(57)【要約】【課題】嗜癖を減少させ得るか、または克服し得る薬物、および、可能な場合、習慣性薬物および嗜癖性薬物の離脱に関連する症状を軽減し得るか、または取り除き得る薬物を提供すること。【解決手段】嗜癖性物質からの離脱を管理する際に使用するための組成物が、記載される。この組成物は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のεアイソザイムおよび／またはγアイソザイムに対する特異的活性を有する１つ以上のペプチドを含む。このペプチドは、嗜癖性物質の投与の前、投与と同時、または投与の後に投与され得る。εＰＫＣまたはγＰＫＣに対するアイソザイム特異的活性を有するペプチドを含む少なくとも１つの容器および使用のための説明書を有するキットもまた記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、離脱症状を管理するため、ならびに／または習慣性薬物および嗜癖性薬物（例えば、アルコール、麻酔薬、および抗鬱薬）についての患者の依存性を減少させるための処置の組成物および方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
習慣性薬物（例えば、アルコール、精神安定薬、興奮薬、アヘン剤、幻覚薬およびニコチン）の度重なる消費は、多くの場合、ある程度の嗜癖をもたらす。代表的に、そのような嗜癖は、薬物の使用を継続することを要求すること、または必要とすること、および、ある場合には、その投薬量を増加させる傾向によって特徴づけられる。嗜癖は、そのような薬物の効果に対する心理的依存および生理的依存を生じ、そして、最終的に、常習的な個体に対して有害な影響を有する。薬物嗜癖の蔓延は、社会に大きな費用を課しているとして十分に受け入れられている。嗜癖における動機づけの２つの主なカテゴリーは、薬物乱用の快楽の（例えば、価値のある）効果の経験に対する欲求、および薬物離脱症状の快感消失または不快な結果を避ける欲求である。
【０００３】
習慣性薬物の使用に由来する離脱症状は、部分的に、節制を伴う望ましくない物理的症状および／または心理的症状に起因して、困難であり、深刻な問題が存在する。嗜癖の価値のある面および有害な離脱症状の面の両方が、研究されており、特にアヘン剤嗜癖のメカニズムが、報告されている。文献から明らかになることは、単一の脳構造が、嗜癖および常習行為の完全な原因ではないことである。アヘン剤の度重なる使用は、側坐核、腹側被蓋野、基底外側扁桃体、青斑、および分界条床核が挙げられるが、これらに限定されない、多くの脳の領域内の神経経路および神経プロセスにおいて永続的変化を誘導する。脊柱上の脳の領域もまた、脊髄から上行の投入によって変調を受けやすい。脊髄の神経伝達にアヘン剤の深い影響がある。調べられた脳または脊髄の領域にかかわらず、これらの永続的変化としては、神経伝達物質系への適応が挙げられ、それは、グルタミン酸作動性シグナル伝達、ドーパミン作動性シグナル伝達、およびアドレナリン作動性シグナル伝達に限定されないが、これらを含む。これらの適応は、嗜癖の快楽の面の増強ならびに嗜癖の有害な面の増強に関与し得る。アヘン剤は、アヘン剤の価値のある効果および有害な効果に重要であるμ−オピオイドレセプターサブタイプを有する３つのクラスのレセプター（μ、κ、δ）に作用する。アヘン剤がどのようにして神経経路および神経プロセスの永続的な神経適応を媒介し得るかの１つの特定の例は、以下に記載される。
【０００４】
アヘン剤に対する身体的依存を現す１つの機構は、青斑のノルアドレナリン作動性細胞に関与する。アヘン剤は、これらの細胞上の抑制μレセプターでアゴニストとして作用し、それによって、細胞によるシナプス前のノルエピネフリン放出を減少させる。やがて、これは、シナプス後のノルエピネフリンレセプター発現のアップレギュレーションを生じる。同時に、モルヒネは、抑制μレセプターで通常の内因性アゴニストであるβ−エンドルフィンの合成をダウンレギュレートする。アヘン剤が取り除かれる場合、細胞は、もはや阻害されず、シナプス前にノルエピネフィリンを放出する。同時に、ノルエピネフィリンレセプターの増加から生じる、シナプス後の過感受性は、応答の増幅を引き起こし、その後、アドレナリン作動性の急性発症を引き起こす。このアドレナリン作動性の急性発症は、より多くのアヘン剤への欲求として現れ、アヘン剤の摂取は、そのサイクルを再開してさらにひどくする。
【０００５】
アヘン剤嗜癖のメカニズムにおけるμ−アヘン剤レセプターの中心的役割の理解によって、アヘン剤嗜癖を処置するためのいくつかの禁断指向戦略が導かれる。１つのそのような禁断指向戦略は、規則的に、代表的には毎週２回、ナルトレキソンの投与、効力のある、経口的に有効な、永続的なμ−レセプター遮断薬に関する。別の禁断指向処置において、アヘン剤依存性の個体は、ブプレノルフィンを維持される。それは、部分的なμ−レセプターアゴニストであるため、ブプレノルフィンは、多少強化した特性を有し、アヘン剤依存性の個体によるその受容性は、コンプライアンスである場合、高い。同時に、ブプレノルフィンは、μ−レセプターに対して高い親和性を有するので、アヘン剤の効果を遮断し、それは、アヘン剤依存性の個体に、アヘン剤を要求することを止めさせる。
【０００６】
アルコールは、別の乱用の一般的な薬物であり、世界的に主要な公衆衛生問題である。アルコール摂取の強い衝動を調節する少数の薬物が存在し、アルコール中毒の分子的な原因はほとんど特徴付けられないままである。ジスルフラム（ＡＮＴＡＢＵＳＥ（登録商標））が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素（アルコールから酢酸への代謝に関係している）の阻害によるアルコール中毒の処置のために１９５１年に導入された；その薬物は、アルコールの存在下で、頭痛、眩暈および嘔吐を引き起こし、アルコール摂取の強い衝動をネガティブに高める。さらに、ナルトレキソン、アヘン剤レセプターアンタゴニストの投与は、実験動物においてアルコール自己投与を減少させ、ヒトのアルコール中毒を再発する。
【０００７】
離脱症状を管理することによって、消費行動を変化させ得る化合物に対する継続的な必要性がある。アヘン剤のように、多くの脳の領域における神経適応および神経伝達物質系は、アルコール嗜癖の価値のある面および有害な面の基礎をなす。同様に、脊柱上の脳の領域もまた、脊髄から上行の投入によって変調を受けやすく、ここで、アルコールは、脊髄の神経伝達に深刻な影響を与える。
【０００８】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、シグナル伝達カスケードに大いに関与するアイソザイムのファミリーである。種々のＰＫＣアイソザイムは、神経軸（例えば、脳、脊髄、および一次求心性ニューロン）の全体にわたって位置し、神経伝達物質の下流の作用を調節するので、ＰＫＣは、薬物乱用の作用、および離脱症状の発生に役割を果たすようである。アイソザイムのＰＫＣファミリーは、細胞増殖、遺伝仔発現の調節、およびイオンチャネル活性を含む、種々の細胞機能に関与するシグナル伝達における重要な酵素である。
【０００９】
アイソザイムのＰＫＣファミリーとしては、それらの相同性およびアクチベーターに対する感受性に基づいて少なくとも３つのサブファミリーに分けられ得る少なくとも１１個の異なるプロテインキナーゼが挙げられる。古典的なサブファミリーすなわちｃＰＫＣサブファミリーのメンバー（αＰＫＣ、βＩＰＫＣ、βＩＩＰＫＣおよびγＰＫＣ）は、その間にアイソザイムに固有の（可変またはＶ）領域を有する４つの相同ドメイン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４）を含み、カルシウムおよびジアシルグリセロールを活性化のために必要とする。古典的なＰＫＣファミリーのメンバーは、脊髄ならびに多数の脳の領域の背角の表面の薄膜に見い出される。新規のサブファミリーまたはｎＰＫＣサブファミリーのメンバー（δＰＫＣ、εＰＫＣ、ηＰＫＣおよびθＰＫＣ）は、Ｃ２相同ドメインを欠き、そして、カルシウムを活性化のために必要としない。εＰＫＣは、脊髄を刺激する一次求心性ニューロン末端ならびに多数の脳の領域に見い出されている。最後に、異型のサブファミリーまたはαＰＫＣサブファミリーのメンバー（ζＰＫＣおよびλ／ＩＰＫＣ）は、Ｃ２相同ドメインおよびＣ１相同ドメインの半分の両方を欠き、そしてジアシルグリセロールおよびカルシウムに非感受性である。
【００１０】
ＰＫＣアイソザイムの細胞下分布に対する研究は、ＰＫＣの活性化が、細胞内でのその再分布（またはトランスロケーションともいわれる）を生じ、その結果、活性化ＰＫＣアイソザイムが、原形質膜、細胞骨格要素、核、および他の細胞下区画と会合することを実証する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。異なるＰＫＣアイソザイムの固有の細胞機能は、それらの細胞下位置によって決定される。例えば、活性化βＩＰＫＣは、核の内側に見い出されるが、一方、活性化βＩＩＰＫＣは、心筋細胞の核周辺および細胞周辺に見い出される（非特許文献４）。細胞の異なる領域への異なるＰＫＣアイソザイムの局在化は、次いで、活性化Ｃ−キナーゼ（ＲＡＣＫ）についてのレセプターと称される特異的固着分仔への活性化アイソザイムの結合に起因するようである。ＲＡＣＫは、活性化ＰＫＣアイソザイムをそれらのそれぞれの細胞下部位へと選択的に固着することによって機能すると考えられている。ＲＡＣＫは、完全に活性化されたＰＫＣのみを結合し、そして必ずしも酵素の基質ではない。ＲＡＣＫへの結合が、そのキナーゼの触媒ドメインによって媒介されることはない（非特許文献５））。ＰＫＣのトランスロケーションは、細胞粒状画分へと固着されたＲＡＣＫへの活性化酵素の結合を反映し、ＲＡＣＫへの結合は、ＰＫＣがその細胞応答を生じるために必要である（非特許文献６）。インビボでのＲＡＣＫへのＰＫＣ結合の阻害は、ＰＫＣトランスロケーションおよびＰＫＣ媒介機能を阻害する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【００１１】
一般に、ＰＫＣのトランスロケーションは、ＰＫＣアイソザイムの適切な機能のために必要である。ＲＡＣＫ上のＰＫＣ結合部位（非特許文献１０；Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら、前出、１９９５）またはＰＫＣ上のＲＡＣＫ結合部位（Ｒｏｎら、前出、１９９５；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら、前出、１９９６ａ）のいずれかを模倣するペプチドは、インビボで酵素の機能を選択的に阻害するＰＫＣのアイソザイム特異的トランスロケーションインヒビターである。
【００１２】
そのような嗜癖を減少させ得るか、または克服し得る薬物、および、可能な場合、習慣性薬物および嗜癖性薬物の離脱に関連する症状を軽減し得るか、または取り除き得る薬物は、嗜癖に苦しむ人々および一般社会の両方によって所望される。ＰＫＣのインヒビターは、そのような薬物の種類であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓａｉｔｏ，Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３４０９−３４１３（１９８９）
【非特許文献２】Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ．およびＨａｌｌ，Ｐ．Ｆ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０８：５５３−５６７（１９８９）
【非特許文献３】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（以前は、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇ．），１：６９３−７０６，（１９９０）
【非特許文献４】Ｄｉｓａｔｎｉｋ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２１０：２８７−２９７（１９９４）
【非特許文献５】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３９９７−４０００（１９９１）
【非特許文献６】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：２４７−２５１（１９９５）
【非特許文献７】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７１：２４９６２−２４９６６（１９９６ａ）
【非特許文献８】Ｒｏｎ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：４９２−４９６（１９９５）
【非特許文献９】Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｌ．およびＭｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８８：１２３５−１２４０（１９９２）
【非特許文献１０】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２６：１４６６−１４６８（１９９１ａ）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
ある局面において、本発明は、習慣性薬物からの離脱症状と関連する症状を軽減するための方法を含み、その方法は、γＰＫＣまたはεＰＫＣのためのアイソザイム特異的な抑制活性を有するペプチドを投与する工程を包含する。
【００１５】
ある実施形態において、そのペプチドは、習慣性薬物の送達より前、送達の間、または送達の後に投与される。
【００１６】
別の実施形態において、そのペプチドは、本明細書中で、配列番号１または配列番号２として同定される配列を有する。他の実施形態において、そのペプチドは、本明細書中で、配列番号４〜配列番号１４として同定される配列の群からなる群から選択される配列を有する。
【００１７】
他の実施形態において、そのペプチドは、細胞内送達のために処方される。例えば、そのペプチドは、キャリアに結合されるか、または細胞内送達が可能な処方物と混合される。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、習慣性薬物は、アヘン剤、アルコール、またはニコチンである。
【００１９】
別の局面において、本発明は、習慣性薬物からの離脱症状と関連する症状を軽減するための方法を含み、その方法は、麻酔薬の送達より前か、または送達と同時に、εＰＫＣのためのアイソザイム特異的な活性を有するペプチドを投与する工程；および習慣性薬物の送達の後に、γＰＫＣのためのアイソザイム特異的な活性を有するペプチドを投与する工程を包含する。
【００２０】
ある実施形態において、εＰＫＣに対してアイソザイム特異的な活性を有するペプチドは、本明細書中で、配列番号１として同定される配列を有する。別の実施形態において、γＰＫＣに対してアイソザイム特異的な活性を有するペプチドは、本明細書中で、配列番号２として同定される配列を有する。
【００２１】
ある実施形態において、ペプチドの投与は、注射によってである。
【００２２】
さらに別の局面において、本発明は、嗜癖性薬物に由来する離脱症状と関連する症状を軽減するためのキットを含み、そのキットは、（ｉ）γＰＫＣまたはεＰＣＫに対してアイソザイム特異的な阻害活性を有するペプチドを含有する少なくとも１つの容器；および（ｉｉ）使用説明書を、包含する。
【００２３】
ある実施形態において、そのキットは、εＰＫＣに対してアイソザイム特異的な阻害活性を有するペプチドを含有する第１容器からなる。
【００２４】
別の実施形態において、そのキットは、γＰＫＣに対してアイソザイム特異的な阻害活性を有するペプチドを含有する第２容器を包含する。
【００２５】
ある実施形態において、そのキットのペプチドは、本明細書中で、配列番号１または配列番号２として同定される配列を有する。
【００２６】
ある実施形態において、そのキットの使用説明書は、使用者に、嗜癖性薬物の投与より前か、または投与と同時に、εＰＫＣに対してアイソザイム特異的な阻害活性を有するペプチドを投与することを指示する。
【００２７】
別の実施形態において、そのキットの使用説明書は、使用者に、嗜癖性薬物の投与の後に、γＰＫＣに対してアイソザイム特異的な阻害活性を有するペプチドを投与することを指示する。
【００２８】
別の実施形態において、そのキットはさらに、少なくとも１つのペプチドを注射するために適切な注射器を包含する。
【００２９】
さらなる局面は、嗜癖性薬物に由来する離脱症状の管理、および／または嗜癖性薬物の依存の軽減において使用するための医薬の調製におけるペプチドインヒビターの使用を包含する。
【００３０】
本発明のこれらならびに他の目的および特徴は、添付の図面と併せて本発明の以下の詳細な説明を読んだ場合、より完全に理解される。
【００３１】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、εＰＫＣアンタゴニストペプチドである。
【００３２】
配列番号２は、ＰＫＣのγアイソザイムのペプチドインヒビターである。
【００３３】
配列番号３は、Ｔａｔ由来のキャリアペプチド（Ｔａｔ４７−５７）である。
【００３４】
配列番号４は、配列番号２を改変したものである。
【００３５】
配列番号５は、配列番号２を改変したものである。
【００３６】
配列番号６は、配列番号２を改変したものである。
【００３７】
配列番号７は、配列番号２を改変したものである。
【００３８】
配列番号８は、配列番号２を改変したものである。
【００３９】
配列番号９は、配列番号２を改変したものである。
【００４０】
配列番号１０は、配列番号２を改変したものである。
【００４１】
配列番号１１は、配列番号２を改変したものである。
【００４２】
配列番号１２は、配列番号２を改変したものである。
【００４３】
配列番号１３は、配列番号２を改変したものである。
【００４４】
配列番号１４は、配列番号２を改変したものである。
【００４５】
配列番号１５は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン由来のキャリアペプチドである。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
習慣性薬物からの離脱に関連する症状を軽減するための医薬の調製に使用するための組成物であって、該組成物は、γＰＫＣまたはεＰＣＫに対するアイソザイム特異的阻害活性を有する少なくとも１つのペプチドおよび薬学的賦形剤を含有する、組成物。
（項目２）
上記ペプチドが、習慣性薬物の送達前、送達中または送達後に被験体に提供される、請求項１に記載の組成物。
（項目３）
上記ペプチドが、配列番号１または配列番号２として本明細書中で同定された配列を有する、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）
上記ペプチドが、配列番号４〜配列番号１４として本明細書中で同定された配列群より選択される配列を有する、項目１または２に記載の組成物。
（項目５）
上記ペプチドが、細胞内送達のために処方されている、項目３または４に記載の組成物。
（項目６）
上記ペプチドが、キャリアペプチドに結合されることにより細胞内送達のために処方されている、項目５に記載の組成物。
（項目７）
上記習慣性薬物が、オピオイド、アルコール、またはニコチンである、項目１に記載の組成物。
（項目８）
項目１に記載の組成物であって、εＰＫＣに対するアイソザイム特異的活性を有する第一ペプチドが、習慣性薬物の送達前か、または送達と同時に患者に提供され；そして、γＰＫＣに対するアイソザイム特異的活性を有する第二ペプチドが、習慣性薬物の送達後に患者に提供される、組成物。
（項目９）
上記第一ペプチドが、配列番号１として本明細書中で同定される配列を有し、および上記第二ペプチドが、配列番号２として本明細書中で同定される配列を有する、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
上記習慣性薬物が、オピオイド、アルコール、またはニコチンである、項目８または９に記載の組成物。
（項目１１）
嗜癖性因子の離脱に関連する症状を軽減するためキットであって、該キットは、
ｉ）γＰＫＣまたはεＰＣＫに対するアイソザイム特異的阻害活性を有するペプチドを含有する少なくとも１つの容器；および
ｉｉ）使用のための指示書
を含む、キット。
（項目１２）
上記キットが、εＰＫＣに対するアイソザイム特異的阻害活性を有するペプチドを含有する第一の容器から構成される、項目１１に記載のキット。
（項目１３）
上記キットが、γＰＫＣに対するアイソザイム特異的阻害活性を有するペプチドを含有する第二の容器を含む、項目１１に記載のキット。
（項目１４）
上記ペプチドが、配列番号１または配列番号２からなる群より選択される、項目１１に記載のキット。
（項目１５）
上記使用のための指示書が、使用者に、εＰＫＣに対するアイソザイム特異的阻害活性を有する上記ペプチドを嗜癖性因子の投与前か、または投与と同時に投与することを指示する、項目１１または項目１２に記載のキット。
（項目１６）
上記使用のための指示書が、使用者に、γＰＫＣに対するアイソザイム特異的阻害活性を有する上記ペプチドを嗜癖性因子の投与後に投与することを指示する、項目１１または項目１３に記載のキット。
（項目１７）
項目１３に記載のキットであって、εＰＫＣに対するアイソザイム特異的阻害活性を有する上記ペプチドが、配列番号１として本明細書中で同定される配列を有し、およびγＰＫＣに対するアイソザイム特異的阻害活性を有する上記ペプチドが、配列番号２として本明細書中で同定される配列を有する、キット。
（項目１８）
上記ペプチドの注入に適切な少なくとも１つのシリンジをさらに含む、項目１１または１７に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、オピオイド曝露前（図１Ａ）および曝露の間（図１Ｂ）、ならびにナロキソン、オピオイドアンタゴニストで処理後（図１Ｃ）の、単離された脊髄のインビトロでの遅発性前根電位（ｓＶＲＰ）のナロキソン沈殿による応答性亢進を示す。図１Ｄは、モルヒネ抑制およびナロキソン沈殿による応答性亢進の時間経過を示すための、時間（分）の関数としてのｓＶＲＰの曲線下の領域のプロットである。横棒は、単離された脊髄へのモルヒネおよびナロキソンの適用の時間を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、種々の非特異的ＰＫＣインヒビター：モルヒネの存在下（図２Ａ）および非存在下（図２Ｃ）での広域スペクトルインヒビターＧＦ１０９２０３Ｘ；ならびにモルヒネの存在下（図２Ｂ）および非存在下（図２Ｄ）でのＣａ＋＋依存性ＰＫＣイソ型であるＧｏ６９７６に特異的なインヒビター、の適用後の時間（分）の関数としての遅発性前根電位（ｓＶＲＰ）の曲線下の領域を示すプロットである。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、Ｔａｔ結合ＰＫＣε特異的ペプチドインヒビターεＶ１−２（図３Ａ、黒四角）またはＴａｔ単独（図３Ａ、白丸）の存在下でのモルヒネおよびナロキソンの適用後；ならびにモルヒネの非存在下でのＴａｔ結合ＰＫＣεインヒビター単独の適用後（図３Ｂ）の、時間（分）の関数としての遅発性前根電位（ｓＶＲＰ）の曲線下の領域を示すプロットである。図３Ｃ〜３Ｄは、Ｔａｔ結合ＰＫＣγアイソザイム特異的なアンタゴニストγＶ５−３（図３Ｃ、黒四角）またはＴａｔキャリア単独（図３Ｃ、白丸）の存在下でのモルヒネおよびナロキソンの適用後；ならびにモルヒネの非存在下でのＴａｔ結合γＰＫＣアンタゴニストγＶ５−３の適用後（図３Ｄ）の、時間（分）の関数としての遅発性前根電位（ｓＶＲＰ）の曲線下の領域を示すプロットである。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ナロキソンまたは生理食塩水の適用後の、時間の関数としての平均機械的閾値（グラム）（図４Ａ）および平均熱応答潜伏時間（秒）（図４Ｂ）のプロットである。ナロキソンまたは生理食塩水（それぞれ、垂直の縞模様の棒および平行線模様の棒）を、生後７日のラットにモルヒネの送達の３０分後に、投与した。コントロールとしてナロキソンまたは生理食塩水（点線の棒および白い棒）を、モルヒネで処置していない動物に投与した。点線は、平均ベースライン機械的閾値を表す。
【図５】図５Ａは、図５Ｂ〜５Ｃで報告されたデータについての実験プロトコルを示し、ここで、動物を、モルヒネの送達の前にＰＫＣインヒビターで処置し；ナロキソンを、モルヒネ送達の３０分後に投与し；そして、機械的閾値および熱応答潜伏時間の試験を、ナロキソン投与後、１０分間隔で行った。図５Ｂ〜５Ｃは、図５Ａに示したプロトコルに従って処置した動物（モルヒネの直前に、くも膜下腔内に投与した、Ｔａｔ結合ＰＫＣε（垂直の縞模様の棒）、Ｔａｔ結合γＰＫＣ（平行線模様の棒）、Ｔａｔキャリア単独（点線の棒）、または生理食塩水（白い棒）で処置した動物）についてのナロキソンまたは生理食塩水の適用後の時間の関数としての平均機械的閾値（グラム）（図５Ｂ）、および平均熱応答潜伏時間（秒）（図５Ｃ）のプロットである。点線は、平均ベースライン閾値を表す。
【図６】図６Ａは、図６Ｂ〜６Ｃで報告されたデータについての実験プロトコルを示し、ここで、動物を、モルヒネの送達の２．５時間後に、ＰＫＣインヒビターで処置し；そして、機械的閾値および熱応答潜伏時間の試験を、ペプチド投与後、１時間に１度の間隔で行った。図６Ｂ〜６Ｃは、図５Ａに示したプロトコルに従って処置した動物（モルヒネの直前に、くも膜下腔内に投与した、Ｔａｔ結合ＰＫＣε（垂直の縞模様の棒）、Ｔａｔ結合γＰＫＣ（平行線模様の棒）、Ｔａｔキャリア単独（点線の棒）、または生理食塩水（白い棒）で処置した動物）についてのモルヒネの適用後、時間の関数としての平均機械的閾値（グラム）（図６Ｂ）および平均熱応答潜伏時間（秒）（図６Ｃ）のプロットである。点線は、平均ベースライン閾値を表す。
【図７】図７Ａは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプター電流におけるアルコール誘導離脱症状応答性亢進の試験のための腰髄切片の模式図である。図７Ｂは、ＮＭＤＡアンタゴニスト２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰＶ）の適用の前（コントロール）および後に、腰髄切片運動ニューロンから誘発された個々の痕跡を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、アルコール誘導離脱症状の前（コントロール、図８Ａ）、間（図８Ｂ）、および後（図８Ｃ）の運動ニューロンにおけるＮＭＤＡ誘発電流由来の痕跡である。図８Ｄ〜８Ｅは、時間の関数としての規格化したＮＭＤＡ電流（ＩＮＭＤＡ）領域（図８Ｄ）ならびに腰髄切片運動ニューロンへのアルコール（ＥｔＯＨ）の適用後および人工の脳脊髄液での洗浄後のＮＭＤＡ電流領域（コントロールのパーセントとして）（図８Ｅ）を示すプロットである。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、カルシウムキレート剤ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）の存在下でのアルコール（ＥｔＯＨ）の適用の前（コントロール、図８Ａ）、間（図８Ｂ）、および後（図８Ｃ）の運動ニューロンにおけるＮＭＤＡ誘発電流由来の痕跡である。図９Ｄ〜９Ｅは、時間の関数としての規格化したＮＭＤＡ電流（ＩＮＭＤＡ）領域（図９Ｄ）ならびに腰髄切片運動ニューロンへのＢＡＰＴＡの存在下でのアルコール（ＥｔＯＨ）の適用後、および人工の脳脊髄液での洗浄後のＮＭＤＡ電流領域（コントロールのパーセントとして）（図９Ｅ）を示すプロットである。
【図１０】図１０は、エタノールの適用の前（コントロール）、エタノール適用後、人工の脳脊髄液で洗浄後、およびγＰＫＣ  Ｖ５−３ペプチドインヒビターの存在下での、核に局在化するγＰＫＣを有する細胞の数を示す棒グラフである。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｆは、アルコールおよびγＶ５−３ＰＫＣペプチドインヒビター（配列番号２）の存在下での脊髄部分におけるＮＭＤＡ誘発電流の結果を示し、ここで、図１１Ａ、１１Ｃ、および１１Ｆは、２ｎＭ  γＶ５−３ペプチド（図１１Ａ）、５−１０ｎＭ  γＶ５−３ペプチド（図１１Ｃ）、および１０ｎＭ  Ｔａｔキャリアペプチド単独（図１１Ｅ）の存在下でのエタノールの適用の前、間、および後の時間の関数としての規格化したＮＭＤＡ電流（ＩＮＭＤＡ）領域のプロットであり；図１１Ｂ、１１Ｄ、および１１Ｆは、それぞれ図１１Ａ、１１Ｃ、および１１Ｆに対応するヒストグラムである。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、７日齢（図１２Ａ）および２１日齢（図１２Ｂ）のラットの仔に、０．５ｇ／ｋｇ（黒丸）および４ｇ／ｋｇ（星）のエタノールの注射後、または生理食塩水（白丸）注射後の、時間（時間）の関数としての、引っ込め力閾値（グラム）を示すプロットである。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、エタノール（点線の棒）の単回投与または生理食塩水（コントロール、白い棒）に曝露された７日齢のラットの仔（図１３Ａ）および２１日齢のラットの仔（図１３Ｂ）における熱による足を引っ込める潜伏時間を示す棒グラフである。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、エタノール注射後の時間の関数としての、７日齢（黒丸）および２１日齢（白丸）のラットの仔の血中のエタノールレベル（μｇエタノール／ｍｌ血液；図１４Ａ）および脊髄のエタノール濃度（μｇエタノール／ｍｇ組織）のプロットである。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｄは、εＶ１−２（点線の棒）、γＶ５−３（垂直の縞模様の棒）、またはＴａｔ単独（白い棒）で処置した７日齢のラットの仔（図１５Ａ、１５Ｂ）、および同様に処置した２１日齢のラットの仔（図１５Ｃ、図１５Ｄ）のエタノール注射後（図１５Ａ、１５Ｃ）または生理食塩水注射後（コントロール、図１５Ｂ、図１５Ｄ）の種々の時間での、引っ込め力閾値（グラム）を示す棒グラフである。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、エタノール注射後（図１６Ａ）または生理食塩水注射後（図１６Ｂ）の時間の関数としての７日齢のラットの仔についての、足を引っ込める潜伏時間（秒）を示す棒グラフである。４時間の時点で、ＰＫＣインヒビターペプチドであるεＰＫＣ  Ｖ１−２（配列番号１；点線の棒）またはγＰＫＣ  Ｖ５−３（配列番号２、垂直の縞模様の棒）、あるいはＴａｔキャリアペプチド単独（配列番号３、白い棒）を、くも膜下腔内に投与した。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
アミノ酸残基についての略語は、２０種類の一般的なＬ−アミノ酸の１つをいうための当該分野で使用される標準的な３文字および／または１文字のコードである。
【００４８】
「保存的アミノ酸置換」とは、選択されたポリペプチドまたはタンパク質の活性または三次構造の重大な変化を生じない置換である。このような置換は代表的に、選択されたアミノ酸残基を、類似の物理化学的性質を有する異なる残基に変換することを含む。例えば、Ａｓｐに対するＧｌｕの置換は、両方が、類似のサイズの負に帯電したアミノ酸であるので、保存的置換と考えられる。物理化学的性質によるアミノ酸の分類は、当業者に公知である。
【００４９】
「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中で、交換可能に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖から構成される化合物をいう。他に示さない限り、ペプチドについての配列は、アミノ末端からカルボキシ末端への順序で与えられる。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「麻酔剤」とは、標準的な医薬の参考資料（例えば、Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第２６版（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９９５）およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（Ｃｈｉｃａｇｏ）によって出版された定期購読サービスの「Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ」中の「Ａｎａｌｇｅｓｉｃｓ」章に使用される「より最近」の定義）に示される意味を意図する。つまり、任意の定義（古典的または最近のいずれか）において使用される場合、「麻酔剤」としては、以下：（１）アヘン、（モルヒネ、コデイン、ノスカピン、パパベリン、テバイン、およびヘロインを含む、多くの医学的に重要な薬物および／または習慣性薬物もしくは嗜癖性薬物を含むケシ科の植物由来の天然混合物）、の任意の調製物もしくは誘導体と定義されるアヘン剤；および（２）アヘン剤、ならびに類似または関連した化学構造および効果を有する種々の合成麻酔薬を含む、オピオイド薬物、が挙げられる。例示的な合成麻酔薬としては、（ＤＥＭＥＲＯＬＴＭ）、ヒドロコドン（ＶＩＣＯＤＩＮＴＭ）、ヒドロモルフォン（ＤＩＬＡＵＤＩＤＴＭ）、プロポキシフェン（ＤＡＲＶＯＮＴＭ）、オキシコドン（アスピリンで混合する場合、ＰＥＲＣＯＤＡＮＴＭ、またはアセトアミノフェンで混合する場合、ＰＥＲＣＯＣＥＴＴＭ）、レボルファノール、フェンタニール、およびメタドン、が挙げられる。
【００５１】
薬物は、代表的に、その効力として以下：（１）「気分および行動の重大な変化」を引き起こす能力；（２）「昏迷の痛覚脱失」の状態を引き起こす能力；ならびに（３）依存性、耐性、および／または嗜癖の十分なリスク、が挙げられる場合、「麻酔薬」として分類される。
【００５２】
より一般的に、本明細書中で使用される場合、「習慣性薬物」は、種々の薬物（例えば、アルコール）；少数の精神安定薬（例えば、バルビツレート（例えば、ペントバルビタール）、およびベンゾジアゼピン（例えば、リブリウム、バリウム）；興奮薬（例えば、コカイン、アンフェタミンおよびニコチン）；アヘン剤（例えば、フェンタニール、アルフェンタニールおよびヘロイン）を含む麻酔薬；および幻覚薬（例えば、ＬＳＤ）；純粋な形態または混合物のいずれか；タバコ；大麻；マリファナ；など、のことをいう。
【００５３】
嗜癖を被っている個体は、例えば、薬物の離脱に対する多くの望ましくない症状のいずれか１つ以上の存在によって、確認される。習慣性薬物の離脱またはこれを控えることに伴う代表的な症状としては、一般的な不快の感情、頭痛、ふるえ、不安、幻覚、吐き気、嘔吐など、および特に、嗜癖を引き起こさせる習慣性薬物についての連続的な欲求および切望が挙げられ得る。
【００５４】
「離脱の症状を管理する、減衰する、または軽減する」とは、異痛（普通は不快感を与えない刺激に対する侵害受容性応答）、痛覚過敏（侵害刺激に対する強調された応答）、頭痛、ふるえ、不安、幻覚、吐き気、嘔吐、および嗜癖を引き起こさせる習慣性薬物についての連続的な欲求および切望の症状が挙げられるが、これらに限定されない特定の嗜癖性薬物由来の離脱に関連する１つ以上の症状において被験体によって認知できる減少を意図する。
【００５５】
（ＩＩ．離脱症状を管理するための組成物および方法）
本発明は、εプロテインキナーゼＣおよびγプロテインキナーゼＣが、習慣性薬物および嗜癖性薬物からの離脱の機構に関連し、それらの選択的阻害が、離脱に関連する症状を軽減し得るか、または除去し得るという発見に基づいている。
【００５６】
（１．モルヒネ離脱）
遅発性前根電位（ｓＶＲＰ）は、約４０秒続く、脊髄における侵害受容関連応答の電気生理学的測定である（Ｙａｎａｇｉｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０６：２３１−２３９（１９８４）；Ａｋａｇｉ  Ｈ．ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，８４：６６３−６７３（１９８５）；Ｏｔｓｕｋａ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３９５：２５５−２７０（１９８８））。それは、末梢から脊髄までの侵害受容性（有痛性）刺激を伝達する小さい直径の求心性の神経を活性化するのに十分な強さで、腰部の後根の刺激によって誘発される（Ｌｏｚｉｅｒ  Ａ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．，７４：１００１−１００９（１９９５））。単離された脊髄は、アヘン剤離脱のインビトロでの侵害受容性応答性亢進を特徴づけるために使用され得る。なぜなら、このモデルにおいて、オピオイドに対する離脱は、例えば、μオピオイドレセプターアゴニストモルヒネの投与の後に、オピオイドアンタゴニストナロキソンの投与がある場合、コントロールを上まわるレベルへの侵害受容性関連遅発性前根電位（ｓＶＲＰ）の増加として開示されているからである。このように、ｓＶＲＰは、痛みに関連し、ナロキソンの後のその悪化は、インビボで痛覚の増加に変わる離脱症状の現れである。
【００５７】
実施例１に記載したように、新生児のラットの脊髄を、５〜７日齢のラットから単離し、ｓＶＲＰの測定のために準備した。図１Ａ〜１Ｃは、単離した脊髄の初期のｓＶＲＰ（図１Ａ）、モルヒネに曝露中のｓＶＲＰ（図１Ｂ）、次いで、ナロキソンに曝露中のｓＶＲＰ（図１Ｃ）を示す。ｓＶＲＰは、モルヒネによって低下し、ナロキソンの投与に対してコントロールを顕著に上まわるレベルまで戻る。ナロキソンの適用の３０分後、ｓＶＲＰの領域は、コントロールの１４０．９％±１０．１２（平均値±ＳＥＭ）（Ｐは０．００１未満）であった。応答性亢進は、少なくとも１時間、持続した。
【００５８】
図１Ｄは、時間（分）の関数としての、各々の個々のｓＶＲＰ追跡の曲線下の領域をプロットすることによるモルヒネ低下およびナロキソン誘発応答性亢進の時間的経過を示す。横棒は、単離した脊髄へのモルヒネおよびナロキソンの適用の時間を示す。モルヒネの投与によるｓＶＲＰの低下およびナロキソンの適用に対する応答性亢進は、明らかである。
【００５９】
ナロキソン誘発侵害受容性応答を特徴付けるための、このモデルの使用および有効性を確立したので、応答性亢進に対する種々のＰＫＣアンタゴニスト／インヒビターの効果を評価した。図２Ａ〜２Ｄは、種々の非特異的ＰＫＣインヒビター：モルヒネの存在下（図２Ａ）および非存在下（図２Ｃ）での広域スペクトルインヒビターＧＦ１０９２０３Ｘ；モルヒネの存在下（図２Ｂ）および非存在下（図２Ｄ）でのＣａ＋＋依存性ＰＫＣイソ型に特異的なインヒビターＧｏ６９７６の、適用後の時間（分）の関数としての遅発性前根電位（ｓＶＲＰ）を示すプロットである。ＰＫＣアンタゴニストＧＦ１０９２０３Ｘは、ナロキソン後の３０分で、ｓＶＲＰ領域が、コントロールの８７％（±９．８％）であったという結果によって証明されるように、離脱応答性亢進を阻害した（図２Ａ）。これは、コントロールと有意には異ならないが、アンタゴニストのないナロキソン後の強調した応答とは有意に異なる。ＰＫＣアンタゴニストＧｏ６９７６は、ナロキソンの３０分後、平均ｓＶＲＰ領域が、コントロールの１２７．４％（±５．５％）であり、値はナロキソン単独と有意に異ならなかったため、離脱症状を阻害しなかった（図２Ｂ）。インヒビター単独ではいずれも、ｓＶＲＰは変化しなかった（図２Ｃ〜２Ｄ）。
【００６０】
実施例１に示した手順に従って行われた別の研究において、ＰＫＣアイソザイム特異的なアンタゴニストεＰＫＣ  Ｖ１−２（配列番号１）およびγＰＫＣ  Ｖ５−３（配列番号２）を、単離した脊髄に適用した。εＰＫＣアンタゴニストについての結果を、図３Ａ〜３Ｂに示す。図３Ａは、Ｔａｔ結合ＰＫＣε特異的なペプチドインヒビターεＶ１−２（黒四角）またはＴａｔ単独（白丸；配列番号３）の存在下でのモルヒネおよびナロキソンの適用後の時間の関数としての遅発性前根電位（ｓＶＲＰ）領域を示す。Ｔａｔ結合εＰＫＣ  Ｖ１−２ペプチドは、ナロキソン投与の３０分後、ｓＶＲＰ領域がコントロールの１０２％であったという結果に見られるように、離脱応答性亢進を阻害した。対照的に、Ｔａｔペプチド単独（白丸）は、離脱応答を阻害しなかった。図６Ｂは、モルヒネの非存在下で、εＰＫＣ  Ｖ１−２が、ｓＶＲＰを変化させなかったことを示す。
【００６１】
γＰＫＣアンタゴニストγＶ５−３の投与についての結果を、図３Ｃ〜３Ｄに示す。γＰＫＣ  Ｖ５−３（黒四角）は、離脱応答性亢進を減少させたが、ＰＫＣγインヒビターに関連する離脱症状における明らかな減少が、Ｔａｔキャリアペプチドによることを示す、Ｔａｔキャリアビヒクル単独（白丸；図６Ｃ）より有意に大きな量ではなかった。この知見は、Ｃａ２＋依存性アンタゴニストＧｏ６９７６（図２Ｂ）ではなく、全体的なＰＫＣアンタゴニストＧＦ１０９２９３Ｘ（図２Ａ）は、モルヒネ曝露の３０分後、離脱応答性亢進を阻害したという、非特異的インヒビターの知見と一致する。図３Ｄは、モルヒネおよびナロキソンの非存在下で、γＰＫＣ  Ｖ５−３が、ｓＶＲＰを有意に変化させないことを示す。
【００６２】
別の動物のグループにおいて、非特異的なＰＫＣアンタゴニストケレリトリンの効果を研究した。モルヒネに曝露した脊髄へのケレリトリン投与は、モルヒネに対する応答を変化させなかった（結果は示していない）。しかし、ケレリトリンは、コントロールの１００．１％のケレリトンと組み合わせたナロキソン後のｓＶＲＰ応答によって証明されるように、モルヒネ離脱症状を阻害した（データは示さず）。
【００６３】
これらの研究は、脊髄におけるナロキソン誘発離脱応答性亢進が、εＰＣＫの活性を必要とすることを実証する。インビトロで短時間のモルヒネ曝露に供した単離された脊髄において、εＰＫＣに特異的なＰＫＣインヒビターは、ナロキソン処置後のｓＶＲＰの増加を防いだ。以下のインビボでの研究から示されるように、モルヒネ離脱症状はまた、インビトロ研究での使用より、異なる時点であるが、γイソ型のＰＫＣに関連する。
【００６４】
アヘン剤離脱異痛および痛覚過敏のインビボでの研究は、７日齢のラットを使用して行った。実施例２に記載されるように、７日齢のラットに、ナロキソンまたは生理食塩水の３０分後、皮下にモルヒネを与えた。足離脱症状潜伏時間を測定するために、後足を屈曲して引っ込める応答および熱刺激を引き起こすｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔ）を使用して、機械的閾値を、実施例２に記載したように測定した。図４Ａは、機械的閾値試験の結果を示し、図４Ｂは、足の熱による足を引っ込める潜伏時間試験の結果を示す。モルヒネを与えられた新生児のラットは、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントを使用して機械的圧力を増加させることに対する増加した足を引っ込める閾値、および熱刺激に対する増加した足を引っ込める潜伏時間として現れる深い痛覚脱失を示した（平行線模様の棒、図４Ａ〜４Ｂ）。モルヒネ曝露の３０分後（縦縞の棒）、オピオイドアンタゴニストナロキソンの投与は、機械的異痛および熱痛覚過敏を促進させ、ベースラインの前モルヒネ測定（例えば、モルヒネからの離脱に際して有害および有害でない刺激の両方に対する増加した痛みの感受性）と比較して、それぞれ、減少した機械的閾値またはより短い足を引っ込める潜伏時間として表れた。ナロキソン単独（点線の棒）は、機械的刺激に対する足引っ込めの閾値または熱刺激に対する足を引っ込める潜伏時間を変化させなかった。
【００６５】
図５Ａは、処置プロトコルを示し、ここで、ラットの仔に、皮下のモルヒネ送達の前に、ＰＫＣアンタゴニストをくも膜下腔内に（例えば、脊髄周囲の脳脊髄液の中へ直接的に）与えた。モルヒネ送達の３０分後、ナロキソンを投与し、続いて機械的異痛および熱痛覚過敏を（実施例２に記載したように）試験した。その結果を、図５Ｂ〜５Ｃに示す。
【００６６】
図５Ｂは、εＰＫＣ  Ｖ１−２（配列番号１；縦縞の棒）、γＰＫＣ  Ｖ５−３（配列番号２：平行線模様の棒）、Ｔａｔキャリア単独（配列番号３；点線の棒）または生理食塩水（白い棒）を用いて、図５Ａに示したプロトコルに従って処置した動物についてのナロキソン生理食塩水の適用後の時間の関数としての平均機械的閾値（グラム）を示す。図５Ｃは、平均熱応答潜伏時間試験についての同様のプロットである。そのデータは、モルヒネ送達の前に投与されたＴａｔ結合ＰＫＣεＶ１−２（縦縞の棒）が、ナロキソン誘発モルヒネ離脱症状異痛および痛覚過敏を阻害するのに効果的であることを示す（例えば、ＰＫＣεは、痛覚経路の離脱誘発性感作を媒介する）。Ｔａｔ結合γＰＫＣ  Ｖ５−３（平行線模様の棒）での前処置は、より小さい阻害効果を有した。Ｔａｔキャリア単独（点線の棒）および生理食塩水（白い棒）は、異痛および痛覚過敏を防がなかった。
【００６７】
別の研究を、臨床の依存の続発症の状況に、より密接に似ている、通常の離脱症状におけるＰＫＣアイソザイムの役割を調べるために行った。この研究において、７日齢のラットにモルヒネ（１ｍｇ／ｋｇ）の単回注射を与え、通常の離脱症状（すなわち、ナロキソンを離脱症状を促進するために投与しなかった）を受けさせた。処置プロトコルを図６Ａに示し、ここで、モルヒネ送達の２．５時間後、εＶ１−２またはγＶ５−３ペプチドインヒビターを、くも膜下腔内に投与した。機械的異痛および熱痛覚過敏を、実施例２に記載した手順に従って、１時間間隔で評価した。その結果を図６Ｂ〜６Ｃに示す。
【００６８】
図６Ｂは、機械的閾値試験についての結果を示し、図６Ｃは、熱応答潜伏時間の結果を示す。動物を、Ｔａｔ結合ＰＫＣε（配列番号１；縦縞の棒）、Ｔａｔ結合γＰＫＣ（配列番号２、平行線模様の棒）、Ｔａｔキャリア単独（配列番号３、点線の棒）、または生理食塩水（白い棒）を用いて処置し、各々をモルヒネ送達の直前にくも膜下腔内に投与した。ラットは、離脱の結果として機械的異痛および熱痛覚過敏を発現した（生理食塩水処置した動物、白い棒を参照のこと）。γＶ５−３（平行線模様の棒）の投与は、モルヒネからの通常の離脱の間に、機械的異痛および熱痛覚過敏を弱めた（γＶ５−３対Ｔａｔキャリア単独（点線の棒）または生理食塩水（白い棒）についてのｐは０．０５未満）。
【００６９】
図５〜６のデータは、インビボでの離脱応答を阻害する際のＰＫＣアイソザイムεおよびγの時間関係を示す。εＰＫＣペプチドアンタゴニストは、インビボでのナロキソン誘発機械的異痛および熱過敏症、ならびにモルヒネ曝露によるインビトロでの悪化した侵害受容性脊髄応答を防ぐのに効果的であった。εＶ１−２ペプチドは、モルヒネ曝露の前に投与した場合、最も効果的であった。γＰＫＣペプチドアンタゴニストは、モルヒネ曝露の後に投与した場合、離脱症状を弱めるのに効果的であり、モルヒネ曝露のより長い時間の後、最も効果的であった（図６Ｂ〜６Ｃ）。この時間関係から、モルヒネ曝露は、伝達物質放出の増加を引き起こすＰＫＣε依存性一次求心性感作の初期段階を生じ、続いて、ＰＫＣγ依存性脊髄感作に関連する、後期段階を生じるように見える。
【００７０】
このように、本発明は、被験体におけるオピオイド離脱症状痛覚過敏の管理のためのεＰＫＣアンタゴニストまたはγＰＫＣアンタゴニストの投与を企図する。特に、εＰＫＣアンタゴニストは、離脱に関連した異痛および痛覚過敏を軽減するためにオピオイドの送達の前、同時、または直後に、投与され得る。γＰＫＣアンタゴニストは、離脱に関連した異痛および痛覚過敏を軽減するために、好ましくは、オピオイド送達の後、最も好ましくは、オピオイド送達の１時間以上後に投与される。併用療法もまた、企図され、εＰＫＣアンタゴニストは、オピオイド送達の前、同時、または直後に投与され、続いて、オピオイドの送達後、γＰＫＣアンタゴニストが送達される。つまり、εＰＫＣアンタゴニストが、オピオイド送達の直後に投与される場合、γＰＫＣアンタゴニストは、εＰＫＣアンタゴニストと同時またはεＰＫＣアンタゴニストの投与の後に投与され得る。
【００７１】
（２．アルコール離脱）
アルコール離脱症状は、アルコールに対する嗜癖（アルコール中毒）に寄与し、深刻な臨床的な問題を課す。アルコールからの離脱症状を軽減するために、ＰＫＣのεアイソザイムおよびγアイソザイムに特異的なペプチドの能力を実証する研究を行った。その研究は、新生児のラットの脊髄運動ニューロンにおけるグルタミン酸作動性神経伝達によって媒介されるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプター電流のアルコール離脱応答性亢進を媒介するγＰＫＣペプチドの能力、ならびに若いラットにおける離脱症状を弱めるεＰＫＣペプチドインヒビターおよびγＰＫＣペプチドインヒビターの能力を特徴付けること、を含んだ。これらの研究を、これから記載する。
【００７２】
（ａ．インビトロでの研究）
脊髄を若いラットから取得し、これらの脊髄の切片を作製し、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプター電流のアルコール離脱応答性亢進を媒介するγＰＫＣペプチドの能力を特徴付けるために、パッチクランプ電気生理学解析のための人工の脳脊髄液の中に置いた。図７Ａは、その技法の模式図であり、腰髄切片１０を示す。運動ニューロン１６に対するＮＭＤＡの適用のための導出電極（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）１２およびペプチド１４の配置を、示す。図７Ｂは、ＮＭＤＡアンタゴニスト２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰＶ）の適用前（コントロール）および適用後の、脊髄運動ニューロンから誘発された個々の追跡を示す。
【００７３】
図８Ａ〜８Ｃは、アルコール誘導離脱症状の前（コントロール、図８Ａ）、間（図８Ｂ）、および後（図８Ｃ）の運動ニューロンにおけるＮＭＤＡ誘発電流由来の追跡である。ＮＭＤＡ誘発電流の領域上のアルコール（ＥｔＯＨ）の影響の時間的経過を、図８Ｄに示し、ここで、図の横棒は、アルコール適用の時間を表示する。規格化したＮＭＤＡ電流（ＩＮＭＤＡ）領域は、腰髄切片運動ニューロン（ｎ＝１１）へのアルコール（ＥｔＯＨ）の適用後、増加する。
【００７４】
図８Ｅは、図８Ｄの同じ腰髄切片運動ニューロン（ｎ＝１１）の離脱応答性亢進を示すヒストグラムである。ＮＭＤＡ誘導電流を、アルコール（１００ｍＭ）適用の１８分後に測定し、洗浄液（人工の脳脊髄液）を適用した。エタノールの適用後、コントロールレベルより大きいＮＭＤＡ誘導電流の増加は、エタノール誘導離脱応答性亢進を示す。
【００７５】
エタノール離脱応答性亢進は、図９Ａ〜９Ｅに表されるデータによって示されるように、カルシウム依存性である。図９Ａ〜９Ｃは、カルシウムキレート剤ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）の存在下でのアルコール（ＥｔＯＨ）の適用の前（コントロール、図８Ａ）、間（図８Ｂ）、および後（図８Ｃ）の運動ニューロンにおけるＮＭＤＡ誘発電流の追跡である。運動ニューロン由来の個々の追跡は、記録ピペットが、３０ｍＭのカルシウムキレート剤ＢＡＰＴＡを含有する場合、エタノール離脱応答性亢進を示さない。図９Ｄは、細胞内のＢＡＰＴＡの存在下でのＮＭＤＡ誘発電流（ｎ＝８）の領域に対するエタノールの平均的効果の時間的経過を示す。横棒は、エタノールの適用の時間を示し、見られるように、エタノール適用の停止の後、電流はコントロールレベルまで戻った。図９Ｅは、カルシウムキレート剤の存在下で、エタノール投与後の応答性亢進が観測されないことを示すヒストグラムである。
【００７６】
蛍光免疫細胞化学の研究を、実施例３に記載されているように、脊髄切片上で行った。その切片を、ニューロンを識別するために、抗γＰＫＣ抗体および抗ニューロン抗体と一緒にインキュベートした。洗浄後、フルオレセイン標識した二次抗体でその切片を標識し、レーザー共焦点顕微鏡検査によって観測した。本明細書中に示されていないが、脊髄切片の視覚化によって、前角ニューロンにおける多量のγＰＫＣが示され、エタノールが可逆的に、核から細胞質までγＰＫＣの転移を誘発することが示された。γＰＫＣの転移を、エタノールの適用の前（コントロール）および後、ならびに人工の脳脊髄液で洗浄した後に、核に局在化したγＰＫＣを有する細胞の数を数えることによって定量化した。γＰＫＣアイソザイム特異的なペプチドＶ５−３（配列番号２）の存在下での転移もまた、γＰＫＣ  Ｖ５−３ペプチドを切片に投与し、２０分後、エタノールを投与することによって評価した。動物１匹につき、２〜３個の切片を数えた。その結果を図１０に示す。
【００７７】
図１０は、核に局在化するγＰＫＣを有する細胞の数を示す棒グラフである。見られるように、エタノール適用の前に、約１４個の細胞が、核に局在化するγＰＫＣを有すると数えられた。脊髄切片へのエタノールの適用の後、核に局在化するγＰＫＣを有する細胞の数は、約６まで減少し、エタノールが核から細胞質までγＰＫＣの転移を誘発するという目に見える観測と一致している。人工の脳脊髄液で洗浄した後に核に局在化したγＰＫＣを有する細胞の増加によって証明されるように、転移は可逆的であった。エタノール曝露の前に適用された、γＰＫＣアイソザイム特異的なペプチドＶ５−３（配列番号２）の存在は、核におけるγＰＫＣを有する細胞の数がコントロール値の約１４のままであることによって証明されるように、細胞質へのγＰＫＣ転移を阻害するのに効果的であった。
【００７８】
図１１Ａ〜１１Ｆは、アルコールおよびγＶ５−３ＰＫＣペプチドインヒビター（配列番号２）の存在下での脊髄切片におけるＮＭＤＡ誘発電流の結果を示す。図１１Ａ〜１１Ｂは、２ｎｍ  γＰＫＣ  Ｖ５−３（配列番号２）の存在下でのＮＭＤＡ誘発電流に対するエタノールの効果を示す。図１１Ａは、時間の関数としての規格化したＮＭＤＡ誘発電流領域のプロットであり、ここで、横棒は、１５分間のエタノール（１００ｍＭ）の適用を示す。エタノール適用の後、脊髄切片を人工の脳脊髄液で洗浄した。図１１Ｂは、対応するヒストグラムである。２ｎＭの用量で、γＰＫＣペプチドインヒビターＶ５−３は、離脱応答性亢進を、完全には阻害しなかった。しかし、５〜１０ｎＭの用量で、ペプチドは、図１１Ｃ〜１１Ｄに表されたデータに見られるように、エタノール離脱応答性亢進を効果的に阻害した。図１１Ｅ〜１１Ｆは、エタノール離脱応答性亢進に対する１０ｎＭＴａｔキャリア単独の効果を示し、キャリアペプチドは、その症状を防がないことがわかる。
【００７９】
まとめると、図７〜１１のデータは、ＮＭＤＡ誘発電流のエタノール離脱応答性亢進が、カルシウム依存性現象であり、γＰＫＣがカルシウム依存性アイソザイムであることを示す。新生児のラットの脊髄前角は、十分量のγＰＫＣアイソザイムを表し、それは、エタノールによって活性化されて、核から細胞質まで転移する。γＰＫＣアイソザイム特異的なペプチド（例えば、配列番号２）は、転移を阻害するために効果的であり、それによって、エタノール離脱応答性亢進を弱めるか、または阻害する。
【００８０】
（ｂ．インビボ研究）
エタノール離脱誘導性の異痛および痛覚過敏に対するεならびにγのＰＫＣアイソザイム特異的ペプチドの効果を決定するために、子供のラットを使用してインビボ研究を行った。実施例４に詳述されるように、腹腔内注射により７日齢および２１日齢のラットにエタノールを与えた。機械的異痛試験（ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒ刺激）およびエタノール投与後に所定の間隔での熱痛覚過敏（熱に対して足を引く潜伏期（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐａｗ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｌａｔｅｎｃｙ））をラットに受けさせた。０時間での値を確立するために、エタノール処理の前にベースライン試験を行った。
【００８１】
機械的異痛試験についての結果を、７日齢の子（図１２Ａ）および２１日齢の子（図１２Ｂ）について図１２Ａ〜１２Ｂに示す。ｙ軸についての閾値の引っ込め力（グラム）は、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ繊維を屈曲するために必要な力（ミリグラム）の１０倍対数として定義される。４ｇ／ｋｇ  １５％  ＥｔＯＨ（星記号）で処理した出生後７日目のラットは、２時間の試験間隔で閾値の引っ込め力（例えば、痛覚脱失）において、わずかであるが有意な増大を示した。エタノール注射後６時間および８時間で、その７日齢ラットは、生理食塩水コントロールと比較して、足の閾値引っ込め力の減少で明らかなように、機械的異痛を示した（図１２Ａ）。１ｇ／ｋｇ  １５％  ＥｔＯＨ（黒四角）の投与により、閾値引っ込め力は有意に変化しなかった。生理食塩水（白丸）を注射した子を使用して確立した場合、ベースラインの閾値引っ込め力は、研究の期間中、定常のままであった。
【００８２】
７日齢の子と対照的に、２１日齢のラットは、図１２Ｂに示されるように、ＥｔＯＨ投与の後、閾値引っ込め力（例えば、痛覚脱失）の増大を示さなかった。閾値引っ込め力は、エタノール注射後４時間で早くも減少し、その注射後７２時間までベースラインを下回ったままであった。高い（４ｇ／ｋｇ；星記号）用量および低い（０．５ｇ／ｋｇ；黒丸）用量の両方の１５％  ＥｔＯＨ投与により、ＥｔＯＨ注射後６時間で機械的閾値は最も減少した。両方の濃度において、引っ込め閾値は、注射後７２時間までの間、一貫してベースラインを下回ったままであった。生理食塩水（白丸）で注射したラットを使用して確立した場合、Ｐ２１ラットでのベースラインの閾値引っ込め力は、研究の期間中、定常のままであった。
【００８３】
図１３Ａ〜１３Ｂは、生理食塩水（白抜き棒）、４ｇ／ｋｇ  １５％  ＥｔＯＨ（破線棒）で処理した出生後７日目のラット（図１３Ａ）および出生後２１日目のラット（図１３Ｂ）についての上記の熱に対して足を引く潜伏期試験の結果を示す。ベースラインの熱に対して足を引く潜伏期は、７日齢のラットと２１日齢のラットとにおいて、各々、１２．８６±０．７０秒および１２．２６±０．７９秒の値で類似していた。足を引く潜伏期の減少によって示されるような熱痛覚過敏は、７日齢のラットにおいて４ｇ／ｋｇ  １５％  ＥｔＯＨの投与の６時間後に観察された（図１３Ａ）。足を引く潜伏期の変化は、生理食塩水のコントロールでは観察されなかった。７日齢のラットと対照的に、４ｇ／ｋｇ  １５％  ＥｔＯＨを投与した２１日齢のラットは、試験の全期間にわたる生理食塩水のコントロールと比較した場合、足を引く潜伏期の減少を示さなかった（図１３Ｂ）。足を引く潜伏期の変化は、生理食塩水コントロールの２１日齢の子において観察されなかった。
【００８４】
機械的異痛および熱痛覚過敏がＥｔＯＨ濃度の減少と時間的に相関があるか否かを決定するため、ならびに７日齢のラットと２１日齢のラットとの間の応答において観察された差異が、異なるＥｔＯＨの薬物動態学に起因するか否かを決定するために、１回の４ｇ／ｋｇ  １５％  ＥｔＯＨ投与の後、血中および脊髄のＥｔＯＨ濃度を測定した。実施例４に記載の手順に従って、血中および脊髄のエタノールレベルを決定した。その結果を図１４Ａ〜１４Ｂに示す。
【００８５】
図１４Ａは、エタノール注射後の時間の関数として、７日齢のラット（黒丸）および２１日齢のラット（白丸）についての血中エタノールレベルを示す。図１４Ｂは、脊髄中のエタノール濃度についての同様のプロットである（エタノールμｇ／組織ｍｇとして報告した）。７日齢および２１日齢のラットの両方について、血中ＥｔＯＨ濃度は、エタノール注射後３０分で類似した最高点レベルに達した。この時点で、最大血中ＥｔＯＨ濃度は、７日齢の子について５．９１±０．４６μｇ／ｍＬおよび２１日齢のラットについて５．６７±０．６０μｇ／ｍＬであった（図１４Ａ）。
【００８６】
消失薬物動態学を、表１にまとめている。血中からのＥｔＯＨの消失は、始めに速い速度（初期相）、その後より遅い速度（遅延相）を示した。両方の年齢群が、エタノール注射後３時間で、同様の初期相半減期（各々、１．９時間および１．７時間）でＥｔＯＨレベルの劇的な減少を示した。２１日齢のラットは、７日齢ラットより４時間長い遅延相の半減期を示し、そして注射後２４時間にて、低濃度のＥｔＯＨは、依然検出可能であった。
【００８７】
【表１】
2010090176.tif 000002
侵害求心性線維は、脊髄の後角ニューロンで終端している。従って、また、脊髄組織におけるＥｔＯＨの濃度および動力学を検査した。図１４Ｂおよび表１に示されるように、血中とは対照的に、７日齢ラットと２１日齢ラットとの間に脊髄のＥｔＯＨ濃度におけるＥｔＯＨ濃度の明らかな差異が存在した。注射後３０分で最高点のＥｔＯＨレベルが生じ、注射後３時間で、同様の初期相の半減期で最小レベルまで減少した；Ｐ７ラットについて１．６時間およびＰ２１ラットについて１．５時間（図１４Ｂ、表１）。７日齢ラットについての最大ＥｔＯＨ濃度（１４．８μｇ／組織ｍｇ）は、２１日齢のラットについての最大ＥｔＯＨ濃度（１１．４μｇ／組織ｍｇ）よりも高く、初期相の間ずっと高いままであった。脊髄のＥｔＯＨは、血中ＥｔＯＨレベルについての半減期の５０％半減期である遅延相半減期により証明されるように、血中ＥｔＯＨレベルよりも速い速度で検出不可能なレベル付近まで減少した。
【００８８】
エタノール離脱誘導性疼痛を媒介する際のＰＫＣεおよびＰＫＣγの役割を研究するために、離脱痛覚過敏の予想開始の１時間前に、ＰＫＣεペプチドインヒビター（εＶ１−２；配列番号１）またはＰＫＣγペプチドインヒビター（γＶ５−３；配列番号２）を７日齢および２１日齢のラットにくも膜下腔内投与した。Ｔａｔキャリアタンパク質（配列番号３）（これに上記インヒビターを結合体化した）を含むビヒクルをコントロールラットに注射した。
【００８９】
機械的異痛試験の結果を図１５Ａ〜１５Ｄに示す。図１５Ａ〜１５Ｂは、εＶ１−２（破線棒）、γＶ５−３（縦縞棒）、もしくはＴａｔ単独（白抜き棒）で処理した７日齢ラットについての、エタノール注射後（図１５Ａ）または生理食塩水注射後（コントロール、図１５Ｂ）の種々の時間に対する閾値引っ込め力を示す棒グラフである。図１５Ｃ〜図１５Ｄは、２１日齢ラットについての同様の棒グラフである。７日齢ラットに関して、εＰＫＣ（破線棒）ペプチドインヒビターおよびγＰＫＣ（縦縞棒）ペプチドインヒビターの投与により、Ｔａｔキャリア処理ラット（白抜き棒、図１５Ａ）と比較して、ＥｔＯＨ注射後６時間および７時間の両方の時点で機械的異痛が減弱した。８時間で、全てのラットは、同様の閾値引っ込め応答を示し、この閾値引っ込め応答は、処理群にかかわらず、前ＥｔＯＨベースラインレベルよりも有意に低かった。ＰＫＣアイソザイム特異的インヒビターは、ＥｔＯＨの非存在下における閾値の足の引きに対して効果を有さなかった（図１５Ｂ）。
【００９０】
２１日齢ラットに関して、図１５Ｃは、ＰＫＣεインヒビター（破線棒）がエタノール注射後６時間および８時間にて、応答をわずかに弱減したことを示す。ＰＫＣγインヒビター（縦縞棒）は、閾値の引っ込め応答の減少を防止し、前ＥｔＯＨベースラインレベル（図１５Ｃ、ベースライン）およびラットがＥｔＯＨではなく生理食塩水を受けたレベル（図１５Ｄ）と同じ引っ込め応答を有効に維持した。
【００９１】
図１６Ａ〜１６Ｂは、熱痛覚過敏評価についての結果を示す。図１６Ａは、７日齢のラットの子について、エタノール注射前（ベースライン）およびエタノール注射後５時間、６時間、および８時間での足を引く潜伏期（秒）を示す棒グラフである。エタノール注射後４時間で、ＰＫＣインヒビターペプチド（εＰＫＣ  Ｖ１−２（配列番号１；破線棒）もしくはγＰＫＣ  Ｖ５−３（配列番号２；縦縞棒））、またはＴａｔキャリアペプチド単独（配列番号３、白抜き棒）を、くも膜下腔内投与した（実施例４）。図１６Ｂは、エタノールではなく生理食塩水で処理した動物についての同様のグラフである。
【００９２】
図１６Ａは、７日齢のラットにおいて、εＰＫＣおよびγＰＫＣの両方のペプチドインヒビターが熱痛覚過敏を完全に防止したことを示す。ＰＫＣアイソザイム特異的インヒビターを受けたラットは、生理食塩水処理した動物と同様の足を引く潜伏期を有した（図１６Ｂ）。
【００９３】
ＥｔＯＨが、εＰＫＣおよびγＰＫＣの発現および細胞の局在を変化させるか否かを決定するために、実施例４に記載されるように、Ｌ４／５後根神経節（ＤＲＧ）およびＬ４／５腰脊髄の節で免疫組織化学を行った。生理食塩水または４ｇ／ｋｇ  １５％  ＥｔＯＨで処理した出生後７日目および２１日目のラットを、腰脊髄の単離のため、注射後２時間、４時間、または６時間にて安楽死させた。生理食塩水を注射した７日齢のラットにおいて、少ない割合の細胞が、εＰＫＣについて陽性に染色された（データ示さず）。ＥｔＯＨへの２時間の曝露後、εＰＫＣについて陽性に染色している細胞の割合は増大し、個々の細胞における染色密度も増大した（データ示さず）。４時間および６時間で、εＰＫＣについて陽性に染色している細胞数は、生理食塩水を注射した動物と同等のレベルまで回復した。生理食塩水を注射した２１日齢のラットにおいて、生理食塩水で処理した７日齢の子と比較して、εＰＫＣについてより多くの細胞が陽性に染色していることが観察された。ＥｔＯＨでの処理により、陽性染色の細胞数および陽性染色細胞内の染色強度の増大は生じなかった（データ示さず）。εＰＫＣ染色は、主に細胞質のようであった。
【００９４】
７日齢のラットにおいて、わずかなγＰＫＣ陽性のニューロン細胞体が、コントロール動物の腰脊髄のラミナＩＩにおいて観察された。ＥｔＯＨ注射した動物のγＰＫＣ染色は、注射後２時間および４時間にて、生理食塩水注射した動物と変わらなかったが、γＰＫＣについて陽性染色している細胞体の数は、注射後６時間で上記生理食塩水コントロールレベルよりも４倍に増大した（データ示さず）。２１日齢のラットにおいて、細胞体における十分なγＰＫＣ染色が存在した。γＰＫＣ陽性細胞体の数は、ＥｔＯＨの注射後で変化しなかったが、γＰＫＣの染色強度は、ＥｔＯＨ注射後の２時間で増大し、注射後６時間にて増強したままであった（データ示さず）。染色強度の増大に加え、組織の拡大率は、生理食塩水処理した子のγＰＫＣは、主に細胞質にあり；ＥｔＯＨ注射後の２時間で、γＰＫＣは、形質膜に転位置し；６時間で、γＰＫＣは、再度主に細胞質にあったことを実証した（データ示さず）。
【００９５】
（ＩＩＩ．有用性）
従って、εＰＫＣもしくはγＰＫＣの活性を拮抗するペプチドまたは他の化合物の投与が、習慣性薬物または依存性薬物からの離脱を取扱うために企図される。上記の研究において、ＰＫＣのεおよびγのアイソザイムに特異的な例示的ペプチドは、依存性薬物からの離脱に関連する症状を防止または減弱することが示されている。
【００９６】
配列番号１および配列番号２として本明細書中で同定されたペプチドは、単なる例示であることが理解され、本明細書中で実証された活性と同様の活性を有するεＰＫＣ配列に由来する改変、フラグメントおよび誘導体ならびに他のペプチドが、企図される。適切な改変（例えば、保存的アミノ酸置換）は、当業者によって容易に決定される。配列番号２（ＲＬＶＬＡＳ）についての例示的な改変としては、小文字で示される以下の変化が挙げられる：ｋＬＶＬＡＳ（配列番号４）；ＲＬＶＬｇＳ（配列番号５）；ＲＬＶＬｐＳ（配列番号６）；ＲＬＶＬｎＳ（配列番号７）、および上記の任意の組合わせ。他の改変としては、１つまたは２つのＬからＩまたはＶへの変化（例えば、ＲｉＶＬＡＳ（配列番号８）；ＲＬＶｉＡＳ（配列番号９）；またはＲｉＶｉＡＳ（配列番号１０））が挙げられる。また、ＬおよびＶは、ＲＬｉＬＡＳ（配列番号１１）、ＲＬｄＬＡＳ（配列番号１２）、およびＲｉｄＬＡＳ（配列番号１３）またはＲｒｉｄＡＳ（配列番号１４）のように、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、および／またはＤに変化され得る。所望の活性を保持する任意の改変が、適している。従って、上記に列挙される全ての例示的なフラグメント、保存的改変および上記活性を感知できるほど変化させない他の改変が、作製され得、企図されるペプチドの範囲内に含まれる。
【００９７】
上記ペプチドは、天然の形態で使用され得るか、またはキャリアに結合することによって改変され得ることが理解される。天然の形態において、上記ペプチドは、必要に応じて、細胞内へのその送達を容易にするために処方され得る。細胞浸透にとって適切な処方物は、当該分野で公知であり、これらとしては、例えば、ミセル、リポソーム（荷電および無電荷）、および親油性媒体が挙げられる。キャリアに連結される場合、当業者は、当該分野で公知の種々のペプチドキャリアから選択し得る。上記の研究において使用されたＴａｔキャリアに加え、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｈｉｌａ）アンテナペディアホメオドメイン（配列番号１５；Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．らＪ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：７１５８（１９９５）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：１０８６（１９９６ｂ））に基づくキャリア（ここで、上記ＰＫＣペプチドが、アンテナペディアキャリアにＮ末端のＣｙｓ−Ｃｙｓ結合を介して架橋される）が、適している。ポリアルギニンは、別の例示的なキャリアペプチドである（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，５６：３１８−３２５（２０００）；Ｒｏｌｈｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，６：１２５３−１２５７（２０００））。
【００９８】
本明細書中に記載される全てのペプチドは、当該分野で公知の、自動または手動のいずれかの固相合成技術を使用した化学合成によって調製され得る。上記ペプチドはまた、当該分野で公知の技術を使用して、組換え的に調製され得る。
【００９９】
薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組合わせて投与するために、上記ペプチドが調製される。従って、本発明のさらなる局面は、疼痛の取扱いが必要な被験体に投与するために適切な投薬形態において、γＰＫＣペプチドまたはεＰＫＣペプチドを含有する薬学的組成物を提供する。例示的な投薬形態としては、薬学的キャリア（例えば、デンプン、ラクトース、滑石、ステアリン酸マグネシウム、水溶液、油−水エマルジョンなど）中に処方されるペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。任意の経路（くも膜下腔内経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路が挙げられるが、これらに限定されない）による注射にとって適切な投薬形態が、薬学的キャリア（例えば、緩衝化水溶液または非水性媒体）を使用して調製され得る。上記ペプチドは、例えば、局所適用、真皮投与もしくは経皮投与、または皮内注射によって、炎症または末梢神経損傷部位付近に局部投与され得る。粘膜送達もまた、企図され、ここで、上記ペプチドは、舌下送達、膣送達、鼻腔内送達、または眼送達のために処方される。特定の形態の投与は、時間が経つとより広がる送達の初期局在部位に達し得ることが理解される。例えば、頬のパッチまたは膣の坐剤は、適用部位で初期に局在性の送達を提供する。時間が経つと、上記ペプチドは、送達部位から体液（リンパおよび血液）中を移動して、より広範な作用領域を提供する。送達の範囲は、薬学的処方物の分野の当業者に公知であるように、処方の選択および投与経路によって制御され得る。
【０１００】
組成物中のペプチドの量は、適切な用量が得られ、かつ有効な鎮痛性効果が達成されるように変化され得る。上記投薬量は、多くの因子（例えば、投与経路、処置の持続時間、患者のサイズおよび身体的状態、ペプチドの効力ならびに患者の応答）に依存する。ペプチドの有効量は、本明細書中に記載される１つ以上の疼痛モデルにおいて上記ペプチドを試験することによって推定され得る。
【０１０１】
上記ペプチドは、必要に応じて、毎時、１日に数回、毎日、またはヒトが疼痛を経験する度もしくはそのヒトの医師が適切であると判断する度に、投与され得る。上記ペプチドは、疼痛を予想して予防的に投与され得るか、または必要に応じて、疼痛の急性エピソードの前またはその間に投与され得る。上記ペプチドは、慢性の疼痛を取扱う間継続的なベースで投与され得るか、または、疼痛のエピソードの前後（例えば、手術の前および／または後）短い期間ベースで投与され得る。
【０１０２】
本発明はさらに、使用者が依存性薬剤からの離脱の症状を取扱う際に使用するための成分を備えるキットを企図する。上記使用者は、依存性薬剤で処置された患者または依存性薬剤の乱用のために処置された患者を介護する医療介護提供者（例えば、看護士または医師）であり得る。上記使用者はまた、臨床的な嗜癖が生じたか否かにかかわらず、依存性薬剤を扱う人であり得る。
【０１０３】
上記キットは、（ｉ）γＰＫＣおよび／またはεＰＫＣに対してアイソザイム特異的な阻害活性を有するペプチドを含む少なくとも１つの容器；および（ｉｉ）使用のための取扱説明書を備える。１実施形態において、このキットは、εＰＫＣについてのアイソザイム特異的な阻害活性を有するペプチド（例えば、配列番号１により本明細書中で同定されたペプチドまたは上で考察される任意の改変物）を含む第一の容器からなる。
【０１０４】
このキットはまた、γＰＫＣに対してアイソザイム特異的な阻害活性を有するペプチド（例えば、配列番号２により本明細書中で同定されたペプチドまたは上で考察される任意の改変物）を含む第二の容器を含み得る。２つのバイアルを備えるキット（１つは、ε特異的なＰＫＣペプチドを含み、他方は、γ特異的なアイソザイムペプチドを含む）は、依存性薬剤の投与の前またはそれと同時にεＰＫＣに対してアイソザイム特異的な阻害活性を有するペプチドを投与することを使用者に指示する取扱説明書を備える。上記使用者はさらに、依存性薬剤の投与後に、γＰＫＣに対してアイソザイム特異的な阻害活性を有するペプチドを投与するように指示される。
【０１０５】
キット内のペプチドは、直ちに使用できる状態または滅菌流体（例えば、生理食塩水）の添加が必要な形態で提供され得る。必然的に、滅菌流体が必要な場合、上記キットは、必要な流体の量および（注射が必要な場合）シリンジを備え得る。直ちに使用できる状態で処方されるペプチドは、任意の投与経路について上で考察された任意の形態で、単回使用または複数回使用のための投薬形態を意図する。
【０１０６】
本発明はまた、新生児における離脱症状を取扱うための治療的レジメンを企図する。ここで記載される研究は、出生後７日目のラット（発達的に新生児のヒト乳児に相当する）および出生後２１日目のラット（発達的に就学前の年齢のヒトの子供に相当する）を使用した（ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄおよびＡｎａｎｄ，Ｐａｉｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｉｎｆａｎｔｓ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ（Ｓｃｈｅｔｃｈｔｅｒら，（編）），１１−３２頁、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９９３）。ヒト乳児は、慣例的に、機械的な人工呼吸の間、疼痛の軽減および鎮静のためにオピオイドで処置される。これらの乳児の多くは、新生児禁断症候群（発達的に特異的なアヘン剤の同等物の離脱）の症状を示す（Ｎｏｒｔｏｎ，Ｓ．，Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｎｅｔｗ．，７：２５−２８（１９８８））。出生後７日目のラットにおいて本明細書中で記載されるデータから、モルヒネ曝露で生じるεＰＫＣの転位置に依存的な主要な求心性感作の初期相の後に、脊髄内のγＰＫＣ含有ニューロンによって媒介される脊髄感作を含む遅延相が続いた。このデータは、初期相の感作の間、εＰＫＣ特異的な活性を有するペプチド、所望の場合、遅延相の感作の間γＰＫＣ特異的な活性を有するペプチドを投与することによる、ヒト新生児集団におけるアヘン剤の耐性および離脱の処置のための一時的な治療を示唆する。
【０１０７】
上記から、本発明の種々の対象および特徴が、どのように合っているかが、分かり得る。依存性薬剤の使用停止に関連する離脱症状を減弱するための方法が、提供される。最も一般的には、上記方法は、被験体（代表的に、哺乳動物（特に、ヒト））に、εＰＫＣまたはγＰＫＣに対してアイソザイム特異的な活性を有するペプチドを投与する工程を包含する。この方法の１実施形態において、両方のペプチドが、一時性の様式で投与され、ここで、εＰＫＣアイソザイムに対して特異的な活性を有するペプチドが、依存性薬剤の投与の前またはそれと同時に投与される。γＰＫＣアイソザイムに対して特異的な活性を有するペプチドは、依存性薬剤が被験体に与えられた後に投与される。「〜の後」は、依存性薬剤を投与してすぐか、または依存性薬剤の投与の数分後もしくは数時間後の、γＰＫＣアイソザイム特異的なペプチドの投与を意味する。
【実施例】
【０１０８】
（ＩＶ．実施例）
以下の実施例はさらに、本明細書中に記載される本発明を例示し、本発明の範囲を限定することは、決して意図されない。
【０１０９】
（材料および方法）
全てのペプチドを、Ｓｔａｎｆｏｒｄ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉ  Ａｃｉｄ施設で合成し、Ｎ末端でのシステイン−システイン結合を介してＴａｔ（アミノ酸４７〜５７（配列番号３））に結合体化した。εＰＫＣアンタゴニスト（εＶ１−２（配列番号１））およびγＰＫＣアンタゴニスト（γＶ５−３（配列番号２））を、＞９０％の純度で使用した。
【０１１０】
（実施例１）
（ｓＶＲＰのインビトロ測定）
４〜７日齢のラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの脊髄を取り出し、それを緩徐前根電位（ｓＶＲＰ）の電気生理学的記録（Ｗｏｏｄｌｅｙ  Ｓ．Ｊ．ら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，５５９：１７−２１（１９９１））のために設置した。簡単には、ハロタン麻酔下でラット子を断頭し、脊髄を酸素を含ませた人工的脳脊髄流液へ取り出した。吸引刺激電極を腰後根に配置し、そして吸引記録電極を対応する同側の前根に配置した。実験の間中、１／５０秒の一定頻度で、方形波刺激持続時間０．２ｍｓを与えた。試験薬剤を適用し、その応答を記録し、デジタル化し、そして曲線下面積を測定した。
【０１１１】
ｓＶＲＰのベースラインの読み取り後、単離した脊髄にモルヒネ（２００ｎＭ）を適用した。ｓＶＲＰを再度記録して、モルヒネに対する応答を特徴づけた。次いで、ナロキソン（２００ｎＭ）を適用し、ｓＶＲＰを記録した。その結果を図１Ａ〜１Ｄに示す。
【０１１２】
図２Ａ〜２Ｄは、非特異的なＰＫＣアンタゴニスト（ＧＦ１０９２０３Ｘ（１．２μＭ））およびＣａ＋＋依存的ＰＫＣアイソフォームに特異的なインヒビター（Ｇｏ６９７６（１μＭ））の適用後の結果を示す。
【０１１３】
図３Ａ〜３Ｂは、ペプチドキャリア（Ｔａｔ；配列番号３）に結合体化されたεＰＫＣアンタゴニスト（εＶ１−２；配列番号１、２ｎＭ）の適用後の結果およびＴａｔペプチド単独（２ｎＭ；配列番号３）の適用後の結果を示す。図３Ｃ〜３Ｄは、ペプチドキャリア（Ｔａｔ；配列番号３）に抱合体化されたγＰＫＣ（γＶ５−３；配列番号２、４ｎＭ）の適用後の結果およびＴａｔペプチド単独（４ｎｍ；配列番号３）の適用後の結果を示す。
【０１１４】
（実施例２）
インビボの機械閾値および熱足引っ込め（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐａｗ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）の研究
雌雄の生後７日目のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。全ての行動実験について、ラットを、オーバーヘッド加熱ランプで巣の温度に維持した。
【０１１５】
機械閾値を測定するために、ラットを、高架の針金網（２ｍｍの空き）に入れた。Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．，ＷｏｏｄＤａｌｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を使用して、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｍら，ＰＡＩＮ  ＭＡＮＡＧＥＭＥＮＴ  ＩＮ  ＩＮＦＡＮＴＳ，ＣＨＩＬＤＲＥＮ  ＡＮＤ  ＡＤＯＬＥＳＣＥＮＴＳ；Ｓｃｈｅｔｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｙａｓｔｅｒ編、１１〜３２ページ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ）（１９９３））に記載されるとおりに、皮膚屈曲引っ込めを顕著にした。強度を増加するＶｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒｓを、足の引っ込めが誘発されるまで、左後ろ足の足底表面に３回適用した。引っ込め反射を生じるのに必要とされる最も低強度のＶｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒを、低強度の機械刺激に対する応答閾値として記録した。
【０１１６】
熱足引っ込めの潜伏期を、Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ  Ｐｌａｎｔａｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．，ＷｏｏｄＤａｌｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を使用して測定した。簡単に述べると、生後７日のラットを逆さにしたプレキシグラスの囲いに入れ、その左後ろ足の足底表面を、ランプの赤外線強度を３０に設定して下から加熱した。２つの基準の熱応答潜伏の計測を、組織損傷を防ぐためにされた２０秒のカットオフを使用して、モルヒネ投与前に収集した。
【０１１７】
生後７日のラットに、５０μｌ生理食塩水中の１ｍｇ／ｋｇのモルヒネ硫酸塩（Ｓｉｇｍａ）を皮下投与した。機械閾値を、痛覚消失を確立した１５分後に測定した。ラットを、巣（ｄａｍ）に戻した。モルヒネ投与の３０分後または１２０分後に、ラットに５０μｌ生理食塩水中の０．２５ｍｇ／ｋｇのナロキソン（Ｓｉｇｍａ）を皮下投与した。機械閾値および熱足引っ込め潜伏を１０分間間隔で測定した。ＰＫＣのε（εＶ１−２；配列番号１、１０μＭ）およびγ（γＶ３−５；配列番号２、１０μＭ）アイソフォームに特異的なＴａｔ結合ペプチドインヒビター、Ｔａｔキャリア（１０μＭ）または生理食塩水を、ハロタンでわずかに麻酔されたラットにおいて、滅菌した２９目盛りの３／１０ｃｃインスリン用シリンジ（２９ｇａｕｇｅ  ３／１０ｃｃ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｙｒｉｎｇｅ）を使用して、直接腰椎穿刺を介して５μｌ体積でくも膜下腔内投与した。麻酔から完全に回復するために、動物に、ナロキソンの３０分前にペプチドまたはコントロール溶液を投与した。結果を図４Ａ〜４Ｂおよび５Ｂ〜５Ｃに示す。
【０１１８】
自然な引っ込めの研究について、ラットにモルヒネ（１ｍｇ／ｋｇ）を投与し、２．５時間後にεＶ１−２（１０μＭ）、γＶ３−５（１０μＭ）、Ｔａｔキャリア（１０μＭ）、または生理食塩水を投与した。機械閾値および熱足引っ込め潜伏を、モルヒネ後、３時間後、４時間後、５時間後、および６時間後に試験した。結果を図６Ｂ−６Ｃに示す。
【０１１９】
対応のないＴ検定を、基準測定からのナロキソン後測定の有意差を決定するのに使用した。インビボおよびインビトロの両方のＰＫＣインヒビター研究のための処置群の間の有意差を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次に事後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ分析により、決定した。０．０５未満のＰ値は、有意であるとみなした。全ての統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０２型を使用して行った。
【０１２０】
（実施例３）
（インビトロのアルコール離脱超応答性（ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）
に対するγＰＫＣペプチドの効果）
生後７〜１０日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをハロタンで麻酔し、断頭し、そして脊髄を素早く取り除いた。３５０ｍｍ厚さのスライスを、腰椎領域から分離した。全細胞の電圧クランプの記録を、赤外線ビデオ顕微鏡、６０×水浸レンズ、およびＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ａパッチクランプ増幅器を使用して、視覚的に同定された運動ニューロンより記録した。細胞を、ビククリンメチオジド（１０ｍＭ）、ストリキニン（５ｍＭ）、およびテトロドキシン（０．５ｍＭ）を含有する人工の脳髄流体（ＡＣＳＦ）中で、−６０ｍＶの維持電圧を維持した。図７Ａに示すように、シナプス後部の電流を、記録細胞の付近に配置したピペットのからの２ｍＭのＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）の、１〜２分間の間隔での直接的な圧力適用により誘発した。１００ｍＭのエタノール（ＥｔＯＨ）の適用中および適用後の誘発電流の面積を、測定し、そして１０分間の前ＥｔＯＨ適用の間の平均した基準の電流面積に対して正規化した。データを、平均＋／−ＳＥＭとして表す。統計学的有意差を、一次元配置ＡＮＯＶＡ、次に０．０５未満のｐに設定した有意さのＤｕｎｎ多重比較試験またはＴｕｋｅｙ多重比較試験により決定した。
【０１２１】
蛍光免疫細胞化学の研究を、コントロールスライス由来の脊髄部分（３０ｍｍ）（ＡＣＳＦで７０分間灌流）、およびＥｔＯＨ処理スライス由来の脊髄部分（ＡＣＳＦで３０分間灌流、次いで１００ｍＭ  ＥｔＯＨで２０分間灌流してＡＣＳＦで２０分間洗浄）で実施した。この部分をウサギ抗ＰＫＣｇポリクローナル抗体（１：５００）で一晩４℃にてインキュベートした。いくつかの脊髄部において、マウス抗ニューロン核モノクローナル抗体（ＮｅｕＮ、１：７５０）を添加してニューロンを同定した。ＡＣＳＦで複数回洗浄した後、この部分を、蛍光標識化２次抗体（１：５００）で２時間室温にて標識した。２重免疫蛍光を、レーザー共焦点顕微鏡で評価した。
【０１２２】
結果を図７〜１１に示す。
【０１２３】
（実施例４）
（インビボのアルコール離脱誘導異痛に対する痛覚過敏におけるγＰＫＣペプチドおよびεＰＫＣペプチドの効果）
（１．動物）
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，ＭＡ）を、巣で飼育し、餌および水に自由に接触させて１２／１２時間の点灯／消灯サイクルにさらした。他に規定されない限り、実験を、７日齢の雄および雌の幼体（１４〜１７ｇ）または２１日齢の雄の動物（４５〜５５ｇ）で実施した。７日齢の幼体を、機械試験および熱試験の両方のために、オーバーヘッド加熱ランプで巣の温度に維持した。
【０１２４】
７日齢ラットの幼体に、１ｇ／ｋｇまたは４ｇ／ｋｇの１５％ＥｔＯＨまたは生理食塩水の単回用量を腹腔内（ｉ．ｐ．）注入した。２１日齢ラットの幼体に、０．５ｇ／ｋｇまたは４ｇ／ｋｇの１５％ＥｔＯＨまたは生理食塩水をｉ．ｐ．注入した。
【０１２５】
（２．異痛試験および痛覚過敏試験）
機械異痛試験を以下のとおりに実施した。非拘束条件下で、各ラットを、１ｍｍ空きの網を備えた高架のアルミニウム遮蔽表面のプレキシグラスケージ中に単独で入れた。２１日齢動物を、この環境および実験者に事前に慣らした。７日齢および２１日齢の幼体を、それぞれ、０．０４ｇ〜１．４ｇまたは０．１６ｇ〜６ｇのＶｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）を用いて、後ろ足を３つの接触刺激にさらした。疼痛についての閾値を、全ての３つの刺激の際に、上記（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｍら，ＰＡＩＮ  ＭＡＮＡＧＥＭＥＮＴ  ＩＮ  ＩＮＦＡＮＴＳ，ＣＨＩＬＤＲＥＮ  ＡＮＤ  ＡＤＯＬＥＳＣＥＮＴＳ；Ｓｃｈｅｔｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｙａｓｔｅｒ編、１１〜３２ページ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ）（１９９３））のとおりに、足の持ち上げを規定した。７日齢の幼体における基準試験をＥｔＯＨ処理前に実行し、続いて注入後６時間まで１時間毎、そして８時間、１０時間、１２時間および２４時間に測定した。２１日齢の幼体の基準試験を、上のとおりに実行し、エタノール注入後８時間まで２時間毎、そして２４時間、４８時間および７２時間に測定した。異痛を、生理食塩水コントロールの応答を誘発するのに必要とされる閾値力以下の閾値力として規定した。
【０１２６】
熱痛覚過敏試験を以下のとおりに実施した。熱足引っ込め潜伏を、Ｕｇｏ  Ｂａｓｌｅ  Ｐｌａｎｔａｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ，ＷｏｏｄＤａｌｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を使用して計測した。主に、産後７日または２１日のラットを、反転したプレキシグラスの囲いに入れ、その後ろ足の足底表面を、ランプの赤外線強度を３０または４０に設定して、それぞれ下から加熱した。３つの基準の熱応答性潜伏の計測を、組織損傷を防ぐために取り付けられた２０秒のカットオフを使用して、ＥｔＯＨ投与前に収集した。ＥｔＯＨ投与後、１０分間で分離した２つの記録を、各幼体について８時間まで２時間毎、次いで２４時間に採取した。記録した足の離脱潜伏を、個々の計測の平均で表す。
【０１２７】
結果を、図１２Ａ−１２Ｂおよび図１３Ａ−図１３Ｂに示す。
【０１２８】
離脱誘導機械異痛および熱痛覚過敏におけるεＰＫＣおよびγＰＫＣの関与を決定するために、７日齢および２１日齢のラットに、インヒビターペプチドを５時間後（７日齢の幼体）または４時間後（２１日齢の幼体）投与し、次に、４ｇ／ｋｇの１５％  ＥｔＯＨまたは生理食塩水の単回用量を投与した（ｉ．ｐ．）。熱試験について、７日齢の幼体は、ＥｔＯＨ投与後４時間でインヒビターペプチドを受容した。ペプチド薬物のくも膜下送達は、Ｔａｔタンパク質キャリア（配列番号３）に結合した２０μＭのＰＫＣε（εＶ１−２；配列番号１）インヒビターペプチドまたはＰＫＣγ（γＶ５−３；配列番号２）インヒビターペプチドの５μＬ（７日齢の幼体）または１０μＬ（２１日齢の幼体）のハロタン麻酔で、腰椎穿刺を直接介した。ＰＫＣアイソザイム特異的インヒビターを、痛覚過敏／異痛の開始についての所定時間の１時間前に投与した。機械異痛試験および熱痛覚過敏試験を、試験者にペプチド薬物処置がわからないようにして、上記のとおりに実行した。結果を図１５Ａ〜１５Ｄおよび１６Ａ〜１６Ｂに示す。
【０１２９】
（３．血液および脊髄のエタノールレベルの決定）
７日齢および２１日例ラットの幼体に、上記の急性の手順に従って、４ｇ／ｋｇの１５％  ＥｔＯＨを投与した（ｉ．ｐ．）。動物を、注入後の異なる時間に深く麻酔し、血液を、直接の心臓突刺を介してヘパリン含有シリンジに収集した。脊髄および血液を除去し、分析までマイクロヒュージチューブ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  ｔｕｂｅ）に−８０℃で保存した。分析時に、組織を、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）組織ホモジナイザーを使用して組織１ｍｇあたり１μＬの６．２５％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で５秒間ホモジナイズした。全血液のアリコート（１００μＬ）を、９００μＬのＴＣＡに添加し、ボルテックスした。組織および血液サンプルを１０，０００ｒｐｍで５分間室温にて遠心分離し、ＥｔＯＨ容量を、製造者の指示に従って９６ウェルの形式に対応する比色アッセイ（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を使用して決定した。
【０１３０】
（４．免疫組織化学）
４ｇ／ｋｇの１５％ＥｔＯＨまたは生理食塩水の単回用量を投与された（ｉ．ｐ．）動物を、ハロタンで深く麻酔し、経心臓的灌流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）（リン酸緩衝生理食塩水洗浄、次にＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド洗浄、ｐＨ７．４）により注入後２、４または６時間で安楽死させた。灌流後、腰椎脊髄およびＬ４／Ｌ５脊髄神経節（ＤＲＧ）を単離し、４％ホルムアルデヒド溶液で３時間固定化後、３０％スクロース／ＰＢＳ中で４℃にて凍結保護した。切断部を、ＯＣＴ包埋媒体中で凍結して、コルクブロック上にのせ、分析まで−８０℃で保存した。脊髄部分について、遊離浮遊の免疫組織化学を、３０μｍのＬ４〜Ｌ５脊髄部について実施した。脊髄神経節を、低温槽中で１０μｍに切断し、スライドガラス上に置いた。スライドガラスを、一晩３２℃で加熱した。免疫組織化学を、上記（Ｓｗｅｉｔｚｅｒら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，８２９（１−２）：２０９−２２１（１９９９））のとおりにアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）を使用して、実行した。γＰＫＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚより１：５００）、またはεＰＫＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚより１：１０００）に対して、ウサギポリクローナル抗体を使用した。免疫組織化学を、実験条件を隠して評点付けした。
【０１３１】
脊髄組織およびＤＲＧの両方について、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、デンシトメトリーを、３体の個々の動物の各々に由来する少なくとも３つの部分に実施した。
【０１３２】
（５．統計学）
処置群と生理食塩水コントロールとの間の有意差を、一元配置分散分析により実行した。群の平均値を、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓの多重比較試験（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）により比較した。処置群と基準との間の有意差を、ノンパラメトリックｔ検定を使用して試験した。全ての統計値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ、３．０型（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して試験した。
【０１３３】
本発明は、特定の実施形態に関し記載するが、種々の変更および改変が、本発明から逸脱れることなくなされ得ることは、当業者に対し、明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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