(57)【要約】【課題】難溶性物質を被験物質とする細胞毒性試験方法を開発する。【解決手段】本発明は、新規な細胞毒性試験方法を提供する。本発明の細胞毒性試験方法は、可逆的にゲル化可能な生体適合性ゲルがゾル化した液体を用意するステップと、前記液体に細胞を懸濁して該細胞の懸濁液を得るステップと、前記細胞懸濁液をゲル化させて、前記細胞を包埋したゲルを得るステップと、前記細胞を包埋したゲルに被験物質を接触させるステップと、前記細胞を包埋したゲルをゾル化して前記細胞を分離するステップと、前記細胞の生存率を測定するステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
可逆的にゲル化可能な生体適合性ゲルがゾル化した液体を用意するステップと、前記液体に細胞を懸濁して該細胞の懸濁液を得るステップと、前記細胞懸濁液をゲル化させて、前記細胞を包埋したゲルを得るステップと、前記細胞を包埋したゲルに被験物質を接触させるステップと、前記細胞を包埋したゲルをゾル化して前記細胞を分離するステップと、前記細胞の生存率を測定するステップとを含むことを特徴とする、細胞毒性試験方法。
【請求項２】
前記細胞を包埋したゲルをゾル化する前に前記被験物質を除去するステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞毒性試験方法。
【請求項３】
前記可逆的にゲル化可能な生体適合性ゲルは温度応答性ゲルであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞毒性試験方法。
【請求項４】
前記可逆的にゲル化可能な生体適合性ゲルはメビオールゲル（登録商標）であることを特徴とする、請求項３に記載の細胞毒性試験方法。
【請求項５】
メビオールゲル（登録商標）がゾル化した液体を用意するステップと、前記液体にヒト由来の培養細胞を懸濁して該細胞の懸濁液を得るステップと、前記細胞懸濁液をゲル化させて、前記細胞を包埋したゲルを得るステップと、前記細胞を包埋したゲルと、難溶性被験物質を分散させた基材を接触させるステップと、前記細胞を包埋したゲルをゾル化して前記細胞を分離するステップと、前記細胞の生存率を測定するステップとを含むことを特徴とする、細胞毒性試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な細胞毒性試験方法に関し、具体的には、可逆的にゲル化可能な生体適合性ゲルを用いて、液体培地に溶解することが困難な被験物質による前記細胞の生存率を測定する、難溶性被験物質のための細胞毒性試験法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物愛護の見地から、毒性試験の対象を動物個体から細胞に転換することは重要である。現在では、さまざまな細胞タイプの細胞を用いた毒性試験方法が開発されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】日本組織培養学会編、細胞トキシコロジー試験法、朝倉書店（１９９１年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
化粧品や皮膚製剤では、難溶性の有効成分が分散したクリーム又は軟膏として皮膚に塗布して使用される場合がある。かかる難溶性物質は培養液の表面に浮いたり、培養容器の底に沈殿してしまうので、水溶性物質のように単に培養液中に添加して細胞に対する影響を調べることはできない。そこで、難溶性物質を被験物質とする細胞毒性試験方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、可逆的にゲル化可能な生体適合性ゲルがゾル化した液体を用意するステップと、前記液体に細胞を懸濁して該細胞の懸濁液を得るステップと、前記細胞懸濁液をゲル化させて、前記細胞を包埋したゲルを得るステップと、前記細胞を包埋したゲルに被験物質を接触させるステップと、前記細胞を包埋したゲルをゾル化して前記細胞を分離するステップと、前記細胞の生存率を測定するステップとを含む、細胞毒性試験方法を提供する。
【０００６】
本発明の細胞毒性試験方法において、前記細胞を包埋したゲルをゾル化する前に前記被験物質を除去するステップを含む場合がある。
【０００７】
本発明の細胞毒性試験方法において、前記可逆的にゲル化可能な生体適合性ゲルは温度応答性ゲルの場合がある。
【０００８】
本発明の細胞毒性試験方法において、前記温度応答性ゲルはメビオールゲル（登録商標）の場合がある。
【０００９】
本発明は、メビオールゲル（登録商標）がゾル化した液体を用意するステップと、前記液体にヒト由来の培養細胞を懸濁して該細胞の懸濁液を得るステップと、前記細胞懸濁液をゲル化させて、前記細胞を包埋したゲルを得るステップと、前記細胞を包埋したゲルと、難溶性被験物質を分散させた基材を接触させるステップと、前記細胞を包埋したゲルをゾル化して前記細胞を分離するステップと、前記細胞の生存率を測定するステップとを含む、細胞毒性試験方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の細胞毒性試験の細胞培養条件を検討した結果を示すグラフ。
【図２】本発明の細胞毒性試験の被験物質適用条件を検討した結果を示すグラフ。
【図３】被験物質としてＳＤＳを用いた本発明の細胞毒性試験の結果を示すグラフ。
【図４】被験物質としてＨＣＡを用いた本発明の細胞毒性試験の結果を示すグラフ。
【図５】被験物質としてＤＮＣＢを用いた本発明の細胞毒性試験の結果を示すグラフ。
【００１１】
本明細書において「可逆的にゲル化可能」とは、温度その他の物理的条件か、低分子の添加その他の化学的条件かを変化させることによって、ゾル状態からゲル状態に転移させ、さらに、ゲル状態からゾル状態に転移させることができることをいう。
【００１２】
本明細書における「可逆的にゲル化可能な生体適合性ゲル」は、ゲル状態でも、ゾル状態でも、毒性試験の期間中本発明の細胞の生存率その他の生理状態に関する指標に実質的に影響を与えない。前記ゲルは、ゲル化可能なポリマーと、本発明の細胞の生理状態を維持することのできる培養液又は培地を含む。
【００１３】
本明細書において「細胞」とは、古細菌、前核生物及び真核生物のいずれかの種の細胞をいう。本発明の試験方法に用いる細胞は、脊椎動物、特にメダカ、ゼブラフィッシュ等の魚類と、アフリカツメガエル、ネッタイツメガエルその他の両生類と、哺乳動物、特に、マウス、ラットその他の齧歯目と、ブタ、シカ、ウシ、クジラ等の鯨偶蹄目と、イヌ、ネコその他の食肉目と、サル、ヒトその他の霊長目とに属する種の生物に由来することが好ましい。前記細胞は生体から採取された初代培養の細胞の場合と、樹立された細胞株の場合とがある。
【００１４】
本明細書において「前記細胞を分離する」には、遠心分離を含むが、これに限られない分離方法を用いることができる。
【００１５】
本明細書において「細胞の生存率を測定する」とは、標識されたヌクレオチド前駆体の核内への取り込みその他の細胞増殖活性や、トリパンブルーその他の物質の細胞内への侵入の阻止その他の生体膜の能動輸送活性や、ＡＴＰ産生、酸化還元酵素活性その他の代謝活性を検出するいずれかの測定方法を実施することをいう。本発明のＭＴＴ染色法は、水溶性で黄色のＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）が、細胞内に取り込まれると、細胞内のミトコンドリアにある脱水素によって青色の非水溶性の結晶であるホルマザンに変換されることを利用して、５７０ｎｍにおける吸光度によって、ホルマザン産生量から、ミトコンドリアの脱水素酵素活性を測定する方法である。
【００１６】
本明細書において「温度応答性ゲル」とは、該ゲルに包埋された細胞に被験物質を接触させながら培養する温度条件ではゲル状態であって、細胞の生存率その他本発明の試験方法に用いる指標に影響を与えない温度条件でゾル状態に転移することができる生体適合性ゲルをいう。好ましい温度応答性ゲルは、例えば、特開平５−２６２８８２号公報、特開２００５−６０５７０号公報等に説明される。具体的な製品としては、メビオール株式会社から入手可能な、メビオールゲル（Ｍｅｂｉｏｌ  Ｇｅｌ、登録商標）がある。
【００１７】
本明細書において「難溶性被験物質」とは、本発明の細胞の培養液への溶解度が低いため、細胞の生存率に実質的に影響がないか、ＩＣ５０が算出できないか、生存率の再現性が低いかのために毒性を評価することが困難な物質をいう。
【００１８】
本明細書において難溶性被験物質を分散させる「基材」とは、ワセリンその他の軟膏、乳液、クリームその他の両親媒性物質等をいう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
１．細胞培養条件検討
温度応答性ゲルを細胞培養担体としたときの細胞培養条件として、温度応答性ゲル及び細胞の混合物の各ウェルの体積と、各ウェルの播種細胞数とを検討した。
【００２１】
１−１．方法
（使用した材料）
播種する細胞として、ＴＨＰ−１（ロット番号３３７４０５３）が使用された。細胞培養用の培地として、ウシ
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（ＦＣＳ）を１０％含有するＲＰＭＩ１６４０（ＭＰバイオ）が使用された。温度応答性ゲルとしてＭｅｂｉｏｌ  Ｇｅｌ（登録商標、メビオール株式会社、型番：ＰＭＷ２０−１００５）が使用された。培養容器として平底９６穴マルチウェルプレートが使用された。
【００２２】
（温度応答性ゲルの準備）
クリーンベンチ内で温度応答性ゲルＭｅｂｉｏｌ  Ｇｅｌ（凍結乾燥品１０ｍＬ希釈用）入りのフラスコに培地１０ｍＬが添加され、低温（０〜４°Ｃ）下で３時間以上静置後、振とうして温度応答性ゲルＭｅｂｉｏｌ  Ｇｅｌが完全に溶解された。完全に溶解した温度応答性ゲルは、数時間〜数日間低温下で静置保存され、消泡された。
【００２３】
（温度応答性ゲルと細胞との混合）
ＴＨＰ−１細胞の数は計算盤を使用して計測された。各ウェルの体積が５０、８０又は１００μＬ、各ウェルの細胞数が０．２５ｘ１０６個、０．５ｘ１０６個又は１ｘ１０６個となるように、４°Ｃ以下の低温でＭｅｂｉｏｌ  ＧｅｌとＴＨＰ−１細胞とが混合され、温度応答性ゲル及び細胞の混合液が調製された。
【００２４】
（播種及び培養）
上記のとおり調製された温度応答性ゲル及び細胞の混合液は、各ウェルの体積が５０、８０又は１００μＬとなるように９６穴マルチウェルプレートに添加され、ＣＯ２インキュベーターで３７°Ｃ、２分程度培養されることにより温度応答性ゲル及び細胞の混合液がゲル化された。前記混合液はＣＯ２インキュベーターで３７°Ｃ、１〜２分間培養することによりゲル化された。その後、添加した混合液と等量の培地がそれぞれのウェルに添加され、９６穴マルチウェルプレートがＣＯ２インキュベーターで３７°Ｃ、２時間培養された。
【００２５】
（細胞の回収及び生存率測定）
培養開始から２時間経過後、前記９６穴マルチウェルプレートが氷冷され、温度応答性ゲル、細胞等を含む混合液がゾル化された。ゾル化した混合液に培地３００μＬが添加、混合され、上清が除去された後、２００μＬの新鮮な培地が９６穴マルチウェルプレートに添加された。２２時間培養後、ＭＴＴ染色が施された。
【００２６】
（ＭＴＴ染色及び吸光度の測定）
培養後、１．６７ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴのＰＢＳ溶液を２５μＬ添加し、さらに３時間培養した。その後５７０ｎｍ及び６６０ｎｍでの吸光度が測定された。、
【００２７】
１−２．結果
図１は、温度応答性ゲル及び細胞の混合液の各ウェルの体積と、各ウェルの播種細胞数との条件ごとに、細胞培養後のＭＴＴアッセイにより測定された吸光度を示した結果である。図１において、温度応答性ゲル及び細胞の混合物の各ウェルの体積が横軸で、各条件において同一条件ごとに２個のウェルについて行った吸光度の測定値の平均と、ブランクの吸光度の測定値の平均との差が縦軸で、ウェルあたり播種細胞数０．２５ｘ１０６個のウェルの吸光度が白抜きの棒グラフ、０．５ｘ１０６個のウェルの吸光度がハッチングの棒グラフ、１ｘ１０６個のウェルの吸光度が黒塗りの棒グラフである。図１に示すとおり、各ウェルの混合液の体積８０μＬ又は１００μＬ、各ウェルの播種細胞数０．５ｘ１０６個又は１ｘ１０６個という条件で細胞の生存率が高かった。したがって以下の実施例では、各ウェルの温度応答性ゲル及び細胞の混合物の体積を８０μＬ、各ウェルの播種細胞数を０．５ｘ１０６個とする細胞培養条件が用いられた。
【実施例２】
【００２８】
２．被験物質適用条件検討
温度応答性ゲルＭｅｂｉｏｌ  Ｇｅｌを細胞培養担体として細胞毒性試験を行なうときの被験物質適用条件として、細胞への被験物質の添加量が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を被験物質として検討された。
【００２９】
２−１．方法
（被験物質の調製）
細胞、培地及び温度応答性ゲルは実施例１と同様に調製された。ＳＤＳを生理食塩水に溶解させた後、ＲＰＭＩ培地を用いて、濃度１００μｇ／ｍＬのＳＤＳを含む培地が調製された。
【００３０】
（播種及び培養）
温度応答性ゲル及び細胞の混合液は、各ウェルの体積が８０μＬとなるように９６穴マルチウェルプレートに播種された。ウェルは無処理群とＳＤＳ処理群との２群に分けられ、無処理群にはＳＤＳを含まない培地が、ＳＤＳ処理群にはＳＤＳを含む培地が、それぞれ各ウェル２５、３０、５０μＬずつ添加され、３７°Ｃのインキュベーターで２時間培養された。
【００３１】
（細胞の回収及び生存率測定）
培養開始から２時間経過後、前記９６穴マルチウェルプレートは氷冷され、温度応答性ゲル、ＴＨＰ−１細胞等を含む混合液がゾル化された。ゾル化した混合液にＲＰＭＩ培地３００μＬが添加及び混合され、上清が除去された後、ＲＰＭＩ培地が２００μＬ添加され、別の９６穴マルチウェルプレートに移された。２２時間培養後、ＭＴＴ染色が施され、吸光度が測定された。
【００３２】
２−２．結果
図２は、被験物質を含む培地のウェルあたりの体積と、被験物質の種類との条件ごとに、細胞培養後のＭＴＴアッセイにより測定された吸光度を示した結果である。図２において、温度応答性ゲル及び細胞の混合物に添加された、被験物質を含む培地のウェルあたりの体積が横軸で、細胞のＭＴＴ染色の吸光度が縦軸で、ＳＤＳを含まない培地に曝露された細胞の吸光度が白抜きの棒グラフ、ＳＤＳを含む培地に曝露された細胞の吸光度がハッチングの棒グラフである。図２に示すとおり、ＳＤＳを含まない培地が添加された対照条件では、培地の添加量にかかわらず吸光度が約１．０に達し、細胞の生存率が高かった。それに対し、ＳＤＳを含む培地が添加された条件では、吸光度が、添加量２５μＬ又は３０μＬでは約０．７に、添加量５０μＬでは約０．２に、それぞれ低下し、ＳＤＳにより細胞の生存率が下がった。添加量５０μＬの条件は細胞の生存率の低下が著しいため、この条件で細胞毒性試験を行なうのは適切でない。そこで以下の実施例では、各ウェルの添加量２５μＬとする被験物質適用条件が用いられた。
【実施例３】
【００３３】
３．細胞毒性試験
水溶性被験物質としてのＳＤＳと、脂溶性被験物質としてのヒドロキシクエン酸（ＨＣＡ）と、クリームに分散して利用される難溶性被験物質としてのジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）とを用いて、温度応答性ゲルＭｅｂｉｏｌ  Ｇｅｌを細胞培養担体として用いる細胞毒性試験を実施した。
【００３４】
３−１．方法
【００３５】
（被験物質の調製）
ＳＤＳが生理食塩水に溶解された後、２５０μｇ／ｍＬのＳＤＳを含むＲＰＭＩ培地が調製され、ＲＰＭＩ培地を用いて公比１．２で１０段階希釈され、４０．４μｇ／ｍＬから２５０μｇ／ｍＬまで１１種類の濃度のＳＤＳを含むＲＰＭＩ培地が調製された。また、ＨＣＡがＤＭＳＯに溶解された後、１０００μｇ／ｍＬのＨＣＡを含むＲＰＭＩ培地が調製され、ＲＰＭＩ培地を用いて公比２で１０段階希釈され、１．０μｇ／ｍＬから１０００μｇ／ｍＬまで１１種類の濃度のＨＣＡを含むＲＰＭＩ培地が調製された。また、ＤＮＣＢを分散させたクリームがＤＭＳＯに溶解された後、１００μｇ／ｍＬのＤＮＣＢを含むＲＰＭＩ培地が調製され、ＲＰＭＩ培地を用いて公比２で１０段階希釈され、０．１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬまで１１種類の濃度のＤＮＣＢを含むＲＰＭＩ培地が調製された。
【００３６】
（温度応答性ゲル中の細胞への被験物質の曝露）
実施例２と同様の手順で温度応答性ゲル及び細胞の混合液が調製された。この混合液８０μＬに異なる濃度の前記被験物質を含む培地２５μＬが混合され、ＣＯ２インキュベーターで３７°Ｃ、２時間培養された。
【００３７】
（生存率の算出）
同一条件のウェルを３個ずつ用意して測定する実験を２回行った。それぞれの濃度の被験物質を含む培地を添加したウェルのＭＴＴ染色結果の吸光度の測定値３個の平均を出し、被験物質を添加しない培地を温度応答性ゲル及び細胞に添加した対照実験のウェルの吸光度の測定値３個の平均値で除算した結果の百分率を各回の実験の生存率の数値として算出した。つぎに、それぞれの濃度の被験物質の条件ごとの各回の実験の生存率の数値から平均及び標準誤差を算出して、被験物質ごとに折れ線グラフ及び誤差棒として表示した。
【００３８】
３−２．結果
以下の表１ないし３は、それぞれ、被験物質ＳＤＳ、ＨＣＡ及びＤＣＮＢに温度応答性ゲル中でＴＨＰ−１細胞に曝露する細胞毒性試験の結果を示す表である。
【００３９】
【表１】
2010172210.tif 000002
【００４０】
【表２】
2010172210.tif 000003
【００４１】
【表３】
2010172210.tif 000004
【００４２】
図３ないし５のグラフは、それぞれ、被験物質ＳＤＳ、ＨＣＡ及びＤＣＮＢに温度応答性ゲル中でＴＨＰ−１細胞に曝露する細胞毒性試験の結果を示す生存率曲線のグラフである。図３ないし５のグラフの横軸は、各ウェルの８０μＬの温度応答性ゲル及び細胞の混合液に添加された２５μＬの被験物質を含む培地における被験物質の濃度である。縦軸は２回の実験の生存率の平均値である。表３及び図５には、被験物質のＤＣＮＢを分散させるのに用いた媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）であるクリームだけをＤＭＳＯに溶解させた条件での生存率も含まれる。表１ないし３と、図３ないし５とから、いずれの被験物質についても生存率の標準誤差は低く、本発明の細胞毒性試験の再現性が高いことが証明された。
【実施例４】
【００４３】
４．本発明の細胞毒性試験と、通常の細胞毒性試験との比較
本発明の温度応答性ゲルを細胞培養担体として用いた細胞毒性試験の結果と、通常の細胞毒性試験の結果との比較を行なうことにより、本発明の細胞毒性試験の再現性、ｉｎ  ｖｉｖｏのデータの反映性等を検討した。
【００４４】
５−１．方法
従来の細胞毒性試験として、ｈ−ＣＬＡＴ（ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）法を採用した。Ａｓｈｉｋａｇａ，Ｔ．ら（Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，  ２０：７６７−７７３（２００６））に説明される手順にしたがって、ＳＤＳ又はＨＣＡを被験物質としてＴＨＰ−１細胞によるＣＤ８６及びＣＤ５４マーカーの発現を指標とするｈ−ＣＬＡＴを実施し、応答曲線を作成した（図示されない）。前記ｈ−ＣＬＡＴ法によりＳＤＳ又はＨＣＡを被験物質として作成された応答曲線と、本発明の温度応答性ゲルＭｅｂｉｏｌ  Ｇｅｌを細胞培養担体として用いた細胞毒性試験によりＳＤＳ又はＨＣＡを被験物質として作成された生存曲線とから、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。また、ＳＤＳ又はＨＣＡを被験物質として、動物試験により、ｉｎ  ｖｉｖｏの毒性指標として、急性経皮毒性の指標である経皮５０％致死濃度（ｄｅｒｍａｌ  ＬＤ５０）と、局所リンパ節アッセイ（ＬＬＮＡ）において耳に検体を塗布した際に対照群と比較して耳介のリンパ細胞が３倍に増殖する塗布濃度であるＥＣ３とを評価した。経皮５０％致死濃度及びＥＣ３のプロトコールは、それぞれＯＥＣＤガイドライン４０２及び４２９に記載のとおりである。ＳＤＳ及びＨＣＡの経皮５０％致死濃度は、それぞれＯＥＣＤスクリーニング情報データセット（ＳＩＤＳ）と、Ｍｏｒｅｎｏ，Ｏ．Ｍ．、１９７１年３月２４日付け香粧品香料原料安全性研究所報告（Ｒｅｐｏｒｔ  ｔｏ  ＲＩＦＭ）とに記載される。
【００４５】
５−２．結果
表４は、ＳＤＳ及びＨＣＡを被験物質とするさまざまな試験の結果得られたＩＣ５０又はＥＣ３の値をまとめた表である。表で「ｇｅｌ」と表されるのが本発明の温度応答性ゲルに細胞を包埋する方法の結果である。
【００４６】
【表４】
2010172210.tif 000005
【００４７】
表４からは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験のうち本発明の温度応答性ゲルを用いる試験法では、ｉｎ  ｖｉｖｏの毒性試験の結果と同様に、ＳＤＳの毒性はＨＣＡの毒性と同じか数倍高いという結果が得られた。これに対し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験のうち、ｈ−ＣＬＡＴ法では、逆に、ＨＣＡの毒性のほうがＳＤＳの毒性より数倍高い結果となった。したがって、本発明の温度応答性ゲルを用いる試験法のほうが、ｈ−ＣＬＡＴ法よりも生体反映度が高い可能性が示唆される。
【００４８】
また、本発明の温度応答性ゲルを用いる試験法と、ｈ−ＣＬＡＴ法とでＳＤＳ及びＨＣＡのＩＣ５０の平均及び標準誤差を独立した２回の実験を行ってその算出したところ、ＳＤＳについては本発明の試験法では１２４μｇ／ｍＬ±３．７２μｇ／ｍＬであるのに対し、ｈ−ＣＬＡＴ法では８０μｇ／ｍＬ±１０．５μｇ／ｍＬであった。また、ＨＣＡについては本発明の試験法では７４１μｇ／ｍＬ±４．２５μｇ／ｍＬであるのに対し、ｈ−ＣＬＡＴ法では３１μｇ／ｍＬ±１１．５μｇ／ｍＬであった。これらの結果から、本発明の温度応答性ゲルを用いる試験法のほうが、ｈ−ＣＬＡＴ法よりも再現性に優れていることが確認された。
【図１】
2010172210.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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