(57)【要約】【課題】新規なヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、および簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができるマルチラベル化核酸プローブ、そのマルチラベル化核酸プローブの製造方法、そのマルチラベル化核酸プローブまたは核酸プローブを用いた標的核酸の検出方法を提供する。【解決手段】トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、予め共有結合的に複数の標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブを使用することにより、または、標的核酸にハイブリダイズさせた核酸プローブに、共有結合的に複数の標識部分を導入することにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができる。【選択図】図２
2010047559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有することを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体であって、
下記式（１）で示されることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【化１】
2010047559.tif 000039
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【請求項３】
請求項１に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体であって、
下記式（２）で示されることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【化２】
2010047559.tif 000040
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【請求項４】
請求項１に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体であって、
下記式（３）で示されることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【化３】
2010047559.tif 000041
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【請求項５】
請求項１に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体であって、
下記式（４）で示されることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【化４】
2010047559.tif 000042
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【請求項６】
請求項１に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体であって、
下記式（５）で示されることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【化５】
2010047559.tif 000043
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して２価の連結基を表し、Ｚは、置換基を表す。）
【請求項７】
請求項６に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体であって、
前記ＸおよびＹは、それぞれ独立して炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【請求項８】
請求項７に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体であって、
前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【請求項９】
構成単位として、請求項１〜８のいずれか１項に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸であることを特徴とする核酸プローブ。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物が結合されて構成されていることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のマルチラベル化核酸プローブであって、
前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のマルチラベル化核酸プローブであって、
前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。
【請求項１３】
マルチラベル化核酸プローブの製造方法であって、
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、請求項９に記載の核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物を結合することを特徴とするマルチラベル化核酸プローブの製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のマルチラベル化核酸プローブの製造方法であって、
前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブの製造方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載のマルチラベル化核酸プローブの製造方法であって、
前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブの製造方法。
【請求項１６】
標的核酸の検出方法であって、
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のマルチラベル化核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合している前記マルチラベル化核酸プローブを、前記標識部分により検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項１７】
標的核酸の検出方法であって、
請求項９に記載の核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基と、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物のリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンとを反応させて複数の標識部分を導入し、結合している前記核酸プローブを、前記標識部分により検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブの製造方法および標的核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
何らかの標識が施されたＲＮＡプローブなどの核酸プローブを用い、細胞レベルにおけるＤＮＡやＲＮＡの発現パターンを検出、可視化することによって、生命現象に関する数多くの疑問点を解明することが可能となる。細胞レベルでの遺伝子発現パターンを可視化するこのような手法をｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＩＳＨ）と言うが、この際に使用されるプローブの標識法は大別して、「放射性同位体標識法」、「蛍光抗体標識法」、「酵素抗体標識法」に分類される。歴史的には、放射性同位体を取り込ませた核酸プローブが先に確立したが、近年その取り扱いが制限されてきたこともあって、放射性同位体元素を用いない蛍光抗体標識法や酵素抗体標識法が注目されている。
【０００３】
これらの手法は、核酸プローブ作製時に抗原やビオチンでラベル化しておき、それらを標的核酸にハイブリダイズした後、酵素もしくは蛍光物質によって標識された抗体やアビジンを用いて免疫染色法により検出するといった手法である。感度という観点から見ると、酵素反応によるシグナル増幅効果が得られる酵素抗体標識法が優れており、現在最も広く使用されている。
【０００４】
酵素抗体標識法を利用した核酸プローブとしては、例えば、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などの抗体認識部位で修飾したヌクレオチド誘導体を複数個ランダムに導入した抗原マルチラベル化核酸プローブが知られている。この抗原マルチラベル化核酸プローブと標的核酸とのｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションの後、抗体認識部位を認識する酵素標識化抗体との抗原−抗体反応を行い、酵素アルカリホスファターゼとのハイブリッドによる発色反応を利用して検出を行う。しかしながら、酵素標識された抗体が非常に高価であること、抗原−抗体反応に伴う操作の煩雑化や非特異吸着などによるバックグラウンドの増加など、幾つかの問題を有している。
【０００５】
一方、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有するペプチドまたはタンパク質へ、アニオン性であり、かつＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する外来分子を部位特異的に連結する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−５４６５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規なヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、および簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができるマルチラベル化核酸プローブ、そのマルチラベル化核酸プローブの製造方法、そのマルチラベル化核酸プローブまたは核酸プローブを用いた標的核酸の検出方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体である。
【０００９】
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（１）で示されるものであることが好ましい。
【化１】
2010047559.tif 000003
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００１０】
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（２）で示されるものであることが好ましい。
【化２】
2010047559.tif 000004
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００１１】
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（３）で示されるものであることが好ましい。
【化３】
2010047559.tif 000005
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００１２】
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（４）で示されるものであることが好ましい。
【化４】
2010047559.tif 000006
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００１３】
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（５）で示されるものであることが好ましい。
【化５】
2010047559.tif 000007
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して２価の連結基を表し、Ｚは、置換基を表す。）
【００１４】
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体において、前記ＸおよびＹは、それぞれ独立して炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であることが好ましく、Ｚは、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であることが好ましい。また、Ｙは、炭素数２〜４８のオキシアルキレン基（例えば、オキシエチレン基、オキシプロピレン基）また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。
【００１５】
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体において、前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、構成単位として、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブである。
【００１７】
また、本発明は、前記核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブである。
【００１８】
また、前記マルチラベル化核酸プローブにおいて、前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることが好ましい。
【００１９】
また、前記マルチラベル化核酸プローブにおいて、前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることが好ましい。
【００２０】
また、前記マルチラベル化核酸プローブにおいて、前記酵素が、有機溶媒や熱に対して安定な酵素であることが好ましい。
【００２１】
また、本発明は、マルチラベル化核酸プローブの製造方法であって、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物を結合するマルチラベル化核酸プローブの製造方法である。
【００２２】
また、前記マルチラベル化核酸プローブの製造方法において、前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることが好ましい。
【００２３】
また、前記マルチラベル化核酸プローブの製造方法において、前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることが好ましい。
【００２４】
また、本発明は、標的核酸の検出方法であって、前記マルチラベル化核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合している前記マルチラベル化核酸プローブを、前記標識部分により検出する標的核酸の検出方法である。
【００２５】
また、本発明は、標的核酸の検出方法であって、前記核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基と、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物のリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンとを反応させて複数の標識部分を導入し、結合している前記核酸プローブを、前記標識部分により検出する標的核酸の検出方法である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明では、共有結合的に複数の標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブを得るための新規なヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブを提供することができる。
【００２７】
また、本発明では、ターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズする前に、予め共有結合的に複数の標識部分を核酸プローブに導入することにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができるマルチラベル化核酸プローブを提供することができる。
【００２８】
また、本発明では、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、共有結合的に複数の標識部分を核酸プローブに導入することにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができるマルチラベル化核酸プローブの製造方法を提供することができる。
【００２９】
また、本発明では、予め共有結合的に複数の酵素を導入したマルチラベル化核酸プローブを用いることにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができる標的核酸の検出方法を提供することができる。
【００３０】
また、本発明では、核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズさせた後、核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基と標識化合物のリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンとの簡易な反応によって、共有結合的に複数の標識部分を導入することにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することが可能な標的核酸の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の実施形態に係るヌクレオチド誘導体の構造の一例（Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ）を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る酵素マルチラベル化核酸プローブの調製方法を示す概略図である。
【図３】本発明の実施形態に係るヌクレオチド誘導体の一例であるＺ−ＱＧ−ＵＴＰの合成方法の一例を示す図である。
【図４】本発明の実施例１において、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣ（表１のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例１において、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣ（表２のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例１において合成したＺ−ＱＧ−ＵＴＰのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図７】実施例１における実験１の標準プローブを用いたドットブロットの結果を示す図である。
【図８】実施例１における実験２の酵素マルチラベル化核酸プローブを用いてＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔのプロトコールに準じて検出した結果を示す図である。
【図９】ＵＴＰとＺ−ＱＧ−ＵＴＰの割合を変化させてＲＮＡを調製した場合の分子量変化について、（Ａ）アガロースゲル電気泳動装置、（Ｂ）マイクロチップ型電気泳動装置にて電気泳動を行った結果を示す図である。
【図１０】ＭＴＧを用いてＰｆｕＡＰラベル化を行った際のアガロースゲル電気泳動装置による電気泳動の結果を示す図である。
【図１１】ＰｆｕＡＰマルチラベル化ＲＮＡプローブの核酸プローブを用いた室温におけるドットブロットの結果を示す図である。
【図１２】Ａｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔキットにより調製された酵素ラベル化核酸プローブによるＩＳＨの検出感度評価を示す図である。
【図１３】ＰｆｕＡＰマルチラベル化ＲＮＡプローブの核酸プローブを用いた５０℃におけるドットブロットの結果を示す図である。
【図１４】ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ＵＴＰ  ｉｎ  ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）におけるａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ＵＴＰの濃度に対する吸収スペクトル測定結果を示す図である。
【図１５】スペクトルより２９０ｎｍの吸光度を算出し検量線を示す図である。
【図１６】本発明の実施形態に係る標的核酸の検出方法の一例を示す概略図である。
【図１７】本発明の実施例３において合成したＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図１８】本発明の実施例３において、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣ（表１３のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図１９】本発明の実施例３において、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの逆相ＨＰＬＣ（表１３のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図２０】本発明の実施例３のＺ−ＱＧ  ＤＮＡの調製において、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの割合を変化させてＰＣＲした際の電気泳動の結果を示す図である。
【図２１】本発明の実施例３のＺ−ＱＧ  ＤＮＡへのＰｆｕＡＰのラベル化の検討において、ＭＴＧ反応後のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図２２】本発明の実施例３のＰｆｕＡＰマルチラベル化ＤＮＡプローブの調製において、ＭＴＧ反応後のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図２３】本発明の実施例３において、各種ＰｆｕＡＰラベル化ＤＮＡプローブのドットブロットの結果を示す図である。
【図２４】本発明の実施例４のＰｆｕＡＰマルチラベル化ＤＮＡプローブの調製において、ＭＴＧ反応後のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図２５】本発明の実施例４において、各種ＰｆｕＡＰラベル化ＤＮＡプローブのドットブロットの結果を示す図である。
【図２６】本発明の実施例５において、ＭＴＧを用いてＢＡＰラベル化を行った際のアガロースゲル電気泳動装置による電気泳動の結果を示す図である。
【図２７】本発明の実施例５において、ＢＡＰマルチラベル化ＲＮＡプローブの核酸プローブを用いた室温におけるドットブロットの結果を示す図である。
【図２８】本発明の実施例６において、ＭＴＧを用いて、Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡに対してＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅラベル化を行った際の結果を示す図である。
【図２９】本発明の実施例６において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５マルチラベル化ＲＮＡの核酸プローブを用いた室温におけるドットブロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００３３】
本発明者らは、核酸プローブに複数の酵素を共有結合的に導入する手法として、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）などのトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）が有する部位特異的なタンパク質修飾能に着目した。ＴＧａｓｅはアシル転移反応を触媒する酵素であり、例えば、タンパク質中の特定のＧｌｎ残基（Ｑ）のγ−カルボキシアミド基と、Ｌｙｓ残基（Ｋ）のε−アミノ基や各種一級アミンとの共有結合を触媒する酵素である。このＴＧａｓｅを用いて、複数の標識酵素などの標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブの創製を行う。
【００３４】
具体的には、例えば、図１に示す、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）に、ＴＧａｓｅが認識するＧｌｎ（ＭＴＧ認識Ｇｌｎ）を有するＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体であるＺ−ＱＧ−ＵＴＰを合成し、図２に示すように、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際にＺ−ＱＧ−ＵＴＰを取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所導入されたＺ−ＱＧ  ＲＮＡを調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＬｙｓなどのＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などの標識化合物を結合させることによって、ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる。
【００３５】
このマルチラベル化核酸プローブは、ターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、直ちに検出反応を行うことができるため、既存の手法と比較して、操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、バルク酵素である微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いることによるコストの抑制などが見込まれる。
【００３６】
なお、図２において、核酸プローブにおけるＧｌｎ残基と、標識化合物におけるＬｙｓ残基とは逆であってもよい。すなわち、ＴＧａｓｅが認識するＬｙｓ（ＭＴＧ認識Ｌｙｓ）を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を合成し、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓが複数箇所導入された核酸プローブを調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎを導入した標識化合物を結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製してもよい。
【００３７】
また、図１６に示すように、Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡなどの核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＬｙｓなどのＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などの標識化合物を結合させてもよい。ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）となり、このように導入した標識部分の検出反応を行うことにより、既存の手法と比較して、操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、バルク酵素である微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いることによるコストの抑制などが見込まれる。
【００３８】
なお、図１６において、核酸プローブにおけるＧｌｎ残基と、標識化合物におけるＬｙｓ残基とは逆であってもよい。すなわち、ＴＧａｓｅが認識するＬｙｓ（ＭＴＧ認識Ｌｙｓ）を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を合成し、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓが複数箇所導入された核酸プローブを調製する。その後、核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎを導入した標識化合物を結合させてもよい。
【００３９】
＜ヌクレオシド三リン酸誘導体＞
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する。グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体としては、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）誘導体、アデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＴＰ）誘導体、グアノシン三リン酸（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＧＴＰ）誘導体、シチジン三リン酸（ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＣＴＰ）誘導体、デオキシウリジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＵＴＰ）誘導体、デオキシアデノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＡＴＰ）誘導体、デオキシグアノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＧＴＰ）誘導体、デオキシシチジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＣＴＰ）誘導体などが挙げられる。本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体において、グルタミン（Ｇｌｎ）残基は、例えば、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシンの部分に直接または置換基を介して結合されている。
【００４０】
これらのヌクレオシド三リン酸誘導体は、ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはそれらの各種誘導体から得ることができる。
【００４１】
また、これらのヌクレオシド三リン酸誘導体は、ウリジン、ウリジンの一リン酸（ＵＭＰ）および二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン、アデノシンの一リン酸（ＡＭＰ）および二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン、グアノシンの一リン酸（ＧＭＰ）および二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン、シチジンの一リン酸（ＣＭＰ）および二リン酸（ＣＤＰ）、デオキシウリジン、デオキシウリジンの一リン酸（ｄＵＭＰ）および二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシアデノシン、デオキシアデノシンの一リン酸（ｄＡＭＰ）および二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシグアノシン、デオキシグアノシンの一リン酸（ｄＧＭＰ）および二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシシチジン、デオキシシチジンの一リン酸（ｄＣＭＰ）および二リン酸（ｄＣＤＰ）ならびにそれらの各種誘導体から得てもよい。
【００４２】
例えば、ウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンのリン酸化酵素などによるリン酸化（例えば、生物工学会誌，８５（９），ｐ３９７−３９９（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８７（６），ｐ．７３２−７３８（１９９９）など参照）や、プロトンスポンジ存在下でのオキシ塩化リンなどによるリン酸化（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（３６），ｐ．４５２５−４５２８（１９８８）など参照）などによって、それらの三リン酸体を得ることができる。
【００４３】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（１）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するウリジン三リン酸誘導体である。
【化６】
2010047559.tif 000008
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００４４】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（２）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するアデノシン三リン酸誘導体である。
【化７】
2010047559.tif 000009
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００４５】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（３）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するシチジン三リン酸誘導体である。
【化８】
2010047559.tif 000010
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００４６】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（４）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するグアノシン三リン酸誘導体である。
【化９】
2010047559.tif 000011
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００４７】
Ａで表されるグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する置換基としては、特に制限はないが、例えば、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基が挙げられ、合成のし易さなどを考慮して決めればよい。
【００４８】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（５）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するＴＧａｓｅ基質修飾ヌクレオチド誘導体である。
【化１０】
2010047559.tif 000012
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して２価の連結基を表し、Ｚは、置換基を表す。）
【００４９】
ＸおよびＹで表される２価の連結基としては、それぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などの炭素数１〜４８のアルキレン基、エテニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基などの炭素数２〜４８のアルケニレン基などが挙げられる。これらのうち、Ｘ，Ｙは、それぞれ独立して炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基、炭素数１〜４８のアルコキシ基であることが好ましく、Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であることがより好ましい。Ｘ，Ｙはさらにエテニレン基、オキシアルキレン基、例えば−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ｎは繰り返し数でありｎ＝２，４，８，１２，２４）基などで置換されていてもよい。
【００５０】
Ｚで表される置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基などの炭素数１〜４８のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロピオキシ基などの炭素数１〜４８のアルコキシ基、フェニル基、ナフチル基などの炭素数６〜４８のアリール基、フェニルオキシ基などの炭素数６〜４８のアリールオキシ基、ベンジル基などの炭素数７〜４８のアリールアルキル基、ベンジルオキシ基などの炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基などが挙げられる。これらのうち、Ｚは、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であることが好ましく、Ｚはベンジルオキシ基であることがより好ましい。Ｚはさらにジニトロフェニル基、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニル基などで置換されていてもよい。また、上述したＹで表される置換との組み合わせで、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。
【００５１】
Ｘを適宜選択することにより、Ｚ−ＱＧとＵＴＰとを連結するリンカー部位の構造を最適化し、例えば柔軟なリンカー部位を導入することで、酵素などのアクセスを向上することができる。また、Ｙ，Ｚを適宜選択することにより、基質ペプチド配列を最適化し、例えば酵素などの親和性を向上することができる。
【００５２】
微生物由来ＴＧａｓｅ（ＭＴＧ）を用いる場合、ＭＴＧが認識可能なＧｌｎ残基は、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）として存在することが好ましい。Ｚ−ＱＧは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などよりも分子サイズが小さいため好ましい。式（５）で示されるヌクレオシド三リン酸誘導体において、Ｘがエテニレン基、Ｙがメチレン基、Ｚがベンジルオキシ基であるヌクレオチド誘導体が、ＵＴＰにＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰである。また、ヌクレオシド三リン酸誘導体中には、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基または第一級アミンが共存しないようなものを選択することが好ましい。共存する場合には、ＴＧａｓｅにより、自己架橋する可能性があり、目的のマルチラベル化核酸プローブの収率に好ましくない影響を与える場合があるからである。
【００５３】
また、微生物由来ＴＧａｓｅの良基質として、ＬＬＱＧ（配列番号：１）、ＬＡＱＧ（配列番号：２）、ＬＧＱＧ（配列番号：３）、ＰＬＡＱＳＨ（配列番号：４）、ＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号：５）、もしくはＴＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：６）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＬＧＱＧＧＧ（配列番号：７）、ＧＦＧＱＧＧＧ（配列番号：８）、ＧＶＧＱＧＧＧ（配列番号：９）、もしくはＧＧＬＱＧＧＧ（配列番号：１０）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。また、ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｌｉｖｅｒ由来のＴＧａｓｅの良基質として、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルフェニルアラニン（Ｚ−ＱＦ）、またはＥＡＱＱＩＶＭ（配列番号：１１）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＧＧＱＬＧＧ（配列番号：１２）、ＧＧＧＱＶＧＧ（配列番号：１３）、ＧＧＧＱＲＧＧ（配列番号：１４）、ＧＱＱＱＬＧ（配列番号：１５）、ＰＮＰＱＬＰＦ（配列番号：１６）もしくはＰＫＰＱＱＦＭ（配列番号：１７）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基は、用いるＴＧａｓｅの種類に応じ、このようなペプチドとして存在してもよい。
【００５４】
なお、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドは、Ｎ末端アミノ基がＴＧａｓｅの基質になりうるため、自己架橋による副産物が生じうる。したがって、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドについては、Ｎ末端アミノ基の水素を適切な基で置換することによりＴＧａｓｅの基質とはならないように保護して、所望の連結を行うことができるようにするとよい。なお、本明細書において「Ｎ末端保護」というときは、特別な場合を除き、このような意味で用いている。そして、Ｎ末端保護の手段により、反応性が異なることが知られている。詳細には、ほ乳類由来ＴＧａｓｅに関して、ＧＱＱＱＬＧのＮ末端アセチル化による保護（すなわち、Ａｃ−ＧＱＱＱＬＧ）、またＮ末端アミノ酸をＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）にする（すなわち、ＤＯＰＡ−ＧＱＱＱＬＧ）と反応性が向上することが知られている。このような保護の例を、本実施形態においても利用することができる。
【００５５】
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの調製方法を図３に示す。これは、本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体の調製方法の一例であって、これに限定されるものではない。
【００５６】
まず、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）基などを導入し、活性化しておく（ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ）。そして、アミノアリルＵＴＰなどの末端をアミノ化した置換基を有するＵＴＰと、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧとを縮合することにより、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを得ることができる。
【００５７】
また、Ｃ末端のカルボキシル基を活性エステル化する上述の方法に加えて、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するペプチドをＵＴＰに導入する方法として、アミノ基と反応性の高い官能基をペプチドに導入する方法がある。例えば、アルデヒド化、アシルアジド化、スルフォニルクロライド化、エポキシ化、イソシアネート化、またはイソチオシアネート化した基質ペプチドを調製できれば、これをアミノ化ＵＴＰと反応させることにより、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するＵＴＰを調製することができる。ただし、これらの反応性官能基は、基質ペプチドにおいてＴＧａｓｅ認識に影響がない部分に導入する必要がある。したがって、上述のように、Ｇｌｎ残基とは離れたＣ末端のカルボキシル基を活性化する方法は、この目的において最も優れたものの一つである。
【００５８】
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの精製は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）などにより行うことができる。また、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの同定は、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ、ＩＲなどにより行うことができる。また、ＨＰＬＣにより、生成物の確認および収率を求めることができる。
【００５９】
＜ＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸＞
本実施形態に係るＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸は、構成単位として、例えば式（１）〜（５）で示されるＴＧａｓｅ基質ラベル化ヌクレオシド三リン酸誘導体を調製したのち、このＴＧａｓｅ基質ラベル化ヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されているＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸であり、核酸部分が、検出対象である標的核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものである。
【００６０】
核酸には、ＤＮＡ、ＰＮＡおよびＲＮＡが含まれる。核酸の配列および長さには特に制限はない。長さに関しては、例えば少なくとも２０ｍｅｒ程度であればよい。
【００６１】
例えば、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを基質として、ＲＮＡポリメラーゼ活性のある酵素を用いて複数のＺ−ＱＧ−ＵＴＰを取り込ませて、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入され、所望の配列を有するＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸プローブＺ−ＱＧ  ＲＮＡ（図２）を調製することができる。
【００６２】
＜マルチラベル化核酸プローブ＞
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブは、上記核酸プローブにおける構成単位であるヌクレオシド三リン酸誘導体のグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物が結合されて構成されたものである。マルチラベル化核酸プローブは、例えば、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入された核酸プローブＺ−ＱＧ  ＲＮＡに、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などを結合させることによって、ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎであるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる（図２）。
【００６３】
ＲＮＡと標識酵素などの標識部分との比率ｎは、２以上であれば特に制限はなく、適宜調整することができるが、ｎが大きいほど検出感度が高くなり好ましい。ただし、ｎが大きすぎると、標的核酸とのハイブリダイゼーションの効率が低下する場合がある。
【００６４】
また、例えば、以下の方法により、異なる標識酵素、異なる蛍光色素などの異なる標識部分を有する複数のマルチラベル化核酸プローブを調製することができる。
（１）ＴＧａｓｅの由来を変える。
（２）ＴＧａｓｅの基質特異性を変える。
【００６５】
（１）の方法では、例えば、用いるＴＧａｓｅの種類に応じて、異なる基質ペプチドで修飾されたＵＴＰなどを調製すればよい。
【００６６】
（２）の方法では、例えば、ＴＧａｓｅに、タンパク質工学的にアミノ酸変異を導入して基質特異性を変えればよい。例えば、ＭＴＧを大腸菌で調製し（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｋ．  Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｃ．  Ｈｅｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｕｓ  Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４０，Ｉｓｓｕｅ  ６，２  Ｍａｙ  ２００７，ｐ．１５４３−１５５０，”Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏ−ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”参照）、さらに変異体ライブラリーを作って耐熱性の向上したＭＴＧを取得することができる（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｋ．  Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｃ．  Ｈｅｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｕｓ  Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １３６，Ｉｓｓｕｅｓ  ３−４，１０  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００８，ｐ．１５６−１６２，”Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｈｅａｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ”参照）。
【００６７】
本明細書において、「ＴＧａｓｅにより結合する」というときは、特別な場合を除き、得られる連結部は、Ｌｙｓ残基とＧｌｎ残基とが、ε（γ−グルタミル）リシン結合を形成することにより構成されている。
【００６８】
本実施形態においては、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基は、第一級アミンであってもよい。本明細書では、Ｌｙｓ残基を例に説明するが、その説明は、特別な場合を除き、第一級アミンにも当てはまる。
【００６９】
リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物としては、特に制限はない。
【００７０】
標識部分としては、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な標識（例えば、磁性ナノ粒子）、熱的に検出可能な標識（例えば、温度応答性高分子）、電気的に検出可能な標識（例えば、フェロセン部位を有する高分子）などが挙げられ、検出感度、取り扱い性などの点から、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つが好ましい。
【００７１】
蛍光色素としては、選択された波長の紫外光、可視光などの放射線による照射に応答して蛍光または燐光を発する物質であればよく、特に制限はないが、例えば、蛍光色素としてフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、カルボシアニン誘導体など、あるいは蛍光タンパク質として緑色蛍光タンパク質とその変異体などが挙げられる。
【００７２】
放射性同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、１０Ｂ、１１Ｂ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏなどが挙げられる。
【００７３】
ＴＧａｓｅに対し、Ｌｙｓ残基（または第一級アミン）供与体となる基質は、Ｇｌｎ残基供与体となる基質に比較して構造的な制約が少ないと考えられる。したがって、修飾しようとする標識酵素が、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を元来有している場合もあり、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むタグを酵素に付加する場合もある。
【００７４】
ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基（Ｋ）は、ＭＫＨＫＧＳ（配列番号：１８）、ＭＲＨＫＧＳ（配列番号：３５）、ＭＲＲＫＧＳ（配列番号：３６）、ＭＨＲＫＧＳ（配列番号：３７）のアミノ酸配列を有するペプチドとして存在してもよい。このようなＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドによるタグ化は、標識酵素を、タンパク質の所望の部位、例えばＣ末端またはＮ末端に連結する目的で用いることができる。ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含む他のペプチドまたはそのアミノ酸配列の例としては、改変型Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＲＦＥＲＡＨＭＤＳＧＳ（配列番号：１９））、ＭＧＧＳＴＫＨＫＩＰＧＧＳ（配列番号：２０）、Ｎ末端グリシン（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＧＧＧ、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＧＧＧＧＧ（配列番号：２１））、Ｎ末端ＭＫＨＫＧＳと対象タンパク質間のリンカー部位を伸ばしたＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳ（配列番号：２２）などが挙げられる。
【００７５】
Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドを付加した標識酵素は、遺伝子工学的な手法を用いて、組換えタンパク質として調製することができる。Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅの基質ペプチドタグが導入された当該組換えタンパク質の精製は、それぞれＮ末端またはＣ末端に付加した精製用ペプチドタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ（ヘキサヒスチジンタグ））を利用し（ＴＧａｓｅの反応性の低下を回避するために、基質ペプチドタグを入れた末端とは異なる末端に精製用ペプチドタグを入れるようにデザインするとよい。）、ゲル濾過クロマトグラフィなどにより行うことができ、またアミノ酸配列の確認は当該タンパク質をコードするプラスミドベクターの遺伝子配列をＤＮＡシーケンサにて確認するか、Ｎ末端に導入された基質ペプチドについてはＮ末端分析により直接同定することができる。タンパク質の精製の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどで行うことができる。
【００７６】
標識酵素としては、発色反応などを利用して検出を行うことができる性質を有するものであればよく特に制限はない。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。これらのうち、高い触媒活性と安定性の観点から、アルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼが好ましい。ペプチドタグが容易に導入可能との観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。
【００７７】
酵素マルチラベル化核酸プローブと標的核酸の間でより厳密に塩基配列特異的な二本鎖形成を行うためには、比較的高温（例えば、７０℃以上）の条件下で行うことがあるため、常温菌由来の酵素を利用すると活性の損失が懸念される。そこで、標的酵素としては、超好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来アルカリホスファターゼ（ＰｆｕＡＰ）が好ましい。
【００７８】
超好熱菌由来の酵素は、一般的に有機溶媒や熱に対して高い安定性を示すことが知られているため好ましく（例えば、Ｈ．Ａｔｏｍｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，ｐ．１６６−１７３（２００５）参照）、さらに、大腸菌を宿主とした大量調製が比較的容易に行うことができる点においても好ましい。大腸菌を宿主として耐熱性酵素を調製する場合、細胞破砕液を高温処理（例えば、８０℃で３０分温置）することで、大腸菌由来の共雑タンパク質のほとんどを沈殿させ、粗精製を容易に行うことができる。
【００７９】
超好熱菌は一般の生物がほとんど生育できない極限環境で生育することができる微生物であるため、超好熱菌由来のタンパク質は非常に高い耐熱性を有している。さらに、熱に対する耐性だけでなく、一般的に、変性剤、有機溶媒、ｐＨなどに対する耐性も常温菌由来酵素に比べて極めて高いことから、ＰｆｕＡＰを使用することによって、酵素の失活を伴わない厳密な二本鎖形成を達成することができると考えられる。
【００８０】
本実施形態に係る酵素マルチラベル化核酸プローブの好ましい態様の一つは、ＰｆｕＡＰとＺ−ＱＧ  ＲＮＡとの複合体である。このような複合体は、安定な酵素であるＰｆｕＡＰと、安定な分子であるＲＮＡが、アミド結合という安定な共有結合で連結されているため、複合体全体としても安定性であるというメリットがある。
【００８１】
また、酵素マルチラベル化核酸プローブにおいて、酵素が有機溶媒や熱に対して安定な酵素であってもよい。このような安定性の高い酵素は、自然界からのスクリーニング（例えば、化学と工業，ｖｏｌ．６１（Ｎｏ．６），ｐ．５７１−５７５（２００８）、内山拓，宮崎健太郎，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．５），ｐ．２３４−２３９（２００８）、道久則之，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．１２），ｐ．６６７−６７０（２００８））や、タンパク質工学的手法により安定性を高める技術（例えば、荻野博康，ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．１６−２３（２００８）、宮崎健太郎，ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．５２−５８（２００８））により得ることができる。これらの手法により、常温菌由来の酵素であっても、有機溶媒耐性や耐熱性を有する酵素へと変換することができる。
【００８２】
蛍光色素部分を導入した、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有する標識化合物は、例えば、カルボキシル基にジアミンを導入する方法で調製することができる（例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １,Ｓｅｃｔｉｏｎ  ４．３，ｐ．１００−１０４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ．を参照）。
【００８３】
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）としては、種々のものを用いることができる。現在、ＴＧａｓｅとして、哺乳類（ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ、ヒト）、無脊椎動物（昆虫、カブトガニ、ウニ）、植物、菌類、原生生物（粘菌）由来のものが知られており、またヒトの場合については、８種類のアイソザイムが見つかっている。本実施形態において用いることのできるＴＧａｓｅの好ましい例は、安定性、ハンドリングの容易さ、バルク生産が可能などの点から微生物由来微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）である。
【００８４】
本実施形態においてＭＴＧを用いた場合、予想されているＭＴＧの触媒反応から、Ｌｙｓ残基を有する標識酵素などの標識部分を含む標識化合物とＺ−ＱＧ  ＲＮＡとの連結反応は、ＭＴＧ活性中心であるシステイン（Ｃｙｓ）残基の、Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡのＧｌｎへの求核置換反応によるアシル−酵素複合体の形成と、続いて起こる標識化合物のＬｙｓによるアシル−酵素複合体への求核置換反応によるＭＴＧの脱離、の２段階で進行すると予想される。
【００８５】
本実施形態の好ましい態様においては、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するＺ−ＱＧ  ＲＮＡに対する、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基または第一級アミンを有する標識化合物のモル濃度比は、好ましくは２以上であり、より好ましくは５以上である。なお、本明細書で単に「濃度比」というときは、特別な場合を除き、モル濃度による比を指す。例えば、Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡに対するＮＫ１４−ＰｆｕＡＰのモル濃度比は、[ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ]／[Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡ]と表すこともできる。
【００８６】
［ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの調製］
ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰとは、ＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳの配列を有するアミノ酸１４残基からなる付加配列を遺伝子工学的にＰｆｕＡＰのＮ末端に、精製用タグをＣ末端に導入したものである。ＰｆｕＡＰの発現ベクターは香川大学櫻庭春彦教授より委譲頂いた。ＰＣＲによりＰｆｕＡＰをコードする領域を増幅する際、それぞれのタグが導入されるようにタンパク質発現用ベクターｐＥＴ２２に組換え、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、２５ｍＭ  ＴＢＳで２回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のＰｆｕＡＰは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を８０℃で３０分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
【００８７】
また、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの大腸菌での発現量の向上のため、大腸菌のコドン使用頻度に合わせて塩基配列が改変されたＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの発現ベクター（アクセッション番号：ＡＢ４７９３８３、配列番号：２６）を用いてもよい。この発現ベクターは、Codon Devices社（http://www.codondevices.com）に受託合成して得た。ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰをコードする遺伝子領域の両端に適切な制限酵素サイトを導入しておき、これらを利用することでタンパク質発現用ベクターｐＥＴ２２に組換え、得られたＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ発現ベクターにより大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、２５ｍＭ  ＴＢＳで２回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のＰｆｕＡＰは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を８０℃で３０分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
【００８８】
ＴＧａｓｅとしてＭＴＧを用いて連結反応を行う場合には、上述のようにモル濃度比が適切な範囲となるようにすることに加えて、ｐＨ５．５〜８．０、温度４〜５０℃（例えば、室温（例えば、１８℃〜２２℃））の条件で行うことが好ましい。このようにすれば、１２時間以内、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内に、充分に高い反応率が達成可能である。
【００８９】
このような高い反応率が達成できる方法により得られたマルチラベル化核酸プローブ溶液には、未反応の核酸プローブ（例えば、遊離のＺ−ＱＧ  ＲＮＡ）がほとんど存在せず、以下で詳述する、標的核酸の検出にそのまま用いたとしても、マルチラベル化核酸プローブと未反応分子との競合が実質的に生じないか、生じたとしても目的とする検出の結果には実質的な影響を与えないほど少ないと考えられる。したがって、マルチラベル化核酸プローブ溶液を精製することなく、直接検出へと利用できるメリットがある。
【００９０】
本実施形態以前に、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基または第一級アミンを有する標識酵素などの標識化合物と、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するＺ−ＱＧ  ＲＮＡとをＴＧａｓｅを用いて連結することにより、マルチラベル化核酸プローブを得る例は存在しなかった。したがって、本実施形態の方法により連結されたマルチラベル化核酸プローブは、物質として新規なものということができる。
【００９１】
本実施形態における酵素マルチラベル化核酸プローブの形成方法は、従来法に比較して、以下の特徴およびメリットを有する。
・対象となる標識酵素は、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基または第一級アミンを有する酵素、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基または第一級アミンを導入することができるあらゆる酵素を包含する。また、インテインのような大きなタンパク質性タグを必要としない。
・酵素の修飾部位は、Ｃ末端に限定されない。ＴＧａｓｅ活性なＬｙｓ残基が存在するか、そのようなＬｙｓ残基を有するタグを導入することができる部位であれば、修飾可能である。
・Ｃ末端、Ｎ末端に加え、ｌｏｏｐ領域のようなタンパク質構造中の揺らぎの大きな部位も修飾対象となりうる。
・結合する核酸の塩基配列および長さには、特に制限がない。
【００９２】
＜標的核酸の検出方法＞
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、構成単位として例えば上記式（１）〜（５）で示されるヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブを準備し、マルチラベル化核酸プローブと対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合しているマルチラベル化核酸プローブを、酵素部分などの標識部分により検出する工程を含む。
【００９３】
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、標的核酸の定性、定量、識別、染色、局在化の調査などの目的で用いることができる。
【００９４】
この方法においては、上記マルチラベル化核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。酵素部分などの標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。この方法において、標的核酸を含む標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物（ＡＴＰ）、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。検出対象は、（ｉ）ＤＮＡ転写膜、または（ｉｉ）細胞もしくは個体組織切片などである。
【００９５】
検出対象が（ｉ）の場合、標的核酸は、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡまたはゲノム断片ＤＮＡなどであり、（ｉｉ）の場合、標的核酸は、細胞または個体組織中に含まれる核酸（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）などである。本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（酵素など）を配置しているため、検出感度の向上が可能になる。
【００９６】
この方法においては、標的核酸に、マルチラベル化核酸プローブを供し、標的核酸とマルチラベル化核酸プローブの標的核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせるが、このハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ、塩基配列などに応じて、適宜設計することができる。
【００９７】
本実施形態に係る標的核酸の検出方法において、異なる標識酵素、異なる蛍光色素などの異なる標識部分を有する複数のマルチラベル化核酸プローブを準備して、同時に複数の標的核酸を検出してもよい。
【００９８】
また、本実施形態において、標的核酸の検出方法は、
（ａ）基材表面に固定化された核酸、
（ｂ）固定化された固定化核酸の全部または一部に相補的な配列（固定化核酸相補的配列）、および標的核酸に特異的に結合可能な配列（標的核酸特異的配列）を有するアプタマ核酸、
（ｃ）構成単位として上記式（１）で示されるヌクレオチド誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、及び／又は核酸部分がアプタマ核酸の標的核酸特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブ、
を準備し、
（Ａ）固定化核酸に、アプタマ核酸を供し、固定化核酸とアプタマ核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマ核酸を固定化し、
（Ｂ）固定化された固定化アプタマ核酸に、標的核酸を含む標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的核酸とアプタマ核酸の標的核酸分子特異的配列を有する部分とを結合させ、かつ上記マルチラベル化核酸プローブを供し、標的分子が存在しない場合にはマルチラベル化核酸プローブの核酸部分とアプタマ核酸とをハイブリダイズさせることにより、タンパク質を固定化し、
（Ｃ）固定化された酵素部分の有無またはその量を酵素の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出する工程を含む。
【００９９】
この方法における基材表面への核酸の固定化のためには、従来技術、例えばＤＮＡマイクロアレイなどを調製する際に用いられる技術を適用することができる。「基材」は、ガラス、シリコンなどのプラスチック製の、チップ、ビーズ、ウェル、プレートなどの形態とすることができ、核酸は、従来技術を用いて、基材表面に非共有結合（静電結合）的に、または共有結合で固定することができる。あらかじめ調製した核酸を基材に固定化してもよく、基材上で直接核酸を合成してもよい。簡便には、アビジンなどで被覆された市販のプレートを用い、ビオチン化した所望のＤＮＡを固定することができる。
【０１００】
この方法ではさらに、固定化核酸の全部または一部に相補的な配列（固定化核酸相補的配列）、および標的分子を含まれる標的核酸に特異性的に結合可能な配列（標的核酸特異的配列）を有する核酸（アプタマ核酸）が用いられる。標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。標的核酸特異的配列を有する部分は、従来技術、例えばＳＥＬＥＸ（試験管内人工進化法）工程を用いることにより産生することができ、また標的分子に対して非常に高い標的親和性及び特異性を有するものとすることができる。標的核酸特異的配列を有する部分は、修飾ヌクレオチドで構成されていてもよい。
【０１０１】
この方法においては、上記マルチラベル化核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、アプタマ核酸の標的核酸特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものとする。酵素部分などの標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。この方法において、標的核酸を含む標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物（ＡＴＰ）、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。検出対象は、（ｉ）ＤＮＡ転写膜、または（ｉｉ）細胞もしくは個体組織切片などである。
【０１０２】
この方法においては、固定化核酸に、アプタマ核酸を供し、固定化核酸とアプタマ核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマ核酸を固定化するが、このハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ、塩基配列などに応じて、適宜設計することができる。
【０１０３】
また、この方法においては、次いで固定化アプタマ核酸に、標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的分子とアプタマ核酸の標的核酸特異的配列を有する部分とを結合させ、さらにマルチラベル化核酸プローブを供し、標的分子が存在しない場合にはマルチラベル化核酸プローブの核酸部分とアプタマ核酸とをハイブリダイズさせる。試料は、細胞もしくは組織抽出液、体液などでありうる。
【０１０４】
さらにこの方法においては、固定化された酵素部分の有無またはその量を酵素の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出することができる。
【０１０５】
アプタマ核酸においては、固定化核酸相補的配列を有する部分と、標的核酸特異的配列を有する部分とは、重複してもよく、連続してもよく、また適当なスペーサを介して両者が存在するように設計することができる。標的核酸特異的配列を有する部分（アプタマ領域）が分子認識のためにある立体構造をとることを考慮すると、該部分は、固定化核酸相補的配列を有する部分とは少なくとも重複しないようにするのがよい。
【０１０６】
アプタマ核酸は、固定化核酸相補的配列および標的核酸特異的配列以外に、所望の場合にはマルチラベル化核酸プローブと適切にハイブリダイズするための配列をさらに含んでいてもよい。マルチラベル化核酸プローブの核酸部分は、アプタマ核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するが、この特異的配列の全部または一部に相補的な配列からなる領域が長い（標的核酸特異的配列と重複が多い）と、かえってアプタマ核酸とはハイブリダイズできない場合が生じうる。また短い（重複が少ない）と、標的分子が存在し、アプタマ核酸と結合している場合にも、マルチラベル化核酸プローブとアプタマ核酸とがハイブリダイズしてしまう場合が生じうる。当業者であれば、このようなことを考慮して、固定化核酸、アプタマ核酸、マルチラベル化核酸プローブの核酸部分を、適宜設計することができる。
【０１０７】
また、本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものである、構成単位として、例えば上記式（１）〜（５）で示されるヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基と、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物のリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンとを反応させて、容易に検出可能な性質を有する複数の標識部分を導入し、結合している核酸プローブを、標識部分により検出する工程を含む（図１６参照）。
【０１０８】
この方法においては、上記核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。また、標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。
【０１０９】
本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係る核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（標識部分）を配置することにより、検出感度の向上が可能になる。
【０１１０】
例えば、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入された核酸プローブＺ−ＱＧ  ＲＮＡに、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した酵素、蛍光色素などの標識化合物を結合させる。
【実施例】
【０１１１】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【０１１２】
本実施例では、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法への応用を目指して、超好熱菌由来酵素マルチラベル化ＲＮＡの開発を行った。酵素ラベル化の手法としては、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）のタンパク質修飾能を利用した。ＭＴＧの良基質であるＺ−ＱＧを導入したＺ−ＱＧ−ＵＴＰを合成し、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる転写反応によってＺ−ＱＧ  ＲＮＡを調製した。さらに、ＭＴＧを用いて超好熱菌由来酵素マルチラベル化核酸プローブを調製し、その性能をドットブロットによって評価した。
【０１１３】
（実施例１）
＜Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成・精製＞
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成スキームは、図３に示す通りである。
【０１１４】
まず１００ｍＭ  Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ  Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ  Ｚ−ＱＧを、室温（調製した日は２７．０℃）でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中で２０時間反応させることにより、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ（５０ｍＭ）を調製した（この段階で５００μＬずつに分注し、−８０℃で保存）。その後、２５ｍＭのＮＨＳ化Ｚ−ＱＧと５ｍＭの５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ＵＴＰ（以下、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ＵＴＰと略記、ＳＩＧＭＡ社製）とを、１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）とＤＭＦの混合溶媒（ｖ／ｖ＝１／１）０．３２ｍＬ中において２５℃で１２時間反応させた。反応終了後、サンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑで１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製）（高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ  ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって精製を行った。ＨＰＬＣの測定条件は表１の通りとした。生成物の同定は、レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置であるＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ（島津製作所製  ＡＸＩＭＡ（登録商標）−ＣＦＲ  Ｐｌｕｓ）によって行った。なお、サンプル調製手順は、まず、試料１μＬをＭＡＬＤＩ用試料プレートの上に滴下し、次にその上から、マトリックス溶液；２，５−ジヒドロキ安息香酸（ＤＨＢ）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液（超純水）を滴下し、その後、風乾して、得られた試料プレートをＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ装置のイオン源内に導入して計測した。
【０１１５】
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを合成した後、表１に示す条件で逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図４に示す。ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ＵＴＰの場合（図４（Ａ））と比較して、疎水側に新たなピーク（２２ｍｉｎ）が出現しており（図４（Ｂ））、このピークがＺ−ＱＧ−ＵＴＰであると推測される。しかし、生成物ピークの分離が十分でなかったので、ＨＰＬＣ条件を表２に示すように変えて検討を行った。結果を図５に示す。
【０１１６】
【表１】
2010047559.tif 000013
【０１１７】
【表２】
2010047559.tif 000014
【０１１８】
そこで、保持時間１８．８分のピークを回収してＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った（図６参照）。その結果、８５６．８９のピークが確認され、理論分子量の８５７．１３と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成が示された。
【０１１９】
［実験１：Ａｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔキットの検出感度の評価］
＜センス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡの調製＞
ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより転写を行うことによって、センス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡを調製した。標的核酸（ターゲット）としては、マウス中にて発現パターンが既知であるＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）というタンパク質をコードするｍＲＮＡ（ｓｈｈ）をモデルとした。そこでまず、ＳＨＨをコードした遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲを行い、長さ約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この際、上流にはＴ３プロモータ、下流にはＴ７プロモータが含まれるようにプライマー設計を施した。次に得られたＰＣＲ産物を基に、Ｔ３  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（センス鎖（Ｓ）  調製用）を用いてＲＮＡ合成を行い、Ｔ３  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで転写反応を行ってセンス鎖配列を調製した（配列番号：２４）。同様にＴ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アンチセンス鎖（ＡＳ）  調製用）を用いてＲＮＡ合成を行い、Ｔ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにで転写反応を行ってアンチセンス鎖配列を合成した（配列番号：２５）。条件は以下の表３に示す。反応は３７℃で２時間行い、得られたセンス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖はエタノール沈殿によって回収し、ＴＥバッファー２０μＬで縣濁した。ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとＤＴＴを添加し、ＲＮａｓｅによる分解を抑えた。
【０１２０】
【表３】
2010047559.tif 000015
【０１２１】
＜ＲＮＡ濃度の測定＞
転写反応後、Ｎａｎｏ  ＤｒｏｐにてＲＮＡ濃度を測定した。その結果、センス鎖は１０１９ｎｇ／μＬ、アンチセンス鎖は８１５ｎｇ／μＬであった。
【０１２２】
＜標識プローブの作製＞
Ａｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ（商標、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のキットに付随する試薬にて標識プローブを調製した。まず、上述したアンチセンス鎖ＲＮＡを滅菌水を用いて１０ｎｇ／μＬに希釈したもの６０μＬ（総量６００ｎｇ）を９９．９℃で熱変性後、急冷した。キットに添付されているＲｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ６０μＬ、Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  １２μＬ、Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ溶液６０μＬの順に熱変性後のＲＮＡに添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、標識プローブを作製した。
【０１２３】
＜検出用メンブレンの作製＞
まず、ターゲットとなるセンス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡを１ｐｇ／μＬ〜５０ｎｇ／μｌの６段階の濃度に滅菌水を用いて希釈したものを、それぞれ１μＬずつプラスのチャージを持つメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライした。その後、８０℃で２時間ベーキングした。
【０１２４】
＜ハイブリダイゼーション＞
上記検出用メンブレンの作製で作製したメンブレンをキットに添付されているハイブリダイゼーションバッファーに移し、５５℃で１５分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上述した標準プローブを濃度が５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加して５５℃で一晩（１４時間〜１６時間程度）ハイブリダイゼーションを行った。
【０１２５】
＜メンブレンの洗浄＞
ハイブリダイゼーション後、メンブレンをＷａｓｈＩバッファー（表４）に移し、５５℃で振とうしながら１５分洗浄した。この操作を２回繰り返した。その後、ＷａｓｈＩＩバッファー（表５）にて洗浄した。この操作を２回繰り返した。
【０１２６】
【表４】
2010047559.tif 000016
【０１２７】
【表５】
2010047559.tif 000017
【０１２８】
＜発色法による検出＞
ＮＴＭＴｘバッファー（表６）で室温（実験した日は１８〜２２℃程度）、５分間洗浄したメンブレンをＳｔａｉｎｉｎｇ溶液（３７５μｇ／ｍＬ  ＮＢＴ＋１８８μｇ／ｍＬ  ＢＣＩＰ  ｉｎ  ＮＴＭＴｘ）に移し、室温で２時間、遮光下で発色させた。なお、ＮＢＴとは、Nitro blue tetrazolium chlorideの略称であり、ＢＣＩＰは、5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, toluidine saltのことである。
【０１２９】
【表６】
2010047559.tif 000018
【０１３０】
ドットブロットの結果を図７に示す。プローブと相補的なセンス鎖のメンブレンでは、１００ｐｇ／μＬのドットまで検出できた。また、アンチセンス鎖でも５０，１０ｎｇ／μＬのドットに若干のシグナルがみられた。なお、この結果は、ターゲットＲＮＡの調製時に使用した鋳型のＤＮＡがＤＮａｓｅＩで処理できず残っていた可能性が考えられる。また、洗浄操作の際に温度が低下し、ストリンジェンシーの低下による非特異的吸着も考えられる。
【０１３１】
［実験２：Ａｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔのプロトコールに準じた系におけるＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸プローブを用いた場合の検出感度の評価］
＜ＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸の調製＞
上記実験１のセンス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡの調製に加え、表７、表８に準じてＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸もＴ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて同様に調製した。調製後、ＤＮａｓｅＩで処理し、エタノール沈殿でＲＮＡを濃縮・精製してＴＥバッファー２０μＬにて縣濁した。また、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとＤＴＴも添加し、新規酵素マルチラベル化核酸プローブを作製した。
【０１３２】
【表７】
2010047559.tif 000019
【０１３３】
【表８】
2010047559.tif 000020
【０１３４】
＜ＲＮＡ濃度の測定＞
転写反応後、Ｎａｎｏ  ＤｒｏｐにてＲＮＡ濃度を測定した。以下に測定結果を示す。なお、表８中の○数字を以下括弧数字で表示する。
（１）Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ  ０％：４１０ｎｇ／μＬ
（２）Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ  ２０％：４２４ｎｇ／μＬ
（３）Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ  ４０％：３７８ｎｇ／μＬ
（４）Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ  ６０％：３６８ｎｇ／μＬ
（５）Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ  ８０％：３１１ｎｇ／μＬ
（６）Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ  １００％：２５６ｎｇ／μＬ
【０１３５】
＜標識プローブの作製＞
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを異なる割合で取り込んだＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸を９９．９℃で５分間熱変性後、急冷した。熱変性した核酸を用いて表９の条件となるように反応溶液を調製し、４℃で６時間反応させて酵素マルチラベル化プローブを作製した（配列番号：２３）。
【０１３６】
【表９】
2010047559.tif 000021
【０１３７】
以下、上述した実験１の検出用メンブレンの作製、ハイブリダイゼーション、メンブレン洗浄を行った。
【０１３８】
＜発色法による検出＞
検出は発色時の温度を室温（実験した日は１８〜２２℃程度）と５０℃に設定し、それ以外の操作は実験１の発色法による検出操作に準じて行った。その結果、酵素マルチラベル化核酸プローブを用いてＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔのプロトコールに準じて検出した結果を図８に示した。室温で発色反応を行った場合には、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの割合が２０〜４０％のプローブでは１０ｎｇ／μＬまで、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの割合が６０〜１００％のプローブでは１ｎｇ／μＬのドットまで検出することができた。また、５０℃で発色反応を行った場合では、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの割合が２０％では１０ｎｇ／μＬ、４０〜６０％では１ｎｇ／μＬ、８０〜１００％では１００ｐｇ／μＬのドットまで検出できた。
【０１３９】
以上より、Ｚ−ＱＧ導入割合の増加に伴って、検出感度は向上することが分かった。また、室温での発色条件下ではＺ−ＱＧ−ＵＴＰ６０％以上の時、１ｎｇ／μＬのターゲット核酸の検出に成功した。また、発色時の温度を新規酵素（アルカリホスファターゼ：ＰｆｕＡＰ）の至適温度に近づけると、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ８０％以上で市販のＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔの検出限界（１００ｐｇ／μＬ）と同等の検出感度で、コントラストの高い像を得ることができた。
【０１４０】
（実施例２：ドットブロットによるＩＳＨプロトコールに準じた検出感度の評価）
［ＰｆｕＡＰマルチラベル化ＲＮＡプローブの調製および機能評価］
細胞組織内での遺伝子発現パターンが既知であるソニックヘッジホッグ遺伝子（ｓｈｈ）をターゲットのｍＲＮＡとする。まず、ＰＣＲによってｓｈｈをコードするＤＮＡ断片（約１０００ｂｐ）を得た。この際、遺伝子の上流側にはＴ３プロモーター、下流側にはＴ７プロモーターが含まれるようプライマー設計を施した。次に、得られたＰＣＲ産物を基にＴ７Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて転写反応を行った（表１０）。この際、ＵＴＰの代わりに、実験１で合成したＺ−ＱＧ−ＵＴＰを様々な割合（０〜１００％）にて加えることで、導入率の異なるＺ−ＱＧ  ＲＮＡを調製した。得られたＺ−ＱＧ  ＲＮＡはエタノール沈殿によって回収し、アガロースゲル電気泳動およびマイクロチップ型電気泳道装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｅｘｐｅｒｉｏｎ）により評価した。
【０１４１】
【表１０】
2010047559.tif 000022
【０１４２】
＜ＰｆｕＡＰマルチラベル化ＲＮＡの調製＞
遺伝子工学的手法により、Ｎ末端にＭＴＧが認識するＫを含んだペプチドタグ（ＭＫＨＫ（ＧＧＧＳ）２ＧＳ）を導入したＮＫ１４−ＰｆｕＡＰが、ＭＴＧによってＺ−ＱＧ  ＲＮＡと結合するか検討するために、まず、様々な割合のＺ−ＱＧ−ＵＴＰを用いて調製したＺ−ＱＧ  ＲＮＡを、９９．９℃まで加熱した後、急冷することによって、変性処理を行った。続いて、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中にて、各種Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡ５０μｇ／ｍＬ、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ  ０．４ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＧ５．０Ｕ／ｍＬ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｔｏｒ  １．０Ｕ／μＬの条件下にて、６時間反応を行った。コントロールとして、ＭＴＧ未添加の場合にも同様の操作を行い、反応はアガロースゲル電気泳動によって評価した。
【０１４３】
＜ドットブロットによるプローブ能評価＞
ｓｈｈ  Ｓ（ターゲット）をメンブレン上に固定化し、ＰｆｕＡＰマルチラベル化核酸プローブ（ｓｈｈ  アンチセンス、ＡＳ）を用いて検出を試みた。まず、未標識ｓｈｈ  Ｓ（Ｔ３  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより調製）の希釈系列（５０ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、０．１ｍｇ／μＬ）を調製し、メンブレンに１μＬずつスポットし、オーブンにて固定した（８０℃、２時間）。その後、表１１に示す操作を行い、ＰｆｕＡＰマルチラベル化プローブを用いてｓｈｈ  Ｓの検出を行った。コントロールとして、ｓｈｈ  ＡＳ鎖を同様にして固定化したメンブレンを調製し、これを用いて行った。尚、溶液の組成は表１２に記す。
【０１４４】
【表１１】
2010047559.tif 000023
【０１４５】
【表１２】
2010047559.tif 000024
【０１４６】
＜Ｚ−ＱＧマルチラベル化ＲＮＡの調製＞
ＵＴＰとＺ−ＱＧ−ＵＴＰの割合を変化させてＲＮＡを調製した際の結果を、図９の（Ａ）、（Ｂ）に示す。結果より、いずれの条件においてもＲＮＡの合成に成功していることから、合成したＺ−ＱＧ−ＵＴＰは、比較的良好な基質として、Ｔ７  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに認識されることが分かる。また、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの割合増加とともに高分子量側へとシフトしていることから、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの濃度を変化させることによって、Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡへのＺ−ＱＧ−ＵＴＰ導入量が調節可能である。
【０１４７】
＜ＰｆｕＡＰマルチラベル化核酸プローブの調製＞
それぞれ導入量の異なる、Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡに対して、ＭＴＧを用いてＰｆｕＡＰラベル化を行った際の結果を図１０に示す。Ｌａｎｅ２はＭＴＧ未添加時、Ｌａｎｅ３はＭＴＧ添加時の結果である。２０％〜１００％の条件では、ＭＴＧ添加時において高分子量側へのシフトが見られるが、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰが０％の際には確認されないために、導入したＺ−ＱＧ特異的にＺ−ＱＧ−ＵＴＰがラベル化されたことが分かる。また、Ｚ−ＱＧ導入量の増加とともに高分子量側へのシフトも大きくなっていることからＺ−ＱＧ−ＵＴＰの割合を変化させることによって、プローブのＰｆｕＡＰのラベル化量が制御可能である。
【０１４８】
＜ドットブロットによるプローブ能評価＞
調製したＰｆｕＡＰマルチラベル化ＲＮＡプローブの核酸プローブとしての機能について検討するためにドットブロットを行った（図１１）。ＡＳ（アンチセンス）鎖をメンブレンに固定化した際にはスポットが確認されないことから、塩基配列特異的な検出ができている。２０〜１００％導入プローブにおいて１ｎｇ／μＬのセンス鎖の検出が可能であった。以上のことから、転写反応時のＺ−ＱＧ−ＵＴＰ濃度を変化させることによって、得られる修飾ＲＮＡ中のＺ−ＱＧ導入量、その後のＭＴＧによるＰｆｕＡＰラベル化量が制御可能なことが示された。なお、実施例１とは異なり、Ｚ−ＱＧ導入量増加に伴う検出感度向上は確認されなかった。この理由としては、上記表１１，１２に示す様に、ハイブリダイズ条件および洗浄条件が、Ａｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ条件に比べるとかなり厳しい条件であることが挙げられる。図１０に示すようにいずれの場合においても、ＰｆｕＡＰラベル化した際のバンドはブロード化しており、ＰｆｕＡＰが均一に導入されているとは言えない。そのためＰｆｕＡＰの導入数が少ないプローブ、あるいは未修飾のプローブの方がより強固にターゲット（ＡＳ鎖）とハイブリダイズするため、いずれの場合においても同等の感度となったのではないかと推察される。また、ＰｆｕＡＰの導入に伴うプローブの二本鎖形成能低下の可能性も、その一因として挙げられる。
【０１４９】
一方、超好熱菌由来酵素であるＰｆｕＡＰを活性化させるために、染色時の温度を室温から５０℃程度まで上昇させれば、現段階においても更なる感度向上が見込まれる。
【０１５０】
＜高温条件での発色を行う場合の酵素ラベル化核酸プローブによるＩＳＨの検出感度評価＞
本発明における核酸プローブにラベル化されたＰｆｕＡＰは、室温よりも高温条件でより高い触媒活性を発現する。そこで、表１１の酵素発色条件時の反応温度を、室温から５０℃に上げた場合の検出感度を評価した。酵素ラベル化核酸プローブとしての性能を評価するため、まず、Ａｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔキットにより得られる酵素標識核酸プローブと、本発明のＰｆｕＡＰラベル化核酸プローブの性能比較を、ＩＳＨ条件において検討した。実験は、酵素標識核酸プローブをキットにより調製する以外は、上述同様の操作によりドットブロットを行った。その結果、１ｎｇ／μＬのセンス鎖の検出が可能であった（図１２）。このことから、今回新たに調製されたＰｆｕＡＰマルチラベル化核酸プローブは、ＩＳＨ条件下において、市販のＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔにより調製されたプローブと同等の検出感度を有するプローブとして利用できることが示唆された。そこでは、最終的に核酸を検出するステップ、すなわち、酵素（アルカリホスファターゼ）部位による発色反応における温度を室温で行っていた。一方、本発明の核酸プローブにラベル化されたＰｆｕＡＰは、室温よりも高温条件でより高い触媒活性を発現する。そこで、表１０の酵素発色条件時の反応温度を、室温から５０℃に上げた場合の検出感度を評価した。その結果、図１３に示すように、検出限界はＺ−ＱＧ導入割合により異なり、Ｚ−ＱＧ８０％、１００％で１００ｐｇ／μＬから１ｎｇ／μＬ、Ｚ−ＱＧ６０％においては１０ｐｇ／μＬの核酸を検出することが可能であり、上述した実験１のＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔプローブを用いた場合（１ｎｇ／μＬ）より、少なくとも２桁程度、検出感度の向上が可能なことが明らかとなった。
【０１５１】
上述した実施例では、以下に示すような濃度決定したサンプルを用いて実験を行った。
【０１５２】
［Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの濃度算出］
＜ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ＵＴＰの吸光係数算出（＠２９０ｎｍ）＞
ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ＵＴＰをＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解した後、０、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１ｍＭとなるように調製し、吸収スペクトル測定を行った（図１４）。スペクトルより２９０ｎｍの吸光度を算出し検量線を作成した（図１５）。尚、図１４のスペクトルは、スペクトルチャートの吸収感度の一番高いのが０．１ｍＭであり、以下順に０．０８ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０２ｍＭ、０ｍＭと吸収感度が下がっている。
【０１５３】
図１５より、２９０ｎｍの吸光係数が算出される（ε２９０＝５７６０Ｍ−１ｃｍ−１）が、市販のａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ＵＴＰ（ＳＩＧＭＡ社製）の純度が８４％であることを考慮すると、ε２９０＝６８６０Ｍ−１ｃｍ−１となる。なお、２９０ｎｍにおけるＺ−ＱＧの吸収はほとんどないため、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰサンプル中に未反応のＺ−ＱＧが混入していたとしても、濃度決定への影響は無視できる。
【０１５４】
＜Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰストックサンプルの調製＞
ＨＰＬＣによる精製後、凍結乾燥によって溶媒を除去し、滅菌水（２ｍＬ）に溶解した。その後、Ｓｐｅｅｄ  ｖａｃを用いて濃縮した（この際、析出物が見られたため、未反応のＺ−ＱＧが析出していると考えられる。濃縮に伴いａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ＵＴＰと同形のスペクトルは増加したため、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの析出ではないと考える）。濃縮後、上清を回収し、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒによって１０倍希釈した後、Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ（光路長：１ｍｍ）を用いて吸光度測定を行った所、吸収度ＡＢＳ＝１．０６１であった。したがって、希釈前のＺ−ＱＧ−ＵＴＰ濃度Ｃは次式により算出される。
【０１５５】
（数１）
１．０６１＝６８６０［Ｍ−１ｃｍ−１］×０．１［ｃｍ］×Ｃ／１０
したがって、Ｃ＝約１５．５［ｍＭ］である。
【０１５６】
（実施例３）
［Ｚ−ＱＧ  ＤＮＡを用いたＰｆｕＡＰマルチラベル化ＤＮＡプローブの調製とドットブロットによる検出感度の評価］
Ｚ−ＱＧ  ＤＮＡを用いたＰｆｕＡＰマルチラベル化ＤＮＡプローブの調製とドットブロットによる検出感度の評価を行った。
【０１５７】
＜Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成・精製＞
まず、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中にて、１００ｍＭ  Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ  Ｚ−ＱＧを、室温（調製した日は１８〜２２℃程度）で２０時間反応させることによって、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ（５０ｍＭ）を調製した。一方、５０ｍＭ  ５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ｄＵＴＰ（以下、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰと略記、ＳＩＧＭＡ社製）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液（Ａｍｂｉｏｎ製）１６μＬと２００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）４０μＬ、滅菌水１６μＬとを混合し、１０ｍＭ  ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ溶液を８０μＬ調製した。この溶液に対して、上記で調製したＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ溶液を８０μＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。反応終了後、サンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑで１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ  ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって、表１３に示す条件で精製を行った。生成物の同定はＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ  ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ製、ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ）によって行った。結果を図１７に示す。この際、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）をマトリックスとして使用した。
【０１５８】
【表１３】
2010047559.tif 000025
【０１５９】
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図１８に示す。ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの場合（図１９参照）と比較して、疎水側に新たなピークが出現しており、このピークがＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰであると推測された。そこで、保持時間１９．１分のピークを回収してＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果、図１７に示すように、８４１．４６のピークが確認され、理論分子量の８４２．１３と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成が示された。
【０１６０】
＜ＰＣＲによるＺ−ＱＧ  ＤＮＡの調製＞
まず、マウス由来のＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）をコードする遺伝子中の約３００ｂｐ（配列番号：２７）をＰＣＲ増幅するプライマーを設計した（表１４、配列番号：２８，２９）。ＰＣＲのテンプレートにはマウス由来のＳｈｈをコードする遺伝子の全配列（約９９０ｂｐ）を組み込んだプラスミドＤＮＡを用い、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ−Ｆｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用して反応液を調製した（表１５、表１６）。ＰＣＲ条件は９４℃×２分を１サイクル、９４℃×２０秒、５２℃×２０秒、７２℃×１５秒を３０サイクルとした。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で増幅断片を確認した。得られた増幅断片は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製し、Ｎａｎｏ  ＤｒｏｐにてＺ−ＱＧ  ＤＮＡの濃度を測定した。
【０１６１】
【表１４】
2010047559.tif 000026
【０１６２】
【表１５】
2010047559.tif 000027
【０１６３】
【表１６】
2010047559.tif 000028
【０１６４】
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの割合を変化させてＰＣＲした際の電気泳動の結果を図２０に示す。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの割合を５０％、１００％としてＰＣＲした場合でも増幅断片のバンドが確認されたことから、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰはＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの基質として認識されていることが示された。また、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの割合の増加に伴ってバンドが高分子側にシフトしていることから、ＰＣＲを行う際のＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰの量を変化させることで、Ｚ−ＱＧの導入量を調節することが可能であることがわかった。精製後にＮａｎｏ  ＤｒｏｐでそれぞれのＺ−ＱＧ  ＤＮＡの濃度を計った結果、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ  ０％で調製したＺ−ＱＧ  ＤＮＡは７３．８ｎｇ／μＬ、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ  ５０％で調製したＺ−ＱＧ  ＤＮＡは１１１．６ｎｇ／μＬ、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ  １００％で調製したＺ−ＱＧ  ＤＮＡは５９．１ｎｇ／μＬであった。
【０１６５】
＜Ｚ−ＱＧ  ＤＮＡへのＰｆｕＡＰのラベル化の検討＞
遺伝子工学的にＭＴＧが認識可能なリジン残基（Ｋ）を含むペプチドダグを導入したＮＫ１４−ＰｆｕＡＰがＭＴＧによってＺ−ＱＧ  ＤＮＡに結合するかを、Ｚ−ＱＧの導入量が異なるＺ−ＱＧ  ＤＮＡを用いて検討した。まず、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中にて、各種Ｚ−ＱＧ  ＤＮＡ  １５ｎｇ／μＬ、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ  ０．４ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＧ  ５．０Ｕｎｉｔ／ｍＬの条件下で４℃、６時間反応させた。ＭＴＧ未添加の場合も同様に検討した。ＰｆｕＡＰのラベル化の確認はアガロース電気泳動で行った。
【０１６６】
ＭＴＧ反応後のアガロース電気泳動の結果を図２１に示す。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ  ５０％、１００％の条件で調製したＺ−ＱＧ  ＤＮＡを用いた場合はＭＴＧ添加時に高分子側へシフトしているが、Ｚ−ＱＧ未ラベルＤＮＡ（Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ  ０％の条件で調製した陰性対照ＤＮＡ）では分子量シフトが確認されなかった。また、Ｚ−ＱＧ  ＤＮＡに対して、ＭＴＧ未添加時にも高分子量化は確認されなかった。この結果より、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰはＭＴＧによってＺ−ＱＧ  ＤＮＡのＺ−ＱＧ部位へ特異的に結合していることがわかった。また、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ  ５０％の場合よりＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ  １００％の条件で調製したＺ−ＱＧ  ＤＮＡを用いたほうが、より明確に高分子量化が進んでいることから、ＰＣＲによる増幅の際のＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰの割合を変えることによって、ＰｆｕＡＰの結合量を調節することが可能なことが示された。
【０１６７】
＜ＰｆｕＡＰマルチラベル化ＤＮＡプローブの調製＞
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ  ５０％、１００％の条件で調製したＺ−ＱＧ  ＤＮＡとＮＫ１４−ＰｆｕＡＰをＭＴＧにて結合し、ＰｆｕＡＰマルチラベル化ＤＮＡプローブを調製した。まず、各種Ｚ−ＱＧ  ＤＮＡを９０℃で５分間熱処理してＤＮＡを一本鎖に変性させた後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中にて、各種Ｚ−ＱＧ  ＤＮＡ  ２５ｎｇ／μＬ、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ  ０．４ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＧ  ５．０Ｕｎｉｔ／ｍＬの条件下で４℃、６時間反応させた（ＭＴＧ反応前熱処理プローブ）。ＤＮＡプローブは熱処理で一本鎖にすることがプローブの検出能に大きく影響することから、熱処理していないＺ−ＱＧ  ＤＮＡについても同様の条件でＰｆｕＡＰのラベル化を行い、その後、９０℃で５分間熱処理を施したプローブも調製した（ＭＴＧ反応後熱処理プローブ）。ＤＮＡプローブのＰｆｕＡＰラベル化の確認はアガロース電気泳動で行った。
【０１６８】
ＭＴＧ反応後のアガロース電気泳動の結果を図２２に示した。ＭＴＧ反応前に熱処理したＺ−ＱＧ  ＤＮＡおよびＭＴＧ反応後に熱処理したＺ−ＱＧ  ＤＮＡとも高分子側へシフトしていることから、Ｚ−ＱＧ  ＤＮＡへのＰｆｕＡＰのラベル化が確認された。
【０１６９】
＜ドットブロットによる検出感度の評価＞
それぞれ調製したＰｆｕＡＰマルチラベル化プローブの検出感度の評価をドットブロットで行った。なお、ハイブリダイゼーション時の各種組成およびプロトコールは、市販の検出キットＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に準拠した。ターゲットＤＮＡとして、プローブ配列を含む９９０ｂｐのＳｈｈのＤＮＡ断片（配列番号：３０、プライマー配列は表１７参照（配列番号：３１））、およびプローブ配列と同じ３００ｂｐのＳｈｈのＤＮＡ断片を用いた。また、ネガティブコントロールとして、ＰｆｕＡＰをコードする遺伝子約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（配列番号：３２、プライマー配列は表１８参照（配列番号：３３，３４））を用いた。
【０１７０】
【表１７】
2010047559.tif 000029
【０１７１】
【表１８】
2010047559.tif 000030
【０１７２】
それぞれのターゲットＤＮＡをＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて５０ｎｇ／μＬと５０ｐｇ／μＬに希釈し（ネガティブコントロールは５０ｎｇ／μＬのみ）、それぞれを１μＬずつプラスチャージのメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にスポットし、８０℃で２時間熱処理することでＤＮＡをメンブランに固定した。その後、検出キットに添付されているハイブリダイゼーションバッファーにメンブランを移し、５５℃で３０分間、プレハイブリダイゼーションを行った。そして、上記方法で調製した各種ＰｆｕＡＰマルチラベル化ＤＮＡプローブを５０ｎｇ／ｍＬとなるようにハイブリダイゼーションバッファーに添加して、５５℃で一晩（１４時間〜１６時間程度）ハイブリダイゼーションを行った。
【０１７３】
ハイブリダイゼーション後、メンブレンをＷａｓｈ  Ｉバッファー（表１９）に移し、５５℃で震盪しながら１５分間洗浄した。この操作を２回繰り返した。その後、室温（実験した日は１８〜２２℃程度）でＷａｓｈ  ＩＩバッファー（表２０）にて５分間洗浄した。この操作を２回繰り返した。
【０１７４】
【表１９】
2010047559.tif 000031
【０１７５】
【表２０】
2010047559.tif 000032
【０１７６】
ＮＴＭＴｘバッファー（表２１）で室温、５分間洗浄したメンブランをＳｔａｉｎｉｎｇ溶液（３７５μｇ／ｍＬ  ＮＢＴ  ＋  １８８μｇ／ｍＬ  ＢＣＩＰ  ｉｎ  ＮＴＭＴｘ）に移し、５０℃に２時間、遮光下で静置して発色させた。
【０１７７】
【表２１】
2010047559.tif 000033
【０１７８】
各種ＰｆｕＡＰラベル化ＤＮＡプローブのドットブロットの結果を図２３に示した。どのＤＮＡプローブを用いた場合もドットのシグナルが検出されていることから、ＭＴＧを用いてＺ−ＱＧ  ＤＮＡにＰｆｕＡＰでラベルしたＤＮＡプローブは、核酸プローブとしての検出能を有していることが示された。また、ＭＴＧ反応後に熱処理する場合（ＭＴＧ反応後熱処理プローブ）よりも、ＭＴＧ反応前にＺ−ＱＧ  ＤＮＡを熱処理する場合（ＭＴＧ反応前熱処理プローブ）の方が、検出感度を向上できることがわかった。これはＭＴＧ反応後熱処理プローブでは、ＰｆｕＡＰがラベル化されたＤＮＡプローブを熱処理することになるため、熱処理時の反応容量の増加により熱処理が不十分となりＤＮＡが完全に熱変性されなかったことや、ラベル化された状態での熱処理によるＰｆｕＡＰの失活が考えられる。
【０１７９】
ＭＴＧ反応前熱処理プローブでは、Ｚ−ＱＧの導入量が５０％および１００％のプローブのどちらも５０ｐｇ／μＬのドットまで検出することができた。ネガティブコントロールにおけるターゲット核酸濃度が５０ｎｇ／μＬと高い場合には、非特異的なシグナルも若干検出されたが、相補的なＤＮＡを明確に判別することができた。また、ターゲットＤＮＡの鎖長の違いは、検出感度に大きな影響を与えなかった。
【０１８０】
（実施例４）
［Ｚ−ＱＧ  ＤＮＡを用いたＰｆｕＡＰマルチラベル化ＤＮＡプローブのＩＳＨプロトコールに準じたＲＮＡ検出］
実施例３では、検出対象核酸はＤＮＡであった。本実施例４では、検出対象核酸をＲＮＡとした場合の、ＰｆｕＡＰマルチラベル化ＤＮＡプローブの核酸プローブとしての機能について評価した。
【０１８１】
＜ＰＣＲによるＺ−ＱＧ  ＤＮＡの調製＞
実施例３と同様にして、ＰＣＲによるＺ−ＱＧ  ＤＮＡの調製を行った。
【０１８２】
＜ＰｆｕＡＰマルチラベル化ＤＮＡプローブの調製＞
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ  ５０％、１００％の条件で調製したＺ−ＱＧ  ＤＮＡとＮＫ１４−ＰｆｕＡＰをＭＴＧにて結合し、ＰｆｕＡＰマルチラベル化ＤＮＡプローブを調製した。まず、各種Ｚ−ＱＧ  ＤＮＡを９０℃で５分間熱処理してＤＮＡを一本鎖に変性させた後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中にて、各種Ｚ−ＱＧ  ＤＮＡ  ２５ｎｇ／μＬ、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ  ０．４ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＧ  ５．０Ｕｎｉｔ／ｍＬの条件下で４℃、６時間反応させた。ＤＮＡプローブのＰｆｕＡＰラベル化の確認はアガロース電気泳動で行った。
【０１８３】
ＭＴＧ反応後のアガロース電気泳動の結果を図２４に示した。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを５０％、１００％導入したＺ−ＱＧ  ＤＮＡはどちらもＭＴＧ反応後に高分子側にバンドがシフトしていた。この結果よりＺ−ＱＧ  ＤＮＡへのＰｆｕＡＰのラベル化が確認されたため、これらをドットブロットのＤＮＡプローブとして使用した。
【０１８４】
＜ＩＳＨプロトコールに準じたドットブロットによる検出感度の評価＞
実施例３と同様にして、ＰＣＲによってプローブ配列を含む９９０ｂｐのＳｈｈのＤＮＡ断片（配列番号：３０）を得た。この際、Ｓｈｈ遺伝子の下流側にＴ７プロモーターが含まれるようプライマー設計（配列番号：３１、表１７参照）を施した。次に、得られたＰＣＲ産物を基にＴ７  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて転写反応を行った（表２２）。転写反応後、ゲル濾過カラム（Ｍｉｎｉ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｒｏｃｈｅ社製）で未反応のＮＴＰ等を精製したものをターゲットＲＮＡとして用いた。
【０１８５】
【表２２】
2010047559.tif 000034
【０１８６】
得られたターゲットＲＮＡをＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて５０ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、５０ｐｇ／μＬの三段階に希釈し、それぞれを１μＬずつプラスチャージのメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にスポットし、８０℃で２時間熱処理することでＲＮＡをメンブランに固定した。ネガティブコントロールとして、市販の酵母ＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ｔｏｒｕｌａ  ｙｅａｓｔ  ＲＮＡ、シグマ・アルドリッチ製）を５０ｎｇ／μＬに希釈したものを同様にメンブランに１μＬスポットし、固定化した。その後、ハイブリダイゼーションバッファー（表２３）中にメンブランを移し、６０℃で３０分間、プレハイブリダイゼーションを行った。そして、上記方法で調製した各種ＤＮＡプローブを５０ｎｇ／μＬとなるように添加し、６０℃で一晩（１４時間〜１６時間程度）ハイブリダイゼーションを行った。
【０１８７】
【表２３】
2010047559.tif 000035
【０１８８】
ハイブリダイゼーション後、メンブレンの洗浄操作を行った。各種洗浄溶液を表２４に示す。メンブランをＷａｓｈ  Ｉバッファーに移し、６０℃で震盪しながら２０分間洗浄した。この操作を３回繰り返した。そして、５５℃でＷａｓｈ  ＩＩバッファーにて２０分間洗浄した。この操作を３回繰り返した。続いてＮＴＭＴｘバッファーを用いて室温（実験した日は１８〜２２℃程度）で５分間、２回洗浄し、洗浄したメンブランをＳｔａｉｎｉｎｇ溶液（３７５μｇ／ｍＬ  ＮＢＴ  ＋  １８８μｇ／ｍＬ  ＢＣＩＰ  ｉｎ  ＮＴＭＴｘ）に移し、５０℃で２時間、遮光下に静置して発色させた。
【０１８９】
【表２４】
2010047559.tif 000036
【０１９０】
各種ＰｆｕＡＰラベル化ＤＮＡプローブのＩＳＨプロトコールに準じたドットブロットの結果を図２５に示した。Ｚ−ＱＧの導入量が５０％および１００％のどちらのＤＮＡプローブも１ｎｇ／μＬのドットまで検出することができ、シグナルの発色強度もどちらのプローブを用いた場合もほぼ同等であった。また、ネガティブコントロールの非特異的なシグナルは検出されなかった。このことより、ＭＴＧを用いてＺ−ＱＧ  ＤＮＡにＰｆｕＡＰをラベルしたＤＮＡプローブは、ＲＮＡを検出するプローブとして利用可能であることが明らかとなった。
【０１９１】
（実施例５）
実施例２と同様にして、常温菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＡＰ（ＢＡＰ）を用いてマルチラベル化したマルチラベル化核酸プローブについても、プローブ能評価を行った。
【０１９２】
＜ＢＡＰマルチラベル化ＲＮＡの調製＞
実施例２と同様にして、ＲＮＡの変性処理を行った後に、続いて、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中にて、各種Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡ  ５０μｇ／ｍＬ、ＮＫ１４−ＢＡＰ  ０．４ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＧ  ５．０Ｕ／ｍＬ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｔｏｒ  １．０Ｕ／μＬの条件下にて、６時間反応を行った。コントロールとして、ＭＴＧ未添加の場合にも同様の操作を行い、反応はアガロースゲル電気泳動によって評価した。
【０１９３】
＜ドットブロットによるプローブ能評価＞
実施例２と同様にして、ドットブロットによりプローブ能について評価した。
【０１９４】
ラベル化した際の分子量変化を図２６に示す。結果より、Ｚ−ＱＧ導入量に比例して、顕著な分子量増加が生じた。また、Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡ（１００％）を用いた際には、分子量分布が小さくなっていることが確認された。ＲＮＡ調製時にＺ−ＱＧ−ＵＴＰのみを使用した場合には、Ｚ−ＱＧが導入される数や位置が単分散となるため（理論上全てのＵ）、ほぼ均一にラベル化が進行したと考えられる。ＰｆｕＡＰ（図１０）に比べて著しい分子量増加が見られた点から、Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡとの反応性はＢＡＰの方が優れていることが示唆される結果となった。
【０１９５】
一方で、得られたＢＡＰマルチラベル化ＲＮＡを用い、ドットブロットによってプローブ能を評価した（図２７参照）。結果より、Ｚ−ＱＧ導入量が６０％、８０％、１００％のｍＲＮＡに対してＢＡＰラベル化を行った際において、１ｎｇ程度のＲＮＡが検出可能であった。２０％、４０％においてほとんど検出されなかった理由としては、ＢＡＰ未修飾のＲＮＡが残存しているためであると予想される（図２６参照）。ＰｆｕＡＰをラベル化した際のプローブ（検出限界：１０ｐｇ）と比較すると、本系における標識酵素としてはＰｆｕＡＰの方が適していることが示された。
【０１９６】
（実施例６：ＭＴＧによるＺ−ＱＧ  ＲＮＡの蛍光色素ラベル化およびドットブロットによる標的核酸の検出）
＜Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５マルチラベル化ＲＮＡの調製＞
蛍光色素として、一級アミン誘導化されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５５５  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が、ＭＴＧによってＺ−ＱＧ  ＲＮＡと結合するかについて検討した。まず、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ使用率１００％の条件で調製したＺ−ＱＧ  ＲＮＡを、９９．０℃まで加熱した後、急冷することによって、変性処理を行った。続いて、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中にて、Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡ  ５０μｇ／ｍＬ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ  ２０μＭ、ＭＴＧ  ５．０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １．０Ｕ／μＬの条件下にて、６時間反応を行った。コントロールとして、ＭＴＧ未添加の場合およびＺ−ＱＧを導入していない未修飾ＲＮＡに対しても同様の操作を行い、反応はアガロースゲル電気泳動によって評価した。
【０１９７】
ＭＴＧを用いて、Ｚ−ＱＧ  ＲＮＡに対してＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅラベル化を行った際の結果を図２８に示す。ここで、Ｌａｎｅ２は未修飾のＲＮＡとＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅを、Ｌａｎｅ３はＬａｎｅ２の条件にＭＴＧを加えたものを、Ｌａｎｅ４にはＺ−ＱＧ  ＲＮＡとＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅを、Ｌａｎｅ５にはＬａｎｅ４にＭＴＧを加えたものを示す。Ｌａｎｅ４，５において未修飾ＲＮＡとほぼ同等の位置に見られるシグナルは未反応のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅに由来するものと考えられる。このことは、エチジウムブロミド染色前にＬａｎｅ２〜４のいずれのＬａｎｅにおいても同様のバンドが確認されたことからも支持される。Ｌａｎｅ２とＬａｎｅ３では変化が見られないのに対して、Ｌａｎｅ４とＬａｎｅ５とを比較すると、ＭＴＧ添加時にはＺ−ＱＧ  ＲＮＡ由来のバンドが消失し、低分子量側へのシフトが確認された。このことは、負電荷を帯びたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅがＺ−ＱＧ  ＲＮＡに結合したことを示しており、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５マルチラベル化ＲＮＡの生成が示唆された。
【０１９８】
＜ドットブロットによるプローブ能評価＞
ｓｈｈ  Ｓ（ターゲット）をメンブレン上に固定化し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５マルチラベル化核酸プローブを用いて検出を試みた。まず、５００ｎｇ／μＬの未標識ｓｈｈ  Ｓを調製し、メンブレンに１μＬ添加し、乾燥させた後、再度１μＬ添加し（計１，０００ｎｇ）、オーブンにて固定化した（８０℃、２時間）。その後、表２５に示す操作を行い、蛍光イメージャ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ  Ｐｒｏ、５３２ｎｍ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ、５５５ｎｍ  ｌｏｎｇ  ｐａｓｓ）を用いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５マルチラベル化核酸プローブによるｓｈｈ  Ｓの検出を行った。コントロールとして、ｓｈｈ  ＡＳ鎖を同様にして固定化したメンブレンに対しても同様の操作を行った。なお、溶液の組成は表２６に示す。
【０１９９】
【表２５】
2010047559.tif 000037
【０２００】
【表２６】
2010047559.tif 000038
【０２０１】
調製したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５マルチラベル化ＲＮＡの核酸プローブとしての応用性について検討するためにドットブロットを行った（図２９参照）。ＡＳ鎖を固定化した際にはシグナルが得られなかったのに対して、Ｓ鎖を固定化した場合には蛍光が確認されたことから、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５マルチラベル化ＲＮＡはプローブとして応用可能であることが示された。また、塩基配列特異性を保持しているため、今後、ハイブリダイゼーション過程の温度やホルムアミド濃度を最適化することによって、より高感度な検出が期待される。
【図１】
2010047559.tif 000044
【図３】
2010047559.tif 000045
【図４】
2010047559.tif 000046
【図５】
2010047559.tif 000047
【図１８】
2010047559.tif 000048
【図１９】
2010047559.tif 000049
【図２】
2010047559.tif 000050
【図６】
2010047559.tif 000051
【図７】
2010047559.tif 000052
【図８】
2010047559.tif 000053
【図９】
2010047559.tif 000054
【図１０】
2010047559.tif 000055
【図１１】
2010047559.tif 000056
【図１２】
2010047559.tif 000057
【図１３】
2010047559.tif 000058
【図１４】
2010047559.tif 000059
【図１５】
2010047559.tif 000060
【図１６】
2010047559.tif 000061
【図１７】
2010047559.tif 000062
【図２０】
2010047559.tif 000063
【図２１】
2010047559.tif 000064
【図２２】
2010047559.tif 000065
【図２３】
2010047559.tif 000066
【図２４】
2010047559.tif 000067
【図２５】
2010047559.tif 000068
【図２６】
2010047559.tif 000069
【図２７】
2010047559.tif 000070
【図２８】
2010047559.tif 000071
【図２９】
2010047559.tif 000072
【配列表】
2010047559000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年11月30日(2009.11.30)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明は、下記式（１），（２），（３），（４）または（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
【化１】
2010047559.tif 000073
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基、Ｂはヒドロキシル基を表す。）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【化２】
2010047559.tif 000074
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【化３】
2010047559.tif 000075
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【化４】
2010047559.tif 000076
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【化５】
2010047559.tif 000077
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
また、前記酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸において、前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることが好ましい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
また、本発明は、構成単位として、前記式（１），（２），（３），（４）または（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブである。ただし、式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
また、本発明は、前記核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブである。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
また、本発明は、マルチラベル化核酸プローブの製造方法であって、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物を結合するマルチラベル化核酸プローブの製造方法である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
また、本発明は、標的核酸の検出方法であって、前記マルチラベル化核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により相補的に結合させ、結合している前記マルチラベル化核酸プローブを、前記標識部分により検出する標的核酸の検出方法である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
また、本発明は、標的核酸の検出方法であって、前記核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により相補的に結合させた後、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基と、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物のリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンとを反応させて複数の標識部分を導入し、結合している前記核酸プローブを、前記標識部分により検出する標的核酸の検出方法である。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１），（２），（３），（４）または（５）で示されることを特徴とする酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸。
【化１】
2010047559.tif 000078
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基、Ｂはヒドロキシル基を表す。）
【化２】
2010047559.tif 000079
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化３】
2010047559.tif 000080
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化４】
2010047559.tif 000081
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化５】
2010047559.tif 000082
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【請求項２】
請求項１に記載の酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸であって、
前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることを特徴とする酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸。
【請求項３】
構成単位として、下記式（１），（２），（３），（４）または（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸であることを特徴とする核酸プローブ。
【化６】
2010047559.tif 000083
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化７】
2010047559.tif 000084
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化８】
2010047559.tif 000085
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化９】
2010047559.tif 000086
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化１０】
2010047559.tif 000087
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【請求項４】
請求項３に記載の核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物が結合されて構成されていることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。
【請求項５】
請求項４に記載のマルチラベル化核酸プローブであって、
前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。
【請求項６】
請求項５に記載のマルチラベル化核酸プローブであって、
前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。
【請求項７】
マルチラベル化核酸プローブの製造方法であって、
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、請求項３に記載の核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物を結合することを特徴とするマルチラベル化核酸プローブの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載のマルチラベル化核酸プローブの製造方法であって、
前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブの製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載のマルチラベル化核酸プローブの製造方法であって、
前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブの製造方法。
【請求項１０】
標的核酸の検出方法であって、
請求項４〜６のいずれか１項に記載のマルチラベル化核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により相補的に結合させ、結合している前記マルチラベル化核酸プローブを、前記標識部分により検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項１１】
標的核酸の検出方法であって、
請求項３に記載の核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により相補的に結合させた後、
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基と、リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物のリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンとを反応させて複数の標識部分を導入し、結合している前記核酸プローブを、前記標識部分により検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。