(57)【要約】      （修正有）【課題】機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを高い精度で検出することができる機能性糸状菌検出方法及び機能性糸状菌含有製品の評価方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、からなる群より選択された少なくとも１つのポリヌクレオチドを用いて、試料中の機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを検出する機能性糸状菌検出方法と、機能性糸状菌含有製品中の機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケの存在又は濃度を評価する機能性糸状菌含有製品の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、
（２）配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、
（３）配列番号３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、
（４）配列番号４で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、
からなる群より選択された少なくとも１つのポリヌクレオチドを用いて、試料中の機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケ（Coprinellus curtus）を検出する機能性糸状菌検出方法。
【請求項２】
配列番号１若しくは配列番号３で示される塩基配列又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、配列番号２若しくは配列番号４で示される塩基配列又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、で構成されたプライマー対を用いて、ＰＣＲを行うことを含む請求項１記載の機能性糸状菌検出方法。
【請求項３】
配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと、で構成されたプライマー対を用いて、ＰＣＲを行うことを含む請求項１記載の機能性糸状菌検出方法。
【請求項４】
前記機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケが、ヒメツブヒトヨタケＧＭ−２１（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３７）である請求項１〜請求項３のいずれかに記載の機能性糸状菌検出方法。
【請求項５】
前記試料が、土壌試料、コンポスト試料、培養物試料及び固定化物試料からなる群より選択された少なくとも１つである請求項１〜請求項４のいずれかに記載の機能性糸状菌検出方法。
【請求項６】
機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを含む機能性糸状菌含有製品の評価方法であって、
前記機能性糸状菌含有製品に由来する試料に対して、配列番号１若しくは配列番号３で示される塩基配列又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、配列番号２若しくは配列番号４で示される塩基配列又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、で構成されたプライマー対を用いて定量的ＰＣＲを行うこと、
定量的ＰＣＲの結果に基づいて前記機能性糸状菌含有製品中の機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケの存在又は濃度を評価すること、
を含む機能性糸状菌含有製品の評価方法。
【請求項７】
前記プライマー対が、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと、で構成されたプライマー対である請求項６記載の機能性糸状菌含有製品の評価方法。
【請求項８】
前記機能性糸状菌含有製品が、細菌類の活動制限状態にあるコンポストに、前記機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを接種すること、前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して選択的に増殖させること、を含む方法により得られた機能性コンポストである請求項６又は請求項７に記載の機能性糸状菌含有製品の評価方法。
【請求項９】
前記機能性コンポストが、糸状菌の生育条件で活動可能な糸状菌共存生育可能細菌類を更に含む請求項６〜請求項８のいずれかに記載の機能性糸状菌含有製品の評価方法。
【請求項１０】
下記のポリヌクレオチドからなるプライマー対：
（１）  配列番号１若しくは配列番号３で示される塩基配列又はこれと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（２）  配列番号２若しくは配列番号４で示される塩基配列又はこれと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項１１】
下記のいずれかであるポリヌクレオチド：
（１）  配列番号１で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（２）  配列番号２で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（３）  配列番号３で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（４）  配列番号４で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性糸状菌検出方法、機能性糸状菌含有製品の評価方法及びプライマー対に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌すなわちカビには種々の機能があることが知られており、例えば病原性糸状菌によって植物病害が引き起こされることも知られている。病原性糸状菌は、キャベツ、キュウリ、トマト、ナス、小松菜などの多くの野菜、稲などの農産物の他、花、樹木、芝生等に、立枯病、根腐病、葉腐病、萎凋病などの病害を発病させる原因となる。これらの糸状菌としては、リゾクトニア属、フザリウム属、ピシウム属、トリコデルマ属、スクレロチウム属などがよく知られている。
このような病原性糸状菌に対して効果的な植物病害防除方法として、微生物、特に糸状菌を用いた植物病害防除剤が挙げられる（例えば、特許文献１及び特許文献２）。一般に、細菌類と糸状菌類とでは増殖や活性に適した生育条件が異なっていることが知られており、病原性糸状菌の生育に適した条件で効果的に機能を発揮できる植物病害防除機能を有する機能性糸状菌を用いた植物病害防除剤は、細菌類を用いた植物病害防除剤よりも大きい効果が期待される。中でも、ヒトヨタケ科に属する糸状菌を用いた植物病害防除剤は、その機能が高い（特許文献２参照）。
【０００３】
ところで、このような機能性糸状菌を植物病害防除剤として使用するには、適度な密度で土壌やコンポストに存在させて適切な植物病害防除機能を発揮させ、またこの機能を維持させる必要がある。また、機能性糸状菌の所定の機能を簡便に利用するには、土壌やコンポスト、固体培地、固定化担体に機能性糸状菌を接種して、機能性糸状菌含有製品を製造することもある。このような機能性糸状菌含有製品を作製したときには、製造・保管・運搬等の過程において、機能性糸状菌の濃度を適切にモニターすることが不可欠である。
糸状菌の濃度のモニターは、細菌と異なって、例えば希釈平板法のような寒天培地を用いた通常の測定法では測定することができない。また、コンポストなどの固体中に存在するために菌体のみの乾燥重量で測定することも、他の微生物が混在するために菌体ＤＮＡの総量として測定することもできない。
【０００４】
近年、菌の同定や検出を、分子生物学的手法を用いて行う技術が開発されている。例えば、特許文献３では、有機性廃棄物や廃水等のメタン発酵処理汚泥中に存在するメタン生成に関連するメタン生成細菌及び酸生成細菌を、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡ及びＲＮＡ濃度を定量検出し、経時的にモニタリングしながら、その活性を評価する方法を提供することにより、メタン発酵装置の適切な運転管理指標とプロセス制御方法を開示している。また、特許文献４は、農産物（穀類、野菜）、畜産物（肉類）、水産物（魚介類）、毛髪、体液、微生物等の検体に含まれるＤＮＡを、ＳＳＲプライマー対を用いるマルチプレックスにより、高精度、迅速、簡便且つ安価にＤＮＡ増幅及び解析することのできる技術を開示している。
【特許文献１】国際公開第９７／３１５２１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／０８５５６７号パンフレット
【特許文献３】特開２００７−２６８４７１号公報
【特許文献４】特公２００７−１７４９７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、土壌中には目的とする機能性の糸状菌以外にも種々の糸状菌や細菌類が存在しており、機能性糸状菌のみのモニターを行うには、非常に高い特異性を示す検出方法が要求される。また、機能性糸状菌を接種して得られた機能性糸状菌含有製品の評価を適切に行う評価方法が要求されている。
従って、本発明の目的は、機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケ（Coprinellus curtus）を高い精度で検出することができる機能性糸状菌検出方法及び機能性糸状菌含有製品の評価方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下のとおりである。
＜１＞  （１）配列番号１で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、（２）配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、（３）配列番号３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、（４）配列番号４で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、からなる群より選択された少なくとも１つのポリヌクレオチドを用いて、試料中の機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを検出する機能性糸状菌検出方法。
＜２＞  配列番号１若しくは配列番号３で示される塩基配列又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、配列番号２若しくは配列番号４で示される塩基配列又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、で構成されたプライマー対を用いて、ＰＣＲを行うことを含む＜１＞記載の機能性糸状菌検出用方法。
＜３＞  配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと、で構成されたプライマー対を用いて、ＰＣＲを行うことを含む＜１＞に記載の機能性糸状菌検出方法。
＜４＞  前記機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケが、ヒメツブヒトヨタケＧＭ−２１（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３７）である＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の機能性糸状菌検出方法。
＜５＞  前記試料が、土壌試料、コンポスト試料、培養物試料及び固定化物試料からなる群より選択された少なくとも１つである＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の機能性糸状菌検出方法。
【０００７】
＜６＞  機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを含む機能性糸状菌含有製品の評価方法であって、  前記機能性糸状菌含有製品に由来する試料に対して、配列番号１若しくは配列番号３で示される塩基配列又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、配列番号２若しくは配列番号４で示される塩基配列又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、で構成されたプライマー対を用いて定量的ＰＣＲを行うこと、定量的ＰＣＲの結果に基づいて前記機能性糸状菌含有製品中の機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケの存在又は濃度を評価すること、を含む機能性糸状菌含有製品の評価方法。
＜７＞  前記プライマー対が、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと、で構成されたプライマー対である＜６＞記載の機能性糸状菌含有製品の評価。
＜８＞  前記機能性糸状菌含有製品が、細菌類の活動制限状態にあるコンポストに、前記機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを接種すること、前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して選択的に増殖させること、を含む方法により得られた機能性コンポストである＜６＞又は＜７＞記載の機能性糸状菌含有製品の評価。
＜９＞  前記機能性コンポストが、糸状菌の生育条件で活動可能な糸状菌共存生育可能細菌類を更に含む＜６＞〜＜８＞のいずれかに記載の機能性糸状菌含有製品の評価方法。
【０００８】
＜１０＞  下記のポリヌクレオチドからなるプライマー対：（１）  配列番号１若しくは配列番号３で示される塩基配列又はこれと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド、（２）  配列番号２若しくは配列番号４で示される塩基配列又はこれと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
＜１１＞  下記のいずれかであるポリヌクレオチド：（１）  配列番号１で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド、（２）  配列番号２で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド、（３）  配列番号３で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド、（４）  配列番号４で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを高い精度で検出することができる機能性糸状菌検出方法及び機能性糸状菌含有製品の評価方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを検出する方法は、（１）ＧＴＧＴＴＧＣＡＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣ（ＧＭ２１２５Ｆ：配列番号１）で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、（２）ＴＧＡＣＧＣＧＡＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣ（ＧＭ２１５２Ｒ：配列番号２）で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、（３）ＧＴＧＴＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣ（ＧＭ２１２７Ｆ：配列番号３）で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、（４）ＴＧＧＴＡＡＴＴＣＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＡＣ（ＧＭ２１７２Ｒ：配列番号４）で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド及びこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド並びにこれらと実質的に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、からなる群より選択された少なくとも１つのポリヌクレオチドを用いて、試料中の機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを検出するものである。
【００１１】
これらのポリヌクレオチドは機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケに対して高い特異性を示すものであるので、これらのポリヌクレオチドを用いることにより、試料中の機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを精度よく検出することができる。
【００１２】
上記のＧＭ２１２５Ｆ、ＧＭ２１２７Ｆ、ＧＭ２１５２Ｒ又はＧＭ２１７２Ｒは、近縁種とも明確に区別して検出することができるので、目的とする機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを精度高く特異的に検出することに非常に適している。
ＧＭ２１２５Ｆ、ＧＭ２１２７Ｆ、ＧＭ２１５２Ｒ又はＧＭ２１７２Ｒは、図１で示されるＧＭ−２１株の１８Ｓ(一部)、ＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２、２６Ｓ(一部)の配列（配列番号１２）を含む６６３塩基の領域のうち、４６番目から６８番目（配列番号１と配列番号３）と１１９番目から１４３番目の配列（配列番号２）と、１６８番目から１８８番目（配列番号４）に対応する。この領域は比較的保存性の低い領域であり、ヒメツブヒトヨタケに対して特異性が特に高い。このため、この領域に対応するＧＭ２１２５Ｆ、ＧＭ２１２７Ｆ、ＧＭ２１５２Ｒ又はＧＭ２１７２Ｒを使用することにより、精度よくヒメツブヒトヨタケを検出することができる。
【００１３】
また、これらの配列に対してそれぞれ相補的な配列と、このそれぞれ相補的な配列と実質的に相同な配列も、機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを精度よく検出することができるので、ＧＭ２１２５Ｆ、ＧＭ２１２７Ｆ、ＧＭ２１５２Ｒ及びＧＭ２１７２Ｒと同様に本発明の検出方法に使用することができる。
【００１４】
ここで実質的に相同な配列とは、ＧＭ２１２５Ｆ、ＧＭ２１２７Ｆ、ＧＭ２１５２Ｒ及びＧＭ２１７２Ｒの配列又はこれらとそれぞれ相補的な配列と同程度、機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な相同性を有している配列を意味し、このような配列としては、１〜５塩基程度の数塩基の置換、欠失、付加されたものを挙げることができる。このような数個の塩基が異なる実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列は、例えば、４×ＳＳＣ ６５℃におけるハイブリダイゼーション、次いで、０．１×ＳＳＣ ６５℃で１時間の洗浄のような一般的なハイブリダイゼーションの条件でＧＭ２１２５Ｆ、ＧＭ２１２７Ｆ、ＧＭ２１５２Ｒ、ＧＭ２１７２Ｒ又はこれらと相補的な配列にハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００１５】
ＧＭ２１２５Ｆ、ＧＭ２１２７Ｆ、ＧＭ２１５２Ｒ及びＧＭ２１７２Ｒの配列又はこれらとそれぞれ相補的な配列と実質的に相同な配列のうち、より好ましい配列としては、上記ＧＭ２１２５Ｆ、ＧＭ２１２７Ｆ、ＧＭ２１５２Ｒ及びＧＭ２１７２Ｒの配列又はこれらとそれぞれ相補的な配列に対して、３’末端側で１〜３塩基の置換若しくは付加、５’末端側で１〜５塩基の置換若しくは付加、又はそれぞれの末端側での１〜５塩基の連続した欠失した配列であって、下記の表１記載のＰＣＲ条件下で増幅可能な配列を挙げることができる。このような実質的に相同な配列であれば、上記ＧＭ２１２５Ｆ、ＧＭ２１２７Ｆ、ＧＭ２１５２Ｒ及びＧＭ２１７２Ｒの配列と同様に、ＰＣＲ技術を含む各種の検出方法に利用することができる。
【００１６】
【表１】
2010046032.tif 000002
【００１７】
従って、下記のいずれかであるポリヌクレオチドは、機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを精度よく検出するための本発明の検出方法に使用される。
（１）  配列番号１で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（２）  配列番号２で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（３）  配列番号３で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（４）  配列番号４で示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【００１８】
また、下記のポリヌクレオチドからなるプライマー対は、機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを特に精度よく検出するためのＰＣＲ法を用いる本発明の検出方法に使用される。
（１）  配列番号１若しくは配列番号３で示される塩基配列又はこれと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（２）  配列番号２若しくは配列番号４で示される塩基配列又はこれと実質的に相同であって機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを認識可能な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【００１９】
本発明の機能性糸状菌検出方法における検出対象としての機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケは、植物病害防除効果があるヒメツブヒトヨタケであることが好ましく、植物病害防除の安定性及び検出精度の観点から、ＧＭ−２１（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３７）であることが好ましい。これらの特に好ましいヒメツブヒトヨタケは、高い植物病害防除機能を有しているため植物病害防除剤として利用されるが、ヒメツブヒトヨタケが適切な量で存在していることがこのような機能を発揮するために必要である。本発明を適用することにより、期待する植物病害防除機能が得られるかどうかの評価を、例えば、後述する定量的ＰＣＲによって、このヒメツブヒトヨタケを正確に検出することにより簡便に行うことができる。これらの糸状菌は、土壌やコンポスト、固体培地等に対して予め接種して増殖させることにより、植物病害防除効果を有する土壌やコンポスト、固体培養物等を構成しうるものである。
【００２０】
本発明における試料は、検出対象としての機能性糸状菌が存在し得る固相、水相、コロイド状、粉体、乾燥物等の試料であれば検出対象として含むことができる。例えば、機能性糸状菌が存在しうる土壌、コンポスト試料、培養物試料及び固定化物試料からなる群より選択された少なくとも１つであってもよい。
【００２１】
本発明におけるコンポストとは、有機廃棄物を腐熟させることによって得られる堆肥である。コンポスト化とは、有機廃棄物中の有機物を微生物の作用により分解処理し、農耕地への施用に適した状態に変化させる工程を意味する。コンポスト化処理とは、一般に、適当な通気及び撹拌条件下に有機物を、所定期間、貯留して、微生物によって発酵させることをいう。本発明において「コンポスト」との語は、腐熟の進行に伴って有機物が完全に分解した完熟状態のものだけでなく、未熟状態のものを指す場合にも用いる。
【００２２】
コンポスト化に用いられる有機廃棄物としては、生ごみ、下水汚泥、及び／又は畜産排泄物等を挙げることができ、魚粉、鶏糞、牛糞、油粕、おがくず、木片、野菜くず、落ち葉、汚泥等が一般に用いられる。
またコンポスト化に用いられる種菌としては、細菌、放線菌など雑多な微生物を含む製剤やコンポスト製品そのものが用いられる。これらのコンポスト化に用いられる種菌は、市販されているものをそのまま利用することができる。
【００２３】
培養物試料は、有機物を栄養源として微生物を培養させた培養物であり、米ぬか、小麦ふすま、おからなどの固体基質の水分を調整し、必要に応じて栄養分も調整して、微生物で発酵させた試料をいう。また、固定化物試料は、微生物と微生物が固定化されうる担体で構成された試料をいう。担体としては、例えば、パーライト、バーミキュライト、ゼオライト、珪藻土、鹿沼土又はこれらの組み合わせのような多孔質、タルク、クレー、炭酸カルシウム又はこれらの組み合わせのような鉱物性粉末、ポリビニルアルコールなどの高分子化合物、ザンタンゴム、アルギン酸又はこれらの組み合わせのような天然高分子化合物などが包含される。
【００２４】
これらの試料は、試料の形態に応じて適宜調製してもよい。例えば、水相の試料の場合には、適度な濃度となるように希釈してもよく、固相、粉体又は乾燥物の場合には、適当な水性媒体に懸濁又は膨潤させてもよい。
また後述するような機能性コンポストを試料として用いてもよい。機能性コンポストについては後述する。
【００２５】
本発明の検出方法では、これらの試料から、上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な核酸試料を調製する調製行程を含むことが好ましい。このような核酸試料を調製する方法としては、例えば、適当な塩濃度の試薬を用いて試料懸濁液を調製し、ＤＮＡを抽出すればよい。これらの試料からのＤＮＡの抽出は、試料の形態に応じて公知の方法を用いることができる。また土壌、コンポスト等の固体試料からの直接ＤＮＡ抽出方法には、市販のキットを用いて行うことができ、例えば、ISOIL for Beads Beating kit（Nippon Gene Co.)等を挙げることができ、当業者には容易に入手可能である。
【００２６】
本発明の機能性糸状菌検出方法は、これらの試料における機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを検出するために上記ポリヌクレオチドの少なくとも１つを用いるものであり、検出に用いる分子生物学的手法の形態に従って、適宜選択することができる。
【００２７】
本発明の機能性糸状菌検出方法に適用可能な分子生物学的な手法としては、例えば、サザンブロットや、ノザンブロット、ドットブロット、in situハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法を用いた各種手法等、当業界で周知の手法を挙げることができる。
【００２８】
これらの手法を用いた検出方法の中でも、検出の精度及び管理の容易性の観点から、本発明の検出方法は、ＧＭ２１２５Ｆ又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ＧＭ２１５２Ｒ又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、で構成された一対のプライマー対を用いて、ＰＣＲを行うことを含むものであることが好ましく、ＧＭ２１２５ＦとＧＭ２１５２Ｒで構成されたプライマー対を用いてＰＣＲを行うことを含むものであることが最も好ましい。
【００２９】
ＰＣＲ法の利用としては、定量的ＰＣＲ法を挙げることができる。一般的な定量的ＰＣＲ法は、試料から調製された核酸試料を一対のプライマーと接触させ、一連のポリメラーゼ連鎖反応条件下で断続的な増幅反応を繰り返す。このときの増幅反応条件は、当業界において技術常識ないし経験則に従って適宜設定すればよい。用いられた一対のプライマー（３’側プライマーと５’側プライマー）の間に相当する特定の断片長の核酸領域が特異的に増幅される。
【００３０】
増幅された核酸が目的とする核酸配列であることは、例えば、その断片長を当業界において周知の方法で確認することができる。このような確認方法としては、電気泳動法や、更にその断片に特異的なプローブ等を用いたハイブリダイゼーション法を挙げることができる。
増幅される核酸の量は、試料中の微生物（本発明では糸状菌）の数量とほぼ相関しているので、その増幅核酸の定量値に基づいて数量を求めることができる。定量的ＰＣＲ法によれば、既知量の核酸の増幅度を指標にして目的核酸の量を知ることができる。
【００３１】
他の方法としてはＦＩＳＨ法を挙げることができる。ＦＩＳＨ法では、プローブを標識化して標識化ＦＩＳＨプローブとし、これを検体試料と混合し、細胞内の標的核酸とＦＩＳＨプローブの結合が行われる条件下でハイブリダイゼーションを行い、蛍光顕微鏡観察下でハイブリダイズしたプローブからの蛍光シグナルが得られるかどうかによって、検出対象を同定し、菌数計測を行うことができる。標識としては、蛍光色素あるいは放射性同位元素、またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等の化学発光物質を挙げることができる。
【００３２】
本発明の検出方法は、ＰＣＲを行う工程の後に、増幅された核酸量から検量線に従って目的とする糸状菌の量を決定することを含む。これにより、目的とする機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケの試料中での有無や、その数量を精度よく知ることができる。
このように本発明の機能性糸状菌検出方法は、精度よく機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを検出することができる。この検出方法はまた同時に、機能性糸状菌を含有する製品の評価方法としても利用可能であり、特に定量的ＰＣＲを用いる場合には、予め機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを接種することによって製造される機能性糸状菌含有製品の評価に好ましく用いることができる。
【００３３】
本発明の機能性糸状菌含有製品の評価方法は、前記機能性糸状菌含有製品に由来する試料に対して、ＧＭ２１２５Ｆ若しくはＧＭ２１２７Ｆ、又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ＧＭ２１５２Ｒ若しくはＧＭ２１７２Ｒ、又はこれと実質的に相同な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、で構成されたプライマー対を用いて定量的ＰＣＲを行うこと、定量的ＰＣＲの結果に基づいて前記機能性糸状菌含有製品中の機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケの存在又は濃度を評価すること、を含む。
【００３４】
上述したようなプライマー対を用いることによって、機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを精度よく検出することができるので、機能性糸状菌含有製品において、接種された機能性糸状菌が維持されているか、また濃度がどのように変化しているかといった評価を精度よく且つ容易に行うことができる。この結果、機能性の高い機能性糸状菌含有製品を適切に管理しながら製造すること、また製造された機能性糸状菌含有製品を保管管理することが容易となる。
【００３５】
用いられるポリヌクレオチドは、上記検出方法と同様に上記のいずれかであってもよいが、ＧＭ２１２５ＦとＧＭ２１５２Ｒとからなるプライマー対であることが、精度よく機能性糸状菌含有製品を評価することができるため、好ましい。
【００３６】
上記評価には、機能性糸状菌含有製品における機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケの存在又は濃度を評価するものであればよく、特定の時点における糸状菌の有無や濃度のみならず、経時的な菌数又は濃度の変化を評価するものであってもよい。
【００３７】
本評価方法における機能性糸状菌含有製品とは、上述した機能性糸状菌が存在しうる製品を意味し、上記検出方法における「試料」として説明したものは、そのまま該当する。また、機能性糸状菌含有製品としては、糸状菌の増殖率の観点及び植物病害防除剤としての効果の観点から機能性コンポストであることが好ましい。
【００３８】
機能性糸状菌含有製品の製造方法としては、例えば所定量の土壌に所定量の機能性糸状菌を接種することにより容易に製造することができる。特に、機能性コンポストの場合には製造効率の面から、以下の製造方法によって得られた機能性コンポストであることが好ましい。
【００３９】
機能性コンポストの好ましい製造方法としては、機能を有する糸状菌を接種すること、前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して選択的に増殖させること、を含む機能性コンポストの製造方法を挙げることができる。
この方法によれば、糸状菌と細菌類との活動環境の違いから、コンポスト内で細菌類よりも糸状菌を選択的に且つ効率よく増殖させることができる。この結果、増殖した糸状菌をコンポストに安定して定着させることができ、機能性コンポストを効率よく製造することができる。
【００４０】
また、機能性コンポストの好ましい他の製造方法としては、糸状菌の生育条件で活動可能な糸状菌共存生育可能細菌類を含むコンポストであって前記糸状菌共存生育可能細菌類以外の細菌類の活動制限状態のコンポストに、機能を有する糸状菌を接種すること、前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して前記糸状菌共存生育可能細菌類と共に選択的に増殖させること、を含む機能性コンポストの製造方法であってもよい。
この方法によれば、糸状菌共存生育可能細菌類以外の細菌類に対しては活動を制限すると共に、糸状菌共存生育可能細菌類と機能を有する糸状菌とを選択的に且つ効率よく増殖させることができる。この結果、機能を有する糸状菌が糸状菌共存生育可能細菌類と共に増殖することによって、機能性コンポスト内では、機能を有する糸状菌と糸状菌共存生育可能細菌類とが協働して環境を形成し、これを維持するため、機能を有する糸状菌にとって有利な環境が機能性コンポスト内に安定して形成される。
【００４１】
コンポストに接種される糸状菌は、糸状菌の菌糸体、胞子体又は子実体であってもよく、これらの粉砕物であってもよい。粉砕にあたっては、そのままでも、乾燥してからでもよいが、好ましくはそのままの状態で、刃物状のもので撹拌するなどして適宜な大きさとすればよい。菌子体をホモジナイザーで粉砕する場合には、一般に、大きいものでも直径３ｍｍ程度であり、多くはそれ以下となる。胞子の場合には胞子一つひとつの大きさであり、子実体であれば、例えば１ｍｍ角の大きさなどとすることができる。勿論、それらの寸法より大きくても細かくてもよいが、細かければ細かい程、均一に接種するのに好都合である。
【００４２】
糸状菌又はその粉砕物をコンポストに接種する際には、糸状菌の生育状態によって異なるが、例えば約８×１０−６ｇ乾燥菌体／ｇ乾燥コンポスト以上、生育安定性の観点から好ましくは約８×１０−４ｇ乾燥菌体／ｇ乾燥コンポスト以上となるように糸状菌又はその粉砕物を接種すればよい。
【００４３】
接種工程では、機能を有する糸状菌を、細菌類の活動制限状態にあるコンポストに接種する。コンポスト内に混在する大多数の細菌や放線菌類（本明細書では、これらを単に「細菌類」と称することがある）と、植物病害防除機能を有する糸状菌とでは、生育及び活動のための環境に対する要求性が異なるので、細菌類が活動制限状態であっても糸状菌が増殖・活動可能な状態の環境とすることで、目的とする糸状菌を選択的に増殖させることができる。
【００４４】
このとき、糸状菌と同一環境下でも活動が可能であり糸状菌と共存することができる細菌類（本明細書では、「糸状菌共存生育可能細菌類」と称する。）が存在していることがさらに好ましい。この糸状菌共存生育可能細菌類は、コンポスト化を行う他の細菌類が活動制限される環境下であっても活動が制限されないので、糸状菌と共にコンポスト内で安定的な菌叢を形成することができる。このような糸状菌共存生育可能細菌類としては、バージバチラス・ハロフィラス（Virgibacillus halophilus）を挙げることができる。バージバチラス・ハロフィラスとしては、バージバチラス・ハロフィラスＩ３０−１株を挙げることができる。この菌株は、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、２００８年５月２８日付けで寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７５）。
【００４５】
本発明における細菌類の活動制限状態とは、コンポスト中の細菌類の活動が制限されて生育、活性が抑制される条件であればよく、例えば、栄養制限状態、ｐＨ制限状態及び水分制限状態からなる群より選択された条件を挙げることができる。これらの各制限条件は、用いられる糸状菌又は細菌類（種菌）の種類や、コンポストの製造を行う環境等に応じて、単独又は２つ以上を組み合わせて適宜選択することができる。
【００４６】
栄養制限状態とは、コンポストの腐熟度が進行して有機廃棄物中の有機物がわずかに残存している所謂「完熟」寸前の状態をいう。このような完熟寸前の状態は、例えばコンポストのＣ／Ｎ比やＣＯ２発生速度の低下（高レベルの炭素変化率）、微生物叢の遷移等によって判定することができる。このような完熟寸前のコンポストでは、栄養状態が非常に乏しいため細菌類の活動が制限されるが、糸状菌は、細菌類の増殖が制限される栄養状態のコンポストであっても増殖することができる。
【００４７】
ＣＯ２発生速度は、コンポスト単位乾燥重量あたり、単位時間あたりのＣＯ２発生量として定義され、重量が既知のコンポスト堆積層への通気速度と排出されるＣＯ２濃度の測定値から容易に求めることができる。なお、ＣＯ２の濃度はフローセル型の赤外吸収式ＣＯ２メータであれば連続測定ができる。また排気ガスを一旦、テドラーバッグのようなプラスチック製バッグに捕集して、ガスクロやガス検知管で測定してもよい。捕集する排気ガス量には特に制限はないが、例えば５Ｌ容のテドラーバッグを用いて捕集可能な量あればよい。
【００４８】
使用可能な完熟寸前のコンポストの一例としては、ＣＯ２発生速度が最大となった後のＣＯ２発生速度が１×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト〜３×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポストのものを挙げることできる。本発明におけるＣＯ２発生速度は、光明理化学工業株式会社製１２６ＳＡ又は１２６ＳＨ、北川式検知管を用いた測定で得られた値を基準とする。
【００４９】
ｐＨ制限状態とは、細菌類の至適ｐＨ条件よりも低いｐＨ状態をいう。このような制限ｐＨ状態としては、例えばｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６を挙げることができる。
【００５０】
水分制限状態とは、細菌類の至適水分率よりも低い水分率の状態をいう。このような水分制限状態としては、例えば水分率２０％〜４０％（質量比）の状態を挙げることができる。水分率は、コンポストを１０５℃、４８時間の条件下で乾燥させた後に、乾燥コンポストの質量を測定することにより得ることができる。
【００５１】
これらの活動制限状態それぞれについては、対象となる糸状菌の生育状態に応じて単独又は組み合わせを適宜選択することができる。これらの活動制限状態は、いずれか１つを律速とすることにより他の条件を緩和することができるが、目的とする糸状菌をより確実に且つ選択的に増殖させることができる観点から、上記の栄養制限状態、ｐＨ制限状態及び水分制限状態からなる群から少なくとも１つを選択することがより好ましく、栄養制限状態とすることが、コンポスト化処理の過程で糸状菌の接種時期を調整することにより簡単に得ることができるため、更に好ましい。
【００５２】
本機能性コンポストの製造方法では、上記のような細菌類の活動制限状態のコンポスト（即ち、後述する糸状菌増殖用コンポスト）を入手することによって行ってもよいが、このようなコンポストを作製する工程を更に含んでいるものであってもよい。
コンポストの作製工程は、有機廃棄物にコンポスト化微生物を接種して培養することにより、有機廃棄物中の有機物を分解させる工程をいう。
【００５３】
原料としての有機廃棄物に微生物を接種すれば、所定期間の培養によって有機物の分解が進行してコンポストが作製されるが、より効率よくコンポスト化を行うには、水分率、ｐＨ等を、コンポスト中の細菌類にとって最適な増殖条件に設定することが好ましい。これにより、細菌類によるコンポスト化を迅速に行うことができる。早期にコンポスト化を行うために水分率及びｐＨ等を細菌類の最適増殖条件に設定してコンポスト化することを、本発明では適宜「高速コンポスト化」という。
【００５４】
このような高速コンポスト化の条件としては、例えば、コンポストの内部の温度、水分率、ｐＨなどを調整することが好ましい。最適活動条件としては、細菌類及び有機廃棄物の種類によって異なるが、一般には通常の好熱性細菌や放線菌の増殖に適した条件であればよく、温度は６０℃付近（例えば、５０〜６５℃）とすることができ、水分率４０％〜６０％、ｐＨ８．０〜ｐＨ８．５の条件を挙げることができる。このような最適条件下の有機廃棄物に種菌を接種して培養することによって、早期に、例えば７日間程度で、上記糸状菌を接種可能なコンポストを得ることができる。
【００５５】
例えば、栄養制限状態のコンポストを得るには、栄養制限状態となるまで有機廃棄物を腐熟させればよい。細菌類の種類及び活動状態並びに細菌数によって異なるが、一般に、細菌類に対する上記最適条件下での培養を５日間〜７日間行うことによって完熟寸前まで腐熟が進行し、栄養制限状態のコンポスト（完熟寸前のコンポスト）を容易に得ることができる。糸状菌の接種は、上述したようにＣ／Ｎ比、ＣＯ２発生速度等を指標に栄養制限状態であることを確認しながら行えばよい。
【００５６】
またｐＨ制限状態のコンポストを得るには、有機廃棄物の腐熟中に適切なｐＨ調整剤を用いてコンポストのｐＨを調整すればよい。このために使用可能なｐＨ調整剤としては、硫酸、塩酸、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム等を挙げることができる。
【００５７】
細菌類の活動制限状態にあるコンポスト内に糸状菌を接種した後、培養して、この糸状菌を選択的に増殖させる（増殖工程）。細菌類の活動制限状態のコンポストでは、細菌類に対する選択圧によって、コンポストに細菌類が存在しているとしても、接種した糸状菌が選択的に増殖する。
【００５８】
このとき、糸状菌共存生育可能細菌類がコンポスト内に存在している場合には、糸状菌が選択的に増殖する際に糸状菌共存生育可能細菌類も同様に選択的に増殖する。この糸状菌共存生育可能細菌類は、糸状菌と共に増殖し且つ糸状菌の機能発揮を阻害しない。また糸状菌共存生育可能細菌類は、増殖によって糸状菌と共に安定した菌叢を形成するので、コンポストが土壌に施用されたときには、土壌中に元々存在する微生物のコンポスト内への侵入を効果的に抑制することができる。これにより、本発明の機能性コンポストを土中に使用しても機能性糸状菌を安定に存在させることができる。
【００５９】
培養温度は、細菌類の活動制限状態が継続可能となるように行うことが好ましく、例えば１０℃〜３５℃とすることができ、２０℃〜３５℃がより好ましく、２７℃〜３０℃が特に好ましい。３５℃以下であれば、細菌類の増殖を効果的に抑制でき、一方、１０℃以上であれば糸状菌の適度な増殖速度を維持することができる。また培養は通気条件下であればよく、ｐＨは４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とすることができる。
【００６０】
培養期間は、目的とする糸状菌がコンポスト内で充分増殖するのに必要な期間であればよく、例えば５日間〜７日間とすることができる。この間に、糸状菌による有機物の分解も進行し、栄養制限状態のコンポストを用いた場合には培養期間終了と同時に完熟したコンポストも得ることができる。
培養期間終了後のコンポストでは、糸状菌が充分に存在している。一例として、乾燥コンポスト１ｇあたりのＤＮＡ量として約５μｇ／ｇ乾燥コンポスト程度以上、好ましくは３０μｇ／ｇ乾燥コンポスト以上とすることができる。
【００６１】
このようにして得られる機能性糸状菌含有製品は、機能性糸状菌として機能性糸状菌ヒメツブヒトヨタケを含むので、植物病原性糸状菌がリゾクトニア属及びフザリウム属の少なくとも一方に属する糸状菌である場合に、特に顕著な植物病害防除効果を発揮できる。本発明の植物病害防除剤を使用可能な植物病害としては、チンゲンサイ尻腐病、シバ葉腐病、メロンつる割病、トマト根腐萎凋病等を挙げることができる。
【００６２】
この機能性糸状菌含有製品を使用する場合には、一般に、対象となる土壌、培地、培養土に適当量混合すればよい。例えば、植物病害防除対象となる植物の場合には、植物の根元付近の土壌、培地や培養土に混合する。このときの混合比については病原菌の濃度などの相対的条件によって変化するが、一般に、植物病害防除機能を有する糸状菌をＤＮＡ量として５μｇ／ｇ乾燥コンポストの菌体量で適当量、例えば１〜２０質量％程度土壌中に混合することが望ましい。
【００６３】
また本発明に用いられる細菌類の活動制限状態にあるコンポストは、糸状菌を効率よく増殖させることができるので、本発明おける機能性糸状菌を接種する材料として好適である。本糸状菌増殖用コンポストに含まれる糸状菌共存生育可能細菌としては、前述したようにバージバチラス・ハロフィラスであることが好ましく、例えばバージバチラス・ハロフィラスＩ３０−１株とすることができる。
【００６４】
この糸状菌増殖用コンポストにおける細菌類の活動制限状態とは、前述した事項がそのまま該当し、栄養制限状態、ｐＨ制限状態及び水分制限状態からなる群より選択された少なくとも１つを挙げることができる。また、このような活動制限状態であれば、細菌類の活動を制限すると共に、糸状菌を選択的に増殖させることができる。
【００６５】
従って、このような糸状菌増殖用コンポストから機能性糸状菌含有製品を作製する工程に本発明の評価方法を適用することによって、製造工程途中での品質管理、出荷時の品質管理だけでなく、製品保存中の品質管理などを簡便に且つ精度よく行うことができ、高い機能性を有する機能性糸状菌含有製品を安定して提供することができる。
【実施例】
【００６６】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００６７】
［実施例１］
（１）ＧＭ−２１株用のプライマーの設計
ＧＭ−２１株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３７）の１８Ｓ（一部）、ＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２、２６Ｓ（一部）の塩基配列（図１）と、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）より取得した種々の糸状菌の塩基配列を、Clustal X(http://www.clustal.org/#Download）を用いてアライメントを行い、保存性の低い領域をＧＭ−２１株の塩基配列の中から選別した。
なお、比較した糸状菌は、Aspergillus fumigatus（NBRC No. 5840)、Chaetomium thermophilum （NBRC No. 30073、No. 30072）、Talaromyces bacillisporus（NBRC No. 8397）、Mycogone rosea （NBRC No. 8882）、Humicola grisea（NBRC No. 9854, No. 4868）、Penicillium argillaceum (NBRC No. 31128）などであった。
【００６８】
この領域に対して、増幅サイズは８０〜１５０ｂｐ、プライマーの長さは１７〜２５塩基、ＧＣ含量は４０〜６０％（部分的にＧＣ、ＡＴリッチができないように、３’末端では特に注意する）、Ｔ／Ｃ又はＡ／Ｇが連続しない、プライマー内部・プライマー間で３塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー３’末端が２塩基以上相補する配列を避けることなど、一般的に用いられる基準を考慮し、Primer 3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)を用いて候補を得た。これらの候補のうち、アニール位置やプライマー長等を適宜修正することによって改変し、本発明のプライマーセットを含む下記プライマーセットＡ〜Ｆを得た（表２参照）。
【００６９】
【表２】
2010046032.tif 000003
【００７０】
（２）最適プライマーの選定Ｉ（Ｃｔ値による比較）
菌体濃度をＤＮＡ濃度として定量するためにリアルタイムＰＣＲ法を適用する。リアルタイムＰＣＲ用の装置はSmart Cycler II（タカラバイオ株式会社）を用い、ＰＣＲ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡの増幅量をリアルタイムでモニタリングし、蛍光強度の２回微分分析によってサイクル数であるＣｔ値を求めた。Ｃｔ値と初期鋳型ＤＮＡ量の間には相関関係があるので、あらかじめ検量線を作成しておくことで、サンプル中のＤＮＡ濃度を求めることができる。
【００７１】
リアルタイムＰＣＲ装置としてはSmart Cycler II（タカラバイオ株式会社）、TaqとしてSYBR Premix Ex Taq（タカラバイオ株式会社）、インターカレーターとしてSYBR Green Iを用い、リアルタイムＰＣＲ反応をおこなった。ＰＣＲ反応の溶液組成を表３に示す。６種類のプライマー、プライマーＡからＦを用い、増幅条件は、最初に９５℃、１０ｓの変性を行った後に、９５℃、５秒（変性）、６０℃、２０秒（アニーリング・伸張）を４０サイクルとした（表４参照）。ＰＣＲ反応溶液組成、増幅条件はメーカー推奨のものを用いた。
【００７２】
【表３】
2010046032.tif 000004
【００７３】
【表４】
2010046032.tif 000005
【００７４】
まず、プライマーがＧＭ−２１株に効率的にアニールするか確認するために、ＧＭ−２１株ＤＮＡ濃度を６７．９ｎｇ／ｍＬとしてリアルタイムＰＣＲ反応をおこなった。
ＧＭ−２１株の培養はポテトデキストロース培地（ＰＤ培地）を用い、２５℃で３日間培養した。ＧＭ−２１株ＤＮＡの抽出・回収には、ISOIL for Beads Beating kit（Nippon Gene Co.)を、また、ＤＮＡ精製にはMicrospin S-300 HR Columns(GE Healthcare UK Ltd., Buckinghamshir, England)を用いた。なお、ＤＮＡ濃度はQuant-tiTM PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen Corporation）を用いて測定した。これらはいずれもメーカーのマニュアルに従って操作した。結果を図２に示す。
【００７５】
図２に示されるように、プライマーセットＡ、Ｂ及びＦはいずれもＣｔ値が１９サイクル程度となり、適正な増幅効率であることが確かめられた。
これに対してプライマーセットＣ、Ｄ及びＥの場合にはＣｔ値が大きく増幅の効率がよくないことわかった。
【００７６】
（３）最適プライマーの選定II（超純水を用いたＣｔ値による比較）
次にプライマーが誤検出をおこしやすい構造か確かめるためにＤＮＡを含まない超純水（ミリＱ）をサンプルとして用いて上記（２）と同様にして、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。この方法での評価では、一般にＣｔ値が３０サイクル付近以上となったときには非特異的増幅であって有効な増幅とは認められと評価することができ、一方、超純水に対して増幅が認められないことは、誤検出しないと評価することができる。結果を図３に示す。
【００７７】
図３に示されるように、３０サイクル以上のプライマーセットＢ〜Ｅは、純水に対しては増幅しないということができ、一方、全く増幅が見られなかったプライマーセットＡでは誤検出しない精度の高いものということができる。
従って、前記（２）を合わせてプライマーセットＡ及びＢは良好なプライマーセットであると判定することができ、とりわけプライマーセットＡは優れたプライマーセットであることが示された。
【００７８】
（４）プライマーセットＡを用いた定量的検出
プライマーセットＡを用いたリアルタイムＰＣＲによってＧＭ−２１株ＤＮＡの定量精度の確認を行った。
ＧＭ−２１株より抽出した濃度１５８３ｎｇ／ｍＬのＤＮＡを１０−８倍まで８段階希釈したものを用い、上記（２）と同様の方法でリアルタイムＰＣＲ反応をおこなった。結果を図４に示す。
【００７９】
図４に示されるように、ＧＭ−２１株ＤＮＡが適当量あれば、プライマーセットＡによる検出が可能であることがわかった。
また、ＤＮＡ濃度が１５．８３ｐｇ／ｍＬ以上（Ｃｔ値が２８サイクル以内）であれば直線性があり、正確な定量ができることが示された。この場合の相関係数を表す直線のＲ２値は０．９９７３であり、十分な定量性があるとわかった。なお、ＰＣＲ増幅効率は約８８．２％であり、ＤＮＡの増幅効率は十分に高いことがわかった。
【００８０】
［実施例２］
複数の糸状菌が存在している環境下での定量性
１．５８ｎｇ／ｍＬのＧＭ−２１株ＤＮＡ溶液と、１２９．６ｎｇ／ｍＬのRhizoctonia属糸状菌、Rhizoctonia solani Pak-choi 2のＤＮＡ溶液を等量で混合し、上記（２）と同様にプライマーセットＡを用いたリアルタイムＰＣＲ反応をおこなった。
【００８１】
その結果、プライマーセットＡによるＣｔ値は２６．１６となり、図４の検量線からＧＭ−２１株ＤＮＡ濃度は０．７３２ｎｇ／ｍＬと計算された。上記（４）で示されたＤＮＡ混合溶液中のＧＭ−２１株ＤＮＡ濃度は０．７９ｎｇ／ｍＬである。
従って、ＧＭ-２１株以外の糸状菌由来ＤＮＡがサンプル中に共存する場合でもＧＭ-２１株ＤＮＡのみを正確に定量できることがわかった。
【００８２】
［実施例３］
（１）近縁種に対する特異性
プライマーセットＡがＧＭ−２１株と近縁のCoprinellus属、およびPsathyrella属糸状菌を識別するのに有効か検討した。
特異性試験にはCoprinus disseminatus （イヌセンボンダケ）、Coprinus cinereus（ウシグソヒトヨダケ）、Psathyrella candolliana（イタチタケ）、Psathyrella velutinaの株を用いた（表５参照）。いずれもポテトデキストロース培地（ＰＤ培地）を用い、２５℃で３日間培養した後、実施例１（２）と同様の方法で、ＤＮＡを抽出・回収し、精製して、プライマーセットＡを用いたリアルタイムＰＣＲを実施した。
結果を図５に示す。プライマーセットＡはＧＭ−２１株と近縁のCoprinellus属、およびPsathyrella属糸状菌とを識別可能であることがわかった。
【００８３】
（２）コンポスト中に普通に存在する糸状菌に対する特異性
プライマーセットＡがＧＭ−２１株とコンポスト中の普通に存在する糸状菌を識別するのに有効か検討した。
特異性試験にはコンポスト中の普通に存在する糸状菌としてAspergillus fumigatus、Penicillium argillaceum、Mycobone rosea、Talaromyces bacillisporus、Humicola grisea、Chaetomium thermophilum var. coprophilumの株を用いた（表５参照）。培養は表５に示した条件でいずれも３日間行い、実施例１（２）と同様の方法で、ＤＮＡを抽出・回収し、精製して、リアルタイムＰＣＲを実施した。
結果を図５に示す。プライマーセットＡはＧＭ−２１株とコンポスト中の普通に存在する糸状菌とを識別可能であることがわかった。
【００８４】
（３）土壌中の病原菌に対する特異性
プライマーセットＡがＧＭ−２１株と土壌中の病原性糸状菌を識別するのに有効か検討した。
病原性糸状菌としてチンゲンサイ尻腐病の病原菌（Rhizoctonia solani Pak-choi 2）、トマト根腐れ萎凋病の病原菌（Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici FO-To-3）、メロンつる割病の病原菌（Fusarium oxysporum f. sp. melonis FO-Me-2）、シバ葉腐病の病原菌（Rhizoctonia solani Kuhn AG2-2 K1）、レタスすそ枯病の病原菌（Rhizoctonia solani lettuce 2）を用いた（表５参照）。いずれもポテトデキストロース培地（ＰＤ培地）を用い、２５℃で３日間培養した後、実施例１（２）と同様の方法で、ＤＮＡを抽出・回収し、精製して、プライマーセットＡを用いたリアルタイムＰＣＲを実施した。
【００８５】
Ｃｔ値は有効な増幅とは認めない３０サイクル以上となったので、プライマーセットＡはこれらの土壌中の病原性糸状菌に対しては反応しないということができ、プライマーセットＡはＧＭ−２１株と土壌中の病原性糸状菌とを識別可能であることがわかった。
【００８６】
（４）土壌中に普通に存在する糸状菌に対する特異性
プライマーセットＡがＧＭ−２１株と土壌中に普通に存在する糸状菌とを識別するのに有効か検討した。
特異性試験には土壌中の普通に存在する糸状菌として研究室で単離したPenicillium sp. MY1、Aspergillus niger MTP-1、Mucor sp. MY 2、Rhizopus oryzae YAN1を用いた（表５参照）。いずれもポテトデキストロース培地（ＰＤ培地）を用い、２５℃で３日間培養した後、実施例１（２）と同様の方法で、ＤＮＡを抽出・回収し、精製して、プライマーセットＡを用いたリアルタイムＰＣＲを実施した。
【００８７】
Ｃｔ値は有効な増幅とは認められない３０サイクル以上となったので、プライマーセットＡはこれらの土壌中の普通に存在する糸状菌に対しては反応しないということができ、プライマーセットＡはＧＭ−２１株と土壌中の普通に存在する糸状菌とを識別可能であることがわかった。
【００８８】
【表５】
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【００８９】
［実施例４］
（１）  コンポストの製造
原料は市販の油粕コンポスト（油かす：富士見園芸株式会社製）を用いた。初期ｐＨを７．８６、含水率を６０％に調整して種菌（オーレスＧ：松本微生物研究所製）を乾燥重量比で１９：１となるように油粕コンポストに接種し、得られたコンポスト混合原料を、１ミニリアクタ当り１５ｇ投入してコンポスト化を行った。
条件は０〜１２時間かけて３０℃から６０℃まで昇温し、１９２時間まで６０℃で高速コンポスト化した。この高速コンポスト化後の油粕コンポスト試料を、以下のＧＭ−２１株検出試験に用いた。
【００９０】
（２）コンポスト・土壌にＧＭ−２１株を接種して検出
純粋培養したＧＭ−２１株をコンポスト、あるいは土壌（静岡大学工学部内花壇の土壌）に一定濃度接種して回収できるか確かめた。ＧＭ−２１株はＰＤ液体培地２００ｍＬを用いて３５℃で３日間振盪培養した。培養後ホモジナイズ処理したＧＭ−２１株懸濁液１ｍＬを、ＤＮＡ量として１／１０量となるように、上記（１）で作成した高速コンポスト化後の油粕コンポスト試料および土壌試料９ｇに接種し、十分に混合した。次いで、ＧＭ−２１株懸濁液、ＧＭ−２１株を接種した高速コンポスト化後の油粕コンポスト試料および土壌から、実施例１（２）と同様にして、ISOIL for Beads Beating kit (Nippon Gene Co., Ltd., Toyama) を用いてそれぞれＤＮＡを抽出・回収し、Microspin S-300 HR Columns(GE Healthcare UK Ltd., Buckinghamshir, England)を用いて精製して、プライマーセットＡを用いたリアルタイムＰＣＲを実施した。
【００９１】
ＤＮＡ量として１／１０量となるようにＧＭ−２１株接種懸濁液（平均ＤＮＡ量：１８９ｎｇ／ｍＬ）を接種された高速コンポスト化後の油粕コンポスト中の平均ＤＮＡ量は、１２．７ｎｇ/ｇ-湿潤コンポストとなり、ほぼ１／１０量となった（図６参照）。
また、土壌試料についても、１／１０濃度になるようにＧＭ−２１株接種懸濁液を接種された土壌試料中のＤＮＡ濃度は、高速コンポスト化後の油粕コンポストと同様に、ほぼ１／１０量となった。
この結果、プライマーセットＡはコンポスト、あるいは土壌に一定濃度接種したＧＭ−２１株を定量可能であることが確かめられた。
【００９２】
［実施例５］
（１）  機能性コンポストの製造
実施例４と同様に市販の油粕コンポストを用いて、１９２時間まで６０℃で高速コンポスト化した。８日（１９２時間）経過後、コンポストの一部を１２１℃、９０ｍｉｎの条件でオートクレーブを用いて滅菌処理した。
【００９３】
滅菌していないコンポストと滅菌したコンポストを適宜混合し、細菌類濃度が１０６ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポスト、１０３ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポストとなるように調整したそれぞれの試料のｐＨを、１０容量％の硫酸を用いて人為的にｐＨ６付近に調節した。次いで、事前にＰＤ液体培地を用いて３５℃、１１０ｒｐｍの条件で３日間振盪培養したＧＭ−２１株（０．００６８ｇ乾燥菌体／ｍＬ）を各試料に１ｍＬ接種して、最終濃度０．００１１３ｇ乾燥菌体／ｇ乾燥コンポストとした。
【００９４】
このように細菌類濃度を１０６ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポスト、および１０３ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポストに変化させＧＭ−２１株を接種したそれぞれの試料を、３０℃で５日間培養してコンポスト化を行い、機能性コンポスト試料１及び２を得た。なお、この機能性コンポスト試料には、ＧＭ−２１株接種前のコンポストのときからＧＭ−２１株と共存生育可能な細菌類が含まれている。この機能性コンポスト試料を、以下のＧＭ−２１株検出試験に用いた。
【００９５】
コンポスト化終了後、機能性コンポスト試料１及び２それぞれの細菌類濃度を希釈平板法（ＴＳ培地、３０℃）によって測定した。また、細菌類が高濃度に存在するコンポスト中のＧＭ−２１株濃度を、実施例１（２）と同様にプライマーセットＡを用いたリアルタイムＰＣＲ法によって測定した。図７は、コンポスト化における細菌類濃度の経時的変化を示している。
【００９６】
図７に示されるように、ＧＭ−２１株接種時の細菌類濃度は、機能性コンポスト試料１の場合では１０６ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポスト、機能性コンポスト試料２の場合では１０３ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポスト程度であったが、機能性コンポスト試料１及び２はいずれも、コンポスト化終了時には１０９ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポスト以上と高濃度になっていた。
【００９７】
＜コンポスト中のＧＭ−２１株濃度の確認＞
上記機能性コンポスト試料１及び２の製造工程におけるＧＭ−２１株濃度を、リアルタイムＰＣＲ法を用いて測定した。測定方法は実施例１（２）と同様にしてISOIL for Beads Beating kit (Nippon Gene Co., Ltd., Toyama) を用いて、ＤＮＡを抽出・回収し、Microspin S-300 HR Columns(GE Healthcare UK Ltd., Buckinghamshir, England)を用いて精製して、プライマーセットＡを用いたリアルタイムＰＣＲを実施した。結果を図８に示す。
【００９８】
図８には、コンポスト化におけるＧＭ−２１株濃度の経時変化が示されている。
図８に示されるように、機能性コンポスト試料２の場合、ＧＭ−２１株接種時に比べて培養終了時には１００倍以上にＧＭ−２１株が増殖していた。このように、本実施例の機能性コンポスト試料の場合、細菌類の生存下で試料へのＧＭ−２１株の接種を行っても、ＧＭ−２１株が増殖可能であることが明らかであった。また、ＧＭ−２１株は、ＧＭ−２１株接種時の細菌類の量に変わりなく増殖可能であることも明らかであった。
【００９９】
さらに、本実施例ではＧＭ−２１株を接種する際に試料を一部滅菌して用いたが、滅菌をまったく行わない高速コンポスト化後の試料にＧＭ−２１株を接種しても、同様にＧＭ−２１株の増殖が認められた。
従って、ＧＭ−２１株接種時に細菌類が存在しても、コンポスト化条件を制御すればＧＭ−２１株が共に増殖していくことがわかった。プライマーセットＡは機能性コンポスト製造過程で接種したＧＭ−２１株の経時変化を定量可能であることが確かめられた。
【０１００】
このように本発明の配列番号１及び配列番号２から構成されたプライマーセットを用いることによって、機能性糸状菌を精度よく検出することができることがわかった。また、機能性糸状菌を含む試料の評価を同様に精度よく行うことができることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明のプライマーセットを得るために使用したＧＭ−２１株の配列である。
【図２】本発明の実施例１にかかるＧＭ−２１株を用いたリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例１にかかる超純水サンプルを用いたリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例１にかかるＧＭ−２１株濃度とプライマーセットＡによるリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との関係を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例３にかかる異なる種類の微生物とプライマーセットＡによるリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例４にかかるＧＭ−２１株接種懸濁液、コンポスト中のＧＭ−２１株濃度をリアルタイムＰＣＲで測定したグラフである。
【図７】本発明の実施例５にかかる機能性コンポスト製造工程におけるコンポスト内の細菌類濃度の変化を経時的に示したグラフである。
【図８】本発明の実施例５にかかる機能性コンポスト製造工程におけるコンポスト内のＧＭ−２１株濃度の変化を経時的に示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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