(57)【要約】【課題】抗血小板抗体の存在を目視で検査することが可能な方法を提供すること。【解決手段】検体中に抗血小板抗体が存在するか否かを検査する方法であって、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子上に被検生物種に対する抗体を結合し、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する抗体結合着色粒子と、容器底面に固相化された血小板と、検体との間で凝集反応を行う工程、および凝集反応の有無を目視で判定する工程を含む方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に抗血小板抗体が存在するか否かを検査する方法であって、
ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子上に被検生物種に対する抗体を結合し、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する抗体結合着色粒子と、容器底面に固相化された血小板と、検体との間で凝集反応を行う工程；および
凝集反応の有無を目視で判定する工程
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
抗体結合着色粒子が、磁性粒子であり、
凝集反応が、磁性混合受身血球凝集法（magnetic-mixed passive hemagglutination法；M-MPHA法）により行われる、方法。
【請求項３】
前記抗体結合着色粒子が、以下の工程を含む方法により調製される、請求項１に記載の方法：
ゼラチンと、アラビアゴムと、顔料を水系分散させた顔料分散液とを混合して、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する着色粒子を調製する工程；および
前記工程で得られた着色粒子上に被検生物種に対する抗体を結合させて、抗体結合着色粒子を調製する工程。
【請求項４】
前記抗体結合着色粒子が、以下の工程を含む方法により調製される、請求項２に記載の方法：
ゼラチンと、アラビアゴムと、顔料を水系分散させた顔料分散液と、磁性体とを混合して、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート磁性粒子内に顔料を含有する着色粒子を調製する工程；および
前記工程で得られた着色粒子上に被検生物種に対する抗体を結合させて、抗体結合着色磁性粒子を調製する工程。
【請求項５】
前記顔料分散液が、顔料を有機ポリマーを分散剤として用いて分散させたものであることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記顔料分散液が、顔料をゼラチンを分散剤として用いて分散させたものであることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記顔料分散液が、墨汁、色墨または朱液であることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
検体中に抗顆粒球抗体が存在するか否かを検査する方法であって、
ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子上に被検生物種に対する抗体を結合し、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する抗体結合着色粒子と、容器底面に固相化された顆粒球と、検体との間で凝集反応を行う工程；および
凝集反応の有無を目視で判定する工程
を含む方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
抗体結合着色粒子が、磁性粒子であり、
凝集反応が、磁性混合受身血球凝集法（magnetic-mixed passive hemagglutination法；M-MPHA法）により行われる、方法。
【請求項１０】
ゼラチンと、アラビアゴムと、顔料を水系分散させた顔料分散液とを混合して、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する着色粒子を調製する工程；および
前記工程で得られた着色粒子上に抗体を結合させて、抗体結合着色粒子を調製する工程
を含む方法により調製される抗体結合着色粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血小板抗体の存在を検査する方法に関する。また、本発明は、抗顆粒球抗体の存在を検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗血小板抗体の検出に関して、非特許文献１は、非着色磁性粒子をインジケーターとして用いてＭ−ＭＰＨＡ（magnetic-mixed passive hemagglutination）法により抗血小板抗体を検出したことを報告している。
【０００３】
一方、免疫学的検査において、凝集反応の有無を目視で判定する場合、着色粒子を使用することが知られている。特許文献１および特許文献２は、ゼラチンと水溶性多糖類を含む粒子を、反応性染料を用いて着色することを開示している。
【０００４】
しかし、抗血小板抗体の検出について、着色粒子をインジケーターとして用いて目視で検出した例はこれまでに報告されていない。また、抗顆粒球抗体の検出についても、着色粒子をインジケーターとして用いて目視で検出した例はこれまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５９−３５１４３号公報
【特許文献２】特開昭５８−１１３７５４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日本輸血細胞治療学会誌、第54巻、第2号、199ページ、O-037  M-MPHA法を用いた血小板クロスマッチが有効であった一症例
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記事情に鑑み、本発明は、着色粒子をインジケーターとして用いて、抗血小板抗体または抗顆粒球抗体の存在を目視で検査することが可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
非特許文献１に従って非着色磁性粒子をインジケーターとして用いて抗血小板抗体を検出した場合、陽性像と陰性像を肉眼で明瞭に識別するのは困難であった（後述の実施例６参照）。そこで、本発明者は、特許文献１および２に記載される反応性染料で着色された粒子をインジケーターとして用いて抗血小板抗体を検出することを試みた。しかし、この場合、検体の非存在下において着色粒子と血小板の間で非特異的な反応が起こり、陰性像が形成されないという問題があった（後述の実施例４参照）。これに対し、顔料で着色された着色粒子をインジケーターとして用いて抗血小板抗体を検出してみたところ、陰性像と陽性像が明確に区別できるように形成され得ることを本発明者は見出し（後述の実施例４および５参照）、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の手段を提供する。
【００１０】
［１］  検体中に抗血小板抗体が存在するか否かを検査する方法であって、
ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子上に被検生物種に対する抗体を結合し、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する抗体結合着色粒子と、容器底面に固相化された血小板と、検体との間で凝集反応を行う工程；および
凝集反応の有無を目視で判定する工程
を含む方法。
【００１１】
［２］  上記［１］に記載の方法であって、
抗体結合着色粒子が、磁性粒子であり、
凝集反応が、磁性混合受身血球凝集法（magnetic-mixed passive hemagglutination法；M-MPHA法）により行われる、方法。
【００１２】
［３］  前記抗体結合着色粒子が、以下の工程を含む方法により調製される、上記［１］に記載の方法：
ゼラチンと、アラビアゴムと、顔料を水系分散させた顔料分散液とを混合して、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する着色粒子を調製する工程；および
前記工程で得られた着色粒子上に被検生物種に対する抗体を結合させて、抗体結合着色粒子を調製する工程。
【００１３】
［４］  前記抗体結合着色粒子が、以下の工程を含む方法により調製される、上記［２］に記載の方法：
ゼラチンと、アラビアゴムと、顔料を水系分散させた顔料分散液と、磁性体とを混合して、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート磁性粒子内に顔料を含有する着色粒子を調製する工程；および
前記工程で得られた着色粒子上に被検生物種に対する抗体を結合させて、抗体結合着色磁性粒子を調製する工程。
【００１４】
［５］  前記顔料分散液が、顔料を有機ポリマーを分散剤として用いて分散させたものであることを特徴とする、上記［３］または［４］に記載の方法。
【００１５】
［６］  前記顔料分散液が、顔料をゼラチンを分散剤として用いて分散させたものであることを特徴とする、上記［３］または［４］に記載の方法。
【００１６】
［７］  前記顔料分散液が、墨汁、色墨または朱液であることを特徴とする、上記［３］または［４］に記載の方法。
【００１７】
［８］  検体中に抗顆粒球抗体が存在するか否かを検査する方法であって、
ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子上に被検生物種に対する抗体を結合し、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する抗体結合着色粒子と、容器底面に固相化された顆粒球と、検体との間で凝集反応を行う工程；および
凝集反応の有無を目視で判定する工程
を含む方法。
【００１８】
［９］  上記［８］に記載の方法であって、
抗体結合着色粒子が、磁性粒子であり、
凝集反応が、磁性混合受身血球凝集法（magnetic-mixed passive hemagglutination法；M-MPHA法）により行われる、方法。
【００１９】
［１０］  ゼラチンと、アラビアゴムと、顔料を水系分散させた顔料分散液とを混合して、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する着色粒子を調製する工程；および
前記工程で得られた着色粒子上に抗体を結合させて、抗体結合着色粒子を調製する工程
を含む方法により調製される抗体結合着色粒子。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、抗血小板抗体または抗顆粒球抗体の存在を、迅速かつ正確に目視で検査することが可能な方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】着色粒子の一例を示す顕微鏡写真（実施例２）。
【図２】着色粒子に結合した抗体量を示すグラフ（実施例３）。
【図３】本発明の抗体結合着色粒子の陰性像を示す写真（実施例４）。
【図４】抗血小板抗体の検出結果を示す写真（実施例５）。
【図５】非着色粒子を用いた比較例の結果を示す写真（実施例６）。
【図６】抗顆粒球抗体の検出結果を示す写真（実施例７）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、以下の記載は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するためのものではない。
【００２３】
本発明は、一つの側面によれば、検体中に抗血小板抗体が存在するか否かを検査する方法であって、
（１）ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子上に被検生物種に対する抗体を結合し、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する「抗体結合着色粒子」と、「容器底面に固相化された血小板」と、「検体」との間で凝集反応を行う工程；および
（２）凝集反応の有無を目視で判定する工程
を含む方法である。
【００２４】
以下、本発明の方法に使用される「１．抗体結合着色粒子」、「２．容器底面に固相化された血小板」および「３．検体」についてまず説明し、次いで「４．検査方法」について説明する。
【００２５】
１．抗体結合着色粒子
本発明において「抗体結合着色粒子」は、公知のゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有し、粒子上に被検生物種に対する抗体を結合しているものである。本発明において「抗体結合着色粒子」は、好ましくは、磁性体を含む磁性粒子である。
【００２６】
本発明において「ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子」は、ゼラチンとアラビアゴムを含むコアセルベート粒子であり、ここで「含む」とは、ゼラチンおよびアラビアゴムを主成分として粒子が構成されているが、その他必要に応じて任意成分を含んでいてもよいことを意味する。任意成分としては、例えば、粒子に所望の性質を付与するために添加される物質、および粒子を形成する際に添加され粒子に混入する化学物質等が挙げられる。ここで「粒子に所望の性質を付与するために添加される物質」には、粒子内に封入される後述の芯物質（本発明で使用される顔料および磁性体を含む）が含まれる。
【００２７】
粒子の原料となるゼラチンは、当該技術分野でゼラチンアラビアゴムコアセルベートを調製する際に使用可能なものであればよく、主として、ウシ、ブタの骨や皮に含まれるコラーゲン質を分解生成したものを使用することができる。ゼラチンおよびアラビアゴムは、商業的に入手可能なものを使用することができる。
【００２８】
作製されるコアセルベート粒子の径（直径）は、コアセルベート形成終了時のｐＨおよびゼラチン/アラビアゴム比（Ｇ/Ａ）により適宜調節することができるが、一般に免疫学的分析に使用する粒子を作製する場合には、コアセルベート径（直径）を例えば１〜１０μｍとすることができる。
【００２９】
本発明において「顔料」は、顔料と称される任意のもの、すなわち水や油に溶けない着色用粉末を使用することができる。本発明において顔料は、好ましくは、「顔料を水系分散させた顔料分散液」の形態で使用される。顔料分散液は、顔料分散液として市販されているものを使用してもよいし、顔料を水系分散させて調製したものを使用してもよい。顔料分散液は、好ましくは、顔料を有機ポリマーを分散剤として用いて分散させたものであり、より好ましくは、顔料をゼラチンを分散剤として用いて分散させたものであり、更に好ましくは、墨汁、色墨または朱液である。他の顔料分散液として、たとえば鉱物の微粉末を水系分散させたもの、塗料、絵の具もしくはポスターカラーと称されるものを使用することができる（後述の実施例参照）。分散剤としては、ナフタレンスルホン酸ナトリウム系分散剤、ポリカルボン酸系分散剤、ポリスルホン酸系分散剤、リン酸系分散剤など任意のものを使用することができる。
【００３０】
顔料は、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子の作製において、ゼラチンとアラビアゴムと任意成分を含有する混合溶液に、すなわちゼラチンアラビアゴムコアセルベート粒子を酸の添加により析出させる前の混合液（以降、粒子作製用混合液ともいう）に添加することができる。顔料は、粒子作製用混合液72 ml（EtOH：24 ml、H2O：48 ml）に対し、たとえば0.01〜0.2ｇの量で添加することができる。あるいは、顔料分散液の状態で市販されているもの（墨汁、朱液等）は、粒子作製用混合液72 mlに対し、たとえば1.0〜7.0 mlの量で添加することができる。
【００３１】
また「磁性体」は、磁性を有する任意の物質、たとえばフェリコロイド（タイホー工業製）を使用することができる。
【００３２】
本発明において「被検生物種に対する抗体」は、検体が由来する生物種に対する抗体であり、検体がヒトである場合、抗ヒト抗体であり、たとえばウサギ抗ヒト抗体である。
【００３３】
「抗体結合着色粒子」は、以下の工程を含む方法により調製することができる：
ゼラチンと、アラビアゴムと、顔料を水系分散させた顔料分散液と（必要に応じて磁性体等の芯物質と）を混合して、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する着色粒子を調製する工程；および
前記工程で得られた着色粒子上に被検生物種に対する抗体を結合させて、抗体結合着色粒子を調製する工程。
【００３４】
すなわち、「抗体結合着色粒子」は、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子を公知の手法に従って作製する際に「顔料を水系分散させた顔料分散液」を添加してゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子を作製し、作製された着色粒子に公知の手法に従って抗体を結合させることにより調製することができる。
【００３５】
以下、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子の一般的な作製の仕方について説明する。
【００３６】
まず、ゼラチンのゲル化温度以上（好ましくは35℃以上、例えば約40℃）において、0.01〜2重量％のゼラチン(Ｇ)と0.01〜2重量％のアラビアゴム(Ａ)を、その重量比(Ｇ/Ａ)を一般的には0.5〜1.5、好ましくは0.5〜1.2、より好ましくは0.5〜1.0になるように、29〜65重量％の水溶性有機溶媒中で混合する。ここで水溶性有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等が使用可能であるが、毒性等を考慮すればエタノールが望ましい。また、Ｇ/Ａが上記範囲を超えるとコアセルベート径の調製が困難になる傾向があり、上記範囲を下回るとリガンドの結合量が減少する傾向がある。コアセルベートの調製液中には、当該分野で公知のとおり、コアセルベート粒子の凝集を防止するために、界面活性剤を添加しておくことが好ましい。界面活性剤の種類および添加量については、その効果を奏する範囲内において当業者であれば適宜設定することができる。
【００３７】
次いで、酸（例えば酢酸、プロピオン酸、希塩酸、希硫酸）の添加により、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートを析出させる。ここで酸の添加量は、作製したいコアセルベート径に応じて適宜設定する。その後ゲル化温度以下（好ましくは35℃以下、例えば約10℃）に冷却し、グルタルアルデヒド、ホルマリン等のアルデヒドで架橋する。
【００３８】
また、コアセルベート粒子の作製にあたっては、芯物質（本発明で使用される顔料および磁性体を含む）を加えて、芯物質をコアセルベートで包んだいわゆるマイクロカプセルとすることもできる。所望の芯物質を用いることにより、コアセルベートの比重調整、コアセルベートの着色、磁性化等を行うことが可能である。その際には適当な界面活性剤（例えばTween20、Tween80、Triton X-100など）を添加して、分散性を上げておくことが望ましい。芯物質としては、SiO2（ガラス）、TiO2、CuO、CoO、Fe2O3などの金属酸化物の微粉末、カーボン、タルクなど種々のものを利用することができる。磁性体を含有させたコアセルベート粒子は、適宜の磁気発生手段（永久磁石、電磁石等）により、液体中での攪拌、洗浄、測定等の各種処理工程を短時間で行うことができる。なお、当業者であれば、コアセルベート粒子を所望の性質とするために適切な芯物質の種類および芯物質の使用量について適宜選択することができる。
【００３９】
次いで、作製された着色粒子に抗体を結合させる手法について説明する。
【００４０】
本発明において、抗体の着色粒子への結合は、当該技術分野で公知の方法、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法、染色法、タンニン酸法、グルタルアルデヒド法等により行うことができるが、抗体の結合効率の観点から、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド法により行うことができる。Ｎ−ヒドロキスクシンイミド法は、着色粒子のカルボキシル基と抗体のアミノ基との共有結合によるものである。
【００４１】
以下、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法について説明する。
【００４２】
まず、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとカルボジイミドを溶かした水溶液（PBS（Phosphate-buffered saline）やMES（2-Morpholinoethanesulfonic acid溶液））に、本発明の着色粒子を懸濁し、室温で2時間から一晩（例えば6〜12時間）反応させる。反応後、着色粒子を遠心洗浄し、そこに、目的とする抗体を適切なバッファー（例えばPBS、クエン酸リン酸バッファー、HEPESバッファー）に適切な濃度で溶解したものを加え、室温あるいは冷蔵（2〜8℃）で2時間から一晩反応させる。反応後、BSA（bovine serum albumin）やゼラチン、動物血清などで、未反応の官能基をブロックし（ブロッキング）、その後の凝集反応に供される抗体を担持した抗体結合着色粒子が作製される。
【００４３】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法は、着色粒子のカルボキシル基と抗体のアミノ基を結合させる方法であるが、当該方法において公知のとおり、着色粒子のカルボキシル基を活性化させる物質として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド以外に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジンを含むＮ−ヒドロキシ化合物を使用することができる。また、当該方法において公知のとおり、抗体の着色粒子への結合反応時に脱水剤として機能するカルボジイミドとして、ＥＤＡＣ；１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、ＤＩＰＣ；ジイソプロピルカルボジイミド等を使用することができる。なお、後述の実施例では、活性化剤としてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を、脱水剤としてＥＤＡＣを使用した（ＥＤＡＣ/ＮＨＳ法）。
【００４４】
作製された「抗体結合着色粒子」は、そのまま凝集反応用の溶液に置換して目的の反応に利用してもよいし、バイアル瓶等に分注して凍結乾燥し、長期保存をすることも可能である。凍結乾燥された抗体結合着色粒子は、好ましくは0.1〜0.6重量％の粒子浮遊液の状態に復元して、凝集反応で使用することができる。
【００４５】
２．容器底面に固相化された血小板
本発明では、検体中の抗血小板抗体を検出するために、インタクトな血小板を容器底面に結合させておく。血小板は、検査の目的に応じて、検体から得たものを使用してもよいし、検体の母親もしくは父親から得たものを使用してもよい。また、スクリーニングの目的のために、特定のヒトの血小板を使用することもできる。
【００４６】
血小板は、当該技術分野で公知の手法に従って、レクチン等のバインダー物質を介して容器底面に固相化することができる（後述の実施例４参照）。血小板は、凝集反応の凝集物（血小板・抗血小板抗体・着色粒子複合体）が容器底面上に広がった陽性パターンを形成し、目視でその陽性パターンを認識することができる程度に、容器底面上の一定の領域に固相化する必要がある。血小板は、容器底面全体に結合させてもよいし、凝集反応の凝集物（血小板・抗血小板抗体・着色粒子複合体）が検出可能であれば、容器底面の一部の領域に結合させてもよい。
【００４７】
容器として、凝集反応の溶液を収容することができる任意の容器を使用することができ、好ましくは底部が斜面を有する容器、たとえばＵ底またはＶ底のウェルを有する容器、具体的にはマイクロタイタープレートを使用することができる。Ｕ底のウェルを有する容器を使用した場合、ウェルの底面の一定の領域にわたって血小板を固相化することにより、着色粒子の凝集物は広がったパターンを形成し、着色粒子の非凝集物は、ウェル底部の最深部に集中して沈降することになる。これにより、陽性反応で得られる着色粒子の凝集物と陰性反応で得られる着色粒子の非凝集物とが異なるパターンを形成し、目視で凝集の有無を識別することが可能である。
【００４８】
３．検体
本発明の方法で「検体」は、抗血小板抗体が存在するか否かを検出したい任意の検体を使用することができる。
【００４９】
４．検査方法
本発明の検査方法において、「抗体結合着色粒子」と、「容器底面に固相化された血小板」と、「検体」との間で凝集反応を行う。
【００５０】
本発明の検査方法は、当該技術分野で「混合受身血球凝集法（mixed passive hemagglutination法；MPHA法）」と称される方法を利用したものである。本発明において好ましくは、抗体結合着色粒子として磁性体を含有する磁性粒子が使用され、この方法は、「磁性混合受身血球凝集法（magnetic-mixed passive hemagglutination法；M-MPHA法）と称される。
【００５１】
たとえば、後述の実施例５に記載されるとおり、本発明の検査方法を実施することができる。すなわち、「容器底面に固相化された血小板」と、「検体溶液」と、「被検生物種に対する抗体を結合した抗体結合着色粒子」とを反応させ、凝集反応の有無を目視で判定することにより、検体中に抗血小板抗体が存在するか否か検査を行うことができる。抗血小板抗体が検体中に存在する場合、着色粒子は容器底面に結合して容器底面に広がったパターンを形成し、一方、抗血小板抗体が検体中に存在しない場合、着色粒子は容器底面に結合せず、容器を傾斜させると最深部に沈降し、広がったパターンを形成しない（容器の底部が斜面を有する場合、容器を傾斜させなくても、着色粒子は最深部に沈降する）。
【００５２】
このように抗体結合着色粒子は、着色されているため、検出のために特別な反応を行う必要もなく迅速に、凝集反応を目視により観察することが可能である。また、後述の実施例５で実証されるとおり、本発明の抗体結合着色粒子は、検体中に抗血小板抗体が存在する場合のみ、高い凝集反応効率で、明瞭かつ安定した陽性像を形成することが可能であり、正確な検出が可能である。
【００５３】
本発明では、上述の抗血小板抗体の存在の検査方法と同様の手法に従って、「容器底面に固相化された顆粒球」と、「検体溶液」と、「被検生物種に対する抗体を結合した抗体結合着色粒子」とを反応させることにより、検体中に抗顆粒球抗体が存在するか否かを検査することも可能である（後述の実施例７参照）。
【００５４】
すなわち、本発明の別の側面に従って、検体中に抗顆粒球抗体が存在するか否かを検査する方法であって、
ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子上に被検生物種に対する抗体を結合し、ゼラチン／アラビアゴムコアセルベート粒子内に顔料を含有する抗体結合着色粒子と、容器底面に固相化された顆粒球と、検体との間で凝集反応を行う工程；および
凝集反応の有無を目視で判定する工程
を含む方法が提供される。
【実施例】
【００５５】
実施例１：種々の量の顔料を用いて着色粒子を調製した例
本実施例では、種々の量の顔料を用いて着色粒子を作製した。
【００５６】
粒子の主要構成材料であるゼラチンS1757はニッピ工業、アラビアゴムは仙波糖化工業より入手した。エタノール、NaOH、酢酸、グルタルアルデヒド、Tween20は、和光純薬製を使用した。
【００５７】
1.2gのアラビアゴムを40% EtOH : H2O 132mLに溶かし、更に10% Tween20; 0.195mL、フェリコロイドW10(タイホー工業); 0.195mLを添加し、更に顔料を添加し、1N NaOHでpHを10以上にしたのち、40℃に加温した4%ゼラチン水溶液(ニッピ工業)20mLを混合した。撹拌しながら、0.2N酢酸をゆっくり添加し、磁性着色粒子を作製した。予め求めたpHにおいて酢酸添加を中止して、約7μm径の磁性着色粒子を作製した。粒子が形成されたら、氷水の入ったバットにて撹拌して10℃以下に冷却し、ゲル化した。その後、グルタルアルデヒドを14ml加え、そのまま30分間撹拌した後、室温で一晩静置して、磁性着色粒子を架橋した。
【００５８】
顔料として、色墨(紫、緑、赤、茶)（市販品：呉竹（株））および朱液（呉竹（株））を使用した。色墨(紫、緑、赤、茶)は、フェリコロイドW10を添加した後、粒子作製用混合液72 mlに対し、約0.01〜0.4g/10mL濃度の水溶液として、1 mLを添加した。朱液は、粒子作製用混合液72 mlに対し、そのまま0.03〜1.0 mLを添加した。
【００５９】
着色粒子の作製結果を表１に示す。
【表１】
2010169435.tif 000002
【００６０】
表１に示すとおり、顔料の添加量を変化させても、同様に着色粒子は合成された。なお、着色粒子の作成に反応性染料を使用した場合には、染料の添加量が増大すると粒子そのものが合成されない場合があることを本発明者は観察しているが、顔料を使用した場合には、添加量を増大させても、粒子そのものの合成に影響を及ぼすことはなかった。
【００６１】
実施例２：種々のタイプの顔料を用いて着色粒子を調製した例
本実施例では、実施例１に記載の方法により、種々のタイプの顔料を用いて着色粒子を作製した。顔料として、表２に記載の顔料を使用した。
【００６２】
墨汁（呉竹（株））、朱液は、粒子作製用混合液72 mlに対し、そのまま1 ml使用した。
【００６３】
ＣｕＯ微粉末、ＣｏＯ微粉末、ＴiＯ2微粉末、Ｆｅ2Ｏ3微粉末、コバルトブルー（いずれもCI化成）については、分散剤（ローマＤ；サンノプコ製）を用いて、0.01 ｇ/mLの濃度になるように水系分散させたものを使用した。ＣｕＯ微粉末、ＣｏＯ微粉末、ＴiＯ2微粉末、Ｆｅ2Ｏ3微粉末、コバルトブルーは、粒子作製用混合液72 mlに対し、0.1ｇ使用した。水溶性アクリル樹脂塗料（市販品）は、粒子作製用混合液72 mlに対し、0.5 mL使用した。
【表２】
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【００６４】
表２に記載の何れの顔料を使用したケースにおいても、使用された顔料の色を示す着色粒子が作製された。作製された着色粒子の一例の顕微鏡写真を図１に示す。図１に示される粒子は、顔料としてＣｏＯ微粉末を使用した例である。図１は、顔料（CoO）が粒子内部に取り込まれていることを示す。
【００６５】
実施例３：抗体結合着色粒子を調製した例
本実施例では、実施例１に記載の方法により作製された着色粒子に抗体を結合させた。顔料としては、朱液、色墨(紫)、色墨(赤)、色墨(緑)、色墨(茶)を使用した。
【００６６】
実施例１に記載の方法により作製された着色粒子を、以下に記載するとおりＥＤＡＣ/ＮＨＳ法によって前処理し、抗体感作をおこなった。
【００６７】
（i）ＥＤＡＣ/ＮＨＳ処理
着色粒子を20%(V/V)粒子に調整し、純水で遠心洗浄し、NHS 及びEDAC をそれぞれ0.01g/mLの濃度になるように加えて、室温で2時間撹拌し反応させた。その後、純水で3回洗浄してNHS/EDAC処理磁性粒子とした。
【００６８】
（ii）抗体感作
NHS/EDAC処理磁性粒子に、ウサギ抗ヒトIgG抗体（Jackson社）を0.01M AcOH-AcONa pH5.0で3〜10μg/mLに希釈したものを粒子濃度10%になるように添加して、室温でOverNight撹拌して感作を行った。その後、0.2% BSA/PBS pH7.2で1回洗浄して、同バッファーに1時間浮遊して撹拌してブロッキングを行った。
【００６９】
結合したウサギ抗ヒトIgG抗体をヤギ抗ウサギALP（アルカリフォスファターゼ標識）抗体（Jackson社）で測定した。
【００７０】
その結果を図２に示す。図２は、本発明による着色粒子が、非染色粒子と同程度に抗体を結合可能であることを示す。
【００７１】
実施例４：顔料で着色された粒子（本発明）と反応性染料で着色された粒子（比較例）との陰性像の対比
本実施例では、実施例１に記載の方法により作製された顔料で着色された粒子を、血小板を固相化したプレートに添加し、非特異反応が起こるか調べた。
【００７２】
比較例として、反応性染料（カヤシオンTurquioiseENA（日本化薬））で着色された粒子を用いた場合の結果も併せて示す。反応性染料で着色された粒子は、以下のとおり作製した。
【００７３】
実施例１の方法に従って作製したゼラチン/アラビアゴムコアセルベート（顔料を含まない）を20％濃度の浮遊液とし、そこに上記染料を0.5％濃度になるように直接添加し、40℃で6時間撹拌しながら染色を行った。その後、染色した粒子を精製水で3回水洗し、10％浮遊濃度とし、オートクレーブで120℃で15分間加熱処理し、冷却後、洗浄して余分な染料を除去した。
【００７４】
血小板を固相化したプレートは、小麦胚芽レクチンをまずプレート（Maxisorp(登録商標) NalgeNunc社）に固相化し、小麦胚芽レクチンを介して血小板（社内Donor採血で調製）を固相化することにより作製した。具体的には、血小板を約10,000細胞/mlの濃度にPBS（phosphate buffered saline）で浮遊調製したものを50μl/ウェル分注し、500rpmで5分間遠心し、その後0.05％ Tween20/生理食塩水で3回洗浄して、血小板固相プレートとした。
【００７５】
このように作製された血小板固相プレートに、着色粒子を0.5 v/v％の濃度で、ウェルあたり25 ml分注して、磁石上で3分間静置した。
【００７６】
結果を図３に示す。図３は、左から順に、反応性染料で着色した粒子、色墨(紫)、色墨(青)、色墨(緑)、朱液で着色した粒子、一つとばして、反応性染料で着色した粒子（左端と同じ）を示す。
【００７７】
反応性染料で着色された粒子（比較例）の場合、非特異反応により陽性像が形成され陰性像が形成されなかったが、顔料で着色された粒子（本発明）の場合、非特異反応が起こらず、明瞭な陰性像が形成された。
【００７８】
実施例５：本発明による抗体結合着色粒子をインジケーターとして用いて抗血小板抗体を検出した例
本実施例では、実施例３に記載の方法により作製された抗ヒトIgG抗体結合着色粒子を用いて、抗血小板抗体の検出を行った。顔料としては色墨(紫)を使用した。
【００７９】
実験は以下のとおり行った。
【００８０】
血小板を固相したマイクロプレートをPBSで3回洗浄した。洗浄後、水切りして検体希釈液で4倍に希釈した陰性検体または陽性血清(オリビオ陽性コントロール)（オリンパス（株））を50μL/wellずつ分注して、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、TweenPBSでプレートを洗浄して、水切りした。水切り後、直ちに0.5 v/v％の抗ヒトIgG抗体結合着色粒子の浮遊液（復元したもの）を25μL/well分注して、磁石上で3分間パターン形成した。
【００８１】
結果を図４に示す。図４は、上の２つのウェルは、陰性検体の例を示し、下の２つのウェルは、陽性検体の例を示す。図４は、陰性検体を使用した場合は陰性像を示し、陽性検体を使用した場合は陽性像を示し、互いに明瞭に区別可能であることを示す。この結果から、本発明の方法を用いて抗血小板抗体の検出が目視により可能であることがわかる。
【００８２】
実施例６（比較例）：非着色磁性粒子をインジケーターとして用いて抗血小板抗体を検出した例
本実施例では、抗ヒトIgG抗体結合非着色粒子を用いて、抗血小板抗体の検出を行った。本実施例は、粒子が着色されていないことを除いて、実施例５と同様にして行った。
【００８３】
その結果を図５に示す。図５は、上の２つのウェルは、陰性検体の例を示し、下の２つのウェルは、陽性検体の例を示す。図５は、非着色粒子を用いた場合、陽性像と陰性像を肉眼で明瞭に識別するのは困難であることを示す。
【００８４】
実施例７：本発明による着色粒子をインジケーターとして用いて抗顆粒球抗体を検出した例
本実施例では、実施例３に記載の方法により作製された抗ヒトIgG抗体結合着色粒子を用いて、抗顆粒球抗体の検出を行った。顔料としては色墨(紫)を使用した。
【００８５】
実験は以下のとおり行った。
【００８６】
顆粒球（社内Donor採血により自家調製したもの）をPBSで浮遊し、レクチンを固相したマイクロプレートに50μL/well分注し、遠心機で500rpm 5分間遠心を行い、洗ビンを用いて、PBSで3回洗浄し、顆粒球固相プレートとした。顆粒球固相プレートに検体（社内保有品）をPBSで4倍希釈した検体を50μL/well添加し、37℃で30分間インキュベートし、その後、洗ビンを用いて、PBSで6回洗浄し、0.5 v/v％の抗体結合着色粒子の浮遊液を25μL/well分注して磁石上で3分間パターン形成した。
【００８７】
その結果を図６に示す。図６は、左のウェルは、陰性検体の例を示し、右のウェルは、陽性検体の例を示す。図６は、陰性検体を用いた場合は陰性像を示し、陽性検体を用いた場合は陽性像を示し、互いに明瞭に区別可能であることを示す。この結果から、本発明の方法を用いて顆粒球抗体の検出が目視により可能であることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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