(57)【要約】【課題】２次元電気泳動の作業者依存を回避するとともに結果の再現性を高めることでき、精度向上を図ることが可能なサンプル分離装置を提供する【解決手段】第１ゲル１１中で第１方向に分離した分離サンプルを、基板２２ａ，２２ｂ内に収納された第２ゲル２１中で第２方向にさらに分離するサンプル分離装置４０において、基板２２ａ内外を連通する第２スリット２２ｂを形成し、第１ゲル１１を支持部材１２によって支持するとともに該支持部材１２に突起部１２ｅを設け、基板２２ａに支持部材１２を第２スリット２２ｂに挿入する際に突起部１２ｅが嵌り込む差込孔２５を設ける。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１ゲル中で第１方向に分離したサンプルを、基板内に収納された第２ゲル中で第２方向にさらに分離するサンプル分離装置あって、
前記基板内外を連通する開口部が形成され、
前記サンプルを含む前記第１ゲルが前記開口部を介して前記第２ゲルに接続される際に、前記第１ゲルと前記第２ゲルとの相対位置を規制する位置決め手段が設けられたことを特徴とするサンプル分離装置。
【請求項２】
前記第１ゲルを支持して前記開口部に挿入される支持部材を備え、
前記位置決め手段が、
前記支持部材と前記基板とのいずれか一方に備えられた突起部と、
他方に備えられ、前記支持部材を前記開口部に挿入する際に前記突起部が嵌り込む差込孔とから構成されていることを特徴とする請求項１に記載のサンプル分離装置。
【請求項３】
前記突起部が前記支持部材の前記開口部への挿入方向に沿った方向に突出していることを特徴とする請求項２に記載のサンプル分離装置。
【請求項４】
前記支持部材に前記突起部又は前記差込孔が複数備えられ、
これら前記突起部又は前記差込孔にそれぞれ対応するようにして、前記基板に前記差込孔又は前記突起部が複数備えられていることを特徴とする請求項２又は３に記載のサンプル分離装置
【請求項５】
前記突起部と該突起部が嵌り込む前記差込孔との少なくとも一方が、テーパ状をなしていること特徴とする請求項２から４のいずれか一項に記載のサンプル分離装置。
【請求項６】
前記位置決め手段が、
前記開口部に近接した閉塞位置と前記開口部から離間した開放位置との間で変位可能とされる蓋部材であって、
前記閉塞位置に変位した前記蓋部材が、前記第１ゲルの前記第２ゲルに対する相対位置を規制することを特徴とする請求項１に記載のサンプル分離装置。
【請求項７】
前記蓋部材が前記基板に対して回動可能に連結されることにより、前記閉塞位置と前記開放位置との間で変位可能とされていることを特徴とする請求項６に記載のサンプル分離装置。
【請求項８】
前記第１ゲルを支持する支持部材を備え、
前記蓋部材における前記開口部を臨む箇所に前記支持板を挟み込む固定溝が形成されたことを特徴とする請求項６又は７に記載のサンプル分離装置。
【請求項９】
前記第１ゲルが前記開口部を介して前記第２ゲルに接続された状態において、
前記蓋部材が前記開放位置から前記閉塞位置に変位して前記固定溝が前記支持部材を挟み込むことにより、該支持部材に支持された前記第１ゲルの前記第２ゲルに対する相対位置が規制されることを特徴とする請求項８に記載のサンプル分離装置。
【請求項１０】
前記開放位置に位置する前記蓋部材における前記固定溝に前記支持部材が挟み込まれ、
前記蓋部材が前記開放位置から前記閉塞位置に変位した際に、前記支持部材に支持された前記第１ゲルが前記第２ゲルに接続されるとともに前記第１ゲルの前記第２ゲルに対する相対位置が規制されることを特徴とする請求項８に記載のサンプル分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多数のタンパク質を２次元電気泳動により分離する際に用いられるサンプル分離装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトが終了した後、プロテオーム研究が盛んに行われている。この「プ
ロテオーム」とは、特定の細胞、器官、臓器の中で翻訳生産されているタンパク質の総体を意味し、該プロテオームの研究としてはタンパク質のプロファイリングなどが挙げられる。
【０００３】
タンパク質をプロファイリングする手法の１つとして、タンパク質の２次元電気泳動が知られている。この２次元電気泳動は、タンパク質を電荷に依存して分離する等電点電気泳動と分子量に依存して分離するスラブゲル電気泳動（ 特に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）との計２つの電気泳動ステップから構成されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
上記２次元電気泳動を行うサンプル分離装置の一例が、特許文献２に開示されている。このサンプル分離装置は、等電点電気泳動によって分離が行なわれる１次チップと、スラブゲル電気泳動を行う２次チップとを備えている。
【０００５】
第１チップは、支持板と該支持板に支持された第１ゲル（１次元目のゲル）とから構成されている。この第１チップにおいては、第１ゲルにサンプルが導入され、第１ゲルを膨潤させる工程を経た後、第１ゲルに電圧が印加されることでサンプルを第１方向に分離させる。そして、第１チップは、分離されたサンプルを染色する工程、第２チップの環境に平衡化する工程が施された後、第２チップに移送される。
第２チップは基板内に第２ゲル（２次元目のゲル）が収納されることで構成されており、該第２ゲルに第１チップの第１ゲルが接続される。この状態で第２ゲルに対して電圧を印加することでサンプルが上記第１方向とは異なる第２方向に分離される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−３０６０５号公報
【特許文献２】特開２００７−６４８４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、上記等電点電気泳動を行う第１ゲルは、非常に薄い形状をしているため、ゲルの表裏やｐＨ勾配の方向の識別が困難であるのみならず、反りや捩れが発生しやすく形状を一定に保つことが困難である。したがって、第１ゲルを支持した１次チップの移動操作は容易でなく、該第１チップを第２チップに移送して第１チップの第１ゲルを第２チップの第２ゲルに接続する際の位置精度を向上させることは困難であり、作業者の熟練した技術を要していた。
その一方で、第１ゲルを第２ゲルに対して常に定位置で接続できなければ、再現性よく定量的なデータを取得することができず、試験精度の低下を招いてしまう。
【０００８】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであって、２次元電気泳動の作業者依存を回避するとともに結果の再現性を高めることでき、精度向上を図ることが可能なサンプル分離装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために本発明は以下の手段を提案している。
即ち、本発明に係るサンプル分離装置は、第１ゲル中で第１方向に分離したサンプルを、基板内に収納された第２ゲル中で第２方向にさらに分離するサンプル分離装置あって、前記基板内外を連通する開口部が形成され、前記サンプルを含む前記第１ゲルが前記開口部を介して前記第２ゲルに接続される際に、前記第１ゲルと前記第２ゲルとの相対位置を規制する位置決め手段を備えることを特徴とする。
【００１０】
このような特徴のサンプル分離装置によれば、位置決め手段によって第１ゲルが第２ゲルに対して定位置にて接続されるため、作業者の熟練度にかかわらず再現性高く２次元目の電気泳動を行なうことができる。
【００１１】
また、本発明に係るサンプル分離装置においては、前記第１ゲルを支持して前記開口部に挿入される支持部材を備え、前記位置決め手段が、前記支持部材と前記基板とのいずれか一方に備えられた突起部と、他方に備えられ、前記支持部材を前記開口部に挿入する際に前記突起部が嵌り込む差込孔とから構成されていることを特徴とする。
【００１２】
このような特徴のサンプル分離装置によれば、第１ゲルを支持する支持部材と、第２ゲルが収納された基板に備えられた突起部及び差込孔が嵌り合うことにより、第１ゲルと第２ゲルとの相対位置を規制し、第１ゲルを常に定位置にて第２ゲルに接続することが可能となる。
【００１３】
さらに、本発明に係るサンプル分離装置においては、前記突起部が前記支持部材の前記開口部への挿入方向に沿った方向に突出していることが好ましい。
これによって、第１ゲルとともに支持部材を開口部に挿入する動作をもって突起部と差込孔とが嵌り合うことになるため、より簡便に第２ゲルに対する第１ゲルの位置合わせを行うことができる。
【００１４】
また、本発明に係るサンプル分離装置においては、前記支持部材に前記突起部又は前記差込孔が複数備えられ、これら前記突起部又は前記差込孔にそれぞれ対応するようにして、前記基板に前記差込孔又は前記突起部が複数備えられていることを特徴としている。
これによって、複数の突起部及び差込孔が嵌り合うことで、より確実に位置合わせを行うことができる。
【００１５】
さらにまた、本発明に係るサンプル分離装置においては、前記突起部と該突起部が嵌り込む前記差込孔との少なくとも一方が、テーパ状をなしていることが好ましい。
これにより、突起部を差込孔に嵌め込む際に多少のずれが生じていても突起部を差込孔に容易に挿入することができる。したがって、より位置合わせを容易に行なうことができる。
なお、突起部がテーパ状をなすとは、該突起部の外周面が先端側に向かうに連れて漸次縮径する形状をなしていることをいい、差込孔がテーパ状をなすとは、差込孔の内周面が突起部の挿入方向に向かうに連れて漸次縮径する形状をなしていることをいう。
【００１６】
一方、本発明に係るサンプル分離装置によれば、前記位置決め手段が、前記開口部に近接した閉塞位置と前記開口部から離間した開放位置との間で変位可能とされる蓋部材であって、前記閉塞位置に変位した前記蓋部材が、前記第１ゲルの前記第２ゲルに対する相対位置を規制することを特徴としている。
【００１７】
このような特徴のサンプル分離装置によれば、蓋部材が開放位置から閉塞位置に変位する動作をもって、第１ゲルを常に定位置にて第２ゲルに接続することが可能となる。
【００１８】
また、本発明に係るサンプル分離装置においては、前記蓋部材が前記基板に対して回動可能に連結されることにより、前記閉塞位置と前記開放位置との間で変位可能とされていることを特徴とする。
これにより、蓋部材を閉塞位置と開放位置との間で容易かつ正確に変位させることができるため、より簡便かつ確実に第１ゲルを定位置にて第２ゲルに接続することが可能となる。
【００１９】
さらに、本発明に係るサンプル分離装置においては、前記第１ゲルが前記開口部を介して前記第２ゲルに接続された状態において、前記蓋部材が前記開放位置から前記閉塞位置に変位した際に前記固定溝が前記支持部材を挟み込むことにより、該支持部材に支持された前記第１ゲルの前記第２ゲルに対する相対位置が規制されることを特徴とする。
【００２０】
このような構成によれば、固定溝に支持部材が挟み込まれることにより、閉塞位置に位置する蓋部材と支持部材との相対位置が一義的に定まるため、該支持部材に支持された第１ゲルを第２ゲルに対して、より精度高く定位置にて接続することができる。
【００２１】
さらにまた、本発明に係るサンプル分離装置においては、前記開放位置に位置する前記蓋部材における前記固定溝に前記支持部材が挟み込まれ、前記蓋部材が前記開放位置から前記閉塞位置に変位した際に、前記支持部材に支持された前記第１ゲルが前記第２ゲルに接続されるとともに前記第１ゲルの前記第２ゲルに対する相対位置が規制されるものであってもよい。
【００２２】
これによって、固定溝に挟み込まれる支持部材と蓋部材との相対位置が一義的に定まるため、該支持部材に支持された第１ゲルを第２ゲルに対して、より精度高く定位置にて接続することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係るサンプル分離装置によれば、第１方向への分離を行う第１ゲルと第２方向への分離を行う第２ゲルとが位置決め手段によって常に定位置にて接続されるため、作業者の熟練度にかかわらず再現性高く２次元目の電気泳動を行なうことができ、試験精度を向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】第１実施形態に係るサンプル分離装置の概略構成を示す斜視図である。
【図２】第１実施形態に係る第１チップの正面図である。
【図３】第１実施形態に係る第２チップの平面図である。
【図４】図３のＡ−Ａ断面図である。
【図５】図３のＢ−Ｂ断面図である。
【図６】図３のＡ−Ａ断面図における第２チップに第１チップを挿入した状態を示す図である。
【図７】図３のＢ−Ｂ断面図における第２チップに第１チップを挿入した状態を示す図である。
【図８】第２実施形態に係るサンプル分離装置おいて第１ゲルを第２ゲルに接続する前の状態を示すＸ１方向における縦断面図である。
【図９】図８のＡ−Ａ断面図である。
【図１０】第２実施形態に係るサンプル分離装置おいて第１ゲルを第２ゲルに接続した後の状態を示すＸ１方向における縦断面図である。
【図１１】図１０のＡ−Ａ断面図である。
【図１２】第３実施形態に係るサンプル分離装置の正面図である。
【図１３】図１２のＡ−Ａ断面図である。
【図１４】第３実施形態に係るサンプル分離装置において蓋部材の回動する様子を示す正面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（第１実施形態）
以下、本発明の第１実施形態について図１から図７を参照して詳細に説明する。
図１は第１実施形態に係るサンプル分離装置の概略構成を示す斜視図である。本実施形態のサンプル分離装置４０は、蛋白質などのサンプルを解析する際に使用される２次元電気泳動法における２次元目の泳動に好適に適用可能な構成を有している。
【００２６】
サンプル分離装置４０は、第１ゲル１１を備えた第１チップ１０と、第２ゲル２１を収納した第２チップ２０と、第１チップ１０を第２チップに２０に移送する搬送手段３０とを備えている。
【００２７】
このサンプル分離装置４０は、サンプルが第１チップ１０の第１ゲル１１内にて第１方向Ｘ１に分離された後に、第１ゲル１１内のサンプルを第２チップ２０の第２ゲル２１にて第１方向Ｘ１とは異なる第２方向Ｙ１に分離する際に使用される。
なお、本実施形態においては、第１方向Ｘ１と第２方向Ｙ１とは水平面に沿った互いに直交する方向とされている。
【００２８】
第１チップ１０は、図１及び図２に示すように、支持板１２と第１ゲル１１とから構成されている。
支持板１２は、第１方向Ｘ１を長手方向とするとともに鉛直面に沿って配置される略板状をなす部材であって、下端側に位置して長手方向の寸法が後述する第２スリット２３ｂの長手方向と略同一に形成された挿入部１２ａと、上端側に位置して挿入部１２ａよりも長手方向の寸法が大きく形成された幅広部１２ｂとを備えている。これによって支持板１２は、その正面視において、挿入部１２ａの上端から幅広部１２ｂが長手方向に張り出す略Ｔ字状をなしている。
【００２９】
上記挿入部１２ａの下端面は、第１方向に沿って延びるゲル接着面１２ｃとされている。また、幅広部１２ｂにおける挿入部１２ａとの段差となる段差面１２ｄ，１２ｄ、即ち、幅広部１２ｂにおける挿入部１２ａの長手方向両側に位置して下方を臨む面１２ｄ，１２ｄにはそれぞれ突起部１２ｅ，１２ｅが備えられている。これら突起部１２ｅ，１２ｅは下方に向かって突出しており、突起部１２ｅ，１２ｅの外周面は上下方向Ｚ１に沿った軸線ｋ．ｋを中心として下方に向かうに従って漸次縮径するテーパ状をなしている。
【００３０】
第１ゲル１１は、１次元目の分離、即ち、サンプルの電荷に依存した等電点電気泳動による分離を行うゲルであって、サンプルにおいて注目する電荷の幅に合わせて適切な濃度・ｐＨを有する周知の組成のゲルを適宜採用することができる。この第１ゲル１１は、上記支持板１２のゲル接着面１２ｃに、例えば接着剤等を用いて接着されており、これによって、第１ゲル１１が支持板１２の下端側にて第１方向に沿って延在するように支持されている。
【００３１】
搬送手段３０は、図１に示すように、上記第１チップ１０の上端側の面を例えば吸着することにより保持するチャック３１と、該チャック３１に接続されたアーム３２とを備えている。このアーム３２は図示しない駆動手段に連結されており、これにより、チャック３１に保持された第１チップが、第１ゲル１１を第１方向Ｘ１に沿わせた状態で、第１方向Ｘ１、第２方向Ｙ１及び上下方向Ｚ１に移動可能とされる。
【００３２】
第２チップ２０は、２次元目泳動用の第２ゲル２１が予め充填されて供給されるプレキャストゲルチップ、あるいは実験者自らが充填したゲルチップである。この第２チップ２０は、図１及び図３〜図５に示すように、合成樹脂からなる基板２２ａ及び基板２２ｂを組み合わせて構成された本体２２を備えている。基板２２ａと基板２２ｂとは接着あるいは溶着によって一体化されている。基板２２ａと基板２２ｂとの間には、略直方体形状のキャビティＣが生じており、このキャビティＣには２次元目電気泳動に使用される第２ゲル２１が充填されている。
【００３３】
この第２ゲル２１は、２次元目の分離、即ち、分子量に基づいたサンプルの分離を行なうゲルであって、例えばポリアクリルアミドの重合体によって構成されたゲルを採用することができる。また、サンプルにおいて注目する分子量の幅に合わせて適切な濃度・ｐＨを有する周知の組成のゲルを適宜採用することができる。
【００３４】
基板２２ａには、第２方向Ｙ１の手前側に位置するバッファー槽２３と、奥側に位置するバッファー槽２４とが設けられている。バッファー槽２３，２４は、電気泳動に使用される泳動バッファー（ランニングバッファー）が注入可能な容器形状を有している。
【００３５】
一方のバッファー槽２３には、それぞれ第２ゲル２１が露出可能な第１スリット２３ａ及び第２スリット（開口部）２３ｂが形成されている。
第１スリット２３ａは第１方向Ｘ１に沿って延びる矩形状の開口であって、バッファー槽２３に供給されるランニングバッファーを介して第２ゲル２１に通電させるために形成されている。
また、第２スリット２３ｂは、バッファー槽２３における第１スリット２３ａよりも第２方向Ｙ１の奥側に近い位置に形成された第１方向Ｘ１に沿って延びる矩形状の開口であって、搬送手段３０によって搬送される第１チップ１０がその下端側、即ち、挿入部１２ａ側から挿入される。このように第１チップ１０が第２スリット２３ｂに挿入されることで、第１チップ１０の第１ゲル１１が第２チップ２０の第２ゲル２１に接続される。
【００３６】
バッファー槽２４には、上述の第１スリット２３ａと同様な形状を有する第３スリット２４ａが形成されている。第３スリット２４ａは、バッファー槽２４に供給されるランニングバッファーを介して第２ゲル２１に通電させるために形成されている。
【００３７】
バッファー槽２３とバッファー槽２４とのそれぞれには、図示しない直流電源装置の一対の電極が接続可能とされている。これら電極により直流電圧を印加することで、第２ゲル２１においてサンプルを電気泳動させることができる。
【００３８】
そして、本実施形態においては、図１、図３及び図５に示すように、上側の基板２２ａに一対の差込孔２５，２５が形成されている。
この差込孔２５，２５は、基板２２ａの上面２２ｃにおける第２スリット２３ｂの両側に対応する箇所に形成された凹部であって、その内周面は、底部側に向かうに従って漸次縮径するテーパ状をなしており、そのテーパ角度は上記第１チップ１０の突起部１２ｅ，１２ｅのテーパ角度と略同一とされている。また、この差込孔２５，２５の中心軸線ｍ，ｍ同士の間隔は、上記第１チップ１０の突起部１２ｅ，１２ｅの軸線ｋ，ｋ同士の間隔と略同一とされている。さらに、この差込孔２５，２５の深さは、上記突起部１２ｅ，１２ｅの突出長さと略同一寸法に形成されている。
【００３９】
即ち、これら差込孔２５，２５は第１チップ１０の突起部１２ｅ，１２ｅとそれぞれ嵌合可能な構成とされ、これら差込孔２５，２５と突起部１２ｅ，１２ｅとによって本実施形態の位置決め手段が構成されている。
【００４０】
次に、以上のような構成のサンプル分離装置４０によってサンプルに２次元目の電気泳動分離を施す手順について説明する。サンプル分離装置４０により２次元目の電気泳動分離を施す前段階として、１次元目の電気泳動分離が行なわれる。具体的には、
第１チップ１０の第１ゲル１１にサンプルを導入して膨潤化させた後、該第１ゲル１１に対して第１方向Ｘ１に沿って直流電圧を印加することで、サンプルの電荷に依存した等電点電気泳動による分離が行われる。これによりサンプルは、電荷に応じて第１方向に分離させられる。そして、このような分離サンプルを含む第１ゲル１１に対して染色・洗浄・平衡化の処理が施された後、第１チップ１０は搬送手段３０によって第２チップ２０へと移送される。
【００４１】
搬送手段３０は、そのアーム３２が駆動手段により第１方向Ｘ１又は第２方向Ｙ１に駆動されることによって、第１チップ１０を第２チップの上方に移送する。そして、図６及び図７に示すように、第１チップ１０が第２チップ２０の第２スリット２３ｂの直上に移送された時点で、第１方向Ｘ１又は第２方向Ｙ１へ搬送手段３０の移動が停止する。次いで、第１チップ１０の挿入部１２ａを第２スリット２３ｂに挿入すべく、搬送手段３０が第１チップ１０を上下方向Ｚ１に沿って降下させる。
【００４２】
すると、図６及び図７に示すように、第１チップ１０が第２スリット２３ｂに挿入されると同時に、第１チップ１０の一対の突起部１２ｅ，１２ｅがそれぞれ基板２２ａの差込孔２５に挿入される。そして、さらに第１チップ１０を降下させると、第１チップ１０の下端に位置する第１ゲル１１が第２スリット２３ｂを介してキャビティＣ内に入り込み、該第１ゲル１１が第２ゲル２１に適切に接続された時点で、突起部１２ｅ，１２ｅと差込孔２５，２５とが嵌合する。また、この際、本実施形態においては、第１チップ１０の段差面１２ｄが第２チップ２０の基板２２ａの上面２２ｃに密着する。
これにより、第１チップ１０の第２チップ２０に対する第１方向Ｘ１、第２方向Ｙ１及び上下方向Ｚ１の相対位置が規制され、第１ゲル１１が第２ゲル２１に対して定位置にて接続させられる。
【００４３】
そして、この状態において、バッファー槽２３、２４内のランニングバッファーに直流電圧が印加され、第１スリット２３ａ及び第３スリット２４ａを介してこれらランニングバッファーに接触する第２ゲル２１に対して、第２方向Ｙ１に沿った通電が施される。これにより、第２ゲル２１に接続された第１ゲル１１内のサンプルが第２ゲル２１内を第２方向Ｙ１に移動し、分子量に基づいたサンプルの分離が行なわれる。
【００４４】
以上のように、本実施形態のサンプル分離装置５０によれば、第１チップ１０を第２チップ２０の第２スリット２３ｂに挿入して第１ゲル１１を第２ゲル２１に接触させた際に、第１チップ１０側の突起部１２ｅ，１２ｅが第２チップ２０の差込孔２５，２５に嵌め込まれるため、第１ゲル１１と第２ゲル２１との相対位置が規制され、第１ゲル１１を常に定位置にて第２ゲル２１に接続することが可能となる。
【００４５】
また、突起部１２ｅ，１２ｅ及び差込孔２５，２５は、第１チップ１０における第２スリット２３ｂへの挿入方向、即ち、上下方向Ｚ１に沿って形成されているため、第１ゲル１１を支持した第１チップ１０を第２スリット２３ｂに挿入する動作をもって突起部１２ｅ，１２ｅ及び差込孔２５，２５とを嵌り合わせることができる。したがって、極めて簡便に第２ゲル２１に対する第１ゲル１１の位置合わせを行うことが可能となる。
【００４６】
さらに、本実施形態においては、一対の突起部１２ｅ，１２ｅに対し一対の差込孔２５，２５を備え、これらがそれぞれ嵌り合う構成、即ち、複数の突起部１２ｅ及び差込孔２５同士が嵌り合う構成のため、第１チップ１０の第２チップ２０に対する相対位置をより確実に規制することができる。
【００４７】
さらにまた、突起部１２ｅ，１２ｅ及び差込孔２５，２５がテーパ状をなしているため、突起部１２ｅ，１２ｅを差込孔に嵌め込む際に多少ずれが生じていても、突起部１２ｅ，１２ｅを差込孔２５，２５に容易に挿入することができる。したがって、より位置決めを容易に行うことができる。また、突起部１２ｅ，１２ｅ及び差込孔２５，２５が隙間なく嵌合するため、第２チップ２０に対する第１チップ１０の相対位置が一義的に定まり、位置合わせをより精密に行なうことができる。よって、第１ゲル１１を確実に定位置において第２ゲル２１に接触させることが可能となる。
【００４８】
以上のように、本実施形態のサンプル分離装置４０によれば、第１方向Ｘ１への分離を行う第１ゲル１１と第２方向Ｙ２への分離を行う第２ゲル２１とが突起部１２ｅと差込孔２５とからなる位置決め手段によって常に定位置にて接続されるため、作業者の熟練度にかかわらず再現性高く２次元目の電気泳動を行なうことができ、試験精度をより向上させることが可能となる。
【００４９】
なお、本実施形態においては、突起部１２ｅ，１２ｅ及び差込孔２５，２５の両方がテーパ状であったが、突起部１２ｅと差込孔２５との少なくともいずれか一方がテーパ状であるものであってもよい。これによって、突起部１２ｅ，１２ｅを差込孔に嵌め込む際に多少ずれが生じていても、突起部１２ｅ，１２ｅを差込孔２５，２５に容易に挿入することができる。
【００５０】
また、突起部１２ｅ，１２ｅ及び差込孔２５，２５の形状は、互いに嵌り合うことが可能な限り、いかなる形状であってもよく、例えば、水平断面形状が円形のみならず、多角形状であってもよい。
【００５１】
さらに、第１チップ１０を第２チップ２０に移送する際には、必ずしも搬送手段３０によって移送する必要はなく、作業者が手動でもって第１チップ１０を移送してもよい。この場合であっても、突起部１２ｅと差込孔２５を嵌合させることでもって位置合わせを行うことができるため、容易かつ確実に第１ゲル１１を第２ゲル２１に接続させることが可能となる。
【００５２】
また、突起部１２ｅ，１２ｅ及び差込孔２５，２５はテーパ状でなくてもよい。即ち、突起部１２ｅ，１２ｅ及び差込孔２５，２５とが嵌り合う形状ならばいかなる形状であってもよい。さらに、差込孔２５は凹部ではなく、基板２２ａを貫通する貫通孔であってもよい。
【００５３】
また、第１実施形態においては、第１チップ１０が第２スリット２３ｂに挿入されると同時に、第１チップ１０の一対の突起部１２ｅ，１２ｅがそれぞれ基板２２ａの差込孔２５に挿入される構成としたが、第１チップ１０が第２スリット２３ｂに挿入される前後において第１チップ１０の一対の突起部１２ｅ，１２ｅがそれぞれ基板２２ａの差込孔２５に挿入される構成であってもよい。
【００５４】
（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態について図８から図１１を参照して詳細に説明する。
図８は第２実施形態に係るサンプル分離装置おいて第１ゲルを第２ゲルに接続する前の状態を示すＸ１方向における縦断面図、図９は図８のＡ−Ａ断面図、図１０は第２実施形態に係るサンプル分離装置おいて第１ゲルを第２ゲルに接続した後の状態を示すＸ１方向における縦断面図、図１１は図１０のＡ−Ａ断面図である。
【００５５】
本実施形態のサンプル分離装置５０は第１実施形態同様、蛋白質などのサンプルを解析する際に使用される２次元電気泳動法における２次元目の泳動に好適に適用可能な構成を有している。なお、第２実施形態において上述した第１実施形態のサンプル分離装置４０と構成を共通とする箇所には同一符号を付けて、説明を省略することにする。
【００５６】
サンプル分離装置５０は、第１ゲル１１を備えた第１チップ６０と、第２ゲル２１を収納した第２チップ７０とを備えている。このサンプル分離装置５０においては、サンプルが第１チップ６０の第１ゲル１１内にて第１方向Ｘ１に分離された後、第２チップ７０の第２ゲル２１内にて第１方向Ｘ１とは異なる第２方向Ｙ１に分離される。なお、本実施形態においても第１実施形態同様、第１方向Ｘ１と第２方向Ｙ１とは水平面に沿った互いに直交する方向とされている。
【００５７】
第１チップ６０は、図８及び図９に示すように、支持板６２と第１ゲル１１とから構成されている。
支持板６２は、第１方向Ｘ１を長手方向とするとともに鉛直面に沿って配置される矩形板状をなす部材であって、その長手方向の寸法は、後述する挿入孔７５の長手方向の寸法と略同一に形成されている。この支持板６２の下端には、第１方向に沿って延びる第１ゲル１１が、例えば接着等されることによって支持されている。
【００５８】
第２チップ７０は、２次元目泳動用の第２ゲル２１が予め充填されて供給されるプレキャストゲルチップ、あるいは実験者自らが充填したゲルチップである。この第２チップ７０は、図８及び図９に示すように、合成樹脂からなる基板７２ａ及び基板７２ｂを組み合わせて構成された本体７２を備えている。基板７２ａと基板７２ｂとは接着あるいは溶着によって一体化されている。基板７２ａと基板７２ｂとの間には、略直方体形状のキャビティＣが生じており、このキャビティＣには２次元目電気泳動に使用される第２ゲル２１が充填されている。
【００５９】
基板７２ａの上面側には、第２方向Ｙ１の手前側に位置するバッファー槽７３と、第２方向Ｙ１の奥側に位置するバッファー槽７４とが設けられている。バッファー槽７３，７４は、電気泳動に使用される泳動バッファー（ランニングバッファー）が注入可能な容器形状を有している。
【００６０】
一方のバッファー槽７３には、第２ゲル２１が露出可能な第１スリット７３ａが形成されている。第１スリット７３ａは第１方向Ｘ１に沿って延びる矩形状の開口であって、バッファー槽７３に供給されるランニングバッファーを介して第２ゲル２１に通電させるために形成されている。
【００６１】
他方のバッファー槽７４には、上述の第１スリット７３ａと同様の形状を有する第２スリット７４ａが形成されている。第２スリット７４ａは、バッファー槽７４に供給されるランニングバッファーを介して第２ゲル２１に通電させるために形成されている。
【００６２】
また、上記一方のバッファー槽７３の第２方向Ｙ１奥側には、基板７２ａの上面７２ｃとキャビティＣ内を連通させる挿入孔７５が形成されている。この挿入孔７５は、第１スリット７３ａ及び第２スリット７４ａと同様に第１方向Ｘ１に沿って延びる鉛直孔であって、その水平断面形状は第１チップ６０の水平断面形状と略同一とされている。これにより、挿入孔７５に対して第１チップ６０を隙間なく、あるいは、僅かな隙間を介して挿入することができる。
【００６３】
そして、第２実施形態の第２チップ７０には、挿入孔７５を開放、閉塞自在とする蓋部材７６が設けられている。本実施形態においてはこの蓋部材７６が、第１ゲル１１の第２ゲル２１に対する相対位置を規制する位置決め手段として機能する。
【００６４】
この蓋部材７６は、第２チップ７０の基板７２ａの第１方向Ｘ１一端側に連結部材７８を介して回動可能に取り付けられている。これにより、蓋部材７６は、挿入孔７５に近接して閉塞状態する閉塞位置と、挿入孔７５から離間して開放状態とする開放位置との間で変位可能とされている。
【００６５】
また、この蓋部材７６における挿入孔７５を臨む面は、基板７２ａの挿入孔７５周りの上面７２ｃと当接可能な当接面７６ａとされており、さらに、この当接面７６ａには、第１チップ６０の支持板６２上端側を挟み込んで固定可能な固定溝７７が形成されている。この固定溝７７は、第１チップ６０における支持板６２の上端側の形状に応じて略矩形状に形成されており、これによって、蓋部材７６の固定溝７７内の定位置に第１チップ６０を固定可能とされている。
【００６６】
さらに、この固定溝７７は、蓋部材７６が閉塞位置にある場合においては挿入孔７５と連通状態にあり、固定溝７７の長手方向寸法及び溝幅は、挿入孔７５の長手方向寸法及びスリット幅と略同一とされている。これにより、挿入孔７５に第１チップ６０を挿入した状態において蓋部材７６を開放位置から閉塞位置に変位させると、蓋部材７６の固定溝７７が挿入孔７５に挿入された第１チップ６０の上端側を挟み込むことになる。
【００６７】
次に、以上のような構成の第２実施形態のサンプル分離装置５０によってサンプルに２次元目の電気泳動分離を施す手順について説明する。
サンプル分離装置５０により２次元目の電気泳動分離を施す前段階として、第１実施形態と同様の１次元目の電気泳動分離が行なわれる。次いで、分離サンプルを含む第１ゲル１１に対して染色・洗浄・平衡化の処理が施された後、図示しない搬送手段又は作業者によって、第１チップ６０を第２チップ７０に搬送する。そして、蓋部材７６を開放位置とした状態で、第１チップ６０をその下端側、即ち第１ゲル１１側から、第２チップ７０の挿入孔７５に挿入し、第１ゲル１１をキャビティＣ内の第２ゲル２１に接触させる。
【００６８】
このように第１チップ６０が第２チップ７０の挿入孔７５に挿入された状態では、第１チップ６０における第１ゲル１１の位置精度は、挿入時の搬送手段の位置制御、あるいは、作業者の熟練度に依存し、精密な位置合わせは施されていない。
【００６９】
そこで、このように第１チップ６０が挿入孔７５に挿入された状態において蓋部材７６を開放位置から閉塞位置へと変位させると、上述のように蓋部材７６の固定溝７７が第１チップ６０の上端側を挟み込む。ここで、固定溝７７は、第１チップ６０の支持板６２の上端側形状と略同一形状に形成されているため、第１チップ６０と蓋部材７６との相対位置は一義的に定まり、即ち、蓋部材７６の固定溝７７内の定位置に第１チップ６０を固定される。また、この際、蓋部材７６の挿入孔７５を臨む側の面である当接面７６ａが基板７２ａの挿入孔７５周りの上面７２ｃに当接し、蓋部材７６と基板７２ａの相対位置も一義的に定まる。
【００７０】
したがって、第１チップ６０と第２チップ７０との相対位置も一義的に定まり、これによって、第１チップ６０に支持された第１ゲル１１と第２チップ７０に収納された第２ゲル２１とが定位置にて接触する。
【００７１】
そして、この状態において、バッファー槽７３、７４内のランニングバッファーに直流電圧が印加され、第１スリット７３ａ及び第３スリット７４ａを介してこれらランニングバッファーに接触する第２ゲル２１に対して、第２方向Ｙ１に沿った通電が施される。これにより、第２ゲル２１に接触する第１ゲル１１内のサンプルが第２方向Ｙ１に移動し、分子量に基づいたサンプルの分離が行なわれる。
【００７２】
以上のように、本実施形態のサンプル分離装置５０によれば、第２チップ７０の挿入孔７５に挿入された第１チップ６０が蓋部材７６の固定溝７７に挟み込まれることにより、第１チップ６０と第２チップ７０との相対位置も一義的に定まり、第１ゲル１１と第２ゲル２１とを定位置にて接続させることができる。
即ち、蓋部材７６によって、第１ゲル１１と第２ゲル２１との相対位置を規制することができるため、第１ゲル１１を常に定位置にて第２ゲル２１に接続することが可能となる。
【００７３】
また、蓋部材７６が基板７２ａに対して回動可能に取り付けられているため、蓋部材７６が開放位置から閉塞位置に回動させる動作をもって、第１チップ６０と第２チップ７０との位置合わせを行うことができる。よって、極めて容易かつ簡単に第１ゲル１１の位置決めを行なうことが可能となる。
【００７４】
なお、本実施形態においては、第１チップ６０を挿入孔７５に挿入して第１ゲル１１が第２ゲル２１に接続された状態において、蓋部材７６を開放位置から閉塞位置に変位させて第１チップ６０を挟み込んで位置合わせをする構成とされているが、これに限定されることはなく、例えば、まず開放位置に位置する蓋部材７６の固定溝７７に第１チップ６０を挟み、その後、蓋部材７６を閉塞位置に変位させることで第１チップ６０を挿入孔７５に挿入させる構成であってもよい。これによっても、第１チップ６０の第２チップ７０に対する相対位置を規制することができるため、第１ゲル１１を定位置において第２ゲル２１に接続することが可能となる。
【００７５】
また、支持板６２に第１ゲル１１が支持された第１チップ６０としてではなく、第１ゲル１１単独で用いてもよい。この場合、該第１ゲル１１を直接的に蓋部材７６に例えば接着等により固定すればよい。これによって第１ゲル１１と第２ゲル２１との相対位置を規制することができるため、第１ゲル１１を定位置において第２ゲル２１に接続することが可能となる。
【００７６】
（第３実施形態）
次に、本発明の第３実施形態について図１２〜図１４を参照して詳細に説明する。
図１２は第３実施形態に係るサンプル分離装置の正面図、図１３は図１２のＡ−Ａ断面図、図１４は第３実施形態に係るサンプル分離装置において蓋部材の回動する様子を示す正面図である。
【００７７】
本実施形態のサンプル分離装置８０も第１及び第２実施形態同様、蛋白質などのサンプルを解析する際に使用される２次元電気泳動法における２次元目の泳動に好適に適用可能な構成を有している。なお、第２実施形態において上述した第２実施形態のサンプル分離装置５０と構成を共通とする箇所には同一符号を付けて、説明を省略することにする。
【００７８】
サンプル分離装置８０は、第１ゲル１１を備えた第１チップ６０と、第２ゲル２１を収納した第２チップ９０とを備えている。このサンプル分離装置８０においては、サンプルが第１チップ６０の第１ゲル１１内にて第１方向Ｘ２に分離された後、第２チップ７０の第２ゲル２１にて第１方向Ｘ１とは異なる第２方向Ｚ２に分離される。なお、本実施形態のサンプル分離装置８０は、縦型の分離装置であって、第１方向Ｘ２は水平方向に沿った図１２における左右方向（図１３における紙面奥行き方向）、第２方向Ｚ２は上下方向とされている。また、これら第１方向Ｘ２及び第２方向Ｚ２に直交する方向が厚み方向Ｙ２とされている。
【００７９】
第２チップ９０は、２次元目泳動用の第２ゲル２１が予め充填されて供給されるプレキャストゲルチップ、あるいは実験者自らが充填したゲルチップである。この第２チップ９０は、図１２及び図１３に示すように、合成樹脂からなる基板９２ａ及び基板９２ｂを組み合わせて構成された本体９２を備えている。基板９２ａと基板９２ｂとは接着あるいは溶着によって一体化されている。裏面側の基板９２ｂの方が表側の基板９２ａよりも上方に延びた構成とされている。また、基板９２ａと基板９２ｂとの間には、略直方体形状のキャビティＣが生じており、このキャビティＣには２次元目電気泳動に使用される第２ゲル２１が充填されている。
【００８０】
本実施形態においては、第２ゲル２１は、サンプルをその分子量に基づいて分離する分離ゲル２１ａと、サンプルを濃縮するための濃縮ゲル（スタッキングゲル）２１ｂとから構成されており、サンプルが濃縮ゲル２１ｂ端面から分離ゲル２１ａ側へ向かって泳動されるにしたがってサンプルが濃縮され、分離ゲル２１ａに移動すると、濃縮されたサンプルが分子量にしたがって泳動、分離されるものである。なお、キャビティＣ内の第２ゲル２１において、上部が濃縮ゲル２１ｂ、下部が分離ゲル２１ａとされている。    
【００８１】
分離ゲル２１ａ及び濃縮ゲル２１ｂとしては、例えばポリアクリルアミドの重合体によって構成されたゲルを採用することができる。また、サンプルにおいて注目する分子量の幅に合わせて適切な濃度・ｐＨを有する周知の組成のゲルを適宜採用することができる。
【００８２】
表側の基板９２ａには、図１３に破線で示すように、上方に向かって延びるバッファー受部材９３が取り付けられる。これにより、該バッファー受部材９３の内側に、電気泳動に使用される泳動バッファー（ランニングバッファー）が注入可能な容器形状を有するバッファー槽９４が形成される。なお、上記バッファー受部材９３の大きさは任意に選択することができ、これによりバッファー受部材９３の内側に形成されるバッファー層９４の大きさも任意に設定することができる。
【００８３】
キャビティＣの上端は、上記バッファー槽９４内に臨むとともに第１方向に向かって延びる開口部９５とされている。これによって、キャビティＣ内の濃縮ゲル２１ｂがバッファー槽９４内に露呈することになる。また、バッファー槽９４には、図示しない直流電源装置の電極が接続可能とされている。さらに、キャビティＣの下端側には、図示しないバッファー槽が設けられており、該バッファー槽に直流電源装置の電極が接続可能とされている。
これら電極により直流電圧を印加することで、分離ゲル２１ａと濃縮ゲル２１ｂとからなる第２ゲル２１において第２方向Ｚ２に沿ってサンプルを電気泳動させることができる。
なお、上記バッファー槽は自作、あるいは市販されているものいずれを用いても差し支えない。
【００８４】
そして、第３実施形態の第２チップ９０には、開口部９５に近接、離間可能とされた蓋部材９６が設けられている。本実施形態においては、この蓋部材９６が、第１ゲル１１の第２ゲル２１に対する相対位置を規制する位置決め手段として機能する。
【００８５】
この蓋部材９６は、第２チップ７０の基板９２ａに回動可能に取り付けられており。これによって、開口部９５に近接した閉塞位置と、開口部９５から離間した開放位置との間で変位可能とされている。
【００８６】
蓋部材９６は、閉塞位置において第１方向Ｘ２に直交する断面形状が略Ｌ字状をなして第１方向Ｘ２に延びるガイド部材９７と、該ガイド部材９７を保持する挟持部材９８とから構成されている。
【００８７】
ガイド部材９７は第２チップ９０の基板９２ｂの第１方向Ｘ２一端側に連結部材９９を介して回動可能に連結されている。これにより、ガイド部材９７は第１方向Ｘ２及び第２方向Ｚ２を含む面に沿って回動可能とされ、この回動の際、ガイド部材９７の一部が裏側の基板９２ｂに摺接することで、当該回動がガイドされるようになっている。
【００８８】
また、挟持部材９８は、該ガイド部材９７と同様に第１方向Ｘ２に延在しており、ガイド部材９７の断面Ｌ字の内側に配置されている。さらに、この挟持部材９８における開口部９５側を臨む面は、蓋部材９６の閉塞位置において基板９２ｂに当接する当接面９８ａとされており、該当接面９８ａには、第１チップ６０の支持板６２上端側を挟み込んで固定する固定溝９８ｂが形成されている。この固定溝９８ｂは、第１チップ６０の支持板６２の上端側の形状に応じて略矩形状に形成されており、これによって、挟持部材９８における固定溝９８ｂ内の定位置に第１チップ６０を固定可能とされている。
【００８９】
この固定溝９８ｂは、蓋部材９６が閉塞位置にある状態においては開口部９５と対向状態にあり、固定溝９８ｂの第１方向Ｘ２の寸法及び溝幅は、開口部９５の第１方向Ｘ２の寸法及び開口幅（厚み方向Ｙ２の幅）と略同一とされている。
【００９０】
次に、以上のような構成の第３実施形態のサンプル分離装置８０によってサンプルに２次元目の電気泳動分離を施す手順について説明する。
サンプル分離装置５０により２次元目の電気泳動分離を施す前段階として、第２実施形態と同様の１次元目の電気泳動分離が行なわれる。次いで、分離サンプルを含む第１ゲル１１に対して染色・洗浄・平衡化の処理が施された後、図示しない搬送手段又は作業者によって、第１チップ６０を第２チップ９０に搬送する。
【００９１】
そして、図１４（ａ）に示すように、蓋部材９６を開放位置とした状態で、第１チップ６０をその上端側、即ち、支持板６２側から蓋部材９６における挟持部材９８の固定溝９８ｂに挟み込ませる。ここで、固定溝９８ｂは、第１チップ６０の支持板６２の上端側形状と略同一形状に形成されているため、上記のように固定溝９８ｂに第１チップ６０を挟み込ませることで、第１チップ６０と蓋部材９６との相対位置は一義的に定まる。
【００９２】
次いで、図１４（ｂ）に示すように、蓋部材９６を開放位置から閉塞位置に回動させ変位させる。すると、図１２及び図１３に示すように、第１チップ６０の下端の第１ゲル１１が、開口部９５を介して第１方向Ｘ２全体にわたって第２ゲル２１に接続される。また、この際、挟持部材９８の当接面９８ａが基板９２ｂの上端に接触し、蓋部材９６と基板９２ｂとの相対位置が一義的に定まる。
【００９３】
したがって、第１チップ６０と第２チップ９０との相対位置も一義的に定まり、これによって、第１チップ６０に支持された第１ゲル１１と第２チップ９０に収納された第２ゲル２１とが定位置にて接触する。
【００９４】
そして、この状態において、キャビティＣの上方のバッファー槽９４及びキャビティＣの下方の図示しないバッファー槽に直流電圧が印加され、第２ゲル２１に対して、第２方向Ｚ２に沿った通電が施される。これにより、第２ゲル２１に接触する第１ゲル１１内のサンプルが第２方向Ｚ２に移動し、分子量に基づいたサンプルの分離が行なわれる。
【００９５】
以上のように、本実施形態のサンプル分離装置８０によれば、蓋部材９６の固定溝９８ｂに第１チップ６０を挟み込ませることにより蓋部材９６と第１チップ６０との相対位置が一義的に定まり、蓋部材９６を閉塞位置に変位させることで該蓋部材９６と基板９２ｂとの相対位置も一義的に定まるため、第１ゲル１１と第２チップ９０に収納された第２ゲル２１とを定位置にて接続させることができる。
即ち、蓋部材９６によって、第１ゲル１１と第２ゲル２１との相対位置を規制することができるため、第１ゲル１１を常に定位置にて第２ゲル２１に接続することが可能となる。
【００９６】
また、蓋部材９６が基板９２ｂに対して回動可能に取り付けられているため、蓋部材９６が開放位置から閉塞位置に変位する動作をもって、第１チップ６０と第２チップ９０との位置合わせを行うことができる。よって、極めて容易かつ簡単に第１ゲル１１の位置決めを行なうことが可能となる。
【００９７】
なお、本実施形態においては、第１チップ６０を挿入孔９５に挿入して第１ゲル１１が第２ゲル２１に接続された状態において、蓋部材９６を開放位置から閉塞位置に変位させて第１チップ６０を挟み込んで位置合わせをする構成とされているが、これに限定されることはなく、例えば、まず開放位置に位置する蓋部材９６の固定溝９７に第１チップ６０を挟み、その後、蓋部材９６を閉塞位置に変位させることで第１チップ６０を挿入孔９５に挿入させる構成であってもよい。これによっても、第１チップ６０の第２チップ９０に対する相対位置を規制することができるため、第１ゲル１１を定位置において第２ゲル２１に接続することが可能となる。
【００９８】
また、支持板６２に第１ゲル１１が支持された第１チップ６０としてではなく、第１ゲル１１単独で用いる場合には、第２実施形態と同様にして、該第１ゲル１１を直接的に蓋部材９６に例えば接着等により固定すればよい。これによっても、第１ゲル１１と第２ゲル２１との相対位置を規制することができるため、第１ゲル１１を定位置において第２ゲル２１に接続することが可能となる。
【００９９】
以上、本発明の第１〜第３実施形態について詳細に説明したが、本発明の技術的思想を逸脱しない限り、これらに限定されることはなく多少の設計変更等も可能である。即ち、第１ゲル１１と第２ゲル２１との相対位置を規制する位置決め手段を備えたものであれば、実施形態に示された構成のサンプル分離装置４０，５０，８０に限定されず、他の構成の位置決め手段を備えたものであってもよい。
【符号の説明】
【０１００】
１０  第１チップ
１１  第１ゲル
１２  支持板（支持部材）
１２ｄ       段差面
１２ｅ       突起部（位置決め手段）
２０  第２チップ
２１  第２ゲル
２２ａ       基板
２２ｂ       基板
２３ｂ       第２スリット（開口部）
２５  差込孔（位置決め手段）
３０  搬送手段
４０  サンプル分離装置
５０  サンプル分離装置
６０  第１チップ
６２  支持板（支持部材）
７０  第２チップ
７２ａ       基板
７２ｂ       基板
７５  挿入孔（開口部）
７６  蓋部材（位置決め手段）
７６ａ       当接面
７７  固定溝
８０  サンプル分離装置
９０  第２チップ
９２ａ       基板
９２ｂ       基板
９５  開口部
９６  蓋部材（位置決め手段）
９７  ガイド部材
９８  挟持部材
９８ａ       当接面
９８ｂ       固定溝
Ｃ    キャビティ
Ｘ１  第１方向
Ｙ１  第２方向
Ｘ２  第１方向
Ｚ２  第２方向
【図１】
2010286394.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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