(57)【要約】      （修正有）【課題】触媒性抗体およびそのフラグメントの産生を刺激する新規組成物及び方法を提供する。【解決手段】共有結合反応性抗原アナログであり、あらかじめ決められた疾病に関連する抗原に対して特異性を有する触媒性抗体の産生を刺激する。該抗原アナログは３つの必須エレメントを含み、（ａ）セリンプロテアーゼの反応性セリン残基に化学的に結合し、（ｂ）触媒部位の塩基性残基の開裂特異性の原因である正に帯電したＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のごとき構造に結合し、（ｃ）イオン対形成および非共有結合力によって複数のアミノ酸において抗体連合部位に結合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造式：
Ｘ１−Ｙ−Ｅ−Ｘ２
［式中、Ｘ１およびＸ２は反応中心のアミノ末端側およびカルボキシ末端側の３個ないし１０個のアミノ酸を含むペプチド配列であり、ここで、ペプチド配列は疾病関連蛋白のエピトープであり；Ｙはリジン、アルギニンまたはそれらの類似体からなる群より選択される正に帯電したアミノ酸残基であり；Ｅはホスホン酸部分またはボロネート部分からなる群より選択される求電子反応中心である］
を含む共有結合反応性抗原アナログ（ＣＲＡＡ）。
【請求項２】
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ、腫瘍壊死因子、上皮成長因子受容体、インターロイキン−１、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｂ型肝炎表面抗原、細菌エキソトキシン、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ｐ５３、前立腺特異的抗原、癌胎児性抗原、プロラクチン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、上皮成長因子受容体、ＨＥＲ−２、プロラクチン受容体、ステロイド受容体およびＩＬ−４からなる群より選択される蛋白中に存在するエピトープのペプチド配列である、請求項１記載の共有結合反応性抗原アナログ。
【請求項３】
Ｘ１がＭｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓであり；ＹがＬｙｓであり；Ｅがホスホン酸エステルであり；Ｘ２がＣｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒｇである、上皮成長因子受容体に対する触媒性抗体の産生を誘発する共有結合反応性抗原アナログ；または
Ｘ１がＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙであり；ＹがＬｙｓであり；Ｅがホスホン酸エステルであり；Ｘ２がＡｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａである、ｇｐ１２０に対する触媒性抗体の産生を誘発する共有結合反応性抗原アナログ；または
Ｘ１がＬｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕであり；ＹがＬｙｓであり；Ｅがホスホン酸エステルであり；Ｘ２がＡｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏである、ＴＮＦαに対する触媒性抗体の産生を誘発する共有結合反応性抗原アナログ；または
Ｘ１がＰｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓであり；ＹがＬｙｓであり；Ｅがホスホン酸エステルであり；Ｘ２がＰｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕである、ＩＬ−１βに対する触媒性抗体の産生を誘発する共有結合反応性抗原アナログ；
である請求項１または２記載の共有結合反応性抗原アナログ。
【請求項４】
触媒性抗体の産生を刺激し、該抗体を単離し、精製するための、医薬調合品の調製に使用するための請求項１ないし３のいずれか一項に記載の共有結合反応性抗原アナログ。
【請求項５】
該医薬調合品が免疫原性量の遷移状態アナログ（ＴＳＡ）をさらに含む、請求項４に記載の使用のための共有結合反応性抗原アナログ。
【請求項６】
触媒性抗体を阻害するのに使用する請求項１ないし３のいずれか一項に記載の共有結合反応性抗原アナログ。
【請求項７】
微生物感染に対して患者への積極的免疫付与に使用するための、感染性微生物由来の免疫原性の微生物エピトープを含む請求項１ないし３のいずれか一項に記載の共有結合反応性抗原アナログ。
【請求項８】
体内で生成された触媒性抗体の存在に関連した病理学的状態を治療するための医薬調合品であって、該触媒性抗体により不可逆的に結合される、該触媒性抗体の活性を阻害するに十分な量の請求項１ないし３のいずれか一項に記載の共有結合反応性抗原アナログおよび生物学的に適合する媒体を含有する医薬調合品。
【請求項９】
触媒性抗体の活性を不可逆的に阻害することによって患者の病状を治療するために使用される請求項１ないし３のいずれか一項に記載の共有結合反応性抗原アナログ。
【請求項１０】
該病状が自己免疫性疾患であって、該自己免疫性疾患が好ましくは、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリトマトーデス、喘息、リューマチ性関節炎、混合結合組織疾患、Reiter症候群、Sjogren症候群、血管炎およびバードショット網膜症（bird shot retinopathy）からなる群より選択されるか；または
リンパ増殖性疾患であって、該リンパ増殖性疾患が好ましくは、多発性ミエローマ、急性リンパ芽球性白血病、リンパ芽球性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞様リンパ腫、Waldenstromsマクログロビン血症、フォリキュラーセンター（Follicular Center）、リンパ腫、粘膜結合性リンパ様組織リンパ腫、ヘアリーセル白血病、広範性大Ｂ細胞リンパ腫、Burkitt'sリンパ腫、および結節をベースにした単球様リンパ腫からなる群より選択される；
請求項９の使用のための共有結合反応性抗原アナログ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学、分子生物学および医学の分野に関連する。より詳細には、本発明は、新規触媒性抗体およびその阻害剤の産生を刺激する新規方法および組成物を提供する。また本発明は、生殖細胞系遺伝子から発現される天然に存在する触媒性抗体の同定および単離方法も提供する。最終的には、本発明は、触媒性抗体の産生を刺激し、そして／あるいはその活性を不可逆的に阻害する、共有結合反応性抗原アナログの合成方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において括弧内に番号を示すことによりいくつかの刊行物を参照して、本発明の属する分野の技術的現状を十分に説明する。これらの各刊行物の開示を参照により本明細書に記載されているものとみなす。
バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド（ＶＩＰ）が全速患者由来の抗体（Ａｂｓ）により開裂されるという観察結果は、Ａｂｓがペプチダーゼ活性を有することを早くから明らかにしていた（１、２）。この観察結果は、Suzukiら（３）により独立別個に再現された。自己抗体の触媒はＶＩＰに対する触媒に限らない。ハシモト甲状腺炎における自己抗体はチログロブリンの開裂を触媒する（４）。自己抗体の触媒に関するさらなる証拠は、狼そう患者由来のＡｂｓのＤＮａｓｅ活性についての報告により提供された（５、６）。自己免疫疾患において触媒性Ａｂが合成される傾向にあるということは、遺伝的に自己免疫疾患傾向のあるマウス株が、遷移状態アナログでの免疫に応答した対照マウス株と比較して、高レベルのエステラーゼＡｂｓを産生するという観察結果（７）により支持されている。
【０００３】
非触媒性Ａｂｓと同様に、ペプチダーゼＡｂｓは、ＶＬおよびＶＨドメインの残基に接触することにより媒介される高い特異性をもって抗原（Ａｇｓ）に結合することができる。精製ＨおよびＬサブユニットは、親抗体よりも低い親和性を有するにもかかわらず、独立してＡｇｓに結合できることが知られている。Ａｂ−Ａｇ複合体のＸ線結晶回折像は、ＶＬおよびＶＨドメインが両方ともＡｇへの結合に関与していることを示した（８）。２種のＶドメインの正確な関与は個々のＡｂ−Ａｇ複合体により様々であるが、ＶＨドメインがいくぶん大きく関与している可能性がある。なぜなら、ＣＤＲＨ３はＣＤＲＬ３と比較して長く、配列の変化も多いからである。
【０００４】
ペプチダーゼＡｂによるポリペプチドＡｇの最初の複合体形成後に、１またはそれ以上のペプチド結合の開裂が起こる。開裂の直前に、遷移状態のペプチド結合によって抗体の触媒残基との接触が確立される。ペプチド結合を加水分解する能力はＶＬドメインに存すると思われる。この結論は、ポリクローナル自己抗体のＬ鎖、多発性ミエローマ患者から単離されたモノクローナルＬ鎖およびそれらの組換え型ＶＬドメイン、ならびにＶＩＰでの免疫により生じた組換え型Ｌ鎖によるＶＩＰの開裂に基づいている。ＶＩＰに対するポリクローナルおよびモノクローナルＡｂｓのＨ鎖はＶＩＰに結合しうるが、触媒活性を欠く（９）。それにもかかわらずＶＨドメインは「リモートコントロール」によりペプチダーゼ活性に影響する。なぜなら、ＶＨドメインに連結された触媒性抗ＶＩＰのＶＬドメインから構成されるＦv構築物のペプチダーゼ活性により示されるように、開裂部位から離れたＶＩＰへの結合において、ＶＨドメインは結合部位のコンホーメーションに影響しうるからである。ＶＩＰ結合親和性および触媒効率の値により評価されるように、抗ＶＩＰのＶＨドメインは触媒活性に対して有益な効果を奏し、無関係なＶＨドメインは触媒活性に対して悪影響を及ぼす。触媒性Ａｂｓにおける別個の触媒サブサイトおよび抗原結合サブサイトの存在が提唱されているが、そのことは、一般的にはＡｂｓが１５〜２２個のアミノ酸からなるポリペプチド基質に適応しうる大きな連合部位（combining sites）を含むこと（８）、ならびに開裂部位から離れた基質領域がＡｂｓにより認識されることと矛盾しない。かくして、ＶＨドメインは触媒部位の特異性を制御するための手段を提供する。
【０００５】
Ｌ鎖の分子モデリングは、そのＡｓｐ１、Ｓｅｒ２７ａおよびＨｉｓ９３が適切に配置されているので触媒トライアッド（triad）として役立つことを示唆する（１０）。部位特異的突然変異法によりＳｅｒ２７ａ、Ｈｉｓ９３またはＡｓｐ１をＡｌａ残基に置き換えることにより、ＶＩＰの加水分解が９０％以上抑制された（１２）。セリンプロテアーゼ阻害剤であるジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）により野生型蛋白の触媒活性が阻害されたが、Ｓｅｒ２７ａ変異体の残存活性はＤＦＰに耐性があった。ＶＩＰに対する野生型Ｌ鎖のＫm値（１３０ｎＭ）は、Ｓｅｒ２７ａ、Ｈｉｓ９３およびＡｓｐ１における突然変異によっては影響されなかった。対照的に、Ｌ鎖の拡張された活性部位を形成する残基（Ｓｅｒ２６、Ｈｉｓ２７ｄ／Ａｓｐ２８）における突然変異は、Ｋm値を増大させ（１０倍）、ターンオーバーを増大させた（１０倍）。これらの結果は、基底状態の安定性が減少したことによるものと説明できる。結果生じたΔＧ+catの減少はターンオーバーを増大させる。かくして、Ｌ鎖による触媒に関与する２つのタイプの残基が同定された。Ｓｅｒ７２ａおよびＨｉｓ９３は触媒に必須であるが、基底状態のＶＩＰとの最初の高親和性複合体形成には必要でない。Ｓｅｒ２６およびＨｉｓ２７ｄ／Ａｓｐ２８はＶＩＰ基底状態の結合に関与し、間接的にターンオーバーを制限する。図１参照。
【０００６】
ＶＩＰａｓｅのＬ鎖は反応の初期段階においてバーストキネティクス（burst kinetics）を示し、セリンプロテアーゼによるペプチド結合開裂の間に生じるような、共有結合によるアシル−Ｌ鎖中間体の形成が示唆される。Ｌ鎖を基質Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡと混合した後の時間の関数として蛍光強度がモニターされた。共有結合による中間体の形成に対応する、即座の蛍光増加があり、次いで、定常状態の確立に対応する、ゆっくりとした蛍光減少があった。標準的なアミノメチルクマリンの蛍光収量と比較することにより、バーストの強度から活性部位の数が計算された。触媒部位の濃度は１１４ｎＭと見積もられ、Bradford法により見積もられたＬ鎖濃度（１２５ｎＭ）の約９０％であった。
【０００７】
抗ＶＩＰ ＶＬドメイン中の触媒残基（Ｓｅｒ２７ａ、Ｈｉｓ９３、Ａｓｐ１）もまた、その生殖細胞系のＶＬドメインカウンターパート（該生殖細胞系ＶＬ遺伝子のGenBank受託番号はＺ７２３８４）中に存在している。抗ＶＩＰ ＶＬドメインは、その生殖細胞系配列と比較した場合、４個のアミノ酸置換を含んでいる。これらはＨｉｓ２７ｄ：Ａｓｐ、Ｔｈｒ２８ｅ：Ｓｅｒ、Ｉｌｅ３４：ＡｓｎおよびＧｌｎ９６：Ｔｒｐである。以前記載された必要な４つの変異（１２）を導入することにより抗ＶＩＰ Ｌ鎖の生殖細胞系コンフィギュレーション蛋白が構築された。その精製生殖細胞系蛋白はＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＡＣＡ基質の開裂により検出される触媒活性を示したが、成熟Ｌ鎖よりも３．５倍低レベルであった（３３０±２３ＦＵ／０．４μＭ Ｌ鎖／２０分；基質濃度５０μＭ）。そのデータは、体細胞突然変異による残基に起因する遠隔効果は触媒活性の発現に必須でないことを示唆する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、触媒性抗体およびそのフラグメントの産生を刺激する新規組成物および方法を提供する。あらかじめ決められた疾病に関連する抗原に対して特異性を有する触媒性抗体は臨床的に使用される貴重な治療ツールを提供する。感染症、自己免疫疾患および新生物疾患（これらに限らない）を包含する種々の医学的疾病および疾患を治療するための、天然に存在する触媒性抗体を同定、単離および精製するための方法が本発明において提供される。かかる触媒性抗体は、獣医学、工業および臨床研究および皮膚科学の分野にも適用されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明の１の態様によれば、発症プロセスおよび新生物プロセス（これらに限らない）に関与するあらかじめ決定された標的抗原に対する触媒性抗体の産生を刺激するための方法および組成物が提供される。共有結合反応性抗原アナログ（ＣＲＡＡｓ）が記載され、それらは、自己免疫疾患、微生物性疾患、リンパ球分化疾患および癌を包含する種々の医学的状態の治療において治療的価値を有する触媒性抗体の産生を刺激する。本発明の触媒性抗体を予防的に用いて、敗血性ショック、全身性炎症疾患および急性呼吸困難症候群（これらに限らない）を包含する特定の医学的疾患を予防してもよい。
【００１０】
本発明の共有結合反応性抗原アナログ（ＣＲＡＡｓ）は３つの必須エレメントを含み、式：Ｘ１−Ｙ−Ｅ−Ｘ２を有する。Ｅは特定のアミノ酸の求核性側鎖と反応して共有結合するように設計された求電子反応中心であり；ＹはＰ１位置（反応中心のＮ末端上の第１アミノ酸）における塩基性残基（ＡｒｇまたはＬｙｓ）であり；Ｘ１およびＸ２は反応中心のＮ末端側およびＣ末端側にある３個ないし１０個の隣接アミノ酸からなる。得られるＣＲＡＡは個々の構造エレメントの新規組み合わせであり、それらは共働して（ａ）特定のセリンプロテアーゼタイプの触媒性抗体のために生殖細胞系遺伝子によりコードされる反応性セリン残基（ならびに生殖細胞系遺伝子の体細胞変異による配列変化により化学反応性を獲得したＴｈｒおよびＣｙｓのごとき残基）に化学的に結合し；（ｂ）イオン対形成および非共有結合力を用いて、生殖細胞系によりコードされる触媒部位の塩基性残基の開裂特異性の原因である正に帯電したＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のごとき構造に結合し；（ｃ）イオン対形成および非共有結合力によって複数のアミノ酸において抗体連合部位に結合する。
【００１１】
本発明の１の態様において、ＣＲＡＡｓが特定の触媒性抗体の産生を刺激する条件下でＣＲＡＡｓを生きた生物に投与する。次いで、触媒性抗体を精製する。次いで、そのようにして精製された抗体を、あらかじめ決められた医学的疾患に関連した抗原を不活性化するに十分な量、かかる治療を必要とする患者に投与する。
【００１２】
本発明のもう１つの態様において、免疫原量の慣用的な遷移状態アナログ（ＴＳＡ）と組み合わせて免疫原量のＣＲＡＡｓを投与して、触媒性抗体の産生をさらに刺激するための方法および組成物が開示される。
【００１３】
かかる異常な病理学的状態の例は、ある種の自己免疫疾患ならびにリンパ球分化性疾患である。該方法は、内因的に産生される触媒性抗体の活性を阻害し、それにより病理学的状態を改善するに十分な量の、内因的に産生される触媒性抗体に不可逆的に結合しうるＣＲＡＡを含む医薬調合物を、かかる病理学的状態を有する患者に投与することを含む。
【００１４】
本発明のもう１つの態様によれば、内因的に産生される触媒性抗体の存在に関連した病理学的状態を治療するための医薬調合物が提供される。この医薬調合物は、生物学的に適合する媒体中のＣＲＡＡを含む。内因的に産生される触媒性抗体はＣＲＡＡに曝露されると、これに不可逆的に結合し、不活性化される。該触媒性抗体の活性を阻害するに十分な量の調合物を投与する。
【００１５】
本発明のもう１つの態様において、触媒性抗体調合物を用いて患者を受動免疫する方法が提供される。触媒性抗体を患者体内に注入し、触媒性抗体は標的疾患に関連した抗原を不活性化させる作用をする。
【００１６】
もう１つの具体例において、患者が望ましくない副作用を被る場合に、免疫するためのＣＲＡＡを患者に投与することにより、注入された触媒性抗体の活性を不可逆的に不活性化させてもよい。さらに、この具体例において、最少の免疫原性Ｂ細胞エピトープを用いることによりＣＲＡＡの免疫原性を低下させる。Ｔ細胞の普遍的エピトープはこのＣＲＡＡ中に含まれない。
【００１７】
さらに別の具体例において、本発明の触媒性抗体をｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドと共投与してもよい。かかる組み合わせ治療はガンの治療において有効なはずである。
【００１８】
本発明のさらにもう１つの態様において、ＣＲＡＡ−アジュバント複合体となった本発明のＣＲＡＡｓを免疫すべき患者に投与することにより、患者の能動免疫を行う。少なくとも２回のＣＲＡＡ−アジュバント複合体のブースター注射を４週間間隔で投与する。この手順を行った後、患者の血清を予防的触媒性抗体の存在に関して調べる。
【００１９】
本発明の方法およびＣＲＡＡｓは、あらかじめ決定された標的抗原に特異的な触媒性抗体を刺激するために現在利用できる化合物および方法に優る著しい利点を提供する。したがって、開示された本発明の化合物および方法は疾病の治療のための貴重な臨床的試薬を提供する。
【００２０】
発明の詳細な説明
あらかじめ決定された特異性を有する触媒性抗体の免疫系による合成を刺激する方法が開示される。本発明の１の具体例において、選択されたペプチド抗原に対する触媒性抗体を得るための組成物および方法が提供される。もう１つの具体例において、癌および他の医学的状態を治療するための受動免疫療法様式において有用な組成物および方法が提供される。ＴＮＦαおよびＩＬβ１が重要な役割を果たしている疾病の治療のための触媒性抗体も本発明での使用を企図される。かかる疾病は、虚血および再潅流傷害、敗血性ショック、ＳＩＲＳ、急性呼吸困難症候群、リューマチ性関節炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症および向神経性の痛みを包含するが、これらに限らない。
【００２１】
本発明のもう１つの具体例において、あらかじめ決定されたウイルスまたは病原性抗原に対する触媒性Ａｂ産生を誘導するワクチン投与プロトコールが記載される。開示された共有結合反応性抗原アナログは触媒性抗体の産生を優先的に刺激する。かかる抗体は、標的抗原を恒久的に不活性化させる標的抗原に対する触媒作用が存在するため、感染に対して優れた防御を提供する。さらに、単一の触媒性Ａｂ分子を再利用して、可逆的かつ化学量論的に抗原に結合する非触媒性Ａｂｓよりも多くの抗原分子を不活性化させることもできる。
【００２２】
ＴＳＡｓでの免疫（１）は、遷移状態に結合しうるＡｂｓを誘導し、かくして、反応の活性化エネルギー障壁を低くするための手段として提案された。通常使用されるホスホン酸アナログは四面体リン原子およびリンに結合している負に帯電した酸素原子を含む。ペプチド結合開裂の遷移状態の形成は、開裂部位の三角形の炭素原子を四面体に変換すること、およびカルボニル基の酸素による負電荷の獲得を含む。それゆえ、慣用的なホスホン酸ＴＳＡｓは、オキシアニオン構造および遷移状態の四面体配置に結合しうるＡｂｓの合成を誘導するのかもしれない。しかしながら、これらのＴＳＡｓに対するＡｂｓは、比較的簡単なアシル転移反応を加速しうるが、ペプチド結合の開裂を有効に触媒することはできない。最近、次亜リン酸ＴＳＡに対する抗体が安定な第１級アミドをゆっくりと開裂することが報告された（１１）。抗次亜リン酸Ａｂが、より通常の抗ホスホン酸Ａｂｓよりも、開裂しやすい結合におけるアミド窒素にプロトンを輸送することはあり得るし、そのことは、抗次亜リン酸Ａｂのよりよい触媒活性についての説明となりうる。
【００２３】
大多数の酵素学者は、ホスホン酸ＴＳＡｓは良い遷移状態模倣物ではなく、複数の遷移状態が含まれるので、ホスホン酸ＴＳＡｓは有効な触媒性Ａｂｓを誘導しないと考えている。酵素は活性化アミノ酸側鎖を用いてペプチド結合開裂を触媒する。例えば、Ｓｅｒのヒドロキシル基は促進された求核性を獲得し、さらにＳｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｐ残基からなる分子内水素結合ネットワークの形成により共有結合的触媒を媒介する能力を獲得する。ホスホン酸アナログは求核性反応中心への結合に必要な構造エレメントを含まない。それゆえ、Ａｂｓにおける共有結合的触媒能の誘導は、慣用的なホスホン酸ＴＳＡｓを用いたのでは達成できない。さらに、これらのＴＳＡｓは生殖細胞系によりコードされるＡｂｓ中のセリンプロテアーゼ部位の存在を利用しない。
【００２４】
触媒性Ａｂｓの求核性セリン残基と反応しうる求電子的ＣＲＡＡｓの製造方法が開示される。これらの新規抗原アナログは抗体ライブラリー由来の触媒の選択に適用されるであろう。この戦略の論理的拡張は、ＥＧＦＲのごとき個々の標的抗原に特異的な抗体の合成のためにセリンプロテアーゼ部位の使用を促進するためのものである。上述の求電子的ＣＲＡＡｓを用いて免疫することによりこのことが達成されうる。かかるＣＲＡＡｓは、生殖細胞系によりコードされるセリンプロテアーゼ部位を細胞表面に発現するＢ細胞のクローン選択を促進する。さらに、共有結合により反応する抗原アナログ構造に隣接するＥＧＦＲ由来の適当な抗原エピトープを含ませることにより、例えば、ＥＧＦＲに対する特異性が確実なものとなる。
【００２５】
触媒性Ａｂの合成は自己免疫疾患において公表されている（２、４）。さらに、免疫系は、ＨＩＶ蛋白ｇｐ１２０の開裂を包含する外来性抗原の開裂を触媒するＡｂｓを産生できるものである。しかしながら、ウイルスに感染した患者はｇｐ１２０に対する触媒性Ａｂの応答をマウントしない。本明細書で議論するＨＩＶ ＣＲＡＡｓはＨＩＶに対する防御的触媒性抗体を合成するために免疫系を強化するであろう。このアプローチを支持するデータを本明細書に掲載する。以下の理由により、ｇｐ１２０を標的抗原として選択した：（ａ）それは宿主細胞への増殖性感染のためのＨＩＶ−１の必須構成成分であること；（ｂ）ウイルス表面蛋白として、ｇｐ１２０は容易にＡｂｓに近接できること；および（ｃ）ある種の抗ｇｐ１２０ＡｂｓはＨＩＶ感染を停止させることが示されていること。
【００２６】
本発明のＣＲＡＡｓで免疫することにより、触媒ＶＬの遺伝子をＨＩＶ特異的触媒性Ａｂｓの合成のために動員することができる。アナログは求核性の生殖細胞系によりコードされる触媒部位に結合でき、それゆえ、触媒性Ａｂｓを産生するＢ細胞のクローン増大を優先的に刺激する。必要な場合には、ホスホン酸ＴＳＡｓをＣＲＡＡｓと組み合わせて、求核的化学反応性のほかにオキシアニオンホールを含む触媒性抗体を誘導することができる。
【００２７】
ＣＤ４結合に関与するｇｐ１２０のモデルＢ細胞エピトープ（残基４２１〜４３６）を含み、セリンプロテアーゼ様触媒の重要な構造エレメントと反応するＣＲＡＡｓを合成する。当業者によく知られた方法を用いて自己免疫および非自己免疫マウスを該ＢエピトープおよびそのＣＲＡＡで免疫する。ＴヘルパーエピトープもＣＲＡＡ中に含ませる。セリンプロテアーゼ触媒に貢献することが知られている個々の構造的特徴、すなわち、求核性セリン残基、オキシアニオンホール形成残基、開裂しやすい結合の四面体構造での形態相補性、ならびに基質中の隣接残基の認識を、下記の特徴をＴＳＡｓ中に含ませることによって、誘発された抗体中に動員する：求電子的な四面体ホスホン酸エステルまたはＢエピトープ残基に隣接した負に帯電したホスホン酸。
【００２８】
本発明のＣＲＡＡｓおよび得られる触媒性抗体は、少なくとも３つの主要用途がある。第１の用途は、特定の医学的疾患用に設計されたＣＲＡＡを用いた免疫後のヒトまたは動物における触媒性抗体の産生に指向される。次いで、そのようにして産生された触媒性抗体を患者に投与して標的抗原分子を不活性化させる。このシナリオにおいて、患者が副作用を経験する場合、免疫ＣＲＡＡを投与して不可逆的に触媒性抗体を不活性化させてもよい。この具体例におけるＣＲＡＡｓはＢ細胞エピトープのみを用いて合成され、その結果、免疫原性が最小となる。
【００２９】
第２の用途において、特定の病気に対して患者を有効に免疫して防御免疫状態を生じさせる目的でＣＲＡＡｓを患者に投与してもよい。これらのＣＲＡＡｓをＣＲＡＡ−アジュバント複合体として投与する。
【００３０】
最後に、自己免疫疾患または多発性ミエローマのごとき医学的疾患に関連した触媒性抗体を発現中の患者に本発明のＣＲＡＡｓを投与してもよい。存在する抗体に対して特異的に反応するようにＣＲＡＡｓを設計してもよい。触媒機能の阻害は疾病状態改善させるはずである。さらに、最少の免疫原Ｂ細胞エピトープのみを含むようにこれらのＣＲＡＡｓを設計する。
【００３１】
以下の詳細な説明は本発明を実施するための好ましい方法を説明する。ＣＲＡＡｓの選択および調製方法、あらかじめ決定された疾病の抗原に対する触媒性抗体の産生を刺激する方法、ならびにＣＲＡＡｓまたは触媒性抗体をインビボで投与する方法につき説明する。
【００３２】
Ｉ．ＣＲＡＡｓの選択および調製
本発明の共有結合反応性抗原アナログを、慣用的な有機合成スキームを用いて調製する。本発明の新規ＣＲＡＡｓは、開裂の標的とされ、かつＣＲＡＡの使用が意図される特定のペプチド抗原に関連した蛋白由来のペプチド残基に隣接した求電子中心を含む。
【００３３】
適当な隣接アミノ酸配列の選択は、開裂の標的とされる特定のペプチド抗原に左右される。例えば、ウイルスコート蛋白、ある種のサイトカイン、および腫瘍関連抗原は多くの異なるエピトープを含む。これらの多くは慣用的なモノクローナルＡｂによる方法を用いてマッピングされている。この知識により、触媒性抗体阻害剤として有用な共有結合して反応する有効な抗原アナログ、並びにあらかじめ決定された標的抗原に対して触媒活性を有する触媒性抗体のインデューサーとして有用な共有結合して反応する有効な抗原アナログの設計が容易となる。
【００３４】
反応中心に隣接するアミノ酸は、疾病において役割を果たしている定義されたポリペプチド中の標的エピトープの配列、または疾病において自己抗体を生じさせる定義されたポリペプチド中の標的エピトープの配列である。
ＣＲＡＡｓの構造的特徴は、生殖細胞系によりコードされる未成熟な抗体ならびに標的エピトープの認識を専ら行う成熟抗体への特異的な共有結合を可能にするものである。クローン選択理論に基づけば、ＣＲＡＡｓは、標的エピトープに対して指向された成熟抗体の合成のために触媒性抗体をコードする生殖細胞系遺伝子を動員するものである。
【００３５】
標的とされるポリペプチドは、可溶性リガンドおよびこれらのリガンドに対する膜結合受容体を包含する。
微生物蛋白も、本発明の抗体による触媒の標的とされる。これらは、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、Ｌｅｘ１リプレッサー、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｂ型肝炎表面抗原、細菌外トキシン（ジフテリアトキシン、C. tetaniトキシン、C. Botulinumトキシン、百日咳トキシン）を包含するが、これらに限らない。
新生物抗原は治療上有益なＣＲＡＡｓに包含されるであろう。これらは、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ｐ５３生成物、前立腺特異的抗原、癌胎児性抗原、プロラクチン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｐ−糖蛋白、多剤耐性関連蛋白、金属プロテイナーゼおよび血管形成因子を包含するが、これらに限らない。
新生物抗原の受容体も、抗体により媒介される触媒の標的とされる。これらは、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ変異体、ＨＥＲ−２、プロラクチン受容体、およびステロイド受容体を包含する。
炎症メディエイタも触媒に適した標的である。このグループの典型的な分子は、ＴＮＦ、ＩＬ−１β，ＩＬ−４ならびにそれらの同族受容体を包含する。
すでに存在している触媒性抗体は自己免疫性疾患およびリンパ球分化性疾患において見られる。これらの触媒性抗体の有害な作用は、ＣＲＡＡＡｓを患者に投与することにより抑制されるであろう。ＶＩＰ、Ａｒｇ−バソプレッシン、チログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、インターフェロン、プロテイナーゼ−３、グルタメートデカルボキシラーゼに対する特異性を有する抗体サブユニットと共有結合的に相互作用する、弱い免疫原性を有するように設計されたＣＲＡＡｓを投与する。
【００３６】
選択性を最大にするために、隣接ペプチド配列は開裂の標的となるエピトープを含む。例えば、上皮成長因子受容体中に存在するエピトープを本発明のＣＲＡＡ中に含ませる。本発明のもう１つの具体例において、ＨＩＶ ｇｐ１２０中に存在するエピトープをＣＲＡＡ中に含ませる。ＨＩＶ感染の治療のための典型的なＣＲＡＡは、ＣＲＡＡの免疫原性を最大化するＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープの両方を含む。本明細書において典型的な他のＣＲＡＡｓは、ＴＮＦおよびＩＬ−１βに対する触媒性抗体を得るのに適したＣＲＡＡｓである。
【００３７】
ＩＩ．ＣＲＡＡｓの投与
一般的には、本明細書記載のＣＲＡＡｓを医薬調合物として患者に投与する。本明細書の用語「患者」はヒトまたは動物対象をいう。
本発明のＣＲＡＡｓを含有する医薬調合物は、都合良くは、水、緩衝化セイライン、エタノール、ポリポール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油脂、界面活性剤、懸濁化剤またはそれらの適当な混合物のごとき許容される媒体とともに投与するように処方される。選択された媒体中のＣＲＡＡｓの濃度は、媒体の疎水性または親水性ならびにＣＲＡＡの他の性質に左右される。当業者は溶解度の限界を容易に決定できる。
本明細書の用語「生物学的に許容される媒体」は、上のパラグラフで例示説明したような医薬調合物の望ましい投与経路に適合しうる溶媒、分散媒等を包含する。薬理学的に活性のある物質のためのかかる媒体の使用は当該分野において知られている。慣用的な媒体または薬剤が投与すべきＣＲＡＡに適合しない場合を除き、医薬調合物中の慣用的媒体の使用が企図される。
【００３８】
慣用的な免疫法を適用して触媒性Ａｂの合成を誘導する。免疫原を３回腹腔内投与し１回静脈注射する（それぞれペプチド約１００μｇ）。最後の免疫を静脈注射により行う。ＲＩＢＩを動物実験に使用する。ヒトにはアラムをアジュバントとして使用する。アラムはヒトへの使用が認可されており、本発明において提案されるのと同様のＢ−Ｔエピトープに対するＡｂの合成を促進することがすでに示されている。ＲＩＢＩはFreudの完全アジュバントの低毒性代替物であり、種々のＡｇｓに対する良好なＡｂの応答を再現性良く可能にする。２種のアジュバントの分析が有利である。なぜなら、アジュバントにより動員されるサイトカインおよびＴＨ下位集団のＢ細胞に対する影響を介して、ワクチンに対するＡｂ応答の質および強度はアジュバントにより影響されうるからである。
【００３９】
血流中への静脈注射により、あるいは付加注射、筋肉内注射または腹腔内注射によりＣＲＡＡｓを非経口的に投与してもよい。非経口注射用の医薬調合物は当該分野において広く知られている。本発明の分子の投与方法として非経口注射を選択する場合、十分量の分子が標的細胞に到達して生物学的効果を発揮することを確実にするための段階を経なくてはならない。
投与容易化および用量の均一性のために医薬調合物を投与単位形態に処方する。本明細書の投与単位形態は、治療を受ける患者に適した医薬調合物の物理的に別個の単位をいう。各用量は、選択された医薬担体と一緒になって所望効果を生じるように計算された一定量の有効成分を含む必要がある。適当な投与単位を決定する手順は当業者によく知られている。
ＣＲＡＡを含有する医薬調合物を適当な間隔で投与してもよく、例えば、病理学的徴候は減少または改善されるまで１日２回、その後、用量を維持レベルにまで減少させてもよい。通常には、個々の場合における適当な間隔は、患者の治療すべき症状および病理学的状態に左右される。
【００４０】
ＩＩＩ．触媒性抗体の投与
一般的には、本明細書記載の触媒性抗体を医薬調合物として患者に投与する。
本発明の触媒性抗体を含有する医薬調合物は、都合良くは、水、緩衝化セイライン、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油脂、界面活性剤、懸濁化剤またはそれらの適当な混合物のごとき許容される媒体とともに投与するように処方される。選択された媒体中の触媒性抗体の濃度は、媒体の疎水性または親水性ならびに触媒性抗体の他の性質に左右される。当業者は溶解度の限界を容易に決定できる。
本明細書の用語「生物学的に許容される媒体」は、上のパラグラフで例示説明したような医薬調合物の望ましい投与経路に適合しうる溶媒、分散媒等を包含する。薬理学的に活性のある物質のためのかかる媒体の使用は当該分野において知られている。慣用的な媒体または薬剤が投与すべき触媒性抗体に適合しない場合を除き、医薬調合物中の慣用的媒体の使用が企図される。
本発明の触媒性抗体を投与する場合、慣用的な受動免疫法を用いる。好ましい具体例において、Ａｂｓを静脈から患者に輸液する。ある種の医学的疾病の治療のためには、十分な量の分子が標的細胞に到達して生物学的効果を発揮することを確かなものにするために段階を経なければならない。分子、または分子がデリバリーされる医薬調合物の親油性を増大させて、分子が標的位置に到達するようにしてもよい。さらにそのうえ、細胞を標的とする担体中に本発明の触媒性抗体を入れてデリバリーして、十分な数の分子が標的細胞に到達するようにしてもよい。治療分子の親油性および標的化の方法は、抗体をちりばめたリポソーム中に本発明の触媒抗体を封入することを包含し、それらの方法は当該分野において知られている。
本発明の主題である触媒性抗体を抗体フラグメントまたは抗体全体として用いることができ、あるいはそれらを組み換え分子中に含ませることができ、あるいはポリエチレングリコールのごとき担体と抱合させることもできる。さらに、かかるフラグメントまたは抗体全体を、該抗体またはフラグメントを上記のごとく細胞膜を通って輸送することのできる担体に結合させることもできる。このタイプの担体は記載されたもの（Cruikshank et al., in the Journal of Aquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology, March 1997）を包含するが、これらに限らない。
【００４１】
投与容易化および用量の均一性のために医薬調合物を投与単位形態に処方する。本明細書の投与単位形態は、治療を受ける患者に適した医薬調合物の物理的に別個の単位をいう。各用量は、選択された医薬担体と一緒になって所望効果を生じるように計算された一定量の有効成分を含む必要がある。適当な投与単位を決定する手順は当業者によく知られている。例えば、ヒトにおける同系のＩｇＧの半減期は約２０日である。この期間中、６０４８０個のＡｇ分子が１個の抗体分子により開裂され、ターンオーバーは２．１／分である（それはファージディスプレイライブラリーから単離されたヒト抗ＶＩＰ Ｌ鎖のターンオーバー（１４）である）。それゆえ、ペプチダーゼ抗体は、化学量論的に可逆的に結合する分子よりも、かなり強力な抗原中和活性を発現しうることが理解できる。ここで議論する抗体の軽鎖は、その抗原結合親和性、抗原に固く結合する様式に基づいて選択されたことに注意すべきであるが、最良のターンオーバーを有する触媒を選択したのではない。ＣＲＡＡｓでの免疫により産生され、本明細書に記載したような適当な選別方法により単離される抗体はかなり大きなターンオーバーを示すであろう。かかる触媒性抗体を用いて、対応非触媒性抗体よりも実質的に少ない用量で疾病を治療することができる。
触媒性抗体を含有する医薬調合物を適当な間隔で投与してもよく、例えば、病理学的徴候は減少または改善されるまで１日２回、その後、用量を維持レベルにまで減少させてもよい。通常には、個々の場合における適当な間隔は、患者の治療すべき症状および病理学的状態に左右される。
【００４２】
下記の許容される予防薬または治療薬に関する標準的判断基準を満たす受動および能動免疫療法のための触媒性抗体を生じさせるＣＲＡＡｓを選択する：（１）触媒性抗体による標的ペプチド抗原の開裂が、標的ペプチド抗原を機能的に活性化または機能的に不活性化することにより病理学的プロセスにおける有益な変化をもたらすものであること；および（２）該触媒性抗体の投与あるいはＣＲＡＡを用いる免疫手段による体内におけるそれらの産生の誘導が、好ましい治療指標を生じさせ、その結果、得られた臨床的利益が副作用に関連した病的状態に優るものであること。予防薬または治療薬の受容可能性に関してどのようにしてかかる判断基準が確立されたのかについての議論は当該分野においては普通のものであり、Guide to Clinical Trials by Bert Spiker, Raven Press, New York, 1991のような教科書に見出される。
【００４３】
本発明を実施するための予防または治療標的ペプチド抗原の適当なカテゴリーは、サイトカイン、成長因子、サイトカインおよび成長因子の受容体、成長因子により開始された刺激のトランスダクションに関与する蛋白、凝固因子、インテグリン、抗原受容体、酵素、特に、細胞プログラム（分化、増殖およびプログラムされた細胞死）に関与する転写レギュレーター、これらの細胞プログラムの他のインデューサー、抗癌剤を排除しうる細胞ポンプ、微生物およびウイルスのペプチド抗原を包含するが、これらに限らない。
【００４４】
特定の標的分子の機能を阻害するように作用する慣用的なモノクローナル抗体は、バイオテクノロジー会社および製薬会社による臨床的使用のために開発中の最もありふれたタイプの治療薬である。これらのうちいくつかは実質的に臨床的に見込みがあることが示されており、同じ分子機能単位の一部である曝露されたペプチド標的抗原は、それゆえ、本発明の主題である触媒性抗体の潜在的標的として特に十分な適確を有することが示される。本発明で企図される触媒性抗体はかかる慣用的分子に優る大きな改良を構築する。なぜなら、それらがたった１つの標的分子に影響するのではなく、多くの分子に影響し、治療コストを劇的に低下させるからである。これらの標的抗原中のペプチド結合の利用可能性を、当該分野で十分に確立された方法により調べることができ、それらの方法は、蛋白分解酵素に曝露した後の開裂を示すこと、および一定範囲のペプチド結合を開裂できる触媒軽鎖を示すことを包含するが、これらに限らない。
臨床的見込を示す慣用的モノクローナル抗体により標的とされる抗原のいくつか、ならびに対応する医学的症状の一覧を図１９Ａおよび１９Ｂに示す。
【００４５】
かくして、共有結合反応性抗原アナログ、ならびにその製造方法を提供することが本発明の１の目的であり、共有結合反応性抗原アナログは、１）あらかじめ決定された抗原に対して特異的な本発明の触媒性抗体の生成を促進し、そして／あるいは２）自己免疫性疾患およびある種のリンパ球分化性疾患の関連した触媒性抗体の触媒作用を不可逆的に阻害する。さらなる目的は、抗原およびそれらの対応抗体の製造方法を提供することであり、さらに、これらの抗体を有益な治療薬として使用するアッセイおよび方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、基質の基底状態および遷移状態の安定化に関与する抗体の触媒作用に関する自由エネルギー（ぞれぞれΔＧSおよびΔＧTS）のダイヤグラムである。ΔＧ+uncatおよびΔＧ+catはそれぞれ触媒されない反応および触媒される反応の活性化エネルギーに対応する。Ｋｍは基底状態安定化の程度の関数である。Ｋｃａｔ／Ｋｍは、触媒−基質基底状態複合体に対する遷移状態安定化の程度の関数である。
【図２】図２は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）蛋白のドメイン構造を図式的に示したものである。Ligandは主にドメインＩＩＩに見られるリガンド結合領域を示し；ＴＭは膜貫通ドメインを示し；ＣＹｓはシステイン豊富ドメインを示し；ＳＰはシグナルペプチドを示す。
【図３】図３は、抗ＥＧＦＲ触媒性抗体の調製のために提案されたクローニング戦略を図式的に示すダイヤグラムである。
【図４】図４は、ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲペプチドの構造を示す。
【図５】図５は、重複伸長法によるＦｖの構築を示すダイヤグラムである。
【図６】図６は、セリンプロテアーゼ反応性フルオロホスフェート遷移状態アナログの固定化を図式的に示すダイヤグラムである。（ａ）トリエチルアミン、ＣＨ2Ｃｌ2；（ｂ）水、ＴＨＦ；（ｃ）ＤＡＳＴ；（ｄ）無水グルタル酸、ピリジン；（ｅ）ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、トリエチルアミン、フルオレセイン。
【図７】図７は、ｇｐ１２０の構造を図式的に示したものである。Ｖは可変領域；ＰＮＤは主要中和領域；矢印は、本発明方法を用いて得られた触媒性抗体により標的とされる開裂部位である。
【図８】図８は、求核性セリン残基とＤＦＰとの反応を図式的に示す。
【図９】図９は、ジイソプロピルフルオロホスフェートエステルによりビオチンに抱合することによる、Ｌ鎖ペプチド活性に対する不可逆的阻害を示す棒グラフである。クローンＵ１９由来のＬ鎖（１μＭ）を阻害剤とともに３０分インキュベーションした。未結合阻害剤をゲル濾過により除去した。２０ｎＭのＬ鎖および放射性標識ＶＩＰ基質を用いてペプチダーゼ活性を測定した。阻害剤で前処理しないでゲル濾過に供したＬ鎖の活性（約１５０００ｃｐｍ）に対する阻害％としてデータを表す。
【図１０】図１０は、本発明での使用を企図された典型的な免疫原構造を示す。ボックスは標的とされる開裂部位（Ｌｙｓ４３２−Ａｌａ４３３）周辺の構造を示す。隣接残基は３種の免疫原において同じである。アミノ酸番号は全長のｇｐ１２０中のものである。
【図１１】図１１は、５０ｎＭの狼そう患者由来のＩｇＧとともにインキュベーションされた125Ｉ−ｇｐ１２０（１００ｎＭ）の加水分解（左パネルのレーン２）およびＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来の１１ｎＭのＬ鎖とともにインキュベーションされた125Ｉ−ｇｐ１２０（１００ｎＭ）の加水分解（右パネルのレーン２）を示す非還元性ゲルのオートラジオグラムである。左および右のパネルのレーン１はＨＩＶ−１陽性対象由来の非触媒性ＩｇＧおよびＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＬ鎖とともにインキュベーションされた同量の基質を示す。インキュベーションは３７℃で２時間行った。
【図１２】図１２は、ＤＦＰ（１０μＭ）の存在下および不存在下で狼そうＩｇＧ（５０ｎＭ）とともに１時間インキュベーションした場合の、抗体により触媒される125Ｉ−ｇｐ１２０の開裂を示すグラフである。（Ｂ）種々の株由来の125Ｉ−ｇｐ１２０をＬ鎖Ｌａｙ２（２０μＭ）とともに２時間インキュベーションしたものである。
【図１３】図１３は、Ｌ鎖Ｌａｙ２（２０μＭ）による未標識ｇｐ１２０の加水分解を示す、還元性ＳＤＳゲルのイムノブロットである（レーン２）。
【図１４】図１４は、セリンプロテアーゼによるペプチド結合開裂の間におけるアシル−酵素形成の推定遷移状態を図式的に描いたものである。アシル酵素複合体（右の構造）は水分子の攻撃により脱アシル化される。
【図１５】図１５は、ＴＮＦαに対する触媒性抗体を誘導するように設計された典型的なＣＲＡＡである。
【図１６】図１６は、ＩＬ−１βに対する触媒性抗体を誘導するように設計された典型的なＣＲＡＡである。
【図１７】図１７は、ＩＬ−１βに対する触媒性抗体を誘導するように設計された典型的なＣＲＡＡである。このＣＲＡＡにおいて、求電子反応中心はボロネート分子を含む。
【図１８】図１８は、ｐ５３により媒介されるシグナリングに関与する細胞性分子を図式的に示すダイヤグラムである。
【図１９Ａ】図１９Ａは、臨床的に有望な慣用的モノクローナル抗体により標的とされる抗原の一覧を示す。かかる抗原は本発明の触媒性抗体に適した標的である。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、臨床的に有望な慣用的モノクローナル抗体により標的とされる抗原の一覧を示す。かかる抗原は本発明の触媒性抗体に適した標的である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４７】
（実施例ＩＡ）
腫瘍の免疫療法のための触媒性抗体
癌の治療に適した触媒性抗体（Ａｂｓ）の製造方法を本実施例に記載する。かかる抗体は、癌治療のための優れた免疫療法の別法を提供する。なぜなら、標的抗原の開裂はその恒久的な不活性化を生じるからである。さらに、単一のＡｂ分子を再利用して複数の抗原分子を不活性化できる。対照的に、非触媒性Ａｂｓは化学量論的に抗原に結合し、その結合は可逆的である。複合体から開裂した後、抗原はその生物学的機能を回復しうる。
腫瘍関連抗原である上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を、酵素活性を用いる抗体産生の刺激に適した典型的な抗原の合成に使用する。ペプチダーゼ抗体に関する以前の研究は以下のことを明らかにした：１）ある種のＡｂｓは、個々のペプチド抗原に結合する能力をペプチド結合開裂活性と結び付けることができる；２）ペプチデーゼ部位は構造的に非ＡＢセリンプロテアーゼの活性部位に類似している。この部位はＶＬドメイン中にあり、生殖細胞系Ｖドメイン遺伝子によりコードされている；３）ペプチダーゼＡｂｓの合成は自己免疫性疾患のレベルが上昇した場合に起こる。
【００４８】
ＥＧＦＲは、細胞分化および有糸分裂に必要なシグナルのトランスダクションにおいて重要な役割を果たす。図２参照。さらに、ＥＧＦＲを介してトランスダクションされたシグナルは腫瘍の侵入性および形態変化に関連している。ＥＧＦまたはＴＧＦαのＥＧＦ受容体への結合は、受容体チロシンキナーゼ活性および自己リン酸化活性を刺激する。受容体活性化は細胞内イベントのカスケードを生じさせ、それは細胞増殖を促進させる。
ＥＧＦＲ遺伝子の過剰発現は、アデノカルシノーマおよび肺の偏平上皮細胞癌腫、乳癌、結腸癌、婦人科学的癌および膀胱癌、グリオーム、肝細胞癌および膵臓癌および前立腺癌を包含する多くの新生物に関連している。いくつかの癌における過剰発現はＥＧＦＲ遺伝子の増幅によるものとされている（１５）。
【００４９】
ＥＧＦＲは正常組織と比較して腫瘍において非常に高レベルで発現されるので、適当な腫瘍抗原である。したがって、ＥＧＦＲに対するＡｂｓは抗腫瘍試薬に適した候補である。ＥＧＦＲに対する多くのモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）が、ＥＧＦＲへの結合に関して互いに競合しない受容体の特異的エピトープに対して生成されている（例えば１６）。Mendelsohnおよび共同研究者は、免疫原としてヒトＡ４３１類表皮癌腫細胞由来のＥＧＦ受容体蛋白を用いて生成したマウスＭＡｂｓを記載している。ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合を阻害するＭＡｂｓはＥＧＦにより刺激されたチロシン蛋白キナーゼ活性も阻害し、それは無傷の細胞または可溶化された膜および外来性ペプチド基質を用いてアッセイされた。さらに、これらのＭＡｂｓは組織培養中のＡ４３１細胞の増殖も阻害したが、ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合をブロックできないＭＡｂｓは細胞増殖に影響しなかった。さらなる研究は、抗ＥＧＦ受容体ＭＡｂｓの投与により胸腺除去マウスにおいてＡ４３１細胞による腫瘍形成を阻害できることを示した。異なるイソタイプのＭＡｂｓはマウスにおいて腫瘍増殖を阻害することが示され、おそらく、不変ドメインのエフェクター機能は観察された抗増殖活性にとり重要でないことが示された。十分量のＡｂが投与された場合に、インビボにおける腫瘍増殖の完全な阻害が観察された。ＥＧＦＲを発現し続ける腫瘍はわずかであり、それらの生存は細胞をＡｂｓに不適切に曝露したためであることが示唆される（１７）。
【００５０】
乳癌細胞系を免疫原として用いて、Modjtahediら（１６）は、ＥＧＲＦに対する数種のＭＡｂｓを得ており、そのいくつかはＥＧＦＲによる成長因子への結合をブロックし、ヒト偏平上皮癌細胞系の成長を阻害した。精製ＥＧＦ受容体または高レベルのＥＧＦＲを発現する細胞を免疫原として用いて、さらに数種のＥＧＦＲ特異的ＭＡｂｓが調製された（１８）。悪性グリオーム（１９、２０）、当部および頸部の癌、ならびに肺癌の治療に関する抗ＥＧＦＲ Ａｂｓに対するフェーズ１の臨床試験が進行中である。
そのデータは、ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合を壊すことのできるＡｂｓを、ＥＧＦＲを発現する腫瘍の免疫療法の有効な薬剤の開発において使用できることを明らかにしている。ＥＧＦＲ発現とＢＣＬ−２（プログラムされた細胞死（アポトーシス）に打ち勝つことにおいて重要な役割を果たしている蛋白）のレベルとの間における逆の相関関係が見出されている。特定条件下でのＥＧＦＲによるリガンド結合は、ｃ−ｍｙｃにより誘導されるアポトーシスから腫瘍細胞を防御することが見出されている。変異ＥＧＦＲで形質転換されたグリオブラストーマ細胞はアポトーシスの減少を示す（２１）。それゆえ、原理的には、ＥＧＦＲに対するＡｂｓは腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導できる。この可能性が確かであれば、ＥＧＦＲ Ａｂｓでの治療後のアポトーシス経路による完全な腫瘍細胞の後退の可能性が強まるであろう。
下記の理由により、ＥＧＦＲを開裂しうるＡｂｓは、それらの非触媒性カウンターパートと比較して優れた免疫療法剤を構成する：（ａ）適当なペプチド結合におけるＥＧＦＲの開裂は恒久的な生物学的活性の消失を引き起こすはずであり、一方、Ａｂの解離はＥＧＦＲの生物学的機能を復活させるであろう；（ｂ）単一の触媒分子は複数の基質分子を開裂でき、一方、非触媒性Ａｂｓは化学量論的に作用するだけである。
【００５１】
触媒性Ａｂｓの調製のための３つの戦略を本明細書に開示する。第１の戦略は、ペプチダーゼ活性を有するクローン化されたＡｂ軽鎖を利用するものである。以前の研究は、ＶＬドメインに存する非特異的ペプチダーゼ活性をＶＨドメインの抗原結合特異性に指向させ得ることを示唆している。ＥＧＦＲ結合性ＶＨドメインに連結された利用可能なＶＬドメインから構成されるハイブリッドＦｖ構築物が得られるであろう。適当な系で合成し、発現した後、Ｆｖ構築物を特異的ＥＧＦＲ開裂活性に関して評価する。
第２のクローニング戦略は、自己免疫性疾患において発現されるある種のＡｂｓは生殖細胞系ＶＬ遺伝子によりコードされるセリンプロテアーゼ触媒部位を用いるという観察結果に基づく。自己免疫性疾患の背景を有するマウスをＥＧＦＲ発現細胞で免疫する。免疫後、触媒性Ｆｖドメインをファージディスプレイライブラリーから単離する。生殖細胞系によりコードされた触媒活性を体細胞により獲得されたＥＧＦＲに対する特異性と結び付ける触媒を選択する。該選択は、求核性セリン残基と反応する共有結合反応性抗原アナログ（ＣＲＡＡｓ）に結合させ、次いで、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合させることにより行う。
第３の戦略は、免疫系が、染色細胞系によりコードされた触媒部位をＥＧＦＲに対するＡｂｓの合成に利用するようにされうるという仮説に基づく。触媒性Ａｂの合成を優先的に刺激しうるＥＧＦＲペプチドの求電子性ＣＲＡＡでマウスを免疫する。そのようにして得られたＡｂ触媒を、当業者に知られた種々の方法、すなわち、ＥＧＦにより刺激されたＥＧＦＲ自己リン酸化の阻害および腫瘍細胞増殖の阻害を用いてインビボにおいてＥＧＦＲ発現ヒト細胞系の腫瘍発生性に対する抑制効果につき評価する。
【００５２】
本明細書開示の組成物および方法は、癌の免疫療法に適した、特異的かつ触媒として有効なＥＦＧＲ開裂抗体の製造を容易にする。図３は用いたアプローチをまとめたものである。以前の研究は、ある種のＡｇｓ、すなわち、ＶＩＰ、チログロブリンおよびｇｐ１２０の開裂を触媒しうるＡｂｓの単離の実行可能性を確立した。これらの研究からの情報を本発明に適用して、ＥＧＦＲに対する触媒性Ａｂｓの調製方法（本明細書に開示）を得た。
下記の材料および方法は本発明の実施を容易にするために示される。
【００５３】
材料および方法
免疫：すでに記載したようにＥＧＦＲ発現細胞で６匹のＭＲＬ／ｌｐｒマウスを高度免疫する。簡単に説明すると、組織培養フラスコをトリプシン処理することにより約１０7個のＡ４３１細胞を回収し、ＰＢＳ中に再懸濁し、ＲＩＢＩアジュバント中に入れてマウスに腹腔内投与する。約５ｘ１０6個の細胞を用いて３回の追加免疫を１０日間隔で行う。高レベルのＡｂ力価が得られない場合、上皮成長因子受容体の可溶性細胞外ドメイン（ｅｘＥＧＦＲ）（２５μｇ）を用いて追加免疫注射を行う。免疫系が触媒性抗体を生じるようにするために、上記スキームに準じてＲＩＢＩ中のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（蛋白として５０μｇ）に抱合したＴＳＡ−ＥＧＦＲを６匹のＭＲＬ／ｌｐｒマウスに腹腔内注射して高度免疫する。１０日間隔で眼窩集網後方から血液を採取する。
【００５４】
ｅｘＥＧＦＲの発現および精製：ＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ｅｘＥＧＦＲ、ＥＧＦＲの残基１〜６２１から構成される）をすでに記載されているバキョロウイルス発現系（２２）から精製する。約２ｍｇ／ｍｌのｅｘＥＧＦＲを培地上清中に分泌する（２２）Ｓｆ９昆虫細胞においてｅｘＥＧＦＲの発現を行う。２工程のイオン交換クロマトグラフィーによる精製により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた場合、均一蛋白の回収率は約９５％である（２２）。
【００５５】
ＥＧＦＲ−ＣＲＡＡペプチドの調製および精製：ＣＲＡＡは３つの基本エレメントから構成されている。それらは、求電子性ホスホン酸エステル、そのＮ末端に隣接するＥＧＦＲ残基２９４〜３０３、およびそのＣ末端に隣接する残基３０４〜３１０である。図４参照。求電子性はリン原子上にあり、Ａｂｓ中に存在する求核性セリン残基をトラップすることとなる。かかるＣＲＡＡｓの合成のための基本的な合成スキームが記載されている（２３）。簡単に説明すると、リジンのイソステア（isostere）を含む次亜リン酸を適当な隣接ペプチド配列に結合させる。次亜リン酸のジフェニルメチルアミン塩および６−アミノヘキサナールからイソステアを調製し、次いで、酸のジフェニルメチル基を除去する（２４）。ＥＧＦＲ残基３０４〜３１０に対応するペプチドがＮ末端リジンのかわりに２−ヒドロキシ−６−アミノヘキサン酸を含む以外は、慣用的な固相ペプチド合成により必要な隣接ペプチドを調製する。側鎖を保護したペプチドを、古典的な液相ペプチド合成法により次亜リン酸構造に結合させる。フェノールとの酸化的カップリングにより次亜リン酸構造をホスホン酸フェニルエステルに変換する。側鎖を保護したＣＲＡＡ−ＥＧＦＲペプチドのＮ末端を、グルタルアルデヒド法によりＫＬＨにカップリングさせる。反応混合物をゲル濾過により分離し、低分子フラクション中に残った未抱合ペプチドを、過塩素酸での完全消化後に無機リンについて分析する。このことにより、抱合有効性を評価することができる。
【００５６】
ｅｘＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ−ＣＲＡＡを用いたＥＬＩＳＡ：ｅｘＥＧＦＲまたはＣＲＡＡ−ＥＧＦＲ（１００ｎｇ／ｍｌ）をＰＶＣの９６ウェルプレート上にコートし、過剰の蛋白結合部位を５％アルブミンでブロックし、適当に希釈した血清Ａｂｓの固定化抗原への結合を測定する。ペルオキシダーゼのタグを付したヤギ抗マウスＩｇＧで処理することにより反応の程度を測定する。対照は、免疫前の血清および過剰の可溶性競合物質ｅｘＥＧＦＲとともにインキュベーションしたものを含む。クローン化Ｆｖ構築物によるｅｘＥＧＦＲおよびＣＲＡＡ−ＥＧＦＲへの結合を測定する方法は本質的には上記のとおりであるが、マウス抗ｃ−ｍｙｃ Ａｂ（１０残基のｃ−ｍｙｃタグを含む組み換え蛋白）およびペルオキシダーゼでタグを付した抗マウスＩｇＧで処理することにより反応を可視化することが異なる。
【００５７】
Ｆｖの調製：以前の刊行物（１０、１４、２５）に記載された方法を以下に要約するように若干改変して適用する。図５も参照。下記のようにしてＦｖ ｃＤＮＡライブラリーの構築を行う：ＲＮａｓｅの混入を最小にしながら免疫マウスの脾臓細胞から標準的方法により全ＲＮＡを調製する。ＶＬ ｃＤＮＡ（残基１〜１１３）およびＶＨ ｃＤＮＡ（残基１〜１２３）のライブラリーを、逆転写酵素および適当なＶＬまたはＶＨ前方プライマー（それぞれ、ベクター中にクローニングするためのＳｆｉＩ制限部位およびペプチドリンカーをコードするアンチセンス配列を含む）を用いてＲＮＡ鋳型から作成する。図５に示すようにＴａｑ、ｄＮＴＰｓおよび適当なプライマーを用いてＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅する。後方プライマーは、ＦＲ１領域中で保存されたＮ末端アミノ酸をコードする配列に基づいている。制限された縮重性をプライマーに導入して、密接に関連したＶ遺伝子ファミリー（例えば、ｋファミリー２、３、６）の増幅を可能にする。６個の後方ＶＬプライマー、８個のＶＨ後方プライマー、１個のＶＬ前方プライマーおよび２個のＶＨ前方プライマーが必要である。Ｖドメインの３’末端に近接した不変領域配列にアニールするように前方プライマーを設計する（２６）。ＶＨおよびＶＬ後方プライマーは、クローニングのためのＮｏｔＩ部位およびリンカーをコードするセンス配列を含む。リンカーは１４残基のフレキシブルペプチドである。ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位はめったに切断されず、制限消化工程におけるライブラリーの多様性の減損を最小にする。ＰＣＲ完了後、増幅された正しいサイズのｃＤＮＡのバンドをアガロースゲルから切り出し、Geneclean II (BIO 101)を用いて抽出し、ＥｔＢｒ蛍光（λｅｍ ５９０ｎｍ、λｅｘ ３０２ｎｍ）により定量する。ＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡ種を重複伸長により連結し、すなわち、リンカーセンスおよびアンチセンス配列をアニールし、２つの鎖をＴａｑを用いてフィルイン（filling in）する。アガロースゲル電気泳動およびWizard kits (Promega)を用いて個々のｃＤＮＡ種を精製し、次いで、連結反応を行う。
【００５８】
クローニングおよびファージディスプレイ：次いで、ライブラリーをファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢｈｉｓ6（２７）中にクローン化する。該ベクターは下記配列エレメントを含む：制限部位、シグナルペプチド、遺伝子３構造ペプチド、インサートと遺伝子３との間のストップコドン（アンバー）、ｃ−ｍｙｃペプチドタグ、ポリ（ｈｉｓ）6、ＩＰＴＧにより誘導可能なｌａｃプロモーターならびにアンピシリン耐性遺伝子。アンバーコドンは、宿主株に応じて（ＨＢ２１５１細胞はアンバーを停止と認識し、ＴＧ１細胞はアンバーをＧｌｕと認識する）、可溶性Ｖドメインの分泌あるいはファージ表面上のｐ３−融合蛋白としてのそれらの発現を可能にする。ｃＤＮＡおよびベクターをＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで逐次消化し、次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結させる。エレクトロポレーションにより宿主細胞を形質転換し、カナマイシン中でクローンを選択し、インサートの上流および下流に存在するプライマーを用いるＰＣＲにより個々のコロニー中のインサートの存在を確認し、０．７ｋｂのＥｔＢｒ染色バンドを得る。ヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３）を添加することにより、ＴＧ１細胞培養物からのファージ粒子のパッケージングが可能となる。培養上清中の粒子を４％ＰＥＧで２回沈殿させて、下記の選択工程に使用可能なファージを得る。
【００５９】
ＥＧＦＲ結合Ｆｖの選択：ｅｘＥＧＦＲをＰＢＳ中約５μｇ／ｍｌの濃度でポリスチレンプレート上にコートする。未結合蛋白を除去し、非特異的蛋白結合部位を飽和させた後、プレートをファージ調合物とともにインキュベーションする。さらに洗浄することにより未結合ファージを除去し、結合ファージ粒子をｐＨ３．０のバッファーで溶離させる。
【００６０】
触媒性ＶＬドメインおよびハイブリッドＦｖライブラリー：免疫されていないマウスから単離され、すでに触媒活性を有するようにされたＶＬドメイン（クローンＵ２４（１５））を、ＥＧＦＲ結合Ｆｖライブラリー由来のＶＨドメインに連結することによりハイブリッドＦｖライブラリーを調製する。前方プライマーがベクター中への直接クローニングのためのＮｏｔＩ部位を含むこと以外は上記のようにしてＶＬドメインｃＤＮＡをＰＣＲにより再増幅する。前方プライマーがリンカーアンチセンス配列を含むこと以外は上記のようにしてＶＨドメインを再増幅する。ＶＬ／ＶＨ連結は上記と同様である。
【００６１】
可溶性Ｆｖの発現および精製：選択クローンからのファージミドＤＮＡをＨＢ２１５１細胞中で増殖させる。ペリプラスム抽出物は２〜１０ｍｇ／Ｌの組み換え蛋白を含む。クロマトグラフィーはＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏａｓｅ（Qiagen）上で行う。未結合蛋白を０．５Ｍ ＮａＣｌバッファーで溶離させる。組み換え抗体をｐＨ５において、あるいはイミダゾールとともに溶離させる。第２ラウンドの金属アフィニティークロマトグラフィーにより、ＳＤＳ電気泳動、等電点フォーカシング、Ｍｏｎｏ−ＱクロマトグラフィーおよびＮ末端アミノ酸配列決定により純粋であると評価される組み換え蛋白が得られる。ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラム）および固定化抗ｃ−ｍｙｃ Ａｂとの免疫吸着（１４）により精製蛋白の各バッチを分析して、触媒活性がＡｂフラグメントに属することを確認する。グラジエントＦＰＬＣ系を用いてクロマトグラフィー手順を行う。University of Nebraska Medical CenterにおけるProtein Structure Core Facilityによる電気泳動ゲルのブロットを用いてアミノ酸配列決定を行う。
【００６２】
触媒選択試薬：求核性セリン残基と共有結反応しうる２種の化合物を調製する。第１の化合物はフルオロホスフェート（ＦＰ）二官能基試薬であり、以前の研究において示されたセリンプロテアーゼ阻害剤ＤＦＰと類似でありＡｂｓの触媒活性を阻害する。水中でのＤＦＰの安定性が低いので、ファージ吸着のためにそれを直接固体支持体に結合させることは実用的でない。アビジン被覆固相上への抱合体の固定化を可能にする、ビオチンのようなアフィニティータグに抱合したＦＰ基を含む二官能基試薬を用いる。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドで活性化したビオチン（ＮＨＳ−ＬＣビオチン ＩＩ）（図６中の１）とＦＰエステルとを反応させる。それにより、立体障害効果を最小にするための長いスペーサーも導入される。リン酸ジエステル２をＮＨＳ−ＬＣビオチンＩＩ（１）でエステル化することにより合成を進行させる。４−トリイソプロピルシリルオキシ−２−ブタノールをジクロロイソプロピルホスフェートでリン酸化し、次いで、加水分解し、モノクロロホスフェート中間体を脱保護することにより化合物２を得る。最終工程においてジエチルアミノスルフリルトリフルオライド（ＤＡＳＴ）での処理によりフルオロホスフェート３への変換を行う。試薬３をジオキサンまたは他の有機溶媒中に保存して、起こり得る自己反応を軽減する。次いで、有機溶液の一部をファージ含有水溶液に移して３の有効濃度を０．１ないし０．５ｍＭとする。試薬３の化学的自己反応が実用には重大すぎる場合、ビオチンのかわりにフルオレセインタグを用いる。フルオレセインはフェノール性ＯＨおよびカルボン酸エステルを含み、それらはフルオロホスフェートに適合する。フルオレセインをホスフェート誘導体４（２を無水グルタル酸で処理することにより得られる）を用いてアシル化して、そのアニリン基へのアミド結合を形成させる。５を得るためのリンにおけるフッ素化を、ＤＡＳＴでの処理により行う。図６参照。
セリンプロテアーゼ部位をトラップするための手段としてのペプチドアルデヒドマトリックスも調製する。市販アルギナール含有リガンドであるアンチパイン（Ｎ−［Ｎ−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−アール］−Ｐｈｅ）をカルボジイミドで活性化させ、Ｐｈｅ残基のカルボキシル基を介してＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Pharmacia）のアミノ残基に共有結合させる。その合成方法はルーチンであり、Pharmaciaにより詳述されている。
【００６３】
触媒性Ｆｖの選択：Ｆｖファージライブラリーを上記の固定化セリンプロテアーゼトラッピング試薬に通す。十分に洗浄することにより未結合ファージを除去する。ビオチン−アビジン相互作用およびフルオレセインー抗フルオレセイン相互作用を破壊するに十分な０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．２を用いて結合ファージの溶離を行う。０．１−１Ｍヒドロキシルアミンを用いて溶離を行ってホスフェート−セリン結合を解離させることもできる。ヘミアセタール付加物の分解を促進する弱酸性バッファー（ｐＨ４．５）を用いてペプチドアルデヒドマトリックスの溶離を行う。セリンプロテアーゼ結合マトリックスから回収されたファージ粒子をＴＧ１細胞中での増殖により増幅し、次いで、上記のごとく固定化ｅｘＥＧＦＲへの結合に関する選択を行ってＥＧＦＲ結合Ｆｖの選択を行う。
【００６４】
触媒活性のスクリーニング：Ｆｖファージライブラリーを上記の固定化セリンプロテアーゼ捕捉剤上を通過させる。十分に洗浄することにより未結合ファージを除去する。ビオチン−アビジンおよびフルオレセイン−抗フルオレセイン相互作用を破壊するに十分な０．１Ｍイシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．２を用いて結合ファージの溶離を行う。０．１−１Ｍヒドロキシルアミンを用いてリン酸−セリン結合を解離させることにより溶離することもできる。ヘミアセタール付加物の分解を促進する弱酸性バッファー（ｐＨ４．５）を用いてペプチドアルデヒドマトリックスの溶離を行う。セリンプロテアーゼ結合マトリックスから回収されたファージ粒子をＴＧ１細胞中で増殖させて増幅し、次いで、上記のごとく固定化ｅｘＥＧＦＲへの結合に関する選択に付してＥＧＦＲに結合するＦｖを選び出す。
【００６５】
触媒活性のスクリーニング：Ｆｖフラグメントを、ｅｘＥＧＦＲ、ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲペプチドおよび非特異的ペプチダーゼ基質Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−メチルクマリンアミド（ＭＣＡ）の開裂に関してスクリーニングする。金属結合能に基づいて多数のＡｂクローンを迅速に精製するようにプロトコールを発展させた。ニトロセルロースフィルターに適合した９６ウェルプレート中で細菌上清をＮｉ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅとともにインキュベーションし、中性ｐＨバッファーで洗浄することにより未結合物質を除去し、次いで、ｐＨ５のバッファーを用いて、結合したＶドメインを捕捉プレート中に溶離させる。Millipore Multiscreen装置により迅速な処理が可能になる。溶離物を中和し、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（５００μＭ）、［125Ｉ］ｅｘＥＧＦＲまたは［125Ｉ］ＥＧＦＲ（ｔｙｒ，２９４−３１０）（約３００００ｃｐｍ）を添加する。ペプチド−ＭＣＡ基質の加水分解をプレートリーダーを用いて調べる（λｅｘ ３６０ｎｍ、λｅｍ ４７０ｎｍ；Ａｒｇをアミノメチルクマリンに結合させているアミド結合の開裂により蛍光が増大する）。ペプチド−ＭＣＡ基質は市販されている。ＥＧＦＲ（ｔｙｒ，２９４−３１０）はＥＧＦＲの残基２９４−３１０に対応する１９残基の合成ペプチドであり、チロシンがＮ末端に置かれて125Ｉでの放射性標識が可能である。125ＩｅｘＥＧＦＲおよび［125Ｉ］ＥＧＦＲ（ｔｙｒ，２９４−３１０）の調製は標準的なクロラミン−Ｔ法による。遊離125Ｉの除去を、それぞれ、使い捨てゲル濾過カラム上または逆相ＨＰＬＣカラム上で行う。ＰＨＡＳＴシステム（Pharmacia）を用いる非還元性ＳＤＳ−電気泳動（４−１５％ゲル）、次いで、Kodak XARフィルムを用いてオートラジオラフィーを行い、Imageプログラムを用いてバンド領域の定量的スキャンニングを行うことによりｅｘＥＧＦＲの開裂を調べる。反応により、１０５ｋＤのバンドの消失およびより小さい放射活性フラグメントの出現が明らかとなる。Ｘ線フィルムの直線範囲中にあるバンドのみを定量するように心掛ける。１０％トリクロロ酢酸中に可溶化された放射活性を測定することにより［125Ｉ］ＥＧＦＲ（ｔｙｒ，２９４−３１０）の開裂を調べる。ＴＣＡ沈殿法は以前記載されたＶＩＰの開裂調べるための方法（１３）と同様である。Ｃ−１８カラム上でのＲＰ−ＨＰＬＣと比較することにより該方法が実行可能となる。困難な場合、ＶＩＰに関して以前記載されているようにして（２８）、２５％ ＰＡＧＥゲル上での電気泳動を行って無傷のペプチドとそのフラグメントとを識別する。対照は、ｃＤＮＡインサートのないベクターまたは非触媒性ＦｖをコードするｃＤＮＡ有するベクターで形質転換した細菌からの溶離物である。文献（２５）に記載された抗ｃ−ｍｙｃ Ａｂを用いるドットブロッティングにより組み換え蛋白の定量が可能になる。
【００６６】
ＥＧＦ結合に関するスクリーニング：選択されたクローンを、すでに公表された我々の方法（１５、１８）を用いて９６ウェルプレート中でＡ４３１細胞への125Ｉ標識ＥＧＦの結合に対するそれらの影響についてスクリーニングする。細胞（１ｘ１０5個／ウェル）をウェルに撒き、固相に付着させ、125Ｉ標識ＥＧＦ（Amersham）およびＦｖ溶液を添加し（約１ｎＭ）、反応混合物を６０分インキュベーションし、氷冷結合バッファーでウェルを３回洗浄し、次いで、結合125Ｉ標識ＥＧＦＲに関してウェルをカウントする。対照には、Ｆｖ不存在下および過剰の競合物質ｅｘＥＧＦＲの存在下で行う結合アッセイを用いる。
【００６７】
触媒特性の評価
イムノブロッティグ開裂アッセイを行って、開裂反応がｅｘＥＧＦＲの放射性標識に関連した人為的なものによるのではないことを確認する。約１μｇの精製ｅｘＥＧＦＲを食害で適当時間処理し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。ゲルをニトロセルロース上にブロットし、ポリクローナルなウサギ抗ｅｘＥＧＦＲで染色し、次いで、抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼで染色する。免疫染色可能な無傷のｅｘＥＧＦＲの消失および免疫染色可能なｅｘＥＧＦＲフラグメントの出現によりｅｘＥＧＦＲの開裂が示される。
【００６８】
キネティクス：未標識ｅｘＥＧＦＲ量を増加させていった場合におけるＡｂにより触媒される放射性標識ｅｘＥＧＦＲの加水分解の初速度を、ＳＤＳ−電気泳動およびオートラジオグラフィーにより観察されるバンド強度に基づいて計算する。無傷の基質バンドの強度、および個々の反応の速度、および各生成バンドの強度からｅｘＥＧＦＲ開裂速度を決定する。Michaelis-Menten等式｛ｖ＝（Ｖmax・［Ｓ］）／（Ｋm＋［Ｓ］）｝から反応定数（Ｋm、ｋcat）を計算する。また、合成ｅｘＥＧＦＲペプチドを基質として用いてキネティクスの研究を行う。かかる基質の使用により多くの同時反応に関連した複雑性がなくなる。逆相ＨＰＬＣを用いて生成物を分離すること以外は上記のようにしてかかる基質の加水分解のキネティクスを調べる。２１４ｎｍにおいて観察される生成物ピーク面積を調べることにより定量を行う。
【００６９】
開裂部位：Ａｂｓにより開裂されたペプチド結合を確認するために、約１００ｐｍｏｌｅｓの生成物フラグメントを生じさせるに十分な時間、電気泳動的に純粋なｅｘＥＧＦＲを触媒とともにインキュベーションし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりフラグメントを分離し、ＰＶＤＦ膜上にブロットし、UNMC Protein Structure Core Facilityにおいて固定化蛋白をＮ末端Edman分解により配列決定する。対照は、不活性ＦｖとともにインキュベーションされるｅｘＥＧＦＲおよびＦｖ不存在下でインキュベーションされるｅｘＥＧＦＲを含む。各フラグメントの少なくとも５個のＮ末端残基を同定して、開裂部位の明瞭な確認を可能にする。必要ならば、すなわち、Ｎ末端がブロックされている場合には、生じたフラグメントを同定するためのトリプシン処理によるマッピングおよびＦＡＢ−質量スペクトル法を考慮する。
【００７０】
基質特異性：ｅｘＥＧＦＲのほかに、下記の基質の開裂を試験する：（ａ）125Ｉ−リゾチーム；（ｂ）125Ｉ−チログロブリン；（ｃ）125Ｉ−ＩｇＧ；（ｄ）125Ｉ−ＶＩＰ；および（ｅ）種々のペプチド−ＭＣＡ抱合体。精製ヒトチログロブリン、ヒワトリリゾチーム（Sigma）および血清由来のヒトＩｇＧを、クロラミン−Ｔ法により125Ｉで標識し、ゲル濾過により精製する（２、４）。放射性標識蛋白をＡｂｓとともにインキュベーションした後、反応混合物を電気泳動する。オートラジオグラフィーにより、生成物を小さいサイズのバンドとして可視化できる（無傷のチログロブリン（モノマー）、リゾチームおよびＩｇＧの分子量はそれぞれ３３０ｋＤ、１５ｋＤおよび１５０ｋＤ）。ＴＣＡ中に可溶化された放射活性量として、あるいはＲＰ−ＨＰＬＣ分離（２）により、ＶＩＰの開裂を測定する。荷電アミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ）、電荷のないアミノ酸（Ｌｅｕ、Ａｌａ）および嵩高いアミノ酸（Ｐｈｅ）に結合したＭＣＡを含有する基質の開裂をフルオリメトリーにより測定する。
【００７１】
ＥＧＦＲペプチドの共有結合反応性抗原アナログで免疫されたマウスからの特異的ＥＧＦＲ開裂触媒の単離
すでに述べたように、触媒性Ａｂ合成は自己免疫性疾患において促進される。高効率触媒を誘導するために、ＥＧＦＲペプチドの共有結合反応性抗原アナログ（ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲ）での免疫により免疫系をさらに攻撃する。ＥＧＦＲ特異的触媒Ａｂｓの合成のための生殖細胞系Ｖ遺伝子によりコードされる部位の動員を促進するように、この抗原アナログを設計する。さらに、体細胞変異手段により、すなわち、Ｖ／Ｄ／Ｊリアレンジメントおよび体細胞のハイパーミューテ−ションにより形成されたセリンプロテアーゼ様触媒部位に関してＣＲＡＡ−ＥＧＦＲを選択する。
ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲの重要な構造上の特徴は以下のものである：（ａ）触媒Ａｂｓ中の求核性セリン残基に結合しうる四面体で求電子性のリン原子；および（ｂ）もっぱら塩基性残基のＣ末端側を開裂するための触媒部位に結合しうるリン原子のＮ末端側にあるリジン残基；および（ｃ）ＥＧＦＲの残基２９４〜３１０の配列に対応した、ＣＲＡＡ構造のＮ末端およびＣ末端側のそれぞれ１０個および７個のアミノ酸。
リン原子は、ＥＧＦＲ中の残基３０３および３０４を連結している切断可能なペプチド結合の炭素原子のアナログとして役立つ。図４に示されたフェニルエステル立体配置において、リン原子は部分的に正電荷を獲得し、それは切断可能な結合の炭素原子が求核性セリン残基との反応に必要な部分的に正の電荷を担持するのとちょうど同じである。ペプチドのＯ−フェニルホスホネートは、活性部位のセリンの酸素原子と共有結合を形成することにより種々のセリンプロテアーゼを不可逆的に不活性化させうることがしでに記載されている（２９）。SampsonおよびBartlett（２３）は、リン原子においてフェニルエステルを調製し、ホスホン酸エステルに隣接するペプチド配列に結合させるための化学合成プロトコールを確立した。
上記ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲは、エステラーゼＡｂｓを生じさせるために用いられた以前のホスホネートＴＳＡｓ（１３）とは異なることに注意。慣用的なホスホネートＴＳＡｓはリンに結合したアニオン性酸素を含み、触媒中に見出されるオキシアニオンホールに結合しうる。しかしながら、該ホスホネートＴＳＡｓは触媒部位中の求核性セリン残基とは反応しない。
塩基性残基をＣＲＡＡ−ＥＧＦＲのＰ１位置に導入して、生殖細胞系によりコードされるＡｂｓ中の塩基性残基特異的触媒部位の存在を利用する。塩基性残基の存在は、ホスホネートフェニルエステル構造とともに、触媒部位への固い結合を促進し、かくして、触媒部位を合成するＢ細胞のクローン増殖を選択的に刺激するＣＲＡＡ−ＥＧＦＲの能力を促進する。
ＥＧＦＲ残基２９４〜３１０をＣＲＡＡ−ＥＧＦＲ中に導入して、非特異的な触媒活性に対抗するものとして、ＥＧＦＲに特異的触媒活性を有するＡｂｓの合成を促進する。このエピトープはＥＧＦ結合部位を構成する残基の重要部分であるＥＧＦＲのドメインＩＩＩの成分であるので（３０）、このエピトープを選択した。図４参照。さらに、この配列のＮ末端領域における挿入による突然変異は、ＥＧＦ結合を低下させることが記載されている。上記のごとく、ＥＧＦ結合部位は連続していない残基から構成されている。かくして、位置３０３−３０４における意図された開裂によるコンホーメションの破壊は、間接的にＥＧＦＲの機能を損なわせることもできる。
ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲで高度免疫したＭＲＬ／ｌｐｒマウスからＦｖファージディスプレイライブラリーを調製する。ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲに結合しうる高アフィニティー血清の存在をＥＬＩＳＡにより測定して、マウスが活発なＡｂ応答を有することを確認する。固定化ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲを用いてファージの選択を行うこと以外は本質的に記載された方法（２５）のようにしてＦｖライブラリーの調製および選択を行う。基質は、Ｎ末端にチロシン残基を含み、その後にＥＧＦＲの位置２９４−３１０に相当する１７残基を含む１８残基のペプチドである。チロシン残基は意図される開裂部位から離れており、Ｆｖの認識に対する妨害を最小限にしている。さらに、機能的ＥＧＦＲ蛋白中に存在する残基２９４−３１０からなるコンホーメーション上のエピトープを用いてｅｘＥＧＦＲの開裂に関するスクリーニングを行う。
ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲに対する触媒の結合親和性をＥＬＩＳＡにより調べる。ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲ濃度を上昇させることによりＥＧＦＲ（２９４−３１０）開裂の阻害を調べる。ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲは競合性の代替基質として役立ち、結合アッセイから推定されたＫｄ値に近いＫｉ値を有する。
ＥＧＦＲ（２９４−３１０）およびｅｘＥＧＦＲの開裂により生じた生成物フラグメントを同定し、開裂部位の推定を可能にする。ＣＲＡＡ−ＥＧＦＲ中にフェニルホスホン酸エステル構造が存在するので、主として触媒活性の動員が起こり、両方の基質は主にペプチド結合連結残基３０３と３０４との間（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ結合）において開裂されるはずである。上記のように、基底状態の抗原で免疫することにより抗原特異的触媒を合成することができる。かくして、３０３−３０４の結合以外のペプチド結合においてＥＧＦＲ（２９４−３１０）を開裂しうる触媒も同定されるはずである。免疫前レパートリー中に存在する生殖細胞系によりコードされる活性は塩基性残基を認識するものであるので、開裂するための１の可能な標的はＡｒｇ３００−Ｌｙｓ３０１結合において見出される。
上記方法は、ＥＧＦＲを残基３０３−３０４において認識し、開裂させ、ＥＧＦ結合活性の低下を誘導する一連の高親和性、高ターンオーバーの触媒性Ａｂｓを提供する。フェニルホスホン酸エステル構造を導入することは、構造的に最適化されたセリンプロテアーゼ触媒部位を有するＡｂｓのクローン選択を誘導する。それゆえ、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて生成した触媒に優る触媒を、ここに概説したＥＧＦＲ−ＣＲＡＡ法を用いることにより合成する。
【００７２】
生体内分布およびインビボにおける抗腫瘍効果
生体内分布およびインビボにおける増殖に対する効果を評価するために、腫瘍局在化ならびに種々の薬剤、トキシンおよびＡｂｓの抗腫瘍効果を研究するためのモデルとしてヒト腫瘍を有する胸腺切除マウスを使用した。
６種の最も見込みのある触媒性Ｆｖ構築物、ならびに非触媒性Ｆｖ構築物の腫瘍マウスにおける生体内分布を比較する。125Ｉ放射性標識Ｆｖ構築物が標的抗原に結合し開裂する能力を予備試験により確認する。Ｆｖ構築物の組織対血液比および腫瘍対血液比を計算する。イメージング研究を行って、Ｆｖ調合物の腫瘍特異性をさらに評価する。Ｆｖ構築物中の触媒機能の存在は、腫瘍細胞表面からのそれらの解離を促進する可能性がある。なぜなら、標的抗原の生成物フラグメントは、無傷の抗原よりも弱く触媒に結合するからである。このことにより、比触媒性Ｆｖよりも触媒のほうが腫瘍：血液比が低くなる可能性がある。一方、腫瘍細胞中へのＦｖの内在化の速度が非常に速い場合、触媒機能はＦｖの生体内分布パターンに影響しない可能性がある。腫瘍切片のオートラジオグラフィーを行って、腫瘍細胞によりＦｖ構築物が内在化される程度を調べる。
好ましい生体内分布プロフィールを有する標的抗原開裂触媒、ならびに非触媒性Ｆｖおよび無関係なＦｖを、胸腺切除マウスにおける腫瘍細胞増殖阻害能について評価する。腫瘍形成までの時間（潜伏期）、腫瘍を発生させたマウスの数、および腫瘍部位を記録する。細胞増殖および細胞死の相対速度により腫瘍の増殖を調べる。アポトーシスおよび壊死は細胞死における異なったプロセスである。ＥＧＦＲはアポトーシスによる細胞死の重要なレギュレーターであると考えられている。触媒性Ｆｖ構築物での処理は腫瘍の完全な逆行を引き起こす可能性がある。なぜなら、細胞はＥＧＦＲによるアポトーシスの負の調節から解放されうるからである。動物から回収された腫瘍のクリオスタット切片を、増殖およびアポトーシスのマーカー、すなわちＫｉ−６７、ｂｃ１２およびｂａｘに関して組織化学的方法により調べる。ｋｉ−６７は細胞周期全体において存在する増殖関連抗原であり、腫瘍細胞集団の増殖している部分を評価するための信頼できるマーカーである。ｂｃｌ−２およびｂａｘマーカーは、細胞がアポトーシスによる細胞死に至る運命であるかどうかの評価を助ける。
要約すると、本発明の触媒性抗体は新生物性疾患の治療のための有益な治療薬である。
（実施例１Ｂ）
【００７３】
組み合わせ化学療法プロトコールにおける触媒性抗体およびアンチセンスｐ５３の投与
細胞がそのゲノムに対するダメージを受けている場合、細胞が自分で修復するか、あるいはプログラムされた細胞死に至るかを決定する機能が細胞中に適切に存在する。増殖中の細胞が有効にゲノム修復を行うためには、細胞は周期から出なくてはならない。このことは、増殖中の細胞を娘細胞に至らしめるのではなく、ゲノムのダメージを修復するための時間を増殖中の細胞に与える、いわゆる「細胞周期チェックポイント」により行われる。
図１８は、ゲノムのダメージに対するこれら２つの可能な細胞応答の一方または他方を誘導することにおける正常（野生型）ｐ５３の中心的役割を説明する。ゲノムに対するダメージはｐ５３の発現を増加させ、そのことは、このダメージに対して特異的な細胞応答を生じさせる他の種々のイベントを作動させる。
これらの関連性に基づけば、ｐ５３オリゴあるいは本発明により調製され、細胞膜を越えて抗体や抗体フラグメントを得るための方法と組み合わせて使用されるｐ５３触媒性抗体のごときｐ５３機能を阻害するある種の薬剤は、プログラムされた細胞死をブロックし、いずれのイベントが本来的に起こるのかに依存して細胞サイクルチェックポイントの活性化を防止すると考えるのが合理的でありうる。ｐ５３の上流または下流に作用する阻害剤を用いてこれらの細胞応答のいずれかをブロックする試みには、関与する因子が複数であるために問題がある。図１８参照。
これらの重要な認識は、癌、虚血−潅流傷害、および敗血性ショック／ＳＩＲＳを治療するためのｐ５３オリゴおよび触媒性抗体の提案された治療的使用に関して科学的根拠を形成する。
【００７４】
細胞機構の説明
細胞分化中に、３つの基本的なプロセスが共働し、関連したエラーが修復されなくてはならない。すなわち、（１）中心体が複製され、次いで、分裂しなければならない；（２）紡錘体が形成され、染色体に結合し、細胞分裂後期において伸長および姉妹染色体の分離を開始させなくてはならない；ならびに（３）ＤＮＡが複製され、染色体が濃縮され、次いで、紡錘体により分裂されて細胞の対向サイドに移動し、まもなく娘細胞が形成されなくてはならない。
記載された天然のプロセス中に受けるダメージを包含する、ゲノムに対するダメージまたは潜在的ダメージを検知する場合に、チェックポイントを用いることにより細胞分裂を妨害する監視システムは適切なものである。HartwellおよびWeinhertは細胞周期のチェックポイントを以下のように動作の上から定義した：細胞周期イベントＢの生起は前の細胞周期のイベントＡの完了に依存し、その依存は、依存性を緩和する機能消失性変異が見出されるかどうかというチェックポイントによるものである。
３つのチェックポイントが説明される酵母細胞についての研究において、動作上の定義は正確に示された。３つのチェックポイントとは、ＤＮＡダメージチェックポイント、紡錘体チェックポイントおよび紡錘極体（spindle pole body）（中心体と同等）チェックポイントである。ＤＮＡダメージチェックポイントは細胞周期の３つの異なる位置（Ｇ１／Ｓ遷移およびＧ２／Ｍ遷移、さらにＳ期を経てからの進行をモニター）において作動して、ダメージが検出された場合に増殖を停止させる。遺伝学的研究により、酵母において多くのチェックポイント成分が同定されたが、関与する蛋白は機能的に多面発現性であることがわかり、単純な因果関係を確立することが困難となった。Paulovichら（１９７７年）により指摘されたように、例えば、ＤＮＡダメージチェックポイントに必要な遺伝子はＤＮＡ修復、プログラムされた細胞死および転写調節にも関与している。その後、酵母での研究の結果は哺乳動物細胞にもあてはめられ、類似の成分が見出された（Hartwell et al. 1994）。
１のチェックポイントにおける細胞サイクル停止に必要な遺伝子の多くは他の２つのチェックポイントの一方または両方においても必要である。例えば、ｐ５３は３つのチェックポイントすべてにおいて重要な役割を果たすことが示された（Cross et al. 1995; Fukasawa et al. 1996; Levine 1997）。ＤＮＡダメージに応答してＧ１／Ｓ遷移において細胞周期の停止を誘発することにおけるｐ５３の重要な役割は、Kastanおよびその共同研究者（１９９１年）により初めて示され、それ以来さらに研究されている。Kastanのグループは、野生型ｐ５３（エキソン５から９までが配列決定され、正常であることが示された）を発現すると思われるヒトＭＬ−１骨髄芽球白血病細胞系について調べた。正常細胞については真実であるように、致命的でない用量のγ線照射またはアクチノマイシンＤによるこれらの白血病細胞の処理は、Ｇ１／ＳおよびＧ２／Ｍでの停止を引き起こした。ＭＬ−１細胞において、Ｇ１／Ｓでの停止は、細胞周期停止を進行させるｐ５３レベルの３倍ないし５倍の一時的な増加に関連していた。カフェイン処理はｐ５３発現誘導およびＧ１／Ｓでの細胞周期停止の両方をブロックすることが見出され、ｐ５３がＤＮＡダメージに応答したＧ１／Ｓでの停止において役割を果たしていることが示唆された。この仮説に従えば、野生型ｐ５３欠損細胞はγ線照射後にＧ１／Ｓでの停止を示さないことになる。
その後の研究において、Kastanのグループは固体腫瘍細胞系を用いて彼らの仮説を強化した（Kuerbitz et al. 1992）。誘導可能なプロモーターの制御下での野生型ｐ５３の発現を、ｐ５３発現欠損癌細胞系に導入することは、γ線照射後に細胞がＧ１／Ｓにおいて細胞周期を停止することを可能にした。ＤＮＡ鎖の破壊を引き起こす薬剤はｐ５３および周期停止を誘導するが、簡単にＤＮＡ中に取り込まれる抗代謝産物のごとき薬剤はｐ５３および周期停止を誘導しないこともさらに示された（Nelson & Kastan 1994）。
Kastanのグループおよび他の研究者の研究は、医学的に重要な薬剤のグループが反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成を引き起こし、さらにＤＮＡ鎖の破壊を引き起こすことによりｐ５３依存性のプロセスの活性化を誘導することを明らかにした。これらの薬剤は、イオン化放射性照射およびドキソルビシンのごとき種々の抗癌治療作用剤、ならびに一酸化窒素を包含する天然メディエイタを包含する。
ｐ５３を遺伝的にノックアウトしたマウスから取った細胞に対する、ある種の癌化学療法剤を包含する有糸分裂紡錘体阻害剤の効果が研究された。処理後、細胞は、染色体分裂を完了しない複数ラウンドのＤＮＡ合成の結果として４倍体または８倍体となった。対照的に、正常マウス細胞は処理後Ｇ２／Ｍで細胞周期を停止した。紡錘体阻害剤不存在下では、ｐ５３ノックアウトマウス由来の細胞の５０％が７代目に４倍体となったが、正常細胞はそうならなかった。ｐ５３ノックアウトマウスの組織を検査したところ、やはり４倍体細胞の存在が明らかとなり、これらのマウス由来の細胞を用いたインビトロ研究で観察された結果は培養による人為的要因によるものでないことが示された。これらの観察結果は、ｐ５３の損失または不活性化と４倍体化もしくは異数体との間の相関関係を示す初期の報告を確認するものである。同様に、Fukasawaら（１９９６年）は、ｐ５３ノックアウトマウス由来の細胞は異常な数の中心体を生じることを示した。このことは、なぜ無傷のｐ５３を有するマウス由来の細胞が同じ培養時間において２倍体のままであるのに対し、ｐ５３ノックアウトマウス由来の培養細胞が培養中に異数体を増加させるのかを説明するように思われる。Brownら（１９９４年）は、ｐ５３は培養細胞から単離された中心体とともに同時精製されることを見出し、これらのオルガネラの調節におけるｐ５３の直接的役割が示唆された。
【００７５】
図１８に示すように、ｐ２１は、ゲノムのダメージに応答したｐ５３依存性細胞周期停止の重要なメディエイタである。ｐ２１は多くのサイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）からなる複合体ならびに増殖中の細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に結合する。正常レベルのｐ２１はサイクリン−ｃｄｋ複合体の形成に必要であり、さらに細胞周期の進行に必要である（El-Deiry et al. 1993）。しかしながら、ｐ５３活性化から生じるｐ２１のレベル増加は、これらの複合体の機能およびＰＣＮＡを妨害することにより細胞周期をブロックする。少なくともいくつかの状況下で、ゲノムのダメージに応答してｐ５３によりアップレギュレーションされる別の遺伝子、ＧＡＤＤ４５もＧ１／Ｓ遷移ポイントにおいて細胞周期を停止させる可能性がある（Marhin et al. 1997）。
あるいはまた、ゲノムのダメージは細胞周期の停止および修復のかわりにｐ５３依存性のプログラムされた細胞死を誘導しうる。例えば、Clarke et al. (1993)は、ｐ５３遺伝子中の欠失に関して構成的にホモ接合であるマウスから取った胸腺細胞は、γ線照射またはエトポシド（etoposide）によるプログラムされた細胞死の誘導に耐性があるが、グルココルチコイドまたはカルシウムによる誘導には耐性がないことを示した。ｐ５３欠失に関してヘテロ接合であるマウスも、ＤＮＡ鎖の破壊を引き起こす薬剤に対して比較的耐性を有するが、ホモ接合よりも弱い。対照的に、無傷のｐ５３を有するマウス由来の胸腺細胞はこれらすべての処理に対応答してプログラムされた細胞死に至った。
野生型ｐ５３を発現しない癌細胞は、該蛋白の発現を実験的に導入した場合、プログラムされた細胞死に至ることがしばしば見出された。このことは、いかにしてｐ５３がプログラムされた細胞死を誘導するのかについての機構的説明に到達する試みをするためのモデル系を提供した。しかしながら、内在性の野生型ｐ５３の機能を分析するためのモデルを作成するために野生型ｐ５３機能を除去し、その後、実験的に野生型ｐ５３を構成的に発現させた細胞系の使用は、人を誤らせる結論を生じる可能性があることに留意しなくてはならない。
Johnsonら（１９９６年）は、ＲＯＳがｐ５３依存性のプログラムされた細胞死の下流メディエイタとして機能しうることを初めて示した。彼らは、強力なプロモーターの制御下にあるヒトｐ５３ ｃＤＮＡを担持するアデノウイルスベクターを用いて、培養ヒトまたはラット平滑筋細胞（ＳＭＣ）において高レベルのヒト野生型ｐ５３を発現させた。両方の細胞タイプにおいて同レベルのｐ５３が発現されたが、ヒト細胞においてのみプログラムされた細胞死が誘導された。感染から８日以内に、ｐ５３を過剰発現する本質的にすべてのヒトＳＭＣが死んだことがわかった。キネティクスの研究により、ｐ５３担持ウイルスでの感染から４時間でＳＭＣ中のｐ５３およびＲＯＳのレベル増加が示された。３種の無関係な抗酸化剤はＲＯＳ産生をブロックするがｐ５３の過剰発現をブロックしないことならびにプログラムされた細胞死の誘導をブロックすることが示された。ｐ５３の増加した発現は、少なくともいくつかの正常細胞タイプにおいてプログラムされた細胞死を誘導するに十分であり、ＲＯＳはこの誘導の下流メディエイタであると結論された。
Vogelsteinのグループ（Polak et al. 1997）は、アデノウイルスベクターを用いて、不活性な内在性ｐ５３遺伝子を有するヒトＤＬＤ−１大腸癌細胞において野生型ｐ５３の発現を引き起こした。ウイルス感染１６時間後およびプログラムされた細胞死が明らかになる８時間前にＲＮＡが精製された。細胞ｍＲＮＡ集団の定量的評価が可能なＳＡＧＥ法を用いて分析が行われた。約８００００個の転写産物が同定された。ｐ５３発現細胞においてこれらのうち１４個は著しく（１０倍よりも多い）豊富であり、２６個は有意に豊富であった。１４個の最も高度に誘導された遺伝子のうち、１３個が同定され、数個が細胞の酸化還元状態に影響する蛋白をコードしていることがわかった。
そのグループは、ｐ５３がＲＯＳの産生を刺激することによりプログラムされた細胞死を誘導しうると仮定した。細胞内ＲＯＳレベルを測定するために蛍光プローブを用いて、その研究者らは、ｐ５３担持ウイルスでの感染後にＲＯＳ産生が誘導され、プログラムされた細胞死が進行するにつれてＲＯＳレベルが増加し続けることを見出した。強力な酸化剤であるメナジオンまたは過酸化水素でのＤＬＤ−１細胞の処理は１４個の遺伝子のうち１個のみ、すなわちｐ２１のみの発現を誘導し、このグループの遺伝子はＲＯＳ発現の結果としては簡単に誘導されないことが示された。インドメタシンでの細胞の処理の結果としても、セラミドでの細胞の処理の結果としても、これらの遺伝子は誘導されなかった（これら２種の薬剤はｐ５３発現不存在下でプログラムされた細胞死を誘導しうる）。
タイムコース実験により、ｐ５３が酸化還元制御遺伝子を転写的に活性化する一連のイベントが示唆され、該一連のイベントはＲＯＳ産生を引き起こし、それによりミトコンドリアに対する酸化的ダメージが生じ、さらには細胞死を引き起こすものである。これらの工程のそれぞれを特異的な薬剤で阻害することにより連続したイベント間の因果関係が示された。
これらの知見は、下記のＤＬＤ−１細胞においてｐ５３により誘導されるプログラムされた細胞死に関する３工程モデルを示唆する：（１）ｐ５３は、オキシドレダクターゼを包含する遺伝子の特定のサブセットを転写的に活性化する；（２）誘導された蛋白はまとまってＲＯＳレベルの上昇を引き起こす；（３）ＲＯＳはミトコンドリアにダメージを及ぼし、カルシウムおよび他の成分の漏出を引き起こす。これらの成分は、プログラムされた細胞死の最終イベントに構成的に包含されるＩＣＥ様酵素ファミリーのメンバーを刺激する。
ゲノムのダメージに応答して野生型ｐ５３により転写的にアップレギュレーションされる遺伝子に関する異なる細胞タイプ間にはいくぶんかの相違があると思われる。これらのうち２つはＢａｘ（ＢＣＬ−２ファミリーのメンバーであり、ｐ５３依存性のプログラムされた細胞死の誘導に時々関与することが示されている）およびＧＡＤＤ４５（その産物はＰＣＮＡに結合し、そのことにより細胞周期チェックポイントの停止を引き起こす可能性がある）である。例えば、McCurrachら（１９９７年）は、霊長類の線維芽細胞において、Ｂａｘは化学療法により誘導される野生型ｐ５３依存性のプログラムされた細胞死のエフェクターの１つであることを見出した。この研究において、野生型ｐ５３は転写的にｐ５３を活性化することが見出された。しかしながら、ＢａｘもＧＡＤＤ４５も、Polyakら（１９９７年）によって以前に議論された研究において野生型ｐ５３により誘導されることがわかった遺伝子には含まれていなかった。化学療法により引き起こされる細胞のダメージに応答したプログラムされた細胞死の誘導におけるＢａｘの潜在的重要性がStrobelら（１９９６年）による研究において示された。このグループは、Ｂａｘ ｃＤＮＡを担持する発現ベクターを、機能的ｐ５３を欠くＳＷ６２６卵巣癌細胞系中にトランスフェクションした。トランスフェクション体は対照細胞と比較して平均して１０倍のＢａｘ発現増加を示した。化学療法後のプログラムされた細胞死の誘導の閾値は、化学療法剤がパクリタクセル、ビンクリスチンまたはドキソルビシンである場合に、Ｂａｘトランスフェクション体において低下したが、化学療法剤がカルボプラチン、エトポシドまたはヒドロキシウレアである場合には低下しなかった。
【００７６】
野生型ｐ５３を発現し、ドキソルビシンでの処理後に増殖停止またはプログラムされた細胞死のいずれかに至る癌細胞系を用いたさらなる研究により、ｐ５３導入後ＤＬＤ−１細胞中で非常に誘導された同じ１４個の遺伝子の大部分が、低用量の薬剤（細胞周期停止を引き起こした）および高用量の薬剤（プログラムされた細胞死を引き起こした）でアップレギュレーションされることが示された（Polyak et al. 1997）。その著者らは、細胞が周期停止に至るかまたはプログラムされた細胞死に至るかを決定する際の重要な因子は、細胞が酸化的ストレスに対処する能力であると推察した。言い換えると、酸化的ストレスを処理する能力が低い細胞はプログラムされた細胞死に至り、より耐性の細胞は周期停止に至るのである。
細胞が経験する酸化的ストレスのレベルは、ゲノムダメージ後の細胞周期停止および修復よりもむしろｐ５３依存性のプログラムされた細胞死に至る傾向に対して正の相関関係があった。Lotem et al. (1986)は、これらの現象に対する酸化的ストレスおよびサイトカインの影響を骨髄性白血病細胞において研究した。抗酸化剤およびある種のサイトカインはこれらの細胞に関して細胞毒性化合物により誘導されたプログラムされた細胞死からの共働的防御を示した。しかしながら、過酸化水素を用いて酸化的ストレスを増加させると、細胞死プログラムの発生が増加し、プログラムされた細胞死を防止するのに必要な防御的サイトカイン処理のレベルが増大した。
サリチレートはプロテインキナーゼおよびストレス応答に関与している転写因子の活性化を阻害することが知られている。ChernovおよびStark (1997)は、サリチレートがｐ５３のＤＮＡへの結合を可逆的に阻害し、その結果、トキソルビシンまたは放射線照射処理後のｐ２１転写およびプログラムされた細胞死を誘導するｐ５３の能力を抑制した。サリチレートがＤＮＡダメージ後６０分以内に洗い流された場合、抑制されていたｐ５３依存性イベントは遂行可能である。
いくつかの状況下においてゲノムダメージ後に野生型ｐ５３が細胞周期停止またはプログラムされた細胞死を誘導するかどうかに影響する１の因子はｃ−ｍｙｃである。SaitoおよびOgawa (1995)は、構成的にｃ−ｍｙｃを発現し、ｐ５３を発現しないラット肝細胞癌細胞系ＦＡＡ−ＨＴＣ１について研究した。これらの細胞におけるｃ−ｍｙｃ発現はアンチセンスＬ ＣＨＫ２ＨＲオリゴヌクレオチドにより効果的に抑制された。野生型ｐ５３ ｃＤＮＡを担持するデキサメタソンにより誘導可能な発現ベクターをこれらの細胞中にトランスフェクションすることにより野生型ｐ５３発現が成し遂げられた。結果は、野生型ｐ５３がｃ−ｍｙｃの状態に依存して細胞周期のインデューサーとしてあるいはプログラムされた細胞死のインデューサーとして同じ細胞に作用しうることを示した。野生型ｐ５３の発現は一部の細胞においてプログラムされた細胞死を誘導したが、生き残っている細胞の増殖を阻害しなかった。ｃ−ｍｙｃの発現が阻害された場合、野生型ｐ５３の発現は細胞増殖の阻害を引き起こしたが、プログラムされた細胞死を誘導しなかった。プログラムされた細胞死を誘導しうる調節されていないｃ−ｍｙｃの発現も他の研究者により示された（Evan et al. 1992; Hoang et al. 1994; Lotem & Sachs 1993）。
さらなる研究により、野生型ｐ５３がある環境において初めに他の遺伝子の発現を引き起こすことなくプログラムされた細胞死を誘導することが示された。これらの状況下において、野生型ｐ５３依存性のプログラムされた細胞死はアクチノマイシンＤまたはシクロヘキシミド（それぞれＲＮＡおよび蛋白合成をブロックする））の存在下で起こる（Caelles et al. 1994）。例えば、ｐ５３がＤＮＡに結合するのに必要な末端ｐ５３アミノ酸残基を欠くｐ５３を発現するベクターのＨｅｌａ細胞中への導入は、ｐ−５３依存性のプログラムされた細胞死を生じさせることが示された（Haupt et al. 1995）。しかしながら、この観察結果がｐ５３の転写における無関与を支持するものであるということにより、十分な正当化なしに、ｐ５３が転写に影響する唯一の経路は遺伝子の転写エレメント自体に直接結合することによるという仮説が引き出される。これらの知見および類似の知見（Sabbatini et al. 1995）を用いて、ｐ５３が転写に影響せずにプログラムされた細胞死を誘導しうるという議論が支持された。
それゆえ、野生型ｐ５３が、直接的な蛋白−蛋白相互作用によりあるいはこれらの方法の組み合わせによって、特定の遺伝子のセットを転写的に活性化する手段によりプログラムされた細胞死を誘導することはあり得る。しかしながら、プログラムされた細胞死の誘導は野生型ｐ５３の発現には必ずしも必要でなはい。ｐ５３ノックアウトマウスが正常に発達するという観察結果ならびに野生型ｐ５３を欠く細胞が誘導されてプログラムされた細胞死に至るという事実から、このことが明らかである（Clarke et al. 1993）。
図１８に示すように、プログラムされた細胞死を開始させる複数の経路が集まって、インターロイキン１−β変換酵素（ＩＣＥ様）ファミリーを含む共通の末端フェーズを用いる。この酵素ファミリーは１１のメンバーを含むことが知られており、３つのサブファミリーに別けることができる：該３つのサブファミリーはＩＣＥ、ＣＰＰ３２、およびカスパーゼと呼ばれるＩｃｈ−１サブファミリーである（Boldin et al. 1996; Chinnaiyan et al. 1996; Duan et al. 1996a & 1996b; Fernandes-Alnemri et al. 1996; Lin & Benchimol 1995; Lippke et al. 1996; Muzio et al. 1996; Wang et al. 1996）。例えば、Sabbatini et al. (1997)は、ｐ５３依存性のプログラムされた細胞死の発生におけるＩＣＥファミリー酵素の役割について特別に研究した。彼らは、実験的に野生型ｐ５３を発現させることにより誘導した新生ラット腎臓細胞系においてＩＣＥ様プロテアーゼＣＰＰ３２のペプチド阻害剤が細胞死プログラムを阻害することを示した。
【００７７】
野生型ｐ５３はプログラムされた細胞死を引き起こすＩＣＥ酵素ファミリーの能力を高める可能性があるとも思われる（Jung & Yuan 1997）。例えば、ＣＯＳ−１細胞における野生型ｐ５３機能の不活性化は、該細胞がＩＣＥ様酵素のｃＤＮＡを担持する発現ベクターでトランスフェクションされた場合、該細胞がプログラムされた細胞死に至ることを防止するが、正常ＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションは、それらを細胞死プログラムに至らしめる。ＩＣＥ様酵素または温度感受性ｐ５３変異体のいずれかを担持する発現ベクターが不活性な内在性野生型ｐ５３を有するＣＯＳ−１細胞中にトランスフェクションされた。野生型ｐ５３機能に関する許容温度において、ＩＣＥ様酵素がプログラムされた細胞死を引き起こす能力は有意に増大した。さらなる実験は、当該酵素によるプログラムされた細胞死の誘導を促進する野生型ｐ５３の能力がＢａｘにより媒介されることを示した。
【００７８】
癌治療のためのＯＬ（１）ｐ５３
臨床的に用いられるすべての癌治療は、用量依存的な様式でプログラムされた細胞死を誘導することにより癌細胞を殺すものである。いくつかの例において、このプログラムの誘導は野生型ｐ５３依存的であることが示されている。低用量において、ゲノムのダメージを引き起こす多くの薬剤は、野生型ｐ５３を有する細胞においてチェックポイントの誘導を行う。チェックポイントは細胞増殖を一時的に停止させ、ダメージを受けた細胞が修復するための時間を提供する。
ＯＬ（１）ｐ５３の開発に関与した研究者による最近の研究は、野生型ｐ５３の発現を阻害することが無傷の野生型ｐ５３依存性細胞周期チェックポイントを有するかなりの癌細胞に対する多くの抗癌治療薬の殺傷効果をなぜ増大させるのかという疑問に対する論理的解答を提供するものである。証拠は、細胞周期チェックポイントがゲノムに対する治療上のダメージ後に作動しない場合、癌細胞は、プログラムされた細胞死の誘導を導く有糸分裂の不存在下でそのＤＮＡを複製し続ける。治療上重要な結果は、ブロックされたチェックポイントとの関係において、抗癌治療薬はより効果的に癌細胞を殺すようになる。
いくつかの研究において、野生型ｐ５３またはその下流エフェクター（特に、ｐ２１）の１つを遺伝学的にノックアウトすることによりチェックポイントの働きが妨げられた。これらの妨害は不可逆的性質を有するので、これらの状況下において野生型ｐ５３はプログラムされた細胞死の誘導に必要でないことが明らかである。他の実験において、ペントキシフィリンのごときメチルキサンチン誘導体またはプロテインキナーゼＣ阻害剤ＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）は（いずれもＧ２チェックポイント機能を阻害する）、抗癌剤に対する癌細胞の感受性をさらに大きなものにすることにおいて、野生型ｐ５３経路を妨害する薬剤と相乗作用することが示された。
野生型ｐ５３のこの役割と矛盾せずに、ｐ５３オリゴおよびＯＬ（１）ｐ５３は、ゲノムにダメージを与える薬剤の癌細胞殺傷能を特に相乗的に増大させる。さらに、最大の致死的効果を癌細胞に対して引き起こすための最適用量において、ＯＬ（１）ｐ５３および抗癌剤の組み合わせは試験した正常細胞タイプを殺さなかった。
ＯＬ（１）ｐ５３のごときホスホロチオエートオリゴまたは天然ホスホジエステルオリゴが細胞に結合する場合、それらは細胞に対してシクロオキシゲナーゼ依存的機構により遊離酸素ラジカルの産生を増加させるように誘導する。酸素圧を減じた場合よりも２０％（大気中と同じ）酸素下で通常の細胞培養を行った場合のほうがその効果は明らかである。これらのフリーラジカルはゲノムのダメージを引き起こす可能性があり、この現象は、なぜＯＬ（１）ｐ５３が癌の化学治療薬のごときゲノムのダメージを引き起こしうる化合物を添加する必要なしに通常の組織培養において癌細胞を殺すのか、そしてなぜゲノムにダメージを与える薬剤を添加しない場合にＯＬ（１）ｐ５３は体内に見られるのと同様の酸素レベルにおいて培養された癌細胞を殺さないのか、ということを説明しうるものである。ＯＬ（１）ｐ５３のごときオリゴで前処理された癌細胞を、ｐ５３オリゴの不存在下で細胞に対して毒性のないゲノムにダメージを与える薬剤を与えて殺すことができる。おそらく、ペントキシフィリンのごときＧ２阻害剤によってこの相乗効果をさらに高めることができ、該Ｇ２阻害剤は、無傷のｐ５３機能を有する癌細胞よりも損傷した野生型ｐ５３機能を有する癌細胞を治療するために使用した場合に有効である。
ホスホロチオエートはＤＮＡアナログであるので、ＤＮＡに対して親和性を有する癌の化学療法剤がそれらに結合する。この概念は、ミトキサントロンに固く結合するがイダルビシンまたはダウノルビシンには結合しないＯＬ（１）ｐ５３を用いて検証された。ミトキサントロンとオリゴとの間の相互作用は、野生型ｐ５３を発現しない癌細胞に対する化学療法剤の毒性の影響を実質的に減じた。
オリゴ−薬剤相互作用についてのもう１つの研究において、イオウ基と反応することが知られているアセトアミノフェンの生体活性代謝物は、ＯＬ（１）ｐ５３を包含するホスホロチオエートオリゴに結合することが示された。この相互作用はＯＬ（１）ｐ５３を不活性化する可能性があり、さらなる臨床試験を行う前に調査すべきである。
アカゲザルを包含する数種において行われた薬理学的および毒物学的研究は、ＯＬ（１）ｐ５３が全身的治療薬としての使用に好ましい薬剤動力学的特性を有し、当該オリゴ治療レベルと考えられるレベルよりも十分高用量においてさえも無毒であることを示した。配列決定および細胞培養の研究は、ＯＬ（１）ｐ５３が、ヒト細胞におけるのと同様にサル細胞においてｐ５３発現を抑制することを示唆する。しかしながら、当該オリゴは下等動物由来の細胞または組織に対しては特別な効果を有しない。
【００７９】
単一薬剤としてのＯＬ（１）ｐ５３に関するフェーズＩの臨床試験を、急性骨髄性白血病または骨髄形成不全症候群の患者において行った。当該オリゴを１０日間にわたる連続的輸液により与えたところ、当該オリゴは治療レベルと予想される用量配列番号：において無毒であるという結果が示された。完全な応答は見られなかった。
ＯＬ（１）ｐ５３投与開始直前および輸液中の種々の時点で患者から採取した悪性細胞を２０％酸素下で培養した。未治療患者の末梢の白血病性幼若細胞と比較すると、ＯＬ（１）ｐ５３輸液開始後に採取した細胞はより迅速に死滅し、患者に輸液したＬ（１）ｐ５３の効能を表すものであった。同様に、白血病または骨髄Ｋ税不全患者由来の骨髄の長期培養も、悪性細胞を生じさせる能力の実質的低下を示し、ドナーへのＯＬ（１）ｐ５３の輸液の効能を示すものであった。この抑制は治療後何カ月にもわたり持続し、その効果が可逆的であるという証拠はなかった。
ＯＬ（１）ｐ５３臨床試験の結果は、当該オリゴをゲノムにダメージを与える抗癌剤と組み合わせて使用して患者において活性を発揮させなければならないということを強く示唆する研究室での結果と矛盾しない。試験における患者由来の細胞を用いた細胞培養データの解釈もこの仮説と矛盾しない。２０％酸素下で癌細胞を培養した場合、当該オリゴはこれらの細胞を誘導して、ゲノムにダメージを与える薬剤として役立つＲＯＳを細胞に産生させた。上記の議論から、例えばｐ５３オリゴを用いてｐ５３の発現をブロックすることは、（１）細胞周期の停止を防止し、修復のための時間を提供し、（２）ｐ５３依存性のプログラムされた細胞死を防止する。多くの癌治療がゲノムのダメージを引き起こすので、それらはｐ５３を発現する癌細胞において野生型ｐ５３の誘導を引き起こすと考えることもできる。実際、Ｘ線照射、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、紡錘体阻害剤およびある種の代謝拮抗物質はすべて、ｐ５３依存性の細胞周期停止を引き起こすことが知られている（Cross et al. 1995; Kastan et al. 1001; Linke et al. 1996; Tishler et al. 1995）。野生型ｐ５３のかかる誘導の阻害は、ダメージを受けたゲノムを複製させることにより増殖中の癌細胞に対するこれらの抗癌治療薬の毒性を増大させ、機能不全細胞を生じさせ、同様にプログラムされた細胞死も誘導する。
【００８０】
この問題に言及した一連の刊行物はJohns Hopkinsおよびthe University of Pennsylvaniaにおける共同研究者の研究室から出たものである(MaDonald et al. 1996; Waldman et al. 1996 & 1997)。ｐ２１の状態のみが異なる同質遺伝子型のヒト大腸癌細胞系がこれらの研究に使用された。相同組み換えを用いてｐ２１＋／＋細胞からｐ２１−／−細胞が得られた。正常には、ゲノムのダメージによるｐ５３の誘導は、ｐ２１遺伝子への直接結合における転写因子として作用するｐ５３によるｐ２１の誘導を引き起こす。次いで、新たに合成されたｐ２１は、細胞周期の必要な蛋白に結合し、その機能をブロックする（図１８）。
これらの研究の最初のもの（McDonald et al. 1996）は、ｐ２１＋／＋ ＨＣＴ１１６細胞と比較した場合にｐ２１−／− ＨＣＴ１１６ヒト大腸癌細胞（いずれのＨＣＴ１１６クローンも野生型ｐ５３を有する）がＤＮＡ修復欠損を有するかどうかを調べるものであった。クローン原性アッセイによれば、ｐ２１欠損クローンはｐ２１発現細胞よりもＵＶダメージに対して２〜３倍感受性が高いことがわかった。さらに、無傷のｐ２１機能を有する細胞と比較すると、ｐ２１−／−癌細胞は６−ＴＧ−耐性コロニーを自発的に生じる頻度が２〜３倍に上昇しており、変異によるｈｐｒｔ遺伝子の不活性化を示すものであった。これらのデータは、ｐ２１機能の消失が細胞のＤＮＡダメージ修復能の低下に関連していることを示唆するものである。
この概念をさらに検証するために、研究者は発現ベクターをｐ２１＋／＋または−／− ＨＣＴ１１６ヒト大腸癌細胞中にトランスフェクションした。該ベクターは、サイトメガロウイルスのリポーターによりドライブされるベータ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡを含み、トランスフェクションする前にＵＶ照射またはシスプラチン抗癌剤のいずれかを用いて故意にダメージを与えた。ｐ２１＋／＋ ＨＣＴ１１６細胞と比較すると、ｐ２１を欠損したＨＣＴ１１６細胞は、ダメージを受けた発現ベクターの修復効率は３〜５倍低下していた。ｐ２１ ｃＤＮＡを担持する発現ベクターのｐ２１−／− ＨＣＴ１１６細胞中へのトランスフェクションは、その修復能を２〜３倍増大させた。ｐ２１とＰＣＮＡとの相互作用を阻害し、かくしてＤＮＡダメージに応答する際に細胞周期停止を防止する薬剤は、ＤＮＡダメージを引き起こす古典的な抗癌剤との相乗的な細胞毒性的相互作用を有する可能性があると結論された。
引き続いての研究において、研究者らはｐ２１＋／＋および−／− ＨＣ１１６細胞に対するゲノムにダメージを与えるある種の薬剤の効果を調べた（Waldman et al. 1996）。薬剤は癌治療薬ドキソルビシン、エトポシドおよびγ線照射ならびにトポイソメラーゼ−１阻害剤カンプトテカンを包含した。各薬剤は、ｐ２１＋／＋細胞の細胞周期停止を延長させるが死滅させない濃度においてプログラムさた細胞死を誘導することによる処理を行って９０時間以内にｐ２１−／−細胞の培養物を完全に死滅させることができることが示されていた。ｐ２１−／−細胞の分析により、処理後に細胞は短期間Ｇ２においてブロックされたが、Ｇ１においてはブロックされず、次いで、有糸分裂することなしに複数ラウンドのＤＮＡ合成を開始したこと、ならびに生成した異常な核形態を有するハイパージプロイド（hyperdiploid）細胞はその後プログラムされた細胞死に至ったことが示された。
ＨＣＴ１１６細胞系とは異なり変異したｐ５３を有するが、２倍体である点でＨＣＴ１１６細胞系と類似しているＤＬＤ−１ヒト大腸癌細胞系を用いて同様のセットの実験が行われた。その著者は、ｐ５３変異細胞はＤＮＡダメージ後にｐ２１を発現せず、ｐ２１−／−細胞と機能的に同等であると推論した。予想されたように、ＤＬＤ−１細胞はドキソルビシンまたはγ線照射後にｐ２１をほとんど生成せず、プログラムされた細胞死を終わらせるＨＣＴ１１６細胞系におけるのと同じセットの形態学的／生理学的変化を必然的に生じさせるチェックポイントの欠損が示された。
変異ｐ５３を有する異数体ヒト大腸癌細胞系を用いてこれらの実験を行った場合、ＤＮＡにダメージを与える薬剤でのこれらの細胞系のうち２つを処理した効果は、プログラムされた細胞死を引き起こすのと同じパターンの出来事となった。第３の細胞系において、前以て存在している異数体性は、細胞死の前のＤＮＡ内容量の有意な増加に関する堅固な結論を十分に妨げるものであった。Waldmanらは、「詳細な分析によれば、プログラムされた細胞死は明らかに有糸分裂とＤＮＡダメージ後のＳ期とがカップリングしないことにより誘導される。ｐ２１依存性チェックポイントを有しない細胞は、一貫して停止に至るかわりに、有糸分裂不存在下で複数ラウンドのＤＮＡ合成をし続け、倍数体およびプログラムされた細胞死の絶頂を極める。」と結論した（１０３４頁）。
しかしながら、その著者らは、彼らの実験により示された重要な点をコメントしなかった。いくつかの刊行が、野生型ｐ５３を有する細胞において、多くの抗癌治療薬により誘導されたプログラムされた細胞死がｐ５３依存性であることを示している（Dronehower et al. 1992; Lowe et al. 1993; Symonds et al. 1994）。さらに、野生型ｐ５３を有するある種の癌細胞は、変異したｐ５３を有する類似細胞よりも化学療法に対して感受性が高いことがありうる（Aas et al. 1996; Lowe et al. 1993a & 1993b）。しかし、変異したｐ５３を有する３種の異なる大腸癌細胞系は、ＨＣＴ１１６ ｐ２１−／−細胞におけるのと同様のプログラムされた細胞死を誘導する一連のイベントを経験したという知見は、ダメージを受けたＤＮＡを有糸分裂不存在下において複製した結果としてのプログラムされた細胞死が野生型ｐ５３依存性であることを示唆する。
ＨＣＴ１１６に関する研究は、ｐ５３／ｐ２１に依存する細胞周期停止の妨害により、抗癌治療薬によるプログラムされた細胞死の誘導に関する閾値を低下させること可能であることを示している。なぜなら、ｐ２１＋／＋であるＨＣＲ１１６細胞に必要な用量よりも低い用量でプログラムされた細胞死がｐ２１−／−細胞において誘導されるからである。ｐ２１＋／＋および−／−両方のＨＣＴ１１６細胞が野生型ｐ５３を発現するので、この誘導はｐ５３依存性でありうる。ｐ５３依存性のプログラムされた細胞死機構に基づくのであれば、ＤＮＡまたはゲノムのダメージがプログラムされた細胞死を誘導する閾値は野生型ｐ５３を発現する癌細胞において低下する可能性がある。しかしながら、野生型ｐ５３の不存在下において、ｐ５３依存性のプログラムされた細胞死の誘導に関するより高いダメージレベルの閾値が存在する可能性がある。
ＯＬ（１）ｐ５３はｐ５３の発現を一時的に阻害するので、このオリゴならびに慣用的な治療薬での癌細胞の治療は、ｐ５３が抑制されている間の細胞周期チェックポイントの妨害、ならびにｐ５３発現回復後のｐ５３依存性のプログラムされた細胞死の両方を引き起こす可能性がある。それゆえ、ＯＬ（１）ｐ５３は、ｐ５３またはｐ２１の遺伝学的ノックアウトを用いる上記アプローチよりも効果的に野生型ｐ５３発現癌細胞を抗癌治療薬に対して感受性にするはずである。
このシリーズの３番目の研究論文に示された実験は、細胞周期チェックポイントの阻害が免疫寛容動物中で増殖したＨＣＴ１１６ヒト大腸癌細胞のγ線照射感受性を増大させるかどうかを決定するために設計された（Waldman et al. 1997）。細胞系のｐ２１＋／＋およびｐ２１−／−サブクローンから異種移植片腫瘍を確立した。処理しない場合、ｐ２１＋／＋およびｐ２１−／−腫瘍はほとんど同じ速度で増殖した。次いで、約５０ｍｍ2の腫瘍を有する１群につき１７匹の動物のうち１２匹を７．５または１５Ｇｙのγ線で局所照射処理し、その後、２週間ごとに測定した。ｐ２１＋／＋腫瘍を有する動物に対する照射は治療効果がなく、すべてのｐ２１＋／＋腫瘍は処理後数日間増殖し続けた。対称的に、γ線照射により（照射量の関数として）ｐ２１−／−腫瘍の１８％および３８％（chi-square試験によりＰ＜０．０１）が治癒された。ここに、治癒は検出可能な腫瘍が存在しないことと定義した。治癒されなかったｐ２１−／−腫瘍は治療後において実質的に照射量依存性のサイズの減少を示した。
この研究の第２の目的は、標的細胞のｐ５３および／またはｐ２１の状態により影響される癌治療を評価する際のクローン原性生存アッセイの価値を調べることであった。γ線照射で生き残ったクローン数は少ないが、ＨＣＴ１１６のｐ２１＋／＋およびｐ２１−／−サブクローンを比較した場合、ほぼ同数であることが見出された。少ないコロニー数はそれぞれ細胞周期停止およびプログラムされた細胞死によるものとされた。ｐ２１＋／＋細胞の場合（ｐ２１−／−ではない）、生き残ったコロニー間の領域には生きた細胞が存在していた。研究者は、この生き残ったｐ２１＋／＋細胞の存在が支持細胞層のような機能を果たしたと至適した。支持細胞層はクローン原性細胞の増殖を支持することにおいて重要であることが知られている。彼らはさらに、処理されたｐ２１＋／＋腫瘍におけるこの支持細胞層ならびにインビボにおけるかかる支持細胞層の欠如により動物でのデータを説明できることを議論した。
【００８１】
別のグループもまた、野生型ｐ５３および／またはｐ２１の破壊が特定の癌化学療法剤に対する癌細胞の感受性に与える影響ならびにイオン化照射の影響について調べている（Fan et al. 1995 & 1997）。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞系またはＨＣＴ１１６大腸癌細胞（両方とも野生型ｐ５３を有する）を、ヒト乳頭腫ウイルスタイプ−１６のＥ６遺伝子（ＭＣＦ−７／Ｅ６またはＨＣＴ１１６／Ｅ６）または優性ｐ５３変異体（ＭＣＦ−７／ｍｕ−ｐ５３）でトランスフェクションして野生型ｐ５３の機能を妨害した。クローン原性生存アッセイを用いて野生型ｐ５３機能を阻害したこれらすべてのサブクローンならびにＨＣＴ１１６ ｐ２１−／−細胞は、無傷のｐ５３またはｐ２１機能を有する対応細胞よりも、シスプラチンおよびナイトロジェンマスタードに対して有意に感受性が上昇することが示された。
野生型ｐ５３またはｐ２１の機能が破壊された４種のサブクローンすべては、無傷のｐ５３またはｐ２１の機能を有する対応細胞と比較した場合に、トランスフェクションされたシスプラチンによりダメージを受けたＣＡＴ−リポ−ター遺伝子の修復能が欠損していた。したがって、研究者は、これらの細胞のシスプラチン感受性の上昇は、Ｇ１チェックポイント制御の欠損、ヌクレオチド切断の修復の欠損、あるいはそれら両方によるものであるとした。
Johns Hopkinsのグループと同様、Fanのグループは、イオン化照射をゲノムダメージ剤として用いた場合に、無傷の野生型ｐ５３またはｐ２１機能を有する細胞とそれらの機能を有しない細胞との間のクローン原性生存アッセイにおける有意な相違を見出さなかった。しかしながら、明らかに彼らは、Johns Hopkinsの研究チームにより明らかにされたこのアッセイの短所に気づかなかったのである。
頭部および頸部の癌にかかっている患者から採取した２０種のヒト偏平上皮細胞癌細胞系のｐ５３の状態および放射線照射感受性がServomaa et al. (1996)により調べられた。ｐ５３変異および／または欠失が細胞系のうち１５種において見られた。照射処理から４週間後に評価されたクローン原性生存アッセイを用いて「平均不活性化用量」（ＡＵＣ）が決定された。結果は、変異ｐ５３を有する細胞系またはｐ５３不存在の細胞系については１．８２±０．２４Ｇｙであり、野生型ｐ５３を有する細胞系については２．２３±０．１５Ｇｙであった（Ｐ＜０．０１）。その著者らは、ｐ５３を発現しない細胞系が最も放射線に対して感受性が高いと結論した。
メチルキサンチン誘導体ペントキシフィリンはＧ２チェックポイントの阻害剤であることがわかっている（Russell et al. 1996）。種々の疾患の患者に投与した場合、赤血球柔軟性を増大させる能力（Ciocon et al. 1997）を包含するいくつかの他の特性によってそれは比較的毒性のない化合物である。ペントキシフィリンは、妨害されたｐ５３機能を有するかまたはｐ２１を欠損した癌細胞系の殺傷において、無傷の野生型ｐ５３およびｐ２１を有する対照細胞の感受性を変化させることなくシスプラチンとの相乗作用を示す（Pan et al. 1995）。該薬剤は、野生型ｐ５３の機能を損傷した細胞におけるＧ２チェックポイントの阻害においてさらに効果的であることも見出されている。
【００８２】
Russelら(1996)は、ＨＰＶタイプ１６由来のＥ６遺伝子を導入することによってヒトＡ５４９肺アデノカルシノーマ細胞系におけるｐ５３の機能を不活性化させた。クローン原性生存アッセイを用いて、彼らは、ペントキシフィリンならびに新規メチルキサンチンであるリソフィリンの両方が、対照と比較して、γ線照射に対するＥ６導入癌細胞の感受性を１５倍高めることを見出した。両方の薬剤は、Ｇ２細胞周期停止を誘導する放射線の能力をブロックすることが示されており、リソフィリンはＧ１停止もブロックすることが見出された。
ＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）はプロテインキナーゼＣ阻害剤であり、Ｇ２チェックポイントもブロックする。該化合物は、齧歯類において増殖したヒト腫瘍に対する抗新生物活性を示し、現在癌治療に関して臨床試験中である（Pollack et al. 1996）。Wangら(1996)は、野生型ｐ５３またはＨＰＶ Ｅ６遺伝子を担持する発現ベクターのトランスフェクションにより不活性されたｐ５３を有するＭＣＦ−７乳癌細胞のシスプラチンに対する感受性に影響を及ぼすこの薬剤の能力について試験した。クローン原性生存アッセイおよびＭＴＴアッセイを用いて薬剤感受性を測定したところ、機能的な野生型ｐ５３を有する細胞と比較した場合、無傷の野生型ｐ５３機能を有する細胞におけるＵＣＮ−０１処理により薬剤感受性が著しく高まることが示された。ペントキシフィリンを用いる研究については、ＵＣＮ−０１は、無傷のｐ３５機能を有する細胞よりも、野生型ｐ５３機能が除去されている細胞におけるゲノムのダメージにより誘導されるＧ２停止をずっと効果的にブロックすることが見出された。
同様に、Shaoら(1997)は、ＵＣＮ−０１は、実験操作の結果として野生型ｐ５３機能を欠くＨＣＴ１１６大腸癌細胞系およびＭＣＦ−７乳癌細胞系に対するゲノムダメージ剤の細胞毒性効果を、野生型ｐ５３機能が無傷である細胞に対するよりもずっと効果的に増強することを示した。
カフェインもインビトロにおいてＧ２細胞周期停止をブロックし、ｐ３４ｃｄｃ２キナーゼを活性化することにより作動するように思われる。Yao(1996a)は、カフェイン処理が、放射線照射により誘導されるプログラムされた細胞死に対して野生型ｐ５３機能を欠損した腫瘍細胞を選択的に感受性にすることを示した。かくして、いくつかの癌に関しては、ＯＬ（１）ｐ５３ならびにＧ２チェックポイント阻害剤の使用は、ＯＬ（１）ｐ５３単独使用よりも、慣用的な抗癌剤の有益な効果を大いに増強しうると思われる。
微小管活性薬剤は、典型的にはＧ２停止を引き起こす細胞周期チェックポイントを誘導する。いくつかの研究は、Ｇ２活性薬剤に対する細胞の応答に影響する役割を果たすものとして野生型ｐ５３を位置付けてきた（Fan et al. 1995; Powell et al. 1995; Russell et al. 1995）。これらの知見は、Tishlerら(1995)に、前悪性胚性マウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞系における野生型ｐ５３依存性プロセスを誘導する癌の化学療法剤タクソール、ビンブラスチンおよびノコダゾールの能力を調べさせた。３種の微小管活性薬剤はすべてＧ２細胞周期停止を引き起こし、ｐ５３のＤＮＡへの結合を促進した。ビンブラスチンおよびノコダゾールのみがｐ２１転写を促進することを示された。正常ヒト線維芽細胞において、ＨＰＶ Ｅ６遺伝子またはＳＶ４０ Ｔ抗原遺伝子のいずれかを担持する発現ベクターでトランスフェクションすることにより野生型ｐ５３機能が破壊された。線維芽細胞が正常およびｐ５３ノックアウトマウスからも採取された。いずれのタイプに由来する細胞にいても損傷を受けたｐ５３機能は、対照と比較してタクソールの細胞毒性の７〜１０倍の増加と相関関係があった。タクソールは、細胞のｐ５３の状態とは無関係にプログラムされた細胞死を誘導することにより細胞を殺すことが示されている。タクソール処理で生き残った無傷のｐ５３を有する細胞はｐ２１のレベル増加を示し、細胞周期停止に至った。
【００８３】
ゲノムのダメージに応答して、ｐ２１以外に野生型ｐ５３は、ＰＣＮＡに対する阻害効果により細胞周期チェックポイントを誘導する機能を果たす第２の遺伝子ＧＡＤＤ４５を誘導する。Smithら(1996)は、アンチセンスベクターでトランスフェクションすることにより、野生型ｐ５３を発現するＲＫＯヒト大腸癌細胞系におけるＧＡＤＤ４５の発現をブロックした。ＧＡＤＤ４５レベルを低下させることは、ＵＶ照射の殺傷効果およびシスプラチン処理に対して癌細胞を感受性にした。さらに、ＧＡＤＤ４５が抑制された細胞は、ＵＶによりダメージを受けたリポータープラスミドおよび無計画な（unscheduled）ＤＮＡ合成実験により判定した場合、ＤＮＡダメージを修復する能力の低下を示した。野生型ｐ５３機能を破壊する種々の遺伝子を担持する発現ベクターもＲＫＯ細胞中にトランスフェクションされた。ｐ５３機能の抑制は、ＧＡＤＤ４５発現抑制と同じ効果を有していた。
通常にはｐ２１細胞周期チェックポイントと同じ誘導効果を発揮しうる、ｐ５３により調節される少なくとも１種の付加的な遺伝子ＧＡＤＤ４５の存在は、ゲノムにダメージを与える薬剤によるチェックポイントの誘導をブロックするための標的として、ｐ５３をｐ２１よりも良好な標的とした。
【００８４】
本発明によれば、ＯＬ（１）ｐ５３のごときｐ５３オリゴおよび／またはＵＣＮ−０１、ｐ２１オリゴもしくはｐ２７オリゴのごとき他の細胞周期チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用される、慣用的なモノクローナル抗体または好ましくは本発明により得られる触媒性抗体のごときＥＧＦＲまたはＨＥＲ２の阻害剤は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２を発現する癌腫の治療のための慣用的な化学療法剤と組み合わせた使用に特に適するであろう。
Mendelsohnおよびその共同研究者は、例えば、モノクローナル抗体でのＥＧＦＲ機能のブロックは、ｐ５３およびｐ２１またはｐ２７／ＫＩＰＩの発現増加を引き起こし、細胞周期チェックポイントの誘導を引き起こす（Wu et al. 1996; Peng et al., 1996）。ＥＧＦＲ阻害剤とオリゴヌクレオチドまたは触媒性抗体のごときｐ５３、ｐ２１またはｐ２７阻害剤との組み合わせ使用は、特に、ゲノムのダメージを引き起こす可能性のある慣用的な癌治療薬と組み合わせて使用した場合に細胞周期停止を防止し、ＥＧＦＲ阻害剤の抗癌効果を増強するであろう。
さらに、ＯＬ（１）ｐ５３のごときｐ５３オリゴの使用は他のＥＧＦＲ阻害剤の阻害効果を促進するであろう。なぜなら、ｐ５３はＥＧＦＲ遺伝子を転写的に活性化させるからである（Ludes-Meyers et al., 1996; Sheikh et al., 1997）。
【００８５】
（Ｃ）ＥＧＦＲ触媒性抗体およびＯＬ（１）ｐ５３を用いる患者の組み合わせ治療
治療スケジュールは以下の局面を包含する：（１）癌細胞の試料を採取して、ｐ５３遺伝子の変異状態を調べる。（２）患者に０．１ｍｇ／ｋｇ／時のオリゴを約５日かけて輸液し、次いで、抗体のターンオーバー速度に応じてＥＧＦＲ触媒性抗体のボーラス注射を１〜５０ｍｇの範囲の用量で静脈注射する。（３）オリゴ輸液開始から２４時間後に慣用的な化学療法を開始する。選択した化学療法剤（複数も可）はＯＬ（１）ｐ５３に結合せず、ゲノムのダメージを引き起こすことのできるものである。この用途に適したオリゴは米国特許第５６５４４１５号に記載されており、その開示を参照により本明細書に記載されているものとみなす。
【００８６】
（実施例ＩＩ）
ＨＩＶに対するワクチン投与における触媒性抗体
モデルＢ細胞エピトープおよびｇｐ１２０由来のＴヘルパーエピトープから構成されるエイズの治療において有用なワクチン組成物をここに記載する。触媒性Ａｂｓを誘発するようにＢ細胞エピトープのＣＲＡＡｓを設計する。典型的なＢ細胞エピトープをＣＤ４結合部位から誘導し、一般的にはＣＤ４結合部位は異なるＨＩＶ−１株において保存されている。ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位は適当な標的であり、さらに、多くの他のエピトープとは異なっているので、それは天然のウイルス表面上のＡｂｓに近接可能である（３１）。ＣＤ４結合部位がコンホーメーション決定基であることが知られている。
本発明において、ＣＤ４結合部位の特異的部分（ＣＤ４結合部位全体に対するものとして）を認識する触媒性Ａｂの調製を説明する。触媒性Ａｂｓに適する標的となりうるｇｐ１２０（または他のＨＩＶ蛋白）中のさらなるペプチドエピトープも同定される。ｇｐ１２０の開裂は生物学的活性の損失を伴った蛋白コンホーメーションの全体的な変化を引き起こすので、ある種のｇｐ１２０ペプチドエピトープは、それらがＨＩＶ−１の宿主細胞への結合またはＨＩＶ−１と細胞内成分との相互作用に直接関与するものでない場合であっても、触媒性Ａｂｓの適当な標的となりうる。これらのおよび他の標的も本発明の範囲内のものである。
【００８７】
Ａｂ合成に対するＴ細胞の助けは、ＭＨＣの多型性ゆえに、異なる個体における拘束に対する潜在的問題である。本発明において、十分に明らかにされた遺伝学的背景を有するマウス株を、Ｂ−Ｔエピトープ抱合体に対する応答における触媒性免疫の誘発に関するモデルとして使用する。種々のＭＨＣクラスＩＩアリールにより不規則に認識される「普遍的」Ｔ−ヘルパーエピトープを使用する。このアプローチのもう１つの利益は、それがヒトの臨床試験に容易に適用できることである。
ＨＩＶ−１のエンベロープ糖蛋白は１本鎖の１６０ｋＤ前駆体ｇｐ１６０として合成される。この蛋白は細胞のプロテアーゼによりＡｒｇ５１１−Ａｌａ５１２において開裂され、ｇｐ１２０および膜内在蛋白ｐｇ４１を生じる。ｇｐ１２０の生物学的活性は、ＨＩＶ−１により宿主細胞への最初の結合、ウイルス増殖、ならびに未感染のニューロンおよび他の細胞に対する毒性効果において重要な成分である。宿主細胞上のＣＤ４受容体へのｇｐ１２０のコンホーメーションエピトープの結合はＨＩＶ感染の第１段階である。このエピトープを構成している個々のアミノ酸は、第２（Ｃ２）、第３（Ｃ３）、および第４（Ｃ４）の保存されたｇｐ１２０セグメント中に存在すると思われる（１２）。これらはｇｐ１２０の残基２５６、２５７、３６８〜３７０、４２１〜４２７および４５７である。図７参照。ＣＤ４結合部位に結合するモノクローナル抗体が記載されている（３２）。ＣＤ４結合部位はコンホーメーションエピトープなので、自らエピトープを構築しない離れた残基がＣＤ４への結合能維持に重要である。
ｇｐ１２０と他の宿主細胞蛋白との相互作用もウイルス増殖に必要である。例えば、カルモジュリンアンタゴニストの阻害効果により明らかなように、カルモジュリンによるｇｐ１２０への結合はＨＩＶ−１感染性に関与している可能性がある。ｇｐ１２０のＶ１およびＶ２領域の間に存在するＡｓｐ１８０はウイルス複製にとり重要である（３３）。同様に、Ｖ３ループは感染性に必須であるかもしれない（３４）。それゆえ、ＣＤ４結合部位を構築するもの以外のｇｐ１２０中の構造決定基はウイルスゲノム複製、コート蛋白合成、およびウイルス粒子パッケージングに必要である。
【００８８】
ｇｐ１２０のトリプシン処理はその神経毒性効果をブロックする。ＨＩＶ−１粒子をトリプシン処理すると、肥満細胞トリプターゼまたは因子Ｘａはその感染性を弱める。残基２６９〜２７０または４３２〜４３３におけるｇｐ１２０の開裂はＣＤ４結合能をなくすが、残基６４〜６５、１４４〜１４５、１６６〜１６７、１７２〜１７３または３１５〜３１６における開裂はＣＤ４結合に影響しない（３５）。一方、ｇｐ１２０のＶ３ループ中にあるＡｒｇ３１５〜Ａｌａ３１６ペプチド結合の細胞プロテアーゼによる開裂は増殖性ウイルス感染に必須と考えられている。宿主細胞表面上に発現されるジペプチジルペプチダーゼ（ＣＤ２６）は、Ａｒｇ３１５〜Ａｌａ３１６における開裂の原因であると提案されている。この開裂部位は主要中和決定基（ＰＮＤ）中に存在し、ＰＮＤはｇｐ１２０のＶ３ループの成分であり、それに対して防御的Ａｂｓが容易に合成される。ＰＮＤへのＡｂの結合は宿主細胞プロテアーゼによるｇｐ１２０の開裂をブロックし、ＨＩＶの中和を引き起こすと仮定された。ＰＮＤがＣＤ４によるＨＩＶ結合において直接的役割を果たしているという証拠はないが、ＨＩＶ共受容体による結合における関与が示唆されている。
【００８９】
Ｂ細胞による効果的なＡｂ合成は、一部には、Ｔ細胞動員に依存しており、それが一旦合成されると、Ｔ細胞は必要な刺激性サイトカインを分泌し、Ｔヘルパー細胞上のＣＤ４およびＢ細胞上のＢ７のごときアクセサリー分子により媒介される直接的接触によりＢ細胞を活性化させる。Ａｇ特異的Ｔ細胞の動員は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したプロセッシングされたＡｇエピトープからなる複合体のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識によって起こる。
Ｔ細胞エピトープをＢ細胞エピトープ（これに対して宿主がＡｂｓを合成する）に共有結合させることによりペプチドをベースにしたワクチンを処方する。Ｔエピトープは抗原提示細胞表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、次いで、Ｂ−ＴエピトープからなるＭＨＣクラスＩＩ複合体はＴＣＲに結合する。遠縁交配種中の異なる個体は異なるＭＨＣクラスＩＩアリールを発現し、該アリールはＴ細胞へのＡｇ提示に関与する（Ｉ−ＥおよびＩ−Ｋ座）。理想的には、ペプチドワクチンはＭＨＣ拘束のないものであり、すなわち、Ａｇ提示に関与するＭＨＣクラスＩＩのバリエーションにかかわらず強力なＡｂ応答が生じなければならない。
ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＴＣＲおよびＡｇエピトープ間の相互作用は全く不規則なものである。かくして、ある種のペプチドは普遍的なＴエピトープとして役立ち、すなわち、これらのペプチドは異なるＭＨＣクラスＩＩアリールに効率よく結合しうる。さらに、異なるタイプのＴＣＲｓのレベルでのペプチドの認識に対する明らかな制限はない。かかるペプチドは、本明細書に記載したように防御的Ａｂ応答の誘発によりＨＩＶを中和するように設計されたワクチン中の適当なＴエピトープ成分である。
【００９０】
すでに述べたように、ある種のＡｂｓは蛋白抗原中のペプチド結合に結合し、かつこれを開裂する。最近の研究は、Ｌ鎖のＶドメインコードするある種の生殖細胞系遺伝子はこの触媒活性を発現する能力があることを示唆している。免疫されていないヒトおよび動物におけるかなり非特異的なペプチダーゼ活性（多反応性活性と称す）を有するＡｂｓおよびＬ鎖が記載されている（３６）。さらに、突然変異法により同定されたＶＩＰａｓｅ Ｌ鎖の触媒残基は生殖細胞系ＶＬ遺伝子によりコードされている。ペプチド抗原での免疫後に起こるＡｂｓの体細胞系での多様化の過程においてペプチダーゼ活性を改善してもよい。高レベルの触媒効率を有するある種のＶＩＰａｓｅ Ｌ鎖は、その生殖細胞系対応遺伝子と比較して非常に変異していることが観察された（１４）。適当なＶＨドメインを触媒性ＶＬドメインに対合させることは触媒効率を改善すると記載されている（２８）。さらに、自己免疫性疾患を有する患者から単離されたポリクローナル触媒性Ａｂｓはその自己抗原に対して高い親和性を示し（１、４、５）、そのことは、Ａｂｓが体細胞突然変異およびクローン選択に付されたという古典的な兆候である。
自己免疫性疾患における触媒性Ａｂｓの存在は触媒合成への遺伝学的素因によるものである可能性があり、該素因は、特定の生殖細胞系Ｖ遺伝子の発現あるいはＡｂ Ｖドメインの体細胞での配列多様化の間の触媒部位の形成増加により生じる。自己免疫性疾患は異なるＶ遺伝子の異なった使用に関連しているという観察結果は文献において十分に確証されている。Ａｂ発現に関連する他の遺伝子は自己免疫性疾患における触媒活性レベルに関与している可能性がある。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは良好な触媒性Ａｂ生産者であることが知られている（７）。このマウス株において、Ｆａｓアポトーシス遺伝子の変異はＴおよびＢ細胞の増殖および狼そう様疾病の発症を可能にすると考えられている。
【００９１】
ｇｐ１２０に対する特異性と迅速なペプチド結合開裂活性とを合わせ持つＡｂｓの合成を誘導できる適当な構造を免疫原に取り入れることにより、エイズの治療用の免疫療法剤が得られるであろう。
チログロブリンに対する自己抗体の触媒活性および合成プロテアーゼ基質を開裂しうる種々のＬ鎖の触媒活性は、活性化セリン残基と反応して共有結合するジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）により阻害される。図８および９参照。
ＶＩＰに対する触媒性Ａｂｓは、構造的および機能的に触媒サブサイトとは異なる高親和性抗原結合サブサイトを含む。抗ＶＩＰ Ｌ鎖において、化学的開裂に関与する残基（Ｓｅｒ２７ａ、Ｈｉｓ９３）における突然変異はターンオーバー（ｋcat）を減少させるが、Ｋmの変化は最小であり、遷移状態の安定性に関与する残基は基質の基底状態の認識には関与しないことが示唆される。触媒サブサイトから空間的に離れた残基における突然変異は基質基底状態への結合を抑制し（Ｋmの増加）、しかも予想されたようにターンオーバーを増加させる。それゆえ、最初の高親和性結合および化学的開裂段階に関与する残基は同じではないと結論できる。
【００９２】
遷移状態アナログ（ＴＳＡｓ）に対する抗体ならびに共有結合反応性抗原アナログ（ＣＲＡＡｓ）
ＴＳＡｓでの免疫（３７、１３、３８）が遷移状態に結合するＡｂｓを誘導し、かくして、反応の活性化エネルギー障壁を低下させるための手段として提案された。上記のごとく、通常使用されるホスホン酸アナログは四面体リン原子およびリンに結合した負に帯電した酸素原子を含む。ペプチド結合開裂の遷移状態の形成は、開裂におかる三角形の炭素原子の四面体構造への変換、ならびにカルボニル基の酸素による負電荷の獲得を包含すると考えられている。それゆえ、ホスホン酸ＴＳＡｓは、オキシアニオン構造および遷移状態の四面体立体配置に結合しうるＡｂｓの合成を誘導する。しかしながら、これらのＴＳＡｓに対するＡｂｓは比較的望ましくないアシル転移反応を加速するが、ペプチド結合の開裂を触媒することは報告されていない。次亜リン酸ＴＳＡに対する抗体が安定な第１級アミドをゆっくりと開裂することが最近報告された（１１）。抗次亜リン酸Ａｂは、より通常の抗ホスホン酸Ａｂｓよりも、プロトンを切断可能な結合におけるアミド窒素にうまく転移させる可能性があり、そのことはおそらく次亜リン酸Ａｂｓの良好な触媒活性を説明するものとなるだろう。
【００９３】
この実施例において、我々のＣＲＡＡの設計は以下の仮説に基づいて決定された：（ａ）酵素におけるのと同様に、Ａｂｓによる触媒は、ペプチド結合の開裂を触媒するためには化学的に活性化されたアミノ酸の関与を必要とする。（例えば、セリンプロテアーゼ中のＳｅｒのヒドロキシル基は、Ｓｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｐ残基間の分子内で水素結合したネットワークの形成により、求核的性質ならびに共有結合的触媒を媒介する能力を獲得する。）；ならびに（ｂ）触媒により複数の構造エレメントが認識されて、効果的な遷移状態の安定化が達成される。ホスホン酸ＴＳＡ構造のみでは触媒性Ａｂｓを誘導するための免疫原としては不完全であると思われる。なぜなら、この構造は求核性触媒部位、あるいはＳ１隣接残基認識部位に関与する触媒中の部位への結合に必要なエレメントを含んでいないためである。本発明の抗原アナログは、共有結合して触媒する能力ならびに塩基性隣接残基および四面体反応中心を認識する能力を有するＡｂｓの合成を誘導する。生殖細胞系によりコードされるＡｂｓ中のセリンプロテアーゼ部位に結合するように設計されたＣＲＡＡｓにより誘導される上記タイプの触媒性Ａｂｓの合成をここに説明する。触媒性Ａｂｓ中の求核性セリン残基と反応しうる求電子性ＣＲＡＡｓを調製する。これらの新規ＣＲＡＡｓを免疫原として用いてｇｐ１２０特異的Ａｂｓの合成のためにセリンプロテアーゼ部位の使用を促進させる。上記ＣＲＡＡｓでの免疫は、生殖細胞系によりコードされた触媒部位を発現するＢ細胞のクローン選択を促進する。さらに、ＣＲＡＡ構造に隣接したｇｐ１２０の適当な抗原性エピトープを導入することによりｐｇ１２０に対する特異性を確かなものとする。図１０参照。
【００９４】
慣用的なホスホン酸ＴＳＡ構造はそれ自体では不十分な免疫原であるにせよ、有用でありうることに注目すべきである。ホスホン酸ＴＳＡ中のＰ１部位における塩基性残基の導入は触媒性Ａｂの合成の誘導を促進する可能性がある。なぜなら、隣接残基の認識と連動して遷移状態における反応中心の安定化が起こりうるからである。さらに、ホスホン酸エステルＣＲＡＡでの免疫の後にホスホン酸ＴＳＡでの免疫が行われる非対応免疫により、共有結合触媒部位ならびにオキシアニオン安定化部位の発生が可能となる。これらの機能を合わせ持つＡｂ部位は、上記機能を１つだけ用いるＡｂ部位よりも触媒として強力であろう。したがって、ＴＳＡｓおよびＣＲＡＡｓを患者に共投与することは本発明の範囲内と考えられる。
【００９５】
自己免疫性疾患は強力な抗原特異的触媒性Ａｂｓの産生に関連している。ｇｐ１２０に結合（３９）し、これを開裂しうるＡｂｓが狼そう患者において同定されている。さらに、狼そう傾向マウス（ＭＲＬ／ｌｐｒ株）から単離されたＬ鎖はｇｐ１２０を開裂させる。
１７人のＨＩＶ−１陽性患者および１０人の狼そう患者からプロテインＧ−セファロースアフィニティークロマトグラフィー（４１）により精製されたＩｇＧ試料を125Ｉ−ｇｐ１２０開裂能に関して分析した。電気泳動的に純粋なｇｐ１２０（IIIB, AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH）の放射性標識をクロラミン−Ｔ法により行い、次いで、ゲル濾過により125Ｉ−ｇｐ１２０を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより１２０ｋＤの放射性標識されたｇｐ１２０の単一バンドが観察された。１７個のＨＩＶ−１陽性ＩｇＧ試料のうち１６個はｇｐ１２０開裂活性を欠いており、１個はかろうじて検出できる活性を示した。一方、１０個の狼そう試料のうち３個は容易に検出できるｇｐ１２０開裂を示した。図１１参照。ＩｇＧ試料によっては125Ｉ−アルブミンの加水分解は明らかでなく、観察されたｇｐ１２０の加水分解は非特異的現象ではないことが示唆された。別の実験において、ｇｐ１２０開裂性狼そうＩｇＧ試料の１つおよびＭＲＬ／ｌｐｒマウスの設計ＩｇＧからＬ鎖を精製した。ヒトモノクローナルおよびポリクローナルＩｇＧからのＶＩＰ開裂性Ｌ鎖の単離に関して以前記載されたプロトコール（９、２８）を用いて、ＩｇＧの還元およびアルキル化、次いで、ＦＰＬＣゲル濾過を行うことにより精製を行った。狼そう患者およびＭＲＬ／ｌｐｒマウスの両方に由来するＬ鎖ピークに対応するフラクション中で125Ｉ−ｇｐ１２０開裂活性が明らかであった（２５ｋＤ）。ＦＰＬＣカラムから回収されたＬ鎖の同一性を、すでに記載されたように（２８）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによって確認した。ＨＩＶ−１陽性ＩｇＧおよびＢＡＬＢ／ｃ ＩｇＧ由来の類似のＬ鎖フラクションはｇｐ１２０開裂活性を示さなかった。狼そうＬ鎖、ＭＲＬ／ｌｐｒ Ｌ鎖およびトリプシンによる125Ｉ−ｇｐ１２０開裂の比活性（無傷のｇｐ１２０バンド領域の減少として示す、便宜上の単位／ｎＭ触媒／インキュベーション時間（時））はそれぞれ３１、３０７および２０４であった。おそらく触媒の下位集団はＬ鎖の小集団を構成し、触媒性Ｌ鎖の真の比活性は上記の値よりも大きいはずである。
セリンプロテアーゼ阻害剤（０．３ｍＭジイソプロピルフルオロホスフェート）の存在下において、狼そう患者由来のＩｇＧによるｇｐ１２０の開裂は本質的に完全に阻害された（図１２Ａ）。一方、金属プロテアーゼ、システインプロテアーゼおよび酸性プロテアーゼの阻害剤（ＥＤＴＡ、ヨードアセトアミド、ペプスタチンＡ）は反応に影響しなかった。
Ｌ鎖により触媒されるｇｐ１２０の開裂に関する証明は、この活性を有するモノクローナルＬ鎖の同定からも得られる。多発性ミエローマを有する患者から精製した２９種のモノクローナルＬ鎖、これらのＬ鎖の３種の組み換えＶＬドメイン、ＶＩＰ加水分解活性を有する１個の組み換えＬ鎖（１０）ならびにポリクローナル抗ＶＩＰ Ａｂｓ（２）を125Ｉ−ｇｐ１２０の加水分解能に関してスクリーニングした。多発性ミエローマ患者由来のｇｐ１２０加水分解活性を有する１個のモノクローナルＬ鎖が同定された（Ｌａｙ２）。残りのＡｂ試料は活性を欠いていた。ｇｐ１２０加水分解活性がＬ鎖蛋白ピークとともにゲル濾過カラムから溶離した。生理学的バッファー中および栄養培地中（ＰＢＳ、ＨＢＳＳおよびＲＰＭＩ１６４０）においてＬａｙ２によるほとんど同等のｇｐ１２０開裂が観察された。約８０ｋＤａ、５０ｋＤ付近のしみ、２０ｋＤおよび６ｋＤ未満の４種の放射性標識ｇｐ１２０開裂生成物が非還元的電気泳動により明らかとなった。８０ｋＤのバンドは還元条件下でさらにサイズが小さくなり、それがジスルフィド結合したフラグメントを含んでいたことが示唆された。ＨＩＶ−１株ＩＩＩＢ、ＳＦ２およびＭＮに由来する125Ｉ−ｇｐ１２０調合物を用いて同じ生成物プロファイルが観察された（図１２Ｂ）。狼そうＩｇＧと同様、Ｌ鎖の活性はセリンプロテアーゼ阻害剤ＤＦＰにより阻害されたが、他のタイプのプロテアーゼの阻害剤によっては阻害されなかった。
開裂反応がｇｐ１２０の放射性ヨウ素化による人為的なものでないことを確認するために、未標識蛋白の開裂を調べた（図１３）。蛋白の分解産物を認識するために以前記載された還元的ＳＤＳ−電気泳動ゲルおよび抗ｇｐ１２０抗体を用いるイムノブロッティング（３５）により開裂生成物を確認した。１２０ｋＤのバンドの強度低下により評価したところ、Ｌ鎖濃度上昇に伴うｇｐ１２０の加水分解増加が明らかであった。このことは８０ｋＤおよび他の開裂生成物の蓄積増加を伴っていた。還元的条件下で分析した未標識ｇｐ１２０および放射性標識ｇｐ１２０の開裂プロファイルは、個々のバンドの強度が異なること以外は同じであった。おそらく、バンド強度の相違は２つのタイプの基質の検出に使用した方法によるものであろう（イムノブロッティング対Ｔｙｒ残基における125Ｉ−標識後のオーロラジオグラフィー）。
Ｌ鎖濃度を２０ｎＭとしてｇｐ１２０濃度を増加させて（１０〜３００ｎＭ）測定した開裂反応の初速度は飽和しうるものであった（見かけのＫｍ値３０ｎＭ；Ｖｍａｘ０．０６ｎｍｏｌ ｇｐ１２０／ｎｍｏｌ Ｌａｙ２／時）。ｎＭのＫｍ値は比較的高いアフィニティー結合を示唆する。平行して分析したトリプシンにより触媒されるｇｐ１２０の開裂は１μＭまでの濃度においては飽和せず、低いアフィニティー認識が示唆された。ＶＩＰはＬ鎖による125Ｉ−ｇｐ１２０の開裂を阻害した（ＶＩＰのＫｉは６２０ｎＭ）。Ｌａｙ２ Ｌ鎖も放射性標識ＶＩＰを加水分解し、Ｋｍは１４４ｎＭであった（４０）。よって、ＶＩＰはｇｐ１２０よりも約５〜２１倍弱くＬ鎖に結合すると思われる。ｇｐ１２０とＶＩＰとの間に２個の短い相同領域が確認され、両方のポリペプチドの触媒反応性の基礎である可能性がある。
【００９６】
ＨＩＶ感染に対して防御能を有する特異的かつ有効な触媒性Ａｂｓの合成を誘発するペプチドアナログ処方の合成方法を提供する。初期の研究は、生殖細胞系によりコードされるＡｂｓの多反応性触媒活性がｇｐ１２０ペプチドのセリン反応性ＣＲＡＡでマウスを免疫することにより動員され改善されうることを示唆した。触媒Ａｂ応答の誘発は、非触媒性Ａｂの応答の誘発よりもＨＩＶ−１感染に対して優れた防御を提供するはずである。
【００９７】
下記の合成免疫原を調製し、評価する：
（Ａ）合成免疫原
（ａ）破傷風トキソイド（残基８３０〜８４４）由来のＴヘルパーエピトープに抱合したｇｐ１２０（残基４２１〜４３６）のＢ細胞エピトープ［Ｂ−Ｔエピトープと命名］からなるホスホン酸遷移状態アナログ（ＴＳＡ）
（ｂ）Ｂ−Ｔエピトープのホスホン酸エステルＣＲＡＡ；および
（ｃ）Ｂ−Ｔエピトープの未修飾ペプチド形態
（Ｂ）（Ａ）の３種の免疫原での非自己免疫マウス（Ｂ１０．ＢＲ株）および自己免疫マウス（ＭＲＬ／ｌｐｒ）の免疫ならびに血清から精製されたＩｇＧの下記活性に関する研究：
（ａ）ホスホン酸Ｂ−Ｔエピトープ、ホスホン酸エステルＢ−Ｔエピトープおよび未修飾Ｂ−Ｔエピトープの結合および開裂
（ｂ）モノマー全長ｇｐ１２０の結合および開裂；および
（ｃ）本来の細胞表面結合ｇｐ１２０の結合および開裂
【００９８】
免疫原
ＨＩＶに対する触媒性抗体を誘発しうるプロトタイプのワクチンは下記のものを含有する：１）Ｂ細胞が高アフィニティー抗体を産生しうるエピトープ（Ｂエピトープ）；２）ＭＨＣクラスＩＩ抗原により結合され、Ｔ細胞に提示されるエピトープ（Ｔエピトープ）；および３）ペプチド結合開裂中に形成される遷移状態の構造模倣物であって、遷移状態を安定化し、かくして開裂反応を触媒しうる抗体の合成を引き起こすことを意図された構造模倣物。
【００９９】
Ｂエピトープ成分：触媒を、感染プロセスにおいて重要な役割を果たすｇｐ１２０のエピトープ中に存在するペプチド結合を開裂させるようにすることにより、ｇｐ１２０開裂後の感染性を失わせることができる。生物学的に重要な決定基から離れた結合におけるｇｐ１２０の開裂もまたｇｐ１２０の機能を失わせる可能性がある。なぜなら、ｇｐ１２０フラグメントのコンホーメーションが元の蛋白から「全体的に」変化する可能性があるからである。Ａｂを、中和Ａｂｓの既知標的であるエピトープを認識させるようにすることにより、ウイルス感染性に対する中和可能性を増大させることができる。ＣＤ４結合部位の開裂は、以下の理由によりＨＩＶの中和を行うための魅力的な機構である：ＣＤ４−ｇｐ１２０結合はＨＩＶの宿主への侵入に必須の工程である；トリプシンによる４３２〜４３３結合におけるＣＤ４結合の開裂はｇｐ１２０のＣＤ４への結合能をブロックすることが知られている；ＣＤ４結合部位に対するＡｂｓはＨＩＶ感染を抑制することが知られている；ＨＩＶ表面上に発現される本来のｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位は環境に対して露出している（本来のｇｐ１２０中に埋まっているいくつかの他のモノマーエピトープとは異なる）（３２）；さらに、ＣＤ４結合部位はＨＩＶ−１の異なるサブタイプにおいて完全に保存されている。ｇｐ１２０の残基４２１〜４３６から構成される直鎖状ペプチド配列（ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡ；図１０）を、本プロジェクトにおける免疫原のＢエピトープ成分として選択した。突然変異の研究により、ｇｐ１２０のこの領域がＣＤ４結合に重要な貢献をすることが示された。
【０１００】
遷移状態アナログ成分および共有結合反応性抗原アナログ成分：遷移状態が基底状態よりも多く確立された場合に、触媒が生じる。本発明において、抗原アナログは触媒機能を動員するように作用するが、一方では、抗原の基底状態に結合するＡｂｓの能力を保持している。後者の特性は、種々のポリペプチドを非特異的に開裂するＡｂｓとは対照的なｇｐ１２０特異的触媒を得るのに必要である。標的ペプチドに隣接したｇｐ１２０ペプチド配列の導入はｇｐ１２０に対する特異性を付与するであろう。セリンプロテアーゼ様触媒性Ａｂｓによるペプチド結合開裂の遷移状態の安定化に関与する重要な構造上の特色は：図１４に示されており、下記のものを包含しうる：（ａ）切断可能なペプチド結合における遷移状態中に形成された四面体求電子性炭素原子；（ｂ）この炭素において形成されるオキシアニオン構造であって、触媒中のＡｓｎ、ＧｌｎまたはＡｒｇのような残基とのイオン対形成により安定化される構造（いわゆるオキシアニオンホール）；および（ｃ）切断可能なペプチド結合のＮ末端側の塩基性残基であって、Ａｂｓの触媒部位中または触媒部位に近接したところに存在するＡｓｐまたはＧｌｕのごとき酸性残基とのイオン対形成により認識されうる塩基性残基。隣接残基の正に帯電した側鎖は触媒反応中に結合形成および結合破壊プロセスにに直接関与しないが、遷移状態において基底状態とは異なった空間的位置を占める可能性があることに注意。切断可能なペプチド結合の部分的に二重結合的な特性が遷移状態の形成により失われ、この結合の周囲における回転が可能となり、その結果離れた基の位置が変化するので、このことが可能となる。遷移状態におけるかかる離れた場所での空間的変化が起こる可能性は、切断可能な結合におけるｓｐ２（基底状態）およびｓｐ３（遷移状態）立体配置におけるペプチド基質のコンピューターモデリングにより推量される。
ホスホン酸アナログおよびホスホン酸エステルアナログを含むＴＳＡおよびＣＲＡＡをそれぞれ評価する。いずれの場合においても、四面体リン原子がｇｐ１２０中の残基４３２と４３３を連結している切断可能ペプチド結合炭素原子のアナログとして役立つ。図１０に示すフェニルエステ立体配置において、リン原子は部分的に正電荷を獲得し、それはちょうど切断可能な結合の炭素原子が求核性セリン残基との反応に必要な部分的に正の電荷を担持するのと同じである。ペプチドのＯ−フェニルホスホネートは、活性部位のセリン残基の酸素原子と共有結合を形成することにより種々のセリンプロテアーゼを不可逆的に不活性化させうることがすでに記載されている（２９）。SampsonおよびBartlettならびに他の研究者（２３、２４）は、リン原子においてフェニルエステルを作成し、ホスホン酸エステルに隣接するペプチド配列を結合させるのに必要な化学合成を確立した。
１２個および４個のアミノ酸がＴＳＡ／ＣＲＡＡ構造のそれぞれＮ末端側およびＣ末端側に存在し、ｇｐ１２０の残基４２１〜４３６の配列に対応している。塩基性残基がＣＲＡＡ−ｇｐ１２０のＰ１位置に導入され、生殖細胞系によりコードされる塩基性残基に特異的なＡｂｓ中の触媒部位の存在が利用された。塩基性残基の存在は、ホスホン酸フェニルエステル構造とともに、触媒部位への固い結合を促進し、かくして、触媒部位を合成するＢ細胞のクローン増殖を選択的に刺激するＣＲＡＡ−ｇｐ１２０の能力を促進する。
上記のＢエピトープのホスホン酸エステルＣＲＡＡは、エステラーゼＡｂｓを生成させるために用いられた以前のホスホン酸ＴＳＡｓ（１３、３８）とは構造的に異なることに注意すべきである。慣用的なホスホン酸ＴＳＡｓは、触媒中に見出されるオキシアニオンホールに結合しうる、リンに結合したアニオン性酸素を含む。しかしながら、ホスホン酸ＴＳＡｓは触媒部位中の求核性セリン残基と反応しない。Ｐｈｅ−Ｉｌｅペプチド結合からなるホスホン酸ＴＳＡｓはアミダーゼ触媒性Ａｂの生成を誘導しなかったことが報告されている（４１）。
以下の理由により、上記ホスホン酸エステルアナログをＢエピトープのホスホン酸ＴＳＡと比較する：（ａ）上記研究に記載された免疫原はＰ１位置に塩基性残基を含まず、そのことはペプチダーゼＡｂｓの合成のための生殖細胞系触媒の動員に対抗するものである；および（ｂ）ホスホン酸アナログのみでの免疫がペプチダーゼＡｂの合成を引き起こすには不十分であっても、ホスホン酸およびホスホン酸エステルアナログでの非対応免疫は良好なペプチダーゼＡｂ応答を引き起こす可能性がある。なぜなら、該非対応免疫はオキシアニオンホール（ホスホン酸免疫の場合）ならびに求核性セリン残基（ホスホン酸エステル免疫の場合）を選択すると考えられるからである。ｇｐ１２０ホスホン酸およびホスホン酸エステル免疫原を用いるかかる同時免疫は本発明の範囲内であると考えられる。
【０１０１】
Ｔエピトープ成分：抗ｇｐ１２０Ａｂｓの合成にＴ細胞の助けを動員するために、破傷風トキシンの残基８３０〜８４４に対応する１５個のアミノ酸ペプチド（QYIKANSKFIGITEL）をＢエピトープのＮ末端側に置く。ワクチン構築物中のＴエピトープの存在は、大きなキャリア蛋白へのＢエピトープの抱合の必要をなくす。以前のいくつかの研究は、ＴおよびＢエピトープを含む比較的短い直鎖状ペプチドがＢエピトープに対するＡｂの効果的な合成を引き起こしうることを示している（４２）。本発明に使用される破傷風トキシンＴエピトープは、多様なクラスＩＩアリールを発現する宿主においてＴエピトープとして役立つことが知られており、それゆえ、「普遍的」Ｔエピトープとして特徴づけられている（４３）。さらに、このＴエピトープに連結されたｇｐ１２０ Ｂエピトープは抗ｇｐ１２０ Ａｂ合成を誘導することが記載されている。Ｔエピトープの「普遍性」はヒトにおける研究から推論されるが、おそらくマウスにも適用できるであろう。なぜなら、クラスＩＩの拘束は系統発生的に保存されているからである。ヒトとマウスではこの点において相違がありうるにもかかわらず、本発明に使用するマウス株は、Ａｂ合成にＴ細胞の助けを動員することに関与するクラスＩＩアリールに合致し（ＡkＥkハプロタイプ）、差異のあるＴヘルパーの動員は触媒性Ａｂの応答の多様性に貢献するかもしれないという問題をなくす。
【０１０２】
免疫原のアッセンブリー：破傷風トキシン残基８３１〜８４４をＮ末端に含み、ｇｐ１２０残基４２１〜４３６をＣ末端に含む３１残基の基底状態Ｂ−Ｔ構築物（未修飾Ｂ−Ｔエピトープ）の合成を、Applied Biosystemsの合成装置による慣用的な固相合成により行う。質量スペクトルならびに1Ｈおよび13ＣＮＭＲを行って構造を確認する。
Ｂ−ＴエピトープのＴＳＡおよびＣＲＡＡはホスホン酸およびホスホン酸エステル構造を標的開裂部位に含む。これらは新規試薬であるが、その合成は本発明の問題ではない。ＴＳＡｓおよび他のタイプの酵素阻害剤の合成に標準的な有機化学的方法がすでに使用されている（２３、２４）。合成スキームの簡単な概説は以下のごとし：リジンの次亜リン酸イソステア（isostere）を次亜リン酸のジフェニルメチルアミン塩および６−ベンジルカルバマトヘキサナールから調製し、次いで、酸中でジフェニルメチル基を除去する。Ｃ末端フラグメントに対応するペプチドがＮ末端リジンのかわりに２−ヒドロキシ−６−カルボベンジルオキシアミノヘキサン酸を含むこと以外は慣用的な固相合成により、必要な隣接ペプチド（ｇｐ１２０残基４２１〜４３１を伴った破傷風トキソイド残基８３０〜８４４；ｇｐ１２０残基４３２〜４３６）を調製する。他の塩基性側鎖をカルボベンジルオキシ基で保護し、酸性側鎖をベンジルエステル基で保護する。古典的な液相ペプチド合成法により、保護されたペプチドを亜燐酸リジンイソステアに結合させる。最終的なペプチドホスホン酸フェニルエステル構造を、亜燐酸とフェノールとの酸化的カップリングにより調製する。アセトニトリル中でのビス（トリメチルシリル）アセトアミド、次いで、水性トリエチルアミン、四塩化炭素での処理、さらにＡＧ−Ｘ−５０イオン交換樹脂でのリチウム交換により亜燐酸をホスホン酸モノエステルに変換することによるホスホン酸の調製にこれと同じ合成スキームを使用する（２３；スキームｈおよびＩ）。質量スペクトルおよびＮＭＲを行って構造を確認する。
【０１０３】
マウスの免疫
４種の免疫原構築物に対するＡｂ応答を調べるために２株のマウス（ＢＲ１０．ＢＲおよびＭＲＬ／ｌｐｒ）を用いて研究する。免疫を以下のようにして行う：
ａ．Ｂ−Ｔエピトープ（破傷風トキシンの残基８３０〜８４４に連結されたｇｐ１２０の残基４２１〜４３６）
ｂ．残基Ｌｙｓ４３２におけるＢ−Ｔエピトープのホスホン酸アナログ（ＴＳＡ）
ｃ．残基Ｌｙｓ４３２におけるＢ−Ｔエピトープのホスホン酸エステルアナログ（ＣＲＡＡ）
ｄ．ホスホン酸エステルアナログ、次いで、ホスホン酸アナログＢ−Ｔエピトープ
慣用的な免疫法を適用してＡｂ合成を誘導する。３回の腹腔内注射および１回の静脈注射により免疫原を投与する（それぞれ約１００μｇのペプチド）。最後の免疫を静脈注射により行う。２種のアジュバント、ＲＩＢＩおよびアラムを試験する。アラムはヒトへの使用が認可されており、本発明において提案されたのと同様のＢ−Ｔエピトープに対するＡｂ合成を引き起こすことがすでに示されている。ＲＩＢＩはフロイントの完全アジュバントの低毒性代替物であり、種々のＡｇｓに対する良好なＡｂ応答を再現性よく生じさせる。免疫スケジュールを行っている間に５つの時点においてマウスの眼窩後方集網から採血して血清を調製する。脾臓細胞を集め、構造−機能の研究を行うためのＦｖファージディスプレイライブラリーを調製するために処理する。２種のアジュバントの分析が有利である。なぜなら、ワクチンに対するＡｂ応答の質および強度はアジュバントにより影響される可能性があり、その影響はアジュバントにより動員されるサイトカインおよびＴＨ下位集団に対するＢ細胞の発達およびクローン選択に対する影響を介するものである（４４）。かくして、各グループ５匹からなる全部で１６グループのマウスを試験する（４種の免疫原ｘ２種のマウス株ｘ２種のアジュバント）。
低アフィニティー、抗原非特異的ペプチダーゼ抗体がすでに免疫前レパートリー（preimmune repertoire）中に存在する。非特異的ペプチダーゼ活性をコードしている生殖細胞系遺伝子がＡｂ合成に動員される場合には、ＣＲＡＡｓでの免疫はｇｐ１２０特異的触媒性Ａｂｓの合成を引き起こすであろう。自己免疫性疾患のヒトおよびマウスはＡｇ特異的触媒性Ａｂｓを豊富に産生するプロデューサーであり、病的な免疫系が触媒部位をコードする生殖細胞系遺伝子を効率よく動員し、免疫応答期間中に触媒部位を成熟させて個々のＡｂｓに対して特異的なものにすることが示唆される。ＭＲＬ／ｌｐｒマウス株は遺伝学的に自己免疫疾患にかかる傾向があり、高レベルの触媒性抗体を産生する能力がすでに観察されている。さらに、免疫前ＭＲＬマウスの血清由来のＬ鎖はｇｐ１２０開裂活性を発現する。よって、開示した免疫原でのＭＲＬ／ｌｐｒマウスの免疫により生成した抗体の部分集合はｇｐ１２０特異的触媒活性を発現すると考えられる。狼そう患者中に見出されるｇｐ１２０結合Ａｂｓが、一部には、開示した免疫原中に含まれるｇｐ１２０Ｂエピトープに指向されていることは重要である（３９）。ＢＲ１０．ＢＲマウス株は自己免疫性疾患の傾向はない。この株から得られる結果は、健康な免疫系においてｇｐ１２０に対する触媒性免疫を刺激する、開示した免疫原の能力を反映するであろう。Ｂ１０．ＢＲマウスおよびＭＲＬ／ｌｐｒマウスはＡｂ合成のＴ細胞の拘束に関与するクラスＩＩ遺伝子座において同じハプロタイプであり（ＡkＥk）、２つの株における触媒性Ａｂ合成の相違はクラスＩＩの拘束によるものではないであろう。
【０１０４】
Ａｂ結合活性
ＣＲＡＡｓに応答して合成されたＡｂｓは、基底状態よりも、ペプチド結合開裂反応の遷移状態によく結合し、触媒を生じさせるはずである。ＣＲＡＡｓ／ＴＳＡｓへのＡｂｓの結合強度はＡｂの触媒活性を予言するものとして役立つであろう。さらに、免疫原中のＢエピトープが免疫原中および全長ｇｐ１２０中においてほぼ同じコンホーメーションで存在するならば、Ａｂｓは全長蛋白にも結合するであろう。結局、エピトープが、ウイルス表面上のオリゴマー形態で存在することが知られている本来のｇｐ１２０中にあるのと同様に露出したものであれば、Ａｂｓはオリゴマーｇｐ１２０構造にも結合するであろう。
【０１０５】
未修飾Ｂ−ＴエピトープおよびＴＳＡ Ｂ−ＴエピトープおよびＣＲＡＡ Ｂ−Ｔエピトープ：３つの形態、すなわち未修飾、ホスホン酸、およびホスホン酸エステル形態のＢ−Ｔエピトープの結合をＥＬＩＳＡにより比較する。固相として未修飾Ｂ−Ｔエピトープ（約５０μｇ／ｍｌ）で被覆したＥＬＩＳＡプレートを用い、可溶性競合物質として未修飾、ホスホン酸およびホスホン酸エステルＢ−Ｔエピトープを用いる競合アッセイにより結合強度の見かけの値を評価する（ＩＣ５０値として）。ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧを用い、次いで、基質（ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素）を添加して結合を測定する。ポリクローナル抗体調合物を調べるので、結合曲線が単純なＳ字型結合曲線から逸脱するかもしれない。それにもかかわらず、個々のリガンドに関するＩＣ５０値はＡｂｓの平均結合アフィニティーの確実なインジケーターとして役立つであろう。
下記の関連性を適用して触媒速度の加速を予想することができる：
Ｋｉ／Ｋｄ＝ｋcat／ｋuncat  ここにＫｉおよびＫｄはそれぞれＴＳＡおよび未修飾Ｂ−Ｔエピトープの平衡解離定数であり、ｋcatおよびｋuncatはそれぞれ触媒された反応および触媒されなかった反応の１次速度定数である。この等式にＩＣ５０値を代入して反応速度の加速を予想することができるが、予想された値はくつかのＡｂｓの活性の平均値である。なぜなら、研究されるＩｇＧ試料は異なるＡｂｓの混合物だからである。結合アッセイをジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）存在下、４℃で行って、ペプチド開裂による結合パラメーターの測定値への影響を最小にする。セリンプロテアーゼ阻害剤として知られるＤＦＰは、以前の研究においてＡｂｓの触媒活性を不均一に阻害することが観察されている。反応温度の低下は触媒反応の速度を低下させるであろう。触媒のアッセイから見積もられるＫｍ値は、結合強度のインジケーターとしてのＩＣ５０の有効性を確認する助けとなることに注意。
液相アッセイを行って、固相上への抗原の「被覆」による親和性効果が結合の評価を誤らせるものでないことを確認する。125Ｉ−放射性標識Ｂ−Ｔエピトープを用いて液相アッセイを行う。すでに記載されているクロラミン−Ｔ法（２）を用いてエピトープの放射性標識を行う。［Ｂ−Ｔエピトープはｇｐ１２０の残基４３５に対応する１個のＴｙｒを含む］  プロテインＧ−セファロースを用いてＡｂ−Ａｇ複合体をトラップし、ガンマ−スペクトロメーターにおいて放射活性をカウントすることにより結合を調べる。上述のごとく、ＴＳＡ／ＣＲＡＡ競合物質の種々の濃度において結合を調べ、未修飾エピトープおよびそのＴＳＡ／ＣＲＡＡの結合強度の評価を可能にする。
【０１０６】
精製ｇｐ１２０および細胞表面に発現されるｇｐ１２０：精製ｇｐ１２０および細胞表面ｇｐ１２０によるＡｂ結合を測定して、標的Ｂエピトープが蛋白の全長オリゴマー形態のＡｂｓに近接可能かどうかを調べる。哺乳動物細胞系により発現される組み換えｇｐ１２０を用いて、蛋白の糖鎖付加パターンがＨＩＶ感染細胞におけるものと類似かどうかを確認する。固相上に被覆されたｇｐ１２０を用いる競合ＥＬＩＳＡを行って、Ａｂｓの見かけの結合強度を調べる。研究すべき競合リガンドは全長ｇｐ１２０ならびに抗体が生起する３つのＢ−Ｔエピトープである（ホスホン酸ＴＳＡ、ホスホン酸エステルＣＲＡＡおよび未修飾Ｂ−Ｔエピトープ）。合成免疫原および全長ｇｐ１２０の相対反応性を競合リガンドのＩＣ５０値（見かけのＫｉ）から見積もる。全長ｇｐ１２０および未修飾Ｂ−Ｔエピトープのほぼ等しいＩＣ５０値は、それら２つの分子において標的Ｂエピトープがほぼ同じコンホーメーションであることを示すものである。漸騰ｇｐ１２０に対するよりもホスホン酸またはホスホン酸エステルに対するＢ−ＴエピトープのＡｂｓの強力な結合は、Ａｂｓが触媒活性を示す可能性があることを示すものである。上記のごとく、放射性標識ｇｐ１２０を用いる液相アッセイを行って、リガンド固定化による結合親和性増加のごときＥＬＩＳＡの人工的要因の不存在を確認する。
Ｈ９ Ｔ細胞系のＨＩＶ−１感染細胞はその表面上にｇｐ１２０を発現する。細胞表面ｇｐ１２０の大部分は付着ウイルス粒子の形態を模倣する。細胞表面ｇｐ１２０はウイルス粒子表面上のｇｐ１２０の凝集状態に類似したオリゴマー状態として存在すると考えられる。よって、細胞表面に発現されたｇｐ１２０とのＡｂ反応は、ウイルス粒子結合ｇｐ１２０を認識するＡｂｓの能力を示すものである。
【０１０７】
本発明において、NIH AIDS Repositoryから得たＨ９細胞を５％ ＣＯ2においてＲＰＭＩ／１０％ ＦＣＳ中で増殖させる。細胞（１０6個／ｍｌ）をＨＩＶ株ＭＮ（AIDS Repository）を含有する培養上清に３７℃で２時間感染させる。洗浄後、細胞を約１週間培養する。丸底９６ウェルプレート中、１ｍＭのＤＦＰの存在下で種々の濃度のＩｇＧ（１ｎＭ〜１μＭ）と適当数の無傷の細胞とを４℃で４〜６時間インキュベーションし、次いで、細胞を洗浄して未結合Ａｂを除去し、ペルオキシダーゼと抱合したウサギ抗マウスＩｇＧとともにインキュベーションし、過酸化水素およびｏ−フェニレンジアミンで反応物を発色させ、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４９０ｎｍにおける光学密度を定量することにより、種々の濃度のＩｇＧ（１ｎＭ〜１μＭ）の結合を調べる。対照は免疫前（preimmune）ＩｇＧおよび細胞表面ｇｐ１２０と反応することが知られているＡｂ（NIH AIDS repositoryから入手可能）を含む。記載されたようにして（４５）抗ｇｐ１２０Ａｂ検出用蛍光第２抗体を用いるフローサイトメトリーによっても細胞へのＡｂ結合を研究することができる。この手順は、Ａｂ会合および解離速度を見積もることにより見かけのＡｂ親和性を調べることを可能にする。
Ｂ−Ｔエピトープ構築物または可溶性全長ｇｐ１２０を細胞に対するＡｂ結合の競合リガンドとして作用させる競合実験を行う。上の段落で説明したのと同様の競合実験において、Ｂ−ＴエピトープのＩＣ５０値によりＢエピトープに対するＡｂ結合の相対強度を推算する。Ａｂｓによるｇｐ１２０の開裂を最小にするために、４℃でインキュベーションを行う。Ａｂ触媒の有効な阻害剤であるジイソプロピルフルオロホスホネートをインキュベーションに用いることもできる。結合反応の終わりに、トリパンブルー排除試験により細胞生存率を評価して、阻害剤（および他の実験条件）が細胞の完全性を破壊しないことを確認する。細胞の完全性の破壊は潜在的にｇｐ１２０のオリゴマー構造を混乱させるからである。
【０１０８】
触媒活性のスクリーニング
プロテインＧ−セファロースによるアフィニティークロマトグラフィーにより血清から精製されたＩｇＧを、未修飾Ｂ−Ｔエピトープを基質として使用して触媒活性に関してスクリーニングする。１０μＭの基質および０．２５μＭのＩｇＧ濃度において１〜２時間インキュベーションして初期スクリーニングアッセイを行う。見かけのターンオーバーは０．１／分と低いが、生成物は約３μＭの濃度（最初の基質濃度の３０％）にまで蓄積するはずである。２１４ｎｍにおいて検出する逆相ＨＰＬＣ（トリフルオロ酢酸／アセトニトリルグラジエント）により反応混合物を分析する。生成物ピーク面積から生成物濃度を計算する。対照は免疫前ＩｇＧを含む。
すべてのＩｇＧ試料を全長ｇｐ１２０の開裂に関してスクリーニングする。125Ｉ−ｇｐ１２０を基質とする。ｇｐ１２０（ＣＨＯ細胞において発現された組み換えＭＮ）の放射性標識をクロラミンＴ法により行い、次いで、分離用ＦＰＬＣを行って電気泳動的に均一な125Ｉ−ｇｐ１２０を得る。ＳＤＳ−電気泳動およびオートラジオグラフィーを用いて生成物バンドを可視化する。迅速な試料の取り扱いを可能にする手順が記載されている。１日で約５０個のＩｇＧ試料を活性につきスクリーニングすることができる。未標識ｇｐ１２０を基質として用いて、開裂反応が放射性標識工程に関連した人為的なものでないことを確認する。反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの抗ｇｐ１２０Ａｂに対するイムノブロッティングはｇｐ１２０の種々の蛋白分解フラグメントを認識することができるので、この目的に適用する。
触媒として使用するＩｇＧの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認する。変性条件下（６Ｍ塩化グアニジニウム）でのゲル濾過により調製したＦａｂフラクションおよびＩｇＧの保持活性により、すでに説明されているように（３６）触媒活性がＡｂｓによるものであることが確認される。
ヒト血清不存在下および存在下でアッセイを行って、血清中に見出されるプロテアーゼ阻害剤が触媒性Ａｂの活性に影響するかどうかを評価する。予備実験において、血清は狼そう血清から単離されたＡｂｓによるｇｐ１２０またはチログロブリン開裂に影響しないことがわかった。これらの結果に基づけば、血清阻害剤耐性Ａｂｓもマウス中に存在するはずである。
【０１０９】
開裂部位特異性：未修飾Ｂ−Ｔエピトープおよび全長ｇｐ１２０の開裂により生じたフラグメントを同定し、開裂部位の推定を行う。ＨＰＬＣにより分離されたＢ−Ｔエピトープフラグメントを、すでに記載されているようにして（１、２）Ｎ末端アミノ酸配列決定およびＦＡＢ−質量スペクトル測定に供して開裂部位を同定する。全長のｇｐ１２０基質の場合、反応生成物をＳＤＳ−塩基泳動により分離し、ＰＶＤＦ上にブロットし、次いで、プロットされたポリペプチドをＮ末端配列決定に供して、ｇｐ１２０の配列と比較することにより開裂部位の同定を行う。対照は免疫前マウス由来のＩｇＧを含む。
トリプシンを陽性対照として用いる。トリプシンは、ＬｙｓまたはＡｒｇ残基に隣接した複数のペプチド結合、すなわちＢエピトープの残基４２１−４２２および４３２−４３３間のペプチド結合ならびにＴエピトープの残基８３７−８３８間のペプチド結合においてＢ−Ｔエピトープを開裂すると期待される。対照的に、ホスホン酸またはホスホン酸エステル構造の存在によるＡｂｓにおける触媒活性の動員により、主にＬｙｓ４３２−４３３ペプチド結合においてＩｇＧによりＢ−Ｔエピトープが開裂されるはずである。別の結果が観察される可能性がある。基底状態の抗原を用いてＡｇ特異的触媒を合成することができる。かくして、４３２−４３３結合以外のペプチド結合において基質を開裂しうる触媒を見出すことができる。なぜなら、免疫前レパートリー中に存在する、生殖細胞系によりコードされる活性は抗原エピトープの全体構造にかかわらず塩基性残基を認識しうるからである（３６、４０）。残基４３２−４３３において開裂反応が優先的に起こる程度は、触媒部位動員におけるホスホン酸／ホスホン酸エステル構造の重要性を示すものである。同様に、全長ｇｐ１２０の開裂が残基４２１−４３６の範囲内に存在するペプチド結合に限定される程度は、ｇｐ１２０に特異的な触媒活性の動員におけるこのペプチドエピトープの重要性を示すものである。
【０１１０】
基質特異性：これらの研究を行って、抗体触媒の治療有用性を評価する。種々のペプチドおよび蛋白基質の開裂を研究する。以下の基質特異性プロファイルを研究するためにいくつかの放射性標識ポリペプチドが利用可能である：（ａ）125Ｉ−アルブミン；（ｂ）125Ｉ−チログロブリン；（ｃ）125Ｉ−ＶＩＰ；および（ｄ）125Ｉ−ＩｇＧ。電気泳動およびオートラジオグラフィーにより可視化される低分子生成物バンドの出現により蛋白の加水分解が示される。トリクロロ酢酸を用いて無傷のペプチドを沈殿させることにより、あるいは逆相ＨＰＬＣ（２）によりＶＩＰの加水分解を測定する。ランダムに選択したポリペプチドの大きいパネル（ｎ＞１０；市販ポリペプチド、例えば、カゼイン、コラーゲン等）を、阻害アッセイ、すなわち、触媒による125Ｉ−ｇｐ１２０加水分解を阻害する能力により試験する。１２０ｋＤのｇｐ１２０のバントの消失が抑制されることにより反応に対する阻害が示される。
【０１１１】
キネティクス：キネティクスの研究を行って、見かけの反応定数および触媒効率（ｋcat／Ｋm）を決定する。未修飾Ｂ−Ｔエピトープおよび全長ｇｐ１２０を基質として使用する。種々の基質濃度において行うアッセイから反応定数を決定する。血清がエピトープに結合しうる非触媒性Ａｂｓと混合された触媒性Ａｂｓを含む場合、結合物は触媒による開裂からエピトープを保護するかもしれない。これら２つのプールを識別するために、触媒性Ａｂｓに結合できるが非触媒性Ａｂｓには結合できない固定化阻害剤に血清ＩｇＧを吸着させる。かかる阻害剤は入手可能である。かかる阻害剤がｇｐ１２０エピトープを含まないので、それらは、ｇｐ１２０ Ｂ−Ｔエピトープでの免疫により誘導された非触媒性Ａｂｓには結合しない。ビオチンを阻害剤に結合させて、アビジン被覆プレートを用いる固定化を行う。免疫マウス由来の血清ＩｇＧを過剰の固定化阻害剤とともにインキュベーションした後、未修飾Ｂ−Ｔエピトープに対する結合に関して上清をＥＬＩＳＡにより分析する。結合の不存在は、エピトープに対する有意な量の非触媒性Ａｂｓが存在しないことを示唆する。さらに、Ａｂｓと阻害剤との間の共有結合を開裂しうるｐＨ９またはそれ以上のヒドロキシルアミンを用いて結合Ａｂｓを溶離させることができる。溶離したＡｂｓは、Ｂ−Ｔエピトープに対する非触媒性Ａｂｓを含んでおらず、その後これをキネティクスのパラメーターに関して分析することができる。
ナノモルのＫｍ値または低いＫｍ値は、高アフィニティー抗原結合活性を示すものである。２つの基質に関して同等のＫｍおよびｋｃａｔ値が観察されることは、合成免疫原中に存在する残基４２１−４３６がｇｐ１２０中の類似コンホーメーションを取っていることを示唆する。見かけの速度定数に関して、ＩｇＧ調合物はポリクローナルＡｂ調合物を用いてすでに観察されているターンオーバーよりも速いターンオーバーを示すはずである。なぜなら、本発明の免疫原は、免疫手順を行っている間に触媒部位を動員し改良するように特別に設計されているからである。
ＩｇＧにより触媒される未修飾Ｂ−Ｔエピトープの開裂に対するエピトープのホスホン酸およびホスホン酸エステルによる阻害についても評価する。抑制された加水分解は、ホスホン酸およびホスホン酸エステルペプチドがＢ−Ｔエピトープの結合に対する競合阻害剤であり、そして／あるいは別の基質として役立つことを示す。阻害が見られる場合、Ｋi値を測定して、ＩｇＧとＢ−ＴエピトープおよびそのＴＳＡ／ＣＲＡＡｓとの相対反応性を評価する。ＴＳＡ／ＣＲＡＡｓが基質として使用されるかどうかを調べるために、生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ分離およびアミノ酸配列決定による生成物ペプチドの同定によってＩｇＧによるそれらの開裂を調べる。触媒が複数のペプチド結合を非規則に開裂しうるものである場合、ＴＳＡ／ＣＲＡＡペプチドはその触媒により開裂されうる。一方、Ａｂｓが専らＬｙｓ４３２−Ａｌａ４３３結合を開裂する場合、ＴＳＡ／ＣＲＡＡｓは基質として役立たないであろう。なぜなら、それらはこの位置において開裂不可能なペプチド結合のアナログを含んでいるからである。
【０１１２】
細胞表面に発現されたｇｐ１２０の開裂：触媒性抗体の活性がｇｐ１２０に対して生物学的に関連のある形態、すなわち、ウイルス結合性オリゴマーｇｐ１２０に指向されていることを確認するためには、細胞表面上にに発現された、生合成的に放射性標識されたｇｐ１２０が基質として役立つ。ＨＩＶに感染したＨ９細胞を35Ｓ−標識メチオニン存在下（Ｍｅｔ−欠損培地中で）で増殖させることによりｇｐ１２０の放射性標識を行う。免疫前および免疫マウス由来のＩｇＧフラクションの濃度を変えて細胞を処理する。放射標識されたｇｐ１２０を上清中に遊離させるに十分な温和な界面活性剤（０．１％ Triton-X-100）を用いて細胞抽出物を調製する。蛋白の種々のトリプシンフラグメントに結合することが知られている（３５）入手可能なウサギ抗ｇｐ１２０ Ａｂを用いてｇｐ１２０（およびそのフラグメント）を細胞抽出物から免疫沈降させる。ＳＤＳ電気泳動を用いて反応生成物を分離する。無傷のｇｐ１２０バンドの消失および低分子量フラグメントの出現は細胞表面ｇｐ１２０の開裂を示す。対照は非免疫ウサギのＩｇＧを用いた細胞抽出物の免疫沈降物を含有し、その場合、放射活性は沈降しないはずである。抗ｇｐ１２０を用いてゲルをインノブロッティングして、免疫沈降物質がｇｐ１２０フラグメントを示すことを確認する。
ＡｂｓがＨＩＶ−１表面上に発現されたｇｐ１２０のコンホーメーションを認識することの確認実験も行う。蔗糖密度勾配により精製されたＭＮ−ウイルス調合物（Advanced Biotechnologiesから入手可能）を基質として使用する。ウイルスをＡｂｓとともにインキュベーションした後、細胞表面に発現されたｇｐ１２０に関して説明したのと同様にして、すなわち界面活性剤抽出、電気泳動およびｇｐ１２０開裂フラグメントに結合することが知られている抗ｇｐ１２０ Ａｂｗｏ用いるイムノブロッティングによりｇｐ１２０の開裂を調べる。
Ｂ−Ｔエピトープ免疫原での免疫は、全長の可溶性の、細胞表面に発現されたｇｐ１２０に結合するＡｂｓを誘発する。なぜなら、ｇｐ１２０中の標的エピトープはＣＤ４結合部位の一部であり、それが蛋白表面上に露出していると考えられるからである（蛋白内部に埋まっているのとは逆）。そのうえ、標的エピトープは異なるＨＩＶ株において保存されている。よって、広い反応性を有するＡｂｓの合成が期待される。
非自己免疫マウス由来の免疫前ＩｇＧはｇｐ１２０中の標的エピトープの開裂を触媒する能力を欠いている。同様に、未修飾Ｂ−Ｔエピトープで免疫された非自己免疫マウス由来のＩｇＧはｇｐ１２０開裂活性をほとんど発現しないかあるいは発現しない。
自己免疫マウス由来の免疫前ＩｇＧは低レベルのｇｐ１２０の開裂を示す可能性があるが、その活性はｇｐ１２０に非常に特異的ではない。未修飾Ｂ−Ｔエピトープでの自己免疫マウスの免疫は触媒活性をｇｐ１２０特異的なものとするが、触媒ターンオーバーの改善は免疫の構造から予想されない。対照的に、Ｂ−ＴエピトープＴＳＡおよびＣＲＡＡは、ｇｐ１２０の基底状態ならびにペプチド結合開裂反応の遷移状態に結合する能力を合わせ持ったＡｂｓの合成を引き起こすように設計されている。よって、ＴＳＡおよびＣＲＡＡでの免疫は、ｇｐ１２０への高アフィニティー結合（見かけのＫｍおよびＫｄ値が低い）を示し、さらに迅速なターンオーバー（見かけのｋｃａｔ）を示すＡｂｓの合成を誘発すると予想される。さらに、Ｂ−Ｔエピトープのアナログでの自己免疫マウスの免疫は、免疫前の状態において見られる不規則な触媒活性を標識ｇｐ１２０エピトープ（残基４２１−３３６）を専ら認識するように指向させる。
ＴＳＡｓおよびＣＲＡＡｓでのＢ１０．ＢＲマウス（非自己免疫マウス）の免疫は、非自己免疫状態における触媒性Ａｂ合成を制限する抑制機構に打ち勝つであろう。この試験はＨＩＶワクチンの開発に関連している。なぜなら、その目的が、宿主の自己免疫または非自己免疫状態にかかわらず感染から防御するワクチンを開発することだからである。
Ｂ−Ｔエピトープのホスホン酸エステルはホスホン酸Ｂ−Ｔエピトープよりも強力な触媒を誘発するであろう。なぜなら前者の免疫原は、生殖細胞系のＶＬ遺伝子によりコードされていて、すでに存在している触媒部位の特徴である求核性Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基を含むＡｂｓを合成するＢ細胞のクローン増殖を促進するからである。一方、ホスホン酸Ｂ−Ｔエピトープは、遷移状態中のカルボニル酸素上の負の電荷の発生を安定化させるためのオキシアニオンホール（ズブチリシン中のＡｓｎ２５５のごとき）を含むＡｂｓを動員するように設計されている。オキシアニオンの安定化に生殖細胞系によりコードされる触媒による触媒作用が関与していることを示す証拠はない。しかしながら、Ｖ領域の体細胞多様性機構（）はde novoにおいて触媒部位を発達させうる強力な機構であることに注意。生殖細胞系の求核性部位ならびに体細胞により発達したオキシアニオンホールを併有するＡｂｓの開発は非常に実行可能である。かかる求核的なオキシアニオン安定化部位は、抗体でないセリンプロテアーゼによる有効な触媒の原因となっている。ホスホン酸エステルＢ−Ｔエピトープおよびホスホン酸Ｂ−Ｔエピトープでの逐次免疫によりＡｂ合成が誘導される提案された非対応免疫は、高ターンオーバーのｇｐ１２０特異的触媒の合成を引き起こすであろう。非対応免疫は、ホスホン酸エステルの共有結合的、求電子的反応性により、次いで、免疫応答の期間中の体細胞によるオキシアニオン安定化構造の発達により、求核部位をコードするＡｂ生殖細胞系遺伝子を動員するであろう。
【０１１３】
未修飾Ｂ−Ｔエピトープにより誘導された抗ｇｐ１２０抗体のＨＩＶ−１中和活性と、ホスホン酸Ｂ−Ｔエピトープおよびホスホン酸エステルＢ−ＴエピトープＣＲＡＡにより誘導されたＡｂｓの中和活性との比較
ＣＤ４へのｇｐ１２０の結合はＨＩＶ−１による細胞の感染を開始させる。４３２−４３３結合におけるｇｐ１２０の開裂は細胞によるＨＩＶ−１への結合を有効にブロックするであろう。なぜなら、当該開裂部位はｇｐ１２０のＣＤ４結合領域中に存在し、トリプシンによるこの結合の開裂は液相でのＣＤ４によるｇｐ１２０結合を阻害することがすでに示されているからである（３５）。
【０１１４】
Ａｂｓ：対照Ｂ−Ｔエピトープ構築物（未修飾ペプチド）、ホスホン酸Ｂ−Ｔエピトープ（ＴＳＡ）、ホスホン酸エステルＢ−Ｔエピトープ（ＣＲＡＡ）、ならびにホスホン酸およびホスホン酸エステルＢ−Ｔエピトープの組み合わせ（ＴＳＡ＋ＣＲＡＡ）での免疫期間中における種々の時点でマウスから精製したＩｇＧ試料を比較する。これらの免疫すべてにおいて得られた高度免疫ＩｇＧは高アフィニティーｇｐ１２０結合が可能なはずである。両方のマウス株におけるＴＳＡ／ＣＲＡＡ免疫によるＩｇＧに触媒活性が存在すると考えられる。
【０１１５】
ＨＩＶ−１中和：最初に、免疫の種々の段階のすべてのマウスから得たブラインドされた（blinded）ＩｇＧ試料を、十分に特徴づけられた、定量的なＴ細胞系アッセイにおいて標準的な研究用株（ＨＩＶ−１ ＭＮ）を用いてスクリーニングする。免疫スケジュール終了近くに得た高度免疫ＩｇＧを用いてさらなる研究を行う。対照はＨＩＶ−１不存在下でＩｇＧとともにインキュベーションされた細胞を含み、その結果、ＩｇＧの非特異的毒性効果の可能性が排除される。ＰＨＡにより活性化された血液由来のリンパ球を１の細胞タイプとして、さらに血液由来のマクロファージを第２の細胞タイプとして、これらのＩｇＧ試料を分析する。１個の二重刺激性単離体ＨＩＶ−１ ＡＤＡは最初の細胞アッセイにおいて使用されるウイルス単離体である。両方の細胞タイプを用いる理由は、異なる細胞タイプおよびウイルスタイプに特異的なユニークなエピトープに存するかもしれない中和／不活性化活性の消失を回避するためである。多くの要因が、研究室株の中和と現場で単離された株の中和との間の意味深長な相違の原因となっているということが、初期の研究から明らかである。Ｖ３およびＣＤ４の両方を阻害するヒトモノクローナルならびに十分に特徴づけられたＨＩＶ−１陽性ヒトポリクローナル血清に対する能力に関して、中和活性を示すＡｂ試料を直接比較する。さらに、作用、可逆性の段階、機構ならびに複数の一次細胞タイプにおける広範な抗原サブタイプ／クラスに対する中和活性の幅に関してこれらの抗体を評価する。
試験すべきＩｇＧは、非触媒性抗ｇｐ１２０（未修飾Ｂ−Ｔエピトープで免疫した非自己免疫マウス由来）および触媒性抗ｇｐ１２０ ＩｇＧ調合物（例えば、Ｂ−ＴエピトープのＴＳＡ／ＣＲＡＡｓで免疫したマウス由来）を包含する。ｇｐ１２０中の標的ＢエピトープはＣＤ４結合に必須なので、本発明のＩｇＧ調合物中の非触媒性ＡｂｓでさえもＨＩＶ−１の中和を阻害すると考えることができる。十分な力価のＡｂｓが誘導された場合、各実験マウス群からの高度免疫ＩｇＧはＨＩＶ−１の感染性を抑制する可能性がある。
触媒性Ｆｖ構築物および１種の非触媒性Ｆｖ構築物の均一な調合物をＨＩＶ−１中和活性に関して比較する。このことにより、ポリクローナルＩｇＧでの研究から得られた結果が確認される。さらに、Ｆｖ構築物はＦｃドメインを欠くので、補体結合およびＦｃ受容体結合と類似の現象が除かれる。よって、かかる現象による促進されたＨＩＶ−１感染性の不存在は、Ｆｖ構築物を用いると確実なものとなる。
触媒性Ａｂｓの大きな魅力は、非触媒性Ａｂｓと比較した場合の大きく不可逆な中和能である。本発明において、触媒性ＩｇＧ試料は、非触媒性ＩｇＧ試料よりの数オーダー低い濃度で強力なＨＩＶ−１中和を示すはずである。当該触媒により標的とされるエピトープはｇｐ１２０のＣＤ４結合部位の構成成分である。さらに、標的とされる結合（Ｌｙｓ４３２−Ａｌａ４３３）のトリプシンによる開裂はＣＤ４へのｇｐ１２０の結合をブロックすることがわかた。ＣＤ４結合部位は異なるＨＩＶ−１株およびサブタイプにおいても保存される傾向がある。よって、本発明の抗ｇｐ１２０触媒は、ＨＩＶ感染のごとき感染症の治療のための有益な治療ツールである。
【０１１６】
（実施例ＩＩＩ）
虚血−再潅流傷害および敗血性ショック／ＳＩＲＳにおけるＣＲＡＡｓおよび触媒性抗体の使用
Larry Iはこのセクションの参照を要する
虚血−再潅流傷害は、組織への血液の供給が長時間中断され（虚血）、次いで、回復（潅流）した場合に起こる。このタイプの傷害は損傷組織に血流を回復する処置を行った後の心臓発作患者および卒中患者の両方に影響する。虚血および特に潅流はいずれも、この組織中へのある種の因子の放出に関連しており、それらの因子はプログラムされた細胞死を誘導することにより炎症応答および傷害を引き起こすものである。
敗血性ショック症候群および全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）は、血行力学的変化、炎症および最終的には肺から予想できる順番で起こる主要器官の機能不全を包含する、しばしば致命的な症候群に関する用語である。敗血性ショック症候群は元々グラム陰性細菌の感染およびエンドトキシの効果のみに関連するものであったが、その後、自己により生じる拡張された組織損傷のごとき種々の他の医学的問題が当該症候群を開始させることがわかり、感染のないものをＳＩＲＳと称する（４６）。両方の症候群において見られる複数器官の機能不全は密接に関連しており、プログラムされた細胞死の生起により引き起こされる可能性がある。
【０１１７】
虚血−再潅流傷害
この疾病においてプログラムされた細胞死を誘導する主要な４つの可溶性因子は反応性酸素種（ＲＯＳ）および一酸化窒素（→過酸化亜硝酸→ヒドロキシルＲＯＳ）であり、それらはインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）を誘導し、またこれらにより誘導される。
虚血−再潅流傷害および敗血性ショック／ＳＩＲＳにおけるプログラムされた細胞死の関与を考慮すると、上記可溶性因子が両方の疾病において重要な役割を果たしているという事実は医学的急変における病理生理学的類似性を強調する。
本発明の新規ＣＲＡＡｓを利用してＩＬ−１およびＴＮＦを開裂する触媒性抗体を得て、虚血−再潅流傷害、敗血性ショック／ＳＩＲＳおよび急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）ならびにリューマチ性関節炎のごとき疾病の治療およびニューロパシー性の痛みの治療を行ってもよい。
【０１１８】
虚血−再潅流傷害
虚血組織への早期の血流の回復は、中断された酸素および栄養の供給により引き起こされる細胞傷害の進行をくい止めることにおいて重要である。逆説的に言えば、虚血組織への血流の回復はさらなる組織損傷に関連している。例えば、４時間の小腸の虚血は、３時間の虚血、次いで、１時間の再潅流よりも実質的にダメージが少ないことが実験的に示されている（４７、４８）。組織全体に対する再潅流期の重要性が多くの研究において説明されており、虚血期において開始される治療的介入が再潅流の発生時において開始される治療的介入と同様に効果的であることが示されている（４９、５０、５１、５２）。虚血−再潅流傷害を受けた組織は、プログラムされた細胞死が進行している細胞の領域に囲まれた壊死細胞ゾーンを迅速に示す（５３、５４、５５）。
再潅流が発生した場合に傷害を示すためには虚血組織が分子状酸素に曝露されなければならないことが十分に確認されている（５６−６１）。
虚血−再潅流傷害の発生を説明するためにいくつかの機構が仮定されているが、大部分の注意はＲＯＳに注がれていた。ＲＯＳは分子状酸素から誘導される負電荷を有する化合物をいい、それぞれ１個、２個および３個の電子が減っているスーパーオキシド、過酸化水素およびヒドロキシルラジカルを包含する。
虚血−再潅流傷害においてＲＯＳに関連する多くの証拠がある：１）虚血組織におけるＲＯＳの生成は電子スピン共鳴およびスピントラッピングにより（６２、６３）ならびにニトロブルーテトラゾリウム還元、化学発光およびサリチルサントラッピングにより検出された。２）虚血−再潅流傷害の不存在下における組織のＲＯＳへの曝露は虚血−再潅流傷害自体に類似の行理学的変化を引き起こす（６４、６５、６６、６７）。３）ＲＯＳを捕捉あるいはＲＯＳ生成を制限するする作用剤での治療は虚血−再潅流傷害による損傷を有意に軽減する（６８、６９）。
【０１１９】
虚血の初期効果の１つは罹病組織におけるＡＴＰ枯渇であり、それは細胞膜をイオン透過性にし、カルシウム隔離を無効にする。細胞質カルシウムの増加によりカルシウム依存性ホスホリパーゼおよび蛋白分解酵素の活性化が促進されるが、重要な結果はキサンチンデヒドロゲナーゼのキサンチンオキシダーゼへの変換である（７０）。キサンチンオキシダーゼは実質および内皮細胞に見られ、ＲＯＳスーパーオキシドを生成し、直接的または間接的に過酸化水素を生成する。キサンチンオキシダーゼの阻害が虚血−再潅流傷害により引き起こされた損傷を軽減するということは、この酵素によるＲＯＳ生成が発症に関与しているという考えを支持する。
ホスファチジルエタノールアミンの減少、リン脂質の分解、および遊離脂肪酸の放出が虚血組織において起こる。再潅流が開始すると、遊離脂肪酸、特にアラキドン酸が急激に利用され、そのことはリポキシゲナーゼおよびシクロ−オキシゲナーゼ経路を刺激し、ＲＯＳを生じさせる。シクロ−オキシゲナーゼ阻害剤は、虚血−再潅流傷害による組織損傷の軽減において有益であることが示されている。
一酸化窒素は非常に反応性に富む種であり、内皮から連続的に放出される（７１）。それは微小循環系を活性血管拡張および血管不透過性の状態に維持し、血小板および白血球の内皮への付着を防止する。それは構成的に活性のある内皮シンターゼによりＬ−アルギニンから酵素的に合成され、その生成はＮ6−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）のごときＬ−アルギニンアナログにより阻害されうる。冠状血管におけるＬ−ＮＡＭＥのごとき阻害剤での一酸化窒素生成の阻害は血管収縮による心筋虚血を引き起こす可能性がある（７２）。しかしながら、一酸化窒素合成の阻害剤は虚血−再潅流傷害に関連した組織損傷レベルを実質的に低下させるという重要な証拠がある（７３、７４）。
誘導可能形態の一酸化窒素シンターゼは虚血−再潅流傷害の間のこの分子の増大したレベルの原因である。インデューサーは、炎症性サイトカイン、神経興奮性アミノ酸、および虚血後の高体温の間の血流に関連した血管拡張を包含する。Noiriら（７５）は、誘導可能な一酸化窒素シンターゼ遺伝子の転写物を標的しするアンチセンスオリゴがこれらの遺伝子の発現を低下させうることを示した。全身的に投与した場合、このオリゴは腎臓により接種され、ラットにおいて実験的に引き起こされた腎臓虚血による腎不全を有意に軽減した。。
【０１２０】
一酸化窒素はスーパーオキシドアニオンと結合して毒性フリーラジカル過酸化亜硝酸を生じさせ、虚血−再潅流傷害における主要原因因子と考えられるＲＯＳ、ヒドロキシルラジカルを生じさせる可能性がある（７４）。スーパーオキシドを生じさせる分子状酸素の還元はミトコンドリア輸送系のすべての好気的呼吸細胞において起こる。
一酸化窒素は多くの生理学的および実験的状況においてプログラムされた細胞死を誘導することが示されている。一酸化窒素生成に対する高レベルの活性化は、侵入性病原体および腫瘍細胞に対する最初の防衛ライン形成を助ける。
虚血−再潅流傷害領域でのＲＯＳの放出は炎症性サイトカインを誘引し、そのことは、さらなるＲＯＳの放出を含む細胞毒性手段によって組織傷害を引き起こす可能性がある。多くの研究は以下のことを示している：１）白血球が虚血−再潅流傷害領域に蓄積すること、ならびに２）循環好中球の枯渇あるいは好中球活性化を妨害する作用剤の利用は虚血−再潅流傷害に関連した組織損傷を時々軽減しうること。
【０１２１】
プログラムされた細胞死の終末期にはＩＣＥファミリーに属する一連の酵素が関与する。これらの酵素のいくつかを阻害しうるペプチドは、齧歯類において一時的な中大脳動脈閉塞により生じた虚血性脳傷害を軽減し、結果生じる行動の欠陥を有意に改善することが示されている（７６）。後者の観察結果は、プログラムされた細胞死の完了を防止する治療の後に虚血神経組織の機能回復が可能であることを示す。おそらく、虚血後に再潅流傷害が起こる場合よりも機能回復の程度は大きいであろう。
多くの研究は、プログラムされた細胞死が虚血−再潅流傷害により損傷を受けた組織の遍在的な特徴であることを示している（５３、５４、５５）。
Szabolcsらによれば（７７）、誘導可能な一酸化窒素シンターゼレベルの誘導は、ラット心臓におけるプログラムされた細胞死と正の相関関係があった。心臓同種移植片拒絶反応のモデルとして心臓組織がLewisラットからWhistar-Furthラットに移植され、LewisからLewisへの移植片は対照として役立った。プログラムされた細胞死の状態の心筋細胞数は移植から３ないし５日後に急激に増加した。５日目には、同系移植片と比較して、プログラムされた細胞死の状態にある心筋、内皮およびマクロファージにおいて同種移植片が有意に増加した。誘導可能な一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡ、蛋白および酵素活性の発現は、時間および心筋細胞におけるプログラムされた細胞死の程度とともに増加した。免疫組織学的染色は、増加した誘導可能な一酸化窒素の領域もニトロチロシンを発現し、ペルオキシ亜硝酸生成が示された。
【０１２２】
多くの証拠が、インターロイキン−１β（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）が虚血−再潅流傷害の進行において重要な役割を果たしているという結論を支持している。
前炎症性サイトカインの生成は単球／マクロファージシリーズの細胞活性化に関連しており、その活性化はキサンチンオキシダーゼによる酸素ラジカル活性の結果起こることが示された。
ＩＬ−１は１９４０年代に発見され、動物に注射した場合に発熱を引き起こすことが最初に示された。１９７０年代初頭において、ＩＬ−１は、動物に注射した場合に、好中球増多、抗微生物応答の向上、肝臓急性フェーズの反応物の合成増加、およびコロニー刺激因子の誘導を包含する他の種々の生物学的効果を有することが見出された。また、培養においてマイトジェンに対するＴ細胞応答を促進し、アジュバントとして機能することも見出された。
クローニングの研究により、ＩＬ−１がＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１ｒａの３個のメンバーからなるファミリーであることが示された。最初の２つはアゴニストであり、最後のものは受容体アンタゴニストである。ＩＬ−１αは細胞膜上に存在するが、ＩＬ−１βはサイトカインとして放出され、このテキストにおいて言及された形態のみである。それは前駆体として合成され、開裂されてはじめて活性化できる。これらに最も特異的な酵素はインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）であり、プログラムされた細胞死の終末期に活性化される酵素のファミリーに密接に関連している。
腎臓、肝臓、骨格筋および腸の虚血−再潅流傷害領域においてＩＬ−１発現が示されている。ラット脳および心臓においてＩＬ−１およびＴＮＦの両方の発現が同様に示された。Haraら（７６）により使用された齧歯類モデルにおいて、中大脳動脈の実験的閉塞の回復から３０〜６０分後にＩＬ−１発現はピークに達し、その後減少した。
ＩＬ−１でのラット心筋細胞の治療は一酸化窒素シンターゼの転写ならびにプロテインキナーゼＡ依存性経路による当該酵素の増加した発現を誘導した。脳の内皮細胞においてもＩＬ−１はこの酵素を誘導することが示された。同様に、ＩＬ−１およびＴＮＦは、心臓および肝臓の一酸化窒素シンターゼを誘導することが示された。上述のごとく、ＲＯＳは、プログラムされた細胞死を生じさせる可能性のあるｐ５３の発現を誘導するゲノムの損傷を引き起こす。
ＩＬ−１はＩＬ−６のごとき他の前炎症性サイトカインも誘導する。いくつかの場合において、誘導は転写因子ＮＦ−κＢにより媒介され、転写因子ＮＦ−κＢはＴＮＦの効果も媒介する。頻繁に観察されるＩＬ−１とＴＮＦならびにＩＬ−１とＩＬ−６との間の相乗作用は、一部には、３種すべてのサイトカインに応答する細胞集団中の有意に重複したシグナルトランスダクション経路に基づいて説明されうる。
【０１２３】
肝臓虚血−再潅流傷害ラットのＩＬ−１ｒａでの治療はＴＮＦ産生、組織傷害および死亡率を抑制することがわかった（７８）。ラット肝臓において左葉および中葉の血管を９０分間クランプすることにより虚血が誘導された。１セットの実験において、虚血を誘導する５分前にＩＬ−１ｒａが全身投与され、血中および肝臓におけるＴＮＦレベルが再潅流開始後種々の時点において調べられた。対照動物において、両組織中のＴＮＦレベルは再潅流を継続した場合、時間とともに増大することがわかり、虚血開始から４時間半後に実験が終了された。対照的に、ＩＬ−１ｒａでの治療は２つの組織中のＴＮＦレベルの低下を引き起こした。組織学的実験により、対照と比較して、ＩＬ−１ｒａでの治療は肝臓損傷が少ないことが示された。
第２のセットの実験において、虚血完了後に罹病していない肝臓の右の側葉および尾状葉を取った。対照動物の８０％は死亡したが、ＩＬ−１ｒａで治療した動物はその３０％が死亡した。
同様の実験において、Ｌ−１ｒａでの治療および本来的に存在するＩ−１ｒａにより、ラット脳組織が虚血−再潅流傷害により誘導される損傷から防御されることが示された。
【０１２４】
脳の虚血−再潅流傷害におけるＴＮＦの役割が試験された。１のセットの実験において、中大脳動脈を８０分または１６０分閉塞（一時的閉塞）あるいは実験終了まで２４時間閉塞（恒久的閉塞）する２４時間前に、種々の用量のＴＮＦがラットに脳室内投与された。いくつかの群において、ＴＮＦ注射３０分前にＴＮＦ中和抗体が投与された。外来性ＴＮＦの投与は、恒久的閉塞により生じたインファクトサイズ（infact size）を用量依存的に有意に増大させた。高用量のＴＮＦ（２５ｐｍｏｌ）は一時的閉塞群の１００％および恒久的閉塞群の３４％の両方においてインファクトサイズの増大を引き起こした。外来性ＴＮＦのこれらすべての効果は、ＴＮＦ抗体で前処理された動物において生じなかった。
さらにもう１つのセットの実験において、中和抗体または可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩ）を恒久的閉塞３０分前、３時間後または６時間後に投与することにより、外来性ＴＮＦをブロックする効果が評価された。閉塞前後のＴＮＦブロック効果は阻害剤用量に依存してインファクトサイズを２６％まで減少させた。
ＴＮＦは虚血−再潅流傷害の再潅流期に関連した肝臓の損傷を部分的に媒介することが示されている。肝臓のＴＮＦ産生は罹病領域における好中球の隔離および活性化の原因となっており、ＲＯＳの放出を引き起こす。中和ＴＮＦ抗体での受動免疫はこれらの病理学的効果を有意に抑制することができた。培養肝細胞に投与されたＴＮＦは共投与されたＲＯＳの細胞毒性を促進することも示されている。同様に、中和ＴＮＦ抗体は心臓血管系への影響を抑制し、ラットモデルにおいて上腸間膜動脈を４５分間閉塞することにより誘発された急性虚血−再潅流傷害後の生存率を向上させることも示された。
【０１２５】
敗血性ショック／ＳＩＲＳ
病因論は別として、虚血−再潅流傷害および敗血性ショック／ＳＩＲＳにおいて起こる基本的な病理生理学的な出来事は非常に類似しているが、前者において病状は局在化しているが、後者においては病状は全身的であり、肺から始まる複数の器官不全で終わる。両方の疾病グループにおける重要な要素はＲＯＳ、一酸化窒素、ＩＬ−１、ＴＮＦおよびプログラムされた細胞死である。
この分野の大部分の実験的研究は、敗血性ショックを細菌または細菌生成物を用いて誘導できるので敗血性ショックを用いる。患者の敗血性ショック／ＳＩＲＳに関連したこれらの研究において明らかとなった病理生理学的変化は、その症候群が前炎症性メディエイタのカスケードによりドライブされることを示す。最初はマクロファージおよび他の炎症性細胞により分泌されるＩＬ−１およびＴＮＦによりこのカスケードが開始されるということが、一般的に認められている。ＩＬ−１は多種多様な他の細胞タイプによっても分泌され、体内の大部分の細胞がＩＬ−１の受容体を有している。ＩＬ−１の産生は、ＲＯＳおよびＴＮＦにより刺激されることが示されており、これらのサイトカインの両方がＲＯＳ産生を促進する。敗血性ショックにおいて、ＩＬ−１およびＴＮＦ産生はエンドトキシンおよび他の細菌生成物の作用から生じる。これら２つの因子ならびにＲＯＳの高い発現は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、γ−インターフェロン、プロスタグランジンＩ2、スロンボキサンＡ2、プロスタグランジンＥ2、形質転換成長因子β、血小板活性化因子、ブラジキニン、アンギオテンシン、および血管作用性腸ペプチドを包含する広範な二次メディエイタの過剰産生を引き起こす。これらの因子は病理学的な臓血管系の血液動力学および凝血ならびにこの症候群に関連した他の変化を引き起こす。
【０１２６】
ＴＮＦは、その過剰産生がショックおよび死に先立つものであることが示されたので、敗血性ショック／ＳＩＲ症候群にリンクした最初のサイトカインであった。その直後にＩＬ−１が同様に毒性を有し、ＴＮＦとともに与えられた場合、相乗効果を示すことが示された。致命的でない量のＴＮＦおよびＩＬ−１を合わせた場合の結果として、致命的なショックが動物において生じた。
炎症による損傷が生じた後において、ＴＮＦはＩＬ−１に次いで循環系に出現する最初のサイトカインである。例えば、エンドトキシンを注射されたボランティアにおいて、ＴＮＦレベルは損傷後６０〜９０分でピークに達し、３時間以内にベースラインに戻る。ＩＬ−１レベルは処置後３〜４時間でプラトーとなる。これらの一般的観察結果およびＴＮＦがＩＬ−１産生を誘導しうるという知見は、ＴＮＦが敗血性／ＳＩＲ症候群を開始させる最初のサイトカインであり、ＩＬ−１は敗血性／ＳＩＲ症候群の継続に大きく関与しているという考えを導いた。
【０１２７】
ＴＮＦおよびＩＬ−１の両方により誘導される血清ＩＬ−６レベルの測定値は、これらのサイトカインの直接測定よりもＴＮＦおよびＩＬ−１産生についての良好な測定値であることが示唆された。しばしば循環系中のＩＬ−６レベルは、外傷、敗血症および敗血性ショック／ＳＩＲＳの患者の疾病の重さと直接相関関係がある。しかしながら、ＩＬ−１およびＴＮＦとは異なり、ＩＬ−６の投与は炎症または敗血性ショック。ＳＩＲＳを誘導せず、ＩＬ−６の阻害剤はこの症候群の致命的な結果を防止しない。
【０１２８】
大部分のさらなる証拠は、これらのメディエイタがこの症候群の発症において重要な役割を果たしているという考えを支持する。例えば、Caseyら（７７）は敗血性ショックに関与する種々の因子と９７人の患者の結果との間の相関関係を調べたところ、患者のうち５７人が強い敗血性ショックを有しているかあるいは低血圧であり、それは差し迫った敗血性ショック／ＳＩＲＳを早期に示すものであった。この群の患者の生存率は５４％であった。最強の相関関係が結晶ＩＬ−６レベルと死亡率との間に示され、次に強い相関関係がＩＬ−１レベルとの間に示された。通常には、ＩＬ−１は正常対象においては検出できない（＜４０ｐｇ／ｍｌ）。ＴＮＦおよびエンドトキシンレベル、および死亡率との間には相関関係がなかった。ＴＮＦとの相関関係がないことは、このサイトカインが因子カスケードの初期段階においてのみ産生され、その半減期が短いという事実によるものとされた。しかしながら、上昇したＴＮＦレベルはグラム陽性敗血症の存在とは相関関係があった。
【０１２９】
敗血性ショック／ＳＩＲＳに関与する前炎症性サイトカイン、特にＴＮＦは凝血および補体カスケードを促進し、補体カスケードはＲＯＳの放出を伴う好中球活性化を引き起こす。一酸化窒素シンターゼは、ともに内皮細胞および炎症性細胞に存在するＩＬ−１およびＴＮＦによって誘導される。活性化された好中球はいわゆる呼吸バーストにおいて酸素を消費し、スーパーオキシドイオンを形成し、該オインは一酸化窒素と反応して過酸化亜硝酸を生成し、過酸化亜硝酸は分解して非常に毒性の高いヒドロキシルＲＯＳを生じる。ＲＯＳ、特にスーパーオキシドは、それらが自己増幅プロセスにおいて血漿前駆体と反応する場合に化学走性因子を生じる。
【０１３０】
敗血性ショック／ＳＩＲＳの患者は抗酸化剤での治療に好ましく応答し、この症候群の発症におけるＲＯＳの重要性が確認された。例えば、４種の抗酸化剤の組み合わせでの治療後に死亡率の著しい低下が敗血症関連急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）患者において見られた。ＡＲＤＳは、敗血性ショック／ＳＩＲＳの最終期を特徴づける多発性器官不全の最初に起こる病理生理学に関連する肺不全をいう。同様に、別の研究において、抗酸化剤ｎ−アセチルシステインを与えられたＡＲＤＳの患者は、肺血管抵抗性、拍出量および酸素デリバリーの変化を包含する改善された心肺機能を示した。
これらのデータおよびさらなるデータの大部分に基づいて得られた敗血性ショック／ＳＩＲＳの機構に関する理解は、ＴＮＦおよびＩＬ−１の産生をブロックする作用剤によりこの症候群が予防されることを示唆している。ＩＬ−１中和抗体は動物モデルにおいて敗血性ショックを改善することが示されている。しかしながら、組み換えＩＬ−１ｒａ投与は、敗血性ショック／ＳＩＲＳの動物モデルにおいてＩＬ−１機能をブロックするために最も頻繁に用いられたアプローチであった（７８）。
例えば、十分量のＩＬ−１ｒａ、次いで、通常には致死量のエンドトキシンでのウサギの処置は穏やかで一時的な低血圧を生じさせただけで、組織中への好中球浸潤を減少させた。ＩＬ−１ｒａはK. pneumoniaeおよびE. coliによる腹膜炎にかかったラットの死亡を防止することも示されている。
ヒヒにおいて引き続き生じる致命的なE. coliによる敗血性ショックを弱めるＩＬ−１ｒａ輸液の能力について研究が行われた。ＩＬ−１レベルの１０3ないし１０4倍という過剰量のＩＬ−１ｒａを投与した場合、サイトカインの初期生成に対しては影響が見られなかったが、ＩＬ−１ｒａは持続的なＩＬ−１応答を妨害し、生存率はプラシボで４３％であるのに対し、１００％となった。
【０１３１】
多くの報告は、ＴＮＦ中和抗体および可溶性ＴＮＦ受容体は、敗血性ショックを誘導しうるエンドトキシのごとき細菌毒の致命的な注射から動物を防御するという証拠を提供している。しかしながら、有益であるためには、エンドトキシンまたは細菌の輸液前または輸液中にこれらの治療薬を与え与えなければならない。
また、ＴＮＦ−１受容体ノックアウトマウスを用いて敗血性ショックにおけるＴＮＦの役割も調べられた。これらのマウスは、正常マウスにおいて致命的な敗血性ショック症候群を引き起こす用量のＴＮＦに応答しないことが示された。さらにノックアウトマウスは、Ｄ−ガラクトサミンおよび肝臓による代謝をブロックすることにより動物をトキシンに対して感受性にする薬剤で前処理された場合において、通常には致死量のエンソトキシに応答しなかった。エンドトキシにより誘導されるＴＮＦ血漿レベルに関しては正常マウスとノックアウトマウスとの間に差異はなかった。致死量以下のエンドトキシ投与後、循環系中に放出されたＩＬ−６レベルは対象マウスと比較してノックアウトマウスにおいて劇的に低下していることがわかった。最後に、ノックアウトマウス由来のマクロファージは、誘導可能な一酸化窒素シンターゼ経路による一酸化窒素生成能が非常に制限されていることが示された。対照的に、ＩＬ−６欠損マウスはかかる制限を示さなかった。
【０１３２】
５つの異なる企業において開発中の、敗血性ショック治療用の６種のＴＮＦアンタゴニストは同時にフェーズＩＩ〜ＩＩＩの臨床試験中である。これらの阻害剤のうち４種は中和抗体であり、２種は可溶性の組み換えＴＮＦ受容体である。これらの製品はこの症候群に対する実行可能な治療薬としては差異がない。しかしながら、中和抗体を包含するＴＮＦアンタゴニストは本質的に患者において有効でないわけではない。なぜなら、それらはリューマチ性関節炎の治療のための臨床試験において実質的に見込みがあることがその後示されたからである。
明らかに、ここ１０年間における敗血性ショック／ＳＩＲＳの新たな治療薬を開発するための試行は多くの失望を生んできた。Pruittら（７８）は、なぜサイトカイン阻害剤での試験が失敗したのかについての多くの研究者により提示された多くの理由をまとめた。おそらく、成功を妨げる１つの最大の障害は現存のサイトカイン阻害剤のコストに関連しているであろう。それらが高価であることはそれらの予防的使用を不可能にする。例えば、Pruittら（７８）により指摘されたように、血漿における１０〜１５マイクログラム／ｍｌという治療濃度を持続させるためには、患者が敗血症である限り１日約２．５グラムのＩＬ−１ｒａを１．５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／時の濃度で投与しなければならない。
その結果、ＩＬ−１またはＴＮＦの阻害剤を投与される患者はすでに徴候を示している。しかし、この症候群の発症に関する我々の理解は、当該症候群を進行させるための大きな役割を有する過剰な前炎症性サイトカインの放出のカスケードにおける非常に初期の段階おにおいてＩＬ−１および特にＴＮＦの機能をブロックしなければならないことを強く示唆している。さらに、動物実験は、炎症傷害の前または同時にＩＬ−１およびＴＮＦを投与しないと敗血性ショック／ＳＩＲ症候群が有効に発生しないことが動物実験により示されている。
例えば、Synergen Inc.のフェーズＩＩ試験において、患者が研究に適した候補であると判断されてから平均９時間後にＩＬ−１ｒａが投与された（７９）。結果として、試験に入った多くの患者はＩＬ−１ｒａ輸液開始２４時間前またはそれ以前に敗血性応答を発症した。かくして、ＩＬ−１機能をブロックするための試みを開始する時までには、多くの患者について、前炎症カスケードが十分に進行している。
ＩＬ−１ｒａ臨床試験における陽性応答は２８日のオールコーズ（all-cause）死亡率判断基準の使用によりあいまいなものとなった。フェーズＩＩおよび最初のフェーズＩＩＩ試験データの再評価により、ＩＬ−１ｒａ輸液により生じる大きな利益が治療３〜７日目に得られたことが明らかである（７８）。生存率曲線はその後本質的に平行となった。この知見はＩＬ−１ｒａの非常に短い半減期を反映している可能性があった。例えば、敗血症霊長類におけるベータ−フェーズのＩＬ−１ｒａ半減期は約２１分である。同様に、ＩＬ−１およびＴＮＦの半減期は分ないし時において測定される。それゆえ、ＩＬ−１ｒａ輸液から最初の１週間後の死亡率が治療価値の評価とは無関係であることは驚くにあたらない。
全身投与されたＩＬ−１またはＴＮＦの阻害剤について一般的に適用できることであるが、ＩＬ−１ｒａ臨床試験に関するもう１つの問題は、サイトカインの血漿濃度に基づくサイトカイン阻害剤の用量決定に関する慣習により生じる。これらのサイトカインの局部的な組織での濃度は血漿中に存在するよりも高濃度である可能性がある。例えば、ＡＲＤＳ患者において、肺のＩＬ−１濃度は１５ｎｇ／ｍｌであるが、血漿濃度は１００ｐｇ／ｍｌ未満であることが示されている。
【０１３３】
よって、敗血性ショック／ＳＩＲＳのデータおよび当該症候群に関する現在の理解は、（１）ＩＬ−１およびＴＮＦをブロックし、危険性のある患者に予防的に与えても費用が十分に少なくてすむ新規治療薬；（２）およびこの症候群に関連した多くの死亡を引き起こす器官不全に貢献する主要因子であるプログラムされた細胞死を防止する新規治療薬の開発を支持する。
したがって、ＴＮＦおよびＩＬ−１に対して特異的な触媒性抗体の免疫生成を刺激するＣＲＡＡｓを本明細書に記載する。他の既知モノクローナル抗体の投与に基づく免疫療法用にすでに開発されているプロトコールを用いてこれらの抗体を投与してもよい。本発明の抗体は触媒的に作用するので、その用量は、可逆的かつ化学量論的に結合する抗体よりもずっと少ない。したがって、当該症候群の危険性のある患者の予防的処置のコストはおおいに低下するであろう。ＴＮＦαに対する触媒性抗体を誘導する典型的なＣＲＡＡを図１５に示す。ＩＬ１βに対する触媒性抗体を誘導する典型的なＣＲＡＡを図１６および１７に示す。ボロネート求電子中心を図１７に示す。
【０１３４】
（実施例ＩＶ）
本発明の触媒性抗体での受動免疫
モノクローナル抗体の投与が臨床的に有益である多くの医学的領域がある。器官移植の分野において、インビボにおいてＴ細胞を枯渇させるためにＴ細胞受容体に結合するＭｏＡｂ（ＯＫＴ３）が使用されている。さらに、宿主体移植片疾患を治療するためにＭｏＡｂｓが使用されて、ある程度の成功をおさめている。多発性硬化症の治療におけるＴ細胞の下位集団を枯渇させる抗ＣＤ４ＭｏＡｂの能力を評価する臨床試験が確立されている。
したがって、モノクローナル抗体の投与方法は通常の医師によく知られている。典型的方法および投与スケジュールが、化学療法剤のみを用いる、あるいは腫瘍遺伝子ＨＥＲ２に対する組み換えｍｏＡｂとの組み合わせを用いるフェーズＩＩＩのランダム化され、コントロールされた研究において提供されている。
研究される組み換えヒト化ＭｏＡｂ Ｈｅｒ２のアームに対してランダム化されたすべての患者に４ｍｇ／ｋｇの治療薬を静脈注射投与する。０日目（ＭｏＡｂ ＨＥＲ２輸液初日、あるいは対照群における患者に関するランダム化の日）に付加用量を投与し、次いで、研究期間中１週間ごとに２ｍｇ／ｋｇを静脈投与する。研究のための通院期間中に患者を臨床的評価、身体的試験に指向された徴候（適切な場合には）ならびに研究室的試験によりモニターする。研究期間中決められた間隔ですべての患者についてルーチンの腫瘍評価を行う。すべての不利な出来事を記録する。
ＨＥＲ２モノクローナル抗体に関して上で説明したように本発明の触媒性抗体の投与を行う。ＨＥＲ２の研究と同様に、輸液後に、投与された触媒性抗体の有効性を調べるために患者を評価する。
上記のように投与される触媒性抗体が患者において望ましくない副作用を引き起こす場合、免疫性ＣＲＡＡｓ投与して触媒性抗体の作用を共有結合的に抑制する。
【０１３５】
（実施例Ｖ）
本発明のＣＲＡＡｓを用いる能動免疫
すでに開発した方法を用い、所望抗原に対する防御的抗体を誘導するように設計されたワクチンを用いて能動免疫を行う（８２、８３）。例えば、アラムのごとき適当なアジュバント処方と混合されたＣＲＡＡｓを最大抗体合成のために最適化された用量（１００〜１０００μｇ／ｋｇ体重）で筋肉内投与し、血清中の触媒性抗体のレベルがプラトーレベルに達するまで、４週間間隔で２または３回の追加免疫を行うことができる。そのようにして生成した防御免疫は数年間持続すると考えられる。なぜなら、攻撃生物または癌細胞に曝露された場合に刺激されて抗体を産生する特異的で寿命の長いメモリー細胞が、ワクチン投与により生成するからである。触媒性抗体濃度を調べるための説明および方法は実施例ＩおよびＩＩに示されている。大部分の抗原に対する抗体合成応答はＴ細胞依存性であるので、実施例ＩＩにおいてｇｐ１２０の場合に説明したようにペプチド合成により適切なＴ細胞エピトープを免疫原に導入することができる。別法として、必要ならば、Ｌｙｓの側鎖アミノ基またはＣｙｓの側鎖スルフヒドリル基を介してキーホルリムペットヘモシアニンのごとき担体をＣＲＡＡに抱合させて、抗体応答を最大化させることもできる。
【０１３６】
文献
1.   Paul, S., Volle, D.J., Beach, C.M., Johnson, D.R., Powell, M.J. and Massey, R.J. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. Science 244:1158-1162, 1989.
2.             Paul, S., Sun, M., Mody, R., Eklund, S.H., Beach, C.M., Massey, R.J. and Hamel, F. Cleavage of vasoactive intestinal peptide at multiple sites by autoantibodies. J. Biol. Chem. 256:16128-16134, 1991.
3.            Suzuki, H., Imanishi, H., Nakai, T. and Konishi, Y.K.  Human autoantibodies that catalyze the hydrolysis of vasoactive intestinal polypeptide. Biochem. (Life Sci. Adv.) 11:173-177, 1992.
4.            Li, L., Kaveri, S., Tyutyulkova, S., Kazatchkine, M. and Paul, S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies. J. Immunol. 154:3328-3332, 1995.      
5.            Shuster, A.M., Gololobov, G.V., Kvashuk, O.A., Bogomolova, A.E., Smirnov, I.V. and Gabibov, A.G. DNA hydrolyzing autoantibodies. Science 256:665-667, 1992.
6.            Gololobov, G.V., Chernova, E.A., Schourov, D.V., Smirnov, I.V., Kudelina, I.A. and Gabibov, A.G. Cleavage of supercoiled plasmid DNA by autoantibody Fab fragment: Application of the flow linear dichroism technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:254-257, 1995.
7.            Tawfik, D., Chap, R., Green, B., Sela, M. and Eshhar, Z. Unexpectedly high occurrence of catalytic antibodies in MRL/lpr and SJL mice immunized with a transition state analog. Is there a linkage to autoimmunity? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2145-2149, 1995.
8.            Davies, D.R. and Chacko, S. Antibody Structure. Acc. Chem. Res. 26:421-427, 1993.
9.            Sun, M., Gao, Q-S., Li, L. and Paul, S. Proteolytic activity of an antibody light chain. J. Immunol. 153:5121-5126, 1994.
10.            Gao, Q-S., Sun, M., Tyutyulkova, S., Webster, D., Rees, A., Tramontano, A., Massey, R. and Paul, S. Molecular cloning of a proteolytic antibody light chain. J. Biol. Chem. 269:32389-32393, 1994. 
11.            Titmas, R.C., Angeles, T.S., Sugasawara, R., Aman, N., Darsley, M.J., Blackburn, G. and Martin, M.T.  Aspects of antibody-catalyzed primary amide hydrolysis.  Appl. Biochem. Biotechnol. 47:277-290, 1994.
12.            Gao, Q.-S., Sun, M., Rees, A. and Paul, S. Site-directed mutagenesis of proteolytic antibody light chain. J. Mol. Biol. 253:658-664, 1995.
13.            Lerner, R.A., Benkovic, S.J. and Schultz, P.G.  At the crossroads of chemistry and immunology: Catalytic antibodies.  Science 252:659-667, 1991.
14.            Tyulkova, S., Gao, Q-S., Thompson, A., Rennard, A. and Paul, S. light chains selected from an asthma patient by phage display. Biochem. Biophys. Acta. 1316:217-223, 1996.
15.            Batra, S.K., Rasheed, A., Bigner, S.H. and Bigner, D.D.  Oncogenes and anti-oncogenes in human central nervous system tumors.  Lab. Invest. 71:621 637, 1994.
16.            Modjtahei, H., Ecc les, S.A., Box, G., Styles, J. and Dean, J.  Antitumor activity of combinations of antibodies directed against different epitopes on the extracellular domain of the human EGF receptor.  Cell Biophys. 22:129-146, 1993.
17.            Modjtahedi, H., Eccles, S., Sandle, J., Box, G., Titley, J. and Dean, C.  Differentiation or immune destruction: two pathways for therapy of squamous cell carcinomas with antibodies to the epidermal growth factor receptor.  Cancer Res. 54:1695-1701, 1994.
18.            Wikstrand, C.J., Hale, L.P., Batra, S.K., Hill, M.L., Humphrey, P.A., Kurpad, S.N., McLendon, R.E., Moscatello, D., Pegram, C.N., Reist, C.J., Traweek, S.T., Wong, A.J., Zalutsky, M.R. and Bigner, D.D.  Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas.  Cancer Res. 55:3140-3148, 1995.
19.            Faillot, T., Magdelenat, H., Mady, E., Stasiecki, P., Fohanno, D., Gropp, P., Poisson, M. and Delattre, J.Y.  A phase I study of an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for the treatment of malignant gliomas. Neurosurgery 39:478-83, 1996.
20.            Stragliotto, G., Vega, F., Stasiecki, P., Gropp, P., Poisson, M. and Delattre, J.Y. Multiple infusions of anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) monoclonal antibody (EMD 55,900) in patients with recurrent malignant gliomas.  Eur. J. Cancer 32A:636-40, 1996.
21.            Nagane, M., Coufal, F., Lin, H., Bogler, O., Cavenee, W.K. and Huang, H.H.  A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducing apoptosis.  Cancer Res. 56:5079-5086, 1996.
22.            Brown, P.M., Debanne, M.t., Grothe, S., Bergsma, D., Caron, Kay, C. and O' Connor-McCourt, M.D. The extracellular domain of the epidermal growth factor receptor. Studies on the affinity and stoichiometry of binding, receptor dimerization and a binding-domain mutant. Eur. J. Biochem 225:223-233, 1994.
23.            Sampson, N.S. and Barton, P.A.  Peptidic Phophonylating agents as irreversible inhibitors of serine proteases and models of the tetrahedral intermediates.  Biochemistry 30:22255-2263, 1991.
24.            Baylis, E.K., Campbell, C.D., and Dingwall, J.G.  1-aminoalkylphoshonous acids. Part 1. Isosteres of the protein amino acids J. Chem. Soc. Perkin Trans. Part I: 2845-2853, 1984
25.            Tyutyulkova, S., Gao, Q-S. and Paul, S. Selection of human immunoglobulin light chains from a phage display library. Antibody Engineering Protocols. Ed., Paul S. (Methods in Molecular Biology Series, Humana Press, Totowa, NJ) 51:377-394,1995. 
26.            Clackson, T., Hoogenboom, H.R., Griffiths, A.D. and Winter, G.  Making antibody fragments using phage display libraries.  Nature 352:624-628, 1991.
27.            McAfferty, J., Fitzgerald, K.J., Earnshaw, J., Chiswell, J., Chiswell, D.J., Link, J., Smith, R. Kenten, J. Selection and rapid purification of murine antibody fragments that bind a transition state analog yb phage display.  Appl. Biochem. Biotechnol. 47:157-174, 1994.
28.            Sun, M., Mody, B., Eklund, S.H. and Paul, S. VIP hydrolysis by antibody light chains. J. Biol. Chem. 266:15571-15574, 1991.
29.            Bone, R., Sampson, N.S., Bartlett, P.A. and Agard, D.A.  Crystal structures of a-lytic proteaase complexes with irreversibly bound phophonate esters.  Biochemistry 30:2263-2272, 1991.
30.            Lax, I., Fischer, R., Ng, C., Segre, J., Ullrich, A., Givol, D. and Schlessinger, J.  Noncontiguous regions in the extracellular domain of EGF receptor define ligand-binding specificity.  Cell Regul. 2:337-345, 1991.
31.            Moore, J. and Trkola, A.  HIV type 1 coreceptors, neutralization serotypes, and vaccine development.  AIDS Res. Hum. Retroviruses 13:733-736, 1997              
32.            Thali, M., Furman, C., Ho, D., Robinson, J., Tilley, S., Pinter, A. and Sodroski, J. Discontinuous, conserved neutralization epitopes overlapping the CD4-binding region of human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein.  J. Virol. 66:5635 5641, 1992.
33.            Wang, W-K., Essex, M. and Lee, T-H.  The highly conserved aspartic acid residue between hypervariable regions 1 and 2 of human immunodeficiency virus type 1 gp120 is important for early stages of virus replication.  J. Virol. 69:538-542, 1995.
34.            Ivanoff, L.A., Dubay, J.W., Morris, J.F., Roberts, S.J., Gutshall, L., Sternberg, E.J., Hunter, E., Matthews, T.J. and Petteway, S.R.J. V3 loop region of the HIV-1 gp120 envelope protein is essential for virus infectivity.  Virology 187:423-432, 1992.
35.            Pollard, S., Meier, W., Chow, P., Rosa, J. and Wiley, D.  CD4-binding regions of human immunodeficiency virus envelope glycoprotein gp120 defined by proteolytic digestion.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11320-11324, 1991.
36.            Kalaga, R., Li, L., O'Dell, J. and Paul, S. Unexpected presence of polyreactive catalytic antibodies in IgG from unimmunized donors and decreased levels in rheumatoid arthritis. J. Immunol. 155:2695-2702, 1995.
37.            Watanabe-Fukunaga, R., Brannan, C.I., Copeland, N.G., Jenkins, N.A. and Nagata, S., Lymphoproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis.  Nature 356:314-317, 1992.
38.            Tramontano, A., Janda, K.D. and Lerner, R.A.  Chemical reactivity at an antibody binding site elicited by mechanistic design of a synthetic antigen.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6736-6740, 1986.
39.            Bermas, B.L., Petri, M., Berzofsky, J.A., Waisman, A., Shearer, G.M. and Mozes, E. Binding of glycoprotein120 and peptides from the HIV-1 envelope by autoantibodies in mice with experimentally induced systemic lupus erythematosus and in patients with the disease.  AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:1071-1077, 1994.
40.            Paul, S., Li, L., Kalaga, R., Wilkins-Stevens, P., Stevens, F.J. and Solomon, A.  Natural catalytic antibodies: Peptide hydrolyzing activities of Bence Jones proteins and VL fragment.  J. Biol. Chem. 270:15257-15261, 1995.
41.            Pollack, S.J., Hsiun, P. and Schultz, P.G.  Sterospecific hydrolysis of alkyl esters by antibodies.  J. Am. Chem. Soc. 111:5962-5964, 1989.
42.            Ahlers, J.D., Pendleton, C.D., Dunlop, N., Minassian, A., Nara, P.L. and Berzofsky, J.A.  Construction of an HIV-1 peptide vaccine containing a multideterminant helper peptide linked to a V3 loop peptide 18 inducing strong neutralizing antibody responses in mice of multiple MHC haplotypes after two immunizations.  J. Immunol. 150:5647-5665, 1993.            
43.            Panina-Bordignon, P., Tan, A., Termijtelen, A., Demotz, S., Corradin, G. and Lanzavecchia, A.  Universally immunogenic T cell epitopes: promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells.  Eur. J. Immunol. 19:2237-2242, 1989.
44.            Ahlers, J.D., Dunlop, N. Alling, D.W., Nara, P.L. and Berzofsky, J.A.  Cytokine-in-adjuvant steering of the immune response phenotype to HIV-1 vaccine constructs.  J. Immunol. 158:3947-3958, 1997.
45.            Sattentau, Q.J. and Moore, J.P.  Human Immunodeficiency Virus Type 1 Neutralization Is Determined by Epitope Exposure on the gp120 Oligomer.  J. Exp. Med. 182:185-196, 1995.
46.            Bone R., Balk R., Cerr F (1992).  Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM consensus conference committee. American college of chest physicians/society of critical care medicine.  Crit Care Med 20, 864-874.
47.            Parks D & Granger D. (1986a).  Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation.  Am J Physiol 250, G749-G753.
48.            Parks D. & Granger D. (1986b).  Xanthine oxidase: biochemistry, distribution, and physiology.  Acta Physiol Scand 548, 87-100.
49.            Carden D., Smith J. & Korthuis R. (1990).  Neutrophil-mediated microvascular dysfunction in postischemic canine skeletal muscle: role of granulocyte adherence.  Circ Res 66, 1436-1444.
50.            Grisham M. Hernandex L. & Granger D., (1989).  Adenosine inhibits ischemia-reperfusion induced leukocyte adherence and extravasation.  Am J Physiol 257, H1334-H1339.
51.            Jerome S., Smith C. & Korthuis R. (1993).  CD18-dependent adherence reactions play an important role in the development of the no-reflow
phenomenon.  Am J Physiol 263, H1637-H1642.
52.            Morris J., Haglund U. & Bulkley G. (1987).  The protection from postischemic injury by xanthine oxidase inhibition: blockade of free radical generation or purine salvage.  Gastroen, 92 1542-1547.
53.            Charriaut-Marlangue E., Margaill I., Represa A., Popovici T., Plotkine M. & Ben-Ari (1996).  Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia: an in situ DNA fragmentation analysis.  J Cereb Blood Flow Metab 16:186, 33-41.
54.            Johnson E., Greenlund L., Akins P. & Hsu C. (1995).  Neuronal apoptosis: current understanding of moleular mechanisms and potential role in ischemia brain injury.  J Neurotrauma 12, 843-852.
55.            Li Y., Chopp M., Jiang N., Yao F. & Zaloga E. (1995) Temporal profile of in situ DNA fragmentation after transient middle cerebral artery occlusion in the rat.  Cereb Blood Flow Metab 15, 389-397.
56.            Hearse D. (1977).  Reperfusion of ischemic myocardium.  J Mol Cell Cardio 9, 605-615.
57.            Hearse D., Humphrey R. & Chain E. (1973).  Abrupt reoxygenation of the anoxic potassium arrested rat heart: a study of myocardial enzyme release.   J Mol Cell Cardio 5, 395-407.
58.            Korthuis R., Smith J. & Carden D. (1989).  Hypoxic reperfusion attneuates postischemic microvascular injury.  Am J Physio 256, H315-H319.
59.            Perry M. & Wadhaw S. (1988).  Gradual reintroduction of oxygen reduces reperfusion injury in cat stomach.  Am J Physiol 254, 366-372.
60.            Walker P., Lindsay T., Labbe R., Mickle D. & Romaschine A. (1987).  Salvage of skeletal muscle with free radical scavengers.  J Vasc Surg 6, 68-75.
61.            Wright J., Fox D., Kerr J., Valeri C. & Hobson R. (1988).  Rate of reperfusion blood flow modulates reperfusion injury in skeletal muscle.  J Surg Res 44, 754-759.
62.            Bolli F., Jeroudi M., Patel B., DuBose C., Lai E. (1989).  Direct evidence that oxygen-derived free radicals contribute to post ischemic myocardial dysfunction in the intact dog.  Proc Natl Acad Sci USA 86, 4695-4699.
63.            Bolli R., Patel B., Jeroudi M., Lai E., & McKay P. (1988).  Demonstration of free radical generation in stunned myocardium of intact dogs with the use of the spin trap a-phenyl-N-tert-butyl nitrone.   J Clin Invest 82, 476-485.
64.            Burton K. (1988).  Evidence of direct toxic effects of free radicals on the myocardium.  Free Rad Bio Med 4, 15-24.
65.            Gupta M. & Singhal P. (1989).  Time course of structure, function, and metabolic changes due to an exogenous source of oxygen metabolites in the rat heart.  Can J Physiol Pharmcol 67, 1549-1559.
66.            Parks D., Shah A. & Granger D. (1984).  Oxygen radicals: effects on intestinal vascular permeability.  Am J Physiol 247, G167-G170.
67.            Przyklenk K., Whittaker P. & Kloner R. (1990).  In vivo infusion of oxygen free radical substrates causes myocardial systolic, but not diastolic, dysfunction.  Am Heart J 119, 807-815.
68.            Downey J. (1990).  Free radicals and their involvement during long term myocardial ischemia and reperfusion.  Annu Rev Physiol 52, 487-504.
69.            Granger D. (1988).  Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury.  Am J Physiol 255, H1269-H1275.
70.            Chien K & Han A. (1984).  Accumulation of unesterified arachidonic acid in ischemic canine myocardium: relationship to a phophatidylcholine deacylation reacylation cycle and the depletion of membrane phospholipids.  Circ Res 54, 312-322.
71.            Moncada S. & Higgs A. (1993).  The L-argine-nitric oxide pathway.  N Engl J Med 329, 2002-2012.
72.            Patel V., Yellow D., Singh K., Neild G. & Woolfson R. (1993).  Inhibition of nitric oxide limits infarct size in the in situ rabbit heart.  Biochem Biophys Res Commun 194, 234-238.
73.            Depre C., Vanoverschelde J., Goudemant J., Mottet I. & Hue L. (1995).  Protection against ischemic injury by nonvasoactive concentrations of nitric oxide synthase inhibitors in the perfused rabbit heart.  Circulation 92:7, 1911-1918.
74.            Naseem S., Kontos M., Rao P., Jesse R., Hess M. & Kukreja R. (1995).  Sustained inhibition of nitric oxide by NG-nitro-L-arginine improves myocardial function following ischemia/reperfusion in isolated perfused rat heart.  J Moll Cell Cardio 27, 419-426.
75.            Noiri E., Peresleni T., Miller F. & Goligorsky M. (1996).  In vivo targeting of inducible NO synthase with oligodeoxynucleotides protects rat kidney against ischemia.  J Clin Invest 97:10, 2377-2383.
76.            Hara H., Friedlander R., Gagliardini V., Ayata C., Fink K., Huang Z., Shimizu-Sasmata M., Yuan J. & Moskowitz. (1997).  Inhibition of interleukin 1B converting enzyme family proteases reduces ischemic and excitotoxic neuronal damage.  Proc Natl Acad Sci USA 94, 2007-2012.
77.            Szabolcs M., Michler R., Yang X., Aji W., Roy D., Athan E., Sciacca R., Minanov O. & Cannon P. (1996).  Apoptosis of cardiac myocytes during cardiac allograft rejection: relation to induction of nitric oxide synthase.  Circulation 94:7, 1665-1673.
78.            Shito M., Wakabayashi G., Ueda M., Shimazu M., Shirasugi N., Endo M., Mukai M. & Kitajima M. (1997).  Interleukin 1 receptor blockade reduces tumor necrosis factor production, tissue injury, and mortality after hepatic ischemia-reperfusion in the rat.  Transplant 63:1, 143-148.
79.            Casey L, Balk R., & Bone R. (1993).  Plasma cytokine and endotoxin levels correlate with survival in patients with the sepsis syndrome.  Ann Intern Med 119, 771-778.
80.            Pruitt J., Copeland E. & Moldawer L. (1995).  Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism in sepsis, systemic inflammatory response syndrone, and septic shock.  Shock 3:4, 235-251.
81.            Fisher C.,  Slotman G., Opal S., Pribble J., Bone R., Emmanuel G., Ng D., Bloedow D. & Catalano M. (1994b).  Initial evaluation of human recombinant interleukin-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome: a randomized, open-label, placebo-controlled multicenter trial. The IL-1RA sepsis syndrome study group.  Crit Care Med 22, 12-21.
82.            Robinson, A., Farrar, G.H, Wiblin, C.N., Methods in Molecular Medicine Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996.
83.            Dudgeon, J.A, Cutting, W.A.M., Chapman, Hall, Immunization: Principles and Practice, London 1991.
【０１３７】
本発明の特定の好ましい具体例を上で説明し、特別に例示したが、本発明をかかる具体例に限定するものではない。特許請求の範囲に記載のように、本発明の範囲および精神から離れることなく本発明に対して種々の修飾を行うことができる。
【図１】
2010031016.tif 000002
【図２】
2010031016.tif 000003
【図３】
2010031016.tif 000004
【図４】
2010031016.tif 000005
【図５】
2010031016.tif 000006
【図６】
2010031016.tif 000007
【図７】
2010031016.tif 000008
【図８】
2010031016.tif 000009
【図９】
2010031016.tif 000010
【図１０】
2010031016.tif 000011
【図１１】
2010031016.tif 000012
【図１２】
2010031016.tif 000013
【図１３】
2010031016.tif 000014
【図１４】
2010031016.tif 000015
【図１５】
2010031016.tif 000016
【図１６】
2010031016.tif 000017
【図１７】
2010031016.tif 000018
【図１８】
2010031016.tif 000019
【図１９Ａ】
2010031016.tif 000020
【図１９Ｂ】
2010031016.tif 000021
【配列表】
2010031016000001.app