(57)【要約】      （修正有）【課題】有毛細胞の様々な状態を明瞭に識別する新規な有毛細胞標識剤、及び該標識剤を用いた有毛細胞標識方法を提供すること。【解決手段】一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物から選択される少なくとも一種を有効成分として含む事を特徴とする有毛細胞標識剤、及び該標識剤を使用する有毛細胞標識方法。2010169677.tif 000021【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物から選択される少なくとも一種を有効成分として含むことを特徴とする有毛細胞標識剤：
【化１】
2010169677.tif 000017
［一般式（Ｉ）中、
Ｒ1は、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、
Ｒ2〜Ｒ5は、各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、カルボン酸基、スルホン酸基、ヘテロ環基、アミノ基、又はハロゲン原子を表し、Ｒ2とＲ3、Ｒ3とＲ4、又はＲ4とＲ5は互いに結合して環を形成しても良く、Ｒ6は、水素原子、又はアルキル基を表し、
Ｒ7は、水素原子、アルキル基、カルボン酸基、又はシアノ基を表し、
Ｘ1-は、陰イオン性基を表し、
Ｙは、硫黄原子、酸素原子、−Ｎ（Ｒ8）−、又は−Ｃ（Ｒ9）（Ｒ10）−を表し、Ｒ8〜Ｒ10は、各々独立して、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、Ｒ9とＲ10は互いに結合して環を形成しても良く、
Ａは、アリール基、又はアルケニル基を表し、
ｎは、１〜３の整数を示し、ｎが１の時、ＡとＲ6は縮合して環を形成しても良い］、
【化２】
2010169677.tif 000018
［一般式（ＩＩ）中、
Ｒ11〜Ｒ12は、各々独立して、カルボン酸基、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド基、スルホン酸基、スルホン酸エステル、スルホン酸アミド基、カルボン酸の塩、またはスルホン酸の塩を表し、
Ｒ13及びＲ14は、各々独立して、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bは、各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表し、
Ｘ2-は、陰イオン性基を表す］。
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）中のＡのアルケニル基が下記一般式（ＩＩＩ）で表される事を特徴とする請求項１に記載の有毛細胞標識剤：
【化３】
2010169677.tif 000019
［一般式（ＩＩＩ）中、
Ｒ18〜Ｒ21は、各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、カルボン酸基、スルホン酸基、ヘテロ環基、アミノ基、又はハロゲン原子を表し、Ｒ18とＲ19、Ｒ19とＲ20、又はＲ20とＲ21は互いに結合して環を形成しても良く、Ｒ22は、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表す。Ｚは硫黄原子、酸素原子、又は−Ｃ（Ｒ23）（Ｒ24）−を表し、Ｒ23〜Ｒ24は、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、Ｒ23とＲ24は互いに結合して環を形成しても良い］。
【請求項３】
前記一般式（Ｉ）中のＡのアリール基が下記一般式（ＩＶ）で表される事を特徴とする請求項１に記載の有毛細胞標識剤：
【化４】
2010169677.tif 000020
［一般式（ＩＶ）中、
Ｒ25は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロ環基、又はアシル基を表し、
Ｒ26〜Ｒ29は、各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、又はアシル基を表し、Ｒ26とＲ28が互いに結合して環を形成しても良く、
Ｒ30は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はハロゲン原子を表す］。
【請求項４】
前記一般式（ＩＶ）中で表されるＲ26とＲ28が互いに結合して形成される環が、脂肪族環である請求項３に記載の有毛細胞標識剤。
【請求項５】
前記一般式（ＩＶ）中で表されるＲ26とＲ28が互いに結合して形成される環が、シクロペンタン環である請求項３に記載の有毛細胞標識剤。
【請求項６】
前記一般式（ＩＩ）中のＲ15、Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bの少なくとも１つ以上がアルキル基である事を特徴とする請求項１に記載の有毛細胞標識剤。
【請求項７】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物中にカルボン酸基、又はスルホン酸基を１つ以上有する事を特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の有毛細胞標識剤。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物と生物試料とを接触させる工程を含むことを特徴とする有毛細胞の標識方法。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物と生物試料とを接触させる工程と、該生物試料に励起光を照射し、該化合物に由来する蛍光を観察する工程と、
を含むことを特徴とする有毛細胞のイメージング方法。
【請求項１０】
化学物質の聴覚毒性を評価する方法であって、
生物に化学物質を投与する工程と、
該生物と請求項１に記載の化合物を接触させる工程と、
該生物に励起光を照射し、該化合物に由来する蛍光を観察する工程と、
を含むことを特徴とする化学物質の聴覚毒性を評価する方法。
【請求項１１】
前記生物がゼブラフィッシュであることを特徴とする請求項１０に記載の化学物質の聴覚毒性を評価する方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含む聴覚機能診断用組成物。
【請求項１３】
前記有毛細胞標識剤が近赤外領域に蛍光を発する化合物であることを特徴とする請求項１２に記載の聴覚機能診断用組成物。
【請求項１４】
難聴疾患の治療薬又は予防薬をスクリーニングする方法であって、
難聴疾患モデル動物に被験物質を投与する工程と、
該モデル動物に請求項１２に記載の聴覚機能診断用組成物を投与する工程と、
該モデル動物の有毛細胞に対する該聴覚機能診断用組成物の染色状態を調べる工程と、
を含む難聴疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記難聴疾患モデル動物がゼブラフィッシュである請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
難聴疾患の治療薬又は予防薬を評価する方法であって、
難聴疾患モデル動物に被験物質を投与する工程と、
該モデル動物に請求項１２に記載の聴覚機能診断用組成物を投与する工程と、
該モデル動物の有毛細胞に対する該聴覚機能診断用組成物の染色状態を調べる工程と、
を含む難聴疾患の治療薬又は予防薬の評価方法。
【請求項１７】
前記難聴疾患モデル動物がゼブラフィッシュである請求項１６に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有毛細胞標識剤、及び該有毛細胞標識剤を使用した有毛細胞標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有毛細胞は、ヒトでは聴覚の受容器である蝸牛、及び前庭感覚の受容器である三半規官および前庭器官に存在する。有毛細胞には、特殊な繊毛が生えている。この繊毛が、音・運動、姿勢に応じて生じるリンパ液の動きを感知して、電気的変化を生じさせている。
【０００３】
有毛細胞の異常は、末梢感音性聴覚障害（難聴）や耳鳴り、眩暈等の障害要因に関係があると言われている。有毛細胞自体は、非常に代謝が活発であり、特に騒音や化学薬品への暴露に対して脆弱で、損傷を受けやすい。有毛細胞毒性を有する可能性がある薬剤や化学物質のリストが報告されており、例えば、アミノグリコシド系等の抗生物質抗炎症薬、利尿薬、抗マラリア薬、抗腫瘍薬、局所投与剤等がある（非特許文献１）。
【０００４】
しかし、現在でも薬物開発段階で聴覚毒性について、標準化されたスクリーニング方法は存在せず、既に承認された薬剤に関しても聴覚毒性は未知のままであるものが多い。
【０００５】
化学物質の聴覚毒性を評価する手段として、例えば、ゼブラフィッシュの有毛細胞の生死をＤＡＳＰＥＩ（２−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｓｔｙｒｙｌ）−Ｎ−ｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）のような蛍光色素により評価する事が報告されている（非特許文献２）。又、有毛細胞染色染料としてＦＭ１−４３が知られている（非特許文献３）。
【０００６】
化学物質による聴覚毒性発現機構には様々な態様が想定され得る。即ち、化学物質の標的生体分子（タンパク質、酵素、核酸、遺伝子等）の相違に起因する有毛細胞機能に対する障害形式の多様性である。従って障害形式の多様性に応じて、様々な有毛細胞の状態（細胞の生死のみならず特定の細胞機能の喪失等）を識別する事が重要であり、このために様々な化学構造を有する有毛細胞染色剤が求められている。
【０００７】
しかし、有毛細胞を染色する公知の化合物としては、上記に挙げた２種（DASPEI、FM1-43）のみである。これらは、励起波長と、蛍光波長とが互いに近いもの同士であり、上記態様の多様性や、多重染色等の目的に応じた染色技術に対して、選択バリエーションの豊富化に充分寄与できているとは言い難い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．，１４（３），１９８−２１２頁（１９９６年）．
【非特許文献２】Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ，２０８，７９−８８頁（２００５年）．
【非特許文献３】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，４４（７），  ７３３−７４１項（１９９６年）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、有毛細胞の様々な状態を明瞭に識別するための新規な有毛細胞標識剤を提供することである。又、本発明の別の目的は、これらの新規な有毛細胞標識剤を使用して、特異的に有毛細胞を標識し、化学物質の聴覚毒性の評価や有毛細胞のイメージングなどの聴覚機能を評価する方法を提供することである。
【００１０】
また本発明の別の目的は、生体の有毛細胞の状態を評価するための聴覚機能診断用組成物を提供することである。
【００１１】
更に本発明の別の目的は、難聴疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法を提供することである。
【００１２】
また更に本発明の別の目的は、難聴疾患の治療薬又は予防薬の評価方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係る有毛細胞標識剤は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物から選択される少なくとも一種を有効成分として含む事を特徴とする有毛細胞標識剤である。
【００１４】
【化１】
2010169677.tif 000002
【００１５】
［一般式（Ｉ）中、
Ｒ1は、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、
Ｒ2〜Ｒ5は、各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、カルボン酸基、スルホン酸基、ヘテロ環基、アミノ基、又はハロゲン原子を表し、Ｒ2とＲ3、Ｒ3とＲ4、又はＲ4とＲ5は互いに結合して環を形成しても良く、Ｒ6は、水素原子、又はアルキル基を表し、
Ｒ7は、水素原子、アルキル基、カルボン酸基、又はシアノ基を表し、
Ｘ1-は、陰イオン性基を表し、
Ｙは、硫黄原子、酸素原子、−Ｎ（Ｒ8）−、又は−Ｃ（Ｒ9）（Ｒ10）−を表し、Ｒ8〜Ｒ10は、各々独立して、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、Ｒ9とＲ10は互いに結合して環を形成しても良く、
Ａは、アリール基、又はアルケニル基を表し、
ｎは、１〜３の整数を示し、ｎが１の時、ＡとＲ6は縮合して環を形成しても良い］
【００１６】
【化２】
2010169677.tif 000003
【００１７】
［一般式（ＩＩ）中、
Ｒ11〜Ｒ12は、各々独立して、カルボン酸基、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド基、スルホン酸基、スルホン酸エステル、スルホン酸アミド基、カルボン酸の塩、またはスルホン酸の塩を表し、
Ｒ13及びＲ14は、各々独立して、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bは、各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表し、
Ｘ2-は、陰イオン性基を表す］
また、本発明に係る有毛細胞のイメージング方法は、
本発明の有毛細胞標識剤と生物試料とを接触させる工程と、
該生物試料に励起光を照射し、該有毛細胞標識剤に由来する蛍光を観察する工程と、
を含むことを特徴とする有毛細胞のイメージング方法である。
【００１８】
本発明に係る化学物質の聴覚毒性を評価する方法は、
生物に化学物質を投与する工程と、
該生物と本発明の有毛細胞標識剤を接触させる工程と、
該生物に励起光を照射し、該有毛細胞標識剤に由来する蛍光を観察する工程と、
を含むことを特徴とする化学物質の聴覚毒性を評価する方法である。
【００１９】
本発明に係る聴覚機能診断用組成物は、本発明の有毛細胞標識剤を有効成分として含む聴覚機能診断用組成物である。
【００２０】
本発明に係る難聴疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、
難聴疾患モデル動物に被験物質を投与する工程と、
該モデル動物に本発明の聴覚機能診断用組成物を投与する工程と、
該モデル動物の有毛細胞に対する該聴覚機能診断用組成物の染色状態を調べる工程と、
を含む難聴疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法である。
【００２１】
本発明に係る難聴疾患の治療薬又は予防薬の評価方法は、
難聴疾患モデル動物に被験物質を投与する工程と、
該モデル動物に本発明の聴覚機能診断用組成物を投与する工程と、
該モデル動物の有毛細胞に対する該聴覚機能診断用組成物の染色状態を調べる工程と、
を含む難聴疾患の治療薬又は予防薬の評価方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、従来の有毛細胞染色剤とは波長特性の異なる化合物の、新規な用途を提供する。また、本発明に係る有毛細胞標識剤に用いる化合物群は、励起波長／蛍光波長の組み合わせが多様性に富み、且つ側線器官中に存在する感丘を明瞭に可視化することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１０で観測されたゼブラフィッシュ感丘の蛍光観察画像を示す。
【図２】実施例２１で観測されたゼブラフィッシュ感丘の蛍光観察画像を示す。
【図３】実施例２３で観測されたゼブラフィッシュ感丘の蛍光観察画像を示す。
【図４】実施例３８で測定された蛍光強度（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔ  、  ＲＦＵ）の比較（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ／ｍｓｅｃ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に本発明について更に詳しく説明する。
【００２５】
本発明者らは、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物の少なくとも一種を有効成分として含む標識剤は、有毛細胞を高感度で標識し、より高精度な診断や薬のスクリーニングが可能になる新規な有毛細胞標識剤である事を見出して本発明に至った。
【００２６】
尚、本発明において有毛細胞を標識するとは、上記の有効成分が有毛細胞中、またはその表面、あるいはその周囲に保持されることで、有毛細胞の形状、位置、または機能の少なくとも一つを検出可能な状態になることを言う。検出には、後に説明する画像取得手段によって蛍光画像や染色画像を取得する方法や、目視で観察する方法などが挙げられる。
【００２７】
【化３】
2010169677.tif 000004
【００２８】
一般式（Ｉ）中、Ｒ1は水素原子、アルキル基、又はアリール基を表す。Ｒ2〜Ｒ5は各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、カルボン酸基、スルホン酸基、ヘテロ環基、アミノ基、又はハロゲン原子を表す。Ｒ2とＲ3、Ｒ3とＲ4、又はＲ4とＲ5は互いに結合して環を形成しても良い。Ｒ6は水素原子、又はアルキル基を表す。Ｒ7は水素原子、アルキル基、カルボン酸基、又はシアノ基を表す。Ｘ1-は陰イオン性基を表す。Ｙは硫黄原子、酸素原子、−Ｎ（Ｒ8）−、又は−Ｃ（Ｒ9）（Ｒ10）−を表す。Ｒ8〜Ｒ10は水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、Ｒ9とＲ10は互いに結合して環を形成しても良い。Ａはアリール基、又はアルケニル基を表す。ｎは１〜３の整数を示し、ｎが１の時、ＡとＲ6は縮合して環を形成しても良い。
【００２９】
一般式（ＩＩ）中、Ｒ11〜Ｒ12はカルボン酸基、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド基、スルホン酸基、スルホン酸エステル、スルホン酸アミド基、カルボン酸の塩、またはスルホン酸の塩を表す。Ｒ13及びＲ14は水素原子、アルキル基、又はアリール基を表す。Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bは各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表す。Ｘ2-は陰イオン性基を表す。
【００３０】
前記一般式（Ｉ）中のＲ1におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、直鎖、又分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基等。Ｒ1は、更に置換基を有していてもよく、化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければ特に制限されない。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、又はナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、又はブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、又はナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオブチル基、又はチオフェニル基等のアルキルスルファニル基；メチルアミノ基、またはブチルアミノ基等のモノ置換アミノ基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、又はジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、ベンゾイル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、またはカルバモイル基等のアシル基；スルホン酸基、スルホン酸エステル基、またはスルファモイル基等のスルホニル基；ピリジル基、トリアジニル基、又はベンゾチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等のハロゲン原子；ポリエチレングリコール基；４級アンモニウム塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩等の塩類等が挙げられる。これらの置換基で水溶性を向上させる性質のある置換基を有する事が好ましく、これらに限定されるわけではないが、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、ポリエチレングリコール基、カルボン酸塩、スルホン酸塩が特に好ましい。
【００３１】
Ｒ1におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、又はアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式又は多環式アリール基が挙げられる。
【００３２】
Ｒ1として好ましくは、アルキル基の場合であり、更に該アルキル基にカルボン酸基、スルホン酸基、ポリエチレングリコール基、カルボン酸の塩、またはスルホン酸の塩等の置換基を有すると化合物の水溶性が増し、蛍光強度も増すので好ましい。一般式（Ｉ）中、Ｒ2〜Ｒ5におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、直鎖、又は分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基等。
【００３３】
Ｒ2〜Ｒ5におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、又はアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式又は多環式アリール基が挙げられる。
【００３４】
Ｒ2〜Ｒ5におけるアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、炭素数１〜２０個のアルコキシ基が挙げられる。メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、デシルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基、ドデシルオキシ基、又はオクタデシルオキシ基等。
【００３５】
Ｒ2〜Ｒ5におけるヘテロ環基としては、特に限定されるものではないが、４〜１０員環の単環式又は二環式の窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜４個の原子を含有するヘテロ環基が挙げられ、具体的には例えば、以下のものが挙げられる。ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、チエニル基、フリル基、ピラニル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾフリル基、又はベンゾチエニル基等。
【００３６】
Ｒ2〜Ｒ5におけるアミノ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、無置換アミノ基；Ｎ−メチルアミノ基、Ｎ−ブチルアミノ基、Ｎ−ヘキシルアミノ基、Ｎ−テトラデシルアミノ基、Ｎ−フェニルアミノ基、又はＮ−ナフチルアミノ基等のモノ置換アミノ基；Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジフェニルアミノ基、又はＮ，Ｎ−メチルプロピルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチルアミノ基、エチルカルボニルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルアミノ基、ベンゾイルアミノ基、ナフトイルアミノ基、又はメトキシカルボニルアミノ基等のカルボニルアミノ基；メチルスルホニルアミノ基、エチルスルホニルアミノ基、ｔｅｒｔ‐ブチルスルホニルアミノ基、又はｉｓｏ‐プロポキシスルホニルアミノ基等のスルホニルアミノ基が挙げられる。
【００３７】
Ｒ2〜Ｒ5におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等が挙げられる。
【００３８】
Ｒ2〜Ｒ5として、好ましくは、水素原子、カルボン酸基、スルホン酸基、アミノ基、ハロゲン原子であり、より好ましくは化合物の水溶性があがる水素原子、スルホン酸基である。
【００３９】
Ｒ2とＲ3、Ｒ3とＲ4、又はＲ4とＲ5が互いに結合して形成する環としては、特に限定されるものではないが例えば、以下のものが挙げられる。ベンゼン環、ナフタレン環等の炭素数３〜１０の芳香環、シクロオクタン環、シクロヘプタン環、シクロヘキサン環、シクロペンタン環、シクロブタン環等の飽和環、シクロペンテン環、シクロヘキセン環等の部分飽和環、ピリジン環、又はピリミジン環等のヘテロ環。更に該環には、置換基を有していてもよく、化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければ特に制限されない。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、又はナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、又はブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、又はナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、又はジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、ベンゾイル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、またはカルバモイル基等のアシル基；スルホン酸基、スルホン酸エステル基、またはスルファモイル基等のスルホニル基；ピリジル基、トリアジニル基、又はベンゾチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等のハロゲン原子；ポリエチレングリコール基；４級アンモニウム塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩等の塩類等が挙げられる。
【００４０】
Ｒ2とＲ3、Ｒ3とＲ4、又はＲ4とＲ5が互いに結合して形成する環として、化合物の保存安定性が向上するため、ベンゼン環の場合が好ましい。
【００４１】
一般式（Ｉ）中、Ｒ6〜Ｒ7におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基等。
【００４２】
Ｒ6として、好ましくは、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、又はブチル基であり、より好ましくは化合物の安定性から水素原子、メチル基、又はエチル基である。
【００４３】
Ｒ7として、好ましくは、水素原子、又はシアノ基であり、より好ましくは水素原子である。
【００４４】
一般式（Ｉ）中、Ｘ1-は陰イオン性基を表す。ここで陰イオン性基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のものを挙げることができる。フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、又はヨウ化物イオン等のハロゲンイオン；硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、又はヘキサフルオロリン酸イオン等の無機酸イオン；テトラクロロアルミニウムイオン等の含ルイス酸イオン；酢酸イオン、乳酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、又はテトラフェニルホウ酸イオン等の有機酸イオン等。
【００４５】
Ｘ1-の陰イオン性基としては、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、又はメタンスルホン酸イオン等が好ましく、より好ましくは化合物合成の容易さからも臭化物イオン、又はヨウ化物イオンの場合である。
【００４６】
一般式（Ｉ）中、Ｙは硫黄原子、酸素原子、−Ｎ（Ｒ8）−、又は−Ｃ（Ｒ9）（Ｒ10）−を表す。
【００４７】
Ｙ中、Ｒ8〜Ｒ10におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等を挙げることができる。メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基等。
【００４８】
Ｙ中、Ｒ8〜Ｒ10におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、又はアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式又は多環式アリール基が挙げられる。
【００４９】
Ｙ中、Ｒ8〜Ｒ10として好ましくは、化合物の保存安定性が良いため酸素原子、硫黄原子、又は−Ｃ（ＣＨ3）（ＣＨ3）−の場合である。
【００５０】
一般式（Ｉ）中、Ａにおけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、インドリル基、又はアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式又は多環式アリール基が挙げられる。更に該環には、置換基を有していてもよく、化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければ特に制限されない。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、又はナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、又はブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、又はナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオブチル基、又はチオフェニル基等のアルキルスルファニル基；メチルアミノ基、またはブチルアミノ基等のモノ置換アミノ基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、又はジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、ベンゾイル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、またはカルバモイル基等のアシル基；スルホン酸基、スルホン酸エステル基、またはスルファモイル基等のスルホニル基；ピリジル基、トリアジニル基、又はベンゾチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等のハロゲン原子；ポリエチレングリコール基；４級アンモニウム塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩等の塩類等が挙げられる。これらの置換基で水溶性を向上させる性質のある置換基を有する事が好ましく、これらに限定されるわけではないが、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、ポリエチレングリコール基、カルボン酸塩、スルホン酸塩が特に好ましい。
【００５１】
Ａにおけるアリール基として好ましくは、下記一般式（ＩＶ）で表される化合物であることが好ましい。
【００５２】
【化４】
2010169677.tif 000005
【００５３】
一般式（ＩＶ）中、Ｒ25は水素原子、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロ環基、又はアシル基を表す。Ｒ26〜Ｒ29は各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、又はアシル基を表し、Ｒ26とＲ28が互いに結合して環を形成しても良い。Ｒ30は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はハロゲン原子を表す。
【００５４】
一般式（ＩＶ）中、Ｒ25におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基等の直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。
【００５５】
Ｒ25におけるアラルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ベンジル基、又はフェネチル基等が挙げられる。
【００５６】
Ｒ25におけるアルケニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ビニル基、２，２−ジフェニルビニル基、３−ブテニル基、又はシクロヘキセニル基等の炭素数２〜２０個のアルケニル基が挙げられる。
【００５７】
Ｒ25におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、又はアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式又は多環式アリール基が挙げられる。
【００５８】
Ｒ25におけるヘテロ環基としては、特に限定されるものではないが、４〜１０員環の単環式又は二環式の窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜４個の原子を含有するヘテロ環基が挙げられる。具体的なヘテロ環基としては、例えば、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、チエニル基、フリル基、ピラニル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾフリル基、又はベンゾチエニル基等が挙げられる。
【００５９】
Ｒ25は、更に置換基を有していてもよく、化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければ特に制限されない。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、又はナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、又はブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、又はナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオブチル基、又はチオフェニル基等のアルキルスルファニル基；メチルアミノ基、またはブチルアミノ基等のモノ置換アミノ基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、又はジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、ベンゾイル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、またはカルバモイル基等のアシル基；スルホン酸基、スルホン酸エステル基、またはスルファモイル基等のスルホニル基；ピリジル基、トリアジニル基、又はベンゾチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等のハロゲン原子；ポリエチレングリコール基；４級アンモニウム塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩等の塩類等が挙げられる。これらの置換基で水溶性を向上させる性質のある置換基を有する事が好ましく、これらに限定されるわけではないが、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、ポリエチレングリコール基、カルボン酸塩、スルホン酸塩が特に好ましい。
【００６０】
Ｒ25は、上記に列挙した置換基から、それぞれ独立に且つ任意に選択できるが、好ましい形態としてはアラルキル基、アルケニル基、又はアリール基等の場合が蛍光の強度が強いため好ましい。具体的には、フェニル基、ブロモフェニル基、ベンジル基、ブロモベンジル基、メチルチオフェニル基、メトキシフェニル基、メトキシナフチル基、ベンジルフェニル基、２，２−ジフェニルビニル基、又は２，２−ジフェニルビニルフェニル基等が好ましい。更に好ましくは、フェニル基、ブロモフェニル基、ベンジル基、メチルチオフェニル基、メトキシフェニル基、又はメトキシナフチル基が好ましく、特に、メチルチオフェニル基の場合はストークスシフトが飛躍的に大きくなる傾向が認められるため好ましい。
【００６１】
一般式（ＩＶ）中、Ｒ26〜Ｒ29におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基等。
【００６２】
Ｒ26〜Ｒ29におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、又はアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式又は多環式アリール基が挙げられる。
【００６３】
Ｒ26〜Ｒ29におけるカルボン酸エステル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、カルボン酸メチルエステル基、カルボン酸エチルエステル基、カルボン酸プロピルエステル基、又はカルボン酸ブチルエステル基等が挙げられる。
【００６４】
Ｒ26〜Ｒ29におけるアシル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ペンタノイル基、ベンゾイル基、１−ナフトイル基、または２−ナフトイル基等が挙げられる。
【００６５】
Ｒ26〜Ｒ29は更に置換基を有していてもよく、化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければ特に制限されない。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、又はナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、又はブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、又はナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオブチル基、又はチオフェニル基等のアルキルスルファニル基；メチルアミノ基、またはブチルアミノ基等のモノ置換アミノ基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、又はジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、ベンゾイル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、またはカルバモイル基等のアシル基；スルホン酸基、スルホン酸エステル基、またはスルファモイル基等のスルホニル基；ピリジル基、トリアジニル基、又はベンゾチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等のハロゲン原子；ポリエチレングリコール基；４級アンモニウム塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩等の塩類等が挙げられる。これらの置換基で水溶性を向上させる性質のある置換基を有する事が好ましく、これらに限定されるわけではないが、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、ポリエチレングリコール基、カルボン酸塩、スルホン酸塩が特に好ましい。
【００６６】
Ｒ26とＲ28が互いに結合して形成する環としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のものを挙げることができる。シクロオクタン環、シクロヘプタン環、シクロヘキサン環、シクロペンタン環、又はシクロブタン環等の飽和脂肪族環、シクロペンテン環、又はシクロヘキセン環等の部分飽和脂肪族環等。更に該環には、置換基を有していてもよく、化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければ特に制限されない。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、又はナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、又はブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、又はナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオブチル基、又はチオフェニル基等のアルキルスルファニル基；メチルアミノ基、またはブチルアミノ基等のモノ置換アミノ基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、又はジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、ベンゾイル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、またはカルバモイル基等のアシル基；スルホン酸基、スルホン酸エステル基、またはスルファモイル基等のスルホニル基；ピリジル基、トリアジニル基、又はベンゾチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等のハロゲン原子；ポリエチレングリコール基；４級アンモニウム塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩等の塩類等が挙げられる。これらの置換基で水溶性を向上させる性質のある置換基を有する事が好ましく、これらに限定されるわけではないが、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、ポリエチレングリコール基、カルボン酸塩、スルホン酸塩が特に好ましい。
【００６７】
Ｒ26〜Ｒ29として、好ましくは、各々独立して水素原子、アルキル基、又はアリール基、Ｒ26とＲ28が互いに結合して環を形成している場合である。より好ましくは、Ｒ26とＲ28が互いに結合して環を形成している場合が化学構造上安定であるので好ましい。具体的には、シクロオクタン環、シクロヘプタン環、シクロヘキサン環、シクロペンタン環、又はシクロブタン環が挙げられる。より好ましくはシクロペンタン環が保存安定性の上からも好ましい。
【００６８】
一般式（ＩＶ）中、Ｒ30におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基等。
【００６９】
Ｒ30におけるアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、炭素数１〜２０個のアルコキシ基が挙げられる。メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、デシルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基、ドデシルオキシ基、又はオクタデシルオキシ基等。
【００７０】
Ｒ30におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等が挙げられる。
【００７１】
Ｒ30として好ましくは、水素原子、ハロゲン原子、又はアルコキシ基の場合であり、より好ましくは水素原子、又はハロゲン原子の場合である。
【００７２】
Ａにおけるアルケニル基として好ましくは、下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物であることが好ましい。
【００７３】
【化５】
2010169677.tif 000006
【００７４】
一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ18〜Ｒ21は各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、カルボン酸基、スルホン酸基、ヘテロ環基、アミノ基、又はハロゲン原子を表す。Ｒ18とＲ19、Ｒ19とＲ20、又はＲ20とＲ21は互いに結合して環を形成しても良い。Ｒ22は水素原子、アルキル基、又はアリール基を表す。Ｚは硫黄原子、酸素原子、又は−Ｃ（Ｒ23）（Ｒ24）−を表す。Ｒ23〜Ｒ24は水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、Ｒ23とＲ24は互いに結合して環を形成しても良い。
【００７５】
一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ18〜Ｒ21におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基等。
【００７６】
Ｒ18〜Ｒ21におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、又はアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式又は多環式アリール基が挙げられる。
【００７７】
Ｒ18〜Ｒ21におけるアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、炭素数１〜２０個のアルコキシ基が挙げられる。メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、デシルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基、ドデシルオキシ基、又はオクタデシルオキシ基等。
【００７８】
Ｒ18〜Ｒ21におけるヘテロ環基としては、特に限定されるものではないが、４〜１０員環の単環式又は二環式の窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜４個の原子を含有するヘテロ環基が挙げられる。具体的なヘテロ環基としては、例えば、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、チエニル基、フリル基、ピラニル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾフリル基、又はベンゾチエニル基等が挙げられる。
【００７９】
Ｒ18〜Ｒ21におけるアミノ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、無置換アミノ基；Ｎ−メチルアミノ基、Ｎ−ブチルアミノ基、Ｎ−ヘキシルアミノ基、Ｎ−テトラデシルアミノ基、Ｎ−フェニルアミノ基、又はＮ−ナフチルアミノ基等のモノ置換アミノ基；Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジフェニルアミノ基、又はＮ，Ｎ−メチルプロピルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチルアミノ基、エチルカルボニルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルアミノ基、ベンゾイルアミノ基、ナフトイルアミノ基、又はメトキシカルボニルアミノ基等のカルボニルアミノ基；メチルスルホニルアミノ基、エチルスルホニルアミノ基、ｔｅｒｔ‐ブチルスルホニルアミノ基、又はｉｓｏ‐プロポキシスルホニルアミノ基等のスルホニルアミノ基が挙げられる。
【００８０】
Ｒ18〜Ｒ21におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等が挙げられる。
【００８１】
Ｒ18〜Ｒ21として、好ましくは、水素原子、カルボン酸基、スルホン酸基、アミノ基、ハロゲン原子であり、より好ましくは水素原子、スルホン酸基の場合は化合物の水溶性があるため好ましい。
【００８２】
Ｒ18とＲ19、Ｒ19とＲ20、又はＲ20とＲ21が互いに結合して形成する環としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のものを挙げることができる。ベンゼン環、ナフタレン環等の炭素数３〜１０の芳香環、シクロオクタン環、シクロヘプタン環、シクロヘキサン環、シクロペンタン環、シクロブタン環等の飽和環、シクロペンテン環、シクロヘキセン環等の部分飽和環、ピリジン環、又はピリミジン環等のヘテロ環など。更に該環には、置換基を有していてもよく、化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければ特に制限されない。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、又はナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、又はブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、又はナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオブチル基、又はチオフェニル基等のアルキルスルファニル基；メチルアミノ基、またはブチルアミノ基等のモノ置換アミノ基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、又はジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、ベンゾイル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、またはカルバモイル基等のアシル基；スルホン酸基、スルホン酸エステル基、またはスルファモイル基等のスルホニル基；ピリジル基、トリアジニル基、又はベンゾチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等のハロゲン原子；ポリエチレングリコール基；４級アンモニウム塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩等の塩類等が挙げられる。これらの置換基で水溶性を向上させる性質のある置換基を有する事が好ましく、これらに限定されるわけではないが、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、ポリエチレングリコール基、カルボン酸塩、スルホン酸塩が特に好ましい。
【００８３】
Ｒ18とＲ19、Ｒ19とＲ20、又はＲ20とＲ21が互いに結合して形成する環として、化合物の保存安定性が向上するため、ベンゼン環の場合が好ましい。
【００８４】
一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ22におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基等。
【００８５】
Ｒ22には、更に置換基を有していてもよく、化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければ特に制限されない。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、又はナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、又はブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、又はナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオブチル基、又はチオフェニル基等のアルキルスルファニル基；メチルアミノ基、またはブチルアミノ基等のモノ置換アミノ基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、又はジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、ベンゾイル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、またはカルバモイル基等のアシル基；スルホン酸基、スルホン酸エステル基、またはスルファモイル基等のスルホニル基；ピリジル基、トリアジニル基、又はベンゾチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等のハロゲン原子；ポリエチレングリコール基；４級アンモニウム塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩等の塩類等が挙げられる。これらの置換基で水溶性を向上させる性質のある置換基を有する事が好ましく、これらに限定されるわけではないが、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、ポリエチレングリコール基、カルボン酸塩、スルホン酸塩が特に好ましい。
【００８６】
Ｒ22におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、又はアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式又は多環式アリール基が挙げられる。
【００８７】
Ｒ22として好ましくは、アルキル基の場合であり、更に該アルキル基にカルボン酸基、スルホン酸基、ポリエチレングリコール基、カルボン酸の塩、スルホン酸の塩等の置換基を有すると化合物の水溶性が増し、蛍光強度も増すので好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、酢酸基、プロパン酸基、又はエタンスルホン酸基等が挙げられる。
【００８８】
一般式（ＩＩＩ）で表されるＺ中、Ｒ23〜Ｒ24におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基等。
【００８９】
Ｚ中、Ｒ23〜Ｒ24におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、又はアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式又は多環式アリール基が挙げられる。
【００９０】
一般式（ＩＩＩ）中、Ｚとしては、酸素原子、硫黄原子、又は−Ｃ（ＣＨ3）（ＣＨ3）−の場合が、化合物の保存安定性が良いため特に好ましい。
【００９１】
一般式（Ｉ）中、ｎは１〜３の整数を示し、好ましくは、化合物の安定性からｎは１である。又、ｎが１の時、ＡとＲ6は縮合して環を形成しても良い。
【００９２】
ＡとＲ6が縮合して形成される環としては、スクアリウム環、またはチアゾリジン−４−オン環等が挙げられる。
【００９３】
また、近赤外領域の光を励起光に用いる場合は、一般式（Ｉ）中、Ａが一般式（ＩＩＩ）を表す時、ｎは２、もしくは３の場合が好ましい。
【００９４】
また、一般式（Ｉ）で表される化合物中にカルボン酸基、又はスルホン酸基を１つ以上有することが好ましい。
【００９５】
一般式（Ｉ）中、ＡとＲ6が互いに結合して形成する環としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のものが挙げられる。２，３−ジヒドロインデン環、インデン−１，３−ジオン環、４−シクロペンテン−１，３−ジオン環、フルオレン環、シクロヘキセン環、ヒドロキシシクロブテノン環、シクロヘキサノン環、又は５，５−ジメチル−１−シクロヘキセン環等。
【００９６】
一般式（ＩＩ）中、Ｒ11〜Ｒ12におけるカルボン酸エステル基としては、特に限定されないが、例えば、カルボン酸メチルエステル基、カルボン酸エチルエステル基、カルボン酸プロピルエステル基、又はカルボン酸ブチルエステル基等が挙げられる。
【００９７】
Ｒ11〜Ｒ12におけるカルボン酸アミド基としては、特に限定されるものではないが、例えば、カルボン酸モノメチルアミド基、カルボン酸モノブチルアミド基、カルボン酸ジエチルアミド基、カルボン酸−２−エチルヘキシル基等が挙げられる。
【００９８】
Ｒ11〜Ｒ12におけるスルホン酸エステル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、スルホン酸メチルエステル基、スルホン酸エチルエステル基、スルホン酸プロピオン酸エステル基、又はスルホン酸ブチルエステル基等が上げられる。
【００９９】
Ｒ11〜Ｒ12におけるスルホン酸アミド基としては、特に限定されるものではないが、例えば、スルホン酸モノメチルアミド基、スルホン酸モノブチルアミド基、スルホン酸ジエチルアミド基、スルホン酸−２−エチルヘキシルアミド基等が挙げられる。
【０１００】
Ｒ11〜Ｒ12におけるスルホン酸の塩、又はカルボン酸の塩としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のものが挙げられる。リチウム塩、ナトリウム塩、又はカリウム塩等のアルカリ金属塩；アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウムエチルアンモニウム塩、ジエチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩；ｎ−プロピルアンモニウム塩、イソプロピルアンモニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩；ｎ−ブチルアンモニウム塩、テトラｎ−ブチルアンモニウム塩、イソブチルアンモニウム塩；モノエタノールアンモニウム塩、ジエタノールアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩等のアンモニウム塩など。
【０１０１】
Ｒ11〜Ｒ12として、好ましくは、スルホン酸基、カルボン酸基、スルホン酸メチルエステル基、スルホン酸エチルエステル基、カルボン酸メチルエステル基、カルボン酸エチルエステル基、カルボン酸モノブチルアミド基、スルホン酸モノブチルアミド基、スルホン酸ナトリウム塩、スルホン酸カリウム塩、スルホン酸アンモニウム塩、カルボン酸ナトリウム塩、カルボン酸カリウム塩、又はカルボン酸アンモニウム塩の場合である。より好ましくは、水溶性が向上するため、スルホン酸基、カルボン酸基、スルホン酸ナトリウム塩、又はカルボン酸ナトリウム塩が良い。
【０１０２】
一般式（ＩＩ）中、Ｒ13〜Ｒ14におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基等。
【０１０３】
Ｒ13〜Ｒ14におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、又はアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式又は多環式アリール基が挙げられる。
【０１０４】
Ｒ13〜Ｒ14として、好ましくは、アルキル基、フェニル基の場合であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基の場合が良い。
【０１０５】
一般式（ＩＩ）中、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bにおけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下に挙げるものを含む、直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基等。
【０１０６】
Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bにおけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、又はアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式又は多環式アリール基が挙げられる。更に該環には、置換基を有していてもよく、化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければ特に制限されない。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、又はナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、又はブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、又はナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、又はジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、ベンゾイル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、またはカルバモイル基等のアシル基；スルホン酸基、スルホン酸エステル基、またはスルファモイル基等のスルホニル基；ピリジル基、トリアジニル基、又はベンゾチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等のハロゲン原子；ポリエチレングリコール基；４級アンモニウム塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩等の塩類等が挙げられる。
【０１０７】
Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bにおけるヘテロ環基としては、特に限定されるものではないが、例えば、４〜１０員環の単環式又は二環式の窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜４個の原子を含有するヘテロ環基が挙げられる。具体的なヘテロ環基としては、例えば、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、チエニル基、フリル基、ピラニル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾフリル基、又はベンゾチエニル基等が挙げられる。
【０１０８】
Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bとして、好ましくは、アルキル基、又はアリール基の場合であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、無置換又は置換されたフェニル基である。
【０１０９】
一般式（ＩＩ）中、Ｘ2-は陰イオン性基を表す。ここで陰イオン性基としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のものを表すことができる。フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、又はヨウ化物イオン等のハロゲンイオン；硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、又はヘキサフルオロリン酸イオン等の無機酸イオン；テトラクロロアルミニウムイオン等の含ルイス酸イオン；酢酸イオン、乳酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、又はテトラフェニルホウ酸イオン等の有機酸イオン等。
【０１１０】
Ｘ2-の陰イオン性基としては、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、又はメタンスルホン酸イオン等が好ましく、より好ましくは化合物合成の容易さからも臭化物イオン、又はヨウ化物イオンの場合である。
【０１１１】
前記一般式（ＩＩ）で表わされる分子構造においてＲ11がスルホン酸基、又はカルボン酸基の時、下記（ＩＩ'）又は（ＩＩ"）で表わされる互変異性体が存在する。本発明の化合物が有する一般式（ＩＩ）で表わされる構造は、下記一般式（ＩＩ'）又は（ＩＩ"）等で表わされる構造も包含する。
【０１１２】
【化６】
2010169677.tif 000007
【０１１３】
式中（ＩＩ'）、又は（ＩＩ"）で表わされる化合物におけるＲ12〜Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bは前記一般式（ＩＩ）におけるＲ12〜Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bの場合と同義である。
【０１１４】
本発明にかかる化合物は、単独で有毛細胞に保持されるとともに、発色性を有する化合物自体の構造に基づいて有毛細胞を染色する染色剤として、有毛細胞の標識に利用することができる。又、本発明にかかる化合物は、有毛細胞に保持される特徴を利用して、当該化合物に更に光学的シグナルを発信可能な化合物を付加する形態の標識剤として用いることができる。付加する化合物は、直接またはリンカー分子を介して結合することができる。付加する化合物としては、細胞膜を通過して有毛細胞内部に浸透することができる程度の低分子化合物を好適に用いることができる。
【０１１５】
次に、本発明の前記一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物の製造方法について以下に説明する。本発明にかかる一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、公知の方法に従って合成することができる。以下に合成スキームの一例を示す。
【０１１６】
【化７】
2010169677.tif 000008
【０１１７】
上記一般式（Ｉ）、（Ａ）、（Ｂ）中のＲ1〜Ｒ5、Ｒ25〜Ｒ30及びＸ1-は、前記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）におけるＲ1〜Ｒ5、Ｒ25〜Ｒ30及びＸ1-の場合と同義である。
【０１１８】
色素化工程は公知の方法により容易に行うことができる。例えば、Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ，６９，２３７−２３９貢（１９４９年）、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６巻，１３６−１３９貢（１９６８年）、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３７−３８貢（１９７６年）等）を参照することができる。具体的なカップリング方法としては、特に制限はないが、例えば、下記に示す方法が一態様として挙げられる。
【０１１９】
即ち、アルデヒド誘導体（Ａ）と化合物（Ｂ）とをカップリングさせて、化合物（Ｉ）を得る。
【０１２０】
化合物（Ｂ）の使用量は、アルデヒド誘導体（Ａ）１モルに対し、０．１〜１０倍モル、好ましくは０．５〜３倍モル、より好ましくは０．８〜２倍モルである。
【０１２１】
本工程は無溶媒で行う事も可能であるが、溶媒の存在下で行う事が好ましい。溶媒としては、反応に関与しないものであれば特に限定されるものではないが、例えば、以下のものが挙げられる。酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、クロロベンゼンメシチレン等の芳香族系溶媒、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、ｉｓｏ−プロピルアルコール、ブチルアルコール、ジエチレングリコール等のアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、水、酢酸等。好ましくは、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、ｉｓｏ−プロピルアルコール、ブチルアルコール、ジエチレングリコール等のアルコール系溶媒、水、酢酸等であり、より好ましくはエタノール、ｉｓｏ−プロピルアルコール、ジエチレングリコール、酢酸等である。又、２種以上の溶媒を混合して用いる事ができ、混合使用の際の混合比は任意に定める事が出来る。
【０１２２】
本工程の反応溶媒の使用量は、アルデヒド誘導体（Ａ）に対し、０．１〜１０００倍重量の範囲で用いられ、好ましくは０．５〜５００倍重量、より好ましくは１．０〜１５０倍重量である。
【０１２３】
本工程の反応温度は、−８０〜２５０℃の範囲で行われ、好ましくは−２０〜２００℃、より好ましくは−５〜１５０℃である。通常反応は２４時間以内に完結する。
【０１２４】
本工程では、必要に応じて酸又は塩基の添加を行うと反応が速やかに進行する。用いる酸は反応に直接関与しないものであれば制限されないが、例えば、以下のものが挙げられる。塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸；ｐ−トルエンスルホン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸；アンバーライト（ローム・アンド・ハース株式会社）、アンバーリスト（ローム・アンド・ハース株式会社）等の強酸性イオン交換樹脂；ギ酸アンモニウム、又は酢酸アンモニウム等の無機酸塩等。より好ましくは、ギ酸アンモニウム、又は酢酸アンモニウム等の無機酸塩であり、より好ましくは、酢酸アンモニウムである。酸の使用量は、アルデヒド誘導体（Ａ）１モルに対し、０．００１〜５０倍モル、好ましくは０．０１〜１０倍モル、より好ましくは０．１〜５倍モルである。
【０１２５】
本工程で用いる塩基としては、具体的には、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド等の金属アルコキシド；ピペリジン、ピリジン、２−メチルピリジン、ジメチルアミノピリジン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルエチルアミン、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、１、８−ジアザビシクロ［５、４、０］ウンデカ−７−エン（以下、ＤＢＵと略記する）、酢酸アンモニウム等の有機塩基；ｎ−ブチルリチウム、ｔｅｒｔ−マグネシウムクロリド等の有機塩基；水素化ホウ素ナトリウム、金属ナトリウム、水素化ナトリウム、炭酸ナトリウム等の無機塩基等が用いられる。好ましくは、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ピペリジン、ジメチルアミノピリジン、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム等であり、より好ましくは、ナトリウムメトキシド、ピペリジン、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム等が挙げられる。上記塩基の使用量は、アルデヒド誘導体（Ａ）１モルに対し、０．１〜２０倍モル、好ましくは０．５〜８倍モル、より好ましくは１．０〜４倍モルである。
【０１２６】
反応終了後、水で希釈するか或いは塩酸等による酸析を行う事によって化合物（Ｉ）を得る事ができる。
【０１２７】
得られた化合物（Ｉ）は、通常の有機化合物の単離・精製方法を用いる事ができる。例えば、反応液を塩酸等で酸性にして、酸析する事によって固体をろ別し、水酸化ナトリウム等で中和し、濃縮すれば、粗成物が得られる。更に、粗成物をアセトン、メタノール等を用いた再結晶、シリカゲルを用いたカラム精製等により精製する。これらの方法は、単独又は２つ以上組み合わせて精製を行う事により高純度で得る事が可能である。
【０１２８】
次に、本発明の前記一般式（ＩＩ）で表される構造を有する化合物の製造方法について以下に説明する。
【０１２９】
本発明にかかる一般式（ＩＩ）で表わされる化合物は、公知の方法に従って合成することができる。以下に合成スキームの一例を示す。
【０１３０】
【化８】
2010169677.tif 000009
【０１３１】
上記一般式（ＩＩ）、（Ｖ）〜（ＶＩＩＩ）中のＲ11〜Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bは、前記一般式（ＩＩ）におけるＲ11〜Ｒ16、Ｒ17A、及びＲ17Bの場合と同義である。
【０１３２】
色素化工程は公知の方法（例えば、特開２００８‐９４８９７号等）により容易に行う事ができる。即ち、縮合（１）工程と、縮合（２）工程とによって、本発明の化合物（ＩＩ）を合成する事が出来る。
【０１３３】
先ず、縮合（１）工程では、化合物（Ｖ）と化合物（ＶＩ）とを、有機溶剤中（又は溶剤の非存在下）、縮合剤の存在下（又は縮合剤の非存在下）で加熱し縮合させ化合物（ＶＩＩ）を得る。次に、化合物（ＶＩＩ）を、上記に示した化合物（ＶＩＩＩ）と再び加熱縮合させる。この結果、本発明にかかる化合物（ＩＩ）が得られる。
【０１３４】
上記に例示した合成スキームの縮合反応において使用することができる好ましい有機溶剤としては反応に関与しなければ、特に制限はないが、以下のものを挙げる。縮合（１）工程では、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール及びｎ−ブタノール等を、単独で、若しくは混合して使用することができる。縮合（２）工程では、例えば、エチレングリコール、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン及びニトロベンゼン等が挙げられる。
【０１３５】
縮合（１）工程における反応温度は、０℃〜２００℃の範囲内で行われ、好ましくは、１０〜１５０℃、より好ましくは、２０℃〜１００℃の範囲内であることが好ましい。又、縮合（２）工程における反応温度は、５０〜２５０℃の範囲内で行われ、好ましくは、１００〜２３０℃、より好ましくは１５０℃〜２２０℃である。
【０１３６】
前記一般式（ＩＩ）中におけるＲ14とＲ15とが同一の置換基であって、且つ、Ｒ16とＲ17とが同一の置換基である化合物の場合には、前記スキーム中の化合物（ＶＩ）と（ＶＩＩＩ）とは同一のものである。そのため、化合物（Ｖ）より一段階の縮合工程で一般式（ＩＩ）の化合物を得ることができる。その際における反応温度は、縮合（２）工程に準ずる。
【０１３７】
縮合工程で用いられる縮合剤としては、反応に関与しなければ、特に制限はされないが、例えば、酸化マグネシウム、塩化亜鉛及び塩化アルミニウム等から選択して用いることができる。
得られた化合物（ＩＩ）は、通常の有機化合物の単離・精製方法を用いる事ができる。例えば、反応液を塩酸等で酸性にして、酸析する事によって固体をろ別し、水酸化ナトリウム等で中和し、濃縮すれば、粗成物が得られる。更に、粗成物をアセトン、メタノール等を用いた再結晶、シリカゲルを用いたカラム精製等により精製する。これらの方法は、単独又は２つ以上組み合わせて精製を行う事により高純度で得る事が可能である。
【０１３８】
以下に、本発明の具体例（１）〜（７０）を示すが、下記例に限定されるものではない。
【０１３９】
【化９−１】
2010169677.tif 000010
【０１４０】
【化９−２】
2010169677.tif 000011
【０１４１】
【化９−３】
2010169677.tif 000012
【０１４２】
【化９−４】
2010169677.tif 000013
【０１４３】
本発明の有毛細胞染色（標識）液は、本発明の有毛細胞標識剤を、適当な溶媒に溶解させて調製される。溶媒は、生体に影響がなければ、特に限定されるものではないが、生体との親和性が高い水性の液体が好ましい。例えば、水；生理食塩水；リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ等の緩衝液；エタノール、エチレングリコール、グリセリン等のアルコール系溶媒；Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと略する）等の有機溶媒；Ｄ−ＭＥＭ、ＨＢＳＳ等の細胞培養用培地、乳酸リンゲル液等の輸液が挙げられる。特に水が５０％以上含まれている事が好ましい。又、これらの溶媒を２種以上混合して用いる事も出来る。
【０１４４】
有毛細胞染色（標識）液には、保湿剤、表面張力調製剤、又は増粘剤等の少なくともいずれかを添加する事が好ましい。生体に適した塩濃度、ｐＨを制御する事が必要であれば、塩化ナトリウムのような塩類、各種ｐＨ調製剤、防腐剤、抗菌剤、甘味剤、又は香料等を適宜に添加する事も出来る。
【０１４５】
ｐＨ調製剤としては、特に限定されるものではないが、ｐＨを５〜９に調製する事が好ましく、例えば、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、水酸化ナトリウム、または炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【０１４６】
有毛細胞の標識方法は、有毛細胞標識剤の有効成分である一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物と生物試料とを接触させる工程を有するものである。
【０１４７】
本発明の有毛細胞標識剤で染色される生物としては有毛細胞を有するものであれば特に制限されないが、トラフグ、メダカ、ゼブラフィッシュ等の小型硬骨魚類、ラットやマウス等の小動物、サル、ブタ、イヌ等の大動物、サル、ヒト等が挙げられる。さらに、生物個体以外に、前記生物由来の組織、組織切片、前記生物由来の培養細胞等が挙げられる。
【０１４８】
本発明の有毛細胞標識剤の形態は、特に限定されるものではないが、液体、顆粒、錠剤、カプセル剤、貼り薬等の形態で使用する事ができる。
【０１４９】
聴覚器官に存在する有毛細胞を染色するには、有毛細胞標識剤を投与経路は特に限定されるものではないが、経口的、又は非経口的に投与する事が出来る。全身投与でも良いが、染色性の効果を高めるためには局所投与が好ましい。
【０１５０】
局所投与の場合、有毛細胞標識剤は有毛細胞を有する組織（内耳）に直接投与又は、外耳道及び中耳を経由して投与する事が出来る。又、内リンパ嚢、内リンパ管、耳嚢を通して投与しても良い。具体的には以下のとおりである。有毛細胞標識剤の生体への暴露（液体等）、あるいは静脈又は動脈等の血管内、経口内、舌下、直腸内、腹膣内、皮膚、皮下、皮内、膀胱内、気管（気管支）、眼、鼻、耳内等への注射やカテーテルを介しての注入、噴霧、又は塗布等の方法による生体内への投与。更に、米国特許第５，４７６，４４６号や米国特許第５，３５０，５８０号等に記載されているような装置を用いる事も出来る。
【０１５１】
有毛細胞標識剤の投与量は、最終的に標的とする部位を検出できる量であれば特に限定されるものではないが、標的とする部位や使用する標識剤の種類によって適宜増減出来る。特に生物個体に投与する場合には、可能な限り少量が好ましい。又、組織や細胞に暴露する場合には、組織染色（標識）の選択性があり、判別しやすい量を用いればよい。
【０１５２】
有毛細胞標識剤の濃度は、通常、０．００１ｎＭ及至１０００μＭで用いられ、好ましくは０．０１ｎＭ及至１００μＭの範囲で用いられる。
【０１５３】
動物用の場合には、その投与形態、投与経路、投与量は対象となる動物の体重や状態によって適宜選択する。
【０１５４】
本発明の聴覚機能評価方法は、本発明の有毛細胞標識剤の有効成分である一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物によって生物の有毛細胞を染色した後にその染色状態を観察、検出または測定することを特徴とする。本発明の聴覚機能評価方法における観察、測定及び検出方法は当業者には公知の方法を用いて行われる。
【０１５５】
本発明で用いられる染色状態の観察方法は、生物と有毛細胞標識剤の化合物に影響を与えなければ特に限定されるものではないが、生物の状態及び変化を画像として捉える方法である。例えば、生物に可視光、近赤外光、または赤外光を照射してカメラやＣＣＤ等で観察する赤外光観察、レーザー顕微鏡観察。又は蛍光内視鏡等のように生物試料に対して励起光光源から励起光を照射して、生物の蛍光を観察する蛍光観察、蛍光顕微鏡観察、蛍光内視鏡観察、共焦点内視鏡観察、多光子励起蛍光顕微鏡観察、狭帯域光観察、又は共光干渉断層画像観察（ＯＣＴ）。更に、軟エックス線顕微鏡による観察等が挙げられる。
【０１５６】
本発明の有毛細胞標識剤は、放射性核種で標識されていてもよい。
【０１５７】
放射性核種で標識した有毛細胞標識剤は、オートラジオグラフィー、陽電子放射断層法（ＰＥＴ）又はコンピュータ断層画像投影法（ＳＰＥＣＴ）による画像化を行うことが出来る。又、フッ素原子核に由来するＭＲ信号や13Ｃを利用した核磁気共鳴法（ＭＲＩ）で検出してもよい。更に、次世代分子イメージング装置として複数分子同時イメージングが可能なコンプトンカメラ（ＧＲＥＩ）を用いて画像化する事が出来る。これらの方法により、非侵襲的に有毛細胞の分布状態を経時的に測定し、画像化することが出来る。また、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて生物試料用標識剤の定量をする事も可能である。
【０１５８】
また、14Ｃ等の放射性同位元素で標識した有毛細胞標識剤は、加速器質量分析法（ＡＭＳ）等によって、血液中（または、尿中もしくは糞中）の濃度を測定して、次のような試験結果を得ることが可能である。標識化した物質の未変化体や代謝物の薬物動態学的情報（薬物血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）、血中濃度半減期（Ｔ1/2）、最高血中濃度（Ｃmax）、最高血中濃度到達時間（Ｔmax）、分布容積、初回通過効果、生物学的利用率、糞尿中排泄率等。
【０１５９】
放射性核種としては、特に限定されるものではないが、使用の態様によって適宜選択する事が出来る。
【０１６０】
具体的に、ＰＥＴによる測定の場合は、例えば、11Ｃ、14Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、18Ｆ、19Ｆ、62Ｃｕ、68Ｇａ、又は78Ｂｒ等の陽電子放出核種を用いる事が出来る。好ましくは、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、又は18Ｆ等であり、特に好ましくは、11Ｃ、又は18Ｆ等である。又、ＳＰＥＣＴによる測定の場合は、例えば、99mＴｃ、111Ｉｎ、67Ｇａ、201Ｔｌ、123Ｉ、又は133Ｘｅ等のγ線放射核種を用いる事が出来る。好ましくは、99mＴｃ、又は123Ｉ等である。更に、ヒト以外の動物を測定する場合には、例えば、125Ｉのようなより半減期の長い放射線核種を用いる事が出来る。ＧＲＥＩによる測定の場合は、例えば、131Ｉ、85Ｓｒ、65Ｚｎ等を用いる事が出来る。
【０１６１】
放射線核種は一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表わされる化合物に含まれる形でも、結合する形でもよい。放射線核種による標識の方法は、特に限定されるものではないが、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表わされる化合物を構成する元素の少なくとも一部を放射性核種で置換する形でも、結合する形でも良い。
【０１６２】
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表わされる化合物を放射性核種で標識した場合、１ｍＭあたり、１〜１００ｕＣｉ程度の放射性を有することが好ましい。
【０１６３】
この時、用いる有毛細胞標識剤の投与量は、影響がなければ特に制限はされず、化合物の種類及び標識に用いた放射性核種の種類により適宜選択される。
【０１６４】
例えば成人の場合、用いる有毛細胞標識剤の量は１日当たり、０．０００１μｇ〜１０００μｇであり、好ましくは、０．０１μｇ〜１０μｇである。
【０１６５】
本発明で用いられる励起光の波長は、生物と有毛細胞標識剤に影響を与えなければ特に限定されるものではないが、使用する標識剤によって異なり、本発明の標識剤が効率よく蛍光を発すれば特に限定されるものではない。通常、２００〜１０１０ｎｍ、好ましくは４００〜９００ｎｍ、より好ましくは、４８０〜８００ｎｍである。近赤外領域の光を用いる場合は、通常６００〜１０００ｎｍで、好ましくは、生体透過性に優れている６８０〜８００ｎｍの波長が用いられる。
【０１６６】
本発明で用いられる蛍光励起光源としては、生物と有毛細胞標識剤に影響を与えなければ特に限定されるものではないが、各種レーザー光源を用いることが出来る。例えば、色素レーザー、半導体レーザー、イオンレーザー、近赤外パルスレーザー、ファイバーレーザー、ハロゲンランプ、キセノンランプ、又はタングステンランプ等が挙げられる。又、各種光学フィルターを用いて、好ましい励起波長を得たり、蛍光のみを検出したりする事が出来る。
【０１６７】
このように生物に励起光を照射する事により生物個体の内部において発光させた状態で生物個体を撮像すれば発光部位を容易に検出する事が出来る。又、可視光を照射して得られた明視野画像と励起光を照射して得られた蛍光画像を画像処理手段で組み合わせる事で、より詳細に生物個体を観察する事も出来る。
【０１６８】
本発明の有毛細胞標識剤の有効成分である一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、ストークスシフトが大きいものが多数存在するため、明瞭に有毛細胞を識別する事が可能である。本発明で言うストークスシフトとは励起極大波長と蛍光極大波長の差を表わすものとする。一般的に、ストークシフトが小さいと、励起光やその散乱光による測定誤差を生じやすい。
【０１６９】
次に、本発明の有毛細胞標識剤を用いて、化学物質の聴覚毒性を評価する方法について以下に詳細に説明する。以下の工程を含むことによって化学物質の聴覚毒性を評価すること（スクリーニング法）が出来る。即ち、生物に化学物質を投与する工程、該生物と有毛細胞標識剤の有効成分である一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を接触させる工程、及び該生物に励起光を照射し、該化合物に由来する蛍光を観察する工程。
【０１７０】
まず、生物に化学物質を投与する工程について説明する。
【０１７１】
本工程で用いられる生物は、特に制限されるものではないが、例えば、ゼブラフィッシュのような小型硬骨魚類を用いると、様々な化学物質の聴覚毒性をハイスループットによって評価する事が可能である。
【０１７２】
ゼブラフィッシュは、米国及び英国では、近年、既にマウス及びラットに続く第３のモデル動物として認知されている生物である。ゼブラフィッシュの各パーツ（心臓、肝臓、腎臓、消化管等の臓器・器官）が受精卵から分化して形成されていく過程が透明な体を通して観察できるのが特徴であるため、光学的観察が容易である。またヒトと比較して全ゲノム配列が８０％の相同性、遺伝子数もほぼ同じ、主要臓器・組織の発生・構造も良く似ている事が解明されてきている。そのため、ゼブラフィッシュをモデル動物としてスクリーニングされた化学物質の聴覚毒性はヒトに対して適用できる可能性が高い。更に、マウス等の脊椎動物では、感覚有毛細胞は側頭骨部分の奥深くに位置するため、解剖学的に扱いにくく、これらを観察したり、実験で操作を加えたりする事が困難である。それに対して、ゼブラフィッシュは、内耳の感覚有毛細胞は、産卵後の卵の発生段階でもはっきりと観察可能であり、又、側線器という皮膚表面にある器官の中にも感覚有毛細胞があるため、容易に有毛細胞を観察したり、操作したりする事が可能である。側線器は水の動きを感知する働きをしており、その起源は内耳と共通であるとされている事からもモデル動物としてのスクリーニングに相応しい。
【０１７３】
本発明の化学物質の聴覚毒性評価方法によって評価される化学物質とは、生物学的に作用のある可能性のある物質の総称を意味し、特に限定されるものではない。例えば、医薬品、有機化合物、治療剤、治験薬、農薬、化粧品、環境汚染物質、又は内分泌攪乱物質等が挙げられる。
【０１７４】
前記化学物質をゼブラフィッシュに投与する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法が挙げられる。化学物質が水溶性の場合は、飼育水中に化学物質を共存させる方法、非水溶性の場合は、飼育水中に化学物質を単独で分散させて共存させる方法等。さらに微量の界面活性剤やＤＭＳＯを共存させる方法、ゼブラフィッシュの餌に混ぜて経口投与する方法、又は、注射等によって非経口投与する方法等。好ましくは、容易に出来る飼育水中に化学物質を共存させる方法が挙げられる。
【０１７５】
次に生物と有毛細胞標識剤の有効成分である一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を接触させる工程について説明する。
【０１７６】
ゼブラフィッシュに化学物質を投与した後、必要であれば暴露させている化学物質を除き、本発明の有毛細胞標識剤の１種類以上を利用して、ゼブラフィッシュの有毛細胞を染色させる。
本工程において、有毛細胞標識剤をゼブラフィッシュに投与する方法としては、特に限定されるものではないが、有毛細胞標識剤が水溶性の場合は、飼育水中に化学物質を共存させる方法、非水溶性の場合は、飼育水中に化学物質を単独で分散させて共存させる方法、または微量の界面活性剤やＤＭＳＯを共存させる方法、ゼブラフィッシュの餌に混ぜて経口投与する方法、又は、注射等によって非経口投与する方法が挙げられる。好ましくは、容易に出来る飼育水中に有毛細胞標識剤を共存させる方法が挙げられる。
【０１７７】
有毛細胞標識剤の投与量は、最終的に標的とする部位を検出できる量であれば特に限定されるものではないが、標的とする部位や使用する標識剤の種類によって適宜増減出来る。特に生物個体に投与する場合には、可能な限り少量が好ましい。又、組織や細胞に暴露する場合には、組織染色の選択性があり、判別しやすい量を用いればよい。
【０１７８】
次に生物に励起光を照射し、標識剤の化合物に由来する蛍光を観察する工程について説明する。
【０１７９】
本工程で用いられる励起光の波長は、生物と有毛細胞標識剤に影響を与えなければ特に限定されるものではないが、使用する標識剤によって異なり、本発明の標識剤が効率よく蛍光を発すれば特に限定されるものではない。通常、２００ｎｍ〜１０１０ｎｍ、好ましくは４００ｎｍ〜９００ｎｍ、より好ましくは、４８０ｎｍ〜８００ｎｍである。近赤外領域の光を用いる場合は、通常６００ｎｍ〜１０００ｎｍで、好ましくは、生体透過性に優れている６８０ｎｍ〜８００ｎｍの波長が用いられる。
【０１８０】
本工程で用いられる蛍光励起光源としては、生物と有毛細胞標識剤に影響を与えなければ特に限定されるものではないが、各種レーザー光源を用いることが出来る。例えば、色素レーザー、半導体レーザー、イオンレーザー、ファイバーレーザー、ハロゲンランプ、キセノンランプ、又はタングステンランプ等が挙げられる。又、各種光学フィルターを用いて、好ましい励起波長を得たり、蛍光のみを検出したりする事が出来る。
【０１８１】
このようにゼブラフィッシュに励起光を照射する事によりゼブラフィッシュの有毛細胞において化合物を発光させた状態で染色状態を観察、検出又は測定する事によって、ゼブラフィッシュの聴覚機能を評価する。この結果に基づいて試験に供した化学物質の聴覚毒性をスクリーニングする事が可能となる。
【０１８２】
ゼブラフィッシュの体表には側線器官（Ｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｎｅ  ｏｒｇａｎｓ）と呼ばれる特殊な機械受容器が多数存在し、全体として側線系をなしている。この系に属する個々の末端器が感丘（ｎｅｕｒｏｍａｓｔ）となって、特定の脳神経から分枝を受けている。感丘とこれに分布する神経は、発生学的には胚の外胚葉の肥厚によって生ずるプラコード（ｐｌａｃｏｄｅｓ）に由来している。プラコードはおよそ１２０個の細胞からなり、受精後２０時間から４０時間の間に頭部から尾部に向かって移動する原基から分化する。原基の移動経路に沿って７〜９個のｐｒｏｎｅｕｒｏｍａｓｔｓと、それらをつないでいるｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｍａｓｔ細胞が残される。その後、第２のより小さな原基が、同じ経路に沿って移動し、移動経路上に２つまたは３つのｐｒｏｎｅｕｒｏｍａｓｔｓを残していく。後部側線の感丘は、頭部から尾部に向かって、徐々に成熟し、発生５日目までには、９から１１の感丘には、機能的な有毛細胞が含まれる。そのシステムはその後、さらなる感丘の発達と、既存のクラスターの成長と伸長を通して、複雑になっていく。
【０１８３】
本発明の有毛細胞標識剤を用いると、従来報告されているゼブラフィッシュの感丘（大きいサイズ）に加えて、これまで可視化されていなかった体表面の微小器官（小さいサイズの感丘）を染色し、様々なパターンで染色し、識別することが可能となる。
【０１８４】
前記感丘の染め分けは、例えば、発生過程における有毛細胞障害形式の差異に対する化学物質の毒性評価、あるいは、有毛細胞の前駆細胞に対する化学物質の聴覚毒性評価等に利用できる。本発明の化学物質の聴覚毒性を評価する方法（スクリーニング方法）ではゼブラフィッシュを好適に用いることができる。ゼブラフィッシュは飼育及び繁殖が容易で流通価格も安く、受精後４８〜７２時間で主要臓器・組織の基本構造が出来上がるため、マウス及びラット等と比較して、スピード面・コスト面で非常に優れている。
【０１８５】
ゼブラフィッシュは、スクリーニングの目的に応じて野生型ゼブラフィッシュに制限されず、各種疾患系モデルのゼブラフィッシュを用いる事が出来る。聴覚疾患系のモデルを用いた場合には、本発明による有毛細胞標識剤を指標に用いて、有毛細胞を観察により新薬候補化合物の効果及び毒性を見出すスクリーニングに応用する事が出来る。聴覚疾患系のモデルとしては、特に制限はされないが、例えば、薬物性難聴モデル、遺伝性難聴モデルなどのゼブラフィッシュモデルが挙げられる。
【０１８６】
マウス等の脊椎動物では、感覚有毛細胞は側頭骨部分の奥深くに位置するため、解剖学的に扱いにくく、有毛細胞を観察したり、実験で操作を加えたりする事が比較的困難である。ヒトを含め、脊椎動物の感覚有毛細胞を視覚化するためには、本発明の有毛細胞標識剤の中でも、近赤外領域に蛍光を発するものや放射性核種で標識したものが特に好ましい。近赤外領域に蛍光を発するものは、近赤外光はその領域の水やヘモグロビン吸収がないために生体組織を容易に透過し、厚さ１０〜２０ｃｍまでを検査診断出来るからである。又、放射性核種で標識したものは、ＰＥＴ、ＰＥＴ−ＣＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ等を用いて非侵襲的に有毛細胞の状態を画像化することが出来るからである。
【０１８７】
本発明の有毛細胞標識剤は、聴覚機能の診断薬として用いることができる。また、本発明の有毛細胞標識剤の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を有効成分として含む聴覚機能診断用組成物を提供することができる。有毛細胞は障害を受けると回復する事が難しく、又、ヒトでは有毛細胞の数が減ってしまうとその数を増やす事は極めて困難であるといわれている。そのためにも、疾患を早期診断により見つける必要がある。
【０１８８】
聴覚機能としては、特に限定されるものではないが、例えば、末梢感音性聴覚障害（聴力低下、難聴）、耳鳴り、眩暈、耳閉寒感、平行感覚喪失等が挙げられる。難聴としては、特に制限されるものではないが、例えば、以下のものを挙げることができる。老人性難聴、感音性難聴、伝導性難聴、突発性難聴、騒音性難聴、音響外傷性難聴、又、メニエール病、遅発性内リンパ水腫、外リンパ漏、薬物性難聴、ウイルス性内耳炎、聴神経腫瘍、機能性難聴等の急性難聴等。これらの聴覚機能疾患の高精度な診断や治療法は、有毛細胞の染色性から診断する等の応用展開が期待される。又、遺伝子治療やＥＳ細胞・ｉＰＳ細胞等によって有毛細胞再生を試みる際に、有毛細胞の染色性から、有毛細胞の追跡診断に応用展開が期待される。
【０１８９】
本発明の有毛細胞標識剤は、生物試料から取り出した組織や細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）に対する染色性のスクリーニングに用いる事が出来る。更に、有毛細胞標識剤の染色性から、病気の高精度な診断や治療法の開発等の応用展開が期待される。例えば、穿刺型細胞診器具等を用いて、標的とする組織や細胞の一部を極微量吸引採取し、本発明の有毛細胞標識剤を用いて染色し、細胞の形態、種類、良性悪性等の鑑別を行う細胞診断に用いる事が期待される。
【０１９０】
また、ｉｎ  ｖｉｖｏでの有毛細胞標識信号の取得およびこれに基づいた聴覚機能の診断は例えば、次のようにして行うことができる。外耳道から切開された鼓膜経由または上咽頭からユスタキー管経由で鼓室に光ファイバーを導入し、該光ファイバーを介した庭窓部分または蝸牛部分若しくは半規管部分へ励起光を照射して蛍光を取得する。ヒトの内耳は解剖学的に頭蓋骨の窪みに位置するため、鼓室からの光照射においては骨による光の遮蔽を懸念する必要がない。また鼓室は通常気体で満たされているため、液体による近赤外光の吸収も庭窓部分または蝸牛部分若しくは半規管部分を満たしているリンパ液による最小限の吸収で済む。通常用いられる強度の近赤外光は、生体に対して１０〜２０ｃｍまでの透過能を有するため、近赤外域に吸収または蛍光を持つ有毛細胞標識剤は、本発明の聴覚機能診断薬の構成成分として好適に用いることができる。この点、従来知られたＤＡＳＰＥＩやＦＭ１−４３といった有毛細胞標識剤は近赤外域に吸収・蛍光を持たない。
【０１９１】
本発明の有毛細胞標識剤を用いた聴覚機能の画像診断は、従来の生理学的機能検査を補完し得る。聴力の生理学的機能検査としては純音の気導および骨導の閾値，語音聴取閾値，語音弁別能；ティンパノメトリ；および反射減衰検査を含む耳小骨筋反射検査（アブミ骨筋反射検査）などがあり、これらの検査は難聴の鑑別に用いられている。本発明の聴覚機能診断用組成物を用いた画像を組み合わせることにより、患者の主観に頼りがちな生理学的機能検査を補完し得る客観的な診断情報を利用することが可能になる。また、本発明の有毛細胞標識剤と、前記光ファイバーなどの光信号検出手段とを組み合わせた聴覚機能診断システムが提供される。聴覚機能診断システムは、更に取得した光信号の画像化および解析する手段を備えることができる。
【０１９２】
本発明の有毛細胞標識剤には、有毛細胞の細胞体部分のみならず軸索部分も染色するものが含まれる。難聴の原因の一つとして聴覚神経細胞の軸索部分の脱髄が知られており、本発明の有毛細胞のイメージング方法に基づき有毛細胞の細胞体部分の染色性および軸索部分の染色性を評価することによって、難聴のタイプを鑑別することが可能になる。
【０１９３】
慢性中耳炎による耳漏や難聴を改善する目的で、鼓室形成術といわれる治療が行われることがある。また腫瘍の摘出や感染症の治療の目的で、内耳形成術といわれる治療が行われることがある。これらの術式では、耳の後ろの付け根の皮膚を切開し、骨を削って骨の中の炎症を取り除いたり、鼓膜や骨を修復したりする。これら術式のリスクとして、めまい、耳鳴、難聴などの内耳症状が挙げられるが、この術中において、本発明の聴覚機能診断用組成物を用いて、聴覚機能の保存度をモニターすれば、術中画像診断が可能になり、より安全な手術を行うことが可能になる。
【０１９４】
特に、コミュニケーションをとることが困難な乳幼児や痴呆老人、動物等の場合には、聴覚検査の一手段として摘出され培養された有毛細胞を用いたｅｘ  ｖｉｖｏでの染色性に基づく聴覚機能の検査試薬として用いることが期待される。
【０１９５】
本発明の聴覚機能診断用組成物は、本発明の有毛細胞標識剤の有効成分として含まれる一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする。特に限定されるものではないが、例えば、本発明の有毛細胞標識剤で標識された診断用物質を用いたり、該診断用物質を含んだ診断用薬剤として用いたり応用する事も可能である。また、放射線核種で標識された有毛細胞標識剤を含む診断用薬剤を用いれば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、又はＭＲＩ等で容易に有毛細胞のイメージングが可能である。
【０１９６】
本発明の難聴疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、難聴疾患モデル動物に被験物質を投与する工程、該モデル動物に聴覚機能診断用組成物を投与する工程、及び該モデル動物の有毛細胞に対する該聴覚機能診断用組成物の染色状態を調べる工程を含む。難聴疾患モデル動物としては、聴覚毒性を有する薬剤によって聴覚障害を与えられた動物や、アンチセンス核酸の投与により聴覚関連遺伝子をノックダウンされた動物、遺伝子工学的手法により聴覚関連遺伝子をノックアウトされた動物などが挙げられる。具体的には以下に挙げるヒトの遺伝性難聴に関わる難聴遺伝子および相同な遺伝子に変異を加えた動物が揚げられる。特にゼブラフィッシュは既にそのゲノムが解読されており、また前述の優位性を有するため、その遺伝子改変体は難聴疾患モデル動物として好適に用いることができる。難聴遺伝子としてはコネキシン等のイオン輸送に関連する遺伝子、テクトリンや１１型コラーゲンα２ドメイン等の、蓋膜の構成と細胞外マトリックスに関連した遺伝子、７型ミオシンや１５型ミオシン等の有毛細胞の安定性に関連した遺伝子、ＰＯＵドメインクラス３のファクター４やファクター３等の細胞の分化、移動などに関連した遺伝子、１２ＳｒＲＮＡのＡ１５５５Ｇ変異等のミトコンドリア遺伝子、ＣＯＣＨ遺伝子等。
【実施例】
【０１９７】
以下に実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明のより一層の深い理解のために示される具体例であって、本発明は、これらの具体例に何ら限定されるものではない。なお、特に表示していない限りは「％」は質量基準である。
【０１９８】
（実施例１）
［有毛細胞標識剤による染色］
化合物（１）をＤＭＳＯに溶解し、濃度１ｍｇ／ｍＬになるように調製し、ストックソリューションとした。このストックソリューションを蒸留水で希釈し、色素濃度１μｇ／ｍＬの有毛細胞染色液１を調製した。又、人工海水シーライフ（マリンテック社製）を６０ｍｇ／Ｌで蒸留水に溶解して、Ｅｇｇ  Ｗａｔｅｒを調整した。２４穴マルチウエルプレートの任意の１箇所に５匹のゼブラフィッシュの稚魚（受精後７日胚）を飼育水ごと入れた。飼育水を廃棄し、有毛細胞染色液１を１ｍＬ加えた。１時間放置した後、ウエル中の有毛細胞染色液１を廃棄し、新鮮なＥｇｇ  Ｗａｔｅｒ１ｍＬで置換した。更に、Ｅｇｇ  Ｗａｔｅｒを廃棄し、新鮮なＥｇｇ  Ｗａｔｅｒ  １ｍＬで置換する事を２回繰り返した。ウエルから稚魚をシャーレ上に１匹取り出し、メチルセルロースを加え稚魚の動きを制限し、実体蛍光顕微鏡で蛍光画像を撮影した。実体顕微鏡はライカマイクロシステムズ社製ＭＺ１６ＦＡを使用した。
【０１９９】
（実施例２〜３３）
実施例１において使用した化合物（１）を表１に記載した化合物に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行った。実体蛍光顕微鏡の撮像ユニット（オリンパス社製 顕微鏡用デジタルカメラ ＤＰ７２）のＩＲカットフィルターを取り外すことにより、近赤外波長域の蛍光画像を取得できるように改造した。励起・蛍光波長が近赤外域にある化合物を用いる際には、この撮像ユニットを備えた実体蛍光顕微鏡を用い、実施例１と同様の操作を行った。
（比較例１）
実施例１において用いた化合物（１）を（２−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｓｔｙｒｙｌ）−Ｎ−ｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）（ＤＡＳＰＥＩ）に変更し、色素濃度を２５０μｇ／ｍＬとした以外は、実施例１と同様の操作を行った。
（比較例２）
実施例１において使用した化合物（１）を、ＦＭ１−４３に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行った。
（比較例３）
実施例１において使用した化合物（１）を、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）に変更し、色素濃度を２５０μｇ／ｍＬとした以外は、実施例１と同様の操作を行った。
［蛍光強度の評価］
前記実施例１〜３３、前記比較例１〜３を蛍光観察画像からそれぞれ、有毛細胞の蛍光強度を目視による評価（+++：強度に観測される、++：中度に観測される、+：弱度に観測される、染色しない）を行った。なお、化合物の励起波長および蛍光波長は、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ溶液を精製水に５００倍希釈した水溶液を日立ハイテク社製ＦＬ４５００蛍光分光測定機で測定して求めた。
【０２００】
［染色パターンの評価］
前記実施例１〜３３、前記比較例１〜３を蛍光観察画像からそれぞれ、有毛細胞の染色性について目視による評価を行った。評価の基準は、Ｂ：大きいサイズの感丘が主に染色されるもの、Ｓ：小さいサイズの感丘が主に染色されるもの、ＢＳ：大きいサイズと小さいサイズの両方の感丘が染色されるもの、として評価した。
【０２０１】
【表１】
2010169677.tif 000014
【０２０２】
表１から明らかなように、本発明の有毛細胞標識剤は、励起波長／蛍光波長の多様性に富み、側線器官中に存在する感丘を様々なパターンで、蛍光強度も強く、明瞭に染色する事は明らかである。具体的に以下の図１〜図３を比較した。実施例１０の化合物（２５）を含む有毛細胞標識剤で染色した画像（図１）、実施例２１の化合物（５０）を含む有毛細胞標識剤で染色した画像（図２）、実施例２３の化合物（５３）を含む有毛細胞標識剤で染色した画像（図３）。図１〜図３を比較した場合、いずれもゼブラフィッシュの有毛細胞を含む感丘を染色しているが、染色される感丘のパターンには大きな違いが確認される。即ち、化合物（２５）を用いた場合は、感丘のサイズが小さい部分が選択的に染色される。又、化合物（５０）を用いた場合は、感丘のサイズが大きい部分が選択的に染色される。一方、化合物（５３）を用いた場合は、感丘のサイズが大きい部分と小さい部分の両方が同時に染色される。
【０２０３】
（実施例３４）
ゲンタマイシン等のアミノグリコシド系抗生物質や、シスプラチン等の抗がん剤にはヒトに対する聴覚毒性が指摘されている。このような聴覚毒性の疑いのある化学物質を、ヒトモデル生物に暴露し、本発明の有毛細胞標識剤による有毛細胞の染色性の変化を検出することで、化学物質の聴覚毒性を評価することが可能になる。
【０２０４】
本実施例では、ヒトモデル生物としてゼブラフィッシュを選択し、ゲンタマイシンの聴覚毒性を、本発明の有毛細胞標識剤を用いて、次の様にして評価した。５μＭの濃度のゲンタマイシン溶液を受精後７日目のゼブラフィッシュに２４時間暴露した。曝露後のゼブラフィッシュを蒸留水で洗浄した。実施例１において使用した化合物（１）を化合物（５４）に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行った。
【０２０５】
（実施例３５）
実施例３４において使用したゲンタマイシン溶液を５μＭのシスプラチン溶液に変更した以外は、実施例３４と同様の操作を行った。
【０２０６】
（実施例３６）
実施例３４において使用したゲンタマイシン溶液を５μＭのタウリン溶液に変更した以外は、実施例３４と同様の操作を行った。
【０２０７】
実施例３４から実施例３６の結果を表２に示す。
【０２０８】
【表２】
2010169677.tif 000015
【０２０９】
その結果、染色強度及び染色パターンの変化から、ゲンタマイシン、シスプラチンの聴覚神経細胞障害作用を評価できること。また、ゲンタマイシン、シスプラチンの聴覚毒性に関して、ゼブラフィッシュからヒトへの外挿性が確認された。この事からも明らかなように、本発明の有毛細胞標識剤を用いて、化学物質の聴覚毒性を評価できる事は明白である。
【０２１０】
（実施例３７）
本発明の有毛細胞標識剤による細胞染色状態（染色強度や蛍光特性）の変化を指標として、細胞の状態（トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボロームなど）や機能（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ、膜電位など）の変化を、検出・評価することができる。
【０２１１】
特定の化学物質の投与や、特定の栄養成分の枯渇、アンチセンス核酸の投与などにより、細胞の状態や機能を変化させることが出来る。このような細胞状態や機能への人為的な介入に伴う染色状態の変化を評価することにより、人為的介入の効果を検証することが可能になる。
【０２１２】
一方、細胞状態や機能への人為的介入操作は、細胞をある種の疾患状態へ導くことと捉えることもできる。よって、疾患状態を正常に戻す物質のスクリーニングを、本発明の有毛細胞標識剤による細胞染色状態の変化を指標として行うことにより、薬物候補物質を選別することが可能になる。
【０２１３】
このことを確認するために、特定遺伝子のノックダウンによる細胞状態・機能への人為的介入と、これに伴う染色性の変化を調べる実験を、次のようにして行った。
【０２１４】
特定の遺伝子をノックダウンするために、モルフォリノアンチセンスオリゴ（ＭＯ）を含む混合液を調製した。ＭＯの合成はＧｅｎｅＴｏｏｌｓ，ＬＬＣ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＯＲ）にて行った。スタートコドンからのタンパク質への翻訳を阻害するよう設計されたモルフォリノアンチセンスオリゴ（ａｔｇＭＯ）を蒸留水に溶解させて、次の組成のＭＯ混合液を調製した。
ａｔｇＭＯ              １０μｇ／μＬ
フェノールレッド        ０．００５％
ＥＧＦＰ                ５０ｎｇ／μＬ
ゼブラフィッシュの受精後１時間以内（第二卵割期以前）の受精卵に、ＭＯ混合液をマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションには、ＰＣ−１０プーラー（ナリシゲ製）でガラス管を伸展切断し、断面をＥＧ−４００（ナリシゲ製）研磨器で研磨することにより先端を尖らせたガラス製毛細管（内径０．６ｍｍ）を使用した。１０ｃｍデッシュに１％アガロースを敷いたものの中に飼育水と受精卵を入れ、実体顕微鏡下でマイクロインジェクションした。インジェクションの際、ガラス製毛細管にはＩＭ−９Ａ（ナリシゲ製）の手動インジェクターあるいは、ＩＭ−３０（ナリシゲ製）の電動マイクロインジェクターを接続し、圧力による注入を行った。ＭＯの注入量は１受精卵あたり１−１０ｎｇとした。
【０２１５】
ＭＯ混合液には色素（０．００５％  フェノールレッド）が添加されているため、肉眼でのＭＯ混合液の注入の成否を確認することができる。また、ＭＯ混合液には蛍光タンパク質発現ベクター（ＥＧＦＰ）が添加されている。そのため、注入後３日目、受精卵が孵化したのちにマイクロインジェクションが成功したかどうか（蛍光タンパク質のシグナルを認めたサンプルはＭＯもゼブラフィッシュ内に保持されている）を確認することができる。
【０２１６】
ゼブラフィッシュの稚魚（受精後７日胚）を実施例１と同様にして染色し、有毛細胞の染色状態の変化を測定した。
【０２１７】
有毛細胞標識剤として、化合物（５４）を選択し、ＦＭ１−４３と比較した。また標的遺伝子としてＳＬＣ２５Ａ１２及びＴＲＰＣ２を選択した。遺伝子をノックダウンしていない稚魚の感丘の染色強度をコントロールとして、各標的遺伝子をノックダウンした稚魚の感丘の染色強度を、実体顕微鏡によって取得した蛍光画像から数値化し、比較した。
【０２１８】
標的遺伝子のノックダウン（ＫＤ）に伴う、感丘の染色強度の変化を表３に示す。
【０２１９】
【表３】
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【０２２０】
化合物（５４）による染色性は、ＳＬＣ２５Ａ１２及びＴＲＰＣ２遺伝子のノックダウンに伴って、それぞれ２倍程度に有意に増大した。一方、ＦＭ１−４３による染色性も、ＳＬＣ２５Ａ１２及びＴＲＰＣ２遺伝子のノックダウンに伴って、それぞれ有意に増大したが、その割合は３割程度と化合物（５４）に比較して小さなものであった。
【０２２１】
このことは、本発明の有毛細胞標識剤の方が、細胞機能への人為的介入に伴う染色性の変化を、より鋭敏に検出できる可能性を示唆している。
【０２２２】
また、化合物（５４）の化学構造は、ＦＭ１−４３の化学構造とは異なることから、有毛細胞の染色機構が、化合物（５４）とＦＭ１−４３とで異なる可能性がある。
【０２２３】
（実施例３８）
本発明の有毛細胞標識剤には、その染色強度が、ＦＭ１−４３のような従来知られた染色剤による染色強度に比べて、高いものが含まれる。このことを確認するために、染色剤の濃度を変化させて、染色性の変化を調べる実験を、次の様にして行った。
【０２２４】
有毛細胞標識剤として、化合物（４３）、化合物（５４）及び、化合物（６５）を選択し、ＦＭ１−４３と比較した。染色剤の濃度として、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬの３種類の染色液を調製した。ゼブラフィッシュの稚魚（受精後７日胚）を実施例１と同様にして染色した。蛍光強度は単位取込み時間の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ／ｍｓｅｃ）で表し、以下のように計算して求めた。すなわち、実体蛍光顕微鏡で蛍光画像を取得する際に、取込み時間（露光時間）を変化させ、得られた蛍光画像の感丘の蛍光強度（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔ、  ＲＦＵ）を取込み時間で除することにより得られる。
【０２２５】
結果を図４に示す。化合物（４３）、化合物（５４）及び、化合物（６５）による有毛細胞の染色強度は、ＦＭ１−４３による染色強度と比較して高いことが確認された。
【０２２６】
本発明の染色強度の高い有毛細胞標識剤は、低い濃度で使用することが出来る。またバックグラウンドノイズの少ない鮮明な染色画像を取得することが出来る。さらに染色信号のダイナミックレンジが広いために、有毛細胞の生理状態のより詳細な解析が可能になる。
【産業上の利用可能性】
【０２２７】
内耳有毛細胞の細胞死誘導を原因とする感音性難聴は、先天的・後天的原因により、新生児から老人まで幅広く発症する難聴であり、その詳細な発症機序は不明な点が多く、有効な治療法の確立が切望されている。
【０２２８】
本発明の有毛細胞標識剤は、多様な化学構造を有し、励起波長／蛍光波長の多様性に富み、ゼブラフィッシュの側線器官中に存在する感丘を様々なパターンで、蛍光強度も強く、明瞭に染色することが出来る。染色パターンの違いは、各有毛細胞標識剤の有毛細胞に対する染色メカニズムが異なることを反映していると考えられ、有毛細胞の様々な状態を識別することを可能とするものである。
【０２２９】
本発明の有毛細胞標識剤は、細胞の状態や機能に応じて、染色状態が大きく変化しうることから、聴覚機能を様々な角度から評価する事が可能となる。
【０２３０】
本発明の有毛細胞標識剤を用いた聴覚機能の評価に基づいて、感音性難聴の有効な治療法や治療薬、予防薬の開発を進めることができる。
【０２３１】
また、難聴疾患の治療薬または予防薬のスクリーニングが、ゼブラフィッシュを用いることで迅速となり、低コスト化が可能となる。また、難聴疾患の治療薬または予防薬の評価が容易に行うことが可能になる。
【０２３２】
また、化学物質の聴覚毒性評価のスクリーニングを行う際の指標として用いる事ができる。
【０２３３】
更には、細胞状態や機能への人為的介入に伴う、染色状態の変化を解析することで、人為的介入の効果を検証することができ、生命科学研究のための有効なツールとなりえる。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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