(57)【要約】【課題】プロテオリポソームの脂質二分子膜に再構成された膜タンパク質の配向を評価する、膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法を目的とする。【解決手段】プロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０内に再構成された膜タンパク質１０の配向を評価する方法であって、膜タンパク質１０の細胞外ドメイン１２ｂを標識する蛍光標識抗体４２により、プロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の外側に位置する細胞外ドメイン１２ｂを標識する標識工程と、該標識工程の後に蛍光標識抗体４２による標識が施されたプロテオリポソーム１を分析して膜タンパク質１０の配向を評価する評価工程と、を有する膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオリポソームの脂質二分子膜内に再構成された膜タンパク質の配向を評価する方法であって、
前記膜タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインのいずれかを標識する標識物質により、前記プロテオリポソームの前記脂質二分子膜の外側に位置する細胞内ドメインおよび／または細胞外ドメインを標識する標識工程と、
該標識工程の後に前記標識物質による標識が施された前記プロテオリポソームを分析して前記膜タンパク質の配向を評価する評価工程と、を有する膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法。
【請求項２】
前記標識物質が、蛍光標識抗体、金微粒子標識抗体、および金微粒子からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１に記載の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法。
【請求項３】
前記標識物質として蛍光標識抗体を用い、前記評価工程にて、前記プロテオリポソームの蛍光強度を測定して膜タンパク質の配向を評価する、請求項２に記載の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法。
【請求項４】
前記標識物質として金微粒子標識抗体および金微粒子、または金微粒子標識抗体若しくは金微粒子を用い、前記評価工程にて、前記プロテオリポソームの大きさを測定して膜タンパク質の配向を評価する、請求項２または３に記載の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代が到来し、生体から精製したタンパク質を様々な用途に利用する研究開発が頻繁になされるようになってきた。その中でも膜タンパク質は、新しい創薬のターゲットとして注目されている。膜タンパク質である受容体タンパク質は、生体膜中に存在し、生体内の情報伝達に重要な役割を果たす。それゆえ、その機能の障害は疾病に大きく関与し、近年、既存の薬のうち約５０％、研究開発中の薬のうち約７０％が膜タンパク質をターゲットとしたものであるといわれている。そこで、精製した膜タンパク質を取り扱って様々な検討が行われているが、精製した膜タンパク質を、機能を保持した状態で取り扱う際には、多くの場合、該膜タンパク質を人工脂質二分子膜に再構成することが行われている。
【０００３】
また、再構成した膜タンパク質を用いることで、ナノメディシンという新しい分野の研究も生まれている。これはドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に代表されるナノメートル領域でかつ活性を制御した分子を創薬に用いる研究であり、米国では実際に治療に用いられている例もある。
具体的には、脂質二分子膜（以下、単に「脂質膜」ということもある。）により形成したナノメートルサイズのベシクルの表面に細胞接着性のタンパク質または抗体を埋め込み、内部に薬剤を充填しておく。これにより、タンパク質の分子識別能による局所限局性送達が実現されるため、投薬により、肺、目、皮膚の治療のみならず、癌や神経変性疾患、心血管疾患の治療も期待される。さらに、ナノ構造化したスキャフォールドによる再生医工学も注目されている（例えば、非特許文献１）。
【０００４】
一方、生体の機能を利用してチップ化を行うことも広く行われている。タンパク質もしくは抗体を基板上に固定して、その応答を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）等の方法で観察するプロテインチップは、短時間の診断や創薬に役立てられるようになってきた。この方法では、チップ化したタンパク質のリガンド結合能を検討するために、多数の活性を有する状態のタンパク質を基板上に保持している。
また、ベシクルを使ってタンパク質をアレイ化したチップに関しては、膜タンパク質をベシクルに再構成させ、自己配列法により基板の微小領域に結合させるという技術が開発されている（非特許文献２）。
さらに、パターニングしたシリコン基板を用いてベシクルをアレイ状に配列させる技術（特許文献２）や、金のナノメートルサイズのドット上にベシクルを配列させる技術も示されている（非特許文献３）。両者とも、膜タンパク質を含むベシクルを用いることで、膜タンパク質チップを容易に作製することが可能である。
【０００５】
その他、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）等のプローブ顕微鏡による膜タンパク質の構造観察は、膜タンパク質の機能を知る上で重要である。特に二次元結晶化された膜タンパク質については多くの報告がなされており（非特許文献４）、最近では精製後の膜タンパク質を脂質膜へ再構成し、その構造を観察することも行われている（非特許文献５）。プローブ顕微鏡を用いる観察では、単一の膜タンパク質を観察することも可能となり、生体内における膜タンパク質の役割や、他の分子との相互作用等について、より深い知見を得ることも可能である。
【０００６】
膜タンパク質等の生体分子を観察やデバイスに用いる場合、生体分子やその一部が基板に強固に固定されている場合や、生体分子同士が凝集している場合には、それらの生体分子が生体内とは同じ生理活性を保持し難い。膜タンパク質１０は、図１に示すように、生体膜２０に埋め込まれる疎水部１１と、生体膜２０には入り込まない親水部１２（細胞内ドメイン１２ａ、細胞外ドメイン１２ｂ）とを有しており、生体内では、その疎水部１１が生体膜２０に埋め込まれた状態で存在している。そのため、機能を発現させるためには、生体内を模倣した状態、つまり脂質二分子膜中に再構成した状態で扱う必要があり、その状態で、アレイ化して診断等の目的でチップ化したり、プローブ顕微鏡で構造観察を行う目的で基板上に展開したりする必要がある。つまり、特に膜タンパク質の薬学、工学応用において、膜タンパク質を脂質膜へ再構成することは非常に重要である。
【０００７】
膜タンパク質を再構成したリポソーム（プロテオリポソーム）の製造方法としては、透析法やビーズ法等が挙げられる。脂質、膜タンパク質、界面活性剤を混合した混合液から、透析法、ビーズ法によって界面活性剤を除去することで、膜タンパク質が脂質二分子膜からなるリポソームの中に再構成されて安定化し、プロテオリポソームが形成される。基板上に展開する場合は、前述のようにして得たプロテオリポソームをベシクルフュージョン法により展開する。
【０００８】
従来、膜タンパク質の脂質膜への再構成は、主に（１）プロテオリポソームを用いたＤＤＳ（非特許文献６）、（２）Ｘ線構造解析のための膜タンパク質の二次元結晶化（非特許文献７）、（３）電気生理法によるチャネル活性計測（非特許文献８）、（４）膜タンパク質中の特定のペプチドと脂質膜との相互作用の検討（非特許文献９）を目的として行われていた。
しかしながら、（１）〜（４）いずれの場合においても、脂質膜中で再構成した膜タンパク質がどの方向を向いているか（細胞内ドメインと細胞外ドメインが脂質膜のどちら側にあるか）が考慮されていない。
【０００９】
膜タンパク質は、細胞内ドメインと細胞外ドメインとで役割が全く異なるため、脂質膜における膜タンパク質の配向が異なると、その機能が全く異なってしまう。したがって、膜タンパク質の機能をデバイスへ応用する場合等においては、該膜タンパク質を脂質膜に再構成してその機能を発現させることはもちろん、その配向を評価することも不可欠である。そこで、基板上に展開した脂質膜中の膜タンパク質の配向を、抗体を利用したＡＦＭによる観察により評価する方法が示されている（非特許文献１０）。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００９４０５３号明細書
【特許文献２】特開２００５−９８７１８号公報
【非特許文献１】Systemic Leukocyte-Directed siRNA Delivery Revealing Cyclin D1 as an Anti-Inflammatory Target, Peer D., et al., Science, 2008, 319: 627-630.
【非特許文献２】Self-assembled Microarrays of Atto liter Molecular vessels, Dimitriios Stamou et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 5580-5583.
【非特許文献３】Self-assembly of vesicle nanoarrays on Si:A potential route to high-density functional protein arrays, C. S. Ramanujan, Appl. Phys. Lett., 90, 033901 (2007).
【非特許文献４】Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope, Andreas Engel and Daniel J. Muller, Nature Structural Biology, 2000, 7, 9, 715-718.
【非特許文献５】Examination of Reconstitution Condition for AFM Observation of an Ionotropic Glutamate Receptor, N. Kasai, et al., Biophys. J., Meeting Abstract, 2008, 94: 1944.
【非特許文献６】A remote controlled valve in liposomes for triggered liposomal release. Kocer A., Journal of Liposome Research, 2007; 17(3-4): 219-25.
【非特許文献７】Membrane-protein stability in a phospholipid-based crystallization medium, Lunde CS, et al., J. Struct. Biol., Vol. 154, pp.223-231, 2006.
【非特許文献８】Single channel recording of reconstituted AMPA receptors reveal low and high conductance states, Vitaly Vodyanoy, et al., Neuroscience Letters, Vol. 150, pp.80-84, 1993.
【非特許文献９】Liposome reconstitution of a minimal protein-mediated membrane fusion machine. Top D. et al., EMBO J., 2005 Sep 7, 24(17): 2980-2988.
【非特許文献１０】Visualization of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor by atomic force microscopy., Suhara, W., Kobayashi, M., Sagara, H., Hamada, K., Goto, T., Fujimoto, I., Torimitsu, K. and Mikoshiba, K., 2006, Neuroscience Letters, 391, 102-107.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、非特許文献１０では、プロテオリポソームの状態で膜タンパク質の配向を評価することは検討されていなかった。プロテオリポソームの状態で膜タンパク質の配向を評価することができれば、配向の揃ったプロテオリポソームを効率良く選択することができ、それによりデバイス構築の生産性が向上すると考えられる。
そこで本発明では、プロテオリポソームの脂質二分子膜に再構成された膜タンパク質の配向を評価する、膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法は、プロテオリポソームの脂質二分子膜内に再構成された膜タンパク質の配向を評価する方法であって、前記膜タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインのいずれかを標識する標識物質により、前記プロテオリポソームの前記脂質二分子膜の外側に位置する細胞内ドメインおよび／または細胞外ドメインを標識する標識工程と、該標識工程の後に前記標識物質による標識が施された前記プロテオリポソームを分析して前記膜タンパク質の配向を評価する評価工程と、を有する方法である。
また、本発明の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法は、前記標識物質が、蛍光標識抗体、金微粒子標識抗体、および金微粒子からなる群から選ばれる１種以上であることが好ましい。
また、前記標識物質として蛍光標識抗体を用い、前記評価工程にて、前記プロテオリポソームの蛍光強度を測定して膜タンパク質の配向を評価する方法であることが好ましい。
また、前記標識物質として金微粒子標識抗体および金微粒子、金微粒子標識抗体若しくは金微粒子を用い、前記評価工程にて、前記プロテオリポソームの大きさを測定して膜タンパク質の配向を評価する方法であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の評価方法によれば、プロテオリポソームの脂質二分子膜内に再構成された膜タンパク質の配向を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法（以下、「配向評価方法」という。）は、プロテオリポソームの脂質二分子膜内に再構成された膜タンパク質の配向を評価する方法である。本発明の配向評価方法は、前記膜タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインのいずれかを標識する標識物質により、前記プロテオリポソームの前記脂質二分子膜の外側に位置する細胞内ドメインおよび／または細胞外ドメインを標識する標識工程と、該標識工程の後に前記標識物質による標識が施されたプロテオリポソームを分析して膜タンパク質の配向を評価する評価工程と、を有する。以下、本発明の実施形態の一例を示して詳細に説明する。
【００１４】
［第１実施形態］  
本実施形態の配向評価方法は、プロテオリポソームに再構成された膜タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインのいずれかを標識する標識物質として蛍光標識抗体を用いる。本実施形態では、評価工程においてプロテオリポソームの蛍光強度を測定することにより、プロテオリポソーム中の膜タンパク質の配向を評価する。
本実施形態で用いるプロテオリポソーム１は、図２（Ａ）に示すように、脂質二分子膜３０に膜タンパク質１０が再構成されている。プロテオリポソーム１における膜タンパク質１０は、疎水部１１が脂質二分子膜３０中に埋め込まれ、親水部１２である細胞内ドメイン１２ａと細胞外ドメイン１２ｂのどちらか一方が外側を向くようにして再構成されている。
【００１５】
プロテオリポソーム１の製造方法は、従来公知の方法を用いることができ、透析法、ビーズ法等を用いることができる。具体的には、脂質、膜タンパク質、界面活性剤を混合した混合液から、透析法、ビーズ法等により前記界面活性剤を取り除くことにより得ることができる。混合液の媒体としては、例えば、水、食塩水、緩衝溶液等の水性媒体が挙げられる。これらの方法により、混合液中の界面活性剤が徐々に取り除かれていき、混合液中で安定化されていた脂質により脂質二分子膜からなるリポソームが形成され、同時に混合液中で安定化されていた膜タンパク質が徐々に該脂質二分子膜中へと移動し、再構成されて安定化することで、プロテオリポソーム１が得られる。
【００１６】
膜タンパク質１０としては、生体中で生体膜中に配されているものであればよく、例えば、イオンチャンネル型受容体やＧタンパク質共役型受容体等が挙げられる。膜タンパク質１０は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
脂質二分子膜３０を形成する脂質は、プロテオリポソームの形成に用いられる公知の脂質を用いることができ、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質等が挙げられる。これらの脂質は１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
界面活性剤は、プロテオリポソームの形成に用いられるものであればよく、公知の非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤を用いることができる。これら界面活性剤は１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１７】
（標識工程）
標識工程では、プロテオリポソーム１において脂質二分子膜３０に再構成された膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂのいずれかを蛍光標識抗体４２で標識する。この例では、細胞外ドメイン１２ｂを標識する場合について説明する。
【００１８】
まず、プロテオリポソーム１を含む溶液に細胞外ドメイン１２ｂを特異的に認識する一次抗体４１を加え、該一次抗体４１をプロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の外側に位置する細胞外ドメイン１２ｂに結合させる（図２（Ｂ））。このとき、プロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の内側にある細胞外ドメイン１２ｂには一次抗体４１が結合できないため、細胞外ドメイン１２ｂが外側を向いて配向している膜タンパク質１０のみに一次抗体４１が結合する。
【００１９】
次に、一次抗体４１を特異的に認識する二次抗体４２ａが蛍光物質４２ｂで標識された蛍光標識抗体４２を加え、該蛍光標識抗体４２を膜タンパク質１０の細胞外ドメイン１２ｂに結合した一次抗体４１に結合させる（図２（Ｃ））。これにより、プロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の外側にある細胞外ドメイン１２ｂのみに蛍光標識抗体４２を結合させ、該細胞外ドメイン１２ｂのみを標識することができる。
また、細胞内ドメイン１２ａの標識は、細胞内ドメイン１２ａを特異的に認識する一次抗体４１、および該一次抗体４１を特異的に認識する蛍光標識抗体４２の組み合わせを用いて、前述と同様の方法で行うことができる。
【００２０】
一次抗体４１としては、用いる膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂのいずれか一方を特異的に認識する抗体を用いることができ、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。一次抗体４１は、公知の方法により作製したものを用いてもよく、また市販品を用いてもよい。
一次抗体４１の具体例としては、例えば、膜タンパク質１０としてイオンチャネル型グルタミン酸受容体を用い、その細胞内ドメイン１２ａを標識する場合、該受容体のＣ末端を認識する抗体等が挙げられる。また、細胞外ドメイン１２ｂを標識する場合は、該受容体のＮ末端を認識する抗体等が挙げられる。
【００２１】
一次抗体４１の添加量は、脂質二分子膜３０の外側に位置する膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識できる量であればよく、プロテオリポソーム１に再構成する膜タンパク質１０の分子数に対して、１０倍〜１０００倍であることが好ましく、１０倍〜１００倍であることがより好ましい。一次抗体４１の前記添加量が１０倍以上であれば、脂質二分子膜３０の外側に位置する標識対象の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識することが容易である。また、一次抗体４１の前記添加量が１０００倍以下であれば、未反応の一次抗体４１の量が少なくなるため、プロテオリポソーム１における膜タンパク質１０の配向を評価することが容易になる。
【００２２】
蛍光標識抗体４２は、一次抗体４１を特異的に認識する二次抗体４２ａが蛍光物質４２ｂにより標識された抗体である。
二次抗体４２ａとしては、一次抗体４１を特異的に認識する抗体であれば特に限定されず、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。二次抗体４２ａは、公知の方法により作製したものを用いてもよく、また市販品を用いてもよい。二次抗体４２ａの具体例としては、例えば、一次抗体４１がラビットＩｇＧの場合、抗ラビットＩｇＧ抗体等が挙げられる。
蛍光物質４２ｂとしては、抗体の蛍光標識に通常用いられる蛍光物質を用いることができ、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ等が挙げられる。
【００２３】
蛍光標識抗体４２の添加量は、膜タンパク質１０に結合した一次抗体４１に充分に結合できる量であればよく、添加した一次抗体４１の分子数に対して、１０倍〜１００倍であることが好ましい。蛍光標識抗体４２の前記添加量が１０倍以上であれば、脂質二分子膜３０の外側に位置する標識対象の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識することが容易になる。また、蛍光標識抗体４２の前記添加量が１００倍以下であれば、未反応の蛍光標識抗体４２の量が少なくなるため、プロテオリポソーム１における膜タンパク質１０の配向を評価することが容易になる。
【００２４】
（評価工程）
評価工程では、標識工程後のプロテオリポソーム１の蛍光強度を測定することにより、膜タンパク質１０の配向を評価する。
本実施形態における蛍光強度の測定は、フローサイトメトリー法を用いることが好ましい。フローサイトメトリー法は、サブマイクロメートルサイズのひとつひとつのプロテオリポソーム１について、蛍光強度とサイズとを同時に計測することができる。そのため、フローサイトメトリー法を用いる場合、未反応の蛍光標識抗体４２については、プロテオリポソーム１に比べて大きさが小さいことから、蛍光標識抗体４２により標識されたプロテオリポソーム１とは異なる集団に帰属するものとして判断できる。また、蛍光標識抗体４２により標識されていない未反応のプロテオリポソーム１は蛍光強度が低いことから、蛍光標識抗体４２により標識されたプロテオリポソーム１とは異なる集団に帰属するものとして判断できる。これらのことから、フローサイトメトリー法は、未反応の蛍光標識抗体４２を分離除去する必要がなく、工程が簡便になる点で優れている。
【００２５】
また、標識対象の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂが脂質二分子膜３０の外側を向いて配向している膜タンパク質１０の量が多いほど、それらに結合する蛍光標識抗体４２の量が多くなり、そのプロテオリポソーム１の蛍光強度が増大する。
【００２６】
従って、細胞内ドメイン１２ａを標識したプロテオリポソーム１と、細胞外ドメイン１２ｂを標識したプロテオリポソーム１とをそれぞれ計測し、それらの数および蛍光強度の比較から、細胞内ドメイン１２ａが脂質二分子膜３０の外側を向いて配向している膜タンパク質１０と、細胞外ドメイン１２ｂが脂質二分子膜３０の外側を向いて配向している膜タンパク質１０の比を見積もることで、膜タンパク質１０の配向を評価することができる。
【００２７】
また、蛍光標識抗体４２を用いる場合には、蛍光波長の異なる蛍光物質４２ｂで標識された２種以上の蛍光標識抗体４２を用いてもよい。この場合、同じ膜タンパク質１０における別々の部位、または別々の膜タンパク質１０を特異的に認識する２種以上の一次抗体４１を用い、そのそれぞれの一次抗体４１を特異的に認識する二次抗体４２を用いる。
例えば、同じ膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａと細胞外ドメイン１２ｂのそれぞれに異なる動物種由来の２種の一次抗体４１を結合させ、そのそれぞれの一次抗体４１に特異的に結合する蛍光波長が異なる２種の蛍光標識抗体４２を結合させ、それら異なる波長の蛍光シグナルを同時に計測することで、蛍光強度を比較して膜タンパク質１０の配向を評価することができる。
【００２８】
尚、標識工程後に、未反応の蛍光標識抗体４２を除去する工程を行い、その後に蛍光強度の測定を行う場合には、フローサイトメトリー法を用いない測定方法であってもよく、公知の蛍光分光器を用いて測定を行う方法であってもよい。
【００２９】
［第２実施形態］
本実施形態の配向評価方法は、プロテオリポソームに再構成された膜タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインのいずれかを標識する標識物質として金微粒子標識抗体を用いる。本実施形態では、評価工程において、ダイナミック光散乱法（ＤＬＳ）によりプロテオリポソームの大きさを測定することにより、プロテオリポソーム中の膜タンパク質の配向を評価する。
用いるプロテオリポソーム１（図３（Ａ））は、第１実施形態と同じものを用いることができる。
【００３０】
（標識工程）
標識工程では、プロテオリポソーム１において脂質二分子膜３０に再構成された膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂのいずれかを金微粒子標識抗体５２で標識する。この例では、細胞外ドメイン１２ｂを標識する場合について説明する。
まず、プロテオリポソーム１を含む溶液に細胞外ドメイン１２ｂを特異的に認識する一次抗体５１を加え、該一次抗体５１をプロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の外側に位置する細胞外ドメイン１２ｂに結合させる（図３（Ｂ））。このとき、プロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の内側にある細胞外ドメイン１２ｂには一次抗体５１が結合できないため、細胞外ドメイン１２ｂが外側を向いて配向している膜タンパク質１０のみに一次抗体５１が結合する。
【００３１】
次に、一次抗体５１を特異的に認識する二次抗体５２ａが金微粒子５２ｂで標識された金微粒子標識抗体５２を加え、該金微粒子標識抗体５２を膜タンパク質１０の細胞外ドメイン１２ｂに結合した一次抗体５１に結合させる（図３（Ｃ））。これにより、プロテオリポソーム１の脂質二分子膜３０の外側にある細胞外ドメイン１２ｂのみに金微粒子標識抗体５２を結合させ、該細胞外ドメイン１２ｂのみを標識することができる。
また、細胞内ドメイン１２ａの標識は、細胞内ドメイン１２ａを特異的に認識する一次抗体５１、および該一次抗体５１を特異的に認識する金微粒子標識抗体５２の組み合わせを用いて、前述と同様の方法で行うことができる。
【００３２】
一次抗体５１としては、第１実施形態の一次抗体４１で挙げたものと同じ抗体を用いることができる。
一次抗体５１の添加量は、脂質二分子膜３０の外側に位置する膜タンパク質１０の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識できる量であればよく、プロテオリポソーム１に再構成した膜タンパク質１０の分子数に対して、１０倍〜１０００倍であることが好ましく、１０倍〜１００倍であることがより好ましい。一次抗体５１の前記添加量が１０倍以上であれば、脂質二分子膜３０の外側に位置する標識対象の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識することが容易である。また、一次抗体５１の前記添加量が１０００倍以下であれば、未反応の一次抗体５１の量が少なくなるため、プロテオリポソーム１における膜タンパク質１０の配向を評価することが容易になる。
【００３３】
金微粒子標識抗体５２は、一次抗体５１を特異的に認識する二次抗体５２ａが金微粒子５２ｂにより標識された抗体である。
二次抗体５２ａは、第１実施形態の二次抗体４１ａで挙げた抗体と同じものを用いることができる。
【００３４】
また、金微粒子５２ｂの粒径は、１０〜１００ｎｍであることが好ましい。金微粒子５２ｂの粒径が１０ｎｍ以上であれば、ＤＬＳ測定によって膜タンパク質１０の配向を評価することが容易になる。金微粒子５２ｂの粒径が１００ｎｍ以下であれば、一次抗体５１と二次抗体５２ｂとの結合能が充分に得られやすい。
【００３５】
金微粒子標識抗体５２の添加量は、膜タンパク質１０に結合した一次抗体５１に充分に結合できる量であればよく、添加した一次抗体５１の分子数に対して、１０倍〜１００倍であることが好ましい。金微粒子標識抗体５２の前記添加量が１０倍以上であれば、脂質二分子膜３０の外側に位置する標識対象の細胞内ドメイン１２ａ（細胞外ドメイン１２ｂ）を充分に標識することが容易である。また、金微粒子標識抗体５２の前記添加量が１００倍以下であれば、未反応の金微粒子標識抗体５２の量が少なくなるため、該プロテオリポソーム１における膜タンパク質１０の配向を評価することが容易になる。
【００３６】
（評価工程）
評価工程では、ＤＬＳにより標識工程後のプロテオリポソーム１の大きさを測定することにより、膜タンパク質１０の配向を評価する。ＤＬＳを用いれば、ナノメートルレベルでプロテオリポソームのサイズをひとつひとつ計測することができる。
金微粒子標識抗体５２が結合すると、プロテオリポソーム１の大きさと重さが、一次抗体５１および金微粒子標識抗体５２の分だけ大きくなる。本実施形態では、標識工程において、脂質二分子膜３０の外側に位置する、標識対象の細胞内ドメイン１２ａや細胞外ドメイン１２ｂに特異的に金微粒子標識抗体５２を結合させることができることから、大きさ、重さが変化したプロテオリポソーム１は、標識対象の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂが、脂質二分子膜３０の外側を向いた配向で再構成されているといえる。
【００３７】
本実施形態のＤＬＳ測定においては、金微粒子標識抗体５２で標識されていない未反応のプロテオリポソーム１も検出されるため、特に標識されたプロテオリポソーム１と未反応のプロテオリポソーム１の大きさが近く、それらを別々に測定し難い場合には、未反応のプロテオリポソーム１をサンプルから除去する必要がある。未反応のプロテオリポソーム１の除去は、例えば、遠心分離を用い、金微粒子標識抗体５２で標識されたプロテオリポソーム１のみを沈殿させ、未反応のプロテオリポソーム１と分離することにより行うことができる。
【００３８】
未反応の金微粒子標識抗体５２や、標識が解離して遊離した金微粒子５２ｂは、フィルタによって除去することができる。エクストルーダは、フィルタの孔径よりも大きいプロテオリポソーム１のサイズをフィルタ孔径に揃えるために用いるものを使用することができる。エクストルーダにおけるフィルタ径を、金微粒子標識抗体５２が結合したプロテオリポソーム１を通過させず、未反応の金微粒子標識抗体５２および遊離した金微粒子５２ｂを通過させるように調整することで、それらを分離することができる。ただし、これら未反応の金微粒子標識抗体５２や遊離した金微粒子５２ｂが、プロテオリポソーム１と比較して充分小さい場合には、それらは除去しなくてもよい。
未反応のプロテオリポソーム１や、未反応の金微粒子標識抗体５２、遊離した標識抗体５２を除去することにより、金微粒子標識抗体５２により標識されたプロテオリポソーム１をＤＬＳで測定し、その濃度を計測することが容易になる。
【００３９】
ＤＬＳ測定では、サンプル中の標的物質の絶対濃度を計測することができない。そのため、大きさや濃度が既知のポリスチレンやラテックス製のビーズを、基準としてサンプル中に混合しておくことで、金微粒子標識抗体５２が結合したプロテオリポソーム１、未反応のプロテオリポソーム１の濃度を相対的に見積もることができる。これにより、細胞内ドメイン認識抗体と細胞外ドメイン認識抗体のそれぞれを用いて別々に測定し、基準となるビーズに対する濃度比を求めることで、脂質二分子膜の外側に位置する細胞内ドメイン１２ａと細胞外ドメイン１２ｂの比を見積もることができる。
サンプルから未反応のプロテオリポソーム１を除去する場合は、金微粒子標識抗体５２が結合したプロテオリポソーム１と、未反応のプロテオリポソーム１の濃度を別々に測定すればよい。
【００４０】
以上のようなＤＬＳ測定により、一次抗体５１および金微粒子標識抗体５２の分だけ大きくなったプロテオリポソーム１の数と、未反応のプロテオリポソーム１の数とを比較することで、プロテオリポソーム１における標識対象の細胞内ドメイン１２ａや細胞外ドメイン１２ｂが脂質二分子膜３０の外側に向いて配向した膜タンパク質の割合を見積もり、膜タンパク質１０の配向を評価することができる。
【００４１】
本実施形態では、同じ膜タンパク質１０における細胞内ドメイン１２ａと細胞外ドメイン１２ｂをそれぞれ特異的に標識できる、２種類の一次抗体５１と金微粒子標識抗体５２の組み合わせを用い、未反応のプロテオリポソーム１を除去する方法で、細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂが脂質二分子膜３０の外側に配向した膜タンパク質１０の濃度をそれぞれ測定し、それらを比較することで膜タンパク質１０の配向を評価することが好ましい。これにより、脂質二分子膜３０の外側に位置する細胞内ドメイン１２ａと細胞外ドメイン１２ｂの量をそれぞれ測定することができるため、膜タンパク質１０の配向の評価がより正確に行える。
【００４２】
［第３実施形態］
また、ＤＬＳ測定により膜タンパク質の配向を評価する際には、標識物質として金微粒子を用いることもできる。この場合、標識対象の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインに特異的に金微粒子を標識する方法としては、例えば、ビオチン−アビジン結合を用いる方法が挙げられる。
具体的には、プロテオリポソームを形成する前に、膜タンパク質のＮ端またはＣ端にビオチンを結合させておき、プロテオリポソームを形成する。その後、標識工程においてアビジンを被覆した金微粒子を用いることで、標識対象の細胞内ドメイン１２ａまたは細胞外ドメイン１２ｂに特異的に標識することができる。
評価工程におけるＤＬＳ測定は、第２実施形態と同様にして行うことができる。
【００４３】
［その他の実施形態］
また、本発明の配向評価方法では、蛍光標識抗体、金微粒子標識抗体、金微粒子のうちの異なる２種以上を併用してもよい。例えば、膜タンパク質の細胞内ドメインと細胞外ドメインの両方を、異なる標識物質で同時に標識して配向を評価したり、異なる膜タンパク質の細胞内ドメインや細胞外ドメインを異なる標識物質で同時に標識してそれらの配向を評価したりすることができる。
【００４４】
以上説明した本発明の配向評価方法によれば、プロテオリポソームの脂質二分子膜内に再構成された膜タンパク質の配向を簡便に評価することができる。配向を把握することで、そのプロテオリポソームを基板上に展開した後、膜タンパク質の構造を検討するとき、またはデバイス応用するときに、膜タンパク質の機能を把握する上で高い信頼性が得られる。
【００４５】
例えば、基板に展開した膜タンパク質の単一分子の構造を観察や機能の検討と本発明の配向評価方法を組み合わせることで、より正確に膜タンパク質の科学的知識を得ることができる。単一の膜タンパク質の構造や機能の検討に応用する場合は、ＡＦＭや他のタイプの走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）や全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）等が観察に適している。
また、膜タンパク質をナノバイオデバイスに用いる場合、配向が既知の膜タンパク質をデバイスに応用すれば該膜タンパク質の向きを把握することができるため、薬物への応答を効果的かつ効率的に検討することが可能となる。これにより、特定の膜タンパク質受容体に対するドラッグターゲットの能力が飛躍的に向上すると考えられる。また、創薬のドラッグスクリーニングのほか、神経疾患等の診断の分野でも広く用いられる可能性が高い。
以上のように、本発明の配向評価方法は非常に有用な方法であり、医学、薬学、診断等の分野に広く応用することが可能である。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［実施例１］
本発明の配向評価方法により、ダイナミック光散乱法（ＤＬＳ）による測定により膜タンパク質の配向評価を行なった例を示す。
プロテオリポソームは透析法により作製した。膜タンパク質としては、精製したイオンチャネル型グルタミン酸受容体を用いた。該イオンチャネル型グルタミン酸受容体（１００ｎＭ）と、ｎ−オクチル−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ製）（４０ｍＭ）と、ホスファチジルコリン（卵黄由来）およびホスファチジルセリン（ブタ脳由来）の３：１の混合物（２ｍＭ）とを、緩衝液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＧＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ＮａＮ３（０．０２％））に加え、１０分間超音波により混合して混合液を得て、その後、室温で１０分間静置した。得られた混合液（５μｌ）に対し、セルロース膜（ポア１２，０００〜１４，０００ｍｗ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ製））を用いて、７２時間、４℃で透析を行った。透析溶液は３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＧＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ＮａＮ３（０．０２％）の５ｍｌであった。
【００４７】
透析７２時間後に、作製したプロテオリポソームについて抗体反応を行った。まず、細胞外ドメイン１２ｂを認識する一次抗体として、マウス由来の抗グルタミン酸受容体（Ｎ端）抗体（ケミコン社）を、プロテオリポソーム溶液量の１０分の１量添加し、３０分間室温にて静置した。金ナノ粒子標識マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ製）を、同様に１０分の１量添加し、４５分間室温にて静置した。その後、フィルタ（エクストルーダ、ポアサイズ３０ｎｍ、Ａｖａｎｔｉ社製）を用いて、試料内に残った未結合の金ナノ粒子標識抗マウスＩｇＧ抗体を除去し、金ナノ粒子が結合しているプロテオリポソームのみの溶液にした。その後、この試料に直径３００ｎｍ、濃度が既知の標準ラテックスビーズ溶液（テクノケミカル社）を添加し、ＤＬＳにより測定を行った。
一方、細胞内ドメイン１２ａを認識するマウス由来の抗グルタミン酸受容体（Ｃ端）抗体（ケミコン社）を用いた場合についても、上記と同様にしてＤＬＳ計測を行った。得られた結果を図４（Ａ）、（Ｂ）に示す。図４（Ａ）は、Ｎ端を標識する金微粒子標識抗体を用いた結果、（Ｂ）はＣ端を標識する金微粒子標識抗体を用いた結果である。また、ピークｅ、ｇは標識されたプロテオリポソームのサイズに起因するピークであり、ピークｆ、ｈは標準ラテックスビーズのサイズに起因するピークである。
【００４８】
図４（Ａ）、（Ｂ）に示すように、それぞれ添加した標準ラテックスビーズのサイズ、量は同じ（ピークｆとピークｈ）であり、標準ラテックスビーズのピークに対するプロテオリポソームのピークｅ、ｇの比を求めることで、それらのピークサイズの比を求めることができた。本結果では、ｅ／ｆ＝５．０となり、この結果から、Ｎ端（細胞外ドメイン）を外側に向けてプロテオリポソーム中に再構成されている膜タンパク質が、Ｃ端（細胞内ドメイン）を外に向けて再構成されている膜タンパク質の約５倍あることが分かった。
【００４９】
［参考例１］
本発明の配向評価方法により、フローサイトメーターを用いてプロテオリポソームを計測し、膜タンパク質の配向評価を行なう例を示す。
プロテオリポソームは透析法により作製する。膜タンパク質としては、精製したイオンチャネル型グルタミン酸受容体を用いる。該イオンチャネル型グルタミン酸受容体（１００ｎＭ）と、ｎ−オクチル−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ製）（４０ｍＭ）と、ホスファチジルコリン（卵黄由来）およびホスファチジルセリン（ブタ脳由来）の３：１の混合物（２ｍＭ）とを、緩衝液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＧＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ＮａＮ３（０．０２％））に加え、１０分間超音波により混合して混合液を得て、その後、室温で１０分間静置する。得られた混合液（５μｌ）に対し、セルロース膜（ポア１２，０００〜１４，０００ｍｗ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ製））を用いて、７２時間、４℃で透析を行う。透析溶液は３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＧＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ＮａＮ３（０．０２％）の５ｍｌである。
【００５０】
透析７２時間後に、作製したプロテオリポソームについて抗体反応を行う。まず、細胞外ドメイン１２ｂを認識する一次抗体としてマウス由来の抗グルタミン酸受容体（Ｎ端）抗体（ケミコン社製）を、プロテオリポソーム溶液量の１０分の１量添加し、３０分間室温にて静置する。続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を、同様に１０分の１量添加し、４５分間室温にて静置する。その溶液をフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、ＥＰＩＣＳ  ＸＬ）を用いて計測する。
また、同様に透析により作製するプロテオリポソーム溶液について、異なる抗体を用いて抗体反応を行う。細胞内ドメイン１２ａを認識するマウス由来の抗グルタミン酸受容体（Ｃ端）抗体（ケミコン社）を、プロテオリポソーム溶液量の１０分の１量添加し、３０分間室温にて静置した後、さらにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を、同様に１０分の１量添加し、４５分間室温にて静置する。その溶液を前記フローサイトメーターを用いて計測する。
【００５１】
以上のようにしてフローサイトメーターにより計測することにより、例えば、図５（Ａ）、（Ｂ）に例示したような結果が得られた場合には、以下に示すように膜タンパク質の配向を評価することができる。なお、図５（Ａ）は、Ｎ端（細胞外ドメイン）を標識する蛍光標識抗体を用いた場合を示し、図５（Ｂ）はＣ端（細胞内ドメイン）を標識する蛍光標識抗体を用いた場合を示す。また、図５の横軸は蛍光強度、縦軸はＦＳＣ（ｆｏｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ、側方散乱強度、プロテオリポソームの大きさ）を示している。図５中のａ、ｂ、ｃ、ｄはそれぞれ、蛍光標識されたリポソーム（ａ）、蛍光標識されていないリポソーム（ｂ）、蛍光標識抗体（ｃ）、蛍光標識されていない抗体もしくは壊れたリポソーム（ｄ）を示しており、点は該当するサンプルの数を示している。また、図５（Ａ）、（Ｂ）それぞれにおいて、蛍光強度におけるヒストグラムを示している。
【００５２】
このような結果が得られた場合、Ｎ端（細胞外ドメイン）を標識する蛍光標識抗体を用いたとき（図５（Ａ））は、Ｃ端（細胞内ドメイン）を標識する蛍光標識抗体を用いたとき（図５（Ｂ））に比べて、ｃ、ｄの範囲に含まれるサンプルの数がほぼ同じであるが、ａの範囲に含まれるサンプルの数が多く、ｂが少ないことがわかる。これにより、Ｎ端（細胞外ドメイン）が標識された膜タンパク質が多く、Ｃ端（細胞内ドメイン）が標識された膜タンパク質が少なく、すなわちプロテオリポソームの外側にＮ端を向けて再構成されているイオンチャネル型グルタミン酸受容体が多いと評価することができる。このことは、図５（Ａ）、（Ｂ）におけるヒストグラムからも評価することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
また、本発明の配向評価方法により、配向が既知の膜タンパク質が再構成した脂質二分子膜を得ることは、単一分子レベルで膜タンパク質の構造や機能を調べる上で重要な技術であり、科学的に非常に重要である。それだけでなく、非常に高感度でかつ極微小なバイオセンサチップの実現等に応用でき、今後発展が著しいと期待されるナノテクノロジーとバイオテクノロジーの融合分野において、極めて有効であり、広い分野で利用される可能性は極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】生体膜に存在する膜タンパク質を示した概念図である。
【図２】本発明の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法の実施形態の一例の工程図である。
【図３】本発明の膜タンパク質の脂質膜内配向評価方法の実施形態の他の例の工程図である。
【図４】実施例１におけるＤＬＳによる分析結果を示した図である。
【図５】参考例１におけるフローサイトメーターによる分析結果の一例を示した図である。
【符号の説明】
【００５５】
１  プロテオリポソーム  １０  膜タンパク質  １１  疎水部  １２  親水部  １２ａ  細胞内ドメイン  １２ｂ  細胞外ドメイン  ３０  脂質二分子膜  ４２  蛍光標識抗体  ５２  金微粒子標識抗体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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