(57)【要約】【課題】生体骨と同じ機構で体内に吸収されるとともに高い骨形成能を有し、人工骨等に使用できる機械的強度を有する多孔質複合体、及びその製造方法を提供する。【解決手段】リン酸カルシウムとコラーゲンとを２５：７５〜７５：２５の重量比で含み、重量法で求めた密度が１３０〜６００ｍｇ／ｃｍ３である、多孔質複合体によって解決できる。また、（１）可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化し、コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維化工程、（２）前記コラーゲン線維懸濁液中のコラーゲン線維を濃縮し、高濃度コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維濃縮工程、（３）前記高濃度コラーゲン線維懸濁液とリン酸カルシウムとを混合し、リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を得る、混合工程、（４）前記リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を多孔体に成形する工程、及び（５）前記多孔体のコラーゲン線維を架橋する、コラーゲン線維架橋工程、を含む、多孔質複合体の製造方法によって前記多孔質複合体を製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウムとコラーゲンとを２５：７５〜７５：２５の重量比で含み、重量法で求めた密度が１３０〜６００ｍｇ／ｃｍ３である、多孔質複合体。
【請求項２】
リン酸カルシウムがハイドロキシアパタイトである、請求項１に記載の多孔質複合体。
【請求項３】
骨治療用である、請求項１又は２に記載の多孔質複合体。
【請求項４】
骨治療用の薬剤を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多孔質複合体。
【請求項５】
（１）可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化し、コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維化工程、
（２）前記コラーゲン線維懸濁液中のコラーゲン線維を濃縮し、高濃度コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維濃縮工程、
（３）前記高濃度コラーゲン線維懸濁液とリン酸カルシウムとを混合し、リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を得る、混合工程、
（４）前記リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を多孔体に成形する工程、及び
（５）前記多孔体のコラーゲン線維を架橋する、コラーゲン線維架橋工程、
を含む、多孔質複合体の製造方法。
【請求項６】
前記コラーゲン線維濃縮工程における濃縮が、遠心分離による濃縮である、請求項５に記載の多孔質複合体の製造方法。
【請求項７】
前記リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン複合線維懸濁液中のコラーゲン線維濃度が３重量％以上の濃度である、請求項５又は６に記載の多孔質複合体の製造方法。
【請求項８】
前記リン酸カルシウムが、ハイドロキシアパタイトである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の多孔質複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高密度多孔質複合体に関する。本発明によれば、骨欠損部の骨再生において、骨組織の十分な侵入性示す骨伝導能を有しながら、且つ十分な機械的強度を有する骨再生材料を提供することができる。
【背景技術】
【０００２】
骨欠損部の骨再生は、患者自身の腸骨や脾骨等を使用する自家骨移植が主流である。しかし、自家骨移植は二次手術が必要なため、患者への負担が大きく、更に、摘出部位における感染が生じる場合がある。また、自家骨の採取量も限られるため、自家骨の代わりに人工骨を用いる方法や、自家骨の不足する部分を人工骨による補填材による補充する方法が試みられている。
【０００３】
従来、人工骨としては、骨伝導能を有するリン酸カルシウムのみからなるいわゆるセラミックス系人工骨が使用されていたが、セラミックス特有の脆性による術後の破損やハンドリングの悪さが臨床現場で指摘されていた。更に、人工骨は、生体適合性骨伝導性などの生理学的性質が必要である。すなわち、自家骨は吸収と再生という代謝を繰り返すのに対し、アパタイトからなる人工骨は生体内でほとんど溶解しないため、生体内に半永久的に残存する。骨再生に用いられる人工骨には、骨親和性に加えて、骨組織と融合し、骨再生を積極的に促す効果も必要である。従って、生体適用後徐々に吸収され、骨再生サイクルに取り込まれて自身の骨に置換していくための、骨伝導性や生体活性が求められる。
【０００４】
この観点から、ハイドロキシアパタイト（リン酸カルシウム）にコラーゲンを加えたコラーゲン／リン酸カルシウム複合体は、骨再生用の人工骨として期待されている。コラーゲン／リン酸カルシウム複合体は骨伝導能をもち、これまでのセラミックスにはない柔軟性を示すことから、骨再生の足場材料としての実用化研究が検討されている。しかしながら従来のアパタイトからなる材料と比較すると、柔らかすぎるため、わずかの荷重により容易に変形するために、骨再生のテンプレートとして荷重部位には適用しにくいという問題を残している。すなわち、コラーゲン／リン酸カルシウム複合体は、生体骨に近い強い強度や弾性などの機械的性質が十分ではなかった。
【０００５】
前記コラーゲン／リン酸カルシウム複合体を含む多孔質複合体の機械的強度を上げるために、複合体の線維の方向をコントロールすること（特許文献１）、又は複合体の平均線維長を６０μｍ以上にすることによって多孔質材料の機械的強度を高める方法（特許文献２）が開示されている。
しかしながら、いずれの多孔質複合体も、人工骨として用いるための十分な機械的強度を得ることはできていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−９８１１７号公報
【特許文献２】特開２００３−１９０２７１号公報
【特許文献３】国際公開第２００５／０７９８７９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来のリン酸カルシウムのみからなるセラミックス人工骨は、優れた生体適合性と骨伝導性を有するものの、骨欠損部に応じた成形性に手間がかかり、脆性を示すという欠点があった。一方、リン酸カルシウム（例えば、ハイドロキシアパタイト）にコラーゲンを添加したコラーゲン／リン酸カルシウム複合体は、優れた生体適合性及び骨伝導性を有しており、セラミックス人工骨のような脆性はない。しかしながら、従来のコラーゲン／リン酸カルシウム複合体は機械的強度、特に含水状態での強度が低く、人工骨及びＧＢＲ膜（Guided Bone Regeneration：骨誘導再生）としての利用が制限されていた。本発明者らは、コラーゲン／リン酸カルシウム複合体の強度を高くすることができない原因は、コラーゲン／リン酸カルシウム複合体において、リン酸カルシウムのつなぎ材として働くコラーゲン線維の密度を高めることができないためであると考えた。この問題を解決するためには、コラーゲン／リン酸カルシウム複合体中のリン酸カルシウムの密度、及びリン酸カルシウムに対するコラーゲンの重量比を同時に高めることが必要になる。
しかしながら、リン酸カルシウムが多くなると、前記セラミックス人工骨と同じように、硬いが脆い複合体となってしまい、術後の破損や術中のハンドリングの悪さが問題となる。この問題を解決するためには、コラーゲン／リン酸カルシウム複合体中のリン酸カルシウムに対するコラーゲンの重量比、及び複合体の総重量に対するコラーゲンの濃度を一定以上に維持することにより、複合体の密度を上げる必要がある。
コラーゲン／リン酸カルシウム複合体を作製する場合、コラーゲンとして、コラーゲン水溶液もしくはコラーゲン水溶液から生成した線維を原料として複合体を作製する。この場合、コラーゲンは水に溶解すると高い粘性を示すため、コラーゲン水溶液としての利用は低濃度（およそ２重量％が上限）に限定されていた。例えば、特許文献３には、コラーゲン溶液の粘性が高すぎてゲルの製造が困難になる場合があるため、コラーゲン溶液の濃度は、０．０１〜３．０重量％の範囲であることが好ましく、０．０５〜２．０重量％の範囲がより好ましいことが記載されている（特許文献３）。従って、複合体に対するコラーゲンの濃度を上昇させることが困難であり、コラーゲン／リン酸カルシウム複合体中のリン酸カルシウムに対するコラーゲンの重量比が一定以上であり、且つ密度の高いコラーゲン／リン酸カルシウム複合体を得ることができなかった。
従って、本発明の課題は、生体骨と同じ機構で体内に吸収されるとともに高い骨形成能を有し、骨再生のテンプレートとして機能するに十分な力学特性を有する多孔質複合体、及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するため、リン酸カルシウムとコラーゲンを含む複合体を作製する場合に、コラーゲン線維を含む溶液の濃度を遠心分離により、３重量％以上、特には、１０重量％以上に濃縮することが可能であることを見出した。このような３重量％以上の高濃度のコラーゲン懸濁液は、従来コラーゲン／リン酸カルシウム複合体に用いられたことはなかったが、このような高濃度のコラーゲン線維懸濁液を用いても、コラーゲン／リン酸カルシウム複合体を作製することが可能であることが分かった。そして、この方法を用いることにより、リン酸カルシウムとコラーゲンとを一定の重量比で含み、重量法で求めた密度が１３０〜６００ｍｇ／ｃｍ３であり、高い骨伝導能と飛躍的に高まった強度を有するコラーゲン／リン酸カルシウム複合体を作製することができることを見出し、本発明を完成させた。
従って、本発明は、リン酸カルシウムとコラーゲンとを２５：７５〜７５：２５の重量比で含み、重量法で求めた密度が１３０〜６００ｍｇ／ｃｍ３である、多孔質複合体に関する。
本発明の多孔質複合体の好ましい態様においては、リン酸カルシウムがハイドロキシアパタイトである。
また、本発明の多孔質複合体の好ましい態様においては、骨治療用であり、より好ましくは、骨治療用の薬剤を含む。
また、本発明は、（１）可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化し、コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維化工程、（２）前記コラーゲン線維懸濁液中のコラーゲン線維を濃縮し、高濃度コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維濃縮工程、（３）前記高濃度コラーゲン線維懸濁液とリン酸カルシウムとを混合し、リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を得る、混合工程、（４）前記リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を多孔体に成形する工程、及び（５）前記多孔体のコラーゲン線維を架橋する、コラーゲン線維架橋工程、を含む、多孔質複合体の製造方法に関する。
本発明の多孔質複合体の製造方法の好ましい態様においては、前記コラーゲン線維濃縮工程における濃縮が、遠心分離による濃縮である。
また、本発明の多孔質複合体の製造方法の好ましい態様においては、前記リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン複合線維懸濁液中のコラーゲン線維濃度が３重量％以上の濃度である。
更に、本発明の多孔質複合体の製造方法の好ましい態様においては、前記リン酸カルシウムが、ハイドロキシアパタイトである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の多孔質複合体によれば、骨欠損部の骨再生において、骨組織の十分な侵入性示す骨伝導能を有しながら、且つ十分な機械的強度を有する骨再生材料を提供することができる。特に、従来のコラーゲン／リン酸カルシウム複合体と比較して、含水状態での機械的強度を飛躍的に高めることができた。従って、得られた多孔質材料は、人工骨として骨再生の良好な足場となるコラーゲン／リン酸カルシウム複合体の特性を保持しつつ、術中、又は術後の材料の破壊や接合部位での損傷を減らすことができ、荷重による変形が抑制されてテンプレートとしての機能性が高まった。
すなわち、本発明の多孔質複合体は、骨親和性及び骨伝導能を有しながら、従来のハイドロキシアパタイトからなるセラミックスの短所であった硬いが脆いという点を解決することができた。またコラーゲン／リン酸カルシウム複合体の短所であった柔らかく強度が得られないという点を解決することができ、強くそして硬い骨再生材料を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ウサギの大腿骨に多孔質複合体を埋植するため、大腿骨遠位部の前額面に、骨髄に貫通した２ｍｍ×１０ｍｍのスリットを作製した写真である。
【図２】大腿骨のスリットに多孔質複合体を埋植した写真である。
【図３】実施例１の多孔質複合体の埋植６週間後の埋植部位での、骨新生を示す組織像である。
【図４】図３の（１）の部位の×１０の拡大写真である。
【図５】図３の（２）の部位の×４０の拡大写真である。
【図６】実施例１の多孔質複合体の埋植６週間後の埋植部位での、骨新生を示す組織像である。図３及び図７とは埋植したウサギの個体が異なる。
【図７】実施例１の多孔質複合体の埋植６週間後の埋植部位での、骨新生を示す組織像である。図３及び図６とは埋植したウサギの個体が異なる。骨新生が吸収され、皮質骨が正常に近く修復されている。
【図８】実施例２の多孔質複合体の埋植６週間後の埋植部位の皮質骨部位における、骨新生を示す組織像である。
【図９】実施例３の多孔質複合体の埋植６週間後の埋植部位の皮質骨部位における、骨新生を示す組織像である。
【図１０】実施例４の多孔質複合体の埋植６週間後の埋植部位の皮質骨部位における、骨新生を示す組織像である。
【図１１】実施例５の多孔質複合体の埋植６週間後の埋植部位の皮質骨部位における、骨新生を示す組織像である。
【図１２】実施例６の多孔質複合体の埋植６週間後の埋植部位の皮質骨部位における、骨新生を示す組織像である。
【図１３】実施例１〜６の多孔質複合体の「曲げ応力―歪み曲線」を示す図である。１〜６の番号は、それぞれ実施例１〜６を示す。
【図１４】比較例１、３及び４の多孔質複合体の「曲げ応力―歪み曲線」を示す図である。１、３及び４の番号は、それぞれ実施例１、３及び４を示す。
【図１５】コラーゲンペーストの濃度を２％とした比較例２の成形体の代表例２個を示す写真である。成形が不可能であった。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［１］多孔質複合体
本発明の多孔質複合体は、リン酸カルシウム及びコラーゲンを含む多孔質複合体である。
本発明に用いることのできるリン酸カルシウムとしては、ＣａＨＰＯ４、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２、Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、ＣａＰ４Ｏ１１、Ｃａ（ＰＯ３）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏ等の１群の化合物を挙げることができるが、特には、ハイドロキシアパタイトが好ましい。ハイドロキシアパタイトは、生体骨の成分の２５％を占めるリン酸カルシウムの１種であり、Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ、又はＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２の組成式で示される化合物を基本成分とする。ハイドロキシアパタイトのＣａ成分の一部分は、Ｓｒ、Ｂａ、ＭＧ、Ｆｅ、Ａｌ、Ｙ、Ｌａ、Ｎａ、Ｋ、Ｈ等から選ばれる１種以上で置換されてもよく、また（ＰＯ４）成分の一部分が、ＶＯ４、ＢＯ３、ＳＯ４、ＣＯ３、ＳｉＯ４等から選ばれる１種以上で置換されてもよく、更に、（ＯＨ）成分の一部分が、Ｆ、Ｃｌ、Ｏ、ＣＯ３等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、これらの各成分の一部が欠失していてもよい。
【００１２】
コラーゲンは、２０種類程度の分子種の異なるものが、哺乳動物、及び魚類を含む広範な動物の生体組織中に存在することが知られている。本発明の多孔質複合体に用いることのできるコラーゲンは、その出発原料とする動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されないが、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）若しくは鳥類（例えば、ニワトリ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲン、又は魚類（例えば、タラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ、ティラピア等）の皮、骨、軟骨、ひれ、鱗、臓器等から得られるコラーゲン様タンパク質を用いることができる。更には、前記の動物組織からの抽出ではなく、遺伝子組み替え技術によって人工的に得られたコラーゲンを用いてもよい。特には、生体内に移植する人工骨として使用することを考えた場合、人畜共通ウイルスなどの病原体の存在しない魚類由来のコラーゲンを用いることが好ましい。
【００１３】
コラーゲンには、Ｉ型コラーゲンからVIII型の分子種が知られており、Ｉ、II、III、及びＶ型コラーゲンが線維型コラーゲンである。コラーゲンのアミノ酸配列は、グリシンが３残基ごとに繰り返す一次構造を有しており、この繰り返し配列は、コラーゲン様配列と呼ばれ、コラーゲンタンパク質の特徴である。本発明で用いることのできるコラーゲンは、上記の線維型コラーゲンに限定されるが、コラーゲン中のアミノ酸残基を、アセチル化、コハク化、マレイル化、フタル化、ベンゾイル化、エステル化、アミド化、グアニジノ化等といった化学修飾したものを用いることもできる。
【００１４】
本発明の多孔質複合体に含まれるリン酸カルシウムとコラーゲンとの重量比は、好ましくは２５：７５〜７５：２５であり、より好ましくは、３０：７０〜７０：３０であり、最も好ましくは、４０：６０〜６０：４０である。コラーゲンが２５重量％未満である（リン酸カルシウムが７５重量％を超える）と多孔質複合体は、脆性が顕著になり、コラーゲンが７５重量％を超える（リン酸カルシウムが２５重量％未満である）と、多孔質複合体は弱くなり、機械的強度が不足する。換言すると、リン酸カルシウムとコラーゲンとの重量比が、２５：７５〜７５：２５であることにより、人工骨として曲げ破断歪み及び曲げ弾性率が最適な多孔質複合体を得ることができる。
リン酸カルシウムとコラーゲンとの重量比は、多孔質複合体中のリン酸カルシウムとコレーゲンの重量比を分析することによって測定可能であるが、多孔質複合体の製造工程におけるリン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液に含まれるリン酸カルシウムとコラーゲンの重量比によっても、規定することができる。
【００１５】
本発明の多孔質複合体は、重量法による密度が、好ましくは１３０〜６００ｍｇ／ｃｍ３であり、より好ましくは１５０〜５００ｍｇ／ｃｍ３であり、最も好ましくは１８０〜４００ｍｇ／ｃｍ３である。密度が１３０ｍｇ／ｃｍ３未満であると機械的強度が不足し、６００ｍｇ／ｃｍ３を超えると骨組織の侵入性が悪化する。
重量法による密度は、円柱状もしくは板状の多孔質複合体を成型し、その重量をノギスで測定して求めた体積で割ることによって計算することができる。
【００１６】
本発明の多孔質複合体の機械的強度は、例えば、含水状態の試験片に対する曲げ弾性率、曲げ破断応力、及び曲げ破断歪みによって、測定することができる。曲げ弾性率としては、０．３〜１０ＭＰａが好ましく、曲げ破断応力については、０．１〜３ＭＰａが好ましく、曲げ破断歪みについては、３点曲げ試験（スパン２０ｍｍ、試験片の幅及び高さ３ｍｍ）において３ｍｍ以上であることが好ましい。
【００１７】
本発明の多孔質複合体は、前記リン酸カルシウムとコラーゲンとの重量比の範囲、及び前記重量法による密度の範囲である限り、その他の成分を含むことができる。リン酸カルシウム及びコラーゲンと、その他の成分との重量比は、多孔質複合体が骨伝導能を有し、人工骨としての強度を有していれば、特に限定されないが、リン酸カルシウム及びコラーゲンが、多孔質複合体の総重量に対し７０重量％以上が好ましく、７５重量％以上がより好ましく、８０重量％以上が最も好ましい。また、リン酸カルシウム及びコラーゲンからなる多孔質複合体も、本発明の範囲に含まれる。本発明の多孔質複合体は、リン酸カルシウムの含量及びコラーゲン線維間の架橋により強度を得るため、リン酸カルシウム及びコラーゲンが総重量の７０重量％未満となると強度が低下する可能性があり、好ましくない。
【００１８】
多孔質複合体に含むことのできるその他の物質としては、例えば、コラーゲン及びリン酸カルシウムと親和性のある「つなぎ材」、又は骨治療に使用する薬剤を挙げることができる。
【００１９】
つなぎ材としては、例えば、ゼラチン、グリコサミノグリカンを挙げることができ、その他に、ポリ乳酸などの生体吸収性ポリエステル、β１−３グルカン、キチン、あるいはキトサンなどの機能性多糖類を挙げることもできる。
【００２０】
グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧと称することがある）は、ヘキスロン酸又はガラクトースとヘキソサミンの二糖単位の繰り返し構造からなる基本骨格を有する多糖であり、ヒアルロン酸及びコンドロイチンを除くＧＡＧは、構成糖のヒドロキシル基が部分的に硫酸エステル化され、アミノ基がアセチル化又は硫酸化されている。前記ヘキスロン酸としては、例えばグルクロン酸及びイズロン酸を挙げることができ、ヘキソサミンとしては、例えばグルコサミン及びガラクトサミンを挙げることができる。本発明の多孔質複合体に使用することができるＧＡＧとしては、例えばヒアルロン酸（ＨＡ）、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸等を挙げることができるが、その中でも骨再生において血管の誘導を促進することが知られているヒアルロン酸又は硬組織に広く存在するコンドロイチン硫酸が好ましい。
【００２１】
骨治療に使用する薬剤としては、骨再建促進能を有する薬剤が好ましく、例えば、骨誘導能、血管誘導能及び細胞増殖促進能の少なくともいずれかの機能を有する薬剤を挙げることができる。具体的には、細胞成長因子、サイトカインが好ましく、これら薬剤は多孔質複合体を製造する際に原料として含有させるか、多孔質複合体の製造後に、担持させることができる。サイトカインについては、骨誘導能を有する骨形成因子（Bone Morphogenetic Protein；BMP）を使用することで、極めて優れた骨組織の誘導を実現できる。骨形成因子は、骨誘導因子ともいわれており、例えば、ＢＭＰ１〜９がクローニングされており、いずれの因子も使用することができる。また、細胞成長因子は、血管誘導能を有する（細胞増殖促進能を有する場合もある）ものを挙げることができ、例えば、血管内皮細胞増殖因子：Vascular Endothelial Growth Factor（VEGF）、肝細胞増殖因子：Hepatocyte Growth Factor（HGF）、線維芽細胞増殖因子：Fibroblast Growth Factor（FGF）等の血管新生因子を使用することができる。
【００２２】
本発明の多孔質複合体は、生体骨に類似の微小多孔質構造を有しており、人工骨として利用する場合、骨組織が微小多孔質構造に侵入することができる。また、前記の薬剤を含浸させる場合は、微小多孔質構造に、多くの薬剤を吸着することができる。
【００２３】
本発明の多孔質複合体は、骨治療用に用いることができ、例えば、骨欠損部の治療における人工骨材、人工骨充填材等のインプラント、及び骨再建材として用いることができる。特に骨欠損部における充填材として用いた場合、自家骨の代替となりうる骨再生の足場材料となることができる。また、多孔質複合体は、GBR膜（Guided Bone Regeneration：骨誘導再生）、軟骨の治療に用いることもできる。更に、生体外における使用として、細胞培養に用いる基材として使用することも可能である。
【００２４】
［２］多孔質複合体の製造方法
前記多孔質複合体は、
（１）可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化し、コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維化工程、（２）前記コラーゲン線維懸濁液中のコラーゲン線維を濃縮し、高濃度コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維濃縮工程、（３）前記高濃度コラーゲン線維懸濁液とリン酸カルシウムとを混合し、リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を得る、混合工程、（４）前記リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を多孔体に成形する工程、及び（５）前記多孔体のコラーゲン線維を架橋する、コラーゲン線維架橋工程、を含む、多孔質複合体の製造方法によって製造することができる。
【００２５】
従来、リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体を製造する方法としては、例えば、可溶化コラーゲン溶液からコラーゲンを線維化して、コラーゲン線維懸濁液を作製し、コラーゲン線維懸濁液とリン酸カルシウムとを混合する方法が用いられていた。
従来の方法において、可溶化コラーゲンを水などの溶媒に溶解した場合、コラーゲンは高い粘性を示すため、可溶化コラーゲン溶液として２重量％程度の濃度に溶解するのが限界であった。２重量％程度の濃度のコラーゲン溶液を用いてコラーゲン線維を含むコラーゲン線維懸濁液を作製すると、コラーゲン線維の濃度が１重量％程度のものしか得ることができない。
一方、公知の共沈法などにより調製したコラーゲン線維／リン酸カルシウム複合線維懸濁液は加圧脱水等により濃縮して濃度を高めることが可能であるが、コラーゲン線維に析出したリン酸カルシウムがコラーゲン線維表面を覆うため、コラーゲン線維がつなぎ剤として機能しないという問題があった。可溶化コラーゲンをコラーゲン線維／リン酸カルシウム複合線維懸濁液に対してつなぎ剤として添加すると、系の粘度が高まり濃縮が困難になるという問題があった。
従って、１重量％程度のコラーゲン線維を含む懸濁液にリン酸カルシウムを添加する従来法では、最終的な多孔質複合体においてコラーゲン線維の濃度を上昇させることができず、密度が低くなり、強度の高い多孔質複合体を得ることができなかった。また、コラーゲン線維／リン酸カルシウム複合線維懸濁液を濃縮する従来法では、コラーゲンがつなぎ剤として機能せず、強度の高い多孔質複合体を得ることができなかった。
【００２６】
本発明の製造方法においては、可溶化コラーゲン溶液から得られた、コラーゲン線維を含む懸濁液のコラーゲン線維を濃縮することにより、コラーゲンがつなぎ剤として機能する状態を維持しながらコラーゲン線維の濃度を従来の１重量％以下から、３重量％以上、特には１０重量％以上に上昇させることが可能になった。これにより、多孔質複合体中のコラーゲン濃度を調整することが容易になり、高密度の多孔質複合体を得ることができた。
【００２７】
遠心分離は、水分をコラーゲン線維から分離できる条件であれば、特に限定されるものではないが、２０００ｇ〜２００００ｇで行うことが好ましく、例えば、遠心機ＧＲＸ−２２０（トミー精工社製）を用い、１００００ｒｐｍで行うことができる。
遠心機による遠心分離を行い、コラーゲン線維と水分を分離させた後、水分を除去し、ペースト状になったコラーゲン線維を得る。次に、ペースト状のコラーゲン線維を、ホモジェナイザーを用いてホモジェナイズすることによって、コラーゲン線維間に保持されている水分を分離しやすくする。
ホモジェナイズ後、更に遠心機を用い遠心分離を繰り返し、分離した水分を除去する。ホモジェナイザーは、一般に用いられているものを利用することができるが、例えば、セルマスター（アズワン社製）を用い、５０００ｒｐｍで行うことができる。
この遠心分離の回数は、限定されるものではないが、１回〜１０回程度行うことができ、効率の観点から、好ましくは１〜８回、より好ましくは、１〜５回、最も好ましくは１〜３回程度行う。
【００２８】
本発明の多孔質複合体の製造方法の１つの態様である、前記多孔質複合体の製造方法について、以下に説明する。
前記多孔質複合体の製造方法は、
（１）可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化し、コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維化工程、（２）前記コラーゲン線維懸濁液中のコラーゲン線維を濃縮し、高濃度コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維濃縮工程、（３）前記高濃度コラーゲン線維懸濁液とリン酸カルシウムとを混合し、リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を得る、混合工程、（４）前記リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を多孔体に成形する工程、及び（５）前記多孔体のコラーゲン線維を架橋する、コラーゲン線維架橋工程、を含む。
【００２９】
前記コラーゲン線維化工程（１）においては、まず、前記の哺乳動物又は魚類由来の可溶化コラーゲンを水などの水性の溶媒に溶解する。コラーゲンには、酸可溶性コラーゲン及びアルカリ可溶性コラーゲンがあり、それぞれ可溶化できるｐＨが異なる。酸可溶性コラーゲンの場合、酸可溶化コラーゲン溶液に中性の緩衝液を混合してコラーゲン線維を析出させ、コラーゲン線維コラーゲン線維懸濁液を得ることができる。酸可溶化コラーゲン溶液のｐＨは、２．０〜６．０の間であることが好ましい。
コラーゲンの線維化に適するｐＨは、コラーゲンの種類によって変化するが、ｐＨ５〜９の範囲、すなわち中性の範囲である場合が多く、中性の緩衝液が用いられる。コラーゲンを線維化させる中性の緩衝液の条件としては、適度なイオン強度及びｐＨが中性であることが重要である。このような条件を満たすものであれば、緩衝液は、特に限定されるものではないが、生体に用いる人工骨などの最終的な用途を考慮すれば、細胞毒性が無いかあるいは低い、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、Ｔｒｉｓ等の緩衝能を有する塩水溶液を用いることが好ましい。特に、中性の緩衝液であり、安価、生体に毒性を示さない、そしてコラーゲンの線維化を他の中性の緩衝液よりも活発に起こす点において、リン酸緩衝液（特には、リン酸ナトリウム水溶液）が好ましい。
【００３０】
アルカリ可溶性コラーゲンの場合、アルカリ可溶化コラーゲン溶液に中性の緩衝液を混合してコラーゲン線維を析出させ、コラーゲン線維コラーゲン線維懸濁液を得ることができる。アルカリ可溶化コラーゲン溶液のｐＨは、６．０〜１０．０の間であることが好ましい。
コラーゲンの線維化に適するｐＨは、コラーゲンの種類によって変化するが、ｐＨ５〜９の範囲、すなわち中性の範囲である場合が多く、中性の緩衝液が用いられる。コラーゲンを線維化させる中性の緩衝液の条件としては、適度なイオン強度及びｐＨが中性であることが重要である。このような条件を満たすものであれば、緩衝液は、特に限定されるものではないが、生体に用いる人工骨などの最終的な用途を考慮すれば、細胞毒性が無いかあるいは低い、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、Ｔｒｉｓ等の緩衝能を有する塩水溶液を用いることが好ましい。特に、中性の緩衝液であり、安価、生体に毒性を示さない、そしてコラーゲンの線維化を他の中性の緩衝液よりも活発に起こす点において、リン酸緩衝液（特には、リン酸ナトリウム水溶液）が好ましい。
【００３１】
前記コラーゲン線維濃縮工程（２）においては、コラーゲン線維懸濁液中のコラーゲン線維を遠心分離、又は加圧脱水などにより濃縮し、高濃度コラーゲン線維懸濁液を得ることができる。
遠心分離は、前記のようにコラーゲン線維懸濁液を、遠心機による遠心分離とホモジェナイズを１〜１０回程度繰り返し行うことができる。加圧脱水で濃縮を行う場合は、一回で濃縮を行ってもよいが、加圧脱水とホモジェナイズを繰り返し、１〜１０回程度行うことができる。
遠心分離、又は加圧脱水を行う前のコラーゲン線維懸濁液中のコラーゲン線維の濃度は、０．４〜０．５重量％程度であるが、遠心分離又は加圧脱水により、１０重量％以上の濃度のコラーゲン線維懸濁液を得ることができる。本明細書において、高濃度コラーゲン線維懸濁液とは、コラーゲン線維が３重量％以上の濃度の懸濁液を意味する。
【００３２】
前記混合工程（３）においては、前記高濃度コラーゲン線維懸濁液とリン酸カルシウムとを混合し、リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を得ることができる。高濃度コラーゲン線維懸濁液に混合するリン酸カルシウムは、特に限定されるものではないが、ハイドロキシアパタイトが好ましい。
リン酸カルシウムは、公知の湿式法により合成したものを用いることができる。例えば、ハイドロキシアパタイトの場合、水酸化カルシウム（又は炭酸カルシウム）とリン酸とを水溶液中で室温〜８０℃程度の温度下で反応させ、得られたハイドロキシアパタイトの微結晶粉末を１００℃以下で乾燥させることによって得ることができる。より具体的には、水酸化カルシウム水溶液（又は炭酸カルシウム）及びリン酸緩衝液を混合することによって、水に不溶な白い懸濁液（いわゆる、スラリー）を得ることができる。水酸化カルシウム水溶液としては、水酸化カルシウムが完全に溶解していない水酸化カルシウム懸濁液を用いることもできる。反応液のｐＨは７〜１１の範囲で、かつ変化の幅を１以内となるようにリン酸緩衝液を滴下することが望ましく、ｐＨ７〜９の範囲で、かつ変化の幅を０．５以内とすることがより好ましい。
【００３３】
本発明の製造方法において、ｐＨ制御を行うには、ｐＨコントローラを用いることができる。ｐＨコントローラは、反応液のｐＨを測定する手段と、滴下する両溶液の滴下量を調節する手段とを備えたものであり、設定されたｐＨ（例えば１０）に対して一定範囲（例えば±０．３）を保つように、両溶液のｐＨ値に基づいて両溶液の滴下量を調節するものである。なお、反応液のｐＨが偏ることのないように、両溶液及び反応液をたえず攪拌しながら反応を行うことが好ましい。
【００３４】
コラーゲン線維と混合するリン酸カルシウムは、固体となっているものであれば、水分を含んでいてもよいが、コラーゲン線維との重量比をコントロールし、均一な懸濁液を得るために乾燥した粉末のリン酸カルシウムが好ましい。
得られたリン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液は、水に不溶な白い懸濁液（いわゆる、スラリー）である。
【００３５】
リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液における、コラーゲンの濃度及びアパタイト／コラーゲン（組成重量比）は、得られる多孔質複合体の密度が１３０〜６００ｍｇ／ｃｍ３となるように適宜調製することが可能である。すなわち、コラーゲンの濃度を上げることによって、多孔質複合体の密度を上昇させることが可能であり、例えば３％以上であり、好ましくは５％以上、より好ましくは６％以上、最も好ましくは７％以上である。また、アパタイト／コラーゲン（組成重量比）におけるアパタイトの組成重量比を上げることによって、多孔質複合体の密度を上昇させることが可能であり、例えば、２５％以上であり、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは６０％以上である。更に、コラーゲンの濃度の上昇、及び、アパタイト／コラーゲン（組成重量比）におけるアパタイトの組成重量比の上昇を組み合わせることによって、多孔質複合体の密度を上昇させることが可能である。すなわち、コラーゲンの濃度の３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、及びアパタイト／コラーゲン（組成重量比）におけるアパタイトの組成重量比を、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上を適宜組み合わせて、多孔質複合体の密度が１３０〜６００ｍｇ／ｃｍ３とすることが可能である。
【００３６】
前記多孔体形成工程（４）は、リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を多孔体に成形する工程であり、多孔体の成形方法としては、従来公知の方法を用いることが可能であり、具体的には、凍結乾燥法などを挙げることができる。更にマクロ気孔を付与する場合は、ドリル等の加工機で掘削する方法などを用いることができる。
【００３７】
多孔体の成形方法として、凍結乾燥法を用いる場合は、所望の大きさ及び形態の成形容器を用意し、リン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を流し込む。成形容器の材料は、冷凍機による凍結、及び凍結乾燥機における減圧に耐えることができる限り、限定されるものではないが、例えば、シリコンゴムなどを用いることができ、任意の大きさ及び形態の成形容器を作製することが可能である。成形容器中のリン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液は、冷凍機により、例えば−８０〜−５℃で凍結される。凍結されたリン酸カルシウム／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液は、凍結乾燥機に入れ、例えば棚温度−３０〜４０℃で、水分がなくなるまで、凍結乾燥を行う。
【００３８】
得られた多孔体に対して血管や組織の侵入性を高める目的で、Ito et al. J Biomed Mater Res (Appl Biomat) 65: 507-515 (2002)に記載されているような直線的なマクロ気孔を付与することができる。その場合は、例えば、歯科治療において歯の掘削に用いられるドリルにより行うことができる。マクロ気孔の内径としては、１００〜２０００μｍが好ましく、より好ましくは２００〜１０００μｍ、更に好ましくは３００〜５００μｍである。
【００３９】
前記コラーゲン線維架橋工程（５）では、前記の多孔体形成工程において、得られた多孔体中のコラーゲン線維を架橋することによって、密度が高く、一定以上の機械的強度を有する多孔質複合体を得ることができる。
成形した多孔体中のコラーゲン線維を、γ線、紫外線、熱処理（熱脱水）、電子線等を用いた物理的架橋、又は架橋剤や縮合剤を用いた化学的架橋によって架橋することができるが、大規模な装置が必要ないことから、熱処理又は架橋剤などを用いるものが好ましい。
【００４０】
熱処理は、例えば、真空炉を使って減圧下で、加熱処理を行う。この熱処理により、コラーゲン線維のカルボキシル基とアミノ基に脱水縮合を生じさせ、効率よく架橋を生成することができ、弾性に富み、機械的強度を有する多孔質複合体を製造することができる。真空熱処理の実施条件としては、コラーゲンにおける効率のよい架橋生成を考慮すると、温度は９０〜１７０℃の範囲、より好ましくは１００〜１５０℃の範囲であり、圧力（真空度）は気圧２０Ｐａ以下の減圧状態が好ましい。処理時間は、温度によって変化するが、例えば、処理温度が９０〜１１０℃の範囲の場合、処理時間は７２〜１６８時間が好ましく、処理温度が１１０〜１３０℃の範囲の場合、処理時間は２４〜１２０時間が好ましく、また、処理温度が１３０〜１５０℃の範囲の場合、処理時間は８〜４８時間以上が好ましく、更に、処理温度が１５０〜１７０℃の範囲の場合、処理時間は３〜２４時間が好ましい。
【００４１】
また、架橋剤を使用することによっても、前記の真空熱処理と同様に効率よくコラーゲンに架橋を導入させることができる。架橋剤を用いて架橋を行う場合には、前記混合工程（３）において、架橋剤を混合することができる。架橋剤は、タンパク質を架橋でき、水溶性を有するものであれば特に限定されるものではなく、カルボキシル基とアミノ基を架橋するもの、アミノ基同士を架橋するものでもよい。架橋剤としては、医療材料に用いることができるものであれば特に限定されないが、経済性及び操作性の観点からカルボジイミド系架橋剤が好ましく用いられ、具体的には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを挙げることができる。
【００４２】
ゼラチン又はＧＡＧなどのつなぎ材を、多孔質複合体に混合する場合は、コラーゲンの線維化を行う緩衝液にあらかじめ溶解させてから混合しても良いし、コラーゲンとリン酸カルシウムとを混合してからつなき材を別途加えてもよい。すなわち、前記多孔質複合体の製造方法におけるコラーゲン線維化工程（１）又は混合工程（３）において、つなぎ材を添加することができる。添加するつなぎ材の濃度としては、最終的な多孔質複合体の総重量に対して、１〜３０重量％が好ましく、２〜２０重量％がより好ましい。
【００４３】
本発明の多孔質複合体に加えることのできる薬剤は、多孔質複合体の製造方法の工程において、添加することも可能であるが、多孔質複合体の製造後に担持させることもできる。しかしながら、多孔質複合体の製造においては、比較的高い温度での処理を行うこともあるので、高温で失活する薬剤については、製造中の温度を、薬剤の失活温度より低くコントロールするか、多孔質複合体の製造後に担持させることが好ましい。
【００４４】
本発明の多孔質複合体の骨伝導能については、動物への移植実験によって確認することができた。本発明の多孔質複合体は、密度が１３０〜６００ｍｇ／ｃｍ３であり、十分な強度を有していながら、骨形成を誘導することができ、ウサギへの移植後、６週間でほぼ完全に吸収され、異物反応はまったく認められなかった。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４６】
《実施例１》
（１）可溶化コラーゲンの線維化
ティラピア鱗のコラーゲン凍結乾燥物（アテロタイプ；北海道曹達株式会社）を水に溶解し、０．８重量％のコラーゲン水溶液を作製した。このコラーゲン水溶液に、７０ｍＭのＮａＣｌを含むリン酸ナトリウム水溶液（３０ｍＭ）を等容積加えて、薬さじで約３分間よく混合した後、３７℃の水浴中で３０分間静置しコラーゲンを線維化し、コラーゲン線維の懸濁液を得た。
【００４７】
（２）コラーゲン線維懸濁液の遠心分離による濃縮
得られたコラーゲン線維の懸濁液は、薬さじで全体をかき混ぜた後、遠心分離機を用いてコラーゲンを濃縮した。コラーゲン線維懸濁液をチューブに４００ｍＬ分注し、遠心機ＧＲＸ−２２０（トミー精工製）を用い、１０，０００ｇで、２０分間遠心した。上静を廃棄し、沈殿したペースト状のコラーゲン線維をセルマスター（アズワン社製）で、ホモジェナイズした。ホモジェナイズしたコラーゲン線維の懸濁液を、更に前記と同じ条件で遠心した。このようにして、遠心分離を３回繰り返した。１回目の遠心分離で、コラーゲン線維の濃度は、約０．４重量％から４重量％に濃縮され、２回目の遠心分離で約４重量％から１７重量％に濃縮され、高濃度コラーゲン線維懸濁液を得た。
得られた高濃度コラーゲン線維懸濁液の一部（約２ｇ）を、ポリスチレン製のトレーに秤量し、６０℃の乾燥機で２４時間乾燥させ、水分を完全にとばした。乾燥したコラーゲン線維の質量を計り、前記高濃度コラーゲン線維懸濁液中のコラーゲン線維の濃度を算出した。コラーゲン濃度の判明した高濃度コラーゲン線維懸濁液に、５重量％又は１０重量％の濃度の高濃度コラーゲン線維懸濁液となるように水を加えた。
【００４８】
（３）高濃度コラーゲン線維懸濁液とハイドロキシアパタイトとの混合
ハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）粉末を、Ｃａ（ＯＨ）２懸濁液とＨ３ＰＯ４水溶液とから湿式法によって得た。撹拌している水酸化カルシウム溶液中に、ｐＨコントローラを用いｐＨ９．０以下にならないようにコントロールしながら、リン酸塩溶液を滴下した。生成したハイドロキシアパタイト粒子をろ紙を用いて回収し、１００℃以下で送風乾燥することにより粉末のハイドロキシアパタイトを得た。
１０重量％の濃度に調製した高濃度コラーゲン線維懸濁液に、得られた粉末ハイドロキシアパタイトを、ハイドロキシアパタイトとコラーゲンとの重量比が７０：３０となるように添加し、ホモジナイザーで均一になるまで混合した。得られたハイドロキシアパタイト／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液中のアパタイト濃度は２３．３％、コラーゲン濃度は１０％となる。シリコーンゴムシート（厚さ３ｍｍ）から２５ｍｍ×２５ｍｍの枠を作製し、シリコーンゴムシート（厚さ３ｍｍ）２枚で挟み込み、成形容器として用いた。得られたハイドロキシアパタイト／高濃度コラーゲン線維混合懸濁液を、成形容器に流し込み、−２０℃で冷凍した。棚温度２５℃で２日間、凍結乾燥を行った。
【００４９】
（４）熱によるコラーゲン線維の架橋
凍結乾燥後の多孔体サンプルは、真空乾燥機を用いて、真空下で１３０℃、２４時間処理し、脱水縮合により熱架橋を行い、本発明の多孔質複合体を得た。
【００５０】
《実施例２》
ハイドロキシアパタイトとコラーゲンとの重量比を、７０：３０から６０：４０に変更したことを除いては、実施例１の手順を繰り返し、多孔質複合体を得た。
【００５１】
《実施例３》
１０重量％の濃度の高濃度コラーゲン線維懸濁液の代わりに５重量％の濃度の高濃度コラーゲン線維懸濁液を用いたことを除いては、実施例１の手順を繰り返し、多孔質複合体を得た。
【００５２】
《実施例４》
１０重量％の濃度の高濃度コラーゲン線維懸濁液の代わりに５重量％の濃度の高濃度コラーゲン線維懸濁液を用いたこと、及びハイドロキシアパタイトとコラーゲンとの重量比を、７０：３０から６０：４０に変更したことを除いては、実施例１の手順を繰り返し、多孔質複合体を得た。
【００５３】
《実施例５》
ティラピア鱗のコラーゲンの代わりに、豚皮のコラーゲン（アテロタイプ；コラーゲンＢＭ、新田ゼラチン社製）を用いたことを除いては、実施例２の手順を繰り返し、多孔質複合体を得た。
【００５４】
《実施例６》
ティラピア鱗のコラーゲンの代わりに、豚皮のコラーゲンを用いたことを除いては、実施例４の手順を繰り返し、多孔質複合体を得た。
【００５５】
《比較例１》
ハイドロキシアパタイトとコラーゲンとの重量比を、７０：３０から９０：１０に変更したことを除いては、実施例３の手順を繰り返し、多孔質複合体を得た。
【００５６】
《比較例２》
１０重量％の濃度の高濃度コラーゲン線維懸濁液の代わりに２重量％の濃度のコラーゲン線維懸濁液を用いたこと、及びハイドロキシアパタイトとコラーゲンとの重量比を、７０：３０から８０：２０に変更したことを除いては、実施例１の手順を繰り返した。
【００５７】
《比較例３》
ハイドロキシアパタイトとコラーゲンとの重量比を、７０：３０から２０：８０に変更したことを除いては、実施例１の手順を繰り返し、多孔質複合体を得た。
【００５８】
《比較例４》
ハイドロキシアパタイトとコラーゲンとの重量比を、７０：３０から８０：２０に変更したことを除いては、実施例３の手順を繰り返し、多孔質複合体を得た。
【００５９】
《重量法による密度の測定》
得られた多孔質複合体の質量をした。また、マイクロメーターを用いて、多孔質複合体立法体の寸法を計測し、体積を計算した。質量を体積で割り、多孔質複合体の密度を算出した。
【００６０】
《曲げ弾性率、曲げ破断応力、及び曲げ破断歪みの測定》
メスで幅３ｍｍにカットしたサンプル（３ｍｍ×３ｍｍ×２５ｍｍ）を用いて、３点曲げ試験を行った。サンプルはマイクロメーターを用いて幅と高さを正確に計測した後、曲げ試験前にリン酸緩衝生理食塩水に浸漬し、サンプル多孔体中に内包されている気泡を減圧ポンプで十分に除去した。含水したサンプルをスパン２０ｍｍに設定したテクスチャー試験機（TA-XT2i, Stable Micro Systems）に載せた。ヘッドスピード１０ｍｍ／分で荷重をかけ、２３℃の室内で曲げ弾性率と破断歪みを測定した。曲げ弾性率は、得られた応力−歪み曲線の始めの直線部分から以下の式により計算される。本実験では歪み２ｍｍにおける応力を用いた。
曲げ弾性率（ＭＰａ）＝Ｌ３Ｆ／４ｂｈ３Ｙ
Ｌ：スパン（ｍｍ）
Ｆ：応力（Ｎ）
ｂ：サンプルの幅（ｍｍ）
ｈ：サンプルの高さ（ｍｍ）
Ｙ：歪み（ｍｍ）
【００６１】
【表１】
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【００６２】
表１に記載の評価項目において、「曲げ弾性率」が大きい多孔質複合体は硬く、逆に小さいものは柔らかいものである。また「曲げ破断歪み」が大きい多孔質複合体は曲げられても破壊しにくく、すなわち柔軟性の高いものであり、逆に小さい多孔質複合体は柔軟性が低いものである。そして、「曲げ破断応力」が高く、且つ「曲げ破断歪み」が大きい材料、すなわち、曲げ応力―歪み曲線の下方の面積が大きいものは「強い」材料である。一方、曲げ弾性率や曲げ破断応力が高くても、曲げ破断歪みの小さい多孔質複合体は、「弱い」ものである。
【００６３】
表１に示すように、実施例１〜６の多孔質複合体は、「曲げ破断応力」が高く、かつ「曲げ破断歪み」が大きい多孔質複合体、すなわち、いずれも図１３に示す「曲げ応力―歪み曲線」の下方の面積が大きいものであり、従来の多孔質複合体と比較して、強い材料である。
一方、比較例１の多孔質複合体は、実施例３の多孔質複合体と比較すると、アパタイト／コラーゲン（組成重量比）が、７０／３０から８０／２０になり、アパタイトの量が増加しているが、それにより、わずかに硬くなるが、「曲げ破断応力」及び「曲げ破断歪み」が低下し、弱くなってしまう。この点は、図１４に示す比較例１の「曲げ応力―歪み曲線」の下方の面積が、実施例１〜６のそれと比較して小さいことから明らかである。
また、比較例２の場合、コラーゲンペーストの濃度が、従来の方法で用いられていた２％であるが、凍結乾燥前の凍結において板状・針状の氷晶が形成され、それら氷晶が鋳型となって凍結乾燥後に大きな亀裂を生じ、成形が不可能であった。比較例２の成形体を図１５に示す。
更に、比較例３の多孔質複合体は、実施例１又は実施例２の多孔質複合体と比較すると、アパタイト／コラーゲン（組成重量比）が２０／８０であり、アパタイトの重量比が少ないが、それにより、特に「曲げ破断応力」が低下し、弱くなっている。
また、比較例４は、密度が１２２±２ｍｇ／ｃｍ３と低いために、特に「曲げ破断応力」が低下し、弱くなっている。比較例３及び４の「曲げ応力―歪み曲線」を図１４に示すが、いずれも曲線の下方の面積が小さいことがわかる。
【００６４】
《動物実験例１》
（１）多孔質複合体の埋植
３匹のウサギを麻酔し（麻酔前投薬としてネンブタール、維持麻酔としてハロタンを使用）、大腿骨を露出した。大腿骨遠位部の正中前額面において、前・後面皮質骨と骨髄を貫通する２ｍｍ×１０ｍｍのスリットを作製した（図１）。実施例１で得た多孔質複合体を、２ｍｍ×１０ｍｍ×１０ｍｍにカットし、スリットに嵌め込み埋植した（図２）。
【００６５】
（２）組織学的所見
多孔質複合体の埋植６週間後に、ウサギを安楽死させ、大腿骨を摘出した。大腿骨遠位部を１０％ホルムアルデヒドで固定し、アルコールにて脱水した後、キシレンで洗浄を行い、パラフィンワックスに包埋した。この検体を、ミクロトームを用いて、骨軸に対して垂直に薄切した。厚さ５μｍの薄片にＨＥ染色を行い、光学顕微鏡で組織観察を行った。
図３に組織染色の写真を示す。写真内の黄色枠は多孔質複合体の埋植部位である。実施例１の多孔質複合体は完全に吸収され、異物反応はまったく認められなかった。また、多孔質複合体は、これに沿った骨新生を骨髄内に誘導していた。図４は、図３の（１）の部分の×１０の拡大写真であるが、薄い線維性組織をはさむように、骨形成の新生が確認された。また、図５は図３の（２）の部分の×４０の拡大写真であるが、新生骨周辺及び骨髄内における異物反応及び炎症反応は全く見られなかった。
図６及び図７は、他の２匹のウサギの大腿骨の組織染色の写真である。図６に示した組織像は前記のウサギと同様な所見を示しており、６週ではこれが一般的な所見である。一方、図７に示したウサギでは、骨髄内の新生骨が吸収され、皮質骨が修復されつつある所見が認められた。これは正常な骨の改変現象が進んだ像と考えられた。
以上のように、本発明の多孔質複合体は、異物反応及び炎症反応を起こすことなく、更に正常な骨形成を誘導することができると考えられる。
【００６６】
《動物実験例２〜６》
実施例２〜６で得られた多孔質複合体を用いて、動物実験例１と同様の操作により動物実験を実施した（動物実験例２〜６）。動物実験例２〜６の多孔質複合体の埋植６週間後の埋植部位の皮質骨部位における、骨新生を示す組織像をそれぞれ図８〜１２に示す。組織学的所見を表２に示す。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
各評価項目についての基準を以下に示す。
（１）生体吸収性
−：埋植材が吸収されず、ほぼ完全に残っている。
−／＋：埋植材の一部が吸収されている。
＋：埋植材の大部分が吸収されている。
＋＋：埋植材が完全に吸収され、残存が認められない。
（２）異物反応
−：認められない。
−／＋：若干の異物反応が認められる。
＋：異物反応が認められる。
（３）骨髄組織の修復
−：埋植材がほぼ完全に残っているため、骨髄組織の修復が認められない。
−／＋：埋植材の吸収にともない、骨髄組織が修復されつつある。
＋：埋植材がほぼ完全に吸収され、骨形成の新生が認められるが、正常な骨髄組織の修復には至っていない。
＋＋：埋植材が完全に吸収され、正常な骨髄組織の修復が認められる。
（４）皮質骨の修復
−：皮質骨欠損部に新生骨組織は認められない。
−／＋：皮質骨欠損部の一部に新生骨組織を認める。
＋：皮質骨欠損部の大部分に新生骨組織を認めるが一部に欠損がある。
＋＋：皮質骨欠損部は完全に新生骨組織によって修復されている。
【００６９】
このように、本発明の範囲のリン酸カルシウムとコラーゲンとの重量比、及び密度を有する多孔質複合体によれば、生体骨に近い強い強度や弾性などの機械的性質を保ちながら、骨再生のための骨伝導性を有する多孔質複合体を提供することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、潜在市場として存在する自家骨移植の市場（４００億円）を置き換えるための、自家骨の代替になりうる骨再生の足場材料を提供する。更に、セラミックス人工骨として用いることができる。
【図１３】
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【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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