(57)【要約】【課題】細胞のＤＮＡに含まれる損傷ＤＮＡを、簡便な操作で、迅速かつ高い処理効率で定量することができる損傷ＤＮＡの定量方法並びにそれに基づく被験物質の評価方法を提供する。【解決手段】細胞群を固定して固定細胞群を得るステップ、該固定細胞群の細胞にＤＮＡ変性処理を施し、処理細胞群を得るステップ、該処理細胞群と、抗損傷ＤＮＡ抗体と、該抗体に特異的に結合し、かつ蛍光を発する抗体検出試薬と、該処理細胞群の細胞に結合し、かつ蛍光を発する細胞染色試薬とを混合して、該細胞中の損傷ＤＮＡと該抗体とを抗原抗体反応させるとともに該細胞と該細胞染色試薬とを結合させるステップ、得られた混合物中の抗体に結合した抗体検出試薬から放出される蛍光の強度及び細胞に結合した細胞染色試薬から放出される蛍光の強度を測定するステップ、及び該細胞染色試薬の蛍光の強度によって、該抗体検出試薬の蛍光の強度を正規化し、正規化された蛍光強度から損傷ＤＮＡの量を算出するステップを含む損傷ＤＮＡの定量方法並びに被験物質の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）細胞群を固定して固定細胞群を得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた固定細胞群の細胞にＤＮＡ変性処理を施し、処理細胞群を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた処理細胞群と、抗損傷ＤＮＡ抗体と、該抗損傷ＤＮＡ抗体に特異的に結合し、かつ蛍光を発する抗体検出試薬と、前記処理細胞群の細胞に結合し、かつ蛍光を発する細胞染色試薬とを混合し、該細胞中の損傷ＤＮＡと該抗損傷ＤＮＡ抗体とを抗原抗体反応させるとともに該細胞と該細胞染色試薬とを結合させるステップ、
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた混合物中の抗損傷ＤＮＡ抗体に結合した抗体検出試薬から放出される蛍光の強度及び細胞に結合した細胞染色試薬から放出される蛍光の強度を測定するステップ、及び
（Ｅ）前記ステップ（Ｄ）で測定された細胞染色試薬から放出される蛍光の強度によって、前記ステップ（Ｄ）で測定された抗体検出試薬から放出される蛍光の強度を正規化し、正規化された蛍光強度から損傷ＤＮＡの量を算出するステップ
を含む損傷ＤＮＡの定量方法。
【請求項２】
前記抗体検出試薬が、近赤外光で励起して蛍光を発する抗体検出試薬であり、
前記細胞染色試薬が、近赤外光で励起して蛍光を発する細胞染色試薬である請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
（ａ）細胞群に対して、紫外線の照射及び被験物質の曝露を行なうステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞群の細胞を固定して固定細胞群を得るステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた固定細胞群の細胞にＤＮＡ変性処理を施し、処理細胞群を得るステップ、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得られた処理細胞群と、抗損傷ＤＮＡ抗体と、該抗損傷ＤＮＡ抗体に特異的に結合し、かつ蛍光を発する抗体検出試薬と、前記細胞群の細胞に結合し、かつ蛍光を発する細胞染色試薬とを混合し、該細胞中の損傷ＤＮＡと該抗損傷ＤＮＡ抗体とを抗原抗体反応させるとともに該細胞と該細胞染色試薬とを結合させるステップ、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）で得られた混合物中の抗損傷ＤＮＡ抗体に結合した抗体検出試薬から放出される蛍光の強度及び細胞に結合した細胞染色試薬から放出される蛍光の強度を測定するステップ、
（ｆ）前記ステップ（ｅ）で測定された細胞染色試薬から放出される蛍光の強度によって、前記ステップ（ｅ）で測定された抗体検出試薬から放出される蛍光の強度を正規化し、正規化された蛍光強度から損傷ＤＮＡの量を算出するステップ、及び
（ｇ）前記ステップ（ｆ）で算出された損傷ＤＮＡの量に基づき、被験物質が、細胞におけるＤＮＡ修復機構に作用する物質であるどうかを評価するステップ
を含む被験物質の評価方法。
【請求項４】
前記抗体検出試薬が、近赤外光で励起して蛍光を発する抗体検出試薬であり、
前記細胞染色試薬が、近赤外光で励起して蛍光を発する細胞染色試薬である請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
前記細胞が、ヒト表皮角化細胞又はヒト線維芽細胞である請求項３又は４に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷ＤＮＡの定量方法及び被験物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化粧品、外用剤等の評価や開発、生化学等の分野における基礎研究等に好適である損傷ＤＮＡの定量方法及びハイスループットでの被験物質の評価に好適である前記定量方法に基づく被験物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
太陽光線に含まれる紫外線は、シワ、色素沈着等の皮膚の光老化を引き起こすことが知られている。そこで、紫外線による皮膚への悪影響を抑制するために、紫外線を遮断するサンスクリーン剤等の紫外線から皮膚を保護するための化粧料が開発されている。
【０００３】
また、皮膚が紫外線に曝されると、皮膚細胞において、ＤＮＡ損傷が引き起こされる。このとき、皮膚細胞のＤＮＡには、シクロブタン型ピリミジン二量体や６−４光産物が形成される。かかるＤＮＡ損傷は、通常、生体のＤＮＡ修復機構により修復されている。しかしながら、生体内でＤＮＡ修復が正常に行なわれなかった場合、細胞老化、細胞のアポトーシス、細胞のがん化等が引き起こされることがある。
【０００４】
一方、ＤＮＡ修復や損傷ＤＮＡの量を調べる方法として、例えば、ＤＮＡを含む試料と、紫外線等の光化学反応や酸化ストレスにより傷害を受け、修飾された修飾ヌクレオシド又は該修飾ヌクレオシドを含むポリヌクレオチドに特異的な一次抗体とを接触させることにより、前記酸化ストレスにより傷害された領域のＤＮＡ断片を回収し、当該ＤＮＡ断片を定量する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、この方法では、検体からのＤＮＡの単離、傷害された領域を含むＤＮＡ断片の回収及び前記傷害された領域を含むＤＮＡ断片の定量という操作を、解析対象の検体毎に行なう必要がある。したがって、前記方法は、操作が煩雑であり、時間がかかり、多数の検体のＤＮＡの解析には適していないという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／０７３３７３号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、細胞のＤＮＡに含まれる損傷ＤＮＡを、簡便な操作で、迅速かつ高い処理効率で定量することができる損傷ＤＮＡの定量方法を提供することを目的とする。また、本発明は、被験物質が、ＤＮＡ修復機構に作用する物質であるかどうかの評価を、簡便な操作で、迅速かつ高い処理効率で行なうことができる被験物質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）  （Ａ）細胞群を固定して固定細胞群を得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた固定細胞群の細胞にＤＮＡ変性処理を施し、処理細胞群を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた処理細胞群と、抗損傷ＤＮＡ抗体と、前記抗損傷ＤＮＡ抗体に特異的に結合し、かつ蛍光を発する抗体検出試薬と、前記細胞群の細胞に結合し、かつ蛍光を発する細胞染色試薬とを混合し、前記細胞中の損傷ＤＮＡと前記抗損傷ＤＮＡ抗体とを抗原抗体反応させるとともに前記細胞と前記細胞染色試薬とを結合させるステップ、
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた混合物中の抗損傷ＤＮＡ抗体に結合した抗体検出試薬から放出される蛍光の強度及び細胞に結合した細胞染色試薬から放出される蛍光の強度を測定するステップ、及び
（Ｅ）前記ステップ（Ｄ）で測定された細胞染色試薬から放出される蛍光の強度によって、前記ステップ（Ｄ）で測定された抗体検出試薬から放出される蛍光の強度を正規化し、正規化された蛍光強度から損傷ＤＮＡの量を算出するステップ
を含む損傷ＤＮＡの定量方法、並びに
（２）  （ａ）細胞群に対して、紫外線の照射及び被験物質の曝露を行なうステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞群の細胞を固定して固定細胞群を得るステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた固定細胞群の細胞にＤＮＡ変性処理を施し、処理細胞群を得るステップ、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得られた処理細胞群と、抗損傷ＤＮＡ抗体と、前記抗損傷ＤＮＡ抗体に特異的に結合し、かつ蛍光を発する抗体検出試薬と、前記細胞群の細胞に結合し、かつ蛍光を発する細胞染色試薬とを混合し、前記細胞中の損傷ＤＮＡと前記抗損傷ＤＮＡ抗体との抗原抗体反応とともに前記細胞と前記細胞染色試薬との結合を行なうステップ、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）で得られた混合物中の抗損傷ＤＮＡ抗体に結合した抗体検出試薬から放出される蛍光の強度及び細胞に結合した細胞染色試薬から放出される蛍光の強度を測定するステップ、
（ｆ）前記ステップ（ｅ）で測定された細胞染色試薬から放出される蛍光の強度によって、前記ステップ（ｅ）で測定された抗体検出試薬から放出される蛍光の強度を正規化し、正規化された蛍光強度から損傷ＤＮＡの量を算出するステップ、及び
（ｇ）前記ステップ（ｆ）で算出された損傷ＤＮＡの量に基づき、被験物質が、細胞におけるＤＮＡ修復機構に作用する物質であるどうかを評価するステップ
を含む被験物質の評価方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の損傷ＤＮＡの定量方法は、細胞のＤＮＡに含まれる損傷ＤＮＡを、簡便な操作で、迅速かつ高い処理効率で定量することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の被験物質の評価方法は、被験物質が、ＤＮＡ修復機構に作用する物質であるかどうかの評価を、簡便な操作で、迅速かつ高い処理効率で行なうことができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（Ａ）は実験例１において、ＤＮＡ変性処理を行なわなかった場合の励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフ、（Ｂ）は実験例１において、ＤＮＡ変性処理を行なった場合の励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフである。
【図２】（Ａ）は実験例２において、細胞固定液として、ホルムアルデヒド水溶液を用いた場合の励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフ、（Ｂ）は実験例２において、細胞固定液として、メタノール−アセトン溶液を用いた場合の励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフである。
【図３】（Ａ）は実験例３において、２Ｍ塩酸水溶液中で、ＤＮＡ変性処理を５分間施したＵＶ−Ｃ非照射のＮＨＦの染色像を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は実験例３において、２Ｍ塩酸水溶液中で、ＤＮＡ変性処理を３０分間施したＵＶ−Ｃ非照射のＮＨＦの染色像を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｃ）は実験例３において、２Ｍ塩酸水溶液中で、ＤＮＡ変性処理を５分間施し、かつＵＶ−Ｃを照射したＮＨＦの染色像を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｄ）は実験例３において、２Ｍ塩酸水溶液中でＤＮＡ変性処理を３０分間施し、かつＵＶ−Ｃを照射したＮＨＦの染色像を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図４】実験例４において、損傷ＤＮＡを検出した場合における紫外線照射線量と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図５】実験例５において、損傷ＤＮＡを検出した場合における一次抗体溶液中における一次抗体濃度と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図６】（Ａ）は実験例６において、ＵＶ−Ｂ照射時及びＵＶ−Ｂ非照射それぞれの損傷ＤＮＡを検出した場合における二次抗体溶液中における二次抗体濃度と蛍光強度との関係を示すグラフ、（Ｂ）は実験例６において、損傷ＤＮＡを検出し、バックグラウンド（ＵＶ−Ｂ非照射）を補正した場合における二次抗体溶液中における二次抗体濃度と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図７】実験例７において、損傷ＤＮＡを検出し、バックグラウンド（ＵＶ−Ｂ非照射）を補正した場合における標識ストレプトアビジン濃度と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図８】実験例８において、損傷ＤＮＡを検出し、バックグラウンド（ＵＶ−Ｂ非照射）を補正した場合におけるウェルに播種した各細胞の細胞数と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図９】（Ａ）は実施例１において、紫外線照射線量と、紫外線が照射された各細胞における抗ＣＰＤ抗体と複合体を形成している標識ストレプトアビジンに基づく補正前の蛍光強度との関係を調べた結果を示すグラフ、（Ｂ）は実施例１において、紫外線照射線量と、紫外線が照射された各細胞における抗ＣＰＤ抗体と複合体を形成している標識ストレプトアビジンに基づく補正後の蛍光強度との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】（Ａ）は実施例１において、ＵＶ−Ｂが照射された各細胞における補正前の残存ＣＰＤ量とＵＶ−Ｂ照射後の細胞のインキュベーション時間との関係を調べた結果を示すグラフ、（Ｂ）は実施例１において、ＵＶ−Ｂが照射された各細胞における補正後の残存ＣＰＤ量とＵＶ−Ｂ照射後の細胞のインキュベーション時間との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１１】実施例２において、紫外線照射線量と、紫外線が照射された各細胞における抗６−４ＰＰ抗体と複合体を形成している標識ストレプトアビジンに基づく補正後の蛍光強度との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の損傷ＤＮＡの定量方法は、（Ａ）細胞群を固定して固定細胞群を得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた固定細胞群の細胞にＤＮＡ変性処理を施し、処理細胞群を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた処理細胞群と、抗損傷ＤＮＡ抗体と、前記抗損傷ＤＮＡ抗体に特異的に結合し、かつ蛍光を発する抗体検出試薬と、前記細胞群の細胞に結合し、かつ蛍光を発する細胞染色試薬とを混合して、前記細胞中の損傷ＤＮＡと前記抗損傷ＤＮＡ抗体とを抗原抗体反応させるとともに前記細胞と前記細胞染色試薬と結合させるステップ、
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた混合物中の抗損傷ＤＮＡ抗体に結合した抗体検出試薬から放出される蛍光の強度及び細胞に結合した細胞染色試薬から放出される蛍光の強度を測定するステップ、及び
（Ｅ）前記ステップ（Ｄ）で測定された細胞染色試薬から放出される蛍光の強度によって、前記ステップ（Ｄ）で測定された抗体検出試薬から放出される蛍光の強度を正規化し、正規化された蛍光強度から損傷ＤＮＡの量を算出するステップ
を含む方法である。
【００１１】
本発明の定量方法は、前記処理細胞群と抗損傷ＤＮＡ抗体と抗体検出試薬と細胞染色試薬とを混合して、前記処理細胞群に含まれる細胞中の損傷ＤＮＡと前記抗損傷ＤＮＡ抗体とを抗原抗体反応させるとともに前記細胞と前記細胞染色試薬とを結合させる点に１つの大きな特徴がある。そのため、本発明の定量方法では、前記細胞群の細胞数と、前記細胞群中の細胞に含まれる損傷ＤＮＡの量とを同時に測定することができる。
【００１２】
本明細書において、「損傷ＤＮＡ」とは、ＤＮＡに損傷を受けて修飾された修飾ヌクレオシド及び前記修飾ヌクレオシド残基を含むポリヌクレオチドをいう。前記修飾ヌクレオシド残基としては、例えば、シクロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤ）、６−４光産物（６−４ＰＰ）〔例えば、ピリミジン（６−４）ピリミドン二量体等〕等が挙げられる。
【００１３】
ステップ（Ａ）では、細胞群を固定して固定細胞群を得る。ステップ（Ａ）では、前記細胞群の細胞を固定するため、細胞群に含まれる各細胞の細胞膜を、抗損傷ＤＮＡ抗体が透過するのに十分な透過性を有する状態にすることができる。このように、ステップ（ａ）では、ＤＮＡの単離を行なわずに、抗損傷ＤＮＡ抗体と細胞に含まれるＤＮＡ中の損傷ＤＮＡとを抗原抗体反応させることができるため、抗損傷ＤＮＡの定量に要する時間が大幅に短縮され、簡便な操作で、迅速かつ高い処理効率で損傷ＤＮＡを定量することができる。
【００１４】
前記細胞群とは、複数の細胞からなる細胞集団である。前記細胞は、いかなる種類の細胞であってもよい。また、前記細胞は、ＤＮＡ損傷条件に曝された細胞であってもよい。前記ＤＮＡ損傷条件に曝された細胞としては、例えば、紫外線が照射された細胞等が挙げられる。
【００１５】
細胞は、用いられる細胞に適した培地中、用いられる細胞に適した条件下で培養することができる。
【００１６】
前記培地としては、細胞が生育するのに適した成分、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖類、細胞増殖促進因子〔例えば、細胞成長因子、ホルモン（インスリン、上皮細胞増殖因子、ハイドロコーチゾン）等〕、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）等を含む培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に、必要な成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。
【００１７】
細胞群の固定は、例えば、被験物質と接触させた細胞群が入っている培養容器中に、固定液を添加して、細胞群と固定液とを接触させること等により行なわれる。
【００１８】
固定液としては、例えば、ホルムアルデヒド水溶液、ホルムアルデヒドのリン酸緩衝液溶液、メタノールとアセトンとの混合溶媒（以下、「メタノール−アセトン混合溶媒」という）、パラホルムアルデヒド水溶液、パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝液溶液等が挙げられる。これらのなかでは、細胞染色試薬に基づく蛍光の強度に基づいて、より正確に細胞数を定量する観点から、好ましくはホルムアルデヒド水溶液及びメタノール−アセトン混合溶媒、より好ましくはメタノール−アセトン混合溶媒である。
【００１９】
メタノール−アセトン混合溶媒におけるメタノールとアセトンとの体積比（メタノール／アセトン）は、十分な細胞固定効率を確保する観点から、好ましくは１／１０〜１０／１、より好ましくは１／５〜５／１である。また、ホルムアルデヒド水溶液中のホルムアルデヒドの濃度は、細胞の固定を十分に行なう観点から、好ましくは１体積％以上、より好ましくは２体積％以上であり、抗損傷ＤＮＡ抗体による損傷ＤＮＡの検出を良好に行なう観点から、好ましくは２０体積％以下、より好ましくは１０体積％以下である。
【００２０】
細胞を固定することによって得られた固定細胞群を適切な洗浄液で洗浄してもよい。前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水、トリス緩衝化生理的食塩水等が挙げられる。
【００２１】
ステップ（Ｂ）では、前記ステップ（Ａ）で得られた固定細胞群の細胞にＤＮＡ変性処理を施し、処理細胞群を得る。これにより、細胞群の細胞内のＤＮＡを変性させることができるため、細胞群の各細胞内のＤＮＡ中の損傷ＤＮＡと、抗損傷ＤＮＡ抗体とが接触しやすくすることができる。
【００２２】
ＤＮＡ変性処理は、例えば、固定された細胞群が入っている培養容器中にＤＮＡ変性剤を添加し、ＤＮＡ変性剤と細胞群の細胞内のＤＮＡとを接触させること等により行なわれる。
【００２３】
ＤＮＡ変性剤としては、例えば、０．５〜５Ｍ塩酸水溶液、０．５〜５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、加熱処理等が挙げられる。これらのなかでは、抗損傷ＤＮＡ抗体による損傷ＤＮＡの検出を良好に行なうことができる観点から、０．５〜５Ｍ塩酸水溶液が好ましい。
【００２４】
ＤＮＡ変性剤と細胞群の細胞内のＤＮＡとの接触時間は、用いられる変性剤の種類によって異なるため、一概に決定されるものではない。
【００２５】
ステップ（Ｃ）では、前記ステップ（Ｂ）で得られた処理細胞群と、抗損傷ＤＮＡ抗体と、前記抗損傷ＤＮＡ抗体に特異的に結合し、かつ蛍光を発する抗体検出試薬と、前記細胞群の細胞に結合し、かつ蛍光を発する細胞染色試薬とを混合して、前記細胞中の損傷ＤＮＡと前記抗損傷ＤＮＡ抗体とを抗原抗体反応させるとともに前記細胞と前記細胞染色試薬とを結合させる。
【００２６】
かかるステップ（Ｃ）では、細胞群の細胞内のＤＮＡ中に含まれる損傷ＤＮＡと抗損傷ＤＮＡ抗体とが結合するとともに、前記抗損傷ＤＮＡ抗体と抗体検出試薬とが結合することにより、細胞とこの細胞中の損傷ＤＮＡと抗損傷ＤＮＡ抗体と抗体検出試薬とから形成された複合体が生じる。また、細胞染色試薬により処理細胞群の細胞が染色される。そのため、抗体検出試薬から放出される蛍光と細胞染色試薬から放出される蛍光とを検出することにより、損傷ＤＮＡの量と細胞群の細胞数とを同時に算出することが可能になる。したがって、細胞の回収及び回収された細胞からのＤＮＡの単離の各操作を行なわなくても、細胞群の細胞数及び細胞群中の細胞に含まれる損傷ＤＮＡの量を簡便に測定することができる。
【００２７】
抗損傷ＤＮＡ抗体は、紫外線照射によりＤＮＡに生じる損傷ＤＮＡに対する反応性を有する抗体であればよい。かかる抗損傷ＤＮＡ抗体としては、例えば、ＣＰＤに対する抗体、６−４ＰＰに対する抗体等が挙げられる。
【００２８】
前記抗損傷ＤＮＡ抗体は、ポリクローナル抗体（抗損傷ＤＮＡポリクローナル抗体）であってもよく、モノクローナル抗体（抗損傷ＤＮＡモノクローナル抗体）であってもよい。
【００２９】
前記抗損傷ＤＮＡ抗体は、抗ＣＰＤｓ抗体〔商品名：Anti-Cyclobutane pyrimidine
dimmers(CPDs)、コード番号：NMDND001、コスモバイオ（株）製〕、抗６−４ＰＰ抗体〔商品名：Anti-(6-4)photoproducts(6-4PPs)、コード番号：NMDND002、コスモバイオ（株）製〕等の市販の抗体であってもよい。
【００３０】
前記抗損傷ＤＮＡ抗体は、例えば、適切なキャリヤーと、前記修飾ヌクレオシド又は前記修飾ヌクレオシド残基を含むポリヌクレオチドとの複合体を免疫原とし、レーン(Lane，H，D.)ら編、「アンチボディーズ：ア  ラボラトリー  マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年等に記載の製造方法に準じて製造することができる。前記キャリヤーとしては、例えば、メチル化したウシ血清アルブミン（メチル化ＢＳＡ）等が挙げられる。
【００３１】
抗損傷ＤＮＡポリクローナル抗体は、前記免疫原を動物の静脈内、皮下又は腹腔内に投与することにより当該動物を免疫し、抗血清を得、得られた抗血清について、必要に応じて、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等による精製を行なうことにより得られる。
【００３２】
また、抗損傷ＤＮＡモノクローナル抗体は、前記免疫原に対して反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養し、培養上清を得、得られた培養上清について、必要に応じて、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等による精製を行なうことにより得られる。前記ハイブリドーマは、前記免疫原を動物の静脈内、皮下又は腹腔内に投与することにより当該動物を免疫し、抗体産生細胞（例えば、脾臓細胞等）を得、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させ、得られた融合細胞をＨＡＴ培地で培養することにより得られる。
【００３３】
本発明の定量方法に用いることができる抗損傷ＤＮＡ抗体の損傷ＤＮＡに対する反応性は、例えば、酵素標識免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法等で確認することができる。
【００３４】
抗体検出試薬としては、例えば、（Ｉ）前記抗損傷ＤＮＡ抗体への特異的結合能を有する二次抗体に、蛍光物質が結合している蛍光標識二次抗体、（ＩＩ）前記抗損傷ＤＮＡ抗体への特異的結合能を有する二次抗体に第１の特異的結合物質が結合している標識二次抗体と、前記第１の特異的結合物質への特異的結合能を有する第２の特異的結合物質に蛍光物質が結合している三次試薬とを含む試薬等が挙げられる。
【００３５】
前記（Ｉ）の蛍光標識二次抗体は、カルボジイミド法、コハク酸イミドエステル法、グルタルアルデヒド法等の化学的結合法や物理的吸着法によって、二次抗体を蛍光物質で標識することにより製造することができる。また、かかる蛍光標識二次抗体として、市販の蛍光標識二次抗体を用いてもよい。前記二次抗体としては、例えば、前記抗損傷ＤＮＡ抗体を製造する際に免疫した動物が有するＩｇＧ等に対する抗体等が挙げられる。
【００３６】
前記（ＩＩ）の試薬中の標識二次抗体は、前記化学的結合法や物理的吸着法によって、第１の特異的結合物質を二次抗体に結合させることにより製造することができる。また、前記（ＩＩ）の試薬中の三次試薬は、前記化学的結合法や物理的吸着法によって、蛍光物質を第２の特異的結合物質に結合させることにより製造することができる。第１の特異的結合物質及び第２の特異的結合物質は、互いに特異的に結合する物質であればよい。第１の特異的結合物質及び第２の特異的結合物質の組み合わせとしては、例えば、ビオチンと、アビジン又はストレプトアビジンとの組み合わせ等が挙げられる。
【００３７】
より正確に、かつ簡単に損傷ＤＮＡの量及び細胞数を定量する観点から、前記抗体検出試薬は、近赤外光で励起して蛍光を発する抗体検出試薬であり、前記細胞染色試薬は、近赤外光で励起して蛍光を発する細胞染色試薬であることが好ましい。これにより、細胞の自家蛍光に起因する測定誤差を抑制することができる。
【００３８】
近赤外光で励起して蛍光を発する抗体検出試薬としては、例えば、（ｉ）近赤外光で励起して蛍光を発する蛍光物質が前記抗損傷ＤＮＡ抗体への特異的結合能を有する二次抗体に結合している蛍光標識抗体、（ｉｉ）第１の特異的結合物質が前記二次抗体に結合している標識二次抗体と、近赤外光で励起して蛍光を発する蛍光物質が前記第１の特異的結合物質への特異的結合能を有する第２の特異的結合物質に結合している三次試薬とを含む試薬等が挙げられる。
【００３９】
近赤外光で励起して蛍光を発する蛍光物質としては、例えば、ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ等の近赤外蛍光体が挙げられる。
【００４０】
近赤外光で励起して蛍光を発する細胞染色試薬としては、例えば、バイオステータス・リミテッド製、商品名：ＤＲＡＱ５等のアントラキノン系蛍光物質、ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：Ｓａｐｐｈｉｒｅ７００  Ｓｔａｉｎ等の細胞数標準化試薬が挙げられる。前記細胞染色試薬は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４１】
ステップ（Ｃ）では、より正確に損傷ＤＮＡの量及び細胞群の細胞数を測定する観点から、用いられる抗損傷ＤＮＡ抗体の量は、処理細胞中に生じ得る理論量の損傷ＤＮＡと抗原抗体反応する抗損傷ＤＮＡ抗体と同量以上の量であり、用いられる抗体検出試薬の量は、用いられる抗損傷ＤＮＡ抗体の全てに結合する抗体検出試薬の量に対して、同量以上の量であり、かつ用いられる細胞染色試薬の量は、前記処理細胞群に含まれることが推測される数の細胞全てを染色する量以上の量であることが好ましい。
【００４２】
ステップ（Ｃ）で用いられる前記抗損傷ＤＮＡ抗体の量（モル）は、例えば、ステップ（Ａ）において、細胞群として、紫外線が照射された細胞からなる細胞群を用いる場合、細胞群に含まれる細胞中の損傷ＤＮＡに対して抗損傷ＤＮＡ抗体を十分に抗原抗体反応させ、より正確に抗損傷ＤＮＡの量を測定する観点から、細胞に照射された紫外線の照射線量から推定される理論量の損傷ＤＮＡ全てと抗原抗体反応する抗損傷ＤＮＡ抗体の量に対して、好ましくは同量以上、より好ましくは１０倍量以上である。前記抗損傷ＤＮＡ抗体の量の上限は、所望の検出限界、測定に要するコスト等に応じて適宜設定することができる。損傷ＤＮＡであるＣＰＤの理論量は、例えば、２×１０4細胞の細胞に対して、１０Ｊ／ｍ2のＵＶ−Ｃ（波長：２００〜２８０ｎｍ）を照射した場合にＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量と同量の損傷ＤＮＡを生じさせる量のＵＶ−Ｂ（波長：２８０〜３１５ｎｍ）を照射する条件下では、通常、約１．２×１０12個であると考えられている。また、損傷ＤＮＡである６−４ＰＰの理論量は、２×１０4細胞の細胞に対して、前記条件下では、通常、１．２×１０11〜３．６×１０11個であると考えられている。
【００４３】
ステップ（Ｃ）において、前記抗体検出試薬として、前記（Ｉ）の蛍光標識二次抗体を用いる場合、用いられる蛍光標識二次抗体の量（モル）は、損傷ＤＮＡと抗原抗体反応した抗損傷ＤＮＡ抗体の検出を良好に行ない、より正確に損傷ＤＮＡの量を測定する観点から、前記抗原に結合した抗損傷ＤＮＡ抗体の全てに結合する抗体検出試薬の量に対して、好ましくは同量以上である。前記抗体検出試薬の量の上限は、所望の検出限界、測定に要するコスト等に応じて適宜設定することができる。
【００４４】
一方、ステップ（Ｃ）において、前記抗体検出試薬として、前記（ＩＩ）の試薬を用いる場合、用いられる標識二次抗体の量（モル）は、損傷ＤＮＡと抗原抗体反応した抗損傷ＤＮＡ抗体の検出を良好に行ない、より正確に損傷ＤＮＡの量を測定する観点から、前記抗原に結合した抗損傷ＤＮＡ抗体の全てに結合する抗体の量に対して、好ましくは同量以上である。前記標識二次抗体の量の上限は、所望の検出限界、測定に要するコスト等に応じて適宜設定することができる。また、用いられる三次試薬の量（モル）は、損傷ＤＮＡと抗原抗体反応した抗損傷ＤＮＡ抗体の検出を良好に行ない、より正確に損傷ＤＮＡの量を測定する観点から、前記抗損傷ＤＮＡ抗体に結合した標識二次抗体中の第１の特異的結合物質の全てに結合する最小限の三次試薬の量に対して、好ましくは同量以上である。前記三次試薬の量の上限は、所望の検出限界、測定に要するコスト等に応じて適宜設定することができる。例えば、前記標識二次抗体中の第１の特異的結合物質がビオチンであり、三次試薬がストレプトアビジンである場合、前記ストレプトアビジンの量は、前記ビオチン１モルに対して、好ましくは１／４モル以上である。
【００４５】
ステップ（Ｃ）で用いられる前記細胞染色試薬の量（モル）は、より正確に細胞群の細胞数を測定する観点から、例えば、前記処理細胞群を含む一定体積の細胞懸濁物の濁度等に基づき処理細胞群に含まれることが推測される数の細胞全てを染色する量に対して、好ましくは同量以上である。前記細胞染色試薬の量の上限は、所望の検出限界、測定に要するコスト等に応じて適宜設定することができる。
【００４６】
ステップ（Ｄ）では、前記ステップ（Ｄ）で得られた混合物中の抗損傷ＤＮＡ抗体に結合した抗体検出試薬から放出される蛍光の強度及び細胞に結合した細胞染色試薬から放出される蛍光の強度を測定する。
【００４７】
蛍光の強度は、慣用の蛍光イメージング装置により測定することができる。前記抗体検出試薬が、近赤外光で励起して蛍光を発する抗体検出試薬であり、前記細胞染色試薬が、近赤外光で励起して蛍光を発する細胞染色試薬である場合、近赤外光に励起して生じる蛍光は、慣用の近赤外光イメージング装置により測定することができる。
【００４８】
損傷ＤＮＡの量は、用いられた抗体検出試薬の励起波長の光を前記混合物に照射し、生じた蛍光の強度を測定することにより算出することができる。前記抗体検出試薬が、例えば、ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷである場合、励起波長７８０ｎｍにおける蛍光の強度を測定することにより、損傷ＤＮＡの量を算出することができる。また、細胞数は、用いられた細胞染色試薬の励起波長の光を前記混合物に照射し、生じた蛍光の強度を測定することにより算出することができる。前記細胞染色試薬が、例えば、バイオステータス・リミテッド製、商品名：ＤＲＡＱ５及び／又はＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：Ｓａｐｐｈｉｒｅ７００  Ｓｔａｉｎである場合、励起波長６８０ｎｍにおける蛍光の強度を測定することにより、損傷ＤＮＡの量を算出することができる。
【００４９】
ステップ（Ｅ）では、前記ステップ（Ｄ）で測定された細胞染色試薬から放出される蛍光の強度によって、前記ステップ（Ｄ）で測定された抗体検出試薬から放出される蛍光の強度を正規化し、正規化された蛍光強度から損傷ＤＮＡの量を算出する。したがって、細胞間のＤＮＡの量のバラツキ及び細胞数の違いに起因する抗体検出試薬から放出される蛍光の強度の測定誤差を補正することができる。
【００５０】
細胞染色試薬から放出される蛍光の強度による抗体検出試薬から放出される蛍光の強度の正規化は、例えば、抗体検出試薬から放出される蛍光の強度の値を細胞染色試薬から放出される蛍光の強度の値で除することにより行なうことができる。
【００５１】
正規化された蛍光強度からの損傷ＤＮＡの算出は、例えば、既知量の損傷ＤＮＡと抗損傷ＤＮＡ抗体と抗体検出試薬と細胞染色試薬とにより作成された検量線に基づいて行なうことができる。
【００５２】
以上のように、本発明の定量方法によれば、細胞に含まれるＤＮＡ中の損傷ＤＮＡの量を、簡便な操作で、迅速かつ高い処理効率で定量することができる。したがって、本発明の定量方法によれば、種々の細胞に含まれるＤＮＡ中の損傷ＤＮＡの量のハイスループットでの定量が可能になる。
【００５３】
本発明の定量方法において、前記細胞群として、紫外線が照射され、かつ被験物質に曝露された細胞からなる細胞群を用いることによって、被験物質が、細胞におけるＤＮＡ修復機構に作用する物質であるどうかを、簡便な操作で、迅速かつ高い処理効率で評価することができる。したがって、ハイスループットでの被験物質の評価が可能になる。
【００５４】
本発明の被験物質の評価方法は、（ａ）細胞群に対して、紫外線の照射及び被験物質の曝露を行なうステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞群の細胞を固定して固定細胞群を得るステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた固定細胞群の細胞にＤＮＡ変性処理を施し、処理細胞群を得るステップ、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得られた処理細胞群と、抗損傷ＤＮＡ抗体と、前記抗損傷ＤＮＡ抗体に特異的に結合し、かつ蛍光を発する抗体検出試薬と、前記細胞群の細胞に結合し、かつ蛍光を発する細胞染色試薬とを混合して、前記細胞中の損傷ＤＮＡと前記抗損傷ＤＮＡ抗体とを抗原抗体反応させるとともに前記細胞と前記細胞染色試薬とを結合させるステップ、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）で得られた混合物中の抗損傷ＤＮＡ抗体に結合した抗体検出試薬から放出される蛍光の強度及び細胞に結合した細胞染色試薬から放出される蛍光の強度を測定するステップ、
（ｆ）前記ステップ（ｅ）で測定された細胞染色試薬から放出される蛍光の強度によって、前記ステップ（ｅ）で測定された抗体検出試薬から放出される蛍光の強度を正規化し、正規化された蛍光強度から損傷ＤＮＡの量を算出するステップ、及び
（ｇ）前記ステップ（ｆ）で算出された損傷ＤＮＡの量に基づき、被験物質が、細胞におけるＤＮＡ修復機構に作用する物質であるどうかを評価するステップ
を含む方法である。
【００５５】
ステップ（ａ）では、細胞群に対して、紫外線の照射及び被験物質の曝露を行なう。
【００５６】
前記細胞としては、例えば、表皮角化細胞、線維芽細胞等が挙げられる。本発明の評価方法により、ヒトの皮膚への適用に適した物質を評価又はスクリーニングする観点から、前記細胞は、好ましくはヒト細胞である。本発明の評価方法により、ヒトの皮膚への適用に適した化粧料を評価又はスクリーニングする観点から、前記細胞は、ヒト表皮角化細胞又はヒト線維芽細胞（以下、「ＮＨＦ」という）であることが好ましい。また、前記細胞は、被験物質のＤＮＡ修復促進作用をより高い感度で検出する観点から、ＤＮＡ修復能が低下している細胞、例えば、供給源である個体の年齢が高い細胞、継代回数が多い細胞、ＤＮＡ修復能が本質的に低い細胞等であることが望ましい。
【００５７】
細胞群は、単位細胞数あたりの損傷ＤＮＡの量の算出を、より正確に、かつ簡便に行なう観点から、１００％コンフルエンシーの状態になるまで培養された細胞からなる細胞群が好ましい。１００％コンフルエンシーの状態になるまで培養された細胞からなる細胞群では、細胞間でのＤＮＡの量のバラツキが少なくなる。このように、１００％コンフルエンシーの状態になるまで培養された細胞からなる細胞群を用いる場合、前記細胞染色試薬を用いて、前記細胞染色試薬から放出される蛍光の強度によって、抗体検出試薬から放出される蛍光の強度を補正することとあいまって、単位細胞数あたりの損傷ＤＮＡの量の算出を、より正確に、簡便に行なうことができ、被験物質を、簡便な操作で、迅速かつ高い処理効率で評価することができるという優れた効果を奏する。
【００５８】
なお、本明細書において、「１００％コンフルエンシーの状態」とは、培養容器の底表面全体が細胞で覆われている状態であって、細胞周期の進行が停止した状態をいう。したがって、１００％コンフルエンシーの状態で被験物質の評価を行なうことは、損傷ＤＮＡを生じさせた後に細胞分裂によって細胞数が増加することの影響（希釈効果）を無視できる利点もある。
【００５９】
細胞群に対する紫外線の照射は、例えば、紫外線照射装置により行なうことができる。紫外線照射装置を用いる場合、前記紫外線照射装置の紫外線の光源を、培養容器中の細胞群を含む培地の表面から２８〜４０ｃｍ離れた上方位置に配置し、前記細胞群を含む培地に対して、所定照射線量の紫外線を照射することにより、細胞群に対する紫外線の照射を行なうことができる。
【００６０】
細胞群に照射する紫外線としては、ＵＶ−Ａ（波長３１５〜３８０ｎｍ）、ＵＶ−Ｂ（波長：２８０〜３１５ｎｍ）、ＵＶ−Ｃ（波長：２００〜２８０ｎｍ）等が挙げられる。これらのなかでは、地表に到達する太陽光に含まれる紫外線の中で最もＤＮＡ損傷を作りやすい波長域であることから、好ましくはＵＶ−Ｂである。
【００６１】
紫外線の照射線量は、検出感度の観点から、ＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量に基づき、紫外線の照射線量をＵＶ-Ｃ照射線量に換算して、５Ｊ／ｍ2以上、より好ましくは８Ｊ／ｍ2以上であり、生物学的線量の観点から、好ましくは２０Ｊ／ｍ2以下、より好ましくは１２Ｊ／ｍ2以下である。紫外線として、ＵＶ−Ｂを用いる場合、ＵＶ−Ｂ照射線量は、前記ＵＶ−Ｃ照射線量のＵＶ−Ｃを照射したときにＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量と同量の損傷ＤＮＡを生じさせる照射線量である。
【００６２】
なお、紫外線の光源と細胞群を含む培地の表面との間の距離は、用いる光源の照射線量に応じて適宜調整することができる。
【００６３】
前記培地は、用いられる細胞に適した培地であればよい。例えば、細胞が正常ヒト表皮角化細胞である場合、基本培地として、低カルシウム濃度である無血清培地、例えば、ハム培地の改変培地であるＭＣＤＢ１５３基本培地、表皮角化細胞基礎培地〔例えば、倉敷紡績（株）製、商品名：ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２、製品番号：ＫＫ−２３５０Ｓ等〕等を用いることができる。また、例えば、細胞がヒト皮膚線維芽細胞である場合、基本培地として、ダルベッコ改変イーグル培地、あるいは前記表皮角化細胞基礎培地であるＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２、線維芽細胞基本培地であるＲＩＴＣ８０−７等を用いることができる。
【００６４】
培地のｐＨは、用いられる細胞に応じて適宜設定される。細胞が正常ヒト表皮角化細胞又はヒト皮膚線維芽細胞である場合、細胞を良好に生育させる観点から、培地のｐＨは、通常、好ましくは７．０〜７．６、より好ましくは７．２〜７．４である。
【００６５】
培養容器は、一度に多数の被験物質を評価できる観点から、９６ウェルプレートなどの多ウェルプレートが好ましい。また、前記培養容器が９６ウェルプレートなどの多ウェルプレートである場合、紫外線を多ウェルプレートの底面から照射することが好ましい。
【００６６】
細胞群に対する紫外線の照射は、細胞群に含まれる細胞に対して、均一に紫外線を照射する観点から、細胞群を含む培養物から培地を除去し、細胞付着面をダルベッコ−リン酸緩衝化生理的食塩水などで洗浄した後に行なうことが好ましい。
【００６７】
また、細胞群に対する被験物質の曝露は、例えば、被験物質を、細胞群が入っている培養容器中に添加し、得られた混合物をインンキュベーションすること等により行なわれる。
【００６８】
被験物質としては、特に限定されないが、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物等が挙げられる。被験物質は、必要に応じて、溶媒に溶解させてもよい。被験物質を溶解させる溶媒としては、この溶媒単独でＤＮＡ損傷の修復に影響を及ぼさない物質であればよい。前記溶媒としては、例えば、前記培地、リン酸緩衝化生理的食塩水等が挙げられる。
【００６９】
細胞群に対する被験物質の曝露に際して、用いられる被験物質の量は、被験物質の種類に応じて適宜設定することができる。
【００７０】
インキュベーション時の温度、雰囲気における二酸化炭素濃度等の条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。細胞が正常ヒト表皮角化細胞又はヒト皮膚線維芽細胞である場合、細胞を良好な状態で維持する観点から、前記細胞は、通常、好ましくは０〜１０体積％、より好ましくは２〜８体積％の二酸化炭素ガス雰囲気中、好ましくは３６〜３８℃、より好ましくは３６．５〜３７．５℃で、インキュベーションすることができる。
【００７１】
細胞群に対する被験物質の曝露は、細胞群に対する紫外線の照射の前又は後に行なうことができる。細胞群に対する被験物質の曝露を細胞群に対する紫外線の照射の前に行なう場合、被験物質が、紫外線の照射によるＤＮＡの損傷に起因する損傷ＤＮＡの生成を抑制するかどうかを評価することができる。また、細胞群に対する被験物質の曝露を細胞群に対する紫外線の照射の後に行なう場合、被験物質が、損傷ＤＮＡの修復を促進するかどうかを評価することができる。
【００７２】
ステップ（ｂ）では、ステップ（ａ）で得られた細胞群の細胞を固定して固定細胞群を得る。細胞群の細胞の固定は、前記定量方法のステップ（Ａ）における細胞群の細胞の固定と同様にして行なうことができる。
【００７３】
ステップ（ｃ）では、ステップ（ｂ）で得られた固定細胞群の細胞にＤＮＡ変性処理を施し、処理細胞群を得る。ＤＮＡ変性処理は、前記定量方法のステップ（Ｂ）におけるＤＮＡ変性処理と同様にして行なうことができる。
【００７４】
ステップ（ｄ）では、ステップ（ｃ）で得られた処理細胞群と、抗損傷ＤＮＡ抗体と、前記抗損傷ＤＮＡ抗体に特異的に結合し、かつ蛍光を発する抗体検出試薬と、前記細胞群の細胞に結合し、かつ蛍光を発する細胞染色試薬とを混合して、前記細胞中の損傷ＤＮＡと前記抗損傷ＤＮＡ抗体とを抗原抗体反応させるとともに前記細胞と前記細胞染色試薬とを結合させる。かかるステップ（ｄ）では、前記定量方法のステップ（Ｃ）と同様にして、処理細胞群と抗損傷ＤＮＡ抗体と抗体検出試薬と細胞染色試薬とを混合するため、抗体検出試薬から放出される蛍光と細胞染色試薬から放出される蛍光とを検出することにより、損傷ＤＮＡの量と細胞群の細胞数とを同時に算出することが可能になる。したがって、細胞の回収及び回収された細胞からのＤＮＡの単離の各操作を行なわなくても、細胞群の細胞数及び細胞群中の細胞に含まれる損傷ＤＮＡの量を簡便に測定することができるため、被験物質の評価に要する時間を短縮することができる。
【００７５】
ステップ（ｄ）では、前記抗損傷ＤＮＡ抗体の量、前記抗体検出試薬の量及び前記細胞染色試薬の量は、前記定量方法における抗損傷ＤＮＡ抗体の量、抗体検出試薬の量及び細胞染色試薬の量と同様である。
【００７６】
ステップ（ｅ）では、ステップ（ｄ）で得られた混合物中の抗損傷ＤＮＡ抗体に結合した抗体検出試薬から放出される蛍光の強度及び細胞に結合した細胞染色試薬から放出される蛍光の強度を測定する。蛍光の強度の測定は、前記定量方法のステップ（Ｄ）における蛍光の強度の測定と同様にして行なうことができる。
【００７７】
ステップ（ｆ）では、ステップ（ｅ）で測定された細胞染色試薬から放出される蛍光の強度によって、ステップ（ｅ）で測定された抗体検出試薬から放出される蛍光の強度を正規化し、正規化された蛍光強度から損傷ＤＮＡの量を算出する。蛍光の強度の正規化及び損傷ＤＮＡの量の算出は、前記定量方法のステップ（Ｅ）における蛍光の強度の測定と同様にして行なうことができる。
【００７８】
ステップ（ｇ）では、前記ステップ（ｆ）で算出された損傷ＤＮＡの量に基づき、被験物質が、細胞におけるＤＮＡ修復機構に作用する物質であるどうかを評価する。
【００７９】
細胞におけるＤＮＡ修復機構に作用する物質には、例えば、細胞における紫外線毒性を軽減する物質などが含まれる。細胞における紫外線毒性を軽減する物質としては、損傷ＤＮＡの生成を抑制する物質、及び損傷ＤＮＡの修復を促進する物質が挙げられる。
【００８０】
被験物質が、細胞におけるＤＮＡ修復機構に作用する物質であることの判断基準としては、例えば、前記ステップ（ｆ）で算出された損傷ＤＮＡの量が、ステップ（ａ）で被験物質の曝露を行なわずにステップ（ｂ）〜（ｆ）を行なうことによって算出された損傷ＤＮＡの量と比べて、減少していること等が挙げられる。前記判断基準を満たす被験物質は、損傷ＤＮＡの生成抑制又は修復促進を行なう作用を有する物質である。かかる作用を有する物質は、化粧料、皮膚外用剤等の成分として好適である。
【００８１】
以上のように、本発明の評価方法によれば、被験物質が細胞におけるＤＮＡ修復機構に作用する物質であるかどうかを、簡便な操作で、迅速かつ高い処理効率で定量することができる。したがって、本発明の評価方法によれば、種々の被験物質のハイスループットでの評価が可能になる。また、本発明の評価方法によれば、例えば、化粧料、皮膚外用剤等の成分として用いる化合物等を被験物質として用いることにより、前記化合物等が細胞におけるＤＮＡ修復機構に作用する物質であるかどうかを、調べることができる。また、本発明の評価方法によれば、種々の化合物等のなかから、細胞におけるＤＮＡ修復機構に作用する物質である細胞における紫外線毒性を軽減する物質、すなわち、損傷ＤＮＡの生成を抑制する物質、及び損傷ＤＮＡの修復を促進する物質のスクリーニング、薬理学的評価等を行なうことができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
【００８３】
（実験例１）
細胞数の定量条件の検討を、以下のようにして行なった。
【００８４】
ＮＨＦの培養物を、５×１０3細胞／１００μＬ又は１×１０4細胞／１００μＬ程度の細胞濃度となるように、培地〔和光純薬工業（株）製、商品名：Ｄ−ＭＥＭ〕で希釈して、細胞浮遊液を得た。得られた細胞浮遊液１００μＬを、９６ウェルプレート〔ナルジェ  ヌンク  インターナショナル（株）製、商品名：９６穴マイクロプレート（平底）〕の各ウェルに入れた。その後、細胞浮遊液が入った９６ウェルプレートを、二酸化炭素濃度：５体積％及び３７℃に保たれたＣＯ2インキュベータに入れ、２日間インキュベーションした。
【００８５】
つぎに、細胞固定液として、細胞固定液１（４体積％ホルムアルデヒド水溶液）１５０μＬを、培養後のＮＨＦが入った９６ウェルプレートのウェルに入れ、この９６ウェルプレートを１０分間放置することにより、ウェル中のＮＨＦの固定を行なった。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【００８６】
つぎに、各ウェルに２Ｍ塩酸水溶液１５０μＬを加えた後、前記９６ウェルプレートを５分間室温で放置することにより、ＤＮＡ変性処理を行なった。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【００８７】
つぎに、前記９６ウェルプレートの各ウェルに、細胞染色試薬５０μＬを入れ、この９６ウェルプレートを、室温で６０分間静置した。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。なお、前記細胞染色試薬として、細胞染色試薬１（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：Ｓａｐｐｈｉｒｅ７００  Ｓｔａｉｎを１／１０００濃度となるように１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水で希釈した希釈物）、細胞染色試薬２（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：ＤＲＡＱ５を１／１００００濃度となるように１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水で希釈した希釈物）及び細胞染色試薬３〔細胞染色試薬１と細胞染色試薬２との混合物（体積比＝１：１）〕を用いた。
【００８８】
洗浄後の９６ウェルプレートを近赤外光検出器（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：Ｏｄｙｓｓｅｙ）に供して、励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度を測定した。なお、前記ＤＮＡ変性処理が施されたＮＨＦに代えて、前記ＤＮＡ変性処理が施されていないＮＨＦを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度を測定した。また、細胞浮遊液を用いたことに代えて、細胞浮遊液を用いなかったことを除き、前記と同様の操作を行ない、励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度を測定した。
【００８９】
実験例１において、ＤＮＡ変性処理を行なわなかった場合の励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフを図１（Ａ）に示す。また、実験例１において、ＤＮＡ変性処理を行なった場合の励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフを図１（Ｂ）に示す。図中、黒四角は、細胞染色試薬１を用いた場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕、黒丸は、細胞染色試薬２を用いた場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕、白丸は、細胞染色試薬３を用いた場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕を示す。
【００９０】
図１（Ａ）及び（Ｂ）に示された結果から、ＤＮＡ変性処理を行なった場合、細胞染色試薬１に基づく蛍光強度及び細胞染色試薬３に基づく蛍光強度は、細胞染色試薬２に基づく蛍光強度よりも大きくなっており、しかも細胞数に依存的に、ほぼ直線的に増加することがわかる。一方、ＤＮＡ変性処理を行なわなかった場合、細胞染色試薬２に基づく蛍光強度及び細胞染色試薬３に基づく蛍光強度は、細胞染色試薬１に基づく蛍光強度よりも、細胞数を反映して細胞数に依存的に増加することがわかる。
【００９１】
かかる結果から、損傷ＤＮＡと抗損傷ＤＮＡ抗体との抗原抗体反応を良好に行なうのに必要なＤＮＡ変性処理を行なう場合、細胞からのＤＮＡの単離の操作を行なうことなく、簡単な操作でより正確に損傷ＤＮＡを定量するためには、細胞染色試薬１又は細胞染色試薬３を用いて定量した細胞数を用いることが好適であることがわかる。
【００９２】
（実験例２）
細胞数を定量する際に行なわれる細胞の固定処理の条件の検討を、以下のようにして行なった。
【００９３】
ＮＨＦの培養物を、５×１０3細胞／１００μＬ又は１×１０4細胞／１００μＬ程度の細胞濃度となるように、培地〔和光純薬工業（株）製、商品名：Ｄ−ＭＥＭ〕で希釈して、細胞浮遊液を得た。得られた細胞浮遊液１００μＬを、９６ウェルプレート〔ナルジェ  ヌンク  インターナショナル（株）製、商品名：９６穴マイクロプレート（平底）〕の各ウェルに入れた。その後、細胞浮遊液が入った９６ウェルプレートを、二酸化炭素濃度：５体積％及び３７℃に保たれたＣＯ2インキュベータに入れ、２日間インキュベーションした。
【００９４】
つぎに、細胞固定液として、細胞固定液１（４体積％ホルムアルデヒド水溶液）１５０μＬ又は細胞固定液２〔メタノール−アセトン混合溶媒（メタノール／アセトン（体積比）＝１／１）、−２０℃〕１５０μＬを、培養後のＮＨＦが入った９６ウェルプレートのウェルに加え、この９６ウェルプレートを１０分間放置することにより、ウェル中のＮＨＦの固定を行なった。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【００９５】
つぎに、実験例１と同様の操作を行なうことにより、ＤＮＡ変性処理を行なった。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【００９６】
つぎに、前記細胞染色試薬１、細胞染色試薬２及び細胞染色試薬３それぞれを用いて実験例１と同様の操作を行なうことにより、励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度を測定した。
【００９７】
実験例２において、細胞固定液として、ホルムアルデヒド水溶液を用いた場合の励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフを図２（Ａ）に示す。また、実験例２において、細胞固定液として、メタノール−アセトン混合溶媒を用いた場合の励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフを図２（Ｂ）に示す。図中、黒四角は、細胞染色試薬１を用いた場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕、黒丸は、細胞染色試薬２を用いた場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕、白丸は、細胞染色試薬３を用いた場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕を示す。
【００９８】
図２（Ａ）及び（Ｂ）に示された結果から、細胞固定液２を用いた場合には、細胞固定液１を用いた場合と比べて、細胞染色試薬に基づく蛍光強度が、より正確に細胞数に依存的に、直線的に増加することがわかる。したがって、これらの結果から、ホルムアルデヒド水溶液よりもメタノール−アセトン混合溶媒を細胞固定液として用いることがより好適であることが示唆される。
【００９９】
（実験例３）
ＮＨＦの培養物を、２×１０5細胞／２ｍＬ程度の細胞濃度となるように、培地〔和光純薬工業（株）製、商品名：Ｄ−ＭＥＭ〕で希釈して、細胞浮遊液を得た。得られた細胞浮遊液２ｍＬを、３５ｍｍガラスボトムディッシュ〔ＹＳＩジャパン（株）製、商品名：３５ｍｍガラスボトムディッシュ〕に入れた。その後、細胞浮遊液が入った３５ｍｍガラスボトムディッシュを、二酸化炭素濃度：５体積％及び３７℃に保たれたＣＯ2インキュベータに入れ、２日間インキュベーションした。
【０１００】
その後、ＣＯ2インキュベータから、培養後のＮＨＦが入った３５ｍｍガラスボトムディッシュを取り出し、培養後のＮＨＦに対して、培地表面より１４５ｃｍ離れた上方位置から、紫外線として、２０Ｊ／ｍ2のＵＶ−Ｃを照射した。
【０１０１】
つぎに、前記細胞固定液１  １ｍＬを、前記３５ｍｍガラスボトムディッシュに加え、１０分間放置することにより、ＮＨＦの固定を行なった。つぎに、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記３５ｍｍガラスボトムディッシュを洗浄した。
【０１０２】
前記３５ｍｍガラスボトムディッシュに、２Ｍ塩酸水溶液１ｍＬを加え、５分間又は３０分間室温で放置することにより、ＤＮＡ変性処理を行なった。また、ＵＶ−Ｃを非照射としたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ＤＮＡ変性処理を行なった。
【０１０３】
その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記３５ｍｍガラスボトムディッシュを洗浄した。つぎに、前記３５ｍｍガラスボトムディッシュに、ブロッキング液〔組成：２０体積％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水〕１ｍＬを加え、３７℃で３０分間処理することで抗体の非特異的結合部位をブロッキングした。洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により洗浄後、一次抗体としてＤＮＡ中の損傷ＤＮＡ内に存在するシクロブタン型ピリミジン二量体（以下、「ＣＰＤ」という）部分に対する抗損傷ＤＮＡ抗体（以下、「抗ＣＰＤ抗体」という）を含む一次抗体溶液１００μＬを入れ、この３５ｍｍガラスボトムディッシュを、３７℃で３０分間静置した。前記抗ＣＰＤ抗体として、市販の抗ＣＰＤ抗体〔コスモバイオ（株）製、商品名：Anti-Cyclobutane pyrimidine dimmers(CPDs) 、コード番号：NMDND001〕（以下、「抗ＣＰＤ抗体１」という）、又は当該市販の抗ＣＰＤ抗体を産生するハイブリドーマであるclone TDM-2から前記市販の抗ＣＰＤ抗体の製造方法と同様に製造され、かつ前記市販の抗ＣＰＤ抗体と同じ性質を示す抗ＣＰＤ抗体（以下、「抗ＣＰＤ抗体２」という）を用いた。以下、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：１７．７ｍｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕を用いた場合の結果を代表例として示す。
【０１０４】
その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により３５ｍｍガラスボトムディッシュを洗浄した。さらに、二次抗体として蛍光標識二次抗体〔インビトロジェン（株）製、商品名：Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒTM  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ〕を含む二次抗体溶液の２００倍希釈物〔二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：１０μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕１００μＬを入れ、この３５ｍｍガラスボトムディッシュを、３７℃で３０分間静置した。
【０１０５】
洗浄後の３５ｍｍガラスボトムディッシュのウェル中のＮＨＦの染色像を蛍光顕微鏡にて観察した。
【０１０６】
実験例３において、２Ｍ塩酸水溶液中で、ＤＮＡ変性処理を５分間施したＵＶ−Ｃ非照射のＮＨＦの染色像を観察した結果を示す図面代用写真を図３（Ａ）に示す。実験例３において、２Ｍ塩酸水溶液中で、ＤＮＡ変性処理を３０分間施したＵＶ−Ｃ非照射のＮＨＦの染色像を観察した結果を示す図面代用写真を図３（Ｂ）に示す。実験例３において、２Ｍ塩酸水溶液中で、ＤＮＡ変性処理を５分間施し、かつＵＶ−Ｃを照射したＮＨＦの染色像を観察した結果を示す図面代用写真を図３（Ｃ）に示す。実験例３において、２Ｍ塩酸水溶液中でＤＮＡ変性処理を３０分間施し、かつＵＶ−Ｃを照射したＮＨＦの染色像を観察した結果を示す図面代用写真を図３（Ｄ）に示す。図中、スケールバーは、２０μｍを示す。
【０１０７】
図３の（Ａ）及び（Ｂ）に示されるＮＨＦの染色像と比べて、（Ｃ）及び（Ｄ）に示されるＮＨＦの染色像は、より明瞭に見えていることがわかる。特に、ＵＶ−Ｃを照射したＮＨＦでは、２Ｍ塩酸水溶液中でＤＮＡ変性処理を３０分間施した場合に、最も良好に抗ＣＰＤ抗体により染色されることがわかる。したがって、ＤＮＡ変性処理条件は、２Ｍ塩酸水溶液中で、ＤＮＡ変性処理を５分間施す条件と比べて、２Ｍ塩酸水溶液中で、ＤＮＡ変性処理を３０分間施す条件のほうがより好適であることがわかる。また、抗ＣＰＤ抗体１を用いた場合にも、抗ＣＰＤ抗体２を用いた場合と同様である。
【０１０８】
（実験例４）
ＮＨＦの培養物を、６×１０3細胞／１００μＬ程度の細胞濃度となるように、培地〔和光純薬工業（株）製、商品名：Ｄ−ＭＥＭ〕で希釈して、細胞浮遊液を得た。得られた細胞浮遊液１００μＬを、９６ウェルプレート〔ナルジェ  ヌンク  インターナショナル（株）製、商品名：９６穴マイクロプレート（平底）〕の各ウェルに入れた。その後、細胞浮遊液が入った９６ウェルプレートを、二酸化炭素濃度：５体積％及び３７℃に保たれたＣＯ2インキュベータに入れ、２日間インキュベーションした。
【０１０９】
その後、ＣＯ2インキュベータから、培養後のＮＨＦが入った９６ウェルプレートを取り出し、培養後のＮＨＦに対して、培地表面より２８ｃｍ離れた上方位置から、紫外線として、５Ｊ／ｍ2、１０Ｊ／ｍ2、又は２０Ｊ／ｍ2のＵＶ−Ｃを照射したときにＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量と同量の損傷ＤＮＡを生じさせる相当量のＵＶ−Ｂを照射した。
【０１１０】
つぎに、前記細胞固定液２〔メタノール−アセトン混合溶媒（メタノール／アセトン（体積比）＝１／１）、−２０℃〕１５０μＬを、前記９６ウェルプレートのウェルに加え、この９６ウェルプレートを１０分間放置することにより、ウェル中のＮＨＦの固定を行なった。つぎに、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【０１１１】
前記９６ウェルプレートの各ウェル中に、２Ｍ塩酸水溶液１５０μＬを加え、この９６ウェルプレートを３０分間室温で放置することにより、ＤＮＡ変性処理を行なった。
【０１１２】
その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。前記９６ウェルプレートの各ウェルに、ブロッキング溶液（組成：２０体積％ＦＢＳを含む１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水溶液）１５０μＬを添加した後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置して、ブロッキングを行なった。
【０１１３】
ブロッキング後の９６ウェルプレートの各ウェルに、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体１又は抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の１００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：１７７μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。以下、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の１００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：１７７μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕を用いた場合の結果を代表例として示す。
【０１１４】
静置後の９６ウェルプレートを、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で洗浄した。洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔インビトロジェン（株）製、商品名：Ｂｉｏｔｉｎ−Ｆ（ａｂ’）2  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）〕を含む二次抗体溶液の２００倍希釈物〔二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：２．０μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを、３７℃で３０分間静置した。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【０１１５】
洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、標識ストレプトアビジン（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：ＩＲＤｙｅ  ６８０  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を含む三次試薬である標識ストレプトアビジン溶液（標識ストレプトアビジン濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ）の種々の希釈物５０μＬを加え、この９６ウェルプレートを、３７℃で３０分間静置した。１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水で前記９６ウェルプレートを洗浄後、９６ウェルプレートの各ウェル中の混合物の波長６８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。なお、ＵＶ−Ｂが照射されたＮＨＦに代えて、ＵＶ−Ｂ非照射のＮＨＦを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ウェル中の混合物の波長６８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。そして、ＵＶ−Ｂを照射した場合の蛍光強度の値からＵＶ−Ｂ非照射の場合の蛍光強度の値を差し引いた値を算出した。
【０１１６】
実験例４において、損傷ＤＮＡを検出した場合における紫外線照射線量と蛍光強度との関係を示すグラフを図４に示す。図中、白丸は、標識ストレプトアビジン濃度：２.５μｇ／ｍＬの標識ストレプトアビジン溶液（４００倍希釈物）を用いた場合の蛍光強度、白四角は、標識ストレプトアビジン濃度：1.２５μｇ／ｍＬの標識ストレプトアビジン溶液（８００倍希釈物）を用いた場合の蛍光強度、白三角は、標識ストレプトアビジン濃度：０.６２５μｇ／ｍＬの標識ストレプトアビジン溶液（１６００倍希釈物）を用いた場合の蛍光強度、黒四角は、標識ストレプトアビジン濃度：０.３１２５μｇ／ｍＬの標識ストレプトアビジン溶液（３２００倍希釈物）を用いた場合の蛍光強度を示す。なお、図中、紫外線照射量は、ＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量を基づき、ＵＶ−Ｂ照射線量の値をＵＶ−Ｃ照射線量に換算した値として示す。
【０１１７】
図４に示された結果から、標識ストレプトアビジン濃度が０.３１２５〜２.５μｇ／ｍＬである標識ストレプトアビジン溶液を用いた場合、ＵＶ−Ｂの照射線量に依存したＣＰＤの量の増加が、良好に観察できることがわかる。また、抗ＣＰＤ抗体１を用いた場合にも、抗ＣＰＤ抗体２を用いた場合と同様である。
【０１１８】
（実験例５）
ＮＨＦの培養物を、６×１０3細胞／１００μＬ程度の細胞濃度となるように、培地〔和光純薬工業（株）製、商品名：Ｄ−ＭＥＭ〕で希釈して、細胞浮遊液を得た。得られた細胞浮遊液１００μＬを、９６ウェルプレート〔ナルジェ  ヌンク  インターナショナル（株）製、商品名：９６穴マイクロプレート（平底）〕の各ウェルに入れた。その後、ＮＨＦが播種された９６ウェルプレートを、二酸化炭素濃度：５体積％及び３７℃に保たれたＣＯ2インキュベータに入れ、２日間インキュベーションした。
【０１１９】
その後、ＣＯ2インキュベータから、培養後のＮＨＦが入った９６ウェルプレートを取り出し、培養後のＮＨＦに対して、培地表面より２８ｃｍ離れた上方位置から、紫外線として、１０Ｊ／ｍ2のＵＶ−Ｃ（波長：２５４ｎｍ）を照射した場合にＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量と同量の損傷ＤＮＡを生じさせる４００Ｊ／ｍ2のＵＶ−Ｂ（波長：３１０ｎｍ）を照射した。
【０１２０】
実験例４と同様の操作を行なうことにより、細胞固定及びＤＮＡ変性処理を行なった。
【０１２１】
その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。前記９６ウェルプレートの各ウェルに、ブロッキング溶液（２０体積％ＦＢＳを含むリン酸緩衝化生理的食塩水）１５０μＬを添加した後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置して、ブロッキングを行なった。
【０１２２】
ブロッキング後の９６ウェルプレートの各ウェルに、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体１又は抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：１７．７ｍｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕の種々の希釈物５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。以下、抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：１７．７ｍｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕の種々の希釈物を用いた場合の結果を代表例として示す。
【０１２３】
静置後の９６ウェルプレートを、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で洗浄した。洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔インビトロジェン（株）製、商品名：Ｂｉｏｔｉｎ−Ｆ（ａｂ’）2  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）〕を含む二次抗体溶液〔二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：０.４ｍｇ／ｍＬ〕の種々の希釈物５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを、３７℃で３０分間静置した。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【０１２４】
洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、標識ストレプトアビジン（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：ＩＲＤｙｅ  ６８０  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を含む三次試薬である標識ストレプトアビジン溶液の１６００倍希釈物（標識ストレプトアビジン濃度：０.６２５μｇ／ｍＬ）５０μＬを加え、この９６ウェルプレートを、３７℃で３０分間静置した。１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水で前記９６ウェルプレートを洗浄後、９６ウェルプレートの各ウェル中の混合物の波長６８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。なお、ＵＶ−Ｂが照射されたＮＨＦに代えて、ＵＶ−Ｂ非照射のＮＨＦを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ウェル中の混合物の波長６８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。そして、ＵＶ−Ｂを照射した場合の蛍光強度の値からＵＶ−Ｂ非照射の場合の蛍光強度の値を差し引いた値を算出した。
【０１２５】
実験例５において、損傷ＤＮＡを検出した場合における一次抗体溶液中における一次抗体濃度と蛍光強度との関係を示すグラフを図５に示す。図中、白丸は、二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：２.０μｇ／ｍＬ（２００倍希釈物）の場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕、黒四角は、二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：１.０μｇ／ｍＬ（４００倍希釈物）の場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕、黒丸は、二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：０.５μｇ／ｍＬ（８００倍希釈物）の場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕を示す。
【０１２６】
図５に示された結果から、一次抗体溶液の一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：８８．５μｇ／ｍＬ（２００倍希釈物）〜１７７μｇ／ｍＬ（１００倍希釈物）であり、かつ二次抗体溶液の二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：１.０〜２.０μｇ／ｍＬである場合、蛍光強度がほぼ一定であり、損傷ＤＮＡの定量値に誤差が生じていないと考えられる。したがって、損傷ＤＮＡの定量に際して、一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：８８．５μｇ／ｍＬ（２００倍希釈物）〜１７７μｇ／ｍＬ（１００倍希釈物）の一次抗体溶液を用い、かつ二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：１.０〜２.０μｇ／ｍＬの二次抗体溶液を用いることが好適であることがわかる。また、抗ＣＰＤ抗体１を用いた場合にも、抗ＣＰＤ抗体２を用いた場合と同様である。
【０１２７】
（実験例６）
実験例４と同様の操作を行なうことにより、９６ウェルプレートの各ウェルに播種したＮＨＦに１０Ｊ／ｍ2のＵＶ−Ｃを照射した場合にＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量と同量の損傷ＤＮＡを生じさせる相当量のＵＶ−Ｂを照射し、細胞の固定及びＤＮＡ変性処理を行なった。
【０１２８】
その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。前記９６ウェルプレートの各ウェルに、ブロッキング溶液１５０μＬを添加した後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置して、ブロッキングを行なった。ブロッキング溶液として、ブロッキング溶液１［１質量％スキムミルク〔雪印乳業（株）製〕のリン酸緩衝化生理的食塩水溶液］、ブロッキング溶液２（１０体積％ＦＢＳのリン酸緩衝化生理的食塩水溶液）及びブロッキング溶液３（２０体積％ＦＢＳのリン酸緩衝化生理的食塩水溶液）を用いた。
【０１２９】
ブロッキング後の９６ウェルプレートの各ウェルに、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体１又は抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：８８．５μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。以下、抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：８８．５μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕を用いた場合の結果を代表例として示す。
【０１３０】
静置後の９６ウェルプレートを、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で洗浄した。洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔インビトロジェン（株）製、商品名：Ｂｉｏｔｉｎ−Ｆ（ａｂ’）2  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）〕を含む二次抗体溶液〔二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：０.４ｍｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕の種々の希釈物５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【０１３１】
洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、標識ストレプトアビジン（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：ＩＲＤｙｅ  ６８０  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を含む三次試薬である標識ストレプトアビジン溶液の１６００倍希釈物（標識ストレプトアビジン濃度：０.６２５μｇ／ｍＬ）５０μＬを加え、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水で前記９６ウェルプレートを洗浄後、９６ウェルプレートの各ウェル中の混合物の波長６８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。なお、ＵＶ−Ｂが照射されたＮＨＦに代えて、ＵＶ−Ｂ非照射のＮＨＦを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ウェル中の混合物の波長６８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。そして、ＵＶ−Ｂを照射した場合の蛍光強度の値からＵＶ−Ｂ非照射の場合の蛍光強度の値を差し引いた値を算出した。
【０１３２】
実験例６において、ＵＶ−Ｂ照射時及びＵＶ−Ｂ非照射それぞれの損傷ＤＮＡを検出した場合における二次抗体溶液中における二次抗体濃度と蛍光強度との関係を示すグラフを図６（Ａ）に示す。また、実験例６において、損傷ＤＮＡを検出し、バックグラウンド（ＵＶ−Ｂ非照射）を補正した場合における二次抗体溶液中における二次抗体濃度と蛍光強度との関係を示すグラフを図６（Ｂ）に示す。
【０１３３】
図６（Ａ）及び（Ｂ）中、白丸は、ＵＶ−Ｂ非照射で、かつブロッキング溶液が１質量％スキムミルクのリン酸緩衝化生理的食塩水溶液である場合の蛍光強度、白四角は、ＵＶ−Ｂ非照射で、かつブロッキング溶液が１０体積％ＦＢＳのリン酸緩衝化生理的食塩水溶液である場合の蛍光強度、白三角は、ＵＶ−Ｂ非照射で、かつブロッキング溶液が２０体積％ＦＢＳのリン酸緩衝化生理的食塩水溶液である場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕、黒丸は、ＵＶ−Ｂ照射で、かつブロッキング溶液が１質量％スキムミルクのリン酸緩衝化生理的食塩水溶液である場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕、黒四角は、ＵＶ−Ｂ照射で、かつブロッキング溶液が１０体積％ＦＢＳのリン酸緩衝化生理的食塩水溶液である場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕、黒三角は、ＵＶ−Ｂ照射で、かつブロッキング溶液が２０体積％ＦＢＳのリン酸緩衝化生理的食塩水溶液である場合の蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕を示す。
【０１３４】
図６（Ａ）に示された結果から、ブロッキング溶液１を用いた場合には、ＵＶ−Ｂ非照射の場合、蛍光強度が最も低くなることがわかる。したがって、この結果から、ＵＶ−Ｂ照射とは関係のないバックグラウンドを低減させるために、１質量％スキムミルクのリン酸緩衝化生理的食塩水溶液が好適であることがわかる。また、図６（Ｂ）に示された結果から、二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）が、２.０μｇ／ｍＬ（２００倍希釈）である場合、ＵＶ−Ｂ照射により生じたＣＰＤの検出量が最も多くなっているため、この二次抗体濃度が、損傷ＤＮＡの検出に好適であることがわかる。また、抗ＣＰＤ抗体１を用いた場合にも、抗ＣＰＤ抗体２を用いた場合と同様である。
【０１３５】
（実験例７）
細胞染色試薬と、励起波長が７８０ｎｍである蛍光物質により標識された標識ストレプトアビジンを含む三次試薬とを用いた二重染色を行なうための条件を、以下のようにして検討した。
【０１３６】
９６ウェルプレートの各ウェルに入ったＮＨＦへのＵＶ−Ｂの照射、細胞固定、ＤＮＡ変性処理及びブロッキングは、実験例６と同様に行なった。
【０１３７】
ブロッキング後の９６ウェルプレートの各ウェルに、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体１又は抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：８８．５μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。以下、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：８８．５μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕を用いた場合の結果を代表例として示す。
【０１３８】
静置後の９６ウェルプレートを、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で洗浄した。洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔インビトロジェン（株）製、商品名：Ｂｉｏｔｉｎ−Ｆ（ａｂ’）2  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）〕を含む二次抗体溶液の２００倍希釈物〔二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：２.０μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【０１３９】
標識ストレプトアビジン（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を含む三次試薬である標識ストレプトアビジン溶液（標識ストレプトアビジン濃度：１.０ｍｇ／ｍＬ）に対して、かかる標識ストレプトアビジン溶液における標識ストレプトアビジン濃度が種々の濃度となるように、前記細胞染色試薬１又は前記細胞染色試薬３を添加し、種々の混合物を得た。つぎに、前記洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、前記混合物５０μＬを加え、この９６ウェルプレートを、３７℃で３０分間静置した。
【０１４０】
洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェル中の混合物の波長７８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。なお、ＵＶ−Ｂが照射されたＮＨＦに代えて、ＵＶ−Ｂ非照射のＮＨＦを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ウェル中の混合物の波長７８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。そして、ＵＶ−Ｂを照射した場合の蛍光強度の値からＵＶ−Ｂ非照射の場合の蛍光強度の値を差し引いた値を算出した。実験例７において、損傷ＤＮＡを検出し、バックグラウンド（ＵＶ−Ｂ非照射）を補正した場合における標識ストレプトアビジン濃度と蛍光強度との関係を示すグラフを図７に示す。図中、黒丸は、細胞染色試薬として細胞染色試薬１を用いた場合の蛍光強度、黒四角は、細胞染色試薬として細胞染色試薬３を用いた場合の蛍光強度、黒三角は、細胞染色試薬を用いていない場合の蛍光強度を示す。
【０１４１】
図７に示された結果から、細胞染色試薬と標識ストレプトアビジン溶液との混合物の標識ストレプトアビジン濃度が０.３１２５〜1.２５μｇ／ｍＬである場合、蛍光強度がほぼ一定であり、損傷ＤＮＡの定量値に誤差が生じていないと考えられる。したがって、損傷ＤＮＡの定量に際して、標識ストレプトアビジン濃度が０.３１２５μｇ／ｍＬ（３２００倍希釈）〜1.２５μｇ／ｍＬ（８００倍希釈）である細胞染色試薬と標識ストレプトアビジン溶液との混合物を用いることが好適であることがわかる。また、これらの結果から、三次試薬として、励起波長が７８０ｎｍである蛍光物質により標識された標識ストレプトアビジンを含む標識ストレプトアビジン溶液を用いた場合であっても、励起波長が６８０ｎｍである蛍光物質により標識された標識ストレプトアビジンを含む標識ストレプトアビジン溶液を用いた場合と同様に、損傷ＤＮＡを良好に検出できることがわかる。また、抗ＣＰＤ抗体１を用いた場合にも、抗ＣＰＤ抗体２を用いた場合と同様である。
【０１４２】
（実験例８）
ＮＨＦの培養物を、６×１０3細胞／１００μＬ又は１×１０4細胞／１００μＬ程度の細胞濃度となるように、培地〔和光純薬工業（株）製、商品名：Ｄ−ＭＥＭ〕で希釈して、細胞浮遊液を得た。得られた細胞浮遊液１００μＬを、９６ウェルプレート〔ナルジェ  ヌンク  インターナショナル（株）製、商品名：９６穴マイクロプレート（平底）〕の各ウェルに入れた。その後、ＮＨＦが播種された９６ウェルプレートを、二酸化炭素濃度：５体積％及び３７℃に保たれたＣＯ2インキュベータに入れ、２日間インキュベーションした。
【０１４３】
その後、ＣＯ2インキュベータから、培養後のＮＨＦが入った９６ウェルプレートを取り出し、培養後のＮＨＦに対して、培地表面より２８ｃｍ離れた上方位置から１０Ｊ／ｍ2のＵＶ−Ｃを照射したときにＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量と同量の損傷ＤＮＡを生じさせる相当量のＵＶ−Ｂを照射した。
【０１４４】
その後、実験例５と同様の操作を行なうことにより、細胞固定、ＤＮＡ変性処理及びブロッキングを行なった。
【０１４５】
ブロッキング後の９６ウェルプレートの各ウェルに、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体１又は抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：８８．５μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。以下、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：８８．５μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕を用いた場合の結果を代表例として示す。
【０１４６】
静置後の９６ウェルプレートを、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で洗浄した。洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔インビトロジェン（株）製、商品名：Ｂｉｏｔｉｎ−Ｆ（ａｂ’）2  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）〕を含む二次抗体溶液の２００倍希釈物〔二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：２．０μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを、３７℃で３０分間静置した。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【０１４７】
標識ストレプトアビジン（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を含む三次試薬である標識ストレプトアビジン溶液（標識ストレプトアビジン濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ）に対して、かかる標識ストレプトアビジン溶液における標識ストレプトアビジン濃度が１／２５００倍の濃度となるように、前記細胞染色試薬１又は前記細胞染色試薬３を添加し、混合物を得た。つぎに、前記洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、前記混合物５０μＬを加え、この９６ウェルプレートを、３７℃で３０分間静置した。
【０１４８】
洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェル中の混合物の波長７８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。なお、ＵＶ−Ｂが照射されたＮＨＦに代えて、ＵＶ−Ｂ非照射のＮＨＦを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ウェル中の混合物の波長７８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。そして、ＵＶ−Ｂを照射した場合の蛍光強度の値からＵＶ−Ｂ非照射の場合の蛍光強度の値を差し引いた値を算出した。実験例８において、損傷ＤＮＡを検出し、バックグラウンド（ＵＶ−Ｂ非照射）を補正した場合におけるウェルに播種した各細胞の細胞数と蛍光強度との関係を示すグラフを図８に示す。図中、黒丸は、細胞染色試薬１を用いた場合の蛍光強度（ＡＵ）、黒四角は、細胞染色試薬３を用いた場合の蛍光強度（ＡＵ）を示す。
【０１４９】
図８に示された結果から、前記細胞染色試薬１を用いた場合及び前記細胞染色試薬３を用いた場合のいずれにおいても、波長７８０ｎｍでの蛍光強度に大きな差がないことがわかる。また、図８に示された結果から、蛍光強度は、細胞数に依存していることがわかる。損傷ＤＮＡの定量やＤＮＡ修復の動態の評価には、絶対的蛍光強度が大きい方が有利である。さらに、１×１０4細胞／１００μＬ程度の細胞濃度の細胞浮遊液を９６ウェルプレートの各ウェルでインキュベーションした場合、ＮＨＦは、ＵＶ−Ｂ照射を行なう時点で、１００％コンフルエンシーの状態となっていた。したがって、これらの結果より、ウェルに播種する細胞数は、１×１０4細胞以上が好適であることがわかる。また、抗ＣＰＤ抗体１を用いた場合にも、抗ＣＰＤ抗体２を用いた場合と同様である。
【０１５０】
（実施例１）
正常ヒトテロメレース遺伝子導入細胞（ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞）の培養物又はＸＰＡ群ヒトテロメレース遺伝子導入細胞（ＸＰ３ＯＳ／Ｔ−ｎ細胞）の培養物を、１×１０4細胞／１００μＬ程度の細胞濃度となるように、培地〔和光純薬工業（株）製、商品名：Ｄ−ＭＥＭ〕で希釈して、細胞浮遊液を得た。得られた各細胞浮遊液１００μＬを、９６ウェルプレート〔ナルジェ  ヌンク  インターナショナル（株）製、商品名：９６穴マイクロプレート（平底）〕の各ウェルに入れた。その後、ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞又はＸＰ３ＯＳ／Ｔ−ｎ細胞が播種された９６ウェルプレートを、二酸化炭素濃度：５体積％及び３７℃に保たれたＣＯ2インキュベータに入れ、細胞が１００％コンフルエンシーの状態になるように２日間インキュベーションした。
【０１５１】
その後、ＣＯ2インキュベータから、培養後の細胞が入った９６ウェルプレートを取り出し、培養後の細胞に対して、培地表面より２８ｃｍ離れた上方位置から１０Ｊ／ｍ2のＵＶ−Ｃを照射したときにＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量と同量の損傷ＤＮＡを生じさせる相当量のＵＶ−Ｂを照射した。ＵＶ−Ｂの照射後の細胞が入った９６ウェルプレートに培地を添加し、二酸化炭素濃度：５体積％及び３７℃に保たれたＣＯ2インキュベータに入れ、２４時間インキュベーションした。
【０１５２】
つぎに、細胞固定液２〔メタノール−アセトン混合溶媒（メタノール／アセトン（体積比）＝１／１）、−２０℃〕１５０μＬを、前記９６ウェルプレートのウェルに加え、この９６ウェルプレートを室温で１０分間放置することにより、ウェル中のＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞又はＸＰ３ＯＳ／Ｔ−ｎ細胞の固定を行なった。つぎに、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【０１５３】
前記９６ウェルプレートの各ウェル中に、２Ｍ塩酸水溶液１５０μＬを加え、この９６ウェルプレートを３０分間室温で放置することにより、ＤＮＡ変性処理を行なった。
【０１５４】
その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。前記９６ウェルプレートの各ウェルに、ブロッキング溶液（１質量％スキムミルクを含むリン酸緩衝化生理的食塩水）１５０μＬを添加した後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置して、ブロッキングを行なった。
【０１５５】
ブロッキング後の９６ウェルプレートの各ウェルに、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体１又は抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：８８．５μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。以下、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：８８．５μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕を用いた場合の結果を代表例として示す。
【０１５６】
静置後の９６ウェルプレートを、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で洗浄した。洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔インビトロジェン（株）製、商品名：Ｂｉｏｔｉｎ−Ｆ（ａｂ’）2  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）〕を含む二次抗体溶液の２００倍希釈物〔二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：２．０μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕の種々の希釈物５０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置した。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【０１５７】
標識ストレプトアビジン（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を含む三次試薬である標識ストレプトアビジン溶液（標識ストレプトアビジン濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ）に対して、かかる標識ストレプトアビジン溶液における標識ストレプトアビジン濃度が１／２５００倍の濃度となるように、前記細胞染色試薬１を添加し、混合物を得た。つぎに、前記洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、前記混合物５０μＬを加え、この９６ウェルプレートを、３７℃で３０分間静置した。
【０１５８】
１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄後、９６ウェルプレートの各ウェル中の混合物の波長６８０ｎｍ及び７８０ｎｍそれぞれでの蛍光強度を測定した。なお、ＵＶ−Ｂが照射されたＮＨＦに代えて、ＵＶ−Ｂ非照射のＮＨＦを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ウェル中の混合物の波長６８０ｎｍ及び７８０ｎｍそれぞれでの蛍光強度を測定した。また、ＵＶ−Ｂの照射後の細胞が入った９６ウェルプレートをインキュベーションした後、ウェルに前記細胞固定液２を加えたことに代えて、ＵＶ−Ｂの照射直後の細胞が入った９６ウェルプレートのウェルに前記細胞固定液２を加えたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ウェル中の混合物の波長６８０ｎｍ及び７８０ｎｍそれぞれでの蛍光強度を測定した。そして、紫外線として、ＵＶ−Ｂを照射した場合の波長７８０ｎｍでの蛍光強度の値からＵＶ−Ｂ非照射の場合の波長７８０ｎｍでの蛍光強度の値を差し引いた値を算出した。さらに、各ウェルの励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度によって、各ウェルの励起波長７８０ｎｍにおける標識ストレプトアビジンの標識物質に基づく蛍光強度を正規化し、ウェル間の誤差を補正した。
【０１５９】
実施例１において、紫外線照射線量と、紫外線が照射された各細胞における抗ＣＰＤ抗体と複合体を形成している標識ストレプトアビジンに基づく補正前の蛍光強度との関係を調べた結果を示すグラフを図９（Ａ）に示す。また、実施例１において、紫外線照射線量と、紫外線が照射された各細胞における抗ＣＰＤ抗体と複合体を形成している標識ストレプトアビジンに基づく補正後の蛍光強度との関係を調べた結果を示すグラフを図９（Ｂ）に示す。図中、黒丸は、ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞における損傷ＤＮＡに基づく蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕、黒四角は、ＸＰ３ＯＳ／Ｔ−ｎ細胞における損傷ＤＮＡに基づく蛍光強度〔ＡＵ（任意単位）〕を示す。なお、図中、紫外線照射量は、ＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量を基づき、ＵＶ−Ｂ照射線量の値をＵＶ−Ｃ照射線量に換算した値として示す。
【０１６０】
さらに、実施例１において、ＵＶ−Ｂが照射された各細胞における補正前の残存ＣＰＤ量とＵＶ−Ｂ照射後の細胞のインキュベーション時間との関係を調べた結果を示すグラフを図１０（Ａ）に示す。また、実施例１において、ＵＶ−Ｂが照射された各細胞における補正後の残存ＣＰＤ量とＵＶ−Ｂ照射後の細胞のインキュベーション時間との関係を調べた結果を示すグラフを図１０（Ｂ）に示す。図中、黒丸は、ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞における残存ＣＰＤ量の割合、黒四角は、ＸＰ３ＯＳ／Ｔ−ｎ細胞における残存ＣＰＤ量の割合を示す。
【０１６１】
図９（Ａ）及び（Ｂ）に示された結果から、ＸＰ３ＯＳ／Ｔ−ｎ細胞とＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞は同程度のＣＰＤを生成しているため、補正を行なうことにより、より明確になることがわかる。また、図１０（Ａ）及び（Ｂ）に示された結果から、インキュベーション時間（修復時間）が経過するほど、ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞は、ＸＰ３ＯＳ／Ｔ−ｎ細胞と比べて、残存ＣＰＤ量がより多く減少していることがわかる。かかる結果は、健常人由来のＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞はＤＮＡ修復能を有し、この修復能を欠損したＸＰ３ＯＳ／Ｔ−ｎ細胞では従来の結果のとおりＣＰＤの除去がほとんど見られないことを示している。さらに、図１０（Ａ）と（Ｂ）とを比較すると、ＸＰ３ＯＳ／Ｔ−ｎ細胞とＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞との間の残存ＣＰＤ量の差は、補正を行なうことにより、より明確に現れていることがわかる。なお、抗ＣＰＤ抗体１を用いた場合にも、抗ＣＰＤ抗体２を用いた場合と同様である。
【０１６２】
以上のように、細胞染色試薬を用いて細胞数を近赤外光における蛍光を検出することにより定量し、損傷ＤＮＡの量を補正した場合には、１つの多ウェルプレート上で、同時に、小スケールで多数の細胞におけるＤＮＡ中の損傷ＤＮＡの量を定量することができ、ハイスループットでのＤＮＡ修復の解析を行なうことができる。また、細胞への紫外線照射の後に、被験物質と接触させて、本実施例１のように、損傷ＤＮＡの量を測定することにより、被験物質が損傷ＤＮＡの修復を促進するかどうかを評価することができる。
【０１６３】
（実施例２）
実施例１における紫外線照射線量に代えて、種々の照射線量としたこと及び抗ＣＰＤ抗体を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物に代えて、ＤＮＡ中の損傷ＤＮＡ内に存在する６−４光産物部分に対する抗体（以下、「抗６−４ＰＰ抗体」という）を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、紫外線照射線量と、ＵＶ−Ｂが照射された各細胞における抗６−４ＰＰ抗体と複合体を形成している標識ストレプトアビジンに基づく蛍光強度との関係を調べた。なお、抗６−４ＰＰ抗体として、市販の抗６−４ＰＰ抗体〔コスモバイオ（株）製、商品名：Anti-(6-4)photoproducts(6-4PPs) 、コード番号：NMDND002〕（以下、「抗６−４ＰＰ抗体１」という）、又は当該抗６−４ＰＰ抗体１と同様の６−４光産物に対する反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマであるclone 64Ｍ-5から製造された抗６−４ＰＰ抗体（以下、「抗６−４ＰＰ抗体２」という）を用いた。以下、抗６−４ＰＰ抗体のうち、前記抗６−４ＰＰ抗体２（２１．５μｇ／ｍＬ）を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物を用いた場合の結果を示す。
【０１６４】
実施例２において、紫外線照射線量と、紫外線が照射された各細胞における抗６−４ＰＰ抗体と複合体を形成している標識ストレプトアビジンに基づく補正後の蛍光強度との関係を調べた結果を示すグラフを図１１に示す。なお、図中、紫外線照射量は、ＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量を基づき、ＵＶ−Ｂ照射線量の値をＵＶ−Ｃ照射線量に換算した値として示す。
【０１６５】
図１１に示された結果から、ＵＶ−Ｂ照射線量に依存して、蛍光強度補正値が増加していることがわかる。また、抗６−４ＰＰ抗体１を用いた場合にも、抗６−４ＰＰ抗体２を用いた場合と同様である。したがって、抗ＣＰＤ抗体に代えて、損傷ＤＮＡに対する他の抗体である抗６−４ＰＰ抗体を用いても、細胞染色試薬を用いて細胞数を近赤外光における蛍光検出により定量し、損傷ＤＮＡの量を補正することにより、１つのプレート上で、小スケールで多数の細胞におけるＤＮＡ修復を解析することができる。また、細胞への紫外線照射の後に、被験物質と接触させて、実施例２のように、損傷ＤＮＡの量を測定することにより、被験物質が損傷ＤＮＡの修復を促進するかどうかを評価することができる。
【０１６６】
（実施例３）
実施例１における正常ヒトテロメレース遺伝子導入細胞（ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞）の培養物又はＸＰＡ群ヒトテロメレース遺伝子導入細胞（ＸＰ３ＯＳ／Ｔ−ｎ細胞）の培養物に代えて、ＮＨＫを用いたこと及び培地〔和光純薬工業（株）製、商品名：Ｄ−ＭＥＭ〕に代えて、培地〔倉敷紡績（株）製、商品名：ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ〕を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、ＵＶ−Ｂの照射線量と、ＵＶ−Ｂが照射された各細胞における抗ＣＰＤ抗体と複合体を形成している標識ストレプトアビジンに基づく蛍光強度との関係を調べる。
【０１６７】
その結果、細胞が、角化細胞であるＮＨＫである場合であっても、本実施例３のように、細胞染色試薬を用いて細胞数を近赤外光における蛍光検出により定量し、損傷ＤＮＡの量を補正した場合には、１つのプレート上で、同時に、小スケールで多数の細胞におけるＤＮＡ中の損傷ＤＮＡの量を定量することができる。
【０１６８】
（実施例４）
正常ヒトテロメレース遺伝子導入細胞（ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞）の培養物を、１×１０4細胞／１００μＬ程度の細胞濃度となるように、培地〔和光純薬工業（株）製、商品名：Ｄ−ＭＥＭ〕で希釈して、細胞浮遊液を得る。また、ＮＨＫの培養物を、１×１０4細胞／１００μＬ程度の細胞濃度となるように、培地〔倉敷紡績（株）製、商品名：ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ〕で希釈して、細胞浮遊液を得る。得られた各細胞浮遊液１００μＬを、９６ウェルプレート〔ナルジェ  ヌンク  インターナショナル（株）製、商品名：９６穴マイクロプレート（平底）〕の各ウェルに入れる。その後、細胞が播種された９６ウェルプレートを、二酸化炭素濃度：５体積％及び３７℃に保たれたＣＯ2インキュベータに入れ、細胞が１００％コンフルエンシーの状態になるように２日間インキュベーションする。
【０１６９】
その後、ＣＯ2インキュベータから、培養後の細胞が入った９６ウェルプレートを取り出し、培養後の細胞に対して、培地表面より２８ｃｍ離れた上方位置から１０Ｊ／ｍ2のＵＶ−Ｃを照射したときにＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量と同量の損傷ＤＮＡを生じさせる相当量のＵＶ−Ｂを照射する。
【０１７０】
つぎに、被験物質１μＬ程度を、ＵＶ−Ｂ照射後の細胞が入った９６ウェルプレートのウェルに添加し、被験物質と細胞とを接触させる。なお、対照として、被験物質が添加されていないウェル、及び細胞が入っていないウェルを設ける。被験物質と接触させた細胞が入った９６ウェルプレートを、二酸化炭素濃度：５体積％及び３７℃に保たれたＣＯ2インキュベータに入れ、２４時間インキュベーションする。
【０１７１】
インキュベーション後の細胞が入った９６ウェルプレートのウェルに、細胞固定液２〔メタノール−アセトン混合溶媒（メタノール／アセトン（体積比）＝１／１）、−２０℃〕１００μＬを添加し、この９６ウェルプレートを室温で１０分間放置することにより、ウェル中の細胞の固定を行なう。つぎに、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄する。なお、対照として、ＵＶ−Ｂ照射直後に、前記細胞固定液２を加えたウェルを設ける。
【０１７２】
前記９６ウェルプレートの各ウェル中に、２Ｍ塩酸水溶液１００μＬを加え、この９６ウェルプレートを３０分間室温で放置することにより、ＤＮＡ変性処理を行なう。
【０１７３】
その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）により前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄する。前記９６ウェルプレートの各ウェルに、ブロッキング溶液（１質量％スキムミルクを含むリン酸緩衝化生理的食塩水）１５０μＬを添加した後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置して、ブロッキングを行なう。
【０１７４】
ブロッキング後の９６ウェルプレートの各ウェルに、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の２００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：８８．５μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕４０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置する。静置後の９６ウェルプレートを洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で洗浄する。洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔インビトロジェン（株）製、商品名：Ｂｉｏｔｉｎ−Ｆ（ａｂ’）2  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）〕を含む二次抗体溶液の２００倍希釈物〔二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：２．０μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕の２００倍希釈物４０μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置する。その後、洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄する。
【０１７５】
標識ストレプトアビジン（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシス社製、商品名：ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を含む三次試薬である標識ストレプトアビジン溶液（標識ストレプトアビジン濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ）に対して、かかる標識ストレプトアビジン溶液における標識ストレプトアビジン濃度が１／２５００倍の濃度となるように、前記細胞染色試薬１を添加し、混合物を得る。つぎに、前記洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、前記混合物４０μＬずつ加え、この９６ウェルプレートを、３７℃で３０分間静置する。静置後の９６ウェルプレートの各ウェル中の混合物の波長６８０ｎｍ及び７８０ｎｍそれぞれでの蛍光強度を測定する。なお、ＵＶ−Ｂが照射された細胞に代えて、ＵＶ−Ｂ非照射の細胞を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ウェル中の混合物の波長６８０ｎｍ及び７８０ｎｍそれぞれでの蛍光強度を測定する。そして、ＵＶ−Ｂを照射した場合の波長７８０ｎｍでの蛍光強度の値からＵＶ−Ｂ非照射の場合の蛍光強度の値を差し引いた値を算出する。また、各ウェルの励起波長６８０ｎｍにおける細胞染色試薬に基づく蛍光強度によって、各ウェルの励起波長７８０ｎｍにおける標識ストレプトアビジンの標識物質に基づく蛍光強度を正規化し、ウェル間の誤差を補正する。その結果、被験物質が、ＤＮＡ修復促進作用を有する場合、被験物質と接触させていない細胞における損傷ＤＮＡの量と比べて、被験物質と接触させた細胞における損傷ＤＮＡの量が少なくなる。
【０１７６】
（比較例１）
以下のように、ＵＶ−Ｂ照射から所定時間経過後の細胞よりＤＮＡを抽出し、酵素標識免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりＤＮＡ中に含まれる損傷ＤＮＡの量を測定することでＤＮＡ修復の動態解析を行なった。
【０１７７】
まず、複数個の直径１０ｃｍの各ディッシュに、それぞれ培地〔和光純薬工業（株）製、商品名：Ｄ−ＭＥＭ〕１０ｍＬに浮遊させた８×１０5細胞の正常ヒトテロメレース遺伝子導入細胞（ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞）を播種した。つぎに、前記ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞を、ＣＯ2インキュベータ中で、二酸化炭素濃度が５体積％で、３７℃の条件下で、２日間培養した。
【０１７８】
その後、培養後のＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞が入った各ディッシュの培地表面から２８ｃｍ離れた上方位置から、前記ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞に対して、プラスチックの蓋をしたまま、１０Ｊ／ｍ2のＵＶ−Ｃを照射したときにＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量と同量の損傷ＤＮＡを生じさせる相当量のＵＶ−Ｂを照射した。つぎに、ＵＶ−Ｂを照射した後のＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞に培地を添加し、ＣＯ2インキュベータ中で、二酸化炭素濃度が５体積％で、３７℃の条件下で培養した。
【０１７９】
ＵＶ−Ｂの照射から２時間、４時間、８時間及び２４時間経過後のそれぞれの時点で、ＣＯ2インキュベータから培養後のＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞が入ったディッシュを１枚ずつ取り出し、ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞を回収した。つぎに、回収後のＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞からＤＮＡを抽出した。
【０１８０】
ＵＶ−Ｂの照射から２時間、４時間、８時間及び２４時間経過後の各ＳｕＳａ／Ｔ−ｎ細胞から抽出したＤＮＡ５０μＬを、９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製、商品名：ポリ塩化ビニル製９６穴マイクロタイタープレート）の各ウェルに入れ、固相に吸着させた。つぎに、各ウェルに、２体積％ウシ血清を含む１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水を１５０μＬずつ入れて、３７℃で９０分間静置してブロッキングを行なった。その後、各ウェルを洗浄液（組成：１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で洗浄した。
【０１８１】
洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、一次抗体として抗ＣＰＤ抗体２を含む一次抗体溶液の１０００倍希釈物〔一次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：１７．７μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕１００μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で９０分間静置した。静置後の９６ウェルプレートを、洗浄液（組成：０．０５体積％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で洗浄した。洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔インビトロジェン（株）製、商品名：Ｂｉｏｔｉｎ−Ｆ（ａｂ’）2  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）〕を含む二次抗体溶液の１０００倍希釈物〔二次抗体濃度（タンパク質濃度基準）：０.４μｇ／１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水１ｍＬ〕１００μＬを入れた後、この９６ウェルプレートを３７℃で９０分間静置した。その後、洗浄液（組成：０．０５体積％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水）で前記９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した。
【０１８２】
洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、ペルオキシダーゼ標識抗ストレプトアビジンを含む三次試薬である標識ストレプトアビジン溶液（ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン濃度：１．２５ｍｇ／ｍＬ）の１００００倍希釈物１００μＬを加え、この９６ウェルプレートを３７℃で９０分間静置した。
【０１８３】
洗浄後の９６ウェルプレートの各ウェルに、発色溶液〔組成：０．０４質量％ｏ−フェニレンジアミン、０．００７体積％過酸化水素、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）〕５０μＬを加え、この９６ウェルプレートを３７℃で３０分間静置し、発色反応を行なった。２Ｍ硫酸水溶液５０μＬを加えて反応を止めた後、９６ウェルプレートの各ウェル中の発色溶液の波長４９０ｎｍでの吸収を測定した。各ＤＮＡについて、３ウェルずつで試験し、測定された３ウェルの吸収の値を平均し、得られた値からＵＶ−Ｂ非照射のＷＩ３８細胞のＤＮＡについての波長４９０ｎｍでの吸収の平均値を差し引いた。つぎに、検量線から傾きを算出し、各修復時間のサンプルの平均値をその傾きから線量当量に換算することで、照射線量との比率から、ＤＮＡ中における残存ＣＰＤの割合を算出した。
【０１８４】
その結果、ＵＶ−Ｂを照射した後のＷＩ３８細胞のＤＮＡ中における残存ＣＰＤの割合は、経時的に減少した。この結果から、ＵＶ−Ｂが照射されたＷＩ３８細胞において、経時的に損傷ＤＮＡが修復されていることがわかる。
【０１８５】
しかしながら、比較例１の方法は、評価対象のパラメータ毎に、直径が１０ｃｍのディッシュでの細胞の培養、細胞の回収、各培養物からのＤＮＡの抽出等を要するため、操作が煩雑であり、時間がかかる。したがって、比較例１の方法は、損傷ＤＮＡの修復に影響を与える物質の評価等を高速で大量に処理するのには、非効率的である。
【０１８６】
（比較例２）
比較例１における抗体溶液として、抗ＣＰＤ抗体を含む抗体溶液に代えて、抗６−４ＰＰ抗体２を含む抗体溶液を用いたことを除き、比較例１と同様の操作を行ない、１０Ｊ／ｍ2のＵＶ−Ｃを照射したときにＤＮＡ中に生じる損傷ＤＮＡの量と同量の損傷ＤＮＡを生じさせる相当量のＵＶ−Ｂを照射したＷＩ３８細胞のＤＮＡ中における残存６−４ＰＰの割合を調べた。
【０１８７】
その結果、ＵＶ−Ｂが照射されたＷＩ３８細胞のＤＮＡ中における残存６−４ＰＰの割合は、経時的に減少した。この結果から、ＵＶ−Ｂが照射されたＷＩ３８細胞において、経時的に損傷ＤＮＡが修復されていることがわかる。しかしながら、比較例２の方法は、比較例１の方法と同様に、操作が煩雑であり、時間がかかるため、損傷ＤＮＡの修復に影響を与える物質の評価等を高速で大量に処理するのには、非効率的である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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