(57)【要約】【課題】フラノースやピラノースといった糖の骨格の違い、デオキシ糖といった置換基の有無、あるいは天然型や非天然型といった糖の種類に影響されることの無い、汎用性の高い、アノマー選択的な１−リン酸化糖誘導体ならびにヌクレオシドの製造方法を得ること。【解決手段】１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、一方を結晶化することで平衡を傾け、選択的に望む異性体のみを製造する。さらに、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用により、得られた１−リン酸化糖誘導体と塩基より、高い立体選択性と収率でヌクレオシドを製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に晶析することによりアノマー混合物間の平衡を傾け、１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に製造する方法。
【請求項２】
下記式（１）
【化１】
2010031037.tif 000033
〔式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、保護されたヒドロキシメチル基または保護されたカルボキシル基を表し、Ｒ3はアシル基を表し、Ｒ4は水酸基の保護基を表し、Ｘはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｍは１から３の整数を表し、ｎは０または１を表し、ｐおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｐ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕で示される１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に晶析することによりアノマー混合物間の平衡を傾け、１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に製造する方法。
【請求項３】
下記式（１）
【化２】
2010031037.tif 000034
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは請求項２と同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する１−リン酸化糖誘導体モノマーα体またはβ体の一方を選択的に晶析することによりアノマー混合物間の平衡を傾け、１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に製造し、ついでＲ4で表される保護基の脱離反応を行って、下記式（３）
【化３】
2010031037.tif 000035
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基またはカルボキシル基を表し、Ｒ3は水素原子またはアシル基を表し、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは前記と同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体モノマーを製造する方法。
【請求項４】
下記式（４）
【化４】
2010031037.tif 000036
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、置換されたベンゾイル基で保護されたヒドロキシメチル基、または保護されたカルボキシル基を表し、Ｒ4は水素原子または水酸基の保護基を表し、Ｒ3、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｍ、Ｒ3、ｐ、ｑ、ｒは、請求項２と同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体のトリマー、ダイマーもしくはモノマー、またはそれらの塩。
【請求項５】
下記式（５）
【化５】
2010031037.tif 000037
〔式中、ｐおよびｑは０から３の整数を表し、ｒは０または１を表し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚは、請求項２と同義である。（ただし、ｐ、ｑ、ｒは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｒ≦１、ｑ≦２−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦２、ｑ≦４−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕で示される１−リン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩。
【請求項６】
下記式（６）
【化６】
2010031037.tif 000038
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはカルボキシル基を表し、Ｒ3、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは、請求項２と同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩（但し、天然に存在するものを除く）。
【請求項７】
前記式（６）において、ｎ＝１である請求項６記載の１−リン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩。
【請求項８】
Ｒ1がヒドロキシメチル基、Ｒ2が水素原子、ｐおよびｒが０、Ｘがフッ素原子である請求項７記載の１−リン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩。
【請求項９】
下記式（１８）：
【化７】
2010031037.tif 000039
（式中、Ｒ11は保護されたヒドロキシメチル基を表し、Ｒ14は水酸基の保護基を表す。）で示される化合物を、塩基の存在下にリン酸で処理して、下記式（１９）：
【化８】
2010031037.tif 000040
（式中、Ｒ11およびＲ14は、前記と同義であり、ｍは請求項２と同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物とした後、加リン酸分解および異性化し、生成するα体を選択的に晶析させることによるアノマー混合物間の平衡を傾け、下記式（２０）：
【化９】
2010031037.tif 000041
（式中、Ｒ11およびＲ14は前記と同義である。）で示される１−リン酸化糖を製造する方法。
【請求項１０】
下記式（１８）：
【化１０】
2010031037.tif 000042
（式中、Ｒ11は保護されたヒドロキシメチル基を表し、Ｒ14は水酸基の保護基を表す。）で示される化合物を、塩基の存在下にリン酸で処理して、下記式（１９）：
【化１１】
2010031037.tif 000043
（式中、Ｒ11およびＲ14は、前記と同義であり、ｍは請求項２と同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物とした後、加リン酸分解および異性化し、生成するα体を選択的に晶析させることによるアノマー混合物間の平衡を傾け、α体を選択的に製造し、ついで保護基の脱離を行って、２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸を製造する方法。
【請求項１１】
請求項３記載の１−リン酸化糖誘導体モノマーを製造する第一の工程と、該第一の工程で得られた１−リン酸化糖誘導体のリン酸基と塩基との交換反応をヌクレオシドホスホリラーゼにより行う第二の工程により、下記式（８）
【化１２】
2010031037.tif 000044
（式中、Ｂは、独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。また、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは請求項３記載の式（３）と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。
【請求項１２】
ヌクレオシドホスホリラーゼを用いて、請求項６記載の１−リン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応により、下記式（８）
【化１３】
2010031037.tif 000045
（式中、Ｂは請求項１１記載の式（８）と同義であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒは請求項６記載の式（６）と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。
【請求項１３】
ヌクレオシドホスホリラーゼを用いて、請求項７記載の１−リン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応により、式（１０）
【化１４】
2010031037.tif 000046
（式中、Ｂは請求項１１記載の式（８）と同義であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒは請求項７記載の式（７）と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。
【請求項１４】
Ｒ1がヒドロキシメチル基、Ｒ2が水素原子、ｐおよびｒが０、Ｘがフッ素原子である請求項１３記載のヌクレオシドの製造方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸を製造する第一の工程と、該第一の工程で得られた１−リン酸化糖誘導体のリン酸基と塩基との交換反応をヌクレオシドホスホリラーゼにより行う第二の工程による、下記式（２１）
【化１５】
2010031037.tif 000047
（式中、Ｂは請求項１１の式（８）と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。
【請求項１６】
ヌクレオシドホスホリラーゼが、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される１種又は２種以上の酵素であることを特徴とする請求項１１から請求項１５のいずれか一項に記載のヌクレオシドの製造方法。
【請求項１７】
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に代えて、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される１種又は２種以上のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物を用いることを特徴とする請求項１１から請求項１５記載のヌクレオシドの製造方法。
【請求項１８】
ヌクレオシドホスホリラーゼにより、１−リン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応を行う際に、リン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを反応液中に存在させることを特徴とする請求項１１から請求項１５記載の製造方法。
【請求項１９】
リン酸と難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンがカルシウムイオン、バリウムイオン、アルミニウムイオン及びマグネシウムイオンの中から選ばれる1種類以上の金属カチオンである請求項１８記載の製造方法。
【請求項２０】
ヌクレオシドが天然ヌクレオシドである請求項８記載のヌクレオシドの製造方法。
【請求項２１】
下記式(１１)
【化１６】
2010031037.tif 000048
（式中、Ｂ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒは請求項１１記載の式（８）と同義である。）で示される非天然型ヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルオロチミジン、リバビリン、オロチジン、ウラシルアラビノシド、アデニンアラビノシド、２−メチル−アデニンアラビノシド、２−クロル−ヒポキサンチンアラビノシド、チオグアニンアラビノシド、２，６−ジアミノプリンアラビノシド、シトシンアラビノシド、グアニンアラビノシド、チミンアラビノシド、エノシタビン、ジェムシタビン、アジドチミジン、イドクスウリジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデオキシシチジン、ソリブジン、５−メチルウリジン、ビラゾール、チオイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、アロプリノールウラシル、５−フルオロウラシル、２'−アミノウリジン、２'−アミノアデノシン、２'−アミノグアノシン、２−クロル−２'−アミノイノシン、ＤＭＤＣ、ＦＭＤＣは除く）。
【請求項２２】
下記式（１２）
【化１７】
2010031037.tif 000049
（式中、Ｂ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒは請求項１１記載の式（８）と同義である。）で示される非天然ヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルオロチミジン、リバビリン、オロチジン、ウラシルアラビノシド、アデニンアラビノシド、２−メチル−アデニンアラビノシド、２−クロル−ヒポキサンチンアラビノシド、チオグアニンアラビノシド、２，６−ジアミノプリンアラビノシド、シトシンアラビノシド、グアニンアラビノシド、チミンアラビノシド、エノシタビン、ジェムシタビン、アジドチミジン、イドクスウリジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデオキシシチジン、ソリブジン、５−メチルウリジン、ビラゾール、チオイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、アロプリノールウラシル、５−フルオロウラシル、２'−アミノウリジン、２'−アミノアデノシン、２'−アミノグアノシン、２−クロル−２'−アミノイノシン、ＤＭＤＣ、ＦＭＤＣは除く）。
【請求項２３】
下記式（１３）
【化１８】
2010031037.tif 000050
（式中、Ｂ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒは請求項１１記載の式（８）と同義である。）で示されるヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルオロチミジン、リバビリン、オロチジン、ウラシルアラビノシド、アデニンアラビノシド、２−メチル−アデニンアラビノシド、２−クロル−ヒポキサンチンアラビノシド、チオグアニンアラビノシド、２，６−ジアミノプリンアラビノシド、シトシンアラビノシド、グアニンアラビノシド、チミンアラビノシド、エノシタビン、ジェムシタビン、アジドチミジン、イドクスウリジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデオキシシチジン、ソリブジン、５−メチルウリジン、ビラゾール、チオイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、アロプリノールウラシル、５−フルオロウラシル、２'−アミノウリジン、２'−アミノアデノシン、２'−アミノグアノシン、２−クロル−２'−アミノイノシン、ＤＭＤＣ、ＦＭＤＣは除く）。
【請求項２４】
下記式（２０）：
【化１９】
2010031037.tif 000051
（式中、Ｒ11は保護されたヒドロキシメチル基を、Ｒ14は水酸基の保護基を表す。）で示される１−リン酸化誘導体またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１−リン酸化糖誘導体の製造法に関する。１−リン酸化糖誘導体は、広く生物界に存在し、様々な酵素類の反応基質となって、医薬品や栄養食品などの有用な物質の製造原料となる。また、非天然型の１−リン酸化糖誘導体は、抗ウイルス剤や酵素阻害剤の製造原料としての利用が期待されている。
【０００２】
さらに、本発明は、抗ウイルス医薬品、抗ガン医薬品やアンチセンス医薬品などの原料または原体として使用されるヌクレオシド化合物の製造法に関する。
【背景技術】
【０００３】
１−リン酸化糖誘導体の製造法としては、
１）１−臭素化糖とリン酸銀塩とを縮合する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１２１，Ｐ４６５（１９３７）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７８，Ｐ８１１（１９５６）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７９，Ｐ５０５７（１９５７））、
２）１−ハロゲン化糖とジベンジルリン酸のトリエチルアミン塩とを縮合する方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７７，Ｐ３４２３（１９５５）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．８０，Ｐ１９９４（１９５８）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１０６，Ｐ７８５１（１９８４）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５９，Ｐ６９０（１９９４））、
３）１−アセチル化糖を正リン酸と加熱縮合する方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７，Ｐ１１０７（１９６２）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３，Ｐ１１７（１９６６）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３，Ｐ４６３（１９６７）、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５０，Ｐ５７４（１９７２））、
４）１位をイミデート化して活性化した後にジベンジルリン酸と縮合する方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６１，Ｐ１８１（１９７８）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２３，Ｐ４０５（１９８２））、
５）１位をタリウムやリチウムアルコラートとして活性化した後にジベンジルリン酸クロリドで処理する方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．９４，Ｐ１６５（１９８１）、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２３，Ｐ４０５（１９８２））、
６）ヌクレオシドホスホリラーゼの作用によりヌクレオシドの加リン酸分解反応を行って、１−リン酸化糖誘導体を製造する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１８４、Ｐ４３７、１９５０）、
等が知られている。
【０００４】
しかしながら、これらの方法には各々以下の点で問題がある。
【０００５】
１）〜５）の化学的な製造法について共通する問題点としては、１位に隣接する官能基に影響されてα体／β体のアノマー選択性が変化し、望む異性体を選択性良く得るための一般的な合成法を考えることが難しい点があげられる。選択性と高収率を実現するためには、２位アセトキシ基あるいは２位アセトアミノ基などの存在が欠かせず、加えて、２位デオキシ糖が不安定なこともあり、これら合成法の適用範囲は狭い。そのため、２位デオキシピラノースの１−リン酸化体合成については、アノマー選択性の制御が難しいことから、カラムクロマト精製を必要とし、収率の低い結果しか得られていない［Ｃｈｅｍ．Ｚｖｅｓｔｉ ，Ｖｏｌ．２８（１），Ｐ１１５（１９７４）、Ｉｚｖ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ，Ｓｅｒ．Ｋｈｉｍ．，Ｖｏｌ．８，Ｐ１８４３（１９７５）］。
【０００６】
従って、２位デオキシピラノースの１−リン酸化体以上に不安定で選択性の制御が困難な２位デオキシフラノース類の１−リン酸化体に至っては、これまで化学的な製造例は報告されていない。
【０００７】
６）に関しては、イノシンなどごく限られたリボヌクレオシド以外については、ヌクレオシドの供給そのものが困難であり、リボース−１−リン酸などの限られた１−リン酸化糖誘導体しか製造することができない。また、原料となるヌクレオシド自体が高価であるために、コスト的にも満足のゆくものではない。
【０００８】
以上のように、１−リン酸化糖誘導体の工業的な製造方法に関しては、未確立であった。
【０００９】
一方、ヌクレオシドホスホリラーゼはリン酸存在下でヌクレオシドのＮ−グリコシド結合を加リン酸分解できる酵素の総称であり、次式で表される反応を触媒する。
ヌクレオシド＋リン酸（塩） → 塩基 ＋ １−リン酸化糖誘導体
プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンホスホリラーゼに大別される該酵素は、広く生物界に分布し、哺乳類、鳥類、魚類などの組織、酵母、細菌に存在する。この酵素反応は可逆的であり、逆反応を利用した各種ヌクレオシドの合成が以前より知られている。例えば、２´−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基（チミン、アデニンまたはグアニン）からチミジン（特開平０１−１０４１９０号公報）、２´−デオキシアデノシン（特開平１１−１３７２９０号公報）または２´−デオキシグアノシン（特開平１１−１３７２９０号公報）を製造する方法が開示されている。
【００１０】
更に、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５０（１），ＰＰ．１２１〜１２６，（１９８６）では、イノシンをリン酸存在下で、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いた反応により、リボース１−リン酸とヒポキサンチンに分解した後、イオン交換樹脂で単離したリボース１−リン酸と１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミドより、同じくＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、抗ウイルス剤であるリバビリンを製造する技術が報告されている。
【００１１】
しかしながら、前述の理由のように、１−リン酸化糖誘導体の工業的な製造方法が未確立であるため、ヌクレオシドホスホリラーゼの逆反応を利用した汎用性の高いヌクレオシドの工業的な製造方法についても、未確立であった。
【００１２】
また、該酵素の逆反応を利用して、１−リン酸化糖誘導体と塩基よりヌクレオシドを生成させる反応は平衡反応であるため、転化率が向上しないという技術的欠点も存在していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平０１−１０４１９０号公報
【特許文献２】特開平１１−１３７２９０号公報
【特許文献３】特開平１１−１３７２９０号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１２１，Ｐ４６５（１９３７）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７８，Ｐ８１１（１９５６）
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７９，Ｐ５０５７（１９５７）
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７７，Ｐ３４２３（１９５５）
【非特許文献４】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．８０，Ｐ１９９４（１９５８）
【非特許文献５】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１０６，Ｐ７８５１（１９８４）
【非特許文献６】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５９，Ｐ６９０（１９９４）
【非特許文献７】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７，Ｐ１１０７（１９６２）
【非特許文献８】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３，Ｐ１１７（１９６６）
【非特許文献９】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３，Ｐ４６３（１９６７）、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５０，Ｐ５７４（１９７２）
【非特許文献１０】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６１，Ｐ１８１（１９７８）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２３，Ｐ４０５（１９８２）
【非特許文献１１】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．９４，Ｐ１６５（１９８１）
【非特許文献１２】Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２３，Ｐ４０５（１９８２）
【非特許文献１３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１８４、Ｐ４３７、１９５０）
【非特許文献１４】Ｃｈｅｍ．Ｚｖｅｓｔｉ ，Ｖｏｌ．２８（１），Ｐ１１５（１９７４）、Ｉｚｖ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ，Ｓｅｒ．Ｋｈｉｍ．，Ｖｏｌ．８，Ｐ１８４３（１９７５）
【非特許文献１５】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５０（１），ＰＰ．１２１〜１２６，（１９８６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の第一の課題は、フラノースやピラノースといった糖の骨格の違い、デオキシ糖といった置換基の有無、あるいは天然型や非天然型といった糖の種類に影響されることのない、汎用性の高い、アノマー選択的な１−リン酸化糖誘導体の製造法を提供することである。
【００１６】
本発明の第二の課題は、１−リン酸化糖誘導体と核酸塩基からヌクレオシドホスホリラーゼの作用により汎用性の高いヌクレオシドの製造方法を提供することであり、さらに、同反応におけるヌクレオシドの転化率の向上方法を提供することである。
【００１７】
すなわち、本発明の課題は、これら第一および第二の課題を解決することにより、低コストで高純度のヌクレオシドの製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記第一の課題を達成するべく鋭意検討を行い、１−リン酸化糖誘導体が一定の条件下にアノマー異性体および１−リン酸化糖誘導体のダイマーとの平衡状態で存在することを発見し、さらにこの平衡条件を操作することで、望むアノマー異性体のみが結晶として析出し、その結果、平衡が次々と傾くことにより、望むアノマー異性体のみを高い選択性と高収率で得られることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明は、以下の各態様を含む。
（１）１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する１−リン酸化糖誘導体モノマーα体またはβ体の一方を選択的に晶析することによりアノマー混合物間の平衡を傾け、１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に製造する方法。
（２）下記式（１）
【００２０】
【化１】
2010031037.tif 000002
【００２１】
〔式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、保護されたヒドロキシメチル基または保護されたカルボキシル基を表し、Ｒ3はアシル基を表し、Ｒ4は水酸基の保護基を表し、Ｘはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてよい炭素原子を表し、ｍは１から３の整数を表し、ｎは０または１を表し、ｐおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｐ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕で示される１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に晶析することによりアノマー混合物間の平衡を傾け、１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に製造する方法。
（３）上記式（１）で示される１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に晶析することによりアノマー混合物間の平衡を傾け、１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に製造し、ついでＲ4で表わされる保護基の脱離反応を行って、下記式（３）
【００２２】
【化２】
2010031037.tif 000003
【００２３】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基またはカルボキシル基を表し、Ｒ3は水素原子またはアシル基を表し、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは式（１）におけるのと同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体モノマーを製造する方法。
（４）下記式（４）
【００２４】
【化３】
2010031037.tif 000004
【００２５】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、置換されたベンゾイルで保護されたヒドロキシメチル基、または保護されたカルボキシル基を表し、Ｒ4は水素原子または水酸基の保護基を表し、Ｒ3、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは、式（１）におけるのと同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体トリマー、ダイマー、モノマーまたはそれらの塩。
（５）下記式（５）
【００２６】
【化４】
2010031037.tif 000005
【００２７】
〔式中、ｐおよびｑは０から３の整数を表し、ｒは０または１を表し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚは、式（１）におけるのと同義である。（ただし、ｐ、ｑ、ｒは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｑ＋ｒ≦３を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｑ＋ｒ≦５を満たす。）〕で示される１−リン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩。
（６）下記式（６）
【００２８】
【化５】
2010031037.tif 000006
【００２９】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはカルボキシル基を表し、Ｒ3、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは、式（１）におけるのと同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩。
（７）下記式（７）
【００３０】
【化６】
2010031037.tif 000007
【００３１】
〔式中、ｐおよびｑは０から３の整数を表し、ｒは０または１を表し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚは、式（１）におけるのと同義である。（ただし、ｐ、ｑ、ｒは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｒ≦１、ｑ≦２−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦２、ｑ≦４−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕で示される１−リン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩。
（８）下記式（１８）：
【００３２】
【化７】
2010031037.tif 000008
【００３３】
（式中、Ｒ11は保護されたヒドロキシメチル基を表し、Ｒ14は水酸基の保護基を表す。）で示される化合物を、塩基の存在下にリン酸で処理して、下記式（１９）：
【００３４】
【化８】
2010031037.tif 000009
【００３５】
（式中、Ｒ11およびＲ14は、前記と同義であり、ｍは請求項２と同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物とした後、加リン酸分解および異性化し、生成するα体を選択的に晶析させることによるアノマー混合物間の平衡を傾け、下記式（２０）：
【００３６】
【化９】
2010031037.tif 000010
【００３７】
（式中、Ｒ11およびＲ14は前記と同義である。）で示される１−リン酸化糖を製造する方法。
（９） 下記式（１８）：
【００３８】
【化１０】
2010031037.tif 000011
【００３９】
（式中、Ｒ11は保護されたヒドロキシメチル基を表し、Ｒ14は水酸基の保護基を表す。）で示される化合物を、塩基の存在下にリン酸で処理して、下記式（１９）：
【００４０】
【化１１】
2010031037.tif 000012
【００４１】
（式中、Ｒ11およびＲ14は、前記と同義であり、ｍは請求項２と同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物とした後、加リン酸分解および異性化し、生成するα体を選択的に晶析させることによるアノマー混合物間の平衡を傾け、α体を選択的に製造し、ついで保護基の脱離を行って、２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸を製造する方法。
【００４２】
さらに、本発明者らは、上記第二の課題を達成するべく鋭意検討を行い、広く生物界に分布するヌクレオシドホスホリラーゼの逆反応を利用し、かつ、前記１−リン酸化糖誘導体の合成方法と組み合わせることで汎用性の高いヌクレオシドの合成法を確立した。さらに、反応液にリン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを存在させることにより、反応の副生成物であるリン酸イオンが難水溶性の塩として沈殿し、反応の平衡がヌクレオシド合成方向へ移動するために反応収率が向上することも見出した。これにより、低コストで高純度のヌクレオシドの製造法を提供する本発明を完成させるに至った。
【００４３】
すなわち、かかる知見に基づいてなされた本発明は以下の態様を含む。
【００４４】
（１０）１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に晶析することによりアノマー混合物間の平衡を傾け、１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に製造し、ついでＲ4で表わされる保護基の脱離反応を行って１−リン酸化糖誘導体モノマーを製造する上記（３）の態様における第一の工程と、ヌクレオシドホスホリラーゼにより第一の工程で得られた１−リン酸化糖誘導体のリン酸基と塩基との交換反応を行う第二の工程により、下記式（８）
【００４５】
【化１２】
2010031037.tif 000013
【００４６】
（式中、Ｂは、独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。また、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは式（１）におけるのと同義である。）で示されるヌクレオシドを製造する方法。
（１１）ヌクレオシドホスホリラーゼを用いて、上記（６）の態様における１−リン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応により、下記式（９）
【００４７】
【化１３】
2010031037.tif 000014
【００４８】
（式中、Ｂは式（８）におけるのと同義であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは式（１）におけるのと同義である。）で示されるヌクレオシド化合物を製造する方法。
（１２）ヌクレオシドホスホリラーゼを用いて、上記（７）の態様における１−リン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応により、下記式（１０）
【００４９】
【化１４】
2010031037.tif 000015
【００５０】
（式中、Ｂは式（８）におけるのと同義であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒは式（１）におけるのと同義である。）で示されるヌクレオシドを製造する方法。
【００５１】
（１３）  上記（１２）の態様（但し、Ｒ1がヒドロキシメチル基、Ｒ2が水素原子、ｐおよびｒが０、Ｘがフッ素原子である。）における２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸を製造する第一の工程と、該第一の工程で得られた１−リン酸化糖誘導体のリン酸基と塩基との交換反応をヌクレオシドホスホリラーゼにより行う第二の工程による、下記式（２１）
【００５２】
【化１５】
2010031037.tif 000016
【００５３】
（式中、Ｂは請求項１１の式（８）と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。
【００５４】
なお、上記（１０）〜（１３）の態様では、ヌクレオシドホスホリラーゼとして、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される少なくとも１種を用いることができる。
【００５５】
更に、このヌクレオシドホスホリラーゼ活性としては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される一種類以上のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物を用いることができる。
【００５６】
更に、上記（１０）〜（１３）の態様においては、ヌクレオシドホスホリラーゼにより、１−リン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応を行う際に、リン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを反応液中に存在させることができる。
【００５７】
また、上記（１０）〜（１３）の態様におけるリン酸と難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンとしては、カルシウムイオン、バリウムイオン、アルミニウムイオン及びマグネシウムイオンの中から選ばれる1種類以上の金属カチオンを用いることができる。
【００５８】
更に、本発明には、以下の式（１１）〜（１３）、及び（２０）のいずれかにより表される化合物が含まれる。
【００５９】
【化１６】
2010031037.tif 000017
【００６０】
（式中、Ｂ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは式（１）及び式（８）におけるのと同義である。）で示される非天然ヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルオロチミジン、リバビリン、オロチジン、ウラシルアラビノシド、アデニンアラビノシド、２−メチル−アデニンアラビノシド、２−クロル−ヒポキサンチンアラビノシド、チオグアニンアラビノシド、２，６−ジアミノプリンアラビノシド、シトシンアラビノシド、グアニンアラビノシド、チミンアラビノシド、エノシタビン、ジェムシタビン、アジドチミジン、イドクスウリジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデオキシシチジン、ソリブジン、５−メチルウリジン、ビラゾール、チオイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、アロプリノールウラシル、５−フルオロウラシル、２'−アミノウリジン、２'−アミノアデノシン、２'−アミノグアノシン、２−クロル−２'−アミノイノシン、ＤＭＤＣ、ＦＭＤＣは除く）。
【００６１】
【化１７】
2010031037.tif 000018
【００６２】
（式中、Ｂ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは式（１）及び（８）におけるのと同義である。）で示される非天然ヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルオロチミジン、リバビリン、オロチジン、ウラシルアラビノシド、アデニンアラビノシド、２−メチル−アデニンアラビノシド、２−クロル−ヒポキサンチンアラビノシド、チオグアニンアラビノシド、２，６−ジアミノプリンアラビノシド、シトシンアラビノシド、グアニンアラビノシド、チミンアラビノシド、エノシタビン、ジェムシタビン、アジドチミジン、イドクスウリジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデオキシシチジン、ソリブジン、５−メチルウリジン、ビラゾール、チオイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、アロプリノールウラシル、５−フルオロウラシル、２'−アミノウリジン、２'−アミノアデノシン、２'−アミノグアノシン、２−クロル−２'−アミノイノシン、ＤＭＤＣ、ＦＭＤＣは除く）。
【００６３】
【化１８】
2010031037.tif 000019
【００６４】
（式中、Ｂ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒは式（１）及び（８）におけるのと同義である。）で示されるヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルオロチミジン、リバビリン、オロチジン、ウラシルアラビノシド、アデニンアラビノシド、２−メチル−アデニンアラビノシド、２−クロル−ヒポキサンチンアラビノシド、チオグアニンアラビノシド、２，６−ジアミノプリンアラビノシド、シトシンアラビノシド、グアニンアラビノシド、チミンアラビノシド、エノシタビン、ジェムシタビン、アジドチミジン、イドクスウリジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデオキシシチジン、ソリブジン、５−メチルウリジン、ビラゾール、チオイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、アロプリノールウラシル、５−フルオロウラシル、２'−アミノウリジン、２'−アミノアデノシン、２'−アミノグアノシン、２−クロル−２'−アミノイノシン、ＤＭＤＣ、ＦＭＤＣは除く）。
下記式（２０）：
【００６５】
【化１９】
2010031037.tif 000020
【００６６】
（式中、Ｒ11及びＲ14は式（１８）と同義である。）で示される１−リン酸化糖またはその塩も本発明に含まれる。
【発明の効果】
【００６７】
本発明は、アノマー選択的な１−リン酸化糖誘導体ならびにヌクレオシドの製造法として有用性が高く、広範な利用が期待される。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
【００６９】
本発明で用いられる糖類としては、好ましくはフコース、ラムノース、ジギトキソース、オレアンドロース、キノボースのような６−デオキシ糖類、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースのようなヘキソース類、リボース、アラビノース、キシロース、リキソースのようなペントース類、エリトロース、トレオースのようなテトロース類、グルコサミン、ダウノサミンのようなアミノ糖類、グルクロン酸、ガラクツロン酸のようなウロン酸類、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、ペンツロースのようなケトース類、２−デオキシリボースのようなデオキシ糖類といったＤ系列もしくはＬ系列よりなる天然型単糖由来の残基、ピラノース型あるいはフラノース型の非天然糖由来の残基、並びにそれらが有する水酸基および／またはアミノ基が保護もしくはアシル化された糖残基誘導体、またはそれらが有する水酸基がフッ素などのハロゲン原子で置換されたハロゲン化糖残基を有する糖類を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
本発明において、１−リン酸化糖誘導体とは、天然型単糖由来もしくは非天然糖由来の残基のうち、１位水酸基がリン酸化された糖の誘導体を示し、特に指定しない限り、モノマー、ダイマーおよびトリマーをも包含し、あるいはそれらからなる混合物であってもよく、その比率は特に限定されない。
【００７１】
Ｒ1又はＲ2で表される保護されたヒドロキシメチル基および水酸基の保護基における保護基とは、加水素分解、加水分解、光分解のような化学的方法によって除去される保護基を指す。そのような基としては、ホルミル基、アシル基、シリル基、アルキル基、アラルキル基、カルボニル基があり、中でも好ましくは、ホルミル基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、シリル基、アルコキシアルキル基、ハロゲン化アルキル基、アラルキル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基が挙げられる。
【００７２】
脂肪族アシル基としては、アルキルカルボニル基またはハロゲン置換された低級アルキルカルボニル基が挙げられる。
【００７３】
上記のアルキルカルボニル基の具体例として、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノニルカルボニル基、デシルカルボニル基、３−メチルノニルカルボニル基、８−メチルノニルカルボニル基、３−エチルオクチルカルボニル基、３，７−ジメチルオクチルカルボニル基、ウンデシルカルボニル基、ドデシルカルボニル基、トリデシルカルボニル基、テトラデシルカルボニル基、ペンタデシルカルボニル基、ヘキサデシルカルボニル基、１−メチルペンタデシルカルボニル基、１４−メチルペンタデシルカルボニル基、１３，１３−ジメチルテトラデシルカルボニル基、ヘプタデシルカルボニル基、１５−メチルヘキサデシルカルボニル基、オクタデシルカルボニル基などを例示することができる。
【００７４】
また、ハロゲン置換された低級アルキルカルボニル基の具体例として、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基などを例示することができる。
【００７５】
芳香族アシル基としては、アリールカルボニル基、ハロゲン置換されたアリールカルボニル基、低級アルキル化アリールカルボニル基、低級アルコキシアリールカルボニル基、ニトロ化アリールカルボニル基、低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基、アリール化アリールカルボニル基を挙げることができる。
【００７６】
上記のアリールカルボニル基の具体例として、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基などを例示することができる。
【００７７】
また、ハロゲン置換されたアリールカルボニル基の具体例として、２−フルオロベンゾイル基、３−フルオロベンゾイル基、４−フルオロベンゾイル基、２−クロロベンゾイル基、３−クロロベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、２−ブロモベンゾイル基、３−ブロモベンゾイル基、４−ブロモベンゾイル基、２，４−ジクロロベンゾイル基、２，６−ジクロロベンゾイル基、３，４−ジクロロベンゾイル基、３，５−ジクロロベンゾイル基などを例示することができる。
【００７８】
また、低級アルキル化アリールカルボニル基の具体例として、２−トルオイル基、３−トルオイル基、４−トルオイル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル基などを例示することができる。
【００７９】
さらに、低級アルコキシアリールカルボニル基の具体例として、２−アニソイル基、３−アニソイル基、４−アニソイル基などを例示することができる。
【００８０】
ニトロ化アリールカルボニル基の具体例として、２−ニトロベンゾイル基、３−ニトロベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、３，５−ジニトロベンゾイル基などを例示することができる。
【００８１】
さらに、低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基の具体例として、２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基などを、アリール化アリールカルボニル基の具体例として、４−フェニルベンゾイル基などを例示することができる。
【００８２】
シリル基としては、低級アルキルシリル基、アリール基で置換された低級アルキルシリル基を挙げることができる。
【００８３】
低級アルキルシリル基の具体例として、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、トリイソプロピルシリル基を例示することができる。
【００８４】
アリール基で置換された低級アルキルシリル基の具体例として、ジフェニルメチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基などを例示することができる。
【００８５】
アラルキル基としては、ベンジル基、低級アルキル基で置換されたアラルキル基、低級アルコキシ基で置換されたアラルキル基、ニトロ基で置換されたアラルキル基、ハロゲン置換されたアラルキル基、シアノ基で置換されたアラルキル基を挙げることができる。
【００８６】
これらの具体的な基を例示すると、２−メチルベンジル基、３−メチルベンジル基、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、２−メトキシベンジル基、３−メトキシベンジル基、４−メトキシベンジル基、２−ニトロベンジル基、３−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、２−クロロベンジル基、３−クロロベンジル基、４−クロロベンジル基、２−ブロモベンジル基、３−ブロモベンジル基、４−ブロモベンジル基、２−シアノベンジル基、３−シアノベンジル基、４−シアノベンジル基などが挙げられる。
【００８７】
アラルキルオキシカルボニル基としては、低級アルキル基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基、低級アルコキシ基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基、ニトロ基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基、ハロゲン置換されたアラルキルオキシカルボニル基、シアノ基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基を挙げることができる。
【００８８】
これらの具体例として、２−メチルベンジルオキシカルボニル基、３−メチルベンジルオキシカルボニル基、４−メチルベンジルオキシカルボニル基、２，４，６−トリメチルベンジルオキシカルボニル基、２−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３−メトキシベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、３−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基、２−クロロベンジルオキシカルボニル基、３−クロロベンジルオキシカルボニル基、４−クロロベンジルオキシカルボニル基、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基、３−ブロモベンジルオキシカルボニル基、４−ブロモベンジルオキシカルボニル基、２−シアノベンジルオキシカルボニル基、３−シアノベンジルオキシカルボニル基、４−シアノベンジルオキシカルボニル基などを挙げることができる。
【００８９】
アルコキシカルボニル基としては、低級アルコキシカルボニル基、ハロゲン置換されたアルコキシカルボニル化合物、アルキルシリル基で置換されたアルコキシカルボニル基を挙げることができる。
【００９０】
低級アルコキシカルボニル基の具体例として、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基などを例示することができる。
【００９１】
ハロゲン置換されたアルコキシカルボニル基の具体例として、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基を、低級アルキルシリル基で置換されたアルコキシカルボニル基の具体例として、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基などを例示することができる。
【００９２】
アルキル基としては、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−メトキシエトキシメチル基のようなアルコキシアルキル基、２，２，２−トリクロロエチル基のようなハロゲン化アルキル基、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基のようなアリール基で置換された低級アルキル基が挙げられる。
【００９３】
これらの中で、好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、アラルキル基であり、さらに好ましくは、４−トルオイル基、４−クロロベンゾイル基、またはベンジル基である。
【００９４】
Ｒ1およびＲ2でいう保護されたカルボキシル基における保護基とは、加水素分解、加水分解、光分解のような化学的方法によって除去される保護基を指す。そのような基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基のような低級アルキル基、２−（トリメチルシリル）エチル基、２−（トリエチルシリル）エチル基のようなシリル化された低級アルキル基あるいは前述のアラルキル基、アルコキシアルキル基などを挙げることができる。さらに好ましくは、メチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、またはベンジル基である。
【００９５】
Ｘで示すハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を示す。
【００９６】
Ｘでいうアルコキシ基、アルキルチオ基としては、例えば、前述の低級アルキル基、アラルキル基、アルコキシアルキル基を有するアルコキシ基、アルキルチオ基を挙げることができる。さらに好ましくは、メトキシ基、メトキシエトキシ基、メチルチオ基である。
【００９７】
Ｚが示す置換されてよい炭素原子とは、式で表した置換基（Ｘｑ及びＮＨＲ3）のいずれかが１つないし２つ置換した炭素原子を表し、置換していない場合には、水素原子で置換されている炭素原子を指す。
【００９８】
Ｒ3でいうアシル基としては、例えば、前述の脂肪族アシル基、芳香族アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、さらに、メタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基のような低級アルカンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基のようなアリールスルホニル基を挙げることができる。好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、低級アルカンスルホニル基であり、具体的には、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンゾイル基、メタンスルホニル基である。また、ＮＨＲ3の複数が置換基として用いられる場合には、各ＮＨＲ3におけるＲ3はそれぞれ独立して上記の基を表す。
【００９９】
また、Ｒ4、Ｒ11及びＲ14でいう保護されたヒドロキシメチル基や水酸基の保護基における保護基としては、Ｒ1及びＲ2に関して既に説明した水酸基の保護基が利用できる。
【０１００】
式（１）〜（１７）を有する糖残基としては、好ましくは前述の天然型単糖由来の残基、非天然糖由来の残基、糖残基誘導体、ハロゲン化糖残基を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
本発明の式（４）〜（７）で表される化合物の塩とは、化合物が分子内に有するリン酸基が形成する塩を示す。塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウムのようなアルカリ金属の塩、マグネシウム、カルシウム、バリウムのようなアルカリ土類金属の塩、アルミニウム、鉄のような金属の塩、アンモニウム塩、１級、２級、３級のアルキルアミンの塩が挙げられる。
【０１０２】
上記において、１級アミンとしては、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ヘキシルアミン、オクチルアミンのようなアルキルアミン類、シクロヘキシルアミンのようなシクロアルキルアミン類、ベンジルアミンのようなものを挙げることができる。
【０１０３】
また、２級アミンとしては、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、ジヘキシルアミン、ジオクチルアミンのようなジアルキルアミン類、ジシクロヘキシルアミンのようなジシクロアルキルアミン類、ピペリジン、モルフォリン、Ｎ−メチルピペラジンのような環状アミンを例示できる。
【０１０４】
３級アミンとしては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン、トリブチルアミン、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、Ｎ−エチルジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルフォリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミンのような３級のアルキルアミン、アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジブチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジオクチルアニリンのようなアニリン類、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−ルチジン、ニコチンアミドのようなピリジン類の塩、グリシン、アラニン、プロリン、リジン、アルギニン、グルタミンのようなアミノ酸類、シンコニジン、１−（１−ナフチル）エチルアミン、１−フェニルエチルアミンのような光学活性アミンを挙げることができ、何れも１価あるいは２価の塩を包含する。
【０１０５】
さらに、本発明の式（４）〜（７）で表される化合物は、大気中に放置することにより水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があるが、そのような塩も本発明に包含される。
【０１０６】
本発明における１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物は、下記反応式（Ｉ）
【０１０７】
【化２０】
2010031037.tif 000021
【０１０８】
によって製造することができるが、これに限定されるものではない。
【０１０９】
上記式において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑおよびｒは、前述の式（１）と同義であり、Ｙは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を表す。ｍが１の場合はリン酸トリエステルを、ｍが２の場合はリン酸ジエステルを、ｍが３の場合はリン酸モノエステルを意味し、それぞれ１−リン酸化糖誘導体トリマー、１−リン酸化糖誘導体ダイマー、１−リン酸化糖誘導体モノマーと称する。また、１−リン酸化糖誘導体トリマー、１−リン酸化糖誘導体ダイマー、１−リン酸化糖誘導体モノマーを総称して、１−リン酸化糖誘導体と称し、それらの混合比については、特に限定されない。
【０１１０】
リン酸としては、正リン酸のように水分量の少ないものが好ましいが、特に限定されない。
【０１１１】
塩基としては、反応を阻害せず、脱酸剤として機能すれば特に限定はないが、好ましくは、無機塩基としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属の炭酸塩、水酸化物などが、有機塩基としては、３級のアルキルアミン類、アニリン類、ピリジン類、光学活性アミンを挙げることができる。
【０１１２】
脱水剤は、溶媒や添加剤から混入する水分が、反応に悪影響を与える場合に使うことができる。脱水剤としては、水分の吸着性あるいは水分との反応性があれば特に限定されないが、好ましくはモルキュラーシーブスあるいは五酸化リンを挙げることができる。
【０１１３】
反応は、通常、溶媒の存在下に行われる。使用される溶媒としては、反応を阻害せず、出発物質をある程度溶解するものであれば特に限定はないが、例えば、ヘキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン、アニソールのような芳香族炭化水素類、メチレンクロリド、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ｎ−ブチル、炭酸ジエチルエステルのようなエステル類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジグリムのようなエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−イミダゾリジノンのようなアミド類、アセトン、２−ブタノン、メチル イソプロピルケトン、メチル イソブチルケトンのようなケトン類またはそれらから選択される２種ないし３種からなる混合溶媒を挙げることができる。
【０１１４】
反応温度は、特に限定はなく、通常、−８０℃から６０℃、好適には−１０℃から２５℃の範囲で行われる。
【０１１５】
反応時間は、出発原料、試薬および溶媒の種類、反応温度によって異なるが、通常、１分間から２４時間、好適には１０分間から２時間で達成される。
【０１１６】
尚、本反応における糖誘導体（１４）とリン酸の比率は、特に限定はなく、通常、化合物（１４）：リン酸＝１：１０〜３：１で反応を行うことができる。その場合、化合物（１４）とリン酸の比率に応じて、生成物（１）は、通常、リン酸に結合する糖残基の数（即ちｍ）が、１，２または３である化合物が様々に混じった混合物となる。
【０１１７】
さらに、α体またはβ体の一方を有する１−リン酸化糖誘導体（１６ａ）または（１６ｂ）は、下記反応式（ＩＩ）
【０１１８】
【化２１】
2010031037.tif 000022
【０１１９】
によって製造することができる。
【０１２０】
上記式において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑおよびｒは、前述の式（１）と同義である。
【０１２１】
本製造法によれば、化合物（１５）で示される１−リン酸化糖誘導体は、モノマー、ダイマーあるいはトリマーの混合物であっても、反応系内で、化合物（１６）で示される１−リン酸化糖誘導体モノマーへと変換可能であるため、それらの混合比については特に限定されない。
【０１２２】
リン酸としては、正リン酸のように水分量の少ないものが好ましいが、特に限定されない。
【０１２３】
塩基は、化合物（１６）が分子内に有するリン酸基と塩を形成し、α体またはβ体の一方、（１６ａ）または（１６ｂ）、を、選択的に晶析するために重要である。通常、反応に使用する溶媒との組み合わせで、最適な塩基を選ぶことができるが、好ましくは、前述の無機塩基類、３級のアルキルアミン類、アニリン類、ピリジン類、アミノ酸類、光学活性アミンを挙げることができ、形成する塩としては、何れも１価あるいは２価の塩を包含する。
【０１２４】
脱水剤は、溶媒や添加剤から混入する水分が、反応に悪影響を与える場合に使うことができる。脱水剤としては、水分の吸着性あるいは水分との反応性があれば特に限定されないが、好ましくはモルキュラーシーブスあるいは五酸化リンを挙げることができる。
【０１２５】
反応は、通常、溶媒の存在下に行われる。使用される溶媒としては、反応を阻害せず、出発物質をある程度溶解し、化合物（１６）が分子内に有するリン酸基と塩を形成して生成する、α体またはβ体の一方、（１６ａ）または（１６ｂ）、が、選択的に晶析してくるのを助長するならば特に限定はなく、例えば、前述の脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類、エステル類、エーテル類、ニトリル類、アミド類、ケトン類またはそれらから選択される２種ないし３種からなる混合溶媒を挙げることができる。
【０１２６】
反応温度は、化合物（１５）と（１６）との平衡反応を促し、化合物（１６）が分子内に有するリン酸基と塩を形成して生成する、α体またはβ体の一方、すなわち、（１６ａ）または（１６ｂ）、が、選択的に晶析してくるのを助長するならば特に限定はなく、通常、−８０℃から６０℃、好適には−１０℃から２５℃の範囲で行われる。
【０１２７】
反応時間は、出発原料、試薬および溶媒の種類、反応温度によって異なるが、通常、３時間から１週間、好適には６時間から２４時間で達成される。
【０１２８】
尚、本反応における糖誘導体（１）とリン酸の比率は、特に限定はなく、通常、化合物（１）：リン酸＝１：１０〜３：１の範囲で反応を行うことができる。その際、反応系内のｐＨは、通常１から７、好適には１から４の酸性側で行うことが望ましい。
【０１２９】
さらに、α体またはβ体の一方を有する１−リン酸化糖誘導体（１６ａ）または（１６ｂ）は、塩の交換反応を行って、精製し、反応系内で使用した塩基とは異なった塩基のリン酸塩として取り出すことができる。
【０１３０】
ここで使用される塩基としては、前述の無機塩基類、１級のアルキルアミン、２級のアルキルアミン、３級のアルキルアミン、アニリン類、ピリジン類、アミノ酸類、光学活性アミンを挙げることができ、形成する塩としては、何れも１価あるいは２価の塩を包含する。
【０１３１】
さらに、保護基の脱離反応を下記反応式（ＩＩＩ）
【０１３２】
【化２２】
2010031037.tif 000023
【０１３３】
によって行い、１−リン酸化糖誘導体（１７ａ）または（１７ｂ）を製造することができる。
【０１３４】
上記式において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑおよびｒは、前述の式（１）と同義であり、Ｒ1'およびＲ2'は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基またはカルボキシル基を表し、Ｒ3'は水素原子またはアシル基を表す。
【０１３５】
化合物（１６ａ）または（１６ｂ）におけるＲ1およびＲ2のヒドロキシメチル基あるいはＲ4の水酸基の保護基として、前述の脂肪族アシル基、芳香族アシル基、アルコキシカルボニル基、またはＲ1およびＲ2のカルボキシル基の保護基として、前述の低級アルキル基を使用した場合には、例えば、水溶性溶媒中にて塩基で処理することにより除去することができる。塩基としては、好ましくは、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムのようなアルカリ金属炭酸塩、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物、アンモニア水、テトラｎ−ブチルアンモニウム ヒドロキシドのような水酸化アンモニウム類、前述の無機塩基、１級のアルキルアミン、２級のアルキルアミン、３級のアルキルアミンなどを用いて行うことができる。
【０１３６】
使用される溶媒としては、通常の加水分解反応に使用されるものであれば特に限定はないが、好ましくは、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールのようなアルコール類、前述のエーテル類を用いることができる。反応温度および反応時間は出発物質や用いる塩基などによって異なり、特に限定はないが、通常は−１０℃から１００℃で、１時間から５日間で終了する。この際、反応温度、反応時間あるいは試薬の当量数を調節することにより、Ｒ3の保護基を所望により残すこともできるし、同時に除去することもできる。
【０１３７】
化合物（１６ａ）または（１６ｂ）におけるＲ1およびＲ2のヒドロキシメチル基あるいはＲ4の水酸基の保護基として、前述のアラルキル基、アラルキルオキシカルボニル基またはＲ1およびＲ2のカルボキシル基の保護基として、前述のアラルキル基を使用した場合には、例えば、金属触媒を使用して、接触還元を行って除去することができる。
【０１３８】
触媒としては、好ましくは、パラジウム炭素、ラネーニッケル、酸化白金、白金黒、ロジウム−酸化アルミニウム、トリフェニルホスフィン−塩化ロジウム、パラジウム−硫酸バリウムなどを用いて行うことができる。圧力は特に限定はないが、通常使用される溶媒としては、通常の加水分解反応に使用されるものであれば特に限定はないが、好ましくは、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールのようなアルコール類、前述のエーテル類、エステル類を用いることができる。反応温度および反応時間は出発物質や用いる塩基などによって異なり、特に限定はないが、通常は−１０℃から１００℃で、１時間から５日間で終了する。この場合、Ｒ3の保護基は、通常除去されずに残すことができる。
【０１３９】
化合物（１６ａ）または（１６ｂ）におけるＲ1およびＲ2のヒドロキシメチル基あるいはＲ4の水酸基の保護基として、前述のシリル基、またはＲ1およびＲ2のカルボキシル基の保護基として、前述のシリル化された低級アルキル基を使用した場合には、例えば、フッ化テトラｎ−ブチルアンモニウムのようなフッ素アニオンを生成するような化合物を使用して、除去することができる。
【０１４０】
反応溶媒は反応を阻害しないものであれば特に限定はないが、前述のエーテル類を用いることができる。反応温度および反応時間は特に限定はないが、通常は−１０℃から５０℃で、１０分間から１０時間で終了する。この場合、Ｒ3の保護基は、通常除去されずに残すことができる。
【０１４１】
何れの保護基を除去する場合においても、生成物が分子内に有するリン酸基は、反応系内に存在する塩基の塩として得られてくるが、所望により他の塩基の塩に変更して取り出すこともできる。その際に使用する塩基としては、例えば、前述の無機塩基類、１級のアルキルアミン類、２級のアルキルアミン類、３級のアルキルアミン類、アニリン類、ピリジン類、アミノ酸類、光学活性アミンを挙げることができ、形成する塩としては、何れも１価あるいは２価の塩を包含する。
【０１４２】
本発明における１−リン酸化糖誘導体とは、糖類およびその誘導体の１位にリン酸がエステル結合したもののことである。
【０１４３】
具体的には、下記式（６）
【０１４４】
【化２３】
2010031037.tif 000024
【０１４５】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはカルボキシル基を表し、Ｒ3、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは、式（４）におけるのと同義である。）で示すことができる。
【０１４６】
その代表例を挙げると、例えばリボース−１−リン酸、２−デオキシリボース−１−リン酸、２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸、アラビノース−１−リン酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、前述の汎用性の高い、アノマー選択的な製造法により得られるものであれば、特に区別されるものではない。
【０１４７】
尚、１−リン酸化糖誘導体を構成する天然物由来の糖類としては、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−リキソース、Ｄ−リボースのようなアルドペントース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｄ−リブロースのようなケトペントース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノースのようなアルドヘキソース、Ｄ−タガトース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−プシコース、Ｄ−フルクトースのようなケトヘキソース、Ｄ−２−デオキシリボース、Ｄ−２，３−ジデオキシリボース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−ラムノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フコピラノース、Ｌ−フコピラノース、Ｄ−ラムノフラノース、Ｌ−ラムノフラノース、Ｄ−アロメチロース、Ｄ−キノボース、Ｄ−アンチアロース、Ｄ−タロメチロース、Ｌ−タロメチロース、Ｄ−ジキタロース、Ｄ−ジギトキソース、Ｄ−シマロース、チベロース、アベコース、パラトース、コリトース、アスカリロースのようなデオキシ糖類、グルコサミン、ダウノサミンのようなアミノ糖類、グルクロン酸、ガラクツロン酸のようなウロン酸類を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１４８】
次に、本発明にかかるヌクレオシドの製造方法について述べる。この方法に用いられる塩基は、ピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された天然または非天然型の塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。
【０１４９】
置換基としてのハロゲン原子としては、塩素、フッ素、ヨウ素、臭素が例示される。アルキル基としては、メチル、エチル、プロピルなどの炭素数１〜７の低級アルキル基が例示される。ハロアルキル基としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ブロモメチル、ブロモエチルなどの炭素数１〜７のアルキルを有するハロアルキル基が例示される。アルケニル基としては、ビニル、アリルなどの炭素数２〜７のアルケニル基が例示される。ハロアルケニル基としては、ブロモビニル、クロロビニルなどの炭素数２〜７のアルケニルを有するハロアルケニル基が例示される。アルキニル基としては、エチニル、プロピニルなどの炭素数２〜７のアルキニル基が例示される。アルキルアミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノなどの炭素数１〜７のアルキルを有するアルキルアミノ基が例示される。アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシなどの炭素数１〜７のアルコキシ基が例示される。アルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト、エチルメルカプトなどの炭素数１〜７のアルキルを有するアルキルメルカプト基が例示される。アリール基としては、フェニル基；メチルフェニル、エチルフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルを有するアルキルフェニル基；メトキシフェニル、エトキシフェニルなどの炭素数１〜５のアルコキシを有するアルコキシフェニル基；ジメチルアミノフェニル、ジエチルアミノフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルアミノを有するアルキルアミノフェニル基；クロロフェニル、ブロモフェニルなどのハロゲノフェニル基などが例示される。
【０１５０】
ピリミジン塩基を具体的に例示すれば、シトシン、ウラシル、５−フルオロシトシン、５−フルオロウラシル、５−クロロシトシン、５−クロロウラシル、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨ−ドシトシン、５−ヨ−ドウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル（チミン）、５−エチルシトシン、５−エチルウラシル、５−フルオロメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロシトシン、５−トリフルオロウラシル、５−ビニルウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−クロロビニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−プロピニルウラシル、ピリミジン−２−オン、４−ヒドロキシアミノピリミジン−２−オン、４−アミノオキシピリミジン−２−オン、４−メトキシピリミジン−２−オン、４−アセトキシピリミジン−２−オン、４−フルオロピリミジン−２−オン、５−フルオロピリミジン−２−オンなどが挙げられる。
【０１５１】
プリン塩基を具体的に例示すれば、プリン、６−アミノプリン（アデニン）、６−ヒドロキシプリン、６−フルオロプリン、６−クロロプリン、６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−トリフルオロメチルアミノプリン、６−ベンゾイルアミノプリン、６−アセチルアミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−アミノオキシプリン、６−メトキシプリン、６−アセトキシプリン、６−ベンゾイルオキシプリン、６−メチルプリン、６−エチルプリン、６−トリフルオロメチルプリン、６−フェニルプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルメルカプトプリン、６−アミノプリン−１−オキシド、６−ヒドロキシプリン−１−オキシド、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン（グアニン）、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−ヨ−ドプリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシアミノプリン、２−アミノ−６−メトキシプリン、２−アミノ−６−ベンゾイルオキシプリン、２−アミノ−６−アセトキシプリン、２−アミノ−６−メチルプリン、２−アミノ−６−サイクロプロピルアミノメチルプリン、２−アミノ−６−フェニルプリン、２−アミノ−８−ブロモプリン、６−シアノプリン、６−アミノ−２−クロロプリン（２−クロロアデニン）、６−アミノ−２−フルオロプリン（２−フルオロアデニン）などが挙げられる。
【０１５２】
アザプリン塩基およびデアザプリン塩基を具体的に例示すれば、６−アミノ−３−デアザプリン、６−アミノ−８−アザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−８−アザプリン、６−アミノ−７−デアザプリン、６−アミノ−１−デアザプリン、６−アミノ−２−アザプリンなどが挙げられる。
【０１５３】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼとは、リン酸存在下でヌクレオシドのＮ−グリコシド結合を分解する酵素の総称であり、本発明においては逆反応を利用することができる。反応に使用する酵素は、相当する１−リン酸化糖誘導体と塩基から目的とするヌクレオシドを生成しうる活性を有していればいかなる種類及び起源のものでもかまわない。該酵素はプリン型とピリミジン型に大別され、例えば、プリン型としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジン型としてピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）などが挙げられる。
【０１５４】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物とは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される一種類以上のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物であれば特に限定はされない。
【０１５５】
このような微生物の具体例としては、ノカルディア(Nocardia)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）属、セルロモナス(Cellulomonas)属、フラボバクテリウム（Flabobacterium）属、クルイヘラ(Kluyvere)属、ミコバクテリウム(Micobacterium)属、ヘモフィラス（Haemophilus）属、ミコプラナ(Micoplana)属、プロタミノバクター(Protaminobacter)属、キャンディダ(Candida)属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ハフニア（Hafnia）属、プロテウス(Proteus)属、ビブリオ(Vibrio)属、スタフィロコッカス(Staphyrococcus)属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、ザルチナ(Sartina)属、プラノコッカス(Planococcus)属、エシェリシア（Escherichia）属、クルチア(Kurthia)属、ロドコッッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、サルモネラ(Salmonella)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アースロバクター属(Arthrobacter)属またはシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に含まれる微生物株を好適な例として挙げることができる。
【０１５６】
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、上述の微生物株のヌクレオシドホスホリラーゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出することが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。かかる技術水準に鑑み、このようなヌクレオシドホスホリラーゼの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌も本発明のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物に包含されるものとする。
【０１５７】
ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示している。プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ由来のＰLプロモーター及びＰRプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）・アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）・中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３'末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５'末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、ヌクレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
【０１５８】
ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７をベクターとして利用することができる。
【０１５９】
ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
【０１６０】
また、本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼ活性とは、上述の該酵素活性を有する微生物菌体のみならず、該酵素活性を有する微生物菌体の菌体処理物またはそれらの固定化物なども使用できる。菌体処理物とは、例えばアセトン乾燥菌体や機械的破壊、超音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧処理、浸透圧処理、自己消化、細胞壁分解処理、界面活性剤処理などにより調製した菌体破砕物などであり、また、必要に応じて硫安沈殿やアセトン沈殿、カラムクロマトグラフィーにより精製を重ねたものを用いても良い。
【０１６１】
本発明において、リン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンとは、反応において副生したリン酸イオンと難水溶性の塩を形成し、反応液中に沈殿しうるものであれば限定されない。そのようなものとして、カルシウム、マグネシウム、バリウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、モリブデン、鉛、亜鉛、リチウムなどの金属カチオンが挙げられる。それらのうち工業的に汎用性や安全性が高く、反応に影響を与えない金属塩が特に好ましく、そのようなものの例としてカルシウムイオン、バリウムイオン、アルミニウムイオン及びマグネシウムイオンが挙げられる。
【０１６２】
本発明におけるリン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンとは、リン酸と難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを、塩素イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、酢酸イオンまたは水酸イオンの中から選ばれる1種類以上のアニオンとの金属塩として反応液中に添加すればよい。具体的には、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化バリウム、硝酸バリウム、炭酸バリウム、硫酸バリウム、酢酸バリウム、塩化アルミニウム、硝酸アルミニウム、炭酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、酢酸アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウムなどが例示される。
【０１６３】
また、該金属カチオンは、ペントース−１−リン酸の塩として反応液中に存在させてもよい。一例を挙げると、リボース−１−リン酸・カルシウム塩、２−デオキシリボース−１−リン酸・カルシウム塩、２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸・カルシウム塩、アラビノース−１−リン酸・カルシム塩、リボース−１−リン酸・バリウム塩、２−デオキシリボース−１−リン酸・バリウム塩、２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸・バリウム塩、アラビノース−１−リン酸・バリウム塩、リボース−１−リン酸・アルミニウム塩、２−デオキシリボース−１−リン酸・アルミニウム塩、２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸・アルミニウム塩、アラビノース−１−リン酸・アルミニウム塩、などが挙げられる。
【０１６４】
本発明におけるヌクレオシド化合物の合成反応は、目的とするヌクレオシド、基質である１−リン酸化糖誘導体と塩基、反応触媒であるヌクレオシドホスホリラーゼ又は該酵素活性を有する微生物、そしてリン酸を反応系より除外させるために添加する金属塩の種類とその特性により、適切なｐＨや温度などの反応条件ならびに管理幅を選べばよいが、通常はｐＨ５〜１０、温度１０〜６０℃の範囲で行うことができる。ｐＨに関して、その管理幅を外れた場合、目的物や基質の安定性、酵素活性の低下、リン酸との難水溶性塩の未形成などが原因で反応転化率の低下を招く可能性がある。反応途中、ｐＨの変化が生じるようであれば必要に応じて塩酸、硫酸などの酸や水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリを適時添加すればよい。反応に使用する１−リン酸化糖誘導体と塩基の濃度は０．１〜１０００ｍＭ程度が適当であり、両者のモル比は添加する塩基の比率を１−リン酸化糖誘導体又はその塩に対して０．１〜１０倍モル量で行える。反応転化率を考えれば０．９５倍モル量以下が好ましい。
【０１６５】
また、添加するリン酸と難水溶性の塩を形成しうる金属塩は、反応に使用する１−リン酸化糖誘導体に対して０．１〜１０倍モル量、より好ましくは０．５〜５倍モル量添加するのが良い。その添加方法について制限は無く、一括添加や反応中に逐次添加しても良い。また、本反応は基本的に水を溶媒としているが、必要に応じ反応系にアルコールやジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。なお、高濃度の反応においては、基質の塩基や生成物のヌクレオシド化合物が溶解しきれずに反応液中に存在する場合もあるが、このような場合にも本発明を適用することができる。
【０１６６】
このようにして製造したヌクレオシド化合物は、濃縮、晶析、溶解、電気透析処理、イオン交換樹脂や活性炭による吸脱着処理どの常法を適用することにより単離することができる。
【実施例】
【０１６７】
以下に実施例により、本発明を更に詳細に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１６８】
実施例１
３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−Ｄ−リボース−１−リン酸（１８）およびビス〔３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−Ｄ−リボース−１−イル〕リン酸（１９）のアノマー混合物の合成
正リン酸 １．１８ｇとアセトニトリル ５１ｍLの混合物にトリｎ−ブチルアミン ２．３ｇとモルキュラーシーブス４Ａ ５．０７ｇを加え、攪拌しながら５℃に冷却した。１時間後、３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−α−Ｄ−リボシル クロリド（純度８５％） ５．０７ｇを加えて１時間攪拌し、表記化合物（１８）と（１９）の混合物〔（１８）：（１９）＝３：５、（１８）のα体：β体＝５：２〕のアセトニトリル溶液を得た。
【０１６９】
分析用サンプルを得るため、シクロヘキシルアミン塩とし、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、メタノール−酢酸エチル（１：１０）流分より、表記化合物（１９）の２種のアノマー異性体（１９ａ）および（１９ｂ）を得た。
（１９ａ）：低極性流分
1H NMR (CDCl3, 270 MHz) d 8.0-7.8 (m, 8 H), 7.4-7.2 (m, 8 H), 6.06 (m,1.2 H), 5.98 (m, 0.8 H), 5.56 (m, 1.2 H), 5.41 (m, 0.8 H), 4.7-4.3 (m,6 H), 2.6-2.4 (m, 1 H), 2.75-2.6 (m, 2 H), 2.5-2.3 (m, 2 H), 2.2-1.9 (m,2 H), 1.8-1.6 (m, 2 H), 1.6-0.9 (m, 8 H)、 MS (APCI) m/z 883 (M-H)
（１９b）：高極性流分
1H NMR (CDCl3, 270 MHz) d 8.0-7.8 (m, 8 H), 7.4-7.2 (m, 8 H), 6.1-5.9(m, 2 H), 5.55 (m, 0.67 H), 5.39 (m, 1.33 H), 4.7-4.3 (m, 6 H), 3.1-2.85(m, 1 H), 2.75-2.4 (m, 2 H), 2.32 (m, 2 H), 2.2-1.9 (m, 2 H), 1.8-1.6 (m, 2 H), 1.6-0.9 (m, 8 H)、 MS (APCI) m/z 883 (M-H)。
【０１７０】
実施例２
３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−Ｄ−リボース−１−リン酸およびビス〔３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−Ｄ−リボース−１−イル〕リン酸のアノマー混合物の合成
正リン酸 １．１１ｇと２−ブタノン ４９ｍLの混合物にトリｎ−ブチルアミン ２．１１ｇとモルキュラーシーブス４Ａ ４．９ｇを加え、攪拌しながら５℃に冷却した。さらに、３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−α−Ｄ−リボシル クロリド（純度８５％） ４．９ｇを加えて１０分間攪拌し、表記化合物（１８）と（１９）の混合物〔（１８）：（１９）＝１：４、（１８）のα体：β体＝７：１０〕の２−ブタノン溶液を得た。
【０１７１】
実施例３
３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−Ｄ−リボース−１−リン酸およびビス〔３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−Ｄ−リボース−１−イル〕リン酸のアノマー混合物の合成
正リン酸 １３６．８ｇと２−ブタノン ２Lの混合物にトリｎ−ブチルアミン ９０．６ｇとモルキュラーシーブス４Ａ ２００ｇを加え、攪拌しながら５℃に冷却した。１時間攪拌後、３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−α−Ｄ−リボシル クロリド（純度８５％） ２００ｇを加えて２時間攪拌し、表記化合物（１８）と（１９）の混合物〔（１８）：（１９）＝５：４、（１８）のα体：β体＝５：２〕の２−ブタノン溶液を得た。
【０１７２】
実施例４
３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸（１８ａ）の合成
実施例１で得たアセトニトリル溶液を攪拌しながら５℃に冷却し、正リン酸２．２９ｇを加えた。３時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となった。５時間後、反応懸濁液中の表記化合物（１８ａ）のα体／β体比は１０：１であった。結晶をモルキュラーシーブスとの混合物として濾取し、メタノール１００ｍＬに溶解後、再び濾過してモルキュラーシーブスを除いた。ＨＰＬＣ定量した結果、得られたメタノール溶液中に、表記化合物（１８ａ）は、３．６８ｇ含まれた。収率７４．６％（原料純度換算済み：ＨＰＬＣ上、β体は検出されない）。
【０１７３】
実施例５
３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸（１８ａ）の合成
実施例２で得た２−ブタノン溶液を攪拌しながら５℃に冷却し、正リン酸 ２．２ｇを加えた。１時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となった。２０時間後、反応懸濁液中の表記化合物（１８ａ）のα体／β体比は８：１であった。トリｎ−ブチルアミン ６．３３ｇを加えて析出晶を溶解し、モルキュラーシーブスを濾去した。濾液にトルエン ２５０ｍＬを加え、水 ５５ｍＬで洗浄した。有機層を氷冷し、シクロヘキシルアミン ２．３２ｇを加えて、攪拌晶析した。１時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（１６ａ）のジシクロヘキシルアミン塩 ３．１９ｇを無色粉末として得た。収率６４．７％（原料純度換算済み：α体：β体＝９７．５：２．５）
1H NMR (DMSO-d6, 270 MHz) d 8.00 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.96 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.58 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.58 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 5.82 (dd, J = 5.3, 5.3 Hz, 1 H), 5.36 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 4.6-4.3 (m, 3 H),4.7-3.5 (br, 6 H), 2.7-2.6 (m, 2 H), 2.55-2.4 (m, 1 H), 2.25 (d, J = 4.2Hz, 1 H), 1.85-1.75 (m, 4 H), 1.7-1.6 (m, 4 H), 1.55-1.45 (m, 2 H), 1.25-0.9 (m, 10 H)、 MS (APCI) m/z 590 (M+C6H14N)。
【０１７４】
実施例６
３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸（１８ａ）の合成
実施例３で得た２−ブタノン溶液を５℃に冷却し、攪拌した。１時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となった。２３時間後、反応懸濁液中の表記化合物（１８ａ）のα体／β体比は７：１であった。トリｎ−ブチルアミン ２５９ｇを加えて析出晶を溶解し、モルキュラーシーブスを濾去した。濾液を水２．２Ｌで洗浄し、さらに水層をトルエン １Ｌで抽出した。有機層を集め、氷冷し、シクロヘキシルアミン ８７．５ｇを加えて、攪拌晶析した。１時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（１６ａ）のジシクロヘキシルアミン塩 ２１３ｇを無色粉末として得た。収率７８．１％（原料純度換算済み：α体：β体＝９６．９：３．１）。
【０１７５】
実施例７
２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸（２０）の合成
実施例４で得たメタノール溶液にアンモニア水 ２０ｍＬを加え、室温で攪拌した。２８時間攪拌後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（２０）のアンモニウム塩 ５８９ｍｇを無色粉末として得た。収率２１．１％（ＨＰＬＣ上、β体は検出されない）。
【０１７６】
実施例８
２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸（２０）の合成
実施例６で得た化合物（１８ａ）をメタノール ２．３Ｌとアンモニア水 ４５０ｍＬの混合溶液に懸濁し、室温で攪拌した。２８時間攪拌後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（２０）のアンモニウム塩 ６２．０ｇを無色粉末として得た。収率８１．０％（ＨＰＬＣ上、β体は検出されない。）
1H NMR (D2O, 270 MHz) d 5.56 (s, 1 H), 4.03 (m, 2 H), 3.52 (dd, J = 3.3,12.2 Hz, 1 H), 3.41 (dd, J = 5.3, 12.2 Hz, 1 H), 2.17 (m, 1 H) , 1.87 (d, J = 13.9 Hz, 1 H)、 MS (APCI) m/z 213 (M-H)。
【０１７７】
実施例９
２，３，５−Ｏ−トリス（４−クロロベンゾイル）−α−Ｄ−リボース−１−リン酸（２１）
正リン酸 ３．３２ｇとメチルイソブチルケトン ６７ｍLの混合物にトリｎ−ブチルアミン ２．１１ｇとモルキュラーシーブス４Ａ ６．６ｇを加え、攪拌しながら５℃に冷却した。さらに、２，３，５−Ｏ−トリス（４−クロロベンゾイル）−α−Ｄ−リボシル クロリド ６．６６ｇを加えて１時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となった。１０時間後、反応懸濁液中の表記化合物（１９）のα体／β体比は１０：１であった。トリｎ−ブチルアミン ６．３３ｇを加えて析出晶を溶解し、モルキュラーシーブスを濾去した後、濾液を水５５ｍＬで洗浄した。有機層を氷冷し、シクロヘキシルアミン ２．４ｇを加えて、攪拌晶析した。１時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（２１）のジシクロヘキシルアミン塩 ７．０２ｇを無色粉末として得た。収率７３．０％（α体：β体＝９９：１）
1H NMR (DMSO-d6, 270 MHz) d 8.2-7.8 (m, 6 H), d 7.6-7.4 (m, 6 H), 5.9-5.7 (m, 1 H), 5.6-5.4 (m, 3 H), 4.6-4.3 (m, 1 H), 4.7-3.5 (br, 6 H), 2.7-2.6 (m, 2 H), 1.9-1.7 (m, 4 H), 1.7-1.6 (m, 4 H), 1.55-1.4 (m, 2 H), 1.3-0.9 (m, 10 H)、 MS (APCI) m/z 745 (M+C6H14N)。
【０１７８】
実施例１０
α−Ｄ−リボース−１−リン酸（２２）の合成
実施例９で得た化合物（２１）をメタノール １０５ｍＬとアンモニア水 ２１ｍＬの混合溶液に懸濁し、室温で攪拌した。３２時間攪拌後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（２２）のアンモニウム塩 １．９０ｇを無色粉末として得た。収率８６．０％（ＨＰＬＣ上、β体は検出されない。）
1H NMR (D2O, 270 MHz) d 5.6 (m, 1 H), 4.2 (m, 1 H), 4.1-4.0 (m, 2 H), 3.75 (m, 1 H) , 3.7 (m, 1 H)、 MS (APCI) m/z 229 (M-H)。
【０１７９】
実施例１１
５−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−２，３−ジデオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸（２３）
正リン酸 ３．５ｇとアセトニトリル ３３ｍLの混合物にトリｎ−ブチルアミン ２．２ｇとモルキュラーシーブス４Ａ ３．３ｇを加え、攪拌しながら５℃に冷却した。さらに、５−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−２，３−ジデオキシ−α−Ｄ−リボシル クロリド ３．２８ｇを加えて１時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となった。２０時間後、反応懸濁液中の表記化合物（２３）のα体／β体比は１０：１であった。トリｎ−ブチルアミン ６．５ｇを加えて析出晶を溶解し、モルキュラーシーブスを濾去した後、濾液をトルエン７０ｍＬで希釈し、水 ５５ｍＬで洗浄した。有機層を氷冷し、シクロヘキシルアミン ２．５ｇを加えて、攪拌晶析した。１時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（２３）のジシクロヘキシルアミン塩 ４．５６ｇを無色粉末として得た。収率７１．５％（α体：β体＝９７：３）
1H NMR (DMSO-d6, 270 MHz) d 8.2-7.8 (m, 2 H), d 7.6-7.4 (m, 2 H), 5.9-5.7 (m, 1 H), 5.6-5.4 (m, 1 H), 4.6-4.3 (m, 1 H), 4.7-3.5 (br, 6 H), 2.7-2.6 (m, 2 H), 1.9-1.7 (m, 8 H), 1.7-1.6 (m, 4 H), 1.55-1.4 (m, 2 H), 1.3-0.9 (m, 10 H)、 MS (APCI) m/z 374 (M+C6H14N)。
【０１８０】
実施例１２
２，３−ジデオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸（２４）の合成
実施例１１で得た化合物（２３）をメタノール ４６ｍＬとアンモニア水 １０ｍＬの混合溶液に懸濁し、室温で攪拌した。３０時間攪拌後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（２４）のアンモニウム塩 １．６８ｇを無色粉末として得た。収率８５．０％（ＨＰＬＣ上、β体は検出されない。）
1H NMR (D2O, 270 MHz) d 5.2 (m, 1 H), 4.1-3.9 (m, 1 H), 3.6-3.3 (m, 2 H),2.1-2.3 (m, 2 H), 1.9-1.7 (m, 2 H)、 MS (APCI) m/z 197 (M-H)。
【０１８１】
実施例１３
２，３，５−Ｏ−トリス（４−クロロベンゾイル）−α−Ｄ−アラビノフラノシル−１−リン酸（２５）
正リン酸 ３．３ｇとメチルイソブチルケトン ６７ｍLの混合物にトリｎ−ブチルアミン ２．１ｇとモルキュラーシーブス４Ａ ６．６ｇを加え、攪拌しながら５℃に冷却した。さらに、２，３，５−Ｏ−トリス（４−クロロベンゾイル）−α−Ｄ−アラビノフラノシル クロリド ６．６ｇを加えて１時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となった。８時間後、反応懸濁液中の表記化合物（２５）のα体／β体比は１０：１であった。トリｎ−ブチルアミン ６．３ｇを加えて析出晶を溶解し、モルキュラーシーブスを濾去した後、濾液を水５５ｍＬで洗浄した。有機層を氷冷し、シクロヘキシルアミン ２．４ｇを加えて、攪拌晶析した。１時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（２５）のジシクロヘキシルアミン塩 ６．７２ｇを無色粉末として得た。収率７０．５％（α体：β体＝９９：１）
MS (APCI) m/z 745 (M+C6H14N)。
【０１８２】
実施例１４
α−Ｄ−アラビノフラノシル−１−リン酸（２６）の合成
実施例１３で得た化合物（２５）をメタノール ９４ｍＬとアンモニア水 １８ｍＬの混合溶液に懸濁し、室温で攪拌した。４８時間攪拌後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（２６）のアンモニウム塩 １．７２ｇを無色粉末として得た。収率８２．０％（ＨＰＬＣ上、β体は検出されない。）
1H NMR (D2O, 270 MHz) d 5.3 (m, 1 H), 3.95-3.3 (m, 5 H)、 MS (APCI) m/z229 (M-H)。
【０１８３】
実施例１５
（２Ｒ）−２−ベンジルオキシメチル−１，３−ジオキソラン−４−リン酸（２７）の合成
（２Ｒ）−２−ベンジルオキシメチル−４−（Ｒ，Ｓ）−アセトキシ−１，３−ジオキソラン １．０６ｇのエーテル１２ｍｌ溶液に、氷冷下、４Ｎ塩酸−ジオキサン４ｍｌを加え、３．５時間攪拌後、室温まで昇温した。溶媒を濃縮後、さらにトルエンにて共沸し、（２Ｒ）−２−ベンジルオキシメチル−１，３−ジオキソラニル−４−クロリド５００ｍｇを無色透明の油状物として得た。アセトニトリル１．１ｍｌに、オルトリン酸０．２７ｇ、トリn−ブチルアミン０．６６ｍｌ、モルキュラーシーブス４Ａ ０．２３ｇを順次加え、１．５時間攪拌した。この懸濁液中に、氷冷下、先に得た油状物０．２７ｇを加え、氷冷下、５．５時間攪拌した。トリn−ブチルアミン０．６ｍｌを加えて３０分攪拌後、トルエンで希釈して水抽出を行った。水層をｎ−ブタノールで抽出し、濃縮した。濃縮物をトルエンに溶解後、シクロヘキシルアミンを加えて濃縮し、表記化合物（２７）のシクロヘキシルアミン塩を白色固体として得た。
1H-NMR(D2O) δ 0.98-1.10(2H, m), 1.14-1.23(6H,m), 1.47-1.51(2H,m), 1.61-1.64(4H,m), 1.78-1.83(4H,m), 2.94-3.00(2H,m), 3.46-3.60(2H,m), 3.72-3.79(1H,m), 3.92-4.00(1H,m), 4.41-4.51(2H,m), 5.01-5.03 and 5.22-5.24(total 1H, m), 5.64-5.72(total 1H,m), 7.24-7.30(5H,m) 、 MS (APCI) m/z 390 (M+C6H14N)+。
【０１８４】
実施例１６
（２Ｒ）−２−ヒドロキシメチル−１，３−ジオキソラン−４−リン酸（２８）の合成
実施例１５で得た化合物（２７）０．２ｇをメタノール１０ｍｌに溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ ０．１１ｇを触媒として常圧水素添加を行った。触媒をろ過後、ろ液を濃縮し表記化合物（２８）のシクロヘキシルアミン塩を得た。
1H-NMR(D2O) δ 0.99-1.06(2H,m), 1.10-1.24(6H,m), 1.47-1.50(2H,m), 1.62-1.66(4H,m), 1.80-1.85(4H,m), 1.96-3.02(2H,m), 3.51-3.57(2H,m), 3.72-3.79(1H,m), 3.93-4.00(1H,m), 4.99-5.01 and 5.13-5.15(total 1H, m), 5.64-5.67 and 5.70-5.73(total 1H,m) 、 MS (APCI) m/z 199 (M-H)-。
【０１８５】
実施例１７
２，３−ジデオキシ−３−フルオロ−５−O−（４−フェニルベンゾイル）−α−D−エリスロペントフラノース−１−リン酸（２９）の合成
オルトリン酸 ６２ｍｇ、トリｎ−ブチルアミン ５２μＬ、アセトニトリル０．７ｍＬを室温で攪拌し、モレキュラシーブス４Ａ ７０ｍｇを加えて氷浴下で攪拌した。これに２，３−ジデオキシ−３−フルオロ−５−Ｏ−（４−フェニルベンゾイル）−Ｄ−エリスロペントフラノシルクロリド７０ｍｇを加えて、同温で1日反応した。その後、トリｎ−ブチルアミン １５６μＬ、続いて脱イオン水を加えて、トルエンで３回抽出した。抽出した有機層にシクロヘキシルアミン４８μＬを加えて３０分間攪拌した後に、減圧下で濃縮し、アセトンを加えて析出物を濾取した。得られた残査をクロロホルムで洗浄し、減圧下室温で乾燥した。表記化合物（２９）のジシクロヘキシルアミン塩を白色固体として得た。
1H-NMR（CD3OD）δ1.1‐1.4（10H、m）、1.65（2H、m）、1.89（4H、m）、1.96（4H、m）、2.3−2.5（2H、m）、2.91（2H、m）、4.5（2H、m）、4.6−4.8（1H、m）、5.1−5.3（1H、m）、5.97（1H、m）、7.41（1H、m）、7.47（2H、m）、7.68（2H、m）、7.75（2H、m）、8.08（2H、m）、 MS (APCI) m/z 496 (M+C6H14N)+。
【０１８６】
実施例１８
２，３−ジデオキシ−３−フルオロ−α−Ｄ−エリスロペントフラノース−１−リン酸（３０）の合成
実施例１７で得た化合物（２９）２１ｍｇのメタノール１ｍＬ溶液にシクロヘキシルアミン ２０μＬを加え、２週間反応した。その後、減圧下で濃縮し、ジエチルエーテルを加えた。これを濾過した後、減圧下で乾燥して、表記化合物のジシクロヘキシルアミン塩１２ｍｇを白色固体として得た。
1H-NMR（CD3OD）δ 1.1‐1.4（10H、m）、1.66（2H、m）、1.79（4H、m）、1.94（4H、m）、2.3−2.4（2H、m）、2.88（2H、m）、3.59（2H、m）、4.3−4.4（1H、m）、5.11（0.5H、m、もう一方の0.5H分は、水のピークに隠れて判別不能）、5.89（1H、m）、 MS (APCI) m/z 215 (M-H)-。
【０１８７】
実施例１９
２，３−ジデオキシ−３−フルオロ−５−Ｏ−（４−フェニルベンゾイル）−Ｄ−エリスロペントフラノース−１−リン酸（３１）の合成
オルトリン酸 ７５９ｍｇ、トリn−ブチルアミン ６４６μＬ、アセトニトリル８．６ｍＬを室温で攪拌し、モルキュラシーブス４Ａ ０．８６ｇを加えて氷浴下で攪拌した。これに２，３−ジデオキシ−３−フルオロ−５−Ｏ−（４−フェニルベンゾイル）−Ｄ−エリスロペントフラノシルクロリド８６４ｍｇを加えて、同温で1日反応した。その後、トリn−ブチルアミン１．９４ｍＬ、続いて脱イオン水を加えて、トルエンで３回抽出し、さらに純水で５回洗浄した。有機層を分離して、シクロヘキシルアミン ５９０μＬを加えて３０分間攪拌した。減圧下で濃縮し、これにアセトンを加えて攪拌した後に、濾取した。さらに、得られた残査をイソプロピルエーテルで洗浄し、減圧下室温で乾燥し、表記化合物（３１）を白色固体として得た。α体：β体＝６６：３４。
1H-NMR（CD3OD）δ1.1‐1.4ppm（10H、m）、1.66（2H、m）、1.78（4H、m）、1.98（4H、m）、2.3-2.6（2H、m）、2.89（2H、m）、4.44 & 4.46 (α & β、2H)、4.6−4.8（1H、m）、5.1−5.3 & 5.3-5.4 (α & β、1H、m)、5.97 & 6.00(α & β、1H、m)、7.40（1H、m）、7.47（2H、m）、7.68（2H、m）、7.75（2H、m）、8.07（1H、m）、8.13（1H、m）。
【０１８８】
実施例２０
２，３−ジデオキシ−３−フルオロ−Ｄ−エリスロペントフラノース−１−リン酸（３２）の合成
実施例１９で得た化合物（３１）０．２９ｇのメタノール１５ｍＬ溶液にシクロヘキシルアミン２７９μＬを加え、１週間反応した。その後、減圧下で濃縮し、ジエチルエーテルを加えて攪拌した。これを濾過した後、減圧下で乾燥して、表記化合物（３２）のジシクロヘキシルアミン塩１８５ｍｇを白色固体として得た。α体：β体＝６６：３４。
1H-NMR（CD3OD）δ1.1‐1.4ppm（10H、m）、1.67（2H、m）、1.79（4H、m）、2.2-2.4（2H、m）、2.94（2H、m）、3.59 & 3.62(α & β、2H、m)、3.3-3.4 (2H、m)、5.10 & 5.1-5.24(α & β、0.5H & 1H、m、αの0.5Ｈ分は水に隠れて判別不能)、5.88 & 5.93 (α & β、1H、m)。
【０１８９】
実施例２１
３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−Ｏ−メチルリボース−１−リン酸（３３）の合成
１，３，５−Ｏ−トリベンゾイル−２−Ｏ−メチル−α−Ｄ−リボース２．８４ｇに４Ｎ塩酸−ジオキサン１４．５ｍＬを加えて氷冷下攪拌した。２．５時間後、４Ｎ塩酸−ジオキサン１０ｍＬを加え、さらに1時間攪拌した。溶媒を留去した後、ジオキサン１０ｍＬで２回共沸濃縮し、３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−Ｏ−メチルリボシル−１−クロリドを得た。９８％リン酸２．９８ｇを４−メチル−２−ペンタノン１５ｍＬに溶解し、モルキュラーシーブス４Ａ ２．８ｇを加えて３０分攪拌した。トリｎ−ブチルアミン１．４２ｍＬを加え、次いで先に得た３，５−Ｏ−ジベンゾイル−２−Ｏ−メチルリボシル−１−クロリドを４−メチル−２−ペンタノン１０ｍＬに溶解した溶液を加えた。室温で２０時間反応させ、トリｎ−ブチルアミン７．１ｍＬで中和した。モルキュラーシーブスを濾去し、濾液を水２０ｍＬで３回洗浄した。有機層を溶媒留去し、シリカゲルカラムにより精製し、表記化合物（３３）９５０ｍｇを得た。
MS (APCI) m/z 451(M-H)-、IR(KBr) cm-1 3448, 2963, 1721, 1453, 1278, 1111, 976, 711, 558。
【０１９０】
実施例２２
２−Ｏ−メチルリボース−１−β−リン酸（３４）の合成
実施例２１で得た化合物（３３）８５０ｍｇに１４％アンモニア−メタノール２０ｍＬを加え、室温で２０時間反応させた。溶媒を留去し、ジイソプロピルエーテルでスラッジした後、結晶性の粉末を濾過した。この粉末をメタノールに溶解し、シクロヘキシルアミンを加えて攪拌した。メタノールを留去し、残渣にジイソプロピルエーテルを加えてスラッジした。結晶性の粉末を濾過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。目的物を水により抽出し、４−メチル−２−ペンタノンにより２回洗浄した。水層を濃縮し、ジイソプロピルエーテルでスラッジした。結晶を濾取、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、表記化合物（３４）のジシクロヘキシルアミン塩１２０ｍｇを得た。
1H-NMR（D2O）δ3.37(s,3H), 3.49(dd,1H,J=4.9Hz,12.7Hz), 3.62(d,1H,J=4.9Hz), 3.69(dd,1H,J=2.7Hz,12.7Hz), 3.74-3.78(m,1H), 4.28(dd,1H,J=4.6Hz,7.8Hz), 5.39(d,1H,J=5.9Hz)、 MS (APCI) m/z 243(M-H)-。
【０１９１】
実施例２３
３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸（１８ａ）の合成
正リン酸６．９２ｇとアセトニトリル８０ｍLの混合物にトリｎ−ブチルアミン５．５１ｍＬとモルキュラーシーブス４Ａ １０ｇを加え、室温で５時間攪拌した後、一晩静置した。−７℃に冷却した後、３，５−Ｏ−ビス（４−クロロベンゾイル）−２−デオキシ−α−Ｄ−リボシル クロリド（純度８５％） １０ｇを加えて９時間攪拌し、−１５℃で一晩静置した。トリｎ−ブチルアミン １６．５ｍＬを加えた後、モルキュラーシーブスを濾去した。濾液を濃縮し、残さを４−メチル−２−ペンタノンに溶解し、水で洗浄した。有機層を氷冷し、シクロヘキシルアミン５．６６ｍＬを加えて、攪拌晶析した。１．５時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（１８ａ）のジシクロヘキシルアミン塩１３．５ｇを無色粉末として得た。（α体：β体＝９８．８：１．２）。
【０１９２】
実施例２４
２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸（２０）の合成
実施例２３で得た化合物７．０５ｇのメタノール溶液に、シクロヘキシルアミン２．９２ｍＬを加え、室温で攪拌した。７２時間攪拌後、濃縮し、エタノールを加えて懸濁攪拌した。析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（２０）のジシクロヘキシルアミン塩３．８７ｇを無色粉末として得た。（ＮＭＲ上、β体は検出されない。）
1H NMR (D2O) d 5.57 (dd, J = 5.1, 6.1 Hz, 1 H), 4.03 (m, 2 H), 3.54 (ddd, J = 1.2, 2.2, 12.2 Hz, 1 H), 3.42 (ddd, J = 1.2, 5.1, 12.2 Hz, 1 H), 3.18-2.94 (m, 2 H), 2.17 (m, 1 H), 1.90 (d, J = 1.2, 12.8 Hz, 1 H), 1.8-1.45(m, 10 H), 1.25-0.9 (m, 12 H)
Anal.
Calcd. for C5H9O7P・C12H28N2,C: 49.50 %; H: 9.04 %; N: 6.79 %; P:7.51 %,
Found C: 49.26 %; H: 8.81 %; N: 6.64 %; P: 7.29 %。
【０１９３】
実施例２５
２'−デオキシアデノシンの合成（１）
エシェリヒア・コリＫ−１２／ＸＬ−１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、大腸菌染色体ＤＮＡを調製した。
【０１９４】
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のｄｅｏＤ遺伝子の塩基配列（GenBank accession No. AE000508（コード領域は塩基番号11531-12250）に基づいて設計した配列番号：１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。これらのプライマーの５'末端付近及び３'末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIの制限酵素認識配列を有する。
配列番号：１；GTGAATTCAC AAAAAGGATA AAACAATGGC
配列番号：２；TCGAAGCTTG CGAAACACAA TTACTCTTT
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分、アニーリング：５５℃、１分、伸長反応：７４℃、１分からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行なった。
【０１９５】
上記反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、ｐＵＣ−ＰＮＰ７３と命名した。こうして得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリ ＭＴ−１０９０５と名づけた。
【０１９６】
エシェリヒア・コリ ＭＴ−１０９０５株をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。得られた培養液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、菌体を集めた。菌体を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬに懸濁し、超音波により破砕したものを酵素源として用いた。
【０１９７】
実施例８で得られた２．５ｍＭの２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸 ジアンモニウム塩、２．５ｍＭのアデニン（和光純薬製、特級）、上記のように調整した０．１ｍｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に種々の濃度の塩化カルシウム（和光純薬、特級）を添加した反応液１ｍｌを３０℃、２４時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。
【０１９８】
反応終了液を以下に示すＨＰＬＣ分析にて分析した結果、和光純薬製の２'−デオキシアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、すべての反応終了液中に確認された。
【０１９９】
ＨＰＬＣ分析条件
・カラム；ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ３１２ １５０×６．０ｍｍＩ．Ｄ．
・カラム温度；４０℃
・ポンプ流速；０．７５ｍｌ／ｍｉｎ
・検出；ＵＶ２６０ｎｍ
・溶離液；１０ｍＭリン酸：アセトニトリル＝９５：５（Ｖ／Ｖ）
また、反応終了液の２'−デオキシアデノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算した結果を表−１に示した。
【０２００】
【表１】
2010031037.tif 000025
【０２０１】
実施例２６
２'−デオキシアデノシンの合成（２）
塩化カルシウムの代わりに塩化アルミニウムを添加する以外はすべて実施例２５と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例２５と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、和光純薬製の２'−デオキシアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、すべての反応終了液中に確認された。また、反応終了液の２'−デオキシアデノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算した結果を表−２に示した。
【０２０２】
【表２】
2010031037.tif 000026
【０２０３】
実施例２７
２'−デオキシアデノシンの合成（３）
塩化カルシウムの代わりに１０ｍＭの塩化バリウムを添加する以外はすべて実施例２５と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例２５と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、和光純薬製の２'−デオキシアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液の２'−デオキシアデノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算した結果、反応転化率は９２．４％であった。
【０２０４】
実施例２８
チミジンの合成
実施例８で調製した２．５ｍＭの２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸 ジアンモニウム塩、２．５ｍＭのチミン（和光純薬製、特級）、１２ｕｎｉｔｓ／ｍｌのチミジンホスホリラーゼ（ＳＩＧＭＡ製）、０ｍＭまたは１０ｍＭの硝酸カルシウム（和光純薬、特級）、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）から成る反応液１ｍｌを３０℃、２４時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例２５と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、和光純薬製のチミジン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液のチミジンの濃度を定量し、反応転化率を計算した結果を表−３に示した。
【０２０５】
【表３】
2010031037.tif 000027
【０２０６】
実施例２９
２'−デオキシアデノシンの合成（４）
実施例８で調製した１００ｍＭの２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸 ジアンモニウム塩、１００ｍＭのアデニン（和光純薬製、特級）、実施例２５で調製した０．１ｍｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液、０〜１５０ｍＭの塩化カルシウム（和光純薬、特級）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）から成る反応液１ｍｌを５０℃、２４時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例２５と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、和光純薬製の２−デオキシアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液の２'−デオキシアデノシンの濃度を定量した結果を表−４に示した。
【０２０７】
【表４】
2010031037.tif 000028
【０２０８】
実施例３０
２'−デオキシグアノシンの合成
実施例８で調製した１００ｍＭの２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸 ジアンモニウム塩、１００ｍＭのグアニン（和光純薬製、特級）、実施例２５で調製した０．１ｍｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液、０ｍＭまたは１５０ｍＭの塩化カルシウム（和光純薬、特級）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）から成る反応液１ｍｌを５０℃、２４時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例２５と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、和光純薬製の２−デオキシグアノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液の２'−デオキシグアノシンの濃度を定量した結果を表−５に示した。
【０２０９】
【表５】
2010031037.tif 000029
【０２１０】
実施例３１
アデノシンの合成
実施例１０で調製した１００ｍＭのα−Ｄ−リボース−１−リン酸 ジアンモニウム塩、１００ｍＭのアデニン（和光純薬製、特級）、実施例２５で調製した０．１ｍｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液、０ｍＭまたは１５０ｍＭの塩化カルシウム（和光純薬、特級）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）から成る反応液１ｍｌを５０℃、２４時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例２５と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、和光純薬製のアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液のアデノシンの濃度を定量した結果を表−６に示した。
【０２１１】
【表６】
2010031037.tif 000030
【０２１２】
実施例３２
２'，３'−ジデオキシアデノシンの合成
実施例１２で調製した１００ｍＭの２，３−ジデオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸 ジアンモニウム塩、１００ｍＭのアデニン（和光純薬製、特級）、実施例２５で調製した０．１ｍｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液、０ｍＭまたは１５０ｍＭの塩化カルシウム（和光純薬、特級）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）から成る反応液１ｍｌを５０℃、２４時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例２５と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、シグマ社製の２'，３'−ジデオキシアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液の２'，３'−ジデオキシアデノシンの濃度を定量した結果を表−７に示した。
【０２１３】
【表７】
2010031037.tif 000031
【０２１４】
実施例３３
アデニン−９−β−Ｄ−アラビノシドの合成
実施例１４で調製した１００ｍＭのα−Ｄ−アラビノフラノシル−１−リン酸ジアンモニウム塩、１００ｍＭのアデニン（和光純薬製、特級）、実施例２５で調製した０．１ｍｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液、０ｍＭまたは１５０ｍＭの塩化カルシウム（和光純薬、特級）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）から成る反応液１ｍｌを５０℃、２４時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例２５と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、シグマ社製のアデニンアラビノシド（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液のアデニン−９−β−Ｄ−アラビノシドの濃度を定量した結果を表−８に示した。
【０２１５】
【表８】
2010031037.tif 000032
【０２１６】
実施例３４
２−アミノ−６−クロロプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの合成
実施例８で得られた１０ｍＭの２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸ジアンモニウム塩、１０ｍＭの２−アミノ−６−クロロプリン（東京化成）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、実施例２５で調整した５０μｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液を添加した反応液１ｍｌを５０℃、４時間反応させた。反応終了液を以下に示すＨＰＬＣ分析にて分析した結果、２−アミノ−６−クロロプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドのピークが確認された。また、反応終了液の２−アミノ−６−クロロプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、２０．９％であった。
【０２１７】
ＨＰＬＣ分析条件
・カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５ ２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．
・カラム温度；４０℃
・ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出；ＵＶ２５４ｎｍ・
・溶離液；２５ｍＭリン酸二水素一カリウム：メタノール＝８７５：１２５（Ｖ／Ｖ）。
【０２１８】
実施例３５
２，６−ジアミノプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの合成
２−アミノ−６−クロロプリンの代わりに２，６−ジアミノプリン（東京化成）を添加する以外はすべて実施例３４と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了液を実施例３４と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、２，６−ジアミノプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドのピークが確認された。また、反応終了液の２，６−ジアミノプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、７５．５％であった。
【０２１９】
実施例３６
６−メルカプトプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの合成
２−アミノ−６−クロロプリンの代わりに６−メルカプトプリン（ＫＯＵＪＩＮ）を添加する以外はすべて実施例３４と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了液を実施例３４と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、６−メルカプトプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドのピークが確認された。また、反応終了液の６−メルカプトプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、５７．２％であった。
【０２２０】
実施例３７
２−アミノ−６−ヨードプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの合成
２−アミノ−６−クロロプリンの代わりに２−アミノ−６−ヨードプリンを添加する以外はすべて実施例３４と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了液を実施例３４と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、２−アミノ−６−ヨードプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドのピークが確認された。また、反応終了液の２−アミノ−６−ヨードプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、６９．２％であった。
【０２２１】
実施例３８
２−アセチルアミノ−６−ヒドロキシプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの合成
２−アミノ−６−クロロプリンの代わりに２−アセチルアミノ−６−ヒドロキシプリン（東京化成）を添加する以外はすべて実施例３４と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了液を以下に示すＨＰＬＣ分析にて分析した結果、２−アセチルアミノ−６−ヒドロキシプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドのピークが確認された。また、反応終了液の２−アセチルアミノ−６−ヒドロキシプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、４８．７％であった。
【０２２２】
ＨＰＬＣ分析条件
・カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５ ２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．
・カラム温度；４０℃
・ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出；ＵＶ２５４ｎｍ
・溶離液；２５ｍＭリン酸二水素一カリウム：メタノール＝７５：２５（Ｖ／Ｖ）。
【０２２３】
実施例３９
２−アミノ−６−シクロプロピルアミノプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの合成
２−アミノ−６−クロロプリンの代わりに２−アミノ−６−シクロプロピルアミノプリンを添加する以外はすべて実施例３４と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了液を実施例３８と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、２−アミノ−６−シクロプロピルアミノプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドのピークが確認された。また、反応終了液の２−アミノ−６−シクロプロピルアミノプリン−２'−デオキシ−β−Ｄ−リボシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、８７．６％であった。
【０２２４】
実施例４０
２'，３'−ジデオキシ−３'−フルオロ−Ｄ−グアノシンの合成
実施例１８で得られた７．０ｍＭの２，３−ジデオキシ−３−フルオロ−Ｄ−エリスロペントフラノース−１−リン酸、１０ｍＭのグアニン（東京化成）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、実施例２５のように調整した０．１ｍｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液を添加した反応液１ｍｌを５０℃、１１４時間反応させた。反応終了液を実施例３４と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、２'，３'−ジデオキシ−３'−フルオロ−Ｄ−グアノシンのピークが確認された。また、反応終了液の２'，３'−ジデオキシ−３'−フルオロ−Ｄ−グアノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、４７．７％であった。
【０２２５】
実施例４１
２'，３'−ジデオキシ−３'−フルオロ−Ｄ−グアノシンの合成
実施例１８で得られた７．０ｍＭの２，３−ジデオキシ−３−フルオロ−Ｄ−エリスロペントフラノース−１−リン酸、１０ｍＭのグアニン（東京化成）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、実施例２５のように調整した０．１ｍｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液を添加した反応液１ｍｌを５０℃、４７時間反応させた後、終濃度２０ｍＭの塩化カルシウムを添加してさらに５０℃、６７時間反応させた。反応終了液を実施例３４と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、２'，３'−ジデオキシ−３'−フルオロ−Ｄ−グアノシンのピークが確認された。また、反応終了液の２'，３'−ジデオキシ−３'−フルオロ−Ｄ−グアノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、８４．４％であった。
【０２２６】
実施例４２
６−クロロ−９−（β−Ｄ−リボフラノース−１−イル）プリンの合成
１０ｍＭの６−クロロプリン（Ａｌｄｒｉｃｈ）、実施例１０で得た５０ｍＭのＤ−リボース−１−リン酸（２２）、実施例２５で得た０．１ｍｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）からなる反応液１ｍｌを５０℃、２０時間反応させた。反応終了後、反応液を以下に示すＨＰＬＣ分析にて分析した結果、表題化合物のピークが確認された。また、反応終了液の６−クロロ−９−（β−Ｄ−リボフラノース−１−イル）プリンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、６２．４％であった。
【０２２７】
ＨＰＬＣ分析条件
・カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５ ２５０×４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．
・カラム温度：４０℃
・ポンプ流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出：ＵＶ２５４ｎｍ
・溶離液：２５ｍＭリン酸二水素一カリウム：メタノール＝７５：２５（Ｖ／Ｖ）。
【０２２８】
実施例４３
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−１−イル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンおよび３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−１−イル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
実施例８で得た１０ｍＭの２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸アンモニウム塩、１０ｍＭの４−アザベンスイミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、実施例２５で調製した５０μｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液を添加した反応液１ｍｌを５０℃、１７時間反応させた。反応終了液を以下に示すＨＰＬＣ分析にて分析した結果、表題化合物のピークが２本観察された。また、反応終了液の生成物の濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、３％および７．２％であった。
【０２２９】
ＨＰＬＣ分析
・カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５ ２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．
・カラム温度：４０℃
・ポンプ流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出：ＵＶ２５４ｎｍ
・溶離液：２５ｍＭリン酸二水素一カリウム：メタノール＝５０：５０（Ｖ／Ｖ）
ＬＣ−ＭＳ 分析データ：ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ２３６（ＭＨ）+。
【０２３０】
実施例４４
８−アザ−２'−デオキシアデノシンの合成
４−アザベンズイミダゾールの代わりに８−アザアデニン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、実施例４３と同様の条件で反応を行った。反応終了液を以下に示すＨＰＬＣ分析にて分析した結果、８−アザ−２'−デオキシアデノシンのピークが確認された。また、反応終了液の８−アザ−２'−デオキシアデノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、４．８％であった。
ＨＰＬＣ分析
・カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５ ２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．
・カラム温度：４０℃
・ポンプ流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出：ＵＶ２５４ｎｍ
・溶離液：２５ｍＭリン酸二水素一カリウム：メタノール＝８７５：１２５（Ｖ／Ｖ）
・ＬＣ−ＭＳ 分析データ：ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ２５３（ＭＨ）+。
【０２３１】
実施例４５
８−アザ−２'−デオキシグアノシンの合成
４−アザベンズイミダゾールの代わりに８−アザグアニン（東京化成）を用いて、実施例４３と同様の条件で反応を行った。反応終了液を実施例４４と同じＨＰＬＣ分析にて分析した結果、８−アザ−２'−デオキシグアノシンのピークが確認された。また、反応終了液の８−アザ−２'−デオキシグアノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、３６．１％であった。
【０２３２】
実施例４６
２−クロロ−２'−デオキシアデノシン（クラドリビン）の合成
４−アザベンズイミダゾールの代わりに２−クロロ−４−アミノプリンを用いて、実施例４３と同様の条件で反応を行った。反応終了液を以下に示すＨＰＬＣ分析にて分析した結果、表題化合物のピークが確認された。また、反応終了液の２−クロロ−２'−デオキシアデノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、９６％であった。
ＨＰＬＣ分析
・カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５ ２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．
・カラム温度：４０℃
・ポンプ流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出：ＵＶ２５４ｎｍ
・溶離液：２５ｍＭリン酸二水素一カリウム：メタノール＝８７５：１２５（Ｖ／Ｖ）。
【０２３３】
実施例４７
１−（β−Ｄ−リボフラノース−１−イル）−１，３，４−トリアゾール−３−カルボキジアミド（リバビリン）の合成
４−アザベンズイミダゾールの代わりに、１，２，４−トシアゾール−３−カルボキシアミドを用いて、実施例４３と同様の条件で反応を行った。反応終了液を以下に示すＨＰＬＣ分析にて分析した結果、表題化合物のピークが確認された。また、反応終了液の１−（β−Ｄ−リボフラノース−１−イル）−１，３，４−トリアゾール−３−カルボキジアミドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、６９％であった。
ＨＰＬＣ分析
・カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５ ２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．
・カラム温度：４０℃
・ポンプ流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出：ＵＶ２１０ｎｍ
・溶離液：２５ｍＭリン酸二水素一カリウム。
【０２３４】
実施例４８
１−（β−Ｄ−リボフラノース−１−イル）−５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド（アカデシン）の合成
４−アザベンズイミダゾールの代わりに５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドを用いて、実施例４３と同様の条件で反応を行った。反応終了液を以下に示すＨＰＬＣ分析にて分析した結果、表題化合物のピークが確認された。また、反応終了液の１−（β−Ｄ−リボフラノース−１−イル）−５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、４６％であった。
ＨＰＬＣ分析
・カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５ ２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．
・カラム温度：４０℃
・ポンプ流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出：ＵＶ２５４ｎｍ
・溶離液：２５ｍＭリン酸二水素一カリウム：メタノール＝９３：７（Ｖ／Ｖ）。
【０２３５】
実施例４９
２'−デオキシグアノシンの合成
２０ｇの純水に、実施例２４で得た３．２２ｇ（７．７２ｍｍｏｌ）の２−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩、１．１１ｇ（７．３４ｍｍｏｌ）のグアニンと０．６７ｇ（１１．４８ｍｍｏｌ）の水酸化マグネシウムを加えた。得られた反応生成物のｐＨを２０％水酸化ナトリウム水溶液にて９に調整後、０．１ｍｌの前述の酵素液（０．１ｍｌ）を加え、５０℃、８時間攪拌下で反応させた。８時間後の反応生成物をＨＰＬＣで分析したところ、所望の２'−デオキシグアノシンを反応収率９９％で得た。
【０２３６】
実施例５０
２'−デオキシアデノシンの合成
２０ｇの純水に、実施例２４で得た３．２２ｇ（７．７２ｍｍｏｌ）の２−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩、１．０１ｇ（７．４７ｍｍｏｌ）アデニンと０．６７ｇ（１１．４８ｍｍｏｌ）の水酸化マグネシウムを加えた。得られた反応生成物のｐＨを２０％水酸化ナトリウム水溶液にて８．６に調整後、０．１ｍｌの前述の酵素液（０．１ｍｌ）を加え、５０℃、３時間攪拌下で反応させた。３時間後の反応生成物をＨＰＬＣで分析したところ、所望の２'−デオキシアデノシンを反応収率９９％で得た。
【配列表】
2010031037000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月2日(2009.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2010031037.tif 000052
〔式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、保護されたヒドロキシメチル基または保護されたカルボキシル基を表し、Ｒ3はアシル基を表し、Ｒ4は水酸基の保護基を表し、Ｘはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｍは１から３の整数を表し、ｎは０または１を表し、ｐおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｐ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕
で示される１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する１−リン酸化糖誘導体モノマーα体またはβ体の一方を選択的に晶析することによりアノマー混合物間の平衡を傾け、１−リン酸化糖誘導体モノマーのα体またはβ体の一方を選択的に製造し、ついでＲ4で表される保護基の脱離反応を行って、下記式（３）
【化２】
2010031037.tif 000053
（式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基またはカルボキシル基を表し、Ｒ3は水素原子またはアシル基を表し、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは式（１）と同義である。）で示される１−リン酸化糖誘導体モノマーを製造する第一の工程と、
該第一の工程で得られた１−リン酸化糖誘導体のリン酸基と塩基との交換反応をヌクレオシドホスホリラーゼにより行う第二の工程により、下記式（８）
【化３】
2010031037.tif 000054
（式中、Ｂは、独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。また、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは式（３）と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。
【請求項２】
ヌクレオシドホスホリラーゼを用いて、下記式（６）
【化４】
2010031037.tif 000055
〔式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはカルボキシル基を表し、Ｒ3はアシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｎは０または１を表し、ｐおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｐ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕
で示される１−リン酸化糖誘導体モノマー（但し、天然に存在するものを除く）のリン酸基と塩基との交換反応により、下記式（８）
【化５】
2010031037.tif 000056
（式中、Ｂは独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは式（６）と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。
【請求項３】
ヌクレオシドホスホリラーゼを用いて、式（６’）
【化６】
2010031037.tif 000057
〔式中、Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはカルボキシル基を表し、Ｒ3はアシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｐおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｐ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕
で示される１−リン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応により、式（１０）
【化７】
2010031037.tif 000058
（式中、Ｂは独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒは式（６’）と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。
【請求項４】
Ｒ1がヒドロキシメチル基、Ｒ2が水素原子、ｐおよびｒが０、Ｘがフッ素原子である請求項３記載のヌクレオシドの製造方法。
【請求項５】
下記式（１８）：
【化８】
2010031037.tif 000059
（式中、Ｒ11は保護されたヒドロキシメチル基を表し、Ｒ14は水酸基の保護基を表す。）で示される化合物を、塩基の存在下にリン酸で処理して、下記式（１９）：
【化９】
2010031037.tif 000060
（式中、Ｒ11およびＲ14は、前記と同義であり、ｍは１から３の整数を表す。）で示される１−リン酸化糖誘導体のアノマー混合物とした後、加リン酸分解および異性化し、生成するα体を選択的に晶析させることによるアノマー混合物間の平衡を傾け、α体を選択的に製造し、ついで保護基の脱離を行って、２−デオキシ−α−Ｄ−リボース−１−リン酸を製造する第一の工程と、
該第一の工程で得られた１−リン酸化糖誘導体のリン酸基と塩基との交換反応をヌクレオシドホスホリラーゼにより行う第二の工程による、下記式（２１）
【化１０】
2010031037.tif 000061
（式中、Ｂは独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。）
で示されるヌクレオシドの製造方法。
【請求項６】
ヌクレオシドホスホリラーゼが、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される１種又は２種以上の酵素であることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のヌクレオシドの製造方法。
【請求項７】
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に代えて、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される１種又は２種以上のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物を用いることを特徴とする請求項１から５記載のいずれか一項に記載のヌクレオシドの製造方法。
【請求項８】
ヌクレオシドホスホリラーゼにより、１−リン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応を行う際に、リン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを反応液中に存在させることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
リン酸と難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンがカルシウムイオン、バリウムイオン、アルミニウムイオン及びマグネシウムイオンの中から選ばれる1種類以上の金属カチオンである請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
ヌクレオシドが天然ヌクレオシドである請求項８記載のヌクレオシドの製造方法。
【請求項１１】
下記式（１１）
【化１１】
2010031037.tif 000062
〔式中、Ｂは、独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基またはカルボキシル基を表し、Ｒ3は水素原子またはアシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｍは１から３の整数を表し、ｎは０または１を表し、ｐおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｐ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕
で示される非天然型ヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルオロチミジン、リバビリン、オロチジン、ウラシルアラビノシド、アデニンアラビノシド、２−メチル−アデニンアラビノシド、２−クロル−ヒポキサンチンアラビノシド、チオグアニンアラビノシド、２，６−ジアミノプリンアラビノシド、シトシンアラビノシド、グアニンアラビノシド、チミンアラビノシド、エノシタビン、ジェムシタビン、アジドチミジン、イドクスウリジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデオキシシチジン、ソリブジン、５−メチルウリジン、ビラゾール、チオイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、アロプリノールウラシル、５−フルオロウラシル、２'−アミノウリジン、２'−アミノアデノシン、２'−アミノグアノシン、２−クロル−２'−アミノイノシン、ＤＭＤＣ、ＦＭＤＣは除く）。
【請求項１２】
下記式（１２）
【化１２】
2010031037.tif 000063
〔式中、Ｂは、独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基またはカルボキシル基を表し、Ｒ3は水素原子またはアシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｍは１から３の整数を表し、ｎは０または１を表し、ｐおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｐ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕
で示される非天然ヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルオロチミジン、リバビリン、オロチジン、ウラシルアラビノシド、アデニンアラビノシド、２−メチル−アデニンアラビノシド、２−クロル−ヒポキサンチンアラビノシド、チオグアニンアラビノシド、２，６−ジアミノプリンアラビノシド、シトシンアラビノシド、グアニンアラビノシド、チミンアラビノシド、エノシタビン、ジェムシタビン、アジドチミジン、イドクスウリジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデオキシシチジン、ソリブジン、５−メチルウリジン、ビラゾール、チオイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、アロプリノールウラシル、５−フルオロウラシル、２'−アミノウリジン、２'−アミノアデノシン、２'−アミノグアノシン、２−クロル−２'−アミノイノシン、ＤＭＤＣ、ＦＭＤＣは除く）。
【請求項１３】
下記式（１３）
【化１３】
2010031037.tif 000064
〔式中、Ｂは、独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。Ｒ1およびＲ2は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基またはカルボキシル基を表し、Ｒ3は水素原子またはアシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｍは１から３の整数を表し、ｎは０または１を表し、ｐおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｐ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕
で示されるヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルオロチミジン、リバビリン、オロチジン、ウラシルアラビノシド、アデニンアラビノシド、２−メチル−アデニンアラビノシド、２−クロル−ヒポキサンチンアラビノシド、チオグアニンアラビノシド、２，６−ジアミノプリンアラビノシド、シトシンアラビノシド、グアニンアラビノシド、チミンアラビノシド、エノシタビン、ジェムシタビン、アジドチミジン、イドクスウリジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデオキシシチジン、ソリブジン、５−メチルウリジン、ビラゾール、チオイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、アロプリノールウラシル、５−フルオロウラシル、２'−アミノウリジン、２'−アミノアデノシン、２'−アミノグアノシン、２−クロル−２'−アミノイノシン、ＤＭＤＣ、ＦＭＤＣは除く）。