(57)【要約】      （修正有）【課題】屋内や食品に存在するカビの生死判別とカビ種の同定とを個別又は同時に行うことができ、しかも簡易な測定手法によって高精度で前記判別・同定を行うことが可能なＤＮＡチップの提供。【解決手段】特定の塩基配列、又はそれと実質的に同一の塩基配列からなる群から選択される、いずれか１つの塩基配列を有してなるカビ検出用プローブ。このカビ検出用プローブを基板上に固定したカビ検出用ＤＮＡチップ。このＤＮＡチップを用い、ハイブリダイゼーションにより試料中のカビを検出する方法、カビの生死を判別する方法、カビ種を同定する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなる群から選択されるいずれか１つの塩基配列を有してなるカビ検出用プローブ。
【請求項２】
（１）アブシディア  コエルレア（Absidia coerulea）を検出対象とする配列番号１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ア）、
（２）アブシディア  コリンビフェラ（Absidia corymbifera）を検出対象とする配列番号２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（イ）、
（３）アブシディア  グラウカ（Absidia glauca）を検出対象とする配列番号３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ウ）、及び配列番号４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（エ）、
（４）アブシディア  レペンス（Absidia repens）を検出対象とする配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（オ）、及び配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（カ）、
（５）アルタナリア  アルタナータ（Alternaria alternata）を検出対象とする配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（キ）、
（６）アスペルギルス  ニドランス（Aspergillus nidulans）を検出対象とする配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ク）、
（７）アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）を検出対象とする配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ケ）、配列番号１０の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（コ）、配列番号１１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（サ）、配列番号１２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（シ）、及び配列番号１３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ス）、
（８）アスペルギルス  ヴァーシカラー（Aspergillus versicolor）を検出対象とする配列番号１４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（セ）、
（９）カンジダ  アルビカンス（Candida albicans）を検出対象とする配列番号１５の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ソ）、
（１０）クラドスポリウム  クラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）を検出対象とする配列番号１６の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（タ）、配列番号１７の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（チ）、及び配列番号１８の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ツ）、
（１１）クラドスポリウム  クラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）及びクラドスポリウム  スフェロスペルマム（Cladosporium sphaerospermum）を検出対象とする配列番号１９の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（テ）、及び配列番号２０の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ト）、
（１２）クラドスポリウム  ランゲロニー（Cladosporium langeronii）を検出対象とする配列番号２１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ナ）、及び配列番号２２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ニ）、
（１３）ユーロチウム  レペンス（Eurotium repens）を検出対象とする配列番号２３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ヌ）、
（１４）フザリウム  カルモラム（Fusarium culmorum）を検出対象とする配列番号２４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ネ）、
（１５）フザリウム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を検出対象とする配列番号２５の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ノ）、
（１６）ムコール  ラセモサス（Mucor racemosus）を検出対象とする配列番号２６の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ハ）、
（１７）ペシロミセス  テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）を検出対象とする配列番号２７の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ヒ）、
（１８）フォーマ（Phoma）属を検出対象とする配列番号２８の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（フ）、
（１９）リゾプス（Rhizopus）属を検出対象とする配列番号２９の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ヘ）、
（２０）スタキボトリス  チャルトラム（Stachybotrys chartarum）を検出対象とする配列番号３０の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ホ）、及び配列番号３１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（マ）、
（２１）トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）を検出対象とする配列番号３２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ミ）、
（２２）ワレミア（Wallemia）属を検出対象とする配列番号３３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ム）、及び配列番号３４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（メ）、
からなる群から選択されるカビ検出用プローブ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載したカビ検出用プローブの１種又は２種以上を、基板に固定してなるカビ検出用ＤＮＡチップ。
【請求項４】
請求項２に記載したカビ検出用プローブ（ア）〜（メ）のうちの２種以上を、基板に混合した状態で固定してなるカビ検出用ＤＮＡチップ。
【請求項５】
請求項２に記載したカビ検出用プローブ（ア）〜（メ）のうちの２種以上を、それぞれのカビ検出用プローブの固定領域を区切って並べた状態で基板に固定してなるカビ検出用ＤＮＡチップ。
【請求項６】
基板に一端を固定した前記カビ検出用プローブの先端に、同じかまたは異なるカビ検出用プローブが連結されたカスケード構造を有する請求項３〜５のいずれか１項に記載のカビ検出用ＤＮＡチップ。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のカビ検出用ＤＮＡチップを用い、
被検試料中の核酸から、標識化合物で標識された検出用ターゲットを作製する工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブに前記検出用ターゲットをハイブリダイズする工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出することで、被検査試料中に前記カビ検出用プローブの検出対象であるカビが存在するか否かを調べる工程を有するカビの検出方法。
【請求項８】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のカビ検出用ＤＮＡチップを用い、
被検試料中の核酸から、標識化合物で標識された検出用ターゲットを作製する工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブに前記検出用ターゲットをハイブリダイズする工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出し、カビ菌体量に対する標識化合物の検出量が基準値よりも多い場合には、被検査試料中に存在するカビが生きており、カビ菌体量に対する標識化合物の検出量が基準値よりも少ない場合には、被検査試料中に存在するカビが死んでいると判別する工程を有するカビの生死判別方法。
【請求項９】
請求項５に記載のカビ検出用ＤＮＡチップを用い、
被検試料中の核酸から、標識化合物で標識された検出用ターゲットを作製する工程と、
前記カビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブに前記検出用ターゲットをハイブリダイズする工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出することで、被検査試料中のカビが、ＤＮＡチップの標識化合物が検出された領域に固定しておいたカビ検出用プローブの検出対象とするカビであるとして該カビの種を同定する工程を有するカビの同定方法。
【請求項１０】
請求項５に記載のカビ検出用ＤＮＡチップを用い、
被検試料中の核酸から、標識化合物で標識された検出用ターゲットを作製する工程と、
前記カビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブに前記検出用ターゲットをハイブリダイズする工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出することで、被検査試料中のカビが、ＤＮＡチップの標識化合物が検出された領域に固定しておいたカビ検出用プローブが検出対象とするカビであるとして該カビの種を同定するとともに、
該標識化合物の検出量が基準値よりも多い場合には、被検査試料中に存在するカビが生きており、該標識化合物の検出量が基準値よりも少ない場合には、被検査試料中に存在するカビが死んでいると判別する工程を有するカビの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、屋内や食品に存在するカビを検出するためのカビ検出用プローブ、カビ検出用ＤＮＡチップ、カビの検出方法、カビの生死判別方法及びカビの同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
屋内や食品に存在するカビについて（Ｉ）生死判定、（ＩＩ）カビ種の同定、を行うための従来技術としては、下記の方法が知られている。
【０００３】
（Ｉ）生死判定
（ａ）培養法
培養により生存率を求めて、生死判別を行う。具体的には、検体から適宜手段で採取した菌類を所定の菌数に調整した後、寒天培地などを用いて数日〜１週間程度培養してコロニーの増殖を目視判定する方法。
または、発色酵素を混合した発色培地に採取した菌類を植菌した後、所定温度に保持されたインキュベータなどの培養器内で数日〜１週間程度培養し、β−ガラクトシダーゼ酵素で発色酵素を分解発色させて判読する方法。
何れの方法も数日〜１週間程度の培養日数を要する。
【０００４】
（ｂ）迅速法
１）蛍光染色試薬、例えば、アクリジンオレンジは、検出対象の菌が死んでいれば染色して発光し、生きていれば菌外に排出されるので発光しないということから、菌の生死を判別するために使用できる。試薬によっては、ＣＦＤＡのように生菌を染色する試薬もある。またフルオレッセインジアセテート（ＦＤＡ）／エチジウムブロマイド（ＥＢ）染色法のように、生菌は、エステラーゼ活性によりＦＤＡ が分解され緑色の蛍光を発し、死菌はエステラーゼ活性がないため、ＦＤＡによる染色は見られず、ＥＢに染色されオレンジ色の蛍光を発する。その他、フルオレセインまたはその誘導体の蛍光染色試薬、プロピデュームイオダイトからなる蛍光染色試薬を用いる方法が提案されている（特許文献１参照）。さらに蛍光染色試薬の測定にパルス光線を照射して測定する方法（特許文献２参照）も提案されている。
【０００５】
２）ＲＮＡ／ＤＮＡ比からの判定（特許文献３参照）
この方法は、検体から抽出したＲＮＡの定量逆転写ＰＣＲ（定量ＲＴ−ＰＣＲ）とＤＮＡの定量ＰＣＲとの測定によって求められたＲＮＡ／ＤＮＡの値の大きさによって細胞の生死を判別する。
【０００６】
（ＩＩ）カビ種の同定
（ａ）培養法
底部に蒸留水や塩化バリウム（相対湿度９０％／２５℃）などの塩類飽和溶液を入れた密閉容器（内径２０ｃｍ以上のデシケーターなど）の中に、食品等の検体を入れ、蓋をして２０℃又は２５℃の孵卵器内で培養する方法である。毎日観察を行い、生育した真菌の種類、数および生育状態を調べる。
さらに、検体から適宜手段で採取した菌類を所定の菌数に調整した後、寒天培地などを用いて数日〜１週間程度培養してコロニーの増殖を目視判定する。
【０００７】
（ｂ）迅速検査法
培養によるカビ検査には、数日〜１週間程度の培養日数を要し、迅速性が要求される品質管理になじまないことが指摘されている。また、カビ汚染食品からの直接検鏡法は、応用可能な食品が限定され、かつ汚染菌量が少ない試料には適さないため、カビの固有成分、代謝活性、免疫学的特異性、電気的な特性、遺伝子検出により、短時間にカビの存在を定量または定性的に解析する試みが行われ、以下に例示するような迅速試験法が開発されている。その一部は検査キットとして市販されているが、使用条件が限定されるため、その特性を考慮して用いる必要がある。
【０００８】
１）β−グルカンの測定法
カビ試料中の（１，３）−β−Ｄ−グルカン量を比色法または比濁法で測定することにより、真菌（カビ、酵母）量を推定する方法である。検出キット及び分析装置が市販されている（例えば、和光純薬社製の「β−グルカンテストワコー」、同じく「トキシノメーター  ＭＴ−５５００」）。
【０００９】
２）キチン（chitin）分析法
カビ細胞膜中のグルコサミンまたはキトサンを加水分解した後、高速液体クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーで測定し、その値からカビ汚染レベルを推定する方法である。
【００１０】
３）ＡＴＰ測定法
食品中に存在する微生物由来ＡＴＰを測定することで、微生物の存在を検知する方法である。蛍光物質ルシフェリンなどを指標としたキットなどが、細菌およびカビの測定に応用されている。生体成分や細菌類由来のＡＴＰとの識別が困難なことに留意して使用する必要がある。検出キット及び分析装置が市販されている（例えば、英国バイオトレイス社製の「ユニライト」、同じく「クリーントレース」、キッコーマン社製の「ルミテスター  Ｃ−１１０」、「ルシフェールシリーズ」）。
【００１１】
４）免疫学的手法
蛍光抗体法や酵素抗体法による分析が試みられている。日本においてこれらの物質の標準化が検討された当時は、抗原抗体反応を用いた測定法の信頼性が低く、機器分析の値が絶対であったが、現在分子構造からより親和性の高い抗体を純度良く大量に生産することが可能になった。しかし、標準化の検討がなされていないことから、標準法として設定することは難しい。
カビ毒については免疫学的手法（ＥＬＩＳＡ法迅速定量キット）が市販されている。
【００１２】
５）真菌検出用ＤＮＡチップ
ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイなどとも称される）は、細胞内の遺伝子発現量を測定するために、多数のＤＮＡ断片をプラスチックやガラス等の基板上に高密度に配置した分析機器である。このＤＮＡチップを用いれば、数十から数万の遺伝子発現を一度に調べることが可能である。例えば、ヒトの遺伝子数は３万〜４万と言われているが、これらの全ての遺伝子断片を一枚の基板上に固定することができ、このプローブと呼ばれる遺伝子断片と、ターゲットと呼ばれる細胞から抽出し、かつ標識化合物により標識化したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とを接触させてハイブリダイズすることによって、細胞内の遺伝子発現量を測定することができる。
カビ検出に用いるＤＮＡチップのプローブ設計の従来法は、カビのリボソームのスペーサー領域（ＩＴＳ）に由来する、またはそれを含む領域に由来する塩基配列の情報を用いてプローブ設計し、さらにそのプローブを用いてカビの種類を同定する方法が提案されている。例えば、特許文献４には、ハウスダストアレルギーの原因となるダニ・カビ類の検出・識別用マイクロアレイに用いられる核酸プローブとして、ＩＴＳ領域の塩基配列を用いることが記載され、また特許文献５には、カビの検出方法に用いるマイクロアレイの検出用プローブとして、ＩＴＳ領域の塩基配列を用いることが記載されている。さらに、日本薬局方でもＩＴＳの塩基配列の検査が推奨されている。
【特許文献１】特開平９−２７５９９８号公報
【特許文献２】特開平１１-１７８５６８号公報
【特許文献３】特開２００１−２９９３９９号公報
【特許文献４】特開２００８−３５７７３号公報
【特許文献５】特開２００８−５７６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、前述した従来技術には、それぞれ以下のような問題があった。
（Ｉ）生死判定の従来技術である（ａ）培養法については、培養に１週間程度と時間を要するため、迅速な判定ができない。人が生活する屋内や、人が食する食物などの迅速性が要求される検査には不適である。
【００１４】
（Ｉ）生死判定の従来技術である（ｂ）迅速法の１）蛍光染色試薬を用いる方法は、各試薬を使った生死判別の測定は迅速であるが、真菌の場合は特に、専門知識と高い技術を必要とするため、手軽な検査方法とは言えない。この方法は、非熟練者が実施するのは難しく、定量性・再現性が得られにくい。例えば、極端な場合、アクリジンオレンジでは蛍光を発しないはずの生菌が、蛍光を発する場合もある。
【００１５】
（Ｉ）生死判定の従来技術である（ｂ）迅速法の２）ＲＮＡ／ＤＮＡ比による方法は、検体からＲＮＡとＤＮＡのそれぞれをＰＣＲ法で増幅させるには、２日間程度の時間と特殊な装置、高い専門技術を要する。少なくともＲＮＡとＤＮＡの両方の定量が必要となり、簡便な検査法とは言い難い。
【００１６】
（ＩＩ）カビ種の同定の（ａ）培養法は、迅速性に欠けるという問題がある。培養によるカビ検査には数日〜１週間程度を要し、迅速性が要求される品質管理になじまないことが指摘されている。
また、カビ汚染食品からの直接検鏡法は、応用可能な食品が限定され、かつ汚染菌量が少ない試料では難しく、高い専門技術を要する。さらにカビの同定には、経験と専門性が必要である。
【００１７】
（ＩＩ）カビ種の同定の（ｂ）迅速検査法のうち、１）β−グルカンの測定法は、市販キットがあり、測定は容易である。しかし、この方法ではカビの総量を推測することが可能であるが、カビ種の同定はできない。
また、（ｂ）迅速検査法のうち、２）キチン分析法は、高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーを用いるため、専門性が必要であり、前処理も必要であるため、簡便な手法とは言えない。またこの方法ではカビの総量を推測することが可能であるが、カビ種の同定はできない。
また、（ｂ）迅速検査法のうち、３）ＡＴＰ測定法は、市販キットがあり、簡便であるが、カビと他の微生物とを区別することが難しく、微生物の総量を推定することが可能であるが、カビ種の同定はできない。
また、（ｂ）迅速検査法のうち、４）免疫学的手法は、カビ毒の検出用には市販のキットが提供されているが、カビの検出やカビ種の同定用については商品化されていない。
【００１８】
（ｂ）迅速検査法のうち、５）真菌検出用ＤＮＡチップは、検体中のカビの有無やそのカビ種の同定を、迅速かつ簡便に実行でき、また高度な専門知識・技術がなくても正確な判別が可能である。
しかしながら、特許文献４、５に開示されたような従来技術にあっては、ＤＮＡチップのプローブを設計する際に、カビのリボソームのスペーサー領域（ＩＴＳ）に由来する、またはそれを含む領域に由来する塩基配列の情報を用いてプローブ設計しており、現状ではＩＴＳ領域の塩基配列のデータ量が少ないために、カビ検出用プローブの設計・作製が難しいという問題がある。
また、特許文献４、５に開示されたような従来技術にあっては、使用するプローブの塩基配列が塩基数４０〜５０個程度必要あるため、プローブの作製やＤＮＡチップの作製が難しくなるという問題がある。
さらに、特許文献４、５に開示されたＩＴＳに由来する塩基配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションでは、クロスハイブリッドが起きることがあり、同一種に対し何個かのプローブが必要な場合が多く、ＤＮＡチップを用いたカビ種同定の測定精度が十分に得られない問題がある。
また、特許文献４、５に開示されたプローブの塩基配列は、カビのリボソームのＩＴＳに由来するものである。このＩＴＳは、生菌に特異的なｍＲＮＡを介した蛋白質合成に関与しないため、検体のＲＮＡ量を基準とした検体中のカビの生死判別を実行するには不向きである。
【００１９】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたもので、屋内や食品に存在するカビの生死判別とカビ種の同定とを個別又は同時に行うことができ、しかも簡易な測定手法によって高精度で前記判別・同定を行うことが可能なＤＮＡチップの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前記目的を達成するため、本発明は、配列番号１〜３４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなる群から選択されるいずれか１つの塩基配列を有してなるカビ検出用プローブを提供する。
【００２１】
また本発明は、
（１）アブシディア  コエルレア（Absidia coerulea）を検出対象とする配列番号１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ア）、
（２）アブシディア  コリンビフェラ（Absidia corymbifera）を検出対象とする配列番号２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（イ）、
（３）アブシディア  グラウカ（Absidia glauca）を検出対象とする配列番号３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ウ）、及び配列番号４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（エ）、
（４）アブシディア  レペンス（Absidia repens）を検出対象とする配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（オ）、及び配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（カ）、
（５）アルタナリア  アルタナータ（Alternaria alternata）を検出対象とする配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（キ）、
（６）アスペルギルス  ニドランス（Aspergillus nidulans）を検出対象とする配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ク）、
（７）アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）を検出対象とする配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ケ）、配列番号１０の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（コ）、配列番号１１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（サ）、配列番号１２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（シ）、及び配列番号１３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ス）、
（８）アスペルギルス  ヴァーシカラー（Aspergillus versicolor）を検出対象とする配列番号１４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（セ）、
（９）カンジダ  アルビカンス（Candida albicans）を検出対象とする配列番号１５の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ソ）、
（１０）クラドスポリウム  クラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）を検出対象とする配列番号１６の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（タ）、配列番号１７の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（チ）、及び配列番号１８の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ツ）、
（１１）クラドスポリウム  クラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）及びクラドスポリウム  スフェロスペルマム（Cladosporium sphaerospermum）を検出対象とする配列番号１９の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（テ）、及び配列番号２０の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ト）、
（１２）クラドスポリウム  ランゲロニー（Cladosporium langeronii）を検出対象とする配列番号２１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ナ）、及び配列番号２２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ニ）、
（１３）ユーロチウム  レペンス（Eurotium repens）を検出対象とする配列番号２３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ヌ）、
（１４）フザリウム  カルモラム（Fusarium culmorum）を検出対象とする配列番号２４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ネ）、
（１５）フザリウム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を検出対象とする配列番号２５の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ノ）、
（１６）ムコール  ラセモサス（Mucor racemosus）を検出対象とする配列番号２６の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ハ）、
（１７）ペシロミセス  テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）を検出対象とする配列番号２７の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ヒ）、
（１８）フォーマ（Phoma）属を検出対象とする配列番号２８の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（フ）、
（１９）リゾプス（Rhizopus）属を検出対象とする配列番号２９の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ヘ）、
（２０）スタキボトリス  チャルトラム（Stachybotrys chartarum）を検出対象とする配列番号３０の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ホ）、及び配列番号３１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（マ）、
（２１）トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）を検出対象とする配列番号３２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ミ）、
（２２）ワレミア（Wallemia）属を検出対象とする配列番号３３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ム）、及び配列番号３４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（メ）、
からなる群から選択されるカビ検出用プローブを提供する。
【００２２】
また本発明は、前述した本発明に係るカビ検出用プローブの１種又は２種以上を、基板に固定してなるカビ検出用ＤＮＡチップを提供する。
【００２３】
また本発明は、前述したカビ検出用プローブ（ア）〜（メ）のうちの２種以上を、基板に混合した状態で固定してなるカビ検出用ＤＮＡチップを提供する。
【００２４】
また本発明は、前述したカビ検出用プローブ（ア）〜（メ）のうちの２種以上を、それぞれのカビ検出用プローブの固定領域を区切って並べた状態で基板に固定してなるカビ検出用ＤＮＡチップを提供する。
【００２５】
本発明のカビ検出用ＤＮＡチップにおいて、基板に一端を固定した前記カビ検出用プローブの先端に、同じかまたは異なるカビ検出用プローブが連結されたカスケード構造を有する構成としてもよい。
【００２６】
また本発明は、前述した本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップを用い、
被検試料中の核酸から、標識化合物で標識された検出用ターゲットを作製する工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブに前記検出用ターゲットをハイブリダイズする工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出することで、被検査試料中に前記カビ検出用プローブの検出対象であるカビが存在するか否かを調べる工程を有するカビの検出方法を提供する。
【００２７】
また本発明は、前述した本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップを用い、
被検試料中の核酸から、標識化合物で標識された検出用ターゲットを作製する工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブに前記検出用ターゲットをハイブリダイズする工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出し、カビ菌体量に対する標識化合物の検出量が基準値よりも多い場合には、被検査試料中に存在するカビが生きており、カビ菌体量に対する標識化合物の検出量が基準値よりも少ない場合には、被検査試料中に存在するカビが死んでいると判別する工程を有するカビの生死判別方法を提供する。
【００２８】
また本発明は、前述した本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップを用い、
被検試料中の核酸から、標識化合物で標識された検出用ターゲットを作製する工程と、
前記カビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブに前記検出用ターゲットをハイブリダイズする工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出することで、被検査試料中のカビが、ＤＮＡチップの標識化合物が検出された領域に固定しておいたカビ検出用プローブの検出対象とするカビであるとして該カビの種を同定する工程を有するカビの同定方法を提供する。
【００２９】
また本発明は、前述した本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップを用い、
被検試料中の核酸から、標識化合物で標識された検出用ターゲットを作製する工程と、
前記カビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブに前記検出用ターゲットをハイブリダイズする工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出することで、被検査試料中のカビが、ＤＮＡチップの標識化合物が検出された領域に固定しておいたカビ検出用プローブが検出対象とするカビであるとして該カビの種を同定するとともに、
該標識化合物の検出量が基準値よりも多い場合には、被検査試料中に存在するカビが生きており、該標識化合物の検出量が基準値よりも少ない場合には、被検査試料中に存在するカビが死んでいると判別する工程を有するカビの検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明に係るカビ検出用プローブは、塩基配列等のデータが比較的豊富に存在するカビのリボソームの１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列に由来する配列番号１〜３４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなる群から選択されるいずれか１つの塩基配列を有してなるものなので、各種のカビ種に対応した適切なカビ検出用プローブの設計・作製を容易に行うことができる。
また、本発明に係るカビ検出用プローブは、塩基数３０以下の比較的短い塩基配列でありながら、検出対象となるカビの核酸を含む被検試料中の検出用ターゲットと高い確率でハイブリダイズするものなので、プローブの設計・作製を容易に行うことができるとともに、これを基板に固定したＤＮＡチップの製造も容易となる。さらに、比較的短い塩基配列であることから、種々の変更、例えば、一段目のカビ検出用プローブの先端側に同種の又は異種のカビ検出用プローブの一端を連結した多段のカスケード構造とすることなども比較的容易に行うことができる。
また、本発明に係るカビ検出用プローブは、検出対象となるカビの核酸を含む被検試料中の検出用ターゲットと高い確率でハイブリダイズするものなので、検出用ターゲットとハイブリダイズする際に、クロスハイブリッドが起こる確率が低く、高精度でカビの検出を行うことができる。
【００３１】
本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップは、前述した本発明に係るカビ検出用プローブを基板に固定したものなので、塩基数３０以下の比較的短い塩基配列でありながら、検出対象となるカビの核酸を含む被検試料中の検出用ターゲットと高い確率でハイブリダイズすることが可能であり、プローブの設計・作製を含めたＤＮＡチップの製造が容易になる。
また、本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップは、検出対象となるカビの核酸を含む被検試料中の検出用ターゲットと高い確率でハイブリダイズするカビ検出用プローブを有するものなので、検出用ターゲットとハイブリダイズする際に、クロスハイブリッドが起こる確率が低く、高精度でカビの検出を行うことができる。
また、本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップは、カビのリボソームの１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列に由来する塩基配列を有するプローブを基板に固定してなるものなので、ＩＴＳ由来の塩基配列のプローブを有する従来のＤＮＡチップと比べ、検出対象のカビの生存／死滅の差によりプローブにハイブリダイスする核酸量の変動が大きくなるので、その核酸量を調べることで、検出対象のカビの生死を判別することができる。
また、本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップにおいて、本発明に係るカビ検出用プローブのうちの２種以上を、それぞれのカビ検出用プローブの固定領域を区切って並べた状態で基板に固定してなる構成とすれば、被検試料中に存在するカビ由来の核酸が、何れの固定領域のプローブとハイブリダイズするかを調べることで、該カビの種を同定でき、前述したようにクロスハイブリッドが起こる確率が低いことから、高精度でカビ種の同定を行うことができる。
また、本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップにおいて、基板に一端を固定したカビ検出用プローブの先端に、同じかまたは異なるカビ検出用プローブが連結されたカスケード構造を有する構成とすれば、特定のカビをより高精度で検出することができるし、１つのプローブでは検出不可能な変異種や類似の種の検出も可能となる。
【００３２】
本発明に係るカビの検出方法は、前述した本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップを用い、標識した被検試料中の検出用ターゲットとプローブとをハイブリダイズし、洗浄後に該プローブにハイブリダイズした検出用ターゲットを標識をもとに検出することによって、従来のＩＴＳ由来のプローブを有するＤＮＡチップを用いた場合と比べて特定のカビをより高精度で検出することができる。
また、本発明に係るカビの生死判別方法は、前述した本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップを用い、標識した被検試料中の検出用ターゲットとプローブとをハイブリダイズし、洗浄後に該プローブにハイブリダイズした検出用ターゲットを標識をもとに検出し、カビ菌体量に対する検出量の高低によって被検試料中のカビの生死を判別できるので、従来法に比べてカビの生死判別を迅速に、高精度で簡便に行うことができる。
また、本発明に係るカビの同定方法は、本発明に係るカビ検出用プローブのうちの２種以上を、それぞれのカビ検出用プローブの固定領域を区切って並べた状態で基板に固定してなるＤＮＡチップを用い、標識した被検試料中の検出用ターゲットとプローブとをハイブリダイズし、洗浄後に該プローブにハイブリダイズした検出用ターゲットを標識をもとに検出し、被検査試料中のカビが、ＤＮＡチップの標識化合物が検出された領域に固定しておいたカビ検出用プローブの検出対象とするカビであるとして該カビの種を同定できるので、カビの種の同定を迅速に、高精度で簡便に行うことができる。
また、前記カビの同定方法は、カビ種の同定と共に、カビの生死判別を行うこともできるため、１個のＤＮＡチップによってカビの生死判別とカビ種の同定とを同時に実行することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（カビ検出用プローブ）
本発明に係るカビ検出用プローブは、検出対象のカビのゲノム領域に特異的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含むプローブである。このカビ検出用プローブの長さは、特に制限されないが、例えば、１０〜２００ヌクレオチドであって、２０〜１００ヌクレオチドが好ましく、２０〜５０ヌクレオチドがさらに好ましい。複数のプローブ間で、プローブの長さは、同じでもよいし、異なっていてもよい。
【００３４】
プローブのポリヌクレオチドとしては、特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、従来公知のこれらの誘導体や類縁体等を使用できる。カビ検出用プローブの製造方法としては、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボ又はインビトロで製造してもよい。
【００３５】
本発明では、カビ検出用プローブをＤＮＡチップ（マイクロアレイ）として利用することから、前記カビ検出用プローブには、ＤＮＡチップの基板に固定するための修飾がされていてもよい。前記修飾は、使用するＤＮＡチップ基板の種類に応じて従来公知のものを選択できるが、例えばプローブのポリヌクレオチドの５’末端又は３’末端のＣ（３〜７）アミノ化等が挙げられる。
【００３６】
前記カビ検出用プローブの配列としては、検出対象のカビに特異的である従来公知の配列であってもよく、また、前記カビのゲノム配列に基づき設計しても良い。プローブ配列の設計方法は、特に制限されないが、例えば、従来公知のアルゴリズムやソフトウェアを利用することができる。
例えば公知の配列として、次の論文などに記述されている。
(1)Zhihong Wu,Yoshihiko Tsumura et al，18S rRNA Gene Variation among Common Airborne Fungi, and Development of Specific Oligonucleotide Probes for the Detection of Fungal Isolates，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol. 69, No. 9, p. 5389−5397（2003）
(2)WILLEM J. G. MELCHERS, PAUL E VERWEIJ ，General Primer-Mediated PCR for Detection of Aspergillus Species，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Vol. 32, No. 7, p. 1710-1717（1994）
【００３７】
前記ソフトウェアとしては、例えば、ＡＲＢ（The ARB project at Technical University of Munich - the official ARB homepage, http://www.arb-home.de）が挙げられる。
なお、ソフトウェアＡＲＢについては、次の参考文献にも記述されている。
(1)Michael Mayl, BjoE rn Nonhoffl et al., ARB: a software environment for sequence data, Nucleic Acids Research, Vol.32, No.4, pp.1363-1371(2004)
(2)朴相熙、伊藤喜久治、ＡＲＢ；ｒＲＮＡデータベースの処理とプローブのデザイン、腸内細菌学雑誌、Vol.19 pp.53-60(2005)
【００３８】
本発明の好ましい実施形態において、カビ検出用プローブは、検出対象とするカビのリボソームの１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列に由来する、配列番号１〜３４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなる群から選択されるいずれか１つの塩基配列を有する。
【００３９】
なお、本発明において、「それと実質的に同一の塩基配列」とは、配列番号１〜３４の塩基配列において１又は数個の核酸が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、対応する配列番号１〜３４の塩基配列からなるカビ検出用プローブがハイブリダイズするＤＮＡとハイブリダイズできる塩基配列のことを指す。
【００４０】
本発明に係るカビ検出用プローブの好適な実施形態を以下に例示する。
（１）アブシディア  コエルレア（Absidia coerulea）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ア）が挙げられる。
【００４１】
（２）アブシディア  コリンビフェラ（Absidia corymbifera）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（イ）が挙げられる。
【００４２】
（３）アブシディア  グラウカ（Absidia glauca）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ウ）、及び配列番号４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（エ）が挙げられる。
【００４３】
（４）アブシディア  レペンス（Absidia repens）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（オ）、及び配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（カ）が挙げられる。
【００４４】
（５）アルタナリア  アルタナータ（Alternaria alternata）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（キ）が挙げられる。
【００４５】
（６）アスペルギルス  ニドランス（Aspergillus nidulans）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ク）が挙げられる。
【００４６】
（７）アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ケ）、配列番号１０の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（コ）、配列番号１１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（サ）、配列番号１２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（シ）、及び配列番号１３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ス）が挙げられる。
【００４７】
（８）アスペルギルス  ヴァーシカラー（Aspergillus versicolor）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号１４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（セ）が挙げられる。
【００４８】
（９）カンジダ  アルビカンス（Candida albicans）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号１５の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ソ）が挙げられる。
【００４９】
（１０）クラドスポリウム  クラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号１６の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（タ）、配列番号１７の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（チ）、及び配列番号１８の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ツ）が挙げられる。
【００５０】
（１１）クラドスポリウム  クラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）及びクラドスポリウム  スフェロスペルマム（Cladosporium sphaerospermum）の両方を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号１９の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（テ）、及び配列番号２０の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ト）が挙げられる。
【００５１】
（１２）クラドスポリウム  ランゲロニー（Cladosporium langeronii）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号２１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ナ）、及び配列番号２２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ニ）が挙げられる。
【００５２】
（１３）ユーロチウム  レペンス（Eurotium repens）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号２３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ヌ）が挙げられる。
【００５３】
（１４）フザリウム  カルモラム（Fusarium culmorum）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号２４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ネ）が挙げられる。
【００５４】
（１５）フザリウム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号２５の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ノ）が挙げられる。
【００５５】
（１６）ムコール  ラセモサス（Mucor racemosus）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号２６の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ハ）が挙げられる。
【００５６】
（１７）ペシロミセス  テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号２７の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ヒ）が挙げられる。
【００５７】
（１８）フォーマ（Phoma）属を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号２８の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（フ）が挙げられる。
【００５８】
（１９）リゾプス（Rhizopus）属を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号２９の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ヘ）が挙げられる。
【００５９】
（２０）スタキボトリス  チャルトラム（Stachybotrys chartarum）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号３０の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ホ）、及び配列番号３１の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（マ）が挙げられる。
【００６０】
（２１）トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号３２の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ミ）が挙げられる。
【００６１】
（２２）ワレミア（Wallemia）属を検出対象とするカビ検出用プローブとしては、配列番号３３の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（ム）、及び配列番号３４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなるカビ検出用プローブ（メ）が挙げられる。
【００６２】
前述した（ア）〜（メ）のカビ検出用プローブは、塩基配列等のデータが比較的豊富に存在するカビのリボソームの１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列に由来する配列番号１〜３４の塩基配列又はそれと実質的に同一の塩基配列からなる群から選択されるいずれか１つの塩基配列を有してなるものなので、各種のカビ種に対応した適切なカビ検出用プローブの設計・作製を容易に行うことができる。
また、前記カビ検出用プローブは、塩基数３０以下の比較的短い塩基配列でありながら、検出対象となるカビの核酸を含む被検試料中の検出用ターゲットと高い確率でハイブリダイズするものなので、プローブの設計・作製を容易に行うことができるとともに、これを基板に固定したＤＮＡチップの製造も容易となる。さらに、比較的短い塩基配列であることから、種々の変更、例えば、一段目のカビ検出用プローブの先端側に同種の又は異種のカビ検出用プローブの一端を連結した多段のカスケード構造とすることなども比較的容易に行うことができる。
また、前記カビ検出用プローブは、検出対象となるカビの核酸を含む被検試料中の検出用ターゲットと高い確率でハイブリダイズするものなので、検出用ターゲットとハイブリダイズする際に、クロスハイブリッドが起こる確率が低く、高精度でカビの検出を行うことができる。
【００６３】
（カビ検出用ＤＮＡチップ）
本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップは、前述した本発明に係るカビ検出用プローブの１種又は２種以上を基板に固定してなるＤＮＡチップである。
本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップの好ましい実施形態としては、前述したカビ検出用プローブ（ア）〜（メ）のうちの２種以上、好ましくは全種を、それぞれのカビ検出用プローブの固定領域を区切って並べた状態で基板に固定してなるカビ検出用ＤＮＡチップが挙げられる。
【００６４】
この基板上の固定領域の配置方法については、カビ検出用プローブ（ア）〜（メ）がそれぞれどの位置に固定されているのかが明確に認識できればよく、特に限定されない。例えば、カビ検出用プローブ（ア）〜（メ）の固定スポットを直線状とし、それぞれ間隔を置いて平行に並べたり、円形の固定スポットを縦横に規則的に並べたりすることができる。
【００６５】
本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップに使用する基板は、当該技術分野で公知の各種の基板を使用でき、特に限定されない。基板の材質としては、例えば、ガラス、セラミックスなどの無機材料；ポリエチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。基板の形状も長方形、正方形、丸形、楕円形など限定されない。
【００６６】
基板に前記カビ検出用プローブを固定して本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップを製造する方法は、ＤＮＡチップの製造において公知の方法を用いて行うことができ、特に限定されない。例えば、予め調製したカビ検出用プローブを、基板上にスポッターを用いてスポットする方法を用いることができる。また、この場合のスポット方法としては、ピン先端の基板上への機械的な接触によるピン方式、インクジェットプリンタを用いるインクジェット方式、毛細管を用いるキャピラリー方式などが挙げられるが、特にこれらに限定されない。また、他の好ましい製造方法として、フォトリソグラフィ技術と固相反応化学技術を使用し、基板上に前記カビ検出用プローブを人工的に合成する方式を採用することもできる。
【００６７】
このカビ検出用ＤＮＡチップは、前述したカビ検出用プローブ（ア）〜（メ）を基板に固定したものなので、塩基数３０以下の比較的短い塩基配列でありながら、検出対象となるカビの核酸を含む被検試料中の検出用ターゲットと高い確率でハイブリダイズすることが可能であり、プローブの設計・作製を含めたＤＮＡチップの製造が容易になる。
また、このＤＮＡチップは、検出対象となるカビの核酸を含む被検試料中の検出用ターゲットと高い確率でハイブリダイズするカビ検出用プローブ（ア）〜（メ）を有するものなので、検出用ターゲットとハイブリダイズする際に、クロスハイブリッドが起こる確率が低く、高精度でカビの検出を行うことができる。
また、このカビ検出用ＤＮＡチップは、カビのリボソームの１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列に由来する塩基配列を有するプローブ（ア）〜（メ）を基板に固定してなるものなので、ＩＴＳ由来の塩基配列のプローブを有する従来のＤＮＡチップと比べ、検出対象のカビの生存／死滅の差によりプローブにハイブリダイスする核酸量の変動が大きくなるので、その核酸量を調べることで、検出対象のカビの生死を判別することができる。
また、このカビ検出用ＤＮＡチップにおいて、前記カビ検出用プローブ（ア）〜（メ）のうちの２種以上を、それぞれのカビ検出用プローブの固定領域を区切って並べた状態で基板に固定してなる構成とすれば、被検試料中に存在するカビ由来の核酸が、何れの固定領域のプローブとハイブリダイズするかを調べることで、該カビの種を同定でき、前述したようにクロスハイブリッドが起こる確率が低いことから、高精度でカビ種の同定を行うことができる。
また、このカビ検出用ＤＮＡチップにおいて、基板に一端を固定したカビ検出用プローブの先端に、同じかまたは異なるカビ検出用プローブが連結されたカスケード構造を有する構成とすれば、特定のカビをより高精度で検出することができるし、１つのプローブでは検出不可能な変異種や類似の種の検出も可能となる。
【００６８】
（カビの検出方法）
本発明のカビの検出方法は、前述したカビ検出用ＤＮＡチップを用い、
被検試料中の核酸から、標識化合物で標識された検出用ターゲットを作製する工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブに前記検出用ターゲットをハイブリダイズする工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出することで、被検査試料中に前記カビ検出用プローブの検出対象であるカビが存在するか否かを調べることを特徴としている。
【００６９】
本発明において、「標識化合物」とは、特に制限されず、例えば、発光標識や放射性標識の化合物が挙げられる。前記発光標識としては、例えば、蛍光標識、生体発光標識、化学発光標識及び比色定量標識等が挙げられ、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等の蛍光標識化合物が好ましい。
【００７０】
市販の蛍光標識化合物としては、例えば、フルオレプライム（FluorePrime、アマシャムファルマシア社製）、フルオレダイト（Fluoredite、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３及びＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）等の蛍光ホスホルアミダイト類が挙げられる。
【００７１】
標識化合物として前記蛍光標識化合物を用いる場合、蛍光標識化合物で標識された検出用ターゲットをカビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブにハイブリダイズし、洗浄後、そのカビ検出用ＤＮＡチップをスキャナーにセットし、蛍光強度を読み取る。使用した蛍光標識化合物に所定波長の励起光を照射し、蛍光標識化合物から発する特定波長の蛍光強度を測定することで、被検試料中のカビの有無を判別することができる。
本発明のカビの検出方法は、従来のＩＴＳ由来のプローブを有するＤＮＡチップを用いた場合と比べて特定のカビをより高精度で検出することができる。
【００７２】
（カビの生死判別方法）
本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップは、カビのリボソームの１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列に由来する塩基配列を有する前記カビ検出用プローブ（ア）〜（メ）を基板に固定してなるものなので、ＩＴＳ由来の塩基配列のプローブを有する従来のＤＮＡチップと比べ、検出対象のカビの生存／死滅の差によりプローブにハイブリダイスする核酸量の変動が大きくなるので、その核酸量を調べることで、検出対象のカビの生死を判別することができる。同一菌量の生存しているカビと死滅したカビとからそれぞれＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を比較すると、生存しているカビのＲＮＡ量が死滅の場合と比べて格段に多いことが分かる。このため、ＲＮＡ量又はカビ検出用ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション後の標識化合物の検出量から容易に検出対象のカビの生死判別が可能となる。
【００７３】
すなわち、本発明に係るカビの生死判別方法は、前述した本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップを用い、
被検試料中の核酸から、標識化合物で標識された検出用ターゲットを作製する工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブに前記検出用ターゲットをハイブリダイズする工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出し、カビ菌体量に対する標識化合物の検出量が基準値よりも多い場合には、被検査試料中に存在するカビが生きており、カビ菌体量に対する標識化合物の検出量が基準値よりも少ない場合には、被検査試料中に存在するカビが死んでいると判別する工程を有することを特徴とする。
【００７４】
本発明のカビの生死判別方法は、本発明に係るカビ検出用ＤＮＡチップを用い、標識した被検試料中の検出用ターゲットとプローブとをハイブリダイズし、洗浄後に該プローブにハイブリダイズした検出用ターゲットを標識をもとに検出し、カビ菌体量に対する検出量の高低によって被検試料中のカビの生死を判別できるので、従来法に比べてカビの生死判別を迅速に、高精度で簡便に行うことができる。
【００７５】
（カビの同定方法）
本発明に係るカビの同定方法は、前記カビ検出用プローブ（ア）〜（メ）のうちの２種以上を、それぞれのカビ検出用プローブの固定領域を区切って並べた状態で基板に固定してなるＤＮＡチップを用い、
被検試料中の核酸から、標識化合物で標識された検出用ターゲットを作製する工程と、
前記カビ検出用ＤＮＡチップのカビ検出用プローブに前記検出用ターゲットをハイブリダイズする工程と、
次いで、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出することで、被検査試料中のカビが、ＤＮＡチップの標識化合物が検出された領域に固定しておいたカビ検出用プローブの検出対象とするカビであるとして該カビの種を同定する工程を有することを特徴とする。
【００７６】
このカビの同定方法に用いるカビ検出用ＤＮＡチップは、本発明に係るカビ検出用プローブ（ア）〜（メ）の内の２種類以上、好ましくは全種を、それぞれのカビ検出用プローブの固定領域を区切って並べた状態で基板に固定してあり、特定の固定領域に、どのカビ検出用プローブが固定されているかが分かるようになっている。このＤＮＡチップを用い、標識した被検試料中の検出用ターゲットとプローブとをハイブリダイズし、洗浄後、該プローブにハイブリダイズした検出用ターゲットを標識をもとに検出することによって、何番目のカビ検出用プローブに検出用ターゲットがハイブリダイズしたかを調べることで、被検査試料中のカビが、カビ検出用プローブ（ア）〜（メ）の検出対象とするいずれかのカビである、と同定することができる。
【００７７】
本発明に係るカビの同定方法は、カビ検出用プローブのうちの２種以上を、それぞれのカビ検出用プローブの固定領域を区切って並べた状態で基板に固定してなるＤＮＡチップを用い、標識した被検試料中の検出用ターゲットとプローブとをハイブリダイズし、洗浄後に該プローブにハイブリダイズした検出用ターゲットを標識をもとに検出し、被検査試料中のカビが、ＤＮＡチップの標識化合物が検出された領域に固定しておいたカビ検出用プローブの検出対象とするカビであるとして該カビの種を同定できるので、カビの種の同定を迅速に、高精度で簡便に行うことができる。
【００７８】
（カビの生死判別・カビ種の同定の同時測定）
前述したカビの同定方法において、前記カビ検出用ＤＮＡチップを洗浄し、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出することで、被検査試料中のカビが、ＤＮＡチップの標識化合物が検出された領域に固定しておいたカビ検出用プローブの検出対象とするカビであるとして該カビの種を同定する工程を行うと同時に、洗浄後の該ＤＮＡチップについて前記標識化合物を検出し、カビ菌体量に対する標識化合物の検出量が基準値よりも多い場合には、被検査試料中に存在するカビが生きており、カビ菌体量に対する標識化合物の検出量が基準値よりも少ない場合には、被検査試料中に存在するカビが死んでいると判別する工程を行うことで、カビの生死判別・カビ種の同定の同時測定が可能となる。
このように、前記カビの同定方法は、カビ種の同定と共に、カビの生死判別を行うこともできるため、１個のＤＮＡチップによってカビの生死判別とカビ種の同定とを同時に実行することができる。
【００７９】
なお、上述した実施の形態において記載した内容は単なる一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において種々変更可能である。
【実施例】
【００８０】
（カビ検出用プローブの設計）
表１中のＮｏ．１〜２２のカビを検出対象としたカビ検出用プローブとして、配列番号１〜３４に示す塩基配列を有する３４個のカビ検出用プローブを設計した。
【００８１】
【表１】
2010130915.tif 000003
【００８２】
［実施例１］
＜ＤＮＡチップを用いたハイブリダイゼーションによるカビ生死判断＞
以下にＲＮＡ抽出、ＲＮＡ量の定量、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）による測定について記すが、本発明は特にここで用いるキット、ＤＮＡチップ、およびプロトコールに限定するものではなく、一般的に用いられるＲＮＡ抽出、ＲＮＡ量の定量、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）による測定を目的とするキット、ＤＮＡチップおよびそれらに付属するプロトコールを含めるものである。
【００８３】
（ａ）ＲＮＡの抽出操作
表１のＮｏ．７のアスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）、Ｎｏ．１０のクラドスポリウム  クラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）について、生菌・死菌５０ｍｇの同一菌量を採取し、それぞれ液体窒素で凍結・粉砕し、Ｆｕｎｇａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖ−Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ抽出キット（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−ｔｅｋ社製）を用いて、該キットに付属のプロトコールに従い、ＲＮＡを抽出・精製した。
【００８４】
具体的には、まず、凍結し、すりつぶしたカビ菌体を１．５ｍＬのマイクロチューブに回収し、前述した抽出キットのＢｕｆｆｅｒ  ＲＢ  ５００μＬを加え、勢いよく懸濁する。その懸濁液をキット付属のカラム（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ  Ｃｏｌｏｍｎ、緑色）をセットした２ｍＬコレクションチューブに注ぐ。そのコレクションチューブを室温、１３０００×ｇにて５分間遠心分離を行う。コレクションチューブに溜まった液を、新しい１．５ｍＬのチューブに移し、０．５等量の無水エタノールを加え撹拌する。
【００８５】
次に、キット付属のカラム（ＨｉＢｉｎｄ  ＲＮＡ  Ｃｏｌｏｍｎ、赤色）をセットした２ｍＬコレクションチューブに、先ほどの撹拌した液を全量加える。室温、１００００×ｇにて３０秒間遠心分離を行い、コレクションチューブの底に溜まった液を捨て、キット付属のＲＮＡ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ  ５００ｍＬをカラムに加え、再度室温、１００００×ｇにて３０秒間遠心分離を行い、カラムを洗浄する。
【００８６】
さらに、カラムにＲＮＡ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  II  （ｄｉｌｕｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｔｈａｎｏｌ）７００μＬを加え、室温、１００００×ｇにて３０秒間遠心分離、ＲＮＡ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  II  ５００μＬを加えての再度の遠心分離で、カラムの洗浄を行う。そして室温、ｆｕｌｌ  ｓｐｅｅｄで１分間遠心分離し、完全にカラムから液を除去する。
【００８７】
最後に、１．５ｍＬチューブに、前述したカラムを再セットして、キット付属のＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｈｙｌ  Ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）水を５０μＬ加える。室温、ｆｕｌｌ  ｓｐｅｅｄで１分間遠心分離し、ＲＮＡをカラムからＤＥＰＣ水と共にチューブ底に溶出させる。
【００８８】
（ｂ）ＲＮＡ量の測定
ＲＮＡの定量には、分光光度計（ナノドロップ；商品名 ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用した。ＲＮＡを溶出させた液を１μＬ用いて、表２に記した条件下で測定した。測定結果を表３に示す。
【００８９】
【表２】
2010130915.tif 000004
【００９０】
【表３】
2010130915.tif 000005
【００９１】
表３に示した通り、生菌のＲＮＡ濃度は、両方の菌（Ｎｏ．７，Ｎｏ．１０）とも死菌のＲＮＡ濃度と比べて１０倍以上高かった。
【００９２】
（ｃ）ＤＮＡチップによる測定
（ｃ−１）ｒＲＮＡの標識処理
ｒＲＮＡの標識処理とその後のハイブリダイゼーションを蛍光標識試薬キット（商品名；ＬａｂｅｌＩＴ ｍｉＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて行った。具体的には、まず、表４に示すように、ＲＮＡ試料（生菌、死菌は等量）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ、さらにキット付属の１０×Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ、ＬａｂｅｌＩＴ  ＣｙＤｙｅを加えて１００μＬにし、標識反応液とした。それらの反応液をチューブに入れ、３７℃に設定したアルミブロック恒温槽にセットし、１時間標識反応を行った。
その後、各チューブの液に、１０×ＳＴＯＰ Ｒｅａｇｅｎｔを１０μＬ加えてよく混ぜ、標識反応を停止させた。
【００９３】
【表４】
2010130915.tif 000006
【００９４】
次に、標識反応液の精製を行った。マイクロコン（カラムのメンブランフィルターにより、目の粗さに応じて、一定分子量の大きさ以上のｒＲＮＡを捕捉する機能を持つ）のカラムに標識反応液を注入して、室温、１４０００×ｇで２０分間遠心分離、さらにカラムにＮｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  １００μＬを加えて室温、１４０００×ｇで２５分間遠心分離、再度カラムにＮｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  １００μＬを加えて室温、１４０００×ｇで３０分間の遠心分離で精製を行った。
その後、カラムにある精製された標識反応液を、カラムを１５ｍＬチューブに逆にセットして、室温、１０００×ｇで１分間遠心分離して取り出した。
さらに、標識反応液量を一定にするため、真空濃縮器を用い、ここでは９．３μＬになるように濃縮調整した。
【００９５】
（ｃ−２）ハイブリダイゼーションおよび蛍光測定
まず、前述のキット（商品名；ＬａｂｅｌＩＴ ｍｉＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｍｉｒｕｓ社製）に付属のＨｙｂｒｉＢｕｆｆｅｒ Ａ  ０．３μＬを標識反応液に加え、６５℃で３分間保持した。さらにＨｙｂｒｉＢｕｆｆｅｒ Ｂを３０．３μＬ加えて撹拌し、３２℃で５分間保持し、ハイブリダイゼーション用反応液とした。
【００９６】
ＤＮＡチップは、東レ社製のＤＮＡチップ基板に、配列番号９，１１，１２，１３，１６，１８及び２０の塩基配列を、フォトリソグラフィ技術と固相反応化学技術を使用して合成することによって作製した。
【００９７】
次に、前記ＤＮＡチップに各カビの生菌・死菌の反応液を注入した。次に、そのＤＮＡチップを専用のチャンバーにセットし、３２℃、２５０ｒｐｍで回転させながら１６時間の間ハイブリダイゼーションを行った。
【００９８】
さらに、ハイブリダイゼーション反応後に、余分な反応液を除去し、チップ上のプローブの洗浄を行い、スキャナーによりプローブ蛍光検出（蛍光強度測定）を行った。
具体的には、表５に示す３０℃の１次洗浄液中でチップをセットしたラックを振り、５分間洗浄し、同様に３０℃の２次洗浄液に浸し１０分間洗浄、３０℃の３次洗浄液に浸し５分間の洗浄を行う。オゾンフリーのブース内で、３次洗浄終了後、ラック内の洗浄液を拭き取り、チップが乾燥しないうちにスピンドライヤーにて一気に水分を飛ばした。
【００９９】
【表５】
2010130915.tif 000007
【０１００】
ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの測定には、スキャナー（商品名；ＰｒｏＳｃａｎＡｒｒａｙ  ＨＴ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いた。ＤＮＡチップをまずスキャナーにセットし、各プローブとカビのｒＲＮＡハイブリダイゼーションの結果を示す蛍光強度を測定した。
【０１０１】
（ｃ−３）測定結果
図１に、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）の生菌と死菌の測定強度比を示す。
また図２に、クラドスポリウム  クラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）の生菌と死菌の測定強度比を示す。
図１及び図２の結果より、本発明に係る配列番号９，１１，１２，１３，１６，１８及び２０の塩基配列からなるカビ検出用プローブを固定したＤＮＡチップによって、配列番号９，１１，１２，１３の塩基配列からなるカビ検出用プローブの検出対象であるアスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）、及びクラドスポリウム  クラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）のＲＮＡを検出することができた。
また、配列番号９，１１，１２，１３，１６，１８及び２０の塩基配列からなるカビ検出用プローブの全てにおいて、生菌と死菌が同一菌量である場合に、死菌の測定強度に対して生菌の測定強度が１０倍近く高くなった。この強度差であれば、生菌、死菌の区別が十分可能であり、したがって、このＤＮＡチップを用いることによって、カビの生死判断が可能であることが実証された。
【０１０２】
［実施例２］
＜ＤＮＡチップを用いたカビ種の特定（１）＞
アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）２株（Ａ，Ｂと記す）を用いて、アスペルギルス  ニガー検出用の配列番号９，１１，１２，１３からなるプローブと、他のカビ用の配列番号１６，１８，２０からなるプローブとを基板に固着したＤＮＡチップでハイブリダイゼーションを行った。操作手順は、前述した実施例１の場合と同じである。
【０１０３】
その結果を図３に示す。図３の結果より、アスペルギルス  ニガー検出用の配列番号９，１１，１２，１３からなるプローブは蛍光強度が検出されたが、他のカビ用のプローブでは蛍光強度が検出されなかった。このことから、アスペルギルス  ニガーと他のカビ種との選択的な区別が、本発明に係るカビ検出用プローブで可能なことが実証された。
【０１０４】
［実施例３］
＜ＤＮＡチップを用いたカビ種の特定（２）＞
クラドスポリウム  クラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）２株（Ａ，Ｂと記す）を用いて、クラドスポリウム  クラドスポイロイド検出用の配列番号１６，１８，２０からなるプローブと、他のカビ用の配列番号９，１１，１２，１３からなるプローブとを基板に固着したＤＮＡチップでハイブリダイゼーションを行った。操作手順は、前述した実施例１の場合と同じである。
【０１０５】
その結果を図４に示す。図４の結果より、クラドスポリウム  クラドスポイロイド検出用の配列番号１６，１８，２０からなるプローブは蛍光強度が検出されたが、他のカビ用のプローブでは蛍光強度が検出されなかった。このことから、クラドスポリウム  クラドスポイロイドと他のカビ種との選択的な区別が、本発明に係るカビ検出用プローブで可能なことが実証された。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】実施例１において測定したアスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）の生菌と死菌の測定強度比を示すグラフである。
【図２】実施例１において測定したクラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）の生菌と死菌の測定強度比を示すグラフである。
【図３】実施例２において測定したアスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）のハイブリダイゼーション結果を示すグラフである。
【図４】実施例３において測定したクラドスポリウム  クラドスポイロイド（Cladosporium cladosporioides）のハイブリダイゼーション結果を示すグラフである。
【図１】
2010130915.tif 000008
【図２】
2010130915.tif 000009
【図３】
2010130915.tif 000010
【図４】
2010130915.tif 000011
【配列表】
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