(57)【要約】      （修正有）【課題】ｍGluRサブタイプ、特にｍGluR5に高い選択性を示す新規で強力なアゴニストの提供。【解決手段】式（III)で示される化合物並びにその医薬的に許容可能な塩。2010013476.tif 000026mGluR5受容体−媒介疾患に有用であり、例えば胃食道逆流性疾患、IBS、機能性消化不良、咳、肥満、アルツハイマー病、老年性認知症、AIDSによる認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、偏頭痛、てんかん、統合失調症、うつ、不安神経症、急性不安神経症、強迫神経症、眼科疾患、たとえば網膜症、糖尿病性網膜症、緑内障、聴覚神経症、たとえば耳鳴り、化学療法による神経障害、ヘルペス後神経痛及び三叉神経痛、耐性、依存症、中毒性障害、及び欲求障害、神経発達障害、たとえば脆弱X、自閉症、精神発達遅滞、統合失調症及びダウン症、偏頭痛に関連する痛み、等に有効である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式III：
【化１】
2010013476.tif 000025
の化合物並びにその医薬的に許容可能な塩。
【請求項２】
結晶形である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
薬理学的且つ医薬的に許容可能な担体と一緒に、活性成分として請求項１又は２に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項４】
mGluR5受容体−媒介疾患の処置用薬剤の製造のための、請求項１又は２に記載の化合物の使用。
【請求項５】
前記疾患が神経障害である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記疾患が精神疾患である、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記疾患が、胃食道逆流性疾患、IBS、機能性消化不良、咳、肥満、アルツハイマー病、老年性認知症、AIDSによる認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、偏頭痛、てんかん、統合失調症、うつ、不安神経症、急性不安神経症、強迫神経症、眼科疾患、たとえば網膜症、糖尿病性網膜症、緑内障、聴覚神経症、たとえば耳鳴り、化学療法による神経障害、ヘルペス後神経痛及び三叉神経痛、耐性、依存症、中毒性障害、及び欲求障害、神経発達障害、たとえば脆弱X、自閉症、精神発達遅滞、統合失調症及びダウン症、偏頭痛に関連する痛み、炎症性痛覚、神経障害性疼痛、たとえば糖尿病性神経障害、関節炎及びリウマチ性疾患、腰痛、手術後疼痛、種々の症状に伴う疼痛であって狭心症、腎性または胆石疝痛、月経、偏頭痛及び痛風などに伴うもの；卒中、頭部外傷、酸素欠乏障害及び虚血性傷害、低血糖症、循環器疾患及びてんかんのいずれか一つである、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記疾患が慢性疼痛性障害である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記疾患が急性疼痛性障害である、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
前記疾患が不安神経症である、請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
前記疾患がうつである、請求項７に記載の使用。
【請求項１２】
前記疼痛性障害が神経因性疼痛である、請求項７に記載の使用。
【請求項１３】
前記疼痛性障害が偏頭痛である、請求項７に記載の使用。
【請求項１４】
前記疼痛性障害が炎症性痛覚である、請求項７に記載の使用。
【請求項１５】
前記疾患が胃食道逆流性疾患である、請求項７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物、治療におけるそれらの使用、及び前記新規化合物を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸塩は、哺乳類の中枢神経系(CNC)における主な興奮性神経伝達物質である
。グルタミン酸塩は、細胞表面の受容体に結合し、それによって細胞表面の受容体を活性化することにより、中枢神経にその作用をもたらす。これらの受容体は、受容体タンパク質の構造的特徴、受容体がシグナルを細胞に変換する手段と、薬理学的プロフィールとをベースとして、イオンチャネル型受容体と代謝調節型受容体の主に二つの種類に分けられてきた。
【０００３】
代謝調節型グルタミン酸受容体(mGluR)は、グルタミン酸塩が結合した後、種々の細胞
内の第二のメッセンジャーシステムを活性化させるGタンパク質−結合受容体である。無
傷哺乳類ニューロン中のmGluRは、以下の応答の一つ以上を引き出す：ホスホリパーゼCの活性化；ホスホイノシチド(PI)加水分解の増加；細胞内カルシウム放出；ホスホリパーゼDの活性化；アデニルシクラーゼの活性化若しくは阻害；環状アデノシン一リン酸(cAMP)
の形成の増減；グアニルシクラーゼの活性化；環式グアノシン一リン酸(cGMP)の形成の増加；ホスホリパーゼA2の活性化；アラキドン酸放出の増加；並びに電圧−及びリガンド−結合イオンチャネルの活性化の増加または減少。Schoeppら、Trends  Pharmacol．Sci．14：13(1993)、Schoepp，Neurochem．Int．24：439(1994)、Pinら、Neuropharmacology  34：1(1995)、Bordi及びUgolini、Prog．Neurobiol．59：55(1999)。
【０００４】
モレキュラークローニングにより、８種類の独特のmGluRサブタイプが同定され、mGluR1〜mGluR8と名付けられた。Nakanishi、Neuron  13：1031(1994)、Pinら、Neuropharmacology  34：1(1995)、Knopfelら、J．Med．Chem．38：1417(1995)。さらなる受容体の多様性は、特定のｍGluRサブタイプの選択的スプライス形(alternatively  spliced  form)の発現により起きる。Pinら、PNAS  89：10331(1992)、Minakamiら、BBRC  199：1136(1994)、Jolyら、J．Neurosci、15：3970(1995)。
【０００５】
代謝型グルタミン酸受容体サブタイプは、アミノ酸配列相同性、受容体により使用される第二のメッセンジャーシステム及びその薬理学的特徴をベースとして、三つの群、グループI、グループIIとグループIIIのmGluRに分けることができる。グループI  mGluRはmGluR1、mGluR5とその選択的スプライス変異体から構成される。アゴニストのこれらの受容
体への結合によって、ホスホリパーゼCが活性化し、続いて細胞内カルシウムが可動化す
る。
【０００６】
〔神経疾患、精神疾患及び疼痛性障害〕
グループI  mGluRの生理学的役割を解明する試みでは、これらの受容体を活性化すると神経興奮を引き出すことを示唆してきた。種々の研究から、グループI  mGluRアゴニストは、海馬、大脳皮質、小脳及び視床、並びに他のCNS領域のニューロンに適用する際に、シ
ナプス後興奮を生成し得ることを示してきた。証拠は、この励起がシナプス後mGluRの直
接活性化によるものであることを示したが、シナプス前mGluRの活性化が起きて、神経伝
達物質の放出が増えることも示唆した。Baskys、Trends  Pharmacol．Sci．15：92(1992)、Schoepp、Neurochem．Int．24：439(1994)、Pinら、Neuropharmacology  34：1(1995)
、Watkinsら、Trends  Pharmacol．Sci．15：33(1994)。
【０００７】
代謝調節型グルタミン酸受容体は、哺乳類CNSの多くの正常過程に関与している。mGluRの活性化は、海馬の長期相乗作用と小脳の長期減衰の誘発に必要なことが示された。Bashirら、Nature  363：347(1993)、Bortolottoら、Nature  368：740(1994)、Aibaら、Cell
79：365(1994)、Aibaら、Cell  79：377(1994)。痛覚と無痛覚におけるmGluR活性化の
役割も示された。Mellerら、Neuroreport  4：879(1993)、Bordi及びUgolini、Brain  Res．871：223(1999)。さらにmGluR活性化は、シナプス伝達、神経発達、アポトーシスの神経細胞の死、シナプス可塑性、空間学習、嗅覚記憶、心臓活動の集中制御、歩行、運動制御及び前庭動眼反射の制御などの他の種々の通常過程で調節的役割を果たすと示唆されてきた。Nakanishi、Neuron  13：1031(1994)、Pinら、Neuropharmacology  34：1、Knopfelら、J．Med．Chem．38：1417(1995)。
【０００８】
さらにグループI代謝型グルタミン酸受容体及びmGluR5は特に、CNSに影響する種々の病態生理学的プロセス及び障害を担うと示唆されてきた。これらの例としては、卒中(stroke)、頭部外傷、酸素欠乏障害及び虚血性傷害、低血糖症、てんかん、神経変性障害、たとえばアルツハイマー病及び疼痛が挙げられる。Schoeppら、Trends  Pharmacol．Sci．14
：13(1993)、Cunninghamら、Life  Sci．54：135(1994)、Hollmanら、Ann．Rev．Neurosci．17：31(1994)、Pinら、Neuropharmacology  34：1(1995)、Knopfelら、J．Med．Chem
．38：1417(1995)、Spoorenら、Trends  Pharmacol．Sci．22：331(2001)、Gaspariniら
、Curr．Opin．Pharmacol．2：43(2002)、Neugebauer  Pain  98：1(2002)。これらの症
状のほとんどは、CNSニューロンの過剰グルタミン酸−誘導励起によると考えられている
。グループI  mGluRはシナプス後メカニズムと高いシナプス前グルタミン酸放出によりグルタミン酸−媒介ニューロン励起を高めるようなので、活性化するとおそらくその病変の一因となる。従って、グループI  mGluR受容体の選択的アゴニストは、とくに神経保護薬、鎮痛剤または抗痙攣薬として有用であろう。
【０００９】
一般的に代謝調節型グルタミン酸受容体、特にグループIの神経生理学的役割を解明す
る最近の進歩により、これらの受容体を急性および慢性の神経病学的および精神障害と慢性のおよび急性疼痛障害の治療において前途有望な薬剤の目標として確立してきた。
【００１０】
〔消化器疾患〕
下部食道括約筋(LES)は間欠的に弛緩する傾向がある。したがって、そのような時には機
械的バリヤが一時的に無くなるので、胃液は食道に入り込むことがある。そのような事象を以後「逆流」という。
【００１１】
胃食道逆流症(GERD)は、最もよく見られる上部消化管疾患である。現行の薬物療法では、胃液分泌を抑制するか、食道で酸を中和しようとしている。逆流の背後に隠れている主なメカニズムは、低張の下部食道括約筋に依存すると考えられてきている。しかしながら、たとえばHollowayとDent (1990) Gastroenterol． Clin．N．Amer． 19、517-535頁は
、殆どの逆流症状は、一時的な下部食道括約筋の弛緩(transient  lower  esophageal  sphincter  relaxations：TLESR)の間に発現しないことを示した。即ち、弛緩は嚥下が原
因ではない。また、通常、胃酸分泌はGERD患者では正常であることも判明している。
【００１２】
本発明の新規化合物は、一時的な下部食道括約筋弛緩(TLESR)の抑制と、下部食道逆流
症(gastro-esophageal  reflux  disorder：GERD)の処置に有用であると考えられる。
その生理学的及び病態生理学的重要性により、ｍGluRサブタイプ、特にグループIのｍGluR受容体サブタイプ、特にｍGluR5に高い選択性を示す、新規で強力なmGluRアゴニスト
及びアンタゴニストに対する需要がある。
【発明の開示】
【００１３】
本発明の目的は、代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)、特にmGluR5受容体で活性を示す
化合物を提供することである。
〔発明の詳細な説明〕
本発明の一つの態様は、式I：
【００１４】
【化１】
2010013476.tif 000002
【００１５】
の化合物、並びにその医薬的に許容可能な塩、水和物、イソ型及び／またはエナンチオマーを提供する。一態様において、式Iの化合物はR-エナンチオマーである。別の態様にお
いて、式Iの化合物はS-エナンチオマーである。
【００１６】
本発明のさらなる態様では、式II：
【００１７】
【化２】
2010013476.tif 000003
【００１８】
の化合物、並びにその医薬的に許容可能な塩、水和物及び／またはイソ型を提供する。
本発明の別の側面では、式III：
【００１９】
【化３】
2010013476.tif 000004
【００２０】
の化合物、並びにその医薬的に許容可能な塩、水和物及び／またはイソ型を提供する。
別の態様では、一種以上の医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤、及び／または不活性キャリヤと関連して、式I〜IIIの化合物の治療的有効量を活性成分として含む医薬組成物である。
【００２１】
以下、詳細に記載するように、他の態様は、治療、mGluR5媒介疾患の処置、mGluR5媒介疾患の処置用薬剤の製造において使用するための式I〜IIIの化合物に関する。
さらに別の態様は、式I〜IIIの化合物の治療的有効量を哺乳類に投与することを含む、mGluR5媒介疾患の処置法に関する。
【００２２】
別の態様では、ｍGlurR5受容体の活性化を阻害する方法であって、式I〜IIIの化合物の有効量で前記受容体を含む細胞を処置することを含む、前記方法を提供する。
本発明の化合物は、治療、特に神経疾患、精神疾患、疼痛及び消化器疾患の処置に有用である。
【００２３】
本発明の特定の化合物は、溶媒和形、たとえば水和形、並びに非溶媒和形で存在し得ることは当業者には理解されよう。本発明は、式I〜IIIの化合物のそのような全ての溶媒和形を包含することが理解されよう。
【００２４】
本発明の範囲には、式I〜IIIの化合物の塩も含まれる。通常、本発明の化合物の医薬的に許容可能な塩は、当業界で公知の標準的な手順を使用して、たとえば十分に塩基性の化合物、たとえばアルキルアミンと、好適な酸、たとえばHCl若しくは酢酸とを反応させて
、生理学的に許容可能なアニオンをもつ塩を生成することによって得る。好適な酸性プロトンをもつ本発明の化合物、たとえばカルボン酸若しくはフェノールを、アルカリ金属若しくはアルカリ土類金属の水酸化物若しくはアルコキシド(たとえばエトキシド若しくは
メトキシド)、または好適な塩基性有機アミン（たとえばコリン若しくはメグルミン）一
当量で水性媒体中で処理し、続いて慣用の精製手順によって、対応するアルカリ金属(た
とえばナトリウム、カリウム、若しくはリチウム)またはアルカリ土類金属（たとえばカ
ルシウム）塩にすることも可能である。さらに四級アンモニウム塩は、アルキル化剤を中性アミンに添加して製造することができる。
【００２５】
本発明の一態様において、式I〜IIIの化合物は、医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物、特に酸付加塩、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩またはp-トルエンスルホン酸塩に転換することができる。
【００２６】
本発明のさらなる態様において、式I-IIIの化合物は、スルホン酸、1,2-エタンジスル
ホン酸(両方とも１：１〜２：１として)、エタンスルホン酸、硝酸、2-メシチレンスルホン酸、1,5-ナフタレンジスルホン酸(両方とも１：１〜２：１として)またはp-キシレンスルホン酸で、その医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物に転換することができる。
【００２７】
医薬組成物
本発明の化合物は、医薬的に許容可能なキャリヤまたは賦形剤と関連して、式I〜IIIの化合物、またはその医薬的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含む慣用の医薬組成物に配合することができる。この医薬的に許容可能なキャリヤは固体でも液体であってもよい。固形製剤としては、粉末、錠剤、分散可能な粒子、カプセル、サシェ及び座剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
固体キャリヤは、希釈剤、フレーバー剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁化剤、バインダー、または錠剤崩壊剤としても作用し得る一種以上の物質であってもよい。固体キャリヤは封入剤であってもよい。
【００２９】
粉末の場合、キャリヤは微粉末固体であり、、本発明の微細粉末または活性成分と混合する。錠剤の場合、活性成分は好適な割合で必要なバインダー性能をもつキャリヤと混合し、所望の形状及びサイズに圧縮する。
【００３０】
座剤組成物の製造に関しては、低融点ワックス、たとえば脂肪酸グリセリドとココアバターとの混合物などを最初に融解し、活性成分を攪拌するなどしてそのなかに分散させる。溶融した一様な混合物を慣用のサイズの型に流し込み、放冷して固化させる。
【００３１】
好適なキャリヤとしては、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラクトース、糖、ペクチン、デキストリン、スターチ、トラガカント、メチルセルロース、
ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、ココアバターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
組成物なる用語は、(他のキャリアを含んでいてもいなくても)活性成分がキャリヤによって囲まれていて、これと関連づけられているカプセルを提供するキャリヤとして、活性成分を封入材料と共に配合することも含む。同様にサシェも含まれる。
【００３３】
錠剤、粉末、サシェ及びカプセルは、経口用途に適した固体剤形として使用することができる。
液体形組成物としては、溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。たとえば、活性成分の滅菌水溶液または水プロピレングリコール溶液は、非経口用途に適した液体製剤である。液体組成物もポリエチレングリコール水溶液中の溶液に配合することができる。
【００３４】
経口投与用の水溶液は、水中に活性成分を溶解して、所望の好適な着色剤、フレーバー剤、安定剤及び増粘剤を添加して製造することができる。経口用途用の水性懸濁液は、天然合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び医薬製剤業界で公知の他の懸濁化剤と一緒に水中に微粉砕活性成分を分散させて製造することができる。経口用途用の典型的な組成物は、一種以上の着色剤、甘味料、フレーバー剤及び／または保存料を含むことができる。
【００３５】
投与形態に依存して、医薬組成物は、本発明の化合物を約0.05重量%(％w)〜約99重量%
、または約0.10重量％〜50重量％含む。全ての重量％は、本組成物の総重量をベースとする。
【００３６】
本発明の実施のための治療的有効量は、個々の患者の年齢、体重及び応答を含む公知基準を使用して当業者によって決定することができ、処置または予防する疾病の状況で解釈することができる。
【００３７】
医学的用途
本発明の化合物は、mGluR5の興奮性活性化(excitatory  activation)に関連する症状の処置で、及びmGluR5の興奮性活性化により生じる神経損傷を防ぐために有用である。本化合物は、ヒトを含む哺乳類でmGluR5の阻害作用を生み出すために使用することができる。
【００３８】
mGluR5を含むグループI  mGluR受容体は、中枢神経系及び末梢神経系並びに他の組織で高度に発現される。かくして、本発明の化合物は、急性及び慢性の神経障害及び精神障害、消化器疾患、並びに慢性及び急性疼痛性障害などのmGluR5-媒介疾患の処置に十分適し
ていると考えられる。
【００３９】
本発明は、治療で使用するための、上記定義のごとき式I〜IIIの化合物に関する。
本発明は、mGluR5-媒介疾患の処置で使用するための、上記定義のごとき式I〜IIIの化
合物に関する。
【００４０】
本発明は、アルツハイマー病、老年性認知症、AIDSによる認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、偏頭痛、てんかん、統合失調症、うつ、不安神経症、急性不安神経症、強迫神経症、眼科疾患、たとえば網膜症、糖尿病性網膜症、緑内障、聴覚神経症、たとえば耳鳴り、化学療法による神経障害、ヘルペス後神経痛及び三叉神経痛、耐性、依存症、脆弱X、自閉症、精神発達遅滞、統合失調症及びダウン症の処置
で使用するための、上記定義のごとき式I〜IIIの化合物に関する。
【００４１】
本発明は、偏頭痛に関連する疼痛、炎症性痛覚、神経障害性疼痛、たとえば糖尿病性神
経障害、関節炎、及びリウマチ性疾患、腰痛、手術後疼痛、癌、狭心症、腎性若しくは胆石疝痛、月経、偏頭痛及び痛風を含む種々の症状に関連する疼痛の処置で使用するための上記定義のごとき式I〜IIIの化合物に関する。
【００４２】
本発明は、卒中、頭部外傷、酸素欠乏障害及び虚血性傷害、低血糖症、循環器疾患及びてんかんの処置で使用するための、上記定義のごとき式I〜IIIの化合物に関する。
本発明は、mGluR  グループI受容体−媒介疾患及び上記の任意の疾患の処置用薬剤の製造における、上記定義のごとき式I〜IIIの化合物の使用にも関する。
【００４３】
本発明の一態様は、消化器疾患の処置における式I〜IIIの化合物の使用に関する。
本発明の別の態様は、一時的な下部食道括約筋弛緩の抑制用、GERDの処置用、胃食道逆流の予防、逆流処置(treatment  regurgitation)用、喘息処置用、喉頭炎の処置用、肺病の処置用、発育障害の管理用、過敏性腸症候群(IBS)の処置用及び機能性消化不良(functional  dyspepsia：FD)の処置用の薬剤の製造用の式I〜IIIの化合物の使用に関する。
【００４４】
「TLESR：一時的な下部食道括約筋弛緩(transient  lower  esophageal  sphincter  relaxation)」なる用語は、本明細書において、Mittal，R．K．，Holloway，R．H．，Penagini，R．，Blackshaw，L．A．，Dent，J．，1995；Transient  lower  esophageal  sphincter  relaxation．Gastroenterology  109、601-610頁に従って定義する。
【００４５】
「逆流」なる用語は、本明細書中、逆流時には機械的な障壁が一時的に失われているため、食道に到達し得る胃からの流体として定義する。
「GERD：胃食道逆流性疾患（gastro-esophageal  reflux  disease」」なる用語は、本明細書中、van  Heerwarden，M．A．，Smout  A．J．P．M．，2000；Diagnosis  of  reflux  disease．Bailliere’s  Clin．Gastroenterol．14，759-774に従って定義する。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、咳の処置用薬剤の製造のための式I〜IIIの化合物の使用に関する。一態様において、処置すべき咳は慢性の咳である。さらなる態様において、処置すべき咳は急性の咳である。慢性の咳なる用語は、８週間を超えて持続する咳としてKardos
Pら(The  German  Respiratory  Society’s  Guideline  for  the  Diagnosis  and
Treatment  of  Patients  with  Acute  and  Chronic  Cough  Medizinische  Klinik  2004；99(8)：468-75)に従って定義する。しかしながら、慢性の咳は、３週間を超え
て持続する咳としても、また２ヶ月を超えて持続する咳としても定義することができる。「急性の咳」なる用語は、８週間未満持続する咳として上記文献に従って定義する。
【００４７】
上記式I〜IIIの化合物は、肥満または体重超過の処置または予防(たとえば減量の促進
及び減量の維持)、体重増加の予防または逆転(reversal)(たとえば薬物治療または禁煙に続くリバウンド)、食欲及び／または飽満(satiety)、摂食障害(たとえば過食、食欲不振
、食欲異常亢進)及び渇望(薬物、煙草、アルコール、全ての食欲をそそる多量栄養素またはジャンクフード(non-essential  food  items))の調節に有用である。
【００４８】
本発明は、mGluR5-媒介疾患、及び上記任意の疾患にかかっている患者、またはその症
状の危険性のある患者におけるｍGluR5-媒介疾患及び上記任意の疾患の処置法であって、上記定義のごとき式I〜IIIの化合物の有効量を前記患者に投与することを含む、前記方法も提供する。
【００４９】
特定の疾患の治療的または予防的処置に必要な用量は、処置する宿主、投与経路及び処置する病気の重篤度に依存して必然的に変動し得る。
本明細書の文脈において、「治療」及び「処置」なる用語は、反対の指示がない限り、防止(prevention)または予防(prophylaxis)をも含むものとする。「治療的(therapeutic)
」及び「治療的に(therapeutically)」なる用語も、適宜解釈すべきである。
【００５０】
本明細書において、他に記載しない限り、「アンタゴニスト」及び「阻害剤」なる用語は、どんな手段によっても部分的または完全に伝達経路を遮断して、リガンドによる応答生成を導く化合物を意味するものとする。
【００５１】
他に記載しない限り、「疾患(disorder)」なる用語は、代謝型グルタミン酸受容体活性に関連するいかなる症状及び疾病をも意味する。
非医学的用途
治療薬で使用することに加えて、式I〜IIIの化合物、並びにかかる化合物の塩及び水和物は、新規治療薬探究の一端として、ネコ、イヌ、ウサギ、サル、ラット及びマウスなどの実験動物におけるｍGluR関連活性の阻害作用を評価するin-vitro及びin-vivo試験系の開
発及び標準化における薬理学的ツールとして有用である。
【００５２】
製造法
【００５３】
【化４】
2010013476.tif 000005
【００５４】
【化５】
2010013476.tif 000006
【００５５】
【化６】
2010013476.tif 000007
【００５６】
【化７】
2010013476.tif 000008
【００５７】
〔一般的な方法〕
全ての出発物質は市販されているか、文献に記載されている。
1H及び13C-NMRスペクトルは、他に記載しない限り、溶媒として重水素化クロロホルム
中、参照としてTMSまたは残存溶媒シグナルを使用して、1H-NMRに関してはそれぞれ300、400及び400MHzで操作するBruker  300、Bruker  DPX400またはVarian  +400分光計で記録した。報告した全ての化学シフトは、デルタスケールでppmで表し、シグナルの細かい分
裂は記録に表されている通りである(s：一重線、br  s：ブロード一重線、d：二重線、t
：三重線、q：四重線、m：多重線)。
【００５８】
分取インライン液体クロマトグラフィー分離、続くマススペクトル検出は、Alliance  2795(LC)とZQ単一四極質量分析計からなるWaters  LC-MSで記録した。質量分析計には、
正及び／または負イオンモードで操作する電子スプレーイオン源が備えられていた。このイオンスプレー電圧は±３kVであり、質量分析計は、スキャン時間0.8秒でm/z100〜700からスキャンした。このカラム、X-Terra  MS、Waters、C8、2.1×50mm、3.5μｍに、10mM
酢酸アンモニウム(aq.水溶液)または0.1％TFA（aq.水溶液）中５％〜100％アセトニトリ
ルの勾配液を適用した。光学回転は、２３℃、589nmで、10cmセルを使用してPerkin  Elmer  241  偏光計で測定した。
【００５９】
〔略号リスト〕
aq.：水性
DMF：ジメチルホルムアミド
EtOAc：酢酸エチル
NH4Cl：塩化アンモニウム
Novozyme  435(登録商標)：ポリマー結合カンジタ・アンタークチカ・リパーゼ（candida
antarctica  lipase）の登録商標名
r.t.またはRT：室温(他に記載しない限り１６〜２６℃)。
【実施例】
【００６０】
〔中間体の合成〕
実施例１
エチル4-(3-クロロフェニル)-2,4-ジオキソブタノエート
【００６１】
【化８】
2010013476.tif 000009
【００６２】
ナトリウムエトキシド(117.8g，1.73mol)を、０℃でエタノール(3L)中の3-クロロアセ
トフェノン(178.5g，1.15mol)とジエチルオキサレート(188mL，1.39mol)の溶液に少しず
つ添加した。この混合物を室温で１時間攪拌し、次いで70℃で２時間加熱した。冷却後、この混合物を3M塩酸で酸性化(pH〜3)した。溶媒を留去し、混合物にEtOAcを添加した。有機層を水と飽和塩水で洗浄した。溶媒を留去すると、粗な表記生成物が得られ、これを次段階で直接使用した。MS(M+−1)＝253。
【００６３】
実施例２
エチル5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-カルボキシレート
【００６４】
【化９】
2010013476.tif 000010
【００６５】
エタノール(4L)中の粗なエチル4-(3-クロロフェニル)-2,4-ジオキソブタノエート(最大294g，1.16mol)とヒドロキシルアミン塩酸塩(120.4g，1.73mol)の溶液を80℃で４時間加
熱した。(一晩)約５〜10℃に冷却後、混合物を濾過し、冷エタノールで洗浄し、真空乾燥すると、表記化合物が得られた(214.5g，74%)。1H-NMR：7.82(s，1H)，7.72(m，1H)，7.47(m，2H)，4.03(s，3H)。MS(M++1)＝252。
【００６６】
実施例３
[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]メタノール
【００６７】
【化１０】
2010013476.tif 000011
【００６８】
ナトリウムボロヒドリド(96.7g，2.6mol)を、０℃でメタノール(2.5L)中のエチル5-(3-
クロロフェニル)イソキサゾール-3-カルボキシレート(214.5g，0.85mol)の溶液にゆっく
りと添加した。この反応混合物を50℃で２時間加熱し、室温でEtOAcでクエンチした。溶
媒の殆どを留去し、残りの粗な物質にEtOAcを添加した。この有機層を水、飽和塩水で洗
浄し、濃縮すると表記化合物が得られ、これを次段階で直接使用した。MS(M+＋1)＝210。
【００６９】
実施例４
5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-カルボアルデヒド
【００７０】
【化１１】
2010013476.tif 000012
【００７１】
ジクロロメタン(2L)中の[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]メタノール(178.6g，852mmol)を、ジクロロメタン(2L)中のピリジニウムクロロクロメート(400g，1.86mol)に滴下添加した。得られたスラリーを室温で一晩攪拌した。このスラリーをセライト
を通して濾過し、濾液を留去した。残りの溶液に、EtOAcを添加した。有機層を水、飽和
塩水で洗浄し、濃縮すると、粗な表記化合物が得られ、これを直接次段階で使用した。1H-NMR(DMSO-d6)：10.13(s，1H)，8.08(br  s，1H)，7.95(m，1H)，7.61(m，3H)。MS(M+＋1)＝208。
【００７２】
実施例５
1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エタノール
【００７３】
【化１２】
2010013476.tif 000013
【００７４】
MeMgBr(THF中３M，313mL，937，2mmol)をTHF(3L)中の5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-カルボアルデヒド(177g，252mmol)に０℃で滴下添加した。この混合物を放置して室温に到達させ、その温度で３時間攪拌し、次いで０℃でNH4Cl水溶液でクエンチし、溶
媒を留去した。残りのものにEtOAcを添加し、セライト栓で濾過した。有機層を水、飽和
塩水で洗浄し、濃縮した。粗な生成物をヘプタン/酢酸エチル＝80：20を使用してシリカ
ゲルのカラムクロマトグラフィーで精製すると表記化合物が白-黄色固体状で得られた(70g，37%)。1H-NMR：7.73(m，1H)，7.63(m，1H)，7.38(m，2H)，6.57(s，1H)，5.07(q，1H)，2.44(s，1H)，1.59(d，3H)。
【００７５】
実施例６
(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エチルアセテート
【００７６】
【化１３】
2010013476.tif 000014
【００７７】
1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エタノール(106.5g，476mmol)とNovozyme  435(登録商標)(13g)をAr下、乾燥トルエン(1.5L)中に取り出す。酢酸ビニル(66mL
，716mmol)を添加した後、反応を室温で一晩実施し、続いてセライトで濾過し、DCMで洗
浄した。溶媒を真空蒸発させ、粗な生成物をジクロロメタン/メタノール＝20：１を使用
するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製すると、表記化合物が得られた(50g，47%)。1H-NMR：7.76(m，1H)，7.65(m，1H)，7.41(m，2H)，6.54(s，1H)，6.07(q，1H)，2.13(s，3H)，1.66(d，3H)。LC-MS(M+＋1)＝266。
【００７８】
実施例７
(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エタノール
【００７９】
【化１４】
2010013476.tif 000015
【００８０】
(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エチルアセテート(56g，211mmol)と水酸化リチウム一水和物(lithium  hydroxide  monohydrate)(10.6g，253mmol)をTHF/水(7/5，1.2L)と洗浄し、室温で一晩攪拌した。混合物の容積を真空下で約１／２に減らし、続いて塩水で希釈し、エーテル抽出し、次いでMgSO4上で乾燥し、真空濃縮すると粗
な生成物が得られた。この粗な生成物をヘプタン/酢酸エチル＝70：30を使用するシリカ
ゲルのカラムクロマトグラフィーで精製すると、表記化合物が得られた(40g，85%)。1H-NMR：7.73(m，1H)，7.63(m，1H)，7.38(m，2H)，6.57(s，1H)，5.07(q，1H)，2.44(s，1H)，1.59(d，3H)。
【００８１】
実施例８
2-イソニコチノイル-N-メチルヒドラジンカルボチオアミド
【００８２】
【化１５】
2010013476.tif 000016
【００８３】
イソプロピルアルコール(6.0L)中の緩やかに加熱(35℃)し、機械的に攪拌したイソニコチノヒドラジド(435g)の懸濁液に、(メチルイミノ)(チオキソ)メタン(230g)を数回にわけて少量ずつ添加した。添加完了後、反応混合物を６時間加熱(70℃)し、30分後にさらにイソプロピルアルコール(600ml)を添加した。この反応混合物を17℃に(氷浴)冷却した後、
得られた沈殿物を濾別し、イソプロピルアルコール(1.0L)で洗浄した。次いでこの固体を
一晩風乾すると、白色粉末状の表記化合物615gが得られた。
【００８４】
実施例９
4-メチル-5-ピリジン-4-イル-2,4-ジヒドロ-3H-1,2,4-トリアゾール-3-チオン
【００８５】
【化１６】
2010013476.tif 000017
【００８６】
水(5.0L)中の2-イソニコチノイル-N-メチルヒドラジンカルボチオアミド(610g)の機械
的に攪拌した懸濁液に、室温で重炭酸ナトリウム(390g)を添加した。この反応混合物をゆっくりと２時間で70℃に加熱し、その温度でさらに3.5時間保持してから、17℃に(氷浴)
冷却し、濃塩酸(約470mL)をゆっくりと（90分かけて）添加してpHを３に調節した。反応
混合物を濾過し、続いて集めた固体を希塩酸(0.1N，2×1.0L)で洗浄すると、ウエットケ
ーキが得られ、これを100mbarで緩やかな空気流のもと1.5日間乾燥すると、表記化合物544gが得られた。
【００８７】
実施例１０
4-[4-メチル-5-(メチルチオ)-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル]ピリジン
【００８８】
【化１７】
2010013476.tif 000018
【００８９】
アセトン(2.6L)中の4-メチル-5-ピリジン-4-イル-2,4-ジヒドロ-3H-1,2,4-トリアゾー
ル-3-チオン(267g)とヨウ化メチル(197.7g)の機械的に攪拌し、冷却（９℃）した懸濁液
に、温度を10〜15℃に保持するような速度(約20mL/分)で水酸化ナトリウム水溶液(水600mL中54g)を添加した。次いでさらに水(50mL)を添加し、放置して温度を21〜24℃にさせた
。さらに２時間後、アセトンを反応混合物から真空(水浴は30℃に保持)下で留去した。さらに水(750mL)を添加してから冷却し(17〜18℃)、形成した沈殿は濾過により集めた。こ
の固体を水(2×１L)で洗浄してから、空気を緩やかに流しながら100mbar下で乾燥すると
、白色粉末状の表記化合物235gが得られた。1H-NMR(DMSO-d6)：2.7(s，3H)，3.6(s，3H)
，7.7(m，2H)，8.8(d，2H)。
【００９０】
実施例１１
4-[4-メチル-5-(メチルスルホニル)-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル]ピリジン
【００９１】
【化１８】
2010013476.tif 000019
【００９２】
先の段階からの水(1.15L)と酢酸(1.15L)との混合物中の4-[4-メチル-5-(メチルチオ)-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル]ピリジン(228g)の機械的に攪拌した溶液に、冷却しながら
、温度を12〜17℃に保持するような速度(約45分)で過マンガン酸カリウム(234g)を少しずつ添加した。次いでこの反応混合物を室温で４時間攪拌してから、氷浴上で冷却し、水酸化ナトリウム水溶液(5N)を2.5時間かけて添加してpHを約10に設定した。次いでDicalite(登録商標)(100g)とクロロホルム(1.6L)を反応混合物に添加してから濾過した。有機層を
濾液から分離し、濾液からの水性相をクロロホルム抽出した(2×1L)。フィルターケーキ
をクロロホルムで２回抽出した(2×1.5L)。合わせた有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥
し、濾過し、真空濃縮すると、白色粉末状の表記化合物158gが得られた。別のバッチ(crop)(78g，白色粉末)は、フィルターケーキをクロロホルム(2×2L)抽出し、この溶液を真空濃縮することによって得られた。1H-NMR(DMSO-d6)：3.6(s，3H)，3.9(s，3H)，7.8(s，2H)，8.8(s，2H)。
【００９３】
実施例１２
3-[4-メチル-5-(メチルスルホニル)-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル]ピリジン
【００９４】
【化１９】
2010013476.tif 000020
【００９５】
表記化合物は、イソニコチノヒドラジドの代わりにニコチノヒドラジドから出発して、対応する段階からなる対応する配列で、本明細書中に記載の4-[4-メチル-5-(メチルスル
ホニル)-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル]ピリジンと同様にして製造した。1H-NMR：3.59(s，3H)，3.99(s，3H)，7.52(m，1H)，8.02(dt，1H)，8.83(dd，1H)，8.91(m，1H)。
【００９６】
〔最終化合物の合成〕
実施例１３
3-(5-{(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)ピリジン
【００９７】
【化２０】
2010013476.tif 000021
【００９８】
(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エタノール(5.40g，24.1mmol)
をDMF(45mL)に溶解した。これに、3-[4-メチル-5-(メチルスルホニル)-4H-1,2,4-トリア
ゾール-3-イル]ピリジン(5.75g，24.1mmol)と炭酸セシウム(10.1g，31.4mmol)を添加した。60℃で一晩攪拌した後、水を添加した。混合物をジクロロメタン抽出し、続いて有機層を真空濃縮すると、粗な物質が得られ、これをジクロロメタン/メタノール＝98/2を使用
するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製すると、表記化合物が得られた(7.10g，77%)。1H-NMR：8.90(d，1H)，8.72(m，1H)，8.04(dt，1H)，7.76(bs，1H)，7.66(m，1H)，7.45(m，1H)，7.40(m，2H)，6.73(s，1H)，6.35(q，1H)，3.57(s，3H)，1.93(d，3H)
。1H-NMR(DMSO-d6)：8.90(d，1H)，8.71(dd，1H)，8.13(dt，1H)，7.99(s，1H)，7.86(m
，1H)，7.58(m，3H)，7.40(s，1H)，6.19(q，1H)，3.54(s，3H)，1.81(d，3H)。LC-MS(M+
＋1)＝382。[α]DRT(2.92g/L，CDCl3)＝−46.575°。
【００９９】
実施例１４
4-(5-{(rac)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)ピリジン
【０１００】
【化２１】
2010013476.tif 000022
【０１０１】
1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エタノール(63.4mg，0.28mmol)、DMF及び水素化ナトリウム(油中60%分散液，15.1mg，0.38mmol)を不活性雰囲気下で混合し、
室温で１時間攪拌し、続いて4-[4-メチル-5-(メチルスルホニル)-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル]ピリジン(45mg，0.19mmol)を添加した。80℃で24時間攪拌した後、混合物を室温に冷却し、EtOAcで希釈し、水と塩水で洗浄した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、濾過し、真
空濃縮した。粗な残渣を、EtOAc中5％エタノールを使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製すると、表記化合物を単離した(11.7mg)。1H-NMR：8.81(bs，2H)，7.77(s，1H)，7.67(m，3H)，7.42(m，2H)，6.73(s，1H)，6.36(q，1H)，3.62(s，3H)，1.94(d，3H)。
【０１０２】
実施例１５
4-(5-{(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)ピリジン
【０１０３】
【化２２】
2010013476.tif 000023
【０１０４】
〔方法１〕：溶離液としてイソプロパノールを使用するキラパックAD上で4-(5-{(rac)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリア
ゾール-3-イル)ピリジンの分取キラルHPLC分離を実施すると、最初に溶離するエナンチオマーとして表記化合物が得られた。
【０１０５】
〔方法２〕：表記化合物は、DMF中、炭酸セシウムを使用して、(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エタノールと4-[4-メチル-5-(メチルスルホニル)-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル]ピリジンをカップリングすることによって、3-(5-{(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)ピリジンと類似の方法で製造した。1H-NMR(DMSO-d6)：8.73(m，2H)，7.97(br．s
，1H)，7.85(m，1H)，7.74(m，2H)，7.58(m，2H)，7.39(s，1H)，6.20(q，1H)，3.60(s，3H)，1.81(d，3H)。[α]DRT(5.827g/L，CDCl3)＝−48.567°。
【０１０６】
実施例１６
4-(5-{(1S)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)ピリジン
【０１０７】
【化２３】
2010013476.tif 000024
【０１０８】
表記化合物は、4-(5-{(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)ピリジン(方法1)の例で記載したように、分
取キラルHPLC分離で二番目に溶離するエナンチオマーとして単離した。1H-NMR：8.81(bs
，2H)，7.77(s，1H)，7.67(m，3H)，7.42(m，2H)，6.73(s，1H)，6.36(q，1H)，3.62(s，3H)，1.94(d，3H)。
【０１０９】
実施例１７
4-(5-{(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)ピリジン塩酸塩
表記塩は、32重量％HCl水溶液10μlを二度に分けて、50℃で500μlエタノール中の4-(5-{(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)ピリジン遊離塩基35mgの透明溶液に添加して製造した。このスラリーを10℃に冷却し、攪拌しながら一晩維持し、その後塩を濾別し、エタノール500μlで洗浄し、真空下、室温で乾燥した。
【０１１０】
この塩は結晶質で、はっきりした融解挙動をもち、90〜95％RHで吸湿した。
表記塩は、エタノール、2-プロパノール及び酢酸エチル中で同様に、さらにエタノール中１gスケールで再び製造した。全ての場合で同様の結晶質であったが、バッチによって
はアモルファス含有量がやや高かった。融点は150℃〜160℃であった。
【０１１１】
塩はエタノールから１gスケールで製造し、個々の溶解に関してさらに調査し、4-(5-{(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-ト
リアゾール-3-イル)ピリジンの遊離塩基と比較した。この塩は遊離塩基と比較して、1000倍早い固有の溶解速度であった。塩基と塩の溶解速度は、低容積回転ディスク法(low-volume  rotating  disc  method)で測定した。ディスクは純粋な化合物から圧縮し、暴露面積0.07cm2のディスクホルダーの中心に据え付けた。ディスクホルダーは、37℃、50mL  USPリン酸塩緩衝液pH6.8中に浸漬させて500rpmで回転させた。化合物は、フローセルと、
連続して循環する蠕動ポンプを備えた分光光度計によりUV-オンラインで評価した。
【０１１２】
実施例１８
4-(5-{(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)ピリジンサルフェート
油状物に浸った塩は、水500μlと、4-(5-{(1R)-1-[5-(3-クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)ピリジン遊離塩基33mg、メタノール500μlと98重量％硫酸7μlとを混合して得られる透明溶液を蒸発させて製造した。表記塩はエタノール500μｍ中で油状物に漬った塩を再結晶して製造した。
【０１１３】
表記塩は、本質的にアモルファス含有量をもつ結晶質で、明確な融点挙動をもたず、60-70%相対湿度で潮解した。
表記塩は、68℃で2-プロパノール１mlまたはエタノール１ml中、4-(5-{(1R)-1-[5-(3-
クロロフェニル)イソキサゾール-3-イル]エトキシ}-4-メチル-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル)ピリジン遊離塩基66〜68mgの透明溶液に1.5時間で、５μlの濃硫酸(98％)を三回で
添加して再び製造した。このエタノールから製造した塩は、融点128℃であったが、70〜80％相対湿度(RH)で潮解する。
【０１１４】
生物学的評価
〔ｍGluR5Dを発現する細胞系におけるmGluR5拮抗作用の機能的評価〕
本発明の化合物の特性を、薬理学的活性に関する標準アッセイを使用して評価することができる。グルタミン酸受容体アッセイの例は、たとえばAramoriら、Neuron  8：757(1992)、Tanabeら、Neuron  8：169(1992)、Millerら、J．Neuroscience  15：6103(1995)、Balazsら、J．Neurochemistry  69：151(1997)に記載の通り当業界で公知である。これらの刊行物に記載の方法は、本明細書中、参照として含まれる。好都合には，本発明の化合物は、mGluR5を発現する細胞において細胞内カルシウム、[Ca2+]iの動きを測定するアッ
セイ(FLIPR)またはイノシトールホスフェート代謝回転を測定する別のアッセイ(IP3)によって研究することができる。
【０１１５】
FLIPRアッセイ
WO97/05252号に記載のようにヒトmGluR5dを発現する細胞を、黒い側面をもつコラーゲ
ンコーティング化クリアボトム96-ウエルプレート上、100,000細胞/ウエルの密度で播種
し、実験は、播種24時間後で実施する。全てのアッセイは、127mM  NaCl、5mM  KCl、2mM
MgCl2、0.7mM  NaH2PO4、2mM  CaCl2、0.422mg/ml  NaHCO3、2.4mg/ml  HEPES、1.8mg/mlグルコース及び１mg/ml  BSA画分IVを含む緩衝液(pH7.4)で実施する。96-ウエルプレート上の細胞培地を、0.01％プルロニック酸(特許品、非イオン性界面活性剤ポリオール−CAS  Number  9003-11-6)中で蛍光カルシウムインジケーター・fluo-3(Molecular  Probes，Eugene，Oregon)のアセトキシメチルエステル形４μMを含む上記緩衝液中、60分間充填する。充填時間後、このfluo-3緩衝液を取り除き、新しいアッセイ緩衝液で置き換えた。FLIPR実験は、レーザー設定0.800Wと、0.4秒のCCDカメラシャッター速度で、励起及び放
出波長はそれぞれ488nmと562nmで実施する。それぞれの実験は、セルプレートのそれぞれのウエルに存在する緩衝液160μlで開始する。アンタゴニストプレートから40μl添加し
てから、アゴニストプレートから50μL添加する。アンタゴニストとアゴニスト添加の間
には90秒間の間隔をおく。蛍光シグナルは１秒間隔で50回サンプル採取し、続いて２回のそれぞれの添加直後に５秒間隔で３サンプル採取する。アゴニストに対する応答のピーク高さの間の差として応答を測定し、サンプル間隔の間のバックグラウンド蛍光は低い。IC50決定は、線形最小二乗法(linear  least  square)に合うプログラムを使用して実施す
る。
【０１１６】
IP3アッセイ
mGluR5dの追加の機能アッセイはWO97/05252号に記載されており、ホスファチジルイノ
シトール代謝回転をベースとする。受容体活性化はホスホリパーゼC活性を刺激し、イノ
シトール1,4,5,三リン酸(IP3)の形成を増やす。
【０１１７】
ヒトmGluR5dを安定して発現するGHEKを、１μCi/ウエル[3H]ミオ-イノシトールを含む
培地中、40×104個/ウエルで、24ウエルポリ-L-リジンコーティングプレートに播種する
。細胞を一晩(16時間)培養し、次いで三回洗浄し、１単位/mlグルタミン酸ピルビン酸ト
ランスアミラーゼと２mMピルビン酸を補ったHEPES緩衝塩水(146mM  NaCl，4.2mM  KCl，0.5mM  MgCl2，0.1%グルコース，20mM  HEPES，pH7.4)中、37℃で１時間培養した。細胞を
一度HEPES緩衝塩水で洗浄し、10mM  LiClを含むHEPES緩衝塩水中、10分間予備培養する。化合物を37℃で15分間、二重に培養し、次いでグルタミン酸(80μM)またはDHPG(30μM)を添加し、さらに30分間培養する。この反応は、氷浴上、0.5ml過塩素酸(5％)を添加して停止し、４℃で少なくとも30分間培養する。サンプルは15mlポリプロピレン管に集め、イノシトールホスフェートは、イオン交換樹脂(Dowex  AG1-X8蟻酸形、200-400メッシュ、BIORAD)カラムを使用して分離する。イノシトールホスフェート分離は、８mlの30mM蟻酸アンモニウムでグリセロホスファチジルイノシトールを最初に溶離して実施した。次に全てのイノシトールホスフェートを８mlの700mM蟻酸アンモニウム/100mM蟻酸で溶離して、シン
チレーションバイアルに集める。この溶離物を８mlのシンチラントと混合し、[3H]イノシトール含有率をシンチレーションカウンティングにより決定する。二重サンプルからのdpmカウントをプロットし、IC50決定は、線形最小二乗法に合うプログラムを使用して出す
。
【０１１８】
略号
BSA：ウシ血清アルブミン
CCD：電荷結合素子(Charge  Coupled  Device)
CRC：濃度反応曲線(Concentration  Response  Curve)
DHPG：3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン
DPM：１分当たりの崩壊(Disintegrations  per  Minute)
EDTA：エチレンジアミン四酢酸
FLIPR：蛍光イメージングプレートリーダー
GHEK：GLAST-含有ヒト胚腎臓(GLAST-containing  Human  Embrionic  Kidney)
GLAST：グルタミン酸/アスパラギン酸トランスポーター
HEPES：4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(緩衝液)
IP3：イノシトール三リン酸
概して、本発明の化合物（複数）は10000nM未満のIC50値をもち、上記アッセイで活性
であった。本発明の一側面において、IC50値は１μM未満である。本発明のさらなる側面
において、IC50値は100nM未満である。
【０１１９】
〔TLESRに対して活性な化合物のスクリーニング〕
パブロフ・スリング(Pavlov  sling)に立つように訓練された雌雄の成犬のラブラドー
ルレトリバーを使用した。粘膜から皮膚食道瘻造設術(Mucosa-to-skin  esophagostomies)を形成し、完全に回復させてから全ての実験を実施する。
【０１２０】
運動性測定
手短に言えば、約17時間自由に水を飲ませた後、マルチルーメン・スリーブ/サイドホ
ール・アセンブリ(multilumen  sleeve/sidehole  assembly)  (Dentsleeve，Adelaide，South  Australia)を皮膚食道瘻造設術を通して導入し、胃、下部食道括約筋(LES)及び食道内圧を測定する。このアセンブリは低コンプライアンス・マノメロメータ・灌流ポンプ(low-compliance  manometric  perfusion  pump)(Dentsleeve，Adelaide，South  Australia)を使用して灌流する。空気灌流(air-perfused)管を経口方向に通して嚥下を測定し
、アンチモン電極でLES上３cmでpHをモニターした。全てのシグナルを増幅し、10Hzでパ
ーソナルコンピューターで得た。
【０１２１】
絶食している胃/LES相III(fasting  gastric/LES  phase  III)運動活動のないベース
ライン測定が得られたら、偽薬(プラセボ)(0.9%NaCl)または試験化合物を前脚静脈に静脈投与(静脈注射0.5ml/kg)で投与する。静脈注射して10分後、栄養のある食事(nutrient  meal)(10% ペプトン，5% D-グルコース，5% Intralipid，pH 3.0)を100ml/分でアセンブリの中央内腔を通して胃に注入して終容積30ml/kgとする。栄養のある食事を注入した後、
胃の中の圧力が10±１mmHgとなるまで、500ml/分の速度で空気を注入する。次いでさらに空気を注入するため、または胃から空気を抜くために注入ポンプを使用して実験する間、このレベルを保持する。栄養物の注入開始から空気吹き込み終了までの実験時間は45分である。この手順は、TLESRを誘発する確実な方法として確認されている。
【０１２２】
TLESRは、(胃内圧に関して)下部食道括約部圧が＞１mmHg/sの速度で減少することとし
て定義される。緩和開始の＜２秒前に咽頭シグナルがあってはいけない。緩和の前に咽頭シグナルがある場合、この緩和は嚥下誘発性と分類される。LESと胃の間の圧力差が2mmHg未満でなければならず、完全弛緩期間は１秒よりも長くなければならない。