(57)【要約】【課題】測定中に生じたで光軸のずれを自動的に補正して、高精度な測定を行うことが可能な微小粒子測定装置の提供。【解決手段】微小粒子を含む液体が送液される流路１１と、流路１１を通流する微小粒子にレーザー光を照射し、微小粒子から発生する測定対象光を検出して電気的信号に変換する光学検出手段２１，２２と、流路１１に被検微小粒子を含むサンプル液又は均一な光学特性を示す参照微小粒子を含むキャリブレーション液のいずれか一方を送液する送液手段４１と、参照微小粒子からの電気的信号の強度に基づいて、レーザー光に対する流路１１の相対位置を最適化する光軸補正手段と、を備える微小粒子測定装置Ａを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小粒子を含む液体が送液される流路と、
該流路を通流する微小粒子にレーザー光を照射し、該微小粒子から発生する測定対象光を検出して電気的信号に変換する光学検出手段と、
前記流路に被検微小粒子を含むサンプル液又は均一な光学特性を示す参照微小粒子を含むキャリブレーション液のいずれか一方を送液する送液手段と、
前記参照微小粒子からの電気的信号の強度に基づいて、前記レーザー光に対する前記流路の相対位置を最適化する光軸補正手段と、を備える微小粒子測定装置。
【請求項２】
前記光軸補正手段は、前記参照微小粒子からの電気的信号の強度が所定値となるように前記相対位置を移動させる請求項１記載の微小粒子測定装置。
【請求項３】
前記光軸補正手段は、前記レーザー光の入射方向、及び／又は該方向と前記流路の送液方向とを含む平面に対する垂直方向、に前記相対位置を移動させる請求項２記載の微小粒子測定装置。
【請求項４】
前記送液手段は、前記流路に前記サンプル液又は前記キャリブレーション液のいずれかを一方を交互に送液し、
前記光軸補正手段は、前記流路への前記キャリブレーション液の送液時における前記参照微小粒子からの電気的信号の強度に基づいて、続く前記流路への前記サンプル液送液時における前記相対位置を最適化する請求項３記載の微小粒子測定装置。
【請求項５】
装置本体の振動を検知する加速度センサを備え、
前記送液手段は、該加速センサからの検知信号の出力に基づいて、前記流路に前記キャリブレーション液を所定時間送液する請求項４記載の微小粒子測定装置。
【請求項６】
前記流路がマイクロチップ上に形成されており、
該マイクロチップの温度を計測する温度センサを備え、
前記送液手段は、該温度センサによる計測値が所定値を超過した場合に、前記流路に前記キャリブレーション液を所定時間送液する請求項５記載の微小粒子測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小粒子測定装置に関する。より詳しくは、測定中に任意又は所定のタイミングで光軸補正を行うことで、高精度な測定を可能とした微小粒子測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などの微小粒子の特性を判別するため、微小粒子の分散液を流路内に導入し、流路内を通流する微小粒子の特性を光学的に測定する装置が用いられている。
【０００３】
特に生体関連微小粒子については、フローサイトメトリー（フローサイトメータ）と呼ばれる装置が広く用いられている（非特許文献１参照）。フローサイトメトリーには、微小粒子の特性測定のみを行うものや、さらに測定結果に基づいて所望の特性を備えた微小粒子を分取するものがある。後者のうち、特に細胞を分取対象とした装置を「セルソータ」と呼んでいる。
【０００４】
従来のフローサイトメトリーでは、以下のようにして、細胞やマイクロビーズ等の微小粒子の大きさや構造等の特性を測定している。まず、フローセルにおいて測定対象とする微小粒子を含むサンプル液の層流をシース液層流の中心に流し、サンプル流中に微小粒子を一列に配列させる。次に、光学検出部においてサンプル流中に配列されて通流する微小粒子にレーザー光を照射し、微小粒子から生じる散乱光や蛍光を検出して微小粒子の特性を測定する。光学検出部において、サンプル流にレーザー光を当てる方式には、フローセル内部で当てる「クローズド・システム（closed system）」と、ジェットノズルから吐出された水流（ジェット水柱）に当てる「ジェット・イン・エア・システム（jet in air system）」と、がある。続いて、微小粒子の分取を行う場合には、フローセル外の空間に液滴として吐出されたサンプル液の移動方向を制御して、所望の特性を備えた微小粒子を含む液滴を分取する。
【０００５】
特許文献１（第７図）には、従来のセルソータとして、蛍光標識試薬などで染色された細胞をフローセル内で一列に配列するための流路系と、細胞にレーザー光を照射して散乱光や蛍光を検出するための光学系と、フローセル外の空間に吐出された液滴の移動方向を制御するための分取系と、からなる装置が開示されている。このセルソータの光学検出部には、クローズド・システムが採用されている。
【０００６】
光学検出部において、微小粒子から生じる散乱光や蛍光を効率良く検出するためには、レーザー光をサンプル流に直角かつ焦点が合うように調整する操作が必要である。この操作は、一般に「光軸補正（キャリブレーション）」と呼ばれている。光軸補正は、キャリブレーション用のマイクロビーズを流し、そのヒストグラムデータ等を見ながら集光レンズの位置やフォーカスを調整したり、光源の芯出しを行ったりして、レーザー光、サンプル流及び検出器の位置関係を最適化することにより行われている。特許文献２及び特許文献３には、光軸補正に用いられるキャリブレーション用のマイクロビーズが開示されている。
【０００７】
一方、近年、シリコンやガラス製の基板上に化学的及び生物学的分析を行うための領域や流路を設けたマイクロチップが開発されてきている。このようなマイクロチップを用いた分析システムは、μ−ＴＡＳ（micro-total-analysis system）やラボ・オン・チップ、バイオチップ等と称されている。
【０００８】
微小粒子分取技術へのμ−ＴＡＳの応用例として、マイクロチップ上に配設された流路や領域内で微小粒子の特性を光学的、電気的あるいは磁気的に測定する微小粒子測定技術がある。例えば、特許文献４には、基板上に、微粒子含有溶液導入流路と、当該流路の少なくとも一方の側部に配置されたシース流形成流路と、導入された微粒子を計測するための微粒子計測部位と、該微粒子計測部位の下流に設置された微粒子を分別回収するための２以上の微粒子分別流路と、を有する微粒子分別マイクロチップが開示されている。このマイクロチップは微粒子計測部位から微粒子分別流路への流路口付近に電極を有している。このマイクロチップを備える微小粒子分取装置によれば、電極電界との相互作用によって微粒子の移動方向を制御し、微小粒子の分取を行うことが可能である。
【０００９】
μ−ＴＡＳを応用したフローサイトメトリー（マイクロチップ型フローサイトメトリー）では、ディスポーザブルユース（使い捨て）が可能なマイクロチップにより流路系を構成することで、測定間でのサンプルのクロスコンタミネーションを防止できるという利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−４６９４７号公報
【特許文献２】特開平１１−８３７２４号公報
【特許文献３】特開平９−１９６９１６号公報
【特許文献４】特開２００３−１０７０９９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「細胞工学別冊  実験プロトコルシリーズ  フローサイトメトリー自由自在」、中内啓光、秀潤社、第2版、2006年8月31日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
クローズド・システムを採用したフローサイトメトリーでは、フローセルの位置決めが高精度になされており、レーザー光、サンプル流及び検出器の位置関係がずれ難いため、光軸補正は複数回の測定毎に一度で足りるとされている。一方、ジェット・イン・エア・システムを採用したフローサイトメトリーでは、ジェットノズルを着脱してサンプル等の詰りを洗浄除去する操作が必要であり、着脱操作の度にジェット水柱の位置が変わってしまうため、光軸補正は測定の都度に行う必要がある。また、マイクロチップ型フローサイトメトリーでも、マイクロチップの交換の際にチップの取り付け位置が変わってしまうため、チップ交換の度に光軸補正を行う必要がある。
【００１３】
しかしながら、このように光軸補正を行ったとしても、実際の測定中には、装置に振動が加わったり、シース流の圧力変化や装置内部の温度変化が生じたりして、フローセル内のサンプル流の位置やジェット水柱の位置が変化して、調整した光軸がずれてしまう場合がある。特に、マイクロチップ型フローサイトメトリーでは、樹脂製のマイクロチップがレーザー光の照射による温度変化の影響を受け、流路内のサンプル流の位置が変化する可能性がある。このような測定中の振動や圧力・温度変化等による光軸のずれは、測定精度の低下の要因となり、場合によっては測定が不能となることもある。
【００１４】
そこで、本発明は、測定中に生じた光軸のずれを自動的に補正して、高精度な測定を行うことが可能な微小粒子測定装置を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題解決のため、本発明は、微小粒子を含む液体が送液される流路と、該流路を通流する微小粒子にレーザー光を照射し、該微小粒子から発生する測定対象光を検出して電気的信号に変換する光学検出手段と、前記流路に被検微小粒子を含むサンプル液又は均一な光学特性を示す参照微小粒子を含むキャリブレーション液のいずれか一方を送液する送液手段と、前記参照微小粒子からの電気的信号の強度に基づいて、前記レーザー光に対する前記流路の相対位置を最適化する光軸補正手段と、を備える微小粒子測定装置を提供する。
この微小粒子測定装置において、前記光軸補正手段は、前記参照微小粒子からの電気的信号の強度が所定値となるように、前記レーザー光の入射方向、及び／又は該方向と前記流路の送液方向とを含む平面に対する垂直方向、に前記相対位置を移動させ、該相対位置を最適化する。
この微小粒子測定装置において、前記送液手段は、前記流路に前記サンプル液又は前記キャリブレーション液のいずれかを一方を交互に送液し、前記光軸補正手段は、前記流路への前記キャリブレーション液の送液時における前記参照微小粒子からの電気的信号の強度に基づいて、続く前記流路への前記サンプル液送液時における前記相対位置を最適化する。
この微小粒子測定装置は、装置本体の振動を検知する加速度センサを備えていてもよく、この場合において、前記送液手段は、該加速センサからの検知信号の出力に基づいて、前記流路に前記キャリブレーション液を所定時間送液するように構成することができる。
また、この微小粒子測定装置は、前記流路がマイクロチップ上に形成され、該マイクロチップの温度を計測する温度センサを備えていてもよく、この場合において、前記送液手段は、該温度センサによる計測値が所定値を超過した場合に、前記流路に前記キャリブレーション液を所定時間送液するように構成することができる。
【００１６】
本発明において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
【００１７】
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれる。対象とする細胞には、動物細胞（血球系細胞など）及び植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【００１８】
また、「参照微小粒子」とは、レーザー光、サンプル流及び検出器の位置関係や、光増幅器の増幅率等の最適化を一定の測定条件下で行うために用いられる微小粒子集団であり、均一な光学特性を示すように調製された微小粒子集団を意味する。参照用微小粒子には、従来、フローサイトメトリーにおける光軸補正に用いられているキャリブレーション用の微小粒子が広く包含され、固定され生体関連微小粒子や、上記特許文献２及び特許文献３に開示されるような合成粒子が含まれ得る。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、測定中に生じたで光軸のずれを自動的に補正して、高精度な測定を行うことが可能な微小粒子測定装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明に係る微小粒子測定装置Ａの概略構成を説明する模式図である。
【図２】光軸補正手段によるレーザー光に対する流路の相対位置の移動方法を説明する図である。
【図３】微小粒子測定装置Ａの動作を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．微小粒子測定装置の装置構成
（１）マイクロチップ
（２）光学検出手段
（３）送液手段
（４）光軸補正手段
（５）加速度センサと温度センサ
（６）全体制御部
２．微小粒子測定装置の動作
（１）ステップＳ１（被検微小粒子の測定）
（２）ステップＳ２（キャリブレーション液への切換）
（３）ステップＳ３（参照微小粒子の測定）
（４）ステップＳ４（光軸補正）
（５）ステップＳ５（サンプル液への切換）
（６）ステップＳ６（被検微小粒子の測定再開）
（７）ステップＳ２のタイミング
【００２２】
１．微小粒子測定装置の装置構成
図１は、本発明に係る微小粒子測定装置Ａの概略構成を説明する模式図である。
【００２３】
（１）マイクロチップ
図中、符号１は、マイクロチップを示す。マイクロチップ１には、測定対象とする被検微小粒子を含むサンプル液又は参照微小粒子を含むキャリブレーション液が導入され、通流する微小粒子の光学特性測定の場となる流路１１が形成されている。以下、サンプル液及びキャリブレーション液を併せて「サンプル液等」と、また被検微小粒子及び参照微小粒子を併せて「被検微小粒子等」ともいうものとする。
【００２４】
符号１２１で示すサンプル液インレットから分岐流路１１１に導入されたサンプル液又はキャリブレーション液は、シース液インレット１２２，１２２から分岐流路１１２，１１２に導入されたシース液と合流部１２３において合流する。この際、分岐流路１１１から送液されるサンプル液等の層流がシース液インレット１２２，１２２から送液されるシース液層流によって挟み込まれることにより、サンプル液等の層流中の被検微小粒子等が一列に配列されて流路１１へ送流される。
【００２５】
マイクロチップ１は、ガラスや各種プラスチック（ＰＰ，ＰＣ，ＣＯＰ、ＰＤＭＳなど）により形成される。マイクロチップの材質は、次に説明する光学検出手段２１，２２から照射される測定光に対して透過性を有し、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいために光学誤差が少ない材質とすることが望ましい。
【００２６】
マイクロチップ１への流路１１等の成形は、ガラス製基板のウェットエッチングやドライエッチングによって、またプラスチック製基板のナノインプリントや射出成型、機械加工によって行うことができる。マイクロチップ１は、流路１１等を成形した基板を、同じ材質又は異なる材質の基板で封止することで形成することができる。
【００２７】
（２）光学検出手段
流路１１を通流する微小粒子の光学特性の測定は、図中、符号２１，２２で示す一対の光学検出手段によって行われる。光学検出手段２１，２２は、流路１１の所定部位において流路１１を通流する微小粒子にレーザー光（測定光）を照射し、微小粒子から発生する光（測定対象光）を検出して電気的信号へと変換する。以下、流路１１において光検出手段２１，２２からの測定光が照射される部位を「光照射部Ｓ」というものとする。なお、微小粒子測定装置Ａにおいて、サンプル液等及びシース液の層流を形成するための流路構成は、サンプル液層流中に微小粒子を一列に配列して光照射部Ｓに送流することができれば、ここで説明する構成に限られないものとする。また、ここでは、マイクロチップ上に形成した流路１１を微小粒子の光学特性測定の場となる光学検出部として構成した場合を説明するが、微小粒子測定装置Ａにおいて、光学検出部は、従来のクローズド・システム又はジェット・イン・エア・システムにより構成してもよい。これらの場合において、流路１１は、クローズド・システムではフローセル内の流路に、ジェット・イン・エア・システムではジェットノズルから吐出されたジェット水柱にそれぞれ対応する。
【００２８】
光学検出手段２１，２２は、従来のフローサイトメトリーと同様に構成することができる。具体的には、レーザー光源と、微小粒子に対しレーザー光を集光・照射するための集光レンズやダイクロイックミラー、バンドパスフィルター等からなる照射系（光学検出手段２１）と、レーザー光の照射によって微小粒子から発生する測定対象光を検出する検出系（光学検出手段２２）と、によって構成される。検出系は、例えば、PMT（photo multiplier tube）や、CCDやCMOS素子等のエリア撮像素子等によって構成され得る。なお、図では、照射系と検出系を別体に構成した場合を示しているが、照射系と検出系は同一の光学経路により構成してもよい。
【００２９】
光学検出手段２１，２２の検出系により検出される測定対象光は、レーザー光の照射によって微小粒子から発生する光であって、例えば、前方散乱光や側方散乱光、レイリー散乱やミー散乱等の散乱光や蛍光などとすることができる。これらの測定対象光は電気的信号に変換され、全体制御部３に出力される。全体制御部３は、被検微小粒子の電気的信号に基づいて微小粒子の光学特性を判定する。また、全体制御部３は、参照微小粒子の電気的信号の強度に基づいて、照射系（光学検出手段２１）から照射されるレーザー光に対する流路１１の相対位置を最適化するように光軸補正手段（後述）に信号を出力する。
【００３０】
なお、微小粒子測定装置Ａにおいて、光学検出手段２１，２２は、例えば、電気的又は磁気的な検出手段に置換されてもよい。微小粒子の特性を電気的又は磁気的に検出する場合には、流路１１に両側に微小電極を対向させて配設し、抵抗値、容量値（キャパシタンス値）、インダクタンス値、インピーダンス、電極間の電界の変化値、あるいは、磁化、磁界変化、磁場変化等を測定する。
【００３１】
（３）送液手段
図中、符号４１は、サンプル液インレット１２１にサンプル液又はキャリブレーション液を導入するための送液手段を示す。符号４１１はサンプル液を貯留するサンプル液タンクを、符号４１２はキャリブレーション液を貯留するキャリブレーション液タンクを示す。送液手段４１は、通常使用される送液ポンプにより構成され、弁４１３の切り換えによってサンプル液又はキャリブレーション液をサンプル液インレット１２１に送液する。弁４１３には全体制御部３から信号が出力されており、送液手段４１はこの信号出力に基づいて弁４１３を切り換えてサンプル液又はキャリブレーション液のいずれか一方をサンプル液インレット１２１に送液する。
【００３２】
図中、符号４２は、シース液インレット１２２，１２２にシース液を導入するためのシース液供給手段、符号４２１は、シース液を貯留するシース液タンクを示す。流路１１に導入され、光照射部Ｓを通過したサンプル液等及びシース液は、図中、符号４３で示す排出手段によって、アウトレット１２４からマイクロチップ１外の廃液タンク４３１に導出される。シース液供給手段４２及び排出手段４３も、通常使用される送液ポンプによって構成できる。
【００３３】
（４）光軸補正手段
微小粒子測定装置Ａは、図示しない光軸補正手段を備える。この光軸補正手段は、光学検出手段２１（照射系）から照射されるレーザー光に対する流路１１の相対位置を移動させるために機能する。
【００３４】
図１及び図２を参照して、光軸補正手段によるレーザー光に対する流路１１の相対位置の移動方法について説明する。図２は、マイクロチップ１の光照射部Ｓ付近の流路１１を模式的に示す。図中、符号Ｐは微小粒子を、矢印Ｆは送液方向を、矢印Ｌはレーザー光を示す。
【００３５】
光軸補正手段は、レーザー光Ｌの入射方向（図中、Ｚ軸方向）にマイクロチップ１又は光学検出手段２１，２２のいずれか一方又は両方を移動させる。マイクロチップ１及び／又は光学検出手段２１，２２をＺ軸方向に移動させることにより、レーザー光Ｌのフォーカス位置を調整して、流路１１内のサンプル流中を通流する微小粒子Ｐにフォーカスを合わせることができる。また、同様にマイクロチップ１及び／又は光学検出手段２１，２２の移動を行うことにより、微小粒子Ｐへのフォーカスをずらすことも可能である。
【００３６】
さらに、光軸補正手段は、レーザー光Ｌの入射方向と流路１１の送液方向Ｆ（Ｘ軸方向）とを含む平面（ＺＸ平面）に対して垂直方向（Ｙ軸方向）にも、マイクロチップ１又は光学検出手段２１，２２のいずれか一方又はその両方を移動させる。マイクロチップ１及び／又は光学検出手段２１，２２をＹ軸方向に移動させることにより、レーザー光Ｌの照射位置を調整して、流路１１内のサンプル流中を通流する微小粒子Ｐにレーザースポットを合わせることができる。また、同様にマイクロチップ１及び／又は光学検出手段２１，２２の移動を行うことにより、スポットを微小粒子Ｐからずらすことも可能である。
【００３７】
光軸補正手段は、例えば、送りねじ、ガイド及びモータ等によって構成できる。光軸補正手段の構成は、マイクロチップ１及び／又は光学検出手段２１，２２をＺ軸及び／又はＹ軸方向に移動可能なものであれば特に限定されない。光軸補正手段には全体制御部３から信号が出力されており、光軸補正手段はこの信号出力に基づいてマイクロチップ１及び／又は光学検出手段２１，２２をＺ軸及び／又はＹ軸方向に移動させ、レーザー光に対する流路１１の相対位置を移動させる。
【００３８】
（５）加速度センサと温度センサ
図中、符号５は、微小粒子測定装置Ａ本体の振動を検知する加速度センサを示す。加速度センサ５は、装置本体の振動を検知して検知信号を全体制御部３に出力する。
【００３９】
また、図中、符号６は、マイクロチップ１の温度を計測する温度センサを示す。温度センサ６は、マイクロチップ１の温度（特に光照射部Ｓの温度）を計測して計測値を全体制御部３に出力する。
【００４０】
（６）全体制御部
全体制御部３は、光学検出手段２１，２２の検出系から出力される電気的信号に基づいて、被検微小粒子の光学特性の判定を行う。微小粒子の光学特性判定のためのパラメータは、対象とする微小粒子及び測定目的に応じて、微小粒子の大きさを測定する前方散乱光や、構造を測定する側方散乱光、レイリー散乱やミー散乱等の散乱光や蛍光などから変換される電気的信号が適宜用いられる。パラメータの具体的な解析方法は、従来のフローサイトメトリーと同様である。なお、微小粒子の特性を電気的又は磁気的に検出する場合には、抵抗値、容量値（キャパシタンス値）、インダクタンス値、インピーダンス、電極間の電界の変化値、あるいは、磁化、磁界変化、磁場変化等などから変換される電気的信号がパラメータとして用いられる。
【００４１】
また、全体制御部３は、光学検出手段２１，２２の検出系から出力される参照微小粒子の電気的信号の強度に基づいて、照射系（光学検出手段２１）から照射されるレーザー光に対する流路１１の相対位置を最適化するように光軸補正手段に信号を出力する。光軸補正手段は、全体制御部３からの信号を受け、上記電気的信号の強度が所定値となるようにマイクロチップ１及び／又は光学検出手段２１，２２をＺ軸及び／又はＹ軸方向に移動させる。
【００４２】
さらに、全体制御部３は、加速度センサ５から出力される検知信号及び／又は温度センサから出力される計測値に基づいて、サンプル液インレット１２１にキャリブレーション液が送液されるように送液手段４１の弁４１３に信号を出力する。送液手段４１は、全体制御部３からの信号を受け、サンプル液インレット１２１にキャリブレーション液が所定時間送液されるように弁４１３を切り換える。
【００４３】
２．微小粒子測定装置の動作
続いて、微小粒子測定装置Ａの動作について、図３を参照しながら説明する。図３は、微小粒子測定装置Ａの動作を説明するフローチャートである。
【００４４】
（１）ステップＳ１（被検微小粒子の測定）
測定を開始すると、送液手段４１によるサンプル液の送液が開始され、流路１１の光照射部Ｓに被検微小粒子が送流される。光照射部Ｓでは光学検出手段２１，２２による被検微小粒子の光学特性の検出が行われ、検出された測定対象光が電気的信号に変換されて全体制御部３に出力される。全体制御部３は、各種散乱光や蛍光等のパラメータを用いて電気的信号を解析し、微小粒子の光学特性を判定して結果を蓄積する。
【００４５】
（２）ステップＳ２（キャリブレーション液への切換）
被検微小粒子の測定開始後、所定時間が経過すると、全体制御部３は、送液手段４１の弁４１３に信号を出力して切り換えを行い、送液手段４１からのサンプル液の送液を停止してキャリブレーション液の送液を開始させる。
【００４６】
（３）ステップＳ３（参照微小粒子の測定）
キャリブレーション液の送液が開始されると、流路１１の光照射部Ｓに参照微小粒子が送流され、光照射部Ｓにおいて光学検出手段２１，２２による参照微小粒子の光学特性の検出が行われる。キャリブレーション液の送液は所定時間行われ、この間、参照微小粒子から検出された測定対象光が電気的信号に変換されて全体制御部３に出力される。
【００４７】
参照微小粒子には、被検微小粒子と同等の光学特性を示す粒子を用いることが望ましい。参照微小粒子には、例えば、被検微小粒子と同程度の蛍光強度が得られる量の蛍光色素を含有させたり、被検微小粒子と同程度の大きさとしたりすることで、被検微小粒子と同等の光学特性を付与することができる。
【００４８】
（４）ステップＳ４（光軸補正）
全体制御部３は、出力される参照微小粒子の電気的信号の強度に基づいて、レーザー光に対する流路１１の相対位置を最適化する光軸補正を行う。すなわち、全体制御部３は、光軸補正手段に信号を出力し、上記電気的信号の強度が所定値となるようにマイクロチップ１及び／又は光学検出手段２１，２２をＺ軸及び／又はＹ軸方向に移動させる。これにより、微小粒子測定装置Ａは、測定中の振動やシース流の圧力変化、装置内部の温度変化等により生じた光軸のずれを補正する。
【００４９】
参照微小粒子の電気的信号の強度が最大値となるようにマイクロチップ１及び／又は光学検出手段２１，２２をＺ軸及び／又はＹ軸方向に移動させる場合について具体的に説明する。例えば、振動によってマイクロチップ１の取り付け位置が変位し、図２中Ｚ軸正方向にサンプル流の位置が変化してレーザー光Ｌのフォーカスがずれた場合を想定する。この場合、全体制御部３は、マイクロチップ１を逆方向のＺ軸負方向に移動させてフォーカスをサンプル流に合わせる。また、例えば、レーザー光Ｌの照射による温度変化によってマイクロチップ１が影響を受け、Ｙ軸正方向にサンプル流の位置が変化してレーザー光Ｌのスポットがずれた場合、全体制御部３は、光学検出手段２１，２２をＹ軸負方向に移動させてスポットをサンプル流に合わせる。
【００５０】
マイクロチップ１及び／又は光学検出手段２１，２２を移動させてレーザー光Ｌのフォーカス及びスポットの位置をサンプル流に合わせることで、測定中に生じた光軸のずれを補正して、参照微小粒子から生じる測定対象光を高効率に検出し、全体制御部３に出力される電気的信号の強度を最大値とすることができる。
【００５１】
レーザー光に対する流路１１の相対位置の最適化は、上記のように全体制御部３に出力される参照微小粒子の電気的信号の強度が最大値となるように行う場合の他、電気的信号強度が予め与えられた基準値範囲内となるように行うこともできる。この場合、光軸補正手段は、マイクロチップ１及び／又は光学検出手段２１，２２を移動させて、レーザー光Ｌのフォーカス及びスポットの位置をサンプル流に合わせたり、逆にずらしたりすることによって、参照微小粒子の電気的信号の強度が基準値範囲内となるようにする。
【００５２】
ステップＳ３の参照微小粒子の測定とステップＳ４の光軸補正の工程は、ステップＳ２のキャリブレーション液の送液開始後、所定時間内に順に行われてもよく、あるいは同時に行われてもよいものとする。
【００５３】
（５）ステップＳ５（サンプル液への切換）
キャリブレーション液の送液開始後、所定時間が経過すると、全体制御部３は、送液手段４１の弁４１３に信号を出力して切り換えを行い、送液手段４１からのキャリブレーション液の送液を停止して、サンプル液の送液を再開させる。
【００５４】
（６）ステップＳ６（被検微小粒子の測定再開）
サンプル液の送液が再開されると、流路１１の光照射部Ｓに再び被検微小粒子が送流され、光学検出手段２１，２２による被検微小粒子の光学特性の検出が行われる。
【００５５】
この際、上記ステップＳ４において、全体制御部３に出力される参照微小粒子の電気的信号の強度が最大値となるようにレーザー光に対する流路１１の相対位置が最適化されていることで、被検微小粒子から生じる散乱光や蛍光についても高効率に検出して電気信号に変換することが可能である。
【００５６】
ここで、レーザー光に対する流路１１の相対位置を、全体制御部３に出力される参照微小粒子の電気的信号強度が最大値となるように最適化した場合、ステップＳ６において被検微小粒子から得られる電気的信号の強度が、全体制御部３の識別可能範囲（ダイナミックレンジ）を逸脱することがあり得る。
【００５７】
電気的信号の強度のダイナミックレンジの逸脱は、測定中の温度変化の影響によって光増幅器の増幅率が変化することが一因となり得る。この場合には、上記ステップＳ４において、参照微小粒子の電気的信号の強度が予め与えられた基準値範囲内となるようにレーザー光に対する流路１１の相対位置を最適化することが有効となる。基準値範囲を全体制御部３のダイナミックレンジに応じて予め設定し、参照微小粒子の電気的信号強度をこの範囲内とすることで、被検微小粒子から生じる散乱光や蛍光についても識別可能範囲内の強度の電気信号に変換することが可能となる。
【００５８】
さらに、ステップＳ４では、全体制御部３に出力される参照微小粒子の電気的信号の強度が基準値範囲内となるように光増幅器の増幅率にフィードバックを与えたり、全体制御部３における解析パラメータにフィードバックを与えたりすることで、被検微小粒子の電気的信号を識別可能範囲内の強度に変換することも考えられる。この際、ステップＳ４において、参照微小粒子に被検微小粒子と同等の光学特性を示す粒子を用いておくことで、光増幅器の増幅率へのフィードバック及び解析パラメータへのフィードバックがより効果的に行われる。
【００５９】
被検微小粒子の測定再開後、所定時間が経過すると、全体制御部３は、再度、送液手段４１の弁４１３に信号を出力して切り換えを行い、送液手段４１からのサンプル液の送液を停止してキャリブレーション液の送液を開始し、ステップＳ２の工程を行う。そして、ステップＳ３〜ステップＳ６の工程を測定終了まで繰り返し行う。
【００６０】
このように、微小粒子測定装置Ａでは、ステップＳ２〜ステップＳ６の各工程を繰り返し行うことで、キャリブレーション液送液時における参照微小粒子からの電気的信号の強度に基づいて、続くサンプル液送液時におけるレーザー光に対する流路１１の相対位置を最適化する。これにより、微小粒子測定装置Ａでは、測定中の振動や圧力・温度変化等による光軸のずれが生じたとしても、ずれを自動的に補正することができ、高精度な測定を行うことが可能とされている。
【００６１】
（７）ステップＳ２のタイミング
上記では、キャリブレーション液の送液とサンプル液の送液を所定時間間隔で切り換えて、ステップＳ４の光軸補正工程を一定時間間隔で行う場合について説明した。ステップＳ４の光軸補正工程は、このように所定のタイミングにて自動で行われる場合の他、装置Ａの使用者が必要に応じてサンプル液及びキャリブレーション液の切換を行うことで、任意のタイミングで行われるように構成してもよい。
【００６２】
さらに、加速度センサ５から出力される検知信号及び／又は温度センサから出力される計測値に基づいてサンプル液及びキャリブレーション液の切換が自動で行われるように構成してもよい。加速度センサ５は、装置本体の振動を検知して検知信号を全体制御部３に出力している。この検知信号に基づいてキャリブレーション液への切換を行ってステップＳ４の光軸補正を行うことで、振動によって生じた光軸のずれを迅速に補正して測定を行うことができる。
【００６３】
また、温度センサ６は、マイクロチップ１の温度（特に光照射部Ｓの温度）を計測して計測値を全体制御部３に出力している。この計測値が所定値を超過した場合にキャリブレーション液への切換を行ってステップＳ４の光軸補正を行うことで、温度変化による光軸のずれを随時補正して測定を行うこともできる。
【符号の説明】
【００６４】
Ａ  微小粒子測定装置
Ｌ  レーザー光
Ｐ  微小粒子
Ｓ  光照射部
１  マイクロチップ
１１  流路
１１１，１１２  分岐流路
１２１  サンプル液インレット
１２２  シース液インレット
１２３  合流部
１２４  アウトレット
２１  光学検出手段（照射系）
２２  光学検出手段（検出系）
３  全体制御部
４１  送液手段
４１１  サンプル液タンク
４１２  キャリブレーション液タンク
４１３  弁
４２  シース液供給手段
４２１  シース液タンク
４３  排出手段
４３１  廃液タンク
５  温度センサ
６  加速度センサ
【図１】
2010286292.tif 000003
【図２】
2010286292.tif 000004
【図３】
2010286292.tif 000005