(57)【要約】      （修正有）【課題】培養細胞や実験動物では増殖困難で、抗原ウイルスを確保することが極めて難しいノロウイルス（ＧＩＩ−４株）に対する抗体と、該抗体を用いたノロウイルスの診断薬、治療薬、マスクやエアコンフィルターなどのウイルス除去素材を提供する。【解決手段】バキュロウイルスを用いて作製したノロウイルスＧＩＩ−４のＶＬＰをダチョウに免疫後、６週目以降に採取したダチョウの血液および卵黄内のＶＬＰに対する抗体。また、この抗体を利用したノロウイルスの診断薬、治療薬、マスクやエアコンフィルターなどのウイルス除去素材。フィルターは１２０℃、１．２気圧、２０分という過酷な条件下でも活性を維持していた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫細胞によって産生させたノロウイルスＶＬＰをメスのダチョウに免疫し、前記メスのダチョウの血液または卵黄から精製した抗体。
【請求項２】
請求項１に記載された抗体を含むマスク。
【請求項３】
請求項１に記載されたエアコンフィルター。
【請求項４】
請求項１に記載された抗体を含むスプレー剤。
【請求項５】
請求項１に記載された抗体を含むトイレ洗浄剤。
【請求項６】
請求項１に記載された抗体を含む治療薬。
【請求項７】
請求項１に記載された抗体を含む食品。
【請求項８】
請求項１に記載された抗体を含む検査キット。
【請求項９】
ノロウイルスのＯＲＦ２にコードされる構造蛋白質領域のＰＣＲ用ブライマーからｃＤＮＡを作製する工程と、
前記ｃＤＮＡをバキュロウイルスベクターに組み込み、昆虫細胞にＶＬＰを作製させる工程と、
前記ＶＬＰをメスのダチョウに免疫する工程と、
前記免疫されたメスのダチョウの血液まはたその卵黄から抗体を精製する工程を含む抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はノロウイルスに対する抗体の産生方法に関する。より詳しくは鳥類好ましくは、ダチョウを用いその卵からノロウイルスに対する抗体を産生する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスはカリシウイルス科に分類されるエンベロープを持たない一本鎖ＲＮＡウイルスであり、ノロウイルス属、サポウイルス属、ラゴウイルス属、ベシウイルス属など複数の種類の存在が認められている。
【０００３】
このウイルスはヒトに経口感染し、感染性胃腸炎を発症する。発症した患者の症状は、嘔吐、下痢、発熱が主たる症状である。通常は１、２日で治癒し、後遺症も残らない。しかし、免疫力の低い幼児や高齢者は治癒に時間がかかり、死亡する例も報告されている。
【０００４】
ノロウイルスは、ヒトの腸内での増殖が確認されているものの、培養細胞を用いた実験的な増殖方法が発見されておらず、詳細な研究は他のウイルスに対して遅れているのが実情である。
【０００５】
ノロウイルスは数多くのウイルス株が存在するが、老人ホームなどで多数の死者を出すのはＧＩＩ−４という株である。つまり、このＧＩＩ−４に対する抗体を作製すれば、公衆衛生上重要課題となるノロウイルスの診断薬、治療薬、ウイルス除去素材（マスクやエアコンフィルターなど）が開発可能である。
【０００６】
しかしながら、ノロウイルスはヒトの腸内で増殖するものの、培養細胞や実験動物では増殖が困難であり、抗原となるウイルスを確保することが極めて難しい。
【０００７】
そこで特許文献１では、ノロウイルスＧＩのジェノタイプ１〜１４までのカプシ領域において共通する６６番目から７８番目のアミノ酸配列に基づいてモノクロナール、若しくはポリクロナール抗体を得る方法が開示されている。
【０００８】
また、非特許文献１には、ＮＶカプシドタンパクをコードするＯＲＦ２を用いたバキュロウイルス発現システムで発現されたウイルス様中空粒子(Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ＶＬＰs)を抗原として作製されたモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)によるノロウイルスＧＩの検出方法が紹介されている。このモノクローナル抗体を用いた検出キットは、ジェノグループＩ(ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩ、ＧＩ)とジェノグループII(ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ、ＧＩＩ)をそれぞれ検出できる。
【特許文献１】特開２００７−１４５７７５号公報
【非特許文献１】「日本臨床」第６０巻第６号第１１８８〜１１９３頁(２００２年)、日本臨床社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ノロウイルスに感染した場合の治療薬や診断薬またはウイルス除去素材に抗体を利用するのは効果的であると考えられる。そして、工業的な実施となると、均一な品質の抗体を大量に製造する必要がある。
【００１０】
しかし、抗体は生体の免疫活動を利用して産生するという性質上、個体が変れば全く同
じ抗体は得られない。現在インフルエンザウイルスに対する抗体にはニワトリの卵が用いられるが、１個１個の鶏卵から取り出せる抗体はわずかであり、また個々の鶏卵からの抗体は同じ特性を示すとは限らない。従って、大量に生産するには大きな設備が必要であり、また均一の品質を保つためには精製後も多くの検査が必要であった。
【００１１】
本発明はかかる課題に鑑み、想到されたものであり、ノロウイルスに対する抗体を均一かつ大量に製造する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち、本発明は、ノロウイルスの中でも多数の死者を出すＧＩＩ−４という株に対する抗体をダチョウを使って大量に産生するものである。
【００１３】
より具体的には、バキュロウイルスを用いて作製したノロウイルスＧＩＩ−４のＶＬＰをダチョウに免疫し、ダチョウの血液および卵黄内の抗体を抽出する。
【発明の効果】
【００１４】
ダチョウに免疫することにより、卵黄から低コストで大量で均一な抗体（ＩｇＹ）の作製が可能である。一羽の雌のダチョウより半年で約４００ｇ（ウサギの８００匹量）が産出可能である。さらにダチョウの寿命は６０年以上あることから、一羽のダチョウより継続的に均一的な抗体の供給が可能である。多数のダチョウを用いることにより、工業的（使い捨て可能）な用途で抗体を利用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ノロウイルスは実験動物や培養細胞で増やすことが困難であるため、抗体作製用の抗原として十分な量を得ることは困難である。しかしながら、遺伝子工学的に培養細胞に作製させることが可能である。ノロウイルスゲノムの構造蛋白質領域をバキュロウイルスに組み込み、昆虫細胞で発現させると、ウイルス粒子（ＶＬＰ：virus-liked particle）を作出できる。ＶＬＰは構造がノロウイルスそのものであり、ウイルス粒子と同等の抗原性を有するが、内部にゲノムＲＮＡを持たず、中空で感染性はない。
【００１６】
現在、互いに抗原性の異なると予想されるノロウイルスは３０種類以上になろうとしているが、その約６０％をカバーするＶＬＰの作出に成功している。これらのＶＬＰをダチョウに免疫すれば、ノロウイルスに対する抗体が大量作製可能である。
【００１７】
老人ホームで発症した患者の下痢便より得たノロウイルス（ＧＩＩ−４）の遺伝子を基にＯＲＦ２にコードされる構造蛋白質領域のＰＣＲ用プライマーを使用して、ＶＬＰを効率良く作製可能なｃＤＮＡを作製しバキュロウイルスベクターに組み込み、昆虫細胞によりＶＬＰを作製させる。ＧＩＩ−４は老人ホームでの感染性胃腸炎の原因となるノロウイルスの株である。
【００１８】
このバキュロウイルス系で得たＶＬＰをメスのダチョウに免疫し、卵黄から抗体を精製した。免疫プログラムを次に示す。
【００１９】
免疫プログラム
初回免疫：フロイントの完全アジュバントに３０μｇのＶＬＰを混和し、メスのダチョウの腰部の筋肉内に接種した。
【００２０】
追加免疫：初回免疫後、隔週毎に3回追加免疫した。フロイントの不完全アジュバントに３０μｇのＶＬＰを混和し、メスのダチョウの腰部の筋肉内に接種した。
【００２１】
なお、図１を参照して、ノロウイルスの遺伝子構造と増幅のためのプライマーについて説明する。ノロウイルスはＯＲＦ１−３の三つのオープンリーディングフレームをもつ。ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子増幅には、ノロウイルスゲノムの中で最も高度に保存されている領域ＯＲＦ１とＯＲＦ２の境界付近の超高感度定量検出用（リアルタイムＰＣＲ）プライマーセットと、ＯＲＦ２にコードされる構造蛋白質領域のＰＣＲ用プライマーを使用する。図１ではプライマーの５'末端の塩基の位置をＧＩはＮｏｒｗａｌｋ／６８（Ｍ８７６６１）、ＧＩＩはＬｏｒｄｓｄａｌｅ／９３／ＵＫ（Ｘ８６５５７）の塩基番号で示した。
【００２２】
次に抗体の精製法を以下に示す。
卵黄からの抗体（ＩｇＹ）の精製は以下のように行った。
【００２３】
まず、卵黄に５倍量のＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５％ＮａＮ3）と同量の１０％デキストラン硫酸／ＴＢＳを加え２０分攪拌する。そして１ＭＣａＣｌ2／ＴＢＳを卵黄と同量加え攪拌し、１２時間静置する。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し上清を回収する。次に、最終濃度４０％になるように硫酸アンモニウムを加え４℃で１２時間静置する。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿物を回収する。最後に、卵黄と同量のＴＢＳに再懸濁し、ＴＢＳにて透析する。この課程により９０％以上の純度のＩｇＹの回収が可能となった。１個の卵黄より２〜４ｇのＩｇＹを精製することができた。
【００２４】
ＥＬＩＳＡ法による測定
以下のＥＬＩＳＡにより、得られた抗体の抗原反応性を測定した。
２μｇ／ｍＬのＶＬＰ抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの各ｗｅｌｌに１００μｌ入れ、室温で２時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄したのち、市販のブロッキング溶液（ブロックエース：大日本住友製薬）を各ｗｅｌｌに１００μｌ入れ２時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄したのち、免疫前および免疫後（１〜７週）のダチョウの血液および卵黄より抽出したダチョウＩｇＹ抗体の段階希釈液（５μｇ／ｍＬを原液として１００倍、２００倍〜と２倍段階希釈）を各ｗｅｌｌに５０μｌ入れ室温で１時間放置した。
【００２５】
その後、ＰＢＳで３回洗浄したのちペルオキシダーゼ標識抗ダチョウＩｇＹ・ウサギポリクローナル抗体（自作）を各ｗｅｌｌに１００μｌ入れ４５分間放置した。ＰＢＳで３回洗浄したのち市販のペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト）により３０分間発色し、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダーにより吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。得られた結果を、免疫前のＩｇＹの吸光度値の２倍以上となる最高希釈倍率で示した。
【００２６】
これにより、初回免疫後より抗体価の著しい上昇が認められ６週目以降で最高値を維持した（図２）。ダチョウを用いると、半年間で４００ｇのノロＶＬＰに対する抗体の作製が可能となり、多数のダチョウを使用することにより莫大な量の抗体を低コストで提供することができる。このことより、ノロウイルスの診断薬、さらには抗体を用いたノロウイルス除去用素材（スプレー剤やマスクやエアコンフィルター、雑巾、トイレの洗浄液など）の開発が実現できる。
【００２７】
抗ノロウイルスＶＬＰ・ダチョウ抗体の工業的応用化（フィルターへの応用）
免疫7週目（抗体価が最高値）に得られたダチョウＩｇＹを不織布に担持させた。
ＩｇＹ１００μｇを７ｃｍ×１５ｃｍの不織布に塗布し、６０℃〜８０℃で乾燥させた。得られたダチョウＩｇＹ担持フィルターをＰＢＳに漬け、抗体を溶出させ、上記のＥＬＩＳＡ法によるＶＬＰに対する抗体活性を検証した。また、ダチョウＩｇＹ担持フィルターを１２０℃、１．２気圧、２０分間処理（通称、オートクレーブ）したものもＰＢＳにて
溶出させ、抗体活性を検証した。
【００２８】
抗体活性の検証は以下の（１）乃至（４）の４つの抗体を担持させたフィルターから溶出した抗体のＶＬＰに対する活性を検証した。
【００２９】
（１）未処理の抗ノロウイルスＶＬＰ抗体（不織布への担持前）
（２）抗体担持フィルターから溶出した抗体
（３）１２０℃、１．２気圧、２０分間処理したフィルターから溶出した抗体
（４）免疫前のダチョウ抗体
その結果（１）と（２）はほぼ同値、さらに（３）でも活性が高い状態で維持されていた。（４）は活性が認められなかった。このことより、抗ノロウイルスＶＬＰ抗体はフィルター上でも活性が保存されること、さらに熱・圧力処理をしても活性がのこることが証明された。つまり、マスクやエアコンフィルターに担持させることで、ノロウイルス感染防御用商品として工業的利用が可能であることが期待された（図３）。
【００３０】
本発明の抗体は、１２０℃という温度であっても抗体活性が失活しないという特徴を有するため、工業的な大量生産に好適に用いることができる。具体的には、本発明の抗体を含ませたマスクやエアフィルタはノロウイルスが感染者の唾液などから感染を守ることができる。また、本発明の抗体を含むスプレー剤やトイレ洗浄剤は、ノロウイルスの効力を無効にすることができる。また、本発明の抗体はそれ自身治療薬として利用することができる。また、本発明の抗体を含む食品はノロウイルスの増殖を防ぐため、夏に利用される食品には好適に利用できる。また、本発明の抗体はノロウイルスに結合する抗体であるので、ノロウイルスの検査キットとしても利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、大量生産が可能であることから、ノロウイルス治療薬（経口薬）、さらには卵黄そのものを治療。予防用食品として用いる事も可能である。さらに、現在、高感度・高特異的なノロウイルスの診断用は商品化されていないため、このダチョウ抗体を用いた糞便からのノロウイルス検出・診断キットへの実用化も期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ノロウイルスの遺伝子構造と増幅のためのプライマーを説明する図である。
【図２】初回免疫後の血液と卵黄内のＩｇＹ価を測定したグラフである。
【図３】不織布をひたした抗体濃度と、その不織布から溶出させた抗体をＥＬＩＳＡで調べた際の４５０ｎｍにおける発光強度の関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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