(57)【要約】      （修正有）【課題】最適化された倍率で光を受光面に導いて、明るい画像が取得できる走査型顕微鏡を提供する。【解決手段】走査型顕微鏡１を、照明光を射出する光源６と、この照明光を集光して試料Ｓに照射する対物レンズ３２と、光源６と対物光学系３との間に配置され、照明光により試料Ｓの面を走査する走査装置２と、走査装置２と対物レンズ３２との間に配置され、照明光及び試料Ｓからの観察光のいずれか一方を透過し、他方を反射する光分離部４と、受光面５ａが対物レンズ３２の射出瞳位置と略共役位置に配置され、光分離部４で透過若しくは反射した観察光を検出する検出部５と、光分離部４と検出部５との間に配置され、受光面５ａと対物レンズ３２の射出瞳との略共役関係を維持したまま、射出瞳の像の大きさを対物レンズ３２に応じて変化させる倍率変更光学系７と、から構成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光を射出する光源と、
前記照明光を集光して試料に照射する対物レンズと、
前記光源と前記対物レンズとの間に配置され、前記照明光により前記試料の面を走査する走査装置と、
前記走査装置と前記対物レンズとの間に配置され、前記照明光及び前記試料からの観察光のいずれか一方を透過し、他方を反射する光分離部と、
受光面が前記対物レンズの射出瞳位置と略共役位置に配置され、前記光分離部で透過若しくは反射した前記観察光を検出する検出部と、
前記光分離部と前記検出部との間に配置され、前記受光面と前記対物レンズの射出瞳との略共役関係を維持したまま、前記射出瞳の像の大きさを前記対物レンズに応じて変化させる倍率変更光学系と、を有する走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記倍率変更光学系は、前記対物レンズに応じて、前記射出瞳の像が前記受光面の有効領域と略同一大きさになるように変倍する請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記倍率変更光学系は、前記試料側から順に、
前記試料の像を結像する第１リレーレンズ群と、
前記射出瞳の像を前記受光面上に結像する第２リレーレンズ群と、を有し、
前記第１リレーレンズ群、及び、前記第２リレーレンズ群の少なくともいずれか一方を交換することにより、変倍する請求項１または２に記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記倍率変更光学系は、前記試料側から順に、
前記対物レンズから射出された光束の径を変倍する変倍レンズ群と、
前記試料の像を結像する第１リレーレンズ群と、
前記射出瞳の像を前記受光面上に結像する第２リレーレンズ群と、
を有する請求項１または２に記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記倍率変更光学系は、前記試料側から順に、
前記試料の像を結像する第１リレーレンズ群と、
前記射出瞳の像を前記受光面上に結像する第２リレーレンズ群と、を少なくとも有し、
当該倍率変更光学系を構成するレンズの少なくとも一部を光軸に沿って移動させて変倍する請求項１または２に記載の走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、生物顕微鏡の分野では、非線形効果を用いた顕微鏡が注目を集めている。その中でも、多光子励起を使用した顕微鏡は蛍光の試料内の拡散に対して強く、試料の深部まで観察をすることができる。したがって、今まで観察し難かった、脳などの光の拡散が大きい試料の深部を観察することができるため、ユーザーからの需要がある。この需要に対応するため、多くの多光子励起顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
通常、走査型顕微鏡では走査した光を非走査光に変え、ピンホールを通過させ共焦点効果を得ることにより光軸方向の分解能を得る。しかし、多光子励起顕微鏡では、対物レンズにより励起光がスポットを結ぶ位置のみが励起されるので、ピンホールを使用しなくとも光軸方向の分解能を得ることができる。
【０００４】
したがって、ピンホールを使用しなくてよいのであれば、わざわざ試料からの観察光を非走査光に変える必要がなく、走査手段と対物レンズとの間に光束分離手段を挿入配置し、その先にディテクターを配置すればよい。このディテクターをＮＤＤ（Non Descanned Detector)と言う。ピンホールを使用する場合は、試料面のうち当該ピンホールと共役な位置から出射した観察光しか受光できないが、ＮＤＤであれば集光位置の周りに拡散した観察光であっても受光することができるため、明るい画像を得ることができる。このようなアイディアが、従来より提案されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
特に、脳などの試料を観察する場合は、拡散が大きいので深部まで観察するためには、少しでも明るく受光する必要がある。このように少しでも明るく受光するための光学的な手段としては、蛍光取得可能範囲は検出光学系の視野数／対物レンズの倍率で決まるので、試料の拡散した光を少しでも多く獲得するために検出光学系の視野数を大きくすることが考えられる。無限遠系対物レンズの場合、検出光学系の視野数を大きくすると対物レンズの射出瞳を出て行く平行光束が、より大きな角度で射出瞳から射出されることとなる。
【０００６】
ところで、検出器がヘッドオン形状の光電子増倍管（以下、ＰＭＴと呼ぶ）の場合、その種類にもよるが、ユニフォーミティ（光電面での位置に対する光量ムラ）は悪くはないが、入射角度に対する光量ムラが多少残っているのに対し、アンギュラーレスポンス（光電面に入射する角度に対する光量ムラ）は非常に綺麗なカーブを描くＰＭＴが存在する。後者のＰＭＴを用いる場合には、光電面を対物レンズの射出瞳と共役に配置することにより、光量ムラを防ぐことができる。このような配置は、従来より提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００７】
また、一般的に、対物レンズの射出瞳と共役関係にある受光面への縮小倍率は、想定されるどの対物レンズに交換した場合であっても、受光面への入射角度が許容最大入射角度までの範囲で瞳像の大きさが受光面の有効領域内になるように決定される。
【特許文献１】特許第２８４８９５２号公報
【特許文献２】特表２００７−５１０１７６号公報
【非特許文献１】ＮＡＴＵＲＥ  ＶＯＬ３８５・９  ＪＡＮＵＡＲＹ  １９９７  Ｐ１６１〜Ｐ１６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の顕微鏡であれば、この顕微鏡を構成するレンズの位置は固定であり、一定の倍率で対物レンズの射出瞳を受光面に投影することとなり、対物レンズを交換した場合、受光面の有効領域が有効に活用されておらず、試料からの観察光を無駄にしていると言う課題があった。
【０００９】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、対物レンズを交換した場合でも、最適化された倍率で光を受光面に導くことができ、明るい画像を取得することが可能な走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために、本発明に係る走査型顕微鏡は、照明光を射出する光源と、この照明光を集光して試料に照射する対物レンズと、光源と対物レンズとの間に配置され、照明光により試料の面を走査する走査装置と、走査装置と対物レンズとの間に配置され、照明光及び試料からの観察光のいずれか一方を透過し、他方を反射する光分離部と、受光面が対物レンズの射出瞳位置と略共役位置に配置され、光分離部で透過若しくは反射した観察光を検出する検出部と、光分離部と検出部との間に配置され、受光面と対物レンズの射出瞳との略共役関係を維持したまま、射出瞳の像の大きさを対物レンズに応じて変化させる倍率変更光学系と、を有する。
【００１１】
このような走査型顕微鏡装置において、倍率変更光学系は、対物レンズに応じて、射出瞳の像が受光面の有効領域と略同一大きさになるように変倍することが好ましい。
【００１２】
また、このような走査型顕微鏡装置において、倍率変更光学系は、試料側から順に、試料の像を結像する第１リレーレンズ群と、射出瞳の像を受光面上に結像する第２リレーレンズ群と、を有し、第１リレーレンズ群、及び、第２リレーレンズ群の少なくともいずれか一方を交換することにより、変倍することが好ましい。
【００１３】
あるいは、倍率変更光学系は、試料側から順に、対物レンズから射出された光束の径を変倍する変倍レンズ群と、試料の像を結像する第１リレーレンズ群と、射出瞳の像を受光面上に結像する第２リレーレンズ群と、を有することが好ましい。
【００１４】
あるいは、倍率変更光学系は、試料側から順に、試料の像を結像する第１リレーレンズ群と、射出瞳の像を受光面上に結像する第２リレーレンズ群と、を少なくとも有し、この倍率変更光学系を構成するレンズの少なくとも一部を光軸に沿って移動させて変倍することが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る走査型顕微鏡を以上のように構成すると、対物レンズを交換した場合でも、最適化された倍率で光を受光面に導くことができ、明るい画像を取得することが可能な走査型顕微鏡を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、図１を用いて本実施形態における走査型顕微鏡１の構成について説明する。この走査型顕微鏡１は、レーザー光を放射する光源６と、対物レンズ３２とを有し、光源６から放射された照明光（レーザー光）をステージ８上に載置された試料Ｓに照射する機能を有する対物光学系３と、光源６と対物光学系３との間に配置され、試料Ｓからの観察光を取得するために、照明光により試料Ｓの面上を走査する走査装置２と、受光面５ａが対物レンズ３２の射出瞳位置と略共役位置に配置され、観察光を検出する検出部（ＰＭＴ）５と、走査装置２と対物レンズ３２との間に配置され、照明光及び観察光のいずれか一方を透過し、他方を反射する光分離部（ダイクロイックミラー）４と、光分離部４と検出部５との間に配置され、受光面５ａと対物レンズ３２の射出瞳位置との略共役関係を維持したまま、射出瞳の像の倍率を変化させる倍率変更光学系７と、を有して構成される。
【００１７】
ここで、走査装置２は、ガルバノミラーを有して構成される走査機構２２と、この走査機構２２から出射した照明光を一旦結像する瞳投影レンズ２３とを備えて構成される。また、対物光学系３は、瞳投影レンズ２３で結像された照明光を略平行光に変換する第１集光レンズ３１と、この略平行光を試料Ｓ上に集光して照射する上述の対物レンズ３２とを備えて構成される。さらに、倍率変更光学系７は、試料Ｓからの観察光を集光して試料Ｓの像を結像する第１リレーレンズ群７１と、対物レンズ３２の射出瞳の像を検出部５の受光面５ａ上に結像させる第２リレーレンズ群７２と、を備えて構成される。
【００１８】
ここで、この走査型顕微鏡１は、試料Ｓに照明光（レーザー光）を照射することにより、この試料Ｓで発生する蛍光を用いた蛍光観察が可能な共焦点顕微鏡として使用することも可能であり、光源６と走査機構２２との間の光路上に、レーザー光源６からのレーザー光を集光する第２集光レンズ２１、レーザー光源６からのレーザー光を透過して試料Ｓからの蛍光を反射するダイクロイックミラー２４、このダイクロイックミラー２４で反射された蛍光を集光する第３集光レンズ２５、この第３集光レンズ２５の焦点近傍にピンホールが位置するように配置された遮光板２６からなる共焦点光学系１０、及び、このピンホールを通過した光を検出する光検出器９、を有して構成される。
【００１９】
このような本実施の形態に係る走査型顕微鏡１において、上述の倍率変更光学系７は、対物レンズ３２の倍率により変化する射出瞳の径に関わらず、この射出瞳の像の大きさを受光面５ａの有効領域（光量を所定の精度で検出できる領域）と略同一の大きさになるように変倍するように構成されている。具体的には、例えば、倍率変更光学系７を構成する第１リレーレンズ群７１及び第２リレーレンズ群７２のうちのいずれか一方（図２に示す場合には、第２リレーレンズ群７２の方）を、対物レンズ３２の倍率に応じて交換することにより、このような変倍が可能となる。
【００２０】
もちろん、この倍率変更光学系７の変倍方法は、他の方法であっても良く、例えば、正レンズ及び負レンズを組み合わせ、対物レンズ３２から射出された光束の径を変倍する変倍レンズ群を、対物レンズ３２と第１リレーレンズ群７１との間の光路上に挿入するように構成しても良い。あるいは、第１リレーレンズ群７１及び第２リレーレンズ群７２を含むこの倍率変更光学系７を構成するレンズの少なくとも一部を光軸に沿って移動させて変倍するように構成しても良い（すなわち、この倍率変更光学系７をリレーズーム系として構成する）。
【００２１】
ここで、図２を用いて、対物レンズ３２の倍率に応じて変化する射出瞳の径の大きさに関わらず受光面５ａ上での射出瞳の像の大きさが略一定になるように、倍率変更光学系７を変倍することにより、より明るい画像が取得できる理由を説明する。
【００２２】
第１リレーレンズ群７１の焦点距離をｆ1、第２リレーレンズ群７２の焦点距離をｆ2とし、ｆ1＝４ｆ2の関係にあるとする。第１リレーレンズ群７１と第２リレーレンズ群７２（リレー光学系）を介して形成される対物レンズ３２の瞳像の倍率（リレー倍率）は、ｆ2／ｆ1＝ｆ2／４ｆ2＝１／４（倍）である。
【００２３】
ある低倍率の対物レンズ３２の瞳の大きさ（径）をφとすると、受光面５ａ上に形成される瞳像の大きさは、φ×１／４＝φ／４である（これは、受光面５ａの有効領域に相当する大きさになっている）。
【００２４】
また、受光面５ａへの光の入射角度がα（最大入射角度に相当する角度になっている）とすると、受光面５ａへの結像に寄与する光の対物レンズ３２の瞳からの射出角度Ｘは、ヘルムホルツ−ラグランジの不変量より、φ×１／２×Ｘ＝φ／４×１／２×αの関係から、Ｘ＝α／４となる。
【００２５】
このようなリレー光学系において、第１リレーレンズ群７１により結像される試料Ｓの像面Ｆの大きさ（径）を視野数Ａとする。次に、低倍率の対物レンズ３２を高倍率の対物レンズ３２に切り替えたとする。高倍率の対物レンズ３２の瞳の大きさがφ／２であるとすると、リレー倍率が固定の場合は、受光面５ａ上に形成される瞳像の大きさは、φ／２×１／４＝φ／８となる。
【００２６】
受光面５ａの有効領域を最大限に活用するために、瞳像の大きさが受光面５ａ上でφ／４になるように、第２リレーレンズ群７２の焦点距離をｆ3（＝２ｆ2）に変更すると、リレー倍率は、ｆ3／ｆ1＝２ｆ2／４ｆ2＝１／２（倍）となる。
【００２７】
これに伴って、対物レンズ３２の瞳からの射出角度がα／４の光の受光面５ａへの入射角度Ｙは、φ／２×１／２×α／４＝φ／４×１／２×Ｙの関係から、Ｙ＝α／２となる。さらに、受光面５ａへの光の最大入射角度はα（α／２の２倍）なので、受光面５ａへの結像に寄与できる光の対物レンズ３２の瞳からの出射角度はα／２（α／４の２倍）まで可能であり、結果的に視野数は約２Ａとなる。
【００２８】
リレー倍率が固定の場合は、試料Ｓから取得できる蛍光取得可能範囲はＡ（視野数）／対物レンズ３２の倍率であるが、リレー光学系を変倍（１／４倍から１／２倍に変更）することにより、２Ａ／対物レンズ３２の倍率となり、約２倍に増加する。
【実施例】
【００２９】
それでは、上述のような倍率変更光学系７を、試料Ｓの一次像を結像する第１リレーレンズ群７１と、対物レンズ３２の射出瞳の像を検出部５の受光面５ａ上に結像する第２リレーレンズ群７２とを有する構成（図２の構成）とした場合についての実施例を以下に示す。
【００３０】
本実施例に係る走査型顕微鏡１は、図１に示す構成で、その詳細は上述した説明の通りである。この走査型顕微鏡１では、１６倍、２０倍、及び６０倍の対物レンズ３２を使用し、これらを目的に応じて交換可能となっている。また、各対物レンズ３２の倍率に対応して、倍率変更光学系７の第２リレーレンズ群７２を交換するように構成されている。図２に、各対物レンズ３２及び倍率変更光学系７の関係を示す。ここで、図２（ａ）は１６倍、図２（ｂ）は２０倍、図２（ｃ）は６０倍の対物レンズ３２を使用した場合における、各対物レンズ３２と倍率変更光学系７との関係を示している。この図２に示すように、検出部５の受光面５ａは、対物レンズ３２の射出瞳位置Ｈの略共役位置に配置されている。また、試料Ｓの面上と、第１リレーレンズ群７１により結像される試料Ｓの像面Ｆとは、略共役関係にある。
【００３１】
次の表１に、本実施例で使用する各対物レンズ３２毎に、対物レンズ３２の倍率、対物レンズ３２のＮＡ、射出瞳直径、射出瞳から検出部５の受光面５ａまでの倍率変更光学系７によるリレー倍率、視野数、及び、倍率変更光学系７中の第２リレーレンズ群７２の焦点距離を示す。なお、受光面５ａの面積を直径３ｍｍとして計算した円の面積とし、この受光面５ａが受光できる最大入射角を３０°とし、第１集光レンズ３１の焦点距離を２００ｍｍとしている。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
この表１に示す数値は、以下のような計算方法で導出した。本実施例における１６倍の対物レンズ３２での例を挙げる。１６倍の対物レンズ３２の焦点距離は、「第１集光レンズ３１の焦点距離／対物レンズ３２の倍率」で求められるので、２００（ｍｍ）／１６（倍）＝１２．５ｍｍとなる。また、射出瞳の直径は、「２×対物レンズ３２の焦点距離×対物レンズ３２のＮＡ」で求められるので、この射出瞳の直径＝２×１２．５（ｍｍ）×０．８＝２０ｍｍとなる。
【００３４】
直径２０ｍｍの射出瞳を直径３ｍｍの受光面５ａで受光できるように縮小投影するので、倍率変更光学系７によるリレー倍率は０．１５倍となる。そのため、リレー倍率を０．１５倍とすると、倍率変更光学系７中の第１リレーレンズ群７１の焦点距離は、第１集光レンズ３１の焦点距離と同じであるので、この倍率変更光学系７中の第２リレーレンズ群７２の焦点距離は、２００（ｍｍ）×０．１５（倍）＝３０ｍｍとなる。検出部（ＰＭＴ）５への最大入射角は３０度なので、視野数の大きさは「像高＝焦点距離×ｔａｎ（射出角）」で求められ、像高＝３０（ｍｍ）×ｔａｎ（３０度）＝１７．３ｍｍとなる。また、視野数は直径で定義するので、像高を倍にすることにより視野数３４．６が求められる。なお、他の倍率の対物レンズ３２においても同様の方法により上記諸元を求めることができる。
【００３５】
以上の表１及び図２から、本実施例の走査型顕微鏡１では、対物レンズ３２を交換しても、最適化された倍率で光を受光面５ａに導くことができ、高倍の対物レンズ３２ほど、視野数が大きくなり、より広い部分において、試料面からの観察光を取得することができることがわかる。
【００３６】
ところで、高倍の対物レンズ３２ほど、大きな視野数で蛍光を取得すると有利になることが分かっている。その理由を、以下で説明する。
【００３７】
多光子励起顕微鏡の主な使用法の１つに、試料Ｓとして脳の観察がある。脳は一般的に白く見えるが、これは脳が光を拡散し易いためである。この拡散のために多光子励起した脳の一カ所で光った蛍光は拡散されてしまう。この拡散光も含め、如何に多くの蛍光を取り込むことができるかが、明るさのポイントであり、また、明るければ明るいほど、試料のより深部が観察できることになる。ここで、何倍の対物レンズ３２で励起しようとも、一カ所で光った蛍光の、脳内（試料Ｓ内）での拡散の度合いは変化しない。そのため、試料Ｓ上の如何に大きな部分を取り込むかで光の強度が変わることとなる。
【００３８】
次の表２に、各種の対物レンズ３２を使用した際の走査型顕微鏡１の試料Ｓ上の走査範囲の大きさと、各対物レンズ３２の走査型顕微鏡１における試料Ｓ上での蛍光を取得できる範囲（蛍光取得可能範囲）との関係を示す。走査範囲は、走査型顕微鏡１の走査光学系の視野数（１８と設定）／対物レンズ３２の倍率であり、蛍光取得可能範囲は倍率変更光学系７の視野数／対物レンズ３２の倍率である。また、走査範囲と、各対物レンズ３２の試料Ｓ上での蛍光を取得できる範囲を示すとともに、この蛍光を取得できる範囲に対する走査範囲の関係を、各々の面積の割合で示す。また、図３に、各対物レンズ３２における走査範囲（図３においてＡで示される範囲）と、試料Ｓ上での蛍光を取得できる範囲（図３においてＢで示される範囲）とを示す。なお、図３（ａ）は１６倍、図３（ｂ）は２０倍、図３（ｃ）は６０倍の各対物レンズ３２に対する走査範囲と蛍光を取得できる範囲を示す。また、表２中の走査範囲の値は、図３のＡで示される正方形の対角線の長さ（ｍｍ）を示し、蛍光を取得できる範囲の値は、図３のＢで示される円の直径（ｍｍ）を示す。この面積の割合の値が大きいほど、本発明の恩恵を効果的に受けていると考えることができる。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
前述の理由、及び、表２の結果からわかるように、本実施例では、対物レンズ３２の倍率に対応して、倍率変更光学系７（中の第２リレーレンズ群７２）を交換し、リレー倍率を変化させることで、より明るい画像を効果的に取得することができる。
【００４１】
なお、本実施例の走査型顕微鏡１では、第２リレーレンズ群７２を交換し、焦点距離を変えることによりリレー倍率を変更させているが、上述のように、他の異なる実施例として、リレーズーム系として構成したり、変倍レンズ群を中間に挿入することにより変倍しても、本実施例と同様の効果を得ることができる。
【００４２】
また、この倍率変更光学系７を、リレーズーム系で構成すると、対物レンズ３２の倍率に関わらず最適化が図られるので、何種類もの交換レンズ（例えば、第２リレーレンズ群７２）を用意する必要がない分、よりコンパクトな製品を得ることができる。また、このような倍率の変化を自動化することにより、ユーザーが複雑な調整を行わなくても、常に明るい画像を快適に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明に係る走査型顕微鏡の構成を示す説明図である。
【図２】第１実施例に係る走査型顕微鏡の構成を示すレンズ構成図であり、（ａ）は１６倍、（ｂ）は３０倍、（ｃ）は６０倍の対物レンズをそれぞれ用いた場合のレンズ構成図である。
【図３】第１実施例に係る走査型顕微鏡の対物レンズにおける走査範囲の実視野と蛍光を取得できる範囲とを示す概略図で、（ａ）は１６倍、（ｂ）は２０倍、（ｃ）は６０倍の各対物レンズに対する走査範囲の実視野と蛍光を取得できる範囲とを示す。
【符号の説明】
【００４４】
１  走査型顕微鏡    ２  走査装置    ３  対物光学系    ４  光分離部
５  検出部    ６  光源    ７  倍率変更光学系    ３２  対物レンズ
Ｓ  試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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