(57)【要約】      （修正有）【課題】抗肥満関連機能評価用オリゴヌクレオチドプローブを提供する。【解決手段】オリゴヌクレオチドプローブは、以下の(a)若しくは(b)のDNAの塩基配列及び／又は該DNAの塩基配列と相補的な塩基配列の一部を含む抗肥満関連機能評価用オリゴヌクレオチドプローブである。(a)特定の配列番号に示される塩基配列からなるDNA(b)上記(a)のDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂質代謝関連遺伝子のmRNAを検出し得る機能を有するDNA。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)若しくは(b)のDNAの塩基配列及び／又は該DNAの塩基配列と相補的な塩基配列の一部を含む抗肥満関連機能評価用オリゴヌクレオチドプローブ。
(a) 配列番号２８，４６，４８，７２，７９，８２，９１，１２１，１５２，１５７，１６８，１７１，１７６，１８６，２０８，２０９，２２６，２２７，２３６，２３８，２４１，２６１，２６２，２８０，３０１，３５５，４３７，４３９，４４１，４４３，４５０に示される塩基配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂質代謝関連遺伝子のmRNAを検出し得る機能を有するDNA
【請求項２】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブが搭載された抗肥満関連機能評価用ＤＮＡマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質代謝関連遺伝子の発現を検出することのできる、抗肥満関連機能評価用オリゴヌクレオチドプローブに関する。また本発明は、当該オリゴヌクレオチドプローブを搭載したDNAマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化により、本邦でも肥満、高血圧、血糖値の異常などの生活習慣病が増大しており、特に糖尿病は患者・潜在患者などを含めると７００万人に及ぶと考えられている。そのため、医療費の増大は大きな社会問題となっている。そこで、食生活に起因する生活習慣病の罹患者を減少させるべく、食生活の積極的改善手法として、特定保健用食品や栄養機能食品の開発研究が行われている。特定保健用食品は、2007年現在で、約800品目で約6800億円の国内市場があり、年々増加傾向にあり、各企業や研究機関は開発研究を盛んに行っている。これらの特定保健用食品は、従来からの食品と違い、抗肥満や抗高血圧などの効能を謳うことが認められており、特定保健用食品を申請する場合には、科学的根拠のあるデータを含めることが必須になる。
【０００３】
科学的根拠のあるデータの例として、安全性試験の他に、ヒト試験や動物実験、in vitro実験により、抗肥満などといった食品の機能を評価することがある。現在の特定保健用食品には、機能別に分類して、抗肥満、抗高血圧、整腸機能、血糖値改善効果などがあり、機能ごとにデータを取得し、食品の機能を明らかにしている。しかしながら、近年の特定保健用食品開発の問題点として、データ取得に長期間を要することが挙げられており、これらのデータ取得を簡便化する技術の開発が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、食品の機能、ここでは特に、抗肥満、抗高血圧、血糖値改善といった機能（本願において抗肥満関連機能ともいう。）を簡便に評価することができる手法を提供することにある。すなわち、脂質代謝に特に関連性が深い遺伝子群を見出し、これらの遺伝子を利用して、物質（食品や薬剤）の抗肥満関連機能を評価する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、脂質代謝に特に関連性が深い遺伝子群として、３１種類の遺伝子を選択することに成功した。さらに本発明者は、これら遺伝子の発現を検出することのできるオリゴヌクレオチドプローブを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の(a)若しくは(b)のDNAの塩基配列及び／又は該DNAの塩基配列と相補的な塩基配列の一部を含む抗肥満関連機能評価用オリゴヌクレオチドプローブである。
(a) 配列番号２８，４６，４８，７２，７９，８２，９１，１２１，１５２，１５７，１６８，１７１，１７６，１８６，２０８，２０９，２２６，２２７，２３６，２３８，２４１，２６１，２６２，２８０，３０１，３５５，４３７，４３９，４４１，４４３，４５０に示される塩基配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂質代謝関連遺伝子のmRNAを検出し得る機能を有するDNA 
さらに、本発明は、上記オリゴヌクレオチドプローブが搭載された抗肥満関連機能評価用ＤＮＡマイクロアレイである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、脂質代謝に特に関連性が深い３１種類の遺伝子群の発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを提供することができる。また、本発明によれば、当該オリゴヌクレオチドプローブを搭載したDNAマイクロアレイを提供することもできる。これにより、物質（食品や薬剤）の抗肥満、抗高血圧、血糖値改善といった機能を簡便に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】中空繊維束（中空繊維配列体）製造用の配列固定治具を示す概略図である。
【図２】マウス白色脂肪細胞組織に多く発現している３１遺伝子についての、ＤＮＡマイクロアレイによる解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【０００９】
１．本発明の概要
脂質代謝に特に関連性が深い遺伝子群であって、物質（食品や薬剤）の抗肥満、抗高血圧、血糖値改善といった機能（抗肥満関連機能）の評価に用いることができる遺伝子群を見出すため、脂質代謝、糖代謝、タンパク・アミノ酸代謝関連、毒性評価、抱合、排出及び免疫関連遺伝子を４７５遺伝子選択し、これらの遺伝子の発現を特異的に検出するキャプチャープローブを搭載したDNAマイクロアレイ（貫通孔型オリゴヌクレオチドマイクロアレイ「Genopal（登録商標）」、三菱レイヨン社製）を作製した。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールを含めた全ての遺伝子に対するキャプチャープローブは、鎖長65塩基の合成オリゴヌクレオチドで、融解温度（Tm）はほぼ同一であり、標的遺伝子のmRNAの3’末端側より1,500塩基以内の領域に特異的に結合するように、専用ソフトウェアを用いて設計したものである。設計したオリゴヌクレオチドプローブの配列を表１に示した。
【００１０】
【表１】
2010273643.tif 000002
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【００１１】
マウス胎生由来組織及びマウス白色脂肪細胞組織から、それぞれTotal RNAを抽出し、上述したDNAマイクロアレイを用いて白色脂肪細胞組織特有の遺伝子発現プロファイルについて調べた。胎生由来組織から白色脂肪細胞組織に分化する過程において特徴的に発現する遺伝子群は、脂質代謝に特に関連性が深い因子であり、高脂肪食の摂取等で亢進する遺伝子と考えられる。特に白色脂肪細胞組織は、生体の成長過程において分化誘導されやすい組織であり、これらの組織に特徴的に発現している遺伝子群は肥満等に深く関連していると考えられる。DNAマイクロアレイのデータは、ネガティブコントロールの値を引いた後、Gapdh遺伝子（NM_008084）の値を基準としてデータを補正した。さらに、白色脂肪細胞組織において、胎生由来組織よりも１０倍以上の蛍光強度が得られている遺伝子群について、３１遺伝子を選択するに至った。これらの３１遺伝子は、脂質代謝に特に関連性が深く、抗肥満、抗高血圧、血糖値改善に関連した遺伝子である。すなわち、これらの脂質代謝関連遺伝子は、抗肥満、抗高血圧、血糖値改善といった食品成分及び素材等の機能の評価について使用可能である。
【００１２】
２．抗肥満関連機能評価用オリゴヌクレオチドプローブ
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、上記、脂質代謝に特に関連性が深い３１遺伝子の発現を検出し、物質（食品や薬剤）の抗肥満、抗高血圧、血糖値改善といった機能を評価することができるオリゴヌクレオチドプローブである。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、以下の(a)若しくは(b)のDNAの塩基配列及び／又は該DNAの塩基配列と相補的な塩基配列の一部を含む抗肥満関連機能評価用オリゴヌクレオチドプローブである。
(a) 配列番号２８，４６，４８，７２，７９，８２，９１，１２１，１５２，１５７，１６８，１７１，１７６，１８６，２０８，２０９，２２６，２２７，２３６，２３８，２４１，２６１，２６２，２８０，３０１，３５５，４３７，４３９，４４１，４４３，４５０に示される塩基配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂質代謝関連遺伝子のmRNAを検出し得る機能を有するDNA
【００１３】
上記(a)のDNAは、下記表２に列挙した配列番号２８，４６，４８，７２，７９，８２，９１，１２１，１５２，１５７，１６８，１７１，１７６，１８６，２０８，２０９，２２６，２２７，２３６，２３８，２４１，２６１，２６２，２８０，３０１，３５５，４３７，４３９，４４１，４４３，４５０のうちのいずれかに示される塩基配列からなるDNAである。表２では、前述した３１種類の遺伝子それぞれについて、配列番号、遺伝子名、及びGenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ から取得可能）のAccession number（アクセッション番号）が示される。
【００１４】
【表２】
2010273643.tif 000010
【００１５】
上記(b)のDNAは、上記(a)のDNA若しくはそれと相補的な塩基配列からなるDNA、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、cDNAライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のcDNAライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等を適宜参照することができる。
【００１６】
ハイブリダイゼーション法を実施における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション時の条件であって、バッファーの塩濃度が97.5〜390mM、温度が37〜80℃、好ましくは塩濃度が97.5〜200mM、温度が50〜70℃の条件を意味する。具体的には、例えば195mMで65℃等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件も考慮し、上記(b)のDNAを得るための条件を適宜設定することができる。
ハイブリダイズするDNAとしては、上記(a)のDNAの塩基配列に対して少なくとも40％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは60％、さらに好ましくは80％以上、さらにより好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上である。
なお、上記(b)のDNAは、脂質代謝関連遺伝子のmRNAを検出し得る機能を有するDNAであることが重要である。当該機能は、上述のハイブリダイズするDNAとしての物性により発揮され得るものである。
【００１７】
ここで、塩基配列の一部とは、当該塩基配列の全体を除く任意の領域の塩基配列を意味するものであり、塩基長は、特に限定はされないが、例えば、３０塩基以上、好ましくは４０塩基以上、さらに好ましくは５０塩基以上、さらにより好ましくは６０塩基以上、特に好ましくは６２塩基以上である。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、前述した脂質代謝に特に関連性が深い３１種類の遺伝子と、特異的に結合する（ハイブリダイズする）ものであることが好ましい。このように特異的に結合することにより、脂質代謝関連遺伝子のmRNAの検出ができ、物質（食品や薬剤）の抗肥満、抗高血圧、血糖値改善といった機能を簡便に評価することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブの取得方法は、特に限定はされないが、公知の各種DNA合成機を用いて得る方法等が挙げられる。
【００１８】
３．DNAマイクロアレイ
本発明のDNAマイクロアレイ（DNAチップ）は、上述した本発明のオリゴヌクレオチドプローブ（キャプチャープローブ）が搭載されたものである。
本発明のDNAマイクロアレイは、支持体上に、本発明のオリゴヌクレオチドプローブが固定されたものであれば、限定はされない。例えば、前述した脂質代謝関連遺伝子（３１種類）に由来する各々のmRNAとハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ支持体に固定しておくことにより、複数の脂質代謝関連遺伝子の発現の検出や定量を同時に行うことができる。
DNAマイクロアレイについて、その支持体の形態は、限定はされず、平板、棒状、ビーズ等のいずれの形態も使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔をもって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Science 270, 467-470 (1995)等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Science 251, 767-773 (1991)等参照）。他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、所定のプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるＤＮＡマイクロアレイが好ましく例示できる。このＤＮＡマイクロアレイは、貫通孔基板に核酸を固定化したタイプのものと説明することができ、いわゆる「貫通孔型マイクロアレイ」とも言われる（特許第3510882号公報等を参照、図１）。
支持体へのプローブの固定方法は、限定はされず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定することもできる。
【００１９】
以下、中空繊維による貫通孔型マイクロアレイについて、詳細に説明する。このマイクロアレイは、例えば、下記(i)〜(iv)の工程を経て作製することができる。
(i) 複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列して配列体を製造する工程
(ii) 前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程
(iii) オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程
(iv) 中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程
中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開2004-163211号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。
【００２０】
中空繊維は、その長手方向の長さが同一となるように３次元に配列される（工程(i)）。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平11-108928号公報を参照）や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後２枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、２枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法（特開2001-133453号公報を参照）などが挙げられる。
【００２１】
製造された配列体はその配列が乱れないように包埋される（工程(ii)）。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂及びエポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法のほか、繊維どうしを熱融着により接着する方法等が好ましく挙げられる。
包埋された配列体には、各中空繊維の中空部に、オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液（ゲル形成溶液）を充填し、中空部内で重合反応を行う（工程(iii)）。これにより、各中空繊維の中空部に、オリゴヌクレオチドプローブが固定されたゲル状物を保持させることができる。
【００２２】
ゲル前駆体重合性溶液とは、ゲル形成重合性モノマー等の反応性物質を含有する溶液であって、該モノマー等を重合、架橋させることにより該溶液がゲル状物となることが可能な溶液をいう。そのようなモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドン、メチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。この場合溶液には重合開始剤等が含まれていてもよい。
中空繊維内にオリゴヌクレオチドプローブを固定した後、中空繊維の長手方向と交差する方向（好ましくは直交する方向）で、ブロック体を切断して薄片化する（工程(iv)）。このようにして得られた薄片は、DNAマイクロアレイとして使用できる。当該アレイの厚みは、0.01mm〜1mm程度であることが好ましい。ブロック体の切断は、例えば、ミクロトーム及びレーザー等により行うことができる。
当該貫通孔型マイクロアレイとしては、例えば、三菱レイヨン社製のDNAマイクロアレイ（GenopalTM）等が好ましく挙げられる。
【００２３】
４．抗肥満関連機能評価
本発明は、前述した本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及び／又はDNAマイクロアレイを用いて脂質代謝関連遺伝子のmRNAを検出し、以って物質（食品や薬剤）の抗肥満、抗高血圧、血糖値改善といった機能を簡便に評価する方法を提供するものである。
mRNAの検出は、具体的には、本発明のDNAマイクロアレイ等に、脂質代謝関連遺伝子のmRNAを含む被験試料を接触させて、本発明のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした脂質代謝関連遺伝子のmRNAを検出する。
mRNA被験試料の調製は、限定はされないが、例えば、実験動物由来の臓器、組織由来、もしくは培養細胞由来及び被験者から採取した末梢血から末梢血由来単核球細胞（PBMC）を分離しの分画からmRNAを含むハイブリダイゼーション溶液を調製することにより行う。
【００２４】
なお、接触とは、具体的には、上記ハイブリダイゼーション溶液中の核酸をDNAマイクロアレイに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブに結合（ハイブリダイズ）させることを言う。
ハイブリダイゼーション溶液とDNAマイクロアレイとの接触、すなわちハイブリダイゼーション反応は、当該溶液中の核酸が当該アレイに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件（緩衝液の種類、pH、温度など）を適宜設定して行うことができる。なお、ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション時の条件であって、バッファーの塩濃度が97.5〜390mM、温度が37〜80℃、好ましくは塩濃度が97.5〜200mM、温度が50〜70℃の条件を意味する。具体的には、例えば195mMで65℃等の条件を挙げることができる。
【００２５】
洗浄後は、オリゴヌクレオチドプローブに結合した核酸の標識を検出できる装置により、スポットごとに検出強度を測定する。蛍光標識化された核酸を結合させた場合、又は核酸を結合後に蛍光標識化した場合は、各種蛍光検出装置（例えば、三菱レイヨン社製の冷却CCD式蛍光検出装置など）を使用して蛍光強度を測定することができる。得られた検出結果（蛍光強度）は、公知の処理方法により、ターゲットとなる各種遺伝子の発現量の有意性を評価することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
１．ＤＮＡマイクロアレイの製造
実験に使用するＤＮＡマイクロアレイとして、三菱レイヨン社製ＤＮＡマイクロアレイ（Genopal(R) ）を選択した。ＤＮＡマイクロアレイには、表１に記載した配列のオリゴヌクレオチドプローブを搭載した。
【００２７】
２．被験試料の調製
本実施例においては、脂質代謝遺伝子が多く発現している組織として、マウス白色脂肪細胞組織を用いた。対照の組織としては、未分化の胎生由来組織を用いた。
それぞれの群由来のTotal RNAを用いてBiotin標識aRNAを調製し、これを前記製造したDNAマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせる被験試料とした。Biotin標識aRNAの調製はMessage Amp II Biotin Kit (Ambion社製)を用いて、所定の方法に従って実施した。
【００２８】
３．DNAマイクロアレイによるアッセイ
ハイブリダイゼーションバッファー溶液 (0.12M TNT溶液)を以下のように調製した。
1M Tris-HCl        120ml
1M NaCl            120ml
0.5%Tween20 100ml    
蒸留水で           1000ｍｌにメスアップ
Biotin標識aRNAを、ハイブリダイゼーションバッファー溶液 (0.12M TNT溶液)に15μg／150μｌに懸濁させ、ＤＮＡマイクロアレイを使用してハイブリダイゼーション反応を行った。
ハイブリダイゼーション反応は、65℃で16時間行った。反応後のＤＮＡマイクロアレイは、洗浄バッファー溶液（0.12M TNT溶液）を用いて65℃で20分間の洗浄を２回行い、最後に2 x SSCで10分間洗浄した。
次に、オリゴヌクレオチドプローブに結合した核酸の蛍光標識を行った。蛍光標識は、あらかじめ蒸留水によって1mg／mlに溶解したCy5-Streptavdin(GE Healthcare社製)を1/500に蒸留水で希釈した溶液5mlに、DNAマイクロアレイを30分間浸漬させることで行った。浸漬後のDNAマイクロアレイは5mlの0.12M TNT溶液によって5分間、4回洗浄に供した。
検出は、三菱レイヨン社製検出器によりＤＮＡマイクロアレイの各スポットの蛍光強度を測定することで行った。
【００２９】
４．解析結果
測定した蛍光強度は、Gapdh遺伝子（NM_008084）の蛍光強度を基準として補正した。対照群である未分化の胎生由来組織と試験群であるマウス白色脂肪細胞組織とで、蛍光強度の比較を行った。その結果、白色脂肪細胞で顕著な発現亢進が得られた（対照群と比較して10倍以上）のは表２に示す31遺伝子であり、脂質代謝に特に関連性が深い遺伝子であることがわかった（図２）。
【符号の説明】
【００３０】
１１  孔
２１  多孔板
３１  中空繊維
４１  板状物
【図１】
2010273643.tif 000011
【図２】
2010273643.tif 000012
【配列表】
2010273643000001.app