(57)【要約】【課題】HEVに感染した対象において、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測するための手段を提供すること。【解決手段】HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該HEVゲノムRNAのORF1がコードする領域の第1213番目のアミノ酸がアラニンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該HEVゲノムRNAのORF1がコードする領域の第1213番目のアミノ酸がアラニンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法。
【請求項２】
HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該HEVゲノムRNAのORF1がコードする領域の第605番目のアミノ酸がプロリンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法。
【請求項３】
HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該HEVゲノムRNAのORF1がコードする領域の第978番目のアミノ酸がバリンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法。
【請求項４】
HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該HEVゲノムRNAのORF1がコードする領域の第605番目のアミノ酸がプロリンであり、第978位のアミノ酸がバリンでありおよび第1213番目のアミノ酸がアラニンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法。
【請求項５】
HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該HEVゲノムRNAのORF1がコードする領域の第547番目のアミノ酸がグルタミンであり、第598番目のアミノ酸がグルタミンであり、第605番目のアミノ酸がプロリンであり、第721番目のアミノ酸がトレオニンであり、第807番目のアミノ酸がセリンであり、第978番目のアミノ酸がバリンであり、第979番目のアミノ酸がリジンであり、第1135番目のアミノ酸がトレオニンであり、第1213番目のアミノ酸がアラニンであり、第1246番目のアミノ酸がヒスチジンであり、第1469番目のアミノ酸がセリンであり、当該HEVゲノムRNAのORF2がコードする領域の第113番目のアミノ酸がトレオニンであり、当該HEVゲノムRNAのORF3がコードする領域の第91番目のアミノ酸がアスパラギンであり、第97番目のアミノ酸がバリンであり、第98番目のアミノ酸がグルタミンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法。
【請求項６】
前記１〜５の何れか１項に記載の方法であって、当該対象において感染したHEVがジェノタイプ3型であることを特徴とする方法。
【請求項７】
ジェノタイプ3型のHEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該ジェノタイプ3型のHEVゲノムRNAのORF1がコードする領域のアミノ酸配列の何れかのアミノ酸がジェノタイプ4型のアミノ酸に変異したことが検出された場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法。
【請求項８】
請求項1に記載の方法であって、前記HEVがジェノタイプ3型であって、且つ任意に増幅された検体核酸と、以下のプローブからなるプローブセットとを反応することを具備する方法；
（ａ）配列番号1上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
（ｂ）配列番号2上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；および
（ｃ）配列番号3上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
ここで、当該プローブにおいて、当該塩基配列に含まれるYはチミンとシトシンの両方を含み、Wはチミンとアデニンの両方を含み、Mはシトシンとアデニンの両方を含み、Nはチミンとシトシンとアデニンとグアニンのすべてを含む。
【請求項９】
LAMP増幅用プライマーにより検体核酸を増幅することと；
前記増幅産物と検出用プローブとを反応させること；
前記反応の結果を基にHEVの型を決定し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株か否かを決定すること；
を具備するHEVの型を決定し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株を検出する方法；
ここで、前記LAMP増幅用プライマーは、第１のプライマーセットおよび第２のプライマーセットからなる群より少なくとも１選択され、当該第１のプライマーセットおよび第２のプライマーセットはF3プライマー、FIPプライマー、BIPプライマー、B3プライマーおよびFLcプライマーからなり、
前記第１のプライマーセットにおいて、
ジェノタイプ1型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号7および／または配列番号8および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号9および／または配列番号10および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号11および／または配列番号12および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号13および／または配列番号14および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FLcプライマーは、配列番号15および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ2型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号16および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号17および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号18および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号19および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FLcプライマーは、配列番号20および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ3型のHEVを増幅し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株か否かを決定するために、
前記F3プライマーは、配列番号21および／または配列番号22および／または配列番号23および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号24および／または配列番号25および／または配列番号26および／または配列番号27および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号28および／または配列番号29および／または配列番号30および／または配列番号31および／または配列番号32および／または配列番号33および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号34および／または配列番号35および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FLcプライマーは、配列番号36および／または配列番号37および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ4型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号38および／または配列番号39および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号40および／または配列番号41および／または配列番号42および／または配列番号43および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号44および／または配列番号45および／または配列番号46および／または配列番号47および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号48および／または配列番号49および／または配列番号50および／または配列番号51および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FLcプライマーは、配列番号52および／または配列番号53および／または配列番号54および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記第2のプライマーセットにおいて、
ジェノタイプ1型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号55および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号56および／または配列番号57および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号58および／または配列番号59および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号60および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BLcプライマーは、配列番号61および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ2型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号62および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号63および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号64および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号65および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BLcプライマーは、配列番号66および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ3型のHEVを増幅し、且つ重症化する可能性の高いジェノタイプ3型HEV株か否かを決定するために、
前記F3プライマーは、配列番号67および／または配列番号68および／または配列番号69および／または配列番号70および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号71および／または配列番号72および／または配列番号73および／または配列番号74および／または配列番号75および／または配列番号76および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号77および／または配列番号78および／または配列番号79および／または配列番号80および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号81および／または配列番号82および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BLcプライマーは、配列番号83および／または配列番号84および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ4型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号85および／または配列番号86および／または配列番号87および／または配列番号88および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号89および／または配列番号90および／または配列番号91および／または配列番号92および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号93および／または配列番号94および／または配列番号95および／または配列番号96および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号97および／または配列番号98および／または配列番号99および／または配列番号100および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BLcプライマーは、配列番号101および／または配列番号102および／または配列番号103および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなる。
【請求項１０】
請求項9に記載の方法であって、前記検出用プローブが、以下のプローブからなるプローブセットであることを特徴とする方法；
（ａ）配列番号4上で第14目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
（ｂ）配列番号5上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
（ｃ）それぞれ配列番号1、2および3上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；および
（ｄ）配列番号6上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
ここで、当該プローブにおいて、当該塩基配列に含まれるYはチミンとシトシンの両方を含み、Wはチミンとアデニンの両方を含み、Mはシトシンとアデニンの両方を含み、Nはチミンとシトシンとアデニンとグアニンのすべてを含む。
【請求項１１】
請求項9の方法において使用するための以下のプローブからなるプローブセット；
（ａ）配列番号1上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
（ｂ）配列番号2上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；および
（ｃ）配列番号3上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
ここで、当該プローブにおいて、当該塩基配列に含まれるYはチミンとシトシンの両方を含み、Wはチミンとアデニンの両方を含み、Mはシトシンとアデニンの両方を含み、Nはチミンとシトシンとアデニンとグアニンのすべてを含む。
【請求項１２】
請求項9に記載の方法において使用するための以下のプローブからなるプローブセット；
（ａ）配列番号4上で第14目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
（ｂ）配列番号5上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜３０塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
（ｃ）それぞれ配列番号1、2および3上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；および
（ｄ）配列番号6上で第14番目〜第16番目の塩基を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
ここで、当該プローブにおいて、当該塩基配列に含まれるYはチミンとシトシンの両方を含み、Wはチミンとアデニンの両方を含み、Mはシトシンとアデニンの両方を含み、Nはチミンとシトシンとアデニンとグアニンのすべてを含む。
【請求項１３】
HEVの型を決定し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株を検出するための以下の第1のプライマーセットまたは第２のプライマーセットからなるプライマーセット；
第１のプライマーセットは、
（ａ）ジェノタイプ1型のHEVを増幅するための
配列番号7および／または配列番号8および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号9および／または配列番号10および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号11および／または配列番号12および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号13および／または配列番号14および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号15および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
（ｂ）ジェノタイプ2型のHEVを増幅するための、
配列番号16および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号17および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号18および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号19および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号20および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
（ｃ）ジェノタイプ3型のHEVを増幅し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株か否かを決定するための
配列番号21および／または配列番号22および／または配列番号23および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号24および／または配列番号25および／または配列番号26および／または配列番号27および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号28および／または配列番号29および／または配列番号30および／または配列番号31および／または配列番号32および／または配列番号33および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号34および／または配列番号35および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号36および／または配列番号37および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
（ｄ）ジェノタイプ4型のHEVを増幅するための、
配列番号38および／または配列番号39および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号40および／または配列番号41および／または配列番号42および／または配列番号43および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号44および／または配列番号45および／または配列番号46および／または配列番号47および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号48および／または配列番号49および／または配列番号50および／または配列番号51および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号52および／または配列番号53および／または配列番号54および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
からなり、
第2のプライマーセットは、
（ｅ）ジェノタイプ1型のHEVを増幅するための、
配列番号55および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号56および／または配列番号57および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号58および／または配列番号59および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号60および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号61および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー、
（ｆ）ジェノタイプ2型のHEVを増幅するための、
配列番号62および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号63および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号64および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号65および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号66および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー、
（ｇ）ジェノタイプ3型のHEVを増幅し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株か否かを決定するための、
配列番号67および／または配列番号68および／または配列番号69および／または配列番号70および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号71および／または配列番号72および／または配列番号73および／または配列番号74および／または配列番号75および／または配列番号76および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号77および／または配列番号78および／または配列番号79および／または配列番号80および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号81および／または配列番号82および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号83および／または配列番号84および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー、
（ｈ）ジェノタイプ4型のHEVを増幅するための、
配列番号85および／または配列番号86および／または配列番号87および／または配列番号88および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号89および／または配列番号90および／または配列番号91および／または配列番号92および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号93および／または配列番号94および／または配列番号95および／または配列番号96および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号97および／または配列番号98および／または配列番号99および／または配列番号100および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号101および／または配列番号102および／または配列番号103および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー
からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、E型肝炎ウイルス（ここでは「HEV」と略す）に感染した対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法、そこにおいて使用されるプローブセットおよびプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
不衛生な衛生環境下で起こる経口感染が主な原因とされていたために、E型肝炎が日米欧等の先進諸国で検出された場合、そのほとんどが輸入感染症であると理解されてきた。しかしながら、日本国内にも土着のHEV株が存在すること、その原因は、ブタや野生動物の肉および内臓摂食によるものであることが明らかとなってきた。更に、2000年以降、日本におけるHEV感染症報告数は徐々に増えつつある（岡本宏明.我が国に於けるE型肝炎の現況.肝臓2006; 47(3):379-383）。また、重症化するケースも報告されていることから、感染ルートの特定や予防法の確立が急務となっている。
【０００３】
2006年には、厚生労働省が行った肝炎等克服緊急対策研究事業において、「E型肝炎の感染経路・宿主域・遺伝的多様性・感染防止・診断・治療に関する研究」という研究班が立ち上げられた。そこでは、本邦におけるE型肝炎の実体を明らかにするために、全国から集めた254例のHEV 感染例が解析された（阿部敏紀、相川達也、赤羽賢浩、他.本邦に於けるE型肝炎ウイルス感染の統計学的・疫学的・ウイルス学的特徴：全国集計254例に基づく解析.肝臓2006; 47(8):384-391）。
【０００４】
その結果、E型肝炎を発症する患者の男女比は、243例中188例(77%)が男性で、55例（23%）が女性であった。また年齢構成は、242例中最も多い年代が40歳から59歳で105例（43%）、次に多い年齢群は60歳以上で74 例（31%）、最も少ない群が40歳未満の63例（26%）であった。国内の地域別に報告数を比較してみると、最も多く報告されているのが北海道の123例（54%）、次いで関東甲信越地方の48例（21%）、東北地方の18例（8%）の順であった。
【０００５】
同じ解析において、HEVジェノタイプ別の頻度についても報告がある。日本国内で最も多く検出されるジェノタイプはジェノタイプ3型で135例（61%）、次いでジェノタイプ4型の78例（36%）、最も少ない頻度はジェノタイプ1型の7例（3%）であった。ジェノタイプ２型は、１例も検出されなかった。このように、国内で多く見られるジェノタイプは3型であるが、急性肝炎重症型や劇症肝炎のような重症化肝炎を引き起こしたHEV陽性患者においては、ジェノタイプ4型が有意に多く検出されている。先述の解析の中でも、不顕性感染例59例の中には、ジェノタイプ4型が7例（12%）しかないのにも拘わらず、急性肝炎例130例中には48例（37%）、急性肝炎重症型と劇症肝炎の31例中には23例（74%）と、肝炎の悪化に伴ってジェノタイプ４型の頻度が上昇していることが認められる。
【０００６】
以上の理由から、HEV陽性患者に、どのジェノタイプの株が感染しているかを特定することは、その患者の病態を予測して的確な治療を行うために重要な情報となる。
【０００７】
また、これらの肝炎を引き起こす原因となったブタや野生動物の体内から採取されたHEVを解析すると、その動物がいた地域においてHEV陽性になった患者で、同じ株が検出されることが多い。すなわち、重症化株であるジェノタイプ4型を持ったブタや野生動物は、ヒトが摂食しないよう流通から除くとか、ジェノタイプ4型株に対するワクチン対策を強化する等の措置により、重篤な肝炎からヒトを守ることは可能である。
【０００８】
しかしながら、重症化しないとされているジェノタイプ3型陽性例からも、急性肝炎重症型や劇症肝炎のような重症化肝炎が起こることがある。先述の解析の中でも、重症化例である31例のほとんどが（23例74%）ジェノタイプ4型であるとはいえ、残り7例（26%）はジェノタイプ3型である（残り1例はジェノタイプ1）。従って、ジェノタイプ4型にだけ注意していれば、重症化肝炎が防げるわけではなく、ジェノタイプ4型以外のHEVのジェノタイプに存在する重症化型となる可能性を予測することは重要な課題である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、HEVに感染した対象において、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測するための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題は、以下の本発明により解決される。即ち、
（１）HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該HEVゲノムRNAのORFがコードする領域の第1213番目のアミノ酸がアラニンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法；
（２）HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該HEVゲノムRNAのORFがコードする領域の第605番目のアミノ酸がプロリンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法；
（３）HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該HEVゲノムRNAのORF1がコードする領域の第978番目のアミノ酸がバリンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法；
（４）HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該HEVゲノムRNAのORF1がコードする領域の第605番目のアミノ酸がプロリンであり、第978位のアミノ酸がバリンでありおよび第1213番目のアミノ酸がアラニンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法；
（５）HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該HEVゲノムRNAのORF1がコードする領域の第547番目のアミノ酸がグルタミンであり、第598番目のアミノ酸がグルタミンであり、第605番目のアミノ酸がプロリンであり、第721番目のアミノ酸がトレオニンであり、第807番目のアミノ酸がセリンであり、第978番目のアミノ酸がバリンであり、第979番目のアミノ酸がリジンであり、第1135番目のアミノ酸がトレオニンであり、第1213番目のアミノ酸がアラニンであり、第1246番目のアミノ酸がヒスチジンであり、第1469番目のアミノ酸がセリンであり、当該HEVゲノムRNAのORF2がコードする領域の第113番目のアミノ酸がトレオニンであり、当該HEVゲノムRNAのORF3の第91番目のアミノ酸がアスパラギンであり、第97番目のアミノ酸がバリンであり、第98番目のアミノ酸がグルタミンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法；
（６）ジェノタイプ3型HEVに感染した対象から採取された検体核酸に含まれる、当該ジェノタイプ3型のHEVゲノムRNAのORF1がコードする領域のアミノ酸配列の何れかのアミノ酸がジェノタイプ4型のアミノ酸に変異したことが検出された場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと判定することを特徴とする、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測する方法；
（７）LAMP増幅用プライマーにより検体核酸を増幅することと；
前記増幅産物と検出用プローブとを反応させること；
前記反応の結果を基にHEVの型を決定し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株か否かを決定すること；
を具備するHEVの型を決定し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株を検出する方法；
ここで、前記LAMP増幅用プライマーは、第1のプライマーセットおよび第2のプライマーセットからなる群より少なくとも1選択され、当該第1のプライマーセットおよび第2のプライマーセットはF3プライマー、FIPプライマー、BIPプライマー、B3プライマーおよびFLcプライマーからなり、
前記第１のプライマーセットにおいて、
ジェノタイプ1型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号7および／または配列番号8および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号9および／または配列番号10および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号11および／または配列番号12および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号13および／または配列番号14および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FLcプライマーは、配列番号15および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ2型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号16および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号17および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号18および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号19および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FLcプライマーは、配列番号20および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ3型のHEVを増幅し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株か否かを決定するために、
前記F3プライマーは、配列番号21および／または配列番号22および／または配列番号23および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号24および／または配列番号25および／または配列番号26および／または配列番号27および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号28および／または配列番号29および／または配列番号30および／または配列番号31および／または配列番号32および／または配列番号33および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号34および／または配列番号35および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FLcプライマーは、配列番号36および／または配列番号37および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ4型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号38および／または配列番号39および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号40および／または配列番号41および／または配列番号42および／または配列番号43および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号44および／または配列番号45および／または配列番号46および／または配列番号47および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号48および／または配列番号49および／または配列番号50および／または配列番号51および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FLcプライマーは、配列番号52および／または配列番号53および／または配列番号54および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記第2のプライマーセットにおいて、
ジェノタイプ1型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号55および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号56および／または配列番号57および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号58および／または配列番号59および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号60および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BLcプライマーは、配列番号61および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ2型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号62および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号63および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号64および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号65および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BLcプライマーは、配列番号66および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ3型のHEVを増幅し、且つ重症化する可能性の高いジェノタイプ3型HEV株か否かを決定するために、
前記F3プライマーは、配列番号67および／または配列番号68および／または配列番号69および／または配列番号70および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号71および／または配列番号72および／または配列番号73および／または配列番号74および／または配列番号75および／または配列番号76および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号77および／または配列番号78および／または配列番号79および／または配列番号80および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号81および／または配列番号82および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BLcプライマーは、配列番号83および／または配列番号84および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
ジェノタイプ4型のHEVを増幅するために、
前記F3プライマーは、配列番号85および／または配列番号86および／または配列番号87および／または配列番号88および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記FIPプライマーは、配列番号89および／または配列番号90および／または配列番号91および／または配列番号92および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BIPプライマーは、配列番号93および／または配列番号94および／または配列番号95および／または配列番号96および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記B3プライマーは、配列番号97および／または配列番号98および／または配列番号99および／または配列番号100および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなり、
前記BLcプライマーは、配列番号101および／または配列番号102および／または配列番号103および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなる；
（８）HEVの型を決定し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株を検出するための以下の第1のプライマーセットまたは第2のプライマーセットからなるプライマーセット；
第1のプライマーセットは、
（ａ）ジェノタイプ1型のHEVを増幅するための
配列番号7および／または配列番号8および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号9および／または配列番号10および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号11および／または配列番号12および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号13および／または配列番号14および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号15および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
（ｂ）ジェノタイプ2型のHEVを増幅するための、
配列番号16および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号17および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号18および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号19および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号20および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
（ｃ）ジェノタイプ3型のHEVを増幅し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株か否かを決定するための
配列番号21および／または配列番号22および／または配列番号23および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号24および／または配列番号25および／または配列番号26および／または配列番号27および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号28および／または配列番号29および／または配列番号30および／または配列番号31および／または配列番号32および／または配列番号33および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号34および／または配列番号35および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号36および／または配列番号37および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
（ｄ）ジェノタイプ4型のHEVを増幅するための、
配列番号38および／または配列番号39および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号40および／または配列番号41および／または配列番号42および／または配列番号43および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号44および／または配列番号45および／または配列番号46および／または配列番号47および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号48および／または配列番号49および／または配列番号50および／または配列番号51および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号52および／または配列番号53および／または配列番号54および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
からなり、
第2のプライマーセットは、
（ｅ）ジェノタイプ1型のHEVを増幅するための、
配列番号55および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号56および／または配列番号57および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号58および／または配列番号59および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号60および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号61および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー、
（ｆ）ジェノタイプ2型のHEVを増幅するための、
配列番号62および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号63および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号64および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号65および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号66および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー、
（ｇ）ジェノタイプ3型のHEVを増幅し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株か否かを決定するための、
配列番号67および／または配列番号68および／または配列番号69および／または配列番号70および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号71および／または配列番号72および／または配列番号73および／または配列番号74および／または配列番号75および／または配列番号76および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号77および／または配列番号78および／または配列番号79および／または配列番号80および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号81および／または配列番号82および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号83および／または配列番号84および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー、
（ｈ）ジェノタイプ4型のHEVを増幅するための、
配列番号85および／または配列番号86および／または配列番号87および／または配列番号88および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号89および／または配列番号90および／または配列番号91および／または配列番号92および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号93および／または配列番号94および／または配列番号95および／または配列番号96および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号97および／または配列番号98および／または配列番号99および／または配列番号100および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号101および／または配列番号102および／または配列番号103および／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー
からなる；
である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、HEVに感染した対象において、当該対象における肝炎が重症化する可能性を予測するための手段が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、HEVのオープンリーディング領域１（以下「ORF1」と記す）がコードする領域の一部が変異したHEVに感染すると、感染した対象における肝炎が重症化する可能性が高いことを見出したことに基づき達成された。
【００１３】
ここにおいて「対象」とは、ヒト、ブタ、イノシシ、シカ、マングース、ネコ、ネズミ、ウシなどの哺乳動物、シジミなどの貝類、などであってよい。
【００１４】
ここにおいて「検体核酸」とは、対象から採取された検体に由来する何れかの核酸であればよい。検体の例は、例えば、血液、血清、便、組織、バイオプシー等であればよい。
【００１５】
ここにおいて「増幅」とは、PCR、LAMP法などの核酸増幅法であればよく、それ自身公知の何れかの増幅方法であればよく、好ましくはLAMP法である。
【００１６】
（１）HEVについて
Ｉ．HEVゲノムとORF1
HEVは、ヘペウイルス科ヘペウイルス属に分類される１本鎖RNAをゲノムにもつウイルスである。ゲノムの全長は約7400塩基であり、3つのORFが存在する（図1、H. Okamoto, Genetic variability and evolution of hepatitis E virus. 
Virus Research 2007;127:216-228から引用）。そのうち、最も長い領域にわたるものがORF1である。
【００１７】
ORF1は、27番目のヌクレオチドから5138番目のヌクレオチドまででコードされ、全長で1703アミノ酸からなる。いくつかのタンパク質をコードしており、５’末端からメチルトランスフェラーゼ(図1中のM)、Yドメイン(図1中のY)、パパイン様プロテアーゼ(図1中のP)、proline-rich hingeドメイン(図1中のV)、Xドメイン(図1中のX)、RNAヘリカーゼ(図1中のH)、RNAポリメラーゼ(図1中のR)の順にコード領域が存在する。
【００１８】
II．HEVのジェノタイプとその病態
HEVのジェノタイプには、1型、2型、3型および4型が存在し、その分布には明瞭な地域特異性がある。ジェノタイプ1型は、アジアおよびアフリカ等、流行性にE型肝炎が発生する地域に分布する。日本国内でもたまに認められるが、たいていはアジアおよびアフリカへの渡航歴がある患者に見られる。ジェノタイプ2型は、メキシコでの集団感染時およびナイジェリアで散発性に発見された株である。ジェノタイプ3型は、欧米諸国やオーストラリア、韓国などで起こる散発性の急性肝炎患者から分離された株である。日本土着株にこのジェノタイプ3型が多いのは、約100年前に富国強兵策の一環として英国から輸入されたブタによって持ち込まれたものと考えられている（岡本宏明.我が国に於けるE型肝炎の現況.肝臓2006; 47(3):379-383）。ジェノタイプ4型は、主に中国で見られる株であり、他にも台湾やベトナムでも散発性E型肝炎患者から分離されている。
【００１９】
また、先述のとおり、ジェノタイプ3型感染例に比べて、ジェノタイプ4型感染例の方が重症化することがわかってきている。それは、不顕性感染群から劇症肝炎群へと肝炎が悪化するに伴ってジェノタイプ4型の頻度が上昇していることからもわかるが、それ以外にも初診時、あるいはピーク時の総ビリルビン値やトランスアミナーゼ値がジェノタイプ4型感染例で有意に高いことからもうかがえる（阿部敏紀、相川達也、赤羽賢浩、他.本邦に於けるE型肝炎ウイルス感染の統計学的・疫学的・ウイルス学的特徴：全国集計254例に基づく解析.肝臓2006; 47(8):384-391）。
【００２０】
III．ジェノタイプ3型の重症化例
しかしながら、ジェノタイプ3型感染例の中にも、重症化する症例が存在する。先述の厚生労働省における「E型肝炎の感染経路・宿主域・遺伝的多様性・感染防止・診断・治療に関する研究」をテーマとした研究班による、全国から集めた254例のHEV 感染例の解析からも、135例のジェノタイプ3型の患者の中に７例（5%）の重症化例が報告されている。重症化したE型肝炎は、急性肝炎重症型や劇症肝炎のような重篤な症状を引き起こすため、経過観察に注意を要する。そのため、予め病態を予測できるように、ジェノタイプ3型株の中の重症化株のみを検出可能な方法があることが望ましい。
【００２１】
IV．ジェノタイプ3型の重症化例の特徴
後述する例において行った試験によりジェノタイプ3型の重症化例の特徴が明らかになった。ジェノタイプ3型感染患者のうち、重症化した症例から分離したHEV株と重症化しなかった症例から分離したHEV株の塩基配列を全長にわたって比較すると、18アミノ酸が異なっていることがわかった。その18アミノ酸のうち、3アミノ酸変異はジェノタイプ4型で保存されているアミノ酸へと変異していた。
【００２２】
その3アミノ酸とは、HEVゲノムRNAのORF1がコードする領域の第605番目のアミノ酸、第978番目のアミノ酸、第1213番目のアミノ酸である。これらは、ORF1の第605番目のアミノ酸がジェノタイプ3型ではセリンであるのに、重症化した症例ではジェノタイプ4型のプロリンに変異しており、、同じくORF1の第978番目のアミノ酸は、ジェノタイプ3型ではイソロイシンであるのに、重症化した症例ではジェノタイプ4型のバリンに変異しており、同じくORF1の第1213番目のアミノ酸はジェノタイプ3型ではバリンであるのに対して、重症化した症例では、ジェノタイプ4型のアラニンに変異していた。このうち、第1213番目のアミノ酸は、ヘリカーゼをコードする領域のC末端に近い部位の変異である。
【表１】
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【００２３】
本発明においては、当該第605番目、第978番目または第1213番目のアミノ酸がそれぞれジェノタイプ4型と同じアミノ酸であるHEVに感染した対象において、当該対象における肝炎が重症化する可能性が高いと予測することが可能である。更に、当該第605番目、第978番目および第1213番目のアミノ酸が同時にジェノタイプ4型と同じアミノ酸であるHEVに感染した対象において、当該対象における肝炎が重症化する可能性が高いと予測することが可能である。
【００２４】
上述した通り、第1213番目のアミノ酸は、ヘリカーゼをコードする領域のC末端に近い部位の変異である。表1において示す患者番号1〜8のうち、患者番号1から採取されたHEVは、第605番目および第978番目のアミノ酸はジェノタイプ4型のアミノ酸に変異しているが、第1213番目のアミノ酸はジェノタイプ3型のアミノ酸のままであった。この患者番号１の対象においては、肝炎は重症化しなかったことから、第1213番目のアミノ酸のみの種類を特定することにより肝炎が重症化する可能性を判定することができると考えられる。
【００２５】
一方、患者番号1〜8において、ジェノタイプ3型において保存されているアミノ酸（表中「３型の保存アミノ酸」と記す）とは異なるアミノ酸に変異していた部位は、ORF1の第547番目、第598番目、第721番目、第807番目、第979番目、第1135番目、第1246番目および第1469番目、ORF2の第113番目、ORF3の第91番目、第97番目、第98番目であった。
【００２６】
従って、本発明においては、当該HEVのゲノムRNAのORF1の第547番目のアミノ酸がグルタミンであり、第598番目のアミノ酸がグルタミンであり、第605番目のアミノ酸がプロリンであり、第721番目のアミノ酸がトレオニンであり、第807番目のアミノ酸がセリンであり、第978番目のアミノ酸がバリンであり、第979番目のアミノ酸がリジンであり、第1135番目のアミノ酸がトレオニンであり、第1213番目のアミノ酸がアラニンであり、第1246番目のアミノ酸がヒスチジンであり、第1469番目のアミノ酸がセリンであり、ORF2の第113番目のアミノ酸がトレオニンであり、ORF3の第91番目のアミノ酸がアスパラギンであり、第97番目のアミノ酸がバリンであり、第98番目のアミノ酸がグルタミンである場合に、当該対象における肝炎は重症化する可能性が高いと予測することも可能である。
【００２７】
ここでは、ジェノタイプ3型のHEVとジェノタイプ4型のHEVのアミノ酸を比較しているが、ジェノタイプ3型に限らず、ジェノタイプ1型およびジェノタイプ2型においても、ジェノタイプ4型のHEVのアミノ酸に変異することにより、そのようなHEVに感染した対象における肝炎が重症化する可能性を予測することも可能である。また、HEVにおける変異は、留まることを知らず、HEVのゲノムは常に変化している。従って、当該部位に限らず、ジェノタイプ4型のアミノ酸への変異が重症化と大きく関連していることが考えられる。
【００２８】
V．ヘリカーゼ
ヘリカーゼとは、核酸のリン酸エステル骨格に沿って動きながら、絡み合う核酸をほどく役割を持った酵素である。核酸をほどくことは、RNAゲノム複製の際に不可欠な工程であり、正常にゲノムRNAをほどくことができるかどうかは、間違いのないゲノム複製、必要なスピードで行われるゲノム複製にとって重要な要因となると考えられる。その酵素をコードする領域に変異が入り、ジェノタイプ3型のアミノ酸がジェノタイプ4型のものに置き換わることによって、HEVの複製のしやすさに影響して、HEVジェノタイプ3型がジェノタイプ4型のような挙動を示し、重症化してしまうことは十分に考えられる。
【００２９】
従って、ジェノタイプ3型のヘリカーゼをコードする領域のアミノ酸のジェノタイプ4型への変異が、そのようなHEVに感染した対象における肝炎の重症化に大きく関与する可能性が考えられる。
【００３０】
（２）  方法について
Ｉ．LAMP法
本発明で用いる核酸増幅法は好ましくはLAMP法である。この方法は、等温遺伝子増幅法の1種で、4種類あるいは6種類のプライマーを用いる点がPCR法とは異なっている。LAMP法は、PCR法に比べて増幅効率に優れ、短時間で増幅可能であるとともに、サンプル中の不純物の影響も受けにくいと報告されている。そのため、簡便なサンプルの前処理でサンプル中の微量なHEVを短時間に検出する方法が可能となる。
【００３１】
ここで、LAMP法におけるプライマー設計および得られる増幅産物について、図2および図3を参照して説明する。図2は、検出しようとする二本鎖DNAと使用されるプライマーとの対応を示している。使用されるプライマーは、FIPプライマー、F3プライマー、BIPプライマーおよびB3プライアーである。FIPプライマーおよびBIPプライマーは、各々二つの領域を含む。即ち、FIPプライマーはF1c領域とF2領域を含み、BIPプライマーはB1c領域とB2領域を含む。ここで、F3、F2、F1、B1c、B2c、B3c領域は、当該二本鎖DNAのうちの一方のDNA上で設定された領域であり、当該DNA上にこの順番で５’から３’方向に設定された領域である。ここで、B3とB3c、B2とB2c、B1とB1c、F1cとF1、F2cとF2、F3cとF3はそれぞれ互いに相補的である。
【００３２】
これらプライマーとして用いられる合計6つの領域を、以下では夫々プライマー領域と称する。これらの領域から構成される4種類のプライマー、即ち、FIPプライマー、F3プライマー、BIPプライマーおよびB3プライマーを用いてLAMP増幅を行なうと、図2の二本鎖DNAの夫々の鎖から、図3に示すようなダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については説明を省略するが、必要であれば、例えば特開2002−186781号公報を参照されたい。
【００３３】
また、増幅のスピードを速める目的で、図4に示すようなプライマー領域F1とF2との間(F2領域含むことも可能)、プライマー領域F2cとF1cとの間(F2c領域含む)、プライマー領域B1とB2との間(B2領域含む)、および／またはプライマー領域B2cとB1cとの間(B2c領域含む)の何れかに対応する位置にもプライマー領域を設定してもよく、このようなプライマーはループプライマーと称される。。この領域は、増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループの中に位置する領域であり、この鎖に相補的なDNA断片を共存させておくことで、スムーズに増幅が進むために必要な鋳型の立体構造が保たれるため増幅スピードが速まると考えられる。
【００３４】
また、今回のE型肝炎ウイルスのように、そのゲノムがRNAの場合、従来の増幅法では、まず逆転写酵素によってcDNAを合成する工程が不可欠であった。今回のLAMP法では、鎖置換活性を有しているため、逆転写酵素をLAMP反応溶液に添加しておくだけで、別工程の逆転写反応なしで抽出産物から直接増幅が開始できる。
【００３５】
上記増幅反応は、1チューブ当たり1プライマーセットで行っても構わないし、あるいは1チューブに各種遺伝子型に対応した複数のプライマーセットを混在させて行っても構わない。複数のE型肝炎ウイルスのサブタイプを一度に特定する必要がある場合は、後者の方法で行う方が効率的である。
【００３６】
II．検体と検体核酸の抽出
上述した通り、本発明における検体は特に限定される物ではなく、例えば、血液、血清、便、組織、バイオプシー等であってよい。これらの検体からの核酸成分の抽出法は、特に限定されるものではない。例えば、フェノール−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固−液抽出法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法MinElute（QIAGEN社製）、スマイテストEX-R&D（医学生物学研究所社製）等を利用することも可能である。それ自身公知の何れかの方法により抽出された核酸成分を検体核酸として使用してよい。
【００３７】
III．LAMP反応条件
次に、抽出した核酸成分を本発明の方法によりLAMP増幅させる。LAMP増幅の温度は、LAMP法を開発した栄研化学社が推奨する60℃から65℃の間の温度で行うことが望ましい。
【００３８】
反応溶液の組成は、特に限定されるものではないが、例えば下記のような組成で行うことができる。
【００３９】
LAMP反応溶液は以下の組成とする。
【００４０】
・RT-LAMP法の反応溶液組成
20mM Tris-HCl (pH8.8) 
10mM KCl
8mM MgSO4 
10mM (NH4)2SO4
0.1% Tween20
0.8M Betaine
1.4mM each dNTPs。 
この組成の反応液で、総量25μｌで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込む。
【００４１】
・primer 添加量
FIP     40pmol
BIP     40pmol
F3       5pmol
B3       5pmol
IV．検出法
（１）核酸プローブの固相化表面
本発明で用いる核酸プローブを固定化するための表面は特に限定されるものではないが、樹脂ビーズ、磁気ビーズ、金属微粒子、マイクロタイタープート、ガラス基板、シリコン基板、樹脂製基板、電極基板などを用いることができる。
【００４２】
（２）核酸プローブを固相する基盤材料
本発明で使用する基板材料は、特に限定されるものではない。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素、等の無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。
【００４３】
（３）電流検出法を用いる場合の電極材料
電極材料は特に限定されるものではない。例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物を用いる事ができる。更に、酸化珪素等の半導体化合物や、CCD、FET、CMOSなど各種半導体デバイスを用いることが可能である。電極は、メッキ、印刷、スパッタ、蒸着などでも作製することができる。蒸着を行う場合は、抵抗加熱法、高周波加熱法、電子ビーム加熱法により電極膜を形成することができる。また、スパッタリングを行う場合は、直流2極スパッタリング、バイアススパッタリング、非対称交流スパッタリング、ゲッタスパッタリング、高周波スパッタリングで電極膜を形成することが可能である。更に、ポリピロール、ポリアニリンなどの電解重合膜や導電性高分子も用いることが可能である。電極を以外の部分を絶縁するための材料は特に限定されるものではないが、フォトポリマー、フォトレジスト材料であることが好ましい。レジスト材料としては、光露光用フォトレジスト、遠紫外用フォトレジスト、X線用フォトレジスト、電子線用フォトレジストが用いられる。光露光用フォトレジストには、主原料が環化ゴム、ポリけい皮酸、ノボラック樹脂があげられる。遠紫外用フォトレジストには、環化ゴム、フェノール樹脂、ポリメチルイソプロペニルケトン（PMIPK），ポリメチルメタクリレート（PMMA）等が用いられる。また、X線用レジストには、COP、メタルアクリレートほか、薄膜ハンドブック（オーム社）に記載の物質を用いることができる、更に電子線用レジストには、PMMA等上記文献に記載の物質を用いることが可能である。ここで用いるレジストは100Å以上1ｍｍ以下であることが望ましい。フォトレジストで電極を被覆し、リソグラフィーを行うことで、面積を一定にすることが可能になる。これにより、DNAプローブの固定化量がそれぞれの電極間で均一になり、再現性に優れた測定を可能にする。従来、レジスト材料は最終的には除去するのが一般的であるが、遺伝子検出用電極ではレジスト材料は除去することなく電極の一部として用いることも可能である。この場合は、用いるレジスト材料に耐水性の高い物質を使用する必要がある。電極上部に形成する絶縁層にはフォトレジスト材料以外でも用いることが可能である。例えば、Si、Ti、Al、Zn、Pb、Cd、W、Mo、Cr、Ta、Ni等の酸化物、窒化物、炭化物、その他合金を用いることも可能である。これらの材料をスパッタ、蒸着あるいはＣＶＤ等を用いて薄膜を形成した後、フォトリソグラフィーで電極露出部のパターニングを行い、面積を一定に制御する。電極は1つの素子上に幾つかの電極部を構成し、異なったプローブを固定化することで、一度に数種類の標的に対して検査を行うことができる。また、1つの素子上に幾つかの電極部を構成し、同じプローブを固定化することで、一度に数検体の検査を行うことも可能である。この場合、フォトリソグラフィーを利用して、あらかじめ基板上複数の電極をパターニングしておく。この際、隣同士の電極が接触しないように、絶縁膜で仕切りを付けることは有効である。仕切りの高さは0.1ミクロンから100ミクロン程度���望ましい。
【００４４】
（４）ハイブリダイゼーション
増幅した核酸成分と遺伝子検出用電極とでハイブリダイゼーション反応を行う。反応溶液は、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストランや、サケ精子DNA、牛胸腺DNA、EDTA、界面活性剤などを添加することが可能である。ここに抽出した核酸成分を添加し、90℃以上で熱変性させる。遺伝子検出用電極の挿入は、変性直後、あるいは0℃に急冷後に行うことができる。また、基板上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めることもできる。反応温度は10℃〜90℃の範囲で、また反応時間は1分以上1晩程度行う。ハイブリダイゼーション反応後、電極を取り出し洗浄を行う。洗浄には、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いる。
【００４５】
（５）増幅サンプルの標識
増幅したサンプル核酸は、あらかじめFITCやCy3、Cy5、ローダミンなどの蛍光色素やビオチン、ハプテン、オキシダーゼやポスファターゼ等の酵素や、フェロセンやキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識するか、あるいは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出が可能になる。
【００４６】
（６）電流検出系を用いる場合の検出手順
電気化学的に活性なDNA結合物質を用いた検出を行う場合は、以下のような手順で検出を行う。基板は洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合するDNA結合物質を作用させ、電気化学的な測定を行う。ここで用いられるDNA結合物質は特に限定される物ではないが、例えば、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。DNA結合物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には1ng/ml〜1mg/mlの範囲で使用する。この際、イオン強度0.001〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いる。電極をDNA結合物質と反応させた後、洗浄し、電気化学的な測定を行う。電気化学的な測定は、3電極タイプ、すなわち参照電極、対極、作用極、あるいは2電極タイプ、すなわち対極、作用極で行う。測定では、DNA結合物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、DNA結合物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加することができる。測定には、ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、ファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御する。得られた電流値を基に、検量線から標的遺伝子の濃度を算出する。遺伝子検出用電極を用いた遺伝子検出装置は、遺伝子抽出部、遺伝子反応部、DNA結合物質反応部、電気化学測定部、洗浄部等から構成される。
【００４７】
（７）結果 
電流検出法でもその他の固相化単体を用いた場合でも、陽性のシグナルが得られた電極、ウエル等の分画に固相していたプローブの配列から、サンプル中に存在していたHEVゲノムのアミノ酸変異もしくはジェノタイプを知ることができる。
【００４８】
VI．プローブ
本発明に従う当該変異部位のアミノ酸を特定するための好ましいプローブの例を表2に示す。
【表２】
2010142182.tif 000003
【００４９】
それらは、
配列番号1で示されるポリヌクレオチドの第14番目〜第16番目（表2中「（）」で囲まれた部分）を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
配列番号2で示されるポリヌクレオチドの第14番目〜第16番目（表2中「（）」で囲まれた部分）を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
配列番号3で示されるポリヌクレオチドの第14番目〜第16番目（表2中「（）」で囲まれた部分）を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
である。
【００５０】
また、配列番号4で示されるポリヌクレオチドの第14番目〜第16番目(表2中「()」で囲まれた部分)を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブであってもよく；
配列番号5で示されるポリヌクレオチドの第14番目〜第16番目(表2中「（）」で囲まれた部分)を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブであってもよく；
配列番号6で示されるポリヌクレオチドの第14番目〜第16番目(表2中「()」で囲まれた部分)を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブであってもよい。
【００５１】
使用される場合には、ミックス塩基として使用されてもよく、また、必要な数種類を混合して使用されてもよい。ミックス塩基として使用される場合、当該プローブにおいて、当該塩基配列に含まれるYはチミンとシトシンの両方を含み、Wはチミンとアデニンの両方を含み、Mはシトシンとアデニンの両方を含み、Nはチミンとシトシンとアデニンとグアニンのすべてを含めばよい。
【００５２】
これらのプローブは、検出用プローブともいう。これらのプローブと検体核酸をハイブリダイズし、ハイブリダイズの有無を検出することにより、当該ORF1の1213番目のアミノ酸を特定することが可能である。
【００５３】
上述の配列番号1〜3に関連するプローブは、当該ORF1の1213番目のアミノ酸を特定するためのプローブであるが、同様に、他の変異部位、即ち、ORF1の605番目または978番目などのアミノ酸をコードする塩基が、その第14番目〜第16番目になるように15塩基〜30塩基長の配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブを設計することも可能である。そのようなプローブも本発明の範囲に含まれる。
【００５４】
V．プライマー
本発明において好ましく使用されるLAMP増幅用プライマー（単に「プライマー」とも称する）の例を以下に説明する。以下に示すプライマーの例は、検体に含まれるHEVのジェノタイプを特定することが可能な部位を増幅するプライマーである。これらのプライマーは好ましくはセットにおいて使用されることが好ましい。
【００５５】
第１のプライマーセットは、
（ａ）1型を増幅するための
配列番号7により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号8により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号9により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号10により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号11により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号12により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号13により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号14により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号15により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
（ｂ）2型を増幅するための、
配列番号16により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号17により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号18により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号19により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号20により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
（ｃ）3型を増幅し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株か否かを決定するための
配列番号21により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号22により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号23により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号24により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号25により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号26により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号27により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号28により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号29により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号30により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号31により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号32により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号33により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号34により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号35により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号36により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号37により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
（ｄ）4型を増幅するための、
配列番号38により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号39により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号40により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号41により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号42により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号43により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号44により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号45により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号46により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号47により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号48により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号49により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号50により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号51により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号52により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号53により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号54により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFLcプライマー、
からなることが好ましい。
【表３】
2010142182.tif 000004
【００５６】
第2のプライマーセットは、
（ｅ）1型を増幅するための、
配列番号55により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号56により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号57により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号58により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号59により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号60により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号61により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー、
（ｆ）2型を増幅するための、
配列番号62により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号63により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号64により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号65により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号66により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー、
（ｇ）3型を増幅し、且つ重症化する可能性の高い3型HEV株か否かを決定するための、
配列番号67により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号68により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号69により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号70により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号71により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号72により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号73により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号74により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号75により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号76により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号77により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号78により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号79により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号80により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号81により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号82により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号83により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号84により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー、
（ｈ）4型を増幅するための、
配列番号85により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号86により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号87により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号88により示されるポリヌクレオチドにより示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマー、
配列番号89により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号90により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号91により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号92により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマー、
配列番号93により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号94により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号95により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号96により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマー、
配列番号97により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号98により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号99により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号100により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマー、
配列番号101により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号102により示されるポリヌクレオチドおよび／または配列番号103により示されるポリヌクレオチドおよび／またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなるBLcプライマー
からなることが好ましい。
【表４】
2010142182.tif 000005
【００５７】
このようなプライマーにより増幅された増幅産物に含まれる当該変異部位のアミノ酸を特定すると同時にHEVのジェノタイプを特定することが可能な好ましいプローブの例を次に記す。また、表2を参照されたい。
【００５８】
それは、
（ａ）ジェノタイプ1型を判別するためのプローブ；
配列番号4上で第14番目〜第16番目（表2中「（）」で囲まれた部分）を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
（ｂ）ジェノタイプ2型を判別するためのプローブ；
配列番号5上で第14番目〜第16番目（表2中「（）」で囲まれた部分）を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
（ｃ）ジェノタイプ3型を判別するためのプローブ；
それぞれ配列番号1、2および3の塩基配列上で第14番目〜第16番目（表2中「（）」で囲まれた部分）を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
（ｄ）ジェノタイプ4型を判別するためのプローブ；
配列番号6上で第14番目〜第16番目（表2中「（）」で囲まれた部分）を含む連続する15塩基〜30塩基の配列および／またはその相補配列からなるポリヌクレオチドからなるプローブ；
である。
【００５９】
これらのプローブを使用する場合には、ミックス塩基として使用してもよく、また、必要な数種類を混合して使用してもよい。
【００６０】
ミックス塩基として使用する場合には、当該プローブにおいて、当該塩基配列に含まれるYはチミンとシトシンの両方を含み、Wはチミンとアデニンの両方を含み、Mはシトシンとアデニンの両方を含み、Nはチミンとシトシンとアデニンとグアニンのすべてを含めばよい。
【００６１】
＜例＞
例１
HEVジェノタイプ3の株の中に発見した、重症化に関わると考えられるクラスターについて
（１）  系統樹の作製と重症化株クラスターについて
国立遺伝学研究所のデータバンク（DDBJ / GenBank / EMBL databases）に登録されているHEVゲノム配列と、厚生労働省が行った「E型肝炎の感染経路・宿主域・遺伝的多様性・感染防止・診断・治療に関する研究」の研究班の中で全国から集まって来たHEVジェノタイプ３型の重症化例およびブタから得られたジェノタイプ3型株について、全長もしくはORF2の塩基配列を用いて進化的速度に基づく系統樹を作製した（図5）。その結果、図内の矢印で示したようなクラスターを発見した。
【００６２】
（２）重症化株クラスターの構成
発見したクラスターを構成する株を分離した患者のプロフィール
【表５】
2010142182.tif 000006
【００６３】
このクラスターの特徴は、通常のジェノタイプ3型感染症例群においては、重症化肝炎を発症する確率は135例中7 例（5%）であるのに対して、このクラスターでは8例中2例（25%）と高値だということである。さらに、血液の凝固因子に関する数値で、肝炎の進行度を表すとされているプロトロンビン時間が、27%から46％へと延長した症例が、患者番号3、5、7、8の4症例に見られ、明らかな重症化肝炎である患者番号5、8だけではなく、患者番号3、7も重症化肝炎であることが示唆されている。これらの症例から分離されたHEV株は、埼玉県から沖縄県に渡る関東以西の広範囲から検出された。発病時期も様々であることから、突然変異的に流行性、局地性に蔓延した株ではなくて、安定して関東以西の広範囲に広まって存在している株であると思われる。今回の解析で、同じ系統樹の同じクラスターに存在しているブタから得られた株（図5中のswJ19-1,2,5,7,8）は、すべて九州地方の養豚場で、2000年から2002年に検出された株である。実際に、上記8例の患者のうち3例（38%）は、ブタやシカの肉や肝臓を食したことが発病の原因と推測されている。
【００６４】
このクラスターを中心に、これまで解析して得たジェノタイプ3型株とジェノタイプ4型株のアミノ酸配列を全長に渡って比較した（表1）。その結果、これらのクラスターは、他のジェノタイプ3型の株と18アミノ酸が異なっていることがわかった。その18アミノ酸のうち、特に重要であると考えられた15アミノ酸を表1に示す。
【００６５】
その15アミノ酸のうち、太枠で囲った3アミノ酸変異はジェノタイプ4型で保存されているアミノ酸へと変異していた。その3アミノ酸とは、ORF1の605番目のアミノ酸がジェノタイプ3型ではセリンであるのにジェノタイプ4型のプロリンに変異したものと、同じくORF1の978番目のアミノ酸がジェノタイプ3型ではイソロイシンであるのにジェノタイプ4型のバリンに変異したもの、そして同じくORF1の1213番目のアミノ酸がジェノタイプ3型ではバリンであるのにジェノタイプ4型のアラニンに変異したものであった。このうち、1213番目のアミノ酸は、ヘリカーゼをコードする領域のC末端に近い部位の変異である。ヘリカーゼのみのアミノ酸1番目から数えると、ORF１の1213番目はヘリカーゼの239番目に当たる。
【００６６】
また、図6に1213番目（これは、ヘリカーゼの239番目）のアミノ酸近辺のアミノ酸配列を、他のジェノタイプ3型株、ジェノタイプ4型株と並べて示した。矢印で示したクラスターに含まれる症例は、ジェノタイプ3型のアミノ酸配列と数箇所が異なっており、ジェノタイプ4型に近づくような変異の仕方をしていることがわかった。
【００６７】
以上の結果から、ジェノタイプ3型のアミノ酸がジェノタイプ4型のアミノ酸に変異することが肝炎の重症化には重要であることが明らかとなった。
【００６８】
例えば、表1に記載の15箇所の変異のうち、ジェノタイプ3型のアミノ酸からジェノタイプ4型のアミノ酸へ変異した3箇所（ORF1のS605P、I978V、V1213A）に特に重要な意味があると考える。また、特に、ORF1の1213番目のアミノ酸における変異は重要な意味を持つと示唆された。更に、表1に示した15箇所の変異を全て特定することも当該肝炎の重症化の可能性を予測するためには有効であることも示唆された。
【００６９】
また、本例では、OFR1の1213番目、即ち、V1213A（即ち、ヘリカーゼの239番目）を検出する系を確立した。しかしながら、他の変異箇所（例えば、ORF1のS605Pおよび／またはI978Vなど）の検出を行っても同じ効果が得られると考えられる。
【００７０】
例2
実際に使用するプローブについて
ハイブリダイゼーションの温度や溶液の組成、検出法によって、様々な長さのプローブを選択することができる。
【００７１】
例えば、30塩基長でプローブセットを作製すると、下記の表のセットが考えられる。
【表６】
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【００７２】
この表の中で、混合プローブとして組にしたプローブは、一種類ずつの配列を判別する必要がないため、組み合わせることが可能なプローブ群である。
【００７３】
また例えば、27塩基長でプローブセットを作製すると、下記の表7のセットが考えられる。
【表７】
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【００７４】
また例えば、23塩基長でプローブセットを作製すると、下記の表のセットが考えられる。
【表８】
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【００７５】
また例えば、20塩基長でプローブセットを作製すると、下記の表のセットが考えられる。
【表９】
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【００７６】
以上のようなLAMP増幅用プライマーおよび／またはプローブセットを用いることにより、効率よく、且つ正確にHEVに感染した対象における肝炎が重症化する可能性を予測することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】E型肝炎ウイルスゲノムの3つのORFと、ORF1にコードされた蛋白質について説明するための模式図。
【図２】従来のLAMP法による増幅方法を説明するための模式図。
【図３】従来のLAMP法を用いて得られる増幅産物を説明するための模式図。
【図４】本発明の測定用核酸（即ち、ターゲット）の製造における増幅方法を説明するための模式図。
【図５】データバンクに登録されているか、発明者らが手に入れたサンプルをシーケンスするかして得られたHEVジェノタイプ3型株のa)全ゲノム塩基配列、ｂ）ORF2の塩基配列を用いて作成した進化速度に着眼した系統樹。
【図６Ａ】ORF1の1213番目、即ち、ヘリカーゼの239番目のアミノ酸領域近辺のアミノ酸配列を、データバンクに登録されているか、発明者らが手に入れたサンプルをシーケンスするかして得られたHEVジェノタイプ3型株、4型株で作成したアラインメント。
【図６Ｂ】図６Aのつづきのアラインメントを示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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