(57)【要約】【課題】従来の血管新生抑制作用を有する物質は、血管新生病の予防または治療に有効であるが、副作用という点を鑑みると人体に対する安全性が必ずしも保証されていないことが問題であった。また、従来の食品由来物質では血管新生抑制作用が十分とはいえず、さらなる食品由来物質が求められていた。【解決手段】本発明の血管新生抑制剤は、カルノシン酸を含有する、より好ましくはカルノシン酸のみからなる血管新生抑制剤であることを特徴とする。本発明は、人体に対する安全性が高く、生産コストも従来の血管新生抑制剤と比較して安価であるため、長期的な投与・接種を行いやすい。したがって、本発明によれば、従来の問題を克服した、人体に対して安全性が極めて高く、安価な血管新生抑制剤を提供することができる。【選択図】図１
2010090036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルノシン酸を有効成分として含有する血管新生抑制剤
【請求項２】
カルノシン酸のみを有効成分として含有する血管新生抑制剤
【請求項３】
請求項１又は２に記載の血管新生抑制剤を用いて血管新生に起因する疾患を治療する方  法
【請求項４】
血管新生に起因する疾患が悪性腫瘍であることを特徴とする、請求項３に記載の方法
【請求項５】
血管内皮細胞の遊走あるいは増殖を抑制することを特徴とする、請求項３又は４に記載  の方法
【請求項６】
経口投与、血管投与、皮下投与、直腸投与、塗布、ドラッグデリバリーシステムのいず  れか１つ以上の方法を用いて、前記血管新生抑制剤を投与することを特徴とする、請求  項３ないしは５に記載の方法
【請求項７】
請求項１又は２に記載の血管新生抑制剤を含有する健康食品
【請求項８】
請求項１又は２に記載の血管新生抑制剤を含有する化粧用組成物
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管新生関連病を予防および治療するための、カルノシン酸を有効成分とする血管新生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
地中海沿岸地方原産の常緑性低木でありシソ科に属するハーブ「ローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆ ｆｉｃｉｎａｌｉｓ）」、および「セージ（Ｓａｌｖｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）」から抽出されるカルノシン酸には、神経細胞の維持に重要な役割を果たす神経成長因子の生成を高める効果があることが報告されている。さらに、カルノシン酸を投与することによって、脳梗塞による脳組織の壊死を予防、および神経突起の伸長を促進することができることも確認されており、アルツハイマー型痴呆症、パーキンソン病等の脳機能障害性疾患への効果が期待されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）。そのため、これまでにローズマリーおよびセージ抽出液、特にカルノシン酸の神経細胞維持・成長効果は数多く研究されてきた。
【０００３】
一方で、カルノシン酸に関する研究は数多くなされているにもかかわらず、ローズマリーおよびセージ抽出液、中でもカルノシン酸が血管新生抑制作用を有することを報告した文献はこれまでにいっさい見当たらない。これは、血管内皮細胞の成長を抑制する効果である血管新生抑制作用と、上記した神経細胞の維持・成長効果とは全く逆の効果であることから、血管新生抑制効果を見出すことが困難であったことを示している。
【０００４】
また、以前カルノシン酸の誘導体であるＰＣＡ（ｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ｃａｒｎｏｓｉｃ ａｃｉｄ）に血管新生抑制作用があることが報告されている（非特許文献２）が、例え誘導体であっても、構造が異なると生理的作用が全く異なる例は多数ある。つまり、誘導体で得られた効果が、基本となる物質でも得られるとは限らない。因みに、ＰＣＡは少ないながら細胞毒性を有することが同時に報告されているため、血管新生抑制剤として人体へ投与することは難しい。
【０００５】
また、ローズマリーおよびセージは古来より西洋ハーブとして薬用、香料用、料理用など広範な用途に使用されており、人体に対して安全性の高い植物であることが知られている。さらに、カルノシン酸を主要成分として含有するローズマリー抽出液は、既にダイエタリー・サプリメント食品として販売されている。そのため、カルノシン酸の経口投与時における人体への安全性は確認されている。
【０００６】
ところで、上記した血管新生現象とは、既存の血管から新たな血管枝が作られ、血管網を構築する生理的現象である。本現象は、女性性周期や皮膚の創傷治癒過程等に重要な役割を担っており、生体にとって必要な生理的現象であるが、一方で血管新生病と呼ばれる多くの疾患の進行にも重要な役割を果たしている。血管新生病には、腫瘍またはガンの増殖・転移の他、失明の原因である糖尿病性網膜症や加齢性黄斑変性症、さらに乾癬、関節リウマチに代表される慢性炎症疾患などが該当する。
【０００７】
上記疾患において、血管新生は病変組織の増殖・転移に必要となる栄養を供給するために必要な現象である。逆にいえば、血管新生を抑制することにより、上記疾患の予防・治療が可能となると考えられる。
【０００８】
また、研究段階ではあるが、疾患以外にも血管新生としわの形成（非特許文献３）、血管新生と肥満（非特許文献４）が関連していることが報告されており、血管新生抑制剤が血管新生病のみならず、美容、メタボリック・シンドロームの予防にも効果があることが示唆されている。
【０００９】
血管新生においては、さまざまな促進及び抑制因子が知られている。促進因子としては
血管内皮増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、腫瘍壊死因子（TNF-α）やインターロイキン-8（IL-8）などのサイトカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP） などのプロテアーゼなどが挙げられる。一方、抑制因子としては、インターフェロンα／β（IFN-α/β）やインターロイキン-12（IL-12）、形質転換増殖因子-β（TGF-β）などのサイトカイン、インターフェロンインデューシブルプロテイン-10（IP-10）、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター（PAI）などのタンパク質が挙げられる。
【００１０】
上記の血管新生促進因子及び抑制因子が複雑に作用し合うことにより、血管新生プロセスは進行する。血管新生プロセスは以下の４ステップからなる。１）がんや間質から産生される血管新生促進因子によって血管新生のスイッチが入る、２）MMPやプラスミノーゲンアクチベータの関与により血管内皮細胞下の基底膜が消化される、３）血管内皮細胞が遊走・増殖する、４）血管内皮細胞が管腔を形成する。
【００１１】
通常では促進因子より抑制因子の方が強く発現しているが、がんなどの血管新生病の場合には、促進因子の発現が抑制因子の発現を上回ることが知られている。従って、血管新生抑制因子を生体に投与し、血管新生を抑制することが血管新生病に対する治療法として期待されている。その場合、血管新生抑制機能としては、上記した４ステップの内いずれか、あるいは複数を抑制しても良いと考えられる。
【００１２】
血管新生抑制剤としては、現在までに、アンギオスタチン（非特許文献５及び６）、エンドスタチン（非特許文献７）、アスペルギルス・フミガトゥス （Aspergillus fumigatus）に由来するフマギリン（fumagillin）及びその合成誘導体であるTNP-470（非特許文献８）、サイトジェニン（非特許文献９）、メタロプロテアーゼ阻害薬であるバチマスタット（BB-94）及びマリマスタット（BB-2516）（非特許文献１０及び１１）などの合成化学物質、並びに血管新生因子（EGF、TGF-α、VEGFなど）とそれらに対応するレセプターの結合を阻害するモノクローナル抗体（非特許文献１２）が知られている。しかしながら、これらの物質においては副作用を考慮する必要があり、容易には使用できないという欠点が存在する。
【００１３】
そこで、副作用の問題を解決するため、食品由来の物質から血管新生抑制作用を有する物質を探す試みが行われてきた。例えば、サメ軟骨（非特許文献１３）、緑茶成分であるエピガロカテキン（EGC）やエピガロカテキンガレート（EGCG）（非特許文献１４）、大豆のイソフラボンの一種であるゲニステイン（非特許文献１５及び１６）などに、血管新生抑制作用が存在することが報告された。さらに、リコペンとカルノシン酸の混合物に血管新生抑制効果があることが報告されている（特許文献３）。しかし、当該文献においては、リコペンが主要な物質であり、カルノシン酸は他の数多くの物質により代替可能であると記載されているため、カルノシン酸そのものに血管新生抑制剤があることを示したものではない。
【非特許文献１】Takumi Satoh,et.al. Carnosic acid protects neuronal HT22 Cells through activation of the antioxidant-resposive element in free carboxylic acid- and catechol hydroxyl moieties-dependent manners.,Neuroscience Letters,2008,434,p260-265
【非特許文献２】Bertl E, et al., Inhibition of endothelial cell functions by novel potential cancer chmopreventive agents.,Biochemical and Biophysical Research Communications,2004,325,p287-295
【非特許文献３】K.Yano, et al. Targeted overexpression of the angiogenesisinhibitor thrombospondin-1 in the epidermis of transgenic mice prevents ultraviolet-B-induced angiogenesis and cutaneous photo-damage.,THE JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY,2002,118(5),p800-5.
【非特許文献４】M.A.Rupnick, et al. Adipose tissue mass can be regulatedthrough the vasculature.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,2002,99(16),p10730-5.
【非特許文献５】M.S. O'Reilly, et al., Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice.,Nature Medicine, 1996, 2,p689-692
【非特許文献６】B.K. Sim, et al., A recombinant human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer,Cancer Reseach., 1997, 57,p1329-1334
【非特許文献７】M.S. O'Reilly, et al., Endostatin: an endogenous inhibitorof angiogenesis and tumor growth.,Cell,1997, 88,p277-285
【非特許文献８】D.Ingber, et al., Synthetic analogues of fumagillin thatinhibit angiogenesis and suppress tumour growth.,Nature,1990,348,p555-557
【非特許文献９】T.Oikawa, et al., Effects of cytogenin,a novel microbial product,on embryonic and tumor cell-induced angiogenic responses in vivo.,Anticancer Reseach,1997,17,p1881-1886
【非特許文献１０】G.Taraboletti, et al., Inhibition of Angiogenesis and Murine Hemangioma Growth by Batimastat, a Synthetic Inhibitor of Matrix Metalloproteinases,Journal of National Cancer Institute.,1995,87,p293-298
【非特許文献１１】Marimastat: BB 2516, TA 2516.,Drugs in R&D,2003,4(3),p198-203.
【非特許文献１２】S.Iqbal and H.J.Lenz, Integration of novel agents in the treatment of colorectal cancer.,  HYPERLINK "http://www.ingentaconnect.com/content/klu/280" \o "Cancer Chemotherapy and Pharmacology" Cancer Chemotherapy and Pharmacology,2004, 54 Suppl.1,pS32-39
【非特許文献１３】Y.AKIKUNI, Evaluation of the Effectiveness of Fork-Medicine Like Foods. Role of Angiogenesis Inhibitor in Novel Immunotherapy for Cancer (NITC).,Biotherapy,2000,14(10),p973-982
【非特許文献１４】Y.Cao and R.Cao, Angiogenesis inhibited by drinking tea., Nature, 1999,398,p381
【非特許文献１５】T. Fotsis, et al., Genistein, a Dietary-Derived Inhibitor of in vitro Angiogenesis.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1993,90,p2690-2694
【非特許文献１６】三浦健人ら, 製品図解 天然抗腫瘍物質GCPの開発., New Food Industry, 2001,43(3),p17-22
【特許文献１】特開２００７-２３０９４５号公報
【特許文献２】特開２００７-２３０９４６号公報
【特許文献３】特開２００５-５２６７１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記した血管新生抑制作用を持つ化合物は、血管新生病の予防または治療に有効であると考えられるが、副作用という点を鑑みると、人体に対する安全性が必ずしも保証されていないことが問題であった。
【００１５】
また、従来の食品由来物質では血管新生抑制作用が十分とはいえず、また、長期的な摂取を行うには価格が高いこともあり、さらなる食品由来物質が求められている。本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、優れた血管新生抑制作用を有する有効成分を見出し、血管新生抑制剤として提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、カルノシン酸に新規に血管新生抑制作用を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、カルノシン酸を有効成分として含有する血管新生抑制剤又はカルノシン酸のみを有効成分として含有する血管新生抑制剤に関する。
【００１８】
さらに、本発明は、上記血管新生抑制剤を用いて、血管新生に起因する疾患、中でも悪性腫瘍について治療する方法であって、特に血管内皮細胞の遊走、あるいは増殖を抑制することを特徴とする治療方法に関する。さらに、生体への投与方法は、特に限定はされないが、経口投与、血管投与、皮下投与、直腸投与、塗布、ドラッグデリバリーシステムのいずれか1つ以上の投与方法を用いることが好ましい。
【００１９】
また、本発明は、上記した血管新生抑制剤を含有する健康食品、及び化粧用組成物に関する。
【発明の効果】
【００２０】
カルノシン酸はローズマリーおよびセージから抽出される物質であり、さらに既にダイエタリー・サプリメントとして販売されていることから、人体に対する安全性、とりわけ経口投与時の安全性は確認されている。加えて、コストも従来の血管新生抑制剤と比較して安価であり、長期的な投与、摂取が可能である。
【００２１】
したがって本発明によれば、従来の問題を克服した、人体に対して安全性が極めて高く、価格の低い血管新生抑制剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。
【００２３】
本発明の血管新生抑制剤は、有効成分としてカルノシン酸を含有する、より好ましくはカルノシン酸のみを含有する。カルノシン酸は種々の天然物から抽出したもの、化学的に合成したもの、市販されているもののいずれでもよい。
【００２４】
例えば、ローズマリーおよび/またはセージからカルノシン酸を抽出する場合、用いる対象植物の部位は特に限定されず、根、茎、葉、葉柄、枝、花、または全草、あるいはこれらの組み合わせのいずれを用いてもよい。本発明においては、特に限定されないが好ましくは葉を用いる。また、上記植物は生の状態のもの、あるいは当業者に周知の方法で乾燥されたもののいずれを用いてもよい。
【００２５】
本発明に用いられる抽出物とは、上記植物を、水、極性または非極性の溶媒、あるいはこれらの混合物を抽出溶媒として用いて、適切な条件で抽出された抽出物を意味する。
【００２６】
本発明に用いられるローズマリーおよび/またはセージの抽出物は、例えば以下のように得ることができる。まず、ローズマリーおよび/またはセージの所定部位を抽出溶媒に浸漬する。抽出溶媒の量は、対象植物が浸漬し得る量であれば、特に限定はされないが、対象植物の重量に対して２倍量から１００倍量の割合の抽出溶媒が好ましい。使用され得る抽出溶媒の種類としては、特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノールのような低級アルコール類、アセトン等のケトン類、酢酸エチル等のエステル類、エーテル類、クロロホルム、およびジクロロメタンのような有機溶媒、ならびに水が挙げられる。これらは単独または組み合わせて用いられる。本発明においてはメタノール、エタノール、酢酸エチル、またはこれら溶媒と水との組合わせが好ましく、さらに生体への投与を考慮すると、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒といった毒性が低い溶媒がさらに好ましい。対象植物の浸漬時間は、各種条件によって変動し得るため、特に限定されず、当業者により適切に設定され得る。また、抽出温度も各種条件により変動し得るため、特に限定されず、当業者により適切に設定され得る。
【００２７】
上記浸漬後、得られた抽出物はそのまま用いてもよいが、必要に応じて水分を蒸発させた乾固物またはペースト状の形態で用いてもよい。また、カルノシン酸を精製するために、必要に応じて当業者が通常用いる手段（例えば、各種クロマトグラフィー）を用いて、生成して用いてもよい。
【００２８】
本発明の血管新生抑制剤を用いる血管新生に起因する疾患、特に悪性腫瘍の治療方法については、下記の４ステップにわたる血管新生プロセス、１）がんや間質から産生される血管新生促進因子によって血管新生のスイッチが入る、２）MMPやプラスミノーゲンアクチベータの関与により血管内皮細胞下の基底膜が消化される、３）血管内皮細胞が遊走・増殖する、４）血管内皮細胞が管腔を形成する、の内いずれか、あるいは複数を抑制しても良いが、特に上記した３）血管内皮細胞が遊走・増殖する点について強く抑制することを特徴とする。上記治療方法における生体への投与方法としては、治療方法により条件が変更されるため特に限定はされないが、経口投与、血管投与、皮下投与、直腸投与、塗布、ドラッグデリバリーシステムのいずれかの方法、あるいはいずれか1つ以上の投与方法を組み合わせた方法を用いることが好ましい。
【００２９】
さらに、本発明の血管新生抑制剤は適用の仕方に応じて、種々の形態をとることができる。例えば、本発明の血管新生抑制剤が医薬品組成物として用いられる場合、その投与剤形は特に限定されず、日本薬局法に記載の方法に従って適切な剤形に加工される。投与剤形のより具体的な例としては、経口投与を目的とする医薬品組成物の場合、カプセル剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、細粒剤、徐放剤などの剤形が挙げられ、一方非経口投与を目的とする医薬品組成物の場合、静脈注射、輸液剤などの血管投与、あるいは皮下注射などの皮下投与を目的とした注射剤、軟膏等の塗布剤、直腸投与のための坐剤などの剤形が挙げられる。さらに、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を用いた投与においては、ナノカプセル等のナノ粒子も挙げられる。投与量は、対象となる者の体重や投与形態等の条件によって容易に変動し得るため、当業者によって適宜選択されうるが、例えば、ＤＤＳを用いた投与では、標的とする疾患部位、あるいは細胞群が存在する領域のカルノシン酸濃度が、１０ μM 〜 １００μM、好ましくは５０ μM 〜１００ μMであることが望ましい。
【００３０】
上記した医薬品組成物としての実施においては、当業者に周知の方法によって上記形態に加工されたのち、第３成分として、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油などの希釈剤が混合されていてもよい。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤などが混合されていてもよい。
【００３１】
別の例として、本発明の血管新生抑制剤が健康食品として用いられる場合、その形態は固形食品に限定されず、飲料（例えば、液体飲料）のようなものを含有する。より具体的には、液状、ペースト状、固形状等の形態でなるサプリメント（カプセル等の形態）、清涼飲料、シロップ類、口中清涼剤、ゼリーなどが挙げられるが特にこれらに限定されない。本発明の血管新生抑制剤を含有するこのような健康食品は、当業者に周知の方法を用いて製造され得る。
【００３２】
さらに別の例として、本発明の血管新生抑制剤が化粧用組成物として用いられる場合、その形態としては、ローション、乳液、クリーム、パウダーなどが挙げられるが、特にこれらに限定はされない。このような化粧用組成物は、当業者に公知の手法を用いて製造され得る。
【００３３】
また、上記したとおり、本発明の血管新生抑制剤はその実施形態に応じて当該分野で通常用いる方法によって製造され、その形態に応じた方法で適宜適量を摂取、また適用することができる。
【実施例】
【００３４】
以下に、実施例に基づいて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定
されるものではない。
【００３５】
実施例１〔ラット動脈片を用いた血管新生測定系での評価〕使用サンプルであるカルノシン酸はｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅに溶解して用いた。ラットはＷｉｓｔａｒ系の雄で、６週齢から８週齢のものを日本チャールスリバーより購入して使用した。コラーゲン原液（ＣＥＬＬＭＡＴＲＩＸ ｔｙｐｅ Ｉａ）及び再構成緩衝液は新田ゼラチンより購入した。培養液１０×Ｅａｇｌｅ'ｓ ＭＥＭ及びＲＰＭＩ １６４０はＧｉｂｃｏ社より購入した。ＩＴＳ＋はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社より購入した。
【００３６】
コラーゲン溶液は、コラーゲン原液、１０×Ｅａｇｌｅ'ｓ ＭＥＭ培地、そして再構成緩衝液を８：１：１で混合して調製し、４℃で保存した。
【００３７】
カルノシン酸の血管新生への影響は、ラット動脈片をコラーゲンゲル中で培養する血管新生測定系で評価した。Ｗｉｓｔａｒラットをジエチルエーテルにより麻酔し、右大腿動脈切断により出血死させた後、胸部大動脈を取り出し１〜１．５ｍｍの長さに切断した。この動脈片を６ウェル培養プレートに移し、コラーゲンゲル溶液で包埋し、３７℃でゲル化させた。ゲル化後、１％ＩＴＳ＋を含むＲＰＭＩ １６４０培地を２ｍｌ加え、更にサンプル溶液を培養液に加えた。培養はＣＯ2インキュベーター中で行い、７日目に動脈片より生じる微小血管網を倒立顕微鏡下で撮影し、画像をコンピューターに取り込んだ後、微小血管の長さを測定した。
【００３８】
図１には微小血管網を顕微鏡下で撮影した写真を示す。カルノシン酸非存在下（Control）で培養したサンプルでは微小血管の形成が観察されたが、１００μＭカルノシン酸存在下では完全に微小血管の形成が抑制された。
【００３９】
図２には培養７日目における微小血管長をカルノシン酸濃度毎に比較したグラフを示す。本結果から、カルノシン酸の濃度が５０μＭで微小血管の形成が有意に抑制され、１００μＭでは微小血管の形成を完全に抑制されることが示された。
【００４０】
実施例２〔再構成基底膜上でのヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の管腔形成に対するカルノシン酸の影響〕
使用サンプルであるカルノシン酸はｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅに溶解して用いた。ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はクラボウより購入し、３から７継代したものを使用した。再構成基底膜ゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ ＴＭ）はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社より購入した。
【００４１】
ＨＵＶＥＣをＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２培地（クラボウ）に１×１０5 ｃｅｌｌｓ/ｍｌになるように調整した。９６−ｗｅｌｌ培養プレートのウェルに５０μlの再構成基底膜ゲルを加え、ＣＯ2インキュベーター中で1時間ゲル化させた。再構成基底膜ゲル上に各濃度のカルノシン酸を含むＨＵＶＥＣ懸濁液１００μlを加え、ＣＯ2インキュベーター中で１２時間培養を行った。ＨＵＶＥＣによる管腔形成の状態を光学顕微鏡で観察し、管腔の長さを計測した。
【００４２】
図３にはＨＵＶＥＣを再構成基底膜ゲル状に撒き１２時間培養した結果を示す。カルノシン酸非存在下（Ｃｏｎｔｒｏｌ）では管腔形成が観察されたが、５０μＭカルノシン酸存在下では管腔形成が強く抑制された。
【００４３】
図４はカルノシン酸濃度毎の管腔長の長さを示すグラフである。本結果から、カルノシン酸の濃度が５０μＭで管腔形成が有意に抑制され、１００μＭでは管腔形成が完全に抑制されることが示された。
【００４４】
実施例３〔ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖に対するカルノシン酸の影響〕
使用サンプルであるカルノシン酸はｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅに溶解して用いた。ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はクラボウより購入し、３から７継代したものを使用した。ＨＵＶＥＣをＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２培地（クラボウ）に１．５×１０4 ｃｅｌｌｓ/ｍｌになるように調整した。９６−ｗｅｌｌ培養プレートのウェルに各濃度のカルノシン酸を含むＨＵＶＥＣ懸濁液１００ μlを加え、ＣＯ2インキュベーター中で７２時間培養を行った。その後、全ての培地をＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２培地に交換し、１時間 ＣＯ2インキュベーター中で培養を行った。各ウェルにＷＳＴ−１試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ）１０ μlを加え、ＣＯ2インキュベーター中で４時間培養した後、４５０ ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定することにより、生細胞数を比較検討した。
【００４５】
図５は、カルノシン酸濃度毎の、４５０ ｎｍでの吸光度の強さ示すグラフである。すなわち、本グラフはカルノシン酸非存在下において増殖した細胞数を１００として、各濃度のカルノシン酸存在下において、増殖した細胞数の割合を比較した結果である。本結果より、１０ μＭ以上のカルノシン酸存在下においては、ＨＵＶＥＣの増殖が有意に抑制されることが示された。
【００４６】
実施例４〔ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の遊走に対するカルノシン酸の影響〕
使用サンプルであるカルノシン酸はｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅに溶解して用いた。ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はクラボウより購入し、３から７継代したものを使用した。２４−ｗｅｌｌインサート（８ μｍポアサイズ）はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社より購入した。
【００４７】
ＨＵＶＥＣを０．１ ％牛血清アルブミンを含むＭｅｄｉｕｍ １９９（インビトロジェン）培地（培地Ａ）に２．５ ×１０5 ｃｅｌｌｓ/ｍｌになるように調整した。２４−ｗｅｌｌ培養プレートのウェルに４００ μlの培地を加えた。用意した培地は培地Ａ、培地Ａに１０ ｎｇ/ｍｌのＶＥＧＦおよび各濃度のカルノシン酸を含むものである。２４−ｗｅｌｌインサートに４００ μlのＨＵＶＥＣ懸濁液を加え、各ウェルに入れた。培養はＣＯ2インキュベーター中で６時間行った。インサート上面の膜に残っているＨＵＶＥＣを綿棒で取り除き、膜の裏面に移動したＨＵＶＥＣを固定・染色後、光学顕微鏡で観察し、移動したＨＵＶＥＣ数を計測した。
【００４８】
図６は、６時間培養後にフィルターの裏側に移動して来たＨＵＶＥＣ数を、光学顕微鏡下（２００倍）において任意の５点で数えた結果を示すグラフである。本結果より、１０μＭ以上のカルノシン酸を作用させることで、ＨＵＶＥＣの遊走を有意に抑制することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
上記に説示したように、本発明は、人体に対する安全性、とりわけ経口投与時の安全性が確認されている。さらに、生産コストも従来の血管新生抑制剤と比較して安価であるという経済的にも優れた効果を有するため、長期的な投与・接種を可能とするという特徴を有する。したがって、本発明によれば、従来の問題を克服した、人体に対して安全性が極めて高く、安価な血管新生抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ラット動脈片を用いる血管新生測定系でのカルノシン酸の影響。カルノシン酸非存在下（ｃｏｎｔｒｏｌ）では微小血管の成長が見られる。一方、カルノシン酸存在下 （１００ μＭ）では完全に微小血管の形成が抑制された。培養７日目。
【図２】ラット動脈片を用いる血管新生測定系でのカルノシン酸の影響。培養７日目での微小血管長の比較した結果。値は平均 ± 標準偏差 (ｎ＝６)。＊；対象との有意差があるもの (ｐ＜０．０１)
【図３】再構成基底膜上でのヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の管腔形成に対するカルノシン酸の影響。ＨＵＶＥＣを再構成基底膜ゲル上に播種し１２ｈ培養した結果。
【図４】再構成基底膜上でのヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の管腔形成に対するカルノシン酸の影響。管腔の長さを測定し比較した結果。値は平均 ± 標準偏差 (ｎ＝３−４)。＊：対象に比べ有意差があるもの（ｐ＜０．０１）。
【図５】カルノシン酸のヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖への影響。０−１００ μＭのカルノシン酸とＨＵＶＥＣを７２ｈ培養後、ＷＳＴ−１試薬を加え４５０ ｎｍでの吸光度を測定した。カルノシン酸非存在下における吸光度を１００ パーセントとして計算した。値は平均 ± 標準偏差 （ｎ＝６）。＊：対象に比べ有意差があるもの（ｐ＜０．０１）
【図６】カルノシン酸のＨＵＶＥＣ遊走への影響。６時間培養後にフィルターの裏側に移動して来たＨＵＶＥＣ数を光学顕微鏡下（２００倍）で任意の５点で数えた。値は平均 ± 標準偏差 （ｎ＝３）。ＮＣ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）；ＶＥＧＦおよびカルノシン酸非存在条件。ＰＣ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）；ＶＥＧＦ存在下でカルノシン酸は非存在条件。＊：対象に比べ有意差があるもの（ｐ＜０．０１）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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