(57)【要約】      （修正有）【課題】工業的に効率的かつ安定的なカロテノイド類の分離方法、アスタキサンチン類の分離方法、及びアスタキサンチン脂肪酸エステル類とアスタキサンチンとの分離方法を提供する。【解決手段】固定相と移動相とを有する液体クロマトグラフィー法により分離する方法において、該固定相として（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用いることを特徴とする、カロテノイド類を含有する原料からカロテノイド類、好ましくはアスタキサンチン類を分離する方法、更には、前記多孔質有機高分子粒子を用いた液体クロマトグラフィー法により、アスタキサンチン類を含有する原料からアスタキサンチン脂肪酸エステル類とアスタキサンチンとを分離する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド類を含有する原料からカロテノイド類を分離する方法であって、
固定相と移動相とを有する液体クロマトグラフィー法により分離する工程を含み、
該固定相として（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用いる
ことを特徴とする、カロテノイド類の分離方法。
【請求項２】
前記カロテノイド類がアスタキサンチン類である
ことを特徴とする、請求項１に記載のカロテノイド類の分離方法。
【請求項３】
前記アスタキサンチン類がアスタキサンチン脂肪酸エステル類、及びアスタキサンチンを含有する
ことを特徴とする、請求項２に記載のカロテノイド類の分離方法。
【請求項４】
前記移動相に水を含まない
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカロテノイド類の分離方法。
【請求項５】
前記移動相が、前記固定相として用いる（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子に比べて低い比誘電率を有する溶媒、又は、固定相として用いる（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子に比べて低い比誘電率を有する溶媒と固定相として用いる（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子に比べて高い比誘電率を有する溶媒との混合溶媒である
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のカロテノイド類の分離方法。
【請求項６】
前記移動相が、比誘電率２．５未満の溶媒、又は、
比誘電率が２．５未満である溶媒と比誘電率が２．５以上である溶媒とを、比誘電率が２．５未満の溶媒が体積比で５０％を超える割合となるように混合した溶媒である
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のカロテノイド類の分離方法。
【請求項７】
前記液体クロマトグラフィー法における移動相が
ヘキサン、ヘキサン／エタノール混合溶媒、及びヘキサン／アセトン混合溶媒からなる群から選ばれる１種である
ことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のカロテノイド類の分離方法。
【請求項８】
前記液体クロマトグラフィー法における移動相が
ヘキサン、又はヘキサン／エタノール混合溶媒である
ことを特徴とする、請求項７に記載のカロテノイド類の分離方法。
【請求項９】
前記（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子の
窒素吸着法で求められる比表面積が、５０ｍ２／ｇ以上、２０００ｍ２／ｇ以下の範囲であり、かつ、
窒素吸着法で求められる細孔容積が０．１ｍｌ／ｇ以上、３．０ｍｌ／ｇ以下である
ことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のカロテノイド類の分離方法。
【請求項１０】
前記液体クロマトグラフィー法により分離する工程の前に、カロテノイド類を含有する原料を鹸化する工程を含む
ことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のカロテノイド類の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー法により、カロテノイド類、特にアスタキサンチン類を分離する方法に関するものである。詳しくは、液体クロマトグラフィー法、特に順相液体クロマトグラフィー法により、カロテノイド類を含有する原料から、カロテノイド類、特にアスタキサンチン類を分離する方法、並びに、当該アスタキサンチン類を分離すると同時にアスタキサンチン脂肪酸エステル類とアスタキサンチンをも分離する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイド類は、天然物由来の黄色から赤色又は紫色のポリエン色素であり、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、β−カロテン等が知られている。カロテノイド類は、植物、動物、微生物に広く分布し、例えば、植物にはゼアキサンチン、β−カロテン等、藻類にはアスタキサンチン等のカロテノイドが存在し、抽出、精製され利用されている。
カロテノイド類の用途としては、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等が挙げられるが、カロテノイド類の抗酸化機能が注目されており、抗酸化物質としても広く利用されている。
【０００３】
中でも、アスタキサンチンは、魚類、鶏卵の色揚げ剤としてとりわけ広く使用されている。また、食品添加物としても認められており、油脂加工食品、タンパク質性食品、水性液状食品などに幅広く使用されている。さらに、フリーラジカルによって誘起される脂質の過酸化に対する抗酸化活性、α−トコフェロールの数百倍に達する一重項酸素消去作用などから、その強力な抗酸化活性を生かした機能性食品、化粧品、又は医薬品としての用途が期待されている。
アスタキサンチンは、サケ、マス、マダイ等の魚類、カニ、エビ、オキアミ等の甲殻類など広く自然界に分布すると共に、アグロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、パラコッカス属に属する細菌類、ヘマトコッカス属緑藻類、ファフィア属酵母類等の微生物によっても生産されている。
【０００４】
これらの天然物から得られるカロテノイド類抽出物、特にアスタキサンチン類抽出物には多数の夾雑物が含まれ、機能性食品、化粧品、又は医薬品としての用途に用いるためには更なる分離精製が必要とされる。分離精製方法としては、液体クロマトグラフィー法を用いることができることが知られている。例えば、特許文献１に、固定相としてシリカゲルを用いた高速液体クロマトグラフィーによるオキアミ抽出液の分離精製が開示されている。また、特許文献２にも、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる、パラコッカス属細菌由来のカロテノイド粗抽出物からのアスタキサンチンの分離精製が開示されている。
【０００５】
また、特許文献３に、シリカゲル担体を用いた吸着クロマトグラフィーに続いてシアノプロピル基結合シリカゲル担体を用いた高速液体クロマトグラフィーにより、赤色酵母ファフィア由来のアスタキサンチンを分離精製する方法が開示されている。
なお、特許文献３には、芳香族系（ポリスチレン系）合成吸着剤であるダイヤイオンＨＰ−２０が例示されているが、具体的な分離精製例は記載されていない。
【０００６】
更に、非特許文献１に、ヘマトコッカス藻類抽出物の鹸化物を、オクタデシル基結合シリカゲル担体を用いて、水を含む移動相を用いた逆相クロマトグラフィー法によりアスタキサンチンを分離精製する方法が開示されている。
【０００７】
【特許文献１】特開平５−１５５７３６号公報
【特許文献２】特開２００８−１７７３６号公報
【特許文献３】特開平１０−２７６７２１号公報
【非特許文献１】Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、４６巻、３３７１〜３３７５頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１〜３、及び非特許文献１に記載の固定相としてシリカゲルを用いた分離精製においては、シリカゲル担体はその粒子径が大きくなると機械的強度が低下することからカラムサイズを大きくすることが難しく、また、粒子径の小さなシリカゲル担体を用いた場合は圧力損失が高くなることから分離装置の耐圧性を高くする必要があり、その結果、製造スケールを大きくしようとした場合に、製造コストが高くなるという問題がある。
【０００９】
また、特許文献１〜３、及び非特許文献１に記載されるようにシリカゲルを固定相とする順相液体クロマトグラフィーによってカロテノイド類、特にアスタキサンチン類を含有する溶液の分離を行った場合、カロテノイド類、特にアスタキサンチン類の固定相に対する吸着性が低いことから、移動相中に含有される極性有機溶媒の量を少なくする必要がある。そのため、特に機能性食品や化粧品に用いる場合に人体への影響を考慮したとき、極性有機溶媒としてエタノールを用いることが望まれるが、エタノールの比誘電率が23.8と高いことから、液体クロマトグラフィー法によりカロテノイド類、特にアスタキサンチン類と夾雑物との分離を達成するためには、その添加量を少なくせざるを得ない。
【００１０】
上記問題点の解決手段として、例えば、特許文献２では、移動相に添加する極性有機溶媒として比誘電率が20.7とエタノールより低いアセトンを用いている。しかし、この場合は、分離後にアセトンを徹底的に除去する必要があり、総合的な分離コストが高くなるという問題がある。また、特許文献３では、シリカゲルを担体とする吸着クロマトグラフィーの移動相には、比誘電率9.1のジクロロメタンと比誘電率6.02の酢酸エチルとの混合溶
媒を用いており、また、シアノプロピル基結合シリカゲルを担体とする高速液体クロマトグラフィーの移動相に添加する極性有機溶媒としては、比誘電率が9.1と低いジクロロメ
タンを主に用いており、エタノールはごく少量添加されているのみである。特許文献３で用いられている、ジクロロメタンや酢酸エチルは、分離後のアスタキサンチンを機能性食品や化粧品へ用いる場合、その使用が避けられるべき溶媒であると考えられる。
【００１１】
また、非特許文献１に記載の移動相に水を含む逆相クロマトグラフィー法では、抽出物中に混在する油脂分が、固定相であるオクタデシル基結合シリカゲル担体に吸着しやすいため、連続使用時に性能が低下するという問題がある。また、アスタキサンチン類を含むカロテノイド類は水に不溶であることから、固定相に対するカロテノイド類を含む原料の負荷量を高くすることが困難である。
以上のように、従来技術においては工業的に効率的かつ安定的な方法で、カロテノイド類、特にアスタキサンチン類を分離することは困難であった。
【００１２】
本発明は上記実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、工業的に効率的かつ安定的なカロテノイド類の分離方法、アスタキサンチン類の分離方法、及びアスタキサンチン脂肪酸エステル類とアスタキサンチンとの分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、固定相として、（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用いた液体
クロマトグラフィーを適用することにより、カロテノイド類、特にアスタキサンチン類を効率的かつ安定的に分離できることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明の要旨は、以下の（１）〜（１０）に存する。
（１）カロテノイド類を含有する原料からカロテノイド類を分離する方法であって、固定相と移動相とを有する液体クロマトグラフィー法により分離する工程を含み、該固定相として（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用いることを特徴とする、カロテノイド類の分離方法。
（２）前記カロテノイド類がアスタキサンチン類であることを特徴とする、上記（１）に記載のカロテノイド類の分離方法。
（３）前記アスタキサンチン類がアスタキサンチン脂肪酸エステル類、及びアスタキサンチンを含有することを特徴とする、上記（２）に記載のカロテノイド類の分離方法。
（４）前記移動相に水を含まないことを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のカロテノイド類の分離方法。
（５）前記移動相が、前記固定相として用いる（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子に比べて低い比誘電率を有する溶媒、又は、固定相として用いる（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子に比べて低い比誘電率を有する溶媒と固定相として用いる（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子に比べて高い比誘電率を有する溶媒との混合溶媒であることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のカロテノイド類の分離方法。
（６）前記移動相が、比誘電率２．５未満の溶媒、又は、比誘電率が２．５未満である溶媒と比誘電率が２．５以上である溶媒とを、比誘電率が２．５未満の溶媒が体積比で５０％を超える割合となるように混合した溶媒であることを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のカロテノイド類の分離方法。
（７）前記液体クロマトグラフィー法における移動相がヘキサン、ヘキサン／エタノール混合溶媒、及びヘキサン／アセトン混合溶媒からなる群から選ばれる１種であることを特徴とする、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のカロテノイド類の分離方法。
（８）前記液体クロマトグラフィー法における移動相がヘキサン、又はヘキサン／エタノール混合溶媒であることを特徴とする、上記（７）に記載のカロテノイド類の分離方法。（９）前記（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子の窒素吸着法で求められる比表面積が、５０ｍ２／ｇ以上、２０００ｍ２／ｇ以下の範囲であり、かつ、窒素吸着法で求められる細孔容積が０．１ｍｌ／ｇ以上、３．０ｍｌ／ｇ以下であることを特徴とする、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のカロテノイド類の分離方法。
（１０）前記液体クロマトグラフィー法により分離する工程の前に、カロテノイド類を含有する原料を鹸化する工程を含むことを特徴とする、上記（１）〜（９）のいずれかに記載のカロテノイド類の分離方法。
【発明の効果】
【００１４】
従来技術ではカロテノイド類、特にアスタキサンチン類を工業的に高効率に分離することが困難であったが、本発明の分離方法によれば、工業的な規模であっても効率的かつ安定的に、カロテノイド類、特にアスタキサンチン類の分離を行なうことができる。
さらには、アスタキサンチン脂肪酸エステル類とアスタキサンチンとの分離をも工業的な規模で効率的かつ安定的に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
本発明は、液体クロマトグラフィーにより、カロテノイド類、特にアスタキサンチン類を分離する方法に関するものであり、該液体クロマトグラフィーの固定相として（メタ）
アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用いることを必須とするものである。
［原料］
（原料）
本発明の分離方法は、カロテノイド類を含有する原料からカロテノイド類を効率的に分離することができることをその特徴とする。本発明の分離方法によれば、特に、工業的な規模であっても、カロテノイド類を含有する原料からカロテノイド類を効率的に分離することができる。
カロテノイド類とは、天然物由来の黄色から赤色又は紫色のポリエン色素であり、具体的には、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、β−カロテン等が挙げられる。
中でも、本発明の分離方法は、アスタキサンチンの分離に好適であり、アスタキサンチン類を含有する原料から、アスタキサンチンと、アスタキサンチン脂肪酸エステルとに分離することもできる。
（原料の鹸化）
【００１６】
本発明においては、液体クロマトグラフィーによる分離を行なう前に、アスタキサンチン類を含有する原料を鹸化したものを原料として用いることが特に好ましい。アスタキサンチン類は、原料中で、アスタキサンチン脂肪酸エステルの形で存在することが多いが、アスタキサンチン類を含有する原料を予め鹸化しておけば、分離の目的とするアスタキサンチンの、原料中の含有量を高めることができるからである。
鹸化反応は、アスタキサンチン類を含有する原料に、水酸化アルカリ金属類を含有するアルコール溶液を加えることにより行なうことができる。
鹸化反応に用いることのできる水酸化アルカリ金属類としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等が挙げられ、中でも、工業的な観点からコスト上有利であるため、水酸化ナトリウムが好ましい。また、鹸化反応に用いることのできるアルコール溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が挙げられ、中でも、メタノール、又はエタノールを用いることが好ましい。溶媒中の水酸化アルカリ金属類の濃度については、０．００１Ｍ以上、０．０５Ｍ以下が好ましい。濃度が低すぎると、鹸化反応が充分進行しない可能性があり、濃度が高すぎると、アスタキサンチン類が分解してしまう可能性がある。
鹸化反応の温度は、溶媒として用いるアルコール類の融点以上、沸点以下で行われる。また、鹸化反応の反応時間は、０．１時間以上、４８時間以下が好ましい。反応時間が短すぎると、鹸化反応が充分進行しない可能性があり、反応時間が長すぎると、アスタキサンチン類が分解してしまう可能性がある。
なお、このような鹸化反応については、アスタキサンチンのように、脂肪酸エステル類として存在し得る他のカロテノイド類にも適用可能である。
［液体クロマトグラフィー］
本発明において用いられる液体クロマトグラフィーは、固定相と移動相とを有するものであれば、特に制限はない。ここで、固定相とは、前記液体クロマトグラフィーにおいて、試料（溶質）と共に移動しない相を意味し、移動相とは、試料と共に移動する相を意味するものである。
【００１７】
本発明において用いられる液体クロマトグラフィーとしては、順相液体クロマトグラフィーであることが好ましい。順相液体クロマトグラフィーとは、固定相に対して極性の低い移動相を通液し、試料を負荷、分離する方法である。この順相液体クロマトグラフィーは、通常移動相に水を含む逆相クロマトグラフィーよりも、水に不溶であるカロテノイド類を含有する原料の固定相に対する負荷量を高くすることができるという理由により、上述した原料の分離に好適である。
（固定相）
本発明においては、液体クロマトグラフィーの固定相として、（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用いることを必須とする。これにより、後述の実施例にあるように、カロテノイド類、特にアスタキサンチン類の分離が可能となる。なお、この（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子は、固定相として用いた場合に、高度分離に適した数μｍの小粒径から、工業用分離に適した数百μｍの大粒径までの広範囲な粒子径の粒子の製造再現性に優れるという特徴を有するものである。
【００１８】
また、本発明においては、固定相として（メタ）アクリル酸エステル系架橋共重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用いることにより、カロテノイド類、特にアスタキサンチン類を含有する溶液の分離を行った場合、移動相として極性の高い有機溶媒（アルコール等）を、従来のシリカゲル担体の場合よりも高い割合で添加することが可能であることから、例えば、後述の実施例４、５、７のように原料中に極性の高い有機溶媒が存在する場合において、カロテノイド類の吸着性低下の影響を小さくすることが可能となる。
【００１９】
更に、本発明の分離方法は、固定相として（メタ）アクリル酸エステル系架橋共重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用いることにより、上述の原料を鹸化してアスタキサンチン含有量を高めた原料を用いる場合であっても、好適に用いることができる。
固定相として、従来用いられてきたシリカゲル担体を用いる場合、上述の原料を鹸化してアスタキサンチン含有量を高めた原料を用いると、シリカゲル担体は、アルカリに対する耐久性が低いため、連続使用時に性能が低下する問題があり、また、鹸化した原料には極性の高いアルコールが含まれることから、固定相に対する原料の負荷量を高くすると、原料中に存在するアルコールにより固定相に対するアスタキサンチン脂肪酸エステル類、及びアスタキサンチンの吸着性が低下してしまい、分離性を保持することが困難である。一方、本発明においては、移動相として極性の高い有機溶媒（アルコール等）を、従来のシリカゲル担体の場合よりも高い割合で添加することが可能なことから、原料中に存在するアルコールによるアスタキサンチン脂肪酸エステル類、及びアスタキサンチンの吸着性の低下の影響を少なくすることが可能となる。
本発明で用いられる（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子としては、液体クロマトグラフィーに使用可能なものであれば特に制限はない。代表的な（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体としては、（メタ）アクリル酸エステル及びその誘導体と（メタ）アクリル酸ポリオールエステルとの共重合体、（メタ）アクリル酸ポリオールエステルの単独重合体、又は（メタ）アクリル酸ポリオールエステルの少なくとも２種の共重合体が挙げられる。
上記に例示した中でも、（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体の具体例としては、（メタ）アクリル酸ポリオールエステルの単独重合体、や（メタ）アクリル酸エステルと（メタ）アクリル酸ポリオールエステルとの架橋（共）重合体が好ましい。
（メタ）アクリル酸エステル及びその誘導体としては、具体的には、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル類；（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２−クロロエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジエチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸テトラヒドロフルフリル、（メタ）アクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピル等の（メタ）アクリル酸エステル誘導体類が挙げられる。
【００２０】
また、（メタ）アクリル酸ポリオールエステルとしては、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、グリセリントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラヒドロキシブタンジ（メタ）アクリレート、
ブタンジオールジ（メタ）アクリレート，ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの架橋（共）重合体等はそのままで用いることもできるが、必要に応じて更に官能基を導入して用いてもよい。導入する官能基としては、例えば、水酸基、エステル基、エーテル基、カルボニル基等の含酸素官能基、アミノ基、アミド基、ニトロ基、ニトリル基等の含窒素官能基、チオール基、スルホン基等の含硫黄官能基等が挙げられる。中でも、水酸基、エステル基、アミノ基、アミド基、ニトリル基が好ましく、水酸基、エステル基が更に好ましい。
なお、上記に例示した架橋（共）重合体は、公知の方法により製造することができる。
【００２１】
本発明において、（メタ）アクリル酸エステル系架橋共重合体からなる有機高分子粒子は、多孔性であることが好ましい。多孔性のものを用いると、順相クロマトグラフィーによる分離時の処理量を高めるために有効であるからである。
（メタ）アクリル酸エステル系架橋共重合体からなる有機高分子粒子（以下、単に「有機高分子粒子」と称する場合がある。）の多孔性の程度としては、具体的には、窒素吸着法にて求められる比表面積として、通常１ｍ２／ｇ以上、好ましくは５０ｍ２／ｇ以上、更に好ましくは１００ｍ２／ｇ以上であり、また、通常２０００ｍ２／ｇ以下である。
有機高分子粒子の細孔容積としては、通常０．０１ｍｌ／ｇ以上、好ましくは０．１ｍｌ／ｇ以上、更に好ましくは０．２ｍｌ／ｇ以上であり、また、通常３．０ｍｌ／ｇ以下である。
有機高分子粒子の平均粒子径としては、通常１μｍ以上２ｍｍ以下の範囲、好ましくは３μｍ以上２ｍｍ以下の範囲、工業的に更に好ましくは４μｍ以上１ｍｍ以下の範囲である。また、有機高分子粒子の粒子形状は真球状であることが好ましく、粒子径分布は狭いことが好ましい。
【００２２】
本発明の（メタ）アクリル酸エステル系架橋共重合体からなる多孔質有機高分子粒子としては、上記の特性を満たす限り、市販品から適宜選定することができる。具体的には、ダイヤイオン ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ等、ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＨＰ２ＭＧＭ、ＣＨＰ２Ｍ
Ｇ、ＣＨＰ２ＭＧＹ等、セパビーズ ＳＰ２ＭＧＳ，  ＦＰ−ＨＧ等（以上三菱化学社製
；商品名）、アンバーライト ＸＡＤ７、ＸＡＤ７ＨＰ、アンバークロム ＣＧ−７１等（以上、ローム・アンド・ハース社製；商品名）等が挙げられる。
【００２３】
本発明において用いられる液体クロマトグラフィーとしては、順相液体クロマトグラフィーであることが好ましく、順相液体クロマトグラフィーとするためには、固定相よりも極性の低い移動相を選択する必要がある。極性を表す指標としては、比誘電率が挙げられ、例えばポリマーハンドブック第３版によれば、ポリメタクリル酸メチルの比誘電率は２．５７〜３．６である。
（移動相）
移動相としては、通常、上述した固定相よりも極性の低い有機溶媒を使用することができるが、移動相に水を含まないことが好ましい。
より具体的には、固定相として用いる多孔質有機高分子粒子に比べて低い比誘電率を有する溶媒、あるいは、固定相として用いる多孔質有機高分子粒子に比べて低い比誘電率を有する溶媒と、固定相として用いる多孔質有機高分子粒子に比べて高い比誘電率を有する溶媒との混合溶媒を、移動相として選択することが好ましい。
移動相の極性に関し、比誘電率で規定すると、比誘電率２．５未満の溶媒、あるいは、比誘電率が２．５未満である溶媒と比誘電率が２．５以上である溶媒とを、比誘電率が２．５未満の溶媒が体積比で通常５０％を超える割合となるように、好ましくは５５％以上、更に好ましくは６５％以上の割合となるように混合した溶媒を、移動相として選択することが好ましい。
移動相として用いることのできる溶媒としては、具体的には、ｎ−ペンタン（比誘電率1.844）、ｎ−ヘキサン（比誘電率1.890）、ｎ−ヘプタン（比誘電率1.924）、ｎ−オク
タン（比誘電率1.948）、イソオクタン（比誘電率1.943）、シクロヘキサン（比誘電率2.052）等の飽和脂肪族系炭化水素、及びトルエン（比誘電率2.24）、キシレン（比誘電率2.266）等の芳香族系炭化水素からなる群より選択される一種または二種以上の炭化水素系有機溶媒が挙げられる。
これらの炭化水素系有機溶媒は、必要に応じて、少量の極性有機溶媒を含んでいても良い。炭化水素系有機溶媒と極性有機溶媒との混合溶媒を用いると、溶離位置の調整が容易になり好適であるからである。
【００２４】
上記の炭化水素系有機溶媒に添加し得る極性有機溶媒としては、比誘電率が、通常２．５以上、好ましくは４〜３８である有機溶媒から選ばれる。具体的にはメタノール（比誘電率33.1）、エタノール（比誘電率23.8）、ｎ−プロパノール（比誘電率22.2）、２−プロパノール（比誘電率18.3）等の炭素数１から６の脂肪族アルコール類；酢酸エチル（比誘電率6.02）、酢酸プロピル（比誘電率6.002）等のアルキル鎖の炭素数が１から６の酢
酸アルキルエステル類；クロロホルム（比誘電率4.9）、ジクロロメタン（比誘電率9.1）等の塩素系有機化合物類；アセトン（比誘電率20.7）、メチルエチルケトン（比誘電率18.51）等のアルキルケトン類；ジエチルエーテル（比誘電率4.197）、ジイソプロピルエーテル（比誘電率4.49）、テトラヒドロフラン（比誘電率7.58）等のアルキルエーテル類、及びアセトニトリル（比誘電率37.5）等からなる群から任意に選択された一種又は二種以上の有機溶媒が挙げられる。
これらの中でも、ヘキサンを単独で用いるか、ヘキサンにエタノール、又はアセトンを混合した溶媒が好ましい。食品用途で用いる場合、人体への影響等を考慮すると、食品添加物として使用可能であるヘキサン、又はヘキサン−エタノール混合溶媒が特に好ましい。
なお、炭化水素系有機溶媒が含有し得る極性有機溶媒の量は、固定相の極性度、有機溶媒の種類、比誘電率等によっても異なり画一的には決められないが、通常５０％（体積比）未満、好ましくは４５％（体積比）以下、更に好ましくは３５％（体積比）以下である。
【００２５】
（クロマトグラフィー装置）
本発明において行われる液体クロマトグラフィー分離を実施する装置については、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置、中圧液体クロマトグラフィー装置、低圧液体クロマトグラフィー装置等、公知の装置が使用できる。
また、本発明において行われる順相液体クロマトグラフィー分離においては、単カラム法、多段カラム法、複数のカラムを循環接続させ、移動相通液、試料添加および分離成分抜き出しを各カラム間に設けたバルブを介して行ういわゆる擬似移動床（擬似移動層，Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ ＢｅｄまたはＳＭＢ）法、改良型擬似移動床（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｍｏｖｉｎｇ ＢｅｄまたはＩＳＭＢ）法等が可能である。
【実施例】
【００２６】
以下に、本発明の具体的態様を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例によって限定されるものではない。
（実施例１）
送液ポンプ、オートサンプルインジェクタ、可視吸光度検出器、及びデータ処理装置を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用い、固定相としては、（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子である、ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ２ＭＧ（三菱化学株式会社製、粒子径１０μｍ）を、内径４．６ｍｍ、長さ
２５０ｍｍのステンレス製カラムに充填したものを使用した。移動相として、ｎ−ヘキサ
ン／エタノール＝７０／３０（体積比）を用いた順相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速１．００ｍｌ／分で通液した。実験室内の温度は２５℃であった。
【００２７】
試料（分離する原料）として、アスタキサンチン（シグマ社製、純度９２％以上）をエタノール（純正化学製、試薬特級）に飽和になるまで溶解した溶液を用い、オートサンプルインジェクタにて２０μｌをカラムに注入し、分離を行なった。
可視吸光度検出器の波長を４７０ｎｍとして得られたクロマトグラムを図１に示す。図１において、横軸は保持体積（保持時間に流速を掛けた値）をカラム体積にて割った値を表し、縦軸は波長４７０ｎｍにおける吸光度を表す。後掲の図２〜図１１においても同様である。
【００２８】
（実施例２）
試料として、ヘマトコッカス藻色素であるアスタキサンチン２０（オリザ油化社製、アスタキサンチン及びアスタキサンチン脂肪酸エステルの総量として、アスタキサンチン換算で２０％以上含む。なお、分光光度法により求められた値である。）１ｍｇを、１．００ｇのトリオレイン（アルドリッチ社製）に溶解したものを用いたこと以外は、実施例１と同一の条件にて順相クロマトグラフィー分離を行った。
得られたクロマトグラムを図２（ａ）に示す。図２（ａ）において、（保持体積）／（カラム体積）の小さいピークはアスタキサンチン脂肪酸エステル類由来のピークを示すものである。
図２（ａ）の縦軸を拡大したものを図２（ｂ）として示す。図２（ｂ）から、実施例２においても、実施例１（図１）とほぼ同じ（保持体積）／（カラム体積）にアスタキサンチン由来のピークが存在していることがわかる。
従って、本実施例において、アスタキサンチン脂肪酸エステル類とアスタキサンチンとの分離が達成されていることがわかる。
【００２９】
（実施例３）
本発明の分離方法を用いて、アスタキサンチンとアスタキサンチン脂肪酸エステル類とを分離可能であることを明示するために、アスタキサンチンを充分量含む試料を用いた。即ち、試料として、ヘマトコッカス藻色素であるアスタキサンチン２０（オリザ油化製）１ｍｇを、１．００ｇのトリオレイン（アルドリッチ社製）に溶解し、さらにアスタキサンチン（シグマ社製、純度９２％以上）を添加することにより、アスタキサンチンが飽和状態となるようにした溶液を用いたこと以外は、実施例１と同一の条件で順相クロマトグラフィー分離を行った。
得られたクロマトグラムを図３に示す。図３において、（保持体積）／（カラム体積）の小さいピークは、アスタキサンチン脂肪酸エステル類由来のピークを示すものである。また、図３においても、図１とほぼ同じ（保持体積）／（カラム体積）に、アスタキサンチン由来のピークが明瞭に存在していることがわかる。
従って、本実施例において、アスタキサンチン脂肪酸エステル類とアスタキサンチンとの分離が達成されていることがわかる。
【００３０】
（実施例４）
試料として、２４ｍｇのヘマトコッカス藻色素であるアスタキサンチン２０（オリザ油化製）を、１２．０ｇの水酸化ナトリウムのメタノール溶液（濃度０．０２Ｍ）に溶解し、室温にて３時間鹸化反応を行ったものを用いたこと以外は、実施例１と同一条件にて順相クロマトグラフィー分離を行った。
得られたクロマトグラムを図４に示す。図４において、アスタキサンチン脂肪酸エステル類に由来する、（保持体積）／（カラム体積）の小さいピークの割合が小さくなり、一方で、図３とほぼ同じ（保持体積）／（カラム体積）に存在するアスタキサンチン由来のピークの割合が高くなっていることがわかる。
このことから、アスタキサンチン脂肪酸エステル類とアスタキサンチンとの分離が達成されていること、及び、試料の鹸化反応を行なったことにより、アスタキサンチンの含有量が多くなっていることがわかる。
【００３１】
（実施例５）
試料として、２４ｍｇのヘマトコッカス藻色素であるアスタキサンチン２０（オリザ油化製）を、１２．００ｇの水酸化ナトリウムのメタノール溶液（濃度０．０２Ｍ）に溶解し、室温にて３時間鹸化反応を行ったものを用い、オートサンプルインジェクタにて１２５μｌをカラムに注入したこと以外は実施例４と同一条件にて順相クロマトグラフィー分離を行った。
得られたクロマトグラムを図５に示す。本発明の分離方法においては、負荷量が多くなっても、負荷量が少ない場合（実施例４）と同様の分離が得られていることが分かる。
【００３２】
（実施例６）
送液ポンプ、マニュアルサンプルインジェクタ、可視吸光度検出器、データ処理装置を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用い、固定相としては、（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子であるセパビーズ
ＳＰ２ＭＧＳ（粒子径１４５μｍ、三菱化学社製）を、内径２０ｍｍ、長さ５００ｍｍ
のステンレス製カラムに充填したものを使用した。移動相として、ｎ−ヘキサン／エタノール＝７０／３０（体積比）を用いた順相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速４．７３ｍｌ／分で通液した。実験室内の温度は２５℃であった。
【００３３】
試料として、２０ｍｇのヘマトコッカス藻色素であるアスタキサンチン２０（オリザ油化製）を、２０．０ｇのトリオレイン（アルドリッチ社製）に溶解したものに、さらにアスタキサンチン（シグマ社製、純度９２％以上）を添加することにより、アスタキサンチンが飽和状態となるようにした溶液を用い、マニュアルサンプルインジェクタにて４．８ｍｌをカラムに注入し、分離を行なった。
可視吸光度検出器の波長を４７０ｎｍとして得られたクロマトグラムを図６に示す。（保持体積）／（カラム体積）の小さいピークはアスタキサンチン脂肪酸エステル類由来のピークである。また、図６においても、図３とほぼ同じ（保持体積）／（カラム体積）に、アスタキサンチン由来のピークが明瞭に存在する。
従って、本実施例において、アスタキサンチン脂肪酸エステル類とアスタキサンチンとの分離が達成されていることがわかる。
【００３４】
（実施例７）
試料として、３０ｍｇのヘマトコッカス藻色素であるアスタキサンチン２０（オリザ油化製）を、１５．０ｇの水酸化ナトリウムのメタノール溶液（濃度０．０２Ｍ）に溶解し、室温にて２時間鹸化反応を行ったものを用いたこと以外は、実施例６と同一の条件で順相クロマトグラフィー分離を行った。
図７において、アスタキサンチン脂肪酸エステル類に由来する（保持体積）／（カラム体積）の小さいピークの割合が小さくなり、一方、図６とほぼ同じ（保持体積）／（カラム体積）に存在するアスタキサンチン由来のピークの割合が高くなっていることがわかる。
このことから、アスタキサンチン脂肪酸エステル類とアスタキサンチンとの分離が達成されていること、及び、試料の鹸化反応を行なったことにより、アスタキサンチンの含有量が多くなっていることがわかる。
【００３５】
（参考例１）
実施例１で用いたＨＰＬＣ装置と同一のものを用い、固定相としては、ポリスチレン系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子であるＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ５Ｃ（三菱
化学株式会社製、粒子径１０μｍ）を、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレス製カラムに充填したものを使用した。移動相として、ｎ−ヘキサン／エタノール＝９７．５／２．５（体積比）を用いた順相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速１．００ｍｌ／分で通液した。実験室内の温度は２５℃であった。
【００３６】
試料として、アスタキサンチン（シグマ社製、純度９２％以上）を、エタノールに飽和状態となるまで溶解させた溶液を用い、この試料を、オートサンプルインジェクタにて２０μｌをカラムに注入し、分離を行なった。
可視吸光度検出器の波長を４７０ｎｍとして得られたクロマトグラムを図８に示す。アスタキサンチン単独では（保持体積）／（カラム体積）が約４．４の位置にアスタキサンチンピークが検出された。
【００３７】
（比較例１）
試料として、ヘマトコッカス藻色素であるアスタキサンチン２０（オリザ油化製）１ｍｇを、１．００ｇのトリオレイン（アルドリッチ社製）に溶解し、さらにアスタキサンチン（シグマ社製）を添加することにより、アスタキサンチンが飽和状態となるようにした溶液を用いたこと以外は参考例１と同一の条件で順相クロマトグラフィー分離を行った。
得られたクロマトグラムを図９に示す。実施例３と比較すると、アスタキサンチンのピークは確認できず、アスタキサンチン脂肪酸エステル類とアスタキサンチンとの分離が不充分であることが分かる。
【００３８】
（参考例２）
実施例１で用いたＨＰＬＣ装置と同一のものを用い、固定相としては、シリカゲル充填カラムであるＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＳＩＬ  ＳＬ１２Ｓ１１−２５４６ＷＴ（粒子径１０μｍ；カラム内径４．６ｍｍ、カラム長さ２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）を用いた。移動相として、ｎ−ヘキサン／エタノール＝９８／２（体積比）を用いた順相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速１．００ｍｌ／分で通液した。温度は２５℃であった。
【００３９】
試料として２４ｍｇのヘマトコッカス藻色素であるアスタキサンチン２０（オリザ油化製）を１２．００ｇの水酸化ナトリウムのメタノール溶液（濃度０．０２Ｍ）に溶解し、室温にて３時間鹸化反応を行ったものを用い、オートサンプルインジェクタにて２０μｌをカラムに注入し、分離を行なった。
可視吸光度検出器の波長を４７０ｎｍとして得られたクロマトグラムを図１０に示す。実施例４と同一のアスタキサンチン負荷量の場合には、固定相として、シリカゲル充填カラムを用いたときも通常のピーク形状のクロマトグラムが得られた。
【００４０】
（比較例２）
試料として、２４ｍｇのヘマトコッカス藻色素であるアスタキサンチン２０（オリザ油化製）を１２．００ｇの水酸化ナトリウムのメタノール溶液（濃度０．０２Ｍ）に溶解し、室温にて３時間鹸化反応を行ったものを用い、オートサンプルインジェクタにて１２５μｌをカラムに注入したこと以外は比較例３と同一の条件で順相クロマトグラフィー分離を行った。
得られたクロマトグラムを図１１に示す。この場合は、参考例２に比べて固定相に対するアスタキサンチンの負荷量が高く、また、極性が高いメタノール溶液の注入量が多いことの両者の影響から、ピークの形状が乱れ分離性が低下している。したがって、本比較例では、実施例５と同一の負荷量にもかかわらず分離性が低下していることから、シリカゲル充填カラムを用いた場合には、工業的には効率的でないことが分かる。
以上の実施例、及び比較例の結果から、本発明の分離方法によれば、従来品よりも、多量のアスタキサンチン類を一度に分離することができ、工業化に適していることがわかる。また、従来品よりも、アスタキサンチンと、アスタキサンチン脂肪酸エステルとの分離
能にも優れていることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明はカロテノイド類、特に、アスタキサンチン類を分離する任意の分野において用いることができ、本発明の方法により分離されたカロテノイド類、アスタキサンチン類は、例えば、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等に用いて好適である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の実施例１の結果、得られたクロマトグラムを示す。
【図２】本発明の実施例２の結果、得られたクロマトグラムを示す。
【図３】本発明の実施例３の結果、得られたクロマトグラムを示す。
【図４】本発明の実施例４の結果、得られたクロマトグラムを示す。
【図５】本発明の実施例５の結果、得られたクロマトグラムを示す。
【図６】本発明の実施例６の結果、得られたクロマトグラムを示す。
【図７】本発明の実施例７の結果、得られたクロマトグラムを示す。
【図８】本発明の参考例１の結果、得られたクロマトグラムを示す。
【図９】本発明の比較例１の結果、得られたクロマトグラムを示す。
【図１０】本発明の参考例２の結果、得られたクロマトグラムを示す。
【図１１】本発明の比較例２の結果、得られたクロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2010043052.tif 000009
【図９】
2010043052.tif 000010
【図１０】
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【図１１】
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