(57)【要約】【課題】従来技術において開示されるような、ＡＮＰおよびＢＮＰの天然形態およびＡＮＰ配列およびＢＮＰ配列の改変形態よりもすぐれた半減期を有する長時間持続性ナトリウム排泄増加性ペプチドを提供すること。【解決手段】本発明は、長時間持続性のナトリウム排泄増加性ペプチド（ＮＰ）誘導体に関する。ＮＰ誘導体は、ＮＰペプチドおよびＮＰペプチドに結合した反応性実体を有する。この反応性実体は、血液成分上で官能基と共有結合し得る。特に、本発明は、延長されたインビボ半減期を有するＮＰ誘導体、および心臓血管の疾患および障害（例えば、急性非代償性うっ血性心不全（ＣＨＦ）および慢性ＣＨＦ）の処置方法に関する。本発明に従って、ネイティブのＡＮＰまたはネイティブのＢＮＰのうちの１つと比較したときのインビボ半減期が伸長されているＮＰ誘導体を新たに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ナトリウム排泄増加性（ナトリウム利尿性）ペプチド（ＮＰ）誘導体に関する。特に、本発明は、心臓血管性疾患および心臓障害（例えば、代償性不全による鬱血性心不全（ＣＨＦ）および慢性ＣＨＦ）、腎臓障害、および他の疾患ならびに障害の処置のための、延長されたインビボでの半減期を有するＮＰ誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ナトリウム排泄増加性ペプチドファミリーは、以下の４つの構造的に関連したポリペプチドホルモンを含む：心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）、脳ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＣＮＰ）および、近年発見されたＤｅｎｄｒｏａｓｐｉｓナトリウム排泄増加性ペプチド（ＤＮＰ）（Ｙａｎｄｌｅ，１９９４；Ｗｉｌｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎ，１９９８）。
【０００３】
ＡＮＰおよびＢＮＰは、ナトリウム排泄増加、利尿、血管拡張、抗高血圧（ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、レニン阻害（ｒｅｎｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）、抗有糸分裂および変弛緩特性（ｌｕｓｉｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ；心臓律動の弛緩の増大）を媒介する。ＣＮＰは、ナトリウム排泄増加性作用を欠くが、血管拡張活性および成長阻害活性を保持している（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｎｅｔｔ，２０００）。総じて、このナトリウム排泄増加性ペプチドファミリーは、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系の効果を相殺する（Ｅｓｐｉｎｅｒ  １９９４，Ｗｉｌｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。ＡＮＰおよびＢＮＰは、血管緊張、アルドステロン分泌、尿細管ナトリウム再吸収および血管細胞増殖に対するアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）の効果の生理学的アンタゴニストであることが示されている（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｗｉｌｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。さらに、バソプレッシンの分泌（Ｏｂａｎａ  ｅｔ  ａｌ．１９８５）およびエンドセリン−１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１）の分泌（ＥＴ−１）（Ｓａｉｊｏｎｍａａ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）は、ＡＮＰによって低減される。
【０００４】
ＡＮＰおよびＢＮＰは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しないが、ＡＮＰおよびＢＮＰは、中枢神経系の近傍領域（すなわち、弓隆回下部（ｓｕｂｆｏｍｉｃａｌ  ｏｒｇａｎ）および視床下部）に達する。脳でのＮＰの作用は、末梢における作用を強化する。ナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターが、ＢＢＢによって血液と分離されていない第３の室（ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）に隣接する領域、局所的に産生されたペプチドと同様に循環するＡＮＰの結合を可能にする部分で存在する（Ｌａｎｇｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  ｉｎ  Ｋｅｌｌｙ  Ｒ．ａｎｄ  Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓ  Ａ．Ｄ．，２００１）。
【０００５】
ナトリウム排泄増加性ペプチドの生物学的効果は、細胞膜レセプターの結合および活性化を経て媒介され、この細胞膜レセプターの結合および活性化によって、標的細胞中での環状ＧＭＰの産生が生じる。これらとしては、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）、ｃＧＭＰ依存性イオンチャネルおよびｃＧＭＰ調節性ホスホジエステラーゼ（Ｌｉｎｃｏｌｎ  ＆  Ｃｏｒｎｗｅｌｌ  １９９３，ｄｅ  Ｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）が挙げられる。
【０００６】
ナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターの３つのサブタイプが記載されている：ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃ。ＮＰＲ−ＡおよびＮＰＲ−Ｂは、グアニリルシクラーゼであり、これよって、そのリガンドは、環状グアノシンモノホスフェート（ｃＧＭＰ）の産生を誘導する（総説としては、Ｍａａｃｋ  １９９２，Ａｎａｎｄ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ＆  Ｔｒａｃｈｔｅ  １９９３を参照のこと）。ＮＰＲ−Ａは、ＡＮＰおよびＢＮＰの効果のうち多くを媒介するもと考えられる（Ｍａａｃｋ  １９９２，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＆  Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓ  １９９４）が、ＣＮＰは、ＮＰＲ−Ｂレセプターを介して作用する（Ｋｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｃｈｅｎ  ＆  Ｂｕｒｎｅｔｔ
１９９８）。ＮＰＲ−Ｃは、３つ全てのナトリウム排泄増加性ペプチドに対するクリアランスレセプターであり、これは、代替的な経路でシグナル伝達し得る（Ａｎａｎｄ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｌｅｖｉｎ  １９９３）。
【０００７】
ＡＮＰは、（アミノ末端から６アミノ酸およびカルボキシ末端の５アミノ酸の）２つのシステイン残基の間で分子内のジスルフィド架橋（結合）によって形成される１７アミノ酸のループを有する２８アミノ酸ペプチドである。ＡＮＰの構造（このファミリーのなかで、初めて同定されたメンバーである）は、１９８４年に最初に記載されていた（Ｋａｎｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）。心房が、ＡＮＰ遺伝子発現の最も高いレベルを示した。つまり、総ＲＮＡのうちの１％が、ＡＮＰをコードしている。ＡＮＰ  ｍＲＮＡはまた、心房でのレベルの１％で心室でも見出される。ＡＮＰを含む心臓でない部分としては、脳、下垂体の前葉、肺、および腎臓が挙げられる（Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎ，１９９８）。
【０００８】
ＢＮＰは、（アミノ末端から９アミノ酸およびカルボキシ末端の６アミノ酸の）２つのシステイン残基の間で分子内のジスルフィド架橋（結合）によって形成される１７アミノ酸のループを有する３２アミノ酸ペプチドである。ＢＮＰ（ＮＰファミリーのなかで、２番目に同定されたメンバーである）は、その名称が指し示すようにブタ脳の抽出物内で１９８８年に初めて検出された（Ｓｕｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。しかし、ＡＮＰと同様に、脳および羊膜（Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎ，１９９８）のみならず本来的には心室の心筋で発現されるものであることがその後示された（Ｍｉｎａｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｈｏｓｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。ＡＮＰと同様に、ＢＮＰは、その心臓が伸縮したときにその循環流中に放出される（Ｋｉｎｎｕｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。単離された灌流された心臓（Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１９９１）からならびに、ヒトにおけるインビボおよび組織（Ｍｕｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９１）からの、ＢＮＰ分泌の直接的な研究は、心臓性ＢＮＰ分泌の６０〜８０％が、その心室から生じることが示される。
【０００９】
ＡＮＰは、高血圧および肺血管内高血圧（Ｖｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）、喘息、腎不全、心不全、および放射線診断（ｒａｄｉｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）のようないくつかの治療用途を有することが示されている（Ｒｉｂｏｇｈｅｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９８）。
【００１０】
ＢＮＰは、以下のようなものに対するいくつかの治療用途を有することが示されている：高血圧、喘息および炎症性疾患（Ｉｖａｘ  Ｃｏｒｐ．，２００１）、高コレステロール血症（ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ，２０００）、嘔吐（ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ，１９９６）、勃起機能障害（Ｉｖａｘ  Ｃｏｒｐ．，１９９８）、腎不全（Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、心不全およびその診断（Ｍａｒｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、固形腫瘍処置（ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ，１９９９）および転移性乳癌におけるプラクリタキセル（ｐｌａｃｌｉｔａｘｅｌ）に伴う一般的な毒性および著しい毒性に対する防御（Ｈａｕｓｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ，２００１）。
【００１１】
ＡＮＰよびＢＮＰの投与について、克服すべき主要な問題の１つは、それらの速い血液循環クリアランスである。ヒトＡＮＰは、１〜５分間のインビボ半減期を有しており（Ｗｏｏｄｓ，１９８８；Ｔｏｎｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）；そして、ヒトＢＮＰは、１２．７分間のインビボ半減期を有している（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。以下の３つの独立した機構は、ＡＮＰおよびＢＮＰの迅速なクリアランスについての原因である。：１）ＮＰＲ−Ｃに対して結合、その後の内部移行およびリソソームでのタンパク質分解；２）ＤＰＰ  ＩＶ、ＮＥＰ、ＡＰＡ、ＡＰＰおよびＡＣＥのようなエンドペプチダーゼによるタンパク質分解性切断；および３）腎分泌。ウロジラチン（ｕｒｏｄｉｌａｔｉｎ）、つまり、ＡＮＰのアミノ末端伸長形態であることがみだされたナトリウム排泄増加性ペプチドによって、Ｎ末端における４つの追加残基の存在のみで、酵素的な分解に対してより高い耐性が与えられること知られている（Ｋｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。それにもかかわらず、ウロジラチンは、およそ６分間というインビボ半減期を有するのみである（Ｃａｒｓｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【００１２】
ＡＮＰにおける数個の誘導体、アナログ、短縮形態、伸長形態または構築物が、ＡＮＰのネイティブ形態の有効性および／または半減期を改善するために提案および／または特許取得がなされており、そして、この関連する従来技術の参考文献は、以下に列挙される。
【００１３】
はじめに、ネイティブヒトＡＮＰは、米国特許第５，３５４，９００号に開示され、そして、権利主張されている。そのネイティブＡＮＰ配列のより長いかまたはより短いアミノ末端またはカルボキシ末端を有するペプチドが、米国特許第４，６０７，０２３号、同第４，９５２，５６１号、同第４，４９６，５４４号および同第６，０１３，６３０号に開示される。カルボキシ末端およびそのループの一部分を含むネイティブＡＮＰのフラグメントが、米国特許第４，６７３，７３２号に開示される。ＡＮＰのダイマーが、米国特許第４，６５６，１５８号および日本国での出願６２，２８３，９９６号において提案されている。様々なＡＮＰ構築物が、日本国出願第０４，０７７，４９９号、米国特許第５，２４８，７６４号および出願ＷＯ  ０２／１０１９５において提案されている。
【００１４】
アミノ酸末端テイル、カルボキシ末端テイル、またはループの切断、それらのテイルの伸長、それらのテイルの一方にアルキル基を加えること、テイルまたはループにおけるアミノ酸置換および／あるいは別の架橋基によるシステインの置換を伴うＡＮＰ配列は、米国特許第４，９３５，４９２号、同第４，７５７，０４８号、同第４，６１８，６００号、同第４，７６４，５０４号、同第５，２１２，２８６号、同第５，２５８，３６８号、同第５，６６５，７０４号、同第５，８４６，９３２号、欧州特許出願第０，２７１，０４１、同第０，３４１，６０３号、国際公開ＷＯ  ９０／１４３６２、米国特許第５，０９５，００４号、同第５，３７６，６３５号、欧州特許出願第０，３５０，３１８号、欧州特許出願第０，２６９，２９９号、米国特許第５，２０４，３２８号、同第５，０５７，６０３号、欧州特許出願第０，２４４，１６９号、米国特許第４，８１６，４４３号、カナダ特許１，２６７，０８６号、欧州特許出願第０，３０３，２４３号、米国特許第４，８６１，７５５号、同第５，３４０，９２０号、日本国出願０５，２８６，９９７号、米国特許第４，６７０，５４０号、および同第  ５，１５９，０６１号において提唱されている。ＡＮＰのループ部分とある程度の類似性を有するそれらの一部分を有する線状ペプチドが、米国特許第５，０４７，３９７号、同第４，８０４，６５０号および同第５，４４９，６６２号に開示される。
【００１５】
また、ＢＮＰの数個の、誘導体、アナログ、短縮形態、伸長形態および構築物が、ＢＮＰのネイティブ形態の有効性および／または半減期を改善することについて、提案され、そして／または、特許取得される。それらの関連従来技術の参考文献が、本明細書中の以下に列挙される。
【００１６】
ネイティブヒトＢＮＰ、そのアミノ末端短縮形態およびカルボキシ末端短縮形態、ならびにアミノ末端伸長配列が、５，６７４，７１０に開示され、そして権利主張される。
【００１７】
いくつかのグループが、ＢＮＰが酵素的分解を避けるため、またはＢＮＰの活性を増大するために、ネイティブヒトＢＮＰ配列の様々な改変を提案している。それらの改変は、ＵＳ特許第５，１１４，９２３号、同第５，９４８，７６１号、同第６，０２８，０５５号、同第４，９０４，７６３号、日本国出願第０７，２２８，５９８号および出願ＷＯ  ９８／４５３２９に開示されるように、以下の改変のうちの１以上を含む：アミノ末端テイルの短縮；そのカルボキシ末端テイルの短縮；プレプロ（ｐｒｅｐｒｏ）配列またはそれらのフラグメントを用いたアミノ末端の伸長；アミノ末端テイルまたはカルボキシ末端でのアルキル基の添加；およびそれらのテイルまたはループにおけるアミノ酸置換。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上述のＡＮＰ配列およびＢＮＰ配列の全ては、迅速なクリアランスを有する。従来技術において開示されるような、ＡＮＰおよびＢＮＰの天然形態およびＡＮＰ配列およびＢＮＰ配列の改変形態よりもすぐれた半減期を有する長時間持続性ナトリウム排泄増加性ペプチドに対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の要旨）
本発明に従って、ネイティブのＡＮＰまたはネイティブのＢＮＰのうちの１つと比較したときのインビボ半減期が伸長されているＮＰ誘導体を新たに提供する。より具体的には、本発明のＮＰ誘導体は、インビボまたはエキソビボで、それと結合する反応性実体を有し、そして血液成分上の利用可能な官能基と反応し得る、安定した共有結合を形成し、そして、ＮＰペプチド−血液成分結合体を提供し得るＮＰペプチドを含む。血液成分と結合体化すると、このＮＰペプチドは、ＮＥＰのような内因性酵素による所望しない切断が妨げられ、そして、最も起こるのは、大量の血液クリアランスの原因となっているＮＰＲ−Ｃレセプターに対する結合が妨げられ、それによって、インビボ半減期および活性の増大がなされることである。そのＮＰ誘導体と血液成分との間で形成される共有結合はまた、その血液成分が分解されるまでＮＰペプチドの腎臓での排出を実質的に阻害し、それによって、そのＮＰ誘導体のインビボでの半減期を血液成分の半減期近くまで延長させることに寄与し、これは、その半減期の１０００倍〜１００００倍の増加を示し得る。その反応性実体は、ＮＰペプチドのＮ末端またはＣ末端に存在し得るか、またはそのペプチド鎖にそった他の利用可能部位に存在し得る。
【００２０】
必要に応じて、リジン残基が、反応性実体が結合しているペプチド鎖の部位で加えられるかまたは置換され得る。本発明に従った誘導のためのＮＰペプチドは、以下の式：
【００２１】
【化１Ｂ】
2010047614.tif 000002
によって規定され、ここで、ここで、ペプチド結合によって、Ａｒｇ１８とＩｌｅ１９とが連結され、そしてＣｙｓ１１とＣｙｓ２７との間の線は、直接的ジスルフィド架橋を示し
ここで、
Ｘ１は、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ３は、Ｐｒｏ、Ｈｐｒ、Ｖａｌまたは非存在であり；
Ｘ４は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎまたは非存在であり；
Ｘ５は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ６は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎｌｅまたは非存在であり；
Ｘ７は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ８は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎまたは非存在であり；
Ｘ９は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；Ｘ１２は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎ−α（∝）−メチル、メチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレン、スルホンアミド、およびＮ−アルキル−β−アミノプロピオン酸からなる群から選択されるそのアミド結合の同配位置換を有するＰｈｅ、またはＮＥＰ酵素に耐性のある前記アナログを与えるＰｈｅ置換アミノ酸であり；
Ｘ１３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１４は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１５は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＡｓｐであり；
Ｘ１６は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸であり；
Ｘ２０は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２１は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；
Ｘ２２は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＡｓｎであり；Ｘ２４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓまたは非存在であり；
Ｘ２９は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ３０は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒまたは非存在であり；
Ｘ３１は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ３２は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ３３は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロック基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロック基である。
【００２２】
好ましい血液成分は、免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭを含む）、血清アルブミン、フェリチン、ステロイド結合タンパク質、トランスフェリン、チロキシン結合タンパク質、α−２−マクログロブリン、ハプトグロブリンなどのようなタンパク質を含み；血清アルブミンおよびＩｇＧが、より好ましく、そして、血清アルブミンが、最も好ましい。
【００２３】
反応性実体は、それらの上に存在する、アミノ基、水酸基、フェニル基またはチオール基と、インビボまたはインビトロのいずれかで反応することによって、血液成分と共有結合を形成し得る。「インビトロ」および「エキソビボ」との表現は、本願明細書中において互換的に使用され、そして、本発明の状況において同じものを意味する。なぜならば、その身体の外側で生じることは、インビトロで実施されるからである。好ましい実施形態において、タンパク質における官能基は、チオール基であり、そして、その反応性実体は、Ｍｉｃｈｅａｅｌアクセプター（例えば、アクロレイン誘導体、α，β−不飽和ケトン、α，β−不飽和エステル、α，β−不飽和性アミド、α，β−不飽和チオエステル、アクリルアミド、アクリル酸エステル、ビニルベンゾエート、ケイ皮酸エステル、マレイミド、α，β−不飽和またはマレイミド含有基（γマレイミド−ブチリルアミド（γ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｂｕｔｙｒｙｌａｍｉｄｅ；ＧＭＢＡ）またはマレイミドプロピオン酸（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＭＰＡ）などである。この反応性実体は、ヨードメチルベンゾエート、ハロアセテート、ハロアセトアミドなどであり得る。ＭＰＡが、最も好ましい反応実態である。
【００２４】
本発明の別の局面において、薬学的に受容可能なキャリアと合わせてＮＰ誘導体を含む薬学的組成物が、提供される。このような組成物は、鬱血性心不全（例えば、ＮＹＨＡ  クラスＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶである急性代償不全による鬱血性心不全、およびＮＹＨＡ  クラスＩＩＩおよびＩＶの慢性鬱血性心不全）の処置にとって有用である。この組成物はまた、以下の障害または状態のうちの１つを処置するために、または抗癌剤の毒性に対する保護を与えるために使用され得る：腎障害、高血圧、喘息、高コレステロール血症、炎症性疾患、勃起機能障。最後に、本発明のＮＰ誘導体はまた、診断目的または放射線診断目的で使用され得る。
【００２５】
本発明のさらなる局面において、血液成分に共有結合する本発明のＮＰ誘導体を含む結合体が提供される。そのＮＰ誘導体と血液成分との間の共有結合は、インビボまたはエキソビボで十知れ得る。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、鬱血性心不全（例えば、ＮＹＨＡ  クラスＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶである急性代償不全による鬱血性心不全、およびＮＹＨＡ  クラスＩＩＩおよびＩＶの慢性鬱血性心不全）の処置のための方法が提供される。この方法は、被験体（好ましくは、哺乳動物、動物、またはヒト）に対して、有効量のＮＰ誘導体またはＮＰ誘導体との結合体を、単独または薬学的に受容可能なキャリアとともに投与する工程を包含する。
【００２７】
本発明の他の実施形態において、腎障害を処置するための方法、高血圧を処置するための方法、および喘息を処置するための方法が提供される。これらの方法は、被験体（好ましくは、哺乳動物、動物、またはヒト）に対して、有効量のＮＰ誘導体またはＮＰ誘導体との結合体を、単独または薬学的に受容可能なキャリアとともに投与する工程を包含する。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態において、被験体内でのＮＰペプチドのインビボ半減期を延長するための方法が提供され、この方法は、血液成分と共有結合を形成し、そして、血液成分にＮＰ誘導体を共有結合し得る反応基をＮＰペプチドに結合する工程を包含する。その共有結合は、インビボまたはインビトロで生じ得る。
【００２９】
本発明に従って、ＮＰペプチドまたはそのフラグメントは、ナトリウム排泄増加性、利尿性、血管弛緩性および／またはレニン−アンギオテンシン−アルドステロン系調節活性を保持する。これらのペプチドおよびフラグメントの配列の詳細は、以下に示される。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、反応性実体は、結合基を介してＮＰペプチドに結合する。この場合において、この結合基は、限定されることなく、直鎖Ｃ１〜１０アルキルまたは分枝Ｃ１〜１０アルキル；直鎖Ｃ１〜１０アルキルまたは分枝Ｃ１〜１０アルキル；部分的であるかまたは過剰にフッ素化した（ｐｅｒｆｌｕｏｒｉｎａｔｅ）；Ｃ１〜１０アルキルまたはＣ１〜１０フルオロアルキル（ここで、１以上の炭素原子が、Ｏ、Ｎ、またはＳで置換され、エーテルまたはチオエーテルが形成される）；ｏ二置換、ｍ二置換、またはｐ二置換のフェニル（ここで、その置換基は、同一であるかまたは異なっており、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、ＮＲであり、ここで、Ｒは、Ｈ，Ｃ１〜１０アルキル、またはＣ１〜１０アシルである）；または二置換ヘテロ環（例えば、フラン、チオフェン、ピラン、オキサゾール、またはチアゾール）。その結合基は、安定であるか、または、所望される場合、ＮＰペプチドを遊離させるように放出可能であり得る。
また本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＮＰペプチドおよび該ＮＰペプチドに結合した反応性実体を含むナトリウム排泄増加性ペプチド誘導体であって、該反応性実体は、血液成分上の官能基と共有結合され得；ここで該ＮＰペプチドは、以下の式の配列：
【化１】
2010047614.tif 000003
を有し、ここで、
Ｘ１は、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ３は、Ｐｒｏ、Ｈｐｒ、Ｖａｌまたは非存在であり；
Ｘ４は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎまたは非存在であり；
Ｘ５は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ６は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎｌｅまたは非存在であり；
Ｘ７は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ８は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎまたは非存在であり；
Ｘ９は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；Ｘ１２は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎ−α（∝）−メチル、メチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレン、スルホンアミド、およびＮ−アルキル−β−アミノプロピオン酸からなる群から選択されるそのアミド結合の同配位置換を有するＰｈｅ、またはＮＥＰ酵素に耐性のある前記アナログを与えるＰｈｅ置換アミノ酸であり；
Ｘ１３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１４は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１５は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＡｓｐであり；
Ｘ１６は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸であり；
Ｘ２０は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２１は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；
Ｘ２２は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＡｓｎであり；Ｘ２４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓまたは非存在であり；
Ｘ２９は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ３０は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒまたは非存在であり；
Ｘ３１は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ３２は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ３３は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロック基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロック基であり；
ここで、ペプチド結合は、Ａｒｇ１８およびＩｌｅ１９に連結し、そしてＣｙｓ１１とＣｙｓ２７との間の線は、直接的ジスルフィドブリッジを示す、誘導体。
（項目２）
項目１に記載の誘導体であって、以下：
Ｘ１は、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ２は、Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ３は、Ｐｒｏまたは非存在であり；
Ｘ４は、Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ６は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅまたは非存在であり；
Ｘ７は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎまたは非存在であり；
Ｘ８は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎまたは非存在であり；
Ｘ９は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ１２は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎ−α−メチル、メチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレン、スルホンアミドおよびＮ−アルキル−β−アミノプロピオン酸からなる群から選択されるそのアミド結合の同配位置換を有するＰｈｅ、またはＮＥＰ酵素に耐性のある前記アナログを与えるＰｈｅ置換アミノ酸であり；
Ｘ１３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１５は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｄ−ＬｙｓまたはＡｓｐであり；
Ｘ１６は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸であり；
Ｘ２０は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２１は、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；
Ｘ２２は、ＧｌｎまたはＡｓｎであり；
Ｘ２４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２８は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｘ２９は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ３０は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ３１は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ３２は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ３３は、非存在であり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロック基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロック基である、誘導体。
（項目３）
項目２に記載の誘導体であって、以下：
Ｘ１は、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ２は、Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ３は、Ｐｒｏまたは非存在であり；
Ｘ４は、Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｘ５は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ６は、Ｌｅｕまたは非存在であり；
Ｘ７は、Ａｒｇ、Ａｓｐまたは非存在であり；
Ｘ８は、Ａｒｇ、Ａｓｐまたは非存在であり；
Ｘ９は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ１２は、ＰｈｅまたはＮ−α−メチル、メチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレン、スルホンアミドおよびＮ−アルキル−β−アミノプロピオン酸からなる群から選択されるそのアミド結合の同配位置換を有するＰｈｅであり；
Ｘ１３は、Ｇｌｙであり；
Ｘ１４は、Ｇｌｙであり；
Ｘ１５は、ＡｒｇまたはＡｓｐであり；
Ｘ１６は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；
Ｘ２０は、Ｇｌｙであり；
Ｘ２１は、Ａｌａであり；
Ｘ２２は、Ｇｌｎであり；
Ｘ２４は、Ｇｌｙであり；
Ｘ２６は、Ｇｌｙであり；
Ｘ２８は、Ａｓｎまたは非存在であり；
Ｘ２９は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ３０は、Ｐｈｅまたは非存在であり；
Ｘ３１は、Ａｒｇ、Ａｓｐまたは非存在であり；
Ｘ３２は、Ｔｙｒまたは非存在であり；
Ｘ３３は、非存在であり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロック基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロック基である、誘導体。
（項目４）
前記ＮＰペプチドが、配列番号１、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１９から選択される群より選択される、項目３に記載の誘導体。
（項目５）
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択される、項目１〜４のいずれか１項に記載の誘導体。
（項目６）
項目１に記載の誘導体であって、以下：
Ｘ１は、非存在であり；
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ３は、Ｐｒｏ、Ｈｐｒ、Ｖａｌまたは非存在であり；
Ｘ４は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎまたは非存在であり；
Ｘ５は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸または非存在であり；
Ｘ６は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎｌｅまたは非存在であり；
Ｘ７は、Ｇｌｎ、Ａｓｎまたは非存在であり；
Ｘ８は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ９は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ１２は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎ−α−メチル、メチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレン、スルホンアミド、およびＮ−アルキル−β−アミノプロピオン酸からなる群から選択されるそのアミド結合の同配位置換を有するＰｈｅ、またはＮＥＰ酵素に耐性のある前記アナログを与えるＰｈｅ置換アミノ酸であり；
Ｘ１３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１４は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｄ−ＬｙｓまたはＡｓｐであり；
Ｘ１５は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり；
Ｘ１６は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸であり；
Ｘ２０は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２１は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２２は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎまたは非存在であり；
Ｘ２９は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎｌｅまたは非存在であり；
Ｘ３０は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｈｅまたは非存在であり；
Ｘ３１は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ３２は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ３３は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロック基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロック基である、誘導体。
（項目７）
項目６に記載の誘導体であって、以下：
Ｘ１は、非存在であり；
Ｘ２は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ３は、Ｐｒｏまたは非存在であり；
Ｘ４は、Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ５は、Ｍｅｔ、Ｉｌｅまたは非存在であり；
Ｘ６は、Ｖａｌまたは非存在であり；
Ｘ７は、Ｇｌｎまたは非存在であり；
Ｘ８は、Ｇｌｙまたは非存在であり；
Ｘ９は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｇｌｙまたは非存在であり；
Ｘ１２は、ＰｈｅまたはＮ−α−メチル、メチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレン、スルホンアミド、およびＮ−アルキル−β−アミノプロピオン酸からなる群から選択されるそのアミド結合の同配位置換を有するＰｈｅであり；
Ｘ１３は、Ｇｌｙであり；
Ｘ１４は、ＡｒｇまたはＡｓｐであり；
Ｘ１５は、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
Ｘ１６は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；
Ｘ２０は、Ｓｅｒであり；
Ｘ２１は、Ｓｅｒであり；
Ｘ２２は、Ｓｅｒであり；
Ｘ２４は、Ｇｌｙであり；
Ｘ２６は、Ｇｌｙであり；
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｘ２９は、Ｖａｌまたは非存在であり；
Ｘ３０は、Ｌｅｕまたは非存在であり；
Ｘ３１は、Ａｒｇ、Ａｓｐまたは非存在であり；
Ｘ３２は、Ａｒｇ、Ａｓｐまたは非存在であり；
Ｘ３３は、Ｈｉｓまたは非存在である、誘導体。
（項目８）
前記ＮＰペプチドが、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４８および配列番号５１からなる群より選択される、項目７に記載の誘導体。
（項目９）
配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７からなる群より選択される、項目１、６〜８のいずれか１項に記載の誘導体。
（項目１０）
８０％以上程度の選択性で、血液成分上で単一の官能基と選択的に共有結合し得る、項目１〜９のいずれか１項に記載の誘導体。
（項目１１）
前記誘導体が、誘導体：血液成分を１：１の比率で該血液成分と結合する、項目１０のいずれか１項に記載の誘導体。
（項目１２）
前記反応性実体が、マレイミドまたはマレイミド含有基である、項目１〜１２のいずれか１項に記載の誘導体。
（項目１３）
前記反応性実体が、ＭＰＡである、項目１３に記載の誘導体。
（項目１４）
項目１〜１３のいずれか１項に記載の誘導体を、薬学的に受容可能なキャリアと組み合せて含む、薬学的組成物。
（項目１５）
うっ血性心不全の処置のための項目１６に記載の組成物。
（項目１６）
高血圧の処置のための項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
被験体におけるうっ血性心不全を処置するための方法であって、該方法は、被験体に、有効量の、項目１〜１３のいずれか１項に記載の誘導体を、単独または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
（項目１８）
血液成分と共有結合した、項目１〜１３のいずれか１項に記載の誘導体を含む結合体であって、該共有結合が、インビボまたはエキソビボで実施される、結合体。
（項目１９）
前記反応性実体が、マレイミドまたはマレイミド含有基であり、そして該血液成分が血液タンパク質である、項目１８に記載の結合体。
（項目２０）
前記血液タンパク質が、血清アルブミンである、項目１９に記載の結合体。
（項目２１）
被験体におけるうっ血性心不全を処置するための方法であって、該方法は、被験体に、有効量の、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の結合体を、単独または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
（項目２２）
項目１〜９のいずれか１項に記載のＮＰペプチドのインビボ半減期を延長させる方法であって、該方法は、血液成分と共有結合を形成し得る反応基を該ＮＰペプチドに結合させ、インビボまたはエキソビボで該ＮＰペプチドを血液成分に共有結合させる工程を包含する、方法。
（項目２３）
前記血液成分が、血清アルブミンである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
被験体における腎機能障害を処置するための方法であって、該方法は、被験体に、有効量の、項目１〜１３のいずれか１項に記載の誘導体または項目１８〜２０のいずれか１項に記載の結合体を、単独または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
（項目２５）
被験体における高血圧を処置するための方法であって、該方法は、被験体に、有効量の、項目１〜１３のいずれか１項に記載の誘導体または項目１８〜２０のいずれか１項に記載の結合体を、単独または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
（項目２６）
被験体における喘息を処置するための方法であって、該方法は、被験体に、有効量の、項目１〜１３のいずれか１項に記載の誘導体または項目１８〜２０のいずれか１項に記載の結合体を、単独または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
【００３１】
（表の説明）
表１は、アミノ酸の三文字表記および一文字表記を示す。
【００３２】
表２は、本発明に従うＮＰペプチドおよびＮＰ誘導体の保持時間を示す。
【００３３】
表３、４および５は、本発明のＮＰペプチドおよびＮＰ誘導体の分析に使用されるＨＰＬＣの溶出の３つの異なる勾配を示す。
【００３４】
表６および７は、ＮＰペプチド、ＮＰ誘導体およびＮＰ結合体の予測された分子量および測定された分子量を比較する。
【００３５】
表８は、図２を書くのに使用されるデータから計算される５０％阻害（ＥＣ５０）の濃度および阻害定数（ＫＩ）を示す（すなわち、市販のヒトＡＮＰ（ｈＡＮＰ）、合成ヒトＡＮＰ（ネイティブなＡＮＰ）および１２５Ｉ−ｒＡＮＰの置換によるモルモットの副腎膜に対する４つのＮＰ結合体の結合活性）。
【００３６】
表９は、図３を書くのに使用されるデータから計算される５０％阻害（ＥＣ５０）の濃度および阻害定数（ＫＩ）を示す（すなわち、合成ヒトＢＮＰ（ネイティブなＢＮＰ）および１２５Ｉ−ｒＡＮＰの置換によるモルモットの副腎膜に対する４つのＮＰ結合体の結合活性）。
【００３７】
表１０は、図４、５および６を書くのに使用されるデータから計算される５０％阻害（ＥＣ５０）の濃度を示す（すなわち、社内で（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）合成されたヒトＡＮＰ（ネイティブなＡＮＰ）と共にインキュベートされるヒトＨＥＬＡ細胞におけるｃＧＭＰ産生の増加；社内で合成されたヒトＢＮＰ（ネイティブなＢＮＰ）；９つのＮＰ結合体；および２つのＮＰペプチド）。
【００３８】
表１１および１２は、本発明のＮＰペプチドおよびＮＰ誘導体の分析に使用される、それぞれのＨＰＬＣの溶出の勾配を示す。
【００３９】
表１３および１４は、尿素分泌の増加およびｃＧＭＰ発現の増加に対する、それぞれＳＨＲラットおよびＷｉｎｓｔａｒ−ＫｙｏｔｏラットにおけるＮＰ誘導体の注射のインビボ効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ヨウ素法を用いて実施した環化の前後のＮＰペプチドのＬＣ／ＭＳプロファイルの重ね合わせを示す。
【図２】図２は、１２５Ｉ−ｒＡＮＰの置き換えによる、モルモットの副腎膜に対する市販のヒトＡＮＰ（ｈＡＮＰ）、合成ヒトＡＮＰ（ネイティブＡＮＰ）、および４つのＮＰ結合体の結合活性を示す。
【図３】図３は、１２５Ｉ−ｒＡＮＰの置き換えによる、モルモットの副腎膜に対する市販のヒトＢＮＰ（ｈＢＮＰ）、合成ヒトＢＮＰ（ネイティブＢＮＰ）、および４つのＮＰ結合体の結合活性を示す。
【図４】図４および５は、社内で合成したヒトＡＮＰ（ネイティブＡＮＰ）、５つのＮＰ結合体、および２つのＮＰペプチドとインキュベートしたヒトＨＥＬＡ細胞におけるＧＭＰ産生の増加を示す。
【図５】図４および５は、社内で合成したヒトＡＮＰ（ネイティブＡＮＰ）、５つのＮＰ結合体、および２つのＮＰペプチドとインキュベートしたヒトＨＥＬＡ細胞におけるＧＭＰ産生の増加を示す。
【図６】図６は、社内で合成したヒトＢＮＰ（ネイティブＢＮＰ）、および４つのＮＰ結合体、とインキュベートしたヒトＨＥＬＡ細胞におけるＧＭＰ産生の増加を示す。
【図７】図７は、２つの対応するＮＰ結合体と比較した、ｈＡＮＰのヒト血漿中でのインビトロ分解を示す。
【図８】図８は、ｈＡＮＰ配列に沿ったＮＥＰ酵素の切断部位を示す。
【図９】図９は、対応するＮＰ結合体、および参考としてキャップしたヒト血清アルブミンと比較して、ｈＡＮＰのＮＥＰ酵素によるインビトロ分解を示す。
【図１０】図１０は、２つの対応するＮＰ結合体と比較した、ｈＡＮＰ（市販のものおよび自前で合成したもの）のラットでの薬物動態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
（発明の詳細な説明）
インビボ生物結合体化は、体内で、実質的な保持を可能にするかまたはある場合において増加する様式において、結合体化形態におけるオリジナルの未改変ＮＰペプチドの生物学的活性の標的化血液成分（好ましくは、血液タンパク質）に分子（例えば、本発明に従うＮＰ誘導体）を共有結合するプロセスであるが、標的化血液成分の生物物理学的なパラメータをＮＰペプチドに与えることによって生物学的活性の延長した持続時間を提供する。
本発明に従って、本発明のＮＰ誘導体は、直接的にかまたは安定な連結基または放出可能な連結基によってのいずれかで反応性実体に結合することによって化学的に改変されるＮＰペプチドを含む。反応性実体は、血液成分（好ましくは、血液タンパク質）と共有結合を形成し得る。反応性実体は、水溶性環境において安定でなければならない。共有結合は、反応性実体と血液成分のアミノ基、ヒドロキシル基またはチオール基との間で一般に形成される。好ましくは、アミノ基は、カルボキシル、ホスホリルまたはアシルのような反応性実体と共有結合を形成する；好ましくは、ヒドロキシル基は、活性化エステルのような反応性実体と共有結合を形成する；そして、好ましくは、チオール基は、エステルまたは混合無水物のような反応性実体と共有結合を形成する。好ましい血液成分は、血清アルブミン、免疫グロブリンまたはその組み合せのような移動性血液成分であり、そして好ましい反応性実体は、マレイミドまたはマレイミド含有基のような無水物を含む。最も好ましい実施形態において、血液成分は血清アルブミンであり、そして反応性基はマレイミド含有基である。
【００４２】
保護基は、合成プロセス（以下に詳細に記載される）の間、反応性実体とＮＰペプチド自体の官能基との間の相互作用を避けるために必要とされる。これらの保護基は、ペプチド合成の分野において簡便であり、そして他の反応性基との反応からペプチド誘導体を保護し得る化学的部分として一般に記載され得る。種々の保護基は市販され、そしてそれらの例としては、ＵＳ  ５，４９３，００７（これは、本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。適切な保護基の代表的な例としては、アセチル、フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）などが挙げられる。
【００４３】
上記のように、血液成分への結合体化は、内因性酵素（例えば、ＮＥＰ）による分解からＮＰペプチドを防止し、そして血液循環からナトリウム排泄増加性ペプチドの排出のための最も重要な因子であるＮＰＲ−Ｃレセプターに結合することを防止する主要な役割を明確に果たす。血液成分への結合体化はまた、血液成分自体が分解されさえすれば、ＮＰペプチドの腎排泄を克服する。従って、結合体化のために選択される血液成分の内因性の半減期は、結合体化されたＮＰペプチドの半減期の主要な決定要因である。
【００４４】
血液成分は、好ましくは移動性であり、これは、任意の延長した期間（一般的に５分を超えず、そしてより通常に１分を超えない）、固定された状態でないことを意味する。これらの血液成分は膜結合型でなく、そして延長された期間血液中に存在する。好ましい移動性血液成分としては、血清アルブミン、トランスフェリン、フェリチン、１−１型ヘプトグロビン、２−１型ヘプトグロビン、２−２型ヘプトグロビンおよび免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧ）が挙げられる。
【００４５】
より詳細には、本発明は、ＮＰペプチドおよびそのフラグメントの改変に関し、それらのバイオアベイラビリティーを改善し、インビボ半減期を延長し、そして血液成分への選択的結合体化を通しての分布を拡大するが、それらの著しい治療特性を実質的に維持するかまたは改善する。
【００４６】
本発明に従って、ＮＰペプチドは、ネイティブなＡＮＰまたはネイティブなＢＮＰおよび特にヒトＡＮＰおよびヒトＢＮＰの少なくとも１つの生理的活性を有するペプチドである。より詳細には、ＮＰペプチドは、ナトリウム排泄増加性活性、利尿性活性、血管弛緩活性および／またはレニン−アンギオテンシンアルドステロン系調節活性を有する。
【００４７】
表１は、天然アミノ酸の三文字表記および一文字表記ならびに非天然のアミノ酸の三文字表記を提供する。
【００４８】
（表１）
【００４９】
【表１】
2010047614.tif 000004
本発明に従う誘導体化のためのＮＰペプチドの設計は、ネイティブなヒトＡＮＰおよびネイティブなヒトＢＮＰの配列に基づく。これらの配列は、非常に高い類似性を共有する。類似のアミノ酸による置換は、発明者らの構造活性分析に従う薬学的活性にわずかに関与するように思われる残基を提案する。従って、本発明に従うＮＰペプチドは、以下の式の配列に対応し、これは、ペプチド結合が、Ａｒｇ１８およびＩｌｅ１９に連結し、そしてＣｙｓ１１とＣｙｓ２７との間の線は、配列においてループを形成する直接的ジスルフィドブリッジを示すことが理解されるべきである：
【００５０】
【化２】
2010047614.tif 000005
ここで、
Ｘ１は、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ３は、Ｐｒｏ、Ｈｐｒ、Ｖａｌまたは非存在であり；
Ｘ４は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎまたは非存在であり；
Ｘ５は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ６は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎｌｅまたは非存在であり；
Ｘ７は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ８は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎまたは非存在であり；
Ｘ９は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；Ｘ１２は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎ−α−メチル、メチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレン、スルホンアミド、およびＮ−アルキル−β−アミノプロピオン酸からなる群から選択されるそのアミド結合の同配位置換を有するＰｈｅ、またはＮＥＰ酵素に耐性のある前記アナログを与えるＰｈｅ置換アミノ酸であり；
Ｘ１３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１４は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１５は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＡｓｐであり；
Ｘ１６は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸であり；
Ｘ２０は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２１は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；
Ｘ２２は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＡｓｎであり；Ｘ２４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓまたは非存在であり；
Ｘ２９は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ３０は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒまたは非存在であり；
Ｘ３１は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ３２は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ３３は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロック基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロック基である。
【００５１】
本発明の第１の好ましい実施形態に従って、
Ｘ１は、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ２は、Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ３は、Ｐｒｏまたは非存在であり；
Ｘ４は、Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ６は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅまたは非存在であり；
Ｘ７は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎまたは非存在であり；
Ｘ８は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎまたは非存在であり；
Ｘ９は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ１２は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎ−α−メチル、メチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレン、スルホンアミドおよびＮ−アルキル−β−アミノプロピオン酸からなる群から選択されるそのアミド結合の同配位置換を有するＰｈｅ、またはＮＥＰ酵素に耐性のある前記アナログを与えるＰｈｅ置換アミノ酸であり；
Ｘ１３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１５は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｄ−ＬｙｓまたはＡｓｐであり；
Ｘ１６は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸であり；
Ｘ２０は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２１は、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；
Ｘ２２は、ＧｌｎまたはＡｓｎであり；
Ｘ２４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２８は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｘ２９は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ３０は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ３１は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ３２は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ３３は、非存在であり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロック基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロック基である。
【００５２】
本発明の第１の好ましい実施形態に従って、以下の残基がより好ましい：
Ｘ１は、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ２は、Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ３は、Ｐｒｏまたは非存在であり；
Ｘ４は、Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｘ５は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ６は、Ｌｅｕまたは非存在であり；
Ｘ７は、Ａｒｇ、Ａｓｐまたは非存在であり；
Ｘ８は、Ａｒｇ、Ａｓｐまたは非存在であり；
Ｘ９は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ１２は、ＰｈｅまたはＮ−α−メチル、メチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレン、スルホンアミドおよびＮ−アルキル−β−アミノプロピオン酸からなる群から選択されるそのアミド結合の同配位置換を有するＰｈｅであり；
Ｘ１３は、Ｇｌｙであり；
Ｘ１４は、Ｇｌｙであり；
Ｘ１５は、ＡｒｇまたはＡｓｐであり；
Ｘ１６は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；
Ｘ２０は、Ｇｌｙであり；
Ｘ２１は、Ａｌａであり；
Ｘ２２は、Ｇｌｎであり；
Ｘ２４は、Ｇｌｙであり；
Ｘ２６は、Ｇｌｙであり；
Ｘ２８は、Ａｓｎまたは非存在であり；
Ｘ２９は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ３０は、Ｐｈｅまたは非存在であり；
Ｘ３１は、Ａｒｇ、Ａｓｐまたは非存在であり；
Ｘ３２は、Ｔｙｒまたは非存在であり；
Ｘ３３は、非存在であり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロック基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロック基である。
【００５３】
ネイティブなヒトＡＮＰは、本発明の第１の実施形態に従って、ＮＰペプチドに含まれる。本発明の第１の実施形態に従う、さらなる好ましいＮＰペプチドは、配列番号１、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１９である。好ましいＮＰ誘導体（本発明の第１の実施形態に従うＮＰペプチドを含む）は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０である。
【００５４】
本発明の第２の好ましい実施形態に従って、
Ｘ１は、非存在であり；
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ３は、Ｐｒｏ、Ｈｐｒ、Ｖａｌまたは非存在であり；
Ｘ４は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎまたは非存在であり；
Ｘ５は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸または非存在であり；
Ｘ６は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎｌｅまたは非存在であり；
Ｘ７は、Ｇｌｎ、Ａｓｎまたは非存在であり；
Ｘ８は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ９は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａまたは非存在であり；
Ｘ１２は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎ−α−メチル、メチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレン、スルホンアミド、およびＮ−アルキル−β−アミノプロピオン酸からなる群から選択されるそのアミド結合の同配位置換を有するＰｈｅ、またはＮＥＰ酵素に耐性のある前記アナログを与えるＰｈｅ置換アミノ酸であり；
Ｘ１３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ１４は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｄ−ＬｙｓまたはＡｓｐであり；
Ｘ１５は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり；
Ｘ１６は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは酸化的安定性Ｍｅｔ−置換アミノ酸であり；
Ｘ２０は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２１は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２２は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−ＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎまたは非存在であり；
Ｘ２９は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎｌｅまたは非存在であり；
Ｘ３０は、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｈｅまたは非存在であり；
Ｘ３１は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ３２は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ３３は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮ末端ブロック基であり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２またはＣ末端ブロック基である。
【００５５】
本発明の第２の好ましい実施形態に従って、以下の残基が好ましい：
Ｘ１は、非存在であり；
Ｘ２は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ３は、Ｐｒｏまたは非存在であり；
Ｘ４は、Ｌｙｓまたは非存在であり；
Ｘ５は、Ｍｅｔ、Ｉｌｅまたは非存在であり；
Ｘ６は、Ｖａｌまたは非存在であり；
Ｘ７は、Ｇｌｎまたは非存在であり；
Ｘ８は、Ｇｌｙまたは非存在であり；
Ｘ９は、Ｓｅｒまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｇｌｙまたは非存在であり；
Ｘ１２は、ＰｈｅまたはＮ−α−メチル、メチルアミノ、ヒドロキシエチル、ヒドラジノ、エチレン、スルホンアミド、およびＮ−アルキル−β−アミノプロピオン酸からなる群から選択されるそのアミド結合の同配位置換を有するＰｈｅであり；
Ｘ１３は、Ｇｌｙであり；
Ｘ１４は、ＡｒｇまたはＡｓｐであり；
Ｘ１５は、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
Ｘ１６は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；
Ｘ２０は、Ｓｅｒであり；
Ｘ２１は、Ｓｅｒであり；
Ｘ２２は、Ｓｅｒであり；
Ｘ２４は、Ｇｌｙであり；
Ｘ２６は、Ｇｌｙであり；
Ｘ２８は、Ｌｙｓ、Ａｒｇまたは非存在であり；
Ｘ２９は、Ｖａｌまたは非存在であり；
Ｘ３０は、Ｌｅｕまたは非存在であり；
Ｘ３１は、Ａｒｇ、Ａｓｐまたは非存在であり；
Ｘ３２は、Ａｒｇ、Ａｓｐまたは非存在であり；
Ｘ３３は、Ｈｉｓまたは非存在である。
【００５６】
ネイティブなヒトＢＮＰは、本発明の第２の実施形態に従って、ＮＰペプチドに含まれる。本発明の第２の実施形態に従う、さらなる好ましいＮＰペプチドは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４８および配列番号５１である。好ましいＮＰ誘導体（本発明の第２の実施形態に従うＮＰペプチドを含む）は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７である。
【００５７】
他に特定されない限り、本出願に与えられるＮＰペプチドの配列のアミノ酸は、Ｄアミノ酸もしくはＬアミノ酸またはその組み合せであり得る。Ｌアミノ酸が一般的に好ましい。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態において、タンパク質の官能基はチオール基であり、そして反応性実体は、マレイミドまたはマレイミド含有基（例えば、γ−マレイミド−ブチルアミド（ＧＭＢＡ）およびマレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ））である。反応性実体は、安定な連結基または放出可能な連結基を介してＮＰペプチドに連結され得る。対応する連結基は、式Ｖ〜Ｗによって表され、ここで、Ｖは、ＮＰペプチドと反応する官能基であり、そしてＷは、反応性実体に結合する鎖部分である。Ｖは、エーテル、チオエーテル、二級アミンもしくは三級アミン、二級アミドもしくは三級アミド、エステル、チオエステル、イミン、ヒドラジン、セミカルバゾン、アセタール、ヘミアセタール、ケタル、ヘミケタル、アミナル、ヘミアミナル、スルホネート、サルフェート、スルホンアミド、スルホンアミデート、ホスフェート、ホスホンアミド、ホスホネート、またはホスホンアミドであり、そして好ましくは一級アミドである。Ｗは、Ｃ１〜１０の任意のアルキル鎖、Ｃ１〜１０の任意のフルオロアルキル鎖またはＣ１〜１０のフルオロ置換アルキル鎖の任意の組み合せ、アルキル鎖もしくはフルオロアルキル鎖を含む任意のエーテルまたはチオエーテル（例えば、−（Ｚ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｚ）ｎ−、−（Ｚ−ＣＦ２ＣＨ２−Ｚ）ｎ−、−（Ｚ−ＣＨ２ＣＦ２−Ｚ）ｎ−、ここでｎは１〜４であり、そしてＺは、ＯまたはＳのいずれかである）、−Ｙ−Ｃ６Ｈ４−、−Ｙ−Ｃ６Ｈ４−Ｙ−のような構造を有するオルト、メタ、パラ二置換ベンゼン（ここで、Ｙは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ［Ｒ＝Ｈ、アルキル、アシル］の任意の組み合せである）、二置換複素環（例えば、フラン、チオフェン、ピラン、オキサゾールまたはチアゾール）であり、好ましくはＣ１〜６のアルキル鎖である。
【００５９】
この連結基は、好ましくは、ヒドロキシエチルモチーフ（例えば、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、２−［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ））；１以上のアルキル鎖（Ｃ１〜Ｃ１０）モチーフ（例えば、グリシン、３−アミノプロピオン酸（ＡＰＡ）、８−アミノオクタン酸（ＡＯＡ）、４−アミノ安息香酸（ＡＰｈＡ））からなる群から選択される。好ましい連結基は、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、および２−［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）である。連結基および反応性実体の組み合わせの例としては、（ＡＥＥＡ−ＥＤＡ）−ＭＰＡ；（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ）−ＭＰＡ、（ＡＥＡ−ＡＥＥＡ）−ＭＰＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
カップリング手順を容易にするために、１以上のさらなるアミノ酸が、連結基を介してまたは介さずに、その反応性実体にカップリングする部位においてペプチドに付加または置換され得、その後、付加または置換されたアミノ酸に対してこのようなカップリングを行うことがまた企図される。アミノ酸の付加または置換は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその間において行われ得る。ＮＰペプチドの配列を、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎまたは２，４−ジアミノブタン酸（ＤＡＢＡ）でアミノ酸を置換し、それに対して、必要に応じて連結基を介して、反応性基をカップリングすることは好ましい。このようにするためには、リジンが最も好ましい。
【００６１】
マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５と７．４との間で維持される場合に、ペプチド上のスルフヒドリル基に対して最も選択的である。ｐＨ７．０において、マレイミド基とスルフヒドリルとの反応速度は、アミンとの反応速度より１０００倍速い。マレイミド基とスルフヒドリルとの間で安定なチオエーテル連結が形成される場合、この連結は、生理学的条件下で切断され得ない。
【００６２】
本発明のＮＰ誘導体は、血液成分の特異的標識を提供し得る。この特異的標識（特にマレイミドでの標識）は、いくつかの利点を提供する。遊離のチオール基は、インビボでは、アミノ基よりも量が少ないので、結果として、マレイミド誘導体は、より少ないタンパク質に共有結合する。例えば、血清アルブミンにおいて、１分子につきわずか１つの遊離のチオール基が存在する。従って、ＮＰペプチド−マレイミド−アルブミン結合体は、ペプチド：アルブミンが１：１のモル比を含む傾向がある。アルブミンへの付加において、ＩｇＧ分子（クラスＩＩ）もまた、遊離チオールを有する。ＩｇＧ分子および血清アルブミンは、血中の可溶性タンパク質の大部分（すなわち、約８０〜８５％）を構成するので、それらはまた、マレイミド含有基を有するＮＰ誘導体に対する共有結合に利用可能な遊離チオール基の大部分を構成する。
【００６３】
さらに、遊離チオール含有血液タンパク質の中ですら、マレイミドを用いる特異的標識は、アルブミン自体の独特の特性に起因して、ペプチド−マレイミド−アルブミン結合体の優先的な形成をもたらす。アルブミンの単一の遊離チオール基（種間で高度に保存されている）は、アミノ酸残基Ｃｙｓ３４に位置する。アルブミンのＣｙｓ３４が、他の遊離チオール含有タンパク質上の遊離チオールに対して、そしてまた低分子量分子上のチオールと比較して、増大した反応性を有することが最近実証された。このことは、アルブミンのＣｙｓ３４に対する５．５という異常なｐＫ値に一部起因する。これは、一般に、システイン残基に対する代表的なｐＫ値（代表的には、約８〜１０）よりも遙かに低い。この低いｐＫに起因して、通常の生理学的条件下で、アルブミンのＣｙｓ３４は、顕著に、アニオン形態にあり、この形態は、その反応性を劇的に増大させる。Ｃｙｓ３４の低ｐＫ値に加えて、別の要因（これは、Ｃｙｓ３４の反応性を増大させる）は、その位置であり、その位置は、アルブミンの領域Ｖの１つのループの表面に近い疎水性ポケット中にある。この位置は、Ｃｙｓ３４を全ての種類のリガンドに利用されるようにし、フリーラジカルトラップおよび遊離チオールスカベンジャーとしてのＣｙｓ３４の生物学的役割において重要な要因である。結果として、その反応速度加速は、ペプチド−マレイミドと、他の遊離チオール含有タンパク質と、および遊離チオール含有低分子量分子との反応の速度に対して１０００倍程度速くあり得る。
【００６４】
ペプチド−マレイミド−アルブミン結合体の別の利点は、１：１で、ペプチドをＣｙｓ３４において特異的にアルブミンにロードすることと関連づけられた再現性である。従来の活性化技術（例えば、グルタルアルデヒド、ＤＣＣ、ＥＤＣおよび例えば、遊離アミンの他の化学的活性化因子を用いる）は、この選択性がない。例えば、ヒトアルブミンは、５９個のリジン残基を含み、そのうちの２５〜３０個が、アルブミンの表面に位置し、結合体化のために利用可能である。これらのリジン残基を活性化するか、または代わりにこれらのリジン残基を介してカップリングするようにペプチドを改変すると、結合体の異種集団が生じる。等モル比のペプチド：アルブミン（すなわち、１：１）が使用されるとしても、最終的な結果は、無作為な結合生成物の生成であり、いくらかは、アルブミンの各々の分子に連結されたペプチドの不明確な数を含み、そして各々の結合体は、２５〜３０の利用可能なリジン部位のうちのいずれか１つにおいて無作為にカップリングされるペプチドを有する。結論として、正確な組成の特徴付けは、実質的に不可能であり、再現性がないことは言うまでもない。さらに、アルブミンのリジン残基を介する結合体化により、アルブミン１分子あたり、より多くの治療剤が送達されるという利点を少なくとも有すると思われる一方で、研究により、治療剤：アルブミンの１：１の比が好ましいことが示された。Ｓｔｅｈｌｅらによる文献，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，１９９７，８，６７７−６８５（その全体が本明細書中で援用される）において、グルタルアルデヒドを介して結合体化した抗癌メトトレキサート：アルブミンの１：１の比が、最も顕著な結果を与えたことが報告された。これらの結合体は、腫瘍細胞により取り込まれるのに対して、５：１〜２０：１のメトトレキサート分子を有する結合体は、変化したＨＰＬＣプロフィールを有し、インビボで肝臓により素早く取り込まれた。従って、より高い比においては、治療剤のキャリア分子としてのアルブミンの効果は、減少したと思われる。
【００６５】
本発明のＮＰ誘導体（特に、マレイミド反応性実体との誘導体）の制御された投与を介して、特異的なインビボ標識またはアルブミンとＩｇＧとの結合は、制御され得る。代表邸な静脈内投与において、投与されるペプチド誘導体の８０〜９０％は、アルブミンに結合し、５％未満がＩｇＧに結合することが示された。存在する遊離チオール（例えば、グルタチオンおよびシステイン）の微量の結合もまた生じる。このような特異的結合は、投与されるＮＰペプチドの予測半減期の正確な算出を可能にするので、インビボでの使用について好ましい。本発明はまた、８０％以上の選択性の程度を有する、標的化された血液成分上の１つの官能基と選択的に共有結合し得るＮＰ誘導体に関する。好ましくは、選択性の程度は、９０％以上、より好ましくは、９５％以上である。
【００６６】
上記のように、血液成分へのＮＰ誘導体の所望の結合体は、動物またはヒトであり得る被験体に、その誘導体を直接投与することにより、インビボで調製され得る。その投与は、ボーラスの形態で行われてもよいし、計量流量（ｍｅｔｅｒｅｄ  ｆｌｏｗ）などを使用する注入によって、経時的にゆっくりと導入されてもよい。
【００６７】
あるいは、その結合体はまた、血液サンプルまたは精製血液成分をＮＰ誘導体と合わせて、血液成分上の官能基へのＮＰ誘導体の共有結合を可能にすることによって、エキソビボまたはインビボで調製され得、得られた血液溶液または得られた精製血液成分結合体は、被験体（動物またはヒト）に投与され得る。その精製血液成分は、組換え技術によって調製されるかまたは血液サンプルから精製される市販の供給源のものであり得る。その血液は処理されて、エキソビボでの取り扱いの間の凝集が防止され得る。
【００６８】
本発明はまた、インビボでの長期化した半減期、ならびに以下のＡＮＰ関連特性およびＢＮＰ関連特性のうちの１以上を有するＮＰ誘導体およびそのフラグメントの治療的使用および他の関連する使用に関する：
−高血圧の軽減；
−利尿の誘導；
−ナトリウム利尿の誘導；
−血管の拡張または弛緩；
−ナトリウム利尿ペプチドレセプター（例えば、ＮＰＲ−Ａ）結合；
−交感神経（ｓｙｍｐａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ）の抑制を介するノルエピネフリンの遊離抑制；
−腎臓からのレニン分泌の抑制；
−副腎からのアルドステロン分泌の抑制；
−心疾患および障害の処置；
−うっ血性心不全における心臓再構成プロセスの低下、停止または逆転；
−腎疾患および障害の処置；ならびに
−喘息の処置。
【００６９】
本発明に従って、ＮＰ誘導体またはＮＰ結合体は、ナトリウム利尿、利尿および血管拡張を誘導することから利益を受ける患者に投与され得る。本発明のＮＰ誘導体および結合体は、心不全（例えば、うっ血性心不全）（ＣＨＦ）を処置するために、より具体的には、ＮＹＨＡクラスＩＩ、ＩｌＩおよびＩＶの急性非代償性（ａｃｕｔｅ  ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ）ＣＨＦならびにＮＹＨＡクラスＩＩＩおよびＩＶの慢性ＣＨＦを処置するために特に有用である。ＮＰ誘導体またはＮＰ結合体は、急性ＣＨＦまたは以下の慢性ＣＨＦについての長期の薬物療法において単回用量において投与され得る。また、ＮＰ誘導体またはＮＰ結合体は、単独で、または以下の型の化合物のうちの１つ以上と組み合わせて投与され得る：ＡＣＥインヒビター、β遮断薬、利尿剤、スピロノラクトン、ジゴキシン、抗凝固剤および抗血小板薬剤、ならびにアンジオテンシンレセプター遮断薬。
【００７０】
他の疾患または状態は、本発明のＮＰ誘導体およびＮＰ結合体の投与により処置され得、腎障害および疾患、喘息、高血圧および肺高血圧を含み得る。より具体的には、式ＩＩに基づくＮＰ誘導体および結合体に関して、以下の疾患および状態：炎症関連疾患、勃起機能不全、および高コレステロール血症もまた、処置され得る；そしてまた、抗癌薬物の毒性に関する保護材として使用される。
【００７１】
本発明の２以上のＮＰ誘導体および結合体は、それらの治療効果を最適化するために組み合わせて使用され得る。これらの誘導体および結合体は、生理学的に受容可能な媒体（例えば、脱イオン水）、リン酸緩衝化生理食塩水、（ＰＢＳ）、生理食塩水、塩類、水性エタノールまたは他のアルコール、血漿、タンパク質性溶液、マンニトール、水性グルコース、アルコール、植物性油など中で投与され得る。含まれ得る他の添加物としては、緩衝液（ここで媒体は、一般に、約５〜１０の範囲のｐＨにおいて緩衝化され、この緩衝液は、一般に、約５０〜２５０ｍＭの濃度の範囲である）、塩（ここで塩の濃度は、一般に、約５〜５００ｍＭの範囲である）、生理学的に受容可能な安定化剤などが挙げられる。この組成物は、都合のよい貯蔵および輸送のために凍結乾燥され得る。
【００７２】
本発明のＮＰ誘導体および結合体は、経口投与、肺投与、非経口投与（例えば、血管内投与（ＩＶ）、動脈内投与（ＩＡ）、筋肉内投与（ＩＭ）、皮下投与（ＳＣ）など）され得る。輸液による投与は、いくつかの状況において適切であり得る。いくつかの場合において、投与は、経口投与、経鼻投与、直腸投与、経皮投与またはエアロゾルによる投与であり得る。所望の全身的な投薬を構築するために、単回用量または１日に複数回の投与を使用することは適切であり得る。慢性的な使用の場合、投与の間隔は、被験体の必要性と関連して確立される。ＮＰ誘導体または結合体は、任意の都合のよい手段（シリンジ、トロカール、カテーテルなどが挙げられる）によって投与され得る。この特定の投与様式は、投与されるべき量、単回のボーラスまたは連続投与かどうかなどに依存して変化する。
【００７３】
哺乳動物宿主の血液は、ＮＰペプチドの活性および／またはＮＰ誘導体もしくは結合体の存在についてモニターされ得る。異なる時間で被験体から血液サンプルを採取することによって、ＮＰペプチドが治療的に活性であるに十分な量の長期保存血液成分に結合したか否かを決定し得、従って、血中のＮＰペプチドのレベルを決定し得る。所望であれば、ＮＰペプチドが共有結合される血液成分もまた決定し得る。モニタリングはまた、ペプチド活性、ＨＰＬＣ−ＭＳ、ペプチドに対する抗体、または蛍光標識誘導体もしくは放射標識誘導体のアッセイを使用することによって行われ得る。
【００７４】
本発明の別の局面は、ＮＰペプチドに特異的な抗体を用いて生物学的サンプル（例えば、血液）中のＮＰペプチドまたはその結合体の濃度を決定するための方法、およびこのようなＮＰペプチドまたは結合体と潜在的に関連する毒性のための処置としてこのような抗体を使用することに関する。このことは、その増大した安定性および患者におけるＮＰペプチドの寿命が、処置の間の新たな問題（毒性の可能性の増大を含む）をもたらし得るので、有利である。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体いずれかの、ＮＰに対する特異性を有する抗ＮＰ抗体の使用は、任意のこのような問題に介入するにあたって補助となり得る。この抗体は、特定のＮＰ誘導体で、またはＮＰペプチドの免疫原性フラグメントもしくはＮＰペプチドの抗原決定基に対応する合成免疫原で免役された宿主から生成または誘導され得る。好ましい抗体は、ＮＰペプチド、その誘導体化形態およびその結合体のいずれかに対する高い特異性および親和性を有する。このような抗体はまた、酵素、蛍光色素または放射性標識で標識され得る。
【００７５】
特定のＮＰ誘導体に特異的な抗体は、誘導体化されたＮＰ特異的抗体の誘導のために、精製ＮＰペプチドを使用することによって生成され得る。抗体の誘導によって、動物への注射による免疫応答の刺激のみならず、合成抗体または他の特異的結合分子（例えば、組換え免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング）の生成における類似の工程もまた意図される。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方が、当該分野で周知の手順によって生成され得る。
【００７６】
抗体はまた、血流中のＮＰペプチドの存在をモニターするために使用され得る。血液および／または血清のサンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分析され得る。このような技術は、ＮＰ誘導体の結合体化のレベルの決定を可能にする。
【００７７】
抗ＮＰ抗体はまた、ＮＰ誘導体の投与によって誘導される毒性を処置するために使用され得、エキソビボまたはインビボで使用され得る。エキソビボ方法としては、固体支持体に固定された抗治療剤抗体を使用する、毒性についての免疫透析処置（ｉｍｍｕｎｏ−ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）が挙げられる。インビボ方法としては、抗体−薬剤複合体のクリアランスを誘導するに効果的な量の抗ＮＰ抗体の投与が挙げられる。
【００７８】
この抗体は、滅菌条件下で、血液と抗体とを接触させることによって、ＮＰ誘導体およびその結合体をエキソビボで患者の血液から除去するために使用され得る。例えば、抗体は、カラムマトリクスに固定されるか、または他の方法で固定化され得、その患者の血液が、患者から取り出され得、そのマトリクスに通され得る。このＮＰ誘導体は、抗体に結合され、次いで低濃度のＮＰを含む血液は、患者の循環系に戻され得る。取り出されるＮＰ誘導体の量は、圧力および流速を調節することによって制御され得る。ＮＰ誘導体の患者の血液の血清成分からの好ましい除去は、例えば、半透膜の使用によって、またはそうでなければ血清性分を、抗治療剤抗体を含むマトリクスに通過させる前に、当該分野で公知の方法によって血清性分を細胞成分から最初に分離することによって、行われ得る。あるいは、ＮＰ結合体化血球（赤血球を含む）の優先的な除去は、患者の血液中の血球を回収および濃縮し、これらの血球と固定された抗ＮＰ抗体とを接触させて、患者の血液の血清性分の排除によって行われ得る。
【００７９】
抗ＮＰ抗体は、インビボで、非経口的に、処置のためにＮＰ誘導体または結合体を受けた患者に投与され得る。この抗体は、ＮＰ誘導体および結合体を結合する。一旦結合すると、そのＮＰ活性は、完全にブロックされない場合には妨害され、それによって、患者の血流における生物学的に有効な濃度のＮＰ誘導体を減少させ、あるとすれば、有害な副作用を最小にする。さらに、結合した抗体−ＮＰ複合体は、患者の血流からのＮＰ誘導体および結合体のクリアランスを容易にする。
【００８０】
（反応性実体の直接結合）
ＭＰＡのような反応性実体（連結基を介しても介さなくても）は、例えば、コハク酸エステルとして活性化され（当業者は、ハロアシルまたはｐ−ニトロフェニルまたは他のものを使用し得る）、固相合成または組換え手段（実施例２を参照のこと）によって生成される、ＮＰペプチドまたはその誘導体のアミノ基と反応される。反応性実体のこのような直接結合を行うために、そのアミノ基は、Ｃ末端残基のアミノ基、Ｎ末端残基のアミノ基、またはアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄ−ＯｒｎおよびＤＡＢＡ）の側鎖のアミノ基からなる群より選択される。
【００８１】
（ペプチド誘導体合成）
ＮＰペプチドは、当業者に周知の固相ペプチド化学の標準的な方法によって合成され得る。例えば、そのペプチドは、Ｒａｉｎｉｎ  ＰＴＩ  ＳｙｍｐｈｏｎｙＴＭ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用するＳｔｅｗａｒｄら（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，（１９８４））により記載された手順に従う固相化学技術によって合成され得る。同様に、ペプチドフラグメントが合成され得、その後、より大きなペプチドを形成するために一緒に結合され得るかまたは連結され得る（セグメント濃縮）。これらの合成ペプチドフラグメントはまた、特定の位置でのアミノ酸置換および／または欠失によって作製され得る。
【００８２】
固相ペプチド合成について、多くの技術のまとめが、Ｓｔｅｗａｒｔら、「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），１９６３およびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９７３，２  ４６において見出され得る。伝統的な溶液合成については、例えば、Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，第１巻，Ａｃａｃｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。一般に、このような方法は、１以上のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸を、ポリマー上の伸長するペプチド鎖に連続的に付加することを包含する。通常、初めのアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、適切な保護基によって保護される。次いで、この保護され、そして／または誘導体化されたアミノ酸は、不活性固体支持体に結合され得るか、または適切に保護され、アミド連結を形成するに適切な条件下で相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列において次のアミノ酸を付加することによって溶液中で利用され得るかのいずれかである。次いで、その保護基は、この新たに付加されたアミノ酸残基から除去され、次のアミノ酸（適切に保護されている）が付加されるなど。
【００８３】
全ての望ましいアミノ酸が適切な順番で連結された後、任意の残りの保護基（および任意の固体支持体）が逐次的にまたは同時に切断されて、最終ペプチドが得られる。この一般的な手順の単純な改変によって、例えば、保護されたトリペプチドと適切に保護されたジペプチドとを（キラル中心をラセミ化しない条件下で）カップリングさせて、脱保護の後にペンタペプチドを形成する（セグメント濃縮）ことによって、１より多くのアミノ酸を伸長している鎖に一度に付加することは可能である。
【００８４】
本発明のＮＰ誘導体を調製する特に好ましい方法は、固相ペプチド合成であり、ここでこのアミノ酸α−Ｎ−末端は、酸感受性基または塩基感受性基によって保護される。このような保護基は、ペプチド連結形成の条件に適切である一方で、伸長するペプチド鎖を破壊することも、そこに含まれるキラル中心のいずれのラセミ化を生じることもなく、容易に除去可能である特性を有するべきである。Ｎ保護基およびカルボキシ保護基の例は、Ｇｒｅｅｎｅ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｐｐ．１５２−１８６（１９８１））において開示され、この文献は、本明細書中に参考として援用される。Ｎ保護基の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：低級アルカノイル基（例えば、ホルミル、アセチル（「Ａｃ」）、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチルなど；他のアシル基（２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイルなどが挙げられる）；スルホニル基（例えば、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、ｏ−ニトロフェニルスルホニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）など）；カルバメート形成基（例えば、ｔ−アミルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−エトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニリル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２，−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなど；アリールアルキル基（例えば、ベンジル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）など）およびシリル基（例えば、トリメチルシリルなど）。好ましいα−Ｎ保護基は、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｏｃ）��イソボルニルオキシカルボニル；３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル；ｔ−アミルオキシカルボニル；２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニルなどであり、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）がより好ましく、一方好ましい側鎖のＮ保護基は、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、４−メトキシベンゼン−スルホニル、Ｃｂｚ、Ｂｏｃおよびアダマンチルオキシカルボニル（リジンおよびアルギニンのような側鎖アミノ基に関して）；ベンジル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジル、イソプロピル、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、シクロヘキシル、シクロペニルおよびアセチル（Ａｃ）（チロシンに関して）；ｔ−ブチル、ベンジルおよびテトラヒドロピラニル（セリンに関して）；トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、ｐ−トルエンスルホニルおよび２，４−ジニトロフェニル（ヒスチジンに関して）；ホルミル（トリプトファンに関して）；ベンジルおよびｔ−ブチル（アスパラギン酸およびグルタミン酸に関して）；ならびにトリフェニルメチル（トリチル）（システインに関して）である。
【００８５】
カルボキシ保護基は、簡便には、カルボン酸保護エステル基またはアミド基と呼ばれる。このようなカルボキシ保護基は、当業者に周知であり、米国特許第３，８４０，５５６号および同第３，７１９，６６７号（これらの開示は、本明細書中において参考として援用される）に記載されるように、ペニシリンおよびセファロスポリンの分野のカルボキシ基の保護において広範に使用されている。代表的なカルボキシ保護基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃ１〜Ｃ８低級アルキル；アリールアルキル（例えば、フェネチルまたはベンジル）およびその置換誘導体（例えば、アルコキシベンジル基またはニトロベンジル基）；アリールアルケニル（例えば、フェニルエテニル）；アリールおよびその置換誘導体（例えば、５−インダニル）；ジアルキルアミノアルキル（例えば、ジメチルアミノエチル）；アルカノイルオキシ基（例えば、アセトキシメチル、ブチリルオキシメチル、バレリルオキシメチル、イソブチリルオキシメチル、イソバレイルオイキシメチル、１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、１−（ピバロイルオキシ）−１−エチル、１−メチル−１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、ピバロイルオキシメチル、プロピオニルオキシメチル）；シクロアルカノイルオキシアルキル基（例えば、シクロプロピルカルボニルオキシメチル、シクロブチルカルボニルオキシメチル、シクロペンチルカルボニルオキシメチル、シクロヘキシルカルボニルオキシ−メチル）；アロイルオキシアルキル（例えば、ベンゾイルオキシメチル、ベンゾイルオキシエチル）；アリールアルキルカルボニルオキシアルキル（例えば、ベンジルカルボニルオキシメチル、２−ベンジルカルボニルオキシエチル）；アルコキシカルボニルアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルアルキル（例えば、メトキシカルボニルメチル、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシメチル、１−メトキシカルボニル−１−エチル）；アルコキシカルボニルオキシアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、メトキシカルボニルオキシメチル、ｔ−ブトキシカルボニルオキシメチル、１−エトキシカルボニルオキシ−１−エチル、１−シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ−１−エチル）；アリールオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（フェノキシカルボニルオキシ）エチル、２−（５−インダニルオキシカルボニルオキシ）−エチル）；アルコキシアルキルカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（１−メトキシ−２−メチルプロパン−２−オイルオキシ）−エチル）；アリールアルキルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）エチル）；アリールアルケニルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（３−フェニルプロペン−２−イルオキシカルボニルオキシ）エチル）；アルコキシカルボニルアミノアルキル（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノメチル）；アルキルアミノカルボニルアミノアルキル（例えば、メチルアミノカルボニルアミノメチル）；アルカノイルアミノアルキル（例えば、アセチルアミノメチル）；ヘテロ環式カルボニルオキシアルキル（例えば、４−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチル）；ジアルキルアミノカルボニルアルキル（例えば、ジメチルアミノカルボニルメチル、ジエチルアミノカルボニルメチル）；（５−（低級アルキル）−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル（例えば、５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル）；ならびに（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル（例えば、（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル）。代表的なアミドカルボキシ保護基としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アミノカルボニル基および低級アルキルアミノカルボニル基。上記カルボキシ保護基のうち、低級アルキルエステル、シクロアルキルエステル、またはアリールアルキルエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロイピルエステル、ブチルエステル、ｓｅｃ−ブチルエステル、イソブチルエステル、アミルエステル、イソアミルエステル、オクチルエステル、シクロヘキシルエステル、フェニルエチルエステルなど）あるいはアルカノイルオキシアルキルエステル、シクロアルカノイルオキシアルキルエステル、アロイルオキシアルキルエステルまたはアリールアルキルカルボニルオキシアルキルエステルが、好ましい。好ましいアミドカルボキシ保護基は、低級アルキルアミノカルボニル基である。
【００８６】
固相ペプチド合成法において、α−Ｃ末端アミノ酸は、適切な固体支持体または樹脂に付着される。上記合成に有用な適切な固体支持体は、段階的濃縮−脱保護反応の試薬および反応条件に対して不活性であり、そして使用される媒体に不溶性である材料である。α−Ｃ末端カルボキシペプチドの合成に好ましい固体支持体は、Ｒａｍａｇｅ  Ａｍｉｄｅ  ＬｉｎｋｅｒＴＭ  Ｒｅｓｉｎ（Ｒ．Ｒａｍａｇｅら，ＴＨＬ，３４，ｐ．６５９９（１９９３））である。α−Ｃ末端アミドペプチドの好ましい固体支持体は、Ｆｍｏｃ保護Ｒａｍａｇｅ  Ａｍｉｄｅ  ＬｉｎｋｅｒＴＭ  Ｒｅｓｉｎである。
【００８７】
固体支持体が４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ−アセトアミド樹脂である場合、Ｆｍｏｃ基は、上記のように、α−Ｃ末端アミノ酸とのカップリングの前に、第２級アミン（好ましくは、ピペリジン）で切断される。脱保護４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂は、ＤＭＦ中の、Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ、５当量）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、５当量）、および必要に応じて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、５当量）である。首尾良い保護アミノ酸のカップリングは、当該分野で周知なように、従来の様式で自動ペプチド合成機で実施され得る。
【００８８】
伸長するペプチドのα−Ｎ末端側鎖からＦｍｏｃ保護基を除去することは、従来のように、例えば、第２級アミン（好ましくは、ピペリジン）での処理によって達成される。各保護されたアミノ酸は、次いで、約６倍モル濃度過剰で導入され、そしてカップリングは、好ましくは、ＤＭＦ中で実行される。カップリング剤は、通常、Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ、５当量）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、５当量）、および必要に応じて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、５当量）である。
【００８９】
固相合成の最後に、ペプチドは、連続的操作または単一の操作のいずれかで樹脂から除去され、脱保護される。ポリペプチドの除去および脱保護は、樹脂結合ポリペプチドを切断試薬（チオアニソール、トリイソプロピルシラン、フェノール、およびトリフルオロ酢酸）で処理することによって単一操作で従来のように達成され得る。ポリペプチドのα−Ｃ末端がアルキルアミドである場合、この樹脂は、アルキルアミンを用いるアミノ分解によって切断される。あるいは、このポリペプチドは、エステル交換（例えば、メタノールを用いる）に、続いて、アミノ分解または直接的なトランスアミド化によって除去され得る。保護されたペプチドは、この時点で精製され得るか、または次の工程で直接的に取られ得る。側鎖保護基の除去は、上記切断混合物を使用して達成される。完全に脱保護されたペプチドは、以下の型のいずれかまたは全てを使用するクロマトグラフィー工程の順序によって生成され得る：弱い塩基性樹脂（アセテート形態）でのイオン交換；非誘導体化ポリスチレン−ジビニルベンゼンでの疎水性吸着クロマトグラフィー（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤＴＭ）；シリカゲル吸着クロマトグラフィー；カルボキシメチルセルロースでのイオン交換クロマトグラフィー；分配クロマトグラフィー（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ＴＭ、ＬＨ−２０ＴＭまたは向流分布）；高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、特に、オクチル−またはオクタデシルシリル−シリカ結合相カラム充填での逆相ＨＰＬＣ。当業者は、ＮＰペプチドの受容可能な精製を得るために必要とされる好ましいクロマトグラフィー工程または順序が何であるかを容易に決定し得る。
【００９０】
ＮＰペプチドおよび誘導体は、環状である。環化のために、ペプチドのチオール基は、タリウム、ヨウ素によって、またはスルホキシド法によって還元され得る。ヨウ素法は、以下の実施例１において本明細書中で例示され、そしてスルホキシド法は、以下の実施例３、５、２１、および２４において例示される。ペプチドが反応性実体を有する場合、より詳細には、反応性実体が、ＭＰＡである場合、環化は、好ましくは、スルホキシド法によってなされる。
【００９１】
環化工程の後に、最終精製は、環化生成物で実施される。精製の好ましい方法は、ＨＰＬＣによる。
【００９２】
これらのペプチドの分子量は、四重極エレクトロスプレー質量分析法を使用して決定される。
【００９３】
本発明のＮＰ誘導体の生成のための合成プロセスは、ＮＰ誘導体に含まれる、種々の要素（すなわち、ＮＰペプチドの順序、連結基および反応性実体）の性質に依存して幅広く変化する。合成手順は、単純性、高収率および反復性を確実にするように、ならびに高い精製産物をもたらすように選択される。通常、化学的反応性実体は、合成の最後の段階で、例えば、カルボキシル基とカップリングされる（活性エステル形成するためのエステル化）。本発明のＮＰ誘導体の実施形態の生成のための特定の方法は、以下に記載される。
【００９４】
化学的に反応性の実体は、ペプチドが、血液成分に共有結合される一方で、対応するＮＰペプチドの実質的な割合（全てではない場合）の活性および／または利益となる効果を保持する位置に配置されることが、必要である。
【００９５】
ＮＰペプチドの結合活性および薬理学的活性を妨害しないように選択されたＮＰペプチドのペプチド配列に沿った部位で反応性基を結合することが好ましい。インビトロアッセイは、反応性基を結合するために、最良の位置を選択するために使用され得る。
【００９６】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するために提供され、決してその範囲を制限するとは解釈されない。他に示されない限り、Ｌ配置の光学活性保護アミノ酸が使用された。
【００９７】
（ペプチド誘導体合成例）
本発明のナトリウム排泄増加性ペプチドおよびその誘導体の合成は、ナトリウム排泄増加性誘導体の作製の間の手動の介在を伴って、ＳｙｍｐｈｏｎｙＴＭペプチド合成機での自動化固相手順を使用して達成された。この合成は、Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸を使用して、Ｆｍｏｃ−保護Ｒａｍａｇｅ  Ａｍｉｄｅ  ＬｉｎｋｅｒＴＭ樹脂で実施された。カップリングは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のアクチベーターとしてのＯ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）溶液および塩基としてのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用することによって達成された。Ｆｍｏｃ保護基は、２０％ピペリジン／ＤＭＦを使用して除去された。必要な場合、Ｂｏｃ保護アミノ酸は、ペプチドが樹脂から切断された後に、Ｎα末端を作製するために、Ｎ末端において使用された。他に記載しない限り、合成の間に使用した全てのアミノ酸は、Ｌ−立体化学を保有した。ガラス反応容器は、ＳｉｇｍａｃｏｔｅｄＴＭであり、合成の間に使用した。
【００９８】
実施例と式との間の関係をより容易にするために、実施例１〜２０において調製されたＮＰペプチドおよびＮＰ誘導体は、本発明の第１の好ましい実施形態に従ったＮＰペプチドを含み、そして実施例２１〜５７において調製したものは、本発明の第２の好ましい実施形態に従ったＮＰペプチドを含むことが注記され得る。ペプチド結合は、実施例において与えられた各々の配列について、第１のラインの最後のアミノ酸および第２のラインの第１のアミノ酸を連結することが理解されるべきである。本出願において例示される各配列における２つのシステイン間のラインが、配列においてループを形成する直接的なジスルフィド架橋を表すことが理解されるべきである。
【実施例】
【００９９】
（実施例１）
【０１００】
【化３】
2010047614.tif 000006
配列番号１
（工程１）：固相ペプチド合成を、１００マイクロモルのスケールで行った。以下の保護化アミノ酸を、樹脂に連続的に添加した：
【０１０１】
【化４】
2010047614.tif 000007
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去は、２０分間、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンの溶液を使用して達成された。
【０１０２】
（工程２）：ペプチドを、８５％ＴＦＡ／５％ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノールを使用して樹脂から切断し、続いて、ドライアイスで冷やした（０〜４℃）Ｅｔ２Ｏにより沈殿させた。粗ペプチドをポリプロピレン焼結漏斗で収集し、乾燥し、水中アセトニトリルの２０％混合物（０．１％ＴＦＡ）中に再溶解させ、そして凍結乾燥して、精製プロセスにおいて使用される対応する粗物質を作製した。
【０１０３】
（工程３）：得られたペプチドを完全に脱保護し、そして以下の本明細書中に詳述される標準的な精製手順に従って精製した。所望の画分を収集し、一緒にプールして凍結乾燥した。
【０１０４】
（工程４）：工程３の凍結乾燥物を２．５ｍＬ  ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）中においた。次いで、ヨウ素（Ｉ２）（６当量）を添加し、続いて、質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によって反応をモニターした。この溶液を室温で１２時間攪拌した。経過時間後、ビタミンＣの溶液（アスコルビン酸１Ｍ）を添加した。沈殿物を濾過し、そして濾液を凍結乾燥した。
【０１０５】
（工程５）：工程４の凍結乾燥物を、標準的な精製手順（本明細書中に以下で詳述される）を使用して精製した。
【０１０６】
（実施例２）
【０１０７】
【化５】
2010047614.tif 000008
配列番号２
（工程１）：天然の心房ナトリウム排泄増加性ペプチド（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ，カタログ番号００５−０６によって提供される）を、ＤＭＦ中に置いた。この溶液に、ＭＰＡ−ＡＥＥＡ−ＣＯＯ（Ｓｕ）およびＮ−メチルモルホリンを加えた。この溶液を６時間攪拌し、次いで、この溶液を水で（１：１）に希釈し、そして標準的な方法論に従って精製した。
【０１０８】
（実施例３）
【０１０９】
【化６】
2010047614.tif 000009
配列番号３
（工程１）：固相ペプチド合成を、１００マイクロモルのスケールで行った。以下の保護化アミノ酸を、樹脂に連続的に添加した：
【０１１０】
【化７】
2010047614.tif 000010
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去は、２０分間、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンの溶液を使用して達成された。
【０１１１】
（工程２）：ペプチドを、８５％ＴＦＡ／５％ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノールを使用して樹脂から切断し、続いて、ドライアイスで冷やした（０〜４℃）Ｅｔ２Ｏにより沈殿させた。粗ペプチドをポリプロピレン焼結漏斗で収集し、乾燥し、水中アセトニトリルの２０％混合物（０．１％ＴＦＡ）中に再溶解させ、そして凍結乾燥して、精製プロセスにおいて使用される対応する粗物質を作製した。
【０１１２】
（工程３）：得られたペプチドを完全に脱保護し（システインのチオール部分に結合したままであるＡｃｍを除く）、そして以下の本明細書中に詳述される標準的な精製手順に従って精製した。所望の画分を収集し、一緒にプールして凍結乾燥した。
【０１１３】
（工程４）：工程３の凍結乾燥物を、ニートなＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（１ｍｇ／ｍＬ）中においた。次いで、アニソール（１００当量）を添加し、続いて、メチルトリクロロシラン（１０当量）を加え、最後に、ジフェニルスルホキシド（１００当量）加えた。溶液を室温で１８時間攪拌した。経過時間後、この溶液を２Ｎ酢酸（１ｍＬ／ｍｇのペプチド）および冷エーテル（５ｍＬ／ｍＬのＴＦＡ）とともに分液漏斗においた。複数の抽出後、所望の環式ペプチド（水溶液中に存在する）を収集し、一緒にして、凍結乾燥した。
【０１１４】
（工程５）：工程４の凍結乾燥物を、標準的な精製手順（本明細書中に以下で詳述される）を使用して精製した。
【０１１５】
（実施例４）
【０１１６】
【化８】
2010047614.tif 000011
配列番号４
（工程１）：固相ペプチド合成を、１００マイクロモルのスケールで行った。以下の保護化アミノ酸を、樹脂に連続的に添加した：
【０１１７】
【化９】
2010047614.tif 000012
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去は、２０分間、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンの溶液を使用して達成された。
【０１１８】
（工程２〜５）：これらの工程を、実施例３と同じ様式で実施した。
【０１１９】
（実施例５）
【０１２０】
【化１０】
2010047614.tif 000013
配列番号５
（工程１）：固相ペプチド合成を、１００マイクロモルのスケールで行った。以下の保護化アミノ酸を、樹脂に連続的に添加した：
【０１２１】
【化１１】
2010047614.tif 000014
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去は、２０分間、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンの溶液を使用して達成された。
【０１２２】
（工程２）：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護を手動によって実施し、そして樹脂を、５ｍＬのＣ６Ｈ６：ＣＨＣｌ３（１：１）：２．５％  ＮＭＭ（ｖ：ｖ）：５％  ＡｃＯＨ（ｖ：ｖ）中に溶解させた３当量のＰｄ（ＰＰｈ３）４の溶液を用いて２時間処理することによって達成した。次いで、樹脂をＣＨＣｌ３（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中の２０％  ＡｃＯＨ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）を用いて洗浄した。
【０１２３】
（工程３）：次いで、この合成を、Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨの添加について再自動化した。カップリング後、Ｆｍｏｃ保護基を、２０％ピペリジンを用いて除去した。最後に、３−マレイミドプロピオン酸を、標準的カップリング条件を使用して樹脂上でペプチドにカップリングした。各カップリングの間で、樹脂を３回Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で、そして３回イソプロパノールで洗浄した。
【０１２４】
（工程４）：ペプチドを、８５％ＴＦＡ／５％ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノールを使用して樹脂から切断し、続いて、ドライアイスで冷やした（０〜４℃）Ｅｔ２Ｏにより沈殿させた。粗ペプチドをポリプロピレン焼結漏斗で収集し、乾燥し、水中アセトニトリルの４０％混合物（０．１％ＴＦＡ）中に再溶解させ、そして凍結乾燥して、精製プロセスにおいて使用される対応する粗物質を作製した。
【０１２５】
（工程５）：得られたペプチドを完全に脱保護し（システインのチオール部分に結合したままであるＡｃｍを除く）、そして標準的な精製手順に従って精製した。所望の画分を収集し、一緒にプールして凍結乾燥した。
【０１２６】
（工程６）：工程３の凍結乾燥物を、ニートなＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（１ｍｇ／ｍＬ）中においた。次いで、アニソール（１００当量）を添加し、続いて、メチルトリクロロシラン（１０当量）を加え、最後に、ジフェニルスルホキシド（１００当量）を加えた。溶液を室温で１８時間攪拌した。経過時間後、この溶液を２Ｎ酢酸（１ｍＬ／ｍｇのペプチド）および冷エーテル（５ｍＬ／ｍＬのＴＦＡ）とともに分液漏斗においた。複数の抽出後、水溶液を収集し、一緒にして、凍結乾燥した。
【０１２７】
（工程７）：工程４の凍結乾燥物を、標準的な精製手順を使用して精製した。
【０１２８】
（実施例６）
【０１２９】
【化１２】
2010047614.tif 000015
（配列番号６）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１３０】
【化１３】
2010047614.tif 000016
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１３１】
工程２〜７：これらの工程を、実施例５と同じ様式で行った。
【０１３２】
（実施例７）
【０１３３】
【化１４】
2010047614.tif 000017
（配列番号７）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１３４】
【化１５】
2010047614.tif 000018
【０１３５】
【化１６】
2010047614.tif 000019
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１３６】
工程２〜７：これらの工程を、実施例５と同じ様式で行った。
【０１３７】
（実施例８）
【０１３８】
【化１７】
2010047614.tif 000020
（配列番号８）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１３９】
【化１８】
2010047614.tif 000021
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１４０】
工程２〜５：これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１４１】
（実施例９）
【０１４２】
【化１９】
2010047614.tif 000022
（配列番号９）
工程１：出発物質としてウロジラチン（ｕｒｏｄｉｌａｔｉｎ）を使用する実施例２の工程１と同じ。ウロジラチンは、Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ，カタログ番号Ｈ−３０４６．１０００により提供される。
【０１４３】
（実施例１０）
【０１４４】
【化２０】
2010047614.tif 000023
（配列番号１０）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１４５】
【化２１】
2010047614.tif 000024
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１４６】
工程２〜５：これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１４７】
（実施例１１）
【０１４８】
【化２２】
2010047614.tif 000025
（配列番号１１）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１４９】
【化２３】
2010047614.tif 000026
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１５０】
工程２〜５：これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１５１】
（実施例１２）
【０１５２】
【化２４】
2010047614.tif 000027
（配列番号１２）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１５３】
【化２５】
2010047614.tif 000028
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１５４】
工程２〜５：これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１５５】
（実施例１３）
【０１５６】
【化２６】
2010047614.tif 000029
（配列番号１３）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１５７】
【化２７】
2010047614.tif 000030
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１５８】
工程２〜５：これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１５９】
（実施例１４）
【０１６０】
【化２８】
2010047614.tif 000031
（配列番号１４）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１６１】
【化２９】
2010047614.tif 000032
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１６２】
工程２〜５：これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１６３】
（実施例１５）
【０１６４】
【化３０】
2010047614.tif 000033
（配列番号１５）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１６５】
【化３１】
2010047614.tif 000034
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１６６】
工程２〜５：これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１６７】
（実施例１６）
【０１６８】
【化３２】
2010047614.tif 000035
（配列番号１６）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１６９】
【化３３】
2010047614.tif 000036
【０１７０】
【化３４】
2010047614.tif 000037
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１７１】
工程２〜５：これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１７２】
（実施例１７）
【０１７３】
【化３５】
2010047614.tif 000038
（配列番号１７）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１７４】
【化３６】
2010047614.tif 000039
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１７５】
工程２〜５：これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１７６】
（実施例１８）
【０１７７】
【化３７】
2010047614.tif 000040
（配列番号１８）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１７８】
【化３８】
2010047614.tif 000041
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１７９】
工程２〜５：これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１８０】
（実施例１９）
【０１８１】
【化３９】
2010047614.tif 000042
（配列番号１９）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１８２】
【化４０】
2010047614.tif 000043
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１８３】
工程２〜５：これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１８４】
（実施例２０）
【０１８５】
【化４１】
2010047614.tif 000044
（配列番号２０）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで行った。以下の保護アミノ酸を、順次、樹脂に添加した：
【０１８６】
【化４２】
2010047614.tif 000045
これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）のピペリジンの溶液を使用して、２０分かけて達成した。
【０１８７】
工程２〜５  これらの工程を、実施例３と同じ様式で行った。
【０１８８】
（実施例２１）
【０１８９】
【化４３】
2010047614.tif 000046
（配列番号２１）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０１９０】
【化４４】
2010047614.tif 000047
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０１９１】
工程２：８５％  ＴＦＡ／５％  ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノールを用いてこのペプチドを樹脂から切断し、その後、ドライアイスで冷やした（０〜４℃）Ｅｔ２Ｏによる沈殿を行った。粗ペプチドをポリプロピレン焼結漏斗上で収集し、乾燥させ、水中アセトニトリル４０％混合物（０．１％  ＴＦＡ）中に再溶解し、そして凍結乾燥させて、対応する粗金属を産生し、これを精製プロセスにおいて用いた。
【０１９２】
工程３：生じたペプチドを、Ａｃｍ基（システインのチオール部分に結合し続けた）を除いて完全に脱保護し、本明細書中以下で詳述する標準的精製手順に従って精製した。所望の画分を収集してまとめてプールし、凍結乾燥した。
【０１９３】
工程４：工程３の凍結乾燥物質を、ニートなＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（１ｍｇ／ｍＬ）中に入れた。次いで、アニソール（１００当量）を加え、次にメチルトリクロロシラン（１０当量）を加え、最後にジフェニルスルホキシド（ｄｉｐｈｅｎｙｌｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１００当量）を加えた。この溶液を、室温で１８時間撹拌した。この経過時間後、この溶液を、２Ｎ酢酸（ペプチド１ｍｇあたり１ｍＬ）および冷エーテル（ＴＦＡ１ｍＬあたり５ｍＬ）と共に分液漏斗に入れた。複数回の抽出の後に、水溶液を収集し、混合して、凍結乾燥した。
【０１９４】
工程５：工程４の凍結乾燥物質を、標準的精製手順（本明細書中以下に詳述する）を用いて精製した。
【０１９５】
（実施例２２）
【０１９６】
【化４５】
2010047614.tif 000048
（配列番号２２）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０１９７】
【化４６】
2010047614.tif 000049
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０１９８】
工程２〜５  これらの工程を、実施例２１と同じ様式で行った。
【０１９９】
（実施例２３）
【０２００】
【化４７】
2010047614.tif 000050
（配列番号２３）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０２０１】
【化４８】
2010047614.tif 000051
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２０２】
工程２〜５  これらの工程を、実施例２１と同じ様式で行った。
【０２０３】
（実施例２４）
【０２０４】
【化４９】
2010047614.tif 000052
（配列番号２４）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０２０５】
【化５０】
2010047614.tif 000053
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２０６】
工程２：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護を手で行い、そしてこの樹脂の、５ｍＬのＣ６Ｈ６：ＣＨＣｌ３（１：１）：２．５％  ＮＭＭ（ｖ：ｖ）：５％  ＡｃＯＨ（ｖ：ｖ）中に３当量のＰｄ（ＰＰｈ３）４を溶解した溶液で２時間処理することによって、達成した。この樹脂を、次いで、ＣＨＣｌ３（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中２０％  ＡｃＯＨ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄した。
【０２０７】
工程３：次いで、この合成を、Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨの添加について再自動化した。結合後、２０％ピリミジンを用いて、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。最後に、標準的結合条件を用い、樹脂上で３−マレイミドプロピオン酸をこのペプチドに結合させた。各結合の間、樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で３回、イソプロパノールで３回洗浄した。
【０２０８】
工程４：８５％  ＴＦＡ／５％  ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノールを用いてこのペプチドを樹脂から切断し、その後、ドライアイスで冷やした（０〜４℃）Ｅｔ２Ｏによる沈殿を行った。粗ペプチドをポリプロピレン焼結漏斗上で収集し、乾燥させ、水中アセトニトリル４０％混合物（０．１％  ＴＦＡ）中に再溶解し、そして凍結乾燥させて、対応する粗金属を産生し、これを精製プロセスにおいて用いた。
【０２０９】
工程５：生じたペプチドを、Ａｃｍ基（システインのチオール部分に結合し続けた）を除いて完全に脱保護し、標準的精製手順に従って精製した。所望の画分を収集してまとめてプールし、凍結乾燥した。
【０２１０】
工程６：工程３の凍結乾燥物質を、ニートなＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（１ｍｇ／ｍＬ）中に入れた。次いで、アニソール（１００当量）を加え、次にメチルトリクロロシラン（１０当量）を加え、最後にジフェニルスルホキシド（ｄｉｐｈｅｎｙｌｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１００当量）を加えた。この溶液を、室温で１８時間撹拌した。この経過時間後、この溶液を、２Ｎ酢酸（ペプチド１ｍｇあたり１ｍＬ）および冷エーテル（ＴＦＡ１ｍＬあたり５ｍＬ）と共に分液漏斗に入れた。複数回の抽出の後に、水溶液を収集し、混合して、凍結乾燥した。
【０２１１】
工程７：工程４の凍結乾燥物質を、標準的精製方法論を用いて精製した。
【０２１２】
（実施例２５）
【０２１３】
【化５１】
2010047614.tif 000054
（配列番号２５）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０２１４】
【化５２】
2010047614.tif 000055
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２１５】
工程２〜５  これらの工程を、実施例２１と同じ様式で行った。
【０２１６】
（実施例２６）
【０２１７】
【化５３】
2010047614.tif 000056
（配列番号２６）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０２１８】
【化５４】
2010047614.tif 000057
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２１９】
工程２〜５  これらの工程を、実施例２１と同じ様式で行った。
【０２２０】
（実施例２７）
【０２２１】
【化５５】
2010047614.tif 000058
（配列番号２７）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０２２２】
【化５６】
2010047614.tif 000059
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２２３】
工程２から７  これらの工程を、実施例２４と同じ様式で行った。
【０２２４】
（実施例２８）
【０２２５】
【化５７】
2010047614.tif 000060
（配列番号２８）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０２２６】
【化５８】
2010047614.tif 000061
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２２７】
工程２〜５  これらの工程を、実施例２１と同じ様式で行った。
【０２２８】
（実施例２９）
【０２２９】
【化５９】
2010047614.tif 000062
（配列番号２９）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０２３０】
【化６０】
2010047614.tif 000063
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２３１】
工程２〜５  これらの工程を、実施例２１と同じ様式で行った。
【０２３２】
（実施例３０）
【０２３３】
【化６１】
2010047614.tif 000064
（配列番号３０）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０２３４】
【化６２】
2010047614.tif 000065
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２３５】
工程２から７  これらの工程を、実施例２４と同じ様式で行った。
【０２３６】
（実施例３１）
【０２３７】
【化６３】
2010047614.tif 000066
（配列番号３１）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０２３８】
【化６４】
2010047614.tif 000067
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２３９】
工程２〜５  これらの工程を、実施例２１と同じ様式で行った。
【０２４０】
（実施例３２）
【０２４１】
【化６５】
2010047614.tif 000068
（配列番号３２）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μモル規模で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に添加した：
【０２４２】
【化６６】
2010047614.tif 000069
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化させた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間用いて、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２４３】
工程２〜５  これらの工程を、実施例２１と同じ様式で行った。
【０２４４】
（実施例３３）
【０２４５】
【化６７】
2010047614.tif 000070
（配列番号３３）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２４６】
【化６８】
2010047614.tif 000071
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２４７】
工程２−７：実施例２４と同一の様式で工程を実施した。
【０２４８】
（実施例３４）
【０２４９】
【化６９】
2010047614.tif 000072
（配列番号３４）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２５０】
【化７０】
2010047614.tif 000073
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２５１】
工程２−５：実施例２１と同一の様式で工程を実施した。
【０２５２】
（実施例３５）
【０２５３】
【化７１】
2010047614.tif 000074
（配列番号３５）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ
酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２５４】
【化７２】
2010047614.tif 000075
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２５５】
工程２−５：実施例２１と同一の様式で工程を実施した。
【０２５６】
（実施例３６）
【０２５７】
【化７３】
2010047614.tif 000076
（配列番号３６）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２５８】
【化７４】
2010047614.tif 000077
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２５９】
工程２−７：実施例２４と同一の様式で工程を実施した。
【０２６０】
（実施例３７）
【０２６１】
【化７５】
2010047614.tif 000078
（配列番号３７）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２６２】
【化７６】
2010047614.tif 000079
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２６３】
工程２−５：実施例２１と同一の様式で工程を実施した。
【０２６４】
（実施例３８）
【０２６５】
【化７７】
2010047614.tif 000080
（配列番号３８）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２６６】
【化７８】
2010047614.tif 000081
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２６７】
工程２−７：実施例２４と同一の様式で工程を実施した。
【０２６８】
（実施例３９）
【０２６９】
【化７９】
2010047614.tif 000082
（配列番号３９）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２７０】
【化８０】
2010047614.tif 000083
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２７１】
工程２−５：実施例２１と同一の様式で工程を実施した。
【０２７２】
（実施例４０）
【０２７３】
【化８１】
2010047614.tif 000084
（配列番号４０）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２７４】
【化８２】
2010047614.tif 000085
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２７５】
工程２−５：実施例２１と同一の様式で工程を実施した。
【０２７６】
（実施例４１）
【０２７７】
【化８３】
2010047614.tif 000086
（配列番号４１）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２７８】
【化８４】
2010047614.tif 000087
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２７９】
工程２−７：実施例２４と同一の様式で工程を実施した。
【０２８０】
（実施例４２）
【０２８１】
【化８５】
2010047614.tif 000088
（配列番号４２）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２８２】
【化８６】
2010047614.tif 000089
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２８３】
工程２−５：実施例２１と同一の様式で工程を実施した。
【０２８４】
（実施例４３）
【０２８５】
【化８７】
2010047614.tif 000090
（配列番号４３）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２８６】
【化８８】
2010047614.tif 000091
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２８７】
工程２−５：実施例２１と同一の様式で工程を実施した。
【０２８８】
（実施例４４）
【０２８９】
【化８９】
2010047614.tif 000092
（配列番号４４）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２９０】
【化９０】
2010047614.tif 000093
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２９１】
工程２−７：実施例２４と同一の様式で工程を実施した。
【０２９２】
（実施例４５）
【０２９３】
【化９１】
2010047614.tif 000094
（配列番号４５）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２９４】
【化９２】
2010047614.tif 000095
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２９５】
工程２−５：実施例２１と同一の様式で工程を実施した。
【０２９６】
（実施例４６）
【０２９７】
【化９３】
2010047614.tif 000096
（配列番号４６）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０２９８】
【化９４】
2010047614.tif 000097
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０２９９】
工程２−５：実施例２１と同一の様式で工程を実施した。
【０３００】
（実施例４７）
【０３０１】
【化９５】
2010047614.tif 000098
（配列番号４７）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０３０２】
【化９６】
2010047614.tif 000099
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０３０３】
工程２−７：実施例２４と同一の様式で工程を実施した。
【０３０４】
（実施例４８）
【０３０５】
【化９７】
2010047614.tif 000100
（配列番号４８）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０３０６】
【化９８】
2010047614.tif 000101
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０３０７】
工程２−５：実施例２１と同一の様式で工程を実施した。
【０３０８】
（実施例４９）
【０３０９】
【化９９】
2010047614.tif 000102
（配列番号４９）
工程１：１００μｍｏｌスケールで、固相ペプチド合成を行なった。以下の保護アミノ酸を連続的に樹脂に添加した：
【０３１０】
【化１００】
2010047614.tif 000103
それらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、そして、この配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を２０分間使用して、Ｆｍｏｃ保護基の除去を達成した。
【０３１１】
工程２−５：実施例２１と同一の様式で工程を実施した。
【０３１２】
（実施例５０）
【０３１３】
【化１０１】
2010047614.tif 000104
（配列番号５０）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に付加した：
【０３１４】
【化１０２】
2010047614.tif 000105
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、その配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間使用して、達成した。
【０３１５】
工程２〜７：これらの工程を、実施例２４と同じ様式で実施した。
【０３１６】
（実施例５１）
【０３１７】
【化１０３】
2010047614.tif 000106
（配列番号５１）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に付加した：
【０３１８】
【化１０４】
2010047614.tif 000107
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、その配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間使用して、達成した。
【０３１９】
工程２〜５：これらの工程を、実施例２１と同じ様式で実施した。
【０３２０】
（実施例５２）
【０３２１】
【化１０５】
2010047614.tif 000108
（配列番号５２）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に付加した：
【０３２２】
【化１０６】
2010047614.tif 000109
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、その配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間使用して、達成した。
【０３２３】
工程２〜５：これらの工程を、実施例２１と同じ様式で実施した。
【０３２４】
（実施例５３）
【０３２５】
【化１０７】
2010047614.tif 000110
（配列番号５３）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に付加した：
【０３２６】
【化１０８】
2010047614.tif 000111
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、その配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間使用して、達成した。
【０３２７】
工程２〜７：これらの工程を、実施例２４と同じ様式で実施した。
【０３２８】
（実施例５４）
【０３２９】
【化１０９】
2010047614.tif 000112
（配列番号５４）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に付加した：
【０３３０】
【化１１０】
2010047614.tif 000113
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、その配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間使用して、達成した。
【０３３１】
工程２〜５：これらの工程を、実施例２１と同じ様式で実施した。
【０３３２】
（実施例５５）
【０３３３】
【化１１１】
2010047614.tif 000114
（配列番号５５）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に付加した：
【０３３４】
【化１１２】
2010047614.tif 000115
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、その配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間使用して、達成した。
【０３３５】
工程２〜７：これらの工程を、実施例２４と同じ様式で実施した。
【０３３６】
（実施例５６）
【０３３７】
【化１１３】
2010047614.tif 000116
（配列番号５６）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に付加した：
【０３３８】
【化１１４】
2010047614.tif 000117
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、その配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間使用して、達成した。
【０３３９】
工程２〜７：これらの工程を、実施例２４と同じ様式で実施した。
【０３４０】
（実施例５７）
【０３４１】
【化１１５】
2010047614.tif 000118
（配列番号５７）
工程１：固相ペプチド合成を、１００μｍｏｌスケールで実行した。以下の保護アミノ酸を、連続して樹脂に付加した：
【０３４２】
【化１１６】
2010047614.tif 000119
。これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、その配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン溶液を２０分間使用して、達成した。
【０３４３】
工程２〜７：これらの工程を、実施例２４と同じ様式で実施した。
【０３４４】
（合成された誘導体の精製手順）
各化合物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｄｙｎａｍａｘ）調製用バイナリーＨＰＬＣシステムを使用して、調製用逆相ＨＰＬＣによって精製した。この精製は、水／ＴＦＡ混合物（Ｈ２Ｏ中０．１％  ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびアセトニトリル／ＴＦＡ（ＣＨ３ＣＮ中０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ））で平衡化した、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  １０μフェニル−ヘキシル，５０ｍｍ×２５０ｍｍカラム（粒子１０μ）を使用して、実施した。ペプチド含有画分を、２１４ｎｍにおけるＵＶ吸光度（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  ＵＶＤ  ＩＩ）によって検出した。表２は、本発明に従うＮＰペプチドおよび誘導体である化合物の保持時間を示す。
【０３４５】
（表２）
【０３４６】
【表２】
2010047614.tif 000120
Ａ、Ｂ、およびＣと注釈を付けられている保持時間は、それぞれ、表３、表４、および表５において示される溶出勾配を用いて得られた。
【０３４７】
（表３）
【０３４８】
【表３】
2010047614.tif 000121
（表４）
【０３４９】
【表４】
2010047614.tif 000122
（表５）
【０３５０】
【表５】
2010047614.tif 000123
表６は、本発明に従うＮＰペプチドおよび誘導体である化合物の推定分子量（推定）および実測分子量（実測）を示す。すべての分子量は、ｇ／ｍｏｌで表現される。分子量は、Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｐｒａｙ質量分析計によって測定した。推定分子量は、各原子の理論的質量の加算によって確立された。推定分子量と実測分子量との間の差異は、無視でき、それは、合成された化合物が、所望される化合物であることを示す。
【０３５１】
（表６）
【０３５２】
【表６】
2010047614.tif 000124
（ペプチドの環化効率の決定）
環化は、分子内ジスルフィド架橋を形成するようにペプチドの両方のシステイン残基のチオール基の還元によって得る。このプロセスの詳細は、本明細書中にあり、実施例１の工程４および実施例３の工程４において例証される。そのペプチドが首尾良く環化されていることを決定するために、Ｅｌｌｍａｎ試験を、Ｇ．Ｌ．Ｅｌｌｍａｎ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８２（７０）１９５９およびＧ．Ｌ．Ｅｌｌｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７（６８）１９６１において教示されるように、最終環化物質に対して実施した。このＥｌｌｍａｎ試験は、ジスルフィド架橋を形成しないチオール基の決定を可能にする。遊離チオール基が存在しないことは、この環化が成功したことを示す。
【０３５３】
また、ＬＣ／ＭＳによる分析は、環化工程の前に得られた合成中間体と、環化工程後に得られた最終生成物との比較を可能にする。図１は、重ね合わせにおいて、点線（−−−）で示される環化前の実施例１の化合物の合成中間体のＬＣ／ＭＳスペクトル、および連続線（−）で示される環化後の対応する最終生成物を示し、この環化は、実施例１の工程４に例証されるようにヨウ素を用いて実施した。この中間体は、質量３０８０．８に対応する分子イオンフラグメント７７１．２（Ｍ＋４）を有し、最終生成物は、質量３０７８．０に対応する分子イオンフラグメント７７０．５（Ｍ＋４）を有することが、観察され得る。質量２．８の減少は、ジスルフィド架橋の形成の間に２つの水素を喪失することから生じる。直鎖状中間体のピークおよび環状最終生成物のピークの鋭さは、すべての中間体が、環化したことを示す。
【０３５４】
さらに、約１２３２（Ｍ＋５）および／または８８０．４（Ｍ＋７）において、有意なピークは観察されなかった（示さず）。このことは、ダイマーが合成されなかったこと、換言すると、分子間ジスルフィド結合が生成されなかったことを、意味する。
【０３５５】
（インビトロ結合体化）
エキソビボ結合体の調製は、誘導体のインビトロ試験のため、およびその後のその結合体のインビボ投与目的のために、使用される。従って、その誘導体は、血液成分に結合体化される。好ましくは、その血液成分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。実施例２２〜２３〜２４において、ＨＳＡは、Ｃｏｒｔｅｘ−ＢｉｏｃｈｅｍＴＭ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ，ＵＳＡによって提供される。
【０３５６】
（インビトロ結合体化実施例）
（実施例５８：１ｍＭの実施例３の化合物：ＨＳＡ結合体の調製）  １５００μＬ  ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＴＭチューブ中に、４５０μｌのＨＳＡ  ２５％（ｇ／１００ｍｌ）を分注し、変速ボルテックス機器を使用して、このＨＳＡ溶液をボルテックスにかける。ボルテックスの間に、５０μＬの実施例３の化合物（ナノ純水中１０ｍＭ濃度）を添加する。生じる溶液を、３７℃で４時間インキュベートし、２０℃で保存する。
【０３５７】
（実施例５９：１ｍＭの実施例４の化合物：ＨＳＡ結合体の調製）  ＨＳＡに対する結合体化を、実施例５８と同じ様式で実施する。
【０３５８】
（実施例６０：１ｍＭの実施例５の化合物：ＨＳＡ結合体の調製）  ＨＳＡに対する結合体化を、実施例５８と同じ様式で実施する。
【０３５９】
（実施例６１：１ｍＭの実施例６の化合物：ＨＳＡ結合体の調製）  ＨＳＡに対する結合体化を、実施例５８と同じ様式で実施する。
【０３６０】
（実施例６２：１ｍＭの実施例７の化合物：ＨＳＡ結合体の調製）  ＨＳＡに対する結合体化を、実施例５８と同じ様式で実施する。
【０３６１】
（実施例６３：１ｍＭの実施例１４の化合物：ＨＳＡ結合体の調製）  ＨＳＡに対する結合体化を、実施例５８と同じ様式で実施する。
【０３６２】
実施例６４：実施例１８の１ｍＭの化合物の調製：ＨＳＡ結合体。ＨＳＡへの結合が実施例５８と同じ様式で実施される。
【０３６３】
実施例６５：実施例５４の１ｍＭの化合物を調製する：ＨＳＡ結合体。ＨＳＡへの結合が実施例５８と同じ様式で実施される。
【０３６４】
実施例６６：実施例５５の１ｍＭの化合物の調製：ＨＳＡ結合体。ＨＳＡへの結合が実施例５８と同じ様式で実施される。
【０３６５】
実施例６７：実施例５６の１ｍＭの化合物の調製：ＨＳＡ結合体。ＨＳＡへの結合が実施例５８と同じ様式で実施される。
【０３６６】
実施例６８：実施例５７の１ｍＭの化合物の調製：ＨＳＡ結合体。ＨＳＡへの結合が実施例５８と同じ様式で実施される。
【０３６７】
（結合体純度分析）
調製された結合体の純度の分析のために、２つの試験を、液体クロマトグラフフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）（Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ）により実施し：１）１％誘導体基準と比較して残りのフリー誘導体を定量し、そして２）ＨＳＡと比較して結合体を検出する。
【０３６８】
（結合体純度結果）
溶液中に留まっている残りのフリー誘導体は以下である：
実施例５８：実施例３の化合物のＨＳＡとの結合体：    ２．２％
実施例５９：実施例４の化合物のＨＳＡとの結合体：    ４．４％
実施例６０：実施例５の化合物のＨＳＡとの結合体：    ３．６％
実施例６１：実施例６の化合物のＨＳＡとの結合体：    ＜１％
実施例６２：実施例７の化合物のＨＳＡとの結合体：    ＜１％
実施例６３：実施例１４の化合物のＨＳＡとの結合体：  １．２％
実施例６４：実施例１８の化合物のＨＳＡとの結合体：  １．３％
実施例６５：実施例５４の化合物のＨＳＡとの結合体：  １．４％
実施例６６：実施例５５の化合物のＨＳＡとの結合体：  ２．４％
実施例６７：実施例５６の化合物のＨＳＡとの結合体：  ０．８％
実施例６８：実施例５７の化合物のＨＳＡとの結合体：  ２．１％
（結合体重量）
表７は、本発明に従うＮＰ誘導体の結合体の予測された分子量（予測）および測定された分子量（実測）を示す。全ての分子量が、ｇ／ｍｏｌで表される。分子量は、Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｐｒａｙマススペクトロメトリーにより測定される。予測された分子量が、各々の原子の理論質量の追加により、確立されている。予測された分子量と測定された分子量との間の違いは、無視できるものであり、合成された化合物が所望される化合物であることを示す。
【０３６９】
【表７】
2010047614.tif 000125
（インビトロ結合アッセイおよび活性アッセイ）
ＮＰ誘導体の能力は、モルモット副腎のＮＰＲレセプターに結合し、ラット原発性肺線維芽細胞アッセイにおけるｃＧＭＰレベルを高める能力として、評価される。大動脈平滑筋細胞、糸球体間質細胞および副腎細胞のような他の細胞株を使用して、これらのインビトロアッセイを実施し得る。ヒト、ラットおよびモルモット細胞株または他の種の細胞株を、ヒト細胞株について好ましく、使用し得る。
【０３７０】
（インビトロ結合アッセイ実施例）
結合研究についての膜を、以下の様に調製する。副腎が、麻酔された正常なＤｕｎｃａｎ  Ｈａｒｔｌｅｙモルモットから収集され、そして１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中のポリトロン；２５℃でｐＨ７．４を使用して均質化した。このホモジェネートを、１０分間３９，０００×ｇ（４℃）で遠心分離した。ペレットを、再懸濁し、そして洗浄した。最後に、これらの膜を１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ＋０．２％ＢＳＡを補充した同じ緩衝液中に再懸濁した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。この結合アッセイを、４℃で６０分間、０．０１６ｎＭ  １２５Ｉ−ｒＡＮＦおよびＮＰペプチドまたはＮＰ誘導体（１０−５〜１０−１１Ｍ）のいずれかの増加する濃度を有する膜のインキュベーションにより行なう。全てのアッセイを、二連で行った。結合した放射活性ｒＡＮＦおよびフリーの放射活性ｒＡＮＦの分離を、アッセイ緩衝液中に浸されたポリエチレンイミン処理されたＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃフィルターを介する迅速な濾過により達成した。フィルターを洗浄し、乾燥し、γ線計数器において放射活性について計数した。
【０３７１】
式ＩのＮＰペプチドを含むＮＰ誘導体の結合アッセイの結果を、図２に示し、そして式ＩＩに基づくＮＰペプチドを含むＮＰ誘導体の結合アッセイの結果を、図３に示す。
【０３７２】
図２において、「ネイティブＡＮＰ」は、発明者らの研究室で合成されたヒトＡＮＰ配列を有するペプチド（実施例１を参照のこと）であり、そして「ｈＡＮＰ」は、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡにより提供される市販のペプチド（カタログ番号００５−０６）である。図２に見られ得るように、ネイティブＡＮＰおよび市販のｈＡＮＰの両方が、１２５Ｉ−ＡＮＦの、濃度依存様式でのレセプターへの結合を、それぞれ３．４×１０−１０Ｍおよび６．０×１０−１０Ｍの見かけの阻害定数（Ｋｉ値）で阻害した。実施例３および５のＮＰ誘導体の結合体がまた、濃度依存様式において１２５Ｉ−ＡＮＦの、副腎のレセプターへの結合を、それぞれ２．４×１０−９Ｍおよび２．９×１０−９の見かけのＫｉ値で阻害した。実施例６および７のＮＰ誘導体の結合体は、ＮＰＲレセプターに対してより低い結合アフィニティーおよびアビジティーを有した。実施例６および７のＮＰ誘導体は、Ｎ末端およびＣ末端でそれぞれ修飾される、実施例３および５の誘導体と比較してループ中で修飾される。
【０３７３】
表８は、５０％の阻害（ＥＣ５０）での濃度および図２のグラフの元となるデータで計算された阻害定数（ＫＩ）を示す。
【０３７４】
【表８】
2010047614.tif 000126
図３において、「ネイティブＢＮＰ」は、発明者らの研究室で合成されたヒトＢＮＰ配列を有するペプチドである（実施例２１を参照のこと）。図３に見られ得るように、ネイティブＢＮＰは、１２５Ｉ−ＡＮＦの濃度依存様式でのレセプターへの結合を、見かけの阻害定数（Ｋｉ値）４．８×１０−９Ｍで阻害した。実施例５４および５５のＮＰ誘導体の結合体がまた、１２５Ｉ−ＡＮＦの濃度依存様式での副腎のレセプターへの結合を、それぞれ見かけのＫｉ値１．５×１０−８Ｍおよび５．５×１０−８Ｍで阻害した。実施例５６および５７のＮＰ誘導体の結合体は、ＮＰＲレセプターに対してより低い結合アフィニティーおよびアビジティーを有した。実施例５６および５７の誘導体は、Ｎ末端およびＣ末端でそれぞれ修飾される、実施例５４および５５の誘導体と比較してループ中で修飾される。
【０３７５】
表９は、５０％の阻害（ＥＣ５０）での濃度および図３のグラフの元となるデータで計算された阻害定数（ＫＩ）を示す。
【０３７６】
【表９】
2010047614.tif 000127
（インビトロ活性アッセイ実施例）
インビトロ活性研究について、ヒト頚部上皮腺癌細胞株が、使用された。ヒーラ細胞は、グアニル酸シクラーゼ活性を有する高いレベルのナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターを発現する。
【０３７７】
ｃＧＭＰ実験の１日前に、細胞を、４８ウェルプレート（ウェル当たり５×１０４細胞）中に接種し、一晩インキュベートした。実験の日に、細胞を、無血清培地で２回洗い、ｃＧＭＰ分解を防ぐ３−イソブチル−１−メチルキサンチンの存在下で、１時間の間ＮＰ誘導体またはネイティブＡＮＰもしくはＢＮＰと共に、またはこれらなしで、インキュベートする。インキュベーションを、アッセイ培地を取り除くことにより、そしてＨＣｌを１０分間、細胞に加えることにより、終わらせた。次いで上清を収集し、遠心分離し、そしてｃＧＭＰレベルをＳｉｇｍａの直接ｃＧＭＰ  ＥＩＡキットを使用して評価する。
【０３７８】
図４、５および６で例示されるような実施例１４、１８および５６の誘導体の結合体を除く、全てのＮＰ誘導体および結合体が、１０−６Ｍ〜１０−９Ｍにわたる濃度でヒトヒーラ細胞におけるｃＧＭＰを高め得た。ＥＣ５０（最大応答の５０％を引き起こす薬物の有効濃度）が、各々のＮＰ誘導体および結合体について計算され、表１０に列挙される。表１０から見られ得るように、ｃＧＭＰにおける増大は、ネイティブＡＮＰから得られた増大と匹敵すると見なされ、実施例１４：ＨＳＡ、実施例１８：ＨＳＡ、実施例５６：ＨＳＡの結合体についての場合を除いて、これらの間に有意な（Ｐ＜０．０５）差は観察されない。二連で（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔａ）アッセイを実施し、各々の化合物を３回試験した。
【０３７９】
【表１０】
2010047614.tif 000128
（ヒト血漿における安定性の分析）
ＮＰペプチドの結合体の安定性を、ヒト血漿において生じる酵素分解に対する結合したＮＰペプチドの保護を示すように、またはより安定なＮＰ誘導体を選択するように、対応するフリーのＮＰペプチドと比較してヒト血漿において試験する。以下に示される実施例において、対応するフリーＮＰペプチドは、ヒトＡＮＰ（本明細書中以下、「ｈＡＮＰ」と呼ばれる）であり、これは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡにより提供された。
【０３８０】
ヒト血漿における安定性の分析のための条件は、以下の通りである。７５０μＬのヒト血漿（Ｂｉｏｃｈｅｍｅｄ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ，ＵＳＡ）を、１５００μＬエッペンドルフチューブに注ぎ、２５０μＬのＮＰ結合体またはｈＡＮＰ（１ｍＭ）を、最終濃度０．２５ｍＭの結合体またはｈＡＮＰを得るために、この血漿に加える。溶液を、ボルテックスにより混合し、タイマーを始動させた。この溶液を、３７℃で４８時間インキュベートした。１００μＬのアリコートを、０時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間および４８時間で取り除いた。各々のアリコートを、ＨＰＬＣバイアル中に配置し、ドライアイスで即座に急激に凍結させ、ＬＣ／ＭＳ分析まで−８０℃で保存する。
【０３８１】
ペプチドおよび結合体のＬＣ／ＭＳ溶出勾配が、それぞれ表１１および表１２に示される；ここで溶媒Ａは、水／ＴＦＡ混合物（Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ）であり、そして溶媒Ｂは、アセトニトリル／ＴＦＡ（ＣＨ３ＣＮ中０．１％ＴＦＡ）である。
【０３８２】
【表１１】
2010047614.tif 000129
【０３８３】
【表１２】
2010047614.tif 000130
各々の時点において、サンプルの全ピークの高さに対するペプチドまたは結合体のピークの高さのパーセンテージとして、結果が報告される。図７は、ｈＡＮＰ（黒逆三角）、実施例５８の結合体（黒四角）および実施例６０の結合体（黒菱形）についての結果を示す。
【０３８４】
全てのｈＡＮＰが、ヒト血漿におけるインキュベーションの２４時間後に分解される一方、７５％を超えるＨＳＡと結合されたＡＮＰが、４８時間後、分解されていないことが、図７において見られ得る。結果としてのｈＡＮＰの半減期は、約４時間である。実施例５８の結合体（黒四角）は、Ｎ末端で修飾されるＡＮＰ配列（実施例２３）を含み、そして実施例６０の結合体（黒菱形）は、Ｃ末端で修飾されるＡＮＰ配列（実施例２５）を含む。両方の結合体が、ヒト血漿における安定性の同様の結果を示す。
【０３８５】
（ＮＥＰ酵素に対する安定性の分析）
ＮＰペプチドの結合体の安定性がまた、結合したＮＰペプチドのＮＥＰ酵素による特異的な酵素分解に対する保護を示すように、対応するフリーＮＰペプチドと比較したＮＥＰ酵素溶液において試験される。以下に示される実施例において、対応するフリーＮＰペプチドは、ヒトＡＮＰ（本明細書中以下、「ｈＡＮＰ」と呼ばれる）であり、これは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡにより提供された。
【０３８６】
ＮＥＰ酵素分解に対する安定性の分析についての条件は、以下の通りである。ＮＥＰ酵素（Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ／Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ，製品番号３２４７６２）のバイアルに含まれる凍結乾燥された酵素が、１００μＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０に溶解される。これをボルテックスし、超音波処理して（ｓｏｎｎｉｃａｔｅ）、酵素の完全な溶解を確実にした。１つのバイアルは、８００Ｕ〜９５０Ｕの間の酵素を含む。結合体の溶液を、ｐＨ８．０の０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて２５０μＭに調製する。１０部の結合体またはｈＡＮＰの溶液（２５０μＭ）を、１部のＮＥＰ酵素溶液（上で調製された）に加える。生じる溶液を、ボルテックスし、４８時間、混合条件下で３７℃でインキュベートする。５０μＬのアリコートを、時間０、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間および４８時間で取り除く。各々のアリコートを、バイアル中に配置し、ドライアイスで即座に急激に凍結させ、分析まで−８０℃で保存する。
【０３８７】
ＡＮＰの配列上のＮＥＰの加水分解部位は、図８に例示されるようにループの始まりでのＣｙｓ−Ｐｈｅペプチド様結合である。ＢＮＰ配列はまた、同じ部位にて（すなわち、ループの始まりでのＣｙｓ−Ｐｈｅペプチド様結合にて）ＮＥＰにより切断される。
【０３８８】
非加水分解ＮＰペプチドの検出のために、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が、ヒトネイティブＡＮＰに対して惹起される市販のポリクローナル抗体（製品番号ＲＧＧ−８７９８，Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施される。
【０３８９】
ラジオイムノアッセイのために、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．０８％アジ化ナトリウム、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡおよび０．１％ゼラチン）中の、ＮＰ結合体較正標準、精度管理サンプル、または希釈された試験サンプルのいずれかの５０μＬが、適切に標識された１２×７５ｍｍホウケイ酸ガラス試験チューブに加えられる。５０μＬのアッセイ緩衝液が、ＮＳＢ（非特異的結合）および０標準（参照）チューブに加えられる。次いで、３００μＬのアッセイ緩衝液が、各々のＮＳＢチューブに加えられ、２００μＬの同じ緩衝液を、各々の他の１２×７５ｍｍホウケイ酸ガラス試験チューブに加える。次いで、アッセイ緩衝液中で２μｇ／ｍＬの濃度で、１００μＬの容積のウサギ抗ＡＮＰ  ＩｇＧ作用溶液を、ＴＣ（総数）およびＮＳＢチューブを除いて全てのチューブに加える。チューブ内容物を、混合し、約４℃で終夜（１６〜２４時間）インキュベートする。２日目に、１００μＬの１２５Ｉ−ｈＡＮＰ（約２０，０００ｃｐｍ／１００μＬ）を全てのチューブに加える。チューブ内容物を、混合し、約４℃で終夜（１６〜２４時間）インキュベートする。３日目に、０．６％木炭の０．０５μＭリン酸緩衝液１０００μＬを、ＴＣチューブを除いて全てのチューブに加える。チューブを混合し、約４℃で約３０分間インキュベートする。インキュベーション後、次いで、ＴＣチューブを除く全てのチューブを、約４℃で約３０分間の間４０００ｒｐｍで遠心分離する。フリーの抗原が、上清をデカンテーションすることにより結合した抗原から分離される。次いで、上清（結合したフラクション）を、少なくとも２分間の間、γ線計数器（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｂｒａ  ＩＩ  Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａ）で計数する。抗体に結合した［１２５Ｉ］標識された抗原の量は、チューブ中の抗原の濃度に逆比例する。
【０３９０】
ＮＥＰ酵素とのインキュベーションの各々の時点について、結果が、サンプルの総量に対してペプチドまたは結合体のパーセンテージとして報告される。図９は、ｈＡＮＰ（黒逆三角）、実施例５８の結合体（黒四角）、キャップされたＨＳＡ（黒丸）に対する結果を示す。「キャップされたＨＳＡ」は、アルブミンに結合したシステイン残基を有するアルブミンである。
【０３９１】
図９から見られ得るように、ほとんどのｈＡＮＰは、１２時間以内に加水分解される一方、結合したＡＮＰ（実施例５８の結合体）は、試験条件においてＮＥＰ酵素により完全に加水分解されるのに約４８時間かかる。ＮＥＰ酵素により引き起こされる加水分解が、ＡＮＰ配列において起こり、ＨＳＡにおいて起こらないことを証明するために、キャップされたＨＳＡを有するコントロールが使用され、これは、アルブミンがＮＥＰ加水分解に供されていない（またはほとんど供されていない）ことを示す。
【０３９２】
（薬物動力学研究）
誘導体の薬物動力学研究が、皮下注射（２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）または静脈内注射（５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）により、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて行なわれる。一連の血液サンプルを、投薬前に、ならびに薬剤投与後５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で採取した。血液サンプルを、Ｋ２−ＥＤＴＡおよびアプロチニンを含むチューブ中に収集し、次いで遠心分離して血漿を得、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により分析まで凍結し続けた。ヒトネイティブＡＮＰに対して惹起される市販のポリクローナル抗体（製品番号ＲＧＧ−８７９８，Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、化合物を検出する。このアッセイ感度は、３００〜１００００ｐＭである。特異的なモノクローナル抗体は、ＡＮＰおよびＢＮＰと有意に異なるＮＰペプチドを含む各々のＮＰ誘導体を検出するために調製かつ使用される必要がある。ＡＮＰおよびＢＮＰの誘導体について、市販の抗体が、利用可能である。ＡＮＰまたはＢＮＰとの高い相同性を有するＮＰペプチドの誘導体について、市販の抗体が、ＲＩＡにおいて首尾良く使用され得る。
【０３９３】
図１０において、フリーＮＰペプチドのバイオアベイラビリティーは、結合体化したＮＰペプチドのバイオアベイラビリティーと比較される。静脈内注射により投与される結合体化したＡＮＰ（実施例３のＮＰペプチドの結合体）（黒三角）、または皮下注射により投与される結合したＡＮＰ（黒丸）が、９６時間後もバイオアベイラビリティーを有する一方、静脈内注射により投与されるフリーＡＮＰ（実施例３のＮＰペプチド）（白四角）または皮下注射により投与されるフリーＡＮＰ（白丸）は、５分以内に血流に存在しないことが、見られ得る。
【０３９４】
これらのラット研究において、静脈内注射により投与される結合体化したＡＮＰ（実施例５８の結合体）（黒三角）または皮下注射により投与される結合体化したＡＮＰ（黒丸）の半減期は、それぞれ１７．５±１．５時間および１４．８±０．６時間である。皮下注射により投与されるフリーＡＮＰ（実施例３のＮＰペプチド）（白丸）の半減期は、０，２±０，０６時間であり、そして静脈内投与により投与されるＡＮＰ（白四角）についての半減期は、短すぎたために算出できなかった。
【０３９５】
（インビボアッセイ）
鬱血性心不全の動物モデルが使用されて、最適な投薬応答、作用の持続時間ならびに最も効果的なＮＰ誘導体およびＮＰ結合体を評価する。以下の２つの動物モデルが使用されて、その評価をし得る：自発性高血圧ラット（ＳＨＲラット）およびイヌにおけるペーシングモデル（Ｍｕｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｌｓｎｅｒ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，２０００）。ネイティブＢＮＰが、ラットにおける活性を有さないことが公知であるために、ＢＮＰとの高い相同性を有するＮＰペプチドの誘導体は、ＳＨＲラットにおいて試験されない；従って、イヌモデルまたは他のモデルが、使用される。
【０３９６】
ＳＨＲラットは、遺伝的に高血圧のラットであり、このラットは、４週齢までに有意に高められた収縮期血圧（ＢＰ）を発達させる。その寿命にわたって持続的に高められた血圧の結果として、これらのラットは、およそ一才齢までに鬱血性心不全を発達させる。高血圧に加えて、このモデルはまた、左心室肥大および左心室線維症により特徴付けられる。ＳＨＲラットは、心房性ナトリウム排泄増加ペプチドのインビボ効果の研究において以前に使用された。ＡＮＰアナログの単回投薬は、ＢＰにおいて一時的なドロップを生成した一方、連続的な注入が、収縮期ＢＰにおける減少を維持するのに必要とされた（ＤｅＭａｙら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐｅｒ  Ｔｈｅｒａｐ，１９８７）。
【０３９７】
イヌにおけるペーシングモデルは、プログラム可能な心臓ペースメーカーの埋め込みに関与する。外科的回復期間の後、心拍は、３１〜３８日の期間にわたって、１８０〜２４０拍／分で漸増して増加する。このモデルは、心不全の異なる段階の研究を可能にし、正常な心臓から無症候性左心室機能障害へ、明白な鬱血性心不全へ発達する（Ｌｕｃｈｎｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ，２０００）。このモデルの特徴としては、心拍の増加、増加した心臓充填圧（ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｌｌｉｎｇ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、低い心臓アウトプット、水腫形成および交感神経系の活性化ならびに他の血管収縮ホルモンが挙げられる（Ａｒｎｏｌｄａら、Ａｕｓｔｒ．ＮＺ  Ｊ  Ｍｅｄ．，１９９９）。このペーシングモデルは、心不全におけるＡＮＰとＢＮＰとの両方の効果の研究において以前に使用された（Ｌｕｃｈｎｅｒら、２０００；およびＹａｍａｍｏｔｏら，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７）。
【０３９８】
（インビボ結果）
表１３および１４は、それぞれ７週齢のＳＨＲラットおよび７週齢のＷｉｎｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏラットにおけるインビボの結果を示す。尿分泌の増加およびｃＧＭＰ発現の増加が、実施例３の化合物の注入後２４時間および４８時間で測定された。ラット１ｋｇ当たり１ｍｇ、２ｍｇおよび４ｍｇの化合物の濃度が、生理食塩水溶液と比較して試験された。コントロール値が、注入前にとられた（投薬以前）。尿分泌（  Ｖｏｌ．）が、投薬以前の値を超える尿のｍＬ／日で表される。ｃＧＭＰ発現（ｃＧＭＰ）は、ｎｍｏｌ／日で報告され、ＲＩＡ法により測定された。
【０３９９】
【表１３】
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【０４００】
【表１４】
2010047614.tif 000132
本発明が、その特定の実施形態と関係付けられて記載される一方、さらなる改変が可能であることが理解され、そして本願は、一般に本発明の原理に従う、本発明が関連する分野内で公知または慣習的であるような、そして本明細書中以前に示された必要不可欠な特徴に適用され得るような、そして添付の特許請求の範囲内に従うような本発明からの逸脱を含む、本発明のあらゆる変形例、使用法または適合を網羅するように意図される。
【図１】
2010047614.tif 000133
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2010047614.tif 000137
【図６】
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【図７】
2010047614.tif 000139
【図８】
2010047614.tif 000140
【図９】
2010047614.tif 000141
【図１０】
2010047614.tif 000142
【配列表】
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