(57)【要約】【課題】抗原の抗体認識部位の認識能を低下させることなく基材に抗原を担持させ得る抗原付着担体の製造方法を提供すること。【解決手段】本発明の抗原付着担体の製造方法は、基材に抗原が担持された抗原付着担体を得る方法であり、前記基材と、前記抗原と、含有量が０．００１ｗｔ％以上の界面活性剤とを含有する分散液を用意し、該分散液を攪拌しつつ、前記分散液中で前記基材に前記抗原を担持させる。また、界面活性剤は、ポリオキシエチレン系の界面活性剤であるのが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材に抗原が担持された抗原付着担体を得る抗原付着担体の製造方法であって、
前記基材と、前記抗原と、含有量が０．００１ｗｔ％以上の界面活性剤とを含有する分散液を用意し、該分散液を攪拌しつつ、前記分散液中で前記基材に前記抗原を担持させることを特徴とする抗原付着担体の製造方法。
【請求項２】
前記分散液の攪拌は、密閉空間が形成される容器内に前記分散液を収納し、該容器の上下が反転する反転運動により行われる請求項１に記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項３】
前記反転運動は、前記分散液を収納した前記容器を、円板状をなす板材の外周面に、前記容器の軸が前記板材のほぼ中心を通るように配置し、前記板材を前記中心で回転させることにより行われる請求項２に記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項４】
前記板材の鉛直方向に対する傾斜角度は、０〜７５°である請求項３に記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項５】
前記板材の回転速度は、１〜１００ｒｐｍである請求項３または４に記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項６】
前記抗原は、ウイルスである請求項１ないし５のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項７】
前記ウイルスは、その表面にエンベロープを備えるものである請求項６に記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項８】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン系の界面活性剤である請求項１ないし７のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項９】
前記基材は、少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成されている請求項１ないし８のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項１０】
前記分散液中での前記界面活性剤の含有量は、０．０１〜０．１ｗｔ％である請求項１ないし９のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項１１】
前記分散液中での前記抗原の濃度は、０．０１μｇ/ｍＬ〜１０ｍｇ/ｍＬである請求項１ないし１０のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項１２】
前記分散液中での前記基材の濃度は、０．００１〜２０００ｍｇ／ｍＬである請求項１ないし１１のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項１３】
前記分散液中で前記基材に前記抗原を担持させる時間は、１分〜２４時間である請求項１ないし１２のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項１４】
前記分散液中で前記基材に前記抗原を担持させる際の前記分散液の温度は、５０℃以下である請求項１ないし１３のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項１５】
前記抗原を前記基材に担持した後に、前記基材の前記抗原が付着していない領域に、抗体との相互作用が前記基材より低いタンパク質を主材料として構成される被覆層を形成する請求項１ないし１４のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【請求項１６】
前記被覆層は、前記界面活性剤が含まれるように形成される請求項１５に記載の抗原付着担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原付着担体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
検体中に含まれる、検出すべき抗体を検出する方法として、抗原抗体反応を利用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）が知られている。
【０００３】
ＥＬＩＳＡ法は、１）検出すべき抗体を高感度で検出することができ、定量性にも優れていること、２）抗原抗体反応を利用して検出するため、検体中に夾雑物が混在する粗抽出段階で測定が可能であり、他の検査法で必要とされる精製や前処理といった煩雑なステップを必要としないこと、３）短時間で大量の検体を測定し得ること等の利点を有していることから、近年、広く用いられている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
このようなＥＬＩＳＡ法の一種であるサンドイッチ法を用いて、検体中の特異抗体を検出する方法として、例えば、抗原が担持された粒状の抗原付着担体を用いた検出方法が知られている。
【０００５】
Ｉ）まず、ウェルを備えるマイクロプレートを用意する。かかる抗原付着担体を用いた検出方法では、マイクロプレートとして、ウェルの底部の縦断面形状がＶ字状等の収斂形状をなしており、さらにウェルの底部に、非特異的に特異抗体を認識する非特異抗体が担持されているものが用いられる。II）次に、基材に検体を供給して、検体中に含まれる検出すべき特異抗体およびこの特異抗体以外の抗体を非特異抗体に認識させる。III）次に、粒状の基材に抗原が担持された抗原付着担体を供給して、非特異抗体を介して基材に担持された特異抗体に、抗原付着担体に担持されている抗原を特異的に認識させることにより、抗原付着担体をウェルの底部に付着させる。
【０００６】
このように、検体中に検出すべき特異抗体が含まれている（陽性検体である）と、抗原付着担体が特異抗体により認識されるので、ウェルの底部が収斂形状をなしていたとしても、その斜面に沿って下方に移動して、その頂部に集積することはない。
【０００７】
これに対して、検体中に特異抗体が含まれていない（陰性検体である）と、抗原付着担体が特異抗体により認識されることがないので、収斂形状をなすウェルの底部に沿って下方に移動するため、抗原付着担体はその頂部に集積する。
【０００８】
そのため、抗原付着担体の着色等により抗原付着担体を視認し得るようにしておくことで、陽性検体である場合には、ウェル内の検体が全体的に若干着色した状態が観察され、陰性検体である場合には、ウェルの頂部がスポット的に着色された状態が観察される。
【０００９】
かかる手法で検体中の特異抗体の有無が観察される検出方法において、検出感度を向上させるには、より多くの抗原を抗原付着担体に均一に付着させる必要がある。そして、かかる構成の抗原付着担体を得るために、担体を含有する分散液に抗原を添加する際には、通常、分散液を攪拌した状態で抗原の添加が行われている。
【００１０】
しかしながら、このような方法では、攪拌の際に、抗原が容器の壁面に衝突すること、熱を生じることによる抗原の分解等に起因して、抗原が備える抗体認識部位の認識能が低下するという問題がある。
【００１１】
【特許文献１】特開平９−１４５７１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、抗原の抗体認識部位の認識能を低下させることなく基材に抗原を担持させ得る抗原付着担体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このような目的は、下記（１）〜（１６）の本発明により達成される。
（１）  基材に抗原が担持された抗原付着担体を得る抗原付着担体の製造方法であって、
前記基材と、前記抗原と、含有量が０．００１ｗｔ％以上の界面活性剤とを含有する分散液を用意し、該分散液を攪拌しつつ、前記分散液中で前記基材に前記抗原を担持させることを特徴とする抗原付着担体の製造方法。
【００１４】
これにより、抗原の抗体認識部位の認識能を低下させることなく基材に抗原が担持された抗原付着担体を製造することができる。
【００１５】
（２）  前記分散液の攪拌は、密閉空間が形成される容器内に前記分散液を収納し、該容器の上下が反転する反転運動により行われる上記（１）に記載の抗原付着担体の製造方法。
【００１６】
かかる方法では、反転運動により、容器の壁面に抗原が衝突する機会が増大するが、本発明では、分散液に含有量が０．００１ｗｔ％以上の界面活性剤を添加し、この界面活性剤に緩衝材としての機能を発揮させている。そのため、かかる方法で分散液を攪拌した場合であっても、抗体認識部位における認識能の低下を確実に防止または抑制することができる。
【００１７】
（３）  前記反転運動は、前記分散液を収納した前記容器を、円板状をなす板材の外周面に、前記容器の軸が前記板材のほぼ中心を通るように配置し、前記板材を前記中心で回転させることにより行われる上記（２）に記載の抗原付着担体の製造方法。
【００１８】
かかる方法によれば、容器の上下が反転する反転運動を、容器に対して確実に付与することができる。
【００１９】
（４）  前記板材の鉛直方向に対する傾斜角度は、０〜７５°である上記（３）に記載の抗原付着担体の製造方法。
【００２０】
かかる範囲内に設定すれば、板材の中心での回転で、容器の上下を反転させることにより、容器内部の分散液を確実に攪拌することができる。
【００２１】
（５）  前記板材の回転速度は、１〜１００ｒｐｍである上記（３）または（４）に記載の抗原付着担体の製造方法。
【００２２】
回転速度をかかる範囲内に設定することにより、基材に対して抗原を確実に接触させることができ、基材に抗原が十分に担持された抗原付着担体を得ることができる。
【００２３】
（６）  前記抗原は、ウイルスである上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【００２４】
ウイルスが備える抗体認識部位が、容器の壁面や基材に抗原が直接衝突したり約３７度以上の温度条件に曝されることによりその認識能が容易に低下するほど不安定であるため、本発明で用いる抗原として好適である。
【００２５】
（７）  前記ウイルスは、その表面にエンベロープを備えるものである上記（６）に記載の抗原付着担体の製造方法。
【００２６】
エンベロープを有するウイルスは、エンベロープに不安定な抗体認識部位がより多く存在すると推察されるので、本発明で用いる抗原としてより好適である。
【００２７】
（８）  前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン系の界面活性剤である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【００２８】
ポリオキシエチレン系の界面活性剤は、特に、タンパク質等に対する作用が温和であることから、抗体認識部位に変性等を生じさせることなく、緩衝材としての機能を確実に発揮することができる。さらに、基材および抗原の分散性に優れることから、分散液中で基材および抗原を確実に分散させることができ、基材に抗原が均一に担持された抗原付着担体を得ることができる。
【００２９】
（９）  前記基材は、少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成されている上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【００３０】
リン酸カルシウム系化合物は、抗原と優れた親和性を有することから、基材の少なくとも表面付近をリン酸カルシウム系化合物で構成することにより、基材を抗原に対して優れた吸着能を有するものとすることができる。
【００３１】
（１０）  前記分散液中での前記界面活性剤の含有量は、０．０１〜０．１ｗｔ％である上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【００３２】
これにより、抗原認識部位そのものを界面活性剤により変性または変質させることなく、界面活性剤に緩衝材としての機能を確実に発揮させることができる。
【００３３】
（１１）  前記分散液中での前記抗原の濃度は、０．０１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【００３４】
かかる範囲内に設定することにより、基材に対して抗原が均一に担持された抗原付着担体を得ることができる。
【００３５】
（１２）  前記分散液中での前記基材の濃度は、０．００１〜２０００ｍｇ／ｍＬである上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【００３６】
かかる範囲内に設定することにより、基材に対して抗原が均一に担持された抗原付着担体を、十分な量で、分散液中に製造することができる。
【００３７】
（１３）  前記分散液中で前記基材に前記抗原を担持させる時間は、１分〜２４時間である上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
これにより、十分な量の抗原が基材に担持された抗原付着担体を得ることができる。
【００３８】
（１４）  前記分散液中で前記基材に前記抗原を担持させる際の前記分散液の温度は、５０℃以下である上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【００３９】
これにより基材に対する抗原の担持がより円滑に行われるようになり、抗原を担体により確実に担持させることができる。
【００４０】
（１５）  前記抗原を前記基材に担持した後に、前記基材の前記抗原が付着していない領域に、抗体との相互作用が前記基材より低いタンパク質を主材料として構成される被覆層を形成する上記（１）ないし（１４）のいずれかに記載の抗原付着担体の製造方法。
【００４１】
これにより、抗原が備える抗体認識部位を認識する抗体が抗体認識部位に特異的に結合する際に、この特異的に結合する抗体以外の抗体が基材に非特異的に結合してしまうのを好適に防止することができる。
【００４２】
（１６）  前記被覆層は、前記界面活性剤が含まれるように形成される上記（１５）に記載の抗原付着担体の製造方法。
【００４３】
これにより、被覆層としての機能が向上して、検体中の抗体が非特異的に基材または被覆層に結合してしまうのをより確実に防止することができる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明によれば、基材と抗原とを含む分散液を攪拌して、担体に抗原を担持させる際に、分散液中には、これらの他に含有量が０．００１ｗｔ％以上の界面活性剤が含まれているので、抗原が備える抗体認識部位の認識能の前記分散液の攪拌や温度による刺激による低下を招くことなく、担体に抗原が担持された抗原付着担体を製造することができる。
【００４５】
また、界面活性剤として、ポリオキシエチレン系の界面活性剤を用いることにより、抗体認識部位に変性等を生じさせることなく、緩衝材としての機能を確実に発揮させることができ、さらに、分散液中で基材および抗原を確実に分散させることができるため、優れた抗体認識能が保持された状態の抗原が、基材に均一に担持された抗原付着担体を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
以下、本発明の抗原付着担体の製造方法について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００４７】
なお、以下では、担体（基材）として、少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された粒状のものを用いる場合を代表に説明する。
【００４８】
本発明の抗原付着担体の製造方法で製造される抗原付着担体は、本実施形態では、表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体（基材）と、担体の表面に担持された抗原と、抗原が担持されていない担体の表面を被覆する被覆層とを有している。
【００４９】
かかる構成の抗原付着担体３１は、本発明の抗原付着担体の製造方法を用いて、例えば、次のようにして製造される。
【００５０】
本実施形態の抗原付着担体の製造方法では、［１Ａ］少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体を用意する工程と、［２Ａ］担体に抗原を担持させる工程と、［３Ａ］抗原が担持された担体を洗浄する工程と、［４Ａ］担体に被覆層を形成する工程と、［５Ａ］被覆層が形成された担体を洗浄する工程とを有する。
【００５１】
以下、各工程について順次説明する。
［１Ａ］  まず、少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体（基材）を用意する
リン酸カルシウム系化合物は、抗原と優れた親和性を有することから、担体の少なくとも表面付近をリン酸カルシウム系化合物で構成することにより、担体を抗原に対して優れた吸着能を有するものとすることができる。
【００５２】
このような担体としては、例えば、リン酸カルシウム系化合物で構成されたもの、樹脂、セラミックス等で構成された母材の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆したもの等が挙げられる。
【００５３】
これらの中でも、担体としては、母材の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆したものが好適である。このような担体を用いると、次のようなＩ〜IIIのような利点がある。
【００５４】
Ｉ：このような担体は、その密度を、後述する抗体の検出方法において、抗原付着担体３１が備える抗原を特異抗体２２が認識する際に最適な大きさのものに調製することが容易となる。
【００５５】
II：また、このような担体では、母材に対して、リン酸カルシウム系化合物を被覆する前、または、担体の製造後に、染料または顔料等の色素で着色（染色）することが可能である。したがって、母材に着色を施すことにより、抗原付着担体３１の視認性を確実に高めることができる。
【００５６】
III：さらに、後述するように、本発明で得られる抗原付着担体３１は、その表面が比較的滑らかなもの、すなわち緻密体で構成されているのが好ましいが、母材の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆することにより、担体表面を平滑にすることが比較的容易となる。
【００５７】
かかる構成の担体は、例えば、リン酸カルシウム系化合物の多孔質粒子（以下、「リン酸カルシウム系化合物粒子」と言う。）を母材に衝突させることにより、得ることができる。これにより、リン酸カルシウム系化合物粒子は、母材に衝突した際に、破砕されて比較的小さい粒径の粒子となり、この状態で母材表面を被覆することになる。その結果、担体の表面付近を、容易かつ確実に緻密質とすることができる。
【００５８】
また、かかる観点からは、リン酸カルシウム系化合物粒子は、一次粒子を凝集結合させることにより製造されたものを用いるのが好ましい。このようなリン酸カルシウム系化合物粒子は、母材に衝突した際に、より小さい粒径の粒子となるので、担体の表面付近を、より容易かつ確実に緻密質とすることができる。
【００５９】
担体の形状は、特に限定されず、例えば、球状、偏平形状等とすることができる。担体が球状をなしていると、抗原を高い均一性で担体に吸着（固相化）させることが容易となる。
【００６０】
なお、担体が球状をなす場合、その平均粒径は、１〜１００μｍ程度であることが好ましく、３〜２０μｍ程度であることがより好ましい。平均粒径をかかる範囲内とすることにより、抗原の高い担持能が得られるようになる。
【００６１】
また、担体の密度は、０．７〜４．０ｇ／ｃｍ３程度とすることが好ましく、０．９〜３．５ｇ／ｃｍ３程度とすることがより好ましい。これにより、抗原付着担体３１は、後述する抗体の検出方法において、分散液２００中で抗原付着担体３１が備える抗原を特異抗体２２が認識できるようになる。特に、密度を後者の範囲内とすると、このような効果が顕著に得られる。
【００６２】
また、このような担体は、その表面付近が緻密質または多孔質のいずれであってもよいが、特に、緻密質、すなわち、表面が比較的滑らかなものであるのが好ましい。これにより、各抗原を、ほぼ等しい距離離間した状態で、担体の表面に吸着させることができる。すなわち、担体表面の形状に依存する各抗原に対する立体的な制約を低減させることができる。その結果、分散液２００中の抗原付着担体３１が特異抗体２２により確実に認識されるようになる。
【００６３】
なお、母材の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆した担体を用いる場合には、リン酸カルシウム系化合物の被覆層を緻密質とすればよい。
【００６４】
また、リン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０の各種化合物を用いることができ、例えば、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＣａＨＰＯ４等のうちの１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００６５】
これらの中でも、リン酸カルシウム化合物は、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）を主成分とするものが最適である。ハイドロキシアパタイトは、抗原の吸着能が特に優れている。
【００６６】
なお、これらのリン酸カルシウム系化合物は、公知の湿式合成法、乾式合成法等により合成することができる。
【００６７】
また、この場合、リン酸カルシウム系化合物中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００６８】
［２Ａ］  次に、少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体に、抗原を担持させる。
【００６９】
本発明では、この担体に抗原を担持させる工程に特徴を有し、具体的には、担体と、抗原と、含有量が０．００１ｗｔ％以上の界面活性剤とを含有する分散液を用意し、この分散液を攪拌しつつ、分散液中で担体に抗原を担持させる点に特徴を有する。
【００７０】
すなわち、基材と抗原とを含む分散液を攪拌して、担体に抗原を担持させる際に、分散液中に、これらの他に含有量が０．００１ｗｔ％以上の界面活性剤を共存させる点に特徴を有する。
【００７１】
ここで、担体に抗原を担持させるために、分散液中に界面活性剤を添加することなく、担体と抗原とを含有する分散液を攪拌すると、分散液を収納する容器の壁面や担体に直接衝突すること等に起因して、抗原が備える抗体認識部位の認識能が低下するという問題がある。
【００７２】
これに対して、本願発明では、分散液中に基材と抗原との他に、さらに界面活性剤が含まれ、その含有量を０．００１ｗｔ％以上としている。このため、分散液を攪拌して、担体に抗原を担持させる際に、この界面活性剤に緩衝材としての機能を発揮させることができ、容器の壁面や担体に抗原が直接衝突すること等に起因する抗体認識部位の認識能の低下を的確に抑制または防止することができる。さらに、分散液中に界面活性剤が含まれることにより、担体および抗原の双方の分散液中での分散性が向上するため、担体と抗原との間での接触機会が増大し、抗原がより均一に担体に担持された抗原付着担体が得られるという利点もある。
【００７３】
そして、このように担体に抗原が直接衝突するのが低減され、かつ担体および抗原の分散性が向上した状態で、抗原が担体に接触することとなり、担体の表面の構成材料と抗原との親和性の大きさに基づいて、抗原が担体の表面に担持される（吸着する）。
【００７４】
ここで、本実施形態では、担体の少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成されているので、担体の表面に抗原が強固に担持される。
【００７５】
なお、上記のような抗体認識部位における認識能の低下は、抗原としてウイルスを選択したときに顕著に認められると推察される。これは、ウイルスが備える抗体認識部位が容器の壁面や担体に抗原が直接衝突することによりその認識能が容易に低下するほど、不安定であることに起因すると考えられる。
【００７６】
さらに、ウイルスの中でもエンベロープを有するウイルスは、エンベロープにこのような不安定な抗体認識部位がより多く存在すると推察されるので、本発明の抗原付着担体の製造方法に用いられる抗原として好適に適用される。
【００７７】
担体に担持させる抗原としては、後述する検体の検出方法において、検体１００中から検出する特異抗体２２（検査対象物）が特異的に結合（認識）する抗体認識部位を有するものが選択される。
【００７８】
具体的には、例えば、バクテリア細胞、植物細胞、動物細胞等の各種細胞や、デングウイルスおよび日本脳炎ウイルスが属するフラビウイルス科、インフルエンザウイルスが属するオルトミクソウイルス科、風疹ウイルスが属するトガウイルス科、麻疹ウイルスおよびムンプスウイルスが属するパラミクソウイルス科のウイルスのようなエンベロープを有するウイルスならびにパピロマーウイルスが属するパピロマーウイルス科、レオウイルスおよびロタウイルスが属するレオウイルス科のウイルスのようなエンベロープを有さないウイルス等のウイルスが挙げられる。
【００７９】
界面活性剤としては、分散液の攪拌の際に、容器の壁面や担体に抗原が直接衝突するのを防止する緩衝材としての機能を発揮し得るものであればよく、非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤のいずれであってもよいが、非イオン性界面活性剤であるのが好ましい。非イオン性界面活性剤は、イオン性界面活性剤と比較して、タンパク質等に対する作用が温和であることから、抗体認識部位に変性等を生じさせることなく、緩衝材としての機能を確実に発揮することができる。
【００８０】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−α−Ｄ−グルコピラノシドのようなアルキルグルコシド系非イオン界面活性剤、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＥＷＷＮ２０）、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＷＥＥＮ４０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＷＥＥＮ６０）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＥＷＷＮ８０）のようなポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらの中でも、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤は、上述した非イオン性界面活性剤としての特性が特に優れることから、界面活性剤としてより好ましく用いられる。さらに、担体および抗原の分散性に優れることから、０．００１ｗｔ％程度の比較的少量の含有量でも、分散液中で担体および抗原を確実に分散させることができ、担体に抗原が均一に担持された抗原付着担体を得ることができる。
【００８１】
分散媒としては、等張液（細胞やウイルス内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）が好適である。これにより、分散液が抗原に接触した際における、抗原内の浸透圧の違いによる抗原の破壊を防止することができる。
【００８２】
この等張液には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ液（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）、Ｌｏｃｋｅ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｔｙｒｏｄｅ液、Ｅａｒｌｅ液、Ｋｒｅｂｓ液、生理食塩水等を用いることができる。
【００８３】
分散液を攪拌する方法としては、特に限定されないが、例えば、Ｉ）分散液を渦巻き運動させる方法、II）分散液に振動を付与する方法、III）密閉空間が形成される容器内に分散液を収納し、この容器の上下が反転する反転運動を行う方法等が挙げられ、これらの中でも、特に、III）の方法であるのが好ましい。
【００８４】
III）の方法であれば、容器の上下が反転する反転運動により、分散液内に担体をより均一に分散させることができるため、抗原の担体に対する接触機会の均一化を図ることができる。その結果、各担体に均一に抗原が担持された抗原付着担体３１を得ることができる。さらに、III）の方法では、容器の上下が反転する反転運動により、容器の壁面に抗原が衝突する機会が増大するが、本発明では、分散液に界面活性剤を添加し、この界面活性剤に緩衝材としての機能を発揮させているため、かかる方法で分散液を攪拌する場合に本発明が好適に適用される。
【００８５】
このような容器の上下が反転する反転運動は、例えば、以下のような方法により行うことができる。
【００８６】
まず、マイクロチューブ、遠心管またはバイアルのような密閉空間が形成される容器内に分散液を収納する。そして、円板状をなす板材を用意し、この板材の外周面に、分散液を収納した容器の軸が板材のほぼ中心を通るように配置した後、この板材の中心で板材を回転させることにより行うことができる。
【００８７】
また、板材の鉛直方向に対する傾斜角度は、特に限定されず、例えば、０〜７５°程度であるのが好ましく、０〜４５°程度であるのがより好ましい。傾斜角度をかかる範囲内に設定すれば、板材の中心での回転で、容器の上下を反転させることにより、容器内部の分散液を確実に攪拌することができる。
【００８８】
さらに、板材の回転速度は、１〜１００ｒｐｍ程度であるのが好ましく、５〜８０ｒｐｍ程度であるのがより好ましい。この回転速度が遅過ぎると、抗原の担体に対する接触機会が少なくなり、担体に抗原が十分に担持されないおそれがあり、一方、この回転速度を前記上限値を超えて速くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、抗原認識部位の抗原認識能を低減させてしまうおそれがあり好ましくない。
【００８９】
分散液中における界面活性剤の含有量は、０．００１ｗｔ％以上であればよく、担持される抗原の種類によっても若干異なるが、０．０１〜０．１ｗｔ％程度であるのが好ましい。界面活性剤の含有量が低すぎると、抗原の衝突に対する緩衝材としての機能を十分に発揮させることができず、抗原の種類等によっては、抗体認識部位の認識能が低下してしまうおそれがある。また、界面活性剤の濃度を高くしても、それ以上の効果の増大が期待できないばかりか、抗原認識部位そのものを界面活性剤により変性または変質させてしまうおそれがあり好ましくない。
【００９０】
また、分散液中における抗原の濃度は、抗原の種類によっても若干異なるが、０．０１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ程度であるのが好ましく、０．２μｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ程度であるのがより好ましい。抗原の濃度が低過ぎると、本工程において抗原を担体に担持させる際に、担持される抗原の量が少なくなり過ぎるおそれがある。また、抗原の濃度が高過ぎると、それ以上の効果の増大が期待できないばかりか、担体に対する抗原の担持が均一に施されなくなるおそれがあり好ましくない。
【００９１】
さらに、分散液中における担体の濃度は、担体の種類によっても若干異なるが、０．００１〜２０００ｍｇ／ｍＬ程度であるのが好ましく、０．０１〜１０００ｍｇ／ｍＬ程度であるのがより好ましい。担体の濃度が低過ぎると、得られる抗原付着担体の量が少なくなり過ぎるおそれがある。また、担体の濃度が高過ぎると、担体に対する抗原の担持が均一に施されなくなるおそれがあり好ましくない。
【００９２】
分散液中で担体に抗原を担持させる時間は、１分〜１２時間程度であるのが好ましく、１０分〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、担体に対する抗原の担持が十分に行われないおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【００９３】
また、この際の分散液の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４０℃程度であるのがより好ましい。
【００９４】
また、分散液のｐＨは、４．５〜９．５程度とするのが好ましく、５．５〜８．５程度とするのがより好ましい。
【００９５】
分散液の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、担体に対する抗原の担持がより円滑に行われるようになり、抗原を担体により確実に担持させることができる。
【００９６】
［３Ａ］  次に、抗原が担持された担体を洗浄する。
具体的には、担体を洗浄液内に供給し、その後、洗浄液を穏やかに攪拌等することにより、洗浄液中に、担体に担持されなかった抗原を分散させる。そして、洗浄液中で担体を沈降させた後、抗原が洗浄液中に分散した状態で洗浄液を除去して廃棄することにより、担体を洗浄する。
【００９７】
本工程［３Ａ］で用いる洗浄液としては、各種のものが使用可能であるが、抗原に変性・変質が生じるのを防止するために、等張液が好適に用いられる。この等張液には、前記工程［２Ａ］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【００９８】
また、本工程［３Ａ］は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、担体に担持されなかった抗原をより確実に除去することができる。
【００９９】
この場合、用いる洗浄液は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【０１００】
なお、次工程［４Ａ］において担体に形成する被覆層を、界面活性剤を含有する構成とする場合には、本工程を省略してもよい。また、これとは別に、本工程に用いる洗浄液を、界面活性剤を含有するものとすることによっても、次工程［４Ａ］において形成する被覆層を、界面活性剤を含有するものとすることができる。
【０１０１】
［４Ａ］  次に、担体の抗原が付着していない領域の少なくとも一部（より好ましくは、ほぼ全て）に、抗体との相互作用が担体の表面よりも低いタンパク質を主材料として構成される被覆層を形成する。
【０１０２】
かかる構成の被覆層は、例えば、表面に抗原が担持された担体に、抗体との相互作用が担体の表面より低いタンパク質を含む処理液を接触させる処理により形成される。
【０１０３】
具体的には、抗体との相互作用が担体の表面より低いタンパク質を含む処理液内に、表面に抗原が担持された担体を浸漬し、その後、この処理液を攪拌等する。これにより、このタンパク質が担体の抗原が付着していない領域に接触して担持される。これにより、抗体との相互作用が担体の表面より低いタンパク質を主材料として構成される被覆層が形成される。
【０１０４】
なお、ここで言う「抗体」とは、後述する検体１００中に含有され、抗原を認識する特異抗体２２の他、特異抗体２２以外の複数種の抗体２３を含み、一般的な抗体のことを指し、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＡの何れであってもよい。また、「抗体との相互作用が担体の表面より低いタンパク質」とは、抗体を担持（吸着）する能力、抗体と結合する能力等が無いか、極めて低いタンパク質のことを言う。
【０１０５】
このような被覆層を備える構成とすれば、抗原が備える抗体認識部位を認識する特異抗体２２が抗体認識部位に特異的に結合（認識）する際に、この特異抗体２２以外の抗体２３が担体の表面に非特異的に結合（吸着）してしまうのを好適に防止することができる。
【０１０６】
このようなタンパク質としては、例えば、カゼイン、ビテリン、ホスビチン、シトクロムｃ、トランスフェリンのような金属タンパク質、アルブミンおよびミオグロビン等が挙げられる。これらの中でも、タンパク質としては、カゼインおよびアルブミンのうちの少なくとも１種を用いるのが好ましい。これらのタンパク質は、担体の少なくとも表面の構成材料であるリン酸カルシウム系化合物への吸着能に優れている。さらに、これらの中でも、タンパク質としては、カゼインが最適である。カゼインは、リン酸カルシウム系化合物への吸着能に優れ、かつ、抗体との相互作用が極めて低い。
【０１０７】
また、被覆層には、その構成材料として、界面活性剤が含まれているのが好ましい。これにより、被覆層としての機能が向上して、後述する検出方法において、検体１００中の特異抗体以外の抗体２３が非特異的に担体の表面または被覆層に結合してしまうのをより確実に防止することができる。このような界面活性剤を含有する被覆層は、前記工程［３Ａ］を省略するか、前記工程［３Ａ］に用いられる洗浄液を、界面活性剤を含有するものとすればよい。
【０１０８】
処理液中における抗体との相互作用が担体の表面より低いタンパク質の濃度は、特に限定されないが、１００〜５０００ｍｇ／ｍＬ程度であるのが好ましく、５００〜２０００ｍｇ／ｍＬ程度であるのがより好ましい。タンパク質の濃度が低く過ぎると、タンパク質の種類等によっては、担体の表面を十分に被覆できない場合があり、一方、タンパク質の濃度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、タンパク質の種類によっては、抗原をも被覆層で被覆してしまうおそれがある。
【０１０９】
また、タンパク質を溶解する溶媒としては、例えば、前記工程［２Ａ］で説明した分散媒と同様の等張液が好適である。
【０１１０】
この処理液による処理時間は、１分〜１２０時間程度であるのが好ましく、１０分〜２４時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、被覆層の形成が十分に行われないおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、抗原をも被覆層で被覆してしまうおそれがあり好ましくない。
【０１１１】
また、この際（被覆層形成時）の処理液の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４０℃程度であるのがより好ましい。
【０１１２】
また、処理液のｐＨは、４．５〜９．５程度とするのが好ましく、５．５〜８．５程度とするのがより好ましい。
【０１１３】
処理液の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、タンパク質の担体の表面への担持がより円滑に行われるようになり、被覆層を確実に形成することができる。
【０１１４】
［５Ａ］  次に、抗原が担持されていない領域に被覆層が形成された抗原付着担体３１を洗浄する。
【０１１５】
具体的には、前記工程［３Ａ］と同様にして、抗原付着担体３１を洗浄液内に供給し、その後、洗浄液を穏やかに攪拌等することにより、洗浄液中に、抗原付着担体３１に担持されなかった抗原を分散させる。そして、洗浄液中で担体を沈降させた後、抗原が洗浄液中に分散した状態で洗浄液を除去して廃棄することにより、抗原付着担体３１を洗浄する。
【０１１６】
本工程［５Ａ］で用いる洗浄液としては、各種のものが使用可能であるが、前記工程［３Ａ］で説明したのと同様の理由により、等張液が好適に用いられる。
【０１１７】
また、この等張液には、前記工程［２Ａ］で説明したのと同様のものが挙げられる。
さらに、本工程［５Ａ］は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。
これにより、担体に吸着されなかったタンパク質をより確実に除去することができる。
【０１１８】
この場合、用いる洗浄液は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【０１１９】
なお、担体に担持されないタンパク質が含まれていたとしてもごく微量である場合には、本工程を省略することもできる。
以上のような工程を経て、抗原付着担体３１が製造される。
【０１２０】
なお、本実施形態では、担体としては、少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成されているものを代表に説明したが、このような担体に限定されず、抗原をその表面に担持し得る機能を有していればよく、例えば、少なくとも表面が、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル等の樹脂材料で構成されるものであってもよい。
【０１２１】
次に、上述した本発明の抗原付着担体の製造方法で得られた抗原付着担体を用いて、検体中の抗体を検出する抗体の検出方法について説明する。
【０１２２】
図１は、本発明の抗原付着担体の製造方法で得られた抗原付着担体を用いて、検体中の抗体を検出する抗体の検出方法を説明するための縦断面図である。
【０１２３】
本実施形態の抗体の検出方法は、［１Ｂ］非特異的に特異抗体を認識する非特異抗体が底面に担持されたウェルを備えるマイクロプレートを用意する工程と、［２Ｂ］検出すべき特異抗体を含有する検体をウェル内に供給する工程と、［３Ｂ］ウェル内を洗浄する工程と、［４Ｂ］抗原付着担体を含有する分散液をウェル内に供給する工程とを有する。
【０１２４】
以下、各工程について順次説明する。
［１Ｂ］  まず、ウェル１２の底面に、非特異的に特異抗体２２を認識する非特異抗体２１が担持されたマイクロプレート１１を用意する。
【０１２５】
［１Ｂ−１］  まず、マイクロプレート１１を用意し、このマイクロプレート１１が備えるウェル１２の底面に、非特異抗体２１を担持させる（図１（ａ）参照）。
【０１２６】
なお、本実施形態では、このウェル１２の底面は、その縦断面形状がほぼＶ字状をなしている。
【０１２７】
また、マイクロプレート１１の構成材料としては、非特異抗体２１に対して高い親和性を示すものであれば特に限定されず、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル等の樹脂材料が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１２８】
かかる構成のウェル１２の底面に非特異抗体２１を担持させる場合、非特異抗体２１を含有する処理液を、ウェル１２内に供給する。これにより、ウェル１２の底面に非特異抗体２１が接触するため、マイクロプレート１１の構成材料と非特異抗体２１との親和性の大きさに基づいて、非特異抗体２１がウェル１２の底面に担持される（吸着する）。
【０１２９】
ここで、マイクロプレート１１は、非特異抗体２１に対して高い親和性を示す構成材料で構成されているので、ウェル１２の底面に非特異抗体２１が強固に担持される。
【０１３０】
処理液を調製する際に用いる溶媒としては、等張液が好適である。これにより、分散媒が非特異抗体２１に接触した際における、非特異抗体２１の変性・変質等を防止することができる。
【０１３１】
この等張液には、前記工程［２Ａ］で説明したのと同様のものが挙げられる。
この処理液をマイクロプレート１１に接触させる時間は、１分〜２４時間程度であるのが好ましく、１０分〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、ウェル１２の底面に付着する非特異抗体２１の数が少なくなり、検体１００中に含まれる特異抗体２２を検出する際に、この特異抗体２２を検出できるだけの量を、非特異抗体２１で十分に認識できなくなるおそれがある。一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【０１３２】
また、この際（処理時）の処理液の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４０℃程度であるのがより好ましい。処理時の処理液の温度が低く過ぎると、非特異抗体２１の種類等によっては、ウェル１２の底面に非特異抗体２１を効率よく付着させることができないおそれがある。一方、処理時の被処理液の温度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、非特異抗体２１が変性・変質して、非特異抗体２１が検体１００中の抗体を認識する認識能が低下してしまうおそれがある。
【０１３３】
［１Ｂ−２］  次いで、非特異抗体２１が担持されたマイクロプレート１１を洗浄する。
【０１３４】
具体的には、ウェル１２内に洗浄液を供給する。供給時の水流により、洗浄液中に、ウェル１２に担持されなかった非特異抗体２１を分散させる。そして、非特異抗体２１が洗浄液中に分散した状態で除去して廃棄することにより、ウェル１２内を洗浄する。
【０１３５】
本工程［１Ｂ−２］で用いる洗浄液としては、各種のものが使用可能であるが、非特異抗体２１に変性・変質が生じるのを防止するために、等張液が好適に用いられる。この等張液には、前記工程［２Ａ］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【０１３６】
また、本工程［１Ｂ−２］は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、ウェル１２に担持されなかった非特異抗体２１をより確実に除去することができる。
【０１３７】
この場合、用いる洗浄液は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【０１３８】
［１Ｂ−３］  次いで、ウェル１２内の非特異抗体２１が付着していない領域の少なくとも一部、より好ましくは、ほぼ全てに、次工程以降でウェル１２内に供給する抗体（特異抗体２２、特異抗体以外の抗体２３等のうち特に特異抗体２２）との相互作用がウェル１２の内面よりも低いタンパク質を主材料として構成される被覆層４１を形成する。
【０１３９】
かかる構成の被覆層４１は、例えば、ウェル１２の底面に非特異抗体２１が担持されたマイクロプレート１１のウェル１２内に、抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質を含む処理液を供給する処理により形成される。
【０１４０】
具体的には、ウェル１２内に抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質を含む処理液を供給し、その後、この処理液を攪拌等する。これにより、このタンパク質がウェル１２内の非特異抗体２１が付着していない領域に接触して担持される。その結果、抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質を主材料として構成される被覆層４１が形成される。
【０１４１】
なお、ここで言う「抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質」とは、抗体を担持（吸着）する能力、次工程以降でウェル１２内に供給する抗体と結合する能力等が無いか、極めて低いタンパク質のことを言う。
【０１４２】
このような被覆層４１を備える構成とすれば、次工程以降に、ウェル１２内に供給する、特異抗体２２および特異抗体以外の抗体２３等の抗体（特に、特異抗体２２）がウェル１２の内面に非特異的に結合（吸着）してしまうのを好適に防止することができる。
【０１４３】
このようなタンパク質としては、前記工程［３Ａ］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【０１４４】
処理液中におけるタンパク質濃度は、特に限定されないが、１００〜５０００ｍｇ／ｍＬ程度であるのが好ましく、５００〜２０００ｍｇ／ｍＬ程度であるのがより好ましい。タンパク質の濃度が低く過ぎると、タンパク質の種類等によっては、ウェル１２の内面を十分に被覆できない場合があり、一方、タンパク質の濃度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、タンパク質の種類によっては、非特異抗体２１をも被覆層４１で被覆してしまうおそれがある。
【０１４５】
また、処理液を調製する際に用いる溶媒としては、例えば、前記工程［２Ａ］で説明した分散媒と同様の等張液が好適である。
【０１４６】
この処理液による処理時間は、１分〜２４時間程度であるのが好ましく、１０分〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、被覆層４１の形成が十分に行われないおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、非特異抗体２１をも被覆層４１で被覆してしまうおそれがあり好ましくない。
【０１４７】
また、この際（被覆層４１形成時）の処理液の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４０℃程度であるのがより好ましい。
【０１４８】
また、処理液のｐＨは、４．５〜９．５程度とするのが好ましく、５．５〜８．５程度とするのがより好ましい。
【０１４９】
処理液の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、タンパク質のウェル１２の内面への担持がより円滑に行われるようになり、被覆層４１を確実に形成することができる。
【０１５０】
［１Ｂ−４］  次いで、非特異抗体２１が担持されていない領域に被覆層４１が形成されたマイクロプレート１１のウェル１２内を洗浄する。
これにより、ウェル１２に吸着されなかったタンパク質を除去する。
【０１５１】
ウェル１２内を洗浄する方法としては、前記工程［１Ｂ−２］で説明したのと同様の方法が用いられる。
【０１５２】
なお、ウェル１２に担持されないタンパク質が含まれていたとしてもごく微量である場合には、本工程を省略することもできる。
【０１５３】
以上のような工程を経て、縦断面形状がほぼＶ字状をなすウェル１２の底面に非特異抗体２１が担持されたマイクロプレート１１が得られる。
【０１５４】
なお、ウェル１２の底面は、その縦断面形状がほぼＶ字状をなす場合に限定されず、収斂形状をなしていれば良く、例えば、ほぼＵ字状をなすものであってもよい。
【０１５５】
［２Ｂ］  次に、検出すべき特異抗体２２を含有する検体１００を調製した後、この検体１００をウェル１２内に供給する。
【０１５６】
これにより、非特異抗体２１に検体１００が接触して、図１（ｂ）に示すように、検体１００中に含まれる特異抗体２２およびこの特異抗体以外の抗体２３が、非特異抗体２１に非特異的に認識される。（第２の工程）。
【０１５７】
［２Ｂ−１］  まず、検出すべき特異抗体２２を含有する検体１００を用意する。
検体１００としては、上述した抗原付着担体３１に担持される抗原が有する抗体認識部位を特異的に認識する特異抗体２２が含まれているか否かを判定するべきもの、すなわち感染が成立しているか否かを判定すべきものが用意され、例えば、血液、リンパ液、唾液、尿等の体液、または当該体液対して希釈や、遠心分離による固体物の除去等の処理が施されたものが用いられる。
【０１５８】
なお、検体１００として、体液の希釈物を用いる場合、体液を希釈するための希釈液としては、等張液が好適に用いられ、この等張液としては、前記工程［２Ａ］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【０１５９】
［２Ｂ−２］  次に、前記工程［２Ｂ−１］で調製した検体１００を、ウェル１２内に供給する。
【０１６０】
これにより、非特異抗体２１に検体１００が接触する。このとき、検体１００中に、特異抗体２２が含まれていると、非特異抗体２１に特異抗体２２が非特異的に認識される。さらに、検体１００中には、通常、この特異抗体以外の抗体２３が含まれているが、非特異抗体２１は、抗体を非特異的に認識するため、この特異抗体以外の抗体２３も、特異抗体２２と同様に、非特異抗体２１に認識される。
【０１６１】
その結果、ウェル１２の底面に、検体１００中に含まれる特異抗体２２および特異抗体以外の抗体２３の双方が非特異抗体２１を介して担持（吸着）される。
【０１６２】
この検体１００をウェル１２内に留置しておく時間は、１分〜２４時間程度であるのが好ましく、１０分〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、非特異抗体２１が認識する特異抗体２２の数が少なくなるおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【０１６３】
また、この際（処理時）の検体１００の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４０℃程度であるのがより好ましい。
【０１６４】
また、検体１００のｐＨは、４．５〜９．５程度とするのが好ましく、５．５〜８．０程度とするのがより好ましい。
【０１６５】
検体１００の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、検体１００中に含まれる特異抗体２２および特異抗体以外の抗体２３を非特異抗体２１がより迅速かつ確実に認識するようになる。
【０１６６】
［３Ｂ］  次に、マイクロプレート１１が備えるウェル１２内を洗浄する。
これにより、検体１００中に含まれる抗体のうち、非特異抗体２１が認識しなかった抗体（特異抗体２２および特異抗体以外の抗体２３）が、ウェル１２外に廃棄される。
【０１６７】
ウェル１２内を洗浄する方法としては、前記工程［１Ｂ−２］で説明したのと同様の方法が用いられる。
【０１６８】
なお、ウェル１２に非特異抗体２１が認識しなかった抗体（特異抗体２２および特異固体以外の抗体２３）が含まれていたとしてもごく微量である場合には、本工程を省略することもできる。
【０１６９】
［４Ｂ］  次に、本発明の抗原付着担体の製造方法で製造した抗原付着担体３１を含有する分散液２００をウェル１２内に供給する。
【０１７０】
これにより、図１（ｃ）に示すように、分散液２００に含まれる抗原付着担体３１を特異抗体２２に特異的に認識させる（第３の工程）。
【０１７１】
ここで、本実施形態では、前述のようにウェル１２の底面の縦断面形状がほぼＶ字状をなしているが、特異抗体２２が非特異抗体２１を介してウェル１２に担持されている場合（検体１００が陽性検体である場合）、非特異抗体２１と特異抗体２２とを介して、ウェル１２の底面に抗原付着担体３１が担持（吸着）されることとなるため、抗原付着担体３１は、ウェル１２の底面に対してほぼ均一に担持されることとなる。その結果、抗原付着担体３１として着色したものを用いると、ウェル１２内の分散液２００が全体的に若干着色された状態が目視にて観察される。
【０１７２】
これに対して、特異抗体２２が非特異抗体２１を介してウェル１２に担持されていない場合（検体１００が陰性検体である場合）、抗原付着担体３１は、抗原に対して非特異的な抗体２３に接触したとしても、認識されることはない。そのため、ウェル１２の底部に沿って下方に移動（沈降）し、その頂部（底部の中心部）に集積（凝集）する。その結果、この頂部に集積された抗原付着担体３１が目視にて鮮明なスポットとして観察される。
【０１７３】
以上のように、本発明の抗原付着担体の製造方法で製造された抗原付着担体３１を用いれば、比較的簡単な工程で、検体１００中での特異抗体２２の有無を目視にて観察することができる。
【０１７４】
なお、このように抗原付着担体を着色して検体中での特異抗体２２の有無を目視にて観察する場合の他、例えば、蛍光物質や放射性（ＲＩ）物質を抗原付着担体に担持させてこれらの動きを観察するようにしてもよい。
【０１７５】
以上、本発明の抗原付着担体の製造方法を、図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１７６】
例えば、本発明の抗原付着担体の製造方法では、必要に応じて、１以上の任意の目的の工程を追加してもよい。
【実施例】
【０１７７】
・抗原を界面活性剤との共存下で攪拌した場合の検討
＜１＞  まず、抗原として不活化したデング１型、２型、３型、および４型の４種の抗原を等量混合し、ＰＢＳにて１８６μｇ／ｍｌに調整した溶液（デングＭＩＸと称する）を用意し、このデングＭＩＸに含まれる抗原の含有量が５μｇ／ｍＬとなるように、１．０２７ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を用いて希釈することにより、デングＭＩＸ抗原含有量が５μｇ／ｍＬで、ＴＷＥＥＮ２０含有量が１ｗｔ％の抗原含有液を得た。
【０１７８】
＜２＞  次に、ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液に含まれるＴＷＥＥＮ２０の含有量が、０．１０２７ｗｔ％、０．０１０２７ｗｔ％、０．００１０２７ｗｔ％および０．０００１０２７ｗｔ％のものを用いた以外は、前記工程＜１＞と同様にして、デングＭＩＸ抗原含有量が５μｇ／ｍＬで、ＴＷＥＥＮ２０含有量が、それぞれ、０．１ｗｔ％、０．０１ｗｔ％、０．００１ｗｔ％、０．０００１ｗｔ％の抗原含有液を得た。
【０１７９】
また、ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液に代えてＴＷＥＥＮ２０を含有しないＰＢＳ溶液を用いた以外は、前記工程＜１＞と同様にして、デングＭＩＸ抗原含有量が５μｇ／ｍＬで、ＴＷＥＥＮ２０含有量が０ｗｔ％の抗原含有液を得た。
【０１８０】
＜３＞  次に、これらＴＷＥＥＮ２０含有量が、それぞれ、１ｗｔ％、０．１ｗｔ％、０．０１ｗｔ％、０．００１ｗｔ％、０．０００１ｗｔ％、０ｗｔ％の抗原含有液を濃度毎に５００μＬ×５本ずつマイクロチューブ中にサンプリングした。
【０１８１】
＜４＞  次に、５本ずつサンプリングした各ＴＷＥＥＮ２０濃度の抗原含有液を、それぞれ、表１に示す条件Ａ〜Ｅの条件下、すなわち、マイクロチューブを静置、または、マイクロチューブの上下が反転する反転運動を行い得るローテートによる攪拌を行う条件下に置いた後、さらに、４℃の条件下で静置した。
【０１８２】
【表１】
2010048631.tif 000002
【０１８３】
＜５＞  次に、図２に示すような、縦横８×１２＝９６個のウェルを備えるポリスチレン製の９６−ｗｅｌｌマイクロプレート（ベクトンデッキンソン社製）を用意した。
【０１８４】
なお、以下では、説明の便宜上、図２および表２に示すように、それぞれ、マイクロプレートの横の行をＡ〜Ｈレーンと言い、各レーンのウェルを左から順にナンバリングして、例えば、Ａレーンの左から３番目（ウェルＮｏ．３）のウェルをウェルＡ−３、Ｅレーンの左から５番目（ウェルＮｏ．５）のウェルをウェルＥ−５と言うこととする。
【０１８５】
【表２】
2010048631.tif 000003
【０１８６】
＜６＞  次に、各条件Ａ〜Ｅの条件下におかれた各ＴＷＥＥＮ２０濃度の抗原含有液を、表２に示すような位置、すなわちレーンＮｏ．Ａ〜ＥにはＴＷＥＥＮ２０濃度が０．１〜０ｗｔ％のものが、ウェルＮｏ．１〜５には条件Ａ〜Ｅのものが対応する位置に、それぞれ、４８μＬ／ｗｅｌｌずつアプライ（供給）した後、４℃の条件下で一晩、静置することにより、デングＭＩＸ抗原をウェル内に担持させた。
【０１８７】
＜７＞  次に、マイクロプレートの抗原が担持された各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内を、それぞれ、０．１ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を３００μＬずつ各ウェル内に供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液による各ウェルの洗浄を合計３回行った。
【０１８８】
＜８＞  次に、マイクロプレートの各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内に、それぞれ、１ｗｔ％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液を１００μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、各ウェル内の抗原が担持されていない領域に、ＢＳＡを吸着させて、主としてＢＳＡで構成される被覆層を形成した。
＜９＞  次に、前記工程＜７＞と同様にして各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内を洗浄した。
【０１８９】
＜１０＞  次に、抗原を認識する一次抗体を含む試薬として、αＤｅｎｇｕｅＭｉｘ−ＭＵをＰＢＳにより４０００倍希釈したものを用意した。
【０１９０】
なお、αＤｅｎｇｕｅＭｉｘ−ＭＵとは、Ｄｅｎｇｕ１型〜４型のウイルスを接種した数種類のマウスから得られた血清に含まれるＤｅｎｇｕ１型〜４型抗体の抗体価をそろえて混合したものであり、いずれも自社で調整した。
【０１９１】
＜１１＞  次に、マイクロプレートの各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内に、それぞれ、αＤｅｎｇｕｅＭｉｘ−ＭＵ（一次抗体）を含む試薬を５０μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、一次抗体にウェル内に担持された抗原を認識させた。
【０１９２】
＜１２＞  次に、前記工程＜７＞と同様にして各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内を洗浄した。
＜１３＞  次に、酵素標識された抗体（二次抗体）を含有する試薬として、ＰＯＤ標識αＭＵＩｇＧＦＣ（cat:64-6420 Zymed）をＰＢＳにより２０００倍希釈したものを用意した。
【０１９３】
＜１４＞  次に、マイクロプレートの各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内に、それぞれ、ＰＯＤ標識αＭＵＩｇＧＦＣ（二次抗体）を含む試薬を５０μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、二次抗体にウェル内に抗原を介して担持された一次抗体を認識させた。
【０１９４】
＜１５＞  次に、前記工程＜７＞と同様にして各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内を洗浄した。
＜１６＞  次に、マイクロプレートの各ウェルＡ−１〜Ｅ−５内に、それぞれ、ＰＯＤの基質であるＴＭＢを含む試薬を１００μＬずつ供給して９０秒間放置し、さらに１Ｎ・ＨＣｌを５０μＬずつ供給した後、各ウェル内の４５０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定した。
【０１９５】
なお、吸光度の測定は、吸光度測定装置（「GENios  Spectra FLUOR plus」、和光純薬社製）を用いて行った。
【０１９６】
測定された各ウェルでの吸光度と、抗原の処理条件との関係を図３に示す。
図３に示すように、界面活性剤の含有量が０．００１ｗｔ％未満の抗原含有液（比較例）では、静置の条件下（条件Ａ〜Ｃ）では、吸光度の低下を認めないものの、ローテートの条件下（条件ＤおよびＥ）では、吸光度が著しく低下した。
【０１９７】
これに対して、界面活性剤の含有量が０．００１ｗｔ％以上の抗原含有液（実施例）では、界面活性剤の含有量が０．００１ｗｔ％のときに、まず、比較例と比較して、ローテートの条件下（条件ＤおよびＥ）での吸光度の低下が低減される傾向を示した。そして、界面活性剤の含有量が０．０１ｗｔ％および０．１ｗｔ％のときには、この傾向がより顕著に認められ、静置の条件下（条件Ａ〜Ｃ）の吸光度とほぼ同等の値を示した。
【０１９８】
以上のことから、抗原を界面活性剤共存下で攪拌した場合（予備検討）では、マイクロチューブの上下が反転する反転運動すなわち攪拌により、抗原がマイクロチューブの壁面に衝突することに起因する、抗原の抗体認識部位における認識能の低下を、界面活性剤の含有量を０．００１ｗｔ％以上とすること、好ましくは０．０１ｗｔ％以上とすることにより、好適に低減し得ることが判った。
【０１９９】
また、この抗原を界面活性剤との共存下で攪拌した予備検討の結果を受けて、抗原と担体とを界面活性剤との共存下で攪拌した場合についても、同様の検討を行い、抗原がマイクロチューブの壁面に衝突することに起因する、抗体認識部位における認識能の低下の有無について確認したが、上記と同様の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】本発明の抗原付着担体の製造方法で得られた抗原付着担体を用いて、検体中の抗体を検出する抗体の検出方法を説明するための縦断面図である。
【図２】抗原が担持されるマイクロプレートを模式的に示す平面図である。
【図３】マイクロプレートの各ウェルで測定された吸光度と、抗原の処理条件との関係を示す図である。
【符号の説明】
【０２０１】
１１          マイクロプレート
１２          ウェル
２１          非特異抗体
２２          特異抗体
２３          特異抗体以外の抗体
３１          抗原付着担体
４１          被覆層
１００        検体
２００        分散液
【図１】
2010048631.tif 000004
【図２】
2010048631.tif 000005
【図３】
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