(57)【要約】【課題】  ヒトＣａＴ１遺伝子の発現ベクターへの挿入や形質転換等遺伝的応用を可能にし、更に、ヒトＣａＴ１のカルシウム吸収活性の調節に影響する因子の存在等、カルシウム吸収活性のメカニズムを解明し、カルシウム吸収を調節する因子の確認及び新たな発見に役立つ手段の提供を目的とする。【解決手段】  ヒトＣａＴ１遺伝子、そのプラスミドベクター、該プラスミドベクターで形質転換された形質転換体、カルシウム吸収を調節する因子のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット、並びにカルシウム吸収を促進する因子を提供する。特に、チーズホエーをタンパク質分解酵素で消化して得られる、３つのアミノ酸からなるペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａを含むタンパク質分解酵素分解物を有効成分として含有してなることを特徴とする、カルシウム吸収を促進する医薬を提供する。【選択図】  図１６
2010043128.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チーズホエーをタンパク質分解酵素で消化して得られる、３つのアミノ酸からなるペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａを含むタンパク質分解酵素分解物を有効成分として含有してなることを特徴とする、カルシウム吸収を促進する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム吸収を促進する因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内において食品から摂取されたカルシウムは、腸管により吸収されるが、主に小腸により吸収される。
カルシウム吸収は、カルシウムの供給状況に応じて次の２種類の形式のいずれかにより行われる。即ち、カルシウムの供給が充分なときは小腸上皮の細胞間経路を通る単純拡散輸送が行われ、一方供給が足りないときは細胞内を通過する能動輸送が積極的に行われる。
このうち、細胞内を通過する能動輸送には、第１図に示すように、小腸刷子縁膜上に存在するカルシウムチャネル（ＥＣａＣ）とカルシウムトランスポーター（ＣａＴ）が関わっている。遺伝子学的解析及び電気生理学的解析により、両者は同じチャネルファミリーに属するとされ、カルシウムチャネルは、カルシウムチャネル１（ＥＣａＣ１）とカルシウムチャネル２（ＥＣａＣ２）とに分類され、また、カルシウムトランスポーターは、カルシウムトランスポーター１（ＣａＴ１）とカルシウムトランスポーター２（ＣａＴ２）とに分類されているが、最近ではＣａＴ１とＥＣａＣ２とは同一とされている。
ウサギのＥＣａＣは、胃に近い小腸上部の十二指腸で主に発現しており、弱酸性条件下でカルシウム吸収を行うことが明らかにされている（The Journal of Biological Chemistry 1999, Vol. 274, No.13, p8375-8378参照）。また、ヒトのＥＣａＣ１は、腎臓、小腸及び膵臓で主に発現しており、遺伝子も特定されている（Genomics 2000, 67, 48-53参照）
ラットのＣａＴ１は、十二指腸、空腸、盲腸等で発現しているが、そのカルシウム吸収活性は酸性条件下で低下することから、主に小腸上部の中性環境下におけるカルシウム吸収に関与している可能性が高いことが報告されている（The Journal of Biological Chemistry 1999, Vol. 274, No.32, p22739-22746参照）。ヒトのＣａＴ１についても遺伝子が特定され、腸管の上皮細胞に見られること、中性付近でカルシウム吸収活性が上昇すること、また、種々の金属イオンにより活性に影響することが知られている（Biochmical and Biophysical Research Communications 2000, Vol. 278, p326-332参照）。しかしながら、ヒトＣａＴ１遺伝子の発現ベクターへの挿入や形質転換等遺伝的応用についての報告はなく、また、ヒトＣａＴ１のカルシウム吸収活性の調節に影響する因子の存在等、カルシウム吸収活性のメカニズムについても未解明であった。
ところで、成人が生体内のカルシウムホメオタシスを保つ為には、一日当たり５００ｍｇのカルシウムが必要とされている。そのためには腸管から３００ｍｇ吸収する必要があり、それを食物から摂取するには、吸収されない分を含めて７００ｍｇのカルシウムが必要である。そこで、食品メーカーは食品、特に乳や乳飲料、乳製品等でカルシウム強化したものを開発し販売している。その場合、添加するカルシウムの形態としては、リン酸カルシウムや炭酸カルシウム、乳酸カルシウム等であるが、これらカルシウム塩は小腸上部の酸性環境下では可溶化され吸収されるが、小腸下部の中性〜塩基性環境下において多くは不溶化し、吸収されずに排出されてしまう。
しかし、不溶化を防がれたカルシウムは小腸下部のＣａＴ１等により積極的に吸収される。
一方、高齢者では、胃酸の分泌が弱まり、腸内の酸性環境が中性側にシフトしカルシウムの吸収性が低下する。
このことからも、ヒトＣａＴ１のカルシウム吸収活性の調節に影響する因子の存在、特に食品由来物の存在を検討することは重要であると考えられる。
腸管からのカルシウム吸収の促進因子としては、ラクトース等の糖類、ＣＰＰ（カゼインホスホペプチド）、グアーガム加水分解物等があげられる。
ラクトースによるカルシウム吸収促進機構については、刷子縁膜との相互作用とされる（Armbrecht et al., 1976）が詳細は明らかでない。また、ラクトースは他の糖類と比較するとその消化吸収が遅いため腸管下部に到達することで、カルシウムの腸管下部での吸収に影響を及ぼしているとする説もある（Allen，1982）。ＣＰＰについては「カルシウムが小腸下部の中性環境下で不溶化（リン酸カルシウム等を形成）する前にカルシウムをトラップし、その不溶化を防ぐことで細胞間経路による吸収を高める」とされているが（内藤ら，1986）、いずれにせよ、腸管におけるカルシウムチャネルはクローニングされたばかりで、カルシウム吸収を調節する因子は、上記ヒトＣａＴ１のカルシウム吸収活性を何らかの形で制御する可能性があるが、これを裏付ける報告は未だ発表されていない。
【０００３】
このような、カルシウム吸収を調節する因子とヒトＣａＴ１のカルシウム吸収活性との関係を解明できれば、上記因子の有用性を高めることができると共に、カルシウム吸収を調節する新たな因子を発見し、医薬、栄養補助剤、食品などの成分としての利用の道を開くことができることになる。
本発明の目的は、ヒトＣａＴ１遺伝子の発現ベクターへの挿入や形質転換等遺伝的応用を可能にし、更に、ヒトＣａＴ１のカルシウム吸収活性の調節に影響する因子の存在等、カルシウム吸収活性のメカニズムを解明し、カルシウム吸収を調節する因子の確認及び新たな発見に役立つ手段、並びに該手段により得られるカルシウム吸収を調節する因子を提供することにある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、ヒトの消化管細胞から抽出したＲＮＡについてReverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction及び５´ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行い、ヒトＣａＴ１遺伝子のほぼ全長の塩基配列を得ることができた。このヒトＣａＴ１遺伝子をｐＭＥＨｉｓベクターに導入し、プラスミドベクターｐＭＥＨｉｓ−ＣａＴ１を作製し、これをリポフェクション法によりＣＨＯ細胞に形質転換してヒトＣａＴ１定常発現細胞を作製した。このヒトＣａＴ１定常発現細胞に対し、実際にカルシウム吸収に影響する種々の食品因子を作用させた結果、種々の食品因子はヒトＣａＴ１定常発現細胞に影響していること、即ち、ヒトＣａＴ１のカルシウム吸収活性を調節していることを見出し、本発明に到達した。
【０００５】
請求項１に係る本発明は、チーズホエーをタンパク質分解酵素で消化して得られる、３つのアミノ酸からなるペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａを含むタンパク質分解酵素分解物を有効成分として含有してなることを特徴とする、カルシウム吸収を促進する医薬である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】第１図は、カルシウムの腸管吸収（細胞内を通過する能動輸送）の模式図である。
【図２】第２図は、ヒトＣａＴ１遺伝子のクローニングの概略を示す図である。
【図３】第３図は、ヒトＣａＴ１遺伝子のＤＮＡ配列及びヒトＥＣａＣとの相同性を示す図である。
【図４】第４図は、ヒトＣａＴ１の膜貫通領域を示すデータである。
【図５】第５図は、ヒトＣａＴ１のアミノ酸配列、並びに、ヒトＣａＴ１及びラットＣａＴ１との相同性を示す図である。
【図６】第６図は、本発明のプラスミドベクターの一例を示す図である。
【図７】第７図は、本発明の形質転換体の培養条件及び細胞内へのカルシウム取り込み増加を確認する手段の一例を示す図である。
【図８】第８図は、本発明のスクリーニング方法における、形質転換体に取り込まれたカルシウム量を確認する手段の一例を示す図である。
【図９】第９図は、各消化管組織部位におけるＣａＴ１ｍＲＮＡの発現レベルを示す図である。
【図１０】第１０図は、ウェスタンブロットの結果を示す。第１０図において、右側はｐＭＥＨｉｓ−ＣａＴ１をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の結果を、左側はｐＭＥＨｉｓベクターをトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の結果を示す。
【図１１】第１１図は、細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量の経時的変化を示すグラフである。第１１図において、●はｐＭＥＨｉｓ−ＣａＴ１をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の結果を、○はｐＭＥＨｉｓベクターをトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の結果を示す。
【図１２】第１２図は、細胞内に取り込まれたカルシウム量のうち、ヒトＣａＴ１遺伝子が細胞内取り込みに関与したカルシウム量の経時的変化を示すグラフである。
【図１３】第１３図は、45Ｃａ2+取り込みに対するｐＨの影響を示すグラフである。
【図１４】第１４図は、45Ｃａ2+取り込みに対する金属イオンの影響を示すグラフである。
【図１５】第１５図は、食品由来因子による45Ｃａ2+取り込みに対する影響を示すグラフである。
【図１６】第１６図は、ＣＷＰ−Ｄによる45Ｃａ2+取り込みに対する影響を示すグラフである。
【図１７】第１７図は、45Ｃａ2+取り込みに対するＣＷＰ−Ｄによる前処理時間の影響を示すグラフである。
【図１８】第１８図は、45Ｃａ2+取り込みに対するＣＷＰ−Ｄの濃度の影響を示すグラフである。
【図１９】第１９図は、Caco-2細胞の45Ｃａ2+取り込みに対するＣＷＰ−Ｄの影響を示すグラフである。
【図２０】第２０図は、ＣＷＰ−Ｄ存在下或いは不存在下におけるカルシウム飽和曲線を示すグラフである。
【図２１】第２１図は、Lineweaver-Barkのプロットである。
【図２２】第２２図は、45Ｃａ2+取り込みに対するＣＷＰ−Ｄ（ＯＤＳ吸着画分）の影響を示すグラフである。
【図２３】第２３図は、ＦＰＬＣの結果及び45Ｃａ2+取り込みに対するＣＷＰ−Ｄ（ＦＰＬＣ画分）の影響を示すグラフである。
【図２４】第２４図は、ＨＰＬＣの結果を示すグラフである。
【図２５】第２５図は、45Ｃａ2+取り込みに対するＣＷＰ−Ｄ成分（peak．1、2及び3）の影響を示すグラフである。
【図２６】第２６図は、peak．1の純度を示すグラフである。
【図２７】第２７図は、45Ｃａ2+取り込みに対する合成ペプチドＩＰＡの影響を示すグラフである。
【図２８】第２８図は、45Ｃａ2+取り込みに対する合成ペプチドＩＰＡ、ＩＰＡアナログ及びアミノ酸類の影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明のヒトカルシウムトランスポーター１遺伝子は、配列表の配列番号１記載の塩基配列を含有するヒトカルシウムトランスポーター１遺伝子である。
本発明のヒトＣａＴ１遺伝子は、ヒトの消化管各組織及び細胞のtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅してその大部分を得ることができる。ただし、ＲＴ−ＰＣＲだけでは開始コドンを含む５´末端部分について解明できない場合があり、この部分についてはさらに５´ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA end）  ＰＣＲを行うことにより得ることができる。
一連の操作は、例えば、第２図に示す概略に従って行うことができる。
ヒトの消化管各組織及び細胞としては、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸、上行結腸、下行結腸、横行結腸、盲腸、直腸及び肝臓等の各組織及び細胞を利用することができ、特に限定されない。例えば、ヒト小腸上皮細胞の一つCaco-2細胞は、American Type Culture Collection等より入手することができる。ヒトの消化管各組織及び細胞からのＲＮＡの調製は、例えばCaco-2細胞の場合、後述する実施例の方法により行うことができる。
ＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写酵素によりＲＮＡからＤＮＡを得た後、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅する方法である。First strand cDNA synthesis kit（Pharmacia Biotech社製）等のキットを使用して該キットの条件に従って行うと、簡便に進めることができるので好ましい。
逆転写反応により得られたｃＤＮＡについてのＰＣＲに用いるプライマーのデザインは、例えば、ラットＣａＴ１のシークエンスの情報と、ＥＳＴのデータ（BLAST等）からラットＣａＴ１とホモロジーの高いヒト遺伝子の情報を基にして行うことができる。
ＰＣＲの反応液、サイクルについては、通常採用される条件で行うことができる。尚、アニーリング温度は設計したプライマーにより定め、伸長時間は目的のフラグメントサイズにより定めることが好ましい。
５´ＲＡＣＥ  ＰＣＲは、ヒト小腸Marathon-ReadyTM cDNA（Clonetech社製）等のキットを使用して、使用したキットのマニュアルに沿って行うと、簡便に進めることができるので好ましい。
プライマーのデザインは、例えば、先のＲＴ−ＰＣＲで得られたヒトＣａＴ１遺伝子のｃＤＮＡのＣ末端側の情報及びラットＣａＴ１遺伝子のｃＤＮＡの開始コドン付近の情報（The Journal of Biological Chemistry 1999, Vol. 274, No.13, p8375-8378参照）から設計したものと、ヒト小腸Marathon-ReadyTM cDNA（clonetech社製）に付属していたアダプタープライマーとを用いることができる。
本発明のヒトＣａＴ１遺伝子は、配列表の配列番号１記載の塩基配列を含有する。本発明のヒトＣａＴ１遺伝子は、塩基レベルでは、ラットＣａＴ１遺伝子と約８５％の相同性を有しており、また、第３図に示すように、最近報告されたヒトＥＣａＣ遺伝子（第３図の下段参照。Genomics 2000, 67, 48-53参照）とは約８５％の相同性を有するが、Ｃ末端約３００ｂｐの領域における相同性は約５０％と低い。
また、本発明のヒトＣａＴ１遺伝子は、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含有するものである。
アミノ酸レベルでの高次構造は、第４図に示すように６回膜貫通型であること、５及び６番目の膜貫通部位の間にポア領域が存在するものと推定される。尚、高次構造の推定は、http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/cgi-bin/sosui.cgi?/sosui_submit.htmlサイト等を利用して行うことができる。
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列は、第５図に示すように、ヘディガーら（Biochmical and Biophysical Research Communications 2000, Vol. 278, p326-332参照）の報告するヒトＣａＴ１遺伝子のアミノ酸配列（第５図の中段参照）と比較してわずかに３アミノ酸が異なるものである。また、Ｎ末端側の細胞内領域での２箇所については、ラットＣａＴ１遺伝子のｃＤＮＡ（第５図の下段参照。The Journal of Biological Chemistry 1999, Vol. 274, No.13, p8375-8378参照。）と共通である。
本発明のヒトＣａＴ１遺伝子としては、配列番号１記載の塩基配列を含有するものであれば、上述の方法で得られるものに限定されず、本発明のヒトＣａＴ１遺伝子をコードする塩基配列の一部分を有する合成プライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のヒトカルシウムトランスポーター１遺伝子の一部あるいは全領域を用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによっても得ることができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。
【０００８】
本発明のヒトＣａＴ１遺伝子は、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして、適当な発現ベクターに連結することができる。
本発明のプラスミドベクターは、例えば、本発明のヒトＣａＴ１遺伝子からＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌、枯草菌、酵母由来の発現ベクターなどが用いられ、具体的には例えばｐＭＥＨｉｓベクターを用いることができる。
ｐＭＥＨｉｓベクターを用いる場合には、ヒトＣａＴ１遺伝子にＸｈｏ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉサイトを導入すべくプライマーを設計し、ＲＴ‐ＰＣＲを行った後に、ｐＭＥＨｉｓベクターのマルチクローニングサイト内のＸｈｏ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉサイトに挿入すると、第６図のようなプラスミドベクターｐＭＥＨｉｓ−ＣａＴ１を得ることができる。
このようにして構築された本発明のプラスミドベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
本発明において、形質転換（トランスフェクション）の対象となる宿主としては、例えば、エシェリヒア属細菌、バチルス属細菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いることができるが、中でもＣＨＯ（Chinese hamster ovary）細胞が好ましい。ＣＨＯ細胞を形質転換（トランスフェクション）するには、例えば、リポフェクション法にて行うことができる。リポフェクション法によるトランスフェクションは、LIPOFECTAMIN Reagent kit （GIBCO BRL社製）等のキットを使用して行うと簡便なので好ましい。
本発明の形質転換体は、前記プラスミドベクターで形質転換された形質転換体であり、言い換えれば、ヒトカルシウムトランスポーター１遺伝子を含有するプラスミドベクターで形質転換された形質転換体である。
本発明の形質転換体にヒトＣａＴ１遺伝子が含まれ、これが発現していること（即ち、細胞内で遺伝子が発現した結果、ヒトカルシウムトランスポーター１が含まれていること）を確認するには、例えば、ウサギで作製した抗ｈＣａＴ１抗体を用いて、ウェスタンブロットにて確認することができる。具体的にＣＨＯ細胞を宿主とする場合を例にとって説明すると、トランスフェクションしたＣＨＯ細胞をブラストサイジンにてコロニーを選択し、適当な非イオン性界面活性剤（例えば、１％ＮＰ−４０（Nonidet P-40 界面活性剤、ナカライ社）、にて可溶化し、精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により細胞を除去して培養上清を集め、細胞内に含まれるタンパク質を抽出する。一方、適当な発現ベクターにヒトＣａＴ１遺伝子の一部の塩基配列を挿入したコンストラクトを作製し、これを大腸菌に形質転換して得られた融合タンパクを抗原として、ウサギで作製した抗ヒトＣａＴ１抗体を用いて、ウェスタンブロットする。その結果特異的なバンドが見られた場合には、ヒトＣａＴ１遺伝子が含まれ、これが発現していることが明らかである。
尚、細胞の可溶化に用いる非イオン性界面活性剤としては、上述のＮＰ−４０を用いることが好ましいが、一般的なtriton X100等の界面活性剤を用いることもできる。
【０００９】
本発明の形質転換体を、適当な培養条件で培養することにより、いわゆるヒトＣａＴ１定常発現細胞として、ヒトカルシウムトランスポーター１遺伝子を発現し、細胞内へのカルシウム取り込みが増加する。
形質転換体の培養の一例を示すと、例えば第７図のように、宿主がＣＨＯ細胞の場合、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）Ｍｅｄｉｕｍ、Base Catalog No. 11320、GIBCOTMInvitrogen Corporation製）培地などの培地で、３５〜４０℃、好ましくはＣＯ２環境下に培養した形質転換体について、培地を除き、ＰＢＳ（Phosphate-Bufffered Saline）バッファー（Amer. J. of Cancer（1936）27: 55）、ＨＢＳＳ（Hanks' Balanced Salt Solutions）バッファー（Hanks, J. H. and Wallace, R. E., Proc. Soc. Exp. Biol. Med.（1949）71, 196. Modification-National Institutes of Health）等のバッファーにて洗浄した後、放射性同位元素で標識したカルシウム（例えば45Ｃａ2+）を含むバッファーを添加して一定時間後に取り除き、界面活性剤にて細胞を可溶化する。形質転換体を回収して、細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量を液体シンチレーションカウンター等にて測定することにより、細胞内へのカルシウム取り込みの増加を確認することができる。
【００１０】
このような本発明の形質転換体に対し、ｐＨを変化させたり、種々の金属イオンを作用させて、形質転換体に取り込まれたカルシウム量を確認することにより、ｐＨや金属イオンのカルシウム吸収に対する影響を調べることができる。
また、本発明の形質転換体に対し、微生物、動植物、食品由来のペプチド、タンパク質、糖などの検体を作用させて、形質転換体に取り込まれたカルシウム量を確認することにより、カルシウム吸収を調節する因子をスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法は、具体的に例えば、検体のカルシウム吸収調節活性を放射性同位元素で標識したカルシウム（例えば45Ｃａ2+）の取り込みにより測定し、これをカルシウム吸収調節活性の指標として比較することにより、形質転換体に取り込まれたカルシウム量を確認するものである。
カルシウム吸収を調節する因子とは、ヒトの消化管各組織、細胞におけるカルシウム吸収を促進または阻害する化合物またはその塩である。
検体としては、例えば、微生物、動植物、食品由来のペプチド、タンパク質、糖などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。特に、食品由来のペプチド、タンパク質、糖等を検体とすることにより、医薬、栄養補助剤、食品などの成分としての有用性を高めることができるので好ましい。
本発明のスクリーニング方法は、前記の形質転換体に取り込まれたカルシウム量を確認するものであるが、まず、前記の形質転換体を必要に応じて適当なバッファーで洗浄した後、界面活性剤で可溶化もしくは懸濁して用いることが好ましい。バッファーとしては、望ましくはｐＨ約７〜８のリン酸バッファー、ＨＢＳＳバッファー等の、本発明のヒトＣａＴ１のカルシウム吸収活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、界面活性剤としては、前記のものが用いられる。
前記の形質転換体に取り込まれたカルシウム量の確認は、例えば第８図に示すようにして行うことができる。即ち、上述の如くスクリーニングに適した状態とした形質転換体に、上述の検体を含む培地を加え４時間前処理を行う。その後培地を取り除き、形質転換体をＰＢＳ、ＨＢＳＳバッファー等にて洗浄し、45Ｃａ2+を含むバッファーを添加して一定時間後に取り除く。界面活性剤にて細胞を可溶化後、形質転換体を回収し、細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量を液体シンチレーションカウンター等にて測定する。また、対照として、検体を添加しないほかは同様にして測定する。カルシウム吸収を調節する因子のスクリーニングの基準としては、例えば、検体及び対照の両結果についてＡＮＯＶＡ等の統計処理を行い、有意水準が０．０５未満（ｎ＝３）の場合にはカルシウム吸収を促進する因子として、それ以外の場合にはカルシウム吸収を阻害する因子としてスクリーニングすることができる。
また、本発明は、このような前記スクリーニング方法を簡便に行うためのキットを提供する。
【００１１】
このような本発明のスクリーニング方法やスクリーニング用キットによれば、カルシウム吸収を調節する因子、特にカルシウム吸収を促進する因子を容易に得ることができ、このようなカルシウム吸収調節因子を提供するのが、請求項１に係る本発明である。
本発明のカルシウム吸収を促進する因子としては、例えば、３つのアミノ酸からなるペプチドIle-Pro-Ala（ＩＰＡ）を挙げることができる。このようなペプチドＩＰＡは、チーズホエーをプロテアーゼＡ等のタンパク質分解酵素で消化して得られるチーズホエー酵素分解物（ＣＷＰ−Ｄ）をＯＤＳカラム、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ等の各種精製手段を行いながら、各精製段階において本発明のスクリーニング方法を実施するか、或いは前記スクリーニング用キットを用いてカルシウム吸収を阻害する因子を適宜スクリーニングして得ることができる。また、ペプチド自動合成機などにより、上記Ile-Pro-Alaの配列からなるペプチドを合成することによっても得ることができる。
また、本発明のカルシウム吸収を促進する因子は、食品や動植物中の成分等に由来する天然物質であっても良いし、合成物質であっても良い。分子量や立体構造についても特に限定はなく、例えば、ＣＷＰ−Ｄやその精製物もその具体例に含まれる。
このような本発明のカルシウム吸収を促進する因子は、医薬、栄養補助剤、食品などの成分としての有用性を高めることができると共に、カルシウム吸収を調節する新たな因子として、医薬、栄養補助剤、食品などの成分としての利用の道を開くことができるものとして有用である。
【００１２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例１
（１）ヒトＣａＴ１遺伝子のクローニング
まず、ヒトＣａＴ１遺伝子のクローニングを行った。即ち、第２図に示す概略に従い、まずＲＴ−ＰＣＲ（第２図の１参照）によりヒトＣａＴ１遺伝子のＤＮＡの大部分をクローニングした後、５´末端部分について５´ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った（第２図の２参照）。
１．ＲＴ−ＰＣＲ（第２図の１参照）
ヒト小腸上皮細胞の一つCaco-2細胞（American Type Culture Collectionより入手）からＲＮＡを調製し、これを基に逆転写反応を行ってfirst strand cDNAを合成した。
Caco-2細胞からのＲＮＡの調製は、以下のようにして行った。
Caco-2細胞を、１０％ＦＣＳ、４ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、５０ＩＵ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（GIBCOTMInvitrogen Corporation製、Base Catalog No.11965：ＣａＣｌ２（anhyd.）  ２００．００ｍｇ／ｌ、ＫＣｌ  ４００．００ｍｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ６４００．００ｍｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３  ３７００．００ｍｇ／ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  １２５．００ｍｇ／ｌ、Ｄ−グルコース  ４５００．００ｍｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン  ５８４．００ｍｇ／ｌ、Ｌ−イソロイシン  １０５．００ｍｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン  １０５．００ｍｇ／ｌ、Ｌ−リシン・ＨＣｌ  １４６．００ｍｇ／ｌ）を用い、３７℃、５％ＣＯ２、湿潤条件下において培養を行い、１００ｍｍ径ディッシュにて３〜４日後にコンフルエント細胞を得た。
培地を取り除き、１００ｍｍ径ディッシュあたり１ｍｌのISOGENを添加し、ラバーポリスマンにて細胞を掻き取りながら溶解させ、１ｍｌ容チューブに回収した。２５Ｇ針を用いた１ｍｌ容シリンジにて数回ホモジネート後、クロロホルム２００μｌ添加、vortexし、１５，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃にて遠心した。上清を別のチューブに移し、イソプロパノール５００μｌを添加、よく混釈した。室温で５〜１０分放置し、１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃にて遠心した。上清を取り除き、沈澱を７５％エタノールで洗浄後風乾させ、適量のRNase free水で溶解した。サンプルは−８０℃にて保存した。
逆転写反応は、First strand cDNA synthesis kit(Pharmacia Biotech社製)を使用して行った。すなわち、Caco-2細胞から調製したtotal RNAを１〜５μｇ、１ｍｌ容チューブに取った。真空遠心機にて乾燥させた後、８μｌのRNase-free水にて溶解し、６５℃で１０分間加温処理後、直ちに氷冷した。それに、１μｌのPd(N)6プライマー、１μｌのDTT solution、5μlのBulk First-Strand cDNA Reaction Mixを各々添加し、１５μｌにメスアップした後、３７℃で１時間インキュベーションした。次に６５℃で１５分間加温し、その後直ちに氷冷した。サンプルは−２０℃にて保存した。
このｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲを行った。センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、ラットＣａＴ１のシークエンスの情報と、ＥＳＴのデータベース（http：//www．Evolution．bio．titech．ac．jp/keyword/est.html）からラットＣａＴ１とホモロジーの高いヒト遺伝子の情報（AA078617 human brain及びAA579526 human prostate）を基にデザインしたものを用いて行った。尚、ホモロジー解析は、データベースサイト（BLAST）http：//www．Genome．ad．jp/japanese/（http：//www．Hulinks．co．jp/software/turboblast/を参照）で行った。
ＰＣＲは、Accu Taq-LA polymelase PCRbuffer（10x）、Accu Taq-Labuffer（10x）、Deoxynucleotide mix、Dimethyl Sulfoxide（全てSIGMA社製）を用いて、９４℃−２〜３分の後、９４℃−３０秒、Tm℃−30秒、７２℃−XX（分、秒）を何れの場合も３０サイクル行った。尚、アニーリング温度（Tm）は設計したプライマーにより定め、伸長時間（XX（分、秒））は目的のフラグメントサイズにより定めた。
２．未知の開始コドンを含む５´末端領域のクローニング（第２図の２参照）
クローンテック社（Clonetech lab.）製のヒト小腸ｃＤＮＡライブラリー（human small intestinal cDNA library）について、５´ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行い未知の開始コドンを含む５´末端領域のクローニングを行った。
５´ＲＡＣＥ  ＰＣＲは、ヒト小腸Marathon-ReadyTM cDNA（Clonetech社製）を用いて行った。プライマーは、先のＲＴ−ＰＣＲで得られたヒトＣａＴ１遺伝子のｃＤＮＡのＣ末端側の情報及びラットＣａＴ１遺伝子のｃＤＮＡの開始コドン付近の情報（The Journal of Biological Chemistry 1999, Vol. 274, No.13, p8375-8378参照）から設計したものと、ヒト小腸Marathon-ReadyTM cDNA（clonetech社製）に付属していたアダプタープライマーとを用いて行った。
その結果、開始コドンを含む４塩基分を除いた、ヒトＣａＴ１遺伝子のほぼ全長のクローニングに成功した。ヒトＣａＴ１遺伝子のほぼ全長の塩基配列は、配列表の配列番号１に示す通りである。塩基レベルでは、ラットＣａＴ１遺伝子と約８５％の相同性を有していた。また、第３図「ヒトＣａＴ１のＤＮＡ配列およびヒトＥＣａＣとの相同性」に示すように、最近報告されたヒトＥＣａＣ遺伝子（第３図の下段参照。Genomics 2000, 67, 48-53参照）とは約８５％の相同性を有することが確認されたが、Ｃ末端約３００ｂｐの領域における相同性は、約５０％と低いものであった。
また、ヒトＣａＴ１遺伝子の（ほぼ）全長のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示すとおりである。
http：//sosuiproteome．bio．tuat．ac．jp/cgi-bin/sosui．cgi？/sosui  submit．htmlサイトを参照して、ヒトＣａＴ１遺伝子のアミノ酸配列から、アミノ酸レベルでの高次構造の推定を行ったところ、第４図に示すように６回膜貫通型であること、５及び６番目の膜貫通部位の間にポア領域の存在が示唆された。ヒトＣａＴ１遺伝子のアミノ酸配列をヘディガーら（Biochmical and Biophysical Research Communications 2000, Vol. 278, p326-332参照。）の報告するヒトＣａＴ１遺伝子のアミノ酸配列（第５図の中段参照。）と比較すると、第５図に示すように、わずかに３アミノ酸が異なり、Ｎ末端側の細胞内領域での２箇所については、ラットＣａＴ１遺伝子のｃＤＮＡ（第５図の下段参照。The Journal of Biological Chemistry 1999, Vol. 274, No.13, p8375-8378参照。）と同じであった。
【００１３】
（２）ヒトＣａＴ１遺伝子の発現量の確認
次に、ヒト消化管各組織部位（食道、胃、十二指腸、回腸、空腸、上行結腸、下行結腸、横行結腸、盲腸、直腸及び肝臓）におけるヒトＣａＴ１遺伝子の発現量を、以下の手順でノーザンブロッティングを行って確認した。
１．プレハイブリダイゼーション
メンブレンとして、各消化器官のＲＮＡが予めトランスファー、固定されているhuman digestive system MTN Blot(Clontech)のメンブレンを使用した。
乾熱処理したメンブレンを2x SSCに浸し、ハイブリパック内に入れ、プレハイブリダイゼーション液（１０μｌのsalmon testes DNAを９５℃、１０分間処理した後氷中で急冷し、０．５ｍｌのhybridyzation solutionを加えて混ぜたもの。）を加えて、気泡がメンブレン上に生じないように、シーラーでシールした。それを、４２℃のwater bath内にて３時間以上放置した。
尚、hybridyzation solutionの組成は以下の通りである。
〔hybridyzation solutionの組成〕
（final）                  （stock solution）
・5ｘDenhardt's                        50ｘ
・5ｘ SSPE（下記20ｘSSPEを４倍希釈）  20ｘ
・50% ホルムアミド
・0.1％ SDS                           10％
20ｘSSPE
・NaCl                 175.3g
・NaH2PO4・2H2O          7.6g
・EDTA・2Na              7.4g
・milliQ水              up to 1L
（NaOHでｐＨ７．４に合わせ、オートクレーブした）
２．プローブの作製および精製
megaprime labelling system（Amersham pharmacia社製）を使用してプローブの作製および精製を行った。すなわち、約２５ｎｇの鋳型ＤＮＡをmiliQ水で１４μｌにし、９５℃で５分間加熱処理した後、氷中で急冷した。そこに、５μｌのprimer solution，２．５μｌのlabeling buffer，２．５μｌのα-32P-dCTP，１μｌのenzymeを加え、３７℃のwater bath内で１〜２時間放置した。その後、２４μｌの0.2% SDS/TE及び１μｌの0.5M EDTAを添加しプローブ精製前液とした。プローブ精製用のカラムは、ブルーチップの先端に、シリコン処理したグラスウールを詰め、１．５ｍｌ容マイクロチューブに立て、１ｍｌセファデックスＧ−５０（ＴＥにて洗浄した後、平衡化し、オートクレーブ処理したもの。）をチップ内に入れて作製した。
プローブ精製前液をプローブ精製用のカラムに添加し、樹脂内に移動したらカラムにＴＥを適量加え、1 fraction当たり１５０〜２００μｌになるように順次１．５ｍｌ容マイクロチューブに溶出液を回収した。回収したfractionについて、液体シンチレーションカウンターにて、32Ｐの放射量を測定し、１ピーク目のfractionをプローブ液とした。
３．ハイブリダイゼーション
プローブ液を約２５０万ｃｐｍになるように１．５ｍｌ容チューブ内に入れ、salmon testes DNAを５μｌさらに加え、９５℃，１０分間加熱処理し、氷中で急冷した後、hybridyzation solution を０．５ｍｌ加え、ハイブリダイゼーション溶液とした。上述の１．でプレハイダイブリダイゼーションを行ったメンブレンを新しいハイブリパック内に入れ、ハイブリダイゼーション溶液を全量入れ、気泡がメンブレン上に生じないように、シーラーにてシールし、４２℃のwater bath内にて一晩放置した。
４．メンブレンの洗浄および感光
メンブレンをタッパー内で水で軽く濯ぎ、次に、2x SSC及び0.1% SDSで、１回目は２〜３分間、２回目は２０〜３０分間、３７℃下でタッパー内で洗浄した。次に、0.1x SSC及び0.1% SDSにて２回、各２０分間洗浄した。メンブレンをサーベイメーターにて、バックグラウンドの放射性が低下したのを確認した後、水気をペーパータオルで取り、ろ紙に固定しラップで包み、感光用のホルダーに入れＩＰ（Imaging plate）に適当な時間、感光させた。感光させたＩＰは専用のマガジンに移し、FUJI FILM社製のBAS2000にてscan及び解析した。
第９図に消化管各組織部位におけるヒトＣａＴ１遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを示す。なお、第９図の下段には、controlとしてヒトＣａＴ１遺伝子の代わりにヒトｃＤＮＡ（３６Ｂ４）を用いた他は上記と同様の手順で行った結果を示す。
その結果、第９図から明らかな通り、消化管各組織部位においてヒトＣａＴ１遺伝子が発現していることが分かり、特に胃や小腸上部から下部にかけて広く発現が確認された。このことから、ヒトにおいても中性環境の小腸下部におけるカルシウムの取り込みがヒトＣａＴ１を介して行われていることを示唆するものと考えられた。
【００１４】
（３）ヒトＣａＴ１定常発現細胞の作製
ヒトＣａＴ１によるカルシウムの取り込みの制御機構に関する報告はこれまで不十分であったことから、本発明者らは、第６図に示すヒトＣａＴ１遺伝子を導入したベクターを作製し、これをＣＨＯ細胞に形質転換してヒトＣａＴ１定常発現細胞を作製し、前記制御機構の解明を試みた。
まず、ｐＭＥＨｉｓベクターのＸｈｏ  Ｉ及びＮｏｔ  ＩサイトにヒトＣａＴ１遺伝子を挿入した。すなわち、ヒトＣａＴ１遺伝子にＸｈｏ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉサイトを導入すべくプライマーを設計、ＲＴ−ＰＣＲを行った後に、ｐＭＥＨｉｓベクターのマルチクローニングサイト内のＸｈｏ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉサイトに挿入し、ｐＭＥＨｉｓ−ＣａＴ１を作製した。これを、本来ヒトＣａＴ１遺伝子を発現していないＣＨＯ（Chinese hamster ovary）細胞にリポフェクション法にてトランスフェクションした。
リポフェクション法によるトランスフェクションは、LIPOFECTAMIN Reagent kit （GIBCO BRL社製）を使用して行った。すなわち、まず２〜１０μｇのプラスミドDNA、８μｌのplus reagentを２５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に入れ、軽く撹拌し、３７℃下で１５分間放置した。その後、別に用意した、１２μｌのリポフェクタミンを添加した２５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加え、軽く撹拌したのち、更に１５分間３７℃下で放置し、ＤＮＡ溶液とした。１×１０６ cellsの細胞を60mm dishにまき、一晩、３７℃、ＣＯ２環境下で培養した細胞を２ｍｌの無血清培地にて２回程洗浄し、改めて２ｍｌの無血清培地を加えた後、ＤＮＡ溶液を全量添加し、３７℃、ＣＯ２環境下で３時間放置した。その後、通常の血清培地と交換した後、２〜３日間引き続き培養した。
また、対照としてヒトＣａＴ１遺伝子を挿入しないままのｐＭＥＨｉｓベクターをトランスフェクションした。
トランスフェクションしたＣＨＯ細胞がヒトＣａＴ１遺伝子を発現しているかどうかは、ウサギで作製した抗ｈＣａＴ１抗体を用いて、ウェスタンブロットにて確認した。即ち、トランスフェクションしたＣＨＯ細胞をブラストサイジンにてコロニーを選択し、１％ＮＰ−４０（Nonidet P-40 界面活性剤、ナカライ社）にて可溶化し、Ｎｉ  ｒｅｓｉｎにて精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動後、ｐＥＴ２８ａベクターにヒトＣａＴ１のＣ末端（配列表の配列番号１記載の塩基配列の７５７〜１９２３番目の部分）１．２Ｋｂｐを挿入したコンストラクトを作製し、これを大腸菌ＢＬ２１に形質転換して得られた融合タンパクを抗原として、ウサギで作製した抗ヒトＣａＴ１抗体を用いて、ウェスタンブロットした。結果を第１０図に示す。なお、第１０図において、右側はｐＭＥＨｉｓ−ＣａＴ１をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の結果を、左側はｐＭＥＨｉｓベクターをトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の結果を示す。
第１０図から明らかなように、ｐＭＥＨｉｓ−ＣａＴ１をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞、即ちヒトＣａＴ１遺伝子を導入した細胞において、約７５ｋＤａの特異的なバンド（第１０図中の矢印参照）が確認され、ヒトＣａＴ１のタンパク質レベルでの発現を確認することができた。このことから、上述の如くしてヒトＣａＴ１遺伝子を導入して得られた細胞は、ヒトＣａＴ１定常発現細胞であることが明らかとなった。
【００１５】
（４）ヒトＣａＴ１定常発現細胞のカルシウム取り込みの確認
次に、上述の（３）で作製されたヒトＣａＴ１定常発現細胞が実際にカルシウムを取り込むかどうかを、第７図に示す概略に従って確認した。
即ち、24 well plateにて、ヒトＣａＴ１定常発現細胞を前記ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％  ＦＣＳ（胎児牛血清）を添加した培地を用いて、１×１０５cells/ wellを３７℃，５日間、ＣＯ２環境下培養した。培地を除き、細胞をＰＢＳ，ＨＢＳＳバッファーにて洗浄後、各ｗｅｌｌに５．２８μＭの45Ｃａ2+を含むＨＢＳＳバッファーを添加して一定時間（通常は１０分間、ただし、時間をふっている場合（time course）を除く。）後に取り除き１％triton（triton X-100）にて細胞を可溶化後、細胞を回収した。細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。また、対照として、ヒトＣａＴ１遺伝子をトランスフェクションしていないＣＨＯ細胞についても、同様の操作を行い、細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量を測定した。
細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量の経時的変化を第１１図に示す。第１１図から明らかなように、ヒトＣａＴ１定常発現細胞の細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量は、ヒトＣａＴ１遺伝子をトランスフェクションしていないＣＨＯ細胞に比べて増加している。
更に、ヒトＣａＴ１定常発現細胞の細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量から、ヒトＣａＴ１遺伝子をトランスフェクションしていないＣＨＯ細胞の細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量を差し引いたものは、ヒトＣａＴ１遺伝子が細胞内取り込みに関与したカルシウム量と考えられる。そこで、細胞内に取り込まれたカルシウム量のうち、ヒトＣａＴ１遺伝子が細胞内取り込みに関与したカルシウム量の経時的変化を第１２図に示した。第１２図によれば、細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+量は３０分経過時点でほぼ一定となることから、ヒトＣａＴ１遺伝子が関与するカルシウムの取り込みは比較的短時間にて行われ、また、飽和することが明らかである。
尚、以降の細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量に関するデータは、第１２図のように細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+のうち、ｈＣａＴ１が関与した分の量を示すものとする。
【００１６】
（５）ｈＣａＴ１を介したカルシウム取り込みに対するｐＨ及び金属イオンの影響
ｈＣａＴ１を介したカルシウム取り込みに対するｐＨ及び金属イオンの影響を調べて、ｈＣａＴ１（定常発現細胞）のキャラクタライズを行った。
ｐＨによる影響は、５．２８μＭの45Ｃａ2+を含むＨＢＳＳバッファーのｐＨを５．５、６．５、７．５及び８．５のそれぞれに調整したものを用いた他は、（４）と同様の培養条件及び手順で調べた。結果を第１３図に示す。第１３図から、中性側にて細胞内への45Ｃａ2+取り込み量が増大するが、酸性側では抑制されることが分かる。
一方、金属イオンの影響は、Ｌａ3+、Ｇｄ3+、Ｃｄ2+、Ｃｏ2+、Ｆｅ2+、Ｍｎ2+及びＭｇ2+の各塩化物塩１００μＭ（ただし、Ｍｇ2+のみ１０ｍＭ）、及び、塩化コリン（Ｃｈｏ−Ｃｌ）１００μＭを５．２８μＭの45Ｃａ2+を含むＨＢＳＳバッファーにそれぞれ添加したほかは、（４）と同様の培養条件及び手順で調べた。結果を第１４図に示す。
第１４図からも明らかな通り、Ｌａ3+、Ｇｄ3+、Ｃｄ2+及びＣｏ2+イオンでは45Ｃａ2+取り込み量が抑制されるが、Ｆｅ2+、Ｍｎ2+及びＭｇ2+ではcontrolと比較して差がなく、取り込みには影響がないことが分かる。
【００１７】
（６）カルシウム吸収を調節する食品因子のカルシウム吸収調節作用メカニズムの解明
カルシウム吸収を調節する食品因子のカルシウム吸収調節作用のメカニズムに関する情報を得るべく、本発明者らは、第８図の概略に従ってヒトＣａＴ１定常発現細胞のカルシウム取り込みに対する影響を検討することにより、これら食品因子のカルシウム吸収調節作用のメカニズムの解明を試みた。
即ち、（４）と同様の培養条件及び手順で培養したヒトＣａＴ１定常発現細胞について、培地を、食品因子として７％ラクトース（試薬特級）、１％カゼイン酵素分解物、１％グアーガム加水分解物、及び大豆酵素分解物（不二精油製）をそれぞれ含んだＤＭＥＭ（−Ｃａ）培地（Dulbecco's' Modified Eagle Medium（cont.） Base Catalog No. 21068、GIBCOTMInvitrogen Corporation製：ＫＣｌ  ４００．００ｍｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ６４００．００ｍｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３  ３７００．００ｍｇ／ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  １２５．００ｍｇ／ｌ、Ｄ−グルコース  ４５００．００ｍｇ／ｌ、Ｌ−イソロイシン  １０５．００ｍｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン  １０５．００ｍｇ／ｌ、Ｌ−リシン・ＨＣｌ  １４６．００ｍｇ／ｌ、Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ  １０４．００ｍｇ／ｌ））に移し変え、更に４時間プレインキュベートした後の細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量を測定した。結果を第１５図に示す。
第１５図から明らかな通り、細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量は、ラクトース、１％カゼイン酵素分解物及び１％グアーガム加水分解物にて増加した。一方、大豆酵素分解物では、逆に細胞内に取り込まれた45Ｃａ2+の量は抑制された。
このことから、ラクトース、カゼイン及びグアーガム加水分解物はヒトＣａＴ１の働きを促進してカルシウム吸収を促進させることが明らかとなり、一方、大豆酵素分解物は、ヒトＣａＴ１の働きを抑制してカルシウム吸収を阻害することが明らかとなった。
【００１８】
実施例２
食品因子としてのチーズホエーの酵素消化物（ＣＷＰ−Ｄ）について、実施例１で得られたヒトＣａＴ１定常発現細胞のカルシウム取り込みに対する影響を検討することにより、カルシウム吸収調節作用の有無及びそのメカニズムの解明を試みた。
（１）酵素処理によるＣＷＰ−Ｄの調製
３５％  チーズホエーを調製し、０．１２％  プロテアーゼＡ（天野製薬）を加えて溶解した後、３７℃にて６時間インキュベーションした。処理後、９０℃、１０分間加温し、酵素を失活させた。冷却した後、凍結乾燥を行った。
得られた粉末を、酵素処理サンプルとして、以下の手順で精製を行った。
【００１９】
（２）ヒトＣａＴ１定常発現細胞のカルシウム取り込みに対するＣＷＰ−Ｄの影響
（１）で得られる酵素処理サンプルを、ＤＭＥＭ（−Ｃａ）（実施例１（６）で使用したものと同じ）に濃度１．０（ｗ／ｖ）％となるように溶解し、これに実施例１（４）と同様の培養条件及び手順で培養したヒトＣａＴ１定常発現細胞、及びヒトＣａＴ１遺伝子をトランスフェクションしていないＣＨＯ細胞に加え、４時間前処理（プレインキュベート）した。尚、培地には、透析（Spectra/POR MWCO:100）したＦＣＳを２．５％、Ｌ−グルタミン溶液を２％加えた。
前処理終了後直ちに、実施例１（４）と同様の手法で、細胞内に取りこまれた45Ｃａ2+の量の測定を行った。一方、対照として酵素処理サンプルを加えずに同様に処理を行った。結果を第１６図に示す。
第１６図から明らかな通り、細胞内への45Ｃａ2+の取り込み量は、ＣＷＰ−Ｄを添加した場合に、対照と比較して８倍と高く、ＡＮＯＶＡによる解析の結果、ｐ＜０．０１において両者の間には有意差が見られた。
このことから、ＣＷＰ−Ｄは、ヒトＣａＴ１の働きを促進してカルシウム吸収を顕著に促進させることが明らかとなった。
【００２０】
（３）ヒトＣａＴ１定常発現細胞のカルシウム取り込みに対する前処理時間の影響
（２）において、前処理時間を０時間、１時間、２時間、４時間及び６時間とした他は、（２）と同様にして、ヒトＣａＴ１定常発現細胞の45Ｃａ2+取り込みに対するＣＷＰ−Ｄの前処理時間の影響について調べた。結果を第１７図に示す。
第１７図から明らかなように、細胞内への45Ｃａ2+取り込み量は、前処理時間の長さに依存して増加し、２時間で飽和することが明らかとなった。
【００２１】
（４）ヒトＣａＴ１定常発現細胞のカルシウム取り込みに対するＣＷＰ−Ｄの濃度の影響
（２）において、酵素処理サンプルの濃度を、０（ｗ／ｖ）％、０．０１（ｗ／ｖ）％、０．０２（ｗ／ｖ）％、０．０５（ｗ／ｖ）％、０．１（ｗ／ｖ）％、０．２（ｗ／ｖ）％、０．５（ｗ／ｖ）％、１．０（ｗ／ｖ）％の各濃度の細胞添加用サンプル含有培地に換えて、それぞれの培地について処理を行ったほかは、（２）と同様にして、ヒトＣａＴ１定常発現細胞の45Ｃａ2+取り込みに対するＣＷＰ−Ｄの濃度の影響について調べた。結果を第１８図に示す。
第１８図から明らかなように、細胞内への45Ｃａ2+取り込み量は、ＣＷＰ−Ｄ濃度に依存して増加することが明らかとなった。
【００２２】
（５）Caco-2細胞のカルシウム取り込みに対するＣＷＰ−Ｄの影響
ヒト小腸上皮細胞の一つであるCaco-2細胞では、内因性のＣａＴ１が発現している。そこで、（４）において、ヒトＣａＴ１定常発現細胞の代わりにCaco-2細胞を用いた他は同様にして、Caco-2細胞の45Ｃａ2+取り込みに対する酵素処理サンプルの濃度の影響について調べた。結果を第１９図に示す。
第１９図から明らかなように、Caco-2細胞内への45Ｃａ2+取り込み量は、ＣＷＰ−Ｄの濃度に依存して増加し、０．１（ｗ／ｖ）％以上で有意に増加し、０．２（ｗ／ｖ）％でその増加は飽和することが明らかとなった。
【００２３】
（６）カルシウム取り込みのカイネティクスに対するＣＷＰ−Ｄの影響
（２）の前処理終了後、培地中のＣａＣｌ２濃度を０．０１ｍＭ〜１．０ｍＭまで変化させて、その間の細胞内に取りこまれた45Ｃａ2+の量の測定を行った（＋ＣＷＰ−Ｄ）。一方、対照として酵素処理サンプルを添加せずに同様に処理した（−ＣＷＰ−Ｄ）。その結果、第２０図に示すようなカルシウム飽和曲線が得られた。
第２０図を基に、Lineweaver-Barkのプロットを行い（第２１図）、Ｖｍａｘ値、Ｋｍ値を算出した。得られたＶｍａｘ値及びＫｍ値を第１表に示す。
【００２４】
【表１】
2010043128.tif 000003
【００２５】
第1表から明らかなように、細胞内へのＣａ2+の取り込みのＶｍａｘは、＋ＣＷＰ−Ｄと−ＣＷＰ−Ｄとの間でほとんど変わらなかったが、その一方で、Ｋｍは低下することが認められた。
このことから、ＣＷＰ−Ｄは、ＣａＴ１のコンフォメーションを変化させ、細胞内への45Ｃａ2+取り込みのカイネティクスを変化させることが示唆された。
【００２６】
（７）ＣＷＰ−Ｄ由来のカルシウム吸収促進因子の単離
１．ＯＤＳカラムによる粗精製
（１）で得られた酵素処理サンプル（ＣＷＰ−Ｄ）１００ｇを、３００ｍｌの蒸留水に溶解し，５℃で遠心分離（１１，０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）した後、ろ過を行い（ADVANTEC ろ紙No．1）、脂肪層を除去した。この徐脂肪画分を透析（分画分子量１０，０００、４Ｌの蒸留水に対し、３回）し、得られた透析外液を５５．５倍に減圧濃縮（final ２００ｍｌ）した。濃縮液をＯＤＳカラム（Wako gel 50C18，１０ｘ１００ｃｍ）にて通過させた後、吸着画分を８０％  エタノールにて溶出させ、溶出物を減圧濃縮、凍結乾燥し、粗精製されたＯＤＳ吸着画分を得た。
（２）において、酵素処理サンプルの代わりに、（７）１．で得られたＯＤＳ吸着画分を用いた他は、（２）と同様に行った。結果を第２２図に示す。
第２２図から明らかな通り、ヒトＣａＴ１定常発現細胞内への45Ｃａ2+の取り込み量は、ＣＷＰ−Ｄを添加した場合に、対照と比較して高く、ＡＮＯＶＡによる解析の結果、ｐ＜０．０１において両者の間には有意差が見られた。
このことから、ＯＤＳ吸着画分中に、カルシウム吸収促進因子が含まれることが明らかとなったので、さらに精製するため以下のＦＰＬＣを行った。
２．  逆相クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）
１．で得られたＯＤＳ吸着画分を、濃度９２．５ｇ／５ｍｌになるように蒸留水に溶解し、No．1ろ紙にてろ過後、５ｍｌに再調整したものについて、ＦＰＬＣを行った。ＦＰＬＣの条件は以下の通りとした。
〔ＦＰＬＣの条件〕
・カラム：Wakogel 50C18  ０．８×５０ｃｍ，Ｖｔ＝１００ｍｌ
・サンプルループ：５ｍｌ  スーパーループ
・検出：２８０ｎｍ
・溶媒：Ａ．Ｈ２Ｏ（蒸留水）
Ｂ．ＥｔＯＨ
・フラクション：１０ｍｌ／２ｍｉｎ（５ｍｌ／ｍｉｎ）
・濃度勾配：下記の第２表に示す通りである。
【００２７】
【表２】
2010043128.tif 000004
【００２８】
１．のＯＤＳ吸着画分をサンプルループに予め注入し、十分に平衡化しておいたカラムにチャージした。尚、サンプルチャージ、送液、溶媒濃度勾配、フラクションコレクター等は全てプログラム上、自動で行われた。ＦＰＬＣの結果を第２３図に示す。得られた各フラクションは凍結乾燥した後、各々１ｍｌの蒸留水に溶解し、ＦＰＬＣ画分として以下の試験に供した。
（２）において、酵素処理サンプルの代わりに、各ＦＰＬＣ画分を、ヒトＣａＴ１定常発現細胞に対して濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるような濃度で用いた他は、（２）と同様に行って細胞内への45Ｃａ2+の取り込み量を測定した。各画分の結果を、ＦＰＬＣの結果と併せて第２３図に示す。
第２３図から明らかなように、細胞内への45Ｃａ2+の取り込み量は、retention timeが３４〜３６分のＦＰＬＣ画分について特に高かった。
このことから、retention timeが３４〜３６分のＦＰＬＣ画分に、カルシウム吸収促進因子が含まれることが明らかとなったので、この画分をさらに精製するため以下のＦＰＬＣを行った。
３．逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
２．にてカルシウム吸収上昇活性が確認されたＦＰＬＣ画分について、ＨＰＬＣを行った。ＨＰＬＣの条件は以下の通りとした。
〔ＨＰＬＣの条件〕
・カラム：Docosil ４．６ｘ２５０ｍｍ
・サンプルループ：２００μｌ
・溶媒：Ａ．Ｈ２Ｏ＋０．１％  ＴＦＡ
Ｂ．Acetonitorile＋０．１％  ＴＦＡ
・検出：２１４ｎｍ
・フラクション：１ｍｌ／ｍｉｎ
・濃度勾配：下記の第３表に示す通りである。
【００２９】
【表３】
2010043128.tif 000005
【００３０】
ＨＰＬＣの結果を第２４図に示す。
第２４図から明らかなように、retention timeが８．４５０，１６．１０８，２５．６９６分の各位置に主要なピーク（peak．1，2，3）が検出された。そこで、各々のピークを回収した後凍結乾燥を行い、（２）において、酵素処理サンプルの代わりに、３つの回収ピークpeak．1，2，3を、ヒトＣａＴ１定常発現細胞に対してそれぞれ濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるような濃度で用いた他は、（２）と同様に行って細胞内への45Ｃａ2+の取り込み量を測定した。一方、対照として、回収ピークを加えずに同様の処理を行った。結果を第２５図に示す。
第２５図から明らかなように、peak．1を添加した場合の細胞内への45Ｃａ2+の取り込み量は、ＡＮＯＶＡによる解析の結果、他のpeak及び対照と比較して有意（ｐ＜０．０５）に増加していた。
このことから、peak．1に、カルシウム吸収促進因子が含まれることが明らかとなった。
４．peak．1の純度の測定
３．で得られたpeak．1をＮ２ガスにて処理した後乾固させ、リン酸バッファー（ｐＨ２．５）に溶解し、０．４５μｍのフィルターを通したものを、Otsuka Electronics社のCAPI-3000 Integratorを使用してキャピラリー電気泳動を行って、ペプチド純度を検定した。キャピラリー電気泳動は、電圧１５ｋｖ及び温度２５℃の条件で、２００ｎｍの吸光度により検出した。結果を第２６図に示す。
第２６図から明らかなように、シングルピークのみ検出されたことから、peak．１は、単一物質からなることが確認された。
５．ＣＷＰ−Ｄの配列決定
４．にて単一物質からなることを確認したpeak．1について、Applied Biosystem社のProtein Sequence Systemを使用して配列決定を行なった。その結果、peak．1に含まれる物質のアミノ酸一次配列は、Ile-Pro-Alaであることが明らかとなった。
【００３１】
（８）ＣＷＰ−Ｄ由来のカルシウム吸収促進因子のカルシウム取り込みに対する影響
（７）で得られた物質のアミノ酸一次配列からなるペプチドを合成し、この合成ペプチドＩＰＡについて、以下の手順によりカルシウム取り込みに対する影響を調べた。
１．ヒトＣａＴ１定常発現細胞のカルシウム取り込みに対する合成ペプチドＩＰＡの濃度の影響
（２）において、酵素処理サンプルの代わりに、合成ペプチドＩＰＡを、細胞に対して濃度０ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌとなるような濃度で用いた他は、（２）と同様に行って細胞内への45Ｃａ2+の取り込み量を測定した。結果を第２７図に示す。
第２７図から明らかなように、細胞内への45Ｃａ2+の取り込み量は、合成ペプチドＩＰＡの濃度に依存して有意に増加していた。
２．ヒトＣａＴ１定常発現細胞のカルシウム取り込みに対する合成ペプチドＩＰＡ、ＩＰＡアナログ及びアミノ酸類の影響
（２）において、酵素処理サンプルの代わりに、合成ペプチドＩＰＡ、ＩＰＡアナログ（合成ペプチドの類似体）としてのＩＰＩ（Ile-Pro-Ile：ペプチド研究所）及び合成ペプチドＩＰＡを構成するアミノ酸類（Ile（Ｉ）、Pro（Ｐ）及びAla（Ａ））を、それぞれ３．０ｍＭ用いた他は、（２）と同様に行って細胞内への45Ｃａ2+の取り込み量を測定した。一方、対照として、ペプチドやアミノ酸類を加えずに同様の処理を行った。結果を第２８図に示す。
第２８図から明らかなように、ＩＰＡアナログとしてのＩＰＩの他、Ile、Pro及びAlaのいずれも、細胞内への45Ｃａ2+の取り込み量は、ＡＮＯＶＡによる解析の結果、有意な増加は見られなかった。
以上の結果から、チーズホエー酵素分解物（ＣＷＰ−Ｄ）及び合成ペプチドＩＰＡは、カルシウム吸収を促進する因子として有用であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、ヒトＣａＴ１遺伝子の発現ベクターへの挿入や形質転換等遺伝的応用を可能にし、更に、ヒトＣａＴ１のカルシウム吸収活性の調節に影響する因子の存在等、カルシウム吸収活性のメカニズムを解明し、カルシウム吸収を調節する因子、特にカルシウム吸収を促進する因子の確認及び新たな発見に役立つ手段を提供することができるので、有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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