(57)【要約】【課題】新たなカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質などが求められていた。【解決手段】（１）発現誘導可能なプロモーター配列；（２）式（Ｚ）ｎで表され、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第１のコード配列；（３）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリペプチドを付加するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列；及び（４）（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列を含有する発現ベクターを用いて融合蛋白質を可溶性蛋白質として発現させ、該融合蛋白質をリンカーペプチドの切断サイトで切断することで、Ｎ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅが付加した前記（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドを含む蛋白質を得ることを含む、蛋白質を製造する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）発現誘導可能なプロモーター配列；
（２）式（Ｚ）ｎ
（式中、ｎは１〜５の整数を表し、Ｚは以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドを表す：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド）
で表され、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第１のコード配列；
（３）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列；ならびに
（４）以下の（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列；
（ｉ）配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｊ）配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有するポリペプチド、
（ｋ）配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有するポリペプチド、及び
（ｌ）配列番号：７の第４２番目〜第６１４番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有するポリペプチド、
を含有する発現ベクターを用いて融合蛋白質を可溶性蛋白質として発現させ、
該融合蛋白質をリンカーペプチドの切断サイトで切断し、Ｎ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅが付加した前記（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドを含む蛋白質を得ることを含む、蛋白質を製造する方法。
【請求項２】
前記式（Ｚ）ｎで表されるポリペプチドが、（Ｚ）２で表されるポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記式（Ｚ）２で表されるポリペプチドが、
（ｅ）配列番号：４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｆ）配列番号：４のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、
（ｇ）配列番号：４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、及び
（ｈ）配列番号：３の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記発現誘導可能なプロモーター配列が、低温で発現誘導可能なプロモーター配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記低温で発現誘導可能なプロモーター配列が、コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧ、ｃｓｐＩ又はｃｓｄＡのプロモーター配列である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第１のコード配列の５’側に、さらに精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記精製のためのアミノ酸配列が、ヒスチジンタグ配列である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により製造した蛋白質と、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁体とを接触させて、カルシウム結合型発光蛋白質を得ることを含む、カルシウム結合型発光蛋白質の製造方法。
【請求項１１】
セレンテラジン類縁体が、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、Bｉｓ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、及びメトキシセレンテラジンからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
セレンテラジン類縁体が、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、及びｅ−セレンテラジンからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群から選択される蛋白質：
（ｍ）配列番号：１０のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｎ）配列番号：１０のアミノ酸配列において、第１番目〜第４番目のアミノ酸以外の１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有する蛋白質；
（ｏ）配列番号：１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、第１番目〜第４番目のアミノ酸がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有する蛋白質；及び
（ｐ）配列番号：９の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、第１番目〜第４番目のアミノ酸がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有する蛋白質。
【請求項１４】
請求項１３に記載の蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン類縁体のペルオキシドとを含む、カルシウム結合型発光蛋白質。
【請求項１５】
セレンテラジン類縁体が、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、Bｉｓ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、及びメトキシセレンテラジンからなる群から選択される、請求項１４に記載の蛋白質。
【請求項１６】
セレンテラジン類縁体が、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、及びｅ−セレンテラジンからなる群から選択される、請求項１５記載の蛋白質。
【請求項１７】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法によって製造したカルシウム結合型発光蛋白質を用いることを含む、カルシウムイオンを検出または定量する方法。
【請求項１８】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のカルシウム結合型発光蛋白質を用いることを含む、カルシウムイオンを検出または定量する方法。
【請求項１９】
検出または定量するカルシウムイオンが１０−６Ｍ〜１０−４Ｍの濃度範囲である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法によって製造したカルシウム結合型発光蛋白をドナー蛋白質として用いて、生物発光共鳴エネルギー移動法を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法。
【請求項２１】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のカルシウム結合型発光蛋白をドナー蛋白質として用いて、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法を行うことを特徴とする、生理機能の解析方法。
【請求項２２】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のカルシウム結合型発光蛋白をドナー蛋白質として用いて、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法を行うことを特徴とする、酵素活性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光蛋白質、その製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物発光に関与する蛋白質の一つに、カルシウム結合型発光蛋白質がある。この発光蛋白質は、Ｃａ２+と特異的に結合し瞬間的に発光する。カルシウム結合型発光蛋白質は、発光のバックグランドが弱く、Ｓ／Ｎ比が高いため、レポーター蛋白質として有用である。また、カルシウム結合型発光蛋白質は、Ｃａ２+に特異的に結合して発光するため、カルシウム濃度の定量に用いることができる。また、カルシウム結合型発光蛋白質は、生物発光共鳴エネルギー移動法（ＢＲＥＴ：Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）に用いることが望まれている。このＢＲＥＴは、発光反応により生じたエネルギーを蛍光有機化合物あるいは蛍光蛋白質へ移動させて蛍光物質を光らせる方法である。
【０００３】
カルシウム結合型発光蛋白質は、酸素添加機能をもつ蛋白質と発光基質であるルシフェリンのペルオキシドを含む複合体である。カルシウム結合型発光蛋白質において、酸素添加機能をもつ蛋白質はアポ蛋白質とよばれ、ルシフェリンのペルオキシドはセレンテラジンペルオキシド（２-hydroperoxycoelenterazine）である。このようなカルシウム結合型蛋白質としては、具体的には、イクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）、クライティン−Ｉ（ｃｌｙｔｉｎ−Ｉ）、クライティン−ＩＩ（ｃｌｙｔｉｎ−ＩＩ）、マイトロコミン（ｍｉｔｒｏｃｏｍｉｎ）、及びオベリン（ｏｂｅｌｉｎ）などの腔腸動物由来のものが知られている。これらのカルシウム結合型発光蛋白質の最大発光波長は、約４６０ｎｍ〜約４８０ｎｍであり、その半値全幅（ＦＷＨＭ）は、約８０ｎｍ〜９０ｎｍである。また、イクオリン、クライティン、及びマイトロコミンの中で、カルシウム濃度に対する感度が一番良い発光蛋白質は、イクオリンであり、マイトロコミン、クライティンの順にカルシウム濃度に対する感度が低くなると報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
マイトロコミン（ハリスタリン（Ｈａｌｉｓｔａｕｒｉｎ）ともいう）は、１９６３年に下村らにより、発光クラゲ（Ｍｉｔｒｏｃｏｍａ  ｃｅｌｌｕｌａｒｉａ（正式には、Ｈａｌｉｓｔａｕｒａ  ｍｉｔｒｏｃｏｍａ））から単離された（非特許文献２）。マイトロコミンのアポ蛋白質であるアポマイトロコミンは、６つのシステイン残基と、Ｃａ２＋を結合するＥＦ−ｈａｎｄドメインと、Ｃ末端チロシン残基とを含む。そして、アポマイトロコミンのｃＤＮＡとしては、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｌ３１６２３が知られている（塩基配列を配列番号：７に、アミノ酸配列を配列番号：８に示す）。アポマイトロコミンのアミノ酸配列は、アポイクオリン又はアポクライティンなどの他のカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質のアミノ酸配列との同一性が高い（非特許文献３）。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させたアポマイトロコミンから調製したマイトロコミンの発光スペクトルが、イクオリンの発光スペクトルと同じであること、その最大発光波長が４７０ｎｍであることが報告されている（非特許文献３）。
【０００５】
ここで、カルシウム結合型発光蛋白質のうち、イクオリン、オベリン、及びクライティンについては、遺伝子組換えの手法を用いて、宿主大腸菌にて、組換えアポイクオリン、組換えアポオベリン、又は組換えアポクライティンを発現し、その組換えアポ蛋白質を精製する方法が報告されている。しかしながら、組換えアポマイトロコミンの精製方法および精製組換えマイトロコミン調製方法についての報告は、現在までない。
【０００６】
【非特許文献１】O. Shimomura, A. Shimomura, Halistaurin, phialidin and modified forms of aequorin as Ca2+ indicator in biological systems, Biochem. J. 228 (1985) 745-749
【非特許文献２】O. Shimomura, F.H. Johnson, Y. Saiga, Extraction and properties of Halistaurin, a bioluminescent protein from the Hydromedusan Halistaura, J. Cell. Comp. Physiol. 59 (1963) 223-240
【非特許文献３】T.F. Fagan, Y. Ohmiya, J.R. Blinks, S. Inouye, F.I. Tsuji, Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca2+-binding photoprotein, mitrocomin, FEBS Lett. 333 (1993) 301-305
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記状況において、公知の発光蛋白質と異なる発光スペクトルを有するカルシウム結合型発光蛋白質、組換えマイトロコミンの調製法などが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の配列を組合せた発現系を用いて、種々検討した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示す、発光蛋白質の製造方法、及び発光蛋白質などを提供する。
【０００９】
（１）  （１）発現誘導可能なプロモーター配列；
（２）式（Ｚ）ｎ
（式中、ｎは１〜５の整数を表し、Ｚは以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドを表す：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド）
で表され、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第１のコード配列；
（３）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列；ならびに
（４）以下の（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列；
（ｉ）配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｊ）配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有するポリペプチド、
（ｋ）配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有するポリペプチド、及び
（ｌ）配列番号：７の第４２番目〜第６１４番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有するポリペプチド、
を含有する発現ベクターを用いて融合蛋白質を可溶性蛋白質として発現させ、
該融合蛋白質をリンカーペプチドの切断サイトで切断し、Ｎ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅが付加した前記（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドを含む蛋白質を得ることを含む、蛋白質を製造する方法。
（２）  前記式（Ｚ）ｎで表されるポリペプチドが、（Ｚ）２で表されるポリペプチドである、上記（１）記載の方法。
（３）  前記式（Ｚ）２で表されるポリペプチドが、
（ｅ）配列番号：４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｆ）配列番号：４のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、
（ｇ）配列番号：４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド、及び
（ｈ）配列番号：３の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドである、上記（２）記載の方法。
（４）  前記発現誘導可能なプロモーター配列が、低温で発現誘導可能なプロモーター配列である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）  前記低温で発現誘導可能なプロモーター配列が、コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、上記（４）記載の方法。
（６）  前記コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列である、上記（５）記載の方法。
（７）  前記大腸菌コールドショック遺伝子のプロモーター配列が、大腸菌コールドショック遺伝子ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧ、ｃｓｐＩ又はｃｓｄＡのプロモーター配列である、上記（６）記載の方法。
（８）  前記第１のコード配列の５’側に、さらに精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有する、上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）  前記精製のためのアミノ酸配列が、ヒスチジンタグ配列である、上記（８）記載の方法。
（１０）  上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法により製造した蛋白質と、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁体とを接触させて、カルシウム結合型発光蛋白質を得ることを含む、カルシウム結合型発光蛋白質の製造方法。
（１１）  セレンテラジン類縁体が、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、Bｉｓ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、及びメトキシセレンテラジンからなる群から選択される、上記（１０）記載の方法。
（１２）  セレンテラジン類縁体が、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、及びｅ−セレンテラジンからなる群から選択される、上記（１１）記載の方法。
（１３）  以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群から選択される蛋白質：
（ｍ）配列番号：１０のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｎ）配列番号：１０のアミノ酸配列において、第１番目〜第４番目のアミノ酸以外の１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有する蛋白質；
（ｏ）配列番号：１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、第１番目〜第４番目のアミノ酸がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有する蛋白質；及び
（ｐ）配列番号：９の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、第１番目〜第４番目のアミノ酸がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性を有する蛋白質。
（１４）  上記（１３）に記載の蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン類縁体のペルオキシドとを含む、カルシウム結合型発光蛋白質。
（１５）  セレンテラジン類縁体が、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、Bｉｓ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、及びメトキシセレンテラジンからなる群から選択される、上記（１４）に記載の蛋白質。
（１６）  セレンテラジン類縁体が、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、及びｅ−セレンテラジンからなる群から選択される、上記（１５）記載の蛋白質。
（１７）  上記（１０）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法によって製造したカルシウム結合型発光蛋白質を用いることを含む、カルシウムイオンを検出または定量する方法。
（１８）  上記（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載のカルシウム結合型発光蛋白質を用いることを含む、カルシウムイオンを検出または定量する方法。
（１９）  検出または定量するカルシウムイオンが１０−６Ｍ〜１０−４Ｍの濃度範囲である、上記（１７）または（１８）に記載の方法。
（２０）  上記（１０）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法によって製造したカルシウム結合型発光蛋白をドナー蛋白質として用いて、生物発光共鳴エネルギー移動法を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法。
（２１）  上記（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載のカルシウム結合型発光蛋白をドナー蛋白質として用いて、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法を行うことを特徴とする、生理機能の解析方法。
（２２）  上記（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載のカルシウム結合型発光蛋白をドナー蛋白質として用いて、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法を行うことを特徴とする、酵素活性の測定方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一つの態様によれば、新たなカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質が提供される。本発明の好ましい態様のアポ蛋白質から調製したカルシウム結合型発光蛋白質は、イクオリン、マイトロコミン、又はクライティンなどと異なる発光スペクトルを示す。本発明のさらに好ましい態様のアポ蛋白質から調製したカルシウム結合型発光蛋白質は、カルシウム濃度に対する感受性がイクオリン、マイトロコミン、又はクライティンなどに比べて低く、高濃度のカルシウムの定量に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１２】
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質とは、配列番号：１０のアミノ酸配列からなる蛋白質および配列番号：１０のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性もしくは機能を有する蛋白質を意味する。本明細書中、配列番号：１０のアミノ酸配列からなる蛋白質および配列番号：１０のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性もしくは機能を有する蛋白質を「組換えアポマイトロコミン」と称することがある。
【００１３】
実質的に同質の活性もしくは機能とは、例えば、（i）前記蛋白質がセレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合して発光蛋白質を形成することができる機能、（ii）前記蛋白質がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光する発光蛋白質を形成することができる機能、（iii）前記発光蛋白質がカルシウムイオンと結合することによって生じる発光の最大発光強度（Imax）が、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の最大発光強度（Imax）の１／４以上、好ましくは１／３以上、より好ましくは１／２以上、さらに好ましくは１／１．５以上であること、（iv）前記発光蛋白質がカルシウムイオンと結合することによって生じる発光の半減期（T1/2、秒）が、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の半減期（T1/2、秒）の４倍以下、好ましくは３倍以下、より好ましくは２倍以下、さらに好ましくは１．５倍以下であること、などのいずれかを意味する。なお、上記の発光活性や発光パターンの測定は、例えば、Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410 およびShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261, 913-920などに記載の方法によって測定することができる。 具体的には、例えば、前記発光蛋白質にカルシウム溶液を加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置を用いて発光活性または発光パターンを測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えばＴＤ−４０００（ラボサイエンス社製）、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０（ベルトールド社製）などを使用することができる。
【００１４】
本明細書において、「カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性または機能」とは、例えば、アポ蛋白質がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成する活性または機能を意味する。「蛋白質がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成する」とは、具体的には、（１）蛋白質が、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合して発光蛋白質を形成すること、だけではなく（２）蛋白質が、酸素存在下に、セレンテラジンもしくはその誘導体と接触することにより、蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドとを含有する発光蛋白質（複合体）を形成すること、をも意味する。
【００１５】
本明細書において、セレンテラジン類縁体とは、本発明の蛋白質と結合し、カルシウムイオンの作用によって発光しうる発光蛋白質を形成することができる化合物を意味する。
【００１６】
本発明の一つの態様の蛋白質は、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群から選択される蛋白質である。
（ｍ）配列番号：１０のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｎ）配列番号：１０のアミノ酸配列において、第１番目〜第４番目のアミノ酸以外の１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質；
（ｏ）配列番号：１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、第１番目〜第４番目のアミノ酸がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質；及び
（ｐ）配列番号：９の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、第１番目〜第４番目のアミノ酸がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質。
【００１７】
上記「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入若しくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００１８】
また、上記「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における「９０％以上」の範囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。本発明の一つの態様では、塩基配列の同一性の数値は、ＢＬＡＳＴを用いて決定する。
【００１９】
また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：１０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２０】
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２１】
ここで言う「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２２】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
【００２３】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：１０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。本発明の一つの態様では、塩基配列の同一性の数値は、ＢＬＡＳＴを用いて決定する。
【００２４】
２．本発明のカルシウム結合型発光蛋白質
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、本発明の蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン類縁体のペルオキシドとを含む。本発明の一つの態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、ｂｉｓ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、及びメトキシセレンテラジンからなる群から選択される。本発明の好ましい態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、及びｅ−セレンテラジンからなる群から選択される。本発明の別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｎ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｃｐ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｈｃｐ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｆ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｆｃｐ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｈ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｅ−セレンテラジンである。
本発明の好ましい態様のカルシウム結合型発光蛋白質は、イクオリン、マイトロコミン、又はクライティンなどと異なる発光スペクトルを示す。本発明のさらに好ましい態様のカルシウム結合型発光蛋白質は、カルシウム濃度に対する感受性がイクオリン、マイトロコミン、又はクライティンなどに比べて低く、高濃度のカルシウムの定量に用いることができる。
尚、セレンテラジンを含む本発明の好ましい態様のカルシウム結合型発光蛋白質は、組換えマイトロコミンである。また、セレンテラジン類縁体を含む本発明の好ましい態様のカルシウム結合型発光蛋白質は、半合成組換えマイトロコミンである。
【００２５】
３．本発明の蛋白質の製造方法
本発明の一つの態様によれば、以下の蛋白質製造方法が提供される：
（１）発現誘導可能なプロモーター配列；
（２）式（Ｚ）ｎで表され、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能又は活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第１のコード配列；
（３）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列；及び
（４）（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列；
を含有する発現ベクターを用いて融合蛋白質を可溶性蛋白質として発現させ、
該融合蛋白質をリンカーペプチドの切断サイトで切断し、Ｎ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅが付加した前記（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドを含む蛋白質を得ることを含む、蛋白質を製造する方法。
該製造方法によれば、新たなカルシウム結合型蛋白質のアポ蛋白質を提供することができる。
【００２６】
３．１．融合蛋白質
以下、融合蛋白質についてより詳細に説明する。融合蛋白質は、以下のペプチドを含む：
（１）式（Ｚ）ｎで表され、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチド；
（２）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチド；及び
（３）（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチド。
【００２７】
（１）式（Ｚ）ｎで表されるポリペプチド
融合蛋白質において、式（Ｚ）ｎで表されるポリペプチドは、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性又は機能を有する。
Ｚは、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドを表す：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号：１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２８】
上記「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入若しくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００２９】
また、上記「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における「９０％以上」の範囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。本発明の一つの態様では、アミノ酸配列又は塩基配列の同一性の数値は、ＢＬＡＳＴを用いて決定する。
【００３０】
また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
【００３１】
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３２】
ここで言う「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３３】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
【００３４】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。本発明の一つの態様では、塩基配列の同一性の数値は、ＢＬＡＳＴを用いて決定する。
【００３５】
ｎは、１〜５の整数を表し、２又は３であるのが好ましく、特に２であるのが好ましい。
式（Ｚ）ｎで表されるポリペプチドにおいて、各Ｚは同一であっても異なっていてもよい。
式（Ｚ）ｎで表されるポリペプチドとしては、特に式（Ｚ）２で表されるポリペプチドが好ましい。
【００３６】
式（Ｚ）２で表されるポリペプチドとしては、例えば、配列番号：４のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性若しくは機能を有するポリペプチドが挙げられる。本明細書中、配列番号：４のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性若しくは機能を有するポリペプチドを「ＺＺドメイン」と称することがある。
前記「実質的に同質の活性若しくは機能」とは、例えば、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性若しくは機能を意味する。このような活性若しくは機能、例えば、ＺＺドメインのIgG 結合能は、IgGとの結合アッセイ法により測定することができる。
【００３７】
式（Ｚ）２で表されるポリペプチドとしては、より具体的には、例えば、
（ｅ）配列番号：４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｆ）配列番号：４のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性若しくは機能を有するポリペプチド、
（ｇ）配列番号：４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性若しくは機能を有するポリペプチド、及び
（ｈ）配列番号：３の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性若しくは機能を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドなどが挙げられる。
【００３８】
（２）切断サイトを有するリンカーペプチド
融合蛋白質は、式（Ｚ）ｎで表されるポリペプチドのアミノ酸配列を含有する第１のアミノ酸配列と、（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を含有する第２のアミノ酸配列との間に、切断サイトを有するリンカーペプチドのアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列を含む。本発明のある態様では、リンカーペプチドは、切断したときに、式（Ｚ）ｎで表されるポリペプチドを除去するとともに、（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅが付加したポリペプチドを含む蛋白質を生成する。
切断サイトを有するリンカーペプチドとは、酵素的または化学的切断物質により切断することができる切断サイトを有するリンカーペプチドを意味する。酵素（プロテアーゼ）または化学物質により切断されるペプチドは多数知られている（例えば、Harlow and Lane, Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)；Walsh, Proteins Biochemistry and Biotechnology, John Wiley & Sons, LTD., West Sussex, England (2002)など参照）。切断物質とは、ペプチドにおける切断サイトを認識し、ペプチド内の結合の切断によりペプチドを２つのペプチドに分割する化学物質または酵素である。切断物質としては、例えば、化学物質、プロテアーゼなどが挙げられる。
切断サイトを有するリンカーペプチドは、好ましくは、プロテアーゼ切断サイトを有するリンカーペプチドである。プロテアーゼ切断サイトとしては、例えば、トロンビン切断サイト、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断サイト、ファクターＸａ切断サイトなどが挙げられる。
切断サイトを有するリンカーペプチドは、好ましくは、配列番号：６のアミノ酸配列からなるリンカーペプチドである。配列番号：６のアミノ酸配列からなるリンカーペプチドは、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断サイトを有する。
【００３９】
（３）（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチド
融合蛋白質には、以下の（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドが含まれる：
（ｉ）配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｊ）配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性又は機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｋ）配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性又は機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
（ｌ）配列番号：７の第４２番目〜第６１４番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性又は機能を有するポリペプチド。
【００４０】
「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列」及び「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」、及び「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」の意味は、前記と同じである。
【００４１】
（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとしては、例えば、配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性若しくは機能を有するポリペプチドが挙げられる。
【００４２】
実質的に同質の活性もしくは機能とは、例えば、（i）前記ポリペプチドがセレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合して発光蛋白質を形成することができる機能、（ii）前記ポリペプチドがセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光する発光蛋白質を形成することができる機能、（iii）前記発光蛋白質がカルシウムイオンと結合することによって生じる発光の最大発光強度（Imax）が、配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドの最大発光強度（Imax）の１／４以上、好ましくは１／３以上、より好ましくは１／２以上、さらに好ましくは１／１．５以上であること、（iv）前記発光蛋白質がカルシウムイオンと結合することによって生じる発光の半減期（T1/2、秒）が、配列番号：８の第９番目〜第１９８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドの半減期（T1/2、秒）の４倍以下、好ましくは３倍以下、より好ましくは２倍以下、さらに好ましくは１．５倍以下であること、などのいずれかを意味する。なお、上記の発光活性や発光パターンの測定は、例えば、Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410 およびShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261, 913-920などに記載の方法によって測定することができる。 具体的には、例えば、前記発光蛋白質にカルシウム溶液を加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置を用いて発光活性または発光パターンを測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えばＴＤ−４０００（ラボサイエンス社製）、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０（ベルトールド社製）などを使用することができる。
【００４３】
融合蛋白質は、さらに、翻訳促進のためのアミノ酸配列及び／又は精製のためのアミノ酸配列を含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、当技術分野において用いられているアミノ酸配列を使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、例えば、ＴＥＥ配列などが挙げられる。精製のためのアミノ酸配列としては、当技術分野において用いられているアミノ酸配列を使用することができる。精製のためのアミノ酸配列としては、例えば、ヒスチジン残基が４残基以上、好ましくは６残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、グルタチオン Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列などが挙げられる。精製のためのアミノ酸配列は、前記第１のアミノ酸配列のアミノ末端側に存在するのが好ましい。
【００４４】
３．２．ポリヌクレオチド
以下、前述した融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドについて説明する。ポリヌクレオチドとしては、融合蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalＲＮＡ又はｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction（以下、RT-PCR法と略称する）によって増幅することもできる。
【００４５】
ポリヌクレオチドは、具体的には、次の（１）〜（３）の配列を含有するポリヌクレオチドである：
（１）式（Ｚ）ｎで表され、
（式中、ｎ及びＺ前記と同じ意味を表す。）
かつ、（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第１のコード配列；
（２）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列；及び
（３）（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列。
【００４６】
式（Ｚ）２で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドなどが挙げられる：
（ｅ）配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：３の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ目的蛋白質との融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性又は機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、及び
（ｈ）配列番号：４のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつリンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性又は機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００４７】
このような好ましいポリヌクレオチドとしては、例えば、次のコード配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる：
（１）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第１のコード配列；
（ｅ）配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：３の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性又は機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、及び
（ｈ）配列番号：４のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつリンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性又は機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（２）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列；及び
（３）（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列。
【００４８】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）」とは、配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
【００４９】
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００５０】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５１】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
【００５２】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。本発明の一つの態様では、塩基配列の同一性の数値は、ＢＬＡＳＴを用いて決定する。
【００５３】
あるアミノ酸配列に対して、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を有する領域をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異導入法（例えば、Gotoh, T. et al., Gene 152, 271-275 (1995)、Zoller, M.J., and Smith, M., Methods Enzymol. 100, 468-500 (1983)、Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、Kramer W, and Fritz H.J., Methods. Enzymol. 154, 350-367 (1987)、Kunkel,T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492 (1985)、Kunkel, Methods Enzymol. 85, 2763-2766 (1988)、など参照）、アンバー変異を利用する方法（例えば、Gapped duplex法、Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、など参照）などを用いることにより得ることができる。
【００５４】
また目的の変異（欠失、付加、置換及び／又は挿入）を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、Ho S. N. et al., Gene 77, 51 (1989)など参照）によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。
【００５５】
また欠失変異体の一種である蛋白質の部分断片をコードするポリヌクレオチドは、その蛋白質をコードするポリヌクレオチド中の作製したい部分断片をコードする領域の５’端の塩基配列と一致する配列を有するオリゴヌクレオチド及び３’端の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、その蛋白質をコードするポリヌクレオチドを鋳型にしたＰＣＲを行うことにより取得できる。
【００５６】
ポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号：１２のアミノ酸配列からなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどがあげられる。配列番号：１２のアミノ酸配列からなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。これらの塩基配列及びアミノ酸配列を、図８に示す。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（コード配列）及び／又は精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（コード配列）を含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（コード配列）は、前記第１のコード配列の５’側に存在するのが好ましい。
【００５８】
３．３．発現ベクター及び形質転換体
さらに、本発明は、上述したポリヌクレオチドを含有する発現ベクター及び形質転換体を提供する。
（１）発現ベクター
発現ベクターは、適当なベクターに前述のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。
発現ベクターとしては、具体的には、例えば、次のプロモーター配列、及びコード配列を含有する発現ベクターなどが挙げられる：
（１）発現誘導可能なプロモーター配列；
（２）式（Ｚ）ｎ
（式中、ｎ及びＺ前記と同じ意味を表す。）
で表され、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第１のコード配列；
（３）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列；及び
（４）（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列。
【００５９】
ポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などがあげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージなどがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルスなど）などがあげられる。また、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター（以上、タカラバイオ社製）なども好適に使用することができる。
【００６０】
ポリヌクレオチドは、通常、適当なベクター中のプロモーター（発現誘導可能なプロモーター）の下流に、発現可能なように連結される。用いられるプロモーターとしては、形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。また、低温で発現誘導可能なプロモーターも好適に使用することができる。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、例えば、コールドショック遺伝子のプロモーター配列などが挙げられる。コールドショック遺伝子としては、例えば、大腸菌コールドショック遺伝子（例えば、ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧ、ｃｓｐＩ、ｃｓｄＡなど）、Bacillus caldolyticusコールドショック遺伝子（例えば、Ｂｃ−Ｃｓｐなど）、Salmonella entericaコールドショック遺伝子（例えば、ｃｓｐＥなど）、Erwinia carotovoraコールドショック遺伝子（例えば、ｃｓｐＧなど）などが挙げられる。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、なかでも、例えば、ｃｓｐＡプロモーター、ｃｓｐＢプロモーター、ｃｓｐＧプロモーター、ｃｓｐＩプロモーター、ｃｓｄＡプロモーターなどを好適に使用することができる。
【００６１】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、選択マーカなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがあげられる。
【００６２】
また、発現ベクターは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド及び／又は精製のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。
【００６３】
（２）形質転換体
このようにして得られた、ポリヌクレオチド（すなわち、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド）を含有する発現ベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞又は昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli）などがあげられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、例えば、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21などがあげられる。
【００６４】
発現ベクターの宿主への導入方法及びこれによる形質転換方法は、一般的な各種方法によって行うことができる。発現ベクターの宿主細胞への導入方法としては、例えば、例えばリン酸カルシウム法（Virology, 52, 456-457 (1973)）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)）、エレクトロポレーション法（EMBO J., 1, 841-845 (1982)）などがあげられる。エシェリヒア属菌の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)などに記載の方法などがあげられる。バチルス属菌の形質転換方法としては、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168, 111 (1979)に記載の方法などがあげられる。酵母の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,７５,1929 (1978)に記載の方法などがあげられる。動物細胞の形質転換方法としては、例えば、Virology,52, 456 (1973)に記載の方法などがあげられる。昆虫細胞の形質転換方法としては、例えば、Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)に記載の方法などがあげられる。このようにして、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００６５】
（３）低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクター及び形質転換体
発現ベクターとしては、なかでも低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが好ましい。
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターとは、具体的には、次のプロモーター配列、及びコード配列を含有する発現ベクターを意味する：
（１）低温で発現誘導可能なプロモーター配列；
（２）式（Ｚ）ｎ
（式中、ｎ及びＺは前記と同じ意味を表す。）
で表され、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性又は機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第１のコード配列；
（３）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列；及び
（４）（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列。
【００６６】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターとしては、なかでも、次のプロモーター配列、及びコード配列を含有する発現ベクターが好ましい：
（１）低温で発現誘導可能なプロモーター配列；
（２）式（Ｚ）２
（式中、Ｚは前記と同じ意味を表す。）
で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第１のコード配列；
（３）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列；及び
（４）（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列。
【００６７】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列とは、宿主細胞を増殖させる培養条件から、温度を下げることによって融合蛋白質の発現を誘導可能なプロモーター配列を意味する。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、例えば、コールドショック蛋白質をコードする遺伝子（コールドショック遺伝子）のプロモーターが挙げられる。コールドショック遺伝子のプロモーターとしては、例えば、大腸菌のコールドショック遺伝子のプロモーター、Bacillus caldolyticusコールドショック遺伝子のプロモーター（例えば、Ｂｃ−Ｃｓｐなど）、Salmonella entericaコールドショック遺伝子のプロモーター（例えば、ｃｓｐＥなど）、Erwinia carotovoraコールドショック遺伝子のプロモーターなど（例えば、ｃｓｐＧなど）が挙げられる。大腸菌のコールドショック遺伝子のプロモーターとしては、例えば、ｃｓｐＡプロモーター、ｃｓｐＢプロモーター、ｃｓｐＧプロモーター、ｃｓｐＩプロモーター、ｃｓｄＡプロモーターなどが挙げられ、ｃｓｐＡプロモーターが好ましい。Bacillus caldolyticusコールドショック遺伝子のプロモーターとしては、例えば、Ｂｃ−Ｃｓｐなどが挙げられる。Salmonella entericaコールドショック遺伝子のプロモーターとしては、例えば、ｃｓｐＥなどが挙げられる。Erwinia carotovoraコールドショック遺伝子のプロモーターとしては、例えば、ｃｓｐＧなどが挙げられる。
【００６８】
本発明で用いられる低温で発現誘導可能なプロモーターが発現誘導しうる温度としては、通常３０℃以下、好ましくは２５℃以下、より好ましくは２０℃以下、特に好ましくは１５℃以下である。ただし、より効率良く発現を誘導させるため、通常は５℃以上、好ましくは１０℃以上、特に好ましくは約１５℃で発現誘導させる。
【００６９】
本発明の低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターを作製する場合、本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターとしては、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター（以上、タカラバイオ社製）などを好適に使用することができる。これらのベクターを使用して、原核細胞を宿主として発現させた場合、融合蛋白質を宿主細胞の細胞質中に可溶性蛋白質として産生させることができる。
【００７０】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターを導入する宿主としては、原核細胞が好ましく、さらに大腸菌が好ましく、特にBL21株、JM109株が好ましく、なかでもBL21株が好ましい。
【００７１】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが導入された形質転換体を細胞増殖させる培養温度は、通常２５〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃である。発現誘導させる温度は、通常４〜２５℃、好ましくは１０〜２０℃、より好ましくは１２〜１８℃、特に好ましくは１５℃である。
【００７２】
また、発現ベクターとしては、次のプロモーター配列、コード配列、及び制限酵素サイトを含有する発現ベクターなどが挙げられる：
（１）発現誘導可能なプロモーター配列；
（２）式（Ｚ）ｎ
（式中、ｎ及びＺは前記と同じ意味を表す。）
で表され、かつ、リンカーペプチドと（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドとの融合蛋白質として発現された場合に、該融合蛋白質が可溶性蛋白質として発現されうる活性又は機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第１のコード配列；
（３）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列；及び
（４）（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイト。
【００７３】
「（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイト」とは、（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列を挿入することができる制限酵素認識部位を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドである。前記制限酵素サイトとしては、（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列を挿入することができればよく、特に制限はないが、いわゆるマルチクローニングサイトであるのが好ましい。マルチクローニングサイトなどの制限酵素サイトは、当技術分野において周知であり、報告されている（例えば、Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. Gene 33 (1985) 103-119、Improved M13 phage cloning vectors and host strains: Nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33 (1985) 103-119など参照）。
【００７４】
このような発現ベクターの（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトに、上述の（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを連結（挿入）することにより、融合蛋白質を発現できる発現ベクターを作製することができる。
【００７５】
このような発現ベクターとしては、なかでも、次のプロモーター配列、コード配列、及び制限酵素サイトを含有する発現ベクターが好ましい。
（１）低温で発現誘導可能なプロモーター配列；
（２）式（Ｚ）２
（式中、Ｚは前記と同じ意味を表す。）
で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第１のコード配列；
（３）切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列；及び
（４）（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第２のコード配列を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイト。
【００７６】
前記第１のコード配列の５’側に、さらに精製のためのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するコード配列を含有していてもよい。精製のためのアミノ酸配列については、前記した通りである。
【００７７】
３．４．融合蛋白質及び本発明の蛋白質の製造
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、融合蛋白質を生成させる工程を含む、融合蛋白質の製造方法を提供する。融合蛋白質は、例えば、前記形質転換体を本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）が発現可能な条件下で培養し、融合蛋白質を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
【００７８】
さらに、本発明は、融合蛋白質をリンカーペプチドの切断サイトで切断し、式（Ｚ）ｎで表わされるポリペプチドのない、Ｎ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅが付加した（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドを含む蛋白質（本発明の蛋白質）を得る工程を含む、本発明の蛋白質の製造方法を提供する。本発明の蛋白質は、例えば、前記製造した融合蛋白質を、リンカーペプチドの切断サイトで切断し、分離・精製することによって製造することができる。
【００７９】
（形質転換体の培養）
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明の融合蛋白質が生成され、形質転換体内又は培養液中などに融合蛋白質が蓄積される。
【００８０】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)などを、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)などを培地に添加してもよい。
【００８１】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。
【００８２】
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)）や０.５％(w/v)カザミノ酸を含有するＳＤ培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)）があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００８３】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する培地としては、たとえば約５〜２０％(v/v)の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Science, 122, 501 (1952)），ＤＭＥＭ培地（Virology, 8, 396 (1959)）などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００８４】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非働化した１０％(v/v)ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００８５】
なお、低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが導入された形質転換体を細胞増殖させる培養温度及び発現誘導させる温度は、前記した通りである。
【００８６】
（融合蛋白質の分離・精製）
上記培養物から、融合蛋白質を分離・精製することによって、融合蛋白質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体若しくは培養細胞、又は培養菌体若しくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。融合蛋白質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
【００８７】
具体的には、本発明の融合蛋白質が培養菌体内若しくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体若しくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により融合蛋白質の粗抽出液を得ることができる。融合蛋白質がペリプラズムスペース中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば浸透圧ショック法など）により融合蛋白質を含む抽出液を得ることができる。融合蛋白質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体若しくは細胞と培養上清とを分離することにより、融合蛋白質を含む培養上清を得ることができる。
【００８８】
このようにして得られた抽出液若しくは培養上清中に含まれる融合蛋白質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。融合蛋白質が上述した精製のためのアミノ酸配列を含有する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、融合蛋白質がヒスチジンタグ配列を含有する場合にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインを含有する場合にはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法を用いることができる。
【００８９】
（融合蛋白質の切断）
上記融合蛋白質の切断は、公知の方法により行うことができる。
具体的には、融合蛋白質は、切断サイトを有し、かつ、切断したときに（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドのＮ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドを付加するリンカーペプチドを含むので、上記融合蛋白質を、切断物質で処理することによって、式（Ｚ）ｎで表わされるポリペプチドが融合蛋白質から除去され、Ｎ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列からなるポリぺプチドが付加した（ｉ）〜（ｌ）からなる群から選択されるポリペプチドを含む蛋白質を得ることができる。
切断物質としては、例えば、酵素的切断物質と化学的切断物質を挙げることができる。酵素的切断物質は、好ましくは、プロテアーゼである。プロテアーゼとしては、例えば、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼなどが挙げられる。
切断サイトを有するリンカーペプチドは、好ましくは、配列番号：６のアミノ酸配列からなるリンカーペプチドである。配列番号：６のアミノ酸配列からなるリンカーペプチドは、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断サイトを有する。ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断サイトの切断に用いるプロテアーゼとしては、例えば、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を挙げることができる。
【００９０】
（本発明の蛋白質の分離・生成）
上記切断処理物中に含まれる本発明の蛋白質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。融合蛋白質が上述した精製のためのアミノ酸配列を含有する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、融合蛋白質がヒスチジンタグ配列を含有する場合にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインを含有する場合にはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法を用いることができる。これにより、切断処理物中の、未切断の融合蛋白質及び切断された式（Ｚ）ｎで表わされるポリペプチドから、本発明の蛋白質を分離・精製することができる。
【００９１】
４．本発明のカルシウム結合型発光蛋白質
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、本発明の蛋白質の製造方法により製造した蛋白質と、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁体とを接触させて、カルシウム結合型発光蛋白質を得ることにより、製造又は再生することができる。
【００９２】
ここで、「接触」とは、本発明の蛋白質と、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁体を収容した容器に本発明の蛋白質を添加すること、本発明の蛋白質を収容した容器にセレンテラジン又はセレンテラジン類縁体を添加すること、又は本発明の蛋白質とセレンテラジン又はセレンテラジン類縁体とを混合すること、などが含まれる。本発明の１つの態様によれば、接触は、還元剤（例えば、メルカプトエタノール、又はジチオスレイトールなど）及び酸素の存在下、低温で行う。より具体的には、本発明の発光蛋白質は、例えば、Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410 およびShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261, 913-920などに記載の方法によって製造することができる。本発明の発光蛋白質は、酸素存在下において、本発明の蛋白質と、セレンテラジンと分子状酸素から生成するセレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する。前記複合体にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドと二酸化炭素を生成する。前記複合体を「本発明の発光蛋白質」と称することがある。
【００９３】
セレンテラジン類縁体としては、例えば、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、ｂｉｓ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、及びメトキシセレンテラジンからなる群から選択されるものを挙げることができる。本発明の好ましい態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｆｃｐ−セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、及びｅ−セレンテラジンからなる群から選択される。本発明の別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｎ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｃｐ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｈｃｐ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｆ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｆｃｐ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｈ−セレンテラジンである。本発明のさらに別の態様によれば、セレンテラジン類縁体は、ｅ−セレンテラジンである。
【００９４】
５．本発明のカルシウム結合蛋白質などの利用
（カルシウムイオンの検出または定量）
上述したように、本発明の蛋白質（アポ蛋白質）は、セレンテラジンまたはセレンテラジン類縁体と分子状酸素より生成するセレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと非共有的な結合を形成することによって生成可能な蛋白質であって、且つカルシウムイオンの作用によって発光する発光蛋白質（ホロ蛋白質）を形成することができる。よって、本発明の蛋白質または本発明の発光蛋白質は、カルシウムイオンの検出または定量に使用することができる。
【００９５】
カルシウムイオンの検出または定量を行う場合には、本発明の蛋白質（アポ蛋白質）とセレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン類縁体のペルオキシドとからなる発光蛋白質を使用する。発光蛋白質は、前述した方法に従って製造することができる。カルシウムイオンの検出または定量は、検体溶液を直接発光蛋白質溶液に添加し、発生する発光を測定することにより行うことができる。あるいは、検体溶液に発光蛋白質溶液を添加し、発生する発光を測定することにより、カルシウムイオンを検出または定量することもできる。また、前記発光蛋白質は、カルシウムイオンの検出または定量を行う測定系に添加する前に、予め本発明の蛋白質（アポ蛋白質）水溶液とセレンテラジンまたはその誘導体（例えば、h-セレンテラジン、e-セレンテラジン、cl-セレンテラジン、ch-セレンテラジン、hcp-セレンテラジンなど）とを接触させて生成させたものを用いてもよい。また、測定系中で、本発明の蛋白質（アポ蛋白質）とセレンテラジンまたはその誘導体）とを接触させることにより、本発明の蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドとからなる発光蛋白質を生成させてもよい。生成した発光蛋白質は、本発明の蛋白質（アポ蛋白質）とセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドとの複合体（発光蛋白質）であり、前記複合体（すなわち本発明の発光蛋白質）はカルシウムイオン濃度依存的に発光する。従って、本発明の蛋白質（アポ蛋白質）または本発明の発光蛋白質は、カルシウムイオンの検出に使用することができる。カルシウムイオンの検出は、具体的には、前述の通り、検体溶液を直接発光蛋白質溶液に添加し、発生する発光を測定することにより行うことができる。あるいは、検体溶液に発光蛋白質溶液を添加し、発生する発光を測定することによりカルシウムイオンを検出することもできる。
【００９６】
カルシウムイオンの検出または定量は、カルシウムイオンによる本発明の発光蛋白質の発光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０（ベルトールド社製）などを使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、発光蛋白質を用いて、既知のカルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。本発明の好ましい態様によれば、検出または定量するカルシウムイオンは、高濃度、例えば、１０−６Ｍ〜１０−４Ｍの濃度範囲である。
【００９７】
本発明の蛋白質は、本発明の蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン類縁体のペルオキシドとからなる発光蛋白質を作製し、前記発光蛋白質をマイクロインジェクション法などの手法により細胞内に直接導入することによって、生理的条件下の細胞内カルシウムイオン濃度変化の検出に利用することもできる。
【００９８】
本発明の蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、アポ蛋白質遺伝子（本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド）を細胞内で発現させることによって、細胞内で生成させてもよい。さらに、生成した本発明の蛋白質（アポ蛋白質）に細胞外よりセレンテラジンまたはその誘導体を付与することにより、発光蛋白質を生成させてもよい。
【００９９】
このようにして細胞内に導入した、または細胞内で生成した本発明の発光蛋白質を用いて、外部刺激（たとえば、レセプターに関与する薬剤による刺激等）に対する細胞内のカルシウムイオン濃度の変化を測定することもできる。
【０１００】
（レポーター蛋白質としての利用）
本発明の蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列（例えば、エンハンサーなど）に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、本発明の蛋白質に由来する発光（すなわち、本発明の発光蛋白質の発光）を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、上述のようにして、レポーター遺伝子として利用することができる。
【０１０１】
（発光による検出マーカとしての利用）
本発明の蛋白質は、発光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、例えば、イムノアッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明の発光蛋白質を化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質（蛋白質あるいは核酸など）と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。また、本発明の検出マーカは、例えば、目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入することによって、前記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。このような目的物質などの分布の測定は、発光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、本発明の蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。
【０１０２】
（アミューズメント用品の材料）
本発明の蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドとからなる複合体（本発明の発光蛋白質）は、微量のカルシウムイオンと結合するだけで発光する。よって、本発明の蛋白質、本発明の発光蛋白質などは、アミューズメント用品の材料の発光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
【０１０３】
（生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法）
本発明の発光蛋白質は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に利用することができる。
例えば、本発明の発光蛋白質をドナー蛋白質として使用し、有機化合物又は蛍光蛋白質をアクセプター蛋白質として使用して、両者の間で生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を起こすことにより蛋白質間の相互作用を検出することができる。本発明のある態様では、アクセプター蛋白質として使用する有機化合物は、Hoechist3342、Indo-1又はDAP1などである。本発明の別の態様では、アクセプター蛋白質として使用する蛍光蛋白質は、緑色蛍光蛋白質（GFP）、青色蛍光蛋白質（BFP）、変異GFP蛍光蛋白質又はフィコビリンなどである。本発明の好ましい態様において、解析する生理機能は、オーファン受容体（特にG蛋白質共役受容体）、アポトーシス、又は遺伝子発現による転写調節などである。また、本発明の好ましい態様において、分析する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ又はリン酸化酵素などである。
ＢＲＥＴ法による生理機能の解析は、公知の方法で行うことができ、例えば、Biochem. J. 2005, 385, 625-637、又はExpert Opin. Ther Tarets, 2007 11: 541-556などに記載の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことができ、例えば、Nat Methods 2006, 3:165-174、又はBiotechnol J. 2008, 3:311-324などに記載の方法に準じて行うことができる。
【０１０４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【０１０５】
［方法及び材料］
材料
組換えイクオリンをShimomura ＆ Inouye, Protein Express. Purif. 16 (1999) 91-95、クライティン−ＩをInouye ＆ Sahara, Protein Express. Purif. 53 (2007)  384-389、及びクライティン−ＩＩをInouye, J. Biochem. 143 (2008) 711-717の記載に従って調製した。
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１００ｍＭ  ＣａＣＯ３標準溶液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、（±）−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、イミダゾール、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、及びｎ−セレンテラジン（ｎ−ＣＴＺ）を和光純薬（株）より入手した。
キレートセファロース  ファーストフロー  、及びＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅをＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）より入手した。
ｃｐ−セレンテラジン（ｃｐ−ＣＴＺ）、ｈｃｐ−セレンテラジン（ｈｃｐ−ＣＴＺ）、ｆ−セレンテラジン（ｆ−ＣＴＺ）、及びｆｃｐ−セレンテラジン（ｆｃｐ−ＣＴＺ）をプロメガ社（ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）より入手した。
セレンテラジン（ＣＴＺ）、ｈ−セレンテラジン（ｈ−ＣＴＺ）、及びＢｉｓ−セレンテラジン（Ｂｉｓ−ＣＴＺ）を、チッソ株式会社より入手した。
ｅ−セレンテラジン（ｅ−ＣＴＺ）、及びメトキシセレンテラジン（ＭｅＯ−ＣＴＺ）を寺西克倫先生（三重大学）よりご提供頂いた（合成方法については、Shimomura et al., Biochem.J. 251（1988） 405-410など参照。）。
【０１０６】
ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−Ｘの構築
ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−Ｘは、低温で発現誘導可能なベクターであり、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィのためのヒスチジンタグ配列と、ＺＺドメイン配列と、目的蛋白質のコード配列との間のヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）の切断配列と、マルチクローニング部位（ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ）とを含む。ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−Ｘは、ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｘ（Inouye ＆  Sahara, Biochem. Biophys. Res. Commun．376 (2008) 448-453）から次の手順で構築した。
ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｘを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  の切断認識配列をもつ合成リンカー（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｂ／Ｅ−Ｆ（配列番号：１３、5’  GA TCT CTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC G  3’）とＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｂ／Ｅ−Ｒ（配列番号：１４、5’  AA TTC GGG CCC CTG GAA CAG AAC TTC CAG A  3’））を合成し、ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−ＸのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入することによりｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−Ｘを得た（図２（Ａ）、及び（Ｂ））。本ベクターは、ｌａｃ  オペレーターによって制御されるコールドショックプロテインＡ（ｃｓｐＡ）のプロモーター（Qing et al., Nature Biotechnol. 22 (2004) 877-882）を含む。
【０１０７】
融合蛋白質発現ベクター（ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−ＭＩ）の構築
ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−ＭＩは、大腸菌においてアポマイトロコミンとZZドメインとの融合蛋白質を発現するベクターである。ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−ＭＩを次のように構築した。
ｐＭＩ−１７（Fagan et al., FEBS Lett., 333 (1993) 301-305）を鋳型とし、ＭＩ−５Ｎ／ＥｃｏＲＩ（配列番号：１５、5’ ggc GAA TTC GTC AAG CTT ACG ACT GAC TTT  3’ ；下線はEcoRIサイト）及びｐＣｏｌｄ−Ｒプライマー（配列番号：１６、5’ GGC AGG GAT CTT AGA TTC TG 3’）のプライマーセットを用いて、Ｅｘ−Ｔａｑ  ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅにより、ＰＣＲ増幅（２５サイクル；９４℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で１分間）を行い、組換えマイトロコミンのコード領域を含むフラグメントを得た。得られたフラグメントをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−ＸのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入して、ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−ＭＩを得た（図２（Ａ））。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ３１０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒと、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｋｉｔを用いて、ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−ＭＩの塩基配列を確認した。
【０１０８】
大腸菌細胞での融合蛋白質の発現と組換えアポマイトロコミンの精製
図１の手順に従って、組換えアポマイトロコミンを精製した。先ず、大腸菌細胞で可溶性蛋白質として融合蛋白質を発現させた。発現させた融合蛋白質は、６個のヒスチジン残基を含むヒスチジンタグと、ＺＺドメインと、プロテアーゼ切断サイトと、目的蛋白質（すなわち、組換えアポマイトロコミン）とを持つ。次に、大腸菌細胞で発現させた融合蛋白質を含む可溶性画分を、一回目のニッケルキレートカラムにかけた。そして、カラムに吸着した画分を、融合蛋白質を含む画分として回収した。次に、カラムから溶出させた融合蛋白質をプロテアーゼで切断した。さらに、融合蛋白質の切断フラグメントを２回目のニッケルキレートカラムにかけ、カラム通過画分を回収した。通過画分には、目的蛋白質である組換えアポマイトロコミンが含まれる。未切断融合蛋白質と切断ヒスチジンタグＺＺドメインはゲルに吸着させた。以下、これらの手順について詳細に説明する。
【０１０９】
（ｉ）可溶性蛋白質としてのＨｉｓ−ＺＺ−Ｐ−アポマイトロコミン（Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩ）の発現
宿主大腸菌株としてＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いた。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する１０ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で、３７℃で１８時間、ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−ＭＩを含むBL２１株を培養した。この種培養を、４００ｍｌのＬＢ培地を含む３Ｌフラスコに植菌し、３時間培養し、その後、冷水で、１時間冷却した。その培地に、最終濃度が０．２ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた後、さらに１５℃で１７時間培養した。８００ｍｌの培養液から、３０００ｘｇで５分間の遠心分離により大腸菌を回収し、８０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中に懸濁し、Ｂｒａｎｓｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ２５０  ｓｏｎｉｆｉｅｒ（Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）を用いて行い、冷却しながら３分間に３回の超音波処理することにより大腸菌を破壊した。１２０００ｘｇで２０分間の遠心分離後、ＺＺ−Ｐ−アポマイトロコミンを含む上清を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡化したニッケルキレートカラム（カラムサイズ；２．５×６ｃｍ）に供した。２５０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）でカラムを洗浄した後、０．１Ｍイミダゾールで吸着したＺＺ−Ｐ−アポマイトロコミンを溶出させた。８００ｍｌの培養細胞からの融合蛋白質Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩの収量は、５１．２ｍｇであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、純度９５％以上であった。
【０１１０】
（ｉｉ）ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅによるＨｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ＡｐｏＭＩの消化
最適な消化条件を検討するため、ニッケルキレートカラムから溶出したＨｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩ（２．２ｍｇ）を、１５０ｍＭ  Ｎａｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴを含む１ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中で、様々な量（１、３、１０、及び２０uｇ）のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、４℃で１８時間消化した。融合蛋白質Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩの消化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
尚、以下の組換えアポマイトロコミンの精製のためには、９．３ｍｇのＨｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩにつき、６μｇのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅを用いた。
【０１１１】
（ｉｉｉ）組換えアポマイトロコミンの精製
ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅによるＨｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ＡｐｏＭＩの消化処理溶液の中には、切断により生じるＺＺドメインと組換えアポマイトロコミンと、未切断Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩとが含まれる。切断ＺＺドメインと未切断Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩから組換えアポマイトロコミンを分離するため、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ処理溶液を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡化したニッケルキレートカラム（0.5  x６cm）に直接かけた。そして、組換えアポマイトロコミンを含む通過分画を回収した。
【０１１２】
組換えマイトロコミンと半合成組換えマイトロコミンの発光活性の測定
組換えマイトロコミン又は半合成組換えマイトロコミンを再生は、１μｌの２−メルカプトエタノールを含む１ｍｌの３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）−１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、１μｇのセレンテラジン又はセレンテラジン類縁体（メタノール中に１μｇ／μｌ）と組換えアポマイトロコミン（１uｇ）を４℃で２時間放置することにより行なった。組換えマイトロコミンは、組換えアポマイトロコミンとセレンテラジンから再生させたものであり、半合成組換えマイトロコミンは、組換えアポマイトロコミンとセレンテラジン類縁体から再生させたものである。発光測定は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｒ４２２０Ｐ  ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒに備えたアトー社製ＡＢ２２００  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いた。５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）１００μｌを、再生させた組換えマイトロコミン又は半合成組換えマイトロコミン（１μｌ）へ注入し、１０秒間測定し。初期発光強度（Ｉｍａｘ）、発光能、及び半減衰時間を決定した。
【０１１３】
組換えマイトロコミンのＣａ２＋検出感度の測定
組換えアポマイトロコミンから再生した組換えマイトロコミンを、０．０１ｍＭ  ＥＤＴＡと０．１％ウシアルブミンと１５０ｍＭ  ＮａＣｌとを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中で溶解し、１０μｌの組換えマイトロコミン（５ｎｇ）を、５０μｌの様々なＣａ２+濃度（１０−８．５〜１０−４Ｍ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）溶液に注入した。９１２４Ｂ  ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｕｂｅ  ｌｉｍｉｔｅｄ、ＵＫ）に備え付けたＢｅｒｔｈｏｌｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂａｄ  Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）  ｍｏｄｅｌ  Ｃｅｎｔｒｏ  ９６０  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて、組換えマイトロコミンの発光強度を測定した。
【０１１４】
組換え発光蛋白質の生物発光の発光スペクトルの測定
組換えマイトロコミン、クライティン−Ｉ、クライティン−ＩＩ、及びイクオリンのＣａ２+による発光スペクトルは、Inouye ＆ Sasaki FEBS Lett.  580 (2006) 1977-1982の記載に従って、  蛍光分光測定装置ＦＰ６５００（日本分光社製）（発光バンド幅、１０ｎｍ；レスポンス、０．５秒；感度、ｍｅｄｉｕｍ；走査速度、１０００ｎｍ／ｍｉｎ）により、２２〜２５℃で、励起光源を消した状態で、測定した。
【０１１５】
蛋白質の解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685に記載に従って、１２％分離ゲルを用いて、還元条件下で行った。電気泳動条件は、２５ｍＡの電流で９０分間行った。泳動後、ゲルは、コロイドＣＢＢ染色キット（ＴＥＦＣＯ）を用いて染色した。蛋白質濃度は、市販の蛋白質測定キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）によりウシ血清アルブミン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）標準物質としてＢｒａｄｆｏｒｄの色素結合法（Bradford, Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254）に従い、決定した。
【０１１６】
質量分析
蛋白質の質量分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  Ｐｒｏ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を用いて、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ)により行った（Inouye et al., Anal. Biochem. 316 (2003) 216-222.）。
【０１１７】
[結果及び考察]
大腸菌細胞で融合蛋白質（ＺＺドメイン結合アポマイトロコミン）を発現するベクターの構築
最近、本発明者らは、大腸菌を用いた低温誘導システムにおいて、ＺＺドメインを可溶性パートナーとした、目的蛋白質を可溶性蛋白質として発現させることに成功した（Inouye & Sahara, Biochem. Biophys. Res. Commun ．376 (2008) 448-453）。
ＺＺドメインを除いた目的蛋白質を調製するには、融合蛋白質からＺＺドメインを取り除く必要がある。本発明者らは、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）の切断サイトをＺＺドメインと目的蛋白質の間に導入することで達成した（図１）。この目的のために、本発明者らは、新規発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−Ｘを構築した（図２）。これは、ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｘ（Inouye & Sahara, Biochem. Biophys. Res. Commun ．376 (2008) 448-453）に由来するベクターである（図１）。
大腸菌細胞の細胞質で融合蛋白質として発現させるため、ｐＭＩ−１７（Fagan et al., FEBS Lett. 333 (1993) 301-305）のアポマイトロコミンのコード領域をｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−ＸのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−ＭＩを得た（図２（Ａ））。この発現ベクターは、６つのヒスチジンを含むヒスチジンタグ配列と、ＺＺドメイン配列と、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅの切断配列と、ｃｓｐＡプロモーターと、ｌａｃ  オペレーターの制御下にアポマイトロコミンのｃＤＮＡの一部（配列番号：７の第４２番目〜第６１４番目の塩基配列）とを有する。１５℃での低温および０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて融合蛋白質の発現を誘導した。融合蛋白質の塩基配列を配列番号：１１に、アミノ酸配列を配列番号：１２に、それぞれ示す（図８）。
【０１１８】
ＺＺドメイン結合アポマイトロコミンからの組換えアポマイトロコミンの精製
融合蛋白質（ヒスチジンタグＺＺドメイン結合アポマイトロコミン：Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩ）を大腸菌細胞の細胞質で可溶性蛋白質として発現させ、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィにより精製した（図３、レーン  ２）。８００ｍｌの培養細胞から、５１．７ｍｇの精製Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩを得た（表１）。Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩからＺＺドメインを取り除くために、様々な濃度のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅの切断条件を調べた（図３のレーン  ３〜６）。その結果、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅに対するＨｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩの割合が２０００倍を超える条件下で、ＺＺドメインのない組換えアポマイトロコミンを得ることができた（図３のレーン  ６）。融合蛋白質をＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅによって消化処理した後、消化処理物を、直接、ニッケルカラムにかけて、未切断Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩと切断ヒスチジンタグＺＺドメインから組換えアポマイトロコミンを分離した。このようにして、組換えアポマイトロコミンを含む分画を得た（図４、レーン  ５）。還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、組換えアポマイトロコミンは、９５％以上の純度で２４ｋＤａの分子量を示した（図４、レーン  ５）。ニッケルキレートクロマトグラフィーにより、５．９ｍｇの組換えアポマイトロコミンが得られた（表１）。
ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ切断により融合蛋白質が正確に切断されていることを確認するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析を行い、質量値ｍ／ｚ２２，２４５．３を観測した。この質量値は、精製組換えアポマイトロコミンの計算平均質量[Ｍ+Ｈ]+２２，２６１．９と良く一致していた。このことから、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ消化によりＺＺドメインを正確に切断できたことを確認した。すなわち、組換えアポマイトロコミンは、Gly-Pro-Glu-Pheの追加のアミノ酸配列をＮ末端に含む１９４アミノ酸残基からなる組換え蛋白質である。組換えアポマイトロコミンの塩基配列を配列番号：９に、アミノ酸配列を配列番号：１０に示す。
【０１１９】
組換えマイトロコミンの発光スペクトル解析
組換えイクオリン調製の場合の方法（Inouye et al., J. Biochem. 105(1989) 473-477）と同様に、２−メルカプトエタノールの存在下、４℃で、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁体とともに組換えアポマイトロコミンをインキュベートすることにより、組換えマイトロコミン又は半合成組換えマイトロコミンを再生させた。２時間放置で、組換えマイトロコミン又は半合成組換えマイトロコミンを９５％以上再生できた。組換えマイトロコミンのＣａ２+添加による発光スペクトルを測定し、他の発光蛋白質の発光スペクトルと比較した（図５）。組換えマイトロコミン生物発光スペクトルは、４５６ｎｍで発光ピークを示し、７２ｎｍの半値全幅（ＦＷＨＭ）であった（図５）。このスペクトルは、天然マイトロコミン（Hａｌｉｓｔａｕｒｉｎ）やマイトロコミンの粗調製物のもの（Fagan et al., FEBS Lett. 333 (1993) 301-305及びShimomura et al., Biochem. J. 228 (1985) 745-749）と似ているが、一致していない。同条件下で、イクオリン（Inouye & Sasaki, FEBS Lett. 580 (2006) 1977-1982）とクライティン（Inouye, J. Biochem. 143 (2008) 711-717及びInouye & Sahara, Protein Express. Purif. 53 (2007)  384-389）は、それぞれ、８４ｎｍのＦＷＨＭで４６０ｎｍの最大発光波長であり、７６ｎｍのＦＷＨＭで４７０ｎｍの最大発光波長である。これらの結果は、組換えアポマイトロコミン内において、発光源となったセレンテラミドの環境が、アポイクオリンやアポクライティンのものと異なることを示唆する。
【０１２０】
組換えマイトロコミンと半合成組換えマイトロコミンの発光特性
Ｃａ２＋添加による組換えマイトロコミンの発光パターンを図６（Ａ）に示した。半減衰時間は１．３３秒であり、他のすべての発光蛋白質のものより遅い減衰時間を示した。
半合成イクオリンの調製法（Shimomura et al.,  Biochem. J. 270 (1990) 309-312及びShimomura et al., Cell Calcium, 14 (1993) 373-378）と同様の手順により、組換えアポマイトロコミンとセレンテラジン類縁体をインキュベートすることにより半合成組換えマイトロコミンを調製した。過剰のＣａ２+を半合成組換えマイトロコミンに添加し、初期発光強度、発光量、及び半減衰時間を測定し、他の論文に記載のイクオリンや、クライティン−Ｉ、クライティン−ＩＩのものと比較した。その比較結果を、表２に示す。また、発光パターンを比較した結果を、図６（Ａ）に示す。さらに、半合成組換えマイトロコミンの発光パターンを図６（Ｂ）に示す。興味深いことに、ｎ−セレンテラジンから得られた組換えｎ−マイトロコミンは、ゆっくりと大きくなる発光パターンを示し、１０秒を超える半減衰時間を有した。また、ｈｃｐ−セレンテラジンやｆｃｐ−セレンテラジンから得られた半合成組換えマイトロコミンは、他の発光蛋白質よりも良好な発光強度を示した。セレンテラジンにおけるイミダゾピラジノン構造の８位のシクロフェニル（ｃｐ）基は、マイトロコミンの発光強度に有意に影響を与えるものと考えられる。
【０１２１】
組換えマイトロコミンのＣａ２+検出感度
標準Ｃａ２+溶液中に組換えマイトロコミンを注入することにより、組換えマイトロコミンのＣａ２+に対する検出感度を測定し、Inouye, J. Biochem. 143 (2008) 711-717又はInouye ＆ Sahara, Protein Express. Purif. 53 (2007) 384-389に記載されている他の発光蛋白質のものと比較した。標準Ｃａ２+溶液のＣａ２+濃度を１０−８．５〜１０−４Ｍと変動させたところ、１０−６〜１０−４Ｍの高濃度でＣａ２+で組換えマイトロコミンを検出することができた。この結果は、組換えマイトロコミンの感度が、天然マイトロコミン（ｈａｌｉｓｔａｕｒｉｎ）（Shimomura et al., Biochem. J. 228 (1985) 745-749）を含む天然の発光蛋白質や、他の組換え発光蛋白質（Inouye, J. Biochem. 143 (2008) 711-717、Inouye & Sahara, Protein Express. Purif., 53 (2007) 384-389、及びMarkova et al., Biochemistry, 41 (2002) 2227-2236）よりも１０倍以上低いことが明らかとなった（図７）。この組換え蛋白質は、高濃度のＣａ２+の検出測定に使用することができる。
【０１２２】
【表１】
2010142201.tif 000002
【０１２３】
【表２】
2010142201.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】大腸菌細胞で発現させたＺＺドメイン融合蛋白質からの目的蛋白質の精製方法を示す図である。
【図２】切断サイトを有するＺＺドメイン融合蛋白質の発現ベクターを示す図である。（Ａ）発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−Ｘのプラスミドマップである。ｃｐｓＡ：コールドショックプロテインＡのプロモーター、ＴＥＦ：ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ、Ｈｉｓ＿Ｔａｇ：６個のヒスチジンを含むヒスチジンタグ配列。（Ｂ）ＺＺドメインとマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含むｐＣｏｌｄ−ＺＺ−Ｐ−ＸのＮ末端領域のアミノ酸配列と塩基配列を示す図である。
【図３】Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩの様々な量のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅによる酵素消化処理後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す写真である。レーン  １：分子量マーカ（テフコ社製）（β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）、ホスフォリラーゼｂ（９７．４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（９６．０ｋＤａ）、グルタミン酸脱水素酵素（５５．０ｋＤａ）、乳酸脱水素酵素（３６．５ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９．０ｋＤａ）、及びトリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ））、レーン  ２：ニッケルカラムから溶出したＨｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩ（２．２μｇ蛋白質）、レーン  ３：Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩ／ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ＝２．２ｍｇ／２０μｇ（６．６μｇ蛋白質）、レーン  ４：Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩ／ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ＝２．２ｍｇ／１０μｇ（６．６μｇ蛋白質）、レーン  ５：Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩ／ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ＝２．２ｍｇ／３μｇ（６．６μｇ蛋白質）、レーン  ６：Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩ／ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ＝２．２ｍｇ／１μｇ（６．６μｇ蛋白質）。
【図４】組換えアポマイトロコミン精製の各ステップでの蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す写真である。レーン  １：分子量マーカ、レーン  ２：大腸菌の粗抽出物（１６．５μｇ蛋白質）、レーン  ３：ニッケルキレートカラムから溶出させた精製Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩ（２．２μｇ蛋白質）、レーン  ４：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅでの切断後にニッケルキレートカラムから溶出させた精製Ｈｉｓ−ＺＺ−Ｐ−ａｐｏＭＩ（２．５μｇ蛋白質）、レーン  ５：ニッケルキレートカラムから溶出させた精製組換えアポマイトロコミンの通過画分（１．６μｇ蛋白質）。
【図５】組換えマイトロコミン（ＭＩ）と、イクオリン（ＡＱ）、クライティン−Ｉ（ＣＬ−Ｉ）、及びクライティン−ＩＩ（ＣＬ−ＩＩ）との生物発光の発光スペクトルを比較したスペクトル図である。イクオリン、クライティン−Ｉ、及びクライティン−ＩＩの発光スペクトルは、Inouye, J. Biochem. 143 (2008) 711-717に記載のものである。
【図６】組換えマイトロコミンと半合成組換えマイトロコミンのＣａ２＋添加による発光反応を示す図である。。（Ａ）組み換えマイトロコミン（ＭＩ）と、イクオリン（ＡＱ）、クライティン−Ｉ（ＣＬ−Ｉ）、及びクライティン−ＩＩ（ＣＬ−ＩＩ）との発光パターンを比較した図である。（Ｂ）Ｃａ２＋添加による、半合成組換えマイトロコミンの発光パターンを比較した図である。
【図７】組換えマイトロコミン（ＭＩ）、イクオリン（ＡＱ）、クライティン−Ｉ（ＣＬ−Ｉ）、及びクライティン−ＩＩ（ＣＬ−ＩＩ）の初期発光強度とＣａ２＋濃度との間の関係を示す図である。イクオリン及びクライティンのデータは、それぞれ、Inouye, J. Biochem. 143 (2008) 711-717と、Inouye & Sahara Protein Express. Purif. 53 (2007) 384-389に記載のものである。
【図８】融合蛋白質の塩基配列とアミノ酸配列を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２５】
〔配列番号：１〕式Ｚで表されるポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕式Ｚで表されるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕式（Ｚ）２で表されるポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕式（Ｚ）２で表されるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕リンカーペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の一例を示す。
〔配列番号：６〕リンカーペプチドのアミノ酸配列の一例を示す。
〔配列番号：７〕アポマイトロコミンをコードするＤＮＡの塩基配列の一例を示す（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｌ３１６２３）。
〔配列番号：８〕アポマイトロコミンのアミノ酸配列の一例を示す。
〔配列番号：９〕実施例で作製した組換えアポマイトロコミンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕実施例で作製した組換えアポマイトロコミンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕実施例で作製した融合蛋白質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕実施例で作製した融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕実施例で用いた合成リンカーＤＮＡの塩基配列（Ｆ）を示す。
〔配列番号：１４〕実施例で用いた合成リンカーＤＮＡの塩基配列（Ｒ）を示す。
〔配列番号：１５〕実施例で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕実施例で用いたプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
2010142201.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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