(57)【要約】【課題】製造上のコストが掛かる擬似移動層方式クロマト分離を行うことなく、簡便かつ安価に１−ケストースの結晶化母液を調製することができる新規方法を提供することにある。【解決手段】本発明による１−ケストースの結晶化母液の調製方法は、（１）β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼとを含む酵素溶液中において、β−フラクトフラノシダーゼをスクロースと接触させて、１−ケストースを生成させ；（２）前記工程（１）の反応により副生するグルコースを、該溶液中でグルコースオキシターゼによりグルコン酸に変換し；（３）生じたグルコン酸を溶液から除去することによって、溶液中の中性糖における１−ケストース純度を７０％以上に増大させることを含んでなる方法であって、β−フラクトフラノシダーゼとして、特定のβ−フラクトフラノシダーゼ変異体を使用するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）  β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼとを含む酵素溶液中において、β−フラクトフラノシダーゼをスクロースと接触させて、１−ケストースを生成させ、
（２）  前記工程（１）の反応により副生するグルコースを、該溶液中でグルコースオキシターゼによりグルコン酸に変換し、
（３）  生じたグルコン酸を溶液から除去することによって、溶液中の１−ケストース純度を７０％以上に増大させる
ことを含んでなる、１−ケストースの結晶化母液の調製方法であって、
β−フラクトフラノシダーゼとして、フルクトース転移活性を有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列中の１〜１１個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列からなる、β−フラクトフラノシダーゼ変異体を使用することを特徴とする、１−ケストースの結晶化母液の調製方法。
【請求項２】
使用するβ−フラクトフラノシダーゼのフルクトース転移活性が、スクロースからの１−ケストースへの変換率が４５％以上であり、ニストースへの変換率が１０％以下であるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用するβ−フラクトフラノシダーゼのフルクトース転移活性が、スクロースからの１−ケストースへの変換率が５０％以上であり、ニストースへの変換率が６％以下であるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
β−フラクトフラノシダーゼ変異体が、アルペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）ＡＴＣＣ２０６１１株由来のものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
β−フラクトフラノシダーゼ変異体が、配列番号２のアミノ酸配列中、６２、１２２、１２８、１６５、１７０、２２１、３００、３１３、３８６、３９５、および５５０番目からなる群より選択されるいずれか１以上のアミノ酸残基において置換が行われたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
β−フラクトフラノシダーゼ変異体が、配列番号２のアミノ酸配列中、１７０、３００、３１３、および３８６番目からなる群より選択されるいずれか１以上のアミノ酸残基において置換が行われたものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
置換が、
１７０番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸への置換、
３００番のアミノ酸残基の、トリプトファン、バリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸への置換、
３１３番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸への置換、および
３８６番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸への置換
である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
β−フラクトフラノシダーゼ変異体が、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｆ１７０Ｗ、Ｇ３００Ｖ、およびＨ３１３Ｋの三重置換が行われたものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
グルコン酸の溶液からの除去を、電気透析により行うことをさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
グルコースオキシターゼが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）またはペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）由来のものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
グルコースをグルコースオキシターゼによりグルコン酸に変換する反応において、副生される過酸化水素をカタラーゼにより除去することをさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
カタラーゼが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）またはミクロコッカス・リソデキティカス（Micrococcus lysodeikticus）由来のものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法により得られる、１−ケストースの結晶化母液。
【請求項１４】
請求項１３に記載の結晶化母液から調製される、結晶１−ケストース。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、１−ケストースの結晶化母液の調製方法に関する。詳しくは本発明は、結晶１−ケストースを析出させる結晶化母液を、簡便かつ安価に調製することができる方法に関する。
【０００２】
背景技術
フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）は、スクロース（ＧＦ）に１個以上のフラクトース残基がβ２−１結合により結合されたオリゴ糖類である。例えば、スクロースに１個のフラクトース残基が結合したものが１−ケストース（ＧＦ２）、２個結合したものがニストース（ＧＦ３）、３個結合したものがフラクトシルニストース（ＧＦ４）である。フラクトオリゴ糖は、難う蝕性や、ビフィズス菌増殖促進作用、コレステロールなどの脂質の代謝改善作用、免疫調節作用など様々な生理機能を有することが明らかになっており、機能性の食品素材として産業上極めて有用である。
【０００３】
フラクトオリゴ糖は通常、重合度２〜５のオリゴ糖の混合物として得られる。この混合物は固体化すると非結晶性の粉末となってしまうため、吸湿性が高く、加工適性が悪い。一方、フラクトオリゴ糖から分画して得られる１−ケストースは結晶化できる。結晶１−ケストースは、吸湿性がほとんど無いため、フラクトオリゴ糖の生理機能を保持しつつ優れた加工適性を有するものである。このため、結晶１−ケストースは、キャンディ、錠菓、チョコレート等の機能性甘味料として利用可能であり、フラクトオリゴ糖の混合物よりも産業上有用であると言える。
【０００４】
結晶１−ケストースは、高純度な１−ケストース溶液である結晶化母液から結晶化することによって得ることができる。結晶１−ケストースを得るためには、結晶化母液中の１−ケストースの純度が７０％以上であることが好ましいとされている（特公平６−０７００７５号公報（特許文献１））。
【０００５】
１−ケストースは、β−フラクトフラノシダーゼによってスクロースから変換し生成することができる。しかしながら、β−フラクトフラノシダーゼをスクロースと接触させて得られる酵素反応液は、１−ケストース以外に糖類として、通常、未反応のスクロース、副生物としてのグルコース、フラクトース、ニストースを含む。例えば、特公昭６３−６２１８４号公報（特許文献２）および特開昭６１−２６８１９０号公報（特許文献３）に記載の方法によれば、スクロースから１−ケストースへの変換率は最大３６〜４１％に留まり、このとき、ニストースが１１〜２３％、フラクトースやグルコースなどの単糖が１３〜３２％副生し、また未反応のスクロースが１１〜２３％残存するとされている。
このため、通常、酵素反応液中における糖類中の１−ケストース純度は７０％よりも低くくなる。従って、酵素反応液から１−ケストースの結晶化母液を得るためには、スクロース、グルコース、フラクトース、ニストースの全てもしくは一部を除去し、溶液中の１−ケストースの純度を向上させる必要がある。
【０００６】
酵素反応液中の１−ケストース純度を向上させる方法としては、酵素反応液を擬似移動層方式クロマト分離に供して、１−ケストースの純度が向上した画分（すなわち、１−ケストース以外の成分が除去された画分）を集める方法が知られている（特開２０００−２３２８７８号公報（特許文献４））。しかしながら、擬似移動層方式クロマト分離により１−ケストース以外の糖類を除去する場合、１−ケストースの一部も同時に除去されるため、１−ケストースの純度は向上できるものの、１−ケストースの回収率が低下してしまう。また、１−ケストースの分画液がクロマト分離に用いる溶離液により希釈されてしまうため、濃縮画分より１−ケストースを結晶化するためには、大量の水を蒸発させる必要が生ずる。さらに、擬似移動層方式クロマト分離のための設備は通常、非常に高価である。以上の点から、擬似移動層方式クロマト分離を用いる場合には、結晶化母液の調製にコストがかかり、その結果、結晶１−ケストース自体が高価になってしまう。
このため、擬似移動層方式クロマト分離以外の方法によって、酵素反応液中の１−ケストース純度を向上させる方法が望まれていた。
【０００７】
ＷＯ９７／２１７１８（特許文献５）は、結晶１−ケストースおよびその製造方法に関するものであり、ここには、１−ケストース純度が８０％以上の高純度溶液を使用して、真空晶析または冷却晶析によって高回収率で高晶粒の結晶１−ケストースを得る方法が開示されている。スクロースから１−ケストースを生成するために、アスペルギルス属の微生物から得られるフラクトース転移活性を有する酵素を使用することが開示されており、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）ＡＴＣＣ２０６１１株由来の酵素が、１−ケストースの製造に適していることが示唆されている。しかしながら、ここでは、酵素反応液中の１−ケストースの純度を向上させる手段として、擬似移動相クロマト分離が好ましいとされており、他の有効な手段については何ら開示されていない。
【０００８】
擬似移動層方式クロマト分離以外の方法としては、例えば、D. C. Sheuらの文献（Biotechnology Letters 23:2001,p1499-1503（非特許文献１））、および、J. W. Yunらの文献（Journal of Fermentation and Bioengineering 77(2):1994,p159-163（非特許文献２））には、β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼの酵素の混合系を用いて、フラクトオリゴ糖を高収率で生産する方法が開示されている。これらでは、β−フラクトフラノシダーゼによりスクロースを、１−ケストースを含むフラクトオリゴ糖へ変換させると同時に、その際に副生するグルコースをグルコースオキシターゼによりグルコン酸に変換し、酵素反応後にグルコン酸を選択的に除去している。この内、D. C. Sheuらの文献（非特許文献１）では、β−フラクトフラノシダーゼとして、アルペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）ＣＣＲＣ９３００７株、またはアスペルギルス・ニガーＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フラクトフラノシダーゼが使用されており、J. W. Yunらの文献（非特許文献２）では、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）ＫＦＣＣ由来のβ−フラクトフラノシダーゼが使用されている。
【０００９】
しかしながら、これら文献は、１−ケストースを含むフラクトオリゴ糖の高収率での生成に関するものであり、１−ケストースのみを選択的に生成することについては検討されていない。実際、溶液中に生成される１−ケストース純度についてこれら文献中のデータに基づいて算出すると、D. C. Sheuらの文献（非特許文献１）では、アスペルギルス・ジャポニカスＣＣＲＣ９３００７株およびアスペルギルス・ニガーＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フラクトフラノシダーゼを使用した場合には、１−ケストース純度はそれぞれ約６５％、約２２％に留まる。また、J. W. Yunらの文献（非特許文献２）では、計算すると、１−ケストース純度は約４４％に過ぎない。
このため、これら文献の方法に基づいて、１−ケストースの純度が７０％以上となる結晶化母液を得ることは困難であると言える。
【００１０】
一方、ＷＯ９７／３４００４（特許文献６）およびＷＯ２００５／０８５４４７（特許文献７）には、１−ケストースを選択的に産生しうる活性を有する、β−フラクトフラノシダーゼ変異体が開示されている。また、ここには、アスペルギルス・ニガー由来のβ−フラクトフラノシダーゼをコードする遺伝子およびそのアミノ酸配列が開示されている。またこれらで開示されているβ−フラクトフラノシダーゼ変異体は、アスペルギルス・ニガーＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フラクトフラノシダーゼの遺伝子を鋳型として得られたものであることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特公平６−０７００７５号公報
【特許文献２】特公昭６３−６２１８４号公報
【特許文献３】特開昭６１−２６８１９０号公報
【特許文献４】特開２０００−２３２８７８号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ９７／２１７１８
【特許文献６】国際公開ＷＯ９７／３４００４
【特許文献７】国際公開ＷＯ２００５／０８５４４７
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Biotechnology Letters 23:2001,p1499-1503
【非特許文献２】Journal of Fermentation and Bioengineering 77(2):1994,p159-163
【発明の概要】
【００１３】
本発明者等は今般、β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼの酵素の混合系を用いて、スクロースから酵素反応による変換によって１−ケストースを得る一方、副生物であるグルコースをグルコン酸に酵素反応により変換し除去する方法（グルコン酸除去法）に、使用するβ−フラクトフラノシダーゼとして、特定のβ−フラクトフラノシダーゼ変異体を使用することによって、得られる酵素反応液中における１−ケストースの純度を選択的に７０％以上（具体的には７６％）に高めることに成功した。得られた溶液は、１−ケストースを７０％以上の純度で含むため、１−ケストースの結晶化母液として有利に利用できるものである。
【００１４】
前記したように、D. C. Sheuらの文献（非特許文献１）などに開示された従来のグルコン酸除去法では、微生物が産生する天然のβ−フラクトフラノシダーゼを用いて酵素反応を行っており、その結果、得られる反応液の１−ケストースの純度は最大でも６５％程度に留まっていた。このため、従来のグルコン酸除去法によっては、１−ケストースの結晶化母液を得ること自体、困難であった。
【００１５】
また前記したように、ＷＯ９７／２１７１８（特許文献５）には、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）ＡＴＣＣ２０６１１株由来の酵素が、１−ケストースの産生に適していることが示唆されていた一方で、β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼの酵素の混合系を用いる、D. C. Sheuらの文献（非特許文献１）に記載の方法では、アスペルギルス・ニガーＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フラクトフラノシダーゼを使用した場合には、１−ケストース純度は約２２％に留まったことが示されていた。このため、単体のβ−フラクトフラノシダーゼ酵素としては、１−ケストースの産生に適しているものであっても、β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼの酵素の混合系を用いる方法で、そのようなβ−フラクトフラノシダーゼ酵素を使用した場合には、必ずしも、期待通りに１−ケストースの純度を高めることはできず、むしろ純度が低下する可能性も示唆されていたといえる。
【００１６】
このような状況にあって、β−フラクトフラノシダーゼとして、特定のβ−フラクトフラノシダーゼ変異体を使用することによって、β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼの酵素の混合系を用いる方法で、１−ケストースの純度を選択的に大幅に高めることができたことは、予想外であり驚くべきことであった。また、かかる方法は、従来の擬似移動層方式クロマト分離を伴う方法に比べて、製造上のコストが安価に済み、また作業もより簡便である。すなわち、１−ケストースの高純度溶液を、安価かつ簡便に得ることができる。
【００１７】
本発明はこれら知見に基づくものである。
【００１８】
よって本発明は、製造上のコストが掛かる擬似移動層方式クロマト分離を行うことなく、簡便かつ安価に１−ケストースの結晶化母液を調製することをその目的とする。
【００１９】
本発明による１−ケストースの結晶化母液の調製方法は、
（１）  β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼとを含む酵素溶液中において、β−フラクトフラノシダーゼをスクロースと接触させて、１−ケストースを生成させ、
（２）  前記工程（１）の反応により副生するグルコースを、該溶液中でグルコースオキシターゼによりグルコン酸に変換し、
（３）  生じたグルコン酸を溶液から除去することによって、溶液中の１−ケストース純度を７０％以上に増大させる
ことを含んでなる、１−ケストースの結晶化母液の調製方法であって、
β−フラクトフラノシダーゼとして、フルクトース転移活性を有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列中の１〜１１個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列からなる、β−フラクトフラノシダーゼ変異体を使用することを特徴とするものである。
【００２０】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明による調製方法において、使用するβ−フラクトフラノシダーゼのフルクトース転移活性は、スクロースからの１−ケストースへの変換率が４５％以上であり、ニストースへの変換率が１０％以下であるものである。
【００２１】
本発明の一つのより好ましい態様によれば、本発明による調製方法において、使用するβ−フラクトフラノシダーゼのフルクトース転移活性が、スクロースからの１−ケストースへの変換率が５０％以上であり、ニストースへの変換率が６％以下であるものである。
【００２２】
本発明の別の一つの好ましい態様によれば、本発明による調製方法において、β−フラクトフラノシダーゼ変異体は、アルペルギルス・ニガーＡＴＣＣ２０６１１株由来のものである。
【００２３】
本発明の別の一つのより好ましい態様によれば、本発明による調製方法において、β−フラクトフラノシダーゼ変異体は、配列番号２のアミノ酸配列中、６２、１２２、１２８、１６５、１７０、２２１、３００、３１３、３８６、３９５、および５５０番目からなる群より選択されるいずれか１以上のアミノ酸残基において置換が行われたものである。
【００２４】
本発明の別の一つのさらに好ましい態様によれば、本発明による調製方法において、β−フラクトフラノシダーゼ変異体は、配列番号２のアミノ酸配列中、１７０、３００、３１３、および３８６番目からなる群より選択されるいずれか１以上のアミノ酸残基において置換が行われたものである。
【００２５】
本発明の別の一つのさらにより好ましい態様によれば、前記置換は、
１７０番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸への置換、
３００番のアミノ酸残基の、トリプトファン、バリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸への置換、
３１３番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸への置換、および
３８６番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸への置換
である。
【００２６】
本発明の別の一つの特に好ましい態様によれば、本発明による調製方法において、β−フラクトフラノシダーゼ変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｆ１７０Ｗ、Ｇ３００Ｖ、およびＨ３１３Ｋの三重置換が行われたものである。
【００２７】
本発明の一つのさらに好ましい態様によれば、本発明による調製方法は、グルコン酸の溶液からの除去を、電気透析により行うことをさらに含んでなる。
【００２８】
本発明の一つのさらにより好ましい態様によれば、本発明による調製方法において、グルコースオキシターゼは、アスペルギルス・ニガーまたはペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）由来のものである。
【００２９】
本発明の別の一つの好ましい態様によれば、本発明による調製方法は、グルコースをグルコースオキシターゼによりグルコン酸に変換する反応において、副生される過酸化水素をカタラーゼにより除去することをさらに含んでなる。ここでより好ましくは、カタラーゼは、アスペルギルス・ニガーまたはミクロコッカス・リソデキティカス（Micrococcus lysodeikticus）由来のものである。
【００３０】
本発明による１−ケストースの結晶化母液は、前記した本発明による調製方法により得られるものである。
【００３１】
本発明による結晶１−ケストースは、前記した本発明による結晶化母液から調製されるものである。
【００３２】
本発明によれば、擬似移動層方式クロマト分離を用いることなく、従来技術と比較して安価かつ簡便に１−ケストースの結晶化母液を調製することができる。このため、結晶１−ケストースをより安価に得ることができる。結晶１−ケストースを安価に生産できるとことは、キャンディ、錠菓、チョコレート等の機能性甘味料としてのコスト削減につながることが期待できる。
【発明の具体的説明】
【００３３】
１−ケストースの結晶化母液の調製方法
本発明による１−ケストースの結晶化母液の調製方法は、前記したように、
（１）  β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼとを含む酵素溶液中において、β−フラクトフラノシダーゼをスクロースと接触させて、１−ケストースを生成させ、
（２）  前記工程（１）の反応により副生するグルコースを、該溶液中でグルコースオキシターゼによりグルコン酸に変換し、
（３）  生じたグルコン酸を溶液から除去することによって、溶液中の１−ケストース純度を７０％以上に増大させる
ことを含んでなる、１−ケストースの結晶化母液の調製方法であって、
β−フラクトフラノシダーゼとして、フルクトース転移活性を有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列中の１〜１１個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列からなる、β−フラクトフラノシダーゼ変異体を使用することを特徴とするものである。
【００３４】
本発明においては、β−フラクトフラノシダーゼによりスクロースを１−ケストースへ変換させる反応と同時に、副生するグルコースをグルコースオキシターゼによりグルコン酸に変換させながら反応を実施する。そして酵素反応液からグルコン酸を選択的に除去することにより、高純度な（１−ケストース純度７０％以上の）１−ケストース結晶化母液を調製することができる。結晶１−ケストースを得るためには、結晶化母液中の１−ケストースの純度は７０％以上であることが好ましいことが知られているため、得られる溶液が１−ケストースの結晶化母液として有用であることは明らかであろう。
【００３５】
なお、本発明において１−ケストースの純度とは、特にことわりのない限り、結晶化母液中のグルコン酸以外の糖（中性糖）の総重量に占める１−ケストースの重量比を意味する。例えば、純度７０％以上の１−ケストース結晶化母液とは、溶液中のグルコン酸以外の糖の総重量に占める１−ケストースの割合が７０％以上であることを意味する。
【００３６】
ここで使用するβ−フラクトフラノシダーゼは、スクロースに接触させた場合の、スクロースから１−ケストースへの変換率が４５％以上および／またはニストースへの変換率が１０％以下となるようなフルクトース転移活性を有するものが好ましく、より好ましくは、スクロースから１−ケストースへの変換率が４５％以上で、かつ、ニストースへの変換率が１０％以下となるようなフルクトース転移活性を有するものである。さらに好ましくは、１−ケストースへの変換率が５０％以上および／またはニストースへの変換率が６％以下となるようなフルクトース転移活性を有するものであり、さらにより好ましくは、１−ケストースへの変換率が５０％以上で、かつ、ニストースへの変換率が６％以下となるようなフルクトース転移活性を有するものである。１−ケストースへの変換率が４５％未満であるか、またはニストースへの変換率が１０％を越えると、純度７０％以上の結晶化母液を得ることが困難となり、また結晶化の妨げとなることがある。
なお、本発明において変換率とは、特に断りのない限り、反応前のスクロースの総重量に対する反応後における特定の糖の割合を意味する。
【００３７】
β−フラクトフラノシダーゼ変異体
本発明の調製方法においては、使用するβ−フラクトフラノシダーゼとして、フルクトース転移活性を有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列中の１〜１１個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列からなる、β−フラクトフラノシダーゼ変異体を使用する。ここでアミノ酸残基の置換の数は、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、さらにより好ましくは１〜３個であり、さらに１または２個であることができる。
【００３８】
本発明の一つの好ましい態様によれば、β−フラクトフラノシダーゼ変異体は、アルペルギルス属に属する微生物由来のものであり、より好ましくは、アルペルギルス・ニガー由来のものであり、さらに好ましくは、アルペルギルス・ニガーＡＴＣＣ２０６１１株由来のものである。されにより好ましくは、例えばＷＯ９７／３４００４に記載されたアルペルギルス・ニガーＡＴＣＣ２０６１１株のβ−フラクトフラノシダーゼ変異体を用いることができる。
【００３９】
またアミノ酸配列における置換の形式としては、好ましくは保存的置換が挙げられる。ここで、「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように１若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００４０】
また必要であれば、配列番号２のアミノ酸配列とβ−フラクトフラノシダーゼ変異体のアミノ酸配列との整列は、配列同一性を調べるための分析用ソフトウエアを用いて行うことができる。このようなソフトウエアは周知であり、当業者であれば適宜選択して使用することができる。例えば、ＢＬＡＳＴ法（Basic local alignment search tool; Altschul, S.F. et al., J.Mol.Biol.,215,403-410(1990)）を使用して配列番号２のアミノ酸配列と当該変異体のアミノ酸配列とを整列させて、対応するアミノ酸残基を決定することができる。
【００４１】
また、β−フラクトフラノシダーゼ変異体が、所定のフルクトース転移活性を有するか否かは、例えば、そのアミノ酸配列からなるタンパク質を基質に作用させ、反応産物を検出することにより評価することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法に従って評価することができる。
【００４２】
本発明の別の一つのより好ましい態様によれば、β−フラクトフラノシダーゼ変異体は、配列番号２のアミノ酸配列中、６２、１２２、１２８、１６５、１７０、２２１、３００、３１３、３８６、３９５、および５５０番目からなる群より選択されるいずれか１以上のアミノ酸残基において置換が行われたものである。これらの位置で置換が行われることによって、β−フラクトフラノシダーゼ変異体による１−ケストースの生産が選択的かつより効率的に行うことができる（例えば、ＷＯ９７／３４００４およびＷＯ２００５／０８５４４７を参照）。
【００４３】
これらの置換可能位置における置換は、好ましくは下記の通りである。
【００４４】
６２番のアミノ酸残基の、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される酸性アミノ酸、より好ましくはグルタミン酸、への置換。
【００４５】
１２２番のアミノ酸残基の、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはメチオニン、への置換。
【００４６】
１２８番のアミノ酸残基の、アスパラギンおよびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはアスパラギン、への置換。
【００４７】
１６５番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸、より好ましくはフェニルアラニン、への置換。
【００４８】
１７０番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸、より好ましくはトリプトファン、への置換。
【００４９】
２２１番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸、より好ましくはチロシン、への置換。
【００５０】
３００番のアミノ酸残基の、トリプトファン、バリン、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはバリン、への置換。
【００５１】
３１３番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸、より好ましくはリジンまたはアルギニン、への置換。
【００５２】
３８６番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸、より好ましくはリジン、への置換。
【００５３】
３９５番のアミノ酸残基の、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはロイシン、への置換。
【００５４】
５５０番のアミノ酸残基の、セリンおよびスレオニンからなる群から選択されるヒドロキシアミノ酸、より好ましくはセリン、への置換。
【００５５】
本発明の一つのさらに好ましい態様によれば、β−フラクトフラノシダーゼ変異体は、配列番号２のアミノ酸配列中、１７０、３００、３１３、および３８６番目からなる群より選択されるいずれか１以上のアミノ酸残基において置換が行われたものである。
【００５６】
本発明の一つのさらにより好ましい態様によれば、前記置換は、
１７０番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸への置換、
３００番のアミノ酸残基の、トリプトファン、バリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸への置換、
３１３番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸への置換、および
３８６番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩基性アミノ酸への置換
である。
【００５７】
本発明の特に好ましい態様によれば、β−フラクトフラノシダーゼ変異体は、配列番号２のアミノ酸配列中、１７０番目、３００番目および３１３番目のアミノ酸がトリプトファン、トリプトファン、およびリジンに、またはトリプトファン、バリン、およびリジンにそれぞれ置換されたものである。これら変異体は、スクロースより１−ケストースをさらに選択的かつ効率的に生成することができるという有利な性質を有している。
【００５８】
本発明の特に好ましい態様によれば、β−フラクトフラノシダーゼ変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｆ１７０Ｗ、Ｇ３００Ｖ、およびＨ３１３Ｋの三重置換（すなわち、Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋの置換）が行われたものである（ＷＯ９７／３４００４の実施例Ｄ１２参照）。
【００５９】
なお、本明細書においては、β−フラクトフラノシダーゼ変異体の記載にあたって、次の命名を用いて参照を容易にする：
原アミノ酸：位置：置換アミノ酸
この命名に従い、例えば１７０番目のフェニルアラニンをトリプトファンに置換したものは、Ｆ１７０Ｗとして示される。
また、多数の変異は、＋によって分離され、例えば
Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ
は、１７０、３００、および３１３番目のアミノ酸であるフェニルアラニン、グリシン、およびヒスチジンが、それぞれトリプトファン、バリン、およびリジンに置換されていることを示す。
【００６０】
β−フラクトフラノシダーゼ変異体の作製
β−フラクトフラノシダーゼ変異体は、組換えＤＮＡ技術、ポリペプチド合成技術などによって作製することができる。組換えＤＮＡ技術を用いる場合には、β−フラクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１のＤＮＡ配列）を取得し、このＤＮＡに部位特異的変異あるいはランダム変異を発生させてコードするアミノ酸を置換させた後、変異処理を施したＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換細胞を培養することによってβ−フラクトフラノシダーゼ変異体を調製することができる。
【００６１】
遺伝子の部位特異的変異を導入するための方法は、Gapped duplex法（Methods in Enzymology, 154, 350 (1987))、Kunkel法(Methods in Enzymology, 154, 367 (1987)）など当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法は、β−フラクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの特異的部位に突然変異を発生させることに利用することができる。
【００６２】
また、ランダム変異を導入するためには、エラープローンＰＣＲ法など一般的に行われている方法が採用できる。変異処理後のＤＮＡの塩基配列は、マキサム・ギルバートの化学修飾法やジデオキシヌクレオチド鎖終結法などにより確認することができ、β−フラクトフラノシダーゼ変異体のアミノ酸配列は、確認された塩基配列より解読することができる。
【００６３】
β−フラクトフラノシダーゼ変異体の生産
β−フラクトフラノシダーゼ変異体は、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子を発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特にＤＮＡ発現ベクター、に連結してなる組換えベクターを調製し、その組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得て、その形質転換体を適当な培養条件下で培養することにより、調製することができる。
【００６４】
本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウィルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はｐＵＣ、ｐＢＲ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。
【００６５】
本発明の好ましい態様によれば、組換えベクターとしてプラスミドを使用することができる。プラスミドは形質転換体の選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカーを使用することができる。その好ましい具体例としては、使用する宿主細胞が細菌の場合はアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などであり、酵母の場合はトリプトファン合成遺伝子（ＴＲＰ１）、ウラシル合成遺伝子（ＵＲＡ３）、ロイシン合成遺伝子（ＬＥＵ２）などがあり、カビの場合はハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）、ビアラホス耐性遺伝子（Ｂａｒ）、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ）などが挙げられる。
【００６６】
本発明による発現ベクターとしてのＤＮＡ分子は、変異遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結シグナルなどの転写調節シグナル、翻訳調節シグナルなどを有しているのが好ましい。
【００６７】
プロモーターとしては、挿入断片に含まれる宿主中において機能することができるプロモーターはもちろんのこと、大腸菌においてはラクトースオペロン（ｌａｃ）、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）などのプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ）、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ）、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＰＤ）などのプロモーター、カビではα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）、セロビオハイドロラーゼＩ遺伝子（ＣＢＨＩ）などのプロモーターを好ましく用いることができる。
【００６８】
宿主としては、宿主−ベクター系が確立されているものであればいずれも利用可能であり、好ましくは、カビ、酵母が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形質転換体は、適当な条件で培養し、得られた培養液から一般的な方法によって酵素の分取や精製を行うことによりβ−フラクトフラノシダーゼ変異体を得ることができる。また、宿主が枯草菌、酵母、カビの場合には、分泌型ベクターを使用して、菌体外に組換えβ−フラクトフラノシダーゼを分泌させることも有利である。
【００６９】
形質転換体から生産される本発明による変異体は、次のようにして得ることが出来る。まず前記の宿主細胞を適切な条件下で培養し、得られた培養物から公知の方法、例えば遠心分離により培養上清あるいは菌体を得る。菌体の場合にはこれを適切な緩衝液中に懸濁し、凍結融解、超音波処理、磨砕などにより菌体を破砕し、遠心分離またはろ過により組換え酵素を含有する菌体抽出物を得る。
【００７０】
酵素の精製は、慣用されている分離、精製法を適宜組み合わせて実施することができる。例えば、熱処理のような耐熱性の差を利用する方法、塩沈澱および溶媒沈澱のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、更に等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００７１】
１−ケストースの結晶化母液の調製
工程（１）：
本発明においては、β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼとを含む酵素溶液中において、β−フラクトフラノシダーゼをスクロースと接触させて、１−ケストースを生成させる。
すなわち、β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼの酵素の混合系を含む酵素溶液中にて反応を行う。
【００７２】
ここで、β−フラクトフラノシダーゼと、スクロースとの接触態様は溶液中で行い、その条件は、変異体がスクロースに作用可能な様態である限り特に限定されない。具体例を示せば次の通りである。すなわち、スクロースの使用濃度は、用いる糖が溶解されうる範囲であれば、本酵素の比活性、反応温度などを考慮して適宜選択してよいが、５〜８０％の範囲とするのが一般的であり、好ましくは３０〜７０％の範囲である。糖と酵素との反応における反応温度およびｐＨ条件は、変異体の最適条件下で行うことが好ましく、例えば、３０〜８０℃程度、ｐＨ４〜１０程度の条件下で行うのが一般的であり、好ましくは４０〜７０℃、ｐＨ５〜７の範囲である。なお、本発明では、さらにグルコースオキシターゼを使用するため、使用するグルコースオキシターゼに応じて適宜これらの条件をさらに変更することができる。
【００７３】
また、変異体の精製の程度も適宜選択することができ、形質転換体の培養上清あるいは菌体破砕物から粗酵素のまま用いることもでき、また、各種精製工程で得られた精製酵素として利用してもよい。さらには各種精製手段を経て単離精製された酵素として用いてもよい。更に酵素は、常法に準じて担体に固定化された状態でスクロースと接触させてもよい。
【００７４】
β−フラクトフラノシダーゼの添加量は、酵素反応液中のスクロースを十分に利用できる量であれば良い。反応時間は、β−フラクトフラノシダーゼの使用量等により適宜変更することができるが、通常、０．１〜１００時間、好ましくは、０．５〜７２時間である。
なお、反応終了後は酵素は失活させるのが好ましい。
【００７５】
工程（２）：
本発明においては、前記工程（１）の反応により副生するグルコースを、該溶液中でグルコースオキシターゼによりグルコン酸に変換する。すなわち、酵素溶液に共存するグルコースオキシターゼによる酵素反応を同時に進行させる。
【００７６】
グルコースは１−ケストースと同様に中性糖であり、１−ケストースと同様に電荷を持たないため、擬似移動層方式クロマト分離以外の方法で除去することは困難である。グルコン酸は酸性糖で正電荷を持つため、電気透析や陰イオン交換クロマト分離などの擬似移動層方式クロマト分離以外の方法によって、グルコースによる場合と比較して容易に除去可能である。よって、β−フラクトフラノシダーゼとグルコースオキシターゼを同時にスクロースに接触させ、その後、擬似移動層方式クロマト分離以外の方法でグルコン酸を除去する方法は、酵素反応液に含まれる１−ケストースの濃度を簡便かつ安価に向上できる方法であるといえる。
【００７７】
本発明の好ましい態様によれば、副生するグルコースをグルコン酸に変換する際に使用するグルコースオキシターゼとしては、例えば、アスペルギルス・ニガー由来のグルコースオキシターゼやペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）由来のものを用いることができる。
【００７８】
グルコースオキシターゼの添加量は、副生するグルコースを変換するのに十分な量であれば良い。また、グルコースオキシターゼによるグルコースからグルコン酸への変換は酸化反応であるため、反応に酸素が必要である。このため、グルコン酸への変換反応においては、酵素反応液中の溶存酸素量を高めるために、酵素反応液に通気をしながら高速に撹拌することが望ましい。溶存酸素濃度は、原料スクロース濃度や反応温度を調整することによって高めることができる。すなわち、原料スクロース濃度を６０％以下、好ましくは４０％以下に調整することによって溶存酸素を高めることができる。
【００７９】
また、反応温度については、温度が高くなるにつれて溶存酸素濃度が低下するので、反応温度を２０℃〜４０℃に設定することが好ましい。また、グルコースをグルコン酸に変換させる際、グルコン酸により酵素反応液のｐＨが低下し、スクロースから１−ケストースへの変換反応の停止、また、生成した１−ケストースが酸加水分解してしまうことがあるため、酵素反応液に適宜中和剤を投入して、ｐＨを中性付近に調整することが望ましい。使用可能な中和剤としては、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水などが挙げられる。
【００８０】
グルコースオキシターゼによりグルコースをグルコン酸に変換させる際、過酸化水素が副生し、その酸化作用により酵素を失活させてしまう場合がある。このため、必要により、過酸化水素を分解するカタラーゼを添加することが望ましい。
【００８１】
したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、本発明による調製方法は、グルコースをグルコースオキシターゼによりグルコン酸に変換する反応において、副生される過酸化水素をカタラーゼにより除去することをさらに含んでなる。カタラーゼとしては、アスペルギルス・ニガーまたはミクロコッカス・リソデキティカス（Micrococcus lysodeikticus）由来のものが好ましい。
【００８２】
工程（３）：
本発明においては、工程（２）において生じたグルコン酸を溶液から除去することによって、溶液（酵素反応液）中の１−ケストース純度を７０％以上に増大させ、１−ケストースの純度７０％以上の結晶化母液を得る。
ここで、酵素反応液からのグルコン酸の除去は、擬似移動層方式クロマト分離以外の方法である限り特に限定されない。したがって、グルコン酸の除去方法としては、グルコン酸を酵素反応液より選択的に除去できれば、いずれの方法も利用できる。簡便な方法としては、グルコン酸が正電荷を持つ特徴に着目して、グルコン酸を酵素反応液から除去する方法が挙げられる。例えば、電気透析法、陰イオン交換クロマトグラフィー、グルコン酸をカルシウム塩として沈殿除去する方法などが利用できる。特に工程中の１−ケストースの損失が少ないことから、除去方法として電気透析法を用いることが望ましい。
【００８３】
１−ケストースの結晶化母液および結晶１−ケストース
前記したように、本発明による１−ケストースの結晶化母液は、本発明による調製方法により得られるものである。
【００８４】
また本発明による結晶１−ケストースは、本発明による結晶化母液から調製されるものである。結晶化母液からの結晶の調製は、例えば、ＷＯ９７／２１７１８に記載の方法により得ることができる。
【実施例】
【００８５】
本発明を以下の例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８６】
参考例１：  β−フラクトフラノシダーゼのＦ１７０Ｗ変異体の作製と生産
β−フラクトフラノシダーゼのＦ１７０Ｗ変異体を、ＷＯ９７／３４００４の実施例Ｄ１の記載に従って作成し生産した。具体的には下記の通りに実施した（なお下記参考例において詳細が必要であればＷＯ９７／３４００４をさらに参照のこと）。
【００８７】
（１）部位特異的変異によるβ−フラクトフラノシダーゼ遺伝子の塩基置換
アスペルギルス・ニガーＡＣＥ−２−１（ＡＴＣＣ２０６１１）株のβ−フラクトフラノシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＡＷ２０−Ｈｙｇ（ＷＯ９７／３４００４の実施例Ａ４参照）を鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行い、β−フラクトフラノシダーゼ遺伝子の翻訳領域を取り出した。ＰＣＲはPerkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを使用 して行った。反応液は、プラスミドＤＮＡ（ｐＡＷ２０−Ｈｙｇ）０．５μｌ（０．１μｇ相当量）、１０倍濃度の反応緩衝液［５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００］１０μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液８μｌ、０．０１ｍＭプライマー＃１として配列表の配列番号３の＋鎖ＤＮＡプライマーおよびプライマー＃２として配列表の配列番号４の−鎖ＤＮＡプライマー各２μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（和光純薬社製）０．５μｌ、滅菌水７７μｌを加えて１００μｌとした。反応は、９４℃、５分間の前処理後、９４℃１分間（変性ステップ）、５４℃２分間（アニーリングステップ）、７２℃３分間（伸長ステップ）のインキュベーションを２５サイクル行った。最後に７２℃で７分間のインキュベーションを行い反応を終了した。得られた反応液をフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで抽出し、その後エタノール沈殿を行った。沈殿を２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した後、アガロースゲル電気泳動を行い、特異的に増幅された約２ｋｂｐのバンドを常法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩ部位に挿入してプラスミドｐＡＮ１２０を得た（ＷＯ９７／３４００４の図６）。
【００８８】
プラスミドを大腸菌ＣＪ２３６株に導入した後、常法に従い一本鎖ＤＮＡを調製し、これを鋳型ＤＮＡとして部位特異的変異を行った。部位特異的変異はMuta-Gene in vitroミュータジェネシスキット（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ）を用いて行った。部位特異的変異用プライマーとして、配列表の配列番号５のＤＮＡプライマーを用い、キットの説明書に従って実施し、変異処理後プラスミドとしてｐＡＮ１２０（Ｆ１７０Ｗ）を得た。
【００８９】
ｐＡＮ１２０（Ｆ１７０Ｗ）の挿入断片の塩基配列を調べたところ、目的の部分の塩基のみが置換され、それ以外の部分は変化していないことが確認できた。すなわち、変異処理後の遺伝子は１７０番目のアミノ酸だけがフェニルアラニンからトリプトファンに置換されたβ−フラクトフラノシダーゼをコードしていることが明らかとなった。
【００９０】
（２）酵母用発現ベクターｐＹ２８３１の構築
酵母用発現ベクターｐＹ２８３１は以下のようにして構築した（ＷＯ９７／３４００４の図７）。すなわち、プラスミドｐＹＰＲ２８３１（H. Horiuchi et al., Agric. Biol. Chem., 54, 1771-1779, 1990）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化した後、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。これにＢａｍＨＩリンカー（５’−ＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’）を連結し、ＢａｍＨＩで消化した後、自己連結してプラスミドｐＹ２８３１を得た。
【００９１】
（３）酵母によるＦ１７０Ｗ変異体の生産
ｐＡＮ１２０（Ｆ１７０Ｗ）をＢａｍＨＩで消化し、変異遺伝子を含む２ｋｂｐのＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片を取り出した。これをｐＹ２８３１のＢａｍＨＩ部位に挿入してプラスミドｐＹＳＵＣ（Ｆ１７０Ｗ）を構築した（図８）。この際、ｐＡＮ１２０についても同様の処理を行い、野生型酵素を発現させるためのプラスミドｐＹＳＵＣも構築した。
これらのプラスミドを酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＭＳ−１６１株（Suc-, ura3, trp1）に酢酸リチウム法（Ito, H. et al., J. Bacteriol., 153, 163-168, 1983）で導入し、形質転換体を得た。この形質転換体をＳＤ−Ｕｒａ培地（０．６７％酵母ニトロゲンベース（ディフコ社）、２％グルコース、５０μｇ／ｍｌウラシル）で、３０℃、一晩培養した。この培養液を終濃度が１％となるように生産培地（０．６７％酵母ニトロゲンベース（ディフコ社）、２％グルコース、２％カザミノ酸、５０μｇ／ｍｌウラシル）にシードし、３０℃、２日間培養し、培養上清を得た。これらの培養上清のβ−フラクトフラノシダーゼ活性をAgric. Biol. Chem., 53, 667-673 (1989)記載の方法で測定した結果、野生型酵素を発現させた場合は１２．７単位／ｍｌ、Ｆ１７０Ｗ変異体を発現させた場合は１０．１単位／ｍｌの活性がそれぞれ検出された。
なおＦ１７０Ｗ変異体の評価の詳細についてはＷＯ９７／３４００４を参照のこと。
【００９２】
参考例２：  Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ変異体の作製と生産
β−フラクトフラノシダーゼのＦ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ変異体を、ＷＯ９７／３４００４の実施例Ｄ１２の記載に従って作成し生産した。具体的には下記の通りに実施した（なお下記参考例において詳細が必要であればＷＯ９７／３４００４をさらに参照のこと）。
【００９３】
（１）部位特異的変異によるβ−フラクトフラノシダーゼ遺伝子の塩基置換
部位特異的変異用プライマーとして配列表の配列番号５、配列番号６、および配列番号７のＤＮＡプライマーを使用した以外は前記参考例１（ＷＯ９７／３４００４の実施例Ｄ１）に記載した方法と同様の方法で行い、プラスミドｐＡＮ１２０（Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ）を得た。
【００９４】
ｐＡＮ１２０（Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ）の挿入断片の塩基配列を調べたところ、目的の部分の塩基のみが置換され、それ以外の部分は変化していないことが確認できた。すなわち、変位処理後の遺伝子は１７０番目、３００番目および３１３番目のアミノ酸だけがフェニルアラニンからトリプトファン、グリシンからバリン、ヒスチジンからリジンにそれぞれ置換されたβ−フラクトフラノシダーゼをコードしていることが明らかとなった。
【００９５】
（２）アスペルギルス・ニガーによるＦ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ変異体の生産と評価
ｐＡＮ１２０（Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ）をＢａｍＨＩで消化し、変異遺伝子を含む２ｋｂｐのＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片を取り出した。これをｐＡＮ２０５のＢａｍＨＩ部位に挿入してプラスミドｐＡＮ５１７を構築した。
ｐＡＮ５１７をＨｉｎｄIIIで消化して直鎖状にした後、ＷＯ９７／３４００４の実施例Ｄ１１に記載の方法と同様にしてアスペルギルス・ニガーＮＩＡ１６０２株（Ｓｕｃ−、ｎｉａＤ）を形質転換を行い、ベクターＤＮＡが欠落し、宿主の染色体上のβ−フラクトフラノシダーゼ遺伝子の位置にＦ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ変異体をコードする遺伝子が導入されているアスペルギルス・ニガーＮＩＡ１７１７株（Ｓｕｃ＋、ｎｉａＤ）を得た。
【００９６】
次に、アスペルギルス・ニガーＮＩＡ１７１７株を酵素生産培地（５％スクロース、０．７％麦芽エキス、１％ポリペプトン、０．５％カルボキシメチルセルロース、０．３％ＮａＣｌ）で、２８℃、３日間培養した後、菌体を超音波で破砕して粗酵素液を調製した。粗酵素液のβ−フラクトフラノシダーゼ活性を測定した結果、培養液１ｍｌ当たり４５単位の活性が検出された。この粗酵素をスクロース１ｇあたり２．５単位添加し、Ｂｘ４５スクロース、ｐＨ７．５、４０℃、２４時間反応させた。反応後の糖組成をＨＰＬＣで分析したところ、フルクトース１．８％、グルコース２２．３％、スクロース１６．１％、ＧＦ２  ５５．７％、ＧＦ３  ４．１％であった。この結果から、Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋの置換によってＧＦ２が増加し、ＧＦ３が減少することが明らかとなった。
【００９７】
（３）Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ変異体の精製と酵素化学的諸性質
前記（２）で調製した粗酵素液を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に対して透析した後、あらかじめ同緩衝液で平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパール６５０Ｓ（東ソー）カラム（１．６Ｘ１８ｃｍ）に負荷した。次に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中で、ＮａＣｌの０から３００ｍＭの直線的濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。更に、この活性画分をセファクリルＳ−３００（ファルマシア社）カラム（２．６Ｘ６０ｃｍ）に負荷し、５０ｍＭトリメチルアミン−酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出し、活性画分を集め、Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ変異体精製標品とした。これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べたところ、元の親β−フラクトフラノシダーゼと同じ分子量約１０万ダルトンの均一なバンドを示した。
この精製標品を用いて、至適ｐＨ、至適温度、ｐＨ安定性、温度安定性につき元の親β−フラクトフラノシダーゼと比較したところ、ほとんど同じであった。
【００９８】
参考例３：  β−フラクトフラノシダーゼのＧ３００Ｗ、Ｈ３１３Ｋ、Ｅ３８６Ｋ、Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｗ、Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｗ＋Ｈ３１３Ｒ、Ｇ３００Ｗ＋Ｈ３１３Ｋ、Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ、Ｇ３００Ｅ＋Ｈ３１３Ｋ、Ｇ３００Ｄ＋Ｈ３１３Ｋ、およびＦ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｗ＋Ｈ３１３Ｋ変異体の作製
β−フラクトフラノシダーゼのこれら変異体を、ＷＯ９７／３４００４の実施例Ｄ２〜１１の記載に従って作成し生産した。
【００９９】
参考例４：  β−フラクトフラノシダーゼのＧ６２Ｅ、Ｌ１２２Ｍ、Ｉ１２８Ｎ、Ｖ１６５Ｆ、Ｈ２２１Ｙ、Ｑ３９５Ｌ、およびＴ５５０Ｓ変異体の作製
β−フラクトフラノシダーゼのこれら変異体を、ＷＯ２００５／０８５４４７の実施例の記載に従って作成し生産した。
【０１００】
実施例１：  アスペルギルス・ニガー由来のグルコースオキシターゼおよびカタラーゼ存在下でのβ−フラクトフラノシダーゼによるスクロースの１−ケストースへの変換反応
３Ｌジャーファーメンターに脱イオン水で溶解したスクロース４０％（ｗ／ｖ）を含む基質液１．９Ｌを入れ、アスペルギルス・ニガーＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フラクトフラノシダーゼ三重変異体（Ｆ１７０Ｗ、Ｇ３００Ｖ、Ｈ３１３Ｋ）（前記参考例２またはＷＯ９７／３４００４の実施例Ｄ１２）２０８０Ｕ、アスペルギルス・ニガー由来グルコースオキシターゼ２５００Ｕ、アスペルギルス・ニガー由来カタラーゼ４５０００Ｕを添加し、温度３０℃、８００ｒｐｍで３１時間、１−ケストースへの変換反応を行った。
【０１０１】
グルコースオキシターゼの作用によりグルコースがグルコン酸へと変換されることで、酵素反応液のｐＨが低下するため、２０％炭酸ソーダを添加して、ｐＨを６．３に維持した。また、グルコースオキシターゼによる変換反応では、基質として酸素を消費するため３Ｌ／分の通気を行った。途中、一定の間隔で酵素反応液のサンプリングを行い、ＨＰＬＣにより糖組成の分析を行った。
糖組成の成分分析は、カラムとしてRT250-4.0 LiChrosphor 100 NH2（Cica-Reagenet社）を用い、移動相は７１％アセトニトリル、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出器として示差屈折計を使用した。
【０１０２】
結果は表１に示される通りであった。
表では、反応開始からの経過時間と、各時間における酵素反応液の中性糖（グルコン酸を除いた糖）組成を示した。
【０１０３】
【表１】
2010273580.tif 000002
【０１０４】
結果に示されるように、１−ケストース純度７８％の溶液が得られた。  
【０１０５】
実施例２：  Penicillium chrysogenum由来のグルコースオキシターゼ、およびMicrococcus lysodeikticus由来のカタラーゼ存在下でのβ−フラクトフラノシダーゼによるスクロースの１−ケストースへの変換反応
３Ｌジャーファーメンターに脱イオン水で溶解したスクロース４０％（ｗ／ｖ）を含む基質液１．９Ｌを入れ、アスペルギルス・ニガーＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フラクトフラノシダーゼ三重変異体（Ｆ１７０Ｗ、Ｇ３００Ｖ、Ｈ３１３Ｋ）５６３０Ｕ、Penicillium chrysogenuｍ由来のグルコースオキシターゼであるスミチーム（新日本化学工業株式会社製）を２０００Ｕ、Micrococcus lysodeikticus由来のカタラーゼであるレオネット（ナガセケムテック社製）を２５００００Ｕ添加し、温度３０℃、８００ｒｐｍで２６時間、１−ケストースへの変換反応を行った。
【０１０６】
グルコースオキシターゼの作用によりグルコースがグルコン酸へと変換されることで、酵素反応液のｐＨが低下するため、１２．５％アンモニア水を添加してｐＨを７．０に維持した。また、グルコースオキシターゼによる変換反応では、基質として酸素を消費するため３Ｌ／分の通気を行った。途中、一定の間隔で酵素反応液のサンプリングを行い、実施例１と同様の方法でＨＰＬＣにより糖組成の分析を行った。
【０１０７】
結果は表２に示される通りであった。
表では、反応開始からの経過時間と、各時間における酵素反応液の中性糖（グルコン酸を除いた糖）組成を示した。
【０１０８】
【表２】
2010273580.tif 000003
【０１０９】
結果に示されるように、１−ケストース純度７６％の溶液が得られた。
【０１１０】
実施例３：  グルコン酸の電気透析法による選択的除去
実施例１に記載の方法で得られた酵素反応液に含まれるグルコン酸を電気透析法により除去した。
電気透析機は小型電気透析機（ＥＤ−１、膜面積０．１７２ｍ２、日本錬水社製）を使用し、膜種はカチオン膜としてＣＭＶ（日本錬水株式会社）、またアニオン膜としてＡＭＶ（日本錬水株式会社）を用いた。また、極液は４Ｌの３％硫酸ナトリウムを用い、濃縮液は４Ｌの２％食塩液とした。
実施例１で得た酵素反応液を脱塩液側に２Ｌ入れ、電圧１２Ｖで３時間電気透析を行った。途中、一定の間隔で酵素反応液のサンプリングを行い、実施例１と同様の方法でＨＰＬＣにより１−ケストース量の分析を行った。
また、グルコン酸量は、Ｆ−キット  Ｄ−グルコン酸／Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（Ｊ．Ｋ．インターナショナル）を用いて測定した。
【０１１１】
結果は表３に示される通りであった。
表では、値を、透析前のグルコン酸量および１−ケストース量を１００とした場合の相対量として示した。また表では、電気透析開始から経過時間と、各時間における溶液中のグルコン酸量および１−ケストース量を示した。
【０１１２】
【表３】
2010273580.tif 000004
【０１１３】
結果から、電気透析法により酵素反応液からグルコン酸を選択的に除去できることが示された。また、脱塩液の１−ケストース純度は７６％であった。
【０１１４】
よって以上の結果から、本発明の方法によって、擬似移動層クロマト分離を用いる事なく、１−ケストースの結晶化に必要な純度７０％以上の１−ケストース溶液を調製できることがわかった。
【配列表】
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