(57)【要約】      （修正有）【課題】試験サンプル中の標的検体の検出のための方法及び組成物を提供する。【解決手段】電子移送プロセスの核再構成エネルギーλを使用する。具体的には、本発明は、ａ)ｉ)極性配位基に占有されている少なくとも一配位の部位を有する、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体；およびii)標的検体に結合する結合配位子、を含むレドックス活性錯体に検体を結合させること、ここで前記レドックス活性錯体は電極と結合しており、結合すると溶媒阻害遷移金属錯体が形成される；さらにｂ)前記溶媒阻害遷移金属錯体と前記電極間との間の電子移送を検出すること、を含む、試験サンプル中の標的検体を検出する方法、及び結合配位子と溶媒が近づきやすい遷移金属錯体とを含むレドックス活性錯体と共有結合した電極を含む組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合配位子と溶媒が近づきやすい遷移金属錯体とを含むレドックス活性錯体と共有結合した電極を含む組成物。
【請求項２】
前記溶媒が近づきやすい遷移金属錯体が、極性配位基に占有されている少なくとも二配位の部位を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記溶媒が近づきやすい遷移金属錯体が、水分子に占有されている少なくとも一配位の部位を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記電極が、自己集合する単層を含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記溶媒が近づきやすい遷移金属錯体が、導電性オリゴマーを介して前記電極に共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記溶媒が近づきやすい遷移金属錯体が、レドックス活性錯体を形成する前記結合配位子と結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記結合配位子が、導電性オリゴマーを介して電極と共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記溶媒が近づきやすい遷移金属錯体が、約１２００mVより大なる溶媒再構成エネルギーを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ａ)ｉ)極性配位基に占有されている少なくとも一配位の部位を有する、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体；およびii)標的検体に結合する結合配位子、を含むレドックス活性錯体に検体を結合させること、ここで前記レドックス活性錯体は電極と結合しており、結合すると溶媒阻害遷移金属錯体が形成される；さらに
ｂ)前記溶媒阻害遷移金属錯体と前記電極間との間の電子移送を検出すること、
を含む、試験サンプル中の標的検体を検出する方法。
【請求項１０】
前記溶媒が近づきやすい遷移金属錯体が、１２００mVより大なる溶媒再構成エネルギーを有し、前記溶媒阻害遷移金属錯体が１０００mVより少ない溶媒再構成エネルギーを有するものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶媒阻害遷移金属錯体の溶媒再構成エネルギーが、前記検体との結合により少なくとも１００mVまで減少し、前記溶媒阻害遷移金属錯体を形成している、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
結合により、少なくとも１つの溶媒が近づきやすい遷移金属錯体が結合検体から８Åより少ないところにあり、前記溶媒阻害遷移金属錯体を形成している、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記極性配位基が水分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶媒阻害遷移金属錯体への少なくとも第一入力シグナルの適用をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
標的検体が存在しないと、前記第一入力シグナルが有意な電子移送を生じない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一入力シグナルが、少なくとも交流成分を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
さらに複数周波数の入力シグナルの適用を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一入力シグナルが、少なくとも直流電圧を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
さらに複数電圧の入力シグナルの適用を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出が、前記溶媒阻害遷移金属錯体と前記電極間の電子移送に特有の出力シグナルを受けることによるものである、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
前記出力シグナルが電流である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記電流が交流電流である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記結合配位子が、前記溶媒が近づきやすい遷移金属錯体と共有結合している、請求項９に記載の方法。
【請求項２４】
前記配位子が前記電極と共有結合している、請求項９に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶媒が近づきやすい遷移金属錯体が前記電極と共有結合している、請求項９に記載の方法。
【請求項２６】
前記共有結合が導電性オリゴマーを介したものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記検体がバイオ分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項２８】
前記バイオ分子がタンパク質、炭水化物および脂質からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ａ)第一および第二測定電極を含む試験チャンバー、但し、前記第一測定電極は：ｉ)極性配位基により占有されている少なくとも一配位の部位を有する、溶媒が近づきやすい遷移金属；およびii)結合配位子を含む共有結合レドックス活性錯体を含むものである：および、ｂ)前記試験チャンバーと電子的に結合した交流／直流電圧を含む、試験サンプル中の標的検体を検出する装置。
【請求項３０】
前記共有結合がスペーサーを介したものである、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
さらにプロセッサーが前記電極と結合している、請求項２９に記載の装置。
【請求項３２】
前記電極がさらに自己集合単層を含む、請求項２９に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、１９９７年６月１２日に出願したU.S.S.N．08/873,977の継続出願である。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、電子移送過程の核再構成エネルギー"λ"の変化に基づく、検体検出用の新規な方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
電子移送反応は、光合成から好気性呼吸までの範囲の様々な生物学的変換において、重要なステップ群である。化学的および生物学的システム両方における電子移送反応の研究は、多大な知識の蓄積発展と、定義できるパラメーターのセットによる電子移送の速度を叙述する強力な理論的基盤を築いた。
【０００４】
タンパク質および他のバイオ分子の電子トンネルは、レドックス中心の電子相互作用が比較的弱いところでの反応時に生起する。準古典的な理論反応では、電子移送の反応速度は、ドライビングフォース(-△Ｇ0)、核再構成パラメーター(λ)、および経過状態での反応物と生成物間の、電子カップリング力（ＨAB）に依存し、次の等式：
2010091573.tif 000002
に従うものと予測する。上記等式の核再構成エネルギー"λ"は、生成物の平衡核配置における反応物のエネルギーとして定義する。λには２つの成分があり；"領域外"効果(λ0)および"領域内"効果(λi)である。極性溶媒中での電子移送反応では、λへの最も有力な寄与は、反応物の電荷における変化に応じた溶媒分子の再配向から生じる。第２のλ成分は、ドナーとアクセプターの酸化状態の変化による、結合長さおよび角度の変化から生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
電子移送反応の溶媒再構成エネルギーの変化を活用する、標的検体の検出方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
上記目的に従い、本発明は、試験サンプル中の標的検体の検出方法を提供する。この方法は、検体のレドックス活性錯体への結合を含む。レドックス活性錯体は、極性配位基によって占有されている、少なくとも一配位の部位、および、標的検体と結合する結合配位子とを有する、溶媒が近づき易い遷移金属錯体を含む。この錯体は電極と結合している。結合により、溶媒阻害された遷移金属錯体が形成され、溶媒阻害された金属錯体と電極の間で電子移送が検出される。本方法は、少なくとも第一入力シグナルの溶媒阻害された遷移金属錯体への利用も含む。
【０００７】
更なる態様では、本発明は、検体をレドックス活性錯体と会合させることを含む、試験サンプル中の標的検体の検出方法を提供する。本レドックス活性錯体は、溶媒阻害された金属錯体と、標的検体を結合する結合配位子とを含む。会合により溶媒が近づきやすい遷移金属錯体が形成され、次いで検出される。
【０００８】
別の態様では、本発明は、検体のレドックス活性錯体との会合を含む、試験サンプル中の標的検体の検出方法を提供する。本錯体は、溶媒阻害された遷移金属錯体、標的検体を結合する結合配位子、および検体アナログを含む。本錯体は電極と結合し、会合により、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体を形成し、次いでそれが検出される。
【０００９】
更なる態様では、本発明は、レドックス活性錯体が共有的に結合した電極を含む組成物を提供する。本錯体は、結合配位子、および溶媒が近づき易いレドックス活性分子を含み、該活性分子は、極性配位基によって占有されている少なくとも一配位、好ましくは二配位または三配位部位を有し、該配位基の１つまたはそれ以上が水分子である、を含む。
【００１０】
更なる態様では、本発明は、試験サンプル中の標的検体の検出用の装置を提供するものであり、それは第一および第二測定用電極を含む試験チャンバーを含む。第一測定用電極は、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体を含む共有結合したレドックス活性錯体を含み、それは好ましくは、少なくとも３つの極性配位基で占有されている配位部位および、結合配位子を有する。本装置はさらに、試験チャンバーと電気的に連結された交流/直流電源を含み、所望により、検出用シグナルプロセッサーをも含む。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、検体との結合により生ずる、遷移金属錯体と電極の間の電子移送を促進する遷移金属錯体の溶媒再構成エネルギーの変化を使用した、標的検体の検出方法およびその組成物を提供するものである。本発明は、遷移金属イオンなどのレドックス活性分子の酸化状態の変化、すなわち、電子の受け入れまたは提供により、金属イオンの電荷およびサイズの変化を生ずるという事実に基づく。この電荷およびサイズの変化は、酸化状態におけるこの変化により、周囲の溶媒の温度を変化させて再構成させる。
【００１２】
本発明の目的には、溶媒再構成エネルギーをλ支配成分として扱う。従って、溶媒再構成エネルギーが高いと、他の点では好ましい状態であっても酸化状態における変化を妨げるであろう。
【００１３】
従来の電子移送使用方法では、一般的に、水を排除する働きをする、数種の大型疎水性配位子を使用して、レドックス中心における溶媒再構成を最小化する遷移金属錯体を使用して、溶媒効果を最小にしている。従って、従来、遷移金属イオンの配位子として使用されているのは、非極性であり、一般的に疎水性で、しばしば有機環を含むものである。
【００１４】
しかしながら本発明は、標的検体のアッセイの基礎として働くこの溶媒再構成エネルギーを活用する、新規発想によるものである。本発明では、溶媒が近づきやすい、即ち、少なくとも１つ、好ましくはそれ以上の小極性配位子を有し、そのために高い溶媒再構成エネルギーを有する遷移金属錯体、を使用する。従って、溶媒再構成エネルギーより低い開始エネルギーは、有意な電子移送を生じない。しかしながら、一般的に大きな標的検体と結合すると、遷移金属錯体は、溶媒抑制され、一般的な立体効果のために極性溶媒に近づけなくなるが、それは以前は効きめがなかった開始エネルギーでも電子移送できるようになるのである。
【００１５】
従って、遷移金属錯体が溶媒に近づきやすいから溶媒阻害されるものへ変ることは、電子移送へのスイッチまたは引き金として作用する。これは従って検体アッセイの基礎となる。ClossとMillerは、溶液中のドナー(架橋)アクセプター電子移送反応に関する彼らの研究において、非極性溶媒中でのラムダの減少を示している(Closs and Miller，Science，240，440-447，(1988))。この発想は、メトミオグロビンについての研究に着想根拠を見出したものであるが、これは６配位ヘム鉄部位の配位水分子を含み、非常に敏速な、自己交換を受けない(速度定数k22１Ｍ-1s-1)。化学修飾すると、ヘムは５配位になり、水を放ち、自己交換速度定数は顕著に増加する(速度定数k22１×１０4Ｍ-1s-1)；Tsukahara，J．Am．Chem．Soc．111:2040(1989)参照。
【００１６】
理論に結びつくものではないが、本発明で適用し得る２種の一般的メカニズムがある。好ましい実施態様では、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体と立体的に近い結合配位子への標的検体の結合が、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体上の１つまたはそれ以上の小さな極性配位子が、標的検体により供給された１つまたはそれ以上の配位原子によって置換されるようにするが、それは少なくとも２つの理由により溶媒再構成エネルギーの減少をもたらす。第一に、小さな極性配位子を、一般的により大きな非極性配位子と交換することは、一般的に、金属から水を放出させ、必要とする溶媒再構成エネルギー(すなわち領域内λi効果)を低くする。第２に、一般的に大きな標的検体の、比較的小さなレドックス活性分子への近接は、金属イオンの第一または第二配位領域内で、水を立体的に放出させ、併せて、再構成エネルギーを低くする。
【００１７】
更に、好ましい実施態様では、標的検体配位原子による金属イオン上の極性配位子の交換を必ずしも必要とはしない。むしろ、この実施態様では、極性配位子は効果的に、不可逆的に金属イオンと結合し、標的検体との結合による金属イオンの第一または第二配位領域での水放出の結果として、溶媒再構成エネルギーの減少が得られ；必ず水を放出する(すなわち領域外λ0効果)。
【００１８】
それゆえに、本発明は標的検体の検出方法を提供するものである。本方法は一般的に、検体と結合配位子との結合を含むが、それは、遷移金属錯体(レドックス活性錯体を形成して)結合するかまたは近づくことによる。遷移金属錯体は、電極と、一般的に導電性オリゴマーを使用して結合する。検体結合により、遷移金属錯体の再構成エネルギーは減少して、溶媒阻害遷移金属錯体を形成し、溶媒阻害遷移金属錯体と電極との間のより大きな電子移送を起こさせる。
【００１９】
それゆえに、本発明は標的検体の検出方法を提供するものである。本書では、"標的検体"または"検体"またはそれらの同義語により、検出しようとする全ての分子、化合物または粒子を意味する。以下に概説するように、標的検体は好ましくは結合配位子と結合するが、以下でより詳しく叙述する。
【００２０】
好適な検体は有機および無機分子を含み、バイオ分子も含む。好ましい実施態様では、検体は環境汚染物(農薬、殺虫剤、毒物などを含む)；化学品(溶媒、ポリマー、有機物質などを含む)；医療分子(医療用および誤用薬、抗生物質などを含む)；バイオ分子(ホルモン、サイトカイン、タンパク質、脂質、炭水化物、細胞膜抗原およびレセプター(神経系、ホルモン性、栄養分、および細胞表面レセプター)またはそれらのリガンドなどを含む)；全細胞(原核生物(発原性細菌など)および真核生物細胞を含み、哺乳類腫瘍細胞も含む)；ウイルス(レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなどを含む)；および種子などでよい。特に好適な検体は、環境汚染物、核酸、タンパク質(酵素、抗体、抗原、成長因子、サイトカインなどを含む)；医療用および誤用薬、細胞およびウイルスである。
【００２１】
本書において"核酸"または"オリゴヌクレオチド"またはそれらの同義語は、少なくとも２種の互いに共有的結合したヌクレオチドを意味する。本発明での核酸は、一般的にはホスホジエステル結合を含むが、以下に概説のとおりある場合には代わりのバックボーンを持つこともある核酸類縁体、例えば、ホスホロアミド(Beaucage et al.,Tetrahedron 49(10):1925(1993)および引用文献；Letsinger，J．Org．Chem．35:3800(1970);Sprinzl et al.，Eur J．Biochem．81:579(1977);Letsinger et al.，Nucl．Acids Res．14:3487(1986);Sawai et al.，Chem Lett．805(1984)，Letsinger et al.，J．Am．Chem．Soc．110:4470(1988);およびPauwels et al.,Chemica Scripta 26:141 91986参照)、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、Ｏ-メチルフェニルホスホロアミド連鎖(Eckstein，Oligonucleotides and Analogues:A Pratical Approach，Oxford University Press参照)、およびペプチド核酸バックボーンおよび連鎖(Egholm，J Am．Chem．Soc．114:1895(1992);Meier et al.，Chem．Int．Ed．Engl．31:1008(1992);Nielsen，Nature，365:566(1993);Carlsson et al.,Nature 380:207(1996)参照、すべて出典明示により本明細書に組込まれている)を含む。
【００２２】
１つまたはそれ以上の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の定義に含まれる(Jenkins et al.，Chem．Soc．Rev.(1995)pp169-176参照)。これらのリボース-ホスフェートバックボーンの修飾は、構造部分の添加を促進するために行なわれるか、またはこれらの分子の生理的環境中の安定性および半減期を増加するために行なわれる。
【００２３】
核酸は、明記するとき、単鎖または二本鎖であり得、または二本鎖または一本鎖配列両方のタンパク質を含む。核酸はＤＮＡであり得、それらはゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドのものであり得、さらに、核酸は、デオキシリボ-およびリボヌクレオチドの組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサニン、ヒポキサニンなど塩基の組み合わせの全てを含み得る。本書中では、"ヌクレオシド"の用語は、ヌクレオチド、およびアミノまたはチオ修飾ヌクレオシドなどの修飾ヌクレオシドを含む。
【００２４】
本書では、"タンパク質"またはその同義語は、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチド、および非天然アミノ酸およびアミノ酸類縁体、および擬似ペプチド構造体を含む類縁体を意味する。
【００２５】
当業者には理解されるように、本方法を使用して多くの検体を検出し得る；本質的に、以下に叙述するように、対応結合配位子が作成できるすべての標的検体を、本発明の方法を使用して検出し得る。
【００２６】
好ましい実施態様では、標的検体はレドックス活性錯体に加えるかまたは導入し、それを好ましくは電極に結合させる。本書で"レドックス活性錯体"とは、少なくとも１つの遷移金属錯体および少なくとも１つの結合配位子を含む錯体を意味し、それらは、以下にさらに記すように、多種の異なる方法で結合し得る。"遷移金属錯体"または"レドックス活性分子"または"電子移送部"とは、１つまたはそれ以上の電子を、可逆的にまたは半可逆的に移送できる金属含有化合物を意味する。電子ドナーとアクセプター能力は比例的であると理解すべきである；それはある実験条件下で電子を放出できる分子は、異なる実験条件下では電子を受け入れることができるからである。多数の可能性のある遷移金属錯体は非常に大型であり、電子移送化合物の分野の当業者は、多数の化合物を本発明で使用することができると解すべきであろう。遷移金属は、不完全なまたは完全なｄ電子殼を有する原子である。本発明での使用に適当な遷移金属は、カドミウム(Ｃｄ)、銅(Ｃｕ)、コバルト(Ｃｏ)、パラジウム(Ｐｄ)、亜鉛(Ｚｎ)、鉄(Ｆｅ)、ルテニウム(Ｒｕ)、ロジウム(Ｒｈ)、オスミウム(Ｏｓ)、レニウム(Ｒｅ)、白金(Ｐｔ)、スカンジウム(Ｓｃ)、チタン(Ｔｉ)、バナジウム(Ｖ)、クロム(Ｃｒ)、マンガン(Ｍｎ)、ニッケル(Ｎｉ)、モリブテン(Ｍｏ)、テクネチウム(Ｔｃ)、タングステン(Ｗ)、イリジウム（Ｉｒ)を含むが、しかしこれらに限定されない。好ましくは、それは、第一列の遷移金属である、白金属(Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、ＩｒおよびＰｔ)、それに加えてＦｅ、Ｒｅ、Ｗ、ＭｏおよびＴｃである。特に好ましいのは、酸化状態に基づいて配位部位の数が変わらない金属であり、ルテニウム、オスミウム、鉄、白金およびパラジウムを含み、とりわけルテニウムと鉄が好ましい。本書中では、一般的に遷移金属をＭとして叙述する。
【００２７】
遷移金属イオンは、金属イオンを結合する配位原子を供給する機能を果たす配位子で錯体化する。一般的に、遷移金属錯体が、溶媒が近づきやすいかどうかを決めるのは配位子の組成または特徴である。本書では、"溶媒が近づきやすい遷移金属錯体"またはその同義語は、少なくとも１つ、好ましくは２つ、さらに好ましくは３つ、４つまたはそれ以上の小極性配位子を有する遷移金属錯体を意味する。実際の極性配位子の数は、金属イオンの配位数(ｎ)に依存する。極性配位子の好ましい数は(ｎ−１)および(ｎ−２)である。例えば、Ｆｅ、Ｒｕおよびｏｓなどの５配位金属については、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体は、好ましくは１〜５の小極性配位子を有するものであり、他の部位の必要性に基づいて、以下に詳述するように、２〜５のものが好ましく、３〜５のものがさらに好ましい。ＰｔやＰｄなどの四配位金属は、好ましくは１、２つまたは３つの小極性配位子を有する。
【００２８】
"溶媒が近づきやすい"と"溶媒阻害"は関連用語である。それは、高エネルギーを適用した場合、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体でさえ電子を移送するように誘導され得るからである。
【００２９】
金属の他の配位部位は、遷移金属錯体がレドックス活性錯体を形成して結合配位子(直接的またはリンカーを使用して間接的に)に結合するか、あるいは電極(しばしばスペーサーを使用して、以下に詳述するように)に結合するか、またはその両方に結合するためのアタッチメントとして使用される。従って例えば、遷移金属錯体が直接的に結合配位子と結合した場合、金属イオンの一、二またはそれ以上の配位部位は、結合配位子により供給された配位原子により(または間接的に結合する場合はリンカーにより)占有され得る。加えて、または更に、一またはそれ以上の金属イオン配位部位は、遷移金属錯体を電極に結合させるために使用されるスペーサーに占有され得る。例えば、遷移金属錯体を、以下で詳述するように、結合配位子とは別に電極に結合させる場合、金属(ｎ)の１(ｎ−１)を除いた配位部位すべてが極性配位子を含み得る。
【００３０】
適切な小極性配位子は、本書中では一般的に"Ｌ"と叙述しており、以下で詳述するように、２種の総括部類に分けられる。実施態様の１つでは、小極性配位子は、一般的に弱い脱離基または良シグマドナーとしての特性、および金属の個性により、金属イオンと効率よく、不可逆的に結合する。これらの配位子は、"置換不活性"と称し得る。更に、以下で詳しく叙述するように、小極性配位子は、金属イオンと可逆的に結合し得、標的検体との結合において、検体は金属に１つまたはそれ以上の配位子原子を供給し得、その良脱理基特性または弱シグマドナー特性により、小極性電子と効率よく置き換わり得る。これらの配位子は"置換易変性"と称し得る。これは高い溶媒再構成エネルギーを与えるので、この配位子は好んで双極子を形成する。
【００３１】
不可逆的配位子グループは、アミン(-ＮＨ2、-ＮＨＲおよび-ＮＲ2、但し、Ｒは、当業者には理解されるように、好ましくは小さく親水性の置換基である)、シアノ基(-Ｃ＝Ｎ)、チオシアノ基(-ＳＣ＝Ｎ)およびイソチオシアノ基(-Ｎ＝ＣＳ)を含むが、これらに限定されない。可逆的配位子グループは、Ｈ2Ｏおよびハライド原子またはグループを含むが、これらに限定されない。水分子が配位原子として機能するときは、溶媒再構成エネルギーの変化は十分高いことを理解すべきであり；それゆえに、レドックス活性分子上の単体水分子の置換または付加は、他の配位子が小極性配位子でないときでも、一般的に視認できる変化をもたらす。従って、好ましい実施態様では、本発明は、レドックス活性分子中の少なくとも１つの水分子の置換または付加に依存する。
【００３２】
小極性配位子に加えて、金属イオンは、付加的、疎水性配位子を有し得、本書中では"Ｌ"と叙述する。これは、鉄などの６配位金属イオンが、電極への結合に使用されるスペーサーによって満たされた１つの配位子位置(好ましくはアキシャル)、フェナントロリンで満たされた２つの配位子位置、および、結合配位子との結合鎖に依存する２つまたは３つの小極性配位子を有し得るからである。当業者には理解されるように、様々な好適な配位子を使用し得る。適当な常用配位子は、イソエコチンアミド；イミダゾール；ビピリジンおよびビピリジンの置換誘導体；テルピリジンおよび置換誘導体；フェナントロリン類、特に、１,１０−フェナントリン(ｐｈｅｎと略す)および４,７−ジメチルフェナントロリンおよびジピリドル[３,２−ａ：２',３'−ｃ]フェナジン(ｄｐｐｚと略す)などのフェナントロリン置換誘導体；ジピリドフェナジン；１,４,５,８,９,１２−ヘキサアザトリフェニレン(ｈａｔと略す)；９,１０−フェナントレンキノンジイミン(ｐｈｉと略す)；１,４,５,８−テトラアザフェナントレン(ｔａｐと略す)；１,４,８,１１−テトラ−アザシクロテトラデカン(シクラム(cyclam)と略す)；イソシアニドおよびメタロセン配位子を含むが、これらに限定されない。縮合誘導体を含む置換誘導体も使用できる。
【００３３】
遷移金属錯体上に少なくとも１つの小極性配位子が存在すると、溶媒再構成エネルギーが高くなり、それは遷移金属レドックス活性分子への、および、からの電子移送を抑制する。従って、好ましい実施態様では、溶媒が近づきやすいレドックス活性分子は、約５００ｍｅＶより大きい、好ましくは８００ｍｅＶより大きい、さらに好ましくは１ｅＶより大きい、とりわけ好ましくは１.２ないし１.３ｅＶより大きい溶媒再構成エネルギーを有する。
【００３４】
溶媒に近づきやすいレドックス活性分子に加えて、レドックス活性錯体は、標的検体と結合する結合配位子を含む。本書では、"結合配位子"またはその同義語は、標的検体の存在を探すプローグとして使用する化合物を意味し、特異的に検体と結合するものである；この結合配位子は結合対の一部である。"特異的結合"とは、本書では、試験サンプル中の検体と他の成分または汚染物とを識別するのに十分な特異性をもって検体を結合する配位子を意味する。この結合は、非特異的結合を洗浄除去する工程を含むアッセイ条件で結合が維持されるに十分でなければならない。一般的に、結合配位子に対する検体の解離定数は、少なくとも１０-4〜１０-9Ｍ-1の範囲内であり、好ましい範囲は１０-5〜１０-9Ｍ-1、さらに好ましくは１０-7〜１０-9Ｍ-1である。
【００３５】
当業者には理解されるように、結合配位子の組成は標的検体の組成に依存する。広範囲の検体に対する結合配位子が知られており、または既知技術を使用して簡単に見出し得る。例えば、検体が、一本鎖核酸であるとき、結合配位子はその相補的核酸であり得る。更に、検体が一本鎖または二本鎖核酸であるとき、結合配位子は核酸結合タンパク質であり得る。検体がタンパク質であるとき、結合配位子はタンパク質または小分子を含む。好ましい結合配位子タンパク質はペプチドを含む。例えば、検体が酵素のとき、適切な結合リガンドは基質および阻害剤である。抗原−抗体対、レセプターリガンド、および炭水化物とそれらの結合パートナーも、適当な検体-結合配位子対である。
【００３６】
一般的に、好ましい実施態様は、比較的に小さな結合配位子と大きな標的検体を利用するものである。
【００３７】
あわせて、遷移金属錯体とその結合配位子は、レドックス活性錯体を含む。加えて、各レドックス活性錯体ごとに１つ以上の結合配位子または遷移金属錯体があり得る。このレドックス活性錯体は、架橋剤、標識など、および電極への結合用リンカーのような付加的部分を含み得る。
【００３８】
レドックス活性錯体は電極と結合する。これは、当業者には理解されるように多様な方法でなし得る。一般的に、以下で詳しく叙述するが、遷移金属錯体および結合配位子の１つまたは両方を、スペーサーを介して電極に結合させる。
【００３９】
好ましい実施態様では、レドックス活性錯体を、スペーサーを介して電極に共有的に結合させる。本書では"スペーサー"とは、レドックス活性錯体を電極の表面から離して保持する部分を意味する。好ましい実施態様では、スペーサーは、本書中で記述しているように導電性オリゴマーであり、適切なスペーサー部分はパシベーション剤および以下に概説する絶縁体を含む。レドックス活性分子と電極(ＨAB)間の電子カップリングが電子移送の速度制限とならないことが好ましい(しかし必須ではない)が、スペーサー部分は、実質的に非導電性であり得る。
【００４０】
一般的に、スペーサーの長さは、導電性ポリマーおよびパシベーション剤として叙述する程度である。当業者には理解されるように、スペーサーが長すぎると、レドックス活性分子と電極の電子カップリングが減少するであろう。
【００４１】
好ましい実施態様では、スペーサーが導電性オリゴマーである。"導電性オリゴマー"とは、実質的に、好ましくは直鎖状である導電性オリゴマーを意味し、いくつかの実施態様については文献"molecular wires"を参照する。導電性オリゴマーおよびその合成、使用および部分への結合は、PCT US97/20014に叙述されており、その部分を本書中に明示的に組み入れる。
【００４２】
"実質的伝導性"とは、オリゴマーを介した遷移金属錯体と電極(ＨAB)間の電子カップリングが電子移送の律速段階ではないことを意味する。導電性オリゴマーは１つまたはそれ以上のシグマ(σ)結合を含み得るが、一般的に、導電性オリゴマーは実質的に重複Π軌道、すなわち導電性オリゴマーのモノマー単位間の共役Π軌道、を有する。加えて、導電性オリゴマーは、結合した遷移金属錯体の中へまたはそこから電子を通す能力によって機能的に限定される。さらに、導電性オリゴマーはこの中で定義した絶縁体より導電性がある。
【００４３】
好ましい実施例では、導電性オリゴマーは導電性Ｓを有し、それは約１０-6〜約１０4Ω-1cm-1の間であり、好ましくは約１０-5〜約１０3Ω-1cm-1の間であり、これらのＳ値は約２０Åから約２００Åの範囲の分子で計算される。以下で叙述するように、絶縁体は、約１０-7Ω-1cm-1かまたはそれより低い導電性Ｓを有し、好ましくは１０-8Ω-1cm-1以下である。Gardner et al.，Sensors and Actuators A 51（1995）57-66参照、これらは出典明示により本明細書に組込まれている。
【００４４】
導電性オリゴマーの所望特性は、高い導電性、本発明の組成物の合成および使用に用いる有機溶媒および/または水への十分な溶解性、および好ましくはｉ)レドックス活性錯体の合成中、ii)導電性オリゴマーの電極に対する結合中、およびiii)検体アッセイ中、に起こる反応に対する化学的抵抗性、を含む。
【００４５】
本発明のオリゴマーは、本書中に記しているように、少なくとも２つのモノマーサブユニットを含む。以下で詳述するとおり、オリゴマーはホモ-およびヘテロ-オリゴマー、およびポリマーを含む。
【００４６】
好ましい実施態様では、導電性オリゴマーは、構造１に示した構造を持つ：
【化１】
2010091573.tif 000003
【００４７】
当業者には理解されるとおり、ここに示した構造は全て、更なる原子または構造を有し得る。即ち、構造１の導電性オリゴマーは、遷移金属錯体またはレドックス活性錯体、結合配位子、電極、など、またはこれら数種に結合させることができる。特記しない限り、ここに示した導電性オリゴマーは、その左側で電極に結合させる。つまり、構造１の場合は、左側の“Ｙ”を本明細書に記載の電極につなげ、右側の“Ｙ”は、存在するならば、直接的にまたは本発明に記載のリンカーを用いて、レドックス活性錯体、即ち、遷移金属錯体または結合配位子のいずれかに結合させる。
【００４８】
本実施態様では、Ｙは芳香族基であり、ｎは１から５０の整数であり、gは１または０のいずれかであり、ｅは０から１０の整数であり、ｍは０または１である。gが１のとき、Ｂ−Ｄは、隣接する結合(本書中では"共役結合"と称す)と共役し得る結合であり、好ましくは、アセチレン、アルケン、置換アルケン、アミド、アゾ、−Ｃ＝Ｎ−(−Ｎ＝Ｃ−、−ＣＲ＝Ｎ−および−Ｎ＝ＣＲ−を含む)、−Si＝Si−および−Si＝Ｃ−(−Ｃ＝Si−、−Si＝ＣＲ−および−ＣＲ＝Si−を含む)から選択される。gが０のとき、ｅは好ましくは１であり、Ｄは好ましくはカルボニルまたはヘテロ原子部であり、このヘテロ原子は、酸素、硫黄、窒素、ケイ素またはリンから選択される。そのため、適切なヘテロ原子部には、−ＮＨおよび−ＮＲ、式中、Ｒは本明細書に定義のとおりである；置換硫黄；スルホニル(−ＳＯ2−)スルホキシド(−ＳＯ−)；酸化ホスフィン(−ＰＯ−および−ＲＰＯ−)；およびチオホスフィン(−ＰＳ−および−ＲＰＳ−)があるが、これらに限定されない。しかしながら、下記に概略説明するとおり、導電性オリゴマーを金電極に結合させるような場合、硫黄誘導体は好ましくない。
【００４９】
“芳香族基”またはその均等物とは、本書では、一般に５から１４の炭素原子を含む芳香族単環式または多環式炭化水素部(より大きい多環式環構造を作ることもできるが)およびそれらの炭素環式ケトンまたはチオケトン誘導体で、その遊離の原子価を持つ炭素原子が芳香族環の一員であるものを意味する。芳香族環には、アリーレン基および２つ以上の原子を除いた芳香族基がある。本願の目的には、芳香族は複素環を含む。“複素環”または“ヘテロアリール”とは、１から５個の指定炭素原子を、窒素、酸素、硫黄、リン、ホウ素およびケイ素から選択されるヘテロ原子で置換した、そしてその遊離の原子価を持つ原子が芳香族環の一員である芳香族基、およびそれらの複素環式ケトンおよびチオケトン誘導体を意味する。従って、複素環には、チエニル、フリル、ピロリル、ピリミジニル、オキサリル、インドリル、プリニル、キノリル、イソキノリル、チアゾリル、イミドジル等がある。
【００５０】
重要なのは、導電性オリゴマーのＹ芳香族基が異なっていてもよいこと、即ち、導電性オリゴマーがヘテロオリゴマーであり得ることである。つまり、導電性オリゴマーは、単一型のＹ基または複数型のＹ基のオリゴマーを含むことができる。よって、好ましい実施態様では、下記のようにバリアー単層を使用する場合、１またはそれ以上の型のＹ基を、単層レベル上に用いる第２型のＹ基を有する単層内の導電性オリゴマーにおいて使用する。そのため、本明細書に記載のとおり、導電性オリゴマーは、標的検体結合を助長するために、電極表面で単層内に良好なパッキング効率を持つＹ基と、該単層レベル上により大きい柔軟性および親水性を持つ第２型(群)のＹ基を含むことができる。例えば、非置換ベンジル環は、単層パッキング用にＹ環を含むことができ、置換ベンジル環は、該単層上に使用できる。あるいは、複素環式環は、置換または非置換のいずれかで、該単層上に使用できる。更に、一実施態様では、導電性オリゴマーが単層外にははみ出さない場合でも、ヘテロオリゴマーを使用できる。
【００５１】
芳香族基は、本書中で一般にＲで表す置換基で置換できる。Ｒ基は、必要に応じて加え、導電性オリゴマーのパッキングに影響を及ぼすことができる、即ち、導電性オリゴマーが電極上に単層を形成するとき、Ｒ基を用いて単層におけるオリゴマーの会合を変化させることができる。Ｒ基を加えて、１)オリゴマーまたはオリゴマーを含む組成物の溶解度を変える；２)システムの共役または電子化学電位を変える；および３)単層表面の電荷または特性を変えることもできる。
【００５２】
適切なＲ基には、水素、アルキル、アルコール、芳香族、アミノ、アミド、ニトロ、エーテル、エステル、アルデヒド、ケトン、イミノ、スルホニル、ケイ素部、ハロゲン、硫黄含有部、リン含有部、およびエチレングリコールがあるが、これらに限定されない。本明細書に示した構造では、Ｒは、その位置が置換されていない場合は水素である。ある位置では、２つの置換基、ＲおよびＲ'が可能であり、その場合、ＲおよびＲ'基は同一であるかまたは異なっているかのいずれかでよい。
【００５３】
“アルキル基”またはその均等物とは、直鎖状または分枝状アルキル基を意味し、直鎖アルキル基が好ましい。分枝状ならば、１箇所以上の、特記しなければ任意の位置で枝分かれしている。このアルキル基は、約１から約３０の炭素原子(Ｃ１−Ｃ３０)の範囲であり得、好ましい実施態様では、約１から約２０の炭素原子(Ｃ１−Ｃ２０)を利用し、約Ｃ１から約Ｃ１２ないしＣ１５が好ましく、Ｃ１ないしＣ５が特に好ましいが、ある実施態様では、アルキル基は、もっと大きくてもよい。アルキル基の定義の中に含まれるものには、Ｃ５およびＣ６環などのシクロアルキル基や、窒素、酸素、硫黄、珪素またはリンを持つ複素環式環もある。アルキルはまた、好ましくは硫黄、酸素、窒素およびケイ素のヘテロ原子を持つヘテロアルキルも含む。アルキルは、置換アルキル基も含む。“置換アルキル基”とは、更に上記定義の１以上の置換基部“Ｒ”を含むアルキル基を意味する。
【００５４】
“アミノ基”またはその均等物とは、−ＮＨ2、−ＮＨＲおよび−ＮＲ2基を意味し、Ｒは本明細書に定義のとおりである。
【００５５】
“ニトロ基”とは、−ＮＯ2基を意味する。
【００５６】
“硫黄含有部”とは、硫黄原子を含有する化合物を意味し、チア−、チオ−およびスルホ−化合物、チオール(−ＳＨおよび−ＳＲ)、スルフィド(−ＲＳＲ−)、スルホキシド(−Ｒ−ＳＯ−Ｒ−)、スルフォン(−Ｒ−ＳＯ2−Ｒ−)、ジスルフィド(−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−)およびスルフォニルエステル(−Ｒ−ＳＯ2−Ｏ−Ｒ−)、があるが、これらに限定されない。
【００５７】
“リン含有部”は、リンを含有する化合物を意味し、ホスフィンおよびホスフェートがあるが、これらに限定されない。“シリコン含有部”とは、シロキサンを含むシリコン含有化合物を意味する。
【００５８】
“エーテル”とは、−Ｏ−Ｒ−基を意味する。
【００５９】
“エステル”とは、−ＣＯＯＲ基を意味する；エステルはチオエステル(−ＣＳＯＲ)を含む。
【００６０】
“ハロゲン”とは、臭素、ヨウ素、塩素またはフッ素を意味する。好ましい置換アルキルは、部分的にまたは全体的にハロゲン化したアルキル、例えばＣＦ3等である。
【００６１】
“アルデヒド”とは、−ＲＣＯＨ基を意味する。
【００６２】
“ケトン”とは、−Ｒ−ＣＯ−Ｒ基を意味する。
【００６３】
“アルコール”とは、−ＯＨ基およびアルキルアルコール−ＲＯＨを意味する。
【００６４】
“アミド”とは、−ＲＣＯＮＨ−またはＲＣＯＮＲ−基を意味する。
【００６５】
“イミノ”とは、−ＲＣＮＨ−Ｒ−および−ＲＣＮＲ−Ｒ−基を意味する。
【００６６】
“エチレングリコール”とは、−(Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2)n−基を意味するが、エチレン基の各炭素原子は、一重にまたは二重に置換されていてもよく、即ち、−(Ｏ−ＣＲ2−ＣＲ2)n−、但しＲは上記定義のとおりである、であってよい。酸素の位置に他のヘテロ原子を持つエチレングリコール誘導体(即ち、−(Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2)n−または−(Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2)n−または置換基を持つ)も好ましい。
【００６７】
好ましい置換基には、メチル、エチル、プロピル、エチレングリコールおよびそれらの誘導体があるが、これらに限定されない。
【００６８】
好ましい芳香族基には、フェニル、ナフチル、ナフタレン、アントラセン、フェナントロリン、ピロール、ピリジン、チオフェン、ポルフィリンおよび縮合環誘導体を含むこれらそれぞれの誘導体があるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書に示した導電性オリゴマーでは、gが１のとき、Ｂ−Ｄは２つの原子または化学部をつなげる結合である。好ましい実施態様では、Ｂ−Ｄは、重複または共役π軌道を含有する共役結合である。
【００７０】
好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン(−Ｃ≡Ｃ−、アルキンまたはエチンとも呼ばれる)、アルケン(−ＣＨ＝ＣＨ−、エチレンとも呼ばれる)、置換アルケン(−ＣＲ＝ＣＲ−、−ＣＨ＝ＣＲ−および−ＣＲ＝ＣＨ−)、アミド(−ＮＨ−ＣＯ−および−ＮＲ−ＣＯ−または−ＣＯ−ＮＨ−および−ＣＯ−ＮＲ−)、アゾ(−Ｎ＝Ｎ−)、エステルおよびチオエステル(−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、ＣＳ−Ｏ−および−Ｏ−ＣＳ−)および他の共役結合(−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＲ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−および−Ｎ＝ＣＲ−)、(−SiH＝SiH−、−SiR＝SiH−、−SiH＝SiR−、およびSiR＝SiR−)、(−SiH＝ＣＨ−、−SiR＝ＣＨ−、−SiH＝ＣＲ−、−SiR＝ＣＲ−、−ＣＨ＝SiH−、−ＣＲ＝SiH−、−ＣＨ＝SiR−および−ＣＲ＝SiR−)などから選択される。特に好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン、アルケン、アミドおよびこれら３種の置換誘導体およびアゾである。とりわけ好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン、アルケンおよびアミドである。二重結合に結合させたオリゴマー成分は、トランスまたはシス配置、または混合型であってよい。そのため、ＢまたはＤのいずれかは、炭素、窒素またはケイ素を含むことができる。置換基は、上記Ｒのところで定義したとおりである。
【００７１】
構造１導電性オリゴマーのg＝０のとき、ｅは好ましくは１であり、Ｄ部は上記定義のカルボニルまたはヘテロ原子部であり得る。
【００７２】
上記Ｙ環のように、どの単一導電性オリゴマー内でも、Ｂ−Ｄ結合(またはg＝０のときＤ部)は、全て同じでもよく、または少なくとも１つが異なっていてもよい。例えば、ｍが０のとき、末端Ｂ−Ｄ結合は、アミド結合であることができ、残りのＢ−Ｄ結合はアセチレン結合であることができる。一般に、アミド結合が存在するとき、アミド結合はできるだけ少ない方が好ましいが、ある実施態様では、全てのＢ−Ｄ結合がアミド結合である。よって、上記Ｙ環のところで概略説明したとおり、上記単層内ではある型のＢ−Ｄ結合が導電性オリゴマー中に存在でき、単層レベル上では別の型のＢ−Ｄ結合があるので、核酸ハイブリダイゼーションにより大きな柔軟性を与えることができる。
【００７３】
本明細書に示した構造中、ｎは１から５０の整数であるが、より長いオリゴマーもまた使用できる(例えば、Schumm et al.，Angew．Chem．Int．Ed．Engl．1994 33(13):1360参照)。理論に縛られることなく、表面上で効率よく標的検体を結合させるためには、その結合は表面から少し離れて起こるべきであるらしい。例えば、核酸ハイブリダイゼーション速度は、特に２００から３００塩基対の長いオリゴヌクレオチドの場合、表面からの距離の関数として上昇すると思われる。従って、導電性オリゴマーの長さは、その結合配位子が電極表面から約６Åから約１００Å(但し、５００Åまでの距離が使用できる)に位置するような長さであり、約２５Åから約６０Åが好ましい。従って、ｎは芳香族基のサイズに応じて変わるが、一般に、約１から約２０であって、約２から約１５が好ましく、約３から約１０が特に好ましい。
【００７４】
本明細書に示した構造中、ｍは０または１のいずれかである。つまり、ｍが０のとき、導電性オリゴマーの末端には、Ｂ−Ｄ結合またはＤ部があり、即ち、Ｄ原子が直接的かまたはリンカーを介するかのいずれかで、レドックス活性錯体または分子、または結合配位子に結合している。ある実施態様では、導電性オリゴマーと結合部の間に結合させたリンカーなどの別の原子があってもよい。更に、下記に概略説明するとおり、Ｄ原子は、アミノ修飾リボースの窒素原子であり得る。あるいは、ｍが１のとき、導電性オリゴマーの末端にはＹ、芳香族基があり、即ち、その芳香族基は、その部分またはリンカーに結合している。
【００７５】
当業者には明らかなように、多数の導電性オリゴマーが利用できる。これらは、例えば、縮合芳香族環または、−(ＣＦ2)n−、−(ＣＨＦ)n−および−(ＣＦＲ)nなどのテフロン（登録商標）様オリゴマーを含む化合物などの当該分野で知られている他の導電性オリゴマーと同じく、構造１や構造４式の範囲内にある導電性オリゴマーを含む。例えば、Schumm et al.，Angew．Chem．Int．Ed．Engl．33:1361(1994);Grosshenny et al.，Platinum Metals Rev．40(1):26-35(1996);Tour，Chem．Rev．96:537-553(1996);Hsung et al.，Organometallics 14:4808-4815(1995);およびここに引用されている文献参照、これらは全てはっきりと出典明示により本明細書に組込まれている。
【００７６】
この実施態様の特に好ましい導電性オリゴマーは下記のものである。
【化２】
2010091573.tif 000004
【００７７】
構造２は、gが１のときの構造１である。構造２の好ましい実施態様には、ｅが０であり、Ｙがピロールまたは置換ピロールであるもの；ｅが０であり、Ｙがチオフェンまたは置換チオフェンであるもの；ｅが０であり、Ｙがフランまたは置換フランであるもの；ｅが０であり、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであるもの；ｅが０であり、Ｙがピリジンまたは置換ピリジンであるもの；ｅが１であり、Ｂ−Ｄがアセチレンであり、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであるものがある。構造２の好ましい実施態様はまた、下記構造３に示した、ｅが１である場合のものである：
【化３】
2010091573.tif 000005
【００７８】
構造３の好ましい実施態様は、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアゾであるもの；Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアルケンであるもの；Ｙがピリジンまたは置換ピリジンであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがチオフェンまたは置換チオフェンであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがフランまたは置換フランであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがチオフェンまたはフラン(または置換チオフェンまたはフラン)であり、Ｂ−Ｄがアルケンおよびアセチレン交互の結合であるものである。
【００７９】
好ましい実施態様では、導電性オリゴマーは、構造４で示した構造を持つ:
【化４】
2010091573.tif 000006
【００８０】
この実施態様では、Ｃは炭素原子であり、ｎは１から５０の整数であり、ｍは０または１であり、Ｊは窒素、ケイ素、リン、硫黄、カルボニルまたはスルホキシドからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｇはアルカン、アルケンまたはアセチレンから選択される結合であって、２つの炭素原子と一緒になってＣ−Ｇ−Ｃ基はアルケン(−ＣＨ＝ＣＨ−)、置換アルケン(−ＣＲ＝ＣＲ−)またはそれらの混合物(−ＣＨ＝ＣＲまたは−ＣＲ＝ＣＨ−)、アセチレン(−Ｃ≡Ｃ−)またはアルカン(−ＣＲ2−ＣＲ2−、Ｒは水素または本明細書に記載の置換基のいずれかである)であるようになる。各サブユニットのＧ結合は、他のサブユニットのＧ結合と同一かまたは異なっていてもよく、つまり、アルケンとアセチレン結合が交互にあるオリゴマーが使用できる。しかしながら、Ｇがアルカン結合であるとき、オリゴマー中のアルカン結合数は最小に維持すべきであり、導電性オリゴマー当りシグマ結合は約６かそれ以下が好ましい。アルケン結合が好ましく、本明細書に総括的に示しているが、アルカンおよびアセチレン結合は、当業者には明らかなように、本明細書に記載したどの構造または実施態様でも置換できる。
【００８１】
好ましい実施態様では、構造４のｍは０である。特に好ましい実施態様では、構造５に示したように、ｍは０であり、Ｇはアルケン結合である：
【化５】
2010091573.tif 000007
【００８２】
構造５のアルケンオリゴマーおよび本明細書に示した別のものは、一般に、好ましいトランス配置で示しているが、シスまたはトランスとシスの混合したオリゴマーも使用できる。上記のように、Ｒ基を加えて、電極上での組成物のパッキング、オリゴマーの親水性または疎水性、およびオリゴマーの柔軟性、即ち、回転、ねじれ、または縦の柔軟性を変えることができる。ｎは上記定義のとおりである。
【００８３】
好ましい実施態様では、Ｒは水素であるが、Ｒはアルキル基およびポリエチレングリコールまたは誘導体であってもよい。
【００８４】
別の実施態様では、導電性オリゴマーは、異なる型のオリゴマー、例えば、構造１や４の混合物であってもよい。
【００８５】
導電性オリゴマーは、レドックス活性錯体、遷移金属錯体(ひとまとめにしてレドックス活性部)、または結合配位子に共有結合している。“共有結合”とは、２つの部が、シグマ結合、π結合および共役結合を含む少なくとも１つの結合により結びついていることを意味する。
【００８６】
レドックス活性部位または結合配位子は、導電性オリゴマーに共有結合しており、導電性オリゴマーはまた電極に共有結合している。一般に、共有結合は、非共役シグマ結合量を最小にし、電子が電子供与体から電子受容体へと移動しなければならないような方法でなされる。このようにして、リンカーは一般に短いか、またはほとんどシグマ結合を持たない共役結合を含有する。
【００８７】
レドックス活性部または結合配位子および導電性オリゴマーの共有結合は、様々な方法で達成でき、当業者には理解されるように、レドックス活性部または結合配位子の構成に依存する。レドックス活性錯体と電極の結合の典型的な構造を下記の構造６および７に記す：
【化６】
2010091573.tif 000008
【００８８】
構造６で、左の平衡線引きマークは電極を表わす。Ｘは本明細書中で示す導電性オリゴマーである。Ｆ1は電極と導電性オリゴマーを共有結合する連結部であり、結合、原子または本書中に記述したようなリンカーを含む。Ｆ2は導電性オリゴマーとレドックス活性錯体を共有結合する連結部であり、結合配位子、ＢＬを含む。Ｆ1およびＦ2は、結合、原子、または本書中に記述したような連結部であり得る。Ｆ2は、導電性オリゴマーの一部、レドックス活性錯体の一部、または両者の外部であり得る。構造７で、本書中で定義したようにＭは金属イオンでありＬは共同-配位子である；上述のように、通常の疎水性配位子を使用すると、２つまたはそれ以上のＬ配位子は、分離するよりむしろ多座配位子の一部となる。ＢＬをアキシャル位置にしているが、これは必須でないことを留意すべきである。
【００８９】
この実施態様では、配位原子は、結合配位子から直接的に与えられる；更に、配位原子を供給するリンカーであり、結合配位子と結合している。リンカーは当分野では知られており、多種のものを使用することができる。適切なリンカーはよく知られているとおり、ホモまたはヘテロ二官能性リンカーである(1994 Piece Chemical Company catalog，technical section on cross-linker，pages 155-200参照、出典明示により本明細書の一部とする)。好ましいリンカーには、アルキル基やヘテロ原子部を含有するアルキル基があるが、これらに限定されず、好ましいのは、短いアルキル基、エステル、エポキシ基およびエチレングリコールおよび誘導体であり、特に好ましいのは、プロピル、アセチレンおよびＣ2アルケンである。
【化７】
2010091573.tif 000009
【００９０】
構造７は"分枝状"配座を示し、この中で遷移金属錯体と結合配位子は直接的に結合していない。当業者には理解されるように、遷移金属錯体と結合配位子は導電性オリゴマー上の同じ位置または異なる位置に結合し得、１つ以上の遷移金属錯体および/または結合配位子が存在し得る。
【００９１】
構造６および７は、６配位金属イオンを記しているが、当業者には理解されるように、本発明で使用する他の種類の金属イオンも、Ｌ配位子と適応できることが分かった。
【００９２】
金属イオンの結合は、一般的に置換不活性配位子とスペーサーの端部の結合で行なわれる。好ましい実施態様では、配位子が一配座、または他の多配座配位子を使用しても最大で二配座である。これは、例えば、アミノまたはイミダゾール基(一配座)またはフェナントロリン(二配座)を、当分野でよく知られている技術、またはPCT US97/20014(出典明示により本明細書の一部とする)に概説する技術を使用して、スペーサーの端に結合し得る。
【００９３】
結合配位子と金属イオンまたはスペーサーの結合もまた、よく知られている技術を使用して行なわれ、それは結合配位子の構成に依存する。結合配位子が核酸のとき、二本鎖または一本鎖であり、PCT US97/2014記述のとおり金属イオンへ結合させることができる。
一般的に、結合配位子の金属イオンまたはスペーサーへの結合は、結合リガンド上に天然に見出されるかまたはよく知られた技術で付加される官能基を使用して行なうことができる。これらの基は、例えばタンパク質のＮ-またはＣ-末端結合配位子の末端、またはいずれかの内部位置にある。例えば、アミノ、チオ、カルボキシル、またはアミド基を結合に使用することができる。当業者には理解されるように、同じく、通常の配位子の結合に使われるピリジンまたはフェナントロリンも使用することができる。例えば、タンパク質結合配位子の結合は、一般的に、アミノ酸側鎖またはＮ-またはＣ-末端にある官能基を使用して行なわれる；例えばＮ-末端またはヒスチジンなどの側鎖の基を金属イオンの配位子として供給し得る。同様に、炭水化物結合配位子の結合を、金属イオン配位子として作用し得るように糖を誘導体化する方法で行なう。さらに、これらの基をよく知られた技術を用いてスペーサーへの結合に使用し得る。これらの実施態様のいずれにおいても、付加的なコネクターまたはリンカーが存在し得る。例えば、結合配位子がタンパク質酵素基質または阻害剤であるとき、金属イオン配位子と機能的基質または阻害剤との間に、付加的なアミノ酸またはアルキル基などがあり得る。
【００９４】
加えて、本書中に言及しているように、２種またはそれ以上の結合配位子を単一レドックス活性錯体に結合し得る。例えば、２種の一本鎖核酸を結合し得るのであり、そのようにして相補的標的配列の結合は、レドックス活性分子の溶媒再構成エネルギーを変化させ得る。本実施態様では、２つの一本鎖核酸を相補的配列の中の"gap"が、金属イオンと適合するようにする。これは一般的に１から３ノヌクレオチドである。好ましい実施態様としては、結合配位子とレドックス活性分子がレドックス活性錯体を形成しないことであるが、むしろ、一般的にスペーサーを介して各個に電極に結合することである。本実施態様では、レドックス活性分子が、結合配位子に結合している標的検体へ近接して、その結果、それは結合による溶媒再構成エネルギーの減少を引き起こす。溶媒が近づきやすいレドックス活性分子は、標的検体のある部分１２Å以内にあることが好ましく、８Å以下が好ましく、５Å以下がさらに好ましく、３.５Å以下がとりわけ好ましい。結合配位子とレドックス活性分子の間の距離はもっと大きく、それは標的検体の大きさに依存する。従って、大標的検体の結合は、結合配位子からオングストロームを大きく離し、溶媒再構成エネルギーを縮小する。代表的構造を以下の構造８に示す：
【化８】
2010091573.tif 000010
【００９５】
構造８中では、結合配位子と遷移金属錯体は、別々に電極に結合している。構造８は、遷移金属錯体と結合配位子の割合を１：１と示しているが、それは必須ではなく、実際、特に遷移金属錯体と比較して標的検体がかなり大きいときは、電極上に過剰の遷移金属錯体を有するのが好ましい。従って、例えば、標的検体の結合配位子への単結合結果は、もし遷移金属錯体の濃度が結合配位子の部分で十分高いか、または標的検体が十分大きければ、多数の遷移金属錯体溶媒再構成エネルギーの減少をもたらす。同様に、同じ標的検体に対して異なる結合配位子を使用し、；例えば、大標的検体を表面上に"留めつけ"て、単一の標的検体当り、できるだけ多くの遷移金属錯体として作用するようにすることもできる。
【００９６】
レドックス部と結合配位子を、上述のスペーサーを介して電極に結合させる。従って、導電性オリゴマーの末端の一端をレドックス部または結合配位子に結合させ、もう一方を電極に結合させる。いくつかの実施態様では、導電性オリゴマーを先端でない場所に結合させるか、または電極を結合している分枝状導電性オリゴマーを一端に、さらにレドックス活性分子および結合配位子を他端に結合させるのが望ましい。同様に、導電性オリゴマーを電極の２つの部位で結合させ得る。
【００９７】
本明細書で、“電極”とは、電子装置に接続した場合に、電流または電荷を感受し、それをシグナルに変換できる構成物を意味する。好ましい電極は、当分野で既知であり、金；プラチナ；パラジウム；シリコン；アルミニウム；酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、インジウムスズ酸化物、酸化パラジウム、酸化シリコン、酸化アルミニウム、酸化モリブデン(Ｍｏ2Ｏ6)、酸化タングステン(ＷＯ3)および酸化ルテニウムのような酸化金属電極；および炭素(ガラス状炭素電極、グラファイトおよび炭素ペースト)を含むが、これらに限定されない。好ましい電極は、金、シリコン、炭素および酸化金属電極を含む。
【００９８】
本明細書に記載の電極は、平らな表面として記載されているが、これは電極の可能な形態の１つであるだけであり、模式的目的のためだけである。電極の形態は使用する検出法に依存して変わる。例えば、平らな電極は、光学的検出法、または配列を成す場合、従って、合成および検出の両方で、アドレス可能な位置が必要な場合、好ましい。あるいは、単一検体分析のために、電極は管の形であり得、本発明の組成物は内部表面に結合する。これは、核酸を含む表面の最大領域が、少量のサンプルに曝されることを可能とする。
【００９９】
レドックス活性部と本発明の結合配位子を含む導電性オリゴマーの共有結合は、様々な方法で行ない得、電極および使用する導電性オリゴマーに依存する。一般的に、様々な型のリンカーを使用できる。例えば、構造６において、Ｆ1はリンカーまたは原子である。“Ｆ1”の選択は、電極の特徴に一部依存する。従って、例えば、Ｆ1は、金電極を使用する場合、硫黄部分であり得る。あるいは、酸化金属電極を使用するとき、Ｆ1はオキサイドの酸素に結合したシリコン(シラン)部である(例えば、両方とも引用して本明細書に包含させるChen et al.，Langmuir 10:3332-3337(1994);Lenhard et al.，J．Electroanal．Chem．78:195-201(1977)参照)。炭素ベースの電極を使用するとき、Ｆ1はアミノ部分である(好ましくは、１級アミン；例えば、Deinhammer et al.，Langmuir 10:1306-1313(1994)参照)。従って、好ましいＦ1部分は、シラン部分、硫黄部分(アルキル硫黄部分を含む)およびアミノ部分を含むが、これらに限定されない。好ましい態様において、当分野で既知のようなレドックスポリマーとのエポキシドタイプ結合は使用しない。
【０１００】
本明細書には１つの部分としてしか記載していないが、導電性オリゴマーは、一個以上の“Ｆ1”部分で電極と結合し得る；“Ｆ1”部分は同一または異なり得る。従って、例えば、電極が金電極であり、“Ｆ1”が硫黄原子または部分であるとき、一般に、複数の硫黄原子が、電極に導電性オリゴマーを結合させるのに使用し得る。好ましくは、Ｆ1部分は硫黄原子だけであるが、置換硫黄原子も使用し得る。
【０１０１】
好ましい態様において、電極は金電極であり、結合は当分野で既知のように硫黄結合を介しており、すなわち、Ｆ1部分は硫黄原子または部分である。金−硫黄結合の正確な特徴は知られていないが、この結合は本発明の目的で、共有結合とみなす。
【０１０２】
好ましい態様において、電極は炭素電極、すなわち、ガラス状炭素電極であり、結合はアミン基の窒素原子を介している。
【０１０３】
一般的に、２種の一般的なスキームの１つに従って、本発明の組成物を合成し得る。好ましい実施態様では、スペーサーを合成し、レドックス活性分子と結合配位子を含むレドックス活性錯体も別個につくる。これらの２つを一緒に加え、電極に結合させる。あるいは、好ましい実施態様として、スペーサーをつくり電極に結合させる。レドックス活性錯体をつくり、スペーサーに結合させる。一般的な合成スキームはPCT US97/20014で開示されている。
【０１０４】
従って、好ましい態様においては、電極は、より詳細に本明細書に記載しているように、検体アッセイの目的で、レドックス活性部および/または結合配位子に結合させた導電性オリゴマーを含むように製造する。当業者に認められるように、電極は、結合配位子の１つの種（すなわち一検体）または複数の結合配位子種(すなわち複数検体)を有するように製造できる。
【０１０５】
加えて、本明細書に概説のように、電極のような固体支持体の使用は、これらの結合配位子の配列形での使用を可能にする。オリゴヌクレオチド特有の結合配位子配列の使用は、当分野で既知である。加えて、電極内に位置を“アドレッシング”するための、および電極の表面修飾のための方法は既知である。
【０１０６】
従って、好ましい態様においては、異なる結合配位子の配列は、電極の下に置かれ、その各々は導電性リンカーを介して電極に共有結合させる。この態様において、多くの異種結合配位子の種は、１から数千、好ましくは約４から約１００,０００、および特に好ましくは約１０から約１０,０００に広く変化し得る。
【０１０７】
好ましい態様において、電極は、更に、パシベーション剤を、好ましくは電極表面上の単層の形で含む。核酸等いくつかの検体について、検体結合(すなわちハイブリダイゼーション)の効果は、結合配位子が電極からある距離をおいている場合、増加し得る。加えて、単層の存在は、表面への非特異的結合を減少させ得る。パシベーション剤層は、電極表面から離れた位置に結合配位子および/または検体を維持させるのを容易にする。加えて、パシベーション剤は、電荷担体を電極表面から離れた位置に保つ役目を果たす。従って、この層は、電極と電子移送部との間の、または電極と溶媒中の荷電種の間の電気的接触の防止を助ける。このような接触は、サンプル中に存在し得る、荷電種を介した直接“短絡”または間接短絡を生ずる可能性がある。従って、パシベーション剤の単層は、好ましくは電極表面の均一単層中に、最少の“ホール”しか存在しないように、密接にパックされている。あるいは、パシベーション剤は、単層の形ではないが、導電性オリゴマーのパッキングまたは他の性質を助けるように存在し得る。
【０１０８】
従って、パシベーション剤は、電極への溶媒接近性を阻害する、物理的バリアーとして働き得る。このように、パシベーション剤それ自体は、実際、(１)導電性または(２)非導電性、すなわち、絶縁物質であり得る。従って、１つの態様において、パシベーション剤は、電極への電荷の移送を阻害または減少する末端基を有するかまたは有しない、本明細書に記載のような導電性オリゴマーである。
【０１０９】
導電性であり得る他のパシベーション剤は、−(ＣＦ2)n−、−(ＣＨＦ)n−および−(ＣＦＲ)n−のオリゴマーを含む。好ましい態様において、パシベーション剤は、絶縁部である。
“絶縁体”は、実質的に非導電性オリゴマーであり、好ましくは直鎖状である。本明細書中の“実質的に非導電性”とは、絶縁体を介した電子移送の速度が、導電性オリゴマーを介した電子移送の速度よりも遅いことを意味する。言いかえると、絶縁体の電気抵抗は、導電性オリゴマーの電気抵抗より高い。しかしながら、実施例に概説しているように、一般にオリゴマーが、−(ＣＨ2)16分子のような、絶縁体であるとみなされても、例え遅い速度でもなお電子を移送し得ることを承知しておくべきである。
【０１１０】
好ましい態様において、絶縁体は、約１０-7Ω-1cm-1またはそれより低い導電性Ｓを有し、約１０-8Ω-1cm-1より低いのが好ましい。一般に、Gardner et al.，前掲、参照。
【０１１１】
一般に、絶縁体は、シグマ結合を有する、アルキルまたはヘテロアルキルオリゴマーまたは部分であるが、具体的な絶縁体は、芳香族基または一個またはそれ以上の共役結合を含み得る。本明細書の“ヘテロアルキル”なる用語は、鎖に包含された少なくとも１個のヘテロ原子、すなわち、窒素、酸素、硫黄、リン、シリコンまたはホウ素を有するアルキル基を意味する。あるいは、絶縁体は、一個またはそれ以上のヘテロ原子を添加された導電性オリゴマーと非常に類似であり、それが電子移送を、好ましくは、実質的に阻害するか、または遅くさせる。
【０１１２】
絶縁体を含むパシベーション剤は、本明細書で定義のＲ基で置換され得、電極でのその部または導電性オリゴマーのパッキング、絶縁体の親水性または疎水性、および絶縁体の柔軟性、すなわち、回転の、捩れのまたは縦の柔軟性を変える。例えば、分枝アルキル基を使用し得る。加えて、絶縁体を含むパシベーション剤の末端は、更なる基を含み得、単層の暴露された表面に作用する。例えば、電荷が加わると、中性または疎水基が、サンプルの非特異的結合を阻害するようになり得、または検体などの結合の動きに影響する。例えば、それらは核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである場合、核酸が表面上に張りつくのに反発するか、妨げるように、末端では陰性に荷電した基が荷電表面を形成し得る。
【０１１３】
パシベーション剤の長さは、必要に応じて変化する。上記概説のように、パシベーションは導電性オリゴマーの長さと同程度である。加えて、導電性オリゴマーは、基本的にパシベーション剤と同じ長さかそれらより長く、結合配位子がハイブリダイゼーションの溶媒に一層近接可能とする。
【０１１４】
この単層は、絶縁体を含むパシベーション剤の１つのタイプ、または異なるタイプを含み得る。
【０１１５】
適切な絶縁体は当分野で既知であり、−(ＣＨ2)n−、−(ＣＲＨ)n−および−(ＣＲ2)n−、エチレングリコールまたは酸素の代わりに他のヘテロ原子、すなわち窒素または硫黄を使用した誘導体(硫黄誘導体は、電極が金である場合、好ましくない)を含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
パシベーション剤は、一般に、導電性オリゴマーと同様の方法で電極に結合し、上記の“Ｆ1”リンカーと同様に使用し得る。
【０１１７】
試験サンプルに含まれる標的検体を、もし存在すれば、標的検体は結合配位子と結合する条件下に、溶媒が近づきやすいレドックス活性錯体または溶媒が近づきやすい遷移金属錯体と結合配位子の混合物を含む電極に加える。これらの条件は一般的に生理学的条件である。一般的に、複数のアッセイ混合物を、異なる濃度で並行的に処理し、様々な濃度における示差応答を得る。典型的に、これらの濃度の１つを陰性対照、即ち、０濃度または検出レベル以下、とする。加えて、他の様々な試薬をスクリーニングアッセイに含ませ得る。これらは、塩、例えばアルブミンなど中性タンパク質、洗浄剤などの試薬を含み、これらは最適結合を助長し、または非特異的またはバックグラウンド相互作用を減少させる。一方、プロテアーゼインヒビター、核酸、抗菌剤など、他の方法でアッセイの効率を改善する試薬も使用できる。必須の結合を得るために、必要に応じて各成分の混合物を種々の順序で加え得る。
【０１１８】
好ましい実施態様では、標的検体を結合配位子に、可逆的に結合させる。すなわち、非共有的な、抗原-抗体、酵素-基質(またはインヒビター)またはレセプター−リガンドのタンパク質-タンパク質相互作用などである。
【０１１９】
好ましい実施態様では、標的検体を結合配位子に、例えば共有結合など非可逆的に結合させる。例えば、数種の酵素-インヒビター相互作用が非可逆的であると考えられる。あるいは、検体は、はじめは可逆的に結合し、その後のシステム操作で共有結合となる。例えば、当業者には明らかであるように、結合した後化学架橋を起こし得る。例えば、ペプチドは、マレイミド安息香酸、メチルジチオ酢酸、メルカプト安息香酸、Ｓ-ピリジルジチオプロピオナートなど様々な二官能性試薬を使用して架橋形成させ得る。あるいは、標的検体および結合配位子上の機能的反応基を誘導し、共有結合を形成させ得る。
【０１２０】
結合部分への検体の結合により、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体は溶媒阻害となる。"溶媒阻害遷移金属錯体"とは、溶媒阻害遷移金属錯体の溶媒再構成エネルギーが、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体の溶媒再構成エネルギーより低いことを意味する。上述のとおり、これは様々な方法で起こし得る。好ましい実施態様では、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体が少なくとも１つ、好ましくは数個の小極性配位子を放出する等して、標的検体が配位原子を供給する。あるいは、好ましい実施態様では、標的検体と遷移金属錯体の近接により配位子変化は起きないが、むしろ金属イオンをとりまく領域(すなわち、第一または第二配位球面)から溶媒を排除し、このようにして、必要な溶媒再構成エネルギーを有効に低下させる。
【０１２１】
好ましい実施態様では、約１００ｍＶで、好ましくは少なくとも２００ｍＶで、特に好ましくは少なくとも３００〜５００ｍＶで、レドックス活性分子のＥ0の減少をもたらすのに十分なだけ、必要な溶媒再構成エネルギーを十分に下げる。
【０１２２】
好ましい実施態様では、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体と電極の間の電子移送速度に比例する阻害遷移金属錯体と電極間の電子移送(ＫET)の速度変化をもたらすに十分なだけ、必要な溶媒再構成エネルギーを下げる。好ましい実施態様では、この速度変化は、係数約３より大きく、少なくとも係数約１０であることが好ましく、係数約１００またはそれ以上であることが特に好ましい。
【０１２３】
溶媒再構成エネルギーの測定は、当業者には理解される方法で行なう。要約すれば、Marcus理論で概説されているように、電子移送速度(ＫET)を多数の異なるドライビングフォース(または自由エネルギー、-ΔＧ0)で測定する；速度が自由エネルギーと等しくなる点が活性化のない速度(λ)である。これは、ほとんどの場合、溶媒再構成エネルギーと同じとみなされる；Gray et al．Ann．Rev．Biochem．65:537(1996)、出典明示により本明細書に組込まれている。
【０１２４】
標的検体の存在を示す溶媒阻害遷移金属錯体を、当初電子移送で検出し、溶媒阻害レドックス活性分子とその電子の間の電子移送に特徴的なシグナルを検出する。
一般的に、電子移送は、好ましい電位で電子的に開始させる。ある電位を、修飾核酸プローブを含むサンプルに適用する。適用した電位で、正確な制御と変化が、定電位装置、および三電極システム(１つは対照、１つはサンプルおよび１つはカウンター電極)または二電極システム(１つはサンプルおよび１つはカウンター電極)のどちらかを介して行なわれる。これは適要した電位と、一部は遷移金属錯体の選択に、そして一部は使用する伝導オリゴマーに依存するシステムの電子移送電位を最高点との調和を可能とする。
【０１２５】
好ましくは、溶媒が近づきやすい溶媒再構成エネルギーと溶媒阻害遷移金属錯体との相対的差異を最大にするように、開始および検出を選ぶ。
【０１２６】
遷移金属錯体と電極間の電子移送は、これらに限定するわけではないが好ましくは、電流、電位、静電およびインピーダンスを含む、様々な電子的検出方法で検出することができる。これらの方法は、交流または直流電流、パルス方法、ロック-イン技術および濾過(高通過、低通過、帯状通過)に基づく、時間または周波数依存方法を含む。いくつかの実施態様で、とにかく必要とされるものは電子移送検出であり；他の場合では、電子移送速度が測定され得る。
【０１２７】
好ましい実施態様では、アンペロメトリー、ボルタメトリー、キャパシタンスおよびインピーダンスを含む電子的検定を使用する。好ましい技法としては、これらに限定されるものでないが、電解重量分析、クーロメトリー（制御電位クーロメトリーおよび定常電流・クーロメトリーを含む）、ボルタメトリー（サイクルボルタメトリー、パルスボルタメトリー（正常パルスボルタメトリー、スクエア波ボルタメトリー、示差パルスボルタメトリー、オステリオウング・スクエア波ボルタメトリー、静電量パルス法）、ストリッピング分析（アニオンストリッピング、カチオンストリッピング、スクエア波ストリッピングボルタメトリー）、伝導分析（電子的伝導、直接分析）、時間依存電子化学分析（クロノアンペロメトリー、クロノポテンショメトリー、サイクルクロノアンペロメトリー、サイクルクロノポテンショメトリー、交流ポログラフィー、クロノガルバメトリー、クロノクロメトリー）、交流インピーデンス法、キャパシタンス法、交流ボランタメトリー、光学電子化学法がある。
【０１２８】
好ましい実施態様において、電子移送の監視はアンペロメトリー検出で行われる。この検出法において、本発明の組成物を含む電極と試験サンプル中の対照（逆）電極との間の電位（単離された対照電極と比較して）が利用される。相違する効率の電子移送が標的検体の存在または不存在によって生じる。
【０１２９】
アンペロメトリーで電子移送を測定する器具は、感度のよい電流検出を含み、電圧電位を制御する手段、通常ポテンシオスタットを含む。この電圧はレドックス活性分子の電位を参照することにより最適化される。
【０１３０】
好ましい実施態様において、他の電子的検出法が用いられる。例えばポテンシオメトリー（すなわちボルタメトリー）には、非ファラデー法（ネット電流なし）が含まれ、従来からｐＨや他のイオン検出器を利用する。同様のセンサーがレドックス活性分子と電極の電子移送を監視するために用いられる。さらに、絶縁体（抵抗など）および導電体（導電、インピーデンス、キャピシタンス）などの他の性質がレドックス活性分子と電極の電子移送を監視するために用いられる。また、電流を生じるいかなる系（電子移送など）も小さい磁場を生じ、ある実施態様で監視され得る。
【０１３１】
好ましい実施態様では、標的添加前に有機溶媒中でシステムを運転させ、電極上の溶媒が近づきやすい遷移金属錯体の量を測定するようにシステムを対応させる。これは、センサーまたはシステムの内部コントロールとして働くために重要である。これは、むしろ似ているが異なる制御システムに依存するより、検体添加の前に行なう、検出に使用されるものと同じ分子似ついての呼び測定となし得る。したがって、検出に使う実際の分子を、どの、試験の前にも測量し得る。水を存在させないでシステムを、すなわちアセトニトリルなどの有機溶媒中で運転すれば、水と実質上不活性の溶媒再構成エネルギーを排除する。これは、電極の表面にある実際の分子数の定量を可能とする。サンプルを加え、外部シグナルを測定し、結合/非結合分子の比率を測定する。これは前の方法の特筆すべき有利点である。
【０１３２】
本発明の組成物で見られる電子移送の速い速度がもたらす１つの利点は、時間変化が、電流に基づくモニターのシグナル対ノイズ結果を大きく高め得ることであると解する。本発明の電子移送の速い速度は、強度のシグナルと電子移送開始・完了間の特異的遅延とをもたらす。特異の遅延シグナルを増幅することにより、電子移送のパルス開始および“ロックイン”増幅検出によって、シグナル対ノイズに利用オーダの強さの改善がなされる。
【０１３３】
理論にしばられないで言えば、電極と結合する標的検体は、一連のレジスターとコンデンサーと似た方法で応答する。また、レドックス活性分子のＥ0も標的検体結合の結果としてシフトし得る。さらに、電子移送速度を基礎とした溶媒が近づきやすいものと溶媒阻害の遷移金属錯体を識別することが可能となり得、それは標的検体の多数の検出方法に活用し得る。従って、当業者には理解されるように、多くの開始-検出システムを本発明で使用し得る。
【０１３４】
好ましい実施態様では、直流電流(ＤＣ)技術を使用して、電子移送を開始および検出する。上述のとおり、レドックス活性分子のＥ0は、標的検体結合の溶媒再構成エネルギーの変化の結果としてシフトし得る。従って、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体のＥ0および溶媒阻害錯体のＥ0の測定は、検体検出を可能とする。当業者には理解されるように、多数の適切な方法が、電子移送検出に使用し得る。
【０１３５】
好ましい実施態様では、交流電流(ＡＣ)を使用して、電子移送を開始し得る。第一の入力電気シグナルは、システムに与えられ、好ましくは少なくとも同じ電極(本発明の錯体を含む)およびカウンター電極を経由して、電極と第二電極移送部間の電子移送を開始するものである。参照文献および使用電極に適用した電圧も有する三電極システムも使用し得る。本実施態様では、第一入力シグナルは、少なくとも交流成分を含む。この交流成分は、可変の振幅および周波数のものであってよい。一般的に、本発明の使用には、交流振幅は約１mV〜約１.１Vの範囲であり、約１０mV〜約８００mVが好ましく、約１０mV〜約５００mVが特に好ましい。交流周波数は約０.０１Hz〜約１０MHzの範囲であり、約１Hz〜約１MHzが好ましく、約１Hz〜約１００kHzが特に好ましい。
【０１３６】
好ましい実施態様では、第一入力シグナルは直流成分と交流成分を含む。それは、サンプルとカウンター電極間の直流オフセット電圧を、電子移送部の電子化学電位を通して走査する。この走査を、システムの最大応答が見られる部分で、直流電圧を確認するのに使用する。これは一般的に、遷移金属錯体の電子化学的電位で、またはその付近にある。一旦この電圧を決定すると、走査または、１つまたはそれ以上の直流オフセット電圧を使用し得る。約−１V〜約＋１.１Vの直流オフセット電圧が好ましく、約−５００mV〜約＋８００mVが特に好ましく、約−３００mV〜約＋５００mVがきわめて好ましい。直流オフセット電圧の最高値で、可変の振幅および周波数の交流成分が適用される。遷移金属錯体が、交流摂動応答に対して十分低い溶媒再構成エネルギーを有する場合は、電極と遷移金属錯体間の電子移送のため交流電流を生じ得る。
【０１３７】
好ましい実施態様では、交流振幅を変える。理論にしばられないで言えば、振幅増加はドライビングフォースで増加する。従って、高振幅は、高過電位が更に速い電子移送速度を与える結果によるものである。従って、一般的に、同じシステムは、高過電位の使用を通した幾らかのシグナル周波数で、改良応答(すなわち高出力シグナル)を与える。従って、振幅は、システムを通した電子移送速度の増加によって高周波数で増幅され、さらに大きな感度をもたらす。加えて、上述のとおり、電子移送速度に基づく溶媒が近づきやすいおよび溶媒阻害の遷移金属錯体の間の識別を可能にし得、それは周波数に基づく２つの識別または過電位のいずれかにも使用し得る。
【０１３８】
好ましい実施態様では、システムの測定を、少なくとも２つの分けられた振幅または過電位で行ない、複数の振幅で測定するのが好ましい。上述のとおり、振幅の変化による応答変化は、システムの確認、計算および定量の基礎を形成し得る。
【０１３９】
好ましい実施態様では、交流周波数を変える。異なる周波数で、異なる分子は異なる方法で応答する。当業者には理解されるように、周波数増加は、出力電流を増加させる。しかし、周波数が電子が電極と遷移金属錯体間を移動する速度より大きいと、高周波数は出力シグナルの損失または減少をもたらす。幾らかの点において、周波数は溶媒阻害遷移金属錯体の場合であっても電子移送速度より大きく、出力シグナルも落ちる。
【０１４０】
加えて、交流技術の使用は、標的検体以外の実体に因る任意の単一周波数におけるバックグラウンドシグナル、すなわち、例えば"締め出す（locking out）"または"濾過する(filtering）"好ましくないシグナルの有意の縮小をもたらす。これは、溶媒中の担体またはレドックス活性種の変化の周波数応答が、その拡散係数に限られることである。それゆえに、高周波数で、電荷担体は、電極へ電荷を移動させるのに十分なほどにはすばやく放散せず、および/または電荷移動は十分に早くならない。これは、保護層（passivation layer)単層または部分的または不完全単層を利用しない実施態様、すなわち、溶媒が電極影響を受けやすいところで特に顕著である。上述の概説により、直流技術で、電極が溶媒が近づきやすい場所の"ホール"の存在は、溶媒電荷担体中に"短絡"システムを生じる。しかし、現在の交流技術を使用すると、単層の存在、非存在にかかわらず、１つまたはそれ以上の溶液中の電荷担体を防ぐ、１つまたはそれ以上の周波数を選択できる。血液など多くの生体液が電流測定検出方法を妨げるレドックス活性種の有意量を含むので、これは特に重要である。
【０１４１】
好ましい実施態様では、システムの測定は少なくとも２種の別周波数で、好ましくは複数の周波数で行なう。複数の周波数は走査を含む。好ましい実施態様では、周波数応答を少なくとも２つ、好ましくは少なくとも約５つ、さらに好ましくは少なくとも１０の周波数で測定する。
【０１４２】
電子移送を開始する入力シグナル伝達の後、出力シグナルを受けるかまたは、検出する。出力シグナルの存在および強さは、入力シグナルの過電位/振幅；入力交流シグナルの周波数；介入媒体の組成、すなわち電子移送部位間のインピーダンス；直流オフセット；システムの環境；およびその溶媒、に依存する。与えられた入力シグナルにおいて、出力シグナルの存在および強さは、一般的に、金属イオンの酸化状態の変化がもたらす溶媒再構成エネルギーに依存する。従って、交流成分、および直流オフセットを含む、入力シグナルが伝達されると、溶媒再構成が十分低く、周波数が範囲内であり、そして振幅が十分であるとき、電子は電極と遷移金属錯体間を移送され、出力シグナルを生じる。
【０１４３】
好ましい実施態様では、出力シグナルは交流電流を含む。上記概説したように、出力電流の強さはパラメーターの数に依存する。これらのパラメーターを変化させて、システムを多様に最適化する。
【０１４４】
一般的に、本発明で生じる交流電流は、約１フェムトアンプないし約１ミリアンプの範囲であるが、電流が約５０フェムトアンプないし約１００ミクロアンプであることが好ましく、約１ピコアンプないし約１ミクロアンプであることが特に好ましい。
【０１４５】
加えて、当業者には理解されるように、本発明の組成物を、シグナル損失に依存するアッセイでも使用することができる。例えば、遷移金属が阻害されるとき、第一の測定が行なわれ、次いで、標的検体の導入によってシステムが変化し、溶媒阻害分子が溶媒影響を受けやすくなるようにし、その結果、シグナルの損失を生じる。当業者には理解されるように、これは数種の方法で行ない得る。好ましい実施態様では、標的検体が存在するとき最初の測定が行なわれる。標的検体を次いで、例えば高い塩濃度または高温条件で除去し、次いで第二測定を行なう。シグナル損失の定量は、アッセイの基礎となし得る。
【０１４６】
あるいは、標的検体は酵素であり得る。好ましい実施態様では、遷移金属錯体は、酵素基質または類似体の存在下で溶媒阻害であり、好ましくは、必須ではないが、好ましくは１つまたはそれ以上の配位子として遷移金属に共有結合している。標的酵素を導入すると、酵素は基質と結合し、遷移金属錯体が溶媒影響を受けるようになるように、基質を切断するかまたは、さもなければ立体的に変化させる。この変化は検出し得るものである。本実施態様は、単一酵素分子が多数の溶媒が近づきやすい分子を生じた結果、シグナルの増幅をもたらすという点で有利である。これは、酵素、特にスカベンジャープロテアーゼまたはカルボキシラーゼ、を分泌する細菌または他の病原体の検出での使用に特に有用である。
【０１４７】
同様に、好ましい実施態様では、拮抗型アッセイを使用する。本実施態様において、結合リガンドは検出目的の実在分子と同じである；それは、結合リガンドは実際に標的検体または類似体であるということである。結合リガンドの結合相手を表面に加え、遷移金属錯体が溶媒阻害になるように、電子移送が起こりシグナルが生じるようにする。次いで、電極と結合するそれと同じまたは類似の標的検体を含む、実際の試験サンプルを加える。試験サンプル検体は結合相手と競合し、表面での結合相手の損失を引き起こし、シグナルの減少を生じる。
【０１４８】
同様の実施態様では、標的検体(または類似体)を好ましくは大きな部分("ブロッキング部")に共有結合させて利用する。検体-ブロッキング部錯体は、標的検体に結合する結合配位子と結合し、遷移金属錯体を溶媒阻害にする。試験サンプルの標的検体への導入は、検体-ブロック部錯体と競合し、大きな錯体を放出し、さらに溶媒が近づきやすい分子を生成する。
【０１４９】
加えて、上述の大部分は、組成物が電極などの表面に結合する場合の本発明の使用に関連しているが、当業者には理解されるように、これらは溶液-ベースシステムでも可能である。この実施態様においては、溶媒が近づきやすい遷移金属錯体は(直接的に、または、結合配位子と遷移金属錯体とが検出できるほど十分に近接するように近接させて保持できるように、短いリンカーを使用するかどちらかで)結合配位子に結合させ、溶性レドックス活性錯体を形成させる。検体の結合により、この遷移金属錯体は溶媒阻害となり、システムの変化を検出し得る。好ましい実施態様では、反応を蛍光または電子化学的方法でモニターする。あるいは、媒介物を使用して、反応を電子的にモニターする。
【０１５０】
本発明はさらに、交流検出法を用いる検体検出のための装置を提供する。この装置は、少なくとも第1測定すなわちサンプル電極、および第2測定すなわち逆電極、を有する試験室を含む。３電極系も用いられる。第1および第2電極は試験サンプル受け入れ領域に接触し、液体試験サンプルの存在下で、2つの電極は電子的に接触し得る。
【０１５１】
好ましい実施態様において、第1測定電極は、レドックス活性錯体、スペーサーを介して共有結合した、好ましくは本明細書中で述べた、導電性オリゴマーを介して共有結合したものを含む。あるいは、第一測定電極は、共有結合した遷移金属錯体と結合配位子を含む。
装置は、試験室すなわち測定電極に電気的に連結した電圧源を含む。好ましくは、電圧源は、必要であれば、交流および直流電圧も同様に放出し得る。
【０１５２】
好ましい実施態様において、装置はさらに、入力シグナルと出力シグナルとを比較し得るプロセッサーを含む。プロセッサーは電極に結合しており、出力シグナルを受けるように配置され、標的検体の存在を検出する。
【０１５３】
本発明の組成物は、種々の研究、臨床、品質管理、野外試験などに用いられる。
【０１５４】
下記の実施例は、上記した発明を使用する方法をより詳しく記載し、本発明の種々の実施態様を実施するための最上の方法を明らかにするものである。これらの実施例は、本発明の範囲を制限しようとするものではなく、説明のために提示されるものである。すべての引用文献は出典明示により本明細書の一部とする。
【実施例】
【０１５５】
溶媒が近づきやすいレドックス活性部の調製
本実施例で、ルテニウム錯体およびビオチン結合配位子を含むレドックス活性錯体を使用して、センサーの基礎である溶液を調製した。小極性配位配位子(ＮＨ3)を持つルテニウムの遷移金属錯体を調製した。配位原子の１つは、結合配位子ノルビオチン(４炭素リンカーを介して第一級アミンと結合したビオチン)から得、それはアビジンと結合すると、遷移金属錯体が溶媒が近づきやすいものから溶媒阻害へ向かうものである。あるいは、ルテニウムのレドックス活性錯体とビオチンを、活性化させ、表面に加えて、電極-ベースセンサーを形成させる。
【０１５６】
[トランスＲｕIII（ＮＨ3)4(ノルビオチン)Ｃｌ]を数段階で合成する。反応シーケンスの第一中間体は、トランス-[ＳＯ2(ＮＨ3)ＲｕIIＣｌ]Ｃｌ]であり、それは次の方法で合成した。
温度計、還流冷却器、ガス注入口を備えた３首丸底フラスコで予加熱した水（〜７０℃）６５ml中で、[(ＮＨ3)5ＲｕIIIＣｌ]Ｃｌ2２.５gr(８.５mmoles)をスラリーにした。このフラスコにＮａＨＳＯ3 ３.５５gr(２.４mmoles)を加え、すぐに連続的なＳＯガス流を、溶液中に吹き込み、混合物は８３℃に温まるまでおいた。反応を90分間進行させた。溶液を０℃に冷却し、生成物を集めアセトンで数回洗浄した。
【０１５７】
この固体を６Ｍ ＨＣｌ２００ｍｌでスラリーにし、加熱し、５００mlフラスコ中で２０分間、勢いよく還流した。反応混合物を濾過し、４℃で一昼夜放置した。トランス-[ＳＯ2(ＮＨ3)ＲｕIIＣｌ]Ｃｌの赤褐色結晶を集め、次いで水５０mlでスラリーにし、４０℃に加熱した。過剰量のノルビオチンを加え、この溶液を３０分間反応させた。溶液を１０００mlフラスコに移し、アセトン７５０mlを加え、１０分間撹拌した。固体を集め、洗浄し、減圧下で乾燥した。
【０１５８】
この固体を最小量の水に溶かし、濾過した。この溶液に３０％ Ｈ2Ｏ2と２Ｎ ＨＣｌの５０:５０混合物を滴下した。１５倍体積量のアセトンを加え、固体を得、集め、減圧下で乾燥した。生成物を最小量の脱気した０.１５Ｎ ＨＣｌを加えて溶かし、完全に脱気した。亜鉛-水銀アマルガムを調整し、溶液を亜鉛アマルガムに移し、この反応を１時間進行させた。前もって脱気した１Ｍ ＢａＣｌ2を加えた。
【０１５９】
アマルガムを含むこの固体を、３０％ Ｈ2Ｏ2および３Ｍ ＨＣｌ３〜４mlを含む濾過フラスコ中に、できる限りすばやく濾過した。黄色溶液に、１５倍体積量のアセトンを加えて沈殿させ、生成物を得た。それを集め、洗浄し、減圧下で乾燥した。固体を最小量の０.０１Ｎ ＨＣｌで再溶解し、４×３０cmのＳＰSephadex Ｃ-２５カラムにかけた。生成物を０.２Ｎ ＨＣｌを使用して回収した。集めた画分を蒸発させて乾燥し、最少量の０.０１Ｎ ＨＣｌで溶かし、濾過し、１５倍体積量のアセトンを加えて沈殿させた。生成物[トランスＲｕIII(ＮＨ3)4(ノルビオチン)Ｃｌ]Ｃｌ2を集め、減圧下で乾燥した。
【０１６０】
溶液-基礎センサー用に、物質を水中に入れ、蛍光測定を行なった；サンプルは蛍光を示さなかった；これは、水の存在が蛍光の防壁となったためである。アビジンを加え二度目の蛍光測定を行なった；アビジン存在下では、蛍光を検出した。これは錯体の周りの環境が変化して、水がもはや蛍光の防壁とならない；すなわち蛍光は消滅しない。
【０１６１】
電極-基礎センサー用に、以下の導電性オリゴマーを入れて物質を活性化し得る。亜鉛-水銀アマルガムを使用した錯体を還元して、この[トランスＲｕIII(ＮＨ3)4(ノルビオチン)Ｃｌ]Ｃｌ2を活性化し、不活性雰囲気下で[トランスＲｕIII(ＮＨ3)4(ノルビオチン)Ｈ2Ｏ]Ｃｌ2を形成した。この物質に導電性オリゴマーを加えて、基の先端に適切な配位原子、例えば窒素含有種、例えばアナリン(analine)、を供給した。レドックス活性錯体を含む導電性オリゴマー(すなわち溶媒が近づきやすい遷移金属錯体及びその結合配位子)を、パシベーション剤など他の単層形成成分と共に混合し、出典明示により本明細書に組込まれているPCT US97/20014など知られた技術を使用して電極に加え得る。
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月8日(2009.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ)電極に標的検体を添加すること、
ここで前記電極は：
ｉ)第一のＥ0を有するレドックス活性分子（ここで、前記レドックス活性分子は、マンガン、テクネチウム、レニウム、鉄、ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、イリジウム、ニッケル、パラジウム、白金、銅、銀および金からなる群から選択される金属を含む）；および
ii)前記標的検体に結合する結合配位子
を含み、前記標的検体が前記結合配位子に結合すると、異なる第２のＥ0を有するレドックス活性分子が形成される；および、
ｂ)前記標的検体の存在の指標として前記第２のＥ0を測定すること、
を含む、試験サンプル中の標的検体を検出する方法。
【請求項２】
前記測定は、少なくとも第一入力シグナルを前記レドックス活性分子に適用し、出力シグナルを受け取ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的検体が存在しないと、前記出力シグナルが、前記第２のＥ0で有意な電子移送を示さない、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一入力シグナルが、少なくとも交流成分を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
複数周波数での入力シグナルの適用をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記入力シグナルが、少なくとも直流成分を含む、請求項２または４に記載の方法。
【請求項７】
複数電圧での入力シグナルの適用をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記出力シグナルが電流である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記電流が交流電流である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記電極が金を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記電極が自己集合単層をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記自己集合単層が導電性オリゴマーを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記自己集合単層が、絶縁体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記レドックス活性分子が、極性配位基により占有されている少なくとも１つの配位部位を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記レドックス活性分子が、水分子により占有されている少なくとも２つの配位部位を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記レドックス活性分子が、極性配位基により占有されている少なくとも２つの配位部位を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合リガンドが、前記レドックス活性分子に共有結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合リガンドが、前記電極に共有結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記レドックス活性分子が、前記電極に共有結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記共有結合が、スペーサーを介している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記共有結合が、スペーサーを介している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記スペーサーが、導電性オリゴマーである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記スペーサーが、絶縁体である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記金属が、鉄である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記金属が、ルテニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記金属が、オスミウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的検体が、タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質が、ペプチドである、請求項２７に記載の方法。
【外国語明細書】
2010091573000001.pdf