(57)【要約】【課題】  リンパ節または遠位部位に転移した乳癌の長期治療に有効である療法を提供する。【解決手段】  乳癌の治療用医薬の製造における乳細胞の増殖を抑制する量の配列番号：１に示す核酸配列によってコードされるママスタチンタンパク質の使用。該医薬が初期転移疾患の治療のための高投与量の処方用医薬である、該医薬がインビボでのママスタチンの治療学的有効量を維持するための維持投与量の処方用医薬である、該医薬が、フィードバック阻害を誘発せずにママスタチンの治療学的有効量を連続的に維持するための維持投与量の処方用医薬である、または該医薬が、２８日間の連続的な治療の後に３日間の治療欠如を行うために治療学的有効量を維持するのに充分なママスタチンの投与量の処方用医薬である、該使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌の治療用医薬の製造における乳細胞の増殖を抑制する量の配列番号：１に示す核酸配列によってコードされるママスタチンタンパク質の使用。
【請求項２】
該医薬が、初期転移疾患の治療のための高投与量の処方用医薬である、請求項１に記載のママスタチンタンパク質の使用。
【請求項３】
該医薬が、インビボでのママスタチンの治療学的有効量を維持するための維持投与量の処方用医薬である、請求項１に記載のママスタチンタンパク質の使用。
【請求項４】
該医薬が、フィードバック阻害を誘発せずにママスタチンの治療学的有効量を連続的に維持するための維持投与量の処方用医薬である、請求項３に記載のママスタチンタンパク質の使用。
【請求項５】
該医薬が、２８日間の連続的な治療の後に３日間の治療欠如を行うために治療学的有効量を維持するのに充分なママスタチンの投与量の処方用医薬である、請求項３に記載のママスタチンタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌の治療用医薬の製造における乳細胞の増殖を抑制する量の配列番号：１に示す核酸配列によってコードされるママスタチンタンパク質およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は米国単独で毎年４５,０００人の女性を死亡させる疾患である。年間１８０,０００件を超える乳癌の新症例が診断され、８人に１人の女性が乳癌になると推定されている。これらの数値は、乳癌が今日の女性が直面する最も危険な疾患のうちの１つであることを示している。癌の研究では、乳癌の原因を決定することができず、適当な癌療法または妨害法を見出さなかった。
【０００３】
乳癌と診断された女性は、外科的療法、ホルモン療法、化学療法および放射線療法により治療されるであろう。患者が転移性乳癌を患っているならば、脳、骨および肝臓などの離れた領域における癌を除去するために、放射線および多用量の化学療法が必要でなる。
【０００４】
乳癌の治療に利用可能な現在の療法は、有毒、危険、高価であり、その多くは特に、転移性乳癌の治療に無効である。下記の表は非特許文献１から抜粋したものであり、現在の治療方法および予期される生存率に関して利用可能であるデータをまとめている。
【０００５】
【表１】
2010031013.tif 000002
【０００６】
現在、リンパ節または遠位部位に転移した乳癌の長期治療に有効である療法は全くない。局所疾患は、癌全部を除去することができるなら、外科的手術によって有効に治療され得る。乳癌および転移性癌に由来する細胞の増殖を停止できる乳癌の有効な新規の治療法が即急に必要である。そのような療法は局所の乳癌の治療、転移性疾患の長期にわたる治療に有用であり、および腫瘍の外科的切除の後の追跡治療として有用である。他の応用には、初期治療としておよび防御的使用としての増殖インヒビターを含む。
【０００７】
乳房Ｘ線写真、身体検査、ＣＡＴ−スキャン、および超音波などの乳癌の検出方法は、乳癌の初期検出を有意に改善した。しかしながら、これらの方法を用いて、疑わしい腫瘍はさらに、該腫瘍が良性または悪性であるかを決定するための、および組織型および悪性の程度の決定を試みるための病理学的検査ために、外科的切除をしなければならない。この病理学的診断は、以後の治療プロトコールに何を使用するかを決定するために役立つ。
【０００８】
乳癌に関して、適当な乳癌腫瘍マーカーが利用できないので、これらの方法は一般的に決定的ではない。ＣＡ １５−３およびＣＡ ２７−２９などの利用可能なマーカーは転移の指標として使用されるが、しかしながらそれらは特異的ではない。例えば、新規のかつ特異的な乳癌マーカーを使用して、乳癌の有効かつ信頼できる診断が可能である診断手段および方法の必要性が多大である。さらに、乳癌の早期発見および早期診断用の信頼でき、かつ簡単な方法が顕著に必要とされている。好ましくは、そのような早期発見方法は、乳癌の初期段階で乳癌を同定し、進行した転移疾患による乳癌の進行を追跡し、ついで乳癌または進行した疾患の罹患傾向を診断するであろう。より好ましくは、該診断方法は、例えば血液などの体液などの分析によって組織生検なしに使用することができる。
【０００９】
ヒト乳房組織は月経の開始および各月経周期の間で、増殖活動の突発を被る。乳房組織および腫瘍へのエストロゲンの効果に関する研究は、エストロゲンが乳房組織の第１次増殖開始因子であることを示唆している。エストラジオール感受性増殖因子が特徴付けられた。さらに、本来ホルモンの影響を受けない乳房細胞増殖因子もまた記載される。
【００１０】
乳房組織増殖に刺激的影響を及ぼすことが示されている特異的な増殖因子は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）αが挙げられる。他方、ＴＧＦ‐βは乳房組織の増殖を抑圧することを示している。
【００１１】
乳房細胞増殖の調節は乳癌の診断および治療に非常に重要である。乳房組織の新生物的増殖は、調べなければ、年間何千人もの女性の死因である調節不可能に増殖する悪性腫瘍に進行する。乳房細胞増殖を特異的に抑圧することができる増殖阻害因子は、乳癌の診断および治療において使用するため、機能的手段を提供する。
【００１２】
従って、特異的な乳房細胞増殖インヒビターを単離し、特徴付け、その核酸配列およびアミノ酸配列を同定し、ついで精製したタンパク質としてインヒビターを組換え的に発現させることは非常に有効である。該核酸配列および／または組換え的に製造したインヒビターを使用した診断および治療方法は乳癌の診断および治療において非常に利用性が高い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】チャーチル・リビングストン（Churchill Livingston）、Clinical Oncology, 1995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
特異的な乳房細胞増殖インヒビターであるママスタチンを正常ヒト乳房細胞から単離し、ついで特徴付けた。現在ママスタチンは正常乳房細胞により製造されるが乳癌細胞では製造されないことがわかっている。さらに、現在、血液中のママスタチンの減少または不在が乳癌の存在と相関することもわかっている。活性化ママスタチンの投与により乳癌細胞の増殖が妨害される。
【００１５】
ママスタチンをコードする核酸配列は、現在のところクローニングされ、シークエンシングされ、ついで宿主細胞中で組換え的に乳房細胞の増殖の活性インヒビターとして発現されている。単離し特徴付けられた核酸配列（配列番号：１）およびその推定アミノ酸配列は乳癌の診断および治療において使用するための独特かつ特異的な手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は乳房細胞増殖、特に乳癌細胞増殖の特異的なタンパク質インヒビターであるママスタチンをコードする単離し、精製した核酸配列を提供する。本発明はまた、ママスタチン核酸配列、ママスタチンのアミノ酸配列および精製した乳房細胞増殖インヒビターを製造し、乳癌を診断および治療するためのママスタチン核酸またはアミノ酸配列を利用する方法、キットおよび組成物を含むプラスミドおよびベクターを含む。本発明組成物には、ママスタチン核酸配列およびそのＲＮＡ産物に特異的にハイブリダイズするプローブおよびプライマーを含む。
【００１７】
本発明はママスタチンを投与することによって乳癌を治療する方法をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は真核細胞Cos-7細胞における組換えママスタチンの発現を示すウエスタンブロットである。
【００１９】
【図２】図２は、昆虫細胞中のママスタチンの発現を示すイムノブロットである。
【００２０】
【図３】図３は、イン・ビトロ転写および翻訳によって製造される組換えママスタチンによる乳房細胞増殖の阻害を示すイムノブロットである。
【００２１】
【図４】図４は、ママスタチンｃDNAでトランスフェクションしたCos-7細胞のならし培地での処置により、ヒト乳癌細胞増殖における増殖阻害を示すグラフである。
【００２２】
【図５】図５は、ヒト正常乳房細胞および癌性乳房細胞における５３、４９、および４４kDママスタチンの相対量を示すウエスタンブロットである。
【００２３】
【図６】図６は、ママスタチンのホスファターゼ消化を示すイムノブロットである。
【００２４】
【図７】図７は、ママスタチンの活性に及ぼすホスファターゼの影響を示すグラフである。
【００２５】
【図８】図８は、ヒト正常乳房細胞および癌性乳房細胞からのママスタチンならびに正常細胞および癌性細胞の混合培養物中のママスタチンを示すウエスタンブロットである。
【００２６】
【図９】図９は、ＥＬＩＳＡによって分析された正常ヒト血清中のママスタチンを示すグラフである。
【００２７】
【図１０】図１０は、ママスタチンのＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフである。
【００２８】
【図１１】図１１は、治療過程での乳癌患者におけるママスタチンレベルを示すグラフである。
【００２９】
【図１２】図１２は、レトロウイルスによって誘発されたママスタチンの発現を示すウエスタンブロットである。
【００３０】
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃは、ヌードマウスにおけるＭＣＦ７腫瘍細胞へのママスタチン治療の効果を示すグラフである。
【００３１】
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、ヌードマウスにおける腫瘍細胞へのママスタチン治療の効果を示すグラフである。
【００３２】
【図１５】図１５は、正常女性からの血液中のママスタチンと乳癌患者からの血液中のママスタチンの不在を示すドットブロットアッセイである。
【００３３】
【図１６】図１６はCos−７サル腎臓細胞中の組換えママスタチンの製造を示す。イムノブロット分析：細胞溶解産物を７G6抗−ママスタチンモノクローナル抗体でプロービングした。（Ａ)２５μｇ、ＮＨＭＣ−２０、正常ヒト細胞溶解産物（コントロール）、（Ｂ）２５μｇ、Ｃos−７細胞溶解産物、pcＤＮＡ３（コントロール）でトランスフェクション、（Ｃ）１０μｇCos-pMammB細胞溶解産物、pcＤＮＡ３/ママスタチン構築物でトランスフェクション、（Ｄ）２０μｇCos−pMammB細胞溶解産物。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
ママスタチン
ママスタチンは正常ヒト乳房上皮細胞によって製造され分泌されるタンパク質増殖インヒビターである。乳房細胞増殖インヒビターは正常ヒト乳房細胞の増殖によってならし培地中に存在する阻害性タンパク質活性として最初は記載された。阻害活性は正常ヒト乳房細胞からのならし培地中で同定されたが、ヒト乳癌細胞の増殖によってならし培地中では同定されなかった。阻害活性はバイオアッセイと約５３、４９および４４kDa（アービン（Ervin, Paul R.）、ミシガン大学博士論文、１９９５）の分子量を有する３つのタンパク質に存在する抗体の作成によって決定した。
【００３５】
現在、特異的な乳房細胞増殖インヒビターであるママスタチンが、４９kDa〜５３kDaへ分子量を増加リン酸化的に増加させる４４kDaのタンパク質として発現することが決定された。ph４４ｋDaでない形態は活性インヒビターではないが、リン酸化した４９kDaおよび５３kDaの形態は乳癌細胞の増殖を阻害する。活性５３および／または４９kDaリンタンパク質は正常ヒト乳房細胞によって発現されるが、一般的に乳癌細胞では製造されない。癌細胞の中にはリン酸化を欠如しており、不活性な４４kDaタンパク質を製造するものもある。
【００３６】
以下の表は正常細胞および組織および癌性細胞および組織中のママスタチンの発現および活性を示すデータをまとめたものである。
【表２】
2010031013.tif 000003
ヒト乳癌細胞での用量応答実験は、癌細胞増殖は１０ng/mlのママスタチンで５０〜７０％阻害され、２５〜５０ng/mlで完全に停止されていた。
【００３７】
MDA-MB-435およびMDA-MB-231などの高度に転移性の細胞は増殖を停止させるために５０ng/mlを必要とする。イン・ビトロおよびイン・ビボ臨床データ実験は、該効果は可逆的であり、低濃度で癌細胞増殖を停止させるためには、インヒビターの反復投与が必要であることを示唆している。しかしながら、５０ng/mlを超えた用量で、ママスタチンは細胞壊死などのような組織学によって示されるように、アポトーシスを誘発するようである。
ママスタチンは乳癌細胞増殖を阻害する天然に存在する増殖インヒビターであり、活性化ママスタチンを製造する腫瘍は全くないので、ママスタチン置換療法は乳癌治療のための治療法として理想的である。以下の例で提供された臨床データはママスタチン置換療法の有効性を証明する。
【００３８】
ママスタチンタンパク質をコードする核酸配列は、現在単離され、特徴付けられ、シークエンシングされ（配列番号：１）、全部で３つの（５３、４９、および４４kDa）分子量のタンパク質をコードすると決定されており、「ママスタチン（mammastatin）」と名づけられた。３形態の分子量における差異はタンパク質のリン酸化の範囲が原因であると決定された。培養中ママスタチン中のヒト正常乳房細胞（ＮＨＭＣ）によって製造されたママスタチンおよび組換え的に発現されたママスタチンはヒト乳癌細胞の増殖を阻害し、乳癌の治療における治療剤として有用である。
【００３９】
正常女性からのヒト血清および乳癌患者からのヒト血清の分析は、ママスタチンの減少した血液レベルは乳癌の進行と相関があることを示している。以下の実施例中に記載したようにこの活性インヒビターの存在のための血液血清のスクリーニングおよびモニタリングは特異的かつ有効な診断手段を提供する。
【００４０】
核酸配列
ママスタチンＤＮＡ核酸（配列番号：１）は以下の表に示し、ヒト正常乳房細胞ｃＤＮＡライブラリーからのママスタチンｃＤＮＡのクローニングおよびシークエンシングによって示され，以下の実施例でより詳しく述べられる。クロマトグラフィーによって精製されたインヒビターは、以前にはアミノ酸分析を可能にするほど十分に単離されず、標準的技術によってタンパク質インヒビターをシークエンシングする初期の試みは失敗した。クロマトグラフィーによって精製されたインヒビタータンパク質に対して作成された抗体を使用するｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングの試みにより、活性のあるクローンを製造できなかった。これらの問題を克服するために、ママスタチンをコードする遺伝子を、ペプチドシークエンシングおよびヒト正常乳房細胞ｃＤＮＡライブラリーの変性オリゴヌクレオチドスクリーニングにより同定した。
【００４１】
ヒト正常乳房細胞によって製造された濃縮タンパク質は、クロマトグラフィーによって精製したインヒビターに対して作成された抗−ママスタチン抗体を用いてアフィニティー精製された。精製したタンパク質画分は、トレーサーとして３２Ｐ標識した少量（１０５ｃｐｍ）で補った。標識したトレーサータンパク質は、以下の実施例により詳しく記載するように３２Ｐの存在下で増殖した細胞のならし培地から精製した。該タンパク質は臭化シアンで開裂し、ついで開裂した断片を３２Ｐ標識したタンパク質のオートラジオグラフィー分析によってママスタチンとして同定した。開裂により製造された最も豊富な標識されたペプチドがシークエンシングされた。
【００４２】
独特のアミノ酸配列（配列番号：２および３）を有する選択された２つのタンパク質は、変性オリゴヌクレオチドを製造するために使用される。ついで、変性オリゴヌクレオチドを、ヒト正常乳房細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用した。
標識されたpMammAである１つのクローンは、両方の選択されたペプチドからオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。このクローンは、さらに特徴付けられ、抗−ママスタチン抗体によって認識された発現のタンパク質を発現することが示された。該クローンは、ノザンブロット分析、イン・ビトロ転写および翻訳アッセイおよび増殖阻害アッセイによってママスタチンをコードすると査定された。ママスタチンｃＤＮＡインサート（pMammB）を含むpcDNA3クローンをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Cluture Collection) に寄託し、受託番号第９７４５１号を付与された。pMammBから発現した組換えタンパク質は、トランスフェクションした哺乳類細胞株のイムノブロットによって検出され、ついで乳癌細胞に対する増殖阻害活性を保有することを示した。ｃＤＮＡクローンを完全にシークエンシングし（実施例３参照）、BLAST DNAデータベースに対して唯一のものであるとわかった。
【００４３】
本発明の核酸配列（配列番号：１）はヒトママスタチンをコードし、それはヒト正常および癌性の乳房細胞の増殖を阻害する機能を果たす。「ヒト」なる語は、タンパク質の源を制限することを意図しているわけでなく、またヒト細胞および組織にのみ与える阻害効果を制限することを意図しているわけではない。個体のママスタチンの核酸配列およびアミノ酸配列は幾分、タンパク質の構造または機能を変えずに変化するかもしれない。さらに、生化学の分野の当業者であれば、核酸配列またはアミノ酸配列の修飾が分子の構造および／または機能を変更せずに起こるかもしれないことを認識するであろう。例えば，該核酸配列は修飾され、ある特定の細胞宿主の最適な既知のコドンを用いて所望のアミノ酸配列の最適発現を可能にする。
【００４４】
本発明の核酸配列は乳癌の治療における治療法および診断方法において使用するため、高度に精製されたママスタチンの大容量を製造するのに有用である。
抗ママスタチン抗体：
いくつかの抗−ママスタチン抗体が製造され、特徴付けれられた。例えば、１９８９年１１月３０日に公開されたＰＣＴ出願公開公報ＷＯ８９／１１４９１号参照。これらの抗体は、クロマトグラフィーによって精製されたインヒビタータンパク質に対して作成され、乳房細胞増殖にママスタチンタンパク質の阻害効果を与えるのを妨げると示した。
【００４５】
利用可能な抗−ママスタチン抗体は、ネオマーカーズ（Neomarkers）（フリーモント（Freemont）、カリフォルニア）より市販されて利用できる７Ｇ６および３Ｃ６および６Ｂ８を含む。６Ｂ８抗体を作成するハイブリドーマ細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ受託番号第ＨＢ１０１５２号）から入手可能である。これらの各抗体はママスタチンの全部で３つの分子量形態のものに結合し、ドットブロットおよびウエスタンブロットを含む免疫学的アッセイにおいて有用である。該７Ｇ６抗体は変性したタンパク質サンプルのウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡ分析に好ましい。該抗体３Ｇ６および６Ｂ８はＥＬＩＳＡアッセイ、例えば実施例に具体的に記載した条件下でのアッセイにおいて使用されるであろう。
【００４６】
さらなる抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に関して知られる標準的方法を用いて製造され得る。抗体製造のために使用した抗原はＮＨＭＣの培養または組換え的に発現されたママスタチンから得られるかもしれない。
【００４７】
診断方法
本発明はさらに、組織、細胞および液体を含む患者のサンプル中の活性ある阻害性ママスタチンを検出するためのイン・ビトロアッセイを提供する。乳癌および進行性転移性疾患は、患者のサンプル中のママスタチンタンパク質の存在および型とヒト正常乳房細胞または癌性乳房細胞のママスタチンタンパク質の存在および型との相関によって診断される。患者の血液または組織サンプルは、ママスタチンタンパク質、例えば豊富なママスタチンタンパク質および／またはママスタチンの分子量形態などに関して分析される。以下で議論するように、特に高分子量のママスタチンのリン酸化された形態であるママスタチンの存在または喪失は乳癌と相関があり、かつ進行した転移性の疾患の指標である。
【００４８】
ママスタチンの分析は、好ましくは、患者の血液サンプルを抗−ママスタチン抗体を用いてＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析を含むイムノアッセイによる。好ましくは、組換えママスタチンの標準は、信頼可能なインヒビターレベルの量に関する標準曲線を提供するように使用される。そのようなイムノアッセイは以下の実施例に示すドットブロットアッセイおよびウエスタンブロットアッセイによって例示される。本発明の別の好ましい態様において、腫瘍生検のような組織サンプルは免疫組織化学または患者の腫瘍細胞を培養することおよびママスタチンの発現のための培養物を試験することによって分析される。
【００４９】
特に好ましい態様において、乳癌の診断用アッセイには少なくとも２つの特異的な抗体を含む：抗−サイトケラチン抗体などの上皮組織のサンプルとして採取された乳房組織を同定するための抗体および抗−ママスタチン抗体である。例えば、イムノブロット形式を用いて，乳癌細胞を含むと疑われる組織をホモジナイズし、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、膜にトランスファーし、抗−ケラチンおよび抗−ママスタチン抗体の両方で調べる。ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの適当なマーカーシステムにコンジュゲートさせたアイソタイプ特異的第２抗体を使用して、結合した抗体を検出する。ついで、結合した第１および第２抗体を含む膜を公知の側色または蛍光光度法技術を用いて発色させ、公知の方法によって定量する。
【００５０】
最も好ましい態様において、抗−ママスタチン抗体を用いて該サンプルをウエスタンブロットなどによりママスタチンのリン酸化に関して分析する。高分子量（５３／４９kDa）ママスタチンの減少または不在が乳癌の進行と相関がある。
【００５１】
組換え発現ベクターおよび形質転換した細胞
本発明の組換え発現ベクターは、精製ママスタチンタンパク質およびその部分の製造および増幅に、および診断法および治療法において使用されるママスタチンタンパク質およびその部分の簡易単離に有用である。
【００５２】
2.434kbママスタチンcDNA（配列番号：１）の全部またはその一部などの標的配列は、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞に関してはpＵＣ１８、pKC３３０、pBR３２２、ｐKK１７７−３、ｐＥＴ−３、ｐｃＤＮＡ３（イン・ビトロゲン（In Vitrogen））などの適当な核酸配列発現ベクターにクローニングされ、および昆虫細胞における発現にはpＡｃＤ３Ｘバキュロウイルス発現ベクター（ファーミンギン（PharMingin）、サン・ディエゴ、カリフォルニア）にクローニングされ、標準的な方法によって公知のシステムにクローニングされる。市販されており利用可能な発現ベクターは、標的配列が転写および翻訳調節領域へ作動可能に結合するようなベクターの部位へのクローニングのため提供する。
【００５３】
ついで、リン酸カルシウム法、リポソーム媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーションなどの公知の方法を用いて適当な宿主細胞に発現ベクターが導入される。適当な宿主細胞には、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞、High 5およびSF9昆虫細胞、バキュロウイルスおよび酵母細胞を挙げられる。他の宿主細胞には、大腸菌（E.coli）DH5αなどの大腸菌株、およびサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）などの無毒性同遺伝子型サルモネラ種のアデニル酸シクラーゼを欠乏した欠失変異体およびcAMP受容体タンパク質、異種遺伝子内のサルモネラ変異体およびBio/Tech、６：６９３（１９８８）に記載されるような他のサルモネラワクチン株を挙げられる。
【００５４】
好ましくは、該細胞宿主は真核細胞であり、適当な折り畳みおよびリン酸化した活性型インヒビターを製造するためのキナーゼ活性を持つタンパク質を発現することができる。宿主細胞は、ママスタチンをコードするｃＤＮＡでトランスフェクションすることによってスクリーニングされるであろう。形質転換した細胞によって製造されたタンパク質の分析は、例えば、イムノブロットにより、および以下の実施例に記載するように、例えばＭＣＦ７細胞増殖などの乳房細胞の増殖を阻害するためのタンパク質の能力によって潜在的に宿主細胞になり得るシステムをスクリーニングするのに使用することができる。
【００５５】
標的核酸配列で形質転換された宿主細胞をコロニーハイブリダイゼーションまたはママスタチンタンパク質に特異的な抗体との応答性を含む多様な方法によってスクリーニングする。形質転換した細胞は、pcＤＮＡ３または他のプラスミドまたはママスタチンをコードする核酸配列を含む他のベクターを運搬する適当な宿主細胞である。そのような１つのプラスミドはpMammAからの２.４kbBamHI-XhoIインサートを運搬するpcＤＮＡプラスミド（pMammＢ）であり、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９６年２月２２日に寄託し、受託番号第９７４５１号を付与されている（実施例５参照）。
【００５６】
特異的な標的DNA配列を含む発現ベクターは、ママスタチンタンパク質の全部または一部をタンパク質製造用細胞宿主に挿入することによるイン・ビトロ転写および翻訳よって製造するために使用される。発現ベクター系から製造されたタンパク質は正常および癌性の乳房細胞の増殖を阻害する（実施例７参照）。例えば、該ベクターでトランスフェクションされたCos7宿主細胞などの真核細胞は、ならし培地中で、ママスタチンを発現および分泌する。ならし培地は正常および癌性の乳房細胞の増殖を阻害する（実施例８参照）。
【００５７】
アミノ酸配列
ママスタチンタンパク質（配列番号：２）は、核酸配列（配列番号：１）から推定される配列を保有する約２４００アミノ酸残基のポリペプチドであり、表１に示す。クローニングされたママスタチン核酸配列（配列番号：１）から合成されるタンパク質は乳癌細胞（MCF-7)増殖を阻害する。
【００５８】
組換えママスタチンタンパク質は、精製形態でかつ大量に有効に製造することができる。精製した組換えママスタチンは、患者のサンプル中でインヒビターの診断アッセイのための信頼できる標準として有用である。組換えママスタチンタンパク質はまた、乳癌細胞の増殖を阻害または妨害するための精製された治療剤として有用でもある。
【００５９】
治療的使用
治療的使用のためのママスタチンタンパク質は、無血清条件下または組換え手段によるＮＨＭＣ培養物から製造される。ママスタチンリンタンパク質は治療的に使用され、例えば乳癌の治療における乳房細胞の増殖を阻害する。好ましくは、ママスタチンは該タンパク質のリン酸化を達成するために高等真核細胞において製造される。組換えママスタチンタンパク質は宿主細胞または合成手段によって製造する。
【００６０】
機能的なママスタチンを公知の方法によって患者に投与し、リンタンパク質の投与に関しては好ましくは注入によって投与し、血流におけるインヒビターのレベルを増加し、乳房細胞とインヒビターの相互作用を高める。
【００６１】
該タンパク質は、リン酸化タンパク質治療剤の送達に関する当該技術分野において公知の方法によって患者に送達されてよい。概して、該インヒビターはデリバリービヒクルと混合し、注入によって投与される。
【００６２】
投与されるべきインヒビターの用量は当業者によって決定され、治療モダリティー（modality）の型および疾患の程度によって変化するであろう。ママスタチンは、１０ng／mlの濃度で乳癌細胞の約５０％を阻害し、イン・ビトロで約２０−２５ng／mlで増殖を停止し、有用な治療用法範囲は１日用量約２.５μｇから約２５０μｇの投与である。好ましくは、約１２５μｇ／日の投与量である。投与の目的は、生理学的範囲からわずかに高い範囲（５０〜７５ng／ml）で最終的な身体用量となる。インヒビターの高用量（>５０ng／ml）により、処理細胞の組織化学にみられるようにアポトーシスが誘発される。臨床的使用に関して、好ましい用量の範囲は、転移性疾患の初期治療のために約５００ng／mlであり、その後約５０ng／mlの維持用量となる。以下の実施例において報告された最初の臨床研究は、約５０ng／ml〜約７５０ng／mlの１日投与量が第IV段階の乳癌患者における寛解を誘発するのに十分であることを示している。
【００６３】
活性化ママスタチンがリン酸化タンパク質であるため、インヒビターの複数の投与は患者の血液中のママスタチンの増殖阻害レベルを維持するために必要であろうことが予期される。また、ママスタチンは一般的に細胞殺傷剤よりは細胞増殖抑制性剤として機能するので、該インヒビターの最大効果は、乳癌患者におけるインヒビターレベルの一定の維持を必要とすると予期される。
【００６４】
その好ましい使用において、ママスタチンは腫瘍の寛解を誘発するための（>５０ng／ml、好ましくは５０〜５００ng／ml）高用量で投与される。癌細胞増殖を妨害するためには、より低い維持用量（>５０ng／ml、好ましくは２０〜５０ng／ml）が使用される。
【００６５】
第IV段階の乳癌患者において投与されたママスタチンでの臨床経験は、有用な用量とは血液中のママスタチンの生理学的レベルを維持するものであることを示す。投与は、毎日が好ましく、しかし例えば、持続的な注入、徐放性補給（depot）、または２−３日ごとに１回の注入などによってもよい。逸話としての証拠は、持続的な投与はフィードバック阻害を誘発し、従って好ましい投与計画は約２５〜２８日間毎日ママスタチンを投与した後、２〜５日投与をやめることを示唆する。
【００６６】
診断的使用
ヒト組織および血清中の機能的なインヒビターの存在を検出するための本発明のアッセイは、乳癌の罹患の高い危険性を保有する集団のスクリーニング、乳癌発症の早期発見および治療期間中の患者のインヒビターレベルのモニターのため、乳癌患者のスクリーニングに有用である。例えば、患者の血液ママスタチンの分析は、正常のコントロールまたは該患者の以前のママスタチンのプロファイルに比較して、高分子量のリン酸化ママスタチンの量の減少を示すかもしれない。そのような変化は乳癌の危険の高まり、乳癌の早期発症、および転移性乳癌の進行と相関がある。リン酸化、活性化、４９／５３ｋDママスタチンに関する診断アッセイは、例えば、ウエスタン・ブロット、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイによるか、または特異的な抗−ママスタチン抗体を用いる。例えば血清中などのスクリーニングは、例えば、ドット・ブロット・アッセイなどのイムノアッセイによるのが好ましい。
【００６７】
最良の結果のため、患者のサンプルはサンプリングから短期間内で（１週間以内で）アッセイされるべきであり、４℃で保存され（１年以内）るか、または凍結させて長期保存するべきである。サンプルはアッセイの時期まで凍結させているのが最も好ましい。
【００６８】
アッセイキット
本発明の具体的な態様において、患者の液体および／または乳癌組織中のママスタチンの検出のためのアッセイキットが提供される。スクリーニングアッセイは、血清中のママスタチンを検出または定量するためのドット・ブロット・アッセイなどのイムノアッセイが好ましい。そのようなスクリーニングキットには、抗−ママスタチン抗体およびコントロール抗体を含む場合もあり、および／またはママスタチンコントロールまたは標準を含む。第２のスクリーニングアッセイは乳房組織のママスタチンを分析する。該アッセイキットには必須試薬および該組織が乳房上皮であることを特異的に決定するための抗体、例えば抗−サイトケラチン抗体および特異的な抗−ママスタチン抗体と該組織を反応させるための手段を含む。市販されており利用可能な抗体混合物であるパン−ケラチン（シグマ（Sigma））は好ましい抗−サイトケラチン抗体である。
【００６９】
ママスタチンのネガティブアッセイは、乳癌腫瘍の存在または非上皮乳房組織によって引き起こされる。抗−サイトケラチン抗体の使用により、誤ったポジティブアッセイに対して警戒する。抗−ママスタチン抗体で染まらないか、または４４kDママスタチンのみを発現する乳房上皮細胞は形質転換細胞である。従って、例えば乳房組織から単離され、および抗−サイトケラチン抗体で陽性となるような乳房上皮しての組織を最初に同定し、ついで抗−ママスタチン抗体との第２の陽性反応を同定することによって偽陽性が避けられる。
【００７０】
乳癌細胞の約３０％が非リン酸化不活性の４４kDママスタチンを発現することが実験により明らかだったので、分析の好ましい方法は、例えばウエスタン・ブロット分析などによって、５３／４９kDおよび４４kD形態の間で区別することである。
本発明はさらに以下の実施例を参照して定義される：
【実施例１】
【００７１】
ヒト乳房細胞ｃＤＮＡライブラリー
ｃＤＮＡライブラリーを整復乳房形成術（UM病院（UM Hospital））から得られるヒト乳房細胞から調製した。総ＲＮＡを塩化セシウム勾配により乳房細胞から単離した。総ＲＮＡ調製物からｍＲＮＡを単離した。使用された方法はガーナー（Garner I.）「アイソレーション・オブ・トータル・アンド・ポリ・Ａ＋ＲＮＡ・フロム・アニマル・セルズ（“Isolation of total and poly A+RNA from animal cells”）」、Methods Mol. Biol.（１９９４）２８：４１−７に記載されている。
【００７２】
単離されたｍＲＮＡの存在下での逆転写はｃＤＮＡを製造し、ついでEcoRIリンカーにライゲートした。ｃＤＮＡをEcoRI切断T4DNAリガーゼ処理したラムダZapに挿入し、ついでショート（Short JM.）ら（１９８８）Nucleic Acids Research １６：７５８３に記載される方法に従って大腸菌XL1-blue中で増幅した。
【実施例２】
【００７３】
ママスタチンオリゴヌクレオチドの調製
実施例１で調製した正常ヒト乳房細胞ｃＤＮＡを、変性オリゴヌクレオチドを用いてママスタチンをコードする核酸の存在に関してスクリーニングした。その変性オリゴヌクレオチドは以下のようにして得た：
【００７４】
正常ヒト乳房細胞をミシガン大学病院形成外科より、または共同ヒト組織ネットワーク（Cooperative Human Tissue Network）より入手した。その組織をソウル（Soule）ら、In Vitro, ２２：６（１９８６）に記載される手法に概して従い、コラゲナーゼ処理により還元した。
【００７５】
乳房細胞を４０μM CaCl2で調合したＤＭＥＭ／Ｆ１２低カルシウム培地中で、１７５cm２フラスコ中でコンフルエンスに達するまで増殖させ、ついでソウルら、In Vitro, ２２：６（１９８６）に記載される手法に従い、５％ＣＨＥＬＥＸ処理したウマ血清（シグマ）、０.１μg／mlのコレラ毒素（シグマ）、０.５μg／mlヒドロコルチゾン（シグマ）、１０ng／ml上皮増殖因子（ＥＧＦ、コラボラティブ・リサーチ（Collaborative Research）、ベッドフォード、マサチューセッツ）、１０μg／mlインシュリンおよび１μg／mlペニシリン／ストレプトマイシンを補給した。ウマ血清をCHELEXレジンで室温で3時間処理して血清カルシウムを除去した。
【００７６】
細胞溶解産物は、細胞をTBSですすぎ、テフロン製のスクレーパーでフラスコからこすりとることによって調製した。細胞を遠心分離によって回収し、８M 尿素、５０mMトリスpH7.5、０.５％β−メルカプトエタノール、０.５％TRITON X-１０００（溶解バッファー）で溶解させ、氷上で3分間超音波処理した。
【００７７】
該細胞溶解産物を溶解バッファーで平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（Sephacel）陰イオン交換樹脂（シグマ）上で分画した。溶解産物を樹脂を満たしたカラム（５０mlの使い捨て、バイオ・ラド（Bio Rad)）上にロードし、ついでカラムの容量の10倍量の溶解バッファーで洗浄した。物質は、重力の供給によってのみカラムから流出した。画分は、最初に、塩の存在下で溶出バッファー（８Ｍの尿素２５０mlおよび５０mMのトリスｐH７.５）を最初に含む閉鎖混合チャンバーに５ＭのNaClを含む溶出バッファーを持続的に重力の供給によって流して製造された塩勾配で溶出した。
【００７８】
溶出画分（２ml）をギブソン（Gibson）画分コレクターによって回収し、上記のように抗−ママスタチン抗体である７G6でドット・ブロットによって乳房細胞増殖インヒビターの存在に関して分析した。
【００７９】
陽性の画分を保存し、５０mMのNaClで溶解バッファーに透析し、再度同一のイオン交換カラム上で分離し、５０mMのNaClを含む溶出バッファー中のpH勾配（ｐH8〜ｐH３）を持続的に減少させて溶出した。（pH勾配をつくるために、pH３の緩衝尿素を持続的に最初のｐH８のバッファーに混合した。）画分（２ml）を回収し、上記のように７G6抗体で分析した。
【００８０】
陽性の画分を再び保存し、ついで濾過遠心分離によってもともとの容積の１／１０のに濃縮した（アミコン・セントリプレップ（Amicon Centriprep）、１０kD切断）。濃縮した保存物を前もって染色した分子量標準（シグマ）とともに分取SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)によってサイズ分画した。
【００８１】
分子量４０〜６０kD間の分子中に含まれるタンパク質を０.５cmのストリップまたは画分でゲルから切り出した。各ゲルのストリップからのタンパク質の電気溶出を透析チューブ中でランニングバッファー（１９２ｍMのグリシン、２５mMのトリス（ｐH8.3）、0.1％SDS）１ml中にそのゲルストリップを置くことによって行った。そのチューブをサブマリン電気泳動装置中に設置し、終夜２５ボルトで電気溶出した。電流を２分間逆行させ、ランニングバッファー（現在は溶出したタンパク質を含む）を除去した。溶出したタンパク質の純度を、銀染色で分析SDS PAGEによって、またトウビン（Towbin）ら、J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 27：４９５〜５０１（１９８９）に記載されるような手法に従いチェックした。銀染色PAGEによって決定されるように少なくとも７０％純度の画分を貯蔵し、濃縮し、ついで凍結乾燥して粉末形態とした。
【００８２】
貯蔵されたタンパク質を５００μlの７０％ギ酸中に凍結乾燥した粉末を溶解し、２０mg／mlの臭化シアン（シグマ）で室温で終夜（約２０時間）インキュベートすることによって、臭化シアンで開裂させた。使用した方法はフリーモント（Freemont）ら、Arch. Biochem. Biophys. ２２８：３４２−３５２（１９８６）中に記載されている。臭化シアン開裂タンパク質のサンプルを２回蒸留し、脱イオン化した水に透析し、再び濃縮し、ついで凍結乾燥して粉末とした。
【００８３】
臭化シアン開裂は、もともとのタンパク質サンプルからのマルチプルペプチドを産生し、分取１５％SDS PAGEおよび電気溶出によってPVDF膜上にトランスファーすることによって分離した。
【００８４】
乳房細胞溶解産物から得たタンパク質に加えて、タンパク質はまた正常ヒト乳房細胞ならし培地から単離された。正常細胞をリン酸欠如した８mlのDMEMでインキュベートし、２００μCi／mlの３２P-オルトリン酸および１％の透析したウシ胎児血清を補った。細胞をならし培地を回収する前に、３２P存在下で２４時間増殖させることができた。
【００８５】
回収したならし培地を１０ｋDの排除制限でアミコン濾過により５倍の濃度にまで濃縮した。濃縮した培地を濾膜上でPBSで１回漱ぎ、取り込まれていない過剰なリン酸を除去し、ついでさらにPBSで溶出したS-200SEPHACRYL（ファルマシア（Pharmacia）、ウプサラ、スウェーデン）分子篩クロマトグラフィー（１００cm×０.７５cmカラムによって分画した。フィルターとカラムの両者によりサンプルから未取り込み３２Pの除去を可能にする。１mlの画分をカラムから回収し、シンチレーションカウンティングにより標識した画分を同定した。放射活性画分を保存し、ついで銀染色およびオートラジオグラフィーをともなってSDSPAGEによって分析した。保存されたタンパク質を濃縮し、凍結乾燥して粉末とし、ついで臭化シアン開裂の前に上記のように精製した多量の未標識タンパク質と結合させた。標識したタンパク質の添加はリン酸化ママスタチンペプチドを含む臭化シアン開裂断片のトレースの便利な方法を提供する。開裂したペプチドを上記のように分取PAGE上で分離した。
【００８６】
放射活性タンパク質を臭化シアン開裂し、分離してPVDF膜にトランスファーし、X線フィルムに曝した後、２つの標識された約２０kDおよび２２kDのバンドが見ることができた。これら２つのペプチドを膜から切り出し、ウラー（Ullah Alt）らBiochem. Biophys. Res. Comm. ２０３：１８２−１８９（１９９４）に記載の方法を用いて、ユニバーシティ・オブ・ミシガン・バイオメディカル・リサーチ・コア・ファシリティー（University of Michigan Biomedical Research Core Facility）でエドマン法によってシークエンシングした。２つのペプチドの各々のアミノ酸配列をNIH「BLAST」サーバーを用いて公知のデータベースと比較した。その２つのペプチドは新規であることがわかった。
各配列の特に独特の配列を使用して縮重オリゴヌクレオチドを製造し、ジェララ（Jerala）、Biotechniques１３：５６４−５６７（１９９２）において記載される方法による標準的な第３の位置の縮重を用いた。２０kDペプチドから該配列
2010031013.tif 000004
（配列番号：２）
を使用した。：２２kDのペプチドから配列
2010031013.tif 000005
（配列番号：３）
を使用してオリゴヌクレオチドの複数の種を製造した。縮重オリゴヌクレオチドを高圧液体クロマトグラフィーによって精製した。
【００８７】
【表３】
2010031013.tif 000006
【００８８】
変性オリゴヌクレオチドを３２P−γATPおよびT4ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ、ベテスダ（Bethesda）、メリーランド）で末端ラベルし、再度Ｔ４ＤＮＡキナーゼバッファー（６０mMのトリス（pH 7.8）、１０mM MgCl2、１５mM β−メルカプトエタノール）を1.5mg/mlで再度懸濁させた。ついでオリゴヌクレオチド（２５０μＭ）を０.３３μＭのＡＴＰ、２５μlのキナーゼバッファー中の５単位のキナーゼと３７℃で2時間インキュベートした。３２P‐リン酸の取り込みをＴＣＡ沈殿（１５％ＴＣＡ、４℃、15分）によって決定した。典型的な取り込みは１０９cpm／mgＤＮＡであった。
【実施例３】
【００８９】
変性オリゴヌクレオチドでの乳房細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
正常乳房細胞ｃＤＮＡインサートを含む実施例１で調整したファージに感染させた細菌を、トップアガー（感染細菌培養の１／１０希釈から７％NZYMトップアガーの６ml）プレート１５cmのNZCYM(１０ｇ、NZアミン（ベーリンガー・マンハイム）、５ｇのNaCl、５ｇの酵母抽出物、２ｇのMgSO4、１ｇのカサミノ酸）上にプレーティングした。プラーク含有プレートにファージの変性（denaturation）の前15分間ニトロセルロース膜をかけた。ファージを０.５MNaOH、1.5MNaCl飽和したワットマンペーパー上で5分間のブロッティングフィルター（ＤＮＡサイドアップ）により変性させた。フィルターをH2Oで漱ぎ、１Ｍトリス（pH7.0）、1.5ＭNaCl中で5分間インキュベートした後、２０×SSCおよび２×SSCそれぞれ5分間インキュベートした。フィルターを乾燥させ、８０℃で1時間焼くか、または紫外線光線下放置してＤＮＡを固定した。焼いたフィルターを１％ＳＤＳと２×SSC中で30分間洗浄し、ついで５０％脱イオン化ホルムアミド、５×Denhart's溶液、１％ＳＤＳ、５×SSCおよび１００μg／ml変性サケ精子ＤＮＡで３７℃でプレハイブリダイズした。
【００９０】
フィルターを熱変性した（９５℃で５分）標識縮重オリゴヌクレオチド１０７cpm／mlを加えた実施例２に関して記載したように調製した標識した変性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。フィルターを３７℃で３０分間２×SSCで洗浄した後、５０℃で３０分間２×SSCに１％SDSを加えた溶液中で３回洗浄した。フィルターを２×SSCで短く漱ぎ、乾燥させて、ついで２４〜４８時間コダックＡＲ‐５フィルムに露光して陽性プラークを同定した。
【００９１】
陽性プラークを逆２００μl無菌ペプチドチップを用いて切り出したアガープラグから単離し、４℃で終夜ＳＭバッファー中に再懸濁した。第２および第３のプレート（１０cm）をＳＭバッファーを含むファージの１／１０,０００希釈で細菌に感染したＸＬ１−Ｂを用いてNZCYM(１mM MgSO4）中で作成した。プラークを上記のように８時間感染した細菌をインキュベートすることにより製造し、ついで標識した変性オリゴヌクレオチドでスクリーニングする前にニトロセルロースにトランスファーした。スクリーニングは、本質的にはクロチェック（Kroczek, RA.）、J Chromatogr 618：１３３−４５（１９９３）に記載されるのと同様に、１０７cpm／mlの標識したＤＮＡおよび５０℃で３０分間２×SSCの最終的な洗浄ストリンジェンシーを用いて行われた。
【００９２】
さらなる分析に関して選択されたクローンは、両方の変性オリゴヌクレオチドによって認識されるものであった。このクローンは「pMammA」と名づけられた。
【実施例４】
【００９３】
ママスタチンｃＤＮＡのシークエンシング
実施例３で得られた陽性クローンであるpMammAをミシガン大学のバイオメディカル・リサーチ・コア・ファシリティーで自動化シークエンサーを用いてシークエンシングし、ついでまた１５％ＤＮＡシークエンシングゲルを用いたジデオキシシークエンシングおよび３５Ｓヌクレオチドを有する放射標識ＤＮＡ断片によってシークエンシングした。使用した方法はラスケン（Lasken RS）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８２：１３０１−５（１９８５）に記載されている。得られた核酸配列を以下の表１（配列番号：１）に示す。
自動化配列の認識された誤りの割合は約５％である。従って、寄託されたクローンをヌクレオチド配列の確認のために再度シークエンシングし、特に記載されるように、潜在的な過誤の疑いのある部分には注意した。
【実施例５】
【００９４】
ママスタチンｃＤＮＡを発現ベクターにサブクローニングする
ママスタチンｃＤＮＡ挿入物であるpMammAを発現ベクターｐｃＤＮＡ３（イン・ビトロゲン（In Vitrogen）にサブクローニングした。ママスタチンｃＤＮＡを実施例４に記載されたようにして入手したpMammAをBamHIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化することによって単離した。制限酵素はプラスミドをママスタチンクローンインサートの末端で切断し、線形のプラスミド断片および線形挿入断片を作成した。消化したサンプルを電気泳動装置中に沈めた１.２％アガロースゲルのウェル中に静置し、５０Ｖの電流を２時間流した。電気泳動は大きさに基づきＤＮＡ断片を分離し、大きなプラスミドＤＮＡ断片はゆっくりした速度でゲル上を移動する。２.４kbを含むアガロースゲルの一部をエチジウムブロミド染色によって可視化し、ついでゲルを紫外線ボックスの上に置いて観察した。２.４kbママスタチン断片をゲルから切り出し、ついで透析チューブに置き、ついで該ＤＮＡをホウ酸トリスバッファーＴＢＥ（０.０８９Ｍホウ酸トリス、０.０８９Ｍホウ酸、0.002ＭＥＤＴＡ）に電気溶出し、回収し、エタノール沈殿した。
【００９５】
pcＤＮＡ３プラスミドＤＮＡを修飾してライゲーション間のママスタチンｃＤＮＡ断片を受容した。pcＤＮＡ３プラスミドをBamHIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化し、完全に消化した後、そのＤＮＡを子牛腸ホスファターゼの存在下で1時間インキュベートして５'リン酸を除去した。pcＤＮＡ３サンプルをついでフェノール抽出し、エタノール沈殿した。
【００９６】
pcＤＮＡ３およびママスタチン２.４kbｃＤＮＡ断片を一緒にライゲーションした。その２.４kbママスタチン断片および線形のpcＤＮＡ３プラスミドを３：１の割合でＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で混合した。ライゲーション反応は1時間インキュベートした後４℃で終夜保存した。ライゲーション反応が完了した後、そのＤＮＡを使用して大腸菌コンピテント細胞を形質転換した。サブクローニングをアンピシリン選択コロニーからプラスミドＤＮＡを精製することによって確かめた。そのプラスミドをBamHIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化した。消化したＤＮＡサンプルをアガロースゲル上に置き、ついで電気泳動で分離した。正確な大きさのママスタチンＤＮＡ断片を含むプラスミドをpＭammＢと命名し、ついでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection (ATCC)）に1996年2月22日に寄託し、付与された受領番号はＡＴＣＣ９７４５１号である。
【実施例６】
【００９７】
ママスタチンｃＤＮＡ配列からのトランスフェクションおよびタンパク質の発現
Cos７細胞はママスタチンタンパク質と一緒に移動する免疫応答タンパク質を発現しない。pＭammＢおよびPCDNA３を使用してLIPOFECTINR(BRL、ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）、ベテスダ、（Bethesda)、メリーランド）を用いて、製造者の示唆されたプロトコールを利用してCos-7サル繊維芽細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を回収前2日間増殖させた。トランスフェクションした細胞を標準的方法を用いて細胞のトリプシン処理によってプレートから除去した。（トリプシン２.５ml(0.25%シグマ）を３７℃で5分間細胞のフラスコ内でインキュベートした。RPMI培地に１０％FBS（ウシ胎児血清）を補給したものの７.５mlアリコートを加えて細胞を遠心によって回収した。）細胞を血球測定計によって数え、１０７細胞／mlでSDS PAGEサンプルローディングバッファー中で溶解した。細胞溶解産物を８〜１５％のSDS-PAGE勾配ゲル（バイオラド）上で分離し、ついでトウビンらJ. Clin Chem Clin Biochem(1989年8月）２７（８）：４９５−５０１中に記載される方法を用いてナイロン膜にトランスファーした。その膜を抗−ママスタチンモノクローナル抗体７G6でプロービングした。結合抗体をペルオキシダーゼコンジュゲートＧＡＭ−ＩｇＭで検出し、ＥＣＬ（アマシャム）によって発色させた。
【００９８】
図１に示すように、pMammB（レーンＣ、Ｄ）でトランスフェクションしたＣｏｓ-７細胞はママスタチンタンパク質（レーンＡ）と同時に移動する免疫応答性のタンパク質を発現した。空のベクターＰＣＤＮＡ３単独でトランスフェクションしたCos-７細胞はイムノブロット実験が行われる場合に免疫応答性のタンパク質を発現しなかった（レーンＢ）。
ＤＮＡ／ＡＡ配列
【００９９】
【表４】
2010031013.tif 000007
【０１００】
イムノブロット分析はｐMammBクローンが、ママスタチンの大きさおよび免疫学上の特徴を有するタンパク質を合成することができるｃＤＮＡインサートを含むことを示している。さらに、４４，４９および５３kDの免疫応答性のタンパク質がpMammBでトランスフェクションしたCos７細胞において発現した。これらのタンパク質は以前に正常ヒト乳房細胞中に同定したママスタチンと同じ分子量で移動した。この免疫応答性タンパク質の群は、空のベクターpcＤＮＡ３でトランスフェクションしたCos-７細胞中に同定されなかった。
【０１０１】
図１に示す特定のアッセイにおいて、ＮＨＭＣコントロールは通常、４４ｋＤママスタチンを大量に示す。これは４℃でＮＨＭＣ標準の長期（>1年）保存によって製造された人工産物であり、時間をかけて高い分子量の形態の分解を引き起こす。新鮮ＮＨＭＣサンプル（<1年）または凍結サンプルが使用されると、その４４kDタンパク質はいつでも高分子量形態より少ない。
【実施例７】
【０１０２】
GST融合
ママスタチンクローンは同様にバキュロウイルス発現系にサブクローニングされることができる。ｐMammAインサートをファーミンゲン（Pharmingen(サン・ディエゴ、カリフォルニア））から市販されており入手可能であるpAcG3Xにサブクローニングされた。このベクターにより、コーディング領域のGST遺伝子上流の一部を有するグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST)との融合タンパク質として、ママスタチンの製造を可能にした。
【０１０３】
pMammAインサートをBamHI(5'）およびSmaI（３'）制限酵素認識部位、小さい非特異的領域およびママスタチン配列の一部を含むPCRの調製セットによって、サブクローニングした。プライマー３組は、各々はリーディング・フレームにおいて移動し、調製した。プライマーはｐMammAクローンにハイブリダイズし、およびｐMammA鋳型ＤＮＡと典型的なＰＣＲ反応において、ｐAcG3X中のGST遺伝子のリーディング・フレームに挿入することができるｐMammAＰＣＲ産物を増幅した。ついでそのベクターを使用してＨigh５（イン・ビトロゲン）宿主昆虫細胞をトランスフェクションし、グルタチオン樹脂（グルタチオンアガロース、キアゲン（Qiagen)、チャッツワース（Chatsworth）、カリフォルニア）を用いて宿主昆虫細胞から用意に精製したGST-ママスタチン融合タンパク質を発現する。
【０１０４】
pAcG3X（ファーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）のBamHI、SmaI制限部位に挿入するためのＤＮＡを調製するため、プライマーのセットを3つのリーディングフレームを含むように、５'プライマーとしては、BamHI認識部位（GGATCC)、ｐMammA配列の一部およびｐBluescriptベクターからのいくつかの５'配列を含むように調製した。該３'プライマーも同一で、SmaI認識部位（GGGCCC)、ｐMammA配列の一部およびｐBluescriptのいくつかの配列を含むように調製した。
【０１０５】
使用したプライマーのセットを以下の表に示す。
【表５】
2010031013.tif 000008
＊BamHI部位に下線を付す    ＊＊SmaI部位に下線を付す
【０１０６】
1つのプライマーのセットのみ（配列番号：５および７）が活性化阻害ママスタチンをコードすることができるクローンを製造した。その活性化クローンは、High５を形質転換するために使用する場合、形質転換した細胞中で免疫学的に反応性のママスタチンを製造した（図２参照）。他の公知の真核生物発現系を同様にママスタチンタンパクを製造するために使用してよい。
【実施例８】
【０１０７】
イン・ビトロ転写および翻訳によって製造されたタンパク質による阻害アッセイ
イン・ビトロでpMammB、ママスタチンｃＤＮＡの転写をストラタジーンのExpress ＲＮＡ転写キットを用いてママスタチンＲＮＡを製造した。製造されたＲＮＡをストラタジーン・イン・ビトロ・エクスプレス・翻訳キット（Stratagene In Vitro Express translation kit）に翻訳した。ママスタチンＲＮＡの翻訳から製造されたママスタチンタンパク質は培養中で乳房細胞増殖を阻害することを示した。
【０１０８】
MCF-7細胞の培養を上記の翻訳アッセイにて製造したタンパク質産物で処理した。タンパク質産物（容積の５％、培養培地）を１ウェル当たり１mlの培地を含む１２ウェルプレート中の細胞に添加した。平行実験の培養を翻訳産物および抗−ママスタチン抗体３C6の両方で最終濃度３０μg／mlで処理した。
【０１０９】
陰性コントロールとして、培養物をママスタチンｃＤＮＡ（すなわちベクターとして採用）の不在下でインキュベートされたストラタジーン・イン・ビトロ・エクスプレス・翻訳キットで翻訳したタンパク質産物で処理した。これらの溶解産物はママスタチンタンパク質を製造する適当な機構を持たない。
【０１１０】
すべての培養物はタンパク質産物で処理された後、６日間増殖させられ、各サンプルの細胞数をクルターカウンター（Coulter counter）を用いて計算した。各培養条件は３つ同じサンプルを持ち、その結果得られた各サンプルの細胞数を平均し、阻害％をコントロール細胞で処理された網状赤血球に比較することによって決定した。
【０１１１】
図３に示すように、pMammBのタンパク質翻訳産物はMCF-7細胞増殖を阻害した。この阻害は、抗−ママスタチン抗体３C6の存在下で非常に減少されるか、または阻害された。
【実施例９】
【０１１２】
pMammBでトランスフェクションしたCos−７細胞を増殖して得られたならし培地内に存在するタンパク質で乳房細胞を阻害する
乳房細胞の増殖阻害実験を、実施例６に記載するように、pMammBでトランスフェクションしたCos−７細胞から入手したならし培地を用いて行った。ならし培地によって引き起こされる増殖阻害は、抗−ママスタチン抗体の添加によって阻害された。
【０１１３】
MCF-7細胞を１０％可欠アミノ酸およびFBS(シグマ）を補ったMEM培地中で１０４細胞／mlでプレーティングした。細胞を終夜接触可能とし、ついでいずれかからならし培地（３日間培養）の１０％の容量を補った：（１）空のベクターpcＤＮＡでトランスフェクションしたCos-７細胞（陰性コントロール）；（２）pMammBでトランスフェクションしたCos-７細胞（pMammB-Cos）；（３）ＭＨＭＣならし培地、または（４）ならし培地ではない培地である。平行のＭＣＦ−７細胞の培養に３０μg／mlの３C６阻害抗体を補った。処理したMCF−７細胞を６日間増殖させて、ついで血球測定計によって計算した。
【０１１４】
細胞増殖の阻害を、ならし培地中でインキュベートしたMCF-７細胞の増殖とコントロール、条件付けしていない培地中でインキュベートしたMCF-７サンブルックの増殖と比較することによって決定した。データを図４に示し、pMammB形質転換した細胞からのならし培地は正常のヒト乳房細胞ならし培地と同様に有効に乳癌細胞増殖を阻害した。この阻害は抗−ママスタチン抗体の存在下で阻害された。
【実施例１０】
【０１１５】
３つの免疫学的に応答性の抗‐ママスタチンタンパク質
正常ヒト乳房細胞全体（NHMC)および組織培養細胞中の乳癌部位を溶解し、細胞溶解タンパク質を上記のように、およびアービン（Ervin, Paul）１９９５、博士論文、ミシガン大学第２章に記載されるようにSDS／PAGEによって分離された。溶解したサンプルをミニ−プロテインII(Mini-Protean）装置（２５μg／ サンプル）で１０％のSDS−PAGE上で分離した。タンパク質をニトロセルロースへトランスファーし、抗−ママスタチンモノクローナル抗体７G6またはIgMコントロール抗体、アルカリフォスファターゼコンジュゲートタンパク質、ヤギ抗−マウスIgMは陽性の抗体の反応を色彩学的に検出するNBT／BCIP基質系とともに利用した。そのデータを図５に示す。
【０１１６】
【表６】
2010031013.tif 000009
【０１１７】
図５に示すように、正常のヒト乳房細胞は抗−ママスタチンモノクローナル抗体および第３の弱い免疫応答性の４４kDタンパク質によって強く認識される。試験した４つの腫瘍細胞株は４４kD免疫応答性タンパク質単独（レーン１、４）または免疫応答性では全くないタンパク質（図２、３）のいずれかを発現した。
【０１１８】
上記のデータは数年の期間をかけて４２名別個の乳房薬物新生物の低減からの正常細胞から得られる細胞における実験の見本である。正常細胞および癌細胞株の４４kDタンパク質の発現は各調製での強度によって変化する。
【実施例１１】
【０１１９】
ママスタチンはリンタンパク質である
乳房細胞の細胞性のリン酸化タンパク質を３２P-リン酸（２００μCi／ml）で正常の乳房細胞培養中に２４時間封入し３２Pでラベリングした。ならし培地をアミコン遠心により３０kD分子量制限を用いることによって５倍に濃縮した。
【０１２０】
濃縮された培地を濾過膜上でPBSにて１回漱ぎ、過剰な未取り込みリン酸を除去し、PBSで溶出したS-200SEPHACRYL（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）分子篩クロマトグラフィー（１００cm×０.７５cmカラムによって分画した。イムノブロットを上記のように調製し、７G6抗体でプロービングした。
【０１２１】
放射性標識した５３kDママスタチンタンパク質を免疫沈降によってならし培地中で同定した。この分析はママスタチンが分泌リンタンパク質であることを示唆している。分泌リンタンパク質は一般に知られていないので、細胞のブレフェルディン（Brefeldin）A処理が利用されて、ママスタチンが分泌または細胞破損または漏出によりならし培地中に存在するか否かを決定する。ブレフェルディンAは真核細胞からのタンパク質の分泌を阻害する真菌化合物である。ブレフェルディンAは正常の小胞体およびゴルジの機能を阻害し、小胞生成を阻害する（アービン・ポール、１９９５、学位論文、第２５頁）。たいていの分泌タンパク質は膜結合小胞からの細胞外の工程によって細胞から遊離され、小胞生成を阻害することは多くのタンパク質の分泌を阻害する。NHMCがブレフェルディンAの存在下で増殖する場合、リン酸化ママスタチンはならし培地中に同定されなかった。
【０１２２】
ママスタチンタンパク質中でリン酸化されるアミノ酸配列を決定するため、放射性標識した５３kDタンパク質をリン−アミノ酸分析にかける。MHMC細胞を３２P-リン酸と２４時間インキュベートした。ついで、細胞溶解産物を抗−ママスタチン抗体７G６で免疫沈降し、以下のように精製した。その５３kDタンパク質をトリプシンで消化しついで、酸で脱水した。２次元の薄い層のクロマトグラフィーを使用してママスタチンのリン酸化アミノ酸を分析した。３２P-リン酸をホスホ−ser/thr/tyrコントロールで結合させ、ついで最初の（０）２DTLCプレート（２０cm）にロードした。そのサンプルを２次元で分けた：第１次元−ｐH1.9バッファー（５０mlギ酸、１５６ml氷酢酸／２０００ml（１７９４H2O)）、２０分1.5Kボルト流し；時計回りに回転させる；第2次元−ｐH３.５バッファー（１０mlピリジン、１００ml氷酢酸：１８９０ml H2O)）、16分1.3Kボルト流し；時計回りに回転させる。
【０１２３】
TLCプレートをニンヒドリン染色し、フィルムに曝した。リン酸−アミノ酸分析は５３kDママスタチンタンパク質が3つの異なるタンパク質のリン酸アミノ酸残基を燐酸化する3つの型を含み、リン酸アミノ酸標準で染色したニンヒドリンに対してのオートラジオグラフを含むことによって証明される。
【０１２４】
トレオニン（Threonine(Th))は最も豊富なリン酸アミノ酸であり、続いてセリン（Serine S)およびチロシン（Ty）であり、チロシンが最も少ないリン酸化種であった。しかしながら、リン酸アミノ酸残基の相対的な豊かさはそのままのタンパク質におけるものを代表するものではなくてよい。というのは、脱水はリン酸チロシン残基を遊離させることができるからである。
【実施例１２】
【０１２５】
多様なリン酸化での1つのママスタチンタンパク質
タンパク質の細胞リン酸化はホスファターゼおよびキナーゼによって調節されることができる。ママスタチンは、ママスタチンホスファターゼの異なる活性のために、正常および腫瘍細胞溶解産物中で別々にリン酸化される。NHMC溶解産物中のママスタチンへ及ぼすホスファターゼの効果を試験した。
【０１２６】
NHMCを低カルシウム培地中でコンフルエンスに達するまで増殖させTBS中にこそぎとることによって回収した。細胞をTBSで洗浄し、２mg／mlの正確にｐH6.6のバッファーに０.５％のTritonX-100を加えて再懸濁した。５μg／mlのイェルシニアホスファターゼ（Yersinia phosphatase）（YOP)（スタッキー（Stuckey）ら、Nature 370:571-5(1994））または活性化部位を含むイェルシニアホスファターゼ変異体（MYOP）を使用して、３７℃で6時間細胞溶解産物を消化した（YOPおよびMYOPはミシガン大学、生化学研究室のディクソン（S.Jack Dixon）博士より入手）。ついで細胞溶解産物を１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離し、ママスタチンタンパク質を７Ｇ６.６イムノブロットによって同定した。図６に示すように、正常ヒト乳房細胞溶解液のイェルシニアホスファターゼ（YOP）での消化は抗−ママスタチンイムノブロットによって同定された５３kDママスタチンタンパク質の減少した量となった(レーンA)。対照的に、イェルシニアホスファターゼ変異体（MYOP、レーンB）での消化は５３kDのママスタチンタンパク質の同定を変化させなかった。このような結果はイムノブロットによる５３kDママスタチンタンパク質の同定がママスタチンタンパク質のリン酸化の状態の便利な手段であることを示す。
【０１２７】
イェルシニアホスファターゼ（YOP）の存在下でインキュベートしたならし培地をMCF-7を処理するために使用した。以前の観察のように、NHMCならし培地はMCF-7細胞の増殖を阻害し、ついでこの阻害は抗−ママスタチン抗体によって妨害される。図７に示すように、YOPによりNHMCならし培地はこの阻害活性を廃止させる。コントロールとして、NHMCならし培地のホスファターゼ活性（M.YOP）を欠如したYOP変異体処理が試験された。この変異体はNHMCならし培地の阻害活性に影響は全く及ぼさなかった。抗−ママスタチン抗体７G６を含むならし培地の免疫沈降はその阻害活性を除去した。
【０１２８】
TCA沈降はYOPでならし培地のインキュベートが取り込みリン酸の約５０％を除去することを示した。上記に示すように、YOPはまたNHMC溶解産物からの５３kD種を除去した（図６）。
【実施例１３】
【０１２９】
癌性乳房細胞ではなく、正常乳房細胞により製造されたリン酸化ママスタチン
正常かつ形質転換した乳房細胞を３２Pオルトリン酸で標識した。ＭＣＦ−７細胞を別として（１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸およびインスリン（１０mg／l）を添加したＭＥＭ（セロックス（Cerox））中で増殖させた）、癌腫細胞株をＡＴＣＣの示唆どおりに培地中で増殖させた。細胞タンパク質の３２Pオルトリン酸標識を２％の透析したFBSを含むリン酸不含DMEM(ICN)中で行った。細胞を２００μCi／ml３７℃で２４時間インキュベートした。４８時間後、ならし培地を細胞培養液から回収し、５倍に濃縮させた。ならし培地をTBSで洗浄し、ついで１０kD分子量のカットオフのアミコン・フィルターで濃縮した。その細胞層をこそぎとり（テフロン細胞スクレーパー使用）、溶解バッファー、細胞溶解産物およびならし培地から１.５ml／フラスコ（０.５％Toriton X-100、デオキシコール酸で２.０１％SDS）にこすりとった。
【０１３０】
ママスタチンタンパク質を５倍の濃度の培地または細胞溶解産物５００μlあたり５μgの７G6抗−ママスタチン抗体を加え、室温で1.5時間インキュベートすることによって免疫沈降した。ヤギ抗‐マウスIgM第２抗体（５μg／0.5ml）を加え、ついで混合物をさらに1時間インキュベートした。タンパク質GPLUS/AアガロースRスラリー（オンコジーン・サイエンス（Oncogene Science））を加え、ついで該混合物を室温で1.5時間インキュベートして抗体複合体を固定した。
【０１３１】
複合体を溶解バッファーで６回洗浄し、各回の洗浄ののち３０００×ｇで遠心した。SDS-PAGEローディングバッファー（５０μｌ）を加えた後、サンプルを１００℃で3分間加熱した。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロースにトランスファーし、さらにコダックＸ−ＡＲフィルムに露光した。
【０１３２】
ＮＨＭＣタンパク質のリン酸ラベリングおよび続く免疫沈降は、ＮＨＭＣ中の４９ｋＤおよび５３ｋＤリンタンパク質を同定した。癌腫細胞株ＭＨＣ−７、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ−７５−１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５は４４kD免疫応答性タンパク質を発現するが、このタンパク質は３２P−オルトリン酸で標識しなかった。
【０１３３】
本実験は、増大したママスタチンの分子量ではより多くのリン酸が取り込まれていることを示す。形質転換した細胞中のママスタチンのリン酸化の欠如はそのタンパク質の高分子量形態の欠如およびママスタチン阻害活性の欠如に相関する。
【実施例１４】
【０１３４】
ママスタチンキナーゼおよびホスファターゼ
正常細胞または癌腫細胞のフラスコを７５％のコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞培養物をTBSで3回洗浄し、ついでテフロンスクレーパーを用いてTBS中にこそぎ入れた。細胞懸濁液を１０００ｇの遠心でペレット化し、ついで少量のTBS中に再懸濁した。各型の細胞のアリコートをタンパク質定量のため、除去した。ついで、タンパク質濃度は溶解バッファー（０.５％TritonX−１００および、各々にアプロチニン（aprotinin）５μg／ml、ロイペプチンおよびPMSFを加えたTBS）２mg／mlで平衡化した。正常細胞タンパク質および腫瘍細胞タンパク質の等量を混合し、３７℃で3時間インキュベートした。正常および癌腫細胞の平行混合を１０ｎＭオルトバナジウム酸塩（Orthovandate(NaVO4))、ホスファターゼインヒビターの存在下で行った。ついで混合物をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、７Ｇ６抗体を用いてウエスタンブロットによって分析した。そのデータを図８に示す。
【０１３５】
【表７】
2010031013.tif 000010
【０１３６】
図８に示すように癌細胞（ＺＲ−７５−１）（レーンＡ）はＮＨＭＣ(レーンＢ）に比較して、５３／４９kDママスタチンを製造しなかった。正常細胞タンパク質および癌細胞タンパク質をプロテイナーゼの存在下で混合することによって活性化５３kDインヒビター（レーンD)の量が減少する。しかしながら、チロシン−ホスファターゼインヒビター（NaVO4)の存在下で、５３kD種は混合物(レーンC)中に保有されている。これらの結果は癌腫細胞はママスタチンのリン酸化形態を排除することができるホスファターゼ活性を発現することを示している。
【０１３７】
正常細胞株および形質転換株のママスタチンの発現はウエスタンブロット分析ンにより定量的に測定することができる。抗−ママスタチンモノクローナル抗体を用いて、乳癌細胞および正常乳房上皮からの細胞間のタンパク質の発現に一貫した差異が存在することを示していた。ママスタチンは、抗−ママスタチンモノクローナル抗体７G6でウエスタンブロット分析によって４４、４９および５３kD種がヒト正常女性乳組織中に認識された。乳癌細胞において、４４kD種の一貫しない認識があったが、４９または５３kD免疫応答性形態ではなかった。４９および５３kD形態を正常細胞中で同定すると、それらはリン酸化されている。４４kD種はリン酸化されていない。従って、ママスタチンの４４および４９および５３kD種の発現を観察することによってママスタチンがリン酸化されているか否かの決定のためにイムノブロット分析を使用することができる。
【実施例１５】
【０１３８】
ヒト血清中でのママスタチンの同定
酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA)を精製抗−ママスタチンモノクローナル抗体である６B8および３C6を用いて、ママスタチンの検出のために確立した。
【０１３９】
抗体６B8を使用して、１０μg／mlまたは１００μl／ウェルの濃度で、室温で３時間または４℃で終夜、イムロン １（Immulon 1）９６ウェルマイクロタイタープレート（イムロン社）をコートするために使用した。プレートをTBS（１５０mM NaClｍMのトリスｐH7.4）中での２％BSA(シグマ）で３０分間ブロッキングし、ついで２％BSA溶液に５０％に希釈した精製ママスタチンまたはサンプル血清とともに３７℃で1.5時間インキュベートした。第2抗体を加える前にマイクロタイタープレートを３００μl／ウェルのTBSプラス0.1％TritonX-１００で5分間ずつ、3回洗浄した。
【０１４０】
第2抗体はビオチン化した３Ｃ６であった。抗体は、０.１ＭのNaHCO3中でビオチン、Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル（N-hydroxy succinimate ester）（シグマ）と室温で2時間または４℃で16時間インキュベートすることによってビオチン化した。抗体を使用の前または保存前に、１MのNaCl、５０mMのトリス（ｐH7.4）、０.０２％のアジ化物（NaN3、シグマ）に透析した。
【０１４１】
ビオチン化した抗−ママスタチン抗体を１μg/mlで２％BSA／TBS溶液中で１００μl／ウェルに添加し、３７℃で１.５時間インキュベートした。マイクロタイタープレートを上記のようにTBSと0.1％Triton X-100の混合物で5分間で5回洗浄した。第2抗体をアルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジン（サザン・バイオテクノロジー（Southern Biothechnology））で同定し、ついですべてのサンプルについて１００μl／ウェルで２％BSA/TBS中で１／１０００希釈で1時間インキュベートした。
【０１４２】
ELISAアッセイをＰＮＰＰ（パラニトロフェニルホスフェート、シグマ）をアルカリホスファターゼバッファー（１０mMジエタノールアミンｐH9.5（シグマ）、０.５０mMのMgCl2（シグマ））中で１mg／mlにて比色的に発色させた。マイクロタイタープレートを１５分間および３０分間隔で４０５nmでＥＬＩＳＡリーダー上で読みとった。
【０１４３】
細胞溶解産物またはならし培地から単離したクロマトグラフィーを使用して精製したママスタチンを用いてＥＬＩＳＡのための標準曲線が確立し、低いナノグラム範囲でママスタチンのアッセイ感度が示された（図９参照）。正常ヒト志願者血清中のママスタチンレベルの定量は、志願者から１ヶ月に２日の間隔で回収した血清サンプルで行った。正常ヒト女性血清のママスタチンレベルをこのアッセイによって検出可能であり、約１０〜５０μg/ml間（図１０）で変化した。
【０１４４】
ママスタチンレベルはまた、乳癌患者から採取した血清中でも測定した。ミシガン大学胸部ケアセンターで節陰性（node negative）乳癌と診断された患者は、処置の全経過を通じて、血清中のママスタチン発現について検査した。そのデータを図１１に示し、以下にまとめた。血清サンプルを乳癌患者からホルモン周期に関する処置（サイトトキシン、アドリアマイシン、メトトレキセート、および５Fuを用いた組み合わせ物理療法プロトコール）の全経過間で回収した。血清を凝血後、遠心により全血から分離し、使用まで−２０℃で保存した。０.５％NFDM中５０％の濃度の１５０μlの血清を用いたELISAアッセイを、酵素結合した「サンドイッチ」アッセイにて６B8および３C6抗−ママスタチン抗体を用いて２回行った。クロマトグラフィーによって精製したママスタチンで標準曲線を作成し、図９に示す曲線と比較した。
【０１４５】
ママスタチンの発現は、患者ごとに変わり、処置経過間で上下した。ママスタチンレベルは転移性疾患へ進行するにつれて検出されなくなることが一貫して観察された。
【０１４６】
乳癌と診断された患者の血清中の診断時ママスタチンレベルは、正常患者血清中のレベルと比較して低かった。ママスタチンレベルは、一般に、ホルモン周期、アジュバント化学療法プロトコールに応じて上昇した。ママスタチンのレベルは、このプロトコールで上下した。ママスタチンレベルは死亡前、進行した疾患を罹患している患者中では検出されなかった。患者のデータを以下の表に示すように４つの群に分類した。
【０１４７】
I.血清ママスタチンレベルが治療期間中上昇し続ける患者の群
II．血清ママスタチンレベルが治療の最初は増加するが、ついで検出不可能になる患者の群
III．血清ママスタチンレベルが治療期間に上昇するが、ついで広く変動する患者の群
IV．治療で検出不可能であった血清ママスタチンレベルを保有する患者の群。
【０１４８】
患者の血清中のママスタチンレベルのまとめ
【表８】
2010031013.tif 000011
【実施例１６】
【０１４９】
ママスタチンのイン・ビボでの効力
CD-1Nu／Nu同種の雌性、６週齢マウス（チャールズ・リバー(Charles River））に徐放性ペレット、０.７２mg／ペレットで１７βエストラジオールの６０日間放出（イノベーティブ・リサーチ（Innovative Rsearch）＃SE-121）を用いてエストロゲンを補給した。エストロゲンを補給したマウスに６０％マトリゲル中に１００μlの注入あたり、３×１０６MCF-7を注入した。２回の注入がおこなわれ、それぞれわき腹に注入された。腫瘍細胞増殖の７日後、ママスタチンを投与した。試験マウスは６週間に２日の間隔で製造培地中にママスタチンの１，２、または５μgを受けた。コントロールマウスはBSAを投与されるか、または腫瘍を注入されないかインヒビター単独を注入された。
【０１５０】
腫瘍の大きさを１週間ごとに最大直径の点で測定し、処理群に関して平均した。
その結果を図１３A-13Cに平均直径±標準偏差としてサイズプロットにより示した。
【０１５１】
本動物実験をMDA-２３１腫瘍細胞を用いて反復した。細胞をMCF-7細胞に関して上記のように注入１回あたり２×１０６細胞で注入した。その結果を図１４A〜１４Cに示す
【０１５２】
示された結果は期待されるほどではなかった。動物は尾の静脈に注入を受け、必要な血液容量より少ない結果となった。腹腔内注入を用いた続く実験は一層有効な処理という結果をもたらした。５μg/マウスの用量およびそれより多い用量で腫瘍増殖が廃止される。
【実施例１７】
【０１５３】
ママスタチンのレトロウイルス発現
ママスタチンｃＤＮＡ（2.4キロベース（ｋｂ）のインサート）をレトロウイルス発現ベクターにサブクローニングされた。そのベクターを使用して、３Ｔ３繊維芽細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を回収し、溶解し、ついでその細胞溶解産物をウエスタンブロットで分析した。
【０１５４】
図１２に示すように、ママスタチン運搬レトロウイルスにてトランスフェクションされた３Ｔ３細胞はリン酸化したママスタチンを発現した。上記の明細書、実施齢およびデータはその製造物の完全な記載および本発明の組成物の使用についての完全な記載を提供する。本発明の多くの態様は本発明の精神および範囲から逸脱することなく構成されるので、本発明は以後付記された請求の範囲に属する。
【実施例１８】
【０１５５】
バキュロウイルスおよびCos７細胞におけるママスタチン発現
図１６において、Ｃos−７細胞中の組換えママスタチン発現の導入は、ママスタチン遺伝子が真正ママスタチンをコードすることを示している。さらに、Ｃos−７細胞がそのタンパク質リン酸化に関係するママスタチンの異なる形態を発現するという観察は、ママスタチンがリン酸化され、かつヒト乳房細胞以外の真核細胞にて製造される場合に活性であることを示唆する。安定したトランスフェクションは組換えママスタチンの永久的な合成を可能にするように選択される。
【実施例１９】
【０１５６】
培養中における正常ヒト乳上皮細胞によるママスタチンの製造
健常な乳組織を無菌の手術室での直接修正乳房形成術から入手した。その組織をIII型コラーゲン（ライフ・テクノロジーズ、ベテスダ、メリーランド）１ｇ当たり４単位を含む溶液中に薄層流出フード（Laminar Flow hood）中で、無菌状態で微細分した。微細分した組織を終夜振盪ウォーターバス中で３７℃にてインキュベートし、コラゲナーゼ消化させた。
【０１５７】
コラゲナーゼは乳組織を消化し、多様な細胞型および脂肪細胞中から放出された脂肪を含む粘性液体を、遠心によって液体、水性溶液、および他の細胞型を分離した。そのコラゲナーゼ−消化物質を卓上遠心機で１０００rpmにて室欧で約5分間回転させた。脂肪細胞および遊離脂肪は、遠心チューブの分離は、呼吸および廃棄によって退行された。上記細胞ペレットに位置する水性伝説はまた、呼吸および潜在によって取り下げられた。残る細胞ペレットを無菌のママスタチン増殖培地であるDMEMｐH7.4で洗浄した。洗浄を上清がもう濁っていないというところまで（例えば、約４回の洗浄）続けた。その洗浄した細胞を増殖培地中に再度懸濁させ、４０℃で３０分間重力によって安定させることができた。赤血球細胞を除核し、有核上皮細胞より低い密度であるため、この手続は赤血球細胞を含む上清を取り除くことによって、堆積した上皮細胞からの赤血球細胞の除去という結果となる。この沈降手順を細胞ペレットに赤い色が残らなくなるまで、例えば約2回、繰り返した。残る細胞ペレットを５％ウマ血清（Equine）、１０μg/mlの上皮増殖因子、１００ng／mlのコレラ毒素、５００ng／mlのヒドロコルチゾン、１０μg/mlのインスリン、１００単位／mlペニシリンおよびストレプトマイシン、および１mM塩化カルシウムを含む栄養素が豊富なDMEM／F12増殖培地中に再懸濁した。生理的濃度のカルシウムは、細胞培養中の細胞接着および増殖を促進するのを助けた。細胞懸濁液を５％CO2濃度で３７℃にて無菌組織培養フラスコ中でインキュベートした。
【０１５８】
正常乳組織の最初の培養は混合細胞集団を含む。脂肪細胞、ニューロンおよび血管組織は上記の遠心分画工程によって有意に減少させられる。結合組織細胞は有意な量で存在する。上皮細胞でない細胞を除去するために、勾配接触法が使用された。繊維芽細胞、ニューロンおよび乳組織における他の細胞型はすべて上皮細胞より一層迅速に組織培養形成に接触する。さらに、これらの細胞型のすべてを組織培養造形から上皮細胞より迅速にトリプシンによって除去する。乳組織細胞のための培養を豊富にするために、単層を形成し始める培養（最初のプレーティングの後５〜７日）はトリプシン：EDTA（２５０：１（モル比））で処理された。細胞の大多数は、３７℃で5分以内のインキュベーション中で除去された。残った接触細胞は９０％より多くが上皮乳細胞であった。これらの細胞は生かされ、上記の増殖培地に４０μMの塩化カルシウムとともに戻された。繊維芽細胞をトリプシン化した培養フラスコから除去し、ついで３７℃で30分間組織培養プラスティックにプレーティングした。接触した細胞は繊維芽細胞が優勢であった。接触しなかった細胞を有意に繊維芽細胞（５０〜８０％）に関して豊富であった。これらの懸濁細胞を除去し、新鮮組織培養フラスコに落ち着かせることができた。この工程を2回繰り返し、優性なものが上皮細胞となるような細胞集団を得た。コレラ毒素は、上皮細胞増殖を促進さえ、かつ繊維芽細胞の増殖を阻害し、繊維芽細胞がカルシウムが減少した中ではそれほどよく増殖しないので、その培養物は、上記のように低カルシウム培地中で1週間以内で約100％の上皮であった。これらの正常ヒト乳細胞（NHMC)の培養物は、培養培地中にママスタチンを製造した。
【０１５９】
NHMCを増殖させるために使用した栄養培地は、５％エキニン血清を含み、ヒト注射には適さない。エキニン血清タンパク質はママスタチンタンパク質から精製されるか、または無血清培地中での細胞増殖から精製されなければならない。正常細胞は、７〜１０日間で無血清で維持されるのみでよい。無血清ママスタチンの有意な量を長く製造するために、細胞が無血清培地および血清を含む培地で交代で増殖された。
【０１６０】
NHMCを上記のように増殖培地中で、完全なコンフルエントに達するまで増殖させた。その細胞は、細胞がフラスコの利用可能な表面を覆う時、増殖するにつれて溶液中で出芽した。出芽細胞を回収し、ついで新しいフラスコにトランスファーした。コンフルエントに達したフラスコを、血清タンパク質を除去するために洗浄の間に5分食塩水インキュベートして、無菌食塩水で3回漱いだ。ついで細胞を血清、コレラ毒素およびヒドロコルチゾン欠如した本質的に増殖培地である無血清「製造培地」を提供された。細胞を約4日（96時間）、培地の回収と共に製造培地で維持され、少なくとも4日間増殖培地に細胞を戻した。このように製造された典型的な一段のママスタチンの大きさは、１〜２lであった。
【０１６１】
ママスタチンはまた、バイオリアクター（Bioreactor）中、（バイオフロー・３０００（Bioflow 3000）、ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（New Brunswick Scientific）で製造した。この潅流反応において、細胞を組織倍腸処理した繊維細胞ディスクに接触させた。細胞接触ディスクを応答血管中のバスケットを維持し、培地で潅流した。NHMCをリアクターに導入され得る場合、それらは繊維細胞ディスクを集め、および培地の潅流によって栄養を与えられた。ならし培地をリアクターから回収し、冷凍した。
【実施例２０】
【０１６２】
ママスタチンのドット・ブロット・血清アッセイ
２５歳齢の健康な女性の結成を入手し、ついで乳癌患者（第IV段階）からの血清、患者の姉妹で診断されていない者、患者の母親と比較した。その家族は乳癌の家系であった。その血清サンプルをママスタチンの存在下でのイムノアッセイに比較した。診断の日に採取した多発乳癌患者血液サンプルはまた、イムノアッセイにおいて分析された。正常なヒト乳細胞（NHMC)ならし培地を標準コントロールとして使用した。標準的なNHMCママスタチンは、ママスタチンタンパク質標準クロマトグラフィーによる精製により決定したように約５０ng／mlを含む。
【０１６３】
個々の血液サンプルを血管に回収し、ついで全血から血清を分離した。血清サンプル（２５０または５００μl容積）を希釈なしに９６ウェル（S & S Dot-Blot manifold）を用いて吸引によってニトロセルロースにアプライした。ならし培地を実施例１９のように調製した。ニトロセルロースフィルター上のサンプルをTBS中のTriton X-100で洗浄し、脱脂粉乳（TBS中５％）で停止し、５％の脱脂粉乳中で第１抗−ママスタチン抗体（７G6マウスIgM)１μg/mlと一緒に、室温で1.5時間インキュベートした後、５％の脱脂粉乳中で第２抗体（アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗−マウスIgM)１μg/mlと一緒に、室温で1時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ発色反応は、ニトロブルー−テトラゾリウム（nitrobler-tetrazolium）およびBCIPを用いて進行させた。
【０１６４】
図１３に示すように、サンプル中のママスタチンの量は正常乳細胞ならし培地から入手した標準曲線に対して定量した。健康な女性から得た血清は暗く色付けたブロットによって示されるように、容易に検出可能な量のママスタチンを含み、一方、乳癌と診断された患者の血清および診断されていない家族からは殆ど、または全くママスタチンが示されなかった。
【０１６５】
別のサンプルを診断の日に患者から、乳癌患者の家族の健康なメンバーからおよび健康な女性及び男性から入手した。血清を上記のように加工してママスタチンを分析した。ドットブロットは「陰性または低い」または「陽性または高い」として評価され、発色反応の強度を示した。データを以下の表に示す。
【０１６６】
【表９】
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【実施例２１】
【０１６７】
ヒト乳癌患者の治療
２９名の再発した失敗した第IV段階の乳癌患者、または化学療法に失敗した患者にママスタチンタンパク質を投与した。そのタンパク質を上記の実施例１９に記載したように製造し、ついで３mlの注入容積に必要とされる用量にて、製造培地中で提供した。患者は処方された方法に従って、そのタンパク質を静脈内投与された。概して、1日用量を注入した。選択された用は、量患者の血流内のママスタチンの生理学的な量（例えば、健康な女性で５〜５０ng／ml)を提供するものであった。各患者の用量および頻度は以下の表に示すとおりである。
【０１６８】
【表１０】
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【０１６９】
【表１１】
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【０１７０】
２９患者の群のうち、6名が後期段階の肝臓疾患を有しており、生存できなかった。これらの6名の患者はママスタチン受領前の肝臓機能不全の臨床的証拠を示し、治療によって助からなかった。1名の患者は肝臓機能不全以前に黄疸を減少させる徴候を示したが、全6名のこれらの患者は進行した肝臓癌を有する患者に一般的な窒素毒素により死亡したようであった。
【０１７１】
残りの患者は、その疾患により2名が死亡した。1名はママスタチン治療の2ヶ月後に疾患のない状態であったようであった。この患者はコントロール下に決して戻らず、彼女は肝臓に関する疾患で死亡した。これらの後の2人の患者におけるママスタチンの投与は１０倍に増加したが、第2の患者は治療の4ヶ月後に、治療に対する応答を全く示さずに死亡した。
【０１７２】
現在ママスタチン療法を受けている１９名の患者のうち、多数は陽性の利益の徴候を示し、副作用の徴候は全くない。これらの患者のうちの3名がママスタチンの利益を受けているのか否かは不明である。他の１６名の患者は正常レベルまで腫瘍マーカー（CA１５−３およびＣＡ27-29）レベルが減少し、触診できる腫瘍の大きさが減少し、ＭＲＩスキャニングに証明されるような疾患の衰退および痛みの減退を含む利益の明らかな臨床的徴候を示している。これらの患者の数人は、疾患が無くなったと考えられるとの点に改良を示す。しかしながら、これら患者に3日〜5日の期間該タンパク質を与えないと、疾患の徴候を全く示さない患者でさえ、痛みの増大によって証明されるような疾患の再発という結果となることが一貫して観察された。タンパク質治療を再開すると２〜４時間以内に増大した痛みの徴候が低減ないし除去された。
【０１７３】
血中のママスタチンレベルが長期の治療の後に衰退することも観察されており、負のフィードバックシステムが示唆されている。血中レベルにおける一定のこの衰退は、約２８日毎日ママスタチンを投与し、のち２〜3日タンパク質を投与しないことによってうまく回避できる。
【実施例２２】
【０１７４】
ヒト治療のための組換えママスタチン
組換えママスタチンをCos-7サル腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO)およびＳｆ９昆虫細胞中にママスタチンｃＤＮＡ配列を含むプラスミドを有する細胞をトランスフェクションすることによって製造した。ママスタチンｃＤＮＡが安定してこれらの産生細胞株のゲノムに組み込まれ、増殖阻害活性と免疫応答性のタンパク質を分泌する。
【０１７５】
これらの細胞からママスタチンを製造し、ヒトに使用するためのタンパク質を単離するために、細胞株を無血清培地中で約４８〜７２時間増殖させる。培地を取り除き、0.1M〜約0.5Mの塩化ナトリウム濃度勾配を用い、約0.2Mでママスタチン画分を収集するトリスバッファー（pH7.5）中でのイオン交換クロマトグラフィーにより、タンパク質をならし培地から精製した。タンパク質画分をついで生理食塩水に対して透析し、必要であれば希釈し、ついで濾過滅菌する。
【０１７６】
別法において、ママスタチンはCos7またはSf9細胞中で融合タンパク質として製造される。融合タンパク質はヒスチジンタグ（６ヒスチジン残基）およびX因子プロテイナーゼ開裂部位を含む。ママスタチン発現細胞を培養し、好ましくはは１％の血清含有培地中で培養し、ならし培地を回収し、白金キレート樹脂を通す。His-融合タンパク質はカラムに接着し、５０mMのトリス（pH7.5）、0.1MNaClで洗浄し、ついでゆっくりとNaCl含有１０単位／X因子プロテイナーゼを含むトリスにて洗浄する。ママスタチンは、His-融合から遊離する。ママスタチンは上記のように分子篩クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーによって分離する。
【０１７７】
【表１２】
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【０１７８】
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【受託番号】
【０１７９】
ＡＴＣＣ受託番号第９７４５１号
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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