(57)【要約】    【課題】  専門的な歯科医療技術、実験技術および測定機器を必要とせず、非侵襲で簡便かつ迅速に歯周病の罹患状態を診断する方法を開発する。    【解決手段】  歯周病診断試験紙をＬＤＨ基質、ＬＤＨ補酵素、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むｐＨ７〜１１の水溶液、またはジアホラーゼの代わりにＰｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ誘導体を用いて調製したｐＨ７〜１１の水溶液を吸水性基材に浸透させた後、乾燥させることによって製造する。得られた試験紙を用いて唾液のＬＤＨ活性を呈色反応により検出することで歯周病罹患状態を診断する。 【選択図】  図１
2010130924.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸脱水素酵素基質、乳酸脱水素酵素補酵素、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むｐＨ７〜１１の水溶液が吸水性基材に浸透され乾燥されてなることを特徴とする歯周病診断試験紙。
【請求項２】
乳酸脱水素酵素基質、乳酸脱水素酵素補酵素、Ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ誘導体、テトラゾリウム塩、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むｐＨ７〜１１の水溶液が吸水性基材に浸透され乾燥されてなることを特徴とする歯周病診断試験紙。
【請求項３】
請求項１又は２記載の歯周病診断試験紙を用いて唾液の乳酸脱水素酵素活性を検出することにより歯周病の罹患状態を診断することを特徴とする歯周病診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は歯周病診断試験紙に関し、特に歯周病の罹患状態を呈色によって非侵襲（生体を傷つけない）で簡便かつ迅速に診断できる試験紙に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、我が国において歯周病は生活習慣病として位置づけられ、その罹患率は生活習慣の欧米化や精神的ストレスの増加等により高まっている。歯周病は痛み等の自覚症状が現れないうちに進行し、放置すると歯牙喪失に至る。さらには歯周病と肺炎、骨粗鬆症、糖尿病、心筋梗塞、早産、メタボリックシンドローム等との関連性も近年報告されており、歯周病の予防や治療への関心が急速に高まっている。
【０００３】
従来、歯周病罹患状態は歯周ポケットの深さを測定する、ＣＰＩ（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ
Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｉｎｄｅｘ）により診断されている。しかしながら、その診断には熟練した専門技術が求められること、診断に時間がかかること、歯周ポケットへのプローブ挿入時の不快感などの問題が指摘されている。
【０００４】
唾液中には歯周病の有用なマーカーとなりうる物質が多く含まれており、近年、歯周病の早期発見や診断に唾液検査を用いることが提唱されている。これまでに、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、乳酸脱水素酵素（以下、ＬＤＨという）、アルカリフォスファターゼ、酸性フォスファターゼ、γグルタミルトランスフェラーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、クレアチニン、尿素、遊離ヘモグロビン等と歯周病との関連性が指摘されている。
【０００５】
特に、ＬＤＨは歯周病疾患のマーカーとして有用であることが古くから報告されている。ＬＤＨはヒトのほぼ全ての細胞の細胞質中に存在する酵素であるが、細胞の損傷や壊死により細胞外に漏出する。歯周病患者においても唾液のＬＤＨ活性が有意に高いことが知られており、唾液ＬＤＨ活性を歯周病の罹患状態の指標とすることができる。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−２２９５３７号公報
【特許文献２】特開２００４−３２９１４１号公報
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ２９８，１８７−１９１，２０００
【非特許文献２】Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ  Ｐａｔｒｏｌ．Ｏｒａｌ  Ｃｉｒ．Ｂｕｃａｌ  １１，１１５−１１９，２００６
【非特許文献３】Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｓｃｉ．４８，１１７−１８３，２００６
【非特許文献４】Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｓｃｉ．５０，５３−５６，２００８
【非特許文献５】Ｃｈｉｒ．Ｄｅｎｔ．Ｆｒ．５６，６３−６９，１９８６
【非特許文献６】Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．５８，６１４−６２１，１９８７
【非特許文献７】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．１６，１６４−１６９，１９８９
【非特許文献８】Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．５２，９１１−９１５，２００７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来のＬＤＨ活性の測定法は分注器等の実験器具や分光光度計等の測定
機器を必要とし、特に技術及び設備の面で、歯周病患者自身が測定することは実際には困難である。
【０００８】
本発明はかかる状況を鑑み、歯周病の罹患状態を呈色によって非侵襲で簡便かつ迅速に診断できる歯周病診断試験紙を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る歯周病診断試験紙は、ＬＤＨ基質、ＬＤＨ補酵素、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むｐＨ７〜１１の水溶液が吸水性基材に浸透され乾燥してなることを特徴とする。
【００１０】
本発明に係る歯周病診断試験紙は、ＬＤＨ基質、ＬＤＨ補酵素、Ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ誘導体、テトラゾリウム塩、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むｐＨ７〜１１の水溶液が吸水性基材に浸透され乾燥されてなることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係る歯周病診断方法は、請求項１又は２記載の歯周病診断試験紙を用いて唾液のＬＤＨ活性を検出することにより歯周病の罹患状態を診断することを特徴とする。
【００１２】
本件発明者らは簡便な歯周病診断方法を鋭意検討した結果、ＬＤＨ活性試験紙を開発した。本試験紙はＬＤＨの基質である乳酸または乳酸塩、ＬＤＨの補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤという）またはその塩、発色酵素であるジアホラーゼ、ジアホラーゼ基質であるテトラゾリウム塩、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を溶解したｐＨ７〜１１の水溶液、またはジアホラーゼの代わりに電子キャリアであるＰｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（以下、ＰＭＳという）誘導体を用いた上記水溶液を吸水性基材に浸透した後、乾燥することにより製造できる。
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
ＬＤＨの基質としては、乳酸、乳酸リチウム、乳酸ナトリウム、乳酸アンモニウム、乳酸マグネシウム、乳酸カリウム等が好適に用いられる。ＬＤＨ基質はＬＤＨ活性試験紙用発色液中の最終濃度が１．０〜５０ｍｇ／ｍＬとなるように添加することが望ましい。
ＬＤＨの補酵素はＮＡＤまたはそのナトリウム塩またはリチウム塩が好適に用いられる。ＬＤＨ補酵素はＬＤＨ活性試験紙用発色液中の最終濃度が０．０５〜５．０ｍｇ／ｍＬとなるように添加することが望ましい。
酵素安定化剤としては、ウシ血清アルブミン等が好適に用いられる。酵素安定化剤はＬＤＨ活性試験紙用発色液中の最終濃度が０．０５〜２０ｍｇ／ｍＬとなるように添加することが望ましい。
ｐＨ緩衝剤としてはｐＨ７〜１１において緩衝作用を示す、トリス塩酸、リン酸、ホウ酸、グリシン、ジエタノールアミン、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、またはＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等のＧｏｏｄの緩衝液が好適に用いられる。ｐＨ緩衝剤はＬＤＨ活性試験紙用発色液中の最終濃度が０．０５〜５０ｍｇ／ｍＬとなるように添加することが望ましい。
テトラゾリウム塩としては、３，３’−［３，３’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−（１，１’−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−４，４’−ｄｉｙｌ］−ｂｉｓ（２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｕｉｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、３，３’−［３，３’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−（１，１’−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−４，４’−ｄｉｙｌ］−ｂｉｓ［２−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｕｉｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ］（以下、ＮＢＴという）、２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４
−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下、ＩＮＴという）、３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ（以下、ＷＳＴ−１という）、２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ等が好適に用いられる。テトラゾリウム塩はＬＤＨ活性試験紙用発色液中の最終濃度が０．０５〜２０ｍｇ／ｍＬとなるように添加することが望ましい。
ＰＭＳ誘導体は１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（以下、１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳという）が特に好適に用いられる。ＰＭＳ誘導体はＬＤＨ活性試験紙用発色液中の最終濃度が１．０〜１００ｍｇ／ｍＬとなるように添加することが望ましい。
また、吸水性基材には通常の濾紙、書道用吸い取り紙、高分子吸収体、不織布などが用いられる。
【００１４】
本発明により製造された試験紙は、唾液を浸した後、通常室温で１０秒から１０分間、好ましくは１分から５分間放置後の呈色を色調見本の色と比較してＬＤＨ活性、すなわち歯周病罹患状態を判定するものである。
試験紙の呈色は製造に用いるテトラゾリウム塩により異なる。例えば、ＮＢＴを用いる場合は紫色に、ＩＮＴを用いる場合は赤色に、ＷＳＴ−１を用いる場合は黄色に呈色する。呈色の機構の例を図１及び図２に示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、これらによって本発明が限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
４０ｍｇ／ｍＬ  乳酸リチウムおよび１０ｍｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミンを含む１２ｍｇ／ｍＬ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０、２５℃）を調製した（以下、緩衝液という）。ＮＢＴを５．０ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水に添加して熱水中で加温した後、超音波処理により完全に溶解した（以下、ＮＢＴ溶液という）。ＮＡＤ（リチウム塩）（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｓａｌｔ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を３．３４７ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝液に溶解した（以下、ＮＡＤ溶液という）。ジアホラーゼ（Ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ；オリエンタル酵母社製）を５００Ｕ／ｍＬとなるように蒸留水に懸濁したのち、１２，０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離により得られた上清をジアホラーゼ溶液とした。緩衝液、ＮＢＴ溶液、ＮＡＤ溶液およびジアホラーゼ溶液をそれぞれ４：４：１：１（ｍｌ）の割合で混合し、再度１２，０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、得られた上清をＬＤＨ活性試験紙用発色液とした。以上の溶液はすべて褐色瓶中で調製した。得られた発色液を吸い取り紙（墨運堂社製、４０ｍｍ×５ｍｍ）に浸透したのち、遮光下で凍結乾燥して紫発色ＬＤＨ試験紙を得た。
【実施例２】
【００１７】
ＮＢＴの代わりにＩＮＴ（同仁化学研究所製）を使用する以外は実施例１と同様にして赤発色ＬＤＨ試験紙を得た。
【実施例３】
【００１８】
ＮＢＴの代わりにＷＳＴ−１（同仁化学研究所製）を使用する以外は実施例１と同様に
して黄発色ＬＤＨ試験紙を得た。
【実施例４】
【００１９】
ジアホラーゼ溶液の代わりに６７ｍｇ／Ｌ  １−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ（同仁化学研究所製）水溶液を使用する以外は実施例１と同様にして紫発色ＬＤＨ試験紙を得た。
【実施例５】
【００２０】
ジアホラーゼ溶液の代わりに６７ｍｇ／Ｌ  １−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ水溶液を使用する以外は実施例２と同様にして赤発色ＬＤＨ試験紙を得た。
【実施例６】
【００２１】
ジアホラーゼ溶液の代わりに６７ｍｇ／Ｌ  １−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ水溶液を使用する以外は実施例３と同様にして黄発色ＬＤＨ試験紙を得た。
【００２２】
実施例１により得られたＬＤＨ試験紙の評価を行った。
〔唾液検査の方法〕
４６人の成人被験者に水でうがいをさせた後、１分間後に安静時唾液を約１００μＬ、アルミホイル上に吐出させた。試験紙を唾液に浸した後に遮光し、１分間後の色の濃さを１０種類の濃度の色見本の中で最も近いものから選んだ。なお、色の濃さは１０が最も濃く、１が最も薄いものとした。
【００２３】
〔歯周組織の検査〕
各被験者の全ての歯を対象に、歯周ポケットプローブを用いて、１歯に対して６ヶ所を検査し、プロービング後の出血の有無を評価した。
【００２４】
〔歯周病ありの定義〕
全歯の全ての測定箇所のうち、２０％以上に出血の見られた者を「歯周病あり」と定義した。
【００２５】
〔判定結果〕
４６人の被験者のうち、１２人が「歯周病あり」と判定された。
【００２６】
〔カットオフ値の決定と検査特性〕
唾液検査のカットオフ値を求めるために統計ソフトウェア（ＳＰＳＳ  １５．０Ｊ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標））を用いて、ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ  （ＲＯＣ曲線）を作成して検討したところ、色見本の７と８の間がカットオフ値となった。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
〔唾液検査の結果〕
表１の結果により、本発明に係るＬＤＨ試験紙は歯周病の程度に応じて呈色度合いが変化し、罹患状態の判別が可能であることが確認された。このときの敏感度は０．９２、特異度は０．８２となり、ＲＯＣ曲線下の面積は０．９４であった。ＬＤＨ試験紙の呈色と歯周病罹患状態には高い相関性がみられ、唾液を検体として歯周病罹患状態を診断することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明により、従来のＣＰＩによる歯周病診断で課題であった、歯科医師の診断技術、診断時間、受診者の不快感等の問題が解消され、特殊な実験器具や測定機器等を必要とせず、受診者自身でも簡便かつ迅速に歯周病罹患状態を診断することが可能となり、その社会的な有用性は非常に大である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】呈色の機構の例を示す図である。
【図２】呈色の機構の他の例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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