(57)【要約】      （修正有）【課題】腸のコレステロール吸収の調節は、血清コレステロールレベルを調節するための有効な手段であり、コレステロール吸収インヒビターであるエゼチマイブが作用する遺伝子標的の同定は、コレステロール吸収プロセスを理解するため、および他の新規な吸収インヒビターの開発のために重要であり、エゼチマイブの標的であるヒトＮＰＣ１Ｌ１（ＮＰＣ３としても公知であるラットホモログおよびマウスホモログを提供する。【解決手段】特定の配列から選択されるアミノ酸配列からの４２個以上連続するアミノ酸を含む、単離されたポリペプチド。特定の配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年７月１９日に出願した米国仮特許出願番号６０／３９７，４４２（これは、その全体が参考として本明細書中に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それらの使用方法とともに包含する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
先進国における主要死亡原因である脈管疾患の発症をもたらす要因は、血清コレステロールの増加である。２０歳〜７４歳のアメリカ人のうちの１９％が、高い血清コレステロールを有すると推定される。脈管疾患の最も有力な形態は、動脈硬化症であり、これは、動脈壁の肥厚および硬化に関連する状態である。大きな脈管の動脈硬化症は、アテローム性動脈硬化症と呼ばれる。アテローム性動脈硬化症は、脈管障害（例えば、冠状動脈疾患、大動脈瘤、下肢の動脈疾患、および脳血管疾患）における優勢な原因因子である。
【０００４】
コレステリルエステルは、アテローム性動脈硬化症性斑の主要成分であり、動脈壁細胞におけるコレステロールの主要な貯蔵形態である。コレステリルエステルの形成はまた、食餌コレステロールの腸吸収における一段階である。従って、コレステリルエステル形成の阻害および血清コレステロールの減少は、アテローム性動脈硬化症病変形成の進行を阻害し得、動脈壁におけるコレステリルエステルの蓄積を減少し得、そして食餌コレステロールの腸吸収をブロックし得る。
【０００５】
哺乳動物および動物における身体全体のコレステロールホメオスタシスの調節は、腸のコレステロール吸収の調節、細胞コレステロール輸送、食餌コレステロールおよびコレステロール生合成の調節、胆汁酸生合成、ステロイド生合成、およびコレステロール含有血漿リポタンパク質の代謝を包含する。腸のコレステロール吸収の調節は、血清コレステロールレベルを調節するための有効な手段であることが証明されている。例えば、コレステロール吸収インヒビターであるエゼチマイブ（ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）
【０００６】
【化１】
2010142238.tif 000002
は、この点に関して有効であることが示されている。エゼチマイブが作用する遺伝子標的の同定は、コレステロール吸収プロセスを理解するため、および他の新規な吸収インヒビターの開発のために、重要である。本発明は、このエゼチマイブの標的であるヒトＮＰＣ１Ｌ１（ＮＰＣ３としても公知である；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１９２５２２；Ｄａｖｉｓら（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６５（２）：１３７〜４５および非特許文献１）のラットホモログおよびマウスホモログを提供することによって、この必要性に取り組む。
【０００７】
ＮＰＣ１Ｌ１は、ＹＱＲＬ（配列番号３８）モチーフ（すなわち、形質膜輸送シグナルへのトランスゴルジネットワークである；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４および非特許文献５を参照のこと）を含むＮグリコシル化タンパク質であり、これは、限定的な組織分布および胃腸量を示す。また、ヒトＮＰＣ１Ｌ１プロモーターは、ステロール調節エレメント結合タンパク質１（ＳＲＥＢＰｌ）結合コンセンサス配列を含む（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０、および非特許文献１１）。ＮＰＣｌＬ１は、ヒトＮＰＣ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００２０２０）に対して４２％のアミノ酸配列相同性を有し、このＮＣＰ１は、ニーマン−ピックＣ１疾患の原因となるレセプターである（非特許文献１２）。ニーマン−ピックＣ１疾患は、リソソーム中での低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）由来非エステル化コレステロールの蓄積を生じる、ヒトにおいて稀な遺伝性疾患である（非特許文献１３および非特許文献１４）。さらに、ｎｐｃｌ−細胞のトランスゴルジネットワークにおけるコレステロール蓄積、および形質膜へのコレステロールの再配置および形質膜からのコレステロールの再配置が、遅れる。ＮＰＣ１およびＮＰＣｌＬ１は、各々、１３回膜貫通セグメントおよびステロール検知ドメイン（ＳＳＤ）を保有する。いくつかの他のタンパク質（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−Ｒ）、パッチド（Ｐａｔｃｈｅｄ）（ＰＴＣ）およびステロール調節エレメント結合タンパク質切断−活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）を含む）は、おそらく直接的コレステロール結合を含む機構によるコレステロールレベルの検知に関与するＳＳＤを含む  （非特許文献１５；非特許文献１６および非特許文献１７）。
【非特許文献１】Ｉｏａｎｎｏｕ（２０００）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７１（１〜２）：１７５〜８１）
【非特許文献２】Ｂｏｓら、（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２．２２１９−２２２８
【非特許文献３】Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２０：１１２３−１１３５
【非特許文献４】Ｐｏｎｎａｍｂａｌａｍら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２５：２５３−２６８
【非特許文献５】Ｒｏｔｈｍａｎら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２２７−２３４
【非特許文献６】Ａｔｈａｎｉｋａｒら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４９３５−４９４０
【非特許文献７】Ｅｒｉｃｓｓｏｎら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：９４５−９５０
【非特許文献８】Ｍｅｔｈｅｒａｌｌら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５６３４−１５６４１
【非特許文献９】Ｓｍｉｔｈら、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２３０６−２３１０
【非特許文献１０】Ｂｅｎｎｅｔｔら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４．１３０２５−１３０３２
【非特許文献１１】Ｂｒｏｗｎら、（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９：３３１−３４０
【非特許文献１２】Ｃａｒｓｔｅａら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：２２８−２３１
【非特許文献１３】Ｐｅｎｔｃｈｅｖら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２２５：２３５−２４３
【非特許文献１４】Ｖａｎｉｅｒら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９６：３２８−３３７
【非特許文献１５】Ｇｉｌら、（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：２４９−２５８
【非特許文献１６】Ｋｕｍａｇａｉら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９１０７−１９１１３
【非特許文献１７】Ｈｕａら、（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８７：４１５−４２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
エゼチマイブの標的であるヒトＮＰＣ１Ｌ１（ＮＰＣ３としても公知であるのラットホモログおよびマウスホモログを提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
・（項目１）
単離されたポリペプチドであって、配列番号２および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列からの４２個以上連続するアミノ酸を含み得る、ポリペプチド。
・（項目２）
単離されたポリペプチドであって、配列番号２および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含み得る、ポリペプチド。
・（項目３）
項目１に記載のポリペプチドをコードし得る、単離されたポリヌクレオチド。
・（項目４）
単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１および配列番号１１から選択されるヌクレオチド配列を含み得る、ポリヌクレオチド。
・（項目５）
項目３に記載のポリヌクレオチドを含み得る、組換えベクター。
・（項目６）
項目５に記載のベクターを含み得る、宿主細胞。
・（項目７）
項目１に記載のポリペプチドに特異的に結合し得る、抗体。
・（項目８）
配列番号３９〜配列番号４２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合し得る、抗体。
・（項目９）
ポリペプチドを生成するための方法であって、上記方法は、
項目６に記載の宿主細胞を、上記核酸が発現される条件下で培養する工程
を包含し得る、方法。
・（項目１０）
項目９に記載の方法であって、上記ポリペプチドが、上記培養物から単離され得る、方法。
・（項目１１）
ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストを同定するための方法であって、上記方法は、
（ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能性フラグメントを細胞表面上に発現する宿主細胞を、既知量の検出可能に標識されたエゼチマイブの存在下で、上記アンタゴニストの存在について試験されるべきサンプルと接触する工程；ならびに
（ｂ）上記ポリペプチドに特異的に結合した検出可能に標識されたエゼチマイブの量を測定する工程；
を包含し得、
上記サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、そのようなアンタゴニストの非存在下で測定される結合と比較して、上記ポリペプチドに対する上記検出可能に標識されたエゼチマイブの実質的に減少した結合を測定することによって同定され得る、方法。
・（項目１２）
ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストを同定するための方法であって、上記方法は、
（ａ）水性懸濁物中に、蛍光剤を浸漬させた複数の支持体粒子を配置する工程であって、上記粒子に、配列番号２、配列番号４および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能的フラグメントを、細胞表面上に発現する宿主細胞が結合している、工程；
（ｂ）上記懸濁物に、放射標識エゼチマイブと、上記アンタゴニストの存在について試験されるべきサンプルとを添加する工程であって、上記放射標識は、上記エゼチマイブが上記ポリペプチドに結合した際に上記蛍光剤を活性化して光エネルギーを生成可能な放射線エネルギーを発し、一方、上記ポリペプチドに結合しない放射標識エゼチマイブは、概して、上記放射エネルギーが上記蛍光剤を活性化するのを可能にするには上記支持体粒子から離れすぎている、工程；ならびに
（ｃ）上記懸濁物において上記蛍光剤により発せられた光エネルギーを測定する工程；を包含し得、
上記サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、そのようなアンタゴニストの非存在下で測定される光エネルギー放出と比較して、実質的に減少した光エネルギー放出を測定することによって同定され得る、方法。
・（項目１３）
項目１２に記載の方法であって、上記蛍光剤は、ケイ酸イットリウム、酸化イットリウム、ジフェニルオキサゾール、およびポリビニルトルエンから選択され得る、方法。
・（項目１４）
項目１１に記載の方法であって、上記エゼチマイブは、３Ｈおよび１２５Ｉから選択される放射標識で標識され得る、方法。
・（項目１５）
項目１２に記載の方法であって、上記エゼチマイブは、３Ｈおよび１２５Ｉから選択される放射標識で標識され得る、方法。
・（項目１６）
ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストを同定するための方法であって、上記方法は、
（ａ）配列番号２、配列番号４および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能性フラグメントを細胞表面上に発現する宿主細胞を、検出可能に標識されたコレステロール、および上記アンタゴニストの存在について試験されるべきサンプルと、接触させる工程；ならびに
（ｂ）上記細胞における検出可能に標識されたコレステロールの量を測定する工程；
を包含し得、
上記サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、そのようなアンタゴニストの非存在下で測定される検出可能なコレステロールと比較して、上記宿主細胞中の実質的に減少した検出可能に標識されたコレステロールを測定することによって同定され得る、方法。
・（項目１７）
項目１６に記載の方法であって、上記コレステロールは、３Ｈおよび１２５Ｉから選択される放射標識で検出可能に標識され得る、方法。
・（項目１８）
項目１１に記載の方法であって、上記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞、およびＣａｃｏ２細胞から選択され得る、方法。
・（項目１９）
項目１２に記載の方法であって、上記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞、およびＣａｃｏ２細胞から選択され得る、方法。
・（項目２０）
項目１６に記載の方法であって、上記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞、およびＣａｃｏ２細胞から選択され得る、方法。
・（項目２１）
内因性染色体ＮＰＣ１Ｌ１のホモ接合性破壊を含む変異体マウスであって、上記マウスは、いかなる機能性ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質も生成しないものあり得る、マウス。
本発明は、配列番号２および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列からの４２個以上連続するアミノ酸を含む単離されたポリペプチドを包含し、好ましくは、配列番号２および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを包含する。本発明はまた、配列番号２または配列番号１２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、好ましくは、配列番号１、配列番号５〜配列番号１０、配列番号１１および配列番号１３から選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターもまた、そのベクターを含む宿主細胞とともに提供される。
【００１０】
本発明はまた、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、マウスＮＰＣ１Ｌ１もしくはヒトＮＰＣ１Ｌ１）またはその任意の抗原性フラグメントに（好ましくは、ラットＮＰＣ１Ｌ１に、より好ましくは、配列番号３９〜配列番号４２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに）特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。好ましくは、この抗体は、ウサギから得られる。
【００１１】
本発明はまた、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを生成するための方法を包含し、この方法は、本発明の宿主細胞を、その細胞中にあるＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードすする核酸が発現される条件下で培養する工程、を包含する。好ましくは、この方法は、上記ポリペプチドを、上記培養物から単離する工程を包含する。
【００１２】
本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１のアゴニストもしくはアンタゴニストを同定するための方法を包含し、この方法は、
（ａ）配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能性フラグメントを細胞表面上に発現する宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞、およびＣａｃｏ２細胞）を、既知量の検出可能に（例えば、３Ｈおよび１２５Ｉで）標識されたエゼチマイブの存在下で、ＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在について試験されるべきサンプルと接触する工程；ならびに
（ｂ）そのポリペプチドに特異的に結合した検出可能に標識されたエゼチマイブの量を測定する工程；
を包含し、このサンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、そのようなアゴニストまたはアンタゴニストの非存在下で測定される結合と比較して、そのポリペプチドに対する検出可能に標識されたエゼチマイブの実質的に減少した結合を測定することによって同定される。
【００１３】
ＮＰＣ１Ｌ１のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための別の方法もまた、提供される。この方法は、
（ａ）水性懸濁物中に、蛍光剤（例えば、ケイ酸イットリウム、酸化イットリウム、ジフェニルオキサゾール、およびポリビニルトルエン）を浸漬させた複数の支持体粒子を配置する工程であって、その粒子に、配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能性フラグメントを細胞表面上に発現する宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞、およびＣａｃｏ２細胞）が結合している、工程；
（ｂ）その懸濁物に、（例えば、３Ｈおよび１２５Ｉによる）放射標識エゼチマイブと、アンタゴニストまたはアゴニストの存在について試験されるべきサンプルとを添加する
工程であって、その放射標識は、そのエゼチマイブがそのポリペプチドに結合した際にその蛍光剤を活性化して光エネルギーを生成可能な放射線エネルギーを発し、一方、そのポリペプチドに結合しない放射標識エゼチマイブは、概して、その放射エネルギーがその蛍光剤を活性化するのを可能にするにはその支持体粒子から離れすぎている、工程；ならびに
（ｃ）その懸濁物においてその蛍光剤により発せられた光エネルギーを測定する工程；を包含し、
そのサンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、そのようなアゴニストまたはアンタゴニストの非存在下で測定される光エネルギー放出と比較して、実質的に減少した光エネルギー放出を測定することによって同定される。
【００１４】
ＮＰＣ１Ｌ１のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法もまた、提供され、この方法は、
（ａ）配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能性フラグメントを細胞表面上に発現する宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞、およびＣａｃｏ２細胞）を、（例えば、３Ｈおよび１２５Ｉで）検出可能に標識されたコレステロールと、およびアンタゴニストまたはアゴニストの存在について試験されるべきサンプルと、接触させる工程；ならびに
（ｂ）その細胞における検出可能に標識されたコレステロールの量を測定する工程；
を包含し、
そのサンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、そのようなアンタゴニストの非存在下で測定される検出可能なコレステロールと比較して、その宿主細胞中の実質的に減少した検出可能に標識されたコレステロールを測定することによって同定され、そしてそのサンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アゴニストは、そのようなアゴニストの非存在下で測定される検出可能なコレステロールと比較して、その宿主細胞中の実質的に増加した検出可能に標識されたコレステロールを測定することによって同定される。
【００１５】
内因性染色体ＮＰＣ１Ｌ１のホモ接合性破壊を含む変異体マウスもまた、本発明に包含され、好ましくは、このマウスは、いかなる機能性ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質も生成しない。
【発明の効果】
【００１６】
エゼチマイブの標的であるヒトＮＰＣ１Ｌ１（ＮＰＣ３としても公知であるラットホモログおよびマウスホモログを提供し、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それらの使用方法とともに提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ラット由来のおよびマウス由来のＮＰＣｌＬ１ポリペプチドを、個々のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとともに包含する。好ましくは、ラットＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、マウスＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。配列番号１または配列番号１０のラットＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドは、ラットＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする。配列番号１１または配列番号１３のマウスＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドは、マウスＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする。
【００１８】
本発明は、以下の表１において言及されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む、任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含する。
【００１９】
（表１．本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
【００２０】
【表１】
2010142238.tif 000003
ヒトＮＰＣ１Ｌ１はまた、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１９２５２２の下で開示される。下記に考察されるように、配列番号１に示されるラットＮＰＣ１Ｌ１のヌクレオチド配列は、ラット空腸細胞ｃＤＮＡライブラリー由来の発現配列タグ（ＥＳＴ）から得られた。配列番号５〜７は、３つの独立したｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列を含む。配列番号５の下流配列ＥＳＴ（６０３６６２０８０Ｆ１）が、決定された。これらの実験からの配列決定データは、配列番号８に示される。上流配列もまた、決定された。これらのデータは、配列番号９に示される。
【００２１】
配列番号４３および４４は、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１９２５２２の下で開示されるヒトＮＰＣ１Ｌ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である（Ｄａｖｉｅｓら、（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６５（２）：１３７−４５を参照のこと）。
【００２２】
配列番号４５は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＫ０７８９４７の下で開示されるマウスＮＰＣ１Ｌ１のヌクレオチド配列である。
【００２３】
（分子生物学）
本発明に従って、当業者の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。そのような技術は、文献中に完全に説明される。例えば、例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書中では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４．；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照のこと。
【００２４】
配列番号１０および配列番号１３の逆翻訳配列は、ＰＣＴ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの添付物２付属書Ｃの表１に示される１文字コードを使用する。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖形態、二本鎖形態、または他の形態である、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン（ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）を指し得る。
【００２６】
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオシド」とも呼ばれる）であり、２つの以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。
【００２７】
「コード配列」または発現生成物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素）を「コードする」配列は、発現された場合にその生成物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
【００２８】
用語「遺伝子」とは、１つ以上のＲＮＡ分子、タンパク質、もしくは酵素のすべてもしくは一部を含むリボヌクレオチドもしくはアミノ酸の特定の配列をコードするかまたはその特定の配列に対応する、ＤＮＡ配列を意味する。このＤＮＡ配列は、例えばその遺伝子が発現される条件を決定する調節ＤＮＡ配列（例えば、プロモーター配列）を含んでもよいし、含まなくてもよい。遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへと転写され得、このＲＮＡは、アミノ酸配列に翻訳されても翻訳されなくてもよい。
【００２９】
本発明は、配列番号１、５〜１１、または１３のうちのいずれかの核酸フラグメントを包含する。核酸「フラグメント」とは、配列番号１、５〜１１、または１３のうちのいずれか由来の少なくとも３０個（例えば、３１、３２、３３、３４個）、好ましくは少なくとも約３５個（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、もしくは３４個）、より好ましくは少なくとも４５個（例えば、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、もしくは４４個）、そして最も好ましいは少なくとも約１２６個
以上連続するヌクレオチド（例えば、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、１０００または１２００個）を含む。
【００３０】
本発明はまた、配列番号１、５〜１１、または１３のうちのいずれか由来の少なくとも７個（例えば、９、１２、１７、１９個）、好ましくは少なくとも約２０個（例えば、３０、４０、５０、６０個）、より好ましくは約７０個（例えば、８０、９０、９５個）、なおより好ましくは少なくとも約１００個（例えば、１０５、１１０、１１４個）そしてなおより好ましくは少なくとも約１１５個（例えば、１１７、１１９、１２０、１２２、１２４、１２５、１２６個）連続するヌクレオチドからなる核酸フラグメントを包含する。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、目的とするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、または遺伝子をコードするｍＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくは他の核酸にハイブリダイズ可能であり得る、概して約１００ヌクレオチド（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ヌクレオチド）からなる、核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、３Ｈ−ヌクレオチド、１４Ｃ−ヌクレオチド、３５Ｓ−ヌクレオチド、または標識（例えば、ビオチン）が共有結合されているヌクレオチドを組み込むことによって、標識され得る。１つの実施形態において、標識オリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用され得る。別の実施形態において、オリゴヌクレオチド（その一方または両方が標識されている）は、全長遺伝子または遺伝子フラグメントをクローニングすること、または核酸の存在を検出することのいずれかのために、ＰＣＲプライマーとして使用され得る。一般に、オリゴヌクレオチドは、合成によって、好ましくは核酸合成機にて、調製される。
【００３２】
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、または「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中にある一連の２つ以上のアミノ酸を指す。
【００３３】
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続列を含む。本発明の好ましいペプチドは、配列番号２もしくは１２のいずれかに示されるペプチド、ならびにその改変体およびフラグメントを包含する。そのようなフラグメントは、好ましくは、配列番号２または１２のうちのいずれかからの少なくとも約１０個（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９個）、より好ましくは少なくとも約２０個（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６，２７、２８、２９、３０、３５、４０個）、そしてなおより好ましくは少なくとも約４２個（例えば、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、もしくは１３０個）以上連続するアミノ酸残基を含む。
【００３４】
本発明は、配列番号２または１２のうちのいずれか由来の少なくとも７個（例えば、９、１０、１３、１５、１７、１９個）、好ましくは少なくとも約２０個（例えば、２２、２４、２６、２８個）、より好ましくは約３０個（例えば、３２、３４、３６、３８個）、なおより好ましくは少なくとも約４０個（例えば、４１、４２個）連続するアミノ酸からなるポリペプチド（好ましくは、抗原性ポリペプチド）もまた、包含する。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、インタクトなペプチドのタンパク質分解切断によって、化学合成によって、または組換えＤＮＡ技術の適用によって、生成され得る。本発明のポリペプチドは、タンパク質分解切断部位によって線引きされたポリペプチドに限定されない。上記のポリペプチドは、単独でか、またはそのポリペプチドをより免疫原性にするために架橋されてかもしくはキャリア分子に結合体化されて、抗体および抗体フラグメントの生
成を惹起するための抗原として有用である。この抗体は、例えば、免疫親和性精製のためのイムノアッセイにおいて、またはＮＰＣ１Ｌ１の阻害のためなどに、使用され得る。
【００３６】
用語「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたポリペプチド」は、細胞中において通常は見出されない他の成分から部分的にかまたは完全に分離されているか、または組換えＤＮＡ発現系中にある、それぞれ、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子もしくはＤＮＡ分子、または混合ポリマー）またはポリペプチドを包含する。これらの成分としては、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分、および外来ゲノム配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、好ましくは、本質的に均質な分子組成であるが、いくらかの不均質性を含み得る。
【００３８】
ＤＮＡの「増幅」とは、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡ配列の混合物内の特定のＤＮＡ配列の濃度を増加するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することを示し得る。ＰＣＲの説明については、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８７を参照のこと。
【００３９】
用語「宿主細胞」とは、その細胞による物質の生成（例えば、その細胞による遺伝子、ＤＮＡ配列、もしくはＲＮＡ配列またはタンパク質の発現または複製）のために、何らかの様式で選択、改変、形質転換、増殖、または使用される、任意の生物の任意の細胞を包含する。好ましい宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスマクロファージＪ７７４細胞、または他の任意のマクロファージ細胞、およびヒト腸上皮Ｃａｃｏ２細胞が挙げられる。
【００４０】
核酸のヌクレオチド配列は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、化学的配列決定または酵素的配列決定）によって、決定され得る。ＤＮＡの「化学的配列決定」は、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９９７）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０）の方法などを包含し、この方法では、ＤＮＡは、個々の塩基特異的反応を使用してランダムに切断される。ＤＮＡの「酵素的配列決定」は、Ｓａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）の方法などを包含する。
【００４１】
本明細書中の核酸は、天然の調節（発現制御）配列により隣接され得るか、または異種配列（プロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’非コード領域および３’非コード領域などを含む）に結合され得る。
【００４２】
一般に、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに（例えば、直接にか、または他のプロモーター結合タンパク質もしくはプロモーター結合物質を介して）結合可能であり、かつコード配列の転写を開始する、ＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、一般に、転写開始部位によってその３’末端で境界を形成しており、そして上流（５’方向）に延びて、任意のレベルで転写を開始するために必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含む。このプロモーター配列内には、転写開始部位（簡便には、例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いるマッピングによって規定される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が、見出され得る。このプロモーターは、他の発現制御配列（エンハンサー配列およびリプレッサー配列を含む）と、または本発明の核酸と、作動可能に結合され得る。遺伝子発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；原核生物発現ベクター（例えば、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら、（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５））（「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４−９４もまた参照のこと）；ならびに酵母もしくは他の真菌由来のプロモーターエレメント（例えば、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）またはアルカリホスファターゼプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
コード配列は、細胞中の転写制御配列および翻訳制御配列がそのコード配列からＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）へのＲＮＡポリメラーゼ媒介性転写を指向し、そのＲＮＡは、その後、（イントロンを含む場合には）ＲＮＡスプライシングされ得、必要に応じて、そのコード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳され得る場合に、それらの転写制御配列よび翻訳制御配列「の制御下にある」、「と機能的に結合している」、または「と作動可能に結合している」。
【００４４】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列中の情報が明らかになるのを可能にすることまたはそれを引き起こすこと（例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによって、タンパク質を生成すること）を意味する。ＤＮＡ配列は、細胞中でかまたは細胞によって、「発現生成物」（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質）を形成するように発現される。その発現生成物自体はまた、その細胞によって「発現される」と言われ得る。
【００４５】
用語「形質転換」とは、核酸を細胞中に導入することを意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン」と呼ばれ得る。その導入されるＤＮＡまたはＲＮＡを受ける宿主細胞は、「形質転換」されており、これは、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源由来であり得、宿主細胞と同じ属または種の細胞由来であっても、異なる属または種の細胞由来であってもよい。
【００４６】
用語「ベクター」は、宿主を形質転換し、必要に応じて導入された配列の発現および／または複製を促進するように、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が宿主細胞中に導入され得る媒体（例えば、プラスミド）を包含する。
【００４７】
本発明において使用され得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主ゲノム中への核酸の導入を促進し得る他の媒体が挙げられる。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるが、同様の機能を提供しかつ当該分野で公知であるかまたは公知となる他のすべての形態のベクターが、本明細書中で野使用のために適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５
ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら、（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ  １９８８，Ｂｕｔｔｅｒ
ｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
【００４８】
用語「発現系」とは、適切な条件下で、そのベクターにより保有されて宿主細胞中に導入されるタンパク質または核酸を発現し得る、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。
【００４９】
本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸の発現は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかにおいて従来の方法によって実行され得る。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、原核生物系において最も頻繁に使用されるが、他の多くの細菌（例えば、種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓの株）が、当該分野で公知であり、そしてコレラも同様に、使用され得る。ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸を発現するために適切な宿主細胞としては、原核生物および高等真核生物が挙げられる。原核生物は、グラム陰性生物およびグラム陽性生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の両方を包含する。高等真核生物は、動物細胞（非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯類）の両方の動物細胞）由来の樹立された組織培養細胞株を包含する。
【００５０】
原核生物宿主−ベクター系は、多くの異なる種のための広範な種類のベクターを包含する。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその誘導体の多く（例えば、ｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９）である。ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを発現するために使用され得るベクターとしては、ｌａｃプロモーターを含むベクター（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーターを含むベクター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーターを含むベクター（ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰプロモーターもしくはλ−ｐＲプロモーターを含むベクター（ｐＯＴＳ）；またはハイブリッドプロモーター（例えば、ｐｔａｃ）を含むベクター（ｐＤＲ５４０）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｒｏｓｉｕｓら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ  Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５〜２３６を参照のこと。多くのポリペプチドは、米国特許第４，９５２，４９６号、同第５，６９３，４８９号および同第５，８６９，３２０号、ならびにＤａｖａｎｌｏｏ，Ｐ．ら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：２０３５〜２０３９；Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ら、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５６：１２５−１３５；およびＤｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６８：２５９に開示されるような、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系において、高レベルで発現され得る。
【００５１】
高等真核生物組織培養細胞もまた、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドの組換え生成のために使用され得る。任意の高等真核生物組織培養細胞株（昆虫バキュロウイルス発現系が挙げられる）が使用され得るが、哺乳動物細胞が、好ましい。このような細胞の形質転換、トランスフェクションおよび増殖は、慣用的手順となっている。有用な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｊ７７４細胞、Ｃａｃｏ２細胞、ラット乳児腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。そのような細胞株のための発現ベクターは、通常は、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常は、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノ
ウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを保有する、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。発現ベクターの例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１１３６）、ｐＭＣ１ｎｅｏ  Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３）、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびそれらの誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０）が挙げられる。本発明の１つの実施形態は、膜結合型ＮＰＣ１Ｌ１を包含する。この実施形態において、ＮＰＣ１Ｌ１は、原核生物細胞の細胞膜において発現され得、そしてその膜結合型タンパク質は、当該分野で公知の従来の方法によって、その細胞から単離され得る。
【００５２】
本発明はまた、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドおよびＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドと、第２ポリペプチド部分もしくは第２ポリヌクレオチド部分（「タグ」と呼ばれ得る）とを含む、融合物を包含する。本発明の融合物は、表１に示されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのいずれか、またはそれらの任意の部分配列もしくはフラグメント（上記に考察される）を含み得る。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを、発現ベクター中に挿入することによって、簡便に構築され得る。本発明の融合物は、精製または検出を容易するタグを含み得る。そのようなタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、およびｍｙｃタグが挙げられる。検出可能なタグ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１３ｍＩｎ、７６Ｂｒ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎおよび６８Ｇａ）もまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを標識するために使用され得る。このような融合物を構築および使用するための方法は、非常に従来的であり、当該分野で周知である。
【００５３】
ポリペプチドにおいて生じる改変（例えば、翻訳後修飾）は、しばしば、それが行われる方法の関数である。例えば、宿主においてクローン化遺伝子を発現することによって生成されるポリペプチドについて、その改変の性質および程度は、大部分は、宿主細胞の翻訳後修飾能力、およびそのポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルによって、決定される。例えば、周知であるように、グリコシル化は、しばしば、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において生じない。従って、グリコシル化が望ましい場合、ポリペプチドは、グリコシル化する宿主（一般的には、真核生物細胞）において発現され得る。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同様に翻訳後グリコシル化を行う。この理由のために、昆虫細胞発現系は、グリコシル化のネイティブパターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現するために開発されている。本発明において使用され得る昆虫細胞は、Ｉｎｓｅｃｔａ綱の生物に由来する任意の細胞である。好ましくは、その昆虫は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｉｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９もしくはＳｆ２ｌ）またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｈｉｇｈ  ５）である。本発明とともに、例えば、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを生成するために使用され得る昆虫発現系の例としては、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。望ましい場合、脱グリコシル化酵素が、真核生物発現系における生成の間に結合した糖質を除去するために、使用され得る。
【００５４】
他の改変としては、ポリペプチドカルボキシル末端への脂肪族エステルまたはアミドの付加のまた、挙げられ得る。本発明はまた、改変（例えば、非天然アミノ酸残基またはリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン残基、ホスホセリン残基、もしくはホスホスレオニン残基）の組込み）を含むＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドアナログを包含する。他の
改変としては、硫酸化、ビオチン化、または他の部分の付加が挙げられる。例えば、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは、被験体の身体においてそのペプチドの半減期を増加するポリマーを結合され得る。好ましいポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、および４０ｋＤａを有するＰＥＧ）、デキストラン、およびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられる。
【００５５】
本発明のペプチドはまた、環化され得る。具体的には、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドのアミノ末端残基もしくはカルボキシ末端残基、または本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドの２つの内部残基が、融合されて、環化ペプチドを生成し得る。ペプチドを環化するための方法は、当該分野で非常に周知であり、例えば、Ｇｕｒｒａｔｈら、（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０：９１１〜９２１を参照のこと。
【００５６】
本発明は、本発明のポリペプチドに対応するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に対するあらゆる表面的な改変またはわずかな改変も企図する。特に、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸の改変体を企図する。ポリペプチド配列の「配列保存的改変体」は、所定のコドンの１つ以上のヌクレオチドの変化が、その位置においてコードされるアミノ酸の変化をもたらさない、改変体である。本発明のポリペプチドの機能保存的改変体もまた、本発明によって企図される。「機能保存的改変体」は、タンパク質または酵素中の１つ以上のアミノ酸残基が、そのポリペプチドの全体的立体構造および機能を変化することなく変化された、改変体であるが、アミノ酸を同様の特性を有するアミノ酸で置換することには、決して限定されない。同様の特性を有するアミノ酸は、当該分野で周知である。例えば、交換可能であり得る極性／親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が挙げられる；交換可能であり得る非極性／疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる；交換可能であり得る酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、交換可能であり得る塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンが挙げられる。
【００５７】
本発明は、ラットもしくはマウスのＮＰＣ１Ｌ１をコードするポリヌクレオチドおよびそのフラグメント、ならびにそれらのポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸を包含する。好ましくは、その核酸は、低ストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中ストリンジェシー条件下で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズする。核酸分子は、その核酸分子の一本鎖形態が、適切な温度条件および溶液イオン強度条件（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと）下で別の核酸分子にアニールし得る場合に、その核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ）に対して「ハイブリダイズ可能である」。温度条件およびイオン強度条件が、そのハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。代表的な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、０．２５％ミルク、ホルムアミドなし、４２℃；または３０％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、４２℃である。代表的な中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、低ストリンジェンシー条件と同様であるが、但し、ハイブリダイゼーションは、４０％ホルムアミド中で、５Ｘ  ＳＳＣもしくは６Ｘ  ＳＳＣを用いて４２℃で実行される。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、低ストリンジェンシー条件と同様であるが、但し、このハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣもしくは６Ｘ  ＳＳＣ中で、必要に応じて、より高温（例えば、４２℃より高く：５７℃，５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃、または６８℃）で実行される。一般に、ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣ１および０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーシ
ョンには、その２つの核酸が、相補的配列を含むことが必要とされるが、そのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当該分野で周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きい程、それらの核酸がハイブリダイズし得るストリンジェンシーが高くなる。１００ヌクレオチド長より長いハイブリッドについて、その融解温度を計算するための式が、誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）９．５０〜９．５１を参照のこと）。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置が、より重要になり、そのオリゴヌクレオチドの長さは、その特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと）。
【００５８】
本発明にまた含まれるのは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより比較を実施した場合に、参照ラットＮＰＣ１Ｌ１ヌクレオチド（例えば、配列番号１または５〜１０）およびアミノ酸配列（例えば、配列番号２）またはマウスＮＰＣ１ＬＣヌクレオチド（例えば、配列番号１１または１３）およびアミノ酸配列（例えば、配列番号１２）に対して、少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、最も好ましくは少なくとも約９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドおよびそのようなアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、このＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、このアルゴリズムのパラメーターは、個々の参照配列の長さ全体にわたって個々の配列間で最大の一致を生じるように選択される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより比較を実施した場合に、配列番号２の参照ラットＮＰＣ１Ｌ１アミノ酸配列または配列番号１２のマウスＮＰＣ１ＬＣアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％類似し、好ましくは少なくとも約８０％類似し、より好ましくは少なくとも約９０％類似し、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）類似する、アミノ酸配列を含むポリペプチドもまた、本発明に包含される。ここで、このアルゴリズムのパラメーターは、個々の参照配列の長さ全体にわたって個々の配列間で最長の一致を生じるように選択される。
【００５９】
配列同一性とは、比較されている２つの配列のヌクレオチド間またはアミノ酸間で野正確な一致を指す。配列類似性とは、比較されている２つのポリペプチドのアミノ酸間での正確な一致、および同一でない生化学的に関連するアミノ酸間の一致の両方をさす。類似する特性を共有して交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸は、上記に考察されている。
【００６０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する以下の参考文献は、本明細書中で参考として援用される：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら、（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら、（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アライメントスコアリングシステム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら、「Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７８）第５巻、補遺３、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編）、ｐｐ．３４５〜３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら「Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅ
ｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．」Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）第５巻，補遺３．」，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ
３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アライメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら、（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２．２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．」Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００６１】
（タンパク質精製）
本発明のタンパク質、ポリペプチド、および抗原性フラグメントは、標準的方法（塩沈もしくはアルコール沈殿、アフィニティクロマトグラフィ（例えば、上記で考察したようなタグ化ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドの精製と組み合わせて使用する）、調製用ディスクゲル電気泳動、等電集束法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、カチオン交換クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィー、および分配クロマトグラフィー、および向流分配が挙げられるが、これらに限定されない）によって、精製され得る。そのような精製方法は、当該分野で周知であり、例えば、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．に開示される。
【００６２】
精製工程の後には、下記に記載されるようなレセプター結合活性についてのアッセイの実行が行われ得る。ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドが細胞供給源もしくは組織供給源から単離される場合には特に、アッセイ系にタンパク質分解酵素の１つ以上のインヒビター（例えば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ、ペプスタチン、ロイペプトン、キモスタチン、およびＥＤＴＡ）を含むことが、好ましい。
【００６３】
（抗体分子）
本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドの抗原性（免疫原性を含む）フラグメント（例えば、配列番号２、４、または１２由来の４２個以上連続するアミノ酸）は、本発明の範囲内にある。その抗原性ペプチドは、ＮＰＣ１Ｌ１を認識する抗体分子を調製するために、特に有用であり得る。抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子は、有用なＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストである。
【００６４】
抗原は、抗体に特異的に結合し得る任意の分子である。いくつかの抗原は、単独では、抗体生成を惹起し得ない。抗体生成を誘導し得る抗原は、免疫原である。
【００６５】
好ましくは、抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体は、配列番号３９〜４２から選択されるアミノ酸配列を含む抗原性ペプチド（例えば、ラットＮＰＣ１Ｌ１由来の抗原）を認識する。より好ましくは、その抗体は、Ａ０７１５、Ａ０７１６、Ａ０７１７、Ａ０７１８、Ａ０８６７、Ａ０８６８、Ａ１８０１、またはＡ１８０２である。
【００６６】
用語「抗体分子」は、抗体およびそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）を包含するが、これらに限定されない。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントを包含する。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。
【００６７】
常に必要であるわけではないが、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドが、免疫学的に適格な宿主において抗体生成を惹起するための抗原として使用される場合、より小さい抗原性フラグメントが、好ましくは、まず、架橋もしくはコンカテマー形成によってか、または免疫原性キャリア分子（すなわち、宿主動物において免疫学的応答を独立して惹起する特性を有する高分子（例えば、ジフテリア毒素または破傷風毒素））に結合体化することによって、より免疫原性にされる。架橋またはキャリア分子への結合体化が、必要とされ得る。なぜなら、小さいポリペプチドフラグメントは、時には、ハプテン（抗体に特異的に結合可能であるが抗体生成を惹起する能力はない（すなわち、免疫原性ではない）分子）として作用するからである。免疫原性キャリア分子にこのようなフラグメントを結合体化すると、そのようなフラグメントは、一般的には「キャリア効果」として公知であるものを介して、より免疫原性になる。
【００６８】
キャリア分子としては、例えば、タンパク質、および天然ポリマー化合物または合成ポリマー化合物（例えば、ポリペプチド、多糖、リポ多糖など）が挙げられる。タンパク質キャリア分子が、特に好ましく、それには、キーホールリンペットヘモシアニンおよび哺乳動物血清タンパク質（例えば、ヒトガンマグロブリンもしくはウシガンマグロブリン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、もしくはウサギ血清アルブミン、またはこのようなタンパク質のメチル化誘導体もしくは他の誘導体）が挙げられるが、これらに限定されない。他のタンパク質キャリアは、当業者にとって明らかである。好ましくは、このタンパク質キャリアは、そのフラグメントに対する抗体が惹起される宿主動物に対して、外来である。
【００６９】
このキャリア分子に対する共有結合は、当該分野で周知の方法を使用して達成され得、その正確な選択は、使用されるキャリア分子の性質によって示される。その免疫原性キャリア分子がタンパク質である場合、本発明のフラグメントは、例えば、水溶性カルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはグルタルアルデヒド）を使用して、結合され得る。
【００７０】
これらのようなカップリング剤はまた、別のキャリア分子を使用することなく、そのフラグメントをそのカップリング剤自体に架橋するために使用され得る。凝集物へのそのような架橋はまた、免疫原性を増加し得る。免疫原性はまた、既知のアジュバンを単独でかまたはカップリングもしくは凝集と組み合わせて使用することによって、増加され得る。
【００７１】
動物のワクチン接種のためのアジュバントとしては、アジュバント６５（落花生油、モノオレイン酸マンノイド（ｍａｎｎｉｄｅ）、モノステアリン酸アルミニウムを含む）；フロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント；ミネラルゲル（例えば、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびミョウバン）；界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール；ポリアニオン（例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩ
Ｃ、ポリアクリル酸、およびカルボポール）；ペプチド（例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシン（ｔｕｆｔｓｉｎ）；ならびに油乳濁物が挙げられるが、これらに限定されない。このポリペプチドはまた、リポソームまたは他のマイクロキャリア中に組み込まれた後に、投与され得る。
【００７２】
アジュバントおよび免疫アッセイの種々の局面に関する情報は、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｌｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，第３版，１９８７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋによるシリーズ中に開示される。ポリクローナル抗血清を調製するための方法を網羅する他の有用な参考文献としては、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９６９，Ｈｏｅｂｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＨａｒｐｅｒおよびＲｏｗ；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，１９６２，Ｄｏｖｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ならびにＷｉｌｌｉａｍｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｌｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ，Ｖｏｌ．１，１９６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋが挙げられる。
【００７３】
本発明の抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子は、ヒト、マウス、またはラットのＮＰＣ１Ｌ１を好ましくは認識するが、本発明は、任意の種（好ましくは、哺乳動物（例えば、ネコ、ヒツジ、またはウマ）由来のＮＰＣ１Ｌ１を認識する抗体分子を包含する。本発明はまた、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドと抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子とを含む、複合体を包含する。そのような複合体は、抗体分子を、その同族ポリペプチドと単に接触することによって、生成され得る。
【００７４】
種々の方法が、本発明の抗体分子を生成するために使用され得る。ヒト抗体は、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；同第５，８７７，３９７号；同第６，２５５，４５８号；同第６，０２３，０１０号および同第５，８７４，２９９号に開示される方法と同様の方法によって、生成され得る。
【００７５】
モノクローナル抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体を生成するハイブリドーマ細胞は、当該分野で一般的に公知である方法によって生成され得る。これらの方法としては、Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）によって元々開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術（Ｈｅｒｉｎｇら、（１９８８）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４７：２１１−２１６およびＨａｇｉｗａｒａら、（１９９３）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ４：１５）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２
ａｎｄ  Ｃｏｔｅら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｑｐ  ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５）が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＬＩＳＡは、ハイブリドーマ細胞が抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体を発現しているか否かを決定するために、使用され得る。
【００７６】
本発明の抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子はまた、組換えにより（例えば、上記で考察したようなＥ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系において）生成され得る。この実施形態において、本発明の抗体分子（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸は、ｐｅｔベースのプラスミド中に挿入され得、そしてＥ．ｃｏｌｉ／Ｔ７系において発現され得る。組換え抗体を生成するためには、当該分野で公知であるいくつかの方法が、存在する。抗体の組換え生成のための方法の例は、米国特許第４，８１６，５６７号に開示される。また、Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４１；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ
．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６もまた、参照のこと。
【００７７】
用語「モノクローナル抗体」は、実質的な均質な抗体の集団から得られた抗体（すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る、可能な天然に存在する変異以外は同一である）を包含する。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物（特に、他の免疫グロブリンによって汚染されていない）によって合成され得るという点で、有利である。修飾語「モノクローナル」とは、実質的な均質な抗体集団から得られたものとしてのその抗体の特徴を示し、特定の何らかの方法によるその抗体の生成を必要とするものとしては、解釈されるべきではない。本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって記載されるハイブリドーマ方法によって生成され得る。
【００７８】
用語「ポリクローナル抗体」は、他の１つ以上の同一でない抗体とともにか、またはそのような抗体の存在下で、生成された抗体を包含する。一般に、ポリクローナル抗体は、同一でない抗体を生成した他のいくつかのＢリンパ球の存在下であるＢリンパ球から生成される。代表的には、ポリクローナル抗体は、免疫された動物（例えば、ウサギ）から直接得られる。
【００７９】
「二重特異性抗体」は、別個の抗原に結合する２つの異なる抗原結合領域を含む。二重特異性抗体、ならびにその抗体を生成する方法および使用する方法は、従来通りであり、当該分野で非常に周知である。
【００８０】
抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプとは、別の抗体分子の抗原結合領域または可変領域（イディオタイプと呼ばれる）に対する抗体である。Ｊｅｒｎｅ（Ｊｅｒｎｅ，Ｎ．Ｋ．，（１９７４）Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１２５ｃ：３７３およびＪｅｒｎｅ，Ｎ．Ｋ．ら、（１９８２）ＥＭＢＯ  １：２３４）により開示されるように、所定の抗原（例えば、ＮＰＣ１Ｌ１）に対するパラと−プ（抗原結合部位）を発現する抗体分子による免疫は、一群の抗抗体を生成し、その抗抗体のいくつかは、その抗原と、そのパラと−プに対する相補的構造を共有する。その抗イディオタイプ抗体の部分集団による免疫は、その後、最初の抗原に対して反応性である抗体部分集団を生成するか、または細胞部分集団を免疫する。
【００８１】
用語「完全ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン配列のみを含む抗体を指す。同様に、「マウス抗体」とは、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体を指す。
【００８２】
「ヒト／マウスキメラ抗体」とは、ヒト定常領域に融合されたマウス可変領域（ＶＨおよおびＶＬ）を含む抗体を指す。
【００８３】
「ヒト化」抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体もまた、本発明の範囲内にある。ヒト化形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、キメラ免疫グロブリンであり、これは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む。多くは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域由来の残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）の相補性決定領域由来の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合、そのヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基もまた、対応する非ヒト残基によって置換される。
【００８４】
「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に
存在する。一般に、ｓＦｖポリペプチドは、このＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、そのｓＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成可能であるようにするポリペプチドリンカーを、さらに含む。単鎖抗体の生成について記載された技術（米国特許第５，４７６，７８６号；同第５，１３２，４０５号および同第４，９４６，７７８号）は、抗ＮＰＣ１Ｌ１特異的単鎖抗体に適合され得る。ｓＦｖの概説について、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【００８５】
「ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント」および「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって連結された可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）を有する分子を包含する。
【００８６】
本発明の範囲内にある抗体フラグメントはまた、ＩｇＧの酵素（例えば、ペプシン）切断により生成され得るＦ（ａｂ）２フラグメントを包含する。Ｆａｂフラグメントは、例えば、ジチオスレイトールまたはメルカプトエチルアミンを用いるＦ（ａｂ）２の還元によって、生成され得る。
【００８７】
Ｆｖフラグメントは、ＶＨ領域またはＶＬ領域である。
【００８８】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、種々のクラスへと割当てられ得る。免疫グロブリンについて、少なくとも５つの主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ。これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２）へと分割され得る。
【００８９】
本発明の抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子は、キメラ抗体に結合体化され得る。この化学部分は、特に、ポリマー、放射性核種または細胞傷害性因子であり得る。好ましくは、この化学部分は、被験体の身体におけるその抗体分子の半減期を増加するポリマーである。適切なポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａを有するＰＥＧ）、デキストランおよびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第６，１３３，４２６号に記載されるＰＥＧ化抗ＩＬ−８抗体を生成するための方法は、本発明のＰＥＧ化抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体の生成に適用され得る。Ｌｅｅら、（１９９９）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：９７３−９８１）は、ＰＥＧ結合体化単鎖抗体を開示する。Ｗｅｎら、（２００１）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５−５５３）は、放射性金属キレート剤（ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ））に結合されたＰＥＧと抗体を結合体化することを開示する。
【００９０】
本発明の抗体分子はまた、標識（例えば、９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈ、４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒまたは５６Ｆｅ）と結合体化され得る。
【００９１】
本発明の抗体分子はまた、蛍光標識または化学発光標識（発蛍光団（例えば、希金属キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレサミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン（ｓｐｉｎ）標識、および安定なフリーラジカルを包含する）と結合体化され得る。
【００９２】
この抗体分子はまた、細胞傷害性因子（例えば、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ内毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉのタンパク質および化合物（例えば、脂肪酸）、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｉａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシンおよびエノマイシン）に結合体化され得る。
【００９３】
本発明の抗体分子を種々の部分に結合体化するための当該分野で公知の任意の方法が、使用され得、その方法としては、Ｈｕｎｔｅｒら、（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら、（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４；Ｐａｉｎら、（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．，（１９８２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７が挙げられる。
【００９４】
抗体を結合体化するための方法は、従来通りであり、当該分野で非常に周知である。
【００９５】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、種々の医学的状態（上昇した血清コレステロールレベルを含む）の処置および管理において有用であり得る、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、４、または１２）の選択的アゴニストおよびアンタゴニストの発見を可能にする。従って、本発明のＮＰＣ１Ｌ１は、アゴニストまたはアンタゴニストを同定するためにスクリーニング系において使用され得る。本質的には、これらの系は、ＮＰＣ１Ｌ１を、適切な既知のリガンドまたは既知のアゴニストもしくはアンタゴニスト（コレステロール、エゼチマイブ、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチマイブ（Ａｌｔｍａｎｎら（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５８０（１）：７７〜９３）またはＤｅＮｉｎｎｏら（１９９７）（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０（１６）：２５７４〜５４）（Ｍｅｒｃｋ；Ｌ−１６６，１４３）に記載されるような１１−ケトチゴゲニンの４’’，６’’−ビス［（２−フルオロフェニル）カルバモイル］−β−Ｄ−セロビオシル誘導体を包含する）、およびＮＰＣ１Ｌ１アゴニストもしくはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在について試験されるべきサンプルと接触させる方法を提供する。サンプルがＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストを含むか否かを評価するための簡便な方法は、そのサンプルが、既知のアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、エゼチマイブ）と、ＮＰＣ１Ｌ１との間の結合について競合する物質を含むか否かを決定することである。
【００９６】
エゼチマイブは、当業者に周知の種々の方法（例えば、米国特許第５，６３１，３６５号、同第５，７６７，１１５号、同第５，８４６，９６６号、同第６，２０７，８２２号、米国特許公開番号２００２／０１９３６０７およびＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０２０４８（その各々は、その全体が参考として本明細書中で援用される）に開示される方法）によって、調製され得る。
【００９７】
「サンプル」、「候補化合物」または「候補物質」とは、例えば、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、４、もしくは１２）またはその機能性フラグメントとアゴナイズまたはアンタゴナイズする能力について、試験またはアッセイにおいて評価される組成物を指す。この組成物は、低分子、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、亜原子粒子（例えば、α粒子、β粒子）、または抗体であり得る。
【００９８】
２つの基本的な型のスクリーニング系が使用され得、それは、標識−リガンド結合アッセイ（例えば、直接結合アッセイまたはシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ））および「コレステロール取り込み」アッセイである。この結合アッセイにおける使用のための標識リガンドは、コレステロールまたは既知のＮＰＣ１Ｌ１アゴニストもしくは既知のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストを、測定可能な基（例えば、１２５Ｉまたは３Ｈ）で標識することによって、得られ得る。種々の標識形態のコレステロールが、市販されているか、または標準的な技術を使用して生成され得る（例えば、コレステロール−［１，２−３Ｈ（Ｎ）］、コレステロール−［１，２，６，７−３Ｈ（Ｎ）］またはコレステロール−［７−３Ｈ（Ｎ）］；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。好ましい実施形態において、エゼチマイブは、ＢＯＤＩＰＹ基で蛍光標識される（Ａｌｔｍａｎｎら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５８０（ｌ）：７７−９３）か、または検出可能な基（例えば、１２５Ｉまたは３Ｈ）で標識される。
【００９９】
（直接結合アッセイ）
代表的には、所定量の本発明のＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、４、もしくは１２）が、漸増量の標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニスト（上記に考察される）と接触され、結合した標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの量が、未結合の標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストを洗浄により除去した後に、測定される。標識されたリガンドまたは既知アゴニストもしくは既知アンタゴニストの量が増加した場合、すべてのレセプター結合部位が占有されるかまたは飽和される点に、最終的に到達する。その標識されたリガンドまたは既知アゴニストもしくは既知アンタゴニストの特異的レセプター結合は、大過剰の標識されていないリガンドまたは既知アゴニストもしくは既知アンタゴニストによって、廃止される。
【０１００】
好ましくは、レセプターに対する上記標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの非特異的結合が最小限であるアッセイ系が、使用される。非特異的結合は、代表的には、標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの全結合のうちの５０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満である。
【０１０１】
本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド（例えば、配列番号２、４、または１２）をコードする核酸は、適切な宿主細胞中にトランスフェクトされ得、それにより、上記レセプターは、その細胞の膜に組み込まれる。その後、膜画分が、その細胞から単離され得、アッセイのためにそのレセプターの供給源として使用され得る。あるいは、その細胞表面においてそのレセプターを発現する細胞全体が、アッセイにおいて使用され得る。好ましくは、トランスフェクトされていない宿主細胞／形質転換されていない宿主細胞に対する、またはトランスフェクトされていない宿主細胞／形質転換されていない宿主細胞由来の膜画分に対する、上記の標識されたリガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの特異的結合は、無視できる。
【０１０２】
原理的には、本発明の結合アッセイは、本発明の可溶性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系からの標準的方法による生成およびリフォールディングの後に使用して、実行され得る。生じたレセプター−標識リガンド複合体は、例えば、そのレセプターに対する抗体を使用して沈殿され得る。その後、その沈殿物は、洗浄され得、結
合した標識されたリガンドまたはアンタゴニストもしくはアゴニストの量が、測定され得る。
【０１０３】
基本的結合アッセイにおいて、ＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストを同定するための方法は、
（ａ）ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２）またはその部分配列を、既知量の検出可能に標識されたコレステロールまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニスト（例えば、標識されたエゼチマイブ、または標識Ｌ−１６６，１４３）の存在下で、ＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在について試験されるべきサンプルと接触する工程；ならびに
（ｂ）そのレセプターに結合した標識されたコレステロールまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの量を測定する工程；
を包含する。
【０１０４】
サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アゴニストは、そのようなアンタゴニストまたはアゴニストの非存在下で測定される結合と比較して、ＮＰＣ１Ｌ１に対する上記標識されたコレステロールまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識された既知アゴニストの実質的に減少した結合を測定することによって、同定される。例えば、サンプルの存在下での［３Ｈ］−コレステロールとＮＰＣ１Ｌ１との間における減少した結合は、そのサンプルが、ＮＰＣ１Ｌ１結合について［３Ｈ］−コレステロールと競合している物質を含むことを示唆する。
【０１０５】
あるいは、サンプルは、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、４、または１２）に対する結合について直接試験され得る。この型の基本的アッセイは、以下の工程を包含し得る：
（ａ）ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２もしくは４もしくは１２）またはその部分配列を、標識候補化合物（例えば、［３Ｈ］−エゼチマイブ）と接触する工程；および
（ｂ）その標識候補化合物と、ＮＰＣ１Ｌ１との間の結合を検出する工程。
【０１０６】
ＮＰＣ１Ｌ１に結合することが見出される候補化合物は、（例えば、コレステロール取り込みの阻害によって）ＮＰＣ１Ｌ１のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得る。
【０１０７】
（ＳＰＡアッセイ）
ＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アゴニストはまた、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用して測定され得る。ＳＰＡアッセイは、従来的であり、当該分野で非常に周知である。例えば、米国特許第４，５６８，６４９号を参照のこと。ＳＰＡにおいて、目的の標的は、直径約５ミクロンの小さいミクロスフェアに固定される。このミクロスフェアは、代表的には、ポリヒドロキシフィルムでコートされた固体シンチラントコアを含み、これは次いで、カップリング分子を含み、このカップリング分子は、アッセイ設計のための遺伝的関連付けを可能にする。放射性同位体標識された分子がこのミクロスフェアに結合する場合、この放射性同位体は、シンチラントに非常に近接され、この同位体により発せられる電子からの有効なエネルギー移動が、生じて、光の発生をもたらす。その放射性同位体が自由溶液中に残る間に、その放射性同位体は、シンチラントからあまりにも遠すぎる。電子は、水性媒体中にエネルギーを散逸し、従って、検出されないままである。シンチレーションは、シンチレーションカウンターを用いて検出され得る。一般に、３Ｈ標識および１２５Ｉ標識が、ＳＰＡにとって十分に適切である。
【０１０８】
レセプター媒介結合事象のアッセイのために、レクチンコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）が、ＳＰＡビーズカップリング分子（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）として使用され得る。このＷＧＡ結合ビーズは、グリコシル化された細胞膜および糖タンパク質を捕捉する。このビーズは、広範な種類のレセプター供給源および培養細胞膜のために使用されている。このレセプターは、ＷＧＡ−ＳＰＡビーズ上に固定され、シグナルが、同位体標識されたリガンドの結合に際して生成される。レセプター結合ＳＰＡアッセイのために有用であり得る他のカップリング分子としては、ポリ−Ｌ−リジンおよびＷＧＡ／ポリエチレンイミン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。例えば、Ｂｅｒｒｙ，Ｊ．Ａ．ら、（１９９１）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７（Ｓｕｐｐｌ．７）：Ｓ１４３−Ｓ１４５；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．ら、（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３：７０−７５；Ｋｉｅｎｈｕｓら、（１９９２）Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８９−３９９；Ｊｉｎｇ，Ｓ．ら、（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ  ９：１０６７〜１０６９。
【０１０９】
ＳＰＡビーズ中に含まれるシンチラントとしては、例えば、ジフェニルアントラシン（ＤＰＡ）の固体溶媒として作用する、ケイ酸イットリウム（ＹＳｉ）、酸化イットリウム（ＹＯｘ）、ジフェニルオキサゾールまたはポリビニルトルエン（ＰＶＴ）が挙げられ得る。
【０１１０】
ＳＰＡアッセイは、サンプルがＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アゴニストであるか否かを分析するために使用され得る。これらのアッセイにおいて、細胞表面上にＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２もしくは４もしくは１２）を発現する宿主細胞またはその膜画分が、ＳＰＡビーズ（例えば、ＷＧＡコートＹＯｘビーズ、またはＷＧＡコートＹＳｉビーズ）、および標識された既知リガンドまたは標識された既知アゴニストもしくは標識された既知アンタゴニスト（例えば、３Ｈ−コレステロール、３Ｈ−エゼチマイブまたは１２５Ｉ−エゼチマイブ）とともにインキュベートされる。このアッセイ混合物は、試験されるべきサンプル、またはブランク（例えば、水）のいずれかをさらに含み得る。必要に応じたインキュベーションの後に、シンチレーションが、シンチレーションカウンターを使用して測定される。ＮＰＣ１Ｌ１アゴニストまたはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストが、そのようなアゴニストまたはアンタゴニスト（ブランク）の非存在下で測定される蛍光と比較して、実質的に減少した蛍光を測定することによって、サンプル中で同定され得る。実質的に減少した蛍光を測定することは、そのサンプルが、上記の既知リガンド、既知アゴニストまたは既知アンタゴニストとＮＰＣ１Ｌ１結合について競合する物質を含むことを、示唆し得る。
【０１１１】
あるいは、サンプルは、ＳＰＡアッセイにおいて結合を直接検出することによって、ＮＰＣ１Ｌ１のアンタゴニストまたはアゴニストとして同定され得る。このアッセイにおいて、試験されるべき候補化合物の標識形態が、ＳＰＡビーズに結合された、ＮＰＣ１Ｌ１を発現する宿主細胞またはその膜画分と接触するように配置され得る。その後、蛍光は、標識候補化合物と、ＮＰＣ１Ｌ１を発現する宿主細胞または膜画分との間の複合体の存在を検出するためにアッセイされ得る。ＮＰＣ１Ｌ１に結合する候補化合物は、ＮＰＣ１Ｌ１アゴニスト活性またはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニスト活性を保有し得る。
【０１１２】
ＮＰＣ１Ｌ１を発現する宿主細胞は、本発明のＮＰＣ１Ｌ１をコードする核酸を適切な宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトし、それによりそのレセプターがその細胞の膜中に組み込まれることによって調製され得る。その後、膜画分が、その細胞から単離され得、そしてアッセイについてそのレセプター供給源として使用され得る。あるいは、その細胞表面上でそのレセプターを発現する細胞全体が、アッセイにおいて使用され得る。好ましくは、トランスフェクトされていない宿主細胞／形質転換されていない宿主細胞、またはランスフェクトされていない宿主細胞／形質転換されていない宿主細胞由来の膜画分に対する、上記の標識リガンドまたは標識された既知アンタゴニストもしくは標識さ
れた既知アゴニストの特異的結合は、無視できる。好ましい宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスマクロファージＪ７７４細胞または他の任意のマクロファージ細胞株、およびヒト腸上皮Ｃａｃｏ２細胞が挙げられる。
【０１１３】
（コレステロール取り込みアッセイ）
アッセイは、サンプルが、ＮＰＣ１Ｌ１媒介性コレステロール取り込みをアゴナイズまたはアンタゴナイズし得るか否かを決定するために、実施され得る。これらのアッセイにおいて、（上記で考察された）細胞表面にＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２もしくは４もしくは１２）を発現する宿主細胞が、検出可能に標識されたコレステロール（例えば、３Ｈ−コレステロールまたは１２５Ｉ−コレステロール）と、サンプルまたはブランクのいずれかとともに接触され得る。必要に応じたインキュベーションの後、その細胞は、吸収されていないコレステロールを除去するために洗浄され得る。コレステロール取り込みは、宿主細胞における標識コレステロールの存在を検出することによって、決定され得る。例えば、アッセイされる細胞またはその溶解物もしくは画分（例えば、薄層クロマトグラフィーにより分離された画分）は、液体シンチレーションと接触され得、そしてシンチレーションが、シンチレーションカウンターを使用して測定され得る。
【０１１４】
これらのアッセイにおいて、サンプル中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、そのようなアンタゴニストの非存在下で測定される取り込みと比較して、実質的に減少した標識コレステロール（例えば、３Ｈ−コレステロール）の取り込みを測定することによって、同定され得、アゴニストは、そのようなアゴニストの非存在下で測定される取り込みと比較して、実質的に増加した標識コレステロール（例えば、３Ｈ−コレステロール）の取り込みを測定することによって、同定され得る。
【０１１５】
（薬学的組成物）
例えば、上記のスクリーニング方法によって発見されたＮＰＣ１Ｌ１アゴニストおよびＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、ＮＰＣ１Ｌ１の活性を刺激またはブロックするために治療的に（例えば、薬学的組成物中で）使用されて、それにより、そのレセプターにより引き起こされるかまたは媒介される任意の医学的状態が処置され得る。例えば、本発明の抗体分子はまた、ＮＰＣ１Ｌ１に結合するために治療的に（例えば、薬学的組成物中で）使用されて、それにより、そのレセプターがコレステロールに結合する能力がブロックされ得る。コレステロールの結合をブロックすることは、（例えば、腸細胞（例えば、腸細胞）による）その分子の吸収を防止し得る。コレステロールの吸収をブロックすることは、被験体における血清コレステロールレベルを低下させ、それによって、例えば、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈心疾患、発作または動脈硬化症の発生を減少するために有用な方法であり得る。
【０１１６】
用語「被験体」または「患者」は、任意の生物（好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウマ、霊長類、ネコ）、最も好ましくはヒト）を包含する。
【０１１７】
用語「薬学的組成物」は、活性成分と薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントとを含む、組成物を指す。
【０１１８】
本発明の組成物は、単純溶液中で投与され得るが、その組成物は、代表的には、他の材料（例えば、キャリア、好ましくは薬学的に受容可能なキャリア）と組み合わせて使用される。有用な薬学的に受容可能なキャリアは、本発明の組成物を被験体に送達するために適切な、任意の適合性の非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、蝋、および不活性固体が、薬学的に受容可能なキャリア中に含まれ得る。薬学的に受容可能なアジュバント（緩衝剤、分散剤）はまた、薬学的に組成物中に組み込まれ得る。
【０１１９】
好ましくは、本発明の薬学的組成物は、ピルまたはカプセル剤の形態である。ピルおよびカプセル剤を処方するための方法は、当該分野で非常に周知である。例えば、錠剤またはカプセル剤の形態での経口投与のために、活性薬物成分は、任意の経口非毒性の薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、ラクトース、デンプン、ショ糖、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、滑石、マンニトール、エチルアルコール（液体形態）などと合わさられ得る。さらに、望ましい場合または必要な場合には、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた、この混合物中に組み込まれ得る。適切な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、トウモロコシ甘味料、天然ガムおよび合成ガム（例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、および蝋）が挙げられる。これらの投与形態での使用について言及され得るこの滑沢剤の中には、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがある。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、ガーゴムなどが挙げられる。甘味料および矯味矯臭剤および保存剤もまた、適切な場合に含まれ得る。
【０１２０】
本発明の薬学的組成物は、第２の薬学的組成物または物質と組み合わせて投与され得る。好ましい実施形態において、この第２の組成物は、コレステロール低下薬物を含む。併用治療が使用される場合、両方の組成物が、同時送達のために単一組成物へと処方され得るか、または２つ以上の組成物（例えば、キット）へと別々に処方され得る。
【０１２１】
この処方物は、単位投与形態で簡便に提示され得、そして薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０），Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（前出），Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎ．；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１２２】
治療適用に関与する投与レジメンは、治療物質の作用を改変し得る種々の要因（例えば、患者の状態、体重、性別および食事、任意の感染の重篤度、投与回数、および他の臨床因子）を考慮して、医師によって決定され得る。しばしば、処置投与量は、低レベルから上向きに滴定されて、安全性および効力が最適にされる。投与量は、小さい分子サイズおよびおそらく減少する投与後の半減期（クリアランス時間）を計上するように調整され得る。
【０１２３】
本発明のアンタゴニストの「有効量」は、腸コレステロール吸収のレベルを検出可能に減少するか、またはその組成物を投与された被験体中の血清コレステロールレベルを検出可能に減少する量であり得る。
【０１２４】
そのような物質の治療投与のための代表的なプロトコルは、当該分野で周知である。本発明の薬学的組成物は、例えば、任意の腸管外経路または非腸管外経路によって、投与され得る。
【０１２５】
本発明のピルおよびカプセル剤は、経口投与され得る。注射可能な組成物が、当該分野で公知の医療デバイスを用いて、例えば、皮下針を用いる注射によって、投与され得る。
【０１２６】
本発明の注射可能な薬学的組成物はまた、針なし皮下注射デバイス（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイス）を用いて、投与され得る。
【０１２７】
（アンチセンス）
本発明はまた、例えば配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２により規定されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するＮＰＣ１Ｌ１をコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５〜配列番号１１または配列番号１３）に特異的にハイブリダイズしてそのｍＲＮＡの翻訳を防止することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。さらに、本発明は、例えば配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２により規定されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するＮＰＣ１Ｌ１をコードするゲノムＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。
【０１２８】
本発明はさらに、（ａ）ＮＰＣ１Ｌ１媒介性コレステロール吸収を、細胞膜を通過してその細胞中のＮＰＣ１Ｌ１をコードするｍＲＮＡに特異的に結合してそのｍＲＮＡの翻訳を防止することによって減少するために有効な一定量のオリゴヌクレオチドと、（ｂ）細胞膜を通過可能な薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物を提供する。一実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを不活化する物質に結合されている。別の実施形態において、ｍＲＮＡを不活化する物質は、リボザイムである。
【実施例】
【０１２９】
以下の実施例は、本発明をより明確に記載するために提供されており、本発明の範囲を限定するとは決して解釈されるべきではない。
【０１３０】
（実施例１：ラットＮＰＣ１Ｌ１、マウスＮＰＣ１Ｌ１およびヒトＮＰＣ１Ｌ１のクローニングおよび発現）
ラットＮＰＣ、マウスＮＰＣ１Ｌ１またはヒトＮＰＣ１Ｌ１は、すべてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して簡便に増幅し得る。このアプローチにおいて、ラットｃＤＮＡライブラリー、マウスｃＤＮＡライブラリー、またはヒトｃＤＮＡライブラリーからのＤＮＡを、適切なプライマーおよび標準的ＰＣＲ条件を使用して増幅し得る。プライマーの設計および最適な増幅条件は、当該分野で一般的に公知である標準的技術を構成する。
【０１３１】
増幅したＮＰＣ１Ｌ１遺伝子は、これもまた当該分野で一般的に公知である方法を使用して、簡便に発現させ得る。例えば、ＮＰＣ１Ｌ１を、ｐＥＴベースのプラスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｏｌａ，ＣＡ）中のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流に挿入し得る。その後、このプラスミドを、Ｔ７発現系（例えば、ＢＬ２１ＤＥ３  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）中に形質転換し得、液体培養中で増殖させ得、そして（例えば、ＩＰＴＧをその細菌培養物に添加することによって）誘導し得る。
【０１３２】
（実施例２：直接的結合アッセイ）
（膜調製物）  ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、配列番号４、または配列番号１２）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトしたＣａｃｏ２細胞を、５ｍＭ  ＥＤＴＡ／リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートし、その後、繰返しピペッティングすることによって採集する。その細胞を、１０００×ｇにて５分間遠心分離する。このＥＤＴＡ／ＰＢＳを捨て、等容量の氷冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加し、細胞をＰｏｌｙｔｒｏｎ（ＰＴ１０チップ、設定５、３０秒）で破壊する。核および未破壊の細胞を、１０００×ｇにて１０分間沈降させ、そ
の後、上清を５０，０００×ｇで１０分間遠心分離する。その上清を捨て、ペレットをＰｏｌｙｔｒｏｎにより再懸濁し、サンプルをタンパク質アッセイ（ビシンコニニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ），Ｐｉｅｒｃｅ）用に得、この組織を再度５０，０００×ｇで遠心分離する。ペレットを、−２０℃にて凍結保存する。
【０１３３】
（結合アッセイ）  飽和結合のために、４種類の濃度の［３Ｈ］−エゼチマイブ（ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、１０−５Ｍエゼチマイブを伴わずにか１０−５Ｍエゼチマイブとともに、５０μｇの膜タンパク質とともに、総容量２００μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で３０℃にて３０分間、３連でインキュベートする。サンプルをＧＦ／Ｂフィルターにて濾過し、２ｍｌの冷Ｔｒｉｓ緩衝液で３回洗浄する。フィルターを電子レンジ中で乾燥し、Ｍｅｌｔｉｌｅｘワックスシンチラントに浸漬し、そして４５％効率で計数する。競合結合アッセイのために、５種類の濃度のサンプルを、上記の条件下で、１８ｎＭ  ［３Ｈ］−エゼチマイブおよび７０μｇの膜タンパク質とともに３連でインキュベートする。曲線を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）非線形最小二乗曲線フィットプログラムを用いてこのデータにフィットさせ、Ｋｉ値を、ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｃ．ら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９〜３１０８）に従ってＩＣ５０値から誘導する。
【０１３４】
（実施例３：ＳＰＡアッセイ）
９６ウェルプレートの各ウェルについて、１０μｇのヒトＮＰＣ１Ｌ１−ＣＨＯ過剰発現膜、マウスＮＰＣ１Ｌ１−ＣＨＯ過剰発現膜またはラットＮＰＣ１Ｌ１−ＣＨＯ過剰発現膜（Ｂｉｏｓｉｇｎａｌ）と２００μｇ／ウェルのＹｓｉ−ＷＧＡ−ＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）との反応混合物（１００μｌ）を、ＮＰＣ１Ｌ１アッセイ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ）中にて調製する。０．４ｎＭのリガンド−［１２５Ｉ］−エゼチマイブストックを、ＮＰＣ１Ｌ１アッセイ緩衝液中で調製する。上記の溶液を、以下のように９６ウェルアッセイプレートに添加する：５０μｌのＮＰＣ１Ｌ１アッセイ緩衝液、１００μｌの反応混合物、５０μｌのリガンドストック（最終濃度は、０．１ｎＭである）。このアッセイプレートを、プレート振盪機にて５分間振盪し、その後、８時間インキュベートした後に、ｃｐｍ／ウェルを、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にて測定する。
【０１３５】
これらのアッセイは、［１２５Ｉ］−エゼチマイブが、ヒトＮＰＣ１Ｌ１を発現する細胞膜、マウスＮＰＣ１Ｌ１を発現する細胞膜またはラットＮＰＣ１Ｌ１を発現する細胞膜に結合することを示す。同様の結果が、同じ実験を放射標識コレステロール（例えば、１２５Ｉ−コレステロール）を用いて実施した場合に得られる。
【０１３６】
（実施例４：コレステロール取り込みアッセイ）
ＳＲ−Ｂ１を発現するＣＨＯ細胞またはラットＮＰＣ１Ｌ１の３種の異なるクローンもしくは１種のマウスＮＰＣ１Ｌ１クローンを発現するＣＨＯ細胞のいずれかを、無コレステロール培地中で一晩飢餓にし、その後、混合合成ミセルエマルジョン中の［３Ｈ］−コレステロールを、１０μＭエゼチマイブの非存在下または存在下で４分間、８分間、１２分間、または２４分間投与した。その細胞を採取し、脂質を組織的に抽出した。抽出した脂質を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上にスポットし、有機蒸気相内で分離した。各アッセイについての遊離コレステロールのバンドを単離し、シンチレーションカウンターにて計数した。
【０１３７】
ＳＲ−Ｂ１発現細胞は、４分間程度の初期に［３Ｈ］−コレステロール取り込みの増加を示した。この増加はまた、エゼチマイブによって抑制された。これらの３種のラットク
ローンおよび１種のマウスクローンは、バックグラウンドレベルの［３Ｈ］−コレステロール取り込みを生じるように見えた。この取り込みは、非形質転換ＣＨＯ細胞の取り込みと同様であった。
【０１３８】
これらの実験は、ＣＨＯ細胞が、より最適な実験条件が開発された場合には、マウスＮＰＣ１Ｌ１依存性、ラットＮＰＣ１Ｌ１依存性、およびヒトＮＰＣ１Ｌ１依存性の［３Ｈ］−コレステロール取り込みを実施し得ることを示すデータを生じる。
【０１３９】
（実施例５：Ｗｉｓｔａｒラット組織におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の発現）
これらの実験において、いくつかのラット組織におけるラットＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡの発現を、評価した。評価した組織は、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸、遠位結腸、肝臓、膵臓、心臓、大動脈、脾臓、肺、腎臓、脳、筋肉、精巣、卵巣、子宮、副腎および甲状腺であった。全ＲＮＡサンプルを、少なくとも３種の雄動物および３種の雌動物から単離し、そしてプールした。その後、それらのサンプルを、標準的二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用するＴａｑｍａｎ分析を使用する、リアルタイム定量ＰＣＲに供した。代表的なプローブの設計は、５’レポーター色素（例えば、６ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）またはＶＩＣ）および３’クエンチ色素（例えば、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチル−ローダミン））を組み込んだ。
【０１４０】
（ラットＮＰＣ１Ｌ１）
【０１４１】
【化２】
2010142238.tif 000004
ラットβ−アクチン）
【０１４２】
【化３−１】
2010142238.tif 000005
【０１４３】
【化３−２】
2010142238.tif 000006
（配列番号１９）。
【０１４４】
ＰＣＲ反応を、各ウェル中に２５μｌ反応混合物を含む９６ウェル形式で実行した。この反応混合物は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（１２．５μｌ）、ＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ（０．５μｌ）、５０ｍＭ塩化マグネシウム（２μｌ）、逆転写反応からのｃＤＮＡ（０．２μｌ）を含んだ。多重反応は、各々２００ｎＭの遺伝子特異的プライマー、および１００ｎＭのＦＡＭ標識プローブ、および各々１００ｎＭの遺伝子特異的プライマー、および５０ｎＭのＶＩＣ標識プローブを含んだ。反応は、標準的な２段階サイクリングプログラム（９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を、４０サイクル）を用いて実行した。
【０１４５】
最高レベルの発現が、十二指腸、空腸、および回腸組織において観察された。これらのデータは、ＮＰＣ１Ｌ１が、腸におけるコレステロールにおいて役割を果たすことを示す。
【０１４６】
（実施例６：マウス組織におけるマウスＮＰＣ１Ｌ１の発現）
これらの実験において、いくつかのマウス組織におけるマウスＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡの発現を、評価した。評価した組織は、副腎、ＢＭ、脳、心臓、ランゲルハンス島、ＬＩ、小腸、腎臓、肝臓、肺、ＭＬＮ、ＰＬＮ、筋肉、卵巣、下垂体、胎盤、パイエル板、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、子宮および気管であった。全ＲＮＡサンプルを、少なくとも３種の雄動物および３種の雌動物から単離し、そしてプールした。その後、それらのサンプルを、以下のプライマーおよびプローブを使用するＴａｑｍａｎ分析を使用する、リアルタイム定量ＰＣＲに供した：
（マウスＮＰＣ１Ｌ１）
【０１４７】
【化４】
2010142238.tif 000007
（配列番号２２）。
【０１４８】
最高レベルの発現が、パイエル板、小腸、胆嚢、および胃の組織において観察された。これらのデータは、消化系において生じるＮＰＣ１Ｌ１のコレステロール吸収の役割と一致する。
【０１４９】
（実施例７：ヒト組織におけるヒトＮＰＣ１Ｌ１の発現）
これらの実験において、４６種の正常組織を示す２０４５種のサンプルにおけるヒトＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡの発現を、評価した。マイクロアレイベースの遺伝子発現分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの確立されたプロトコルに厳密に従って、塩基対４１９２〜５１１７（配列番号４３）に対応するｃＲＮＡプローブを使用して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ９５  ＧｅｎｅＣｈｉｐにて実施した。ＧｅｎｅＣｈｉｐを、低光増幅管（ＰＭＴ）下でスキャンし、データを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＡＳ  ４．０アルゴリズムまたはＭＡＳ５．０アルゴリズムのいずれかを使用して正規化した。さらに、ほとんどのサンプルについての「スパイクイン（ｓｐｉｋｅ  ｉｎ）」を使用して、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃアルゴリズムおよび手順に従って、標準曲線を構築してＲＮＡ濃度値を得た。これらの結果の要約が、以下の表２に示される。
【０１５０】
（表２．種々のヒト組織におけるＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡの発現レベル）
【０１５１】
【表２】
2010142238.tif 000008
影を付けたデータは、最高レベルのＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡが検出された組織に対応す
る。「存在する」の欄は、ＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡが検出された評価された特定の組織サンプルの割合を示す。「存在せず」の欄は、ＮＰＣ１Ｌ１  ＲＮＡが検出されなかった評価された特定の組織サンプルの割合を示す。「下位２５％」の欄、「中間」の欄および「上位７５％」の欄は、評価された各組織セットについて観察された相対的ＮＰＣ１Ｌ１シグナル強度の統計的分布を示す。
【０１５２】
（実施例８：ラット小腸におけるラットＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡ、ラットＩＢＡＴ  ｍＲＮＡ、ラットＳＲ−Ｂ１  ｍＲＮＡの分布）
これらの実験において、ラット小腸の近位−遠位軸に沿ったラットＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡの分布を、評価した。小腸を、５匹の独立した動物から単離し、ほぼ等しい長さの１０個の切片に分割した。全ＲＮＡを単離し、そしてラットＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡ、ラットＩＢＡＴ（回腸胆汁酸輸送体）ｍＲＮＡまたはラットＳＲ−Ｂ１  ｍＲＮＡの局所発現レベルについて、Ｔａｑｍａｎ分析を使用するリアルタイム定量ＰＣＲによって、分析した。この分析において使用したプライマーおよびプローブは、
（ラットＮＰＣ１Ｌ１）
【０１５３】
【化５】
2010142238.tif 000009
（ラットビリン（Ｖｉｌｌｉｎ））
【０１５４】
【化６】
2010142238.tif 000010
（ラットＳＲ−Ｂ１）
【０１５５】
【化７】
2010142238.tif 000011
（ラットＩＢＡＴ）
【０１５６】
【化７Ａ】
2010142238.tif 000012
であった。
【０１５７】
各動物の小腸切片のｍＲＮＡ発現レベルを、別個に分析し、その後、観察された発現レベルを、その小腸切片において観察されたビリンｍＲＮＡレベルに対して正規化した。そ
の後、各切片について観察された正規化済みｍＲＮＡ発現レベルを、平均化した。
【０１５８】
ＮＰＣ１Ｌ１およびＳＲ−Ｂ１発現レベルは、より遠位の回腸切片と比較して、空腸（切片２〜５）において最高であった。空腸は、コレステロール吸収部位であると考えられるので、これらのデータは、ラットＮＰＣ１Ｌ１のそのような役割を示唆する。回腸を好むＩＢＡＴ分布が、十分に記録され、この実験についてのコントロールとして役立った。
【０１５９】
（実験９：ラット空腸組織におけるラットＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡのインサイチュ分析）
ラットＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡの局在化を、ラット空腸連続切片のインサイチュハイブリダイゼーション分析によって特徴付けた。この分析において使用したプローブは、
（Ｔ７−センスプローブ）
【０１６０】
【化８】
2010142238.tif 000013
（Ｔ７−アンチセンスプローブ）
【０１６１】
【化９】
2010142238.tif 000014
であった。
【０１６２】
これらのＲＮＡプローブは、ラットＮＰＣ１Ｌ１ヌクレオチドの３３１８〜３６７２（配列番号１）に対応するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ増幅を使用して、合成した。センスジゴキシゲニン−ＵＴＰ標識ｃＲＮＡプローブおよびアンチセンスジゴキシゲニン−ＵＴＰ標識ｃＲＮＡプローブを、ＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔを製造業者の指示に従って使用して、Ｔ７プロモーターから作製した。ラット空腸の連続凍結切片を、このセンスプローブおよびアンチセンスプローブとハイブリダイズさせた。ジゴキシゲニン標識を、以前の方法に基づいてＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて検出した。ポジティブシグナルを、ハイブリダイゼーション部位における赤色反応産物の沈着によって特徴付ける。
【０１６３】
このアンチセンスプローブは、低倍率（４０×）下で、陰窩−繊毛軸に沿って、上皮の強い染色を示した。観察されたラットＮＰＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡ発現レベルは、繊毛先端よりも陰窩において、いくらか高かったようであり得る。高倍率（２００×）下では、染色は、腸細胞において観察されたが、杯細胞では観察されなかった。センスプローブ（コントロール）を用いて染色が観察されなかったことにより、ＮＰＣ１Ｌ１アンチセンスシグナルの高い特異性が確認された。これらのデータは、腸コレステロール吸収におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の役割のさらなる証拠を提供した。
【０１６４】
（実施例１０：一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞への蛍光標識エゼチマイブの結合のＦＡＣＳ分析）
これらの実験において、ＢＯＤＩＰＹ標識エゼチマイブ（Ａｌｔｍａｎｎら（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５８０（１）：７７〜９３）がＮＰＣ１Ｌ１およびＳＲ−Ｂ１に結合する能力を、評価した。「ＢＩＯＤＩＰＹ」とは、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチマイブを検出するために使用した蛍光基である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ラットＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡ（ｒＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ）、マウ
スＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡ（ｍＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ）、マウスＳＲ−Ｂ１  ＤＮＡ（ｍＳＲＢＩ／ＣＨＯ）またはＥＧＦＰ  ＤＮＡ（ＥＧＦＰ／ＣＨＯ）で一過性トランスフェクトした。ＥＧＦＰとは、ポジティブコントロールとして使用した増強型緑色蛍光タンパク質である。その後、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞または非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、１００ｎＭ  ＢＯＤＩＰＹ標識エゼチマイブで染色し、そしてＦＡＣＳにより分析した。コントロール実験もまた、実施し、その実験において、細胞は、ＢＯＤＩＰＹ−−エゼチマイブで標識せず、非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチマイブで標識した。
【０１６５】
染色は、非トランスフェクトＣＨＯ細胞でも、ｒＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞でも、ｍＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞でも観察されなかった。蛍光が、ポジティブコントロールＥＧＦＰ／ＣＨＯ細胞において検出された。染色がまた、マウスＳＲ−Ｂ１／ＣＨＯ細胞において検出された。これらのデータは、試験した条件下で、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチマイブが、ＳＲ−Ｂ１に結合可能であること、およびそのような結合は、蛍光ＢＯＤＩＰＹ基の存在によって剥離されないことを示す。より好適な条件が決定された場合、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチマイブは、ｒＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞およびｍＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞を標識することが示される。
【０１６６】
（実施例１１：抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２で標識した一過性トランスフェクトＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析）
これらの実験において、ＣＨＯ細胞におけるＦＬＡＧタグ化ＮＰＣ１Ｌ１の発現を、評価した。ＣＨＯ細胞を、マウスＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡ、ラットＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡ、ＦＬＡＧ−ラット  ＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡまたはＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡで一過性トランスフェクトした。使用した８アミノ酸ＦＬＡＧタグは、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３７）であった。このタグは、分泌シグナル配列直後のアミノ末端細胞外ループ上に挿入した。これらの細胞を、市販の抗ＦＬＡＧモノクローナルマウス抗体Ｍ２とともにインキュベートし、その後、ＢＯＤＩＰＹタグ化抗マウス二次抗体とともにインキュベートした。その後、処理した細胞を、ＦＡＣＳによって分析した。
【０１６７】
このＭ２抗体は、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を染色した。マウスＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞およびラットＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞においては、染色は観察されなかった。これらのデータは、ラットＮＰＣ１Ｌ１およびマウスＮＰＣ１Ｌ１が、何ら有意な固有の蛍光を有さず、抗ＦＬＡＧ抗体によって結合されないことを、示した。これらの細胞の観察されたＦＬＡＧ依存性標識は、このＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１タンパク質およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質が、ＣＨＯ細胞の細胞膜に局在化することを示した。
【０１６８】
（実施例１２：一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰキメラのＦＡＣＳ分析）
これらの実験において、ＣＨＯ細胞におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の表面および細胞質での局在化を評価した。ＣＨＯ細胞を、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡまたはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ  ＤＮＡで一過性トランスフェクトした。これらの融合物において、そのＦＬＡＧタグは、ラットＮＰＣ１Ｌ１のアミノ末端にあり、ＥＧＦＰ融合物は、ラットＮＰＣ１Ｌ１のカルボキシ末端にあった。その後、これらの細胞を、Ｍ２抗ＦＬＡＧマウス（一次）抗体で染色し、その後、ＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス抗体で二次染色した。コントロール実験おいて、細胞を、この二次抗体のみで染色し、上記一次抗体（Ｍ２）では染色しなかった。その後、染色した細胞を、ＦＡＣＳにより分析した。
【０１６９】
コントロール実験において、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１でトランスフェクトした細胞を、ＢＯＤＩＰＹ抗マウス二次抗体で染色したが、上記一次抗体では染色しなかった。そのデータは、二次抗マウス抗体が、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１について何ら有意な特異性を有さないこと、およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１自体が、何ら有意な蛍光を有さないことを示した。
【０１７０】
別のコントロール実験において、非標識ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ細胞を、ＦＡＣＳ分析した。これらの実験において、増強型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の自己蛍光を、検出した。
【０１７１】
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１細胞を、抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２およびＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色し、そしてＦＡＣＳ分析した。この分析からのデータは、これらの細胞が、二次ＢＯＤＩＰＹ標識抗体で標識されたことを示した。このことは、ＣＨＯ細胞の表面上でのＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質の発現を示した。
【０１７２】
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ細胞を、抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２およびＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色し、そしてＦＡＣＳ分析した。この分析からのデータは、両方のマーカー（ＢＯＤＩＰＹおよびＥＧＦＰ）が存在することを示した。この存在は、上記キメラタンパク質の表面発現を示す。このデータはまた、上記タンパク質の一部が、上記細胞内に位置し、輸送小胞と関連し得ることを示した。これらのデータは、コレステロール、または亜細胞器官（例えば、粗面小胞体）において発現したタンパク質の小胞輸送におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の役割を支持した。
【０１７３】
（実施例１３：クローン化ＣＨＯ細胞株におけるＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰキメラのＦＡＣＳ分析および蛍光顕微鏡検査）
これらの実験において、ラットＮＰＣ１Ｌ１の細胞局在化を、ＦＡＣＳ分析および免疫組織化学によって評価した。ＣＨＯ細胞を、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ  ＤＮＡでトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２で染色し、その後、ＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色した。この融合物において、ＦＬＡＧタグは、ラットＮＰＣ１Ｌ１のアミノ末端にあり、増強型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）タグは、ラットＮＰＣ１Ｌ１のカルボキシ末端にある。その後、染色した細胞を、ＦＡＣＳおよび蛍光顕微鏡検査法によって分析した。
【０１７４】
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ  ＤＮＡでトランスフェクトした細胞を、抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２で染色し、その後、ＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色した。これらの細胞のＦＡＣＳ分析によって、上記キメラタンパク質の表面発現を示す両方のマーカーが検出された。
【０１７５】
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰトランスフェクト細胞を、６３×倍率で蛍光顕微鏡によって分析した。これらの細胞の蛍光顕微鏡分析は、非核染色を示し、有意な核周囲オルガネラ染色を伴った。その画像を解像しても、小胞関連タンパク質の存在は確認し得なかった。これらのデータは、上記融合タンパク質が、ＣＨＯ細胞の細胞膜上で発現されたことを示した。
【０１７６】
（実施例１４：ポリクローナル抗ラットＮＰＣ１Ｌ１ウサギ抗体の作製）
アミノ末端システイン残基またはカルボキシ末端システイン残基を含む合成ペプチド（配列番号３９〜４２）を、ジスルフィド結合を介してキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）キャリアタンパク一に結合し、抗原として使用して、ニュージーランド白色ウサギ（３ヶ月齢〜９ヶ月齢の範囲）においてポリクローナル抗血清を惹起した。このＫＬＨ−ペプチドを、等容量のフロイントアジュバントと混合することによって乳化し、３箇
所の皮下背面部位に注射した。１６週間免疫スケジュールの前に、免疫前血清サンプルを収集し、その後、０．２５ｍｇ  ＫＬＨ−ペプチドを初回注射し、そして３回の０．１ｍｇ  ＫＬＨ−ペプチドを３回、計画的にブースター注射した。動物の耳介動脈から採血させ、その血液を凝固させ、その後、その血清を遠心分離によって収集した。
【０１７７】
抗ペプチド抗体力価を、固相において結合した遊離ペプチド（１μｇ／ウェル）を用いる酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＳＩＡ）によって決定した。結果を、ＯＤ４５０  ０．２を生じた血清希釈の逆数として表す。検出は、ビオチニル化抗ウサギＩｇＧ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン（ＨＲＰ−ＳＡ）結合体、およびＡＢＴＳを使用して行った。
【０１７８】
（実施例１５：ウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清を使用する、ラットＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡで一過性トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるラットＮＰＣ１Ｌ１発現のＦＡＣＳ分析）
これらの実験において、ＣＨＯ細胞の表面におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の発現を、評価した。ＣＨＯ細胞を、ラットＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡでトランスフェクトし、その後、ウサギ免疫前血清または上記実施例１４に記載した１０週間抗ラットＮＰＣ１Ｌ１血清（すなわち、Ａ０７１５、Ａ０７１６、Ａ０８６７またはＡ０８６８）のいずれかとともにインキュベートした。その後、一次抗血清で標識細胞を、ＢＯＤＩＰＹ改変抗ウサギ二次抗体で染色し、その後、ＦＡＣＳ分析した。
【０１７９】
抗体表面標識は、免疫前血清サンプルのいずれについても観察されなかった。ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の特異的細胞表面標識が、Ａ０７１５およびＡ０８６８の両方について観察された。抗血清Ａ０７１６およびＡ０８６７は、このアッセイ様式におけるラットＮＰＣ１Ｌ１表面発現を認識しなかった。このことは、ネイティブの非融合ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質が、ＣＨＯ細胞において発現され、ＣＨＯ細胞膜に局在化することを示す。ＮＰＣ１Ｌ１の細胞表面発現は、腸コレステロール吸収における役割と一致する。
【０１８０】
（実施例１６：ウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清を使用する、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡで一過性トランスフェクトしたＣＨＯ細胞またはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡで一過性トランスフェクトしたＣＨＯ細胞または非トランスフェクト細胞のＦＡＣＳ分析）
これらの実験において、ＣＨＯ細胞におけるＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１の発現を、評価した。ＣＨＯ細胞を、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡまたはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１  ＤＮＡで一過性トランスフェクトした。ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞を、Ａ０８０１血清、Ａ０８０２血清、Ａ０７１５血清、またはＡ０８６８血清（実施例１４参照）またはＦＬＡＧ抗体Ｍ２のいずれかで標識した。その後、これらの標識細胞を、ＢＯＤＩＰＹ標識抗ウサギ二次抗体で染色し、そしてＦＡＣＳ分析した。非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、上記のトランスフェクト細胞株と同じ様式で分析した。
【０１８１】
非トランスフェクトＣＨＯ細胞のポジティブ染色は、試験した抗血清のいずれについても観察されなかった。ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の血清Ａ０８０１依存性標識が観察されたが、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞のそのような標識は、観察されなかった。ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞またはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の血清Ａ０８０２依存性標識は、観察されなかった。ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の強い血清Ａ０７１５依存性標識が、観察され、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェク
ト細胞の弱い血清Ａ０７１５依存性標識が、観察された。ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞およびマウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の弱い血清Ａ０８６８依存性標識が、観察された。ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞およびＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の強い抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体依存性標識が、観察された。この強いＭ２染色は、Ｍ２が、既知の濃度の親和性精製されたモノクローナル抗体であるという事実に起因する可能性がある。対照的に、個々の抗血清は、未精製のポリクローナルであり、非特定濃度の抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗体を含む。これらのデータは、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１タンパク質およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質が、ＣＨＯ細胞において発現され、そしてＣＨＯ細胞膜に局在化されるというさらなる証拠を提供する。ＮＰＣ１Ｌ１の細胞表面発現は、腸コレステロール吸収における役割と一致する。
【０１８２】
（実施例１７：ウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清Ａ０７１５を用いるラット空腸の免疫組織化学分析）
これらの実験において、ラット空腸におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の局在化を、免疫組織化学により分析した。ラット空腸を取り出し、すぐにＯ．Ｃ．Ｔ．化合物中に包埋し、そして液体窒素中に凍結した。切片（６μｍ）を、低温槽ミクロトームを用いて切断し、そしてスライドガラス上にマウントした。切片を室温で風乾し、その後、ブワン固定液中に固定した。ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ免疫染色を、ヒストスタイン（Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ）−ＳＰキットを使用して実行した。内因性組織ペルオキシダーゼ活性を、メタノール中の３％Ｈ２Ｏ２中で１０分間インキュベートしてブロックし、非特異的抗体結合を、１０％非免疫ウサギ血清中で４５分間インキュベートして最小にした。切片を、ウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清Ａ０７１５またはＡ０８６８とともに１：５００希釈にて４℃でインキュベートし、その後、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼとともにインキュベートした。その後、これらの背ペンを、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＯ）−Ｈ２Ｏ２染色系において発色させ、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、そして顕微鏡検査法により試験した。このプロトコルを使用する陽性反応を、抗原−抗体反応部位での赤色反応産物の沈着によって特徴付ける。核は、ヘマトキシリン対比染色物から青色を呈した。コントロールは、同じ組織ブロックからの近傍切片に対して同時に実施した。コントロール手順は、以下の（１）一次抗体を免疫前血清で置換すること、（２）一次抗体を非免疫ウサギ血清で置換すること、（３）一次抗体をＰＢＳで置換すること、（４）二次抗体をＰＢＳで置換すること、からなった。
【０１８３】
本実施例は、抗ラットＮＰＣ１Ｌ１血清Ａ０７１５または免疫前血清で染色した組織を、低倍率（４０×）および高倍率（２００×９で分析したことを示す。Ａ０７１５染色組織は、低倍率にて、繊毛上皮層（腸細胞）の強い陽性染色を示した。Ａ０７１５染色組織は、高倍率にて、腸細胞頂端膜の強い陽性染色を示した。免疫前血清のみで処理した組織において、染色は観察されなかった。同様の結果が、血清Ａ０８６８を用いて得られた。これらのデータは、ラットＮＰＣ１Ｌ１が、ラット空腸において発現されることを示し、これは、腸コレステロール吸収における役割と一致する。
【０１８４】
（実施例１８：標識コレステロール取り込みアッセイ）
本実施例において、ラットＮＰＣ１Ｌ１またはマウスＳＲ−Ｂ１で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞が標識コレステロールを取り込む能力を、評価した。これらのアッセイにおいて、単一濃度におけるコレステロール取り込みを、パルスチェイス実験において評価した。これらの実験において生じたデータが、以下の表３において示される。
【０１８５】
（細胞）
Ａ．ラットＮＰＣ１Ｌ１  ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞
Ｂ．ＣＨＯバックグラウンド（トランスフェクションなし）
細胞は、１２ウェルプレート中に５００，０００細胞／ウェル（ｍＬ）で播種した。
【０１８６】
（手順）
すべての試薬および培養プレートを、特に記載しない限り、３７℃で維持した。
【０１８７】
（飢餓）  維持培地（Ｆ１２  ＨＡＭＳ、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０％  ＦＣＳ）を除去し、細胞を、無血清ＨＡＭＳ培地でリンスした。その後、この無血清培地を、１ｍＬ「飢餓」培地（Ｆ１２  ＨＡＭＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５％リポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ））で置換した。
【０１８８】
各細胞株１プレートを、一晩飢餓させた。残りの２プレートを、「飢餓なし」と名付けた（以下を参照のこと）。
【０１８９】
（プレインキュベーション）  培地をすべてのプレートから除去し、無血清ＨＡＭＳでリンスし、そして飢餓培地で３０分間置換した。
【０１９０】
（３Ｈ−コレステロールパルス）  以下を、各ウェルに直接添加した：
５０μｌの混合胆汁酸塩ミセル中の０．５μＣｉ  ３Ｈ−コレステロール（約１．１×１０６ｄｐｍ／ウェル）
４．８ｍＭタウロコール酸ナトリウム（２．５８１ｍｇ／ｍＬ）
０．６ｍＭオレイン酸ナトリウム（０．１８３ｍｇ／ｍＬ）
０．２５ｍＭコレステロール（０．１ｍｇ／ｍＬ）
（これらは、超音波振動により「飢餓」培地中に分散している）
（新鮮な培地のコレステロール濃度＝５μｇ／ｍＬ）。
【０１９１】
標識コレステロールパルスの時点は、０分、４分、１２分、および２４分であった。各処理について３連のウェルを調製した。
【０１９２】
（洗浄）  指定した時間に、培地を吸引し、そして細胞を、３７℃にて、Ｈｏｂｂｓ緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．９％  ＮａＣｌ、０．２％  ＢＳＡ（ｐＨ７．４））で一回洗浄し、Ｈｏｂｂｓ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．９％  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（ＢＳＡなし））で１回洗浄した。
【０１９３】
（処理／分析）  細胞を０．２Ｎ  ＮａＯＨ（２ｍＬ／ウェル）を用いて室温で一晩消化した。１．５ｍｌアリコートを各ウェルから取り出し、中和し、そしてシンチレーション計数により放射能を計数した。すべてのウェルからの５０μｌアリコートさらに２つずつを、Ｐｉｅｒｃｅ  ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ法により総タンパク質についてアッセイした。この細胞において観察された標識コレステロールの量を、その細胞におけるタンパク質の量により正規化した。
【０１９４】
（表３．ラットＮＰＣ１Ｌ１でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞またはマウスＳＲ−Ｂ１でトランスフェクトした細胞または非トランスフェクトＣＨＯ細胞による、３Ｈ−コレステロール取り込み）
【０１９５】
【表３】
2010142238.tif 000015
ｄｐｍ＝１分間当たりの崩壊
ｓｅｍ＝平均の標準誤差。
【０１９６】
（実施例１９：コレステロール取り込みに対するエゼチマイブの効果）
マウスＮＰＣ１Ｌ１またはラットＮＰＣ１Ｌ１またはマウスＳＲ−Ｂ１で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞が３Ｈ−コレステロールを取り込む能力に対するエゼチマイブの効果を、パルスチェイス実験において評価した。１種類のマウスＮＰＣ１Ｌ１  ｃＤＮＡクローン（Ｃ７）および３種類のラットＮＰＣ１Ｌ１クローン（Ｃ７、Ｃ１７、およびＣ２１）を、評価した。マウスＳＲ−Ｂ１で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、マウスＮＰＣ１Ｌ１で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞およびラットＮＰＣ１Ｌ１で安定にトランスフェクトした細胞が、エゼチマイブの非存在下で標識コレステロールを取り込む能力もまた、パルスチェイス実験において評価した。これらの実験において生じたデータは、以下の表４および表５に示される。さらに、４種類の種々の非標識コレステロール濃度の存在下においてトランスフェクトＣＨＯ細胞および非トランスフェクトＣＨＯ細胞によって取り込まれる総コレステロール量もまた、評価した。これらの実験からのデータを、以下の表６に示す。
【０１９７】
（細胞）
Ａ．ラットＮＰＣ１Ｌ１  ｃＤＮＡまたはマウスＮＰＣ１Ｌ１  ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞
Ｂ．ＣＨＯバックグラウンド（トランスフェクションなし）
Ｃ．ＳＲ−Ｂ１トランスフェクトＣＨＯ細胞
（細胞は、１２ウェルプレート中に５００，０００細胞／ウェル（ｍＬ）で播種した）。
【０１９８】
（手順）
すべての試薬および培養プレートを、特に言及しない限りは、３７℃で維持した。
【０１９９】
（飢餓）  維持培地（Ｆ１２  ＨＡＭＳ、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０％  ＦＣＳ
）を除去し、細胞を、無血清ＨＡＭＳ培地でリンスした。その後、この無血清培地を、１ｍＬ「飢餓」培地（Ｆ１２  ＨＡＭＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５％リポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ））で置換した。細胞を一晩飢餓させた。
【０２００】
（プレインキュベーション／プレ投与）  培地をすべてのプレートから除去し、新鮮な飢餓培地で置換し、３０分間プレインキュベートした。ウェルの半分に、エゼチマイブを含む培地を与えた（ＥｔＯＨ中のストック溶液；最終濃度＝１０μＭ）。
【０２０１】
（３Ｈ−コレステロールパルス）  以下を、各ウェルに直接添加した：
５０μｌの混合胆汁酸塩ミセル中の０．５μＣｉ  ３Ｈ−コレステロール（約１．１×１０６ｄｐｍ／ウェル）
４．８ｍＭタウロコール酸ナトリウム（２．５８１ｍｇ／ｍＬ）
０．６ｍＭオレイン酸ナトリウム（０．１８３ｍｇ／ｍＬ）
０．２５ｍＭコレステロール（０．１ｍｇ／ｍＬ）
（これらは、超音波振動により「飢餓」培地中に分散している）
（新鮮な培地のコレステロール濃度＝５μｇ／ｍＬ）。
【０２０２】
標識コレステロールパルスの時点は、４分、１２分、２４分および４時間であった。各処理について３連のウェルを調製した。
【０２０３】
（洗浄）  指定した時間に、培地を吸引し、そして細胞を、３７℃にて、Ｈｏｂｂｓ緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．９％  ＮａＣｌ、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｐＨ７．４））で一回洗浄し、Ｈｏｂｂｓ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．９％  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（ＢＳＡなし））で１回洗浄した。
【０２０４】
（処理／分析）  
（Ａ．４分、１２分、２４分の時点）  細胞を０．２Ｎ  ＮａＯＨ（２ｍＬ／ウェル）を用いて室温で一晩消化した。１．５ｍｌアリコートを各ウェルから取り出し、中和し、そしてシンチレーション計数により放射能を計数した。
【０２０５】
（Ｂ．４時間の時点）  消化した細胞を、薄層クロマトグラフィーによって分析して、細胞中のコレステロールエステルの量を決定した。
【０２０６】
抽出物を、ＴＬＣプレート上にスポットし、そして２ｍｌのヘキサン：イソプロパノール（３：２）移動相中で３０分間移動させ、その後、１ｍｌのヘキサン：イソプロパノール（３：２）移動相中で１５分間、二次移動させた。
【０２０７】
（Ｃ．細胞抽出物のタンパク質測定）  細胞抽出物サンプルを含むプレートを、１２０ｒｐｍの楕円振盪器に指定した時間配置し、その後、抽出物を、１２×７５本のチューブ中にプールした。プレートを、乾燥させ、そしてＮａＯＨ（２ｍｌ／ウェル）を添加した。その後、サンプルのタンパク質含量を、測定した。すべてのウェルからの５０μｌアリコートをさらに２つずつ、Ｐｉｅｒｃｅ  ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ法によって全タンパク質についてアッセイした。細胞中で観察された標識コレステロールの量を、細胞中のタンパク質量に対して正規化した。
【０２０８】
（表４．エゼチマイブの存在下および非存在下でのトランスフェクトＣＨＯ細胞の総コレステロール）
【０２０９】
【表４】
2010142238.tif 000016
ＥＺ＝エゼチマイブ。
【０２１０】
（表５．エゼチマイブの存在下または非存在下でのＣＨＯ細胞のコレステロールエステル）
【０２１１】
【表５】
2010142238.tif 000017
ＥＺ＝エゼチマイブ。
【０２１２】
（表６．漸増量の非標識コレステロールの存在下での標識コレステロールの取り込み）
【０２１３】
【表６】
2010142238.tif 000018
（実施例２０：標識コレステロール取り込みアッセイ）
本実施例において、ラットＮＰＣ１Ｌ１またはマウスＳＲ−Ｂ１で一過性トランスフェクトしたＣＨＯ細胞が標識コレステロールを取り込む能力を、評価した。また、マウスＳＲ−Ｂ１でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞が標識コレステロールを取り込む能力をラットＮＰＣ１Ｌ１が増強する能力も、評価した。これらのアッセイにおいて、単一濃度でのコレステロール取り込みを、パルスチェイス実験において評価した。これらの実験において生じたデータを、以下の表７に示す。
【０２１４】
（細胞）
Ａ．ＣＨＯバックグラウンド細胞（モックトランスフェクション）
Ｂ．マウスＳＲ−Ｂ１で一過性トランスフェクトしたＣＨＯ細胞
Ｃ．ラットＮＰＣ１Ｌ１  ｃＤＮＡで一過性トランスフェクトしたＣＨＯ（ｎ＝８クローン）。一過性トランスフェクトした細胞を、１２ウェルプレート中に３００，０００細胞／ウェル（ｍＬ）で播種した。
【０２１５】
（手順）
すべての試薬および培養プレートを、特に言及しない限りは、３７℃で維持した。
【０２１６】
（飢餓）  維持培地（Ｆ１２  ＨＡＭＳ、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０％  ＦＣＳ）を細胞から除去し、１ｍＬ「飢餓」培地（Ｆ１２  ＨＡＭＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５％リポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ））で置換した。細胞を１時間飢餓させた。
【０２１７】
（３Ｈ−コレステロールパルス）  以下を、各ウェルに直接添加した：
５０μｌの混合胆汁酸塩ミセル中の０．５μＣｉ  ３Ｈ−コレステロール（約１．１×１０６ｄｐｍ／ウェル）
４．８ｍＭタウロコール酸ナトリウム（２．５８１ｍｇ／ｍＬ）
０．６ｍＭオレイン酸ナトリウム（０．１８３ｍｇ／ｍＬ）
０．２５ｍＭコレステロール（０．１ｍｇ／ｍＬ）
（これらは、超音波振動により「飢餓」培地中に分散している）
（新鮮な培地のコレステロール濃度＝５μｇ／ｍＬ）。
【０２１８】
標識コレステロールパルスの時点は、２４分および４時間であった。各処理について３連のウェルを調製した。
【０２１９】
（洗浄）  指定した時間に、培地を吸引し、そして細胞を、３７℃にて、Ｈｏｂｂｓ緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．９％  ＮａＣｌ、０．２％ＢＳＡ（ｐＨ７．４））で一回洗浄し、Ｈｏｂｂｓ緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．９％  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（ＢＳＡなし））で１回洗浄した。
【０２２０】
（処理／分析）  
（Ａ．２４分の時点）  細胞を０．２Ｎ  ＮａＯＨ（２ｍＬ／ウェル）を用いて室温で一晩消化した。１．５ｍｌアリコートを各ウェルから取り出し、中和し、そしてシンチレーション計数により放射能を計数した。
【０２２１】
（Ｂ．４時間の時点）  消化した細胞を、薄層クロマトグラフィーによって分析して、細胞中のコレステロールエステルの量を決定した。
【０２２２】
抽出物を、薄層クロマトグラフィープレート上にスポットし、そして２ｍｌのヘキサン：イソプロパノール（３：２）移動相中で３０分間移動させ、その後、１ｍｌのヘキサン：イソプロパノール（３：２）含有移動相中で１５分間、二次移動させた。
【０２２３】
（Ｃ．細胞抽出物のタンパク質測定）  細胞抽出物サンプルを含むプレートを、１２０ｒｐｍの楕円振盪器に指定した時間配置し、その後、抽出物を、１２×７５本のチューブ中にプールした。プレートを、乾燥させ、そしてＮａＯＨ（２ｍｌ／ウェル）を添加した。その後、サンプルのタンパク質含量を、測定した。すべてのウェルからの５０μｌアリコートをさらに２つずつ、Ｐｉｅｒｃｅ  ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ法によって全タンパク質についてアッセイした。細胞中で観察された標識コレステロールの量を、細胞中のタンパク質量に対して正規化した。
【０２２４】
（表７．一過性トランスフェクトＣＨＯ細胞における標識コレステロール取り込み）
【０２２５】
【表７】
2010142238.tif 000019
（実施例２１：ラットＮＰＣ１Ｌ１、マウスＮＰＣ１Ｌ１およびヒトＮＰＣ１Ｌ１の発現）
本実施例において、ＮＰＣ１Ｌ１を細胞中に導入し、発現させた。種特異的ＮＰＣ１Ｌ１発現構築物を、クローン特異的ＰＣＲプライマーを使用してプラスミドｐＣＤＮＡ３中にクローン化して、このベクターのポリリンカーと適合性の適切な制限部位が隣接したＯＲＦを作製した。ＮＰＣ１Ｌ１の３つすべての種について、小腸全組織ＲＮＡを、オリゴｄＴをテンプレートプライマーとして使用する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのテンプレートとして使用した。このラットＮＰＣ１Ｌ１を、ＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローン化し、ヒトＮＰＣ１Ｌ１を、ＸｂａＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしてクローン化し、マウスＮＰＣ１Ｌ１を、ＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローン化した。各クローンの順方向鎖および逆方向鎖の配列決定を実施して、配列の完全性を確認した。標準的一過性トランスフェクション手順を、ＣＨＯ細胞を用いて使用した。６ウェルプレートにおいて、ＣＨＯ細胞を、プレーティング密度２×１０５細胞／ウェルで、トランスフェクションの１日前にプレートした。翌日、細胞を、２μｇのプラスミドＤＮＡおよび６μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅとともに５時間インキュベートし、その後、新鮮な培地に交換した。４８時間後、細胞を、ＦＡＣＳまたはウェスタンブロットのいずれかによって、抗ＮＰＣ１Ｌ１抗血清を使用するＮＰＣ１Ｌ１発現について分析した。ＮＰＣ１Ｌ１を発現する安定な長期細胞株を樹立するために、トランスフェクトＣＨＯ細胞を、ジェネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８、０．８ｍｇ／ｍｌ）の存在下で製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により推奨されるように選択した。培
養中の１ヶ月間の選択の後、細胞集団を、抗ＮＰＣ１Ｌ１抗血清で染色し、そしてＦＡＣＳにより分別した。個々の陽性染色細胞を、限界希釈によって単離した後にクローン化し、その後、ジェネチシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含む選択培地において維持した。；
トランスフェクション手順に対して感受性が低い他の細胞株が、アデノウイルスベクター系を使用して作製されている。ＮＰＣ１Ｌ１を発現するために使用するこの系は、Ａｄ５（Ｃ型アデノウイルス）から誘導される。この組換え複製欠損アデノウイルスベクターを、Ｅ１領域、Ｅ２領域およびＥ４領域の改変を介して欠損性にさせる。このベクターはまた、Ｅ３領域に対してさらなる改変を有し、Ｅ３ｂ領域ＲＩＤａおよびＲＩＤｂ遺伝子に一般的には影響を与える。ＮＰＣ１Ｌ１発現を、上記アデノウイルスのＥ３領域において置換された発現カセットとしてＣＭＶプロモーターを使用して、駆動する。ラットＮＰＣ１Ｌ１およびマウスＮＰＣ１Ｌ１を、上記アデノウイルスベクターと適合性の制限部位が隣接するクローン特異的プライマーを使用して、増幅した。アデノウイルスの感染性粒子を、力価５×１０１０Ｐ／ｍＬで２９３−Ｄ２２細胞から生成した。ウイルス溶解物を使用して、標準的なトランスフェクション方法に対して抵抗性の細胞に感染させた。ＣａＣｏ２細胞（これは、異種タンパク質発現に対して高度に抵抗性である）において、ＮＰＣ１Ｌ１のアデノウイルス媒介性発現が、感染後少なくとも２１日間持続することが、ウェスタンブロット分析によって示された。
【０２２６】
（実施例２２：ＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトトランスジェニックマウス）
ＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトマウスを、標的化変異誘発を介して構築した。この方法は、マウスＮＰＣ１Ｌ１遺伝子の特定の領域を欠失するように設計された標的化構築物を利用した。この標的化プロセスの間に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺレポーター遺伝子を、内因性ＮＰＣ１Ｌ１プロモーターの制御下に挿入した。ＮＰＣ１Ｌ１（配列番号４５）の欠失する領域は、ヌクレオチド７９０〜ヌクレオチド９９８である。この標的化ベクターは、ヌクレオチド７８９で終わる１．９ｋｂ  ５’アームと、ヌクレオチド９９９で始まる３．２ｋｂ  ３’アームとに隣接された、ＬａｃＺ−Ｎｅｏカセットを含む。組換え胚性幹細胞株からのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲを使用して、相同組換えについてアッセイした。増幅したＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって可視化した。この試験ＰＣＲは、遺伝子特異的プライマーを使用した。このプライマーは、上記標的化ベクターアームに外側に近接して存在し、ＬａｃＺ−Ｎｅｏカセット配列に特異的な３つのプライマーのうちの１つと対をなす。５’ＰＣＲ再確認のために、ＮＰＣ１Ｌ１特異的オリゴヌクレオチド
【０２２７】
【化１０】
2010142238.tif 000020
（配列番号４６）を、そして３’ＰＣＲ再確認のために、ＮＰＣ１Ｌ１特異的オリゴヌクレオチド
【０２２８】
【化１１】
2010142238.tif 000021
（配列番号４７）を、使用した。Ｆ２マウスの遺伝子型決定を、ＮＰＣ１Ｌ１特異的順方向プライマー
【０２２９】
【化１２】
2010142238.tif 000022
（配列番号４８）、ＬａｃＺ−Ｎｅｏカセット特異的順方向プライマー
【０２３０】
【化１３】
2010142238.tif 000023
（配列番号４９）を、ＮＰＣ１Ｌ１遺伝子特異的逆方向プライマー
【０２３１】
【化１４】
2010142238.tif 000024
（配列番号５０）と組み合わせて使用する、多重ＰＣＲによって実施し、標的化した対立遺伝子および内因性対立遺伝子の両方の決定を可能にした。アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ生成物の分析によって、野生型マウス、ヘテロ接合型ヌルマウスおよびホモ接合型ヌルマウスを互いに区別した。
【０２３２】
本発明は、本明細書中に記載される具体的実施形態によっては範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書中に記載される改変に加えて本発明の種々の改変が、上記の説明から当業者にとって明らかになる。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０２３３】
特許、特許出願、刊行物、製品説明書、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号およびプロトコルが、本明細書全体を通じて引用される。これらの開示は、その全体がすべての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【配列表】
2010142238000001.app