(57)【要約】【課題】様々な中枢及び末梢神経系障害を治療するための方法を提供すること。【解決手段】１つ又は複数のスピロ化合物を投与することを含む、中枢及び末梢神経系の機能不全に関する疾患を治療するための方法を提供する。このような方法において有用な薬剤組成物、このような薬剤組成物の調製において使用するための化合物、このような方法の実施において有用な化合物を調製するための方法、及び幾つかの新規なこのような化合物自体も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２６７Ｂ）であって、以下の特性を持つ結晶体：
Ｐ２１２１２１（Ｎｏ１６）ａ＝１０．３９４（１０）（α＝９０°）、ｂ＝２０．１３３（２）（β＝９０°）、ｃ＝５．８５６（４）（γ＝９０°）Å、Ｔ＝１１０Ｋ。
【請求項２】
さらに以下の特性を持つ請求項１記載の結晶体：
体積＝１２２４．２（９）Å３、Ｚ＝４、Ｆｗ＝２０２．３２、計算密度Ｄｃ＝１．０９２Ｍｇ／ｍ３、吸収係数μ＝０．２３２ｍｍ−１。
【請求項３】
（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２６７Ｂ）の結晶体であって、以下の配置を持つ結晶体：
【化１】
2010184946.tif 000091
【請求項４】
請求項１記載の結晶体、及びそのための薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含み；散剤、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、座薬又は複数の分散顆粒である、薬剤組成物。
【請求項５】
単位剤形である、請求項４記載の薬剤組成物。
【請求項６】
単位剤形当たり０．５ｍｇと１００ｍｇの間のＡＦ２６７Ｂを含む、請求項５に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
散剤、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、又は複数の分散顆粒である、請求項４記載の薬剤組成物。
【請求項８】
請求項２記載の結晶体、及びそのための薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含み；散剤、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、座薬又は複数の分散顆粒である、薬剤組成物。
【請求項９】
単位剤形である、請求項８記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
単位剤形当たり０．５ｍｇと１００ｍｇの間のＡＦ２６７Ｂを含む、請求項９に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
散剤、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、又は複数の分散顆粒である、請求項８記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
請求項３記載の結晶体、及びそのための薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含み；散剤、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、座薬又は複数の分散顆粒である、薬剤組成物。
【請求項１３】
単位剤形である、請求項１２記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
単位剤形当たり０．５ｍｇと１００ｍｇの間のＡＦ２６７Ｂを含む、請求項１３に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
散剤、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、又は複数の分散顆粒である、請求項１２記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２６７Ｂ）一水和物の結晶体。
【請求項１７】
請求項１６記載の結晶体、及びそのための薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含み；散剤、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、座薬又は複数の分散顆粒である、薬剤組成物。
【請求項１８】
単位剤形である、請求項１７記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
単位剤形当たり０．５ｍｇと１００ｍｇの間のＡＦ２６７Ｂを含む、請求項１８に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
散剤、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、又は複数の分散顆粒である、請求項１９記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２６７Ｂ）の結晶性一水和物。
【請求項２２】
請求項２１記載の結晶性一水和物、及びそのための薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含み；散剤、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、座薬又は複数の分散顆粒である、薬剤組成物。
【請求項２３】
単位剤形である、請求項２２記載の薬剤組成物。
【請求項２４】
単位剤形当たり０．５ｍｇと１００ｍｇの間のＡＦ２６７Ｂを含む、請求項２３に記載の薬剤組成物。
【請求項２５】
散剤、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、又は複数の分散顆粒である、請求項２１記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な中枢及び末梢神経系障害を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
参照によってその内容が本明細書に組み込まれている以下の先行技術文献は、関連があると考えられる：
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第４，８５５，２９０号。
【特許文献２】米国特許第４，９８１，８５８号。
【特許文献３】米国特許第４，９００，８３０号。
【特許文献４】米国特許第４，８７６，２６０号。
【特許文献５】米国特許第５，０５３，４１２号。
【特許文献６】米国特許第５，４０７，９３８号。
【特許文献７】米国特許第６，２７７，８７４号。
【特許文献８】米国特許第６，２７４，６０３号。
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｆｉｓｈｅｒ及びＢａｒａｋ．「薬剤のニュース及び展望（Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  ＆  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ）」７：４５３〜６４、１９９４；Ｒｅｖｉｅｗ：Ｆｉｓｈｅｒ．Ｊａｐ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８４：１０１〜１１２、２０００。
【非特許文献２】Ｗｏｌｏｚｉｎ他、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．５７：１４３９〜４３、２０００。
【非特許文献３】Ｓｐａｒｋｓ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  １８７：１４２〜１４４、１９９５。
【非特許文献４】Ｒｅｆｏｌｏ他、Ｓｏｃ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ａｂｓｔ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ、２００１。
【非特許文献５】Ｒｅｆｏｌｏ他、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ  ８：８９０〜８９９、２００１。
【非特許文献６】Ｒｅｖｉｅｗ：Ｃｅｄａｚｏ−Ｍｉｎｇｕｅｚ及びＣｏｗｂｕｒｎ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ５：２５４〜２６６、２００１。
【非特許文献７】Ｂａｌｅｓ他、ＰＮＡＳ  ９６：１５２３３、１９９９；Ｂｕｔｔｉｎｉ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ９７：２０７、２０００。
【非特許文献８】Ｈａｒｔｍａｎｎ他、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １７０：３２６、２００１；Ｍｕｄｈｅｒ及びＬｏｖｅｓｔｏｎｅ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５：２２〜６、２００２。
【非特許文献９】Ｍｕｄｈｅｒ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１：４９８７〜９５、２００１。
【非特許文献１０】Ｚｈａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：６９８〜７０２、１９９８。
【非特許文献１１】Ｄｅ  Ｆｅｒｒａｒｉ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  ３３：１〜１２、２０００。
【非特許文献１２】Ｇａｒｒｉｄｏ他、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １６：１９８２〜４、２００２；Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌｅｃ  Ｍｅｄ．８：１２６〜３２、２００２。
【非特許文献１３】Ｂｈａｔ他、「神経シグナル（Ｎｅｕｒｏｓｉｇｎａｌｓ）」１１：２５１〜６１、２００２。
【非特許文献１４】Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ他、「神経関連報告書（ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ）」８：１５１９〜１５２２、１９９７。
【非特許文献１５】Ｒｏｂｅｒｔｓ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔ、５７：４１９〜４２５、１９９４。
【非特許文献１６】Ｈａｖｌｉｋ他、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ５１４０、５８７、１９９８。
【非特許文献１７】Ｍａｙｅｕｘ他、Ｎｅｕｒｏｌ、４５：５５６〜５５７、１９９５。
【非特許文献１８】Ｎｉｃｏｌｌ他、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、７７７：２７１〜２７５、１９９６。
【非特許文献１９】Ｃａｐｒｕｓｏ及びＬｅｖｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ  Ｃｌｉｎ１０：８７９〜８９３、１９９２。
【非特許文献２０】Ｄｉｘｏｎ他、Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ７０：１２５〜１３１、１９９５。
【非特許文献２１】Ｐｉｋｅ及びＨａｍｍ．Ｅｘｐｔｌ  Ｎｅｕｒｏｌ、１４７：５５〜６５、１９９７。
【非特許文献２２】Ｐｉｋｅ及びＨａｍｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｅｈａｖ、５７：７８５〜７９１、１９９７。
【非特許文献２３】Ｐｉｋｅ及びＨａｍｍ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１４：８９７〜９０５、１９９７。
【非特許文献２４】Ｉｒｗｉｎ、Ｓ．ＰＳＹＣＨＯＰＨＡＲＭ  １３：２２２〜２５７、１９６８。
【非特許文献２５】Ｂｅａｃｈ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２８３：９〜１２、２０００。
【非特許文献２６】Ｂｅａｃｈ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ９０５：２２０〜２２３、２００１。
【非特許文献２７】Ｐｆｅｉｆｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２  ２９８：１３７９。
【非特許文献２８】Ｎｉｃｏｌｌ他、「自然医学（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２００３年３月。
【非特許文献２９】Ｓｐａｒｋｓ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  １９９５；１８７：１４２〜１４４。
【非特許文献３０】Ｒｅｆｏｌｏ他、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ  ８：８９０〜８９９、２００１。
【非特許文献３１】Ｒｅｆｏｌｏ他、Ｓｏｃ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ａｂｓｔ  ２００１、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ。
【非特許文献３２】Ｃｅｄａｚｏ−Ｍｉｎｇｕｅｚ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１０５：６５１〜６６１、２００１。
【非特許文献３３】Ｓｐａｒｋｓ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  １９９５；１８７：１４２〜１４４。
【非特許文献３４】Ｄｅａｎ他、Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １９９６；１：５４〜８。
【非特許文献３５】Ｄｅａｎ他、Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２００２；７：１０８３〜９１。
【非特許文献３６】Ｒａｅｄｌｅｒ他、Ａｍ  Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １６０：１１８、２００３。
【非特許文献３７】Ｂｏｒｄａ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２；１６８：３６６７〜７４。
【非特許文献３８】Ｆｅｌｄｅｒ他、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２００１  ８：２６０５〜１３。
【非特許文献３９】Ｂｙｍａｓｔｅｒ他、「現在の薬剤標的−ＣＮＳ及び神経障害（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ−ＣＮＳ  ＆  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」２００２；１：１４７〜１６４。
【非特許文献４０】Ｓｕｌｌｉｖａｎ他、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２０００；１７７：１７７〜８。
【非特許文献４１】Ｇｏｕｌｄ及びＭａｎｊｉ．「神経科学者（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ）」２００２；８：４９７〜５１１。
【非特許文献４２】Ｃｏｔｔｅｒ他、「神経関連報告書（ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ）」９：１３７９、１９９８。
【非特許文献４３】Ｃａｓａｎｏｖａ  ＭＦ他、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）２００２  １０３：３１３〜２０。
【非特許文献４４】Ａｕｌｄ他、Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２００２、６８：２０９〜４５。
【非特許文献４５】Ｐｏｅｇｇｅｌｅｒ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ８１５：３８２−３８８、１９９９。
【非特許文献４６】Ｃｈｙａｎ他、Ｊ  Ｂｉｏｌｏｇ  Ｃｈｅｍ  ２７４：２１９３７〜２１９４２、１９９９。
【非特許文献４７】Ｂｏｎｓ他、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓ（１９９５）１：８３〜８７。
【非特許文献４８】Ｍａｚｚｏｔｉ他（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｅｕｒｏｐｅ  ９６  Ｓｙｍｐ、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ｓｔｏｃｋｐｏｒｔ  ＵＫ、ｐ１０３、１９９６。
【非特許文献４９】Ｋｒｉｓｅ他、Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：３０９４〜３１００（１９９９）。
【非特許文献５０】Ｆａｓｓｂｅｄｅｒ他、ＰＮＡＳ、９８：５８５６、２００１。
【非特許文献５１】Ｓｐａｒｋｓ他、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒａｌ  １９９４；１２６：８８〜９４。
【非特許文献５２】Ｓｐａｒｋｓ  Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉｓ  １９９７：７：２５５〜２６６
【非特許文献５３】Ｂｅａｃｈ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２８３：９〜１２、２０００。
【非特許文献５４】Ｂｅａｃｈ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．９０５：２２０〜２２３、２００１。
【非特許文献５５】Ｋｌａｕｓｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５：７７９〜７８６、１９８７。
【非特許文献５６】Ｌｉｐｍａｎ他、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：１２９〜１７６、１９９２。
【非特許文献５７】Ｒａｐｐｏｐｏｒｔ及びＦｅｒｒｅｉｒａ  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７４：１２５〜１３３（２０００）。
【非特許文献５８】Ｅｋｉｎｃｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０３２２〜３０３２７（１９９９）。
【非特許文献５９】Ｓａｄｏｔ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６６：８７７〜８８０、１９９６。
【非特許文献６０】Ｐｏｉｒｉｅｒ他、「神経科学（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」５５：８１〜９０（１９９３）。
【非特許文献６１】Ｃｅｄａｚｏ−Ｍｉｎｕｅｚ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.  １０５：６５１〜６６１、２００１。
【非特許文献６２】Ｇｕｒｗｉｔｚ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６７、２１、１９９３。
【非特許文献６３】Ｆｉｓｈｅｒ他、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ  ６２：１８９、２００２。
【非特許文献６４】Ｃｈｅｎ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１５：２３１〜２３７、１９９８。
【非特許文献６５】Ｄａｎｔｚｅｒ他、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．９１：３６３〜３６８、１９８７。
【非特許文献６６】Ｐｅｒｉｏ他、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．９７：２６２〜２６８．１９８９。
【非特許文献６７】Ｐｅｒｉｏ他、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．９７：２６２〜２６８．１９８９。
【非特許文献６８】Ｆｉｓｈｅｒ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｔｌ．Ｔｈｅｒａｐ．，２５７：３９２、１９９１。
【非特許文献６９】Ｓｉｍｏｎｓ他、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、４２、３７５〜３８３、１９８８。
【非特許文献７０】Ｖｉｎｃｅｎｔ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、５９７、２６４〜２６８、１９９２。
【非特許文献７１】Ｓｃｈｗａｒｚ他、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，４０、１３３〜１４３、１９９７。
【非特許文献７２】Ｖｏｌｌ他、Ｓｔｒｏｋｅ、２０：１７００〜１７０６、１９８９。
【非特許文献７３】Ｂｙｍａｓｔｅｒ他、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２６７：１６〜２４、１９９３。
【非特許文献７４】Ｒｏｌｄａｎ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２３０：９３〜９６、１９９７。
【非特許文献７５】Ｋｉｍｕｒａ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８３４：６〜１２、１９９９。
【非特許文献７６】Ｇａｒｒｉｄｏ  ＪＬ他、（ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２００２；１６：１９８２。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施形態に従い、
式（Ｉ）の化合物であって：
【化１】
2010184946.tif 000002
上式でＣが、環Ａとａ、ｂ、ｄ及びｅを含む環によって共有されるスピロ炭素原子を表し；
Ａが
【化２】
2010184946.tif 000003
からなる群から選択され、ＲがＨ、Ｃ１〜Ｃ８直鎖又は分岐鎖アルキル、又は−ＣＨ２−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２から選択され；
ａが−Ｏ−又はＳ−であり；
ｂが−ＣＲ１Ｒ２−又は−Ｃ（Ｒ１）＝であり；
ｄが＝Ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−及び＝Ｎ（Ｒ３）＝Ｏからなる群から選択され；
ｅが−ＣＨ２−、−ＣＨＲ４−、−ＮＨ−、−ＮＲ５−、−Ｎ（ＳＯ２Ｒ６）−及び−Ｎ（Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６）−からなる群から選択され；
Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４が、Ｈ、１個、２個又は３個のフェニルにより場合により置換されたＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルキル、Ｃ２〜６アルケニル及びＣ２〜６アルキニルからそれぞれ独立に選択され；
Ｒ５が、Ｈ、１個、２個又は３個のフェニルにより場合により置換されたＣ１〜６アルキル、フェニル、ヘテロアリールにより場合により置換されたＣ１〜６アルコキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルから独立に選択され；且つ
Ｒ６が、１〜６個のハロゲン原子によりそれぞれ場合により置換された、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルキルチオ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、及びＣ３〜７シクロアルキル、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、又はＣＦ３基で置換されたヒドロキシ−Ｃ１〜６−アルキル、アリール、１個、２個又は３個のアリール基により置換されたＣ１〜６アルキル、イソインドリル、３−ピリジニル、３−ピペリジニル、ベンズイミダゾリル、チエニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、ベンゾフラニル、キノリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、プリニル、カルバゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、イソオキサゾリル、ピロリル、ピラゾリル、キナゾリニル、ピリダジニル、ピラジニル、シンノリニル、フタラジニル、キノキサリニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、及びプテリジニルから独立に選択される化合物；
【０００６】
又はこれらの鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、幾何異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩であって、
ただし、Ａが
【化３】
2010184946.tif 000004
であり、Ｒが−ＣＨ３であり、ａがＳであり、ｂが−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−であり、且つｄが−Ｃ（＝Ｏ）−であるとき、したがってｅが−ＮＨ−ではなく（ＡＦ２６７又はその鏡像異性体）、さらにＡが
【化４】
2010184946.tif 000005
であり、Ｒが−ＣＨ３であり、ａがＳであり、ｂが−Ｃ（ＣＨ３）＝であり、且つｄが＝Ｎ−であるとき、したがってｅが−ＣＨ２−ではない（ＡＦ１５０（Ｓ））である化合物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の一実施形態では、Ｒ５は、インドール、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、フリル、ピリジル、ピリミジル、チエニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、ベンゾフラニル、キノリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、プリニル、カルバゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、イソオキサゾリル、ピロリル、ピラゾリル、キナゾリニル、ピリダジニル、ピラジニル、シンノリニル、フタラジニル、キノキサリニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、プテリジニル、５−アザシチジニル、５−アザウラシリル、トリアゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、ピロロピリミジニル、及びピラゾロピリミジニルからなる群から選択されるヘテロアリールである。
【０００８】
本発明の一実施形態では、化合物は、式Ｉの化合物の二量体であって、ｅが−ＮＲ５−であり、２つの式Ｉ部分が、ｎが１〜６である−（ＣＨ２）ｎ−及び−（ＣＨ２Ｏ）ｎ−からなる群から選択される共通の基Ｒ５を共有する二量体、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩である。
【０００９】
本発明の一実施形態では、化合物は、Ｎ−［（２，８−ジメチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−アミン］−Ｎ−オキシド；Ｎ−［（２−エチル−８−メチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−アミン］−Ｎ−オキシド；Ｎ−［（２−メチル−８−フェニル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−アミン］−Ｎ−オキシド；チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン；４−（２，４−ジメトキシベンジル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２８６）；８−メチル−４−ピロリジン−１−イルメチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２８７）；２−（１−ヒドロキシ−エチル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９８）；（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−８−オキシ−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９９）；４−（２，４−ジメトキシ−ベンジル）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２８８）；（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−オキソ−１λ４−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ３００）；２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−チオン（ＡＦ５１０）；（Ｓ）−２−エチル−４−（４−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ７００）；２−エチル−４−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ７０３）；２−エチル−４−（３−１Ｈ−インドール−３−イル−プロピオニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ７０４）；（Ｓ）−エチル−４−（３−１Ｈ−インドール−３−イル−プロピオニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ７０４Ｂ）；（Ｒ）−エチル−４−（３−１Ｈ−インドール−３−イル−プロピオニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ７０４Ａ）；及び２−メチル−８−メチル−ｄ３−１−チア−３，８−ジアザ−スピロ［４．５］デス−２−エン（ＡＦ４０２）、
或いはその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、幾何異性体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される。
【００１０】
本発明の一実施形態では、化合物は、ＡＦ２９２又は薬剤として許容可能なその塩である。
【００１１】
本発明の一実施形態では、化合物は、Ａが
【化５】
2010184946.tif 000006
であり、ＲがＨであり、ａが−Ｓ−であり、ｂが−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−であり、ｄが−Ｃ（＝Ｏ）−であり、且つｅが−ＮＨ−である、即ち２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ５０４）である化合物、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、幾何異性体、ラセミ体、互変異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩である。
【００１２】
本発明の一実施形態では、化合物は、（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９２）、又はそのＨＣｌ塩である。
【００１３】
本発明の一実施形態では、化合物は、（Ｒ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９１）である。
【００１４】
本発明の一実施形態では、本発明の化合物は、Ａが
【化６】
2010184946.tif 000007
であり、Ｒが−ＣＨ３であり、ａが−Ｏ−であり、ｄが＝Ｎ（Ｒ３）＝Ｏである化合物、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、幾何異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩である。本発明の一実施形態では、ｂが−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、Ｒ３が−ＣＨ３である、即ちＮ−［（２，８−ジメチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−メチル−アミン］−Ｎ−オキシド（ＡＦ６００）である。本発明の一実施形態では、ｂが−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、Ｒ３がベンジルである、即ちＮ−［（２，８−ジメチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−ベンジル−アミン］−Ｎ−オキシド（ＡＦ６０４）である。本発明の一実施形態では、ｂが−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、Ｒ３がイソプロピルである、即ちＮ−［（２，８−ジメチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−イソプロピル−アミン］−Ｎ−オキシド（ＡＦ６０５）である。本発明の一実施形態では、ｂが−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−であり、Ｒ３が−ＣＨ３である、即ちＮ−［（２−エチル−８−メチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−メチル−アミン］−Ｎ−オキシド（ＡＦ６０１）である。本発明の一実施形態では、ｂが−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−であり、Ｒ３がフェニルである、即ちＮ−［（２−メチル−８−フェニル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−メチル−アミン］−Ｎ−オキシド（ＡＦ６０２）である。
【００１５】
本発明の一実施形態では、化合物は、Ａが
【化７】
2010184946.tif 000008
であり、Ｒが−ＣＨ３であり、ａが−Ｏ−であり、ｄが＝Ｎ（Ｒ３）＝Ｏである化合物、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、幾何異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩である。本発明の一実施形態では、ｂが−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、Ｒ３がメチルである、即ちジヒドロ−５’−メチルスピロ［１−アザバイシクロ［２．２．２］オクタン−３，５’−（４’Ｈ）−３’−イリデン−メチルアミン］−Ｎ−オキシド（ＡＦ６０３）である。
【００１６】
本発明の一実施形態では、化合物は、Ａが
【化８】
2010184946.tif 000009
であり、Ｒがメチルであり、ａが−Ｓ−であり、ｂが−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−であり、ｄが−Ｃ（＝Ｏ）−であり、ｅが−ＮＲ５−であり、且つＲ５が−（ＣＨ２）３−インドリル及び−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）３−インドリルから選択される、即ち２−エチル−４−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ７０３）又は２−エチル−４−（３−１Ｈ−インドール−３−イル−プロピオニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ７０４）である化合物、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、幾何異性体、ラセミ体、互変異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩である。本発明の一実施形態では、化合物は、（Ｓ）−エチル−４−（３−１Ｈ−インドール−３−イル−プロピオニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ７０４Ｂ）である。
【００１７】
本発明の一実施形態に従い、薬剤組成物の調製における、式（Ｉ）の化合物、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、幾何異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩の使用も提供する。本発明の一実施形態では、化合物は、ＡＦ２９２、又はＡＦ２９２のプロドラッグ、或いはＡＦ２９２又はＡＦ２９２のプロドラッグの薬剤として許容可能な塩である。本発明の一実施形態では、プロドラッグはＡＦ２６７Ｂ、又は薬剤として許容可能なその塩である。
【００１８】
本発明の一実施形態に従い、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、幾何異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩、及び薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬剤組成物も提供する。本発明の一実施形態では、化合物は、ＡＦ２９２、又はＡＦ２９２のプロドラッグ、或いはそれらの薬剤として許容可能な塩である。本発明の一実施形態では、プロドラッグはＡＦ２６７Ｂ、又は薬剤として許容可能なその塩である。
【００１９】
本発明の一実施形態に従い、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激する方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７及びＡＦ１５０（Ｓ）からなる群から選択される化合物、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、幾何異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩を、必要性のある患者に有効量投与することを含む方法も提供する。本発明の一実施形態では、化合物は、ＡＦ２９２、又はＡＦ２９２のプロドラッグ、或いはそれらの薬剤として許容可能な塩である。本発明の一実施形態では、プロドラッグはＡＦ２６７Ｂ、又は薬剤として許容可能なその塩である。
【００２０】
本発明の一実施形態に従い、式（Ｉ）の化合物であって、Ａが
【化９】
2010184946.tif 000010
であり、Ｒが−ＣＨ３であり、ａが−Ｏ−であり、ｄが＝Ｎ（Ｒ３）−Ｏである化合物、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、幾何異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩も、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激し、且つ前記Ｍ１  ｍＡＣｈＲ付近での酸化を遅延させるための薬剤組成物の調製において提供する。
【００２１】
本発明の一実施形態に従い、式（Ｉ）の化合物であって、Ａが
【化１０】
2010184946.tif 000011
であり、Ｒが−ＣＨ３であり、ａが−Ｏ−であり、ｄが＝Ｎ（Ｒ３）＝Ｏである化合物、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、幾何異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩のＭ１  ｍＡＣｈＲアゴニストとしての有効量、及び少なくとも１つの薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬剤組成物も提供する。
【００２２】
本発明の一実施形態に従い、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激するための方法であって、式（Ｉ）の化合物であって、Ａが
【化１１】
2010184946.tif 000012
であり、Ｒが−ＣＨ３であり、ａが−Ｏ−であり、ｄが＝Ｎ（Ｒ３）＝Ｏである化合物、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、幾何異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩を、必要性のある患者に有効量投与することを含む方法も提供する。
【００２３】
本発明の一実施形態に従い、化合物（Ｓ）−２−エチル−４−（４−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ７００）も提供する。
【００２４】
本発明の一実施形態に従い、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激し、且つαセクレターゼを活性化させるための薬剤組成物の調製における、化合物ＡＦ７００、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩の使用も提供する。
【００２５】
本発明の一実施形態に従い、化合物ＡＦ７００、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩のＭ１  ｍＡＣｈＲ刺激及びαセクレターゼ活性化に有効な量、及び少なくとも１つの薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬剤組成物も提供する。
【００２６】
本発明の一実施形態に従い、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激し、且つαセクレターゼを活性化させるための方法であって、化合物ＡＦ７００、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩を、必要性のある患者に有効量投与することを含む方法も提供する。
【００２７】
本発明の一実施形態に従い、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激し、且つβセクレターゼに拮抗するための薬剤組成物の調製における、化合物ＡＦ７００、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩の使用も提供する。
【００２８】
本発明の一実施形態に従い、化合物ＡＦ７００、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、幾何異性体、ラセミ体、互変異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩のＭ１  ｍＡＣｈＲアゴニスト作用及びβセクレターゼアンタゴニスト作用に有効な量、及び少なくとも１つの薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬剤組成物も提供する。
【００２９】
本発明の一実施形態に従い、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激し、且つβセクレターゼに拮抗するための方法であって、化合物ＡＦ７００、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、幾何異性体、ラセミ体、互変異性体、二量体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩を、必要性のある患者に有効量投与することを含む方法も提供する。
【００３０】
本発明の一実施形態に従い、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激し、且つγセクレターゼに拮抗するための薬剤組成物の調製における、化合物ＡＦ７００、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩の使用も提供する。
【００３１】
本発明の一実施形態に従い、化合物ＡＦ７００、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩のＭ１  ｍＡＣｈＲアゴニスト作用及びγセクレターゼアンタゴニスト作用に有効な量、及び少なくとも１つの薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬剤組成物も提供する。
【００３２】
本発明の一実施形態に従い、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激し、且つγセクレターゼに拮抗するための方法であって、化合物ＡＦ７００、又はその鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、互変異性体、代謝生成物、又は薬剤として許容可能な塩を、必要性のある患者に有効量投与することを含む方法も提供する。
【００３３】
本発明の一実施形態に従い、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激し、且つＭ３  ｍＡＣｈＲに拮抗するための薬剤組成物の調製における、化合物（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９２）、或いはその代謝生成物又は薬剤として許容可能な塩の使用も提供する。
【００３４】
本発明の一実施形態に従い、化合物（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９２）、或いはその代謝生成物又は薬剤として許容可能な塩のＭ１  ｍＡＣｈＲアゴニスト作用及びＭ３  ｍＡＣｈＲアンタゴニスト作用に有効な量、及び少なくとも１つの薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬剤組成物も提供する。
【００３５】
本発明の一実施形態に従い、化合物（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９２）、或いはその代謝生成物又は薬剤として許容可能な塩を含む、ヒト又は動物の血液も提供する。本発明の一実施形態では、血液はヒト又は動物の体内にある。本発明の一実施形態では、血液はヒト又は動物の体内にない。
【００３６】
本発明の一実施形態に従い、化合物（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９２）、或いはその代謝生成物又は薬剤として許容可能な塩を含む、ヒト又は動物の血漿も提供する。本発明の一実施形態では、血液はヒト又は動物の体内にある。本発明の一実施形態では、血液はヒト又は動物の体内にない。
【００３７】
本発明の一実施形態に従い、ヒト又は動物の体内にあるときは常に、請求項１に記載の化合物（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９２）、或いはその代謝生成物又は薬剤として許容可能な塩も提供する。
【００３８】
本発明の一実施形態に従い、化合物（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９２）のプロドラッグとして使用するために、化合物（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２６７Ｂ）も提供する。
【００３９】
本発明の一実施形態に従い、化合物（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９２）のプロドラッグとしての、化合物（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２６７Ｂ）の使用も提供する。
【００４０】
本発明の一実施形態に従い、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激し、且つＭ３  ｍＡＣｈＲに拮抗するための薬剤組成物の調製における、化合物（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２６７Ｂ）と、（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９２）の併用も提供する。
【００４１】
本発明の一実施形態に従い、化合物ＡＦ２６７ＢとＡＦ２９２の組合せのＭ１  ｍＡＣｈＲアゴニスト作用及びＭ３  ｍＡＣｈＲアンタゴニスト作用の量、及び少なくとも１つの薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬剤組成物も提供する。
【００４２】
本発明の一実施形態に従い、患者のＭ１  ｍＡＣｈＲを刺激し、且つＭ３  ｍＡＣｈＲに拮抗するための方法であって、化合物ＡＦ２６７ＢとＡＦ２９２の組合せを、患者に有効量投与することを含む方法も提供する。
【００４３】
本発明の一実施形態では、ＡＦ２６７ＢとＡＦ２９２を一緒に投与する。本発明の一実施形態では、ＡＦ２６７ＢとＡＦ２９２を別々に投与する。本発明の一実施形態では、ＡＦ２６７ＢとＡＦ２９２を異なる回数投与する。本発明の一実施形態では、ＡＦ２６７ＢとＡＦ２９２を同じ回数投与する。
【００４４】
本発明の一実施形態に従い、他のｍＡＣｈＲ亜型の刺激による有害な副作用を最小限にしながら、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激するための薬剤組成物の調製における、（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９２）である第１の化合物と、そのラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体及び薬剤として許容可能な塩を含めた、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）からなる群から選択される第２の化合物との併用も提供する。
【００４５】
本発明の一実施形態に従い、ＡＦ２９２である第１の化合物と、そのラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、幾何異性体、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩を含めた、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）からなる群から選択される第２の化合物との組合せのＭ１  ｍＡＣｈＲアゴニスト作用の量、及び少なくとも１つの薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬剤組成物も提供する。
【００４６】
本発明の一実施形態に従い、患者の他のｍＡＣｈＲ亜型を刺激することによる有害な副作用を最小限にしながら、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激する方法であって、ＡＦ２９２である第１の化合物と、そのラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体及び薬剤として許容可能な塩を含めた、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）からなる群から選択される第２の化合物との組合せを、患者に有効量投与することを含む方法も提供する。本発明の一実施形態では、第１の化合物と第２の化合物を一緒に投与する。本発明の一実施形態では、第１の化合物と第２の化合物を別々に投与する。本発明の一実施形態では、第１の化合物と第２の化合物を異なる回数投与する。本発明の一実施形態では、第１の化合物と第２の化合物を同じ回数投与する。
【００４７】
本発明の一実施形態に従い、ＡＦ２６７ＢとＡＦ２９２で同時に患者のＭ１  ｍＡＣｈＲを刺激するための方法であって、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激するのに有効な量のＡＦ２６７ＢとＡＦ２９２の混合物をｉｎ  ｖｉｖｏで形成するために、有効な量のＡＦ２６７Ｂを患者に投与することを含む方法も提供する。
【００４８】
本発明の一実施形態に従い、ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２及びインドール−３−プロピオン酸の群の少なくとも１つをプロドラッグとして使用するための、ラセミ形態の２−エチル−４−（３−１Ｈ−インドール−３−イル−プロピオニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ７０４）、又はそのＳ鏡像異性体（ＡＦ７０４Ｂ）も提供する。
【００４９】
本発明の一実施形態に従い、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを刺激し、Ｍ１  ｍＡＣｈＲ付近での酸化を遅延させ、且つ神経保護活性を与えるための薬剤組成物の調製における、ラセミ形態の２−エチル−４−（３−１Ｈ−インドール−３−イル−プロピオニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ７０４）、又はそのＳ鏡像異性体（ＡＦ７０４Ｂ）の使用も提供する。
【００５０】
本発明の一実施形態に従い、化合物２−エチル−４−（３−１Ｈ−インドール−３−イル−プロピオニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オンのラセミ形態（ＡＦ７０４）、又はそのＳ鏡像異性体（ＡＦ７０４Ｂ）のＭ１  ｍＡＣｈＲ刺激、酸化遅延、及び神経保護に有効な量、及び薬剤として許容可能なそのための担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬剤組成物も提供する。
【００５１】
本発明の一実施形態に従い、２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２６７）を調製するための方法であって、４−エチルピペリドンを２−メルカプト酪酸及びアンモニアと反応させることを含む方法も提供する。本発明の一実施形態では、その方法は、キラル分離によって鏡像異性体ＡＦ２６７Ａ（Ｒ鏡像異性体）及びＡＦ２６７Ｂ（Ｓ鏡像異性体）を得ることをさらに含む。
【００５２】
本発明の一実施形態に従い、ＡＦ２６７Ａをラセミ化すること、及びラセミ混合物からＡＦ２６７Ｂを単離することを含む、ＡＦ２６７Ｂを調製するための方法も提供する。本発明の一実施形態では、その単離は、キラル分離によってラセミ混合物からＡＦ２６７Ｂを分離することを含む。
【００５３】
本発明の一実施形態に従い、（Ｒ）−２−メルカプト酪酸を酢酸アンモニウム及び１−メチル−４−ピペリドンと接触させることを含む、ＡＦ２６７Ｂを合成するための方法も提供する。本発明の一実施形態では、（Ｒ）−２−メルカプト酪酸を、（Ｒ）−２−ベンゾイルチオ酪酸と水酸化アンモニウムを接触させることによって得る。本発明の一実施形態では、（Ｒ）−２−ベンゾイルチオ酪酸を、（Ｒ）−２−ブロモ酪酸とチオ安息香酸セシウムに接触させることによって得る。本発明の一実施形態では、（Ｒ）−２−ブロモ酪酸を、Ｒ立体配座を有する２−アミノ酪酸と、亜硝酸ナトリウム、臭化カリウム及び臭化水素酸を接触させることによって得る。
【００５４】
本発明の一実施形態に従い、１４Ｃで標識したＡＦ２６７Ｂを調製するための方法であって、ＡＦ２８７と１４Ｃ標識した臭化エチルを反応させること、ＡＦ２８７の４位で窒素原子を脱保護すること、及びキラルクロマトグラフィーによって１４Ｃ標識したＡＦ２６７Ｂを単離することを含む方法も提供する。
【００５５】
本発明の一実施形態に従い、（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９２）と（Ｒ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９１）の混合物を調製するための方法であって、ＡＦ２６７と脱メチル化剤を反応させることを含む方法も提供する。
【００５６】
本発明の一実施形態に従い、以下のデータ：Ｐ２１２１２１（Ｎｏ１６）ａ＝１０．３９４（（１０）（α＝９０°）、ｂ＝２０．１３３（２）（β＝９０°）、ｃ＝５．８５６（４）（γ＝９０°）Å、Ｔ＝１１０Ｋによって特徴付けられる、（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２６７Ｂ）の結晶形態も提供する。本発明の一実施形態では、結晶形態は、以下のデータ：体積＝１２２４．２（９）Å３、Ｚ＝４、Ｆｗ＝２０２．３２、計算密度Ｄｃ＝１．０９２Ｍｇ／ｍ３、吸収係数μ＝０．２３２ｍｍ−１によってさらに特徴付けられる。
【００５７】
本発明の一実施形態に従い、実施例２の構造１に示す立体配座を有する、（ＡＦ２６７Ｂ）の結晶形態も提供する。
【００５８】
本発明の一実施形態に従い、２，８−ジメチル−１−チア−３，８−ジアザ−スピロ［４．５］デス−２−エン［ＡＦ１５０（Ｓ）］を調製するための方法であって、１−メチル−４−Ｎ−チオアセチルアミノ−１，２，３．６−テトラ−ヒドロピリジンを環化することを含む方法も提供する。本発明の一実施形態では、環化をリン酸の存在下で行う。本発明の一実施形態では、１−メチル−４−Ｎ−チオアセチルアミノ−１，２，３．６−テトラ−ヒドロピリジンを、１−メチル−４−Ｎ−チオアセチルアミノメチルピリジニウムを水素化ホウ素ナトリウムで還元することによって得る。本発明の一実施形態では、１−メチル−４−Ｎ−チオアセチルアミノメチルピリジニウムを、４−（アセタミノメチル）−１−メチル−ピリジニウムヨウ化物をＬａｗｅｓｓｏｎ試薬と反応させることによって得る。
【００５９】
本発明の一実施形態に従い、パラフィン油中にＡＦ１５０（Ｓ）を含む製剤も提供する。
【００６０】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、βアミロイドペプチド（Ａβ）の放出又は合成を阻害するための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、Ａβの細胞内の放出又は合成を阻害するのに有効な量、哺乳動物細胞、組織又は生物に投与することを含む方法も提供する。
【００６１】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、βアミロイドペプチド（Ａβ）の放出又は合成を阻害するための薬剤組成物の調製における、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物の使用も提供する。
【００６２】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、分泌形態の非アミロイド原性アミロイド前駆体タンパク質（α−ＡＰＰ）のレベルを上昇させるための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、分泌形態の非アミロイド原性アミロイド前駆体タンパク質（α−ＡＰＰ）のレベルを上昇させるのに有効な量、哺乳動物細胞、組織又は生物に投与することを含む方法も提供する。
【００６３】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、分泌形態の非アミロイド原性アミロイド前駆体タンパク質（α−ＡＰＰ）のレベルを上昇させるための薬剤組成物の調製における、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物の使用も提供する。
【００６４】
本発明の一実施形態に従い、脳内に高レベルのＡβを有する哺乳動物の脳内のＡβペプチドのレベルを低下させるための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、前記哺乳動物の脳内のＡβのレベルを低下させるのに有効な量、哺乳動物に投与することを含む方法も提供する。本発明の一実施形態では、脳内の高レベルのＡβは、高コレステロール血症の結果である。本発明の一実施形態では、脳内の高レベルのＡβは、コリン作動性機能不全の結果である。
【００６５】
本発明の一実施形態に従い、脳内に高レベルのＡβを有する哺乳動物の脳内のＡβペプチドのレベルを低下させるための薬剤組成物の調製における、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物の使用も提供する。
【００６６】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、アポリポタンパク質（ＡｐｏＥ）の合成又は放出を阻害するための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、前記哺乳動物細胞、組織又は生物のＡｐｏＥの放出又は合成を阻害するのに有効な量、哺乳動物細胞、組織又は生物に投与することを含む方法も提供する。
【００６７】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、ＡｐｏＥの放出又は合成を阻害するための薬剤組成物の調製における、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物の使用も提供する。本発明の一実施形態では、ＡｐｏＥはＡｐｏＥ４である。
【００６８】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、アポリポタンパク質（ＡｐｏＥ）のレベルを低下させるための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、前記哺乳動物細胞、組織又は生物のＡｐｏＥのレベルを低下させるのに有効な量、哺乳動物細胞、組織又は生物に投与することを含む方法も提供する。
【００６９】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、ＡｐｏＥのレベルを低下させるための薬剤組成物の調製における、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物の使用も提供する。本発明の一実施形態では、ＡｐｏＥはＡｐｏＥ４である。
【００７０】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、ｔａｕ高リン酸化を低下させるための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、ｔａｕ高リン酸化を抑制するのに有効な量、哺乳動物細胞、組織又は生物に投与することを含む方法も提供する。本発明の一実施形態では、ｔａｕ高リン酸化は、Ａβ誘導型のｔａｕ高リン酸化である。
【００７１】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、ｔａｕ高リン酸化を低下させるための薬剤組成物の調製における、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物の使用も提供する。
【００７２】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、対らせん形成を低下させるための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、ｔａｕ高リン酸化を抑制するのに有効な量、哺乳動物細胞、組織又は生物に投与することを含む方法も提供する。
【００７３】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞中の、対らせん形成を低下させるための薬剤組成物の調製における、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物の使用も提供する。
【００７４】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、Ｗｎｔシグナル経路を活性化させるための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、Ｗｎｔ異常を抑制するのに有効な量、哺乳動物細胞、組織又は生物に投与することを含む方法も提供する。
【００７５】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、Ｗｎｔシグナル経路を活性化させるための薬剤組成物の調製における、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物の使用も提供する。
【００７６】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物細胞、組織又は生物中の、ＧＳＫ３β介在作用を阻害するための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、ＧＳＫ３β介在作用を阻害するのに有効な量、哺乳動物細胞、組織又は生物に投与することを含む方法も提供する。本発明の一実施形態では、ＧＳＫ３β介在作用は、ｔａｕ高リン酸化、アポトーシス、β−カテニン分解、及びＷｎｔ標的遺伝子の減少からなる群から選択される。
【００７７】
本発明の一実施形態に従い、哺乳動物中のＧＳＫ３β介在作用を阻害するための薬剤組成物の調製における、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物の使用も提供する。本発明の一実施形態では、Ａβペプチドによって誘導される障害、又はＷｎｔシグナルに対する酸化ストレス欠如、アポトーシス、又は細胞の生存能力に応じて、本発明の方法を使用する。
【００７８】
本発明の一実施形態に従い、細胞中の内因性増殖因子、即ちニューロトロフィンの活性を増大させるための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、哺乳動物細胞、組織又は生物に一定量投与することを含む方法も提供し、その化合物は、神経栄養剤として単独で有効であり、前記ニューロトロフィンと相乗的に作用する。
【００７９】
本発明の一実施形態に従い、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物の使用も提供し、その化合物は、ニューロトロフィンの活性を増大させるための薬剤組成物の調製において、神経栄養剤として単独で有効であり、内因性増殖因子、即ちニューロトロフィンと相乗的に作用する。
【００８０】
本発明の一実施形態に従い、βアミロイドペプチド（Ａβ）の放出又は合成を阻害するため、分泌形態の非アミロイド原性アミロイド前駆体タンパク質（α−ＡＰＰ）のレベルを上昇させるため、脳内に高レベルのＡβを有する哺乳動物の脳内のＡβペプチドのレベルを低下させるため、ＡｐｏＥの放出又は合成を阻害するため、ＡｐｏＥのレベルを低下させるため、ｔａｕ高リン酸化を低下させるため、対らせん形成を低下させるため、Ｗｎｔシグナル経路を活性化させるため、β−カテニンを増大させるため、ＧＳＫ３β介在作用を阻害するため、或いはニューロトロフィンの活性を増大させるための薬剤組成物であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物、及び少なくとも１つの薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む薬剤組成物も提供する。
【００８１】
本発明の一実施形態に従い、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそれらのラセミ体、鏡像異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される少なくとも１つの化合物、及びコリンエステラーゼ阻害剤、ニコチン様アゴニスト、コリン作動性前駆体及びコリン作動性エンハンサー、向知性薬、末梢抗ムスカリン様薬剤、Ｍ２ムスカリン様アンタゴニスト、Ｍ４アンタゴニスト、ベンゾジアピン逆アゴニスト、パーキンソン病（ＰＤ）又はうつ病の治療において使用される抗うつ薬、三環系抗うつ薬又は抗ムスカリン様薬剤、向精神薬及び抗住血吸虫薬、グルタミン酸アンタゴニスト、及び調節物質、ＮＭＤＡアンタゴニスト、ＡＭＰＡアゴニスト、アセチル−Ｌ−カルニチン、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、ペプチド及び増殖因子、コレステロール低下剤、抗酸化剤、ＧＳＫ−３β阻害剤、Ｗｎｔ−リガンド、β−又はγ−セクレターゼ阻害剤、βアミロイド分解剤、βアミロイド抗凝集剤、キレート剤、βアミロイドに対する免疫療法化合物、アミロイドと結合する化合物、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２阻害剤、非ステロイド抗炎症剤、エストロゲン因子、エストロゲン受容体調節物質、ステロイド神経保護物質、及びスピン捕捉薬剤からなる群から選択される、少なくとも１つの他の薬理活性化合物を含む、薬剤組成物も提供する。
【００８２】
本発明の一実施形態では、化合物は、ＡＦ２９２、又はＡＦ２９２のプロドラッグ、又は薬剤として許容可能なその塩である。
【００８３】
本発明の一実施形態に従い、脳アミロイド血管障害を治療又は低下させるための方法であって、（ａ）ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、及びＡＦ７０４Ｂからなる群から選択される化合物、薬剤として許容可能なそれらの塩、或いはこのような化合物又は塩の混合物を有効量、並びに（ｂ）βアミロイドに対する免疫療法化合物、及びアミロイドと結合する化合物からなる群から選択される化合物を有効量、必要性のある患者に投与することを含む方法も提供する。
【００８４】
本発明の一実施形態に従い、（ａ）ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、及びＡＦ７０４Ｂからなる群から選択される化合物、薬剤として許容可能なそれらの塩、或いはこのような化合物又は塩の混合物を有効量と、（ｂ）βアミロイドに対する免疫療法化合物、及びアミロイドと結合する化合物からなる群から選択される化合物と、並びに薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を有効量含む、薬剤組成物も提供する。
【００８５】
本発明の一実施形態に従い、脳アミロイド血管障害を治療又は低下させるための薬剤組成物の調製における、（ａ）ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、及びＡＦ７０４Ｂからなる群から選択される化合物、薬剤として許容可能なそれらの塩、或いはこのような化合物又は塩の混合物と、（ｂ）βアミロイドに対する免疫療法化合物、及びアミロイドと結合する化合物から選択される化合物との併用も提供する。
【００８６】
本発明の一実施形態に従い、アルツハイマー型の老人性痴呆症、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体型痴呆症、混合型アルツハイマー病及びパーキンソン病、多発梗塞性痴呆（ＭＩＤ）、前方側頭部痴呆、血管性痴呆、脳卒中／虚血、脳卒中／虚血／頭部損傷と組み合わさったＭＩＤ、混合型ＭＩＤ及びＡＤ、ヒト頭部損傷、年齢関連記憶障害、軽度認識障害（ＭＣＩ）、ＡＤに進行するＭＣＩ、認知機能障害（忘却、急性錯乱状態、注意欠陥障害、焦点及び集中力障害を含む）、幻覚−妄想状態、感情及び注意力障害、睡眠障害、術後譫妄、三環系抗うつ薬の悪効果、精神分裂病及びパーキンソン病の治療において使用する幾つかの薬剤の悪効果、口内乾燥症、名称失語症、記憶損失及び／又は錯乱、精神病、精神分裂病、ＡＤと結び付いた精神分裂病、後期発症型精神分裂病、パラフレニー、精神分裂病様障害、不安、双極性感情症、そう病、気分安定状態、幾つかのグリオーマを除去した後の認知障害、遅発性ジスキネジア、酸化療法中の酸化ストレス、失語症、脳炎後記憶喪失症、ＡＩＤＳによる痴呆、ろうそう、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性疲労症候群、及び結合組織炎を含めた自己免疫疾患における記憶障害、異型うつ病又は精神分裂病における記憶障害、痛み、リウマチ、関節炎、及び末端障害、眼球乾燥、膣乾燥、皮膚乾燥、免疫機能不全、神経障害及び、過食症及び食欲不振を含めた食物摂取の調節障害、肥満、先天性オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、オリーブ橋小脳萎縮、アルコール禁断症状、禁断症状及び補充療法を含む物質の乱用、ハンチントン舞踏病、進行性核上麻痺、ピック病、フリードライヒ失調症、ジル−デ−ラ−ツレット病、ダウン症候群、緑内障、老眼、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢、便秘、胃酸分泌及び潰瘍などの、胃腸の運動性及び機能の機能障害を含む自律神経障害、切迫尿失禁、喘息、ＣＯＰＤからなる群からの、コリン作動性機能障害に付随する哺乳動物の疾患、又はコリン作動性機能の不均衡が存在する疾患、或いはアセチルコリン受容体の活性障害を有する疾患を治療するための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそのラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、前記疾患の１つを治療するのに有効な量、このような治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む方法も提供する。本発明の一実施形態では、前記化合物は、ＡＦ２９２、又はＡＦ２９２のプロドラッグ、又は薬剤として許容可能なその塩である。
【００８７】
本発明の一実施形態に従い、以下の１つ又は複数：脳、神経系、心臓血管系、免疫系、ニューロクリン系、胃腸系、又は内分泌及び外分泌腺、眼、角膜、肺、前立腺、又はコリン作動性機能がｍＡＣｈＲ亜型によって介在される他の器官の機能不全であって、前記機能不全が脳アミロイド介在疾患、グリコーゲン合成キナーゼ（ＧＳＫ３β）介在疾患、ｔａｕタンパク質高リン酸化介在障害、機能不全又は疾患、ＣＮＳ及びＰＮＳ高コレステロール血症及び／又は高脂血症介在障害、機能不全又は疾患、Ｗｎｔ介在シグナル異常、神経形成の障害、高血糖症、糖尿病、内因性増殖因子介在疾患、又は他の危険因子の組合せ、又はアポリポタンパク質Ｅに関する病状、又はアルツハイマー型の老人性痴呆症、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤを発症する危険がある患者におけるＡＤ症状の発症の遅延、を含めた、コリン作動性機能不全が関与している攪乱状態、レビー小体型痴呆症、脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）、脳アミロイドーシス、前方側頭部痴呆、血管性痴呆、高脂血症、高コレステロール血症、多発梗塞性痴呆（ＭＩＤ）、脳卒中虚血、脳卒中／虚血／頭部損傷と組み合わさったＭＩＤ、混合型ＭＩＤ及びアルツハイマー病、ヒト頭部損傷、年齢関連記憶障害、軽度認識障害（ＭＣＩ）、ＡＤに進行するＭＣＩ、双極性感情症、そう病、精神分裂病、非感情性精神分裂病、パラフレニー、免疫機能不全、神経障害及び、過食症及び食欲不振を含めた食物摂取の調節障害、体重調節、肥満、炎症に関するものである機能不全による、中枢又は末梢神経系の病状を予防又は治療するための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそのラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、前記疾患の少なくとも１つを治療するのに有効な量、このような治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む方法も提供する。本発明の一実施形態では、化合物は、ＡＦ２９２、又はＡＦ２９２のプロドラッグ、又は薬剤として許容可能なその塩である。
【００８８】
本発明の一実施形態に従い、ＡＤ、ＭＣＩ、レビー小体型痴呆症、前方側頭部痴呆、血管性痴呆、頭部損傷の記憶障害、ＡＩＤＳによる痴呆を有する患者を治療して、前記患者の状態のさらなる悪化を抑制するための方法であって、式（Ｉ）の化合物、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）、又はそのラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体及び薬剤として許容可能な塩からなる群から選択される、１種の化合物又は複数の化合物の混合物を、前記患者に有効量投与することを含む方法も提供する。
【００８９】
本発明の一実施形態では、化合物は、ＡＦ２９２、又はＡＦ２９２のプロドラッグ、又は薬剤として許容可能なその塩である。
【００９０】
本発明の一実施形態に従い、精神分裂病を治療するための方法であって、ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、薬剤として許容可能なこれらの塩、並びにＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、又はそれらの塩の混合物を有効量、必要性のある患者に投与することを含む方法も提供する。
【００９１】
本発明の一実施形態に従い、精神分裂病を治療するための薬剤組成物の調製における、ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、薬剤として許容可能なこれらの塩、或いはＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、又は薬剤として許容可能なこれらの塩の混合物の使用も提供する。
【００９２】
本発明の一実施形態に従い、精神分裂病を治療するための薬剤組成物であって、ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、薬剤として許容可能なこれらの塩、或いはＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、又は薬剤として許容可能なこれらの塩の混合物、及び少なくとも１つの薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む薬剤組成物も提供する。
【００９３】
本発明の一実施形態に従い、精神分裂病の症状を改善するための方法であって、ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、薬剤として許容可能なこれらの塩からなる群から選択される化合物、並びにＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、又は薬剤として許容可能なこれらの塩の混合物を有効量、必要性のある患者に投与することを含む方法も提供する。
【００９４】
本発明の一実施形態に従い、精神分裂病の症状を改善するための薬剤組成物の調製における、ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、薬剤として許容可能なこれらの塩、或いはＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、又は薬剤として許容可能なこれらの塩の混合物の使用も提供する。
【００９５】
本発明の一実施形態に従い、精神分裂病の症状を改善するための薬剤組成物であって、ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２から選択される化合物、薬剤として許容可能なこれらの塩、及びＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、又は薬剤として許容可能なこれらの塩の混合物、及び少なくとも１つの薬剤として許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む薬剤組成物も提供する。
【００９６】
本特許出願中では、
「アルキル」は、直鎖又は分岐鎖の１〜８個の炭素原子、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピルなどを意味する。
【００９７】
「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシなどを意味する。
【００９８】
「アルケニル」は、鎖中に少なくとも１個のＣ−Ｃ二重結合を有する、直鎖又は分岐鎖の２〜８個の炭素原子を意味する。
【００９９】
「アルキニル」は、鎖中に少なくとも１個のＣ−Ｃ三重結合を有する、直鎖又は分岐鎖の２〜８個の炭素原子を意味する。
【０１００】
「アルキルチオ」は、−Ｓ−アルキル、例えばメチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオなどを意味する。
【０１０１】
「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素原子を含む、単環式及び二環式環構造を指す。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、デカリニル、及びノルボルニルである。
【０１０２】
「アリール」は、５〜１２個の炭素原子を含む、単環式及び二環式芳香族環構造を指す。アリールの例は、フェニル、ナフチル及びベンジルである。
【０１０３】
「複素環」は、４〜１２個の炭素原子、及び少なくとも１個の窒素、酸素又はイオウ原子を含む、単環式及び二環式環構造を指す。
【０１０４】
「ヘテロアリール」は、４〜１２個の炭素原子、及び少なくとも１個の窒素、酸素又はイオウ原子を含む、単環式及び二環式芳香族環構造を指す。複素環及びヘテロアリールの例は、インドリル、イソインドリル、３−ピリジニル、３−ピペリジニル、ベンズイミダゾリル、チエニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、ベンゾフラニル、キノリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、プリニル、カルバゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、イソオキサゾリル、ピロリル、ピラゾリル、キナゾリニル、ピリダジニル、ピラジニル、シンノリニル、フタラジニル、キノキサリニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、及びプテリジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、フリル、ピリジル、ピリミジル、５−アザシチジニル、５−アザウラシリル、トリアゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、ピロロピリミジニル、及びピラゾロ−ピリミジニルである。
【０１０５】
「ハロゲン原子」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素の１つであってよい。
【０１０６】
他に示さない限り、以下の略語を使用する：
Ａβ                                            β−アミロイド
ＡＡ                                            アラキドン酸
ＡＡＭＩ                                        年齢関連記憶障害
ＡＣｈ                                          アセチルコリン
ＡｃｈＥ−Ｉｓ                                  アセチルコリンエステラーゼ阻害剤
ＡＤ                                            アルツハイマー病
ＡＧＰ                                          ヒトα糖タンパク質
ＡＧＰ                                          α糖タンパク質
ＡｐｏＥ                                        アポリポタンパク質
ＡＰＰ                                          アミロイド前駆体タンパク質
ＡＵＣ                                          曲線下面積
ＢＤＮＦ                                        脳由来増殖因子
ｂＦＧＦ                                        塩基性線維芽細胞増殖因子
ＣＡＡ                                          脳アミロイド血管障害
ＣＣｈ                                          カルバコール
ＣＤＸ                                          メチル−β−シクロデキストリン
ＣＥ                                            衝突エネルギー
ＣＨＩ                                          非開放性頭部損傷
ＣＮＳ                                          中枢神経系
ＣＳＦ                                          脳脊髄液
ＤＡＰＩ                                        ４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール
ＤＣＣ                                          ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＤＷ                                          ２回蒸留水
ＤＭＦ                                          Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＡＰ                                        ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＰＵ                                        Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−プロピル尿素
ＥＣＧ                                          心電図
ＥＧＦ                                          上皮増殖因子
ＦＡＣＳ                                        蛍光活性化細胞選別器
ＦＣＳ                                          ウシ胎児血清
ＧＣ                                            ガスクロマトグラフィー
ＧＳＫ３β                                      グリコーゲン合成キナーゼ
ＨＥＲＧ                                        ｈｕｍａｎ  ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ
ＨＰＬＣ                                        高速液体クロマトグラフィー
ＨＳ                                            ウマ血清
ＨＳＡ                                          ヒト血清アルブミン
ｉ．ｃ．ｖ．，ｉｃｖ                            脳室内
ｉ．ｐ．，ｉｐ                                  腹腔内
ｉ．ｖ．，ｉｖ                                  静脈内
ＬＢＤ                                          レビー小体型疾患
ＬＣ                                            液体クロマトグラフィー
ＬＤＡ                                          ジイソプロピルアミン
Ｌｉ                                            リチウム
Ｍ１  ｍＡＣｈＲ                                １ｍＡＣｈＲ
ｍＡＣｈＲ                                      ｍＡＣｈＲ
ｍＣＰＢＡ                                      ｍ−クロロ過安息香酸
ＭＣＩ                                          軽度認識障害
ＭＩＤ                                          多発梗塞性痴呆
ＭＲＳＡ                                        ｍＡＣｈＲ選択的アゴニスト、及び強力な抗酸化剤
ＭＳ                                            質量分析
ＭＴＢＥ                                        メチル−ｔ−ブチルエーテル
ＭＴＴ                                          ３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム臭化物
ＭＷＭ                                          モリスの水迷路
ｎｂｍ                                          大型細胞基底核
ＮＦＴ                                          神経原線維濃縮体
ＮＧＦ                                          神経増殖因子
ＮＭＤＡ                                        Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸
ＮＭＲ                                          核磁気共鳴
ＮＯＡＥＬ                                      無毒性量
ＮＳＳ                                          神経重度値
ＯＸＯ−Ｍ                                      オキソトレモリン−Ｍ
ＰＡ                                            受動的回避
ＰＢＳ                                          リン酸緩衝塩水
ＰＤ                                            パーキンソン病
ＰＨＦ                                          対らせんフィラメント
ＰＩ                                            ホスホイノシチド
ＰＫＣ                                          タンパク質キナーゼＣ
ＰＭＳＦ                                        フェニルメチルスルホニルフロリド
ＰＮＳ                                          末梢神経系
ｐｏ                                            経口的に、経口
ＰＳ−１                                        プレセニリン−１
ＰＺ                                            ピレンゼペリン
ＱＮＢ                                          キヌクリジニルベンジレート
ＲＥＬ                                          逃避潜時比
ＲＩＤ                                          調査期間比
ＲＯＳ                                          反応性酸素種
ＲＰＬ                                          経路長比
ＲＳＡ                                          受容体選択的抗酸化剤
ｓ．ｃ．，ｓｃ                                  皮下
ＳＤＡＴ                                        アルツハイマー型老人性痴呆症
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ                                ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＵＢ                                          擬似移動床
ＴＢＩ                                          外傷性脳損傷
Ｔｇ                                            トランスジェニック
ＴＨＦ                                          テトラヒドロフラン
ＴＵＮＥＬ                                      末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）介在ｄＵＴＰニック端標識
Ａ１（ヒト）；Ａ２Ａ（ヒト）；Ａ３（ヒト）      アデノシン受容体亜型
ＡＴ１（ヒト組換え体）                          アンジオテンシン
ＢＺＤ（中枢神経系）                            ベンゾジアゼピン
Ｂ２（ヒト組換え体）                            ブラジキニン
ＣＣＫＡ（ヒト組換え体）（ＣＣＫ１）            コレシストキニン
Ｄ１（ヒト組換え体）；Ｄ２Ｓ（ヒト組換え体）    ドーパミン受容体亜型
ＥＴＡ（ヒト組換え体）                          エンドテリン
ＧＡＢＡ（非選択的）                            γ−アミノ酪酸
ＧＡＬ２（ｈ）                                  ガラニン
ＩＬ−８Ｂ（ヒト組換え体）（ＣＸＣＲ２）        ケモカイン受容体亜型
ＣＣＲ１（ヒト組換え体）                        ケモカイン受容体亜型
Ｈ１（中枢神経系）；Ｈ２                        ヒスタミン受容体亜型
ＭＣ４（ヒト組換え体）                          メラノコルチン
ＭＬ１                                          メラトニン
ＮＫ２（ヒト組換え体）；ＮＫ３（ヒト組換え体）  タキキニン
Ｙｌ（ヒト）；ニューロペプチド、Ｙ２（ヒト）    ニューロペプチド
ＮＴ１（ヒト組換え体）（ＮＴＳ１）              ニューロテンシン
デルタ２（ヒト組換え体）；（ＤＯＰ）；          オピエート受容体亜型
ｋａｐｐ（ＫＯＰ）；オピエート、ｍｕ（ヒト組換え体）（ＭＯＰ）
ＯＲＬ１（ヒト組換え体）（ＮＯＰ）              オルファニン
５−ＨＴ１Ａ（ヒト組換え体）；５−ＨＴ１Ｂ；        セロトニン亜型
５−ＨＴ２Ａ（ヒト組換え体）；５−ＨＴ３（ヒト組換え体）；５−ＨＴ５Ａ（ヒト組換え体）（５−ｈｔ５Ａ）；５−ＨＴ６（ヒト組換え体）；５−ＨＴ７（ヒト）
ｓｓｔ（非選択的）                              ソマトスタチン
ＶＩＰ１（ヒト）（ＶＰＡＣ１）                  血管作用性腸ペプチド
Ｖ１ａ（ヒト組換え体）                          バソプレッシン
ＮＥ輸送体（ヒト）                              ノルエピネフェリン
【０１０７】
用語「幾何異性体」は、二重結合の異性、例えばシス／トランス異性、及びＥ／Ｚ異性、並びに例えば立体配座異性体及びシン／アンチ異性を指す。
【０１０８】
用語「薬剤として許容可能な付加塩」は、薬業において許容可能であることが当分野で知られている塩、例えば塩酸塩、マレイン酸塩、及びクエン酸塩などの酸付加塩を指す。薬剤として許容可能な酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素、ヨウ化水素、亜リン酸などの無機酸から誘導される塩、並びに脂肪族モノ−及びジカルボン酸、フェニル−置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、アルカン二酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの有機酸から誘導される塩がある。したがって、このような塩には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、カプリル酸塩、イソ酪酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩などがある。アルギン酸塩、グルコン酸塩、ガラクツロン酸塩などの、アミノ酸の塩も企図される；例えばＢｅｒｇｅ他、「薬剤塩（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ）、Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７７；６６：１〜１９を参照のこと。
【０１０９】
塩基性化合物の酸付加塩は、遊離塩基形態と充分な量の所望の酸を接触させて、塩を生成することによって、従来の方法で調製される。遊離塩基形態は、塩形態と塩基を接触させること、及び遊離塩基を単離することによって、従来の方法で再生することができる。遊離塩基形態は、そのそれぞれの塩形態と、極性溶媒中の溶解度などの幾つかの物理的性質が幾分異なるが、それ以外は塩は、本発明のためのそのそれぞれの遊離塩基と同等である。
【０１１０】
薬剤として許容可能な塩基付加塩は、金属又はアミンで形成され、例えばアルカリ及びアルカリ土類金属の水酸化物、又は有機アミンの水酸化物などである。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適切なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、及びプロカインである；例えばＢｅｒｇｅ他、上記、１９７７を参照のこと。
【０１１１】
酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸形態と充分な量の所望の塩基を接触させて、塩を生成することによって、従来の方法で調製される。遊離酸形態は、塩形態と酸を接触させること、及び遊離酸を単離することによって、従来の方法で再生することができる。遊離酸形態は、そのそれぞれの塩形態と、極性溶媒中の溶解度などの幾つかの物理的性質が幾分異なるが、それ以外は塩は、本発明のためのそのそれぞれの遊離酸と同等である。
【０１１２】
用語「代謝生成物」は、投与形態の化合物に対する身体の作用によりヒト又は動物の身体中で得られる形態の化合物を指し、例えば、メチルを有する化合物に対する身体による作用の結果として、該メチル化化合物の投与後に身体中で得られる、メチル化化合物の脱メチル化類似体を指す。代謝生成物自体が、生物活性を有することがある。
【０１１３】
用語「プロドラッグ」は、ヒト又は動物の身体に投与した後に、生物活性を有する前記身体中で異なる化合物に、化学的又は生化学的に転換される形態の化合物を指す。プロドラッグ形態の化合物自体が、生物活性を有することがある。
【０１１４】
本発明の実施形態の新規な化合物、及び本発明の実施形態に従い使用することができる化合物は、少なくとも１つのキラル中心を有することができ、したがって、鏡像異性体として、或いは鏡像異性体の混合物（例えばラセミ混合物）として存在することができる。化合物が２つ以上のキラル中心を有する場合、その化合物は、ジアステレオ異性体としてさらに存在することができる。
【０１１５】
本発明の幾つかの実施形態では、薬剤組成物、及び薬剤組成物の製造における、幾つかの化合物の使用を提供する。このような組成物は、経口（例えば、カプセル、錠剤、顆粒、粉末又はビーズの形態）、直腸、非経口、静脈内、皮内、皮下、経皮又は局所投与、或いは吸入又は鼻腔スプレー、イオン泳動、バッカル、又は舌下、舌投与による投与に適した形態であってよい。このような組成物は、単位剤形であってよい。式（Ｉ）の化合物は、即ちＡＦ２６７Ｂ又はＡＦ１５０（Ｓ）を使用することができる実施形態では、約０．５〜約１００ｍｇの範囲の量で、単位剤形で存在することができる。本発明の一実施形態では、化合物は、約５〜約１００ｍｇの量で存在する。本発明の一実施形態では、化合物は、約１０〜約５０ｍｇの量で存在する。これらの量は単回用量、或いは１日当たり２〜４回投与するための２〜４回の個別用量の合計であってもよい。本発明の一実施形態では、薬剤組成物は徐放形態である。
【０１１６】
本発明の幾つかの実施形態では、幾つかの化合物は、非溶媒形態、及び水和形態を含めた溶媒形態で存在することができる。一般に、水和形態を含めた溶媒形態は、非溶媒形態と同等であり、本発明の範囲内に含まれると考えられる。
【０１１７】
化合物ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂは、米国特許第５８５２０２９号中に記載されている。
【０１１８】
本発明の幾つかの実施形態では、化合物は抗酸化活性を有する。このような抗酸化活性は、このような化合物がＡＦ６００などのＮ−オキシドである結果である可能性があり、或いはそれは、このような化合物が４−位窒素で連結した抗酸化成分を有する結果である可能性がある。
【０１１９】
当業者は、多くの要因、例えば意図する目的の有効性、安全性、考えられる副作用、及び治療係数が、臨床療法に適用するための任意の化合物の選択に効果を与えることを理解するであろう。したがって当業者は、第三級窒素原子を有する本発明の化合物から構造的に誘導される、「薬剤として許容可能な第四級化合物」という表現の解釈法を理解するであろう。この表現が、本明細書及び特許請求の範囲に使用されているからである。
【０１２０】
本発明の実施形態で使用する化合物は、広く様々な経口及び非経口剤形で、調製し投与することができる。したがって、使用する化合物は、注射、即ち静脈内、筋肉内、皮内、皮下、十二指腸管内、又は腹腔内注射により投与することができる。さらに化合物は、例えば鼻腔内への吸入によって投与することができる。さらに化合物は、経皮的に投与することができる。以下の剤形が、本発明の実施形態に従い、式（Ｉ）の化合物、又は式（Ｉ）の化合物の対応する薬剤として許容可能な塩を、場合により存在するＡＦ２６７Ｂ又はＡＦ１５０（Ｓ）と共に、活性成分として含むことができることは、当業者によって理解されるであろう。
【０１２１】
式（Ｉ）の化合物からＡＦ２６７Ｂ又はＡＦ１５０（Ｓ）も場合により含む薬剤組成物を調製するために、薬剤として許容可能な担体は固体又は液体であってよい。固体形態調製物には、散剤、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、座薬、及び分散顆粒がある。固形担体は、希釈剤、香味剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤、又は被包性物質として作用することもできる、１つ又は複数の物質であってよい。
【０１２２】
粉末中では、担体は、微細活性成分と混合した微細な固体である。錠剤中では、１つ又は複数の活性成分は、適切な比率で必要な結合性を有する担体と混合され、所望の形状及び大きさに成形されている。
【０１２３】
本発明の一実施形態では、粉末及び錠剤は、５又は１０〜約７０パーセントの活性化合物を含む。適切な担体には、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、スターチ、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、ココアバターなどがある。用語「調製物」は、活性化合物と担体としての被包性物質の配合物を含むものとする。該被包性物質は、他の担体と共に、又はそれなしに存在する活性成分が、ある担体に囲まれ、したがって互いに結合した状態のカプセルをもたらす。同様に、カシェ剤及びトローチ剤が含まれる。錠剤、粉末、カプセル、ピル、カシェ剤、及びトローチ剤を、経口投与に適した固体剤形として使用することができる。
【０１２４】
座薬を調製するために、脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物などの、低融点ワックスを最初に溶解させ、攪拌などによって、活性成分をその中に均質に分散させる。溶融させた均質な混合物を、次いで好都合な大きさの金型に注ぎ、冷却し、それによって凝固させる。
【０１２５】
液体形態調製物には、溶液、懸濁液、及び乳濁液、例えば水又は水プロピレングリコール溶液がある。非経口注射用に、水性プロピレングリコール溶液中に、液体調製物を配合することができる。
【０１２６】
経口使用に適した水溶液は、活性成分を水に溶かし、適切な着色剤、香味剤、安定剤及び増粘剤を所望のように加えることによって、調製することができる。
【０１２７】
経口使用に適した水性懸濁液は、微細活性成分を水中に、天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースなどの粘性物質、及び他のよく知られている懸濁剤と共に分散させることによって、作製することができる。
【０１２８】
使用の直前に、経口投与用の液体形態調製物に転換されると考えられる、固体形態調製物も含まれる。このような液体形態調製物には、溶液、懸濁液、及び乳濁液がある。これらの調製物は、活性成分以外に、着色剤、香味剤、安定剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、安定剤などを含むことができる。
【０１２９】
本発明の一実施形態では、薬剤調製物は単位剤形をなす。このような形態では調製物は、適量の活性成分を含む単位用量に細分される。単位剤形は、パッケージ中に小分けした調製物を含むパッケージ入り調製物、例えばパッケージ入りの錠剤、カプセル、及びバイアル又はアンプル中の粉末などであってよい。さらに単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤、又はトローチ剤そのものであってよく、或いは単位剤形は、適切な数の任意のこれらのパッケージ形態であってよい。
【０１３０】
単位用量の調製物中の活性成分の量は、個々の用途及び活性成分の効能に従い、前述のように変更又は調節することができる。望むならば組成物は、他の適合性のある治療剤を含むこともできる。
【０１３１】
治療における使用では、本発明の実施形態に従い使用する化合物は、１日当たり約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇの開始用量で投与することができる。本発明の一実施形態では、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇの、１日当たりの用量範囲を使用する。本発明の他の実施形態では、１０〜５０ｍｇ／ｋｇの、１日当たりの用量範囲を使用する。しかしながら用量は、患者の要件、治療する状態の重度、及び使用する１つ又は複数の化合物に応じて変えることができる。個々の状況に関する適切な用量の決定は、当分野の技術範囲内である。一般に治療は、化合物の最適用量未満の小用量で開始する。後に、その条件下での最適効果に達するまで、用量を少しずつ増大させる。利便性のために、望むならば、１日当たり全体の用量を分けて、１日中少しずつ投与することができる。
【０１３２】
本発明の化合物を調製するために使用される方法には、五員環の形成、環の置換、環の飽和／不飽和度の変更、塩と塩基の相互変換、四級塩の形成などに関する、有機化学者に本質的に知られている方法がある。これらの合成法では、出発原料はキラル中心を含むことができ、ラセミ出発原料を使用するときは、生じる生成物はＲ、Ｓ鏡像異性体の混合物である。或いは、出発原料のキラル異性体を使用することができ、使用する反応プロトコルがこの出発原料をラセミ化しない場合、キラル生成物が得られる。このような反応プロトコルは、合成中のキラル中心の変換を含むことができる。式（Ｉ）の選択化合物は、Ｅ及びＺなどの幾何異性体（ニトロン中）及び鏡像異性体を含めた、幾つかの立体異性体形態で存在することができる。本発明は、これらの立体異性体形態のそれぞれ、及びそれらの混合物を（ラセミ体を含めて）含む。異なる立体異性体形態を、通常の方法により互いに分離することができ、或いは任意の所与の異性体を、立体特異的又は不斉合成によって得ることができる。したがって、本発明の幾つかの化合物を調製する例示的な方法が記載されるが、当業者に知られるように、他の方法を使用して、これらの化合物を調製することもできることが理解されよう。
【０１３３】
五員環がチアゾリジン−３’−オン環であるとき、例えばこれらの化合物は、対応するＮ−複素環ケトンと２−メルカプトカルボン酸［Ｒ１ＣＨ（ＳＨ）ＣＯ２Ｈ］及びアンモニアを反応させることにより、この環を形成することによって調製することができ、生成物中の４−Ｎ原子は、知られている方法で置換することができる。これらの反応は以下のようにスキーム１に例示することができ、この場合Ｎ−複素環ケトンは、例示的に１−メチルピペリジン−４−オンである。
【化１２】
2010184946.tif 000013
【０１３４】
「Ｒ５−（脱離基）」中の脱離基は、例えば臭化物又は塩化物であってよい。構造体（Ｂ）を得るためのこの置換反応は、本質的に知られている条件下において、例えばリチウムジ−イソプロピルアミン（ＬＤＡ）などのアルカリの存在下で（Ａ）を反応させ、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの溶媒を使用することによって行うことができる。
【０１３５】
化合物構造体（Ａ）又は化合物構造体（Ｂ）を、キラルＨＰＬＣによって２つの鏡像異性体に分離することができ、例えば、ＡＦ２６７（Ｒ１＝Ｅｔ、Ｒ５＝Ｈ）のキラル調製液体クロマトグラフ（ＬＣ）分離によって、ＡＦ２６７Ａ［Ｒ１＝（Ｒ）Ｅｔ、Ｒ５＝Ｈ］、及び活性鏡像異性体ＡＦ２６７Ｂ［Ｒ１＝（Ｓ）Ｅｔ、Ｒ５＝Ｈ］を得た。大規模なコスト効率の良い方法を開発し、それぞれの鏡像異性体の最大５０％の収率を得ることができる（それぞれの鏡像異性体の収率＞９７％、ｅｅ＞９９％及びＨＰＬＣ純度＞９９％）。
【０１３６】
Ｍａｚｚｏｔｉ他（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｅｕｒｏｐｅ  ９６  Ｓｙｍｐ、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ｓｔｏｃｋｐｏｒｔ  ＵＫ、ｐ１０３、１９９６）によって定義されたのと同様に、キラル分離に関する擬似移動床（ＳＭＢ）技術を使用して、当業者用のより一層実用的な分離のために、方法をさらに拡大することができる。
【０１３７】
化学的手段、例えば塩基触媒作用、或いは酵素触媒作用によるＡＦ２６７Ａのラセミ化、その後のキラルＨＰＬＣ又はＳＭＢ分離によって、ＡＦ２６７Ｂを生成させることもできる。
【０１３８】
構造体（Ｂ）は、対応するＮ−複素環ケトンと２−メルカプトカルボン酸［Ｒ１ＣＨ（ＳＨ）ＣＯ２Ｈ］及び第一級アミンを反応させることにより、調製することができる。この反応は以下のようにスキーム２に例示することができ、この場合Ｎ−複素環ケトンは、例示的に１−メチルピペリジン−４−オンである：
【化１３】
2010184946.tif 000014
【０１３９】
構造体（Ｂ）は、スキーム３中に以下に記載するアミド結合を得るための条件下で、（Ａ）を反応させることによって得ることもでき、この場合、反応する酸は、例示的に３−インドールプロピオン酸である：
【化１４】
2010184946.tif 000015
【０１４０】
構造体（Ａ）又は構造体（Ｂ）中のＲ１基は、２−非置換化合物（Ａ）又は（Ｂ）とハロゲン化アルキル又はアルキルアルデヒドを、標準的条件下で反応させて、２位の置換を行うことによって得ることができる。これらの反応は以下のようにスキーム４に例示することができる：
【化１５】
2010184946.tif 000016
【０１４１】
この方法は、ＡＦ２６７の１４Ｃ標識に適用することができる。１４Ｃ標識臭化エチルを用いる、容易に利用可能なＮ−保護ＡＦ２７７（ＡＦ２８７）のアルキル化によってエチル部分を導入し、次に保護基を除去することによって、ＡＦ２６７の１４Ｃ標識が生じる。１３Ｃが豊富なＡＦ２６７の調製と同様に使用することができる合成経路は、スキーム５中に以下に記載する：
【化１６】
2010184946.tif 000017
【０１４２】
構造体（Ａ）又は構造体（Ｂ）中の１−メチル基は、スキーム６中に示すように、ｍ−クロロ過安息香酸／ＦｅＣｌ２、或いはクロロギ酸フェニルなどの脱メチル化剤と反応させることによって、除去することができる：
【化１７】
2010184946.tif 000018
【０１４３】
ＡＦ５０４又はＡＦ２９２は、対応するＮ−複素環ケトンと２−メルカプトカルボン酸［Ｒ１ＣＨ（ＳＨ）ＣＯ２Ｈ］及び第一級アミンを反応させることにより、調製することもできる。この反応は以下のようにスキーム７に例示することができ、この場合Ｎ−複素環ケトンは、Ｎ−ＢＯＣ−ピペリジン−４−オン（ＢＯＣ＝ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）である：
【化１８】
2010184946.tif 000019
【０１４４】
構造体（Ａ）又は（Ｂ）の立体特異的合成は、対応するＮ−複素環ケトンと適切な２−メルカプトカルボン酸を反応させることによって行うこともでき、例えば１−メチルピペリジン−４−オンを、（Ｓ）−２−メルカプト酪酸及びＮＨ３と反応させるとき、スキーム８中に示すように、ＡＦ２６７Ｂを得る［（Ｓ）立体配座は、ＡＦ２６７ＢのＸ線結晶解析に基づく］：
【化１９】
2010184946.tif 000020
【０１４５】
（Ｓ）−２−メルカプト酪酸は市販のものであるか、或いは（Ｒ）−ブロモ酪酸から調製する。この反応は以下のようにスキーム９に例示することができる：
【化２０】
2010184946.tif 000021
【０１４６】
化合物（Ａ）を、過酸化水素又はｍ−クロロ過安息香酸などの酸化剤と反応させると、スキーム１０中に示すように、構造体（Ｄ）又は構造体（Ｅ）を得る。
【化２１】
2010184946.tif 000022
【０１４７】
構造体（Ａ）又は（Ｂ）のチオ類似体は、例えばスキーム１１中に示すように、構造体（Ａ）中の対応するチアゾリジノン環とＬａｗｅｓｓｏｎ試薬を反応させることによって、一般的に得ることができる。
【化２２】
2010184946.tif 000023
【０１４８】
同一分子内に本質的に２つのリガンドを含む二価化合物は、先に記載されたのと同様に、化合物構造体（Ｂ）を得るための同じ条件下において、対応する化合物構造体（Ａ）とスペーサーを反応させることによって得ることができる。スペーサー（脱離基）は、例示的にジハロゲン化アルカン、アルカンジオール、アルカン二酸、ポリ（エチレングリコール）である。この反応は以下のようにスキーム１２に例示することができる：
【化２３】
2010184946.tif 000024
【０１４９】
Ｎ−ホスホノオキシメチルのプロドラッグは、Ｋｒｉｓｅ他、Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：３０９４〜３１００（１９９９）中に報告された。Ｎ−ホスホノオキシメチルのこのような成分を、以下に示すように第三級アミン含有化合物（Ｂ）の水溶性を改善するために、プロドラッグ（Ｈ）の合成用に使用することもできる。化合物構造体（Ｂ）中の第三級アミンは、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルクロロメチルホスフェートによる求核置換反応を経て、これにより第四級リン酸アンモニウム保護プロドラッグが形成される。スキーム１３に示すように、プロドラッグの遊離酸形態を、第三級ブチル基を除去した後に得る：
【化２４】
2010184946.tif 000025
【０１５０】
型（Ｉ）及び（Ｊ）の化合物であるニトロンは、スピロ−ケトンと、アルキルヒドロキシルアミン又はアリールヒドロキシルアミンを反応させることによって調製することができる。これらの反応は、以下のようにスキーム１４Ａ及び１４Ｂに例示することができる：
【化２５】
2010184946.tif 000026
【化２６】
2010184946.tif 000027
【０１５１】
或いは、構造体（Ｉ）を、五員環カルボニルと、アルキルヒドロキシルアミン又はアリールヒドロキシルアミンを反応させることによって調製することができる。生成したニトロンを環化して、スピロ構造を形成させる。
【０１５２】
ＡＦ１５０（Ｓ）と指定される式
【化２７】
2010184946.tif 000028
の化合物は、米国特許第５，４０７，９３８号に記載されている。しかしながら、この化合物の合成は、現在改善されてきている。改善型の合成を、以下のスキーム１５に記載する：
【化２８】
2010184946.tif 000029
【０１５３】
ＡＦ１５０（Ｓ）を、４−ピコリルアミンと無水酢酸／ヨウ化メチルの反応、次にＬａｗｅｓｓｏｎ試薬との反応によって得た。得られたヨウ化チオピリジニウムを還元して、チオアセチルアミノ−テトラヒドロピリジンを得て、これを環化してＡＦ１５０（Ｓ）を形成した。
【０１５４】
遊離塩基として調製すると、ＡＦ１５０（Ｓ）は無色の液体である。この遊離塩基は、乾燥真空下の暗所貯蔵庫において、塊状の物質として低温（−２０〜０℃）で保存することができる。ＡＦ１５０（Ｓ）は、塩として得ることもできる。本発明の一実施形態では、クエン酸を使用して、大規模な製造において最終的に使用することができる、安定した塩を得る。白い結晶状のＡＦ１５０（Ｓ）のクエン酸塩を、ＡＦ１５０（Ｓ）遊離塩基と、クエン酸を２−プロパノール及びテトラヒドロフラン溶液に溶かしたものを混合することによって調製した。遊離塩基とは対照的に、塩は（ａ）高温でも発色せず（加速安定性試験）、且つ（ｂ）高温でも塊状物を無水条件下に保てば、高い安定性を示す（加速安定性試験）。
【０１５５】
本発明の他の実施形態では、薬剤として許容可能なパラフィン油中の、ＡＦ１５０（Ｓ）を提供する。パラフィン油中の１０％ｗ／ｗのＡＦ１５０（Ｓ）の安定性を、空気又は窒素雰囲気、及びトコフェロールの有無の下で、４０℃において調べた。０．１％を超える分解生成物は検出されなかった。トコフェロールを含まない試料中では、わずかな黄色を観察したが、ＡＦ１５０（Ｓ）中０．５％ｗ／ｗのトコフェロールを含む試料中では、発色しなかった。
【０１５６】
ＡＦ１５０（Ｓ）中のＮ−メチル基は、スキーム１６中に示すように、ｍ−クロロ過安息香酸／ＦｅＣｌ２と反応させることによって、除去することができることを、示すことができる。
【化２９】
2010184946.tif 000030
【０１５７】
ＡＦ１５０（Ｓ）をｍ−クロロ過安息香酸などの酸化剤と反応させると、ＡＦ４０６が得られる。
【化３０】
2010184946.tif 000031
【０１５８】
ＡＦ１５０（Ｓ）、ＡＦ４０２の１４Ｃ標識の非放射性擬似体を、ＡＦ１５０（Ｓ）の合成のスキームに従い、合成の第１ステップのヨードメタンの代わりに、ｄ３−ヨードメタンを使用することによって得た。ＡＦ４０２の合成を、以下のスキーム１７に記載する：
【化３１】
2010184946.tif 000032
【０１５９】
前述の記載では、本発明の例示的な化合物を示したが、ピペリジン、及びキヌクリジン環、スピロ立体配座に適した他の任意の窒素含有複素環、及び示したスピロ五員環を、それらと置換することができることは理解されよう。このような化合物は、３−又は４−ピペリドンを使用して前に示した化合物を得るのと同様に、対応するケトンを使用することによって、作製することができる。同様の所見が本発明の実施例に当てはまり、これらは単なる例示的なものであり、制限的なものではない。
【０１６０】
ここで本発明を、以下の非制限的な実施例により例示する。
【実施例１】
【０１６１】
（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オンの合成
【化３２】
2010184946.tif 000033
ステップ１：２−メルカプト酪酸の合成
２−ブロモ酪酸（３．２ｋｇ、１９．１６ｍｏｌ）を、冷却した（氷−水浴）フラスコ中に導入した。これを攪拌し、水性水酸化カリウム（１８．２ｍｏｌ）を、温度を３０〜４０℃に保ちながら、徐々に加えた（０．５時間）。冷却を停止し、カリウムＯ−エチルジチオカルボネート（３．４８ｋｇ、２１．７ｍｏｌ）を少しずつ加えて、その結果温度が５０℃を超えないようにした（０．５時間）。反応混合物を５０℃で１時間攪拌し、次いで１５〜２０℃に冷却した（氷−水浴）。エチレンジアミン（２．６ｌ、〜３９ｍｏｌ）を、温度を４５〜５５℃に保ちながら（外部冷却）、２０分間の間に加えた。生成した懸濁液を５０℃で２時間攪拌し、２０℃に冷却し、濾過して、固体を２×１．５リットルの温水で洗浄した（４０〜５０℃）。水性濾過物と洗浄液を組合せ、２０℃未満に冷却し（氷−水浴）、水性硫酸［５．２ｌ、５０％（ｗ／ｗ）］を、温度を４５〜５５℃に保ちながら、ゆっくりと加えた（０．５時間、ｐＨ＝２まで）。溶液を３０℃に冷却し、機械的攪拌装置を備える２５リットル容器に移した。メチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、３ｌ）を加え、混合物を攪拌し、室温で一晩放置した。上部油相を分離し、下部水性相を減圧下で濾過して、形成された沈殿を除去した。水性相をＭＴＢＥを用いて抽出し、抽出物を組合せ、ＭＴＢＥを除去した。油の残留物をシクロヘキサン（５ｌ）に溶かし、冷蔵庫内に一晩保った。下部相が形成された。それを分離し、シクロヘキサンを用いて抽出した。シクロヘキサン抽出物を上部相と組合せ、シクロヘキサンを除去し、２−メルカプト酪酸（粗製）を真空中で乾燥させて（５４℃／２ｍｍＨｇ）、２−メルカプト酪酸（２．１８ｋｇ、１８．１６ｍｏｌ）を得た。
【０１６２】
ステップ２：ＡＦ２６７（ラセミ体）の合成
２−メルカプト酪酸（７０５ｇ、５．８８ｍｏｌｅ）、及びシクロヘキサン／ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（１；３．５（ｗ／ｗ）、４．３ｌ）の混合物を、フラスコ中に導入した。得られた溶液を攪拌し、４０〜６０℃に加熱した。気体状アンモニアを、すべて又は大部分の２−メルカプト酪酸がそのアンモニウム塩に転換されるまで、溶液中で発泡させた。アンモニアの発泡を停止させ、反応混合物を加熱して還流させ、１−メチル−４−ピペリドン（４９６ｇ、４．３９ｍｏｌ）をシクロヘキサン／ｔｅｒｔ−ブチルアルコールの混合物に溶かした溶液（５００ｍｌ）を加えた。１時間後、溶液は透明になり、アンモニアの発泡が再開し、１３時間後（ピペリドンの添加、その後の反応時間）、反応混合物を冷却し、室温で一晩放置した。水（２体積）（９６０ｍｌ）で水性濃酸（１体積）を希釈することによって調製した塩酸溶液を加え、混合物を１時間攪拌した。得られた溶液（ｐＨ〜２〜３）を２５℃に冷却し、下部水性相を分離し、水性水酸化カリウム（ｐＨ〜８．５〜９）を用いて塩基性にし、次いで室温で一晩放置した。沈殿した生成物を濾過し、冷水（１００ｍｌ）で洗浄して、湿った粉末を得た。この濾過物をｐＨ９まで塩基性にし、５℃で一晩放置し、濾過して、５０ｍｌの冷水で洗浄して、７２ｇの粉末を得た。同じ手順を繰り返して、ＡＦ２６７の第２バッチを合成した（１．２を掛けた）。これらの生成物を組み合わせて、１．６ｋｇの湿った生成物を得た。粗製の組合せ生成物を４．５リットルの温水（９５℃）に溶かし、濾過して、透明な溶液を室温で１０時間放置し、濾過して、２４時間乾燥させて（５０℃、１ｍｍＨｇ）、ＡＦ２６７を得た（１．０４８ｋｇ、収率５０．７％）。濾過物を濃縮し、５℃で一晩冷却し、濾過して、洗浄し（１００ｍ１冷水）、乾燥させてＡＦ２６７を得た（２１５ｇ、収率１０．４％）。全体のＡＦ２６７収率：６１％。融点１４２〜１４４℃；
2010184946.tif 000034
【０１６３】
ステップ３：ＡＦ２６７ＢとＡＦ２６７Ａのキラル分離
Ｐｒｏｃｈｏｍ  ＬＣ  １１０分取高速液体クロマトグラフ
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＡＳＶ（ロット番号ＪＧ００１）
ポンプ流速：５００ｍｌ／分
圧力：１２．７バール
カラム温度２６℃
移動相：アセトニトリル／ＥｔＯＨ８５：１５
濃度：３７ｇｒ／ｌ
ＵＶ検出：２４０／２３０ｎｍ
溶出の後、溶出液を蒸発させて乾燥させた。
最初に鏡像異性体（ＡＦ２６７Ａ）を溶出する：ｅｅ：９９．７（６８７．１ｇｒ；純度９９．３％；収率：９７％）
２番目に鏡像異性体（ＡＦ２６７Ｂ）を溶出する：ｅｅ：９９．８（６９４．９ｇｒ；９９．９％；収率：９８％）
残留溶媒（例えばアセトニトリル）を、エタノールをさらに加えることによって除去し、蒸発させて乾燥させた。
類似の合成法によって、ＡＦ２９２及び他の関連化合物を、調製することができる。
【実施例２】
【０１６４】
Ｘ線による（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２６７Ｂ）の単結晶構造の分析
結晶データ：Ｃ１０Ｈ１９ＮＯＳ＋Ｈ２Ｏ（一水和物）、透明、薄黄色、角柱、結晶の大きさ、０．２×０．２×０．４ｍｍ３；結晶系、斜方晶系、スペース基：Ｐ２１２１２１（Ｎｏ１６）ａ＝１０．３９４（１０）（α＝９０°）、ｂ＝２０．１３３（２）（β＝９０°）、ｃ＝５．８５６（４）（γ＝９０°）Å、２５からの反射率、Ｔ＝１１０Ｋ、体積＝１２２４．２（９）Å３、Ｚ＝４、Ｆｗ＝２０２．３２、計算密度Ｄｃ＝１．０９２Ｍｇ／ｍ３、吸収係数μ＝０．２３２ｍｍ−１。
【０１６５】
データ収集及び処理：Ｒｉｇａｋｕ  ＡＦＣ５Ｒ  ４軸回析計、ＭｏＫα、グラファイトモノクロメーター（λ＝０．７１０７３Å）、収集した反射率１１４６１、データ収集に関するシータ範囲：２．８２°≦θ≦２７．５３°；尺度範囲：−１３≦ｈ≦１３、−２６≦ｋ≦２６、０≦ｌ≦７、ω走査法、走査幅＝１．２°、走査速度２°／分、典型的な半値幅＝０．４５°、強度変化３％で、それぞれ６２回収集した３つの標準、収集した反射率：６２７２の測定値、２８３３の別個の反射率［Ｒ（ｉｎｔ）＝０．０６０４、バイフート反射率は別々に保った］。
【０１６６】
溶液及び精製：直接法（ＳＨＥＬＸＳ−９７）によって解明された構造。Ｆ２（ＳＨＥＬＸＬ−９７）に基づく、フルマトリクス最少２乗法による精製。理想水素を配置し、ライディングモードで精製し、水素水を、差フーリエ図、１４８パラメーター；最終Ｒ屈折率：データＩ＞２シグマ（Ｉ）ｗＲ２＝０．１４８４に関してＲ１＝０．０６７１（Ｆ２に基づく）、及びすべてのデータに関してＲ１＝０．０７４７、ｗＲ２＝０．１５５３、Ｆ２の適合度＝１．１３、Ｓ原子周辺の最大電子密度＝０．７４５ｅ／−３から発見した。
【０１６７】
絶対配置：分子の絶対配置を、フラックのパラメーター手法、及び鏡像異性体双晶化成分の他の精製法を使用して決定した。２つの方法により、存在する化合物の配位は、適切な絶対配置（Ｓ鏡像異性体）に属することが明らかに示される。この化合物の結晶は、トルエン／石油エーテル／メタノール中での結晶化から調製した。
【０１６８】
【化３３】
2010184946.tif 000035
【実施例３】
【０１６９】
（Ｒ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ２６７Ａのキラル合成
【化３４】
2010184946.tif 000036
ＡＦ２６７合成において光学的に活性がある２−メルカプト酪酸を使用することにより、ＡＦ２６７Ａの不斉合成を行って、Ｓ鏡像異性体の合成をモデル化した。光学的に活性がある２−メルカプト酪酸は、Ｓ立体配座を有するＬ−（＋）−２−アミノ酪酸（Ｉ）から始めて合成した。アミノ酸は、硝酸ナトリウム、臭化カリウム及び臭化水素酸で処理することによって、立体配座を保持している（Ｓ）−２−ブロモ酪酸（ＩＩ）に転換した。得られた臭化物の鏡像異性体純度を、（Ｒ）−（＋）−Ｎ−ベンジル−α−メチル−ベンジルアミンの存在下で測定したプロトンＮＭＲによって調べ、同じ条件で測定したラセミ臭化物のスペクトルと比較した。ただ１つの鏡像異性体の存在を、この方法によって検出した。セシウムチオ安息香酸をＤＭＦに溶かしたもので処理することによって、臭化物を（Ｒ）−２−ベンゾイルチオ酪酸（ＩＩＩ）（立体配座が反転したもの）に転換した。（ＩＩＩ）の脱ベンゾイル化を、アミノ分解（１Ｎ水酸化アンモニウム、室温）によって、ラセミ化なしで行った。
【０１７０】
得られた（Ｒ）−２−メルカプト酪酸を、蒸留によって精製し、次いで沸騰シクロヘキサン中で酢酸アンモニウム及び１−メチル−４−ピペリドンと反応させた。粗製反応混合物を、キラルカラム上でのＧＣによって分析し、少量（２〜３％）のＡＦ２６７Ｂを伴うＡＦ２６７Ａが含まれることを見出した。
【実施例４】
【０１７１】
（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ２６７Ｂのキラル合成
この化合物は実施例３と同様に得る。ただし、使用する出発原料は（Ｒ）−２−ブロモ酪酸である。
【実施例５】
【０１７２】
（Ｓ）−２−エチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ２９２の合成
【化３５】
2010184946.tif 000037
ＡＦ２６７Ｂ（６．１ｇｒ、０．０２８ｍｏｌ）をジクロロメタン（６０ｍｌ）に溶かした、冷却した（氷−塩浴）攪拌溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）を１５分間少量ずつ加えた。ｍＣＰＢＡ（７０％、７．０２ｇｒ、０．０２８ｍｏ１合計）。混合物を１時間攪拌し、次いで塩化鉄（ＩＩ）（水に溶かした２．１４ｍｌの１Ｍ溶液）で処理した。攪拌及び冷却（−１０℃）を１時間続け、次いで室温で２時間攪拌を続けた。エチレンジアミン（１．９ｍｌ、０．２８５ｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（３０．５ｍｌの２Ｎ水溶液）、及び石油エーテル４０〜６０℃（６０ｍｌ）を加えた。激しい攪拌の後に層を分離し、水性層を、ジクロロメタン／石油エーテル１：１の混合物（６００ｍｌ）、次にジクロロメタン（最初は６００ｍｌ、次いで３００ｍｌ）を用いて抽出した。組み合わせた抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過して、減圧下で溶媒を除去した。残留物のフラッシュクロマトグラフィー（シリカ−ゲル６０、２３０〜４００メッシュ、Ｍｅｒｃｋ  １．０９３８５、メタノール／クロロホルム／水酸化アンモニウム１０：８９：１ｖ／ｖを用いて溶出）によって、ＡＦ２９２を得た。
2010184946.tif 000038
ＨＰＬＣ、ＧＣにより、化合物は＞９９．９％純度であった。
【０１７３】
ＡＦ２９２の塩酸塩を、ＨＣｌ（メタノール中に４Ｍ）を加えることによって形成し、メタノール−ジエチルエーテルから再結晶化させて、白い沈殿を得て、これを濾過して乾燥させた。
2010184946.tif 000039
【実施例６】
【０１７４】
［１４Ｃ］−２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン；Ｒ及びＳ異性体を調製するための反応
【化３６】
2010184946.tif 000040
磁気バー及び窒素導入口を備える、セプタム付き乾燥フラスコ（１０ｍｌ）に、ジイソプロピルアミン（０．０７８ｍｌ、０．５６ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１．４ｍｌ）に溶かした溶液を、シリンジによって導入し、０℃に冷却した。ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中に０．９Ｍ、０．６２ｍｌ、０．５６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃で２０分間攪拌し、次いで−７８℃に冷却した。ＡＦ２８７（０．１３７５ｇｒ、０．５１ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦ（０．４ｍｌ）及び乾燥Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−プロピレン尿素（ＤＭＰＵ）（０．６ｍｌ）に溶かした溶液を、一適ずつ加え（３０分間）、反応混合物を−７８℃で２０分間攪拌する。１−炭素を１４Ｃで標識した、臭化エチル（０．０４３ｍｌ、０．５６ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、温度を室温まで上昇させ、反応混合物をさらに４時間攪拌する。溶媒は、最初に２５℃で２０分間水ポンプを、次いで油ポンプ（〜４ｍｍＨｇ）を６０℃までで３０分までを使用することによって（ニードルを使用し、これを空気の流れに導入してさらに速く溶媒を除去する）、減圧下で除去する。残留物のフラッシュクロマトグラフィーによって、ラセミ体ＡＦ２６７を得る（９５ｍｇ、収率８６％まで）。調製キラルＨＰＬＣを使用して、鏡像異性体を分離することができる。標識しなかった臭化エチルを使用する前述の手順に従うことにより、フラッシュクロマトグラフィー後に得られた、６０ｍｇのラセミ体の調製ＨＰＬＣによって、非同位体標識ＡＦ２６７Ｂ（１７．６ｍｇ）を得た。
【実施例７】
【０１７５】
（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−８−オキシ−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ２９９の合成
【化３７】
2010184946.tif 000041
ｍＣＰＢＡ（７０％、２．６２ｇｒ、１０．６４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶かした溶液を、ＡＦ２６７Ｂ（２．０７ｇｒ、９．６７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶かした、冷たい（０℃）攪拌済み溶液にゆっくりと加えた（０．５時間）。冷却浴を除去し、反応混合物を室温で２時間攪拌し、次いで溶媒を減圧下で除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（メタノール／クロロホルム／水酸化アンモニウム１０：８９：１ｖ／ｖ）に掛け、生成物をメタノール−アセトニトリルから固体として沈殿させて、Ｎ−オキシド、ＡＦ２９９を得た；
2010184946.tif 000042
【実施例８】
【０１７６】
（Ｓ）−２−エチル−８−メチル−１−オキソ−１λ４−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ３００の合成
【化３８】
2010184946.tif 000043
ＡＦ２６７Ｂ（１．７２ｇｒ、０．００８ｍｏｌ）を水（２．５ｍｌ）に溶かした溶液を冷却し（氷−水浴）、トリフルオロ酢酸（３．５ｍｌ）を加えた。冷却攪拌し得られた混合物に、過酸化水素（３０％、０．５７ｍｌ、０．００８ｍｏｌ）を加え、冷却浴を除去し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。亜硝酸ナトリウムを加え、炭酸ナトリウムの飽和溶液を用いて、溶液のｐＨを９に調整した。水性相はジクロロメタン（２×１００ｍｌ）、次いで酢酸エチル（１×５０ｍｌ）を用いて抽出した。有機抽出物を組合せ、乾燥させ（Ｍｇ２ＳＯ４）、溶媒を蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ−ゲル６０、２３０〜４００メッシュ、Ｍｅｒｃｋ  １．０９３８５、メタノール／クロロホルム／水酸化アンモニウム１０：８９：１ｖ／ｖを用いて溶出）によって、ＡＦ３００を得た。
2010184946.tif 000044
【実施例９】
【０１７７】
２−（１−ヒドロキシ−エチル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２９８）の合成
【化３９】
2010184946.tif 000045
ジイソプロピルアミン（０．２８ｍｌ、０．００２ｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１２ｍｌ）に溶かした冷却（０℃）溶液に、アルゴン雰囲気下において、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中に１．４Ｍ、１．４ｍｌ、０．００２ｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を２０分間攪拌し、−７８℃に冷却した。ＡＦ２８７（０．４１ｇ、０．００１５ｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍｌ）に溶かした溶液を一滴ずつ加え（１０分間）、生成した混合物を−７８℃でさらに１０分間攪拌した。アセトアルデヒド（０．８５ｍｌ、０．０１５ｍｏｌ）を１部加え、１０分後−７８℃で、酢酸（０．１１ｍ１、０．００２ｍｏｌ）を１部加え、温度を室温まで上昇させた。反応混合物をクロロホルム（２００ｍｌ）に加え、有機相を水（２×２０ｍｌ）で洗浄し、分離し乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残留物のフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ８０／２０／１）によって、ＡＦ２９８（０．１３２ｇ）を得た。
2010184946.tif 000046
【実施例１０】
【０１７８】
（Ｓ）−２−エチル−４−（４−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ７００の合成
【化４０】
2010184946.tif 000047
リチウムヘキサメチルジシラザン（８ｍｌ、ＴＨＦ中に１Ｍ）の冷却（０℃、氷−水浴）溶液に、アルゴン雰囲気下において１５分の間、ＡＦ２６７Ｂ（１．５ｇ、０．００７ｍｏｌ）を少量加えた。冷却浴を除去し、反応混合物を室温で４０分間攪拌した。４−フルオロベンジルスルホニルクロリド（１．３７ｇ、０．００７ｍｏｌ）を加え（添加中、冷却浴で温度を２０℃未満に保った）、反応混合物をアルゴン雰囲気下において一晩、室温で放置した。ジクロロメタン（１００ｍｌ）を加えた。反応混合物を水（２０ｍｌ）で洗浄し、有機相を分離、乾燥（ＭｇＳＯ４）、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／メタノール／水酸化アンモニウム１０／２／０．１）によって、ＡＦ７００（０．４６ｇｒ、０．００１５ｍｏ１）を得た。
2010184946.tif 000048
【実施例１１】
【０１７９】
８−メチル−４−ピロリジン−１−イルメチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ２８７の合成
【化４１】
2010184946.tif 000049
８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（ＡＦ２７７  ５．１３ｇ、０．０２７５ｍｏｌ）、ホルムアルデヒド（３７％溶液、２．７５ｍｌ）、エタノール（２．３ｍｌ）中に溶かしたピロリジン（２．３ｍ１、０．０２７５ｍｏｌｅ）の溶液を４時間還流させ、室温で一晩放置した。トルエン（１０ｍｌ）を加え、溶媒を蒸発させた。沸騰ペンタン（１００ｍｌ）を残留物に加え、溶液をデカントした。熱ペンタンを用いた粉砕を４回繰り返し、ペンタン層を組合せ、０℃に冷却し、沈殿を回収しＡＦ２８７として同定した（４．６ｇｒ、収率６３％）。
2010184946.tif 000050
【実施例１２】
【０１８０】
２−エチル−４−（３−１Ｈ−インドール−３−イル−プロピオニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ７０４の合成
【化４２】
2010184946.tif 000051
ＡＦ２６７（１．２ｇｒ、０．００５６ｍｏｌ）、３−インドールプロピオン酸（１．３７ｇｒ、０．００７２ｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１．５７ｇｒ、０．００７６ｍｏｌ）、及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．９３ｇｒ、０．００７６ｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１２０ｍｌ）中に溶かした溶液を、室温で３日間攪拌した。反応混合物を水（２×４０ｍｌ）で洗浄し、有機相を乾燥させ、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ９０／１０／１）によって、表題の化合物を得て、これをアセトン中で粉砕した。溶液を濾過して不純物を除去し、次いでアセトンを蒸発させ、得られた濃い油をエーテル中で粉砕した。得られた固体（ＡＦ７０４）、４００ｍｇを濾過し、乾燥させた。融点１２２．５〜１２４．５；
2010184946.tif 000052
出発原料がＡＦ２６７Ｂであるとき、鏡像異性体ＡＦ７０４Ｂを得る。
【実施例１３】
【０１８１】
２−エチル−４−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ７０３の合成
【化４３】
2010184946.tif 000053
磁気攪拌装置及びＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ及び滴下漏斗を備える三つ口フラスコ中に、２−メルカプト酪酸（７．３８ｇｒ、０．０６５ｍｏｌ）を、ｔ−ブタノール／シクロヘキサン（３０／１０４ｇｒ／ｇｒ、８６ｍｌ）の混合物に溶かした溶液を、４０℃に加熱した。トリプトアミン（１０．８ｇｒ、０．０６８ｍｏｌ）を４部加え（２０分間）、反応混合物をさらに４５分間攪拌し、次いで加熱して還流させた。１−メチル−４−ピペリドン（６．１８ｍｌ、０．０４９ｍｏｌ）をｔ−ブタノールシクロヘキサン（３０／１０４ｇｒ／ｇｒ、１０ｍｌ）に溶かした溶液を、４０分間中一適ずつ加え、還流は５時間続けた（１ｍｌの水を回収した）。ＨＣｌ／水（２：２ｖ／ｖ）の混合物をｐＨ２〜３まで加え、水性相を分離し、水酸化カリウムの溶液を用いてｐＨ１０まで塩基性にし、ジクロロメタンを用いて抽出した。有機相を分離し、乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残留物のフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ９０／１０／１）によって、表題の化合物を得た。沸騰ヘキサンからの再結晶化によって、純粋なＡＦ７０３を得た。
2010184946.tif 000054
【実施例１４】
【０１８２】
２，８−ジメチル−１−チア−３，８−ジアザ−スピロ［４．５］デス−２−エンＡＦ１５０（Ｓ）の合成
【化４４】
2010184946.tif 000055
ステップ１：４−（アセトアミノメチル）−１−メチル−ピリジニウムヨウ化物の合成
４−ピコリルアミン（１０７０ｇｒ、９．９ｍｏｌ）をメタノール（３ｌ）に溶かした冷却（氷−水浴）溶液に、無水酢酸（１４００ｇｒ、１３．７ｍｏｌ）を一滴ずつ加えた。添加中、反応温度は１０℃と３０℃の間に保った。試薬の添加の終了時に、反応混合物を室温で一晩放置した。ヨードメタン（８００ｍｌ、２４．８ｍｏｌ）を反応混合物に加え、窒素雰囲気下においてそれを水浴で冷却した。添加中、反応温度は２５℃未満に保った。添加の終了時に、反応混合物を光から保護し、室温で一晩放置した。過剰なヨードメタンは蒸発させ、結晶化を誘導し、反応混合物を冷却し（氷浴）、イソプロパノール（１．５ｌ）を加えた。反応温度は−３０℃で一晩放置し、沈殿を濾過除去し、イソプロパノールで洗浄し、乾燥させた。４−（アセトアミノメチル）−１−メチル−ピリジニウムヨウ化物（２０４３ｇｒ、７ｍｏｌ）を、黄色い粉末として得た（収率７１％）。
2010184946.tif 000056
【０１８３】
ステップ２：１−メチル−４−Ｎ−チオアセチルアミノメチルピリジニウムヨウ化物の合成
４−（アセトアミノメチル）−１−メチル−ピリジニウムヨウ化物（１．９２ｋｇ、６．５ｍｏｌ）及びＬａｗｅｓｓｏｎ試薬（１．８７ｋｇ、４．６ｍｏｌ）を、アセトニトリル（６ｌ）に溶かした攪拌溶液を、１７時間で８０℃に温めた。次いで反応混合物を室温に冷却し、さらに４時間攪拌した。粗製チオアミドを濾過除去し、アセトニトリル（２．８ｌ）で洗浄した。得られたチオアミドに酢酸エチル（１０ｌ）を加え、懸濁液を１時間還流させた。７２〜７３℃において、有害ガスを放出させ、ＮａＯＨ溶液で捕獲した。懸濁液を６０℃に冷却した。チオアセトアミドを濾過除去し、酢酸エチル（２ｌ）で洗浄し、乾燥させた（４５℃）。２ｋｇのチオアミドを得た。
【０１８４】
ステップ３：１−メチル−４−Ｎ−チオアセチルアミノ−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンの合成
１−メチル−４−Ｎ−チオアセチルアミノメチルピリジニウムヨウ化物（２．０７ｋｇ、６．７ｍｏｌ）を水（６．２ｌ）に懸濁させた懸濁液を、２５ｌのフラスコ中で調製し、室温において攪拌した。水素化ホウ素ナトリウム（３８３ｇｒ、１０．ｌｍｏｌ）を水（１．２ｌ）に溶かした溶液を、３．５時間の間に一滴ずつ加え、温度が３２℃未満に保たれるようにした。反応混合物を室温で２時間攪拌し、エタノール（６００ｍｌ）を加え、攪拌を３０分間続けた。炭酸ナトリウム（７８０ｇ）を加え、反応混合物を一晩攪拌した。ジクロロメタン（４ｌ）を加え、攪拌を４５分間続けた。溶液を濾過して固体を除去し、これをクロロホルム（１ｌ）及び水（０．５ｌ）で洗浄した。濾過物をデカントし、水性相をクロロホルム（２．５ｌ）を用いて抽出した。有機相を組合せ、１０％チオ硫酸ナトリウム溶液（２．２ｌ）で洗浄した。水性相をクロロホルム（１ｌ）を用いて抽出し、有機相を組合せ、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し濃縮した。アセトン（１．５ｌ）を加え、その懸濁液を室温で３０分間、０℃で４５分間攪拌した。チオアセトアミドを濾過除去し、アセトン（１．５ｌ）で洗浄し、乾燥させた（５０℃）。８６０ｇｒのチオアセトアミドを得た。融点１４０℃；
2010184946.tif 000057
【０１８５】
ステップ４：２，８−ジメチル−１−チア−３，８−ジアザ−スピロ［４．５］デス−２−エンＡＦ１５０（Ｓ）の合成
機械的攪拌装置を備える三つ口丸底フラスコ（５ｌ）中で、ポリリン酸（２．１ｋｇ）を攪拌し、１００℃に加熱した。チオアセトアミド（８４０ｇｒ）を少量加えた。添加の最後に、温度を１７０℃に上昇させ、この温度を２〜３時間保った。この熱反応混合物を、炭酸ナトリウム（２５％、１０ｌ）の攪拌冷却水溶液にゆっくり注いだ。水性水酸化ナトリウム溶液（５０％、３５０ｍｌ）を加えることによって、塩基性度を上昇させた。反応混合物はクロロホルム（２×３ｌ）を用いて抽出し、有機相を組合せ、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。残留物を石油エーテル（３．５ｌ）に溶かして、溶液及び少量の不溶性物質を得た。石油エーテル溶液の蒸発によって、粗製のＡＦ１５０（Ｓ）を得た。記載した手順を繰り返し、合わせたバッチからの粗製のＡＦ１５０（Ｓ）を活性炭で処理し、２回蒸留して、減圧下（０．５ｍｍＨｇ、６１℃）においてＡＴ１５０（Ｓ）を得た（＞１．２Ｋｇ、全収率４０％）。
2010184946.tif 000058
【実施例１５】
【０１８６】
２，８−ジメチル−１−チア−３，８−ジアザ−スピロ［４．５］デス−２−エン８−オキシドＡＦ４０６の合成
【化４５】
2010184946.tif 000059
ｍ−クロロ過安息香酸、ｍＣＰＢＡ（１．４０ｇｒ、８．１１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶かした溶液を、ＡＦ１５０（Ｓ）（１．４５ｇｒ、７．８８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶かした溶液に徐々に加えた。反応混合物は、室温で一晩攪拌した。反応混合物のクロマトグラフィーは、天然酸化アルミニウムのカラム上であり（Ｍｅｒｃｋ）（メタノール：クロロホルム１／４９）、ＡＦ４０６（０．７５ｇｒ）を結晶状の固体として得た。試料は酢酸エチルから結晶化させた。非常に吸湿性の固体を得た。融点１３０〜１３２℃（分解点１４５〜１５９℃）；
2010184946.tif 000060
【実施例１６】
【０１８７】
２−メチル−１−チア−３，８−ジアザ−スピロ［４．５］デス−２−エン、ＡＦ４００の合成
【化４６】
2010184946.tif 000061
ＡＦ４０６（２ｇｒ、０．０１ｍｏ１）をクロロホルム（１０ｍｌ）に溶かした溶液を、氷−塩浴中で−１０℃〜−５℃に冷却した。ＦｅＣｌ２（１Ｍ、０．７ｍｌ）の溶液を加え、２相の反応混合物を４．５時間攪拌した。反応混合物の色は時間と共に、暗緑色から暗橙色−褐色に変化する。冷却した反応混合物に、石油−エーテル（１０ｍｌ）、エチレンジアミン（６００ｍｇ、０．０１ｍｏ１）及び２Ｎの水酸化ナトリウム（１０ｍｌ、０．０２ｍｏｌ）の混合物を慎重に加えた。水相のｐＨは１３であった。有機相を分離し、水性相はクロロホルムを用いて抽出し、５ＮのＨＣｌを用いてｐＨ＝９まで酸性にし、再度クロロホルムを用いて抽出した。すべての有機分画を合わせ、炭酸カリウムで乾燥させ、濾過し蒸発させた。残留物のクロマトグラフィー［シリカ−ゲル（ＲＩＥＤＥＬ  ＤＥ  Ｈａｅｎ  ３１６０７）、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４Ｏ  ９０／９／１］によって、ＡＦ４００を得た。融点４０℃；
2010184946.tif 000062
【実施例１７】
【０１８８】
２−メチル−８−メチル−ｄ３−１−チア−３，８−ジアザ−スピロ［４．５］デス−２−エン、ＡＦ４０２の合成
【化４７】
2010184946.tif 000063
４−ピコリルアミン（５０ｇ、０．４６２ｍｏｌ）をメタノール（２００ｍｌ）に溶かした攪拌冷却（氷−水浴）溶液に、無水酢酸（７５ｇ、０．７３５ｍｏｌ）をゆっくり（１時間）加えた。添加中、温度は１０〜１５℃に保った。反応混合物は室温で一晩放置した。ＴＬＣ［シリカ、クロロホルム／メタノール／アンモニア（３３％）９０：１０：１（ｖ／ｖ）］によって、Ｒｆ〜０．４で１つのスポットが示された。生成物、Ｎ−ピリジン−４−イルメチル−アセトアミドは単離せず、次のステップ用に処理した。
【０１８９】
反応混合物の一部（４３ｍｌ）を蒸発させた。アセトアミド塩は、黄色い油（１４．５ｇ）として得た。油の一部（１．９ｇ、≦０．０６ｍｏｌ）を、メタノール（４０ｍｌ）に溶かし、窒素雰囲気下で攪拌し、光から保護した。ヨードメタン−ｄ３（１０ｇ、０．０７ｍｏ１）を加え、反応混合物の温度は１５〜２５℃に保った。反応混合物は室温で一晩放置し、次いでエーテル（２×２００ｍｌ）を用いて２回粉砕した。４−（アセトアミド−メチル）−１−メチル−ｄ３−ピリジニウムヨウ化物を、黄色い固体として得た。ＴＬＣ［シリカ、クロロホルム／メタノール／アンモニア（３３％）９０：１０：１（ｖ／ｖ）］によって、Ｒｆ〜０．０５］で１つのスポットが示され、これをさらには精製せずに次のステップで還元した。
【０１９０】
ヨウ化ピリジニウム塩をメタノール（４０ｍｌ）に溶かした冷却（氷−水浴）溶液に、窒素雰囲気下において、水素化ホウ素ナトリウム（３．９ｇｒ、０．２ｍｏｌ）を徐々に加え（２時間）、温度が１５〜３０℃に保たれるようにし、反応混合物は室温でさらに２時間攪拌し、一晩攪拌せずに放置した。溶媒は蒸発させた。Ｎ−（１−メチル−ｄ３−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン−４−イルメチル）−アセトアミドを、粘性のある黄色い油（８．５ｇ）として得た。
2010184946.tif 000064
【０１９１】
追加の漏斗及び塩化カルシウム製チューブをその先端に有する凝縮器を備えた三つ口丸底フラスコ（２５０ｍｌ）中に、テトラヒドロピリジンアセトアミド（８．５ｇ）を乾燥アセトニトリル（７０ｍ１）に溶かした溶液を加えた。攪拌溶液に、五硫化リン（６．７ｇｒ、０．０３ｍｏｌ）を加え、次に１０〜１５分間で追加の漏斗から加えた、トリエチルアミン（１２ｇｒ、０．１２ｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を還流下で５時間加熱し、次いで１５℃で３日間放置した。溶液を蒸発させ、１０％水性炭酸カリウムを用いて塩基性にし、次いでクロロホルムを用いて抽出した。有機相を乾燥させ、蒸発させた。粗製の黒いＮ−（１−メチル−ｄ３−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン−４−イルメチル）−チオアセトアミド（６．６２ｇｒ、０．０３６ｍｏｌ）を得た。
2010184946.tif 000065
【０１９２】
フラスコ（１５０ｍ１）中において、ポリリン酸（３０ｇ）を粗製チオアセトアミド（６．５ｇｒ）に加えた。反応混合物を攪拌し、３．５時間で１７０℃に加熱した。この熱反応混合物を、攪拌した２５％水性炭酸ナトリウム（１５０ｍｌ）にゆっくり注いだ。２５％水性炭酸ナトリウム（５０ｍｌ）を、反応フラスコ中の残留物に加え、２つの溶液を合わせた。５０％水性水酸化ナトリウム（６ｍｌ）を加えることによって、塩基性を上昇させ、反応混合物はクロロホルムを用いて抽出した。有機相を分離し、乾燥させ、蒸発させた。残留物を石油エーテル（１００ｍｌ）に溶かして、１２時間後−２０℃において、溶液及び少量の不溶性物質を得た。石油エーテル溶液を蒸発させ、得られた油（５ｇ）を減圧下で蒸留して（ｂ．ｐ．５０〜５３℃、０．２ｍｍＨｇ）、ＡＦ４０２（２．１５ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を得た。
2010184946.tif 000066
【実施例１８】
【０１９３】
Ｎ−［（２，８−ジメチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−メチル−アミン］−Ｎ−オキシド、ＡＦ６００の合成
【化４８】
2010184946.tif 000067
Ｎ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（０．８５ｇｒ、０．０１ｍｏｌ）を、エタノール（１３．５ｍ１）に溶かした溶液に、酢酸ナトリウム（０．８４ｇｒ、０．０１ｍｏｌ）を加えた。白い沈殿を得た。２，８−ジメチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（１．６２ｇｒ、０．００８８ｍｏｌ）を、エタノール（７ｍｌ）に溶かした溶液を加え、混合物は室温で４．５時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、ジクロロメタン（６７５ｍｌ）を加え、得られた溶液を２０％水性炭酸ナトリウムで洗浄した。有機相を乾燥させ、溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ９０／１０／１）によって、２つの異性体の混合物［低極性異性体（Ａ）／高極性異性体（Ｂ）１：４］として、ＡＦ６００（１．５ｇｒ）を得た。
2010184946.tif 000068
【実施例１９】
【０１９４】
Ｎ−［（２，８−ジメチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−ベンジル−アミン］−Ｎ−オキシド、ＡＦ６０４の合成
【化４９】
2010184946.tif 000069
Ｎ−ベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩（１．２７ｇｒ、０．００８ｍｏｌ）を、エタノール（６ｍ１）に溶かした溶液に、酢酸ナトリウム（０．６５ｇｒ、０．００８ｍｏｌ）を加えた。白い沈殿を得た。２，８−ジメチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（１．３ｇｒ、０．００７２ｍｏｌ）を、エタノール（３．５ｍｌ）に溶かした溶液を加え、混合物は室温で４時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、ジクロロメタン（４５０ｍｌ）を加え、得られた溶液を２０％水性炭酸ナトリウムで洗浄した。有機相を乾燥させ、溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ９０／１０／１）によって、２つの異性体の混合物［低極性異性体（Ａ）／高極性異性体（Ｂ）１：８］として、ＡＦ６０４（１．８１ｇｒ）を得た。
2010184946.tif 000070
【実施例２０】
【０１９５】
Ｎ−［（２，８−ジメチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−イソプロピル−アミン］−Ｎ−オキシド、ＡＦ６０５の合成
【化５０】
2010184946.tif 000071
ｎ−イソプロピルヒドロキシルアミン塩酸塩（１．８４ｇｒ、０．０１ｍｏｌ）を、エタノール（７ｍ１）に溶かした溶液に、酢酸ナトリウム（０．９１ｇｒ、０．０１１ｍｏｌ）を加えた。白い沈殿を得た。２，８−ジメチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（１．８４ｇｒ、０．０１ｍｏｌ）を、エタノール（４ｍｌ）に溶かした溶液を加え、混合物は室温で４．５時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、ジクロロメタン（５００ｍｌ）を加え、得られた溶液を２０％水性炭酸ナトリウムで洗浄した。有機相を乾燥させ、溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ９０／１０／１）によって、２つの異性体の混合物［低極性異性体（Ａ）／高極性異性体（Ｂ）１：４］として、ＡＦ６０５（１．５ｇｒ）を得た。
2010184946.tif 000072
【実施例２１】
【０１９６】
Ｎ−［（２−エチル−８−メチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−メチル−アミン］−Ｎ−オキシド、ＡＦ６０１の合成
【化５１】
2010184946.tif 000073
Ｎ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（０．９５ｇｒ、０．０１１ｍｏｌ）を、エタノール（１４．３ｍｌ）に溶かした溶液に、酢酸ナトリウム（０．９４ｇｒ、０．０１１ｍｏｌ）を加えた。白い沈殿を得た。２−エチル−８−メチル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（２．ｌｇｒ、０．０１ｍｏｌ）を、エタノール（７．４ｍｌ）に溶かした溶液を加え、混合物は室温で５．５時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、ジクロロメタン（７７０ｍｌ）を加え、得られた溶液を２０％水性炭酸ナトリウムで洗浄した。有機相を乾燥させ、溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ９０／１０／１）によって、２つの異性体の混合物［低極性異性体（Ａ）／高極性異性体（Ｂ）］として、ＡＦ６０１（２．４ｇｒ）を得た。
2010184946.tif 000074
【実施例２２】
【０１９７】
Ｎ−［（２−メチル−８−フェニル−１−オキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デス−３−イリデン）−メチル−アミン］−Ｎ−オキシド、ＡＦ６０２の合成
【化５２】
2010184946.tif 000075
Ｎ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（０．３３ｇｒ、０．００４ｍｏｌ）を、エタノール（５．４ｍｌ）に溶かした溶液に、酢酸ナトリウム（０．３２ｇｒ、０．００４ｍｏｌ）を加えた。白い沈殿を得た。８−メチル−２−フェニル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン（０．８５ｇｒ、０．００４ｍｏｌ）を、エタノール（３ｍｌ）に溶かした溶液を加え、混合物は室温で４．５時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、ジクロロメタン（２５０ｍｌ）を加え、得られた溶液を２０％水性炭酸ナトリウムで洗浄した。有機相を乾燥させ、溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ９０／１０／１）によって、２つの異性体の混合物［低極性異性体（Ａ）／高極性異性体（Ｂ）１：３］として、ＡＦ６０２（１３０ｍｇ）を得た。
2010184946.tif 000076
【実施例２３】
【０１９８】
ジヒドロ−５’−メチルスピロ［１−アザバイシクロ［２．２．２］オクタン−３，５’−（４’Ｈ）−３’−イリデン−メチルアミン−Ｎ−オキシド、ＡＦ６０３の合成
【化５３】
2010184946.tif 000077
Ｎ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１．１７ｇｒ、０．０１４ｍｏｌ）を、エタノール（１５ｍｌ）に溶かした溶液に、酢酸ナトリウム（１．１５ｇｒ、０．０１４ｍｏｌ）を加えた。白い沈殿を得た。ジヒドロ−５’−メチルスピロ［１−アザバイシクロ［２．２．２］オクタン−３，５’−（４’Ｈ）−３’−オン（２．１ｇｒ、０．０１ｍｏｌ）を、エタノール（７．４ｍｌ）に溶かした溶液を加え、混合物は室温で４．５時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、ジクロロメタン（７７０ｍｌ）を加え、得られた溶液を２０％水性炭酸ナトリウムで洗浄した。有機相を乾燥させ、溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ９０／１０／１）によって、２つの異性体の混合物［低極性異性体（Ａ）／高極性異性体（Ｂ）］として、ＡＦ６０１（０．４５ｇｒ）を得た。
2010184946.tif 000078
【実施例２４】
【０１９９】
２−エチル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−チオン、ＡＦ５１０の合成
【化５４】
2010184946.tif 000079
ＡＦ２６７（２１４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）とＬａｗｅｓｓｏｎ試薬（２８０ｍｇ、０．６９２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍｌ）に溶かした混合物を、還流下で１７時間加熱した。溶媒を除去し、残留物を濃水性炭酸ナトリウム（０．５ｍｌ）に溶かし、次いで酢酸エチルを用いて抽出した。抽出物を乾燥させ、溶媒を蒸発させた。最初にトルエンから、次いでアセトニトリルから再結晶化させた残留物（２５０ｍｇ）によって、純粋なＡＦ５１０を得た。
2010184946.tif 000080
【実施例２５】
【０２００】
４−ベンジル−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ２８２の合成
【化５５】
2010184946.tif 000081
磁気攪拌装置及びＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ、並びに２つの滴下漏斗を備える三つ口フラスコ中に、メルカプト酢酸（８ｍｌ、０．２４２ｍｏｌ）を、ベンゼン（７５ｍｌ）に溶かした溶液を、加熱還流した。臭化ベンジル（１３ｍｌ、０．２４２ｍｏｌ）及び１−メチル−４−ピペリドン（９．３ｍｌ、０．０８ｍｏｌ）を一滴ずつ同時に加え（４５分間）、反応混合物をさらに１．５時間還流させた（２ｍｌの水を回収した）。反応混合物を室温に冷却し、水（３０ｍｌ）を加え、有機相を分離し、乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残留物のフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、クロロホルム中に１０％メタノール）によって、ＡＦ２８２（３．８ｇ）を得た。
2010184946.tif 000082
【実施例２６】
【０２０１】
４−（２，４−ジメトキシベンジル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ２８６の合成
【化５６】
2010184946.tif 000083
磁気攪拌装置及びＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋを備える三つ口フラスコ中において、１−メチル−４−ピペリドン（０．２７ｍｌ、２．４ｍｍｏｌ）、２，４−ジメトキシベンジルアミン塩酸塩（０．７２ｇｒ、３．５ｍｍｏｌ）及びメルカプト酢酸（０．２４ｍｌ、３．５ｍｍｏｌ）を、ベンゼン（５ｍｌ）に溶かした溶液を、３時間還流させた。反応混合物を室温に冷却し、水（１０ｍｌ）を加え、有機相を分離した。水性相のｐＨは、２．５Ｎ水性水酸化ナトリウム溶液を用いて１０に調整し、次いで水性相はクロロホルムを用いて抽出した。有機相を組み合わせ、乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残留物のフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、クロロホルム中に１０％メタノール）によって、ＡＦ２８６（１４０ｍｇ、収率１５％）を得た。
2010184946.tif 000084
【実施例２７】
【０２０２】
４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−８−メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン、ＡＦ２８４の合成
【化５７】
2010184946.tif 000085
ＡＦ２７７（２．６０ｇｒ、１３．９７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６０ｍｌ）に溶かした溶液に、トリエチルアミン（１．９５ｍｌ、１３．９９ｍｍｏ１）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル重炭酸塩（３．８５ｍｌ、１６．７６ｍｍｏｌ）、及び４−ジメチルアミノピリジン（１．７１ｇｒ、１３．９９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を一晩室温で攪拌し、次いで溶媒を蒸発させた。残留物のフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ８０／２０／１）によって、ＡＦ２８４（４ｇｒ、＞９５％収率）を得た。
2010184946.tif 000086
【実施例２８】
【０２０３】
パラフィン油中のＡＦ１５０（Ｓ）の配合物＋安定性試験
薬剤として許容可能なパラフィン油（パラフィン油Ｅｕｒ．Ｐｈ）中の１０％ｗ／ｗのＡＦ１５０（Ｓ）の安定性を、トコフェロールの有無の下で、大気又は窒素雰囲気下において４０℃で調べた。試料は２カ月保存した後に分析した。ＴＬＣ、ＨＰＬＣ及びＧＣを使用して、考えられる分解生成物の量を検出し測定した。色の変化は、同じ条件下においてトコフェロールの有無の下で、パラフィン油と比較して測定した。ＡＦ１５０（Ｓ）は、パラフィン油の配合物中では安定性があった。ＡＦ１５０（Ｓ）の加水分解によって得られる分解生成物、チオールアミド誘導体（Ｍ＋２０２）は、任意の試験試料中において、０．１％を超えては検出されなかった。トコフェロールを含まない試料中では、わずかな黄色を観察したが、ＡＦ１５０（Ｓ）中０．５％ｗ／ｗのトコフェロールを含む試料中では、発色しなかった。
【実施例２９】
【０２０４】
ＡＦ１５０（Ｓ）クエン酸塩＋安定性試験
ＡＦ１５０（Ｓ）（３０．１３ｇｒ、１６３．８ｍｍｏｌ）を、２−プロパノール（６０ｍｌ）及びテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）に溶かした溶液に、無水クエン酸（２９．５１ｇｒ、１５３．５ｍｍｏｌ）を２−プロパノール（２００ｍｌ）に溶かした溶液を、４５分間一滴ずつ加えた。生成した混合物は、さらに２時間アルゴン雰囲気下において室温で攪拌し、次いで生成した白い沈殿を濾過し、アルゴン雰囲気下においてヘキサンで洗浄した。その白い固体を、Ｐ２Ｏ５を含む乾燥用ピストルに導入し、乾燥用ピストルを空にし（０．２ｍｍＨｇ）、次いで温度を６時間で５５〜６０℃に加熱した。ＡＦ１５０（Ｓ）クエン酸塩（５３．８ｇ、収率８７．６％）を得た。ＴＬＣ（メタノール中に２％ＮＨ４ＯＨ）Ｒｆ０．５７；融点１４６．５〜１４７．５℃；
2010184946.tif 000087
【０２０５】
無水条件下において保存した参照標準と対照的に、様々な条件下において保存した（６０℃で３カ月；３カ月間室温で大気中）、この塩の試料のＨＰＬＣ分析によって、塩が非常に安定性があることが示された。
【実施例３０】
【０２０６】
化合物の脳への移行性
１．ＡＦ２６７Ｂの解離定数（ｐＫａ）：ＡＦ２６７Ｂの遊離塩基型（非イオン化）は脳血液関門を通過する。ＡＦ２６７ＢのｐＫａは７．８であることから、下記に示すとおり、ｐＨ７．３５の脳脊髄液（ＣＳＦ）中ではＡＦ２６７Ｂの２６．７％が遊離塩基型であると算出された。このことは、遊離塩基は脳血液関門を通過する種であることからＡＦ２６７Ｂが高い脳への移行性を有することを示す。それと比較して、ＣＮＳに活性のある他の既知の化合物には、例えば塩基がキヌクリジニルの場合、ｐＫａが９以上のものがある（３級アミンは高塩基性である）。このような化合物は適性ｐＨ７．３５において非イオン型の割合はたった２．２％である。これはＡＦ２６７Ｂがこのような化合物と比較して高い脳への移行性を示すことを示す。これらの計算は次に基づくものである。
ＢＨ＋→Ｂ＋Ｈ＋
％Ｂ＝１００−％ＢＨ＋＝１００−１００／［１＋１０（ｐＨ-ｐＫａ）］
ｐＫａ（ＡＦ２６７Ｂ）＝７．８
ｐＨ（ＣＳＦ）＝７．３５
％Ｂ＝１００−１００／［１＋１０−０．４５］
％Ｂ＝２６．２％
塩基Ｂ’のｐＫａが９．０の場合
％Ｂ’＝１００−１００／［１＋１０−１．６５］
％Ｂ’＝２．２％
【０２０７】
２）ラットにＡＦ２６７Ｂ（２ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）を投与し、脳内薬剤濃度と血漿中薬剤濃度はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した。次の２つの比較検討により、ＡＦ２６７Ｂは血漿と比較して脳への高い移行性を有することが明らかとなった。
ａ）無限大まで外挿したときの血中濃度下面積（ＡＵＣ）について、全脳中（ｎｇ／ｇｒ）と血漿中（ｎｇ／ｍｌ）の比較を静脈内投与（ｉｖ）（１ｍｇ／ｋｇ）及び経口投与（ｐｏ）（２ｍｇ／ｋｇ）でそれぞれで行った結果、脳と血漿のＡＵＣ比（脳内ＡＵＣ／血漿中ＡＵＣ）は雄で１．７９（ｉｖ）及び２．４３（ｐｏ）、雌で１．３２（ｉｖ）及び１．２５（ｐｏ）であることが分かった。このように血漿中よりも脳中に大量の化合物が認められた。
ｂ）脳（ｎｇ／ｇ）と血漿（ｎｇ／ｍｌ）（ｐｏ）の最高血中濃度（Ｃｍａｘ）の比を比較した結果、雄では化合物の２５％が、雌では化合物の１６％が脳中に認められた。この計算は脳重量（２ｇ）に対する全血漿量（１４ｍｌ）に基づいて行われた。これは脳中に高い割合で化合物が存在することをも示す。
【０２０８】
３）マウスの脳組織におけるＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂ（１００μｍｏｌ／ｋｇ、ｐｏ）の生体外での研究（脳組織に添加した標準化合物（ＡＦ２６１）と比較したＡＦ１５０（Ｓ）又はＡＦ２６７ＢのＧＣ分析、或いはトリチウムで標識したオキソトレモリン−Ｍのような放射性ムスカリン化合物を脳組織から置換する実験）もまた血漿と比較して明らかに高い脳への移行性を示す（ＧＣ及び結合試験）。ＡＦ１５０（Ｓ）：Ｔｍａｘ＝１〜１０分；Ｔ１／２＝２１及び５３分（二相性）、ｉｖ；ＭＲＴ（平均保持時間）＝５０分、ｉｖ，ｐｏ．ＡＦ１５０（Ｓ）は速やかに脳に移行する（１分，ｉｖ）；Ｃｍａｘ＝４０．７μｍｏｌ／ｋｇ（経口投与量から脳内へ４０．７％）；ＡＦ２６７Ｂ：投与後２〜２４０分の間に脳中に検出され、ピークは２０〜３０分、ＭＲＴ＝１２８分；Ｃｍａｘ＝３６．４μｍｏｌ／ｋｇ（経口投与量から脳内へ３６．４％）。
【実施例３１】
【０２０９】
ビーグル犬に対するＡＦ２６７Ｂ投与後のＡＦ２９２の検出
この実験の目的は、ＡＦ２６７Ｂ（１．５、３及び６ｍｇ／ｋｇ、雄イヌ及び雌イヌに経口投与）の１３週連日単回亜慢性投与後におけるイヌ血漿中のＡＦ２６７Ｂ並びにＡＦ２９２（ＡＦ２６７Ｂの代謝物）濃度を測定することである（以下に示す方法に従った）。
【０２１０】
内部標準（ＡＦ２６１）：２−メチル−８メチル−１−チア−４，８−ジアザ−スピロ［４．５］デカン−３−オン；分子量２００。分析に使用する血漿試料はこの実験におけるイヌの生存中のものを使用した。ＡＦ２６７ＢとＡＦ２９２の濃度は以下の条件により測定した。
カラム：Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ  ＳＴＡＲ  ＲＰ１８ｅ（４×５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：溶媒Ａ：  １ｇ／ｌ（ＮＨ４）２ＣＯ３（Ｈ２Ｏ）
溶媒Ｂ：  メタノール
ループ／注入量：  ５０μｌ／１０μｌ
イオン化法：      大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）；陽イオン
シースガス圧：    窒素：７０ｐｓｉ
キャピラリー温度：２５０℃
噴霧電圧：        〜３．６ｋＶ
分析法：          ＳＲＭ（選択反応検出）
ＡＦ２９２：ｍ／ｚ：  ２０１．０［ＣＥ（ＣＥ＝衝突エネルギー３０Ｖ）］→ｍ／ｚ：７０．０（０．０〜５．２ｍｉｎ）］
ＡＦ２６１：ｍ／ｚ：  ２０１．０（ＣＥ３５Ｖ）→ｍ／ｚ：７０．０（５．２〜６．２ｍｉｎ）；内部標準
ＡＦ２６７Ｂ：ｍ／ｚ：２１５．０（ＣＥ３０Ｖ）→ｍ／ｚ：７０．０（６．２〜１０．０ｍｉｎ）
衝突ガス（ＣＩＤ）：    ２．５ｍＴｏｒｒ／Ａｒｇｏｎ
【０２１１】
結果：
ＡＦ２６７Ｂの１３週反復連日投与後、血中消失半減期は１〜２時間、Ｔｍａｘ＝１．５〜３時間、Ｃｍａｘ（ｎｇ／ｍｌ）＝１６２〜１３５２（線形態、用量依存的）及びＡＵＣ（０〜ｔ）（ｎｇ＊ｈ／ｍｌ）＝７１２〜３９４７（線形態、用量依存的）であった。ＡＦ２９２の血中Ｔ１／２は約１０倍長く（〜９〜２０時間）、Ｔｍａｘ＝３時間、Ｃｍａｘ（ｎｇ／ｍｌ）＝１３６〜５５５及びＡＵＣ（０〜ｔ）（ｎｇ＊ｈ／ｍｌ）＝６１６〜２４５１（線形態、用量依存的）であった。ＡＦ２６７Ｂと比較すると、ＡＦ２９２の薬物動態プロファイルは次のように要約できる。ＡＦ２９２の血中Ｔ１／２はＡＦ２６７Ｂより３〜５倍長い（例えばＡＦ２６７Ｂの雌における血中Ｔ１／２が１０．６時間であるのに対し、ＡＦ２９２の血中Ｔ１／２は１０．６時間である）。ＡＦ２９２のＣｍａｘはＡＦ２６７Ｂの５０〜９０％である。ＡＦ２９２のＣｍａｘは明らかにＡＦ２６７ＢのＣｍａｘに対して右側にシフトする（ＡＦ２６７Ｂに対しＡＦ２９２の血中への出現が遅延することによる）。この知見により、ＡＦ２６７ＢとＡＦ２９２は、どちらか単独の場合よりも長い血中Ｔ１／２を呈する併用薬剤を協同して形成することが認識されるであろう。このような併用薬剤はそのまま投与し得る。
【実施例３２】
【０２１２】
Ｍ１  ｍＡＣｈＲを安定的に導入した培養細胞及びラット海馬と大脳皮質の神経細胞の初代培養における、α−ＡＰＰの分泌に対する被験化合物の効果
細胞は６ウェルのプレートに入れ、その後３〜５日経過したものを使用した。細胞は無血清培地中で二度洗い、ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂ又はＡＦ２９２と共に３７℃、１時間の条件で培養した。この細胞培養液を様々な濃度の被験化合物（１０−６〜１０−３Ｍ）、及びカルバコール（１０−４Ｍ）に１時間曝露させた。培養液のみに曝露した細胞を対照群と呼ぶ。カルバコール、リバスチグミン及びデプレニルは参考化合物として使用した。
【０２１３】
細胞の上清をプロテアーゼ阻害剤カクテル（５単位／ｍｌのアプロチニン、５ｍｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、５ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１０−４Ｍのフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤）；シグマ、ＵＳＡ）を含むエッペンドルフチューブに集めた。集められた培養液はセントリコンチューブ（Ａｍｉｃｏｎ、ベバリー、マサチューセッツ州、ＵＳＡ）で濃縮し、α−ＡＰＰ分泌の測定のために凍結保存した。等量のタンパク質（５０〜１００μｇ）を入れ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。ニトロセルロース膜でのウェスタンブロットの後に脱脂乳で反応を停止させ、抗アルツハイマー前駆タンパク質Ａ４モノクローナル抗体２２Ｃ１１（０．２５μｇ／ｍｌ；ベーリンガーマンハイム、ドイツ）で標識し４℃、２４時間で検出した。このニトロセルロース膜を洗い、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチ、ＵＳＡ）と共に室温で２時間培養した。その後よく洗い流し、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）検出システム（アマシャム）で染色した。露光したフィルムにおける免疫反応したバンドの定量は、ビデオ画像デンシトメトリー（ゲル−エイドソフトウェア；ガライＣｏ．、イスラエル）を用いて行った。ＡＰＰ濃度は基本レベルの１０倍で表した。Ｍ１  ｍＡＣｈＲを安定に導入した培養細胞でのα−ＡＰＰ誘発分泌を１０−４Ｍカルバコールに対する最大反応値の％としても算出した。
【０２１４】
Ｍ１  ｍＡＣｈＲを発現している細胞のα−ＡＰＰ分泌は、アゴニストによる刺激により用量依存的に増加した。最大の増加は１０−４ＭのＡＦ２６７Ｂ（対照の約６倍増加）で得られ、カルバコールで誘発した最大増加と同等であった。ムスカリン性拮抗薬のアトロピンを１０−５Ｍで添加するとＡＦ２６７Ｂで誘発したα−ＡＰＰ分泌を完全に阻害した。これはＡＦ２６７Ｂの効果がＭ１  ｍＡＣｈＲを通して伝達されることを示す。幾つかの実験の中でＡＦ２６７Ｂの活性をＡＦ１５０（Ｓ）の活性と比較した。その結果、ＡＦ２６７ＢはＡＦ１５０（Ｓ）よりも有効且つ効力が強いことが示された（ＡＦ２６７Ｂはカルバコールの最大反応と同等であるのに対し、ＡＦ１５０（Ｓ）はカルバコールの最大反応の５０％）。さらに、α−ＡＰＰ分泌に対する効力の弱い光学異性体であるＡＦ２６７ＡはＡＦ１０２Ｂと同様な効力であるが、ＡＦ２６７Ｂはこれのラセミ化合物（ＡＦ２６７）又はＡＦ１０２Ｂより有効で且つ効力が強い（カルバコールの最大反応の５０％）。
【０２１５】
リバスチグミンとデプレニルがＡＰＰ濃度の増加に有効ではないのに対し、ＡＦ２９２はＡＰＰ増加の活性化の点でＡＦ２６７Ｂ（ＥＣ５０＝３μＭ）及びカルバコールと同等の効力を有する。アトロピン（１０μＭ）の添加によりカルバコール、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ２９２に誘発されたＡＰＰの分泌が阻害されたことは、これらのアゴニストの効果がＭ１  ｍＡＣｈＲを通して伝達されることを示す。
【０２１６】
総合すれば、これらの結果はＡＦ２６７Ｂが選択的Ｍ１ムスカリンアゴニストであり、さらにそれ自体が選択的Ｍ１ムスカリンアゴニストであり、弱いＭ３ムスカリンアンタゴニスト作用であるＡＦ２９２にとって、「ドラッグ−プロドラッグ」であることを示す。ＡＦ２６７ＢとＡＦ２９２は、どちらか単独の場合よりも長い血中消失半減期及びムスカリン活性を呈する併用薬剤を協同して形成する。
【０２１７】
上述の試験を用いたところ、その試験条件でＡＦ７００及びＡＦ７０４もまたＡＰＰ濃度増加に効果があることが明らかとなった（１００μＭでカルバコールの最大効果の５０％）。
【０２１８】
様々なムスカリンアゴニストのＡＰＰ分泌濃度に対する効果について、海馬、大脳皮質（両方主にＭ１  ｍＡＣｈＲを含む）及び脊髄（Ｍ２受容体を含む）から調製したラットの初代培養を用いて調べた。この研究ではカルバコール（非選択的ムスカリンアゴニスト）、オキソトレモリン（＞Ｍ２選択的ムスカリンアゴニスト）、フィソスチグミン（コリンエステラーゼ阻害剤）、ＡＦ１０２Ｂ、ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂ（Ｍ１選択的ムスカリンアゴニスト）のＡＰＰ分泌に対する効果を調べた。
【０２１９】
初代培養細胞はＳＤラットの胎仔から作成した。この実験は「実験動物のケアと使用に関する指針」（全米研究評議会、ワシントン、１９９６）というガイドラインに従い、海馬、大脳皮質、及び脊髄の培養細胞を用いて行った。
【０２２０】
脳組織、海馬、大脳皮質及び脊髄は１３〜１４又は１８〜１９日齢ラット胎仔の各々からフリーハンドの切開により摘出し、６ｍｇ／ｍｌグルコースを含む冷却したＧｅｙの平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）に移した。髄膜の除去後、切開した組織は細胞懸濁液を調製するためにパスツールピペットを用い機械的に分離した後、トリプシンＤＮＡａｓｅ溶液で処理した。分離した細胞は６ｍｇ／ｍｌグルコース、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸塩、１０００ＩＵ／ｍｌペニシリンを含むダルベッコＭＥＭ培地（バイオロジカルインダストリー、Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）に移した。この細胞懸濁液はポリ−Ｌ−リジン（１ｍｇ／ｍｌ）プレコートの１２ウェル組織プレートに海馬は４×１０５細胞／ウェルの濃度、そして大脳皮質細胞は６×１０５細胞／ウェルの濃度で播種した。細胞培養液は３７℃のインキュベーター（９５％空気及び５％ＣＯ２）で２週間維持した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける１１〜１４日目の細胞は良く洗浄した後、以下の詳細のように様々な処理を施した。海馬及び大脳皮質細胞は１００μＭ濃度の実験対象リガンドと共にマグネシウム非含有Ｌｏｃｋｅ−ＨＥＰＥＳ緩衝塩水中で１時間インキュベートした。この緩衝塩水の組成は１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．６ｍＭ  ＫＣｌ、３．６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、５．６ｍＭグルコース及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳであり、ｐＨ７．４で０．０２％ＢＳＡを含む。受容体の阻害実験では、ムスカリンアゴニストはアンタゴニストであるピレンゼピン（１０μＭ）と共培養した。緩衝塩水単独のみに曝露した細胞を対照群とした。インキュベート期間の最後に調整された培養液を取り出し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（上に明記した）を含むエッペンドルフチューブに移した。上清はセントリコン−３０コンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ，ＩＮＣ．、マサチューセッツ州、ＵＳＡ）を用いた遠心分離（２５００×ｇ、４℃下で４５分）により濃縮し、ＡＰＰ濃度測定まで−７０℃で凍結した。
【０２２１】
試料中のタンパク質量の測定をＢｉｏ−Ｒａｄアッセイによるマイクロプレート内で行った。各試料を等量（４０μｇ／ｌａｎｅ）ずつ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。電気泳動の完了後、ニトロセルロース膜にゲルをブロットし、脱脂乳で反応を停止させ、ＡＰＰのバンドを抗アルツハイマー前駆タンパク質Ａ４（モノクローナル抗体２２Ｃ１１、ベーリンガーマンハイム）で標識し、さらにペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチ、Ｐ）で２次標識した。その後バンドをよく洗い流し、ＴＭＢ（単一溶液、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ．、カルフォルニア）で染色するか、又はＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（デュポン、ＮＥＮ）で現像した後、オートラジオグラフィーフィルム（ハイパーフィルムＥＣＬ、アマシャム）に露光した。全ＡＰＰバンドの定量は、ビデオ画像デンシトメトリー（ゲル−エイドソフトウェア；ガライ、イスラエル）を用いて行った。得られたＡＰＰのデータは、Ｌｏｃｋｅ緩衝塩水単独で培養した細胞である対照群の倍の強度で表した。
【０２２２】
ラット大脳皮質及び海馬の初代培養細胞は、非選択的アゴニストであるカルバコール（ＣＣｈ）及びオキソトレモリン（＞Ｍ２選択的）、並びにＭ１ムスカリンアゴニストであるＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂ、そしてコリンエステラーゼ阻害剤であるフィソスチグミンにすべて１００μＭ濃度で曝露した。Ｍ１アゴニストは対照群と比較して、海馬と大脳皮質の両細胞系のＡＰＰ分泌を有意に増加させた。大脳皮質の培養細胞ではＡＰＰ濃度が対照群の２．５〜３．１倍の範囲で増加し、海馬の培養細胞では対照群の１．８〜２．８倍の範囲で増加した。ＡＦ１５０（Ｓ）とＡＦ２６７ＢはＣＣｈよりさらに効力が強かった（それぞれ対照群の２．８倍及び１．５倍）。オキソトレモリンとフィソスチグミンは活性がなかった。ＡＦ１５０（Ｓ）、ＡＦ２６７Ｂ及びＣＣｈにより誘発されたＡＰＰの分泌は、Ｍ１選択的アンタゴニストであるピレンゼピン（１０μＭ）により完全に阻害された。これらのアゴニストは神経細胞にＭ１  ｍＡＣｈＲを含まない脊髄の培養細胞においてＡＰＰを活性化しなかった。
【実施例３３】
【０２２３】
ニューロトロフィンの存在又は非存在下におけるムスカリンアゴニストの神経突起の伸長反応
Ｍ１  ｍＡＣｈＲを導入したラットの褐色細胞腫細胞はガーウィッツ他（Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ６、４８５、１９９５）の方法により培養した。神経突起の伸長の測定のために、６ウェルのプレートに播種した後３〜５日経過した細胞を使用した。培養開始から１日経過時に成長因子を添加し、最後の２４時間の間にムスカリンアゴニストを添加した。
【０２２４】
倒立顕微鏡下で細胞を観察した。各ウェルの数百の細胞からなる３つの無作為な視野から、細胞の直径より長い神経突起を有する細胞の割合を算出した。結果は神経突起を有する細胞の割合で表した。実験は３倍に増殖させた細胞を用いて行った。プレートに細胞を播種して１日後にＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の両方を添加した。ムスカリンアゴニストは細胞数をカウントする２４時間前に添加した。カルバコールに対するＡＦ１０２Ｂ、ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂのニューロトロフィン様作用、並びにこれらとＮＧＦ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及び上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）のようなニューロトロフィンとの相互作用を評価した。ＡＦ２６７Ｂでの最大反応が６０％、ＡＦ１５０（Ｓ）での最大反応が３０％であるのと比較して、ＣＣｈでの最大反応は８０％であった。Ｍ１  ｍＡＣｈＲを導入したラット褐色細胞腫細胞におけるＮＧＦでの前処理は、すべての実験対象リガンドに対するニューロトロフィン様反応を相乗的に増大し、さらに効果も増加させた。
【０２２５】
Ｍ１  ｍＡＣｈＲを導入したラット褐色細胞腫細胞の細胞反応の中には、一方ではＮＧＦやｂＦＧＦに対する反応（分化誘導）、他方では上皮細胞増殖因子、ＥＧＦに対する反応（増殖促進）という目に見える違いが認められた。ＥＧＦの増殖促進作用の特徴はムスカリンアゴニストの存在下で変化を見せ、ＥＧＦとムスカリンアゴニストを共培養すると加速的な分化を誘導した。
【０２２６】
総合すると上述の結果は、Ｍ１選択的アゴニストが単独、又は内因性成長因子若しくは投与された成長因子のいずれかとの併用でＡＤのような神経変性疾患の治療に有益なニューロトロフィン様作用を誘発するために使用できることを示す。
【０２２７】
ＡＦ２９２、ＡＦ７００及びＡＦ７０４もまたニューロトロフィン様作用を有し、この作用がアトロピンで完全に阻害されることから、これらの化合物がムスカリンの性質を有することが示される。
【実施例３４】
【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡβ濃度への効果
ヒトＡＰＰ６９５又はＡＰＰ  Ｃ９９又はＣ１１１（Ｆａｓｓｂｅｄｅｒ他、ＰＮＡＳ、９８：５８５６、２００１）をコードする組換えセムリキ森林熱ウイルスに感染したラット大脳皮質神経細胞の初代培養混合物は、被験化合物（ＡＦ１０２Ｂ、ＡＦ１５０、又はＡＦ２６７Ｂ）の１つによりそれぞれ５〜８時間処理された。これらの細胞培養液の中でＡβを産生するためにＡＰＰをγ−及びβ−セクレターゼにより開裂させた。α−セクレターゼはＡβを破壊するのであるが、しかしながらα−セクレターゼは細胞内には存在しない。細胞は溶解し、ＡβをＷ０２（抗Ａβ抗体）で沈殿させた。
【０２２９】
ＡＰＰから生成した切断構造体であるＣ９９（及びＣ１１１）を用いてＡβ変調の機序を調べた。ＡＰＰとは異なり、Ｃ９９／Ｃ１１１はγ−セクレターゼに対する直接的な基質である。ＡＰＰでは不可能であるが、両構造体（Ｃ９９／Ｃ１１１）を用いればγ−セクレターゼ活性の直接測定が可能である。Ｃ９９／Ｃ１１１はＡＰＰと比較してα−セクレターゼの基質としての効果はない。細胞膜からコレステロールを抽出する薬剤であるＣＤＸ（メチル−β−シクロデキストリン）を用いて相乗効果も評価した。ＣＤＸはＡβ産生をもまた阻害する。ＣＤＸで処理した細胞はさらにコレステロール含量を減少させるために、各ムスカリンアゴニストで５分間処理した。
【０２３０】
Ａβ濃度はムスカリンアゴニスト処理でこの実験系の細胞溶解物及び培養液の両方において減少した。ＡＦ２６７Ｂは、ＡＦ１５０（Ｓ）の少なくとも５倍以上の効力があり、μＭの範囲でＡβ濃度を減少させた。ＡＦ２６７Ｂ及び一般的なコレステロール降下剤であるＣＤＸ（５ｍＭ）の間の相乗効果が観察され、この相乗作用はこの実験系においてＡβを検出できない濃度まで低下させるものであった。これらの研究で今回のＭ１アゴニストがα−セクレターゼを活性化することに加えて、γ−セクレターゼを阻害することも観察された。ＡＦ２６７Ｂは約５０％までの範囲でＡβ様断片（すべて３〜４Ｋｄａの断片）の放出を減少させた。これはγ−セクレターゼの活性を５０％減少させることと等しい。このことは対照群に対してＡＦ２６７Ｂ処理（１ｍＭ）細胞においてｐ３断片（γ−セクレターゼ開裂に由来するＡＰＰの断片）が完全消失したことによっても証明された。様々なセクレターゼ（α、β、及びγ）においてこのような複数の有益な性質を有する他の化合物の報告はない。この結果はＭ１アゴニストとスタチンのようなコレステロール降下剤の併用は、Ｍ１アゴニストの投与量を減少させ、それによりＭ１アゴニストに発現しうる副作用の低減を可能とすることを示す。
【実施例３５】
【０２３１】
ＡＦ２６７Ｂは高コレステロール血症ウサギの大脳皮質で上昇したβ−アミロイドを低下させる
食物中のコレステロールはウサギの脳においてアルツハイマー様Ａβ−免疫反応を誘発する（Ｓｐａｒｋｓ他、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ、１９９４；１２６：８８〜９４；Ｓｐａｒｋｓ  Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉｓ、１９９７；７：２５５〜２６６）。ニュージーランドホワイト雄ウサギを自由摂食、自由飲水とした。これらのウサギには標準的な食物、又は重量の２％コレステロールを含有する食物のどちらかを１０週間与えた。ウサギの１つの群には１日１回０．９％滅菌生理的食塩液を皮下（ｓ．ｃ．）に投与し、他のコレステロール飼育群には薬剤を投与した（ＡＦ２６７Ｂ、１ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．体重）。ウサギは１０週間の処理の後に屠殺し、すべての切断面が同時に染色された時にＡβの免疫組織化学法により評価した。
【０２３２】
標準的な食物で飼育したウサギの大脳皮質及び門部においてわずかな神経細胞のＡβが観察された。コレステロールを与え、生理的食塩液を投与したウサギでは識別可能なＡβを含む神経細胞が大量に認められた。これらの神経細胞は対照群の動物に時折発見するものよりも見た目で分かる程に小さなものであった。ＡＦ２６７Ｂを投与されたウサギではＡβ免疫反応を呈する神経細胞の数は２５〜３０％減少しており、免疫反応の強度は約５０％減少していた。ＡＦ２６７Ｂ処理後のＡβを発現する神経細胞の大きさは対照群の脳に見つける細胞の大きさと同様であり、コレステロールを与え、生理的食塩液を投与したウサギの脳の神経細胞より大きかった。
【０２３３】
これらの結果はＡＦ２６７Ｂが高コレステロール血症に続く脳内Ａβ免疫反応の上昇を減少させる効果を有し、さらにこれらのＡβペプチドを含む神経細胞における神経保護効果を有することを示す。
【実施例３６】
【０２３４】
ＡＦ２６７Ｂは低コリン性ウサギ（損傷ウサギ）の大脳皮質中で上昇したβ−アミロイドを減少させる
実験的に誘発した大脳皮質コリン性除神経は大脳皮質Ａβ濃度の生化学的上昇とＡβの組織学的沈着（Ｂｅａｃｈ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２８３：９〜１２、２０００）を起こし、またムスカリンＭ１選択的薬剤の正常動物への投与はＣＳＦ中のＡβ濃度を低下させることが知られている（Ｂｅａｃｈ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．９０５：２２０〜２２３、２００１）。この実験では、損傷により誘発したＣＳＦ及び大脳皮質内Ａβの増加を長期的なＭ１受容体の活性化によって予防又は減少できるかどうかを判断するために、前脳基底核損傷動物をＭ１選択的アゴニストであるＡＦ２６７Ｂで処理した。
【０２３５】
１匹約２．５ｋｇ（若い成兎）のニュージーランドホワイト雌ウサギを２８匹使用した。２１匹にはコリン性前脳基底核（ｎｂｍ）の損傷を施した。損傷は抗毒素を片側脳室内に注射して行った。抗毒素は低親和性ニューロトロフィン受容体ｐ７５を標的とするモノクローナル抗体ＭＥ２０．４に結合したリボソーム毒素サポリンからなる。ＭＥ２０．４抗体はサルｐ７５を標的として作製され、これはウサギｐ７５をも認識する。抗毒素の投与量は１２μｌ中３２．４μｇであり、これを前頂へ２ｍｍ右側の右側脳室に注入した。７匹には滅菌した普通の生理食塩液を脳室内注射した（偽手術損傷）。抗毒素を投与した動物は７匹からなる３群に分割した。１つの群はＡＦ２６７Ｂを１日２回皮下注射した；各投与量は１ｍｇ／ｋｇで１日の総投与量は２ｍｇ／ｋｇであった。他の群は生理的食塩液に溶解したフィソスチグミンヘミサリチレートを１日投与量３ｍｇ／ｋｇで皮下の浸透圧ポンプにより投与した。３番目の群は１日２回滅菌生理的食塩液を皮下注射した。偽手術損傷を施術した動物は皮下に生理的食塩液を満たした浸透圧ポンプを埋め込んだ。動物は手術施行から４週間後に安楽死させた。ＡＦ２６７Ｂの注射をした動物の場合は、すべて屠殺の約２〜３時間前に最後の注射を行った。４匹が成熟前に死亡し［（１匹は対照群、３匹はフィソスチグミン処理動物）、１匹は術後の出血死、１匹は抑制不可能な痙攣発現後の安楽死、１匹は手術前における麻酔薬の筋肉内注射が誘発した後肢麻痺による安楽死、１匹は解剖後原因不明と判明した死亡例］、そして分析から除外された。屠殺時に全動物の後小脳延髄槽から脳脊髄液を取り出した；脳を取り出し、冠状断で０．５ｃｍにスライスした。視床下部のレベルの１スライス（このスライスは大脳皮質だけでなく海馬も含む）を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ａβに対する抗体で免疫組織化学染色の処理を行った。他のスライスはドライアイスシートで凍結した（他のスライスは大脳、脳幹、及び小脳の０．５ｃｍ非固定冠状断スライス）。ＡβとｓＡＰＰαのためのウェスタンブロット分析を４群中の２群のＣＳＦにおいて行った。この２群はｎｂｍ損傷と生理的食塩液の群及びｎｂｍ損傷とＡＦ２６７Ｂの群である。
【０２３６】
ＣＳＦＡβを呈する４ｋＤａのバンドの定量により対照群に対してＡＦ２６７Ｂ処理群のＣＳＦＡβに顕著な低下が示された（ｐ＝０．０５、対応のない、両側ｔ検定）。ｓＡＰＰαを示すバンドの強度に有意差は認められなかった。Ａβの免疫組織化学的な染色を行った同じ２群からの断面は、すべての動物において血管へのＡβの沈着及び血管周囲への沈着の拡散も示していた。損傷及び薬剤処理による研究は、ＡＦ２６７Ｂとフィソスチグミンの両方が組織学的沈着及びＡβの生化学的濃度を減少させることを示した。損傷、未処理群の組織学的なＡβ沈着は、フィソスチグミンで６．４％、ＡＦ２６７Ｂで１２％に減少した。分散分析では２つの処理群にＡβ沈着の点で有意差（ｐ＝．０１）が認められ（Ａβ沈着はＡＦ２６７Ｂで処理された損傷動物で低かったのに対し、未処理損傷動物で高かった。）、ＡＦ２６７Ｂ及びフィソスチグミンで処理された動物の両方がＡβ沈着の点で損傷、未処理動物と有意差（ｐ＜．０５、フィッシャーの最小有意差法）が認められることが分かった（Ａβ沈着はＡＦ２６７Ｂ又はフィソスチグミンで処理された損傷動物で低かったのに対し、未処理損傷動物で高かった）。
【０２３７】
この結果はｎｂｍ損傷を有する動物にＡＦ２６７Ｂを投与すれば、損傷で誘発されたＣＳＦＡβ及び脳内Ａβ沈着の増加を減少させることを示す。またＡＦ２６７ＢのようなＭ１ムスカリンアゴニストがＡＤの予防的治療に使用できるかもしれないことも示している。
【実施例３７】
【０２３８】
様々な損傷（血清中の複数又は１種の成長因子の欠乏、β−アミロイド、酸化ストレス）に誘発される細胞毒性及びプログラム細胞死（アポトーシス）の予防
Ｍ１  ｍＡＣｈＲを導入した集密的ラット褐色細胞腫の培養細胞をトリプシンにより剥離し、洗浄後、２４ウェル、６ウェル、６０ｍｍ又は１００ｍｍのラット尾コラーゲンプレコートプレート（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）に播種した。幾つかの実験を無血清培地で行った。３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−ｙｌ）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイのために、様々な薬剤があるか、又はない状態で、細胞（１．５×１０４）を９６ウェルコラーゲンプレコートプレートの無血清培地中で２４時間播種／培養した。分化させる為に５０ｎｇ／ｍｌＮＧＦを添加した１％仔牛血清（ＦＣＳ）及び１％ヒト血清（ＨＳ）の存在下で細胞を７日間培養し、完全な分化を誘導した。細胞は２４ウェルプレート（７５００細胞／ウェル；Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−Ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、ＤＡＰＩ）内にある１００ｍｍプレート上（５×１０５細胞／プレート；ＭＴＴ、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）活性）、又はコラーゲンでプレコートしたチャンバースライド上（１．５×１０４細胞；ＴＵＮＥＬ）、又はポリ−Ｌ−リジン前処理１３ｍｍカバーグラス上のいずれかで培養した。７日後、細胞を洗浄し、培養液を無血清培地に移すか、又は剥離後に無血清培地に播種した。無血清培地中の細胞はあらかじめ熟成したＡβペプチドか、又は過酸化水素のいずれか一方で処理した。被験化合物は他に記載しない限り、指定した時間、損傷を誘発する物質と共に添加した。
【０２３９】
細胞生存率の分析
細胞は９６ウェルプレートの１００μｌ培養液に播種した。様々な薬剤に曝露後、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中の５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロマイド；Ｓｉｇｍａ、イスラエル］溶液を１０μｌ各ウェルに加えた。プレートは３７℃で２時間培養した後、塩酸−イソプロパノールを加えた（１００μｌの０．０４規定ＨＣＬ／イソプロパノール）。プレートはＥＬＩＳＡを用いて５７０ｎｍの波長で測定した。
【０２４０】
核ＤＮＡ染色
細胞はカバーグラスの上で培養し、処理した。処理後、細胞は−２０℃のメタノールで５分間固定し、次に４℃のアセトンで２分間処理してＰＢＳ中で洗浄した。カバーグラスはインターカレーターであるＤＡＰＩ（４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、イスラエル）で蛍光的に染色した。ＤＡＰＩにより室温、１５分間で細胞核のクロマチンの凝縮を見ることができる。細胞はＰＢＳで３回洗浄し、脱色を防ぐために２２ｍＭの１，４−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ（２，２，２）ｏｃｔａｎｅ（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）を含むグリセロールの溶液にマウントした。そして蛍光顕微鏡で核クロマチンの形態を観察した。アポトーシス細胞及び生存細胞を計数した（カバーグラス当たり２００細胞、各実験は２回実施した）。
【０２４１】
ＴＵＮＥＬ分析
この方法は個々のアポトーシス細胞のＤＮＡ断片化を示す。ＴＵＮＥＬ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）法はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄＵＴＰ（ベーリンガーマンハイム、ドイツ）でＤＮＡ断片の３’ＯＨ末端（ＤＮＡ鎖の切断を示す）を酵素で標識する。次の処理を簡潔に言えば、チャンバースライドに成長した細胞をＰＢＳ中のパラホルムアルデヒド（４％）で、ｐＨ７．４、室温で３０分間固定する。ＰＢＳで細胞を洗浄後、０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％クエン酸ナトリウム溶液にて氷上（４℃）で２分間処理して細胞の浸透性を良くし、ＰＢＳで洗浄した。そして湿ったチャンバー内の各試料に５０μｌのＴＵＮＥＬ反応混合液を加え、３７℃で１時間処理した。エバンスブルー試薬（ＰＢＳで２０００倍希釈）を加えて５分後、蛍光顕微鏡でスライドを観察した。
【０２４２】
蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析
細胞は７日間で分化を促進し、トリプシンでプレートから剥離した。各薬剤の存在又は非存在下で、無血清培地を含む５０−ｍｍコラーゲンコートプレート内に１０６個の細胞を再び播種した。２００ｇで遠心分離したペレットを作成し、３００μのＰＢＳに再懸濁した。４ｍｌのメタノール（−２０℃）を各試験管に加え、−２０℃で１５分間固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌ  ＰＢＳ中で撹拌し再懸濁した。ヨウ化プロピジウム原液（Ｓｉｇｍａ；１０ｍｇ／ｍｌ）を５μｌそして２０ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅＡ溶液を５μｌ室温で５〜１０分間加えた。波長４８８ｍｍで励起した蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳｃａｎ；ベクトンディッキンソンＣｏｒｐ．）を用い、５７５±２１ｎｍのＢＰフィルターで透過光を集め、個々の核の蛍光を観察した。データはセルクエストソフトウェアコンピューターシステムにより分析した。この方法により細胞内ＤＮＡ量の測定が可能となる（アポトーシス細胞はＤＮＡ量が少ない）。細胞周期がＧ１期の細胞は有糸分裂後であり、Ｇ２／Ｍ期（有糸分裂中又は前）の細胞と比較してＤＮＡ量が少ない。アポトーシス細胞は前Ｇ１期として識別した。
【０２４３】
ＭＴＴ分析は細胞内の最初の早期変化の尺度となり、電子伝達系が完全な状態であることを反映し、細胞内酸化還元活性の情報を供与する。この試験はβ−アミロイドが原因である細胞死メカニズムの特異的且つ早期の尺度であり、急速な阻害反応の検出に利用できる。栄養が欠乏し、未分化であるＭ１  ｍＡＣｈＲを導入したラット褐色細胞腫細胞は単独で１０〜２０％まで細胞の生存率が減少し、神経毒性のある全長型β−アミロイド（β−Ａ１−４２）ペプチド及びその断片（β−Ａ２５−３５）（０．５−２０μＭ）の濃度上昇によってこの効果はさらに増大した（５０〜６０％阻害まで）。その様な細胞が血清欠乏下でβ−アミロイド処理され、ムスカリンアゴニストの存在又は非存在下である場合、２４時間後β−Ａ２５−３５（１μＭ）により誘発された細胞死はカルバコール、ＡＦ２９２、ＡＦ１５０（Ｓ）、及びＡＦ２６７Ｂの添加により有意に低下した。
【０２４４】
過酸化水素により誘発された直接的酸化ストレスから、Ｍ１  ｍＡＣｈＲ導入細胞を保護する効力をカルバコール、ＡＦ１５０（Ｓ）、及びＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２について調べた。これらのアゴニストは過酸化水素により誘発された毒性から細胞を保護することが観察された。
【０２４５】
驚いたことに、ムスカリンアゴニストは抗酸化作用も有するムスカリン薬理作用群として検出された。これらには、ＡＦ６０４、ＡＦ７００、及びＡＦ７０４の様な抗酸化作用に繋がる選択的Ｍ１アゴニスト作用を有する構造が含まれる。注目すべきことは、ＡＦ７００、ＡＦ７０３、特にＡＦ７０４及びＡＦ７０４Ｂは、カルバコール及びＡＦ２６７Ｂと比較してβ−Ａ２５−３５（１０及び２０μＭ）で誘発される細胞毒性に対する効果が大きいことである。
【０２４６】
細胞核内クロマチン凝縮の視覚化を可能とするインターカレーターであるＤＡＰＩを用いて、Ａβ又は過酸化水素処理後のアポトーシス細胞死を追跡した。Ａβ処理細胞は萎縮し、活力を失ったアポトーシス細胞の形態を示した。ＤＡＰＩ染色はアポトーシスの過程を示す核の凝縮及びクロマチンの断片化を示した。ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂはこれらのアポトーシスから細胞を保護することが分かり、神経炎様作用がよく観察できた。
【０２４７】
Ｍ１  ｍＡＣｈＲ導入細胞を２４時間飢餓にすると、アポトーシス細胞死が２倍に増加した（未導入細胞では増加しない）。ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂは飢餓由来のアポトーシス細胞死から細胞を有意に保護した。アトロピン（非選択的ムスカリンアンタゴニスト）とピレンゼピン（Ｍ１選択的アンタゴニスト）はＭ１  ｍＡＣｈＲ導入細胞のみにおいてムスカリンアゴニストの保護効果を打ち消した。
【０２４８】
Ｍ１  ｍＡＣｈＲ導入細胞をβ−Ａ２５−３５（２５μＭ）又はβ−Ａ１−４２（２５μＭ）で処理すると、飢餓よりアポトーシス細胞死がさらに１．５〜２倍に増加した。両ペプチドの選択的毒性作用を、アポトーシスを誘発しない逆順ペプチド（β−Ａ３５−２５）を用いて示した。Ｍ１導入細胞のみにおいて、ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７ＢはＡβ誘発アポトーシスを防止したが、ムスカリンアンタゴニストはこの作用を打ち消した。
【０２４９】
過酸化水素（２５及び５０μＭ）に誘発される酸化的損傷は、飢餓よりアポトーシス集団をそれぞれ１．５及び２．５倍に増加した。ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂは過酸化水素（２５及び５０μＭ）誘発アポトーシスを防止した。アトロピンがその効果を打ち消すように、この効果はＭ１  ｍＡＣｈＲによる活性化に選択的であった。
【０２５０】
ＴＵＮＥＬ法もまた、個々のアポトーシス細胞においてアポトーシス後に起こるＤＮＡ断片化を示す。ＴＵＮＥＬ陽性に染色された細胞数は２５μＭのβ−アミロイド２５−３５処理後に増加し、アポトーシス作用を示したが、ＡＦ１５０（Ｓ）（１００μＭ）がアポトーシスを停止することができた為に多くの細胞がＴＵＮＥＬ陰性染色であった。この細胞はこの状態を保持し、細胞質のみが赤く染まった。
【０２５１】
ＦＡＣＳ分析を用いた様々な処理の後に、アポトーシス集団の定量化を細胞内ＤＮＡ量の測定により実施した。Ｍ１導入細胞での血清欠乏下のニューロン培養により得られたＤＮＡヒストグラムから、低下した（２倍体未満）ＤＮＡ含量（Ｍ１＝前Ｇ１期）を示すアポトーシス細胞集団が出現した。飢餓から２４時間後に全細胞の約２０％がアポトーシス死となった。カルバコール、ＡＦ１５０（Ｓ）、及びＡＦ２６７Ｂは飢餓中のアポトーシス死から細胞を保護した。β−アミロイド２５−３５又はβ−アミロイド１−４２は全細胞中のアポトーシス集団を３０−３５％に増加させた。カルバコールと、ＡＦ１５０（Ｓ）又はＡＦ２６７Ｂとを共に添加すると、飢餓時に見られる値未満にまで有意にアポトーシス集団を減少させた。ムスカリンアゴニストの効果が１０μＭアトロピンにより阻害されたが、これにより細胞の生存効果にはＭ１  ｍＡＣｈＲの活性化が関与することが示される。さらに未導入神経細胞では、飢餓又はβ−アミロイドが原因のアポトーシス抑制に対するムスカリンアゴニストの効果はなかった。
【実施例３８】
【０２５２】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパレート（ＮＭＤＡ）により誘発した細胞死に対する保護効果
１８〜１９日齢のラット胎仔脳（ＳＤラット）由来ラット脳細胞初代培養は機械的分離により作成した。脳を６ｍｇ／ｍｌグルコースを含む冷却したＧｅｙの平衡電解質溶液（ＧＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）に取り出した。海馬と大脳皮質を分離し、６ｍｇ／ｍｌグルコース、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（バイオロジカルインダストリー．Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）、１０００ＩＵ／ｍｌペニシリンＧナトリウムそして３％ｕｌｔｒｏｓｅｒｅＧ（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）を含むダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭバイオロジカルインダストリー、Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）に移した。火入れして先端を滑らかにしたパスツールピペットで細胞分離を行った後にできた細胞懸濁液を、ポリ−Ｌ−リジン（分子量３０，０００〜７０，０００、Ｓｉｇｍａ）を１ｍｇ／ｍｌ含むホウ酸緩衝塩水を入れたプレコート組織プレートに播種した。細胞は９６ウェルの培養プレートでは８００００細胞／ウェルの密度で、１２ウェルの培養プレートでは４０００００細胞／ウェルの密度（海馬の細胞）及び６０００００細胞／ウェルの密度（大脳皮質細胞）で播種した。細胞培養は３７℃、５％ＣＯ２／９５％Ｏ２の培養液で約２週間維持した。その後の３〜４日間、培養液の中に５−フルオロ−２’−デオキシウリジン／ウリジン／シトシンアラビノシド混合物（最終濃度５ｍＭ）を添加することにより、グリア細胞の増殖を停止させた。
【０２５３】
ＮＭＤＡへの曝露を評価するために、９６ウェル培養プレートの１０日目の大脳皮質及び海馬の培養細胞に１００又は２００μＭのＮＭＤＡ（ＲＢＩ、アメリカ）を曝露した。化学式Ｉ由来の化合物の神経細胞保護効力を、２０μＭのＭＫ８０１（非競合的ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト）が有する効力と比較した。培養細胞を培養液単独にも平行して曝露させ、これを対照群とした。神経損傷を広く起こすために、すべての曝露を神経細胞死の評価前２０〜２４時間の間に実行した。神経毒性は｛２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−サルフォフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−カルボキサニリド分子内塩］｝を基本とする分析（Ｋｌａｕｓｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５：７７９〜７８６、１９８７；リップマン他、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：１２９〜１７６、１９９２）を用いて、生きている細胞のミトコンドリア活性レベルを測定することにより定量的に評価した。
【０２５４】
ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂは細胞死の予防に効果的であった。１００μＭのＮＭＤＡに誘発された毒性に対する、これらのアゴニスト１００μＭでの神経細胞保護効力は、２０μＭのＭＫ８０１が有する効力と同等であり、２００μＭのＮＭＤＡに対してはやや低かった。
【実施例３９】
【０２５５】
１．タウタンパク質の高リン酸化に対する効果
実施例３８に記したように初代培養細胞を培養した。細胞の上清を除去し、０．２ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ＝７．４の冷たいリン酸緩衝食塩（ＰＢＳ）液に加える前に培養液中で１度洗浄した。細胞はラバーポリスマンで掻き取り、エッペンドルフチューブに移し、４℃で遠心分離した。細胞のペレットはプロテアーゼ阻害薬（５単位／ｍｌのアプロチニン、５ｍｇ／ｍｌのペプスタチン、５ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、０．１ｍＭのＰＭＳＦ；シグマ）を含む溶解緩衝塩水（ＥＤＴＡ５ｍＭ、トリス５０ｍＭ、トリトン１％、塩化ナトリウム１５０ｍＭ）で再懸濁し、４℃で遠心分離した。上清はエッペンドルフチューブに移し、分析まで−２０℃で保存した。タウ−１の免疫反応（非リン酸化タウタンパク質のＳｅｒ１９９を認識する抗体）の程度はウェスタンブロットで決定した。
【０２５６】
ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂは１〜１００μＭ範囲の曝露量で、大脳皮質及び海馬の両培養細胞におけるタウタンパク質の免疫反応を上昇させる効果があった。
【０２５７】
２．タウリン酸化への効果、及びタウリン酸化に対するＡβ誘発効果への拮抗作用
Ｓｅｒ１９９／２０２でリン酸化タウタンパク質を認識する抗体であるＡＴ８抗体でのイムノブロットを含めたＳａｄｏｔ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６６：８７７〜８８０、１９９６の実験計画に従って、ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、ＡＦ７０４及びＡＦ７０４Ｂ（１００μＭ）は、対照群と比較して細胞培養液中でのタウタンパク質脱リン酸化を誘発することが明らかとなった。抗酸化部分にＭ１アゴニストを連結することにより、タウリン酸化が減少し得る。このことは、酸化ストレス及びタウ高リン酸化による複合損傷が原因の様々なＣＮＳ疾患状態において新しい治療戦略を提供することになる。
【実施例４０】
【０２５８】
ラット１型星状細胞の初代培養におけるＡｐｏＥ合成及び分泌に対する効果
１型星状細胞の初代培養はＳＤラットの大脳皮質から得た。被験化合物は培養液に溶解し、細胞に２４、４８、７２、及び９６時間添加した。その後培養液を除去し、Ｐｏｉｒｉｅｒ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５５：８１〜９０（１９９３）に記載のようにＡｐｏＥタンパク質濃度をイムノブロット分析により評価するまで凍結保存した。代わりにＣｅｄａｚｏ−Ｍｉｎｕｅｚ他（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １０５：６５１〜６６１、２００１）の方法を採用してもよい。９６時間の時点でＡＦ１０２ＢはＡｐｏＥ代謝（合成及び分泌）に対して活性がなかった。化合物ＡＦ２６７Ｂ及びその程度は小さいがＡＦ１５０（Ｓ）も、ＡｐｏＥの産生を長期にわたり阻害し、最大作用は９６時間で認められる。この阻害作用（６０−８０％阻害）は、前記化合物の非常に低い濃度である０．１ｎＭにおいて認められる。これらの結果は、この化合物が、ラット星状細胞におけるＡｐｏＥ４を含めたａｐｏＥ産生を阻害すること、したがってＡｐｏＥ産生の阻害を尺度とする治療に使用し得ることを示す。
【実施例４１】
【０２５９】
標識プローブとしてのアゴニストを使用した、ｍＡＣｈＲに対する競合的結合試験
オキソトレモリン−Ｍ（ＯＸＯ−Ｍ）は、同様な親和性ですべてのｍＡＣｈＲ亜型に結合するアゴニストである。トリチウム標識ＯＸＯ−Ｍの結合を置換する被験化合物の能力は、受容体アゴニストの結合部位に対する被験化合物の親和性の尺度となる。トリチウム標識ＯＸＯ−Ｍの結合に対するＡＦ２９２及びその異性体ＡＦ２９１の競合は、完全アゴニストであるカルバコールの阻害定数０．０５μＭに対し、それぞれ０．２７及び６．５６μＭの阻害定数を示す。
【０２６０】
ＯＸＯ−Ｍが非選択的にすべてのｍＡＣｈＲ亜型に結合するのに対して、ピレンゼピン（ＰＺ）はムスカリンアゴニストであり、優先的にＭ１受容体に結合する。ＰＺとＯＸＯ−Ｍの阻害定数の比は被験化合物の選択性の尺度となる。比が最小であれば、その分被験化合物はＭ１選択的と言える。ラット大脳皮質膜へのトリチウム標識ＰＺの結合に対するＡＦ２９２（阻害定数１．３９μＭ）とその異性体ＡＦ２９１（阻害定数１０．７μＭ）の競合は、ＡＦ２９２が活性のある異性体であることを示す。ＯＸＯ−Ｍ／ＰＺの比は〜０．３６であるが、これはＭ１受容体に対する中程度に高い選択性を示す。
【実施例４２】
【０２６１】
ｍＡＣｈＲの選択性
１．ヒトｍＡＣｈＲ亜型を導入した培養細胞における機能的研究
１．１  ＡＦ２９２については、そのアゴニスト作用又はアンタゴニスト作用、その効力、並びにヒトＭ３及びＭ５受容体と比較したＭ１受容体への選択性を検証した。その方法は、ガーウィッツ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６７、２１、１９９３の方法に従って、ホスホイノシチド（ＰＩ）加水分解の活性化を用いた。ＰＩ加水分解におけるＡＦ２９２の効果はアトロピン感受性であり、ムスカリン性の性質を示していた。この範例で測定したＰＩ活性の点で、カルバコールに対してＡＦ２９２及びＡＦ２６７Ｂはそれぞれ〜３５％及び〜６６％の活性を示し、Ｍ１受容体に対する部分アゴニストであることが明らかとなった。ＡＦ２６７Ｂ（Ｍ３においてカルバコールに対して約３０％）と比較して、ＡＦ２９２ではＭ３及びＭ５受容体に対し活性が見られなかった。ＡＦ２９２はＭ２又はＭ５  ｍＡＣｈＲでアゴニスト作用を示さないが、Ｍ１受容体では部分アゴニストであり、且つＭ３受容体では弱いアンタゴニスト（塩基解離定数＝０．６６μＭ）であった。カルバコールによる活性化の後に細胞内カルシウムイオンが上昇する改変細胞培養において、Ｍ２受容体への効果を測定した。Ｍ２  ｍＡＣｈＲに対してカルバコールが誘発する活性は８倍増加したが、ＡＦ２９２ではどの試験濃度（１０−９〜１０−３Ｍ）においてもアゴニストとしての活性はなかった。
【０２６２】
１．２  ＡＦ２９２については、そのアゴニスト作用又はアンタゴニスト作用、その効力、並びにヒトＭ３及びＭ５受容体と比較したＭ１受容体への選択性を検証した。その方法はガーウィッツ他のＥｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６７、２１、１９９３の方法に従って、アラキドン酸（ＡＡ）加水分解の活性化を用いた。ＡＦ２９２ではＭ１  ｍＡＣｈＲを介するＡＡ放出の効力（８０％）がＰＩ活性（３５％）より高かったが、Ｍ３及びＭ５  ｍＡＣｈＲにおけるアゴニスト活性（ＡＡ放出）はやはりなかった。このようにＡＦ２９２はＰＩ（ホスホリパーゼＣを介する）に対しての作用より、Ｍ１  ｍＡＣｈＲを介するＡＡ放出（ホスホリパーゼＡ２を介する）を呈するアゴニスト作用がより強い。要約すると、ＡＦ２９２はアゴニストとしてＭ１  ｍＡＣｈＲに高い選択性を示すのみならず、選択されたＧタンパク質の明瞭な活性化を呈する（例えば、すべての受容体を同程度に活性化する非選択的ｍＡＣｈＲアゴニストであるカルバコールのように、すべてのＧタンパク質が同程度に活性化されるのではない）。
【０２６３】
２．ｍＡＣｈＲ及び他の系に対する結合試験
２．１  ｍＡＣｈＲ受容体に対する以下のリガンドの競合結合試験により、ＡＦ２６７Ｂは以下のＭ１  ｍＡＣｈＲ亜型に極めて選択的であることが分かった。ＱＮＢ［ラット大脳皮質（ＣＴＸ）膜におけるムスカリンアンタゴニスト］（阻害定数＝４９．６±９μＭ）、ＱＮＢ［ラット小脳膜におけるムスカリンアンタゴニスト］（阻害定数＝４５．２±１０．８μＭ）、ピレンゼピン（ＣＴＸにおけるＭ１選択的アンタゴニスト）（阻害定数＝３．７４±０．５９μＭ）、オキソトレモリン−Ｍ（ＣＴＸにおけるムスカリンアゴニスト）（阻害定数＝１．６２±０．３４μＭ）、これに対して、セロトニン、５ＨＴ３は１０−４Ｍで５１．３％阻害、オピオイド／オピエートは１０−４Ｍで非選択的に５２．５％阻害した。以下にはまったく結合を示さなかった。そのようなものは、アドレナリン作用性（Ａ）、α１Ａ、アドレナリン作用性、α１Ｂ、アドレナリン作用性、α２Ａ（ヒト組み換え型）；アドレナリン作用性、α２Ｂ；アドレナリン作用性、α２Ｃ（ヒト組み換え型）；アドレナリン作用性、β１；アドレナリン作用性、β２；ベンゾジアゼピン（ＢＺＤ）、末梢；クロザピン；ドーパミン、Ｄ１；ドーパミン、Ｄ２；（ヒト組み換え型）；ドーパミン、Ｄ３（ラット組み換え型）；γ−アミノ酪酸Ａ、アゴニスト部位；γ−アミノ酪酸Ｂ、ベンゾジアゼピン、中枢；グルタミン酸塩、ＡＭＰＡ部位；グルタミン酸塩、カイニン酸部位；グルタミン酸塩、ＮＭＤＡアゴニスト部位、グルタミン酸塩、ＮＭＤＡ、グリシン；グリシン、ストリキニン感受性；ヒスタミン、Ｈ１；ヒスタミン、Ｈ２；ヒスタミン、Ｈ３；ニコチン酸；神経節部位；ニコチン酸、ニューロン部位；セロトニン、５ＨＴ１Ａ（ヒト組み換え型）；セロトニン、５ＨＴ１Ｂ；セロトニン、５ＨＴ４；セロトニン、５ＨＴ６（ラット組み換え型）；セロトニン、５ＨＴ７（ラット組み換え型）；コリンアセチルトランスフェラーゼ；グルタミン酸デカルボキシラーゼ；モノアミンオキシドＡ、ＭＡＯ−Ａ；モノアミンオキシダーゼＢ、ＭＡＯ−Ｂであった。
【０２６４】
２．２  結合試験において、ＡＦ２９２（１０μＭ）はｍＡＣｈＲ亜型［Ｍ１（ヒト）（５５％）、Ｍ２（ヒト）（６１％）、Ｍ３（ヒト）（５５％）］に極めて選択的であることが分かった。以下にはまったく結合を示さなかった。そのようなものは、アデノシンＡ１（ヒト）；アデノシンＡ２（ヒト）；アデノシンＡ３（ヒト）；α１アドレナリン性（非選択的）；α２（非選択的）；β１（ヒト）；アンジオテンシン、ＡＴ１（ヒト組み換え型）；ベンゾジアゼピン（ＢＺＤ）（中枢）；ブラジキニン、Ｂ２（ヒト組み換え型）；コレシストキニン（ＣＣＫＡ）（ヒト組み換え型）（ＣＣＫ１）；ドーパミンＤ１（ヒト組み換え型）；Ｄ２Ｓ（ヒト組み換え型）；エンドセリン、ＥＴＡ（ヒト組み換え型）；ＧＡＢＡ（非選択的）；ガラニン、ＧＡＬ２（ヒト）；ケモカイン、ＩＬ−８Ｂ（ヒト組み換え型）（ＣＸＣＲ２）；ケモカイン、ＣＣＲ１（ヒト組み換え型）；ヒスタミン、Ｈ１（中枢）；ヒスタミン、Ｈ２；メラノコルチン、ＭＣ４（ヒト組み換え型）；メラトニン、ＭＬ１；タキキニン、ＮＫ２（ヒト組み換え型）；ＮＫ３（ヒト組み換え型）；ニューロペプチド、Ｙ１（ヒト）；ニューロペプチド、Ｙ２（ヒト）；ニューロテンシン、ＮＴ１（ヒト組み換え型）（ＮＹＳ１）；オピエート、デルタ２（ヒト組み換え型）（ＤＯＰ）；オピエート、カッパ（ＫＯＰ）；オピエート、ミュー（ヒト組み換え型）（ＭＯＰ）；オーファニン、ＯＲＬ１（ヒト組み換え型）（ＮＯＰ）；セロトニン、５−ＨＴ１Ａ（ヒト組み換え型）；セロトニン、５−ＨＴ１Ｂ；セロトニン、５−ＨＴ２Ａ（ヒト組み換え型）；セロトニン、５−ＨＴ３（ヒト組み換え型）；セロトニン、５−ＨＴ５Ａ（ヒト組み換え型）（５−ＨＴ５Ａ）；５−ＨＴ６（ヒト組み換え型）；５−ＨＴ７（ヒト）；ソマトスタチン、ｓｓｔ（非選択的）；血管作用性小腸ペプチド、ＶＩＰ１（ヒト）（ＶＰＡＣ１）；バソプレッシンＶ１ａ（ヒト組み換え型）；Ｃａ２＋チャネル（Ｌ、ベラパミル部位）；Ｋ＋Ｖチャネル；ＳＫ＋Ｃａチャネル；Ｎａ＋チャネル（部位２）；Ｃｌ−チャネル；ノルエピネフリンＮＥトランスポーター（ヒト）であった。
【実施例４３】
【０２６５】
老齢キツネザルにおける効果
老齢キツネザルは老人やＡＤ患者に見られるものと同様な認識障害や脳損傷を示す。したがって、これはＡＤにおける３大特徴［プラーク（Ａβ）、対螺旋状繊維（高リン酸化及び凝集τタンパク質）、認識機能障害］を呈する、ＡＤの良い動物モデルである。このモデルはＡＤを助長するＭＣＩの再現にも用いられる。
【０２６６】
このモデルにおいてＡＦ１５０（Ｓ）［１８カ月の長期投与］は、ｉ）認識及び行動障害を改善し、ｉｉ）高リン酸化されたτタンパク質（例えば、罹患した脳の徴候）、凝集したτタンパク質を含む神経細胞数、及び対螺旋状繊維の数を減少させ、及びｉｉｉ）星細胞腫及び炎症を減少させた。このことはＡＦ１５０（Ｓ）がＡＤの治療又はその症状を緩和するための薬剤として使用できる可能性があるが、長期間の投与による耐性を起こさないことを示す。
【実施例４４】
【０２６７】
Ｍ１アゴニストはマウスの閉鎖性頭部外傷後の神経行動学的障害を減少させる
マウスで、チェン他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１５：２３１〜２３７、１９９８に記載のように閉鎖性頭部外傷（ＣＨＩ）を誘発させた。神経学的重症度スコア（ＮＳＳ）は一連の１０種類のパラメーター（１０＝最悪の結果、０＝正常な機能）を用いて評価した。被験化合物（化合物１ｍｇ／体重ｋｇ）とプラセボは、ＣＨＩ誘発（対照群はプラセボ処置）から５分後に腹腔内投与した。投与したマウスは外傷の重症度を決める為に１時間後、さらに回復性を決める為に２４及び４８時間後に評価した。ＮＳＳは以下の通り。
2010184946.tif 000088
【０２６８】
すべての被験化合物は、極めて有意な運動機能の改善を示した。回復性は２種類の平衡試験（平均台歩行）においてＡＦ２６７Ｂ投与マウスがより早かった［２４時間（３ｃｍ）で対照群８０％に対し２２％、又は４８時間（２ｃｍ）で対照群８０％に対し３３％］。
【実施例４５】
【０２６９】
ラットの社会的記憶におけるＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂ
作動記憶の評価及びコリン作用性薬物への感受性を評価するために、齧歯類における社会的嗅覚認識が示された（ダンツァーラ他、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．９１：３６３〜３６８、１９８７；ペリオ他、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．９７：２６２〜２６８、１９８９）。本実施例では、未処置ラットの調査行動におけるＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂの効果を試験した。
【０２７０】
体重４００〜５３０ｇ（４〜５カ月齢）の１２匹の雄ラットを使用した。ラットは試験前、個別に１４日間飼育した。体重４０〜５０ｇ（到着時）の幼若ウィスターラットを６群に分けて飼育し、成熟ラットの社会的刺激とした。ラットは逆転明暗周期（午後２：００から午前２：００まで照明）で２１℃±１の条件で飼育した。この試験は明暗周期の暗期の７時間目に赤い照明下で行った。
【０２７１】
成熟ラットは社会的試験開始の１．５時間前に暗い照明の部屋に置いた。すべての幼若ラットを試験開始の３０分前にケージの中に隔離した。試験開始時に、慣れていない幼若ラットは成熟ラットのホームケージに５分間置いた。成熟ラットが幼若ラットを調査する行動に費やす時間を記録した。成熟ラットはその後直ちに（１〜２分）溶媒又は被験化合物を投与した。２時間後、同じ幼若ラットを同じ成熟ラットにさらに５分間一緒にさせた。この５分間は通常、幼若ラットによる刺激がこれ以上認められない時間である（即ち、最初の刺激の時、成熟ラットは幼若ラットを調査する行動に同じ時間を費やした）。例えば、記憶力を高めるといわれている薬物の影響下では、同じ幼若ラットの調査に費やす時間は短縮すると予想される。２日後、最初の刺激時に使用した個体とは異なる幼若ラットを、薬物又は溶媒の投与から２時間後に一緒にした。この異なる幼若ラットの社会的探査に費やす時間の短縮は、薬物の非特異的効果（即ち、記憶に関連しない）を反映すると考えられる。同じ幼若刺激ラットで２回成熟ラットを試験することはなく、４８時間の期間内で幼若ラットを２回以上使用することもなかった。
【０２７２】
幼若ラットと最初に一緒にさせた直後に、ＡＦ１５０（Ｓ）又はＡＦ２６７Ｂ（０．５、１、及び５ｍｇ／ｋｇｐ．ｏ．）又は溶媒、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を成熟ラットに投与した。
【０２７３】
幼若刺激ラットの社会的調査に費やした時間を測定し（秒）、その後、１回目の刺激曝露に対する２回目の刺激曝露の比［調査期間の比（ＲＩＤ）］として各ラットについて表した。このＲＩＤへの変換は、基準成績における日々のばらつきだけでなく、個体間のばらつきを最小限にする為に使用した（ペリオ他、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．９７：２６２〜２６８、１９８９）。それゆえ、２回目の刺激曝露での調査期間における減少は１以下のＲＩＤを導き、これは成熟ラットが幼若ラットを認識していることを示す。反復測定の分析には３元配置分散分析を使用し、事後比較は単純主効果対比分析により行った。
【０２７４】
ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂはプラセボ群と比較して、同じ幼若ラットの調査期間を用量依存的に減少させた。２回目の刺激曝露に異なる幼若ラットを使用した際、非特異的効果は観察されなかったので、記憶の改善は非特異的効果によるものとは考えられなかった。このように両化合物は幼若ラットにおいて社会的記憶を促進するようであった。
【０２７５】
２つの化合物の全ＲＩＤ間に有意差は認められなかったが、両薬剤の用量×同じ／異なる幼若ラット間の相互作用は統計学的に有意であった［Ｆ（３／３３）＝１４．９、ｐ＜０．０００１］。具体的には、両化合物はプラセボと比較して３種の投与量すべてにおいて同じ幼若ラットの調査期間を有意に減少させた（ｐ＜０．００１）。その上、０．５ｍｇ／ｋｇのＲＩＤと他の２種の投与量のＲＩＤ間に有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。１ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇで観察されたＲＩＤは０．５ｍｇ／ｋｇで観察されたＲＩＤより有意に低かった。
【０２７６】
３種の投与量すべてにおいて同じ幼若ラット群のＲＩＤと異なる幼若ラット群のＲＩＤとの間に有意差が認められたことは注目されるべきである（ｐ＜０．０１−ｐ＜０．００１）。
【実施例４６】
【０２７７】
コリノトキシン（ＡＦ６４Ａ）投与ラットの受動的回避（ＰＡ）に対するＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ２９２の効果
一般的な手順はフィッシャー他の報告、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｔｌ．Ｔｈｅｒａｐ、２５７：３９２、１９９１に従った。ＡＦ６４Ａ（１０ｍＭ）は塩酸アセチルエチルコリンマスタードのアルカリ加水分解により作成した。エキセシン（０．３ｍｌ／１００ｇ、ＩＰ）で麻酔したラットにＡＦ６４Ａ（３ｎｍｏｌ／２μｌ／片側）又は生理的食塩液（２μｌ）を側脳室（ＡＰ＝−０．８；Ｌ＝前頂から±１．５ｍｍ；そしてＤＶ＝頭蓋骨表面より−４．８ｍｍ）の両側に定位で注射した。注入はＣＭＡ１００微量注入ポンプ、３０ゲージ注入用カニューレ、０．２５μｌ／分の一定速度により行った。カニューレは脳室内に溶液が拡散できるように注射後４分間は同じ位置に置いた。化合物又はリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）は電撃を与えた直後に経口的に投与した。記憶保持については訓練後７２時間で試験した。
【０２７８】
すべてのＡＦ６４Ａ注射ラット（２９．０２±３．１秒）及びすべての生理的食塩液注射ラット（２０．５５±１．９５秒）の間で初期反応において有意差が認められた［Ｆ（１／７２）＝５．１３、ｐ＜０．０５］。ＡＦ６４Ａ投与×薬剤投与群の間に保持潜時において統計学的に有意な相互作用が認められた［Ｆ（３／７２）＝１１．９９、ｐ＜０．００１）。ＰＢＳを投与されたＡＦ６４Ａ注射ラットの保持潜時（６７．１±１８．９秒）はＰＢＳを投与された生理的食塩液注射ラットの保持潜時（４５５．３±５５．１秒）より有意に短かった（記憶力が乏しい）（ｐ＜０．００１、単純主効果対比分析による）。
【０２７９】
ＡＦ２６７Ｂ（０．１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＡＦ６４Ａ注射ラットの保持潜時（４４０．７±４６．４秒）、及びＡＦ２９２（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＡＦ６４Ａ注射ラットの保持潜時（４４７±４６．８秒）は、ＰＢＳを投与されたＡＦ６４Ａ注射ラットの保持潜時より有意に長かった（記憶力が良い）（ｐ＜０．００１、単純主効果対比分析による）。ＡＦ２６７Ｂ（０．０３ｍｇ／ｋｇ）を投与されたＡＦ６４Ａ注射ラットの保持潜時（１０５．７±３１．９秒）とＰＢＳを投与されたＡＦ６４Ａ注射ラットの保持潜時との間に有意差は認められなかった。生理的食塩液を投与したどの群間においても保持潜時に有意差は認められなかった。
【０２８０】
受動的回避課題での記憶保持においてＡＦ６４Ａ投与ラットは明らかに障害を示していた。ＡＦ６４Ａが誘発する記憶保持障害を低下させるＡＦ２６７Ｂの最小効果量は経口で０．１ｍｇ／ｋｇ未満である。受動的回避課題におけるＡＦ２６７Ｂ、０．１ｍｇ／ｋｇとＡＦ２９２、１ｍｇ／ｋｇは、ＰＢＳを投与されたＡＦ６４Ａ注射ラットの場合と比較すると、ＡＦ６４Ａが誘発する記憶保持の欠陥を改善する効果を有する。ＡＦ２９２の最小効果量は経口で１ｍｇ／ｋｇ未満である。
【実施例４７】
【０２８１】
ＭＷＭテストにおける、ＡＦ６４Ａで誘発したラットの認識障害に対するＡＦ２６７Ｂの効果
ＡＦ６４Ａ又は生理食塩液を注射したＳＤラット（６カ月齢）をモリスの水迷路（ＭＷＭ）課題でテストした。使用した範例は参照記憶方式による空間認識能力を評価し、これは訓練（１〜４日目）、移動試験（探査試行−最終訓練試行から４日目に３分間）及び逆転試験（５日目）を含む。
【０２８２】
試験から４カ月後、ＡＦ６４Ａ及び生理的食塩液の各群のラットは４つの亜群（ｎ＝９）に無作為に再分割した。亜群１〜３はＡＦ２６７Ｂを０．３、１、及び３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｌ／ｋｇの量で経口投与したが、亜群４（対照群）は等量の１０ｍＭリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を投与した。薬剤とＰＢＳは行動試験を開始する前の５日間に１日１回投与し、その後５日間の実験期間において試験３０分前に投与した。
【０２８３】
３つの尺度である逃避潜時、道程、及び水泳速度を多変量分散分析で分析し、次に単純主効果対比分析を行った。
【０２８４】
結果：
ＡＦ６４Ａを注射したラットは生理的食塩液を注射したラットより有意に長い逃避潜時を示した［Ｆ（１／６４）＝１０．５６、ｐ＜０．００５］。道程に関しては、ＡＦ６４Ａを注射したラットは生理的食塩液を注射したラットより有意に遅い学習曲線を示した［Ｆ（３／１９２）＝４．０１、ｐ＜０．０１］。ＡＦ２６７Ｂは学習においては有意な効果を有していなかった。しかしながら、ＡＦ６４Ａを注射したラットにＡＦ２６７Ｂを１ｍｇ／ｋｇ投与した場合、逃避潜時においてのみ改善の傾向を示し、ＡＦ２６７Ｂが３ｍｇ／ｋｇの場合はこれらのラットの能力を低下する傾向があった。認識能力尺度（逃避潜時、道程）及び非特異的運動尺度（水泳速度）の間には相関関係がなかった。
【０２８５】
生理的食塩液を注射したすべてのラットがプローブ試行において空間的偏向を示し、２つのパラメーターはそれぞれ逃避潜時；Ｆ（３／１９２）＝７．８６、ｐ＜０．００１、及び道程Ｆ（３／１９２）＝７．４４、ｐ＜０．００１であった。一方、ＡＦ６４Ａを注射したラットにＰＢＳを投与した場合、この試験では部分的な空間的偏向のみを示した。しかしながら、ＡＦ６４Ａを注射したラットにＡＦ２６７Ｂを投与した場合は、生理的食塩液を注射したラットと同様に完全な空間的偏向を示し、これは逃避潜時のみに示された［Ｆ（９／１９２）＝２．３、ｐ＜０．０２５］。ＡＦ２６７Ｂの様々な投与量間には、記憶に対する有益な効果の点で有意差がなかった。
【０２８６】
逆転試験における試験群間に有意差はなかった。しかしながら、ＡＦ６４Ａの注射により両尺度において認識能力が低下する傾向があった。さらに、ＡＦ６４Ａを注射したラットにＡＦ２６７Ｂを３ｍｇ／ｋｇ投与した場合はこのテストにおいて低下の傾向が示されたのであるが、ＡＦ６４Ａを注射したラットにＡＦ２６７Ｂを１ｍｇ／ｋｇ投与した場合は改善の傾向が示された。
【実施例４８】
【０２８７】
Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスに対するＣ５７ＢＬ／１０ＳｎＪマウスのＭＷＭ能力における、ＡＦ１５０（Ｓ）、ＡＦ２６７Ｂ、リバスチグミン及びニコチンの効果
Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ（Ｂ１０）マウスは海馬が小さく、海馬錐体の神経細胞数が減少している（細胞消失は空間学習能力の欠落に関係していると思われる）という理由により選択された。空間的記憶課題の欠落がこれらの動物に観察されたが、これはコリン作用性の薬物（スコポラミン）に応答すると報告され（シモンズ他、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、４２、３７５〜３８３、１９８８）、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬（フィソスチグミン）及びムスカリンアゴニスト（ＡＦ１０２Ｂ、ＰＤ１５１８３２）（シモンズ他、１９８８；ビンセント他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、５９７、２６４〜２６８、１９９２；シュワルツ他、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．、４０、１３３〜１４３、１９９７）の両薬剤はＭＷＭを用いたこのモデルの中で成績を上昇させる効果を有することが示された。
【０２８８】
各群のマウスは無作為に７つの投与群に分けられた（ｎ＝１２〜１４／群）。１群と２群はＡＦ１５０（Ｓ）を０．５及び１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．１０ｍｌ／ｋｇの液量で、３群と４群はＡＦ２６７Ｂを同じ投与量と液量で、５群と６群はリバスチグミンとニコチンをそれぞれ１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐで、７群は溶媒である０．９％生理的食塩液を投与した。すべての被験化合物と生理的食塩液は行動試験開始前の４日間に１日１回投与し、その後５日間の実験期間に、試験３０分前に投与した。
【０２８９】
訓練：各マウスは４日連日試行（１ブロック）を１日４回、プラットホームの位置が一定のまま、プールの南東区画の中央に位置した状態で訓練を行った。４試行からなる各ブロック内で、各マウスは各スタート位置をスタートしたが、位置の順番は無作為に選択された。試行はプール周囲の４スタート位置のうち、北、南、東、又は西の１つでプール壁に面した水中に手でマウスを入れることからなっていた。逃避潜時（プラットホーム発見までの時間）、道程（マウスの運動距離）、及び速度（マウスの水泳率）を監視装置により試行ごとに記録した。
【０２９０】
各マウスのために、各４訓練日における４試行の道程、逃避潜時、及び水泳速度をブロック（各日１ブロック）に群分けした。３つの全尺度のスコアを３元配置の多変量分散分析（２×７×４）により解析した。この分析には１つの反復変数（日）及び２つの非反復変数［マウスの系統−Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ又はＣ５７ＢＬ６Ｊ、及び投与−各２つの投与量、ＡＦ１５０（Ｓ）、ＡＦ２６７Ｂ、リバスチグミン、ニコチン（各１つの投与量）及び生理的食塩液］を用いた。有意な相互作用の試験に特に適している単純主効果対比分析の手法を用いて特定の比較を行った。
【０２９１】
逃避潜時：海馬が小さいマウス（小海馬マウス）は正常な海馬のマウス（正常海馬マウス）より有意に長い逃避潜時（最低のＲＭ能力を示す）を示した。ＡＦ１５０（Ｓ）とＡＦ２６７Ｂ及びリバスチグミンは小海馬マウスの訓練成績に良い効果を与えた［Ｆ（６／１６１）＝６．３９、ｐ＜０．０００１］。具体的には、各ムスカリン化合物の２つの投与量において小海馬マウスの逃避潜時が対照群と比較して改善し（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）、その上、ＡＦ１５０（Ｓ）は両投与量で等しく成績に効果したが、ＡＦ２６７Ｂは成績に対する効果において用量応答曲線を示した（ｐ＜０．０２）。ＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂは両方ともリバスチグミンより効果的に成績に効果した（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１）。ＡＦ２６７Ｂが訓練中に正常海馬マウスの逃避潜時に有意に効果しなかったのに対し、ＡＦ１５０（Ｓ）は両投与量で正常海馬マウスの逃避潜時を増加させた（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）。ニコチンは小海馬マウスに見られる記憶障害の改善効果を有しないが、正常海馬マウスの成績を低下させた（ｐ＜０．０２）。この結果はさらに、訓練の有意な一般的効果を示し［Ｆ（３／４８３）＝９０．４９、ｐ＜０．０００１］、４日の訓練期間中すべての群の逃避潜時が直線的に減少した（ｐ＜０．０００１、多項式対比による）。
【０２９２】
道程：小海馬マウスは正常海馬マウスより道程が有意に長いことが示された［Ｆ（６／１６１）＝２．３５、ｐ＜０．０３３］。ＡＦ１５０（Ｓ）（両投与量）、ＡＦ２６７Ｂ（高い方の投与量）、及びリバスチグミンは小海馬マウスの成績に良い効果を与えた（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）。ＡＦ２６７Ｂもリバスチグミンもこれらのマウスの道程への効果はないのであるが、ＡＦ１５０（Ｓ）（高い方の投与量のみ）は有意に（ｐ＜０．０５）正常海馬マウスの道程を低下させた。ニコチンは、試験に供したマウスのどの系統にも有意な道程に対する効果を示さなかった。この結果はさらに、有意な訓練の一般的効果を示し［Ｆ（３／４８３）＝８６．９８、ｐ＜０．０００１］、４日の訓練期間中すべての群の道程が直線的に減少した（ｐ＜０．０００１、多項式対比による）。
【０２９３】
水泳速度：生理的食塩液を投与した２つのマウス系統間で自発運動量の違いが観察された。小海馬マウスの水泳速度は正常海馬マウスの水泳速度より有意に遅かった［Ｆ（６／１６１）＝１４．３２、ｐ＜０．０００１］。その上、両ムスカリン性薬剤は有意に小海馬マウスの水泳速度を増加させた。具体的には、ＡＦ１５０（Ｓ）の増加効果は両投与量間で同等であるが（ｐ＜０．００１）、ＡＦ２６７Ｂは用量依存的に水泳速度を高めた（ｐ＜０．００１、対照群と比較して；ｐ＜０．０２、投与量間で）。さらに１ｍｇ／ｋｇのＡＦ２６７Ｂは１ｍｇ／ｋｇのＡＦ１５０（Ｓ）より水泳速度をさらに強く有意に増大させた（ｐ＜０．００１）。リバスチグミンもニコチンも小海馬マウスの水泳速度に対する有意な効果を持たなかった。ＡＦ１５０（Ｓ）は有意に正常海馬マウスの水泳速度を低下させた（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）が、ＡＦ２６７Ｂに低下効果はなかった。同様に、リバスチグミン（ｐ＜０．０１）及びニコチン（ｐ＜０．００１）はこれらのマウスの水泳速度を有意に減少させた。この結果は訓練のさらに有意な一般的効果を示し［Ｆ（３／４８３）＝１５．３４、ｐ＜０．０００１］、４訓練日の間、すべての群の水泳速度が直線的に増加した（ｐ＜０．０００１、多項式対比による）。
【０２９４】
移動試験：４日目の第１７試行の間、プラットホームはプール（探査試行）から完全に除去された。この試行ではマウスを一定時間（３０秒）水中に入れ、プールの４区画に渡る逃避潜時及び道程の相対分布を記録して空間的偏向を測定した。トランスファー試行による道程及び逃避潜時（第１７試行）は３元配置の多変量分散分析（２×７×４）により解析した。この解析には１つの反復変数（プールの区画）及び２つの非反復変数［マウスの系統−Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ又はＣ５７ＢＬ６Ｊ、及び投与−各２つの投与量、ＡＦ１５０（Ｓ）、ＡＦ２６７Ｂ、リバスチグミン、ニコチン（各１つの投与量）及び生理的食塩液］を用いた。
【０２９５】
道程の測定による相互作用はもう少しで有意となる程度であったが［Ｆ（１８／４８３）＝１．５、ｐ＜０．０８］、逃避潜時測定による３元相互作用は統計学的に有意であることが明らかとなった［Ｆ（１８／４８３）＝１．６２、ｐ＜０．０５］。生理的食塩液を投与された正常海馬マウスは移動試験において完全な空間的偏向を示した。このマウスはプールの他の３区画に対し、有意に訓練区画にいる時間が多かった（ｐ＜０．００１）。一方、生理的食塩液を投与された小海馬マウスはこのテストにおいて部分的空間的偏向のみを示した。このマウスは第２区画では相関がなく、第３区画（ｐ＜０．００１）及び第４区画（ｐ＜０．０５）と比較して第１区画内で費やす時間が有意に多かった。しかしながら、ＡＦ１５０（Ｓ）又はＡＦ２６７Ｂ（両投与量による）又はリバスチグミンを投与した小海馬マウスは、正常海馬マウスの様に完全な空間的偏向を示した。反対に、ニコチンを投与された小海馬マウスは生理的食塩液を投与した正常海馬マウスの様に部分的にしか空間的偏向を示さなかった。他の薬剤を投与した正常海馬マウスのすべてが移動試験で完全な空間的偏向を示したのに対し、１ｍｇ／ｋｇのＡＦ１５０（Ｓ）を投与した正常海馬マウスは移動試験において部分的空間的偏向を示した。道程測定の結果は逃避潜時測定結果とほぼ同様であった。
【０２９６】
逆転試験：５日目の１８〜２１試行の間、プラットホームの位置を訓練区画と反対の北西の区画に変えた。このように、逆転学習の間、空間内物体の配置と相対的にプラットホーム位置を移動させた。しかしプール自体は、試験全体を通して空間内の同じ位置を占めた。ネズミでのテスト及びその尺度は訓練の時と同様である。
【０２９７】
各マウスに対し、逆転試験の逃避潜時、道程、及び水泳速度（第１８〜２１試行）は１つのブロックに群別した。３種の尺度すべてを２元配置の多変量分散分析（２×７）により解析した。この解析には２つの変数［マウスの系統−Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ又はＣ５７ＢＬ６Ｊ、及び投与−各２つの投与量、ＡＦ１５０（Ｓ）、ＡＦ２６７Ｂ、リバスチグミン、ニコチン（各１つの投与量）及び生理的食塩液］を用いた。
【０２９８】
逃避潜時：小海馬マウスは逆転学習の間、正常海馬マウスより有意に長い逃避潜時を示した［Ｆ（６／１６１）＝３．２６、ｐ＜０．００５］。０．５ｍｇ／ｋｇのＡＦ１５０（Ｓ）を投与した正常海馬マウスは有意に（ｐ＜０．０５）逃避潜時を低下させたが、ムスカリン性薬剤であるＡＦ１５０（Ｓ）及びＡＦ２６７Ｂの両剤は（２つの投与量により）、有意に（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）小海馬マウスの逃避潜時を改善した。リバスチグミン及びニコチンの両薬剤はＣ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ又はＣ５７ＢＬ６Ｊのマウスのいずれにも有意な効果を示さなかった。
【０２９９】
道程：この尺度で認められた唯一の有意な効果（ｐ＜０．０５）は、正常海馬マウスにおける１ｍｇ／ｋｇのＡＦ１５０（Ｓ）による逆転学習の低下であった［Ｆ（６／１６１）＝２．８５、ｐ＜０．０１１、２元相互作用］。
【０３００】
水泳速度：自発運動量において生理的食塩液投与とマウス２系統の間に有意差は認められなかった。しかしながら、両ムスカリン性薬剤は両投与量において有意に（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）小海馬マウスの水泳速度を増加させた［Ｆ（６／１６１）＝８．７１、ｐ＜０．０００１］。正常海馬マウスの水泳速度は０．５ｍｇ／ｋｇのＡＦ１５０（Ｓ）（ｐ＜０．０２）、１ｍｇ／ｋｇのＡＦ２６７Ｂ（ｐ＜０．０５）、リバスチグミン（ｐ＜０．０１）及びニコチン（ｐ＜０．０５）により有意に減少した。
【０３０１】
ＡＦ１５０（Ｓ）、ＡＦ２６７Ｂ、及びアセチルコリンエステラーゼ阻害薬、リバスチグミンは、小海馬マウスにおいて有意にこれらの悪化（水泳速度）を弱めた。逆転学習において２つのムスカリン性化合物により同様な改善が示されたが、習得と保持の間に認識機能の改善がさらに目立った。反対に、ニコチンでは小海馬マウスの認識能力において有益な効果は認められなかった。逃避潜時測定で示された他の薬剤とは異なる認識障害の改善により、習得におけるＡＦ２６７Ｂの用量応答効果が実証された。１ｍｇ／ｋｇにおける有益な効果は０．５ｍｇ／ｋｇの場合より有意に強かった。移動試験の間、薬剤を投与していない小海馬マウスは、プラットホーム位置に関する部分的記憶障害のみを示した。これらの障害の有意な改善は、試験された２種の投与量における両ムスカリン性薬剤でもリバスチグミンと同様に、同等に申し分なく実証された。ニコチンでは有意な改善は認められなかった。学習及び記憶過程の改善に対する、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ１５０（Ｓ）の寄与は２つの知見により強調された。２つの知見とは、習得におけるＡＦ２６７Ｂにより示された用量応答効果、及びプローブ（移動）試行で実証された両薬剤の有益な効果である。この観点において、探査試行はＭＷＭ課題において最も重要な手法であり、原学習の強度及び精度の定量化の尺度となることに留意すべきである。
【実施例４９】
【０３０２】
ＡＦ１５０（Ｓ）は虚血ラットにおける認識障害の回復に効果がある
ラットにおける一過性虚血を虚血モデル（ボール他、Ｓｔｒｏｋｅ、２０：１７００〜１７０６、１９８９）の修正法により誘発した。この誘発はＳＤラット（４２匹の雄、３カ月齢、体重２７０〜３４０ｇ）の両側性頚動脈閉塞に、ニトロプルシドナトリウムによる血圧低下を併用して行った。虚血は２１匹のラットに誘発させ、他の２１匹は偽手術対照群とした。ペントバルビタール麻酔下（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）でニトロプルシドナトリウム（４．８ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ）を２５分間、尾静脈に留置したカニューレから投与した。投与開始から５分後、平均血圧が３０〜６０ｍｍＨｇに維持された時（初期値〜１１０ｍｍＨｇ）、両側の頚動脈をクランプで２０分間固定した。その直後、全身性アシドーシスを最小限に抑えるために１．８ｍＥｑ重炭酸ナトリウム溶液を腹腔内投与した。偽手術ラットは虚血ラットとして麻酔し、生理的食塩液を投与した。偽手術ラットの頚動脈は取り出したが、クランプによる固定はしなかった。虚血を誘発したラットは術後２４時間で３０％の死亡率を記録した。虚血ラットは行動試験を実施するまでの３週間を回復期間とした。ラットは無作為に４群に割付した。即ち、ＡＦ１５０（Ｓ）（０．５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）を投与する虚血ラット及び偽手術ラット、そして対照群である２回滅菌した蒸留水（ＤＤＷ）（１０ｍｌ／ｋｇ、ｐｏ）を投与する虚血ラット及び偽手術ラットである。各群は１０〜１１匹で構成した。ＡＦ１５０（Ｓ）の投与は、手術直後、行動試験開始前の各週に１日１回（６日／週）、その後３週の実験期間に試験の６０分前に行った。試験した動物の評価はＭＷＭにおける作動記憶見本合わせ範例を使用して行った。
【０３０３】
逃避潜時の割合（ＲＥＬ）及び道程の割合（ＲＰＬ）は各パラメーターでの第２ブロック／第１ブロックの比で算出した。ＲＥＬとＲＰＬは第１試行から第２試行までの行動における相対的省力を反映する。ＲＥＬとＲＰＬは３元配置の分散分析（２×２×３）により解析した。この解析には１つの反復変数（週）及び２つの非反復変数［手術−虚血／偽手術及び投与−ＡＦ１５０（Ｓ）／ＤＤＷ］を用いた。
【０３０４】
ＲＥＬとＲＰＬの両方において、手術×投与間の相互作用が統計学的に有意であることが分かった［ＲＥＬ及びＲＰＬがそれぞれＦ（１／３２）＝８．０８；ｐ＜０．０１、及びＦ（１／３２）＝６．７５；ｐ＜０．０２５］。単純主効果対比分析は、ＤＤＷを投与した虚血ラットのＲＥＬ及びＲＰＬがＤＤＷを投与した対照ラットのＲＥＬ及びＲＰＬより高値であることを示した（ＲＥＬ及びＲＰＬがそれぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．０２）。この結果は、対照ラットと比較して虚血ラットが作動記憶過程に障害を持つことを示す。
【０３０５】
ＡＦ１５０（Ｓ）はＤＤＷ投与と比較して虚血ラットの作動記憶成績を有意に改善した。ＡＦ１５０（Ｓ）を投与した虚血ラットのＲＥＬ及びＲＰＬの両方が、ＤＤＷを投与した虚血ラットのＲＥＬ及びＲＰＬと比較して有意に低かった（ｐ＜０．０５）。ＡＦ１５０（Ｓ）を投与した対照ラットは成績に有意な変化を示さなかった。どの試験群においても水泳速度に差が認められなかった。結論として、ＡＦ１５０（Ｓ）、０．５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏの長期投与は、３週間の実験期間（３〜６週間の薬剤投与後）における虚血ラットの作動記憶成績に明らかな改善を示した。非特異的な運動協調効果は、虚血ラットの行動に対する効果について、或いはＡＦ１５０（Ｓ）の改善効果についての説明ともならない。なぜなら、モリスの水迷路試験においてラットの水泳能力に有意な効果が示されなかったからである。
【実施例５０】
【０３０６】
トリヘキシフェニジルを投与したラットにおけるＡＦ１５０（Ｓ）、ＡＦ２６７Ｂ、ＡＦ２９２、ＡＦ７０４の効果
トリヘキシフェニジルは脳血液関門を通過し、記憶及び学習障害を誘発するＭ１選択的なムスカリンアンタゴニストである（バイマスター他、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２６７：１６〜２４、１９９３、ロルダン他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２３０：９３〜９６、１９９７；木村他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８３４：６〜１２、１９９９）。
【０３０７】
実験未使用のウィスターラットを以下の実験に使用した。受動的回避課題は訓練（習得）期及び保持期から構成した。訓練手順の中で各ラットは個々に照明を施した小さな区画に置き、６０秒間の習熟／順応の後、大きな区画へのドアを開け、大きな区画に入る潜時を測定した（初期潜時）。暗い区画に入った直後、ドアを閉め、回避できない肢刺激（０．６ｍＡ、３秒）を格子床から与えた。初期潜時のカットオフ値は１８０秒とした。１８０秒以内に入らなかった（通過しなかった）ラットは実験から除外した。習得試行の後、ラットは元のケージに返した。受動的回避課題の保持は２４時間後に測定した。即ち、ラットを再び明るい区画に置き、６０秒の順応期間の後、ドアを開け、暗い区画に再び入るまでの潜時を測定した。保持潜時のカットオフ値は３００秒とした。３００秒以内に通過しなかったラットは実験器具から取り出し、３００秒の潜時として記録した。
【０３０８】
被験化合物はＡＦ１５０（Ｓ）（０．５、１、及び５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）、ＡＦ２６７Ｂ（０．５、１、及び５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）、ＡＦ１０２Ｂ（１ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）である。ＡＦ１５０（Ｓ）−５ｍｇ／ｋｇ（２２２±２５．６）、ＡＦ２６７Ｂ−０．５ｍｇ／ｋｇ（１８１．１±３５．４）、ＡＦ２６７Ｂ−１ｍｇ／ｋｇ（２９０．１±８．５）、ＡＦ１０２Ｂ−１ｍｇ／ｋｇ（２３４．４±３５．３）を投与したトリヘキシフェニジル処理ラットの保持潜時は、２回滅菌した蒸留水（ＤＤＷ）を投与したトリヘキシフェニジル処理ラットの保持潜時より有意に長かった（８２．９±１９．５５）（ｐ＜０．０１−０．００１）。その上、ＡＦ２６７Ｂ−１ｍｇ／ｋｇを投与したトリヘキシフェニジル処理ラットの保持潜時は、ＡＦ２６７Ｂ−０．５ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）又はＡＦ１５０（Ｓ）−５ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）を投与したトリヘキシフェニジル処理ラットの保持潜時より有意に長かった。様々な薬剤又はＤＤＷを投与した対照群の保持潜時の間には、差は認められなかった。ＡＦ７０４もまたこの試験において有意な効果を示した。このように、ＤＤＷを投与したトリヘキシフェニジル処理ラットの保持潜時（１１６．２５±３６．３６）はＤＤＷを投与した対照ラット（ＤＤＷ）の保持潜時（３００±０）より有意に短かった（ｐ＜０．００１）。しかしながら、ＡＦ７０４−０．１ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ（２１４．７０±３６．６３）、０．５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ（２８３．５０±１７．３９）、及び１ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ（２７４．４４±２６．９７）投与したトリヘキシフェニジル処理ラットの保持潜時は、ＤＤＷを投与したトリヘキシフェニジル処理ラットの保持潜時より有意に長かった（ｐ＜０．０１−０．００１）。
【０３０９】
ＡＦ２９２は試験したアゴニストの中で最も効力の強い化合物であった。ＡＦ２９２は０．１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏの投与量の時に有意に効果的であった。ＡＦ２９２の最低用量である０．０３ｍｇ／ｋｇ、ｐｏを２４及び７２時間後に投与した場合、７２時間遅延の場合のみがＰＡでの保持潜時において有意な効果を示した［ＤＤＷの９３．１±２９．０に対し２２５．９±３６；ｐ＜０．０１  ＤＤＷを投与したトリヘキシフェニジル処理ラットとの比較］。初期潜時において効果は認められなかった。これらの結果は、ピレンゼピンを用いた結合試験でＡＦ１５０（Ｓ）がより高い効力を持つ（低親和性及び高親和性）のにもかかわらず、ＡＦ２９２は効力の高いアゴニストであることを示す［例えば、ＡＦ１５０（Ｓ）より２桁効力が高い］。ＡＦ２９２のこの効果は、ラットにおけるＡＦ２９２の生物学的利用率がＡＦ１５０（Ｓ）より高い（４９％対３１％）という理由のみによるものではない。
【実施例５１】
【０３１０】
老齢ラットの認識機能に対するＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ２９２の効果
老齢ラット（２２〜２４カ月齢）及び幼若ＳＤラット（３カ月齢）をＭＷＭで試験した。老齢ラットは幼若ラットより有意に遅い学習曲線を示した［Ｆ（３／２６７）＝６．７４、ｐ＜０．０００１］及び［Ｆ（３／２６７）＝４．６６、ｐ＜０．００３、それぞれ逃避潜時及び道程］。学習においてはどの被験化合物も有意な効果を示さなかった。しかしながら、ＡＦ２６７Ｂ−１ｍｇ／ｋｇを投与した老齢ラットでは改善の傾向を示した。すべての幼若ラットは老齢ラットと比較して、探査試行における２つのパラメーターにおいて空間的偏向を示した［Ｆ（３／２６７）＝３４．９１、ｐ＜０．０００１及びＦ（３／２６７）＝９．０６、ｐ＜０．０００１、それぞれ逃避潜時及び道程］。記憶については有意な効果はどの被験化合物にも認められなかった。しかしながら、ＤＤＷを投与した老齢ラットと比較して、ＡＦ２９２を２つの投与量で投与した老齢ラットはこの試験で部分的な空間的偏向の傾向を示した。
【０３１１】
老齢ラットは逆転学習の間、幼若ラットより有意に悪い成績を示した。ＡＦ２６７Ｂ−１ｍｇ／ｋｇは老齢ラットの逆転学習を有意に改善した［Ｆ（４／８８）＝２．６２、ｐ＜０．０４及びＦ（４／８８）＝２．５８、ｐ＜０．０４、それぞれ逃避潜時及び道程］。老齢ラットの逆転学習におけるＡＦ２６７Ｂの有益な効果は、ＡＦ２６７Ｂが老齢ラットの水泳能力に有意な効果を示さなかったので、非特異的な運動協調効果に由来するものとは考えられない。ＡＦ２９２は老齢ラットの逆転学習において有意差に達しなかったが、曲線の形態から両方の投与量、１及び０．５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏにおいて改善の傾向がある。
【実施例５２】
【０３１２】
ＡＦ２９２のＣＮＳに対する安全性プロファイル（表１）
ＡＦ２９２の一般行動に対する可能性のある効果及び他のＣＮＳ関連薬理効果について齧歯類で評価した。ＡＦ２９２を経口で１、１０、３０、６０、又は１００ｍｇ／ｋｇ投与したラットにおいて、溶媒対照群と比較して有意な身体的又は行動的特徴は観察されなかった。投与後２４時間において身体的又は行動的特徴は観察されなかった。すべてのラットをそのままの状態で１４日間維持したが、この維持期間を通して、すべてのラットは正常と思われた。対照的に、化合物ＡＦ２６７Ｂでは投与後最初の１時間で既に幾つかの効果（約４０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏで唾液分泌及び涙液分泌）を示し始めた。
【実施例５３】
【０３１３】
ＡＦ２９２の心血管系に対する安全性
１．アステミゾール（ＨＥＲＧ（ｈｕｍａｎ  ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）チャネル）結合試験。ｈＥＲＧにコードされるチャネルへの［３Ｈ］−アステミゾールの結合を阻害しなかったので、この結合試験においてＡＦ２９２は活性がなかった。
【０３１４】
２．分離したモルモットの心房（心房細動）。ＡＦ２９２は収縮力に対して有意に効果しなかった。しかし、対照である溶媒で見られた程度よりも、ＡＦ２９２はわずかに収縮率を減少する傾向があった。
【０３１５】
３．機器を取り付けた覚醒イヌの心臓電気生理学的、血行動態におけるＡＦ２９２（投与量５ｍｇ／ｋｇ、経口）の効果。多様な年齢で体重が９．４〜１２ｋｇの範囲であり、健康で訓練を受け、機器を長期的に取り付けたビーグルの雌イヌを心血管パラメーターの測定に使用した。心血管パラメーターは心拍数、拡張期及び収縮期血圧、ＰＲＰ（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｒａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ、心拍数×収縮期血圧）、ＬＶｄｐ／ｄｔ  ｍａｘ、ＬＶｄｐ／ｄｔ  ｍａｘ／ｐｄ、ＬＶｄｐ／ｄｔ  ｍｉｎ、心拍出量、１回拍出量、全身血管抵抗、及び心電図パラメーター［ＰＱ、ＱＲＳ、ＱＴ、ＱＴｃＢａｚｅｔｔ（ＱＴｃＢ）、ＱＴｃＦｒｉｄｅｒｉｃｉａ（ＱＴｃＦ）及びＱＴｃＶａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒ（ＱＴｃＶｄＷ）］の各間隔期間、並びにＱＴ間隔分散）である。実験前最後の１８時間はイヌに餌を与えなかった。水は自由に摂取させた。各実験の開始時に、各パラメーターの対照値を少なくとも３０分間記録した。その後、５ｍｇ／ｋｇのＡＦ２９２（ｎ＝４）又は同量の溶媒（ｎ＝４）を経口チューブにより投与した。各血行動態パラメーターをその後連続４時間記録した。
【０３１６】
５ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与したＡＦ２９２は、血行動態又は心電図パラメーターにおいて、統計学的に有意で関連する効果を示さなかった。例えば、血圧、心臓収縮性（ＬＶｄｐ／ｄｔ  ｍａｘ；ＬＶｄｐ／ｄｔ  ｍａｘ／ｐｄ）及び弛緩（ＬＶｄｐ／ｄｔ  ｍｉｎ）、１回拍出量、全身血管抵抗、ＰＱ、ＱＲＳ、ＱＴ、ＱＴｃＢ、ＱＴｃＦ、及びＱＴｃＶｄＷの各間隔、並びにＱＴ間隔分散及び心電図の形態についてである。
【実施例５４】
【０３１７】
チトクロームＰ４５０アイソフォーム阻害におけるＡＦ２９２の効果
チトクロームＰ４５０活性は潜在的な薬物間相互作用の指標となりうる。ＡＦ２９２をＰ４５０阻害について、マイクロタイタープレートアッセイにて評価した。ＡＦ２９２は１０μＭまでの濃度において、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ３Ａ４、及びＣＹＰ２Ｄ６アイソフォームを有意に阻害しなかった。これらは主要な５種のヒトＰ４５０酵素であり、薬物代謝及び関連する薬物間相互作用を担っている。
【実施例５５】
【０３１８】
ＡＦ２９２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ代謝
ＡＦ２９２の代謝安定性について、ラット、イヌ、サル、及びヒトの肝ミクロソーム中でインキュベートした間のＡＦ２９２の消失を観察して評価した。テストステロン、及びプロプラノロールも実験対照としてインキュベートした。結果は表１に示した。
【実施例５６】
【０３１９】
ヒト大腸腺癌（Ｃａｃｏ−２）細胞へのＡＦ２９２の浸透性試験
この試験は被験化合物の腸への浸透性を決定するために用いられた。Ｃａｃｏ−２細胞が半透性フィルター上で増殖した時は、培養液中で自然に分化し、構造的にも機能的にも小腸上皮細胞と類似する集密的単層を形成する。この特性により、Ｃａｃｏ−２細胞は腸管粘膜における薬剤吸収や吸収中の代謝を研究するｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして有用である。Ｃａｃｏ−２細胞の単層は、１２ウェルプレート中のコラーゲン被覆した微多孔性のポリカーボネート膜上で集密的状態に増殖させ、被験物質の浸透性を決定した。ＡＦ２９２の平均浸透率（Ｐａｐｐ）は１７．４×１０６ｃｍ／秒であり、高い吸収能を有すると評価された（双方向性分析を実施した）。
【実施例５７】
【０３２０】
タンパク質結合
ヒト血清、α１−糖タンパク質、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及びダルベッコのリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中でタンパク質結合試験を実施した。ＡＦ２９２は最終濃度を１０μＭとして添加した。結果はＰＢＳ緩衝塩水中、用量濃度（μＭ）、及びヒトα−糖タンパク質（ＡＧＰ）中では０％のタンパク質結合であった（表１参照）。
【実施例５８】
【０３２１】
ラット及びイヌにおけるＡＦ２９２の薬物動態プロファイル
ラット及びビーグル犬（１晩絶食、薬剤は水溶液にて投与；経口チューブ）におけるＡＦ２９２の薬物動態プロファイルの結果を表１に一覧表として示した。
【実施例５９】
【０３２２】
ＡＦ２６７Ｂの毒性学的プロファイル
ウィスターラット及びビーグル犬における１３週までの慢性毒性試験において広範囲にわたりＡＦ２６７Ｂを試験した。イヌにおいて無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は経口で６〜９ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であると考えられた。イヌ（＞９ｍｇ／ｋｇ）及びラット（＞４０ｍｇ／ｋｇ）で認められた効果は、ムスカリンアゴニストであるＡＦ２６７Ｂのプロファイルと一致し、心血管系の毒性変化は認められなかった（覚醒イヌでの試験）。ＡＦ２６７Ｂは広範囲にわたりビーグル犬で１３週までの経口投与による毒性を評価し、心電図（ＥＣＧ）は定期的に被験化合物の投与前後に記録した。心拍数、Ｐ波の持続時間及び振幅、Ｐ−Ｑ、ＱＲＳ、及びＱＴ間隔を測定したが、被験化合物の投与に関連すると考えられるＥＣＧの変化は観察されなかった。
【実施例６０】
【０３２３】
Ａβ線維に曝露したラット海馬神経細胞におけるＡＦ２６７Ｂの効果；その後の生存率及びアポトーシス、ＧＳＫ３−β活性、細胞質及び核内β−カテニンの安定性、サイクリンＤ１の発現について
この研究はラット海馬の初代培養細胞において、ガリド  ＪＬ他（ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２００２；１６：１９８２）により述べられた方法を用いて行った。
【０３２４】
ＡＦ２６７Ｂは０．５〜５０μＭの濃度において、海馬神経細胞の生存率及び形態に効果しなかった。しかしながら、ＡＦ２６７Ｂ（１０μＭ）は、単独曝露において生存率及び形態において４５％の低下を引き起こすＡβ１−４０（５μＭ）から、９０％を越える海馬の神経細胞を保護した。これらのＡＦ２６７Ｂの保護効果は、Ｍ１アンタゴニストであるピレンゼピン（１０ｎＭ）で阻害されたことから、Ｍ１ムスカリン性受容体により介在される。ＡＦ２６７Ｂ（１００μＭ）はラット海馬神経細胞の培養細胞においてＧＳＫ−３β活性を６０％まで低下させた。このような実験条件の中で、１０μＭのＡβ線維は対照群（１００％）と比較してＧＳＫ−３β活性を３７０％まで増加させた。その上、ＡＦ２６７Ｂ（１０μＭ）は、対照群と比較してＧＳＫ−３β活性を１５０％と同程度に低下させ、Ａβ繊維（１０μＭ）の効果に拮抗した。ＡＦ２６７Ｂ（１０μＭ）はＡβ１−４０（５μＭ）が誘導するアポトーシスを対照群のレベルまで抑制した。海馬神経細胞の培養細胞をＡβ１−４０（５μＭ）に曝露した場合、可溶性β−カテニンが分解したが、この分解はＡＦ２６７Ｂ（１００μＭ）により抑制された。実際に、ＡＦ２６７Ｂは濃度依存的に可溶性β−カテニン濃度を対照群より増加させた［例えば、１μＭ（１００％）、１０μＭ（３００％）、１００μＭ（３５０％）］。Ａβ１−４０（５μＭ）は核内β−カテニンを低下させ（６０％まで）、この効果はＡＦ２６７Ｂにより阻害された［１μＭ（対照群に対し１４０％）］。これらのＡＦ２６７Ｂの保護効果は、ピレンゼピン（１０ｎＭ）により阻害されるので、Ｍ１  ｍＡＣｈＲにより介在される。ラット海馬神経細胞におけるＡβ１−４０（５μＭ）の不安定化作用は、免疫蛍光染色で検出した樹状細胞の萎縮により示された。核の位置はｃ−ｊｕｎ抗体により示された。ＡＦ２６７Ｂは神経細胞を保護し、この神経細胞はＭ１アゴニストに曝露した時、正常な神経突起を有していた。このＡＦ２６７Ｂの効果は、ピレンゼピン（１０ｎＭ）で阻害されることから、Ｍ１  ｍＡＣｈＲにより介在される。最後に、ＡＦ２６７ＢはＡβ１−４０（５μＭ）に誘導されたサイクリンＤ１の減少（対照群に対して４０％）に対して保護効果（対照群に対して５０％）を有する。サイクリンＤ１はＷｎｔシグナル経路の標的遺伝子である。この場合もやはり、ＡＦ２６７Ｂのこの効果は、ピレンゼピン（１０ｎＭ）で阻害される。
【０３２５】
ここに示された結果は、ＭＴＴ減少、神経フィラメントの免疫蛍光、及びアポトーシス分析により評価されたように、ＡＦ２６７Ｂが神経細胞を保護することを示す。
【０３２６】
上に示されたように、現在の発明の実施例に使用された化合物は低分子化合物であり、脳血液関門を通過する。これらの化合物の多くは、とりわけ、ＡＤ及び他の関連疾患と様々な点で類似する症状を示す各種動物モデルでの記憶改善や学習改善など、さらに有益な効果を持ち、優れた安全域を有する。
【０３２７】
表１はＡＦ２９２及びＡＦ２６７Ｂにおける試験結果の幾つかの比較を示す。
【０３２８】
【表１−１】
2010184946.tif 000089
【表１−２】
2010184946.tif 000090
【０３２９】
表１に示された結果は、ＡＦ２６７Ｂ及びＡＦ２９２は同じ親和性を有するが、ｍＡＣｈＲ亜型により効果が異なることを示す。
【０３３０】
本発明は特に前記に特に示し、述べたものに限らないということは、当業者であれば理解されよう。本発明の範囲には、前記特徴の組合せ及び部分的組合せの両方、並びに前記説明を読んだとき、当業者であれば想いつくもので、従来技術にはない改変及び変更も含まれる。
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月8日(2010.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
【化３３】
2010184946.tif 000092