(57)【要約】【課題】  カラムに分離剤を均一充填し、安定した分離性能を達成すると共に再現性良く分離剤を充填する方法を提供する。【解決手段】  液体クロマトグラフィー用カラムに充填剤を充填する方法であって、下記（１）〜（４）の工程を経ることを特徴とする充填方法。  （１）合成吸着剤からなる充填剤を水媒体に分散させたスラリーを調製する  （２）スラリーをカラム上部より送入し、カラム内に合成吸着剤を留めて水媒体をカラム下部より排出し、合成吸着剤充填層を形成する  （３）カラム下部より、該水媒体と相溶性を有する極性有機溶媒を上向流で注入しカラム内の水媒体を置換する  （４）該極性有機溶媒と相溶性を有する展開剤をカラム上部より下降流で注入し、極性有機溶媒を置換する【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィー用カラムに充填剤を充填する方法であって、下記（１）〜（４  ）の工程を経ることを特徴とする充填方法。
（１）合成吸着剤からなる充填剤を水媒体に分散させたスラリーを調製する
（２）スラリーをカラム上部より送入し、カラム内に合成吸着剤を留めて水媒体をカラム下部より排出し、合成吸着剤充填層を形成する
（３）カラム下部より、該水媒体と相溶性を有する極性有機溶媒を上向流で注入しカラム内の水媒体を置換する
（４）該極性有機溶媒と相溶性を有する展開剤をカラム上部より下降流で注入し、極性有機溶媒を置換する
【請求項２】
上記工程（２）において、スラリーをカラム上部より送入し、カラム内に合成吸着剤を留め水媒体をカラム下部より排出する際、カラム内の合成吸着剤は、下式で示される充填率が少なくとも９４％であることを特徴とする請求項１に記載の充填方法。
充填率＝｛（充填された合成吸着剤体積）／（カラム容量）｝×１００
【請求項３】
充填率が９６〜９７％であることを特徴とする請求項２に記載の充填方法。
【請求項４】
上記（３）工程において、極性有機溶媒の流量は、ＳＶ≦２であることを特徴とする請求項１又は２に記載の充填方法。
【請求項５】
極性有機溶媒は、比誘電率が１５〜４０の炭素数１〜４の脂肪族アルコール又はアセトニトリルから選ばれることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の充填方法。
【請求項６】
極性有機溶媒がエタノールであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の充填方法。
【請求項７】
合成吸着剤の平均粒径は、１００μｍ〜２００μｍであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の充填方法。
【請求項８】
合成吸着剤は、（メタ）アクリル酸系架橋共重合体であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の充填方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー用の充填剤として用いられる合成吸着剤のカラムへの充填方法に関する。詳しくは、本発明は、簡易な操作により、液体クロマトグラフィーに用いられる合成吸着剤を同一分離性能が得られるようカラムに充填する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーは、各種有機物質の分析・分取手法として広く行われているが、この液体クロマトグラフィーに使用されるカラムは、混合物からの分離精度を高める為に分離用充填剤（分離剤とも言う）がカラム内で均一な充填層を形成した状態で充填されていることが求められている。
従来、クロマトグラフィー用充填剤をカラムに充填する方法としては、充填剤を適当な液媒体、例えば水に分散させてスラリー化した後、このスラリーをある容量を持ったカラムへ充填し、更に溶媒をガス圧やポンプ圧により送入し充填剤を圧密化させ、その後カラム内の液媒体を展開剤（溶離剤）で置換する方法が知られている。例えば、パッカー内のスラリーに押出液を圧入しカラムに流入させるスラリーの充填方法（特許文献１）、過剰分の樹脂を抜出し還流させる方法（特許文献２）、或いは可動栓を用いた充填方法（特許文献３）などが挙げられる。
【０００３】
分離剤を充填したカラムは、充填操作の終了時にはカラム内の液媒体を展開剤で置換した状態とされるが、展開剤は分離の対象である有機物質の種類により異なる。ところで、分離剤として用いられる合成吸着剤は、使用する展開剤によっては膨潤したり収縮したりする性質を有しており、展開剤の種類を変更すると充填剤（分離剤）の膨潤・収縮度合が変化することから充填層が変化し、収縮度合が大きいとカラムと分離剤の間にデッドボリュームが出来たり、また膨潤度合が大きいとカラムに対して分離剤の過充填が起きることがある。クロマトグラフィーにおいて展開剤はピストンフローで流れることが理想的であるが、デッドボリュームや過充填はこの理想的なピストンフローを阻害する要因となるので、分離剤として合成吸着剤を充填したカラムでは、このような膨潤・収縮による悪影響を出来るだけ回避することが求められる。
【０００４】
また、合成吸着剤の充填カラムは、単カラムで使用されるだけでなく、擬似移動床法における如く、複数のカラムを接続して使用される場合がある。その場合、複数のカラムの分離性能は同一であることが必要であるが、公知の方法では同じ操作により充填を行ってもカラムの性能にバラツキが認められ、同一分離性能のカラムを再現性良く得ることは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−５０１２３号公報
【特許文献２】特表２００２−５３１８４８号公報
【特許文献３】特開２０００−３４６８３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記問題に鑑み、合成吸着剤のカラムへの充填方法とカラム内での充填状態について鋭意検討した。上述の特許文献１〜３の充填方法では、充填剤スラリーの注入やカラム内の液体交換のための溶媒の通液等の操作はいずれもカラムの上部より下降流で注入されているが、縦型カラムにおいて流れ方向が下降流であるとカラムの上下において不均一な充填状態となり、また、加圧下における押出液を停止させた場合、カラム内では樹脂が膨潤した残留応力により膨張が継続されるが、この時に上下方向に不均一な充填状況を発生させることが考えられる。
このように下降流によりスラリー充填及び液体交換を行った場合には充填状態が均一でないため十分な分離性が発揮されないので、本発明は、充填方法を改良して合成吸着剤を均一充填し、安定した分離性能を達成する充填方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、合成吸着剤を充填後のカラムに、展開溶媒とは異なる極性有機溶媒を充填層に上向流で送液してカラム内のスラリーの液媒体を置換し、その後に展開溶媒を送液することにより合成吸着剤の展開溶媒による膨潤収縮で生ずる充填層の不均一状態を回避できることを見出し達成したものである。
即ち、本発明の要旨は、液体クロマトグラフィー用カラムに充填剤を充填する方法であって、下記（１）〜（４）の工程を経ることを特徴とする充填方法に存する。
（１）合成吸着剤からなる充填剤を水媒体に分散させたスラリーを調製する
（２）スラリーをカラム上部より送入し、カラム内に合成吸着剤を留めて水媒体をカラム下部より排出し、合成吸着剤充填層を形成する
（３）カラム下部より、該水媒体と相溶性を有する極性有機溶媒を上向流で注入しカラム内の水媒体を置換する
（４）該極性有機溶媒と相溶性を有する展開剤をカラム上部より下降流で注入し、極性有機溶媒を置換する
【０００８】
本発明の好適な態様として、上記工程（２）において、スラリーをカラム上部より送入し、カラム内に合成吸着剤を留めて水媒体をカラム下部より排出する際、カラム内の合成吸着剤は、下式で示される充填率が少なくとも９４％であることよりなる充填方法が挙げられ、
充填率％＝｛（充填された合成吸着剤体積）／（カラム容量）｝×１００
更に、充填率が９６〜９７％であること；上記（３）工程において、極性有機溶媒の流量は、ＳＶ≦２であること；極性有機溶媒は、比誘電率が１５〜４０の炭素数１〜４の脂肪族アルコール又はアセトニトリルから選ばれること；極性有機溶媒がエタノールであること；合成吸着剤の平均粒径は、１００μｍ〜２００μｍであること；合成吸着剤は、（メタ）アクリル酸系架橋共重合体であることが挙げられる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明方法で得られたカラムを用いて液体クロマトグラフィーによる分離を行った場合、分離曲線パターンは良好で、且つ繰り返し充填を行っても分離曲線の再現性が高いカラムを得ることが出来る。また、本発明方法で得られるカラムを用いてクロマトグラフィーを行った場合、使用前後でカラムに充填された合成吸着剤の充填層上面の変化は認められず、更に使用後の合成吸着剤の外観指数も９９％以上であり、合成吸着剤粒子の膨潤収縮による破砕なども生起しないので、本発明方法は極めて有用な充填方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】充填カラムの溶媒置換における溶媒の流れ方向、流量と充填状態の関係を示す、フタル酸ジブチルとフタル酸ジメチルの分離パターン曲線図である。
【図２】本願の実施例において充填カラムへ極性有機溶媒を上向流で注入する概略図である。
【図３】本願の実施例において充填カラムへ展開剤を下降流で注入する概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明方法による液体クロマトグラフィー用カラムへの合成吸着剤の充填は、下記（１）〜（４）の工程を経ることにより行われる。
（１）合成吸着剤からなる充填剤を水媒体に分散させたスラリーを調製する
（２）スラリーをカラム上部より送入し、カラム内に合成吸着剤を留めて水媒体をカラム下部より排出し、合成吸着剤充填層を形成する
（３）カラム下部より、該水媒体と相溶性を有する極性有機溶媒を上向流で注入しカラム内の水媒体を置換する
（４）該極性有機溶媒と相溶性を有する展開剤をカラム上部より下降流で注入し、極性有機溶媒を置換する
【００１２】
本発明方法が適用されるカラムとしては、液体クロマトグラフィー用カラムであれば、特に制限されないが、カラムの内径が３０ｍｍφ以上の大口径カラムに対し効果的に適用することができる。使用されるカラムは、通常、内径３０〜５０ｍｍφ、高さ３００〜１０００ｍｍｈのＳＵＳ製カラムから選ばれる。
カラムは、その下端部分に分散板、及び下部導出口を取付け、カラム上部は開放し、カラム下部導出口から水媒体だけが排出されるようにして垂直に設置する。
【００１３】
工程（１）：
カラムに充填剤である合成吸着剤が充填されるが、カラムへの充填に先立ち、合成吸着剤の水媒体スラリーを調製する。
合成吸着剤のスラリーは、水媒体に合成吸着剤を分散させることにより調製される。水媒体としては水、特に脱塩水が好適に使用されるが、場合により実質的に水を主成分とするが少量の相溶性のある極性有機溶媒を含んでいてもよい。
スラリー中における合成吸着剤の量は、好ましくは４０〜６０（容量）％であり、５０（容量）％が最も好ましい。この範囲を超えて低すぎるとカラムへの移送・充填に長時間を要し、他方高すぎるとスラリー粘度が高くなり均一な充填層の形成が困難になりやすい。
また、市販品の合成吸着剤を使用する場合、予め合成吸着剤を脱塩水により十分湿潤させておくのが好ましい。
合成吸着剤の使用量は、カラム体積の約１０％増の体積（ｍｌ）に相当する量を目処に適宜決められる。
【００１４】
工程（２）
工程（１）で調製された水媒体に合成吸着剤が分散したスラリーは、攪拌しながらカラム壁面に沿って流下させながら注入し、下降流で沈降させることにより充填層を形成し、カラム下部の導出口から水媒体を排出させる。水媒体の排出により生じた合成吸着剤層面の上位の空間部へスラリーを再度注入し、水媒体を排出する操作を、合成吸着剤層の上面がカラム上端に達するまで繰り返して行う。その際、合成吸着剤は、下式で示される充填率が少なくとも９４％、好ましくは９６〜９７％となるように充填する。
充填率％＝｛（充填された合成吸着剤体積）／（カラム体積）｝×１００
ここで、充填された合成吸着剤体積は、以下により算出する。
（Ａ）スラリー調製に先立ち、カラム体積の約１０％増の体積（ｍｌ）に相当する量の合成吸着剤を脱塩水に十分湿潤させ、湿潤した合成吸着剤体積（ａ）をメスシリンダーにより測定しておく（ｍｌ）。
（Ｂ）スラリーをカラムに注入・充填し、充填終了時の残りのスラリー中の合成吸着剤体積（ｂ）をメスシリンダーで測定する（ｍｌ）。
（充填された合成吸着剤体積）＝（ａ）−（ｂ）
【００１５】
合成吸着剤の充填率が９４％未満の場合には、充填後のカラムを用いたクロマトグラフィーの再現性が得られず、一方、９７％を超えて過剰に充填すると再現性の低下に繋がるおそれがある。
合成吸着剤が上記充填率を満たすためには、充填終了持の近辺でカラムに外部よりかすかな振動を与える等して注意深く充填する分離剤量を調整するのが好ましい。
【００１６】
工程（３）：
工程（２）において合成吸着剤が充填されたカラムには、その上端部分に分散板、及びカラム上部導出口を取り付ける。また、カラム下端部分に圧送用の配管を接続し、配管の反対側にはポンプなどで置換液を圧送することができるようにし、カラム上端部分に排出用の配管を接続させる。
カラム下端部分に設けられた配管を介して水媒体と相溶性を有する極性有機溶媒を置換液として上向流で注入しカラム内の水媒体を置換する。
極性有機溶媒は、空間速度（ＳＶ）≦２、好ましくはＳＶ＝０．５〜１で注入されるが、本発明方法では上向流で注入することが必須である。公知方法のように置換液を下降流で供給し溶媒置換した場合は、充填剤が上下方向に対し不均一な充填となるので良好な分離性能が得られないが、本発明の如く、上向流で溶媒置換した時は、分離剤の充填層が均一となり良好、かつ、繰り返し充填において同一分離性能が得られる。
置換液としての極性有機溶媒は、具体的にはカラム体積の３倍以上、好ましくは３〜６倍量の溶媒をカラムに上向流で通液させる。
【００１７】
本発明方法により、置換液を上向流で供給して溶媒置換を行った充填カラムの分離性能が優れていることは、フタル酸ジブチル及びフタル酸ジエチルをサンプルとしたクロマトグラフィーによる分離結果を示す図１の分離曲線から明らかである。図１において、Ａは充填率９６．５％で置換液（エタノール）を上向流・ＳＶ＝０．７５で注入して調製したカラムであり、Ｂは充填率９６．５％で置換液を下降流・ＳＶ＝０．７５で注入し、Ｃは充填率９３％で置換液を下降流・ＳＶ＝０．７５で注入したカラムである。
Ａは繰り返し充填を行っても同じ分離性能を得ることができ、特に、擬似移動床法のように同一性能のカラムが必要とされる場合に効果が期待できる。ＢはＡと比較し、大きな差はないように見えるが、リーディングの程度や分離度が充填毎に変化してしまうため、擬似移動床法においてＡよりも性能が低下してしまう。Ｃは明らかにピーク形状が異なり、また、充填毎にテーリングやピーク割れ等、ピーク形状が変化してしまい安定した分離性能を得ることができない。
なお、カラムの分離性能は、後述の実施例１に記載の「カラム性能試験」法によりおこなった。
【００１８】
置換液としての極性有機溶媒は、水及びクロマトグラフィー分離の展開剤として使用される溶媒それぞれに相溶性があるものが適用され、通常、比誘電率が１５〜４０の炭素数１〜４の脂肪族アルコール又はアセトニトリルから選ばれる。具体的には、メタノール（比誘電率３３．１）、エタノール（比誘電率２３．８）、ｎ−プロパノール（比誘電率２２．２）、２−プロパノール（比誘電率１８．３）等の脂肪族アルコール、アセトニトリル（比誘電率３７．５）が挙げられるが、この中エタノールが好ましい。
【００１９】
工程（４）：
溶媒置換されたカラム上端部分に圧送用の配管を接続し直し、カラム下端部分に排出用の配管を接続する。
工程（３）で極性有機溶媒により溶媒置換された充填カラムに、該極性有機溶媒と相溶性を有する展開剤をカラム上部より下降流で注入し、極性有機溶媒を置換する。
カラム上端部分の配管から、カラムクロマトグラフィー分離に使用される展開剤を下降流、空間速度≦２でカラム体積の３〜６倍量通液する。
この工程により充填操作は終了する。
【００２０】
展開剤は、クロマト分離に実際使用される分離対象物質により異なるので、画一的に決められないが、置換液として使用された極性有機溶媒と相溶性のあるものから選ばれる。通常、展開剤としては、ｎ−ヘキサン，ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、シクロヘキサン、トルエン、キシレン等の飽和脂肪族系炭化水素、及び芳香族系炭化水素系の溶媒、更には、水、メタノール、アセトニトリル、エタノールなどの極性溶媒から適宜選択して使用され、これらは、相分離しなければ任意の割合で混合して使用することが出来る。中でも、例えば、ヘキサン/エタノール溶液（容量混合比９０：１０）のような炭化水素系溶媒に極性有機溶媒を少量混合した混合溶媒を使用するのが好適である。
【００２１】
本発明方法で充填剤として使用される合成吸着剤は、液体クロマトグラフィーに使用されている公知の合成吸着剤から適宜選択して使用することができる。合成吸着剤の平均粒子径は、通常１００μｍ〜２００μｍであり、特にこの範囲内で、均一係数が１．２以下の均一粒径品が好ましく、このような粒子の合成吸着剤は、流動性もよく、充填密度も均一化される。また、合成吸着剤は、多孔性であることが分離時の処理量を高めることから有利であり、その細孔容積は、通常０．２ｍｌ／ｇ〜３．０ｍｌ／ｇである。
【００２２】
本発明方法で使用する合成吸着剤として特に好ましいのは、（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる合成吸着剤である。
（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる合成吸着剤は、上記の特性を満たす限り市販品から適宜選定することができるが、その具体的製品例としては、ダイヤイオン ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ等、ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＨＰ２ＭＧＭ、ＣＨＰ２ＭＧ、ＣＨＰ２ＭＧＦ、ＣＨＰ２ＭＧＡ、ＣＨＰ２ＭＧＹ等、セパビーズ ＦＰ−ＨＧ、ＳＰ２ＭＧＳ等（以上三菱化学社製；商品名）、アンバーライト ＸＡＤ７、ＸＡＤ７ＨＰ、アンバークロム ＣＧ−７１等（以上、ローム・アンド・ハース社製；商品名）等があげられる。
【００２３】
本発明方法は、充填剤としての合成吸着剤を充填したカラムに、極性有機溶媒の置換液を上向流で通液してカラム内の液媒体を置換するという極めて簡単な操作により、またその際カラムに充填される合成吸着剤量を所定の範囲内にすることにより、充填剤が均一な充填層を形成するカラムを調製することができる。従って、本発明方法によりで得られたカラムを用いて液体クロマトグラフィーによる分離を行った場合、分離曲線パターンは良好で、且つ高い再現性でカラムを得ることが出来る。また、本発明方法によれば、気温５〜４０℃の条件下でも同一性能の充填カラムを得ることができる。更に、本発明方法で得られた充填カラムを用いてクロマトグラフィーを行った場合、使用前後でカラムに充填された合成吸着剤の充填層上面において、合成吸着剤の収縮やパッキング状態等の変化は認められず、また、使用後の合成吸着剤の外観指数（正常な樹脂粒子）も９９％以上であり、合成吸着剤粒子の膨潤収縮による破砕なども生起しないので、本発明方法は極めて有用な充填方法である。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
［実施例１］
予め脱塩水により湿潤させたメタクリル酸エステル系合成吸着剤ＳＰ２ＭＧＳ（商品名：三菱化学社製：平均粒子径１４０μｍ）８００ｍｌに同容量の脱塩水を加えて撹拌し、５０（容量）％スラリーを調製した。
底部に分散板（フィルター）が装着された、内径４３ｍｍ×高さ５４０ｍｍのＳＵＳ製カラム（内容積：７８４ｍｌ）を垂直に設置した。上記スラリーを、このカラムの上部入口から内壁に沿って流下させながら注入し、カラム上端入口まで到達したら、スラリーの注入を止め、液面が合成吸着剤層の上面付近に達するまでカラム下部に設けられた出口から水を抜き出す。この様なスラリーの注入、水の抜き出し操作を合成吸着剤層面がカラム上端面と同じになるまで繰り返す。この時の残ったスラリー中の合成吸着剤量を測定した結果、合成吸着剤の充填率は９６．５％であった。
【００２６】
ついで、カラム上端部分に分散板、及びカラム上部導出口を取り付け、図２に示す如く予熱コイルやサンプルループを組み込んだラインを形成する。カラム下端部からエタノールをポンプにより上向流で圧入し、カラム内の水をエタノールで置換し、カラム上部より廃液を流出させた。エタノールは、ＳＶ＝０．７５で４ＢＶ注入した。
その後、図３に示す如く配管をし直し、カラム上部よりヘキサン/エタノール（容量混合比９０：１０）溶液を下降流・ＳＶ＝２で供給し、カラム内をヘキサン／エタノール溶液に置換し、カラム充填を終了した。
充填カラムの分離性能の再現性を確認するため、上記と同じ操作により複数（４本）の充填カラムを作成した。
【００２７】
［カラム性能試験］
得られた合成吸着剤を充填したカラムを用い、フタル酸ジブチル及びフタル酸ジエチルをサンプルとしたクロマトグラフィーによる分離性能を評価した。その結果、分離曲線は良好なピーク形状となり、また、作成した４本のカラムすべてにおいて、同じ分離性能が得られた。
試験は、得られた合成吸着剤の充填カラムを液体クロマトグラフィー装置（ＧＩＬＳＯＮ製分取クロマト装置）に設置した。フタル酸ジブチル及びフタル酸ジエチルをヘキサン/エタノール溶液（容量混合比９０：１０）に、それぞれの濃度が０．５重量％となるように溶解した溶液をサンプルとした。カラムにサンプル１０ｍｌを注入し、溶離液として上記ヘキサン/エタノール溶液を、６０ｍｌ／分で通液した。その結果、立ち上がりもシャープで２０分及び２８分に２個のピークを有する良好な分離曲線が得られた（図１：Ａ参照）。
【００２８】
また、クロマトグラフィーによる分離を行った後、目視による観察では、カラム内の合成吸着剤充填層面には変化が認められず、更に使用後の合成吸着剤の外観指数も９９％以上であった。
【００２９】
［比較例１］
実施例１において、合成吸着剤の充填率を９３％とし、カラム内を水からエタノールに置換する操作を下降流・ＳＶ＝０．７５で行った以外は同じ操作を行い、複数の充填カラム(４本)を調製した。得られたカラムの性能試験を行ったところ、同じ操作で充填したカラムであるにもかかわらず、カラムの充填毎にピークの形状が変化してしまい、溶離時間まで変動してしまうことが確認され、再現性が得られなかった。
【００３０】
［比較例２］
実施例１において、カラム内を水からエタノールに置換する操作を下降流・ＳＶ＝０．７５で行った以外は同じ操作を行い、複数の充填カラム（４本）を調製した。得られた充填カラムにつきクロマトグラフィーによる性能試験を行ったところ、溶離時間は再現性のある結果が得られたが、リーディングが確認された充填カラム、リーディングが確認されない充填カラムがあり、かつ、リーディングの程度も充填毎に異なる結果であった。
【符号の説明】
【００３１】
Ａ：充填率９６．５％、置換液を上向流・ＳＶ＝０．７５で注入したカラムでの分離曲線
Ｂ：充填率９６．５％、置換液を下降流・ＳＶ＝０．７５で注入したカラムでの分離曲線
Ｃ：充填率９３．０％、置換液を下降流・ＳＶ＝０．７５で注入したカラムでの分離曲線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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