(57)【要約】      （修正有）【課題】薬物を細胞内へ移送する輸送タンパク質（トランスポーター）を適当な宿主に発現させ、その活性を高感度で測定する方法を提供する。【解決手段】トランスポーターをコードする遺伝子を含む組換えウイルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される出芽ウイルス膜上にトランスポーターを発現させる方法。および、膜上に内因性トランスポーターを発現していない、出芽バキュロウイルスを用いたトランスポーター活性の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスポーターをコードする遺伝子を含む組換えウイルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される出芽ウイルス膜上にトランスポーターを発現させることを特徴とする、トランスポーター活性を有するトランスポーターを発現させる方法。
【請求項２】
ウイルスがバキュロウイルスである請求項１記載の方法。
【請求項３】
トランスポーターが非ウイルス由来である請求項１または２いずれか記載の方法。
【請求項４】
トランスポーターがペプチドトランスポーターまたは有機アニオントランスポーターである請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
トランスポーターがPepT1、PepT2又は OATP-Cである請求項４記載の方法。
【請求項６】
トランスポーター活性を有するトランスポーターを発現しているウイルス。
【請求項７】
トランスポーターが非ウイルス由来である請求項６記載のウイルス。
【請求項８】
ウイルスがバキュロウイルスである請求項７記載のウイルス。
【請求項９】
ウイルスが出芽ウイルスである、請求項６〜８いずれか記載のウイルス。
【請求項１０】
トランスポーターがペプチドトランスポーターまたは有機アニオントランスポーターである請求項６〜９いずれか記載のウイルス。
【請求項１１】
トランスポーターがPepT1、PepT2又は OATP-Cである請求項１０記載のウイルス。
【請求項１２】
ウイルス膜上でトランスポーターを発現させることを特徴とする、トランスポーターの活性測定方法。
【請求項１３】
ウイルスが出芽バキュロウイルスである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
トランスポーターがペプチドトランスポーターまたは有機アニオントランスポーターである請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
トランスポーターがPepT1、PepT2又は OATP-Cである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
以下の工程を含むトランスポーターのトランスポート活性を阻害又は促進する物質のスクリーニング方法。
(a)ウイルス膜上にトランスポーターを発現させる工程、
(b)該トランスポーターに被験物質を接触させる工程、及び
(c)トランスポート活性を阻害又は促進する物質を選択する工程
【請求項１７】
ウイルスがバキュロウイルスである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスが出芽ウイルスである請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項１９】
トランスポーターが非ウイルス由来である請求項１６〜１８いずれか記載の方法。
【請求項２０】
トランスポーターがペプチドトランスポーターまたは有機アニオントランスポーターである、請求項１６〜１９いずれか記載の方法。
【請求項２１】
トランスポーターがPepT1、PepT2又は OATP-Cである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ウイルスが担体に固定されていることを特徴とする請求項１６〜２１いずれか記載の方法。
【請求項２３】
ウイルスの担体への固定が、ウイルス膜上に発現している膜タンパク質に対する抗体を介して行われていることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ウイルスの担体への固定が、ウイルス膜上に発現しているタンパク質をビオチン化することでビオチン・ストレプトアビジン反応を介して行われることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトランスポーターをコードする遺伝子を用いて出芽ウイルス膜上にトランスポーターを発現させることを特徴とする、トランスポーター活性を有するトランスポーターを発現させる方法に関する。また、本発明はトランスポーター活性を有するトランスポーターを発現しているウイルス、該ウイルスを用いたトランスポーターの活性測定法、及び、トランスポーターのトランスポート活性を阻害または促進する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物は、生体外から栄養源を取り込む必要性があり、細胞には多くの輸送タンパク質（トランスポーター）が存在することが知られている。このようなトランスポーターは主として生命維持に必須の物質(アミノ酸や糖等)を細胞内に輸送する働きを有する。生理的環境下では同一基質を輸送するトランスポーターが細胞に複数存在することが多い。このような場合、キネティクス解析(Km、Vmaxなどの算出；例えば、Wright E.M., Am.J.Physiol.Renal Physiol. 280: F10-18 (2001)参照)により細胞への取り込みに対するそれぞれのトランスポーターの寄与が推定できる。従って、トランスポーターの輸送基質を同定し、キネティクス解析をすることは、その生理機能ならびに薬物送達の可能性を明らかにする上で極めて重要である。
【０００３】
現在、トランスポーターの機能解析には、(1)生体から単離したトランスポーターを含む初代培養細胞、及び細胞膜小胞(肝細胞、刷子縁膜小胞など)、(2)トランスポーターを含む癌細胞などからライン化された細胞株(Caco-2細胞など)、(3)トランスポーターの遺伝子を導入した哺乳類細胞(LLC-PK1細胞、MDCK細胞など)やアフリカツメガエル卵母細胞、並びに(4)バキュロウイルス発現系を用いてトランスポーターを発現させた昆虫細胞膜(Sf9細胞膜など)を材料として用いる方法が挙げられる。中でも、哺乳類細胞やアフリカツメガエル卵母細胞の遺伝子発現系が主に用いられている。しかし、トランスポーター遺伝子を導入した哺乳類細胞やアフリカツメガエル卵母細胞でも内因性トランスポーターに由来する活性が検出され、バックグラウンドが高くなる（Kanai Y. et al., J.Clin.Invest. 93: 397-404 (1994); Kekuda R. et al., J.Biol.Chem. 271: 18657-18661 (1996); Kekuda R. et al., Am.J.Physiol. 272: G1463-1472 (1997); Yabuuchi H. et al., J.Pharmacol.Exp.Ther. 286: 1391-1396 (1998); Hatanaka T. et al., J.Clin.Invest. 107: 1035-1043 (2001)）。そのため、トランスポーターの種類によっては、遺伝子を導入していない細胞(親株)と導入した細胞との活性比が2倍程度しかないものも報告される。このように活性比の低い遺伝子導入細胞では、キネティクス解析を行うことは困難である。
【０００４】
また、トランスポーター遺伝子を注入したアフリカツメガエル卵母細胞では電気生理学的手法によりトランスポーター活性を測定できる。NaやHイオンを駆動力にするトランスポーターならびに生理的pHで電荷を有する基質の場合、基質の輸送により生じる電流を測定することでトランスポーター活性が検出できる。しかし、駆動力がなく、且つ、生理的pHで電気的に中性な基質では、輸送活性を測定することは困難である。また、トランスポーター活性が認められたが弱い電流しか検出できない場合、キネティクス解析は困難である。また、電気生理学的手法には特殊な機器を使用するため、簡便性に欠ける。
【０００５】
薬物を細胞内へ移送するトランスポーターの活性や基質特異性は薬物の生体利用率(bioavailability)に影響を及ぼすことが報告されている(例えば、Ganapathy, Leibach, Curr.Biol 3: 695-701 (1991); Nakashima et al., Biochem.Pharm. 33: 3345-3352 (1984); Friedman, Amidon, Pharm.Res. 6:1043-1047 (1989); Okano et al., J.Biol.Chem. 261: 14130-14134 (1986); Muranushi et al., Pharm.Res. 6: 308-312 (1989); Friedman, Amidon, J.Control.Res. 13: 141-146 (1990))。ここ数年、ヒトにおける薬物の体内動態変動要因を明らかにする研究が行われており、薬物代謝酵素と同様に薬物トランスポーターも、薬物の体内における作用に影響を及ぼすことが明らかにされてきた。薬物トランスポーターとしては、p-glycoprotein(Annu.Rev.Biochem. 58: 137 (1989))、multidrug resistance protein(Science 258: 1650 (1992); Cancer Res. 55: 102 (1995))、lung resistance protein (Ann.Oncl. 7: 625 (1996); Int.J.Cancer 73: 1021 (1997))、organic cation transporter(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91: 133 (1994); Molec.Pharmacol. 51: 913 (1997))等が公知である。これらの薬物トランスポーターについても薬物代謝酵素についてと同様に、SNPs解析が実施されている。近年、機能変化を伴うトランスポーターのSNPsが発見され、個体間変動要因の一つとして注目されている(Ryu S. et al., J.Biol.Chem. 275: 39617-39624 (2000); Tirona R.G. et al., J.Biol.Chem. 276: 35669-35675 (2001))。現在、トランスポーターのSNPsの機能解析は遺伝子を導入した哺乳類細胞を用いるのが主流である。しかし、親株との活性比の低い基質に対しては、SNPsによる機能変化を精度良く検出することは困難と推測される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、その目的は、バックグラウンドの低い、目的とするトランスポーター活性を高感度で測定する方法を提供することである。さらに、本発明はそのような方法を用い、トランスポーターのトランスポート活性を阻害または促進する物質をスクリーニングする方法を提供することも目的とする。
【０００７】
本発明者らは、ウイルスは基本的に自己で増殖する必要がないため、生命維持に必要な物質を取り込む生理的意義は存在しないと推測し、ウイルス膜上に内因性トランスポーターは発現していない(或いは、極めて微量な発現)と考えられる点に着目した。膜上に内因性トランスポーターを発現していない出芽バキュロウイルスを用いたトランスポーター活性測定法は、バックグラウンドが低く、目的とする活性を高感度で測定できると考えられた。また、このような方法によりトランスポーターのSNPsによる機能変化をより広範な基質について測定でき、テーラーメイド医療への応用が可能と考えられる。
【０００８】
即ち、本発明は、
[１]トランスポーターをコードする遺伝子を含む組換えウイルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される出芽ウイルス膜上にトランスポーターを発現させることを特徴とする、トランスポーター活性を有するトランスポーターを発現させる方法、
[２]ウイルスがバキュロウイルスである[１]記載の方法、
[３]トランスポーターが非ウイルス由来である[１]または[２]いずれか記載の方法、
[４]トランスポーターがペプチドトランスポーターまたは有機アニオントランスポーターである[１]〜[３]いずれか記載の方法、
[５]トランスポーターがPepT1、PepT2又はOATP-Cである[４]記載の方法、
[６]トランスポーター活性を有するトランスポーターを発現しているウイルス、
[７]トランスポーターが非ウイルス由来である[６]記載のウイルス、
[８]ウイルスがバキュロウイルスである[７]記載のウイルス、
[９]ウイルスが出芽ウイルスである[６]〜[８]いずれか記載のウイルス、
[１０]トランスポーターがペプチドトランスポーターまたは有機アニオントランスポーターである[６]〜[９]いずれか記載のウイルス、
[１１]トランスポーターがPepT1、PepT2又はOATP-Cである[１０]記載のウイルス、
[１２]ウイルス膜上でトランスポーターを発現させることを特徴とする、トランスポーターの活性測定方法、
[１３]ウイルスが出芽バキュロウイルスである[１２]記載の方法、
[１４]トランスポーターがペプチドトランスポーターまたは有機アニオントランスポーターである[１２]または[１３]記載の方法、
[１５]トランスポーターがPepT1、PepT2又はOATP-Cである[１４]記載の方法、
[１６]以下の工程を含むトランスポーターのトランスポート活性を阻害又は促進する物質のスクリーニング方法、
(a)ウイルス膜上にトランスポーターを発現させる工程、
(b)該トランスポーターに被験物質を接触させる工程、及び
(c)トランスポート活性を阻害又は促進する物質を選択する工程
[１７]ウイルスがバキュロウイルスである[１６]記載の方法、
[１８]ウイルスが出芽ウイルスである[１６]又は[１７]記載の方法、
[１９]トランスポーターが非ウイルス由来である[１６]〜[１８]いずれか記載の方法、
[２０]トランスポーターがペプチドトランスポーターまたは有機アニオントランスポーターである、[１６]〜[１９]いずれか記載の方法、
[２１]トランスポーターがPepT1、PepT2又はOATP-Cである、[２０]記載の方法、
[２２]ウイルスが担体に固定されていることを特徴とする[１６]〜[２１]いずれか記載の方法、及び
[２３]ウイルスの担体への固定が、ウイルス膜上に発現している膜タンパク質に対する抗体を介して行われていることを特徴とする[２２]記載の方法、
[２４]ウイルスの担体への固定が、ウイルス膜上に発現しているタンパク質をビオチン化することでビオチン・ストレプトアビジン反応を介して行われることを特徴とする請求項２２記載の方法、
を提供するものである。
【０００９】
本発明は、トランスポーターをコードする遺伝子を含む組換えウイルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される出芽ウイルス膜上にトランスポーターを発現させることを特徴とする、トランスポーター活性を有するトランスポーターを発現させる方法に関する。ここで、本発明におけるトランスポーターとしては、例えば、ペプチドトランスポーター、アミノ酸トランスポーター、糖トランスポーター等が挙げられる。より詳細には、表１に示されるようなトランスポーターを例示することができる。
【００１０】
【表１】
2010046068.tif 000002
2010046068.tif 000003
2010046068.tif 000004
2010046068.tif 000005
【００１１】
本発明において、好ましいトランスポーターはペプチドトランスポーターまたは有機アニオントランスポーターであり、特にPepT1、PepT2又はOATP-Cが好ましい。PepT1およびPepT2の塩基配列、アミノ酸配列は既に知られている（ヒトPepT1：GenBank XM_007063、J.Biol.Chem. 270(12): 6456-6463 (1995); ヒトPepT2：GenBank NP_066568、XM_002922、Biochim.Biophys.Acta. 1235:461-466 (1995); マウスPepT1：GenBank AF205540、Biochim. Biophys. Acta. 1492: 145-154 (2000); マウスPepT2：GenBank NM_021301、Biochim. Biophys. Res. Commun. 276: 734-741 (2000)）。また、OATP-Cの塩基配列、アミノ酸配列も既に知れらている（表１：Commun.273(1),251-260( 2000)）。しかしながら、本発明のトランスポーターは特にこれらのトランスポーターに限定されず、ウイルス膜上に発現され得るものであればよい。
【００１２】
トランスポーターをコードする遺伝子は、例えば、表１に記載のものについては米国バイオテクノロジー情報センター(NCBI)に表記のAccession番号で登録されており、例えば、それらの配列情報を元にcDNAライブラリーやゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、cDNAまたはゲノムライブラリーをプローブ(目的のトランスポーターに対する抗体、若しくは、標的のトランスポーターをコードする塩基配列に対してハイブリダイズするオリゴヌクレオチド)を用いてスクリーニングする。スクリーニングは例えば、Sambrookらの『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』(New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)第10〜12章に記載の標準的な手法に従って行うことができる。また、PCR法(前述のSambrookら(1989)の第14章など参照)により目的のトランスポーターをコードする遺伝子を単離することも可能である。
【００１３】
トランスポーターのウイルス膜上への発現方法としては、例えば、WO98/46777及びLoiselら(T.P.Loisel et al., Nature Biotech. 15: 1300-1304 (1997))の出芽バキュロウイルスを用いた膜タンパク質の発現方法を挙げることができる。より詳細には、トランスポーターをコードする遺伝子を含む昆虫細胞用の組換えベクターを作製し、バキュロウイルスDNAと共にSf9等の昆虫細胞へ導入する。すると、組換えベクターにコードされるトランスポーターは、感染細胞が死滅する前に感染細胞より細胞外に放出される成熟ウイルス粒子(ビリオン)上に発現され、トランスポーターを発現する組換えウイルスを得ることができる。
【００１４】
本発明において、出芽ウイルスとは出芽(budding)により感染細胞から放出されるウイルスのことである。一般に細胞膜を被ったウイルスは細胞が破壊されていない状態でも当該ウイルスに感染した細胞から発芽し、継続的に放出されるのに対し、膜を被らないアデノウイルスや、核膜を被ったヘルペスウイルスは細胞が破壊された時に一斉に放出される。本発明においては、特に出芽ウイルスが好ましい。また、本発明において組換えウイルスを感染させる宿主は、当業者であれば、用いるウイルスの種類に応じて、ウイルスの増殖を可能ならしめる宿主を適宜選択することができる。例えば、バキュロウイルスを用いる場合、Sf9等の昆虫細胞の使用が考えられる。一般に、バキュロウイルス-昆虫細胞を用いたタンパク質発現系は、哺乳動物細胞と同様に脂肪酸アセチル化及び糖鎖付加等の翻訳と同時または翻訳後の修飾が行われること、並びに、哺乳動物細胞系よりも異種タンパク質の発現レベルが高いこと(Luckow V.A. and Summers M.D., Virol. 167: 56 (1988))から有利な系であると考えられている。
【００１５】
さらに、本発明により、トランスポーター活性を有するトランスポーターを発現しているウイルスが提供される。ここで、ウイルスとしてはバキュロウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、SV40(simian virus 40)、アデノウイルス、EBV(Epstein-Bar virus)、レトロウイルス等を挙げることができる。本発明において、特に好ましいウイルスとしては、AcMNPV(Invitrogen)等のバキュロウイルスが挙げられ、また、出芽ウイルスが本発明のウイルスとして好ましい。また、ウイルスにより発現されているトランスポーターは好ましくは非ウイルス由来であり、例えば表１に挙げられるトランスポーターが例示される。中でも、ペプチドトランスポーターまたは有機アニオントランスポーターが好ましく、さらに好適にはPept1、PepT2及びOATP-Cを挙げることができる。
【００１６】
本発明のトランスポーター活性を有するトランスポーターを発現しているウイルスは、例えば、トランスポーターをコードする遺伝子を含む組換えウイルスを感染させた宿主を培養することによって得ることができる。または、上述のWO98/46777及びLoiselら(T.P.Loisel et al., Nature Biotech. 15: 1300-1304 (1997))の方法の様に、トランスポーターをコードする組換えベクターをバキュロウイルスと共に昆虫細胞に導入することにより、細胞外へ放出されるバキュロウイルスの膜上にトランスポーターを発現させることもできる。また、Strehlowら（D.Strehlow et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97: 4209-4214(2000)）の方法のように、トランスポーターをコードする遺伝子を導入したMoloneyウイルス由来ベクターより作製した組換えウイルスをPA317等のパッケージング細胞に感染させることにより、細胞外へ放出されるMoloney murine leukemiaウイルスの膜上にトランスポーターを発現させることができる。しかしながら、本発明のトランスポーター活性を有するトランスポーターを発現しているウイルスは、この方法により調製されたものに限定されず、トランスポーターがウイルス粒子内、または表面に発現されていれば如何なる方法により作製されたウイルスも包含される。
【００１７】
上述のようにして調製された組換えウイルスは、公知の手法により精製することができる。例えば、増加密度勾配遠心法(augment densitygradient centrifugation)(Albrechtsen et al., J.Virological Methods 28: 245-256 (1990); Hewish et al., J.Virological Methods 7: 223-228 (1983))、サイズ排除(size exclusion)クロマトグラフィー(Hjorth and Mereno-Lopez, J.Virological Methods 5: 151-158 (1982); Crooks et al., J.Chrom. 502: 59-68 (1990); Mento S.J. (Viagene, Inc.) 1994 Williamsburg Bioprocessing Conference)、モノクローナル抗体及びフコース硫酸含有多糖類等を利用したアフィニティークロマトグラフィー(Najayou et al., J.Virological Methods 32: 67-77 (1991); Diaco et al., J.Gen.Virol. 67: 345-351 (1986); Fowler, J.Virological Methods 11: 59-74 (1986); 特再表97/032010)、DEAEイオン交換クロマトグラフィー(Haruna et al., Virology 13: 264-267 (1961))等がウイルスを精製する方法として知られている。本発明のトランスポーターを発現しているウイルスもこれらに限定されるわけではないが、上述の方法、または、これらの方法を組み合せて精製しても良い。
【００１８】
本発明はまた、ウイルス膜上でトランスポーターを発現させることを特徴とする、トランスポーターの活性測定方法に関する。例えば、出芽バキュロウイルスを用いたトランスポーター活性測定は次のような方法で実施できる。まず、最初に必要であればトランスポーターによりウイルス内に取り込ませる基質を検出可能なように標識する。例えば、放射性物質、蛍光等による標識が考えられる。次に、トランスポーターを発現している出芽バキュロウイルスと基質を混合し、37℃で反応させる。一定時間後、反応液をセルロース膜などのフィルター上に移し、ウイルス内に取り込まれた基質取り込まれなかった基質を吸引濾過法で分離する。あらかじめ氷冷しておいた緩衝液で数回フィルターを洗浄し、フィルターに捕捉されたウイルス中の基質濃度を液体シンチレーションカウンター、蛍光検出器やHPLCなどで定量する。非特異的な取り込みは、トランスポーターを発現していない野生型ウイルスへの基質の取り込みで検出することができる。また、トランスポーターに対する阻害剤を基質と共存させる、あるいは基質が放射性物質の場合は過剰量の非標識体を共存させて取り込み試験を実施することでも非特異的取り込みを評価できる。また、4℃で取り込み試験を実施し、非特異的取り込みを評価することもできる。
【００１９】
別の方法としては、トランスポーターを発現している出芽バキュロウイルス溶液を96ウェルプレートなどに添加し、4℃で一晩放置し、プレートへのコーティングを行う。または、ウイルス膜上に高発現しているgp64タンパク質などの膜タンパク質に対する抗体を96ウェルプレートなどに添加し、4℃で一晩放置する。その後、トランスポーターを発現している出芽バキュロウイルスをプレートに添加し、抗gp64抗体(Novagen社、Clontech社)などの膜タンパク質に対する抗体を介してウイルスをプレートにコーティングすることもできる。ウイルスをコーティングしたプレートに基質を添加し、反応を開始する。一定時間後、あらかじめ氷冷しておいた緩衝液でプレートを洗浄し、ウイルスに取り込まれなかった基質を取り除く。ウイルスに取り込まれた基質量を液体シンチレーションカウンター、蛍光検出器やHPLCなどで定量する。プレートへの非特異的吸着が高い場合には、活性測定前にスキムミルクなどでブロッキングを行ってもよい。非特異的な取り込みは、トランスポーターを発現していない野生型ウイルスへの基質の取り込みで検出することができる。また、トランスポーターに対する阻害剤を基質と共存させる、あるいは基質が放射性物質の場合は過剰量の非標識体を共存させて取り込み試験を実施することでも非特異的取り込みを評価できる。また、4℃で取り込み試験を実施し、非特異的取り込みを評価することもできる。
【００２０】
通常、生体材料や培養細胞から調製した細胞膜小胞などはディープフリーザーあるいは液体窒素中で保存するが、出芽バキュロウイルスは4℃で保存可能であり、特殊な冷凍機器は必要としない。また、細胞培養など煩雑な操作がなく、活性測定に電気生理学的手法のような特殊な機器を必要としないため、発芽バキュロウイルス発現系は簡便なトランスポーター活性測定法である。
【００２１】
本発明のウイルス膜上でトランスポーターを発現させることを含むトランスポーター活性の測定方法は、トランスポーターの活性を阻害または促進する物質の探索にも応用可能である。特に発芽バキュロウイルス発現系を用いる方法は簡便であり、トランスポーター活性を阻害または促進する物質を同定するに当たっても有用である。本方法においては、具体的には、例えば、目的とするトランスポーターを発現させた出芽バキュロウイルスを作製する。そのトランスポーターの放射性基質あるいは蛍光基質と被験物質を混合し、トランスポーター発現ウイルスへ添加する。基質を添加する前に、化合物をあらかじめウイルスにプレロードすることも可能である。被験物質非存在下での輸送活性を100として、被験物質存在下での活性変化を指標にトランスポーター活性を阻害または促進する物質を探索する。被験物質がトランスポーター活性を阻害または促進しているか否かの判定は、公知の方法、例えば、放射性物質(14Cなど)、蛍光物質等で輸送の対象となる基質(例えば、ペプチドトランスポーターの場合にはペプチド)を標識し、該基質がトランスポーター発現ウイルスに取り込まれた量を測定すること等により行うことができる。
【００２２】
本発明のトランスポーターのトランスポート活性を阻害または促進する物質のスクリーニング方法における被験物質としては、例えば、精製若しくは粗タンパク質(抗体を含む)、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、合成低分子化合物のライブラリー、ペプチド、非ペプチド性化合物、天然化合物等が挙げられるが、これらに制限されない。
【００２３】
ウイルス膜上に発現されたトランスポーターは、例えば、精製したタンパク質の形態、担体に結合させた形態、他のタンパク質との融合タンパク質の形態、または膜画分の形態等で被験物質に接触させることができる。ここでウイルスを固定する担体としては、合成または天然の有機高分子化合物、ガラスビーズ、シリカゲル、アルミナ、活性炭等の無機材料、さらにはこれらの材料に多糖類、合成高分子をコーティングしたもの等を挙げることができる。有機高分子化合物としては、アガロース、セルロース、キチン、キトサン、セファロース、デキストラン等の多糖類、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリアミド、シリコン樹脂、フッ素樹脂、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、それらの誘導体を含む多数の化合物を例示することができるが、ウイルスを固定化することができれば特にその組成は制限されるものではないことが理解される。担体の形状にも特に制限はなく、例えば、プレート等の膜状、繊維状、顆粒状、中空糸状、不織布状、多孔形状、ハニカム形状等が挙げられるが、本発明においては、特に市販のプレートへの固定が簡便性の面から好ましい。これらの担体の形状や表面積等を変化させることによって、被験物質との接触面積を制御することができる。ウイルスは、例えば、該ウイルス上に発現している膜タンパク質に対する抗体を介して担体に固定することができる。また、あらかじめビオチン化すればストレプトアビジンやアビジンを介して担体に固定することもできる。
【００２４】
トランスポーター活性の阻害剤または促進剤の探索により、トランスポーターの生理的機能を明らかにできると共に、それらの阻害剤及び促進剤を、トランスポーターの異常に起因する疾患に対する医薬品開発において応用することも考えられる。
【００２５】
本発明のトランスポーター発現出芽バキュロウイルス又は該ウイルスのトランスポーターを含む膜部分はトランスポーター抗体を作製する際の免疫抗原ならびにスクリーニング抗原として利用可能である。このような抗原の調製は、例えば、バキュロウイルスを用いたWO98/46777等の記載の方法に準じて行うことができる。
【００２６】
従来、トランスポーターに対する抗体を作成する際には、活性を有するトランスポーターを免疫原とすることは困難であったが、本発明の方法により発現させたトランスポーターはトランスポート活性を有していることが確認されているので、本発明のトランスポーター発現ウイルス又は該ウイルスのトランスポーターを含む膜部分を免疫原として用いれば、活性を有するトランスポーターを免疫原にすることが可能となる。
【００２７】
よって、本発明のトランスポーター発現ウイルス又は該ウイルスのトランスポーターを含む膜部分を免疫原として抗体を作成することは非常に有用である。
【００２８】
従って、本発明は、トランスポーター発現出芽ウイルス又は該ウイルスのトランスポーターを含む膜部分を免疫抗原とすることを特徴とする抗トランスポーター抗体の作製方法、及び該方法により作製された抗体を提供する。
【００２９】
本発明のトランスポーター抗体の作製は、トランスポーター発現ウイルス又は該ウイルスのトランスポーターを含む膜部分を皮下または腹腔内注射等により非ヒト哺乳動物に複数回投与することにより、当業者に周知の方法で作製することができる。
【００３０】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
【００３１】
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
【００３２】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をPBS(Phosphate-Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、4〜21日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
【００３３】
ここで、本発明のトランスポーターに対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明のトランスポーターをカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明のトランスポーターのみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインAあるいはプロテインGカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンGあるいはMを調製することができる。
【００３４】
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
【００３５】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法(Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46)等に準じて行うことができる。
【００３６】
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
【００３７】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroで本発明のトランスポーター発現ウイルス又は該ウイルスのトランスポーターを含む膜部分で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、トランスポーターへの結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭63-17688号公報）。
【００３８】
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のトランスポーターをカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のトランスポーターの精製、検出に用いられる他、本発明のトランスポーターのアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明のトランスポーターが関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
【００３９】
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるトランスポーター発現ウイルス又は該ウイルスのトランスポーターを含む膜部分を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いてトランスポーターに対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号WO92-03918、WO93-2227、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735およびWO96-34096参照）。
【００４０】
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子(oncogene)により不死化させた細胞を用いてもよい。
【００４１】
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。組換え型抗体は、それをコードするDNAをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
【００４２】
さらに、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Fab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv(scFv) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
【００４３】
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
【００４４】
また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のCDR（相補性決定領域）とヒト抗体由来のFR（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
【００４５】
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常の分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる(Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)等により行うことができる。
【００４６】
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。
【００４７】
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる(Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーはHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【００４８】
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ELISAを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のトランスポーターを添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。本発明の抗体の活性評価には、BIAcore(Pharmacia製)を使用することができる。
【００４９】
トランスポーター結合抗体のスクリーニングは出芽バキュロウイルスをコーティングした96ウェルプレートを用いてELISAにより行うことができる。ウイルス抗原に対する抗体は野生型ウイルスをスクリーニング抗原としたELISAで除くことができる。あるいは、ハイブリドーマ培養上清と野生型ウイルスを反応させ、ウイルス抗原に対する抗体をあらかじめ除いた後に、トランスポーター発現ウイルスをスクリーニング抗原としたELISAを行い、トランスポーターの結合抗体を取得することもできる。結合抗体の中から、機能阻害抗体のスクリーニングも可能である。即ち、目的とするトランスポーターの放射性基質あるいは蛍光基質とハイブリドーマ培養上清など抗体を含む溶液を混合し、トランスポーター発現ウイルスへ添加する。基質を添加する前に、ハイブリドーマ培養上清などの抗体を含む溶液をあらかじめウイルスにプレロードすることも可能である。抗体非存在下での輸送活性を100として、抗体存在下での活性低下を指標に機能阻害抗体をスクリーニングすることができる。トランスポーターに対する結合抗体により、トランスポーターの組織分布を細胞レベルで明らかにできる。また、機能阻害抗体は培養細胞に添加する、あるいは実験動物に投与することでトランスポーターの生理的機能の解明に大きく貢献できる。また、疾患に関連するトランスポーターに対する結合抗体や機能阻害抗体は、医薬品として応用することも考えられる。
【００５０】
本発明は、SNPsなどの多型や変異などによるアミノ酸配列の変化により、トランスポーターの活性がどのように変化するかの評価などにも利用することが可能である。例えば、OATP-Cでは多数のSNPsが存在し、これらのSNPsによりアミノ酸配列が変化していることが報告されている(J. Biol. Chem.,276, (2001))。これらアミノ酸の変化したOATP-Cのそれぞれについて本発明の方法によりトランスポート活性を測定すれば、トランスポート活性に影響を与えるSNPsを同定することや、活性の高いトランスポーターをスクリーニングすることなどを行うことが可能である。
【００５１】
又、トランスポーターのアミノ酸配列を人為的に置換、挿入、欠失、付加などして変異体を作成した後に、該トランスポーターの活性を測定して、活性の高いトランスポーターをスクリーニングすることや、トランスポート活性に影響を与える領域を同定することも可能である。アミノ酸を置換したトランスポーターの調製は当業者によく知られた方法を用いることができ、例えば、部位特異的変異誘発法(Hashimoto-Gotoh, T. et al., Gene, 152, 271-275, (1995)、Zoller, MJ, and Smith, M., Methods Enzymol, 100, 468-500, (1983)、Kramer, W et al., Nucleic Acids Res, 12, 9441-9456, (1984)、Kramer, W and Fritz, HJ., Method Enzymol, 154, 350-367, (1987)、Kunkel, TA., Proc Natl Acad Sci USA, 82, 488-492, (1985)、Kunkel, TA., Methods Enzymol, 85, 2763-2766, (1988))などを用いることができる。
【００５２】
さらに、本発明を用いれば、トランスポーターにより輸送される物質を被験物質として、トランスポート活性を測定することにより、トランスポーターにより輸送されやすい物質、又は輸送されにくい物質をスクリーニングすることも可能である。
【００５３】
本発明はトランスポーター以外のタンパク質においても利用でき、例えば、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル、カリウムチャネル、クロライドチャネル、陽イオンチャネル、陰イオンチャネルなどのイオンチャネル（ion channel）、などにおいても同様の活性測定方法、スクリーニング方法などを行うことが可能である。この場合、トランスポーターの代わりにチャネルをウイルス膜上に発現させ、基質としてはチャネルが透過する物質を用いることができる。本発明に用いるチャネルとしては、例えば、表２に記載のチャネルを用いることができる。従って、本発明はトランスポーターやイオンチャネルなどのように、物質の輸送または通過が可能なタンパク質（特に、膜上に発現し、基質特異的な輸送または通過が可能なタンパク質）において利用できる。
【００５４】
本発明は上記トランスポーター、イオンチャンネル以外にも、Ｇプロテイン共役型受容体(GPCR：G protien coupled receptor)にも応用することが可能である。
【００５５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、PepT1発現ウイルスにおけるPepT1活性を示す図である。ウイルス膜上のPepT1活性は、ウイルスの[14C]グリシルザルコシンの取り込み量として測定した。「野生型」は野生型のウイルスによる取り込み量を示し、「His-PepT1」はN末端にHis-tagを付加したPepT1発現ウイルスによる取り込み量を示す。
【図２】図２は、PepT2発現ウイルスにおけるPepT2活性を示す図である。ウイルス膜上のPepT2活性は、ウイルスの[3H]グリシルザルコシンの取り込み量として測定した。「野生型」は野生型のウイルスによる取り込み量を示し、「His-PepT2」はN末端にHis-tagを付加したPepT2発現ウイルスによる取り込み量を示す。
【図３】図３は、OATP-C発現ウイルスにおけるOATP-C活性を示す図である。ウイルス膜上のOATP-C活性は、ウイルスの[3H]エストロン硫酸抱合体の取り込み量として測定した。「野生型」は野生型のウイルスによる取り込み量を示し、「OATP-C WT」は野生型OATP-C発現ウイルスによる取り込み量を示し、「OATP-C N130D」はN130D変異体OATP-C発現ウイルスによる取り込み量を示し、「OATP-C V174A」はV174A変異体OATP-C発現ウイルスによる取り込み量を示す。なお、いずれのOATP-CもN末端にHis-Tagが付加されている。
【図４】図４は、抗ヒトPepT1モノクローナル抗体の、PepT1発現ウイルスにおけるPepT1活性の阻害を検出した結果を示す図である。ウイルス膜上のPepT1活性は、ウイルスの[14C]グリシルザルコシンの取り込み量として測定した。データは平均±SD（n=3-4）で表示している。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりいかなる意味でも限定されるものではない。
【００５８】
[実施例１]
1. PepT1発現出芽バキュロウイルスの調製
ヒト腎臓ライブラリーからPCRを用いて完全長のPepT1遺伝子を単離した。完全長のヒトPepT1遺伝子をpBlueBacHis2A (Invitrogen) に挿入することでトランスファーベクターpBlueBacHis-PepT1を作製した後、Bac-N-Blue transfection kit (Invitrogen) を用いてBac-N-Blue DNAと共にトランスファーベクターをSf9細胞に導入することでヒトPepT1発現用組換えウイルスを調製した。即ち、4μgのpBlueBacHis-PepT1をBac-N-Blue DNAに加え、さらに1mLのGrace's培地(GIBCO)20μLのCell FECTIN試薬を加え、混和し、室温で15分間静置した後、Grace's培地で1回洗浄した2×106個のSf9細胞に滴下した。室温で4時間静置した後、さらに2mLの完全培地(10％ウシ胎児血清(Sigma社製)、100units/mLのペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシン(GIBCO-BRL社製)を含むGrace's培地)を加え、27℃で培養した。相同組換えにより作製されたヒトPepT1発現用組換えウイルスはキット添付の指示書に従い二度の純化を行った後、組換えウイルスのウイルスストックを得た。
【００５９】
ヒトPepT1を発現する発芽型ウイルスの調製は以下のようにして行った。すなわち、上記により調製した組換えウイルスをMOI=５となるように500mLのSf9細胞(2×106/mL)に感染させた。27℃で３日間培養した後、培養液を800×gで15分間遠心分離し、細胞ならびに細胞破砕物を除去した。遠心分離により回収した上清は45,000×gで30分間遠心した後、沈殿物をPBSに懸濁し、さらに800×gで15分遠心することで細胞成分を除去した。上清は再度45,000×gで30分間遠心した後、沈澱物をPBSに再懸濁したものを発芽型ウイルス画分とした。ウイルスならびにSf-9細胞膜上でのPepT1発現は抗His抗体を用いたウエスタン解析で確認した。また、タンパク質濃度はDc Protein Assay kit (Bio-Rad) を用い、BSAを標準物として測定した。
【００６０】
2. PepT1機能解析
[14C]グリシルザルコシンを終濃度50μMになるようにHBSS(pH6.0)で希釈し、基質溶液とした。ウイルス溶液40μL(100μg蛋白)を37℃で30分間プレインキュベートし、あらかじめ37℃で加温していた基質溶液を160μL添加し、反応を開始した。1分後、氷冷していたHBSS(pH7.4)(以下、「反応停止液」と略す)を1mL添加して、反応を停止させた。直ちにウイルスを含む反応液を混合セルロース膜フィルターを用いて吸引濾過し、5mLの反応停止液で2回洗浄した。膜フィルターを液体シンチレーターバイアルに移し、クリアゾルIを5mL添加してフィルターを溶解した。溶解後、液体シンチレーションカウンターでフィルター上の放射能を計測した。ウイルス溶液に基質溶液を添加する前に反応停止液を添加した系についても同様にフィルターへの非特異的吸着を計測し、得られた値を各実験の数値から差し引いた。
N末端にHis-tagを付加したPepT1発現ウイルスでのPepT1活性を図1に示した。PepT1を発現していない野生型ウイルスに比べて、約７倍の活性比でPepT1活性を検出することができた。
【００６１】
[実施例２]
1. PepT2発現出芽バキュロウイルスの調製
ヒト腎臓ライブラリーから完全長PepT2遺伝子を単離した。完全長のヒトPepT2をコードする遺伝子は、PCRを用いてpBlueBacHis2A (Invitrogen) に組み込むことで完全長のPepT2トランスファーベクター(pBlueBac)を作製し、ウイルスDNAと共にSf-9細胞に導入した。相同組換えにより作製された組換えウイルスを純化した後、組換えウイルス高活性ストックを作製した。ストックウイルスをSf-9細胞に感染させ、一定期間培養後にウイルスならびにSf-9細胞膜上へのPepT2の発現を行った。ウイルスならびにSf-9細胞膜上でのPepT2発現は抗His抗体を用いたウエスタン解析で確認した。より詳細には、PepT2遺伝子を用いた以外は、実施例１に記載の方法に従って操作を行った。
【００６２】
2. PepT2機能解析
[3H]グリシルザルコシンを終濃度0.8μMになるようにHBSS(pH6.0)で希釈し、基質溶液とした。ウイルス溶液40μL(100μg蛋白)を37℃で30分間プレインキュベートし、予め37℃で加温していた基質溶液を160μL添加し、反応を開始させた。1分後、反応停止液1mLを添加して、反応を停止させた。直ちにウイルスを含む反応液を混合セルロース膜フィルターを用いて吸引濾過し、5mLの反応停止液で2回洗浄した。膜フィルターを液体シンチレーションバイアルに移し、クリアゾルIを5mL添加してフィルターを溶解させた。溶解後、液体シンチレーションカウンターでフィルター上の放射能を計測した。ウイルス溶液に基質溶液を添加する前に反応停止液を添加して同様の操作を行い、フィルターへの非特異的吸着を計測し値を各実験の数値から差し引いた。
N末端にHis-tagを付加したPepT2発現ウイルスでのPepT2活性を図2に示した。PepT2を発現していない野生型ウイルスに比べて、約９倍の活性比でPepT2活性を検出することができた。
【００６３】
[実施例３]
1. OATP-C発現出芽バキュロウイルスの調製
野生型ヒトOATP-C（OATP-C WT）をコードするcDNAは以下のようにしてクローニングした。すなわち、ヒト成体肝臓由来cDNAを鋳型とし、以下のプライマーの組み合わせによるPCRによりOATP-C WT cDNAを2つの断片に分け増幅した。
5’側
OAHC17プライマー：5' gat ggt acc aaa ctg agc atc aac aac aaa aac 3'  （配列番号：１）
OAHC18プライマー：5' gat ggt acc cat cga gaa tca gta gga gtt atc 3'  （配列番号：２）
3’側
OAHC21プライマー：5' gat ggt acc tac cct ggg atc tct gtt ttc taa 3'  （配列番号：３）
OAHC22プライマー：5' gat ggt acc gtt tgg aaa cac aga agc aga agt 3'  （配列番号：４）
これらの断片をそれぞれpT7Blue-Tベクター（Novagen社）にサブクローニングし、PCRエラーのないクローンを選択した。重なり合う領域に存在するBgl IIサイトで両者を連結した後、両端に存在するKpn Iサイトで切断し、pcDNA3ベクター（Invitrogen社）のKpn Iサイトに組み込み、pcDNA3/OATP-C WTを得た。
【００６４】
次に、pcDNA3/OATP-C WTを鋳型とし、GeneEditorTM（Promega社）を用いたin vitroミュータジェネシスにより、130番目のアスパラギンがアスパラギン酸に変異したOATP-C N130Dならびに174番目のバリンがアラニンに変異したOATP-C V174AをそれぞれコードするcDNAの作製を行った。変異導入用プライマーは以下のものを使用した。
OATP-C N130D用プライマー：5’ gaa act aat atc gat tca tca gaa aat 3’（配列番号：５）
OATP-C V174A用プライマー：5’ atg tgg ata tat gcg ttc atg ggt aat 3’（配列番号：６）
【００６５】
変異導入用プライマーとキットに添付されている選択用プライマー（ボトムストランド用）を、共に一本鎖にした鋳型プラスミドDNAとアニールさせ、新たなDNA鎖を合成した。これを大腸菌に導入し、GeneEditorTM抗生物質耐性クローンを得た。これらのクローンをシークエンシングすることにより変異が入っているクローン（pcDNA3/OATP-C N130D、およびpcDNA3/OATP-C V174A）を選択した。
【００６６】
次に、pcDNA3/OATP-C WT、pcDNA3/OATP-C N130D、およびpcDNA3/OATP-C V174Aをそれぞれ鋳型とし、以下のプライマーを用いたPCRを行うことにより、両端にSal Iサイトを付加したそれぞれのcDNAを増幅した。
C45プライマー：5' gat gtc gac tta aca atg tgt ttc act 3'（配列番号：７）
C58プライマー：5' gat gtc gac tat gga cca aaa tca aca t 3'（配列番号：８）
これらをSal Iにより切断し、pBlueBac His2Aベクター（Invitrogen社）のSal Iサイトに組み込むことにより、N末端にHis-tagが付加された各OATP-Cタンパクをコードするトランスファーベクター（pBlueBac His2A/OATP-C WT、pBlueBac His2A/OATP-C N130D、pBlueBac His2A/OATP-C V174A）を作製した。
【００６７】
Bac-N-Blueトランスフェクションキット（Invitrogen社）を用いて、これらベクターをウイルスDNAと共にSf-9細胞に導入した。5〜8日後に、培養上清中の組換えウイルスをプラークアッセイにより純化した。その後、ウイルスを増幅し、組換えウイルス高活性ストックを作製した。ストックウイルスをMOI=1でSf-9細胞に感染させ、4日間後の培養上清から組換えウイルスを回収した。ウイルス膜上でのOATP-C発現は抗His抗体を用いたウエスタン解析で確認した。
【００６８】
2. OATP-C機能解析
[3H]エストロン硫酸抱合体を終濃度10nMになるようにHBSS（pH7.4）で希釈し、基質溶液とした。ウイルス溶液20μL（50μg蛋白）を37℃で30分間プレインキュベートし、予め37℃で加温していた基質溶液を180μL添加し、反応を開始させた。1分後、氷冷していたHBSS（pH7.4）（以下、反応停止液と略す）を1mL添加して、反応を停止させた。直ちにウイルスを含む反応液を混合セルロース膜フィルターを用いて吸引濾過し、5mLの反応停止液で2回洗浄した。膜フィルターを液体シンチレーターバイアルに移し、クリアゾルIを5mL添加してフィルターを溶解させた。溶解後、液体シンチレーションカウンターでフィルター上の放射能を計測した。基質溶液を添加する前に反応停止液を添加して同様の操作を行い、フィルターへの非特異的吸着を計測し、各実験の数値から差し引いた。
【００６９】
N末端にHis-tagを付加した3種類のOATP-C発現ウイルスでの[3H]エストロン硫酸抱合体の取り込み活性を図3に示した。OATP-Cを発現していない野生型ウイルスに比べて、OATP-C野生型、N130D、V174Aでそれぞれ約57倍、41倍、36倍の活性比で[3H]エストロン硫酸抱合体の取り込み活性を検出することができた。また、野生型ウイルスでの取り込み試験から、ウイルスに由来する内因性OATP-C活性はほとんど検出されなかった。このことから、出芽バキュロウイルス発現系はバックグラウンドが極めて低い評価系であることが明らかとなった。また、OATP-C変異体（N130D、V174A）のウイルス膜上への機能発現が可能であることから、SNPsによる基質特異性の変化も測定でき、テーラーメイド医療への応用が可能である。
【００７０】
[実施例４]  PepT1機能阻害抗体の探索
[14C]グリシルザルコシンを終濃度50μMになるようにHBSS（pH6.0）で希釈し、基質溶液とした。また、ヒトPepT1の細胞外領域を認識するマウス型モノクローナル抗体を終濃度200μg/mLになるようにPBSで希釈し、抗体溶液とした。N末端にHis-tagを付加したPepT1発現出芽バキュロウイルス溶液20μL（50μg蛋白）と抗体溶液20μLを混合し、37℃で1時間プレインキュベートした。予め、37℃で加温していた基質溶液160μLをウイルス溶液に添加し、反応を開始させた。1分後、氷冷していたHBSS（pH7.4）（以下、「反応停止液」と略す）を1mL添加し、反応を停止させた。直ちにウイルスを含む反応液を混合セルロース膜フィルターを用いて吸引濾過し、5 mLの反応停止液で2回洗浄した。膜フィルターを液体シンチレーションバイアルに移し、クリアゾルＩを5 mL添加してフィルターを溶解させた。溶解後、液体シンチレーションカウンターでフィルター上の放射能を計測した。基質溶液を添加する前に反応停止液を添加して同様の操作を行い、フィルターへの非特異的吸着を計測し、各実験の数値から差し引いた。
【００７１】
抗ヒトPepT1モノクローナル抗体によるPepT1活性阻害を図４に示した。抗体非存在下でのPepT1活性を対照として100で表した。3種類の抗ヒトPepT1モノクローナル抗体の中で、対照に比べてクローン119で約20%、クローン253で約10%のPepT1活性を阻害した。このPepT1活性阻害は統計的（Studentのｔ検定）に有意であった。以上より、発芽バキュロウイルス発現系は、トランスポーターの活性を阻害あるいは促進する物質の探索に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により提供されるトランスポーター活性を有するトランスポーターを発現しているウイルスを用いることにより、従来よりも低いバックグラウンドでトランスポーターの活性を高感度で測定することができる。従って、本方法を採用することによりトランスポーターの輸送基質の同定、駆動力の同定、及びキネティクス解析等の機能解析を従来と比べ、より簡便に、そして正確に行えると期待される。また、該ウイルスを用いてウイルス膜上に発現されるトランスポーターのトランスポート活性を阻害または促進する物質のスクリーニングを行うことも可能である。トランスポーターは細胞内への薬剤の輸送にも関与していることが報告されていることから、疾患に関連するトランスポーターの活性を阻害または促進する物質は、新しい医薬品の候補となり得る。また、本方法をトランスポーターをコードする遺伝子におけるSNPs解析に用いることにより、トランスポーターのSNPsによる機能変化をより広範な基質について測定でき、各個体についての薬物への応答を解析できることから、テーラーメイド医療への応用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月23日(2009.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスポーターをコードする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される出芽バキュロウイルス膜上にトランスポーターを発現させることを特徴とする、トランスポーター活性を有するトランスポーターを発現させる方法。
【請求項２】
トランスポーターが非ウイルス由来である請求項１記載の方法。
【請求項３】
トランスポーターが有機アニオントランスポーターである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
有機アニオントランスポーターがOATP-Cである請求項３記載の方法。
【請求項５】
バキュロウイルス膜上でトランスポーターを発現させることを特徴とする、トランスポーターの活性測定方法。
【請求項６】
トランスポーターが有機アニオントランスポーターである請求項５記載の方法。
【請求項７】
有機アニオントランスポーターがOATP-Cである請求項６記載の方法。
【請求項８】
以下の工程を含むトランスポーターのトランスポート活性を阻害又は促進する物質のスクリーニング方法。
(a)バキュロウイルス膜上にトランスポーターを発現させる工程、
(b)該トランスポーターに被験物質を接触させる工程、及び
(c)トランスポート活性を阻害又は促進する物質を選択する工程
【請求項９】
トランスポーターが非ウイルス由来である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
トランスポーターが有機アニオントランスポーターである、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
有機アニオントランスポーターがOATP-Cである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスが担体に固定されていることを特徴とする請求項８〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスの担体への固定が、ウイルス膜上に発現している膜タンパク質に対する抗体を介して行われていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスの担体への固定が、ウイルス膜上に発現しているタンパク質をビオチン化することでビオチン・ストレプトアビジン反応を介して行われることを特徴とする請求項１２記載の方法。