(57)【要約】【課題】水相中でのキトサンナノ粒子の調製方法を提供すること。【解決手段】この方法は、  (a) 約0.05w/v%から約1w/v%の濃度を有するキトサン溶液を準備するステップ；  (b) アセチル化を実施するために、このキトサン溶液に、まず水を添加し、次いで無水酢酸を添加するステップであって、無水酢酸の濃度が、溶液全体の全容積の約10v/v%から約30v/v%であるステップ；および  (c) ステップ(b)により得られた溶液に物理的分散を加えるステップを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水相中でのキトサンナノ粒子の調製方法であって、
(a) 約0.05w/v%から約1w/v%の濃度を有するキトサン溶液を準備するステップ；
(b) アセチル化を実施するために、前記キトサン溶液に、まず水を添加し、次いで無水酢酸を添加するステップであって、無水酢酸の濃度が、溶液全体の全容積の約10v/v%から約30v/v%であるステップ；および
(c) ステップ(b)による溶液に物理的分散を加えるステップ；
を含む方法。
【請求項２】
前記キトサンが甲殻類または菌類から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キトサン溶液が、キトサンを溶媒に溶解することによって生成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶媒が、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、リンゴ酸、コハク酸、および乳酸から選択されるものの水溶液である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記溶媒が、約1v/v%の濃度の酢酸水溶液である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記キトサン溶液中のキトサン濃度が、約0.05w/v%から約0.6w/v%の範囲にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記キトサン溶液のキトサン濃度が、約0.1w/v%から約0.3w/v%の範囲にある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
無水酢酸の濃度が、溶液全体の全容積の約12.5v/v%から約25v/v%の範囲にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
無水酢酸の濃度が、溶液全体の全容積の約17.5v/v%から約25v/v%の範囲にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ(c)における物理的分散が、機械的撹拌または超音波処理によって実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記の機械的撹拌が、ステップ(b)による溶液に磁気撹拌子を入れ、約150rpmから約1,500rpmの速度で溶液を撹拌することによって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記の超音波処理が約15Wのパワーで実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記の物理的分散が約20℃から約40℃で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
調製されたキトサンナノ粒子が約100nmから約500nmの平均粒径を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記キトサンナノ粒子が約100nmから約300nmの平均粒径を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記キトサンナノ粒子が約100nmから約200nmの平均粒径を有する、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はキトサンのナノ粒子の製造に関する。特に、本発明は、水相におけるキトサンナノ粒子の調製方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
今日、医薬分野において、ナノテクノロジーは、薬剤による予防、診断、ドラッグデリバリーおよび疾患の治療の研究に広く応用されている。ナノ粒子はドラッグデリバリーのための担体として有用である。それらは、多くの利点、例えば、消化管における薬剤の安定性を向上させること、経口投与された薬剤の吸収および生物学的利用能を向上させること、多量の投与により生じる副作用を減らせるように薬剤の投与量を減らすこと、および特効性をもって薬剤を投与すること、を有する。しかし、安全性に対する配慮によって、使用される材料および試薬の原料のような要因がナノ粒子の応用を制限する傾向にある。
【０００３】
キトサンは、極めて高い安全性を有する(LD50>4g/kg)と現在見なされている薬剤担体である。一般的に、キトサンは加工され、マイクロスフィアに製造される。例えば、CN 1698900は薬剤担持キトサンマイクロスフィアの調製方法を開示し、この方法は、酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液に親水性薬剤を溶解して水溶液とするステップ、この水性相を、微多孔膜を通して圧力により油性相に押し出して、均一な大きさのミルク様液滴を生成するステップ、および液滴が架橋した固体状になるように液滴に2ステップ硬化プロセスを行うステップを特徴とする。前記「2ステップ硬化プロセス」は、キトサン粒子をそれらの分子鎖を通じて凝集させるためのイオン性ゲル化剤(例えば、トリフェニルホスフェート(TPP))を添加するステップ、およびキトサン粒子を架橋した固体状にするための化学架橋剤を添加するステップを含む。しかし、前記方法は、ナノスケールのキトサン粒子を得ることができない。
【０００４】
キトサンと、キトサン隣接分子および有機酸(例えば、乳酸)との間の強い水素結合の形成により、キトサンはほとんど水に溶解しない。キトサンの水への溶解性はキトサンの用途に影響を及ぼす重要な要素である。キトサンの水への溶解性は、有機相中で特定の反応条件下にキトサンと酸無水物でアセチル化を実施して、様々なアセチル化レベルを有するキトサンを生成することによって制御できることが知られている。さらに、キトサンナノ粒子の調製方法も示唆されている。
【０００５】
US 2005/0226938 A1は、キトサンから架橋コアおよびコア-シェル型ナノ粒子ポリマーを調製する方法を開示しており、この方法は、キトサンと、少なくとも2つのカルボキシル基を有する少なくとも1種のカルボン酸とを反応させるステップを含む。好ましくは、使用される活性化剤はカルボジイミドである。
【０００６】
US 2006/0013885 A1は、抗癌剤をデリバリーするための水溶性キトサンナノ粒子、およびその調製方法を開示している。この方法は、キトサン分子と、メトキシポリ(エチレングリコール)p-ニトロフェニルカルボネートとを結合させて、両親媒性分子鎖を生成させ、次いで自己集合させて、キトサンナノ粒子を生成させるステップを含む。
【０００７】
JP 2006241321はキトサンナノ粒子の製造方法を開示しており、この方法は、キトサンを酸性水溶液に溶解してキトサン水溶液を得るステップ、およびこのキトサン水溶液をアルカリ性水溶液、例えば、3Nの水酸化ナトリウム水溶液に添加するステップを含む。
【０００８】
CN 1686560はキチンの第四級アンモニウム塩の調製方法を開示しており、この方法は、キトサンとシクロプロピル-トリメチル-アミンクロリドとを反応させて、キトサンの第四級アンモニウム塩を得るステップを含み、キトサンの第四級アンモニウム塩は、カプセル化される薬剤、およびトリポリリン酸ナトリウムと混合され、次いでキトサンの第四級アンモニウム塩のナノ粒子を得るために架橋される。
【０００９】
US 4,996,307は水溶性アシル化キトサンの調製方法を開示しており、この方法は、少なくとも70%の脱アセチル化度を有する水溶性キトサンを酸性水溶液に溶解するステップ、この溶液を水、またはメタノールなどの水混和性溶媒によって希釈するステップ、およびこの希釈された溶液に無水酢酸などのアシル化剤を、アセチル化のために添加するステップを含む。この米国特許の実施例によれば、有機溶媒、例えば、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールが有機相として用いられる。
【００１０】
JP 2000256403は部分的にアシル化されたキトサン粒子の調製方法を開示し、この方法は、キトサンを酸性水溶液に溶解するステップ、この溶液を粒状化溶媒に分散させるステップ、粒子を生成させるためにこの分散相を撹拌するステップを含む。この方法は、アセチル化によりアシル化キトサン粒子を生成させるステップ、これらの粒子にアルカリを添加し、加熱するステップ、粒子を部分的に脱アセチル化するステップ、次いで架橋反応を通じて粒子を安定化させるステップをさらに含む。
【００１１】
JP 62079201は、多孔性の粒状N-アシル化キトサンの製造方法を開示している。この方法では、低分子量キトサンを酸性水溶液に溶解し、得られた溶液を、キトサン溶液に凝集を起こさせて多孔質粒状N-アシル化キトサンを生成させるために、塩基性溶液に添加する。アセチル化は、有機相、例えば、メタノールまたはベンゼン中で実施される。
【００１２】
CN 1367183は、ヒアルロン酸様キトサンの調製方法を開示し、この方法は、キトサンにアシル化反応を行い、次いでその構造がヒアルロン酸の構造に似たキトサン誘導体を得るために選択的な酸化を行なうステップを含む。前記アシル化は、有機相、例えばメタノール中で実施される。
【００１３】
さらに、「N-Acetylchitosan Gel: A Polyhydrate of Chitin」(Shigehiro Hirano and Ryuji Yamaguchi, BIOPOLYMER, Vol. 15, 1685-1692(1976))という標題の刊行物は、メタノール相と水相中での、キトサン酢酸溶液のアセチル化により生じるゲル化の間の違いを比較している。この文献は、本質的には、キトサンのアセチル化により生じるゲル化、およびこのゲル化により得られるゲルの基本的な物理的性質を検討している。この文献において検討されている物理的性質には、例えば、どの溶媒にゲルを溶解するかということ、およびゲルの溶解度が含まれる。しかし、この文献は、特定の量の無水酢酸をキトサンの水相に添加すると、キトサンがアセチル化され、ゲルが生成するということだけしか教示していない。得られるコロイド粒子の大きさは、通常、大きすぎる。さらに悪いことに、粒子は凝集し、大きな塊を生じる。キトサンナノ粒子は、前記文献の操作条件下では製造することができない。
【００１４】
関連する他の刊行物には、「Physicochemical properties and blood compatibility of acylated chitosan nanoparticles」(Dong-Won Lee et al., Carbohydrate Polymers, 58(2004) 371-377)、および「Reacetylated chitosan microspheres for controlled delivery of anti-microbial agents to the gastric mucosa」(A. Portero et al., MICROCAPSULATION, 19 (2002))が含まれ、これらの内容は、参照のために本明細書に援用する。
【００１５】
上述した、キトサン粒子を調製するための公知の方法は全て、1つまたは複数の次の不都合を有する。第1に、キトサンナノ粒子は実際には調製することができない。第2に、これらの方法は、複雑な化学的変性を伴い、多くの時間および労力を必要とする。第3に、製造時に用いられる有機溶媒が、得られるキトサン粒子中に残る傾向がある。このような事情の下では、たとえキトサンナノ粒子が製造されたとしても、それらが医療用途に使用されて安全であるかどうかは、厄介な問題である。
【００１６】
良好な生体適合性を有し、医療用途に向けて安全であるキトサンナノ粒子の調製方法が依然として求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】CN 1698900
【特許文献２】US 2005/0226938 A1
【特許文献３】US 2006/0013885 A1
【特許文献４】JP 2006241321
【特許文献５】CN 1686560
【特許文献６】US 4,996,307
【特許文献７】JP 2000256403
【特許文献８】JP 62079201
【特許文献９】CN 1367183
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】「N-Acetylchitosan Gel: A Polyhydrate of Chitin」(Shigehiro Hirano and Ryuji Yamaguchi, BIOPOLYMER, Vol. 15, 1685-1692(1976))
【非特許文献２】「Physicochemical properties and blood compatibility of acylated chitosan nanoparticles」(Dong-Won Lee et al., Carbohydrate Polymers, 58(2004) 371-377)
【非特許文献３】「Reacetylated chitosan microspheres for controlled delivery of anti-microbial agents to the gastric mucosa」(A. Portero et al., MICROCAPSULATION, 19 (2002))
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、前記の要求を満たす、水相中でのキトサンナノ粒子の調製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の方法は、約0.05w/v%から約1w/v%の濃度を有するキトサン溶液を準備するステップ、アセチル化を実施するために、このキトサン溶液に、まず水を添加し、次いで無水酢酸を添加するステップであって、無水酢酸の濃度が、溶液全体の全容積の約10v/v%から約30v/v%であるステップ、および得られた溶液に物理的分散を加えるステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、水相中でのキトサンナノ粒子の調製方法を提供し、この方法は、
(a)約0.05w/v%から約1w/v%の濃度を有するキトサン溶液を準備するステップ；
(b)アセチル化を実施するために、このキトサン溶液に、まず水を添加し、次いで無水酢酸を添加するステップであって、無水酢酸の濃度が、溶液全体の全容積の約10v/v%から約30v/v%であるステップ；および
(c)ステップ(b)によって得られた溶液に物理的分散を加えるステップ
を含む。
【００２２】
本発明の方法では、キトサン溶液の化学修飾は、キトサンの分子鎖を変換し、それを両親媒性にするために、水相において化学的に修飾される。物理的分散によって、キトサンの両親媒性分子鎖は自己集合し、その結果キトサンナノ粒子が得られる。キトサンのアセチル修飾によるゲル生成時、キトサンおよび無水酢酸の濃度を制御し、かつ物理的分散を用いることによって、本発明では、ナノスケールのキトサン粒子が得られ、Shigehiro HiranoとRyuji Yamaguchiの1976年の論文に見られる大きなゲルの塊の生成が防止される。
【００２３】
ステップ(a)において用いられるキトサンは、β-[1→4]-2-アミノ-2-デオキシ-D-グルコピラノースを表し、これは、広い範囲の分子量、例えば、10から1,000kDaを有し、通常、70%から90%の間の範囲の脱アセチル化度を有する。キトサンは知られているどのような供給源からでも得ることができ、供給源には、これらに限らないが、軟体動物(例えば、イカ)、昆虫の殻、藻類、甲殻類、および菌類が含まれる。甲殻類から得られるキトサンの場合、エビの殻およびカニの殻が好ましい供給源である。菌類から得られるキトサンの場合、アクチノムコル・タイワネンシス（Actinomucor taiwanensis）が好ましい供給源である。本発明によるキトサン溶液は、キトサンを溶媒に溶解することによって生成される溶液を意味する。溶媒は、キトサンを溶解することが知られているどのようなものでもよく、溶媒には、これらに限らないが、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、リンゴ酸、コハク酸、および乳酸の水溶液が含まれる。約1v/v%の濃度の酢酸水溶液が好ましい。キトサン溶液のキトサン濃度は、好ましくは、約0.05w/v%から約0.6w/v%、より好ましくは、約0.1w/v%から約0.3w/v%である。
【００２４】
ステップ(b)において用いられる無水酢酸は市販されている。無水酢酸の濃度は、溶液の全容積の約10v/v%から約30v/v%、好ましくは、約12.5v/v%から約25v/v%、より好ましくは、約17.5v/v%から約25v/v%である。
【００２５】
本発明では、アセチル化は、キトサンのアミノ基と無水酢酸のカルボキシル基との間の反応をいい、この反応はアセチル基を生じる。この反応は、当技術分野において知られている適切な任意の温度で実施できる。
【００２６】
ステップ(c)における物理的分散は、溶液内の分子を分散させるために、物理的なやり方で実施される処理を表す。物理的分散は、当技術分野において知られているどのようなやり方で実施されてもよく、このやり方には、これらに限らないが、振盪機(shaker)またはスプレースパージャの利用、あるいは、機械的撹拌または超音波処理によるものが含まれる。物理的分散が撹拌を通じて実施される時、ステップ(b)により得られる溶液に磁気撹拌子が添加されてもよく、溶液は24時間にわたって適切な速度で撹拌され得る。撹拌速度は反応溶液の容積に応じて決まり、例えば、約150rpmから約1,500rpm、好ましくは、約175rpmから約1,300rpmであり得る。物理的分散が、超音波処理を通じて実施される時、本発明の好ましい実施形態によれば、超音波処理器(ultrasonicator、Sonic & Materials Inc. Mode：VC134、電力（パワー）：130W、電圧：115V、50/60Hz)が使用され得る。超音波処理時間は約5分間であり、パルス間隔は約4秒であり、溶液は、超音波処理の完了後、直ちに氷浴に入れられる。
【００２７】
ステップ(c)の物理的分散は、当技術分野において知られている適切な任意の温度、例えば、約20℃から約40℃で実施できる。物理的分散が、機械的撹拌によって実施される時、それは、好ましくは、約37℃で実施される。物理的分散が超音波処理によって実施される場合、それは、好ましくは、室温で実施される。
【００２８】
本発明の方法により得られるキトサンナノ粒子は、約100nmから約500nm、好ましくは、約100nmから約300nm、より好ましくは、100nmから約200nmの平均直径を有する。
【００２９】
本発明の方法は、有機溶媒、または化学修飾のための複雑なステップを用いることなく、穏やかな条件下にキトサンナノ粒子を得ることができる。本発明の方法の全ての手順は水相中で実施されるので、有機溶媒残渣を含むという、従来のキトサンナノ粒子の問題のある傾向を避けることができる。したがって、本発明の方法により得られるキトサンナノ粒子は、医薬用途に向けて安全であるだけでなく、一層良好な生物学的利用能を有する。
【００３０】
本発明は以下の実施例を参照すれば明らかになるであろうが、これらの実施例は単に例示のためのものであり、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定すると見なされてはならない。当業者によって容易に成され得る明白な如何なる修正および変更も、本明細書の開示、および添付の本件の特許請求の範囲内にある。
【実施例１】
【００３１】
(実施例1)
キトサンナノ粒子の調製(磁気撹拌子を使用)
(I)様々な供給源から得られ、様々な分子量を有するキトサン試料から開始
エビ/カニの殻から得られ、様々な平均分子量を有するキトサン試料を、Shin Era Technology Co., Ltd.(台湾、ROC)から購入し、様々な平均分子量を有するキトサン試料を菌類(アクチノムコル・タイワネンシス（Actinomucor taiwanensis）、Food Industry Research and Development Institute(台湾、ROC)から購入)から得た。各0.2gのキトサン試料を、予め配合した1v/v%の酢酸水溶液に溶解した。次いでキトサン溶液の容積を水により100mlに調節した。このキトサン溶液の各10mlを次の反応のために取り出した。アセチル化を実施するために、まず5mlのMilli Qによる純水を、次いで5mlの100%無水酢酸を、10mlのキトサン溶液の各々に添加した(すなわち、純水と無水酢酸の容積比は1：1であった)。この反応において、各反応溶液の全容積は20mlであり、無水酢酸の濃度は反応溶液の全容積の25v/v%であった。磁気撹拌子を各溶液に入れた。溶液を37℃、1,300rpmで24時間撹拌した。溶液内で生成したキトサンナノ粒子を、ナノ粒子の大きさを測定する分析装置を用いることによって調べ、結果を表1に記載した。表1に示すように、得られたキトサンナノ粒子の平均粒径は195から326nmの範囲であった。
【００３２】
【表１】
2010031218.tif 000002
【００３３】
(II) 様々な濃度のキトサンおよび無水酢酸の使用
セントラルコンポジットデザイン(Central Composite Design、CCD)試験の実験条件を、Design-Expert 6.0.2ソフトウェアによって決定した。ソフトウェアによって決定した実験条件下でフラスコ試験を実施した。試験結果はソフトウェアによってデザインされた実験表に入れた。ソフトウェアの分析を通じて、変動因子に関連する具体的な結論を得た。本件の実施例において用いたCCD計画実験は、1つの実験で複数の変動因子を検討することを可能にする。本発明と異なり、従来の実験計画は、一度に1つの変動因子だけしか検討できない。反応条件および試行回数を含めて、Design-Expert 6.0.2によって求めた変動因子に従って、計画された実験条件を用いてフラスコ試験を実施できる。フラスコ試験の結果を入れ、ソフトウェアによって結果を統計的に解析した後、1つの変動因子のそれぞれが実験の結果に如何に影響を及ぼすか、および2つの変動因子のあらゆる組合せが如何に実験結果に相互に影響を及ぼすかが理解できる。
【００３４】
(1) この実施例では、エビ/カニの殻から得られ、95kDaの分子量を有するキトサン試料(CC 95)(Shin Era Technology Co., Ltd.(台湾、RCO)から市販されている)を用いて、前記CCD計画実験を実施した。
【００３５】
0.05、0.20、および0.35gの上述したキトサン試料を、別々に、予め配合した1v/v%の酢酸水溶液に溶解した。次いでキトサン溶液の容積を水により100mlに調節した。このキトサン溶液の各5mlを次の反応のために取り出した。アセチル化を実施するために、まず2.5mlのMilli Qによる純水を、次いで2.5mlの100%無水酢酸を、5mlのキトサン溶液の各々に添加した(すなわち、純水と無水酢酸の容積比は1：1であった)。この反応において、各反応溶液の全容積は10mlであり、各溶液における無水酢酸の濃度は反応溶液の全容積の25v/v%であった。アセチル化は、(I)に記載のものと同じ条件下に実施した。結果は、様々なキトサン濃度で調製した水溶液の全てからキトサンナノ粒子を得ることができることを示した。水溶液内で生成したキトサンナノ粒子を、ナノ粒子の大きさを測定する分析装置を用いることによって調べ、結果を表2に記載した。表2に示すように、得られたキトサンナノ粒子の平均粒径は189から298nmの範囲である。
【００３６】
【表２】
2010031218.tif 000003
【００３７】
(2) この実施例では、アクチノムコル・タイワネンシス（Actinomucor taiwanensis）菌(Food Industry Research And Development Institute(台湾、ROC)から市販されている)から得られ、24kDaの分子量を有するキトサン試料(FC24)を用いて、上記CCD計画実験を実施した。
【００３８】
0.4gおよび0.6gのキトサン試料を、別々に、予め配合した1v/v%の酢酸水溶液に溶解した。次いでキトサン溶液の容積を水により100mlに調節した。このキトサン溶液の各5mlを次の反応のために取り出した。アセチル化を実施するために、まず2.5mlのMilli Qによる純水を、次いで2.5mlの100%無水酢酸を、5mlのキトサン溶液の各々に添加した(すなわち、純水と無水酢酸の容積比は1：1であった)。この反応において、各反応溶液の全容積は10mlであり、無水酢酸の濃度は反応溶液の全容積の25v/v%であった。磁気撹拌子を各溶液に入れた。溶液を37℃、175rpmで24時間撹拌した。水溶液内で生成したキトサンナノ粒子を、ナノ粒子の大きさを測定する分析装置を用いることによって調べ、結果を表3に記載した。表3に示すように、得られたキトサンナノ粒子の平均粒径は196から206nmの範囲である。
【００３９】
【表３】
2010031218.tif 000004
【００４０】
表2および3の結果が示すように、本発明の方法は、0.1w/v%から0.6w/v%の範囲の濃度のキトサンから、キトサンナノ粒子を得ることができる。
【００４１】
(3) 上記の実験に従って、0.2gのキトサンCC 95を、予め配合した1v/v%の酢酸水溶液に溶解した。次いでキトサン溶液の容積を水により100mlに調節した。このキトサン溶液の5mlを次の反応のために取り出した。アセチル化を実施するために、まず異なる容積のMilli Qによる純水を、次いで異なる容積の無水酢酸を、5mlのキトサン溶液に添加した。この反応では、各反応溶液の全容積は10mlであり、無水酢酸の濃度は、反応溶液の全容積の17.5v/v%と25v/v%であった。アセチル化を、(2)に記載したものと同じ条件下に実施した。溶液内で生成したキトサンナノ粒子を、ナノ粒子の大きさを測定する分析装置を用いることによって調べ、結果を表4に記載した。表4に示すように、得られたキトサンナノ粒子の平均粒径は170から245nmの範囲である。結論として、本発明の方法は、17.5v/v%から25v/v%の無水酢酸の濃度でキトサンナノ粒子を得ることができる。
【００４２】
【表４】
2010031218.tif 000005
【実施例２】
【００４３】
(実施例2)
キトサンナノ粒子の調製(超音波処理器を使用)
(I) 様々な供給源から得られ、様々な分子量を有するキトサン試料から開始
エビ/カニの殻から得られ、様々な平均分子量を有するキトサン試料を、Shin Era Technology Co., Ltd.(台湾、ROC)から購入し、様々な平均分子量を有するキトサン試料を菌類(アクチノムコル・タイワネンシス（Actinomucor taiwanensis）、Food Industry Research and Development Institute(台湾、ROC)から購入)から得た。0.2gの各キトサン試料を、予め配合した1v/v%の酢酸水溶液に溶解した。次いでキトサン溶液の容積を水により100mlに調節した。このキトサン溶液の各3.6mlを次の反応のために取り出した。アセチル化を実施するために、まず様々な容積のMilli Qによる純水を、次いで様々な容積の100%無水酢酸を3.6mlのキトサン溶液の各々に添加した(すなわち、純水と無水酢酸の容積比は、1：2、2：3、および1：1であった)。この反応では、各反応溶液の全容積は7.2mlであり、無水酢酸の濃度は、反応溶液の全容積の16.67v/v%、20v/v%、および25v/v%であった。物理的分散を、超音波処理器(Sonic & Materials Inc. Mode：VC134)により、4秒のパルス間隔で5分間、15Wの出力仕事率で、室温で実施した(超音波処理器は、反応装置(すなわち、管)内に置いた)。超音波処理の完了後、溶液をすぐに氷浴に移し、こうして、キトサンナノ粒子の水溶液を得た。この溶液内で生成したキトサンナノ粒子は、ナノ粒子の大きさを測定する分析装置を用いることによって調べ、結果を表5に記載した。表5に示すように、得られたキトサンナノ粒子の平均粒径は138から213nmの範囲である。
【００４４】
【表５】
2010031218.tif 000006
【００４５】
表5の結果は、本発明の方法によれば、138から213nmの範囲の平均粒径を有するキトサンナノ粒子が、超音波処理器の利用により、16.67から25v/v%の無水酢酸の濃度で、様々な供給源(例えば、エビ/カニの殻、および菌類)から得られ且つ様々な平均分子量を有するキトサン試料を用いることによって得られることを示す。
【００４６】
(II) 様々な最終濃度の無水酢酸の使用
この試験例では、アクチノムコル・タイワネンシス（Actinomucor taiwanensis）菌(Food Industry Research and Development Institute(台湾、ROC)から市販されている)から得られ、340kDaの分子量を有するキトサン試料(FC 340)を用いた。
【００４７】
0.2gのキトサンFC 340を、予め配合した1v/v%の酢酸水溶液に溶解した。次いでキトサン溶液の容積を水により100mlに調節した。このキトサン溶液の2mlを次の反応のために取り出した。アセチル化を実施するために、まず様々な容積のMilli Qによる純水を、次いで様々な容積の無水酢酸を2mlのキトサン溶液に添加した(すなわち、純水と無水酢酸の容積比は、1：1、3：5、および1：3であった)。この反応では、各反応溶液の全容積は4mlであり、無水酢酸の濃度は、反応溶液の全容積の25v/v%、18.75v/v%および12.5v/v%であった。物理的分散を、(I)に記載のものと同一の超音波処理器および条件により実施した。キトサンナノ粒子の水溶液を得た。溶液内で生成したキトサンナノ粒子を、ナノ粒子の大きさを測定する分析装置を用いることによって調べ、結果を表6に記載した。表6に示すように、得られたキトサンナノ粒子の平均粒径は153から170nmの範囲であった。
【００４８】
【表６】
2010031218.tif 000007
【００４９】
表6の結果は、本発明の方法によれば、153から170nmの範囲の平均粒径を有するキトサンナノ粒子が、超音波処理器の利用により、12.5v/v%、18.75v/v%および25v/v%の無水酢酸の濃度で、菌類からのキトサン試料FC 340を用いることによって得られることを示す。
【００５０】
実施例1および2の結果を考慮すると、キトサンナノ粒子が、物理的分散の利用により(例えば、撹拌または超音波処理によって)、12.5v/v%から25v/v%の範囲の無水酢酸濃度で、様々な供給源から(例えば、エビ/カニの殻、および菌類から)得られ且つ様々な平均分子量を有するキトサン試料を用いることによって得られることが分かる。
【外国語明細書】
2010031218.tif 000008
2010031218.tif 000009
2010031218.tif 000010
2010031218.tif 000011
2010031218.tif 000012
2010031218.tif 000013
2010031218.tif 000014
2010031218.tif 000015
2010031218.tif 000016
2010031218.tif 000017
2010031218.tif 000018
2010031218.tif 000019
2010031218.tif 000020
2010031218.tif 000021
2010031218.tif 000022
2010031218.tif 000023
2010031218.tif 000024
2010031218.tif 000025
2010031218.tif 000026
2010031218.tif 000027
2010031218.tif 000028
2010031218.tif 000029
2010031218.tif 000030
2010031218.tif 000031