用語と区別なく使用される。
【０２６６】
本明細書では「ガラクト脂質転移酵素活性」という用語は、ガラクト脂質供与体から例えばグリセリンなどの（水以外の）受容体分子へのアシル基転移を触媒する酵素の能力を意味する。
【０２６７】
同様に、本明細書では「リン脂質転移酵素活性」という用語は、リン脂質供与体から例えばグリセリンなどの（水以外の）受容体分子へのアシル基転移を触媒する酵素の能力を意味する。
【０２６８】
本明細書では「ガラクトリパーゼ転移酵素活性とリン脂質転移酵素活性の高い比」という用語は、酵素変異体が、前記親酵素と比較したときに、ガラクト脂質転移酵素をリン脂質転移酵素よりも高速で触媒することができることを意味する。これは、ガラクト脂質転移酵素活性とリン脂質転移酵素活性の両方が親酵素よりも増加すること、又は親酵素と比較してガラクト脂質転移酵素活性が増加しリン脂質転移酵素活性が減少することを意味し得る。重要なのは２つの活性間の最終関係である。
【０２６９】
適切には、本明細書に規定される脂質アシル基転移酵素は、以下の反応、すなわち、エステル交換、エステル転移、アルコール分解、加水分解の１種類又は複数を触媒する。
【０２７０】
「エステル交換」という用語は、脂質供与体と脂質受容体の間の酵素によって触媒されたアシル基転移を意味する。ここで、脂質供与体は遊離アシル基ではない。
【０２７１】
本明細書では「エステル転移」という用語は、（遊離脂肪酸以外の）脂質供与体から（水以外の）アシル受容体への酵素によって触媒されたアシル基転移を意味する。
【０２７２】
本明細書では「アルコール分解」という用語は、生成物の一方がアルコールのＨと結合し、もう一方の生成物がアルコールのＯＲ基と結合するような、アルコールＲＯＨとの反応による酸誘導体の共有結合の酵素による切断を指す。
【０２７３】
本明細書では「アルコール」という用語は、ヒドロキシル基を含むアルキル化合物を指す。
【０２７４】
本明細書では「加水分解」という用語は、脂質から水分子のＯＨ基への酵素によって触媒されたアシル基転移を指す。加水分解に起因するアシル転移には水分子の分離が必要である。
【０２７５】
本明細書では「ガラクト脂質加水分解活性」という用語は、ガラクト脂質から水分子のＯＨ基にアシル基を転移させることによってガラクト脂質の加水分解を触媒する酵素の能力を意味する。
【０２７６】
同様に、本明細書では「リン脂質加水分解活性」という用語は、リン脂質から水分子のＯＨ基にアシル基を転移させることによってリン脂質の加水分解を触媒する酵素の能力を意味する。
【０２７７】
本明細書では「ガラクトリパーゼ転移酵素活性とガラクト脂質加水分解活性の高い比」という用語は、酵素変異体が、前記親酵素と比較したときに、ガラクト脂質転移酵素をガラクト脂質加水分解よりも高速で触媒することができることを意味する。これは、ガラクト脂質転移酵素活性とガラクト脂質加水分解活性の両方が親酵素よりも増加すること、又は親酵素と比較してガラクト脂質転移酵素活性が増加しガラクト脂質加水分解活性が減少することを意味し得る。重要なのは２つの活性間の最終関係である。
【０２７８】
本明細書では「遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに」という用語は、本発明による脂質アシル基転移酵素が、１００％転移酵素活性を有する（すなわち、加水分解活性を持たずに、アシル基の１００％をアシル供与体からアシル受容体に転移させる）ことが好ましいが、脂質アシル供与体中のアシル基の１００％未満をアシル受容体に転移させてもよいことを意味する。この場合、好ましくは、アシル基転移酵素活性は、全酵素活性の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％及びより好ましくは少なくとも９８％を占める。％転移酵素活性（すなわち、全酵素活性の百分率としての転移酵素活性）は、以下のプロトコールによって求めることができる。
【０２７９】
％アシル基転移酵素活性を求めるプロトコール：
本発明による脂質アシル基転移酵素が添加された食料品は、以下の詳細な手順に従って、酵素反応後にＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ ２：１で抽出し、脂質材料を含む有機相を単離し、ＧＬＣによって分析することができる。ＧＬＣ（及び必要に応じてＨＰＬＣ分析）から、遊離脂肪酸及びステロール／スタノールエステル；炭水化物エステル、タンパク質エステル；ジグリセリド又はモノグリセリドの１個又は複数の量が求められる。本発明による酵素が添加されていない対照食料品も同様に分析される。
計算：
ＧＬＣ（及び場合によりＨＰＬＣ分析）の結果から、遊離脂肪酸及びステロール／スタノールエステル及び／又は炭水化物エステル及び／又はタンパク質エステル及び／又はジグリセリド及び／又はモノグリセリドの増加量を計算することができる。
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸（酵素）−％脂肪酸（対照）；Ｍｖ脂肪酸＝脂肪酸の平均分子量；
Ａ＝Δ％ステロールエステル／Ｍｖステロールエステル（ここで、Δ％ステロールエステル＝％ステロール／スタノールエステル（酵素）−％ステロール／スタノールエステル（対照）及びＭｖステロールエステル＝ステロール／スタノールエステルの平均分子量）−アシル受容体がステロール及び／又はスタノールである場合に適用可能；
Ｂ＝Δ％炭水化物エステル／Ｍｖ炭水化物エステル（ここで、Δ％炭水化物エステル＝％炭水化物エステル（酵素）−％炭水化物エステル（対照）及びＭｖ炭水化物エステル＝炭水化物エステルの平均分子量）−アシル受容体が炭水化物である場合に適用可能；
Ｃ＝Δ％タンパク質エステル／Ｍｖタンパク質エステル（ここで、Δ％タンパク質エステル＝％タンパク質エステル（酵素）−％タンパク質エステル（対照）及びＭｖタンパク質エステル＝タンパク質エステルの平均分子量）−アシル受容体がタンパク質である場合に適用可能；並びに
Ｄ＝ジグリセリド及び／又はモノグリセリド／Ｍｖジ／モノグリセリドの絶対値（ここで、Δ％ジグリセリド及び／又はモノグリセリド＝％ジグリセリド及び／又はモノグリセリド（酵素）−％ジグリセリド及び／又はモノグリセリド（対照）並びにＭｖジ／モノグリセリド＝ジグリセリド及び／又はモノグリセリドの平均分子量）−アシル受容体がグリセリンである場合に適用可能。
【０２８０】
転移酵素活性は、全酵素活性の百分率として計算される。
％転移酵素活性＝（Ａ*＋Ｂ*＋Ｃ*＋Ｄ*×１００） ／ （Ａ*＋Ｂ*＋Ｃ*＋Ｄ*＋Δ％脂肪酸／（Ｍｖ脂肪酸））
*−適宜削除
【０２８１】
「非極性」、「極性−無電荷」、「極性−荷電」という用語の範囲内にあるアミノ酸を下表に示す。「脂肪族」及び「芳香族」という用語の範囲内にあるアミノ酸も同様である。「極性」という用語は、「極性−無電荷」と「極性−荷電」アミノ酸の両方を指す。
【０２８２】
【表３】
2010142243.tif 000005
【０２８３】
ＧＬＣ分析
ＷＣＯＴ溶融シリカカラム１２．５ｍ×０．２５ｍｍ ＩＤ×０．１μ膜厚５％フェニル−メチル−シリコーン（Chrompack社製CP Sil 8 CB）を備えたPerkin Elmer社製Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph。
キャリアガス：ヘリウム。
インジェクター．PSSIコールドスプリット注入（初期温度５０℃ ３８５℃に昇温）、体積１．０μｌ
検出器 ＦＩＤ：３９５℃
乾燥器プログラム：   １   ２     ３
乾燥器温度、℃       ９０ ２８０ ３５０
等温、時間、ｍｉｎ   １   ０     １０
昇温速度、℃/ｍｉｎ  １５ ４
【０２８４】
試料調製：内部標準ヘプタデカン０．５ｍｇ／ｍｌを含むヘプタン：ピリジン２：１ ９ｍｌに試料３０ｍｇを溶解した。試料溶液３００μｌをクリンプバイアルに移し、ＭＳＴＦＡ（N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid）３００μｌを添加し、６０℃で２０分間反応させた。
計算：モノ−ジ−トリグリセリド及び遊離脂肪酸の応答係数を標準２（モノ−ジ−トリグリセリド）から求めた。コレステロール、パルミチン酸コレステリル及びステアリン酸コレステリルの場合には、純粋な基準材料（純粋材料１０ｍｇを計量）から応答係数を求めた。
【０２８５】
技術的効果
本発明は、卵製品、特にマヨネーズにおける以下の予想外の技術的効果、すなわち、低温殺菌中の熱安定性の改善、感覚器官が感知し得る諸特性の改善、粘稠性の改善の１つ又は複数を提供することができる。
【０２８６】
高いリン脂質転移酵素活性、特にリン脂質とコレステロールなどのステロール及び／又はスタノールとの間の高い転移酵素活性を有する酵素変異体は、リゾリン脂質の製造方法並びに／或いは食用油の酵素精練方法並びに／或いは改善された乳化特性及び／又は健康上の利点を有する卵製品の製造方法に特に有用であり得る。
【０２８７】
酵素精練方法に使用する場合には、ステロールへの高い絶対リン脂質転移酵素活性を有する変異体が好ましい。
【０２８８】
適切には、本発明は、卵又は卵製品における以下の予想外の技術的効果、すなわち、エマルジョンの安定性の改善、エマルジョンの熱安定性、風味の改善、悪臭の減少、濃化特性の改善、粘稠性の改善の１つ又は複数を提供することができる。
【０２８９】
本発明は、生地及び／又は焼いた製品における以下の予想外の技術的効果、すなわち、生地又は焼いた製品（例えば、パン及び／又はケーキ）の比体積の改善；生地安定性の改善；外皮成績（crust score）（例えば、薄く且つ／又はぱりぱりしたパン外皮）の改善、パンの身の成績（crumb score）（例えば、より均一なパンの身の分布及び／又はより細かいパンの身構造及び／又はより柔らかいパンの身）の改善；外観（例えば、ふくれも穴もない又はふくれも穴も実質的にない滑らかな表面）の改善；老化の減少；柔らかさの向上；匂いの改善；味覚の改善の１つ又は複数を提供することができる。
【０２９０】
適切には、本発明は、食料品における以下の予想外の技術的効果、すなわち、外観の改善、口当たりの改善、安定性の改善、特に、熱安定性の改善、味覚の改善、柔軟性の改善、弾性の改善、乳化の改善の１つ又は複数を提供することができる。
【０２９１】
適切には、本発明は、アイスクリームなどの乳製品における以下の予想外の技術的効果、すなわち、例えば口当たりの改善（好ましくは、よりふわっとして滑らかな口当たり）、味覚の改善、溶融の改善の１つ又は複数を提供することができる。
【０２９２】
食料品調製において、本明細書に規定される脂質アシル基転移酵素の使用に伴う具体的な技術的効果を下表に示す。
【０２９３】
【表４】
2010142243.tif 000006
【０２９４】
適切には、本発明は、チーズにおける以下の予想外の技術的効果、すなわち、チーズにおけるオイルオフ現象の抑制；チーズ収率の増加；風味の改善；悪臭の減少；「石けんのような」味覚の減少の１つ又は複数を提供することができる。
【０２９５】
一態様においては、本発明は、脂質アシル基転移酵素を使用することによって、チーズなどの食品の収率を改善することができるという理解に一部基づいている。それとは別に又はそれに加えて、食品の風味、食感、酸化安定性及び／又は品質保持期間を改善することができる。それとは別に又はそれに加えて、食品のコレステロールレベルを低下させ、又は植物ステロール／スタノールエステルの含量を増加させることができる。
【０２９６】
本発明は、一態様においては、本明細書に規定される脂質アシル転移酵素を含む食品添加組成物を提供することができる。
【０２９７】
本発明は、別の態様においては、本明細書に規定される脂質アシル基転移酵素を含む化粧品組成物を提供することができる。
【０２９８】
また、本発明は、化粧品組成物を製造するための本明細書に規定されるアシル基転移酵素の使用を提供することができる。
【０２９９】
利点
本発明の転移酵素変異体は、親酵素と比較して、以下の有利な諸特性の１つ又は複数を有する。
i）極性脂質に対する高い活性及び／又はトリグリセリドよりも極性脂質に対する高い活性
ii）ＤＧＤＧ（digalactosyl diglyceride）及び／又はＭＧＤＧ（monogalactosyl diglyceride）の１個又は複数などのガラクト脂質（糖脂質）に対する高い活性。
iii）ガラクト脂質（糖脂質）とリン脂質及び／又はトリグリセリドに対する高い活性比。
【０３００】
本発明の転移酵素変異体は、ＤＧＤＧ（digalactosyl diglyceride）及び／又はＭＧＤＧ（monogalactosyl diglyceride）に対して高い活性を有することが好ましい。
【０３０１】
本発明の転移酵素変異体は、ＤＧＤＧ及び／又はＭＧＤＧに対して高い活性を有し、ＤＧＭＧ及び／又はＭＧＭＧに対して低い活性を有することが好ましい。
【０３０２】
本発明の転移酵素変異体は、トリグリセリドに対しても高い活性を有することができる。
【０３０３】
本発明の転移酵素変異体は、ホスファチジルコリンを含めたレシチンなどのリン脂質に対しても高い活性を有することができる。
【０３０４】
本発明の転移酵素変異体は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対して低い活性を有することができる。
【０３０５】
極性脂質という用語は、生地中に通常存在する極性脂質、好ましくはガラクト脂質及びリン脂質を指す。
【０３０６】
生地又は焼いた製品の調製に使用されたときに、本発明の転移酵素変異体は、生地及び／又は焼いた製品における以下の予想外の技術的効果、すなわち、生地又は焼いた製品（例えば、パン及び／又はケーキ）の比体積の改善；生地安定性の改善；外皮成績（例えば、薄く且つ／又はぱりぱりしたパン外皮）の改善、パンの身の成績（例えば、より均一なパンの身の分布及び／又はより細かいパンの身構造及び／又はより柔らかいパンの身）の改善；外観（例えば、ふくれも穴もない又はふくれも穴も実質的にない滑らかな表面）の改善；老化の減少；柔らかさの向上；匂いの改善；味覚の改善の１つ又は複数をもたらすことができる。
【０３０７】
単離
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、単離された形であることが好ましい。「単離された」という用語は、配列が本来天然に付随し、天然に存在する少なくとも１個の他の成分から、その配列が少なくとも実質的に遊離されていることを意味する。
【０３０８】
精製
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、精製された形であることが好ましい。「精製された」という用語は、配列が比較的純粋な状態、例えば少なくとも純度約５１％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも純度約９０％、少なくとも純度約９５％又は少なくとも純度約９８％であることを意味する。
【０３０９】
本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のクローニング
本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチド又は改変に適切であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを産生するあらゆる細胞又は生物から単離することができる。ヌクレオチド配列を単離する様々な方法が当技術分野で周知である。
【０３１０】
例えば、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリは、ポリペプチドを産生する生物から得られる染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列が知られている場合には、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、それを使用して、ポリペプチドをコードするクローンを、生物から調製されるゲノムライブラリから特定することができる。或いは、別の既知のポリペプチド遺伝子と相同な配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ポリペプチドをコードするクローンを特定することができる。後者の場合には、厳密性のより低いハイブリッド形成条件及び洗浄条件が使用される。
【０３１１】
或いは、ポリペプチドをコードするクローンは、ゲノムＤＮＡの断片をプラスミドなどの発現ベクターに挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリで酵素陰性細菌を形質転換し、次いでポリペプチドによって阻害される酵素を含む寒天上に形質転換細菌を播くことによって特定することができ、それによってポリペプチドを発現するクローンを特定することができる。
【０３１２】
さらなる別法においては、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、確立された標準方法、例えば、Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869に記載されたホスホラミダイト法又はMatthes et al (1984) EMBO J. 3, p 801-805に記載された方法によって合成して調製することができる。ホスホラミダイト法においては、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置中で合成され、精製され、アニールされ、連結され、適切なベクターにクローン化される。
【０３１３】
ヌクレオチド配列は、標準技術に従って合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源の断片を（適宜）連結することによって調製された混合ゲノム・合成起源、混合合成・ｃＤＮＡ起源又は混合ゲノム・ｃＤＮＡ起源とすることができる。連結された各断片は、ヌクレオチド配列全体の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列は、例えば、ＵＳ ４，６８３，２０２又はSaiki R K et al （Science (1988) 239, pp 487-491）に記載された特異的プライマーを用いたＰＣＲ（polymerase chain reaction）によって調製することもできる。
【０３１４】
ヌクレオチド配列
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本明細書では「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列並びに（その部分などの）その変異体、相同体、断片及び誘導体を意味する。ヌクレオチド配列は、センス鎖であろうとアンチセンス鎖であろうと、２本鎖でも１本鎖でもよいゲノム、合成又は組換え起源とすることができる。
【０３１５】
本発明では「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。この用語は、コード配列のＤＮＡ、より好ましくはｃＤＮＡを意味することが好ましい。
【０３１６】
好ましい実施形態においては、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列自体は、やはりその天然環境にあるその天然に付随する配列に連結されたときに、その天然環境における未変性ヌクレオチド配列を包含しない。参照を容易にするために、本発明者らはこの好ましい実施形態を「変性（non-native）ヌクレオチド配列」と称する。この点で、「未変性ヌクレオチド配列」という用語は、その本来の環境にあるヌクレオチド配列全体であって、それが天然に付随し、やはりその本来の環境にあるプロモーター全体に動作可能に連結されるときのヌクレオチド配列全体を意味する。したがって、本発明のポリペプチドは、その固有の生物中のヌクレオチド配列によって発現され得るが、そのヌクレオチド配列は、その生物中の天然に付随するプロモーターの制御下にはない。
【０３１７】
このポリペプチドは、未変性ポリペプチドではないことが好ましい。この点で、「未変性ポリペプチド」という用語は、その本来の環境にあり、その未変性ヌクレオチド配列によって発現されたときのポリペプチド全体を意味する。
【０３１８】
一般に、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製される（すなわち、組換えＤＮＡ）。しかし、本発明の別の実施形態においては、このヌクレオチド配列は、当分野で周知の化学的方法によって全体的又は部分的に合成することができる（Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23及びHorn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232参照）。
【０３１９】
分子進化
酵素をコードするヌクレオチド配列が単離された後に、又は酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が特定された後に、選択されたヌクレオチド配列を改変することが望ましいことがあり、例えば、本発明による酵素を調製するためにその配列を変異させることが望ましいことがある。
【０３２０】
変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
【０３２１】
適切な方法は、Morinaga et al （Biotechnology (1984) 2, p646-649）に開示されている。酵素をコードするヌクレオチド配列に変異を導入する別の方法は、Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)に記載されている。
【０３２２】
上述したものなどの部位特異的変異誘発の代わりに、例えば、Stratagene社製GeneMorph PCR変異誘発キット、Clontech社製Diversify PCRランダム変異誘発キットなどの市販キットを用いて変異をランダムに導入することができる。ＥＰ ０ ５８３ ２６５は、ＰＣＲに基づく変異誘発を最適化する方法に言及している。この方法は、ＥＰ ０ ８６６ ７９６に記載されたものなどの変異原性ＤＮＡアナログの使用と組み合わせることもできる。誤りを犯しやすいＰＣＲ技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシル基転移酵素の変異体の生成に適している。国際公開第０２０６４５７号は、リパーゼの分子進化について言及している。
【０３２３】
新規配列を得る第３の方法は、任意の数のDnase Iなどの制限酵素又は酵素を用いて異なるヌクレオチド配列を断片化し、機能タンパク質をコードする完全なヌクレオチド配列を再び組み立てることである。或いは、完全ヌクレオチド配列の再組み立て中に、１個又は複数の異なるヌクレオチド配列を用い、変異を導入することができる。ＤＮＡシャフリング及びファミリーシャフリング技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシル基転移酵素変異体の製造に適している。「シャフリング」を実施する適切な方法は、ＥＰ ０ ７５２ ００８、ＥＰ １ １３８ ７６３、ＥＰ １ １０３ ６０６にある。シャフリングは、ＵＳ ６，１８０，４０６及び国際公開第０１／３４８３５号に記載された別の形のＤＮＡ変異誘発と組み合わせることもできる。
【０３２４】
したがって、多数の部位特異的又は無作為な変異をヌクレオチド配列中にインビボ又はインビトロで生じさせ、続いて、コードされたポリペプチドの機能が改善されたかどうかを様々な手段によってスクリーニングすることができる。コンピュータ及びエキソ媒介（exo mediated）組換え方法（国際公開第００／５８５１７号、ＵＳ ６，３４４，３２８、ＵＳ ６，３６１，９７４参照）を用いて、例えば、生成される変異体が、既知の酵素又はタンパク質に対して極めて低い相同性を有する分子進化を実施することができる。それによって得られるかかる変異体は、既知の転移酵素に構造がかなり類似しているが、極めて低いアミノ酸配列相同性を有することができる。
【０３２５】
さらに、非限定的な例として、ポリヌクレオチド配列の変異体又は自然変異体は、野生型又は他の変異体若しくは自然変異体と組み換えて新しい変異体を生成することもできる。かかる新しい変異体も、コードされたポリペプチドの機能が改善されたかどうかによってスクリーニングすることができる。
【０３２６】
上述及び類似の分子進化方法を適用することによって、タンパク質構造又は機能の予備知識なしに、好ましい諸特性を有する本発明の酵素の変異体を特定し選択することができ、予測不可能であるが有益な突然変異体又は変異体を生成することができる。当分野では、酵素活性を最適化又は変更するために分子進化を適用した例が多数ある。かかる例としては、以下、すなわち、宿主細胞中又はインビトロで最適化された発現及び／又は活性、酵素活性の増大、基質及び／又は生成物特異性の変化、酵素又は構造安定性の増大又は低下、好ましい環境条件、例えば温度、ｐＨ、基質における酵素活性／特異性の変化の１つ又は複数が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０３２７】
当業者には明らかなように、分子進化ツールを使用して、酵素を変化させて酵素の機能を改善することができる。
【０３２８】
適切には、本発明において使用される脂質アシル基転移酵素は変異体とすることができ、すなわち、親酵素と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むことができる。酵素変異体は、親酵素と少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の相同性を保持する。適切な親酵素としては、エステラーゼ又はリパーゼ活性を有する任意の酵素などが挙げられる。親酵素は、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整合することが好ましい。
【０３２９】
好ましい実施形態においては、脂質アシル基転移酵素変異体は、ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロック中のｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列アミノ酸残基の少なくとも１個若しくは複数を保持し、又は含む。
【０３３０】
水系環境において脂質アシル基転移酵素活性がない又は低いリパーゼなどの酵素は、分子進化ツールを用いて変異させて転移酵素活性を導入し又は高めることができ、それによって本発明の組成物及び方法に使用するのに適切なかなりの転移酵素活性を有する脂質アシル基転移酵素を生成することができる。
【０３３１】
適切には、本発明において使用される脂質アシル基転移酵素は、極性脂質、好ましくはリン脂質及び／又は糖脂質に対する酵素活性が親酵素よりも高い変異体とすることができる。かかる変異体は、リゾ極性脂質に対しても低い活性を有するか、又は活性を持たないことが好ましい。極性脂質、リン脂質及び／又は糖脂質に対する高い活性は、加水分解及び／又は転移酵素活性或いは両方の組み合わせの結果かもしれない。
【０３３２】
本発明に使用される脂質アシル基転移酵素変異体は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対して親酵素よりも低い活性を有することができる。
【０３３３】
適切には、本酵素変異体は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対して活性を持たなくすることができる。
【０３３４】
或いは、本発明に使用される酵素変異体は、トリグリセリドに対して高い活性を有することができ、且つ／又は以下、すなわち、極性脂質、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、糖脂質、ジガラクトシルモノグリセリド、モノガラクトシルモノグリセリドの１個若しくは複数に対しても高い活性を有することができる。
【０３３５】
脂質アシル基転移酵素の変異体は公知であり、かかる変異体の１個若しくは複数は、本発明による方法及び使用並びに／又は本発明による酵素組成物に使用するのに適切なことがある。単なる例として、脂質アシル基転移酵素の変異体は、以下の参考文献、すなわち、Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269(3): 2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996 Apr; 178 (7): 2060-4; Peelman et al Protein Sci. 1998 Mar; 7(3):587-99に記載されており、本発明によって使用することができる。
【０３３６】
アミノ酸配列
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列も包含する。
【０３３７】
本明細書では「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。「アミノ酸配列」という用語が「ペプチド」という用語と同義である場合もある。
【０３３８】
アミノ酸配列は、適切な出所から調製／単離することができ、或いは組換えＤＮＡ技術を用いて合成又は調製することができる。
【０３３９】
適切には、アミノ酸配列は、本明細書に教示される単離ポリペプチドから標準技術によって得ることができる。
【０３４０】
単離ポリペプチドからアミノ酸配列を決定するのに適切な一方法は以下のとおりである。
【０３４１】
精製ポリペプチドを凍結乾燥させ、その凍結乾燥材料１００μｇを８Ｍ尿素と０．４Ｍ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ８．４の混合物５０μｌに溶解させることができる。溶解されたタンパク質を変性し、窒素で覆い、４５ｍＭジチオスレイトール５μｌを添加した後に、５０℃で１５分間還元することができる。室温に冷却後、１００ｍＭヨードアセトアミド５μｌを添加し、窒素下、暗所において室温で１５分間システイン残基を誘導体化することができる。
【０３４２】
水１３５μｌ及びエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ ５μｇの５μｌ水溶液を上記反応混合物に添加し、窒素下３７℃で２４時間消化することができる。
【０３４３】
生成したペプチドは、逆相ＨＰＬＣによってVYDAC C18カラム（０．４６×１５ｃｍ；１０μｍ；The Separation Group, California, USA）上で溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液及び溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液を用いて分離することができる。選択されたペプチドをDevelosil Ｃ18カラム上で同じ溶媒系を用いて再度クロマトグラフにかけた後、Ｎ末端の配列を決定することができる。配列決定は、Applied Biosystems 476A配列決定装置を用い、製造者（Applied Biosystems, California, USA）の指示に従ってパルス液体高速サイクル（pulsed liquid fast cycles）を用いて実施することができる。
【０３４４】
配列同一性又は配列相同性
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列、或いはかかるポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列の使用も包含する（以下「相同配列」と記述する）。ここで、「相同体」という用語は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は「同一性」と同等とみなすことができる。
【０３４５】
相同アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、機能活性を保持するポリペプチド及び／又は酵素の活性を高めるポリペプチドを提供及び／又はコードすべきである。
【０３４６】
本明細書において、相同配列は、対象配列に少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るアミノ酸配列を含むと解釈される。一般に、相同体は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性は類似性の点から考えることもできるが（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明では配列同一性の点から相同性を表現することが好ましい。
【０３４７】
本明細書において相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）に少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。一般に、相同体は、対象配列と同じ、活性部位などをコードする配列を含む。相同性は類似性の点から考えることもできるが（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明では配列同一性の点から相同性を表現することが好ましい。
【０３４８】
相同性比較は、目視によって、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを利用して実施することができる。これらの市販コンピュータプログラムは、２個以上の配列間の％相同性を計算することができる。
【０３４９】
％相同性は、隣接配列にわたって計算することができる。すなわち、一方の配列はもう一方の配列とアラインメントさせ、一方の配列中の各アミノ酸はもう一方の配列中の対応するアミノ酸と１回に１個の残基が直接比較される。これは、「ギャップのない」アラインメントと呼ばれる。一般に、かかるギャップのないアラインメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実施される。
【０３５０】
これは極めて単純で一貫性のある方法ではあるが、例えば、それ以外は同一である配列対における１つの挿入又は欠失によって後続のアミノ酸残基がアラインメントから排除され、したがって、全体的なアラインメントを実施したときに％相同性が大きく低下する可能性があることを考慮していない。その結果、ほとんどの配列比較方法は、全体の相同性スコアを不当に減少させずに、起こり得る挿入及び欠失を考慮する最適なアラインメントとなるように設計されている。これは、「ギャップ」を配列アラインメントに挿入して局所的相同性が最大になるようにすることによって実施される。
【０３５１】
しかし、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸の場合に、２個の比較配列間の高い関連性を反映してギャップができるだけ少ない配列アラインメントが、ギャップが多い配列アラインメントよりも高いスコアが得られるように、アラインメント中に存在する各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在に対しては比較的高いコストを課し、ギャップにおける各後続残基に対してはペナルティを減少させる「アフィンギャップコスト」が一般に使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティが、ギャップのより少ない最適なアラインメントを生じることは言うまでもない。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかし、かかるソフトウエアを配列比較に用いるときには、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用するときには、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対しては−１２であり、各伸長に対しては−４である。
【０３５２】
したがって、最大％相同性の計算は、まず、ギャップペナルティを考慮して、最適なアラインメントを作成する必要がある。このようなアラインメントを実行するのに適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387）である。配列比較を実施することができる他のソフトウエアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18参照）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡの両方ともオフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58 to 7-60参照）。しかし、一部の適用例では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールは、タンパク質及びヌクレオチド配列を比較することもできる（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8及びtatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照）。
【０３５３】
最終％相同性は同一性の点から測定することができるが、アラインメントプロセス自体は全か無かの対比較には一般に基づいていない。その代わり、化学的類似度又は進化距離に基づいて各対ごとの比較に対してスコアが割り当てられるスケールド類似度スコアマトリックス（scaled similarity score matrix）が一般に使用される。通常使用されるかかるマトリックスの例は、ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、公開デフォルト値又はもし提供されていれば個別のシンボル比較表（symbol comparison table）を一般に使用する（さらなる詳細については利用者マニュアルを参照されたい）。一部の適用例では、ＧＣＧパッケージの場合には公開デフォルト値を、他のソフトウエアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
【０３５４】
或いは、相同性百分率は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）に類似したアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（Hitachi Software社製）の複数のアラインメント機能を用いて計算することができる。
【０３５５】
ソフトウエアが最適なアラインメントを作成した後に、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウエアは、一般に、配列比較の一部としてこれを実行し、数値結果を与える。
【０３５６】
配列は、サイレントな変化をもたらし機能的に等価な物質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を含むこともある。物質の二次結合活性（secondary binding activity）が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性に基づいて、計画的なアミノ酸置換を実施することができる。例えば、負に帯電したアミノ酸としてはアスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられ、正に帯電したアミノ酸としてはリジン、アルギニンなどが挙げられ、類似した親水性値を有する無電荷極性頭部基を含むアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシンなどが挙げられる。
【０３５７】
保存的置換は、例えば下表に従って実施することができる。第２カラムの同じブロックのアミノ酸及び好ましくは第３カラムの同じ行のアミノ酸は互いに置換することができる。
【０３５８】
【表５】
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【０３５９】
本発明は、起こり得る相同置換（置換と交換は、本明細書ではともに、既存のアミノ酸残基と別の残基を取り替えることを意味する）、すなわち、塩基性残基と塩基性残基、酸性残基と酸性残基、極性残基と極性残基などの同種（ｌｉｋｅ−ｆｏｒ−ｌｉｋｅ）置換も包含する。非相同置換、すなわち、１クラスの残基から別のクラスの残基への非相同置換、或いはオルニチン（以後、Ｚと記述する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後、Ｂと記述する）、ノルロイシンオルニチン（以後、Ｏと記述する）、ピリイルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシンなどの人為的なアミノ酸の介在も含む非相同置換も起こることがある。
【０３６０】
交換は、人為的（unnatural）アミノ酸によっても成されうる。
【０３６１】
変異体アミノ酸配列は、グリシン、β−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル、プロピル基などのアルキル基を含めて、配列の任意の２個のアミノ酸残基の間に挿入することができる適切なスペーサー基を含むことができる。さらに別の形の変異は、１個又は複数のペプトイド型アミノ酸残基の存在を含み、当業者には十分知られている。不確かさを回避するために、「ペプトイド型」は、α−炭素置換基が残基のα−炭素ではなく窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を意味するために使用される。ペプトイド型ペプチドを調製する方法は当分野、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134において公知である。
【０３６２】
本発明に使用されるヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、合成又は改変ヌクレオチドをその中に含むことができる。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる改変タイプが当分野で知られている。これらの改変は、メチルホスホネート骨格及びホスホロチオエート骨格並びに／或いは分子の３’末端及び／又は５’末端におけるアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加を含む。本発明では、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、当分野で利用可能な任意の方法によって改変できることを理解されたい。かかる改変は、ヌクレオチド配列のインビボでの活性を高め又は寿命を延ばすために実施することができる。
【０３６３】
本発明は、本明細書に考察される配列又は任意の誘導体、その断片若しくは誘導体に相補的であるヌクレオチド配列の使用も包含する。配列がその断片に相補的である場合には、その配列をプローブとして使用して他の生物などにおける類似のコード配列を特定することができる。
【０３６４】
本発明の配列に１００％相同ではないが、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドは、いくつかの方法で得ることができる。本明細書に記載される配列の他の変異体は、例えば、ある範囲の個体、例えば、異なる集団からの個体で構成されるＤＮＡライブラリを探索することによって得ることができる。また、他のウイルス／細菌又は細胞の相同体、特に哺乳動物細胞（例えばラット、マウス、ウシ及び霊長類細胞）中にある細胞相同体を得ることができ、かかる相同体及びその断片は、一般に、本明細書の配列リストに示される配列と選択的にハイブリッド形成することができる。かかる配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリ又はゲノムＤＮＡライブラリを探索することによって、また、添付された配列リスト中の配列のいずれか１つの全部又は一部を含むプローブを用いて中度から高度の厳密性の条件下でかかるライブラリを探索することによって、得ることができる。本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体を得るために、類似の考察が適用される。
【０３６５】
変異体及び系統／種相同体は、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードする変異体及び相同体内の配列を標的にするように設計されたプライマーを使用した縮重ＰＣＲによって得ることもできる。保存配列は、例えば、いくつかの変異体／相同体から得られるアミノ酸配列をアラインメントさせることによって予測することができる。配列アラインメントは、当分野で公知のコンピュータソフトウエアを使用して実施することができる。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられる。
【０３６６】
縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは、１個又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用される厳密性よりも低い厳密性の条件で使用される。
【０３６７】
或いは、かかるポリヌクレオチドは、特徴の明らかな配列の部位特異的変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞に対してコドン優先度を最適化するためにサイレントなコドン配列変化が必要な場合に有用となり得る。制限ポリペプチド認識部位を導入するために、或いはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性又は機能を変えるために、別の配列変化が望まれる場合もある。
【０３６８】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）を使用して、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、選択的増幅反応用プライマー、プローブ、例えば放射性又は非放射性標識を用いて従来の手段によって明示用標識（revealing label）で標識されたプローブを作製することができ、或いはこのポリヌクレオチドをベクターにクローン化することができる。かかるプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチド長であり、本明細書において使用される本発明のポリヌクレオチドという用語によってやはり包含される。
【０３６９】
本発明によるＤＮＡポリヌクレオチド、プローブなどのポリヌクレオチドは、組換え、合成又は当業者に利用可能なあらゆる手段によって作製することができる。これらは、標準技術によってクローン化することもできる。
【０３７０】
一般に、プライマーは、所望の核酸配列を１回に１個のヌクレオチドで段階的に製造することを含めた合成手段によって作製される。自動化技術を用いてこれを実施する技術は、当分野で容易に利用することができる。
【０３７１】
より長鎖のポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段、例えば、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）クローニング技術を用いて作製される。ＰＣＲクローニング技術は、クローン化が求められる脂質ターゲティング配列領域に隣接する１対のプライマー（例えば、約１５から３０ヌクレオチド）を作製すること、そのプライマーを動物又はヒト細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させること、前記所望領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、増幅断片を（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することによって）単離すること及び増幅ＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅ＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローン化することができるように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。
【０３７２】
ハイブリッド形成法
本発明は、本発明の配列に相補的である配列、或いは本発明の配列又はそれに相補的である配列とハイブリッド形成可能である配列も包含する。
【０３７３】
本明細書では「ハイブリッド形成法」という用語は、「核酸の鎖が塩基対形成によって相補鎖と連結されるプロセス」及びＰＣＲ（polymerase chain reaction）技術において実施される増幅プロセスを含むものとする。
【０３７４】
本発明は、本明細書に考察される対象配列又は任意の誘導体、その断片若しくは誘導体に相補的である配列とハイブリッド形成可能であるヌクレオチド配列の使用も包含する。
【０３７５】
本発明は、本明細書で考察されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な配列に相補的である配列も包含する。
【０３７６】
ハイブリッド形成条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA）に教示されたようにヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、以下に説明される規定の「厳密性」を与えるものである。
【０３７７】
最大の厳密性は、一般に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低温）で得られ、高度の厳密性はＴｍよりも約５℃から１０℃低温、中度の厳密性はＴｍよりも約１０℃から２０℃低温、低度の厳密性はＴｍよりも約２０℃から２５℃低温で得られる。当業者には理解されるように、最大の厳密性のハイブリッド形成法は、同一ヌクレオチド配列を特定又は検出するために使用することができ、中度（又は低度）の厳密性のハイブリッド形成法は、類似又は関係するポリヌクレオチド配列を特定又は検出するために使用することができる。
【０３７８】
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と高度の厳密性条件又は中度の厳密性条件下でハイブリッド形成可能である配列に相補的な配列を包含することが好ましい。
【０３７９】
より好ましくは、本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と高度の厳密性条件下（例えば、６５℃及び０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ７．０｝）でハイブリッド形成可能である配列に相補的な配列を包含する。
【０３８０】
本発明は、（本明細書で考察されるヌクレオチド配列の相補的配列も含めて）本明細書で考察されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列にも関する。
【０３８１】
本発明は、（本明細書で考察されるヌクレオチド配列の相補的配列も含めて）本明細書で考察されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる配列に相補的であるヌクレオチド配列にも関する。
【０３８２】
本明細書で考察されるヌクレオチド配列と中度から最大の厳密性条件下でハイブリッド形成することができるポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。
【０３８３】
好ましい態様においては、本発明は、本明細書で考察されるヌクレオチド配列又はその補体と厳密な条件下（例えば、５０℃及び０．２ｘＳＳＣ）でハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を包含する。
【０３８４】
より好ましい態様においては、本発明は、本明細書で考察されるヌクレオチド配列又はその補体と高度の厳密性条件下（例えば、６５℃及び０．１ｘＳＳＣ）でハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を包含する。
【０３８５】
ポリペプチドの発現
本発明に使用されるヌクレオチド配列又は本明細書に定義される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。このベクターを使用して、適合した宿主細胞中で、且つ／又は適合した宿主細胞から、ヌクレオチド配列を複製し、ポリペプチドの形で発現させることができる。発現は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む調節配列を用いて制御することができる。原核生物プロモーター及び真核細胞中で機能するプロモーターを使用することができる。組織特異的又は刺激特異的プロモーターを使用することができる。上記２種類以上の異なるプロモーターに由来する配列要素を含むキメラプロモーターを使用することもできる。
【０３８６】
ヌクレオチド配列の発現によって宿主組換え細胞によって産生されるポリペプチドは、使用される配列及び／又はベクターに応じて分泌されても、細胞内に含まれてもよい。コード配列は、特定の原核細胞膜又は真核細胞膜を通って物質コード配列（substance coding sequence）の分泌を誘導するシグナル配列を用いて設計することができる。
【０３８７】
発現ベクター
「発現ベクター」という用語は、インビボ又はインビトロでの発現が可能な構築体を意味する。
【０３８８】
発現ベクターは、生物のゲノム中に組み込まれることが好ましい。「組み込む」という用語は、ゲノム中への安定な組み込みを好ましくは包含する。
【０３８９】
本発明のヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はベクター中に存在することができ、そのベクター中でヌクレオチド配列は、制御配列がヌクレオチド配列の発現を適切な宿主生物によってもたらすことができるように、制御配列に作動可能に結合される。すなわち、このベクターは発現ベクターである。
【０３９０】
本発明のベクターは、以下に示される適切な宿主細胞に形質転換されて、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドを発現することができる。
【０３９１】
ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス又はファージベクターの選択は、それが導入される宿主細胞によって決まることが多い。
【０３９２】
ベクターは、抗生物質抵抗性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン抵抗性を与える遺伝子などの１個又は複数の選択可能な標識遺伝子を含むことができる。或いは、選択は、（国際公開第９１／１７２４３号に記載された）同時形質転換によって実施することができる。
【０３９３】
ベクターは、インビトロで、例えばＲＮＡの産生に使用することができ、又は宿主細胞に形質移入し、又は宿主細胞を形質転換するのに使用することができる。
【０３９４】
したがって、さらなる実施形態においては、本発明は、複製可能なベクター中にヌクレオチド配列を導入し、そのベクターを適合性宿主細胞に導入し、そのベクターの複製をもたらす諸条件下でその宿主細胞を増殖させることによって、本発明のヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
【０３９５】
ベクターは、さらに、当該宿主細胞中でベクターを複製することができるヌクレオチド配列を含むことができる。かかる配列の例は、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1及びpIJ702の複製開始点である。
【０３９６】
制御配列
一部の適用例においては、本発明に使用されるヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞などによって、ヌクレオチド配列の発現を可能にする制御配列に作動可能に結合することができる。例として、本発明は、かかる制御配列に作動可能に結合した本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを包含する。すなわち、このベクターは発現ベクターである。
【０３９７】
「作動可能に結合され」という用語は、記述された成分が意図したように機能できる関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に結合され」る制御配列は、調節配列に適合した諸条件下でコード配列が発現されるように連結される。
【０３９８】
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む。
【０３９９】
「プロモーター」という用語は、当技術分野の通常の意味で使用され、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０４００】
本明細書に規定される具体的諸特性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の発現増大は、異種調節領域、例えばプロモーター領域、分泌リーダー領域及びターミネーター領域を選択することによって実施することもできる。
【０４０１】
本発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動可能に結合できることが好ましい。
【０４０２】
細菌、真菌又は酵母宿主中でヌクレオチド配列の転写を誘導するのに適切なプロモーターの例は、当分野で周知である。
【０４０３】
構築体
「構築体」という用語は、「抱合体」、「カセット」、「ハイブリッド」などの用語と同義であり、プロモーターに直接又は間接的に結合し、本発明によって使用される、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。間接的な結合の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列の間に介在するＳｈ１−イントロン、ＡＤＨイントロンなどのイントロン配列などの適切なスペーサー基の提供である。直接又は間接的結合を含む、本発明に関係する「融合」という用語でも同じことが当てはまる。これらの用語は、野生型遺伝子プロモーターを通常伴うタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせを、それらがどちらも天然環境にあるときに包含しない場合もある。
【０４０４】
構築体は、さらに、遺伝子構築体の選択を可能にするマーカーを含み、発現させることもできる。
【０４０５】
一部の適用例では、構築体は、プロモーターに作動可能に結合された、少なくとも本発明のヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
【０４０６】
宿主細胞
本発明に関係する「宿主細胞」という用語は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドの組換え産生に使用される上記発現ベクターのどちらかを含む任意の細胞を含む。
【０４０７】
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドを発現するヌクレオチド配列で形質転換された、又はそれを形質移入した宿主細胞を提供する。これらの細胞は、前記ベクターに適合するように選択され、例えば、原核（例えば、細菌）細胞、真菌細胞、酵母細胞又は植物細胞とすることができる。宿主細胞は、ヒト細胞ではないことが好ましい。
【０４０８】
適切な細菌宿主生物の例はグラム陰性菌又はグラム陽性菌である。
【０４０９】
本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の性質及び／又は発現タンパク質のさらなるプロセシングの望ましさに応じて、酵母、他の真菌などの真核生物宿主が好ましいことがある。一般に、酵母細胞は、操作が容易であるので、真菌細胞よりも好ましい。しかし、一部のタンパク質は、酵母細胞からうまく分泌されないか、又は適切に処理されない場合がある（例えば、酵母における過剰糖鎖形成（hyperglycosylation））。これらの場合には、異なる真菌宿主生物を選択すべきである。
【０４１０】
酵母、真菌、植物宿主細胞などの適切な宿主細胞を使用すると、本発明の組換え発現産物に対して最適な生物活性を付与するために必要となることがある翻訳後修飾（例えばミリストイル化、グリコシル化、切断、投石（lapidation）及びチロシン、セリン又はトレオニンリン酸化）が可能になる。
【０４１１】
宿主細胞は、プロテアーゼ欠乏又はプロテアーゼマイナス系統とすることができる。
【０４１２】
生物
本発明に関係する「生物」という用語は、本発明によるヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又はそれらから得られる生成物を含むことができるあらゆる生物を含む。
【０４１３】
適切な生物としては、原核生物、真菌、酵母又は植物を挙げることができる。
【０４１４】
本発明に関係する「トランスジェニック生物」という用語は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又はそれから得られる生成物を含み、且つ／又はプロモーターが、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のその生物内での発現を可能にする、あらゆる生物を含む。ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中に組み込まれることが好ましい。
【０４１５】
「トランスジェニック生物」という用語は、その天然環境にあるその未変性プロモーターの制御下にあるときのやはりその天然環境にある未変性ヌクレオチドコード配列を包含しない。
【０４１６】
したがって、本発明のトランスジェニック生物としては、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本明細書に規定される構築体、本明細書に規定されるベクター、本明細書に規定されるプラスミド、本明細書に規定される細胞又はそれらの産物のいずれか１個又は組み合わせを含む生物が挙げられる。例えば、トランスジェニック生物は、異種プロモーターの制御下にある、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。
【０４１７】
宿主細胞／生物の形質転換
先に示したように、宿主生物は、原核生物又は真核生物とすることができる。適切な原核生物宿主の例としては、大腸菌及びバチルス サブチリスが挙げられる。
【０４１８】
原核生物宿主の形質転換に関する教示は、当分野ではこれまでたくさん記述されており、例えば、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照されたい。原核生物宿主が使用される場合には、ヌクレオチド配列は、イントロンの除去などによって形質転換前に適切に改変する必要があることがある。
【０４１９】
別の実施形態においては、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
【０４２０】
糸状菌細胞は、既知の方法によるプロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換、それに続く細胞壁の再生を含むプロセスなど当分野で既知の様々な方法を用いて形質転換することができる。宿主微生物としてアスペルギルスを使用することは、ＥＰ ０ ２３８ ０２３に記載されている。
【０４２１】
別の宿主生物は植物とすることができる。植物の形質転換に使用される一般技術の総説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)の論文にある。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許公開第０４４９３７５号にある。
【０４２２】
真菌、酵母及び植物の形質転換に関する全般的な教示を以下の項に示す。
【０４２３】
形質転換細菌
宿主生物は、ストレプトミセス、バチルス サブチリス、大腸菌などの細菌とすることができる。大腸菌中での異種発現の適切な方法は、国際公開第０４／０６４５３７号に開示されている。バチルス中での異種発現の適切な方法は、国際公開第０２／２１４４９０号に開示されている。適切な細菌宿主生物の例は、バチルス サブチリス、バチルス リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス レンタス（Bacillus lentus）、バチルス ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス ロータス（Bacillus lautus）、バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）及びバチルス チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含めたバチルス科、ストレプトミセス ムリナス（Streptomyces murinus）などのストレプトミセス種、ラクトコッカス ラクチスなどのラクトコッカス種、ラクトバチルス ロイテリ（Lactobacillus reuteri）を含めたラクトバチルス種、ロイコノストック種、ペジオコッカス種及びストレプトコッカス種を含めた乳酸菌種などのグラム陽性菌種である。或いは、大腸菌を含めた腸内細菌科又はシュードモナス科に属するグラム陰性菌種の系統を宿主生物として選択することができる。
【０４２４】
形質転換真菌
宿主生物は、糸状菌などの真菌とすることができる。適切なかかる宿主の例としては、サーモマイセス（Thermomyces）属、アクレモニウム（Acremonium）属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ムコール（Mucor）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、トリコデルマ（Trichoderma）属などに属するあらゆるメンバーが挙げられる。
【０４２５】
糸状真菌の形質転換に関する教示は、ＵＳ−Ａ−５７４１６６５に概説されており、糸状真菌の形質転換及び真菌培養の標準技術が当分野で周知であることが記載されている。Ｎ．クラッサ（N. crassa）に適用された技術の広範な総説は、例えば、Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143にある。
【０４２６】
糸状菌の形質転換に関するさらなる教示は、ＵＳ−Ａ−５６７４７０７に概説されている。
【０４２７】
一態様においては、宿主生物は、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス属とすることができる。
【０４２８】
本発明によるトランスジェニックアスペルギルスは、例えば、Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666)の教示に従って調製することもできる。
【０４２９】
糸状菌における遺伝子発現は、Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20(5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4): 273-306に概説されている。
【０４３０】
形質転換酵母
別の実施形態においては、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
【０４３１】
酵母における異種遺伝子発現の原理の総説は、例えば、Methods Mol Biol (1995), 49: 341-54及びCurr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8(5): 554-60にある。
【０４３２】
この点で、サッカロミセス セレビシ（Saccharomyces cerevisi）種又はピキア パストリス（Pichia pastoris）種（FEMS Microbiol Rev (2000 24(1): 45-66参照）などの酵母は、異種遺伝子発現用ビヒクルとして使用することができる。
【０４３３】
サッカロミセス セレビシエにおける異種遺伝子発現、及び遺伝子産物の分泌の原理の総説は、E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.)にある。
【０４３４】
酵母の形質転換の場合には、いくつかの形質転換プロトコールが開発されている。例えば、本発明によるトランスジェニックサッカロミセスは、Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929)、Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104)及びIto, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168)の教示に従って調製することができる。
【０４３５】
形質転換酵母細胞は、栄養要求性マーカー優性抗生物質抵抗性マーカーなどの様々な選択マーカーを使用して選択することができる。
【０４３６】
適切な酵母宿主生物は、ピキア種、ハンゼヌラ種、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ヤロウイニア（Yarrowinia）種、Ｓ．セレビシエを含めたサッカロミセス種又はシゾサッカロミセ ポンベ（Schizosaccharomyce pombe）を含めたシゾサッカロミセ（Schizosaccharomyce）種から選択される酵母種など、ただしこれらだけに限定されない生物工学的に関連する酵母種から選択することができる。
【０４３７】
メチロトローフの酵母種ピキア パストリスの系統を宿主生物として使用することができる。
【０４３８】
一実施形態においては、宿主生物は、（国際公開第０１／３９５４４号に記載された）Ｈ．ポリモルファ（H. polymorpha）などのハンゼヌラ種とすることができる。
【０４３９】
形質転換植物／植物細胞
本発明に適切な宿主生物は植物とすることができる。一般技術の総説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)による論文又は国際公開第０１／１６３０８号にある。トランスジェニック植物は、例えば、高レベルの植物ステロールエステル及び植物スタノールエステルを産生することができる。
【０４４０】
したがって、本発明は、本明細書に規定される脂質アシル基転移酵素を用いて（特に、本明細書に規定される脂質アシル基転移酵素を含む発現ベクター又は構築体を用いて）植物細胞を形質転換するステップと、その形質転換植物細胞から植物を成長させるステップとを含む、高レベルの植物ステロールエステル及び植物スタノールエステルを含むトランスジェニック植物を生成する方法にも関する。
【０４４１】
分泌
ポリペプチドは、発現宿主から、酵素をより容易に回収することができる培地中に分泌されることが望ましいことが多い。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択することができる。ハイブリッドシグナル配列は、本発明の状況でも使用することができる。
【０４４２】
異種分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌のＡＧ（amyloglucosidase）遺伝子（例えば、アスペルギルス由来のｇｌａＡ−１８及び２４アミノ酸）、ａ因子遺伝子（酵母、例えばサッカロミセス、クルイベロミセス及びハンゼヌラ）又はα−アミラーゼ遺伝子（バチルス）に由来する分泌リーダー配列である。
【０４４３】
検出
アミノ酸配列の発現を検出し、測定する様々なプロトコールが当分野で知られている。例としては、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）、ＲＩＡ（radioimmunoassay）及びＦＡＣＳ（fluorescent activated cell sorting）が挙げられる。
【０４４４】
多種多様な標識及び抱合（conjugation）技術が当業者に知られており、様々な核酸及びアミノ酸アッセイに使用することができる。
【０４４５】
Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)、Promega (Madison, WI)、US Biochemical Corp (Cleveland, OH)など数社が、これらの手順用の市販キット及びプロトコールを提供している。
【０４４６】
適切なレポーター分子又は標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤又は発色剤並びに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。かかる標識の使用を教示している特許としては、ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７、ＵＳ−Ａ−３，８５０，７５２、ＵＳ−Ａ−３，９３９，３５０、ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５、ＵＳ−Ａ−４，２７７，４３７、ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９及びＵＳ−Ａ−４，３６６，２４１が挙げられる。
【０４４７】
また、組換え免疫グロブリンは、ＵＳ−Ａ−４，８１６，５６７に示されたように製造することができる。
【０４４８】
融合タンパク質
本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドは、融合タンパク質として生成され、例えば、その抽出及び精製に役立てることができる。融合タンパク質パートナーの例としては、（ＧＳＴ（glutathione-S-transferase）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。融合タンパク質パートナーと目的タンパク質配列の間にタンパク質分解性切断部位を入れて、融合タンパク質配列の除去を可能にすることが好都合な場合もある。融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げないことが好ましい。
【０４４９】
大腸菌における遺伝子融合発現系は、Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5): 501-6に概説されている。
【０４５０】
本発明の別の実施形態においては、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を異種配列に連結させて、融合タンパク質をコードすることができる。例えば、物質活性に影響を及ぼすことができる薬剤についてペプチドライブラリをスクリーニングするために、市販抗体によって認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコードすることが有用な場合がある。
【０４５１】
単なる例として以下の図及び実施例を参照して、本発明を以下に説明する。
【実施例１】
【０４５２】
１ＩＶＮ上でのアエロモナス ヒドロフィラＧＤＳｘリパーゼのモデリング
アエロモナス ヒドロフィラＧＤＳＸリパーゼアミノ酸配列（Ｐ１０４８０）とエシェリキア コリ（Escherichia coli）チオエステラーゼアミノ酸配列（１ＩＶＮ）及びアスペルギルス アキュレアタス（Aspergillus aculeatus）ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼアミノ酸配列（１ＤＥＯ）とのアラインメントは、ＰＦＡＭデータベースからＦＡＳＴＡ形式で得られた。Ｐ１０４８０と１ＩＶＮのアラインメントは、１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造座標ファイル図５２）と一緒に自動３Ｄ構造モデラー（ HYPERLINK "http://www.expasy.org" www.expasy.orgのＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬＬＥＲサーバー）に入力された。得られたＰ１０４８０モデルは、（www.expasy.org/spdbv/から得られる)’Deep View Swiss-PDBビューア’を用いて１ＩＶＮ．ＰＤＢ及び１ＤＥＯ．ＰＤＢの結晶構造座標に構造的にアラインメントさせた（図５３）。ＰＦＡＭデータベースから得られたアミノ酸アラインメント（アラインメント１−（図５５））は、１ＤＥＯ．ＰＤＢ及び１ＩＶＮ．ＰＤＢの構造アラインメントに基づいて改変された。この別のアミノ酸アラインメントはアラインメント２（図５６）と呼ばれる。
【０４５３】
１ＩＶＮ．ＰＤＢ構造はグリセリン分子を含む。この分子は、触媒作用残基の付近にあるので活性部位中に存在すると考えられる。したがって、選択は、活性部位に近く、そのために基質結合、生成物放出及び／又は触媒作用に影響を及ぼす可能性がある残基から行うことができる。１ＩＶＮ．ＰＤＢ構造においては、活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を有する１０Åの球内の全アミノ酸が選択された（アミノ酸セット１）（図５３及び図５４参照）。
【０４５４】
以下のアミノ酸がＰ１０４８０配列から選択された；（１）アラインメント１におけるアミノ酸セット１に対応するＰ１０４８０中の全アミノ酸、（２）アラインメント２におけるアミノ酸セット１に対応するＰ１０４８０中の全アミノ酸、（３）Ｐ１０４８０モデルと１ＩＶＮ中のグリセリン分子から１２Å以内のＰ１０４８０モデル中の１ＩＶＮ全アミノ酸との重なり（overlay）から。全３グループは組み合わされてアミノ酸セット２を与える。
【０４５５】
配列Ｐ１０４８０は「ＡＡＧ０９８０４．１ ＧＩ：９９６４０１７グリセロリン脂質−コレステロールアシル基転移酵素［アエロモナス サルモニシダ］」とアラインメントさせ、アミノ酸セット２に対応するＡＡＧ０９８０４中の残基が、アミノ酸セット３を得るために選択された。
【０４５６】
セット１、２、及び３
アミノ酸セット１：
アミノ酸セット１（これらは１ＩＶＮ中のアミノ酸であることに留意されたい−図５７及び図５８）。
Ｇｌｙ８、Ａｓｐ９、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｔｙｒ１５、Ｇｌｙ４４、Ａｓｐ４５、Ｔｈｒ４６、Ｇｌｕ６９、Ｌｅｕ７０、Ｇｌｙ７１、Ｇｌｙ７２、Ａｓｎ７３、Ａｓｐ７４、Ｇｌｙ７５、Ｌｅｕ７６、Ｇｌｎ１０６、Ｉｌｅ１０７、Ａｒｇ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｐｒｏ１１０、Ｔｙｒ１１３、Ｐｈｅ１２１、Ｐｈｅ１３９、Ｐｈｅ１４０、Ｍｅｔ１４１、Ｔｙｒ１４５、Ｍｅｔ１５１、Ａｓｐ１５４、Ｈｉｓ１５７、Ｇｌｙ１５５、Ｉｌｅ１５６、Ｐｒｏ１５８
【０４５７】
ＧＤＳｘ、触媒作用残基などの高度に保存されたモチーフは、セット１から除外された（下線を引いた残基）。不確かさを回避するために、セット１は、１ＩＶＮモデルの活性部位中のグリセリンの中心炭素原子の１０Å以内にあるアミノ酸残基を規定する。
【０４５８】
アミノ酸セット２：
アミノ酸セット２（アミノ酸の番号付与は、Ｐ１０４８０成熟配列中のアミノ酸を参照したものであることに留意されたい）
Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９及びＶａｌ２９０。
【０４５９】
セット２と比較したセット１中の選択残基の表：
【０４６０】
【表６】
2010142243.tif 000008
2010142243.tif 000009
【０４６１】
アミノ酸セット３：
アミノ酸セット３はセット２と同一であるが、アエロモナス サルモニシダ（配列番号２８）コード配列を指す。すなわち、アミノ酸残基番号は、シグナル配列を含むタンパク質（配列番号２８）と比較した成熟タンパク質（配列番号２）中のアミノ酸番号付与の差を反映して、セット３が１８大きい。
【０４６２】
アエロモナス サルモニシダＧＤＳＸ（配列番号２８）とアエロモナス ヒドロフィラＧＤＳＸ（配列番号２６）の成熟タンパク質は５アミノ酸だけ異なる。これらは、Ｔｈｒ３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１８２Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３０９Ａｌａ、Ｓｅｒ３１０Ａｓｎ、Ｇｌｙ３１８−である。サルモニシダ残基は最初に、ヒドロフィラ残基は最後に記載されている（図５９）。ヒドロフィラタンパク質は、わずか３１７アミノ酸長であり、３１８位の残基を欠いている。アエロモナス サルモニシダＧＤＳＸは、ガラクト脂質基質などの極性脂質に対してアエロモナス ヒドロフィラタンパク質よりもかなり高い活性を有する。全５個のアミノ酸位置に対して部位の走査が実施された。
【０４６３】
アミノ酸セット４：
アミノ酸セット４はＳ３、Ｑ１８２、Ｅ３０９、Ｓ３１０及び−３１８である。
【０４６４】
アミノ酸セット５：
Ｆ１３Ｓ、Ｄ１５Ｎ、Ｓ１８Ｇ、Ｓ１８Ｖ、Ｙ３０Ｆ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｅ、Ｄ１５７ Ｎ、Ｙ２２６Ｆ、Ｄ２２８Ｎ Ｙ２３０Ｆ。
【０４６５】
アミノ酸セット６：
アミノ酸セット６は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、−３１８である。
【０４６６】
セット６におけるアミノ酸の番号付与は、Ｐ１０４８０（配列番号２）におけるアミノ酸残基を参照したものである。他の配列骨格における対応するアミノ酸は、Ｐ１０４８０及び／又は１ＩＶＮに対する相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントによって求めることができる。
【０４６７】
アミノ酸セット７：
アミノ酸セット７は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、−３１８、Ｙ３０Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｙ２２６Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｙ２３０Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷから選択される）、Ｓ１８Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ又はＹから選択される）、Ｄ１５７Ｘ（ここで、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹから選択される）。
【０４６８】
セット７におけるアミノ酸の番号付与は、Ｐ１０４８０（配列番号２）におけるアミノ酸残基を参照したものである。他の配列骨格における対応するアミノ酸は、Ｐ１０４８０及び／又は１ＩＶＮに対する相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントによって求めることができる）。
【０４６９】
結晶構造から二次構造分類（secondary structure classification）を得ることができる。すなわち、各アミノ酸をアルファヘリックス又はベータシートの部分として分類することができる。図５７に、１ＤＥＯ、１ＩＶＮ及びＰ１０４８０（データベース アエロモナス ヒドロフィラ）のＰＦＡＭアラインメントを示す。配列の各行の下に付記されたのは構造分類である。
【０４７０】
ＰＦＡＭデータベースは、配列同一性が低いタンパク質のアラインメントを含む。したがって、これらのアラインメントはあまり良くない。アラインメントアルゴリズム（ＨＡＭＭＥＲプロファイル）は保存モチーフを認識するのに適切であるが、このアルゴリズムは詳細なレベルではあまり良くない。したがって、ＰＦＡＭアラインメントと構造アラインメントとの相違を見出すことは驚くべきことではない。当業者は容易に気づくとおり、構造データに基づいてＰＦＡＭアラインメントを改変することができる。重複する構造上の要素をアラインメントさせることができることを意味する。
【０４７１】
図５５に、１ＤＥＯ、１ＩＶＮ及びＰ１０４８０の最初のＰＦＡＭアラインメントを示す。アラインメントに付記されているのは、１ＤＥＯ及び１ＩＶＮの結晶構造から得られる二次構造情報である。図５６のアラインメント２は手操作で改変されたアラインメントであり、二次構造要素間の一致が改善される。１ＤＥＯとＰ１０４８０又は１ＩＶＮとＰ１０４８０の間の保存残基に基づいて、アラインメントは、Ｐ１０４８０に対しても同様に改変された。配列ブロックを容易に区別するために、アラインメント２における配列識別子はさらにｍを有する（１ＤＥＯｍ、１ＩＶＮｍ、Ｐ１０４８０ｍ）。
【０４７２】
アラインメント３は１と２の混合であり、ブロックごとのアラインメントを与える。
【実施例２】
【０４７３】
部位走査ライブラリの構築
Stratagene社製Quick Change Multi Site-Directed Mutagenesis Kitを製造者の指示に従って使用した。各ライブラリに対して、１個のＮＮＫ又はＮＮＳ（ヌクレオチド略語）コドンを有する縮重プライマーが設計された。プライマー設計は、Stratagene社ウェブサイト上で利用可能なツールを用いて実施した。プライマーの品質管理は、プライマーがヘアピン又はプライマー２量体を形成する可能性があるかどうかを分析する標準分析ツールを用いてさらに確認された。
【０４７４】
この方法の主概念は以下のとおりである。すなわち、Pfu-Turbo、単一プライマーなどの非鎖置換高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＤＮＡテンプレートを線形増幅するものである。これは、ＰＣＲ反応の通常の指数増幅プロセスとは対照的である。この線形増幅プロセスによってエラー頻度は確実に低くなる。生成物は、一本鎖非メチル化ＤＮＡ及び二重鎖半メチル化ＤＮＡである。適切な宿主生物からテンプレートが得られる場合には、テンプレートは二重鎖メチル化ＤＮＡである。これは、テンプレートＤＮＡが、Dpn Iエンドヌクレアーゼによって、生成物ＤＮＡを消化することなく、消化され得ることを意味する。したがって、適切な宿主中にこのＤＮＡを形質転換すると、非変異誘発プラスミドによる形質転換体が極めて低頻度である。
【実施例３】
【０４７５】
部位走査ライブラリからの勝者の選択
２つの代替手法、すなわち、ライブラリ配列決定とそれに続く一義的なアミノ酸の分析又はライブラリ分析とそれに続く勝者の配列決定が記述される。
【０４７６】
勝者選択方法１；ライブラリ配列決定とそれに続く一義的アミノ酸の分析
大腸菌における部位走査ライブラリ／変異体の作製及びＢ．サブチリスにおける変異体発現に使用される形質転換／発現シャトルベクターは、選択カセットをカナマイシン選択カセットに置換することによってpDP66S、Penninaga et al., (Biochemistry (1995), 3368-3376)から誘導された。Ｐ３２プロモーターの下流のｃｇｔ遺伝子の代わりにアシル基転移酵素変異体遺伝子を挿入するのに使用されたベクター。ベクターは、Ｐ３２プロモーターを使用してＢ．サブチリス中でアシル基転移酵素変異体遺伝子を発現させる。
【０４７７】
発現ベクターは、Molecular Biological Methods for Bacillus (Ed. C.R. Harwood and S.M. Cutting), 1990. John Wiley & Sons Ltd. Chichester, UK)の第３章に記載されたとおり、形質転換方法を用いてｎｐｒＥ−、ａｐｒＡ−バチルス サブチリスＤＢ１０４（Kawamura and Doi, J. of Bacteriology Oct 1984, p442-444）に形質転換された。
【０４７８】
部位走査ライブラリは、１個のＮＮＫコドンを含む縮重オリゴを用いて構築された。ここで、ＫはＧ又はＴであり、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである。これは、（「部位走査ライブラリ」としても知られる）ＮＮＫプライマーを用いた増幅反応から構築される１セットのクローンが、３２個の一義的コドン（４×４×２＝３２の組み合わせ選択肢）を原則的には含むことを意味する。然るべき偏り（bias due）がないとして、３２個のコドンの各々を少なくとも１回選択する確率が９５％であるように選択する必要があるクローン数は９５である。これは、以下の式を用いて計算することができる。
式１；ｎ＝｛ｌｏｇ（１−ｃ）｝／｛ｌｏｇ（１−ｆ）｝
【０４７９】
式中、ｎはクローン数であり、ｃは信頼区間の割合であり、例えば９５％信頼区間は０．９５の値を有し、９９％信頼区間は０．９９の割合であり、ｆは各個々のコドンが発生する頻度であり、ＮＮＫプライマーの場合には１／３２又は０．０３１２５である。ｎについて式を解くと９４．３６又は９５個のクローンが得られる。９５％信頼区間は低すぎると考えられる場合、或いはライブラリ構築プロセスの１つ又は複数のステップにおいて偏りを回避することができない場合には、より多くのクローンを分析し又は配列決定することに決めることができる。例えば、式１において、ｎを３８４、ｆを１／３２又は０．０３１２５と設定すると、信頼区間ｃは９９％よりもはるかに大きい。クローンの６０％が同じ変異又は野生型コドンを含む場合でも、３６３個のクローンは、全３２個のコドンを得る信頼度が９９％である。このことから、３８４個のクローンは、３２個のコドンの各々を少なくとも１回含む信頼度が９９％であると結論することができる。
【０４８０】
コロニーＰＣＲを実施した（細菌コロニー又は細菌培養液上でのＰＣＲ反応によって細菌内部のプラスミドから断片を増幅し、続いて変異誘発された断片部分の配列を決定するのが確立された手順である。コロニーＰＣＲは、コロニーＰＣＲ、配列決定及び配列精製用の（キットとしても知られる）既成の材料の入手性のために、９６のセットに対して常法に従って実施することができる。この手順全体は、AGOWA GmbH, Glienicker weg 185, D-12489 Berlin, Germanyなどのいくつかの会社によってサービスとして提供される。
【０４８１】
９６個の配列反応を解析した後に、９６個の配列からなるセットにおいて利用可能である各コドンに対して１個の個々のクローンが選択される。続いて、変異体であるクローンの各々について、カナマイシン５０ｍｇ／ｌが補充されたＬＢブロス５ｍｌ（カゼイン酵素消化、１０ｇ／ｌ；低ナトリウム酵母エキス、５ｇ／ｌ；塩化ナトリウム、５ｇ／ｌ；不活性錠剤形成助剤（tableting aid）、２ｇ／ｌ）が接種され、３３℃で６時間２０５ｒｐｍでインキュベートされた。この培養物０．７ｍｌを使用して、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ及び高マルトースデンプン加水分解物溶液（６０ｇ／ｌ）が補充されたＳＡＳ基質５０ｍｌ（Ｋ2ＨＰＯ4、１０ｇ／ｌ；ＭＯＰＳ（3-morpholinopropane sulfonic acid）、４０ｇ／ｌ；塩化ナトリウム、５ｇ／ｌ；消泡剤（Sin 260）、５滴／ｌ；脱脂大豆粉、２０ｇ／ｌ；Biospringer 106（１００％ ｄｗ ＹＥ）、２０ｇ／ｌ）を接種した。インキュベーションを３３℃及び１８０ｒｐｍで４０時間続けた後、１９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して培養上清を分離した。上清を清浄な管に移し、アッセイに直接使用した。
【０４８２】
勝者選択方法２；ライブラリスクリーニングとそれに続く勝者の配列決定
３８４個のクローンの配列決定を選択することもできるが、それらを分析し改良変異体を選択した後に配列決定することもできる。
【０４８３】
かかるいくつかの試料をスクリーニングするときには、いくつかの問題を考慮すべきである。網羅的でなく、１個の基質に対する活性が変化した変異体を選択することは可能であるが、３８４ウェルマイクロタイタープレートを用いたとしても、３８４個の培養物間の発現レベル差は相当なものになり得、その結果、バックグラウンドが高くなる。したがって、２つの活性を測定し、比の変化に基づいて勝者を選択することが好ましい方法である。例えば、２つの活性がある比Ｒを有する場合、存在する酵素の絶対量にかかわらず、２つの活性の比は常にＲである。Ｒ値の変化は、第２の活性に対して１つの活性を変えた変異を示す。
【０４８４】
図６０に部位走査ライブラリから得られたデータセットを示す。クローンは、ＰＣ（phosphatidyl cholin）及びＤＧＤＧ（digalactosyl diglyceride）に対する活性についてすべて試験される。Ｒ値が変化しない全クローンは、変異していてもいなくても、ある許容誤差をもって直線上に載る。これらのクローンを無視すると、目的とする３個のグループは図６１のようになる。
【０４８５】
図６１のセクション１は、（変異していない）野生型よりもかなり高いＲを有するが全ＤＧＤＧ活性がそれよりも低い全クローンを含む。セクション２は、野生型よりも高いＲ値及びＤＧＤＧ活性を有するクローンを含む。セクション３は、より高いＲ値を持たないがかなり高いＤＧＤＧ又はＰＣ活性を有するクローンを含む。
【０４８６】
ＤＧＤＧに対して高い活性を有する変異体に関心がある場合には、セクション２は最も興味深い変異体を含み、セクション３も目的とする変異体を含む。加水分解活性が大きく増加するセクション３の変異体は、転移酵素活性の減少を伴うことがある。
【０４８７】
１つのことが注目に値する。特異性決定残基に命中した場合には、２０個の可能なアミノ酸の大部分は極めて異なるＲ値を生じ得る。しかし、ライブラリが単一のアミノ酸に対して大きな偏りを含む（例えば６０％がチロシンである）場合には、これらの変異体はすべて依然として直線上に載る。
【実施例４】
【０４８８】
３８４ウェルマイクロタイタープレートにおけるＰＣ及びＤＧＤＧ活性のアッセイ
出発材料
・ＥＭ培地
・形質転換体を含むプレート
・野生型を含むプレート
・３８４個のプレート
・コロニー採取器（colony picker）
・Waco社製NEFA-Cキット
・３８４プレート中のＰＣ及びＤＧＤＧ溶液
【０４８９】
パート１−コロニー採取
・ＥＭ培地が充填された３８４プレートにコロニーを採取する
・４個のウェルを抜かし、非変異骨格を含むコロニーでそれらを接種する
・３０℃、振とう速度２００ｒｐｍでｏ／ｎを増殖させる
【０４９０】
パート２−基質上でのインキュベーション
・ｏ／ｎ増殖プレートを遠心分離する；２５００ｒｐｍ、２０分間
・各ウェルから２個の空の３８４プレートに上清１０μｌを移す
・１２．５ｍＭ ＤＧＤＧ ５μｌをプレートの一方に添加し、１２．５ｍＭ ＰＣ ５μｌをもう一方のプレートに添加する
・両方のプレートを３７℃で２時間インキュベートする。最初に振とうして混合し、次いで振とうを停止する
・NEFA C手順を続ける
【０４９１】
パート３−NEFA-C手順
・Ａ溶液１０μｌを添加する
・３７℃、３００ｒｐｍで１０分間インキュベートする
・Ｂ溶液２０μｌを添加する
・３７℃、３００ｒｐｍで１０分間インキュベートする
・５５０ｎｍでプレートを読み取る
【０４９２】
基質組成−ｍＭ
２５ｍＭ ＰＣ ｅｌｌｅｒ ＤＧＤＧ
１０ｍＭ ＣａＣｌ2
６０ｍＭ Triton X 100
１５ｍＭ ＮａＮ3
２０ｍＭ Briton Robinson ｐＨ５．０
【実施例５】
【０４９３】
選択変異体
酵素活性の測定
さまざまな基質に対する酵素活性を測定するために、酵素溶液４μｌを基質１１μｌと一緒に３７℃で６０分間インキュベートした。続いて、WACO社製NEFA-Cキットを用いて遊離脂肪酸量を測定した。酵素＋基質混合物１５μｌにNEFA溶液Ａ ７５μｌを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。続いて、NEFA溶液Ｂ １５０μｌを添加し、１５分間インキュベートした。続いて、試料の光学濃度（ＯＤ）を５５０ｎｍで測定した。
【０４９４】
対照として、各変異体から、酵素溶液４μｌをHEPES緩衝剤１１μｌと一緒に３７℃で６０分間インキュベートした。続いて、上述したように遊離脂肪酸量を測定した。この対照試料のＯＤ値を各基質に対する実測ＯＤから差し引いて、補正された活性を得た。
【０４９５】
４個の異なる基質が使用された。組成物は、一般に、脂質３０ｍｇ、５０ｍＭ HEPES緩衝剤ｐＨ７ ４．７５ｍｌ、０．６Ｍ ＣａＣｌ２ ４２．５μｌ、１０％Triton X-100 Ｈ２Ｏ２無添加２００μｌであった。脂質３０ｍｇは、ＰＣ（phosphatidyl choline）、９：１比のＰＣとコレステロール、ＤＧＤＧ（digalactosyl diglyceride）又は９：１比のＤＧＤＧとコレステロールであった。
【０４９６】
改良変異体の選択
ＰＣに対する活性が改善された変異体
ＰＣに対してインキュベートされたときに野生型酵素よりもＯＤが増加した変異体は、ホスホリパーゼ活性が改善された変異体として選択された。
【０４９７】
ＤＧＤＧに対する活性が改善された変異体
ＤＧＤＧに対してインキュベートされたときに野生型酵素よりもＯＤが増加した変異体は、ＤＧＤＧに対する活性が改善された変異体として選択された。
【０４９８】
ＤＧＤＧに対する特異性が改善された変異体
ＤＧＤＧに対する特異性は、ＤＧＤＧに対する活性とＰＣ（phosphatidylcholine）に対する活性の比である。ＤＧＤＧとＰＣの比が野生型よりも高い変異体は、ＤＧＤＧに対する特異性が改善された変異体として選択された。
【０４９９】
アシル供与体としてＰＣを用いて転移酵素活性が改善された変異体
ＰＣに対して及びＰＣとコレステロールに対して酵素をインキュベートするときに形成される遊離脂肪酸量の差は、加水分解活性量に対する転移酵素活性量の指標である。転移酵素活性は、遊離脂肪酸の形成を生じない。転移酵素優先度は、基質としてＰＣが使用されたときに形成される遊離脂肪酸と、基質としてＰＣとコレステロールが使用されたときに形成される遊離脂肪酸との比である。転移酵素優先度の増加を示す変異体及びＰＣに対して野生型活性よりも高い変異体は、改善された転移酵素活性を有するとして選択された。
【０５００】
アシル供与体としてＤＧＤＧを用いて転移酵素活性が改善された変異体
ＤＧＤＧ及びＤＧＤＧとコレステロールに対して酵素をインキュベートするときに形成される遊離脂肪酸量の差は、加水分解活性量に対する転移酵素活性量の指標である。転移酵素活性は、遊離脂肪酸の形成を生じない。転移酵素優先度は、基質としてＤＧＤＧが使用されたときに形成される遊離脂肪酸と、基質としてＤＧＤＧとコレステロールが使用されたときに形成される遊離脂肪酸との比である。転移酵素優先度の増加を示す変異体及びＤＧＤＧに対して野生型活性よりも高い変異体は、改善された転移酵素活性を有するとして選択された。
【０５０１】
選択変異体
上記４つの選択判定基準の各々に対していくつかの変異体が選択された。この実施例における「野生型」酵素はＡ．サルモニシダ（配列番号２８）である。
ＰＣに対する活性が改善された変異体：
【０５０２】
【表７】
2010142243.tif 000010
【０５０３】
ＤＧＤＧに対する活性が改善された変異体：
【０５０４】
【表８】
2010142243.tif 000011
【０５０５】
ＤＧＤＧに対する特異性が改善された変異体：
【０５０６】
【表９】
2010142243.tif 000012
【０５０７】
アシル供与体としてＰＣを用いて転移酵素活性が改善された変異体：
【０５０８】
【表１０】
2010142243.tif 000013
【０５０９】
アシル供与体としてＤＧＤＧを用いて転移酵素活性が改善された変異体：
【０５１０】
【表１１】
2010142243.tif 000014
【実施例６】
【０５１１】
転移酵素アッセイ リン脂質：コレステロール
リン脂質はＤＧＤＧで置換されて、ガラクト脂質からの転移酵素アッセイを提供することができる。他の受容体、例えば、グリセリン、グルコース、ヒドロキシ酸、タンパク質又はマルトースも同じアッセイに使用することができる。
【０５１２】
ホスファチジルコリン（Avanti #441601）：コレステロール（Sigma C8503）９：１ ３００ｍｇをWheatonガラスに計量する。５０ｍＭ HEPES緩衝剤ｐＨ７．０ １０ｍｌを添加し、４０℃で撹拌して基質を分散させる。
基質０．５ｍｌを４ｍｌバイアルに移し、４０℃の加熱ブロック中に置く。転移酵素溶液０．０５０ｍｌを添加し、水０．０５０ｍｌを含む対照も同様に分析する。反応混合物を４０℃で４時間撹拌する。次いで、試料を凍結し、凍結乾燥させ、ＧＬＣによって分析する。
計算：
ＧＬＣ分析から、遊離脂肪酸とコレステロールエステルの含量を計算する。
【０５１３】
酵素活性は以下のとおり計算される。
％転移酵素活性＝（Δ％コレステロールエステル／（Ｍｖステロールエステル）×１００） ／ （Δ％コレステロールエステル／（Ｍｖコレステロールエステル）＋Δ％脂肪酸／（Ｍｖ脂肪酸））
％加水分解活性＝（Δ％脂肪酸／（Ｍｖ脂肪酸）×１００） ／ （Δ％コレステロールエステル／（Ｍｖコレステロールエステル）＋Δ％脂肪酸／（Ｍｖ脂肪酸））
転移酵素／加水分解（Hydrolyse）比＝％転移酵素活性／％加水分解活性
ここで、
Δ％コレステロールエステル＝％コレステロールエステル（試料）−％コレステロールエステル（対照）
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸（試料）−％脂肪酸（対照）
【０５１４】
転移酵素アッセイ ガラクト脂質：コレステロール。
ＤＧＤＧ（digalactosyldiglyceride）（純度＞９５ガラクト脂質、使用されるＤＧＤＧはコムギ脂質から精製される。Sigma社製ＤＧＤＧ D4651も適切に使用することができる）：コレステロール（Sigma社製）９：１ ３００ｍｇをWheatonガラスに計量する。５０ｍＭ HEPES緩衝剤ｐＨ７．０ １０ｍｌを添加し、４０℃で撹拌して基質を分散させる。
基質０．５ｍｌを４ｍｌバイアルに移し、４０℃の加熱ブロック中に置く。転移酵素溶液０．０５０ｍｌを添加し、水０．０５０ｍｌを含む対照も同様に分析する。反応混合物を４０℃で４時間撹拌する。次いで、試料を凍結し、凍結乾燥させ、ＧＬＣによって分析する。
計算：
ＧＬＣ分析から、遊離脂肪酸とコレステロールエステルの含量を計算する。
酵素活性は以下のとおり計算される。
％転移酵素活性＝（Δ％コレステロールエステル／（Ｍｖステロールエステル）×１００） ／ （Δ％コレステロールエステル／（Ｍｖコレステロールエステル）＋Δ％脂肪酸／（Ｍｖ脂肪酸））
％加水分解活性＝（Δ％脂肪酸／（Ｍｖ脂肪酸）×１００） ／ （Δ％コレステロールエステル／（Ｍｖコレステロールエステル）＋Δ％脂肪酸／（Ｍｖ脂肪酸））
転移酵素／加水分解比＝％転移酵素活性／％加水分解活性
ここで、
Δ％コレステロールエステル＝％コレステロールエステル（試料）−％コレステロールエステル（対照）
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸（試料）−％脂肪酸（対照）
【実施例７】
【０５１５】
アエロモナス ヒドロフィラの脂質アシル基転移酵素変異体（配列番号２６）
変異は、Stratagene, La Jolla, CA92037, USA社製QuikChange（登録商標）Multi-Site Directed Mutagenesisキットを用いて、Stratagene社の指示に従って導入された。
【０５１６】
Ｔｙｒ２５６における変異は、リン脂質に対する活性を増大させた。
【０５１７】
Ｔｙｒ２５６及びＴｙｒ２６０における変異は、ガラクト脂質に対する活性を増大させた。
【０５１８】
Ｔｙｒ２６５における変異は、アシル供与体としてのガラクト脂質と一緒に転移酵素活性を増大させた。
【０５１９】
番号は、以下の配列上の位置を示す：そのアミノ酸配列が配列番号２６で示されるアエロモナス ヒドロフィラ由来の酵素。ヌクレオチド配列は配列番号２７で示される。
【実施例８】
【０５２０】
アエロモナス サルモニシダ由来のＧＣＡＴ（glycerophospholipid:cholesterol acyltransferase）の変異体のスクリーニング
ホスファチジルコリンよりもジガラクトシルジグリセリドに対して良好な活性を有する変異体を選択する目的で、アエロモナス サルモニシダ由来のＧＣＡＴ（glycerophospholipid:cholesterol acyltransferase）の点変異から得られる変異体を、供与体としてホスファチジルコリン又はジガラクトシルジグリセリド及び受容体としてコレステロールを用いて転移酵素活性についてスクリーニングした。
【０５２１】
ＧＣＡＴ変異体を、供与体としてＤＧ（digalactosyldiglyceride）及びＰＣ（phosphatidylcholine）並びに受容体としてコレステロールを用いて転移酵素活性についてスクリーニングした。
【０５２２】
ＤＧ（純度＞９５％ジガラクトシルジグリセリド（使用されるＤＧＤＧはコムギ脂質から精製される。Sigma社製ＤＧＤＧ D4651もSignma社製D4651から適切に使用することができる）、）及びコレステロール（Sigma社製C8503）を比９：１で計量し、クロロホルムに溶解させ、蒸発乾固させた。
【０５２３】
基質は、３％ＤＧ：コレステロール ９：１を５０ｍＭ HEPES緩衝剤ｐＨ７に分散させることによって調製された。
【０５２４】
基質０．２５０ｍｌをネジ蓋つき３ｍｌガラスに移した。変異体ＧＣＡＴの発酵から得られた上清０．０２５ｍｌを添加し、４０℃で２時間インキュベートした。酵素の代わりに水を含む基準試料も調製された。反応混合物を沸騰水浴中で１０分間加熱して酵素反応を停止させた。
【０５２５】
９９％エタノール２ｍｌを添加し、コレステロール分析及び遊離脂肪酸分析に供した。
【０５２６】
コレステロールアッセイ
コレステロールオキシダーゼ（SERVA Electrophoresis GmbH cat. No 17109）１．４Ｕ／ｍｌ、ABTS（Sigma社製A-1888）０．４ｍｇ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ（Sigma社製6782）６Ｕ／ｍｌを含む基質１００μｌの０．１Ｍ ＴＲＩＳ、ＨＣｌ緩衝剤ｐＨ６．６＋０．５％Triton X 100（Sigma社製X-100）溶液を３７℃で５分間インキュベートした。コレステロール試料５μｌを添加し混合した。反応混合物をさらに５分間インキュベートし、ＯＤ ４０５ｎｍを測定した。コレステロール含量を、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．２０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ及び０ｍｇ／ｍｌを含むコレステロール標準液の分析から計算した。
【０５２７】
遊離脂肪酸アッセイ
試料中の遊離脂肪酸は、NEFA Cキット（WAKO Chemicals GmbH）を用いて測定された。
NEFA試薬A ７５μｌを37℃で１０分間インキュベートした。酵素試料１５μｌを添加し、混合した。反応混合物を１０分間インキュベートした。NEFA試薬B １５０μｌを添加し、混合し、さらに１０分間インキュベートし、ＯＤ ５４０ｎｍを測定した。遊離脂肪酸は、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５及び０ｍＭ脂肪酸標準液から計算された。
【０５２８】
供与体としてホスファチジルコリンを用いた転移酵素アッセイも同様に測定されたが、ＤＧ（ＤＧＤＧ）の代わりにホスファチジルコリン（Avanti #441601）を用いた。
【０５２９】
転移酵素活性は、基準試料中の遊離コレステロールと酵素試料中の遊離コレステロールの差から計算された％エステル化コレステロールとして表された。
【０５３０】
加水分解活性は、酵素試料中の遊離脂肪酸と基準試料中の遊離脂肪酸の差から計算された生成遊離脂肪酸％として表された。
【０５３１】
ＤＧとＰＣに対する相対転移酵素活性は、％ＴDG／ＴPCとして計算された。ＤＧに対する変異体の転移酵素活性ＴDG／加水分解活性ＨDGは、以下のとおり計算された。
（０．１×％ＴＤＧ／３８６） ／ （％ ＨＤＧ／２８０） ＝ （０．１×％ＴＤＧ×２８０） ／ （％ ＨＤＧ×３８６）
ここで、３８６＝コレステロールのＭＷ及び２８０＝脂肪酸のＭＷ。
ＴDG＞５０％及びＴDG／ＴPC＞３及び（０．１×％ＴDG／３８６） ／ （％ ＨDG／２８０） ＞ ２．５
の変異体が、改良変異体として選択された。
【０５３２】
上記実施例から得られたデータは、鍵となる部位及び／又はＴPCに比べてＴDGの高い割当て（ration）などの所望の活性プロファイルを与える特異的アミノ酸置換を特定し優先順位をつけるために、統計学によって分析することができる。例えば、以下の堅牢なモデリングが提案される。
【０５３３】
ＴPC及びＴDGに関する情報は、打切り応答最大（０、ＴPC）及び最大（０、ＴDG）によって伝達される。試験の目的は、絶対スケールと対照（負）と比較した相対スケールとの両方において正の値が優先されるｌｎ（１＋ＴDG）−ｌｎ（１＋ＴPC）のスコアに基づいて、ＴDG＞＝Ｔｐｃとなる設定を特定することである。好ましい設定は、バイナリ応答（イベント、非イベント）に基づいて特定される。ここで、イベントは、スコアに関して好ましい応答と定義される。予備情報が含まれない経験的データ構造に基づく、相補的ｌｏｇ−ｌｏｇリンクを有する二項式ＧＬＩＭモデルによって、バイナリ応答が分析される。統計解析を実施する方法の詳細については、以下の参考文献を参照されたい：proc LOGISTIC in SAS Institute Inc., SAS/STAT（登録商標） User's Guide, Version 6, 4.Ed, Vol.2, Cary, NC: SAS Institute Inc., 1989。
【０５３４】
【表１２】
2010142243.tif 000015
2010142243.tif 000016
【実施例９】
【０５３５】
アエロモナス サルモニシダ由来のＧＣＡＴ（glycerophospholipid:cholesterol acyltransferase）の改良変異体の選択
この実施例における「親」酵素はＡ．サルモニシダ（配列番号２８）である。
【０５３６】
アエロモナス サルモニシダ由来のＧＣＡＴの３２個の位置（２３０ Ｔｙｒ、１８２ Ｌｙｓ、３ Ｔｈｒ、１５７ Ａｓｐ、３１０ Ｔｈｒ、３１８ Ｇｌｙ、３０９ Ｇｌｕ、１７ Ｌｅｕ、１１１ Ｔｒｐ、１１７ Ｔｙｒ、１７９ Ｔｙｒ、１１８ Ｌｅｕ、２１５ Ａｓｎ、２２ Ｌｙｓ、２９０ Ｖａｌ、２８９ Ｇｌｎ、２８５ Ｍｅｔ、１８ Ｓｅｒ、２３ Ｍｅｔ、１８０ Ｈｉｓ、２８４ Ｌｙｓ、１８１ Ａｓｎ、２０９ Ｍｅｔ．、２１０ Ｌｅｕ、２１１ Ａｒｇ、４０ Ｇｌｙ、８１ Ｐｒｏ，１１２ Ｖａｌ、８０ Ａｓｎ、８２ Ｌｙｓ、８８ Ａｓｎ、８７ Ａｓｎを、実施例８の実験概要に従ってスクリーニングした。
【０５３７】
スクリーニング結果及び３つの選択判定基準に基づいて、表１に記載された以下の変異体が選択された。
【０５３８】
【表１３】
2010142243.tif 000017
【実施例１０】
【０５３９】
アエロモナス サルモニシダ由来のＧＣＡＴ（glycerophospholipid:cholesterol acyltransferase）の変異に対する目的とする特異的アミノ酸領域の選択
ｐｆａｍアラインメント（アラインメント２；図５６）及びＰ１０４８０モデルと１ＩＶＮとの重なりから、１ＩＶＮの活性部位中のグリセリン分子を包囲する領域中の全アミノ酸が選択され、特定の目的領域（ループ）を限定するために使用された。（番号は、Ｐ１０４８０成熟配列（配列番号２）中のアミノ酸を指す）：
Thr 20- Arg 41 (ループ1、L1)
Ile 77- Leu 89 (ループ2、L2)
Leu 118 - Asp 127 (ループ3、L3)
Gly 146- Val 176 (ループ4、L4)
Glu 208 - Trp 287 (ループ5、L5)
【０５４０】
したがって、ＩＶＲ（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）は以下のとおり命名される。
Ala 1 - Asp 19 (IVR1)
Phe 42 - Lys 76 (IVR2)
Asp 90 - Tyr 117 (IVR3)
Ala 128 - Asn 145 (IVR4)
Ser 177 - Ala 207 (IVR5)
Asp 288 - His 317 (IVR6)
【０５４１】
以下の表は、アエロモナス サルモニシダ由来のＧＣＡＴ（glycerophospholipid:cholesterol acyltransferase）の変異に対する好ましい位置の割当てを要約したものである。この結果は、実施例８から１０に記載された実験概要に基づく。
【０５４２】
【表１４】
2010142243.tif 000018
【０５４３】
上記明細書に述べられたすべての刊行物を参照により本明細書に援用する。本発明に記載の方法及びシステムの様々な改変形態及び変更形態が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を具体的な好ましい実施形態と関連して説明したが、特許請求する本発明がかかる具体的実施形態に不当に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明白である本発明の記載された実施形態の様々な変形形態は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０５４４】
【図１】データベースバージョン６からのｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】生物アエロモナス ヒドロフィラ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から得られるアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。このアミノ酸配列は基準酵素であり、本発明による親酵素とすることができる。
【図３】生物アエロモナス サルモニシダ（ＡＡＧ０９８４０４；ＧＩ：９９６４０１７）から得られるアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図４】生物ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）から得られるアミノ酸配列（配列番号４）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６３１５５８）を示す図である。
【図５】生物ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）から得られるアミノ酸配列（配列番号５）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＣ４２１４０）を示す図である。
【図６】生物サッカロミセス セレビシエから得られるアミノ酸配列（配列番号６）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ４１７３４）を示す図である。
【図７−１】ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列に対する選択配列のアラインメントを示す図である。
【図７−２】ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列に対する選択配列のアラインメントを示す図である。
【図７−３】ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列に対する選択配列のアラインメントを示す図である。
【図８】アミノ酸配列同一性が９３％である配列番号３と配列番号２の対アラインメントを示す図である。シグナル配列には下線が引かれている。＋は相違を示す。活性部位セリン１６を含むＧＤＳＸモチーフ並びに活性部位アスパラギン酸１１６及びヒスチジン２９１は強調表示されている（陰影付きの領域を参照）。アミノ酸の後ろの番号は、シグナル配列を引いたものである。
【図９】生物アエロモナス ヒドロフィラから得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す図である。
【図１０】生物アエロモナス サルモニシダから得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号８）を示す図である。
【図１１】生物ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）から得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｃ＿００３８８８．１：８３２７４８０．．８３２８３６７）を示す図である。
【図１２】生物ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）から得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ９３９１３１．１：２６５４８０．．２６６３６７）を示す図である。
【図１３】生物サッカロミセス セレビシエから得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｚ７５０３４）を示す図である。
【図１４】生物ラルストニアから得られるアミノ酸配列（配列番号１２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ６４６０５２）を示す図である。
【図１５】生物ラルストニアから得られる、本発明による脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す図である。
【図１６】配列番号１４．Ｓｃｏｅ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８保存仮想タンパク質（hypothetical protein）［ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図１７】ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８保存仮想タンパク質をコードする配列番号１５のヌクレオチド配列［ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図１８】配列番号１６．Ｓｃｏｅ２ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＣ０１４７７．１ ＧＩ：９７１６１３９保存仮想タンパク質のアミノ酸［ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図１９】Ｓｃｏｅ２ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＣ０１４７７．１ ＧＩ：９７１６１３９保存仮想タンパク質をコードする配列番号１７のヌクレオチド配列［ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２０】アミノ酸配列（配列番号１８）Ｓｃｏｅ３ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８８８３３．１ ＧＩ：７６３５９９６推定分泌タンパク質［ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２１】Ｓｃｏｅ３ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８８８３３．１ ＧＩ：７６３５９９６推定分泌タンパク質をコードする配列番号１９のヌクレオチド配列［ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２２】アミノ酸配列（配列番号２０）Ｓｃｏｅ４ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８９４５０．１ ＧＩ：７６７２２６１推定分泌タンパク質［ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２３】Ｓｃｏｅ４ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８９４５０．１ ＧＩ：７６７２２６１推定分泌タンパク質をコードする配列番号２１のヌクレオチド配列［ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２４】アミノ酸配列（配列番号２２）Ｓｃｏｅ５ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ６２７２４．１ ＧＩ：６５６２７９３推定リポタンパク質［ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２５】Ｓｃｏｅ５ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ６２７２４．１ ＧＩ：６５６２７９３推定リポタンパク質をコードする配列番号２３のヌクレオチド配列［ストレプトミセス コエリコラーＡ３（２）］を示す図である。
【図２６】アミノ酸配列（配列番号２４）Ｓｒｉｍ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＡＡＫ８４０２８．１ ＧＩ：１５０８２０８８ ＧＤＳＬ−リパーゼ［ストレプトミセス リモサス］を示す図である。
【図２７】Ｓｒｉｍ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＡＡＫ８４０２８．１ ＧＩ：１５０８２０８８ ＧＤＳＬ−リパーゼをコードする配列番号２５のヌクレオチド配列［ストレプトミセス リモサス］を示す図である。
【図２８】アミノ酸配列（配列番号２６）−アエロモナス ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ ＃７９６５）由来の脂質アシル基転移酵素を示す図である。
【図２９】アエロモナス ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ ＃７９６５）由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号２７）を示す図である。
【図３０】アエロモナス サルモニシダ亜種サルモニシダ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシル基転移酵素のアミノ酸配列（配列番号２８）を示す図である。
【図３１】アエロモナス サルモニシダ亜種サルモニシダ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）を示す図である。
【図３２】アエロモナス遺伝子の相同体は、National Center for Biotechnology Information, NIH, MD, USAの基本的局所アラインメント検索ツールサービス及び完全ゲノムデータベースを用いて特定できることを示す図である。ＧＤＳＸモチーフがデータベース検索に使用され、脂肪分解活性を有する酵素を潜在的にコードするいくつかの配列／遺伝子が特定された。遺伝子は、ストレプトミセス属、ザントモナス属及びラルストニア属から特定された。以下の例として、ラルストニア ソラナセアルムがアエロモナス サルモニシダ（ｓａｔＡ）遺伝子とアラインメントさせた。対アラインメントによって２３％同一であることが判明した。活性部位セリンはアミノ末端に存在し、触媒作用性残基ヒスチジン及びアスパラギン酸を特定することができる。
【図３３−１】Ｐｆａｍ００６５７．１１［ファミリー００６５７、データベースバージョン１１］コンセンサス配列（以後、Ｐｆａｍコンセンサスと呼ぶ）及び様々な配列とＰｆａｍコンセンサス配列のアラインメントを示す図である。各矢印は活性部位残基を示し、下線が引かれたボックスは[Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20；179-179]によって示された相同性ボックスのうちの３個を示す。Ｐｆａｍコンセンサス中の大文字は、多数のファミリーメンバーにおいて保存されている残基を示す。−記号は、Ｐｆａｍコンセンサスの隠れマルコフモデルによって残基が存在すると予想されたが存在せず、ギャップが挿入される位置を示す。記号は、Ｐｆａｍコンセンサス中に対応する残基がない残基を示す。これらの配列は、図１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８及び３０に記載されたアミノ酸配列である。
【図３３−２】Ｐｆａｍ００６５７．１１［ファミリー００６５７、データベースバージョン１１］コンセンサス配列（以後、Ｐｆａｍコンセンサスと呼ぶ）及び様々な配列とＰｆａｍコンセンサス配列のアラインメントを示す図である。各矢印は活性部位残基を示し、下線が引かれたボックスは[Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20；179-179]によって示された相同性ボックスのうちの３個を示す。Ｐｆａｍコンセンサス中の大文字は、多数のファミリーメンバーにおいて保存されている残基を示す。−記号は、Ｐｆａｍコンセンサスの隠れマルコフモデルによって残基が存在すると予想されたが存在せず、ギャップが挿入される位置を示す。記号は、Ｐｆａｍコンセンサス中に対応する残基がない残基を示す。これらの配列は、図１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８及び３０に記載されたアミノ酸配列である。
【図３４】Ｐｆａｍ００６５７．１１［ファミリー００６５７、データベースバージョン１１］コンセンサス配列（以後、Ｐｆａｍコンセンサスと呼ぶ）及び様々な配列とＰｆａｍコンセンサス配列のアラインメントを示す図である。各矢印は活性部位残基を示し、下線が引かれたボックスは[Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]によって示された相同性ボックスのうちの３個を示す。Ｐｆａｍコンセンサス中の大文字は、多数のファミリーメンバーにおいて保存されている残基を示す。−記号は、Ｐｆａｍコンセンサスの隠れマルコフモデルによって残基が存在すると予想されたが存在せず、ギャップが挿入される位置を示す。記号は、Ｐｆａｍコンセンサス中に対応する残基がない残基を示す。これらの配列は、図２、１６、１８、２０、２６、２８及び３０に記載されたアミノ酸配列である。これらのタンパク質はすべて脂質基質に対して活性であることが判明した。
【図３５】実施例７においてアエロモナス ヒドロフィラ脂質アシル基転移酵素遺伝子の変異誘発に使用された融合構築体のアミノ酸配列（配列番号３０）を示す図である。下線が引かれたアミノ酸は、キシラナーゼシグナルペプチドである。
【図３６】キシラナーゼシグナルペプチドを含むアエロモナス ヒドロフィラ由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１）を示す図である。
【図３７】ストレプトミセス由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す図である。
【図３８】ストレプトミセス由来の脂質アシル基転移酵素のポリペプチド配列（配列番号３３）を示す図である。
【図３９】テルモビフィダ由来の脂質アシル基転移酵素のポリペプチド配列（配列番号３４）を示す図である。
【図４０】テルモビフィダ由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号３５）を示す図である。
【図４１】テルモビフィダ由来の脂質アシル基転移酵素のポリペプチド配列（配列番号３６）を示す図である。
【図４２】コリネバクテリウム＼エフィシエンス＼ＧＤＳｘ ３００ ａａ＿由来の脂質アシル基転移酵素のポリペプチド（配列番号３７）を示す図である。
【図４３】コリネバクテリウム＼エフィシエンス＼ＧＤＳｘ ３００ ａａ＿由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す図である。
【図４４】ノボスフィンゴビウム＼アロマティシボランス＼ＧＤＳｘ ２８４ ａａ＿由来の脂質アシル基転移酵素のポリペプチド（配列番号３９）を示す図である。
【図４５】ノボスフィンゴビウム＼アロマティシボランス＼ＧＤＳｘ ２８４ ａａ由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号４０）を示す図である。
【図４６】ストレプトミセス＼コエリコラー＼ＧＤＳｘ ２６８ ａａ由来の脂質アシル基転移酵素のポリペプチド（配列番号４１）を示す図である。
【図４７】ストレプトミセス＼コエリコラー＼ＧＤＳｘ ２６８ ａａ由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す図である。
【図４８】ストレプトミセス＼アベルミチリス（avermitilis）＼ＧＤＳｘ ２６９ ａａ由来の脂質アシル基転移酵素のポリペプチド（配列番号４３）を示す図である。
【図４９】ストレプトミセス＼アベルミチリス＼ＧＤＳｘ ２６９ ａａ由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す図である。
【図５０】ストレプトミセス由来の脂質アシル基転移酵素のポリペプチド（配列番号４５）を示す図である。
【図５１】ストレプトミセス由来の脂質アシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す図である。
【図５２】活性部位中にグリセリンを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造のリボン表示である。図は、Deep View Swiss-PDBビューアを用いて作製された。
【図５３】活性部位中にグリセリンを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造のDeep View Swiss-PDBビューアを用いた側面図である。活性部位グリセリンの１０Å以内の残基は黒く塗られている。
【図５４】活性部位中にグリセリンを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造のDeep View Swiss-PDBビューアを用いた上面図である。活性部位グリセリンの１０Å以内の残基は黒く塗られている。
【図５５】アラインメント１を示す図である。
【図５６】アラインメント２を示す図である。
【図５７−１】１ＩＶＮとＰ１０４８０（Ｐ１０４８０は、Ａ ヒドロフィラ酵素のデータベース配列である）のアラインメントを示す図である。このアラインメントは、ＰＦＡＭデータベースから得られ、モデル構築プロセスに使用された。
【図５７−２】１ＩＶＮとＰ１０４８０（Ｐ１０４８０は、Ａ ヒドロフィラ酵素のデータベース配列である）のアラインメントを示す図である。このアラインメントは、ＰＦＡＭデータベースから得られ、モデル構築プロセスに使用された。
【図５８】１ＩＶＮとＰ１０４８０（Ｐ１０４８０は、Ａ ヒドロフィラ酵素のデータベース配列である）のアラインメントを示す図である。このアラインメントは、ＰＦＡＭデータベースから得られ、モデル構築プロセスに使用された。
【図５９−１】Ｐ１０４８０がアエロモナス ヒドロフィラのデータベース配列であるアラインメントを示す図である。この配列は、モデル構築及び部位選択に使用される。完全タンパク質が示され、（配列番号２に等しい）成熟タンパク質は残基１９から始まることに留意されたい。Ａ．ｓａｌはアエロモナス サルモニシダ（配列番号２８）ＧＤＳＸリパーゼであり、Ａ．ｈｙｄはアエロモナス ヒドロフィラ（配列番号２６）ＧＤＳＸリパーゼである。コンセンサス配列は、示された各配列間の相違位置にある＊を含む。
【図５９−２】Ｐ１０４８０がアエロモナス ヒドロフィラのデータベース配列であるアラインメントを示す図である。この配列は、モデル構築及び部位選択に使用される。完全タンパク質が示され、（配列番号２に等しい）成熟タンパク質は残基１９から始まることに留意されたい。Ａ．ｓａｌはアエロモナス サルモニシダ（配列番号２８）ＧＤＳＸリパーゼであり、Ａ．ｈｙｄはアエロモナス ヒドロフィラ（配列番号２６）ＧＤＳＸリパーゼである。コンセンサス配列は、示された各配列間の相違位置にある＊を含む。
【図６０】典型的な３８４クローンセットを示すグラフである。野生型対照は、０．９ＰＣ、０．８ＤＧＤＧの交点にある。
【図６１】目的とする３つの区域を示すグラフである。セクション１は、比Ｒは増加するがＤＧＤＧに対する活性は低下する変異体を含む。領域２は、比Ｒが増加しＤＧＤＧ活性が増加する変異体を含む。領域３は、ＰＣ又はＤＧＤＧ活性は増加するが比Ｒは増加しないクローンを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
2010142243.tif 000052
【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５８】
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【図５９−１】
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【図５９−２】
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【図６０】
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【図６１】
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【配列表】
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