(57)【要約】【課題】  対象中に自家蛍光を有する物質が含まれている場合であっても、バックグラウンドの上昇を抑制して蛍光偏光測定によって分子間相互作用を有する物質のスクリーニングを可能とする方法を提供すること。【解決手段】  蛍光標識物からの蛍光偏光を測定することによる、対象サンプル中の当該標識物に対して分子間相互作用を有する物質のスクリーニング方法において、蛍光測定波長（λ２）において対象サンプルの自家蛍光を抑制し得る励起波長（λ１）を用いることにより前記課題を解決する。【選択図】  図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識物からの蛍光偏光を測定することによる、対象サンプル中の当該標識物に対して分子間相互作用を有する物質のスクリーニング方法であって、蛍光測定波長（λ２）において対象サンプルの自家蛍光を抑制し得る励起波長（λ１）を用いることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記励起波長（λ１）が５５５ｎｍ近傍であり、前記蛍光測定波長（λ２）が５６５から６２０ｎｍである、請求項１の方法。
【請求項３】
テトラメチルローダミンを蛍光標識物として使用する、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
前記励起波長（λ１）が６５０ｎｍ近傍であり、前記蛍光測定波長（λ２）が６６０から７２０ｎｍである、請求項１の方法。
【請求項５】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（商品名）又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（商品名）を蛍光標識物として使用する、請求項１又は４の方法。
【請求項６】
前記分子間相互作用が免疫反応であることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項７】
対象サンプルからの蛍光測定を、対象サンプル保持容器に石英ガラスの蓋をして行うことを特徴とする、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光偏光法を用いて分子間相互作用を有する物質を迅速にスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ある抗原と結合するモノクローナル抗体（当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）をスクリーニングする際には、ＥＬＩＳＡを用いる場合が多い。一例を例示すると、当該抗原を固定化したＥＬＩＳＡプレートに、ハイブリドーマの培養上清（ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体）を反応させ抗原抗体複合体を形成させる。その後、結合しなかった抗体を分離し、抗体と特異的に反応する酵素標識抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体を分離した後、標識である酵素の基質を添加する。そしてこれにより、抗原と結合するモノクローナル抗体をスクリーニングすること、あるいは当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。
【０００３】
上記方法は感度良く抗体の存在を確認することができる反面、結果が得られるまでに未反応物を分離する操作（いわゆるＢ／Ｆ分離操作）が数回必要となるため、スクリーニングしようとする抗体の種類（数）が多くなると、非常に多くの工数が必要となる。
【０００４】
例えばＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）、ＴＲ−ＦＲＥＴ（Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ＦＲＥＴ）、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（商品名）又は蛍光偏光法といったＢ／Ｆ分離を必要としないスクリーニング方法も知られている。また現実に、ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ又はＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（商品名）といった方法では、それら方法を実施するための専用の試薬キットも市販されている。しかし、当該試薬はきわめて高価であり、モノクローナル抗体のスクリーニングの様に多数のサンプルを処理する目的で使うというのは現実的ではない。
【０００５】
一方、Ｐｅｒｒｉｎによって紹介された蛍光偏光法（非特許文献１）は、抗原を蛍光物質で標識するだけで良いため操作性に優れ、またランニングコストを低く抑えることができことから、多数のサンプルを処理するスクリーニングには適している。液体中の蛍光性分子が平面偏光により励起されると、蛍光性分子が動かない場合には同一の偏光平面で蛍光を放射する。しかし、蛍光性分子が回転等の運動を行った場合には、励起平面とは異なった平面へ蛍光を放射し蛍光偏光が解消される。分子の運動はその分子の大きさに影響を受け、蛍光性分子が低分子である場合は運動速度が速いために放射光の偏光が解消され、蛍光偏光度は小さい値を示す。一方、蛍光性分子が高分子である場合、励起状態の間の分子の運動はほとんどなく、放射光は偏光が解消できずに大きな蛍光偏光度を与える。蛍光標識した低分子抗原の場合、蛍光偏光は解消されるが、それに抗体が結合すると見かけ上分子量が大きくなり、蛍光偏光が解消できなくなって大きな蛍光偏光度を与えることになる。つまり、蛍光偏光度を測定することで抗原が抗体に結合しているかどうか、Ｂ／Ｆ分離をすることなく確認できるのである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｅｒｒｉｎ、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．、１、３９０、１９２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の通り、蛍光偏光法は、その操作性とランニングコストの面において、モノクローナル抗体のスクリーニングに適しているが、改良すべき点も残されている。まず、ウシ胎児血清を含む溶液をサンプルとするスクリーニングを可能とすることである。一般にハイブリドーマの培養は１０％程度のウシ胎児血清を含む培地中で行われ、当該培地に放出されたモノクローナル抗体に対してスクリーニングが行われるが、これまでの蛍光偏光法では、このように高濃度のウシ胎児血清を含むサンプルを対象とすると、ウシ胎児血清の自家蛍光によってバックグラウンドが高くなり、スクリーニングは困難になる。
【０００８】
次に、蛍光測定を行う対象サンプルを保持する保持容器の蓋の課題がある。ハイブリドーマを培養する際には、バクテリア等のコンタミネーションを避けるため、保持容器であるプレートに蓋を被せ、クリーンベンチ以外で蓋をあけることはない。しかし蛍光偏光は、通常、プレートの上部から励起光を照射し、得られる蛍光を上部から測定するために、測定にあたってはプレートの蓋を開けることとなって、コンタミネーションのリスクが高くなる。対象サンプルを培養のためのプレートから別の保持容器に移すことも考えられるが、かかる方法では蛍光偏光の測定によるスクリーニングに煩雑な操作が付加されてしまうため、その効率化を達成できないという課題がある。
【０００９】
そこで本発明は、対象サンプル中に、ハイブリドーマの培養に当たって普通に使用されているウシ胎児血清が含まれている場合であっても、その自家蛍光によるバックグラウンドの上昇を抑制し得る、蛍光偏光測定による抗体等の分子間相互作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することを目的とするものである。また本発明は、蛍光測定中のバクテリア等によるコンタミネーションのリスクを避けることが可能な蛍光偏光測定による抗体等の分子間相互作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題に鑑みてなされた本発明は、蛍光標識物からの蛍光偏光を測定することによる、対象サンプル中の当該標識物に対して分子間相互作用を有する物質のスクリーニング方法であって、蛍光測定波長（λ２）において対象サンプルの自家蛍光を抑制し得る励起波長（λ１）を用いることを特徴とするものである。また本発明は、対象サンプルからの蛍光測定を、対象サンプル保持容器に石英ガラスの蓋をして行うことを特徴とするものである。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明では、例えばテトラメチルローダミンやＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）等、市販されている蛍光物質を蛍光標識として使用することができる。蛍光標識物は、スクリーニングしようとする分子間相互作用を有する物質のペアの一方に蛍光標識を結合したものであるが、結合方法は当該物質が蛍光標識物としての機能を保持できれば良く、化学的結合、物理的結合又はアビジンとビオチンのような親和性物質を介しての結合であっても良い。分子間相互作用を有する物質には、例えば、上述したような抗原と抗体、ＤＮＡ（ＲＮＡ）断片とＤＮＡ（ＲＮＡ）断片又はリガンドとレセプター等があり、分子量が蛍光偏光の測定対称範囲の分子量であれば特に制限はない。分子間相互作用を有する物質が抗原と抗体である場合について詳細に説明すると、蛍光偏光の測定原理から、蛍光標識を結合した抗原（測定原理上抗体との分子量の差が大きいほうが好ましい）を蛍光標識物として使用することにより、感度良く測定することができる。なお、蛍光偏光を測定することにより、蛍光標識物と分子間相互作用を有する物質が対象サンプル中に存在するか否かを知る方法そのものは既に良く知られた方法であり、本明細書では詳細しないが、原理としては先に述べた通りである。
【００１２】
自然界に存在する種々の物質が出す蛍光は、一般的に、長波長域では弱くなる。本発明者の知見によれば、ハイブリドーマ培養用のウシ胎児血清を含む培地が出す自家蛍光についても、自家蛍光が低く抑えられる励起波長（λ１）と蛍光測定波長（λ２）の組合せは、具体的には、励起波長（λ１）５５５ｎｍ近傍、蛍光測定波長（λ２）５６５〜６２０ｎｍの組合せ（以下、第１の組合せという）と、励起波長（λ１）６５０ｎｍ近傍、蛍光測定波長（λ２）６６０〜７２０ｎｍの組合せ（以下、第２の組合せという）を例示できる。第１の組合せと第２の組合せでは、ハイブリドーマ培養用のウシ胎児血清を含む培地からの自家蛍光が低く抑えられる結果、本発明の目的を達成することが可能となるのである。なお、励起波長に関しては、各波長から多少ずれた波長でも、ウシ胎児血清を含む培地からの自家蛍光を十分に抑えることが可能である。また他の波長の光を一切含まない励起光を調製することは技術的に困難である。そこで本発明における５５５ｎｍ（６５０ｎｍ）近傍は、５５５ｎｍ（６５０ｎｍ）の光を含むものであるか、又は、５５５ｎｍ（６５０ｎｍ）近傍の波長の光を用いることを意味するものである。
【００１３】
励起波長と蛍光測定波長に関する前記第１の組合せ又は第２の組合せを実施するために好適な蛍光標識として、第１の組合せについてはテトラメチルローダミンを例示することができ、前記第２の組合せについてはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（インビトロジェン社製）やＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（インビトロジェン社製）を例示することができる。テトラメチルローダミンはその極大吸収波長が５５５ｎｍであるが、当該波長から多少ずれた波長でも、効率は下がるものの十分に蛍光励起が可能である。同様にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７はその極大吸収波長が６５０ｎｍであり、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０はその極大吸収波長が６７９ｎｍであるが、当該波長から多少ずれた波長でも、効率は下がるものの十分に蛍光励起が可能である。よって、厳密に５５５ｎｍ、６５０ｎｍ又は６７９ｎｍの励起光を使用する必要はなく、その近傍の波長の励起光であっても良い。また他の波長の光を一切含まない励起光を調製することは技術的に困難であるため、例えば５５５ｎｍで励起を行う場合には、蛍光装置の光源にバンドパスの幅が５５５ｎｍの前後２０ｎｍの程度のフィルターを取り付け、５３５ｎｍから５７５ｎｍ程度と波長幅のある光を励起光とするのが普通である。従って本発明において蛍光標識を励起する場合には、その極大吸収波長の光を含む励起光を用いたり、又は、極大吸収波長近傍の波長の光を用いたりすれば良い。
【００１４】
本発明を実施するうえで好適な励起波長（λ１）と蛍光測定波長（λ２）の第１又は第２の組合せでは、ウシ胎児血清を含む細胞培養用培地中にモノクローナル抗体が存在するか否かを判定することが可能である。なお、ウシ胎児血清以外の自家蛍光を発する物質が含まれている場合であっても、後述する実施例で使用したような対象サンプルのように、蛍光偏光の測定の妨害が主としてウシ胎児血清が発する自家蛍光に由来するものである場合には、前記のような励起波長（λ１）と蛍光測定波長（λ２）の組合せにより、良好な蛍光偏光の測定（スクリーニング）を実施することが可能である。
【００１５】
対象サンプル中に、通常は使用されないような、自家蛍光を発する物質（ウシ胎児血清以外）を添加して使用しているような場合には、上記した励起波長（λ１）と蛍光測定波長（λ２）の具体的な組合せでは、必ずしも良好な蛍光偏光の測定（スクリーニング）を実施できるとは限らない。このような場合には、本発明の実施例に記載した方法を用いることにより、当該対象サンプルについて本発明を実施するのに好適な励起波長（λ１）と蛍光測定波長（λ２）の組合せ、及び、当該組合せで本発明を実施するのに適当な蛍光標識を適宜決定すれば良い。
【００１６】
本発明における蛍光偏光の測定にあたり、対象サンプルのプレパラートにカバーガラスの蓋を被せる等することにより、蛍光測定中のバクテリア等によるコンタミネーションのリスクを避けることが可能である。特に通常のカバーガラスよりも光学特性の良い石英ガラス板の場合、本発明者の知見によれば、１ｍｍ程度という十分な厚みとしても、蓋の有無によって測定結果は変動せず、同じ結果を得ることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、対象サンプル中にハイブリドーマの培養に当たって普通に使用されているウシ胎児血清等の自家蛍光を発する物質が含まれている場合であっても、その自家蛍光によるバックグラウンドの上昇を抑制して、蛍光偏光測定により抗体等の分子間相互作用を有する物質を高感度にスクリーニング方法を提供することが可能である。また本発明は、対象サンプルを保持する容器に蓋を被せた状態で実施することができるので、そのような態様で実施すれば、蛍光測定中のバクテリア等によるコンタミネーションのリスクを避けることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１の結果を示すものである。
【図２】図２は、実施例２の結果を示すものである。
【図３】図３は、実施例３のうち、マリナブルーを用いた場合の結果を示すものである。
【図４】図４は、実施例３のうち、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０（インビトロジェン社製）を用いた場合の結果を示すものである。
【図５】図５は、実施例３のうち、フルオレッセイン（ＦＩＴＣ）を用いた場合の結果を示すものである。
【図６】図６は、実施例３のうち、テトラメチルローダミンを用いた場合の結果を示すものである。
【図７】図７は、実施例３のうち、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（インビトロジェン社製）を用いた場合の結果を示すものである。
【図８】図８は、実施例３のうち、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（インビトロジェン社製）を用いた場合の結果を示すものである。
【図９】図９は、実施例４の結果を示すものである。
【図１０】図１０は、実施例５の結果を示すものである。
【図１１】図１１は、実施例６の結果を示すものである。
【図１２】図１２は、実施例７の結果を示すものである。
【図１３】図１３は、実施例８の結果を示すものである。
【図１４】図１４は、実施例８の結果を示すものである。
【図１５】図１５は、実施例９の結果を示すものである。
【図１６】図１６は、実施例１０の結果を示すものである。
【図１７】図１７は、実施例１０の結果を示すものである。
【図１８】図１８は、実施例１１の結果を示すものである。
【図１９】図１９は、実施例１２の結果を示すものである。
【図２０】図２０は、実施例１３の結果を示すものである。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
【００２０】
実施例１
ＰＢＳと、市販の動物細胞培養用の培地（商品名：ＧＩＴ、日本製薬（株）製）を蛍光標識であるフルオレッセインの励起波長（λ１、４８８ｎｍ）で励起した際の蛍光スペクトルを測定した。結果を図１に示す。ＰＢＳでは蛍光はほとんど観察されないが、培養用培地ではそれに含まれている各種成分の自家蛍光が観察された（図１中の実線）。
【００２１】
これらの対象サンプルに各同量のフルオレッセイン（ＦＩＴＣ）を添加し、フルオレッセインの励起波長（λ１）で蛍光励起し、蛍光測定波長（極大蛍光波長）（λ２、５１８ｎｍ）で蛍光を測定し、Ｓ／Ｎ比を計算したところ、ＰＢＳの場合は１１であったが、培養用培地の場合は２．２であった。このことからフルオレッセインの励起波長（λ１）で蛍光励起し、その蛍光測定波長（λ２）で蛍光測定を行うと、培養用培地の自家蛍光によりＳ／Ｎ比が低くなり、良好な蛍光偏光の測定は困難である。
【００２２】
実施例２
種々の濃度に調製した抗フルオレッセイン抗体の溶液に対し、一定量のフルオレッセインを混合した後、これらをＰＢＳ又はＥ−ＲＤＦ無血清培地（極東製薬工業（株）製）に加えて対象サンプルとし、市販の測定装置（商品名：ＢＥＡＣＯＮ、宝酒造（株）製）を用いて測定した。結果を図２に示す。図２からは、Ｅ−ＲＤＦ無血清培地を対象サンプルとしたときには、検出感度がＰＢＳと比較して１／１０程度に低下することがわかる。これは培地中の成分の影響と考えられる。通常の細胞培養で使用する、Ｅ−ＲＤＦ無血清培地にウシ胎児血清を１０％添加したものについては、自家蛍光の影響が大きく、測定ができなかった。
【００２３】
実施例３
前述した市販の動物細胞培養用の培地（商品名：ＧＩＴ）を対象に、種々の蛍光物質を蛍光標識として、それらの励起波長（λ１）で励起した場合の蛍光スペクトルを調査した。結果を図３から図８に示す。各グラフでは、フルオレッセインの励起波長（λ１）で得られた蛍光強度の値を破線で示してあるが、この波線で示した値よりも低い値を示す範囲に蛍光測定波長（λ２）を有する蛍光標識であれば、フルオレッセインよりも感度良く蛍光偏光を測定できる可能性が高い。本実施例の結果からは、テトラミチルローダミン（λ１；５５５ｎｍ、λ２；５８０ｎｍ、図６）とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（インビトロジェン社製）（λ１；６５０ｎｍ、λ２；６６８ｎｍ、図８）でその可能性が認められる。
【００２４】
実施例４
フルオレッセイン又はテトラメチルローダミン（以下「ＴＡＭＲＡ」）を用いて、ＰＢＳ又は市販の動物細胞培養用培地（商品名：ＧＩＴ）の蛍光を測定した。測定には市販の装置（商品名Ａｎａｌｙｓｔ  ＧＴ、モレキュラーデバイス社製）を用いた。結果を図９に示す。図９から、動物細胞培養用の培地の蛍光強度は、ＴＡＭＲＡを用いると、フルオレッセインを用いて測定する場合と比較して約１／１０に低下し、Ｓ／Ｎ比率が大幅に改善されることが分かる。
【００２５】
実施例５
エストラジオール（以下「Ｅ２」）をＴＡＭＲＡに結合した蛍光標識物（以下「Ｅ２−ＴＡＭＲＡ」）を次のようにして調製した（図１０参照）。まず、Ｅ２の６位にアミノ基を導入してＥ２−ＮＨ２を調製し、ＮＨＳ基が導入されたＴＡＭＲＡ（以下「ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ」、モレキュラーデバイス社製）とＤＭＳＯ中で反応させた。なお、ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳを大過剰で反応させることで、未反応のＥ２−ＮＨ２が残らないようにした（図１０の１．）。その後、抗Ｅ２抗体を固定化したカラムを用いて、大過剰のＴＡＭＲＡ−ＥＨＳを除去し、Ｅ２−ＴＡＭＲＡを得た（図１０の２．）。
【００２６】
実施例６
実施例５で調製したＥ２−ＴＡＭＲＡを用いて、市販の動物細胞培養用培地（商品名ＧＩＴ）中での抗原抗体反応を観察した。種々の濃度の抗Ｅ２抗体（６０マイクロリットル）に対し、前記培地に溶解した一定量のＥ２−ＴＡＭＲＡ（２０マイクロリットル）を加えたものを対象サンプルとして、各サンプルの蛍光偏光値を市販の装置（商品名：Ａｎａｌｙｓｔ  ＧＴ）で測定した。結果を図１１に示す。図１１から、抗体の濃度が高くなるにつれて蛍光偏光値（ｍＰ値）が増加する様子が培地中で確認できた。なお、ハイブリドーマの培養上清を対象サンプルとする場合、その中には数マイクログラム／ｍＬから数１０マイクログラム／ｍＬ程度の濃度でモノクローナル抗体が含まれていることが多いという経験則から、本発明の方法を適用することにより、培養上清中にモノクローナル抗体が存在するか否かについても、容易かつ迅速に測定できることが分かる。
【００２７】
実施例７
本発明のスクリーニング方法の特異性を次の方法で評価した。６０マイクロリットルの市販の動物細胞培養用の培地（商品名：ＧＩＴ）にウサギ血清（抗Ｅ２ウサギ抗血清又は抗Ｔ３ウサギ抗血清）を０．４マイクロリットル加え、更に、ＧＩＴに溶解した一定量のＥ２−ＴＡＭＲＡ（２０マイクロリットル）を加えて対象サンプルとし、その蛍光偏光値を測定した。結果を図１２に示す。図１２から分かるように、抗Ｅ２ウサギ抗血清についてのみ、ｍＰ値の上昇が確認された。このことから、本発明の方法は分子間相互作用特異的（本例では抗原特異的）な反応であることが分かる。
【００２８】
実施例８
Ｅ２をＢＳＡに結合したＥ２−ＢＳＡをマウスに免疫し、十分に抗体価が上昇したことを確認後、脾臓を摘出し、脾臓細胞をミエローマ細胞とＰＥＧ法により融合した。６７個のハイブリドーマの存在を目視で確認し、それらの培養上清を取得し、その中にＥ２に対するモノクローナル抗体が存在するか否かを本発明の方法により判定した。結果を図１３に示す。図１３の右端（Ｎｅｇ．）は培地そのものについての測定値であり、その左横（Ｐｏｓｉ．（培地＋抗Ｅ２抗体））が培地に予め用意しておいた抗Ｅ２モノクローナル抗体を添加したポジテイブコントロールである。この結果、いくつかの培養上清でｍＰ値の上昇が確認された。次に、上記した６７個の培養上清について、市販の試薬（商品名：ＢＩＡＣＯＲＥ、ＧＥヘルスケア（株）製）を用い、その中にＥ２に対するモノクローナル抗体が存在するか否かを評価した。当該市販試薬を用いる方法では、アミンカップリング法でＥ２−ＮＨ２を結合させたセンサーチップを使用して、一定量の培養上清を流したときにＥ２と結合する物の量（ＲＵ）を算出するものである。
【００２９】
図１４は、横軸にｍＰの値、縦軸にＲＵの値をプロットしたものである。図１４からＢＩＡＣＯＲＥの結果と本発明の方法の結果には相関性があること、そして本発明の方法によってモノクローナル抗体のスクリーニングが可能であることが分かる。
【００３０】
実施例９
モノクローナル抗体のスクリーニングの過程で多用される９６ウエルプレートに加えて、３８４ウエルプレート又は１５３６ウエルプレートを用い、より多くの対象サンプルについてスクリーニングを実施可能かどうか調査した。結果を図１５に示す。図１５から、本例で試験した全てのマルチウエルプレートについて本発明を適用することが可能であり、本発明が多検体スクリーニングが必要なモノクローナル抗体の製造にはきわめて有効な方法であることが分かる。
【００３１】
実施例１０
実施例５で調製した一定量のＥ２−ＴＡＭＲＡを、種々の濃度の抗Ｅ２抗体を含む動物細胞培養用の培地（商品名：ＧＩＴ）に添加し、蓋を開けたウエル、プレートシートフィルムを被せたウエル又はカバーガラスを被せたウエルのそれぞれに適用した。結果を図１６に示す。図１６左のように、従来は蓋を開けて測定を実施する。市販されているプレートシール用のフィルムを被せて測定すると、測定が困難となった（図１６中）。一方、カバーガラスで蓋をすると測定に支障はなかった（図１６右）。そこで、カバーガラスよりも光学特性の良い石英ガラス板（厚さ１ｍｍ）で蓋を作製し、種々の濃度の抗Ｅ２抗体を含む動物細胞培養用の培地（商品名：ＧＩＴ）を分注した３８４ウエルプレートに、実施例５で調製した一定量のＥ２−ＴＡＭＲＡを添加して測定を行い、結果を蓋を開けた場合と比較した。結果を図１７に示す。図１７からは、石英ガラス製の蓋を被せた場合と被せない場合では、測定結果に差がない（結果が相関している）ことが分かる。
【００３２】
実施例１１
ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端アミノ酸（配列番号１）０．１ｍｇに、マレイミドが導入されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（Ａ２０３４４：インビトロジェン社製）を反応させた（図１８の１．）。その後、抗ＢＮＰのＣ末端アミノ酸認識抗体を固定化したカラムを用いて、大過剰のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０を除去し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０で標識した配列番号１を得た（図１８の２．）。
【００３３】
実施例１２
実施例１１で調製した蛍光標識ペプチドを用いて、市販の動物細胞培養用培地（商品名：ＧＩＴ）中での抗原抗体反応を観察した。種々の濃度のＢＮＰのＣ末端認識抗体（４５マイクロリットル）に対し、ＧＩＴ培地に溶解した適量の蛍光標識ペプチド（５マイクロリットル）を一定量加えたものを測定サンプルとして蛍光偏光値をテカン社製プレートリーダー（商品名：Ｍ５００）で測定した。なお励起光のフィルターは６３０ｎｍでバンド幅３５ｎｍのものを使用し、測定フィルターは７２０ｎｍでバンド幅４０ｎｍのものを使用した。結果を図１９に示す。図１９から、抗体の濃度が高くなるにつれて蛍光偏光値（ｍＰ値）が増加する様子が培地中で確認できた。
【００３４】
実施例１３
実施例１２と同じ条件でハイブリドーマの培養上清中の抗体の有り無しの判定をおこなった。ハイブリドーマの培養上清４５マイクロリットルに実施例１２と同量の蛍光標識ペプチドを５マイクロリットル加えてサンプルとした。結果を図２０に示す。図２０から、本法により抗体を発現しているハイブリドーマを検出できることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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