(57)【要約】      （修正有）【課題】多数の候補物質について簡便に肌荒れに有効かどうかを評価することのできるスループットの高いスクリーニング系を構築するために、生体で起こる肌荒れを再現した肌荒れモデルの提供。【解決手段】培養下で維持された表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮、及び当該モデル表皮を用いた角層透明度を高める薬剤の評価方法。前記評価方法は、前記薬剤と、培養下で維持された表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮とを用意するステップと、前記薬剤を前記肌荒れモデル表皮に投与するステップと、前記肌荒れモデル表皮の全透過率を得るステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養下で維持された表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなることを特徴とする、肌荒れモデル表皮。
【請求項２】
培養下で維持された表皮組織から単離された後、相対湿度３０％の条件下で乾燥された角層シートからなることを特徴とする、肌荒れモデル表皮。
【請求項３】
培養下で維持された表皮組織から単離された後に低湿下で乾燥された角層シートからなり、高湿下で乾燥されたものより全透過率が低いことを特徴とする、肌荒れモデル表皮。
【請求項４】
角層透明度を高める薬剤の評価方法であって、
前記薬剤と、培養下で維持された表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮とを用意するステップと、
前記薬剤を前記肌荒れモデル表皮に投与するステップと、
前記肌荒れモデル表皮の全透過率を得るステップとを含むことを特徴とする、角層透明度を高める薬剤の評価方法。
【請求項５】
角層透明度を高める薬剤の評価方法であって、
前記薬剤と、培養下で維持された表皮組織とを用意するステップと、
前記薬剤を前記培養下で維持された表皮組織に投与するステップと、
前記表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮を調製するステップと、
前記肌荒れモデル表皮の全透過率を得るステップとを含むことを特徴とする、角層透明度を高める薬剤の評価方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の方法によってスクリーニングされるステップを含むことを特徴とする、肌荒れを改善する薬剤の製造方法。
【請求項７】
皮膚バリヤ機能を改善及び／又は向上させる活性を有する薬剤の評価方法であって、
前記薬剤と、培養下で維持された表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮とを用意するステップと、
前記薬剤を前記肌荒れモデル表皮に投与するステップと、
前記肌荒れモデル表皮の全透過率を得るステップとを含むことを特徴とする、皮膚バリヤ機能を改善及び／又は向上させる活性を有する薬剤の評価方法。
【請求項８】
皮膚バリヤ機能を改善及び／又は向上させる活性を有する薬剤の評価方法であって、
前記薬剤と、培養下で維持された表皮組織とを用意するステップと、
前記薬剤を前記培養下で維持された表皮組織に投与するステップと、
前記表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮を調製するステップと、
前記肌荒れモデル表皮の全透過率を得るステップとを含むことを特徴とする、皮膚バリヤ機能を改善及び／又は向上させる活性を有する薬剤の評価方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の方法によってスクリーニングされるステップを含むことを特徴とする、肌荒れを改善する薬剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥させた表皮を用いた肌荒れモデルと、これを用いた角層透明度を高める薬剤の評価方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
肌荒れに有効な化粧品及びその原料を開発するための評価方法として、従来は生体の皮膚が用いられてきた。肌荒れは、湿度の低い冬期にはよく発生するが、湿度の高い夏期にはあまり起こらない。そのため、自然に肌荒れを起こしたヒト被検者の皮膚を使って、肌荒れに有効な物質を高いスループットで通年スクリーニングすることは実際的ではない。人工的に肌荒れを惹起させるために界面活性剤のような化学物質を皮膚に適用する場合には、該化学物質が評価対象の物質と反応するため、肌荒れのスクリーニング方法としての有用性が限定される。
【０００３】
肌荒れになった皮膚では、角層は粉を吹いたように不透明になり、皮膚のバリヤ機能が失われるため経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）が増加し、角層水分量が低下する。非特許文献１は乳がん除去手術の際に採取された胸部の皮膚から単離された角層シートのＴＥＷＬを測定する装置及び方法を開示する。しかし、前記装置及び方法を用いるＴＥＷＬの測定に関する報告は、低湿時などに起る肌荒れとの関連を明らかにしていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎｏｒｌｅｎ，  Ｌ．ら、Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１３：５３３−５４０，１９９９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、多数の候補物質について簡便に肌荒れに有効かどうかを評価することのできるスループットの高いスクリーニング系を構築するために、生体で起こる肌荒れを再現した肌荒れモデルを開発する必要がある。また、前記肌荒れモデルを利用する肌荒れを改善する薬剤の製造方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、培養下で維持された表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮を提供する。
【０００７】
本発明は、培養下で維持された表皮組織から単離された後相対湿度３０％の条件下で乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮を提供する。
【０００８】
本発明は、培養下で維持された表皮組織から単離された後に低湿下で乾燥された角層シートからなり、高湿下で乾燥されたものより全透過率が低いことを特徴とする肌荒れモデル表皮を提供する。
【０００９】
本発明は、角層透明度を高める薬剤の評価方法を提供する。前記評価方法は、前記薬剤と、培養下で維持された表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮とを用意するステップと、前記薬剤を前記肌荒れモデル表皮に投与するステップと、前記肌荒れモデル表皮の全透過率を得るステップとを含む。
【００１０】
本発明は、角層透明度を高める薬剤の評価方法を提供する。前記評価方法は、前記薬剤と、培養下で維持された表皮組織とを用意するステップと、前記薬剤を前記培養下で維持された表皮組織に投与するステップと、前記表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮を調製するステップと、前記肌荒れモデル表皮の全透過率を得るステップとを含む。
【００１１】
本発明は、本発明の角層透明度を高める薬剤の評価方法によってスクリーニングされるステップを含む、肌荒れを改善する薬剤の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明は、皮膚バリヤ機能を改善及び／又は向上させる活性を有する薬剤の評価方法を提供する。前記評価方法は、前記薬剤と、培養下で維持された表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮とを用意するステップと、前記薬剤を前記肌荒れモデル表皮に投与するステップと、前記肌荒れモデル表皮の全透過率を得るステップとを含む。
【００１３】
本発明は、皮膚バリヤ機能を改善及び／又は向上させる活性を有する薬剤の評価方法を提供する。前記評価方法は、前記薬剤と、培養下で維持された表皮組織とを用意するステップと、前記薬剤を前記培養下で維持された表皮組織に投与するステップと、前記表皮組織から単離された後に乾燥された角層シートからなる肌荒れモデル表皮を調製するステップと、前記肌荒れモデル表皮の全透過率を得るステップとを含む。
【００１４】
本発明は、本発明の皮膚バリヤ機能を改善及び／又は向上させる活性を有する薬剤の評価方法によってスクリーニングされるステップを含む、肌荒れを改善する薬剤の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の透明度測定装置の模式図。
【図２】異なる湿度条件で乾燥させた角層シートの角層全透過率を示すグラフ。
【図３】異なる湿度条件で乾燥させた角層シートの水分蒸散量を示すグラフ。
【００１６】
本明細書において「培養下で維持される表皮組織」とは、ヒト又は実験動物の皮膚から採取した皮膚組織か、胚性幹細胞又は成体幹細胞を試験管内で分化させて得られた皮膚組織かを重層構造を維持しながら試験管内で培養した組織をいう。特にヒトについては、ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング）のような商業的に入手可能なヒト3次元培養表皮モデル製品を用いる場合がある。
【００１７】
培養下で維持された表皮組織から角層シートを単離するには、前記表皮組織をカルシウムイオン及びマグネシウムイオン濃度を制御した生理食塩水中でタンパク質分解酵素で処理する等の手法を用いることができる。前記角層シートを表皮組織から剥離又は単離した直後、あるいは、なんらかの処理後に全透過率が測定される場合もある。代替的には、温度及び湿度が制御可能な恒温恒湿インキュベータを用いて調製した後に全透過率が測定される場合がある。
【００１８】
本発明において、「低湿下で乾燥」するとは、相対湿度３０％以下で乾燥するとことをいう。本発明のおいて「高湿下で乾燥」するとは、前記「低湿下で乾燥」する条件より高いいずれかの相対湿度で乾燥することをいう。「高湿下で乾燥」する条件としては、３０％を超えるいずれかの相対湿度で乾燥することが好ましく、６０％以上の相対湿度で乾燥することがより好ましい。
【００１９】
本明細書において「角層透明度」とは、本発明の角層シートの透明性の程度をいう。角層透明度は、本発明の角層シートを透過して測光した白色光の強度の測定値を、該生体組織サンプルのかわりにブランク状態で測光した白色光の強度の測定値で除算した百分率である、全透過率によって評価される。
【００２０】
本発明の角層透明度の評価装置は、白色光源と、生体組織サンプルの保持具と、集光器と、測光器とを含み、前記白色光源、前記生体組織サンプルの保持具、前記集光器及び前記測光器は、前記白色光源から発して、前記保持具に保持される前記生体組織サンプルを透過した光だけが前記集光器に導かれ、該集光器から導かれた光の強度が前記測光器によって計測されるように配置される。
【００２１】
本発明の角層透明度の評価装置において、白色光源とは、発光スペクトルの分布が可視領域のほぼ全域にわたっていて肉眼で白色に見えるような光の光源をいう。生体組織サンプルの保持具は、新鮮な皮膚から剥離された角層が付着した前記透明な固体支持体や、培養下で維持される表皮組織から調製された角層シートを含むがこれらに限られない生体組織サンプルが前記白色光源からの光路を横切る位置に保持することができることを条件としていかなる形状のものであってもかまわない。集光器は、前記生体組織サンプルを透過した光を集めて均一化して、測光器に導くことができることを条件としていかなる形状及び／又は構造のものであってもかまわない。好ましい集光器は積分球である。前記生体組織サンプルを透過した光だけが前記集光器に入射するように、前記生体組織サンプルと集光器の間に遮光体が設けられる場合がある。好ましい遮光体は暗幕である。測光器は集光器から導かれた可視光の強度を測定することができることを条件としていかなる種類の測光器であってもかまわない。好ましい測光器は光電素子である。
【００２２】
本明細書において、「皮膚バリヤ機能」は、経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）によって評価される。ＴＥＷＬの測定は、フランツセル（ＰｅｒｍｅＧｅａｒ，Ｉｎｃ．、米国）のように、鉛直方向に隣接し、着脱可能に角層シートで隔てられた２個のチャンバーを有する装置を用いて実施される。前記チャンバーのうち下のチャンバーには水溶液を満たし、上のチャンバーには空気が入っていて、前記角層シートを通過して下のチャンバーから上のチャンバーの空気に流入した水分蒸散量は、ＶａｐｏＭｅｔｅｒ（Ｄｅｌｆｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．、フィンランド）のようなエバポリメータを用いて測定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
方法
（角層の調製）
１２穴プレートの３次元ヒト表皮培養モデル（ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ、株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング）を、０．１％トリプシン溶液／等張リン酸緩衝液中で３７°Ｃで３０分間インキュベーションすることにより、直径約１０mmの角層シートを調製した。該角層シートを、恒温恒湿槽ＭＴＨ−２２００（三洋電機株式会社）を用いて、温度３４°Ｃ、相対湿度３０％、６０％又は９０％の条件下で１８時間乾燥させた。
【００２５】
（角層全透過率の測定）
図１に本発明の透明度測定装置の模式図を示す。本発明の透明度測定装置は、ＣＩＥ（国際照明委員会）標準光源Ｃ規格の白色光源と、角層サンプルの保持具（図示されない）と、角層サンプルを透過しない光の遮光体としての暗幕と、角層サンプルを透過した光を均一化する積分球と、積分球から導かれた光の強度を測定する測光器（図示されない）とを含む。１−１で説明したとおり調製された角層シートを本発明の透明度測定装置に装着し、前記光源からの白色光を照射して前記角層シートを透過した光を積分球に導いて均一化された光の強度を測定した。結果は、全透過率、すなわち、前記角層シートを透過した光の強度の測定値を、角層シートを装着しないブランク状態で前記光源からの白色光を直接積分球に導いた光の強度の測定値で除算した百分率で表した。
【００２６】
（角層からの水分蒸散量の測定）
フランツセル（ＰｅｒｍｅＧｅａｒ，Ｉｎｃ．、米国）に乾燥処理後の角層シートを装着した。前記角層シートに対してレシーバー側を水で満たし、ドナー側を空に保つことにより、前記角層シートの上面を気相に、下面を液相に曝して、角層シートを気液界面に配置した。角層からの水分蒸散が安定する２時間後にＶａｐｏＭｅｔｅｒ（Ｄｅｌｆｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．、フィンランド）をネールモードで水分蒸散量を測定した。
【００２７】
結果
図２は、異なる湿度条件で乾燥させた角層シートの角層全透過率を示すグラフである。図２の縦軸は全透過率で、横軸は角層シート乾燥時の湿度である。各乾燥条件における全透過率の値は４回の測定による算出値の平均値を示しており、誤差棒は標準偏差を示す。図２に示すとおり、乾燥操作時の相対湿度が低いほど、角層シートの全透過率は低いという結果が得られた。ここで、相対湿度３０％で乾燥させた角層シートの全透過率の算出値と、６０％又は９０％で乾燥させた角層シートの全透過率の算出値との間で、対応の無いt検定を実施したところ、ともに危険率ｐ＜０．００１で有意であった。
【００２８】
図３は、異なる湿度条件で乾燥させた角層シートの水分蒸散量を示すグラフである。図３の縦軸は水分蒸散量（ｇ／ｍ２ｈｒ）で、横軸は角層シート乾燥時の湿度である。各乾燥条件における全透過率の値は４回の測定による算出値の平均値を示しており、誤差棒は標準偏差を示す。図３に示すとおり、乾燥操作時の相対湿度が低いほど、角層シートからの水分蒸散量は高いという結果が得られた。ここで、相対湿度３０％で乾燥させた角層シートからの水分蒸散量の測定値と、６０％又は９０％で乾燥させた角層シートからの水分蒸散量の測定値との間で、対応の無いt検定を実施したところ、ともに危険率ｐ＜０．００５で有意であった。
【００２９】
図２及び３の結果から、相対湿度３０％の条件下で乾燥させた角層は、６０％又は９０％で乾燥させた角層と比較して透明度及びバリア機能が低く、冬季の乾燥による肌荒れ状態の皮膚をより適切に表現していることがわかった。したがって、前記相対湿度３０％の条件下で乾燥させた角層は、肌荒れ皮膚モデルとして利用可能であることが明らかになった。
【図１】
2010172200.tif 000002
【図２】
2010172200.tif 000003
【図３】
2010172200.tif 000004