(57)【要約】【課題】治療剤を細胞区画に標的化するための、新規で、より単純で、より効率的で、かつ、より費用有効な方法を提供すること。【解決手段】本発明は、治療剤が必要とされる細胞の亜細胞区画に局在化させる標的化タンパク質治療剤を提供することよって、代謝疾患の処置を容易にする。本発明は、このタンパク質の翻訳後プロセッシングまたは合成後プロセッシングの必要性を減少させることによって、標的化タンパク質治療剤の調製を簡単にする。本発明は、リソソームのような特定の亜細胞区画に局在する標的化治療剤を提供する。この標的化治療剤は、治療薬剤および細胞の外側表面上のレセプターに結合する標的性部分を含み、レセプターの内在化の際に、標的化治療剤の適切な亜細胞局在を可能にする。本発明の実施に関する、核酸、細胞および方法もまた、提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許第６０／２８７，５３１号（２００１年４月３０日出願）；同第６０／３０４，６０９号（２００１年７月１０日出願）；同第６０／３２９，４６１号（２００１年１０月１５日出願）、および同第６０／３５１，２７６号（２００２年１月２３日出願）の利益を主張し、それらの内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、哺乳動物細胞の標的化亜細胞区画にタンパク質を特異的に送達する手段を提供する。亜細胞区画にタンパク質を標的化する能力は、代謝疾患（例えば、リソソーム蓄積症（特に、リソソーム酵素を欠いているかまたは欠乏する４０を超える遺伝的疾患のクラス））の処置において非常に有用である。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
細胞区画（例えば、ゴルジ、小胞体およびリソソーム）における酵素欠乏は、広範なヒト疾患を生じる。例えば、リシルヒドロキシラーゼ（これは、通常、小胞体の管腔内の酵素）は、コラーゲンの適切なプロセッシングに必要とされ；この酵素を欠くことで、エーレルス−ダンロー症候群ＶＩ型（重篤な結合組織障害）が生じる。ＧｎＴ  ＩＩ（通常、ゴルジ中で見出される）は、タンパク質の正常なグリコシル化に必要とされ、ＧｎＴ  ＩＩを欠くことで、脳発達における欠陥誘導する。４０を超えるリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）が、リソソームにおける１つ以上のタンパク質を欠くことによって、直接的にかまたは間接的に引き起こされる。
【０００４】
哺乳動物のリソソーム酵素は、この酵素がＮ連結高マンノース型炭水化物でグリコシル化される、サイトゾルおよびトラバース小胞体で合成される。ゴルジにおいて、高マンノース炭水化物は、リソソームタンパク質をリソソームに標的化するマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の添加によって、このリソソームタンパク質で改変される。Ｍ６Ｐ改変化タンパク質は、２つのＭ６Ｐレセプターのいずれかとの相互作用を介して、リソソームに送達される。改変物の最も都合の良い形態は、二つのＭ６Ｐが高マンノース炭水化物に添加される場合である。
【０００５】
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）のための酵素置換治療は、活発に探求されている。ゴシェ病を除く治療は、一般的に、ＬＳＤタンパク質が取り込まれ、そして、Ｍ６Ｐ依存様式で種々の細胞型のリソソームに送達されることを必要とする。１つの可能なアプローチは、ＬＳＤタンパク質を精製すること、および、このタンパク質が、Ｍ６Ｐを炭水化物部分に組み込むように改変することを包含する。この改変化物質は、細胞表面上でのＭ６Ｐレセプターとの相互作用に起因して、非改変化ＬＳＤよりもより効率的に細胞によって取り込まれ得る。しかし、亜細胞標的化における使用のためにタンパク質を調製、精製および改変するために必要とされる時間および費用に起因して、治療剤を細胞区画に標的化するための、新規で、より単純で、より効率的で、かつ、より費用有効な方法についての必要性が、依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、治療剤が必要とされる細胞の亜細胞区画に局在化させる標的化タンパク質治療剤を提供することよって、代謝疾患の処置を容易にする。本発明は、このタンパク質の翻訳後プロセッシングまたは合成後プロセッシングの必要性を減少させることによって、標的化タンパク質治療剤の調製を簡単にする。例えば、本発明の標的化治療剤は、融合タンパク質を正確な亜細胞区画に標的化する治療ドメインおよびドメインを含む融合タンパク質として、合成され得る（本明細書中で使用される場合「融合タンパク質」は、同じポリペプチド中に通常存在しない、少なくとも２つのドメインを有する単一のポリペプチドをいう。従って、天然に存在するタンパク質は、本明細書中で使用される場合「融合タンパク質」ではない）。融合タンパク質としての合成は、治療ドメインを所望の亜細胞区画に、例えば、別個の治療剤および標的ドメインの化学的架橋に関連する複雑さなしに、標的化することを可能にする。
【０００７】
本発明はまた、Ｍ６Ｐ非依存様式で、治療剤をリソソームに標的化することも可能にする。従って、標的化治療剤は、哺乳動物中で合成されることを必要としないが、化学的に合成され得、またはグリコシル化パターンにかかわらず、細菌、酵母、原生生物もしくは他の生物中で合成され得、高収率でかつ比較的低コストでの標的化治療剤の生成を容易にする。この標的化治療剤は、融合タンパク質として合成され得、さらに生成を簡単にするか、または、独立して合成された治療剤と標的部分を結合することによって、生成され得る。
【０００８】
本発明は、高マンノース炭水化物へのＭ６Ｐの添加を必要としないで、リソソームが治療剤の標的となることを可能にする。このことは、これら２つのＭ６Ｐレセプターの１つがまた、高親和性で他のリガンドに結合するという知見に、部分的に基づいている。例えば、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターはまた、このレセプターが高親和性でＩＧＦ−ＩＩに結合するので、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−ＩＩ）として公知である。この低分子量ポリペプチドは、３つのレセプター（インスリンレセプター、ＩＧＦ−ＩレセプターおよびＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプター）と相互作用する。前者の２つのレセプターとの相互作用を主に介して、その生物学的効果が発揮すると考えられている一方、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターとの相互作用は、リソソーム（ここで、ＩＧＦ−ＩＩが分解される）に輸送されるＩＧＦ−ＩＩを優勢に生じると考えられる。
【０００９】
従って、本発明は、哺乳動物リソソームで治療的に活性である標的部分および治療剤を含む、標的化治療剤の一つの局面に関する。本明細書中で使用される場合「治療的に活性な」は、酵素活性が欠乏する細胞、またはその区画に酵素活性を提供する、少なくともポリペプチドまたは他の分子を含む。「治療的に活性な」はまた、細胞中の生化学的欠乏を改善または補充することが意図される他のポリペプチドまたは他の分子を含むが、主として細胞傷害性または細胞増殖抑制性である分子（例えば、化学療法剤）を含まない。
【００１０】
１つの実施形態において、標的部分は、レセプターが標的細胞の原形質膜に存在する場合、Ｍ６Ｐ非依存性の様式で、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインに結合するための手段（例えば、分子）である。別の実施形態において、この標的部分は、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインに結合する、非グルコシル化リソソーム標的ドメインである。いずれかの実施形態において、標的部分としては、例えば、ＩＧＦ−ＩＩ；レチノイン酸もしくはこの誘導体；ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターレセプターのドメインに少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質；このレセプターを認識する抗体の可変ドメイン；またはこれらの改変体が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、標的部分は、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で、マイクロモル以下の解離定数（例えば、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、または１０−７Ｍと１０−１１Ｍとの間）、およびｐＨ５．５または約ｐＨ５．５で、少なくとも１０−６Ｍの解離定数、ならびにｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で少なくとも１０倍の解離定数でレセプターに結合する。特定の実施形態において、結合するための手段は、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４でよりも、ｐＨ５．５または約ｐＨ５．５で、少なくとも１０倍弱く（ｌｅｓｓ  ａｖｉｄｌｙ）（すなわち、少なくとも１０倍高い解離定数）細胞外ドメインに結合する；１つの実施形態において、ｐＨ５．５または約ｐＨ５．５での解離定数は、少なくとも１０−６Ｍである。さらなる実施形態において、標的化治療剤と結合手段との結合は、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４〜ｐＨ５．５または約ｐＨ５．５のｐＨ変化によって不安定化される。
【００１１】
別の実施形態において、標的部分は、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインに結合するが、アミノ酸１５７２がイソロイシンからスレオニンに変化されるレセプターのムテインには結合しないか、または少なくとも１０倍弱い親和性（すなわち、少なくとも１０倍高い解離定数で）でムテインに結合する、リソソーム標的ドメインである。別の実施形態において、この標的部分は、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１０〜１５から本質的になるレセプタードメインに結合し得るリソソーム標的ドメインである；このリソソーム標的ドメインは、タンパク質が、このリソソーム標的ドメインに結合する他の部分を含まない場合でさえも、リピート１０〜１５を含むタンパク質に結合し得る。好ましくは、このリソソーム標的ドメインは、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターのリピート１０〜１３から本質的になるレセプタードメインに結合し得る。より好ましくは、このリソソーム標的ドメインは、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１１〜１２、リピート１１またはアミノ酸１５０８〜１５６６から本質的になるレセプタードメインに結合し得る。これらの実施形態の各々において、このリソソーム標的ドメインは、好ましくは、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４でマイクロモル以下の解離定数で、レセプターまたはレセプタードメインに結合する。１つの好ましい実施形態において、このリソソーム標的ドメインは、約１０−７Ｍの解離定数で結合する。別の好ましい実施形態において、この解離定数は、１０−７未満である。
【００１２】
別の実施形態において、標的部分は、ヒトＩＧＦ−ＩＩの十分に重複する結合部分であり、その結果、この結合部分は、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合する。この結合部分は、ＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部に十分に相同であるアミノ酸配列を含むことによって、またはＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部に十分相当する分子構造を含むことによって十分に重複し得、その結果、この結合部分は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合する。この結合部分は、ＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部（例えば、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８〜５５、またはヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８、４８、４９、５０、５４および５５からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸）に相当する三次元形状を有する有機分子であり得る。好ましい有機分子は、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８に相当する部分にて疎水性部分を有し、そして、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４９に相当する部分にて、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で、正の荷電を有する。１つの実施形態において、この結合部分は、５以下のアミノ酸によって分離される逆平行のαへリックスを有するポリペプチドを含む、ポリペプチドである。別の実施形態において、この結合部分は、アミノ酸５５〜５６が変更し、そして／またはアミノ酸１〜４が欠失または変化される、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉのムテインのアミノ酸を有するポリペプチドを含む。さらなる実施形態において、この結合部分は、ヒトＩＧＦ−ＩＩに少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む；ヒトＩＧＦ−ＩＩの５４位および５５位に対応する位置でのアミノ酸は、好ましくは、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で、荷電していないか、または負に荷電される。
【００１３】
１つの実施形態において、この標的部分は、アミノ酸配列のフェニルアラニン−アルギニン−セリンを含むポリペプチドである。別の実施形態において、この標的部分は、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８〜５５に対して少なくとも７５％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態において、この標的部分は、単一のポリペプチドまたは別個のポリペプチド上に、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８〜２８および４１〜６１を含む。別の実施形態において、この標的部分は、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４１〜６１、ならびにアミノ酸９、１９、２６および／または２７にてヒト配列とは異なる、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８〜２８のムテインを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、治療剤と標的部分との結合は、ｐＨ５．５または約ｐＨ５．５で不安定である。好ましい実施形態において、この標的部分と治療剤との結合は、５．５〜７．４の間のｐＫａを有するタンパク質アクセプター（例えば、イミダゾールまたはヒスチジンのようなこの誘導体）によって媒介される。好ましくは、治療剤または標的部分の一方は金属に連結され、そして他方は、ｐＨ依存性金属結合部分に連結される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、治療ドメインおよび亜細胞標的ドメインを含む治療的融合タンパク質に関する。この亜細胞標的ドメインは、細胞の外部表面上のレセプターの細胞外ドメインに結合する。このレセプターの内部移行の際に、亜細胞標的ドメインは、治療ドメインの亜細胞区画（例えば、リソソーム、エンドソーム、小胞体（ＥＲ）またはゴルジ複合体）への局在化を可能にして、ここで、この治療ドメインは、治療的に活性である。１つの実施形態において、このレセプターは、構成的エンドサイトーシスを受ける。別の実施形態において、この治療ドメインは、治療的酵素活性を有する。この酵素活性は、好ましくは、（細胞または細胞の特定の区画における）その欠損がヒト疾患（例えば、リソソーム蓄積症）に関連する活性である。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、治療タンパク質をコードする核酸およびこれらの核酸を含む細胞（例えば、哺乳細胞、昆虫細胞、酵母細胞、原生生物、または細菌）に関する。本発明はまた、これらの細胞に、タンパク質の発現を可能にする条件を（例えば、インビトロ培養との関連で、または、細胞を哺乳動物体内に維持することによって）提供することによって、このタンパク質を生成する方法を提供する。このタンパク質は、（例えば、インビトロで生成される場合）その後回収され得るか、または（例えば、患者においてインビボで生成される場合）回収工程を介在することなく、使用され得る。従って、本発明はまた、（注入、インサイチュ合成、その他によって）治療タンパク質を投与することによってか、このタンパク質をコードする核酸を投与することによって（これによって、インビボでのタンパク質合成が可能になる）か、または、このタンパク質をコードする核酸を含む細胞を投与することによって、患者を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、標的化治療剤を合成する工程、ならびに、この標的化治療剤を患者に投与する工程を包含し、この標的化治療剤は、哺乳動物のリソソーム、およびマンノース−６−リン酸非依存性様式で、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターを結合する標的部分において治療的に活性である治療剤を含む。この方法または、（例えば、組み換えディスプレイ技術（例えば、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイもしくは酵母２ハイブリッド）によってか、または、要求性結合特性についてライブラリーをスクリーニングすることによって）標的部分を同定する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ヒトＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部に相当する三次元形状を規定する分子モデルを（例えば、コンピューター上に）提供する工程；ＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部（例えば、アミノ酸４８〜５５）に相当する三次元形状を有する候補ＩＧＦ−ＩＩアナログを同定する工程、ならびに、哺乳動物のリソソームで活性であり、この候補ＩＧＦ−ＩＩアナログに直接的にかまたは間接的に結合される治療剤を生成する工程を包含する。この方法はまた、この候補ＩＧＦ−ＩＩアナログが、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合するか否かを決定する工程も包含し得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
標的化治療剤であって、以下：
治療剤であって、哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性である、治療剤；および
結合用手段であって、マンノース−６−リン酸に非依存性な様式で、ヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合するための、手段
を含む、標的化治療剤。
（項目２）
前記結合用手段が、レイチノイン酸またはその誘導体を含む、項目１の標的化治療剤。
（項目３）
項目１の標的化治療剤であって、ここで、前記結合用手段が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターレセプターのドメインと少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、標的化治療剤。
（項目４）
前記結合用手段がＩＧＦ−ＩＩまたは抗体可変ドメインを含む、項目１の標的化治療剤。
（項目５）
前記治療薬剤と前記結合用手段との結合が、約ｐＨ７．４から約ｐＨ５．５へのｐＨ変化によって不安定化される、項目１の標的化治療剤。
（項目６）
前記結合用手段が約ｐＨ７．４でマイクロモル以下の解離定数で細胞外ドメインに結合する、項目１の標的化治療剤。
（項目７）
前記解離定数が１０−８Ｍ未満である、項目６の標的化治療剤。
（項目８）
前記解離定数が１０−９Ｍ未満である、項目６の標的化治療剤。
（項目９）
前記解離定数が１０−１０Ｍ未満である、項目６の標的化治療剤。
（項目１０）
前記解離定数が１０−７Ｍと１０−１１Ｍとの間である、項目６の標的化治療剤。
（項目１１）
前記結合用手段が、約ｐＨ５．５では約ｐＨ７．４での解離定数の少なくとも１０倍の解離定数で細胞外ドメインに結合する、項目６の標的化治療剤。
（項目１２）
前記解離定数が、約ｐＨ５．５で少なくとも１０−６Ｍである、項目１１の標的化治療剤。
（項目１３）
標的化治療剤であって、以下：
治療剤であって、哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性である、治療剤；および
非グリコシル化リソソーム標的性ドメインであって、ヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合する、ドメイン
を含む、標的化治療剤。
（項目１４）
標的化治療剤であって、以下：
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤；ならびに
リソソーム標的性ドメインであって、ヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合し、そして
（ｉ）  ヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターのアミノ酸１５７２位がイソロイシンからスレオニンに変更された場合に、ムテインに結合せず、
（ｉｉ）  ヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合に関する解離定数の少なくとも１０倍の解離定数でムテインに結合する、ドメイン
を含む、標的化治療剤。
（項目１５）
標的化治療剤であって、以下：
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤；および
リソソーム標的性ドメインであって、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターの１０〜１５の反復からなるレセプタードメインに結合し得る、ドメイン
含む、標的化治療剤。
（項目１６）
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターの１０〜１３の反復からなるレセプタードメインに結合し得る、項目１５に記載の標的化治療剤。
（項目１７）
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターの１１〜１２の反復からなるレセプタードメインに結合する、項目１６に記載の標的化治療剤。
（項目１８）
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターの１１の反復からなるレセプタードメインに結合する、項目１７に記載の標的化治療剤。
（項目１９）
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターのアミノ酸１５０８〜１５６６位からなるレセプタードメインに結合する、項目１８に記載の標的化治療剤。
（項目２０）
前記リソソーム標的性ドメインが、ｐＨ７．４でマイクロモル以下の解離定数でレセプタードメインに結合する、項目１５に記載の標的化治療剤。
（項目２１）
前記解離定数が約１０−７Ｍである、項目２０に記載の標的化治療剤。
（項目２２）
前記解離定数が約１０−７Ｍ未満である、項目２０に記載の標的化治療剤。
（項目２３）
標的化治療剤であって、以下：
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤；および
ヒトＩＧＦ−ＩＩに十分に重複する結合部分であって、その結果、該結合部分がヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する、結合部分
含む、標的化治療剤。
（項目２４）
前記結合部分が、ＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部を代表する三次元形状を有する有機分子である、項目２３に記載の標的化治療剤。
（項目２５）
前記ＩＧＦ−ＩＩの一部がヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８〜５５位を含む、項目２４に記載の標的化治療剤。
（項目２６）
前記ＩＧＦ−ＩＩの一部が、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８位、４８位、４９位、５０位、５４位および５５位からなる群より選択される少なくとも３つのアミノ酸を含む、項目２４に記載の標的化治療剤。
（項目２７）
前記有機分子が、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８位を代表する位置において疎水性部分を有し、そしてヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４９位を代表する位置において約ｐＨ７．４で正電荷を有する、項目２４に記載の標的化治療剤。
（項目２８）
前記結合部分が、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉムテインのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、ここで、
（ｉ）  アミノ酸５５位および５６位が変更されているか、
（ｉｉ）  アミノ酸１〜４位が除去されるかまたは変更されているか、または
（ｉｉｉ）  アミノ酸５５位および５６位が変更されて、かつアミノ酸１〜４位が除去されるかもしくは変更されている、項目２３に記載の標的化治療剤。
（項目２９）
前記結合部分が、ヒトＩＧＦ−ＩＩに少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目２３に記載の標的化治療剤。
（項目３０）
前記アミノ酸配列が、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸５４位および５５位に対応する位置で、ｐＨ７．４にて各々が荷電しないかまたは負電荷を帯びるアミノ酸を含む、項目２９に記載の標的化治療剤。
（項目３１）
前記結合部分が、５以下のアミノ酸によって区切られる逆平行α−ヘリックスを有するペプチドを含む、項目２３に記載の標的化治療剤。
（項目３２）
標的化治療剤であって、以下：
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤；および
ポリペプチドであって、フェニルアラニン−アルギニン−セリンのアミノ酸配列を含むポリペプチド
含む、標的化治療剤。
（項目３３）
標的化治療剤であって、以下：
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤；および
ポリペプチドであって、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８〜５５位に少なくとも７５％の相同性があるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド
含む、標的化治療剤。
（項目３４）
標的化治療剤であって、以下：
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤；
ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８〜２８位；および
ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４１〜６１位
含む、標的化治療剤。
（項目３５）
前記アミノ酸配列８〜２８位および４１〜６１位が単一のポリペプチド中に存在する、項目３４に記載の標的化治療剤。
（項目３６）
標的化治療剤であって、以下：
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤；
ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４１〜６１位；および
ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８〜２８位のムテインであって、アミノ酸９位、アミノ酸１９位、アミノ酸２６位およびアミノ酸２７位からなる群より選択される位置で、ヒトＩＧＦ−ＩＩと異なる、ムテイン
含む、標的化治療剤。
（項目３７）
治療的融合タンパク質であって、以下：
治療的ドメイン、および
亜細胞標的性ドメインであって、細胞の外側表面上のレセプターの細胞外ドメインに結合し、そしてレセプターの内部移行の際、該治療的ドメインが治療的に活性である亜細胞区画への該治療的ドメインの局在を可能にする、ドメイン
を含む、治療的融合タンパク質。
（項目３８）
前記亜細胞区画が、リソソーム、エンドソーム、小胞体およびゴルジ体からなる群より選択される、項目３７に記載の治療的融合タンパク質。
（項目３９）
前記亜細胞区画がリソソームである、項目３８に記載の治療的融合タンパク質。
（項目４０）
前記レセプターが継続的なエンドサイトーシスを受ける、項目３７に記載の治療的融合タンパク質。
（項目４１）
前記治療的ドメインが治療的酵素活性を有する、項目３７に記載の治療的融合タンパク質。
（項目４２）
前記酵素活性における細胞または亜細胞の欠損がヒトの疾患に関連する、項目４１に記載の治療的融合タンパク質。
（項目４３）
前記ヒトの疾患がリソソーム蓄積症である、項目４２に記載の治療的融合タンパク質。
（項目４４）
項目３７に記載の治療的融合タンパク質をコードする、核酸。
（項目４５）
項目４４に記載の核酸を含む、細胞。
（項目４６）
治療的融合タンパク質を作製する方法であって、項目４５に記載の前記細胞に対して、該治療的融合タンパク質の発現を可能とする状態を提供する工程を包含する、方法。
（項目４７）
前記細胞をインビトロで培養する工程を包含する、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記細胞を哺乳動物の体内で維持する工程を包含する、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記治療的融合タンパク質を回収する工程をさらに包含する、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
患者を処置する方法であって、
項目３７に記載の治療的融合タンパク質を該患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目５１）
患者を処置する方法であって、項目４４に記載の核酸を該患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目５２）
患者を処置する方法であって、項目４５に記載の細胞を該患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目５３）
患者を処置する方法であって、以下：
（ｉ）  哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性な治療剤、およびマンノース−６−リン酸に非依存性の様式でヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する標的性部分を含む標的化治療剤を、合成する工程；および
（ｉｉ）  該患者に標的化治療剤を投与する工程、
を包含する、方法。
（項目５４）
項目５３に記載の方法であって、工程（ｉ）の前に、以下：
マンノース−６−リン酸に非依存性の様式でヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合する標的性部分を、同定する工程
をさらに含む、方法。
（項目５５）
前記標的性部分が、核酸ライブラリーまたはペプチドライブラリーのスクリーニングによって同定される、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
標的化治療剤を作製する方法であって、以下の工程：
（ａ）  ヒトＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部を代表する三次元形状を規定する分子モデルを提供する工程；
（ｂ）  ヒトＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部を代表する該三次形状に一致する三次元形状を有する、候補ＩＧＦ−ＩＩアナログを同定する工程；および
（ｃ）  該候補ＩＧＦ−ＩＩアナログに直接的にか、または間接的に結合される該治療剤を作製する工程であって、該治療剤が哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性である、治療剤を作製する工程
を含む、方法。
（項目５７）
前記工程ｃにおいて作製される化合物が、ヒトのカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合するかどうかを決定する工程をさらに包含する、項目５６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ヒトＩＧＦ−ＩＩオープンリーディングフレームのマップである。成熟ＩＧＦ−ＩＩは、シグナルペプチドおよびＣＯＯＨ切断領域を欠く。
【図２】図２は、ｐＩＲ１−ＳＡＴのＸｂａＩ部位に示された、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａコドンに最適化されたＩＧＦ−ＩＩである。
【図３】図３は、本発明の好ましい実施形態の描写であり、シグナルペプチド配列、成体β−ガルクロニダーゼ配列、三つのアミノ酸の橋、およびＩＧＦ−ＩＩ配列を組み込む。
【図４】図４は、ＧＵＳ、ＧＵＳ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質（ＧＩＬＴ−ＧＵＳ）、ＩＧＦ−ＩＩ部分中にΔ１−７およびＹ２７Ｌの変異を有するＧＩＬＴ−ＧＵＳ（ＧＩＬＴ２−ＧＵＳ）またはネガティブコントロール（ＤＭＥＭ）に曝露した、ヒトムコ多糖症ＶＩＩ皮膚線維芽細胞ＧＭ４６６８細胞におけるβ−ガルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を示す。
【図５】図５は、過剰なＩＧＦ−ＩＩ（＋ＧＩＬＴ＋ＩＧＦ−ＩＩ）またはネガティブコントロール（ＧＭ４６６８）の存在下で、ＧＵＳ（＋βＧＵＳ）、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ（＋ＧＩＬＴ）、ＧＵＳ−ＧＩＬＴに曝露したＧＭ４６６８細胞におけるＧＵＳ活性を示す。
【図６】図６は、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩのアライメントであり、Ａドメイン、Ｂドメイン、ＣドメインおよびＤドメインを示す。
【図７】図７は、ＧＵＳ、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ、７つのアミノ末端残基が欠失したＧＵＳ−ＧＩＬＴ（ＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７）、過剰なＩＧＦ−ＩＩの存在下でのＧＵＳ−ＧＩＬＴ、過剰なＩＧＦ−ＩＩの存在下でのＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７、またはネガティブコントロール（Ｍｏｃｋ）に曝露したＧＭ４６６８細胞中のＧＵＳを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される場合、「グリコシル化非依存性リソソーム標的」および「ＧＩＬＴ」は、マンノース−６−リン酸非依存性であるリソソーム標的化をいう。
本明細書中で使用される場合、「ＧＩＬＴ構築物」は、哺乳動物のリソソームにおいて有効な、マンノース−６−リン酸非依存性のリソソーム標的部分および治療部分を含む構築物をいう。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「ＧＵＳ」は、β−グルクロニダーゼ（例示的な治療部分）をいう。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「ＧＵＳ−ＧＩＬＴ」は、ＩＧＦ−ＩＩ標的部分に連結されたＧＵＳを有するＧＩＬＴ構築物をいう。
【００２１】
ＩＧＦ−ＩＩ中のアミノ酸位置への全ての参照は、成人ＩＧＦ−ＩＩにおける位置をいう。従って、例えば、１位、２位および３位は、各々、アラニン、チロシンおよびアルギニンによって占められる。
【００２２】
本発明は、細胞の外に提供される場合に、この細胞に侵入して、標的化治療剤が活性である亜細胞区画に局在する標的化治療剤を提供することによって、代謝性疾患の処置を容易にする。この標的化治療剤は、少なくとも治療剤および標的部分（例えば、タンパク質の亜細胞標的ドメイン）、または、リソソーム標的化のために、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合するための手段（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチドアナログまたは有機化学物質）を含む。
【００２３】
（治療剤と標的部分との間の結合）
治療剤および標的部分は、直接的または間接的に必ず結合される。１つの実施形態において、治療剤および標的部分は、非共有結合される。この結合は、好ましくは、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で安定である。例えば、標的部分は、ビオチン化され得、そして、治療剤と結合したアビジンに結合する。あるいは、この標的部分および治療剤は、各々、多量体タンパク質の異なるサブユニットに（例えば、融合タンパク質として）結合され得る。別の実施形態において、この標的部分および治療剤は、（例えば、化学的架橋剤を使用して）互いに架橋される。
【００２４】
好ましい実施形態において、この治療剤は、融合タンパク質として、標的部分に融合される。この標的部分は、この融合タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端であり得るか、この標的部分の存在が、治療剤の治療活性を過度に干渉しない位置にて、治療剤の配列内に挿入され得る。
【００２５】
治療剤がヘテロマータンパク質である場合、サブユニットの１つ以上は、標的部分に結合され得る。ヘキソサミニダーゼＡ（例えば、テイ−サックス病において作用されるリソソームタンパク質）は、αサブユニットおよびβサブユニットを含む。このαサブユニット、βサブユニット、またはこれらの両方は、本発明に従って、標的部分に結合され得る。例えば、このαサブユニットが標的部分に結合され、そして、βサブユニットと同時発現される場合、活性複合体は、適切に形成され、そして（例えば、リソソームに）標的化される。
【００２６】
治療剤のリソソームへの標的化のために、この治療剤は、ｐＨを、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４〜５．５または約５．５に下げることにより混乱される相互作用を介して、標的部分に結合され得る。この標的部分は、細胞の外部のレセプターに結合する；この選択されたレセプターは、エンドサイトーシスを受けそして、後期エンドソーム（これは、約５．５のｐＨを有する）を通るレセプターである。従って、後期エンドソームにおいて、治療剤は、標的部分から解離して、そして、リソソームに向かい、ここで、治療剤が作用する。例えば、治療部分は、金属イオン（例えば、ニッケル）に強固に結合するキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはトリニトリロトリ酢酸）を取り込むように、化学的に改変され得る。この標的部分（例えば、ＧＵＳ）は、融合タンパク質として、（例えば、アミノ末端か、カルボキシ末端か、または、表面に接近可能な可塑性のあるループにおいて）６つのヒスチジンタグと共に発現され得る。ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で、この６つのヒスチジンタグは、実質的に脱プロトン化されて、金属イオン（例えば、ニッケル）に、高親和性で結合する。ｐＨ５．５または約ｐＨ５．５で、この６つのヒスチジンタグは、実質的にプロトン化されて、ニッケルの放出を導き、結果的に、標的部分から治療剤を放出する。
【００２７】
（治療剤）
本発明の方法および組成物は、任意の治療剤を生成して、亜細胞区画に送達するのに有用であるが、本発明は、代謝疾患を処置するための遺伝子産物を送達するのに、特に有用である。
【００２８】
好ましいＬＳＤ遺伝子は、表１に示され、そして、ゴルジ欠損または小胞体欠損に関連する、好ましい遺伝子は表２に示される。好ましい実施形態において、野生型ＬＳＤ遺伝子産物は、同じＬＳＤ遺伝子の欠損に罹患する患者に送達され得る。代替の実施形態において、ＬＳＤ遺伝子の機能配列または種改変体が使用される。さらなる実施形態において、ＬＳＤ遺伝子欠損をレスキューし得る、異なる酵素をコードする遺伝子が、本発明の方法に従って使用される。
【００２９】
【表１】
2010043103.tif 000002
2010043103.tif 000003
2010043103.tif 000004
【００３０】
【表２】
2010043103.tif 000005
１つの特に好ましい治療剤は、ゴシェ病のための効果的な酵素置換治療剤としてＧｅｎｚｙｍｅによって現在製造される、グルコセレブロシダーゼである。現在、その酵素は、曝露されたマンノース残基（これは、マクロファージ系列の細胞に、タンパク質を特異的に標的化する）によって調製される。１型ゴシェ病患者の主な病理学は、グルコセレブロシドを蓄積するマクロファージに起因するが、他の細胞型に対してグルコセレブロシダーゼを送達することには治療効果が存在し得る。本発明を使用するリソソームへのグルコセレブロシダーゼの標的化は、複数の細胞型に対して薬剤を標的化し、そして他の調製物と比較して治療効果を有し得る。
【００３１】
（亜細胞標的化ドメイン）
本発明は、タンパク質、またはこのタンパク質の細胞レセプターに特異的に結合するタンパク質のアナログを使用して、リソソームに対する治療剤の標的化を可能にする。細胞表面の外部は、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ、および小胞体区画と位相幾何学的に同等である。従って、適切なレセプターとの相互作用を介する分子のエンドサイトーシスは、膜を横切ることなくこれらの区画のいずれかへの分子の輸送を可能にする。遺伝欠損は、これらの区画のいずれかにおける特定の酵素活性の欠失を生じ、治療的タンパク質の送達は、適切なレセプターに対するリガンドとのこのタンパク質のタグ化によって達成され得る。
【００３２】
原形質膜からゴルジおよび／または小胞体に、レセプター結合タンパク質を指向させる複数の経路が特徴付けられている。従って、例えば、ＳＶ４０、コレラ毒素、または植物性リシン毒素（これらの各々は、これらの細胞輸送経路の１つ以上を選出する）由来の標的化部分を使用することによって、治療剤は、細胞内の所望の位置に標的化され得る。各々の場合において、取りこみは、細胞の外側への物質の結合によって開始される。例えば、ＳＶ４０は、ＭＨＣクラスＩレセプターに結合し、コレラ毒素は、ＧＭ１ガングリオシド分子に結合し、そしてリシンは、細胞の表面上の、末端ガラクトースを有する糖脂質および糖タンパク質に結合する。この初期の工程に続いて、分子は種々の経路によってＥＲに達する。例えば、ＳＶ４０は、小胞エンドサイトーシスを起こし、そしてゴルジをバイパスする２段階のプロセスにおいてＥＲに達するのに対し、コレラ毒素は、小胞エンドサイトーシスを起こすが、ＥＲに達する前にゴルジを横切る。
【００３３】
コレラ毒素またはリシンに関連する標的化部分が使用される場合、コレラ毒素またはリシンの毒性が回避されることが重要である。コレラ毒素およびリシンの両方は、ヘテロマーのタンパク質であり、そしてその細胞表面結合ドメインおよび毒性を担う触媒活性は、別々のポリペプチド上に存在する。従って、レセプター結合ポリペプチドを含むが、毒性の原因であるポリペプチドは含まない、標的化部分が構築され得る。例えば、リシンの場合において、Ｂサブユニットは、タンパク質の内在化の原因であるガラクトース結合活性を有する。Ａサブユニットのさらなる存在が亜細胞局在を改善する場合、適切に折りたたまれるが触媒的に不活性であるＡ鎖の変異バージョン（ムテイン）は、Ｂサブユニット−治療剤融合タンパク質と共に提供され得る。
【００３４】
ゴルジに送達されたタンパク質は、ゴルジに逃げているＥＲ標的化タンパク質を回収するＫＤＥＬレセプターを介して小胞体（ＥＲ）に移送され得る。従って、治療タンパク質をゴルジに配向する標的化ドメインの末端にＫＤＥＬモチーフを含ませることは、ＥＲへの引き続く局在化を可能にする。例えば、標的化部分（例えば、抗体、またはファージディスプレイ、酵母ツーハイブリッド、チップベース（ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ）アッセイのようなハイスループットスクリーニングおよび溶液ベースアッセイによって同定されたペプチド）は、ｐＨ７．４またはそのあたり、およびｐＨ５．５またはそのあたりの両方で、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合し、この標的化部分は、ゴルジに対する治療剤の標的化を可能にし；さらにＫＤＥＬモチーフの付加が、ＥＲに対する標的化を可能にする。
【００３５】
（リソソーム標的化部分）
本発明は、リソソームに対する治療剤の標的化を可能にする。標的化は、例えば、後にリソソームを通過する原形質膜レセプターの結合を介して生じ得る。あるいは、標的化は、後に後期（ｌａｔｅ）エンドソームを通過する原形質レセプターの結合を介して生じ得；ついで、治療剤は、後期エンドソームからリソソームへ移動し得る。好ましいリソソーム標的化機構は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合を含む。
【００３６】
（カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター）
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、哺乳動物組織中で遍在的に発現される２７５ｋＤａの単鎖膜貫通糖タンパク質である。それは、Ｍ６Ｐに結合する２つの哺乳動物レセプターのうちの１つであり；２番目は、カチオン依存性Ｍ６Ｐレセプターとよばれる。このカチオン依存性Ｍ６Ｐレセプターは、Ｍ６Ｐ結合のために二価のカチオンを必要とするが；カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、必要としない。これらのレセプターは、リソソーム酵素上の高マンノース炭水化物におけるＭ６Ｐ部分の認識によって、リソソーム酵素の輸送に重要な役割を果たす。カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインは、レセプター上の別個の位置に様々な群のリガンドに結合する１５個の相同ドメイン（「リピート」）を含む。
【００３７】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、Ｍ６Ｐのための２つの結合部位を含む：１つはリピート１〜３に位置し、そして他方は、リピート７〜９に位置する。このレセプターは、おそらくレセプターオリゴマー化に起因して、ｎＭ範囲の解離定数を有する二価のＭ６Ｐリガンドに結合したまま、μＭ範囲の解離定数を有する一価のＭ６Ｐリガンドに結合する。レセプターによるＩＧＦ−ＩＩの取りこみは、レセプターに対する、リソソーム酵素のような多価のＭ６Ｐリガンドの随伴性の結合によって増強される。
【００３８】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターはまた、少なくとも３つの別々のリガンドについての結合部位を含み、これは、標的化部分として使用され得る。カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、主に、リピート１１との相互作用を介して、ｐＨ７．４またはそのあたりで、約１４ｎＭの解離定数でＩＧＦ−ＩＩに結合する。リソソームへのＩＧＦ−ＩＩの標的化におけるその機能と一致して、解離定数は、酸性後期エンドソームにおいてＩＧＦ−ＩＩの解離を促進するｐＨ５．５またはそのあたりで、約１００倍に増加する。このレセプターは、高分子量のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−ＩＩ形態と結合し得る。
【００３９】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのためにさらに有用なリガンドは、レチノイン酸である。レチノイン酸は、２．５ｎＭの解離定数でレセプターに結合する。カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの、レチノイン酸との親和性光標識は、レセプターへのＩＧＦ−ＩＩの結合もＭ６Ｐの結合も妨害せず、レチノイン酸が、レセプター上の別々の部位に結合することを示す。レチノイン酸のレセプターへの結合は、細胞質小胞中のレセプターのより大きい蓄積を有するレセプターの細胞内分布を変更し、また、Ｍ６Ｐ修飾β−グルクロニダーゼの取りこみを増強する。レチノイン酸は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合するその能力を妨害することなく、治療剤に結合するために使用され得る光活性化可能部分を有する。
【００４０】
このカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターはまた、９μＭの解離定数でウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター（ｕＰＡＲ）に結合する。ｕＰＡＲは、ほとんどの細胞型の表面上のＧＰＩ−アンカーレセプターであり、ここで接着分子として、およびプラスミノーゲンおよびＴＧＦ−βのタンパク分解性活性化において機能する。ｕＰＡＲのＣＩ−Ｍ６Ｐレセプターへの結合は、ＣＩ−Ｍ６Ｐレセプターをリソソームに標的化し、それによって、その活性を改変する。従って、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合し得るｕＰＡＲの細胞外ドメインまたはその一部の治療剤への融合は、リソソームに対する薬剤の標的化を可能にする。
【００４１】
（ＩＧＦ−ＩＩ）
好ましい実施形態において、リソソーム標的化部分は、タンパク質、ペプチド、またはマンノース−６−ホスフェート−非依存性様式で、カチオン非依存性Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合する他の部分である。有利なことに、この実施形態は、ＬＳＤタンパク質の取りこみについての通常の生物学的機構を模倣するが、マンノース−６−ホスフェートに依存しない様式でこれを行なう。
【００４２】
例えば、成熟ＩＧＦ−ＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡを、ＬＳＤ遺伝子カセットの３’末端に融合することによって、種々の細胞型によって取り込まれ、リソソームに輸送され得る融合タンパク質が作製される。この方法は、一旦タンパク質が単離されると、さらなる改変がなされる必要がないので、単純さおよびコスト効率を含め、グリコシル化を含む方法よりも多くの利点を有する。
【００４３】
ＩＧＦ−ＩＩは、好ましくは、Ｍ６Ｐレセプターに特異的に標的化される。ＩＧＦ−ＩＩポリペプチドにおける特に有用な変異は、高い親和性でＭ６Ｐレセプターに結合するタンパク質を生じるが、感知可能な親和性で他の２つのレセプターにはもはや結合しない。ＩＧＦ−ＩＩはまた、ＩＧＦ−ＩＩ／ＧＩＬＴ構築物の隔離を避けるために、血清ＩＧＦ−結合タンパク質への結合を最小化するように改変され得る（Ｂａｘｔｅｒ（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２７８（６）：９６７−７６）。多くの研究によって、ＩＧＦ−結合タンパク質に結合するために必要なＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ中の残基が特定された。これらの残基での変異を有する構築物は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの高親和性結合の保持について、およびＩＧＦ−結合タンパク質に対する親和性の減少についてスクリーニングされ得る。例えば、ＩＧＦ−ＩＩのＰＨＥ２６の、ＳＥＲでの置換は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合に影響を及ぼさずに、ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−６についてのＩＧＦ−ＩＩの親和性を減少させることが報告されている（Ｂａｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６８（１３）：９２４６−５４）。ＰＨＥ１９からＳＥＲへ、およびＧＬＵ９からＬＹＳへのような他の置換もまた、有利であり得る。類似の変異は、ＩＧＦ−ＩＩと共に高度に保存されたＩＧＦ−Ｉ中の領域において、別々に、または組み合わせて、ＩＧＦ−ＢＰ結合における大きな減少を生じる（Ｍａｇｅｅら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８（４８）：１５８６３−７０）。
【００４４】
代替的なアプローチは、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに高親和性で結合し得るＩＧＦ−ＩＩの最小領域を同定することである。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合するＩＧＦ−ＩＩに関与する残基は、ほとんどがＩＧＦ−ＩＩの１つの面でクラスター形成する（Ｔａｒａｓａｗａら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７）。ＩＧＦ−ＩＩの３次構造は、通常、３つの分子内ジスルフィド結合によって維持され、ＩＧＦ−ＩＩの表面に結合するＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプター上のアミノ酸配列を取りこむペプチドは、適当に折りたたみ、そして結合活性を有するように設計され得る。このような最小結合ペプチドは、高度に好ましい標的化部分である。アミノ酸４８〜５５周辺の領域に基づいて設計されたペプチドは、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する結合について試験され得る。あるいは、ペプチドのランダムライブラリーは、酵母ツーハイブリッドアッセイを介して、またはファージディスプレイ型アッセイを介してのいずれかで、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合する能力についてスクリーニングされ得る。
【００４５】
（血液脳関門）
リソソーム蓄積症のための治療における１つの挑戦は、これらの疾患の多くが、有意な神経学的関与を有していることである。血流に投与される治療酵素は、一般的に血液脳関門を横切らず、従って、この疾患と関連する神経学的症状を軽減し得ない。しかし、ＩＧＦ−ＩＩは、トランスサイトーシスを介して血液脳関門を横切る輸送を促進することが報告されている（Ｂｉｃｋｅｌら（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４６（１−３：２４７−７９）。従って、適切に設計されたＧＩＬＴ構築物は、血液脳関門を横切ることが可能であるべきであり、リソソーム蓄積症と関連する神経学的症状を処置する手段を初めて提供する。この構築物は、実施例７（後述）に記載されるようにＧＵＳマイナスマウスを使用して試験され得る。血液から神経組織に達し得る標的化された治療剤の設計、構築物および試験に関するさらなる詳細は、米国シリアル番号６０／３２９，６５０（２００１年１０月１６日出願）および米国シリアル番号１０／＿（代理人事件番号ＳＹＭ−００８）（２００２年４月３０日出願）に開示される。
【００４６】
（ＩＧＦ−ＩＩの構造）
ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、２つのグループによって解かれている（Ｔｅｒａｓａｗａら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７；Ｔｏｒｒｅｓら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ記録１ＩＧＬを参照のこと）。ＩＧＦ−ＩＩ構造の一般的な特徴は、ＩＧＦ−Ｉおよびインスリンと類似である。ＩＧＦ−ＩＩのＡドメインおよびＢドメインは、インスリンのＡ鎖およびＢ鎖に対応する。２次構造特徴は、残基２６〜２８中の短いβ鎖へと残基２２〜２５の逆行ターンによって接続される、Ｂ領域の残基１１〜２１からのαヘリックスを含む。残基２５〜２７は、小さい逆平行βシートを形成するようであり；残基５９〜６１および残基２６〜２８はまた、分子間βシート形成に関与し得る。ＩＧＦ−ＩＩのＡドメインにおいて、αヘリックスは、Ｂ−ドメインヘリックスと垂直な逆平行立体配置に配置される残基４２〜４９および５３〜５９におよぶ。３つのジスルフィド架橋のうちの２つおよび保存された疎水性残基によって形成される疎水性クラスターは、これらの２次構造特徴を安定化する。Ｎ末端およびＣ末端は、残基３１〜４０の間の領域として不充分に規定されたままである。
【００４７】
ＩＧＦ−ＩＩは、比較的高い親和性でＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６ＰおよびＩＧＦ−Ｉレセプターに結合し、そしてインスリンレセプターへはより低い親和性で結合する。ＩＧＦ−ＩＩはまた、多くの血清ＩＧＦＢＰと相互作用し得る。
【００４８】
（ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプターへの結合）
ＩＧＦ−ＩＩの残基４８〜５０（Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ）の、インスリン由来の対応する残基（Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ）での置換、または残基５４〜５５（Ａｌａ  Ｌｅｕ）の、ＩＧＦ−Ｉ由来の対応する残基（Ａｒｇ  Ａｒｇ）での置換は、ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプターへの減少された結合を生じるが、ＩＧＦ−Ｉおよびインスリンレセプターへの結合は保持する（Ｓａｋａｎｏら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３１）：２０６２６−３５）。
【００４９】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、残基４８〜５０の領域における同一の配列および構造を共有するが、ＩＧＦ−ＩＩレセプターについての親和性においては１０００倍もの差異を有する。このＮＭＲ構造は、ＩＧＦ−ＩＩの残基５３〜５８（ＩＧＦ−Ｉの残基５４〜５９）の領域におけるＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩとの間の構造的差異を表し：このαヘリックスは、ＩＧＦ−ＩにおいてよりもＩＧＦ−ＩＩにおいてよりよく規定され、そしてＩＧＦ−Ｉとは異なり、残基５３と５４の周りの骨格に曲がりが存在しない（Ｔｏｒｒｅｓら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）。この構造的差異は、ＩＧＦ−ＩＩにおけるＡｌａ５４およびＬｅｕ５５のＩＧＦ−ＩにおけるＡｒｇ５５とＡｒｇ５６での置換と相関する。ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合が、この領域における荷電した残基の存在によって直接的に破壊されることか、または荷電した残基によって引き起こされる構造中の変化が、ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する結合における変化を生じることのいずれかが可能である。いずれの場合においても、ＩＧＦ−Ｉ中の２つのＡｒｇ残基の非荷電残基での置換は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターについてのより高い親和性を生じた（Ｃａｃｃｉａｒｉら（１９８７）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｉａｎ  １４（３）：１４６−５３）。従って、これらの位置における正に荷電した残基の存在は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合の喪失と関連する。
【００５０】
ＩＧＦ−ＩＩは、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１１に結合する。実際に、リピート１１のみがカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに融合されるミニレセプターは、（全長レセプターの約１０分の１の親和性で）ＩＧＦ−ＩＩに結合し得、かつＩＧＦ−ＩＩの内在化およびリソソームへの、その送達を媒介し得る（Ｇｒｉｍｍｅら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３６９７−３３７０３）。Ｍ６Ｐレセプターのドメイン１１の構造は公知である（タンパク質データベース登録番号１ＧＰ０および１ＧＰ３；Ｂｒｏｗｎら（２００２）ＥＭＢＯ  Ｊ．２１（５）：１０５４−１０６２）。この推定ＩＧＦ−ＩＩ結合部位は、ＩＧＦ−ＩＩの疎水性アミノ酸と相互作用すると考えられる疎水性ポケットであり；ＩＧＦ−ＩＩの候補アミノ酸としては、ロイシン８、フェニルアラニン４８、アラニン５４、およびロイシン５５が挙げられる。リピート１１は、ＩＧＦ−ＩＩ結合には十分であるが、構築物は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのより大きい部分（例えば、リピート１０〜１３、または１〜１５）を含み、一般的により大きい親和性で、および増加されたｐＨ依存性でＩＧＦ−ＩＩに結合する（例えば、Ｌｉｎｎｅｌｌら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２６）：２３９８６−２３９９１を参照のこと）。
【００５１】
（ＩＧＦ−Ｉレセプターへの結合）
ＩＧＦ−ＩＩの残基Ｔｙｒ２７をＬｅｕで、Ｌｅｕ４３をＶａｌでまたはＳｅｒ２６をＰｈｅでの置換は、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの親和性を、それぞれ９４倍、５６倍、および４倍、減少させる（Ｔｏｒｒｅｓら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）。ヒトＩＧＦ−ＩＩの残基１〜７の欠失は、ヒトＩＧＦ−Ｉレセプターに対する親和性において３０倍の減少を生じ、そしてラットＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する親和性において随伴性の１２倍の増加を生じた（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３０）：１８０１３−８）。ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、Ｔｈｒ７が、残基４８Ｐｈｅおよび５０Ｓｅｒの近く、ならびに９Ｃｙｓ−４７Ｃｙｓジスルフィド架橋の近くに位置することを示す。これらの残基とのＴｈｒ７の相互作用は、ＩＧＦ−Ｉレセプター結合に必要な可撓性のＮ−末端ヘキサペプチドを安定化し得ることが考えられる（Ｔｅｒａｓａｗａら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）５５９０−７）。同時に、この相互作用は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合を調節し得る。ＩＧＦ−ＩＩのＣ末端（残基６２〜６７）の短縮はまた、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの親和性を５倍低くするようである（Ｒｏｔｈら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１（２）：９０７−１４）。
【００５２】
（ＩＧＦ−ＩＩの欠失変異）
ＩＧＦ−Ｉおよびカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに対する結合表面は、ＩＧＦ−ＩＩの別々の面にある。構造データおよび変異データに基づいて、ヒトＩＧＦ−ＩＩよりも実質的に小さい機能性カチオン非依存性Ｍ６Ｐ結合ドメインが、構築され得る。例えば、アミノ末端アミノ酸１〜７および／またはカルボキシ末端残基６２〜６７は、欠失または置換され得る。さらに、アミノ酸２９〜４０は、ポリペプチドの残りの部分の折りたたみまたはカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合を変更することなく除去または置換されるようであり得る。従って、アミノ酸８〜２８および４１〜６１を含む標的化部分が、構築され得る。アミノ酸のこれらのストレッチは、おそらく直接的に結合され得るかまたはリンカーによって分離され得る。あるいは、アミノ酸８〜２８および４１〜６１は、別々のポリペプチド鎖上に提供され得る。ＩＧＦ−ＩＩと相同であり、そしてＩＧＦ−ＩＩの構造に近い３次構造を有するインスリンの匹敵するドメインは、別々のポリペプチド鎖に存在する場合でさえ、適切な３次構造への適切な再折りたたみを可能にする十分な構造情報を有する（Ｗａｎｇら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２７９−２８１）。従って、例えば、アミノ酸８〜２８、またはその保存的置換改変体は、治療剤に融合され得；生じる融合タンパク質は、アミノ酸４１〜６１またはその保存的置換改変体と混合され得、そして患者に投与され得る。
【００５３】
（ＩＧＦ結合タンパク質への結合）
ＩＧＦ−ＩＩおよび関連する構築物は、ＩＧＦＢＰに対する親和性を減少するように改変され得、それによって、タグ化タンパク質のバイオアベイラビリティーを増加する。
【００５４】
ＩＧＦ−ＩＩの残基フェニルアラニン２６のセリンでの置換は、ＩＧＦＢＰ１〜５への結合を、１／５〜１／７５に減少させる（Ｂａｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１３）：９２４６−５４）。ＩＧＦ−ＩＩの残基４８〜５０のスレオニン−セリン−イソロイシンでの置換は、ＩＧＦＢＰの大分部への結合を１／１００未満に減少させる（Ｂａｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１３）：９２４６−５４）；しかし、これらの残基はまた、カチオン非依存性マンノース−６−ホスフェートレセプターへの結合に重要である。ＩＧＦ−Ｉレセプターへの結合を破壊するＹ２７Ｌ置換は、ＩＧＦＢＰ３および酸不安定性サブユニットを有する３次複合体の形成を妨害する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４４）：２７９３６−４２）；この３次複合体は、循環におけるＩＧＦ−ＩＩの大部分を占める（Ｙｕら（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ  Ａｎａｌ．１３（４）：１６６−７２）。ＩＧＦ−ＩＩの始めの６残基の欠失はまた、ＩＧＦＢＰ結合を妨害する（Ｌｕｔｈｉら（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５（２）：４８３−９０）。
【００５５】
ＩＧＦ−ＩのＩＧＦＢＰとの相互作用の研究は、さらに、フェニルアラニン１６の、セリンでの置換が、２次構造に影響を及ぼさないがＩＧＦＢＰ結合を１／４０〜１／３００倍の間、減少させることを明らかにした（Ｍａｇｅｅら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（４８）：１５８６３−７０）。グルタミン酸９の、リジンへの変化はまた、ＩＧＦＢＰ結合に有意な減少を生じた。さらに、リジン９／セリン１６の２重変異は、ＩＧＦＢＰに対するより低い親和性を示した。これらの変異体は、ＩＧＦ−ＩＩにおいて以前に試験されていないが、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩのこの領域間の配列の保存は、類似の変異（グルタミン酸１２リジン／フェニルアラニン１９セリン）がＩＧＦ−ＩＩ中に作製される場合に類似の効果が観察されることを示唆する。
【００５６】
（ＩＧＦ−ＩＩホモログ）
ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列またはカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合に作用するその一部分は、候補配列が本発明の方法において妥当な成功見込みを有するに十分なアミノ酸類似性を有するか否かを決定するための参照配列として使用され得る。好ましくは、改変体配列は、ヒトＩＧＦ−ＩＩに対して、少なくとも７０％類似または６０％同一であり、より好ましくは、少なくとも７５％類似または６５％同一であり、そして最も好ましくは、８０％類似または７０％同一である。
【００５７】
候補ペプチド領域がヒトＩＧＦ−ＩＩに対して必要な百分率の類似性または同一性を有するか否かを決定するために、この候補アミノ酸配列およびヒトＩＧＦ−ＩＩは、まず、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：１０９１５〜１０９１９の図２に記載されるＢＬＯＳＵＭ６２置換行列と組み合わせた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５〜１９７に記載される動的プログラミングアルゴリズムを用いて整列される。本発明について、ギャップ挿入ペナルティーに対する適切な値は−１２であり、そしてギャップ伸長ペナルティーに対する適切な値は−４である。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムおよびＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用する整列を実施するコンピュータプログラム（例えば、ＧＣＧプログラム一式（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ））は、市販されており、そして当業者によって広範に使用されている。
【００５８】
一旦、候補配列と参照配列との間の整列が作製されると、類似性スコアパーセントが計算され得る。各々の配列の個々のアミノ酸は、互いに対するそれらの類似性に従って順次比較される。２つの整列されたアミノ酸に対応するＢＬＯＳＵＭ６２行列における値が、ゼロまたは負の数である場合、このペアワイズ類似性スコアはゼロであるか；そうでなければ、このペアワイズ類似性スコアは１．０である。未処理の類似性スコアは、整列されたアミノ酸のペアワイズ類似性スコアの合計である。次いで、未処理のスコアは、これを候補配列または参照配列のより小さい方におけるアミノ酸の数で割ることによって正規化される。この正規化された未処理のスコアは、類似性パーセントである。あるいは、同一性パーセントを計算するために、各々の配列の整列されたアミノ酸は、再び順次比較される。アミノ酸が同一でない場合、ペアワイズ同一性スコアはゼロであるか；そうでなければ、ペアワイズ同一性スコアは１．０である。未処理の同一性スコアは、同一の整列アミノ酸の合計である。次いで、未処理のスコアは、これを候補配列または参照配列のより小さい方におけるアミノ酸の数で割ることによって正規化される。この正規化された未処理のスコアは、同一性パーセントである。挿入および欠失は、類似性パーセントおよび同一性パーセントを計算する目的で無視される。従って、ギャップペナルティーは、この計算において使用されないが、これらは、最初の整列において使用される。
【００５９】
（ＩＧＦ−ＩＩ構造アナログ）
ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの既知の構造は、米国特許第６，２２６，６０３号および同第６，２７３，５９８号で考察されるようなコンピュータ支援設計原理を用いた、ＩＧＦ−ＩＩアナログおよび他のカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合タンパク質の設計を可能にする。例えば、ＩＧＦ−ＩＩの既知の原子座標は、従来のコンピュータモデリングプログラム（例えば、Ｂｉｏｓｙｍ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から市販されるＩＮＳＩＧＨＴＩＩ、ＤＩＳＣＯＶＥＲ、もしくはＤＥＬＰＨＩ、またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．から市販されるＱＵＡＮＴＡもしくはＣＨＡＲＭＭ）を備えたコンピュータへ提供され得る。これらおよび他のソフトウェアプログラムは、分子構造の解析ならびに構造および分子間相互作用に対する分子的変化の効果を推定するシミュレーションを可能にする。例えば、このソフトウェアは、標的レセプターに対するアナログの親和性を改善する、付加的な分子間の水素結合またはイオン結合を形成する能力を有する改変されたアナログを同定するために使用され得る。
【００６０】
ソフトウェアはまた、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面の表面の少なくとも一部に示される同一の特徴を模倣する構造的特徴および化学的特徴を有するペプチドおよび有機分子の設計を可能にする。レセプター結合表面への主な寄与は、レセプター結合表面をともに規定するアミノ酸の側鎖内に存在する化学的に相互作用性の部分の空間的配置であるので、本発明の好ましい実施形態は、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面を構成するアミノ酸側鎖に対して配置された化学的部分の空間的関係を模倣する空間的関係において化学的に相互作用性の部分を保有するフレームワークを有する合成有機分子を設計および作製することに関する。好ましい化学的部分としては、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面を構成するアミノ酸のアミノ酸側鎖によって規定される化学的部分が挙げられるが、これらに限定されない。従って、ＩＧＦ−ＩＩアナログのレセプター結合表面は、そこに配置されたアミノ酸残基を含む必要はないが、化学部分を含む必要があることが理解される。
【００６１】
例えば、関連する化学基が同定されたら、従来のコンピュータプログラムを使用する当業者は、適切なキャリアフレームワーク上に配置されたレセプター相互作用性化学部分を有する低分子を設計し得る。有用なコンピュータプログラムは、例えば、Ｄｉｘｏｎ（１９９２）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １０：３５７〜３６３；Ｔｓｃｈｉｎｋｅら（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８６３〜３８７０；およびＥｉｓｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：１９９〜２２１（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００６２】
「ＣＡＶＥＡＴ」という名の１つの特定のコンピュータプログラムは、化学部分の望ましい空間的配向を有する構造について、データベース（例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ）を検索する（Ｂａｒｔｌｅｔｔら（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．編）１８２〜１９６頁）。このＣＡＶＥＡＴプログラムは、テンダミスタット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）（α−アミラーゼの７４残基のインヒビター）の三次元構造における選択されたアミノ酸側鎖の配向に基づいて、テンダミスタットのアナログを設計するために使用されている（Ｂａｒｔｌｅｔｔら（１９８９）前出）。
【００６３】
あるいは、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合活性を模倣する一連のアナログが同定されたら、当業者は、当業者が定量的構造活性関係（ＱＳＡＲ）を開発するのを支援し、そして付加的なモルフォゲンアナログのデノボ設計をさらに支援する、種々のコンピュータプログラムを使用し得る。他の有用なコンピュータプログラムは、例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ−Ｍａｒｔｉｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：５８７〜６１３；Ｄｉｘｏｎ（１９９２）前出；およびＷａｓｚｋｏｗｙｃｚら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｎｍ．３７：３９９４〜４００２に記載されている。
【００６４】
（標的化部分の親和性）
好ましい標的化部分は、それらの標的レセプターに対してマイクロモル濃度未満の解離定数で結合する。一般的には、より低い解離定数（例えば、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満）が、ますます好ましい。解離定数の決定は、好ましくは、Ｌｉｎｎｅｌｌら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２６）：２３９８６〜２３９９１に記載されるように表面プラズモン共鳴によって決定される。標的レセプターの細胞外ドメインの可溶性形態（例えば、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの反復部１〜１５）が作製され、そしてアビジン−ビオチン相互作用を介してチップに固定化される。この標的化部分を、チップ上に通過させ、そして速度定数および平衡定数が、チップ表面に関する質量の変化を測定することによって検出および計算される。
【００６５】
（核酸および発現系）
キメラ融合タンパク質は、インビトロの翻訳系およびインタクトな細胞を含む種々の発現系において発現され得る。Ｍ６Ｐの改変は、標的化のために欠くことができないわけではないので、タンパク質をグリコシル化しない種々の発現系（酵母系、バキュロウイルス系および原核生物系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でさえも含む）は、標的化治療タンパク質の発現に適切である。実際に、グリコシル化されたタンパク質は、肝臓の洞様毛細血管内皮におけるマンノースレセプターに対する結合を介して循環から迅速に除去されるので、グリコシル化されていないタンパク質は、一般的に、改善されたバイオアベイラビリティーを有する。
【００６６】
あるいは、哺乳類細胞発現系におけるキメラ標的化リソソーム酵素の生成は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに対する複数の結合決定基を有するタンパク質を生成する。２つ以上のカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターリガンド（例えば、Ｍ６ＰおよびＩＧＦ−ＩＩ、またはＭ６Ｐおよびレチノイン酸）間の相乗作用が、利用され得る：多価リガンドは、レセプター架橋によってレセプターに対する結合を増強することが示されている。
【００６７】
一般的には、キメラ治療タンパク質をコードする遺伝子カセットは、プロモーター、リボソーム結合部位、イントロン、またはコドン使用頻度を最適化するためのコード配列における変更を含む最適な発現のために必要な配列を組込むために特定の発現系に対して調整され得る。このタンパク質は、好ましくは、産生細胞から分泌されるので、発現系と適合性のシグナルペプチドをコードするＤＮＡは、内因性シグナルペプチドに対して置換され得る。例えば、ＬｅｉｓｈｍａｎｉａにおいてＩＧＦ−ＩＩでタグ化されたβ−グルクロニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼＡについて、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａシグナルペプチド（ＧＰ６３またはＳＡＰ）をコードするＤＮＡカセットは、最適な発現を達成するために内因性シグナルペプチドをコードするＤＮＡの代わりに挿入される。哺乳類発現系において、内因性シグナルペプチドが利用され得るが、ＩＧＦ−ＩＩタグがコード配列の５’末端で融合される場合、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドを使用することが所望され得る。
【００６８】
ＣＨＯ細胞は、治療タンパク質の生成のために好ましい哺乳類宿主である。ＣＨＯ細胞からの高収率な発現を達成するための伝統的な方法は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠損するＣＨＯ細胞株（例えば、ＣＨＯ株ＤＵＫＸ（Ｏ’Ｄｅｌｌら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３０（７）：７６７〜７１））を使用することである。ＣＨＯ細胞のこの株は、増殖のためにヒポキサンチンおよびチミジンを必要とする。別個のプラスミドに対してかまたは単一のプラスミドでの、ＤＨＦＲ遺伝子カセットで過剰発現される遺伝子の同時トランスフェクションは、ＤＨＦＲ遺伝子についての選択を可能にし、そして一般的に、選択した組換えタンパク質も発現するクローンの単離を可能にする。例えば、プラスミドｐｃＤＮＡ３は、目的の遺伝子の発現を駆動するためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期領域調節性領域プロモーターおよびＤＨＦＲの発現を促進するためのｐＳＶ２ＤＨＦＲを用いる。組換え遺伝子カセットを有する細胞の、漸増濃度の葉酸アナログメトトレキサートに対する引き続いての曝露は、ＤＨＦＲ遺伝子および同時トランスフェクトされた遺伝子の両方の遺伝子のコピー数の増幅をもたらす。
【００６９】
この系における真核生物発現についての好ましいプラスミドは、ＣＭＶのような強力なプロモーターの下流に配置された目的の遺伝子を含む。イントロンは、遺伝子カセットの３’側（ｆｌａｎｋ）に配置され得る。ＤＨＦＲカセットは、同一のプラスミド由来かまたは別個のプラスミド由来の第２のプロモーターによって駆動され得る。さらに、これは、プラスミド中にさらなる選択マーカー（例えば、Ｇ４１８に対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）を組込むために有用であり得る。
【００７０】
あるいは、組換えタンパク質は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製系に基づく発現系を用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞株中で生成され得る。これは、ＥＢＶ複製起点ｏｒｉＰおよびＥＢＶ  ｏｒｉ結合タンパク質ＥＢＮＡ−１から構成される。ｏｒｉＰに対するＥＢＮＡ−１の結合は、染色体外プラスミドの複製および引き続く増幅を惹起する。この増幅は次に、プラスミド内に収容された遺伝子カセットの高レベルの発現をもたらす。ｏｒｉＰを含むプラスミドは、ＥＢＮＡ−１形質転換ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販）中にトランスフェクトされ得るか、または代替的に、ＥＢＮＡ−１の発現を駆動し、そしてＥＢＶ  ｏｒｉＰを含むプラスミド（例えば、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販））が利用され得る。
【００７１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、治療タンパク質は、好ましくは、細胞周辺腔中に分泌される。これは、細菌性シグナルペプチド（例えば、ｏｍｐＡシグナル配列）をコードする核酸カセットで、ＬＳＤタンパク質の内因性シグナルペプチドをコードするＤＮＡを置換することによって達成され得る。発現は、任意の多くの強力な誘導性プロモーター（例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、またはｔａｃプロモーター）のいずれかによって駆動され得る。１つの適切なベクターは、ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販）であり、これは、Ｇｅｎｅ  ＩＩＩシグナルペプチドおよびａｒａＢＡＤプロモーターを使用する。
【００７２】
（インビトロでのリフォールディング）
１つの有用なＩＧＦ−ＩＩ標的化部分は、３つの分子内ジスルフィド結合を有する。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧＩＬＴ融合タンパク質（例えば、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ）が、構築され得、これは、細胞周辺腔へタンパク質を指向する。別のタンパク質のＣ末端に融合される場合、ＩＧＦ−ＩＩは、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおいて活性な形態で分泌され得る（Ｗａｄｅｎｓｔｅｎら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３（３）：４１２〜２１）。ＩＧＦ−ＩＩ部分の最適なフォールディングを容易にするために、適切な濃度の還元型および酸化型グルタチオンが、好ましくは、細胞性環境にジスルフィド結合形成を促進するために添加される。ジスルフィド結合を有する融合タンパク質が不完全に可溶性である場合、任意の不溶性物質は、好ましくは、変性したタンパク質を可溶化するためのカオトロピック剤（例えば、尿素）で処理され、そして適切なジスルフィド結合の形成を容易にするために、適切な濃度の還元型および酸化型グルタチオン、または他の酸化剤および還元剤を有する緩衝液中でリフォールドされる（Ｓｍｉｔｈら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（１６）：９３１４〜２１）。例えば、ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩＩの変性および還元のための６Ｍグアニジン−ＨＣｌおよび０．１Ｍトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン還元剤を用いてリフォールドされている（Ｙａｎｇら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５３）：３７５９８〜６０４）。タンパク質のリフォールディングは、１ｍＭ酸化型グルタチオン、１０ｍＭ還元型グルタチオン、０．２Ｍ  ＫＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中で達成された。
【００７３】
（インビボでの発現）
治療タンパク質（好ましくは、分泌される治療タンパク質）をコードする核酸は、疾患で苦しむ患者に直接的に有利に提供され得るか、またはエキソビボでの細胞に続いて、患者にこの生細胞を投与することによって提供され得る。当該分野で公知のインビボでの遺伝子治療法としては、精製されたＤＮＡを（例えば、プラスミド中におけるように）提供すること、ウイルス性ベクターでＤＮＡを提供すること、またはリポソームもしくは他の小胞でＤＮＡを提供することが挙げられる（例えば、遺伝子治療で使用するための脂質キャリアを開示する米国特許第５，８２７，７０３号、および遺伝子治療に有用なアデノウイルスベクターを提供する米国特許第６，２８１，０１０号を参照のこと）。
【００７４】
組換えタンパク質を発現するために改変された細胞を移植することによって疾患を処置するための方法はまた周知である。例えば、ヒトへの導入のために始原ヒト細胞への核酸を導入するための方法を開示している米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。エキソビボでの治療のためのヒト細胞の使用は、いくつかの実施形態において好ましいが、他の細胞（例えば、細菌性細胞）が、患者の脈管構造に移植されて、連続的に治療剤を放出し得る。例えば、米国特許第４，３０９，７７６号および同第５，７０４，９１０号を参照のこと。
【００７５】
本発明の方法は、精製工程を必要とすることなく、亜細胞区画に直接的にタンパク質を標的化するために特に有用である。１つの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質は、宿主に投与される共生または弱毒化した寄生生物中で発現される。発現されたＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質は、この生物によって分泌され、宿主細胞によって取り込まれ、そして宿主細胞のリソソームに標的化される。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態において、ＧＩＬＴタンパク質は、感染したマクロファージのリソソームへこのタンパク質を分泌する生きたＬｅｉｓｈｍａｎｉａを介してインサイチュで送達される。この小器官から、このタンパク質はその細胞を離れ、そしてそのマクロファージの直系でない隣接細胞によって取り込まれる。従って、ＧＩＬＴタグおよび治療剤は、このタンパク質が、マクロファージリソソーム中に存在する間、必然的にインタクトなままである。よって、ＧＩＬＴタンパク質がインサイチュで発現される場合、これらは、好ましくは、リソソームの環境との適合性を確実にするために改変される。ヒト−β−グルクロニダーゼ（ヒト「ＧＵＳ」）（例示的な治療部分）は、通常、リソソームにおいてか、またはリソソームへの輸送の間のいずれかでＣ末端ペプチド切断を受ける（例えば、ＧＵＳにおける残基６３３と残基６３４との間）。従って、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ構築物がマクロファージリソソームにおいてＬｅｉｓｈｍａｎｉａによって発現される実施形態において、ヒトＧＵＳが、好ましくは、このタンパク質に切断に対する耐性を与えるために改変されるか、または残基６３３に続く残基が、好ましくは、ＧＩＬＴ融合タンパク質から単に取り除かれる。同様に、ＩＧＦ−ＩＩ（例示的な標的化部分）が、好ましくは、タンパク質分解に対するその耐性を増加させるために改変されるか、または最小の結合ペプチド（例えば、ファージディスプレイまたは酵母ツーハイブリッドによって同定されるような）が、野生型ＩＧＦ−ＩＩ部分に対して置換される。
【００７７】
（投与）
本発明に従って発見された標的化治療剤は、任意の経路によって哺乳類宿主に投与され得る。従って、必要に応じて、投与は、経口、または静脈内および腹腔内の投与経路を含む非経口であり得る。さらに、投与は、治療剤のボーラスの定期的な注射によってであり得るか、または外部（例えば、ｉ．ｖ．バッグ）であるレザバからの静脈内もしくは腹腔内の投与によってより連続的になされ得る。特定の実施形態において、本発明の治療剤は、製薬等級であり得る。すなわち、特定の実施形態は、ヒトへの投与のために要求される純度の規格および品質管理に従う。獣医学の適用もまた、本明細書中で使用されるような意図される意義の範囲内である。
【００７８】
本発明に従う治療剤の獣医学的使用およびヒト医学的使用のための両方の処方物は、代表的には、そのための薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の成分と関連してこのような治療剤を含む。キャリアは、処方物の他の成分と適合性であり、そしてそのレシピエントに有害でないという意味で「受容可能」であり得る。この点で、薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的投与に適合性の任意ならびに全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である範囲以外で、この組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物（本発明に従って同定され、そして／または当該分野で公知である）もまたこの組成物中に組込まれ得る。処方物は、都合よく、投薬単位形態で提示され得、そして薬学／微生物学の当該分野において周知の任意の方法によって調製され得る。一般的には、いくつかの処方物は、治療剤を液体キャリアもしくは微細に分割された固体キャリアまたは両方と関連させ、必要に応じて、次いで所望の処方物に生成物を形づくることによって調製される。
【００７９】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方される。投与経路の例としては、経口または非経口（例えば、静脈内、皮内、吸入、経皮（局所）、経粘膜、および直腸の投与）が挙げられる。非経口、皮内、または皮下の適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含有し得る：滅菌した希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート）および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調整され得る。
【００８０】
経口投与または非経口投与のための有用な溶液は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．編），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．，１９９０に記載される、製薬分野において周知の任意の方法によって調製され得る。非経口投与のための処方物はまた、頬側投与のためのグリココレート、直腸投与のためのメトキシサリチラート、または膣投与のためのクエン酸（ｃｕｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）を含み得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジもしくは複数回投与バイアル中に封入され得る。直腸投与のための座剤はまた、薬物を非刺激性の賦形剤（例えば、カカオ脂、他のグリセリド、または室温で固体であり、そして体温で液体である他の組成物）と混合することによって調製され得る。処方物はまた、例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、植物起源のオイル、水素添加されたナフタレンなどを含み得る。直接投与のための処方物は、グリセロールおよび高粘度の他の組成物を含み得る。これらの治療剤について他の潜在的に有用な非経口キャリアとしては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧性ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームが挙げられる。吸入投与のための処方物は、賦形剤として、例えば、ラクトースを含み得るか、または例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む水溶液、または点鼻剤の形態での投与のための油性溶液、または鼻腔内に塗布するためのゲルとしてであり得る。保持浣腸もまた、直腸送達のために使用され得る。
【００８１】
経口投与のために適切な本発明の処方物は、別個の単位の形態（例えば、カプセル、ゼラチンカプセル、薬袋（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、トローチ、または口内錠（各々が所定量の薬物を含む））；散剤または顆粒剤の形態；水性液体または非水性液体中の溶液もしくは懸濁液の形態；あるいは水中油乳剤または油中水乳剤の形態であり得る。この治療剤はまた、ボーラス、舐剤またはパスタ剤の形態で投与され得る。錠剤は、薬物を、必要に応じて１つ以上の副成分とともに、圧縮するかまたは成形することによって作製され得る。圧縮された錠剤は、自由に流れる形態（例えば、散剤または顆粒剤）における薬物を適切な機械で、必要に応じて、結合剤、潤沢剤、不活性な希釈剤、界面活性剤または分散剤で混合されて、圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状の薬物および適切なキャリアの混合物を適切な機械で成形することによって作製され得る。
【００８２】
経口組成物は、一般には、不活性な希釈剤または食用のキャリアを含む。経口治療投与の目的で、活性化合物は、賦形剤とともに組込まれ得る。うがい薬として使用するために流体キャリアを用いて調製される経口組成物は、流体キャリア中に化合物を含み、そして経口的に適用され、音を立てられ、そして吐かれるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質は、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、任意の以下の賦形剤、または同様な性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、スターチまたはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ）；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料）。
【００８３】
注射可能な使用に適切な薬学的組成物は、滅菌された注射可能な溶液または分散系の即席調製物のための、滅菌された水溶液（水溶性の場合）または分散系および滅菌された散剤を包含する。静脈投与について、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は、滅菌され得、容易に注射可能である程度に、流動性であり得る。この組成物は、製造および保存の条件下で安定であり得、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存され得る。このキャリアは、溶媒または分散系媒体であり得、これらとしては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散系の場合に必要な分子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザールなど）によって達成され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、および組成物中の塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の長時間の吸収性は、組成物中に、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによって成し遂げられ得る。
【００８４】
滅菌された注射可能な溶液は、１つまたは上に列挙された成分の組合せを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組込むことによって調製され得、必要な場合、続いて、フィルター濾過を行う。一般的に、分散系は、滅菌されたビヒクル中に活性化合物を組込むことによって調製され、このビヒクルは、基本的な分散媒体および上記に列挙される成分から必要な他の成分を含む。滅菌された注射可能な溶液の調製物について滅菌された散剤の場合、調製の方法は、活性成分の散剤および前に濾過滅菌されたこの成分の溶液からの任意のさらなる成分の散剤を生じる真空乾燥工程および凍結乾燥工程を包含する。
【００８５】
関節内投与に適した処方物は、微晶質形態であり得る、滅菌された水性治療調製物の形態、例えば、水性微晶質懸濁物の形態であり得る。リポソーム処方物または生体分解性ポリマー系はまた、関節内投与および眼内投与の両方に関する治療剤を提供するために使用され得る。
【００８６】
局所投与（眼の処置を含む）に適切な処方物としては、液体調製物または半液体調製物（例えば、リニメント、ローション、ゲル、散布剤、水中油または油中水エマルジョン（例えば、クリーム、軟膏またはペースト）；あるいは溶液または懸濁液（例えば、ドロップ））が挙げられる。皮膚表面への局所投与のための処方物は、皮膚科学的に受容可能なキャリア（例えば、ローション、クリーム、軟膏または石鹸）を有する治療剤を散布することによって調製され得る。いくつの実施形態において、塗布を局在化し除去を防止するために、皮膚の上にフィルムまたは層を形成することが可能なキャリアが、有用である。組織の表面への接着が所望される場合、組成物は、フィブリノーゲン−トロンビン組成物または他の生体接着剤中に分散する治療剤を含有し得る。次いで、治療剤は、所望される組織表面に、塗布（ｐａｉｎｔ）されるか、スプレーされるかまたはそうでなければ塗布（ａｐｐｌｙ）され得る。内部組織表面への局所投与について、薬剤は、液体組織接着剤または組織表面への吸着を強化することが公知である他の物質中に分散され得る。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースまたはフィブリノーゲン／トロンビン溶液が、有利に使用され得る。あるいは、組織コーティング溶液（例えば、ペクチン含有処方物）が使用され得る。
【００８７】
吸入処置（例えば、喘息に対する）について、スプレー缶、ネブライザ、またはアトマイザで分配された散剤（自己推進処方物またはスプレー処方物）の吸入が、使用され得る。そのような処方物は、散剤吸入デバイスからの肺投与のための微細に粉砕された散剤の形態または自己推進散剤分配処方物の形態であり得る。自己推進溶液およびスプレー処方物の場合、効果は、所望のスプレー特性（すなわち、所望の粒子径を有するスプレーを生成し得る特性）を有するバルブの選択によってかまたは制御された粒子径の懸濁された散剤として活性成分を組込むことによってのいずれかで達成され得る。吸入による投与に関して、治療剤はまた、適切な推進剤（例えば、気体（例えば、二酸化炭素）、またはネブライザ）を含む、加圧容器またはディスペンサから、エアロゾルスプレー形態で送達され得る。点鼻薬もまた使用され得る。
【００８８】
全身投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段であり得る。経粘膜的投与または経皮的投与に関して、浸透されるべき障壁に適切な浸透剤を、処方物に使用する。このような浸透剤は、当該分野で一般的に公知であり、そのような浸透剤としては、例えば、経粘膜的投与については、界面活性剤、胆汁塩、およびフィルシジン酸誘導体が挙げられる。経皮的投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を介して達成され得る。経皮的投与に関して、治療剤は、代表的には、当該分野で一般的に公知である軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。
【００８９】
１つの実施形態では、治療剤は、身体からの急速な排除を保護する、キャリア（例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出処方）と共に調製される。生分解性の、生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が用いられ得る。このような処方物の調製方法は、当業者に理解される。材料もまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販のものを入手し得る。リポソーム懸濁液はまた、薬学的に受容可能なキャリアとして用いられ得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に公知の方法に従って調製され得る。ミクロソールおよび微粒子もまた、使用され得る。
【００９０】
経口組成物または非経口組成物は、投与を容易にするおよび投薬を均一にするために、投薬単位形態で処方され得る。投薬単位形態とは、単一の投薬として、処置されるべき被験体に適した物理的に分散した単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共に所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての仕様は、個体の処置のための活性化合物のように、活性化合物の固有の特性および達成される特定の治療効果、ならびに配合の分野に固有の制限によって、およびこれらに直接的に依存して、決定される。
【００９１】
一般的に、本発明に従って同定された治療剤は、例えば、治療的に有効な量（例えば、適切な濃度の薬物を標的組織に対して、所望の効果を誘導するのに十分な時間提供する量）で、ヒトまたは他の哺乳動物に対する非経口投与または経口投与のために処方され得る。さらに、本発明の治療剤は、単独、または特定の疾患もしくは目的の症状に対する有益な効果を有することが公知の他の分子との組み合わせで投与され得る。単なる例示として、有用な補因子としては、症状緩和補因子（消毒剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤を含む）、ならびに鎮痛剤および麻酔剤が挙げられる。
【００９２】
治療組成物中に送達されるべきである本発明に従って同定された治療剤の有効濃度は、投与される薬物の最終の所望の投薬量および投与の経路を含む、多数の因子に依存して変化する。投与される好ましい投薬量はまた、処置される疾患または症状の型および程度、特定の患者の全体的な健康状態、送達される治療剤の相対的な生物学的効力、治療剤の処方、処方物中の賦形剤の存在および型、ならびに投与の経路のような変動に依存すると考えられる。いくつかの実施形態では、本発明の治療剤は、最も最近に記載された非ヒト霊長類およびげっ歯類を用いた哺乳動物研究から推定された代表的な投薬単位を用いて個体に提供され得る。上記のように、投薬単位は、単一性（すなわち、患者に投与され得る単回用量、および治療剤自体または固体もしくは液体の薬学的希釈剤もしくはキャリアとの混合物のいずれかを含む、生理学的および生物学的に安定な単位用量として残る、容易に扱われかつ充填され得る単回用量）をいう。
【００９３】
特定の実施形態では、生物は、本発明に従って同定された治療剤を産生するように操作される。これらの生物は、収集するために治療剤を放出し得るか、または患者に直接導入され得る。別の一連の実施形態では、細胞を利用して、本発明に従って同定された治療剤のキャリアとして作用し得る。
【００９４】
本発明の治療剤としてはまた、「プロドラッグ」誘導体が挙げられる。用語プロドラッグは、活性成分を放出または活性化する生物内で自発的かまたは酵素学的かのいずれかで生体内変化を必要とする親分子の、薬理学的に不活性な（または部分的に不活性な）誘導体をいう。プロドラッグは、代謝条件の下で切断可能な基を有する本発明の治療剤の改変体または誘導体である。プロドラッグは、これらが生理学的条件下で加溶媒分化を受けるか、または酵素分解を受ける場合、インビボで薬学的に活性である本発明の治療剤となる。本発明のプロドラッグは、生物内の活性な薬物成分を放出もしくは活性化するために必要とされる多数の生体内変化に依存して、単一、二重、三重などと呼ばれ得、そして、このことは、前駆体型形態で存在する官能基の数を示す。プロドラッグ形態は、しばしば、哺乳動物生物において、可溶性、組織適合性、または遅延された放出の利点を提供する（Ｂｕｎｄｇａｒｄ，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，７−９頁，２１−２４頁，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９８５およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ，３５２−４０１頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９２を参照のこと）。さらに、本発明に従うプロドラッグ誘導体は、バイオアベイラビリティーを増大させる他の特徴と組合され得る。
【実施例】
【００９５】
（実施例１．ＧＩＬＴ構築物）
ＩＧＦ−ＩＩカセットを、一連の重複するオリゴの連結により合成し、そしてＰｉｒ１−ＳＡＴ（標準的なＬｅｉｓｈｍａｎｉａ発現ベクター）中にクローン化した。４つのＩＧＦ−ＩＩカセットを作製した：１つは、野生型の成熟ポリペプチドをコードし、１つはΔ１−７欠失を有し、１つはＹ２７Ｌ変異を有し、そして１つは両方の変異を有する。これらの変異は、他のレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの結合を減少させるが、Ｍ６Ｐレセプターに対する結合を生じないことが報告されている。
【００９６】
ヒトＩＧＦ−ＩＩのコード配列を、図１に示す。タンパク質は、アミノ末端に２４個の単一のペプチド、および８９個のアミノ酸のカルボキシ末端領域を有するプレ−プロ−タンパク質として合成され、これらの両方は、Ｏ’Ｄｅｌｌら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３０（７）：７６７−７１に総説されるように、翻訳後に取り除かれる。成熟タンパク質は、６７個のアミノ酸である。変異体ＩＧＦ−ＩＩのＬｅｉｓｈｍａｎｉａコドン最適化バージョンは、図２に示される（Ｌａｎｇｆｏｒｄら（１９９２）Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ７４（３）：３６０−１）。このカセットを、重複するオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより構築した。このオリゴヌクレオチドの配列を、表２に示す。変異体ポリペプチドのアミノ酸１〜７の欠失（Δ１−７）、チロシンからロイシンへの残基２７の変異（Ｙ２７Ｌ）、または両方の変異（Δ１−７、Ｙ２７Ｌ）を含むさらなるカセットを、以下に記載されるような、所望のレセプターについてのみ特異性を有するＩＧＦ−ＩＩカセットを生じるように作製した。野生型ＩＧＦ−ＩＩカセットを作製するために、オリゴＧＩＬＴ１−９を、アニーリングおよび連結した。Ｙ２７Ｌカセットを作製するために、オリゴ１、１２、３、４、５、１６、７、８および９を、アニーリングおよび連結した。連結後、２つのカセットをカラム精製した。野生型カセットおよびＹ２７Ｌカセットを、オリゴＧＩＬＴ２０および１０ならびに適切なテンプレートを用いてＰＣＲにより増幅した。Δ１−７欠失を組み込むために、２つのテンプレートを、オリゴＧＩＬＴ１１および１０を用いて増幅した。得られた４つのＩＧＦ−ＩＩカセット（野生型、Ｙ２７Ｌ、Δ１−７およびＹ２７ＬΔ１−７）を、カラム精製し、ＸｂａＩで消化し、ゲル精製し、そしてＸｂａＩに連結してＰｉｒ１−ＳＡＴを切断した。
【００９７】
次いで、遺伝子カセットを、リーディングフレームを保存するような方法でベクター中のＸｂａＩの上流のＸｍａＩ部位（示さず）とＡｓｃＩ部位との間にクローニングした。３’ＸｂａＩ部位の重複するＤＡＭメチラーゼ部位は、クローニングのためのＸｍａＩ部位の代わりに５’ＸｂａＩ部位の使用を可能にした。このＡｓｃＩ部位は、３つのアミノ酸残基のブリッジを加える。
【００９８】
（表３．Ｐｉｒ−ＧＩＬＴベクターの構築に用いたオリゴヌクレオチド）
【００９９】
【表３】
2010043103.tif 000006
示した変異をＩＧＦ−ＩＩカセットに組み込む目的は、融合タンパク質を適切なレセプターに標的化することを保証するためである。ヒトＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−Ｉ（例えば、図６を参照のこと）およびインスリンのＢ鎖およびＡ鎖に対して高い程度の配列類似性および構造類似性を有する（Ｔｅｒａｓａｗａら（１９９４）Ｅｍｂｏ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７）。従って、これらのホルモンが、重複するレセプター結合特異性を有することは驚くべきことではない。ＩＧＦ−ＩＩは、インスリンレセプター、ＩＧＦ−Ｉレセプターおよびカチオン依存マンノース６−ホスフェート／ＩＧＦ−ＩＩレセプター（ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ）に結合する。ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターは、ＩＧＦ−ＩＩに対するレセプターとして、およびリソソームの加水分解酵素の分類に関与するマンノース６−ホスフェートレセプターとして作用する、二重活性レセプターである。長年にわたり、これらの２つの活性は、両方の活性が単一のタンパク質中に存在することが決定されるまで、別々のタンパク質に起因すると考えられてきた（Ｍｏｒｇａｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９（６１３７）：３０１−７）；（Ｔｏｎｇら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（６）：２５８５−８）。
【０１００】
ＩＧＦ−ＩＩの殆どの著しい生物学的効果（例えば、その分裂促進効果）は、ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターよりむしろ、ＩＧＦ−Ｉレセプターを介して媒介される（（Ｌｕｄｗｉｇら（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：２０２−２０６）において総説され、（Ｋｏｒｎｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１）：２８７−９５）もまた参照のこと）。ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの結合の最初の結果は、引き続いての分解のためのリソソームへの輸送であると考えられる。このことは、ＩＧＦ−ＩＩレベルを制御する重要な手段を表し、そしてなぜＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターのヌル変異を有するマウスは、ＩＧＦ−ＩＩがまた欠失されない限り、出生前の死を示すのかを説明する（Ｌａｕら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８（２４）：２９５３−６３）；（Ｗａｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７２（６５０５）；４６４−７）；（Ｌｕｄｗｉｇら（１９９６）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７７（２）：５１７−３５）。本発明の方法において、ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質をＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合させることが望ましい。Ｙ２７ＬおよびΔ１−７変異は、ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対するアフィニティーを変化させることなく、ＩＧＦ−Ｉおよびインスリンレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩ結合を低下させる（Ｓａｋａｎｏら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３１）：２０６２６−３５）；（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３０）：１８０１３−８）。従って、本発明に従って、これらのＩＧＦ−ＩＩの変異形態は、ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対して特異的に融合タンパク質を標的化する手段を提供する。
【０１０１】
１つの実験において、適切な配列を有する４つの異なるＩＧＦ−ＩＩカセット（野生型、Δ１−７、Ｙ２７ＬおよびΔ１−７／Ｙ２７Ｌ）を作製した。β−ＧＵＳカセットを、ＩＧＦ−ＩＩカセットに融合し、これらの構築物を寄生生物に置いた。α−ガラクトシダーゼカセットもまた、ＩＧＦ−ＩＩカセットに融合する。ＧＵＳ融合物を試験し、そして酵素学的に活性なタンパク質を産生することを示した。
【０１０２】
図３に示される、１つの好ましい構築物は、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ分泌酸ホスファターゼ（ＳＡＰ−１）のシグナルペプチドを含み、単一のＳａｌＩ部位が除去された改変型Ｐｉｒ１−ＳＡＴのＸｂａＩ部位へとクローニングされる。インフレームで融合されるものは、変異体β−ＧＵＳ配列であり、これは３つのアミノ酸ブリッジによりＩＧＦ−ＩＩタグに接続される。
【０１０３】
（実施例２．ＧＩＬＴタンパク質調製）
β−ＧＵＳを発現および分泌するＬ．ｍｅｘｉｃａｎａを、１００ｍｌのＳｔａｎｄａｒｄ  Ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ培地（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  アデニン、０．０００５％ヘミン、０．０００１％ビオチン、５％ウシ胎児血清、５％胚流体、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌナルセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）を含むＭ１９９）中、２６℃で増殖させた。約５×１０６無鞭毛型細胞／ｍｌの密度に到達した後、これら無鞭毛型細胞を、室温で１０分間の１０００×ｇにおける遠心分離によって集めた；これらの無鞭毛型細胞を用いて、室温で、１リットルの低タンパク質培地（０．１ｍＭアデニン、０．０００１％ビオチン、５０単位／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補填したＭ１９９）に接種した。この１リットルの培養物は、滅菌攪拌バーを備えた２リットルのキャップ付フラスコ中に含められ、この培養物は、穏やかな攪拌とともに２６℃でインキュベートされ得た。この１リットルの培養は、層流フード中にそれらを移動させること、キャップを取り除くこと、およびキャップを置き換える前に激しく旋回することにより１日に２度通気した。この培養物が、２−３×１０７無鞭毛型細胞／ｍｌの密度に到達したとき、上記のようにこの培養物を遠心分離した。ただし、無鞭毛型細胞ペレットは棄て、そして培地は滅菌フラスコにデカントした。１リットルあたり４３４ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４の添加は、培地から活性ＧＵＳタンパク質を沈殿させ；この塩折培地を４℃で一晩貯蔵した。沈殿したタンパク質を、１０，５００×ｇにおける３０分間の遠心分離か、またはＧｅｌｍａｎ  Ｓｕｐｏｒ−８００膜を通じる濾過のいずれかにより回収した；このタンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＣａＣｌ２中に再懸濁し、そして透析まで−８０℃で貯蔵した。数リットルの培地からの粗沈殿物を融解し、プールし、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ−７、ＭＷＣＯ  ２５，０００）中に置き、そして２つの１リットル容量の重炭酸塩を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地）に対して一晩透析した。
【０１０４】
（実施例３．ＧＩＬＴ取り込みアッセイ）
皮膚線維芽細胞株ＧＭ４６６８（ヒト、ＮＩＧＭＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）は、ＶＩＩ型ムコ多糖体沈着症の患者由来である；従って、細胞は、β−ＧＵＳ活性をほとんど有さないかまたはそれを有さない。従って、ＧＭ４６６８細胞は、ヒト細胞中へのＧＵＳ−ＧＩＬＴ構築物の取り込みを試験するために特に有用である。ＧＭ４６６８細胞を、１２ウェル組織培養プレート中、１５％（ｖ／ｖ）子ウシ血清を補填したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）で、５％ＣＯ２中３７℃で培養した。線維芽細胞は、実施例２で記載のように調製された、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａで発現したヒトβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＧＵＳ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質（ＧＵＳ−ＧＩＬＴ）、または変異体ＧＵＳ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質（ＧＵＳΔ−ＧＩＬＴ）の約１５０単位の存在下で一晩培養した。コントロールウェルは、添加された酵素を含まなかった（ＤＭＥＭ培地ブランク）。インキュベーションの後、培地をウェルから取り除き、そしてＧＵＳ活性を３回重複してアッセイした。ウェルを、１ｍｌの３７℃のリン酸緩衝化生理食塩水で５回洗浄し、次に０．２ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライドハイドロクロライド（ＡＥＢＳＦ、Ｓｉｇｍａ）、および１％  ＮＰ−４０）中、室温で１５分間インキュベートした。細胞溶解物を、微量遠心チューブに移し、次に１３，０００ｒｍｐで５分間遠心分離し、細胞残渣を取り除いた。溶解物の３つの１０μＬのアリコートを、タンパク質濃度についてアッセイした（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ）。
【０１０５】
溶解物の３つの３８μＬのアリコートを、（Ｗｏｌｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ２６３−２７４）から適合された標準的な蛍光定量的アッセイを用いて、ＧＵＳ活性についてアッセイした。アッセイは、廃棄可能な蛍光定量キュベット中で行なう。１５０μｌの反応混合物を各キュベットに添加する。１ｍｌの反応混合物は、８６０μｌのＨ２Ｏ、１００μｌの１Ｍ酢酸ナトリウム、４０μｌの２５×β−ＧＵＳ基質混合物である。２５×β−ＧＵＳ基質混合物は、デシケーター中−２０℃で貯蔵された４．５５ｍｌのエタノール中の２５０ｍｇ  ４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄグルクロニドの懸濁物である。３８μｌのサンプルをこの反応混合物に添加し、そして反応物を３７℃でインキュベートする。反応を、２ｍｌの停止溶液（１０．６ｇ  Ｎａ２ＣＯ３、１２．０１ｇ  グリシン、Ｈ２Ｏで５００ｍｌに、ｐＨ１０．５）の添加により終結する。次いで、蛍光出力を蛍光定量計で測定する。
【０１０６】
取り込み実験の結果は、細胞会合ＧＵＳ−ＧＩＬＴの量が、非改変ＧＵＳのそれより１０倍大きいことを示す（図４）。二重変異体構築物は、非改変ＧＵＳより約５倍効果的である。これらの結果は、ＧＩＬＴ技術が取り込みのためにリソソーム酵素を標的にする効果的な手段であることを示す。取り込みはまた、標準的な免疫蛍光技法を用いて確認され得る。
【０１０７】
（実施例４．競争実験）
ＧＩＬＴ媒介取り込みが、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター上のＩＧＦ−ＩＩ結合性部位を経由して生じることを確認するために、組換えＩＧＦ−ＩＩを用いて競争実験を実施した。実験デザインは、ＧＭ４６６８線維芽細胞が、血清を含まないＤＭＥＭ＋２％ＢＳＡ中で約１８時間指定のタンパク質とインキュベートしたことを除いて上記に記載のデザインと同じであった。各β−ＧＵＳ誘導体を１５０Ｕ／ウェルで添加した。競争のために、２．８５μｇのＩＧＦ−ＩＩを各ウェルに添加した。これは、ＧＩＬＴ−ＧＵＳに対し約１００倍モル過剰に相当し、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合について競合するに十分な濃度である。
【０１０８】
競争実験の結果を図５に示す。ＩＧＦ−ＩＩの非存在下、２４単位を超えるＧＩＬＴ−ＧＵＳ／ｍｇ溶解物が検出された。ＩＧＦ−ＩＩの添加に際し、細胞会合ＧＩＬＴ−ＧＵＳの量は５．４Ｕまで落ちた。このレベルは、線維芽細胞により取り込まれる非改変ＧＵＳのレベルと同様である。従って、ＧＩＬＴタンパク質取り込みの大部分（ｂｕｌｋ）は、ＩＧＦ−ＩＩによって競争され得、これは、この取り込みが実際に特異的レセプター−リガンド相互作用を通じて生じていることを示す。
【０１０９】
（実施例５．血清を含まない培地中の遺伝子産物発現）
発現産物はまた、血清を含まない培地から単離され得る。一般に、発現株を血清を含む培地中で増殖させ、血清を含まない培地中に希釈し、そして発現産物を単離する前に、数世代の間（好ましくは２−５世代）増殖させる。例えば、分泌された標的治療タンパク質の産生は、最初７５ｃｍ２フラスコ中の５０ｍｌの１×Ｍ１９９培地中２７℃で培養されるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ無鞭毛型細胞から単離され得る。細胞密度が１−３×１０７／ｍｌに達するとき、この培養を用いて１．２ＬのＭ１９９培地に接種する。この培養の密度が約５×１０６／ｍｌに到達するとき、細胞を遠心分離により回収し、１８０ｍｌの上清液中に再懸濁し、そして１６Ｌのスピナーフラスコ中の１２Ｌの「Ｚｉｍａ」培地に接種するために用いる。この培養の初期細胞密度は、代表的には約５×１０５／ｍｌである。この培養を、約１．０−１．７×１０ｅ７細胞／ｍｌの細胞密度まで増殖させる。この細胞密度に到達するとき、細胞を遠心分離により培養培地から分離し、そして上清液を４℃で０．２μｌフィルターを通じて濾過し、残存する無鞭毛型細胞を取り除く。濾過された培地を、タンデム流れ濾過デバイス（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ−ＴＦＦカートリッジ）を用いて１２．０Ｌから５００ｍｌに濃縮した。
【０１１０】
この方法のために好適な増殖培地は、Ｍ１９９増殖培地および「Ｚｉｍａ」増殖培地である。しかし、その他の血清含有培地および血清非含有培地もまた有用である。Ｍ１９９増殖培地は以下のようである：（１Ｌバッチ）＝２００ｍｌ  ５×Ｍ１９９（フェノールレッドｐＨ指示薬を含む）＋６３７ｍｌ  Ｈ２Ｏ、５０．０ｍｌ  ＦＢＳ、５０．０ｍｌ  ＥＦ、２０．０ｍｌの５０μｇ／ｍｌ  ＳＡＴ、２．０ｍｌの５０％トリエタノールアミン中０．２５％ヘミン、１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５中１０ｍＭ  アデニン、４０．０ｍｌの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１ｍｌの９５％エタノール中０．１％ビオチン、１０．０ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン。用いたすべての血清は熱により不活性化する。最終容量＝１Ｌそして滅菌濾過する。「Ｚｉｍａ」改変Ｍ１９９培地は以下のようである：（２０．０Ｌバッチ）＝２１７．８ｇ  Ｍ１９９粉末（−）フェノールレッド＋７．０ｇ重炭酸ナトリウム、２００．０ｍｌの５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５中１０ｍＭアデニン、８００．０ｍｌのＨｅｐｅｓ遊離酸ｐＨ７．５、２０．０ｍｌの９５％エタノール中０．１％ビオチン、２００．０ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、最終容量＝２０．０Ｌそして滅菌濾過される。
【０１１１】
標的治療タンパク質は、好ましくは、ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ（ＣｏｎＡ）クロマトグラフィーにより精製される。例えば、培養物が１．０×１０７無鞭毛型細胞／ｍｌを超える密度に到達するとき、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａを遠心分離、５００×ｇで１０分により取り除く。回収された培養培地を０．２μｍフィルターを通過させ、ＣｏｎＡ−アガロースカラム（４％架橋ビーズ状アガロース、Ｓｉｇｍａ）上に直接ロードする前に粒子を取り除く。このＣｏｎＡ−アガロースカラムは、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、５ｍＭの各ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２で前処理し、そして次に５容量のカラム緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、および１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）で平衡化されている。培養培地中の合計１７９，８００単位（ｎｍｏｌ／時間）のＧＵＳ活性（２Ｌ中）を、２２ｍｌのＣｏｎＡアガロースカラム上にロードする。フロースルーまたは洗浄中に活性は検出可能ではない。ＧＵＳ活性は、２００ｍＭメチルマンノピラノシドを含むカラム緩衝液で溶出される。活性ピークを含む溶出フラクションをプールしそして濃縮する。取り込みおよび競争実験を実施例３および４に記載のように実施した。但し、生物は、血清を含まない培地中で増殖させ、そしてＣｏｎＡで精製した；約３５０−６００単位の酵素を線維芽細胞に付与した。結果を図７に示す。
【０１１２】
（実施例６．競争物として変性ＩＧＦ−ＩＩを用いる競争実験）
実施例４における実験を、競争物として正常または変性ＩＧＦ−ＩＩのいずれかを用いて繰り返す。実施例４におけるように、細胞会合ＧＵＳ−ＧＩＬＴの量は、競争に効果的である正常ＩＧＦ−ＩＩ濃度と同時インキュベートされるとき減少するが、匹敵する濃度で、変性ＩＧＦ−ＩＩはほとんど影響を有しないか、または影響を有さない。
【０１１３】
（実施例７．結合取り込みおよび半減期の実験）
線維芽細胞上のＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対するＧＵＳ−ＧＩＬＴタンパク質の結合を測定し、そして取り込み速度を公開された方法（Ｙｏｒｋら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２）：１１６４−７１）と同様に検証する。上記のように１２ウェル培養ディッシュにおいて培養したＧＭ４６６８線維芽細胞を、１％  ＢＳＡを含む、氷冷した無血清培地中で洗浄した。リガンド（ＧＵＳ、ＧＵＳ−ＧＩＬＴまたはＧＵＳ−ΔＧＩＬＴのいずれか、あるいはコントロールタンパク質）を冷やした１％ＢＳＡ添加の無血清培地中の細胞に添加した。リガンド添加の際、プレートを氷上で３０分間インキュベートした。３０分後、リガンドを除去して、そして細胞を氷冷した培地で素早く５回洗浄した。０時点のウェルに１ｍｌの氷冷ストリップ緩衝液（０．２Ｍ  酢酸、ｐＨ３．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を入れる。次いで、プレートを３７°の水浴に浮かべて、そして０．５ｍｌの予め加温した培地を添加して、取り込みを開始させる。全ての停止点で、１ｍｌのストリップ緩衝液を添加する。実験終了時に、ストリップ緩衝液のアリコートを、実施例３に記載されるようにβ−グルクロニダーゼ活性の蛍光定量的なアッセイのために保存する。次いで、細胞を上記のように溶解して、そして溶解物をβ−グルクロニダーゼ活性についてアッセイする。
【０１１４】
一旦、温度を３７°に移すと、ＧＵＳ−ＧＩＬＴが線維芽細胞によって数分以内に直ちに取り込まれる（Ｙｏｒｋら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２）：１１６４−７１）こと、およびその酵素活性が亜細胞で長時間持続することが予想される。
【０１１５】
（実施例８．インビボ治療剤）
Ｂ６．Ｃ−Ｈ−２ｂｍｌ／ＢｙＢＩＲ−ｇｕｓｍｐｓ／＋  マウスのヘテロ接合性メイティングによって作製されたＧＵＳ欠損マウス（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ８３（４）：１２５８−６）を使用して、酵素置換治療剤におけるＧＵＳ−ＧＩＬＴまたはその誘導体の効果を検証する。２つの形式を使用する。１つの形式では、３〜４匹の動物に、１００μｌの酵素希釈緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５）中の２０，０００Ｕの酵素の単回注入を施す。マウスを７２〜９６時間後に屠殺して、この治療剤の有効性を検証する。２つ目の形式では、マウスに、３〜４週間にわたって２０，０００Ｕの毎週投与を施し、そして最終投与の１週間後に屠殺する。肝臓、脾臓および脳の組織化学的分析および組織病理学的分析を、公開された方法（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒら（１９９１）Ｂｌｏｏｄ  ７８（１１）：３０８１−９２）；（Ｓａｎｄｓら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９３（６）：２３２４−３１）；（Ｄａｌｙら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（５）：２２９６−３００）によって実施する。治療剤の非存在下では、ＧＵＳ欠損マウス細胞（例えば、マクロファージおよびクプファー細胞）は、リソソーム中の廃棄物の蓄積から起因する巨大な亜細胞蓄積区画を発達させる。ＧＵＳ−ＧＩＬＴ構成物で処置されたマウスの細胞において、これらの区画のサイズが見分可能に低下するか、またはこの区画がもはや光学顕微鏡では見えないまでに収縮することが、予想される。
【０１１６】
同様に、リソソーム蓄積症を患うヒトを、そのヒトのリソソームに対して適切な治療剤部分を標的化する構成物を使用して処置する。いくつかの例において、処置は、ＧＩＬＴタンパク質の定期的な（例えば、毎週の）注入形態をとる。他の例においては、患者内で、ＧＩＬＴタンパク質のインビボ発現を持続し得る核酸の投与によるか、またはＧＩＬＴタンパク質を発現する細胞（例えば、ヒト細胞、または単一細胞の器官）の投与により、処置を達成する。例えば、米国特許第６，０２０，１４４号（２０００年２月１日に公開）；米国特許仮出願第６０／２５０，４４６号；および米国特許仮出願事務所処理番号ＳＹＭ−００５ＰＲＡ，「Ｐｒｏｔｏｚｏａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｇｅｎｅｓ」（２００１年５月１１日出願）に記載されるＬｅｉｓｈｍａｎｉａベクターを使用して、ＧＩＬＴタンパク質をインサイチュで発現し得る。
【０１１７】
（実施例９．）
これらの実験の目的は、ファブリー病の酵素置換治療として、ＧＩＬＴ修飾α‐ガラクトシターゼＡ（α−ＧＡＬ  Ａ）の有効性を評価することである。
【０１１８】
ファブリー病は、α−ＧＡＬ  Ａ（ＧＬ−３および他の神経スフィンゴ脂質から末端のガラクトースを除去すること担う酵素）の不十分な活性から起因する、リソソーム蓄積症である。この酵素活性の減少は、Ｘ連鎖遺伝子における種々のミスセンス変異およびナンセンス変異に起因して起こる。ＧＬ−３の蓄積は、心臓、肝臓、腎臓、皮膚および脳の血管内皮細胞のリソソームにおいて最も優勢であるが、他の細胞および組織においても起こる。血管内皮細胞におけるＧＬ−３の蓄積は、最終的に、心疾患および腎不全を導く。
【０１１９】
酵素置換治療は、ファブリー病に対する効果的な処置であり、そしてその成功は、この治療酵素の、ＧＬ−３が蓄積する細胞のリソソームによって取り込まれる能力に依存する。Ｇｅｎｚｙｍｅ産物であるＦａｂｒａｚｙｍｅは、この実証された有効性に起因してヨーロッパにおいてファブリー病の患者の処置について認可されている、ＤＵＫＸ  Ｂ１１
ＣＨＯ細胞で生産された組換えα−ＧＡＬ  Ａである。
【０１２０】
Ｆａｂｒａｚｙｍｅの、細胞により取り込まれる能力、およびリソソームに送達される能力は、Ｎ連結した炭水化物上のマンノース  ６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）の存在に起因する。Ｆａｂｒａｚｙｍｅは、大部分の細胞型の細胞表面に存在する、マンノース−６−ホスフェート／ＩＧＦ−ＩＩレセプター（Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−Ｉｉｒ）との結合、そしてその後のレセプター媒介性のエンドサイトーシスを介して、リソソームへと送達される。Ｆａｂｒａｚｙｍｅは、報告によると、ＡＳＮ残基１０８位、１６１位および１８４位に、に３つのＮ連結性グリコシル化部位を有する。これら３つの位置で優勢な炭水化物は、それぞれ、フコシル化二方向アンテナの二重シアリル化複合体（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ  ｂｉｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、モノリン酸化マンノース−７  オリゴマンノース、および二重リン酸化マンノース−７  オリゴマンノースである。
【０１２１】
本発明のグリコシル化非依存性のリソソーム標的化（ＧＩＬＴ）技術は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−Ｉｉｒとの異なる相互作用を介して，リソソームに対して治療タンパク質を直接的に標的化する。標的化リガンドは、成熟したヒトＩＧＦ−ＩＩに由来し、これはまた、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−Ｉｉｒに対して高い親和性で結合する。現在の適用において、架橋を含む他の構成が可能であるが、ＩＧＦ−ＩＩタグは、治療的タンパク質とのｃ末端融合物として提供される。ＧＩＬＴ修飾酵素の亜細胞への取り込みについての能力は、ＧＩＬＴ修飾β−グルクロニダーゼを使用して確立され、このＧＩＬＴ修飾β−グルクロニダーゼは、過剰なＩＧＦ−ＩＩと競合的であるプロセスにおいて、線維芽細胞によって効率的に取り込みまれる。ＧＩＬＴ修飾の利点は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合の増加、標的細胞のリソソーム内への取り込みの増強、薬理動態の変更または改善、および組織分布範囲の拡大、変更または改善である。組織分布範囲の改善は、ＩＧＦタンパク質が血液脳関門を実際に通過するので、ＧＩＬＴ修飾α−ＧＡＬ  Ａの血液脳関門を横切る送達を包含し得る。
【０１２２】
ＧＩＬＴ系の別の利点は、Ｍ６Ｐ修飾が起こらない非哺乳動物の発現系において、取り込み適合性のタンパク質を生成する能力である。特定の実施形態において、ＧＩＬＴ修飾タンパク質は、主に、ＣＨＯ細胞において生成される。特定の他の実施形態において、このＧＩＬＴタグは、α−ＧＡＬ  Ａのｃ末端に配置されるが、本発明はこのようには限定されない。
【０１２３】
（参考文献による援用）
本明細書中で開示された特許文献、科学的刊行物およびタンパク質データバンクの記録、ならびに米国特許仮出願第６０／２５０，４４６号（２０００年１１月３０日出願）；米国特許仮出願第６０／２８７，５３１号（２００１年４月３０日出願）；米国特許仮出願第６０／２９０，２８１号（２００１年５月１１日出願）；米国特許仮出願第６０／３０４，６０９，（２００１年７月１０日出願）；米国特許仮出願第６０／３２９，４６１号（２００１年１０月１５日出願）；国際特許出願第  ＰＣＴ／ＵＳ０１／４４９３５号（２００１年１１月３０日出願）；米国特許仮出願第６０／３５１，２７６号（２００２年１月２３日出願）；および米国第１０／＿＿＿号（事務所処理番号ＳＹＭ−００８）（２００２年４月３０日出願）は、本出願中でこれらの全体が参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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