(57)【要約】【課題】炎症状態を有するか炎症状態の発症の危険がある患者に関する予後を得る方法及びキット。【解決手段】炎症状態を有するか炎症状態の発症の危険がある患者に関する予後を得る方法であって、前記患者のプロテインＣ遺伝子の１又は２以上の多型部位を含む遺伝子型であって、前記患者が炎症状態から回復する能力を示す遺伝子型を決定することを含む方法が提供される。【選択図】図１
2010142252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症状態を有するか炎症状態の発症の危険がある患者に関する予後を得るために遺伝子型を決定する方法であって、
前記患者のプロテインＣ遺伝子の１又は２以上の多型部位を含む遺伝子型を決定することを含み、前記遺伝子型は、前記患者が炎症状態から回復する能力を示し、前記多型部位は、配列番号１の位置２４１８又は該位置２４１８と連鎖不平衡にある多型部位に対応し、前記炎症状態は敗血症又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記多型部位は、配列番号１の位置２４１８、１３８６、２５８３又は３９２０に対応する請求項１の方法。
【請求項３】
遺伝子型は、２又は３以上の多型部位の組合せにおいて決定され、該組合せは、配列番号１の以下の位置（複数）の群から選択される請求項１の方法：
５８６７及び２４０５；
５８６７及び４９１９；
５８６７及び４９５６；
５８６７及び６１８７；
５８６７及び９５３４；
５８６７及び１２１０９；
４８００及び２４０５；
４８００及び４９１９；
４８００及び４９５６；
４８００及び６１８７；
４８００及び９５３４；
４８００及び１２１０９；
９１９８及び６３７９及び２４０５；
９１９８及び６３７９及び４９１９；
９１９８及び６３７９及び４９５６；
９１９８及び６３７９及び６１８７；
９１９８及び６３７９及び９５３４；及び
９１９８及び６３７９及び１２１０９。
【請求項４】
前記決定された遺伝子型と、前記患者と同様の炎症状態又は他の炎症状態からの回復に関する予後を示す既知の遺伝子型とを比較することを更に含む請求項１〜３の何れか一の方法。
【請求項５】
前記患者のプロテインＣ遺伝子配列を得ることを更に含む請求項１〜４の何れか一の方法。
【請求項６】
遺伝子型の前記決定は、前記患者からの核酸試料に対して実行される請求項１〜４の何れか一の方法。
【請求項７】
遺伝子型の前記決定は、
（ａ）制限フラグメント長分析
（ｂ）シークエンシング
（ｃ）ハイブリダイゼーション
（ｄ）オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ
（ｅ）ライゲーションローリングサークル増幅
（ｆ）５’ヌクレアーゼアッセイ
（ｇ）ポリメラーゼプルーフリーディング法
（ｈ）アレル特異的ＰＣＲ、及び
（ｉ）リーディング配列データ
の１又は２以上を含む請求項１〜６の何れか一の方法。
【請求項８】
前記患者の前記遺伝子型は、炎症状態からの回復の可能性の低下を示す請求項１〜７の何れか一の方法。
【請求項９】
前記予後は、重病患者の重篤な心血管又は呼吸器障害を示す請求項８の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子型は、以下の単独の多型部位及び多型部位の組合せの群から選択される請求項８又は９の方法：
１３８６Ｔ；
２４１８Ａ；
２５８３Ａ；
３９２０Ｔ；
５８６７Ａ及び２４０５Ｔ；
５８６７Ａ及び４９１９Ａ；
５８６７Ａ及び４９５６Ｔ；
５８６７Ａ及び６１８７Ｃ；
５８６７Ａ及び９５３４Ｔ；
５８６７Ａ及び１２１０９Ｔ；
４８００Ｇ及び２４０５Ｔ；
４８００Ｇ及び４９１９Ａ；
４８００Ｇ及び４９５６Ｔ；
４８００Ｇ及び６１８７Ｃ；
４８００Ｇ及び９５３４Ｔ；
４８００Ｇ及び１２１０９Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び２４０５Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び４９１９Ａ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び４９５６Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び６１８７Ｃ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び９５３４Ｔ；及び
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び１２１０９Ｔ。
【請求項１１】
前記患者の前記遺伝子型は、炎症状態からの回復の可能性の上昇を示す請求項１〜７の何れか一の方法。
【請求項１２】
前記予後は、重病患者の重篤度が低い心血管又は呼吸器障害を示す請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子型は、以下の単独の多型部位及び多型部位の組合せの群から選択される請求項１１又は１２の方法：
１３８６Ｃ；
２４１８Ｇ；
２５８３Ｔ；
３９２０Ｃ；
５８６７Ｇ及び２４０５Ｃ；
５８６７Ｇ及び４９１９Ｇ；
５８６７Ｇ及び４９５６Ｃ；
５８６７Ｇ及び６１８７Ｔ；
５８６７Ｇ及び９５３４Ｃ；
５８６７Ｇ及び１２１０９Ｃ；
４８００Ｃ及び２４０５Ｃ；
４８００Ｃ及び４９１９Ｇ；
４８００Ｃ及び４９５６Ｃ；
４８００Ｃ及び６１８７Ｔ；
４８００Ｃ及び９５３４Ｃ；及び
４８００Ｃ及び１２１０９Ｃ。
【請求項１４】
前記炎症状態は、全身性炎症反応症候群である請求項１〜１３の何れか一の方法。
【請求項１５】
患者の予後と関連するプロテインＣ遺伝子配列中の多型を同定する方法であって、
ａ）患者群から得た核酸試料からプロテインＣ遺伝子配列情報を得ること
ｂ）前記プロテインＣ遺伝子中の少なくとも１つの多型の部位を同定すること
ｃ）前記患者群内の個々の患者に関する前記部位における遺伝子型を決定すること
ｄ）前記患者群内の個々の患者の炎症状態から回復する能力を決定すること、及び
ｅ）ステップｃ）で決定された遺伝子型と、ステップｄ）で決定された患者の能力（ないし可能性）との相関性を求めること、
前記炎症状態は敗血症又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）であること、
を含む方法。
【請求項１６】
患者が炎症状態から回復する能力の予後を提供するために、該患者のプロテインＣ遺伝子配列の多型部位内の所定のヌクレオチド位置において遺伝子型を決定するためのキットであって、
前記多型部位において交代ヌクレオチドを識別可能な制限酵素、又は前記多型部位に対する十分な相補性を有しかつ該交代ヌクレオチドを識別可能な標識されたオリゴヌクレオチドを、パッケージ内に含み、前記交代ヌクレオチドは、配列番号１の位置２４１８及び該位置２４１８と連鎖不平衡にある多型部位内のヌクレオチド位置の１又は２以上に対応し、前記炎症状態は敗血症又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、キット。
【請求項１７】
前記交代ヌクレオチドは、配列番号１の位置２４１８、１３８６、２５８３及び３９２０の１又は２以上に対応する請求項１６のキット。
【請求項１８】
前記交代ヌクレオチドは、位置２４１８に対応する請求項１７のキット。
【請求項１９】
前記制限酵素と、前記多型部位を包囲する領域の増幅に好適な１つのオリゴヌクレオチド又は複数のオリゴヌクレオチドのセットとを含む請求項１６、１７又は１８のキット。
【請求項２０】
重合剤を更に含む請求項１９のキット。
【請求項２１】
遺伝子型を決定するための前記キットの使用説明書を更に含む請求項１６〜２０の何れか一のキット。
【請求項２２】
炎症状態を有するか炎症状態の発症の危険がある被検体に関する予後を得るために遺伝子型を決定する方法であって、
該方法は、配列番号１の位置２４１８、１３８６、２５８３及び３９２０又はこれらと連鎖不平衡にある位置から選択される前記被検体のプロテインＣ遺伝子の１又は２以上の多型部位を含む遺伝子型を決定することを含み、前記遺伝子型は、前記被検体が前記炎症状態から回復する能力を示し、前記位置２４１８、１３８６、２５８３及び３９２０におけるヌクレオチドと前記予後と間の関連は、以下の（１）〜（８）：
（１）センス鎖２４１８Ａ又はアンチセンス鎖２４１８Ｔは前記炎症状態から回復する能力の低下の予後を示す；
（２）センス鎖２４１８Ｇ又はアンチセンス鎖２４１８Ｃは前記炎症状態から回復する能力の上昇の予後を示す；
（３）センス鎖２５８３Ａ又はアンチセンス鎖２５８３Ｔは前記炎症状態から回復する能力の低下の予後を示す；
（４）センス鎖２５８３Ｔ又はアンチセンス鎖２５８３Ａは前記炎症状態から回復する能力の上昇の予後を示す；
（５）センス鎖１３８６Ｔ又はアンチセンス鎖１３８６Ａは前記炎症状態から回復する能力の低下の予後を示す；
（６）センス鎖１３８６Ｃ又はアンチセンス鎖１３８６Ｇは前記炎症状態から回復する能力の上昇の予後を示す；
（７）センス鎖３９２０Ｔ又はアンチセンス鎖３９２０Ａは前記炎症状態から回復する能力の低下の予後を示す；
（８）センス鎖３９２０Ｃ又はアンチセンス鎖３９２０Ｇは前記炎症状態から回復する能力の上昇の予後を示す、
であり、
前記炎症状態は敗血症又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００２年５月２８に出願した米国仮出願第６０／３８３，１２８号に関連する。この仮出願の開示内容は引用を以って本書に繰り込み本書に記載されているものとする。
【技術分野】
【０００２】
本発明の技術分野は、炎症状態を有する患者の評価又は処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
プロテインＣは、活性化されて活性プロテインＣ（ＡＰＣ）を形成するが、３つの生物学的プロセスないし状態、即ち凝血、線溶及び炎症において重要な役割を演じる。急性炎症状態は、遊離型のプロテインＳのレベルを減じるが、遊離型プロテインＳは、ＡＰＣの重要な補因子なので、ＡＰＣの機能も減じられる。腐敗症（ないし敗血症）、急性炎症及びサイトカインは、内皮細胞におけるトロンボモジュリン発現を減じるため、ＡＰＣの活性ないしレベルも減じられる。敗血症ショックは、トロンボモジュリンの循環レベルを増加するが、これは、内皮細胞トロンボモジュリンの切断増加と関連する。腐敗症におけるＡＰＣの機能低下の他の機構としては、ＴＮＦ−αのようなエンドトキシン及びサイトカインが内皮細胞プロテインＣレセプター（ＥＰＣＲ）の発現を下方制御することによりＡＰＣの作用を低下することがある。髄膜炎菌血症のような重篤な腐敗症状態もまたプロテインＣの消耗に繋がる。プロテインＣレベルの抑制は、紫斑病、指状梗塞（digital infarction）及び髄膜炎菌血症における死に関わる。
【０００４】
プロテインＣは、心肺バイパス形成手術（ＣＰＢ）後の非敗血症患者において改変される。プロテインＣ、ＡＰＣ及びプロテインＳは、トータルで、ＣＰＢ中に減少する。大動脈のクランプ解除（ＣＰＢ終了時の再灌流）後、プロテインＣはさらに活性化されるため、残余の非活性プロテインＣの割合は著しく減じる。ＣＰＢ中及び後のプロテインＣの減少は、術中及び術後の血栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、器官虚血及び炎症の危険を増大する。活性プロテインＣが少ない患者では、一般的に、心機能の回復に障害が見られたが、このことは、低レベルのプロテインＣは微小血管血栓及び心筋虚血の危険を増大するという考えと一致する。アプロチニンは、ＡＰＣの競合的阻害剤であり、心臓手術及びＣＰＢにおいて使用されることが時折ある。アプロチニンは、極低体温循環停止後の術後血栓性合併症の原因として意味付けられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細菌内毒素及び心肺バイパス形成手術（ＣＰＢ）のような腐敗症性及び非腐敗症性刺激は、凝血システムを活性化し、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を誘発する。プロテインＣレベルの減少は、敗血症ショックの患者（グリフィン（GRIFFIN）JH. et al. (1982) Blood 60: 261-264; テイラー（TAYLOR）FB. et al. (1987) J. Clin. Invest. 79: 918-925; ヘッセルヴィク（HESSELVIK）JF. et al. (1991) Thromb. Haemost. 65: 126-129; フィジンヴァンドラート（FIJNVANDRAAT）K. et al. (1995) Thromb. Haemost. 73(1): 15-20）、重篤な感染を有する患者（ヘッセルヴィク JF. et al.(1991) Thromb. Haemost. 65: 126-129）及び大手術後の患者（ブレーミー（BLAMEY）SL. et al. (1985) Thromb. Haemost. 54: 622-625）において示されている。この減少は、プロテインＣの転写の減少に起因することが提案されている（スペック（SPEK）CA. et al. J. Biological Chemistry (1995) 270(41): 24216-21 at 24221）。また、プロテインＣ活性化に要求される内皮経路は重篤な髄膜炎菌性敗血症において損なわれることも示されている（ファウスト（FAUST）SN. et al. New Eng. J. Med. (2001) 345: 408-416）。腐敗症患者における低レベルのプロテインＣは予後不良と関連する（ヤン（YAN）SB.及び ダイノート（DHAINAUT）J-F. Critical Care Medicine (2001) 29 (7): S69-S74; フィシャー（FISHER）CJ.及びヤン SB. Critical Care Medicine (2000) 28 (9 Suppl): S49-S56; ヴァーヴレート（VERVLOET）MG. et al. Semin Thromb Hemost. (1998) 24(1): 33-44; ローレンテ（LORENTE）JA. et al. Chest (1993) 103 (5): 1536-42）。組換えヒト活性プロテインＣは、重篤な腐敗症又は敗血症ショックを有する患者における死亡率を低下する（バーナード（BERNARD）GR. et al. New Eng. J. Med. (2001) 344: 699-709）。従って、プロテインＣは、全身性炎症反応症候群において重要で有益な役割を演ずるように思われる。
【０００６】
ヒトプロテインＣ遺伝子は、染色体２ｑ１３−ｑ１４に位置し、１１ｋｂにわたる。代表的なホモ・サピエンスプロテインＣ遺伝子配列は、ジーンバンクにアクセッション番号ＡＦ３７８９０３で登録されている。３つの一塩基多型（ＳＮＰｓ）がプロテインＣ遺伝子の５’非翻訳プロモーター領域において同定されており、（フォスター（FOSTER）DC. et al. Proc Natl Acad Sci U S A (1985) 82 (14): 4673-4677の番号付与体系によれば）−１６５４Ｃ／Ｔ、−１６４１Ａ／Ｇ及び−１４７６Ａ／Ｔとして特徴付けられ、また（ミラー（MILLAR）DS. et al. Hum. Genet. (2000) 106: 646-653 at 651によれば）−１５３Ｃ／Ｔ、−１４０Ａ／Ｇ及び−２６Ａ／Ｔとして特徴付けられる。
【０００７】
−１６５４Ｃ／−１６４１Ｇ／−１４７６Ｔに対しホモ接合性の遺伝子型は、−１６５４Ｔ／−１６４１Ａ／−１４７６Ａホモ接合性遺伝子型と比べると、プロテインＣ遺伝子の転写速度の低下と関連付けられている（スコープス（SCOPES）D.et al. Blood Coagul. Fibrinolysis (1995) 6 (4): 317-321）。−１６５４Ｃ／−１６４１Ｇ／−１４７６Ｔ遺伝子型に対しホモ接合性の患者は、−１６５４Ｔ／−１６４１Ａ／−１４７６Ａ遺伝子型に対しホモ接合性の患者と比べると、血漿プロテインＣレベル及びプロテインＣ活性レベルに関し２２％の減少を示す（スペック（SPEK）CA. et al. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology (1995) 15: 214-218）。−１６５４Ｃ／−１６４１Ｇハプロタイプは、−１６５４Ｔ／−１６４１Ａと比べると、ホモ接合体及びヘテロ接合体の両者において低濃度のプロテインＣと関連付けられている（アイアック（AIACH）M. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. (1999) 19 (6): 1573-1576）。
【０００８】
本発明は、部分的に、プロテインＣの減少に関連する科学文献において特徴付けられたプロテインＣプロモーター多型の２つが、炎症状態を有する患者における予後ないし患者結果の改善と関連するという驚くべき発見に基づく。更に、種々のプロテインＣ多型は、患者結果の指標として、患者のスクリーニングに対して有用であり、また炎症状態からの回復に対する予後に対して有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一側面によれば、炎症状態を有するかその発症の危険がある患者に関する予後ないし医学上の見通しを得るための方法であって、該患者のプロテインＣ遺伝子の１又は２以上の多型部位を含む遺伝子型であって、該患者が炎症状態から回復する能力（ないし可能性）の指標をなす遺伝子型を決定することを含む方法が提供される。
【００１０】
多型部位は、配列番号１の位置２４１８又はそれとリンクした多型部位に対応し得る。また、多型部位は、配列番号１の位置２４１８、１３８６、２５８３又は３９２０に対応する。
【００１１】
遺伝子型は、２又は３以上の多型部位の組合せであって、配列番号１の以下の複数の位置の群から選択される組合せにおいて決定され得る：
５８６７及び２４０５；
５８６７及び４９１９；
５８６７及び４９５６；
５８６７及び６１８７；
５８６７及び９５３４；
５８６７及び１２１０９；
４８００及び２４０５；
４８００及び４９１９；
４８００及び４９５６；
４８００及び６１８７；
４８００及び９５３４；
４８００及び１２１０９；
９１９８及び６３７９及び２４０５；
９１９８及び６３７９及び４９１９；
９１９８及び６３７９及び４９５６；
９１９８及び６３７９及び６１８７；
９１９８及び６３７９及び９５３４；及び
９１９８及び６３７９及び１２１０９。
【００１２】
本発明の他の一側面によれば、上記のように決定された遺伝子型と、当該患者と同じ炎症状態又は他の炎症状態からの回復に関する予後の指標をなす既知の遺伝子型とを比較することを更に含む方法が提供される。
【００１３】
患者の遺伝子型は、炎症状態からの回復の可能性ないし見込みの減少を示すか、又は重病患者の重篤な心血管又は呼吸器障害の予後を示し得る。更に、そのような遺伝子型は、以下の単独の多型部位及び複数の多型部位の組合せの群から選択することも可能である：
１３８６Ｔ；
２４１８Ａ；
２５８３Ａ；
３９２０Ｔ；
５８６７Ａ及び２４０５Ｔ；
５８６７Ａ及び４９１９Ａ；
５８６７Ａ及び４９５６Ｔ；
５８６７Ａ及び６１８７Ｃ；
５８６７Ａ及び９５３４Ｔ；
５８６７Ａ及び１２１０９Ｔ；
４８００Ｇ及び２４０５Ｔ；
４８００Ｇ及び４９１９Ａ；
４８００Ｇ及び４９５６Ｔ；
４８００Ｇ及び６１８７Ｃ；
４８００Ｇ及び９５３４Ｔ；
４８００Ｇ及び１２１０９Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び２４０５Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び４９１９Ａ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び４９５６Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び６１８７Ｃ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び９５３４Ｔ；及び
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び１２１０９Ｔ。
【００１４】
患者の遺伝子型は、炎症状態からの回復の見込みないし可能性の上昇を示すか、又は重病患者の重篤度が低い心血管又は呼吸器障害の予後を示すことができる。更に、そのような遺伝子型は、以下の単独の多型部位及び複数の多型部位の組合せの群から選択することも可能である：
１３８６Ｃ；
２４１８Ｇ；
２５８３Ｔ；
３９２０Ｃ；
５８６７Ｇ及び２４０５Ｃ；
５８６７Ｇ及び４９１９Ｇ；
５８６７Ｇ及び４９５６Ｃ；
５８６７Ｇ及び６１８７Ｔ；
５８６７Ｇ及び９５３４Ｃ；
５８６７Ｇ及び１２１０９Ｃ；
４８００Ｃ及び２４０５Ｃ；
４８００Ｃ及び４９１９Ｇ；
４８００Ｃ及び４９５６Ｃ；
４８００Ｃ及び６１８７Ｔ；
４８００Ｃ及び９５３４Ｃ；及び
４８００Ｃ及び１２１０９Ｃ。
【００１５】
本発明の他の一側面によれば、患者の予後と関連するプロテインＣ遺伝子配列中の多型を同定する方法が提供される。この方法は、患者群からプロテインＣ遺伝子配列情報を得ること、該プロテインＣ遺伝子中の少なくとも１つの多型の部位を同定すること、該患者群内の個々の患者に関する該部位における遺伝子型を決定すること、該患者群内の個々の患者の炎症状態から回復する能力（ないし可能性）を決定すること、及び決定された遺伝子型と患者の能力（ないし可能性）との相関性を求めることを含む。
【００１６】
上記相関性決定方法は、十分に有意な相関性を達成するために、十分な大きさの患者母集団に対して繰り返し実行することも可能である。
【００１７】
本発明の方法は、更に、患者のプロテインＣ遺伝子配列を得るステップ又は患者から核酸試料を得るステップを含む。遺伝子型の決定は、患者からの核酸試料に対して実行してもよい。
【００１８】
位置２４１８のヌクレオチドに対応する患者の遺伝子型がアデニン（Ａ）である場合、予後は、炎症状態から回復する見込みないし可能性の減少、又は重病患者の重篤な心血管又は呼吸器障害を示し得る。
【００１９】
位置２４１８のヌクレオチドに対応する患者の遺伝子型がグアニン（Ｇ）である場合、予後は、炎症状態から回復する見込みないし可能性の増加、又は重病患者の重篤度の低い心血管又は呼吸器障害を示し得る。
【００２０】
炎症状態は、腐敗症、敗血症、肺炎、敗血症ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷、感染、膵炎、菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷に起因する炎症、手術に起因する炎症、慢性炎症疾患、虚血、器官又は組織の虚血−再灌流損傷、疾患に起因する組織傷害、化学療法又は放射線療法に起因する組織傷害、及び経口摂取された、吸入された、注入された、注射された又は送達された物質に対する反応からなる群から選択される。
【００２１】
遺伝子型の決定は、制限フラグメント長分析；シークエンシング；ハイブリダイゼーション；オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ；ライゲーションローリングサークル増幅；５’ヌクレアーゼアッセイ；ポリメラーゼプルーフリーディング法；アレル特異的ＰＣＲ、及びリーディング配列データ、の１又は２以上を含み得る。
【００２２】
本発明の他の一側面によれば、患者が炎症状態から回復する能力（ないし可能性）の予後を提供するために、該患者のプロテインＣ遺伝子配列の多型部位内の所定のヌクレオチド位置において遺伝子型を決定するためのキットであって、該多型部位において交代ヌクレオチドを識別可能な制限酵素、又は該多型部位に対する十分な相補性を有しかつ該交代ヌクレオチドを識別可能な標識されたオリゴヌクレオチドを、パッケージ内に含むキットが提供される。
【００２３】
交代ヌクレオチドは、配列番号１の位置２４１８、配列番号２の位置８、又はそれ（ら）とリンクした多型に対応し得る。また、交代ヌクレオチドは、配列番号１の位置２４１８、１３８６、２５８３及び３９２０の１又は２以上に対応し得る。
【００２４】
制限酵素を有するキットは、多型部位を包囲する領域の増幅に好適な１つのオリゴヌクレオチド又は複数のオリゴヌクレオチドのセット、重合剤、及び遺伝子型を決定するためのキットの使用説明書も含み得る。
【００２５】
本発明の他の一側面によれば、炎症状態を有するかその発症の危険がある患者における患者予後を決定するための方法であって、プロテインＣプロモーター領域中の１又は２以上の多型の同一性であって、該患者の該炎症状態から回復する能力ないし可能性を示す１又は２以上の多型の同一性を検出することを含む方法が提供される。
【００２６】
本発明の他の一側面によれば、（ａ）患者からプロテインＣ遺伝子配列情報を得るステップ、及び（ｂ）プロモーター領域中の１又は２以上の多型であって、患者が炎症状態から回復する能力ないし可能性を示し得る１又は２以上の多型の同一性を決定するステップを含む患者スクリーニングを実行する方法が提供される。
【００２７】
本発明の他の一側面によれば、（ａ）炎症状態を発症する危険又は炎症状態を現に有していることに基づき患者を選択するステップ、（ｂ）当該患者からプロテインＣ遺伝子配列情報を得るステップ、及び（ｃ）該プロテインＣ遺伝子中の１又は２以上の多型であって、患者が炎症状態から回復する能力ないし可能性を示す多型を検出するステップを含む患者スクリーニングを実行する方法が提供される。
【００２８】
上記の配列位置は、プロテインＣ遺伝子プロモーター領域の有意鎖に関する。分析は患者の結果を決定するために反意鎖に対して実行可能であることは当業者には明らかである。
【００２９】
より重篤な患者結果又は予後は、より大きいプロテインＣ発現と関係付けることができ、又は逆にいえば重篤度がより小さい患者結果又は予後の指標は、より小さいプロテインＣ発現と関係付けることができるが、これは、予期されたことと反対である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
１．定義
【００３１】
以下の記載においては、幾つかの用語は頻繁に使用されるが、本発明の理解の容易化のため以下のような定義づけを行う。
【００３２】
「遺伝物質」は、任意の核酸を含み、一本鎖又は二本鎖の何れかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーであり得る。
【００３３】
「プリン」は、融合したピリミジン及びイミダゾール環を含む複素環式有機化合物であり、プリン塩基、即ちアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）の親化合物として作用する。「ヌクレオチド」は、一般に、ペントース、通常、リボース又はデオキシリボースと共有結合したプリン（Ｒ）又はピリミジン（Ｙ）塩基である。なお、この糖は、１又は２以上のリン酸基を担持する。核酸は、一般に、３’５’リン酸ジエステル結合により結合したヌクレオチドのポリマーである。本書で使用する場合、「プリン」は、プリン塩基、即ちＡ及びＧを指称するために使用するが、広義では、ポリヌクレオチド鎖の成分としての、ヌクレオチドモノマー、即ち、デオキシアデノシン−５’−リン酸及びデオキシグアノシン−５’−リン酸をも意味するものとする。
【００３４】
「ピリミジン」は、ヌクレオチド塩基、即ちシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）を構成する単環式有機塩基である。本書で使用する場合、「ピリミジン」は、ピリミジン塩基、即ちＣ、Ｔ及びＵを指称するために使用されるが、広義では、プリンヌクレオチドと共にポリヌクレオチド鎖の成分をなすピリミジンヌクレオチドモノマーをも意味するものとする。
【００３５】
「多型性部位（polymorphic site）」又は「多型部位（polymorphism site）」又は「一塩基多型部位」（ＳＮＰ部位）は、本書で使用される場合、所定の配列内において相違が生じている座位ないし位置である。好ましい多型性部位は、選択された母集団において１％以上の頻度、好ましくは１０％又は２０％の頻度でそれぞれ現れる少なくとも２つのアレルを有する。多型部位は、ある核酸配列内の既知の位置であってもよく、本書に記載した方法によって存在が特定されてもよい。
【００３６】
「プロモーター」領域は、翻訳開始部位の５’又は上流であるが、この場合、翻訳開始部位は、表１Ａ（配列番号１）の位置４０６２に位置し、転写開始部位は、表１Ａ（配列番号１）の位置２５５９に位置する。
【００３７】
多数の他の部位がプロテインＣ遺伝子の多型として同定されているが、これら多型は、配列番号１の位置２４１８における多型とリンクしており、従って患者の予後を示し得る。以下の単独の多型部位及び複数の多型部位の組合せは、配列番号１の位置２４１８とリンクしている：
１３８６；
２５８３；
３９２０；
５８６７及び２４０５；
５８６７及び４９１９；
５８６７及び４９５６；
５８６７及び６１８７；
５８６７及び９５３４；
５８６７及び１２１０９；
４８００及び２４０５；
４８００及び４９１９；
４８００及び４９５６；
４８００及び６１８７；
４８００及び９５３４；
４８００及び１２１０９；
９１９８及び６３７９及び２４０５；
９１９８及び６３７９及び４９１９；
９１９８及び６３７９及び４９５６；
９１９８及び６３７９及び６１８７；
９１９８及び６３７９及び９５３４；及び
９１９８及び６３７９及び１２１０９。
【００３８】
位置２４１８と更にリンクする単独の多型部位及び複数の多型部位の組合せが決定可能であることは当業者であれば認識できる。ハプロタイプのプロテインＣは、期待最大化（expectation maximization）アルゴリズムを有するプログラム（即ち、ＰＨＡＳＥ）を用いて正常な被検体におけるプロテインＣのスニップスを評価することにより生成することができる。構築されたハプロタイプのプロテインＣは、２４１８に関し総（total）連鎖不平衡（ＬＤ）にあるスニップスの組合せを発見するために使用することも可能である。従って、１つの個体のハプロタイプは、２４１８に関し総ＬＤにある他のスニップスの遺伝子型を求めることにより決定することも可能である。結合された単独の多型部位又は複数の多型部位の組合せは、患者の予後を評価するために遺伝子型を求められることも可能である。
【００３９】
単独の多型部位及び複数の多型部位の組合せに関する以下の遺伝子型は、炎症状態からの回復の見込みないし可能性の低下を示すことができ、又は重病患者の重篤な心血管又は呼吸器障害を示すことができる：
１３８６Ｔ；
２５８３Ａ；
３９２０Ｔ；
５８６７Ａ及び２４０５Ｔ；
５８６７Ａ及び４９１９Ａ；
５８６７Ａ及び４９５６Ｔ；
５８６７Ａ及び６１８７Ｃ；
５８６７Ａ及び９５３４Ｔ；
５８６７Ａ及び１２１０９Ｔ；
４８００Ｇ及び２４０５Ｔ；
４８００Ｇ及び４９１９Ａ；
４８００Ｇ及び４９５６Ｔ；
４８００Ｇ及び６１８７Ｃ；
４８００Ｇ及び９５３４Ｔ；
４８００Ｇ及び１２１０９Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び２４０５Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び４９１９Ａ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び４９５６Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び６１８７Ｃ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び９５３４Ｔ；及び
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び１２１０９Ｔ。
【００４０】
単独の多型部位及び複数の多型部位の組合せに関する以下の遺伝子型は、炎症状態からの回復の見込みないし可能性の上昇を示すことができ、又は重病患者の重篤度の低い心血管又は呼吸器障害を示すことができる：
１３８６Ｃ；
２５８３Ｔ；
３９２０Ｃ；
５８６７Ｇ及び２４０５Ｃ；
５８６７Ｇ及び４９１９Ｇ；
５８６７Ｇ及び４９５６Ｃ；
５８６７Ｇ及び６１８７Ｔ；
５８６７Ｇ及び９５３４Ｃ；
５８６７Ｇ及び１２１０９Ｃ；
４８００Ｃ及び２４０５Ｃ；
４８００Ｃ及び４９１９Ｇ；
４８００Ｃ及び４９５６Ｃ；
４８００Ｃ及び６１８７Ｔ；
４８００Ｃ及び９５３４Ｃ；及び
４８００Ｃ及び１２１０９Ｃ。
【００４１】
（１つの）配列内の（複数の）多型の位置の数値名称が特定の配列に対して相対的なものであることは、当業者であれば認識できる。上掲フォスターet al.及びミラーet al.における対応する多型の異なるナンバリング法によって説明されたように、同じ位置同士が、配列がナンバリングされ及び配列が選択される態様に応じて異なる数値名称を付与されこともまたあり得る。更に、挿入又は削除のような、母集団内での配列変化により、多型部位における及びその周囲における特定のヌクレオチドの相対位置従って数値名称が変化し得る。
【００４２】
後掲表１Ａは、ホモ・サピエンスプロテインＣ遺伝子配列の代表例であり、ジーンバンクにアクセッション番号ＡＦ３７８９０３で登録された配列を含む。フォスターet al.のナンバリングシステムを用いて−１６５４Ｃ／Ｔ、−１６４１Ａ／Ｇ及び−１４７６Ａ／Ｔとして記述されるスニップスは、それぞれ、表１Ａ（配列番号１）の２０４５、２４１８及び２５８３に対応する。後掲表１Ａに示す多型部位は、白三角印の頂点に位置する大文字Ｎによって表されている。大文字Ｎは、遺伝子型における変化が（１つの）母集団内のそれらの位置において可能であることを示すために使用される。２４１８多型は、その位置におけるヌクレオチドがａ、ｔ、ｕ、ｇ又はｃであり得ることを示す（１つの）Ｎによって示されている。しかしながら、位置２４１８における遺伝子型は、最も一般的にはａ又はｇ（プリン）ヌクレオチドである。
【００４３】
表１Ａ
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【００４４】
表１Ｂに示した配列は、上掲表１Ａに示したプロテインＣ配列から抜き出した配列フラグメントである。更に、配列番号２は、上掲表１Ａにおいて下線を引いた配列に対応する。配列番号２の位置８のヌクレオチドＮは、配列番号１の位置２４１８に見出されるヌクレオチドに対応する。後掲表２Ｂに記載した配列のすべてにおいて、大文字Ｎで表した多型は、ａ、ｔ、ｕ、ｇ又はｃで置換されてもよい。更に、表２Ｂの配列番号３〜１１においてＮで表した太字のかつ下線を引いたヌクレオチドは、すべて、配列番号１の位置２４１８に見出されるヌクレオチドに対応する。プロテインＣ配列においては変化ないし変異が可能であるため、以下の配列モチーフは、（一人の）患者からの遺伝子型決定に好適なプロテインＣ配列の同定に有用であり得る。例えば、以下のモチーフ（配列番号３〜１１）と整列（一致）する患者配列は、当該患者配列はプロテインＣ配列であること、及び太字のかつ下線を引いたＮは、配列番号１の位置２４１８における多型に対応するため遺伝子型決定に好適であることを示し得る。本書で同定された他の多型部位に同様のストラテジーを適用することも可能である。
【００４５】
表１Ｂ
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【００４６】
「アレル（対立遺伝子）」は、所与の遺伝子の１又は２以上の他の任意の型として定義される。二倍体細胞又は生物においては、アレル対のメンバー（即ち、所与の遺伝子の２つのアレル）は、一対の相同染色体において対応する位置（座位ないし遺伝子座）を占有する。特定の遺伝子に関し、これらアレルが遺伝的に同一であれば、当該（二倍体）細胞又は生物は「ホモ接合体」と指称され、遺伝的に異なる場合は、当該（二倍体）細胞又は生物は「ヘテロ接合体」と指称される。
【００４７】
「遺伝子」は、特定の機能性産物をコードする特定の染色体の特定の位置に位置するヌクレオチドの規則正しい配列であるが、当該コード領域に近接する非翻訳・非転写配列も含み得る。そのような非コード配列は、コード配列の転写・翻訳に必要な制御配列又はイントロン等を含み得る。
【００４８】
「遺伝子型」は、生物の遺伝的構成として定義されるが、通常特定の状況に関連する１つの遺伝子又は２〜３の遺伝子又は１つの遺伝子の１つの領域（即ち、特定の表現型の原因をなす遺伝子座）に関する。
【００４９】
「表現型」は、生物の観察可能な性質として定義される。
【００５０】
「一塩基多型」（ＳＮＰ：スニップ）は、１つの塩基によって占有される多型性部位において生起するが、これは、複数のアレル配列間の相違の部位に相当する。この部位の前後には、通常、アレルの高保存配列（例えば、母集団の１／１００ないし１／１０００未満の構成員において変化する配列。）が存在する。一塩基多型は、通常、多型性部位における１つの塩基の他の塩基による置換によって生起する。「トランジション」は、１つのプリンの他の１つのプリンによる置換又は１つのピリミジンの他の１つのピリミジンによる置換である。「トランスバージョン」は、１つのプリンの１つのピリミジンによる置換又は１つのピリミジンの１つのプリンによる置換である。また、一塩基多型は、基準アレル（reference allele）に関連する１つのヌクレオチドの削除又は１つのヌクレオチドの挿入からも生起し得る。更に、所与の配列内における挿入又は削除により、相対的な位置関係が変化され、従って当該配列内における他の多型の位置番号も変化され得ることは、当業者であれば認識できるであろう。
【００５１】
「全身性炎症反応症候群」ないし（ＳＩＲＳ）は、敗血性全身性炎症反応（即ち、腐敗症ないし敗血症又は敗血性ショック）及び非敗血性全身性炎症反応（即ち、術後の反応）の両者を含むものとして定義される。「ＳＩＲＳ」は、更に、ＡＣＣＰ（アメリカ胸部外科大学：American College of Chest Physicians）ガイドラインに応じ、Ａ）温度＞３８℃又は＜３６℃、Ｂ）心拍数＞９０拍／分、Ｃ）呼吸数＞２０息／分、及びＤ）白血球数＞１２，０００／ｍｍ３又は＜４，０００／ｍｍ３の条件のうちの２又は３以上が存在として定義される。以下の記載においては、「ＳＩＲＳ」基準のうちの２つ、３つ又は４つの存在が、２８日間の観察期間の間毎日記録された。
【００５２】
「腐敗症ないし敗血症（sepsis）」は、少なくとも２つの「ＳＩＲＳ」基準の存在として定義され、既知の又は疑いのある感染源である。敗血症ショックは、腐敗症と、ブラッセル基準による１つの更なる器官の機能不全と、昇圧剤投与の必要性との３つによって定義されている。
【００５３】
本書で使用する場合の患者の結果又は予後とは、炎症状態から回復する患者の能力ないし可能性をいうものとする。炎症状態は、腐敗症（sepsis）、敗血症（septicemia）、肺炎、敗血症ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷、感染、膵炎、菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷に起因する炎症、手術に起因する炎症、慢性炎症疾患、虚血、器官又は組織の虚血−再灌流損傷、疾患に起因する組織傷害、化学療法又は放射線療法に起因する組織傷害、及び経口摂取された、吸入された、注入された、注射された又は送達された物質に対する反応からなる群から選択され得る。
【００５４】
患者結果又は予後の評価は、種々の方法で実行することができる。例えば、“ＡＰＡＣＨＥ II”スコアは、Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（急性生理機能及び慢性健康評価）として定義され、本書においては、生の臨床及び実験変量（データ）から毎日計算した。ヴィンセント（Vincent）et al.（ヴィンセントJL. フェレイラ（Ferreira）F. モレノ（Moreno）R. Scoring systems for assessing organ dysfunction and survival. Critical Care Clinics. 16:353-366, 2000）は、ＡＰＡＣＨＥスコアについて以下のように要約している：「（ＡＰＡＣＨＥスコアは）１９８１年、クナウス（Knaus）et al.によって初めて開発された。ＡＰＡＣＨＥスコアは、世界中で最も一般的に使用されるＩＣＵ生存予測モデルとなった。ＡＰＡＣＨＥ IIスコアは、オリジナルのプロトタイプの修正・簡略化したバージョンであるが、１２の常用生理学的尺度の初期値、年齢及び以前の健康状態に基づいたポイントスコアを使用して、疾患の重症度の一般的尺度を提供する。記録される値（複数）は、ＩＣＵにおける患者の最初の２４時間の間に得られる最悪の値（複数）である。スコアは、疾患特異的死亡率（ＡＰＡＣＨＥ II予測致死リスク）を評価するために、３４の入院患者診断の１つに適用される。ＡＰＡＣＨＥ IIスコアの可能な最大値は７１であり、大きなスコアは、死亡との関連性が大きかった。ＡＰＡＣＨＥ IIスコアは、臨床試験に入る際の疾患の重症度により、腐敗症の患者を含む重病患者の種々のグループ間での等級分類及び比較のために広く使用された。」
【００５５】
「ブラッセルスコア」スコアは、ベースラインと比較した器官の機能障害を評価するための方法である。ブラッセルスコアが２以上の場合（即ち、中度、重度、又は極重度）、器官障害は、その特定の日に存在するものとして記録された（後掲表１Ｃ参照）。以下の記載では、観察期間中の死亡（数）を補正するために、生存及び器官障害解放日数（ＤＡＦ）が、以前に記載されたようにして計算された。例えば、急性肺損傷は、以下のようにして計算された。急性肺損傷は、患者が以下の４つの基準を全て充足した場合に存在するものとして定義される。この４つの基準とは、１）機械による人工呼吸の必要、２）急性肺損傷と一致する胸部Ｘ線写真における両側の肺の浸潤（の存在）、３）ＰａＯ２／ＦｉＯ２比が３００未満、４）鬱血性心不全の臨床的証拠の不存在又は肺動脈カテーテルが臨床目的のために適用される場合、肺毛細管楔入圧が１８ｍｍＨｇ（１）未満、である。急性肺損傷の重症度は、２８日間の観察期間にわたって生存及び急性肺損傷解放日数を測定することによって評価される。急性肺損傷は、患者がブラッセルスコアで定義されるような中度、重度又は極重度の機能障害を有する日毎に存在するものとして記録される。生存及び急逝肺損傷解放日数は、所定の観察期間（２８日間）の間に急性肺損傷が発症した後で患者が生存しておりかつ急性肺損傷から解放されている日数として計算される。従って、生存及び急逝肺損傷解放日数のより低いスコアは、急性肺損傷がより深刻であることを示す。生存及び急逝肺損傷解放日数が、急性肺損傷の単なる存在又は不存在よりも好まれる理由は、急性肺損傷は急性死亡率が大きく、（２８日以内の）早期の死亡は死亡した患者における急性肺損傷の存在又は不存在の計算を妨げることである。心血管系、腎臓、神経系、肝臓及び凝固の機能障害は、患者がブラッセルスコアによって定義されるような中度、重度又は極重度の機能障害を有する日毎に存在するものとして同様に定義された。生存及びステロイド解放日数は、患者が生存しかつ外因性副腎皮質ステロイド（例えば、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン）で治療されていない日数である。生存及び昇圧剤解放日数は、患者が生存しかつ静脈内昇圧剤（例えば、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、フェニレフリン）で治療されていない日数である。生存及び国際標準化比（ＩＮＲ：International Normalized Ratio）＞１．５解放日数は、患者が生存しかつＩＮＲ＞１．５を有しない日数である。
【００５６】
表１Ｃ
ブラッセル多器官機能障害（ＭＯＤ）スコア
2010142252.tif 000010
【００５７】
分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、測定のセット間の統計的有意差を試験するための標準的な統計的手法である。
【００５８】
フィッシャーの正確確率検定は、異なるグループで測定された要因のレート及びプロポーション速度間の統計的有意差を試験するための標準的な統計的手法である。
【００５９】
２．一般的方法
【００６０】
本発明の一側面は、炎症状態の発症の危険を有するか又は既に炎症状態を有する患者の同定ないし患者の選択を含み得る。例えば、大手術を受けた又は大手術の予定ないし計画のある患者は、炎症状態の発症の危険があるとみなすことができる。更に、患者は、医療分野で既知の診断方法及び臨床評価を用いて炎症状態を有すると決定されてもよい。炎症状態は、腐敗症（sepsis）、敗血症（septicemia）、肺炎、敗血症ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷、感染、膵炎、菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷に起因する炎症、手術に起因する炎症、慢性炎症疾患、虚血、器官又は組織の虚血−再灌流損傷、疾患に起因する組織傷害、化学療法又は放射線療法に起因する組織傷害、及び経口摂取された、吸入された、注入された、注射された又は送達された物質に対する反応からなる群から選択することができる。
【００６１】
患者が炎症状態を発症する危険を有するか又は既に有していると同定されると、遺伝子配列情報は、当該患者から得ることができる。或いは、遺伝子配列情報は、当該患者から既に（上記同定前に）得られたものであってもよい。例えば、患者は、他の目的のための生物学的試料を既に提供していてもよく、全部又は一部が決定されかつ将来の使用のために保存された遺伝子配列を有していてもよい。遺伝子配列情報は、種々の異なる方法で得ることができ、遺伝物質を含有する生物学的試料の採取を伴ってもよい。とりわけ、遺伝物質は、１又は２以上の目的の配列を含み得る。
【００６２】
身体試料を採取するための及び当該試料から遺伝物質を抽出するための多くの方法が当業者には知られている。遺伝物質は、血液、組織及び毛髪及びその他の試料から抽出することができる。生物物質からＤＮＡ及びＲＮＡを分離単離するための方法は多数知られている。典型的には、ＤＮＡは生物試料から単離され得る。この場合、まず生物試料が溶解され、次いで時間の長さが変化可能な種々の多段階プロトコールの何れか１つに応じてライセートからＤＮＡが単離される。ＤＮＡ単離法は、フェノールの使用を伴い得る（サンブルック（Sambrook）J. et al., "Molecular Cloning", Vol.2, pp.9.14-9.23, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)及びオースベル（Ausubel）,フレデリック（Frederick）M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Vol.1, pp. 2.2.1-2.4.5, John Wiley & Sons, Inc. (1994)）。典型的には、生物試料を界面活性剤溶液で溶解し、ライセートのタンパク質成分を１２〜１８時間タンパク質分解酵素で消化する。次に、ライセートをフェノールで抽出して細胞成分の大部分を除去し、残余の水相を更に処理してＤＮＡを単離する。ヴァンネス（Van Ness）et al.（米国特許第5,130,423号）に記載されたような他の方法では、非腐食性フェノール誘導体を用いて核酸を単離する。得られた調製物は、ＲＮＡとＤＮＡの混合物である。
【００６３】
ＤＮＡ単離の他の方法では、非腐食性カオトロピック試薬を用いる。この方法は、グアニジン塩、尿素及びヨウ化ナトリウムの使用を基礎とするのであるが、カオトロピック水溶液中での生物試料の溶解及びそれに続く低アルコールによる未精製ＤＮＡフラクションの沈殿を伴う。沈殿された未精製ＤＮＡフラクションの最終精製は、カラムクロマトグラフィー（アナレクツ（Analects）, (1994) Vol. 22, No.4, ファルマシア・バイオテック社）又はコーラー（Koller）（米国特許第5,128,247号）に記載されたような未精製ＤＮＡのポリアニオン含有タンパク質への曝露を含む幾つかある方法のうち何れか１つによって達成することができる。
【００６４】
ボットウェル（Botwell）, D.D.L.（Anal. Biochem. (1987) 162: 463-465）に記載されているＤＮＡ単離の更なる方法は、６Ｍ塩酸グアニジン中における細胞の溶解、２．５倍量のエタノールの添加による酸性ｐＨでのライセートからのＤＮＡの沈殿、及びエタノールでのＤＮＡの洗浄を伴う。
【００６５】
チョムジンスキー（Chomezynski）（米国特許第5,945,515号）によって記載された方法のような、ＲＮＡとＤＮＡの両方を単離するための他の方法も当業者には数多く知られている。チョムジンスキーの方法では、僅かに２０分程度で遺伝物質を効率的に抽出することができる。エバンズ（Evans）とヒュー（Hugh）（米国特許第5,989,431号）は、中空膜フィルターを用いたＤＮＡの単離方法を記載している。
【００６６】
患者の遺伝子配列情報が当該患者から得られたら、当該情報に対し、プロテインＣ遺伝子中の１又は２以上の多型の同一性又は遺伝子型を検出ないし決定するために更に評価を行うことができる。得られた遺伝物質が目的の配列を含有するとすれば、とりわけ、目的の患者のプロテインＣプロモーター遺伝子型であって、配列番号の位置２４１８又は配列番号２の位置８に対応する（１つの）ヌクレオチドを含む遺伝子型の決定に関心がもたれるであろう。また、この目的の配列は、更に、他のプロテインＣ遺伝子多型を含み又は目的の多型を包囲する配列の一部を含み得る。（１又は複数の）一塩基多型又は他の多型の塩基同一性又は遺伝子型の検出又は決定は、以下に列挙するものを含むがそれらに限定されない当業者には既知の多数の方法ないしアッセイの任意の１つによって達成することができる：
【００６７】
制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）ストラテジー−ＲＦＬＰゲル利用分析は、１つの遺伝子の複数の多型部位における複数のアレル間の識別に使用することができる。要約すれば、ＤＮＡの短セグメント（典型的には数百塩基対）をＰＣＲで増幅する。可能であれば、一方の変異体アレルが存在すれば該短ＤＮＡセグメントを切断し、他方の変異体アレルが存在すれば該短ＤＮＡセグメントを切断しない特殊な制限エンドヌクレアーゼが選択される。この制限エンドヌクレアーゼによるＰＣＲ増幅したＤＮＡをインキュベートした後、反応生成物をゲル電気泳動法を用いて分離する。そのため、このゲルを検査したとき現れる２つのより低分子量のバンド（電気泳動中、分子は、分子量がより小さいほど一層下方にゲル内を進行する。）は、元のＤＮＡ試料は選択された制限エンドヌクレアーゼによって切断可能なアレルを有していたことを示す。これに対し、（ＰＣＲ産物の分子量に関し）より大きい分子量のバンドが１つしか観察されない場合は、もとのＤＮＡ試料は、選択された制限エンドヌクレアーゼによっては切断不能なアレル変異体を有していたことを示す。最後に、より大きい分子量の１つのバンドとより小さい分子量の２つのバンドの両方が観察される場合は、元のＤＮＡ試料は、両方のアレルを含んでいた、従って患者はこの一塩基多型に対しヘテロ接合体であったことを示す；
【００６８】
シークエンシング（塩基配列決定法）−例えばシークエンシングのためのマクサム−ギルバート法（マクサムAM及びギルバートW. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74(4): 560-564）は、末端で標識されたＤＮＡの特異的化学的切断を伴う。この方法では、標識された同じＤＮＡの４つの試料が、それぞれ異なる化学反応にかけられて、特異的な塩基同一性の１又は２以上のヌクレオチドにおいてＤＮＡ分子の優先的な切断が実行される。部分的切断のみが得られるように条件ないし状態が調節されるため、ＤＮＡフラグメントは各試料において生成されるが、その長さは、当該切断にかけられる（１又は複数の）ヌクレオチドのＤＮＡ塩基配列内での位置に依存する。部分的切断が行われた後、各試料は、異なる長さのＤＮＡフラグメントを含むが、各フラグメントは、４つのヌクレオチドのうちの同じ１又は２のフラグメントで終端する。とりわけ、第１の試料では、個々のフラグメントはＣで終端し、第２の試料では、個々のフラグメントはＣ又はＴで終端し、第３の試料では、それぞれＧで終端し、第４の試料では、それぞれＡ又はＧで終端する。これら４つの反応の産物が、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によりサイズによって分離されるならば、ＤＮＡ配列は、放射性バンドのパターンから読み取ることができる。この方法により、標識部位から少なくとも１００塩基のシークエンシングが可能となる。他の方法としては、サンガー等によって刊行されたシークエンシングのジデオキシ法（Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74(12): 5463-5467）がある。サンガー法は、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性に基づいて種々の長さの配列依存性フラグメントを合成する。フラグメントの長さは、ジデオキシヌクレオチド塩基特異的ターミネーターのランダム導入によって決定される。次に、これらのフラグメントは、マクサム−ギルバート法の場合のようにゲルで分離され、視覚化され、配列が決定される。これらの方法を洗練しシークエンシング手順を自動化するために様々な改良が試みられた。また、ＲＮＡシークエンシング法も知られている。例えば、脳心筋炎ウイルスＲＮＡのシークエンシングのためにジデオキシヌクレオチドと共に逆転写酵素が使用された（ツィンメルン（Zimmern）D.及びケースベルク（kaesberg）P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75(9): 4257-4261）。ミルズ（Mills）DR.及びクラーマー（Kramer）FR.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76(5): 2232-2235）は、連鎖停止反応機構においてＲＮＡのシークエンシングを行うためのＱβレプリカーゼ及びヌクレオチドアナログイノシンの使用を記載している。ＲＮＡシークエンシングのための直接的化学的方法も知られている（ピアッティ（Peattie）DA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76(4): 1760-1764）。その他の方法としては、例えば、ドニス（Donis）−ケラー（Keller）et al.（1977, Nucl. Acids Res. 4: 2527-2538）、シモンクシッツ（Simoncsits）A. et al.（Nature (1977) 269(5631): 833-836）、アクセルロッド（Axelrod）VD. et al.（Nucl. Acids Res. (1978) 5(10): 3549-3563）、及びクラーマーFR.及びミルズDR.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75(11): 5334-5338）等がある。これらの文献は、引用を以って本書に繰り込み、ここに記載されているものとする。核酸配列は、レーザーによって切断されたヌクレオチドの自然蛍光の刺激によって読み取ることもでき��が、このシングルヌクレオチドは蛍光増強マトリックスに含有されている（米国特許第5,674,743号）；
【００６９】
ハイブリダイゼーション技術を用いたスニップスの同定のためのハイブリダイゼーション法は、米国特許第6,270,961号及び同第6,025,136号に記載されている；
【００７０】
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）−は、ポリメラーゼ連鎖反応単位複製配列ストランドにアニールしたプローブと検出用オリゴヌクレオチドのライゲーションに基づき、酵素免疫法により検出される。（ビヤエルモサ（Villahermosa）ML. J Hum Virol (2001) 4(5): 238-48; ロンパネン（Romppanen）EL. Scand J Clin Lab Invest (2001) 61(2): 123-9; イアノネ（Iannone）MA. et al. Cytometry (2000) 39(2): 131-40）；
【００７１】
ライゲーション−ローリングサークル増幅法（Ｌ−ＲＣＡ）もまた、チー（Qi）X. et al. Nucleic Acids Res (2001) 29(22): E116に記載されているように、一塩基多型の遺伝子型決定に首尾よく使用することができた；
【００７２】
５’ヌクレアーゼアッセイもまた、一塩基多型の遺伝子型決定に首尾よく使用することができた（アイディン（Aydin）A. et al. Biotechniques (2001) (4): 920-2, 924, 926-8）；
【００７３】
ポリメラーゼプルーフリーディング法は、WO 0181631に記載されているように、スニップスの同一性の決定に使用される；又は
【００７４】
アレル特異的ＰＣＲ法もまた一塩基多型の遺伝子型決定に首尾よく使用することができた（ホーキンス（Hawkins）JR. et al. Hum Mutat (2002) 19(5): 543-553）。
【００７５】
また、患者の配列データが既に分かっている場合は、（遺伝情報の）獲得は、当該患者の核酸配列データをデータベースから検索し、多型部位における当該患者の核酸配列を読み取ることにより当該多型部位における核酸又は遺伝子型の同一性の決定ないし検出をすることを含んでもよい。
【００７６】
（１又は複数の）多型の同一性が決定ないし検出されると、当該目的の多型の（位置における）遺伝子型（ヌクレオチド）に基づき患者結果ないし予後に関する指標が得られ得る。本発明では、プロテインＣプロモーター領域における多型又は他のプロテインＣ遺伝子多型が、予後を得るため又は患者結果を決定するために使用される。患者結果ないし予後を得るための又は患者スクリーニングのための方法は、炎症状態から回復する患者の能力（ないし可能性）を決定するために有用であり得る。また、単独の多型部位又は複数の多型部位の組合せは、それらが炎症状態から回復する患者の能力を示すものとして決定された多型とリンクしているならば、炎症状態から回復する患者の能力の指標として使用することも可能である。
【００７７】
患者結果ないし予後が決定されると、そのような情報は、可能な治療方針の選択を支援し、患者をモニターすべき程度及び当該モニターの頻度の決定に役立つので、内科医及び外科医によって関心が持たれ得る。究極的には、治療の決定は、特定の患者に特異的な要因及び患者の治療に携わる内科医又は外科医の経験に基づく要因の両方に応じてなされ得る。内科医又は外科医が炎症状態を有する患者の治療に考慮に入れ得る治療方針としては、以下のものがあるが、これらに限定されない：
（ａ）抗炎症療法の使用；
（ｂ）ステロイドの使用；
（ｃ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する抗体又はエンドトキシンに対する抗体の使用；
（ｄ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターの使用；
（ｅ）活性プロテインＣ（LillyからのXigris）の使用；
（ｆ）組織因子経路阻害剤（Chironからのtifacogin alpha）の使用；
（ｇ）血小板活性化因子ヒドラーゼ（ICOSからのPAFase）の使用；及び
（ｈ）（種々のタイプのヘパリンのような）凝固カスケードの修飾因子の使用。
【００７８】
また、患者結果ないし予後と関係するプロテインＣ配列における新たな多型を同定するために類似の方法を採用することも可能である。
【００７９】
上述のように、遺伝子配列情報ないし遺伝子型情報は（一人の）患者から獲得可能であるが、該配列情報は、プロテインＣ遺伝子中の１又は２以上の一塩基多型部位を含む。同様に、上述したように、１又は２以上の患者のプロテインＣ遺伝子における１又は２以上の一塩基多型の配列同一性も検出ないし決定することができる。更に、患者結果ないし予後は、上述のように、評価することができる。例えば、ＡＰＡＣＨＥ IIスコアリングシステム又はブラッセルスコアを使用して、治療前後における患者のスコアを比較することにより、患者結果ないし予後を評価することができる。患者結果ないし予後が評価されたら、患者結果ないし予後は、（１又は複数の）一塩基多型の配列同一性と関連付けることができる。患者結果ないし予後の関連付けは、更に、複数の患者の患者結果スコア及び多型（１又は複数）の統計的分析を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】プロテインＣ２４１８の遺伝子型によるショック状態にある患者とショック状態にない患者との間の生存率の比較
【図２】心肺バイパス手術前後における平均動脈圧（ｍｍＨｇ）対時間、心肺バイパス手術前後における心指数（Ｌ／ｍ２）対時間、心肺バイパス手術前後における全身血管耐性指数対時間、及び心肺バイパス手術前後における昇圧剤使用対時間をプロットした一連のグラフ。これらのグラフでは、それぞれ、プロテインＣ２４１８のＡＡホモ接合体と、ＡＧヘテロ接合体及びＧＧホモ接合体とを比較している。
【図３】心肺バイパス手術前後におけるパーセント動脈血酸素飽和度対時間をプロットしたグラフ。このグラフでは、プロテインＣ２４１８のＡＡホモ接合体と、ＡＧヘテロ接合体及びＧＧホモ接合体とを比較している。
【実施例】
【００８１】
３．実施例１：２４１８多型を用いた２つの母集団における患者結果ないし予後
【００８２】
（ａ）第１母集団、敗血性ＳＩＲＳ
【００８３】
選択基準
【００８４】
２０００年１１月から２００１年５月の間に集中治療室（ＩＣＵ）に収容された患者は全てこの研究の対象として適格性を有していた。遺伝子型分析のために血液を採取できない患者は除外した。
【００８５】
データ収集
【００８６】
データは２８日間又は退院するまで記録した。生の臨床及び実験変量（データ）は、２４時間毎に最悪ないし最も異常な変量（データ）を用いて記録したが、グラスゴー・コーマ・スコア（Glasgow Coma Score）については、２４時間毎に可能な最も良好なスコアを記録した。入院日における欠測データには正常値が割り当てられ、入院日後における欠測データには前日の値で代用した。個体群統計学データ及び微生物学的データを記録した。患者毎のデータ収集が完了したとき、患者識別名は全て記録全部から除去し、患者ファイルには、ランダムに、血液試料と相互参照される独自の番号を割り当てた。完成した生データファイルは、標準的な定義（即ち、ＡＰＡＣＨＥ II、及びブラッセル基準を用いて計算した生存及び器官障害解放日数）を用いて、疾患スコアの計算された記述及び重症度に変換した。
【００８７】
（ｂ）第２母集団、非敗血性ＳＩＲＳ
【００８８】
選択基準
【００８９】
心肺バイパス（ＣＰＢ）を要する新たに選択された冠動脈バイパス移植に登録された白人の患者が含められた。緊急ないし応急ＣＰＢ手術を受ける患者は選択しなかった。というのは、このような患者は、ショックのような他の誘因に対する炎症反応を既に呈し得たからである。弁手術又は繰り返し心臓手術を受けている患者も選択しなかった。というのは、このような患者は異なる術前病態生理を有し、しばしばより長い総手術及びＣＰＢ時間を有するからである。
【００９０】
麻酔の導入及び全身及び肺動脈カテーテル（これらは通常我々の研究所では臨床目的のために挿入される。）の設置後、ＣＰＢ以前に、遺伝子型決定のために及びベースラインＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＩＬ−１０測定のために採血した。更に、平均動脈圧、サーモダイリュエーション心臓結果（thermodiluation cardiac outcome）及び右動脈圧並びに身長及び体重を含む血行動態測定値を記録して、全身血管耐性指数を計算した。全身血管耐性指数（ＳＶＲＩ：Systemic Vascular Resistance Index）は、平均動脈圧と右動脈圧との差を心指数で割ることにより計算した。採血は、術後４時間（ピーク応答を示す）及び２４時間（該応答が持続しているか否かの決定）に（繰り返し）行った。ＳＶＲＩを計算するための血行動態は、術後０、４及び２４時間に測定した。
【００９１】
一般的方法−第１及び第２母集団
【００９２】
採血及び処理
【００９３】
上記２つの母集団からの廃棄された全血液試料は、４℃で保存されていたが、病院実験室から収集した。バフィーコートを抽出し、該試料を１．５ｍｌクライオチューブに移し、バーコードを付着し、独自の患者番号で相互参照を可能とし、−８０℃で保存した。ＤＮＡは、商品名ＱＩＡ ａｍｐ ＤＮＡ ｍａｘｉキット（キアゲン）を用いてバフィーコートから抽出した。患者は、スペック（Spek）et al.（Blood Coagulation and Fibrinolysis, 5: 309-311, 1994）によって記載されたようなＲＦＬＰストラテジーを用いて−１６４５（２４０５）及び−１６４１（２４１８）において遺伝子型決定を行った。ここで使用した第１のＰＣＲストラテジーは、ＢｓｔＸＩ制限酵素切断部位をＰＣＲ産物中に導入する。この場合、Ｔは位置−１６５４（２４０５）に存在するため、２４６ｂｐのＰＣＲ産物はＢｓｔＸＩによって切断されて２０５ｂｐ及び４１ｂｐの２つのフラグメントが生成する。第２のＰＣＲストラテジーもＢｓｔＸＩ制限酵素切断部位をＰＣＲ産物に導入するが、この場合は、Ｇが位置−１６４１（２４１８）に存在するため、２３３ｂｐのＰＣＲ産物はＢｓｔＸＩによって切断されて、１９３ｂｐ及び４０ｂｐの２つのフラグメントが生成する。ＰＣＲ増幅ＤＮＡをＢｓｔＸＩと共にインキュベートした後、ゲル電気泳動法を用いて反応産物を分離した。
【００９４】
統計分析
【００９５】
優性モデル及び共優性モデルを用いて疾患重症度の測定値を比較した。連続データのためのＡＮＯＶＡと離散データのためのフィッシャー正確確率検定とを用いて遺伝子型群間の差を検査した。
【００９６】
第１母集団、敗血性ＳＩＲＳ−結果
【００９７】
この研究では、ＩＣＵに収容されたＳＩＲＳを有する８１人の白人患者が対象とされた。患者の４６.９％がＡＡホモ接合体であり、３８．３％がＡＧヘテロ接合体であり、１４．８％がＧＧホモ接合体であった。Ａアレルの出現頻度は６６％であり、Ｇアレルの出現頻度は３４％であり、これらのアレルは、この母集団においてはハーディ−ワインベルクの平衡状態にあった。表２は、ＡＡ、ＡＧ及びＧＧ群間のベースライン特性に有意差がなかったことを示している。（これらの群の）患者は、ほぼ同じ年齢構成、ほぼ同じ性別構成を有し、類似の認容（admitting）ＡＰＡＣＨＥ IIを有した。これら患者のほぼ４０％は入院時に腐敗症ないし敗血症を有し、これら患者の１０％は入院時に敗血症ショックを有していた。これらの患者の８％はＩＣＵに収容されている間のある時点において腐敗症ないし敗血症を発症し、これら患者の４５％は病院に収容されている間のある時点において敗血症ショックを発症した。
【００９８】
表２
敗血性ＳＩＲＳ患者のベースライン特性
2010142252.tif 000011
【００９９】
生存及びＳＩＲＳ及び器官機能障害解放日数の測定によって、アレルＡの共優性効果が示唆された。Ａアレルを有する患者は、より小さい生存及びＳＩＲＳ解放日数、より小さいＤＡＦ（days alive and free of）急性肺損傷及びより小さいＤＡＦ心血管障害を示した（表３）。興味深いことに、ステロイドを使用した場合のＤＡＦにも有意差があった。ステロイドの使用は、一般的には、我々の集中治療室では、内科医の判断によりケースバイケースで実施されるが、重篤な腐敗症及び敗血症ショックを有すると推定される患者に対してより頻繁に実施される。更に、Ａアレルは、有意により小さいＤＡＦ昇圧剤と関連することも確認した。更に、Ａアレルに関して結果ないし予後が不良となる傾向が、ＤＡＦ肝臓障害、ＤＡＦ腎臓障害、ＤＡＦ ＣＮＳ障害、及びＤＡＦ国際標準化比（ＩＮＲ）＞１．５についても存在することがわかった（表４）。
【０１００】
表３
敗血性ＳＩＲＳ母集団：ＤＡＦ ＳＩＲＳ及び主要器官機能障害
2010142252.tif 000012
【０１０１】
表４
敗血性ＳＩＲＳ母集団：ＤＡＦ他の器官機能障害
2010142252.tif 000013
【０１０２】
最も重要なのは、Ａアレルは、生存率の減少と関連したことである（図１）。ＡＡ遺伝子型の患者の生存率は５８％であり、ＡＧ遺伝子型の患者の生存率は７４％であり、ＧＧ遺伝子型の患者の生存率は１００％であった（Ｐ＜０．０１７）。従って、プロテインＣ−１６４１（２４１８）Ａアレルは、生存率の減少、より多いＳＩＲＳ、より重い心血管及び呼吸器障害、及び他の器官系におけるより重い障害への傾向と関連した。
【０１０３】
第２母集団非敗血性ＳＩＲＳ−結果
【０１０４】
上記の観察を確認するため及びプロテインＣ−１６４１（２４１８）Ａアレルはより重いＳＩＲＳと関係するという仮説の生物学的確からしさの証拠を検査するために、独立ないし別個の母集団に取り組んだ。そこで、心肺バイパス（ＣＰＢ）手術後の６１人の白人の患者を研究することにした。ＣＰＢは、ＳＩＲＳの定義を充足する炎症反応と関係しており、ＣＰＢ手術後炎症性サイトカイン発現の増加と関連している。この６１人の白人の母集団では、２４人の患者がＡＡ遺伝子型であり、２８人がＡＧ遺伝子型、及び９人がＧＧ遺伝子型であった。このため、Ａアレルの出現頻度は６２％であり、Ｇアレルの出現頻度は３８％であった。この母集団もハーディ−ワインベルクの平衡状態にあった。術前ベースラインにおいては、年齢、性別、喫煙者、糖尿病、高血圧の存在、術前駆出率、バイパス時間、クロスクランプ時間及びアプロチニン使用については有意差はなかった（表５）。
【０１０５】
表５
ＣＰＢ ＳＩＲＳ：ベースライン特性
2010142252.tif 000014
【０１０６】
術後、ＡＡ遺伝子型の患者の６４％が最初の２４時間中に少なくとも一回は１５００未満のＳＶＲＩを生じたのに対し、他の患者では５０％しか１５００未満のＳＶＲＩを生じなかった。最初の２４時間以内の１５００未満の２つの連続ＳＶＲＩ測定の存在は、ＡＡ遺伝子型の患者ではその３２％にみられ、他の患者ではその１９％にしか見られなかった（Ｐ＜０.０３）。ＣＰＢ後１時間における平均動脈圧のより大きな減少（ｐ＜０.０５）及び心指数のより大きな上昇のために、ＣＰＢ後１時間におけるＳＶＲＩはＡＡ遺伝子型の患者では減少した（図２）。ＣＰＢ後１時間におけるＡＡ遺伝子型の患者の昇圧剤の極めて大きい使用量についての更なる観察は、更に、ＣＰＢ後のＡＡ遺伝子型の患者に対する過剰な血管拡張の臨床的重要性を大きくする。更に、動脈酸素飽和度は、ＣＰＢ後の最初の２４時間の間に、ＡＡ遺伝子型の患者では大きく減少した（図３）。
【０１０７】
ＡＡ遺伝子型の患者は、ＣＰＢ後４時間及び２４時間において著しくより大きい血清ＩＬ−６濃度を有した（表６）。これは、ＣＰＢ後４時間及び２４時間におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−８及びとりわけＩＬ−１０が増加する傾向と関連がみられた。従って、プロテインＣ−１６４１（２４１８）Ａアレルは、より低いＳＶＲＩにより示されるようなより重いＳＩＲＳ、炎症促進サイトカイン反応の上昇、及びＣＰＢ後の心血管及び呼吸器障害の悪化との関連が見られたが、重病ＳＩＲＳ患者においてみられるものと同様であった。
【０１０８】
表６
ＣＰＢ ＳＩＲＳ：ＣＰＢ後サイトカイン発現
2010142252.tif 000015
【０１０９】
実施例のまとめ
【０１１０】
プロテインＣ−１６４１（２４１８）Ａアレルは、重病ＳＩＲＳ母集団及びＣＰＢ後ＳＩＲＳ母集団におけるＳＩＲＳ及び重篤な心血管及び呼吸器機能障害のよりはっきりした証拠と関係する。重病ＳＩＲＳ母集団は、ＡＡ遺伝子型の患者の重篤なＳＩＲＳはより重篤なＳＩＲＳ及びより重い心血管及び呼吸器障害（より重い急性肺損傷、昇圧剤のより多い使用、ステロイドのより多い使用を含む）と関連するが、更なる器官系の機能障害の発生及び重要なことに、生存率の低下に至る傾向もあったことを示している。このような観察結果は、重病患者の類似するが完全に独立したＳＩＲＳ母集団において確認された。ＣＰＢ母集団では、ＳＩＲＳは心臓手術及び心肺バイパス過程自体によって誘発されたが、感染の形跡はみられなかった。この母集団におけるＡＡ遺伝子型の患者におけるＳＩＲＳの悪化の証拠は、ＣＰＢ後１時間におけるＳＶＲＩ及び平均動脈圧におけるより大きな減少及び昇圧剤の使用量の増加並びに炎症性サイトカイン発現の増加の観察によって提供される。増加した炎症性サイトカイン発現は、当該サイトカインが、急性炎症反応、ＴＮＦ−α、及び集積（integrated）炎症反応（ＩＬ−６）、肺損傷と関連するケモカイン発現（ＩＬ−８）、及び対抗制御的抗炎症反応（ＩＬ−１０）の代表として選択されたことの生物学的な確からしさの証拠も提供する。
【０１１１】
−１６４１（２４１８）Ａアレルの重病患者は、より低い生存率、より重いＳＩＲＳ、より重篤な心血管及び呼吸器障害、及びより深刻な肝臓、腎臓（Ｐ＝０.０５６）、神経系、及び凝固機能障害への傾向によって示されるような著しくより悪い結果を有した。−１６４１（２４１８）Ａアレルを有した患者の低臨床表現型は、コルチコステロイドの使用量の増加とも関係した。コルチコステロイドの使用量の増加の理由は、重篤なショック及び呼吸障害の長期化の見込みに対しステロイド治療の必要性が高まったと医師が判断したことにあると思われる。−１６４１（２４１８）Ａアレルを有した患者の生存率の著しい低下は、重病状態に関し現在まで研究されている他の殆どの多型についての関連する生存率関係よりも一層明確である。
【０１１２】
要約すると、−１６４１（２４１８）Ａアレルは、−１６４１（２４１８）Ｇアレルと比べると、第１母集団−敗血性ＳＩＲＳ及び第２母集団−非敗血性ＳＩＲＳの両方に関し重病状態におけるより深刻な結果と関係する。−１６４１（２４１８）Ａアレルを有する患者は、−１６４１（２４１８）Ｇアレルの患者と比べると、より低い生存率、より深刻なＳＩＲＳ、及びより深刻な心血管及び呼吸器障害、より深刻な（その他の）器官機能障害を通常示した。従って、−１６４１（２４１８）プロテインＣプロモーター多型は、重病状態及び選択ＣＰＢ及び他の大手術のために選択される患者に関する診断及び予後的使用（価値）ないし有用性を有する。
【０１１３】
４．実施例２：２４０５多型を用いた２つの母集団における患者結果ないし予後
【０１１４】
同様に、上記２つの母集団に属する患者は、上述したＲＦＬＰストラテジーを用いて、位置−１６５４（２４０５）における遺伝子型の決定も行った。−１６５４（２４０５）Ｃ及びＴアレルは、−１６４１（２４１８）Ａアレルと比べると、第１母集団−敗血性ＳＩＲＳの重病患者についても第２母集団−非敗血性ＳＩＲＳの重病患者についても患者予後ないし結果と関連するものとは見出されなかった。ＣＣ遺伝子型の生存率は６３％、ＣＴ遺伝子型の生存率は７１％、ＴＴ遺伝子型の生存率は６１％であった（Ｐ＜ＮＳ）。従って、−１６５４（２４０５）プロテインＣプロモーター多型は、重病状態及び選択ＣＰＢ及び他の大手術のために選択される患者に関する診断及び予後的使用（価値）ないし有用性を有するとは考えられない。
【０１１５】
５．実施例３：２５８３及び２３２２多型
【０１１６】
同様に、２３２２多型も検査され、遺伝子型の生存率との関連性がないことが見出された；ＡＡ遺伝子型の２８日生存率は６４％、ＡＧ遺伝子型の２８日生存率は７２％、及びＧＧ遺伝子型の２８日生存率は６３％（ｐ ＮＳ）であった。更に、２５８３多型は上述のように検査されなかったが、この多型は、２４１８並びに１３８６、３９２０の多型及び他のスニップの組合せに関して総連鎖不平衡の状態にある。例えば、５８６７＋２４０５における多型と５８６７＋４９５６における多型との組合せも、２４１８とリンクしている。これらの多型は、２４１８に関して連鎖不平衡にあるので、遺伝子型と、生存率、器官機能障害及び例えばステロイド又は昇圧剤による爾後の治療に応答する患者の能力との関連を示す。
【０１１７】
本発明については、理解の容易化のために、実施例を用いてある程度詳細に説明してきたが、本発明の教示に鑑みれば、特許請求の範囲の思想ないし範囲から逸脱しない限りにおいて本発明に対し変更・修正をなし得ることは、当業者であれば容易に理解できるであろう。本書で引用した特許、特許出願及び刊行物は全て引用を以って本書に繰り込み本書に記載されているものとする。
最後に、本発明の実施の形態をまとめると以下のとおりとなる：
（形態１）  本発明の課題を解決するために、第１の視点により、炎症状態を有するか炎症状態の発症の危険がある患者に関する予後を得るために遺伝子型を決定する方法であって、
前記患者のプロテインＣ遺伝子の１又は２以上の多型部位を含む遺伝子型を決定することを含み、前記遺伝子型は、前記患者が炎症状態から回復する能力を示し、前記多型部位は、配列番号１の位置２４１８又は該位置２４１８と連鎖不平衡にある多型部位に対応し、前記炎症状態は敗血症又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、ことを特徴とする方法が提供される（第１基本構成）。
（形態２）  上記形態１の方法において、前記多型部位は、配列番号１の位置２４１８、１３８６、２５８３又は３９２０に対応することが好ましい。
（形態３）  上記形態１の方法において、遺伝子型は、２又は３以上の多型部位の組合せにおいて決定され、該組合せは、配列番号１の以下の位置（複数）の群から選択されることが好ましい：
５８６７及び２４０５；
５８６７及び４９１９；
５８６７及び４９５６；
５８６７及び６１８７；
５８６７及び９５３４；
５８６７及び１２１０９；
４８００及び２４０５；
４８００及び４９１９；
４８００及び４９５６；
４８００及び６１８７；
４８００及び９５３４；
４８００及び１２１０９；
９１９８及び６３７９及び２４０５；
９１９８及び６３７９及び４９１９；
９１９８及び６３７９及び４９５６；
９１９８及び６３７９及び６１８７；
９１９８及び６３７９及び９５３４；及び
９１９８及び６３７９及び１２１０９。
（形態４）  上記形態１〜３の何れかの方法において、前記決定された遺伝子型と、前記患者と同様の炎症状態又は他の炎症状態からの回復に関する予後を示す既知の遺伝子型とを比較することを更に含むことが好ましい。
（形態５）  上記形態１〜４の何れかの方法において、前記患者のプロテインＣ遺伝子配列を得ることを更に含むことが好ましい。
（形態６）  上記形態１〜４の何れかの方法において、遺伝子型の前記決定は、前記患者からの核酸試料に対して実行されることが好ましい。
（形態７）  上記形態１〜６の何れかの方法において、遺伝子型の前記決定は、
（ａ）制限フラグメント長分析
（ｂ）シークエンシング
（ｃ）ハイブリダイゼーション
（ｄ）オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ
（ｅ）ライゲーションローリングサークル増幅
（ｆ）５’ヌクレアーゼアッセイ
（ｇ）ポリメラーゼプルーフリーディング法
（ｈ）アレル特異的ＰＣＲ、及び
（ｉ）リーディング配列データ
の１又は２以上を含むことが好ましい。
（形態８）  上記形態１〜７の何れかの方法において、前記患者の前記遺伝子型は、炎症状態からの回復の可能性の低下を示すことが好ましい。
（形態９）  上記形態８の方法において、前記予後は、重病患者の重篤な心血管又は呼吸器障害を示すことが好ましい。
（形態１０）  上記形態８又は９の方法において、前記遺伝子型は、以下の単独の多型部位及び多型部位の組合せの群から選択されることが好ましい：
１３８６Ｔ；
２４１８Ａ；
２５８３Ａ；
３９２０Ｔ；
５８６７Ａ及び２４０５Ｔ；
５８６７Ａ及び４９１９Ａ；
５８６７Ａ及び４９５６Ｔ；
５８６７Ａ及び６１８７Ｃ；
５８６７Ａ及び９５３４Ｔ；
５８６７Ａ及び１２１０９Ｔ；
４８００Ｇ及び２４０５Ｔ；
４８００Ｇ及び４９１９Ａ；
４８００Ｇ及び４９５６Ｔ；
４８００Ｇ及び６１８７Ｃ；
４８００Ｇ及び９５３４Ｔ；
４８００Ｇ及び１２１０９Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び２４０５Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び４９１９Ａ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び４９５６Ｔ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び６１８７Ｃ；
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び９５３４Ｔ；及び
９１９８Ａ及び６３７９Ｇ及び１２１０９Ｔ。
（形態１１）  上記形態１〜７の何れかの方法において、前記患者の前記遺伝子型は、炎症状態からの回復の可能性の上昇を示すことが好ましい。
（形態１２）  上記形態１１の方法において、前記予後は、重病患者の重篤度が低い心血管又は呼吸器障害を示すことが好ましい。
（形態１３）  上記形態１１又は１２の方法において、前記遺伝子型は、以下の単独の多型部位及び多型部位の組合せの群から選択されることが好ましい：
１３８６Ｃ；
２４１８Ｇ；
２５８３Ｔ；
３９２０Ｃ；
５８６７Ｇ及び２４０５Ｃ；
５８６７Ｇ及び４９１９Ｇ；
５８６７Ｇ及び４９５６Ｃ；
５８６７Ｇ及び６１８７Ｔ；
５８６７Ｇ及び９５３４Ｃ；
５８６７Ｇ及び１２１０９Ｃ；
４８００Ｃ及び２４０５Ｃ；
４８００Ｃ及び４９１９Ｇ；
４８００Ｃ及び４９５６Ｃ；
４８００Ｃ及び６１８７Ｔ；
４８００Ｃ及び９５３４Ｃ；及び
４８００Ｃ及び１２１０９Ｃ。
（形態１４）  上記形態１〜１３の何れかの方法において、前記炎症状態は、全身性炎症反応症候群であることが好ましい。
（形態１５）  本発明の課題を解決するために、第２の視点において、患者の予後と関連するプロテインＣ遺伝子配列中の多型を同定する方法であって、
ａ）患者群から得た核酸試料からプロテインＣ遺伝子配列情報を得ること
ｂ）前記プロテインＣ遺伝子中の少なくとも１つの多型の部位を同定すること
ｃ）前記患者群内の個々の患者に関する前記部位における遺伝子型を決定すること
ｄ）前記患者群内の個々の患者の炎症状態から回復する能力を決定すること、及び
ｅ）ステップｃ）で決定された遺伝子型と、ステップｄ）で決定された患者の能力（ないし可能性）との相関性を求めること、
前記炎症状態は敗血症又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）であること、
を含む方法が提供される（第２基本構成）。
（形態１６）  本発明の課題を解決するために、第３の視点において、患者が炎症状態から回復する能力の予後を提供するために、該患者のプロテインＣ遺伝子配列の多型部位内の所定のヌクレオチド位置において遺伝子型を決定するためのキットであって、
前記多型部位において交代ヌクレオチドを識別可能な制限酵素、又は前記多型部位に対する十分な相補性を有しかつ該交代ヌクレオチドを識別可能な標識されたオリゴヌクレオチドを、パッケージ内に含み、前記交代ヌクレオチドは、配列番号１の位置２４１８及び該位置２４１８と連鎖不平衡にある多型部位内のヌクレオチド位置の１又は２以上に対応し、前記炎症状態は敗血症又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、キットが提供される（第３基本構成）。
（形態１７）  上記形態１６のキットにおいて、前記交代ヌクレオチドは、配列番号１の位置２４１８、１３８６、２５８３及び３９２０の１又は２以上に対応することが好ましい。
（形態１８）  上記形態１７のキットにおいて、前記交代ヌクレオチドは、位置２４１８に対応することが好ましい。
（形態１９）  上記形態１６、１７又は１８のキットにおいて、前記制限酵素と、前記多型部位を包囲する領域の増幅に好適な１つのオリゴヌクレオチド又は複数のオリゴヌクレオチドのセットとを含むことが好ましい。
（形態２０）  上記形態１９のキットにおいて、重合剤を更に含むことが好ましい。
（形態２１）  上記形態１６〜２０の何れかのキットにおいて、遺伝子型を決定するための前記キットの使用説明書を更に含むことが好ましい。
（形態２２）  本発明の課題を解決するために、第４の視点により、炎症状態を有するか炎症状態の発症の危険がある被検体に関する予後を得るために遺伝子型を決定する方法であって、
該方法は、配列番号１の位置２４１８、１３８６、２５８３及び３９２０又はこれらと連鎖不平衡にある位置から選択される前記被検体のプロテインＣ遺伝子の１又は２以上の多型部位を含む遺伝子型を決定することを含み、前記遺伝子型は、前記被検体が前記炎症状態から回復する能力を示し、前記位置２４１８、１３８６、２５８３及び３９２０におけるヌクレオチドと前記予後と間の関連は、以下の（１）〜（８）：
（１）センス鎖２４１８Ａ又はアンチセンス鎖２４１８Ｔは前記炎症状態から回復する能力の低下の予後を示す；
（２）センス鎖２４１８Ｇ又はアンチセンス鎖２４１８Ｃは前記炎症状態から回復する能力の上昇の予後を示す；
（３）センス鎖２５８３Ａ又はアンチセンス鎖２５８３Ｔは前記炎症状態から回復する能力の低下の予後を示す；
（４）センス鎖２５８３Ｔ又はアンチセンス鎖２５８３Ａは前記炎症状態から回復する能力の上昇の予後を示す；
（５）センス鎖１３８６Ｔ又はアンチセンス鎖１３８６Ａは前記炎症状態から回復する能力の低下の予後を示す；
（６）センス鎖１３８６Ｃ又はアンチセンス鎖１３８６Ｇは前記炎症状態から回復する能力の上昇の予後を示す；
（７）センス鎖３９２０Ｔ又はアンチセンス鎖３９２０Ａは前記炎症状態から回復する能力の低下の予後を示す；
（８）センス鎖３９２０Ｃ又はアンチセンス鎖３９２０Ｇは前記炎症状態から回復する能力の上昇の予後を示す、
であり、
前記炎症状態は敗血症又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、方法が提供される（第４基本構成）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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