(57)【要約】【課題】培養された細胞等からなる試料に散布される薬品の使用量を低減することのできる試料保持体等を提供する。【解決手段】試料保持体４０は、開放された試料保持面３７ａの少なくとも一部が膜３２と膜３２の周囲のテーパ部３７ｂで構成され、膜３２の試料保持面３２ａにおいて試料３８を培養可能である。テーパ部３７ｂがあるので、使用する試薬の量を少なくすることができる。試料３８には、膜３２を介して、試料観察又は検査のための一次線が照射可能となっている。これにより、細胞等の試料３８を培養させた状態で生きたままでの観察又は検査を良好に行うことができる。特に、一次線として電子線を用いれば、生きた状態での試料のＳＥＭ観察・検査を良好に行うことができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部からアクセス可能なように開放された試料保持面と該試料保持面に連通する孔とが底部に設けられた本体部と、本体部の該孔を覆うように配置され、該試料保持面側に位置する第一の面が試料保持面を構成する膜とを備えた試料保持体であって、該膜の周囲に位置する本体部の試料保持面に凹状のテーパ部が形成され、該膜の第一の面に保持された試料に、該膜を介して、該膜の第二の面側から試料観察又は検査のための一次線が照射可能であることを特徴とする試料保持体。
【請求項２】
外部からアクセス可能なように開放された試料保持面と該試料保持面に連通する孔とが底部に設けられた本体部と、本体部の該孔を覆うように配置され、該試料保持面側に位置する第一の面が試料保持面を構成する膜とを備えた試料保持体であって、該膜の周囲に位置する本体部の試料保持面に凹状のテーパ部が形成され、真空雰囲気に接する該膜の第二の面側から、該膜を介して該膜の第一の面に保持された試料に、試料観察又は検査のための一次線が照射可能であることを特徴とする試料保持体。
【請求項３】
前記膜は、枠状部材の開口を覆って該枠状部材に設けられており、該枠状部材が前記本体部の孔に対応して配置されていることを特徴とする請求項１又は２記載の試料保持体。
【請求項４】
前記本体部に形成されたテーパ部の開き角度は、０〜１７０度の間にあることを特徴とする請求項１乃至３何れか記載の試料保持体。
【請求項５】
前記本体部に形成されたテーパ部の形状は円錐台状であり、その内部の最小直径が１〜１０ｍｍの間にあることを特徴とする請求項１乃至４何れか記載の試料保持体。
【請求項６】
前記本体部に形成されたテーパ部において、前記膜の第一の面からテーパ部上面までの高さが０．１〜１０ｍｍの間にあることを特徴とする請求項１乃至５何れか記載の試料保持体。
【請求項７】
前記本体部には、前記膜に隣接し、該膜の第一の面に連通する面を有する段差部が設けられていることを特徴とする請求項１乃至６何れか記載の試料保持体。
【請求項８】
少なくとも前記膜の第一の面では、試料に含まれる細胞、組織、ウイルス若しくは菌を培養可能であることを特徴とする請求項１乃至７何れか記載の試料保持体。
【請求項９】
前記膜の膜厚は、１０〜１０００ｎｍの間にあることを特徴とする請求項１乃至８何れか記載の試料保持体。
【請求項１０】
前記膜の膜厚は、２０〜２００ｎｍの間にあることを特徴とする請求項１乃至８何れか記載の試料保持体。
【請求項１１】
前記一次線は、電子線若しくはイオン線であることを特徴とする請求項１乃至１０何れか記載の試料保持体。
【請求項１２】
請求項１乃至１１何れか記載の試料保持体を用いて試料の観察又は検査を行う試料検査装置であって、該試料保持体が載置される載置手段と、該試料保持体の膜の第一の面に配置された試料に、該膜を介して、該膜の第二の面側から一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段とを備える試料検査装置。
【請求項１３】
前記試料保持体における前記膜の第二の面に接する雰囲気を真空雰囲気とするための真空室を備えることを特徴とする請求項１２記載の試料検査装置。
【請求項１４】
前記一次線は、電子線若しくはイオン線であり、前記二次的信号は、二次電子、反射電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光若しくはＸ線であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の試料検査装置。
【請求項１５】
前記膜の第一の面が該膜の上面となっており、該膜の第二の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項１２乃至１４何れか記載の試料検査装置。
【請求項１６】
前記試料保持体における前記膜の第一の面に保持された試料の光学像を取得するための光学像取得手段を備えることを特徴とする請求項１２乃至１５何れか記載の試料検査装置。
【請求項１７】
請求項１乃至１１何れか記載の試料保持体の試料保持面に試料を配置し、該試料に前記膜を介して一次線を照射し、この一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出することを特徴とする試料検査方法。
【請求項１８】
前記一次線の照射時には、前記試料保持体における前記膜の第二の面が真空雰囲気に接しており、該真空雰囲気を通して一次線が照射されることを特徴とする請求項１７記載の試料検査方法。
【請求項１９】
前記一次線は、電子線若しくはイオン線であり、前記二次的信号は、二次電子、反射電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光若しくはＸ線であることを特徴とする請求項１７又は１８記載の試料検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養された動植物の組織、及び細胞等からなる試料の観察又は検査を良好に行うことのできる試料保持体、試料検査装置及び試料検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学や、製薬分野では、細胞に刺激（電気、化学物質、薬等）を与え、その反応を観察することが重要となっている。従来、このような観察には光学顕微鏡が、細胞の刺激にはマニピュレータやピペットが用いられていたが、観察すべき重要な箇所は光学顕微鏡では観察不可能な０．１μｍ以下の微小領域であることも多い。
【０００３】
例えば、細胞間の物質のやり取りが正常に行えなくなることに起因する病気に高血圧症、尿崩症、不整脈、筋肉疾患、糖尿病、うつ病等がある。この細胞間の物質のやり取りは細胞膜にある１０ｎｍ程度の大きさのイオンチャンネルにより行われる。このようなイオンチャンネルは、光学顕微鏡では観察困難である為、分解能の高い走査型電子顕微鏡（以下、「ＳＥＭ」（Scanning Electron  Microscope）という）を用いた観察が望まれていた。
【０００４】
しかし、ＳＥＭの構成を備える検査装置において、検査対象となる試料は、通常、真空引きにより減圧された試料室内に配置される。そして、このように減圧雰囲気とされた試料室内に配置された試料に電子線（荷電粒子線）が照射され、当該照射により試料から発生する二次電子や反射電子（後方散乱電子）等の二次的信号が検出される。
【０００５】
このようなＳＥＭによる試料検査では、試料が減圧雰囲気に晒されることとなる。よって、試料から水分が蒸発して細胞が死んでしまい、生きた状態の細胞における刺激に対する反応を観察することは不可能であった。
【０００６】
また、蛋白の固定された細胞（死細胞）においても、減圧された真空雰囲気中に試料を配置する際には、真空中での水分蒸発に伴う形状変化を防止する為、手間と、熟練の必要な脱水、乾燥、及び金属蒸着の前処理が必要であった。その為、観察までには膨大な時間が必要で、高スループット観察は不可能であった。
【０００７】
このようなことから、生物試料を観察する為には、水分の蒸発を防止することが望ましい。試料に水分が含まれた状態で検査を行う際には、試料から水分が蒸発しないように、試料を減圧雰囲気に晒されることがないようにする必要がある。このように試料が減圧雰囲気に晒されることなくＳＥＭを用いて検査を行う例の一つとして、膜により開口（アパーチャ）が密封された試料容器（サンプルカプセル）の内部に試料を配置し、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に、このサンプルカプセルを設置する手法が考えられている。
【０００８】
ここで、試料が配置されるサンプルカプセルの内部は減圧されない。そして、サンプルカプセルに形成された当該開口を覆う膜は、ＳＥＭの試料室内の減圧雰囲気とサンプルカプセル内の減圧されていない雰囲気（例えば、大気圧雰囲気）との間の圧力差に耐えられるとともに、電子線が透過するものとなっている（特許文献１参照）。
【０００９】
試料検査を行う際には、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に配置されたサンプルカプセルの当該膜を介して、サンプルカプセルの外部からサンプルカプセル内の試料に電子線が照射される。電子線が照射された試料からは反射電子が発生し、この反射電子はサンプルカプセルの当該膜を通過して、ＳＥＭの試料室内に設けられた反射電子検出器によって検出される。これにより、ＳＥＭによる像（ＳＥＭ画像）が取得されることとなる。
【００１０】
しかしながら、この発明では試料は閉じた空間内に封入させるので、外部からマニピュレータ等により細胞に刺激を与えることは不可能であった。また、試料である細胞をこのサンプルカプセルに封入した後に、その細胞を生きた状態で長時間観察・検査をする場合には問題があった。
【００１１】
さらに、ＳＥＭ画像の分解能は高いが、白黒の情報しかないので、観察した組織の同定が困難であった。一方、光学顕微鏡は蛍光ラベリング技術が確立しており、組織の同定が容易であった。ＳＥＭ画像と光学顕微鏡像をほぼ同時に同位置を観察できれば、高分解能なＳＥＭ画像で組織同定が可能となる。しかし、上記サンプルカプセルでは、光学顕微鏡像取得の為にはカプセルを開放、ＳＥＭ画像取得の為には密閉する必要があり、同時観察は不可能であった。
【００１２】
通常、細胞は、直径３５ｍｍ以上の大きさのシャーレ（皿）上に吸着させてその上に培養液を満たし、温度３６〜３８℃（通常３７℃）、二酸化炭素濃度３〜１０％（通常５％）の雰囲気下に置いて培養させている。細胞の観察の際には、この細胞をシャーレから剥がし、このサンプルカプセルに入れることになる。
【００１３】
しかし、サンプルカプセル内の環境がシャーレ内とは異なるため、試料容器内で細胞が生存する確率が低かった。すなわち、特許文献１に記載のサンプルカプセルでは、溶液を１５μｌ程度しかその内部に入れることができず、短時間で環境雰囲気（ｐＨ、浸透圧等）が変化する為、細胞培養は困難であった。
【００１４】
なお、このように真空と大気圧との圧力差に耐えられる膜を介して試料に電子線を照射し、試料から発生する反射電子を検出してＳＥＭ画像を取得する例は、非特許文献１（当該文献のChapter1 Introduction）や特許文献２にも記載されている。
【００１５】
また、このような膜を対向して設置して一対の膜を構成し、該一対の膜の間に試料を配置して透過型電子顕微鏡による像を取得する例は、特許文献３及び特許文献４に記載されている。特に、特許文献３には、このような一対の膜を利用して、その間に配置された試料のＳＥＭ画像を取得する場合についても述べられている。
【００１６】
【特許文献１】特表２００４−５１５０４９号公報
【特許文献２】特開昭５１−４２４６１公報
【特許文献３】特開昭４７−２４９６１号公報
【特許文献４】特開平６−３１８４４５号公報
【非特許文献１】「Atmospheric scanning electron microscopy」 Green、 Evan Drake Harriman、 Ph.D.、 Stanford University、 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
マニピュレータやピペットを用いて細胞に刺激を与えた後の細胞の反応に基づいて生ずる構造変化は、細胞内の微小領域で生じる為、光学顕微鏡では観察不可能でＳＥＭによる高分解能観察が必須となる。液体を保持したまま細胞をＳＥＭで観察する為には、シャーレ上で培養していた試料（細胞）をサンプルカプセルに封入し、サンプルカプセルに備えられた膜を介して電子線を試料に照射することで像を得ていた。
【００１８】
しかし、サンプルカプセルは閉じた空間である為、刺激を与える為のマニピュレータやピペットを用いることが不可能であった。また、サンプルカプセル内では、封入後の細胞が生存している確率は低かった。さらに、ＳＥＭで高分解能観察ができたとしても組織の同定は不可能で、組織の同定が可能な光学顕微鏡像との同時観察が望まれていた。
【００１９】
よって、培養された細胞等に対して外部からのマニピュレーションや薬品（薬液）の散布を行うことができ、また生存状態の細胞等を良好に観察及び検査することのできる試料保持体の開発が望まれている。
【００２０】
上記において、試料保持体内において細胞を長時間培養することができ、これにより生きたままの状態での試料の観察又は検査を良好に行うことができることが好ましい。また、培養させた細胞にマニピュレータやピペットを用いて刺激を与えることができ、その際の試料の観察又は検査を良好に行うことができるように、光学顕微鏡とＳＥＭの同時観察も可能であることが好ましい。
【００２１】
特に、マニピュレータやピペットを用いて、培養された細胞に薬品の散布を行う場合には、散布される薬品の使用量を低減することが望まれている。
【００２２】
本発明は、このような点に鑑みてなされたものであり、培養された細胞等からなる試料に散布される薬品の使用量を低減することのできる試料保持体、試料検査装置及び試料検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明に基づく第一の試料保持体は、外部からアクセス可能なように開放された試料保持面と該試料保持面に連通する孔とが底部に設けられた本体部と、本体部の該孔を覆うように配置され、該試料保持面側に位置する第一の面が試料保持面を構成する膜とを備えた試料保持体であって、該膜の周囲に位置する本体部の試料保持面に凹状のテーパ部が形成され、該膜の第一の面に保持された試料に、該膜を介して、該膜の第二の面側から試料観察又は検査のための一次線が照射可能であることを特徴とする。
【００２４】
本発明に基づく第二の試料保持体は、外部からアクセス可能なように開放された試料保持面と該試料保持面に連通する孔とが底部に設けられた本体部と、本体部の該孔を覆うように配置され、該試料保持面側に位置する第一の面が試料保持面を構成する膜とを備えた試料保持体であって、該膜の周囲に位置する本体部の試料保持面に凹状のテーパ部が形成され、真空雰囲気に接する該膜の第二の面側から、該膜を介して該膜の第一の面に保持された試料に、試料観察又は検査のための一次線が照射可能であることを特徴とする。
【００２５】
本発明に基づく試料検査装置は、上記何れかの試料保持体を用いて試料の観察又は検査を行う試料検査装置であって、該試料保持体が載置される載置手段と、該試料保持体の膜の第一の面に配置された試料に、該膜を介して、該膜の第二の面側から一次線を照射する一次線照射手段と、該一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出する信号検出手段とを備えることを特徴とする。
【００２６】
本発明に基づく試料検査方法は、上記何れかの試料保持体の試料保持面に試料を配置し、該試料に前記膜を介して一次線を照射し、この一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
本発明においては、開放された試料保持面に位置する膜上に培養された試料に、該膜を介して、試料観察又は検査のための一次線を照射することができる。
【００２８】
これにより、細胞等の試料を培養させた状態で生きたままでの観察又は検査を良好に行うことができる。特に、一次線として電子線を用いれば、生きた状態での試料のＳＥＭ観察・検査を良好に行うことができる。
【００２９】
また、当該試料保持面は開放されているので、ピペットやマニピュレータによる試料へのアクセス（接触又は接近）や、試料への薬品の散布が可能となり、マニピュレータを用いて試料への刺激（化学物質散布、電気刺激）を行い、その反応を観察・検査することも可能になる。さらに一次線照射する側の反対側から光学顕微鏡の観察も可能になり、ほぼ同時に同一場所の観察ができる。
【００３０】
特に、試料保持面の膜周囲はテーパ形状になっており、ピペットやマニピュレータを用いて、当該テーパ部の内部のみに薬品を供給することにより、薬品の散布量（使用量）を低減できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、図面を参照して、本発明における試料保持体及び試料検査装置等について説明する。
【実施例１】
【００３２】
図１は、本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。この図において、一次線照射手段である鏡筒１には、電子銃（電子源）２が配置されている。電子銃２から加速された状態で放出された一次線としての電子線（荷電粒子線）７は、集束レンズ（対物レンズ）３により集束される。
【００３３】
これにより集束された電子線７は、試料保持体４０に形成された試料保持膜３２（後述）を介して、試料保持体４０に保持されたサンプル２０に照射される。このサンプル２０には、試料（本実施例では細胞）と液体（本実施例では培養液）が含まれている。
【００３４】
当該照射時において、電子線７は図示しない偏向手段により偏向され、これにより電子線７はサンプル２０を走査する。このときには、サンプル２０に含まれる試料も電子線７により走査される。
【００３５】
なお、鏡筒１の先端側は真空室１１に接続されている。また、電子銃２が設けられた鏡筒１の基端側は真空室１１の下方に位置している。この構成により、電子銃２から放出された電子線７は、鏡筒１内を上方向に進み、鏡筒１の先端に設けられた開口１ａを介して、真空室１１内の空間及び試料保持膜３２を通過し、サンプル２０に到達する。
【００３６】
このように、この鏡筒１は、一次線照射手段を構成し、本実施例では倒立型鏡筒となっている。真空室１１内であって鏡筒１の先端側には、反射電子検出器４が設けられている。反射電子検出器４は、電子線７がサンプル２０内の試料に照射された際に発生する反射電子を検出するものである。反射電子検出器４は、例えばPN接合を利用した半導体型検出器やYAG結晶を用いたシンチレータ型検出器が用いられる。
【００３７】
鏡筒１内は排気手段８により真空引きされて、所定の圧力まで減圧される。また、真空室１１内は、図示しない排気手段により真空引きされ、これにより所定の圧力まで減圧される。ここで、真空室１１は、除振装置１３を介して、架台１０に載置されている。
【００３８】
真空室１１の上部には、試料保持体載置部１２が設けられている。試料保持体載置部１２には、電子線７が通過するための孔１２ａが形成されている。この試料保持体載置部１２には、Ｏリング（図示せず）を介して、試料保持体４０が載置されている。これにより、試料保持体４０は真空室１１に着脱自在に支持される。
【００３９】
また、真空室１１の上側部分には、開閉バルブ１４が設置されている。この開閉バルブ１４は、真空室１１内において、試料保持体４０と鏡筒（一次線照射手段）１の先端部との間の空間１９を仕切るためのものである。図１は、開閉バルブ１４が開かれた状態である。開閉バルブ１４を閉じると、図２のように真空室１１内の当該空間１９が仕切られることとなる。このように開閉バルブ１４により仕切られた当該空間１９が仕切られることにより、開閉バルブ１４と試料保持膜３２との間において密閉された空間部１９ａが形成される。この空間部１９ａは、開閉バルブ１４を境として試料保持体４０側に位置する空間となる。
【００４０】
当該空間部１９ａに連通して排気手段（減圧手段）９が設けられている。この排気手段９は、当該空間部１９ａを個別に排気できる。また、当該空間部１９ａには、図示しないガス供給手段が接続されている。このガス供給手段は、窒素やエアー等のガスを当該空間部１９ａに供給し、この空間部１９ａ内を減圧状態から常圧（大気圧）状態に復帰させる。これにより、当該空間部１９ａは、独立して減圧状態からの常圧復帰が可能となる。
【００４１】
さらに、当該空間部１９ａには、図示しない洗浄手段が接続されている。この洗浄手段は、当該空間部１９ａ内に洗浄剤を供給し、当該空間部１９ａを洗浄する。これにより、当該空間部１９ａを構成する壁面は洗浄される。
【００４２】
このとき使用される洗浄剤としては、洗剤、エタノール、アルコール、アセトン、過酸化水素水の少なくとも一つからなる洗浄液、又はこれらの物質の蒸気を使用できる。当該空間部１９ａに供給された洗浄剤は、この空間部１９ａの洗浄を実施後、排出管１５により該空間部１９ａから排出される。排出管１５には、開閉弁１６が設けられている。この開閉弁１６が開放されることにより、洗浄剤は排出管１５を介して外部に排出される。なお、後述する試料の検査を実行する際には、開閉弁１６は閉じられる。
【００４３】
上記洗浄剤を用いずに、当該空間部１９ａに紫外光や放射線を照射することにより、当該空間部１９ａの殺菌を行うこともできる。
【００４４】
ここで、試料保持体４０は、図３のような構成となっている。この試料保持体４０は、プラスチック又はガラスからなる皿状の本体部３７と、電子線７が透過する試料保持膜３２が設けられた膜保持体（枠状部材）１８とから構成される。本体部３７の内側に位置する凹部の底面は、試料保持面３７ａとテーパ部３７ｂのテーパ面とから構成される。試料保持体４０の内部は密閉されずに、その試料保持面３７ａ及びテーパ部３７ｂのテーパ面は、開放されている。試料保持面３７ａと試料保持膜３２の試料保持面との間の高さは０．１〜１０ｍｍで、テーパ部３７ｂの開き角３７ｅは０度〜１７０度であると良い。また、テーパ部３７ｂ内の最小直径は１〜１０ｍｍの間にあると使いやすい。
【００４５】
また、試料保持面３７ａの反対側には、別のテーパ部３７ｃが設けられている。このテーパ部３７ｃは、試料保持面３７ａの反対側の面に向けて広がるように開いているテーパ構造となっており、その開き角度は９０度〜１２０度に設定されている。
【００４６】
２つのテーパ部３７ｂ，３７ｃは繋がっており、これらテーパ部３７ｂ，３７ｃにより、試料保持体４０における本体部３７の底部には孔３７ｆが形成されている。この孔３７ｆは、本体部３７の試料保持面３７ａに連通している。
【００４７】
さらに、試料保持体４０の下面で真空雰囲気に晒され、電子線７が照射される可能性のある領域には、電子線７の照射に伴う帯電を防止するため導電膜３０１が形成されている。導電膜３０１は膜保持体１８に接しており、電子線７の照射により蓄積された電荷を膜保持体１８（シリコン製）とサンプル２０を介して大気中へ逃がすことができる。
【００４８】
この導電膜３０１があることにより試料保持体４０の下面での帯電を低減させ、電子線７の軌道変位や、（電子線７がサンプル２０に照射された際に発生する）反射電子の軌道変位により生ずるＳＥＭ画像の歪や輝度斑を防止することができる。
【００４９】
また、電荷の蓄積を確実に防止するためには、サンプル２０へのアース線の接続や、導電膜３０１を試料保持体載置部１２と電気的に繋げておくことが有効である。導電膜３０１は、例えばアルミニウムや金を蒸着することによって形成させても、銀ペーストで塗りつけてもよい。
【００５０】
膜保持体１８には、図４（Ｂ）のように試料保持膜３２が形成されており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａ（図４（Ｂ）では下面、図３では上面）は露出されている。この試料保持膜３２の第１の面（試料保持面）３２ａには、培養液等の液体及び試料（細胞）を含むサンプル２０が配置される。第一の面３２ａは大気圧下にあるので、サンプル２０からの水分の蒸発を極力抑えることができる。
【００５１】
また、膜保持体１８は、試料保持膜３２の第２の面３２ｂ（図４（Ｂ）では上面、図３では下面）に設けられた基板部３４を備えている。基板部３４の中央には開口３４ａが形成されており、この開口３４ａは、試料保持膜３２により覆われている。ここで、試料保持膜３２における第２の面３２ｂの中央部は、該開口３４ａを介して真空室１１の内部雰囲気に露出されている。
【００５２】
次に、膜保持体１８の作成方法について説明する。まず、図４（Ａ）に示すように、基板部３４を構成するシリコン層３３と、該シリコン層３３の一方の面（同図では下面）に設けられた窒化シリコン膜３６とを有する基板を用意する。この窒化シリコン膜３６は、プラズマＣＶＤ等の化学気相成長法により、シリコン層３３（基板部３４）上に成膜されて形成される。窒化シリコン膜３６の第１の面（同図では下面）は露出されており、窒化シリコン膜３６の第２の面はシリコン層３３に覆われている。この窒化シリコン膜３６は、膜保持体１８の試料保持膜３２を構成することとなる。
【００５３】
次いで、図４（Ａ）におけるシリコン層３３の他方の面（上面）の中央部３３ａを選択的にエッチングする。シリコン層３３の中央部３３ａには、図４（Ｂ）に示すように、開口３４ａが形成される。これにより、窒化シリコン膜３６における第２の面の一部が該開口３４ａにより露出されるとともに、該開口３４ａは窒化シリコン膜３６により覆われた状態となる。窒化シリコン膜３６は膜保持体１８の試料保持膜３２を構成し、シリコン窒化膜３６の第２の面は試料保持膜３２の第２の面３２ｂに対応する。これにより、開口３４ａを備える枠状部材からなる膜保持体１８が作成される。
【００５４】
このようにして作成された膜保持体１８は、図４（Ｂ）の状態から上下反転され、試料保持膜３２である窒化シリコン膜３６の第１の面を上面とする。この窒化シリコン膜３６の上面である第１の面は、膜保持体１８における試料保持膜３２の第１の面３２ａとなる。なお、第２の面３２ｂを上面にすることも可能である。図４では膜保持体１８の外形は四角であるが、必要に応じて円形にしても良い。
【００５５】
この膜保持体１８を、本体部３７のテーパ３７ｂの下部に接続された底面３７ｄに、本体部３７に形成された穴を塞ぐように固着し、これにより試料保持体４０を作成する。この固着には、シリコーン系やエポキシ系等の接着剤による接着、又は熱、超音波若しくはレーザによる融着によって行うことができる。また、試料保持膜３２の第１の面３２ａに、試料付着用分子としての細胞接着分子（後述）を塗布すると細胞の培養に便利である。
【００５６】
ここで、窒化シリコン膜３６の厚みは、１０〜１０００ｎｍの範囲に設定される。なお、膜保持体１８の試料保持膜３２として用いられる膜としては、窒化シリコン膜の他に、酸化シリコン、窒化ボロン、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、若しくはカーボンからなる膜を用いても良い。これらの膜を用いた場合でも、その膜厚は１０〜１０００ｎｍに設定される。上述した素材からなる試料保持膜３２は、電子線７が透過するが気体や液体は透過しないものとなる。さらに、膜の両面で少なくとも一気圧の圧力差に耐えられる必要がある。なお、このような試料保持膜３２は、その厚さが薄ければ電子線７の散乱が少なくなるので分解能が向上するが破損しやすくなり、また、その厚さが厚くなれば電子線７の散乱が増加して分解能が低下するが破損しにくくなる。好適な膜厚としては２０〜２００ｎｍとなる。
【００５７】
次に、図１に戻って、試料検査装置の構成をさらに説明する。反射電子検出器４により検出された検出信号は、真空室１１の外部に配置された画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データは、ＳＥＭ画像に対応する画像データとなる。
【００５８】
当該画像データは、表示装置２３に送られる。表示装置２３は、送られた画像データに基づく画像を表示する。表示された画像は、ＳＥＭ画像となる。また、画像形成装置２２により形成された画像データは、必要に応じてコンピュータ２５に送られる。コンピュータ２５は、画像処理を当該画像データに対して施すとともに、当該画像処理の結果に基づく判定を実行する。
【００５９】
ここで、鏡筒１及び真空室１１を備える電子線装置部２９（試料保持体４０より下の部分）は電子線制御部２４により制御される。また、試料保持体載置部１２には、試料に刺激（電圧、化学物質、薬等）を与え、必要に応じて試料を移動させるマニピュレータ２６と、試料の観察やマニピュレータ２６の位置を確認する光学顕微鏡２７が載置されている。これらは制御部２８で制御されている。
【００６０】
なお、光学顕微鏡２７と電子線７の光軸は一致しており、もしくは、光学顕微鏡２７とＳＥＭ画像の視野中心は一致しており、光学顕微鏡の観察領域がＳＥＭ画像にほぼ一致させることができる。さらに、ＳＥＭ画像の視野と光学顕微鏡２７の視野調整は、マニピュレータ２６や、試料保持体４０が搭載されている試料保持体載置部１２を移動させる（移動機構は図示していない）ことによって行う。
【００６１】
本発明における試料検査装置は、電子線装置部２９、マニピュレータ２６、光学顕微鏡２７、電子線制御部２４、制御部２８、画像形成装置２２、及び表示装置２３を備えており、各部とコンピュータ２５が接続され、各部の情報がやり取りされることも可能である。
【００６２】
次に、本発明における検査方法について図１、図２、図３、及び図５を用いて説明する。まず、図３のように試料保持体４０を用いて、試料となる細胞３８を培養液３９中で培養させる。細胞３８をこの図３のように培養させるには、予め細胞を培養してあるシャーレから試料保持体４０へ植え接ぎを行う必要がある。それには、以下に示す通常の方法を用いる。
【００６３】
すなわち、予め細胞の培養してあるシャーレ内から培養液を捨て、Tripsin＋EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid）混合液を当該シャーレの中に入れることで、このシャーレに吸着した細胞を剥がす。
【００６４】
次に、剥がれた細胞を遠沈管に回収して培養液を加え、Tripsinの活性度を止めた後に遠沈させる。その後、遠沈管内から上澄み液を捨て、培養液で攪拌する。その攪拌された液（細胞３８を含む）の例えば１／１０を試料保持体４０に入れ、培養液３９を継ぎ足す。この状態で、培養室に静置させることで、数時間で試料保持体４０の試料保持面３７ａ（試料保持膜３２の表面３２ａを含む）に細胞３８が吸着し、増殖し始める。これにより、試料保持体４０内において、観察・検査対象である試料となる細胞３８が培養され、培養された細胞３８と培養液３９を含有するサンプル２０が構成されることとなる。試料保持体４０に細胞を培養させる際に細胞の量が少ない場合、図５のようにテーパ部３７ｂのみに細胞３８を含む培養液３９を入れても良い。その後、細胞３８が試料保持膜３２に吸着した時点で、培養液３９を継ぎ足し、図３に示すような状態にすることで、長期培養が可能になる。
【００６５】
なお、細胞によっては試料保持体４０の試料保持面３７ａ、特に電子線による観察領域である試料保持膜３２の第一の面（試料保持面）３２ａに細胞接着分子（試料付着用分子）を塗布しておくと培養が容易になる。細胞接着用分子とは、培養のために配置された細胞及び培養により増殖した細胞を試料保持面に吸着させる作用を有し、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、インテグリン、クローディン、デスモグレイン、ニューロリギン、ニューレキシン、セレクチン、ラミニン、ポリLリジンである。このような細胞接着用分子を介して細胞が試料保持膜３２に付着することによって、試料保持膜３２を介して細胞に電子線７が照射される際、電子線７の散乱による分解能低下を最低限にすることができる。
【００６６】
上述のように試料保持体４０内で試料となる細胞が培養された後、試料保持体載置部１２に当該試料保持体４０を載置する。このとき、開閉バルブ１４は閉じられており、図２の状態になっている。この開閉バルブ１４と試料保持膜３２との間において密閉された空間部１９ａは、常圧である大気圧雰囲気となっている。また、真空室１１内において、開閉バルブ１４の下側に位置する空間は所定の真空状態（減圧状態）となっている。さらに、当該空間に連通する鏡筒１内は、真空排気手段８により排気されて減圧され、所定の真空状態となっている。真空室１１内の圧力（真空度）は、例えば、１０−3Ｐａ〜１０−4Ｐａ程度に設定される。鏡筒１１内（特に電子銃２周囲）の圧力（真空度）は、例えば、１０−４Ｐａ〜１０−５Ｐａ程度に設定される。
【００６７】
この状態で、排気手段９を用いて上記空間部１９ａを減圧して真空にする。真空にする際、大気圧状態からの急激な圧力変化による試料保持膜３２の破損を防ぐ為、図示しないニードルバルブ等を用いて１秒〜１００秒の間の時間かけて、大気圧である１気圧（１０１３２５Ｐａ）から１／２気圧〜１／１０気圧程度の圧力（５０ｋＰａ〜１０ｋＰａ）にまで減圧する。この工程で、試料保持体４０の試料保持膜３２が破壊されないことの確認を行う。
【００６８】
上記工程により試料保持膜３２の破壊がないことの確認をした後、光学顕微鏡２７で細胞（試料）３８とマニピュレータ２６の位置を確認する。マニピュレータ先端は微小電極とガラス微小管が設置してあり、微小電極により電圧の印加が、ガラス微小管により液体の流出及流入が可能になっている。
【００６９】
この状態で、光学顕微鏡２７で観察しながら細胞３８とガラス微小管が近接するようにマニピュレータ２６を移動させる。その後、ガラス微小管に負の圧力を掛けて細胞膜と密着させる。これにより、電位応答が測定可能となる。
【００７０】
以上のようなマニピュレータ２６の移動の際、誤って試料保持膜３２を破損させることがあっても、開閉バルブ１４が閉まっているので、サンプル２０の拡散による汚染は当該空間部１９ａ内のみで済む。万が一にも試料保持膜３２が破壊されて、当該空間部１９ａ内がサンプル２０の拡散により汚染された場合、上述したように、当該空間部１９ａの洗浄は実施可能である。
【００７１】
そして、洗浄で用いた洗浄剤である液体又は蒸気は、開閉弁１６を開けることにより、排出管１５を介して排出及び廃棄可能である。なお、当該空間部１９ａを構成する壁面を、窒化ボロンもしくは、フッ素樹脂でコーティング（被膜）することにより、汚染されにくくすることができる。
【００７２】
当該空間部１９ａが減圧（真空）状態において、サンプル２０が載置された試料保持膜３２が破壊されないことを確認した後、開閉バルブ１４を開ける。これにより、真空室１１内の空間の仕切りが解除され、真空室１１内の下側の空間と当該空間部１９ａとが連通される。その後、光が試料保持膜３２を介して反射電子検出器４に入射させない為に、光学顕微鏡２７の光の照射を止め、他の外光の遮蔽（図への記載は略）を行う。この遮蔽は、膜保持体１８やサンプル２０に電子線７が照射した際に発生する放射線の防護の役目も果たしている。
【００７３】
次に、図１のように鏡筒１から電子線７をサンプル２０（細胞３８を含む）に向けて照射して撮像を行う。電子線７は試料保持体４０の試料保持膜３２を透過して細胞３８に照射され、当該照射に基づいて細胞３８から発生する反射電子（後方散乱電子）は反射電子検出器４で検出される。
【００７４】
このとき、試料保持体４０を構成する本体部３７の孔には、上述したテーパ部３７ｃが設けられているので、反射電子がテーパ部３７ｃの内側面に衝突して遮られることを極力防止することができ、反射電子検出器４による反射電子の検出を効率的に行うことができる。
【００７５】
反射電子検出器４からの検出信号は、画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データに基づいて、表示装置２３が画像（ＳＥＭ画像）を表示する。
【００７６】
これに引き続き、細胞３８に、マニピュレータ２６の先端に設置してある微小電極を用いて電気刺激を加え、先ほどと同様にＳＥＭ画像を取得し、刺激に対する細胞３８の応答性を確認する。
【００７７】
撮像後は開閉バルブ１４を閉じることにより、万が一にでも試料保持膜３２が破壊される場合での鏡筒１への汚染を防止する。なお、上記のように細胞３８に刺激を与えた後の変化をＳＥＭで観察する前に、光学顕微鏡２７で観察する場合もある。その際も、開閉バルブ１４を閉じておくと、試料保持膜３２が破れた際の汚染のリスクを低減できる。いずれにせよ、電子線７をサンプル２０に照射させない時は開閉バルブ１４を閉じる等、検査中における開閉バルブ１４の開放時間を短縮することで、装置内部の汚染確立を低減させることができる。
【００７８】
刺激に対する細胞３８の反応速度が遅い場合、一旦開閉バルブ１４を閉じ、反応した頃合を見計らって再度開放バルブ１４を開放し、電子線７による撮像を行っても良い。反応の確認は光学顕微鏡２７で行うことができる。
【００７９】
また、マニピュレータ２６には、化学物質（薬物（薬品）を含む）をサンプル２０中に散布可能な機構を備えることができ、ＳＥＭで細胞を観察しながら化学物質に対する細胞３８の挙動も観察・検査することができる。このような化学物質散布の際、化学物質が高価で、もしくは量が少ない場合、試料保持体４０にはテーパ部３７ｂが加工してあるので、図５に示すように少量の化学物質３０２であっても容易に化学物質３０２を細胞に与えることができる。また、マニピュレータでなく、ピペットを用いて細胞に化学物質を散布する場合においても、この方法は有効である。
【００８０】
ピペットを用いて当該化学物質の回収を行う場合、試料保持膜３２の試料保持面３２ａにピペットを近接する必要がある。しかし、この場合、試料保持面３２ａの中央部（枠状部材１８を構成する基板部３４の開口３４ａにより露出されている部分）は、僅か１０ｎｍ〜１０００ｎｍの厚みしかなく、ピペットにより破壊される恐れがある。
【００８１】
この問題を解決するには図６のように、ピペット６２を試料保持面３２ａに近接させる為に、本体部３７に段差部６１ａを形成し、ピペット接触面（当該段差部６１ａの下面）６１を設けると良い。このピペット接触面６１は、試料保持膜３２の試料保持面３２ａとほぼ同一平面上に位置するようにするのが好ましい。
【００８２】
これにより、試料保持膜３２の試料保持面３２ａと当該段差部６１ａの下面（ピペット接触面）６１ａとを連通させることができ、当該ピペット接触面６１ａに配置されたピペット６２の先端を介して、テーパ部３７ｂ内の化学物質の回収を確実に行うことができる。図７に、このような段差部６１ａが形成された試料保持体４０を上方から見た状態を示す。
【００８３】
さらに、マニピュレータ２６には、液体の流出機能を有することもでき、これにより散布した化学物質の回収を行うことや、培養液のｐＨや浸透圧を一定にすることが可能になる。この場合、図６において、ピペット６２の代わりにマニピュレータ２６を用いることができる。
【００８４】
上記において、像を形成する電子には反射電子を用いた。反射電子は原子番号に比例した信号強度を持つ。その為、生物試料のようにほぼ全体が低原子番号の物質で構成されている場合、像のコントラストが非常に弱く、分解能を向上させることが困難である。そこで、細胞３８の挙動で注目すべき部位に、金などの重金属を吸着させておくと良い。
【００８５】
具体的には、該部位（抗原）に吸着する性質を持つ金粒子を標識した抗体を細胞に散布することで、抗原抗体反応を利用して、その部位（抗原）に該抗体を介して金を吸着させる。また、予め、電子線が照射されると発光する蛍光色素や量子ドット（例えばＳｉのナノ粒子、ＣｄＳｅをＺｎＳでコーティングした１０〜２０ｎｍの粒子）を細胞３８の特定部位に吸着させ発光を光学顕微鏡で観察しても良い。
【００８６】
これら化学物質は一般的に高価であり、極力使用量を低減させたい。その際にも本発明の試料保持体４０構造は有効である。図５に示すようにテーパ部３７ｂにのみ化学物質３０２を保持させ、化学物質３０２の使用量を低減させることができる。化学物質３０２をテーパ部３７ｂにのせた後は、化学物質を洗い流し、細胞が培養しやすいように培養液３９の量を図３のように増加させると良い。
【００８７】
上記実施例において、通常用いられる金粒子は１０〜３０ｎｍの粒径である。しかし、抗体と金粒子との吸着力が弱く、１０〜３０ｎｍの金粒子を付けられないこともある。その場合には、まず粒径数ｎｍと非常に小さな金（ナノゴールド）を抗体に付ける。このままでは金が小さすぎ、ＳＥＭでの観察は困難であるが、銀増感を利用して該金の周りに銀を吸着させることで、ＳＥＭで検出し易くする方法を用いても良い。
【実施例２】
【００８８】
ここでは光学顕微鏡とＳＥＭでの同一場所のほぼ同時観察を行った例について述べる。
【００８９】
実施例１で記述した方法で図３のように試料保持体４０で細胞を培養する。その後、グルタールアルデヒドやホルムアルデヒドを用いた細胞の固定を行う。さらに細胞を光学顕微鏡やＳＥＭで観察しやすいように染色を行う。まず、光学顕微鏡用に細胞の組織を染め分ける。例えば小胞を染色するためには、Invitrogen社のSelectFX Alexa Fluor 488 Endoplasmic Reticulum Labeling Kitを使用すればよい。引き続き、SEM用には例えばリンタングステン酸を用い、細胞のタンパク質を染め、反射電子の放出効率を増加させる。これら化学薬品が高価である場合には、図５のようにして、テーパ部３７ｂ内のみに化学薬品３０２を供給して、化学薬品３０２の使用量を低減させることができる。
【００９０】
このようにして前処理を終了した後、図１のように試料保持体４０を試料保持体載置部１２に設置し、実施例１と同様に観察する。試料保持体４０の上方は開放されている為、ＳＥＭで観察しながら、光学顕微鏡２７の観察も可能である。さらに、光学顕微鏡２７と鏡筒１の光軸が合っているので同じ場所をほぼ同時に観察可能である。これにより、光学顕微鏡で目的の組織（例えば小胞）の位置を特定し、ＳＥＭでその高分解能像を得ることが可能になる。
【００９１】
なお、上記においては、予めシャーレにおいて培養されていた細胞を取り出して、試料保持体４０に植え接ぎをして培養を行っていた。別の試料として、生体から細胞を取り出して、この取り出された細胞を直接試料保持体４０の試料保持面３２ａに配置し培養をしてもよい。
【００９２】
以上、上述した実施例において、開放された試料保持体４０を使用しているので、従来技術では不可能であった生きた細胞の刺激に対する反応を、ＳＥＭを用いて高分解能で観察・検査が可能になる。また、細胞を培養させたまま該試料検査装置で検査可能な試料保持体の使用が可能になる。さらに、（生、死問わず）細胞を光学顕微鏡とＳＥＭで同位置をほぼ同時に観察可能で、ＳＥＭ画像で高分解能像を取得し、光学顕微鏡で細胞組織の染色分けを行い、高分解能像の組織同定ができる。液中観察が可能で、従来の真空観察用の脱水、乾燥、及び金属蒸着が不要で、前処理が高速になり高スループット観察が可能になる。
【００９３】
ここで、上記各例での細胞とは、副腎皮質細胞、心筋細胞、胃や腸、血管の細胞等さまざまな組織細胞のことである。
【００９４】
なお、上記各実施例では二次的信号として反射電子を用いたが、それ以外でも試料３８への電子線７の照射により生ずる二次電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光、及び試料３８への吸収電流を検出することにより、細胞等からなる試料３８の情報を得ることが可能である。なお、吸収電流の測定はマニピュレータ２６を用いると便利である。
【００９５】
本実施例での試料保持膜３２は、少なくとも一気圧の圧力差に耐えることができ、気体や液体の流入出がないことが必要である。具体的な物質としては、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、又は窒化ボロンのうちの少なくとも一つを含むものを用いることができる。
【００９６】
また、上記各実施例においては、一次線として電子線を用いたが、試料保持膜３２が他の荷電粒子（ヘリウムイオンビーム等）の照射に対する耐衝撃性及び強度が十分に高ければ、当該他の荷電粒子線を用いた場合でも適用可能である。さらに、本発明では倒立型ＳＥＭを用いたが、試料によっては通常の正立型ＳＥＭでも問題は無い。
【００９７】
このように、本発明における試料保持体４０は、外部からアクセス可能なように開放された試料保持面３７ａと該試料保持面３７ａに連通する孔３７ｆとが底部に設けられた本体部３７と、本体部３７の該孔３７ｆを覆うように配置され、該試料保持面３７ａ側に位置する第一の面が試料保持面３２ａを構成する膜３２とを備え、該膜３２の周囲に位置する本体部３７の試料保持面３７ａに凹状のテーパ部３７ｂが形成され、該膜３２の第一の面に保持されたサンプル２９（試料３８を含む）に、該膜３２を介して、該膜３２の第二の面３２ｂの側から試料観察又は検査のための一次線が照射可能なっている。
【００９８】
特に、真空雰囲気に接する該膜３２の第二の面３２ｂの側から、該膜３２を介して該膜３２の第一の面３２ａに保持されたサンプル２９に、試料観察又は検査のための一次線が照射可能である。
【００９９】
該膜３２は、枠状部材１８の開口３４ａを覆って該枠状部材１８に設けられており、該枠状部材１８が本体部３７の孔３７ｆに対応して配置されている。
【０１００】
ここで、本体部３７に形成されたテーパ部３７ｂの開き角度３７ｅは、０〜１７０度の間にあることが好ましい。
【０１０１】
また、本体部３７に形成されたテーパ部３７ｂの形状は円錐台状であり、その内部の最小直径が１〜１０ｍｍの間にあることが好ましい。
【０１０２】
さらに、本体部３７に形成されたテーパ部３７ｂにおいて、膜３２の第一の面３２ａからテーパ部３７ｂの上面までの高さは、０．１〜１０ｍｍの間にあることが好ましい。
【０１０３】
ここで、本体部３７には、膜３２に隣接し、該膜３２の第一の面３２ａに連通する下面６１を有する段差部６１ａを設けることもできる。当該段差部６１ａの下面６１にピペット６２等の先端を配置することにより、該膜３２に損傷を与えることなく、テーパ部３７ｂ内に供給された薬品の回収を効率良く行うことができる。
【０１０４】
上述した各試料保持体４０において、少なくとも膜３２の第一の面では、サンプル２０に含まれる試料としての細胞、組織、ウイルス若しくは菌の培養が可能である。
【０１０５】
膜３２の膜厚は、１０〜１０００ｎｍの間に設定することができる。特に、該膜３２の膜厚は、２０〜２００ｎｍの間とすることが好ましい。
【０１０６】
試料保持体４０の膜３２を介して試料に照射される一次線７は、電子線若しくはイオン線を利用することができる。
【０１０７】
本発明における試料検査装置は、上記何れかの試料保持体４０を用いて試料の観察又は検査を行う試料検査装置であって、該試料保持体４０が載置される載置手段１２と、該試料保持体４０の膜３２の第一の面に配置された試料３８に、該膜３２を介して、該膜３２の第二の面側から一次線７を照射する一次線照射手段１と、該一次線７の照射により該試料３８から発生する二次的信号を検出する信号検出手段４とを備える。
【０１０８】
ここで、当該試料検査装置には、試料保持体４０における膜３２の第二の面に接する雰囲気を真空雰囲気とするための真空室１１が備えられている。
【０１０９】
膜３２の第一の面は該膜３２の上面となっており、該膜３２の第二の面は該膜３２の下面となっている。
【０１１０】
さらに、試料保持体４０における膜３２の第一の面に保持された試料３８の光学像を取得するための光学像取得手段２７が備えられている。
【０１１１】
本発明における試料検査方法は、上記何れかの試料保持体４０の試料保持面３７ａに試料３８を配置し、該試料３８に膜３２を介して一次線７を照射し、この一次線７の照射により該試料３８から発生する二次的信号を検出して行われる。
【０１１２】
一次線７の照射時には、試料保持体４０における膜３２の第二の面が真空雰囲気に接しており、該真空雰囲気を通して一次線７が照射される。
【０１１３】
一次線７は、電子線若しくはイオン線であり、二次的信号は、二次電子、反射電子、吸収電流、カソードルミネッセンス光若しくはＸ線である。
【０１１４】
本発明においては、開放された試料保持面３７ａに位置する膜３２上に培養された試料３８に、該膜３２を介して、試料観察又は検査のための一次線７を照射することができる。
【０１１５】
これにより、細胞等の試料３８を培養させた状態で生きたままでの観察又は検査を良好に行うことができる。特に、一次線７として電子線を用いれば、生きた状態での試料３２のＳＥＭ観察・検査を良好に行うことができる。
【０１１６】
また、当該試料保持面３７ａは開放されているので、ピペット６２やマニピュレータ２６による試料３８へのアクセス（接触又は接近）や、試料３８への薬品の散布が可能となり、マニピュレータ２６を用いて試料への刺激（化学物質散布、電気刺激）を行い、その反応を観察・検査することも可能になる。さらに一次線照射する側の反対側から光学顕微鏡の観察も可能になり、ほぼ同時に同一場所の観察ができる。
【０１１７】
特に、試料保持面３７ａの膜３２の周囲はテーパ形状になっており、ピペット６２やマニピュレータ２６によって当該テーパ部３７ｃ内のみに薬品を供給することにより、薬品の散布量（使用量）を低減できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。
【図２】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。
【図３】本発明における試料保持体の構成を示す断面図である。
【図４】本発明における試料保持体を構成する枠状部材の作成方法を示す図である。
【図５】本発明における試料保持体の構成を示す断面図である。
【図６】本発明における試料保持体の構成を示す断面図である。
【図７】本発明における試料保持体の構成を示す上面図である。
【符号の説明】
【０１１９】
１…鏡筒（一次線照射手段）、１ａ…開口、２…電子銃、３…集束レンズ、４…反射電子検出器（信号検出手段）、７…電子線（一次線）、８…排気手段、９…排気手段、１０…架台、１１…真空室、１２…試料保持体載置部（載置手段）、１２ａ…孔、１３…除震装置、１４…開閉バルブ、１５…排出管、１６…開閉弁、１８…膜保持体（枠状部材）、１９…空間、１９ａ…空間部、２０…サンプル、２２…画像形成装置、２３…表示装置、２４…電子線制御部、２５…コンピュータ、２６…マニピュレータ、２７…光学顕微鏡（光学像取得手段）、２８…制御部、２９…電子線装置部、３２…試料保持膜（膜）、３２ａ…第１の面（試料保持面）、３２ｂ…第２の面、３３…シリコン層、３３ａ…中央部、３４…基板部、３４ａ…開口、３６…窒化シリコン膜、３７…本体部、３７ａ…試料保持面、３７ｂ…テーパ部、３７ｃ…テーパ部、３７ｄ…底面、３７ｅ…開き角、３８…細胞（試料）、３９…培養液、４０…試料保持体、６１…ピペット接触面、６１ａ…段差部、６２…ピペット、３０１…導電膜、３０２…試薬
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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