(57)【要約】      （修正有）【課題】高光学純度の乳酸を安価な培地を用いて効率よく生産する方法を提供する。【解決手段】乳酸生産能を有する微生物を、窒素源と炭素源とを含む培地で培養する工程と、生産された乳酸を回収する工程とを含む乳酸の製造方法であり、培地が、窒素源として魚由来窒素源とそれ以外の窒素源とを含み、魚由来窒素源とそれ以外の窒素源との重量比が、乾燥重量に換算して、５０〜１：１（魚由来窒素源：それ以外の窒素源）である方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸生産能を有する微生物を、窒素源と炭素源とを含む培地で培養する工程と、生産された乳酸を回収する工程とを含む乳酸の製造方法であり、培地が、窒素源として魚由来窒素源とそれ以外の窒素源とを含み、魚由来窒素源とそれ以外の窒素源との重量比が、乾燥重量に換算して、５０〜１：１（魚由来窒素源：それ以外の窒素源）である方法。
【請求項２】
培地中の魚由来窒素源の濃度が０．５〜１０重量％であり、それ以外の窒素源の濃度が０．０１〜５重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
魚由来窒素源が、フィッシュミールである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
魚由来窒素源が、タンパク質分解酵素処理物である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
培養開始時の培地には、窒素源として魚由来窒素源のみ添加し、乳酸生産速度が低下又は実質的に停止した時点で、それ以外の窒素源を添加する、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
乳酸生産能を有する微生物がLactobacillus属に属する乳酸菌である請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
乳酸生産能を有する微生物がLactobacillus delbrueckiiである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
炭素源が糖質を含み、糖質が、グルコース、スクロース、及びサトウキビ廃糖蜜からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
乳酸がＤ-乳酸である請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は代替プラスチックとして注目されている乳酸ポリマーの原料として有用な高純度の乳酸を微生物利用（発酵法)により工業的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラセミ体乳酸は化学的な方法で生産されているが、光学活性の乳酸は発酵法により生産される場合がほとんどである。
乳酸を産生する微生物としては、Lactobacillus delbrueckiiなどの乳酸菌が古くから知られている（特許文献１、非特許文献１）。乳酸菌は、比較的高温での発酵が可能であり、グルコースから理論値に近い乳酸を生産することが知られている。しかし、乳酸菌を用いた工業的な乳酸の生産条件については、余り研究されていない。
また、乳酸は、プラスチックの代替物となりうる乳酸ポリマーの原料として生産するのであるから、工業的に安価に生産することが求められる。しかし、従来、乳酸生産菌を用いて高光学純度の乳酸の生産を行うためには、乳酸原料としてグルコースのような糖質、酵母エキスやペプトンのような窒素源、Tween80などの脂肪酸、及びビタミンなどを含む培養液を用いる必要があった。酵母エキス、ペプトン、ビタミンなどは高価であるため、得られる乳酸も高価なものになってしまう。さらに糖質も、グルコースより安価なデンプンを利用することが望ましい。
【０００３】
また、乳酸を産生する微生物の生育には比較的高い栄養価の培地を必要とするため、発酵後の培養液には培地成分が高濃度に含まれる。従って、発酵後の培養液から乳酸を精製するために多段階の化学的手法を要する。特に、乳酸の主原料である糖質が培養液に残存すると、乳酸をエステル化に供するときに、乳酸のカルボキシル基と糖質のヒドロキシル基との間で副反応が起こり、目的とする乳酸エステルの収率が低下する。従って、発酵後の培養液から残存した糖質を除去する必要があり、煩雑でコスト高な方法になる。
なお、鯖の肉の加水分解物が乳酸菌の生育促進や乳製品のカードテンションを低下させることが報告されているが、魚肉乾燥物の加水分解物で効果のあった乳酸菌はStreptcoccus thermophilus, Streptcoccus lactis, Streptococcus cremoris, Lactobacillus helveticusの４種の菌株である（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭62−44188号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】K. Hofvendahl, Enzyme and Microbial Technology, 26, 87-107 (2000)
【非特許文献２】H. Yuguchi, Japanese Journal of Dairy and Food Science, 33,81-91 (1984)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、高光学純度の乳酸を安価な培地を用いて効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。即ち、乳酸生産能を有する微生物を窒素源と炭素源とを含む培地で培養するに当たり、窒素源として魚由来窒素源とそれ以外の窒素源とを含む培地を用い、魚由来窒素源とそれ以外の窒素源との重量比を５０〜１：１（魚由来窒素源：それ以外の窒素源）とすれば、魚由来の安価な窒素源を使用しながら、高光学純度の乳酸を得ることができる。
【０００８】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の乳酸の製造方法を提供することを課題とする。
項１．  乳酸生産能を有する微生物を、窒素源と炭素源とを含む培地で培養する工程と、生産された乳酸を回収する工程とを含む乳酸の製造方法であり、培地が、窒素源として魚由来窒素源とそれ以外の窒素源とを含み、魚由来窒素源とそれ以外の窒素源との重量比が、乾燥重量に換算して、５０〜１：１（魚由来窒素源：それ以外の窒素源）である方法。
項２．  培地中の魚由来窒素源の濃度が０．５〜１０重量％であり、それ以外の窒素源の濃度が０．０１〜５重量％である、項１に記載の方法。
項３．  魚由来窒素源が、フィッシュミールである項１又は２に記載の方法。
項４．  魚由来窒素源が、タンパク質分解酵素処理物である項１又は２に記載の方法。
項５．  培養開始時の培地には、窒素源として魚由来窒素源のみ添加し、乳酸生産速度が低下又は実質的に停止した時点で、それ以外の窒素源を添加する、項１〜４の何れかに記載の方法。
項６．  乳酸生産能を有する微生物がLactobacillus属に属する乳酸菌である項１〜５の何れかに記載の方法。
項７．  乳酸生産能を有する微生物がLactobacillus delbrueckiiである項６に記載の方法。
項８．  炭素源が、グルコース、スクロース、及びサトウキビ廃糖蜜からなる群より選ばれる少なくとも１種である項１〜７の何れかに記載の方法。
項９．  乳酸がＤ-乳酸である項１〜８の何れかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明方法によれば、魚由来窒素源を含む安価な培地を用いながら、高光学純度の乳酸を製造することができる。また、上記培地を用いることにより、糖質の残存率が極めて低くなるため、培養後の培養液から糖質を除去する手間を省くことができる。さらに、上記培地を用いて培養することにより、乳酸濃度が高い培養液が得られる。即ち、培地中の原料糖質濃度を高くすることができ、その結果、培養後に、高乳酸濃度の培養液を得ることができる。
本発明方法は、特にＤ−乳酸の製造に適している。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】魚由来窒素源にそれ以外の窒素源を後添加した場合の、Ｄ-乳酸濃度、及び残存グルコース濃度の推移を示す図である。
【図２】培養開始時に炭酸カルシウムを添加しておき、その後水酸化ナトリウムを用いてｐＨ調整した場合の、Ｄ-乳酸濃度、Ｌ-乳酸濃度、及び残存グルコース濃度の推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
培地中の窒素源
＜魚由来窒素源＞
魚由来窒素源としては、魚肉；魚の骨、皮、目玉、内臓のような「あら」（魚の魚肉以外の部分）；及び魚の全体；並びにそれらの乾燥物などが挙げられる。中でも、フィッシュミール（魚粉）が好ましい。フィッシュミールは、魚を丸ごと乾燥し、粉砕したものである。魚の種類は特に限定されないが、大量に入手できるイワシ、カツオ、サメ、タラ、ニシン、メンハーデンなどを使用すればよい。
魚由来窒素源は、例えば粉砕してそのまま培地に添加してもよいが、乳酸生産菌の乳酸発酵性能が高くなる点で、タンパク質分解酵素で処理したものを用いることが好ましい。タンパク質分解酵素処理物は、魚肉、あら、魚の全体、及びそれらの乾燥物などを、プロテアーゼで例えば約３０〜８０℃で数時間処理することにより得ることができる。
【００１２】
魚由来窒素源としては、中でも、乳酸生産菌の発酵性能が高くなり、また低価格である点で、フィッシュミールのタンパク質分解酵素処理物が好ましい。タンパク質分解酵素は、公知の酵素を制限なく使用できる。また、アルカリ性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼの何れでもよく、由来生物種も制限されない。Ｄ−乳酸を製造する場合は、アルカリ性プロテアーゼが好ましい。アルカリ性プロテアーゼで、魚肉、あら、魚の全体、及びそれらの乾燥物などを処理することにより、混入しているＬ−乳酸生産菌などの雑菌を殺菌することができ、得られるＤ−乳酸の光学純度の低下を防止できる。
魚由来窒素源は１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００１３】
＜その他の窒素源＞
魚由来以外の、即ちその他の窒素源としては、微生物の培養に用いられる公知の窒素源を制限なく使用できる。魚由来以外の窒素源には、非魚動物由来窒素源、微生物由来、及び植物由来窒素源が含まれる。このような窒素源として、例えば、酵母エキス、ペプトン（魚由来ペプトンを除く。非魚動物由来ペプトン、植物由来ペプトンを含む。）、ポリペプトン（魚由来ポリペプトンを除く。牛乳カゼイン由来ポリペプトンのような非魚動物由来ポリペプトン、大豆やエンドウ豆由来ポリペプトンのような植物由来ポリペプトンを含む。）、ビール酵母、肉エキス、大豆加水分解物、エンドウ豆加水分解物、麦加水分解物、カゼイン分解物、カザミノ酸、油粕のようなペプチド又はアミノ酸類；アンモニア、硝酸塩のような無機体窒素類；尿素などが挙げられる。中でも、乳酸生産菌の発酵性能が高くなる点で、ペプチド又はアミノ酸類が好ましく、酵母エキス、非魚動物又は植物由来のポリペプトンがより好ましく、トルラ酵母エキス（中でも、日本製紙ケミカル製、ＳＫ酵母エキスＳ２、ＳＫ酵母エキスＨＵＡＰ）、大豆由来ポリペプトン（中でも、マルハニチロ製、バクテリオンＳＨ、バクテリオンＳＳ）、エンドウ豆由来ポリペプトン（中でも、マルハニチロ製、バクテリオンＰＦ）が特に好ましい。
その他の窒素源は１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００１４】
＜窒素源の比率＞
培地中の魚由来窒素源とその他の窒素源との比率（魚由来窒素源：それ以外の窒素源）は、乾燥重量に換算して、例えば、約５０〜１：１とすればよく、約４５〜１：１が好ましく、約４１〜１：１がより好ましく、約４０〜１：１がさらにより好ましく、約２０〜１：１がさらにより好ましく、約１０〜１：１が特に好ましい。上記範囲であれば、安価な魚由来窒素源を用いながら、高光学純度の乳酸（特に、Ｄ-乳酸）が得られる。
また、培地中の魚由来窒素源の濃度は、乾燥重量に換算して、約０．５〜１０ ｗ/ｖ％が好ましく、約１〜８ｗ/ｖ％がより好ましく、約２〜６ｗ/ｖ％がさらに好ましく、約３〜５ｗ/ｖ％が特に好ましい。上記範囲であれば、高光学純度の乳酸が得られる。また、魚由来窒素源が多すぎて攪拌し難くなるということがない。
【００１５】
また、培地中のその他の窒素源の濃度は、乾燥重量に換算して、約０．０１〜５ ｗ/ｖ％が好ましく、約０．０５〜４.５ ｗ/ｖ％がより好ましく、約０．０５〜４ｗ/ｖ％がさらにより好ましい。上記範囲であれば、高光学純度の乳酸を製造しながら、工業上実用できる程度に培地コストを抑えることができる。
また、種菌は、どのような窒素源を用いた培地で培養したものであってもよい。種菌も魚由来窒素源を含む培地を用いてもよい。
窒素源は培地に一度に添加してもよく、魚由来窒素源とその他の窒素源とを異なるタイミングで培地に添加してもよい。具体的には、培養開始時に魚由来窒素源とその他窒素源を添加した培地で培養を行ってもよく、培養開始時は魚由来窒素源だけとし、培養途中で、乳酸の生産が低下、実質的に停止、又は停止した時点で、その他の窒素源を追加してもよい。本発明において、乳酸の生産が低下又は実質的に停止した時点とは、例えば、乳酸の生産量が０．３ｍｇ／ｍｌ／ｈｒ以下、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ／ｈｒ以下になった時点を意味する。
【００１６】
魚由来窒素源だけでは、培地中の糖質の全ては乳酸に変換されず、培地中に糖質が残存しているのに乳酸生産が遅滞又は停止してしまう傾向にあるが、その他の窒素源を添加することにより、乳酸発酵が進行して、残存する糖質の全て、又は殆ど全てを乳酸に転換することができる。
なお、その他の窒素源を後添加する方法には、当該その他窒素源のみ後添加する方法、当該その他窒素源と炭素源とを後添加する方法、当該その他窒素源と窒素源以外の必要成分を含む培地とを後添加する方法、当該窒素源と魚由来窒素源と窒素源以外の必要成分を含む培地とを後添加する方法などが含まれる。
【００１７】
培地中の炭素源
炭素源としては、使用する乳酸生産菌が乳酸発酵できる糖質を用いればよい。糖質としては、グルコース、フルクトースのような単糖類；シュークロース、マルトース、トレハロースのような二糖類；デンプン、セルロース、ヘミセルロース、キシランのような多糖類などが挙げられる。糖質としてデンプン、セルロース、ヘミセルロース、キシランなどの多糖類を用いる場合は、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エンドキシラナーゼ、キシロシダーゼのような、当該多糖類を分解する酵素で予め処理したものを用いたり、又は多糖類とともに多糖類分解酵素を培地に添加することにより多糖類の分解と並行して乳酸発酵を行うことが好ましく、これにより、効果的に乳酸を産生させることができる。また、これらの糖類を含有する甘藷糖蜜、サトウキビ廃糖蜜のような廃糖蜜なども使用できる。
【００１８】
中でも、乳酸生産菌の発酵性能が高くなる点で、単糖類、二糖類がより好ましく、グルコース、スクロースがさらにより好ましい。また、乳酸の生産性が高くなる点で、サトウキビ廃糖蜜も好ましい。
糖質に加えて、酢酸、フマル酸のような有機酸；エタノールのような一価アルコール類；グリセリンのような多価アルコールなども炭素源として用いることができる。
糖質を含む炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を組合わせて使用できる。
培養開始時の培地中の糖質濃度は、約５〜１５ｗ／ｖ％が好ましく、約８〜１４ｗ／ｖ％がより好ましく、約１０〜１３ｗ／ｖ％がさらにより好ましい。上記範囲であれば、効率よく乳酸を生産できるとともに、残存糖質量が抑えられる。
炭素源、及び窒素源は、それぞれ、蒸気殺菌、ろ過殺菌、瞬間殺菌など一般的な殺菌方法で殺菌しておき、培地に添加すればよい。
【００１９】
培地のその他の成分
培地は、乳酸発酵用の培地に通常添加される、リン酸塩、硫酸マグネシウムのようなマグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩のような無機塩類；ビタミン類；ポリソルベートのような脂肪酸などを含んでいてよい。
乳酸生産菌
乳酸生産菌、特にＤ-乳酸を生産できる菌としては、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus plantarum、Leuconostoc mesenteroides、Spololactobacillus属などが知られており、その中で、ホモ発酵を行う乳酸菌株としては、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis IAM 12476 、Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus IAM 12472 、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii IAM 12474 、Lactobacillus delbrueckii IFO 3534、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii NRIC0760、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii NRIC0761等の菌株が挙げられる。中でも、発酵性能が良く、乳酸、特にＤ−乳酸の工業生産に適している点で、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii NRIC0761が好ましい。その他、ヘテロ発酵を行う乳酸菌株として、Leuconostoc pseudomesenteroides JCM 9696等も用いることができる。
ＩＦＯ番号が付された微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）から入手できる。ＩＡＭ番号およびＪＣＭ番号の付された微生物は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ−ＪＣＭ）から入手できる。ＮＲＩＣ番号が付された微生物は、東京農業大学菌株保存室から入手できる。
【００２０】
培養条件
乳酸発酵の温度は、使用する乳酸生産菌が生育する温度であればよく、例えば約０〜６０℃が好ましく、約３０〜５０℃がより好ましく、約３５〜４５℃がさらにより好ましい。
発酵中は、乳酸の生成に伴って培地ｐＨが低下する。培地ｐＨが下がりすぎると菌の生育を阻害するため、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニアなどのアルカリでｐＨを調整すればよい。中でも、水酸化ナトリウム、アンモニアが好ましい。これは乳酸ナトリウム、乳酸アンモニウムは常温で液状であるため、培養後に、菌体などの不溶性成分と分離し易いからである。また水酸化ナトリウムなどの液状の中和剤を用いれば、中和剤の必要添加量と乳酸の生成量が相関することから、中和剤の添加量から発酵の進行度合いを簡単に知ることができる。さらに水酸化ナトリウムは安価であり、工業生産に有利である。発酵液のｐＨは、使用菌株によって異なるが、約４〜７に調整することが好ましく、約５〜６．５に調整することがより好ましい。
培養開始時又はその後に培地中に予め炭酸カルシウムを約０．１〜１ｗ/ｖ％添加しておき、ｐＨの低下に伴い、さらに異種のアルカリを用いて上記範囲にｐＨ調整することも好ましい。これにより、乳酸生産速度が一層高くなり、効率よく乳酸を製造できる。
培養は、回分培養、半回分培養、連続培養の何れであってもよい。中でも、残存糖質量を低減できる点で回分培養が好ましい。また、糖質のみ培養中に追加する半回分培養、連続培養であってもよい。
培養時間は、使用菌株、培地成分、特に糖質の量などにより異なるが、回分培養の場合、約１〜８日間が好ましく、約２〜７日間がより好ましい。連続培養、半回分培養を行う場合はこれに限定されない。
本発明方法により、魚由来窒素源を含む安価な培地を用いながら、高光学純度の乳酸を製造することができ、さらに、乳酸濃度が高い培養液が得られる。また、上記培地を用いることにより、最終的に培地中の残糖濃度を極めて低くすることができる。
【００２１】
乳酸の回収
培養後の培養液から菌体を除去することにより、乳酸を、乳酸又は乳酸アルカリ塩の形態で回収することができる。また、ｐＨ調整用のアルカリとして、炭酸カルシウムを使用する場合は乳酸カルシウムが生じるが、乳酸カルシウムは水に不溶性であるため、培養液を例えば硫酸で酸性（ｐＨ３．５以下）にし、カルシウムを硫酸カルシウムとして析出させ、菌体と共に除去すればよい。さらに、菌体などの不溶性成分を除去した後、エタノール、又はメタノールで乳酸エステルを生成させ、有機溶媒中に回収することもできる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
分析方法
(1)乳酸の定量および光学純度の測定
乳酸の定量用試料は、乳酸カルシウムの溶解度を考慮し、試料希釈液０．２ｍｌにエタノール０．８ｍｌを加え生じる沈殿物を遠心分離(１５．０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ)して除去し、上清を水で適宜希釈することにより調製した。この試料をＨＰＬＣ(キラルカラム)で分析した。ＨＰＬＣ条件は下記の通りである。
カラム：Sumichiral OAキラルカラム(Column, Sumichiral OA-5000  (4.6mm ID×15cm)
温度：室温
移動相：２ｍＭ Cooper(II)sulfate-5H2O(249.69) の水-イソプロパノール混液(９８：２)溶液
溶出率：１．０ｍｌ/ｍｉｎ
検出：ＵＶ ａｔ ２５４ｎｍ
鏡像異性体過剰率ee（Enantiomeric excess）は、以下の式により計算した。
ee (%) =([Ｄ体]-[Ｌ体])/([Ｄ体]+[Ｌ体])×１００
【００２３】
(2)糖の定量
糖はフェノール硫酸法で定量した。グルコースは、グルコース定量キット（グルコースＣIIテストワコー、和光純薬）を用いて定量した。
実施例１（各乳酸菌によるＤ−乳酸の生産率の比較）
試薬培地(魚エキス１ｗ/ｖ（株式会社マルハニチロ食品）、１ｗ/ｖ％酵母エキス（日本製紙ケミカル株式会社）、３ｗ/ｖ％ＣａＣＯ３ 、５ｗ/ｖ％グルコース、ｐＨ６．８、１２１℃１５分オートクレーブ滅菌)１０ｍｌに、凍結保存バイアルから各菌を植菌し、３７℃のインキュベーターで２４時間静置培養し、種培養液とした。試薬培地(１ｗ/ｖ％魚エキス（株式会社マルハニチロ食品）、１ｗ/ｖ％酵母エキス（日本製紙ケミカル株式会社）、３ｗ/ｖ％ＣａＣＯ３ 、５ｗ/ｖ％グルコース、ｐＨ６．８、１２１℃１５分オートクレーブ滅菌)１００ｍｌに、種培養液から各菌を１ｍｌ植菌し、ロータリーシェイカーにて３７℃で７２時間培養した。表１に、試験した菌種、培養時間、Ｄ−乳酸の生成濃度、残存した糖濃度、生成したＤ−乳酸の光学純度を示す。
【００２４】
【表１】
2010273604.tif 000002
菌種１：Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii NRIC0760
菌種２：Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii NRIC0761
表１から、窒素源として、魚エキスと酵母エキスとを１：１で用いることにより、何れの菌株を用いた場合も、高濃度の乳酸が得られたことが分かる。
【００２５】
実施例２（培地の種類による乳酸菌の生育比較）
培地の種類による乳酸菌の生育の比較を行った。窒素源が異なる試験培地１〜４(各窒素源、３ｗ／ｖ％ＣａＣＯ３ 、５ｗ／ｖ％グルコース、ｐＨ６．８、１２１℃１５分オートクレーブ滅菌)１００ｍｌに、凍結保存バイアルから乳酸菌（Lactobacillus delbrueckii NRIC0761）を１％量植菌し、３７℃のインキュベーターで２４時間静置培養した。
培地中の各窒素源は以下の通りである。
試験培地１：０．５ｗ／ｖ％ポリペプトンＮ（大豆由来、日本製薬株式会社）、１ ｗ／ｖ％酵母エキス（ＨＹ−ｙｅｓｔ、ＫＥＲＲＹ）
試験培地２：ＭＲＳ（非魚由来動物由来肉エキス及び酵母由来、関東化学株式会社）
試験培地３：０．５ ｗ／ｖ％ポリペプトンＮＦ（魚由来、日本製薬株式会社）、１ｗ／ｖ％ＳＫ酵母エキスＳ−２（酵母由来、日本製紙ケミカル株式会社）
試験培地４：１ｗ／ｖ％魚エキス（魚由来、バクテリオンＫＮ、株式会社マルハニチロ食品）、１ｗ／ｖ％ＳＫ酵母エキスＨＵＡＰ（酵母由来、日本製紙ケミカル株式会社）
結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
2010273604.tif 000003
表２から、魚由来窒素源と酵母由来窒素源とを併用した試験培地３、４では、魚由来以外の窒素源だけ使用した試験培地１、２に比べて、Ｄ-乳酸の生産性が高いことが分かる。
【００２７】
実施例３（カツオ魚粉末の蛋白分解酵素処理による影響）
カツオ魚粉末（丸石株式会社）８ｇに対して、中性プロテアーゼ（オリエンターゼ９０Ｎ、エイチビィアイ株式会社）、またはアルカリプロテアーゼ（オリエンターゼ２２ＢＦ、エイチビィアイ株式会社）を４００ｍｇ添加して６０℃で酵素処理を行い、酵素処理前と酵素処理後の処理液を１００μｌＰＹＧ培地プレートに塗布し、処理液中に含まれる雑菌数を測定した。結果を以下の表３に示す。
表３に示されるように、中性プロテアーゼ処理したものは処理前よりも多くの雑菌を含み、アルカリプロテアーゼ処理したものは酵素処理前よりも雑菌数が少なかった。表３中、+は１ｍｌの酵素処理液に雑菌数１０〜１００個を示し、++は１００〜１０００個を示し、+++は１０００個以上を示す。
【００２８】
【表３】
2010273604.tif 000004
【００２９】
実施例４（魚粉末の種類の検討）
各種魚粉を魚由来の窒素源として使用し培地を作成した。これらを用いて乳酸菌発酵によりＤ−乳酸を生産し、乳酸濃度と光学純度を比較した。即ち、２００ｍｌ容の三角フラスコに各種魚粉末４ｇ、０．４％Ｋ２ＨＰＯ４(ｐＨ ７．２)５０ｍｌ、オリエンター２２ＢＦ（アルカリプロテアーゼ、エイチビィアイ株式会社）８０ｍｇを加えて、６０℃で３時間反応させた。反応後、ＣａＣＯ３を５ｇ加え、水でメスアップして９０mlとした。これを１２１℃で１５分間オートクレーブし、別にオートクレーブした１００％（ｗ／ｖ）グルコース溶液１０ｍｌ（培地中のグルコース仕込み濃度は約１０ｗ／ｖ％）を加え魚粉末培地とした。これらの培地に実施例１と同様に調製したLactobacillus delbrueckii NRIC0761株の種培養液を１ｍｌ加え、３７℃で７２時間培養した。培地中の魚由来窒素源濃度は約４ｗ/ｖ％である。結果を以下の表４に示す。表４から、各魚粉末とも同等濃度のＤ−乳酸を生成することができたことが分かる。
【００３０】
【表４】
2010273604.tif 000005
【００３１】
実施例５（各乳酸菌による魚粉末培地でのＤ−乳酸の生産）
乳酸菌発酵により乳酸を生産した。２００ｍｌ容の三角フラスコにメンハーデン魚粉末（アメリカ）４g、０．４％Ｋ２ＨＰＯ４(ｐＨ ７．２)５０ｍｌ、オリエンターゼ２２ＢＦ（アルカリプロテアーゼ、エイチビィアイ株式会社）８０ｍｇを加えて、６０℃で３時間反応させた。反応後、ＣａＣＯ３を５ｇ加え、水でメスアップして９０ｍｌとした。１２１℃で１５分間オートクレーブし、別にオートクレーブした１００％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を１２ｍｌ（培地中のグルコース仕込み濃度は約１２ｗ／ｖ％）加え、魚粉末培地とした。培地中の魚由来窒素源濃度は約４ｗ/ｖ％である。これらの培地に実施例１と同様に調製したLactobacillus delbrueckii NRIC0760株、NRIC0761株の種培養液を１ｍｌ加え、３７℃で９６時間培養した。結果を以下の表５に示す。
【００３２】
【表５】
2010273604.tif 000006
【００３３】
実施例６（魚由来窒素源の濃度）
乳酸菌発酵により乳酸を生産した。２００ｍｌ容の三角フラスコにメンハーデン魚粉末（アメリカ）４ｇまたは２ｇ、０．４％Ｋ２ＨＰＯ４(ｐＨ ７．２)５０ｍｌ、オリエンターゼ２２ＢＦ（アルカリプロテアーゼ、エイチビィアイ株式会社）８０ｍｇまたは４０ｍｇを加えて、６０℃で３時間反応させた。反応後、ＣａＣＯ３を１２ｇ加え、水でメスアップして９０ｍｌとした。１２１℃で１５分間オートクレーブし、別にオートクレーブした１００％（ｗ／ｖ）グルコース溶液１２ｍｌ（培地中のグルコース仕込み濃度は１２ｗ／ｖ％）を加え魚粉末培地とした。培地中の魚由来窒素源濃度は４ｗ/ｖ％、又は２ｗ/ｖ％である。これらの培地に実施例１と同様に調製したLactobacillus delbrueckii NRIC0760株、NRIC0761株の種培養液を１ｍｌ加え、３７℃で９６時間培養した。結果を以下の表６に示す。
【００３４】
【表６】
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表６から、魚由来の窒素源が２ｗ／ｖ％あるいは４ｗ／ｖ％の濃度で調製された培地で高効率な乳酸発酵が可能であることが分かる。また、魚由来の窒素源を２倍にすることにより、得られる乳酸濃度がさらに向上したことが分かる。
【００３５】
実施例７（魚由来窒素源とそれ以外の窒素源との併用）
実施例６と同様にして、メンハーデン魚粉末（アメリカ）２ｇを用いて魚粉末蛋白分解酵素分解物含有培地（フィッシュミール培地）１００ｍｌを２００ｍｌ容の三角フラスコに調製した。培地には、さらに、下記表７に示す窒素源を１ｗ／ｖ％になるように添加した。窒素源のバーレックス６０（株式会社大麦発酵研究所）は麦由来であり、Bacterion-Ｎ-ＰＦ（株式会社マルハニチロ食品）はエンドウ豆由来であり、Bacterion-Ｎ-ＳＨ（株式会社マルハニチロ食品）、及びBacterion-Ｎ-ＳＳ（株式会社マルハニチロ食品）は大豆由来である。
これらの培地を用いて、Lactobacillus delbrueckii NRIC0761株を３７℃で９６時間培養した。
結果を表７に示す。表７中のグルコース濃度は、発酵終了後の培地中の残存グルコース濃度である。
【００３６】
【表７】
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表７から、魚由来窒素源とその他の窒素源とを併用することにより、魚由来窒素源のみ用いる場合に比べて、高濃度の乳酸が得られたことが分かる。
【００３７】
実施例８（魚由来窒素源とそれ以外の窒素源との併用）
魚由来窒素源と魚由来以外の窒素源を用いたＤ-乳酸生成方法について、魚由来以外の窒素源の添加量の有効範囲（添加により、Ｄ-乳酸の生成効率などにおいてメリットをもたらす濃度範囲）について調査を行なった。なお、魚由来以外の窒素源としてはＳＫ酵母エキス(ＨＵＡＰ)を用いた。
Lactobacillus delbrueckii NRIC0761株の凍結菌体０．１ｍｌを、種培養用培地（ＳＫ酵母エキスＨＵＡＰ１ｗ/ｖ％、Polypeptone（バクテリオンＫＮ） １ｗ/ｖ％、グルコース５ｗ/ｖ％、ＣａＣＯ３３ｗ/ｖ％、ｐＨ６．８）９．９ｍｌに接種し、３７℃で２４時間静置し、種培養した。
本培地は以下のようにして調製した。０．４％Ｋ２ＨＰＯ４にニシンフィッシュミール（エクアドル）８ｗ/ｖ％を懸濁し、ｐＨ１０に調整した。オリエンターゼ２２ＢＦ（アルカリプロテアーゼ、エイチビィアイ株式会社）をフィッシュミールに対して１/２０量（０．４ｗ／ｖ％）加え、６０℃で３ｈｒ処理した。遠心分離した上清を、ｐＨ６．３に調整したものをフィッシュミール上清培地とした。
【００３８】
後掲の表８に示す試験区１〜９ではフィシュミール上清培地を試験管に５ｍｌ、イオン交換水３．９ｍｌ、ＣａＣＯ３ ６ｗ/ｖ％、ＨＵＡＰを表８に示す量加え、１２１℃で１５ｍｉｎ加熱処理した。試験区１０〜１８ではフィッシュミール上清培地を試験管に２．５ｍｌ、イオン交換水６．４ｍｌ、ＣａＣＯ３６ｗ/ｖ％、ＨＵＡＰ を表８に示す量加え、１２１℃で１５ｍｉｎ加熱処理した。各試験区の試験管に、別容器で滅菌した１ｇ/ｍｌグルコース溶液を１ｍｌ（培地中のグルコース仕込み濃度１０ｗ／ｖ％）添加した。本培養培地９．９ｍｌに種培養液を０．１ｍｌ接種し、３７℃で静置し、９６時間培養した。結果を表８に示す。
【００３９】
【表８】
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表８から、魚由来窒素源とその他の窒素源とを約４０〜１：１で使用することにより、高乳酸濃度が得られたことが分かる。
【００４０】
実施例９（魚由来窒素源とそれ以外の窒素源との併用）
ミツワ製５０Ｌ容のジャーファーメンターにニシンフィッシュミール（エクアドル）１．２ｋｇ、０．４％Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）１５Ｌ、オリエンターゼ２２ＢＦ（アルカリプロテアーゼ、エイチビィアイ株式会社）を６０ｇ加えて、６０℃で３時間（回転数１００ｒｐｍ）反応させた。反応後、２７Ｌになるように水でメスアップし、１２１℃で３０分間蒸気滅菌し、別途オートクレーブ滅菌した１００ｗ／ｖ％グルコース溶液３Ｌ（培地中のグルコース仕込み濃度１０ｗ／ｖ％）を加えて魚粉培地とした。
この魚粉培地に実施例１と同様に調製したLactobacillus delbrueckii NRIC0761株の種培養液を３００ｍｌ加えて培養を行った。培養条件は攪拌回転数１００ｒｐｍ、培養温度３７℃、通気は５％ｖｖｍ量を気相のみに行い、２５％ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ６．０に制御した。培養開始４７時間後、乳酸の生産が停止した時点で、魚エキスバクテリオンＫＮと酵母エキスＨＵＡＰを３０ｇ(０．１ｗ／ｖ％)ずつ添加した。培地中の魚粉末蛋白分解酵素分解物の濃度は４ｗ／ｖ％であり（１．２ｋｇ／３Ｌ）、後添加した魚エキスの濃度は０．１ｗ／ｖ％、後添加した酵母エキスの濃度は０．１ｗ／ｖ％であるから、最終的な魚由来窒素源と酵母由来窒素源との重量比は、４１：１（魚由来窒素源：酵母由来窒素源）である。
培養液中のＤ-乳酸濃度を経時的に測定した結果を以下の表９、及び図１に示す。表９、及び図１から、一旦停止したＤ-乳酸の発酵が、魚エキスバクテリオンＫＮと酵母エキスＨＵＡＰの添加により再開されたことが分かる。
【００４１】
【表９】
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【００４２】
実施例１０（炭酸カルシウムを添加する改良水酸化ナトリウム中和法）
炭酸カルシウムを添加剤として培養液に１ｗ/ｖ％添加しておき、ｐＨスタットは 水酸化ナトリウムで行なう中和法にて発酵性試験を行なった。
＜方法＞
ニシンフィッシュミール（エクアドル）４０ｇ（４ｗ／ｖ％）とオリエンターゼ２２ＢＦ（エイチビィアイ株式会社）２ｇを２Ｌ容のジャーファーメンターへ投入し、水を５００ｍｌ加えて６０℃で３０分間８０ｒｐｍで撹拌混合し、酵素処理した。ここに、酵母エキス（ＨＵＡＰ）を１．０ｇ（最終濃度０．１ｗ／ｖ％）、炭酸カルシウムを１０ｇ（最終濃度１ｗ／ｖ％）、及び水を３６０ｍｌ添加し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌を行なった。別滅菌した７０ｗ／ｖ％グルコース水溶液を１４０ｍｌ（最終グルコース濃度は約１０ｗ／ｖ％）培養槽に添加し、本培養培地とした。本培地中の魚由来窒素源濃度は４．０ｗ／ｖ％であり、酵母由来窒素源濃度は０．１ｗ／ｖ％であり、グルコース濃度は１０ｗ／ｖ％である。
【００４３】
種菌は、ペプトン（バクテリオンＫＮ）と酵母エキス（ＨＵＡＰ）を各１ｗ／ｖ％含む培地で１ｓｔ種培養を行い、これを同じ組成の培地に接種して２ｎｄ種培養したものを用いた。具体的には、Lactobacillus delbrueckii  NRIC0761凍結菌株バイアルから１％量植菌し、３７℃で静置培養を行なった（1st seed）。培養２２．５ｈｒ (OD;１０．０) で１％量を2nd seed 培地に植え継いだ。同様に培養し、本培養に移植した2nd seed の濁度は１７．２であった。これを本培養培地に１０ｍｌ移植後、３７℃で７５ｒｐｍで穏やかに攪拌しながら１２０時間、培養を行なった。
【００４４】
＜結果＞
乳酸濃度及び残存グルコース濃度の推移を図２に示す。図２から明らかなように、魚由来窒素源の培地にその他窒素源と炭酸カルシウムを添加しておくことにより、非常に発酵速度が高くなり、極めて効率の高いＤ−乳酸発酵を行うことができた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明方法によれば、ポリ乳酸原料となる乳酸を安価に効率よく生産できるため、乳酸、特にＤ-乳酸を低コストで工業生産できるようになった。
【図１】
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【図２】
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