(57)【要約】      （修正有）【課題】前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、又は脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制することが可能な新規抗肥満剤の提供。【解決手段】少なくとも１種のホップ苦味成分を有効成分として含有する脂肪細胞分化抑制剤。ホップ苦味成分として、好ましくはベータ酸及び還元型イソアルファ酸が特に好適である。ベータ酸としては、例えば、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、ポストルプロン及びプレルプロンが挙げられる。また、還元型イソアルファ酸としては、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のホップ苦味成分を有効成分として含有する脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項２】
ベータ酸を有効成分として含有する、請求項１に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項３】
前記ベータ酸が、ルプロン、コルプロン及びアドルプロンのうちの少なくとも１種である、請求項２に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項４】
還元型イソアルファ酸を有効成分として含有する、請求項１に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項５】
前記還元型イソアルファ酸がテトラヒドロイソアルファ酸である、請求項４に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項６】
前記テトラヒドロイソアルファ酸が、テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロンのうちの少なくとも１種である、請求項５に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の脂肪細胞分化抑制剤を含有する医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の脂肪細胞分化抑制剤を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞分化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、糖尿病、脂質代謝異常症、高血圧等の生活習慣病のリスクファクターとして問題となっている。抗肥満剤としては、例えば、小麦蛋白質の加水分解物を含有するものが知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１０６６８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
肥満は、前駆脂肪細胞が脂肪細胞（成熟脂肪細胞）へと分化し、その数が増加すること、又は脂肪細胞に脂肪が蓄積されることにより形成されるので、肥満を抑制するには、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、又は脂肪細胞への脂肪の蓄積を抑制するのが効果的である。そのような作用を有する抗肥満剤は種々知られている（例えば、上記特許文献１参照）が、未だ、消費者の多様な需要を満たすのに十分ではなく、更なる選択肢が強く求められている。
【０００５】
そこで、本発明は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、又は脂肪細胞への脂肪の蓄積を十分に抑制することが可能な新規の抗肥満剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、少なくとも１種のホップ苦味成分を有効成分として含有する脂肪細胞分化抑制剤を提供する。また、本発明は、少なくとも１種のホップ苦味成分を有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤を提供する。
【０００７】
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、脂肪細胞分化（前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化）及び脂肪蓄積（脂肪細胞への脂肪の蓄積）を十分に抑制することができ、そのような作用により、肥満及びそれに起因する種々の症状若しくは疾患（例えば、糖尿病、脂質代謝異常症、高血圧）の予防、治療又は軽減を可能とする。
【０００８】
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤において、ホップ苦味成分としては、より高い脂肪細胞分化抑制効果及び脂肪蓄積抑制効果が得られる点で、例えば、ベータ酸及び還元型イソアルファ酸が特に好適である。
【０００９】
ベータ酸としては、例えば、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、ポストルプロン及びプレルプロンが挙げられるが、ホップ中の含有量が多い点で、ルプロン、コルプロン及びアドルプロンが好適である。
【００１０】
還元型イソアルファ酸とは、イソアルファ酸のケトン基及び／又はプレニル基の二重結合を還元することによって得ることが可能な化合物を意味し、例えば、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸が挙げられる。
【００１１】
テトラヒドロイソアルファ酸としては、例えば、テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン、テトラヒドロイソアドフムロン、テトラヒドロイソポストフムロン及びテトラヒドロイソプレフムロンが挙げられるが、ホップ中の含有量が多い点で、テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロンが好適である。
【００１２】
ローイソアルファ酸としては、例えば、ローイソフムロン、ローイソコフムロン、ローイソアドフムロン、ローイソポストフムロン及びローイソプレフムロンが挙げられるが、ホップ中の含有量が多い点で、ローイソフムロン、ローイソコフムロン及びローイソアドフムロンが好適である。
【００１３】
ヘキサヒドロイソアルファ酸としては、例えば、ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン、ヘキサヒドロイソアドフムロン、ヘキサヒドロイソポストフムロン及びヘキサヒドロイソプレフムロンが挙げられるが、ホップ中の含有量が多い点で、ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン及びヘキサヒドロイソアドフムロンが好適である。
【００１４】
ベータ酸、還元型イソアルファ酸を始めとするホップ苦味成分は、生体に対する安全性が高く、長年に渡ってビール系飲料で利用されてきたものである。従って、ホップ苦味成分を有効成分とする本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤も、生体に対する安全性が高く、長期間継続的に摂取可能であり、医薬品、飲食品、飲食品添加物、飼料、飼料添加物等の成分として使用するのに好適である。すなわち、本発明はまた、上記脂肪細胞分化抑制剤又は脂肪蓄積抑制剤を含有する医薬品、飲食品、飼料等を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を十分に抑制することが可能な新規の抗肥満剤が提供される。また、そのような抗肥満剤を含有する医薬品、飲食品、飼料等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１で測定された色素抽出液の吸光度を示すグラフである。
【図２】実施例１（コントロール）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図３】実施例１（ベータ酸１ｐｐｍ）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図４】実施例１（ベータ酸５ｐｐｍ）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図５】実施例１（ベータ酸１０ｐｐｍ）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図６】実施例２で測定された色素抽出液の吸光度を示すグラフである。
【図７】実施例２（コントロール）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図８】実施例２（ベータ酸１ｐｐｍ）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図９】実施例２（ベータ酸５ｐｐｍ）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１０】実施例３で測定された色素抽出液の吸光度を示すグラフである。
【図１１】実施例３（コントロール）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１２】実施例３（ベータ酸２ｐｐｍ）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１３】実施例３（ベータ酸４ｐｐｍ）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１４】実施例３（ベータ酸８ｐｐｍ）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１５】実施例４で測定された色素抽出液の吸光度を示すグラフである。
【図１６】実施例４（コントロール）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１７】実施例４（テトラヒドロイソアルファ酸３０ｐｐｍ）で得られた、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１８】実施例５で測定された反応混合液の吸光度の経時的変化を示すグラフである。
【図１９】実施例５で測定された脂肪細胞のＧＰＤＨ活性を示すグラフである。
【図２０】実施例６で測定されたマウスの後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量、腸間膜脂肪重量及び腹腔内総脂肪重量を示すグラフである。
【図２１】実施例６で測定されたマウスの血清総コレステロール値を示すグラフである。
【図２２】実施例６で測定されたマウスの血清リン脂質値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１８】
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、少なくとも１種のホップ苦味成分を有効成分として含有する。
【００１９】
ホップ苦味成分としては、例えば、ベータ酸、アルファ酸、イソアルファ酸及び還元型イソアルファ酸（テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸等）が挙げられる。
【００２０】
ベータ酸、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸は、それぞれ、下記一般式（１）〜（６）で表される化合物である。一般式（１）〜（６）中、Ｒは、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２等から選択される基を表す。
【００２１】
【化１】
2010043064.tif 000002
【００２２】
【化２】
2010043064.tif 000003
【００２３】
【化３】
2010043064.tif 000004
【００２４】
【化４】
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【００２５】
【化５】
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【００２６】
【化６】
2010043064.tif 000007
【００２７】
ベータ酸としては、例えば、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、ポストルプロン及びプレルプロンが挙げられる。ルプロン、コルプロン、アドルプロン、ポストルプロン及びプレルプロンは、それぞれ、一般式（１）で表される化合物のうち、Ｒが−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である化合物である。
【００２８】
アルファ酸としては、例えば、フムロン、コフムロン、アドフムロン、ポストフムロン及びプレフムロンが挙げられる。フムロン、コフムロン、アドフムロン、ポストフムロン及びプレフムロンは、それぞれ、一般式（２）で表される化合物のうち、Ｒが−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である化合物である。
【００２９】
イソアルファ酸としては、例えば、イソフムロン、イソコフムロン、イソアドフムロン、イソポストフムロン及びイソプレフムロンが挙げられる。イソフムロン、イソコフムロン、イソアドフムロン、イソポストフムロン及びイソプレフムロンは、それぞれ、一般式（３）で表される化合物のうち、Ｒが−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である化合物である。
【００３０】
テトラヒドロイソアルファ酸としては、例えば、テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン、テトラヒドロイソアドフムロン、テトラヒドロイソポストフムロン及びテトラヒドロイソプレフムロンが挙げられる。テトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン、テトラヒドロイソアドフムロン、テトラヒドロイソポストフムロン及びテトラヒドロイソプレフムロンは、それぞれ、一般式（４）で表される化合物のうち、Ｒが−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である化合物である。
【００３１】
ローイソアルファ酸としては、例えば、ローイソフムロン、ローイソコフムロン、ローイソアドフムロン、ローイソポストフムロン及びローイソプレフムロンが挙げられる。ローイソフムロン、ローイソコフムロン、ローイソアドフムロン、ローイソポストフムロン及びローイソプレフムロンは、それぞれ、一般式（５）で表される化合物のうち、Ｒが−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である化合物である。
【００３２】
ヘキサヒドロイソアルファ酸としては、例えば、ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン、ヘキサヒドロイソアドフムロン、ヘキサヒドロイソポストフムロン及びヘキサヒドロイソプレフムロンが挙げられる。ヘキサヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロイソコフムロン、ヘキサヒドロイソアドフムロン、ヘキサヒドロイソポストフムロン及びヘキサヒドロイソプレフムロンは、それぞれ、一般式（６）で表される化合物のうち、Ｒが−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である化合物である。
【００３３】
ホップ苦味成分は、公知の方法（例えば、特開平７−３３０５９４号公報に記載の方法）に従って、天然のホップを抽出し、抽出物を分画・精製することによって得ることができる。また、ホップ苦味成分は、所望の成分を含有する市販のホップエキスから、ＨＰＬＣ等を用いて分取することによって得ることもできる。
【００３４】
また、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸は、例えば、下記反応式で表される方法に従って得ることができる。下記反応式において、一般式（２）〜（６）は、それぞれ、アルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ローイソアルファ酸及びヘキサヒドロイソアルファ酸を表す。また、一般式（２）〜（６）中、Ｒは、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２等から選択される基を表す。
【００３５】
【化７】
2010043064.tif 000008
【００３６】
このように、イソアルファ酸は、アルファ酸をアルカリ条件下で加熱することによって得ることができる。また、テトラヒドロイソアルファ酸は、イソアルファ酸をパラジウム付活性炭の存在下、水素ガスで接触還元させることによって得ることができる。また、ローイソアルファ酸は、イソアルファ酸を水素化ホウ素ナトリウムと反応させることによって得ることができる。また、ヘキサヒドロイソアルファ酸は、テトラヒドロイソアルファ酸を水素化ホウ素ナトリウムと反応させることによって得ることができる。
【００３７】
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、固体（例えば、凍結乾燥させて得られる粉末）、液体（水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液）、ペースト等のいずれの形状でもよく、また、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、軟膏剤、硬膏剤等のいずれの剤形をとってもよい。また、本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、少なくとも１種のホップ苦味成分からなるものであってもよい。
【００３８】
上述の各種製剤は、少なくとも１種のホップ苦味成分と、薬学的に許容される添加剤（賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等）と、を混和することによって調製することができる。
【００３９】
例えば、賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｐａｎ  ８０、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ  ８０等が挙げられる。懸濁化剤としては、上述の界面活性剤の他、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００４０】
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、医薬品、飲食品、飲食品添加物、飼料、飼料添加物等の成分として使用することができる。医薬品、飲食品、飼料等には、他の脂肪細胞分化抑制剤又は脂肪蓄積抑制剤が含有されてもよい。
【００４１】
例えば、本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醤油、味噌、菓子類等の飲食品への添加物として使用することができる。飲食品は、当分野で通常使用される他の添加物を更に含有してもよく、そのような添加物としては、例えば、苦味料、香料、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂；グルコース、フルクトース等の単糖類；スクロース等の二糖類；デキストロース、デンプン等の多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール類；ビタミンＣ等のビタミン類、が挙げられる。本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤はまた、特定保健用食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、病者用食品等の成分として使用することもできる。
【００４２】
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は、ヒトに投与されても、非ヒト哺乳動物に投与されてもよい。投与量及び投与方法は、投与される個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。好適な投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。
【００４４】
［実施例１］
（試験サンプルの調製）
ベータ酸（主としてルプロン、コルプロン及びアドルプロン）及びアルファ酸（主としてフムロン、コフムロン及びアドフムロン）の混合物（ＨＰＬＣ用標準品、ＩＣＥ−２、Ｌａｂｏｒ  Ｖｅｒｉｔａｓ）を８５％ＣＨ３ＯＨ／４．５％ＣＨ３ＣＯＯＨで５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、この溶液を遠心分離及びフィルター濾過にかけた後、ＨＰＬＣによりアルファ酸を除去してベータ酸画分を得た。得られたベータ酸画分から、減圧濃縮及び凍結乾燥により水分を除去し、２０％ＤＭＳＯ溶液で段階希釈して、所定濃度の試験サンプルを得た。なお、ベータ酸を含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
・カラム：  Ｃ１８カラム（資生堂  ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８；１０ｍｍ×２５０ｍｍ）
・移動層：  ８５％ＣＨ３ＯＨ／４．５％ＣＨ３ＣＯＯＨ
・流速：  ３ｍＬ／分
【００４５】
（前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導）
マウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＩＦＯ５０４１６）を２４ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で４日間培養した（２日目に培地交換を行った）。
【００４６】
培養開始から４日目に、デキサメタゾン２５０ｎＭ、１−メチル−３−イソブチルキサンチン５００μＭ及びインスリン１０μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に培地交換して分化誘導を行った。３日間の分化誘導の後、試験サンプルを含有する１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に培地交換して、更に７日間培養した（試験サンプル含有培地への培地交換から４日目に、試験サンプルを含有しない１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に培地交換した）。
【００４７】
（オイルレッドＯ染色）
オイルレッドＯ染色液の調製：
オイルレッドＯ粉末０．５ｇを２−プロパノール１００ｍＬに溶解し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をシリンジフィルター（０．４５μｍ）で濾過して、オイルレッドＯ染色原液を得た。オイルレッドＯ染色の際に、原液６ｍＬに蒸留水４ｍＬを加えて１時間静置した後、シリンジフィルター（０．４５μｍ）で濾過して、オイルレッドＯ染色液を得た。
【００４８】
オイルレッドＯ染色：
培養終了後、ウェルから培地を除去し、ＰＢＳ  ５００μＬで細胞を洗浄した後、１０％ホルマリン溶液５００μＬを添加し、４℃で１時間静置して細胞をウェル上に固定した。ホルマリン除去後、蒸留水５００μＬで細胞を洗浄し、オイルレッドＯ染色液３００μＬを添加し、室温で１５分間静置して細胞内の脂肪滴を染色した。染色液除去後、蒸留水で細胞を洗浄し、光学顕微鏡（ＩＭＴ−２、オリンパス社）を用いて１００倍で観察した。更に、２−プロパノール５００μＬを添加して細胞から色素を抽出し、色素抽出液の吸光度（５５０ｎｍ）をプレートリーダーで測定した。
【００４９】
（結果）
結果を図１〜５に示す。図１は、色素抽出液の吸光度を示すグラフである。図１において、ベータ酸濃度は、培養に用いた培地中のベータ酸濃度を示す。図２〜５は、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真であり、それぞれ、ベータ酸０ｐｐｍ（コントロール）、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍの存在下で培養した脂肪細胞に対応する。なお、顕微鏡観察では、細胞毒性が認められず、また、培地中のベータ酸濃度が高いほど脂肪滴（赤色に染色された部分）が少ないことが確認された。
【００５０】
上記結果から明らかなように、ベータ酸は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を顕著に抑制した。
【００５１】
［実施例２］
試験サンプル中及び培地中のベータ酸濃度以外は実施例１と同様にして、試験サンプルの調製、前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導、オイルレッドＯ染色を行った。
【００５２】
結果を図６〜９に示す。図６は、色素抽出液の吸光度を示すグラフである。図６において、ベータ酸濃度は、培養に用いた培地中のベータ酸濃度を示す。図７〜９は、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真であり、それぞれ、ベータ酸０ｐｐｍ（コントロール）、１ｐｐｍ、５ｐｐｍの存在下で培養した脂肪細胞に対応する。なお、顕微鏡観察では、細胞毒性が認められず、また、培地中のベータ酸濃度が高いほど脂肪滴（赤色に染色された部分）が少ないことが確認された。
【００５３】
上記結果から明らかなように、ベータ酸は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を顕著に抑制した。
【００５４】
［実施例３］
試験サンプル中及び培地中のベータ酸濃度以外は実施例１と同様にして、試験サンプルの調製、前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導、オイルレッドＯ染色を行った。
【００５５】
結果を図１０〜１４に示す。図１０は、色素抽出液の吸光度を示すグラフである。図１０において、ベータ酸濃度は、培養に用いた培地中のベータ酸濃度を示す。図１１〜１４は、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真であり、それぞれ、ベータ酸０ｐｐｍ（コントロール）、２ｐｐｍ、４ｐｐｍ、８ｐｐｍの存在下で培養した脂肪細胞に対応する。なお、顕微鏡観察では、細胞毒性が認められず、また、培地中のベータ酸濃度が高いほど脂肪滴（赤色に染色された部分）が少ないことが確認された。
【００５６】
上記結果から明らかなように、ベータ酸は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を顕著に抑制した。
【００５７】
［実施例４］
テトラヒドロイソアルファ酸（主としてテトラヒドロイソフムロン、テトラヒドロイソコフムロン及びテトラヒドロイソアドフムロン）を含有する試薬（Ｔｅｔｒａ（ＩＣＳ−Ｔ２）、Ｌａｂｏｒ  Ｖｅｒｉｔａｓ、純度：９９．４％）を２０％ＤＭＳＯ溶液で段階希釈して、所定濃度の試験サンプルを得た。なお、テトラヒドロイソアルファ酸を含有しない２０％ＤＭＳＯ溶液をコントロールとした。
【００５８】
得られた試験サンプルについて、実施例１と同様にして、前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導、オイルレッドＯ染色を行った。
【００５９】
結果を図１５〜１７に示す。図１５は、色素抽出液の吸光度を示すグラフである。図１５において、テトラヒドロイソアルファ酸（ＴＨＩＡＡ）濃度は、培養に用いた培地中のテトラヒドロイソアルファ酸濃度を示す。図１６、１７は、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の光学顕微鏡写真であり、それぞれ、テトラヒドロイソアルファ酸０ｐｐｍ（コントロール）、３０ｐｐｍの存在下で培養した脂肪細胞に対応する。なお、顕微鏡観察では、細胞毒性が認められず、また、テトラヒドロイソアルファ酸３０ｐｐｍの場合の方が、コントロールと比較して脂肪滴（赤色に染色された部分）が少ないことが確認された。
【００６０】
上記結果から明らかなように、テトラヒドロイソアルファ酸は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を顕著に抑制した。
【００６１】
［実施例５］
（試験サンプルの調製）
試験サンプル中及び培地中のベータ酸濃度以外は実施例１と同様にして、試験サンプルを調製した。
【００６２】
（前駆脂肪細胞の培養及び分化誘導）
マウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＩＦＯ５０４１６）を２４ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で４日間培養した。
【００６３】
培養開始から４日目に、デキサメタゾン２５０ｎＭ、１−メチル−３−イソブチルキサンチン５００μＭ及びインスリン１０μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に培地交換して分化誘導を行った。３日間の分化誘導の後、試験サンプルを含有する１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に培地交換して、更に１１日間培養した（試験サンプル含有培地への培地交換から４日目、１０日目に、試験サンプルを含有しない１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に培地交換した）。
【００６４】
（ＧＰＤＨ活性の測定）
細胞抽出用緩衝液の調製：
ＴＥＳ  １．１４６ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ  ３７．２ｍｇ及び２−メルカプトエタノール６．９７μＬに蒸留水を添加し、ｐＨを７．５に調整した後、蒸留水で１０００ｍＬにメスアップして細胞抽出用緩衝液を得た。
【００６５】
反応用緩衝液の調製：
トリエタノールアミン２．３２１ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ  １．１６３ｇ及び２−メルカプトエタノール８７２μＬに蒸留水を添加し、ｐＨを７．５に調整した後、蒸留水で１００ｍＬにメスアップして反応用緩衝液を得た。
【００６６】
ＧＰＤＨ活性の測定：
培養終了後、ウェルから培地を除去し、ＰＢＳ  ５００μＬで細胞を２回洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％）１００μＬを添加し、３７℃で３分間インキュベートした。その後、細胞抽出用緩衝液１５０μＬを添加し、氷冷した水中で５分間、超音波処理を行った。超音波処理後、室温下、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収して細胞抽出液を得た。
【００６７】
細胞抽出液１０μＬを、反応用緩衝液７０μＬ、１ｍＭ  ＮＡＤＨ  １０μＬ及び２ｍＭ  ＤＨＡ  １０μＬと共にウェルに入れて酵素反応を開始させ、反応混合液の吸光度（３４０ｎｍ）を３０秒毎に１０分間測定した。測定結果に基づいて、下記式により脂肪細胞のＧＰＤＨ（グリセロール−３−リン酸脱水素酵素）活性を求めた。
ＧＰＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）＝ΔＯ．Ｄ．×０．４８２
［式中、ΔＯ．Ｄ．は、１分間当たりの吸光度の変化量（平均）を表す。］
【００６８】
（結果）
結果を図１８、１９に示す。図１８は、反応混合液の吸光度の経時的変化を示すグラフである。図１９は、脂肪細胞のＧＰＤＨ活性を示すグラフである。図１８、１９において、ベータ酸濃度は、培養に用いた培地中のベータ酸濃度を示す。
【００６９】
上記結果から明らかなように、ベータ酸は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を顕著に抑制した。
【００７０】
［実施例６］
（試験飼料の調製）
液状の１０％ベータ酸含有エキスであるＢｅｔａｓｔａｂ  １０Ａ（登録商標）（ＢＡＲＴＨ−ＨＡＡＳ社）を粉末飼料ＡＩＮ９３Ｇに混合して、ベータ酸を０．５重量％含有するベータ酸含有飼料を調製した。ＡＩＮ９３Ｇ及びベータ酸含有試料の組成は表１（各成分量の単位はｇ／ｋｇ飼料）の通りである。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
（試験飼料の投与）
７週齢の雌性ｄｄｙマウス（日本エスエルシー社）を１週間馴化飼育した後、一般状態が良好であった２４匹を選抜し、体重（平均）が群間でバラつかないように各群８頭の３群（偽手術群、コントロール群、ベータ酸投与群）に分け、コントロール群及びベータ酸投与群のマウスには卵巣摘出手術（切開したマウスの背部から左右の卵巣を摘出し、摘出後、切開した部位を縫合）を、また、偽手術群のマウスには偽手術を施した。なお、卵巣が摘出されると、エストロゲンが欠乏して脂質代謝異常が生じ、脂肪重量及び体重が増加することが知られている。
【００７３】
手術後、偽手術群及びコントロール群のマウスにはＡＩＮ９３Ｇ及び水道水を、また、ベータ酸投与群のマウスにはベータ酸含有飼料及び水道水を６週間自由摂取させた。
【００７４】
馴化期間（１週間）及びその後の試験期間（６週間）を通じて、マウスは、ＳＰＦ環境下、温度２３±２℃、湿度５５±５％、明暗サイクル１２時間（明期：８時３０分〜２０時３０分；暗期：２０時３０分〜８時３０分）の条件で個別に飼育した。馴化期間中は、飼料としてＡＩＮ９３Ｇをそのまま使用した。
【００７５】
（体重、脂肪重量、血清脂質値の測定）
試験期間終了後、各群のマウスについて体重を測定した。また、エーテル麻酔下、解剖及び心採血を行って、後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量、腸間膜脂肪重量、血清総コレステロール値及び血清リン脂質値を測定した（後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量及び腸間膜脂肪重量の測定は、コントロール群及びベータ酸投与群についてのみ行った）。血清総コレステロール値及び血清リン脂質値の測定は、テストワコー（和光純薬工業）を用いて行った。
【００７６】
（結果）
結果（平均±標準誤差）を表２〜５及び図２０〜２２に示す。図２０は、各群のマウスの後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量、腸間膜脂肪重量及び腹腔内総脂肪重量を示すグラフである。図２１は、各群のマウスの血清総コレステロール値を示すグラフである。図２２は、各群のマウスの血清リン脂質値を示すグラフである。なお、腹腔内総脂肪重量は、後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量及び腸間膜脂肪重量の合計に相当する。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
【表３】
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【００７９】
【表４】
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【００８０】
【表５】
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【００８１】
表２から明らかなように、試験期間中の体重増加は、コントロール群において、偽手術群と比較して顕著に大きかった。そして、ベータ酸投与群では、偽手術群及びコントロール群と比較して体重増加が顕著に抑制された。
【００８２】
表３、４及び図２０から明らかなように、後腹壁脂肪重量、生殖器周辺脂肪重量、腸間膜脂肪重量及び腹腔内総脂肪重量はいずれも、ベータ酸投与群において、コントロール群と比較して顕著に小さかった。
【００８３】
表５及び図２１、２２から明らかなように、血清総コレステロール値及び血清リン脂質値はいずれも、卵巣摘出手術を施した２群（コントロール群、ベータ酸投与群）において、偽手術群と比較して顕著に高かった。そして、血清総コレステロール値及び血清リン脂質値のいずれも、ベータ酸投与群ではコントロール群と比較して顕著に低かった。
【００８４】
以上の実施例により、本発明の脂肪細胞分化抑制剤又は脂肪蓄積抑制剤を使用すれば、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化、及び脂肪細胞への脂肪の蓄積を顕著に抑制することが可能となることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の脂肪細胞分化抑制剤及び脂肪蓄積抑制剤は肥満予防等に有用である。
【図１】
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【図６】
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【図１０】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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