(57)【要約】【課題】所定の領域における細胞クロマチンの標的化された切断及び／又は細胞内の予め決定された所定の領域での相同組換えのための組成物及び方法を提供する。【解決手段】本明細書は、ゲノム配列の標的化された切断、ゲノム配列の標的化された変更、及びゲノム領域とそのゲノム領域と相同な外来性ポリヌクレオチドの間の標的化された組換えのための方法及び組成物を開示する。これらの組成物は、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)及び操作されたジンクフィンガードメインを含む融合タンパク質並びにこれをコードするポリヌクレオチドを含む。標的化された切断の方法は、このような融合タンパク質、又はこれをコードするポリヌクレオチドを細胞へ導入することを含む。標的化された組換えの方法は更に、ゲノム領域に相同な外来性ポリヌクレオチドを、開示された融合タンパク質を含む細胞へ導入することを含む。【選択図】図３
2010046099.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム配列の標的された置換方法であって、以下：
(a)第一、第二、第三及び第四の融合タンパク質を細胞中で発現するステップであって、当該融合タンパク質のそれぞれは、
(i)DNAにおいて標的部位に結合するジンクフィンガーDNA-結合ドメイン、及び
(ii)切断ハーフドメイン
を含み；
ここで、第一及び第二融合タンパク質は、第一及び第二標的部位にそれぞれ結合し、第一切断部位は第一標的部位と第二標的部位との間に存在し、そして、
第三及び第四融合タンパク質は、第三及び第四標的部位にそれぞれ結合し、第二切断部位は第三標的部位と第四標的部位との間に存在し；
それによって、第一及び第二融合タンパク質は第一切断部位でDNAを切断し、第三及び第四融合タンパク質は第二切断部位でDNAを切断する；並びに
(b)細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させるステップであって、当該ドナーポリヌクレオチドは、
(i)第一及び第二切断部位に隣接するゲノム配列と相同の配列；及び
(ii)第一切断部位と第二切断部位との間のゲノム配列と相同であるが同一でない配列
を含み；
それによって、第一切断部位と第二切断部位との間のゲノム配列は、ドナーポリヌクレオチドと相同であるが同一でない配列によって置換される、前記方法。
【請求項２】
前記相同であるが同一でない配列は、ゲノム配列の欠失を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記相同であるが同一でない配列は、ゲノム配列の挿入を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記相同であるが同一でない配列は、ゲノム配列の置換を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ゲノム配列の標的された置換方法であって、以下：
(a)第一、第二、第三及び第四の融合タンパク質を細胞中で発現するステップであって、当該融合タンパク質のそれぞれは、
(i)DNAにおいて標的部位に結合するジンクフィンガーDNA-結合ドメイン、及び
(ii)切断ハーフドメイン
を含み；
ここで、第一及び第二融合タンパク質は、第一及び第二標的部位にそれぞれ結合し、第一切断部位は第一標的部位と第二標的部位との間に存在し、そして、
第三及び第四融合タンパク質は、第三及び第四標的部位にそれぞれ結合し、第二切断部位は第三標的部位と第四標的部位との間に存在し；
それによって、第一及び第二融合タンパク質は第一切断部位でDNAを切断し、第三及び第四融合タンパク質は第二切断部位でDNAを切断する；並びに
(b)細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させるステップであって、当該ドナーポリヌクレオチドは、
(i)第一及び第二切断部位に隣接するゲノム配列と相同の配列；及び
(ii)第一切断部位と第二切断部位との間のゲノム配列と相同でない配列
を含み；
それによって、第一切断部位と第二切断部位との間のゲノム配列は、ドナーポリヌクレオチドの非-相同配列によって置換される、前記方法。
【請求項６】
(a)細胞の細胞クロマチン中の所定の領域内の、第一のヌクレオチド配列；
(b)第一の融合タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド、ここで、当該第一の融合タンパク質は、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一のFokI切断ハーフ-ドメインを含み、
当該第一のジンクフィンガードメインは、所定の領域内の第二のヌクレオチド配列に結合し、当該第二の配列は少なくとも9ヌクレオチドを含む；
(c)第二の融合タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド、ここで、当該第二の融合タンパク質は、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二のFokI切断ハーフ-ドメインを含み、
当該第二のジンクフィンガードメインは、所定の領域中の第三のヌクレオチド配列に結合し、当該第三の配列は少なくとも9ヌクレオチドを含み、かつ第二の配列から2〜50ヌクレオチドに位置する；並びに
(d)第四のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ここで当該第四のヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列と相同であるが同一ではない、
を含む、細胞。
【請求項７】
細胞クロマチン中の所定の領域に第一のヌクレオチド配列を変更するための医薬組成物であって、以下：
(a)第一の融合タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド、ここで当該第一の融合タンパク質は、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含み；
当該第一のジンクフィンガードメインは、所定の領域内の第二のヌクレオチド配列に結合し、当該第二の配列は少なくとも9ヌクレオチドを含み；
(b)第二の融合タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド、ここで、当該第二の融合タンパク質は、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含み、
当該第二のジンクフィンガードメインは第三のヌクレオチド配列に結合し、当該第三の配列は少なくとも9ヌクレオチドを含み、かつ第二の配列から2〜50ヌクレオチドに位置する；並びに
(c)第四のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ここで当該第四のヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列と相同であるが同一ではない、
を含む、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2003年8月8日に出願された米国特許仮出願第60/493,931号；2003年11月7日に出願された米国特許仮出願第60/518,253号；2003年12月18日に出願された米国特許仮出願第60/530,541号；2004年2月5日に出願された米国特許仮出願第60/542,780号；2004年3月26日に出願された米国特許仮出願第60/556,831号；及び、2004年6月1日に出願された米国特許仮出願第60/575,919号の恩典を請求するものであり、これらの特許仮出願はそれらの全体が全ての目的のために本明細書に参照として組入れられている。
【０００２】
連邦の支援で行われた研究の発明の権利に関する陳述
なし。
【０００３】
技術分野
本開示は、ゲノム工学及び相同組換えの分野内である。
【背景技術】
【０００４】
背景
ゲノム生物学において興味深い大きい領域は、特に多くのゲノムの完全なヌクレオチド配列の決定を考慮した、ゲノム配列の標的化された変更である。単なる一例を提示すると、鎌状細胞貧血は、ヒトβ-グロビン遺伝子の1個のヌクレオチド対の変異により引き起こされる。従って安定した状態でこの変異体ヌクレオチド対の内在性ゲノムコピーを野生型配列へ転換し、正常なβ-グロビンを生じる能力は、鎌状細胞貧血の治癒をもたらすであろう。
【０００５】
相同組換えの自然現象の利点を利用し、培養細胞においてゲノム配列を変更する試みが成されている。例えばCapecchi、Science, 244: 1288-1292 (1989)；米国特許第6,528,313号及び第6,528,314号を参照のこと。ポリヌクレオチドが、変更される配列を含むゲノム領域に対し十分な相同性を有するならば、このポリヌクレオチド配列の一部又は全てで、相同組換えによりゲノム配列を交換することが可能である。しかしこれらの状況下での相同組換え頻度は、極めて低い。更に配列相同性を欠いたゲノム位置での外来性ポリヌクレオチドの挿入頻度は、相同組換え頻度を数桁上回る。
【０００６】
外来性ポリヌクレオチドに対する相同性を持つゲノム領域における、2本鎖切断のゲノムDNAへの導入は、培養細胞において相同組換えを数千倍刺激することが示されている。Rouetら、Mol. Cell. Biol., 14: 8096-8106 (1994)；Choulikaら、Mol. Cell. Biol., 15: 1968-1973 (1995)；Donohoら、Mol Cell. Biol., 18: 4070-4078 (1998)を参照のこと。同じくJohnsonら、Biochem. Soc. Trans, 29: 196-201 (2001)；及び、Yanezら、Gene Therapy 5: 149-159 (1998)を参照のこと。これらの方法において、望ましいゲノム領域におけるDNA切断は、所望のゲノム領域へのメガヌクレアーゼ(すなわち、所定のゲノムにおいてその認識配列が、生じないか、又は単に稀に生じる程に大きいエンドヌクレアーゼ)の認識部位の挿入により実現された。
【０００７】
しかし、メガヌクレアーゼ切断-刺激された相同組換えは、変更されるべきゲノム領域の近傍での適当なメガヌクレアーゼ認識部位の偶然の存在又は指定された挿入のいずれかに頼っている。メガヌクレアーゼ認識部位は、典型的哺乳類ゲノムにおいては稀(又は存在しない)であり、適当なメガヌクレアーゼ認識部位の挿入は、他のゲノム変更と同じくらい困難を伴い厄介であり、これらの方法は、広くは使用されていない。
従って、いずれかのゲノムにおける配列の標的化された変更のための組成物及び方法の必要性が存在し続ける。
【発明の概要】
【０００８】
概要
本発明の開示は、所定の領域における細胞クロマチンの標的化された切断及び／又は細胞内の予め決定された所定の領域での相同組換えのための組成物及び方法を提供する。細胞は、培養細胞、生物の細胞、並びに細胞及び／又はそれらの後代が処置後生物に戻されるような場合に処置のために生物から取出された細胞を含む。細胞クロマチンの所定の領域は、例えば、ゲノム配列又はそれらの一部であることができる。組成物は、操作されたジンクフィンガー結合ドメイン(例えば、新規特異性を有するジンクフィンガー結合ドメイン)及び切断ドメインを含む融合ポリペプチド、並びに操作されたジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む融合ポリペプチドを含む。切断ドメイン及び切断ハーフ-ドメインは、例えば様々な制限エンドヌクレアーゼ及び／又はホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。
【０００９】
細胞クロマチンは、原核細胞及び真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、霊長類細胞及びヒト細胞を含むが、これらに限定されるものではない、あらゆる種類の細胞中に存在することができる。
【００１０】
ひとつの局面において、所定の領域の細胞クロマチンの切断法(例えば、ゲノム配列の標的化された切断の方法)が提供され、この方法は：(a)所定の領域の第一の配列を選択する工程；(b)第一の配列に結合するように第一のジンクフィンガー結合ドメインを操作する工程；及び、(c)細胞中で第一の融合タンパク質を発現し、この第一の融合タンパク質は、操作されたジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ドメインを含み；ここで、第一の融合タンパク質は、第一の配列に結合し、及び細胞クロマチンは、所定の領域で切断される工程を含む。切断部位は、それに融合タンパク質が結合する配列と一致するか、又はこれは隣接することができる(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又はより多いヌクレオチドにより結合部位の近端から分離されている)。融合タンパク質は、例えば、この融合タンパク質を細胞へ送達することによるか、又はこの融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを細胞へ送達することにより、細胞において発現することができ、ここでこのポリヌクレオチドがDNAである場合はこれは転写され、並びに細胞に送達されたRNA分子又は細胞へ送達されたDNA分子の転写産物は翻訳され、この融合タンパク質を生成する。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの細胞への送達法は、本開示の別所に記載されている。
【００１１】
ある態様において、切断ドメインは、同じポリペプチドへ共有的に連結されたふたつの切断ハーフ-ドメインを含んでよい。ふたつの切断ハーフ-ドメインは、同じエンドヌクレアーゼ又は異なるエンドヌクレアーゼに由来することができる。
【００１２】
追加の態様において、所定の領域における細胞クロマチンの標的化された切断は、細胞におけるふたつの融合タンパク質の発現により実現され、各融合タンパク質は、ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む。融合タンパク質のジンクフィンガー結合ドメインの一方又は両方は、意図された切断部位の近傍において標的配列に結合するように操作することができる。融合タンパク質の発現がポリヌクレオチド送達による場合、ふたつの融合タンパク質の各々は、個別のポリヌクレオチドによりコードされるか、又は単独のポリヌクレオチドが両方の融合タンパク質をコードすることができる。
【００１３】
従って、所定の領域の細胞クロマチンの切断法は、(a)所定の領域の第一の配列を選択する工程；(b)第一のジンクフィンガー結合ドメインを、第一のヌクレオチド配列に結合するように操作する工程；(c)細胞において第一の融合タンパク質を発現し、この第一の融合タンパク質が、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含む工程；並びに、(d)細胞において第二の融合タンパク質を発現し、この第二の融合タンパク質が、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含む工程を含み、ここで第一の融合タンパク質は、第一の配列に結合し、及び第二の融合タンパク質は、第一の配列から2〜50ヌクレオチドに位置した第二のヌクレオチド配列に結合し、これにより、細胞クロマチンが所定の領域で切断されるように切断ハーフ-ドメインを位置決めする。
【００１４】
ある態様において、第一及び第二の融合タンパク質の結合は、機能的切断ドメインが再構成されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めする。
【００１５】
ある態様において、第二のジンクフィンガー結合ドメインが、第二の配列に結合するように操作される。更なる態様において、第一及び第二の切断ハーフ-ドメインは、同じエンドヌクレアーゼに由来し、これは例えば制限エンドヌクレアーゼ(例えば、FokIのようなIIS型制限エンドヌクレアーゼ)又はホーミングエンドヌクレアーゼであることができる。
【００１６】
別の態様において、本明細書に説明された方法は、(a)所定の領域の第一及び第二の配列を選択し、ここで第一及び第二の配列は2〜50ヌクレオチド離れている工程；(b)第一のジンクフィンガー結合ドメインが、第一の配列に結合するように操作する工程；(c)第二のジンクフィンガー結合ドメインが、第二の配列に結合するように操作する工程；(d)細胞において第一の融合タンパク質を発現し、第一の融合タンパク質が、第一の操作されたジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含む工程；(e)細胞において第二の融合タンパク質を発現し、第二の融合タンパク質が、第二の操作されたジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含む工程を含み；ここで第一の融合タンパク質は、第一の配列に結合し、及び第二の融合タンパク質は、第二の配列に結合し、これにより細胞クロマチンが所定の領域で切断されるように、第一及び第二の切断ハーフ-ドメインが位置決めされる。
【００１７】
ある態様において、第一及び第二の切断ハーフ-ドメインは、同じエンドヌクレアーゼ、例えばIIS型制限エンドヌクレアーゼで、例としてFokIに由来する。追加の態様において、細胞クロマチンは、それに融合タンパク質が結合する第一及び第二の配列の間の1個又は複数の部位で切断される。
【００１８】
更なる態様において、所定の領域での細胞クロマチンの切断法は、(a)所定の領域を選択する工程；(b)第一のジンクフィンガー結合ドメインが、所定の領域の第一の配列に結合するように操作する工程；(c)所定の領域の第二の配列に結合する第二のジンクフィンガー結合ドメインを提供する工程であり、ここで第二の配列は、第一の配列から2〜50ヌクレオチドの位置にある工程；(d)細胞において第一の融合タンパク質を発現し、第一の融合タンパク質が、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含む工程；並びに、(e)細胞において第二の融合タンパク質を発現し、第二の融合タンパク質が、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含む工程を含み；ここで第一の融合タンパク質は、第一の配列に結合し、及び第二の融合タンパク質は、第二の配列に結合し、これにより細胞クロマチンが所定の領域で切断されるように、切断ハーフ-ドメインが位置決めされる。
【００１９】
本明細書に説明されたあらゆる方法において、第一及び第二の切断ハーフ-ドメインは、同じエンドヌクレアーゼ又は異なるエンドヌクレアーゼに由来することができる。追加の態様において、第二のジンクフィンガー結合ドメインは、第二の配列に結合するように操作される。
【００２０】
融合タンパク質をコードしている1種又は複数のポリヌクレオチドが細胞へ導入される場合、所定の領域の細胞クロマチンの標的化された切断のための例証的方法は：(a)所定の領域を選択する工程；(b)第一のジンクフィンガー結合ドメインを、所定の領域の第一の配列に結合するように操作する工程；(c)所定の領域の第二の配列に結合する第二のジンクフィンガー結合ドメインを提供する工程であり、ここで第二の配列は、第一の配列から2〜50ヌクレオチドの位置にある工程；並びに、(d)細胞を、(i)第一の融合タンパク質をコードしている第一のポリヌクレオチドであり、融合タンパク質が第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含むもの、並びに(ii)第二の融合タンパク質をコードしている第二のポリヌクレオチドであり、融合タンパク質が第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含むものと、接触する工程を含み；ここで、第一及び第二の融合タンパク質が発現され、第一の融合タンパク質は、第一の配列に結合し、及び第二の融合タンパク質は、第二の配列に結合し、これにより細胞クロマチンが所定の領域で切断されるように、第一及び第二の切断ハーフ-ドメインが位置決めされる。この方法の変法において、細胞は両方の融合タンパク質をコードしている単独のポリヌクレオチドと接触される。
【００２１】
前述のあらゆる方法について、細胞クロマチンは、染色体、エピソーム又はオルガネラゲノム内に存在することができる。加えて本明細書に説明されたあらゆる方法のいずれかにおいて、少なくとも1種のジンクフィンガー結合ドメインは、例えばデザイン又は選択の方法により、操作される。
【００２２】
同様に、前述のあらゆる方法について、切断ハーフ-ドメインは、例えばホーミングエンドヌクレアーゼ、又は制限エンドヌクレアーゼ、例えばIIS型制限エンドヌクレアーゼに由来することができる。IIS型制限エンドヌクレアーゼの例は、FokIである。
【００２３】
本明細書に開示された標的化された切断、標的化された変異誘発及び／又は標的化された組換えの切断ハーフ-ドメインを含む融合タンパク質を利用するあらゆる方法について、融合タンパク質の結合部位の近端は、5又は6個の塩基対により隔てられている。これらの態様において、融合タンパク質の結合ドメイン及び切断ドメインは、4個のアミノ酸残基のリンカーにより隔てられている。
【００２４】
ある態様において、一方又は両方の切断ハーフ-ドメインが、二量体化界面のアミノ酸配列の変更を含むような融合タンパク質を利用することにより、増大した切断特異性を得ることが可能である。
【００２５】
細胞クロマチンの所定の領域の標的化された変異誘発は、先に説明されたように標的化された切断事象に、非-相同末端連結(NHEJ)が続く場合に、生じる。従って細胞クロマチンの所定の領域の第一のヌクレオチド配列を変更する方法が提供され、この方法は：(a)第一のジンクフィンガー結合ドメインを、所定の領域の第二のヌクレオチド配列に結合するように操作し、ここで第二の配列が、少なくとも9ヌクレオチドを含む工程；(b)第三のヌクレオチド配列に結合する第二のジンクフィンガー結合ドメインを提供し、ここで第三の配列が、少なくとも9ヌクレオチドを含み、及び第二の配列から2〜50ヌクレオチドに位置する工程；(c)細胞において第一の融合タンパク質を発現し、第一の融合タンパク質は、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含む工程；並びに、(d)細胞において第二の融合タンパク質を発現し、第二の融合タンパク質は、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフドメインを含む工程を含み、ここで第一の融合タンパク質は第二の配列へ結合し、及び第二の融合タンパク質は第三の配列へ結合し、これにより、細胞クロマチンが所定の領域で切断され、かつ切断部位が非-相同末端連結を受けるように切断ハーフ-ドメインが位置決めされる。
【００２６】
前述の方法から生じる標的化された変異は、点変異(すなわち、単独の塩基対の異なる塩基対への転換)、置換(すなわち、複数の塩基対の同じ長さの異なる配列への転換)、1個又は複数の塩基対の挿入、1個又は複数の塩基対の欠失及び前述の配列変更の組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
標的化された組換えの方法(例えば染色体又は細胞クロマチンの所定の領域中の配列の変更又は置換について)も提供される。例えば、変異体ゲノム配列は、例えば遺伝子疾患又は遺伝性障害の治療のために、野生型配列により置換することができる。加えて野生型ゲノム配列は、例えば癌遺伝子産物又は不適切な炎症反応に関連した遺伝子産物の機能を防止するために、変異体配列により置換することができる。更に遺伝子の1個のアレルを、異なるアレルにより置換することができる。
【００２８】
このような方法において、1種又は複数の標的化されたヌクレアーゼは、予め決定された部位での細胞クロマチンの2本鎖切断を生じ、及びこの切断領域の細胞クロマチンのヌクレオチド配列と相同性を有するドナーポリヌクレオチドが、この細胞へ導入される。細胞DNA修復プロセスは、2本鎖切断の存在により活性化され、並びにドナーポリヌクレオチドが、この切断の修復のための鋳型として使用され、ドナーのヌクレオチド配列の全て又は一部が細胞クロマチンへ導入される。従って細胞クロマチン中の第一の配列は変更され、ある態様においては、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列へ変換することができる。
【００２９】
この文脈において、用語「置換する」又は「置換」の使用は、ひとつのヌクレオチド配列の別のものによる置換(すなわち、情報を持つセンスでの配列の置換)を表すと理解され、ひとつのポリヌクレオチドの別のものによる物理的又は化学的置換は必ずしも必要としない。
【００３０】
従ってひとつの局面において、第一のヌクレオチド配列による細胞クロマチン内の所定の領域(例えばゲノム配列)の置換法が提供され、この方法は：(a)所定の領域の第二の配列に結合するようにジンクフィンガー結合ドメインを操作する工程；(b)細胞において融合タンパク質を発現する工程であり、融合タンパク質が、ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ドメインを含む工程；並びに、(c)細胞を、第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触する工程を含み；ここで、この融合タンパク質は、第二の配列と結合し、その結果細胞クロマチンが所定の領域で切断され、及び所定の領域のヌクレオチド配列が、第一のヌクレオチド配列と置換される。一般に細胞クロマチンは、第二の配列で又はこれに隣接して、所定の領域で切断される。更なる態様において、切断ドメインは、ふたつの切断ハーフ-ドメインを含み、これらは同じ又は異なるヌクレアーゼに由来することができる。
【００３１】
加えて、細胞クロマチンの所定の領域(例えばゲノム配列)を第一のヌクレオチド配列と置換する方法が提供され、この方法は：(a)第一のジンクフィンガー結合ドメインを、所定の領域の第二の配列に結合するように操作する工程；(b)所定の領域の第三の配列に結合するために第二のジンクフィンガー結合ドメインを提供する工程；(c)細胞において第一の融合タンパク質を発現する工程であり、第一の融合タンパク質が、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含む工程；(d)細胞において第二の融合タンパク質を発現する工程であり、第二の融合タンパク質が第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含む工程；並びに、(e)細胞を、第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触する工程を含み；ここで第一の融合タンパク質は第二の配列に結合し、及び第二の融合タンパク質は第三の配列に結合し、これにより、細胞クロマチンが所定の領域で切断され及び所定の領域のヌクレオチド配列が第一のヌクレオチド配列と置換されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めする。一般に、細胞クロマチンは、第二及び第三の配列の間の部位の所定の領域において切断される。
【００３２】
追加の細胞クロマチンの所定の領域(例えばゲノム配列)の第一のヌクレオチド配列との置換の方法は：(a)第二の配列を選択する工程であり、ここで第二の配列は、所定の領域にあり、及び長さが少なくとも9ヌクレオチドである工程；(b)第一のジンクフィンガー結合ドメインを、第二の配列に結合するように操作する工程；(c)第三の配列を選択する工程であり、ここで第三の配列は、長さが少なくとも9ヌクレオチドであり、及び第二の配列から2〜50ヌクレオチドに位置する工程；(d)第三の配列と結合するように、第二のジンクフィンガー結合ドメインを提供する工程；(e)細胞において第一の融合タンパク質を発現する工程であり、第一の融合タンパク質は、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含む工程；(f)細胞において第二の融合タンパク質を発現する工程であり、第二の融合タンパク質は、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含む工程；並びに、(g)細胞を、第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触させる工程を含み；ここで、第一の融合タンパク質は第二の配列に結合し、及び第二の融合タンパク質は第三の配列に結合し、これにより細胞クロマチンが所定の領域において切断され、及び所定の領域のヌクレオチド配列が第一のヌクレオチド配列と置換されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めする。一般に細胞クロマチンは、第二及び第三の配列の間の部位の所定の領域において切断される。
【００３３】
別の局面において、標的化された組換えのための方法が提供され、ここで細胞クロマチンの所定の領域に位置した第一のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列と置換される。この方法は、(a)第一のジンクフィンガー結合ドメインを、所定の領域の第三の配列に結合するように操作する工程；(b)第四の配列に結合する第二のジンクフィンガー結合ドメインを提供する工程；(c)細胞において第一の融合タンパク質を発現する工程であり、この融合タンパク質は、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含む工程；(d)細胞において第二の融合タンパク質を発現する工程であり、第二の融合タンパク質は、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含む工程；並びに、(e)細胞を、第二のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触させる工程を含み；ここで、第一の融合タンパク質は第三の配列に結合し、及び第二の融合タンパク質は第四の配列に結合し、これにより細胞クロマチンが所定の領域で切断され、及び第一のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列で置換されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めする。
【００３４】
追加の態様において、細胞クロマチンの所定の領域において第一のヌクレオチド配列を変更する方法が提供され、この方法は、(a)第一のジンクフィンガー結合ドメインを、所定の領域の第二のヌクレオチド配列に結合するように操作し、ここで第二の配列が、少なくとも9ヌクレオチドを含む工程；(b)第三のヌクレオチド配列に結合する第二のジンクフィンガー結合ドメインを提供し、ここで第三の配列が、少なくとも9ヌクレオチドを含み、及び第二の配列から2〜50ヌクレオチドに位置する工程；(c)細胞において第一の融合タンパク質を発現し、第一の融合タンパク質は、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含む工程；(d)細胞において第二の融合タンパク質を発現し、第二の融合タンパク質は、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフドメインを含む工程；並びに、(e)細胞を、第四のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触させる工程であり、ここで第四のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列と相同であるが、同一ではない工程を含み；ここで、第一の融合タンパク質は第二の配列へ結合し、及び第二の融合タンパク質は第三の配列へ結合し、これにより、細胞クロマチンが所定の領域で切断され及び第一のヌクレオチド配列が変更されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めする。ある態様において、第一のヌクレオチド配列は、第四のヌクレオチド配列へ変換される。追加の態様において、第二及び第三のヌクレオチド配列(すなわち、融合タンパク質の結合部位)は、第四のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド(すなわちドナーポリヌクレオチド)に存在し、及び第四のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが切断される。
【００３５】
前述の標的化された組換え法において、融合タンパク質の結合部位(すなわち、第三及び第四の配列)は、いくつかのヌクレオチドを含むことができる。好ましくはこれらの長さは、少なくとも9個のヌクレオチドであるが、より長い(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18及び最大100個のヌクレオチドであり、9〜100個の間のあらゆる整数を含むヌクレオチドである)こともでき；更に第三及び第四の配列は、同じ長さである必要ない。結合部位の間の距離(すなわち、第三及び第四の配列の間のヌクレオチド配列の長さ)は、ひとつの結合部位の近端から他の結合部位の近端まで測定されたとして、2〜50の整数のヌクレオチド対(例えば5又は6塩基対)であることができる。
【００３６】
前述の標的化された組換え法において、細胞クロマチンは、ふたつの融合タンパク質の結合部位の間に位置した部位で切断することができる。ある態様において、結合部位は、反対DNA鎖上に存在する。更に細胞における融合タンパク質の発現は、タンパク質の細胞への導入によるか、又は1種もしくは複数のポリヌクレオチドの細胞への導入のいずれかにより実現され得、これは任意に転写され(ポリヌクレオチドがDNAである場合)、この転写物(複数)は翻訳され、融合タンパク質を作製する。例えば各々ふたつの融合タンパク質のひとつをコードしている配列を含むふたつのポリヌクレオチドを、細胞へ導入することができる。あるいは、両方の融合タンパク質をコードしている配列を含む単独のポリヌクレオチドを、細胞へ導入することができる。
【００３７】
従ってひとつの態様において、細胞クロマチンの所定の領域(例えばゲノム配列)の第一のヌクレオチド配列による置換の方法は：(a)第一のジンクフィンガー結合ドメインを、所定の領域の第二の配列に結合するように操作する工程；(b)第三の配列に結合する第二のジンクフィンガー結合ドメインを提供する工程；並びに、(c)細胞を：
(i)第一のヌクレオチド配列を含む第一のポリヌクレオチド；
(ii)第一の融合タンパク質をコードしている第二のポリヌクレオチドであり、第一の融合タンパク質は第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含むもの；及び、
(iii)第二の融合タンパク質をコードしている第三のポリヌクレオチドであり、第二の融合タンパク質は第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含むもの；と接触させる工程を含み、
ここで第一及び第二の融合タンパク質が発現され、第一の融合タンパク質は第二の配列に結合し、及び第二の融合タンパク質は第三の配列に結合し、これにより細胞クロマチンが所定の領域で切断され；並びに、所定の領域が、第一のヌクレオチド配列で置換されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めする。
【００３８】
細胞クロマチンにおける所定の領域の配列の標的化された組換え及び／又は交換及び／又は変更の方法の好ましい態様において、染色体の配列は、外来性「ドナー」ヌクレオチド配列による相同組換えにより変更される。このような相同組換えは、2本鎖切断の領域に相同な配列が存在する場合は、細胞クロマチン内の2本鎖切断の存在により刺激される。細胞クロマチンの2本鎖切断は、非-相同末端連結の細胞機構も刺激する。
【００３９】
本明細書に説明したいずれかの方法において、第一のヌクレオチド配列(「ドナー配列」)は、所定の領域のゲノム配列と相同であるが同一でない配列を含み、これにより所定の領域の非-同一配列を挿入するための相同組換えを刺激する。従ってある態様において、所定の領域の配列に相同であるドナー配列の部分は、交換されるゲノム配列と、約80〜99％(又はその間のいずれかの整数)の配列同一性を示す。別の態様において、例えば100個の近接塩基対にわたり、ドナーとゲノム配列の間でただ1個のヌクレオチドが異なる場合、ドナー及びゲノム配列の間の相同性は、99％よりも高い。場合によっては、ドナー配列の非-相同部分は、所定の領域には存在しない配列を含むことができ、その結果新規配列が所定の領域へ導入される。これらの場合において、非-相同配列は一般に、所定の領域の配列と相同であるか又は同一である50〜1,000個(又はその間のいずれかの整数値)の塩基対配列又は1,000よりも大きいいくつかの塩基対配列が側方に位置している。別の態様において、ドナー配列は、第一の配列と非-相同であり、かつ非-相同組換え機構によりゲノムに挿入される。
【００４０】
細胞クロマチンの所定の配列の標的化された組換え及び／又は置換及び／又は変更の方法において、第一及び第二の切断ハーフ-ドメインは、同じエンドヌクレアーゼ又は異なるエンドヌクレアーゼに由来することができる。エンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ及び制限エンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されるものではない。制限エンドヌクレアーゼの例は、IIS型制限エンドヌクレアーゼであり；IIS型制限エンドヌクレアーゼの例はFokIである。
【００４１】
所定の領域は、染色体、エピソーム又はオルガネラゲノムであることができる。所定の領域は、変異を含み、これは野生型配列(又は異なる変異体配列)により置換することができるか、又は所定の領域は、変異体配列もしくは異なるアレルにより置換される野生型配列を含むことができる。変異は、点変異(転位、転換)、1個又は複数のヌクレオチド対の挿入、1個又は複数のヌクレオチド対の欠失、再配列逆位及び転座を含むが、これらに限定されるものではない。変異は、コード配列を変更し、未熟な終止コドン(複数)を導入し及び／又は遺伝子内の反復配列モチーフ(例えばトリヌクレオチドリピート)の頻度を修飾する。標的化された組換えが変異体配列の交換に使用されるような適用に関して、細胞クロマチンは一般に、その変異のいずれかの側の100ヌクレオチド以内に位置した部位において切断されるが、変異部位から最大6-10kbに位置した切断部位も使用される。
【００４２】
本明細書において説明されたいずれかの方法において、第二のジンクフィンガー結合ドメインは、例えばデザイン及び／又は選択されるように操作され得る。
【００４３】
更にドナーポリヌクレオチドは、DNA又はRNAであることができ、線状又は環状であることができ、並びに1本鎖又は2本鎖であることができる。これは、ネイキッド核酸として、1種もしくは複数の送達物質(例えばリポソーム、ポロキサマー)との複合体として、又は例えばアデノウイルスもしくはアデノ-随伴ウイルス(AAV)などのウイルス送達ビヒクル中に含まれて、細胞へ送達することができる。ドナー配列は、長さ10〜1,000ヌクレオチド(又はその間のいずれかの整数値のヌクレオチド)の範囲であるか又はそれよりも長いことができる。
【００４４】
同様にジンクフィンガー結合ドメインと切断ドメイン又はハーフ-ドメインの間の融合をコードしているポリヌクレオチドは、DNA又はRNAであることができ、線状又は環状であることができ、並びに1本鎖又は2本鎖であることができる。これらは、ネイキッド核酸として、1種又は複数の送達物質(例えばリポソーム、ポロキサマー)との複合体として、又は例えばアデノウイルス又はアデノ-随伴ウイルス(AAV)などのウイルス送達ビヒクル中に含まれて、細胞へ送達することができる。ポリヌクレオチドは、1種又は複数の融合タンパク質をコードすることができる。
【００４５】
標的化された組換え法においては、標的化された切断法と同様に、切断ドメイン又はハーフ-ドメインは、いずれかのヌクレアーゼ、例えばホーミングエンドヌクレアーゼ又は制限エンドヌクレアーゼ、特にIIS型制限エンドヌクレアーゼに由来することができる。切断ハーフ-ドメインは、同じ又は異なるエンドヌクレアーゼに由来することができる。それから切断ハーフ-ドメインが由来する給源の例は、IIS型制限エンドヌクレアーゼFokIである。
【００４６】
ある態様において、相同組換え頻度は、細胞周期のG2相において細胞を停止することにより、及び／又は相同組換えに関連した1種もしくは複数の分子(タンパク質、RNA)の発現を活性化することにより、及び／又は非-相同末端-連結に関連したタンパク質の発現もしくは活性を阻害することにより、増大され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図1は、タンパク質のアミノ-末端部分をコードしているヒトhSMC1L1遺伝子の部分の2本鎖型のヌクレオチド配列(配列番号:1)、及びコードされたアミノ酸配列(配列番号:2)を示す。hSMC1-特異的ZFPの標的配列には、下線を付けている(各DNA鎖上に1個)。
【図２】図2は、hSMC1遺伝子の標的化された切断のためのZFP-FokI融合をコードしているプラスミドの概略図を示している。
【図３】図3A〜Dは、hSMC1遺伝子の概略図を示す。図3Aは、hSMC1遺伝子を含むヒトX染色体の部分の概略を示す。図3Bは、上流領域(+1の左側)、第一のエキソン(+1と"SMC1コード配列"と表記した矢印の右側末端の間)及び第一のイントロンの一部を含む、hSMC1遺伝子の一部の概略を示している。最初の増幅プライマー及び染色体-特異的プライマー(表3参照)に相同な配列の位置も提供されている。図3Cは、SMC1開始コドン領域のヒトX染色体のヌクレオチド配列(配列番号:3)、及びコードされたアミノ酸配列(配列番号:4)、並びにSMC1-特異的ジンクフィンガータンパク質の標的部位を示している。図3Dは、ドナー分子の対応する領域の配列(配列番号:5)を示し、ドナー配列と染色体配列の間の差異には下線をつけている。ドナー-特異的増幅プライマー(表3)中に含まれた配列は、二重下線で示している。
【図４】図4は、hSMC1ドナー構築体の概略図を示している。
【図５】図5は、トランスフェクションされたHEK293細胞由来のDNAのPCR分析を示している。レーンは、左側から、GFPをコードしているプラスミド(対照プラスミド)でトランスフェクションされた細胞、各々2種のhSMC1-特異的ZFP-FokI融合タンパク質(ZFPのみ)の一方をコードしている、2種のプラスミドでトランスフェクションされた細胞、ふたつの濃度のhSMC1ドナープラスミド(ドナーのみ)でトランスフェクションされた細胞、並びに2種のZFP-コードしているプラスミド及びドナープラスミド(ZFPs+ドナー)でトランスフェクションされた細胞の結果を示している。詳細については実施例1を参照のこと。
【図６】図6は、標的化された相同組換えにより作製された、変異されたhSMC1遺伝子由来の増幅産物のヌクレオチド配列(配列番号:6)を示している。増幅産物がクローニングされたベクター由来の配列には、1本線をつけ、ドナー分子に存在しない染色体配列は、点下線で示し(ヌクレオチド32-97)、ドナー及び染色体に共通の配列は、下線をつけず(ヌクレオチド98-394及び402-417)、並びにドナーに特有の配列は、二重下線をつけた(ヌクレオチド395-401)。小文字は、染色体とドナーの間で異なる配列を表している。
【図７】図7は、第二のイントロンの3'末端及び第三のエキソンの5'末端を含むヒトIL2Rγ遺伝子の一部のヌクレオチド配列(配列番号:7)、並びに第三のエキソンの示された部分によりコードされたアミノ酸配列(配列番号:8)を示す。IL2Rγ-特異的ZFPの第二の対の標的配列には、下線をつけた。詳細は実施例2を参照のこと。
【図８】図8は、IL2Rγ遺伝子の標的化された切断のためのZFP-FokI融合体をコードしているプラスミドの概略図を示す。
【図９】図9A〜Dは、IL2Rγ遺伝子の概略図を示す。図9Aは、IL2Rγ遺伝子を含むヒトX染色体の一部の概略を示す。図9Bは、第二のイントロンの一部、第三のエキソン及び第三のイントロンの一部を含む、IL2Rγ遺伝子の一部の概略を示している。最初の増幅プライマー及び染色体-特異的プライマー(表5参照)に相同な配列の位置も提供されている。図9Cは、IL2Rγ遺伝子の第三のエキソンの領域中のヒトX染色体のヌクレオチド配列(配列番号:9)、コードされたアミノ酸配列(配列番号:10)、及びIL2Rγ-特異的ジンクフィンガータンパク質の第一の対の標的部位を示している。図9Dは、ドナー分子の対応する領域の配列(配列番号:11)を示し、ドナー配列と染色体配列の間の差異は下線をつけている。ドナー-特異的増幅プライマー(表5)中に含まれた配列は、二重下線で示している。
【図１０】図10は、IL2Rγドナー構築体の概略図を示す。
【図１１】図11は、トランスフェクションされたK652細胞由来のDNAのPCR分析を示している。レーンは、左側から、各々IL2Rγ-特異的 ZFP-FokI融合タンパク質の対の一方をコードしている2種のプラスミドでトランスフェクションされた細胞(ZFPのみ、レーン1)、ふたつの濃度のIL2Rγドナープラスミドでトランスフェクションされた細胞(ドナーのみ、レーン2及び3)、並びに2種のZFP-コードしているプラスミド及びドナープラスミドでトランスフェクションされた細胞(ZFPs+ドナー、レーン4-7)の結果を示している。IL2Rγ-特異的ZFP-FokI融合体のふたつの対の各々を使用し("対1"及び"対2"として同定)、及び両方の対の使用は、診断用増幅産物の産生を生じた(図において"予想されるキメラ産物"と印した)。詳細については実施例2を参照のこと。
【図１２】図12は、標的化された相同組換えにより作製された、変異されたIL2Rγ遺伝子由来の増幅産物のヌクレオチド配列(配列番号:12)を示している。増幅産物がクローニングされたベクター由来の配列には、1本線をつけ、ドナー分子に存在しない染色体配列は、点下線で示し(ヌクレオチド460-552)、ドナー及び染色体に共通の配列は、下線をつけず(ヌクレオチド32-42及び59-459)、並びに染色体配列からドナー配列を識別するヌクレオチドを含む配列のひと配列は、二重下線をつけた(ヌクレオチド44-58)。小文字は、染色体とドナーの間で異なる配列を持つヌクレオチドを表している。
【図１３】図13は、コアプロモーター、最初の2個のエキソン及び第一のイントロンのセグメントをコードしているヒトβ-グロビン遺伝子の一部のヌクレオチド配列(配列番号:13)を示している。染色体11番(BLAT, UCSC Genome Bioinformatics site)上の5212541位でA(太字及び下線)をTに変更するミスセンス変異は、鎌状細胞貧血を生じる。第一のジンクフィンガー/FokI融合タンパク質を、一次接触が、下線をつけた12-ヌクレオチド配列AAGGTGAACGTG(配列番号:13のヌクレオチド305-316)によるようにデザインし、並びに第二のジンクフィンガー/FokI融合タンパク質は、一次接触が、下線をつけた12-ヌクレオチド配列CCGTTACTGCCC (配列番号:13のヌクレオチド325-336)の相補鎖によるようにデザインした。
【図１４】図14は、ヒトβグロビン遺伝子の標的化された切断のためのZFP-FokI融合体をコードしているプラスミドの概略図である。
【図１５】図15は、上流領域、第一及び第二のエキソン、第一のイントロン及びプライマー結合部位を示している、クローニングされたヒトβグロビン遺伝子の概略図である。
【図１６】図16は、βグロビンドナー構築体、pCR4-TOPO-HBBdonorの概略図である。
【図１７】図17は、β-グロビン-特異的ZFPヌクレアーゼ及びβグロビンドナープラスミドの2個の対でトランスフェクションされた細胞由来のDNAのPCR分析を示す。左側パネルは、最初のamp1及び最初のamp2プライマー(表7)が増幅に使用された負荷対照である。右側パネルに示した実験においては、「染色体-特異的」及び「ドナー-特異的」プライマー(表7)が増幅に使用された。各パネルの最左レーンは分子量マーカーを示し、次のレーンは偽-トランスフェクションされた細胞から得られた増幅産物を示す。残りのレーンは、左から右へ、以下でトランスフェクションされた細胞由来の増幅産物を示す：GFP-コードしているプラスミド、各ZFP/FokI-コードしているプラスミド100ng、各ZFP/FokI-コードしているプラスミド200ng、ドナープラスミド200ng、ドナープラスミド600ng、ドナープラスミド200ng＋各ZFP/FokI-コードしているプラスミド100ng、並びにドナープラスミド600ng＋各ZFP/FokI-コードしているプラスミド200ng。
【図１８】図18は、標的化された相同組換えにより作製された、変異されたβ-グロビン遺伝子由来の増幅産物のヌクレオチド配列(配列番号:14)を示す。ドナー分子内に存在しない染色体配列は、点下線で示し(ヌクレオチド1-72)、ドナーと染色体に共通の配列は下線をつけず(ヌクレオチド73-376)、及び染色体配列からドナー配列を識別するヌクレオチドを含む配列のひと配列には二重下線をつけた(ヌクレオチド377-408)。小文字は、配列が染色体とドナーの間で異なるヌクレオチドを示している。
【図１９】図19は、インターロイキン-2受容体γ鎖(IL-2Rγ)遺伝子の5番目のエキソン部分のヌクレオチド配列(配列番号:15)を示す。5-8及び5-10 ZFP/FokI融合タンパク質の標的配列も示した(下線付き)。詳細については実施例5を参照のこと。
【図２０】図20は、ヒトIL-2Rγ遺伝子のエキソン5が標的化された5-8 ZFP/FokI融合体のアミノ酸配列(配列番号:16)を示す。アミノ酸残基1-17は、核局在化配列(NLS、下線付き)を含み；残基18-130は、ZFP部分を含み、成分ジンクフィンガーの認識領域は太字で示しており；ZFP-FokIリンカー(ZCリンカー、下線付き)は、残基131から140へ伸び、及びFokI切断ハーフ-ドメインは、残基141から始まり、残基336のタンパク質末端まで伸びている。Q486E変異を作出するように変更された残基には、下線をつけ太字で記している。
【図２１】図21は、ヒトIL-2Rγ遺伝子のエキソン5が標的化された5-10 ZFP/FokI融合体のアミノ酸配列(配列番号:17)を示す。アミノ酸残基1-17は、核局在化配列(NLS、下線付き)を含み；残基18-133は、ZFP部分を含み、成分ジンクフィンガーの認識領域は太字で記し；ZFP-FokIリンカー(ZCリンカー、下線付き)は、残基134から143に伸長し、FokI切断ハーフ-ドメインは残基144で始まり、残基339のタンパク質末端まで伸びる。E490K変異を作出するように変更された残基には、下線を付け、太字で記している。
【図２２】図22は、Aequorea victoria GFP遺伝子に由来した増強グリーン蛍光タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号:18)を示している(Tsien (1998) Ann. Rev. Biochem. 67:509-544)。ATG開始コドンに加え、変異誘発された領域には下線をつけた。
【図２３】図23は、変異体欠損eGFP遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号:19)を示している。ZFP-ヌクレアーゼの結合部位には、下線を付け、結合部位の間の領域は、修飾された領域に対応している。
【図２４】図24は、eGFP遺伝子に標的化されたジンクフィンガーヌクレアーゼをコードしているプラスミドの構造を示している。
【図２５】図25は、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼによる、変異体eGFP遺伝子の標的化されたDNA切断の分析に使用した10％アクリルアミドゲルのオートラジオグラムを示している。詳細については実施例8を参照のこと。
【図２６】図26は、プラスミドpcDNA4/TO/GFPmutの構造を示している(実施例9参照)。
【図２７】図27は、ヒトHEK293細胞のトランスフェクションから得られた様々な細胞株における、GAPDH mRNAに対し基準化した、eGFPmut mRNAのレベルを示している。明色バーは、未処理細胞のレベルを示し；暗色バーは、2ng/mlドキシサイクリンで処理した細胞中のレベルを示す。詳細については実施例9参照のこと。
【図２８】図28は、プラスミドpCR (R)4-TOPO-GFPdonor5の構造を示す。詳細については実施例10を参照のこと。
【図２９】図29は、pCR(R)4-TOPO-GFPdonor5に挿入されたeGFPのヌクレオチド配列(配列番号:20)を示す。この挿入断片は、開始コドンを欠いている、非-修飾型増強グリーン蛍光タンパク質の一部をコードしている配列を含む。詳細については実施例10を参照のこと。
【図３０】図30は、ノコダゾール100ng/mlによる48時間のトランスフェクション後24時間で、細胞周期のG2相で停止された、2種のZFPヌクレアーゼをコードしているプラスミド及びドナー配列をコードしているプラスミドによりトランスフェクションされたT18細胞のFACSトレースを示す。培地は交換し、細胞は、更に48時間かけて回収し、遺伝子相関はFACS分析により測定した。詳細については実施例11を参照のこと。
【図３１】図31は、0.2uMビンブラスチンによる48時間のトランスフェクション後24時間で、細胞周期のG2相で停止された、2種のZFPヌクレアーゼをコードしているプラスミド及びドナー配列をコードしているプラスミドでトランスフェクションされたT18細胞のFACSトレースを示している。培地は交換し、細胞は、更に48時間かけて回収し、遺伝子相関はFACS分析により測定した。詳細については実施例11を参照のこと。
【図３２】図32は、pCR(R)4-TOPO中の1,527ヌクレオチドeGFP挿入断片のヌクレオチド配列(配列番号:21)を示している。配列は、開始コドンを欠いている、非-修飾型増強グリーン蛍光タンパク質をコードしている。詳細については実施例13を参照のこと。
【図３３】図33は、内在性ヒトIL-2Rγ遺伝子の校正頻度を測定するために使用したアッセイの概略図である。詳細については実施例14を参照のこと。
【図３４】図34は、標的化された切断及び相同組換えによる、内在性細胞遺伝子の校正頻度を測定するアッセイにおいて使用したアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを示す。"GFP"と記したレーンは、細胞がeGFP-コードしているベクターによりトランスフェクションされた対照のアッセイ結果を示し；"ZFPs only"と記されたレーンは、2種のZFP/ヌクレアーゼ-コードしているプラスミド(各50ng)でトランスフェクションされたがドナー配列ではトランスフェクションされない、別の対照実験の結果を示す。"doner only"と記されたレーンは、1ugのドナープラスミドでトランスフェクションされたが、ZFP/ヌクレアーゼ-コードしているプラスミドではトランスフェクションされない対照実験の結果を示す。実験レーンにおいて、50Zは、50ngの各ZFP/ヌクレアーゼ発現プラスミドでトランスフェクションされた細胞を意味し、100Zは、100ngの各ZFP/ヌクレアーゼ発現プラスミドでトランスフェクションされた細胞を意味し、0.5Dは、0.5μgのドナープラスミドでトランスフェクションされた細胞を意味し、並びに1Dは、1.0μgのドナープラスミドでトランスフェクションされた細胞を意味する。"+"は、0.2μMビンブラスチンに曝露された細胞を意味し；"-"は、ビンブラスチンに曝露されなかった細胞を意味する。"wt"は、野生型染色体IL-2Rγ遺伝子を含む染色体から得られた増幅産物のBsrBI消化後に得られた断片を意味し；"rflp"は、相同組換えにより組込まれたドナープラスミド由来の配列を含む染色体から得られた増幅産物のBsrBI消化後に得られた2種の断片(ほぼ等しい分子量)を意味する。
【図３５】図35は、K562細胞のヒトIL-2Rγ遺伝子座で標的化された組換えを測定するアッセイにおいて使用されたゲルの4時間曝露のオートラジオグラフィー画像を示す。"wt"は、未変性のK562 IL-2Rγ配列を含む染色体DNAを診断するバンドを同定し；"rflp"は、ドナーDNA分子中に存在する変更されたIL-2Rγ配列を含む染色体DNAの二重診断を同定する。レーン上の印"+"は、細胞が0.2uMビンブラスチンで処理されたことを示し；印"-"は、細胞がビンブラスチンで処理されなかったことを示す。"ZFP+donor"レーンの数値は、ドナーDNA分子中に当初存在する配列を含む染色体DNAの合計の割合を示し、これは製造業者のマニュアルの第8章(Molecular Dynamics ImageQuant User's Guide；part 218-415)に記載された、Molecular Dynamics' ImageQuant v.5.1ソフトウェアの「peak finder, automatic baseline」関数を用い、算出される。"Untr"は、トランスフェクションされない細胞を示す。更なる詳細については実施例15を参照のこと。
【図３６】図36は、K562細胞のヒトIL-2Rγ遺伝子座で標的化された組換えを測定するアッセイにおいて使用されたゲルの4時間曝露のオートラジオグラフィー画像を示す。"wt"は、未変性のK562 IL-2Rγ配列を含む染色体DNAを診断するバンドを同定し；"rflp"は、ドナーDNA分子中に存在する変更されたIL-2Rγ配列を含む染色体DNAを診断するバンドを同定する。レーン上の印"+"は、細胞が0.2uMビンブラスチンで処理されたことを示し；印"-"は、細胞がビンブラスチンで処理されなかったことを示す。"ZFP+donor"レーンの下側の数値は、ドナーDNA分子中に当初存在する配列を含む染色体DNAの合計の割合を示し、これは実施例35において説明されたように算出される。更なる詳細については実施例15を参照のこと。
【図３７】図37は、ヒトIL-2Rγ遺伝子に特異的な断片でプロービングされたDNAブロットの4時間曝露のオートラジオグラムを示す。画像の右側の矢印は、その配列が相同組換えにより変更されたゲノムDNAに対応するバンドの位置を示す。レーンの上の印"+"は、細胞が0.2uMビンブラスチンで処理されたことを示し；印"-"は、細胞がビンブラスチンで処理されなかったことを示す。"ZFP+donor"レーンの下側の数値は、ドナーDNA分子中に当初存在する配列を含む染色体DNAの合計の割合を示し、これは実施例35において説明されたように算出される。更なる詳細については実施例15を参照のこと。
【図３８】図38は、CD34+ヒト骨髄細胞のヒトIL-2Rγ遺伝子座での標的化された組換えを測定するためのアッセイにおいて使用されたゲルのオートラジオグラフィー画像を示す。左側パネルは、正常なヒトゲノムDNA(MaeII部位を含む)の示された割合が、Jurkat細胞(MaeII部位を欠く)由来のゲノムDNAに添加され、この混合物がPCRにより増幅され、放射標識された増幅産物を生じ、この増幅産物がMaeIIで消化された参照標準を示す。"wt"は、未消化のDNAを示すバンドを同定し、"rflp"は、MaeII消化から得られたバンドを同定する。  右側パネルは、CD34+細胞が、BsrBI部位を含むドナーDNA及びジンクフィンガー-FokI融合エンドヌクレアーゼをコードしているプラスミドでトランスフェクションされた実験の結果を示す。その後関連するゲノム領域が増幅及び標識され、標識された増幅産物がBsrBIで消化された。"GFP"は、GFP-コードしているプラスミドでトランスフェクションされた対照細胞を示し；"donor only"は、ドナーDNAのみでトランスフェクションされた対照細胞を示し；並びに、"ZFP+donor"は、細胞が、ドナーDNA及びジンクフィンガー/FokIヌクレアーゼをコードしているプラスミドでトランスフェクションされたことを示している。"wt"は、未変性のIL-2Rγ配列を含む染色体DNAを診断するバンドを同定し；"rflp"は、ドナーDNA分子に存在する変更されたIL-2Rγ配列を含む染色体DNAを診断するバンドを同定する。最も右側レーンは、DNAサイズマーカーを含む。更なる詳細については実施例16を参照のこと。
【図３９】図39は、Ku70-標的化されたsiRNAでトランスフェクションされた細胞においてKu70タンパク質レベルを試験するために使用した免疫ブロッティング像を示す。T7細胞株(実施例9、図27)は、2種の異なるsiRNAプール(実施例18参照)からの各siRNAの2種の濃度でトランスフェクションした。レーン1：70ngのsiRNAプールD；レーン2：140ngのsiRNAプールD；レーン3：70ngのsiRNAプールE；レーン4：140ngのsiRNAプールE。"Ku70"は、Ku70タンパク質を表すバンドを示し；"TFIIB"は、対照として使用したTFIIB転写因子を表すバンドを示す。
【図４０】図40は、ヒトβ-グロビン遺伝子に標的化された4種のジンクフィンガードメインのアミノ酸配列を示す：sca-29b(配列番号:22)；sca-36a(配列番号:23)；sca-36b(配列番号:24)、及びsca-36c(配列番号:25)。sca-29bドメインの標的部位は、1本のDNA鎖上にあり、及びsca-36a、sca-36b及びsca-36cドメインの標的部位は、反対鎖上にある。実施例20参照のこと。
【図４１】図41は、ジンクフィンガー/FokI融合ヌクレアーゼ(ZFNs)の異なる組合せを、配列-特異的DNA切断について試験したin vitroアッセイ結果を示す。"U"と記されたレーンは、DNA鋳型の試料を示す。次の4個のレーンは、4種の各β-グロビン-標的化されたZFNと一緒のDNA鋳型のインキュベーションの結果を示す(これらのZFNの特徴については実施例20を参照のこと)。最も右側の3個のレーンは、sca-29b ZFN及びsca-36a、sca-36bもしくはsca-36c ZFNのひとつ(全て、sca-29bが標的化された鎖とは反対鎖に標的化された)との、鋳型DNAのインキュベーションの結果を示す。
【図４２】図42は、ドキシサイクリン濃度(横座標として提供)の関数としての、T18細胞のeGFP mRNAのレベル(バー)を示す。各バーの上の数値は、ドキシサイクリン濃度の関数としての、ドナーDNA及びeGFP-標的化されたジンクフィンガーヌクレアーゼをコードしているプラスミドでトランスフェクションした細胞における、eGFP変異の補正した割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明
例えば外来性ポリヌクレオチド(細胞ヌクレオチド配列と相同である1種又は複数の領域を含む)とゲノム配列の間の、標的化された切断、それに続く非-相同末端連結によるか、又は標的化された切断、それに続く相同組換えによる、細胞クロマチンの標的化された切断及び細胞ヌクレオチド配列の標的化された変更に有用な組成物及び方法が、本明細書において明らかにされている。ゲノム配列は、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム(例えばミトコンドリア、葉緑体)、人工染色体、並びに細胞中に存在する他の種類の核酸、例えば増幅された配列、二重微小染色体及び内在性又は感染性細菌及びウイルスのゲノム中に存在するものを含む。ゲノム配列は、正常(すなわち野生型)又は変異体であることができ；変異体配列は、例えば、挿入、欠失、転座、再構成、及び／又は点変異を含むことができる。ゲノム配列は、多くの異なるアレルのひとつを含むこともできる。
【００４９】
標的化された切断及び組換えに有用な組成物は、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)及びジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質、これらのタンパク質をコードしているポリヌクレオチド、並びにポリペプチド及びポリペプチド-コードしているポリヌクレオチドの組合せを含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、1個又は複数のジンクフィンガー(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又はそれよりも多いジンクフィンガー)を含むことができ、及びゲノム配列に結合するように操作することができる。従って切断又は組換えが望ましい所定の標的ゲノムの領域を同定することにより、本明細書に明らかにされた本発明の方法に従い、該ゲノム領域内の標的配列を認識するように操作された切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)及びジンクフィンガードメインを含む1種又は複数の融合タンパク質を構築することができる。細胞内のこのような融合タンパク質(又は複数のタンパク質)の存在は、融合タンパク質(複数)のその(それらの)結合部位(複数)への結合、及び該ゲノム領域内又はその近傍での切断を生じるであろう。更にはこのゲノム領域に相同である外来性ポリヌクレオチドも、このような細胞内に存在し、ゲノム領域と外来性ポリヌクレオチドの間で相同組換えが高い割合で生じる。
【００５０】
概論
これらの方法の実践に加え、本明細書に示された組成物の調製及び使用は、特に記さない限りは、分子生物学、生化学、クロマチン構造及び解析、コンピュータケミストリー、細胞培養、組換えDNA及び当該技術分野である関連した分野内の通常の技術を使用する。これらの技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、及び第3版、2001；Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons、New York、1987及び定期最新版；シリーズのMETHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；Wolffe、CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION、第3版、Academic Press, San Diego, 1998；METHODS IN ENZYMOLOGY、304巻、「Chromatin」(P. M. Wassarman及びA. P. Wolffe編集)、Academic Press, San Diego, 1999；及び、METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、119巻、「Chromatin Protocols」(P. B. Becker編集)、Humana Press, Totowa, 1999を参照のこと。
【００５１】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、1本鎖又は2本鎖のいずれかの形の、線状又は環状のコンホメーションのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味する。本発明の開示を目的とし、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定を構成するものではない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログに加え、塩基、糖及び／又はリン酸部分が修飾されたヌクレオチドを包含することができる(例えば、ホスホロチオエート骨格)。一般に特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成の特異性を有し；すなわち、AのアナログはTと塩基対形成する。
【００５２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを意味するように、互換的に使用される。この用語は、1種又は複数のアミノ酸が、対応する天然のアミノ酸の化学的アナログ又は修飾された誘導体であるようなアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００５３】
「結合」は、巨大分子(例えばタンパク質及び核酸)間の配列-特異的で非-共有的な相互作用を意味する。全体が配列-特異的であるような相互作用である限りは、結合の相互作用の成分全てが配列-特異的(例えば、DNA骨格中のリン酸残基との接触)である必要はない。このような相互作用は一般に、解離定数が(Kd)10-6M-1又はそれ以下であることを特徴とする。「親和性」は、結合強度を意味し；結合親和性の増加は、より低いKdに相関している。
【００５４】
「結合タンパク質」は、別の分子へ非-共有的に結合することができるタンパク質を意味する。結合タンパク質は、例えば、DNA分子(DNA-結合タンパク質)、RNA分子(RNA-結合タンパク質)及び／又はタンパク質分子(タンパク質-結合タンパク質)に結合することができる。タンパク質-結合タンパク質の場合、これはそれ自身結合することができるか(ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する)、及び／又はこれは異なるタンパク質もしくはタンパク質類の1種又は複数の分子と結合することができる。結合タンパク質は、1種よりも多い結合活性を有することができる。例えばジンクフィンガータンパク質は、DNA-結合活性、RNA-結合活性及びタンパク質-結合活性を有する。
【００５５】
「ジンクフィンガーDNA結合タンパク質」(又は結合ドメイン)は、その構造が亜鉛イオンの配位により安定化されている結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、1個又は複数のジンクフィンガーを介した配列-特異的様式でDNAに結合するタンパク質又は比較的大きいタンパク質内のドメインである。用語ジンクフィンガーDNA結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質又はZFPと略されることが多い。
【００５６】
ジンクフィンガー結合ドメインは、予め決定されたヌクレオチド配列に結合するように「操作する」ことができる。ジンクフィンガータンパク質を操作する方法の非限定的例は、デザイン及び選択である。デザインされたジンクフィンガータンパク質は、そのデザイン/組成が原則的に合理的基準から生じる天然には生じないタンパク質である。デザインのための合理的基準は、置換則の適用及び現存するZFPデザイン及び結合データのデータベース保存情報における情報処理のためのコンピュータによるアルゴリズムを含む。例えば米国特許第6,140,081号；第6,453,242号；及び、第6,534,261号を参照し；同じく、国際公開公報第98/53058号；第98/53059号；第98/53060号；第02/016536号及び第03/016496号を参照のこと。
【００５７】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、その生成は、ファージディスプレイ、相互作用捕捉又はハイブリッド選択などの主に経験的プロセスに由来する天然に見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第5,789,538号；第5,925,523号；第6,007,988号；第6,013,453号；第6,200,759号、国際公開公報第95/19431号；第96/06166号；第98/53057号；第98/54311号；第00/27878号；第01/60970号；第01/88197号及び第02/099084号を参照のこと。
【００５８】
用語「配列」は、いずれかの長さのヌクレオチド配列を意味し、これはDNA又はRNAであることができ；線状、環状又は分枝することができ、並びに1本鎖又は2本鎖であることができる。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されたヌクレオチド配列を意味する。ドナー配列は、いずれかの長さ、例えば2〜10,000ヌクレオチドの長さ(又はその間又はそれを上回るいずれかの整数値)であることができ、好ましくは約100〜1,000ヌクレオチドの長さ(又はその間のいずれかの整数)、より好ましくは約200〜500ヌクレオチドの長さである。
【００５９】
「相同な同一でない配列」とは、配列の同一性の程度を第二の配列と分担しているが、その配列は第二の配列と同一ではないような第一の配列を意味する。例えば変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、その変異体遺伝子の配列と相同であるが非-同一である。ある態様において、2種の配列間の相同性の程度は、通常の細胞機構を使用し、それらの間の相同組換えを可能にするのに十分なものである。2種の相同な非-同一の配列は、あらゆる長さであることができ、並びにそれらの非-相同性の程度は、単独のヌクレオチドと同じ位小さい(例えば、標的化された相同組換えによるゲノム点変異の修正のため)か、又は10キロベースもしくはそれ以上のように大きい(例えば、染色体の予め決定された異所性部位での遺伝子の挿入のため)ことができる。相同な非-同一の配列を含むふたつのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、20〜10,000ヌクレオチド又はヌクレオチド対の外来性ポリヌクレオチド(すなわち、ドナーポリヌクレオチド)を使用することができる。
【００６０】
核酸及びアミノ酸配列同一性を決定する技術は、当該技術分野において公知である。典型的にはこのような技術は、遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列の決定及び／又はそれらによりコードされたアミノ酸配列の決定、並びにこれらの配列の第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列との比較を含む。ゲノム配列も、この様式で決定し比較することができる。一般に同一性は、ふたつのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の、各々、ヌクレオチド-対-ヌクレオチド又はアミノ酸-対-アミノ酸の正確な対応を意味する。2種又はそれよりも多い配列(ポリヌクレオチド又はアミノ酸)は、それらの％同一性を決定することにより、比較することができる。核酸又はアミノ酸配列のいずれかのふたつの配列の％同一性は、ふたつの並置した配列の間の正確なマッチの数を、より短い方の配列長により除算し、これを100倍する。核酸配列のおおまかなアラインメントは、Smith及びWaterman(Advances in Applied Mathematics, 2: 482-489 (1981))のローカルホモロジーアルゴリズムから提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff(Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff編集、5 suppl. 3: 353-358、National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C. , USA)により開発されたスコアリング行列を使用し、及びGribskov(Nucl. Acids Res., 14(6): 6745-6763 (1986))による基準化することにより、アミノ酸配列に適用することができる。配列の％同一性を決定するためのアルゴリズムの例証的実行は、Genetics Computer Group (Madison, WI)により「BestFit」ユーティリティーアプリケーションにより提供されている。この方法のためのデフォルトのパラメータは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, ver. 8 (1995) (Genetics Computer Groupより入手可能、Madison, WI)に説明されている。本開示の状況において％同一性を確立する好ましい方法は、John F. Collins 及び Shane S. Sturrokにより開発され、University of Edinburghにプログラムの著作権があり、IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)により頒布されている、MPSRCHパッケージを使用する。この一組のパッケージから、デフォルトのパラメータ(例えば、ギャップオープンペナルティ12、ギャップ伸長ペナルティ1、及びギャップ6)がスコアリングテーブルにおいて使用される場合、Smith-Watermanアルゴリズムを利用することができる。作製されたデータから、「Match」値は、配列同一性を反映している。配列間の％同一性又は類似性を計算する他の適当なプログラムは、一般に当該技術分野において公知であり、例えば別のアラインメントプログラムは、BLASTであり、これはデフォルトのパラメータと共に使用される。例えば、BLASTN及びBLASTPを、下記のデフォルトのパラメータを用い、使用することができる：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両鎖；カットオフ＝60；期待値＝10；行列＝BLOSUM62；説明＝50配列；検索＝HIGH SCORE；データベース＝重複なし、GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS translations＋Swiss Protein＋Spupdate＋PIR。これらのプログラムの詳細については、下記のインターネットアドレスにおいて認めることができる：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。本明細書に説明された配列に関して、配列同一性の望ましい程度の範囲は、およそ80％〜100％であり、この間のいずれかの整数値である。典型的には配列間の％同一性は、少なくとも70〜75％、好ましくは80〜82％、より好ましくは85〜90％であり��更により好ましくは92％、なおより好ましくは95％、及び最も好ましくは98％の配列同一性である。
【００６１】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間の安定した二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、それに続く1本鎖-特異的ヌクレアーゼ(複数)による消化、及び消化された断片のサイズ決定により決定することができる。ふたつの核酸、又はふたつのポリペプチド配列は、これらの配列が前述の方法を用いて決定された、分子の規定された長さにわたり少なくとも約70％〜75％、好ましくは80％〜82％、より好ましくは85％〜90％、更により好ましくは92％、なおより好ましくは95％、及び最も好ましくは98％の配列同一性を示す場合に、互いに実質的に相同である。本明細書において使用される実質的に相同とは、特定されたDNA又はポリペプチド配列に対し完全な同一性を示す配列も意味する。実質的に相同であるDNA配列は、例えば、特定のシステムについて規定されているような緊縮条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の規定は、当該技術分野の範囲内である。例えば、Sambrookら、前掲；Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach、編集者B. D. Hames及びS. J. Higgins、(1985)、Oxford；Washington, DC； IRL Press)を参照のこと。
【００６２】
ふたつの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように決定することができる。ふたつの核酸分子間の配列同一性の程度は、これらの分子間のハイブリダイゼーション事象の効率及び強度に影響を及ぼす。部分的に同一の核酸配列は、完全に同一の配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害するであろう。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該技術分野において周知であるハイブリダイゼーションアッセイを用い評価することができる(例えば、サザン(DNA)ブロット、ノーザン(RNA)ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Sambrookら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual、第二版(1989)、Cold Spring Harbor, N. Y.)。このようなアッセイは、変動する選択性の程度を用い、例えば、低から高緊縮性まで変動する条件を用い、実行することができる。低緊縮性条件が使用される場合、非-特異的結合の非存在は、部分的配列同一性の程度さえ欠いている第二のプローブ(例えば標的分子との約30％未満の配列同一性を有するプローブ)を用い評価することができ、その結果、非-特異的結合事象が存在しない場合、第二のプローブは、標的へハイブリダイズしないであろう。
【００６３】
ハイブリダイゼーション系の検出システムを使用する場合、参照核酸配列と相補的である核酸プローブが選択され、次に適当な条件の選択により、プローブ及び参照配列は、互いに、選択的にハイブリダイズ又は結合し、二重鎖分子を形成する。中度の緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、参照配列に選択的にハイブリダイズすることが可能である核酸分子は、典型的には選択された核酸プローブの配列と少なくともおよそ70％の配列同一性を有する少なくとも約10〜14ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択された核酸プローブの配列とおよそ90〜95％以上の配列同一性を有する長さが少なくとも約10〜14ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ及び参照配列が、特異的配列同一性の程度を有する場合の、プローブ/参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において公知のように決定することができる(例えば、Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, 編集者B. D. Hames及びS. J. Higgins, (1985) Oxford； Washington, DC； IRL Press参照)。
【００６４】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーション緊縮性は、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチのヌクレオチドを含むハイブリッドの形成に適さない程度を意味し、より高い緊縮性は、ミスマッチハイブリッドのより低い容認と相関している。ハイブリダイゼーションの緊縮性に影響を及ぼす要因も、当業者には周知であり、これは例えばホルムアミド及びジメチルスルホキシドのような有機溶媒の温度、pH、イオン強度、及び濃度を含むが、これらに限定されるものではない。当業者に公知であるように、ハイブリダイゼーション緊縮性は、より高い温度、より低いイオン強度及びより低い溶媒濃度により増大する。
【００６５】
ハイブリダイゼーションの緊縮性条件に関して、例えば、下記の要因を変動することにより、特定の緊縮性を確立するために、多くの同等の条件を使用することができることは、当該技術分野において周知である：配列の長さ及び性質、様々な配列の塩基組成、塩及び他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロック剤(例えば硫酸デキストラン、及びポリエチレングリコール)の存在及び非存在、ハイブリダイゼーション反応温度、及び時間パラメータ、更には変動する洗浄条件。ハイブリダイゼーション条件の具体的セットの選択は、当該技術分野の標準方法に従い選択される(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual、第二版(1989) Cold Spring Harbor, N. Y.参照)。
【００６６】
「組換え」は、ふたつのポリヌクレオチド間で遺伝子情報を交換するプロセスを意味する。本開示の目的に関して、「相同組換え(HR)」は、例えば細胞内の2本鎖切断の修復時に生じるような交換の特定化された形を意味する。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「標的」分子(すなわち2本鎖切断を経験したもの)の修復を鋳型する「ドナー」分子を使用し、並びにこれは遺伝子情報のドナーから標的への移動につながるので、「非-クロスオーバー遺伝子変換」又は「ショートトラクト（short tract）遺伝子変換」など様々な形で知られている。特定の理論に結びつけられることは欲さないが、このような移動は、切断された標的とドナーの間に形成するヘテロ二重鎖DNAのミスマッチ修正、及び／又はドナーが標的の一部である遺伝子情報の再合成に使用される「合成-依存鎖アニーリング」及び／又は関連したプロセスに関与することができる。このような特定されたHRは、しばしば標的分子の配列の変更を生じ、その結果ドナーポリヌクレオチドの配列の一部又は全てが、標的ポリヌクレオチドへ組込まれる。
【００６７】
「切断」は、DNA分子の共有的骨格の破壊を意味する。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解を含むが、これらに限定されるものではない様々な方法により、開始することができる。1本鎖切断及び2本鎖切断の両方が可能であり、2本鎖切断は、ふたつの個別の1本鎖切断事象の結果として生じることができる。DNA切断は、平滑末端又は付着末端のいずれかの形成の結果であることができる。ある態様において、融合ポリペプチドが、標的化された2本鎖DNA切断に使用される。
【００６８】
「切断ドメイン」は、DNA切断に対し触媒活性を有する1種又は複数のポリペプチド配列を含む。切断ドメインは、単独のポリペプチド鎖内に含まれるか、又は切断活性は、ふたつ(又はそれよりも多い)ポリペプチドの会合から生じることができる。
【００６９】
「切断ハーフ-ドメイン」は、第二のポリペプチド(同一又は異なるのいずれか)と共に、切断活性(好ましくは2本鎖切断活性)を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。
【００７０】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にDNA、及びヒストン及び非-ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形で存在し、ここでヌクレオソームコアは、ヒストンH2A、H2B、H3及びH4の各2個を含む八量体に関連したDNAのおよそ150塩基対を含み；並びにリンカーDNA(生物によって様々な長さの)は、ヌクレオソームコア間に伸長している。ヒストンH1の分子は一般に、リンカーDNAに会合している。本開示の目的に関して、用語「クロマチン」は、原核細胞及び真核細胞の両方の、全ての種類の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体及びエピソームクロマチンの両方を含む。
【００７１】
「染色体」は、細胞のゲノムの全て又は一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、その核型により特徴付けられることが多く、これは細胞のゲノムを含む全ての染色体の集合である。細胞のゲノムは、1個又は複数の染色体を含むことができる。
【００７２】
「エピソーム」は、複製する核酸、核タンパク質複合体、又はその他の細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む構造である。エピソームの例は、プラスミド及びある種のウイルスゲノムを含む。
【００７３】
「アクセス可能な領域」とは、核酸内に存在する標的部位が、標的部位を認識する外来性分子により結合され得るような、細胞クロマチン内の位置である。特定の理論に結びつけられることは欲さないが、アクセス可能な領域は、ヌクレオソーム構造へパッケージングされないものであると考えられている。アクセス可能な領域の個別の構造は、化学的及び酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対するその感受性により検出され得る。
【００７４】
「標的部位」又は「標的配列」とは、結合が存在するのに十分な条件が提供される場合に、結合分子が結合する一部の核酸を規定する核酸配列である。例えば、配列5'-GAATTC-3'は、Eco RI制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
【００７５】
「外来性」分子は、通常細胞内に存在しないが、1種又は複数の遺伝的、生化学的又は他の方法により細胞へ導入することができる分子である。「通常細胞内に存在する」とは、細胞の特定の発達段階及び環境条件に関して決定される。従って例えば、筋肉胚発達時にのみ存在する分子は、成人の筋細胞にとって外来性分子である。同様にヒートショックにより誘導された分子は、熱ショックを受けない細胞にとって外来性分子である。外来性分子は、例えば、機能不良の内在性分子の機能型又は正常に-機能する内在性分子の機能不良型を含む。
【００７６】
外来性分子は、とりわけ小型分子、例えばコンビナトリアルケミストリープロセスにより作製されたもの、又は巨大分子、例えばタンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、修飾されたそれらの分子の誘導体、もしくは1種又は複数の前記分子を含む複合体であることができる。核酸は、DNA及びRNAを含み、1本鎖又は2本鎖であることができ；線状、分枝型又は環状であることができ；並びに、あらゆる長さであることができる。核酸は、二重鎖の形成が可能であるものに加え、三重鎖形成する核酸を含む。例えば米国特許第5,176,996号及び第5,422,251号を参照のこと。タンパク質は、DNA-結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化されたDNA結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチル化酵素、脱メチル化酵素、アセチル化酵素、脱アセチル化酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、及びヘリカーゼを含むが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
外来性分子は、内在性分子と同じ型の分子、例えば、外来性タンパク質又は核酸であることができる。例えば外来性核酸は、細胞に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、又は細胞に通常存在しない染色体を含むことができる。外来性分子を細胞へ導入する方法は、当業者に公知であり、脂質-媒介型移動(すなわち、中性及びカチオン性脂質を含む、リポソーム)、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、DEAE-デキストラン-媒介型導入及びウイルスベクター-媒介型導入を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
対照的に「内在性」分子は、通常特定の細胞内に特定の発達段階で特定の環境条件下で存在するものである。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラストもしくは他のオルガネラのゲノム、又は天然に生じるエピソーム核酸を含む。追加の内在性分子は、タンパク質、例えば転写因子及び酵素を含む。
【００７９】
「融合」分子は、2又はそれよりも多いサブユニット分子が、好ましくは共有的に、連結された分子である。これらのサブユニット分子は、同じ化学型の分子であるか、又は異なる化学型の分子であることができる。第一の型の融合分子の例は、融合タンパク質(例えば、ZFP DNA-結合ドメインと切断ドメインの間の融合)及び融合核酸(例えば、前述の融合タンパク質をコードしている核酸)を含むが、これらに限定されるものではない。第二の型の融合分子の例は、三重鎖-形成する核酸とポリペプチドの間の融合体、及び副溝結合剤と核酸の間の融合体を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
細胞内での融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達、又は融合タンパク質をコードしているポリペプチドの細胞への送達により生じることができ、ここでポリヌクレオチドは転写され、その転写産物は翻訳され、融合タンパク質を生成する。トランス-スプライシング、ポリペプチド切断及びポリペプチド連結も、細胞におけるタンパク質の発現に関連している。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの細胞への送達方法は、本開示の別所に示されている。
【００８１】
本開示の目的に関する「遺伝子」は、遺伝子産物をコードしているDNA領域(下記参照)に加え、調節配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているかどうかに関わらず、遺伝子産物の生成を調節する全てのDNA領域を含む。従って遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位及び遺伝子座調節領域を含むが必ずしも限定されない。
【００８２】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれた情報の遺伝子産物への転換を意味する。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物(例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構成的RNA又はいずれか他の型のRNA)又はmRNAの翻訳により生成されたタンパク質である。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び校正などのプロセスにより修飾されているRNA類、並びに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADP-リボシル化、ミリスチル化、及びグリコシル化により修飾されたタンパク質も含む。
【００８３】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子活性の変化を意味する。発現の調節は、遺伝子活性化及び遺伝子抑制を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
「真核」細胞は、真菌細胞(酵母など)、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞及びヒト細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
「所定の領域」は、例えば、外来性分子に結合することが望ましい、遺伝子又は遺伝子内もしくはそれに隣接する非-コード配列などの、細胞クロマチンのいずれかの領域である。結合は、標的化されたDNA切断及び／又は標的化された組換えを目的とすることができる。所定の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム(例えば、ミトコンドリア、葉緑体)、又は感染しているウイルスゲノム内に存在することができる。所定の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非-コード領域内、又はコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非-転写領域内であることができる。所定の領域は、単ヌクレオチド対と同じくらい小さいか、又は最大2,000ヌクレオチド対の長さ、もしくはヌクレオチド対の整数値(integral value)であることができる。
【００８６】
用語「作動的連結」及び「作動可能に連結された」(又は「作動的に連結された」)は、両方の成分が正常に機能し、かつ少なくとも1種の成分が少なくとも1種の他の成分に対し発揮される機能を媒介することができる可能性があるように成分が配置された、2種又はそれよりも多い成分(例えば配列エレメント)の近位に関して互換的に使用される。例証のために、転写調節配列が、1種又は複数の転写調節因子の存在又は非存在に反応して、コード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターなどの転写調節配列は、コード配列に作動的に連結されている。転写調節配列は一般に、コード配列へシスで作動的に連結されているが、これに直接隣接している必要はない。例えばエンハンサーは、例えそれらが近接していなくとも、コード配列へ作動的に連結された転写調節配列である。
【００８７】
融合ポリペプチドに関して用語「作動的に連結された」とは、各成分は、他方の成分への連結において、そのように連結されていない場合に生じるであろう機能と、同じ機能を発揮するという事実を意味することができる。例えばZFP DNA-結合ドメインが切断ドメインに融合されているような融合ポリペプチドに関して、ZFP DNA-結合ドメイン部分がその標的部位及び／又はその結合部位に結合することができると同時に、切断ドメインはその標的部位の近傍でDNAを切断することができる場合には、ZFP DNA-結合ドメインと切断ドメインは、融合ポリペプチドにおいて作動的に連結している。
【００８８】
タンパク質、ポリペプチド又は核酸の「機能的断片」とは、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチド又は核酸と同じではないが、依然完全長タンパク質、ポリペプチド又は核酸と同じ機能を維持している、タンパク質、ポリペプチド又は核酸である。機能的断片は、対応する未変性の分子よりもより多い、より少ない、又は同じ数の残基を有し、及び／又は1種又はそれよりも多いアミノ酸もしくはヌクレオチドの置換を含むことができる。核酸の機能(例えば、コード機能、別の核酸へハイブリダイズする能力)を決定する方法は、当該技術分野において周知である。同様にタンパク質機能を決定する方法は周知である。例えばポリペプチドのDNA-結合機能は、例えばフィルター-結合、電気泳動移動度-シフト、又は免疫沈降アッセイにより決定することができる。DNA切断は、ゲル電気泳動によりアッセイすることができる。Ausubelら、前掲の論文を参照のこと。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば共-免疫沈降、ツー-ハイブリッドアッセイ又は遺伝的及び生化学的の両方の相補性決定により、決定することができる。例えばFieldsら、Nature, 340:245-246 (1989)；米国特許第5,585,245号及び国際公開公報第98/44350号参照のこと。
【００８９】
標的部位
開示された方法及び組成物は、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)及びジンクフィンガードメインを含む融合タンパク質を含み、ここでジンクフィンガードメインは、細胞クロマチン内の配列への結合により(例えば、標的部位又は結合部位)、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)のその配列の近傍への活性を指示し、その結果標的配列の近傍での切断を誘導する。本開示の別所において示したように、ジンクフィンガードメインは、事実上あらゆる所望の配列へ結合するように操作することができる。従って切断又は組換えが望ましい配列を含む所定の領域の同定後、1個又は複数のジンクフィンガー結合ドメインを、所定の領域の1個又は複数の配列に結合するように操作することができる。細胞における、ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ドメインを含む融合タンパク質の(又は、各々ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含むふたつの融合タンパク質の)発現は、所定の領域の切断に作用する。
【００９０】
ジンクフィンガードメインによる結合のための細胞クロマチン中の配列(例えば、標的部位)の選択は、例えば同じくZFPが選択された配列へ結合するようにデザインする方法を開示している共有の米国特許第6,453,242号(2002年9月17日)に開示された方法に従い実現することができる。ヌクレオチド配列の単純な目視検査を用い、標的部位を選択することができることは、当業者には明らかであろう。従って、標的部位選択のあらゆる手段を、請求された方法で使用することができる。
【００９１】
標的部位は一般に、複数の隣接標的サブサイトにより構成されている。標的サブサイトは、個々のジンクフィンガーにより結合された配列(通常、ヌクレオチド三つ組、又は隣接する四つ組と1個のヌクレオチドが重複するヌクレオチド四つ組)を意味する。例えば、国際公開公報第02/077227号を参照のこと。それと共にジンクフィンガータンパク質がほとんどの接触を作製している鎖が標的鎖「一次認識鎖」又は「一次接触鎖」と称される場合、一部のジンクフィンガータンパク質は、標的鎖の3個の塩基三つ組及び非-標的鎖の第四の塩基に結合する。標的部位は一般に、少なくとも9ヌクレオチドの長さを有し、従ってこれは少なくとも3個のジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインに結合される。しかし例えば4-フィンガー結合ドメインの12-ヌクレオチド標的部位への、5-フィンガー結合ドメインの15-ヌクレオチド標的部位への、又は6-フィンガー結合ドメインの18-ヌクレオチド標的部位への結合も可能である。明らかなように、より長い結合ドメイン(例えば、7-、8-、9-フィンガー又はそれ以上)のより長い標的部位への結合も可能である。
【００９２】
標的部位が、複数の3ヌクレオチドであることは不要である。例えば交差-鎖相互作用(cross-strand interaction)が生じる場合(例えば米国特許第6,453,242号及び国際公開公報第02/077227号参照)、マルチ-フィンガー結合ドメインの1個又は複数の個々のジンクフィンガーは、重複している四つ組サブサイトに結合することができる。結果的に、3-フィンガータンパク質は、10-ヌクレオチド配列に結合することができ、ここで10番目のヌクレオチドは、末端フィンガーにより結合された四つ組の一部であり、4-フィンガータンパク質は、13-ヌクレオチド配列に結合することができ、ここで13番目のヌクレオチドは、末端フィンガーにより結合された四つ組の一部であるなどである。
【００９３】
マルチ-フィンガー結合ドメイン内の個々のジンクフィンガー間のアミノ酸リンカー配列の長さ及び性質も、標的配列への結合に影響を及ぼす。例えばマルチ-フィンガー結合ドメイン内の隣接するジンクフィンガー間の、いわゆる「非-カノニカル(non-canonical)リンカー」、「ロングリンカー」又は「構造リンカー」は、これらのフィンガーが、直接隣接しないサブサイトに結合することを可能にする。このようなリンカーの限定的でない例は、例えば米国特許第6,479,626号及び国際公開公報第01/53480号に開示されている。従ってジンクフィンガー結合ドメインの標的部位において、1個又は複数のサブサイトは、1、2、3、4、5又はそれよりも多いヌクレオチドにより、互いに分離することができる。単なる一例を提供すると、4-フィンガー結合ドメインは、順に、2個の近接3-ヌクレオチドサブサイト、介在ヌクレオチド、及び2個の近接三つ組サブサイトを含む、13-ヌクレオチド標的部位に結合することができる。
【００９４】
配列(例えば、標的部位)間の距離は、互いに最も近い配列の末端から測定された、ふたつの配列間に介在するヌクレオチド又はヌクレオチド対の数を意味する。
【００９５】
標的部位を分離するための切断が2種のジンクフィンガードメイン/切断ハーフ-ドメイン融合分子の結合に左右されるようなある態様において、これらふたつの標的部位は、反対DNA鎖上に存在することができる。別の態様において、両方の標的部位は同一DNA鎖上にある。
【００９６】
ジンクフィンガー結合ドメイン
ジンクフィンガー結合ドメインは、1個又は複数のジンクフィンガーを含む。Millerら、EMBO J., 4:1609-1614 (1985)；Rhodes, Scientific American, Feb:56-65 (1993)；米国特許第6,453,242号。典型的には、単独のジンクフィンガードメインは、長さが約30個のアミノ酸である。構造試験は、各ジンクフィンガードメイン(モチーフ)は、2個のβシート(2個の不変システイン残基を含むβターンで支えられた)及びαヘリックス(2個の不変ヒスチジン残基を含む)を含み、これらは特定のコンホメーション中に、2個のシステイン及び2個のヒスチジンによる亜鉛原子の配位を介して特定の立体配置に保持されていることを明らかにしている。
【００９７】
ジンクフィンガーは、カノニカルC2H2ジンクフィンガー(すなわち、亜鉛イオンが2個のシステイン残基及び2個のヒスチジン残基により配位されているもの)、並びに例えばC3Hジンクフィンガー(亜鉛イオンが3個のシステイン残基及び1個のヒスチジン残基により配位されているもの)及びC4ジンクフィンガー(亜鉛イオンが4個のシステイン残基により配位されているもの)のような、非-カノニカルジンクフィンガーの両方を含む。同じく国際公開公報第02/057293号を参照のこと。
【００９８】
ジンクフィンガー結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作することができる。例えば、Beerliら、Nature Biotechnol., 20:135-141 (2002)；Paboら、Ann. Rev. Biochem., 70:313-340 (2001)；Isalanら、Nature Biotechnol., 19:656-660 (2001)；Segalら、Curr. Opin. Biotechnol., 12:632-637 (2001)；Chooら、Curr. Opin. Struct. Biol., 10:411-416 (2000)を参照のこと。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然のジンクフィンガータンパク質と比べ、新規結合特異性を有することができる。操作法は、理論的デザイン及び様々な種類の選択を含むが、これらに限定されるものではない。理論的デザインは、例えば、各三つ組又は四つ組ヌクレオチド配列が、特定の各三つ組又は四つ組配列に結合するジンクフィンガーの1種又は複数のアミノ酸配列と関連付けられている、三つ組(又は四つ組)ヌクレオチド配列及び個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含む。例えば共有の米国特許第6,453,242号及び第6,534,261号を参照のこと。
【００９９】
ファージディスプレイ及びツー-ハイブリッドシステムを含む選択法の例は、米国特許第5,789,538号；第5,925,523号；第6,007,988号；第6,013,453号；第6,410,248号；第6,140,466号；第6,200,759号；及び第6,242,568号；更には、国際公開公報第98/37186号；第98/53057号；第00/27878号；第01/88197号、及び英国特許第GB 2,338,237号を参照のこと。
【０１００】
ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性の増強は、例えば共有の国際公開公報第02/077227号に開示されている。
【０１０１】
個々のジンクフィンガーは3-ヌクレオチド(すなわち三つ組)配列(又は1個のヌクレオチドが隣接ジンクフィンガーの4-ヌクレオチドの結合部位と重複する4-ヌクレオチド配列)に結合するので、ジンクフィンガー結合ドメインが結合する(例えば標的配列)ように操作された配列の長さは、操作されたジンクフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガーの数を決定するであろう。例えば、フィンガーモチーフが重複しているサブサイトと結合しないZFPについて、6-ヌクレオチド標的配列は、2-フィンガー結合ドメインにより結合され；9-ヌクレオチド標的配列は、3-フィンガー結合ドメインにより結合されるなどである。本明細書に記したように、標的部位中の個々のジンクフィンガーの結合部位(すなわちサブサイト)は、近接する必要はないが、マルチ-フィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガー間のアミノ酸配列(すなわち、フィンガー間リンカー)の長さ及び性質により左右される、1個又は数個のヌクレオチドにより分離され得る。
【０１０２】
マルチ-フィンガージンクフィンガー結合ドメインにおいて、隣接ジンクフィンガーは、およそ5個のアミノ酸のアミノ酸リンカー配列によるか(いわゆる「カノニカル」フィンガー間リンカー)、あるいは1種又は複数の非-カノニカルリンカーにより分離することができる。例えば共有の米国特許第6,453,242号及び第6,534,261号を参照のこと。3個よりも多いフィンガーを含む操作されたジンクフィンガー結合ドメインについて、あるジンクフィンガー間へのより長い(「非-カノニカル」)フィンガー間リンカーの挿入は、結合ドメインによる結合の親和性及び／又は特異性を増加することが好ましい。例えば米国特許第6,479,626号及び国際公開公報第01/53480号参照。従って、マルチ-フィンガージンクフィンガー結合ドメインは、非-カノニカルフィンガー間リンカーの存在及び位置に関して特徴付けることもできる。例えば、3個のフィンガー(2個のカノニカルフィンガー間リンカーにより連結された)、長いリンカー及び3個の追加のフィンガー(2個のカノニカルフィンガー間リンカーにより連結された)を含む、6-フィンガーのジンクフィンガー結合ドメインが、2x3立体配置で表示される。同様に、2個のフィンガー(それらの間のカノニカルリンカーと共に)、長いリンカー及び2個の追加のフィンガー(カノニカルリンカーにより連結された)を含む結合ドメインは、2x2タンパク質と表示される。3個の2-フィンガー単位(各々、2個のフィンガーがカノニカルリンカーにより連結されている)を含み、及び2-フィンガー単位の各々は隣接2フィンガー単位に長いリンカーで連結されているようなタンパク質は、3x2タンパク質と表示される。
【０１０３】
マルチ-フィンガー結合ドメイン内のふたつの隣接ジンクフィンガー間の長いリンカー又は非-カノニカルフィンガー間リンカーの存在は、これらふたつのフィンガーの、標的配列内で直接近接していないサブサイトへの結合を可能にすることが多い。従って標的部位内のサブサイト間に1個又は複数のヌクレオチドのギャップが存在することができ；すなわち、標的部位は、ジンクフィンガーにより接触されていない1個又は複数のヌクレオチドを含むことができる。例えば、2x2ジンクフィンガー結合ドメインは、1個のヌクレオチドにより分離されたふたつの6-ヌクレオチド配列に結合することができ、すなわちこれは13-ヌクレオチド標的部位に結合する。同じくMooreら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 1432-1436 (2001a)；Mooreら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 1437-1441 (2001b)及び国際公開公報第01/53480号参照のこと。
【０１０４】
前述のように、標的サブサイトは、単独のジンクフィンガーにより結合される3-又は4-ヌクレオチド配列である。ある目的のために、2-フィンガー単位が、結合モジュールで表示される。結合モジュールは、例えば、特定の6-ヌクレオチド標的配列に結合しているマルチ-フィンガータンパク質(一般に3個のフィンガー)の状況で、2個の隣接フィンガーの選択により得ることができる。あるいは、モジュールは、個々のジンクフィンガーの集成により構築することができる。同じく国際公開公報第98/53057号及び第01/53480号を参照のこと。
【０１０５】
切断ドメイン
本明細書に明らかにされた融合タンパク質の切断ドメイン部分は、エンド-又はエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来することができるエンドヌクレアーゼの例は、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されるものではない。例えば2002-2003カタログ、New England Biolabs, Beverly, MA；及び、Belfortら、Nucleic Acids Res., 25: 3379-3388 (1997)を参照のこと。DNAを切断する追加の酵素が知られている(例えば、S1ヌクレアーゼ；サヤインゲンヌクレアーゼ；膵臓DNase I；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母HOエンドヌクレアーゼ；同じく、Linnら、(編集) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993を参照のこと)。1種又は複数のこれらの酵素(又はそれらの機能的断片)を、切断ドメイン及び切断ハーフ-ドメインの給源として使用することができる。
【０１０６】
同様に切断ハーフ-ドメイン(例えば、ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む融合タンパク質)は、前述のように、切断活性のために二量体化が必要である、いずれかのヌクレアーゼ又はそれらの部分に由来することができる。一般に、融合タンパク質が切断ハーフ-ドメインを含む場合、ふたつの融合タンパク質が切断に必要である。ふたつの切断ハーフ-ドメインは、同じエンドヌクレアーゼ(又はそれらの機能的断片)に由来するか、又は各切断ハーフ-ドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ(又はそれらの機能的断片)に由来することができる。加えてふたつの融合タンパク質の標的部位は、互いに関して、これらふたつの融合タンパク質の結合が、例えば二量体化により、互いに切断ハーフ-ドメインが機能的切断ドメインを形成することが可能であるような空間的方向に切断ハーフ-ドメインを配置するように、配置されることが好ましい。従ってある態様において、標的部位の近端は、5-8ヌクレオチド又は15-18ヌクレオチドにより分離される。しかし、いくつかの整数のヌクレオチド又はヌクレオチド対が、ふたつの標的部位の間に介在することができる(例えば、2〜50ヌクレオチド又はそれ以上)。一般に切断点は、標的部位の間に位置する。
【０１０７】
一般に、各々切断ハーフ-ドメインを含むふたつの融合タンパク質が使用される場合、各融合タンパク質のジンクフィンガー部分の一次接触鎖は、異なるDNA鎖上にあり、反対方向である。すなわち、ZFP/切断ハーフ-ドメイン融合体の対に関して、標的配列は、反対鎖上にあり、これらふたつのタンパク質は反対方向に結合する。
【０１０８】
制限エンドヌクレアーゼ(制限酵素)は、多くの種に存在し、DNAへ配列-特異的に結合し(認識部位において)、並びにDNAを結合の部位で又はその近傍で切断することが可能である。ある制限酵素(例えばIIS型)は、DNAを、認識部位から離れた部位で切断し、分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインを有する。例えばIIS型酵素FokIは、一方の鎖のその認識部位から9ヌクレオチドで、及び他方の鎖のその認識部位から13ヌクレオチドで、DNAの2本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第5,356,802号；第5,436,150号及び第5,487,994号；更には、Liら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4275-4279 (1992)；Liら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2764-2768 (1993)；Kimら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 883-887 (1994a)；Kimら、J. Biol. Chem., 269: 31,978-31,982 (1994b)を参照のこと。従ってひとつの態様において、融合タンパク質は、少なくとも1個のIIS型制限酵素に由来した切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)、及び操作されてもされなくともよい、1個又は複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【０１０９】
その切断ドメインは結合ドメインから分離可能であるIIS型制限酵素の例は、FokIである。この特定の酵素は、二量体として活性がある。Bitinaiteら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 10,570-10,575 (1998)。従って本開示の目的に関して、開示された融合タンパク質において使用されるFokI酵素の部分は、切断ハーフ-ドメインと考えられる。従ってジンクフィンガー-FokI融合体を使用する、標的化された2本鎖切断及び／又は標的化された細胞配列の交換に関して、各々FokI切断ハーフ-ドメインを含むふたつの融合タンパク質を使用し、触媒活性のある切断ドメインを再構成することができる。あるいはジンクフィンガー結合ドメイン及びふたつのFokI切断ハーフ-ドメインを含む単独のポリペプチド分子も使用することができる。ジンクフィンガー-FokI融合体を使用する標的化された切断及び標的化された配列交換のためのパラメータは、本明細書の別所に提供されている。
【０１１０】
IIS型制限酵素の例を、表1に列記した。追加の制限酵素も、分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインを含み、これらは本発明の開示により企図されている。例えばRobertsら、Nucleic Acids Res., 31:418-420 (2003)参照のこと。
【０１１１】
【表１】
2010046099.tif 000003
【０１１２】
【表２】
2010046099.tif 000004
【０１１３】
ジンクフィンガードメイン-切断ドメイン融合体
融合タンパク質(及びこれをコードしているポリヌクレオチド)をデザイン及び構築する方法は、当業者に公知である。例えば、ジンクフィンガータンパク質(及びそれをコードしているポリヌクレオチド)を含む融合タンパク質をデザイン及び構築する方法は、共有の米国特許第6,453,242号及び第6,534,261号に開示されている。ある態様において、このような融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが構築される。これらのポリヌクレオチドはベクターに挿入することができ、このベクターは細胞へ導入することができる(ポリヌクレオチドの細胞への導入のためのベクター及び方法に関する追加の開示については下記参照)。
【０１１４】
本明細書に開示された方法のある態様において、融合タンパク質は、ジンクフィンガー結合ドメイン及びFokI制限酵素からの切断ハーフ-ドメインを含み、このようなふたつの融合タンパク質が細胞において発現されている。細胞におけるふたつの融合タンパク質の発現は、ふたつのタンパク質の細胞への送達；ひとつのタンパク質及びこれらのタンパク質のひとつをコードしているひとつの核酸の細胞への送達；各々タンパク質のひとつをコードしているふたつの核酸の細胞への送達；又は、両方のタンパク質をコードしている単独の核酸の細胞への送達により生じることができる。追加の態様において、融合タンパク質は、ふたつの切断ハーフ-ドメイン及びジンクフィンガー結合ドメインを含む、単独のポリペプチド鎖を含む。この場合、単独の融合タンパク質は、細胞において発現され、及び特定の理論と結びつけられることは欲さないが、切断ハーフ-ドメインの分子内二量体形成の結果として、DNAを切断すると考えられる。
【０１１５】
一般に、融合タンパク質(例えば、ZFP-FokI融合体)の成分は、ジンクフィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端の最も近くに位置し、及び切断ハーフ-ドメインがカルボキシ末端の最も近くに位置するように配置される。これは、DNA-結合ドメインがアミノ末端の最も近くに位置し及び切断ハーフ-ドメインがカルボキシ末端の最も近くに位置するFokI酵素に由来するもののような、自然に二量体化する切断ドメインにおける切断ドメインの相対方向を反映している。
【０１１６】
開示された融合タンパク質において、ジンクフィンガー結合ドメイン(ふたつの保存されたシステイン残基の最もN-末端側及びふたつの保存されたヒスチジン残基の最もC-末端-側により境界が定められている)と切断ドメイン(又はハーフ-ドメイン)の間のアミノ酸配列は、「ZCリンカー」として表示されている。ZCリンカーは、前述のフィンガー間リンカーとは区別される。例えばZFP-FokI融合タンパク質(成分は、以下のように配置されている：N末端−ジンクフィンガー結合ドメイン−FokI切断ハーフ-ドメイン−C末端)において、ZCリンカーは、最もC-末端側のジンクフィンガーの第二のヒスチジン残基と切断ハーフ-ドメインの最もN-末端側のアミノ酸残基(これは一般に配列QLVのグルタミン(Q)である)の間に位置する。ZCリンカーは、いずれかのアミノ酸配列であることができる。最適な切断を得るために、リンカーの長さ及び標的部位(結合部位)間の距離は、相互関連されている。例えばSmithら、Nucleic Acids Res., 28: 3361-3369 (2000)；Bibikovaら、Mol. Cell. Biol., 21: 289-297 (2001)を参照し、これはリンカー長はここに示されたものとは異なることに注意。例えば4個のアミノ酸(本明細書で定義されたような)のZCリンカー長を有するZFP-FokI融合体について、最適な切断は、融合タンパク質の結合部位が、6又は16ヌクレオチド離れて(各結合部位の近端から測定された)位置する場合に生じる。
【０１１７】
標的化された切断の方法
明らかにされた方法及び組成物を用い、DNAを細胞クロマチン内の所定の領域で切断することができる(例えば、変異体又は野生型のいずれかの遺伝子において、ゲノム内の所望の部位又は予め決定された部位で)。このような標的化されたDNA切断に関して、ジンクフィンガー結合ドメインは、予め決定された切断部位の又はその近くの標的部位に結合するように操作され、この操作されたジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ドメインを含む融合タンパク質が細胞において発現される。融合タンパク質のジンクフィンガー部分の標的部位への結合時に、DNAは、切断ドメインにより、標的部位の近くで切断される。正確な切断部位は、ZCリンカーの長さに応じて左右される。
【０１１８】
あるいは、各々がジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含むふたつの融合タンパク質が、細胞において発現され、機能的切断ドメインが再構成され、及びDNAが標的部位の近傍で切断されるように並置されている標的部位へ結合される。ひとつの態様において、切断は、ふたつのジンクフィンガー結合ドメインの標的部位の間で生じる。一方又は両方のジンクフィンガー結合ドメインを操作することができる。
【０１１９】
ジンクフィンガー結合ドメイン-切断ドメイン融合ポリペプチドを使用する標的化された切断に関して、結合部位は、切断部位を包含するか、又は結合部位の近端は、切断部位から1、2、3、4、5、6、10、25、50又はそれよりも多いヌクレオチド(又は1〜50ヌクレオチド間のいずれかの整数値)であることができる。切断部位に関して、結合部位の正確な位置は、具体的な切断ドメイン、及びZCリンカー長により左右されるであろう。各々がジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含むふたつの融合ポリペプチドが使用される方法について、結合部位は一般に、切断部位にまたがっている。従って第一の結合部位の近端は、切断部位の片側上の1、2、3、4、5、6、10、25又はそれよりも多いヌクレオチド(又は1〜50ヌクレオチド間のいずれかの整数値)であり、並びに第二の結合部位の近端は、切断部位の他側上の1、2、3、4、5、6、10、25又はそれよりも多いヌクレオチド(又は1〜50ヌクレオチド間のいずれかの整数値)であることができる。切断部位をin vitro及びin vivoにおいてマッピングする方法は、当業者に公知である。
【０１２０】
従って本明細書に開示された方法は、切断ドメインに融合された操作されたジンクフィンガー結合ドメインを使用することができる。これらの場合、結合ドメインは、切断が望ましい部位で又はその近くで標的配列へ結合するように操作されている。融合タンパク質、又はこれをコードしているポリヌクレオチドは、細胞へ導入される。一旦細胞へ導入されるか又は細胞で発現されると、この融合タンパク質は、標的配列に結合し、及び標的配列で又はその近くで切断する。切断の正確な部位は、切断ドメインの性質並びに／又は結合ドメインと切断ドメインの間のリンカー配列の存在及び／もしくは性質により左右される。各々が切断ハーフ-ドメインを含むふたつの融合タンパク質が使用される場合、結合部位の近端間の距離は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25又はそれよりも大きいヌクレオチド(又は1〜50ヌクレオチド間のいずれかの整数値)であることができる。最適な切断レベルは、ふたつの融合タンパク質の結合部位の間の距離(例えば、Smithら、Nucleic Acids Res., 28: 3361-3369 (2000)；Bibikovaら、Mol. Cell. Biol., 21: 289-297 (2001)参照)及び各融合タンパク質中のZCリンカー長の両方に応じて決まる。
【０１２１】
ZFP-FokI融合ヌクレアーゼに関して、ZFPとFokI切断ハーフ-ドメインの間のリンカー(すなわちZCリンカー)の長さは、切断効率に影響を及ぼすことができる。4個のアミノ酸残基のZCリンカーを伴うZFP-FokI融合体を使用するひとつの実験システムにおいて、2種のZFP-FokIヌクレアーゼの結合部位の近端が、6塩基対により分離される場合に、最適な切断が得られた。この特定の融合ヌクレアーゼは、ジンクフィンガー部分とヌクレアーゼハーフ-ドメインの間の下記のアミノ酸配列で構成された：
HQRTHQNKKQLV (配列番号:26)
ここで、ジンクフィンガーのC-末端部分の2個の保存されたヒスチジン及びFokI切断ハーフ-ドメイン中の最初の3残基には下線を付けた。従ってこの構築体中のリンカー配列は、QNKKである。Bibikovaら、Mol. Cell. Biol., 21: 289-297 (2001)。本発明者らは、様々なZCリンカー長及び配列を有する多くのZFP-FokI融合ヌクレアーゼを構築し、これらのヌクレアーゼの一連のZFP結合部位の間の距離が異なる基質に対する切断効率について分析した。実施例4参照のこと。
【０１２２】
ある態様において、切断ドメインは、ふたつの切断ハーフ-ドメインを含み、これらは両方とも結合ドメイン、第一の切断ハーフ-ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含む単独のポリペプチドの一部である。切断ハーフ-ドメインは、それらがDNAを切断するように機能する限りは、同じアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列を有することができる。
【０１２３】
切断ハーフ-ドメインは、個別の分子において提供されてもよい。例えばふたつの融合ポリペプチドが細胞へ導入され、ここで各ポリペプチドは、結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む。この切断ハーフ-ドメインは、それらがDNAを切断するように機能する限りは、同じアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列を有することができる。更にこの結合ドメインは、典型的には融合ポリペプチドの結合時に、ふたつの切断ハーフ-ドメインが、切断ドメインの再構成を可能にするように(例えば、ハーフ-ドメインの二量体化により)互いに空間的方向で提示されるような様式で配置されている標的配列に結合し、これにより互いにハーフ-ドメインを位置決めし、機能的切断ドメインを形成し、所定の領域における細胞クロマチンの切断を生じる。一般に再構成された切断ドメインによる切断は、ふたつの標的配列の間に位置した部位で生じる。一方又は両方のタンパク質は、その標的部位へ結合するように操作することができる。
【０１２４】
これら2種の融合タンパク質は、同じ又は反対の極性の所定の領域で結合することができ、及びこれらの結合部位(すなわち標的部位)は、いくつかのヌクレオチド、例えば0〜200ヌクレオチド又はそれらの間のいずれかの整数値のヌクレオチドにより分離することができる。ある態様において、各々がジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含むふたつの融合タンパク質の結合部位は、別の結合部位に最も近い各結合部位の端から測定されたとして、5-18ヌクレオチド離れた、例えば5-8ヌクレオチド離れた、もしくは15-18ヌクレオチド離れた、又は6ヌクレオチド離れた、もしくは16ヌクレオチド離れた間に位置することができ、並びに切断はこれらの結合部位の間で生じる。
【０１２５】
DNAが切断される部位は一般に、ふたつの融合タンパク質の結合部位の間に位置する。DNAの2本-鎖切断は、ふたつの1本-鎖切断、又は1、2、3、4、5、6又はそれよりも多いヌクレオチドによる「ニック」オフセット(offset)から生じることが多い(例えば、未変性のFokIによる2本鎖DNAの切断は、4ヌクレオチドによる1本-鎖切断オフセットから生じる)。従って切断は、必ずしも正確に各DNA鎖の反対部位では生じない。加えて融合タンパク質の構造及び標的部位間の距離は、切断が単独のヌクレオチド対に隣接して生じるかどうか、又は切断がいくつかの部位で生じるかどうかに影響を及ぼし得る。しかし、標的化された組換え(下記参照)を含む多くの適用において、ヌクレオチドの範囲内の切断で一般に十分であり、及び特定の塩基対間の切断は必要ない。
【０１２６】
前述のように、融合タンパク質(複数)は、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドへ導入することができる。例えば各々が前述のポリペプチドのひとつをコードしている配列を含むふたつのポリヌクレオチドを、細胞に導入することができ、ポリペプチドが発現され及び各々がその標的配列へ結合する場合、切断は、標的配列で又はその近くで生じる。あるいは両方の融合ポリペプチドをコードしている配列を含む単独のポリヌクレオチドが、細胞へ導入される。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA又はいずれか修飾された形もしくはアナログ又はDNA及び／もしくはRNAであることができる。
【０１２７】
切断特異性を増強するために、本明細書に説明された方法において追加の組成物を使用することもできる。例えば単独の切断ハーフ-ドメインは、限定された2本鎖切断活性を示すことができる。各々が3-フィンガージンクフィンガードメイン及び切断ハーフ-ドメインを含むふたつの融合タンパク質が細胞へ導入される方法において、いずれかのタンパク質は、およそ9-ヌクレオチド標的部位を特定する。18ヌクレオチドの凝集(aggregate)標的配列は恐らく哺乳類のゲノムに独特であるが、ヒトゲノムにおいては所定の9-ヌクレオチド標的部位が、平均しておよそ23,000回生じる。従って単独のハーフ-ドメインの部位-特異的結合に起因した、非-特異的切断が生じることがある。従って本明細書に説明された方法は、細胞においてこれらは2種の融合タンパク質と共に発現されるFokIのような切断ハーフ-ドメインのドミナント-ネガティブ変異体(又はそれをコードしている核酸)の使用を企図している。ドミナント-ネガティブ変異体は、二量体化することは可能であるが、切断はできず、同じく二量体化されるハーフ-ドメインの切断活性をブロックする。融合タンパク質に対しモルで過剰なドミナント-ネガティブ変異体を提供することにより、両方の融合タンパク質が結合した領域のみ、二量体化及び切断の発生のために十分に高い機能的切断ハーフ-ドメインの局所的濃度を有するであろう。ふたつの融合タンパク質のただひとつが結合した部位では、その切断ハーフ-ドメインは、ドミナント-ネガティブ変異体ハーフ-ドメインと共に二量体を形成し、望ましくない非-特異的切断は生じない。
【０１２８】
FokI切断ハーフ-ドメイン内の3個の触媒的アミノ酸残基が同定されている：Asp 450、Asp 467及びLys 469。Bitinaiteら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 10,570-10,575 (1998)。従ってこれらの残基のひとつでの1種又は複数の変異を用い、ドミナント-ネガティブ変異体を作製することができる。更に他のIIS型エンドヌクレアーゼの多くの触媒的アミノ酸残基が公知であり、並びに／又は例えばFokI配列のアラインメントによるか及び／もしくは触媒活性のための変異体の作出及び試験により、決定されている。
【０１２９】
切断ハーフ-ドメインにおける二量体化ドメインの変異
ZFPと切断ハーフ-ドメインの間の融合体(例えば、ZFP/FokI融合体など)の使用に関連した標的化された切断法には、各々一般に異なる標的配列に方向付けられたようなふたつの融合分子の使用が必要である。これらのふたつの融合タンパク質の標的配列は、先に考察されたように、標的化された切断がゲノム内の独自の部位に方向付けられるように選択することができる。低下した切断特異性の可能性のある給源は、2種のZFP/切断ハーフ-ドメイン融合体のひとつのホモ二量体化から生じる。これは、例えばゲノム内の機能的二量体を形成することができる方向及びスペーシングにより、同じ融合タンパク質のふたつのコピーが結合することができるように配置された、2種のZFP/切断ハーフ-ドメイン融合体のひとつのための標的配列の逆方向反復の存在により生じるであろう。
【０１３０】
意図された標的部位以外の配列でのこの種の異常な切断の可能性を低下するひとつの方法は、ホモ二量体化を最小化又は防止する切断ハーフ-ドメインの変種の作製に関連している。好ましくは、その二量体化に関連したハーフ-ドメインの領域内の1個又は複数のアミノ酸が、変更される。FokIタンパク質二量体の結晶構造において、切断ハーフ-ドメインの構造は、DNAのFokIによる切断時の切断ハーフ-ドメインの配列に類似していることが報告されている。Wahら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 10564-10569 (1998)。この構造は、483及び487位のアミノ酸残基は、FokI切断ハーフ-ドメインの二量体化において重要な役割を果たすことを示している。この構造は、446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537、及び538位のアミノ酸残基は全て、二量体化に影響を及ぼすのに十分なように二量体化界面に近いことも示している。従って1個又は複数の前述の位置でのアミノ酸配列の変更は、恐らく切断ハーフ-ドメインの二量体化特性を変更するであろう。このような変化は、例えば、これらの位置に異なるアミノ酸残基を含む(又はコードしている)ライブラリーを構築し及び所望の特性を伴う変種を選択することによるか、又は個々の変異体を理論的にデザインすることより導入することができる。ホモ二量体化の防止に加え、これらの変異の一部は、ふたつの野生型切断ハーフ-ドメインで得られるものを上回るように切断効率を増加することも可能である。
【０１３１】
従って、二量体化に影響を及ぼすいずれかのアミノ酸残基でのFokI切断ハーフ-ドメインの変更を用い、ZFP/FokI融合体の対のひとつが望ましくない配列での切断につながるホモ二量体化を受けることを防止することができる。従ってZFP/FokI融合体の対を用いる標的化された切断について、これらの融合タンパク質の一方又は両方は、自己-二量体化を阻害するが、所望の標的部位で切断が生じるようにこれらふたつの融合タンパク質のヘテロ二量体化を生じることは可能であるような、1個又は複数のアミノ酸変更を含むことができる。ある態様において、変更は、両方の融合タンパク質に存在し、かつこれらの変更は、追加の作用を有し；すなわち、異常な切断につながるいずれかの融合体のホモ二量体化は、最小化又は排除されるのに対し、これらふたつの融合タンパク質のヘテロ二量体化は、野生型切断ハーフ-ドメインで得られるものと比べ促進される。実施例5を参照のこと。
【０１３２】
ゲノム配列の標的化された変更及び標的化された組換えの方法
ゲノム配列(例えば、細胞クロマチン中の所定の領域)を相同な非-同一配列と交換する方法(すなわち、標的化された組換え)も、本明細書において説明されている。特定の配列を交換する先行する試みは、細胞の、染色体の領域と相同性を有する配列を含むポリヌクレオチド(すなわちドナーDNA)との接触、その後のドナーDNA分子がゲノム内で相同組換えを受けた細胞の選択に関連している。相同組換えの効率の悪さ及びドナーDNAの標的部位以外のゲノム領域への高頻度の非-特異的挿入のために、これらの方法の成功率は低い。
【０１３３】
本開示は、より大きい効率の標的化された組換え及びより低い頻度の非-特異的挿入事象を特徴とする、標的化された配列変更の方法を提供する。これらの方法は、細胞DNAにおいて1種又は複数の標的化された2本鎖切断を作製するための、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)に融合された操作されたジンクフィンガー結合ドメインの作製及び使用に関連している。細胞DNAにおける2本鎖切断は、相同組換えを切断部位の近傍で数千倍刺激するので、このような標的化された切断は、ゲノム内の事実上あらゆる部位での配列の変更又は交換(相同組換えにより)を可能にする。
【０１３４】
本明細書に説明された融合分子に加え、選択されたゲノム配列の標的化された交換も、交換(又はドナー)配列の導入を必要としている。ドナー配列は、融合タンパク質(複数)の発現の前に、同時に又は続けて、細胞へ導入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、それと相同性を生じるゲノム配列との間の相同組換えを支援するために、ゲノム配列と十分な相同性を有する。ドナーとゲノム配列の間の配列相同性がおよそ25、50、100又は200ヌクレオチド又はそれよりも多い(又は10〜200ヌクレオチドの間のいずれかの整数値、又はそれよりも多い)ことは、それらの間の相同組換えを支援するであろう。ドナー配列長は、10〜5,000ヌクレオチド(又はその間のヌクレオチドのいずれかの整数値)又はそれよりも長い範囲であることができる。ドナー配列は、典型的には、交換するゲノム配列とは同一ではないことは容易に明らかであろう。例えばドナーポリヌクレオチドの配列は、相同組換えを支援するのに十分な相同性が存在する限りは、ゲノム配列に関して1個又は複数の単塩基の変化、挿入、欠失、逆位又は再構成を含むことができる。あるいはドナー配列は、相同なふたつの領域が側方に位置した非-相同配列を含むことができる。加えてドナー配列は、細胞クロマチン中の所定の領域と相同でない配列を含むベクター分子を含むことができる。一般にドナー配列の相同領域(複数)は、組換えが望ましいゲノム配列と少なくとも50％の配列同一性を有する。ある態様において、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、又は99.9％の配列同一性が存在する。1％から100％の間のいずれかの値の配列同一性が、ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、存在することができる。
【０１３５】
ドナー分子は、細胞クロマチンに相同ないくつかの不連続領域を含むことができる。例えば、所定の領域中に通常存在する配列の標的化された挿入に関して、該配列は、ドナー核酸分子内に存在し、及び所定の領域の配列に相同性の領域が側方に位置することができる。
【０１３６】
ドナー配列の良好な挿入を決定するためのアッセイ(例えば、ハイブリダイゼーション、PCR、制限酵素消化)を簡略化するために、そのゲノム配列に対するある配列差異がドナー配列に存在することができる。好ましくは、このようなヌクレオチド配列差異がコード領域に位置する場合、これはアミノ酸配列を変更しないか、又はサイレントなアミノ酸変化(すなわち、タンパク質の構造又は機能に影響しない変化)を生じるであろう。相同組換えにより細胞クロマチンへ導入されるドナー配列の切断を防止するために、ドナーポリヌクレオチドは、任意に所定の領域中のジンクフィンガードメイン結合部位に相当する配列の変化を含むことができる。
【０１３７】
ドナーポリヌクレオチドは、DNA又はRNA、1本鎖又は2本鎖であることができ、並びに線状又は環状の形で細胞へ導入することができる。線状形で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法により保護される(例えば、エキソヌクレアーゼによる分解)。例えば1個又は複数のジデオキシヌクレオチド残基が、線状分子の3'末端に追加され、及び／又は自己-相補性オリゴヌクレオチドが、一方又は両方の末端に連結される。例えば、Changら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 4959-4963 (1987)；Nehlsら、Science, 272: 886-889 (1996)参照。外来性ポリヌクレオチドを分解から保護する追加の方法は、末端アミノ基(複数)の付加、及び修飾されたヌクレオチド間連結の使用、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど、及び0-メチルリボース又はデオキシリボース残基などを含むが、これらに限定されるものではない。ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードしている遺伝子のような、追加配列を有するベクター分子の一部として細胞へ導入することができる。更にドナーポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として、リポソームもしくはポロキサマーのような物質と複合体化された核酸として、導入することができるか、又はウイルス(例えばアデノウイルス、AAV)により送達することができる。
【０１３８】
ひとつの理論に結びつけられるものではないが、細胞配列中の2本鎖切断の存在は、切断に隣接する又はそれを取り囲む領域に対する相同性を有する外来性DNA分子の存在と組合せて、配列情報のドナー分子から細胞(例えば、ゲノム又は染色体)配列への移行により；すなわち、相同組換えのプロセスにより、切断を修復する細胞機序を活性化するように見える。本出願者らの方法は、有利なことに、組換えが望ましいゲノム領域に2本鎖切断を特異的に標的化するために、操作されたZFPの強力な標的化能を、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)と組合せる。
【０１３９】
染色体配列の変更のために、ドナー配列が望ましい配列変更を実現するのに十分にコピーされる限りは、ドナーの全配列が染色体にコピーされる必要はない。
【０１４０】
相同組換えによるドナー配列の挿入効率は、細胞DNA内の2本鎖切断と組換えが望ましい部位の間の距離に反比例する。別の表現をすると、2本鎖切断が望ましい組換え部位により近い場合に、より高い相同組換え効率が認められる。組換えの正確な部位が予め決定されない(例えば、望ましい組換え事象がゲノム配列の隔たりにわたり生じる)場合、ドナー核酸の長さ及び配列は、切断部位(複数)と共に、所望の組換え事象を得るように選択される。望ましい事象がゲノム配列中の単ヌクレオチド対の配列を変更するようにデザインされる場合、細胞クロマチンは、そのヌクレオチド対のいずれかの側で10,000ヌクレオチド以内で切断される。ある態様において、切断は、その配列が変更されるヌクレオチド対のいずれかの側で、500、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、又は2ヌクレオチド以内で生じるか、又は2から1,000の間の整数値のヌクレオチドで生じる。
【０１４１】
先に詳述したように、各々がジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含むふたつの融合タンパク質の結合部位は、他方の結合部位に最も近い各結合部位の端から測定して5-8又は15-18ヌクレオチド離れて配置することができ、並びに切断はこれらの結合部位の間で生じる。切断が、結合部位間の単独部位又は複数部位で生じるかどうかは重要ではなく、その理由は切断されたゲノム配列は、ドナー配列により交換されるからである。従って標的化された組換えによる単ヌクレオチド対の配列の効率的な変更に関して、これらの結合部位の間の領域の中間点は、そのヌクレオチド対の10,000ヌクレオチド以内、好ましくは1,000ヌクレオチド以内、又は500ヌクレオチド、又は200ヌクレオチド、又は100ヌクレオチド、又は50ヌクレオチド、又は20ヌクレオチド、又は10ヌクレオチド、又は5ヌクレオチド、又は2ヌクレオチド、又は1ヌクレオチド、又は所定のヌクレオチド対においてである。
【０１４２】
ある態様において、相同染色体は、ドナーポリヌクレオチドとして利用することができる。従って例えば、ヘテロ接合子内の変異の修正は、ひとつの染色体上の変異体配列に結合しかつ切断するが、相同染色体上の野生型配列は切断しないような融合タンパク質を操作することにより実現することができる。変異を生じる染色体上の2本鎖切断は、相同染色体からの野生型配列を切断された染色体にコピーし、その結果野生型配列のふたつのコピーを回復する相同性-ベースの「遺伝子変換」プロセスを刺激する。
【０１４３】
例えばRAD52エピスタシス群の一員(例えば、Rad50、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad52、Rad54、Rad54B、Mrell、XRCC2、XRCC3)、その産物は前述の遺伝子産物と相互作用する遺伝子(例えば、BRCA1、BRCA2)、及び／又はNBS1複合体中の遺伝子などの、相同組換えに関連した遺伝子の発現の活性化のための追加のZFP-機能的ドメイン融合体の使用を含むが、これらに限定されるものではない、標的化された組換えのレベルを増強し得る方法及び組成物も提供される。同様にZFP-機能的ドメイン融合体を、本明細書に明らかにされた方法及び組成物と組合せて使用し、非-相同末端連結に関連した遺伝子(例えば、Ku70/80、XRCC4、ポリ(ADPリボース)ポリメラーゼ、DNAリガーゼ4)の発現を抑制することができる。例えばYanezら、Gene Therapy, 5: 149-159 (1998)；Hoeijmakers, Nature, 411: 366-374 (2001)；Johnsonら、Biochem. Soc. Trans., 29: 196-201 (2001)；Tauchiら、Oncogene, 21: 8967-8980 (2002)参照。ジンクフィンガー結合ドメインと機能的ドメインの間の融合を使用する遺伝子発現の活性化及び抑制の方法は、共有の米国特許第6,534,261号に開示されている。追加の抑制法は、抑制されるべき遺伝子配列に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は低分子干渉RNA(siRNA又はRNAi)の使用を含む。
【０１４４】
相同組換えに関連した遺伝子産物の発現の活性化の代わりに又はこれに加えて、所定の領域に標的化されたジンクフィンガー結合ドメインとのこれらのタンパク質(又はそれらの機能的断片)の融合体を使用し、これらのタンパク質(組換えタンパク質)を所定の領域へ動員し、これによりそれらの局所的濃度を増大し、更に相同組換えプロセスを刺激することができる。あるいは、前述の相同組換えに関連したポリペプチド(又はそれらの機能的断片)は、ジンクフィンガー結合ドメイン、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)及び組換えタンパク質(又はそれらの機能的断片)を含む三重融合タンパク質の一部であることができる。前述の方法及び組成物において使用することができる遺伝子変換及び組換え-関連したクロマチンリモデリングに関与した追加のタンパク質は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(例えば、Esa1p、Tip60)、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(例えば、Dot1p)、ヒストンキナーゼ及びヒストンホスファターゼを含む。
【０１４５】
p53タンパク質は、相同組換え(HR)の抑制において中心的役割を果たすことが報告されている。例えば、Valerieら、Oncogene, 22: 5792-5812 (2003)；Janzら、Oncogene, 21: 5929-5933 (2002)参照。例えばp53-欠損ヒト腫瘍株のHR率は、初代ヒト線維芽細胞よりも10,000-倍大きく、非-機能的p53を伴う腫瘍と機能的p53を伴う腫瘍との比較では、腫瘍細胞におけるHRの100-倍の増加が存在する。Mekeelら、Oncogene, 14: 1847-1857 (1997)。加えてp53ドミナントネガティブ変異体の過剰発現は、自然組換えの20-倍の増加につながる。Bertrandら、Oncogene, 14: 1117-1122 (1997)。異なるp53変異の分析は、転写トランス活性化及びG1細胞周期チェックポイント制御におけるp53の役割は、HRにおけるその関与から分離することができることを明らかにしている。Saintignyら、Oncogene, 18: 3553-3563 (1999)；Boehdenら、Oncogene, 22: 4111-4117 (2003)。従ってp53活性のダウンレギュレーションは、本明細書に開示された方法及び組成物を使用し標的化された相同組換えの効率を増加するために利用することができる。例えば共有の米国特許第6,534,261号に開示された方法に従う、p53ドミナントネガティブ変異体の同時トランスフェクション及び過剰発現又はp53遺伝子発現の標的化された抑制を含むが、これらに限定されるものではない、p53活性をダウンレギュレーションする方法を使用することができる。
【０１４６】
ジンクフィンガー/ヌクレアーゼ融合分子及びドナーDNA分子を含む細胞における、標的化された組換えの効率の更なる増加は、相同性-駆動された修復プロセスが最大に活性化されている場合、細胞周期G2相で細胞をブロックすることにより実現される。このような停止は、多くの方法により実現することができる。例えば細胞は、G2相で細胞を停止するように細胞周期の進行に影響を及ぼす、例えば薬物、化合物及び／又は小型分子などで処理することができる。この種の分子の例は、微小管重合に影響する化合物(例えば、ビンブラスチン、ノコダゾール、タキソール)、DNAと相互作用する化合物(例えば、cis-白金(II)ジアミンジクロリド、シスプラチン、ドキソルビシン)及び／又はDNA合成に作用する化合物(例えば、チミジン、ヒドロキシ尿素、L-ミモシン、エトポシド、5-フルオロウラシル)を含むが、これらに限定されるものではない。組換え効率の更なる増加は、細胞組換え機構によりアクセス可能なゲノムDNAを作製するようにクロマチン構造を変更するヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤(例えば、酪酸ナトリウム、トリコスタチンA)の使用により実現される。
【０１４７】
細胞周期停止の追加の方法は、例えば、そのタンパク質をコードしているcDNAの細胞への導入、又はそのタンパク質をコードしている遺伝子の発現を活性化する操作されたZFPの細胞への導入による、CDK細胞周期キナーゼ活性を阻害するタンパク質の過剰発現を含む。細胞周期停止は、例えば、RNAi法(例えば米国特許第6,506,559号)の使用、又は例えばサイクリン及び／もしくはCDK遺伝子のような、細胞周期進行に関連した1種又は複数の遺伝子の発現を抑制する操作されたZFPの細胞への導入などによる、サイクリン及びCDKの活性の阻害によっても実現することができる。遺伝子発現の調節のための操作されたジンクフィンガータンパク質の合成法については、例えば共有の米国特許第6,534,261号を参照のこと。
【０１４８】
あるいはある場合において、標的化された切断は、ドナーポリヌクレオチド(好ましくはS又はG2相)の非存在において行われ、及び組換えは相同染色体間で生じる。
【０１４９】
相同組換えを促進する細胞因子のスクリーニング法
相同組換えは、DNA末端の修飾及びいくつかの細胞因子のタンパク質複合体への動員が必要である多-工程プロセスであるので、ドナーDNA及びジンクフィンガー-切断ドメイン融合体をコードしているベクターと共に、1種又は複数の外来性因子を追加することは、標的化された相同組換えを促進するために使用することができる。このような1種又は複数の因子を同定する例証的方法は、異なる細胞のmRNA発現パターンを比較するためにマイクロアレイ(例えば、Affymetrix Gene Chip（登録商標）アレイ)を使用する遺伝子発現の分析を使用する。例えばドナーDNA及びジンクフィンガー-切断ドメイン融合体の存在下での2本鎖切断-駆動された相同組換えを刺激するより高い能力を示す細胞は、助けを受けないか又は遺伝子修正のレベルを増加することがわかっている条件下のいずれかにおいて、それらの遺伝子発現パターンについて、そのような能力を欠いた細胞と比較し分析することができる。相同組換えの増加したレベルと直接相関する方法でアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされた遺伝子は、これにより同定され、及び多くの発現ベクターのひとつにクローニングすることができる。これらの発現構築体は、ジンクフィンガー-切断ドメイン融合体及びドナー構築体と共に同時-トランスフェクションされ、高効率の相同組換えを実現する改善された方法を生じることができる。あるいは、このような遺伝子の発現は、1種又は複数のこれらの遺伝子の発現(活性化又は抑制のいずれか)を変調する操作されたジンクフィンガータンパク質を用い、適宜調節することができる。遺伝子発現を調節するための操作されたジンクフィンガータンパク質の合成法については、例えば共有の米国特許第6,534,261号を参照のこと。
【０１５０】
例として、ドナーDNA及びジンクフィンガー-切断ドメイン融合体をコードしているプラスミドによりトランスフェクションされた場合、広範な相同組換え頻度が示された実施例9及び図27に説明された実験において、異なるクローンが得られることが認められた。従って高頻度の標的化された組換えを示すクローンにおける遺伝子発現は、低頻度を示すクローンのそれと比較することができ、及び前者のクローンに特有の発現パターンを同定することができる。
【０１５１】
追加例として、細胞周期阻害剤(例えば、ノコダゾール又はビンブラスチン、例えば、実施例11、14及び15を参照)を用いる試験は、細胞周期のG2相で停止された細胞は、より高い率で相同組換えを実行することを示し、このことは相同組換えに寄与する細胞因子は、G2において優先的に発現されるか又は活性化されることを示唆している。これらの因子を同定するひとつの方法は、高及び低レベルで遺伝子修正を実行する安定してトランスフェクションされたHEK293細胞クローン(例えば、クローンT18、対、クローンT7)の間で、mRNA発現パターンを比較することである。同様の比較は、G2相で細胞を停止する化合物に反応するこれらの細胞株間で行われる。相同組換えを高効率で実行する細胞において示差的に発現された候補遺伝子は、助けを受けないか又はG2において細胞を停止する化合物に反応するかのいずれかにおいて、同定され、クローニングされ、及び細胞へ再-導入され、それらの発現が、改善された率で再現するのに十分であるかどうかが決定される。あるいは該候補遺伝子の発現は、操作されたジンクフィンガー転写因子を用いて活性化され、これは例えば共有の米国特許第6,534,261号に開示されている。
【０１５２】
発現ベクター
1種又は複数のZFP又はZFP融合タンパク質をコードしている核酸は、複製及び／又は発現のために原核細胞又は真核細胞へ形質転換するためのベクターにクローニングすることができる。ベクターは、原核細胞ベクター、例えば、プラスミド、又はシャトルベクター、昆虫ベクター、又は真核細胞ベクターであることができる。ZFPをコードしている核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は原生動物細胞に投与するために、発現ベクターにもクローニングすることもできる。
【０１５３】
クローニングされた遺伝子又は核酸の発現を得るために、ZFP又はZFP融合タンパク質をコードしている配列は、典型的には、転写を指示するために、プロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングされる。適当な細菌及び真核細胞プロモーターが当該技術分野において周知であり、並びに例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第2版、1989；第3版、2001)；Kriegler、Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；及び、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら、前掲)に説明されている。ZFPを発現するための細菌発現システムは、例えばE. coli、Bacillus種、及びSalmonellaにおいて入手可能である(Palvaら、Gene, 22:229-235 (1983))。このような発現システムのキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、及び昆虫細胞のための真核細胞発現システムは、当業者に周知であり、同じく市販されている。
【０１５４】
ZFP-コードしている核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、具体的適用により決まる。例えば強力な構成的プロモーターは典型的には、ZFPの発現及び精製のために使用される。対照的にZFPが遺伝子調節のためにin vivo投与される場合、ZFPの具体的使用に応じて、構成的又は誘導的プロモーターのいずれかが使用される。加えてZFPの投与に好ましいプロモーターは、HSV TKなどの弱いプロモーター又は同様の活性を有するプロモーターであることができる。プロモーターは典型的には、例えば、低酸素反応エレメント、Gal4反応エレメント、lacリプレッサー反応エレメントなどの、トランス活性化に寄与するエレメント、並びにtet-調節されたシステム及びRU-486システムのような小型分子制御システムを含むこともできる(例えば、Gossen & Bujard、PNAS, 89: 5547 (1992)；Oliginoら、Gene Ther., 5: 491-496 (1998)；Wangら、Gene Ther., 4: 432-441 (1997)；Neeringら、Blood, 88: 1147-1155 (1996)；及び、Rendahlら、Nat. Biotechnol., 16: 757-761 (1998)参照)。MNDU3プロモーターも使用することができ、及びCD34+造血幹細胞において優先的に活性化する。
【０１５５】
発現ベクターは典型的には、プロモーターに加え、原核細胞又は真核細胞のいずれかの宿主細胞における核酸の発現に必要な追加エレメントの全てを含む転写単位又は発現カセットを含む。従って典型的発現カセットは、例えばZFP、及び例えば転写産物の効率的ポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、又は翻訳終結のために必要なシグナルをコードしている核酸配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。このカセットの追加のエレメントは、例えばエンハンサー及び異種スプライシングシグナルを含むことができる。
【０１５６】
遺伝子情報の細胞への輸送に使用される特定の発現ベクターは、ZFPの意図された用途、例えば植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関して選択される(以下に説明された発現ベクターを参照)。標準の細菌発現ベクターは、pBR322-ベースのプラスミド、pSKF、pET23Dなどのプラスミド、並びにGST及びLacZのような市販の融合体発現システムを含む。例証的融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質「MBP」である。このような融合タンパク質がZFPの精製に使用される。発現のモニタリング、並びに細胞及び細胞下局在のモニタリングのために通常の単離法を提供するために、例えばc-myc又はFLAGなどの、エピトープタグも、組換えタンパク質に追加することができる。
【０１５７】
例えば、SV40ベクター、パピローマウイルスベクター、及びエプスタイン-バーウイルス由来のベクターなどの、真核細胞ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、真核細胞発現ベクターにおいて繁用される。他の例証的真核細胞ベクターは、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、及びSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター又は真核細胞における発現について有効であることが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にするいずれか他のベクターを含む。
【０１５８】
一部の発現システムは、安定してトランスフェクションされた細胞株の選択のためのマーカー、例えばチミジンキナーゼ、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸還元酵素などを有する。ポリヘドリンプロモーター又は他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示の下で、ZFPコード配列と共に、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用するような、高収率の発現システムも適している。
【０１５９】
典型的には発現ベクターに含まれるこれらのエレメントは、E. coliにおいて機能するレプリコン、組換えプラスミドを抱える細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードしている遺伝子、及び組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域の独自の制限部位も含む。
【０１６０】
標準のトランスフェクション法を用い、標準技術を用い後に精製される大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳類、酵母又は昆虫の細胞株が作製される(例えば、Colleyら、J. Biol. Chem., 264: 17619-17622 (1989)；Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, 182巻(Deutscher編集、1990)参照)。真核細胞及び原核細胞の形質転換は、標準技術に従い実行される(例えばMorrison, J. Bact., 132: 349-351 (1977)；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology, 101: 347-362(Wuら編集、1983)参照)。
【０１６１】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入する周知の手法のいずれかを使用することができる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、超音波法(例えば、ソノポレーション)、リポソーム、微量注入、ネイキッドDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソーム性及び組込みの両方、並びにクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAもしくは他の外来遺伝物質を宿主細胞へ導入する他の周知の方法のいずれかの使用を含む(例えば、Sambrookら、前掲参照)。使用される特定の遺伝子操作手法は、少なくとも1種の遺伝子を選択されたタンパク質を発現可能な宿主細胞へうまく導入することが可能であることのみが必要である。
【０１６２】
融合タンパク質をコードしている核酸及び細胞への送達
通常のウイルス及び非-ウイルスベースの遺伝子導入法を用い、操作されたZFPをコードしている核酸を、細胞(例えば哺乳類細胞)及び標的組織へ導入することができる。このような方法は、ZFPをコードしている核酸の細胞へのin vitro投与にも使用することができる。ある態様において、ZFPをコードしている核酸は、in vivo又はex vivo遺伝子治療の用途のために投与される。非-ウイルスベクター送達システムは、DNAプラスミド、ネイキッド核酸、及びリポソーム又はポロキサマーなどの送達ビヒクルに複合された核酸を含む。ウイルスベクター送達システムは、細胞への送達後エピソーム性又は組込まれたゲノムのいずれかを有する、DNA及びRNAウイルスを含む。遺伝子治療手法の検証については、Anderson, Science, 256: 808-813 (1992)；Nabel & Felgner, TIBTECH, 11: 211-217 (1993)；Mitani & Caskey, TIBTECH, 11: 162-166 (1993)；Dillon, TIBTECH, 11: 167-175 (1993)；Miller, Nature, 357: 455-460 (1992)；Van Brunt, Biotechnology, 6(10): 1149-1154 (1988)；Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience, 8: 35-36 (1995)；Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin, 51(1): 31-44 (1995)；Haddadaら、Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm(編集)(1995)；及び、Yuら、Gene Therapy, 1:13-26 (1994)を参照のこと。
【０１６３】
操作されたZFPをコードしている核酸の非-ウイルス送達法は、電気穿孔、リポフェクション、微量注入、遺伝子銃、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質:核酸複合体、ネイキッドDNA、人工ビリオン、及び物質-増強されたDNA取込みを含む。例えばSonitron 2000システム(Rich-Mar)を用いるソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。
【０１６４】
核酸送達システムの追加例は、Amaxa Biosystems(Cologne, 独国)、Maxcyte, Inc.(Rockville, MD)及びBTX Molecular Delivery Systems(Holliston, MA)により提供されるものを含む。
【０１６５】
リポフェクションは、例えば米国特許第5,049,386号、第4,946,787号；及び第4,897,355号に開示されており、リポフェクション試薬は市販されている(例えば、Transfectam(商標)及びLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的受容体-認識リポフェクションに適しているカチオン性及び中性脂質は、Felgnerの国際公開公報第91/17424号、第91/16024号に開示されたものを含む。送達は、細胞(ex vivo投与)又は標的組織(in vivo投与)へであることができる。
【０１６６】
免疫脂質複合体のような標的化されたリポソームを含む、脂質:核酸複合体の調製は、当業者に周知である(例えば、Crystal, Science, 270: 404-410 (1995)；Blaeseら、Cancer Gene Ther., 2: 291-297 (1995)；Behrら、Bioconjugate Chem., 5: 382-389 (1994)；Remyら、Bioconjugate Chem., 5: 647-654 (1994)；Gaoら、Gene Therapy, 2: 710-722 (1995)；Ahmadら、, Cancer Res., 52: 4817-4820 (1992)；米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、及び第4,946,787号参照)。
【０１６７】
操作されたZFPをコードしている核酸の送達のためのRNA又はDNAウイルスベースのシステムの使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し及びウイルスの搭載(payload)を核へ送る高度に進展されたプロセスを利用する。ウイルスベクターは、直接患者(in vivo)へ投与するか、又はこれらは細胞をin vitro処理するために使用することができ、修飾された細胞が患者へ投与される(ex vivo)。ZFPを送達する通常のウイルスベースのシステムは、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ-随伴、ワクシニア及び単純ヘルペスウイルスのベクターを含むが、これらに限定されるものではない。レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ-随伴ウイルス遺伝子導入法により、宿主ゲノム中の組込みが可能であり、しばしば挿入された導入遺伝子の長期発現を生じる。加えて多くの異なる細胞型及び標的組織において、高い導入効率が認められる。
【０１６８】
レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質の組込み、標的細胞の可能性のある標的集団の増殖により変更することができる。レンチウイルスベクターは、非-分裂細胞の導入又は感染ができるレトロウイルスベクターであり、典型的には高いウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織によって決まる。レトロウイルスベクターは、最大6-10kbの外来配列のパッケージング能を伴う、cis-活性化長末端反復配列で構成される。最小のcis-活性化LTRは、ベクターの複製及びパッケージングには十分であり、これはその後治療的遺伝子の標的細胞への組込に使用され、永久導入遺伝子の発現を提供する。広範に使用されるレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(MuLV)、ギボンサル白血病ウイルス(GaLV)、シミアン免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)及びそれらの組合せをベースにしたものを含む(例えば、Buchscherら、J. Virol., 66: 2731-2739 (1992)；Johannら、J. Virol., 66: 1635-1640 (1992)；Sommerfeltら、Virol., 176: 58-59 (1990)；Wilsonら、J. Virol., 63: 2374-2378 (1989)；Millerら、J. Virol., 65: 2220-2224 (1991)；PCT/US94/05700参照)。
【０１６９】
ZFP融合タンパク質の一過性発現が好ましいような適用において、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターにより、高い力価及び高い発現レベルが得られる。このベクターは、比較的簡単なシステムにおいて大量に作製することができる。アデノ-随伴ウイルス(「AAV」)ベクターも、例えば、核酸及びペプチドのin vitro生成において、並びにin vivo及びex vivo遺伝子治療法のために、標的核酸の細胞への導入に使用される(例えば、Westら、Virology, 160: 38-47 (1987)；米国特許第4,797,368号；国際公開公報第 93/24641号；Kotin, Human Gene Therapy, 5: 793-801 (1994)；Muzyczka, J. Clin. Invest., 94: 1351 (1994)参照)。組換えAAVベクターの構築は、多くの刊行物に説明されており、これは米国特許第5,173,414号；Tratschinら、Mol. Cell. Biol., 5: 3251-3260 (1985)；Tratschinら、Mol. Cell. Biol., 4: 2072-2081 (1984)；Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6466-6470 (1984)；及び、Samulskiら、J Virol., 63: 03822-3828 (1989)を含む。
【０１７０】
少なくとも6種のウイルスベクターの方法が、遺伝子導入の臨床試験において現在利用可能であり、これらは導入物質を生成するためのヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの補完が関連している方法を利用する。
【０１７１】
pLASN及びMFG-Sは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例である(Dunbarら、Blood, 85: 3048-305 (1995)；Kohnら、Nat. Med., 1: 1017-102 (1995)；Malechら、PNAS, 94: 22 12133-12138 (1997))。PA317/pLASNは、遺伝子治療の治験において使用された最初の治療用ベクターであった(Blaeseら、Science, 270: 475-480 (1995))。MFG-Sパッケージしたベクターに関して、50％以上の導入効率が認められた(Ellemら、Immunol Immunother., 44(1): 10- 20 (1997)；Dranoffら、Hum. Gene Ther., 1: 111-2 (1997))。
【０１７２】
組換えアデノ-随伴ウイルスベクター(rAAV)は、欠損及び非病因性のパルボウイルスアデノ-随伴2型ウイルスを基にした見込みのある代わりの遺伝子送達システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットの側方に位置したAAVの145bp逆方向末端反復配列のみを保持するプラスミドに由来している。導入された細胞のゲノムへの組込みに起因した有効な遺伝子導入及び安定した導入遺伝子送達は、このベクターシステムの重要な特徴である(Wagnerら、Lancet, 351: 9117 1702-3 (1998)；Kearnsら、Gene Ther., 9: 748-55 (1996))。
【０１７３】
複製-欠損組換えアデノウイルスベクター(Ad)は、高力価で作製され、及び多くの異なる細胞型に容易に感染することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子が、Ad E1a、E1b及び／又はE3遺伝子を交換し；引き続き複製欠損ベクターが、欠失された遺伝子機能をトランスで供給するヒト293細胞において増殖されるように操作される。Adベクターは、肝臓、腎臓及び筋肉において認められるもののような、分裂していない分化した細胞を含み、in vivoにおいて複数の型の組織を導入することができる。通常のAdベクターは、大きい運搬能を有する。臨床試験におけるAdベクターの使用例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫処置のためのポリヌクレオチド治療が関連している(Stermanら、Hum. Gene Ther., 7: 1083-9 (1998))。臨床試験における遺伝子導入に関するアデノウイルベクターの使用の追加例は、Roseneckerら、Infection, 24: 1 5-10 (1996)；Stermanら、Hum. Gene Ther., 9: 7 1083-1089 (1998)；Welshら、Hum. Gene Ther., 2: 205-18 (1995)；Alvarezら、Hum. Gene Ther., 5: 597-613 (1997)；Topfら、Gene Ther., 5: 507-513 (1998)；Stermanら、Hum. Gene Ther., 7: 1083-1089 (1998)の論文を含む。
【０１７４】
パッケージング細胞を使用し、宿主細胞の感染が可能であるウイルス粒子を形成する。このような細胞は、アデノウイルスをパッケージしている293細胞、及びレトロウイルスをパッケージしているΨ2細胞又はPA317細胞がある。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子へパッケージするプロデューサー細胞株により作製される。これらのベクターは典型的には、パッケージング及びその後の宿主への組込み(適用される場合)に必要な最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列が、発現されるタンパク質をコードしている発現カセットにより交換される。ウイルス機能の喪失は、パッケージング細胞株によりトランスで供給される。例えば遺伝子治療において使用されるAAVベクターは典型的には、宿主ゲノムへのパッケージング及び組込みに必要なAAVゲノム由来の逆方向末端反復(ITR)配列を有するのみである。ウイルスDNAは、細胞株にパッケージされ、これは他のAAV遺伝子、すなわちrep及びcapをコードしているが、ITR配列を欠いている、ヘルパープラスミドを含む。この細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスによっても感染されている。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製及びヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠損のために、著しい量パッケージされない。アデノウイルスの夾雑は、例えばアデノウイルスがAAVよりも感受性が高熱による処理により低下することができる。
【０１７５】
多くの遺伝子治療の適用において、遺伝子治療ベクターは、特定の組織型に対し高度の特異性を伴い送達されることが望ましい。従ってウイルスベクターは、ウイルスの外面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することにより、所定の細胞型に対し特異性を有するように修飾することができる。このリガンドは、所定の細胞型に存在することがわかっている受容体に親和性を有するように選択される。例えばHanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 9747-9751 (1995)は、モロニーマウス白血病ウイルスは、gp70に融合したヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、この組換えウイルスは、ヒト上皮細胞増殖因子受容体を発現しているある種のヒト乳癌細胞に感染することを報告している。この原理は、他のウイルス-標的細胞対に拡大することができ、ここで標的細胞は受容体を発現し、及びウイルスは細胞-表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現している。例えば線維状ファージは、事実上あらゆる選択された細胞受容体に特異的結合親和性を有する抗体断片(例えばFAB又はFv)をディスプレイするように操作することができる。前述の説明は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を、非ウイルスベクターに適用することができる。このようなベクターは、特異的標的細胞による取込みに好ましい特異的取込み配列を含むように操作することができる。
【０１７６】
遺伝子治療ベクターは、個々の患者への投与により、典型的には以下に説明にするように、全身投与(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、又は頭蓋内注入により)又は局所的投与により、in vivo送達することができる。あるいは、ベクターは、個々の患者から外移植された細胞(例えばリンパ球、骨髄吸引液、組織生検)又は普遍的な(universal)ドナー造血幹細胞などの細胞へex vivoで送達し、その後これらの細胞を患者へ、通常ベクターが組込まれた細胞の選択後に、再移植することができる。
【０１７７】
診断、研究又は遺伝子治療(例えば、トランスフェクションされた細胞の宿主生物への再注入による)のための、ex vivo細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい態様において、細胞は、対象生物から単離され、ZFP核酸(遺伝子又はcDNA)でトランスフェクションされ、及び対象生物(例えば患者)へ再注入されている。Ex vivoトランスフェクションに適した様々な細胞型は、当業者に周知である(例えば、Freshneyら、Culture of Animal Cell, A Manual of Basic Technique (第3版、1994)参照)、並びに患者からの細胞の単離及び培養法の考察のためにそこに引用された参考文献)。
【０１７８】
ひとつの態様において、幹細胞が、細胞トランスフェクション及び遺伝子治療のためにex vivo手法において使用される。幹細胞を使用する利点は、これらは他の細胞型にin vitroにおいて分化するか、又は哺乳類(例えばその細胞のドナー)へ導入し、その骨髄で生着することができることである。GM-CSF、IFN-γ及びTNF-αなどのサイトカイン類を使用し、CD34+細胞をin vitroにおいて臨床的に重要な免疫細胞型へ分化する方法は、公知である(Inabaら、J. Exp. Med., 176: 1693-1702 (1992)参照)。
【０１７９】
幹細胞は、公知の方法を使用する導入及び分化のために単離されている。例えば幹細胞は、CD4+及びCD8+(T細胞)、CD45+(panB細胞)、GR-1(顆粒球)、及びIad(分化した抗原提示細胞)などの望ましくない細胞を結合する抗体による骨髄細胞のパンニングにより骨髄細胞から単離される(Inabaら、J. Exp. Med., 176: 1693-1702 (1992)参照)。
【０１８０】
治療的ZFP核酸を含むベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど)も、細胞のin vivo形質導入のために、直接生物へ投与することができる。あるいはネイキッドDNAを投与することができる。投与は、注射、注入、局所的適用及び電気穿孔を含むが、これらに限定されるものではない、血液又は組織細胞との最終的接触への分子の導入に通常使用されるいずれかの経路による。このような核酸の投与の適当な方法は、利用可能であり、当業者に周知であるが、1種よりも多い経路を使用し特定の組成物を投与することができ、特定の経路が、他の経路よりもより迅速かつより有効な反応を提供することができることが多い。
【０１８１】
DNAを造血幹細胞へ導入する方法は、例えば米国特許第5,928,638号において開示されている。
【０１８２】
医薬として許容される担体は、一部は、投与される具体的組成物、更には組成物の投与に使用される具体的方法により決定される。従って以下に説明されるような、利用可能な医薬組成物の多種多様な適当な製剤が存在する(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第17版、1989参照)。
【０１８３】
DNA構築体は、様々な通常の技術により、望ましい植物宿主のゲノムへ導入することができる。このような技術の検証については、例えばWeissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, NY)、第VIII節、pp.421-463；及び、Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988、第2版), Blackie, London, 第7-9章を参照のこと。例えばDNA構築体は、植物細胞プロトプラストの電気穿孔及び微量注入などの技術を用い、植物細胞のゲノムDNAへ直接導入するか、又はDNA構築体を、植物組織へDNA粒子衝突などの遺伝子銃法を用い直接導入することができる(例えば、Kleinら、Nature, 327: 70-73 (1987)参照)。あるいはDNA構築体は、適当なT-DNAフランキング領域と組合せ、かつ通常のAgrobacterium tumefaciens宿主ベクターへ導入することができる。不活化(disarming)及びバイナリーベクターの使用を含むAgrobacterium tumefaciens-媒介型技術は、科学文献においてよく説明されている。例えば Horschら、Science, 233 : 496-498 (1984)、及びFraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803 (1983)を参照のこと。Agrobacterium tumefaciens宿主の病原性機能は、バイナリーT DNAベクター(Bevan, Nuc. Acid Res., 12: 8711-8721(1984))又は同時培養手法(Horsch, Science, 227: 1229-1231 (1985))を用い細胞が細菌により感染された場合に、構築体及び隣接マーカーの植物細胞DNAへの挿入を指示するであろう。一般にAgrobacterium形質転換システムを用い、双子葉植物を操作することができる(Bevanら、Ann. Rev. Genet, 16: 357-384 (1982)；Rogers, Methods Enzymol., 118: 627-641 (1986))。Agrobacterium形質転換システムを用い、形質転換することに加え、DNAを単子葉植物及び植物細胞へ導入してもよい。Hernalsteenら、EMBO J, 3: 3039-3041 (1984)；Hooykass-Van Slogterenら、Nature, 311: 763-764 (1984)；Grimsleyら、Nature, 325: 1677-179 (1987)；Boultonら、Plant Mol. Biol., 12: 31-40 (1989)；及び、Gouldら、Plant Physiol., 95: 426-434 (1991)参照。
【０１８４】
選択遺伝子導入及び形質転換の方法は、ネイキッドDNAのカルシウム-、ポリエチレングリコール(PEG)-又は電気穿孔-媒介型取込みによる、プロトプラスト形質転換(Paszkowskiら、EMBO J, 3: 2717-2722 (1984)；Potrykusら、Molec. Gen. Genet., 199: 169-177 (1985)；Frommら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 5824-5828 (1985)；及び、Shimamoto, Nature, 338: 274-276 (1989)参照)並びに植物組織の電気穿孔(D'Halluinら、Plant Cell, 4: 1495-1505 (1992))を含むが、これらに限定されるものではない。植物細胞の形質転換の追加の方法は、微量注入、シリコンカーバイド媒介型DNA取込みを含む(Kaepplerら、Plant Cell Reporter, 9: 415-418 (1990))、及び微量注入可能な遺伝子衝突(Kleinら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 4305-4309 (1988)；及び、Gordon-Kammら、Plant Cell, 2: 603-618 (1990)参照)。
【０１８５】
開示された方法及び組成物を用い、外来性配列を植物細胞ゲノムの予め決定された位置へ挿入することができる。これは、植物ゲノムへ導入された導入遺伝子の発現は、その組込み部位に大きく左右されるので、有用である。従って例えば栄養素、抗生物質又は治療的分子をコードしている遺伝子は、標的化された組換えにより、それらの発現に好ましい植物ゲノムの領域へ挿入することができる。
【０１８６】
先の形質転換技術のいずれかにより作製された形質転換された植物細胞は、形質転換された遺伝子型を有し、その結果望ましい表現型を有する植物体全体を再生するように培養することができる。このような再生技術は、組織培養増殖培地中のある種の植物ホルモンの操作に頼り、典型的には所望のヌクレオチド配列と共に導入されている殺虫剤及び／又は除草剤マーカーに頼っている。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evansら、「Protoplasts Isolation and Culture」、Handbook of Plant Cekll Culture、pp.124-176, Macmillian Publishing Company, NY, 1983；及び、合本「Regeneration of Plants, Plant Protoplasts」、pp.21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985に記載されている。再生は、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚又はそれらの一部から得ることもできる。このような再生技術は、一般にKleeら、 Ann. Rev. of Plant Phys., 38: 467-486 (1987)に記載されている。
【０１８７】
植物細胞へ導入された核酸を使用し、本質的にあらゆる植物に所望の形質を付与することができる。多種多様な植物及び植物細胞システムを、本開示の核酸構築体及び前述の様々な形質転換法を用い、本明細書に説明された所望の生理学的及び農学的特徴のために操作することができる。好ましい態様において、操作するための標的植物及び植物細胞は、単子葉植物及び双子葉植物、例えば穀類(例えばコムギ、トウモロコシ、コメ、キビ、オオムギ)、果実作物(例えば、トマト、リンゴ、ナシ、ストロベリー、オレンジ)、飼料作物(例えばアルファルファ)、根菜作物(例えばニンジン、ジャガイモ、テンサイ、ヤムイモ)、葉菜作物(例えばレタス、ホウレンソウ)を含む作物；顕花植物(例えばペチュニア、バラ、キク)、針葉植物及びマツ科の木(例えばマツ、モミ、トウヒ)；ファイトレメディエーションとして使用される植物(例えば重金属蓄積植物)；油料作物(例えばヒマワリ、ナタネ)及び実験目的に使用される植物(例えばArabidopsis)を含むが、これらに限定されるものではない。従って開示された方法及び組成物は、アスパラガス(Asparagus)、カラスムギ(Avena)、アブラナ(Brassica)、シトラス(Citrus)、柑橘類(Citrullus)、唐辛子(Capsicum)、ウリ(Cucurbita)、ニンジン(Daucus)、ダイズ(Glycine)、オオムギ(Hordeum)、アキノノゲシ(Lactuca)、トマト(Lycopersicon)、リンゴ(Malus)、トロロアオイ(Manihot)、タバコ(Nicotiana)、コメ(Oryza)、アボガド(Persea)、エンドウマメ(Pisum)、ラフランス(Pyrus)、モモ(Prunus)、ダイコン(Raphanus)、ライムギ(Secale)、ナス(Solanum)、モロコシ(Sorghum)、コムギ(Triticum)、ブドウ(Vitis)、アズキ(Vigna)、及びトウモロコシ(Zea)などの属の種を含むが、これらに限定されるものではない、広範な植物に使用することができる。
【０１８８】
当業者は、発現カセットがトランスジェニック植物に安定して組込まれ及び機能することが確認された後に、有性交配により、他の植物に導入することができることは認めるであろう。交配される種に応じて、多くの標準繁殖技術のいずれかを使用することができる。
【０１８９】
形質転換された植物細胞、カルス、組織又は植物体は、形質転換するDNA上に存在するマーカー遺伝子によりコードされた形質について操作された植物材料の選択又はスクリーニングにより同定及び単離される。例えば、選択は、形質転換遺伝子構築体が耐性を付与する抗生物質又は除草剤の阻害量を含有する培地上での、操作された植物材料の増殖により行うことができる。更に形質転換された植物及び植物細胞は、組換え核酸構築体上に存在することができる目視可能なマーカー遺伝子(例えば、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、B又はC1遺伝子)の活性のスクリーニングにより同定することもできる。このような選択及びスクリーニング法は、当業者に周知である。
【０１９０】
挿入された遺伝子構築体を含む植物又は植物細胞の形質転換体を同定するために、生理的及び生化学的方法も使用することができる。これらの方法は、1)組換えDNA挿入断片の構造を検出及び決定するためのサザン分析又はPCR増幅；2)遺伝子構築体のRNA転写産物を検出及び決定するためのノーザンブロット、S1 RNase保護、プライマー-伸長又は逆転写酵素-PCR増幅；3)そのような遺伝子産物が遺伝子構築体によりコードされている場合の、酵素又はリボザイムの活性を検出するための酵素アッセイ；4)遺伝子構築体産物がタンパク質である場合の、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット技術、免疫沈降、又は酵素-結合イムノアッセイを含むが、これらに限定されるものではない。インサイチュハイブリダイゼーション、酵素染色、及び免疫染色などの追加の技術も、特定の植物器官及び組織における組換え構築体の存在又は発現を検出するために使用することができる。これらのアッセイ全てを行うための方法は、当業者に周知である。
【０１９１】
本明細書に開示された方法を用いる遺伝子操作の作用は、例えば、所定の組織から単離されたRNA(例えば、mRNA)のノーザンブロットにより認められる。典型的には、mRNAの量が増加した場合は、対応する内在性遺伝子は、以前よりもより大きい割合で発現されると推定することができる。遺伝子及び／又はCYP74B活性を測定する他の方法を使用することができる。様々な種類の酵素アッセイを、使用される基質及び反応生成物又は副産物の増加又は減少を検出する方法に応じて、使用することができる。加えて発現されたCYP74Bタンパク質のレベルを、免疫化学的に、すなわち、ELISA、RIA、EIA及び当業者に周知の他の抗体ベースのアッセイ、例えば電気泳動検出アッセイ(染色又はウェスタンブロットのいずれか)により、測定することができる。この導入遺伝子は、植物の一部の組織においてもしくは一部の発達段階で選択的に発現されるか、又はこの導入遺伝子は、実質的に全ての植物組織において、実質的にその全生活環において発現され得る。しかしコンビナトリアル発現様式も適用可能である。
【０１９２】
本開示は、種子が導入遺伝子又は遺伝子構築体を有するような先に説明されたトランスジェニック植物の種子も包含している。本開示は更に、先に説明されたトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株又は細胞を包含し、ここで該子孫、クローン、細胞株又は細胞は、導入遺伝子又は遺伝子構築体を有する。
【０１９３】
送達ビヒクル
ZFP融合タンパク質などのポリペプチド化合物の投与における重要な因子は、このポリペプチドが、細胞の形質膜、又は核のような細胞内区画の膜を横断する能力を有することを保証することである。細胞膜は、小型、非イオン性親油性化合物は自在に透過し、かつ極性化合物、巨大分子、及び治療的又は予防的物質に対しては本来の非透過性である、脂質-タンパク質二層で構成されている。しかしZFPのようなポリペプチドが細胞膜を超えて移行する能力を有する、タンパク質及びリポソームのような他の化合物が説明されている。
【０１９４】
例えば「膜移行ポリペプチド」は、膜-移行する担体として作用する能力を有する両親媒性又は疎水性のアミノ酸小配列を有する。ひとつの態様において、ホメオドメインタンパク質は、細胞膜を超えて移行する能力を有する。ホメオドメインタンパク質の最も短いインターナリゼーション可能なペプチドであるアンテナペディアは、アミノ酸位置43-58の、このタンパク質の第三のヘリックスであることがわかった(例えば、Prochiantz, Current Opinion in Neurobiology, 6: 629-634 (1996)参照)。別の小配列であるシグナルペプチドのh(疎水性)ドメインは、同様の細胞膜移行特性を有することがわかった(例えば、Linら、J. Biol. Chem., 270: 14255-14258 (1995)参照)。
【０１９５】
タンパク質の細胞への取込みを促進するためにタンパク質に連結することができるペプチド配列の例は、HIVのtatタンパク質の11アミノ酸ペプチド；p16タンパク質のアミノ酸84-103に相当する20残基ペプチド配列(Fahraeusら、Current Biology, 6: 84 (1996)参照)；アンテナペディアの60-アミノ酸長のホメオドメインの第三のヘリックス(Derossiら、J. Biol. Chem., 269: 10444 (1994))；Kaposi線維芽細胞増殖因子(K-FGF)h領域(Linら、前掲)などの、シグナルペプチドのh領域；又は、HSV由来のVP22移行ドメイン(Elliot & O'Hare, Cell, 88: 223-233 (1997))を含むが、これらに限定されるものではない。増強された細胞取込みを提供する他の適当な化学部分は、ZFPに化学的に連結されてもよい。膜移行ドメイン(すなわちインターナリゼーションドメイン)は、ランダム化されたペプチド配列のライブラリーから選択することもできる。例えば、Yehら、Molecular Therapy, 7(5): S461 (2003)、Abstract番号；1191参照。
【０１９６】
毒素分子も、ポリペプチドを細胞膜を超えて輸送する能力を有する。このような分子(いわゆる「バイナリー毒素」)は、少なくとも2種の部分で構成されることが多い：移行/結合ドメイン又はポリペプチド及び個別の毒素ドメイン又はポリペプチド。典型的には、この移行ドメイン又はポリペプチドは、細胞受容体に結合し、その後毒素は細胞へ輸送される。ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)ι毒素、ジフテリア毒素(DT)、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素A(PE)、百日咳毒素(PT)、炭疽菌(Bacillus anthracis)毒素、及び百日咳アデニル酸シクラーゼ(CYA)などを含むいくつかの細菌毒素を使用し、ペプチドを、細胞の細胞質ゾルへ、内部又はアミノ-末端融合体として送達している(Aroraら、J. Biol. Chem., 268: 3334-3341 (1993)；Perelleら、Infect. Immun., 61: 5147-5156 (1993)；Stenmarkら、J. Cell Biol., 113: 1025-1032 (1991)；Donnellyら、PNAS, 90: 3530-3534 (1993)；Carbonettiら、Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol., 95: 295 (1995)；Seboら、Infect. Immun., 63: 3851-3857 (1995)；Klimpelら、PNAS USA, 89: 10277-10281 (1992)；及び、Novakら、J. Biol. Chem., 267: 17186-17193 (1992))。
【０１９７】
このようなペプチド配列を使用し、ZFPを細胞膜を超えて移行することができる。ZFPは通常、このような配列と融合又は誘導体化され得る。典型的には、移行配列は、融合タンパク質の一部として提供される。任意に、リンカーは、ZFP及び移行配列の連結のために使用することができる。いずれか適当なリンカー、例えばペプチドリンカーを使用することができる。
【０１９８】
ZFPは、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞へ、リポソーム及び免疫リポソームのようなリポソーム誘導体を介して導入することもできる。用語「リポソーム」は、水相で被包されている、1種又は複数の同心の順番の脂質二層で構成された小胞を意味する。水相は典型的には、細胞へ送達される化合物、すなわちZFPを含む。
【０１９９】
リポソームは、形質膜に融合し、これにより薬物を細胞質ゾルに放出する。あるいは、リポソームは、輸送小胞中の細胞により食作用又は取込まれる。一旦エンドソーム又はファゴソームにおいて、リポソームは、分解又は輸送小胞の膜との融合のいずれかを生じ、その内容物を放出する。
【０２００】
現在のリポソームによる薬物送達法において、リポソームは最終的に、透過性となり、及び被包された化合物(この場合ZFP)を、標的組織又は細胞へ放出する。全身性又は組織特異性の送達に関して、これは、例えば、リポソーム二層が体内の様々な物質の作用により時間をかけて分解するような、受動様式で実現することができる。あるいは、活性物質の放出は、リポソーム小胞において透過性の変化を誘導する物質の使用に関連している。リポソーム膜は、リポソーム膜の近傍の環境が酸性となり始めた場合に脱安定化されるように構築することができる(例えば、PNAS, 84: 7851 (1987)；Biochemistry, 28: 908 (1989)参照)。リポソームが標的細胞によりエンドサイトーシスされた場合、例えばこれらは脱安定化し始め、それらの内容物を放出する。この脱安定化は、融合誘導(fusogenesis)と称される。ジオレイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE)は、多くの「融合誘導」システムの基礎である。
【０２０１】
このようなリポソームは典型的には、ZFP及び脂質成分、例えば中性及び／又はカチオン性脂質を含み、任意に予め決定された細胞表面受容体又はリガンド(例えば抗原)に結合する抗体などの受容体-認識分子を含む。リポソームを調製するために、様々な方法が利用可能であり、例えば、Szokaら、Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980)、米国特許第4,186,183号、第4,217,344合、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、第4,946,787号、PCT国際公開公報第91/17424号、Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta, 443: 629-634 (1976)；Fraleyら、PNAS, 76: 3348-3352 (1979)；Hopeら、Biochim. Biophys. Acta, 812: 55-65 (1985)；Mayerら、Biochim. Biophys. Acta, 858: 161-168 (1986)；Williamsら、PNAS, 85: 242-246 (1988)；Liposomes (Ostro (編集), 1983, 第1章)；Hopeら、Chem. Phys. Lip., 40: 89 (1986)；Gregoriadis, Liposome Technology, (1984)、及びLasic, Liposomes: from Physics to Applications (1993)に説明されている。適当な方法は、例えば、音波処理、押出、高圧/ホモジナイゼーション、マイクロフルイダイゼーション、界面活性剤透析、小型リポソーム小胞のカルシウム-誘導した融合、及びエーテル-融合法を含み、これらは全て当業者に公知である。
【０２０２】
ある態様において、特定の細胞型、組織等に特異的である標的化部分を使用し、リポソームを標的化することが望ましい。様々な標的化部分(例えば、リガンド、受容体、及びモノクローナル抗体)を使用するリポソームの標的化が説明されている。例えば米国特許第4,957,773号及び第4,603,044号参照のこと。
【０２０３】
標的化部分の例は、新生物に関連した抗原、例えば前立腺癌特異性抗原及びMAGEなどに特異的であるモノクローナル抗体を含む。ras又はc-erbB2のような、癌遺伝子の活性化又は過剰-発現から生じる遺伝子産物を検出することにより、腫瘍を診断することもできる。加えて多くの腫瘍は、αフェトタンパク質(AFP)及び癌胎児性抗原(CEA)のような、通常胎児組織により発現される抗原を発現する。ウイルス感染部位は、B型肝炎コア及び表面抗原(HBVc、HBVs)、C型肝炎抗原、エプスタイン-バーウイルス抗原、1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV1)及びパピローマウイルス抗原のような、様々なウイルス抗原を用い診断することができる。炎症は、インテグリン受容体(例えばVCAM-1)、セレクチン受容体(例えばELAM-1)などの炎症部位で発現されている表面分子により特異的に認識された分子を用い、検出することができる。
【０２０４】
標的化物質をリポソームへカップリングする標準的方法を、使用することができる。これらの方法は一般に、例えば、標的化物質の付着のために活性化され得るホスファチジルエタノールアミン、又は脂質誘導体化されたブレオマイシンなどの誘導体化された親油性化合物のような、脂質成分のリポソームへの取込みに関連している。抗体に標的化されたリポソームは、例えばプロテインAを取込むリポソームを用いて、構築することができる(Renneisenら、J Biol. Chem., 265: 16337-16342 (1990)、及びLeonettiら、PNAS, 87: 2448-2451 (1990)参照)。
【０２０５】
用量
本開示の状況において、治療的適用に関して、患者へ、又は患者へ導入される細胞へ投与される投与量は、患者において経時的に有益な治療的反応を実現するのに十分でなければならない。加えて特定の投与計画は、例えば、機能的ゲノム試験、及び細胞又は動物モデルにおいてなど、実験の状況において表現型の変化を決定するために有益であることができる。投与量は、使用される特定のZFPの効率及びKd、標的細胞の核容積、並びに患者の状態に加え、治療される患者の体重及び体表面積により決定される。投与量のサイズは、特定の患者における特定の化合物又はベクターの投与に付随する有害な副作用の存在、性質、及び程度によっても決定されるであろう。
【０２０６】
標的部位におよそ99％結合するZFPの最大治療的有効量は、細胞1個当り特異的ZFP分子約1.5x105〜1.5x106コピー未満の範囲であることが計算される。この結合レベルに関する細胞1個当りのZFP数は、HeLa細胞核の容積(およそ1000μm3又は10-12L；Cell Biology, (Altman & Katz編集、(1976))を用い、下記のように計算される。HeLa核は比較的大きいので、この用量数は、必要であれば、標的細胞核の容積を用い再計算される。この計算は、他の部位によるZFP結合の競合も考慮していない。この計算は、ZFPの本質的に全てが核に局在されると仮定している。値100xKdを用い、標的部位のおよそ99％結合を計算し、及び値10xKdを用い、標的部位のおよそ90％結合を計算する。この例に関して、Kd＝25nMである。
ZFP＋標的部位←→複合体
すなわち、DNA＋タンパク質←→DNA：タンパク質複合体
Kd＝[DNA][タンパク質]／[DNA：タンパク質複合体]
50％ZFPが結合した場合、Kd＝[タンパク質]
そのため[タンパク質]＝25nMでありかつ核容積が10-12Lである場合
[タンパク質]＝(25x10-9moles/L)(10-12L/核)(6x1023分子/mole)
＝50％結合について15,000分子/核
99％標的が結合した場合；100xKd＝[タンパク質]
100xKd＝[タンパク質]＝2.5μM
(25x10-6moles/L)(10-12L/核)(6x1023分子/mole)
＝標的部位の99％結合について約1,500,000分子/核
【０２０７】
ZFPをコードしている発現ベクターの適当な投与量も、プロモーターからのZFP発現の平均率及び細胞におけるZFP分解の平均率を考慮することにより、計算することができる。ある態様において、先に説明されたような、野生型又は変異体HSV TKプロモーターのような弱いプロモーターが使用される。微生物におけるZFPの投与量は、使用される特定のZFPの分子量を考慮することにより計算される。
【０２０８】
疾患の治療又は予防における投与されるZFPの有効量の決定において、医師は、ZFP又はZFPコードしている核酸の循環血漿中レベル、可能性のあるZFP毒性、疾患の進行、及び抗-ZFP抗体の産生を評価する。投与は、単回投与量又は分割投与量により実現される。
【０２０９】
医薬組成物及び投与
ZFP及びZFPをコードしている発現ベクターは、標的化された切断及び／又は組換えのため、並びに例えば癌、虚血、糖尿病、網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、乾癬、HIV感染症、鎌状細胞貧血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管疾患、嚢胞性線維症、卒中などの治療的もしくは予防的適用のために、直接患者へ投与することができる。ZFP遺伝子治療により阻害することができる微生物の例は、病原菌、例えば、クラミジア、リケッチア菌、ミコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、及びcono球菌、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、シュードモナス属、レジオネラ属、ジフテリア属、サルモネラ属、バチルス属、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ菌、及びライム病菌；感染性真菌、例えばアスペルギルス、カンジダ種；原生動物、例えば、胞子虫(例えばマラリア原虫)、根足虫(例えば赤痢アメーバ)及び鞭毛虫(トリパノソーマ、リーシュマニア、トリコモナス、ジアルディアなど)；ウイルス疾患、例えば、肝炎(A、B、又はC型)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV、HSV-1、HSV-6、HSV-II、CMV、及びEBV)、HIV、エボラ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体(RS)ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、及びアルボウイルスの脳炎ウイルスなどを含む。
【０２１０】
治療的有効量の投与は、治療されるべき組織に最終的に接触するようにZFPを導入するために通常使用される経路のいずれかによる。ZFPは、いずれか適当な様式で、好ましくは医薬として許容される担体と共に、投与される。モジュレーターのような適当な投与法が利用可能であり、及び当業者に周知であるが、1種よりも多い経路も特定の組成物の投与に使用することができ、特定の経路は、他の経路よりも、より迅速かつより有効な反応を提供することが多い。
【０２１１】
医薬として許容される担体は、投与される具体的な組成物により、更には組成物の投与に使用される具体的な方法により、一部決定される。従って利用可能な医薬組成物の多種多様な適当な製剤が存在する(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第17版、1985参照)。
【０２１２】
ZFPは、単独で又は他の適当な成分と組合せて、吸入により投与されるべきエアゾール製剤(すなわち、これらは「ネブライズ」することができる)を作製することができる。エアゾール製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの、加圧された利用可能な噴射剤に入れることができる。
【０２１３】
例えば静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下経路などの、非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる、水性及び非水性の、等張滅菌注射液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び保存剤を含有することができる、水性及び非-水性の滅菌懸濁液を含む。明らかにされた組成物は、例えば、注入で静脈内へ、経口、外用、腹腔内、膀胱内、又は髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は、アンプル及びバイアルなどの、単位投与量又は反復投与量の密封された容器中で提供することができる。注射用液剤及び懸濁剤は、先に説明された種類の、滅菌散剤、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。
【０２１４】
適用
明らかにされた標的化された切断の方法及び組成物を使用し、例えば、ふたつの部位で切断し、その間の配列を欠失することにより、単部位での切断後に、続けて非-相同末端連結することにより、及び／又は1もしくは2又は数個のヌクレオチドを除去するように部位で切断することにより、ゲノム配列に変異を誘導することができる。標的化された切断も、遺伝子ノックアウトを作製するために(例えば、機能的ゲノム又は標的バリデーションのために)及び配列のゲノムへの標的化された挿入を促進するため(すなわち遺伝子ノックイン)に；例えば、細胞操作又はタンパク質過剰発現を目的として、使用することができる。挿入は、相同組換え又は標的化された組込みによる、染色体配列の交換によることができ、ここで染色体において所定の領域と相同な配列が側方に位置した新規配列(すなわち、所定の領域に存在しない配列)は、予め決定された標的部位で挿入される。
同じ方法を、野生型配列の変異体配列との交換、又はひとつのアレルの異なるアレルへの転換にも使用することができる。
【０２１５】
感染又は組込まれたウイルスゲノムの標的化された切断を使用し、宿主におけるウイルス感染症を治療することができる。加えてウイルスの受容体をコードしている遺伝子の標的化された切断を用い、そのような受容体の発現をブロックすることができ、これにより宿主生物におけるウイルス感染及び／又はウイルスの蔓延を防ぐことができる。ウイルス受容体(例えば、HIVのCCR5及びCXCR4受容体)をコードしている遺伝子の標的化された変異誘発を用い、受容体をウイルスに結合できないようにし、これにより新たな感染を予防しかつ存在する感染症の蔓延を防ぐことができる。標的化され得るウイルス又はウイルス受容体の非-限定的例は、単純ヘルペスウイルス(HSV)、例えばHSV-1及びHSV-2、水痘-帯状疱疹ウイルス(VZV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)及びサイトメガロウイルス(CMV)、HHV6及びHHV7を含む。肝炎ウイルスファミリーは、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、デルタ肝炎ウイルス(HDV)、E型肝炎ウイルス(HEV)及びG型肝炎ウイルス(HGV)を含む。他のウイルス又はそれらの受容体も標的化され、これはピコナウイルス科(例えば、ポリオウイルスなど)；カリシウイルス科；トガウイルス科 (例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど)；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科(例えば、狂犬病ウイルスなど)；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科(例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど)；オルソミクソウイルス科(例えば、A、B及びC型インフルエンザウイルスなど)；ブニヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウウイルス科；レンチウイルス(例えば、HTLV-I；HTLV-II；HIV-1(同じくHTLV-III、LAV、ARV、hTLRなどとして知られているもの)HIV-II)；シミアン免疫不全ウイルス(SIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、インフルエンザウイルス及びマダニ媒介脳炎ウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。これら及び他のウイルスの説明に関しては、例えば、Virology、第3版(W. K. Joklik編集、1988)；Fundamental Virology、第2版(B. N. Fields及びD. M. Knipe編集、1991)を参照のこと。HIVの受容体は、例えば、CCR-5及びCXCR-4を含む。
【０２１６】
同様の様式で、感染している細菌のゲノムを、標的化されたDNA切断、それに続く非-相同末端連結により変異誘発し、細菌感染症を防止又は改善することができる。
標的化された組換えの明らかにされた方法を用い、ゲノム配列を、相同の非-同一配列と交換することができる。例えば変異体ゲノム配列は、その野生型対応部分と交換し、これにより例えば、遺伝子疾患、遺伝性障害、癌、及び自己免疫疾患の治療法を提供することができる。同様の様式で、遺伝子のひとつのアレルを、異なるアレルと、本明細書に明らかにされた標的化された組換えの方法を用い、交換することができる。
【０２１７】
遺伝子疾患の例は、軟骨無形成症、全色盲、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症(OMIM No.102700)、副腎脳白質ジストロフィー、エカルディ症候群、α-1アンチトリプシン欠損症、α-サラセミア、男性ホルモン不応症候群、アペール症候群、不整脈惹起性右心室形成異常、毛細血管拡張性運動失調、バース症候群、β-サラセミア、青色ゴムマリ様母斑症候群、キャナバン病、慢性肉芽腫症(CGD)、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉性形成異常、ファンコーニ貧血、進行性骨化性線維形成異常症、脆弱X症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドース(例えばGM1)、ヘモクロマトーシス、β-グロビン第6コドンのヘモグロビンC変異(HbC)、血友病、ハンチントン病、フルラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、Langer-Giedion症候群、白血球接着不全(LAD、OMIM No.116920)、白質萎縮症、QT延長症候群、マルファン症候群、Moebius症候群、ムコ多糖症(MPS)、爪-膝蓋骨症候群、腎源性尿崩症、神経線維腫症、Neimann-Pick病、骨形成不全症、ポルフィリン症、Prader-Willi症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルービンスタイン-テービ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合型免疫不全症(SCID)、シュバッハマン症候群、鎌状細胞疾患(鎌状細胞貧血)、Smith-Magenis症候群、スティックラー症候群、ティ-サックス病、血小板減少橈骨欠損(TAR)症候群、トレチャー-コリンズ症候群、トリソミー、結節硬化症、ターナー症候群、尿素回路障害、フォン・ヒッペル-リンダウ疾患、ワールデンブルヒ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ヴィスコット-オールドリッチ症候群、X-連鎖リンパ増殖症候群(XLP、OMIM No.308240)を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２１８】
標的化されたDNA切断及び／又は相同組換えにより治療することができる疾患の追加例は、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積病(例えば、ゴーシェ病、GM1、ファブリー病及びティ-サックス病)、ムコ多糖症(例えばハンター病、ハーラー病)、異常血色素症(例えば、鎌状細胞疾患、HbC、α-サラセミア、β-サラセミア)及び血友病を含む。
【０２１９】
場合によっては、多能性細胞(例えば、造血幹細胞)におけるゲノム配列の変更が望ましい。造血幹細胞の動員、濃縮及び培養の方法は、当該技術分野において公知である。例えば米国特許第5,061,620号；第5,681,559号；第6,335,195号；第6,645,489号及び第6,667,064号参照。処置された幹細胞は、SCID及び鎌状細胞貧血を含むが、これらに限定されるものではない様々な疾患の治療のために、患者へ戻すことができる。
【０２２０】
これらの多くの場合において、所定の領域は変異を含み、及びドナーポリヌクレオチドは、対応する野生型配列を含む。同様に野生型ゲノム配列は、それが望ましい場合は、変異体配列により交換することができる。例えば癌遺伝子の過剰発現は、遺伝子の突然変異又はその制御配列の発現をより低い非病原性レベルで支える配列との交換により、逆転(reverse)することができる。別の例として、アテローム性動脈硬化症を治療するために、ApoAI遺伝子の野生型アレルは、ApoAI Milanoアレルにより交換することができる。実際、いずれかの様式で特定のゲノム配列に依存する病因は、本明細書に明らかにされた方法及び組成物を使用し、修正又は緩和することができる。
【０２２１】
標的化された切断及び標的化された組換えを使用し、遺伝子産物の発現レベルを変更するために、非-コード配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、イニシエーター、ターミネーター、スプライシング部位などの調節配列)を変更することもできる。このような方法を、例えば、治療目的、機能的ゲノム及び／又は標的バリデーション試験において使用することができる。
【０２２２】
本明細書に説明された組成物及び方法は、新規方法及びシステムが、宿主の自家移植片に対する免疫反応に対処することも可能にする。特に自家幹細胞(又はいずれかの種類の自家細胞)の宿主レシピエントへの移植時に直面する大きな問題は、生着した細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)の認識により主に媒介された、宿主の免疫系による拒絶反応の高いリスクである。MHCは、共通のβサブユニット及び可変性αサブユニットで構成されるヘテロ二量体として機能するHLAクラスIタンパク質(複数)を含む。HLAを欠いている幹細胞由来の組織移植片は、宿主の免疫応答を回避することが明らかにされている。例えば、Coffmanら、J. Immunol, 151, 425-35 (1993)；Markmannら、Transplantation, 54, 1085-9 (1992)；Kollerら、Science, 248, 1227-30 (1990)参照。本明細書に説明された組成物及び方法を用い、移植片拒絶反応に関連したHLAタンパク質をコードしている遺伝子は、それらのコード配列又は調節配列のいずれかを、切断し、変異誘発し、又は組換えにより変更することができ、その結果それらの発現はブロックされるか、又はこれらは非-機能的産物を発現する。例えば本明細書に説明されたようなZFP融合タンパク質を用い共通のβサブユニット(β2ミクログロブリン)をコードしている遺伝子を失活することにより、HLAクラスIは、その細胞から除去され、ドナーからのHLAクラスIヌル幹細胞を迅速かつ信頼できるように作製し、これにより幹細胞移植時の密に合致したドナー/レシピエントMHCハプロタイプの必要性が低下される。
【０２２３】
あらゆる遺伝子(例えばβ2ミクログロブリン遺伝子)の失活は、例えば単独の切断事象により、切断とそれに続く非-相同末端連結により、2部位での切断とそれに続く連結によるふたつの切断部位間の配列の欠失により、ミスセンスもしくは非センスコドンのコード領域への標的化された組換えにより、又は無関係の配列(すなわち、「stuffer」配列)の該遺伝子もしくはその調節領域への標的化された組換えによる遺伝子又は調節領域の破壊により、実現される。
【０２２４】
共有の国際公開公報第01/83793号に明らかにされたような、クロマチン構造の標的化された修飾を使用し、融合タンパク質の細胞クロマチンへの結合を促進することができる。
【０２２５】
追加の態様において、本明細書に明らかにされたジンクフィンガー-切断ドメイン融合体に加えて又はその代わりに、ジンクフィンガー結合ドメインとリコンビナーゼ(又はそれらの機能的断片)の間の1種又は複数の融合体を用い、標的化された組換えを促進することができる。例えば、共有の米国特許第6,534,261号、及びAkopianら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 8688-8691 (2003)を参照のこと。
【０２２６】
追加の態様において、明らかにされた方法及び組成物を用い、それらの活性のために二量体化(ホモ二量体化又はヘテロ二量体化のいずれか)を必要とする、ZFP結合ドメインの転写活性化又は抑制ドメインとの融合体を提供することができる。これらの場合において、融合ポリペプチドは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び機能ドメイン単量体(例えば、二量体の転写活性化又は抑制ドメイン由来の単量体)を含む。ふたつのこのような融合ポリペプチドの適切に配置された標的部位への結合は、二量体化を可能にし、その結果機能的転写活性化又は抑制ドメインを再構成する。
【実施例】
【０２２７】
実施例1：標的化された組換えによる染色体hSMC1L1遺伝子の校正
hSMC1L1遺伝子は、出芽酵母遺伝子の第1染色体構造維持(structural maintenance of chromosomes 1)のヒトオルソログである。Walker ATPaseドメインを含むタンパク質のアミノ-末端部分をコードしているこの遺伝子の領域を、標的化された切断及び組換えにより変異誘発した。切断は、ジンクフィンガーDNA-結合ドメイン及びこのコドンの近傍に結合するFokI切断ハーフ-ドメインを含むキメラヌクレアーゼをデザインすることにより、メチオニン開始コドン(ヌクレオチド24-26、図1)の領域に標的化した。従って2種のジンクフィンガー結合ドメインがデザインされ、その一方はヌクレオチド23-34を認識し(図1に示したように上側鎖に沿って一次接触する)、及び他方はヌクレオチド5-16を認識する(下側鎖に沿って一次接触する)。ジンクフィンガータンパク質は、共有の米国特許第6,453,242号及び第6,534,261号に開示したようにデザインした。これらのジンクフィンガータンパク質の認識領域のアミノ酸配列については、表2を参照のこと。
【０２２８】
これら2種のZFP結合ドメインを各々コードしている配列を、FokI切断ハーフ-ドメインをコードしている配列(未変性のFokI配列のアミノ酸384-579；Kitaら、J. Biol. Chem., 264: 5751-5756 (1989))に融合し、その結果コードされたタンパク質は、カルボキシ末端にFokI配列を及びアミノ末端にZFP配列を含んだ。これらの各融合配列は次に、修飾された哺乳類発現ベクターpcDNA3においてクローニングした(図2)。
【０２２９】
【表３】
2010046099.tif 000005
【０２３０】
ドナーDNA分子は、以下のように得た。最初に、X染色体"-"鎖のヌクレオチド52415936-52416635を表しているヒトゲノムDNA(UCSCヒトゲノム、2003年7月リリース)の700塩基対断片は、ヒトhSMC1L1遺伝子の第一のエキソンを含むが、これを、鋳型としてHEK293細胞由来のゲノムDNAを用いて増幅した。増幅に使用したプライマーの配列は、表3に示した(「Initial amp 1」及び「Initial amp 2」)。その後PCR産物を、標準の重複伸長PCR法(例えば、Hoら、Gene, 77: 51-59 (1989)参照)を用いて変更し、配列ATGGGG(図1のヌクレオチド24-29)をATAAGAAGCに交換した。この変化は、ATGコドン(メチオニン)のATAコドン(イソロイシン)への転換、並びにGGG(図1のヌクレオチド27-29)の配列AGAAGCによる交換を生じ、組換え後のドナー-由来の配列と内在性染色体配列の間の識別を可能にした。開始コドン領域の染色体DNAの配列、及び染色体配列と異なるドナーDNAの配列を含む、hSMC 1遺伝子の概略図を、図3に示した。得られる700塩基対ドナー断片を、ヒトゲノムと相同なあらゆる配列を含まないpCR4BluntTopoにクローニングした。図4参照。
【０２３１】
染色体hSMC1L1遺伝子の標的化された変異のために、ZFP-FokI融合体をコードしているふたつのプラスミド及びドナープラスミドを、1x106個HEK293細胞へと、Lipofectamine 2000（登録商標）(Invitrogen)を使用するトランスフェクションにより導入した。対照は、ZFP-FokI融合体をコードしているこれら2種のプラスミドでトランスフェクションされた細胞、ドナープラスミドのみでトランスフェクションされた細胞及び対照プラスミド(pEGFP-N1、Clontech)でトランスフェクションされた細胞を含んだ。細胞は、5％CO2中37℃で培養した。トランスフェクション後48時間で、ゲノムDNAを細胞から単離し、200ngをPCR増幅の鋳型として使用し、ドナー配列(X染色体の"-"鎖上のヌクレオチド52416677-52416701；UCSC、2003年7月)と相同なその領域の外側の遺伝子領域に相補的なひとつのプライマー、及び識別用の変異が導入されたドナー分子の領域に相補的な第二のプライマーを用いた。これら2種のプライマーを使用し、標的化された組換え事象が生じた場合に、400塩基対の増幅産物をゲノムDNAから得た。これらのプライマーの配列を、表3に示した(各々、「染色体-特異的」及び「ドナー-特異的」と表示)。増幅の条件は以下であった：94℃で2分間、その後、94℃で30秒間、60℃で1分間、72℃で1分間を40サイクル；並びに最終工程72℃で7分間。
【０２３２】
この分析の結果(図5)は、400塩基対増幅産物(図の中で「キメラDNA」と表示)は、ドナープラスミド及び両方のZFP-FokIプラスミドでトランスフェクションされた細胞から抽出したDNAでのみ得られたことを示している。
【０２３３】
【表４】
2010046099.tif 000006
【０２３４】
この結果を確認するために、ふたつの追加実験を行った。第一に、この増幅産物を、pCR4Blunt-Topo(Invitrogen)にクローニングし、そのヌクレオチド配列を決定した。図6(配列番号:6)に示したように、2種のZFP-FokI-コードしているプラスミド及びドナープラスミドでトランスフェクションされた細胞の染色体DNAから得られた増幅された配列は、ドナー分子には存在しない染色体配列(図6のヌクレオチド32-97)に共有的に連結された、ドナーに独自のAAGAAGC配列(図6に示された配列のヌクレオチド395-401)を含んでおり、このことはドナー配列が染色体に組換えられたことを示している。特に開始コドンをイソロイシンコドンに転換するG→A変異が、この配列の395位に認められた。
【０２３５】
第二の実験においては、ドナープラスミドのみでトランスフェクションされた細胞、両方のZFP-FokI融合プラスミドでトランスフェクションされた細胞、ドナープラスミド及び両方のZFP-FokI融合プラスミドでトランスフェクションされた細胞、又はEGFP対照プラスミドでトランスフェクションされた細胞由来の染色体DNAを、増幅の鋳型として用い、ドナー配列と染色体配列の間の相同な700-ヌクレオチド領域の外側の配列に相補的なプライマーを使用した(表3で「Outside 1」及び「Outside 2」と示した)。得られた増幅産物は精製し、先に説明したドナー-特異的及び染色体-特異的プライマーを使用する第二の増幅反応の鋳型として使用した(表3)。この増幅は、ドナー構築体及び両ZFP-FokI融合構築体でトランスフェクションされた細胞からのみ、400ヌクレオチドの産物を生じ、結果はこれらの細胞の標的化された組換えによるゲノム配列の交換と一致した。
【０２３６】
実施例2：標的化された組換えによる染色体IL2Rγ遺伝子の校正
IL-2Rγ遺伝子は、いくつかのインターロイキン受容体(IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-9R、IL-15R及びIL-21Rを含む)のサブユニットとして機能する「共通サイトカイン受容体γ鎖」として知られているタンパク質をコードしている。この遺伝子の変異は、第三エキソンの5'末端(例えば、チロシン91コドン)を取り囲むものを含むが、これは、X-連鎖重症複合型免疫不全症(SCID)を引き起こす。例えば、Puckら、Blood, 89: 1968-1977 (1997)を参照。チロシン91コドンの変異(配列番号:7のヌクレオチド23-25；図7)を、標的化された切断及び組換えにより、IL2Rγ遺伝子に導入した。切断は、ジンクフィンガータンパク質の2種の対をデザインすることにより、この領域に標的化した。第一の対(表4の最初の2列)は、ヌクレオチド29-40に結合するようにデザインされたジンクフィンガータンパク質(図7に示された上側鎖に沿って一次接触する)、及びヌクレオチド8-20に結合するようにデザインされたジンクフィンガータンパク質(下側鎖に沿って一次接触する)を含む。第二の対(表4の第三及び第四列)は、ふたつのジンクフィンガータンパク質を含み、そのひとつは、ヌクレオチド23-34を認識し(図7に示された上側鎖に沿って一次接触する)、及び第二は、ヌクレオチド8-16を認識する(下側鎖に沿って一次接触する)。ジンクフィンガータンパク質は、共有の米国特許第6,453,242号及び第6,534,261号に開示されたようにデザインした。ジンクフィンガータンパク質の認識領域のアミノ酸配列については、表4を参照のこと。
【０２３７】
ZFP結合ドメインをコードしている配列は、FokI切断ハーフ-ドメイン(未変性のFokI配列のアミノ酸384-57、Kitaら、前掲)をコードしている配列に融合し、その結果このコードされたタンパク質は、カルボキシ末端にFokI配列を含み、及びアミノ末端にZFP配列を含んだ。これらの融合配列の各々は、次に、修飾された哺乳類発現ベクターpcDNA3においてクローニングした。この構築体の概略については、図8を参照のこと。
【０２３８】
【表５】
2010046099.tif 000007
【０２３９】
ドナーDNA分子は、以下のように得た。最初に、X染色体"-"鎖のヌクレオチド69196910-69197609位に対応しているヒトDNA(UCSC、2003年7月)の700塩基対断片は、IL2Rγ遺伝子のエキソン3を含むが、これを、鋳型としてK562細胞由来のゲノムDNAを用いて増幅した。図9参照。増幅に使用したプライマーの配列は、表5に示した(「Initial amp 1」及び「Initial amp 2」と表示)。その後PCR産物を、標準の重複伸長PCR法(例えば、Hoら、前掲)を用いて変更し、配列TACAAGAACTCGGATAAT(配列番号:62)を配列TAAAAGAATTCCGACAAC(配列番号:63)に交換した。この交換は、ヌクレオチド25での点変異の導入(図7)、チロシン91コドンTACのTAA終止コドンへの転換を生じ、コドン91の下流の配列の差異のために、組換え後のドナー-由来の配列と内在性染色体配列の識別を可能にした。得られる700塩基対断片を、ヒトゲノムと相同なあらゆる配列を含まないpCR4BluntTopoにクローニングした。図10参照。
【０２４０】
染色体IL2Rγ遺伝子の標的化された変異のために、ドナープラスミドを、各々ZFP-FokI融合体の対のひとつをコードしている2種のプラスミドと共に、2x106個K652細胞に、混合型リポフェクション／電気穿孔(Amaxa)を用い導入した。ZFP/FokI対の各々(表4参照)を、個別の実験で試験した。対照は、ZFP-FokI融合をコードしている2種のプラスミドのひとつでトランスフェクションされた細胞、及びドナープラスミドのみでトランスフェクションされた細胞を含んだ。細胞は、5％CO2中37℃で培養した。トランスフェクションの後48時間で、ゲノムDNAを細胞から単離し、200ngをPCR増幅の鋳型として使用し、ドナー配列(X染色体の"+"鎖上のヌクレオチド69196839-69196863；UCSC、2003年7月)と相同なその領域の外側の遺伝子領域に相補的なひとつのプライマー、並びに識別用の変異が導入され(前記参照)及びその配列は染色体DNAから分岐しているドナー分子の領域に相補的な第二のプライマーを用いた。プライマー配列については、各々「染色体-特異的」及び「ドナー-特異的」と表示された表5を参照のこと。これら2種のプライマーを使用し、標的化された組換え事象が生じた場合に、500bpの増幅産物を、ゲノムDNAから得た。増幅の条件は以下であった：94℃で2分間、その後、94℃で30秒間、62℃で1分間、72℃で45秒間を35サイクル；並びに最終工程72℃で7分間。
【０２４１】
この分析の結果(図11)は、予想されたサイズ(500塩基対)の増幅産物は、ドナープラスミド及びZFP-FokIの対のいずれかをコードしているプラスミドでトランスフェクションされた細胞から抽出したDNAで得られたことを示している。ZFPの対をコードしているプラスミド(ドナープラスミドなし)でトランスフェクションされた細胞由来のDNAは、500bp産物の生成を生じず、更にドナープラスミドのみでトランスフェクションされた細胞からもDNAを生じなかった。
【０２４２】
【表６】
2010046099.tif 000008
【０２４３】
この結果を確認するために、ZFP/FokI融合体の第二の対を用いる実験から得た増幅産物を、pCR4Blunt-Topo(Invitrogen)にクローニングし、そのヌクレオチド配列を決定した。図12(配列番号:12)に示したように、この配列は、染色体配列とドナープラスミド由来の配列の融合からなる。特に、チロシン91を終止コドンに転換するGからAへの変異は、この配列の43位に認められた。43-58位は、ドナー独自のヌクレオチドを含み；ヌクレオチド32-42及び59-459は、ドナー及び染色体に共通の配列であり、並びにヌクレオチド460-552は、染色体に独自であった。染色体に存在するがドナーに存在しない配列に共有的に連結されたドナー-独自の配列の存在は、ドナープラスミド由来のDNAが、相同組換えにより染色体へ導入されたことを示している。
【０２４４】
実施例3：標的化された組換えによる染色体のβ-グロビン遺伝子の校正
ヒトβグロビン遺伝子は、成人赤血球のヘモグロビンの構造及び機能に寄与するふたつの遺伝子産物のひとつである。β-グロビン遺伝子の変異は、鎌状細胞貧血を生じる。変異された場合に鎌状細胞貧血を引き起こすヌクレオチドの位置の傍、この配列内に結合するふたつのジンクフィンガータンパク質をデザインした。図13に、ヒトβ-グロビン遺伝子の一部のヌクレオチド配列を示し、ふたつのジンクフィンガータンパク質の標的部位には、図13に示した配列において下線を付けている。ふたつのジンクフィンガータンパク質の認識領域のアミノ酸配列は、表6に示した。これら2種のZFP結合ドメインの各々をコードしている配列を、先に説明したように、FokI切断ハーフ-ドメインをコードしている配列に融合し、内在性βグロビン遺伝子を標的化した操作されたZFP-ヌクレアーゼを作出した。その後これらの融合配列の各々を、哺乳類の発現ベクターpcDNA3.1においてクローニングした(図14)。
【０２４５】
【表７】
2010046099.tif 000009
【０２４６】
ドナーDNA分子は、以下のように得た。最初に、第11番染色体の"-"鎖のヌクレオチド5212134-5212833に対応しているヒトゲノムDNA(BLAT、UCSCヒトゲノムサイト)の700塩基対断片を、鋳型としてK562細胞由来のゲノムDNAを用い、PCRにより増幅した。増幅に使用したプライマーの配列は、表7に示した(「Initial amp 1」及び「Initial amp 2」と表示)。得られた増幅された断片は、プロモーターヒトβグロビン遺伝子の、最初のふたつのエキソン及び最初のイントロンに対応する配列を含む。βグロビン配列中のエキソン1及び2、最初のイントロン、及びプライマー結合部位の位置について概略的に示した図15を参照のこと。その後クローニングした産物は、PCRにより更に修飾し、ヌクレオチド305-336の間に配列変化のセットを導入し(図13に示した)、これは配列CCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG(配列番号:78)を、gCGTTAgTGCCCGAATTCCGAtcGTcAACcac(配列番号:79)と交換した(太字は変化)。これらのある種の変化(小文字で示した)は、ZFP/FokI融合タンパク質が一旦染色体に組込まれたドナー配列を結合及び切断することを阻止するように、特異的に操作した。加えて全ての配列変化は、組換え後のドナー及び内在性染色体配列の間の識別が可能である。得られる700塩基対断片を、ヒトゲノムと相同な配列を全く含まないpCR4-TOPOへクローニングした(図16)。
【０２４７】
染色体のβグロビン遺伝子の標的化された変異のために、ZFP-FokI融合をコードしている2種のプラスミド及びドナープラスミド(pCR4-TOPO-HBBdonor)を、1x106個K652細胞に、Nucleofector(商標)液(Amaxa Biosystems)を使用するトランスフェクションにより導入した。対照は、100ng(低)又は200ng(高)のZFP-FokI融合体をコードしている2種のプラスミドのみでトランスフェクションされた細胞、200ng(低)又は600ng(高)のドナープラスミドのみでトランスフェクションされた細胞、GFP-コードしているプラスミドでトランスフェクションされた細胞、及び偽トランスフェクションされた細胞を含んだ。細胞は、10％ウシ胎仔血清(FBS)(Hyclone)及び2mM L-グルタミンを補充した、RPMI培地1640(Invitrogen)中で培養した。細胞は、5％CO2大気中37℃で維持した。トランスフェクション後72時間で、ゲノムDNAを細胞から単離し、200ngをPCR増幅の鋳型として使用し、ドナー配列(第11染色体の"-"鎖上のヌクレオチド5212883-5212905)と相同なその領域の外側の遺伝子領域に相補的なひとつのプライマー、並びに識別用の変異がドナー配列に導入された(前記参照)ドナー分子の領域に相補的な第二のプライマーを用いた。これらのプライマーの配列については、表7を参照のこと(各々「染色体-特異的」及び「ドナー-特異的」と表示した)。これら2種のプライマオーを使用し、標的化された組換え事象が生じた場合に、415塩基対の増幅産物を、ゲノムDNAから得た。DNA負荷の対照として、同様のレベルのゲノムDNAが各PCR反応に添加されたことを確実にするために、Initial amp 1及びInitial amp 2プライマーを用いるPCR反応も行った。増幅の条件は以下であった：95℃で2分間、その後、95℃で30秒間、60℃で45秒間、68℃で2分間を40サイクル；並びに最終工程68℃で10分間。
【０２４８】
この分析の結果(図17)は、415塩基対の増幅産物は、ドナープラスミド及び両ZFP-FokIプラスミドの「高」濃度でトランスフェクションされた細胞から抽出したDNAでのみ得られたことを示し、これはドナー配列の染色体β-グロビン遺伝子座への標的化された組換えと一致している。
【０２４９】
【表８】
2010046099.tif 000010
【０２５０】
この結果を確認するために、この増幅産物を、pCR4-Topo(Invitrogen)にクローニングし、そのヌクレオチド配列を決定した。図18(配列番号:14)に示したように、この配列は、ドナープラスミド上には存在しない染色体配列とドナープラスミドに独自の配列の融合からなる。例えば、ZFP-結合を破壊するふたつのC→G変異が、この配列の377及び383位に認められる。ヌクレオチド377-408は、先に説明された配列変化を含むドナープラスミドから得られた配列を表し；ヌクレオチド73-376は、ドナー及び染色体に共通の配列であり、及びヌクレオチド1-72は、染色体に独自である。ドナー-特異的及び染色体-特異的配列の共有的連結は、K562細胞のゲノム内の正確な遺伝子座にドナー配列がうまく組換えられたことを確認している。
【０２５１】
実施例4：ZFP-FokIリンカー(ZCリンカー)最適化
切断効率に対するZCリンカー長の作用を試験するために、様々な長さのZCリンカーを用い、4-フィンガーZFP結合ドメインを、FokI切断ハーフ-ドメインに融合した。ZFPの標的部位は、5'-AACTCGGATAAT-3' (配列番号:84)であり、各ジンクフィンガーの認識領域のアミノ酸配列(α-ヘリックスの開始点に対して-1から+6の位置)は、以下であった(ここでF1は最もN-側、及びF4は最もC-側のジンクフィンガーである)：
F1：DRSTLIE (配列番号:85)
F2：SSSNLSR (配列番号:86)
F3：RSDDLSK (配列番号:87)
F4：DNSNRIK (配列番号:88)
前述のZFP結合ドメイン及びFokI切断ハーフ-ドメインが、2、3、4、5、6又は10アミノ酸残基により分離されているZFP-FokI融合体を構築した。これらのタンパク質の各々を、4、5、6、7、8、9、12、15、16、17、22、又は26塩基対により分離した反復配列を伴う、ZFP標的部位の逆方向反復を有する基質の切断について試験した。
【０２５２】
ZFP-FokI接合部(下線を付けたZCリンカー配列と)の領域における、融合構築体のアミノ酸配列は、以下である：
10-残基リンカー  HTKIHLRQKDAARGSQLV (配列番号:89)
6-残基リンカー  HTKIHLRQKGSQLV (配列番号:90)
5-残基リンカー  HTKIHLRQGSQLV (配列番号:91)
4-残基リンカー  HTKIHLRGSQLV (配列番号:92)
3-残基リンカー  HTKILGSQLV(配列番号:93)
2-残基リンカー  HTKIHGSQLV (配列番号:94)
【０２５３】
下線を付けたZFP標的部位を伴う様々な切断基質の配列は、以下である。
【０２５４】
【表９】
2010046099.tif 000011
【０２５５】
異なるZFP-FokI融合体タンパク質をコードしているプラスミド(前記参照)は、標準の分子生物学的技術により構築し、in vitroにおいて組合せた転写/翻訳システムを用い、コードされたタンパク質を発現した。各構築体について、200ng線状プラスミドDNAを、20μL TnT混合物中でインキュベーションし、及び30℃で1時間45分インキュベーションした。TnT混合物は、TnT溶解液(Promega, Madison, WI)100μlを、T7 RNAポリメラーゼ(Promega)4μl＋メチオニン(1mM)2μl＋ZnCl2(20mM)2.5μlと共に含んでいた。
【０２５６】
様々なZFP-FokI融合体によるDNA切断の分析のために、組合せた転写/翻訳反応混合物1μlを、およそ1ng DNA基質(T4ポリヌクレオチドキナーゼを用い32Pで末端標識した)と一緒にし、この混合物を、FokI切断緩衝液により最終容積19μlに希釈した。FokI切断緩衝液は、20mM Tris-HCl(pH8.5)、75mM NaCl、10μM ZnCl2、1mM DTT、5％グリセロール、500μg/ml BSAを含む。この混合物は、37℃で1時間インキュベーションした。その後8mM MgCl2を含有するFokI緩衝液6.5μlを添加し、インキュベーションを37℃で1時間継続した。各反応液への10μlフェノール-クロロホルム溶液の添加、混合、及び相分離するための遠心により、タンパク質を抽出した。各反応液からの水相10μlを、10％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分析した。
【０２５７】
このゲルに、オートラジオグラフィーを施し、各ZFP-FokI融合体/基質対の切断効率を、未切断及び切断基質に対応するバンド中の放射能を定量し、総放射能を得るために合計し、及び切断産物を示すバンド中に存在する総放射能の割合を決定することにより算出した。
【０２５８】
この実験の結果を表8に示した。このデータは、所定の標的部位の分離について最適な切断効率を提供するZCリンカーの選択を可能にしている。このデータは、標的部位の選択された対で切断することができるが、意図された切断部位のものとは異なる分離を有する同じ又は同様のZFP標的部位での切断を識別するリンカー長の選択も可能にしている。
【０２５９】
【表１０】
2010046099.tif 000012
【０２６０】
4残基リンカーを伴うZFP-FokI融合体について、リンカーのアミノ酸配列も変動する。個別の構築体において、当初のLRGSリンカー配列(配列番号:107)は、LGGS(配列番号:108)、TGGS(配列番号:109)、GGGS(配列番号:110)、LPGS(配列番号:111)、LRKS(配列番号:112)、及びLRWS(配列番号:113)に変更され；及び、得られた融合体は、結合部位間で6-塩基対分離を有する基質について試験された。LGGS(配列番号:108)リンカー配列を含む融合体は、当初のLRGS配列(配列番号:107)を含むものよりも、より効率的に切断することが観察された。LRKS(配列番号:112)及びLRWS(配列番号:113)配列を含む融合体は、LRGS配列(配列番号:107)よりも効率が低く切断されたが、残りの融合体の切断効率は、当初のLRGS配列(配列番号:107)を含む融合体の場合と類似していた。
【０２６１】
実施例5：二量体化界面におけるFokI切断ハーフ-ドメインの変更から生じた増大した切断特異性
ZFP/FokI融合タンパク質対(5-8及び5-10と示した)は、標的部位間の領域の切断を促進するために、IL-2Rγ遺伝子の5番目のエキソンで標的部位に結合するようにデザインした。ふたつの融合タンパク質の標的配列を含むこの遺伝子の関連領域を、図19に示した。5-8タンパク質のアミノ酸配列は図20に示し、及び5-10タンパク質のアミノ酸配列は図21に示した。両方のタンパク質は、10アミノ酸ZCリンカーを含む。これらのタンパク質のジンクフィンガー部分に関して、DNA標的配列に加え、ジンクフィンガーの認識領域のアミノ酸配列を、表9に示した。
【０２６２】
【表１１】
2010046099.tif 000013
この融合タンパク質対の、それらの標的配列間のDNAの特異的切断を触媒する能力(図19参照)を、標的配列を含む標識したDNA鋳型を用い、診断的消化産物の存在をアッセイし、in vitroで試験した。特異的切断は、両方のタンパク質を使用した場合に得た(表10、第一行)。しかし5-10融合タンパク質(野生型FokI切断ハーフ-ドメインを含む)は、5-8タンパク質の非存在下で非-標的部位での異常な切断も可能であり(表10、第二行)、これは恐らく自己-二量体化によるものであろう。
【０２６３】
従って、5-10は、そのFokI切断ハーフ-ドメインにおいて、アミノ酸残基490のグルタミン酸(E)からリシン(K)への転換により修飾された(FokIタンパク質のアミノ酸残基の番号付けは前掲のWahらの論文に従う)。この修飾は、二量体化界面でのアミノ酸残基の変更による、ホモ二量体化を防止するようにデザインした。5-10(E490K)変異体は、親5-10タンパク質とは異なり、5-8融合タンパク質の非存在下で異常な部位で切断することはできなかった(表10、行3)。しかし5-10(E490K)変異体は、5-8タンパク質と共に、この基質の特異的切断を触媒した(表10、行4)。従って二量体化に関連した、5-10切断ハーフ-ドメイン中の残基の変更は、自己-二量体化のために、この融合タンパク質による異常な切断を防止した。E490R変異体は、親タンパク質よりもより低いレベルのホモ二量体化も示した。
【０２６４】
加えて5-8タンパク質を、486位のグルタミン(Q)残基をグルタミン酸(E)と交換することにより、その二量体化界面を修飾した。この5-8(Q486E)変異体を、野生型5-10タンパク質又は5-10(E490K)変異体のいずれかの存在下で、標的化された切断を触媒する能力について試験した。DNA切断は、標識された基質が5-8(Q486E)及び野生型5-10の両方の存在下でインキュベーションされた場合には認められなかった(表10、行5)。しかし5-8(Q486E)及び5-10(E490K)変異体が組合せて使用された場合には、切断が認められた(表10、行6)。
【０２６５】
これらの結果は、これらふたつの融合タンパク質の標的配列により規定されたもの以外の領域での、ZFP/FokI融合タンパク質対によるDNA切断は、融合タンパク質の一方又は両方の切断ハーフ-ドメインのアミノ酸配列の変更により、最小化又は排除することができることを示している。
【０２６６】
【表１２】
2010046099.tif 000014
【０２６７】
実施例6：欠損増強グリーン蛍光タンパク質(eGFP)遺伝子の作製
増強されたグリーン蛍光タンパク質(eGFP)は、アミノ酸64(フェニルアラニンからロイシン)及び65(セリンからトレオニン)の変化を含む、グリーン蛍光タンパク質(GFP；例えば、Tsien, Ann. Rev. Biochem., 67: 509- 544 (1998)参照)の修飾形である。Heimら、Nature, 373: 663-664 (1995)；Cormackら、Gene, 173: 33-38 (1996)。終止コドン及び2-bpフレームシフト変異を含む、eGFP遺伝子の欠損型を作製することにより、eGFP-ベースのレポーターシステムを構築した。eGFP遺伝子の配列は、図22に示した。これらの変異は、Platinum（登録商標）Taq DNAポリメラーゼHigh Fidelityキット(Invitrogen)並びにプライマーとしてオリゴヌクレオチドGFP-Bam、GFP-Xba、stop sense2、及びstop anti2(オリゴヌクレオチド配列は下記表11に列記した)を用いる、重複PCR変異誘発により挿入した。GFP-Bam及びGFP-Xbaは、外部プライマーとして使用したのに対し、プライマーstop sense2及びstop anti2はヌクレオチド変化をコードしている内部プライマーとして使用した。完全長eGFP遺伝子をコードしているpeGFP-NIベクター(BD Biosciences)を、ふたつの個別の増幅反応においてDNA鋳型として使用し、第一ではGFP-Bam及びstop anti2オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、第二ではGFP-Xba及びstop センス2オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。これは、その配列が重複した2種の増幅産物を作製した。これらの産物は一緒にし、外部GFP-Bam及びGFP-Xbaオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する、第三の増幅反応の鋳型として使用し、修飾されたeGFP遺伝子を作製し、これはヌクレオチド280-287の配列GACCACAT(配列番号:124)が、配列TAACAC(配列番号:125)と交換されていた。全ての増幅反応のPCR条件は以下であった：鋳型は最初に94℃で2分間変性し、その後反応液を、94℃で30秒間、46℃で45秒間、及び68℃で60秒間インキュベーションすることにより、25サイクル増幅した。最終の伸長ラウンドは、68℃で10分間行った。最終増幅産物の配列は、図23に示した。この795bp断片は、pCR(R)4-TOPOベクターへ、TOPO-TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローニングし、pCR(R)4-TOPO-GFPmut構築体を作製した。
【０２６８】
【表１３】
2010046099.tif 000015
【０２６９】
実施例7：eGFPを標的化するジンクフィンガーヌクレアーゼのデザイン及び集成
ヌクレオチド271-294(番号付けは図23に従う)に対応する変異されたGFP遺伝子(実施例6)の領域に結合するように、 2種類の3-フィンガーZFPをデザインした。これらのタンパク質の結合部位は、ふたつの結合部位を分離する6塩基対とは反対配向で生じた。図23参照。ZFP 287Aは、非-コード鎖上のヌクレオチド271-279に結合するのに対し、ZFP 296は、コード鎖上のヌクレオチド286-294に結合する。ZFPの認識領域のDNA標的及びアミノ酸配列は、以下及び表12に列記した：
287A：
F1  (GCGg)  RSDDLTR (配列番号:130)
F2  (GTA)  QSGALAR (配列番号:131)
F3  (GGG)  RSDHLSR (配列番号:132)
296S：
F1  (GCA)  QSGSLTR (配列番号:133)
F2  (GCA)  QSGDLTR (配列番号:134)
F3  (GAA)  QSGNLAR (配列番号:135)
【０２７０】
【表１４】
2010046099.tif 000016
【０２７１】
これらのタンパク質をコードしている配列は、PCR集成(例えば米国特許第6,534,261号)により作製し、pcDNA3.1ベクター(Invitrogen)のKpnI及びBamHI部位の間にクローニングし、FokIエンドヌクレアーゼの触媒ドメイン(Looneyらの論文(Gene, 80: 193-208 (1989))の配列のアミノ酸384-579)とインフレームで融合した。得られた構築体は、pcDNA3.1-GFP287-FokI及びpcDNA3.1-GFP296-FokI(図24)と称した。
【０２７２】
実施例8：デザインされたジンクフィンガーヌクレアーゼによる標的化されたin vitro DNA切断
pCR(R)4-TOPO-GFPmut構築体(実施例6)を用い、287及び296ジンクフィンガータンパク質の、それらの標的部位を特異的に認識し及びこのeGFPの修飾型をin vitroにおいて切断する能力を試験するための鋳型を提供した。
【０２７３】
欠損eGFP-コードしている挿入断片を含むDNA断片は、T7及びT3ユニバーサルプライマー及びpCR(R)4-TOPO-GFPmutを鋳型として用いるPCR増幅により得た。この断片は、γ-32P-ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用い末端標識した。組込まれないヌクレオチドは、微量遠心G-50カラム(Amersham)を用い除去した。
【０２７４】
実施例7に説明した287及び296ジンクフィンガーヌクレアーゼを発現するために、in vitroで組合せた転写/翻訳システムを使用した。各構築体について、200ng線状プラスミドDNAを、20μL TnT混合液中でインキュベーションし、及び30℃で1時間45分インキュベーションした。TnT混合液は、メチオニン(1mM)2μl及びZnCl2(20mM)2.5μlが補充された、TnT溶解液(これは、T7 RNAポリメラーゼ、Promega, Madison, WIを含む)100μlを含んだ。
【０２７５】
DNA切断の分析のために、287及び296の組合せた転写/翻訳反応混合物の各々からのアリコートを一緒にし、その後切断緩衝液により連続希釈した。切断緩衝液は、20mM Tris-HCl(pH8.5)、75mM NaCl、10mM MgCl2、10μM ZnCl2、1mM DTT、5％グリセロール、500μg/ml BSAを含有している。各希釈液5μlを、およそ1ng DNA基質(先に説明したように、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用い32Pで末端標識)と一緒にし、各混合物を更に希釈し、下記組成を有する20μl切断反応液を作製した：20mM Tris-HCl(pH8.5)、75mM NaCl、10mM MgCl2、10μM ZnCl2、1mM DTT、5％グリセロール、500μg/ml BSA。切断反応液は、37℃で1時間インキュベーションした。タンパク質は、10μlフェノール-クロロホルム溶液の各反応液への添加、混合、及び相を分離するための遠心により抽出した。各反応液からの水相10μlを、10％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分析した。
【０２７６】
このゲルに、オートラジオグラフィーを施し、実験結果を図25に示した。4本の左側のレーンは、各組合せた転写/翻訳反応混合物(切断反応液中)の最終希釈が、各々、1/156.25、1/31.25、1/12.5及び1/5であり、各組合せた転写/翻訳反応液の有効量0.032、0.16、0.4及び1μlを生じた。出発断片(図25において「未切断(uncut control)」と記したレーン)よりもより低い分子量を有するふたつのDNA断片の出現は、反応混合物中の漸増量の287及び296ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼと相関し、予想された標的部位でのDNA切断が得られたことを示した。
【０２７７】
実施例9：組込まれた欠損eGFP遺伝子を含む安定した細胞株の作製
変異eGFPをコードしているDNA断片eGFPmutを、pCR(R)4-TOPO-GFPmutベクター(実施例6)から切出し、pcDNA4/TOのHindIII及びNotI部位にクローニングし、これによりこの遺伝子を、テトラサイクリン-誘導性CMVプロモーターの制御下に配置した。得られるプラスミドを、pcDNA4/TO/GFPmut(図26)と称した。T-Rex 293細胞(Invitrogen)を、10％Tet-非含有ウシ胎仔血清(FBS)(Hyclone)を補充したダルベッコの変法イーグル培地(DMEM)(Invitrogen)において増殖した。細胞は、50％の集密度で6-ウェル皿に播種し、ふたつのウェルを各々、pcDNA4/TO/GFPmutでトランスフェクションした。これらの細胞は、48時間かけて回収し、その後両方のウェルからの細胞を一緒にし、選択培地、すなわち400μg/ml Zeocin(Invitrogen)を補充した培地中の10xl5-cm2皿に分けた。この培地は3日毎に交換し、10日後に単独のコロニーを単離し、更に増殖させた。各クローン株を、定量的RT-PCR(TaqMan（登録商標）)により、eGFPmut遺伝子のドキシサイクリン(dox)-誘導性発現について個別に試験した。
【０２７８】
定量的RT-PCR分析について、High Pure Isolationキット(Roche Molecular Biochemicals)を用い、総RNAを、dox-処理した又は未処理の細胞から単離し、各試料からの総RNA 25ngに、TaqMan（登録商標）アッセイを用い、リアルタイムRT-PCRを施し、内在性遺伝子発現を分析した。プローブ及びプライマー配列は、表13に示した。反応は、ABI 7700 SDS装置(PerkinElmer Life Sciences)上で、下記の条件下で行った。逆転写反応は、MultiScribe逆転写酵素(PerkinElmer Life Sciences)により48℃で30分間行い、引き続き95℃での10分間の変性工程を行った。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、AmpliGold DNAポリメラーゼ(PerkinElmer Life Sciences)により、95℃で15秒間及び60℃で1分間の40サイクル行った。結果は、SDS ver.1.7ソフトウェアを用いて解析し、図27に示し、eGFPmut遺伝子発現は、ヒトGAPDH遺伝子発現に対し基準化した。多くの細胞株が、eGFPのドキシサイクリン-依存型発現を示し；株18(T18)を、更なる試験のためのモデル細胞株として選択した。
【０２７９】
【表１５】
2010046099.tif 000017
【０２８０】
実施例10：欠損染色体のeGFP遺伝子の修正のためのドナー配列の作製
欠損eGFPmut遺伝子の修正に関する遺伝子情報を含むドナー構築体を、PCRにより構築した。PCR反応を、peGFP-NIベクターを鋳型として用い、先に説明したように行った。標的化された組換え実験におけるドナー構築体のバックグラウンド発現を防止するために、最初の12bp及び開始コドンを、プライマーGFPnostart及びGFP-Xba(表14に示した配列)を用いるPCRにより、ドナーから除去した。得られたPCR断片(734bp)を、哺乳類細胞プロモーターを含まないpCR(R)4-TOPOベクターにTOPO-TAクローニングによりクローニングし、pCR(R)4-TOPO-GFPdonor5(図28)を作製した。この構築体のeGFP挿入断片の配列(図22に示した配列のヌクレオチド64-797に相当)を、図29(配列番号:20)に示した。
【０２８１】
【表１６】
2010046099.tif 000018
【０２８２】
実施例11：標的化された切断及び組換えにより組込まれた染色体eGFP遺伝子における変異の修正
T18安定細胞株(実施例9)を、製造業者のプロトコールに従い、Opti-MEM I低(reduced)血清培地においてLipofectAMINE 2000試薬(Invitrogen)300ngを使用し、ZFP-FokI発現プラスミド(pcDNA3.1-GFP287-FokI及びpcDNA3.1-GFP296-FokI、実施例7)の一方又は両方及びドナープラスミドpCR(R)4-TOPO-GFPdonor5(実施例10)でトランスフェクションした。欠損染色体eGFP遺伝子の発現は、培養培地への2ng/mlドキシサイクリンの添加により、トランスフェクション後5〜6時間誘導した。トランスフェクション後24時間での100ng/mlノコダゾール(図30)又は0.2μMビンブラスチン(図31)の添加により、細胞を、細胞周期のG2相で停止した。G2停止は24〜48時間継続することができ、その後培地の除去により解放(release)した。これらの細胞をPBSで洗浄し、培地をテトラサイクリン-非含有FBS及び2ng/mlドキシサイクリンを含有するDMEMと交換した。これらの細胞を24〜48時間回収し、蛍光標示式細胞分取器(FACS)分析により、eGFP蛍光を示す細胞数をモニタリングすることにより、遺伝子修正効率を測定した。FACS分析は、Beckman-Coulter EPICS XL-MCL装置及びシステムII Data Acquisition and Displayソフトウェア、ver.2.0を用いて行った。eGFP蛍光は、アルゴンレーザーによる488nmでの励起、及び525nm(x-軸)の放出モニタリングにより検出した。バックグランド又は自己蛍光を、570nm(y-軸)での放出をモニタリングすることにより測定した。525nmでの高蛍光放出及び570nmでの低放出を示す細胞(領域E)を、遺伝子修正のために正(positive)スコア化した。
【０２８３】
これらの結果を、表15並びに図30及び31にまとめた。図30及び31は、T18細胞を、ZFPヌクレアーゼをコードしているpcDNA3.1-GFP287-FokI及びpcDNA3.1-GFP296-FokIプラスミド並びにpCR(R)4-TOPO-GFPdonor5プラスミドでトランスフェクションし、eGFP発現をドキシサイクリンで誘導し、並びに細胞をノコダゾール(図30)又はビンブラスチン(図31)のいずれかによりG2において停止した結果を示している。両方の図は、FACSトレースを示し、ここでeGFP蛍光を示す細胞は、トレースの右下部分に示されている(曲線下四分円4の部分である領域Eとして同定)。ノコダゾールで処理したトランスフェクションされた細胞について、GFP蛍光を示した細胞の5.35％が変異体染色体eGFP遺伝子の修正の指標である(図30)のに対し、ビンブラスチンで処理された細胞の6.7％がeGFP遺伝子修正を受けた(図31)。これらの結果は、表15の行1-8に対照実験と共にまとめた。
【０２８４】
まとめるとこれらの実験は、2種のZFPヌクレアーゼ及びドナー配列の存在下で、処理された細胞のおよそ1％が、遺伝子修正を受け、及びこの修正レベルは、細胞周期のG2相での処理された細胞を停止することにより、4〜5倍増大されたことを示している。
【０２８５】
【表１７】
2010046099.tif 000019
【０２８６】
実施例12：二量体化界面における配列変更を伴うジンクフィンガーヌクレアーゼを使用する欠損染色体遺伝子の修正
その配列が二量体化界面で変更されたジンクフィンガーヌクレアーゼを、欠損染色体eGFP遺伝子の修正を触媒するそれらの能力について試験した。ZFPヌクレアーゼのヌクレアーゼ部分(すなわち、FokI切断ハーフ-ドメイン)を実施例5に説明っしたように変更した以外は、実施例11に示したプロトコールを用いた。従って、E490K切断ハーフ-ドメインは、GFP296 ZFPドメインに融合され(表12)、及びQ486E切断ハーフ-ドメインは、GFP287 ZFPに融合されている(表12)。
【０２８７】
結果は、表15の行9-11に示し、これはそれらの二量体化界面に変更を有する2種のZFPヌクレアーゼの存在下で、いずれかのヌクレアーゼ単独の存在下で得られた結果と比べ、遺伝子修正頻度の有意な増加が得られたことを示している。追加実験では、T18細胞を、ドナープラスミド並びに287/Q486E及び296/E490Kジンクフィンガーヌクレアーゼコードしているプラスミドでトランスフェクションし、その後ノコダゾール又はビンブラスチンによりG2で停止したが、これはeGFP蛍光を示す細胞の2％以上の更なる遺伝子修正頻度の増加を示し、これは修正された染色体のeGFP遺伝子の指標である(表15、行12及び13)。
【０２８８】
実施例13：遺伝子修正の頻度に対するドナー長の作用
実施例11に説明した実験に類似した実験において、ドナー配列長の標的化された組換え頻度に対する作用を試験した。実施例11のように、T18細胞を、2種のZFPヌクレアーゼでトランスフェクションし、eGFP発現をドキシサイクリンで誘導した。細胞は、実施例11のような734bpのeGFP挿入断片(図29)を含むpCR(R)4-TOPO-GFPドナー5プラスミド(図28)か、又は変異された染色体eGFP遺伝子に相同な 1527bpの配列挿入断片(図32)を含む類似したプラスミドのいずれかでもトランスフェクションした。加えて、ノコダゾールによるG2停止の組換え頻度に対する作用を評価した。
【０２８９】
第二の実験において、0.7、1.08及び1.5kbpのドナー長を比較した。T18細胞は、実施例11に説明されたように、287-FokI及び296-FokI発現プラスミドの50ng(実施例7、表12)、及び0.7kbp、1.08kbp、又は1.5kbpドナーの500ngによりトランスフェクションした。トランスフェクションの4日後、細胞を、FACSにより欠損eGFP遺伝子の修正についてアッセイし、GFP蛍光をモニタリングした。
【０２９０】
表16に示したこれらふたつの実験の結果は、より長いドナー配列は、標的化された組換え頻度(及びここでは遺伝子の修正)を増大することを示し、並びに細胞周期G2相での細胞の停止も同じく標的化された組換えの頻度を増大することを確認している。
【０２９１】
【表１８】
2010046099.tif 000020
【０２９２】
実施例14：ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用する標的化された切断及び組換えによる内在性ヒトIL-2Rγ遺伝子の校正
各々ヒトIL-2Rγ遺伝子に標的化されたZFP-ヌクレアーゼをコードしているふたつの発現ベクターを構築した。各ZFP-ヌクレアーゼは、4個のアミノ酸のZCリンカーを介して(実施例4参照)、IIS型制限酵素FokIのヌクレアーゼドメイン(Wahらの論文の配列のアミノ酸384-579(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 10564-10569 (1998))に融合したジンクフィンガータンパク質-ベースのDNA結合ドメイン(表17参照)を含んだ。これらのヌクレアーゼは、コドン228及び229(この遺伝子における変異のホットスポット)を取り囲む染色体IL-2Rγ遺伝子のエキソン5の位置に結合し、かつそれらの結合部位の間にDNAの2本鎖切断を導入するようにデザインした。
【０２９３】
【表１９】
2010046099.tif 000021
【０２９４】
各キメラエンドヌクレアーゼの完全なDNA-結合部分は以下であった：
ACTCTGTGGAAG(配列番号:152)に標的化されたヌクレアーゼ
MAERPFQCRICMRNFSRSDNLSVHIRTHTGEKPFACDICGRKFARNAHRINHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDTLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAARSTRTNHTKIHLRGS (配列番号:162)
AAAGCGGCTCCG (配列番号:157)に標的化されたヌクレアーゼ
MAERPFQCRICMRNFSRSDTLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAARSTRTTHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDSLSKHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQRSNLKVHTKIHLRGS (配列番号:163)
【０２９５】
ヒト胚性腎293細胞を、ふたつの発現構築体によりトランスフェクションし(Lipofectamine 2000；Invitrogen)、これらは各々前段に説明されたZFP-ヌクレアーゼの一方をコードしている。これらの細胞は、pCR4Blunt-Topo (Invitrogen)ベクター中にX染色体(UCSCヒトゲノム、2003年7月リリース)の"-"鎖の位置69195166-69196708に相当するIL2Rγ遺伝子座の1,543bp断片を挿入断片として保持するドナー構築体でもトランスフェクションした。IL-2Rγ挿入断片配列は、下記のエキソン5(下線)配列のふたつの点変異を含んだ：
F R V R S R F N P L C G S (配列番号:164)
TTTCGTGTTCGGAGCCGGTTTAACCCGCTCTGTGGAAGT (配列番号:165)。
【０２９６】
第一の変異(CGC→CGG)は、アミノ酸配列(上側)を変更せず、ZFP-ヌクレアーゼのドナーDNAへの、及び組換え後の染色体DNAへの結合能に有害に作用するように役立つ。第二の変異(CCA→CCG)は、アミノ酸配列を変更せず、制限酵素BsrBIの認識部位を作製する。
【０２９７】
2つ組トランスフェクションにおいて、各ZFP-ヌクレアーゼ発現構築体の50又は100ng、及びドナー構築体の0.5又は1μgのいずれかを用いた。以下の対照実験も行った：eGFPタンパク質をコードしている発現プラスミドによるトランスフェクション；ドナー構築体のみによるトランスフェクション；及びZFPヌクレアーゼを発現しているプラスミドのみによるトランスフェクション。トランスフェクションの24時間後、ビンブラスチン(Sigma)を、各2つ組で、一方の試料へは最終濃度0.2μMとなるよう添加し、他方は未処理で維持した。ビンブラスチンは、細胞の紡錘体を集成する能力に影響を及ぼし、従って強力なG2停止剤として作用する。ビンブラスチン処理を行い、標的化の頻度を増大したが、その理由は相同-定方向(directed)2本鎖切断修復経路は、細胞周期のG2相における非-相同末端-連結よりもより活性があるからである。0.2μMビンブラスチンによる処理の48時間後、増殖培地を交換し、及びこれらの細胞を、更に24時間かけてビンブラスチン処理から回収した。その後ゲノムDNAを、DNEasy Tissue Kit (Qiagen)を用い、全ての細胞試料から単離した。その後各試料からの500ngのゲノムDNAを、図33に概略的に示したアッセイを用い、染色体IL-2Rγ遺伝子座中の新たなBsrBI部位の存在について試験することにより、遺伝子標的化頻度についてアッセイした。
【０２９８】
簡単に述べると、各々1.5kbドナー配列に相同な領域の直ぐ外側の染色体IL-2Rγ遺伝子座にハイブリダイズする表18に示したプライマーを使用するPCRの20サイクルを行った。PCR産物の検出を可能にするために、α-32P-dCTP及びα-32P-dATPの各々20μCiを各PCR反応液中に含んだ。PCR反応液は、G-50カラム(Amersham)上で脱塩し、BsrBI(New England Biolabs)10ユニットで1時間消化した。消化産物を、10％非-変性ポリアクリルアミドゲル(BioRad)上で分解し、このゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーにかけた(図34)。IL2Rγ遺伝子座の1.55kb増幅断片(図34の「wt」)に相当する主なPCR産物に加え、追加のバンド(図34の「rflp」)が、ドナーDNA構築体及び両ZFP-ヌクレアーゼ構築体でトランスフェクションされた細胞からの試料に対応するレーンにおいて観察された。この追加バンドは、対照レーンのいずれにおいても明らかでなく、このことは染色体へのBsrBI RFLP-含有ドナー配列のZFPヌクレアーゼ-促進した組換えがこの実験において生じたことを示している。
【０２９９】
RFLP-含有IL-2RγDNA配列の微量をヒトゲノムDNA(野生型IL-2Rγ遺伝子を含む)に添加し、及び得られた混合物を増幅し、RFLPを切断する制限酵素による消化を施した追加実験において、0.5％と少ないRFLP-含有配列が、このアッセイを用い定量的に検出できることを示した。
【０３００】
【表２０】
2010046099.tif 000022
【０３０１】
実施例15：K562細胞におけるIL-2Rγ遺伝子座での標的化された組換え
K562は、ヒト慢性骨髄性白血病に由来した細胞株である。標的化された切断に使用したタンパク質は、5-8G及び5-9DジンクフィンガーDNA-結合ドメインへのFokI融合体であった(実施例14、表17)。ドナー配列は、実施例14に説明した、変異により導入されたBsrBI部位を含むヒトIL-2Rγ遺伝子の1.5kbp断片であった。
【０３０２】
K562細胞は、10％ウシ胎仔血清(FBS)(Hyclone)及び2mM L-グルタミンを補充した、RPMI培地1640(Invitrogen)において培養した。全ての細胞は、5％CO2大気中、37℃で維持した。これらの細胞を、Nucleofection(商標)(Solution V, Program T16)(Amaxa Biosystems)で、1試料につき2,000,000個細胞をトランスフェクションする製造業者のプロトコールに従いトランスフェクションした。以下に説明したような様々な組合せで使用したトランスフェクションのためのDNAは、5-8G ZFP-FokI融合エンドヌクレアーゼをコードしているプラスミド、5-9D ZFP-FokI融合エンドヌクレアーゼコードしているプラスミド、対照としてドナー配列を含むプラスミド(前記及び実施例14に説明)及びpeGFP-N1ベクター(BD Biosciences)を使用した。
【０３０３】
第一の実験において、細胞は、表19に示した、様々なプラスミド又はプラスミドの組合せによりトランスフェクションした。
【０３０４】
【表２１】
2010046099.tif 000023
【０３０５】
ビンブラスチン-処理した細胞は、30時間トランスフェクションした後、0.2μMビンブラスチンに24時間曝露した。これらの細胞を収集し、PBSで2回洗浄し、及び増殖培地に再播種した。トランスフェクションの4日後、細胞は、ゲノムDNAの分析のために収集した。
【０３０６】
ゲノムDNAは、DNEasyキット(Qiagen)を用い細胞から抽出した。各試料からの100ngのゲノムDNAを、下記プライマーによるPCR反応に使用した：
エキソン5フォワード：GCTAAGGCCAAGAAAGTAGGGCTAAAG (配列番号:168)
エキソン5リバース：TTCCTTCCATCACCAAACCCTCTTG (配列番号:169)
【０３０７】
これらのプライマーは、IL2Rγ遺伝子のエキソン5を含む、"-"鎖(UCSCヒトゲノム、2003年7月リリース)上の位置69195100-69196768に対応する X染色体の1,669bp断片を増幅した。ドナーDNAによる相同組換えを受けるゲノムDNAの増幅は、BsrBI部位を含む産物を生成したのに対し；ドナーDNAによる相同組換えを受けないゲノムDNAの増幅産物は、この制限部位を含まなかった。
【０３０８】
反応産物の可視化を可能にするために、10μCiの各α-32P-dCTP及びα-32P-dATPを各増幅反応液に含んだ。PCRの20サイクル後、この反応液を、Sephadex G-50カラム(Pharmacia)において脱塩し、BsrBI(New England Biolabs)10ユニットで37℃で1時間消化した。その後この反応液を、10％非-変性PAGE上で分離し、乾燥し、PhosphorImagerスクリーンに曝した。
【０３０９】
この実験の結果を、図35に示した。細胞を対照GFPプラスミド、ドナープラスミド単独又はドナー非存在下での2種のZFP-コードしているプラスミドでトランスフェクションした場合、図35においてこれらの試料に対応するレーン中の「rflp」記されたバンドの非存在により示されるように、増幅産物中にBsrBI部位は存在しなかった。しかしドナープラスミド及び両ZFP-コードしているプラスミドでトランスフェクションされた細胞のゲノムDNAは、ドナーDNAによる相同組換えにより導入されたBsrBI部位(「rflp」と記されたバンド)を含んだ。図35に示された、RFLP-含有DNAにより表されたシグナルの割合の定量は、最適条件下でトランスフェクションされた細胞集団において全IL-2Rγ遺伝子の最大18％が、相同組換えにより変更されたことを示した。 
【０３１０】
第二の実験は、トランスフェクション後10日間細胞を増殖した以外は、上記に説明したプロトコールに従い行った。トランスフェクションに使用したDNAは、表20に示した。
【０３１１】
【表２２】
2010046099.tif 000024
【０３１２】
図36に示した増幅されたDNAのBsrBI消化の分析は、IL-2Rγ遺伝子の最大18％が、複数回の細胞分裂後、相同組換えにより配列変更を受けたことを再度示した。従って標的化された組換え事象は安定している。
【０３１３】
加えてこの第二の実験においてトランスフェクションされた細胞のDNAを、サザンブロットにより分析した。この分析のために、各試料からの12μgゲノムDNAを、100ユニットのEcoRI、50ユニットのBsrBI、及び40ユニットのDpnI(全てNew England Biolabs)により、37℃で12時間消化した。この消化は、未変性のIL-2Rγ遺伝子(BsrBI部位を欠いている)から7.7kbp EcoRI断片を、並びにその配列が相同組換えによりBsrBI部位を含むように変更された染色体IL-2Rγ遺伝子から6.7及び1.0kbp断片を生じた。メチル化に依存した制限酵素であるDpnIは、dam-メチル化されたドナーDNAを破壊するために含有した。メチル化されないK562細胞ゲノムDNAは、DpnI消化に対し耐性を有した。
【０３１４】
消化後、ゲノムDNAを、フェノール-クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製し、TE緩衝液中に再懸濁し、サイズマーカーを生じるEcoRI及びSphIで消化されたゲノムDNA試料と共に、0.8％アガロースゲル上で分解した。このゲルを、標準手法に従いアルカリ転写(alkaline transfer)のために処理し、DNAをナイロンメンブレン(Schleicher and Schuell)に写した。その後ブロットへのハイブリダイゼーションを、X染色体"-"鎖(UCSCヒトゲノム、2003年7月リリース)の位置69198428-69198769に対応するIL-2Rγ遺伝子座の放射標識された断片を用いて行った。この遺伝子のこの領域は、ドナーDNAに相同な領域の外側である。ハイブリダイゼーション後、このメンブレンを、PhosphorImagerプレートに曝し、データはMolecular Dynamicsソフトウェアを用い定量した。染色体IL-2Rγ配列の変更を、EcoRI-BsrBI断片(オートラジオグラフの隣の矢印；BsrBI部位は、オートラジオグラフィー上のマップで黒三角で示した)に相当するバンド強度の分析により測定した。
【０３１５】
図37に示された結果は、染色体IL-2Rγ配列の最大15％が、相同組換えにより変更されたことを示し、従ってPCR分析により得られた結果は、標的化された組換え事象が複数回の細胞分裂後により安定したことを確認した。サザンブロットの結果も、図36に示された結果は、増幅のアーチファクトから生じないことを示した。
【０３１６】
実施例16：CD34-陽性造血幹細胞におけるIL-2Rγ遺伝子座での標的化された組換え
遺伝子疾患(例えば、重症複合型免疫不全症(SCID)及び鎌状細胞貧血)は、疾患に寄与する特異的DNA配列変更の相同組換え-媒介型修正により治療することができる。ある症例において、治療の最大効率及び安定性は、多能性細胞における遺伝子欠損の修正から生じる。この目的のために、本実施例は、ヒトCD34-陽性骨髄細胞におけるIL-2Rγ遺伝子の配列の変更を明らかにしている。CD34+細胞は、赤血球、骨髄及びリンパ球系統を生じる多能性造血幹細胞である。
【０３１７】
骨髄-由来のヒトCD34細胞は、AllCells, LLCから購入し、及び凍結貯蔵品として出荷された。これらの細胞は解凍し、5％C02大気下で、10％ウシ胎仔血清(FBS)(Hyclone)及び2mM L-グルタミンを補充したRPMI培地1640(Invitrogen)中に37℃で2時間放置した。細胞試料(1x106又は2x106個細胞)を、Human CD34 Cell Nucleofector(商標)Kitを製造業者のプロトコールに従い用い、Nucleofection(商標)(amaxa biosystems)によりトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を、10％FBS、2mM L-グルタミン、100ng/ml顆粒球-コロニー刺激因子(G-CSF)、100ng/ml幹細胞因子(SCF)、100ng/mlトロンボポイエチン(TPO)、50ng/ml Flt3リガンド、及び20ng/mlインターロイキン-6(IL-6)を補充したRPMI培地1640(Invitrogen)において培養した。カスパーゼ阻害剤zVAD-FMK(Sigma-Aldrich)を、トランスフェクション直後に増殖培地に最終濃度40μMまで添加し、アポトーシスをブロックした。追加のカスパーゼ阻害剤を、48時間後に、最終濃度20μMまで添加し、更なるアポトーシスを阻止した。これらの細胞は、5％C02大気下で37℃で維持し、トランスフェクション後3日間収集した。
トランスフェクションに使用した細胞数及びDNAを、表21に示した。
【０３１８】
【表２３】
2010046099.tif 000025
【０３１９】
ゲノムDNAは、MasterPure DNA Purification Kit(Epicentre)を用い、細胞から抽出した。沈殿中のグリコーゲンの存在により、PCR反応液中の投入物として使用したこのDNAの正確な定量は不可能であり；臭化エチジウム-染色したアガロースゲルの分析を用いた推定は、約50ngゲノムDNAが各試料中で使用されたことを示した。その後PCRの30サイクルを、下記プライマーを用い行い、各々1.5kbドナーに相同な領域のすぐ外側の染色体IL-2Rγ遺伝子座にハイブリダイズしている：
ex5 1.5detF3  GCTAAGGCCAAGAAAGTAGGGCTAAAG (配列番号:170)
ex5 1.5detR3  TTCCTTCCATCACCAAACCCTCTTG (配列番号:171)
【０３２０】
PCR産物の検出を可能にするために、20μCiの各α-32P-dCTP及びα-32P-dATPを各増幅反応液に含んだ。ゲル内の定量参照を提供するために、Jurkat細胞のIL-2Rγ遺伝子のエキソン5の自然発生的に生じたSNPの存在を、外挿し：このSNPは、正常ヒトDNAに存在するMaeII部位の破壊により、RFLPを生じる。従って参照標準は、1又は10ngの正常ヒトゲノムDNA(Clontech、Palo Alto, CAから入手)の、各々、100又は90ngのJurkatゲノムDNAへの添加により作製した。PCR反応液は、G-50カラム(Amersham)上で脱塩し、制限酵素で1時間消化し：実験試料は、BsrBI(New England Biolabs)10ユニットで消化し；「参照標準」反応液を、MaeIIで消化した。この消化産物を、10％非-変性PAGE(BioRad)上で分解し、ゲルを乾燥し、PhosphorImagerプレート(Molecular Dynamics)に曝すことにより分析した。
【０３２１】
結果を図38に示している。IL2Rγ遺伝子座の1.6 kb断片(図38の右側パネルにおいて「wt」)に相当する主なPCR産物に加え、追加バンド(「rflp」と表示)が、ZFP-ヌクレアーゼ及びドナーDNA構築体をコードしているプラスミドによりトランスフェクションされた細胞由来の試料に相当するレーンに認められた。この追加バンドは、対照レーンには認められず、共通γ鎖のエキソン5を標的化するZFP-ヌクレアーゼ補助する遺伝子標的化が、この実験において生じるという考えと一致する。
【０３２２】
標的化する割合の正確な定量は、RFLPバンドの野生型バンドに対する接近性により複雑化されるが；標的化頻度は、参照標準(左側パネル)との比較により、1〜5％の間であると推定された。
【０３２３】
実施例17：ドナー-標的相同作用
ドナーDNAとそれと組換えする染色体配列の間の相同性の程度の相同組換え頻度に対する作用を、実施例9において説明したように、T18細胞株において試験した。この株は、染色体に組込まれた欠損eGFP遺伝子を含み、ドナーDNAは、この欠損を修正する染色体遺伝子に関する配列変化を含む。
【０３２４】
従って実施例10に示されたドナー配列を、PCR変異誘発により修飾し、標的に非-相同性の程度が異なる一連の〜700bpドナー構築体を作製した。修飾されたドナーは全て、染色体eGFP遺伝子の欠損が修正された配列変化を含み、及び切断部位の周辺のコード領域へ挿入された追加のサイレント変異(コードされたタンパク質の配列を変化しないDNA変異)を含んだ。これらのサイレント変異は、ドナー配列のジンクフィンガー-切断ドメイン融合体による結合及び切断を防止し、これによりキメラヌクレアーゼによる結合に関する意図された染色体標的とドナープラスミドの間の競合を低下することを意図した。加えて相同組換え後、キメラヌクレアーゼが新たに挿入された染色体配列を結合及び再切断する能力(並びに、別の組換えラウンドを刺激するか、又は非-相同末端連結もしくはゲノムの他の2本鎖切断-駆動した変更を引き起こす可能性)は、最小化された。
【０３２５】
4種の異なるドナー配列を試験した。ドナー1は、染色体欠損eGFP標的配列に対し8個のミスマッチを含み、ドナー2は、10個のミスマッチを有し、ドナー3は、6個のミスマッチを有し、及びドナー5は、4個のミスマッチを有した。ドナー5の配列は、野生型eGFP配列と同じであるが、T18細胞株の欠損染色体eGFP配列に対し4個のミスマッチを含むことに注意。表22は、ヌクレオチド201-242の間の各ドナーの配列を提供する。T18細胞株のゲノムへ組込まれた欠損eGFP遺伝子の配列から分岐する(divergent)ヌクレオチドは、太字で印し下線を付けた。欠損染色体eGFP遺伝子(GFPmut)及び正常eGFP遺伝子(GFPwt)の対応する配列も示した。
【０３２６】
【表２４】
2010046099.tif 000026
【０３２７】
T18細胞株は、実施例11に示したように、287-FokI及び296-FokI発現構築体の50ng(実施例7及び表12)及び各ドナー構築体500ngでトランスフェクションした。FACS分析は、実施例11に説明したように行った。
【０３２８】
表23に示した結果は、ドナー及び染色体標的配列の間のミスマッチの減少した程度(すなわち、増加した相同性)が、GFP機能の回復により評価した、相同組換え頻度の増加を生じることを示している。
【０３２９】
【表２５】
2010046099.tif 000027
【０３３０】
前述の結果は、相同組換えのレベルは、標的-ドナー配列の分岐の程度の減少により増加されることを示している。特定の理論と結びつけられることは欲さないか、又は特定の機構を提唱するものではないが、ドナーと標的の間のより大きい相同性は、細胞の相同組換え機構が適当な鋳型としてドナー分子を認識することによる効率の増加により、相同組換えを促進することは注目される。あるいは、標的に対するドナー相同性の増加も、キメラZFPヌクレアーゼによるドナーの切断につながり得る。切断されたドナーは、鎖の侵入速度の増加による、相同組換えの促進を補助するか、又は相同組換え機構による相同性検索時にDNAの相同なひと配列としての切断されたドナー末端の認識を補助する。更にこれらの可能性は、相互には排除されない。
【０３３１】
実施例18：siRNAの調製
非-相同末端連結(NHEJ)に関連したタンパク質の細胞レベルの減少は、標的化された相同組換えを促進するかどうかを試験するために、Ku70タンパク質のレベルを、siRNA阻害により減少した実験を行った。Ku70遺伝子に標的化されたsiRNA分子は、Ku70 cDNAの転写、それに続くダイサー酵素による2本鎖転写産物の切断により作製した。
【０３３２】
簡単に述べると、293及びU20S細胞から作製されたcDNAプールを、Ku70遺伝子に特異的な増幅プライマーの異なるセットを使用する5種の個別の増幅反応において使用し、500-750bpのサイズ範囲の5種のcDNA断片のプール(プールA-E)を作製した。次にこれらの5種のプール中の断片を、再度各cDNAプールのプライマーの異なるセットを使用し、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーターエレメントを含むプライマーを用いて再増幅した。cDNA生成及びPCR反応を、Superscript Choice cDNAシステム及びPlatinum Taq High Fidelity Polymerase(両方ともInvitrogen, Carlsbad, CA)を製造業者のプロトコール及び推奨に従い用いて行った。
【０３３３】
その後増幅されたDNAプールの各々を、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼによりin vitroで転写し、RNAMAXX in vitro 転写キット(Stratagene, San Diego, CA)を製造業者の指示に従い使用し、2本鎖RNA(dsRNA)の5種のプール(A-E)を作製した。エタノールによる沈殿後、各プールのRNAを再懸濁し、組換えダイサー酵素(Stratagene, San Diego, CA)を製造業者の指示に従い用いin vitro切断した。5種のプールの各々における21-23bp siRNA産物を、最初にMicrospin G-25カラム(Amershan)を、その後Microcon YM-100カラム(Amicon)を使用する2工程法により精製した。siRNA産物の各プールを、Lipofectamone 20000（登録商標）を使用し、T7細胞株へ一過性にトランスフェクションした。
【０３３４】
Ku70発現を抑制するsiRNAプールの相対有効性をアッセイするためのウェスタンブロットを、トランスフェクション後およそ3日間行った。簡単に述べると、細胞を溶解し、RIPA緩衝液(Santa Cruz Biotechnology)を用いて破壊し、溶解液をQIAshredder(Qiagen, Valencia, CA)を通過させることによりホモジナイズした。透明化された溶解液を次に、SDS PAGE 試料緩衝液(還元剤としてβメルカプトエタノールを使用した)で処理し、5分間煮沸した。その後試料を、4〜12％勾配NUPAGEゲル上で分解し、PVDFメンブレン上に転写した。このブロットの上側部分は、抗-Ku70抗体(Santa Cruz sc-5309)に曝し、下側部分は、抗-TF IIB抗体(Santa Cruz sc-225、投入対照として使用)に曝した。その後このブロットを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ-複合したヤギ抗-マウス二次抗体に曝し、Pierce Chemical Co.のキットを製造業者の指示に従い使用するエレクトロケミルミネッセンス(ECL)検出について処理した。
【０３３５】
図39は、2種のsiRNAプール(プールD及びE)のT7細胞へのトランスフェクション後の代表的結果を示す。siRNA Eの70ngによるトランスフェクションは、Ku70タンパク質レベルの有意な減少を生じている(図39、レーン3)。
【０３３６】
実施例19：非-相同末端連結に関連したタンパク質発現の阻害による相同組換え頻度の増加
ゲノムDNA中の2本鎖切断の修復は、ふたつの異なる細胞経路に沿って進行することができる；相同組換え(HR)又は非-相同末端連結(NHEJ)。Ku70は、ゲノムDNA内の2本鎖切断から生じる自由な(free)DNA末端に結合する、NHEJに関連したタンパク質である。NHEJに関連したタンパク質の細胞内濃度の低下が、HR頻度を増加するかどうかを試験するために、実施例18に説明されたように調製した低分子干渉RNA(siRNA)を用い、Ku70 mRNAの発現を阻害し、これによりKu70タンパク質のレベルを低下し、細胞において、ドナーDNA及びキメラヌクレアーゼをコードしているプラスミドにより同時-トランスフェクションした。
【０３３７】
これらの実験に、T7細胞株(実施例9及び図27)を使用した。これらの細胞は、染色体に-組込まれた欠損eGFP遺伝子を含むが、実施例11-13において使用したT18細胞株よりも、標的化された相同組換えのより低いレベルを示すことが認められた。
【０３３８】
T7細胞は、実施例11に説明したように、Ku70を標的化するダイサー生成物のふたつのプール(実施例18参照)の一方の70又は140ngのいずれかでトランスフェクションした。タンパク質ブロット分析を、トランスフェクションされた細胞由来の抽出物について行い、細胞のsiRNAによる処理は、Ku70タンパク質のレベルの減少を生じるかどうかを決定した(前記実施例参照)。図39は、Ku70タンパク質のレベルが、プールE由来のsiRNAの70ngで処理された細胞において低下されることを示している。
【０３３９】
同じ実験において別の細胞試料を、70又は140ngのsiRNA(プールD又はプールE)の、各50ngの287-FokI及び296-FokI発現構築体(実施例7及び表12)並びに500ngの1.5kbp GFPドナー(実施例13)と共に同時-トランスフェクションし、より低いKu70レベルが、相同組換え頻度を増大するかどうかを決定した。この実験プロトコールは、表24に示した。相同組換えによる、eGFP活性の回復は、実施例11に示されたようなFACS分析によりアッセイした。 
【０３４０】
【表２６】
2010046099.tif 000028
【０３４１】
トランスフェクションされたT7細胞における欠損eGFP遺伝子の％補正(標的化された相同組換え頻度の指標)は、表24の最も右側の列に示した。最高の標的化された組換え頻度は実験6において認められ、ここでは細胞は、ドナーDNA、2種のeGFP-標的化された融合ヌクレアーゼをコードしているプラスミド、及びsiRNAプールEの70ngでトランスフェクションされた。実施例18及び図39を参照し、プールE siRNAの70ngが、Ku70タンパク質レベルを有意に抑制したことが示されている。従って、NHEJに関連したタンパク質の細胞レベルを低下する方法は、相同組換えを促進する手段として使用することができる。
【０３４２】
実施例20：ヒトβ-グロビン遺伝子に標的化されたジンクフィンガー-FokI融合ヌクレアーゼ
ヒトβ-グロビン遺伝子に標的化された多くの4-フィンガージンクフィンガーDNA結合ドメインがデザインされ、及びFokI切断ハーフ-ドメインに融合された各ジンクフィンガードメインをコードしているプラスミドが構築された。各ジンクフィンガードメインは、4ジンクフィンガーを含み、及び鎌状細胞貧血の原因となる変異をコードしているヒトβ-グロビン遺伝子の領域の12bp標的部位を認識した。これらの各タンパク質のその標的配列に対する結合親和性を評価し、強力な結合を示している4種のタンパク質(sca-r29b、sca-36a、sca-36b及びsca-36c)を、FokI融合エンドヌクレアーゼの構築に用いた。
【０３４３】
ヒトβ-グロビン遺伝子の配列に並置したZFP DNA結合ドメインの標的部位を以下に示す。翻訳開始コドン(ATG)は、太字で下線を付け、A-T置換は鎌状細胞貧血を引き起こす。
【０３４４】
【表２７】
2010046099.tif 000029
【０３４５】
これら4種のタンパク質中のジンクフィンガーの認識領域のアミノ酸配列を、表25に示す。これらのジンクフィンガードメインの完全なアミノ酸配列は、図40に示した。sca-36aドメインは、12近接ヌクレオチド(先に大文字で示した)を有する標的部位を認識するのに対し、他の3種のドメインは、単独のヌクレオチドで(小文字で示した)隔てられたふたつの6-ヌクレオチド標的部位(大文字で示した)を含む13ヌクレオチド配列を認識する。従ってsca-r29b、sca-36b及びsca-36cドメインは、それらの4種のフィンガーの第二及び第三の間にアミノ酸配列TGGGGSQKP(配列番号:183)を有する非-カノニカルフィンガー間リンカーを含む。
【０３４６】
【表２８】
2010046099.tif 000030
【０３４７】
実施例21：DNA標的配列のβ-グロビン-標的化されたZFP/FokI融合エンドヌクレアーゼによるin vitro切断
先の実験において説明されたFokI切断ハーフ-ドメイン及び4種のZFP DNA結合ドメインのひとつを含む融合タンパク質を、推定された配列特異性によるin vitroにおいてDNAを切断するそれらの能力について試験した。これらのZFPドメインは、先に説明したように、pcDNA3.1発現ベクターに、KpnI及びBamHI部位でクローニングし、FokI切断ドメインへ4種のアミノ酸ZCリンカーによりインフレームで融合した。700bpのヒトβ-グロビン遺伝子を含むDNA断片を、K562細胞から得たゲノムDNAからクローニングした。この断片の単離及び配列は、前記実施例3に説明した。
【０３４８】
In vitroアッセイ用の融合エンドヌクレアーゼ(ZFN)を作製するために、sca-r29b、sca-36a、sca-36b及びsca-36cタンパク質への FokI融合体をコードしている環状プラスミドを、in vitro転写/翻訳システムにおいてインキュベーションした。実施例4を参照のこと。TNT反応液2μl(単独タンパク質がアッセイされる場合、単独反応液2μl、又はタンパク質の対がアッセイされる場合、各反応液1μl)を、切断緩衝液混合物13μl及び標識したプローブ(〜1ng/μl)3μlに添加した。このプローブは、ポリヌクレオチドキナーゼを用い、32Pで末端標識した。この反応液を、室温で1時間インキュベーションし、ZFNの結合を可能にした。切断は、8mM MgCl2の8μlの添加により刺激し、切断緩衝液で希釈し、最終濃度およそ2.5mMとした。切断反応液を、37℃で1時間インキュベーションし、フェノール/クロロホルム11μlの添加により停止した。DNAは、フェノール/クロロホルム抽出液から単離し、実施例4に説明したように、ゲル電気泳動により分析した。対照として、未切断のDNAの移動を印すために、プローブ3μlをゲル上で分析した(図41の標識された"U")。
【０３４９】
これらの結果は、図41に示した。標的DNAの単独のジンクフィンガー/FokI融合体のいずれかとのインキュベーションは、鋳型DNAのサイズの変化を生じなかった。しかし、sca-r29bヌクレアーゼのsca-36b又はsca-36cヌクレアーゼのいずれかとの組合せは、ふたつのより短いDNA断片の存在により証明されるように(図41の最も右側のふたつのレーン)、標的DNAの切断を生じた。
【０３５０】
実施例22：染色体のGFPレポーターシステムにおいて試験されたβ-グロビン遺伝子に標的化されたZFP/FokI融合エンドヌクレアーゼ
実施例20に説明したようなZFNにより標的化されたヒトβ-グロビン遺伝子配列を含むDNA断片を合成し、及びeGFPレポーター遺伝子のSpeI部位にクローニングし、これによりeGFP発現を破壊した。この断片は、以下の配列を含み、ここで鎌状細胞変異の原因となるヌクレオチドには、太字で下線を付けた：
CTAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTAG (配列番号:200)
【０３５１】
この挿入されたβ-グロビン配列を含む破壊されたeGFP遺伝子は、pcDNA4/TO(Invitrogen, Carlsbad, CA)へ、HindlII及びNotI部位を用いクローニングし、得られたベクターは、HEK293 TRex細胞(Invitrogen)へトランスフェクションした。個々の安定したクローンを単離し、増殖し、これらのクローンを、sca-29bと対をなす各sca-36タンパク質(sca-36a、sca- 36b、sca-36c)をトランスフェクションすることにより、標的化された相同組換えについて試験した(これらのキメラヌクレアーゼの配列及び結合部位については実施例20及び表25を参照のこと)。細胞は、各ZFNをコードしているプラスミド50ng及び1.5-kb GFPドナー(実施例13)の500ngでトランスフェクションした。トランスフェクションの5日後、細胞を、挿入された欠損eGFP遺伝子座での相同組換えについて試験した。最初に、細胞は、eGFP機能について蛍光顕微鏡により試験した。蛍光を示す細胞を次に、実施例11に説明したように、FACSアッセイを用い、eGFP蛍光について定量的に分析した。
【０３５２】
これらの結果は、sca-29b及びsca-36aでトランスフェクションされた全ての細胞株は、蛍光顕微鏡でアッセイした場合に、eGFP機能について陰性であったことを示している。sca-36b又はsca-36cのいずれかと対をなすsca-29bでトランスフェクションされた株の一部は、蛍光顕微鏡でアッセイした場合に、eGFP発現陽性であり、従ってFACS分析により更に分析した。これらのふたつの株のFACS分析の結果を表26に示し、これはβ-グロビン配列に標的化されたジンクフィンガーヌクレアーゼは、生存細胞において相同組換えを促進するために、配列-特異的な2本鎖DNA切断を触媒することが可能であることを示している。
【０３５３】
【表２９】
2010046099.tif 000031
【０３５４】
実施例23：標的化された相同組換えに対する転写レベルの作用
染色体DNA配列の転写は、そのクロマチン構造の変更に関連しているので (一般に転写された配列はよりアクセス可能となる)、活性のある転写された遺伝子は、標的化された相同組換えにとってより好ましい基質であることが可能である。この考えは、その転写が、ドキシサイクリン-誘導性プロモーターの制御下にある欠損eGFP遺伝子をコードしている染色体配列を含むT18細胞株(実施例9)を用いて試験した。
【０３５５】
T18細胞の個別の試料を、eGFP-標的化された287及び296ジンクフィンガー/FokI融合タンパク質をコードしているプラスミド(実施例7)並びに染色体eGFP遺伝子の欠損を修正する配列を含む1.5kbpドナーDNA分子(実施例9)でトランスフェクションした。トランスフェクションの5時間後、トランスフェクションされた細胞を、異なる濃度のドキシサイクリンで処理し、その後eGFP mRNAレベルを、ドキシサイクリン添加後48時間測定した。520nmでのeGFP蛍光(挿入されたβ-グロビン配列を交換するための、ドナー配列の染色体への標的化された組換えの指標)を、トランスフェクション後4日目にFACSにより測定した。
【０３５６】
結果は図42に示した。GAPDH mRNAへ基準化したへeGFP mRNAの安定した状態のレベルの増加(最初の近似の結果に対し、欠損染色体eGFP遺伝子の転写率と同等)は、バーで示した。各バーの上の数値は、eGFP蛍光を示す細胞の割合(％)を示す。結果は、標的遺伝子の増加する転写率は、より高い標的化された組換えの頻度を随伴することを示している。このことは、転写の標的化された活性化(例えば共有の米国特許第6,534,261号及び第6,607,882号に開示されているように)は、標的化されたDNA切断と組合せて用い、細胞における標的化された相同組換えを刺激することができることを示唆している。
【０３５７】
実施例24：IL-2Rγ遺伝子に変異を含む細胞株の作製
K562細胞を、5-8GL0及び5-9DL0ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)をコードしているプラスミド(実施例14；表17参照)及び1.5kbp DraIドナー構築体でトランスフェクションした。DraIドナーは、IL2Rγ遺伝子の5番目のエキソンをコードしている領域と相同な配列で構成されたが、ZFN-結合部位の間に余分な塩基を挿入し、フレームシフトを生じ及びDraI部位を作製している。
【０３５８】
トランスフェクションの24時間後、細胞を、0.2μMビンブラスチン(最終濃度)で30時間処理した。細胞を、PBSで3回洗浄し、培地中に再播種した。細胞を、3日間回収し、細胞のアリコートを取り出し、実施例14に説明されたものに類似したPCR-ベースのRFLPアッセイを行い、DraI部位の存在について試験した。その集団内の遺伝子修正頻度をおよそ4％と決定した。
【０３５９】
細胞は更に2日間回収させ、1600個の個別の細胞を、培地100μlが入った40x96-ウェルプレートに播種した。
【０３６０】
これらの細胞を約3週間増殖し、DraI変異体の表現型について均質な細胞を単離した。これらの細胞を、ゲノム修飾について(IL-2Rγ遺伝子のエキソン5中のDraI部位の存在についての試験することによる)並びにIL-2Rγ mRNAレベル(リアルタイムPCRによる)及びタンパク質レベル(ウェスタンブロットによる)について試験し、この変異の遺伝子発現に対する作用を決定した。細胞は、FACS分析により機能について試験した。
【０３６１】
IL-2Rγ遺伝子内に DraIフレームシフト変異を含む細胞は、5-8GL0及び5-9DL0融合タンパク質をコードしているプラスミド並びに1.5kb BsrBIドナー構築体(実施例14)によりトランスフェクションし、Dralフレームシフト変異を、機能的タンパク質をコードしている配列と交換した。1％より大きい相同組換えレベルを、実施例14に説明したBsrBI部位の存在をアッセイすることにより測定し、これらの細胞において得た。遺伝子機能の回復は、mRNA及びタンパク質レベルの測定並びにFACS分析により明らかにされた。
【０３６２】
本明細書において引用された全ての特許、特許出願及び刊行物は、全ての目的のためにそれら全体が参照として組入れられている。
【０３６３】
開示が、理解を明確化する目的で例証及び実施例により詳細に提供されているが、当業者には、開示の精神又は範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修飾を実践することができることは明らかであろう。従って先の説明及び実施例は、限定として構成されるものではない。
【図１】
2010046099.tif 000032
【図２】
2010046099.tif 000033
【図３】
2010046099.tif 000034
【図４】
2010046099.tif 000035
【図５】
2010046099.tif 000036
【図６】
2010046099.tif 000037
【図７】
2010046099.tif 000038
【図８】
2010046099.tif 000039
【図９】
2010046099.tif 000040
【図１０】
2010046099.tif 000041
【図１１】
2010046099.tif 000042
【図１２】
2010046099.tif 000043
【図１３】
2010046099.tif 000044
【図１４】
2010046099.tif 000045
【図１５】
2010046099.tif 000046
【図１６】
2010046099.tif 000047
【図１７】
2010046099.tif 000048
【図１８】
2010046099.tif 000049
【図１９】
2010046099.tif 000050
【図２０】
2010046099.tif 000051
【図２１】
2010046099.tif 000052
【図２２】
2010046099.tif 000053
【図２３】
2010046099.tif 000054
【図２４】
2010046099.tif 000055
【図２５】
2010046099.tif 000056
【図２６】
2010046099.tif 000057
【図２７】
2010046099.tif 000058
【図２８】
2010046099.tif 000059
【図２９】
2010046099.tif 000060
【図３０】
2010046099.tif 000061
【図３１】
2010046099.tif 000062
【図３２】
2010046099.tif 000063
【図３３】
2010046099.tif 000064
【図３４】
2010046099.tif 000065
【図３５】
2010046099.tif 000066
【図３６】
2010046099.tif 000067
【図３７】
2010046099.tif 000068
【図３８】
2010046099.tif 000069
【図３９】
2010046099.tif 000070
【図４０】
2010046099.tif 000071
【図４１】
2010046099.tif 000072
【図４２】
2010046099.tif 000073
【配列表】
2010046099000001.app