(57)【要約】      （修正有）【課題】ウイルスの抗体認識部位に対して物理的な負荷がかかることに起因する、抗体認識部位の認識能の低下を効果的に抑制し得る抗体認識能低下抑制法を提供する。【解決手段】ウイルスが備える抗体認識部位の認識能の低下を抑制するものであり、前記ウイルスを含有する溶液に、界面活性剤を前記溶液中における含有量が０．００１ｗｔ％以上となるように添加して、前記ウイルスと前記界面活性剤とを共存させることにより、前記ウイルスの前記抗体認識部位に物理的な負荷が掛かることに起因する前記認識能の低下を抑制する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスが備える抗体認識部位の認識能の低下を抑制する抗体認識能低下抑制法であって、
前記ウイルスを含有する溶液に、界面活性剤を前記溶液中における含有量が０．００１ｗｔ％以上となるように添加して、前記ウイルスと前記界面活性剤とを共存させることにより、前記ウイルスの前記抗体認識部位に物理的な負荷が掛かることに起因する前記認識能の低下を抑制するよう構成したことを特徴とする抗体認識能低下抑制法。
【請求項２】
前記ウイルスは、その表面にエンベロープを備える請求項１に記載の抗体認識能低下抑制法。
【請求項３】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン系の界面活性剤である請求項１または２に記載の抗体認識能低下抑制法。
【請求項４】
前記溶液中での前記界面活性剤の含有量は、０．０１〜０．１ｗｔ％である請求項１ないし３のいずれかに記載の抗体認識能低下抑制法。
【請求項５】
前記溶液中での前記ウイルスの含有量は、０．５μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである請求項１ないし４のいずれかに記載の抗体認識能低下抑制法。
【請求項６】
前記溶液の温度は、７０℃以下である請求項１ないし５のいずれかに記載の抗体認識能低下抑制法。
【請求項７】
前記溶液中からカラムを用いて前記ウイルスを精製する際に、前記抗体認識部位に前記物理的な負荷が掛かる請求項１ないし６のいずれかに記載の抗体認識能低下抑制法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体認識能低下抑制法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応を利用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、遺伝子治療におけるウイルスベクターおよびワクチン等の開発において、その検出感度や安全性等を向上させることを目的に、培養されたウイルスをより精度よく精製する必要がある。
【０００３】
近年、このようなウイルスの精製に、培養液中に含まれるウイルスをクロマトグラフィー法を用いて精製することが提案されているが（例えば、特許文献１参照。）、ウイルスを、このようなクロマトグラフィー法を用いて精製すると、この精製の際にウイルスに対して物理的な負荷がかかり、これに起因してウイルスが備える抗体認識部位の認識能が低下するという問題がある。
【０００４】
また、このような問題は、ウイルスを含有する溶液を運搬する際にも、ウイルスが容器の壁面に衝突することに起因して、ウイルスに対して物理的な負荷がかかるため同様に起こり得る。
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−３１８８９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ウイルスの抗体認識部位に対して物理的な負荷がかかることに起因する、抗体認識部位の認識能の低下を効果的に抑制し得る抗体認識能低下抑制法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的は、下記（１）〜（７）の本発明により達成される。
（１）  ウイルスが備える抗体認識部位の認識能の低下を抑制する抗体認識能低下抑制法であって、
前記ウイルスを含有する溶液に、界面活性剤を前記溶液中における含有量が０．００１ｗｔ％以上となるように添加して、前記ウイルスと前記界面活性剤とを共存させることにより、前記ウイルスの前記抗体認識部位に物理的な負荷が掛かることに起因する前記認識能の低下を抑制するよう構成したことを特徴とする抗体認識能低下抑制法。
【０００８】
これにより、ウイルスの抗体認識部位に対して物理的な負荷がかかることに起因して、抗体認識部位の認識能が低下してしまうのを効果的に抑制することができる。
【０００９】
（２）  前記ウイルスは、その表面にエンベロープを備える上記（１）に記載の抗体認識能低下抑制法。
【００１０】
エンベロープは、エンベロープウイルスにおいて最も外側に位置するため、抗体認識部位に物理的負荷がかかることに起因する認識能の低下は、エンベロープに存在する抗体認識部位においてより顕著に生じていると考えられる。そのため、本発明をエンベロープを備えるウイルスに適用するのが好ましい。
【００１１】
（３）  前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン系の界面活性剤である上記（１）または（２）に記載の抗体認識能低下抑制法。
【００１２】
ポリオキシエチレン系の界面活性剤は、タンパク質等に対する作用が特に温和であることから、ウイルスが備える抗体認識部位に変性等を生じさせることなく、抗体認識部位に掛かる物理的な負荷を低減させる緩衝材としての機能をより確実に発揮することができる。
【００１３】
（４）  前記溶液中での前記界面活性剤の含有量は、０．０１〜０．１ｗｔ％である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の抗体認識能低下抑制法。
【００１４】
これにより、抗原認識部位そのものを界面活性剤により変性または変質させることなく、界面活性剤に緩衝材としての機能を確実に発揮させることができる。
【００１５】
（５）  前記溶液中での前記ウイルスの含有量は、０．５μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の抗体認識能低下抑制法。
【００１６】
かかる範囲内に設定することにより、界面活性剤で抗体認識部位を十分に取り囲むことができ、界面活性剤による抗体認識部位の認識能の低下を確実に抑制することができる。
【００１７】
（６）  前記溶液の温度は、７０℃以下である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の抗体認識能低下抑制法。
【００１８】
これにより、界面活性剤の界面活性剤含有細胞溶解液中における分散性が向上する。そのため、抗体認識部位を界面活性剤により均一に取り囲むことができるようになり、その結果、抗体認識部位に物理的な負荷が掛かることに起因する抗体認識部位の認識能の低下がより確実に抑制される。
【００１９】
（７）  前記溶液中からカラムを用いて前記ウイルスを精製する際に、前記抗体認識部位に前記物理的な負荷が掛かる上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の抗体認識能低下抑制法。
【００２０】
かかる場合に、ウイルスが備える抗体認識部位に掛かる物理的な負荷を、界面活性剤をウイルスとともに溶液中に共存させることにより、確実に低減させることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ウイルスを含有する溶液に、界面活性剤をこの溶液中における含有量が０．００１ｗｔ％以上となるように添加していることにより、ウイルスと界面活性剤とが共存しているので、たとえ、ウイルスの抗体認識部位に物理的な負荷が掛かったとしても、界面活性剤が抗体認識部位に掛かる物理的な負荷を低減させる緩衝材としての機能を発揮して、抗体認識部位の認識能が低下してしまうのを確実に抑制することができる。
【００２２】
また、界面活性剤として、ポリオキシエチレン系の界面活性剤を用いることにより、ウイルスが備える抗体認識部位に変性等を生じさせることなく、抗体認識部位に掛かる物理的な負荷を低減させる緩衝材としての機能をより確実に発揮させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の抗体認識能低下抑制法について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００２４】
なお、以下では、本発明の抗体認識能低下抑制法を、リン酸カルシウム系化合物を用いたカラムクロマトグラフィーによるウイルスの精製に適用した場合を代表に説明する。
【００２５】
まず、ウイルスの精製に用いられるカラム（分離装置）の一例について説明する。
図１は、本発明で用いる分離装置の一例を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図１中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。
【００２６】
ここで、流入側とは、目的とするウイルスを精製（分離）する際に、例えば、後述する界面活性剤含有細胞溶解液（ウイルスを含有する溶液）を、分離装置内に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記溶液が分離装置内から流出する側のことを言う。
【００２７】
ウイルスを精製（分離）するために用いられる、図１に示す分離装置１は、カラム２と、粒状の吸着剤（充填剤）３と、２枚のフィルタ部材４、５とを有している。
【００２８】
カラム２は、カラム本体２１と、このカラム本体２１の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体）２２、２３とで構成されている。
【００２９】
カラム本体２１は、例えば円筒状の部材で構成されている。カラム本体２１を含めカラム２を構成する各部（各部材）の構成材料としては、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、各種セラミックス材料等が挙げられる。
【００３０】
カラム本体２１には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材４、５を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ２２、２３が螺合により装着される。
【００３１】
このような構成のカラム２では、カラム本体２１と各フィルタ部材４、５とにより、吸着剤充填空間２０が画成されている。そして、この吸着剤充填空間２０の少なくとも一部に（本実施形態では、ほぼ満量で）、吸着剤３が充填されている。
【００３２】
吸着剤充填空間２０の容積は、試料液の容量に応じて適宜設定され、特に限定されないが、溶液１ｍＬに対して、０．１〜１００ｍＬ程度が好ましく、１〜５０ｍＬ程度がより好ましい。吸着剤充填空間２０の寸法を上記のように設定し、かつ吸着剤３の寸法を後述のように設定することにより、ウイルスと、界面活性剤含有細胞溶解液中にウイルス以外に含まれる夾雑物とを確実に分離することができる。なお、溶液中に含まれる夾雑物としては、例えば、ウイルスを培養する際に用いた宿主細胞が備える細胞膜等が挙げられる。
【００３３】
また、カラム本体２１に各キャップ２２、２３を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。
【００３４】
各キャップ２２、２３のほぼ中央には、それぞれ、流入管２４および流出管２５が液密に固着（固定）されている。この流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に、界面活性剤含有細胞溶解液が供給される。また、吸着剤３に供給された液体（界面活性剤含有細胞溶解液）は、吸着剤３同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材５および流出管２５を介して、カラム２外へ流出する。このとき、界面活性剤含有細胞溶解液中に含まれるウイルスと夾雑物とは、吸着剤３に対する吸着性の差異およびリン酸系緩衝液に対する親和性の差異に基づいて分離される。
【００３５】
各フィルタ部材４、５は、それぞれ、吸着剤充填空間２０から吸着剤３が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材４、５は、それぞれ、例えば、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエーテルポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体（連通孔を有するスポンジ状多孔質体）、織布、メッシュ等で構成されている。
【００３６】
吸着剤３は、本実施形態では、その少なくとも表面が、リン酸カルシウム系化合物で構成されている。かかる吸着剤３には、界面活性剤含有細胞溶解液（試料）中に含まれるウイルスが、このウイルス固有の吸着（担持）力で特異的に吸着し、この吸着力の差に応じて、夾雑物と分離・精製される。
【００３７】
リン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、例えば、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、ＴＣＰ（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＤＣＰＤ（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２や、これらの一部が他の原子または原子団で置換されたもの等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３８】
中でも、リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものが好ましい。吸着剤３として、その少なくとも表面付近が主としてハイドロキシアパタイトで構成されるものを用い、さらに、溶出液として、リン酸系緩衝液の塩濃度を変えて用いることで、ウイルスを、吸着剤３から容易かつ特異的に取り外すことができる。
【００３９】
また、吸着剤３の形態（形状）は、図１に示すように、粒状（顆粒状）のものであるのが好ましいが、その他、例えばペレット状（小塊状）、ブロック状（例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状）等とすることもできる。なお、吸着剤３を粒状とすることにより、その表面積を増大させることができ、ウイルスの分離特性の向上を図ることができる。
【００４０】
粒状の吸着剤３の平均粒径は、特に限定されないが、０．５〜１０００μｍ程度であるのが好ましく、１０〜５００μｍ程度であるのがより好ましく、１０〜８０μｍであるのがさらに好ましい。このような平均粒径の吸着剤３を用いることにより、前記フィルタ部材５の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤３の表面積を十分に確保することができる。
【００４１】
なお、吸着剤３は、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものであってもよく、担体（基体）の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆したものであってもよいが、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものであるのが好ましい。これにより、吸着剤３の強度をさらに向上することができ、多量のウイルスを分離する際の使用に適した分離装置１を得ることができる。
【００４２】
なお、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤３は、例えば、湿式合成法や乾式合成法を用いて、リン酸カルシウム系化合物粒子（一次粒子）を得、かかるリン酸カルシウム系化合物粒子を含有するスラリーを、乾燥や造粒することにより、乾燥粒子を得、さらに、この乾燥粒子を焼成する等して得ることができる。
【００４３】
一方、担体の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆した吸着剤３は、例えば、樹脂等で構成される担体に、前記乾燥粒子を衝突（ハイブリダイズ）させる方法等により得ることができる。
【００４４】
また、本実施形態のように、吸着剤３を吸着剤充填空間２０にほぼ満量充填する場合には、吸着剤３は、吸着剤充填空間２０の各部において、ほぼ同一の組成をなしているのが好ましい。これにより、分離装置１は、ウイルスの分離（精製）能が特に優れたものとなる。
【００４５】
なお、吸着剤充填空間２０の一部（例えば流入管２４側の一部）に吸着剤３を充填し、その他の部分には他の吸着剤を充填するようにしてもよい。
【００４６】
次に、このような分離装置１を用いたカラムクロマトグラフィーによるウイルスの精製方法について説明する。
【００４７】
［１］  調製工程
まず、精製すべきウイルスを宿主細胞中で培養する。
【００４８】
培養するウイルスとしては、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー、遺伝子導入、遺伝子治療およびワクチン等に用いられる各種ウイルスが選択され、例えば、デングウイルスおよび日本脳炎ウイルスが属するフラビウイルス科、インフルエンザウイルスが属するオルトミクソウイルス科、風疹ウイルスが属するトガウイルス科、麻疹ウイルス、センダイウイルスおよびムンプスウイルスが属するパラミクソウイルス科のウイルスのようなエンベロープを有するウイルスならびにパピロマーウイルスが属するパピロマーウイルス科、アデノウイルスが属するアデノウイルス科、レオウイルスおよびロタウイルスが属するレオウイルス科のウイルスのようなエンベロープを有さないウイルス等が挙げられる。
【００４９】
また、宿主細胞としては、培養すべきウイルスの種類に応じて適宜選択され、例えば、デングウイルスを培養する場合には、宿主細胞として哺乳類の血液細胞等が用いられ、日本脳炎ウイルスを培養する場合には、宿主細胞として哺乳類の脳細胞または神経細胞や、蚊の細胞等が用いられ、インフルエンザウイルスを培養する場合には、宿主細胞として鶏卵細胞等が用いられる。
【００５０】
次に、ウイルスが培養された後の宿主細胞に対して、溶解処理を施すことにより、宿主細胞を溶解させて細胞溶解液を得る。
【００５１】
溶解処理としては、各種方法が用いられ特に限定されるものではないが、例えば、宿主細胞に対して超音波のような振動を付与する方法、宿主細胞を高張緩衝液中に浸漬する方法および宿主細胞を酵素含有溶液中に浸漬する方法等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５２】
もしくは、これらの他、細胞を溶解せずに細胞外の培地中に放出されたウイルスを培地ごと回収する方法もある。
【００５３】
次に、得られた細胞溶解液に、界面活性剤をその含有量が０．００１ｗｔ％以上となるよう添加して、次工程［２］において、カラム２内を通過させる界面活性剤含有細胞溶解液（ウイルスを含有する溶液）を調製する。
【００５４】
界面活性剤としては、次工程［２］および後工程［３］において、ウイルスを吸着剤３に接触・吸着させ、その後、溶出液を用いて吸着剤３から分離させる際に、ウイルスが備える抗体認識部位に物理的な負荷が掛かることに起因する認識能の低下を抑制し得るものであればよく、非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤のいずれであってもよいが、非イオン性界面活性剤であるのが好ましい。非イオン性界面活性剤は、イオン性界面活性剤と比較して、タンパク質等に対する作用が温和であることから、ウイルスが備える抗体認識部位に変性等を生じさせることなく、抗体認識部位に掛かる物理的な負荷を低減させる緩衝材としての機能を確実に発揮することができる。
【００５５】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−α−Ｄ−グルコピラノシドのようなアルキルグルコシド系非イオン界面活性剤、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＥＷＷＮ２０）、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＷＥＥＮ４０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＷＥＥＮ６０）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＥＷＷＮ８０）のようなポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらの中でも、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤は、上述した非イオン性界面活性剤としての特性が特に優れることから、界面活性剤としてより好ましく用いられる。さらに、界面活性剤含有細胞溶解液における分散性に優れることから、０．００１ｗｔ％程度の比較的少量の含有量でも、界面活性剤含有細胞溶解液中でウイルスが備える抗体認識部位を取り囲むように存在することができ、この抗体認識部位に掛かる物理的な負荷を確実に緩和することができる。
【００５６】
なお、界面活性剤およびウイルス等の含有量を調製する場合には溶媒を界面活性剤含有細胞溶解液に添加してもよいが、この溶媒としては、等張液（細胞やウイルス内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）が好適である。これにより、溶媒がウイルスに接触した際における、ウイルス内の浸透圧の違いによるウイルスの破壊を防止することができる。
【００５７】
この等張液には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ液（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）、Ｌｏｃｋｅ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｔｙｒｏｄｅ液、Ｅａｒｌｅ液、Ｋｒｅｂｓ液、生理食塩水等を用いることができる。
【００５８】
界面活性剤含有細胞溶解液中における界面活性剤の含有量は、含有量が０．００１ｗｔ％以上であればよく、当該溶解液中に含まれるウイルスの種類によっても若干異なるが、０．０１〜０．１ｗｔ％程度であるのが好ましい。界面活性剤の含有量が低すぎると、抗体認識部位に掛かる物理的な負荷を低減するための緩衝材としての機能を十分に発揮させることができず、ウイルスの種類等によっては、抗体認識部位の認識能が低下してしまうおそれがある。また、界面活性剤の濃度を高くしても、それ以上の効果の増大が期待できないばかりか、抗体認識部位そのものを界面活性剤により変性または変質させてしまうおそれがあり好ましくない。
【００５９】
また、界面活性剤含有細胞溶解液中におけるウイルスの含有量は、ウイルスの種類によっても若干異なるが、０．５〜１００００μｇ／ｍＬ程度であるのが好ましく、０．２〜１０００μｇ／ｍＬ程度であるのがより好ましい。ウイルスの濃度が低過ぎると、次工程［２］および後工程［３］おいて、ウイルスを吸着剤３に接触・吸着させ、その後、溶出液を用いて吸着剤３から分離させる際に、分離されるウイルス量が少なくなり過ぎるおそれがある。また、ウイルスの濃度が高過ぎると、抗体認識部位を取り囲む界面活性剤の絶対量が少なくなり、界面活性剤による抗体認識部位の認識能の低下を十分に抑制できなくなるおそれがあり好ましくない。
【００６０】
さらに、この際の界面活性剤含有細胞溶解液の温度は、７０℃以下であるのが好ましく、２〜２５℃程度であるのがより好ましい。
【００６１】
また、界面活性剤含有細胞溶解液のｐＨは、４．５〜１０．０程度とするのが好ましく、５．５〜９．０程度とするのがより好ましい。
【００６２】
界面活性剤含有細胞溶解液の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、界面活性剤の界面活性剤含有細胞溶解液中における分散性が向上する。そのため、抗体認識部位を界面活性剤により均一に取り囲むことができるようになり、その結果、抗体認識部位に物理的な負荷が掛かることに起因する抗体認識部位の認識能の低下がより確実に抑制される。
【００６３】
なお、界面活性剤含有細胞溶解液中から、予め、吸着剤３に対して吸着能の低い夾雑タンパク質や、タンパク質以外の夾雑物を除去することを目的に、次工程［２］に先立って、界面活性剤含有細胞溶解液に対して前処理を施してもよい。この前処理としては、例えば、ポリエチレングリコールのような水溶性高分子の界面活性剤含有細胞溶解液への添加・抽出や遠心分離機を用いた粗精製等が挙げられる。
【００６４】
［２］  供給工程
次に、調製した界面活性剤含有細胞溶解液を、流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給して、カラム２（分離装置１）内を通過させることにより、吸着剤３に接触させる。
【００６５】
これにより、吸着剤３に対して吸着能が高いウイルスや、ウイルス以外の夾雑タンパク質の中でも吸着剤３に対して比較的吸着能の高いものは、カラム２内に保持される。そして、吸着剤３に対して吸着能の低い夾雑タンパク質や、タンパク質以外の夾雑物は、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出する。
【００６６】
ここで、界面活性剤含有細胞溶解液中に界面活性剤を添加することなく、この溶解液を、カラム２内を通過させると、カラム２の壁面や吸着剤３に直接接触すること等に起因して、ウイルスが備える抗体認識部位に物理的な負荷がかかり、その結果、この抗体認識部位の認識能が低下するという問題がある。
【００６７】
これに対して、本願発明では、界面活性剤含有細胞溶解液中にウイルスの他に、さらに界面活性剤が含まれ、その含有量を０．００１ｗｔ％以上としている。すなわち、界面活性剤含有細胞溶解液中に、ウイルスと、含有量が０．００１ｗｔ％以上の界面活性剤を共存させている。このため、ウイルスを吸着剤３に接触・吸着させ、その後、溶出液を用いて吸着剤３から分離させる際に、この界面活性剤に抗体認識部位に掛かる物理的な負荷を低減させる緩衝材としての機能を発揮させることができ、これにより、カラム２の壁面や吸着剤３に直接接触すること等に起因する抗体認識部位の認識能の低下を的確に抑制することができる。
【００６８】
なお、上記のような抗体認識部位における認識能の低下は、ウイルスとしてエンベロープを有するウイルスを選択したときに顕著に認められると推察される。これは、エンベロープは、ウイルスの最も外側に位置するため、カラム２の壁面や吸着剤３に直接接触すること等に起因する抗体認識部位の認識能の低下は、エンベロープに存在する抗体認識部位においてより顕著に生じていると考えられる。
【００６９】
［３］  分画工程
次に、流入管２４からカラム２内に、ウイルスを溶出させるための溶出液として、例えば、リン酸系緩衝液を供給して、カラム２内から流出管２５を介して流出する流出液を、所定量ずつ分画（採取）する。これにより、吸着剤３に吸着しているウイルスおよび夾雑タンパク質は、それぞれ、各タンパク質が有する吸着剤３に対する吸着力の差に応じて、各分画内に溶出した状態で回収（分離）される。
【００７０】
なお、流出液を所定量ずつ分画して得られる各画分は、例えば、マイクロチューブ、バイアルのような容器内にそれぞれ回収される。この際にも、流出液が容器の壁面に衝突することに起因して、ウイルスが備える抗体認識部位に物理的な負荷が掛かるが、本実施形態では、界面活性剤含有細胞溶解液中に界面活性剤が含まれているため、抗体認識部位に物理的な負荷が掛かることに起因する認識能の低下を確実に抑制することができる。
【００７１】
リン酸系緩衝液には、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸リチウム等が挙げられる。
【００７２】
リン酸系緩衝液のｐＨは、特に限定されないが、６〜８程度であるのが好ましく、６．５〜７．５程度であるのがより好ましい。これにより、分離するウイルスの変質（変成）を防止することができ、その抗体認識部位の認識能が変化するのを防止することができる。また、吸着剤３の変質（溶解等）を好適に防止することができ、分離装置１における分離能の変化を防止することもできる。
【００７３】
このリン酸系緩衝液の温度も、特に限定されないが、２〜５０℃程度であるのが好ましく、２〜２５℃程度であるのがより好ましい。これにより、分離するウイルスの変質（変成）を防止することができる。
【００７４】
また、リン酸系緩衝液の塩濃度は、５００ｍＭ以下であるのが好ましく、４００ｍＭ以下であるのがより好ましい。このような塩濃度のリン酸系緩衝液を用いて、ウイルスの分離を行うことにより、リン酸系緩衝液によるウイルスへの悪影響を防止することができる。
【００７５】
具体的には、塩濃度が１〜４００ｍＭ程度のリン酸系緩衝液を用いることができる。また、リン酸系緩衝液は、ウイルスの分離操作の際に、連続的または段階的に変化させるのが好ましい。これにより、ウイルスの分離操作の効率化を図ることができる。
【００７６】
さらに、リン酸系緩衝液の流速は、０．１〜１０ｍＬ／分程度であるのが好ましく、１〜５ｍＬ／分程度であるのがより好ましい。このような流速で、ウイルスの分離を行うことにより、分離操作に長時間を要することなく、目的とするウイルスを確実に分離すること、すなわち、高純度なウイルスを得ることができる。
以上のような操作により、所定の画分に、ウイルスが回収・精製される。
【００７７】
なお、本実施形態では、吸着剤３は、その少なくとも表面が、リン酸カルシウム系化合物で構成されている場合について説明したが、吸着剤３は、いかなる材料で構成されていてもよく、例えば、シリカゲル、アルミナ、デキストランおよびゼオライト等のうちの少なくとも１種で構成されるものであってもよい。
【００７８】
また、本実施形態では、本発明の抗体認識能低下抑制法を、カラムクロマトグラフィーによるウイルスの精製に適用した場合を一例に説明したが、このような場合に限定されず、ウイルスが備える抗体認識部位に物理的な負荷が掛かるいかなる方法にも適用することができ、例えば、ウイルスを含有する溶液を容器内に収納して運搬するウイルスの運搬方法等にも適用することができる。
【００７９】
以上、本発明の抗体認識能低下抑制法を、図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８０】
例えば、本発明の抗体認識能低下抑制法では、必要に応じて、１以上の任意の目的の工程を追加してもよい。
【実施例】
【００８１】
・ウイルスを界面活性剤との共存下で攪拌した場合の検討
＜１＞  まず、ウイルスとしてデングウイルスの１型、２型、３型、４型(全て自社にて製作)の４種をＰＢＳ中で等量混合し、抗原濃度１８６μｇ／ｍＬに調整した抗原液を用意し、この抗原液の抗原濃度が５μｇ／ｍＬとなるように、１．０２７ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を用いて希釈することにより、不活化デングＭＩＸ抗原含有量が５μｇ／ｍＬで、ＴＷＥＥＮ２０含有量が１ｗｔ％のウイルス含有液を得た。
【００８２】
＜２＞  次に、ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液に含まれるＴＷＥＥＮ２０の含有量が、０．１０２７ｗｔ％、０．０１０２７ｗｔ％、０．００１０２７ｗｔ％および０．０００１０２７ｗｔ％のものを用いた以外は、前記工程＜１＞と同様にして、不活化デングＭＩＸ抗原含有量が５μｇ／ｍＬで、ＴＷＥＥＮ２０含有量が、それぞれ、０．１ｗｔ％、０．０１ｗｔ％、０．００１ｗｔ％、０．０００１ｗｔ％のウイルス含有液を得た。
【００８３】
また、ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液に代えてＴＷＥＥＮ２０を含有しないＰＢＳ溶液を用いた以外は、前記工程＜１＞と同様にして、不活化デングＭＩＸ抗原含有量が５μｇ／ｍＬで、ＴＷＥＥＮ２０含有量が０ｗｔ％のウイルス含有液を得た。
【００８４】
＜３＞  次に、これらＴＷＥＥＮ２０含有量が、それぞれ、１ｗｔ％、０．１ｗｔ％、０．０１ｗｔ％、０．００１ｗｔ％、０．０００１ｗｔ％、０ｗｔ％のウイルス含有液を濃度毎に５００μＬ×５本ずつマイクロチューブ中にサンプリングした。
【００８５】
＜４＞  次に、５本ずつサンプリングした各ＴＷＥＥＮ２０濃度のウイルス含有液を、それぞれ、表１に示す条件Ａ〜Ｅの条件下、すなわち、マイクロチューブを静置、または、マイクロチューブの上下が反転する反転運動を行い得るローテートによる攪拌を行う条件下に置いた後、さらに、４℃の条件下で静置した。
【００８６】
【表１】
2010046003.tif 000002
【００８７】
＜５＞  次に、図２に示すような、縦横８×１２＝９６個のウェルを備えるポリスチレン製の９６−ｗｅｌｌマイクロプレート（コーニング社製）を用意した。
【００８８】
なお、以下では、説明の便宜上、図２および表２に示すように、それぞれ、マイクロプレートの横の行をＡ〜Ｈレーンと言い、各レーンのウェルを左から順にナンバリングして、例えば、Ａレーンの左から３番目（ウェルＮｏ．３）のウェルをウェルＡ−３、Ｅレーンの左から５番目（ウェルＮｏ．５）のウェルをウェルＥ−５と言うこととする。
【００８９】
＜６＞  次に、各条件Ａ〜Ｅの条件下におかれた各ＴＷＥＥＮ２０濃度のウイルス含有液を、表２に示すような位置、すなわちレーンＮｏ．Ａ〜ＥにはＴＷＥＥＮ２０濃度が０．１〜０ｗｔ％のものが、ウェルＮｏ．１〜５には条件Ａ〜Ｅのものが対応する位置に、それぞれ、４８μＬ／ｗｅｌｌずつアプライ（供給）した後、４℃の条件下で一晩、静置することにより、不活化デングＭＩＸ抗原（ウイルス）をウェル内に担持させた。
【００９０】
【表２】
2010046003.tif 000003
【００９１】
＜７＞  次に、マイクロプレートのウイルスが担持された各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内を、それぞれ、０．１ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を３００μＬずつ各ウェル内に供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液による各ウェルの洗浄を合計３回行った。
【００９２】
＜８＞  次に、マイクロプレートの各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内に、それぞれ、１ｗｔ％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液を１００μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、各ウェル内のウイルスが担持されていない領域に、ＢＳＡを吸着させて、主としてＢＳＡで構成される被覆層を形成した。
【００９３】
＜９＞  次に、前記工程＜７＞と同様にして各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内を洗浄した。
＜１０＞  次に、ウイルスを認識する一次抗体を含む試薬として、αＤｅｎｇｕｅＭｉｘ−ＭＵをＰＢＳにより４０００倍希釈したものを用意した。
【００９４】
なお、αＤｅｎｇｕｅＭｉｘ−ＭＵとは、Ｄｅｎｇｕ１型〜４型のウイルスを接種した数種類のマウスから得られた血清に含まれるＤｅｎｇｕ１型〜４型抗体の抗体価をそろえて混合したものであり、これら何れも自社で調整した。
【００９５】
＜１１＞  次に、マイクロプレートの各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内に、それぞれ、αＤｅｎｇｕｅＭｉｘ−ＭＵ（一次抗体）を含む試薬を５０μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、一次抗体にウェル内に担持されたウイルスを認識させた。
【００９６】
＜１２＞  次に、前記工程＜７＞と同様にして各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内を洗浄した。
＜１３＞  次に、酵素標識された抗体（二次抗体）を含有する試薬として、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧＦＣ（cat:64-6420 Zymed）をＰＢＳにより２０００倍希釈したものを用意した。
【００９７】
＜１４＞  次に、マイクロプレートの各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内に、それぞれ、ＰＯＤ標識αＭＵＩｇＧＦＣ（二次抗体）を含む試薬を５０μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、二次抗体にウェル内にウイルスを介して担持された一次抗体を認識させた。
【００９８】
＜１５＞  次に、前記工程＜７＞と同様にして各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内を洗浄した。
＜１６＞  次に、マイクロプレートの各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内に、それぞれ、ＰＯＤの基質であるＴＭＢを含む試薬を１００μＬずつ供給して９０秒間放置し、さらに１Ｎ・ＨＣｌを５０μＬずつ供給した後、各ウェル内の４５０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定した。
【００９９】
なお、吸光度の測定は、吸光度測定装置（「ＧＥＮｉｏｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ ＦＬＵＯＲ ｐｌｕｓ」、和光純薬社製）を用いて行った。
【０１００】
測定された各ウェルでの吸光度と、ウイルスの処理条件との関係を図３に示す。
図３に示すように、界面活性剤の含有量が０．００１ｗｔ％未満のウイルス含有液（比較例）では、静置の条件下（条件Ａ〜Ｃ）では、吸光度の低下を認めないものの、ローテートの条件下（条件ＤおよびＥ）では、吸光度が著しく低下した。
【０１０１】
これに対して、界面活性剤の含有量が０．００１ｗｔ％以上のウイルス含有液（実施例）では、界面活性剤の含有量が０．００１ｗｔ％のときに、まず、比較例と比較して、ローテートの条件下（条件ＤおよびＥ）での吸光度の低下が低減される傾向を示した。そして、界面活性剤の含有量が０．０１ｗｔ％および０．１ｗｔ％のときには、この傾向がより顕著に認められ、静置の条件下（条件Ａ〜Ｃ）の吸光度とほぼ同等の値を示した。
【０１０２】
以上のことから、ウイルスを界面活性剤共存下で攪拌した場合、すなわちウイルスと界面活性剤との共存下でウイルスに物理的な負荷を掛けた場合では、攪拌によるウイルスの抗体認識部位における認識能の低下を、界面活性剤の含有量を０．００１ｗｔ％以上とすること、好ましくは０．０１ｗｔ％以上とすることにより、好適に低減し得ることが判った。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明で用いる分離装置の一例を示す縦断面図である。
【図２】ウイルス処理物が担持されるマイクロプレートを模式的に示す平面図である。
【図３】マイクロプレートの各ウェルで測定された吸光度と、ウイルスの処理条件との関係を示す図である。
【符号の説明】
【０１０４】
１            吸着装置
２            カラム
２０          吸着剤充填空間
２１          カラム本体
２２、２３    キャップ
２４          流入管
２５          流出管
３            吸着剤
４、５        フィルタ部材
【図１】
2010046003.tif 000004
【図２】
2010046003.tif 000005
【図３】
2010046003.tif 000006