(57)【要約】【課題】バイオマス資源の主成分であるデンプン、セルロースおよびヘミセルロースの加水分解物からエタノールの製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属またはリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属に属する微生物が、嫌気および好気条件下で優れたエタノール生成能を有することを見出した。本発明の微生物を用いることにより、バイオマス資源の主成分であるデンプン、セルロースおよびヘミセルロースの加水分解物から効率的にエタノールを製造することができる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
木質系バイオマスまたは草本系バイオマスの加水分解物にケカビに属する糸状菌を作用させることを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項２】
ケカビに属する糸状菌がペントースの資化能を有するものである請求項１記載のエタノールの製造方法。
【請求項３】
ペントースの資化能を有するケカビに属する糸状菌がムコール（Ｍｕｃｏｒ）属またはリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属である請求項１または２記載のエタノールの製造方法。
【請求項４】
木質系バイオマスまたは草本系バイオマスの加水分解物が、ペントースおよび／またはヘキソースを含むものである請求項１〜３記載のエタノールの製造方法。
【請求項５】
草本系バイオマスが穀類、稲わら、もみ殻、麦わらまたはバガスである請求項１〜４記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケカビを用いたエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油資源の枯渇とともに、未利用なバイオマス資源を開拓し、その利用法を開発することが急務となってきた。特に、我が国のような貧資源国では、新規エネルギー資源の開発は国家的な課題であり、バイオマス資源の開発および有効変換法によるエタノール製造法の開発が進められている。
【０００３】
一般に、バイオマスからエネルギー資源であるエタノールを生産するためには、バイオマスを発酵用の糖質へ加水分解させる工程と、その発酵用糖質を微生物で発酵させる工程を経ることが古くから行われてきた。
【０００４】
サトウキビ、トウモロコシ、米、麦などの穀類、稲わら、麦わら、バガスなどの草本系バイオマス、木材チップ、流木、廃建材などの木質系バイオマスなどは、酸やアルカリを用いた加水分解法または酵素による加水分解法、あるいはそれら技術の併用により、発酵用糖質を効率よく得る方法が広く検討されている。
【０００５】
また、次の工程である発酵工程は、一般的に、嫌気条件下で酒造製造用の酒精酵母（Saccharomyces cerevisiae）を用いた発酵により行われている。具体的には、現在、ブラジル、米国などで行われている穀類を原料としたバイオエタノールの生産は、トウモロコシやサトウキビから得られたグルコースなどヘキソース（６炭糖）を主成分とする発酵糖液を原料とした発酵法により行われている。
【０００６】
トウモロコシやサトウキビは生産が容易で加工がしやすく豊富な糖が得られ、酵母は高濃度の糖存在下で優れた成長能力を持ち、エタノール生産収率も高い。しかし、食料を燃料に替えるという倫理上の問題がある。また、食料としての供給の減少などの重大な問題を抱えている。
【０００７】
このような背景から、穀類に競合しない稲わら、もみ殻などの草本系バイオマスまたは廃木材などの木質系バイオマスからエタノールを高収率で得るための技術開発が進められている。
【０００８】
木質系バイオマスは、キシロース、アラビノースなどのペントース（５単糖）類およびグルコース、ガラクトース、マンノースなどヘキソース（６単糖）類を構成単位とするヘミセルロースと、グルコースを構成単位とするセルロースとを含んでいる。
一方、草本系バイオマスである稲わらおよびもみ殻は、我が国の農産廃棄物の代表で、セルロース、ヘミセルロース、リグニンを含んでいる。
【０００９】
ヘミセルロースは、セルロースに比べて酸・アルカリによる加水分解により糖化されやすく、高収率で糖質を回収しやすい。しかし、酒精酵母やエタノール発酵細菌ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）はペントースを資化できるものの発酵性を有しない。
【００１０】
そのため、キシロース発酵酵母であるキャンディダ・シェハタエ（Candida shehatae）またはピチア・スデイピチィス（Phichia stipitis）を用いた草本系バイオマス加水分解液のエタノール発酵が検討された（非特許文献１，２）。
【００１１】
また、キシロース代謝酵素遺伝子などを組換えた酵母またはコネリ菌（特許文献１）、アルコール発酵能を持つ遺伝子組み換え大腸菌を用いる方法(特許文献２)などにより商業ベースでの利用が行われようとしている。
【００１２】
しかし、これらエタノール発酵微生物を用いてペントースの代表であるキシロースからエタノール発酵を行う場合、酸素の供給条件を厳密に制御する必要がある上、副生成物としてキシリトールやグリセリンなどが生成してしまう。
また、加水分解の際に生ずる発酵阻害物質(フルフラール、５-ヒドロキシメチルフラード、酢酸など)により強く発酵が阻害されるため、エタノール発酵効率の向上や阻害物質除去法の開発が必須である。
さらに、組換え微生物を用いた場合には、高いエタノール生産性を達成できるものの、組換え菌を使用する際の安全対策として、発酵装置から菌体の流失を防ぐためのシールド対策、発酵後の殺菌対策などの付帯設備を用意する必要がある(特許文献３)。さらに、倫理的問題を解決していく必要がある。
【非特許文献１】Toivola, A., Yarrow, D., van den Bosch, E., van Dijen, J.P., andScheffers, W.A. (1984) Alcoholic Fermentation of D-xylose by Yeasts, Appliedand Environmental Microbiology, June, 1221-1223
【非特許文献２】Trans, A.V. and Chambers, R.P. (1986)Ethanol Fermentation of Red Oak Acid Prehydrolysate by the Yeast Phichia stipitis CBS 5776, Enzyme Microbiology and Technology, Vol.8, 439-444.
【特許文献１】公表2001-525682
【特許文献２】特開2006-087350
【特許文献３】特開2007-202517
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
以上に述べたように、多種多様なバイオマスおよびバイオマス加水分解物から安全かつ効率的にエタノール生産が達成できる微生物は得られていない。
本発明は、上記問題点を解決しつつ、微生物の作用を利用して、バイオマス資源の主成分であるデンプン、セルロース、およびヘミセルロースの加水分解物から、エタノールを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らはこれらの点に鑑み、草本系バイオマスの主成分であるグルコースまたはキシロースを含む加水分解液から嫌気または好気条件下でエタノールを得るための生化学的方法を鋭意検討した。
その結果、これまでキシロースからのエタノール生成活性が知られていなかったケカビ、特にムコール（Ｍｕｃｏｒ）属またはリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属の微生物が、グルコースまたはキシロースを含む加水分解液からエタノールを生成する能力に優れていることを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち本発明は、以下のエタノールの製造方法に関する。
〔１〕木質系バイオマスまたは草本系バイオマスの加水分解物にケカビに属する糸状菌を作用させることを特徴とするエタノールの製造方法。
〔２〕ケカビに属する糸状菌がペントースの資化能を有するものである〔１〕のエタノールの製造方法。
〔３〕ペントースの資化能を有するケカビに属する糸状菌がムコール（Ｍｕｃｏｒ）属またはリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属である〔１〕または〔２〕のエタノールの製造方法。
〔４〕木質系バイオマスまたは草本系バイオマスの加水分解物が、ペントースおよび／またはヘキソースを含むものである〔１〕〜〔３〕のエタノールの製造方法。
〔５〕草本系バイオマスが穀類、稲わら、もみ殻、麦わらまたはバガスである〔１〕〜〔４〕のエタノールの製造方法。
【００１６】
エタノールは、一般に、ヘキソースがエタノール発酵微生物内に取り込まれ、解糖経路を経て、生成したピルビン酸が、ピルビン酸ジイカルボキシラーゼおよびアルコールデキドロゲナーゼの反応により還元され生成されるアルコールである。エタノールは古くより醸造酒の主成分であるとともに、溶剤（有機溶剤）、有機合成原料、解毒剤などとして広く使われている産業上有用な化合物である。さらに、バイオマス燃料としてその利用が拡大している。
【００１７】
本発明で使用する、キシロース、アラビノースなどのペントースからエタノールを生成する能力を有する微生物は、ケカビに属する糸状菌であり、好ましいものとして、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属およびリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属が挙げられる。
【００１８】
生化学的性状等に基づいて、微生物を分類する方法は公知である。更に上記属に属する微生物が目的とする活性を有していることは、たとえば実施例に示すような方法に基づいて確認することができる。すなわち、被験微生物を、キシロース含有培地で静置または振盪培養し、培養液に蓄積するエタノールを検出することによって、目的とする生産能を有していることが確認できる。エタノールはガスクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーなどの手法によって同定することができる。
【００１９】
本発明において、使用されるムコール属およびリゾムコール属の糸状菌として、例えば以下のような種を示すことができる。
ムコール・バシリイホルムス（Ｍｕｃｏｒ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）
ムコール・シイルシネロイデェス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）
ムコール・グイリイモビイデイ（Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｂｉｄｉｉ）
ムコール・ヘマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）
ムコール・ヤバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）
ムコール・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）
ムコール・オドラトス（Ｍｕｃｏｒ  ｏｄｏｒａｔｕｓ）
リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）
リゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）
【００２０】
上記のムコールは、接合菌門・接合菌綱・ケカビ目・ケカビ科に属する代表的なカビであり、リゾムコールは、ケカビ科の一種である。いずれも湿気の多い有機物上に出現する、ごく普通のカビである。これら微生物の、土壌、河川、あるいは湖沼などの材料からの単離・同定法は公知である。たとえば単離および同定方法については以下のような文献を参照することができる。
カビ：”The Genera of Hyphomycetes from soil”， G.L.Barron, Baltimore, Maryland, Williams and Wilkins(1968)． ”Compendium of soil Fungi”， K.H. Domsh, W. Gams, T. Anderson, New York, Academic Press(1980)．
【００２１】
キシロースから代謝によりエタノールを生成するムコール属およびリゾムコール属の糸状菌としてより具体的には、以下の菌株を示すことができる。これらの菌株は、それぞれのアクセション番号をもとに下記のセルバンクから入手することができる。
ムコール・バシリイホルムス（ＮＢＲＣ６４１４，８６３８）
ムコール・シイルシネロイデェス（ＮＢＲＣ４５５４，４５６３，４５７４，５３９８，５７７４，５７７５，６７４６，３０４７０，３１３９８）
ムコール・グイリイモビイデイ（ＮＢＲＣ９４０３）
ムコール・ヘマリス（ＮＢＲＣ９２６１，９４１０，９４１１，９４１２）
ムコール・ヤバニカス（ＮＢＲＣ４５６９，４５７０，４５７２，５３８２）
ムコール・オドラトス（ＮＢＲＣ７１０２，８６３７）
ムコール・ラセモサス（ＮＢＲＣ４５８１，５４０３）
リゾムコール・ミエヘイ（ＮＢＲＣ９７４０，９７４１，９７４２，９７４３）
リゾムコール・プシルス（ＮＢＲＣ４５７８，４５７９，４５８０，９７４４，９７４５，９８５６）
これらの糸状菌は、野生株、変異株、または、細胞融合、もしくは遺伝子操作などの遺伝子手法より誘導される組み換え株など、いずれの株も好適に用いることができる。また、これらの糸状菌は、単独または混合して使用することができ、酵母などのヘキソースの資化能・発酵能を有する微生物と組み合わせて使用することもできる。
【００２２】
なお、上記のＮＢＲＣ番号の付された糸状菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構
バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ） 発行の微生物カタログ第１版（２００５年）に記載されており、ＮＢＲＣより入手することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、Ｍｕｃｏｒ属またはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属に属するエタノール生産微生物を用いることで、バイオマス資源の主成分であるデンプン、セルロース、およびヘミセルロースの加水分解物から効率よくエタノールを製造する方法が提供される。
本発明で用いる菌は糸状性を持つため，簡便な方法でエタノールを分離することができる。
さらに、好気条件でもエタノールが生産できるため、嫌気環境を作るための施設を必要としない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明のエタノール生産微生物を培養して、該培養液よりエタノールを採取する方法について述べる。
【００２５】
本発明に使用される微生物を培養する場合、微生物分野における常法に従い、炭素源、窒素源、無機塩類等の栄養成分を含む培地を用いて行うことができる。
本発明に使用される培地はいわゆる液体培地であって、炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類、核酸成分、微量金属塩等を必要により取捨選択し、組み合わせて適当量添加した水溶液が使用可能である。
【００２６】
培地の炭素源は、その微生物が増殖しうるものであれば特に制限はないが、望ましくは、炭素源としては上記微生物が利用可能な任意の炭素源を使用することができる。具体的には、ヘキソースとしてグルコース、マンノース、ガラクトースおよびフルクトース、ペントーストしてキシロース、アラビノースおよびリボース、二糖として、マンノース、セロビオース、ラクトース、シュクロース、トレハロース、ニゲロース、イソマルトースおよびゲンチオビオース、多糖類としてデキストリン、デキストラン、可溶性デンプン、キシランおよびセルロースなどの多糖類、米、小麦、大麦、黒麦、芋、ジャガイモ、サツマイモ、菊芋およびタロ芋などのデンプン系バイオマス、稲わら、もみ殻、麦わら、バガス、古紙、新聞紙および草(葉、茎、根、花、鞘、種子)の草本系バイオマス、木、流木、伐採木および廃建材などの木質系バイオマスを、直接あるいは酸処理、アルカリ処理、または酵素処理した加水分解液などあるいはこれらの混合物を使用することができる。その添加濃度は１〜３０重量％、好ましくは５〜２０重量％が適当である
【００２７】
窒素源としては例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、コハク酸アンモニウム、フマル酸アンモニウムおよびクエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆油、モラセス、カゼイン加水分解物および尿素などの無機有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００２８】
他に無機塩、微量金属塩、核酸成分、ビタミン類など、通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加して用いてもよい。
【００２９】
培養は完全密閉した容器内での嫌気静置培養、通気型発酵槽を用いて窒素ガス、あるいは窒素ガスと炭酸ガスの混合液を通気した嫌気培養、または振盪、通気撹拌等の好気的条件下で行われ、培養温度は一般に２０〜４０℃、好ましくは２２〜３５℃である。培養ｐＨは３〜９、好ましくは、５〜８、さらにキシロースを含む糖質溶液の場合好ましくは、７〜８である。培養期間は、特に制限されるものではないが、通常１日〜１０日間、より好ましくは、１日間〜５日間で行われる。
【００３０】
さらに、上記のように培養して得られた菌体を、アクリルアミド等の重合性モノマーやアルギン酸塩、カラギーナン、多孔性のセルロース発泡体、ポリウレタンフォーム、光硬化性樹脂、フェルトなどの適当な担体を用いて固定化し、原料と接触させてもよい。
【００３１】
菌体又はその処理物の濃度は特に制限されるものではないが、一般には１〜５０重量％、好ましくは２〜２０重量％の範囲内が好適である。
【００３２】
以上に述べた方法により培養液中に産生したエタノールを培養液から採取するに際しては、それ自体既知の方法に従いエタノールを分離・精製すればよい。この際、サッカロマイセス・セレビシエ、ザイモモナス・モビリス、キャンディダ・シェハタエ、ピチア・スデイピチィスまたは遺伝子組換え微生物などの単細胞生物によるエタノール生産法と異なり、本発明で用いる菌は糸状性を示していることから、簡便な濾過、沈降分離、ディカンテーションなどの分離方法を用いることにより容易に培養液と分離ができ、さらに、得られた濾液、上清などの分離液は、クロマトグラフィーや簡便な蒸留装置などの分離方法を適宜用いることによりエタノールを得ることができる。
【実施例】
【００３３】
次に、本発明について、以下の実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００３４】
［実施例１］
以下に示す組成の培地を調製した後、この培地２５ｍＬを１００ｍＬエーレンマイヤーフラスコに分注し、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）により滅菌した。
炭素源
グルコース５．０％、キシロース５．０％、あるいはグルコース２．５％とキシロース２．５％の混合液、
その他成分
酵母エキス                  ０．５％
硫酸アンモニウム            ０．７５％
硫酸アンモニウム・７水和物  ０．０７５％
リン酸水素二カリウム        ０．３５％
塩化カルシウム              ０．１％
ｐＨ  ７．５（ｐＨ調整剤: １Ｎ水酸化ナトリウム水溶液)
【００３５】
以下の表１，表２，表３に示す菌株を各フラスコに植菌した後、１２０ｒｐｍ、２８℃で５日間振盪培養を行った。培養終了後、定性濾紙(Ａｄｖａｎｔｅｃ製、Ｎｏ．１３１)を用いて濾過を行うことにより菌体を除去し、各培養液の培養上清液を調製した。濾紙上に得られた菌体は、蒸留水で十分洗浄した後、９０℃で２４時間乾燥させた後、重量を測定し、乾燥菌体重量を求めた。一方、ＧＣにより、培養により得られた培養液中のエタノールを定量した。さらに、ＨＰＬＣ分析法により、培養により得られた培養液中の残留グルコースあるいはキシロースを測定した。
【００３６】
その結果、表３に示した通常の清酒酵母（協会７号）を用いた場合、この条件では、菌体は増殖するものの、いずれの炭素源を用いてもエタノールの生産は確認することができず、好気条件すなわち呼吸代謝により、炭素源は全て炭酸ガスと水へ変換されたと推測された。
一方、本発明では、各培養上清液中のエタノールが確認できたことから、好気培養によりグルコースまたはキシロースを炭素源としてエタノールを生産できることを見出した。特に、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ４５７８を用いた場合、グルコースを炭素源とした時のエタノール濃度は、２２．０ｇ／Ｌ、キシロースの時、２．１５ｇ／Ｌ、またはグルコースとキシロースの混合液の時に、１１．５ｇ／Ｌできることが判明した。さらに、グルコースを用いて得られたエタノール収率ＹＥ／Ｓは０．４４以上と、前述の酵母あるいはＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓなどを培養した際に用いて得られる最大収率０．４２あるいは０．４４を上回るエタノールを生産できる微生物であることがわかった。一方、キシロースを用いて得られたエタノール収率ＹＥ／Ｓは０．１２と、前述のＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ  ＣＢＳ５７７６を微好気条件下で用いた場合に得られる最大収率０．３６と同等量のエタノールを得ることはできないものの、好気条件下でかなり高い収率でエタノールを得ることができることがわかった。
【００３７】
本発明で得られた好気条件下でのエタノール生産は、通常の微生物代謝の概念を覆す現象であるが、Ｃｒａｂｔｒｅｅ（クラブトリー）効果が顕著に表れた結果だと推察される。通常、好気条件では糖質が解糖系を通過してピルビン酸からＴＣＡ回路へ代謝が進行するが、糖質が培養液に存在することにより、ＴＣＡ回路への代謝が阻害され、エタノールへ変換されたものと推察される。
以下に表１、表２、表３にまとめた。
【００３８】
なお、上記のエタノール濃度のＧＣ分析は、以下の条件にて実施した。
カラム；ＢＰＸ５、内径０．２５μｍ  x ２５ｍ（ＳＧＥ製）
移動相；ヘリウムガス
流速；３２ｍＬ／分間
カラム温度；６０℃（２ｍｉｎ）→ １５℃上昇／分→１８０℃（５ｍｉｎ）
検出器；水素炎イオン化型検出器  （ＦＩＤ，ＧＣ−２０１０，島津製作所製）
検出時間：０．９５分間
【００３９】
また、上記の培養液中の残存炭素源濃度のＨＰＬＣ分析は、以下の条件にて実施した。
カラム；ＣＡＲＢＯＳｅｐ  Ｇｅｌ−８７Ｐ (東京化成工業製）
移動相；水
流速；１．０ｍＬ／分間
カラム温度；８０℃
検出器；示唆屈性計（ＲＩＤ−１０Ａ，島津製作所製）
検出時間：グルコース  ７．１分間，キシロース  ７．８分間
標準物質；Ｌ−グルコース（和光純薬製）、キシロース（和光純薬製）
【００４０】
＜好気条件下での微生物によるエタノール生産＞
表中、Ｇは炭素源としてグルコース５０ｇ／Ｌを示す。Ｘは炭素源としてキシロース５０ｇ／Ｌを示す。 Ｇ＋Ｘは炭素源としてグルコース２５ｇ／Ｌとキシロース２５ｇ／Ｌの混合液を示す。なお、培養は、２８℃で１２０ｒｐｍの振盪培養を行った。
【００４１】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００４２】
［実施例２］
実施例１と同じ培地を調製し、各々２５ｍＬを１００ｍＬエーレンマイヤーフラスコ中に分注し、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）により滅菌した。Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ４５７８を各フラスコに等量植菌後、実施例１と同じ培地を用いて同じ条件で１２０時間２８℃で静置嫌気培養と好気振盪培養を行い、実施例１と同様の方法にて、適当な時間ごとにフラスコを回収し、培養上清液を調製した。
【００４３】
その結果、炭素源をグルコースとした場合(図１)、好気培養において約６０時間で、嫌気培養では若干遅れて７２時間で完全に消費した。これに伴って菌体も良好に増殖し、好気・嫌気培養とも菌体量は約５．０ｇ−ｄｒｙ／Ｌに達した。一方、エタノールは、好気培養の場合、培養７２時間目において最大約２２ｇ／Ｌであり、このときのエタノール収率は０．４４ｇ／ｇにも達した。その後、クラブトリー効果が無くなり、培地中に生産されたエタノールは次第に低下した。また、嫌気培養では、エタノールは徐々に増加し培養１２０時間目に２０．１ｇ／Ｌに達した。この結果から本発明は、嫌気条件よりも好気条件の方が菌体の増殖も良く、更にエタノール生成量も多いことが判明した。
【００４４】
一方、炭素源をキシロースとした場合（図２）、キシロースの消費は好気・嫌気条件ともグルコースと比較してかなり遅く、培養１２０時間目に２０から２２ｇ／Ｌのキシロースが残留したものの、菌体の増殖は良く、培養７２時間目以降３．３から４．１ｇ−ｄｒｙ／Ｌに達した。生成したエタノールは、培養とともに次第に蓄積し、培養１２０時間目において好気培養で６．６ｇ／Ｌ、嫌気培養で７．３ｇ／Ｌと好気または嫌気条件下でエタノールを生産できる。このときのエタノール収率は、それぞれ０．２８、０．２１ｇ／ｇとかなり高い値を示した。
【００４５】
[比較例１]
実施例２と同じ培地を調製し、各々２５ｍＬを１００ｍＬエーレンマイヤーフラスコ中に分注し、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）により滅菌した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  協会７号を用いて、静置嫌気培養と好気振盪培養を行った。
【００４６】
その結果、炭素源をグルコースとした場合(図３)、好気培養においてグルコースの消費は良好で２４時間でほぼ完全にグルコースを消費した。しかし、エタノールの生産は全く確認することはできなかった。嫌気培養において、菌体の増殖は好気条件と比較して若干遅れたが、グルコースは４８時間で完全に消費した。エタノールは、培養４８時間目に２１．１ｇ／Ｌに達した。
また、キシロースを用いた場合(図４)、嫌気または好気条件いずれの場合でも、キシロースの消費は認められたが、エタノールの培地中での蓄積は確認することはできなかった。
【００４７】
［実施例３］
本発明が、農産廃棄物である稲わらの加水分解物からエタノールを生産できるか確認するために、４Ｌのサクラ精機製気泡塔型バイオリアクター中に硫酸による稲わら加水分解液４．０Ｌを仕込み、常法により滅菌処理を行った。
硫酸加水分解稲わらの調製は、３００g−ｄｒｙの稲わらを０．５％硫酸水溶液３Ｌ中に２４時間浸した後、１２１℃で６０分間オートクレーブ処理を行った。その後、沈殿物を除いた後、６Ｎ水酸化ナトリウムを用いて体積４．０Ｌ、ｐＨ７．５に調製した。この時得られた加水分解物溶液の成分は、ヘキソース(グルコース＞２２ｇ／Ｌ，ガラクトース＜０．１ｇ／Ｌ，マンノース＜０．１ｇ／Ｌ)，ペントース(キシロース＞１５ｇ／Ｌ，アラビノース＜０．８ｇ／Ｌ)，カルソンリグニン(２４．２ｇ／Ｌ)，酸可溶リグニン(２．２ｇ／Ｌ)である。この溶液を直接気泡塔型バイオリアクター内に入れ、そこへＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ４５７８を植菌することにより１２０時間好気培養を行った(図５)。
また、気泡塔は２８℃に制御し、さらに、好気条件に保つために、除菌した空気０．２ＶＶＭになるようにリアクター内に供給した。
また、比較のためにグルコース３０ｇ／Ｌとキシロース２０ｇ／Ｌ(グルコース：キシロース＝３：２)を炭素源とした培養も同時に行った。
【００４８】
図６に示した対照実験において、グルコースは４８時間で完全に消費した後、キシロースの消費は速くなり、培養１２０時間目においてほぼ完全に消費した。この炭素源の消費に伴い菌糸は良好に生育し、培養終了時には約４．６ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌの菌糸が得られた。また、エタノールは培養７２時間目に約１７．５ｇ／Ｌ生成できた。
【００４９】
一方、稲わらの加水分解物を培地とした場合(図５)、炭素源の消費は、対照と比較して若干遅いものの培養１２０時間目でほぼキシロースも消費できた。また、最終的に得られた菌体量は３．８ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌと、増殖に対して阻害が認められた。また、エタノール生産量は、培養１２０時間目に１４．０ｇ／Ｌであった。この値は、図６で示した対照実験により得られたエタノール量と比較すると、約２０％少ないものの、本発明は、発酵を阻害する夾雑物質を多く含む稲わら加水分解物でも十分発酵に適応できることを実証することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、微生物を利用した多種多様なバイオマスおよびバイオマス加水分解物からのエタノール生産を、安全かつ効率的に行うことができる。また、本発明で用いる菌は糸状性を持つため，簡便な方法でエタノールを分離することができる。さらに、好気条件でもエタノールが生産できるため、嫌気環境を作るための施設を必要としない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ４５７８を用いたグルコースからのエタノール生産
【図２】Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ４５７８を用いたＸｙｌｏｓｅからのエタノール生産
【図３】Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  協会７号を用いたグルコースからのエタノール生産
【図４】Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  協会７号を用いたキシロースからのエタノール生産
【図５】Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ４５７８を用いたグルコースとキシロース混合液からのエタノール生産
【図６】Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ４５７８を用いた稲わら加水分解物からのエタノール生産
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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