(57)【要約】      （修正有）【課題】川崎病の治療又は診断の方法を提供する。【解決手段】（ａ）ＣＡＣＮＡ２Ｄ３；（ｂ）ＣＡＭＫ２Ｄ；（ｃ）ＫＣＮＩＰ４；（ｄ）ＡＮＧＰＴ１；（ｅ）ＮＡＡＬＡＤＬ２；（ｆ）ＺＦＨＸ３；（ｇ）ＭＰＨＯＳＰＨ１０；（ｈ）（ａ）から（ｇ）のいずれかに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列；又は（ｉ）（ａ）から（ｅ）のいずれかの調節因子、を含む分子、および川崎病の治療および予防のためのプレガバリン（（３Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチル−ヘキサン酸）の使用。【選択図】図３
2010043063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
川崎病の個体の治療又は診断の方法に使用するための分子であって、例えば製薬上許容される賦活剤、担体又は希釈剤と共に当該分子を含む医療用組成物の形態で、（ａ）ＣＡＣＮＡ２Ｄ３；（ｂ）ＣＡＭＫ２Ｄ；（ｃ）ＫＣＮＩＰ４；（ｄ）ＡＮＧＰＴ１；（ｅ）ＮＡＡＬＡＤＬ２；（ｆ）ＺＦＨＸ３；（ｇ）ＭＰＨＯＳＰＨ１０；（ｈ）（ａ）から（ｇ）のいずれかに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列；又は（ｉ）（ａ）から（ｅ）のいずれかの調節因子、を含む分子。
【請求項２】
前記分子は、プレガバリン（（３Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチル−ヘキサン酸）のようなＣＡＣＮＡ２Ｄ３のアンタゴニストを含み、前記方法は好ましくはＣＡＣＮＡ２Ｄ３のアンタゴニストを個体に投与する事からなる、所定の使用のための請求項１に記載の分子。
【請求項３】
川崎病の治療、予防又は緩和のために適当な分子を同定する方法であって、候補分子が（ａ）ＣＡＣＮＡ２Ｄ３；（ｂ）ＣＡＭＫ２Ｄ；（ｃ）ＫＣＮＩＰ４；（ｄ）ＡＮＧＰＴ１；（ｅ）ＮＡＡＬＡＤＬ２；（ｆ）ＺＦＨＸ３；（ｇ）ＭＰＨＯＳＰＨ１０；（ｈ）（ａ）から（ｇ）のいずれかに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、からなる群より選択されるポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを決定する事を含む方法であり、好ましくは当該候補分子がそれらの調節剤であるかどうかを決定するために当該候補分子がポリペプチド又はポリペプチドを発現している細胞に曝露される方法。
【請求項４】
（ａ）ＣＡＣＮＡ２Ｄ３；（ｂ）ＣＡＭＫ２Ｄ；（ｃ）ＫＣＮＩＰ４；（ｄ）ＡＮＧＰＴ１；（ｅ）ＮＡＡＬＡＤＬ２；（ｆ）ＺＦＨＸ３；（ｇ）ＭＰＨＯＳＰＨ１０；（ｈ）  （ａ）から（ｇ）のいずれかに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、からなる群より選択されるポリペプチドの調節剤を同定する方法であって、候補分子を川崎病に罹患している、例えばマウスである齧歯類のような動物、に投与する事、及び当該動物が川崎病の緩和された兆候を示すかどうかを決定する事を含む方法。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の方法によって同定され、好ましくは川崎病の治療に使用するためのポリペプチドの分子又は調節剤。
【請求項６】
個体での川崎病の治療又は予防における使用のためのプレガバリン（（３Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチル−ヘキサン酸）。
【請求項７】
個体での川崎病の治療における医療用組成物の調整のための請求項５又は６に記載の分子の使用。
【請求項８】
個体での川崎病の治療又は予防のための医療用組成物であって、製薬上許容される賦活剤、担体又は希釈剤と共にプレガバリン（（３Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチル−ヘキサン酸）を含む医療用組成物。
【請求項９】
川崎病を診断又は検出するための方法であって、以下を含む方法。
（ａ）ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＡＮＧＰＴ１及びＺＦＨＸ３又はそれらに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、から選択される遺伝子の内部又は周辺の遺伝子多型を検出すること；
（ｂ）表２又は表Ｓ１に提示されるようなｒｓ１７５３１０８８、ｒｓ１０１０８２４、ｒｓ６４６９１０１、ｒｓ７１９９３４３、ｒｓ１０８５２５１６及びｒｓ１１０７５９５３からなる群から選択される一塩基多型（ＳＮＰ）を検出すること；
（ｃ）ＭＰＨＯＳＰＨ１０、ＲＢＭＳ１及びＬＯＣ４４１９３８又はそれらに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、から選択される遺伝子の内部又は周辺のハプロタイプを検出すること；
（ｄ）表２又は表Ｓ２に提示されるようなｒｓ７５５８２２０、ｒｓ３５７７５２；並びにｒｓ７５５８２２０、ｒｓ３５７７５２、ｒｓ１４５８８６８、ｒｓ３５７７２９及びｒｓ１１６７４８９９からなる群から選択されるハプロタイプを検出すること；
（ｅ）上記の（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせ。
【請求項１０】
次の特徴のいずれか１又はそれ以上を含む請求項９に記載の方法：
（ａ）例えば請求項９の（ｂ）に規定される一塩基多型（ＳＮＰｓ）のような全ての遺伝子多型で、５又はそれ以上の遺伝子多型のような複数の遺伝子多型を検出すること；
（ｂ）例えば請求項９の（ｄ）に規定される全てのハプロタイプで、５又はそれ以上のハプロタイプのような複数のハプロタイプを検出すること；
（ｃ）複数の遺伝子、当該遺伝子にコードされるポリペプチド又はマーカーを検出すること；
（ｄ）複数の遺伝子の遺伝子多型プロファイル、ハプロタイププロファイル又は発現プロファイルを作成すること；
（ｅ）アフィメトリクスマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションのようなマイクロアレイハイブリダイゼーションによって又はリアルタイムポリメラーゼチェーンリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、遺伝子、遺伝子によってコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型又はハプロタイプから、プロファイルを検出する又は引き出すこと；
又は、
（ｆ）請求項９に提示される、１又はそれ以上の遺伝子、その遺伝子にコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型又はハプロタイプ、における発現又は遺伝子多型データをコンピューターで処理する事を含むコンピューター関与方法を実行すること
【請求項１１】
川崎病の診断又は検出のための方法であって、ＮＡＡＬＡＤＬ２若しくはＣＡＭＫ２Ｄを含む遺伝子又は前記遺伝子にコードされるポリペプチド又はそれらに少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列の、発現パターン又は発現レベルの変化のような発現を検出することを含む方法。
【請求項１２】
次のいずれか１又はそれ以上を含む、川崎病又は川崎病の感受性のための診断キット：
（ａ）ＣＡＣＮＡ２Ｄ３；（ｂ）ＣＡＭＫ２Ｄ；（ｃ）ＫＣＮＩＰ４；（ｄ）ＡＮＧＰＴ１；（ｅ）ＮＡＡＬＡＤＬ２；（ｆ）ＺＦＨＸ３；（ｇ）ＭＰＨＯＳＰＨ１０、又はそれらに少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列；のポリペプチドに結合できる抗体のような分子、前記をコードする核酸、（ａ）ＣＡＣＮＡ２Ｄ３；（ｂ）ＣＡＭＫ２Ｄ；（ｃ）ＫＣＮＩＰ４；（ｄ）ＡＮＧＰＴ１；（ｅ）ＮＡＡＬＡＤＬ２；（ｆ）ＺＦＨＸ３；（ｇ）ＭＰＨＯＳＰＨ１０、又はそれらに少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列；からなる群より選択される核酸に結合できる核酸であって、例えば、あるタイプの遺伝子多型には特定の位置で結合できるが、他のタイプの遺伝子多型にはその場所で結合できないことのより、遺伝子多型間を識別できるような核酸。
【請求項１３】
好ましくはマイクロアレイのようなアレイの形態で、請求項９の（ａ）から（ｄ）に提示される複数のマーカー、遺伝子多型又はハプロタイプを含む組み合わせ。
【請求項１４】
請求項９（ａ）から（ｄ）に提示される情報を含むデータ担体。
【請求項１５】
請求項９、１０、又は１１に記載される方法であって、さらに、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に記載される遺伝子、遺伝子にコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型若しくはハプロタイプ又はそれらに少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を、検出又は改変することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学、遺伝学に関する。特に、本発明は川崎病の診断と治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
川崎病(KD、MIM：611775)は、主に乳幼児が罹患する炎症性の脈管炎である。川崎病は、無治療で２５％、治療により３−５％の乳幼児に発症する冠動脈病変に特徴づけられる。
【０００３】
川崎病は、先進国の子供が罹患する心疾患の最も一般的な原因であり、冠動脈病変を発症する患者に、後に動脈硬化症の発症を増加させる。明白な冠動脈病変がない患者において、川崎病の長期にわたる心血管系への関与は明らかになっていない。川崎病の原因は不明だが、遺伝的に感受性のある個体における、1又はそれ以上の感染症トリガーへの異常で慢性的な免疫反応によると考えられている。川崎病の一致した原因物質は同定されておらず、正確でタイムリーな診断と、最適な管理方法の開発の妨げとなっている。
【０００４】
川崎病の罹患率は人種グループによって大幅に異なっており、北東アジアで最も罹患率が高い；日本人の小児およそ150人に1人が罹患し、 また、韓国の小児病院の入院患者の1-2%に及ぶ。川崎病の感受性に遺伝的背景が関与する事を強力に支持する疫学的データがある。日本人の罹患率 (135-200/100 000   5歳未満) は、コーカサス人種の罹患率(9-17/100 000   5歳未満)より10-15倍高く、この差異は、米国に移住した日本人の子供でも同じである。英国(Harnden et al、未発表データ)や米国の他のアジア人種についても、同地域に住む非アジア人種より有意に高い罹患率を示す。川崎病の家族性遺伝パターンは多遺伝子性で多系統があり、時や地域に関係なく家系内に発症する。川崎病患者全体では男性が約1．6倍多い。日本における兄弟内での発生リスク比率は、流行時でおよそ10倍、全体を通して6倍である。子供の頃に川崎病に親自身が罹患した場合、その子供では川崎病は一般の2倍を超える。その場合、多世代の系図に渡ってしばしば1人以上の子供が罹患し、発症年齢が早く、また重症の表現型である。
【０００５】
疫学的、臨床的、免疫学的データは、川崎病が1種類又は数種類の広く分布する感染症が原因である事を強く支持している。感染症が、遺伝的に感受性のある人に異常な免疫炎症反応を惹起すると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
40年研究が行われたにも関わらず、診断テストや効果的な治療法はない。成人型非特異的抗体（ガンマグロブリン）の注射は、非特異的で最適とは言えず、10%の患者では冠動脈病変(CAL)の発症を防げない。また、動脈硬化症への移行の予防に対する効果はさらに少ない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、川崎病の感受性に関与する新規遺伝子座の同定のための、ゲノムワイド関連研究（genome-wide association study (GWAS)）に基づく。これは、実施例に詳細に記載される。
【０００８】
まず、研究例の多いオランダ系コーカサス人種のGWASを行い、3カ国の主要なコーカサス人種グループトリオの大規模独立コホート分析で、最も関連性の高い一塩基多型とハプロタイプを検証した。
【０００９】
川崎病に関連する多数の新規遺伝子座を同定した。それらの多くは、急性期と回復期を識別する遺伝子発現を示し、もっともらしい生物学的ネットワークを形成する。
本発明の第１の観点では、個体における川崎病の診断法と治療法に使用するための分子を提供する。当該分子は、(a) CACNA2D3； (b) CAMK2D； (c) KCNIP4； (d) ANGPT1； (e) NAALADL2； (f) ZFHX3； (g) MPHOSPH10のいずれか１又は複数を含んでいて良い。当該分子は、(h)  (a)から(g)のいずれかに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列からなるを含んでいても良い。それは(i)  (a) から (e)のいずれかの調節剤を含んで良い。当該分子は、例えば、製薬上許容される賦形剤、担体、希釈剤と共にその分子を含む医療用組成物の形態であっても良い。
【００１０】
前記分子は、CACNA2D3のアンタゴニストを含んでも良い。CACNA2D3のアンタゴニスト(antagonise)はプレガバリン ((3S)-3-(アミノメチル)-5-メチル-サキサン酸)を含んでも良い。前記方法は、好ましくは個体にCACNA2D3のアンタゴニストを投与する事を含んでも良い。
【００１１】
本発明の第２の観点によると、川崎病の治療、予防、緩和のために適した分子を同定する方法を提供する。当該方法は、候補分子がポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを決定する事を含んでも良い。前記ポリペプチドは、以下を含むグループから選択されても良い： (a) CACNA2D3； (b) CAMK2D； (c) KCNIP4； (d) ANGPT1； (e) NAALADL2； (f) ZFHX3； (g) MPHOSPH10； 及び(h) (a)から(g)のいずれかに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列からなる。当該方法は、候補分子が調節剤であるかどうかを決定するために、候補分子を前記ポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現する細胞に曝露する事を含んでも良い。
【００１２】
本発明の第３の観点によると、以下を含むグループから選択されるポリペプチドの調節剤を同定する方法を提供する：(a) CACNA2D3； (b) CAMK2D； (c) KCNIP4； (d) ANGPT1； (e) NAALADL2； (f) ZFHX3； (g) MPHOSPH10； (h) (a)から(g)のいずれかに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列。当該方法は、川崎病に罹患している、例えばマウス、齧歯類のような、動物に候補分子を投与して、前記動物が川崎病の緩和を示すかどうかを決定する事を含んでも良い。
【００１３】
本発明の第４の観点では、上記の方法によって同定された分子、又はポリペプチドの調節剤を提供する。同定された前記分子は、川崎病の治療に使用のためであっても良い。
【００１４】
本発明の第５の観点では、個体の川崎病の治療又は予防に使用するためのプレガバリン ((3S)-3-(アミノメチル)-5-メチルヘキサン酸) を提供する。
【００１５】
第６の観点で本発明は、個体の川崎病の治療のための医薬組成物の調整のための、同定された分子の使用を提供する。
【００１６】
本発明の第７の観点では、個体の川崎病の治療又は予防のための医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、製薬上許容される賦形剤、担体、希釈剤とプレガバリン ((3S)-3-(アミノメチル)-5-メチルヘキサン酸) を含んでも良い。
【００１７】
本発明の第８の観点では、川崎病の診断又は検出のための方法を提供する。当該方法は、(a) NAALADL2、ANGPT1 、及びZFHX3、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列、から選択される遺伝子の内部又は周辺の遺伝子多型を検出する事を含んでも良い。当該方法は、(b) 表２ 又は表Ｓ１で提示されるようなrs17531088、rs1010824、rs6469101、rs7199343、rs10852516 及びrs11075953を含むグループから選択される一塩基多型（single nucleotide polymorphism (SNP)）を検出する事を含んでも良い。当該方法は、(c) MPHOSPH10、RBMS1及びLOC441938、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列から選択される遺伝子の内部又は周辺部のハプロタイプを検出する事から構成されても良い。当該方法は、(d) 表２ 又は表Ｓ１で提示したようなrs7558220、rs357752； 並びにrs7558220、rs357752、rs1458868、rs357729 及び rs11674899を含むグループから選択されるハプロタイプを検出する事を含んでも良い。当該方法は(e) 上記の(a) から (d)の任意の組み合わせを含んでも良い。
【００１８】
前記方法は、以下の特徴の任意の1又はそれ以上を含んでも良い。前記方法は、(a)5又はそれ以上の遺伝子多型のような多数の遺伝子多型、例えば、上記(b)で明示されるような一塩基多型(SNPs)ような全ての遺伝子多型を検出する事を含んでも良い。前記方法は、(b) 5又はそれ以上のハプロタイプのような多数のハプロタイプ、例えば上記(d)で明示されるような全てのハプロタイプを含んでも良い。前記方法は、(c)多数の遺伝子、前記遺伝子によってコードされるポリペプリド、又はマーカーを検出する事を含んでも良い。前記方法は、(d)多数の遺伝子の遺伝子多型プロファイル、ハプロタイププロファイル、又は発現プロファイルを作成する事を含んでも良い。前記方法は、(e)アフィメトリクス(Affymetrix)マイクロアレイへのハイブリダイゼーションのようなマイクロアレイハイブリダイゼーション、又はリアルタイムポリメラーゼチェーンリアクション(RT-PCR)によって、遺伝子、遺伝子にコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型、又はハプロタイプから、プロファイルを検出する事又は引き出す事を含んでも良い。前記方法は、(f)上記で明示された1又はそれ以上の遺伝子、遺伝子によってコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型、又はハプロタイプのための、発現又は遺伝子多型データをコンピューターで処理する事を含むコンピューター実行方法を行う事を含んでも良い。
【００１９】
本発明の第９の観点によれば、川崎病の診断又は検出のための方法を提供する。当該方法は、NAALADL2又はCAMK2Dを含む遺伝子の、又はそのような遺伝子、若しくはそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列にコードされるポリペプチドの、発現のパターン又はレベルの変化のような、発現を検出する事を含んでも良い。
【００２０】
本発明の第１０の観点によれば、川崎病、または川崎病への感受性のための診断キットを提供する。当該診断キットは、以下の任意の1又はそれ以上を含んでも良い。以下のポリペプチドに結合可能な分子を含んでも良い(a) CACNA2D3； (b) CAMK2D； (c) KCNIP4； (d) ANGPT1； (e) NAALADL2； (f) ZFHX3； (g) MPHOSPH10、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列。当該分子は、抗体を含んでも良い。当該診断キットは、そのような物をコード可能な核酸を含んでも良い。当該診断キットは、以下を含むグループから選択される核酸に結合可能な核酸を含んでも良い：(a) CACNA2D3； (b) CAMK2D； (c) KCNIP4； (d) ANGPT1； (e) NAALADL2； (f) ZFHX3； (g) MPHOSPH10又は、それらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列。当該核酸は、遺伝子多型を識別可能な核酸であっても良く、例えばある位置の1タイプの遺伝子多型に結合できるが、その場所の他のタイプの遺伝子多型に結合できない事によって識別する。
【００２１】
本発明の第１１の観点として、マイクロアレイのようなアレイのような形態で、上記(a)から(d)に明示された多数のマーカー、遺伝子多型、又はハプロタイプを含む組み合わせを提供する。
【００２２】
本発明の第１２の観点によれば、上記(a)から(d)に明示される情報を含むデータ担体を提供する。
【００２３】
前記方法は、さらに、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３若しくは図４に示される遺伝子、遺伝子によってコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型若しくはハプロタイプ、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列を検出する事又は調節する事を含んでも良い。
【００２４】
本発明者らは、個体の川崎病の治療又は予防のための方法を記載する。当該方法は、以下を含むグループから選択される遺伝子： (a) CACNA2D3； (b) CAMK2D； (c) KCNIP4； (d) ANGPT1； (e) NAALADL2； (f) ZFHX3； (g) MPHOSPH10、若しくはそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列、の発現、又はそのような遺伝子にコードされるポリペプチドの量若しくは活性を調節する事を含む方法を記載する。
【００２５】
本発明者らは、さらに、以下のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを投与する事を含む方法を記載する：(a) CACNA2D3； (b) CAMK2D； (c) KCNIP4； (d) ANGPT1； (e) NAALADL2； (f) ZFHX3； (g) MPHOSPH10、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列。
【００２６】
前記方法は、治療上の有効量のプレガバリン ((3S)-3-(アミノメチル)-5-メチル-サキサン酸)、プレガバリンに構造的に類似する化合物、機能的に同等である化合物、化学的誘導体、化学的改変体、置換体、製薬上許容される塩、遺伝子多型体、同位体変異、プロドラッグ、前駆成分、又はプレガバリンの塩を、個体に投与する事を含んでも良い。
本発明の実現には、その他の指示がなければ、当業者の能力の範囲内で、化学、分子生物学、微生物学、組み換えDNA及び免疫学の通常の技術を使用する。そのような技術は、発行物に説明されている。例えば、以下参照： J. Sambrook,E. F. Fritsch,and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning： A Laboratory Manua, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press； Ausubel, F. M. et al.  (1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)； B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing： Essential Techniques、John Wiley & Sons； J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization： Principles and Practice； Oxford University Press； M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis： A Practical Approach, Irl Press； D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology： DNA Structure Part A： Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press； Using Antibodies ： A Laboratory Manual ： Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7)； Antibodies ： A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY、Marcel Dekker、ISBN 0-8247-0562-9)； and Lab Ref： A Handbook of Recipes、Reagents, 及び Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3. これらの一般的な各文書は、参照する事により本文献に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】アレル分布のための分位点分位点プロット(Quantile-quantile plot)。107例の川崎病症例と134例のコントロールにおける、223,922 のSNPsの、期待されるP値対観察されるP値の相関解析。同等の直線からの逸脱を示している赤点は、理論上の分布が不正確である、又は真の相関によって作成される値にそのような試料が混入されている事を示唆する。
【図２】GWASからのSNPs及びハプロタイプの選択と検証。GWAS SNPsとハプロタイプは、P値によってランク付けされ、上位1101(関連の全件数14,065の内)SNPsと35(オーバーラップしない関連の全件数3,549の内)のハプロタイプが、フォローアップステージに進められた。括弧内の数値は、各選択法によってGWASから選択された変異体の数を示し、それらはその後の家系研究で繰り返された。
【図３】インジェヌイティパスウェイアナラシス(Ingenuity Pathway Analysis)ソフトウェアから引き出された遺伝子ネットワーク。エッジはノード間の関係性を記載するラベルで表示される。 遺伝子間の直線は、既知の相互作用を示し、実践は直接的相互作用、破線は間接的相互作用である。ノードは、遺伝子産物の機能的分類を表す種々の形態を用いて表示される。オレンジハイライトは、有意に関連する遺伝子を示し、非ハイライトはネットワーク内に同定された遺伝子を表す。川崎病の急性期対回復期でディファレンシャリーな発現を示した遺伝子は、発現が川崎病急性期で有意に高い場合に赤、発現が有意に低い場合は緑、発現に有意な変化がない場合は白である。色の強度はフォールドチェンジに相関する。
【図４】インジェヌイティパスウェイアナラシス(Ingenuity Pathway Analysis)ソフトウェアから引き出された遺伝子ネットワーク。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
川崎病遺伝子
本発明は、川崎病の感受性の遺伝的背景を構成する遺伝子群の証明に基づく。アフィメトリクス250K SNP チップ(Affymetrix 250K SNP chip) を使用して、119症例のコーカサス人種の川崎病群と、135の民族的に同一のコントロール群について、ゲノムワイド関連研究（GWAS）を行った。
【００２９】
583の独立の川崎病家系で、有意に関連性のある40の一塩基多型と6ハプロタイプと31の既知遺伝子が確認された。それによって、本発明者らは、川崎病の検出、又は診断の方法を記載する。前記方法は、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は 図４に示した遺伝子、遺伝子にコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型、ハプロタイプ、又はそれらに少なくとも90%の配列同一性を持つ配列の検出を含む。特に、上記の31遺伝子の中の任意の１又はそれ以上が、この目的のために検出されても良い。
【００３０】
これら31遺伝子のうち15遺伝子が、急性期対回復期に末梢血でディファレンシャリーに発現していた。それによって、本発明では、川崎病の治療や軽減のための方法を記載する。前記方法は、上記の15遺伝子を含み、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に示した遺伝子、遺伝子にコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型、ハプロタイプ、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列の検出又は調節を含む。
【００３１】
NAALADL2のイントロン内の一塩基多型は最も関連性が強く(pcombined = 1.1x10-6)、急性期に最も大幅な変化（fold change (FC)）を示す(FC = -6.7、p = 0.0003)。血管新生メディエーターANGPT1遺伝子内の2箇所の一塩基多型 (pcombined = 3.4x10-5、5.4x10-5)と同様に、先天性免疫系の制御に関係するZFHX3 (別名ATBF1)内の3箇所の一塩基多型もかなり関連性が高い(pcombined = 5.3x10-4、7.1x10-5及び2.4x10-6)。ANGPT1は川崎病の急性期にディファレンシャリーに発現される。
【００３２】
従って、本発明者らは、川崎病の診断又は検出の方法を記載する。前記方法は、NAALADL2、ANGPT1及びZFHX3から選択される遺伝子、又はそれらに少なくとも90%の配列同一性を持つ配列の内部又は周辺の遺伝子多型の検出を含む。
【００３３】
さらに、本発明者らは、川崎病の診断又は検出の方法を記載する。前記方法は、表２又は表Ｓ１に提示したrs17531088、 rs1010824、 rs6469101、rs7199343、rs10852516及び rs11075953のグループから選択される一塩基多型の検出を含む。
【００３４】
疾患関連性は、MPHOSPH10、RBMS1及びLOC441938遺伝子でも検出された。従って、本発明では、川崎病の診断又は検出のための方法を記載する。前記方法はMPHOSPH10、RBMS1及びLOC441938、又はそれらと少なくとも90%の配列同一性を持つ配列から選択される遺伝子の内部又は周辺のハプロタイプの検出を含む。表２又は 表Ｓ２に提示するrs7558220、rs357752；及び rs7558220、rs357752、rs1458868、rs357729 及びrs11674899から成るグループから選択されるハプロタイプの検出から構成されても良い。
【００３５】
インジェヌイティパスウェイアナラシス(Ingenuity Pathway Analysis)を使用した関連遺伝子間の機能的関連性の研究により、心血管病に関連する１つの重要性の高いネットワークが同定された。それは、GWASの関連遺伝子のうち12を含む35遺伝子から成る。
【００３６】
ネットワークに含まれる10遺伝子が、川崎病の急性期にディファレンシャリーに発現されている。
【００３７】
表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３若しくは図４の遺伝子、又はそれらと少なくとも90%の配列同一性を持つ配列を含む、任意の上記遺伝子の発現の検出、例えば遺伝子発現変化の検出は、川崎病の検出又は診断のために使用されても良い。
【００３８】
本研究は、感染症疾患領域の初めてのGWASであり、新規の川崎病感受性に関連する生物学的にもっともらしい変異体を同定した。また、他の心血管系疾患に共通のパスウェイであることを強調する。
【００３９】
表４.  川崎病関連遺伝子リスト (35)
2010043063.tif 000003
【００４０】
2010043063.tif 000004
【００４１】
ZFHX3
ZFHX3 は遺伝子多型が知られる大きなエンハンサー結合転写因子をコードする25。ZFHX3はPIAS3（活性化STATの蛋白質阻害剤）と結合して、STAT3（シグナルトランスデューサーで、トランスクリプション３(transcription-3)のアクチベーター）を阻害する26。初期の先天性免疫応答や川崎病の病態に関与するインターロイキン6(IL-6)によって、STAT3は活性化される27。
【００４２】
本明細書で使用されている“ZFHX3”の用語は、場合により、ジェンバンクの登録番号NM_006885.3の塩基配列、ジェンバンクの登録番号NP_008816.3のポリペプチド配列を指す。以下で説明するように、これらの配列の相同体、断片、変異体及び誘導体も含む。
【００４３】
以下の文書は、OMIMエントリー104155を改変したものである。
【００４４】
ZFHX3はジンクフィンガーホメオボックス３、Atモチーフ結合ファクター１（Atbf1）、At結合転写因子１、又はアルファフェトプロテインエンハンサー結合蛋白としても知られる。ZFHX3の染色体上の位置は遺伝子座位16q22.3-q23.1である。
【００４５】
ヒトアルファフェトプロテイン（alpha-fetoprotein (AFP)）遺伝子(OMIM 104150)の組織特異的発現は、転写開始点の3.3 から 4.9 kb上流のエンハンサーによって強く刺激される。エンハンサーエレメントの１つはATリッチなコア配列(AT モチーフ)を含んでいる。ヘパトーマ細胞株で、ヒトAFPエンハンサーATモチーフと相互作用する核内因子を決定するために、Morinaga ら(1991)は、ATモチーフを含むAFPエンハンサー断片でヘパトーマcDNA発現ライブラリーをスクリーニングした。ATモチーフ結合因子をコードするcDNAの単離に成功し、ATBF1と名付けた。これはその当時に同定されていた中で最も大きいDNA結合蛋白であり、複数のホメオドメインと複数のジンクフィンガーモチーフを含む事が示された最初の蛋白である。その蛋白は質量306kDと推定され、4つのホメオドメインと17個のジンクフィンガーモチーフを含んでいた。
【００４６】
Qiら(2008)は、マウスPit1遺伝子(POU1F1； OMIM 173110)のプロモーター領域に、高度に保存された３つの調節エレメントを見出した。そして、Atbf1が結合し、これらのエレメントの中の１つ、EE-アルファからPit1を活性化する事を発見した。
【００４７】
ハイポモルフィックAtbf1アレルを持つマウスの脳下垂体は、成長ホルモン産生細胞マーカーGh (OMIM 139250)の発現が少なく、甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカーTshb (OMIM 188540)はほとんど発現していない事が示された。Qi ら(2008)は、ATBF1はPIT1転写活性化初期に必要とされると結論づけた。
【００４８】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、Yamada ら(1995)は、ATBF1遺伝子を16q22.3-q23.1にマッピングした。Yamadaら(1996)は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、Atbf1遺伝子をマウス染色体8E1に位置づけた。
【００４９】
第16番染色体の長腕は、ヒト癌で頻繁に欠失している。Sunら(2005)は、ATBF1遺伝子が16q22の癌抑制遺伝子の良い候補である証拠を提示した。彼らは16q22の欠失領域を、ATBF1を含む861 kbに狭めた。ATBF1のmRNAは、正常前立腺では多量に発現しているが、テストした前立腺癌の約半数で欠乏していた。Sunら(2005)は、テストした癌66検体中の24検体(36%)で、22種類の特別な体細胞変異を同定した。その多くがATBF1の機能を損なう。さらに、ATBF1は細胞増殖を阻害した。Sun ら(2005)は、前立腺癌では、ATBF1の欠失が増殖コントロールの欠損を規定する１つのメカニズムである結論づけた。
【００５０】
悪性度が低から中程度のグレードの原発前立腺癌４症例(OMIM 176807)で、Sunら(2005)は、ATBF1遺伝子のエクソン10に24-bpの欠失、10814del24を同定した。それは、グルタミンリッチドメイン内の、コドン3381から始まる8アミノ酸の欠失となる。その欠失は、悪性度の高いグレードの転移癌原発巣のマイクロダイセクションでも見つかった。
【００５１】
[OMIMからの改変文書終了]
【００５２】
ANGPT1
２つの関連する一塩基多型が、アンジオポエチン１をコードするANGPT1の3'非翻訳領域に位置している。ANGPT1は川崎病急性期に大幅に発現が減少する事が示された。ANGPT1は、血管新生のメディエーターであり、血管の伸展に重要な機能を持つ。Angpt1-/-ノックアウトマウスは、構造的に異常な拡張した血管を持ち、破裂し易い28。すなわち、冠動脈の拡張は川崎病の特徴であり、巨大冠動脈瘤が破裂するかもしれない29。成熟した血管でANGPT1は、血漿の流失を抑制し、血管の炎症を抑制し、又は内皮細胞のアポトーシスを阻害する事で、血管内皮の統合性を維持する28。川崎病では、血管漏出が冠動脈障害と予後不良の強い予測因子である30。ANGPT1と、ANGPT2や血管内皮細胞成長因子(VEGF)といった他の血管新生メディエーターは、正確な役割は不明だが血管新生に中心的な役割を果たしている31。興味深い事に、動脈瘤を伴う川崎病の症例の血清は、ANGPT1レベルの報告はないものの血管新生活性を減弱させた32。致死的な症例の川崎病患者の冠動脈瘤と心筋では強い炎症と血管新生が観察される33。前臨床試験は、ANGPT1が内毒血症と移植後のアテローム性動脈硬化の治療に有効であるかもしれない事を示唆した28。
【００５３】
本明細書で使用されている“ANGPT1”の用語は、場合によって、ジェンバンクの登録番号NM_001146.3の塩基配列、ジェンバンクの登録番号NP_001137.2のポリペプチド配列を指す。以下で説明するように、これらの配列のホモログ、断片、変異体及び誘導体も含む。
【００５４】
以下の文書は、OMIMエントリー601667を改変したものである。
【００５５】
ANGPT1はアンジオポエチン１としても知られる。ANGPT1の染色体上の位置は遺伝子座位8q22である。
【００５６】
TIE2 (TEK； 600221)は、ほとんど例外なく内皮細胞と初期の血液幹細胞に発現される受容体様チロシンキナーゼであり、発生過程で血管構造の正常な発達に必要とされる。Davisら (1996)は、COS細胞で、リガンドの細胞内トラッピングとプロテクションを含む新規発現クローニング技術を用いて、TIE2の分泌型リガンドを同定し、アンジオポエチン１と名付けた。ヒト遺伝子は、コイルドコイルとフィブリノーゲン様ドメインを含む498アミノ酸ポリペプチドをコードする。アンジオポエチン１の構造は、既知の血管新生因子や受容体型チロシンキナーゼの他のリガンドとは異なる。アンジオポエチン１はTIE2に結合してチロシンリン酸化を引き起こすが、直接的に培養内皮細胞の増殖を誘導しない。しかし、伸展中の血管のごく近傍で発現する事は、アンジオポエチン１の血管形成への関与を示唆した。アンジオポエチン２(601922)も参照。
【００５７】
Folkman とD'Amore (1996)は、マウスとヒトにおける血管の異常は、血管内皮細胞の受容体−リガンドシステムによって規定される事を指摘した。血管のリモデリングの明らかな欠損は、受容体の活性型突然変異(Vikkulaら、1996)、リガンドの欠損(Suriら、1996)、又はTIE2受容体自身の欠失(Satoら、1995)に起因しうる。しかし、各々の現象は、血管リモデリングにおいて共通の異常を現す一方で、微妙だが重要な違いが存在する。
【００５８】
癌の血管新生においてVEGF(192240)とアンジオポエチンが協同する可能性を試験するため、Holashら(1999)は、数種の異なるマウスとヒトの腫瘍モデルを解析した。ラットC6グリオーマにおいて、腫瘍血管の退縮、アポトーシス及び内皮細胞相互作用の崩壊と、支持細胞との明白な関連性は、Ang1の安定化作用の阻害が腫瘍血管の退縮に寄与している可能性を提示した。この可能性と一致して、Holashら(1999)は、アンジオポエチン1が培養内皮細胞に対してアンチアポトーシスであり、そのアンタゴニストであるアンジオポエチン２の発現が、退縮の前に 選択された腫瘍血管の内皮で発現誘導される事を記載した。アンジオポエチン１の広汎性発現はラットモデルでの現象に似ていた。Holash ら(1999)は、一群の腫瘍は、宿主の血管を選択して、最初から十分に血管形成した腫瘍塊を形成する事を示唆した。恐らく、宿主の防御機構の一部として、これら初期に選択された血管の広範囲にわたる退縮が起き、２次的に無血管の腫瘍と腫瘍細胞の消失につながる。しかし、腫瘍周縁部での強力な血管新生により、ついには生き残った腫瘍が救助される。
【００５９】
LoughnaとSato (2001)は、アンジオポエチン１とオーファン受容体TIE1(600222)の組み合わせの機能が、右側静脈系の発達に重要であるが、左側静脈系には必ずしも必要ない事を示した。この発見は、静脈ネットワーク非対称性が形態的に区別できるようになる以前に、右側と左側静脈ネットワークの構築のための明確な遺伝的プログラムが存在する事を示している。
【００６０】
Gevaら(2002)は、VEGFA、ANGPT1又はANGPT2について、妊娠期間中を通して、正常血圧の妊婦の胎盤中の転写プロファイルとコードする蛋白産物を調べた。定量的リアルタイムPCR解析は、VEGFAとANFPT1mRNAが、各々週に2.5%(有意差なし)と2.8%(P = 0.034) 直線的に増加し、一方、ANGPT2は週に3.5% (P = 0.0003)対数的に減少する結果を示した。ANGPT2 mRNAは、最初の３ヶ月間にはANGPT1とVEGFAより400 倍と100倍高値を示し、妊娠６〜９ヶ月には20倍と7倍に下落した。インサイチュハイブリダイゼーションと免疫組織化学的研究は、VEGFAが細胞栄養芽層、栄養膜、血管周囲細胞に位置している事を示した。一方、ANGPT1とANGPT2は、妊娠３ヶ月と６ヶ月では未熟な絨毛中間部の栄養膜と血管周囲細胞、第３ヶ月期の期間では成熟した中間と末端の絨毛に位置している事を示した。著者らは、これらの分子が胎盤の生物学と絨毛膜絨毛血管の伸展とリモデリングにオートクライン又はパラクラインの様式で、重要な役割を果たしているかもしれないと結論づけた。
【００６１】
血球幹細胞(HSCs)と幹細胞ニッチとして知られる特別な微小環境との相互細胞が、骨髄内での大人の造血に重要である。Araiら(2004)は、チロシンキナーゼTIE2を発現している血球幹細胞は、静止期にあり、抗アポトーシス性で、骨髄ニッチの中で骨芽細胞に接着する血球幹細胞サイドポピュレーションを構成している事を示した。TIE2とリガンドのANG1の相互作用は、in vitroでは血球幹細胞のコブルストーン（cobblestone）形成を誘導し、in vivoでは長期間、血球幹細胞の再増殖を維持する。さらに、ANG1は、血球幹細胞が静止期に入り骨へ接着するのを強化して、その結果、血球幹細胞を骨髄抑制ストレスから保護する。これらのデータは、TIE2/ANG1シグナル伝達系が骨髄幹細胞の骨髄ニッチ内で静止期の状態を維持するのに重要な役割を果たしている事を示唆している。
【００６２】
Ward ら(2001)は、ANGPT1遺伝子が９エクソンを含み、全長48.3kbである事を特定した。エクソン１から５は、N末端のコイルドコイルドメインとヒンジ領域の一部をコードし、エクソン５から９は、残りのヒンジ領域とフィブリノーゲン（134820参照）−様ドメインとC末端をコードする。
【００６３】
FISHと放射線ハイブリッド解析により、Cheung ら(1998)は、ANGPT1遺伝子を染色体上の8q22.3-q23にマッピングした。放射線ハイブリッド解析とFISHにより、Grosiosら(1999)も、ANGPT1遺伝子を染色体上の8q22.3-q23にマッピングした。Valenzuelaら(1999)は、FISHにより、彼らがマップしたマウスAngpt1遺伝子が存在するマウス第１５番染色体と位置的に相同である8q22領域にANGPT 1遺伝子をマッピングした。しかし、Marziliano ら (1999)は、インダイレクトインサイチュPCRとFISHにより、Angpt12遺伝子を、マウス染色体9E2にマッピングした。
【００６４】
Suriら (1996)は、アンジオポエチン１を欠損させたマウスが、以前にTie2欠損マウスで観察されたのを想起させる血管新生障害を発現する事を示した。そして、アンジオポエチン１は、Tie2の第１の生理的リガンドであり、血管内皮細胞増殖因子(VEGF； 192240)とは異なる生体内での血管新生作用があり、VEGFの性質を明らかにするのに用いられた古典的なin vitro解析には反映されない血管新生作用である事を示した。彼らは、アンジオポエチン１が内皮細胞と取り囲むマトリックスと間充織との相互作用を媒介する重要な役割を担っているようであると結論付けた。
【００６５】
マウス遺伝子ターゲッティング研究は、血管内皮細胞増殖因子が血管伸展の初期段階に必要であり、アンジオポエチン１が血管リモデリングのより遅い段階で必要である事を示している。Suriら(1998)は、アンジオポエチン１を皮膚に過剰発現させたトランスジェニックマウスは、より広範囲にわたる、より巨大は、より高度に枝分かれした血管を形成する事を示した。この結果は、アンジオポエチンを血管新生促進の治療に、単独で、又はVEGFと併用で使用しうる可能性を示した。
【００６６】
hurstonら(1999)は、皮膚にVegf又はAng12を過剰発現させたトランスジェニックマウスを比較した。Vegf−過剰発現マウスで誘導された血管は、血漿漏出しやすく、一方、Ang1−過剰発現マウスはそうではなかった。さらに、Ang-1過剰発現マウスは、炎症誘導化合物による血漿漏出に耐性であった。Ang1のVegfの共発現は、血管新生に相加効果があるが、Ang1の典型である血漿漏出耐性の血管となった。Thurstonら(1999)は、従って、ANG1が慢性的炎症又はVEGF上昇による微小血管の血漿漏出の改善に有効である可能性と、漏出しない血管の増殖促進にはVEGFとの併用が有効である可能性を結論付けた。
【００６７】
[OMIMからの改変文書終了]
【００６８】
NAALADL2
一塩基遺伝子多型とハプロタイプの関連により同定された他の遺伝子の機能はあまりよくわかっていない。最も強く関連し、また、川崎病の急性期と回復期で最も大幅な発現変化を示した遺伝子(NAALADL2)は、全長1.37Mbで32エクソンのとても大きな遺伝子である。NAALADL2は広範囲の選択的スプライシングを受けて、多数の5'と3'の非翻訳領域と多用なコード配列を持つ。その機能はほとんどわかっていない34。
【００６９】
本明細書で使用されている“NAALADL2”という用語は、ケースによって、ジェンバンクの登録番号NM_207015.2の塩基配列、ジェンバンクの登録番号NP_996898.2のポリペプチド配列を指す。以下で説明するように、これらの配列のホモログ、断片、変異体又は誘導体も含む。
【００７０】
以下の文書は、OMIMエントリー608806を改変したものである。
【００７１】
NAALADL2は、N-アセチル化アルファ結合酸性ジペプチダーゼ様蛋白2 (N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like-2)としても知られる。NAALADL2の染色体上の位置は、遺伝子座3q26.3である。
【００７２】
第3染色体と第7染色体を含むコルネリア・デ・ランゲ症候群関連染色体転座の研究(122470)の中で、Tonkinら(2004)は、3q26.3のブレークポイントにこれまで知られていなかった遺伝子を見出し、N-アセチル化アルファ結合酸性ジペプチダーゼ様蛋白2と名付けた。ノーザンブロット解析で、腎臓、胎盤で1から10kbの6種類以内の異なる転写産物の強発現を見出し、また、胎児性発現は、十二指腸胃部内胚葉、中腎、後腎、膵臓に広い範囲に限局された。転写解析により、多数の5'と3'非翻訳領域と多様なコード配列につながる広範囲の選択的スプライシングが同定された。多数の蛋白アイソフォームは、異なるN末端領域（少なくとも4箇所のメチオニン開始コドン）と、選択的スプライシング／ポリアデニレーションによる蛋白切断／選択的なC末端配列により、定義づけられた。予測蛋白は、N末端以外でN-アセチル化アルファ結合酸性ジペプチダーゼ(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase)とトランスフェリン受容体に有意な相同性を示した。全長NAALADL2は推定795アミノ酸蛋白質をコードし、マウスの相同分子種に74％の配列同一性をしめす。
【００７３】
Tonkinら (2004)は、NAALADL2遺伝子は少なくとも1.37Mbに渡り、32エクソンを含む事を決定した。
【００７４】
コルネリア・デ・ランゲ症候群患者由来の細胞株で、Tonkinら(2004)は、FISHを用いて、 (3；17)転座のブレークポイントを3q26.3と17q23.1にマップした。NAALADL2遺伝子は3q26.3ブレークポイントによって破壊されていた。
【００７５】
コルネリア・デ・ランゲ症候群患者由来のDNAサンプルのパネルで、Tonkinら(2004)はNAALADL2遺伝子の突然変異スクリーニングを行ったが患者特異的変異は見出せなかった。
【００７６】
[OMIMからの改変文書終了]
【００７７】
KCNIP4
KCNIP4 (電位依存性カリウムチャネル相互作用蛋白質４、KChIP-4) は、カリウムチャネル相互作用蛋白ファミリーの一員をコードし、主として心臓と脳に発現される。Aタイプカリウムチャネルと相互作用して、細胞内カルシウムの変化に応答した神経の興奮を調節する35。KCNIP蛋白質は心臓毒に結合する36。インビトロでTNFに暴露された培養心筋細胞は、Kv4.2とKChIP-2の発現が大幅に減少する。それは、炎症下での心筋細胞の電位再構築のメカニズムである事が示唆されており37、また、川崎病急性期では心臓性不整脈が報告されている38。
【００７８】
本明細書で使用されている“KCNIP4”という用語は、ケースによって、ジェンバンクの登録番号NM_001035003.1の塩基配列、ジェンバンクの登録番号NP_001030175.1のポリペプチド配列を指す。以下で説明するように、これらの配列のホモログ、断片、変異体及び誘導体も含む。
【００７９】
以下の文書は、OMIMエントリー608182を改変したものである。
【００８０】
KCNIP4は、カリウムチャネル相互作用蛋白質４、Kchip4、カルセニリン様蛋白質；CALPとしても知られる。KCHIP4の染色体上の位置は遺伝子座4p15.3である。
【００８１】
KCNIP4のようなカリウムチャネル相互作用蛋白質は、Kv4 Aタイプカリウムチャネルの活性を特異的に調節する(KCND1； 300281参照)。Kv4 Aタイプチャネルは、神経活動電位の遅延型繰り返し発火(slow repetitive firing)と誤差逆伝播(back-propagation)の周期、及び心臓の活動電位形成に貢献している(Holmqvist ら2002)。
【００８２】
Holmqvistら(2002)は、マウスKcnip4をクローニングし、Kchip4と名付けた。彼らは、ヒトと齧歯類のデータベースを解析して、ほとんどがN末端ドメインに違いのある数種のKCNIP4スプライスバリアントを同定した。N末端134アミノ酸のカリウムチャネル不活化サプレッサー(K channel inactivation suppressor ；KIS)ドメインを含むヒトとマウスのバリアントは、100%アミノ酸相同性を示す。ラット組織のノーザンブロット解析では、Kcnip4の脳での発現を検出したが、心臓や試験した他の組織では検出できなかった。また、マウス組織のRT-PCRでは、脳で2種のスプライスバリアントの発現を検出したが、心房と心室では検出できなかった。
【００８３】
プローブとしてプレセニリン２(PS2； 600759)のC末端を用いた酵母ツーハイブリッドスクリーニングの後に、脳cDNAライブラリーのスクリーニングとPCRを行い、Morohashi ら(2002)は、KCNIP4の2種類のスプライスバリアントをクローニングして、CALPと名付けた。１つは、216アミノ酸蛋白質をコードし、他方は、N末端に挿入部を含む250アミノ酸蛋白をコードする。KCNIP4のN末端配列は、他のKCHIP蛋白のN末端と異なっているが、C末端は、KCNIP2 (604661)とKCNIP3 (CSEN； 604662)のC末端に各々、79.6%と77.6%の相同性を示す。ノーザンブロット解析では、KCNIP4の発現は脳に限定して検出されており、前頭、側頭、頭頂、後頭の大脳皮質と小脳を含む、試験した全ての脳領域で発現している。KCNIP4は、一過性に遺伝子導入したCOS細胞で細胞質と核に散在的に分布した。しかし、PS2とKCNIP4の共遺伝子導入では、PS2と重なって核周囲領域と小胞体膜に網状に再分布した。ウェスタンブロット解析で、内在性のマウスKcnip4は、主に約28kDの蛋白として検出された。
【００８４】
Holmqvistら(2002)は、Kv4 アルファサブユニットとKcnip4 の共発現が、Kv4電流の急速な消失を消滅させる事を、ラット小脳顆粒神経細胞を含む種々の細胞タイプで示した。Kcnip4のKISドメインは、 Kv4.3 (KCND3； 605411)の開口を遅延させるが、一旦チャネルが開口すると、急速な不活化を妨害してKv4.3の閉口を遅くした。よって、Kcnip4は単一Kv4.3チャネルの開口確率を増加させた。Kcnip4と他のKcnipsサブユニットのKv4ゲートへの正味の効果は全く異なっている。Kcnip4 とKcnip1 (604660)の両者が存在すると、Kv4.3電流は、Kcnip4/Kcnip1の比に依存して混合された不活化の特性を示した。KISドメインは、AタイプKv4電流を、ゆっくり不活化する遅延型整流タイプのカリウム電流に変換した。
【００８５】
酵母ツーハイブリッド解析により、Morohashiら(2002)は、KCNIP4がPS2 とPS1 (104311)のC末端と相互作用する事を明らかにした。Ca(2+) オーバーレイ解析により、KCNIP4のEFハンドモチーフがカルシウムに結合する事を明らかにした。突然変異解析と共免疫沈殿実験により、EFハンドがKCNIP4とラットKv4間の相互作用を媒介する事を示した。KCNIP4の過剰発現はPSの代謝や安定性を変化させないが、ラットKv4.2 (KCND2； 605410)と同時のKCNIP4の過剰発現はAタイプカリウム電流の特性を元に戻した。Morohashi ら(2002)は、KCNIP4は、PSとKv4の両者と相互作用する新規EFハンド蛋白質と結論づけた。
【００８６】
ゲノム塩基配列解析によって、Morohashi ら(2002)は、KCNIP4遺伝子を第4染色体にマップした。
【００８７】
[OMIMからの改変文書終了]
【００８８】
CACNA2D3 とCAMK2D
CACNA2D3 とCAMK2DはMYCとNFYBに関連する遺伝子で、特に有望な川崎病の候補遺伝子である。
【００８９】
CACNA2D3(電位依存性カルシウムチャネルアルファ２／デルタ３サブユニット)は、心臓で発現されており、サイトカインのような血漿中のリガンドを結合してカルシウムシグナリングを引き起こす可能性がある45。
【００９０】
CAMK2D(カルシウム／カルモヂュリンプロテインキナーゼ(CaM kinase)II)も、心臓で発現されてカルシウムシグナリングに関与する。
【００９１】
CAMK2Dは、心臓肥大の抑制因子であるクラスIIヒストンデアセチラーゼの調節に関与しており、心臓内のシグナル伝達系に幅広い役割を果たしている事が示唆される46。それに加えて、CAMK2DはエンドトキシンやTNFが媒介する前単球のアポトーシスを調節する47。リンパ球のアポトーシスの遅延は川崎病急性期の特徴であり、病理に寄与しているかもしれない48。
【００９２】
CAMK2DはLNX1(numb蛋白 X 1のリガンド)と相互作用する。LNX1は、NUMBL (線虫numbホモログ-様)を含むNUMB蛋白ファミリーの足場として働く。NUMB蛋白ファミリーは、興味深い事に、連鎖研究により最近川崎病感受性に関連づけられた小さなハプロタイプブロックに存在する49。LNX1は、コクサッキーウイルスとアデノウイルスの受容体(CAR)に結合する50。CARは、ヒトに心筋炎を引き起こすコクサッキーウイルスB3の受容体であり、動物モデルでは、CARへの結合を拮抗阻害すると心筋炎が引き起こされない51。コクサッキーウイルスB3は、急性心筋梗塞にも関係している52。
【００９３】
興味深い事に、ヒト内在性レトロウイルスK蛋白Np9もLNX1と相互作用する。従って、多数のウイルスが理論上NUMB/CAR/LNX1複合体に結合し、細胞内に移行してCAMK2D活性化につながる。この事は、遺伝的に感受性のある川崎病患者では、複数の感染の引き金が心血管障害を引き起こすメカニズムである可能性を示唆している。
【００９４】
CACNA2D3
本明細書で使用されている“KCNIP4”という用語は、ケースによって、ジェンバンクの登録番号NM_018398.2の塩基配列、ジェンバンクの登録番号NP_060868.2のポリペプチド配列を指す。以下で説明するように、これらの配列のホモログ、断片、変異体及び誘導体も含む。
【００９５】
以下の文書は、OMIMエントリー606399を改変したものである。
【００９６】
CACNA2D3は、電位依存性カルシウムチャネルアルファ２/デルタサブユニット3としても知られる。CACNA2D3の染色体上の位置は遺伝子座3p21.1である。
【００９７】
自然誘発性とヒッペル・リンダウ病(VHL； 193300)関連でよく見られる腎細胞癌(RCCs)において、3番染色体の欠失は最も頻度の高い遺伝的変異である。Hankeら(2001)は、RCCで3p21.1に約1cMのヘテロ接合性の消失(loss of heterozygosity (LOH))を検出した。彼らは、新規マイクロサテライトのBACショットガンシークエンスの後に5'と3'のRACEを行い、カルシウムチャネルサブユニット遺伝子、CANA2D3のcDNAを得た。予想される997アミノ酸の蛋白質は、マウスCacna2d3に高いホモロジーがあるが、マウス蛋白のN末端の44アミノ酸が欠失している。RT-PCR解析では、CACNA2D3は胎児の全組織と、試験した多くの成体の癌で発現が検出された。著者らはLOHがもっぱらイントロン配列に含まれる事を発見した。
【００９８】
Hankeら(2001)は、CACNA2D3遺伝子が全長500kbと決定した。
【００９９】
BACとマイクロサテライト解析により、Hankeら(2001)は、CACNA2D3遺伝子を3p21.1にマップした。
【０１００】
[OMIMからの改変文書終了]
【０１０１】
CAMK2D
本明細書で使用されている“CAMK2D”という用語は、ケースによって、ジェンバンクの登録番号NM_001221.3の塩基配列、ジェンバンクの登録番号NP_001212.2のポリペプチド配列を指す。以下で説明するように、これらの配列のホモログ、断片、変異体及び誘導体も含む。
【０１０２】
以下の文書は、OMIMエントリー607708を改変したものである。
【０１０３】
CAMK2Dは、カルシウム／カルモヂュリン依存性プロテインキナーゼIIデルタとしても知られる。CAMK2Dの染色体上の位置は、4番染色体である。
【０１０４】
CAMK2Dは、タイプII多機能カルシウムカルモヂュリン(114180参照)依存性蛋白キナーゼファミリーに属する。少なくとも4つのCAMK2遺伝子が存在し、それぞれが選択的スプライシングにより数種のアイソフォームを生産しうる。CAMK2アイソフォームは、8から12個のサブユニットから構成されるホモ又はヘテロの多量体ホロ酵素に集合する。
【０１０５】
Tombesと Krystal (1997)らは、数種類のヒト癌細胞株と脳のcDNAライブラリーのスクリーニングで得た主要なCAMK2クローンであるCAMK2D変異種を同定した。この変異株は、悪性の度合いに関わらず、試験した全ての非神経細胞で発現されていた。他のCAMK2D変異種は例外なく、齧歯類とヒトの大脳皮質に発現されていた。
【０１０６】
Hochら (1999)は、ヒトの心筋と骨格筋からCAMK2Dのアイソフォームを数種類クローン化した。心筋も骨格筋も、独特の主要なアイソフォームを発現していた。ある主要な変異種にコードされる推定蛋白は499アミノ酸だった。
【０１０７】
正常な心臓と拡張型心筋症患者由来の左心室組織の半定量RT-PCRによって、Hochら(1999)は、心筋症では、主要な心臓のCAMK2D転写産物の発現が亢進している事を明らかにした。他のCAMK2アイソフォームの転写レベルはコントロールレベルのままだった。
【０１０８】
子供から大人への移行には、多数の組織と臓器でプログラムされたリモデリングが伴い、それは、生物が環境の要求に適応する鍵となる。Xuら (2005)は、マウスで生後の心臓リモデリングに決定的な、制御された選択的スプライシングプログラムを報告した。彼らは、そのプログラムの鍵となる構成要素として必須なスプライシング因子Asf/Sf2 (SFRS1； 600812)を同定した。それは、心臓リモデリングの間に、限定されたセットの組織特異的な選択的スプライシングを制御する。Asf/Sf2が欠損した心筋細胞は、Camk2d転写の生後スプライシングスイッチが起こらず、予期しない収縮過剰を起こした。この障害はキナーゼの筋細胞膜へのミスターゲティングを誘導して、重篤な興奮-収縮連動の障害を引き起こした。
【０１０９】
Zhuら (2003)は、マウス心筋細胞で、ベータ１アドレナリン受容体(ADRB1； 109630)誘導アポトーシスはPKA (参照176911)の阻害に抵抗性である事を示した。むしろ、Adrb1プロアポトーシス活性は、Pka非依存性細胞内Ca(2+)とCamk2活性の上昇に相関していた。LタイプCa(2+)チャネル(114205参照)のブロッキング、細胞内Ca(2+)の緩衝、又はCamk2活性の阻害は、Adrb1誘導アポトーシス活性から心筋細胞を十分に保護した。また、Camk2のスプライシング変異種cの過剰発現は、Adrb1のアポトーシス効果を大幅に強化した。Zhuら(2003)は、CAMK2が、PKA非依存性のADRB1による心筋細胞アポトーシス刺激を伝達していると結論づけた。
【０１１０】
インターナショナルラディエーションハイブリッドマッピングコンソーシアム(International Radiation Hybrid Mapping Consortium)は、CAMK2D遺伝子を4番染色体にマップした(SHGC-8542)。
【０１１１】
Zhangら(2003)は、心臓特異的アルファミオシン重鎖プロモーター下でCamk2dのスプライシング変異種c(Camk2d-c)を発現するトランスジェニックマウスを作成した。マウスは拡張型心筋症を発症し、短縮率(shortening fraction(SF))が65%まで減少して死産した。単離した心筋細胞は巨大化して収縮能が低下しCa(2+)の操作が変化していた。心不全の発症前でも、Camk2部位での2型リアノジン受容体(RYR2； 180902)のリン酸化が亢進し、Camk2トランスジェニックマウスの免疫沈降でCamk2がRyr2と相互作用する事が見出された。フォスフォランバン(172405)のリン酸化もCamk2部位で特に増加していたが、Pkaのリン酸化サイトでは増加していなかった。これらの発見は、Camk2d-cは生体内でCa(2+)制御蛋白のリン酸化を媒介しうる事を示し、CAMK2D-Cの活性化は拡張型心筋症と心不全の病態に関与する証拠となった。
【０１１２】
Zhangら(2005)は、遺伝子ターゲッティングにより心臓Camk2阻害のモデルマウスを作成し、過剰なベータアドレナリン受容体(109630参照)刺激による不適応リモデリングの実質的阻害と心筋梗塞を示し、また、ベースラインと、ベータアドレナリン受容体刺激による心臓機能の生理的向上を維持したまま、興奮−収縮カップリングのバランス変化の誘導を示した。Zhang ら(2005)は、CAMK2が臨床上重要な心臓疾患の表現系の決定因子であると結論付けた。
【０１１３】
[OMIMからの改変文書終了]
【０１１４】
MPHOSPH10
本明細書で使用されている“MPHOSPH10”という用語は、場合によって、ジェンバンクの登録番号NM_005791.1の塩基配列、ジェンバンクの登録番号NP_005782.1のポリペプチド配列を指す。以下で説明するように、これらの配列のホモログ、断片、変異体及び誘導体も含む。
【０１１５】
以下の文書は、OMIMエントリー605503を改変したものである。
【０１１６】
MPHOSPH10はM期リン酸化蛋白10又はMPP10としても知られる。
【０１１７】
間期から分裂期への細胞の進行には細胞構造と活性の変化が伴う。G2期からM期への移行は、M期促進因子又はMPF(CCNB1； 123836参照)によって誘導される。M期では、直接MPFによって、又は、間接的にMPFに活性化されるキナーゼによって多数の蛋白質がリン酸化される。これらのM期リン酸化蛋白(MPPs 又はMPHOSPHs)は間期の構造体の分解と、M期の酵素活性と構造体の生成を可能にする。
【０１１８】
Matsumoto-Taniuraら(1996)は、バクテリア発現ライブラリーを、脱リン酸化酵素阻害剤存在下で適切なキナーゼを含むM期細胞質で処理した後に、MPM2抗体でイムノスクリーニングを行って、MPP10と称するMPHOSPH10を含む多数のMPHOSPHのcDNAを単離した。イムノブロット解析により、M期の細胞でリン酸化された際に120kDの蛋白として発現されている事が示された。蛍光免疫顕微鏡では、間期にMPHOSPH10は核、ほとんどが核小体に存在していた。分裂期の細胞では、MPHOSPH10は、フィブリラリン(FBL； 134795)と同じ様式で染色体に接着していた。
【０１１９】
Westendorfら(1998)は、cDNAライブラリーのスクリーニング、PCR、5'RACEを行い、MPHOSPH10をコードする全長cDNAを得た。塩基配列解析により、PEST配列と、多くの核小体蛋白に見られる酸性塩基性ストレッチを含むコイルドコイルアルファヘリックスを持つ681アミノ酸蛋白と推測された。細胞分画とイムノブロット解析により、MPHOSPH10が核と核小体に局在している事が確認された。蛍光免疫顕微鏡による種々の細胞周期の詳細解析により、MPHOSPH10は、U3低分子リボ核タンパク(snoRNPs)の構成員であるフィブリラリンと一緒に位置していた。しかし、ノーザンブロット解析では、MPHOSPH10はU3以外のsnoRNAsを含むリボ核粒子の主要な構成員ではない事が明らかにされた。共焦点顕微鏡では、FBLやp80 コイリン(COIL； 600272)と共にコイルド小体には位置していない事が示された。MPHOSPH10はFBLを含む小体とは異なる分裂終期小体に見つかった。Westendorf ら(1998)は、MPHOSPH10はrRNAのプロセッシングに関与すると結論づけた。
【０１２０】
[OMIMからの改変文書終了]
【０１２１】
RBMS1
RBMS1はRNA結合モチーフ単鎖結合蛋白１アイソフォームc (RNA binding motif、single stranded interacting protein 1 isoform c)である。本明細書で使用されている“RBMS1”という用語は、場合によって、ジェンバンクの登録番号NM_002897.4の塩基配列、ジェンバンクの登録番号NP_002888.1のポリペプチド配列を指す。以下で説明するように、これらの配列のホモログ、断片、変異体及び誘導体も含む。
【０１２２】
LOC441938
LOC441938はシグナル調節蛋白ベータ１様蛋白である。
【０１２３】
本明細書で使用されている“LOC441938”という用語は、場合によって、ジェンバンクの登録番号NC_000002 (1664616..1593952の領域) 又は NT_011387.8 (1656616..1585952の領域)の塩基配列を指す。以下で説明するように、これらの配列のホモログ、断片、変異体及び誘導体も含む。
【０１２４】
プレガバリン
本発明者らは、川崎病の治療にCANA2D3のアンタゴニストのような調節剤の使用を提供する。CACNA2D3のアンタゴニストは、プレガバリン ((3S)-3-(アミノメチル)-5-メチル-ヘキサン酸)でも良い。前記方法は、好ましくはCACNA2D3を個体に投与する事を含んでも良い。
【０１２５】
(3S)-3-(アミノメチル)-5-メチル-ヘキサン酸であるプレガバリンは、148553-50-8、3-イソブチルGABA、CI-1008、ヘキサン酸、3-(アミノメチル)-5-メチル-、(3S)-、ヘキサン酸、3-(アミノメチル)-5-メチル-、(S)-、PD 144723 及び S-(+)-3-イソブチルgabaとしても知られる。商品名“リリカ(Lyrica)”として販売されている。
【０１２６】
プレガバリンの組織名は、ヘキサン酸、3-(アミノメチル)-5-メチル-、(3S)-である。IUPAC名は(3S)-3-(アミノメチル)-5-メチル-ヘキサン酸である。プレガバリンのCAS登録番号は148553-50-8で、スマイルス(SMILES)記法はCC(C)C[C@@H](CC(=O)O)CNである。InChIはInChI=1/C8H17NO2/c1-6(2)3-7(5-9)4-8(10)11/h6-7H,3-5,9H2,1-2H3,(H,10,11)/t7-/m0/s1/f/h10Hである。化学式C8H17NO2で分子量159.226である。パブケム(PubChem)のリンクは5486971である。
【０１２７】
プレガバリンは異痛症(アロディニア)に関係すると考えられる。プレガバリンの治療薬分類は、抗てんかん薬；非麻薬性鎮痛薬である。プレガバリンの適応症(現状)は、線維筋痛症(フェーズIII)、HIV感染症(フェーズIII)、変形性関節炎(フェーズIII)、疼痛(フェーズIII)、一部のてんかん(承認)、末梢神経障害(フェーズIII)、ヘルペス後神経痛(承認)、てんかん(フェーズIII)を含む。標的分子(作用)はCACNA2D1(結合)、CACNA2D2(結合)、CACNA2D3(結合)、CACNA2D4(結合)と考えられる。
【０１２８】
本明細書で使用されている“プレガバリン”という用語は、文書に従って、プレガバリンに構造の類似した化合物、機能的に同等の化合物、化学的誘導体、化学的修飾体、置換体、薬学上許容される塩、遺伝子多型体、同位変異体、プロドラッグ、前駆成分、又はプレガバリンの塩を含むものとして取り扱われるべきである。
【０１２９】
プレガバリンはリリカ(ファイザー社)として製品を入手しても良い。それは、当該技術において知られる多数の方法によって製造される。例えば、米国特許第6,127,418号に記載されるような化学合成である。米国特許第6891059号にはプレガバリンの不斉合成(asymmetric synthesis)の方法が記載されている。
【０１３０】
プレガバリンの合成と特徴が、例えば以下の米国特許に記載されている。
7,524,864、7,517,910、7,514,457、7,511,158、7,507,742、7,507,732、7,507,717、7,507,546、7,501,414、7,494,998、7,491,835、7,488,846、7,488,740、7,485,636、7,482,460、7,482,375、7,476,665、7,470,812、7,465,826、7,462,738、7,462,737、7,456,218、7,449,585、7,446,220、7,442,701、7,442,370、7,438,927、7,438,893、7,432,299、7,429,580、7,427,600、7,425,631、7,425,569、7,423,169、7,423,159、7,423,054、7,420,002、7,419,981、7,417,165、7,414,156、7,414,134、7,410,945、7,402,687、7,393,873、7,393,872、7,393,852、7,390,931、7,390,798、7,381,747、7,374,779、7,368,477、7,368,472、7,365,095、7,354,937、7,354,929、7,354,925、7,351,724、7,338,968、7,332,504、7,332,499、7,329,664、7,329,659、7,329,658、7,326,729、7,326,721、7,326,414、7,319,106、7,312,233、7,309,799、7,309,790、7,309,719、7,309,712、7,285,563、7,279,486、7,268,133、7,262,192、7,261,529、7,256,216、7,247,628、7,241,788、7,235,667、7,235,657、7,235,363、7,232,924、7,232,823、7,230,135、7,230,024、7,227,028、7,217,721、7,214,824、7,205,295、7,199,244、7,199,141、7,196,079、7,189,747、7,186,855、7,183,259、7,176,210、7,164,034、7,151,097、7,146,205、7,145,012、7,141,695、7,141,669、7,138,542、7,138,406、7,135,484、7,129,239、7,125,848、7,122,683、7,109,149、7,074,814、7,071,339、7,067,262、7,060,727、7,060,708、7,053,122、7,049,305、7,041,704、7,038,085、7,030,119、7,026,505、7,026,351、7,026,332、7,022,678、6,992,110、6,992,109、6,992,076、6,984,659、6,984,634、6,984,496、6,977,070、6,972,341、6,962,973、6,958,218、6,955,888、6,942,876、6,927,036、6,924,377、6,923,988、6,916,841、6,900,192、6,894,047、6,891,059、6,887,902、6,855,849、6,855,724、6,849,629、6,833,370、6,833,140、6,828,344、6,828,328、6,825,217、6,818,787、6,809,105、6,797,708、6,774,132、6,761,903、6,750,171、6,730,674、6,720,348、6,720,001、6,713,490、6,703,522、6,689,915、6,680,343、6,642,398、6,635,675、6,630,496、6,630,490、6,620,829、6,605,745、6,602,911、6,596,900、6,593,368、6,579,879、6,569,463、6,566,400、6,562,865、6,544,998、6,521,650、6,500,853、6,488,964、6,451,857、6,436,974、6,426,368、6,372,792、6,359,005、6,329,429、6,326,374、6,310,098、6,309,663、6,306,910、6,267,985、6,248,363、6,242,488、6,194,459 及び6,127,418
【０１３１】
川崎病
以下の参考文献は川崎病に関連する：ICD-10 M30.3； ICD-9 446.1； OMIM 611775； DiseasesDB 7121； MedlinePlus 000989； eMedicine ped/1236； MeSH D009080
【０１３２】
川崎病(リンパ節症候群、皮膚粘膜リンパ節症、小児多発動脈炎、川崎症候群としても知られる)は、中間サイズの血管の炎症(血管炎)である。川崎病は、皮膚、粘膜、リンパ節、血管壁を含む多数の臓器に影響するが、元も重篤な影響は心臓であり、重症の動脈瘤性拡張を引き起こす。治療しなければ、通常、発症から6週間以内で死亡率は1%に近い。米国では、治療により死亡率は<0.01%である[1]。しばしば、病態にいくらか寄与するウイルスに予め感染している。表皮(皮膚)に沿って結膜と口腔の粘膜に紅斑(赤く炎症)が現れる。しばしば浮腫が手や足に見られ、しばしば頚部リンパ節に腫脹が見られる。また、しばしば多少の熱を認める。罹患した20%の子供に心血管の後遺症が見られる。
【０１３３】
川崎病は、1967年に日本の川崎富作博士によって記載された[2]。
【０１３４】
発生率とリスク因子
米国での発生率は増加しているものの、日本では川崎病の発生率がはるかに高い (100,000当たり175人)。川崎病は主として幼い子供の疾患で、80%の患者が5歳以下である。疾患は少女より少年に多く発症する。毎年米国では約2000-4000症例発見される[3][4]。
【０１３５】
原因
全ての自己免疫疾患と同様、川崎病の原因は、恐らく遺伝的要因と環境要因、あるいは感染も含めての相互作用である。特別な原因は知られていないが[5][6][7]、最近の説では第一に免疫学的原因が中心となっている。感染との因果関係を示す証拠が増加しているが[8]、原因がありふれた抗原なのかスーパー抗原なのか討論が続いている[9]。ボストン子供病院は、“川崎病の発生と、カーペットクリーニングや淀んだ水系近辺の居住への曝露との間に相関が見出された；しかし、原因と作用は未だ確立されていない”と報告している[4]。
【０１３６】
T細胞の活性を負に調節する酵素をコードするITPKC遺伝子の一塩基多型との関連が同定された[10]。遺伝的感受性を示唆する付加的な要因は、どこに居住しているかに関わらず日本人の子供が他の子供よりかかりやすいという事実である[4]。HLA-B51血清タイプが風土の発生率と相関している事が見出されている[11]。
【０１３７】
症状
心臓の合併症が断然最も重要な側面である。川崎病は、冠動脈の血管炎(血管壁の炎症)を引き起こし、続いて冠動脈瘤を引き起こす。この動脈瘤は、幼い子供でも心筋梗塞(心臓発作)へとつながりうる。全体の約10-18%の川崎病の子供が、冠動脈瘤を生じ、疾患の初期に治療しなかった患者が罹患し易い。川崎病とリウマチ熱が、米国の子供の後天性心疾患の最も一般的な原因である[3][4]。
【０１３８】
兆候
川崎病はしばしば、通常の用量のパラセタモール(アセトアミノフェン)やイブプロフェンに反応しにくい高くしつこい熱で始まる。熱は2週間までの間一定に維持され、通常、過敏を伴う。発症した子供は目が赤くなり、口腔粘膜が赤くなり、唇が赤く割れ、“いちご様の舌”となり[12] 、虹彩炎、角膜後面沈着物(眼科医によって発見されるが、通常肉眼では小さすぎて見えない)、及びリンパ節腫脹になる。疾患の初期に皮膚の発疹が現れ、より遅い時期には、生殖器領域、手、足(特に爪の周囲と手のひらと足の裏)に皮膚のはがれが起きる。これらの兆候が病気の経過の間に出現し消えていく。未治療のままだと、最終的に兆候は和らぐが、冠動脈瘤は改善せず死亡又は心筋梗塞(心臓発作)による障害の重大なリスクに帰結する。タイミングよく治療すれば、このリスクはほとんど避けられ、病気の経過は短縮される。
【０１３９】
通常、治療しないと5日以上続く高熱(39℃又は102°F以上；しばしば40℃又は104°F)
・膿又は排膿のない赤目(結膜炎)。“結膜炎性充血”としても知られる。
・真っ赤に荒れてひび割れた唇
・赤い口腔粘膜
・いちご様舌、舌上の白い皮膜、舌の裏側に顕著な赤いこぶ(小乳頭状突起)
・赤い手のひらと足の裏
・胴体部の、小疱(水疱様)ではない不定形の発疹
・特に頚部の、リンパ節の腫脹(しばしば1つのリンパ節のみが腫脹)
・しばしば対称性の、関節の痛み(関節痛(arthralgia))と腫れ
・刺激過敏性
・頻脈 (速い心拍)
・手のひらと足の裏のはがれ (剥離) (後には病的な)； はがれは爪の周囲から始まる
・ボー線(Beau's lines) (爪を横切る溝)
【０１４０】
兆候とテスト
生理的検査は上記の多数の特徴を示す。
【０１４１】
血液検査
・全血球数(CBC)は、正球性貧血と最終的に血小板増加を示す。
・赤血球沈降係数(ESR)は上昇する。
・C反応性蛋白(CRP)は上昇する。
・肝機能検査は肝炎と低血清アルブミンの所見を示す。
【０１４２】
他の検査(実施するかもしれないししないかもしれない)
・心電図は心室機能不全、場合によっては、心筋炎による不整脈の所見を示す。
・心臓エコーはわずかな冠動脈の変化、又は後には動脈瘤を示す。
・超音波又はコンピュータートモグラフは胆嚢のハイドロップ(拡張)を示す。
・尿検査は、微生物の増殖の所見なしに、尿中白血球と蛋白を検出する(pyuriaと尿蛋白)。
・腰部穿刺は、無菌性髄膜炎を示す。
・歴史的に冠動脈瘤を検出するのに血管造影が用いられており、未だにゴールドスタンダードである。しかし、今日では、心臓エコーで冠動脈瘤が検出されなければめったに行われない。
【０１４３】
診断
川崎病は、診断用の特別なラボテストが存在していないので、病院でのみ(医学的前兆と兆候によって)診断されうる。通常、確定診断するのは難しく、特に、疾患の初期には難しい。医師が数回診察するまで、又は何カ所もの違う医療提供者を受診するまで診断されない事がよくある。多くの他の重症疾患が同じような兆候を示し、猩紅熱、毒素ショック症候群、若年性関節リウマチを含む色々な診断が考慮される。
【０１４４】
古典的には、5日間の熱[13]に加えて、5種類の診断基準のうちの4種類が診断を確定するために合算された。診断基準は：(1)唇又は口腔の紅斑、又は唇のひび割れ；(2)体幹の紅斑；(3)手足の腫れ又は紅斑；(4)赤目(結膜充血) (5)少なくとも15ミリメーターの首のリンパ節の腫れ、である。
【０１４５】
最終的に川崎病と診断された多くの子供達、特に幼児は上記の診断基準の全てを満たしていない。実際に、多くの専門家達は現在、熱が3日以上続き、少なくとも3種類の診断基準が存在している場合、特に他の試験が川崎病に一致する異常を示していれば、川崎病として扱うよう求めている。加えて、単に、適切な臨床状況における冠動脈瘤の検出によっても診断が下されうる。
【０１４６】
治療
川崎病の子供は入院して、この疾患に経験のある医師の治療を受けるべきである。学際領域の医療センターでは、治療はしばしば小児心臓病科と小児感染症専門で分担される(特別な感染はまだ見つかっていないけれど[4])。診断がされ次第すぐに治療を開始する事が、冠動脈の障害を予防するために必要不可欠である。
【０１４７】
イムノグロブリン静注(IVIG)は川崎病の標準治療であり[14]、通常24時間以内に顕著な改善が認められる高用量が投与される。もし熱が反応しなければ、追加の用量が検討される。冠動脈瘤を予防するという観点では、IVIG単独では、発熱から7日以内が最も効果的である。
【０１４８】
サリチル酸療法、特にアスピリンは、治療の重要な部分のままである(疑問の声はいくらかあるが)が、サリチル酸単独はイムノグロブリン静注ほど効果的ではない。アスピリン療法は熱が治まるまで高用量で開始され、患者が自宅に戻った時に低用量で、通常、血液凝固の形成を予防するために2ヶ月間継続される。ライ症候群を併発するため、川崎病と他の少数の疾患を除いて、通常、アスピリンは小児には適用されない。
【０１４９】
コルチコステロイドも用いられる[16]。特に他の治療に失敗、又は兆候が再発した場合に用いられるが、ランダマイズドコントロールド臨床試験では、イムノグロブリンとアスピリンにコルチコステロイドを追加しても結果は改善されなかった[17]。
【０１５０】
虹彩炎や他の目の兆候の治療法もある。
【０１５１】
予後
初期の治療で、急性期の症状から急速な回復が期待され、また、冠動脈瘤のリスクが大幅に減少しうる。無治療でも、川崎病の急性期の症状は治まる(すなわち、患者は最終的には回復する)。しかし、冠動脈合併症のリスクはかなり高い。全体で約2%の患者が冠動脈炎の合併症で死亡する。川崎病に罹患した患者は、心臓の合併症の進行をスクリーニングするために、当初2,3週間毎に、その後1-2年毎に心臓エコーを行うべきである。
【０１５２】
最初のIVIG治療後すぐに症状のぶり返しが起きることも珍しくない。この場合、通常、再入院と再治療が必要となる。IVIGでの治療は、無菌性髄膜炎、水分過負荷、また、まれには他の重篤な反応といったアレルギー性又は非アレルギー性の急性反応を引き起こす。アスピリンは、他の原因による出血のリスクを増大させ、また、レイ症候群を併発する可能性がある。全体では、特に無治療のリスクに比較すると、川崎病の治療に起因する生命を脅かす合併症は極めてまれである。
【０１５３】
この章の文書は“川崎病”に関するウィキペディアのエントリーからの改変である。Kawasaki disease (2009年4月23日)。ウィキペディアの無料百科事典を(http：//en.wikipedia.org/w/index.php?title=Kawasaki_disease&oldid=285754914)  2009年4月28日09：34に検索した。
【０１５４】
ポリペプチド
本明細書で記載される方法と組成は、詳細を以下に記載のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3及びMPHOSPH10のポリペプチドを用いる。
【０１５５】
これらのポリペプチドのいずれかの、幾つかの、又は全ての相同体、変異体及び誘導体も含まれる。
【０１５６】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3及びMPHOSPH10ポリペプチドは、種々の目的のために使用されても良い。例えば、治療のための川崎病に罹患している患者、又は罹患している事が疑われる患者への投与である。それらは、特異的にCACNA2D3、CAMK2D、 KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10に結合する物質、特に、CACNA2D3、CAMK2D、 KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10に対する抗体のような、CACNA2D3、CAMK2D、 KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10に抗する物質のスクリーニング、若しくは生産のために使用されても良い。これらは、以下に、さらに詳細に記載される。CACNA2D3、CAMK2D、 KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10ポリペプチドの発現は川崎病の検出又は診断のために検出されても良い。
【０１５７】
“ポリペプチド”は、ペプチド結合、又は修飾されたペプチド結合によってお互いが結合された2個又はそれ以上のアミノ酸から構成されるいかなるペプチド又は蛋白、すなわちペプチド同配体にも言及する。“ポリペプチド”は、一般的にペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーとして参照される短鎖と、一般的には蛋白質として参照される長鎖の両者にも言及する。ポリペプチドは、20遺伝情報にコードされるアミノ酸以上のアミノ酸を含んでも良い。
【０１５８】
“ポリペプチド”は、翻訳後プロセッシングのような自然の過程により修飾されたアミノ酸配列、又は、当該技術分野で良く知られる化学修飾技術によって修飾されたアミノ酸配列を含む。そのような修飾は、多量の研究論文と同様に、基本書や、もっと詳くは研究書に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖と、アミノ末端又はカルボキシ末端を含むポリペプチドのどこにでも起きうる。１つのあるポリペプチドの複数箇所に、同程度、又は様々な程度に、同じタイプの修飾が存在しても良い事は当然のことである。また、あるポリペプチドに多くのタイプの修飾を含んでも良い。
【０１５９】
ポリペプチドはユビキチン化の結果、分枝しても良く、分枝の有無に関わらす環状化しても良い。環状、分枝と分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の自然のプロセスによっても良く、合成法によっても良い。修飾には、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、鉄成分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、フォスフォチヂルイノシトールの共有結合、クロスリンク、閉環、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有クロスリンクの形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、フォルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイレーション、硫酸化、アルギニン化のようなtRNAが媒介するアミノ酸の付加、ユビキチン化を含む。例えば、Proteins - Structure and Molecular Properties,2nd Ed.,T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 、及び Wold, F., Posttranslational Protein Modifications： Perspectives and Prospects、pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983； Seifter et al., “Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”, Meth Enzymol (1990) 182：626-646 and Rattan et aL, “Protein Synthesis： Posttranslational Modifications and Aging”, Ann NY Acad Sci (1992) 663：48-62.を参照。
【０１６０】
“ポリペプチド”という用語には、レトロインバーソ体Dペプチドのような当技術分野で知られる種々の合成ペプチドの誘導体を含む。ペプチドは、抗原決定基であっても良く、また／あるいはT細胞のエピトープであっても良い。ペプチドは生体内で抗原性であっても良い。ペプチドは生体内で中和抗体を誘導可能であっても良い。
【０１６１】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、又はMPHOSPH10に適用されるように、例えば、ヒトCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、又はMPHOSPH10ポリペプチドである、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、又はMPHOSPH10ポリペプチドに共通の生物学的活性のように、アミノ酸配列は、1又はそれ以上の活性を持っても良い。 例えば、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10類似体は、正常細胞に比較して川崎病の細胞では発現量が増加していても良い。特に“類似体”という用語は、結果的にアミノ酸配列がCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の活性を持つ構造及び／又は機能に関する同一性を含む。配列同一性(すなわち相同性)に関しては、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%以上であっても良い。少なくとも95%、少なくとも98%以上の配列同一性であっても良い。これらの用語は、ACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の核酸配列のアレルバリエーションであるアミノ酸由来のポリペプチドも含む。
【０１６２】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10 のようなポリペプチドの“活性”又は“生物活性”と言及される場合、これらの用語は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の代謝又は生理学的機能を言及する事を意図し、類似の活性、改善された活性、又は望ましくない副作用を減少させた活性を含む。また、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の抗原性、免疫原性としての活性も含まれる。そのような活性の例や活性の解析方法と定量方法は、当技術分野で知られており、本明細書の他の箇所に詳細に記載されている。
【０１６３】
他のポリペプチド
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3及びMPHOSPH10の相同体、変異体、誘導体及び断片も、本明細書に記載した方法と組成に有益である。
【０１６４】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10 に関する“変異体”、“相同体”、“誘導体”又は“断片”の用語は、配列から又は配列への、１(又はそれ以上)のアミノ酸のいかなる付加、欠失、置換、修飾、誘導、代替をも含む。文脈上、異なる必要がある場合を除き、“CACNA2D3”、“CAMK2D”、“KCNIP4”、“ANGPT1”、“NAALADL2”、“ZFHX3”又は“MPHOSPH10”は、場合により、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の変異体、相同体、誘導体及び断片への言及を含む。
【０１６５】
本明細書で用いられる“欠失”は、１又はそれ以上の塩基又はアミノ酸残基が失われる塩基配列又はアミノ酸配列の変化と定義される。本明細書で用いられる“挿入” 又は“付加”は、自然に生産される物質と比べて、１又はそれ以上の塩基又はアミノ酸残基の追加となる塩基又はアミノ酸配列の変化である。本明細書で用いられる“置換”は、１又はそれ以上の塩基又はアミノ酸が、異なる塩基又はアミノ酸に置き換えられた事による変化と定義される。
【０１６６】
本明細書で記載されるCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のポリペプチドは、機能的に等しいアミノ酸残基により影響がないアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換を含んでも良い。アミノ酸の置換は、アミノ酸残基の極性、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の同一性に基づいて慎重に行われても良い。例えば、負電荷のアミノ酸には、アスパラギン酸とグルタミン酸が含まれ；正電荷のアミノ酸にはリジンとアルギニンが含まれ；同程度の親水性(hydrophilicity values)を示す非電荷水溶性残基(uncharged polar head groups)のアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン。アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニンとチロシンが含まれる。
【０１６７】
保存的置換は、例えば、以下のテーブルに従ってなされても良い。第2のカラムの同じブロックで第3のカラムの同じライン上にあるアミノ酸は、相互に置き換えても良い：
【０１６８】
2010043063.tif 000005
【０１６９】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドは、さらにヘテロ(heterologous)なアミノ酸配列を構成しても良い。典型的にはN末端、又はN末端同様にC末端である。ヘテロな配列には、細胞内又は細胞外蛋白ターゲッティングに影響を及ぼす配列(リーダー配列のような)を含んでも良い。ヘテロな配列は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドの免疫原性を高める配列を含んでも良く、そして／又は、ポリペプチドの同定、抽出、そして／又は精製を容易にする配列を含んでも良い。用いても良い他のヘテロな配列には、ポリヒスチジンのようなポリアミン酸配列があり、N末端であっても良い。50アミノ酸以下の少なくとも10アミノ酸、少なくとも17アミノ酸のポリヒスチジン配列であっても良い。
【０１７０】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドは、“成熟”蛋白の形態でもよく、又は融合蛋白のような大きい蛋白の一部であっても良い。分泌配列又はリーダー配列、前駆配列(pro-sequences)、多数のヒスチジン残基のような精製を目的とした配列、又は組み換え体を生産する際の安定化のための付加的配列といった付加的アミノ酸配列を含む事は、しばしば有利である。
【０１７１】
本明細書に記載されるCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドは、既知の技術を用いた組み換え法により、有利に作られる。しかし、それらのポリペプチドは、固相合成のような当業者に周知の技術を用いた合成法によって作られても良い。そのようなポリペプチドは、例えば抽出や精製を手助けするような融合蛋白質として生産されても良い。融合蛋白質の組み合わせのパートナーの例には、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、6xHis、GAL4(DNA結合及び／又は転写活性化ドメイン)とβガラクトシダーゼを含む。融合蛋白質のパートナーと目的の蛋白配列の間に、トロンビン切断部位のような蛋白分解切断部位を含み、目的の蛋白配列から融合蛋白配列が除去されても都合が良い。融合蛋白質は、目的とする配列の蛋白機能を妨げない蛋白質であっても良い。
【０１７２】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドは、実質的に単離された形態であっても良い。この“単離”という用語は、自然の状態から人手により変化する事を意図する。“単離される”組成又は物質が自然に発生すると、元々の環境から変化若しくは除去される、又はその両者である。ここで“単離”という用語が使用される場合、例えば、生きている動物に自然に存在するポリヌクレオチド、核酸又はポリペプチドは、“単離”ではなく、自然な状態で共存している材料から分離された同じポリヌクレオチド、核酸又はポリペプチドは“単離”である。
【０１７３】
しかし、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10蛋白質は、蛋白質の意図する目的を妨げない担体又は希釈液と混合されても良く、実質的に単離と見なされるのは当然である。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドは、実質的に精製された形態であっても良く、その場合、一般的に標品中に90%以上その蛋白が含まれる。例えば、蛋白質標本の95%、98%、又は99%が、ACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドである。
【０１７４】
異なる種由来のACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10配列を並べる事により、アミノ酸配列のどの領域が異なる種間で保存されているのか(“相同領域”)、また、異なる種間でどの領域が多様なのか(“ヘテロ領域”)を決定する事ができる。ACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドは、従って、少なくとも相同領域の一部に当たる配列を含んでも良い。相同領域は、少なくとも2種間で高い相同性を示す。例えば、相同領域は、上述のテストを用いたアミノ酸レベルにおいて、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性を示しても良い。相同領域に当たる配列を含むペプチドは、以下に詳細を説明するように、治療戦略に用いられても良い。又は、ACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ペプチドは、少なくともヘテロ領域の一部に当たる配列を含んでも良い。ヘテロ領域は、少なくとも2種間で低いホモロジーを示す。
【０１７５】
相同体(Homologues)
使用のために開示されるCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドは、それ自身の変異体や誘導体と同様に、例えば、関連するウイルス／微生物蛋白質、細胞の相同配列と合成ペプチドから得られた相同配列を含む。従って、ポリペプチドは、ホ乳類(例えば、マウス、ラット又はラビット)、特に霊長類、さらに特にヒトのような動物を含む他の種由来のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の相同体をコードするポリペプチドも含む。
【０１７６】
本明細書では、相同配列は、少なくともアミノ酸レベルで95、98%相同であると同様に、少なくとも15、20、 25、30、40、50、60、70、80 又は 90%相同であるアミノ酸配列を含むとする。 例えば、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10配列と、少なくとも50 又は100、110、115、120、125、130、135、140、141、142、143、144、145、146、147、148又は149アミノ酸以上相同である配列を含むとする。
【０１７７】
特に、相同性は、典型的には、非必須の配列と言うより、蛋白機能に必須である事が知られる配列の領域に関して考察されるべきである。この事は、遠縁の生物種由来の相同配列を考察する際に特に重要である。例として、ヒトCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10蛋白質の95番目の、又はそれに相当するシステインと、その周囲のアミノ酸残基が挙げられる。そのシステインは脱リン酸化機能に必須である事が示されている。
【０１７８】
相同性は、シミラリティ(similarity)(例えば化学的性質／機能が似ているアミノ酸残基)の意味で考察される事もあるが、本明細書では、ホモロジーは、配列の同一性の意味で使用されても良い。
【０１７９】
相同性の比較は目で確認できるが、もっと一般的には、既に使用可能な配列比較プログラムを使用する。公共と販売されているコンピュータープログラムで、２又はそれ以上の配列間の同一性%を計算できる。
【０１８０】
相同性%は、近接する配列を超えて計算されても良い。例えば、ある配列と他の配列を並べ、ある配列の個々のアミノ酸を、他の配列の相当するアミノ酸と、１アミノ酸ずつ比較する。これは、“アンギャップド(ungapped)”アラインメントと呼ばれる。典型的には、そのようなアンギャップド  アラインメントは、比較的短鎖(例えば50アミノ酸以下)でのみ行われる。
【０１８１】
アンギャップド  アラインメントは、とても単純で矛盾のない方法である。しかし、別の方法で相同配列ペアになる場合でも、１アミノ酸の挿入や欠失が、それに続くアミノ酸のアラインメントを狂わせる。その結果、全体のアラインメントを見ると、相同性%の大幅な低下を招く事がある。結果的に、全体の相同性スコアに過度なペナルティを与える事なしに、挿入や欠失の可能性を考慮した最適なアラインメントを行えるよう多数の配列比較方法がデザインされた。局所的な同一性と類似性を最大化するように、配列アラインメントに“ギャップ”を挿入する事で達成された。
【０１８２】
より複雑な方法では、次のようなアラインメントとなるように各ギャップに“ギャップペナルティー”を割り当てる；同一のアミノ酸が同数の場合、可能な限りギャップが少ない配列アラインメント−２つの配列間の相同性がより高く反映される−が、多数のギャップを挿入した配列アラインメントより高いスコアとなるようなアラインメント。“アフィンギャップコスト”は、典型的には、ギャップに対して比較的高いコストと、ギャップ内の各残基には小さいペナルティを課す。これは、最も一般的なギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、勿論ギャップの少ない最適なアラインメントを構築する。多数のアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを変えられる。しかし、配列比較用のソフトウェアを使用する場合、デフォルトの設定を用いても良い。例えば、GCGウィスコンシン  ベストフィット  パッケージ(GCG Wisconsin Bestfit package)(以下参照)を使用する場合、アミノ酸配列用のデフォルトのギャップペナルティーは、ギャップに対して-12で、各伸張に対して-4である。
【０１８３】
最大ホモロジー%の計算は、まず、ギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの構築が必要である。そのようなアラインメントを実現する最適なコンピュータープログラムがGCGウィスコンシン  ベストフィット  パッケージ(米国ウィスコンシン大学； Devereux ら、1984、Nucleic Acids Research 12：387)である。配列比較に限定されないが配列比較が可能な他のソフトウェアの例として、BLASTパッケージ(Ausubelら、1999 同書 Chapter 18)、FASTA(Altschul ら.、1990、J. Mol. Biol.、403-410)があり、また、ジーンワークス(GENEWORKS)が比較ツールに適している。BLASTとFASTAは、オフラインとオンライン検索で活用できる(Ausubelら.、1999 同書、pages 7-58 to 7-60参照)。GCGベストフィットプログラムを使用しても良い。
【０１８４】
最終的なホモロジー%は、同一性の点で計算されるが、アラインメントの過程は、典型的には、全か無かのペア比較に基づかない。化学的類似性又は進化的距離に基づくペア比較にスコアを割り当てる類似性スコアマトリックスが一般的には使用される。そのような一般的に使用されるマトリックスの例として、BLAST用のデフォルトマトリックスであるブロッサム(BLOSUM)62マトリックスがある。GCGウィスコンシンプログラムは、一般的に、公共のデフォルトマトリックスも、供給されるならカスタムの記号比較テーブル(custom symbol comparison table)のどちらも使用できる(さらに詳細はユーザーズマニュアル参照)。GCGパッケージのために、公共のデフォルトマトリックスが使用されても良く、または、他のソフトウェアの場合にブロッサム62のようなデフォルトマトリックスが使用されても良い。
【０１８５】
ソフトウェアが最適なアラインメントを構築すると、配列同一性%と同様に、ホモロジー%を計算できる。ソフトウェアは、典型的には、このように配列比較を行い、膨大な結果を作り出す。
【０１８６】
アミノ酸配列に関する“変異体”と“誘導体”の用語は、実質的に変更されていない配列と同等の活性を維持すれば、配列への、又は配列からの、１(又はそれ以上)のアミノ酸の、いかなる置換、変位、修飾、代替、欠失、付加も含む。例えば、少なくともCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドと同等の活性を持つようにである。
【０１８７】
本明細書で開示されるCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のアミノ酸配列を持つポリペプチド、又は断片又は相同体は、本明細書で記載される方法と組成の使用のために改変されても良い。典型的には、配列の生物活性を維持する改変がなされる。アミノ酸の置換は、改変された配列が未改変の配列の生物活性を維持するように、例えば、1、2、3、10、20又は30アミノ酸の置換が行われても良い。また、修飾は、ここに記載されるポリペプチドの１又はそれ以上の機能ドメインを故意に失活させても良い。アミノ酸の置換は、例えば、治療用ポリペプチドの血中半減期を引き延ばす人工的アナログの使用を含んでも良い。
【０１８８】
断片
本明細書に記載される方法と組成に使用するためのポリペプチドは、前述のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のどのポリペプチドの全長配列の断片を含んでも良い。断片は、少なくとも１つのエピトープから構成されても良い。エピトープを同定する方法は、当技術分野において周知である。断片は、典型的には、少なくとも6アミノ酸、少なくとも10、20、30、50、100アミノ酸で構成される。
【０１８９】
断片は、以下から構成される又は以下を含む；CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10由来の、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145又はそれ以上のアミノ酸残基。
【０１９０】
さらに、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドの一部を構成するペプチドを記載する。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の断片と相同体、変異体、誘導体が含まれる。ペプチドは、長さ2から200アミノ酸の間、4から40アミノ酸の間であっても良い。ペプチドは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドに由来しても良く、例えば、トリプシンの様な適当な酵素で消化して得ても良い。又は、ペプチド、断片などは、組み換え法又は合成法によって作られても良い。
【０１９１】
そのような断片は、例えば、そのような断片に対する抗体を通して、関連するポリペプチドの発現を検出するためのプローブを製造するために使用しても良い。これらの抗体は特異的にポリペプチドに結合する事が期待され、本明細書に記載される診断や治療の方法に有効である。
【０１９２】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10と、その断片、相同体、変異体は、組み換え技術によって作成されても良い。しかし、それらは、固相合成のような当業者に周知の技術を用いた合成法によって作成されても良い。そのようなポリペプチドは、例えば抽出や精製を手助けするような融合蛋白質として生産されても良い。融合蛋白質の組み合わせのパートナーの例には、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、6xHis、GAL4(DNA結合及び／又は転写活性化ドメイン)とβガラクトシダーゼを含む。融合蛋白質のパートナーと目的の蛋白配列の間に、蛋白分解切断部位を含み、融合蛋白配列が除去されても都合が良い。融合蛋白質は、目的とする配列の蛋白機能を妨げない蛋白質であっても良い。蛋白質は、動物細胞の細胞抽出液の精製によって得ても良い。
【０１９３】
本明細書で開示されるCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチド、変異体、相同体、断片及び誘導体は、実質的に単離された形態であっても良い。そのようなポリペプチドは、蛋白質の意図する目的を妨げない担体又は希釈液と混合されても良く、実質的に単離と見なされるのは当然である。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10変異体、相同体、断片又は誘導体は、実質的に精製された形態であっても良く、その場合、一般的に標品中に90%以上その蛋白が含まれる。例えば、蛋白質標本の95%、98%、又は99%が、目的の蛋白質である。
【０１９４】
本明細書で開示するCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチド、変異体、相同体、断片及び誘導体は、ラベルで標識されても良い。ラベルは、ポリペプチドなどを検出するのに適当などのようなラベルでも良い。適当なラベルには、125Iなどの放射性同位体、抗体、ポリヌクレオチドとビオチンなどのリンカーを含む。標識されたポリペプチドは、試料中のポリペプチドを定量する免疫アッセイのような診断方法に用いられても良い。ポリペプチド又は標識ポリペプチドは、ヒトや動物の体内の免疫交差性を検出するために、標準的なプロトコルを用いた血清又は細胞を使用した免疫アッセイに使用されても良い。
【０１９５】
本明細書で開示するCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチド、変異体、相同体、断片及び誘導体、選択肢として標識されたそれらは、例えば、免疫アッセイのウェル又はディップスティックの表面といった固相に固定しても良い。そのような標識及び／又は固定をしたポリペプチドが、適当な試薬、コントロール、使用説明書と必要に応じた物と共に、適当な容器にキットとしてパッケージされても良い。そのようなポリペプチドとキットは、ポリペプチド、アレルの変異、種の変異に対する抗体を、免疫アッセイで検出するために使用されても良い。
【０１９６】
免疫アッセイの方法は当技術分野において周知であり、一般的には次のように構成される：(a)目的の蛋白質に対する抗体に結合するエピトープからなるポリペプチドを供する；(b)抗原-抗体複合体が形成される条件で、ポリペプチドと生物試料をインキュベートする；(c)ポリペプチドを含む抗原-抗体複合体が形成されているか決定する。
【０１９７】
本明細書で開示するポリペプチド、変異体、相同体、断片及び誘導体は、応答遺伝子の役割や、病的機能を含む細胞機能上の相同体の役割を研究する目的で、インビトロ又はインビボ細胞培養系で使用されても良い。例えば、細胞内の正常機能を破壊するために、切断した又は改変したポリペプチドを細胞内に導入しても良い。ポリペプチドは、組み換え発現ベクター(下記参照)からインサイチュで発現させる事によって、細胞内に導入しても良い。発現ベクターには、ポリペプチドの発現を調節するための誘導プロモーターを持っているベクターもある。
【０１９８】
組み換え体産物に最適な生物活性を付与する必要がある時には、昆虫細胞やホ乳類細胞のような適切なホスト細胞を使用する事で、翻訳後修飾(例えば、ミリストイル化、グリコシル化、切断、ラピデーションや、チロシン、セリン、スレオニンのリン酸化)を供給する事が期待される。ポリペプチド、変異体、相同体、断片又は誘導体を発現するそのような細胞培養系は、細胞内でそのポリペプチド機能を妨げる、又は強化する物質候補を同定するアッセイ系として使用しても良い。
【０１９９】
核酸
本明細書で記載する方法と組成は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリヌクレオチド、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ヌクレオチド、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸、それらの変異体、相同体、誘導体と断片の発現レベルを検出する手段として使用しても良い。加えて、診断法に活用できる特別な断片を開示する。これらの核酸は、治療や予防に使用しても良い。
【０２００】
“ポリヌクレオチド”、“ヌクレオチド”と“核酸”の用語は、相互に入れ替え可能で、cDNAとゲノム配列の両者を含むと理解されるべきである。これらの用語には、関連するポリペプチド及び／又は、それらの断片、誘導体、相同体又は変異体をコードする核酸配列も含まれる。
【０２０１】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸について言及される場合、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸ファミリーのいずれかのメンバーに言及するのは当然である。また、下記の“他の核酸配列”として提示される核酸配列の任意の1又はそれ以上も含まれる。
【０２０２】
本明細書に記載する核酸は、種々の目的に使用しても良い。例えば、川崎病患者、又は川崎病が疑われる患者に、治療を目的として投与する目的である。その核酸の発現は、川崎病の検出又は診断のために検出されても良い。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸は、対応するポリペプチドの発現又は産生を目的に使用されても良い。
【０２０３】
“ポリヌクレオチド”は、一般的に、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシヌクレオチドを指し、改変されていないRNA若しくはDNA、又は改変されたRNA若しくはDNAであっても良い。“ポリヌクレオチド”は以下の物を含む；限定されない1本鎖と2本鎖DNA、1本鎖と2本鎖領域の混合であるDNA、1本鎖と2本鎖RNA、1本鎖と2本鎖領域の混合であるRNA、1本鎖又は一般的には2本鎖若しくは1本鎖と2本鎖領域の混合であるDNAとRNAを含むハイブリッド分子。加えて、“ポリヌクレオチド”は、DNA又はRNA又はDNAとRNAの両者を含む3本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドの用語は、1又はそれ以上の改変された塩基を含むDNA又はRNAと、安定性又は他の理由により改変された骨格を持つDNA又はRNAも含む。“改変された”塩基は、例えば、トリチル化された塩基とイノシンのような一般的でない塩基を含む。種々の改変がDNAとRNAに加えられてきた；従って“ポリヌクレオチド”は、ウイルスや細胞のDNAやRNAの化学的形態と同様に、自然に見られるポリヌクレオチドを化学的、酵素的、代謝的に改変した形態を包含する。“ポリヌクレオチド”は、オリゴヌクレオチドと呼ばれる短鎖のポリヌクレオチドも包含する。
【０２０４】
遺伝子コードの縮重の結果、多数のヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードする事は、当業者には当然のことである。
【０２０５】
本明細書で用いられる“ヌクレオチド配列”の用語は、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、そして、変異体、相同体、断片若しくは誘導体の配列(その一部も同様)を指す。ヌクレオチド配列は、センス、アンチセンス又はその組み合わせによらず、1本鎖又は2本鎖のゲノム、合成の、又は組み換え体由来のDNA又はRNAであっても良い。ヌクレオチド配列は、組み換えDNA技術の使用によって調整されても良い(例えば、組み換えDNA)。
【０２０６】
“ヌクレオチド配列”は、DNAを意味しても良い。
【０２０７】
他の核酸
本発明者らは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の核酸の断片、相同体、変異体、又は誘導体も提供する。“誘導体”、“相同体”又は“断片”の用語は、関連するヌクレオチド配列から又は関連するヌクレオチド配列への、1又は(それ以上)の核酸の付加、欠失、代替、修飾、変異、又は置換を含む。文脈に他を認めない限り、“CACNA2D3”、“ CAMK2D”、“ KCNIP4”、“ ANGPT1”、“NAALADL2”、“ ZFHX3”と“ MPHOSPH10”は、変異体、相同体、誘導体と断片を含む。
【０２０８】
それらのヌクレオチド配列は、１又はそれ以上の関連する活性を持つポリペプチドをコードしても良い。“相同体”は、同様の活性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のように、構造及び／又は機能に関して同一性をカバーする物であっても良い。例えば、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の相同体などは、正常細胞に比べて川崎病細胞で発現が増加していても良い。配列同一性(すなわち相同性)に関しては、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%の配列同一性であっても良い。関連する配列に、少なくとも95%、少なくとも98%の配列同一性であっても良い。これらの用語は、その配列のアレル変異体を包含しても良い。
【０２０９】
変異体、誘導体と相同体
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の核酸の変異体、断片、誘導体と相同体は、DNA又はRNAを含んでも良い。それらは、1本鎖又は2本鎖であっても良い。それらは、合成又は改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであっても良い。多数のタイプのオリゴヌクレオチドの改変が当技術分野で知られている。改変には、メチルフォスフォナート骨格、フォスフォロチオエート骨格、3'及び／又は5'末端へのアクリジン又はポリリジン鎖の付加を含む。本明細書の目的において、ポリヌクレオチドは、当技術分野で活用されるいかなる方法によって改変されても良いことは当然である。そのような改変は、ポリヌクレオチドのインビボ活性の寿命を強化する目的で実現されても良い。
【０２１０】
ポリヌクレオチドが2本鎖の場合、1本鎖ずつ又は組み合わせで両方の鎖が、本明細書に記載する方法と組成に包含される。ポリヌクレオチドが1本鎖の場合、それに相補的な配列も含むことは当然である。
【０２１１】
ヌクレオチド配列に関する“変異体”、“相同体”、又は“誘導体”は、その配列から、又はその配列への１(又はそれ以上)の核酸の付加、欠失、代替、修飾、変異、置換を含む。そのような変異体、相同体、又は誘導体は、生物活性を持つポリペプチドをコードしても良い。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のそのような断片、相同体、変異体と誘導体は、上記のように改変された活性を持っても良い。
【０２１２】
上記のように、配列同一性に関して、“相同体”は、関連するCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10配列に、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の同一性を持っても良い。
【０２１３】
少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一でであっても良い。ヌクレオチド同一性の比較は、上記のように行われても良い。使用されても良い配列比較プログラムは、上記のGCGウィスコンシンベストフィットプログラムである。デフォルトスコアマトリックスは、同一のヌクレオチドに10、ミスマッチに-9のマッチバリューである。デフォルトギャップペナルティーは、-50で、デフォルトギャップ伸張ペナルティーは、1塩基あたり-3である。
【０２１４】
ハイブリダイゼーション
さらに、以下の配列に選択的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を記載する；本明細書で記載する配列、その変異体若しくは断片若しくは誘導体、又はその配列に相補的な配列。ヌクレオチド配列は、少なくとも長さ20、30、40、50ヌクレオチドと同様に、少なくとも長さ15ヌクレオチドであっても良い。
【０２１５】
本明細書で使用する“ハイブリダイゼーション”の用語は、ポリメラーゼチェーンリアクション技術で実行される増幅の過程のように“塩基対を通して、核酸の鎖が、相補的な鎖と結合するプロセス”を含む。
【０２１６】
本明細書に提示する配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列は、対応するヌクレオチド配列に対して、少なくとも40% 、少なくとも45% 、少なくとも50% 、少なくとも 55% 、少なくとも60% 、少なくとも65% 、少なくとも70% 、少なくとも 75% 、少なくとも80%  、少なくとも85% 、少なくとも90% 、少なくとも95%類似していても良い。そのようなポリヌクレオチドは、一般的に、25又は30ヌクレオチドのように、20ヌクレオチド以上の領域で−例えば40、60、100又はそれ以上の連続したヌクレオチド、対応するヌクレオチド配列に、少なくとも70%、少なくとも80%若しくは90%、少なくとも95%若しくは98%の類似性であっても良い。
【０２１７】
“選択的にハイブリダイズする”とは、標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドより有意にハイブリダイズする条件で、プローブであるポリヌクレオチドが使用される事を意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングしているcDNAライブラリーやゲノムライブラリーに存在する他のオリゴヌクレオチドが原因で起きる。この現象でのバックグラウンドは、ライブラリー中の非特異的DNAとプローブとの間の相互作用によって発生するシグナルレベルを意味しており、標的DNAとの特異的相互作用の100分の１以下であると同様に、10分の1以下の強度である。相互作用の強度は、例えば、32P 若しくは33Pといった放射性標識プローブによって、又は非放射性プローブ(例えば蛍光色素、ビオチン又はジゴキシゲニン)で測定しても良い。
【０２１８】
ハイブリダイゼーション条件は、核酸複合体の解離温度(Tm)に基づく。核酸複合体の解離温度は、Berger とKimmel (1987、Guide to Molecular Cloning Techniques、Methods in Enzymology、Vol 152、Academic Press、San Diego CA)で知ることができる。また、核酸複合体の解離温度は、以下で説明するように、明確な“ストリンジェンシー(stringency)”を授与するものである。
【０２１９】
最大のストリンジェンシーは、一般的には約Tm-5℃ (プローブのTmより5℃低い温度)；高いストリンジェンシーは、Tmより約5℃から10℃低く；中間のストリンジェンシーはTmより約10℃から20℃低く；低いストリンジェンシーはTmより約5℃から10℃低い温度で達成される。当業者には明らかなように、最大のストリンジェンシーによるハイブリダイゼーションは、同一のポリヌクレオチドを同定又は検出するために使用され、中間(又は低い)ストリンジェンシーによるハイブリダイゼーションは、類似の又は関連のあるポリヌクレオチド配列を同定又は検出するのに使用される。
【０２２０】
本発明者らは、あるストリンジェンシーの条件下(例えば65℃ and 0.1xSSC (1xSSC = 0.15 M NaCl、0.015 M Na3 Citrate pH 7.0))で、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の核酸、断片、変異体、相同体、又は誘導体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を提供する。
【０２２１】
相同体、変異体と誘導体の作成
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の配列と100%同一ではないが、それらが含まれるポリヌクレオチドは、相同体、変異体と誘導体と同様に多数の方法で得る事ができる。その配列の変異体は、例えば、異なる集団由来の個体からなる幅広い個体由来のDNAライブラリーから釣る事によって得られる。例えば、そのような相同体は、他の個体又は他の種から同定されても良い。さらに、核酸とポリヌクレオチドの組み換え体は、その相同体の対応する位置を同定して作成されても良く、本明細書の他の箇所に記載されるように、その分子を合成して作成しても良い。
【０２２２】
それに加えて、ウイルス／バクテリア、又は細胞の相同体、特にホ乳類細胞の相同体(例えばラット、牛、霊長類の細胞)を得ても良く、そのような相同体と断片は、一般的にヒトCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10と選択的なハイブリダイズが可能である。そのような相同体は、ヒト以外の核酸、断片、変異体と相同体をデザインするのに使用されても良い。さらに変異体を得るために、当技術分野で知られる方法でミュータジェネシスが行われても良い。
【０２２３】
そのような相同体の配列は、他の動物種由来のcDNAライブラリー又はゲノムDNAライブラリーをプロービング(probing)して得ても良く、ここに記載する核酸、断片、変異体、相同体、若しくは他の断片の一部若しくは全体を含むプローブで、そのようなライブラリーを、中から高程度のストリンジェンシーでプロービングする事によって得ても良い。
【０２２４】
同様の考察が、本明細書に開示するポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の種相同体とアレル変異体に適用される。
【０２２５】
変異体や系統／種の相同体は、ディジェネレートPCR (degenerate PCR)によって得ても良い。ディジェネレートPCRは、保存されたアミノ酸配列をコードする相同体と変異体の核酸配列を標的とするプライマーを使用する方法である。保存された配列は、例えば、数種類の変異体／相同体由来のアミノ酸配列を並べる(aligning)事で予測できる。配列のアライメントは、当技術分野で知られるコンピューターソフトウェアを使用して実行可能である。例えば、GCGウィスコンシンパイルアッププログラムが広く使用されている。
【０２２６】
ディジェネレートPCRで使用されるプライマーは、１又はそれ以上の縮重した位置を含む。そのプライマーは、既知の配列に対する1種類の配列のプライマーで行うクローニングより、低いストリンジェンシー条件で使用する。遠縁の生物由来の配列間の全体的なヌクレオチド類似性はとても低い事が多く、従って、このような状態においては、関連する配列の標識断片でライブラリーをスクリーニングするより、ディジェネレートPCRが選択すべき方法であることは、当業者には当然のことである。
【０２２７】
加えて、相同配列は、BLASTプログラムのような検索アルゴリズムを使用した核酸データベース及び／又は蛋白質データベースを検索することにより、同定しても良い。
【０２２８】
あるいは、そのようなポリヌクレオチドは、例えば、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸、又はその変異体、相同体、誘導体、又はその断片といった、特徴の知られる配列のサイトディレクティッドミュータジェネシス(site directed mutagenesis)によって得ても良い。例えば、ポリヌクレオチド配列を発現する特定の宿主細胞におけるコドンの嗜好性を最適化する目的で、サイレントコドン変化が必要とされる場合に、この方法は便利である。他にも、制限酵素認識サイトを導入する目的や、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの性質又は機能を変える場合に、配列の改変が望まれる。
【０２２９】
本明細書に記載するポリヌクレオチドは、プライマー(例えば、増幅反応用のPCRプライマー)や、プローブ(放射性又は非放射性標識体を使用して従来法により標識する)を作成するために使用しても良い。また、ポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングしても良い。プライマー、プローブ、断片は、少なくとも長さ20ヌクレオチドのように、少なくとも8、9、10、15ヌクレオチドであり、例えば、少なくとも長さ25、30、40ヌクレオチドである。またそれらは、ここで用いられる“ポリヌクレオチド”の用語に包含される。
【０２３０】
DNAポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドとプローブは、組み換え技術によって、合成によって、又は当技術分野で活用可能ないかなる方法によって作成されても良い。それらは、標準的技術によってクローン化されても良い。
【０２３１】
一般的にプライマーは、一度に1ヌクレオチドずつ目的の核酸配列を段階的に製造する合成法によって作成される。これを行う自動技術は、当技術分野ですでに活用されている。
【０２３２】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の断片を含むプライマーは、川崎病に伴う発現の上昇のような関連遺伝子の発現を検出する方法に特に有用である。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の増幅に適したプライマーは、関連する核酸のどの適当な部分から作成されても良い。使用されても良いプライマーは、特定の核酸配列を増幅できるプライマーを含む。
【０２３３】
そのようなプライマーは単独で供給されてもよいが、フォワードプライマーとリバースプライマーを含むプライマーペアとして供給されるのが、最も有用である。
【０２３４】
より長いポリヌクレオチドは、一般的に、PCR(ポリメラーゼチェーンリアクション)クローニング技術のような組み換え技術を用いて作成される。この技術は以下の工程を含む；プライマーペアの作成(例えば約15から30ヌクレオチド)、動物又はヒト細胞由来のcDNA又はmRNAと、プライマーとの接触、望む領域が増幅される条件でのポリメラーゼチェーンリアクションの実行、増幅された断片の単離(例えばアガロースゲル上での反応液の精製)と増幅されたDNAの回収。増幅したDNAを適当なクローニングベクターにクローニングできるよう、適当な制限酵素認識サイトを含むようデザインしても良い。
【０２３５】
ポリヌクレオチド又はプライマーは標識されても良い。適当な標識には、32P 又は35Sのような放射性同位体、ジゴキシゲニン、蛍光色素、酵素標識、又はビオチンのような他の蛋白標識を含む。そのような標識は、ポリメラーゼ又はプライマーに付加されても良く、また、既知の技術によって検出されても良い。標識された、又は未標識のポリヌクレオチド、プライマー又は断片は、当業者によって、ヒト又は動物の体内のポリヌクレオチドの検出又はシークエンシングを目的とする核酸ベースの試験に使用されても良い。
【０２３６】
検出のためのそのような試験では、ハイブリダイズする条件で、ポリヌクレオチド又はプライマーを含むプローブと、DNA又はRNAを含む生物試料とを接触させる工程を含み、試料中の核酸とプローブで形成された2本鎖を検出する工程を含む。検出は、PCRのような技術を用いて行っても良い。又は、固相支持体にプローブを固定して、プローブにハイブリダイズしない核酸を除去し、プローブにハイブリダイズした核酸を検出しても良い。あるいは、試料中の核酸を固相支持体に固定しても良く、その支持体に結合するプローブの量を検出する事ができる。この、又は他の形式の適当なアッセイ方法は、例えばWO89/03891 とWO90/13667で調べる事ができる。
【０２３７】
例えば、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸のようなヌクレオチドをシークエンシングする試験は、以下の工程を含む；ハイブリダイズする条件で、ポリヌクレオチド又はプライマーを含むプローブと、標的DNA又は標的RNAを含む生物試料とを接触させ、例えばサンガーダイデオキシチェーンターミネーション法(Sanger dideoxy chain termination method) (Sambrook et al.参照)によって配列を決定する。
【０２３８】
そのような方法は、適当な試薬の存在下で、標的DNA又は標的RNAの相補鎖の合成によってプライマーを伸長し、選択的に1又はそれ以上のA、C、G、T/U残基で伸長反応を停止する；鎖の伸長と停止反応を起こし；サイズによって伸長産物を分離して、選択的に停止した部位のヌクレオチドの配列を決定する。適当な試薬には、DNAポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドdATP、dCTP、dGTP、dATP、緩衝液とATPを含む。ダイデオキシヌクレオチドが選択的停止のために使用される。
【０２３９】
調節領域
幾つかの目的のために、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の調節領域を調べて利用する事が必要となるかもしれない。調節領域は、プロモーター、エンハンサーと部位調節領域を含む。調節領域とは、操作上関連するコード領域の発現を調節できる核酸の配列又は構造を意味する。
【０２４０】
例えば、調節領域は、関連遺伝子を発現しているトランスジェニック動物を作成するのに有用である。さらに、調節領域は、そのような発現のための発現コンストラクトを作成するために使用しても良い。これについては、詳細に以下に記載する。
【０２４１】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の調節領域の同定は簡単で、多数の方法で実行されうる。例えば、ヒト又はマウスのcDNA配列をプローブとしてcDNAライブラリーのスクリーニングを行い、ある生物の関連遺伝子のコード配列を得ることができる。適当なゲノムライブラリーのスクリーニングによって、又は、当技術分野で知られるプライマー伸長法によって5'配列を得ても良い。ゲノムデータベースの検索を行っても良い。特に関心ある5'配列は、非コード領域を含む。プロモーター及び／又はエンハンサー領域の存在を示すモチーフ配列を見出すために、5'領域は目で調べてもよく、又はコンピュータープログラムを用いても良い。
【０２４２】
さらに、2種類又はそれ以上の生物由来の関連する核酸配列の配列アラインメントを行っても良い。異なる種由来のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10配列のアラインメントによって、アミノ酸配列のどの領域が、異なる種間で保存されているか決定する事ができる。そのような保存された領域は、問題の遺伝子の調節領域を含んでいる事がよくある。本明細書で開示されるマウスとヒトのゲノム配列、例えば、あるマウスのゲノム配列はこの目的に使用されても良い。マウスとヒトの配列から作成された適当なプローブを用いた標準的なスクリーニング方法により、他の生物からの相同体を得ても良い。フグ(Takifugu rubripes)又はゼブラフィッシュのゲノムは、相同体を同定するためにスクリーニングされても良い。フグ又はゼブラフィッシュの遺伝子の5'領域と、マウス又はヒトゲノム配列との比較は、調節領域を含む保存領域の同定に使用されても良い。デリーション研究が、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のプロモーター及び／又はエンハンサー領域を同定するために行われても良い。
【０２４３】
推定された調節領域の同一性は、配列候補をレポーター遺伝子に連結してレポーターの発現を検出すsubjectiveる分子生物学的実験によって確認されても良い。
【０２４４】
治療と診断
この文献で使用される“治療する(treatment)”又は“治療(treating)”という用語は、障害、病態、状態の治療の成功の兆候、緩和又は改善を含み、以下のような客観的、主観的パラメーターを含む；減退；寛解；症状の縮小、又は障害、病態、状態が患者にとってより我慢し易くなる事；変性や衰えの速度が遅くなる事；変性の到達点の軽減；患者の生理学的又は精神的健康の改善；又は、ある状態では、川崎病のような疾患の発症の予防。
【０２４５】
“診断する(diagnose)”又は“診断(diagnosis)”の用語が本明細書で使用される場合、性質の決定、又は状態(疾患)の同定を意味する。診断は、疾患の重症度の決定を伴っても良い。“兆候(prognostic)”又は“予後(prognosis)”は、臨床検査の結果と観察に基づき、生存機会を宣告するといった、疾患の臨床、又は予後を予測する事を意味しても良い。“素因”は、ある疾患への感受性、又は、診断され易さを意味しても良い。
【０２４６】
一般的に、診断は、医学的に関連する状態の有無に関するある種の評価を含んでいてもよい。従って診断は、以下のような過程を含んでいて良い；医学的に関連する状態の素因のスクリーニング、医学的に関連する状態の前兆のスクリーニング、医学的に関連する状態のスクリーニング、医学的に関連する状態の臨床的病理学的診断など。診断は、細胞学的、組織学的、生化学的、分子生物学的レベルを検出するといった、ある状態の試験を含んで良い。それらの試験は、ヒトの健康及び／又は体に有益かもしれない。そのような試験には、例えば、医学的診断方法とライフサイエンス研究を含んで良い。本発明の実施態様では、例えば疾患のような医学的に関連する状態の診断方法に使用される。そのような疾患は、例えば、細胞又は組織の非野生型増殖によって特徴付けられる異常を含みうる。
【０２４７】
検出と診断の方法
遺伝子多型の検出
遺伝子多型又は突然変異を調べる目的でDNAを分析するために、幾つかの方法が使用されている。最も信頼のおける方法は、DNAシークエンスを行い、実際の塩基配列を決定する事である(Maxam and Gilbert、1977； Sanger et al.、1977)。そのような方法は最も信頼がおけるが、最も高価で時間がかかる方法である。
【０２４８】
制限酵素解析も、遺伝子多型を目的としたDNA分析に使用されても良い。もし、制限酵素の認識部位を変化させる既知の遺伝子多型を探すなら、この制限酵素でDNAを切断してゲルで断片を解析するか、サザンブロットを行うかによって、簡単に、多型の有無を決定する事ができる。このタイプの解析は、全体として挿入又は欠失の有無を決定するためにも有用である。アレル特異的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションも、未だに既知の遺伝子多型の存在を決定するための方法である。
【０２４９】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10をコードする遺伝子など、特定のDNA配列は、DNA配列の欠失、重複した配列の挿入、配列の反転、又は単一ヌクレオチドの置換など多数の種々の変化が起きる。特定のDNA配列の変化は、4-6ヌクレオチドの特異的なDNA配列を認識する制限酵素を使用して調べても良い。制限酵素は、特異的に認識する配列でDNAを切断(消化)する。その結果、多数の断片となる。酵素で認識される配列が認識されない配列に変化するといった違いが存在する場合、その領域の切断によって生じるDNA断片が異なるサイズとなる。従って、ある領域の種々の断片サイズは、その領域の正確なDNA配列に依存する。断片産物の多様性は、“制限酵素断片長遺伝子多型(RFLP)”と呼ばれる。異なるDNA配列バリアントを反映する異なるサイズの断片は、消化DNAをアガロースゲルでサイズにより分離して、放射性標識DNA“プローブ”にアニーリングする事によって個々の断片を可視化しても良い。1個体は、2種類の型の特異的配列を持つかもしれない。2種類の相同体が同一の型である場合、1本のバンドが検出される。集団中の特定のDNAマーカーには、2種類以上の多型が存在するが、1家族には、4種類の型の可能性があるのみである；片方の親から2種類の可能性である。各子供は、各親から1種の型を受け継ぐ。従って、各染色体領域の由来は突き止められうる(母由来又は父由来)。
【０２５０】
さらには、RT-PCRの後に制限酵素フィンガープリンティング(REF)が行われても良い。REFは、1本鎖コンフォメーション多型(SSCP)法の変法であり、長さ2KbまでのDNA断片の配列変化を効果的に検出できる(Liu and Sommer、1995)。
ある遺伝子内の遺伝子多型を決定するための質量分析法が、米国特許第5,869,242号に開示されている。
【０２５１】
1本鎖コンフォメーション多型(SSCP)解析は、迅速で多型を検出するには効果的な方法である(Dean et al., Cell 61：863, 1990； Glavac and Dean, Hum. Mutation 2：404, 1993； Poduslo et al., Am. J. Hum. Genet. 49：106, 1992)。SSCPでは、DNA鎖のゲル上での異常な移動度は、遺伝子突然変異を伴っている。
【０２５２】
遺伝子多型解析は、以下の米国特許に詳細に開示されている； 5,552,28、5,654,13、5,670,33、5,807,67、5,858,66、5,691,15、5,922,57、5,972,60、6,136,53、5,955,26など。
【０２５３】
上記参考文献に記載されているこれらのいずれの方法も、本発明の診断方法に使用されても良い。
【０２５４】
連鎖不平衡解析
連鎖不均衡(LD)解析は、疾患遺伝子のマッピングに強力なツールであり、特に複雑な特徴を調べるのに有用であるかもしれない。LDマッピングは、次の予想に基づく：ある集団内のどの2人についても、数世代に渡って起きる遺伝子の組み換えは、ゲノムをシャッフルすると推測され、そのため、祖先とはほとんど共通しない。しかし、もし、この2人が共通の祖先由来の遺伝性疾患に罹患しているとしたら、疾患遺伝子とその周囲のマーカーは、祖先から変化しないで、又はIBD(“同一祖先由来”)で受け継がれる。共有(IBDなど)している領域のサイズは、その患者らとその共通の祖先の間の世代数に逆相関する。従って、“古い”集団は、精密マッピング(fine scale mapping)に適しており、最近明らかになった事は、疾患遺伝子をおおざっぱに位置づけるためにはLDを使用する事が適切であるという事である(Houwen et al.、1994、特にFIG. 3 とその説明文書)。孤立した集団は、典型的には少数の祖先を持っているので、フィンランドで行われた幾つかのLD研究成功例によって示唆されたように、孤立した集団は、特にLDによるアプローチに適している(de la Chapelle、1993)。
【０２５５】
LD解析は、数種のポジショナルクローニングの試みで用いられてきた(Kerem et al.,1989； MacDonald et al.,1992； Petrukhin et al.,1993； Hastbacka et al.,1992 and 1994)。しかし、どのケースも最初の位置決めは従来の連鎖法を用いて行われた。ポジショナルクローニングは、その生化学的機能に関わらず、染色体の位置を基にした遺伝子単離法である。LanderとBotstein (1986)は、従来の連鎖解析なしで、LDマッピングを、ヒトゲノムの疾患座位のスクリーニングに用いる事を提唱した。このアプローチは、ゲノム全体をカバーする位置決めされたマーカーが活用できるようになるまで実用的ではなかった(Weissenbach et al., 1992)。LDマッピングを用いたゲノムスクリーニングの実行可能性は、現在、出願人らによって示されている。
【０２５６】
上皮の細胞−細胞接着を増加又は減少させる疾患の原因遺伝子の染色体座位の同定は、診断、治療と罹患する家系の人々の遺伝相談を容易にした。
【０２５７】
疾患の重症度と表現型での診断の限界のため、遺伝的サブタイプの人々にとって、臨床的診断を確認して遺伝型に基づく適切な治療を決定する事の高い必要性がある。
【０２５８】
発現の検出
実施例で、川崎病の組織ではCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現が変化しており、正常組織に比較して上昇する事を示す。
【０２５９】
従って、本発明者らはCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の中の１又はそれ以上の発現変化を検出する事を含む、川崎病の診断方法を提供する。例えば、患者の細胞、又は組織のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現の上昇を検出する。
【０２６０】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、活性、量の検出が、細胞の状態を決定する方法を提供しても良い。従って、その方法は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、活性、量が正常細胞に比較して高いレベルにある細胞を検出しても良い。同様に、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、活性、量が正常細胞に比較して低いレベルの細胞を検出しても良い。
【０２６１】
そのような検出は、細胞が川崎病細胞になるかどうか(その細胞を持つ、又は細胞を供給した個体が、川崎病にかかるか)を決定するために用いられても良い。細胞内のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の高レベルの発現、量、活性の検出は、その細胞が川崎病細胞になり易い、又は個体が川崎病になり易い事を示すかもしれない。もし、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、活性が低レベルならば、その細胞は、川崎病細胞にならない又はなり難い(又はその個体が川崎病にかかり難い)。
【０２６２】
当然のことながら、もし、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のレベルが、川崎病へのかかり易さでばらつくなら、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、活性の検出は、川崎病患者の生存率を予測するために使用されても良い。例えば、正常レベルのCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10と、(場合により)個体又は家系集団を比較して、高いレベルのCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10は、生存率が低い、又はその可能性を示し、低いレベルのCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10は、生存率が高い、又はその可能性を示す。従って、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、活性の検出は、川崎病患者の経過見通しの方法として使用されても良い。
【０２６３】
典型的には、川崎病は、上記の “川崎病” の項目下の“兆候”、“兆候とテスト”、“血液検査”及び“他の検査”のセクションに記載された１又はそれ以上の兆候の出現によって診断される。本明細書に記載される前記方法は、これらの試験により補充または置換して使用されても良い。
【０２６４】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、又はレベルの検出は、川崎病患者の治療成功の可能性を決定するために使用されても良い。
【０２６５】
本明細書に記載される診断方法は、記載される治療方法と組み合わせても良い。従って、川崎病患者の治療、予防、緩和の方法を提供する。その方法は、個体の細胞のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、活性の変化を検出する事を含み、川崎病にかかる可能性に基づき、個体に適当な治療を施す事を含む。治療には、上記の抗川崎病化合物を含んでも良い。
【０２６６】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のポリペプチドと核酸の存在と量は、以下に詳細に記載するように、試料中に検出されても良い。従って、川崎病は、患者由来の試料から、発現、量、活性の異常な現象又は増加を決定する事を含む方法によって診断され得る。例えば、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のポリペプチド、又はCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のmRNAの発現、量、活性の増加の決定である。
【０２６７】
試料は、川崎病のような疾患に罹患している又は罹患している事が疑われる個体又は生物に由来する細胞又は組織を含んでも良く、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、活性が増加、減少、又は他の異常を伴っても良く、発現、量、活性のレベル又はパターンの空間的又は時間的変化を含む。そのような疾患に罹患している、又は罹患している事が疑われる生物のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、又は活性のレベル又はパターンは、疾患の診断方法として、正常な生物の発現、量、活性のレベル又はパターンと、有効に比較されても良い。
【０２６８】
試料は、川崎病に罹患している、又は罹患していることが疑われる個体の細胞又は組織試料を含んでも良く、例えば、心臓組織又は細胞試料である。
【０２６９】
ある実施態様では、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、活性のレベルの増加が試料で検出される。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のレベルは、正常細胞、又は川崎病患者由来でない事が知られる細胞と比較すると、有意な程度に、増加しても良い。そのような細胞は、検査される個体から得てもよく、年齢、体重、ライフスタイルなどが検査される個体と一致するといった他の個体から得ても良い。
【０２７０】
ある実施態様では、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、活性のレベルが、10%、20%、30%又は 40%又はそれ以上増加する。ある実施態様では、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、活性のレベルが、cDNAハイブリダイゼーションの結果、50%又はそれ以上のように、45%又はそれ以上増加する。
【０２７１】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、活性は、当技術分野で知られるような、そして、以下に詳細を記載するように、多数の方法で検出されても良い。典型的には、患者組織由来の試料のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10量が測定され、罹患していない個体由来の試料と比較される。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドのレベルと同様に、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸の両者が測定されても良い。
【０２７２】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の量、活性、発現の検出は、川崎病を類別するために使用されても良い。例えば、高いレベルのCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の量、活性、発現は、川崎病の急性期を示唆する。同様に、低いレベルのCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の量、活性、発現は、川崎病の回復期を示唆する。
【０２７３】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現レベルは、多数の技術を用いて決定されても良い。
【０２７４】
RNA発現レベルの測定
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現は、RNAレベルで検出されても良い。
【０２７５】
従って、試料中のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸を含む核酸の存在を検出する方法を開示する。その方法は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10(場合によって)核酸に特異的な少なくとも１つの核酸プローブと試料とを接触させて、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸の存在をモニタリングする。例えば、核酸プローブは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸、又はその一部に特異的に結合しても良く、2つの結合が検出される；複合体自身の存在が検出されても良い。
【０２７６】
従って、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10mRNAの形態で、試料中のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸の量が測定されても良い。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のmRNAは、インサイチュハイブリダイゼーション(in situ hybridization)、ノーザンブロットやRT-PCRによって解析されても良い。核酸配列は、インサイチュハイブリダイゼーション、サザンブロット、1本鎖コンフォメーショナルポリモロフィズム、PCR増幅や特異的なプライマーを用いたDNAチップ解析によって同定されても良い。
【０２７７】
上記の技術は、以下の文献に詳細に記載されている；Kawasaki ES. Amplification of RNA. In： PCR protocols： A Guide to Methods and Applications、Innis MA、Gelfand DH、Sninsky JJ、White TJ、eds. Academic Press、1990、pp21-27.； Sambrook et al.、Molecular Cloning： A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York (1989)； Lichter et al.、High-resolution mapping of human chromosome 11 by in situ hybridization with cosmid clones Science 247：64-69 (1990)； Orita et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci USA 1989； 86：2766-2770； Fodor et al、Multiplexed biochemical assays with biological chips、Nature 364：555-556 (1993)； Pease et al.、Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11)： 5022-5026 (1994).
【０２７８】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のRNAは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出(RNAzol B； バイオジェネシス)、RNeasy RNA プレパレーションキット(キアゲン)を含むRNA抽出技術を用いて、細胞から抽出されても良い。リボ核酸ハイブリダイゼーションを用いる典型的な解析フォーマットは、核ランオンアッセイ、RT-PCR、RNaseプロテクションアッセイ(Melton et al.、Nuc. Acids Res. 12：7035を含む。使用可能な検出方法は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識と他の適当な標識である。
【０２７９】
これらの各方法は、定量的測定ができ、当技術分野において周知である。従って、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、活性の増減は、当技術分野で周知のポリヌクレオチドの定量方法を使用して、RNAレベルで測定可能である。
【０２８０】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10配列に由来するいかなる適当なプローブでも、例えば、適当なヒトCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10配列のどの部位でも、プローブとして使用して良い。
【０２８１】
典型的には、RT-PCRが、標的RNAを増幅するために使用される。このプロセスでは、逆転写酵素が、RNAを相補鎖DNA(cDNA)に変換するのに使用され、その後、検出を容易にするために増幅されうる。
【０２８２】
多くのDNA増幅法が知られ、その多くが、酵素的チェーンリアクション(ポリメラーゼチェーンリアクション(polymerase chain reaction)、リガーゼチェーンリアクション(ligase chain reaction)、セルフサステインドシークエンスレプリケーション(self-sustained sequence replication))に依存する。あるいは、クローニングされているベクター全体、又は一部の複製がある。
【０２８３】
多数の標的とシグナルを増幅する方法が文献に記載されている。例えば、Landegren,Uら、Science 242：229-237 (1988) 、及びLewis,R.,Genetic Engineering News 10：1,54-55 (1990)といったこれらの方法の一般的レビューである。
【０２８４】
例えば、ポリメラーゼチェーンリアクションがCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のmRNAを検出するために行われても良い。
【０２８５】
“ポリメラーゼチェーンリアクション”又は“PCR”は、特に、米国特許第 4,683,195号 と第 4,683,202号に記載されている核酸増幅方法である。PCRは、診断の面で、既知の核酸を増幅するために使用される(Mok et al.、1994、Gynaecologic Oncology 52：247-252)。セルフサステインドシークエンスレプリケーション(3SR)は、TASの変法で、逆転写酵素(RT)、ポリメラーゼとヌクレアーゼ活性の連続的な回転を通した核酸鋳型の定温増幅を含み、それは、酵素カクテルと適当なオリゴヌクレオチドプライマーによって媒介される(Guatelli et al.、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：1874)。ライゲーション増幅反応、又はライゲーション増幅システムは、DNAリガーゼと、標的鎖当たり2種類で、4種類のオリゴヌクレオチドを使用する。この技術は、Wu,D. Y. とWallace,R. B., 1989, Genomics 4：560に記載されている。Lizardi ら 1988, Bio/Technology 6：1197に記載されるように、Ｑβレプリカーゼ技術では、一本鎖RNAを複製するバクテリオファージＱβのRNAレプリカーゼが、標的DNAを増幅するために使用される。
【０２８６】
PCR法は、基本的に以下の工程を含む：(1)抽出DNAの1本鎖相補鎖を形成するような処理；(2)オリゴヌクレオチドプライマーのペアの添加。ペアの一方のプライマーは、実質的にセンス鎖の配列の一部に相補的で、他方のプライマーは、実質的に、相補的なアンチセンス鎖の中の、同じ配列の違う部位に相補的である。(3)相補的な配列にプライマーペアをアニーリング；(4) アニーリングしたプライマーを、各プライマーの3'末端から同時に伸長。各プライマーにアニーリングした鎖に相補的な伸長産物を合成する。その伸長産物は、相補鎖から分離した後、他のプライマーペアによる伸長産物の合成のための鋳型として働く。；(5)伸長反応産物を、1本鎖分子を作成するための鋳型から分離；(6)少なくとも1回、アニーリング、伸長と分離ステップを繰り返し、1本鎖分子を増幅。
【０２８７】
逆転写−ポリメラーゼチェーンリアクション(RT-PCR)が行われても良い。定量的RT-PCRが使用されても良い。そのようなPCR技術は、当技術分野において周知であり、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10配列由来の適当なプライマーを使用しても良い。
【０２８８】
他の増幅技術も使用可能である。例えば、ローリングサークル増幅(Lizardi et al.、1998、Nat Genet 19：225)は、商品（RCAT（登録商標））として利用可能な増幅技術で、DNAポリメラーゼによって動作し、定温で、直線的又は幾何学的なキネティクスで、環状オリゴヌクレオチドプローブを増幅できる。ストランドディスプレースメント増幅という技術(SDA； Walker et al.、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：392)は、特別な標的に独特な配列で始まる。
【０２８９】
ポリペプチドレベルの発現の測定
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現は、ポリペプチドレベルで検出しても良い。
【０２９０】
従って、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、活性は、試料中のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のポリペプチドの存在、又は量の検出によって検出しても良い。これは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドに結合する分子を使用して行われても良い。検出のための、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドに直接的又は間接的に結合する適当な分子／化合物は、ペプチドと蛋白質のような自然に生産される分子、例えば抗体を含む。又は、それらは、合成分子であっても良い。
【０２９１】
従って、本発明者らはCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドの存在を検出する方法を開示する。それは、細胞試料を、ポリペプチドに結合可能な抗体と接触させて、ポリペプチドの存在をモニタリングする事による。
【０２９２】
例えば、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドは、抗−CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10抗体を使用して検出されても良い。そのような抗体は、例えばHarlowとLaneに記載されるような、当技術分野で知られる方法によって作成されても良い。
【０２９３】
これは、簡便には、抗体とポリペプチドの間に形成された複合体の存在をモニタリングする事によって、又は、ポリペプチドと抗体の間の結合をモニタリングする事によって達成されうる。2種類の実体間の結合を検出する方法は、当技術分野で知られており、FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)、表面プラズモン共鳴などを含む。
【０２９４】
上記のイムノブロットのような標準的な実験技術は、同じ細胞集団の非処理細胞群と比較する事によって、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10蛋白質のレベルの変化を検出するのに用いる事ができる。
【０２９５】
遺伝子発現は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3 若しくはMPHOSPH10ポリペプチドの翻訳後プロセッシング、又は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3 若しくはMPHOSPH10核酸の転写後修飾の変化を検出する事によって決定されても良い。
【０２９６】
例えば、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドのディファレンシャルなリン酸化、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドの切断、又はCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のRNAのオルタナティブスプライシングであり、同様の物が測定されても良い。翻訳後修飾と同様に、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドのような遺伝子産物の発現レベルが、固有の蛋白質アッセイ、又は2Dポリアクリルアミドゲル電気泳動のような技術を用いて検出されても良い。
【０２９７】
宿主由来の試料の中のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10蛋白質のレベルを測定する用いる事ができるアッセイ法は、当技術分野において周知である。抗体は、当業者に周知のいかなる方法によっても、免疫特異的結合を解析されうる。
【０２９８】
使用できるイムノアッセイは、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、寒天ゲル中沈降反応、凝集反応、補体結合法、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイとプロテインAイムノアッセイのような技術を使用する競合アッセイ系と非競合アッセイ系が含まれるが、限定されるものではない。そのようなアッセイは、当技術分野ではルーチンの仕事である(例えば、 Ausubel et al.、eds、1994、Current Protocols in Molecular Biology、Vol. 1、John Wiley & Sons、Inc.、New Yorkを参照。全体が参考文献である)。
【０２９９】
標本は、ポリペプチド／蛋白質のために、免疫組織化学と免疫細胞化学の染色により解析されても良い(一般的には以下参照： Stites and Terr、Basic and Clinical Immunology、Appleton and Lange、1994)。また、標本は、ELISA、RIA、 イムノブロット、ウェスタンブロット、免疫沈降 、機能的解析や、蛋白質切断テストにより解析されても良い。他のアッセイ方法として、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、ELISAアッセイを含む。
【０３００】
ELISAアッセイは、当業者に周知である。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両者が、このアッセイで使用されても良い。ラジオイムノアッセイ(RIA)のような、適当な他のアッセイが当業者に知られているように使用されても良い。利用可能なイムノアッセイは、特許や科学文献に広く記載されている。例えば、Sambrook et al、1992と同様に、米国特許第3,791,932； 3,839,153； 3,850,752； 3,850,578； 3,853,987； 3,867,517； 3,879,262； 3,901,654； 3,935,074； 3,984,533； 3,996,345； 4,034,074； 4,098,876； 4,879,219； 5,011,771 と5,281,521である。
【０３０１】
修飾物質のスクリーニング
調節物質、アゴニスト、アンタゴニストの同定
アンタゴニスト、特に低分子は、川崎病の治療用に、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10を特異的に阻害するために使用されても良い。従って、本発明者らは、これらをスクリーニングする解析法と同様に、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10アンタゴニストと低分子阻害剤を開示する。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のアンタゴニストは、結合、又は他の関連する活性の減少と言った変化を検出する事によってスクリーニングされても良い。従って、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドの発現、量、活性を減少させる化合物を提供する。そのような化合物は、ここで記載される川崎病の治療と予防のための方法と組成に用いられても良い。
【０３０２】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10は、例えば、細胞、無細胞調整物、化合物ライブラリー、自然の産物の混合物の中で、低分子基質とリガンドの結合を評価するために使用されても良い。これらの基質とリガンドは、自然の基質とリガンドであっても良く、又は、構造的、若しくは機能的模倣体であっても良い。Coligan et al.、Current Protocols in Immunology 1(2)：Chapter 5 (1991)参照。さらに、スクリーニングは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現に影響する因子を同定するために行われても良い。
【０３０３】
一般的に、アゴニストとアンタゴニストの解析は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の１又はそれ以上の活性に対する候補分子の影響の測定に依存している。解析は、候補分子の存在下でポリペプチドの活性の解析を含んでも良く、付加的には、候補分子の非存在下、又は活性を阻害又は活性化する事が知られる分子の存在下で、ポリペプチドの活性の解析を含んでも良い。
【０３０４】
本発明者らはCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現は、川崎病細胞、又は川崎病患者由来の細胞で変化している事を示す。従って、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現の調節は、川崎病の治療に使用しても良い。従って、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現及び／又は活性を刺激する、削減する、又は別の調節をする化合物と薬剤を見つける事、又は、その蛋白質の機能を阻害できる化合物と薬剤を見つける事が望まれている。一般的に、アゴニストとアンタゴニストが、川崎病の治療と予防のために使用される。
【０３０５】
“ダウンレギュレーション”には、研究する状態に対するどんな負の効果も含む；これは、全体又は部分的であっても良い。従って、結合が検出される場合、候補アンタゴニストは、2種類の実体間の結合を減少、回復、消失させることができる。候補分子によって達成される結合のダウンレギュレーション(又は他の活性)は、候補分子の非存在下の結合(又は他の活性)に比較して、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、又はそれ以上、と同様に、少なくとも10%であっても良い。従って、アンタゴニストとして使用するために適当な候補分子は、10%以上、結合又は他の活性を減少させる分子である。
【０３０６】
“化合物”の用語は、化学的化合物(自然に生産された、又は合成された)に言及し、生物学的高分子(例えば、核酸、蛋白質、非ペプチド、又は有機分子)、又はバクテリア、植物、真菌、若しくは動物(特にホ乳類)の細胞や組織のような生物材料由来の抽出物、又は無機的要素又は無機的分子である。化合物は、抗体であっても良い。
【０３０７】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のアンタゴニストとなる可能性の例は、ポリペプチドの活性が妨げられるような、抗体、低分子、ヌクレオチドとそのアナログ(プリンとプリンアナログを含む)、オリゴヌクレオチド、又は関連ポリペプチドの結合パートナーに強く関連する蛋白質、例えば、結合パートナーの断片、又は、ポリペプチドに結合するが応答を誘発しない低分子を含む。
【０３０８】
スクリーニングキット
スクリーニングを行うのに必要な材料がスクリーニングキットとして包装されても良い。
【０３０９】
そのようなスクリーニングキットは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、又は、関連ペプチドの生産を減少又は増加させる化合物を同定するために、有用である。スクリーニングキットは、(a) CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチド；(b) CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドを発現する組み換え細胞；(c) CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドに対する抗体、を含んで良い。スクリーニングキットは、ライブラリーを含んでも良い。スクリーニングキットは、以下に記載するように、スクリーニングに必要な成分のいずれか1又はそれ以上を含んでも良い。スクリーニングキットは、付加的に、使用説明書を含んでも良い。
【０３１０】
スクリーニングキットは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現を核酸レベルで検出できる物を提供しても良い。そのようなキットは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の増幅用のプライマーを含んでも良く、又は増幅用のプライマーペアを含んでも良い。プライマー又はプライマーペアは、いかなる適当な配列から選択しても良く、例えば、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10配列の一部である。プライマー配列を同定する方法は、当技術分野で周知であり、当業者は、簡単に、そのようなプライマーをデザインする事ができるであろう。キットは、本明細書に記載されているような、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10発現のための核酸プローブを含んでも良い。キットは、付加的に使用説明書を含んでも良い。
【０３１１】
理論的デザイン
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10と結合しそうな候補化合物の理論的デザインは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドの分子形の構造的研究に基づいても良い。どの部位が特定の他の蛋白質と相互作用するかを決定する1つの方法は、物理的構造決定法であり、例えば、X線結晶構造解析、又は2次元NMR技術である。これらの技術は、どのアミノ酸残基が結合領域を形成するかのガイダンスを提供するであろう。蛋白質構造解析の詳細な説明は、例えば、Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography、Academic Press、New Yorkを参照。
【０３１２】
ポリペプチド結合解析
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の活性又は発現の調節剤とアンタゴニストは、当技術分野で知られているいかなる方法によって同定されても良い。
【０３１３】
最も簡単な方法によれば、解析は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドを含む溶液と候補化合物を混合して混合液を形成し、混合液中のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドの活性を測定して、その活性を標準の活性と比較するステップを含んでも良い。
【０３１４】
さらに、分子は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10と分子の結合を検出する解析で、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10との結合によって同定されても良い。
【０３１５】
ここで記載するCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドに結合する物質を同定するための１つのタイプの解析は、固相支持体に固定したCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドを、固定化していない候補化合物に接触させて、興味あるCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドと候補化合物が、相互にどの程度結合しているかを測定する事を含む。あるいは、候補化合物が固定されても良く、本明細書で提示するようにCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドは固定されなくても良い。
【０３１６】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドとその物質の結合は、一時的、可逆的、又は永久的であっても良い。その物質は、コントロールポリペプチド(例えば、川崎病に関連しない事が知られているポリペプチド)に結合するKd値より低いKd値で、そのポリペプチドに結合しても良い。その物質のKd値は、コントロールポリペプチドに結合するKd値より100倍又は1000倍小さいのと同様に、コントロールポリペプチドに結合するKd値より2倍小さくても良い。
【０３１７】
解析法の例では、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドは、アガロースビーズのようなビーズに固定されても良い。典型的には、これは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドをGST融合蛋白質として、バクテリア、酵母、高等真核細胞株で発現して、グルタチオンアガロースビーズを用いて粗細胞抽出液からGSTポリペプチド融合蛋白質を精製する事によって行われても良い(Smith and Johnson、1988； Gene 67(10)：31-40)。コントロールとして、GST融合蛋白質でない候補化合物と、固定されたポリペプチドとの結合は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチド非存在下で測定されても良い。それから、候補化合物と、固定されたCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドとの結合が測定されても良い。このタイプの解析は、当技術分野で、プルダウンアッセイとして知られる。また、候補化合物が固定されて、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドが固定されなくても良い。
【０３１８】
片方の成分を固定するために別のアフィニティー精製システムを使用して、このタイプの解析を行う事も可能であり、例えば、Ni-NTAアガロースとヒスチジンタグを付けた成分である。
【０３１９】
ポリペプチドの候補化合物への結合は、当技術分野で周知の種々の方法によって測定されても良い。例えば、非固定化成分が標識されても良い(例えば、放射性標識、エピトープタグ、又は酵素−抗体複合体で)。あるいは、結合は、免疫学的検出技術によって測定されても良い。例えば、反応混合液をウェスタンブロットにかけて、非固定化成分を検出する抗体で調べる事ができる。ELISA技術を使用しても良い。
【０３２０】
候補物質は、典型的には、終濃度1から100 nm/mlのように、終濃度1から1000 nm/mlで加えられる。抗体の場合は、使用される終濃度は、典型的には、200から300μg/mlのように、100から500μg/mlである。
【０３２１】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の調節剤とアンタゴニストは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10と、このポリペプチドに結合する分子との結合の変化、又はそのような結合と解離に重要な活性の変化を検出しても良い。
【０３２２】
セルベースアッセイ
セルベースアッセイは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドを持つ細胞への接着が、候補化合物に直接的又は間接的に結合された標識によって検出される方法で、又は、標識競合物質による競合を含む解析で、候補化合物の結合を単純に試験しても良い。
【０３２３】
さらに、これらの解析は、細胞表面にポリペプチドを持つ細胞に適した検出系を用いて、候補化合物のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドへの結合が、シグナルを誘導するかどうかを試験しても良い。活性化の阻害は、一般的に既知のアゴニストの存在下でアッセイを行い、候補化合物の存在下でアゴニストによる活性化効果が観察される。
【０３２４】
化合物をスクリーニングする他の方法は、化合物ライブラリーを発現する組み換えDNA分子で安定に形質転換した真核又は原核宿主細胞を使用する。そのような細胞は、生きた状態でも固定した状態であっても、標準的な結合パートナーアッセイに使用する事ができる。Parce et al. (1989) Science 246：243-247； and Owicki et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87；4007-4011を参照。この文献は、細胞応答の高感度法を記載している。
【０３２５】
競合アッセイは、特に有用であり、以下の工程である。：化合物ライブラリーを発現している細胞は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドと結合する事が知られる125I−抗体のような標識抗体と接触又はインキュベートして、候補化合物のような試験試料の結合成分への結合親和性が測定される。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10に結合した(bound)、又はフリー(free)の標識結合パートナーは、結合の程度を評価するために分離される。結合した試験試料の量は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドへ結合した標識抗体の量と逆相関する。
【０３２６】
膨大な技術のうちのいずれか1つの技術が、結合の程度を評価するためにフリー(free)から結合(bound)を分離するために使用され得る。この分離過程は、典型的には、膜への結合後に洗浄、プラスチックへの結合後に洗浄、又は細胞膜の遠心分離のような手法を含む。
【０３２７】
その解析は、候補化合物の細胞への曝露と、適当な方法によるCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現解析を含んでも良い。そのような解析で、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現をダウンレギュレートする分子は、付加的に選択されても良く、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10発現をダウンレギュレートする薬剤として使用されても良い。そのような薬剤は、川崎病の治療、又は予防のために有益に使用されても良い。
【０３２８】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10蛋白質をコードするcDNAと、その蛋白質に対する抗体は、細胞内のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のmRNAと蛋白質の生産への添加した化合物の影響を検出する解析法を形成しても良い。例えば、当技術分野で知られる標準的方法により、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を使用して、分泌された、又は細胞に結合したCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドレベルを測定するためにELISAが構築されても良い。また、この解析法は、適当に操作された細胞又は組織からのCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10蛋白質の生産を阻害、又は増強する物質を発見するために使用する事ができる。スクリーニングアッセイを行う標準的な方法は、当技術分野で良く理解されている。
【０３２９】
活性アッセイ
調節剤又はアンタゴニストを検出する解析は、候補分子存在下でCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の活性の変化の検出を含み、付加的には、候補分子非存在下での活性の変化の検出も同時に行う事を含む。
【０３３０】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の特定の生物学的活性を検出する解析が使用されても良い。解析は、典型的には、候補分子(例えばライブラリーの形態で)を、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10に接触させる工程を含み、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、又は、細胞、オルガネラ、抽出物、又は、そのような物を含む他の材料の形態である。調節剤候補の存在が影響しているかどうか確認するために、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の相対活性(例えば、以下に記載するような脱リン酸化活性)が検出されても良い。
【０３３１】
解析されても良いCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の相対活性は、ポリペプチドに関連して上記の項に記載される。そのような活性の解析法は、当技術分野で知られており、スクリーニングを目的としたCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の生物活性の検出のために行っても良い。
【０３３２】
結合して／又はCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の転写又は発現に影響する調節剤候補を検出するために、プロモーター結合アッセイが使用されても良い。それから、調節剤候補はその後の研究のために選択されても良く、使用のために単離されても良い。そのようなスクリーニング方法の詳細は、当技術分野において周知であり、例えば、Handbook of Drug Screening、edited by Ramakrishna Seethala、Prabhavathi B. Fernandes (2001、New York、NY、Marcel Dekker、ISBN 0-8247-0562-9)に記載される。
【０３３３】
本明細書に記載されるスクリーニング方法は、インビトロでの使用のために構築されても良いが、インビボアッセイで使用されても良い。インビボアッセイは、一般的に、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10を持つ細胞に候補分子を曝露する事を含む。インビトロアッセイは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10が候補分子に曝露され、付加的には、粗細胞抽出液、半精製細胞抽出液、又は精製蛋白質のような他の成分存在下で行う。インビトロアッセイを行う場合、候補分子アレイ(例えばアレイライブラリー)を利用しても良い。インビボアッセイが利用されても良い。従って、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドは異種性に細胞に含まれても良い。そのような細胞は、上記のように、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10を発現するように操作されたトランスジェニック細胞であっても良い。
【０３３４】
抽出液が利用される場合、それは、細胞質抽出液、又は核抽出液を含んでも良く、その調整方法は、当該分野において周知である。
【０３３５】
当然のことながら、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10を持ついかなる細胞成分が利用されても良く、オルガネラであっても良い。ある実施態様では、細胞質、又は核の調整物を利用する。例えば、記載のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10を持つ細胞核を含む。核調整物は、1又はそれ以上の核を含んでも良く、核は、例えば界面活性剤処理で、透過性、又は半透過性にされても良い。
【０３３６】
従って、具体的な実施形態において、解析の形態は以下を含む：マルチウェルマイクロタイタープレートは、各ウェルに、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドを発現する細胞を1又はそれ以上含むように設定する；各候補分子、又は、例えばライブラリー由来の候補分子プールが、各ウェルに添加されても良く、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10活性の変化が測定される。プールが利用される場合、さらなるプールに小分けして、同じように試験されても良い。それから、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の活性、例えば、この文献の他の箇所に記載されているような結合活性、又は転写活性化活性が解析されても良い。
【０３３７】
上記の解析方法に加えて、又は選択的に、“サブトラクティブ(subtractive)”法も、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の調節剤又はアンタゴニストを同定するために使用されても良い。“サブトラクティブ”法では、調節剤として機能しうる1又はそれ以上の候補分子を含む(例えば、細胞抽出液、核抽出液、分子ライブラリーなど)多数の分子が提供され、1又はそれ以上の成分が、多数の分子から除去、又は枯渇、又は差し引きされる。“サブトラクトされた”抽出液などは、それから、記載のようにCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10(又は成分そのもの)を含む細胞に曝露する事により、活性を解析される。
【０３３８】
従って、例えば、以下のように‘免疫除去’アッセイが、調節剤を同定するために行われても良い。細胞質、又は核抽出液が、適当な細胞から調節されても良い。抽出液は、適当な抗体を用いた免疫除去によって、推定上の調節剤を除去するために、枯渇又は分画されても良い。もし抽出液から調節剤が枯渇したら、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の機能又は活性又は発現に影響する活性が失われる事になる。調節剤又はアンタゴニストを同定するためには、一連のサブトラクション及び／又は枯渇が必要とされる。
【０３３９】
上記の“枯渇”又は“サブトラクション”アッセイは、さらなるスクリーニングのための、仮想調節剤を同定する最初のステップとして使用されても良い。さらに、又は、選択的に、“枯渇”又は“サブトラクション”アッセイは、仮想調節剤として、他の方法(例えば、この文献の他の箇所に記載されている“ポジティブ”スクリーニング)で同定された分子の調節活性を確認するために使用されても良い。
【０３４０】
解析にかけられて、それが興味あるものとして同定された候補分子は、単離されて、さらに研究される。興味の分子の単離方法は、ライブラリーの形式かどうか、幾つの候補分子が一度に試験されたか、その後にバッチ法が行われたかどうかなど、使用された分子のタイプに依存する。
【０３４１】
候補分子はライブラリーの形式で提供されても良い。ある実施態様では、1以上の候補分子が同時にスクリーニングされても良い。候補分子ライブラリーが作成されても良く、例えば、低分子ライブラリー、ポリペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、化合物ライブラリー(コンビナトリアルライブラリーのような)、アンチセンスDNA又はアンチセンスRNAのようなアンチセンス分子のライブラリー、抗体ライブラリーなどであり、当技術分野で知られた方法による。そのようなライブラリーは、ハイスループットスクリーニングに適当である。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10を持つ異なる細胞は、ライブラリーの個々のメンバーに曝露されても良く、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10活性への影響が測定されても良い。アレイ技術は、この目的のために利用されても良い。細胞は、例えば、ウェルで、又はマイクロタイタープレートで空間的に分けられても良い。
【０３４２】
ある実施態様では、低分子ライブラリーが使用される。“低分子”は、分子量が50kDa以下のである分子に言及する。特別な実施態様では、低分子は、約15kDa以下、約10kDa以下などのように、約30kDa以下の分子量であっても良い。ここで“低分子ライブラリー”と言及する低分子のライブラリーは、ポリペプチド、小さいペプチドを含んでも良く、例えば、20アミノ酸、又は、15、10、5アミノ酸、単純な組成など20アミノ酸以下のペプチドである。
【０３４３】
選択的に、又は加えて、以下に詳細に記載するように、コンビナトリアルライブラリーが、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の調節剤、又はアンタゴニストのスクリーニングに用いられても良い。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10活性の解析は、以上に記載されている。
【０３４４】
ライブラリー
ポリペプチドライブラリー、又は核酸ライブラリーのような候補分子のライブラリーは、本明細書に記載されるCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10アンタゴニストと阻害剤のスクリーニングに使用されても良い。そのようなライブラリーは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10蛋白に曝露されて、もしあるなら、その蛋白質の活性への影響が測定される。
【０３４５】
大きなライブラリーから望むメンバーを単離する選別プロトコルは、ファージディスプレイ技術に代表されるように当技術分野で知られている。多様なペプチド配列が繊維状バクテリオファージの表面に表示される(Scott and Smith (1990 前述)そのようなシステムは、抗体断片(とそれらをコードするヌクレオチド配列)のライブラリー作成と、インビトロの標的抗原に結合する特異的な抗体断片の選別と増幅に有用である事が明らかにされた。VH とVLをコードするヌクレオチド配列は、E. coliの膜周辺に向かわせるリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に結合される。そして、結果として生じる抗体断片は、典型的にはバクテリオファージコート蛋白(例えば、pIII 又はpVIII)の融合蛋白質として、バクテリオファージ表面に表示される。あるいは、抗体断片は、ラムダファージカプシド(ファージボディー)の外部に表示される。ファージをベースとするディスプレイシステムの利点は、生物システムのために、選別されたライブラリーのメンバーが、それを含むファージのバクテリア内での成長と共に、簡単に増幅される事である。さらに、ポリペプチドライブラリーのメンバーのヌクレオチド配列は、ファージ、又はファージミドベクターに含まれるため、シークエンシング、発現とその後の遺伝子操作が比較的簡単である。
【０３４６】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーとラムダファージ発現ライブラリーの構築方法は、当技術分野において周知である (McCafferty et al. (1990) 前述； Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、88： 4363； Clackson et al. (1991) Nature、352： 624； Lowman et al. (1991) Biochemistry、30： 10832； Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.、88： 10134； Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res.、19： 4133； Chang et al. (1991) J. Immunol.、147： 3610； Breitling et al. (1991) Gene、104： 147； Marks et al. (1991)前述； Barbas et al. (1992)前述； Hawkins and Winter (1992) J. Immunol.、22： 867； Marks et al.、1992、J. Biol. Chem.、267： 16007； Lerner et al. (1992) Science、258： 1313。その内容は、参照する事により、本明細書に組み入れられる。)。一般的にポリペプチドライブラリーの発現に必要な場合、そのような技術は改変されても良い。
【０３４７】
1つの特別に有利なアプローチは、scFvファージライブラリーの使用である (Bird、R.E.、et al. (1988) Science 242： 423-6、Huston et al.、1988、Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.、85： 5879-5883； Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.、87： 1066-1070； McCafferty et al. (1990) 前述； Clackson et al. (1991) 前述； Marks et al. (1991) 前述； Chiswell et al. (1992) Trends Biotech.、10： 80； Marks et al. (1992) 前述)。バクテリオファージのコート蛋白上に表示するscFvライブラリーの種々の実施例が記載されている。ファージディスプレイアプローチの改良も知られており、例えば、WO96/06213、WO92/01047 (Medical Research Council et al.) とWO97/08320 (Morphosys、前述)に記載されている。その内容は、参照する事により、本明細書に組み入れられる。
【０３４８】
又は、ライブラリー選別技術は、バクテリオファージラムダ発現システムを含む。それは、両者とも以前に記載されたように(Huse et al. (1989) Science、246： 1275； Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、87； Mullinax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、87： 8095； Persson et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、88： 2432)、バクテリオファージプラーク、又は溶原菌コロニーとして直接スクリーニングしてもよく、本明細書に記載される方法と組成に有用である。これらの発現システムは、約106の単位又はそれ以上の、ライブラリーの多数の他のメンバーをスクリーニングするのに用いても良い。他のスクリーニングシステムは、例えば、ライブラリーメンバーの直接的化学合成に依存する。1つの初期の方法は、WO84/03564に記載されるように、ピン又はロッドのセット上のペプチド合成を含む。同様の方法は、ビーズ上でのペプチド合成を含み、各ビーズが各ライブラリーメンバーであるペプチドライブラリーを形成する。この方法は、米国特許第4,631,211に記載され、また、関連の方法がWO92/00091に記載されている。ビーズ法の重要な改善は、各ライブラリーメンバーのアミノ酸配列の同定を促進するために、各ビーズに、オリゴヌクレオチドのような独特の検出用タグを付与した事を含む。これらの改善されたビーズ法は、WO93/06121に記載されている。
【０３４９】
他の化学合成法は、表面でのペプチド(又はペプチド模倣体)アレイの合成を含む。各ライブラリーメンバーを、アレイの中の、不連続で予め定義した位置に置く方法で作成する。各ライブラリーメンバーの同一性は、アレイ中の空間位置によって決定される。前もって決められた分子(例えば受容体)と反応するライブラリーメンバー間の結合相互作用が発生するアレイ中の位置を決定し、それによって空間位置に基づき反応したライブラリーメンバーの配列を同定する。これらの方法は、米国特許第5,143,854号； WO90/15070 とWO92/10092； Fodor et al. (1991) Science、251： 767； DowerとFodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem.、26： 271に記載されている。
【０３５０】
ポリペプチド又は核酸ライブラリーを作成する他のシステムは、ライブラリーメンバーのインビトロ合成のための無細胞酵素マシーナリを含む。1つの方法では、RNA分子が、標的リガンドに対する選択性による選択的なラウンドによって選別されて、PCR増幅される(Tuerk and Gold (1990) Science、249： 505； Ellington and Szostak (1990) Nature、346： 818)。同様の技術が、前もって決められたヒト転写因子と結合するDNA配列を同定するために使用されても良い(Thiesen and Bach (1990) Nucleic Acids Res.、18： 3203； Beaudry and Joyce (1992) Science、257： 635； WO92/05258 と WO92/14843)。同様に、インビトロトランスレーションが、巨大ライブラリーを作成するための方法としてポリペプチドを合成するために使用される。これらの方法は、一般的に安定化したポリソーム複合体を含み、さらにはWO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058とWO92/02536に記載されている。ファージベースではない他の表示システムは、WO95/22625とWO95/11922 (Affymax) に開示されるシステムのように、選別のためのポリペプチドを表示するためにポリソームを使用する。これらと前述の全ての文献も、参照する事により、本明細書に組み入れられる。
【０３５１】
コンビナトリアルライブラリー
ライブラリー、特に候補分子のライブラリーは、コンビナトリアルライブラリーの形態であっても適当である(コンビナトリアルケミカルライブラリーとしても知られる)。
【０３５２】
本明細書で使用される“コンビナトリアルライブラリー”の用語は、ランダムに選択されたサブユニットから成る多種類の化合物のコレクションである。コンビナトリアルライブラリーは、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10を阻害できる分子をスクリーニングしても良い。
【０３５３】
種々の化合物のコンビナトリアルライブラリーが現在使用可能であり、蛋白分解酵素と非蛋白分解酵素に対して活性のあるライブラリー、G蛋白結合受容体(GPCRs)のアゴニストとアンタゴニストのライブラリー、非GPCRs標的(例えば、インテグリン、イオンチャネル、ドメイン相互作用、核受容体と転写因子)に対して活性のあるライブラリー、癌と抗感染標的の全細胞ライブラリーなどを含む。コンビナトリアルライブラリーの膨大なレビュー、特にライブラリーの構築と使用に関し、DolleとNelson (1999)、Journal of Combinatorial Chemistry、Vol 1 No 4、235-282に提供されている。Combinatorial peptide library protocols (edited by Shmuel Cabilly、Totowa、N.J. ： Humana Press、c1998. Methods in Molecular Biology v. 87) も、参考文献である。特別なコンビナトリアルライブラリーとその構築方法が、Baldwin ら(1995)、“Synthesis of a Small Molecule Library Encoded with Molecular Tags,” J. Am. Chem. Soc. 117：5588-5589と同様に、米国特許第6,168,914号 (Campbell、et al)と、それらの文献に記載されている参考文献中に開示されている。
【０３５４】
1つの実施態様では、スクリーニングされるコンビナトリアルライブラリーは、遺伝子発現に影響する細胞成分と相互作用する分子を含む可能性のあるデザインのライブラリーである。例えば、クロマチン構造蛋白質に対してコンビナトリアルライブラリーがスクリーニングされても良い。この実施態様に有用な他のライブラリーは、ヒストン修飾酵素(例えば、ヒストンアセチル化酵素、又はヒストンメチル化酵素)、又はDNA修飾、例えば、DNAメチル化又は脱メチル化に対するコンビナトリアルライブラリーを含む。
【０３５５】
ケミカルコンビナトリアルライブラリー、その作成と使用について記載するさらなる参考文献は、URL http：//www.netsci.org/Science/Combichem/から利用可能なものを含み、以下を含むThe Chemical Generation of Molecular Diversity. Michael R. Pavia、Sphinx Pharmaceuticals、A Division of Eli Lilly (Published July、1995)； Combinatorial Chemistry： A Strategy for the Future - MDL Information Systems discusses the role its Project Library plays in managing diversity libraries (Published July、1995)； Solid Support Combinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization、Adnan M. M. Mjalli and Barry E. Toyonaga、Ontogen Corporation (Published July、1995)； Non-Peptidic Bradykinin Receptor Antagonists From a Structurally Directed Non-Peptide Library. Sarvajit Chakravarty、Babu J. Mavunkel、Robin Andy、Donald J. Kyle*、Scios Nova Inc. (Published July、1995)； Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity Keith Davies and Clive Briant、Chemical Design Ltd. (Published July、1995)； A Database System for Combinatorial Synthesis Experiments - Craig James and David Weininger、Daylight Chemical Information Systems、Inc. (Published July、1995)； An Information Management Architecture for Combinatorial Chemistry、Keith Davies and Catherine White、Chemical Design Ltd. (Published July、1995)； Novel Software Tools for Addressing Chemical Diversity、R. S. Pearlman、Laboratory for Molecular Graphics and Theoretical Modeling、College of Pharmacy、University of Texas (Published June/July、1996)； Opportunities for Computational Chemists Afforded by the New Strategies in Drug Discovery： An Opinion、Yvonne Connolly Martin、Computer Assisted Molecular Design Project、Abbott Laboratories (Published June/July、1996)； Combinatorial Chemistry and Molecular Diversity Course at the University of Louisville： A Description、Arno F. Spatola、Department of Chemistry、University of Louisville (Published June/July、1996)； Chemically Generated Screening Libraries： Present and Future. Michael R. Pavia、Sphinx Pharmaceuticals、A Division of Eli Lilly (Published June/July、1996)； Chemical Strategies For Introducing Carbohydrate Molecular Diversity Into The Drug Discovery Process.. Michael J. Sofia、Transcell Technologies Inc. (Published June/July、1996)； Data Management for Combinatorial Chemistry. Maryjo Zaborowski、Chiron Corporation and Sheila H. DeWitt、Parke-Davis Pharmaceutical Research、Division of Warner-Lambert Company (Published November、1995)； and The Impact of High Throughput Organic Synthesis on R&D in Bio-Based Industries、John P. Devlin (Published March、1996)。
【０３５６】
コンビナトリアルケミストリーの技術は、新規リード化合物の作成のための現代の方法の中で、広く認知されている(Gallop、M. A. et al.、1994、J. Med. Chem. 37：1233-1251； Gordon、E. M. et al.、1994、J. Med. Chem. 37：1385-1401.)。使用されている1つのコンビナトリアルのアプローチは、固相支持体である各粒子上での異なる構造を含むライブラリーの合成、可溶性受容体とライブラリーの相互作用、マクロ分子と相互作用する‘ビーズ’の同定、同定された‘ビーズ’に担持される構造の決定を含む戦略に基づいている(Lam、K. S. et al.、1991、Nature 354：82-84)。このアプローチの変法は、固相からの一定少量の化合物の連続的放出と、続いて溶液中の活性の決定、活性化合物が放出された粒子の同定と、直接シークエンシングによる(Salmon、S. E. et al.、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11708-11712)、又はコードの読み取りによる(Kerr、J. M. et al.、1993、J.Am.Chem.Soc. 115：2529-2531； Nikolaiev、V. et al.、1993、Pept. Res. 6：161-170； Ohlmeyer、M. H. J. et al.、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10922-10926)、その構造の決定である。
【０３５７】
可溶性ランダムコンビナトリアルライブラリーは、ペプチドの等モル混合液を作成する単純な原理により合成されても良く、それは最初にFurkaによって記載された (Furka、A. et al.、1988、Xth International Symposium on Medicinal Chemistry、Budapest 1988； Furka、A. et al.、1988、14th International Congress of Biochemistry、Prague 1988； Furka、A. et al.、1991、Int. J. Peptide Protein Res. 37：487-493)。反復スクリーニングのための可溶性ライブラリーの構築も記載されている(Houghten、R. A. et al.1991、Nature 354：84-86) 。 K. S. Lam は、不溶性ランダムコンビナトリアルライブラリーを使用した新規の予期しない強力な技術を開示した。Lamは、固相支持体上でランダムコンビナトリアルライブラリーを合成した。そのため、各支持体は画一的な分子構造のテスト化合物を持ち、固相結合プロトコルにより、支持体からテスト化合物を予め除去する事なくライブラリーをスクリーニングする(Lam、K. S. et al.、1991、Nature 354：82-84)。
【０３５８】
従って、候補分子のライブラリーは合成コンビナトリアルライブラリー(例えばコンビナトリアルケミカルライブラリー)、細胞抽出液、体液(例えば、尿、血液、涙、鼻水、又は唾液)、又は合成若しくは自然の産物の他の混合物(例えば、低分子ライブラリー、又は発酵混合液) であって良い。
【０３５９】
分子ライブラリーは、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白質、又はペプチド若しくは蛋白質の断片；核酸(例えばアンチセンス；DNA；RNA；又はペプチド核酸、PNA)；アプタマー；又は炭水化物又は多糖を含んでも良い。ライブラリーの各メンバーは、特異的であるか、又は混合物である(例えば圧縮ライブラリー)。ライブラリーは、精製された化合物を含んでいても良く、又は“ダーティ”(すなわち多くの不純物を含む)でありうる。
【０３６０】
商品として購入可能なライブラリー(例えば、アフィメトリクス、アルクル(ArQule)、ネオステクノロジー(Neose Technologies)、サルコ(Sarco)、シドコ(Ciddco)、オックスフォードアシメトリー(Oxford Asymmetry)、メイブリッジ(Maybridge)、アルドリッチ(Aldrich)、パンラブス(Panlabs)、ファルマコピア(Pharmacopoeia)、シグマ又はトリポース(Tripose))も、本明細書に記載される方法に使用しても良い。
【０３６１】
上記のライブラリーに加えて、ダイバシティファイル(diversity files)と呼ばれる特別なライブラリーは、新しい方法の特異性、信頼性、又は再現性の評価に用いる事ができる。ダイバシティファイルは、解析で非特異的検出に帰結する可能性のある、多くのクラスの代表的な化合物を膨大に含んでいる(1000又はそれ以上の低分子)。ダイバシティファイルは、商品として購入可能であり、あるいは、ベンダーのリストに挙げられる個々の化合物を統合する事も可能である。
【０３６２】
抗体
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の調節剤、又はアンタゴニストを含む、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の調節剤は、その蛋白質の活性を調節する(例えば本明細書に記載されるように、川崎病のような疾患の予防又は治療の方法のために)ために使用されても良く、その関連蛋白質に対する抗体を含んでも良い。
【０３６３】
従って、本発明者らはCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチド、断片、相同体、変異体、又は誘導体に結合する抗体を提供する。そのような抗体は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現を検出するのに有用であり、特に、川崎病を含むCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10に伴ういかなる疾患の診断にも有用である。他の抗体として、治療活性をもつ抗体を含む。すなわち、それらは、川崎病を含むCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10に伴ういかなる疾患の治療、管理、又は予防のために、治療法の中で使用されても良い。
【０３６４】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10に対する抗体は、ヒトポリペプチドのアミノ酸残基に相当するペプチドで免疫する事により作成されても良い。
【０３６５】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10に特異的な抗体は、いかなる適当なエピトープに対して作成されても良い(例えば、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10蛋白質由来のエピトープ)。
【０３６６】
本明細書の目的においては、“抗体”という用語は、選択的標的に結合できる完全抗体、又は抗体断片に言及する。反対に限定することなく、当該用語は、以下を含むが、以下に限定されない：ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、自然抗体、又は、キメラ抗体、CDR-グラフト抗体、ヒト化抗体を含む操作された抗体、そして、ファージディスプレイ又は他の技術を用いて作成した人工的に選択された抗体。当該用語は、単鎖抗体、Fab断片とFab発現ライブラリーによって生産された断片も含む。そのような断片は、標的物質に対する結合活性を保持する全抗体の断片を含み、単鎖抗体(scFv)、抗体の抗原結合部位を持つ他の合成蛋白質と同様に、Fv、F(ab') と F(ab')2 断片を含む。FvとscFvのような小さい断片は、サイズが小さく結果として組織拡散性に優れるため、診断と治療応用に有利な性質を示す。
【０３６７】
抗体とその断片は、例えば、EP-A-239400に記載されるているようなヒト化抗体であっても良い。さらには、例えば、米国特許第5,545,807 と第 6,075,181に記載されているような、完全ヒト可変領域を含む抗体(又はその断片)が用いられても良い。中和抗体、すなわち、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10のある生物活性を阻害する抗体、が、診断と治療のために使用されても良い。
【０３６８】
本明細書で記載される抗体は、標識のようなエフェクター蛋白質を含むように改変された抗体であっても良い。インビボ又はインビトロで、抗体の分布のイメージングを可能にする標識が使用されても良い。そのような標識は、放射性標識、又は金属粒子のような放射線不透過性標識であっても良く、それは、既に、胎児又は細胞塊内で可視化可能である。さらに、それらは、蛍光標識、又は組織試料上で可視化可能な他の標識であっても良い。
【０３６９】
抗体は、免疫によって、又はファージディスプレイライブラリーを用いて生産されても良い。そのような抗体は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10蛋白質、又は相同体、断片などに、特異的に結合可能であっても良い。
【０３７０】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体が望まれる場合、選択されたホ乳類(例えばマウス、ラビット、ゴート、ホースなど)が、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチド、又はペプチドを含む免疫原性組成で免疫されても良い。宿主の種類に依存して、種々のアジュバントが、免疫応答を増加させるために使用されても良い。そのようなアジュバントは、以下を含むが、以下に限定されない：フロイント(Freund's)、アルミニウムハイドロオキサイド(aluminium hydroxide)のようなミネラルゲル、リソレシチン(lysolecithin)のような界面活性剤、プルロニックポリオール(pluronic polyols)、ポリアニオン(polyanions)、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin)、ジニトロフェノール。BCG (Bacilli Calmette-Guerin) とコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum)は、有益なヒトのアジュバントの可能性を持ち、免疫学的に損なわれている個体に精製されたアミノ酸が投与される場合に全身の防御反応を刺激する目的で、それらが使用されても良い。
【０３７１】
免役された動物から血清が回収されて既知の方法によって処理される。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドから得られるエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が、他の抗原に対する抗体を含むなら、そのポリクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィによって精製される。ポリクローナル抗血清を生産して処理する技術は、当技術分野において周知である。我々は、そのような抗体を作成するための、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10アミノ酸配列、又はその断片も提供する。それらは、動物又はヒトの免疫原として使用するために、他のアミノ酸配列にハプテン化される。
【０３７２】
モノクローナル抗体
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチド又はペプチドから得られたエピトープに対するモノクローナル抗体も、当業者によって、容易に産生される。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作成する一般的方法がよく知られている。不死化抗体産生細胞株が、細胞融合によって作成される。また、直接Bリンパ球を癌原性DNAで形質転換する、又はエプスタイン・バーウイルス(Epstein-Barr virus)をトランスフェクションするような他の技術によっても作成される。軌道(orbit)エピトープに対して生産されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性、すなわちアイソタイプ及びエピトープ親和性についてスクリーニングされる。
【０３７３】
モノクローナル抗体は、培養され続けている細胞株による抗体分子の生産を提供する任意の技術を用いて製造することができる。これらは以下を含むが、これらに限定されるものではない： Koehler と Milstein（1975、Nature 256：495-497）により初めに記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB-細胞ハイブリドーマ技術（Kosborら(1983) Immunol Today 4：72； Coteら(1983) Proc Natl Acad Sci 80：2026-2030）及びEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら(1985) Monoclonal Antibodies and Therapy、Alan R Liss Inc.、pp 77-96）
【０３７４】
組み換えDNA技術が本文献に記載されるような抗体を改善するために使用されても良い。従って、診断用途又は治療用途に、その免疫原性を弱めるために、キメラ抗体が作成されても良い。そのような技術は、マウス抗体遺伝子の人抗体遺伝子へのスプライシングを含み、適当な抗体特異性と生物活性の分子を得る(Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81：6851-6855； Neuberger et al (1984) Nature 312：604-608； Takeda et al (1985) Nature 314：452-454)。さらに、免疫原性は、CDRグラフティングによる抗体のヒト化 [欧州出願特許0 239 400 (Winter)参照] 及び、付加的に骨組みの改変 [EP 0 239 400] によって最小化されても良い。
【０３７５】
また、単鎖抗体の生産(米国特許第 4,946,779号)のための技術は、物質特異的単鎖抗体の生産に応用する事ができる。
【０３７６】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチド、又はペプチドから得られたエピトープに対するモノクローナル抗体とポリクローナル抗体のどちらも、特に診断に有用である。モノクローナル抗体、特に抗イディオタイプ抗体が作成されても良い。抗イディオタイプ抗体は、保護が望まれる物質及び／又は化合物の“内部イメージ”を持つイムノグロブリンである。抗イディオタイプ抗体を作成する技術は、当技術分野において知られている。これらの抗イディオタイプ抗体も治療に有用であるかもしれない。
【０３７７】
抗体はまた、リンパ球集団にイン ビボ(in vivo)生産を誘導することによって、又は、Orlandiら（1989、Proc Natl Acad Sci 86：3833-3837）およびWinter  GとMilstein  C（1991；Nature 349：293-299）に開示されたような、非常に特異的な結合試薬のパネル、又は組換えイムノグロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって、製造することができる。
【０３７８】
ポリペプチド又はペプチドに対して特異的結合部位を含む抗体断片を作成することもできる。例えば、そのような断片としては、これらに限定されることはないが、抗体分子のペプシン消化によって作成することができるF(ab')2断片および、F(ab')2断片のジスルフィド結合を減らすことによって作成することができるFabフラグメントが挙げられる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片のすばやくかつ容易な同定を可能にするために、Fab発現ライブラリーが構築されても良い(Huse WD et al (1989) Science 256：1275-128 1)。
【０３７９】
単鎖抗体の生産技術(米国特許第4,946,778号)は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドに対する単鎖抗体を生産するために適用され得る。また、トランスジェニックマウス、又は他のホ乳類を含む他の生物は、ヒト化抗体を発現するために使用されても良い。
【０３８０】
上記の抗体は、ポリペプチドを発現しているクローンを同定、若しくは単離するために、又はアフィニティークロマトグラフィーによってポリペプチドを精製するために使用されても良い。
【０３８１】
抗体産生のための組み換え技術
組み換えDNA技術が、確立された技術に従って、ホ乳類細胞又はバクテリアの培養で抗体を生産するために使用され得る。選択される細胞培養系は抗体産物を分泌しても良い。
【０３８２】
従って、本発明者らは、培養宿主、例えば大腸菌(E. coli)、又はホ乳類細胞の培養を含む抗体の生産に関する過程を開示する。宿主は、機能的なプロモーターを含む発現カセットを含むハイブリッドベクターで形質転換される。プロモーターは、シグナルペプチドをコードする第1のDNA配列に連結され、それは、正しいリーディングフレームで、単離される抗体蛋白質をコードする第2のDNA配列に連結される。
【０３８３】
ハイブリドーマ細胞、又はホ乳類宿主細胞のインビトロ増殖は、適切な培養液で実現される。培養液は、例えば、ダルベッコモディファイドイーグル培地(DMEM)、又はRPMI 1640培地のような通常の標準的培養液であり、付加的に、ホ乳類血清、例えば、牛胎児血清、又は以下のような微量元素と増殖維持サプリメント：例えばマウス腹膜滲出細胞のようなフィーダー細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、2-アミノエタノール、インシュリン、トランスフェリン、低密度リポ蛋白質、オレイン酸、又は好ましい物、が補充される。バクテリア細胞又は酵母細胞である宿主細胞の増殖は、当技術分野において周知の適当な培養用培地で、同様に実現される。例えば、バクテリア用には、LB、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific 培地、 SOB、SOC、 2 x YT、又はM9 最小培地(M9 Minimal Medium)、酵母用には、YPD、YEPD、最小培地(Minimal Medium)、又は完全最小ドロポウト培地(Complete Minimal Dropout Medium)である。
【０３８４】
インビトロでの生産は、比較的純度の高い抗体調整物を提供し、スケールアップにより望む抗体の大量生産が可能である。バクテリア細胞、酵母、又はホ乳類細胞の培養技術は、当技術分野において知られており、例えば、エアリフトリアクター、連続撹拌リアクターの均一懸濁培養法、又は、例えば中空糸、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ、セラミックカートリッジに、固定若しくは封入した細胞培養法を含む。
【０３８５】
大量の望む抗体は、インビボでのホ乳類細胞の増殖によっても得られる。この目的のために、望む抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、組織適合ホ乳類に注入されて、抗体産生主要の増殖を誘導する。付加的には、その動物は、注入前に、炭化水素で、好ましくはプリスタン(テトラメチルペンタデカン)のようなミネラルオイルで前処理される。1から3週間後に、抗体は、動物の体液から単離される。例えば、適当なBalb/cマウス由来の抗体産生脾臓細胞とミエローマ細胞の融合によって得られるハイブリドーマ細胞、又は、望む抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Sp2/0由来の遺伝子導入細胞は、Balb/cマウスの腹腔内に注入され、付加的には、プリスタンで前処理を行う。そして、1から2週間後に動物から腹水が回収される。
【０３８６】
前述の技術と他の技術が、例えば、Kohler とMilstein、(1975) Nature 256：495-497； 米国特許第4,376,110号； Harlow とLane、Antibodies： a Laboratory Manual、(1988) Cold Spring Harborで議論されている。その内容は、参照する事により、本明細書に組み入れられる。組み換え抗体分子の調整技術は、上記の参考文献に記載されており、また、例えば、欧州特許第 0623679号； 欧州特許 0368684号 及び 欧州特許 0436597号にも記載されている。その内容は、参照する事により、本明細書に組み入れられる。
【０３８７】
細胞培養上清は、望む抗体を得るためにスクリーニングに使用される。好ましくは、始原生殖細胞(PGCs)若しくはES若しくはEG細胞のような他の多能性細胞の蛍光免疫染色によって、又はイムノブロットによって、又はサンドイッチアッセイ若しくはドットアッセイのようなエンザイムイムノアッセイによって、又はラジオイムノアッセイによってスクリーニングされる。
【０３８８】
抗体の単離のために、培養上清、又は腹水中のイムノグロブリンは濃縮され得る。例えば、硫酸アンモニウムで沈殿、ポリエチレングリコールのような吸湿性材料に対する透析、選択性透過膜による濾過などによる。必要性及び／又は希望により、抗体は通常のクロマトグラフィ法、例えばゲル濾過、イオン交換グロマトグラフィ、DEAEセルロース及び／又は(イムノ-)アフィニティクロマトグラフィ、例えば抗原、その断片、又はプロテインＡを結合したアフィニティクロマトグラフィにより精製される。
【０３８９】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞も提供される。ハイブリドーマ細胞は、遺伝的に安定で、望む特異性のモノクローナル抗体を分泌し、解凍および再クローニングにより急速凍結培養液(deep-frozen culture)から活性化できる。
【０３９０】
本発明はまた、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を調製するプロセスに関し、適切な哺乳動物、例えばBalb/cマウスを、1又はそれ以上のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチド、又はそれらの抗体断片で免疫し、免疫哺乳動物の抗体産生細胞を、適切なミエローマ細胞系の細胞と融合し、融合で得られたハイブリッド細胞をクローン化し、望む抗体を分泌する細胞クローンを選択することを特徴とする。例えば、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10で免疫したBalb/cマウスの脾臓細胞を、ミエローマ細胞株ＰＡＩ又はミエローマ細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合し、得られたハイブリッド細胞を、所望の抗体の分泌についてスクリーニングし、陽性ハイブリドーマ細胞をクローン化する。
【０３９１】
Balb/cマウスを、適切なアジュバントと共にCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10を発現する10個から107個、107個から108個の細胞を、数回、例えば４〜６回、数ヶ月間におよび、例えば２ないし４ヶ月間、皮下および／又は腹腔内注射することにより免疫し、免疫マウス由来の脾臓細胞を、最後の注射の２〜４日後に採取し、融合促進物質、好ましくはポリエチレングリコールの存在下でミエローマ細胞株ＰＡＩの細胞と融合することを特徴とする、ハイブリドーマ細胞株の調製プロセスを記載する。ミエローマ細胞は、分子量約4000の約30％〜約50％のポリエチレングリコールを含む溶液中で、免疫マウス由来の３〜２０倍過剰の脾臓細胞と融合されても良い。融合後、細胞を、選択培地、例えばＨＡＴ培地を補充した前記のような適切な培養培地で、通常の間隔で増殖させる事で、正常ミエローマ細胞が、望むハイブリドーマ細胞を超えて増殖する事を防ぐ。
【０３９２】
本明細書に記載されているCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10に対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／又は軽鎖可変ドメインをコードする挿入フラグメントを含む組換えＤＮＡもまた開示される。定義によると、そのようなDNAは、1本鎖DNA、コードDNA及びその相補鎖DNAからなる2本鎖DNA、又はこれらの相補鎖(1本鎖）DNAそれ自体を含む。
【０３９３】
さらに、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10に対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／又は軽鎖可変ドメインをコードするDNAは、重鎖可変ドメインおよび／又は軽鎖可変ドメインをコードする真性ＤＮＡ配列又はその変異体を有する、酵素的又は化学的に合成したDNAでありうる。DNAの変異体は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が欠失又は１つ又はそれ以上の他のアミノ酸と交換した、上記抗体の重鎖可変ドメインおよび／又は軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。前記修飾（群）は、抗体の重鎖可変ドメインおよび／又は軽鎖可変ドメインのCDRの外であってよい。そのような変異ＤＮＡは、１つ又はそれ以上のヌクレオチドが、同じアミノ酸（群）をコードする新規コドンの他のヌクレオシドにより置換された、サイレント変異であると捉えられる。そのような変異配列はまた縮重配列である。縮重配列は遺伝子コードの意味内で縮重しており、最初にコードされているアミノ酸配列の変化を引き起こすことなく、無制限の数のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換される。そのような縮重配列は、重鎖ネズミ可変ドメインおよび／又は軽鎖ネズミ可変ドメインの最適な発現を得るために、特定の宿主、特にE.Coliにより好まれる制限酵素認識部位および／又は特定のコドンの頻度のために有用であるかもしれない。
【０３９４】
変異体の用語は、当技術分野において知られる方法による真性ＤＮＡのインビトロミュータジェネシスにより得られるＤＮＡ変異体を含むことを意図する。
【０３９５】
完全な四量体イムノグロブリン分子のアセンブリ、及びキメラ抗体の発現のために、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡ挿入断片は、重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする対応するＤＮＡと融合させ、次いで、例えばハイブリッドベクターへの取込み後に、適切な宿主細胞に導入する。
【０３９６】
ヒト定常ドメインｇ、例えばγ１、γ２、γ３又はγ４、好ましくはγ１又はγ４に融合した、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10に対する抗体の重鎖ネズミ可変ドメインをコードする挿入断片を含む組換えDNAもまた開示される。同様に、ヒト定常ドメインκ又はλ、好ましくはκに融合した、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10に対する抗体の軽鎖ネズミ可変ドメインをコードする挿入断片を含む組換えDNAもまた開示される。
【０３９７】
別の実施態様において、本発明者らは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、スペーサー基により連結された組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを開示する。付加的には、宿主細胞での抗体のプロセシングを容易にするシグナル配列、および／又は抗体の精製を容易にするペプチドをコードするＤＮＡ、および／又は切断部位、および／又はペプチドスペーサー、および／又は効果分子を含む。
【０３９８】
効果分子をコードするＤＮＡは、診断又は治療の用途に有用な効果分子をコードするＤＮＡである。従って、毒素又は酵素、特にプロドラッグの活性化を触媒できる酵素である効果分子が特に指示される。そのような効果分子をコードするＤＮＡは、天然酵素又は毒素をコードするＤＮＡ、又はその変異体の配列を有し、当技術分野において周知の方法により調製され得る。
【０３９９】
使用
抗CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10抗体は、以下を含む方法によって、生物試料中に存在する関連するポリペプチドを検出する方法に使用されても良い：(a) 抗−CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10抗体を提供する；(b)抗原-抗体複合体を形成させるために、生物試料を前述の抗体とインキュベートする；(c)前述の抗体を含む抗原-抗体複合体が形成されたかどうか決定する。
【０４００】
適当な試料は、脳、乳房、卵巣、肺、大腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉と骨組織、又は、そのような組織由来の新生増殖組織の抽出物を含む。生物試料は、特に、川崎病の罹患が疑われる個体由来の組織を含んでもよい。
【０４０１】
抗体は、固相支持体に結合されて／又は適当な試薬、コントロール、使用説明書などと適当な容器にキットとして包装されても良い。
【０４０２】
抗体デリバリー
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10蛋白質に対する抗体は、当技術分野で知られる技術で細胞内に運搬されても良く、例えば、リポソーム、ポリマー(例えばポリエチレングリコール(PEG)、N-(2-ヒドロキシプロピル)、メタクリルアミド(HPMA)コポリマー、ポリアミドアミン(PAMAM)デンドリマー、HEMA、直鎖ポリアミドアミンポリマーなど)などである。イムノグロブリン及び／又は抗体は、細胞膜及び／又は核膜を通過できる蛋白質と融合体、又は結合体として細胞内に運搬されても良い。例えば、イムノグロブリン及び／又は標的は、トランスロケーション活性に寄与する蛋白質のドメイン又は配列と、融合又は結合されても良い。トランスロケーションドメインと配列は、HIV-1転写活性化蛋白質(Tat)、ドロソフィラアンテナペディア  ホメオボックス蛋白質(Drosophila Antennapedia homeodomain protein)、とヘルペス単純ウイルス-1(herpes simplex-1 virus )VP22 蛋白質由来のドメインと配列を含んでも良い。
【０４０３】
診断キット
本発明では、個体毎に川崎病、又は川崎病の感受性を検出する診断キットも提供する。
【０４０４】
診断キットは、個体毎のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量又は活性を検出する方法を含んでも良く、本明細書に記載される任意の方法による。診断キットは、従って、以下の任意の1又はそれ以上を含んでも良い：CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリヌクレオチド、又はその断片；CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10核酸、又はその断片に相補的なヌクレオチド配列；CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10ポリペプチド、又はその断片。
【０４０５】
診断キットは、以下の任意の1又はそれ以上を含んでも良い：抗−CACNA2D3抗体、抗−CAMK2D抗体、抗−KCNIP4抗体、抗−ANGPT1抗体、抗−NAALADL2抗体、抗−ZFHX3抗体と抗−MPHOSPH10抗体。診断キットは、例えば、抗−ペプチド抗体であるヒトCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10抗体を含んでも良い。
【０４０６】
診断キットは、使用説明書、又は他の記載を含んでも良い。診断キットは、さらに、本明細書に記載される任意の組成、又は当技術分野で川崎病の治療として知られる任意の方法のような、川崎病の治療又は予防のための方法を含んでも良い。特に、診断キットは、例えばスクリーニングによって得られる、記載のような抗−CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10物質を含んでも良い。診断キットは、記載のプレガバリン(Pregabalin)、そして／又はCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の調節剤を含んでも良い。
【０４０７】
診断キットは、サリチル酸、コルチコステロイド、プレガバリン、又はイムノグロブリン(IVIV)のような治療薬を含んでも良い。治療薬は、抗−CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10抗体を含んでも良い。
【０４０８】
予防法と治療法
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10、又はその調節剤(プレガバリンを含む)は、ヒト又は他の動物の疾患の治療に使用され得る。
【０４０９】
本発明者らは、川崎病の治療方法を開示する。川崎病を防ぐ方法(すなわち予防)も、同じ又は類似のアプローチを使用するのに適している。
【０４１０】
従って、本発明者らは、川崎病の治療又は予防に、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10とその調節剤の使用を提供する。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリン)は、川崎病を治療する薬剤又は治療法として使用されても良い。それらは、その疾患の発症又は進行を紡糸するために使用されても良い。
【０４１１】
一般的には、発明の方法は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の発現、量、又は活性の調節(ダウンレギュレーションのように)による細胞の操作を含む。治療は、一般的には、川崎病細胞、又は川崎病が疑われる細胞と、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10、又はその調節剤(プレガバリンを含む)との接触を含んでも良い。当該方法は、患者を、本明細書に記載されるCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10、又はその調節剤(プレガバリンを含む)に曝露する事を含んでも良い。
【０４１２】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10、又はその調節剤(プレガバリンを含む)、又は川崎病を治療する若しくは予防する効果を持つ事が知られる他の分子に、ただ曝露されても良く、又は併用されても良い。この場合、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10、又はその調節剤(プレガバリンを含む)の両者に、個々を同時に、又は連続的に、細胞に曝露しても良い。曝露は何回も繰り返されても良い。量又は相対量に関わらず、曝露のタイミングに関わらず、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10、又はその調節剤(プレガバリンを含む)と、他の薬剤の任意の組み合わせが使用されても良い。
【０４１３】
従って、本発明者らは、上記のようなCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10、又はその調節剤(プレガバリンを含む)と、抗川崎病薬との組み合わせの、川崎病の治療への使用を提供する。
【０４１４】
細胞は、個々の細胞であっても良く、又は細胞集団であっても良い。細胞は、生物の体内にあっても良い。生物は、川崎病に罹患している事が知られる生物であっても良く、川崎病が疑われる生物であっても良く、又は、川崎病に感受性の生物であっても良い。治療は、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10、又はその調節剤(プレガバリンを含む)を、生物に投与する事を含んでも良い。上記のように、1種類のポリペプチド／核酸／調節剤が投与されても良く、又は、任意のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10とその調節剤(プレガバリンを含む)の組み合わせが投与されても良い。投与は、上記のように、同時又は連続的であっても良い。従って、治療は、抗−CACNA2Dを、同時に又は連続的に、例えば抗−CAMK2Dと共に、個体に投与する事を含んでも良い。
【０４１５】
この目的のために、多数の定義が示され、それは、患者の治療、予防、又は福祉の進展を反映する。川崎病の場合の有用な定義は、前述の“川崎病”の項目下の“兆候”の項目に記載された任意の兆候を含む。
【０４１６】
従って、例示のように、治療された個体は、適切な解析、又は検査によって測定されると、そのような兆候の減少を示すかもしれない。治療された個体は、治療されていない個体に比較して、例えば、1又はそれ以上の兆候について、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 又はそれ以上の減少を示すかもしれない。
【０４１７】
例えば、患者の病気が、病気に伴う状態がコントロールに比較して有意に阻害(すなわち50%又はそれ以上)された場合“治療された”と定義される。阻害は、コントロールに比較して、90%まで、95%まで、又は100%のように、コントロールに比較して少なくとも75%までであっても良い。“治療”の用語は、本発明では、川崎病の予防又はALLEVIATIONも含む。
【０４１８】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリンを含む)の使用を含む治療の抗体アプローチは、従来の薬剤に基づくアプローチを含む治療への他のアプローチと組み合わされても良い。
【０４１９】
医薬組成物
本明細書に開示するように、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10とその調節剤は、川崎病の治療と予防のために使用されても良い。
【０４２０】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10とその調節剤は、経腸的、非経口的 及び局所の投与経路を含む種々の方法で投与され得る。例えば、投与の適当な形態は、経口、皮下、経粘膜、イオン泳動、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、硬膜下、直腸などである。
【０４２１】
他の実施態様としては、川崎病の治療又は予防のための、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10とその調節剤(プレガバリンを含む)からなる組成物を、製薬上許容される担体又は賦形剤と共に提供する。
【０４２２】
適当な製薬上許容される賦形剤は、プロセッシング剤とドラッグデリバリー改変剤と強化剤を含み、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、単糖、二糖、澱粉、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ソディウムカルボキシメチルセルロース、デキストロース、ヒドロキシプロピル-p-シクロデキストリン、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス、イオン交換レジン、などであり、これらの任意の2又はそれ以上の組み合わせである。他の適当な製薬上許容される賦形剤は、“レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”、Mack Pub. Co.、New Jersey (1991) に記載されており、その内容は参照することにより、本明細書に組み入れられる。
【０４２３】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10とその調節剤(プレガバリンを含む)を含む医薬組成物は、意図する投与方法に適当な任意の剤形であって良く、例えば、溶液、懸濁液、又は乳化剤を含む。液状の担体は、典型的には、溶液、懸濁液と乳化剤の調整に使用される。実際の使用のために考案された液状担体は、例えば、水、生理食塩水、製薬上許容される有機溶媒、製薬上許容される油脂、などで、それらの2又はそれ以上の混合物も同様である。 前記水溶性担体は、可溶化剤、乳化剤、栄養剤、緩衝剤、保存剤、懸濁剤、肥厚剤、粘度調節剤、安定化剤などのような、他の適当な製薬上許容される添加剤を含んでも良い。適当な有機溶媒は、例えば、エタノールのような一価アルコール、グリコールの様な多価アルコールを含む。
【０４２４】
適当な油は、例えば、大豆油、ココナッツ油、オリーブ油、ベニバナ油、綿実油などを含む。非経口投与のために、前記担体は、エチルオレイン酸、イソプロピルミリスチリン酸などのオイルエステルである事もできる。組成物は、微粒子、マイクロカプセル、リポソームカプセルなどの形態であっても良く、それらの任意の2又はそれ以上の組み合わせも同様である。
【０４２５】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、MPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリンを含む)は、望みの通常の無毒の製薬上許容される担体、アジュバント、及び溶媒を含む用量単位の剤形で、経口、非経口、舌下、吸入剤スプレイによる、直腸経由、又は局所的に投与されても良い。局所的な投与は、経皮パッチ、またはイオン泳動デバイスのような経皮投与の使用を含んでも良い。本明細書で使用される“非経口”の用語は、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、stemal内投与又は注入技術をを含むものである。
【０４２６】
注射用調整は、例えば、適当な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、公知の技術により処方されても良い。前記の無菌注射用調整は、無毒で非経口的に許容される希釈剤又は溶媒の無菌注射用水性又は油性懸濁液であっても良く、例えば1,3-プロパンジオールの溶液である。使用され得る溶媒(vehicles 及びsolvents)は、リンガー液、及び生理食塩水である。加えて、無菌の不揮発性油が、通常、溶媒又は懸濁用媒体として使用される。この目的のために、合成1価又は2価グリセライドを含む任意の不揮発性油が使用されても良い。加えて、オレイン酸のような脂肪酸は、注射剤の調整に使用できる。
【０４２７】
薬剤の直腸投与のための座薬は、適当な非刺激性の賦活剤と薬剤を混合する事により調整され得る。賦活剤は、常温で固体だが直腸温で液体であるココアバター及びポリエチレングリコールのようであって、従って、直腸で溶解して薬剤を放出する。
【０４２８】
経口投与のための固形用量形態は、カプセル、タブレット、ピル、粉末及び顆粒を含む。そのような固形用量形態では、活性化合物は、ショ糖、乳糖又は澱粉のような、少なくとも1種類の不活性な希釈剤と混合されても良い。そのような用量形態は、正常な使用法として、例えばステアリン酸マグネシウムの様な潤滑剤である、不活性な希釈剤ではない付加的な物質も含んで良い。カプセル、タブレット、及びピルにおいて、用量形態は、緩衝剤も含んで良い。タブレット及びピルは、付加的には、腸管コーティング剤と共に調整され得る。
【０４２９】
経口投与のための液状用量形態は、水のような、当技術分野で一般的に使用されている不活性な希釈剤を含む、製薬上許容される乳剤、液体、懸濁液、シロップ、及びエリキシル剤を含んでも良い。そのような組成物は、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、シクロデキストリン、及び、甘味、風味、香味剤のような、アジュバントを含んでも良い。
【０４３０】
さらに他の実施態様において、本発明者らは、ヒト又は動物において、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の任意の活性を阻害する、又は増強する方法を提供する。当該方法は、動物に、関連する活性を阻害するのに効果的な量のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10調節剤(又はそのような化合物を含む組成物)を投与することを含む。他の実施態様において、ヒト又は動物の川崎病の治療方法を提供する。その治療方法は、細胞又は動物内のCACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3又はMPHOSPH10の活性、量、又は発現を阻害する、又は増強するために効果的な量の、本明細書に記載される組成物、又は成分を、細胞、又はヒト若しくは動物に投与する事を含む。当該動物は、ヒトであっても良く、又はヒトでない動物であっても良い。蛋白活性の阻害は、コントロールに比較して、又は期待される蛋白活性に比較して、関連蛋白質の活性の検出可能な抑制を含む。
【０４３１】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3若しくはMPHOSPH10とその調節剤(プレガバリンを含む)の効果的な量は、一般的に、関連蛋白の活性を検出可能な程度に阻害するために十分な任意の量を含む。関連蛋白の活性は、本明細書に記載される任意のアッセイにより、又は当業者に知られる他のアッセイにより、又は、川崎病に苦しめられる動物において、前述の“川崎病”の項目下の“兆候”の項で記載される任意の1又はそれ以上の兆候のような兆候の軽減を検出する事によって検出される。
【０４３２】
担体材料と組み合わせて1投与量フォームとする活性成分の量は、治療される宿主と、特に投与モードに依存して様々である。しかし、任意の患者に固有の投与レベルは、以下を含む種々の因子に依存することは当然のことである：使用される組成物の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排出率、薬剤の組み合わせ、治療を行う疾患の重症度である。ある状態での治療上の有効量は、ルーチンの実験により既に決定可能であり、また、一般医師の技術と判断の範囲内で決められる。
【０４３３】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、 MPHOSPH10、又はその調節剤(プレガバリンを含む)の治療上の有効量は、一般的に、約10μg/kg/dayから100mg/kg/dayまでであり、例えば、25μg/kg/day から約 20 mg/kg/day、又は約50μg/kg/day から約 about 2mg/kg/dayである。１回又は複数回で投与されても良い。
【０４３４】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、MPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリンを含む)は、リポソームの形態でもまた投与され得る。当技術分野で知られるように、リポソームは、一般的にはリン脂質又は他の脂質に由来する。リポソームは、水系溶媒中に分散された単層又は多層の水和液晶構造によって形成される。無毒で生理学的に許容され代謝されるリポソームを形成しうる脂質が使用され得る。リポソームの形状の現在の組成は、化合物に加えて、安定剤、 保存剤、賦形剤と同種の物を含み得る。使用され得る脂質は、リン脂質とフォスファチジルコリン(レシチン類)で、自然の物と合成物の両者を含む。リポソームを形成する方法は当技術分野で知られている。例えば、Prescott、Ed.、Methods in Cell Biology、Volume XIV、Academic Press、New York、N. W.、p. 33以下(1976) 参照。
【０４３５】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、 MPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリンを含む)は、単剤の活性医薬剤として投与可能である一方、疾患の治療に使用される1又はそれ以上の他の薬剤と併用で使用され得る。川崎病の治療のために、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、MPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリンを含む) との併用に有用な代表的薬剤は、前述の“川崎病”項目下の“治療”の項の記載のように、例えば、イムノグロブリン(IVIV)、サリチル酸、コルチコステロイド治療薬などを含む。
【０４３６】
追加の活性薬剤が、CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、MPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリンを含む)と併用で使用される場合、追加の活性薬剤は、一般的には、PHYSICIANS'DESK REFERENCE (PDR) 53rd Edition (1999)−参照により本明細書に組み入れられる−に指示される治療用の用量で使用されても良く、又は、当業者により知られる治療上の有効量で使用されても良い。
【０４３７】
CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、MPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリンを含む)と、他の治療用活性薬剤は、推奨される最大治療用量で、又はより低い用量で投与され得る。組成物中の活性CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、MPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリンを含む)の用量レベルは、投与経路、疾患の重症度及び患者の反応に依存する望まれる治療反応を得るために、まちまちであっても良い。その組み合わせは、別々の組成物として、又は両薬剤を含む一剤形として投与され得る。組み合わせとして投与される場合、治療薬は、同時に、又は違う時に服用される別々の組成物として処方され得る、又は、治療薬は1つの組成物として服用され得る。
【０４３８】
バイオアベイラビリティ
本明細書で開示される化合物(と組み合わせ)は、幾つかの態様では経口的にバイオアベイラブルである。経口バイオアベイラビリティとは、経口投与薬が全身循環に到達する割合に言及する。薬の経口バイオアベイラビリティを決定する因子は、溶解、膜透過性及び代謝安定性である。典型的には、最初のインビトロのスクリーニング過程とインビボ技術が、経口バイオアベイラビリティを決定するために用いられる。
【０４３９】
溶解、消化管(gastro-intestinal tract (GIT))の水溶性内容物による薬剤の可溶化は、GITを模倣する適当なpHで行われるインビトロ溶解性実験により推定され得る。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、MPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリンを含む)は、幾つかの態様では、最小溶解度は50 mg/mlであってもよい。溶解度は、Adv. Drug Deliv. Rev. 23、3-25、1997に記載されるような、当技術分野で知られる標準的方法によって決定され得る。
【０４４０】
膜透過性は、GITの細胞を通した化合物の通過に言及する。脂溶性が、これを予測する鍵の性質であり、有機溶媒と緩衝液を用いたLog D7.4インビトロ測定によって定義される。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、MPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリンを含む)は、Log D7.4 of 2 to +4 or 1 to +2であってもよい。log D は、J. Pharm. Pharmacol. 1990、42：144に記載されるような、当技術分野で知られる標準方法によって決定され得る。
【０４４１】
CaCO2のような単層細胞アッセイは、p-糖蛋白質のような排出トランスポーターの存在下で、実質的な都合の良い膜透過性の予測を加え、caco2フラックスと呼ばれる。CACNA2D3、CAMK2D、KCNIP4、ANGPT1、NAALADL2、ZFHX3、MPHOSPH10又はその調節剤(プレガバリンを含む)は、2x106cms1より大きい（例えば、5x106cms1より大きい）caco2フラックスを有していても良い。caco flux 値は、J. Pharm. Sci、1990、79、595600.に記載されるような、当技術分野で知られる標準的な方法で決定され得る。
【０４４２】
代謝安定性は、吸収の過程で化合物を代謝するGIT又は肝臓の能力である：すなわち初回通過効果である。ミクロソーム、肝臓のようなアッセイ系は、代謝能を予測する。実施例の化合物は、幾つかの実施態様では、0.5より小さい肝抽出液と同一基準のアッセイ系で代謝安定性を示すかもしれない。アッセイ系とデータ取り扱い例は、Curr. Opin. Drug Disc. Devel.、201、4、36-44、Drug Met. Disp.,2000、28、1518-1523.に記載されている。
【０４４３】
上記の過程の相互作用のため、薬剤がヒトで経口バイオアベイラブルかどうかのさらなる裏付けが、動物のインビボ試験で獲得され得る。この試験では、化合物が別々に、又は混合されて経口経路で投与される事によって、明らかなバイオアベイラビリティが決定される。明白な決定(吸収%)のために、血管経路も行われる。動物での経口バイオアベイラビリティの評価例は、Drug Met. Disp.,2001、29、82-87； J. Med Chem 、1997、40、827-829、Drug Met. Disp.,1999、27、221-226.に見出される。
【０４４４】
本明細書で使用される“製薬上許容可能な担体”の用語は、一般的に、活性成分と反応しない有機又は無機材料に言及する。担体は、以下を含むがこれらに限定されるものではない：乳糖、ブドウ糖、ショ糖のような糖；コーンスターチ、ジャガイモ澱粉のような澱粉；カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、セルロースアセテートのようなセルロースとその誘導体；粉末のトラガンカンス(tragancanth)；モルト；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ごま油、オリーブ油、コーン油、カカオ油のような植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マニトール、ポリエチレングリコールのようなポリオール；寒天；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張性生理食塩水；リン酸緩衝液；スキムミルクパウダー；製剤に使用する他の無毒生体適合性物質。着色料、調味料、潤滑剤、賦形剤、タブレット化剤、安定化剤、抗酸化剤と同様に、湿潤剤とラウリル硫酸ナトリウムのような潤滑剤も使用され得る。
【０４４５】
本明細書で使用される“治療上の有効量”の用語は、一般的に、治療の必要性において患者に投与された時に、本明細書で定義される治療を成し遂げるために十分であるような、活性成分としての化合物の量のような薬剤の量である。本発明の化合物、塩、誘導体、異性体、鏡像異性体の治療上の有効量は、以下を含む多数の因子に依存する：例えば患者の年齢と体重、治療を必要とする正確な状態と重症度、製剤の性質、投与経路である。また、最終的には、医師又は獣医師の裁量による。しかし、本発明の化合物の、バクテリア又はウイルス感染に伴う疾患、特に細菌性髄膜炎の治療のための有効量は、一般的には、1日当たり約10 から 約 40 mg/kg 体重 (ホ乳類) で、さらに一般的には約40 mg/kg 体重 ／日である。従って、70 kgの成人患者に対する1日当たりの具体的量は、典型的には約2,800 mgであり、この用量は1日当たり1回で服用されても良く、又はさらに一般的には、1日当たりの用量は同じになるように、副用量を1日当たり数回(２，３，４，５又は６回)で服用されても良い。本発明の塩の有効量は、化合物そのものの有効量との比で決定されても良い。
【０４４６】
本明細書で使用される“治療”の用語は、動物の、詳しくはホ乳類の、さらに詳しくはヒトの、状態又は疾患の任意の治療であり、以下を含む：その疾患の素因があるが、まだ罹患していると診断されていない患者に発生する状態と疾患の予防；疾患又は状態の抑制、すなわち疾患の進展の停止；疾患又は状態の寛解、すなわち状態の退縮の誘導；又は疾患により引き起こされる状態、すなわち疾患の兆候の寛解。
【０４４７】
化学的誘導体
本明細書で使用される“誘導体(derivative)”又は“誘導体化された(derivatised)”の用語は、化合物の化学修飾を含む。化学修飾の実例は、水素の、ハロゲングループ、アルキルグループ、アシルグループ、又はアミノグループへの置換である。
【０４４８】
化学修飾
1つの実施態様として、化合物は、化学修飾された化合物であっても良い。
【０４４９】
化合物の化学修飾は、化合物と標的間の、水素結合、電荷結合、疎水結合、ファンデルワールス結合、又は双極子結合を、増強又は減少させてもよい。
【０４５０】
ある局面では、見出された化合物は、他の化合物を開発するためのモデル(例えば、テンプレート)として働くかもしれない。
【０４５１】
個体(individual)
化合物は個体に渡される。本明細書で使用される“個体(individual)”は、脊椎動物、特にホ乳類のメンバーに言及する。当該用語は、家庭の動物、スポーツ用動物、霊長類とヒトを含むが、これらに限定されるものではない。
【０４５２】
［実施例１．材料及び方法：研究デザイン］
本発明では、段階的な研究デザインを用いた。最初に、オランダコーカサス人種の症例−コントロール試料のゲノムワイド関連解析を行った。最も有意に関連する一塩基多型及びハプロタイプを、オーストラリア、米国と英国の川崎病トリオの独立の試料で、別の遺伝子タイピング技術を用いて、再度試験を行った。
【０４５３】
［実施例２．材料及び方法：表現型定義と症例確認］
KDは、発熱、発疹と粘膜の変化を含む、乳幼児の他の感染症性疾患と多くの特徴を共有する。診断テストはなく、研究上の個々のパラメーターは、感度や特異性が診断のためには不十分である2。
【０４５４】
全てのコホート分析で、保存的で広く受け入れられる川崎病症例の定義を行い、表現型の均質性と診断の特異性を最大化しようと試みた。川崎病は、5種類の古典的な診断基準13の内の少なくとも4種類と、長引く発熱の存在により定義される13。少なくとも5日間の熱と2種類の診断基準と、川崎病の急性期及び／又は回復期の冠動脈障害の心エコーの変化を伴う子供も含まれる。これらの冠動脈の症状は、川崎病にありがちな特徴である13。不完全な川崎病の症例−発熱と4種類より少ない診断基準が存在する症例で、臨床的治療を受けている川崎病の約15%を構成する14−は除外されている。
【０４５５】
全てのコホートで、臨床データと実験データは、患者の医療ファイルから直接入手し、親の質問表で捕捉された。表現型データは、全症例で、経験のある小児科によってレビューされた。各研究集団に、適当な公的地域制度の審査委員会から倫理上の承認が得られた(Academic Medical Center [AMC]、Amsterdam (Dutch cohort)、UK Multi-Centre Research Ethics Committee (UK cohort)、each participating tertiary paediatric hospital's ethics committee (Australian cohort) 、 the University of California at San Diego、The Children's Memorial Hospital of Chicago、Northwestern University Feinberg School of Medicine、Boston Children's Hospital (US cohort))。必要に応じて、インフォームドコンセントと同意が、参加する家族から得られた。
【０４５６】
［実施例３．材料及び方法：患者］
最初のGWASは、119のオランダ系コーカサス人種の川崎病症例と135の健常者コントロールで行われた。症例は、共同研究を行っている小児科医によって同定されて、急性期の間、心臓学的評価のために、引き続きフォローアップのためにAMCに送られる。コントロールは、無関係の、同じ地理的地域に居住する成人コーカサス人種血液ドナーである。民族は、患者自身、又は親の民族識別により決定される。集団の構造化の評価はエイジェンストラット(Eigenstrat)で行われた 15。第2の独立コホート−583の川崎病家系で構成され、オーストラリア、米国、英国からの完全トリオと不完全トリオを含む−は、最初のGWASで同定された最も有意に関連する変異体を確認するために使用された。各国の川崎病家系の症例は、小児病院データベースから、川崎病親のサポートグループを通して、又はメディアの公表を通して発見された。生物学的親(有用な場合)と非罹患の兄弟(再構成により親の遺伝子型を失っている)は、募集された。
【０４５７】
［実施例４．材料及び方法：DNA 及び RNA の回収と抽出］
血液はEDTA (オランダ、英国、 及び 米国コホート)及びADC (オーストラリアコホート   バフィーコートは分離される)中に回収される。脱落する口腔の細胞が、以前に記載されたように回収された16。ゲノムDNAは、標準プロトコルによって抽出された。DNAの品質は、1.2%アガロースゲル電気泳動後にOD260nm/280nmの吸収比率を計算する事により、視覚的検査で評価された。DNA定量は、ピコグリーンdsDNA試薬（Picogreen（登録商標） dsDNA reagent）を用いて測定された。分解された、又は低濃度の試料は除外された。
【０４５８】
川崎病症例の定義を完全に満たす米国の27症例に由来する、急性川崎病症例由来のRNA試料は、血管内イムノグロブリン治療の前と、再度回復期に回収された(1年以内n = 17,1年後 n = 10)。これらの川崎病患者は、フォローアップコホートの遺伝子型タイピングでも解析された。全血は、パックスジーン（PaxGene（登録商標））のチューブに回収され、使用説明書の通りにRNAが抽出され、バッチ解析の間、-80oCで保存された。RNA定量は、吸光度(260nM)によって測定された。
【０４５９】
［実施例５．材料及び方法：GWASの遺伝子型タイピング及びフォローアップ研究］
アフィメトリクス250KNSPチップ（Affymetrix（登録商標） 250K NSP chip）を使用して、使用説明書に従って、オランダ人の症例−コントロール試料の遺伝子型タイピングを行った。BRLMMアルゴリズム(マハラノビス距離分類を含むベイズの直線モデル、アフィメトリクス（Bayesian Robust Linear Model with Mahalanobis distance classifier,Affymetrix（登録商標））で解析後にコールレートが93%以下、p = 0.33の試料は、再度ハイブリダイゼーションを行い、決められた閾値に達しない場合、次の解析から排除された。
【０４６０】
GWASによる関連する個々の一塩基多型は、アーミテッジの傾向検定(Armitage trend) テスト、リセッシブ−ドミナント(recessive-dominant)モデルとアレルの関連性の組み合わせを用いて、名義上の重要性によってランク付けされた。ボンフェローニ修正法を適用した後に、コントロールグループのHWEから大きく逸脱する場合、又は遺伝子型タイピングのQCを失敗した場合(セルレート < 93%、又は単一遺伝子型)、一塩基多型は次の解析から除外された。最も有意に関連する一塩基多型1176は、慣習的にイルミナオリゴプールアッセイ（Illumina（登録商標）Oligo Pool Assay）によって、オーストラリア、英国、及び米国トリオの遺伝子型タイピングのために選択された。28の一塩基多型の遺伝子型タイピングアッセイは、デザインされず、1148の一塩基多型はフォローアップ研究のために残した。レルペア(RelPair) 17で家系的関係が検出されない場合、試料の重複がある場合、発端者の遺伝子型が活用できない場合、3以上のメンデル遺伝の変異を含む場合、その家族は排除された。うまく遺伝子型タイピングが行われた一塩基多型の解析は、イルミナビーズスタジオ（Illumina（登録商標） BeadStudio）ソフトウェアで行われた。加えて、GWAデータのハプロタイプ解析が、マルチマーカースライディングウィンドウ18を使用して行われた。ハプロタイプ解析によって同定された全166の一塩基多型の遺伝子型タイピングは、家系のフォローアップコホートでシークエノムiPLEX（Sequenom iPLEX（登録商標））によって実行された。
【０４６１】
［実施例６．材料及び方法：関連遺伝子の同定］
フォローアップ家系研究で確認された各疾患関連遺伝子多型のために、その変異が、アノテートされた遺伝子の内部にあるかどうかを探索した。一塩基多型が遺伝子領域の内部にある場合、50kb上流と下流内に位置する最も近接したアノテートされた遺伝子を解析した。
【０４６２】
［実施例７．材料及び方法：ジーンオントロジークラスタリング］
関連遺伝子は、インジェニュイティパスウェイアナラシス(Ingenuity Pathways Analysis (IPA))ソフトウェア（Ingenuity（登録商標）Systems、www.ingenuity.com）を使用して、ジーンオントロジーが解析された。ネットワークの構築を開始するために、IPAは、同定した“注目遺伝子”−本明細書ではGWASで検出された遺伝子、とナレッジベースに保存される他の全遺伝子との間の相互作用を探して、1セットのネットワークを作成するために−最大のネットワークサイズは、１蛋白質当たり35遺伝子−インジェニュイティパスウェイナレッジベース(Ingenuity Pathways Knowledge Base)に質問した。ネットワークは、遺伝子／遺伝子産物(‘ノード’)と、ノード間の生物学的相互作用(‘エッジ’)として、グラフィカルに表示される。全エッジは、印刷物からの、又はインテグリティパスウェイナレッジベースに保存された標準情報からの少なくとも1つの参考文献によって、支持される。IPAは、使用者の重要遺伝子セットにフィットにより、各ネットワークのスコアを計算する。スコアは、log (p-値)で表示され、インジェニュイティのナレッジベースのネットワーク内で、注目遺伝子が、ランダムな機会の結果一緒に見出される可能性を示す。
【０４６３】
［実施例８．材料及び方法：遺伝子発現］
IPAによる関連性に対応する又は同定された遺伝子は、タックマン低密度アレイ(TLDA； Applied Biosystems、Foster City、CA、USA)を使用して、製造者の使用説明書のように2μgトータルRNAで、ディファレンシャルな発現が調べられた(川崎病の急性期と回復期の間)。試料RNAの濃度は、内部標準として18S  RNAを用いて、標準化された。データは、SDS RQ マネージャーソフトウェア(Applied Biosystems)で解析された。遺伝子発現データは、ジーンスプリング GXV 7.3 (Silicon Genetics、Redwood City、CA)に取り込まれて、ディファレンシャリーに発現される遺伝子を同定するために、ANOVA t-検定(不均一な分散と仮定する)によって、解析された。
【０４６４】
［実施例９．材料及び方法：統計解析］
最初のGWASと、コントロールグループのHWEと、アレル関連解析は、ヘリクスツリー v4.4.1 (GoldenHelix Inc.、Bozeman、MT、United States) とエグゼンプラー (Sapio Sciences、LLC、York、PA、United States)を使用して計算された。アレルのP-値は、2 x 2 インチ分割表の方法で計算されて、アーミテッジの傾向検定が遺伝子型タイピングのp-値を引き出すために使用された。遺伝子型関連解析とオッズ比率は、エグゼンプラーを用いて計算された。任意の細胞が5以下と数えられる場合に、両側のフィッシャーの正確確率検定が使用された。X染色体の一塩基多型のアレル解析は、ハプロビュー v3.31 19で行われ、尤度比検定(likelihood ratio test)が、遺伝子型の関連を計算するのに適用された。分位点分位点(quantile-quantile (Q-Q))プロットは、1セットのlog pの値のランキングにより構築され、期待値に対してプロットされる。1度の自由度でカイ二乗分布から抜き出される仮想値が与えられる。同等ラインからの逸脱は、理論上の分布が正しくない事、又は試料は、他の意味で作成された値が混入(例えば、真の関連によって)している事を示した。家系の相関分析は、FBAT20を用いて行われ、広範囲の家系に連鎖不均衡分析を行った。P-値とオッズ比の組み合わせが、フィッシャーの組み合わせ確率検定によって計算され、欠損仮説21を共有する数種類の検定の情報プールを形成した。
【０４６５】
［実施例１０．材料及び方法：ハプロタイプ解析］
ハプロタイプの関連性の解析は、最近記載された方法、集団内の症例−コントロールの関連研究のための方法18であるVSSWRR (Variable-Sized Sliding Window via Regularized Regression)を用いて行われる。それは、多様なサイズのスライディングウィンドウを使用し、最大ウィンドウサイズは、ハプロタイプの多様性及び試料サイズにより決定される。また、長さの異なる(最大ウィンドウサイズまで)全ハプロタイプの、同じ開始点からの組み合わせ解析は、ハプロタイプ間の依存性と相補性で調整するL1-正則化 回帰法を用いて行われる。それは、多数のハプロタイプの効果的な管理を行い、また患関連性の検出に強力である18。
【０４６６】
［実施例１１．結果：ゲノムワイド関連研究］
川崎病119症例とコントロール135例が、最初のGWASで解析された(表１)。
【０４６７】
表１.GWAS(オランダ症例-コントロール試料) とフォローアップ研究 (オーストラリア、米国、英国の家族)  被験者の人口統計学的 臨床的特徴
2010043063.tif 000006
a 17患者は情報なし。
【０４６８】
10人の非コーカサス人種患者は、この後のエイゲンストラット(Eigenstrat)による混合解析から排除された15。3試料は、遺伝子型タイピングコールレート<93%のため排除された。従って、最終的にGWA解析は、107人の川崎病患者と134人のコントロールで構成された。アフィメトリクス250K NSP チップ上の262,264の一塩基多型のうち18,211が、コールレート<93%であり、18,981が、単一多型である(MAF <0.1%)。また、コントロールグループのHWE から1,150が有意に逸脱；従って、223,922の一塩基多型が解析に利用可能であった。そのうち5,571がx染色体上にある。総数14,065の一塩基多型は、有意に関連し(p <0.05)、1915以上の一塩基多型は、単なる偶然によってこのレベルの有意性で関連すると期待された。実測と期待値間のアレル頻度の分位点分位点(quantile-quantile (Q-Q))プロットは、期待値から逸脱を示し、p <~10-4であり、真の関連性の存在が示唆された(図１)。
【０４６９】
［実施例１２．結果： 独立コホートのフォローアップ研究］
家系の関連性の確認と試料重複のチェックの後に、63試料が次の解析から排除された。従って、498トリオを含む583の川崎病家系の1,903人のメンバーがフォローアップ関連分析で検定された。
【０４７０】
［実施例１３．結果：個々のSNP関連性］
1,148のかなり相関性の高い一塩基多型変異(優位差の最小レベルがp <0.0024に対応)がアーミテッジの傾向検定、リセッシブードミナント、アレル関連分析(図２)の組み合わせによって選択された。一塩基多型は、イルミナオリゴプールアッセイ（Illumina（登録商標） Oligo Pool Assay）によるフォローアップコホートで遺伝子型がタイピングされた。1,116の一塩基多型が遺伝子型タイピングに成功である(表Ｓ１)。15の一塩基多型がクオリティフィルターに失敗して、総数1,101の一塩基多型が残された(表２)。
【０４７１】
40の一塩基多型が複製され、川崎病感受性との有意な相関が示された。28が50kbの既知の遺伝子内に位置する。
【０４７２】
最も高く相関した一塩基多型は、N−アセチル化アルファ結合酸性ジペプチダーゼ様２(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 2 (NAALADL2))の遺伝子内部に位置する(症例ーコントロールと家系解析の組み合わせOR = 1.43 (1.32-1.53)； pcombined = 1.13x10-6)。
【０４７３】
3種類の一塩基多型が、AT結合転写因子1(ZFHX3)のイントロン内に位置している。3種類の全てが保護効果を持っていた(それぞれ、ORcombined = 0.64 (0.52-0.75)、0.68 (0.57-0.79)、0.73 (0.62-0.84)； pcombined = 2.37x10-6、7.06x10-5、5.35x10-4)。これらの位置塩基多型のうち2種類は、647bpしか離れておらず、高い不均衡連鎖(LD) (r2 = 0.93)である。一方、3種類目は~10kbの距離にあり小さいLD (r2 = 0.46)である。
【０４７４】
325bpの距離で、完全LD (r2 = 1)の2つの一塩基多型が、アンジオポエチン1遺伝子(ANGPT1) (ORcombined = 0.58 (0.43-0.73) 及び0.6 (0.45-0.76)； pcombined = 3.39x10-5 及び5.44x10-5)の.3'側.~10kb に位置する。
【０４７５】
表２.フォローアップ研究で確認された有意に関連する変異
2010043063.tif 000007
【０４７６】
2010043063.tif 000008
【０４７７】
2010043063.tif 000009
【０４７８】
2010043063.tif 000010
【０４７９】
2010043063.tif 000011
a 一塩基多型を含む遺伝子、又は一塩基多型の上流又は下流50kbまでの近接遺伝子。b ハプロタイプTDTのオッズ比が、FBAT ソフトウェアビューハップ コマンドから再構築されたハプロタイプに基づいて計算された。. c 情報源の家系数d 35 rs11711042を構築
【０４８０】
［実施例１４．結果：ハプロタイプの関連性］
最も高い関連性を示す35種類のハプロタイプブロック(p < 2x10-3に相当)内部の166種類の一塩基多型は、フォローアップコホートで、シークエノムiPLEX(Sequenom iPLEX)プラットフォームを使用して遺伝子型タイピングが行われた(表Ｓ２)。29種類の一塩基多型は、遺伝子型タイピングできず、137種類の一塩基多型が次の解析に残された。有意な関連性が6種類のハプロタイプで確認され、そのうち4種類は既知の遺伝子内にある。
【０４８１】
2種類のハプロタイプが、M期リン酸蛋白質10(U低分子リボ核タンパク)、MPHOSPH10をコードする遺伝子の内部に位置する。これらのハプロタイプの内1種類は、感受性の亢進に関与し(ORcombined = 3.52 (1.6-7.75)； p = 3.69x10-3)、他方は、川崎病からの保護に関与する(ORcombined = 0.39 (0.24-0.63)； p = 3.91x 10-4) (表２)。
【０４８２】
［実施例１５．結果：ネットワーク解析］
個々の一塩基多型とハプロタイプ解析は、合計45疾患関連性を同定した(40 種類の一塩基多型と6種類のハプロタイプ )。これらの45種類の相関に関連して31遺伝子を同定した(表２)；14種類の変異体が10種類の遺伝子内部にあり、17種類が50kb以内に21遺伝子を含み、一方、14種類が、既知のアノテートされた遺伝子の近傍ではない。
【０４８３】
31遺伝子は、IPAナレッジデータベースにロードされる。全遺伝子がこのソフトウェアで同定されるが、29遺伝子のみが、データベースにマップされ、21遺伝子のみがIPAによって連結されたネットワークを持つ事が知られる。
【０４８４】
高度に有意なスコア29(p <10-29)を持つ35遺伝子の1つのネットワークを同定した。それは、GWASで同定された21の関連遺伝子の内、12遺伝子を含む。24遺伝子が取り込まれ、後にネットワークに含まれる遺伝子として参照される。このネットワークからのハイライトが図３ と図４に示される。このネットワークは、IPAによって、心血管系の発達と機能に関して分類される。
【０４８５】
図３の遺伝子は、ANGPT1、TNF、PCZD2、TREM1、CACNA2D3、NFYB、HMGN3、AK2、MYC、SERBP1、TPP2、RBMS1、ZFHX3、CCND1、GLG1、ヘパリン、CAMK2D、NUMB、LNX2、LNX1、TGFBETA及びRNF11を含む。
【０４８６】
図４の遺伝子は、ANGPT1、LNX2、NUMB、CAMK2D、FXYD1、IL1B、ELK1、IFNGR2、KLRG1、CCL2、IL2、CDKN1A、IL13、IL4、CASP1、CCL8、IL10、FCGR2A及びカスパーゼを含む。
【０４８７】
［実施例１６．結果：遺伝子発現］
31種類の遺伝的に関連する遺伝子の内27種類を検討し、24種類のネットワークに含まれる遺伝子の内15種類はディファレンシャルな発現を検討した(川崎病の急性期 vs. 回復期)。解析には、研究症例の定義を完全に満たす米国の子供27症例の急性期と回復期のペアの全血液試料を用いた(表３)。
【０４８８】
54のRNA試料の内、2つのペアが、RNAの品質が不適当のため、排除された。これらの42遺伝子の発現は、リアルタイム逆転写PCRで評価された(表３)。4種類の遺伝子は、TLDAによって検出されず、末梢血で発現されていないかもしれない。末梢血で発現されているGWASで同定された関連遺伝子のうち、最も大きな変化(fold change) (FC =-6.6 ,p = 3.5x 10-4)を示すNAALADL215と、最も重大な差異(p = 6.3x10-8、FC = -2.6) (表３)を示すCAMK2Dを含む15種類が急性期の川崎病患者で、有意にディファレンシャリーに発現されていた。
【０４８９】
IPAで同定された15遺伝子の内、10種類が、川崎病の急性期対回復期でディファレンシャリーに発現されていた(表３)
【０４９０】
表３.関連遺伝子と、同一川崎病患者の急性期と回復期試料のIPA (Ingenuity Pathway Analysis)によって同定された遺伝子の、ディファレンシャル遺伝子発現
2010043063.tif 000012
【０４９１】
2010043063.tif 000013
【０４９２】
2010043063.tif 000014
【０４９３】
［実施例１７．ディスカッション］
我々の知る限り、これは、任意の感染症の最初のGWASであり、これまでで最大の川崎病の遺伝子研究である。我々は、川崎病の感受性に関連する多数の新規一塩基多型とハプロタイプを同定した。
【０４９４】
これらには、その機能が川崎病の病態にもっともらしい遺伝子の内部、又は近傍に位置する変異体を含む。同様に、アノテートされた発現遺伝子のない明白な‘遺伝子砂漠’の内部に位置する遺伝子も含む。これらの発見は、2型糖尿病、肥満、クローン病のような他の複雑な疾患の、最近の大規模GWASと一致する：既知の発現遺伝子の内部にも、アノテートされた遺伝子が同定されていないゲノム領域内部にもマーカーが存在する22,23。
【０４９５】
川崎病感受性への効果の程度については、本発明で最も有意に関連する変異体は感受性に3．5倍まで影響し、多くの複雑な疾患で一般的に報告されている効果より高いけれども、他のGWASからの報告に匹敵する22。
【０４９６】
これらの関連する一塩基多型のマッピングは進行中であり、疾患-改変変異体を同定しやすく、又はこれらの変異体と共に連鎖不均衡の変異体を同定しやすい。そのため、本物の関連を現す領域のため、効果の大きさは増加傾向にある。関連する変異体が川崎病の感受性に関与する遺伝子座の内部、またはその近傍に位置する事の主張は、以下によって支持される；(i) LDの中に、 2又は3の独立の関連する変異体を含む多数の遺伝子、(ii)23種類の血液に発現する関連遺伝子の内、15種類の遺伝子が、川崎病の急性期対回復期でディファレンシャルな遺伝子発現、(iii)多数の関連遺伝子座位と、機能的に関連する遺伝子間の、偶然に全く起こりそうにない、もっともらしい関連性を示唆するネットワーク解析。
【０４９７】
31種類の関連する変異体が、発現される遺伝子の内部、又は近傍に位置しており、それらの多くが、川崎病の初期症状に関連するであろう機能を持つ。特に、長引く異常な炎症を伴う免疫学上の又は感染症の結果にリンクする機能である24。参考文献がZFHX3、ANGPT1、NAALADL2 及びKCNIP4のディスカッションのために、前述に文書化されている。
【０４９８】
個々の関連遺伝子に加え、公表された文献の知識に基づくレビューよりネットワークを同定するIPAにより、関連遺伝子間の関連を検討した。この解析は、遺伝的関連遺伝子の内12種類を23種類の他のノード−‘心血管系の発達と機能’として記載される重要なネットワークのノード−に連結した。そのネットワークは、炎症と心臓特異的分子の間の多数の相互作用を示し、カルシウムシグナリングが中心的な役割を果たす。
【０４９９】
炎症は、川崎病の血管障害を媒介する2。炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子(TNF)と、負の調節因子トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)のようなメディエーターは、川崎病で逆の発現を示し、冠動脈瘤の病態に関与する事が動物モデルで示唆されている39-42。最近の研究で同定されたRNF11遺伝子は、TGFβの既知の調節因子をコードし、また、多数の他の細胞シグナリング機能を持つ43。そのネットワークは、TNFとTGFβが、転写因子NFYB(核転写因子 Y、beta) とMYC (v-myc ミエロサイトマトーシスバイラルオンコジーンホモローグ(トリ))を通して、病態効果を発揮する事を示唆する。それらの転写因子は、VEGFとANGPY1と2の調節因子でもある44。NFYBとMYCの両者は、カルシウムシグナリングに関与しており、カルシウムシグナリングは、ネットワークで同定された多数の遺伝子の機能の中心である。
【０５００】
MYCとNFYBに関連する2種類の遺伝子は、川崎病の特に強調される候補分子である；(i) CACNA2D3 (電位依存性カルシウムチャネルアルファ 2/デルタ 3 サブユニット)。心臓で発現され、サイトカインやカルシウムシグナリングにつながる血漿中のリガンドを結合する45； (ii) CAMK2D (カルシウムカルモヂュリン依存性蛋白リン酸化酵素 (CaM kinase) II デルタ)。心臓で発現され、カルシウムシグナリングに関与する。前述のCACNA2D3 とCAMK2Dのディスカッションの文章を参照。
【０５０１】
さらに、これらの真の機能的関連性を探究するために、ゲノムと遺伝子発現の検討が進められている。
【０５０２】
702症例の試料は、最も大規模な遺伝的川崎病コホートを示し、主に、単一民族グループに由来する。本研究では、この最も緩やかな効果サイズのサンプルにおける、緩やかな効果サイズの関連性をマスクする多数の統計的比較を修正する事を避けるために、段階的アプローチを行った。GWASのゲノムカバー率とパワーは限定的であり、最初のGWASは、OR が2.0 、 p <0.05を検出するための約50％のパワーにすぎない事に本発明者らは気付いている。従って、本研究におけるアプローチは、最初のデザインの部分に多数の独立の重複コホートが含まれる事を確認する事で、1型エラーのリスクを削減する事を目的としており、GWASでコホートサイズを与えるGW有意差に達する事は期待していなかった。最初のGWASは、偶然だけでは期待されないp<0.05の有意な関連性の1915種類の一塩基多型を同定した。
【０５０３】
Q-Q解析は、凡そp <10-4で、観察された関連性が、期待される結果(有意な関連性の欠如)から有意に逸脱している事を示した。混入する集団から発生する偽相関の機会を最小化するために、本発明者らは、明確なコーカサス人種でない試料を排除して、症例ーコントロール試料の詳細な階層別解析を行った。重複研究では、主としてコーカサス人種の家系に基づく関連性解析を使用した。それは、集団の階層化効果に感受性が低く55、類似した関連性の推測を与える56。しかし、情報のない親の排除によって、パワーが減少する。追加する家系ベースの解析は、アレルのみが同定でき、遺伝子型の相関は同定できない。従って劣性の（リセッシブ）効果は失われる。本発明者らは、重複研究のために、遺伝子型法とアレル法の両者によりSNPsを選択した。しかし、遺伝子型の相関は、症例−コントロールデザインで確認されなければならず、コントロール群は、本コホートでは活用できなかった。従って、家系ベースの方法により確認された関連性は、症例ーコントロールデザインを行うより強い関連性だが、この研究デザインによって確認できない生物学的に重要な関連性が存在するかもしれない。
【０５０４】
GWASで同定された変異体周辺の付加的な変異体を含む関連遺伝子座のようなファインマッピング(fine-mapping)というよりは、GWASによって関連付けられたSNPsを直接、重複研究する事を選択した。フォローアップ段階で同定される付加的な局所変異体は、擬陽性関連の機会を増大させる事を含むように57、重複研究にとって、前記方法が最もパワフルで効果的な戦略であることが示唆されている。本発明者らは、遺伝子型タイピングのエラーにより発生する擬陽性関連の持ち越しを最小化するために、各ステージ毎に、異なる遺伝子型タイピング技術を使用した。
【０５０５】
正確な計算は不可能だが、本研究のゲノムカバー率は50%以下のようである。本研究の目的は、明らかな候補遺伝子座ではない、川崎病の新規遺伝子決定因子を同定することにある。従って、以前に報告された信頼できる川崎病に関連する候補遺伝子IL-458、VEGF59,60、 CCR516、及びMBL61も、最近報告されたn ITPK変異体 49も、GWASで再現されない事は驚きではない。本研究は、ほぼ確かに、これらや、川崎病の感受性のさらなる主要な決定因子である未同定の変異体を、同定し損なっている。川崎病の疫学データは、感染トリガーが広く分布しており、多くの患者が、乳幼児期に、原意となる病原体に遭遇している事を示唆している3。川崎病は、主要な効果を発揮する比較的少数の珍しい遺伝子変異から、又は、組み合わせが比較的珍しい数種類のより一般的な変異体から発生する可能性がある。北東アジア民族にかなり罹患が多い事は、幾つかの遺伝的決定因子がこれらの集団に特徴的であるか、その頻度がコーカサス人種よりかなり高いかを意味する。ITPKC変異49は、米国のコーカサス人種と日本人の両者に存在しており、少なくともこのハプロタイプブロック内の遺伝的均質性を意味している。他の民族グループの患者の他の調査研究はほとんどない。
【０５０６】
結論として、これは、感染症の初めてのGWASであり、川崎病の大規模遺伝子研究である。比較的緩やかなパワーとゲノムカバー率にも関わらず、多数の新規関連SNPsを同定した。それらの多くが、以前には川崎病の候補と認識されていなかった遺伝子の内部、又は近傍に位置している。その効果サイズ、異なる手段での独立の検証、ディファレンシャルな遺伝子発現、及びネットワーク解析の全てが、少なくともこれらの変異体の比率が、川崎病の遺伝的リスク因子である事を表している。幾つかの関連遺伝子が、相互作用して、心血管系の炎症の有害な効果を媒介するかもしれない。関連遺伝子とそれらの機能的相互作用のさらなる特徴付けは、川崎病の新規診断方法や治療標的の同定につながるかもしれない。また、動脈硬化症の初期の病態プロセスに情報を与えるかもしれない。
【０５０７】
本発明のさらなる観点と態様が、以下の番号付けされたパラグラフに提示される；当然のことながら、本発明はこれらの観点を包含する：
【０５０８】
パラグラフ 1. 川崎病の診断、検出、治療、又は予防のための方法であって、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３ 又は図４に示される遺伝子、遺伝子によってコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型、又はハプロタイプ、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列の、検出又は改変を含む方法。
【０５０９】
パラグラフ 2. 前記方法は、表２に示される遺伝子多型を検出する事を含む、川崎病の診断又は検出のためのパラグラフ１に記載の方法。
【０５１０】
パラグラフ 3. 前記遺伝子多型は、NAALADL2、ANGPT1及びZFHX3から選択される遺伝子、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列の内部、又は周辺に存在するパラグラフ1又は2に記載の方法。
【０５１１】
パラグラフ 4.前記遺伝子多型は、rs17531088、rs1010824、rs6469101、rs7199343、rs10852516 及び rs11075953からなる群より選択されるパラグラフ1、2又は3に記載の方法。
【０５１２】
パラグラフ 5. 前記方法は、表２に示されるハプロタイプ、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列を検出する事を含む、川崎病の診断又は検出のためのパラグラフ1に記載の方法。
【０５１３】
パラグラフ 6. 前記ハプロタイプは、MPHOSPH10、RBMS1及びLOC441938から選択される遺伝子、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列の内部、又は周辺に存在するパラグラフ6に記載の方法。
【０５１４】
パラグラフ 7. 前記ハプロタイプは、rs7558220、rs357752； 及び rs7558220、rs357752、rs1458868、rs357729 並びにrs11674899からなる群より選択されるパラグラフ6又は7に記載の方法。
【０５１５】
パラグラフ 8. 前記方法は、表３に示される遺伝子の、又は、そのような遺伝子若しくはそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列にコードされるポリペプチドの、発現のパターン又はレベルの変化のような発現を検出する事を含む、川崎病の診断又は検出のためのパラグラフ1に記載の方法。
【０５１６】
パラグラフ 9. 前記遺伝子は、NAALADL2又はCAMK2Dを含むパラグラフ8に記載の方法。
【０５１７】
パラグラフ 10. 多数の遺伝子、その遺伝子にコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型、又はハプロタイプを検出する事を含む、先行するパラグラフのいずれかに記載の方法。
【０５１８】
パラグラフ 11. 多数の遺伝子の遺伝子多型プロファイル、ハプロタイププロファイル、又は発現プロファイルを作成する事を含む、先行するパラグラフのいずれかに記載の方法。
【０５１９】
パラグラフ 12. 関連するテーブルの全ての遺伝子多型又はハプロタイプのように、5又はそれ以上の遺伝子多型又はハプロタイプが検出される、先行するパラグラフのいずれかに記載の方法。
【０５２０】
パラグラフ 13. 関連するテーブルの全ての遺伝子のように、5又はそれ以上の遺伝子の発現レベルが検出される、先行するパラグラフのいずれかに記載の方法。
【０５２１】
パラグラフ 14. 前記遺伝子、遺伝子にコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型、又はハプロタイプが検出される、又は、アフィメトリクスマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのようなマイクロアレイハイブリダイゼーションから、若しくはリアルタイムポリメラーゼチェーンリアクション(RT-PCR)によって、プロファイルが引き出される、先行するパラグラフのいずれかに記載の方法。
【０５２２】
パラグラフ 15. 前記方法は、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３ 又は図４に提示される1又はそれ以上の遺伝子、前記遺伝子にコードされるポリペプチド、マーカー、遺伝子多型、又はハプロタイプの発現又は遺伝子多型データをコンピューターで処理する事を含む、コンピューターが関与する方法であって、川崎病の診断又は検出のための先行するパラグラフのいずれかに記載の方法。
【０５２３】
パラグラフ 16. 前記方法は、表３に示される遺伝子の発現又はそのような遺伝子若しくはそれらに少なくとも90%の配列同一性を持つ配列にコードされるポリペプチドの量又は活性を調節する事を含む、個体の川崎病の治療又は予防のためのパラグラフ1に記載の方法。
【０５２４】
パラグラフ 17. 前記遺伝子は、CAMK2D、CACNA2D3又はKCNIP4を含むパラグラフ17に記載の方法。
【０５２５】
パラグラフ 18. 前記方法は、前記ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを投与する事を含むパラグラフ16又は17に記載の方法。
【０５２６】
パラグラフ19. 治療上の有効量のプレガバリン ((3S)-3-(アミノメチル)-5-メチル-サキサン酸)、プレガバリンに構造的に類似する化合物、機能的に同等である化合物、化学的誘導体、化学的改変体、置換体、製薬上許容される塩、遺伝子多型体、同位体変異、プロドラッグ、前駆成分又は塩を個体に投与する事を含む、パラグラフ17又は18 に記載の方法。
【０５２７】
パラグラフ 20. 前記方法は、候補分子が、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３若しくは図４に示される核酸配列、若しくはそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列によってコードされる、又は表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３若しくは図４に示されるポリペプチドの、アゴニスト若しくはアンタゴニストであるかどうかを決定する事を含む、川崎病の治療、予防、軽減のための分子を同定する方法。
【０５２８】
パラグラフ 21. 川崎病の治療、予防、又は軽減のための分子を同定するための方法における、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３若しくは図４に示される核酸配列、若しくはそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列によってコードされる、又は表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３若しくは図４に示されるポリペプチドの使用。
【０５２９】
パラグラフ 22. 前記候補分子が、それらのアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを決定するために、前記ポリペプチドに曝露される、パラグラフ20又は21に記載の方法。
【０５３０】
パラグラフ 23. 前記候補分子が、前記ポリぺプチドを発現する細胞に曝露されるパラグラフ20に記載の方法。
【０５３１】
パラグラフ 24. 川崎病の治療、予防、軽減に適した分子の同定のための、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に示される核酸配列、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列の使用。
【０５３２】
パラグラフ25. 前記方法は、川崎病に罹患している動物に候補分子を投与して、前記動物が川崎病の軽減された兆候を示すかどうかを決定する事を含む、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に示される核酸配列、若しくはそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列によってコードされる、又は、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に示されるポリペプチドの、アゴニスト又はアンタゴニストを同定するための方法。
【０５３３】
パラグラフ26. 前記動物は、マウスのような齧歯類であるパラグラフ25に記載の方法。
【０５３４】
パラグラフ27. 前記アゴニスト又はアンタゴニストは、抗体のようなイムノグロブリン、又は表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に示される核酸配列、若しくはそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列によってコードされる、又は、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に示されるポリペプチドに、特異的に結合できる低分子化合物を含む、先行するパラグラフのいずれかに記載の方法。
【０５３５】
パラグラフ 28. 前記ポリペプチドは、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に示される核酸配列、若しくはそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列によってコードされる、又は、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に示されるポリペプチドであって、先行するパラグラフのいずれかに記載の方法又は使用により同定されるポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト。
【０５３６】
パラグラフ 29. 川崎病の治療、予防又は軽減に使用するためのパラグラフ28に記載の分子。
【０５３７】
パラグラフ 30. 個体での川崎病の治療のための医薬組成物の調整のためのパラグラフ28に記載の分子の使用。
【０５３８】
パラグラフ 31. 次にいずれか１又はそれ以上を含む川崎病又は川崎病感受性のための診断キット：抗体のような、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に示されるポリペプチド、又ははそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列；そのようなものをコードし得る核酸；例えば特異的な位置の1つの遺伝子多型に結合できるが、その位置の他の遺伝子多型に結合できない事によって、遺伝子多型間を区別し得る核酸のような、表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に示される核酸、又はそれらに少なくとも90% の配列同一性を持つ配列に結合できる核酸。
【０５３９】
パラグラフ 32. 表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に提示される多数のマーカー、遺伝子多型、又はハプロタイプを含む組み合わせ。
【０５４０】
パラグラフ33. マイクロアレイのような、アレイの形態での、パラグラフ32に記載の組み合わせ。
【０５４１】
パラグラフ 34. 表２、表３、表４、表Ｓ１、表Ｓ２、図３又は図４に提示される情報を含むデータ担体。
【０５４２】
パラグラフ 35. 個体の川崎病の治療又は予防のための、プレガバリン ((3S)-3-(アミノメチル)-5-メチル-サキサン酸)の使用。
【０５４３】
パラグラフ 37. 前記医薬組成物は、製薬上許容される賦活剤、担体、又は希釈剤と共にプレガバリン ((3S)-3-(アミノメチル)-5-メチル-サキサン酸)を含む個体の川崎病の治療又は予防のための医薬組成物。
【０５４４】
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【０５４５】
本文献に記載される各出願並びに特許、及び、各出願並びに特許の審査の間を含む各上記出願並びに特許の各引用文献又は参考文献 (“出願引用文献”)、及び各出願並びに特許並びに出願引用文献に、引用又は記載される任意の製品の製造者使用説明書又はカタログは、参照することにより本文献に取り込まれる。
【０５４６】
さらに、本文献に引用される全ての文書、及び本文献に引用される文書に引用又は参照される全ての文書、及び本文献に記載または引用される任意の製品の、任意の使用説明書又はカタログは、参照することにより本文献に取り込まれる。
【０５４７】
本発明の記載される方法及びシステムの種々の改変及び変異は、本発明の範囲と精神から外れる事なく、当技術分野の技術者に明白である。本発明は、特に好ましい態様に連結して記載されているが、請求される本発明は、不当にそのような特別な態様に限定されない事を理解されるべきである。本当に、分子生物学又は関連分野の技術者に明らかな、本発明を実現するための前記記載の形態の種々の改変は、本請求の範囲内にある事を意味する。
【０５４８】
表Ｓ１
以下の表Ｓ１ (付加的な表１) は、フォローアップ研究で、1,116種類の遺伝子タイピングされた一塩基多型の、染色体上の位置とアレル頻度を示す。
【０５４９】
表Ｓ１. フォローアップ研究で、1,116種類の遺伝子タイピングされた一塩基多型の、染色体上の位置とアレル頻度
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【０５５０】
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【０５８０】
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【０５９５】
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【０５９９】
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【０６００】
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【０６０１】
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【０６０２】
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【０６０３】
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【０６０４】
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【０６０５】
表Ｓ２
以下の表Ｓ２ (付加的な表２)は、ハプロタイプ解析から派生したフォローアップ研究で137種類の遺伝子タイピングされた一塩基多型の、染色体上の位置、アレル頻度とハプロタイプブロック
【０６０６】
表Ｓ２.ハプロタイプ解析から派生したフォローアップ研究で遺伝子タイピングされた137種類の一塩基多型の、染色体上の位置、アレル頻度とハプロタイプブロック
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【０６０７】
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【０６０８】
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【０６０９】
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【０６１０】
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【０６１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【外国語明細書】
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