(57)【要約】【課題】、対象試料中の分析対象物を高感度に、かつ、手軽に測定することができる測定方法及びそれを用いた測定装置を提供する。【解決手段】前記従来の課題を解決するもので、分析対象物と反応した抗体量を二本鎖核酸に保持する多数の電子伝達体の量とし、抗体にヘリカーゼを修飾しておくことで、測定したい抗体量検出時の応答増幅が可能となり、対象試料中の分析対象物を簡便な方法で高感度に測定することが可能となる測定方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）二本鎖核酸を単鎖に遊離するスイッチ物質を結合した第一の特異結合物質に分析対象物を含む試料を接触させ、第一特異結合物質に前記分析対象物を結合させて、スイッチ物質−第一の特異結合物質−分析対象物の結合体を得る工程、
（Ｂ）第一の固定部に固定した第二の特異結合物質に前記試料を接触させ、前記結合体を第二の特異結合物質に結合させて、固定部に固定する工程、
（Ｃ）試料の移動方向に沿って前記第一の固定部よりも下流位置に標識物質をインターカレートした二本鎖核酸を固定化した第二の固定部があり、前記第一の固定部で固定されなかった第一の結合物質を含む溶液が第二の固定部に接触することで、第一の結合物質と結合しているスイッチ物質が二本鎖構造にインターカレートされていた標識物質が遊離する工程、
（Ｄ）前記遊離した標識物質を検出部で計測する工程、および
（Ｅ）前記検出部で検出した信号強度に基づいて、前記試料中の分析対象物を定量する工程
を有することを特長とする特異結合分析方法。
【請求項２】
更に、前記第一の特異結合物質、及び第二の特異結合物質が抗体であることを特長とする請求項１記載の特異結合分析方法。
【請求項３】
更に、前記スイッチ物質がヘリカーゼであることを特長とする請求項１記載の特異結合分析方法。
【請求項４】
更に、前記標識物質が電子伝達体と二本鎖核酸とインターカレートする構造から成り、前記検出部が少なくとも作用極及び対極から成る電極系を含むことを特長とする請求項１記載の特異結合分析方法。
【請求項５】
更に、前記標識物質に含まれる前記電子伝達体がフェロセンであることを特長とする請求項４記載の特異結合分析方法。
【請求項６】
試料を供給する試料供給口と、前記試料供給口より供給された試料を一時的に保持する空間形成部と、前記空間形成部に保持された第一の特異結合物質と、第二の特異結合物質を固定化した第一の固定化部と、標識物質をインターカレートした二本鎖核酸を固定化した第二の固定部と、前記標識物質を検出する検出部とを備えた特異結合分析センサ。
【請求項７】
請求項７記載の前記特異結合分析センサを到着する装着部と、装着された前記特異結合分析センサの検出部の信号強度から前記試料中の分析対象物を定量する演算部と、前記演算部で定量された結果を表示する表示部とを備えた特異結合分析デバイス。
【請求項８】
（Ａ）二本鎖核酸を単鎖に遊離するスイッチ物質を結合した第一の特異結合物質に分析対象物を含む試料を接触させ、第一特異結合物質に前記分析対象物を結合させて、スイッチ物質−第一の特異結合物質−分析対象物の結合体を得る工程、
（Ｂ）第一の固定部に固定した第二の特異結合物質に前記試料を接触させ、前記結合体を第二の特異結合物質に結合させて、固定部に固定する工程、
（Ｃ）試料の移動方向に沿って前記第一の固定部よりも下流位置に標識物質をインターカレートした二本鎖核酸を固定化した第二の固定部があり、前記第一の固定部で固定されなかった第一の結合物質を含む溶液が第二の固定部に接触することで、第一の結合物質と結合しているスイッチ物質が二本鎖構造にインターカレートされていた標識物質が遊離する工程、
（Ｄ）前記第二の固定部が検出部を兼ねており、第二の固定部で遊離した標識物質を計測する工程、
（Ｅ）前記検出部で検出した信号強度に基づいて、前記試料中の分析対象物を定量する工程
を有することを特長とする特異結合分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試料中の微量な分析対象物を高感度に測定するための測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康志向の高まりにより、病院内での専門家による臨床検査に加え、専門家ではなくとも在宅で簡便に検査を実施し、病期の予兆を捉えたいというニーズが高まっている。
【０００３】
病期の予兆を捉えるためには、測定する試料中に含まれる微量の分析対象物を正確に計測することが必要である。
【０００４】
このように、微量の分析対象物に対して、特異的に結合し分析する方法としては、抗原抗体反応を応用したイムノアッセイ、受容体を用いたレセプターアッセイ、及び相補的核酸配列のハイブリダイゼーションを用いた核酸プローブアッセイなどの多くの方法が知られており、その特異性の高さから、臨床検査をはじめとする広い分野で汎用されている。
【０００５】
更に、イムノアッセイの１ 種であるクロマトグラフ分析法においては、例えば、特異結合物質が不溶化ないし固定化された多孔性担体または微粒子充填型担体からなるマトリクスに液状試料を接触させ、液状試料がマトリクスに沿って毛細管現象による浸透力によって流出する現象を利用することにより試料中の分析対象物の存否を分析する。
【０００６】
具体的には、光学的方法などにより任意に検知できる標識材によって標識された特異結合物質と、分析対象物とを特異結合反応させる。そして、分析対象物と特異結合反応した特異結合物質をマトリクス上に固定化された結合材に結合させ、マトリクス上に固定された標識量に応じて、最終的に試料中の分析対象物の存否を分析する。このクロマトグラフ分析法は、マトリクスにおける担体の表面積が大きいため、多量の特異結合物質を不溶化させることができ、特異結合反応を引き起こしうる反応分子間の衝突頻度が液相中における反応の場合に比して大きいため、計測感度および計測時間の面から有利である。
【０００７】
また、在宅で簡便に測定を実施することが必要であることから、測定器の小型化や簡便な操作での測定が望まれている。上記に示したような光学的方法を用いた標識材を用いると、光学測定が可能な測定装置を用いなければならず、測定装置が大型化する。
【０００８】
近年、抗原抗体反応を応用したイムノアッセイにおいて電気化学的に測定することを目的とし、標識材として電気化学メディエーターを用いる方法が提案されている。例えば、対象となる分析対象物に特定的に結合する抗体に、電極で反応する電気化学メディエーターであるフェロセンを結合させる方法が開示されている（非特許文献１参照）。このように電気化学メディエーターを結合した抗体を用いると、測定装置の小型化、簡便測定が可能となり、特に在宅での測定で有利である。
【非特許文献１】Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 2051-2056、P2052 「2.2. Preparation of anti-human Hb IgG labeled with Fc-COOH」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記文献での抗体に結合した電気化学メディエーターは抗体に対して2.6個と少なく、分析対象物が微量しか存在しない場合、電気化学メディエーターの変化量が小さいことから、必要感度が得られない場合がある。また、抗体に対して多くの電気化学メディエーターを結合させると、抗体抗原反応に悪影響を及ぼし、測定感度が低下する場合がある。
【００１０】
そこで本発明は、前記従来の課題を解決するもので、対象試料中の分析対象物を高感度に、かつ、手軽に測定することができる測定方法及びそれを用いた測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記従来の課題を解決するために、本発明の特異結合分析方法は、
（Ａ）二本鎖核酸を単鎖に遊離するスイッチ物質を結合した第一の特異結合物質に分析対象物を含む試料を接触させ、第一特異結合物質に前記分析対象物を結合させて、スイッチ物質−第一の特異結合物質−分析対象物の結合体を得る工程、
（Ｂ）第一の固定部に固定した第二の特異結合物質に前記試料を接触させ、前記結合体を第二の特異結合物質に結合させて、固定部に固定する工程、
（Ｃ）試料の移動方向に沿って前記第一の固定部よりも下流位置に標識物質をインターカレートした二本鎖核酸を固定化した第二の固定部があり、前記第一の固定部で固定されなかった第一の結合物質を含む溶液が第二の固定部に接触することで、第一の結合物質と結合しているスイッチ物質が二本鎖構造にインターカレートされていた標識物質が遊離する工程、
（Ｄ）前記遊離した標識物質を検出部で計測する工程、
（Ｅ）前記検出部で検出した信号強度に基づいて、前記試料中の分析対象物を定量する工程
とを含む。
【００１２】
このことから、試料中に含まれる微量の分析対象物と反応した第一の特異結合物質の量を定量する際、インターカレートされた標識物質で増幅した応答として検知することが可能となる。よって、微量の分析対象物を応答増幅し検出するため、高感度な測定が可能となる。
【００１３】
また、前記第一の特異結合物質、及び第二の特異結合物質が抗体であることが好ましい。
【００１４】
また、前記スイッチ物質がヘリカーゼであることが好ましい。これは、比較的容易に二本鎖核酸を一本鎖に解離することが可能であるためである。
【００１５】
また、前記標識物質が電子伝達体と二本鎖核酸とインターカレートする構造から成り、前記検出部が少なくとも作用極及び対極から成る電極系を含むことが好ましい。このことから、分析対象物を電気化学的に検出することが可能となり、簡便で小型な測定システムの構築が容易となる。
【００１６】
また、前記標識物質に含まれる前記電子伝達体がフェロセンであることが好ましい。
【００１７】
また、本発明の特異結合分析センサは、試料を供給する試料供給口と、前記試料供給口より供給された試料を一時的に保持する空間形成部と、前記空間形成部に保持された第一の特異結合物質と、第二の特異結合物質を固定化した第一の固定化部と、標識物質をインターカレートした二本鎖核酸を固定化した第二の固定部と、前記標識物質を検出する検出部とを備える。
【００１８】
更に、本発明の特異結合分析デバイスは、前記特異結合分析センサを到着する装着部と、装着された前記特異結合分析センサの検出部の信号強度から前記試料中の分析対象物を定量する演算部と、前記演算部で定量された結果を表示する表示部とを備えるとよい。
【００１９】
このようにすると、簡便で小型な分析デバイスを構築することが可能となる。
【００２０】
また、本発明の特異結合分析方法として、
（Ａ）二本鎖核酸を単鎖に遊離するスイッチ物質を結合した第一の特異結合物質に分析対象物を含む試料を接触させ、第一特異結合物質に前記分析対象物を結合させて、スイッチ物質−第一の特異結合物質−分析対象物の結合体を得る工程、
（Ｂ）第一の固定部に固定した第二の特異結合物質に前記試料を接触させ、前記結合体を第二の特異結合物質に結合させて、固定部に固定する工程、
（Ｃ）試料の移動方向に沿って前記第一の固定部よりも下流位置に標識物質をインターカレートした二本鎖核酸を固定化した第二の固定部があり、前記第一の固定部で固定されなかった第一の結合物質を含む溶液が第二の固定部に接触することで、第一の結合物質と結合しているスイッチ物質が二本鎖構造にインターカレートされていた標識物質が遊離する工程、
（Ｄ）前記第二の固定部が検出部を兼ねており、第二の固定部で遊離した標識物質を計測する工程、
（Ｅ）前記検出部で検出した信号強度に基づいて、前記試料中の分析対象物を定量する工程
でもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、分析対象物と反応した抗体量を二本鎖核酸に保持する多数の電子伝達体の量で評価する事で、応答増幅が可能となり、対象試料中の分析対象物を簡便な方法で高感度に測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら詳しく説明する。
【００２３】
（実施の形態）
ここでは、分析対象物としてヒト血清アルブミン（ｈｓＡ）、第一の特異結合物質、および第二の特異結合物質として抗ｈｓＡモノクローナル抗体、スイッチ物質としてヘリカーゼを、第二の固定部に固定する二本鎖核酸として、5'末端にメルカプトヘキシル基を有するチミジンの２０量体（ＨＳ−ｄＴ２０）とアデニン２０量体（ｄＡ２０）を、またインターカレートする標識物質としてフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（Ｓ．Ｔａｋｅｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｏｍｍｉｍ．，１１１１（1998））を例に本発明の一実施の形態を説明する。
【００２４】
＜固定化基板の作成＞
固定化基板３０は次のように作成する。まず、ポリエチレンテレフタレ−ト等からなる電気絶縁性の基板上に第二の固定部３１として金薄膜を形成した。次に、第二の固定部３１である金薄膜上に、5'末端にメルカプトヘキシル基を有するチミジンの２０量体（ＨＳ−ｄＴ20）の水溶液を滴下し、２時間放置した後、超純粋で洗浄する。
【００２５】
次に、アデニンの２０量体（ｄＡ20）およびフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体とを含む０．１Ｍ酢酸／酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．６）−０．１Ｍ演歌カリウム水溶液の混合液に、ＨＳ−ｄＴ20を固定化した基板を浸漬、２５℃で２０分間インキュベートする。その後、溶液から基板を引き上げ、５秒間、０．１Ｍリン酸二水素ナトリウムーリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ７）で洗浄、遊離のインターカレーターおよび未反応のｄＡ20を除去し、固定化基板３０とする。
【００２６】
なお、チミジンの２０量体（ＨＳ−ｄＴ20）、アデニン２０量体（ｄＡ20）、およびインターカレートする標識物質であるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体の合成方法については、  特開２０００−３２９７３８の実施例１記載の方法を用いる。
【００２７】
＜電極基板の作成＞
電極基板１０は次のように作成する。まず、ポリエチレンテレフタレ−ト等からなる電気絶縁性の基板上にパラジウムをスパッタリングした後トリミングにより、作用極１４、作用極リード１２、対極１５、及び対極リード１３からなる電極系を作製する。また、電極基板のリード側に、試料供給口を形成するための凹みを設ける。
【００２８】
＜マトリックス部の作成＞
マトリックス２２は、分析対象物および特異結合物質が展開される場であればよく、多孔性担体やゲル担体などが挙げられる。ここでは、ニトロセルロースを使用する。
【００２９】
まず、第一の固定部２４に第二の特異結合物質である抗ｈｓＡモノクローナル抗体を固定化する。次にマトリクスをブロッキングし、マトリクスへの非特異吸着を低減させることが好ましい。ブロッキングは、タンパク質（例えば、牛血清アルブミン、もしくは乳蛋白質など）、ポリビニルアルコール、エタノールアミン、またはこれの組み合わせなどを用いて処理することができる。
【００３０】
次に、マトリックス２２の担持部２３に、第一の特異結合物質として、スイッチ物質であるヘリカーゼを標識した抗ｈｓＡモノクローナル抗体を担持する。この時、乾燥状態で担持することが好ましい。例えば、ブロッキング後のマトリクスに第一の特異結合物質を含む試薬を塗布し、乾燥させる。
【００３１】
今回は、スイッチ物質としてヘリカーゼを使用したが、これに限定されるものではない。ヘリカーゼと同様に、二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離する機能を保持していれば、使用することが可能である。
【００３２】
＜特異結合分析センサの作成＞
図１に特異結合分析センサ１の分解斜視図を示す。固定化基板３０、スペーサ２０、マトリックス２２、電極基板１０を図１のような順で張り合わせる。スペーサ２０の厚みとマトリックス２２の厚みをそろえることで、試料空間４０、及び空気孔４１が形成される。また、固定化基板３０上に形成された第二の固定部３１の位置は、電極基板１０上に形成された作用極１４および対極１５から成る電極系よりも試料点着部寄りに形成されている。これは、インターカレートしている標識物質と電極が反応するのを防止するためである。従って、第二の固定部３１と作用極１４および対極１５から成る電極系の位置は、本実施の形態に示した構成に限定されるものではなく、インターカレートした標識物質とは電極反応せず、かつ解離した標識とは電極反応可能な位置に配置していればよい。よって、電極系は前述した条件を満たす範囲で、第二の固定部の上面、下面、及び、下流部に設置が可能である。
【００３３】
＜特異結合分析センサを用いた分析対象物の測定＞
次に、特異結合分析センサ１の測定方法について、以下説明する。
【００３４】
まず、ｈｓＡを含む試料溶液を準備する。ｈｓＡを緩衝液に溶解させた標準液でも、尿や血液のサンプルでもよい。
【００３５】
ｈｓＡ標準液を特異結合分析センサ１の試料点着部２１から供給すると、まずマトリックス２２内を毛管現象で浸透展開しながら担持部２３に流入する。そこで、試料液中のｈｓＡと担持部２３に担持しているヘリカーゼ標識抗ｈｓＡモノクローナル抗体とが結合する。結合したｈｓＡ−ヘリカーゼ標識抗ｈｓＡモノクローナル抗体複合体及び、未反応のヘリカーゼ標識抗ｈｓＡモノクローナル抗体は、更にマトリックス上を進み、第一の固定部２４に流入する。そこで、ｈｓＡ−ヘリカーゼ標識抗ｈｓＡモノクローナル抗体複合体は、第一の固定部２４に固定化されている抗ｈｓＡモノクローナル抗体と更に複合体を形成する。一方、抗原であるｈｓＡ結合していないヘリカーゼ標識抗ｈｓＡモノクローナル抗体は、第一の固定部２４に固定化されている抗ｈｓＡモノクローナル抗体と反応せずそのまま試料空間４１に進む。
【００３６】
次に、試料空間４０に到達したヘリカーゼ標識抗ｈｓＡモノクローナル抗体のヘリカーゼにより、第二の固定部３１に固定化された二本鎖核酸は１本鎖に解かれ、その結果、インターカレートされている標識物（フェロセン化ナフタレンジイミド誘導体）は二本鎖核酸から遊離する。遊離した標識物の電気化学的な検出から、ヘリカーゼ標識抗ｈｓＡモノクローナル抗体の量を推定する。今回の標識物の電気化学活性なフェロセンにつき、十分な酸化電位を作用極１４に引加することで、作用極上でフェロセンの酸化電流を測定し、その電流値の変化から濃度を推定する。
【００３７】
つまり、本法では、試料中のｈｓＡ量が減少するほど、試料空間に流出する、ヘリカーゼ標識抗ｈｓＡモノクローナル抗体の量が多くなり、その結果、遊離するフェロセン誘導体量が増加するため、作用極で測定する酸化電流値は増大することになる。
【００３８】
また、本発明の特長は、ヘリカーゼ抗体に修飾し、電極で検出する標識物を大量に第二の固定部に配置させることから、抗体１分子の応答を数十倍のフェロセンの放出に増幅させることがかのうであることから、抗体の抗原との反応性を落とすことなく、高感度でかつ簡便な計測系を構築することが可能となることである。
【００３９】
ここで、本発明の特異結合分析方法に用いられる試料は、分析対象物が含まれると予測される液状の試料である。例えば、尿、血清、血漿、全血、唾液、涙液、髄液、および乳頭などからの分泌液などが挙げられる。また、粘液、体組織または細胞などの固形状、ゲル状またはゾル状物を、緩衝液、抽出液または溶解液などの液体に懸濁または溶解させて得られる試料であってもよい。
【００４０】
また、本発明における分析対象物は、当該分析対象物と特異的に結合する特性を有する特異結合物質が存在するものであればよく、例えば、抗体や抗原として機能する各種蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質、多糖類、複合糖脂質、核酸、エフェクター分子、レセプター分子、酵素およびインヒビターなどが挙げられる。さらに具体的には、α ― フェトプロテイン、癌胎児性抗原（ Ｃ Ｅ Ａ ） 、Ｃ Ａ １ ２ ５ 、Ｃ Ａ １ ９ − ９ などの腫瘍マーカー、アディポネクチンやレプチンなどのメタボリックマーカー、β ２ −ミクログロブリン（ β ２ ｍ ） 、フェリチンなどの各種蛋白質、糖蛋白質または複合糖脂質、エストラジオール（ Ｅ ２ ） 、エストリオール（ Ｅ ３ ） 、ヒト絨毛性性線刺激ホルモン（ｈ Ｃ Ｇ ） 、黄体形成ホルモン（ Ｌ Ｈ ） 、ヒト胎盤ラクトゲン（ ｈ Ｐ Ｌ ） などの各種ホルモン、Ｈ Ｂ ｓ 抗原、Ｈ Ｂ ｓ 抗体、Ｈ Ｂ ｃ 抗原、Ｈ Ｂ ｃ 抗体、Ｈ Ｃ Ｖ 抗体、Ｈ Ｉ Ｖ 抗体などの各種ウィルス関連抗原およびウィルス関連抗体、各種アレルゲンおよびこれに対応するＩｇ Ｅ 抗体、麻薬性薬物、医療性薬物およびこれらの代謝産物、ウィルスおよび腫瘍関連ポリヌクレオチド配列の核酸などが挙げられる。
【００４１】
なお、標識物は二本鎖核酸にフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体を使用する例を示したが、これに限定されるものではなく、インターカレートし、かつ酸化還元活性を有する物質であればよい。酸化還元活性部分としては、フェロセン化合物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体あるいはビオローゲン化合物であることが好ましく、フェロセン化合物であることが特に好ましい。縫い込み型インターカレータ部分としては、ナフタレンジイミド、アントラセン、アントラキノン等であることが好ましい。
【００４２】
また、作用極としては、電子伝達体を酸化する際にそれ自身が酸化されない導電性材料であれば用いることができる。対極としては、パラジウム、金、白金等の貴金属やカーボン等の一般的に用いられる導電性材料であれば用いることができる。この中で、作用極、対極が貴金属を主成分とすることが好ましい。このようにすると、電極をより微細に加工することが可能となるため、高精度化及び検体量の削減が可能となる。また、電極反応を妨げない程度に、タンパク質の吸着を防ぐ表面処理を実施すれば、より高感度化が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明にかかる高感度電気化学式の特異結合分析方法およびデバイスは、試料中の微量な分析対象物を小型で簡便に、かつ高感度に測定することが可能になり、例えば、在宅で使用する健康管理用途としての尿、血液センサとして有用である。更に、この在宅センサを用いることで、健康増進を促進するツールを提供することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の一実施の形態に係る特異結合分析センサの分解斜視図
【符号の説明】
【００４５】
１  センサ
１０  電極基板
１２  作用極リード
１３  対極リード
１４  作用極
１５  対極
２０  スペーサ
２１  試料点着部
２２  マトリックス
２３  担持部
２４  第一の固定部
３０  固定化基板
３１  第二の固定部
４０  試料空間
【図１】
2010230619.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月29日(2009.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2010230619.tif 000004