(57)【要約】【課題】被検試料中の微生物の生菌を簡便かつ迅速に検出し、かつ同時に微生物の種類を同定することができる方法の提供。【解決手段】食品等の試料をインキュベーションし、インキュベーション中の異なる２点の時間における核酸の量を、検出する微生物に特異的な検出対象領域とハイブリダイズし得るプローブが固定化された担体を用いて測定することにより、検出対象の微生物の生菌を迅速かつ簡便に検出し、同時に微生物の種類を同定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 被検試料を、前記試料中に含まれる可能性のある微生物が増殖し得る条件下でインキュベーションする工程、
(b) 前記インキュベーションの時間ｔ0およびｔ1（ｔ1＞ｔ0）における前記試料から核酸を抽出する工程、
(c) 時間ｔ0およびｔ1において抽出した前記それぞれの核酸を鋳型として、検出対象とする微生物に特異的な検出対象領域を含む核酸配列を増幅させ、それぞれ増幅核酸試料ａ0および増幅核酸試料ａ1を得る工程、
(d) 増幅核酸試料ａ0および増幅核酸試料ａ1を、前記検出対象領域にハイブリダイズ可能なプローブが固定化された担体に接触させる工程、および
(e) 増幅核酸試料ａ0について前記担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした核酸の量と、増幅核酸試料ａ1について前記担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした核酸の量を比較する工程、
を含む、被検試料中の微生物の生菌を検出する方法。
【請求項２】
検出対象とする微生物の死菌が被検試料中に存在する場合に前記死菌の核酸量が培養時間の経過とともに減少する条件下で被検試料をインキュベーションし、増幅核酸試料ａ0でハイブリダイズした核酸の量と比較して増幅核酸試料ａ1でハイブリダイズした核酸の量が同等もしくは増えた場合に微生物が生菌であると判定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸配列がハイブリダイズしたプローブの配列に基づいて微生物の種類を同定する工程をさらに含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程(a)〜(e)の一部またはすべてが、自動で、かつ外部からの汚染がない環境下で行われる、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
担体がマイクロアレイである、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品などの被検試料中に存在する微生物の生菌を検出・同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品中に存在する食中毒菌や腐敗菌等の微生物や、環境中に存在する各種微生物の生菌の有無を確認することは、食品の品質管理や感染症の防止などのために重要である。上記のような被検試料中に存在する微生物を確認・同定する一般的な方法として、従来よりシャーレ等に作製した固体培地上に被検試料を置き、数日間培養して菌を培地上に生育させ、その形体等から微生物の種類を確認、同定する平板培養などの培養法が用いられてきたが、これに加えて、遺伝子解析技術の進歩を背景として特に近年は微生物の検出及び同定をより短時間で行うための方法の開発も進んでいる。
微生物を短時間で検出する一般的な方法としてＰＣＲ法により微生物のＤＮＡを増幅して検出する方法があるが、被検試料に対して単純にこの方法を用いただけでは生菌のみならず死菌のＤＮＡも増幅されてしまうため、偽陽性となる可能性がある。この問題の解決のために、生菌と死菌を区別して検出する技術も報告されており、例えば特開２００８−６７７１８号公報には、死菌および損傷菌のＤＮＡを選択的に切断する条件下で死菌及び損傷菌のＤＮＡを酵素で切断し、リアルタイムＰＣＲによって生菌の遺伝子を増幅して解析する方法が開示されている（特許文献１）。さらに、被検試料を増菌用液体培地で培養し、０時間目と４時間目の被検試料の核酸の量の違いをリアルタイムＰＣＲで検出することによって生菌の存在を確認する方法も報告されている（http://www.amr-inc.jp/detail/ez-cocktail.html：非特許文献１）。
しかしながら、上記のようにリアルタイムＰＣＲを用いる方法では、ＰＣＲ時に使用できるプライマー数や検出できるシグナルの数などの制限により、数多くの微生物種を高感度に検出するのには限界があり、また、増幅された微生物の種類の同定は同時に行うことはできず、シークエンス等の遺伝子解析を行って微生物を１種ずつ同定する作業がさらに必要となるなどの問題点があった。従って、食品などの被検試料中に存在する微生物の生菌を迅速かつ簡便に検出し、かつ同時に微生物の種類を同定することが可能な技術の開発が必要とされていた。
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−６７７１８号公報
【非特許文献１】エーエムアール株式会社、EZ-Cocktailパンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本願発明者らは、食品等の試料をインキュベーションし、インキュベーション中の異なる２点の時間における核酸の量を、検出する微生物に特異的な検出対象領域とハイブリダイズし得るプローブが固定化された担体を用いて測定することにより、検出対象の微生物の生菌を迅速かつ簡便に検出し、同時に微生物の種類を同定できることを見出し、本願発明に至った。特に、インキュベーション中の異なる２点の時間でサンプリングした試料から核酸を抽出し、前記核酸を増幅し、検出対象である各微生物に特異的な検出対象領域を検出することにより、生死菌の判定および微生物種の同定が可能となる。
【０００５】
即ち、本発明は、
(a) 被検試料を、前記試料中に含まれる可能性のある微生物が増殖し得る条件下でインキュベーションする工程、
(b) 前記インキュベーションの時間ｔ0およびｔ1（ｔ1＞ｔ0）における前記試料から核酸を抽出する工程、
(c) 時間ｔ0およびｔ1において抽出した前記それぞれの核酸を鋳型として、検出対象とする微生物に特異的な検出対象領域を含む核酸配列を増幅させ、それぞれ増幅核酸試料ａ0および増幅核酸試料ａ1を得る工程、
(d) 増幅核酸試料ａ0および増幅核酸試料ａ1を、前記検出対象領域にハイブリダイズ可能なプローブが固定化された担体に接触させる工程、および
(e) 増幅核酸試料ａ0について前記担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした核酸の量と、増幅核酸試料ａ1について前記担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした核酸の量を比較する工程、
を含む、被検試料中の微生物の生菌を検出する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の方法によれば、被検試料中の微生物の生菌を簡便かつ迅速に検出し、かつ同時に微生物の種類を同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法の工程(a)では、被検試料を、前記試料中に含まれる可能性のある微生物が増殖し得る条件下でインキュベーションする。本明細書において、被検試料は特に限定されず、検出対象とする微生物の生菌の存在の有無を確認する必要のあるものであればいずれのものでもよい。例えば、牛乳、水、緑茶、酸性飲料等の飲料、食肉、チルド食品、生鮮食品（肉、野菜、魚）、弁当・惣菜などの食品、および、食品製造環境中の空気などの環境試料が挙げられる。また、本明細書において「微生物」とは、本発明の方法を実施する者が検出することを所望するものであればいずれのものでもよく、例えば大腸菌、赤痢菌、サルモネラ菌、セレウス菌、キャンピロバクター、黄色ブドウ球菌、リステリア菌、腸炎ビブリオ菌、コレラ菌、ウェルシュ菌などの食中毒菌や、例えば、Aeromonas属、Bacillus属、Lactobacillus属、Pseudomonas属、Streptococcus属等の腐敗菌が挙げられる。
【０００８】
被検試料のインキュベーションの様式は、被検試料や検出対象とする微生物の種類に応じて当業者が適宜設定することが可能である。例えば被検試料が飲料等の液体である場合は、前記飲料を例えば孔径0.22 mmまたは0.45 mmのメンブレンフィルターにより吸引ろ過したものを液体培地でインキュベーションしてもよく、また被検試料が食品等の固形物である場合には、前記固形物を生理食塩水または適切な増菌培地に入れ、機械的に破砕したものをそのままインキュベーションしてもよい。検出対象とする微生物が増殖し得るインキュベーション条件も、同様に微生物の種類等に応じて当業者が適宜設定することが可能であり、例えば、細菌用として標準培地、SCD培地、BHI培地、真菌用としてポテトデキストロース培地などの汎用の液体培地を使用して３０〜６０℃の温度条件下、必要により振とうしながらインキュベーションすることができる。なお、本発明においては、操作の簡便性を考慮してインキュベーションを単一の培地中で行うこともでき、そのような培地の組成は検出対象とする微生物の種類を考慮して当業者が決定することが可能である。
【０００９】
さらに、上記のインキュベーションの条件は、検出対象とする微生物の死菌が被検試料中に存在する場合に前記死菌の核酸量が培養時間の経過とともに減少するものであることが好ましい。このような条件下でインキュベーションすることにより、インキュベーション時間の経過に伴う生菌と死菌の核酸量の変化を区別し、この核酸量の変化の仕方に基づいて後の工程により生菌と死菌を判定することが可能となる。このような条件は当技術分野において数多く知られており、例えばＲＮＡの場合には、通常のインキュベーション条件とすることにより不安定な物質であるＲＮＡは死菌中では減少し（生菌中では細胞内ではＲＮＡ量はほぼ一定である）、また、ＤＮＡの場合には、例えば特開２００８−６７７１８号公報に開示される、死菌および損傷菌のＤＮＡを酵素により選択的に分解させる条件下でインキュベーションすることにより、インキュベーションの時間の経過に伴って核酸の量を減少させることができる。
【００１０】
本発明の方法の工程(b)では、工程(a)のインキュベーションの時間ｔ0およびｔ1（ｔ1＞ｔ0）における試料から核酸を抽出する。具体的な時間ｔ0およびｔ1は、検出対象の微生物の種類、インキュベーションの条件（温度、振とうの有無等）などを考慮して、本発明の方法を有効に実施できる程度に生菌が増殖するのに必要な時間を基に設定することができる。ｔ0は典型的にはインキュベーションの開始直後であり（ｔ0＝０）、（ｔ1−ｔ0）は例えば１日程度、好ましくは６〜１２時間程度、より好ましくは２〜６時間とすることができるが特に限定はされず、検出対象とする微生物の種類、使用する培地などを考慮して決定することができる。
また、抽出する核酸はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよく、またその抽出法は当業者によく知られている。ＤＮＡの場合には、proKなどの酵素や界面活性剤により溶菌したものからＤＮＡを抽出し、最終的にはフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製することができる。また、ＲＮＡの場合には、AGPC法、NP-40法、セシウム超遠心法などにより抽出することができる。各種市販のキットを使用してもよく、ＤＮＡの場合は、例えばQIAGEN社製 DNeasy Blood & Tissue Kit、富士フイルム社製  自動核酸抽出装置 QuickGene-810  QuickGene SP Kit、TaKaRaBio社製 FastPure DNA Kit、MoBio社製 UltraClean Microbial DNA Kitなど、ＲＮＡの場合は、例えばQIAGEN社製  RNeasy Mini Kit、invitrogen社製  TRIzol Max Bacterial RNA Isolation Kit、TakaraBio社製  FastPure RNA Kitなどを使用することができる。
【００１１】
本発明の方法の工程(c)では、時間ｔ0およびｔ1において抽出した前記それぞれの核酸を鋳型として、検出対象とする微生物に特異的な検出対象領域を含む核酸配列を増幅させ、それぞれ増幅核酸試料ａ0および増幅核酸試料ａ1を得る。検出対象とする微生物に特異的な検出対象領域としては、例えば16S-23S 遺伝子間スペーサー領域（internal transcribed spacer (ITS)）、16S rRNA、23S rRNA などの配列から、検出対象の各微生物に特異性の高い領域を選択することができる。このような検出対象領域を含む核酸配列の増幅はＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription PCR）法により行うことができる。
増幅に使用するプライマーは、検出対象とする微生物の配列に合わせて設計され、微生物毎に異なるプライマーセットを使用してもよいし、検出対象とする微生物群に特異的で微生物間で保存性の高い領域を２箇所選択し、その２つの領域の間の核酸配列を特異的に増幅し得るプライマーを設計して使用してもよい。例えば、16S rRNA 配列の保存性の高い部分にForwardプライマー、23S rRNA 配列の保存性の高い領域にReverseプライマーを設計し、この２つの領域に挟まれる16S-23S ITS領域（各微生物種に特異的な配列を含む）を増幅することができる（図１）。
好ましくは、数多くの微生物を検出するための簡便性を考慮して、検出対象とする複数の微生物種または菌株のそれぞれの種または菌株に特異的な検出対象領域を含む核酸配列を、前記核酸配列のいずれをも増幅し得る単一のプライマーセットにより増幅することが好ましい。プライマーの長さは、選択した配列の特異性等を考慮して当業者が適宜設定することが可能であり、例えば10〜50 mer、好ましくは15〜25 mer、例えば20 mer程度とすることができる。
【００１２】
本発明の方法の工程(d)では、増幅核酸試料ａ0および増幅核酸試料ａ1を、前記検出対象領域にハイブリダイズ可能なプローブが固定化された担体に接触させる。前記プローブは、検出対象とする各微生物に特異的な配列である前述の検出対象領域とハイブリダイズ可能な核酸の断片であり、例えば10〜50 mer、好ましくは10〜40 mer、典型的には20〜30 mer程度とすることができる。前記プローブが固定化された担体としては特に限定はされず、ビーズ、タイタープレート、マイクロアレイなどが挙げられるが、特に検出対象微生物の種類を多くする場合や、検出感度、再現性、自動化の容易さなどの要素を考慮してマイクロアレイであることが好ましい。担体の作製方法および増幅核酸試料とプローブとの接触のさせ方は公知であり、適切な条件は当業者が適宜決定することができる。増幅核酸試料ａ0およびａ1は、それぞれ別の担体（同一のプローブまたはプローブ群が固定化された担体）に接触させて次の工程(e)で核酸の量を比較してもよいし、増幅核酸試料ａ0およびａ1の混合物をそれぞれ別の蛍光標識でラベリングし、それらの混合物を１つの担体に接触させて、各蛍光標識のシグナルを別々に検出することにより核酸の量を比較してもよい。
【００１３】
本発明の方法の工程(e)では、増幅核酸試料ａ0について前記担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした核酸の量と、増幅核酸試料ａ1について前記担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした核酸の量を比較する。この工程では、増幅核酸試料ａ0およびａ1について、工程(a)におけるインキュベーションに起因する核酸量の変化に基づいて被検試料中の微生物の生死を判定し、生菌を検出する。インキュベーション中には生菌は増殖し、その核酸量も増殖に伴って増加するのに対し、死菌はインキュベーションしても増殖しないため核酸量も増加しない。よって、増幅核酸試料ａ0でハイブリダイズした核酸の量と比較して増幅核酸試料ａ1でハイブリダイズした核酸の量が増えた場合に微生物が生菌であると判定される。また、検出対象とする微生物の死菌が被検試料中に存在する場合に前記死菌の核酸量が培養時間の経過とともに減少する条件下で被検試料をインキュベーションすることにより生菌と死菌の差をより確実に検出することが可能であり、前記同様、増幅核酸試料ａ0でハイブリダイズした核酸の量と比較して増幅核酸試料ａ1でハイブリダイズした核酸の量が同等もしくは増えた場合に微生物が生菌であると判定される（図２参照）。
検出対象とする微生物の死菌が被検試料中に存在する場合に前記死菌の核酸量が培養時間の経過とともに減少する条件は、核酸がＲＮＡである場合には、通常のインキュベーション条件とすることにより不安定な物質であるＲＮＡは死菌中で時間の経過と共に分解されて減少するため、一般にこの条件が満たされる。また、ＤＮＡの場合には、例えば特開２００８−６７７１８号公報に開示される、死菌および損傷菌のＤＮＡを酵素により選択的に分解させる条件下でインキュベーションすることにより、検出対象とする微生物の死菌が被検試料中に存在する場合に前記死菌の核酸量が培養時間の経過とともに減少するという条件を満たすことができる。この方法により生菌と死菌を区別することができるため、死菌の核酸が増幅されることにより見かけ上陽性と判定されてしまう偽陽性の検出を防止することができる。
核酸の検出およびその定量は使用する担体の種類等に応じて当技術分野に知られる方法を用いることができる。例えば担体としてマイクロアレイを使用した場合、工程(c)における核酸配列の増幅時にCy-3、Cy-5等の蛍光標識を導入することによって、プローブにハイブリダイズした核酸を蛍光シグナルとして検出および定量することができる。
【００１４】
本発明の方法は、好ましくは核酸配列がハイブリダイズしたプローブの配列に基づいて微生物の種類を同定する工程をさらに含む。担体に固定化されたプローブは、検出対象とする各微生物の検出対象領域を検出するものであるため、担体の作製時に各プローブの由来微生物と担体との関係を特定してデータベース化しておくことにより、核酸の検出と同時にその微生物の種類を同定することができる（図３参照）。本発明の方法では、マイクロアレイを使う場合はプローブと微生物のアレイ上の位置の関係をデータベース化しておけば、核酸の検出の後にさらなる遺伝子解析を行うことなく、数多くの検出対象微生物の種類を瞬時に同定することができる。検出対象とする微生物の種類は、例えば５種類以上、好ましくは１０種類以上、より好ましくは３０種以上などにすることができるが、担体に固定化し得るプローブの数の範囲内であれば制限されない。
【００１５】
本発明の方法は、好ましくは工程(a)〜(e)の一部またはすべてが、自動で、かつ外部からの汚染がない環境下で行われる。このようにすることにより、被検試料中の生菌の検出を迅速、簡便かつ精密に行うことができる。
【００１６】
以下、本発明のより具体的な実施態様の一例を示す。
食品サンプル25 gを汎用の標準培地（精製水１L当たり酵母エキス2.5g、トリペプト5g、ブドウ糖1g；pH 7.1〜7.5）225 ｍｌに懸濁し、機械的に破砕する。これを35℃の温度条件下でインキュベートし、インキュベート開始時および４時間後に一部をサンプリングする。
TaKaRaBio社製 FastPure DNA Kitを用い、その説明書に従って前記サンプリングした試料からＤＮＡを抽出する。抽出した前記ＤＮＡを鋳型として、以下の条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅する。
2010046016.tif 000002
【００１７】
プライマーとしては、６種類の微生物（Bacillus coagulans、Geobacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis、Bacillus megaterium、Bacillus licheniformis、Paenibacillus polymyxa）の 16S rRNA 領域および 23S rRNA 領域の中から各微生物間で保存性の高い部分を基に設計され、16S rRNA 領域と 23S rRNA 領域との間にある16S-23S ITS領域を上記６種類の微生物について増幅することができることが確認されている以下のプライマーを、それぞれForward プライマーおよびReverse プライマーとして使用する。
・Forward プライマー（16S rRNA 領域）
ITS-FP-1：CCGCGGTGAATACGTTCC（配列番号：１）
・Reverse プライマー（23S rRNA 領域）
RP-1a：CTCCTAGTGCCAAGGCATCC（配列番号：２）
【００１８】
サーマルサイクラーとしてTOYOBO社製 LittleGeneを使用し、以下の温度条件により反応を行う。
2010046016.tif 000003
【００１９】
微生物の検出対象領域を検出するための担体としてはマイクロアレイを使用し、前述の６種類の微生物（Bacillus coagulans、Geobacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis、Bacillus megaterium、Bacillus licheniformis、Paenibacillus polymyxa）のそれぞれに特異的な16S-23S ITS領域（塩基数 20〜24 mer  Tm値 53〜63℃）にハイブリダイズ可能なプローブを設計し、それらをマイクロアレイ上に固定化する。作製したマイクロアレイに対し、前記のＰＣＲにより増幅したＤＮＡ産物を、室温〜50℃で1〜16時間ハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ溶液は、［PCR産物：ハイブリダイズバッファー（10×SSC/0.5% SDS） = 1：1］の溶液である（20×SSC：3M NaCl、0.3M クエン酸ナトリウム、SDS：ドデシル硫酸ナトリウム）。
次いで、核酸をハイブリダイズさせたマイクロアレイを、室温で、2×SSC/0.2% SDSで１回、2×SSCで２回洗浄する。
【００２０】
蛍光は、基盤の非スポット部をバックグラウンドとしてCy5の蛍光を検出する。
解析機により各蛍光強度算出し、インキュベーション開始時および４時間後における蛍光強度の増減算出して、インキュベーション４時間後に蛍光強度が増加した場合に、被検試料中におけるその微生物が生菌であったと判定する。同時に、シグナルが検出されたプローブの位置に基づいて微生物の種類を同定する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】16S rRNA 領域のForwardプライマーおよび23S rRNA 領域のReverseプライマーを使用した、16S-23S ITS領域の核酸増幅を示す。
【図２】マイクロアレイを用いた生死菌判定のパターンを示す。１．生菌が存在し、かつ、死菌由来の核酸量が予め設定した閾値を超えている場合、ｔ0では弱いシグナルが検出されるが偽陽性の可能性を排除できない。しかし、ｔ1では生菌の増殖に伴う核酸の増殖によりｔ0よりも強いシグナルが検出されるため、生菌の存在が確認される。２．生菌および死菌由来の核酸量が予め設定した閾値に達しない場合、ｔ0ではシグナルは検出されないが、ｔ1では生菌の増殖に対応してシグナルが検出されるため、生菌の存在が確認される。３．生菌が存在しないが、死菌由来の核酸量が予め設定した閾値を超えている場合、ｔ0ではシグナルが検出されるものの、核酸量は時間の経過と共に減少してｔ1では弱いシグナルとなるため、ｔ0のシグナルは偽陽性であり、当初の試料には生菌は存在しなかったことが分かる。
【図３】マイクロアレイによる、微生物の生死菌の判定およびその種類の同定を示す。
【図１】
2010046016.tif 000004
【図２】
2010046016.tif 000005
【図３】
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【配列表】
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