(57)【要約】【課題】ハロタンなどの各種薬物による肝障害誘導のメカニズムを明らかにする。【解決手段】ハロタン誘導性肝障害の発症にはＴｈ１とＴｈ２のバランスの変動およびＩＬ−１７を介したＭＩＰ−２の誘導による好中球の肝臓への浸潤が関与しており、これらの変動はＰＧＥ１の投与によって抑制されることを明らかにした。【選択図】図２０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロスタグランジンＥを含む、哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項２】
前記プロスタグランジンＥが、プロスタグランジンＥ１である、
請求項１記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項３】
前記薬物誘導性の肝障害が、アレルギー性肝障害である、
請求項１または２記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項４】
前記薬物誘導性肝障害が、好中球浸潤性肝障害である、
請求項１または２記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項５】
前記肝障害が、ハロタンによって誘導される肝障害である、
請求項１乃至４いずれかに記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項６】
前記肝障害が、インターロイキン１７によって誘導される肝障害である、
請求項１乃至４いずれかに記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項７】
前記肝障害が、ＣＸＣケモカインによって誘導される肝障害である、
請求項１乃至４いずれかに記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項８】
前記ＣＸＣケモカインが、ＭＩＰ−２である、
請求項７記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項９】
プロスタグランジンＥを含む、インターロイキン１７発現抑制剤。
【請求項１０】
抗インターロイキン１７抗体を含む、哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項１１】
前記抗インターロイキン１７抗体が、モノクローナル抗体である、
請求項１０記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項１２】
前記肝障害が、アレルギー性肝障害である、
請求項１０または１１記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項１３】
前記肝障害が、好中球浸潤性肝障害である、
請求項１０または１１記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項１４】
前記肝障害が、ハロタンによって誘導される肝障害である、
請求項１０乃至１３いずれかに記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項１５】
前記肝障害が、インターロイキン１７によって誘導される肝障害である、
請求項１０乃至１４いずれかに記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項１６】
前記肝障害が、ＣＸＣケモカインによって誘導される肝障害である、
請求項１０乃至１４いずれかに記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項１７】
前記ＣＸＣケモカインが、ＭＩＰ−２である、
請求項１６記載の薬物誘導性肝障害の抑制薬。
【請求項１８】
医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測をする方法であって、
前記候補化合物を、哺乳動物に投与する工程と、
前記哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定する工程と、
を含む、予測方法。
【請求項１９】
医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測をする方法であって、
前記候補化合物を、哺乳動物に投与する工程と、
前記哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定する工程と、
を含む、予測方法。
【請求項２０】
アレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニング方法であって、
前記アレルギー性薬物誘導性肝障害を誘導するアレルギー性薬物を、哺乳動物に投与する工程と、
前記候補化合物を、前記哺乳動物に投与する工程と、
前記哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定する工程と、
を含む、スクリーニング方法。
【請求項２１】
アレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニング方法であって、
前記アレルギー性薬物誘導性肝障害を誘導するアレルギー性薬物を、哺乳動物に投与する工程と、
前記候補化合物を、前記哺乳動物に投与する工程と、
前記哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定する工程と、
を含む、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬、インターロイキン１７発現抑制剤、ＣＸＣケモカイン発現抑制剤、医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測をする方法、およびアレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の開発における前臨床試験は実験動物を用いて候補化合物のヒトにおける有効性、安全性を予測することで、臨床試験の安全性の確保や上市できない可能性の高い化合物の開発を早期に中止するために不可欠なものとなっている。しかし新規候補化合物の９０％以上は早期臨床試験における副作用のために開発中止になるといわれており（非特許文献１）、財務上の大きな負荷を製薬企業に与え、医薬品の開発により長い期間を要する原因となっている。
【０００３】
医薬品の副作用は服用した患者の転帰に関わる重大な健康上の問題である。副作用には様々なものがあり、全ての臓器が影響を受け得るが肝臓における副作用は医薬品の販売が中止となる主要な原因となっており、６００以上の医薬品が肝障害と関連があるといわれている。しかし種差や個体差の問題がヒトにおける薬物誘導性肝障害の発症を予測することを困難にしており、また発症機序も断片的に明らかになっているにすぎない。薬物誘導性肝障害の病態は他の肝疾患とも類似性があり、肝毒性発症メカニズムに関して研究することは薬の安全性の確保に貢献するだけでなく、様々な肝疾患に対して新規の薬物治療戦略を提供し得ると考えられる（非特許文献２）。
【０００４】
肝臓は糖新生、胆汁の分泌など様々な働きを持つ臓器であるが、脂溶性の高い生体外異物を、より素早く排泄可能な水溶性の高い誘導体へと変換する異物代謝も肝臓が担っている重要な役割のひとつである。肝臓に流入する血液の約８０％は消化管で吸収した栄養分を含む門脈血であり、肝臓は生体内において最も高濃度の異物に曝される臓器のひとつであるといえる。肝臓は高い薬物代謝酵素活性を有しており、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）は薬物を含む様々な生体外異物の代謝を担う主要な酵素として知られている（非特許文献２）。
【０００５】
薬物代謝酵素の主要な役割は本来その解毒作用にあるが、代謝物が高い反応性を獲得し、生体高分子と共有結合を形成することで副作用を発現する場合がある。代謝反応によって生じたこのような活性代謝物は非常に不安定で半減期が短いため、血漿からはほとんどの場合検出することができない。そのため製薬企業においては還元型グルタチオン等を用い、化合物の生体内における代謝的活性化によって生じる付加体形成についての試験が行われている。しかし肝臓において代謝的活性化を受けるが肝障害を起こさない化合物も数多く存在している。その原因のひとつとしても生体内に存在するグルタチオンによる抱合反応が重要であると考えられており、その最も典型的な例として常用量のアセトアミノフェンの投与が挙げられる。さらにアセトアミノフェンの位置異性体は肝障害を起こさないことが報告されており（非特許文献３）、活性代謝物と生体内高分子の共有結合が必ずしも肝障害を引き起こすとは限らず、このことはヒトにおける肝障害の予測をより困難にしている。
【０００６】
厚生労働省は現在、薬物誘導性肝障害を中毒性と特異体質性に分類しており、前者は薬物自体またはその代謝物が肝障害性を持ち、用量依存的な肝障害が全てのヒトに発生するものを指しており、これは実験動物においても再現可能である。一部の抗がん剤、アセトアミノフェンなどの医薬品のほか臨床では用いられないパラコート、四塩化炭素、キノコ毒などが中毒性肝障害の起因物質として知られている。一方、後者の特異体質性肝障害は実験動物において再現できず、また個体差が存在するため予測不可能であり、大部分の症例はこちらに分類される。これは現在さらに、代謝性特異体質によるものとアレルギー性特異体質によるものに分類されている。代謝性特異体質は薬物代謝関連酵素の遺伝的素因などの個人差に起因しており、発症の予測が困難な場合が多いが、代謝関連遺伝子異常などについて調査することで予測可能になりつつある。一方のアレルギー性特異体質による肝障害は薬物、またはその反応性中間代謝物がハプテンとなり、肝細胞の種々の構成成分と結合して免疫原性を獲得することによって生じるアレルギー反応に起因している。非常に多くの薬物がアレルギー性特異体質性肝障害に分類されるが、肝細胞内の物質が免疫原性を獲得して肝細胞障害が生じるメカニズムについては十分に解明されていない。
【０００７】
このようなアレルギー性特異体質による肝障害には各種サイトカインを介した肝組織内の炎症および免疫反応が関与しているといわれている（非特許文献４）。肝内にはＴ細胞やマクロファージなどの浸潤細胞、クッパー細胞や類洞内皮細胞などの肝非実質細胞および肝実質細胞が存在しており、サイトカインを介した細胞間のネットワークを形成している。Ｔ細胞は細胞表面に発現しているＣＤ抗原によりさらに細かく分類されておりＣＤ４＋ＣＤ８−のＴ細胞はヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞と呼ばれている。Ｔｈ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（Ｔｈｐ）はサイトカインの産生特性がそれぞれ異なる１型（Ｔｈ１）および２型（Ｔｈ２）へと分化することが知られており（非特許文献５）、様々な因子が分化に関与している（非特許文献６）。Ｔｈ１細胞は主にＩＬ−２とＩＦＮγを分泌し、他のＴ細胞やマクロファージを活性化することで細胞性免疫を誘導するといわれている。一方Ｔｈ２細胞は、Ｂリンパ球による抗体産生や好酸球の増殖、分化を促進するサイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３を分泌することで体液性免疫を誘導する（非特許文献６）。またＩＦＮγはＴｈ２細胞由来のＩＬ−４の産生を、ＩＬ−４はＴｈ１細胞によるサイトカインの産生を抑制している。このようにＴｈ１細胞とＴｈ２細胞は互いに制御し合うことで生体内におけるバランスを保っているが、性ホルモン、衛生環境、食事、医薬品などによりそのバランスが変動するといわれており、様々な疾患の発症との関連が示唆されている（非特許文献７）。Ｔｈ２に対しＴｈ１が過剰になることは関節リウマチ、多発性硬化症およびＩ型糖尿病の、Ｔｈ１に対しＴｈ２が過剰になることはアレルギー、喘息、湿疹、花粉症および蕁麻疹のリスクファクターになると考えられている（非特許文献７）。
【０００８】
図１は、従来想定されていたマウスにおけるＴｈ細胞の分化およびサイトカイン分泌のメカニズムの概要を説明するための概念図である。前臨床試験において用いられるマウスやラットなどのげっ歯類には免疫学的なバックグラウンドの異なる様々な系統が存在することが知られている。最も一般的に動物実験に用いられるマウスであるＣ５７ＢＬ／６マウスとＢＡＬＢ／ｃマウスとではリーシュマニア原虫に対する抵抗性に系統差が存在し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは感染によってＴｈ１反応を誘導し抵抗性を示すのに対し、ＢＡＬＢ／ｃマウスはＴｈ２反応が誘導されるため抵抗性を持たないことが古くから知られている（非特許文献８）。またＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスとでは免疫性疾患の実験動物モデルの病態が異なることが、関節リウマチ（非特許文献９）、多発性硬化症（非特許文献１０）、気管支喘息（非特許文献１１）などについて報告されている。またＣ５７ＢＬ／６マウスとＢＡＬＢ／ｃマウスとで誘導される肝障害の重篤さが異なる化合物としてアセトアミノフェン（非特許文献１２）、四塩化炭素（非特許文献１３）、ＬＰＳ（非特許文献１４）およびＣｏｎ  Ａ（非特許文献１５）などが報告されている。
【０００９】
一方、図２は、従来想定されていたハロタンの代謝経路の概要を説明するための概念図である。吸入型全身麻酔薬であるハロタンは個体特異的な肝障害を引き起こすことが知られており、軽度なものや無症候性のものも含めると２０％以上の患者において血清中のトランスアミナーゼの上昇が起こること（非特許文献１６）、およそ１０，０００人に１人の割合で劇症肝炎が起こることが知られている（非特許文献１７）。このようなハロタンによる肝障害はモルモットや特殊な条件下の実験動物を除き再現することができず、ヒトとの間に大きな種差が存在している（非特許文献１８）。生体内に取り込まれたハロタンは肝臓の第Ｉ相酵素によって代謝を受けることが知られており、主にＣＹＰの２Ｅ１分子種が触媒するといわれている（非特許文献１９）。ＣＹＰ２Ｅ１によってハロタンが代謝を受けると反応性中間体であるトリフルオロアセチルラジカルを生じ、生体の高分子と共有結合し、トリフルオロアセチル化タンパク質を生成する（非特許文献２０）。
【００１０】
ハロタンによって肝障害を生じた患者の血清からは抗ＴＦＡ抗体、抗組織抗体、抗ＣＹＰ２Ｅ１抗体が検出されること（非特許文献２）、曝露する回数を重ねるほど発症しやすいこと（非特許文献２１）が知られている。ハロタンによってリジン残基を修飾されたタンパク質がクッパー細胞に取り込まれ（非特許文献２２）、免疫細胞に抗原として提示されることでアレルギー反応による肝細胞の壊死が起こり肝障害が誘導されると考えられている。
【００１１】
ハロタンによる肝障害について行われた最近の研究によって、マウスの系統や雌雄の違いによって肝障害の程度が異なることが明らかとなっており（非特許文献２３）、ヒトにおいても男性に比べ女性においてハロタンによる肝障害の発症例が多いことが報告されている（非特許文献２４）。またトリフルオロアセチル化されたタンパク質はハロタンを曝露した様々な実験動物において検出されるが肝障害を起こす種は限られており、付加体の生成以降に存在する何らかのメカニズムの違いがこのような系統差の原因として重要であることが示唆されている（非特許文献２５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８
【非特許文献２】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５ａ
【非特許文献３】Ｔｉｒｍｅｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ，  １９８９
【非特許文献４】Ｓｏｂｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１
【非特許文献５】Ｍｏｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６
【非特許文献６】Ａｇｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３
【非特許文献７】Ｋｉｄｄ  Ｐ，  ２００３
【非特許文献８】Ｈｅｉｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９
【非特許文献９】Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｄａｈｌ，  ２００６
【非特許文献１０】Ｋｉｇｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献１１】Ｆｕｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７
【非特許文献１２】Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８
【非特許文献１３】Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７
【非特許文献１４】Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６
【非特許文献１５】Ｍｉｚｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８
【非特許文献１６】Ｓｐｒａｃｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７
【非特許文献１７】Ｍｏｕｌｔ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｌｏｃｋ，  １９７５
【非特許文献１８】Ｕｅｔｒｅｃｈｔ，  ２００７
【非特許文献１９】Ｓｐｒａｃｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７
【非特許文献２０】Ｋｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２
【非特許文献２１】Ｈｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２
【非特許文献２２】Ｆｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７
【非特許文献２３】Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献２４】Ｃｏｕｓｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９
【非特許文献２５】Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
第一に、上記文献記載の従来技術では、ハロタンなどの各種薬物による肝障害誘導のメカニズムは未だ明らかになっていない。そのため、そのメカニズムに基づいて医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測をする方法を組み立てることが困難であった。また、同様の理由により、アレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニング方法を組み立てることも困難であった。
【００１４】
第二に、上記文献記載の従来技術では、ハロタンなどの各種薬物によって誘導される肝障害を抑制する方法が未だ確立されていない。そのため、ハロタンなどの各種薬物によって誘導される肝障害によって多くの患者の生命・健康が未だに脅かされている。また、同様の理由により、医療現場で有用なハロタンなどの各種薬物が、副作用を危惧するあまり医療現場で十分に活用されていない。
【００１５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ハロタンなどの各種薬物による肝障害誘導のメカニズムを明らかにすることを目的とする。また、本発明の別の目的は、そのメカニズムに基づいて医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測をする方法を組み立てることである。さらに、本発明の他の目的は、そのメカニズムに基づいてアレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニング方法を組み立てることである。そして、本発明のもう一つの目的は、それらのスクリーニング方法を用いて、哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬となり得る物質を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明によれば、プロスタグランジンＥを含む、哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬が提供される。
【００１７】
この組成によれば、後述する実施例で哺乳動物の薬物誘導性肝障害を抑制することが実証されているプロスタグランジンＥを含むため、薬全体としても哺乳動物の薬物誘導性肝障害を抑制する効果が得られる。
【００１８】
また、本発明によれば、プロスタグランジンＥを含む、インターロイキン１７発現抑制剤が提供される。
【００１９】
この組成によれば、後述する実施例でインターロイキン１７の発現を抑制することが実証されているプロスタグランジンＥを含むため、剤全体としてもインターロイキン１７の発現を抑制する効果が得られる。
【００２０】
また、本発明によれば、抗インターロイキン１７抗体を含む、哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬が提供される。
【００２１】
この組成によれば、後述する実施例で哺乳動物の薬物誘導性肝障害を抑制することが実証されている抗インターロイキン１７抗体を含むため、薬全体としても哺乳動物の薬物誘導性肝障害を抑制する効果が得られる。
【００２２】
さらに、本発明によれば、医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測をする方法であって、その候補化合物を、哺乳動物に投与する工程と、その哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定する工程と、を含む、予測方法が提供される。
【００２３】
この方法によれば、後述する実施例で哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現がアレルギー性の肝障害を誘導することが実証されているため、哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定することによって、医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測を行うことができる。
【００２４】
また、本発明によれば、医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測をする方法であって、その候補化合物を、哺乳動物に投与する工程と、その哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定する工程と、を含む、スクリーニング方法が提供される。
【００２５】
この方法によれば、後述する実施例で哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現がアレルギー性の肝障害を誘導することが実証されているため、哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定することによって、医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測を行うことができる。
【００２６】
また、本発明によれば、アレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニング方法であって、そのアレルギー性薬物誘導性肝障害を誘導するアレルギー性薬物を、哺乳動物に投与する工程と、その候補化合物を、その哺乳動物に投与する工程と、その哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定する工程と、を含む、スクリーニング方法が提供される。
【００２７】
この方法によれば、後述する実施例で哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現がアレルギー性の肝障害を誘導することが実証されているため、哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定することによって、アレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニングを行うことができる。
【００２８】
また、本発明によれば、アレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニング方法であって、アレルギー性薬物誘導性肝障害を誘導するアレルギー性薬物を、哺乳動物に投与する工程と、候補化合物を、哺乳動物に投与する工程と、哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定する工程と、を含む、スクリーニング方法が提供される。
【００２９】
この方法によれば、後述する実施例で哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現がアレルギー性の肝障害を誘導することが実証されているため、哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定することによって、アレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニングを行うことができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、ハロタンなどの各種薬物による肝障害誘導のメカニズムを明らかにしたことによって、そのメカニズムに基づいて医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測をする方法を組み立てることができる。さらに、同様の理由により、そのメカニズムに基づいてアレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニング方法を組み立てることができる。そして、同様の理由により、それらのスクリーニング方法を用いて、哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬となり得る物質を見出すことに成功している。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、従来想定されていたマウスにおけるＴｈ細胞の分化およびサイトカイン分泌のメカニズムの概要を説明するための概念図である。
【図２】図２は、従来想定されていたハロタンの代謝経路の概要を説明するための概念図である。
【図３】図３は、本発明で明らかになった哺乳動物におけるＴｈ細胞制御および炎症のメカニズムの概要を説明するための概念図である。
【図４】図４は、実施例１でＢＡＬＢ／ｃマウスに対しハロタンを１００、３００または６００μｍｏｌ／ｍｏｕｓｅで単回腹腔内投与し、２４時間の血漿試料中のＡＬＴの平均値に標準偏差を付した結果を示したグラフである。
【図５】図５は、実施例１でＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスのハロタン投与群について３、６、１２および２４時間の血漿試料中のＡＳＴおよびＡＬＴの平均値に標準偏差を付した結果を示したグラフである。
【図６】図６は、実施例１で行ったＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるハロタン投与による肝障害の程度と好中球の肝臓への浸潤について検討するため、Ｈ＆Ｅ染色および抗ＭＰＯ抗体を用いた免疫染色による肝組織像の評価を行った結果を示す写真である。
【図７】図７は、実施例１でハロタンの投与後３、６、１２および２４時間のマウス血漿中のＩＦＮγおよびＩＬ−４タンパク質量の変動をＥＬＩＳＡを用いて検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスについて各時間において得られた血漿３匹分を等量ずつ混合し、検討に用いた結果を示したグラフである。
【図８】図８は、実施例１でハロタン投与後３、６、１２および２４時間のマウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの発現変動を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した際に、各サンプルについてＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−２、β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの量を測定し、Ｔ−ｂｅｔ量にはＧＡＴＡ−３量を、ＩＦＮγ量にはＩＬ−１０量を、ＴＮＦαおよびＭＩＰ−２量にはβ−ａｃｔｉｎ量を補正に用いて対照群に対するＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３比、ＩＦＮγ／ＩＬ−１０比の平均値に標準偏差を付した結果を示したグラフである。
【図９】図９は、実施例１でハロタン投与後３、６、１２および２４時間のマウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの発現変動を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した際に、各サンプルについてＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−２、β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの量を測定し、Ｔ−ｂｅｔ量にはＧＡＴＡ−３量を、ＩＦＮγ量にはＩＬ−１０量を、ＴＮＦαおよびＭＩＰ−２量にはβ−ａｃｔｉｎ量を補正に用いて対照群に対するＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎ比およびＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎ比の平均値に標準偏差を付した結果を示したグラフである。
【図１０】図１０は、実施例２でＣ５７ＢＬ／６マウスにオリーブ油またはハロタンを投与し、投与から２４時間後に採取した脾臓細胞をＣｏｎ  Ａの最終濃度を１、３または５  μｇ／ｍＬとして培養した際の、培養から２４時間後に回収した上清中のＩＦＮγ濃度およびＩＬ−４濃度を示したグラフである。
【図１１】図１１は、実施例２でＣ５７ＢＬ／６マウスにオリーブ油またはハロタンを投与し、投与から２４時間後に採取した脾臓細胞をＣｏｎ  Ａの最終濃度を５  μｇ／ｍＬとして培養した際の、培養から２４、４８、７２および９６時間後に回収した上清中のＩＦＮγ濃度およびＩＬ−４濃度を示したグラフである。
【図１２】図１２は、実施例２でＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにオリーブ油またはハロタンを投与し、投与から２４時間後に採取した脾臓細胞をＣｏｎ  Ａの最終濃度を５  μｇ／ｍＬとして培養した際の、培養から２４時間後に回収した上清中のＩＦＮγ濃度およびＩＬ−４濃度の平均値に標準偏差を付した結果を示したグラフである。
【図１３】実施例３でＢＡＬＢ／ｃマウスのハロタンおよびＰＧＥ１投与後の血漿試料中のＡＳＴおよびＡＬＴの平均値に標準偏差を付した結果を示したグラフである。
【図１４】実施例３でハロタン投与後２４時間のマウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの発現変動を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した際に、各サンプルについてＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−２およびβ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの量を測定し、Ｔ−ｂｅｔ量にはＧＡＴＡ−３量を、ＩＦＮγ量にはＩＬ−１０量を、ＴＮＦαおよびＭＩＰ−２量にはβ−ａｃｔｉｎ量を補正に用いて対照群に対するＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３比、ＩＦＮγ／ＩＬ−１０比の平均値に標準偏差を付した結果を示したグラフである。
【図１５】実施例３でハロタン投与後２４時間のマウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの発現変動を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した際に、各サンプルについてＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−２およびβ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの量を測定し、Ｔ−ｂｅｔ量にはＧＡＴＡ−３量を、ＩＦＮγ量にはＩＬ−１０量を、ＴＮＦαおよびＭＩＰ−２量にはβ−ａｃｔｉｎ量を補正に用いて対照群に対するＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎ比およびＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎ比の平均値に標準偏差を付した結果を示したグラフである。
【図１６】実施例４でハロタンの投与後２４時間のマウス血漿中のＩＬ−１７タンパク質量の変動をＥＬＩＳＡを用いて検討した。血漿中ＩＬ−１７濃度の平均値に標準偏差を付した結果を示したグラフである。
【図１７】実施例４でＢＡＬＢ／ｃマウスのハロタンおよび抗ＩＬ−１７抗体投与後の血漿試料中のＡＳＴおよびＡＬＴの平均値に標準偏差を付した結果を以下に示したグラフである。
【図１８】実施例４でハロタン投与後２４時間のマウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの発現変動を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した際に、各サンプルについてＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−２およびβ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの量を測定し、Ｔ−ｂｅｔ量にはＧＡＴＡ−３量を、ＩＦＮγ量にはＩＬ−１０量を、ＴＮＦαおよびＭＩＰ−２量にはβ−ａｃｔｉｎ量を補正に用いて対照群に対するＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３比、ＩＦＮγ／ＩＬ−１０比の平均値に標準偏差を付した結果を以下に示したグラフである。
【図１９】実施例４でハロタン投与後２４時間のマウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの発現変動を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した際に、各サンプルについてＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−２およびβ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの量を測定し、Ｔ−ｂｅｔ量にはＧＡＴＡ−３量を、ＩＦＮγ量にはＩＬ−１０量を、ＴＮＦαおよびＭＩＰ−２量にはβ−ａｃｔｉｎ量を補正に用いて対照群に対するＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎ比およびＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎ比の平均値に標準偏差を付した結果を示したグラフである。
【図２０】実施例１〜４の実験結果によって解明されたハロタンによって誘導される肝障害のメカニズムについて説明するための概念図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
＜発明の経緯＞
本発明者らは、薬物によるアレルギー性肝障害の発症には他のいくつかの免疫性の疾患と同様に、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインが関与しており、Ｔｈ１／Ｔｈ２のバランスの個人差は肝障害のリスクファクターとなるという仮説を立て、それについて検証するために、アレルギー性肝障害を起こす典型的な薬物であるハロタンを肝障害の程度と免疫学的なバックグラウンドの異なる２種類の系統のマウスに投与し、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインの産生能の変動等について評価した。
【００３３】
さらに研究を進めていくうちに、近年脚光を浴びている新たなＴｈ細胞サブセットであるＴｈ１７がハロタン誘導性肝障害に関与することを示唆する実験データが得られた。Ｔｈ１７細胞はＴｈ１やＴｈ２などのＴｈ細胞サブセットと同様にＴｈｐより分化することが知られており、その分化にはＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＴＧＦβ、ｓｔａｔ−３およびＲＯＲγｔシグナルが重要であると言われている（Ｕｓｕｉ，２００７）。またＴｈ１７によって産生されるＩＬ−１７が組織の炎症を誘導することを示した数多くの報告がなされている（Ｋｏｍｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５ｂ）。そこでＴｈ１およびＴｈ２サイトカインの産生能の変動に加えて、ハロタン誘導性肝障害とＩＬ−１７の関与についての検討も併せて行った。
【００３４】
ここで、図３は、後述する実施例１〜４の実験結果によって解明された哺乳動物におけるＴｈ細胞制御および炎症のメカニズムの概要を説明するための概念図である。また、図２０は、後述する実施例１〜４の実験結果によって解明されたハロタンによって誘導される肝障害がプロスタグランジンＥ１および抗インターロイキン１７抗体によって抑制されるメカニズムについて説明するための概念図である。この図に示すように、上述の検討の結果、本発明者らは、抗ＩＬ−１７抗体によるＩＬ−１７の中和はＭＩＰ−２の発現を抑制し、肝障害を軽減することを明らかとした。さらに、本発明者らは、ハロタン誘導性肝障害の発症にはＴｈ１とＴｈ２のバランスの変動およびＩＬ−１７を介したＭＩＰ−２の誘導による好中球の肝臓への浸潤が関与しており、これらの変動はＰＧＥ１の投与によって抑制されることを明らかにし、本発明を完成した。
【００３５】
＜用語の説明＞
本明細書および特許請求の範囲において、各種用語の意味を以下のとおり定義する。
【００３６】
（１）薬物誘導性肝障害
「薬物誘導性肝障害」とは、薬剤が原因となる肝障害をいう。薬物誘導性肝障害は、大別して、アレルギー性機序により起こるアレルギー性肝障害と、肝毒性機序により起こる中毒性肝障害に大別される。前者はアレルギー性機序であり肝障害を予知することが困難であるが、後者は用量依存性であり、肝障害を予知することが容易である。
【００３７】
つまり、「アレルギー性肝障害」とは、薬剤の代謝産物が高分子化合物と結合することで抗原性を獲得し、それに対してアレルギー反応が起きることにより生じる肝障害をいう。一般的に、アレルギー性肝障害の場合、肝細胞の変性・壊死所見は、ウイルス性肝炎などでみられるものと類似する。このとき、肝細胞変性は風船化の形態をとり、壊死により好酸体を形成する。また、変性・壊死は同一の領域で観察される。好酸体は肝細胞索から類洞内に放出され、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞に貪食されて処理され、壊死物質を貪食したＫｕｐｆｆｅｒ細胞は腫大する。さらに、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の増生はみられるが、浸潤細胞は、リンパ球が主体で、好酸球や時に好中球の浸潤もみられる。なお、門脈域に好酸球浸潤が目立つ場合は、薬物性肝障害に特徴的な所見ととらえることができるものの、頻度はそれほど高くない。薬物性肝障害の場合、炎症細胞浸潤の程度は、ウイルス性肝炎と比較しても軽度である。肉芽腫は、アレルギー性肝障害の場合にみられ、薬物に対する肝網内系の免疫応答の結果として形成される。肉芽腫にはリンパ球、組織球、好中球、好酸球などが構成成分である炎症性肉芽腫と、リンパ球、活性化マクロファージが構成成分である類上皮性肉芽腫があり、ともに、多核巨細胞を伴うことがある。他の肉芽腫形成性の病変（サルコイドーシス、結核など）との鑑別が困難な場合もある。
【００３８】
（２）プロスタグランジンＥ
「プロスタグランジン」とは、単一の物質ではなく、プロスタン酸を基本骨格とし、これに二重結合や水酸基等が加わった数多くの不飽和脂肪酸の総称を意味する。プロスタグランジンを大別すると、プロスタグランジン類、トロンボキサン類、ロイコトリエン類となる。このなかで、発熱に関係しているのが、主としてプロスタグランジンＥ１およびプロスタグランジンＥ２である。プロスタン酸、プロスタグランジンＥ１およびプロスタグランジンＥ２の化学構造式を以下に示す。
【００３９】
【化１】
2010229041.tif 000003
【００４０】
なお、「プロスタグランジンＥ」と言う場合には、プロスタグランジンＥ１およびプロスタグランジンＥ２の両方を含むものとする。
【００４１】
（３）ハロタン
「ハロタン（Ｈａｌｏｔｈａｎｅ）」とは、吸入麻酔薬の一種である。気化させやすく、導入も覚醒も速いが、副作用が強いため近年ではあまり使用されなくなっている。副作用として、心血管系の抑制作用があり、外科麻酔レベルで中程度の血圧低下を生じる。また、ハロタンの肝臓代謝が起こり、肝臓ミクロソーム酵素誘導が麻酔後にみられ、肝機能障害になることがある。さらに、心臓の刺激伝導系におけるカテコールアミンの感受性を増加させるため、不整脈発生時はカテコールアミンの併用は推奨されない。ハロタンの化学式を以下に示す。
【００４２】
【化２】
2010229041.tif 000004
【００４３】
（４）インターロイキン１７
「インターロイキン１７」は、１９９３年にマウスのＴ細胞ハイブリドーマからクローニングされ、ＣＴＬＡ−８と名付けられ、その後、１９９５年に、このタンパク質にＮＦ−ｋＢの活性化能やＩＬ−６誘導能があることが示され、新しいサイトカインとしてＩＬ−１７と命名された蛋白質である。ＩＬ−１７は分子量２０−３０ｋＤのペプチドからなるホモダイマーの糖蛋白質であり、現在、ＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａとも呼ぶ）以外に、相同性を持つ６個のファミリー分子（ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−２５（ＩＬ−１７Ｅ）、ＩＬ−１７Ｆ）からなることが知られている。ＩＬ−１７は主に活性化Ｔ細胞より産生され、繊維芽細胞や上皮細胞、血管内皮細胞、マクロファージなど種々の細胞に作用して、炎症性サイトカインやケモカイン、細胞接着因子など、種々の因子を誘導して炎症を誘導することが知られている。最近、ＩＬ−１７を産生するＴ細胞が従来知られていたＴｈ１細胞、あるいはＴｈ２細胞と呼ばれるＴ細胞サブセットではなく、新たなＴｈ１７細胞と呼ばれるサブセットから産生されることがわかり、炎症や感染防御に於けるこの細胞集団の役割が大きな注目を集めている。
【００４４】
（５）ＣＸＣケモカイン
白血球やリンパ球など細胞を組織へ遊走させるのに必要な物質をケモカインと呼び、システイン配列の違いによりＣＣ、ＣＸＣ、Ｃ、ＣＸ３Ｃの４種類に分類される。「ＣＸＣケモカイン」とは、システイン残基の間に他のアミノ酸が１つ介在する構造を有するケモカインの総称である。ＣＸＣサブファミリーの既知のケモカインには、ＭＩＰ−２、インターロイキン−８（ＩＬ−８）および成長調節タンパク質（ＧＲＯ−アルファおよびベータ）が含まれる。一方、ＣＣケモカインには、ＭＩＰ−１などが含まれる。
【００４５】
（６）ＭＩＰ−２
「ＭＩＰ−２」は、最初はリポ多糖類（ＬＰＳ）での刺激時にマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７により分泌された６ｋＤａのヘパリン結合タンパク質として同定された。ＭＩＰ−２は、ケモカインのＣ−Ｘ−Ｃ（またはＣＸＣ）サブファミリーのメンバーである。マウスＭＩＰ−２はヒト好中球に対して化学走化性であり、マウスの足の裏に注射した場合、局所的好中球浸潤を誘発する。ラットＭＩＰ−２はマウスＭＩＰ−２に対して８６％のアミノ酸相同性を示し、ラット好中球に対して化学走化性であるが、ラット肺胞マクロファージ又はヒト末梢血好酸球又はリンパ球の遊走を刺激しない。また、ラットＭＩＰ−２はラット肺胞内皮細胞の増殖を刺激するが線維芽細胞の増殖は刺激しないことが実証されている。
【００４６】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。尚、同様な内容については、繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。
【００４７】
＜実施形態１：プロスタグランジンＥによる薬物誘導性肝障害の抑制＞
本実施形態に係る哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬は、プロスタグランジンＥを含む。ここで、プロスタグランジンＥは、図２０にも示すように、インターロイキン１７の発現を抑制することを介して、哺乳動物の薬物誘導性肝障害を抑制することが後述する実施例で実証されている。したがって、本実施形態に係る哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬は、プロスタグランジンＥを含むので、薬全体としても哺乳動物の薬物誘導性肝障害を抑制する効果が得られることになる。
【００４８】
また、この現象を別の側面からみれば、本実施形態に係るインターロイキン１７発現抑制剤は、プロスタグランジンＥを含むことにもなる。すなわち、プロスタグランジンＥは、図２０にも示すように、インターロイキン１７の発現を抑制することを介して、哺乳動物の薬物誘導性肝障害を抑制することが後述する実施例で実証されている。したがって、本実施形態に係るインターロイキン１７発現抑制剤は、プロスタグランジンＥを含むので、剤全体としてもインターロイキン１７の発現を抑制する効果が得られることになる。
【００４９】
１．プロスタグランジンＥ製剤の剤形
本実施形態におけるプロスタグランジンＥは、哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬として用いることができる。本実施形態におけるプロスタグランジンＥは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、これにより、本実施形態におけるプロスタグランジンＥは製薬的に許容される担体媒体と混合される。
【００５０】
すなわち、本実施形態における哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬は、上記のプロスタグランジンＥを含み、散剤、細粒剤、顆粒、錠剤、又はカプセル剤の形態で提供される製剤である。散剤、細粒剤、顆粒、錠剤、又はカプセル剤の形態で提供される製剤とすることにより、経口投与用の薬剤としての利便性がさらに向上する。好ましい態様の一つは、賦形剤を含む固体分散体もしくは製剤、特に経口投与用の製剤である。
【００５１】
本実施形態における哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬は、経口的又は非経口的に投与可能であり、経口投与の剤型としては、散剤、細粒剤、顆粒、錠剤、錠剤、カプセル剤が好適に用いられる。また、非経口投与の剤型としては坐剤等が好適に用いられる。さらに、本実施形態における哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬を製薬学的に許容可能な溶液中に予め分散させた液剤として使用することもでき、この場合は、経口投与用のシロップ剤や非経口投与用の注射剤（用時溶解して用いる注射用凍結乾燥剤を含む）として用いることができる。また、リポソーム剤として調製することも可能である。これらの剤型の調製には、常用される着色剤、甘味剤、着香剤や、希釈剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、軟化剤、懸濁化剤、乳化剤、防腐剤、酸化防止剤、界面活性剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、及び分散剤を用いることができる。また、これらの剤型は、用いられる状況に応じて、腸溶性コーティングなどの機能性コーティングをさらに施されていてもよい。これらの各種剤型は、常法に従い調製され、無菌的に調製されてもよい。
【００５２】
２．プロスタグランジンＥ製剤の送達経路
本実施形態における哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬を哺乳類とりわけヒトに適用する場合においては、所望の送達経路に適した任意の剤形を用い、例えば、経口、皮膚、皮内、気管支内、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、腹腔内、鼻内、経膣、経直腸、舌下、頭蓋内、硬膜内または気管内のような経路により送達することができるが、好ましくは経口投与である。
【００５３】
３．プロスタグランジンＥ製剤の投与量
本実施形態における哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬の医薬的有効量は、それぞれの化合物、送達の様式、治療される症状の重篤性、および他の成分に依存して変動し得る。いくつかに分割した用量を１日当たりに送達する（例えば、１日当たり分割用量を２〜４回）こともでき、単回用量を送達することもできる。また、送達は、毎日、毎週または毎月の何れを基本としてもよい。
【００５４】
適切な投与計画は、公知の技術知識、本明細書で提供される情報および処置される個々の被検体についての経験に基づいて決定することができる。通常、本実施形態における哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬は、危険または有害な副作用を起こすことなく効果的な結果を生じ得る濃度で投与されることが好ましい。
【００５５】
一例として、経口剤として使用される場合、有効成分の投与量は、患者の症状、年齢、体重等に応じて異なるが、体重６０ｋｇの成人に対しては、一日量として１０〜５００ｍｇを２〜３回に分けて投与することができる。また、点眼剤、肺や鼻腔への吸入、炎症関節腔への注射を目的とした場合においても患者の症状に応じて異なるが、成人に対する一日量として１〜１００μｇを２〜３回に分けて投与することができる。
【００５６】
＜実施形態２：抗インターロイキン１７抗体による薬物誘導性肝障害の抑制＞
本実施形態に係る哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬は、抗インターロイキン１７抗体を含む。ここで、抗インターロイキン１７抗体は、図２０にも示すように、ＣＸＣケモカインであるＭＩＰ−２の発現を抑制することを介して、哺乳動物の薬物誘導性肝障害を抑制することが後述する実施例で実証されている。したがって、本実施形態に係る哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬は、抗インターロイキン１７抗体を含むので、薬全体としても哺乳動物の薬物誘導性肝障害を抑制する効果が得られることになる。
【００５７】
また、この現象を別の側面からみれば、本実施形態に係るＣＸＣケモカイン発現抑制剤は、抗インターロイキン１７抗体を含むことにもなる。すなわち、抗インターロイキン１７抗体は、図２０にも示すように、ＣＸＣケモカインであるＭＩＰ−２の発現を抑制することを介して、哺乳動物の薬物誘導性肝障害を抑制することが後述する実施例で実証されている。したがって、本実施形態に係るＣＸＣケモカイン発現抑制剤は、抗インターロイキン１７抗体を含むので、剤全体としてもＣＸＣケモカインであるＭＩＰ−２の発現を抑制する効果が得られることになる。
【００５８】
ここで、本実施形態における抗インターロイキン１７抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性およびヘテロ結合体抗体が含まれる。
【００５９】
１．ポリクローナル抗体
抗インターロイキン１７抗体は、ポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで産生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、インターロイキン１７ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００６０】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗インターロイキン１７抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。免疫化剤は、典型的にはインターロイキン１７ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬｓ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培養培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００６１】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現をサポートし、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１  （１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ等，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３］。
【００６２】
ついでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、インターロイキン１７に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合アッセイによって測定される。このような技術及びアッセイは、当該分野において既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００６３】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Ｇｏｄｉｎｇ，上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
【００６４】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００６５】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作製することができる。本実施形態のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に組込むことができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等，上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【００６６】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の断片、特にＦａｂ断片を生成するための抗体の消化は、当該分野において知られている定法的技術を使用して達成できる。
【００６７】
３．ヒト及びヒト化抗体
本実施形態の抗インターロイキン１７抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Ｊｏｎｅｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【００６８】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者［Ｊｏｎｅｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００６９】
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Ｃｏｌｅ等及びＢｏｅｒｎｅｒ等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる（Ｃｏｌｅ等，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ．ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ等，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化してマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Ｍａｒｋｓ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３  （１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３  ６５−９３（１９９５）に記載されている。
【００７０】
また、抗体は上述した既知の選択及び／又は突然変異誘発法を使用し、親和成熟させてもよい。好ましい親和成熟抗体は、成熟抗体が調製された（一般的にマウス、ヒト化又はヒトの）出発抗体のものよりも、５倍、より好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０又は３０倍の親和性を有する。
【００７１】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。この場合、結合特異性の一方はインターロイキン１７に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
【００７２】
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づく［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【００７３】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行われる。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【００７４】
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖が小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えられた第２の抗体分子の界面に作り出される。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００７５】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再転換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００７６】
大腸菌からＦａｂ’断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙ等，Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５  （１９９２）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【００７７】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：６０（１９９１）。
【００７８】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたインターロイキン１７ポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗インターロイキン１７ポリペプチドアームは、特定のインターロイキン１７ポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のインターロイキン１７ポリペプチドを発現する細胞に細胞障害薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はインターロイキン１７−結合アーム及び細胞障害薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。対象の他の二重特異性抗体はインターロイキン１７ポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【００７９】
５．ヘテロ結合体抗体
ヘテロ結合抗体も本発明の範囲内に入る。ヘテロ結合抗体は２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが含まれる。
【００８０】
６．抗体の製薬組成物
ここで同定されたインターロイキン１７ポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
【００８１】
インターロイキン１７ポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０，７８８９−７８９３（１９９３）参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【００８２】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は上掲のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  に開示されている。インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商品名）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−（Ｄ）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【００８３】
７．抗体医薬の剤形
本実施形態における抗インターロイキン１７抗体は、哺乳動物の薬物誘導性肝障害の抑制薬として用いてもよい。本実施形態における抗インターロイキン１７抗体は、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、これにより、本実施形態における抗インターロイキン１７抗体は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．  Ｅｄ．，［１９８０］）、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（残基数１０個未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤、マンニトール又はソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００８４】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。ここで、本実施形態の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
【００８５】
本実施形態の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｙａｃｏｂｉら編，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−９６のＭｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．及びＣｈａｐｐｅｌｌ，  Ｗ．「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」に記載された原理に従って実施できる。
【００８６】
抗インターロイキン１７抗体のインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
【００８７】
抗インターロイキン１７抗体の投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でインターロイキン１７ポリペプチドの持続放出が望まれる場合、インターロイキン１７ポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン−２、及びＭＮ  ｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，２：７９５−７９９（１９９６）；Ｙａｓｕｄａ，Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｔｈｅｒ．，２７：１２２１−１２２３（１９９３）；Ｈｏｒａら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７５５−７５８  （１９９０）；Ｃｌｅｌａｎｄ，「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｐｏｗｅｌｌ及びＮｅｗｍａｎ編，（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５），ｐ．４３９−４６２；国際公開９７／０３６９２，国際公開９６／４００７２，国際公開９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【００８８】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Ｌｅｗｉｓ，「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ」：Ｍ．  Ｃｈａｓｉｎ及びＲ．  Ｌａｎｇｅｒ（編），Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０），ｐｐ．１−４１。
【００８９】
＜実施形態３：ＩＬ−１７発現量により副作用の予測をする方法＞
本実施形態に係る医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測をする方法は、候補化合物を、哺乳動物に投与する工程と、その哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定する工程と、を含む、予測方法である。
【００９０】
この方法によれば、後述する実施例で哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現がアレルギー性の肝障害を誘導することが実証されているため、哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定することによって、医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測を行うことができる。
【００９１】
ここで、この予測方法で用いる哺乳動物としては、特に限定するものではなく、倫理的な観点からヒト個体を除く、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ウマ、ウシなどの任意の哺乳動物を用いることができる。これらの中でも、特に好ましいのは、入手および取り扱いが容易であり、後述する実施例で示すように、この予測方法で実際に用いることができることが実証されているマウスである。また、マウスにも色々な系統があるが、特に好ましいのは、後述する実施例で示すように、ハロタンを投与することによってアレルギー性の肝障害を起こすことが実証されているＢＡＬＢ／ｃマウスである。
【００９２】
ここで、医薬品の候補化合物を、哺乳動物に投与する工程においては、投与の仕方は特に限定するものではないが、実際の治療において予想される投与形態・投与量などに対応した形で投与することが好ましい。例えば、実際の治療において予想される投与形態・投与量などに対応した形で、経口、皮膚、皮内、気管支内、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、腹腔内、鼻内、経膣、経直腸、舌下、頭蓋内、硬膜内または気管内のような経路により投与することができるが、最も好ましくは、低分子化合物医薬の場合に一般的な投与形態であり実験が容易な投与形態でもある経口投与である。
【００９３】
また、哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定する工程においては、測定の仕方は特に限定するものではないが、例えば、インターロイキン１７のｍＲＮＡの発現量、インターロイキン１７の蛋白質の発現量などを公知の測定方法によって測定することができる。できるだけ測定の手間を省きたい場合には、より簡便な測定方法であるｍＲＮＡの発現量の測定を行えばよい。一方、できるだけ正確に測定したい場合には、インターロイキン１７の蛋白質の発現量を測定すればよい。
【００９４】
＜実施形態４：ＣＸＣケモカイン発現量により副作用の予測をする方法＞
本実施形態に係る医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測をする方法は、候補化合物を、哺乳動物に投与する工程と、その哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定する工程と、を含む、予測方法である。
【００９５】
この方法によれば、後述する実施例で哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現がアレルギー性の肝障害を誘導することが実証されているため、哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定することによって、医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測を行うことができる。
【００９６】
ここで、この予測方法で用いる哺乳動物としては、特に限定するものではなく、倫理的な観点からヒト個体を除く、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ウマ、ウシなどの任意の哺乳動物を用いることができる。これらの中でも、特に好ましいのは、入手および取り扱いが容易であり、後述する実施例で示すように、この予測方法で実際に用いることができることが実証されているマウスである。また、マウスにも色々な系統があるが、特に好ましいのは、後述する実施例で示すように、ハロタンを投与することによってアレルギー性の肝障害を起こすことが実証されているＢＡＬＢ／ｃマウスである。
【００９７】
ここで、医薬品の候補化合物を、哺乳動物に投与する工程においては、投与の仕方は特に限定するものではないが、実際の治療において予想される投与形態・投与量などに対応した形で投与することが好ましい。例えば、実際の治療において予想される投与形態・投与量などに対応した形で、経口、皮膚、皮内、気管支内、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、腹腔内、鼻内、経膣、経直腸、舌下、頭蓋内、硬膜内または気管内のような経路により投与することができるが、最も好ましくは、低分子化合物医薬の場合に一般的な投与形態であり実験が容易な投与形態でもある経口投与である。
【００９８】
また、哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定する工程においては、測定の仕方は特に限定するものではないが、例えば、ＣＸＣケモカインのｍＲＮＡの発現量、ＣＸＣケモカインの蛋白質の発現量などを公知の測定方法によって測定することができる。できるだけ測定の手間を省きたい場合には、より簡便な測定方法であるｍＲＮＡの発現量の測定を行えばよい。一方、できるだけ正確に測定したい場合には、ＣＸＣケモカインの蛋白質の発現量を測定すればよい。
【００９９】
ＣＸＣケモカインのｍＲＮＡの発現量を測定するには、例えば、後述する実施例で用いられているＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲによる測定を行うことができる。この場合、マウスの肝臓からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製し、そのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いてＲＴ反応を行った上で、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを行えばよい。
【０１００】
＜実施形態５：ＩＬ−１７発現量により医薬候補をスクリーニングする方法＞
本実施形態に係るアレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニング方法は、アレルギー性薬物誘導性肝障害を誘導するアレルギー性薬物を、哺乳動物に投与する工程と、その候補化合物を、その哺乳動物に投与する工程と、その哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定する工程と、を含む、スクリーニング方法である。
【０１０１】
この方法によれば、後述する実施例で哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現がアレルギー性の肝障害を誘導することが実証されているため、哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定することによって、アレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニングを行うことができる。
【０１０２】
ここで、この予測方法で用いる哺乳動物としては、特に限定するものではなく、倫理的な観点からヒト個体を除く、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ウマ、ウシなどの任意の哺乳動物を用いることができる。これらの中でも、特に好ましいのは、入手および取り扱いが容易であり、後述する実施例で示すように、この予測方法で実際に用いることができることが実証されているマウスである。また、マウスにも色々な系統があるが、特に好ましいのは、後述する実施例で示すように、ハロタンを投与することによってアレルギー性の肝障害を起こすことが実証されているＢＡＬＢ／ｃマウスである。
【０１０３】
ここで、アレルギー性薬物誘導性肝障害を誘導するアレルギー性薬物を、哺乳動物に投与する工程においては、投与の仕方は特に限定するものではないが、実際のアレルギー性薬物誘導性肝障害の発症の原因として予想される投与形態・投与量などに対応した形で投与することが好ましい。例えば、実際のアレルギー性薬物誘導性肝障害の発症の原因として予想される投与形態・投与量などに対応した形で、経口、皮膚、皮内、気管支内、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、腹腔内、鼻内、経膣、経直腸、舌下、頭蓋内、硬膜内または気管内のような経路により投与することができるが、最も好ましくは、後述する実施例に示すように実験が容易な投与形態でもある腹腔内注射による投与である。
【０１０４】
また、医薬品の候補化合物を、哺乳動物に投与する工程においては、投与の仕方は特に限定するものではないが、実際の治療において予想される投与形態・投与量などに対応した形で投与することが好ましい。例えば、実際の治療において予想される投与形態・投与量などに対応した形で、経口、皮膚、皮内、気管支内、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、腹腔内、鼻内、経膣、経直腸、舌下、頭蓋内、硬膜内または気管内のような経路により投与することができるが、最も好ましくは、低分子化合物医薬の場合に一般的な投与形態であり実験が容易な投与形態でもある経口投与である。
【０１０５】
また、哺乳動物の体内におけるインターロイキン１７の発現量を測定する工程においては、測定の仕方は特に限定するものではないが、例えば、インターロイキン１７のｍＲＮＡの発現量、インターロイキン１７の蛋白質の発現量などを公知の測定方法によって測定することができる。できるだけ測定の手間を省きたい場合には、より簡便な測定方法であるｍＲＮＡの発現量の測定を行えばよい。一方、できるだけ正確に測定したい場合には、インターロイキン１７の蛋白質の発現量を測定すればよい。
【０１０６】
＜実施形態６：ＣＸＣケモカイン発現量により医薬候補をスクリーニングする方法＞
本実施形態に係るアレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニング方法は、アレルギー性薬物誘導性肝障害を誘導するアレルギー性薬物を、哺乳動物に投与する工程と、その候補化合物を、その哺乳動物に投与する工程と、その哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定する工程と、を含む、スクリーニング方法である。
【０１０７】
この方法によれば、後述する実施例で哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現がアレルギー性の肝障害を誘導することが実証されているため、哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定することによって、アレルギー性薬物誘導性肝障害の治療における医薬品の候補化合物のスクリーニングを行うことができる。
【０１０８】
ここで、この予測方法で用いる哺乳動物としては、特に限定するものではなく、倫理的な観点からヒト個体を除く、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ウマ、ウシなどの任意の哺乳動物を用いることができる。これらの中でも、特に好ましいのは、入手および取り扱いが容易であり、後述する実施例で示すように、この予測方法で実際に用いることができることが実証されているマウスである。また、マウスにも色々な系統があるが、特に好ましいのは、後述する実施例で示すように、ハロタンを投与することによってアレルギー性の肝障害を起こすことが実証されているＢＡＬＢ／ｃマウスである。
【０１０９】
ここで、アレルギー性薬物誘導性肝障害を誘導するアレルギー性薬物を、哺乳動物に投与する工程においては、投与の仕方は特に限定するものではないが、実際のアレルギー性薬物誘導性肝障害の発症の原因として予想される投与形態・投与量などに対応した形で投与することが好ましい。例えば、実際のアレルギー性薬物誘導性肝障害の発症の原因として予想される投与形態・投与量などに対応した形で、経口、皮膚、皮内、気管支内、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、腹腔内、鼻内、経膣、経直腸、舌下、頭蓋内、硬膜内または気管内のような経路により投与することができるが、最も好ましくは、後述する実施例に示すように実験が容易な投与形態でもある腹腔内注射による投与である。
【０１１０】
また、医薬品の候補化合物を、哺乳動物に投与する工程においては、投与の仕方は特に限定するものではないが、実際の治療において予想される投与形態・投与量などに対応した形で投与することが好ましい。例えば、実際の治療において予想される投与形態・投与量などに対応した形で、経口、皮膚、皮内、気管支内、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、腹腔内、鼻内、経膣、経直腸、舌下、頭蓋内、硬膜内または気管内のような経路により投与することができるが、最も好ましくは、低分子化合物医薬の場合に一般的な投与形態であり実験が容易な投与形態でもある経口投与である。
【０１１１】
また、哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定する工程においては、測定の仕方は特に限定するものではないが、例えば、ＣＸＣケモカインのｍＲＮＡの発現量、ＣＸＣケモカインの蛋白質の発現量などを公知の測定方法によって測定することができる。できるだけ測定の手間を省きたい場合には、より簡便な測定方法であるｍＲＮＡの発現量の測定を行えばよい。一方、できるだけ正確に測定したい場合には、ＣＸＣケモカインの蛋白質の発現量を測定すればよい。
【０１１２】
ＣＸＣケモカインのｍＲＮＡの発現量を測定するには、例えば、後述する実施例で用いられているＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲによる測定を行うことができる。この場合、マウスの肝臓からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製し、そのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いてＲＴ反応を行った上で、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを行えばよい。
【０１１３】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【０１１４】
例えば、上記実施の形態ではマウスにハロタンをはじめとするアレルギー性薬物誘導性肝障害を誘導するアレルギー性薬物を腹腔内注射によって投与するとしたが、特に限定する趣旨ではなく、ハロタンによるアレルギー性薬物誘導性肝障害の原因として一般的な吸入投与としてもよい。このようにすれば、ハロタンなどの吸入麻酔薬によるアレルギー性薬物誘導性肝障害の誘導をより実態に沿った形で再現できるという利点が得られる。
【実施例】
【０１１５】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１１６】
＜実施例１：ハロタン誘導性急性肝障害モデルマウス作成および炎症・免疫関連遺伝子の発現変動解析＞
全身麻酔薬ハロタンは個体特異的に肝障害を引き起こすことが知られており、ハロタンを使用した患者の約２０％で血清トランスアミナーゼが増加すると言われている。古くからラットやモルモットなどの実験動物においてハロタンの急性肝障害の研究が行われてきたが、近年マウスを用いた肝障害モデルが開発され、ＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスの間には非常に大きな系統差が存在することが報告されている。そこでハロタンの毒性発現機序の解明に用いるために、本実施例ではこれら２種類の系統のマウスにハロタンを投与し、経時的に血中の肝障害マーカーを測定することで肝障害レベルの評価を行った。同時に肝臓における炎症・免疫に関与する転写因子およびサイトカイン類のｍＲＮＡの定量を行った。
【０１１７】
（１−１−１）実験材料および実験試薬
ハロタンはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。オリーブ油、トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコーキットは和光純薬工業（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅは東洋紡（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より、逆転写用ｄＮＴＰｓはグライナー・ジャパン  （Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。ＲＮＡｉｓｏ、ランダムヘキサマー、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｒ）  （Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）は宝酒造（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。プライマーは北海道システムサイエンス（Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）に合成を依頼した。Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＤｙｅにはＢｒｉｌｌｉａｎｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＱＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）付属のものを使用した。Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−ＧＯ！  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４（ＩＬ−４）およびＲｅａｄｙ−ＳＥＴ−ＧＯ！  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ（ＩＦＮ−ｇ）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より購入した。イムノモジュール（ストリップ＆フレーム）  はＮａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋ．Ｋ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。その他の試薬類は市販品の特級、生化学用または高速液体クロマトグラフィー用のものを用いた。
【０１１８】
また、以下に本章で使用した溶液等の組成を示した。
ＤＥＰＣ処理精製水
ＤＥＰＣの最終濃度が０．１％になるように精製水に加え、３７℃で２時間加温した。その後、１２１℃、４０分間オートクレーブした。
【０１１９】
（１−１−２）ハロタンによる肝障害マウスの作成
ＢＡＬＢ／ｃＣｒＳｌｃマウス（雌性、７週齢；日本ＳＬＣ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）およびＣ５７ＢＬ／６ＪＪｍｓＳｌｃマウス（雌性、７週齢；日本ＳＬＣ）を馴化飼育した後、体重を測定し、群分けを行った。ハロタン投与群にはハロタン１００、３００または６００μｍｏｌ／ｍｏｕｓｅを単回腹腔内投与した。投与時間は３、６、１２および２４時間とし、下行大静脈より採血を行い（１−１−３）および（１−１−４）で使用した。ハロタンの投与量の検討の際には投与から２４時間後に採血を行った。同時に肝臓を採取し、１．１５％塩化カリウム溶液で洗浄後、（１−１−５）で使用した。
【０１２０】
（１−１−３）血漿中ＡＳＴおよびＡＬＴ値の測定
ヘパリナイズした器具を用いて採取したマウスの全血を１，５００ｇ、４℃で１５分間遠心分離を行った後、上清をサンプルチューブに移し血漿とした。血漿中ＡＳＴおよびＡＬＴ値は、トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコーキットを用いて、マニュアルに修正を加え、以下の方法で定量した。血漿５μＬにＡＬＴ用基質酵素液を１２５μＬ加え混合し、３７℃で５分間インキュベートした。その後、発色試薬を加えよく混合し、３７℃で正確に２０分間加温した。２０分後に反応停止液を加え、混合した後、５５５ｎｍでの吸光度を測定し、ＡＳＴおよびＡＬＴ値を求めた。
【０１２１】
（１−１−４）ＥＬＩＳＡによる血漿中のＩＦＮγおよびＩＬ−４の定量
上述の（１−１−２）で採取したマウスの全血を１時間室温で放置し、１，５００ｇ、４℃で１５分間遠心分離を行った後、上清をサンプルチューブに移し血漿とした。血漿中のＩＦＮγ濃度およびＩＬ−４濃度をＲｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！のマニュアルにしたがって以下の方法で測定した。９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに溶かしたｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙを１ｗｅｌｌあたり１００  μＬ加え、４℃で１８時間静置した。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  でｗｅｌｌを５回洗浄しｗｅｌｌの水分を除き、１ｘ  Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔを１ｗｅｌｌあたり２００μＬ加え、２５℃で１時間静置した。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  でｗｅｌｌを１回洗浄しｗｅｌｌの水分を除き、血漿および１ｘ  Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔを用いて段階希釈を行ったｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮγまたはｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−４を１ｗｅｌｌあたり１００μＬ加え、２５℃で２時間静置した。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  でｗｅｌｌを５回洗浄しｗｅｌｌの水分を除き、１ｘ  Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔに溶かしたｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙを１ｗｅｌｌあたり１００μＬ加え、２５℃で１時間静置した。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  でｗｅｌｌを５回洗浄しｗｅｌｌの水分を除き、１ｘ  Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔに溶かしたＡｖｉｄｉｎ  −  ＨＲＰを１  ｗｅｌｌあたり１００μＬ加え、２５℃で３０分間静置した。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  でｗｅｌｌを７回洗浄しｗｅｌｌの水分を除き、１ｘ  ＴＭＢ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを１ｗｅｌｌあたり１００μＬ加え、２５℃で１５分間インキュベートし、１Ｍリン酸を１ｗｅｌｌあたり５０μＬ加え反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。
【０１２２】
（１−１−５）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
ＲＮＡｉｓｏのマニュアルに修正を加え、以下の方法で肝臓からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。約１００ｍｇの肝臓に、ＲＮＡｉｓｏ  １ｍＬを加えてホモジナイズ後、サンプルチューブに分注し、クロロホルム  ０．２ｍＬを加えて激しく１５秒間攪拌した。室温で３分間放置した後、１０，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を別のチューブに採取し、０．５ｍＬのイソプロパノールを加えて室温にて８分間放置した後、１０，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。沈殿を７０％エタノールで洗浄した。この沈殿を乾燥させた後、ＤＥＰＣ処理精製水に溶解させ、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより定量した。
【０１２３】
（１−１−６）ＲＴ反応
上述の（１−１−５）より得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用い、以下の方法に従ってＲＴ反応を行った。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １０μｇ、１５０ｎｇ／μＬランダムヘキサマー１μＬにＤＥＰＣ処理精製水を加えて２３μＬとした。７０℃水浴中で１０分間反応後、氷冷した。５ｘ  逆転写用バッファー８μＬと２．５Ｍ  ｄＮＴＰｓ  ８μＬ、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅを１μＬ加え、全量を４０μＬとした後、３０℃で１０分間、４２℃で６０分間反応させた。その後、９８℃で１０分間インキュベートし、ＲＴ酵素を失活させた後、ＰＣＲに供した。
【０１２４】
（１−１−７）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ
Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−２および補正用のβ−ａｃｔｉｎのＲＮＡ含量の測定は、Ｍｘ３０００Ｐ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）  を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにて行った。反応条件を以下に示した。上述の（１−１−６）で得られたｃＤＮＡ試料２μＬ、１０μＭ  ＦＰ  ０．８μＬ、１０μＭ  ＲＰ  ０．８μＬ、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｒ）バッファー１０μＬ、５μＭ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ  ０．３μＬに滅菌精製水を加え、全量を２０μＬとした。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１２５】
Ｔ−ｂｅｔ，ＦＰ：５’−ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  Ｇ−３’（配列番号：１），ＲＰ：５’−ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＣＧ  ＡＴＣ−３’（配列番号：２）；
ＧＡＴＡ−３，ＦＰ：５’−ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＣＡ−３’（配列番号：３），ＲＰ：  ５’−  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  Ａ−３’（配列番号：４）；
ＩＦＮγ，ＦＰ：５’−ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＡＡＧ  Ｃ−３’（配列番号：５），ＲＰ：５’−ＴＧＧ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ−３’（配列番号：６）；
ＩＬ−１０，ＦＰ：５’−ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＧＣ  ＧＧ−３’（配列番号：７），ＲＰ：５’−ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＡＧＧ  ＴＣＣ  ＴＧＧ−３’（配列番号：８）；
ＴＮＦα，ＦＰ：５’−ＴＧＴ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＴＴＣ  Ｃ−３’（配列番号：９），ＲＰ：５’−ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＴＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号：１０）；
ＭＩＰ−２，ＦＰ：５’−ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ−３’（配列番号：１１），ＲＰ：５’−ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＴＴＣ−３’（配列番号：１２）；
β−ａｃｔｉｎ，ＦＰ：５’−ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＴＧ  Ｇ−３’（配列番号：１３），ＲＰ：５’−  ＣＴＡ  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴＣ  ＴＣ−３’（配列番号：１４）．
【０１２６】
調製した反応液を専用のサンプルチューブに入れ、以下のプロトコールで反応を行った。Ｔ−ｂｅｔ、ＩＦＮγ、β−ａｃｔｉｎでは熱変性反応を９５℃、６０秒の後、解離反応を９５℃、１５秒、アニーリングと伸長反応を同時に６８℃、２０秒を１サイクルとし４０サイクル行った。アニーリングと伸長反応の際に、蛍光をｒｅａｌ  ｔｉｍｅで検出した。ＩＬ−１０では熱変性反応を９５℃、３０秒の後、解離反応を９４℃、４秒、アニーリングと伸長反応を同時に６６℃、２０秒を１サイクルとし４０サイクル行った。アニーリングと伸長反応の際に、蛍光をｒｅａｌ  ｔｉｍｅで検出した。ＴＮＦαでは熱変性反応を９５℃、６０秒の後、解離反応を９５℃、１５秒、アニーリングと伸長反応を同時に６６℃、２０秒を１サイクルとし４０サイクル行った。アニーリングと伸長反応の際に、蛍光をｒｅａｌ  ｔｉｍｅで検出した。ＭＩＰ−２では熱変性反応を９５℃、６０秒の後、解離反応を９４℃、４秒、アニーリングと伸長反応を同時に６４℃、２０秒を１サイクルとし４５サイクル行った。アニーリングと伸長反応の際に、蛍光をｒｅａｌ  ｔｉｍｅで検出した。ＧＡＴＡ−３では熱変性反応を９５℃、６０秒の後、解離反応を９４℃、１５秒、アニーリングを６２℃、１５秒、伸長反応を７２℃、３０秒を１サイクルとし、４０サイクル行った。伸長反応の際に、蛍光をｒｅａｌ  ｔｉｍｅで検出した。４０サイクルの反応を終了後、６０℃から９５℃まで、０．２℃／ｓｅｃ温度を上昇させて融解曲線の測定を行った。融解曲線の測定により、産物が単一物であるかを推定することができる。反応終了後、２〜４％アガロースゲルで電気泳動を行い特異的に増幅されるバンドの再確認を行った。
【０１２７】
（１−２）実験結果
（１−２−１）ハロタン投与マウスの血漿試料の生化学検査
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対しハロタンを１００、３００または６００  μｍｏｌ／ｍｏｕｓｅで単回腹腔内投与し、２４時間の血漿試料中のＡＬＴの平均値に標準偏差を付した結果を以下に示した（図４）。
【０１２８】
ハロタン投与後２４時間のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、投与量１００または６００μｍｏｌ／ｍｏｕｓｅでＡＬＴの活性は対照群と比べ、有意な増加が認められた。また３００μｍｏｌ／ｍｏｕｓｅにおいてＡＬＴは有意ではないが増加傾向にあった。以下、ハロタンの投与量を６００μｍｏｌ／ｍｏｕｓｅとして検討を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスのハロタン投与群について３、６、１２および２４時間の血漿試料中のＡＳＴおよびＡＬＴの平均値に標準偏差を付した結果を以下に示した（図５）。
【０１２９】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては、ハロタン投与後３、６、１２および２４時間でＡＳＴの活性は対照群と比べ、有意な増加が認められた。ＡＳＴは投与後３時間から増加し始め、２４時間で最も高い値を示した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいては、ハロタン投与後３、１２および２４時間でＡＳＴの活性は対照群と比べ、有意な増加が認められた。ＡＳＴは投与後３時間から増加し始め、６時間で最大となり、その後も２４時間まで活性は維持された。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては、ハロタン投与後２４時間でＡＬＴの活性は対照群と比べ、有意な増加が認められた。ＡＬＴは投与後３時間から増加し始め、２４時間で最も高い値を示した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいては、ハロタン投与後３、１２および２４時間でＡＬＴの活性は対照群と比べ、有意な増加が認められた。ＡＬＴは投与後３時間から増加し始め、１２時間で最大となり、その後減少する傾向にあった。２４時間においてＡＬＴは１２時間に比べ減少したが対照群の活性値には至らなかった。
【０１３０】
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるハロタン投与による肝障害の程度と好中球の肝臓への浸潤について検討するため、Ｈ＆Ｅ染色および抗ＭＰＯ抗体を用いた免疫染色による肝組織像の評価を行った（図６）。その結果として、ハロタンを投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて中心静脈周囲の肝細胞の脱落が認められた。これは薬物誘導性肝障害の一般的な所見である。また、ハロタンを投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて多数のＭＰＯ陽性細胞の浸潤が認められ、ハロタンによる肝障害の誘導に好中球が寄与していることが示唆された。一方、対照群のＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびハロタンを投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいては肝細胞の脱落やＭＰＯ陽性細胞の浸潤は認められなかった。
【０１３１】
（１−２−２）ハロタン投与マウス血漿中のＩＦＮγおよびＩＬ−４タンパク質量の変動解析
ハロタンの投与後３、６、１２および２４時間のマウス血漿中のＩＦＮγおよびＩＬ−４タンパク質量の変動をＥＬＩＳＡを用いて検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスについて各時間において得られた血漿３匹分を等量ずつ混合し、検討に用いた（図７）。
【０１３２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてハロタンの投与後２４時間において血漿中のＩＦＮγおよびＩＬ−４タンパク質が検出された。しかし他のいずれの時間においても血漿中のＩＦＮγおよびＩＬ−４タンパク質は検出されなかった。一方、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいては、いずれの時間においても血漿中のＩＦＮγおよびＩＬ−４タンパク質は検出されなかった。
【０１３３】
（１−２−３）ハロタン投与マウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの変動解析
ハロタン投与後３、６、１２および２４時間のマウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの発現変動を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した。各サンプルについてＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−２、β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの量を測定し、Ｔ−ｂｅｔ量にはＧＡＴＡ−３量を、ＩＦＮγ量にはＩＬ−１０量を、ＴＮＦαおよびＭＩＰ−２量にはβ−ａｃｔｉｎ量を補正に用いて対照群に対するＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３比、ＩＦＮγ／ＩＬ−１０比（図８）、ＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎ比およびＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎ比（図９）の平均値に標準偏差を付した結果を以下に示した。
【０１３４】
ＢＡＬＢ／ｃマウス肝においてＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３比はハロタンの投与後３時間で対照群と比べ０．４倍、投与後１２時間で対照群の０．４倍、投与後２４時間で対照群の０．１倍となり、いずれも有意な減少が認められた。ハロタンの投与後６時間においては対照群と比べ減少傾向にあったが有意な差は認められなかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウス肝においてＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３比はハロタンの投与後３時間で対照群と比べ０．５倍、投与後６時間で対照群の０．６倍、投与後２４時間で対照群の１．５倍となり有意な変動が認められた。ハロタンの投与後１２時間においては対照群と比べ変動は認められなかった。
【０１３５】
ＢＡＬＢ／ｃマウス肝においてＩＦＮγ／ＩＬ−１０比はハロタンの投与後３時間で対照群と比べ０．１倍となり、有意な減少が認められた。ハロタンの投与後６時間、１２時間および２４時間においては対照群と比べ減少傾向にあったが、有意な差は認められなかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウス肝においてＩＦＮγ／ＩＬ−１０比はハロタンの投与後３時間で対照群と比べ０．２倍、投与後６時間で対照群の０．２倍となり、有意な減少が認められた。ハロタンの投与後１２時間と２４時間においては対照群と比べ増加傾向にあったが、有意な差は認められなかった。
【０１３６】
ＢＡＬＢ／ｃマウス肝においてＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎ比は対照群に比べ、ハロタンの投与後３時間で減少傾向にあったが６時間から増加し始め、１２時間で最大となり、その後減少する傾向にあったが、いずれの時間においても有意な変動は認められなかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウス肝においてＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎ比はハロタンの投与後１２時間で対照群と比べ２．９倍となり、有意な増加が認められた。ハロタンの投与後２４時間においても増加傾向にあったが有意な差は認められなかった。ハロタンの投与後３および６時間においてはＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎ比の変動は認められなかった。
【０１３７】
ＢＡＬＢ／ｃマウス肝においてＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎ比はハロタンの投与後２４時間で対照群と比べ約９６０倍となり、有意な増加が認められた。ハロタンの投与後３時間で対照群と比べ２．０倍、６時間で対照群と比べ３．７倍、１２時間で対照群と比べ３７．８倍となり、増加傾向にあったが有意な差は認められなかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウス肝においてＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎ比はハロタンの投与後１２時間で対照群と比べ１６．１倍、投与後２４時間で対照群と比べ１７．８倍となり、有意な増加が認められた。ハロタンの投与後３時間で対照群と比べ５．９倍、６時間で対照群と比べ１．８倍となり、増加傾向にあったが有意な差は認められなかった。
【０１３８】
（１−３）結果の考察
ハロタンは吸入型全身麻酔薬として古くから用いられているがヒトにおいてまれな頻度であるが肝障害を引き起こすことが知られており、現在はより肝障害性の少ないセボフルランが主流となっている。しかし現在でも設備や様々な法的な問題からハロタンの使用が余儀なくされる状況が存在している（Ｓｐｌｉｎｔｅｒ，２００２）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてハロタンはＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ２Ａ６によって酸化的に（Ｍａｄａｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，１９９６；Ｓｐｒａｃｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ａ６によって還元的に（Ｓｐｒａｃｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）代謝を受けると言われている。またヒトにおいてＣＹＰ２Ｅ１がハロタンの主要な代謝酵素であること（Ｋｈａｒａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ハロタンによって肝炎を発症した患者の４５％は血漿から抗ＣＹＰ２Ｅ１抗体が検出されること（Ｂｏｕｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）が報告されており、ハロタンによる肝障害の発症にはＣＹＰ２Ｅ１による代謝的活性化が関与していると考えられる。多くの種においてハロタン誘導性肝障害は通常の条件では再現されないが、モルモットを用いた検討でハロタンがＣＹＰ２Ｅ１によってトリフルオロ酢酸に代謝され、血漿中のＡＬＴの増加と肝細胞のネクローシスが起こること、ハロタンの投与による肝臓のグルタチオンの減少と肝障害の増悪が関連することが報告されている（Ｌｉｎｄ  ａｎｄ  Ｇａｎｄｏｌｆｉ，１９９７）。
【０１３９】
ハロタン誘導性肝障害のモデルマウスはこれまでハロタンの投与による呼吸抑制でマウスが死亡してしまうため、投与量に限界があり作成が困難であった。本章ではＹｏｕら（２００６）の報告を参考にハロタンの投与方法を決定したが、この方法では多量のハロタンを投与してもハロタンが溶媒から徐々に放出されるため呼吸抑制によってマウスが死亡することなく、肝臓にハロタンを蓄積させることができる。本章においてハロタンの投与量を１００、３００または６００μｍｏｌ／ｍｏｕｓｅとし検討を行ったがＡＬＴの顕著な増加はＹｏｕら（２００６）と同じ６００μｍｏｌ／ｍｏｕｓｅにおいてのみ認められたため、その後の検討は全て投与量を６００μｍｏｌ／ｍｏｕｓｅとして行った。またＹｏｕら（２００６）は今回と同様の投与法において肝臓のトリフルオロアセチル化タンパク質の生成についてＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスの間に系統差が存在しないことを報告している。
【０１４０】
今回、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてハロタンの投与によって投与後３時間からＡＳＴが上昇し始め、２４時間において最も増加しており、いずれの時間においても対照群との間に有意な増加が認められた。またハロタンの投与によって投与後３時間からＡＬＴが上昇し始め、２４時間において対照群と比べて有意な差となった。Ｙｏｕら（２００６）の報告では同様の投与方法でＡＬＴのピークは投与後２４時間において１２００ＩＵ／Ｌ程度を示し、その後減少していることから今回の投与によっても投与後２４時間以降でＡＬＴが減少していくと考えられる。しかしＹｏｕら（２００６）の行った検討で投与後１２時間においてＡＬＴが７００ＩＵ／Ｌ程度まで上昇していたのに対し、本章では投与後１２時間におけるＡＬＴの上昇は非常に小さい値であった。実験条件が厳密に同様ではないためこのような違いが見られたと考えられるがＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるハロタン誘導性肝障害動物モデルをある程度再現することができたと考えられる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて今回、投与後３時間からＡＳＴが上昇し始め、３、１２および２４時間において対照群と比べて有意な差となった。ハロタンの投与後６時間でＡＳＴは最大となったが３匹中１匹のマウスが比較的高いＡＳＴ値を示したため平均値と標準偏差が増加し、このような結果になったと考えられる。ＡＳＴは肝臓以外にも心筋、骨格筋、腎臓および赤血球などにも含まれており、実験操作中の溶血によって値が上昇することがある。しかし今回同じマウスの血漿中のＡＬＴも比較的高い値を示していたため溶血による増加ではなくマウスの個体差によって、ＡＳＴおよびＡＬＴの増加が起こったと考えられる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、投与後３時間からＡＬＴが上昇し始め、３、１２および２４時間において対照群と比べて有意な差となった。Ｙｏｕら（２００６）の報告では同様の投与方法でＡＬＴのピークは投与後１２時間に現れており、今回の結果と一致していた。
【０１４１】
肝組織像の評価については、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるハロタン投与による肝障害の程度と好中球の肝臓への浸潤をＨ＆Ｅ染色および抗ＭＰＯ抗体を用いた免疫染色によって行った。その結果として、ハロタンを投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて中心静脈周囲の肝細胞の脱落が認められた。これは薬物誘導性肝障害の一般的な所見であり、Ｙｏｕら（２００６）による検討と同様の結果となった。またモルモットにおいてもハロタンによる肝障害時には中心静脈周囲の肝細胞の脱落が見られることが報告されている（Ｌｉｎｄ  ａｎｄ  Ｇａｎｄｏｌｆｉ，１９９７）。
【０１４２】
Ｈ＆Ｅ染色による肝障害の程度の評価に加えて、抗ＭＰＯ抗体を用いた免疫染色によってＭＰＯ陽性細胞の肝臓への浸潤についての評価を行い、好中球の関与について検討した。ハロタンを投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓において多数のＭＰＯ陽性細胞の浸潤が認められており、マウスにおいて好中球とハロタン誘導性肝障害の関与を示唆した報告（Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）を支持する結果となった。一方、対照群のＢＡＬＢ／ｃマウス、対照群のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびハロタンを投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいては肝細胞の脱落やＭＰＯ陽性細胞の浸潤は認められなかった。
【０１４３】
好中球の肝血管系への蓄積にはＴＮＦα、ＩＬ−１、ＣＸＣケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−２、ＫＣ、ＣＩＮＣ−１）、ＰＡＦなど様々な炎症調節因子が関与している。しかし類洞内への好中球の蓄積だけでは肝細胞を傷害するには不十分であり、好中球が血管外の肝実質細胞へ遊走されることが必要であると言われており、それには好中球のβ２インテグリンと内皮細胞および肝実質細胞のＩＣＡＭ−１との接着が必要であると言われている。肝細胞の傷害には肝実質細胞内の好中球に由来する過酸化水素や次亜塩素酸による酸化ストレスが寄与していると言われており、次亜塩素酸は好中球のもつＭＰＯによって産生されている。虚血再灌流による肝障害、アルコール性肝炎、αナフチルイソチオシアネートによる肝障害およびアセトアミノフェンによる肝障害などが好中球の浸潤によって引き起こされる、または悪化することが報告されており（Ｒａｍａｉａｈ  ａｎｄ  Ｊａｅｓｃｈｋｅ，２００７）、本検討におけるＭＰＯ陽性細胞の浸潤も肝細胞の傷害に寄与していると考えられる。しかしアセトアミノフェンは免疫担当細胞を含まない条件でマウス肝細胞を培養した場合においても、ｉｎ  ｖｉｖｏと同様のメカニズムで細胞を傷害することが報告されており（Ｂａｊｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、好中球などの非実質細胞が関与しない可能性が示唆されている。ハロタンについてもｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける詳細な検討が、好中球の関与を明らかにするために必要であると考えられる。
【０１４４】
Ｔ−ｂｅｔは新たに発見されたＴｈ１細胞に特異的な転写因子であり、Ｔｈ１細胞への分化を促進し、Ｔｈ２細胞への分化を抑制すると考えられている（Ｓｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。逆にＧＡＴＡ−３はＴｈ２細胞の発達において中心的な役割を果たす転写因子であり、Ｔｈ１細胞への分化を抑制すると言われている  （Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｏｕｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。Ｔｈ細胞に特異的なこれら２つの主要な転写因子がＴｈ１サイトカイン、Ｔｈ２サイトカインの発現を制御し、Ｔｈ細胞の分化において重要な役割を果たしていると考えられている。Ｔ−ｂｅｔの発現はＩＦＮγの発現と相関しており、またＩＦＮγは転写因子ｓｔａｔ−１を介してＴ−ｂｅｔの発現を誘導していることから、ポジティブフィードバックループが形成されていることが知られている（Ａｇｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。一方、ＩＬ−４は転写因子ｓｔａｔ−６を介してＧＡＴＡ−３の発現を誘導しており、ポジティブフィードバックループの形成が報告されている（Ａｇｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。またＩＦＮγはＴｈ２サイトカインの、ＩＬ−４はＴｈ１サイトカインの産生を抑制しており、Ｔｈ１とＴｈ２は互いに制御し合っていることが知られている（Ｒｅｎｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。喘息患者の気道のＴ細胞ではＴ−ｂｅｔの発現量が低下すること、Ｔ−ｂｅｔノックアウトマウスがヒトにおける喘息に類似した気道の過敏症を発症すること（Ｆｉｎｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）およびＧＡＴＡ−３の発現が上昇することが報告されており  （Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、Ｔｈ２細胞の関与が示唆されている。またＣｏｎ  Ａを投与することで誘導した肝障害モデルにおいては野生型のマウスに比べ、ｓｔａｔ−１トランスジェニックマウスにおいて重症化し、ｓｔａｔ−１、Ｔ−ｂｅｔ、ＩＦＮγのいずれかをノックアウトしたマウスにおいては軽減されることが報告されており、肝障害に対するＴｈ１細胞の寄与が示唆されている（Ｓｉｅｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０１４５】
Ｔｈ１とＴｈ２の分化において中心的な役割を果たす転写因子であるＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量の変化を疾患モデル動物を用いて評価した種々の報告（Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）はＴ−ｂｅｔやＧＡＴＡ−３について評価することがＴｈ１やＴｈ２と様々な疾患との関連を明らかにする上で有用であることを示している。またＴ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡの発現量の比は、それぞれを単独で評価した場合よりもＴｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインの実際の分泌量をより正しく反映することが報告されており（Ｃｈａｋｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、肝臓においてもＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡ比の変動はＴｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインの実際の分泌のバランスを反映していると考えられる。しかし組織におけるサイトカインを測定したという報告は非常に少なく、それは抽出に適切な界面活性剤を正しい濃度で用いなければ抽出効率が悪く、さらに検出の際の抗体の反応性を変えてしまうことが原因であると言われている（Ｍａｔａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。さらに界面活性剤がサイトカインの測定値に与える影響は測定するサイトカインの種類によって異なっており（Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、肝組織中のサイトカインの測定は困難であると考え、本章では血漿中のＩＦＮγおよびＩＬ−４タンパク質の濃度を測定した。
【０１４６】
ＩＦＮγおよびＩＬ−４タンパク質の血漿中の濃度はハロタンの投与後２４時間のＢＡＬＢ／ｃマウス以外は検出限界以下であり、これらのＴｈ１およびＴｈ２サイトカインの発現量の変動を評価することはできなかった。しかしハロタンによる肝障害が誘導されたマウスの血漿中のみから検出されており、ハロタンによる肝障害に対して、これらサイトカインが何らかの影響を与えていると考えられる。そこでＴｈ１とＴｈ２の応答性の変動の評価には肝臓のｍＲＮＡを用いることにした。
【０１４７】
本実施例ではＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓のＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡの比がハロタンの投与後３、１２および２４時間で有意に減少しており、６時間においては有意ではないが減少する傾向があることを明らかにした。一方Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓のｍＲＮＡにおいてＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３比はハロタンの投与後３時間および６時間で有意に減少し、投与後２４時間で有意に増加していた。
【０１４８】
続いてハロタンの投与による肝臓のｍＲＮＡのＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３比の変動が、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインの発現を反映しているかどうかをＴｈ１サイトカインであるＩＦＮγおよびＴｈ２サイトカインのＩＬ−１０のｍＲＮＡの発現の変動を測定することで評価した。本検討におけるＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓のＩＦＮγ／ＩＬ−１０のｍＲＮＡの比はハロタンの投与後３時間で有意に減少しており、ハロタンの投与後６、１２および２４時間においては減少する傾向があることを明らかにした。一方Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓においてＩＦＮγ／ＩＬ−１０のｍＲＮＡの比はハロタンの投与後３および６時間で有意に減少し、投与後１２および２４時間においては増加する傾向にあることを明らかにした。ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてハロタン投与後のＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡ比の変動はＩＦＮγ／ＩＬ−１０のｍＲＮＡの比の変動と類似しており、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける比が投与後、常に減少していたことと、重篤な肝障害を発症することの間には何らかの関連があるのではないかと考えられる。
【０１４９】
次に好中球の活性化やアポトーシスの誘導に関わるサイトカインであるＴＮＦαについての評価を行った。本実施例におけるＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓のＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比は対照群に比べ、有意な変動は認められなかったがハロタンの投与後１２および２４時間において増加傾向にあった。これはＹｏｕら（２００６）の報告と類似した結果であったが増加の程度や有意差が見られた点などは本検討とは異なっていた。Ｃ５７ＢＬ／６マウス肝においてＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎ比はハロタンの投与後１２時間で対照群と比べ２．９倍となり、有意な増加が認められた。ハロタンの投与後２４時間においても増加傾向にあったが有意な差は認められなかった。ハロタンの投与後３および６時間においてはＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎ比の変動は認められなかった。Ｙｏｕら（２００６）の報告では１２時間におけるＴＮＦαは増加傾向にあったが有意差がつかない点が本検討と異なっていた。本検討においてはｍＲＮＡの定量をｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲによって行い、補正には今回ＧＡＰＤＨよりもバラつきの少なかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）β−ａｃｔｉｎを用いたがＹｏｕら（２００６）はＲＴ−ＰＣＲを行い、バンド強度を測定することでｍＲＮＡの定量を行っており、また補正にはＧＡＰＤＨを用いている。このような実験条件の違いが本検討とＹｏｕら（２００６）の報告の結果が違うことの一因として考えられる。
【０１５０】
ＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓のＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比はハロタンの投与後、時間依存的に増加し２４時間で顕著に増加することを明らかにした。一方Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓のＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比はハロタンの投与後、有意に増加または増加傾向にあったが、いずれの時間においてもハロタンの投与後２４時間のＢＡＬＢ／ｃマウス程の変動は認められなかった。ＭＩＰ−２は好中球の遊走に関わるケモカインであり、好中球の浸潤に起因する気道や肝臓の炎症は抗ＭＩＰ−２抗体の処置で軽減されることが報告されている（Ｍｕｒｕｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｌａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。肝臓におけるＭＩＰ−２の発現にはクッパー細胞が関与すること（Ｈａｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）およびハロタン誘導性肝障害モデル動物の肝臓のクッパー細胞からトリフルオロアセチル化タンパク質が検出されること（Ｆｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）から、本検討におけるハロタンを投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓への好中球の浸潤はＭＩＰ−２による好中球の遊走に起因するのではないかと考えられる。
【０１５１】
また本検討と同様の投与方法で炎症性サイトカインであるＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６や好中球の遊走に関わるケモカインであるＫＣのｍＲＮＡの発現量がＣ５７ＢＬ／６マウスに比べ、ＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓において有意に増加することが報告されており（Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ハロタンによる肝障害の誘導には様々な因子が関与していることが示唆された。
【０１５２】
さらにＴｈ１サイトカインとして肝臓におけるＩＬ−２のｍＲＮＡの発現量の変化をＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスについて評価し、ハロタンの投与後の発現量の変化に系統差があるか検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウスでは投与後３時間をピークにＩＬ−２／β−ａｃｔｉｎ比の誘導が見られ（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）、１２時間で対照群程度にまで減少しており、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいても同様の変化が見られたため系統差が少なくハロタンによる肝障害の発症との関連が低いと判断し、詳細な検討を行わなかった。またハロタンの投与後３時間においてＴ−ｂｅｔ／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）および本章において示したＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡの比が減少しているにも関わらずＩＬ−２／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比は増加していたため詳細な検討は、より典型的なＴｈ１サイトカインであり様々な研究がなされているＩＦＮγについて行うことにした。またヒトにおけるＩＬ−２はマウスほど厳密にＴｈ１が産生するわけではなく、種差が存在することが知られており（Ｍｏｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓａｄ，１９９６）マウスからヒトへの外挿がより困難であると考えたことも検討を中止した要因の１つである。
【０１５３】
Ｔｈ２サイトカインとして典型的なＩＬ−４およびＩＬ−５についても肝臓のｍＲＮＡの検出を試みたが測定条件を確立することができず、本実施例ではＩＬ−１０について評価することで代用した。ＩＬ−５についてはＴ細胞が豊富に存在する脾臓から抽出したｍＲＮＡを用いた場合には測定条件を確立できたことから、肝臓における発現量の低さが検出を困難にした原因の１つであると考えられる。しかしＩＬ−１０についてもヒトとマウスの間に種差が存在することが知られており（Ｍｏｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓａｄ，１９９６）ヒトにおいて本章で見られたようなＩＦＮγ／ＩＬ−１０比の変動が起こるとは限らないため、ヒトにおいて評価する場合にはＩＬ−４、ＩＬ−５またはＩＬ−９等を測定するなど、マウスとの種差を考慮する必要がある。
【０１５４】
本実施例における検討はハロタンの投与によって肝障害が誘導され、血漿ＡＳＴ、ＡＬＴおよび肝組織像から判断される肝障害の重篤さ、免疫・炎症に関連する様々な遺伝子の発現の変化に系統差があることを明らかにした。次に脾臓に由来するサイトカインがハロタンによる肝障害に関連するかどうか検討するために実施例２ではハロタン投与後の脾臓のサイトカインの産生能の変化について検討した。
【０１５５】
＜実施例２：ハロタン投与による脾臓におけるサイトカイン産生能の変動解析＞
実施例１ではハロタン抵抗性モデルと感受性モデルの作成とハロタンの投与による炎症・免疫関連遺伝子の発現変動を解析した。本章ではハロタンの投与によって脾臓におけるサイトカインの産生能が変動し、その変動の系統差が肝障害に関連しているかについてハロタン投与マウスの初代培養脾臓細胞をマイトジェン存在下で培養し、産生するサイトカインの量をＥＬＩＳＡで測定することによって検討した。
【０１５６】
（２−１−１）実験材料および実験試薬
ＰＢＳタブレットは宝酒造より購入した。ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＣ／ＳＴ）はＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）より購入した。ＨＥＰＥＳは同仁化学研究所（Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。Ｃｏｎ  Ａおよび２−メルカプトエタノールはＳｉｇｍａより購入した。ＲＰＭＩ１６４０培地は日水製薬（Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）より購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）より購入した。セルストレーナーはＢＤファルコン（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）より購入した。Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−ＧＯ！  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４（ＩＬ−４）およびＲｅａｄｙ−ＳＥＴ−ＧＯ！  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ（ＩＦＮ−ｇ）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃより購入した。イムノモジュール（ストリップ＆フレーム）はＮａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋ．Ｋ．より購入した。その他の試薬類は市販品の特級、生化学用または高速液体クロマトグラフィー用のものを用いた。また、以下に本章で使用した溶液等の組成を示した。
【０１５７】
ＰＢＳ（ＰＣ／ＳＴ）
ＰＢＳタブレット２錠に精製水を加えオートクレーブ  （１２１℃、２０分間）し、ＰＣ／ＳＴを４ｍＬ加え、全量を２００ｍＬとした。
【０１５８】
１．２５Ｍ  ＨＥＰＥＳ
２９．７８ｇのＨＥＰＥＳに精製水を加え、水酸化ナトリウムを加えｐＨ  ７．３にあわせ、全量を１００ｍＬとした。
【０１５９】
１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール
１０μＬの２−メルカプトエタノールに精製水を加え、全量を１４３０μＬとした。
【０１６０】
ＡＣＴＢ
４１１．１８ｍｇのＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｏｍｅｔｈａｎｅに精製水を加え、塩酸を加えｐＨ  ７．６５にあわせ、１．５ｇの塩化アンモニウムを加え、全量を２００ｍＬとした。
【０１６１】
ＲＰＭＩ１６４０培地
５．１ｇのＲＰＭＩ１６４０培地、５ｍＬの１．２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２５ｍＬの１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノールに精製水を加えオートクレーブ（１２１℃、２０分間）し、２５ｍＬのＦＢＳ、１２．５ｍＬの８％ＮａＨＣＯ３、５ｍＬの３％グルタミン、１０ｍＬのＰＣ／ＳＴを加え、全量を５００ｍＬとした。
【０１６２】
（２−１−２）マウス脾臓細胞の培養
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌性、７週齢；日本ＳＬＣ）およびＣ５７ＢＬ／６マウス（雌性、７週齢；日本ＳＬＣ）を馴化飼育した後、体重を測定し、群分けを行った。ハロタン投与群にはハロタン６００μｍｏｌ／ｍｏｕｓｅを単回腹腔内投与した。対照群にはオリーブ油のみを２ｍＬ／ｍｏｕｓｅ投与した。投与から２４時間後に脾臓を採取し、ＰＢＳ（ＰＣ／ＳＴ）で洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地に細胞を懸濁した。ＡＣＴＢ中に細胞を懸濁し、室温で５分間静置後、８００ｇ、４℃で５分間遠心分離を行うことで赤血球を除き、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに各ｗｅｌｌあたり１．０ｘ  １０６個の細胞を蒔いた。Ｃｏｎ  Ａを最終濃度が１、３または５μｇ／ｍＬとなるように加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。２４時間後に上清を回収し、サンプルチューブに移しＥＬＩＳＡで測定を行うまで−８０℃で保存した。
【０１６３】
（２−１−３）ＥＬＩＳＡによる上清中のＩＦＮγおよびＩＬ−４タンパク質量の変動解析
実施例１の（１−１−２）で得られた上清中のＩＦＮγ濃度およびＩＬ−４濃度を実施例１の（１−１−４）の方法に従って測定した。
【０１６４】
（２−２）実験結果
（２−２−１）ハロタン投与ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの初代培養脾臓細胞のＩＦＮγおよびＩＬ−４の産生能の変動の解析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにオリーブ油またはハロタンを投与し、投与から２４時間後に採取した脾臓細胞をＣｏｎ  Ａの最終濃度を１、３または５μｇ／ｍＬとして培養した。培養から２４時間後に回収した上清中のＩＦＮγ濃度およびＩＬ−４濃度を以下に示した（図１０）。
【０１６５】
上清中のＩＦＮγ濃度はＣｏｎ  Ａの濃度に依存して増加した。しかし上清中のＩＬ−４の濃度はＣｏｎ  Ａの濃度が１および３μｇ／ｍＬでは検出できず、５μｇ／ｍＬにおいてのみ検出された。Ｃｏｎ  Ａの濃度が１または３μｇ／ｍＬではＩＦＮγとＩＬ−４の両方を同時に検出することができないため、以下の検討はＣｏｎ  Ａの濃度を５μｇ／ｍＬとして行った。次にＣ５７ＢＬ／６マウスにオリーブ油またはハロタンを投与し、投与から２４時間後に採取した脾臓細胞をＣｏｎ  Ａの最終濃度を５μｇ／ｍＬとして培養した。培養から２４、４８、７２および９６時間後に回収した上清中のＩＦＮγ濃度およびＩＬ−４濃度以下に示した（図１１）。
【０１６６】
ＩＦＮγ濃度は２４、４８および７２時間のいずれの培養時間においても大きな変動は見られなかった。しかし９６時間において検出されたＩＦＮγ濃度はそれ以前の時間と比べ、減少傾向にあった。一方ＩＬ−４濃度は２４時間で最も高い値を示し、培養時間を長くするにつれて減少する傾向にあり、９６時間においては検出限界以下となった。本検討の目的はサイトカインの産生能の変化を評価することであり、ＩＬ−４が培養時間に依存して上清中から消失することは結果の解釈を複雑にすると考えられる。よって以下の検討では培養時間をＩＬ−４の上清中からの消失が最も少ないと考えられる２４時間に設定し行うことにした。
【０１６７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにオリーブ油またはハロタンを投与し、投与から２４時間後に採取した脾臓細胞をＣｏｎ  Ａの最終濃度を５μｇ／ｍＬとして培養した。培養から２４時間後に回収した上清中のＩＦＮγ濃度およびＩＬ−４濃度の平均値に標準偏差を付した結果を以下に示した（図１２）。
【０１６８】
ハロタン投与ＢＡＬＢ／ｃマウスの初代培養脾臓細胞のＩＦＮγの産生量は対照群に比べ０．６倍に変動しており、有意な差が認められた。一方ハロタン投与Ｃ５７ＢＬ／６マウスの初代培養脾臓細胞のＩＦＮγの産生量に変動は認められなかった。またＩＦＮγの産生量はハロタンの投与に依らずＣ５７ＢＬ／６マウスに比べ、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて高い値を示していた。
【０１６９】
ハロタン投与ＢＡＬＢ／ｃマウスの初代培養脾臓細胞のＩＬ−４の産生量は対照群に比べ０．６倍に変動しており、有意な差が認められた。一方ハロタン投与Ｃ５７ＢＬ／６マウスの初代培養脾臓細胞のＩＬ−４の産生量は対照群に比べ０．９倍に変動しており、有意な差が認められた。また対照群におけるＩＬ−４の産生量はＣ５７ＢＬ／６マウスに比べ、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて高い値を示していたが、ハロタン投与群においてはＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＬ−４の産生量は同程度であった。
【０１７０】
（２−３）結果の考察
実施例１ではハロタンによる肝障害の程度とその際の様々な遺伝子の発現量の変動に系統差が存在することを明らかにした。そこで実施例２においては脾臓に由来するサイトカインとハロタン誘導性肝障害との関連について検討を行った。
【０１７１】
脾臓は厚い被膜で覆われた組織であり、赤い組織の赤脾髄と白い斑状の組織である白脾髄によって構成されている。赤脾髄は赤血球に富んだ組織であるのに対し、白脾髄はＴ細胞およびＢ細胞の集積した組織であり、生体の免疫機能を担っている。
【０１７２】
閉塞性黄疸の実験動物モデルマウスにおいて、脾臓に由来するサイトカインが肝障害の重篤さに関連していること（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、ラット肝臓の虚血再灌流障害による肝臓組織の障害、血清のＡＳＴとＡＬＴ、アポトーシス、ＭＰＯ活性、ＴＮＦαの発現および好中球の浸潤は脾臓の摘出によって軽減されること（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、Ｔ細胞によるラクトシル化ウシ血清アルブミンに対する免疫反応を介したマウスにおける肝障害が脾臓の摘出によって軽減されること（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）が報告されており、またＩ章においてハロタンによる肝障害の発症時に炎症や免疫に関連した遺伝子の変動や好中球の浸潤が認められたことからハロタンによる肝障害の発症に対して脾臓が何らかの関与をしていると考えられた。
【０１７３】
肝臓、脾臓およびリンパ節などの組織から得たリンパ球やマクロファージなどの免疫担当細胞をＣｏｎ  Ａなどのマイトジェンの存在下で培養することで様々なサイトカインが上清中に放出されることが知られている（Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｏｋ，２００３；Ｈａｌｌｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。細胞をマイトジェン存在下で培養し、上清中のタンパク質を定量するこのような手法はリンパ球のサイトカイン産生能の変動を評価する場合などに一般的に用いられている。Ｔｈ１によって産生されるＩＦＮγはＴｈ１細胞上のＩＦＮγ受容体に結合することで転写因子ｓｔａｔ−１およびＴ−ｂｅｔを介してＴｈ１を活性化するポジティブフィードバックループの存在が知られており、最も典型的なＴｈ１サイトカインとして研究がなされている。またＩＬ−４はＴｈ２によって産生され、Ｔｈ２細胞上のＩＬ−４受容体に結合することで転写因子ｓｔａｔ−６およびＧＡＴＡ−３を介してＴｈ２を活性化するポジティブフィードバックループが知られている（Ａｇｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。これら２つのサイトカインの産生能の変動を測定し、Ｔｈ１とＴｈ２の応答性を評価した数多くの研究がこれまでに報告されている（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｍｏｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０１７４】
本実施例での検討においてもＴｈ１サイトカインとして上清中のＩＦＮγタンパク質量をＴｈ２サイトカインとして上清中のＩＬ−４タンパク質量を定量することで、ハロタンの投与の有無および系統間のＴｈ１とＴｈ２の応答性の違いについて評価を行った。
【０１７５】
本実施例において、ハロタンの投与がＢＡＬＢ／ｃマウスの初代培養脾臓細胞におけるＩＦＮγの産生能を有意に低下させることが明らかとなった。一方Ｃ５７ＢＬ／６マウスにハロタンを投与した場合は初代培養脾臓細胞のＩＦＮγの産生能に変動は認められなかった。またＩＦＮγの産生量はハロタンの投与に依らずＣ５７ＢＬ／６マウスに比べ、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて高い値を示しておりＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞よりもＣｏｎ  Ａ処置に対してＩＦＮγを産生しやすいのではないかと考えられる。ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにＣｏｎ  Ａを投与し血清中のＩＦＮγを測定するとＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＣ５７ＢＬ／６マウスよりも高値を示すことが報告されている（Ｍｉｚｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。しかしＣｏｎ  Ａによって誘導される肝障害はＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてＢＡＬＢ／ｃマウスよりも重篤であり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＢＡＬＢ／ｃマウスに比べＩＦＮγによるｉＮＯＳの発現の誘導が起こりやすいことがＣｏｎ  Ａによる肝障害の系統差の原因であると言われている（Ｍｉｚｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。従って本検討においてＣ５７ＢＬ／６マウスに比べ、ＢＡＬＢ／ｃマウスがＩＦＮγをより多く産生したことが、ＢＡＬＢ／ｃマウスの方がＣ５７ＢＬ／６マウスに比べＴｈ１反応を起こしやすいことを意味しているとは限らず、またハロタンの投与によってＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩＦＮγの発現量が減少していること、今回と同様の投与によってｉＮＯＳのｍＲＮＡの発現量にはＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスとの間に有意差がないこと（Ｙｏｕ，２００６）から脾臓に由来するＩＦＮγはハロタンによる肝障害の誘導に関与しないと考えられる。
【０１７６】
本実施例において、ハロタンの投与がＢＡＬＢ／ｃマウスの初代培養脾臓細胞におけるＩＬ−４の産生能を有意に低下させることが明らかとなった。またＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてもハロタンの投与が初代培養脾臓細胞のＩＬ−４の産生能を僅かではあるが有意に低下させた。Ｉ章においてＢＡＬＢ／ｃマウスに対するハロタンの投与によって肝臓のＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３およびＩＦＮγ／ＩＬ−１０のｍＲＮＡの比が減少したことから本章において検討した脾臓のＩＬ−４の産生能は増加すると考えていたが、予想に反した結果となった。しかしＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＦＮγとＩＬ−４の産生量の比はハロタンの投与によって変化しておらず（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）、ラットにおいてハロタンはＴ細胞のマイトジェンに対する応答性を低下させること（Ｈａｍｒａ  ａｎｄ  Ｙａｋｓｈ，１９９６）から、ハロタンの投与は脾臓におけるＴｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインのバランスに影響を与えないこと、Ｃｏｎ  Ａに対する応答性が減少し、ＩＦＮγおよびＩＬ−４の産生量が低下することが明らかとなった。
【０１７７】
肝毒性化合物を処置したマウスの脾臓細胞を無処置のマウスの肝実質細胞を共培養すると肝実質細胞からＡＬＴが漏出するが、膜を隔てて培養することでＡＬＴの漏出が有意に減少することから、脾臓のＴ細胞が肝障害を誘導するにはＴ細胞と肝実質細胞の接着が必要であるといわれている（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。本章における検討では脾臓のＴ細胞が肝臓へ遊走され、肝実質細胞に接着し肝障害の発症に寄与する可能性を否定することはできないが、脾臓細胞におけるＩＦＮγとＩＬ−４の産生能はハロタンの投与によって減少しており、肝障害の誘導には脾臓が分泌するこれらサイトカインは関連しないのではないかと考えられる。
【０１７８】
本実施例における検討はハロタンによって誘導される肝障害の感受性の高いＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて脾臓細胞のＩＦＮγおよびＩＬ−４の産生能が低下することを明らかにした。次にＩ章で変動の見られた遺伝子の発現の変動がハロタンによって誘導される肝障害に影響しているかどうか評価するために、実施例３ではサイトカインの産生をＰＧＥ１の投与によって変動させ、肝障害の程度と遺伝子の発現変動について解析した。
【０１７９】
＜実施例３：ＰＧＥ１投与がハロタン誘導性肝障害に与える影響の検討＞
ＰＧＥ１は肝障害モデル動物における様々なサイトカインの発現に影響を与えることで障害を軽減することが知られている。またＰＧＥ１は好中球の遊走、免疫複合体の貪食およびリソソームの放出を抑制すると言われている。そこでハロタン誘導性肝障害モデルマウスにＰＧＥ１を投与することでＴｈ１、Ｔｈ２サイトカインの発現や好中球の浸潤が変化し、肝障害の程度に影響が現れるかについて検討した。
【０１８０】
（３−１−１）実験材料および実験試薬
ＰＧＥ１のアピスタンディン注射用５００μｇは日本ケミファ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。その他の試薬は上述の（１−１−１）に準じた。
【０１８１】
（３−１−２）マウスへのＰＧＥ１およびハロタンの投与
上述の（１−１−２）の方法に従ってＢＡＬＢ／ｃマウス（雌性、６週齢；日本ＳＬＣ）にハロタンを投与した。ＰＧＥ１投与群にはハロタンの投与から６、９および１２時間後に２．５ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔを単回腹腔内投与した。対照群には生理食塩水を５００μＬ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔで投与した。ハロタンの投与から２４時間後に下行大静脈より採血を行い（３−１−３）で使用した。同時に肝臓を採取し、１．１５％塩化カリウム溶液で洗浄後、（３−１−４）で使用した。
【０１８２】
（３−１−３）血漿中ＡＳＴおよびＡＬＴ値の測定
上述の（３−１−２）で得られた全血を用いて血漿中のＡＳＴおよびＡＬＴ値を上述の（１−１−３）の方法に従って測定した。
【０１８３】
（３−１−４）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
上述の（１−１−２）で得られた肝臓からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを上述の（１−１−５）の方法に従って調製した。
【０１８４】
（３−１−５）ＲＴ反応
上述の（３−１−４）で得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用い、上述の（１−１−６）の方法に従ってＲＴ反応を行った。
【０１８５】
（３−１−６）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ
上述の（３−１−５）で得られたｃＤＮＡ試料を用い、上述の（１−１−７）の方法に従ってｍＲＮＡの定量を行った。
【０１８６】
（３−２）実験結果
（３−２−１）ハロタン投与マウスの血漿試料の生化学検査
ＢＡＬＢ／ｃマウスのハロタンおよびＰＧＥ１投与後の血漿試料中のＡＳＴおよびＡＬＴの平均値に標準偏差を付した結果を以下に示した（図１３）。
【０１８７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスはハロタン投与後２４時間で高いＡＳＴ値を示すが、ＡＳＴの上昇はハロタンの投与から９時間後にＰＧＥ１を投与することによって有意に減少した。またハロタンの投与から６および１２時間後にＰＧＥ１を投与することによってＡＳＴは減少する傾向にあった。ＢＡＬＢ／ｃマウスはハロタン投与後２４時間で高いＡＬＴ値を示すが、ＡＬＴの上昇はハロタンの投与から６、９および１２時間後にＰＧＥ１を投与することによって有意に減少した。
【０１８８】
（３−２−２）ハロタン投与マウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの変動解析
ハロタン投与後２４時間のマウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの発現変動を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した。各サンプルについてＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−２およびβ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの量を測定し、Ｔ−ｂｅｔ量にはＧＡＴＡ−３量を、ＩＦＮγ量にはＩＬ−１０量を、ＴＮＦαおよびＭＩＰ−２量にはβ−ａｃｔｉｎ量を補正に用いて対照群に対するＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３比、ＩＦＮγ／ＩＬ−１０比（図１４）、ＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎ比およびＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎ比（図１５）の平均値に標準偏差を付した結果を以下に示した。
【０１８９】
ハロタンの投与後２４時間で対照群と比べて有意に減少していた肝臓のＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡの比は、ハロタンの投与から６、９および１２時間後にＰＧＥ１を投与することで有意に増加した。ハロタンの投与後２４時間で対照群と比べて減少していた肝臓のＩＦＮγ／ＩＬ−１０のｍＲＮＡの比はハロタンの投与から６および９時間後にＰＧＥ１を投与することで増加する傾向にあった。しかしハロタンの投与から１２時間後にＰＧＥ１を投与した場合には有意な減少が認められた。ハロタンの投与後２４時間で対照群と比べて増加傾向にあった肝臓のＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比はハロタンの投与から６、９および１２時間後にＰＧＥ１を投与することで減少する傾向にあった。ハロタンの投与後２４時間で対照群と比べて有意に増加していた肝臓のＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比はハロタンの投与から６および９時間後にＰＧＥ１を投与することで有意に減少した。またハロタンの投与から１２時間後にＰＧＥ１を投与することで減少する傾向にあった。
【０１９０】
（３−３）結果の考察
本実施例において用いたＰＧＥ１製剤はＰＧＥ１をα−シクロデキストリンで包接し、安定化したものであり、血小板凝集抑制作用および末梢血管拡張作用を有することから様々な末梢循環障害の治療に用いられている。
【０１９１】
プロスタグランジンの細胞に対する保護作用に関しては古くから研究がなされており（Ｒｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）、ＰＧＥ１は四塩化炭素の投与によって誘導した劇症肝炎を軽減すること  （Ａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＬＰＳによって誘導される肝障害を軽減し、血清中のＩＬ−１２の減少、ＩＬ−１０の増加および肝臓のリンパ球のＩＬ−４の産生能を増加させることが報告されている（Ｍｏｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。またＰＧＥ１はクッパー細胞の活性化を抑制すること（Ｋａｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、好中球の細胞への接着を抑制すること（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ヒト好中球におけるＲＯＳの産生を抑制すること（Ｔａｌｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が報告されており、様々なサイトカインや好中球などを介した炎症および免疫反応との関連について研究がなされている。さらにＰＧＥ１は血行の改善作用を有しており、肝臓の虚血再灌流障害に対し保護的に働くことが報告されている（Ｈｏｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１９２】
本実施例ではＰＧＥ１がハロタン誘導性肝障害にどのような影響を与えるかを検討した。ＰＧＥ１の投与方法については臨床における用法と同様に点滴静注を採用した報告が多数存在するが、Ｍｏｋｕｎｏら（１９９９）の報告を参考に投与方法はより簡便な腹腔内単回投与とし、投与量もこの報告を参考に決定した。
【０１９３】
実施例１ではＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてハロタン投与後２４時間で血漿中のＡＳＴおよびＡＬＴが顕著に上昇することを示した。本実施例においてＰＧＥ１の投与がハロタンによる肝障害にどのように影響を与えるかを検討したところ、ＰＧＥ１の投与によって血漿中のＡＳＴおよびＡＬＴが有意に減少することが明らかとなった。
【０１９４】
また実施例１ではハロタンを投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて中心静脈周囲の肝細胞の脱落および多数のＭＰＯ陽性細胞の浸潤が認められ、好中球の肝臓への浸潤の増加が見られることを示した。本実施例においてＰＧＥ１の投与の影響を検討したところ中心静脈周囲の肝細胞の脱落が認められたのに対し、ＭＰＯ陽性細胞の浸潤は減少しており、ＰＧＥ１の投与は好中球が肝臓へ浸潤するのを抑制することを明らかにした（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。また好中球の遊走に関連するケモカインであるＭＩＰ−２のｍＲＮＡの発現量がＢＡＬＢ／ｃマウスに対するハロタンの投与によって顕著に増加することを実施例１において示したが、本実施例においてＰＧＥ１の投与がＭＩＰ−２の誘導を有意に抑制することを明らかにした。実施例１においてＴＮＦαがハロタンの投与によって増加する傾向にあることを示したが、本実施例においてＰＧＥ１の投与がＴＮＦαの誘導を抑制する傾向にあることが明らかとなった。
【０１９５】
さらに実施例１においてＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３およびＩＦＮγ／ＩＬ−１０のｍＲＮＡの発現量の比がＢＡＬＢ／ｃマウスに対するハロタンの投与によって有意に低下することを示したが、本実施例においてＰＧＥ１の投与がこれらの比の減少を抑制することを明らかにした。しかしハロタンの投与から１２時間後にＰＧＥ１を投与した場合にはＩＦＮγ／ＩＬ−１０のｍＲＮＡの発現量の比はハロタンのみを投与した群よりも有意に減少していた。６時間および９時間後に投与した場合とは異なった変化であったが、ＬＰＳ誘導性肝障害時においてＰＧＥ１の投与が血清中のＩＬ−１０濃度を増加させることが報告されており  （Ｍｏｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、ＩＬ−１０が誘導されやすい条件なのかも知れない。実際、ハロタン投与の１２時間後にＰＧＥ１を投与した場合には６時間および９時間後に投与した場合と比べ、肝臓におけるＩＬ−１０／ｂ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比が４倍程度高い値を示していた（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。
【０１９６】
Ｔｈ１とＴｈ２のバランスを変動させることで様々な疾患が軽減または増悪されるという事象については多くの研究がなされており（Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、肝障害についてもＴｈ１とＴｈ２のバランスの関与が報告されている（Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｍｏｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。またＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＭＩＰ−２、ＫＣ、ＣＩＮＣ−１など様々なサイトカインやケモカインが好中球の肝臓への浸潤に関与することが報告されており（Ｒａｍａｉａｈ  ａｎｄ  Ｊａｅｓｃｈｋｅ，２００７；  Ｊａｅｓｃｈｋｅ  ａｎｄ  Ｈａｓｅｇａｗａ，２００６）、実施例１および本実施例の結果からハロタンによる肝障害についてもＴｈ１とＴｈ２のバランスやＭＩＰ−２の変動との関連があることが示唆された。
【０１９７】
本実施例においてはマウスにおけるハロタンの体内動態や代謝物の生成の系統差およびＰＧＥ１の投与による影響を評価していないが、ハロタンの投与後１２時間におけるＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓中のトリフルオロアセチル化タンパク質の生成に系統差がないことがＹｏｕら（２００６）によって報告されており、本実施例においてハロタンの投与後１２時間の時点でＰＧＥ１を投与した場合にも肝障害の軽減および遺伝子の発現の変動が見られたことから、トリフルオロアセチル化タンパク質の生成以降の炎症および免疫反応の違いがハロタンによる肝障害の系統差の原因であると考えられる。
【０１９８】
本実施例における検討はハロタンによる肝障害はＰＧＥ１の投与によって軽減されることを明らかにした。また本実施例において検討した炎症・免疫に関連する遺伝子がハロタンによる肝障害の発症に関与する可能性が示唆された。マウスにＣｏｎ  Ａを投与するとＴＮＦαが放出され、ＴＮＦαがＭＩＰ−２を誘導することで肝臓への好中球の浸潤が増加すると言われており（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、本実施例においてもハロタンによる肝障害時にはＴＮＦαおよびＭＩＰ−２が誘導され、ＰＧＥ１によって障害を軽減した場合には誘導の抑制が認められた。ハロタンの投与によってＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３比やＩＦＮγ／ＩＬ−１０比が減少し、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスがＴｈ２側へと傾いていることが示唆されるにも関わらず、Ｔｈ１が産生すると言われている  （Ａｆｚａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）ＴＮＦαの発現量は本実施例においてハロタンの投与によって増加傾向にあった。このことからＴＮＦαがＴｈ１以外の細胞において誘導されている可能性およびＭＩＰ−２の誘導にはＴＮＦα以外の因子が関与することが示唆された。そこで、実施例４では、Ｔｈ１とは別のＴＮＦαを産生するＴ細胞であり、ＭＩＰ−２の誘導に関与しているＴｈ１７についてハロタンによる肝障害との関与を検討した。
【０１９９】
＜実施例４：ＩＬ−１７がハロタン誘導性肝障害に与える影響の検討＞
近年新たに発見されたＴｈ１およびＴｈ２とは異なるＴｈサブセットであるＴｈ１７はＩＬ−１７を産生することで様々な炎症反応と関連することが報告されている。Ｔｈ１７はＴｈ１やＴｈ２と互いに抑制し合う関係にあると言われており、ハロタンの投与によるＴｈ１サイトカインやＴｈ２サイトカインの変動によって何らかの影響を受けているまたはＴｈ１７サイトカインがＴｈ１やＴｈ２を変動させている可能性がある。またＴｈ１７はＴＮＦαを産生すること、ＩＬ−１７はＭＩＰ−２を誘導することが報告されている。Ｔｈ１７とハロタン誘導性肝障害との関連を明らかにするために、本実施例ではＴｈ１７によって主に産生されるＩＬ−１７を抗ＩＬ−１７モノクローナル抗体によって中和し、ハロタン誘導性肝障害に与える影響についての検討を行った。
【０２００】
（４−１−１）実験材料および実験試薬
Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−ＧＯ！  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃより購入した。抗マウスＩＬ−１７モノクローナル抗体５００  μｇおよびラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）より購入した。その他の試薬は上述の（１−１−１）に準じた。
【０２０１】
（４−１−２）ＥＬＩＳＡによる血漿中のＩＬ−１７タンパク質量の変動解析
上述の（１−１−２）および（３−１−２）で得られた全血から（１−１−３）の方法に従って血漿を調製し、Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−ＧＯ！  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）を用いて１−１−４の方法に従って血漿中のＩＬ−１７濃度の測定を行った。
【０２０２】
（４−１−３）マウスへの抗ＩＬ−１７抗体およびハロタンの投与
上述の（１−１−２）の方法に従ってＢＡＬＢ／ｃマウス（雌性、６週齢；日本ＳＬＣ）にハロタンを投与した。抗ＩＬ−１７抗体投与群およびＩｇＧ２ａ投与群にはハロタンの投与の９時間後に１００μｇ／ｍｏｕｓｅを単回腹腔内投与した。ハロタンの投与から２４時間後に下行大静脈より採血を行い上述の（４−１−４）で使用した。同時に肝臓を採取し、１．１５％塩化カリウム溶液で洗浄後、上述の（４−１−５）で使用した。
【０２０３】
（４−１−４）血漿中ＡＳＴおよびＡＬＴ値の測定
上述の（４−１−３）で得られた血漿中のＡＳＴおよびＡＬＴ値を上述の（１−１−３）の方法に従って測定した。
【０２０４】
（４−１−５）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
上述の（４−１−３）で得られた肝臓からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを上述の（１−１−５）の方法に従って調製した。
【０２０５】
（４−１−６）ＲＴ反応
上述の（４−１−５）で得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用い、上述の（１−１−６）の方法に従ってＲＴ反応を行った。
【０２０６】
（４−１−７）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
上述の（４−１−６）で得られたｃＤＮＡ試料を用い、上述の（１−１−７）の方法に従ってｍＲＮＡの定量を行った。
【０２０７】
（４−２）実験結果
（４−２−１）ＥＬＩＳＡによる血漿中のＩＬ−１７の定量
ハロタンの投与後２４時間のマウス血漿中のＩＬ−１７タンパク質量の変動をＥＬＩＳＡを用いて検討した。血漿中ＩＬ−１７濃度の平均値に標準偏差を付した結果を以下に示した（図１６）。
【０２０８】
ＢＡＬＢ／ｃマウスはハロタン投与後２４時間において対照群と比べ、血漿中のＩＬ−１７濃度の顕著な増加が認められた。一方Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてはハロタンの投与後２４時間において対照群との間に有意な違いは認められなかった。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるハロタン投与後２４時間の血漿中のＩＬ−１７濃度の上昇はハロタンの投与から６時間および９時間後にＰＧＥ１を投与することで有意に減少した。またハロタンの投与から１２時間後にＰＧＥ１を投与した場合には有意ではないが血漿中のＩＬ−１７濃度は減少する傾向にあった。
【０２０９】
（４−２−２）ハロタン投与マウスの血漿試料の生化学検査
ＢＡＬＢ／ｃマウスのハロタンおよび抗ＩＬ−１７抗体投与後の血漿試料中のＡＳＴおよびＡＬＴの平均値に標準偏差を付した結果を以下に示した（図１７）。
【０２１０】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてハロタン投与後２４時間で顕著なＡＳＴ値の増加が認められるが、ハロタンの投与から９時間後に抗ＩＬ−１７抗体を投与することによってＡＳＴ値は有意に減少した。一方ＩｇＧ２ａの投与ではＡＳＴ値に有意な変化は見られなかった。またＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてハロタン投与後２４時間で顕著なＡＬＴ値の増加が認められるが、ハロタンの投与から９時間後に抗ＩＬ−１７抗体を投与することによってＡＬＴ値は有意に減少した。一方ＩｇＧ２ａの投与ではＡＬＴ値に有意な変化は見られなかった。
【０２１１】
（４−２−３）ハロタン投与マウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの変動解析
ハロタン投与後２４時間のマウス肝における炎症・免疫に関与する遺伝子のｍＲＮＡの発現変動を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した。各サンプルについてＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−２およびβ−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの量を測定し、Ｔ−ｂｅｔ量にはＧＡＴＡ−３量を、ＩＦＮγ量にはＩＬ−１０量を、ＴＮＦαおよびＭＩＰ−２量にはβ−ａｃｔｉｎ量を補正に用いて対照群に対するＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３比、ＩＦＮγ／ＩＬ−１０比（図１８）、ＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎ比およびＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎ比（図１９）の平均値に標準偏差を付した結果を以下に示した。
【０２１２】
対照群に比べ、ハロタン投与群、ＩｇＧ２ａ投与群において肝臓のＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡの比の有意な減少が認められた。また抗ＩＬ−１７抗体投与群においても有意ではないがＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡの比の減少が認められた。しかしハロタン投与群とＩｇＧ２ａ投与群および抗ＩＬ−１７抗体投与群との間にＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡの比の有意な差は見られなかった。
【０２１３】
対照群に比べ、ハロタン投与群、ＩｇＧ２ａ投与群および抗ＩＬ−１７抗体投与群において肝臓のＩＦＮγ／ＩＬ−１０のｍＲＮＡの比の有意な減少が認められた。しかしハロタン投与群とＩｇＧ２ａ投与群および抗ＩＬ−１７抗体投与群との間にＩＦＮγ／ＩＬ−１０のｍＲＮＡの比の有意な差は見られなかった。
【０２１４】
対照群に比べ、ハロタン投与群およびＩｇＧ２ａ投与群においてＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比は増加する傾向にあった。ＩｇＧ２ａ投与群に比べ、抗ＩＬ−１７抗体投与群においてＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比の有意な減少が認められ、対照群と同程度となった。
【０２１５】
対照群に比べ、ハロタン投与群においてＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比は増加する傾向にあった。抗ＩＬ−１７抗体投与群においてＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比はハロタン投与群に比べ、減少する傾向にあったが、ＩｇＧ２ａ投与群ではそのような減少傾向は認められなかった。
【０２１６】
（４−３）結果の考察
ＩＬ−１７にはＩＬ−１７ＡからＩＬ−１７Ｆまでの６つのファミリー分子が存在することが知られている（Ｍｏｓｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａ）についてはこれまで様々な研究がなされており、ＩＬ−１７は感染性微生物から宿主を守る役割を果たすが（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、一方でＩＬ−１７の誘導はリウマチ性関節炎、結腸炎および多発性硬化症などの自己免疫性疾患との関連が示唆されている（Ｌａｎｇｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｋｏｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＩＬ−１７はＫＣ（ＣＸＣＬ１）、ＭＩＰ−２（ＣＸＣＬ２）およびＬＩＸ（ＣＸＣＬ５）などのケモカインを強く誘導すること（Ｐｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；  Ｒｕｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｗｉｔｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）および好中球の浸潤を促進させ様々な組織の炎症に関与することが報告されている（Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＩＬ−１７Ｆが様々な細胞から産生されるのに対し、ＩＬ−１７Ａの主な産生細胞はＴｈ１７であると言われている。
【０２１７】
Ｔｈ１およびＴｈ２とは異なるサブセットとして近年発見されたＴｈ１７は自己免疫性疾患、アレルギー疾患および細胞外増殖性細菌に対する応答などにおいて中心的な役割を果たしていることが明らかとなっており（Ｉｓｈｉｇａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、またこれまでＴｈ１病であると考えられてきたリウマチ性関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患および乾癬が実際はＴｈ１７に関連していることが報告されている（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＩＦＮγやＩＬ−４はＴｈ１７がＩＬ−１７を産生するのを抑制しており（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５ｂ）、ＩＬ−１７もＴｈ１およびＴｈ２サイトカインを抑制することからＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７は互いに制御し合う関係にあることが示唆されている（Ｓｃｈｎｙｄｅｒ−Ｃａｎｄｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０２１８】
本実施例に用いたＣ５７ＢＬ／６マウスとＢＡＬＢ／ｃマウスとではＴｈ１とＴｈ２の応答性に系統差があり、微生物の感染に対する抵抗性が異なること古くから知られているが（Ｈｅｉｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、Ｔｈ１７の応答に関する系統差については明らかになっていない。しかしＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスとではリウマチ性関節炎（Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｄａｈｌ，２００６）および多発性硬化症（Ｋｉｇｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）などの免疫性疾患の実験動物モデルの病態が異なることが報告されており、Ｔｈ１７の性質に違いがある可能性は十分に考えられる。また両マウスにおいてＴｈ１とＴｈ２の性質が異なることが、間接的にＴｈ１７の制御に異なる影響を与えているかも知れない。
【０２１９】
実施例３までにＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／ｃマウスとではハロタン誘導性肝障害の発症に系統差があり、感受性を示すＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて特にＴｈ１とＴｈ２の応答性がＴｈ２にシフトしている可能性があることを示してきた。しかしＴｈ２の応答が優位であるにも関わらず、Ｔｈ１によって産生すると言われているＴＮＦαの肝臓におけるｍＲＮＡの発現はハロタンを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて誘導される傾向にあり、Ｔｈ１以外の細胞によるＴＮＦαの発現が誘導されていることが示唆された。ＴＮＦαがＭＩＰ−２の誘導に関与することが報告されており（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、実施例１〜３においてＴＮＦαの下流の因子については検討を行っていないが、ハロタンを投与することで見られたＴＮＦαの誘導はＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて同程度であり、ＭＩＰ−２の顕著な誘導はＴＮＦαのみでは説明することはできないと考えられた。そこで本実施例ではＴＮＦαを発現し、ＩＬ−１７を介してＭＩＰ−２を含む様々なケモカインの誘導に関与するＴｈ１７について検討を行った。
【０２２０】
最初に肝臓にＴｈ１７が浸潤している可能性を考え、肝臓におけるＩＬ−１７およびＩＬ−１７ＦのｍＲＮＡの発現量の変化について検討を行ったがＩＬ−１７は測定条件を確立することができず、ＩＬ−１７Ｆについてはハロタンの投与によって顕著な変化はみられなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。ＲＯＲγｔはＴｈ１７のマスター遺伝子であると言われており  （Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、Ｔｈ１７への分化において中心的な役割を果たしているが胸腺以外の組織には発現しておらず、肝臓においてもＲＯＲγｔのｍＲＮＡの発現は確認されていない（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。本実施例ではハロタンの投与によって肝障害を誘導した場合には肝臓においてＩＬ−１７のｍＲＮＡの発現を確認できることを期待したが、それに反した結果となり、様々な細胞によって産生されるＩＬ−１７Ｆの発現のみ確認された。ＩＬ−１７ＦはＩＬ−１７ファミリーの中では最もＩＬ−１７と相同性が高いと言われているが、Ｔｈ１７関連疾患に対する寄与は低いと考えられており（Ｉｓｈｉｇａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、肝臓におけるＩＬ−１７およびＩＬ−１７ＦのｍＲＮＡに関する検討は保留とした。
【０２２１】
次にＥＬＩＳＡによる肝臓中および血漿中のＩＬ−１７タンパク質の検出を行い、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスに対してハロタンを投与することによる変動を検討した。肝臓のライゼートを調製し、ＥＬＩＳＡを行ったところ全てのサンプルにおいて定量限界である５００ｐｇ／ｍＬを超えてしまい、測定することができなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。組織中のサイトカインをＥＬＩＳＡによって測定することは難しく、報告が非常に限られているが、それは組織からの抽出に用いる界面活性剤の選択によって非常に影響を受けやすいためだと言われている（Ｍａｔａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。しかし本実施例においては抽出に界面活性剤は用いていないため、抽出効率は悪くなったことが予想されるが抗体の反応性に影響は与えていないと考えられる。肝臓においてＩＬ−１７タンパク質が非常に高濃度に存在している、または肝臓中にＥＬＩＳＡによる測定に影響を与える物質があるのかも知れない。一方、血漿中のＩＬ−１７タンパク質については、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてハロタン投与後２４時間で有意な増加が認められ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてはハロタンの投与による変動は認められなかった。血漿中のＩＬ−１７タンパク質はＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてのみ変動が見られ、ハロタンによる肝障害の発症または増悪に寄与している可能性が示唆された。
【０２２２】
ＩＬ−１７がＭＩＰ−２を誘導することで肝臓に好中球が浸潤し、ハロタン誘導性肝障害が発症または増悪するという仮説を検証するために抗マウスＩＬ−１７モノクローナル抗体をＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。ＬＰＳによって誘導した肺の炎症や虚血再灌流による肝障害において、抗ＩＬ−１７抗体はＭＩＰ−２などのケモカインの誘導や好中球の浸潤を抑制することが報告されている（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。その他いくつかの報告を参考に抗ＩＬ−１７抗体の投与方法を決定した  （Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５ｂ）。
【０２２３】
本実施例においてハロタン誘導性肝障害を発症するＢＡＬＢ／ｃマウスに抗ＩＬ−１７抗体を投与することによって血漿中のＡＳＴおよびＡＬＴが有意に減少することを明らかにした。一方、ＩｇＧ２ａの投与ではＡＳＴおよびＡＬＴの有意な減少は見られなかった。よってハロタン誘導性肝障害の軽減は抗ＩＬ−１７抗体に特異的な事象であり、ＩＬ−１７はハロタンによる肝障害の誘導に関与することが示された。本実施例においてハロタンの投与後に抗ＩＬ−１７抗体を投与することで肝臓のＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡの比やＩＦＮγ／ＩＬ−１０のｍＲＮＡの比に有意な変化は認められなかった。実施例１において、これらの比がハロタンの投与後３時間から減少することが示されており、抗ＩＬ−１７抗体を投与しても変動が見られないのは抗体の投与が遅かったためかも知れない。しかし血漿中のＩＬ−１７タンパク質はハロタンの投与後３、６および１２時間では変動が見られなかったことから（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）、Ｔｈ１とＴｈ２の変動はＩＬ−１７以外の経路によって誘導されたため、抗体による影響が現れなかったとも考えられる。一方、抗ＩＬ−１７抗体の投与によって肝臓のＴＮＦα／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比はＩｇＧ２ａ投与に比べ有意に減少しており、ハロタンの投与によるＴＮＦαの発現の変動はＴｈ１ではなくＴｈ１７に由来することが示唆された。また肝臓のＭＩＰ−２／β−ａｃｔｉｎのｍＲＮＡの比も抗ＩＬ−１７抗体の投与によって減少傾向にあり、ＩＬ−１７によって誘導されたＭＩＰ−２がハロタンによる肝障害に関与することが示唆された。抗ＩＬ−１７抗体を投与したマウスについて肝障害の程度とＭＩＰ−２のｍＲＮＡの発現量を個体ごとに評価すると、ＭＩＰ−２のｍＲＮＡの誘導が強く抑制されたマウスほどＡＳＴおよびＡＬＴが低値を示しており（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）、ＭＩＰ−２が肝障害の発症または増悪に寄与するという仮説を支持していた。ＩＬ−１７によって誘導される他のケモカインについてもＭＩＰ−２と同様に変動し、肝障害に寄与している可能性がある。今回、抗ＩＬ−１７抗体の投与時間の詳細な検討を行っていないため、適切な時間に投与することでハロタンによる肝障害を、より軽減できると考えられる。
【０２２４】
血漿中のＩＬ−１７タンパク質、肝臓中のＴＮＦαおよびＭＩＰ−２のｍＲＮＡは、実施例１で見られたＴｈ１とＴｈ２の変動の後で誘導されており、ハロタンによるＩＬ−１７、ＴＮＦαおよびＭＩＰ−２の誘導はＴｈ１とＴｈ２の影響を受けている可能性が示唆された。また抗ＩＬ−１７抗体を用いた検討によってハロタンによる肝障害の誘導に対してＩＬ−１７が寄与することが明らかとなった。ＩＬ−１７を主に産生するＴｈ１７の系統差の存在は明らかとはされていないが、ＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスのハロタンに対する感受性の違いはＴｈ１７の応答性に系統差があることを示唆している。野生型のマウスにおいてはＢＡＬＢ／ｃマウスがハロタンによって肝障害を発症し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスが耐性を示すがＣ５７ＢＬ／６マウスのＩＬ−１０をノックアウトすることで肝障害が発症するようになり、また遺伝子組み換えＩＬ−１０タンパク質を野生型のＢＡＬＢ／ｃマウスに投与すると肝障害が軽減されることが報告されている（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。またＩＬ−１０はＴｈ１７サイトカインの産生を抑制すると言われており  （Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、これらの報告は本実施例において明らかとなったハロタン誘導性肝障害に対するＩＬ−１７の関与を支持していると考えられる。
【０２２５】
虚血再灌流による肝障害、アルコール性肝炎、αナフチルイソチオシアネートおよびアセトアミノフェンによる肝障害などが好中球の浸潤によって引き起こされる、または悪化することが報告されており（Ｒａｍａｉａｈ  ａｎｄ  Ｊａｅｓｃｈｋｅ，２００７）、さらにラニチジン投与によってヒトで発症する個体特異的な肝障害の実験モデルラットにおいても好中球の浸潤が認められている（Ｌｕｙｅｎｄｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。虚血再灌流による肝障害についてはＩＬ−１７が関与することを示唆した研究がなされており（Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、ヒトにおける個体特異的な肝障害とＩＬ−１７が関与する可能性が示唆される。また血清中のＩＬ−１７がヒトにおける急性肝障害の有用なマーカーとなり得ること（Ｙａｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）が報告されており、肝障害に対するＩＬ−１７の重要性を支持している。
【０２２６】
しかしＴｈ１７の分化についてヒトとマウスとでは完全に異なっていると言われており（Ａｃｏｓｔａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、この他にもＴｈ１７の性質については様々な種差の存在が報告されている（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，２００８）。よって実験動物で得られた結果をヒトへ外挿する場合にはこのような種差に関して考慮しなければならないと考えられる。
【０２２７】
ヒトおよびマウスにおいてハロタンによる肝障害時に様々な自己抗体が生成されるが、血清から自己抗体が検出されるのは肝障害の発症後であり、ハロタンによる肝障害は自己抗体の生成とは異なるメカニズムによって誘導されることが示唆されている（Ｎｊｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ハロタンによる肝障害の発症は複数回曝露の例が多いことから、自己抗体は肝障害の発症ではなく増悪に寄与しているのかも知れない。本研究ではハロタンによる急性肝障害動物モデルにおいてＩＬ−１７を介したメカニズムの存在を明らかにしており、肝障害の発症に対するＴｈ１７の寄与が考えられる。
【０２２８】
ＩＬ−１７の上流にはｓｔａｔ−３やＲＯＲγｔなどの転写因子や核内受容体があり（Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；  Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、下流にはｐ３８  ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、Ｃ／ＥＢＰ、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１など様々な経路が存在しており、遺伝子の発現を調節している（Ｃｏｒｔｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。またｐ３８  ＭＡＰＫとＮＦ−κＢはＩＬ−１０ノックアウトマウスにハロタンを投与することで活性化されることがわかっている（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ｐ３８  ＭＡＰＫおよびＮＦ−κＢ  がＭＩＰ−２の誘導に関与することが報告されており（Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｇａｌｌｏｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、これらの経路のハロタンによる肝障害への寄与が考えられる。ＩＬ−１７に関連する様々な因子について検討することで様々な肝障害のメカニズムが明らかになるのではないかと考えられる。
【０２２９】
＜実施例１〜４の総括＞
薬物誘導性肝障害は医薬品の開発が中止となる主要な原因であり、多くの医薬品が肝障害に関連すると言われている。しかしアセトアミノフェンの過剰投与による肝障害のように古くから研究がなされているものを除き、そのメカニズムは断片的にしか明らかにされていない。また非臨床試験で用いられる実験動物とヒトとの間にある種差およびヒトにおける個体差が薬物誘導性肝障害の発症の予測を困難にしている。免疫担当細胞であるＴ細胞の機能の違いが様々な疾患の発症に関連していると考えられるが、薬物誘導性肝障害の種差や系統差については、一部の薬物についてのみ研究がなされているに過ぎない。
【０２３０】
実施例１ではハロタンによる肝障害モデル動物の作成、肝組織像の評価および炎症や免疫に関連した遺伝子の発現変動について検討した。ハロタンに対し高い感受性を示すＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて肝組織の障害、好中球の浸潤、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスの変化およびＭＩＰ−２の発現の顕著な誘導が認められた。
【０２３１】
実施例２ではハロタンによる肝障害に対する脾臓細胞の寄与を調べるために初代培養脾臓細胞のＩＦＮγおよびＩＬ−４の産生能の変化をマイトジェンに対する応答性を測定することで評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて脾臓細胞のＩＦＮγおよびＩＬ−４の産生能はハロタンの投与によって減少することを示唆する結果となり、脾臓に由来するこれらサイトカインの肝障害に対する寄与は低いと考えられた。
【０２３２】
実施例３ではＰＧＥ１をＢＡＬＢ／ｃマウスに投与することでＴｈ１とＴｈ２のバランスや好中球の浸潤が変化し、肝障害の程度に影響が現れるかについて検討した。ＰＧＥ１の投与によって肝障害の軽減、好中球の浸潤の抑制、変動していたＴｈ１とＴｈ２のバランスの回復およびＭＩＰ−２の誘導の抑制が認められた。Ｔｈ１とＴｈ２のバランスおよび好中球の肝臓への浸潤については肝障害の発症に関わることが報告されている（Ｒａｍａｉａｈ  ａｎｄ  Ｊａｅｓｃｈｋｅ，２００７；Ｍｏｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０２３３】
実施例４ではハロタンによる肝障害に対するＩＬ−１７の影響について検討した。抗ＩＬ−１７抗体によるＩＬ−１７の中和はＭＩＰ−２の発現を抑制し、肝障害を軽減することが明らかとなった。
【０２３４】
図２０は、実施例１〜４の実験結果によって解明されたハロタンによって誘導される肝障害のメカニズムについて説明するための概念図である。この図に示すように、実施例１〜４によってハロタン誘導性肝障害の発症にはＴｈ１とＴｈ２のバランスの変動およびＩＬ−１７を介したＭＩＰ−２の誘導による好中球の肝臓への浸潤が関与しており、これらの変動はＰＧＥ１の投与によって抑制されることを明らかにした。実施例１〜４は薬物誘導性肝障害のメカニズムの解明に寄与すると考えられる。
【０２３５】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０２３６】
たとえば、上記実施例では、哺乳動物としてマウスを用いたが、特に限定する趣旨ではなく、哺乳動物であれば、ヒト、ラット、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ブタなどをはじめとする任意の種について、同様の実験を行えば、同様の結果を得ることができることは、生化学、医学、薬学などの技術分野の研究者であれば技術常識に基づいて容易に理解できることが明らかである。
【０２３７】
＜参考文献＞
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【０２３８】
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Ａｋａｍａｔｓｕ  Ｋ，  Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｙ，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｍ，  Ｔａｋａｋｕｒａ  Ｙ，  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｄａ  Ｍ  （２００１）  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ１  ｕｓｉｎｇ  ｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙ（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）  ａｓ  ａ  ｃａｒｒｉｅｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６２：  １５３１−１５３６．
【０２４１】
Ｂａｊｔ  ＭＬ，  Ｋｎｉｇｈｔ  ＴＲ，  Ｌｅｍａｓｔｅｒｓ  ＪＪ，  ａｎｄ  Ｊａｅｓｃｈｋｅ  Ｈ  （２００４）  Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｘｉｄａｎｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ８０：  ３４３−３４９．
【０２４２】
Ｂｏｕｒｄｉ  Ｍ，  Ｃｈｅｎ  Ｗ，  Ｐｅｔｅｒ  ＲＭ，  Ｍａｒｔｉｎ  ＪＬ，  Ｂｕｔｅｒｓ  ＪＴ，  Ｎｅｌｓｏｎ  ＳＤ，  ａｎｄ  Ｐｏｈｌ  ＬＲ  （１９９６）  Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｅ１  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈａｌｏｔｈａｎｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ９：  １１５９−１１６６．
【０２４３】
Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ＣＣ，  Ｏｋａｙａ  Ｔ，  Ｍａｒｔｉｇｎｏｎｉ  Ａ，  Ｈｕｓｔｅｄ  Ｔ，  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  Ｒ，  ａｎｄ  Ｌｅｎｔｓｃｈ  ＡＢ  （２００５）  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８９：  Ｇ９６９−９７６．
【０２４４】
Ｃｈａｋｉｒ  Ｈ，  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  ＤＥ，  Ｗｅｂｂ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ  ＦＷ  （２００３）  Ｔ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３  ｒａｔｉｏ  ａｓ  ａ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｍｉｘｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＧＡＴＡ−３．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７８：  １５７−１６９．
【０２４５】
Ｃｏｒｔｅｚ  ＤＭ，  Ｆｅｌｄｍａｎ  ＭＤ，  Ｍｕｍｍｉｄｉ  Ｓ，  Ｖａｌｅｎｔｅ  ＡＪ，  Ｓｔｅｆｆｅｎｓｅｎ  Ｂ，  Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  Ｍ，  Ｂａｒｎｅｓ  ＪＬ，  ａｎｄ  Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒ  Ｂ  （２００７）  ＩＬ−１７  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ＭＭＰ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｖｉａ  ｐ３８  ＭＡＰＫ−  ａｎｄ  ＥＲＫ１／２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃ／ＥＢＰ−β，  ＮＦ−κＢ，  ａｎｄ  ＡＰ−１  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９３：  Ｈ３３５６−３３６５．
【０２４６】
Ｃｏｕｓｉｎｓ  ＭＪ，  Ｐｌｕｍｍｅｒ  ＪＬ，  ａｎｄ  Ｈａｌｌ  ＰＤ  （１９８９）  Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈａｌｏｔｈａｎｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ａｕｓｔ  Ｎ  Ｚ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ５９：  ５−１４．
【０２４７】
Ｄａｎｉｅｌ  Ｃ，  Ｓａｒｔｏｒｙ  ＮＡ，  Ｚａｈｎ  Ｎ，  Ｒａｄｅｋｅ  ＨＨ，  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ  ＪＭ  （２００８）  Ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ａ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  （Ｔｈ）  １／Ｔｈ１７  ｔｏ  ａ  Ｔｈ２  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｆｉｌｅ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３２４：  ２３−３３．
【０２４８】
Ｆｅｎｇ  Ｄ，  Ｗａｎｇ  Ｙ，  Ｘｕ  Ｙ，  Ｌｕｏ  Ｑ，  Ｌａｎ  Ｂ，  ａｎｄ  Ｘｕ  Ｌ  （２００９）  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １０  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ  ｈａｌｏｔｈａｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７７：  ２７７−２８４．
【０２４９】
Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  Ｓ，  Ｂｏｎｎｅａｕ  Ｏ，  Ｄｕｂｏｉｓ  ＧＲ，  Ｊｏｎｅｓ  ＣＥ，  ａｎｄ  Ｔｒｉｆｉｌｉｅｆｆ  Ａ  （２００３）  ＩＬ−１７，  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｉｒｗａｙ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉａ：  ＩＬ−１５  ａｓ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｔｒｉｇｇｅｒ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：  ２１０６−２１１２．
【０２５０】
Ｆｉｎｏｔｔｏ  Ｓ，  Ｎｅｕｒａｔｈ  ＭＦ，  Ｇｌｉｃｋｍａｎ  ＪＮ，  Ｑｉｎ  Ｓ，  Ｌｅｈｒ  ＨＡ，  Ｇｒｅｅｎ  ＦＨ，  Ａｃｋｅｒｍａｎ  Ｋ，  Ｈａｌｅｙ  Ｋ，  Ｇａｌｌｅ  ＰＲ，  Ｓｚａｂｏ  ＳＪ，  Ｄｒａｚｅｎ  ＪＭ，  Ｄｅ  Ｓａｎｃｔｉｓ  ＧＴ，  ａｎｄ  Ｇｌｉｍｃｈｅｒ  ＬＨ  （２００２）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｉｒｗａｙ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ａｓｔｈｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｔ−ｂｅｔ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：  ３３６−３３８．
【０２５１】
Ｆｕｋｕｎａｇａ  Ｊ，  Ａｂｅ  Ｍ，  Ｍｕｒａｉ  Ａ，  Ａｋｉｔａｋｅ  Ｙ，  Ｈｏｓｏｋａｗａ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｍ  （２００７）  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｔｏ  ｅｌｕｃｉｄａｔｅ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ  ｍｏｕｓｅ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７：  １８５２−１８６１．
【０２５２】
Ｆｕｒｓｔ  ＳＭ，  Ｌｕｅｄｋｅ  Ｄ，  ａｎｄ  Ｇａｎｄｏｌｆｉ  ＡＪ  （１９９７）  Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈａｌｏｔｈａｎｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇｓ  ｃａｒｒｙ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄｄｕｃｔｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １２０：  １１９−１３２．
【０２５３】
Ｇａｌｌｏｗａｙ  Ｅ，  Ｓｈｉｎ  Ｔ，  Ｈｕｂｅｒ  Ｎ，  Ｅｉｓｍａｎｎ  Ｔ，  Ｋｕｂｏｋｉ  Ｓ，  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  Ｒ，  Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  Ｊ，  Ｗｏｎｇ  ＨＲ，  ａｎｄ  Ｌｅｎｔｓｃｈ  ＡＢ  （２００８）  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７２．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９５：  Ｃ５１４−５２０．
【０２５４】
Ｇｕ  Ｙ，  Ｙａｎｇ  Ｊ，  Ｏｕｙａｎｇ  Ｘ，  Ｌｉｕ  Ｗ，  Ｌｉ  Ｈ，  Ｙａｎｇ  Ｊ，  Ｂｒｏｍｂｅｒｇ  Ｊ，  Ｃｈｅｎ  ＳＨ，  Ｍａｙｅｒ  Ｌ，  Ｕｎｋｅｌｅｓｓ  ＪＣ，  ａｎｄ  Ｘｉｏｎｇ  Ｈ  （２００８）  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １０  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｔｈ１７  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３８：  １８０７−１８１３．
【０２５５】
Ｈａｌｌｑｕｉｓｔ  Ｎ，  Ｈａｋｋｉ  Ａ，  Ｗｅｃｋｅｒ  Ｌ，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｓ  Ｓ  （２０００）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ  ｏｎ  ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１−  ｖｅｒｓｕｓ  Ｔｈ２−ｔｙｐｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２２４：  １４１−１４６．
【０２５６】
Ｈａｍｒａ  ＪＧ  ａｎｄ  Ｙａｋｓｈ  ＴＬ  （１９９６）  Ｈａｌｏｔｈａｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ  １８：  ３２３−３３６．
【０２５７】
Ｈａｔａｎｏ  Ｍ，  Ｓａｓａｋｉ  Ｓ，  Ｏｈａｔａ  Ｓ，  Ｓｈｉｒａｔｓｕｃｈｉ  Ｙ，  Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｔ，  Ｎａｇａｔａ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｙ  （２００８）  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５１：  ２５−３０．
【０２５８】
Ｈｅ  ＹＷ，  Ｄｅｆｔｏｓ  ＭＬ，  Ｏｊａｌａ  ＥＷ，  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ  ＭＪ  （１９９８）  ＲＯＲγｔ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＩＬ−２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：  ７９７−８０６．
【０２５９】
Ｈｅｉｎｚｅｌ  ＦＰ，  Ｓａｄｉｃｋ  ＭＤ，  Ｈｏｌａｄａｙ  ＢＪ，  Ｃｏｆｆｍａｎ  ＲＬ，  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｓｌｅｙ  ＲＭ  （１９８９）  Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎγ  ｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６９：  ５９−７２．
【０２６０】
Ｈｏｅｔ  Ｐ，  Ｂｕｃｈｅｔ  ＪＰ，  Ｓｅｍｐｏｕｘ  Ｃ，  Ｈａｕｆｒｏｉｄ  Ｖ，  Ｒａｈｉｅｒ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｌｉｓｏｎ  Ｄ  （２００２）  Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２，２−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−１，１，１−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈａｎｅ  （ＨＣＦＣ−１２３）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｉｎ  ｇｕｉｎｅａ−ｐｉｇｓ．  Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ７６：  ７０７−７１４．
【０２６１】
Ｈｏｎｇ  ＪＹ，  Ｆ  Ｓａｔｏ  Ｅ，  Ｈｉｒａｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｅ  Ｍ  （２００７）  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｊａｕｎｄｉｃｅ：  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ，  Ｓｐｌｅｎｉｃ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｆｌｏｒａ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｎｕｔｒ  ４０：  １８４−１９３．
【０２６２】
Ｈｏｓｓａｉｎ  ＭＡ，  Ｉｚｕｉｓｈｉ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｍａｅｔａ  Ｈ  （２００３）  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ１  ｏｎ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ  ｉｎ  ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ２７：  １１５５−１１６０．
【０２６３】
Ｈｕａｎｇ  Ｗ，  Ｎａ  Ｌ，  Ｆｉｄｅｌ  ＰＬ，  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｐ  （２００４）  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７Ａ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｔｉ−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９０：  ６２４−６３１．
【０２６４】
Ｈｕｎｇ  ＣＣ，  Ｃｈａｎｇ  ＣＴ，  Ｔｉａｎ  ＹＣ，  Ｗｕ  ＭＳ，  Ｙｕ  ＣＣ，  Ｐａｎ  ＭＪ，  Ｖａｎｄｅｗａｌｌｅ  Ａ，  ａｎｄ  Ｙａｎｇ  ＣＷ  （２００６）  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｎａｌ  ｔｕｂｕｌｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ａｎｄ  ｐ３８  ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２１：  ８９８−９１０．
【０２６５】
Ｉｓｈｉｇａｍｅ  Ｈ，  Ｋａｋｕｔａ  Ｓ，  Ｎａｇａｉ  Ｔ，  Ｋａｄｏｋｉ  Ｍ，  Ｎａｍｂｕ  Ａ，  Ｋｏｍｉｙａｍａ  Ｙ，  Ｆｕｊｉｋａｄｏ  Ｎ，  Ｔａｎａｈａｓｈｉ  Ｙ，  Ａｋｉｔｓｕ  Ａ，  Ｋｏｔａｋｉ  Ｈ，  Ｓｕｄｏ  Ｋ，  Ｎａｋａｅ  Ｓ，  Ｓａｓａｋａｗａ  Ｃ，  ａｎｄ  Ｉｗａｋｕｒａ  Ｙ  （２００９）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７Ａ  ａｎｄ  −１７Ｆ  ｉｎ  ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｃｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３０：  １０８−１１９．
【０２６６】
Ｉｖａｎｏｖ  ＩＩ，  ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ＢＳ，  Ｚｈｏｕ  Ｌ，  Ｔａｄｏｋｏｒｏ  ＣＥ，  Ｌｅｐｅｌｌｅｙ  Ａ，  Ｌａｆａｉｌｌｅ  ＪＪ，  Ｃｕａ  ＤＪ，  ａｎｄ  Ｌｉｔｔｍａｎ  ＤＲ  （２００６）  Ｔｈｅ  ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＯＲγｔ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ＩＬ−１７＋  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  １２６：  １１２１−１１３３．
【０２６７】
Ｊａｅｓｃｈｋｅ  Ｈ  ａｎｄ  Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｔ  （２００６）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｔ  ２６：  ９１２−９１９．
【０２６８】
Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＲＥ，  Ｋｉｔｔｅｒｉｎｇｈａｍ  ＮＲ，  Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ＣＥ，  Ｄｏｗｄａｌｌ  ＳＭ，  Ｈａｍｌｅｔｔ  Ｊ，  Ｌａｎｅ  ＣＳ，  Ｂｏｅｒｍａ  ＪＳ，  Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  ＮＰ，  ａｎｄ  Ｐａｒｋ  ＢＫ  （２００８）  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｐｉ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８：  ３０１−３１５．
【０２６９】
Ｊｉａｎｇ  Ｈ，  Ｍｅｎｇ  Ｆ，  Ｌｉ  Ｗ，  Ｔｏｎｇ  Ｌ，  Ｑｉａｏ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｓｕｎ  Ｘ  （２００７）  Ｓｐｌｅｎｅｃｔｏｍｙ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ａｃｕｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｉｖｅｒ  ｗａｒｍ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １４１：  ３２−４０．
【０２７０】
Ｋａｎｇ  ＢＹ，  Ｓｏｎｇ  ＹＪ，  Ｋｉｍ  ＫＭ，  Ｃｈｏｅ  ＹＫ，  Ｈｗａｎｇ  ＳＹ，  ａｎｄ  Ｋｉｍ  ＴＳ  （１９９９）  Ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｈ１  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １２８：  ３８０−３８４．
【０２７１】
Ｋａｙａｎｏ  Ｋ，  Ｓａｋａｉｄａ  Ｉ，  Ｋｕｂｏｔａ  Ｍ，  Ｙａｓｕｎａｇａ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｏｋｉｔａ  Ｋ  （１９９５）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：  ＬＰＳ  ｕｐｔａｋｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｗｉｔｈ  ＴＮＦα  ｒｅｌｅａｓｅ．  Ｌｉｖｅｒ  １５：  ２５３−２５９．
【０２７２】
Ｋｅｌｌｙ  ＭＮ，  Ｋｏｌｌｓ  ＪＫ，  Ｈａｐｐｅｌ  Ｋ，  Ｓｃｈｗａｒｔｚｍａｎ  ＪＤ，  Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｐ，  Ｃｏｍｂｅ  Ｃ，  Ｍｏｒｅｔｔｏ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｋｈａｎ  ＩＡ  （２００５）  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７３：  ６１７−６２１．
【０２７３】
Ｋｅｎｎａ  ＪＧ，  Ｍａｒｔｉｎ  ＪＬ，  ａｎｄ  Ｐｏｈｌ  ＬＲ  （１９９２）  Ｔｈｅ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈａｌｏｔｈａｎｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｒａｔｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４４：  ６２１−６２９．
【０２７４】
Ｋｈａｒａｓｃｈ  ＥＤ，  Ｈａｎｋｉｎｓ  Ｄ，  Ｍａｕｔｚ  Ｄ，  ａｎｄ  Ｔｈｕｍｍｅｌ  ＫＥ  （１９９６）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｈａｌｏｔｈａｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｌｏｔｈａｎｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３４７：  １３６７−１３７１．
【０２７５】
Ｋｉｄｄ  Ｐ  （２００３）  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｂａｌａｎｃｅ：  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ，  ｉｔｓ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｌｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  Ｒｅｖ  ８：  ２２３−２４６．
【０２７６】
Ｋｉｇｅｒｌ  ＫＡ，  ＭｃＧａｕｇｈｙ  ＶＭ，  ａｎｄ  Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＰＧ  （２００６）  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｅｓｉｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｏｕｒ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４９４：  ５７８−５９４．
【０２７７】
Ｋｏｍｉｙａｍａ  Ｙ，  Ｎａｋａｅ  Ｓ，  Ｍａｔｓｕｋｉ  Ｔ，  Ｎａｍｂｕ  Ａ，  Ｉｓｈｉｇａｍｅ  Ｈ，  Ｋａｋｕｔａ  Ｓ，  Ｓｕｄｏ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｉｗａｋｕｒａ  Ｙ  （２００６）  ＩＬ−１７  ｐｌａｙｓ  ａｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７：  ５６６−７３．
【０２７８】
Ｋｏｔａｋｅ  Ｓ，  Ｕｄａｇａｗａ  Ｎ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ，  Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  Ｋ，  Ｉｔｏｈ  Ｋ，  Ｉｓｈｉｙａｍａ  Ｓ，  Ｓａｉｔｏ  Ｓ，  Ｉｎｏｕｅ  Ｋ，  Ｋａｍａｔａｎｉ  Ｎ，  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ＭＴ，  Ｍａｒｔｉｎ  ＴＪ，  ａｎｄ  Ｓｕｄａ  Ｔ  （１９９９）  ＩＬ−１７  ｉｎ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０３：  １３４５−１３５２．
【０２７９】
Ｋｒｅｍｅｒ  Ｍ，  Ｈｉｎｅｓ  ＩＮ，  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＪ，  ａｎｄ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＭＤ  （２００６）  Ｆａｖｏｒｅｄ  Ｔ  Ｈｅｌｐｅｒ  １  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｓｔｅａｔｏｓｉｓ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４４：  ２１６−２２７．
【０２８０】
Ｌａａｎ  Ｍ，  Ｃｕｉ  ＺＨ，  Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｈ，  Ｌｏｔｖａｌｌ  Ｊ，  Ｓｊｏｓｔｒａｎｄ  Ｍ，  Ｇｒｕｅｎｅｒｔ  ＤＣ，  Ｓｋｏｏｇｈ  ＢＥ，  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｅｎ  Ａ  （１９９９）  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１７  ｖｉａ  Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｉｒｗａｙｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：  ２３４７−２３５２．
【０２８１】
Ｌａｎｇｒｉｓｈ  ＣＬ，  Ｃｈｅｎ  Ｙ，  Ｂｌｕｍｅｎｓｃｈｅｉｎ  ＷＭ，  Ｍａｔｔｓｏｎ  Ｊ，  Ｂａｓｈａｍ  Ｂ，  Ｓｅｄｇｗｉｃｋ  ＪＤ，  ＭｃＣｌａｎａｈａｎ  Ｔ，  Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ  ＲＡ，  ａｎｄ  Ｃｕａ  ＤＪ  （２００５）  ＩＬ−２３  ｄｒｉｖｅｓ  ａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１：  ２３３−２４０．
【０２８２】
Ｌｉｎｄ  ＲＣ  ａｎｄ  Ｇａｎｄｏｌｆｉ  ＡＪ  （１９９７）  Ｌａｔｅ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｋｉｄｎｅｙ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １４２：  ２０１−２０７．
【０２８３】
Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ  Ｓ，  Ｇｉｅｒｅｒ  Ｃ，  ａｎｄ  Ｄａｒｉｕｓ  Ｈ  （２００３）  Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ９８：  ８−１５．
【０２８４】
Ｌｕｙｅｎｄｙｋ  ＪＰ，  Ｍａｄｄｏｘ  ＪＦ，  Ｃｏｓｍａ  ＧＮ，  Ｇａｎｅｙ  ＰＥ，  Ｃｏｃｋｅｒｅｌｌ  ＧＬ，  ａｎｄ  Ｒｏｔｈ  ＲＡ  （２００３）  Ｒａｎｉｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ａ  ｍｏｄｅｓｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ  ｉｄｉｏｓｙｎｃｒａｓｙ−ｌｉｋｅ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３０７：  ９−１６．
【０２８５】
Ｍａｄａｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  Ａ  （１９９６）  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＮＡＤＰＨ−ＤＥＰＥＭＤＥＮＴ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＯＦ  ［１４Ｃ］ＨＡＬＯＴＨＡＮＥ  ＴＯ  ＨＵＭＡＮ  ＬＩＶＥＲ  ＭＩＣＲＯＳＯＭＥＳ：  Ａ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０２Ｅ１  ａｔ  Ｌｏｗ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ２４：  １３０７−１３１３．
【０２８６】
Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ  Ｙ，  Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｈｏｒｉｅ  Ｔ  （２００８）  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ａｓ  ａ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
【０２８７】
Ｍａｔａｌｋａ  ＫＺ，  Ｔｕｔｕｎｊｉ  ＭＦ，  Ａｂｕ−Ｂａｋｅｒ  Ｍ，  ａｎｄ  Ａｂｕ  Ｂａｋｅｒ  Ｙ  （２００５）  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｉｌｉｅｕ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．  Ｎｅｕｒｏ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２６：  ２３１−２３６．
【０２８８】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｐｒａｕｓｅ  Ｏ，  Ｓｊｏｓｔｒａｎｄ  Ｍ，  Ｌａａｎ  Ｍ，  Ｌｏｔｖａｌｌ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｅｎ  Ａ  （２００３）  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＩＬ−１７  ａｓ  ａ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｉｒｗａｙｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：  ４６６５−４６７２．
【０２８９】
Ｍｉｚｕｈａｒａ  Ｈ，  Ｋｕｎｏ  Ｍ，  Ｓｅｋｉ  Ｎ，  Ｙｕ  ＷＧ，  Ｙａｍａｏｋａ  Ｍ，  Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｍ，  Ｏｇａｗａ  Ｔ，  Ｋａｎｅｄａ  Ｋ，  Ｆｕｊｉｉ  Ｔ，  Ｓｅｎｏｈ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｈ  （１９９８）  Ｓｔｒａｉｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｇａｍｍａ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：  ５１３−５１９．
【０２９０】
Ｍｏｋｕｎｏ  Ｙ，  Ｔａｋａｎｏ  Ｍ，  Ｍａｔｓｕｇｕｃｈｉ  Ｔ，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｈ，  Ｗａｓｈｉｚｕ  Ｊ，  Ｎａｉｋｉ  Ｙ，  Ｎｉｍｕｒａ  Ｙ，  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｋａｉ  Ｙ  （１９９９）  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ１  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｔｈ２−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３０：  １４６４−１４７２．
【０２９１】
Ｍｏｓｅｌｅｙ  ＴＡ，  Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄ  ＤＲ，  Ｒｏｓｅ  Ｌ，  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｉ  ＡＨ  （２００３）  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｆａｍｉｌｙ  ａｎｄ  ＩＬ−１７  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １４：  １５５−１７４．
【０２９２】
Ｍｏｓｍａｎｎ  ＴＲ  ａｎｄ  Ｓａｄ  Ｓ  （１９９６）  Ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｕｎｉｖｅｒｓｅ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ：  Ｔｈ１，  Ｔｈ２  ａｎｄ  ｍｏｒｅ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １７：  １３８−１４６．
【０２９３】
Ｍｏｓｍａｎｎ  ＴＲ，  Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ  Ｈ，  Ｂｏｎｄ  ＭＷ，  Ｇｉｅｄｌｉｎ  ＭＡ，  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｍａｎ  ＲＬ  （１９８６）  Ｔｗｏ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅ．  Ｉ．  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３６：  ２３４８−２３５７．
【０２９４】
Ｍｏｕｌｔ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｌｏｃｋ  Ｓ  （１９７５）  Ｈａｌｏｔｈａｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｗｅｎｔｙ−ｓｉｘ  ｃａｓｅｓ．  Ｑ  Ｊ  Ｍｅｄ  ４４：  ９９−１１４．
【０２９５】
Ｍｕｒｕｖｅ  ＤＡ，  Ｂａｒｎｅｓ  ＭＪ，  Ｓｔｉｌｌｍａｎ  ＩＥ，  ａｎｄ  Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ  ＴＡ  （１９９９）  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒａｐｉｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：  ９６５−９７６．
【０２９６】
Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ，  Ｏｋａｄａ  Ｍ，  Ｙｏｎｅｄａ  Ｍ，  Ｔａｋａｍｏｔｏ  Ｓ，  Ｎａｋａｄｅ  Ｙ，  Ｔａｍｏｒｉ  Ｋ，  Ａｓｏ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｍａｋｉｎｏ  Ｉ  （２００１）  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｐｌａｙｓ  ａ  ｐｉｖｏｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ３５：  ２１７−２２４．
【０２９７】
Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｇｈａｆｆａｒ  Ｏ，  Ｏｌｉｖｅｎｓｔｅｉｎ  Ｒ，  Ｔａｈａ  ＲＡ，  Ｓｏｕｓｓｉ−Ｇｏｕｎｎｉ  Ａ，  Ｚｈａｎｇ  ＤＨ，  Ｒａｙ  Ａ，  ａｎｄ  Ｈａｍｉｄ  Ｑ  （１９９９）  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＡＴＡ−３  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ａｔｏｐｉｃ  ａｓｔｈｍａ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０３：  ２１５−２２２．
【０２９８】
Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ  ＫＳ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｄａｈｌ  Ｒ  （２００６）  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｓ  ＩＬ−４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３６：  １６０８−１６１８．
【０２９９】
Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  Ｍ，  Ｏｇｕｒａ  Ｈ，  Ｕｅｄａ  Ｎ，  Ｔｓｕｒｕｏｋａ  Ｍ，  Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  Ｃ，  Ｔｓｕｊｉ  Ｆ，  Ａｏｎｏ  Ｈ，  Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｋ，  Ｈｕｓｅｂｙ  Ｅ，  Ｂｅｔｚ  ＵＡ，  Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｈｉｒａｎｏ  Ｔ  （２００７）  ＩＬ−６−ｇｐ１３０−ＳＴＡＴ３  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＩＬ−１７＋  Ｔｈ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈａｔ  ｏｆ  Ｔｒｅｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：  ６９５−７０２．
【０３００】
Ｎｊｏｋｕ  ＤＢ，  Ｔａｌｏｒ  ＭＶ，  Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ  Ｄ，  Ｆｒｉｓａｎｃｈｏ−Ｋｉｓｓ  Ｓ，  Ｏｄｕｍａｄｅ  ＯＡ，  ａｎｄ  Ｒｏｓｅ  ＮＲ  （２００５）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｈａｐｔｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｏｕｓｅ．  Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ７８：  ８７−１００．
【０３０１】
Ｏｕｙａｎｇ  Ｗ，  Ｒａｎｇａｎａｔｈ  ＳＨ，  Ｗｅｉｎｄｅｌ  Ｋ，  Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  Ｄ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＴＬ，  Ｓｈａ  ＷＣ，  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ  ＫＭ  （１９９８）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＧＡＴＡ−３  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  ＩＬ−４−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：  ７４５−７５５．
【０３０２】
Ｐａｒｋ  ＢＫ，  Ｋｉｔｔｅｒｉｎｇｈａｍ  ＮＲ，  Ｍａｇｇｓ  ＪＬ，  Ｐｉｒｍｏｈａｍｅｄ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＤＰ  （２００５ａ）  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ４５：  １７７−２０２．
【０３０３】
Ｐａｒｋ  Ｈ，  Ｌｉ  Ｚ，  Ｙａｎｇ  ＸＯ，  Ｃｈａｎｇ  ＳＨ，  Ｎｕｒｉｅｖａ  Ｒ，  Ｗａｎｇ  ＹＨ，  Ｗａｎｇ  Ｙ，  Ｈｏｏｄ  Ｌ，  Ｚｈｕ  Ｚ，  Ｔｉａｎ  Ｑ，  ａｎｄ  Ｄｏｎｇ  Ｃ  （２００５ｂ）  Ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｏｆ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １７．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：  １１３３−１１４１．
【０３０４】
Ｐａｒｋ  ＨＪ，  Ｌｅｅ  ＣＭ，  Ｊｕｎｇ  ＩＤ，  Ｌｅｅ  ＪＳ，  Ｊｅｏｎｇ  ＹＩ，  Ｃｈａｎｇ  ＪＨ，  Ｃｈｕｎ  ＳＨ，  Ｋｉｍ  ＭＪ，  Ｃｈｏｉ  ＩＷ，  Ａｈｎ  ＳＣ，  Ｓｈｉｎ  ＹＫ，  Ｙｅｏｍ  ＳＲ，  ａｎｄ  Ｐａｒｋ  ＹＭ  （２００８）  Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｂａｌａｎｃｅ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｓｔｈｍａ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
【０３０５】
Ｐｒａｕｓｅ  Ｏ，  Ｌａａｎ  Ｍ，  Ｌｏｔｖａｌｌ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｅｎ  Ａ  （２００３）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＧＣＰ−２−，  ＧＲＯα  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４６２：  １９３−１９８．
【０３０６】
Ｒａｍａｉａｈ  ＳＫ  ａｎｄ  Ｊａｅｓｃｈｋｅ  Ｈ  （２００７）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ３５：  ７５７−７６６．
【０３０７】
Ｒｅｎｇａｒａｊａｎ  Ｊ，  Ｓｚａｂｏ  ＳＪ，  ａｎｄ  Ｇｌｉｍｃｈｅｒ  ＬＨ  （２０００）  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２１：  ４７９−４８３．
【０３０８】
Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ，  Ｎｅｚａｍｉｓ  ＪＥ，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｃ，  ａｎｄ  Ｈａｎｃｈａｒ  ＡＪ  （１９７９）  Ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｌｃｏｈｏｌ，  ＨＣｌ，  ＮａＯＨ，  ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ  ＮａＣｌ，  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ７７：  ４３３−４４３．
【０３０９】
Ｒｏｍａｇｎａｎｉ  Ｓ  （２００８）  Ｈｕｍａｎ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １０：  ２０６．
【０３１０】
Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎ  Ｓ，  Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  ＧＳ，  ａｎｄ  Ｂｏｙｌｅ  ＤＬ  （２００３）  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ．  Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：  １００２−１０１０．
【０３１１】
Ｒｕｄｄｙ  ＭＪ，  Ｓｈｅｎ  Ｆ，  Ｓｍｉｔｈ  ＪＢ，  Ｓｈａｒｍａ  Ａ，  ａｎｄ  Ｇａｆｆｅｎ  ＳＬ  （２００４）  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ＬＩＸ／ＣＸＣＬ５  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ．  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７６：  １３５−１４４．
【０３１２】
Ｓｃｈｎｙｄｅｒ−Ｃａｎｄｒｉａｎ  Ｓ，  Ｔｏｇｂｅ  Ｄ，  Ｃｏｕｉｌｌｉｎ  Ｉ，  Ｍｅｒｃｉｅｒ  Ｉ，  Ｂｒｏｍｂａｃｈｅｒ  Ｆ，  Ｑｕｅｓｎｉａｕｘ  Ｖ，  Ｆｏｓｓｉｅｚ  Ｆ，  Ｒｙｆｆｅｌ  Ｂ，  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｙｄｅｒ  Ｂ  （２００６）  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｉｓ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｓｔｈｍａ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：  ２７１５−２７２５．
【０３１３】
Ｓｈｅｎ  Ｆ，  Ｒｕｄｄｙ  ＭＪ，  Ｐｌａｍｏｎｄｏｎ  Ｐ，  ａｎｄ  Ｇａｆｆｅｎ  ＳＬ  （２００５）  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｌｉｎｋ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７−  ａｎｄ  ＴＮＦα−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７７：  ３８８−３９９．
【０３１４】
Ｓｈｉ  Ｚ，  Ｗａｋｉｌ  ＡＥ，  ａｎｄ  Ｒｏｃｋｅｙ  ＤＣ  （１９９７）  Ｓｔｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｒｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：  １０６６３−１０６６８．
【０３１５】
Ｓｈｉｅｒ  Ｐ，  Ｈｏｆｓｔｒａ  ＣＬ，  Ｍａ  ＸＪ，  Ｗｕ  Ｙ，  Ｎｇｏ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｆｕｎｇ−Ｌｅｕｎｇ  ＷＰ  （２０００）  Ｔｂｔ−１，  ａ  ｎｅｗ  Ｔ−ｂｏｘ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔｈ１  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５１：  ７７１−７７８．
【０３１６】
Ｓｉｅｂｌｅｒ  Ｊ，  Ｗｉｒｔｚ  Ｓ，  Ｋｌｅｉｎ  Ｓ，  Ｐｒｏｔｓｃｈｋａ  Ｍ，  Ｂｌｅｓｓｉｎｇ  Ｍ，  Ｇａｌｌｅ  ＰＲ，  ａｎｄ  Ｎｅｕｒａｔｈ  ＭＦ  （２００３）  Ａ  Ｋｅｙ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＳＴＡＴ１／Ｔ−ｂｅｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｔ−Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３８：  １５７３−１５８０．
【０３１７】
Ｓｏｂｕｅ  Ｓ，  Ｎｏｍｕｒａ  Ｔ，  Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｔ，  Ｉｔｏ  Ｓ，  Ｓａｓｏ  Ｋ，  Ｏｈａｒａ  Ｈ，  Ｊｏｈ  Ｔ，  Ｉｔｏｈ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｋａｋｕｍｕ  Ｓ  （２００１）  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ３６：  ５４４−５５１．
【０３１８】
Ｓｐｌｉｎｔｅｒ  Ｗ  （２００２）  Ｈａｌｏｔｈａｎｅ：  ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｏｆ  ａｎ  ｅｒａ？  Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ  ９５：  １４７１．
【０３１９】
Ｓｐｒａｃｋｌｉｎ  ＤＫ，  Ｈａｎｋｉｎｓ  ＤＣ，  Ｆｉｓｈｅｒ  ＪＭ，  Ｔｈｕｍｍｅｌ  ＫＥ，  ａｎｄ  Ｋｈａｒａｓｃｈ  ＥＤ  （１９９７）  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｅ１  ｉｓ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃａｔａｌｙｓｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｈａｌｏｔｈａｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８１：  ４００−４１１．
【０３２０】
Ｓｐｒａｃｋｌｉｎ  ＤＫ，  Ｔｈｕｍｍｅｌ  ＫＥ，  ａｎｄ  Ｋｈａｒａｓｃｈ  ＥＤ  （１９９６）  ＨＵＭＡＮ  ＲＥＤＵＣＴＩＶＥ  ＨＡＬＯＴＨＡＮＥ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ  ＩＮ  ＶＩＴＲＯ  ＩＳ  ＣＡＴＡＬＹＺＥＤ  ＢＹ  ＣＹＴＯＣＨＲＯＭＥ  Ｐ４５０  ２Ａ６  ＡＮＤ  ３Ａ４．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ２４：  ９７６−９８３．
【０３２１】
Ｓｚａｂｏ  ＳＪ，  Ｋｉｍ  ＳＴ，  Ｃｏｓｔａ  ＧＬ，  Ｚｈａｎｇ  Ｘ，  Ｆａｔｈｍａｎ  ＣＧ，  ａｎｄ  Ｇｌｉｍｃｈｅｒ  ＬＨ  （２０００）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ，  Ｔ−ｂｅｔ，  ｄｉｒｅｃｔｓ  Ｔｈ１  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ．  Ｃｅｌｌ  １００：  ６５５−６６９．
【０３２２】
Ｔａｇａｗａ  Ｙ，  Ｓｅｋｉｋａｗａ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｉｗａｋｕｒａ  Ｙ  （１９９７）  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ＩＦＮγ（−／−）  ｍｉｃｅ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ＴＮＦα（−／−）  ｍｉｃｅ：  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＩＦＮγ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：  １４１８−１４２８．
【０３２３】
Ｔａｌｐａｉｎ  Ｅ，  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＲＡ，  Ｃｏｌｅｍａｎ  ＲＡ，  ａｎｄ  Ｖａｒｄｅｙ  ＣＪ  （１９９５）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＧＥ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１４：  １４５９−１４６５．
【０３２４】
Ｔａｎａｋａ  Ｙ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ａ，  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ，  Ｔａｋａｙａｍａ  Ｋ，  Ｙａｈａｔａ  Ｔ，  Ｈａｂｕ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｔ  （１９９６）  Ａ  ｐｉｖｏｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩＬ−１２  ｉｎ  Ｔｈ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：  ５６９−５７６．
【０３２５】
Ｔｉｒｍｅｎｓｔｅｉｎ  ＭＡ  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ  ＳＤ  （１９８９）  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ  ａｎｄ  ａ  ｎｏｎｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃ  ｒｅｇｉｏｉｓｏｍｅｒ，  ３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔａｎｉｌｉｄｅ，  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ．  Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２６４：  ９８１４？９８１９．
【０３２６】
Ｕｅｔｒｅｃｈｔ  Ｊ  （２００７）  Ｉｄｉｏｓｙｎｃｒａｔｉｃ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ４７：  ５１３−５３９．
【０３２７】
Ｕｓｕｉ  Ｔ  （２００７）  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｎｉｈｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  Ｍｅｎｅｋｉ  Ｇａｋｋａｉ  Ｋａｉｓｈｉ  ３０：  ４１９−４２７．
Ｗｅａｖｅｒ  ＣＴ，  Ｈａｔｔｏｎ  ＲＤ，  Ｍａｎｇａｎ  ＰＲ，  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＬＥ  （２００７）  ＩＬ−１７  ｆａｍｉｌｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５：  ８２１−８５２．
【０３２８】
Ｗｉｔｏｗｓｋｉ  Ｊ，  Ｐａｗｌａｃｚｙｋ  Ｋ，  Ｂｒｅｂｏｒｏｗｉｃｚ  Ａ，  Ｓｃｈｅｕｒｅｎ  Ａ，  Ｋｕｚｌａｎ−Ｐａｗｌａｃｚｙｋ  Ｍ，  Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋａ  Ｊ，  Ｐｏｌｕｂｉｎｓｋａ  Ａ，  Ｆｒｉｅｓｓ  Ｈ，  Ｇａｈｌ  ＧＭ，  Ｆｒｅｉ  Ｕ，  ａｎｄ  Ｊｏｒｒｅｓ  Ａ  （２０００）  ＩＬ−１７  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＧＲＯ  ａｌｐｈａ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：  ５８１４−５８２１．
【０３２９】
Ｘｕ  Ｌ，  Ｚｈａｏ  Ｙ，  Ｑｉｎ  Ｙ，  ａｎｄ  Ｘｕ  Ｑ  （２００６）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４：  １２５−１３３．
【０３３０】
Ｙａｎｇ  Ｍ  ａｎｄ  Ｃｏｏｋ  ＭＥ  （２００３）  Ｄｉｅｔａｒｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｃａｃｈｅｘｉａ，  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  α  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  （Ｍａｙｗｏｏｄ）  ２２８：  ５１−５８．
【０３３１】
Ｙａｓｕｍｉ  Ｙ，  Ｔａｋｉｋａｗａ  Ｙ，  Ｅｎｄｏ  Ｒ，  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ  （２００７）  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｈｅｐａｔｏｌ  Ｒｅｓ  ３７：  ２４８−２５４．
【０３３２】
Ｙｅ  Ｐ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＦＨ，  Ｋａｎａｌｙ  Ｓ，  Ｓｔｏｃｋｉｎｇ  ＫＬ，  Ｓｃｈｕｒｒ  Ｊ，  Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｐ，  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｐ，  Ｈｕａｎｇ  Ｗ，  Ｚｈａｎｇ  Ｐ，  Ｚｈａｎｇ  Ｊ，  Ｓｈｅｌｌｉｔｏ  ＪＥ，  Ｂａｇｂｙ  ＧＪ，  Ｎｅｌｓｏｎ  Ｓ，  Ｃｈａｒｒｉｅｒ  Ｋ，  Ｐｅｓｃｈｏｎ  ＪＪ，  ａｎｄ  Ｋｏｌｌｓ  ＪＫ  （２００１）  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｌｕｎｇ  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ，  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：  ５１９−５２７
【０３３３】
Ｙｉ  Ｔ，  Ｚｈａｏ  Ｄ，  Ｌｉｎ  ＣＬ，  Ｚｈａｎｇ  Ｃ，  Ｃｈｅｎ  Ｙ，  Ｔｏｄｏｒｏｖ  Ｉ，  ＬｅＢｏｎ  Ｔ，  Ｋａｎｄｅｅｌ  Ｆ，  Ｆｏｒｍａｎ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｚｅｎｇ  Ｄ  （２００８）  Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ  Ｔｈ１７  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  Ｔｈ１  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｂｌｏｏｄ  １１２：  ２１０１−２１１０．
【０３３４】
Ｙｏｕ  Ｑ，  Ｃｈｅｎｇ  Ｌ，  Ｒｅｉｌｌｙ  ＴＰ，  Ｗｅｇｍａｎｎ  Ｄ，  ａｎｄ  Ｊｕ  Ｃ  （２００６）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈａｌｏｔｈａｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｊｕｒｙ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４４：  １４２１−１４３１．
【０３３５】
Ｚｈａｎｇ  ＤＨ，  Ｃｏｈｎ  Ｌ，  Ｒａｙ  Ｐ，  Ｂｏｔｔｏｍｌｙ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｒａｙ  Ａ  （１９９７）  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＧＡＴＡ−３  ｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ２  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｔｈ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−５  ｇｅｎｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：  ２１５９７−２１６０３．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月26日(2009.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
また、本発明によれば、医薬品の候補化合物のアレルギー性薬物誘導性肝障害の予測をする方法であって、その候補化合物を、哺乳動物に投与する工程と、その哺乳動物の体内におけるＣＸＣケモカインの発現量を測定する工程と、を含む、予測方法が提供される。