(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞毒性薬のプロドラッグを提供する。【解決手段】切断可能保護基、例えばピペラジノカルバメート、４−ピペリジノ−ピペリジノカルバメート又はホスフェートを有する抗腫瘍性抗生物質ＣＣ−１０６５の類似体のプロドラッグであって、該保護基はプロドラッグに向上した水溶性と安定性を付与し、また該プロドラッグは抗体のような細胞結合因子に複合できるジスルフィドのような部分も有する。そのような細胞毒性薬のプロドラッグは標的化された様式で細胞毒性プロドラッグを特定の細胞集団に送達し、細胞毒性薬に酵素変換できるので、治療的用途を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣ−１０６５の類似体を含むプロドラッグであって、該分子のアルキル化部分のフェノール基は保護されており、前記プロドラッグは、前記プロドラッグを細胞結合因子に複合させることができるリンカーをさらに含むプロドラッグ。
【請求項２】
前記リンカーが、チオール又はジスルフィド結合を含む、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項３】
前記保護基が、前記プロドラッグの水溶性を増大させる、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項４】
前記保護基が、ピペラジノカルバメート、４−ピペリジノ−ピペリジノカルバメート及びホスフェートからなる群から選ばれる、請求項３に記載のプロドラッグ。
【請求項５】
前記リンカーが、式−（−Ｏ（ＣＨ２）２）ｎ−［式中、ｎは２〜１０００の整数］のポリエチレングリコールを含む、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項６】
請求項１のプロドラッグ及び製薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
【請求項７】
ｓｅｃｏ−シクロプロパベンズインドール含有細胞毒性薬の類似体を含むプロドラッグであって、式（Ｉ）の第一のサブユニットと式（II）、（III）、（IV）、（Ｖ）、（VI）、（VII）、（VIII）又は（IX）の第二のサブユニットが、第一のサブユニットのピロール部分の第二級アミノ基から第二のサブユニットのＣ−２カルボキシルへのアミド結合を介して共有結合して形成された類似体からなる群から選ばれ、
式（Ｉ）は次の通りであり：
【化１】
2010229151.tif 000012
式（II）〜（IX）は次の通りであり：
【化２】
2010229151.tif 000013
【化３】
2010229151.tif 000014
式中、Ｒは、前記プロドラッグの細胞結合因子への連結を可能にする部分を表し；Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ３直鎖アルキル、メトキシ、ヒドロキシル、第一級アミノ、第二級アミノ、第三級アミノ、又はアミドであり；そしてＲ７は酵素切断可能な保護基であるプロドラッグ。
【請求項８】
Ｒがチオール又はジスルフィド結合を含む、請求項７に記載のプロドラッグ。
【請求項９】
Ｒ１〜Ｒ６が水素である、請求項７に記載のプロドラッグ。
【請求項１０】
Ｒ７が、ピペラジノカルバメート、４−ピペリジノ−ピペリジノカルバメート及びホスフェートからなる群から選ばれる、請求項７に記載のプロドラッグ。
【請求項１１】
Ｒが、ジスルフィド結合を介して該プロドラッグの細胞結合因子への連結を可能にする部分を表す、請求項１０に記載のプロドラッグ。
【請求項１２】
前記第二のサブユニットが式（II）で表され、式中、Ｒ１〜Ｒ６が水素である、請求項１０に記載のプロドラッグ。
【請求項１３】
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−メチルピペラジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、又はその塩もしくは異性体である、請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項１４】
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−メチルピペラジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、又はその塩もしくは異性体である、請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項１５】
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−ピペリジノ−ピペリジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、又はその塩もしくは異性体である、請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項１６】
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−ピペリジノ−ピペリジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、又はその塩もしくは異性体である、請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項１７】
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−（ホスホノキシ）−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、又はその塩もしくは異性体である、請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項１８】
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−（ホスホノキシ）−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、又はその塩もしくは異性体である、請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項１９】
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−（ジベンジルホスホノキシ）−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、又はその塩もしくは異性体である、請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項２０】
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−ニトロ−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、又はその塩もしくは異性体である、請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項２１】
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、又はその塩もしくは異性体である、請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項２２】
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（１５”−メチルジチオ−４”，７”，１０”，１３”−テトラオキサペンタデシル−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、又はその塩もしくは異性体である、請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項２３】
請求項１又は請求項７の一つ以上のプロドラッグに連結された細胞結合因子を含むプロドラッグ複合体。
【請求項２４】
前記細胞結合因子が抗体又はそのフラグメントである、請求項２３に記載のプロドラッグ複合体。
【請求項２５】
請求項７のプロドラッグ及び製薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
【請求項２６】
患者の治療法であって、その必要のある患者に有効量の請求項６又は２５の組成物を投与することを含む方法。
【請求項２７】
患者の治療法であって、その必要のある患者に有効量の請求項２４のプロドラッグ複合体を投与することを含む方法。
【請求項２８】
前記リンカーが、式−（−Ｏ（ＣＨ２）２）ｎ−［式中、ｎは２〜１０００の整数］のポリエチレングリコールを含む、請求項７に記載のプロドラッグ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞毒性薬の新規プロドラッグ及びそれらの治療的使用に関する。更に詳しくは、本発明は、ＣＣ−１０６５の類似体である細胞毒性薬の新規プロドラッグに関し、該プロドラッグは、細胞結合因子への化学連結部分とインビボで切断される保護基の両方を含む。該プロドラッグは、細胞結合因子(cell binding agent)に化学的に連結できるので、治療薬はインビボで活性化及び放出され、そして標的化された様式で特定の細胞集団に送達されることが可能になる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
モノクロナール抗体−薬物複合体による腫瘍細胞のターゲティングに関する多数の報告が世に出ている｛Ｓｅｌａら、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，ｐｐ．１８９−２１６（Ｃ．Ｖｏｇｅｌ編、１９８７）；Ｇｈｏｓｅら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇｓ，ｐｐ．１−２２（Ｅ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ編、１９８３）；Ｄｉｅｎｅｒら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．１−２３（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．２５−３３（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８）；Ｂｕｍｏｌら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．５５−７９（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８）；Ｇ．Ａ．Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ＆  Ｋ．Ｋｒａｕｅｒ，２  Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１８３−２１５（１９９４）；Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉ，３１  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｓ．，８９−１０４（１９９８）；Ｗ．Ａ．Ｂｌａｔｔｌｅｒ  ＆  Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，３１７−３３８，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ７９６；及びＩ．Ｏｊｉｍａら編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００１｝。メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリチェアマイシン及びメイタンシノイド系といった細胞毒性薬が各種のマウスモノクロナール抗体に複合されている。薬物分子が中間担体分子を通じて抗体分子に連結されたこともあった。中間担体分子は、例えば、血清アルブミン｛Ｇａｒｎｅｔｔら、４６  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２４０７−２４１２（１９８６）；Ｏｈｋａｗａら、２３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｎｕｎｏｔｈｅｒ．８１−８６（１９８６）；Ｅｎｄｏら、４７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０７６−１０８０（１９８０）｝、デキストラン｛Ｈｕｒｗｉｔｚら、２  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５−３５（１９８０）；Ｍａｎａｂｉら、３４  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２８９−２９１（１９８５）；Ｄｉｌｌｍａｎら、４６  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８８６−４８９１（１９８６）；及びＳｈｏｖａｌら、８５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２７６−８２８０（１９８８）｝、又はポリグルタミン酸｛Ｔｓｕｋａｄａら、７３  Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．７２１−７２９（１９８４）；Ｋａｔｏら、２７  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１６０２−１６０７（１９８４）；Ｔｓｕｋａｄａら、５２  Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１１−１１６（１９８５）｝である。
【０００３】
今日では、そのような免疫複合体の製造に、切断可能及び切断不能リンカーを含む多様なリンカーが利用可能である。しかしながら、インビトロの細胞毒性試験によれば、抗体−薬物複合体が遊離の非複合薬と同じ細胞毒性力を達成するのは稀なことが明らかとなっている。このことは、薬物分子が複合抗体から放出される機序が極めて非効率的であることを示している。イムノトキシン分野の初期の研究で、モノクロナール抗体と触媒活性タンパク質トキシンとの間がジスルフィド架橋を介して形成された複合体は、他のリンカーを含有する複合体よりも細胞毒性が強いことが示された｛Ｌａｍｂｅｒｔら、２６０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１２０３５−１２０４１（１９８５）；Ｌａｍｂｅｒｔら、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  １７５−２０９（Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌ編、１９８８）；Ｇｈｅｔｉｅら、４８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２６１０−２６１７（１９８８）｝。この改良された細胞毒性は、抗体分子とトキシン間のジスルフィド結合の効率的切断に寄与する還元型グルタチオンの細胞内濃度が高いことに起因していた。メイタンシノイド系とカリチェアマイシンは、ジスルフィド結合を介してモノクロナール抗体に連結された最初の高細胞毒性薬の例であった。これらの薬物の抗体複合体は、インビトロで高い効力及びマウスにおけるヒト腫瘍異種移植モデルで並外れた抗腫瘍活性を有することが示されている｛Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉら，５２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１２７−１３１（１９９２）；Ｃ．Ｌｉｕら、９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６１８−８６２３（１９９６）；Ｌ．Ｍ．Ｈｉｎｍａｎら、５３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３５３６−３５４２（１９９３）；及びＰ．Ｒ．Ｈａｍａｎｎら、１３，ＢｉｏＣｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４０−４６（２００２）｝。
【０００４】
そのような細胞毒性複合体製造のための魅力的な候補はＣＣ−１０６５で、これはストレプトマイセス・ゼレンシス(Streptomyces zelensis)の培養ブロスから単離された強力な抗腫瘍性抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、一般に使用されている抗がん剤、例えばドキソルビシン、メトトレキサート及びビンクリスチンなどよりインビトロで約１０００倍も強力である｛Ｂ．Ｋ．Ｂｈｕｙａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４２，３５３２−３５３７（１９８２）｝。
【０００５】
ＣＣ−１０６５（化合物１、図１Ａ）の構造はｘ線結晶学によって決定されている｛Ｍａｒｔｉｎ，Ｄ．Ｇ．ら、３３  Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ９０２−９０３（１９８０）、及びＣｈｉｄｅｓｔｅｒ，Ｃ．Ｇ．ら、１０３  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７６２９−７６３５（１９８１）｝。ＣＣ−１０６５分子は、アミド結合で連結された３つの置換ピロロインドール部分からなる。“Ａ”サブユニットは、分子中に不斉炭素のみを含有するシクロプロピル環を有する。ｘ線データからはこれらの炭素の相対配置しか得られないが、ＤＮＡをキラル試薬として使用することにより、絶対配置は３ｂ−Ｒ、４ａ−Ｓと推測されている｛Ｈｕｒｌｅｙ，Ｌ．Ｈ．ら、２２６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８４３−８４４（１９８４）｝。ＣＣ−１０６５の“Ｂ”及び“Ｃ”サブユニットは同一のピロロインドール部分である。
【０００６】
ＣＣ−１０６５の細胞毒性力は、そのアルキル化活性及びそのＤＮＡ結合又はＤＮＡ挿入（インターカレーション）活性に相関している。これら二つの活性は分子の別の部分に存在する。従って、アルキル化活性はシクロプロパピロロインドール（ＣＰＩ）サブユニットに含有され、ＤＮＡ結合活性は二つのピロロインドールサブユニットに存在する（図１Ａ）。
【０００７】
しかしながら、ＣＣ−１０６５は細胞毒性薬として確かに魅力的な特徴を備えているが、治療的使用には制限がある。ＣＣ−１０６５をマウスに投与すると、遅延肝毒性を起こし、１２．５μｇ／ｋｇの静脈内１回投与後５０日目に死亡した｛Ｖ．Ｌ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，XXIX，３１９−３３４（１９８６）｝。このため、遅延毒性を起こさない類似体の開発努力に拍車がかかり、ＣＣ−１０６５をモデルとしたより単純な類似体の合成が報告された｛Ｍ．Ａ．Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３１，５９０−６０３（１９８８）｝。別のシリーズの類似体では、ＣＰＩ部分がシクロプロパベンズインドール（ＣＢＩ）部分で置換された｛Ｄ．Ｌ．Ｂｏｇｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５，５８２３−５８３３（１９９０）、Ｄ．Ｌ．Ｂｏｇｅｒら、ＢｉｏＯｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１，１１５−１２０（１９９１）｝。これらの化合物は、マウスに遅延毒性を起こさずに親薬物の高いインビトロ効力を維持している。ＣＣ−１０６５と同様、これらの化合物はＤＮＡの副溝に共有結合様式で結合して細胞死を起こすアルキル化薬である。しかしながら、最も有望な類似体のアドゼレシン(Adozelesin)及びカルゼレシン(Carzelesin)の臨床評価は残念な結果に終わった｛Ｂ．Ｆ．Ｆｏｓｔｅｒら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，１３，３２１−３２６（１９９６）；Ｉ．Ｗｏｌｆｆら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２，１７１７−１７２３（１９９６）｝。これらの薬物は全身毒性が高いために乏しい治療効果しか発揮しないのである。
【０００８】
ＣＣ−１０６５類似体の治療的効能は、腫瘍部位への標的送達を通じてインビボの分布を変え、非標的組織への低毒性、ひいては低い全身毒性を実現させることによって大きく改善させることができる。この目標を達成するために、ＣＣ−１０６５の類似体及び誘導体と腫瘍細胞を特異的に標的にする細胞結合因子との複合体が報告されている｛米国特許第５，４７５，０９２号；５，５８５，４９９号；５，８４６，５４５号｝。これらの複合体は、典型的にはインビトロで高い標的特異的細胞毒性、及びマウスにおけるヒト腫瘍異種移植モデルで並外れた抗腫瘍活性を発揮する｛Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５，４０７９−４０８４（１９９５）｝。
【０００９】
細胞結合因子は、典型的には水性媒体にのみ可溶なので、通常水溶液中に貯蔵される。従って、これらの類似体は、細胞結合因子との効率的な反応とその結果の水溶液中製剤を可能にするに足る水溶性を持たなくてはならない。さらに、細胞結合因子複合体が有用な貯蔵寿命を持つには、これらの細胞結合因子に連結されるＣＣ−１０６５類似体が水溶液中で長期間安定であることが重要である。
【００１０】
これまでに報告されたＣＣ−１０６５類似体（例えば図１Ｂ及び１Ｃ参照）は、水にわずかしか溶けない。ＣＣ−１０６５類似体が難溶性であるために、細胞結合因子との複合体化反応は、現在は極めて希薄な水溶液中で実施しなければならない。従って、これらのプロドラッグは、親薬物と比較した場合に高い水溶性を持つ必要がある。
【００１１】
また、これまでに報告されたＣＣ−１０６５類似体は、次の理由で水溶液中で極めて不安定である。ｓｅｃｏ形の薬物は自然にシクロプロピル形に転化し、次にこれがＤＮＡをアルキル化しうる（存在する場合）。しかしながらシクロプロピル形と水との競合反応があると、シクロプロピル環の開環が起こり、不活性なヒドロキシ化合物が生成する。従って、水溶液中での有用な寿命を延長するために、ＣＣ−１０６５類似体の反応性部分を、例えばＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグの開発によって保護する必要がある。
【００１２】
そこで、水溶液中での貯蔵に非常に安定なＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグを開発する必要がある。好ましくは、これらのプロドラッグはインビボでのみ活性薬物に転化すべきである。該プロドラッグは患者に注入されたら、好ましくは活性薬物に効率的に転化されるべきである。
【００１３】
カルゼレシンは、アドゼレシンのフェノール基がフェニルカルバメートとして保護されたプロドラッグである｛Ｌ．Ｈ．Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２，４９０４−４９１３（１９９２）｝。しかしながら、このプロドラッグは治療的使用にはあまりにも不安定な上、親薬物に比較して水溶性が増大していない。第二の例では、ＣＣ−１０６５類似体のフェノール残基をグリコシル化してプロドラッグを製造した（米国特許第５，６４６，２９８号）。しかしながら、このプロドラッグはインビボで活性薬物に転化せず、それを細胞毒性形に転化するために細菌源由来の酵素を追加投与する必要がある。
【００１４】
ＣＣ−１０６５とは無関係な抗がん剤で、水溶性プロドラッグに転化されている例が少しある。抗がん剤のイリノテカンでは、フェノール基が４−ピペリジノ−ピペリジノカルバメートで保護されている。この保護基は薬物に水溶性を付与することが報告されている。さらに、該プロドラッグはヒトのインビボで活性薬物に容易に転化される。これはおそらく、ヒト血清、腫瘍組織及び一部の器官に天然に存在する酵素カルボキシエステラーゼによるものであろう｛Ａ．Ｓｐａｒｒｅｂｏｏｍ，４，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２７４７−２７５４（１９９８）；Ｌ．Ｐ．Ｒｉｖｏｒｙら、５２，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１１０３−１１１１（１９９６）｝。
【００１５】
同様に、抗がん剤のエトポシドホスフェートは、ホスフェート保護基を有するプロドラッグの１例で、インビボで容易に活性薬物に転化される。これはおそらく、内因性アルカリホスファターゼによる加水分解によると思われる｛Ｓ．Ｚ．Ｆｉｅｌｄｓら、１  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０５−１１１（１９９５）｝。
【００１６】
従って、生物活性は維持しつつ水溶液中での細胞結合因子との複合を容易にするために、水溶液中での高い溶解性と安定性を有するＣＣ−１０６５類似体が求められている。さらに、有毒な副作用を削減するために、ＣＣ−１０６５類似体は、主として所望の治療部位で好ましくは内因性因子の作用によって細胞毒性薬に転化されるプロドラッグの形態で提供されるのが好都合であろう。これら全ての利点及びその他は、以下の開示及び実施例を読めば当業者には明白なように、本明細書中に記載の発明によって提供される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の概要
本発明の目的は、水性媒体中で高い安定性及び溶解性を有するＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグを提供することである。この及びその他の目的は、分子のアルキル化部分のフェノール基(phenolic が、水溶液中での貯蔵時に薬物を安定にする官能基で保護されているプロドラッグを提供することによって達成される。その上、保護基は、保護されていない類似体と比較した場合、薬物に高い水溶性も付与する。保護基はインビボで容易に切断され、対応する活性薬物が提供される。本明細書中に記載のプロドラッグでは、フェノール置換基は、ピペラジノカルバメート、４−ピペリジノ−ピペリジノカルバメートとして、又はホスフェートとして優先的に保護される。これらはそれぞれ生理的ｐＨで電荷を保有しているので、高い水溶性を有する。水溶性をさらに高めるために、場合によりポリエチレングリコールスペーサーを、末端インドリルサブユニットＣとジスルフィド基のような切断可能連結との間の連結基に導入してもよい。このスペーサーが導入されても薬物の効力に変わりはない。
【００１８】
本発明のさらに特定の態様は、水溶性及び安定性を高め、インビボで切断されうる保護基を有するｓｅｃｏ−シクロプロパベンズインドール含有細胞毒性薬の類似体を含むプロドラッグを提供する。この特定の態様のプロドラッグは、第一及び第二のサブユニットを有し、それらは第一のサブユニットのピロール部分の第二級アミノ基から第二のサブユニットのＣ−２カルボキシルへのアミド結合によって連結されている。第一のサブユニットは式（Ｉ）として示され、式（II）〜（IX）から選ばれる第二のサブユニットに複合している。
【００１９】
【化１】
2010229151.tif 000002
【００２０】
【化２】
2010229151.tif 000003
【００２１】
式中、Ｒはプロドラッグを細胞結合因子に連結する連結基を表し、そのような連結は好ましくはジスルフィド結合を介する。該連結基はポリエチレングリコールスペーサーを含んでいてもよい。Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ３直鎖アルキル、メトキシ、ヒドロキシル、第一級アミノ、第二級アミノ、第三級アミノ、又はアミドである。Ｒ７はインビボで切断されうる、そしてシクロプロパベンズインドール含有細胞毒性薬の水溶性を高める保護基であり、好ましくは、ピペラジノカルバメート、４−ピペリジノ−ピペリジノカルバメート又はホスフェートである。
【００２２】
本発明のプロドラッグは、細胞結合因子が本発明の一つ以上のプロドラッグに連結された細胞毒性複合体に使用できる。細胞結合因子は、抗体及びそのフラグメント、インターフェロン、リンホカイン、ビタミン、ホルモン及び増殖因子などである。そのような複合体を含有する医薬組成物も提供する。
【００２３】
細胞毒性複合体は、有効量の上記医薬組成物を投与することによる患者の治療法に使用できる。選択された細胞結合因子が結合する細胞の種類によって、多くの疾患がインビボ、エクスビボ又はインビトロのいずれかで治療できる。そのような疾患は、例えば、リンパ腫、白血病、肺、乳、結腸、前立腺、腎臓、膵臓などの各がんを含む多くの種類のがんの治療である。
【００２４】
そこで、水溶液中で溶解性及び安定性の改良された、そして活性化されてアルキル化薬を生じたときに細胞毒性を保持した、そして特定の細胞結合因子との複合により特定の細胞種のターゲティングに有用なＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１Ａは、ＣＣ−１０６５及びそのサブユニットＡ、Ｂ、及びＣの構造を示す図である。図１Ｂは、ＣＣ−１０６５の二つの公知類似体の構造を示す図である。図１Ｃは、ＣＣ−１０６５の二つの公知類似体の構造を示す図である。
【図２】図２は、本発明の典型的ＣＣ−１０６５類似体及びプロドラッグの構造を示す図である。
【図３】図３は、本発明の典型的ポリエチレングリコール含有プロドラッグの構造を示す図である。
【図４Ａ】図４ＡおよびＢは、（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−メチルピペラジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ２）及び（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−ピペリジノ−ピペリジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ３）の製造のための合成スキームを示す図である。
【図４Ｂ】図４ＡおよびＢは、（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−メチルピペラジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ２）及び（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−ピペリジノ−ピペリジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ３）の製造のための合成スキームを示す図である。
【図５】図５は、ＤＣ１、ＤＣ２及びＤＣ３のＰＥＧ化バージョン、すなわちそれぞれＤＣ５、ＤＣ６及びＤＣ７の合成のためのスキームを示す図である。
【図６】図６は、（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−（ホスホノキシ）−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ４）の製造のための二つの合成スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な記述
本発明者らは、ある種のＣＣ−１０６５類似体の安定性、水溶性及び有用性は、該類似体のアルキル化部分を適切な保護基で保護することによって増大することを見出した。従って本発明者らが提供するＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグは、高い水溶性及び安定性を有し、さらに細胞結合因子への連結が可能であることによってそのようなＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグの治療的効能が、腫瘍部位への該プロドラッグの標的送達を通じてインビボの分布を変えた結果、非標的組織への低毒性、ひいては低い全身毒性が実現することによって改良されたプロドラッグである。該プロドラッグが送達されると、内因性物質が実質的に該プロドラッグをその活性薬物形に転化し、細胞結合因子への切断可能リンカーを有する態様では、活性薬物形のＣＣ−１０６５類似体が放出されるので、さらにその細胞毒活性が増大する。あるいは、細胞結合因子へのリンカーが標的細胞内部でまず切断され、その後活性薬物に内因的転化をしてもよい。
【００２７】
この目標を達成するために、発明者らはｓｅｃｏ−シクロプロパベンズインドール（ＣＢＩ）含有細胞毒性プロドラッグであるＣＣ−１０６５類似体の典型的プロドラッグ（図２〜６）を合成した。該プロドラッグは、（ａ）安定性及び水溶性を高めるためにフェノール性ヒドロキシルがインビボで切断される保護基によって保護されている式（Ｉ）の第一のサブユニット、及び（ｂ）式（II）〜（IX）の一つによって表される構造を有し、該プロドラッグを細胞結合因子に複合させるための連結基を含む第二のサブユニットを含む。連結基はポリエチレングリコールスペーサーを含有することもできる（図３）。プロドラッグの保護基が除去されると親薬物の高い細胞毒性を保持する活性形の薬物が生成する。リンカーは細胞結合因子への複合に使用され、好ましくはジスルフィド結合を介する。
【００２８】
ジスルフィド結合のような切断可能リンクを用いて高い細胞毒性薬を抗体に連結すると、細胞内部で十分活性な薬物の放出が確保されること、及びそのような複合体は抗原特異的様式で細胞毒性を発揮することがこれまでに示されている｛Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉら，５２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２７−１３１（１９９２）；Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉら，５５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０７９−４０８４（１９９５）；並びに米国特許第５，２０８，０２０号及び５，４７５，０９２号｝。本発明で発明者らは、ＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグの合成、それらのモノクロナール抗体への複合法、並びにそのような複合体のインビトロの細胞毒性及び特異性の測定法について記載する。従って、本発明は、腫瘍細胞、ウィルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞（自己抗体を産生する細胞）、活性化細胞（移植片拒絶反応又は移植片対宿主疾患に関与する細胞）、又は任意のその他の種類の病的又は異常細胞のような殺滅又は溶解されるべき病的又は異常細胞の除去を目的とした、副作用も少ない治療薬の製造に有用な化合物を提供する。
【００２９】
従って、本発明は、細胞結合因子に化学的に連結でき、保護基が放出されると親化合物ＣＣ−１０６５の高い細胞毒性を維持しているＣＣ−１０６５の類似体及び誘導体のプロドラッグの合成を教示する。さらに、活性化されると、これらの化合物は、細胞結合因子に連結されている場合、細胞結合因子が結合する細胞に対して細胞毒性を発揮し、非標的細胞に対しては極めて低毒性である。
【００３０】
本発明のプロドラッグ
本発明によるプロドラッグは、分子のアルキル化部分のフェノール基が保護されているＣＣ−１０６５の類似体を含み、該プロドラッグはさらに、該プロドラッグを細胞結合因子に複合することができるリンカーを含む。該プロドラッグは、アミド結合を介して連結された第一及び第二のサブユニットを含みうる。
【００３１】
本発明のある態様に従って、ＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグは、オープン（open）クロロメチル形のｓｅｃｏ−ＣＢＩ（シクロプロパベンズインドールユニット）である第一のサブユニットを有し、前記第一のサブユニットは、インビボで切断できる水溶性保護基によって保護されているフェノール性ヒドロキシルを有する。本発明のある態様のプロドラッグの第二のサブユニットは、２−カルボキシ−インドール又は２−カルボキシ−ベンゾフラン誘導体、又は両方であり、式（II）〜（IX）で表されるＣＣ−１０６５（図１）のＢ及びＣの結合サブユニットの類似体を含む。天然のＣＣ−１０６５からも公表されている類似体の性質からも確認できるように｛例えば、Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉら、３１  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５９０−６０３（１９８８）、Ｂｏｇｅｒら、６６  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６５４−６６６１（２００１）｝、Ｂ及びＣサブユニットは、式（II）〜（IX）のＲ１〜Ｒ６の位置に対応するインドール又はベンゾフラン環の異なる位置で異なる置換基を持つこともでき、その場合でも強力な細胞毒活性を保持している。
【００３２】
ＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグを細胞結合因子に連結するには、該プロドラッグはまず、ジスルフィド結合、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基、又はエステラーゼに不安定な基のような切断可能な連結を介して該誘導体を細胞結合因子に連結させる部分を含まなくてはならない。プロドラッグ類似体は、該類似体を、例えばジスルフィド結合、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基、又はエステラーゼに不安定な基を介して細胞結合因子に連結するのに必要な部分を含有するように製造される。水溶液中での溶解性をさらに向上させるために、該連結基はポリエチレングリコールスペーサーを含有することができる（図３）。
【００３３】
好ましくはジスルフィド連結が使用される。なぜならば、標的細胞の還元環境がジスルフィドの切断とプロドラッグ（又は薬物、プロドラッグが細胞結合因子から切断されるのと保護基の加水分解の相対的順序による）の放出をもたらし、随伴して細胞毒性も増大するからである。
【００３４】
更に詳しくは、本発明のある態様に従って、ＣＣ−１０６５の類似体のプロドラッグは、第一及び第二のサブユニットを含み、それらは第一のサブユニットのピロール部分の第二級アミノ基から式（II）〜（IX）を有する第二のサブユニットのＣ−２カルボキシ基へのアミド結合を介して共有結合している。
【００３５】
式（II）〜（IX）中、Ｒは、ＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグの細胞結合因子への連結を可能にする部分を表す。該連結部分はポリエチレングリコールスペーサーを含有していてもよい。例としては、ジスルフィド結合、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基、又はエステラーゼに不安定な基を介する連結を可能にする部分などで、当該技術分野で周知である｛例えば、米国特許第５，８４６，５４５号（引用によって本明細書に援用する）参照｝。好適な部分はジスルフィド結合を介する連結を可能にする部分で、例えばチオール（ＤＣ１、ＤＣ２、ＤＣ３、ＤＣ４、ＤＣ５、ＤＣ６、ＤＣ７）又はジスルフィド（ＤＣ１−ＳＭｅ、ＤＣ２−ＳＭｅ、ＤＣ３−ＳＭｅ、ＤＣ４−ＳＭｅ、ＤＣ５−ＳＭｅ、ＤＣ６−ＳＭｅ、ＤＣ７−ＳＭｅ、図２〜６参照）である。任意の末端脱離基を含有する混合ジスルフィド、例えばチオメチル（ＤＣ１−ＳＭｅ、ＤＣ２−ＳＭｅ、ＤＣ３−ＳＭｅ、ＤＣ４−ＳＭｅ、ＤＣ５−ＳＭｅ、ＤＣ６−ＳＭｅ、ＤＣ７−ＳＭｅ）、グルタチオン、アルキルチオール、チオピリジル、アリールチオールなども、そのようなジスルフィドがプロドラッグと細胞結合因子とのカップリングのためにジスルフィド交換反応を受けることが可能であれば、使用することができる。Ｒは、場合により、連結可能部分の反応基と２−カルボキシ−インドール又は２−カルボキシ−ベンゾフラン誘導体部分との間に挟まれたスペーサー領域をさらに含むこともできる。好適な態様は、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍＳＺ、ＮＨＣＯＣ６Ｈ４（ＣＨ２）ｍＳＺ、又はＯ（ＣＨ２）ｍＳＺ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＺ、ＮＨＣＯＣ６Ｈ４（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＺ、又はＯ（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＺなどで、式中、ＺはＨ又はＳＲ８を表し、Ｒ８は、メチル、直鎖アルキル、分枝アルキル、環状アルキル、単純又は置換アリール又はヘテロサイクリックを表し、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは４〜１０００の整数を表す。Ｒ８で表される直鎖アルキルの例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシルなどである。Ｒ８で表される分枝アルキルの例は、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル及び１−エチル−プロピルなどである。Ｒ８で表される環状アルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルなどである。Ｒ８で表される単純アリールの例は、フェニル及びナフチルなどである。Ｒ８で表される置換アリールの例は、アルキル基、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆのようなハロゲン、ニトロ基、アミノ基、スルホン酸基、カルボン酸基、ヒドロキシ基及びアルコキシ基で置換されたフェニル又はナフチルのようなアリールなどである。Ｒ８で表されるヘテロサイクリックは、ヘテロ原子がＯ、Ｎ、及びＳから選ばれる化合物で、例は、フリル、ピロリル、ピリジル、（例えば２−置換ピリミジン基）及びチオフェンなどである。Ｒの最も好適な態様は、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＳＨ及びＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＳＳＣＨ３、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＨ及びＮＨＣＯ（ＣＨ２）２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＳＣＨ３などである。
【００３６】
式（II）〜（IX）中、Ｒ１〜Ｒ６は、同じでも異なっていてもよいが、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ３直鎖アルキル、メトキシ、ヒドロキシル、第一級アミノ、第二級アミノ、第三級アミノ、又はアミドを表す。第一級アミノ基含有置換基の例は、メチルアミノ、エチルアミノ、及びイソプロピルアミノである。第二級アミノ基含有置換基の例は、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、及びエチル−プロピルアミノである。第三級アミノ基含有置換基の例は、トリメチルアミノ、トリエチルアミノ、及びエチル−イソプロピル−メチルアミノである。アミド基の例は、Ｎ−メチル−アセトアミド、Ｎ−メチル−プロピオンアミド、Ｎ−アセトアミド、及びＮ−プロピオンアミドなどである。
【００３７】
式（II）〜（IX）中、Ｒ７は、ｓｅｃｏ−シクロプロパベンズインドール含有細胞毒性薬の水溶性を高めるインビボ切断可能保護基である。好適なインビボ切断可能保護基の例は、ピペラジノカルバメート、４−ピペリジノ−ピペリジノカルバメート及びホスフェート、並びにそれらの誘導体である。従って、ピペラジノカルバメート及び４−ピペリジノ−ピペリジノカルバメート保護基は、血清及び血漿中に存在するカルボキシルエステラーゼのような酵素によって酵素切断される。ホスフェート保護基は、アルカリホスファターゼのようなホスファターゼ酵素によって切断可能である。
【００３８】
本発明のジスルフィド含有及びメルカプト含有ＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグは、活性化された後にのみ、インビトロで各種の望まざる細胞株の増殖を抑制するそれらの能力について評価できる。例えば、ホスホリル基含有プロドラッグ、例えばＤＣ４は、市販のアルカリホスファターゼとのインキュベーションによって活性化でき、一方カルバメート含有プロドラッグ、例えばＤＣ３及びＤＣ４は、市販のカルボキシルエステラーゼとのインキュベーションによって活性化できる。細胞株は、例えば、ヒト類表皮がん株ＫＢ、ヒト乳腫瘍株ＳＫ−ＢＲ−３、及びバーキットリンパ腫株Ｎａｍａｌｗａのような細胞株が、これらの化合物の細胞毒性の評価に容易に使用できる。評価される細胞は化合物に２４時間暴露し、細胞の生存画分を公知法によって直接アッセイで測定することができる。ＩＣ５０値は、次にそのアッセイの結果から算出できる。
【００３９】
細胞結合因子の製造
本発明のプロドラッグ化合物の治療薬としての有効性は、適切な細胞結合因子の注意深い選択にかかっている。細胞結合因子は、現在知られている又は知られるようになったいずれの種でもよく、ペプチド及び非ペプチドを含む。一般的に、これらは、抗体（特にモノクロナール抗体）又は少なくとも一つの結合部位を含有する抗体フラグメント、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、栄養素輸送分子（例えばトランスフェリン）、又は任意のその他の細胞結合分子又は物質でありうる。
【００４０】
使用できる細胞結合因子のより具体的な例は：
モノクロナール抗体；
一本鎖抗体；
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖのような抗体のフラグメント｛Ｐａｒｈａｍ，１３１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８９５−２９０２（１９８３）；Ｓｐｒｉｎｇら、１１３  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７０−４７８（１９７４）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、８９  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３０−２４４（１９６０）｝；
インターフェロン；
ペプチド；
ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６のようなリンホカイン；
インスリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、アンドロゲン及びエストロゲンのようなステロイドホルモンなどのホルモン；
ＥＧＦ、ＴＧＦα、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II）、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ｛Ｂｕｒｇｅｓｓ，５  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５５−１５８（１９８４）｝のような増殖因子及びコロニー刺激因子；
葉酸のようなビタミン、及び
トランスフェリン｛Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、２６０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９３２−９３７（１９８５）｝
などである。
【００４１】
モノクロナール抗体技術により、特異的モノクロナール抗体の形態で極めて選択的な細胞結合因子の製造が可能である。当該技術分野で特によく知られているのは、マウス、ラット、ハムスター又は任意のその他の哺乳動物を問題の抗原、例えば無傷標的細胞、標的細胞から単離した抗原、ホール(whole)ウィルス、弱毒ホールウィルス、及びウィルスコートタンパク質のようなウィルスタンパク質で免疫感作することによって製造されるモノクロナール抗体製造技術である。
【００４２】
適切な細胞結合因子の選択は、標的にされる特定の細胞集団によって決まる選択の問題であるが、一般的に、適切なのが利用できればモノクロナール抗体が好適である。
例えば、モノクロナール抗体ＭＹ９は、ＣＤ３３抗原に特異的に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり｛Ｊ．Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｎら、８  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓ．，５２１（１９８４）｝、標的細胞が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の疾患の場合のようにＣＤ３３を発現していれば使用できる。同様に、モノクロナール抗体抗Ｂ４は、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に結合するマウスＩｇＧ１であり｛Ｎａｄｌｅｒら、１３１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４４−２５０（１９８３）｝、標的細胞がＢ細胞又は非ホジキンリンパ腫又は慢性リンパ芽球性白血病のようにこの抗原を発現している病的細胞であれば使用できる。
【００４３】
さらに、骨髄細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦは、急性骨髄性白血病の病的細胞に対する細胞結合因子として使用できる。活性化Ｔ細胞に結合するＩＬ−２は、移植片拒絶反応の予防、移植片対宿主疾患の療法及び予防、そして急性Ｔ細胞白血病の治療に使用できる。メラニン細胞に結合するＭＳＨは黒色腫の治療に使用できる。
【００４４】
プロドラッグ複合体の製造
プロドラッグと細胞結合因子の複合体は、現在知られている又は後に開発される任意の技術を用いて形成できる。ｓｅｃｏ−ＣＢＩ類似体に結合させたインドリル、ベンゾフラニル、ビス−インドリル、ビス−ベンゾフラニル、インドリル−ベンゾフラニル、又はベンゾフラニル−インドリル誘導体は、遊離アミノ基を含有するように製造し、次いで酸に不安定なリンカーを介して、又は光に不安定なリンカーによって抗体又は他の細胞結合因子に連結させることができる。プロドラッグ化合物を適切な配列を有するペプチドと縮合させ、その後細胞結合因子に連結させるとペプチダーゼに不安定なリンカーを製造することができる。細胞毒性化合物を、スクシニル化できる第一級ヒドロキシル基を含有するように製造し、細胞結合因子に連結させると細胞内エステラーゼによって切断されて遊離プロドラッグを放出できる複合体が製造できる。好ましくは、プロドラッグ化合物は、ＰＥＧ含有スペーサーがある場合もない場合も、遊離又は保護チオール基を含有するように合成し、次いで一つ以上のジスルフィド又はチオール含有プロドラッグをそれぞれ細胞結合因子にジスルフィド結合を介して共有結合させる。
【００４５】
本発明の代表的複合体は、ＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグと抗体、抗体フラグメント、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、エストロゲン、エストロゲン類似体、アンドロゲン、及びアンドロゲン類似体との複合体である。
【００４６】
ＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグと細胞結合因子との各種複合体の代表的製造例を以下に記載する。
ジスルフィドリンカー：小細胞肺がん細胞表面に発現されるＣＤ−５６抗原に結合する抗体Ｎ９０１｛Ｊ．Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｔ．Ｈｅｒｃｅｎｄ，Ｒ．Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅ  ＆  Ｓ．Ｆ．Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３０：２９４７（１９８３）｝は、複合体の製造に使用できる。該抗体を以前の報告通りＮ−スクシンイミジル−３−ピリジルジチオプロピオネートで修飾し｛Ｊ．Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｈ．Ｄｒｅｖｉｎ  ＆  Ｒ．Ａｘｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３（１９７８）｝、抗体分子１個につき平均４個のピリジルジチオ基を導入する。該修飾抗体をチオール含有プロドラッグと反応させてジスルフィド連結複合体を製造する。
【００４７】
酸に不安定なリンカー：本発明のアミノ基含有プロドラッグは、以前の報告通り酸に不安定なリンカーを介して抗体及び他の細胞結合因子に連結させることができる｛Ｗ．Ａ．Ｂｌａｔｔｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４，１５１７−１５２４（１９８５）；米国特許第４，５４２，２２５号、４，５６９，７８９号、４，６１８，４９２号、４，７６４，３６８号｝。
【００４８】
同様に、本発明のヒドラジド基含有プロドラッグは、酸に不安定なヒドラゾンリンカーを介して抗体及び他の細胞結合因子の炭水化物部分に連結させることができる｛ヒドラゾンリンカーの例については、Ｂ．Ｃ．Ｌａｇｕｚｚａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３２，５４８−５５５（１９８９）；Ｒ．Ｓ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０，６６００−６６０７（１９９０）参照｝。
【００４９】
光に不安定なリンカー：本発明のアミン基含有プロドラッグは、以前の報告通り光に不安定なリンカーを介して抗体及び他の細胞結合因子に連結してもよい｛Ｐ．Ｓｅｎｔｅｒら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，４２，２３１−２３７（１９８５）；米国特許第４，６２５，０１４号｝。
【００５０】
ペプチダーゼに不安定なリンカー：本発明のアミン基含有プロドラッグは、ペプチドスペーサーを介して細胞結合因子に連結してもよい。薬物と高分子タンパク質担体間の短ペプチドスペーサーは血清中では安定であるが、細胞内ペプチダーゼによって容易に加水分解されることがこれまでに示されている｛Ａ．Ｔｒｏｕｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７９，６２６−６２９（１９８２）｝。アミノ基含有プロドラッグを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ＨＣｌ（ＥＤＣ−ＨＣｌ）のような縮合剤を用いてペプチドと縮合させてペプチド誘導体を製造し、これを細胞結合因子に連結すればよい。
【００５１】
エステラーゼに不安定なリンカー：ヒドロキシアルキル基を持つ本発明のプロドラッグを無水コハク酸でスクシニル化し、次いで細胞結合因子に連結すると、細胞内エステラーゼで切断されて遊離薬物を放出できる複合体が製造できる｛例えば、Ｅ．Ａｂｏｕｄ−Ｐｉｒａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３８，６４１−６４８（１９８９）参照｝。
【００５２】
上記方法で製造した複合体は、標準のカラムクロマトグラフィー又はＨＰＬＣによって精製できる。
好ましくは、モノクロナール抗体又は細胞結合因子と本発明のプロドラッグ間の複合体は、前述のようにジスルフィド結合を介して合体させたものである。そのような細胞結合複合体は、スクシンイミジルピリジル−ジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）でモノクロナール抗体を修飾するような公知法によって製造される｛Ｃａｒｌｓｓｏｎら，１７３  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７２３−７３７（１９７８）｝。得られたチオピリジル基を次にチオール含有プロドラッグで処理して置換するとジスルフィド連結複合体が得られる。ジスルフィド架橋を介して連結された１〜１０個のプロドラッグを含有する複合体はこの方法で容易に製造される。この方法による複合は米国特許第５，５８５，４９９号に十分に記載されている。前記特許は引用により本明細書に援用する。
【００５３】
細胞結合因子と本発明のプロドラッグ間の複合体のインビトロ細胞毒性
本発明のプロドラッグ及びそれらの細胞結合因子との複合体の細胞毒性は、保護基を切断し活性薬物に転化してから測定できる。Ｎａｍａｌｗａ及びＳＷ２のような非付着細胞株に対する細胞毒性は、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒら、１３５  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６４８−３６５１（１９８５）に記載のように、細胞増殖曲線の後方補外(back-extrapolatiion)によって測定できる。Ａ−３７５及びＳＣａＢＥＲのような付着細胞株に対するこれらの化合物の細胞毒性は、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒら、１０２  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３１２−１３１９（１９８６）に記載のように、クローン形成アッセイ(clonogenic assay)によって測定できる。
【００５４】
選択された細胞集団の成長を抑制するための治療薬及び方法
本発明は選択された細胞集団の成長を抑制するための治療薬も提供する。該治療薬は、
（ａ）細胞毒量の、細胞結合因子に連結された一つ以上の上記プロドラッグ、及び
（ｂ）製薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤
を含む。
【００５５】
同様に、本発明は選択された細胞集団の成長を抑制するための方法も提供し、該方法は、前記選択細胞集団由来の細胞を含有すると思われる細胞集団又は組織を、細胞結合因子に連結された一つ以上の上記プロドラッグを含む細胞毒量の細胞毒性薬と接触させることを含む。
【００５６】
細胞毒性薬は前述のように製造する。
製薬学的に許容しうる適切な担体、希釈剤、及び賦形剤は周知であり、臨床状況の許可するところ(clinical situation warrants) に応じて当業者が決定できる。
【００５７】
適切な担体、希釈剤及び／又は賦形剤の例は、（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ約７．４）、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ）、及び（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースなどである。
【００５８】
選択された細胞集団の成長抑制法は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで実施できる。
インビトロでの使用例は、標的抗原を発現していない望ましい変異株以外の全細胞を殺滅する；又は望まざる抗原を発現している変異株を殺滅するために細胞培養物を処理することなどである。
【００５９】
非臨床的インビトロの条件は当業者によって容易に決定される。
エクスビボでの使用例は、病的又は悪性細胞を殺滅するために自己骨髄を処理してから同じ患者に移植すること；コンピテントＴ細胞を殺滅して移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を予防するために骨髄を処理してからそれらを移植することなどである。
【００６０】
がんの治療又は自己免疫疾患の治療で自己移植前に骨髄から腫瘍細胞又はリンパ系細胞を除去する、又はＧＶＨＤ予防のために移植前に同種骨髄又は組織からＴ細胞及び他のリンパ系細胞を除去するための臨床的エクスビボ治療は、以下のように実施できる。患者又はその他の個人から骨髄を採取し、次いで本発明の細胞毒性薬（濃度範囲約１０μＭ〜１ｐＭ）を加えた血清含有培地中で、約３７℃で約３０分〜約４８時間インキュベートする。濃度及びインキュベーション時間の正確な条件（＝用量）は当業者によって容易に決定される。インキュベーション後、骨髄細胞を血清含有培地で洗浄し、公知法に従って静脈内注入によって患者に戻す。患者が、骨髄採取と処理細胞再注入の時間の間に外科的化学療法又は全身照射コースなどのその他の治療を受ける場合、処理された骨髄細胞は標準的医療装置を用いて液体窒素中で凍結保存される。
【００６１】
臨床的インビボでの使用の場合、本発明の細胞毒性薬は、無菌性及びエンドトキシンレベルについて試験される溶液として、又は注射用滅菌水に再溶解できる凍結乾燥固体として供給されることになろう。複合体投与の適切なプロトコルの例は以下の通りである。複合体は、６週間にわたって毎週静脈内ボーラスとして投与される。ボーラス投与用量を、５０〜４００ｍｌの生理食塩水に与え、これにヒト血清アルブミン（例えば０．５〜１ｍＬのヒト血清アルブミン濃縮溶液、１００ｍｇ／ｍＬ）を加えることができる。用量は、１週間当たり約５０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の静脈内注射である（注射当たり１０μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ）。６週間の治療後、患者は２回目のコースの治療を受けてもよい。投与経路、賦形剤、希釈剤、用量、時間などに関する具体的臨床プロトコルは、臨床状況の許可するところに応じて専門家が決定できる。
【００６２】
選択された細胞集団を殺滅するインビボ又はエクスビボの方法に従って治療できる医学的状態の例は、あらゆる種類の悪性腫瘍、例えば、肺、乳、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、卵巣、及びリンパ器官のがん；黒色腫；自己免疫疾患、例えば全身性狼瘡、リウマチ様関節炎、及び多発性硬化症；移植片拒絶反応、例えば腎移植拒絶反応、肝移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、及び骨髄移植拒絶反応；移植片対宿主疾患；ウィルス感染、例えばＣＭＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなど；細菌感染；及び寄生虫感染、例えばランブル鞭毛虫症、アメーバ症、住血吸虫症、及び当業者が決めるその他などである。
【実施例】
【００６３】
実施例
本発明をこれから非制限的実施例を引用することによって説明する。別途記載のない限り、全てのパーセント、比率、部などは重量による。
【００６４】
材料及び方法
融点は電熱装置を用いて測定し、補正していない。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ４００（４００ＭＨｚ）スペクトロメータで記録した。化学シフトは、内部標準としてＴＭＳに対するｐｐｍで報告する。質量スペクトルはＢｒｕｋｅｒ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００  システムを用いて得た。紫外線スペクトルはＨｉｔａｃｈｉ  Ｕ１２００  分光光度計で記録した。ＨＰＬＣは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  システム  ＧＯＬＤ  １６８  可変波長検出器及びＷａｔｅｒｓ  ＲＡＤＩＡＬＰＡＫ（逆相Ｃ−１８カラム）を備えたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧＯＬＤ  １２５  システムを用いて実施した。薄層クロマトグラフィーはＡｎａｌｔｅｃｈ  ＧＦ  シリカゲル  ＴＬＣプレートで実施した。フラッシュカラムクロマトグラフィー用のシリカゲルはＢａｋｅｒ製であった。テトラヒドロフランはナトリウム金属上で蒸留して乾燥させた。ジメチルアセトアミド及びジメチルホルムアミドは減圧下水素化カルシウム上で蒸留して乾燥させた。使用したその他全ての溶媒は試薬級又はＨＰＬＣ級であった。
【００６５】
プロドラッグＤＣ２（２）、ＤＣ３（３）及びＤＣ４（４）ＤＣ５ＤＣ６ＤＣ７ＤＣ８（図２〜６）の合成をここに記載する。ＤＣ２、ＤＣ３及びＤＣ４は親薬物ＤＣ１から誘導されるが、ＤＣ６、ＤＣ７及びＤＣ８はＰＥＧ化された(pegylatd) 親薬物ＤＣ５から製造できる。プロドラッグＤＣ２及びＤＣ３は水溶液中で極めて安定で、血清、血漿中又はカルボキシルエステラーゼのような酵素とインキュベーションすることにより親薬物ＤＣ１に転化できる。これらの薬物はＤＣ１と比較した場合に水溶性も向上している。プロドラッグＤＣ４も水溶液中で極めて安定で、さらに可溶性である。ＤＣ４をアルカリホスファターゼとインキュベーションすると親薬物ＤＣ１に転化される。
【００６６】
ＤＣ１（１）の、プロドラッグＤＣ２（２）及びＤＣ３（３）への転化の合成スキームを図４に示す。ＤＣ１のフェノール置換基は、図３に掲載したいずれか一つの試薬と反応でき、中間体５となる。５をＮ−メチルピペラジンと反応させるとＤＣ２が得られる。５を４−ピペリジノ−ピペリジンと反応させるとＤＣ３が得られる。
【００６７】
ＤＣ１は、図６に示すようにプロドラッグＤＣ４に転化された。ＤＣ１−ＳＭｅを塩基の存在下でジベンジルホスフェート及び四塩化炭素で処理すると中間体４ｃが得られるが、ＤＣ１−ＳＭｅをオキシ塩化リンと反応させると中間体４ｂが得られる。４ｃのベンジル保護基を水素で除去し、随伴してジスルフィド結合を還元するとＤＣ４が得られた。中間体４ｂをＴＣＥＰ又はＤＴＴで還元するとＤＣ４が得られた。
【００６８】
（実施例Ｉ）
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−メチルピペラジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ２−ＳＭｅ、２ｂ）の製造
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ１ＳＭｅ）ＤＣ１−ＳＭｅ（１ｂ、４０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）中溶液に、４−ニトロフェニルクロロホルメート（１７ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）及びジ−イソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１５μｌ）を加えた。該反応混合物をアルゴン雰囲気下で３時間撹拌した。ＴＬＣによる分析で、全てのＤＣ１が消費されてＲｆ値０．４５の中間体が形成されたことが示された（移動相は１：２のアセトン／トルエン）。該反応混合物を４−メチルピペラジン（８．３ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）で処理し、次いでアルゴン下で一晩撹拌した。次に、該混合物をＥｔＯＡｃ／ＴＨＦの１：１（ｖ／ｖ）混合物（１５ｍＬ）及びｐＨ５．０の１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４水溶液（５ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、水性層をＥｔＯＡｃ／ＴＨＦ（１：１，４×１５ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥、ろ過、蒸発、シリカゲルクロマトグラフィーによりアセトン／トルエン（３：８）で溶離して精製、そしてＴＨＦ／ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで再結晶化して４０ｍｇ（収率８５％）のＤＣ２−ＳＭｅ（２ｂ）を得た。Ｒｆ＝０．３１（アセトン／トルエン、３：８）；ｍｐ＝２２５℃（分解）；
【００６９】
【数１】
2010229151.tif 000004
【００７０】
（実施例II）
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−メチルピペラジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ２、２ａ）の製造
トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ、３０ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（２ｍＬ）中溶液をＮａＨＣＯ３粉末でｐＨ７．０に調整した。この溶液に、２５ｍｇ（０．０３１ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（３ｍＬ）中ＤＣ２−ＳＭｅ（２ｂ）を加えた。２時間撹拌後、数滴のＨＯＡｃを加えてｐＨを３〜４に調整した。該混合物を濃縮し、分取用シリカゲルＴＬＣ（１：２のアセトン／トルエンで溶離）を用いて精製し、２１ｍｇ（９０％）のＤＣ２（２ａ）を得た。
【００７１】
【数２】
2010229151.tif 000005
【００７２】
（実施例III）
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−ピペリジノ−ピペリジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ３−ＳＭｅ、３ｂ）（３ｂ）（ＤＣ３−ＳＭｅ）の製造
ＤＣ１−ＳＭｅ、１ｂ、（５０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍｌ）中溶液に、４−ニトロフェニルクロロホルメート（３５ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（５０μｌ）を加えた。アルゴン下で３時間撹拌後、ＴＬＣ分析で、全てのＤＣ１−ＳＭｅが消費されてＲｆ＝０．４５の中間体が得られたことが示された（１：２のアセトン／トルエン）。該反応混合物を４−ピペリジノ−ピペリジン（４０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）で処理したところ、重い沈殿物が形成された。混合物を４時間撹拌し、２０ｍｌのＥｔＯＡｃ／ＴＨＦ（１：１）及び５ｍｌの１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．５）で希釈した。有機層を分離し、水性層をＥｔＯＡｃ／ＴＨＦ（１：１，４×１５ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥、ろ過、蒸発、シリカゲルクロマトグラフィー（アセトン／トルエン、３：８）で精製、そしてＴＨＦ／ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで結晶化してＤＣ３−ＳＭｅ（３ｂ、４５ｍｇ、収率７０％）を得た。ｍｐ＝２８５℃（分解）；［α］＝２９．７°（ＤＭＦ中  ｃ０．５）；
【００７３】
【数３】
2010229151.tif 000006
【００７４】
（実施例IV）
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−［（４−ピペリジノ−ピペリジノ）カルボニルオキシ］−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ３、３ａ）（３ａ）（ＤＣ３）の製造
ＴＣＥＰ（１５．２ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（０．７ｍＬ）中溶液を１３．５ｍｇのＮａＨＣＯ３粉末の添加でｐＨ７．０に調整した。該溶液にＤＭＡ（２ｍＬ）中ＤＣ３−ＳＭｅ（３ｂ、８．２ｍｇ、０．００９３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２時間撹拌した。次に数滴のＨＯＡｃを加えてｐＨを３〜４に調整した。該混合物を濃縮し、分取用シリカゲルＴＬＣを用いアセトン／トルエン（１：２）で溶離して精製し、７ｍｇのＤＣ３（３ａ）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ＋８５４．３１（Ｍ＋Ｎａ）＋、８５５．３１、８５６．３２、８５７．３１。
【００７５】
（実施例Ｖ）
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−（ホスホノキシ）−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（４ｂ）（ＤＣ４−ＳＭｅ）の製造
ＤＣ１−ＳＭｅ（１ｂ、５０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）の、ＴＨＦ（５ｍｌ）、ＣＨ３ＣＮ（４ｍｌ）及びＤＭＡ（０．５ｍｌ）の混合物中溶液をアルゴン雰囲気下で撹拌した。該混合物に、ＰＯＣｌ３（８０μＬ）、ＤＩＰＥＡ（１５０μＬ）及びＤＭＡＰ（３ｍｇ）を順に加えた。２時間の撹拌後、ＴＬＣ及びＨＰＬＣ両方の分析からＤＣ１−ＳＭｅが完全に消費されたことが示された。ｐＨ４．０の１．０Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４水溶液（２ｍｌ）を加え、混合物を一晩撹拌した。該混合物をＨ３ＰＯ４でさらに酸性化してｐＨ２．０にし、ＮａＣｌで飽和し、ＴＨＦ／ＥｔＯＡｃ（１：１、６×１５ｍｌ）で抽出した。有機層を分離し、濃縮し、残渣をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＯＨで再結晶化して４７ｍｇ（８４％）の標記化合物（ＤＣ４−ＳＭｅ）を得た。
【００７６】
【数４】
2010229151.tif 000007
【００７７】
（実施例VI）
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−（ホスホノキシ）−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（４ａ）（ＤＣ４）の製造
ＴＣＥＰ（３０ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）の２ｍｌＨ２Ｏ中溶液をＮａＨＣＯ３粉末の添加によってｐＨ６．５〜７．０に調整した。該溶液に３ｍｌのＤＭＡ／Ｈ２Ｏ（１：１）中ＤＣ４−ＳＭｅ（２６ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン下で２時間撹拌した後、数滴の１０％Ｈ３ＰＯ４を加えてｐＨ２．０にした。次に、該混合物をＤＭＡ／ＥｔＯＡｃ（１：５、６×１０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、蒸発させ、分取用ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、２０×２５０ｍｍ、流速＝８．０ｍｌ／分、移動相：Ａ：Ｈ２Ｏ中０．０１％ＨＯＡｃ、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ中２％ＤＭＡ；タイムテーブル：０−１０’、５％Ｂ；２０’まで、２０％Ｂ；５０’まで、５０％Ｂ）により精製した。ＤＣ４のピークは３０〜３８分に溶出された。ＤＣ４含有画分をプールし、濃縮し、真空下で乾燥させて２２ｍｇ（８９％）の標記化合物４ａを得た。
【００７８】
【数５】
2010229151.tif 000008
【００７９】
あるいは、ＤＴＴ（２０ｍｇ）の、アセトン（３ｍＬ）及び５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（３ｍＬ、ｐＨ７．０）の混合物中溶液に、ＤＣ４ＳＭｅ（２２ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン下で４時間撹拌後、数滴の５％Ｈ３ＰＯ４を加えてｐＨ３．０にした。該混合物を濃縮し、Ｃ１８カラム（１．０×１２ｃｍ）で１００％水からアセトン中５０％水で溶離して精製した。画分をプールし、蒸発乾固して１８ｍｇ（９０％）のＤＣ４（４ａ）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ−  ７１６．３０、７１８．３０、７１７．３０。
【００８０】
（実施例VII）
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−（ジベンジルホスホノキシ）−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（４ｃ）（ＤＣ４−ＳＭｅ  ジベンジルホスフェート）の製造
ＤＣ１−ＳＭｅ（５０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）の１０ｍｌＴＨＦ／ＣＨ３ＣＮ（１：１）中溶液にアルゴン下で、ＣＣｌ４（１００μＬ、１．０３６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（５５μＬ、０．３１６ｍｍｏｌ）、ジベンジルホスファイト（１００μＬ、０．４５２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．２ｍｇ、０．００１６ｍｍｏｌ）を順に加えた。アルゴン下で一晩撹拌後、ＴＬＣ分析によれば反応は完了したようで、Ｒｆ＝０．３７（１：２のアセトン／トルエン中）を有する新生成物が形成された。混合物を５ｍｌの１．０Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．０）及びＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、水溶液をＴＨＦ／ＥｔＯＡｃ（１：１、４×１５ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥、ろ過、蒸発及びシリカゲルクロマトグラフィーでアセトン／トルエン（３：７）で溶離して精製し、６２ｍｇ（８９％）の標記化合物４ｃを得た。
【００８１】
【数６】
2010229151.tif 000009
【００８２】
ＤＣ４への転化：
フラスコに４ｃ（２０ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を入れ、Ｐｄ／Ｃ（１５ｍｇ）、氷酢酸（１００μｌ）及びＤＭＡ（４ｍｌ）で処理した。系を真空吸引で真空排気し、次いで水素充填バルーンを通じて水素下で一晩撹拌した。触媒をろ過除去し、溶媒を蒸発させ、残渣を前述のような分取用ＨＰＬＣで精製して６ｍｇ（３９％）のＤＣ４（４ａ）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ  ７１６．４８（Ｍ−Ｈ）−、７１７．４８、７１８．５０。
【００８３】
（実施例VIII）
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−ニトロ−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ０、１０ａ）の製造
５−ヒドロキシ−３−アミノ−１−［Ｓ］−（クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール塩酸塩［ｓｅｃｏ−（−）ＣＢＩ、２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ］及び５−［５’−ニトロインドール−２’−イル−カルボニルアミノ］インドール−２−カルボン酸（９、２５ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（３ｍＬ）中溶液に、アルゴン下でＥＤＣ（４０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を加えた。一晩撹拌後、数滴の５０％ＨＯＡｃを加え、混合物を蒸発乾固して分取用シリカゲルＴＬＣクロマトグラフィー（トルエン中４０％アセトン）で精製して２５ｍｇのＤＣ０（１０ａ）を得た。
【００８４】
【数７】
2010229151.tif 000010
【００８５】
（実施例IX）
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（３−メチルジチオ−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、ＤＣ１ＳＭｅ（１ｂ）の製造
フラスコに、１０ａ（１０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）、Ｐｄ／Ｃ（１０ｍｇ）、ＨＣｌ（濃、３μｌ）及びＤＭＡ（２．５ｍｌ）を入れた。空気を排気した後、水素バルーンによって水素を一晩導入した。触媒をろ過除去し、溶媒を蒸発させて１０ｂを褐色固体として得た。該固体化合物はこれ以上精製せずにそのまま使用した。
【００８６】
ＤＭＡ（２ｍＬ）中の１０ｂに、３−（メチルジチオ）プロピオン酸（５ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（１５ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）をアルゴン下で加えた。一晩撹拌後、２滴の５０％ＨＯＡｃを加え、混合物を蒸発乾固して分取用シリカゲルＴＬＣ（トルエン中４０％アセトン）で精製して６ｍｇのＤＣ１−ＳＭｅ（１ｂ）を得た。Ｒｆ＝０．４０（３：７のアセトン／トルエン）；
【００８７】
【数８】
2010229151.tif 000011
【００８８】
（実施例Ｘ）
（Ｓ）−Ｎ−［２−｛（１−クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−３Ｈ−ベンズ（ｅ）インドール−３−イル｝カルボニル］−１Ｈ−インドール−５−イル］−５−［（１５”−メチルジチオ−４”，７”，１０”，１３”−テトラオキサペンタデシル−１−オキソプロピル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＤＣ５−ＳＭｅ）の製造
１０ｂ（５０ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（５ｍＬ）中溶液に、１５”−メチルジチオ−４”，７”，１０”，１３”−テトラオキサペンタデカン酸（３３ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（８８ｍｇ、０．４５９ｍｍｏｌ）をアルゴン下で加えた。一晩撹拌後、２滴の５０％ＨＯＡｃを混合物に加え、該混合物を蒸発乾固し、シリカゲルクロマトグラフィー（トルエン中３０％アセトン）で精製してＤＣ５−ＳＭｅを得た。
【００８９】
いくつかの特許及び刊行物を本開示中に引用したが、それらの教示内容はこれを以てそれぞれの全内容が引用によって本明細書に取り込まれる。
本発明をその特定の態様について詳細に説明してきたが、本発明の精神及び範囲から離れることなく多様な変形が可能であることは当業者には明白であろう。
【図１】
2010229151.tif 000015
【図２】
2010229151.tif 000016
【図３】
2010229151.tif 000017
【図４Ａ】
2010229151.tif 000018
【図４Ｂ】
2010229151.tif 000019
【図５】
2010229151.tif 000020
【図６】
2010229151.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月15日(2010.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
2010229151.tif 000022
のプロドラッグであって、
式中、Ｒは、前記プロドラッグの細胞結合因子への連結を可能にするアミド含有側鎖であり；Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して水素、Ｃ１−Ｃ３直鎖アルキル、メトキシ、ヒドロキシル、第一級アミノ、第二級アミノ、第三級アミノ、又はアミドであり；Ｒ７は、ピペラジノカルバメート、４−ピペリジノ−ピペリジノカルバメート又はホスフェートであり；そして、Ｙは、ＮＨまたはＯである；前記プロドラッグ。
【請求項２】
Ｒがチオール又はジスルフィド結合を含む、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項３】
Ｒが、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍＳＺ、−ＮＨＣＯＣ６Ｈ４（ＣＨ２）ｍＳＺ、−ＮＨＣＯＣ６Ｈ４Ｏ（ＣＨ２）ｍＳＺ、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＺ、−ＮＨＣＯＣ６Ｈ４（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＺ、及び−ＮＨＣＯＣ６Ｈ４Ｏ（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＺからなる群より選択され、ここで、ＺはＨまたはＳＲ８を表し、ここでＲ８はメチル、直鎖状アルキル、分枝状アルキル、環状アルキル、単純もしくは置換アリール、又は、フリル、ピロリル、ピリジル、及びチオフェンからなる群より選択される複素環を表し、ｍは１ないし１０の整数を表し、そしてｎは４ないし１０００の整数を表す、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項４】
Ｒが、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＺ、−ＮＨＣＯＣ６Ｈ４（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＺ、及び−ＮＨＣＯＣ６Ｈ４Ｏ（ＣＨ２）ｍ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＺからなる群より選択され、ここで、ＺはＨまたはＳＲ８を表し、ここでＲ８はメチル、直鎖状アルキル、分枝状アルキル、環状アルキル、単純もしくは置換アリール、又は、フリル、ピロリル、ピリジル、及びチオフェンからなる群より選択される複素環を表し、ｍは１ないし１０の整数を表し、そしてｎは２ないし１０００の整数を表す、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項５】
Ｒが、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＳＨ、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＳＳＣＨ３、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＨ、及び−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＳＳＣＨ３、からなる群より選択される、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項６】
Ｒが、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＳＳＣＨ３である、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロドラッグの１つ以上に連結された細胞結合因子を含むプロドラッグ複合体。
【請求項８】
細胞結合因子が、腫瘍細胞；ウィルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞、活性化細胞、骨髄細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞またはメラニン細胞；および、インスリン増殖因子受容体、上皮増殖因子受容体、または葉酸受容体を発現している細胞；からなる群より選択される標的細胞に結合し、例えばここで該腫瘍細胞は、乳房の腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、及び小細胞肺腫瘍細胞、からなる群より選択される、請求項７に記載のプロドラッグ複合体。
【請求項９】
細胞結合因子が、抗体またはその抗原結合フラグメント、リンホカイン、ホルモン、ビタミン、増殖因子、コロニー刺激因子、または栄養素輸送分子である、請求項７に記載のプロドラッグ複合体。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロドラッグを含む、医薬組成物。
【請求項１１】
乳癌腫瘍、前立腺癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、結腸癌腫瘍、腎臓癌腫瘍、膵臓癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、小細胞肺腫瘍、およびリンパ器官の癌の腫瘍、からなる群より選択される腫瘍の治療のための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のプロドラッグ複合体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
乳癌腫瘍、前立腺癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、結腸癌腫瘍、腎臓癌腫瘍、膵臓癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、小細胞肺腫瘍、およびリンパ器官の癌の腫瘍、からなる群より選択される腫瘍の治療のための、請求項１２に記載の医薬組成物。