(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞伸展活性、細胞移動活性を有するペプチド及び細胞接着伸展剤等を提供する。【解決手段】ペプチド及び細胞接着伸展剤等は、フィブロネクチンのＩＩＩ型３領域（ＦｎＩＩＩ３、特定の配列１の１０３番目から１９８番目に記載のアミノ酸配列）を有する。当該ペプチドは、発生過程での細胞移動、形態形成、結合組織形成の分子メカニズム、創傷治癒、ガン転移のメカニズムを解明する手がかりとなるヒト線維芽細胞に対する伸展活性及び移動活性を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の１０３番目から１９８番目に記載のアミノ酸配列を有し、細胞の形態を変化させることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
配列番号１の１番目から１０２番目、１９９番目から２８８番目、及び／又は、２８９番目から３７８番目のアミノ酸配列を更に有する、ことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ヒト線維芽細胞に対する伸展活性及び移動活性を有する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載のペプチドを含有する、ことを特徴とする細胞接着伸展剤。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載のペプチドを含有する、ことを特徴とするガン転移防止剤。
【請求項６】
配列番号１の１番目から１０２番目、１０３番目から１９８番目、１９９番目から２８８番目、及び／又は、２８９番目から３７８番目のアミノ酸配列をコードする、ことを特徴とする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の形態を変化させるペプチド及び細胞接着伸展剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲン、フィブロネクチンといった細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ExtraCellular Matrix）を構成する細胞接着性タンパク質の多くは、胚発生や器官形成、組織修復などの生命現象における重要な過程で多様な細胞に作用し、その機能を調節することが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
発生過程での細胞移動及び形態形成、結合組織形成の分子メカニズム及び創傷治癒、並びにガン転移のメカニズム等を解明するために、線維芽細胞とＥＣＭ分子との結合様式の解析が求められている。例えば、モノクローナル抗体（Ａ３Ａ５）は、フィブロネクチンＩＩＩ型の領域内の所定のペプチド部分を認識する抗体であることが知られている（非特許文献１参照）。
【０００４】
また、ヒト正常細胞において、フィブロネクチン内のＲＧＤ（アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ））配列を有するペプチドにより、細胞移動及び形態形成が引き起こされることが知られている（非特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開平９−１０４６９７号公報
【非特許文献１】Obara M., Yoshizato K., FEBS Letters, Volume 412, Number 1, 21 July 1997 , pp. 48-52(5)
【非特許文献２】Fidler IJ., Cancer Research, 1 Oct 1990, 50(19), 6130-6138
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＲＧＤ配列を有するペプチドは、正常細胞の発現にも影響を及ぼすため、細胞の接着及び伸展が阻害されることによる副作用のおそれがある。そこで、細胞接着性等を有し、副作用のおそれのないペプチド等が求められている。
【０００７】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、細胞伸展活性、細胞移動活性を有するペプチド及び細胞接着伸展剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点にかかるペプチドは、
配列番号１の１０３番目から１９８番目に記載のアミノ酸配列を有し、細胞の形態を変化させることを特徴とする。
【０００９】
配列番号１の１番目から１０２番目、１９９番目から２８８番目、及び／又は、２８９番目から３７８番目のアミノ酸配列を更に有する、ことも可能である。
【００１０】
ヒト線維芽細胞に対する伸展活性及び移動活性を有する、ことも可能である。
【００１１】
本発明の第２の観点にかかる細胞接着伸展剤は、
前記ペプチドを含有する、ことを特徴とする。
【００１２】
本発明の第３の観点にかかるガン転移防止剤は、前記ペプチドを含有する、ことを特徴とする。
【００１３】
本発明の第４の観点にかかる遺伝子は、配列番号１の１番目から１０２番目、１０３番目から１９８番目、１９９番目から２８８番目、及び／又は、２８９番目から３７８番目のアミノ酸配列をコードする、ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細胞の形態を変化させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の細胞の形態を変化させるペプチド及び細胞接着伸展剤等について説明する。
【００１６】
本発明のペプチドは、ヒト線維芽細胞に対する細胞伸展活性、及び、細胞移動促進活性を有する。本発明のペプチドは、図１に示すように、フィブロネクチン（Ｆｎ）のＩＩＩ型の２から５領域のアミノ酸配列（ＦｎＩＩＩ  ２−５）から構成される。
【００１７】
ここで、細胞接着活性とは、培養皿表面にコーティングされた物質が概ね球状の形態で細胞を付着させる活性をいう。細胞伸展活性とは、培養皿表面にコーティングされた物質が仮足を伸ばした状態で細胞を付着させる活性をいう。細胞移動活性は、培養皿表面にコーティングされた物質が概ね球状の細胞を一定以上変形させる活性をいう。当該活性は、付着した細胞を蛍光色素（例えば、トルイジンブルー）等で染色することにより、又、顕微鏡観察により測定される。また、活性の有無は、Ｆｎ等のポジティブコントロールとの差が有意であるか否かの基準により判断される。
【００１８】
ＦｎＩＩＩ  ２−５は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から構成される。ＦｎＩＩＩ  ２は、配列番号１の１番目から１０２番目のアミノ酸配列から構成される。ＦｎＩＩＩ  ３は、配列番号１の１０３番目から１９８番目のアミノ酸配列から構成される。ＦｎＩＩＩ  ４は、配列番号１の１９９番目から２８８番目のアミノ酸配列から構成される。ＦｎＩＩＩ  ５は、配列番号１の２８９番目から３７８番目のアミノ酸配列から構成される。
【００１９】
なお、ＦｎＩＩＩ  ２−５は、ＦｎのＳ７０８−Ｌ１０８５の領域で示されるアミノ酸配列と同一である。ＦｎＩＩＩ  ２は、ＦｎのＳ７０８−Ｔ８０９の領域で示されるアミノ酸配列と同一である。ＦｎＩＩＩ  ３は、ＦｎのＡ８１０−Ｄ９０５の領域で示されるアミノ酸配列と同一である。ＦｎＩＩＩ  ４は、ＦｎのＴ９０６−Ｔ９９５の領域で示されるアミノ酸配列と同一である。ＦｎＩＩＩ  ４は、ＦｎのＫ９９６−Ｌ１０８５の領域で示されるアミノ酸配列と同一である。これらのアミノ酸配列は、米国ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のＡＢ１９１２６１から引用したものである。
【００２０】
本ペプチドは、少なくともＦｎＩＩＩ  ３のアミノ酸配列を含んで構成され、さらに、ＦｎＩＩＩ  ２、ＦｎＩＩＩ  ４、及びＦｎＩＩＩ  ５のアミノ酸配列を含んで構成させることもできる。本ペプチドは、例えば、ＦｎＩＩＩ  ２−３、ＦｎＩＩＩ  ３−４、ＦｎＩＩＩ  ２−４、ＦｎＩＩＩ  ３−５、ＦｎＩＩＩ  ２−５のアミノ酸配列より構成させることができる。
【００２１】
本ペプチドは、当該ペプチドをコードする遺伝子でもよい。当該遺伝子には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等も含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい。また、当該遺伝子は、非翻訳領域の配列やベクタ配列等を含むものであってもよい。
【００２２】
なお、本ペプチドを構成するアミノ酸配列において、細胞の接着及び／又は伸展活性を有する限り、少なくとも１個、好ましくは１個又は数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
【００２３】
置換例として、疎水性残基（例えば、イロソイシン、バリン等）の置換、親水性残基（例えば、アルギニン、リシン）の置換、酸性残基（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）の置換、塩基性残基（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）の置換が挙げられる。
【００２４】
本ペプチドの適用対象となる細胞の種類は限定されず、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、副腎皮質細胞、線維芽細胞、腫瘍由来細胞等のいずれでもよい。
【００２５】
次に、本ペプチドを含有する細胞伸展活性剤及びガン転移防止剤について説明する。本発明の細胞伸展活性剤は、炎症、腫瘍、創傷、及び免疫疾患等を治療する治療剤、ガン転移抑制剤等の創薬等として使用することができる。これらの疾患は単独でも、２つ以上の疾患でも適用の対象となり、当該疾患以外の疾患が併発した場合でも適用の対象となる。また、本発明のガン転移防止剤は、ガン（例えば、肺ガン、胃ガン）の転移を防止する創薬として使用することができる。
【００２６】
炎症は、例えば、化膿性炎症、漿液性炎症、に限定されず、生体が自己の恒常性を維持するための防衛的反応を含む。腫瘍は、例えば、脳腫瘍、骨肉腫、に限定されず、任意である。創傷は、例えば、切創、刺創、に限定されず、体組織の損傷を含む。免疫疾患は、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫疾患、に限定されず、組織の機能喪失や破壊による疾患を含む。
【００２７】
本発明の細胞伸展活性剤及びガン転移防止剤は、ＲＧＤ配列を有するペプチド以外の本ペプチド（ＦｎＩＩＩ  ３等）から構成される。
【００２８】
本発明のペプチドは、ＦｎＩＩＩ  ９及びＦｎＩＩＩ  １０等とは異なるアミノ酸配列を有する。ＦｎＩＩＩ  ９、ＦｎＩＩＩ  １０等の領域で示されるアミノ酸配列は、細胞接着性等を有することが既に知られている。ＦｎＩＩＩ  １０の領域は、ＲＧＤ配列を有するペプチドにより構成され、ヒト正常細胞において細胞の形態変化及び細胞の移動を引き起こす。これは、細胞接着性等を有するＲＧＤ配列を有するペプチドが、細胞表面のインテグリンに結合すると、細胞内のシグナリング系が動き出すためである。
【００２９】
しかし、ＲＧＤ配列を有するペプチドは、正常細胞の発現にも影響を及ぼすため、細胞の接着及び伸展が阻害されることによる副作用のおそれがある。
【００３０】
本発明の細胞伸展活性剤及びガン転移防止剤は、ＲＧＤ配列を有しないためインテグリンとは結合せず、正常細胞の発現に影響を与えることはない。従って、本発明のガン転移防止剤等は、副作用がなく、細胞接着性等を有する。
【００３１】
本発明の細胞伸展活性剤及びガン転移防止剤は、細胞接着及び／又は伸展を必要とする哺乳動物に投与することができる。投与対象の哺乳動物は、例えば、ヒト、ウシ、イヌ、マウス、に限定されず、任意である。
【００３２】
また、投与方法は、例えば、錠剤、注射剤、に限定されず、任意である。投与量は、例えば、年齢、症状、投与経路、によって異なり、適宜選択される。
【００３３】
本発明のペプチド等は、細胞接着伸展活性及び細胞移動活性を有する。従って、発生過程での細胞移動、形態形成、結合組織形成の分子メカニズム、創傷治癒、ガン転移のメカニズムを解明するための重要な手がかりとなる。
また、本ペプチド等は、ＲＧＤ配列を有しないため、正常細胞の発現に影響を及ぼすことはない。従って、細胞の接着及び伸展が阻害されることによる副作用のおそれは少ない。
【実施例】
【００３４】
（ＦｎＩＩＩ  ２−７領域の発現）
ＦｎＩＩＩ  ２−４、ＦｎＩＩＩ３−５、ＦｎＩＩＩ  ４−６、ＦｎＩＩＩ  ５−７、ＦｎＩＩＩ  ３、及び、ＦｎＩＩＩ  ４の領域で示されるアミノ酸を単離する。まず、ＦｎＩＩＩ  ２−７領域内の複数の断片について、それぞれ１０×Ｈｉｓタグとの融合タンパク質を調製する。当該領域について、Ｎｄｅ１配列をもつプライマ及びヒト線維芽細胞ｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction）を行い、当該領域を含むｃＤＮＡ断片を得る。さらにＮｄｅ１処理後、１０×Ｈｉｓタグを融合するためのベクタ−ｐＥＴ−１６ｂ（ノバゲン社）にクローニングする。
【００３５】
次に、ＩＰＣＲ（Inverse Polymerase Chain Reaction）法により、ＦｎＩＩＩ  ３及びＦｎＩＩＩ  ４の領域をクローニングする。既存の方法に従い、大腸菌ＤＨ５αに導入し、当該領域を含んだクローンを単離する。さらに、定法に従い、クローン内のタンパク質発現を誘導し、遠心分離法により大腸菌を回収する。
【００３６】
次に、生理食塩水を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ；Phosphate Buffered Saline）に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を捲濁後、リゾチーム処理を経て、超音波粉砕法によりタンパク質を可溶化する。当該可溶化タンパク質を材料にＨｉＴｒａｐ金属キレートカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製する。最後に、ＰＢＳに対して透析し、回収した標品を生物活性の検定に供する。精製標品の純度は、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により分離し、色素ＣＢＢ（Coomassie Brilliant Blue）−Ｒ２５０（ナカライテスク社）で染色後、検定する。
【００３７】
図２は、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による分離結果である。ＦｎＩＩＩ  ３の領域等が分離されたことがわかる。
【００３８】
以上の処理により、ＦｎＩＩＩ  ２−４、ＦｎＩＩＩ３−５、ＦｎＩＩＩ  ４−６、ＦｎＩＩＩ  ５−７、ＦｎＩＩＩ  ３、及び、ＦｎＩＩＩ  ４の領域を単離した。
【００３９】
（細胞接着活性、細胞伸展活性の評価）
円形から紡鐘状態に細胞形態を変える細胞を培養基質に接着し、伸展した細胞として全細胞に対する伸展細胞の割合を算出することにより評価する。
【００４０】
精製したＦｎＩＩＩ  ２−４、ＦｎＩＩＩ  ３−５、ＦｎＩＩＩ  ４−６、ＦｎＩＩＩ  ５−７、ＦｎＩＩＩ  ３、及び、ＦｎＩＩＩ  ４を培養皿に塗布したものを培養基質とする。正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ；Human Dermal Fibroblast）（倉敷紡績社）及び低血清増殖用培地を用いて、所定の方法（Obara M., Kang M. S. and Yamada K.M., 1988, Cell 53, 649-657参照）により細胞接着活性等を検定する。ポジティブコントロールとして１２０  ｋＤａ細胞結合ヒトＦｎ断片（テリオス社）を用いる。
【００４１】
細胞をパラホルムアルデヒドで固定して顕微鏡で観察した。図３は、フィブロネクチンの細胞接着伸展活性を示す図である。
【００４２】
ＦｎＩＩＩ  ２−４、ＦｎＩＩＩ３−５、ＦｎＩＩＩ  ３について、ポジティブコントロールが示す容量依存的な細胞伸展活性が認められた。従って、ＦｎＩＩＩ  ３には細胞接着伸展活性があることが認められた。
【００４３】
（細胞移動活性の評価）
培養皿上に約１．５×１０４サイズの細胞を形成し、当該細胞の外観変化により評価する。
【００４４】
精製したＦｎＩＩＩ  ３、ＦｎＩＩＩ  ３−５、ＦｎＩＩＩ  ４、及び、Ｆｎを培養皿に塗布したものを培養基質とする。ＨＤＦを用いて、所定の方法（Pankov R., and Yamada KM., 2002, J Cell Sci. 115, 3861-3863参照）により、細胞移動活性を検定する。Ｆｎは細胞移動活性を有するため、評価対象としてＦｎを用いる。
【００４５】
図４（ａ）から（ｄ）は、フィブロネクチン（Ｆｎ）の細胞移動活性を示す図である。図４（ａ）はＦｎ、（ｂ）はＦｎＩＩＩ  ３−５、（ｃ）はＦｎＩＩＩ  ３、（ｄ）はＦｎＩＩＩ  ４を示す。
【００４６】
ＦｎＩＩＩ  ３−５及びＦｎＩＩＩ  ３には、Ｆｎと同様に、細胞移動活性があることが認められた。
【００４７】
以上説明したように、本発明のペプチド及び細胞接着伸展剤は、細胞接着伸展活性及び細胞移動活性を有する。従って、発生過程での細胞移動、形態形成、結合組織形成の分子メカニズム、創傷治癒、ガン転移のメカニズムを解明するための重要な手がかりとなる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
以上説明したように、本発明によれば、細胞伸展活性、細胞移動活性を有するペプチド及び細胞接着伸展剤等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】フィブロネクチンのドメイン構造を示す図である。
【図２】ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図３】フィブロネクチンの細胞接着伸展活性を示す図である。
【図４】フィブロネクチンの細胞移動活性を示す図であり、（ａ）はフィブロネクチン（Ｆｎ）、（ｂ）はフィブロネクチンＩＩＩ型  ３−５の領域（ＦｎＩＩＩ  ３−５）、（ｃ）はフィブロネクチンＩＩＩ型  ３の領域（ＦｎＩＩＩ  ３）、（ｄ）はフィブロネクチンＩＩＩ型  ４の領域（ＦｎＩＩＩ  ４）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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