(57)【要約】【課題】多くの種々の標的のための抗体の価値ある供給源であり、そして機能ゲノム学の分野で標的の発見および確認での重要な役割を演ずるＦａｂライブラリーを作製すること。【解決手段】本発明は、ＦａｂライブラリーおよびＦａｂライブラリーを用いて標的に対する抗体を得る方法を提供する。本発明のＦａｂライブラリーは、少なくとも１０9の異なるＦａｂを含み、そしていくつかの実施形態では、少なくとも１０9個の異なるＦａｂを含む。本発明のＦａｂライブラリーは、高い特異性で標的に結合する、ポリクローナルＦａｂまたはモノクローナルＦａｂを単離するために用いられる。特に本発明は、Ｆａｂライブラリーをコードするポリヌクレオチド、Ｆａｂライブラリー、およびＦａｂライブラリーの設計、構築、およびＦａｂライブラリーからの選択の方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のベクターを含むＦａｂライブラリーをコードする複数のポリヌクレオチドであって、ここで、該ベクターは、以下：
−第１および第２のクローニング領域であって、ここで、
−各クローニング領域は、該ベクターについて唯一の、少なくとも１つの制限酵素切断部位を含み、
−各クローニング領域は、リボソーム結合部位およびシグナル配列に５’側で隣接している、
第１および第２のクローニング領域、
−該第２のクローニング領域の３’側に位置するアンカー領域をコードするポリヌクレオチド、
−第１および第２の複数の可変ポリヌクレオチドであって、
−各々が、完全な抗体可変領域または抗体可変領域の一部、おそらくそれに続いて完全な抗体定常領域または抗体定常領域の一部をコードし、
−該第１の複数の可変ポリヌクレオチドは、該ベクター中に該第１のクローニング領域の該制限酵素切断部位でクローニングされており、
−該第２の複数の可変ポリヌクレオチドは、該ベクター中に該第２のクローニング領域の該制限酵素切断部位でクローニングされている、
第１および第２の複数の可変ポリヌクレオチド
を含む、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、ヒトＦａｂフラグメントのファージディスプレーライブラリー、およびＦａｂフラグメントライブラリーを使用して高い親和性の抗体を単離する方法に関する。特に本発明は、Ｆａｂライブラリーをコードするポリヌクレオチド、Ｆａｂライブラリー、およびＦａｂライブラリーの設計、構築、およびＦａｂライブラリーからの選択の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
選択と組み合わせた糸状のファージにおけるディスプレーはペプチドまたはタンパク質に基づいた薬物の同定に重要な道具となる（Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９４）。これらの中で抗体は、それらが高い特異性および親和性を有する種々の標的を認識する能力に起因して、特に興味深い。特に一部または完全なヒト抗体の使用は、患者に投与されるとき免疫応答を全く誘導しないか、または最小限の免疫応答を誘導し、ＦＤＡ承認のタンパク質に基づいた薬剤のリストの増加を生じている（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９８）。ファージのディスプレー技術はヒト抗体の大規模なレパートリーの生成を可能にし（Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９３；Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６）、そしてバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）手順は、所望の特異性を有する個々の抗体の選択を可能にする。
【０００３】
この技術の成功する鍵には、２つの重要な観察があった：（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムに分泌することによる、機能的な抗体フラグメントの発現（Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８；Ｓｋｅｒｒａら、１９８８）、および（ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応による可変領域遺伝子のプールへ迅速なアクセス（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９８９；Ｗａｒｄら、１９８９；Ｍａｒｋｓら、１９９１）。抗体のライブラリーの構築には、Ｖ遺伝子は、Ｂ細胞のｃＤＮＡより増幅され、そして重鎖および軽鎖の遺伝子は、無作為に組み合わされ、そして単鎖のＦｖ（ＳＣＦＶ）またはＦａｂの抗体フラグメントのコンビナトリアルライブラリーをコードするようにクローン化される（Ｍａｒｋｓら、１９９１；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１；Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１；Ｏｒｕｍら、１９９３）。Ｂ細胞中の天然の一次（非選択の）抗体レパートリーは、種々の抗原を認識する大量のアレイの抗体を含む；このアレイは、末梢血リンパ球（Ｍａｒｋｓら、１９９１）、骨髄または扁桃（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６）、あるいは類似の動物の供給源（Ｇｒａｍら、１９９２）より単離された、免疫化されていないヒトドナーのＢ細胞のＩｇＭ  ｍＲＮＡからＶ遺伝子を採集することによって、再整列した遺伝子の「ｎａＶｖｅ」のレパートリーとしてクローニングされ得る。この手順は、まだ抗原に遭遇していない抗体の入手方法を提供するが、これらの真性「生殖系列」抗体の頻度は、Ｂ細胞の供給源に非常に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９９７）。１つの単純な「未刺激」（ｎａｉｖｅ）ライブラリーは、十分に大規模かつ多様である場合、自己抗原、非免疫原性抗原および比較的毒性の抗原を含む多くのパネルの抗原に対する抗体を生成するのに使用され得る（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９３；Ｍａｒｋｓら、１９９１）。異なったアプローチでは、Ｖ遺伝子セグメントおよびＤ／Ｊセグメントのインビトロでのアセンブリによって、抗体が人工的に作製され得、「合成」抗体を生じる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９２）。これらの手順の主な欠点は、最初の「ｎａＶｖｅ」および「合成の」ライブラリーから、中程度の親和性の抗体のみが単離されたことである（Ｍａｒｋｓら、１９９１；Ｎｉｓｓｉｍら、１９９４）。最近数年間にわたって、洗練されたインビボ組換え法（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９３）または力ずくのクローニング方法（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８）を使用して、抗体フラグメントのより大きなライブラリーを作製するより効率のよい技術が開発された。そのような大規模なライブラリーは、平均がはるかに高い親和性を有する（ナノモル未満まで）、試験される抗原１つ当り、より大きな数のヒト抗体を生じる。しかし、獲得され得るまたは選択で処理され得るライブラリーのサイズの技術的な制限、ライブラリー増幅の際のライブラリー多様性の喪失、および選択された抗体の比較的長い下流の分析経路（すなわち、大規模な親和性分析）は、抗体生成において包括的な道具としてのこれらのライブラリーの普及を制限してきていた。
【０００４】
今までに作られた最も大きなライブラリーは、ファージにおけるディスプレーのための単鎖フォーマットを使用する（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８）。ある報告は、ファージにおけるヒト未刺激Ｆａｂライブラリーの使用を記載した（これは、選択された可溶性のＦａｂフラグメントの即時のスクリーニングを可能としない）（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４）。ｓｃＦｖ’ｓは、クローンに依存した方法および比較的予想不可能な方法で、二量体およびより高次の多量体を形成する傾向を有する（Ｗｅｉｄｎｅｒら、１９９２；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３；Ｍａｒｋｓら、１９９３）。結果として、使用された親和性アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ分析など）は、しばしば、選択された抗体フラグメントの精製を必要とする。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅを使用したレート外の格付けは、精製されていないｓｃＦｖフラグメントを用いると単純には可能ではない；選択されたｓｃＦｖクローンの単量体フラグメントは、まずアフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過によって、精製される必要がある（Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６）。
【０００５】
Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓらによって仮定され、観察されたように（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４）、抗体のライブラリーの大きさは、抗原に対する高い親和性の抗体の選択の確率を支配する。２．９×１０7クローンを含む、第一のｎａＶｖｅ  ｓｃＦｖのレパートリー（Ｍａｒｋｓら、１９９１）と、約１０10クローンの最近構築されたｓｃＦｖレパートリーとの比較（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８）により、この仮説が確かめられる：ライブラリーのサイズを５００倍に増加させると、約１００倍高い親和性を生じた。この増加は、より小さなサイズのライブラリーより選択されるフラグメントについて１０-1〜１０-2ｓ-1からより大きなライブラリーからのフラグメントについて１０-3〜１０-4ｓ-1へとレート外を低めることによって起こされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、多くの種々の標的のための抗体の価値ある供給源であり、そして機能ゲノム学の分野で標的の発見および確認での重要な役割を演ずるＦａｂライブラリーを作製することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、複数のベクターを含有するＦａｂライブラリーをコードする複数のポリヌクレオチドを提供し、ここでこのベクターは以下を含有する：
−第一および第二のクローニング領域であって、ここで、
−それぞれのクローニング領域は、少なくとも１つの、ベクター特有の制限酵素切断部位を含み、
−それぞれのクローニング領域は、リボソーム結合部位およびシグナル配列が５’の側面に位置する、第一および第二のクローニング領域、
−第二のクローニング領域の３’に位置する、アンカー領域をコードするポリヌクレオチド、
−第一および第二の複数の可変ポリヌクレオチドであって、
−それぞれが抗体の完全可変領域または抗体の可変領域の一部に続き、可能なら、抗体の完全不変領域または抗体の不変領域の一部をコードし、
−この第一の複数の可変ポリヌクレオチドは、この第一クローニング領域のその制限酵素切断部位でそのベクターにクローニングされ、
−この第二の複数の可変ポリヌクレオチドは、この第二クローニング領域のその制限酵素切断部位でそのベクターにクローニングされる。
【０００８】
用語「ベクターに特有の制限酵素切断部位」とは、そのベクターの配列中における、そのような制限部位の１つの存在をいうと理解され、抗体の完全な可変領域または抗体の可変領域の一部に続き、可能なら抗体の完全な不変領域または抗体の不変領域の一部をコードする、上記記載の第一および／または第二のポリヌクレオチドにおけるそのような部位の可能な存在を考慮しない。上記の第一および第二のポリヌクレオチドは、その「特有の」部位と同一の制限部位を含有し得る。このことは、第一および第二の両方のポリヌクレオチド配列がそのベクターにクローニングされる前は、上記制限部位は「特有」であることを意味する。
【０００９】
この第一および第二の可変のポリヌクレオチドは、好ましくは、所定の向きでクローニング領域にクローニングされる。従って、このクローニング領域が単一の特有の制限部位を含有する場合には、この部位は好ましくは、非同一の制限末端が生成されるような型であり、例えば、制限酵素ＳｆｉＩによって生成される。しかし、このクローニング領域は２つ以上の特有の制限部位を含有し、その結果、可変のポリヌクレオチドは、対応する末端を有する制限フラグメントとして便利にクローニングされ得る。
【００１０】
好ましくは、本発明に従うベクターでは、この第一のクローニング領域、第二のクローニング領域、両方のリボソーム結合部位、シグナル配列およびアンカー配列は、単一のポリリンカー配列の一部である。両方のクローニング領域は、従って、単一のカセットの一部であり得、このカセットは、その第一クローニング領域を含有し、５’にはリボソーム結合部位およびシグナル配列が隣接し、この第１のクローニング領域は、第２のクローニング領域に隣接して存在し、この第二のクローニング領域もまた、５’にはその対応するリボソーム結合部位およびシグナル配列が隣接し、そして３’にはアンカー配列が隣接する。
【００１１】
好ましくはこの第一の複数の可変ポリヌクレオチドは、ＶLポリヌクレオチドであり、そしてこの第二の複数の可変ポリヌクレオチドは、ＶHポリヌクレオチドである。より好ましくは、ＶLポリヌクレオチドは、Ｖ6ポリヌクレオチド、Ｖ6Ｃ6ポリヌクレオチド、Ｖ8ポリヌクレオチド、Ｖ8Ｃ8ポリヌクレオチド、Ｖ6およびＶ8ポリヌクレオチドの混合物、または、Ｖ6Ｃ6およびＶ8Ｃ8ポリヌクレオチドの混合物である。
【００１２】
本発明によるポリヌクレオチドの別の実施形態では、このベクターはさらに抗体の精製または検出のためのタグを含有し、抗体の精製のためのこのタグは、好ましくは、ポリヒスチジンテールを含有し；抗体の検出のためのタグは、好ましくは、ｃ−ｍｙｃ由来のタグである。
【００１３】
本発明によるポリヌクレオチドの別の実施形態では、このベクターはさらに、その第二の可変ポリヌクレオチドとアンカータンパク質との間に位置するａｍｂｅｒ終止コドンを含有する。
【００１４】
本発明によるポリヌクレオチドのさらに別の実施形態では、このベクターはさらに、その第二の可変ポリヌクレオチドとアンカータンパク質との間に位置するＣH1ドメインを含有し、このＣH1ドメインは好ましくは、ヒトγ−１  ＣH1ドメインである。
【００１５】
「アンカータンパク質」は、そのライブラリーを発現する生物によって生成される粒子（例えば、ファージまたはウイルス粒子）の外皮中に、または、生物そのものがそのライブラリーを発現する場合には、生物そのものの外皮中に、少なくとも部分的に収容され得る、タンパク質またはその一部であると定義される。本明細書中において、外皮は、その外皮表面を規定する、細胞、ウイルスまたはファージ粒子の構造と定義される。このライブラリーを発現するファージまたはファージミドの場合には、アンカータンパク質は、例えば、ｇｅｎｅ  ＩＩＩの産物などの膜タンパク質であり得る。しかし、当業者に知られている他の系は、本発明に従うライブラリーを獲得するために使用され得る。従って、例えば、膜貫通タンパク質またはその膜貫通領域は、真核細胞の発現系のアンカータンパク質として使用されることが企図され得る。本発明では、アンカータンパク質は、抗体の可変領域またはその一部に融合され得、上記可変領域を生物の外環境に提示することを生じ、その領域は、外膜に係留される。本発明によるポリヌクレオチドの好ましい実施形態では、アンカータンパク質は、糸状のファージｆdのマイナーな膜タンパク質ＩＩＩである。
【００１６】
本発明のある実施形態では、本発明によるポリヌクレオチド、および従って、Ｆａｂライブラリーは、少なくとも１０9の異なったＦａｂをコードする。本発明の別の実施形態では、本発明のＦａｂライブラリーは、少なくとも１０10の異なったＦａｂをコードする。本発明のさらに別の実施形態では、Ｆａｂライブラリーは少なくとも３．７×１０10の異なったＦａｂｓをコードする。本発明のさらに別の実施形態では、Ｆａｂライブラリーは１０9〜３．７×１０10の異なったＦａｂをコードする。
【００１７】
さらに、本発明はＦａｂライブラリーを提供し、以下を含有する
−上記に定義されるような複数のベクター、
−複数の融合タンパク質をコードする融合ポリヌクレオチドを形成するそれぞれのベクターの第二クローニング領域、
−複数のキャプシド粒子、ここで、第一および第二の複数の種々のポリヌクレオチドを含む複数のベクターは、キャプシド粒子にパッケージングされ、ここで、
−このキャプシド粒子の少なくともいくつかは、そのキャプシドの表面のキャプシド中にパッケージングされるベクターによってコードされる融合タンパク質をディスプレーする。
【００１８】
さらに本発明は、Ｆａｂライブラリーをコードする複数のポリヌクレオチドを作製する方法に関し、以下の工程を包含する：
−第一のセットのプライマーを用いて、その第一の複数の種々のポリヌクレオチドを増幅し、
−第二のセットのプライマーを用いて、その第二の複数の種々のポリヌクレオチドを増幅し、
−ここでそれぞれのセットのプライマーは、抗体の可変領域またはその一部をコードする可変のポリヌクレオチドの５’および３’末端に相同であるように設計されたオリゴヌクレオチドを含有し、その結果、それらのプライマーを使用して、抗体の抗原結合部位の全てまたは一部を保持しつつ、遺伝子の天然または合成の供給源由来の可変のポリヌクレオチドのプールを増幅し得；
−第一および第二の複数の可変のポリヌクレオチドを複数のベクターにクローニングし、
−ここでベクターは、以下を含有する：
−第一および第二のクローニング領域であって、ここで、
−それぞれのクローニング領域は少なくとも１つの、ベクターに特有の制限酵素切断部位を含有し、
−リボソーム結合部位およびシグナル配列が、５’に隣接する、それぞれのクローニング領域、
−第二クローニング領域の３’に位置するアンカー領域をコードするポリヌクレオチド、
−ここで、第一の複数の可変のポリヌクレオチドは、このベクターの第一クローニング領域の制限酵素切断部位中にクローニングされ、そして第二の複数の可変のポリヌクレオチドは、このベクターの第二クローニング領域の制限酵素切断部位中にクローニングされる。
【００１９】
ある実施形態では、Ｆａｂライブラリーの構築の方法は、以下の工程を包含する：１つのセットのプライマーを用いて、複数の可変の遺伝子プールを増幅する工程であって、これらのプライマーは、抗体の可変領域またはその一部をコードする可変のポリヌクレオチドの５’および３’末端に対して相同であるように設計されたオリゴヌクレオチドを含有し、その結果それらのプライマーを使用して、抗体の抗原結合部位の全てまたは一部を保持しつつ、遺伝子の天然または合成の供給源からの可変のポリヌクレオチドのプールを増幅し得；２工程の手順を用いて、ベクターに増幅した可変の遺伝子プールをクローニングしてＦａｂライブラリーを獲得し；ここでこのベクターは、抗体Ｆａｂフラグメントとして、クローニングされた抗体の可変ポリヌクレオチドの発現を適応させるファージまたはファージミドベクターを含有するベクターであり、ここで、２つの抗体鎖のうちの１つはファージの膜タンパク質の１つに融合している（例えば、ｇｅｎｅＩＩＩ産物）。
【００２０】
ある実施形態では、ＢＡＣＫプライマーは、それらが結合することになるヒト生殖系列遺伝子セグメント領域に比較して、全部で２１から２３のヌクレオチドの中で多くとも３つの変異を有するが、オリゴヌクレオチドの３’部位近くに少なくとも３つの対応する残基を有するように設計された。このオリゴヌクレオチドのセットは、ヒト生殖系列遺伝子セグメントの約９０％を認識し、そしてそれ自体免疫化されていない供給源のＢ細胞のこの多様性のほとんどに対してアクセスを提供する。別の実施形態では、重鎖プライマーは、高いアニーリング温度で（少なくとも５５℃）、安定した結合を保証するために「ＧＧ」で終わるべきである。同様に、ＶｋａｐｐａＢＡＣＫプライマー、およびＶｌａｍｂｄａＢＡＣＫプライマーのほとんどは、優先的に「ＣＣ」で終わるように設計される。他の実施形態では、これらのプライマーは図２の配列からなる。
【００２１】
本発明はまた、Ｆａｂライブラリー由来の抗原に特異的な抗体を獲得する方法を提供する。ある実施形態では、本発明の方法は、本発明のＦａｂライブラリーを用いるレート外の迅速な初期のスクリーニングを可能とする。別の実施形態では、本特許の方法は、本発明のＦａｂライブラリーを用いて、大規模な一連の抗原特異的なＦａｂについてレート外をスクリーニングした。
【００２２】
本発明はまた、選択した抗原に特異的な単離された抗体、およびそれらに対応する核酸に関し、その抗体は、本発明のＦａｂライブラリーより単離される。他の実施形態では、これらの単離された抗体は、高い親和性の抗体である。この抗体は、研究試薬または治療製品として使用され得る。本発明の抗体は、それらの標的の性質および局在を調査するのに理想的であり、その抗体は、その標的を精製するのに使用され得る。従って、本発明の抗体は、機能ゲノム学の分野において、標的の確認および標的の発見に重要である。
【００２３】
本発明はまた、上記定義のベクターに関する。このベクターは、それぞれ、第一および第二のクローニング領域にクローニングされた、第一の複数の可変ポリヌクレオチドの１つおよび第二の複数の可変ポリヌクレオチドの１つを含有する。
【００２４】
本発明はさらに、本発明のＦａｂライブラリーまたは本発明のＦａｂライブラリーをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【００２５】
ある局面では、本発明は、所望の特異的結合対メンバー（例えば、抗体分子など）をファージの膜タンパク質に連結させることを含む。次いで、特異的結合対メンバーを（例えば、アフィニティー技術などにより）富化することによって、例えば、特異的結合対メンバーをコードするＤＮＡもまた、高化され、次いで単離され得る。次いで、獲得されたＤＮＡは、他の系でクローニングおよび発現され得、潜在的に大量の所望の特異的結合対メンバーを生じ得るか、または発現の前に配列決定、さらなるクローニングおよび遺伝子操作に供され得る。
【００２６】
典型的に、特異的結合対メンバーの標的（例えば、抗原またはハプテン）は、その特異的結合対メンバーが抗体であるときには既知であり、そして、本明細書における方法は、特異的に目的の標的に結合する特異的結合対メンバーを作製および／または同定する手段を提供する。従って、そのタンパク質が抗体のとき、本発明は、所定の標的に対して特異性がある抗体（特にモノクローナル抗体）を生成する新規の手段を提供し、このことにより、従来のモノクローナル抗体技術の労働集約的で、時間のかかりかつ、しばしば予想不能なプロセスを回避する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）複数のベクターを含むＦａｂライブラリーをコードする複数のポリヌクレオチドであって、ここで、該ベクターは、以下：
−第１および第２のクローニング領域であって、ここで、
−各クローニング領域は、該ベクターについて唯一の、少なくとも１つの制限酵素切断部位を含み、
−各クローニング領域は、リボソーム結合部位およびシグナル配列に５’側で隣接している、
第１および第２のクローニング領域、
−該第２のクローニング領域の３’側に位置するアンカー領域をコードするポリヌクレオチド、
−第１および第２の複数の可変ポリヌクレオチドであって、
−各々が、完全な抗体可変領域または抗体可変領域の一部、おそらくそれに続いて完全な抗体定常領域または抗体定常領域の一部をコードし、
−該第１の複数の可変ポリヌクレオチドは、該ベクター中に該第１のクローニング領域の該制限酵素切断部位でクローニングされており、
−該第２の複数の可変ポリヌクレオチドは、該ベクター中に該第２のクローニング領域の該制限酵素切断部位でクローニングされている、
第１および第２の複数の可変ポリヌクレオチド
を含む、ポリヌクレオチド。
（項目２）前記第１の複数の可変ポリヌクレオチドがＶLポリヌクレオチドであり、そして前記第２の複数の可変ポリヌクレオチドがＶHポリヌクレオチドである、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目３）前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１０9の異なるＦａｂ、好ましくは少なくとも１０10の異なるＦａｂ、最も好ましくは少なくとも３．７×１０10の異なるＦａｂをコードする、項目１または２に記載のポリヌクレオチド。
（項目４）Ｆａｂライブラリーであって、該ライブラリーは、複数のベクターを含み、ここで、該ベクターは、以下：
−第１および第２のクローニング領域であって、ここで、
−各クローニング領域は、該ベクターについて唯一の、少なくとも１つの制限酵素切断部位を含み、
−各クローニング領域は、リボソーム結合部位およびシグナル配列に５’側で隣接している、
第１および第２のクローニング領域、
−該第２のクローニング領域の３’側に位置するアンカー領域をコードするポリヌクレオチド、
−第１および第２の複数の可変ポリヌクレオチドであって、
−各々は、完全な抗体可変領域または抗体可変領域の一部、おそらくそれに続いて完全な抗体定常領域または抗体定常領域の一部をコードし、
−該第１の複数の可変ポリヌクレオチドは、該ベクター中に該第１のクローニング領域の該制限酵素切断部位でクローニングされており、
−該第２の複数の可変ポリヌクレオチドは、該ベクター中に該第２のクローニング領域の該制限酵素切断部位でクローニングされて、複数の融合タンパク質をコードする複数の融合ポリヌクレオチドを形成する、
第１および第２の複数の可変ポリヌクレオチド、
−複数のキャプシド粒子であって、ここで該第１および第２の複数の可変ポリヌクレオチドを含む該複数のベクターは、該キャプシド粒子中にパッケージングされており、ここで
−該キャプシド粒子のうちの少なくともいくつかは、該キャプシドの表面上で該キャプシド中にパッケージングされた該ベクターによってコードされる該融合タンパク質を提示する、複数のキャプシド粒子
を含む、ライブラリー。
（項目５）Ｆａｂライブラリーをコードする複数のポリヌクレオチドの作製方法であって、以下の工程：
−第１セットのプライマーを用いて第１の複数の可変ポリヌクレオチドを増幅する工程、
−第２セットのプライマーを用いて第２の複数の可変ポリヌクレオチドを増幅する工程であって、
−ここで、各セットのプライマーは、抗体可変領域またはその一部をコードする可変ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に対して相同であるように設計されたオリゴヌクレオチドを含み、その結果、該抗体の抗原結合部位の全てまたは一部を維持しながら、該セットのプライマーを用いて可変ポリヌクレオチドプールを天然または合成の遺伝子供給源から増幅し得る、工程；
−該第１および第２の複数の可変ポリヌクレオチドを複数のベクター中にクローニングする工程であって、
−ここで、該ベクターは、第１および第２のクローニング領域であって、
−ここで、各クローニング領域は、該ベクターについて唯一の、少なくとも１つの制限酵素切断部位を含み、
−各クローニング領域は、リボソーム結合部位およびシグナル配列に５’側で隣接している、
第１および第２のクローニング領域、
−該第２のクローニング領域の３’側に位置するアンカー領域をコードするポリヌクレオチド
を含み、
ここで、該第１の複数の可変ポリヌクレオチドは、該ベクターの該第１のクローニング領域の該制限酵素切断部位でクローニングされており、そして該第２の複数の可変ポリヌクレオチドは、該ベクターの該第２のクローニング領域の該制限酵素切断部位でクローニングされている、工程
を包含する、方法。
（項目６）さらに、以下の工程：
−前記第２の複数の可変ポリヌクレオチドを、複数の別のベクター中にクローニングする工程、および制限酵素を用いて該可変ポリヌクレオチドを該ベクターから切り出す工程
を包含する、項目５に記載の方法。
（項目７）Ｆａｂライブラリーの作製方法であって、ここで、項目４または５によって得られる前記第１および第２の複数の可変ポリヌクレオチドを含む複数のベクターが、複数のキャプシド粒子中にパッケージングされている、方法。
（項目８）標的に対する特異性を有するＦａｂクローンを得るための方法であって、以下の工程：
−項目４に記載のライブラリーを得る工程、および
−固定化されたかまたは標識された抗原に対するインビトロ選択を用いて、抗原に結合するＦａｂを選択する工程
を包含する、方法。
（項目９）モノクローナルＦａｂまたはＦａｂクローンのポリクローナルコレクションであって、以下：
−ヒト糖タンパク質多型上皮ムチン−１（ＭＵＣ１）に対して特異的に結合する、項目４に記載のライブラリーから得られた、１つのクローンまたは複数のクローン
をそれぞれ含む、モノクローナルＦａｂまたはＦａｂクローンのポリクローナルコレクション。
（項目１０）項目１〜３のいずれかに記載のベクター。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】抗体ＦａｂフラグメントのディスプレーのためのファージミドベクターｐＣＥＳ１。ｐＣＥＳ１の概略図（Ａ）およびポリリンカー領域（Ｂ）。ポリリンカー領域は、２つのシグナル配列（「Ｓ」；ｐｅｌＢおよびｇｅｎｅＩＩＩのリーダー配列）、Ｃ６ドメイン、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）、ＣＨ１ドメイン、ヘキサヒスチジン標識（Ｈ６）およびｃ−ｍｙｃ由来の配列を含有する。可変ドメイン遺伝子は、それぞれＶＬまたはＶＬＣＬについてＡｐａＬＩ−ＸｈｏＩフラグメントまたはＡｐａＬＩ−Ａｓｃフラグメント、およびそれぞれＶＨまたはＶＨＣＨ１についてＳｆｉＩ／ＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩまたはＳｆｉＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてクローニングされ得る。抗体遺伝子とバクテリオファージｇｅｎｅＩＩＩとの間のａｍｂｅｒ終止コドン（＊）は、Ｅ．ｃｏｌｉ．の非抑制株で、可溶性Ｆａｂフラグメントの生産を可能にする。二シストロン性オペロンの発現は、ＬａｃＺプロモーター（ｐＬａｃＺ）の制御下にある。
【図２−１】この図は、ヒト重鎖および軽鎖のＶ領域のＰＣＲ増幅のための一つの実施形態で使用されるオリゴヌクレオチドを記載する。
【図２−２】この図は、ヒト重鎖および軽鎖のＶ領域のＰＣＲ増幅のための一つの実施形態で使用されるオリゴヌクレオチドを記載する。
【図２−３】この図は、ヒト重鎖および軽鎖のＶ領域のＰＣＲ増幅のための一つの実施形態で使用されるオリゴヌクレオチドを記載する。
【図２−４】この図は、ヒト重鎖および軽鎖のＶ領域のＰＣＲ増幅のための一つの実施形態で使用されるオリゴヌクレオチドを記載する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
用語「活性な」とは、任意の天然に存在するポリペプチドの生物学的および／または免疫学的活性を保持するポリペプチドの形態をいう。
本出願で使用される用語「活性化された」細胞は、細胞外または細胞内の膜の輸送（正常または疾患の過程の一部としての神経分泌分子または酵素分子の排出を含む）に関与する細胞である。
【００２９】
用語「抗体」は、天然の、または一部あるいは全体を合成して生成される免疫グロブリンを意味する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインと相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質またはポリペプチドを包含する。これらのタンパク質は、天然供給源に由来し得、または一部もしくは全体が合成的に生成され得る。実例的な抗体は、免疫グロブリンのアイソタイプおよびＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡａｂ、ＶＨＨ、Ｆｄフラグメントである。
【００３０】
用語「抗体ポリペプチド二量体」は、抗体の２つのポリペプチド鎖成分の抗体に結合し得る会合物を意味する。従って、それは重鎖および軽鎖からなり得る、抗体の１つのアームであり得、それは、ＶL、ＶH、ＣL、およびＣH1の抗体ドメインからなるＦａｂフラグメントであり得、またはＶLドメインまたはＶHドメインからなるＦＶフラグメントであり得る。
【００３１】
用語「キャプシド」は、遺伝的情報を有するかまたは有しない、複製可能な遺伝的ディスプレーパッケージを意味する。キャプシドは、その表面に特異的結合対のメンバーをディスプレーする。そのパッケージは、個体群のいくつかのまたは全てのキャプシドの表面に、抗原結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ）をディスプレーするバクテリオファージの個体群であり得る。この型のパッケージは、ファージ抗体（ｐＡｂ）と呼ばれている。
【００３２】
用語「ＣH1領域」は、抗体の重鎖の第一の不変領域またはその一部のまたは抗体の軽鎖と、発現した（ＶＨ）ＣＨ１の対合および可能なジスルフィド架橋の形成を可能とするためのヒンジ領域からアミノ酸で伸長されたものを意味する。これはヒト抗体のアイソタイプγ−１のＣＨ１ドメインであり得る。
【００３３】
「抗体の抗原結合部位の成分部分」は、ポリペプチド鎖成分（例えば、ＶHまたはＶLドメイン）であり得るか、または対応し得る。しかし、それはＣＤＲ、またはＶL配列およびＶHのＣＤＲ、ＶH配列およびＶLのＣＤＲ、ＶHおよびＣＤＲのみが欠損したＶL配列、などであり得る。条件は、抗体の抗原結合部位の第一および第二の成分の部分は、組み合わせて（一緒に）抗原結合部位を形成しなければならないことである。従って、目的の抗原に特異的な非ヒト抗体の抗原結合部位の第二の成分部分がＣＤＲである場合、次いで、ヒト抗体の抗原結合部位の第一の成分の部分は、抗原結合部位を形成するのに必要なＶHおよびＶL領域の残りを含有する（関連の抗体不変領域を伴うかまたは伴わないで（Ｆａｂフォーマットにおいて）、または、リンカーペプチド配列を伴うかまたは伴わないで（Ｆｖフォーマットにおいて）。非ヒト抗体の抗原結合部位の第二の成分の部分は、ＶLドメインおよびＶHドメインの部分を含有し得る。その部分は、例えば、１つ以上のＣＤＲであり、ことによるとＣＤＲ３である。そのような場合では、ヒト抗体の抗原結合部位の第一の成分部分は、第二の成分の部分と組み合わせて、抗原結合部位を形成するＶH配列の残りを含有する。もちろん、逆の状況も存在し、そして当業者は、一緒になって、抗原結合部位を形成する第一および第二の成分の部分の他の組み合わせを認識し得る。
【００３４】
用語「条件的に欠損した」は、あるセットの条件下で、特定のポリペプチドを発現しないが、別のセットの条件下では発現する遺伝子を意味する。例としては、非抑制的または抑制的宿主のそれぞれにおいて発現される、ａｍｂｅｒ変異を含む遺伝子がある。あるいは、遺伝子は、あるセットの条件下では欠損しているタンパク質またはポリペプチドを発現し得るが、別のセットの条件下では発現しないかもしれない。例としては、温度感受性変異を有する遺伝子がある。
【００３５】
用語「誘導体の」とは、例えば、ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種または種々の酵素）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールで誘導体化する）および、ヒトタンパク質には通常存在しないアミノ酸（例えば、オルニチン）の化学合成による挿入または置換などの技術によって化学的に改変されたポリペプチドをいう。
【００３６】
用語「ドメイン」とは、それ自体の中に同じタンパク質またはポリペプチドの他の部分から独立し、かつ相補的な結合メンバーからは独立して折りたたまれているタンパク質またはポリペプチドの一部を意味する。
【００３７】
用語「溶離液」とは、２つの分子間の連結を分解するために使用される溶液を意味する。連結は、非共有結合または共有結合であり得る。２つの分子はｓｂｐのメンバーであり得る。
【００３８】
用語「発現調節フラグメント」（ＥＭＦ）とは、作動可能に連結されたＯＲＦまたは別のＥＭＦの発現を調節する一連のヌクレオチドを意味する。
【００３９】
本明細書中で使用されるように、配列は、その配列の発現がＥＭＦの存在によって変化するとき、「作動可能に連結された配列の発現を調節する」といわれる。ＥＭＦは、プロモーターおよびプロモーター調節配列（誘導性エレメント）を含むが、それに限定されない。ＥＭＦの一つのクラスは、特定の調節因子または生理学上の事象に応答して、発現または作動可能に連結されたＯＲＦを誘導するフラグメントである。
【００４０】
用語「Ｆａｂ」とは、ヒンジ領域の少なくとも１つのジスルフィド架橋によって結合された重鎖ポリペプチドの２つのＮ末端部分、および２つの完全な軽鎖ポリペプチドを含有するフラグメントを含む抗体フラグメントをいい、それぞれの軽鎖は、重鎖の１つのＮ末端部分と複合体化する。Ｆａｂはまた、重鎖ポリペプチド（例えば、ＶHＣH1）のＮ末端部分と複合体化される軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶLＣL）の全てまたは大部分を含むＦａｂフラグメントを含む。
【００４１】
用語「Ｆａｂライブラリー」は、クローン中のＦａｂポリヌクレオチド配列の集合をいう；または、個々のＦａｂポリペプチドまたはＦａｂポリペプチドの混合した集合を提供するための選択またはスクリーニングし得るｒｇｄｐｓにおいてのディスプレーされたＦａｂポリペプチドの遺伝子的に多様な集合をいう。
【００４２】
用語「折りたたみ単位」とは、αへリックスおよび／またはβ鎖および／またはβターン構造の特定の組み合わせを意味する。ドメインおよび折りたたみ単位は、一次の構造では隣接していないアミノ酸を一緒にする構造を含む。
【００４３】
用語「遺伝子的に多様な集合」とは、抗体またはそのポリペプチド成分を意味し、これは細胞や生物の天然の集合に存在し得る多様性だけではなく、インビトロまたはインビボの人工変異によって生成される多様性もまたいう。例えば、インビトロの変異は、変化させることが所望される配列のランダムな変異を有するオリゴヌクレオチドを使用する無作為変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を含み得る。例えば、インビボ変異誘発は、ＤＮＡを収容するために宿主微生物の変異因子を使用し得る（ＷＯ９２／０１０４７の実施例３８を参照のこと）。用語「特有の集団」は、遺伝的には多様ではない（すなわち、それらは全く同じである）複数のもの（例えば、ポリペプチド鎖）を表すために使用され得る。制限された集団は、多様ではあるが、動物の完全なレパートリーよりは多様ではない集団である。多様性は、先の選択（例えば、抗原結合特異性を用いて）によって減少する。
【００４４】
用語「ヘルパーファージ」とは、欠損ファージゲノムを含む細胞に感染させるために使用するファージを意味し、それは、その欠損を補うために機能する。欠損ファージゲノムは、遺伝子配列をコードするいくつかの機能が取り去られたファージミドまたはファージであり得る。ヘルパーファージの例は、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｋ０７ｇｅｎｅＩＩＩ  ｎｏ．３；およびキャプシドタンパク質に融合した結合分子をディスプレーまたはコードするファージである。
【００４５】
用語「ホモログ」は、その一次、二次または三次構造の対応する位置において同じまたは保存された残基を有するポリペプチドを意味する。この用語はまた、相同なポリペプチドをコードする２つ以上のヌクレオチド配列に拡張される。例示の相同ペプチドは、免疫グロブリンのアイソタイプである。
【００４６】
用語「宿主細胞」は、本発明のベクターが導入され得、発現され得および／または増幅され得る原核生物または真核生物の細胞をいう。代表的な原核生物の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株を含む。代表的な真核生物の宿主細胞は、酵母または糸状真菌、または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスターの卵巣細胞、マウスのＮＩＨ  ３ｔ３線維芽細胞、またはヒト胚性腎臓１９３細胞など）である。
【００４７】
用語「免疫グロブリンスーパーファミリー」とは、ポリペプチドのファミリーを意味し、そのメンバーは、免疫グロブリン分子の可変または不変領域の構造に関連した構造を有する少なくとも１つのドメインを有する。そのドメインは、２つのＢシートおよび通常保存されたジスルフィド結合を含む（Ａ．Ｆ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ  １９８８  Ａｎｎ．Ｒｅｖ  Ｉｍｕｎｏｌ．６  ３８１−４０５を参照のこと）。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの例としては、ＣＤ４、血小板由来増殖因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）、細胞間付着分子（ＩＣＡＭ）がある。状況がそうでないように支配する場合を除き、本願での免疫グロブリンおよび免疫グロブリンホモログとの言及、免疫グロブリンスーパーファミリーのおよびそのホモログメンバーを包含する。
【００４８】
用語「感染」とは、ウイルスまたはウイルスベクターを使用して、核酸を適切な宿主細胞に導入することをいう。
【００４９】
用語「中間フラグメント」とは、長さが５塩基と１０００塩基との間の核酸を意味し、そして好ましくは、長さが１０ｂｐと４０ｂｐとの間である。
【００５０】
本明細書で使用される用語「単離された（る）」とは、核酸またはポリペプチドの天然の供給源に存在する他の核酸またはポリペプチドからだけでなく、ポリペプチドからも分離される核酸またはポリペプチドをいう。そして好ましくは、溶媒、緩衝剤、イオン、または通常そのポリペプチドの溶液に存在する他の成分のみの存在下で（ある場合）、見出される核酸またはポリペプチドをいう。用語「単離された（る）」および「精製された（る）」は、天然の供給源に存在する核酸またはポリペプチドを含まない。
【００５１】
用語「ミューテーター株」は、その株の中で複製されるＤＮＡがその親のＤＮＡに関して、変異を起こす遺伝的欠損を有する宿主細胞を意味する。ミューテーター株の例は、ＮＲ９０４６ｍｕｔＤ５およびＮＲ９０４６ｍｕｔＴ１である（ＷＯ９２／０１０４７の実施例３８を参照のこと）。
【００５２】
用語「天然に存在するポリぺプチド」とは、遺伝子的に操作されていない細胞によって生成されるポリペプチドをいい、特にポリペプチドの翻訳後の修飾によって生じる種々のポリペプチドを企図し、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含むが、それに限定されない。
【００５３】
用語「ヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチドのへテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列をいう。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」とはまた、本明細書中で、交換可能に使用され、ヌクレオチドのへテロポリマーをいう。概して、本発明によって提供される核酸セグメントは、微生物またはウイルスのオペロン、あるいは真核細胞の遺伝子に由来する調節因子を含有する組換え転写ユニット中で発現され得る合成核酸を提供するために、ゲノムのフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーより、または一連のオリゴヌクレオチドより、または個々のヌクレオチドより、組み立てられる。
【００５４】
用語「オリゴヌクレオチドフラグメント」または「ポリヌクレオチドフラグメント」、「一部（部分）」または「セグメント」は、ｍＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の同一のまたは関連の一部を同定しまたは増幅するための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＣＲ）または種々のハイブリダイゼーション手順で使用するのに十分長いポリペプチドヌクレオチド残基のストレッチのことをいう。
【００５５】
用語「オリゴヌクレオチド」または「核酸プローブ」は、本発明中に提供されたポリヌクレオチド配列に基づいて調製される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１５ヌクレオチド、そして通常少なくとも約２０ヌクレオチドを有する、そのようなポリヌクレオチド配列の部分を含有する。核酸プローブは、約６ｋｂより少ないヌクレオチド、通常約１ｋｂよりも少ないヌクレオチドを有するそのようなポリヌクレオチド配列の一部を含有する。偽陽性を除去させるための大まかな試験の後に、例えば、これらのプローブを使用して、特定のｍＲＮＡ分子が細胞や組織に存在するかどうかを決定し得、または、Ｗａｌｓｈら（Ｗａｌｓｈ，Ｐ．Ｓ．ら、１９９２、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ  １：２４１−２５０）によって記載されているように、染色体ＤＮＡから同様の核酸配列を単離し得る。
【００５６】
用語「オープンリーディングフレーム」、（ＯＲＦ）とは、いずれの終止コドンもないアミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレットを意味し、そしてタンパク質に翻訳され得る配列である。
【００５７】
用語「ファージベクター」とは、ファージゲノムの改変に由来するベクターを意味し、バクテリオファージの複製起点を含むが、プラスミドのもの（複製起点）は含まない。
【００５８】
用語「ファージミドベクター」とは、プラスミドゲノムの改変に由来するベクターを意味し、バクテリオファージの複製起点およびプラスミドの複製起点を含む。
【００５９】
用語「表現型」とは、ある様式で測定され得または利用され得、そしてレポーター遺伝子によってもたらされる細胞の物理的（例えば、色素または細胞の形）および／または代謝的特徴をいう。
【００６０】
用語「ポリリンカー領域」とは、ポリリンカー領域を含むベクター中の特有の、少なくとも２つの制限酵素部位を含むポリヌクレオチド（すなわち、これらの制限部位は、そのベクター中のクローニング部位として、簡単に使用される）を意味する。
【００６１】
ポリペプチド「フラグメント」「一部（部分）」または「セグメント」は、少なくとも約５つのアミノ酸残基のストレッチであり、しばしば、少なくとも７つのアミノ酸であり、代表的には、少なくとも９から１３のアミノ酸であり、そして種々の実施形態では、少なくとも１７以上のアミノ酸である。活性であるために、いずれのポリペプチドも、生物学的および／または免疫学的活性をディスプレーするのに十分な長さを有さなければならない。
【００６２】
用語「プローブ」は、天然に存在するまたは組換えのまたは化学的に合成された、１本鎖または２本鎖の核酸を含む。それらは、ニック翻訳、クレノウフィルイン反応、ＰＣＲまたは当業者に周知の他の方法によって、標識され得る。本発明のプローブ、その調製およびまたは標識は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ、中に記述されており、その両方ともその全体が本明細書中に参考として援用される。
【００６３】
本明細書中で使用される用語「精製された（る）」は、推定の核酸またはポリペプチドが、他の生物学的高分子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）がほとんどない中で存在することを示す。ある実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは精製され、その結果、存在する推定の生物学的マクロ分子の少なくとも約９５重量％、より好ましくは９９．８重量％を構成する（しかし、水、緩衝剤、および他の低分子、特に１０００ダルトン未満の分子量を有する分子は存在し得る）。
【００６４】
用語「組換え（の）」とは、本明細書中でポリペプチドまたはタンパク質をいうために使用するとき、ポリペプチドまたはタンパク質が、組換えの（例えば、微生物のまたは哺乳動物の）発現系に由来することを意味する。「微生物（の）」とは、細菌または真菌（例えば、酵母）の発現系で作製された組換えポリペプチドまたはタンパク質をいう。産物として、「組換え微生物（の）」とは、実質上ネイティブな内因性の物質がなく、そして関連したネイティブなグリコシル化は伴わないポリペプチドまたはタンパク質を定義する。多くの細菌培養物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中に発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化修飾がなく；酵母で発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、概して、哺乳動物細胞で発現されるパターンとは異なったグリコシル化パターンを有する。
【００６５】
用語「組換え発現ビヒクルまたはベクター」とは、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からポリペプチドを発現する、プラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターをいう。発現ビヒクルは、（１）遺伝エレメントまたは遺伝子発現で調節の役割を有するエレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）、（２）ｍＲＮＡに転写され、そしてタンパク質に翻訳される、構造上のまたはコード配列、および、（３）適切な転写開始および転写終結の配列、のアセンブリを包含する転写ユニットを含有し得る。酵母または真核生物の発現系での使用を意図した構造ユニットは、好ましくは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質が、リーダー配列も輸送配列もなしで発現されるとき、それは、Ｎ末端のメチオニン残基を含み得る。続いて、この残基は、最終産物を提供するために、発現した組換えタンパク質またはポリペプチドより切断されてもよく、またはされなくてもよい。
【００６６】
用語「組換え発現系」とは、組換え転写ユニットを染色体ＤＮＡに組み込んだか、または、組換え転写ユニットを染色体外に有する、宿主細胞を意味する。本明細書中に定義された組換え発現系は、発現されるＤＮＡセグメントまたは合成遺伝子に連結した調節エレメントの誘導の際、異種のポリペプチドまたはタンパク質を発現する。この用語はまた、組換え遺伝エレメントまたは遺伝子発現に調節の役割を有するエレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）を安定に組み込んだ宿主細胞を意味する。本明細書中で定義された組換え発現系は、内因性ＤＮＡセグメントまたは発現される遺伝子に連結される調節エレメントの誘導の際、細胞に対して内因性のポリペプチドまたはタンパク質を発現する。その細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。
【００６７】
用語「組換え改変体」とは、組換えＤＮＡ技術を使用して作製され、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、およびアミノ酸置換によって、天然に存在するポリペプチドとは異なった任意のポリペプチドもいう。目的の活性を失うこと無しに（例えば、細胞内輸送）、どのアミノ酸残基を置換し付加しまたは欠失し得るかを決定する際の手引きは、特定のポリペプチドの配列と相同するペプチドの配列とを比較すること、および高い相同性領域で行なわれるアミノ酸配列変化の数を最小限にすることによって見出され得る。
【００６８】
好ましくは、アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似した構造およびまたは化学特性を有する別のアミノ酸に置き換えることの結果である（すなわち、保存的アミノ酸置換）。アミノ酸置換は、関連残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または親水性疎水性性質の類似性に基づいて行われ得る。例えば、非極性（疎水性の）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；陽性電荷の（塩基性の）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ；陰性電荷の（酸性の）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００６９】
「挿入」または「欠失」は、代表的に約１〜５アミノ酸の範囲にある。可能な改変は、組換えＤＮＡ技術を使用して、ポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を体系的に行なうこと、および得られる組換え改変体を活性についてアッセイすることによって実験的に決定され得る。
【００７０】
あるいは、機能変化が所望されるとき、挿入、欠失、または非保存的の変化が、変化したポリペプチドを生成するために行なわれ得る。例えば、そのような変化は、本発明のポリペプチドの１つ以上の生物学的機能または生化学的特徴を変化させる。例えば、そのような変化は、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または、分解／代謝回転速度などのポリペプチドの特徴を変化させ得る。さらに、そのような変化は、発現のために選択された宿主細胞中での発現、スケールアップなどにより良好に適したポリペプチドを生成するために、選択され得る。例えば、システイン残基は、ジスルフィド架橋を除去するために、欠失され得、別のアミノ酸残基と置換され得る。
【００７１】
あるいは、これらの同じまたは類似のポリペプチドをコードする組換え改変体は、遺伝子コードにおける「縮重」の使用をすることによって、合成され得または選択され得る。種々の制限部位を生成するサイレント変化のような、種々のコドンの置換は、プラスミドまたはウイルスベクターへのクローニングまたは特定の原核生物または真核生物の系での発現を最適化するために導入され得る。ポリヌクレオチド配列における変異は、ポリペプチドの任意の部分の特質を改変して、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または、分解／代謝回転速度などの特徴を変化させるために、そのポリペプチドに加えられた、そのポリペプチドまたは他のペプチドのドメインで反映され得る。
【００７２】
用語「人工的に再配列された免疫グロブリン遺伝子のレパートリー」とは、動物からの再配列される免疫グロブリン配列以外の供給源からの、全部または一部が由来するヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）配列の採集を意味する。これは例えば、再配列されていないＶセグメントをＤおよびＪセグメントと組み合わせることによって、ＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列、およびＶおよびＪセグメントを組み合わせることによって、ＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含み得る。ＤＮＡ配列の一部または全部は、オリゴヌクレオチド合成に由来し得る。
【００７３】
用語「再配列された免疫グロブリン遺伝子のレパートリー」とは、天然に存在するヌクレオチド（例えば、動物で発現される免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮＡ配列）の収集物を意味する。その配列は、例えば、Ｈ鎖についてＶ、ＤおよびＪのセグメント、および例えば、Ｌ鎖についてのＶおよびＪセグメントの、インビトロの再配列によって生成される。あるいは、この配列は、インビトロで免疫化された細胞系より生成され得、そこで、免疫化に応答した再配列が、細胞内で起こる。用語「レパートリー」は、遺伝子の多様性を示すために、使用される。
【００７４】
用語「複製可能な遺伝子ディスプレーパッケージ」（Ｒｇｄｐ）とは、複製する能力を有する粒子を提供する遺伝情報を有する生物学的粒子を意味する。その粒子は、ポリペプチドの少なくとも一部を、その表面にディスプレーし得る。そのポリペプチドは、粒子にとってネイティブの遺伝情報によってコードされ得、そして／または粒子中に人工的に配置され得るか、その祖先に配置され得る。ディスプレーされたポリペプチドは、特異的な結合対（例えば、免疫グロブリン分子、酵素、またはレセプターなどに基づいた重鎖または軽鎖のドメイン）のいずれのメンバーにもなり得る。この粒子は、ウイルス（例えば、ｆｄまたはＭ１３などのバクテリオファージ）であり得る。
【００７５】
用語「レポーター遺伝子」とは、宿主細胞を分離するために測定および／または使用され得る宿主細胞中の表現型の変化を生じるタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸をいう。例えば、そのレポーター遺伝子は、蛍光特性を有するタンパク質またはポリペプチド（例えば、β−ガラクトシダーセ、自己蛍光タンパク質ＧＦＰなど）をコードし得；または、レポーター遺伝子は、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードし得；または、宿主細胞の表面に発現されるエピトープをコードし得る。
【００７６】
用語「リボソーム結合部位」とは、翻訳の開始の期間に、リボソームが適切な開始コドンを選択するのを可能にするポリヌクレオチドを意味する。いくつかの原核生物では、このポリヌクレオチドは、シャイン−ダルガーノ配列と呼ばれており、シャイン−ダルガーノ配列の塩基は、リボソームの１６ＳＲＮＡと対含する。
【００７７】
用語「分泌された（る）」タンパク質またはポリペプチドとは、膜を横切ってまたは通って輸送される（適切な宿主細胞で発現されるとき、そのアミノ酸配列中のシグナル配列の結果として輸送されることを含む）タンパク質またはポリペプチドをいう。「分泌された（る）」タンパク質またはポリペプチドとは、それらが発現される細胞から全体が（例えば、可溶性タンパク質）または部分的（例えば、レセプター）に分泌されるタンパク質またはポリペプチドを制限なしで含む。「分泌された（る）」タンパク質またはポリペプチドはまた、小胞体の膜を横切って輸送されるタンパク質またはポリペプチドを制限なしで含む。
【００７８】
用語「シグナル配列」とは、ポリペプチドのアミノ末端で見出され、かつ膜を横切ってまたは通ってポリペプチドの輸送を指向するアミノ酸配列を意味する。シグナル配列は、１３〜３６残基の長さであるアミノ末端のポリペプチドを含み、そして、Ｎ末端の近くに通常１以上の塩基性残基を含むいくつかの親水性残基が隣接した、７から１３残基の疎水性の核を有する。
【００７９】
用語「ストリンジェント」は、当業者にストリンジェントとして一般的に理解されている条件についていうために使用される。条件の例示的なセットとしては、６０−７０℃の温度（好ましくは約６５℃）、および０．７０Ｍ〜０．８０Ｍの塩濃度（好ましくは約０．７５Ｍ）を含む。さらに例示的な条件としては以下のハイブリダイズ条件を含み、このハイブリダイズする条件は、（１）洗浄のために低いイオン強度および高い温度（例えば、５０℃で、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ）を用いる；（２）ハイブリダイズの間、変性剤（ホルムアミドなど、例えば、４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ６．５  ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液／７５ｍＭクエン酸ナトリウムなどを有する５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド）を使用する；または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０７５Ｍピロリン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で４２℃で洗浄する。
【００８０】
デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合において、さらなる例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、３７ＥＣ（１４塩基オリゴ）、４８ＥＣ（１７塩基オリゴ）、５５ＥＣ（２０塩基オリゴ）、および６０ＥＣ（２３塩基オリゴ）での６×ＳＳＣ／０．０５％  ピロリン酸ナトリウムを含む。
【００８１】
本明細書に使用されるように、「実質上等価な」とは、１以上の置換、欠失、または、付加の分、参照配列とは異なる、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列（例えば、変異配列）の両方をいい得、その正味の効果は、参照配列と目的配列との間に有害な機能上の相違点を生じない。代表的には、そのような実質上等価な配列は、本明細書中に列挙されている配列の１つと、決して約２０％以下だけ異なる（すなわち、実質上等価な配列での、個々の残基の置換、付加、および／または欠失の数は、対応する参照配列と比較して、実質上等価な配列中の残基の総数で割ったところ約０．２以下である）。そのような配列は、列挙された配列に対して８０％の配列同一性を有するといわれる。１つの実施形態では、本発明の実質上等価な（例えば、変異体）配列は、列挙された配列と比べ、１０％以下だけ異なり（９０％の配列同一性）；この実施形態の変化形では、５％以下だけ異なる（９５％の配列同一性）；この実施形態のさらに変形では、２％以下だけ異なる（９８％の配列同一性）。本発明による実質的に等価な（例えば、変異体）アミノ酸配列は、概して、列挙されたアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、他方、例えば、遺伝子コードの冗長または縮重を考慮に入れると、実質上等価な本発明のヌクレオチド配列は、低い割合の配列同一性を有し得る。本発明の目的のために、実質的に等価な生物学的活性および実質的に等価な発現の特徴を有する配列は、実質上等価とみなされる。等価性を決定する目的のために、成熟配列の切断（例えば、擬似の終止コドンを作製する変異によって）は無視されるべきである。
【００８２】
そのような実質上等価な配列（例えば、例示されるパーセント同一性）をコードする核酸配列は、当業者に周知の標準的なハイブリダイズ手順を介して慣例的に単離および同定され得る。
【００８３】
用語「抑制性翻訳終止コドン」とは、あるセットの条件下では、コドンの下流のヌクレオチド配列の翻訳を可能にするが、別のセットの条件下では、翻訳はコドンで終了するコドンを意味する。抑制性翻訳終止コドンの例は、アンバー（ａｍｂｅｒ）、オーカー（ｏｃｈｒｅ）およびオパール（ｏｐａｌ）コドンである。
【００８４】
用語「タグ」とは、例えば、重鎖のカルボキシ末端で発現される抗体Ｆａｂフラグメントの拡張物を意味する。それは、少なくとも１つのアミノ酸を含有し、より典型的には、５から１５のアミノ酸を含有し、その配列について、抗体または他の結合リガンドもしくは結合マトリックスによって特異的に認識され得る。タグは、同じＦａｂ中で組み合わされ得る。例は、特異的抗体よりおよび定義された固定化された金属イオンによって認識され得る５つのヒスチジン残基のストレッチであり、そして、９Ｅ１０抗体によって認識される次の１２アミノ酸残基（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ）のストレッチである（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。
【００８５】
用語「標的」とは、抗原性である（例えば、Ｆａｂライブラリーからの抗体によって合理的な特異性を伴って、認識され得る）任意の分子を意味する。
【００８６】
用語「標的エレメント」とは、標的遺伝子の発現を変化させる核酸配列をいう。標的エレメントとは、プロモーター、およびプロモーター調節配列（誘導性因子）を含むが、それに限定されない。あるクラスの標的因子は、特定の調節因子または生理学的事象に応答して、発現を誘導するフラグメントである。
【００８７】
用語「トランスフェクション」とは、何らかのコード配列が、実際に発現されるかどうかに関わらず、適切な宿主細胞によって、発現ベクターをとりこむことをいう。
【００８８】
用語「形質転換」とは、ＤＮＡを適切な宿主細胞に導入し、その結果、染色体外因子としてまたは染色体統合によってのどちらかによって、ＤＮＡは複製され得ることを意味する。
【００８９】
用語「ユニバーサルセット」とは、核酸のセットをいい、最も好ましくは、オリゴヌクレオチドのセットをいう。それは、ヌクレオチドの与えられた長さに対する全ての可能な配列の組み合わせ（例えば、６ヌクレオチド長さの全ての４０９６挿入オリゴヌクレオチド）を表す。好ましい実施形態では、用語ユニバーサルセットとは、与えられた長さの全ての可能なオリゴヌクレオチドセットをいい、ここで、オリゴヌクレオチドの１つ以上の部位は、不変である（例えば、同じヌクレオチドが、セットの全てのメンバーのこの部位に存在する）。
【００９０】
本明細書で使用されているように、「取りこみ調節フラグメント」（ＵＭＦ）とは、連結されるＤＮＡフラグメントの細胞への取りこみを媒介する一連のヌクレオチドを意味する。ＵＭＦは、以下に記述したコンピューターに基づいたシステムを用いて、公知のＵＭＦを標的配列または標的モチーフとして使用して、簡単に同定され得る。
【００９１】
ＵＭＦの存在および活性は、推定されるＵＭＦをマーカー配列に付着させることによって確かめられ得る。次いで、生じる核酸分子は、適切な条件下で適切な宿主とともにインキュベートし、マーカー配列の取りこみを決定する。上記記述のように、ＵＭＦは、連結されるマーカー配列の取りこみの頻度を増加させる。
【００９２】
用語「ベクター」とは、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からポリペプチドを発現するためのプラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターをいう。ベクターは、以下の組み合わせを含有する転写ユニットを含有し得る、（１）遺伝子発現において調節の役割を有する遺伝エレメント（単数または複数）（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）、（２）ｍＲＮＡに転写され、そしてタンパク質に翻訳される、構造またはコード配列、および（３）適切な翻訳開始配列および翻訳終止配列。酵母または原核生物の発現系において使用されると意図される構造ユニットは、宿主細胞によって翻訳されるタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含み得る。
【００９３】
用語「ＶLポリヌクレオチド」とは、Ｖ6−ファミリーおよび／またはＶ8ファミリー由来の軽鎖遺伝子のいくつかまたは全てのドメインを含むＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００９４】
用語「ＶHポリヌクレオチド」とは、重鎖遺伝子ファミリー由来の重鎖遺伝子のいくつかまたは全てのドメインを含むＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００９５】
上記用語のそれぞれは、内容がそうでないこと示すのでなければ、それぞれについて記述される全てを含むことを意味する。
【００９６】
本発明の組換え構築物は、目的の核酸が挿入され得るベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を包含する。そのベクターはさらに、目的の核酸に作動可能に連結される調節配列（例えば、プロモーターを含む）を含有し得る。多数の適切なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、そして本発明の組換え構築物を生成するために市販されている。次のベクターは、例示のために提供される。細菌のベクター：ｐＢｓ，ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ，ＰｓｉＸ１７４，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ，ｐＢｓ  ＫＳ，ｐＮＨ８ａ，ｐＮＨ１６ａ，ｐＮＨ１８ａ，ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐＫＫ２３３−３，ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核細胞のベクター：ｐＷＬｎｅｏ，ｐＳＶ２ｃａｔ，ｐＯＧ４４，ＰＸＴＩ，ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３，ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧ，ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【００９７】
当業者に周知の方法を使用して、本発明のポリヌクレオチドおよび適切な転写／翻訳制御シグナルを含むベクターを構築し得る。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される技術を参照のこと。
【００９８】
プロモーター領域は、いずれの所望の遺伝子からも、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択的マーカーを有する他のベクターを用いて、選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特別に名前のついた細菌のプロモーターとしては、ｌａｃＩ，ｌａｃＺ，Ｔ３，Ｔ７，ｇｐｔ，ｌａｍｄａ  Ｐおよびｔｒｃが挙げられる。真核生物のプロモーターは、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ＳＶ４０初期およびＳＶ４０後期の、レトロウイルス由来のＬＴＲおよびマウスのメタロチオネインＩを含む。
【００９９】
概して、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指向する高率発現される遺伝子に由来するプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖酵素、ａ−因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。本発明のポリヌクレオチドは、翻訳開始配列および翻訳終止配列と適切な相でアセンブルされ、ならびに好ましくは、翻訳されたタンパク質の分泌を、ペリプラズム空間または細胞外培地に指向させ得るリーダー配列とアセンブルされる。必要に応じて、本発明のポリヌクレオチドは、所望の特徴（例えば、発現される組換え産物の安定化または単純化された精製）を付与するＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【０１００】
細菌にとって有用な発現ベクターは、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと一緒に本発明のポリヌクレオチドを、必要に応じて、機能プロモーターと作動可能な読み枠をにおいて挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持を保証するために、そして、所望の場合、宿主内の増幅を提供するために、１以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。形質転換に適切な原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種を含むが、他もまた、選択の問題があるが、使用され得る。
【０１０１】
代表的なしかし非制限的な実施例として、細菌にとって有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝エレメントを含有する市販のプラスミドに由来する、選択マーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。そのような、市販のベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」部位は、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と組み合わせられる。
【０１０２】
本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供し、ここで、核酸は、公知の形質転換、トランスフェクションまたは感染の方法を用いて、宿主細胞に導入されている。宿主細胞は、高等真核生物の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）、下等真核細胞の宿主細胞（例えば、酵母細胞）であり得、または宿主細胞は、原核生物の細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。組換え構築物の宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介のトランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって行われ得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【０１０３】
いずれの宿主／ベクター系も、本発明の１つ以上の標的因子を同定するために使用され得る。これらは、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ−１細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳｆ９細胞などの真核生物宿主、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの原核生物宿主を含むが、これらに限定されない。最も好ましい細胞は、特定のレポーターポリペプチドまたはタンパク質を通常発現しない細胞、または、低い天然のレベルで、レポーターポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞である。
【０１０４】
本発明の宿主はまた、酵母または他の真菌であり得る。酵母では、構成性または誘導性のプロモーターを含む多数のベクターが、使用され得る。概説について、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈ．１３（１９８８）；Ｇｒａｎｔら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５３：５１６−５４４（１９８７）；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第ＩＩ版、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３（１９８６）；Ｂｉｔｔｅｒ，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ編、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５２：６７３−６８４（１９８７）；およびＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（１９８２）を参照のこと。
【０１０５】
本発明の宿主はまた、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、他の腸内細菌科（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｅｓｃａｎｓ、バチルス属、種々のシュードモナス属）、または形質転換され得、トランスフェクトされ得、感染され得る等（すなわち、核酸を宿主細胞に導入する方法が存在する）の他の原核生物であり得る。
【０１０６】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。例えば、そのような宿主細胞は、公知の形質転換、トランスフェクションまたは感染法を用いて、宿主細胞に導入される本発明の核酸を含み得る。本発明はなおさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された宿主細胞を提供し、ここで、そのようなポリヌクレオチドは、細胞中のポリヌクレオチドの発現を駆動する宿主細胞にとって、異種の調節配列に、作動可能に連結される。
【０１０７】
宿主細胞は、高等真核生物の宿主細胞（例えば、哺乳動物）、下等真核生物の宿主細胞（例えば、酵母細胞）であり得、または宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。
【０１０８】
組換え構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介のトランスフェクション、またはエレクトロポレ−ションによって行なわれ得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。本発明のポリヌクレオチドの１つを含む宿主細胞は、単離されたフラグメントによってコードされた遺伝子産物を生成する慣習的な方法で使用され得（ＯＲＦの場合）、また、ＥＭＦの制御下で、異質なタンパク質を生成するために使用され得る。
【０１０９】
いずれの宿主／ベクター系も、本発明の１つ以上のＯＲＦを発現するのに使用され得る。これらは、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ−１細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳｆ９細胞などの真核生物宿主、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの原核生物宿主を含むが、これらに限定されない。最も好ましい細胞は、特定のポリペプチドまたはタンパク質を通常発現しない細胞、または、低い天然レベルで、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞である。成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物の細胞、酵母、細菌、または他の細胞で発現され得る。無細胞翻訳系はまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてそのようなタンパク質を生成するために使用され得る。原核生物および真核生物の宿主と一緒に用いるのに適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｅｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）によって記載されており、その開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０１１０】
種々の哺乳動物細胞培養系はまた、組換えタンパク質を発現するのに使用され得る。哺乳動物の発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５（１９８１）によって記載される、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株が挙げられ、そして適合性のベクター（例えば、Ｃ１２７，３Ｔ３，ＣＨＯ，ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株）を発現し得る他の細胞株を含む。哺乳動物の発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターならびにまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシング供与部位および受容部位、転写終結配列、および５’に隣接した非翻訳配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０起源、初期のプロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位）は、要求された非転写の遺伝エレメントを提供するために使用され得る。細菌培養物中に生成される組換えポリペプチドおよびタンパク質は、通常細胞ペレットの最初の抽出、続いて１つ以上の塩析水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーの工程がによって単離される。タンパク質の再折りたたみ工程は、成熟タンパク質の構造を完成する際に、必要に応じて、使用され得る。最後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、最終の精製工程のために使用され得る。タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、任意の簡便な方法によって破砕され得、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を含む。
【０１１１】
多数の型の細胞は、タンパク質の発現に適した宿主細胞として作用し得る。哺乳動物の宿主細胞としては、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換した霊長類細胞系統、通常の二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養に由来する細胞系統、初代移植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａｋまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。
【０１１２】
あるいは、下等な真核生物（例えば、酵母）、または、原核生物（例えば、細菌）でタンパク質を生成することが可能であり得る。潜在的に適した酵母株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ、または異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株を含む。潜在的に適した細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種タンパク質を発現し得るいずれかの細菌株を含む。タンパク質が、酵母または細菌で生成される場合、機能的なタンパク質を獲得するために、例えば適切な部位のリン酸化およびグリコシル化によって、そこで生成されるタンパク質を改変することが必要であり得る。そのような共有結合は、公知の化学法または酵素法を用いて達成され得る。
【０１１３】
本発明の別の実施形態では、細胞および組織は、誘導性調節因子の制御下で、本発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように操作され得、その場合に、内因性遺伝子の調節配列は、相同組換えによって置き換えられ得る。本明細書中に記載されているように、遺伝子の標的化は、遺伝子の存在する調節領域を、異なった遺伝子より単離した調節配列、または遺伝子操作法によって合成された新規の調節配列と置き換えるために使用され得る。そのような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、骨格結合領域、負調節因子、転写開始部位、調節タンパク質結合部位または上記配列の組み合わせを含有し得る。あるいは、構造、ＲＮＡの安定性または生成されるタンパク質に影響を与える配列は標的化によって置き換えられ得、除去され得、付加され得、または他の様式で改変され得る（ポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安定化エレメント、スプライシング部位、タンパク質の輸送または分泌特性を増幅しまたは改変するためのリーダー配列、またはタンパク質もしくはＲＮＡ分子の機能または安定性を変化もしくは改善する他の配列を含む）。
【０１１４】
標的化事象は、調節配列の単純な挿入であり得、その遺伝子を新しい調節配列の制御下に配置することであり得る（例えば、遺伝子の上流に新しいプロモーターもしくはエンハンサーまたは両方を挿入すること）。あるいは、標的化事象は、単純に調節因子を欠失させることであり得る（例えば、組織特異的負調節因子の欠失）。あるいは、標的化事象は、既存エレメントを置き換え得る；例えば、組織特異的エンハンサーは、天然に存在するエレメントよりも広いかまたは異なった細胞型特異性を有するエンハンサーによって置き換えられ得る。ここでは、この天然に存在する配列は、欠失され、そして新しい配列が付加される。全ての場合で、標的ＤＮＡと隣接する一つ以上の選択マーカー遺伝子の使用によって、標的化事象の同定が容易になり、外因性ＤＮＡが宿主細胞ゲノムに組み込まれた細胞の選択を可能となる。標的化事象の同定はまた、負選択の特性を示す一つ以上のマーカー遺伝子の使用によって、容易になり得、その結果負の選択マーカーは外因性ＤＮＡに連結するが、その負選択マーカーが標的配列に隣接するように構造をとり、そして宿主細胞ゲノム中の配列との正確な相同組換え事象は、負選択マーカーの安定した統合を生じない。この目的に有用なマーカーは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子または細菌のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を含む。
【０１１５】
本発明のこの側面に従って使用され得る、遺伝子標的または遺伝子活性化技術は、さらに特に、Ｃｈａｐｐｅｌの米国特許第５，２７２，０７１号、Ｓｈｅｒｗｉｎらの米国特許第５，５７８，４６１号；Ｓｅｌｄｅｎらによる国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７（ＷＯ９３／０９２２２）；Ｓｋｏｕｌｔｃｈｉらによる国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６４３６（ＷＯ９１／０６６６７）に記載されており、それらのそれぞれが、その全てが、本明細書中に参考として援用される。
【０１１６】
概して、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびに所望の抗体を生成し得るハイブリドーマの調製技術は、当業者に周知である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｍ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４）；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１−２１（１９９０）；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））、ｔｈｅ  ｔｒｉｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６頁）。
【０１１７】
免疫化の方法は、当業者に周知である。そのような方法は、本ペプチドの皮下および腹腔内の注射を含む。当業者は、免疫化に用いられる本発明のレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の量が免疫化される動物、ペプチドの抗原性および注射部位に基づいて変動することを認識する。
【０１１８】
免疫原として使用される、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質の抗原性を増加させるために、改変されまたはアジュバント中で投与され得る。ポリペプチドまたはタンパク質の抗原性を増加させる方法は、当該分野で周知であり、抗原を異種のタンパク質（例えば、グロブリンまたはβガラクトシダーゼ）と結合させること、または免疫化の間にアジュバントを含ませることを包含するが、それに限定されない。
【０１１９】
モノクローナル抗体について、免疫化した動物より脾臓細胞を取り出し、骨髄腫細胞（例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞）と融合させ、そしてハイブリドーマ細胞を生成するモノクローナル抗体とさせる。
【０１２０】
当業者に周知の多数の方法のいずれも、所望の特徴を有する抗体を生成するハイブリドーマ細胞を同定するために使用され得る。これらは、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、または放射性免疫アッセイを用いたハイブリドーマのスクリーニングを含む（Ｌｕｔｚら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１７５：１０９−１２４（１９８８））。
【０１２１】
所望の抗体を分泌するハイブリドーマは、当業者に公知の手順（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｍ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４））を用いて、クローニングされ、クラスおよびサブクラスが決定される。
【０１２２】
ポリクローナル抗体については、上記の手順の１つを使用して、抗血清を含む抗体を、免疫化された抗体から単離し、そして所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングする。
【０１２３】
本発明はさらに、検出可能に標識した形態で、上記記載の抗体を提供する。抗体は、放射性同位体、アフィニティー標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣまたはローダミンなど）、常磁性原子などの使用を通して検出可能に標識され得る。そのような標識を行なう手順は、当業者に周知であり、例えば（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ＣｙｔｏＣｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））を参照のこと。
【０１２４】
本発明の標識された抗体は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質が発現される細胞や組織を同定するためのインビトロ、インビボ、およびインサイチュのアッセイに使用され得る。
【０１２５】
本発明はさらに、固体支持体に固定された上記記載の抗体を提供する。そのような固体支持体の例は、ポリカルボネートのようなプラスチック、アガロースおよびセファロースのような複合炭水化物、ポリアクリルアミドなどのアクリル樹脂およびラテックスビーズを含む。抗体をそのような固体支持体に結合させる技術は、当該分野において周知である（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．ら、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第４版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，第１０章（１９８６）；Ｊａｃｏｂｙ，Ｗ．Ｄ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７４））。本発明の固定された抗体は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質を発現する宿主細胞の免疫アフィニティー精製のために使用され得る。
【０１２６】
宿主細胞は、上記ベクターでトランスフェクトされ、または好ましくは、感染され、または形質転換され、そしてそのベクターを含む形質導入体または形質転換体を選択するのに適切な栄養培地で培養される。
【０１２７】
本発明のポリペプチドまたはタンパク質を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一般的なアプローチによって同定され得る；（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーション；（ｂ）遺伝子機能の存在または非存在；（ｃ）宿主細胞中のｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写レベルの評価；および（ｄ）免疫アッセイまたはその遺伝子産物の生物学的活性によって測定される遺伝子産物の検出。
【０１２８】
第１のアプローチでは、ベクター中に挿入された本発明のポリペプチドまたはタンパク質の存在は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質にそれぞれ相同なヌクレオチド配列、または、その一部またはその誘導体を含有するプローブを使用する、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって検出され得る。
【０１２９】
第２のアプローチでは、組換え発現ベクター／宿主系は、ある「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在に基づいて、同定および選択され得る（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メトトレキサートに対する抵抗性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉鎖体の形成など）。例えば、本発明のポリペプチドまたはタンパク質が、そのベクターのマーカー遺伝子配列の中に挿入される場合、本発明のポリペプチドまたはタンパク質を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在によって同定され得る。あるいは、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の発現を制御するのに使用されるのと同じまたは異なったプロモーターの制御下で、マーカー遺伝子が本発明のポリペプチドまたはタンパク質と縦列して配置され得る。誘導または選択に応答したマーカーの発現は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の発現を示す。
【０１３０】
第３のアプローチでは、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の転写活性は、ハイブリダイゼーションアッセイによって評価され得る。例えば、ＲＮＡは単離され得、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質、または特定のその一部に相同なプローブを使用するノーザンブロットによって分析され得る。あるいは、宿主細胞の全核酸を抽出し得、そのようなプローブに対するハイブリダイゼーションについてアッセイし得る。
【０１３１】
第４のアプローチでは、本発明のポリペプチドまたはタンパク質からの産物の発現は、免疫学的に（例えば、ウエスタンブロット、放射性免疫沈降などの免疫アッセイ、酵素連結免疫アッセイなどによって）評価され得る。
【０１３２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリヌクレオチドに実質上等価なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明によるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、より代表的には少なくとも約９０％、そしてさらにより代表的には少なくとも約９５％の配列同一性を有し得る。本発明はまた、上記に示されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、より代表的には少なくとも約９０％、そしてさらにより代表的には少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補体を提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、増幅の、または合成の）またはＲＮＡであり得る。そのようなポリヌクレオチドを獲得するための方法およびアルゴリズムは、当業者に周知であって、そして例えば、所望の配列同一性のポリヌクレオチドを慣用的に単離し得るハイブリダイゼーション条件を決定する方法を含み得る。
【０１３３】
本発明によるポリヌクレオチドは、十分に確立された組換えＤＮＡ技術によって、種々の他のヌクレオチド配列のいずれかに結合され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８９）Ｍｅｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹを参照のこと）。ポリペプチドに接合するための有用なヌクレオチド配列は、当該分野において周知のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ラムダファージ誘導体、ファージミドなど）の集合を含む。従って、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよびポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。概して、ベクターは、少なくとも１つの生物で機能的な複製の起点、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および宿主細胞についての選択マーカーを含む。本発明によるベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターを含む。本発明による宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞であり得、そして単細胞生物または多細胞生物の一部であり得る。
【０１３４】
本発明の範囲内に分類される配列は、本明細書中に記載される特異的配列には制限されず、また、その代表的なフラグメント、または、本発明の核酸に少なくとも９９．９％同一な核酸配列を含む。さらに、コドンの変異性を収容するために、本発明は、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸分子を含む。言い換えると、本発明のポリペプチド配列のコード領域では、あるコドンと同じアミノ酸をコードする別のコドンとの置換が、明示的に企図される。本明細書中で開示されるいずれの特異的配列も、両方向で特異的フラグメント（例えば、ＯＲＦ）を再配列決定する（すなわち、両鎖を配列決定する）ことによって、誤りを簡単にスクリーニングし得る。
【０１３５】
本発明はさらに、本発明の核酸、またはそのフラグメントを含有する、組換え構築物を提供する。本発明の組換え構築物は、ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を包含し、そのベクターまたはそのフラグメントには本発明の核酸が正方向または逆方向に挿入されている。本発明のＯＲＦの１つを含有するベクターの場合には、そのベクターはさらに、ＯＲＦに作動可能に連結される調節配列（例えば、プロモーターを含む）を含有し得る。本発明のＥＭＦおよびＵＭＦを含有するベクターについて、ベクターはさらに、マーカー配列またはＥＭＦまたはＵＭＦに作動可能に連結される異種ＯＲＦを含有し得る。大多数の適切なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、そして本発明の組換え構築物を生成するために市販されている。以下のベクターが、例として提供される。細菌のベクター：ｐＢｓ，ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ，ＰｓｉＸ１７４，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ，ｐＢｓ  ＫＳ，ｐＮＨ８ａ，ｐＮＨ１６ａ，ｐＮＨ１８ａ，ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐＫＫ２３３−３，ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核細胞のベクター：ｐＷＬｎｅｏ，ｐＳＶ２ｃａｔ，ｐＯＧ４４，ＰＸＴＩ，ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３，ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧ，ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【０１３６】
本発明の単離された（る）ポリヌクレオチドは、タンパク質またはポリペプチドを組換えて生成するために、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４４８５−４４９０（１９９１）で開示されているｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターなどの発現制御配列に作動可能に連結され得る。多くの適切な発現制御配列が、当該分野において公知である。組換えタンパク質の一般的な発現方法もまた公知であり、Ｒ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，５３７−５６６（１９９０）に例証されている。本明細書に定義されているように、「作動可能に連結される」は、タンパク質またはポリペプチドが、連結されるポリヌクレオチド／発現制御配列で形質転換された（トランスフェクトされた）宿主細胞によって発現されるように、本発明の単離されたポリヌクレオチドおよび発現制御配列が、ベクターまたは細胞内に位置することを意味する。
【０１３７】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特に有名な細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰRおよびｔｒｃが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期のＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲおよびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、充分に当業者のレベル内である。一般的に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＲＰ１遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指向するための、高度に発現される遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、とりわけ、解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ａ因子、酸性ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列と、そして好ましくは、翻訳されたタンパク質またはポリペプチドの、細胞周辺腔または細胞外培地への分泌を指向し得るリーダー配列と、適切な相で組み立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または単純化された精製）を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌での使用のために有用な発現ベクターは、所望のタンパク質またはポリペプチドを適切な翻訳開始および終結シグナルと一緒にコードする構造的ＤＮＡ配列を、機能的プロモーターと作動可能な読み取り相に挿入することによって構築される。このベクターは、１以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含んで、このベクターの維持を確実にし、そして所望の場合、宿主内での増幅を提供する。形質転換のために適切な原核生物宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの属内の種々の種が挙げられるが、他のものもまた、選択対象として用いられ得る。
【０１３８】
代表的な、しかし非限定的な例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌複製起点を含み得る。このような商業的ベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「骨格」セクションは、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と合わされる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度へのこの宿主株の増殖後、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）によって誘導または抑制解除され、そして細胞は、さらなる期間培養される。細胞は代表的に、遠心分離によって収集され、物理的手段または化学的手段によって破砕され、そして得られる粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
【０１３９】
本発明の核酸配列の範囲内に含まれるのは、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドに対してハイブリダイズする核酸配列であり、このポリヌクレオチドは、約１０ｂｐより大きく、好ましくは２０〜５０ｂｐ、そして１００ｂｐより大きくさえある。本発明に従って、本発明のポリヌクレオチド配列またはその機能的等価物を用いて、適切な宿主細胞内でのそのポリヌクレオチドまたはその機能的等価物の発現を指向する組換えＤＮＡ分子を作製し得る。
【０１４０】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の改変体をコードする配列に対してさらに指向される。これらのアミノ酸配列改変体は、ネイティブのまたは改変体のポリヌクレオチドに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、当該分野で公知の方法によって調製され得る。アミノ酸配列改変体の構築において２つの変数が存在する：変異の位置および変異の性質。この核酸のアミノ酸配列改変体は好ましくは、ポリヌクレオチドを変異させて、天然では生じないアミノ酸配列を得ることによって構築される。これらのアミノ酸の変化は、異なる種とは核酸が異なる部位（可変位置）で、または高度に保存された領域（定常領域）において行われ得る。このような位置での部位は代表的に、例えば、保存的な選択で（例えば、疎水性アミノ酸から異なる疎水性アミノ酸へと）最初に置換し、次いで、さらに遠い選択で（例えば、疎水性アミノ酸から荷電アミノ酸へと）置換することによって連続して改変され、次いで、欠失または挿入が標的部位で行われ得る。アミノ酸配列の欠失は一般的に、約１残基〜３０残基、好ましくは約１残基〜１０残基の範囲に及び、そして代表的には連続している。アミノ酸の挿入としては、長さが１〜１００以上の残基の範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに１または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。配列内挿入は、一般的に約１アミノ残基〜１０アミノ残基、好ましくは１残基〜５残基の範囲に及び得る。末端挿入物の例としては、分泌または異なる宿主細胞における細胞内標的化のために必要な異種シグナル配列が挙げられる。
【０１４１】
アミノ酸配列の欠失は一般的に約１残基〜３０残基、好ましくは約１残基〜１０残基の範囲に及び、そして代表的には連続している。アミノ酸挿入としては、１〜１００以上の残基の範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに１または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。配列内挿入は一般的に約１アミノ残基〜１０アミノ残基、好ましくは１残基〜５残基の範囲に及び得る。末端挿入物の例としては、分泌または異なる宿主細胞における細胞内標的化のために必要な異種シグナル配列が挙げられる。
【０１４２】
ＰＣＲをまた用いて、本発明のポリヌクレオチドのアミノ酸配列改変体を作製し得る。少量のテンプレートＤＮＡを出発材料として用いる場合、テンプレートＤＮＡ中の対応する領域とは配列がわずかに異なるプライマーは、所望のアミノ酸改変体を作製し得る。ＰＣＲ増幅は、そのプライマーによって指定される位置でポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドテンプレートとは異なる産物ＤＮＡフラグメントの集団を生じる。産物ＤＮＡフラグメントは、プラスミド内の対応する領域を置換し、そしてこれは、所望のアミノ酸改変体を与える。
【０１４３】
好ましい方法では、本発明のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異誘発によって変更される。この方法は、所望のアミノ酸改変体のポリヌクレオチド配列、ならびに変更されたアミノ酸の両側の充分な隣接するヌクレオチドをコードするオリゴヌクレオチド配列を用いて、変更される部位のいずれかの側に安定な二重鎖を形成する。一般に、部位特異的変異誘発の技術は、当業者に周知であり、そしてこの技術は、刊行物（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ  ２：１８３（１９８３））によって例示される。部位特異的変化をポリヌクレオチド配列において生成するための用途が広くかつ効率的な方法は、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）によって刊行された。ＰＣＲをまた用いて、新規な核酸のアミノ酸配列改変体を作製し得る。少量のテンプレートＤＮＡを出発材料として用いる場合、テンプレートＤＮＡ中の対応する領域とは配列がわずかに異なるプライマーは、所望のアミノ酸改変体を作製し得る。ＰＣＲ増幅は、そのプライマーによって指定される位置でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドテンプレートとは異なる産物ＤＮＡフラグメントの集団を生じる。産物ＤＮＡフラグメントは、プラスミド内の対応する領域を置換し、そしてこれは、所望のアミノ酸改変体を与える。
【０１４４】
アミノ酸改変体を作製するためのさらなる技術は、Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（１９８５）に記載されるカセット変異誘発技術；および当該分野で周知の他の変異誘発技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌらにおける技術など）である。遺伝暗号の固有の縮重に起因して、実質的に同じかまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列は、これらの新規な核酸のクローニングおよび発現のために本発明の実施において用いられ得る。このようなＤＮＡ配列としては、ストリンジェントな条件下で適切な新規な核酸配列にハイブリダイズし得るＤＮＡ配列が挙げられる。
【０１４５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドまたはタンパク質の、生物学的活性を示し得るフラグメントもまた、本発明によって包含される。タンパク質またはポリペプチドのフラグメントは直鎖状形態であり得るか、またはこれらは、例えば、Ｈ．Ｕ．Ｓａｒａｇｏｖｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、７７３−７７８（１９９２）およびＲ．Ｓ．ＭｃＤｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４、９２４５−９２５３（１９９２）（これらは両方とも、本明細書中に参考として援用される）に記載されるような公知の方法を用いて環状化され得る。
【０１４６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の全長形態および成熟形態の両方を提供する。このようなポリペプチドまたはタンパク質の全長形態は、本発明の各々のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の翻訳によって同定され得る。このようなポリペプチドまたはタンパク質の成熟形態は、適切な哺乳動物細胞または他の宿主細胞における全長ポリヌクレオチドの発現によって入手され得る。ポリペプチドまたはタンパク質の成熟形態の配列はまた、全長形態のアミノ酸配列から決定され得る。
【０１４７】
本発明のタンパク質またはポリペプチドが膜結合型である（例えば、レセプターである）場合、本発明はまた、可溶性形態のこのようなタンパク質またはポリペプチドを提供する。このような形態において、タンパク質またはポリペプチドの細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインの一部または全ては、タンパク質またはポリペプチドが、これを発現する細胞から充分に分泌されるように欠失される。本発明のタンパク質またはポリペプチドの細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインは、配列情報からのこのようなドメインの決定のための公知の技術に従って同定され得る。
【０１４８】
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはタンパク質を産生するための方法に関し、この方法は、本発明の細胞の培養物を適切な培養培地中で増殖させる工程、および本発明のタンパク質またはポリペプチドをこの培養物から精製する工程を含む。例えば、本発明の方法は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質を産生するためのプロセスを含み、このプロセスでは、本発明のポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む適切な発現ベクターを含む宿主細胞が、コードされるポリペプチドまたはタンパク質の発現を可能にする条件下で培養される。このポリペプチドまたはタンパク質は、この培養物から（便利には、培養培地から）回収され得、そしてさらに精製され得る。
【０１４９】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列に実質的に等価であるアミノ酸配列を含む、本発明のポリペプチドまたはタンパク質を提供する。本発明によるポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも約９５％の、そしてより代表的には少なくとも約９８％の配列同一性を、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列に対して有し得る。
【０１５０】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｃｕｅｌｔｉｄｅ）によってまたは本発明のポリヌクレオチドの縮重改変体によってコードされる、単離されたポリペプチドまたはタンパク質を提供する。「縮重改変体」によって、本発明の核酸フラグメント（例えば、ＯＲＦ）とは、ヌクレオチド配列が異なるが、遺伝暗号の縮重に起因して同一のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドが意図される。本発明の好ましいポリヌクレオチドは、タンパク質またはポリペプチドをコードするＯＲＦである。当該分野で公知の種々の方法論を利用して、本発明の単離されたポリペプチドまたはタンパク質のうちの任意の１つを入手し得る。最も単純なレベルで、このアミノ酸配列は、市販のペプチド合成機を用いて合成され得る。このことは、小さなペプチドおよびより大きなポリペプチドのフラグメントを産生する際に特に有用である。フラグメントは、例えば、ネイティブなポリペプチドに対する抗体を作製する際に有用である。代替的な方法では、このポリペプチドまたはタンパク質は、このポリペプチドまたはタンパク質を天然で産生する細菌細胞から精製される。当業者は、本発明の単離されたポリペプチドまたはタンパク質のうちの１つを得るために、ポリペプチドおよびタンパク質を単離するための公知の方法に容易に従い得る。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：イムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティークロマトグラフィー。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと。
【０１５１】
あるいは、本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように変更された細胞から精製され得る。本明細書中で用いられる場合、遺伝子操作を通して、細胞が、通常は産生しないかまたはその細胞が通常はより低いレベルで産生するポリペプチドまたはタンパク質を産生するようにされた場合、その細胞は、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように変更されたといわれる。当業者は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質のうちの１つを産生する細胞を作製するために、組換え配列または合成配列のいずれかを真核生物細胞または原核生物細胞中に導入して発現させるための手順を容易に適応させ得る。精製されたポリペプチドまたはタンパク質は、当該分野で周知であるインビトロ結合アッセイにおいて用いられて、そのポリペプチドまたはタンパク質に結合する分子を同定し得る。これらの分子としては、例えば、低分子、コンビナトリアルライブラリー由来の分子、抗体または他のタンパク質もしくはポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。次いで、結合アッセイにおいて同定された分子は、インビボでの組織培養物または当該分野で周知である動物モデルにおいてアンタゴニスト活性またはアゴニスト活性について試験される。手短には、これらの分子は、複数の細胞培養物または動物中で力価測定され、次いで、細胞／動物の死または動物／細胞の長期化した生存のいずれかについて試験される。
【０１５２】
さらに、結合分子は、毒素（例えば、リシンまたはコレラ）と、または細胞に対して中毒性である他の化合物と複合体化し得る。次いで、毒素結合分子複合体は、その結合分子の特異性によって、腫瘍または他の細胞へと標的化される。
【０１５３】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、本発明のタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、体細胞性細胞または生殖細胞によって特徴付けられる、トランスジェニック動物の産物として（例えば、トランスジェニックなウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジの乳汁の成分として）発現され得る。
【０１５４】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、公知の従来の化学的合成によって産生され得る。合成手段によって本発明のタンパク質またはポリペプチドを構築するための方法は、当業者に公知である。合成によって構築されるタンパク質またはポリペプチドは、一次構造、二次構造もしくは三次構造および／またはコンホメーションの特徴をタンパク質またはポリペプチドと共有することによって、タンパク質活性を含む、それと共通の生物学的特性を保有し得る。従って、これらは、治療化合物のスクリーニングにおいて、および抗体の開発のための免疫学的プロセスにおいて、本発明の天然の精製されたタンパク質またはポリペプチドについての生物学的に活性なまたは免疫学的な置換物として用いられ得る。
【０１５５】
本明細書中に提供される本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、本発明の精製されたタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と類似した、しかし、その中に、改変が天然で提供されているかまたは故意に操作されているアミノ酸配列によって特徴付けられる、タンパク質またはポリペプチドを含む。例えば、ペプチド配列またはＤＮＡ配列における改変は、公知の技術を用いて当業者によって作製され得る。タンパク質配列における目的の改変は、コード配列における選択されたアミノ酸残基の変更、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｉｏｎ）、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、挿入または欠失を含み得る。例えば、１以上のシステイン残基は、別のアミノ酸で欠失または置換されて、この分子のコンホメーションを変更し得る。このような変更、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、挿入または欠失のための技術は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号を参照のこと）。好ましくは、このような変更、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、挿入または欠失は、タンパク質またはポリペプチドの所望の活性を保持する。
【０１５６】
全体または一部のタンパク質活性を保持する、従って、スクリーニングまたは他の免疫学的方法論に有用であり得ることが期待される、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の他のフラグメントおよび誘導体はまた、本明細書中の開示を考慮すれば、当業者によって容易に作製され得る。このような改変は、本発明によって包含される。
【０１５７】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、本発明のポリヌクレオチドを１以上の昆虫発現ベクター中の適切な制御配列に作動可能に連結し、そして昆虫発現系を用いることによって産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系についての材料および方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．からキットの形態（ＭａｘＢａｔ．ＲＴＭ．キット）で市販され、そしてこのような方法は、本明細書中に参考として援用される、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されるように、当該分野で周知である。本明細書中で使用される場合、本発明のポリヌクレオチドを発現し得る昆虫細胞は、「形質転換されている」。
【０１５８】
本発明のタンパク質またはポリペプチドは、形質転換された宿主細胞を、組換えタンパク質または組換えポリペプチドを発現するに適切な培養条件下で培養することによって調製され得る。次いで、得られる発現されたタンパク質またはポリペプチドは、このような培養物から（すなわち、培養培地または細胞抽出物から）、公知の精製プロセス（例えば、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィー）を用いて精製され得る。タンパク質またはポリペプチドの精製はまた、このタンパク質もしくはポリペプチドに結合する因子を含むアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ．ＲＴＭ．もしくはＣｉｂａｃｒｏｍ  ｂｌｕｅ  ３ＧＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ．ＲＴＭ．のような親和性樹脂での１以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテルもしくはプロピルエーテルのような樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１以上の工程；またはイムノアフィニティークロマトグラフィーを含み得る。
【０１５９】
あるいは、本発明のタンパク質またはポリペプチはまた、精製を容易にする形態で発現され得る。例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチは、融合タンパク質（例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）の融合タンパク質）として発現され得る。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）およびＩｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎからそれぞれ市販される。タンパク質またはポリペプチドはまた、エピトープでタグ化され得、続いてこのようなエピトープに対して指向される特異抗体を用いることによって精製され得る。１つのこのようなエピトープ（「Ｆｌａｇ」）は、Ｋｏｄａｋ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎ．）から市販される。
【０１６０】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる１以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて、タンパク質またはポリペプチドをさらに精製し得る。先述の精製工程のいくつかまたは全てはまた、種々の組み合わせで用いられて、実質的に均質な単離された組換えタンパク質またはポリペプチドを提供し得る。このように精製されたタンパク質またはポリペプチドは、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まず、そして「単離されたタンパク質」として本発明に従って定義される。
【０１６１】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、以下で同定される、１以上の用途または生物学的活性（本明細書中に引用されるアッセイに関連したものを含む）を示すことが期待される。本発明のポリペプチドまたはタンパク質について記載される用途または活性は、このようなタンパク質もしくはポリペプチドの投与または使用によって、またはこのようなタンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの（例えば、遺伝子治療またはＤＮＡの導入に適切なベクターなどにおける）投与もしくは使用によって提供され得る。
【０１６２】
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、種々の目的のために研究共同体によって用いられ得る。ポリヌクレオチドは、分析、特徴付け、診断または治療の用途のための組換えタンパク質またはポリペプチドを発現するために；標的タンパク質が（例えば、構成的にまたは組織分化もしくは発生の特定の段階でまたは疾患状態において）異常にまたは正常に発現される組織についてのマーカーとして；サザンゲルでの分子量マーカーとして；染色体を同定するためまたは関連する遺伝子の位置をマッピングするための染色体マーカーまたはタグ（標識される場合）として；潜在的な遺伝障害を同定するための患者における内因性ＤＮＡ配列と比較するために；新規な、関連するＤＮＡ配列にハイブリダイズする、従って、このＤＮＡ配列を発見するためのプローブとして；遺伝的フィンガープリンティングのためのＰＣＲプライマーを誘導するための情報源として；他の新規のポリヌクレオチドを発見するプロセスにおいて公知の配列を「差引き」するためのプローブとして；発現パターンの検査のためを含めて、「遺伝子チップ」または他の支持体へ接着させるオリゴマーを選択および作製するための；タンパク質（標的）発現パターンまたは標的発現レベルもしくは標的の存在を調べるための抗体チップを作製するために基材に付着させるために；そして抗イディオタイプ抗体を惹起する抗原として、用いられ得る。標的タンパク質が別のタンパク質または他の因子に結合するかまたは潜在的に結合する場合、本発明のポリヌクレオチドはまた、相互作用捕捉アッセイ（例えば、Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ  ７５：７９１−８０３（１９９３）に記載されるアッセイなど）において用いられて、結合が生じる他のタンパク質もしくは因子をコードするポリヌクレオチドを同定し得るか、または結合相互作用に関与する他の因子もしくはタンパク質を同定し得る。
【０１６３】
本発明によって提供されるタンパク質またはポリペプチドは、高スループットスクリーニングのための複数のタンパク質またはポリペプチドのパネルにおいて生物学的活性を決定するために；生物学的サンプル中の標的タンパク質のレベルを定量的に決定するように設計されたアッセイにおける試薬（標識された試薬を含む）として；（構成的にまたは組織分化もしくは発生の特定の段階でまたは疾患状態においてのいずれかで）本発明の標的タンパク質が正常にまたは異常に発現される組織についてのマーカーとして；そしてもちろん、相関するレセプターまたはリガンドを同定するために、同様に用いられ得る。標的タンパク質が（例えば、レセプター−リガンド相互作用においてなど）別のタンパク質または因子に結合するかまたは潜在的に結合する場合、本発明のポリペプチドを用いて、結合が生じる他のタンパク質もしくは因子を同定し得るか、または結合相互作用のインヒビターを単離し得る。これらの結合相互作用に関与するタンパク質をまた用いて、結合相互作用のペプチド性もしくは低分子のインヒビターまたはアゴニストについてスクリーニングし得る。
【０１６４】
これらの研究的有用性のいずれかまたは全ては、研究製品としての商品化のために試薬グレードにまたはキット形式に開発され得る。
【０１６５】
上記に列挙した用途を実施するための方法は、当業者に周知である。このような方法を開示する参考文献としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ編、１９８９、ならびに「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓ．Ｌ．およびＡ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ編、１９８７。
【０１６６】
本発明のポリヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチドはまた、栄養源または補充物として用いられ得る。このような用途としては、タンパク質またはポリペプチドまたはアミノ酸の補充物としての用途、炭素源としての用途、窒素源としての用途および炭水化物源としての用途が挙げられるがこれらに限定されない。このような場合、本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、特定の生物の食餌に添加され得るか、または別の固体もしくは液体の調製物として（例えば、散剤、丸剤、液剤、懸濁剤またはカプセル剤の形態で）投与され得る。微生物の場合、本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その中または上で微生物を培養する培地に添加され得る。
【０１６７】
本発明のタンパク質またはポリペプチドは、サイトカイン活性、細胞増殖活性（誘導するかもしくは阻害するかのいずれか）もしくは細胞分化活性（誘導するかもしくは阻害するかのいずれか）を示し得るか、または特定の細胞集団における他のサイトカインの産生を誘導し得るか、または上記のいずれかのアンタゴニストもしくはアゴニストであり得る。本発明のポリヌクレオチドは、このような属性を示すポリペプチドをコードし得る。今日までに発見された多くのタンパク質因子（全ての公知のサイトカインを含む）は、１以上の因子依存性細胞増殖アッセイにおいて活性を示しており、それ故、これらのアッセイは、サイトカインのアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性の便利な確認物として役立つ。本発明のタンパク質またはポリペプチドの活性は、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢ  Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫを含むがこれらに限定されない細胞株についての多数の慣用的な因子依存性細胞増殖アッセイのうちのいずれか１つによって実証される。
【０１６８】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの活性は、他の手段の中でも、以下の方法によって測定され得る：
Ｔ細胞または胸腺細胞の増殖についてのアッセイとしては、以下に記載されるアッセイが挙げられるがこれらに限定されない：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（第３章、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；第７章、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１７０６−１７１２、１９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７−３４１、１９９１；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８−３７８３、１９９２；Ｂｏｗｍａｎら、Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１７５６−１７６１、１９９４。
【０１６９】
サイトカイン産生および／または脾臓細胞、リンパ節細胞もしくは胸腺細胞の増殖についてのアッセイとしては、以下に記載されるアッセイが挙げられるがこれらに限定されない：Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ａ．Ｍ．およびＳｈｅｖａｃｈ、Ｅ．Ｍ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、第１巻、３．１２．１−３．１２．１４頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４；ならびにＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ．ｇａｍｍａ．、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｒ．Ｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、第１巻、６．８．１−６．８．８編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４。
【０１７０】
造血性細胞およびリンパ球産生性細胞の増殖および分化についてのアッセイとしては、以下に記載されるアッセイが挙げられるがこれらに限定されない：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４、Ｂｏｔｔｏｍｌｙ、  Ｋ．、Ｄａｖｉｓ、Ｌ．Ｓ．およびＬｉｐｓｋｙ、Ｐ．Ｅ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、第１巻、６．３．１−６．３．１２頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１；ｄｅＶｒｉｅｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１２０５−１２１１、１９９１；Ｍｏｒｅａｕら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６９０−６９２、１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２９３１−２９３８、１９８３；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６−−Ｎｏｒｄａｎ、Ｒ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、第１巻、６．６．１−６．６．５頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：１８５７−１８６１、１９８６；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １１−−Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｆ．、Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ、Ｊ．、Ｃｌａｒｋ、Ｓ．Ｃ．およびＴｕｒｎｅｒ、Ｋ．Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、第１巻、６．１５．１頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ９−−Ｃｉａｒｌｅｔｔａ、Ａ．、Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ、Ｊ．、Ｃｌａｒｋ、Ｓ．Ｃ．およびＴｕｒｎｅｒ、Ｋ．Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、第１巻、６．１３．１頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１。
【０１７１】
抗原に対するＴ細胞クローン応答についてのアッセイ（とりわけ、増殖およびサイトカイン産生を測定することによる、ＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用ならびに直接的なＴ細胞効果に影響を与えるタンパク質を同定するアッセイ）としては、以下に記載されるアッセイが挙げられるがこれらに限定されない：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（第３章、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ；第６章、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；第７章、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：６０９１−６０９５、１９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１１：４０５−４１１、１９８１；Ｔａｋａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｔａｋａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２、１９８８。
【０１７２】
上記の全てのアッセイでは、本発明のポリペプチドまたはタンパク質はアッセイ系に添加され、そして標的サイトカインの活性が、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の存在下および非存在下において決定される。
【０１７３】
さらに、本発明のポリペプチドを用いて、サイトカインの発現レベルまたは存在を調べ得る。代替的な実施形態では、サイトカインの検出またはサイトカインレベルの検出は、疾患状態または状態についての診断である。
【０１７４】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、免疫刺激活性もしくは免疫抑制活性を示し得るか、またはいずれかの活性（アッセイが本明細書中で記載される活性を含むがこれに限定されない）のアンタゴニストもしくはアゴニストであり得る。本発明のポリヌクレオチドは、このような活性を示す、ポリペプチドまたはタンパク質をコードし得る。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、例えば、Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を調節（アップレギュレートまたはダウンレギュレート）する際の、ならびにＮＫ細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性に影響を与える際の、種々の免疫不全および障害（重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を含む）の処置および／または検出（例えば、診断）において有用であり得る。これらの免疫不全は、遺伝的であり得るか、またはウイルス（例えば、ＨＩＶ）ならびに細菌または真菌の感染によって引き起こされ得るか、または自己免疫障害からもたらされ得る。より詳細には、ウイルス、細菌、真菌または他の感染によって引き起こされる感染性疾患は、本発明のタンパク質またはポリペプチドを用いて処置可能または検出可能であり得る（例えば、診断試験）。このような感染としては、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、マイコバクテリア、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．、ｍａｌａｒｉａ  ｓｐｐ．による感染および種々の真菌感染（例えば、カンジダ症）が挙げられる。当然、これに関して、本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、免疫系に対するブーストが一般的に所望され得る場合（すなわち、癌の処置において）、有用であり得る。
【０１７５】
本発明のタンパク質またはポリペプチドを用いて処置または検出され得る自己免疫障害としては、例えば、以下が挙げられる：結合組織疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、自己免疫性肺性炎症、ギヤン−バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、対宿主性移植片病および自己免疫性炎症性眼疾患。本発明のこのようなタンパク質またはポリペプチドはまた、アレルギー反応およびアレルギー状態（例えば、喘息（特に、アレルギー性喘息））または他の呼吸器の問題の処置において有用であり得る。免疫抑制が所望される他の状態（例えば、器官移植を含む）はまた、本発明のタンパク質またはポリペプチドを用いて処置可能であり得る。
【０１７６】
本発明のタンパク質またはポリペプチドを用いて、多数の方法で、免疫応答を調節することもまた可能であり得る。ダウンレギュレーションは、既に進行した免疫応答の阻害もしくはブロックの形態であり得るか、または免疫応答の誘導の予防を含み得る。活性化されたＴ細胞の機能は、Ｔ細胞応答を抑制することによって、もしくはＴ細胞中に特異的寛容を誘導することによって、または両方によって阻害され得る。Ｔ細胞応答の免疫抑制は一般的に、抑制性因子へのＴ細胞の連続曝露を必要とする、活性な、非抗原特異的なプロセスである。寛容は、Ｔ細胞における非応答性またはアネルギーを誘導することを含み、一般的に、抗原特異的であってかつ寛容化因子への曝露がやめられた後も持続するという点で、免疫抑制とは区別される。操作的に、寛容は、寛容化因子の非存在下での特異的抗原に対する再曝露の際のＴ細胞応答の欠如によって実証され得る。
【０１７７】
１以上の抗原機能（Ｂリンパ球抗原機能（例えば、Ｂ７など）を含むがこれに限定されない）をダウンレギュレートまたは妨げること（例えば、活性化されたＴ細胞による高レベルのリンホカイン合成を妨げること）は、組織、皮膚および器官の移植の状況において、ならびに対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）において有用である。例えば、Ｔ細胞機能の遮断は、組織移植における組織破壊の減少をもたらすべきである。代表的に、組織移植では、移植片の拒絶は、Ｔ細胞による異物としてのその認識を通して開始され、これには、移植片を破壊する免疫反応が続く。Ｂ７リンパ球抗原と免疫細胞上のその天然のリガンドとの相互作用を阻害またはブロックする分子の、移植前における投与（例えば、Ｂ７−２活性を有する可溶性のモノマー形態のペプチドの、単独での、または別のＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−３）の活性を有するかまたは抗体をブロックするモノマー形態のペプチドと組み合わせた投与）は、対応する補助刺激シグナルを伝達することなく、免疫細胞上の天然のリガンドに対する分子の結合をもたらし得る。この問題においてＢリンパ球抗原機能をブロックすることは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）によるサイトカイン合成を妨げ、従って、免疫抑制剤として作用する。さらに、補助刺激の欠如はまた、Ｔ細胞をアネルギー化（ａｎｅｒｇｉｚｅ）するに十分であり得、それによって被験体において寛容を誘導する。Ｂリンパ球抗原ブロック試薬による長期寛容の誘導は、これらのブロッキング試薬の反復投与の必要性を回避し得る。充分な免疫抑制または寛容を被験体において達成するために、Ｂリンパ球抗原の組み合わせの機能をブロックすることもまた必要であり得る。
【０１７８】
器官移植拒絶またはＧＶＨＤを予防する際の特定のブロッキング試薬の効力は、ヒトにおける効力を予測する動物モデルを用いて評価され得る。用いられ得る適切な系の例としては、ラットにおける同種異系心臓移植片およびマウスにおける異種膵島細胞移植片が挙げられ、これらは両方とも、Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：７８９−７９２（１９９２）およびＴｕｒｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９：１１１０２−１１１０５（１９９２）において記載されるように、ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質のインビボでの免疫抑制効果を調べるために用いられている。さらに、ＧＶＨＤのマウスモデル（Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９、８４６−８４７頁を参照のこと）を用いて、その疾患の発症に対する、Ｂリンパ球抗原機能をインビボでブロックすることの効果を決定し得る。さらに、本発明のポリペプチドを用いて、器官移植後にＧＶＨＤを検出し得る。
【０１７９】
抗原機能をブロックすることはまた、自己免疫疾患を処置するために治療的に有用であり得る。多くの自己免疫障害は、自己組織に対して反応性であって、かつこの疾患の病理に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する、Ｔ細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性Ｔ細胞の活性化を妨げることは、疾患症状を低減または除去し得る。Ｂリンパ球抗原のレセプター：リガンド相互作用をなくすことによってＴ細胞の補助刺激をブロックする試薬の投与を用いて、Ｔ細胞活性化を阻害し得、そしてその疾患プロセスに関与し得る自己抗体またはＴ細胞由来サイトカインの産生を妨げ得る。さらに、ブロッキング試薬は、この疾患の長期の軽減をもたらし得る、自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的寛容を誘導し得る。自己免疫障害を予防または軽減する際のブロッキング試薬の効力は、ヒト自己免疫疾患の、多数の充分に特徴付けられた動物モデルを用いて決定され得る。例としては、マウスの実験的自己免疫性脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスもしくはＮＺＢ雑種マウスにおける全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫性コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける糖尿病、ならびにマウスの実験的重症筋無力症が挙げられる（Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９、８４０−８５６を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドを用いて、免疫障害についての生物の免疫障害および／または感受性を診断し得る。
【０１８０】
免疫応答をアップレギュレーションする手段としての抗原機能（好ましくは、Ｂリンパ球抗原機能）のアップレギュレーションもまた、治療において有用であり得る。免疫応答のアップレギュレーションは、既存の免疫応答を増強するかまたは初期免疫応答を惹起する形態であり得る。例えば、Ｂリンパ球の抗原機能を刺激することを通して免疫応答を増強することは、ウイルス感染の場合に有用であり得る。さらに、全身性ウイルス疾患（例えば、インフルエンザ、感冒および脳炎）は、刺激形態のＢリンパ球抗原の全身投与によって緩和され得る。
【０１８１】
あるいは、抗ウイルス免疫応答は、感染患者からＴ細胞を取り出し、このＴ細胞を、ウイルス抗原でパルスした、本発明のペプチドを発現するＡＰＣでまたは刺激形態の本発明の可溶性ペプチドと一緒にかのいずれかでインビトロで補助刺激し、そしてこのインビトロで活性化されたＴ細胞をこの患者に再度導入することによって、この患者中で増強され得る。抗ウイルス免疫応答を増強する別の方法は、感染した細胞を患者から単離し、本明細書中に記載される通りの本発明のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸でこれらをトランスフェクトして、その結果、この細胞にこのタンパク質またはポリペプチドの全てまたは一部をその表面に発現させ、そしてこのトランスフェクトされた細胞をこの患者中に再度導入することである。感染された細胞はここで、補助刺激シグナルをＴ細胞に送達し得、それによってＴ細胞をインビボで活性化し得る。
【０１８２】
腫瘍細胞表面における、Ｂリンパ球抗原の活性を有する本発明のポリペプチドまたはタンパク質の存在は、Ｔ細胞に対する必須の補助刺激シグナルを提供して、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対してＴ細胞媒介性免疫応答を誘導する。さらに、ＭＨＣクラスＩ分子もしくはＭＨＣクラスＩＩ分子を欠損する腫瘍細胞、または十分な量のＭＨＣクラスＩ分子もしくはＭＨＣクラスＩＩ分子を再発現できない腫瘍細胞を、ＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質およびβ2ミクログロブリンタンパク質、またはＭＨＣクラスＩＩ”鎖タンパク質およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖タンパク質のすべてまたは部分（例えば、細胞質ドメイン短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）部分）をコードする核酸でトランスフェクトし、それによって、その細胞表面上でＭＨＣクラスＩタンパク質またはＭＨＣクラスＩＩタンパク質を発現させ得る。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を有するペプチドと組合せた、適切なクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣの発現は、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答を誘導する。必要に応じて、ＭＨＣクラスＩＩ関連タンパク質（例えば、不変鎖）の発現をブロックするアンチセンス構築物をコードする遺伝子もまた、Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡと共に同時トランスフェクトされて、腫瘍関連抗原の提示を促進し得、そして腫瘍特異的免疫を誘導し得る。従って、ヒト被験体におけるＴ細胞媒介性免疫応答の誘導は、被験体における腫瘍特異的寛容を克服するに十分であり得る。
【０１８３】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって測定され得る：
胸腺細胞または脾細胞の細胞傷害性について適切なアッセイとしては、限定されないが、以下に記載されるアッセイが挙げられる：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（第３章，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；第７章，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２４８８−２４９２，１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：１９６８−１９７４，１９８２；Ｈａｎｄａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５６４−１５７２，１９８５；Ｔａｋａｉら，Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２，１９８８；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２４８８−２４９２，１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：１９６８−１９７４，１９８２；Ｈａｎｄａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５６４−１５７２，１９８５；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｂｏｗｍａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１９９２−１９９８；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２，１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７−３４１，１９９１；Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３０７９−３０９２，１９９４。
【０１８４】
Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答およびアイソタイプスイッチについてのアッセイ（これは、とりわけ、Ｔ細胞依存性抗体応答を調節し、そしてＴｈ１／Ｔｈ２プロフィールに影響するタンパク質を同定する）としては、限定されないが、以下に記載されるアッセイが挙げられる：Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０２８−３０３３，１９９０；およびＡｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｏｎｄ，Ｊ．Ｊ．およびＢｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｍ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編，第１巻，３．８．１−３．８．１６頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４。
【０１８５】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（これは、とりわけ、主にＴｈ１応答およびＣＴＬ応答を生じるタンパク質を同定する）としては、限定されないが、以下に記載されるアッセイが挙げられる：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（第３章，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；第７章，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２，１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８−３７８３，１９９２。
【０１８６】
樹状細胞依存性アッセイ（これは、とりわけ、未刺激Ｔ細胞を活性化する樹状細胞によって発現されるタンパク質を同定する）としては、限定されないが、以下に記載されるアッセイが挙げられる：Ｇｕｅｒｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：５３６−５４４，１９９５；Ｉｎａｂａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７３：５４９−５５９，１９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５４：５０７１−５０７９，１９９５；Ｐｏｒｇａｄｏｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８２：２５５−２６０，１９９５；Ｎａｉｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：４０６２−４０６９，１９９３；Ｈｕａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１−９６５，１９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６９：１２５５−１２６４，１９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ９４：７９７−８０７，１９９４；およびＩｎａｂａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７２：６３１−６４０，１９９０。
【０１８７】
リンパ球の生存／アポトーシスについてのアッセイ（これは、とりわけ、スーパー抗原誘導後のアポトーシスを妨げるタンパク質、およびリンパ球のホメオスタシスを調節するタンパク質を同定する）としては、限定されないが、以下に記載されるアッセイが挙げられる：Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １３：７９５−８０８，１９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：６５９−６７０，１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：１９４５−１９５１，１９９３；Ｉｔｏｈら，Ｃｅｌｌ  ６６：２３３−２４３，１９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４５：４０３７−４０４５，１９９０；Ｚａｍａｉら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １４：８９１−８９７，１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：６３９−６４８，１９９２。
【０１８８】
Ｔ細胞の拘束および発生の初期の段階に影響するタンパク質についてのアッセイとしては、限定されないが、以下に記載されるアッセイが挙げられる：Ａｎｔｉｃａら，Ｂｌｏｏｄ  ８４：１１１−１１７，１９９４；Ｆｉｎｅら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：１１１−１２２，１９９４；Ｇａｌｙら，Ｂｌｏｏｄ  ８５：２７７０−２７７８，１９９５；Ｔｏｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７５４８−７５５１，１９９１。
【０１８９】
本発明のタンパク質またはポリペプチドは、ホメオスタシスの調節において（アンタゴニストまたはアゴニストとして）、そして結果として、骨髄性細胞またはリンパ系細胞の欠損の処置および／または検出（例えば、診断）において、有用であり得る。コロニー形成細胞または因子依存性細胞株を支持した限界の生物学的活性でさえ、造血の調節（例えば、単独または他のサイトカインとの組合せにおける、赤血球前駆細胞の成長および増殖の支持）における関与を示し、それによって、例えば、以下における有用性を示す：種々の貧血の処置および／もしくは検出（例えば、診断）において、または赤血球前駆体および／もしくは赤血球系細胞の産生を刺激するための照射／化学療法との組合せにおける使用のため；例えば、引き続く骨髄抑制を予防または処置するために、化学療法と組合せて、骨髄性細胞（例えば、顆粒球および単球／マクロファージ）の成長および増殖（すなわち、従来のＣＳＦ活性）を支持する際；巨核球および引き続いて血小板の成長および増殖を支持し、それによって、種々の血小板障害（例えば、血小板減少症）の予防または処置を可能にする際、そして一般的に、血小板輸血の代わりか、または血小板輸血に対して補完的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）な使用のため；ならびに／あるいは、上記に言及した、任意のすべての造血細胞へと成熟し得る造血幹細胞の成長および増殖を支持し、従って、種々の幹細胞障害（例えば、通常、移植で処置される障害であり、限定されないが、再生不良性貧血および発作性夜間血色素尿症が挙げられる）における治療的有用性を見出す際；ならびに、正常細胞としてか、または遺伝子治療のために遺伝的に操作されたものとして、インビボまたはエキソビボ（すなわち、骨髄移植と組合せてか、または末梢前駆細胞移植（同種または異種）と組合せて）のいずれかにおいて、照射／化学療法後の幹細胞区画を再増殖させる際。
【０１９０】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって測定され得る：
種々の造血系列の増殖および分化について適切なアッセイは、上記で引用されている。
【０１９１】
胚性幹細胞の分化についてのアッセイ（これは、とりわけ、胚の分化の造血に影響するタンパク質を同定する）としては、限定されないが、以下に記載されるアッセイが挙げられる：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：１４１−１５１，１９９５；Ｋｅｌｌｅｒら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：４７３−４８６，１９９３；ＭｃＣｌａｎａｈａｎら，Ｂｌｏｏｄ  ８１：２９０３−２９１５，１９９３。
【０１９２】
幹細胞の生存および分化についてのアッセイ（これは、とりわけ、リンパ−造血を調節するタンパク質を同定する）としては、限定されないが、以下に記載されるアッセイが挙げられる：Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｍ．Ｇ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編，Ｖｏｌ，２６５−２６８頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｈｉｒａｙａｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５９０７−５９１１，１９９２；Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＭｃＮｉｅｃｅ，Ｉ．Ｋ．およびＢｒｉｄｄｅｌｌ，Ｒ．Ａ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編，Ｖｏｌ，２３−３９頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｎｅｂｅｎら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２２：３５３−３５９，１９９４；Ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ  ａｒｅａ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ，Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，Ｒ．Ｅ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編，Ｖｏｌ，１−２１頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｓｐｏｏｎｃｅｒ，Ｅ．，Ｄｅｘｔｅｒ，Ｍ．およびＡｌｌｅｎ，Ｔ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編，Ｖｏｌ，第１６３−１７９頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｈ．Ｊ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編，Ｖｏｌ，１３９−１６２頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４。
【０１９３】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、骨組織、軟骨組織、腱組織、靭帯組織および／または神経組織の成長または再生のため、ならびに創傷の治癒ならびに組織の修復および置換のため、ならびに熱傷、切開、および潰瘍の処置において使用される組成物において有用性を有し得る（アンタゴニストまたはアゴニストとして）。
【０１９４】
軟骨および／または骨の成長のアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、ヒトおよび他の動物における、骨折および軟骨の損傷または欠損の治癒における適用を有する。本発明のタンパク質またはポリペプチドを使用するこのような調製物は、閉鎖骨折ならびに開放骨折の整復において、そしてまた、人工関節の固定の改善において、予防的用途を有し得る。骨形成因子によって誘導されるデノボでの骨形成は、先天的な頭蓋顔面欠損、外傷誘導性の頭蓋顔面欠損、または腫瘍学的切開誘導性の頭蓋顔面欠損の修復に寄与し、そしてまた、美容形成外科において有用である。
【０１９５】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、歯周病の処置および／または検出（例えば、診断）、ならびに他の歯の修復プロセスにおいて使用され得る。このような薬剤は、骨形成細胞を誘引するか、骨形成細胞の成長を刺激するか、または骨形成細胞の前駆体の分化を誘導するための環境を提供し得る。本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、骨粗しょう症または変形性関節症の処置（例えば、骨および／または軟骨の修復の刺激を通してか、あるいは炎症または炎症プロセスによって媒介される組織破壊のプロセス（コラーゲナーゼ活性、破骨細胞活性など）をブロックすることによる）において有用であり得る。
【０１９６】
本発明のタンパク質またはポリペプチドに起因し得る、組織再生活性の別の分類は、腱／靭帯の形成である。腱／靭帯様組織または他の組織が通常は形成されない環境下においてこのような腱／靭帯様組織または他の組織の形成を誘導する、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、ヒトおよび他の動物における、腱または靭帯の断裂、変形、および他の腱または靭帯の欠損の治癒における適用を有する。腱／靭帯様組織誘導タンパク質（アンタゴニストまたはアゴニストとして）を使用するこのような調製物は、腱組織または靭帯組織に対する損傷を予防する際の予防的用途、ならびに骨組織または他の組織への腱または靭帯の固定の改善における用途、および腱組織または靭帯組織に対する欠損を修復する際の用途を有し得る。本発明の組成物によって誘導される、デノボでの腱／靭帯様組織の形成は、他の起源の先天的、外傷誘導性、または他の腱もしくは靭帯の欠損の修復に寄与し、そしてまた、腱または靭帯の付着または修復のための美容形成外科において有用である。本発明の組成物は、腱もしくは靭帯の形成細胞を誘引するか、腱もしくは靭帯の形成細胞の成長を刺激するか、腱もしくは靭帯の形成細胞の前駆体の分化を誘導するか、または組織修復をもたらすためにインビボに戻されるための腱／靭帯の細胞または前駆体のエキソビボでの成長を誘導するための環境を提供し得る。本発明の組成物はまた、腱炎、手根管症候群、および他の腱または靭帯の欠損の処置において有用であり得る。この組成物はまた、当該分野において周知のような、キャリアとしての適切なマトリクスおよび／または金属イオン封鎖剤を含み得る。
【０１９７】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、神経細胞の増殖のために、ならびに神経および脳組織の再生のために（すなわち、中枢神経系および末梢神経系の疾患および神経障害、ならびに機械的および外傷的障害（これは、神経細胞または神経組織に対する変質、死、または外傷を含む）の処置および／または検出（例えば、診断）のために）有用であり得る。より詳細には、タンパク質またはポリペプチドは、末梢神経系の疾患（例えば、末梢神経損傷、末梢神経障害および限局性神経障害）および中枢神経系の疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）の処置および／または検出（例えば、診断）において使用され得る。本発明に従って処置され得る、さらなる状態としては、機械的および外傷的障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、および脳血管疾患（例えば、発作））が挙げられる。化学療法または他の医学的治療から生じる末梢神経障害もまた、本発明のタンパク質またはポリペプチドを使用して処置可能であり得る。
【０１９８】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、治癒していない創傷（限定はしないが、圧迫性潰瘍、脈管不全に関連した潰瘍、外科手術による創傷および外傷性損傷などが挙げられる）の、より良好かつ急速な閉鎖を促進するために有用であり得る。
【０１９９】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、他の組織（例えば、器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、および脈管（脈管内皮を含む）の組織）の生成または再生のため、またはこのような組織を含む細胞の成長を促進するための活性を示し得ることが予期される。所望される効果の一部分は、正常な組織が再生されるのを可能にするために、線維症性瘢痕を阻害または調節することにより得る。本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、新脈管形成活性を示し得る。
【０２００】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、腸の保護または再生、ならびに肺もしくは肝臓の線維症、種々の組織における再灌流障害、および全身性サイトカイン損傷から生じる状態の処置のために有用であり得る。
【０２０１】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、前駆組織もしくは細胞からの上記組織の分化を促進もしくは阻害するためにか；または、上記組織の成長を阻害するために有用であり得る。
【０２０２】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって測定され得る：
組織生成活性についてのアッセイとしては、限定されないが、以下に記載されるアッセイが挙げられる：国際特許公開番号ＷＯ９５／１６０３５（骨、軟骨、腱）；国際特許公開番号ＷＯ９５／０５８４６（神経、ニューロン）；国際特許公開番号ＷＯ９１／０７４９１（皮膚、内皮）。
【０２０３】
創傷治癒活性についてのアッセイとしては、限定されないが、以下に記載されるアッセイが挙げられる：Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ，７１−１１２頁（Ｍａｉｂａｃｈ，Ｈ．Ｉ．およびＲｏｖｅｅ，Ｄ．Ｔ．編），Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＥａｇｌｓｔｅｉｎおよびＭｅｒｔｚによる改変，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ７１：３８２−８４（１９７８）。
【０２０４】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、アクチビン関連活性またはインヒビン関連活性に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を示し得る。インヒビンは、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を阻害するその能力によって特徴付けられ、一方、アクチビンは、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激するその能力によって特徴付けられる。従って、インヒビンのアゴニストである本発明のタンパク質またはポリペプチドは、雌性哺乳動物における受胎能を減少させ、そして雄性哺乳動物において精子形成を減少させるインヒビンの能力に基づいて、避妊薬として有用であり得る。さらに、アクチビンのアンタゴニストである本発明のタンパク質またはポリペプチドは、下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ放出を刺激する際のアクチビン分子の能力に基づいて、避妊薬として有用であり得る。あるいは、アクチビンのアゴニストである本発明のタンパク質またはポリペプチドは、下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ放出を刺激する際のアクチビン分子の能力に基づいて、受精誘導（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ）治療剤として有用であり得る。例えば、米国特許第４，７９８，８８５号を参照のこと。さらに、インヒビンのアンタゴニストである本発明のタンパク質またはポリペプチドは、雌性哺乳動物における受胎能を減少させ、そして雄性哺乳動物において精子形成を減少させるインヒビンの能力に基づいて、受精誘導治療剤として有用であり得る。本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、ウシ、ヒツジおよびブタのような家畜動物の生涯の生殖能力を増加させるために、性的に未熟な哺乳動物において受精の開始の促進のために有用であり得る。
【０２０５】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって測定され得る：
アクチビン／インヒビン活性についてのアッセイとしては、限定されないが、以下に記載されるアッセイが挙げられる：Ｖａｌｅら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ９１：５６２−５７２，１９７２；Ｌｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７９−７８２，１９８６；Ｖａｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７６−７７９，１９８６；Ｍａｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：６５９−６６３，１９８５；Ｆｏｒａｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３０９１−３０９５，１９８６。
【０２０６】
本発明のタンパク質またはポリペプチドは、哺乳動物細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮および／または内皮細胞を含む）に対する走化性活性またはケモキネシス活性（例えば、ケモカインとして作用する）のアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。走化性およびケモキネシス性タンパク質は、所望される作用部位に所望される細胞集団を移動または誘引するために使用され得る。走化性またはケモキネシス性タンパク質のアンタゴニストまたはアゴニストは、炎症、または組織への創傷および他の外傷の処置、ならびに限局性感染の処置において、特定の利点を提供する。例えば、腫瘍または感染部位へのリンパ球、単球、または好中球の誘引は、その腫瘍または感染因子に対する免疫応答の改善を生じ得る。
【０２０７】
タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、走化性活性が、直接的または間接的に、そのような細胞集団の方向付けられた配向または動きを刺激し得る場合には、特定の細胞集団についての走化性活性のアゴニストである。好ましくは、タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、細胞の方向付けられた動きを直接的に刺激する能力を有する。特定のタンパク質が、細胞の集団についての走化性活性を有するか否かは、細胞の走化性についての任意の公知のアッセイにおいてそのようなタンパク質またはペプチドを使用することによって、容易に決定され得る。
【０２０８】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの活性は、とりわけ、以下の方法によって測定され得る：
走化性活性についてのアッセイ（これは、走化性を誘導または妨害するタンパク質を同定する）であって、このアッセイは膜を横切る細胞の移動ならびに１つの細胞集団の別の細胞集団への接着を誘導するタンパク質の能力を測定するアッセイからなる。動きおよび接着についての適切なアッセイには、非限定的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊（６．１２章、αケモカインおよびβケモカインの測定  ６．１２．１〜６．１２．２８）；Ｔａｕｂら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１３７０−１３７６、１９９５；Ｌｉｎｄら、ＡＰＭＩＳ  １０３：１４０−１４６、１９９５；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１７４４−１７４８；Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５８６０−５８６７、１９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１７６２−１７６８、１９９４に記載されたアッセイが挙げられる。
【０２０９】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、止血活性または血栓崩壊活性のアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。このようなタンパク質またはポリペプチドは、種々の凝固障害（遺伝性の障害（例えば、血友病）を含む）の処置および／または検出（例えば、診断的な検出）において有用であるか、または、外傷、手術、または他の原因から生じる創傷の処置において、凝固および他の止血事象を増強することが予想される。本発明のタンパク質またはペプチドはまた、血栓を溶解することまたは血栓の形成を阻害すること、および、そこから生じる状態（例えば、心臓および中枢神経系血管の梗塞形成（例えば、発作））の処置および予防のために有用であり得る。
【０２１０】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの活性は、とりわけ、以下の方法によって測定され得る：
止血活性および血栓崩壊活性についてのアッセイは、非限定的に、Ｌｉｎｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６：１３１−１４０、１９８６；Ｂｕｒｄｉｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．４５：４１３−４１９、１９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ５：７１−７９（１９９１）；Ｓｃｈａｕｂ、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ３５：４６７−４７４、１９８８に記載される活性を含む。
【０２１１】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、レセプター、レセプターリガンド、またはレセプター／リガンド相互作用のアンタゴニストもしくはアゴニスト、としての活性を実証し得る。このようなレセプターおよびリガンドの例は、非限定的に、サイトカインレセプターおよびそれらのリガンド、レセプターキナーゼおよびそれらのリガンド、レセプターホスファターゼおよびそれらのリガンド、細胞−細胞相互作用に関与するレセプターおよびそれらのリガンド（細胞接着分子（例えば、セレクチン、インテグリン、およびそれらのリガンド）を非限定的に含む）、ならびに、抗原提示、抗原認識ならびに細胞免疫応答および体液性免疫応答の発生に関与するレセプター／リガンド対を含む。レセプターおよびリガンドはまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の可能性のあるペプチドまたは低分子インヒビターのスクリーニングのために有用である。本発明のタンパク質またはポリペプチド（非限定的に、レセプターおよびリガンドのフラグメントを含む）は、それ自体、レセプター／リガンド相互作用のインヒビターとして有用であり得る。
【０２１２】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの活性は、とりわけ、以下の方法によって測定され得る：
レセプター−リガンド活性についての適切なアッセイは、非限定的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊（７．２８章、静的条件下での細胞接着の測定７．２８．１〜７．２８．２２）、Ｔａｋａｉら。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：６８６４−６８６８、１９８７；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１４５−１１５６、１９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１４９−１６０  １９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：５９−６８、１９９４；Ｓｔｉｔｔら、Ｃｅｌｌ  ８０：６６１−６７０、１９９５に記載されたアッセイを含む。
【０２１３】
本発明のタンパク質、またはポリペプチドはまた、炎症のアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。抗炎症活性は、炎症応答に関与する細胞に対する刺激を提供することによって、細胞−細胞相互作用（例えば、細胞接着）を阻害または促進することによって、炎症プロセスに関与する細胞の走化性を阻害または促進することによって、細胞の血管外遊走を阻害または促進することによって、あるいは、炎症応答をより直接的に阻害または促進する他の因子の産生を刺激または抑制することによって、達成され得る。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、慢性状態または急性状態を含む炎症状態（感染と関係する示唆（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））を非限定的に含む）、虚血性再灌流障害、内毒素性死亡率、関節炎、補体媒介超急性拒絶、腎炎、サイトカインもしくはケモカイン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦもしくはＩＬ−１）の過剰産生から生じるものを処置および／または検出（例えば、診断的に）に使用され得る。本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、抗原性物質または材料に対するアナフィラキシーおよび過敏症を処置するために有用であり得る。
【０２１４】
本発明のポリペプチドまたはタンパク質で処置および／または検出（例えば、診断的に）され得る神経系障害には、神経系傷害、および軸索の切断、ニューロンの減少もしくは変性、または脱髄のいずれかを生じる疾患または障害が含まれるがこれらに限定されない。本発明に従って患者（ヒトおよび非ヒト哺乳動物の患者を含む）において処置および／または検出（例えば、診断的に）され得る神経系の損傷には、中枢神経系（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のいずれかの以下の損傷を含むがこれらに限定されない：
（ｉ）外傷性損傷（物理的な傷害によって引き起こされた損傷または外科手術に関連する損傷（例えば、神経系の一部を切断する傷害または圧迫性傷害）を含む）；
（ｉｉ）虚血性損傷（ここでは、神経系の一部における酸素の欠乏が、ニューロンの傷害または死を生じる（大脳の梗塞形成もしくは虚血、または脊髄梗塞形成もしくは虚血を含む））；
（ｉｉｉ）悪性損傷（ここでは、神経系に関連する悪性または非神経系組織由来の悪性のいずれかである悪性組織によって、神経系の一部が破壊されるかまたは傷害を受ける）；
（ｉｖ）梗塞形成損傷（ここでは、神経系の一部が、感染の結果として破壊または傷害を受けており、この梗塞は、例えば、膿瘍によるか、あるいは、ヒト免疫不全ウイルス、帯状疱疹、もしくは単純疱疹ウイルス、またはライム病、結核、梅毒による感染と関連する）；
（ｖ）変性損傷（ここでは、神経系の一部が、変性プロセス（パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、または筋萎縮性側索硬化症に関連する変性を含むがこれらに限定されない）の結果として破壊または傷害を受ける）；
（ｖｉ）栄養性疾患または栄養性障害に関連する損傷（ここでは、神経系の一部が、栄養性障害または代謝の障害（ビタミンＢ１２欠損症、葉酸欠損症、ヴェルニッケ病、タバコ−アルコール性弱視、Ｍａｒｃｈｉａｆａｖａ−Ｂｉｇｎａｍｉ病（脳梁の主要な変性）、およびアルコール性小脳変性を含むがこれらに限定されない）によって破壊または傷害を受ける）；
（ｖｉｉ）全身性疾患（糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌、またはサルコイドーシスを含むがこれに限定されない）に関連する神経学的損傷；
（ｖｉｉｉ）アルコール、鉛、または特定の神経毒を含む毒性物質によって引き起こされる損傷；ならびに
（ｉｘ）脱髄性損傷（ここでは、神経系の一部が脱髄性疾患（多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連ミエロパシー、横断ミエロパシーもしくは種々の病因、進行性多病巣性白質脳障害、および橋中央ミエリン溶解を含むがこれらに限定されない）によって破壊または傷害を受ける）；
神経系障害の処置のための本発明に従う有用な治療剤は、ニューロンの生存および分化を促進する際の生物学的活性について試験することによって選択され得る。例えば、限定のためではなく、以下の効果のいずれかを誘発する治療剤は、本発明に従って有用であり得る：
（ｉ）培養中のニューロンの生存時間の増加；
（ｉｉ）培養中またはインビボでのニューロンの成長の増加；
（ｉｉｉ）培養中またはインビボでのニューロン関連分子の産生の増加（例えば、運動ニューロンに関係するコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ）；または
（ｉｖ）インビボでのニューロンの機能不全の症状の減少。
【０２１５】
このような効果は、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得る。好ましい非限定的な実施形態において、ニューロンの生存の増加は、Ａｒａｋａｗａら（１９９０、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：３５０７−３５１５）；ニューロンの成長の増加は、Ｐｅｓｔｒｏｎｋら（１９８０、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５−８２）またはＢｒｏｗｎら（１９８１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１７−４２）に示される方法によって測定され得；ニューロン関連分子の産生の増加は、測定される分子に依存して、バイオアッセイ、酵素的アッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイなどによって測定され得；そして運動ニューロンの機能不全は、運動ニューロン障害の身体的な発現（例えば、虚弱、運動ニューロン伝達速度、または機能障害）を評価することによって測定され得る。
【０２１６】
特定の実施形態において、本発明に従って処置および／または検出（例えば、診断的に）され得る運動ニューロン障害には、障害（例えば、梗塞形成）、感染、毒素への曝露、外傷、外科的損傷、運動ニューロンおよび神経系の他の成分に影響を与え得る変性疾患または悪性疾患、ならびにニューロンに選択的に影響を与える障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症）が含まれるがこれらに限定されない。そして、以下の疾患が含まれるがこれらに限定されない：進行性脊髄筋萎縮、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、小児筋萎縮および若年性筋萎縮、小児期の進行性球麻痺（Ｆａｚｉｏ−Ｌｏｎｄｅ症候群）、ポリオおよびポリオ後症候群、ならびに遺伝性運動感覚ニューロパシー（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｍｏｔｏｒｓｅｎｓｏｒｙ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（シャルコー−マリー−ツース病）。
【０２１７】
本発明のタンパク質またはポリペプチドはまた、以下のさらなる活性または効果の１以上を示し得る：感染性因子（非限定的に、細菌、ウイルス、真菌、および他の寄生生物を含む）の増殖、感染もしくはその機能の阻害、またはそれを殺傷すること；身体の性質または植物の性質（非限定的に、高さ、重量、髪の色、眼の色、皮膚、肥満対やせ型の比、または他の組織の色素沈着、あるいは器官または身体の部分のサイズまたは形状（例えば、胸部の増大または減少、骨形成または骨形状における変化）を含む）をもたらす（抑制するかまたは増強する）こと；生体リズムまたはｃａｒｉｃａｄｉｃサイクルもしくはリズムをもたらすこと；雄性または雌性被験体の受精能をもたらすこと；食事性の脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補助因子、または他の栄養的因子もしくは成分の代謝、異化、同化、プロセシング、利用、貯蔵、または除去をもたらすこと；行動の性質（非限定的に、食欲、性欲、ストレス、認識（認識障害を含む）、抑うつ（抑うつ性障害を含む）、および暴力的行動を含む）をもたらすこと；鎮痛効果または他の疼痛減少効果を提供すること；造血系列以外の系列での胚性幹細胞の分化および増殖を促進すること；ホルモン性または内分泌性活性；酵素の場合に、酵素の欠損を修正することおよび欠損関連疾患を処置すること；過剰増殖性障害（例えば、乾癬）の処置；免疫グロブリン様活性（例えば、抗原または補体に結合する能力）；およびワクチン組成物中で抗原として作用してそのようなタンパク質または別の物質またはそのようなタンパク質と交差反応性である実体に対する免疫応答を惹起する能力。
【０２１８】
本発明のタンパク質またはポリペプチド（それが由来する供給源（組換えおよび非組換えの供給源を非限定的に含む）が何であっても）は、それ自体で、または薬学的組成物（ここで、本発明のタンパク質またはポリペプチドが適切なキャリアまたは賦形剤とともに混合される）中で、種々の障害を処置または改善する用量で、必要のある患者に投与され得る。このような組成物はまた、タンパク質またはポリペプチドおよびキャリアに加えて、希釈剤、増量剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当該分野で周知の他の物質を含み得る。用語「薬学的に受容可能」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性物質を意味する。キャリアの性質は、投与の経路に依存する。本発明の薬学的組成物はまた、サイトカイン、リンホカイン、または他の造血性因子（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリトロポエチン）を含み得る。その薬学的組成物は、タンパク質またはポリペプチドの活性を増強するか、あるいはその活性または処置における使用を相補するかのいずれかである他の薬剤をさらに含み得る。このようなさらなる因子および／または薬剤は、本発明のタンパク質またはポリペプチドとの相乗作用的な効果を産生するために、または副作用を最小化するために薬学的組成物中に含まれ得る。逆に、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血性因子、血栓溶解因子もしくは抗血栓溶解因子、または抗炎症剤の処方物中に含まれて、サイトカイン、リンホカイン、他の造血性因子、血栓溶解因子もしくは抗血栓溶解因子、または抗炎症剤の副作用を最小化し得る。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、マルチマー（例えば、ヘテロダイマーまたはホモダイマー）で、またはそれ自体もしくは他のタンパク質との複合体で活性であり得る。結果として、本発明の薬学的組成物は、このようなマルチマー型または複合体型で、本発明のタンパク質またはポリペプチドを含み得る。
【０２１９】
即時的な適用の化合物の処方および投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版に見出され得る。治療的に有効な用量とは、さらに、症状の改善（例えば、関連する医学的状態の処置、治癒、予防、もしくは改善、またはこのような状態の処置、治癒、予防、もしくは改善の速度の増加）をもたらすに十分な化合物の量をいう。個々の活性成分に適用された場合、単独で投与されると、治療的に有効な用量とは、その成分単独の量をいう。組み合わせて適用される場合、治療的に有効な用量とは、治療効果をもたらす活性成分の組み合わせた量をいい、これは、連続的にまたは同時に組み合わせて投与されたかには関係がない。
【０２２０】
本発明の処置または使用の方法を実施する際に、本発明のタンパク質またはポリペプチドの治療的に有効な量は、処置される状態を有する哺乳動物に投与される。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、単独で、または他の治療（例えば、サイトカイン、リンホカイン、または他の造血性因子を使用する治療）と組み合わせてのいずれかで、本発明の方法に従って投与され得る。１以上のサイトカイン、リンホカイン、または他の造血性因子と同時投与された場合、本発明のタンパク質またはポリペプチドのプレーサ（ｐｒｅｓｅ）有効量のタンパク質またはポリペプチドが、処置される状態を有する哺乳動物に投与される。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、単独で、または他の治療（例えば、サイトカイン、リンホカイン、または他の造血性因子を使用する治療）と組み合わせてのいずれかで、本発明の方法に従って投与され得る。１以上のサイトカイン、リンホカイン、または他の造血性因子と同時投与された場合、投与のｐｒｅｓｅｏｕｔｅのタンパク質またはポリペプチドは、例えば、経口、直腸、経粘膜、または腸の投与；非経口送達（筋肉内、皮下、骨髄内の注入、ならびに、鞘内、直接的な心室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注入を含む）を含み得る。薬学的組成物中で使用されるか、または本発明の方法を実施するために使用される本発明のタンパク質またはポリペプチドの投与は、種々の従来的な方法（例えば、経口食物摂取、吸息、局所適用、または皮膚、皮下、腹腔内、非経口、または静脈内の注入）で実行され得る。患者への静脈内投与が好ましい。
【０２２１】
あるいは、全身的な様式であるよりはむしろ、局所的な様式で（例えば、化合物の関節炎の関節または線維症組織への直接的な注入を介して、しばしば蓄積処方物または徐放性処方物中で）化合物を投与し得る。緑内障手術の合併症としてしばしば生じる瘢痕性プロセスを予防するために、これらの化合物は、例えば、点眼剤として局所的に投与され得る。さらに、標的化された薬物送達系中（例えば、関節炎または線維症組織を標的化する、特異的な抗体でコートしたリポソーム中）で薬物を投与し得る。このリポソームは、罹患した組織を標的化し、そしてその組織によって選択的に取り込まれる。
【０２２２】
従って、本発明に従う使用のための薬学的組成物は、１つ以上の生理学的に受容可能なキャリアを用いて従来の様式で処方され得る。このキャリアとしては、活性化合物を薬学的に使用され得る調製物に加工することを容易にする賦形剤および補助剤が挙げられる。これらの薬学的組成物は、例えば、従来の混合プロセス、溶解プロセス、顆粒化プロセス、糖衣錠製造プロセス、微粒子化（ｌｅｖｉａｔｉｎｇ）プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、捕捉プロセスまたは凍結乾燥プロセスにより、それ自体公知の様式で製造され得る。適切な処方物は、選択された投与経路に依存する。本発明のタンパク質またはポリペプチドの治療的に有効な量は、経口的に投与され、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、錠剤、カプセル剤、粉剤、溶液またはエリキシルの形態である。錠剤形態で投与される場合、本発明の薬学的組成物は、固体キャリア（例えば、ゼラチンまたはアジュバント）をさらに含み得る。錠剤、カプセル剤、および粉剤は、本発明のタンパク質またはポリペプチドを約５〜９５％、そして好ましくは、本発明のタンパク質またはポリペプチドを約２５〜９０％含む。液体形態で投与される場合、液体キャリア（例えば、水、鉱油（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）、動物起源および植物起源の油（例えば、落花生油、鉱油（ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ）、大豆油、またはゴマ油）、あるいは合成油）が添加され得る。薬学的組成物の液体形態は、生理食塩水、デキストロースもしくは他のサッカリド溶液、またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）をさらに含み得る。液体形態で投与される場合、この薬学的組成物は、本発明のタンパク質またはポリペプチドを約０．５〜９０重量％、そして好ましくは、本発明のタンパク質またはポリペプチドを約１〜５０重量％含む。
【０２２３】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの治療的に有効な量が、静脈内、皮膚または皮下注射により投与される場合、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、発熱物質非含有の、非経口的に受容可能な水溶液の形態である。このような非経口的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに対して十分な考慮を受け、当該分野の技術範囲内である。静脈内、皮膚または皮下注射のための好ましい薬学的組成物は、本発明のタンパク質またはポリペプチドに加えて、等張性ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸加リンゲル液、または当該分野で公知の他のビヒクル）を含むべきである。本発明の薬学的組成物はまた、安定化剤、保存剤、緩衝化剤、抗酸化剤、または当業者に公知の他の添加剤を含み得る。注射に関しては、本発明の薬剤は、水溶液中に、好ましくは生理学的に適合する緩衝液（例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水緩衝液）中に処方され得る。経粘膜投与に関しては、透過される障壁に適切な浸透剤が、処方物中に使用される。このような浸透剤は、一般に当該分野で公知である。
【０２２４】
経口投与に関しては、当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアと活性化合物を組合わせることにより、化合物が容易に処方され得る。このようなキャリアは、本発明の化合物を、処置される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能にする。経口用途のための薬学的調製物は、固体賦形剤が適用され得、必要に応じて、得られた混合物をすりつぶし、そして適切な賦形剤を添加した後に顆粒の混合物に加工して、所望であれば、錠剤または糖衣コアを得る。適切な賦形剤は、特に、糖のような充填剤（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールが挙げられる）；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望であれば、崩壊剤が添加され得、崩壊剤としては、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）が挙げられる。糖衣コアは、適切なコーティングとともに提供される。この目的のために、濃縮糖溶液が用いられ得、この溶液は、必要に応じて、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含み得る。染料または色素は、同定のために、または活性化合物用量の異なる組合わせを特徴付けるために錠剤もしくは糖衣コーティングに添加され得る。
【０２２５】
経口的に使用され得る薬学的調製物としては、ゼラチンから作られるプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、ならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）から作られる軟質の密封カプセル剤（ｓｅａｌｅｄ  ｃａｐｓｕｌｅ）が挙げられる。プッシュフィットカプセル剤は、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、ならびに必要に応じて安定化剤と混合された活性成分を含み得る。軟質カプセルにおいては、活性化合物を適切な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール）中に溶解または懸濁し得る。さらに、安定化剤が添加され得る。経口投与のための全ての処方物は、このような投与のために適切な投薬量であるべきである。口内投与に関しては、組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。
【０２２６】
吸入による投与に関しては、本発明に従う使用のための化合物は、適切なプロペラント（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切な気体）を使用して、加圧パックまたはネブライザからのエアロゾルスプレー提示の形態で従来通り送達され得る。加圧エアロゾルの場合においては、投薬量単位は、測定量を送達するためにバルブを設けることにより決定され得る。カプセル剤、および例えば、吸入器または注入器において使用するためのゼラチンのカートリッジが処方され得、これらには、化合物の粉剤ミックス、およびラクトースもしくはデンプンのような適切な粉末基材が含まれる。この化合物は、注射による非経口投与（例えば、ボーラス注射または連続注入による）のために処方され得る。注射のための処方物は、単位投薬量形態で（例えば、添加された防腐剤を含有したアンプルまたは複数回用量容器で）提示され得る。この組成物は、懸濁液、溶液、または油性ビヒクルもしくは水性ビヒクル中の乳剤のような形態をとり得、そして懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含み得る。
【０２２７】
非経口的投与のための薬学的処方物としては、水溶性形態における活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油状注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質を含み得る（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン）。必要に応じて、懸濁液はまた、化合物の溶解性を増大させて、高濃縮溶液の調製を可能にする適切な安定化剤もしくは薬剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌発熱物質非含有水）での構成に適した粉剤形態であり得る。
【０２２８】
この化合物はまた、坐剤または保持浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａ）のような直腸組成物（例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む）に処方され得る。以前に記載された処方物に加えて、化合物はまた、デポー調製物として処方され得る。このような長期作用処方物は、移植（例えば、皮下または筋肉内に）あるいは筋肉内注射により投与され得る。従って、例えば、化合物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、受容可能な油中で乳剤として）またはイオン交換樹脂とともに、あるいは可溶性が乏しい誘導体として（例えば、可溶性が乏しい塩として）処方され得る。
【０２２９】
本発明の疎水性化合物のための薬学的キャリアは、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水と混和可能な有機ポリマー、および水相を含む共溶媒系である。この共溶媒系は、ＶＰＤ共溶媒系であり得る。ＶＰＤは、３％  ｗ／ｖベンジルアルコール、８％  ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％  ｗ／ｖポリエチレングリコール３００の溶液（無水エタノールで容量に達するまで調合されている）である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、５％デキストラン水溶液で１：１に希釈したＶＰＤからなる。この共溶媒系は、疎水性化合物を十分に溶解し、そしてそれ自体、全身投与に際して低毒性を生じる。当然のこととして、共溶媒系の特性は、その溶解性および毒性の特徴を壊すことなく、かなり変更され得る。さらに、共溶媒成分の本体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、変更され得る：例えば、他の低毒性の非極性界面活性剤がポリソルベート８０の代わりに使用され得る；ポリエチレングリコールの分画サイズは、変更され得る；他の生体適合性ポリマーがポリエチレングリコールと置き換えられ得る（例えば、ポリビニルピロリドン）；そして他の糖またはポリサッカリドがデキストロースと置き換えられ得る。あるいは、疎水性薬学的成分のための他の送達系が用いられ得る。リポソームおよび乳剤は、疎水性薬物のための送達ビヒクルまたはキャリアの周知の例である。特定の有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド）も用いられ得るが、通常は、より高い毒性という犠牲を払う。さらに、化合物は、徐放系を用いて送達され得る（例えば、治療剤を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス）。種々の徐放物質が確立されており、そして当業者に周知である。徐放カプセル剤は、それらの化学的性質に依存して、数週間から１００日にわたり化合物を放出し得る。治療的試薬の化学的性質および生物学的安定性に依存して、タンパク質安定性のためのさらなるストラテジーが用いられ得る。
【０２３０】
薬学的組成物はまた、適切な固体相またはゲル相キャリアまたは賦形剤を含み得る。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマー。本発明の化合物を阻害する多くのプロテイナーゼは、薬学的に適合性の対イオンとの塩として提供され得る。このような薬学的に受容可能な塩基付加塩は、生物学的有効性および遊離酸の特性を保持し、かつ無機塩基または有機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、トリアルキルアミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、二塩基アミノ酸、酢酸ナトリウム、安息香酸カリウム、トリエタノールアミンなど）との反応により得られる塩である。
【０２３１】
本発明の薬学的組成物は、本発明のタンパク質またはポリペプチドとタンパク質またはペプチド抗原との複合体の形態であり得る。タンパク質および／またはペプチド抗原は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球両方に刺激シグナルを送達する。Ｂリンパ球は、それらの表面の免疫グロブリンレセプターを通じて抗原に応答する。Ｔリンパ球は、ＭＨＣタンパク質による抗原の提示の後にＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を通じて抗原に応答する。ＭＨＣおよび構造的に関連するタンパク質（宿主細胞上のクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ遺伝子によりコードされるタンパク質を含む）は、Ｔリンパ球に、ペプチド抗原を提示するように働く。抗原成分はまた、精製したＭＨＣ−ペプチド複合体単独として、またはＴ細胞に直接シグナル伝達し得る同時刺激分子とともに供給され得る。あるいは、抗体は、表面の免疫グロブリンおよびＢ細胞上の他の分子に結合し得、そして抗体は、ＴＣＲを結合し得、そしてＴ細胞上の他の分子は、本発明の薬学的組成物と結合し得る。本発明の薬学的組成物は、リポソームの形態であり得る。ここで、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、他の薬学的に受容可能なキャリアに加えて、両親媒性薬剤（例えば、水溶液中でミセル、不溶性単層、液晶、またはラメラ層として凝集形態で存在する脂質）と組合わされ得る。リポソーム処方物のために適切な脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸など。このようなリポソーム処方物の調製物は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号；同第４，８３７，０２８号；および同第４，７３７，３２３号（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）において開示されるように、当該分野の技術レベル内である。
【０２３２】
本発明の薬学的組成物における本発明のタンパク質またはポリペプチドの量は、処置される状態の性質および重篤度に、ならびに患者が受けていた以前の治療の性質に依存する。最終的に、主治医は、このことと共に、各個々の患者を処置するために本発明のタンパク質またはポリペプチドの量を決定する。最初に、主治医は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの低用量を投与し、そして患者の応答を観察する。最適な治療効果が患者で得られ、かつその段階において投薬量がさらに増大しなくなるまで、本発明のタンパク質またはポリペプチドのより高い用量が投与され得る。本発明の方法を実施するために使用される種々の薬学的組成物は、体重１ｋｇあたり本発明のタンパク質またはポリペプチドを、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ（好ましくは、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは、約０．１μｇ〜約１ｍｇ）含むべきであることが意図される。骨、軟骨、腱または靱帯再生のために有用な本発明の組成物については、この治療方法は、局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、全身に、またはインプラントもしくはデバイスとして局部的に（ｌｏｃａｌｌｙ）組成物を投与する工程を包含する。投与される場合、本発明において使用するための治療組成物は、もちろん、発熱物質非含有の生理学的に受容可能な形態である。さらに、この組成物は、望ましくは、カプセル化され得るか、または骨、軟骨または組織損傷の部位へ送達するために粘性形態で注射され得る。局所的投与は、創傷治癒および組織修復に適切であり得る。本発明のタンパク質またはポリペプチド以外の治療的に有用な薬剤（上記のように、また、必要に応じて組成物中に含まれ得る）は、代替的にまたは補助的に、本発明の方法においてこの組成物と同時にまたは逐次的に投与され得る。好ましくは、骨および／または軟骨形成のために、この組成物は、タンパク質含有組成物を骨および／または軟骨損傷の部位に送達し得（このことにより、骨および軟骨が発生するための構造物が提供される）、かつ必要に応じて身体に再吸収され得るマトリックスを含む。このようなマトリックスは、現在、他の移植された医学的適用（ｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）のために使用されている材料から形成され得る。
【０２３３】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、審美的外観および界面特性に基づく。組成物の特定の適用により、適切な処方物が規定される。組成物の潜在的マトリックスは、生分解性、かつ化学的に規定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ無水物であり得る。他の潜在的マトリックスは、生分解性、かつ生物学的に十分に規定されている（例えば、骨または皮膚コラーゲン）。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス成分から構成され得る。他の潜在的マトリックスは、非生分解性であり、かつ化学的に規定されている（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸塩、または他のセラミック）。マトリックスは、上記の型の材料のいずれかの組合わせから構成され得る（例えば、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンとリン酸三カルシウム）。生体セラミックは、組成が改変され得（例えば、カルシウム−アルミネート−ホスフェートにおいて）、そして孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状、および生分解性を改変するために処理されている。１５０〜８００ミクロンの範囲の直径を有する多孔性粒子の形態にある、乳酸とグリコール酸が５０：５０（モル重量）のコポリマーが現在好ましい。いくつかの適用において、金属イオン封鎖剤（例えば、カルボキシメチルセルロースまたは自己血餅）を利用して、タンパク質またはポリペプチド組成物がマトリックスから解離することを防止することは有用である。
【０２３４】
金属イオン封鎖剤の好ましいファミリーは、（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）アルキルセルロースのようなセルロース物質（メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられる）であり、最も好ましいものは、カルボキシメチルセルロースのカチオン性塩（ＣＭＣ）である。他の好ましい金属イオン封鎖剤としては、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマーおよびポリ（ビニルアルコール）が挙げられる。本明細書中で有用な金属イオン封鎖剤の量は、処方物総重量を基にして、０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％である。この量は、タンパク質またはポリペプチドがポリマーマトリックスから脱着することを妨げ、かつ組成物の適切な取り扱いを提供することが必要な量を示すが、前駆細胞がマトリックスに浸潤することを妨げるほどの量ではなく、それにより、前駆細胞の骨形成活性を補助する機会をタンパク質またはポリペプチドに提供する。さらなる組成物において、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、骨および／または軟骨欠損、創傷、または問題の組織の処理に有益な他の薬剤と組合わされ得る。これらの薬剤としては、種々の増殖因子（例えば、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ））が挙げられる。
【０２３５】
治療組成物はまた、現在、獣医学的適用のために価値がある。ヒトに加えて、特に家畜動物およびサラブレッド種のウマは、本発明のタンパク質またはポリペプチドでのこのような処置のために望まれる患者である。組織再生において使用されるタンパク質含有薬学的組成物の投薬量レジメは、主治医が種々の因子を考慮することにより決定される。これらの因子は、タンパク質またはポリペプチドの作用を改変する（例えば、形成が所望される組織重量、損傷部位、損傷組織の状態、創傷のサイズ、損傷組織の型（例えば、骨）、患者の年齢、性別、および食餌、任意の感染の重篤度、投与時間および他の臨床的因子）。投薬量は、再構成に使用されるマトリックスの型、および薬学的組成物における他のタンパク質の包含とともに変化し得る。例えば、他の公知の増殖因子（例えば、ＩＧＦ  Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ））の最終組成物への添加はまた、投薬量に変化をもたらし得る。組織／骨の増殖および／または修復の周期的評価（例えば、ｘ線、組織形態形成測定およびテトラサイクリン標識）により進歩がモニターされ得る。
【０２３６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療のために使用され得る。このようなポリヌクレオチドは、哺乳動物被験体にける発現のために細胞にインビボまたはエキソビボのいずれかで導入され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、細胞または生物体に核酸を導入するための他の公知の方法により投与され得る（ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡの形態が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０２３７】
細胞をまた、増殖させるため、またはこのような細胞に対する所望の効果もしくはこのような細胞における活性を生じるために、本発明のタンパク質またはポリペプチドの存在下でエキソビボで培養され得る。次いで、処理された細胞は、治療目的のためにインビボで導入され得る。
【０２３８】
本発明における使用に適切な薬学的組成物は、その意図される目的を達成するために有効な量で活性成分が含まれる組成物を含む。より詳細には、治療的有効量は、処置される対象の存在する症状の発達を防止するか、または緩和するために有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書中で提供される詳細な開示を考慮して、十分に当業者の能力の範囲内である。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に評価され得る。例えば、用量は、細胞培養物において決定されるＩＣ50を含む循環濃度範囲（すなわち、最大のＣ−プロテイナーゼ活性の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を達成するために、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【０２３９】
治療的に有効な用量は、患者における症状の回復または生存の延長を生じる化合物の量をいう。このような化合物の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物（例えば、ＬＤ50（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ50（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための）における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療係数であり、そしてこれはＬＤ50とＥＤ50との間の比として表され得る。高い治療係数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて使用するためのある範囲の投薬量の処方において使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を有さず、ＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。この投薬量は、使用される剤形および利用される投与の経路に依存してこの範囲内で変化し得る。的確な処方物、投与の経路および投薬量は、その個々の医師によって患者の状態を考慮して選択され得る。例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｃｈ．１，ｐ．１を参照のこと。投薬の量および間隔は、Ｃ−プロテイナーゼ阻害効果または最少有効濃度（ＭＥＣ）を維持するために十分な活性部分の血漿レベルを提供するために、個々に調節され得る。このＭＥＣは、各化合物について変化するが、本明細書中に記載のアッセイを使用して、インビトロのデータ（例えば、Ｃ−プロテイナーゼの５０〜９０％の阻害を達成するために必要な濃度）から評価され得る。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、個体の特徴および投与の経路に依存する。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイは、血漿の濃度を決定するために使用され得る。
【０２４０】
投薬量の間隔はまた、ＭＥＣ値を使用して決定され得る。化合物は、時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％の間、そして最も好ましくは５０％〜９０％の間、ＭＥＣを超える血漿レベルを維持するレジメンを使用して投与されるべきである。局所投与または選択的取りこみの場合、この薬物の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連しなくてもよい。
【０２４１】
当然のことながら、投与される組成物の量は、処置される被験体、被験体の体重、苦痛の重症度、投与の様式および処方する医師の判断に依存する。
【０２４２】
この組成物は、所望の場合、活性成分を含む１以上の単位剤形を含み得るパックまたは分配デバイスにおいて存在し得る。このパックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔（例えば、ブリスターパック）を含み得る。このパックまたは分配デバイスは、投与の使用説明書を伴い得る。適合性の薬学的キャリアにおいて処方される本発明の化合物を含む組成物もまた調製され得、適切な容器中に配置され得、そして指示された状態の処置についてラベルされ得る。
【０２４３】
この実施形態の１つの適用において、本発明のヌクレオチド配列は、コンピューター読み取り可能な媒体に記録され得る。本明細書中で使用される場合、「コンピューター読み取り可能な媒体」は、コンピューターによって直接読み取りおよびアクセスされ得る任意の媒体をいう。このような媒体としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープのような磁気記憶媒体；ＣＤ−ＲＯＭのような光学記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電気的記憶媒体；ならびにこれらのカテゴリーのハイブリッド（例えば、磁気／光学記憶媒体）。当業者は、任意の現在公知のコンピューター読み取り可能な媒体が、本発明のヌクレオチド配列が記録されたコンピューター読み取り可能な媒体を備える製品を作製するために使用され得る方法を、容易に理解し得る。本明細書中で使用される場合、「記録される」は、コンピューター読み取り可能な媒体に情報を記憶するプロセスをいう。当業者は、本発明のヌクレオチド配列情報を含む製品を作製するために、コンピューター読み取り可能な媒体に情報を記録するための現在公知の任意の方法を容易に採用し得る。
【０２４４】
種々のデータ記憶構造体が、本発明のヌクレオチド配列が記録されたコンピューター読み取り可能な媒体を作製するために、当業者に利用可能である。このデータ記憶構造体の選択は、一般に記憶された情報にアクセスするために選択される手段に基づく。さらに、種々のデータプロセッサプログラムおよびフォーマットが、コンピューター読み取り可能な媒体に本発明のヌクレオチド配列情報を記憶するために使用され得る。この配列情報は、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄのような市販のソフトウエアにおいてフォーマットされた文書処理テキストファイルにおいて表され得るか、またはＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅなどのようなデータベースアプリケーションにおいて記憶されるＡＳＣＩＩファイルの形態で表され得る。当業者は、本発明のヌクレオチド配列情報を記録したコンピューター読み取り可能な媒体を得るために、多くのデータプロセッサ構築フォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を容易に適合させ得る。コンピューターソフトウエアは公的に入手可能であり、これは当業者がコンピューター読み取り可能な媒体において提供される配列情報にアクセスすることを可能にする。続く実施例は、Ｓｙｂａｓｅシステム上のＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））およびＢＬＡＺＥ（Ｂｒｕｔｌａｇら、Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１７：２０３−２０７（１９９３））検索アルゴリズムを実行するソフトウエアが、核酸配列内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定するために使用される方法を実証する。このようなＯＲＦは、フラグメントをコードするタンパク質またはポリペプチドであり得、そして発酵反応に使用される酵素のような商業的に重要なタンパク質またはポリペプチドの生成において、および商業的に有用な代謝産物の生成において有用であり得る。
【０２４５】
本明細書中で使用される場合、「コンピューターベースのシステム」は、本発明のヌクレオチド配列情報を分析するために使用される、ハードウエア手段、ソフトウエア手段、およびデータ記憶手段をいう。本発明のコンピューターベースのシステムの最低限のハードウエア手段は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段を備える。当業者は、現在使用可能なコンピューターベースのシステムのいずれか１つが、本発明における使用に適切であることを容易に理解し得る。上記のように、本発明のコンピューターベースのシステムは、検索手段を補助および実行するために、本発明のヌクレオチド配列が保存されたデータ記憶手段、ならびに必要なハードウエア手段およびソフトウエア手段を備える。本明細書中で使用される場合、「データ記憶手段」は、本発明のヌクレオチド配列情報を記憶し得るメモリ、または本発明のヌクレオチド配列情報が記録された製品にアクセスし得るメモリアクセス手段をいう。
【０２４６】
本明細書中で使用される場合、「検索手段」は、標的配列または標的構造モチーフをデータ記憶手段内に記憶された配列情報と比較するために、コンピューターベースのシステム上で実行される１以上のプログラムをいう。検索手段は、特定の標的配列または標的モチーフと一致する既知の配列のフラグメントまたは領域を同定するために使用される。種々の公知のアルゴリズムは公に開示され、そして検索手段を行うための種々の市販のソフトウエアは、本発明のコンピューターベースのシステムにおいて使用されており、そして使用され得る。このようなソフトウエアの例としては、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＡ（ＮＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＩＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、相同性検索を行うための、利用可能なアルゴリズムまたは実行ソフトウエアパッケージのいずれか１つが、このコンピューターベースのシステムにおける使用のために適合され得ることを容易に認識し得る。本明細書中で使用される場合、「標的配列」は、６以上のヌクレオチドまたは２以上のアミノ酸の、任意の核酸配列またはアミノ酸配列であり得る。当業者は、標的配列が長ければ長いほど、標的配列がデータベースにおいてランダムな存在として存在する可能性が低くなることを容易に認識し得る。標的配列の最も好ましい配列長さは、約１０〜１００アミノ酸、または約３０〜３００ヌクレオチド残基である。しかし、商業的に重要なフラグメント（例えば、遺伝子発現およびタンパク質またはポリペプチドのプロセシングに関連する配列フラグメント）についての検索は、より短い配列であり得ることが十分に認識されている。
【０２４７】
本明細書中で使用される場合、「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」は、合理的に選択される任意の配列または配列の組み合わせ（ここで、この配列は標的モチーフの折り畳みによって形成される３次元配置に基づいて選択される）をいう。当該分野で公知の種々の標的モチーフが存在する。タンパク質またはポリペプチドの標的モチーフとしては、酵素活性部位およびシグナル配列が挙げられるがこれらに限定されない。核酸の標的モチーフとしては、プロモーター配列、ヘアピン構造および誘導性の発現エレメント（タンパク質またはポリペプチド結合配列）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４８】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたはタンパク質、あるいはそのホモログによって認識される標的の１つの、試験サンプルにおける存在または発現を同定する方法を提供する。
【０２４９】
一般的には、本発明のポリペプチドまたはタンパク質によって認識される標的を検出する方法は、サンプルを、標的と結合し、そして複合体を形成する本発明のポリペプチドまたはタンパク質と、複合体を形成するのに十分な時間接触させる工程、およびこの複合体を検出し、その結果複合体が検出される場合に、本発明の標的をサンプル中で検出する工程を包含し得る。
【０２５０】
詳細には、このような方法は、試験サンプルを本発明の１以上の抗体と共にインキュベートする工程、および試験サンプル中の標的に対するこの抗体の結合についてアッセイする工程を包含する。
【０２５１】
抗体（本発明のＦａｂフラグメントを含む）を、試験サンプルとインキュベートするための条件は変化する。インキュベーション条件は、アッセイにおいて使用される形式、使用される検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体の型および性質に依存する。当業者は、一般に利用可能な増幅または免疫学的アッセイの形式の任意の１つが、本発明の抗体を使用するために容易に適合され得ることを認識する。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，Ｔ．、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ  Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．、Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）；およびＫｕｗａｔａら、ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４５：７６４−７３（１９９８）、Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：１１９３−２０２（１９９１）、米国特許第５，１１１，９３７号ならびに同第５，７１９，０６０号において見出され得る。本発明の試験サンプルとしては、細胞、タンパク質もしくはポリペプチド、または細胞の膜抽出物、あるいは唾液、血液、血清、血漿、または尿のような生物学的流体が挙げられる。上記の方法において使用される試験サンプルは、アッセイの形式、検出方法の性質、およびアッセイされるサンプルとして使用される組織、細胞または抽出物に基づいて変化する。タンパク質またはポリペプチドの抽出物あるいは細胞の膜抽出物を調製するための方法は、当該分野で周知であり、そして利用されるシステムに適合性のサンプルを得るために容易に適合され得る。
【０２５２】
本発明の別の実施形態において、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。詳細には、本発明は、以下を含む１以上の容器を、ぴったり合った状態（ｃｌｏｓｅ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）において受け取る区画分けされたキットを提供する：（ａ）本発明の抗体の１つを含む第１の容器；および（ｂ）以下の１以上を含む１以上の他の容器：洗浄試薬、結合した抗体の存在を検出し得る試薬。
【０２５３】
詳細には、区画分けされたキットは、試薬が別個の容器に含まれる任意のキットを含む。このような容器としては、小さなガラス容器、プラスチック容器、あるいはプラスチックまたは紙のストリップが挙げられる。このような容器は、サンプルと試薬とが相互に混入されないように、試薬を１つの区画から別の区画に効率的に移すことを可能にし、そして各容器のその薬剤または溶液は、１つのコンパートメントから別のコンパートメントに定量的な様式で添加され得る。このような容器としては、試験サンプルを受容する容器、アッセイにおいて使用される抗体を含む容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液など）を含む容器、および結合した抗体またはプローブを検出するために使用される試薬を含む容器が挙げられる。検出試薬の型としては、標識された二次抗体、またはこの代替において、この一次抗体が標識される場合、標識された抗体と反応し得る酵素試薬もしくは抗体結合試薬が挙げられる。当業者は、本発明の開示されるプローブおよび抗体が、当該分野で周知の確立されたキット形式の１つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識する。
【０２５４】
本発明のポリペプチドまたはタンパク質を使用して、本発明はさらに、このポリペプチドまたはタンパク質によって認識される標的に結合する薬剤を取得し、そして同定する方法を提供する。詳細には、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）標的を、本発明の単離されたタンパク質またはポリペプチドと接触させる工程；および
（ｂ）この標的が、このタンパク質またはポリペプチドに結合しているか否かを決定する工程。
【０２５５】
一般に、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するためのこのような方法は、化合物を、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間、本発明のポリペプチドと接触させる工程、およびこの複合体を検出し、その結果ポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物を同定する工程を包含し得る。
【０２５６】
本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法はまた、化合物を、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間、細胞中の本発明のポリペプチドと接触させる工程であって、ここでこの複合体は、細胞におけるレセプター遺伝子配列の発現を誘導する、工程、およびレポーター遺伝子配列の発現を検出することによってこの複合体を検出し、その結果ポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定する工程を包含し得る。
【０２５７】
このような方法を介して同定される化合物は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質によって認識される標的の活性を調節する（すなわち、この化合物の非存在下で観察される活性と比較して、標的の活性を増加または減少させる）化合物を含み得る。あるいは、このような方法を介して同定される化合物は、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する（すなわち、この化合物の非存在下で観察される発現レベルと比較して、発現を増加または減少させる）化合物を含み得る。化合物（例えば、本発明の方法を介して同定される化合物）は、当業者に周知の標準的アッセイを使用して、活性／発現を調節するその能力について試験され得る。
【０２５８】
上記のアッセイにおいてスクリーニングされる薬剤は、ペプチド、炭水化物、ビタミン誘導体、または他の薬学的薬剤であり得るが、これらに限定されない。この薬剤は、ランダムにまたは合理的に選択されてスクリーニングされ得るか、あるいはタンパク質モデリング技術を使用して設計され得る。
【０２５９】
ランダムスクリーニングについて、ペプチド、炭水化物、薬学的薬剤などのような薬剤は、ランダムに選択され、そして本発明のポリペプチドまたはタンパク質によって認識される標的に結合するその能力についてアッセイされる。あるいは、薬剤は合理的に選択または設計され得る。本明細書中で使用される場合、薬剤が特定のタンパク質またはポリペプチドの配置に基づいて選択される場合、この薬剤は「合理的に選択または設計される」といわれる。例えば、当業者は、合理的に設計された抗ペプチド性ペプチド（ａｎｔｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）（例えば、Ｈｕｒｂｙら、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ（１９９２），２８９−３０７頁，およびＫａｓｐｃｚａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：９２３０−８（１９８９）を参照のこと）、ならびに薬学的薬剤などを作製するために、特定のペプチド配列に結合し得るペプチド、薬学的薬剤などを作製するための現在利用可能な手順を容易に適合し得る。
【０２６０】
上記に加えて、大まかに記載される本発明の薬剤の１つのクラスは、本発明のＯＲＦまたはＥＭＦの１つへの結合を通して遺伝子発現を制御するために使用され得る。上記のように、このような薬剤は、ランダムにスクリーニングされ得るか、または合理的に設計／選択され得る。ＯＲＦまたはＥＭＦの標的化は、当業者が、発現の制御を同じＥＭＦに頼る一つのＯＲＦまたは複数のＯＲＦのいずれかの発現を調節する、配列特異的またはエレメント特異的な薬剤を設計することを可能にする。
【０２６１】
抗体の形式の選択として、本発明者らは、ｓｃＦｖ形式よりも、Ｆａｂ形式を好む。なぜなら、Ｆａｂ形式は、粗製の抗体調製物についての迅速な高スループット親和性スクリーニングアッセイを可能にするためである。多くのｓｃＦｖは、実際にはより高分子量の種（二量体（Ｗｅｉｄｎｅｒら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０２８１−１０２８８；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６４４４−６４４８）および三量体（Ｋｏｒｔｔｅｔら、（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０，４２３−４３３）を含む）を形成し、これは選択および特徴付けの両方を複雑にする。本発明者らは、Ｆａｂ提示形式を選択し、この形式において、重鎖または軽鎖の遺伝子由来の可変ドメインがファージコートタンパク質に結合しており、そしていくつかの実施形態においてまた、検出および精製のためのタグを有する。他の鎖は、ペリプラズムに分泌される別々のフラグメントとして発現され、そこでこれはタンパク質ではファージコートタンパク質との融合体である遺伝子と対になり得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４１３３−４１３７）。いくつかの実施形態において、このファージコートタンパク質はｐＩＩＩコートタンパク質である。別の実施形態において、重鎖遺伝子由来の可変ドメインは、ファージコートタンパク質に融合され、そしてこの軽鎖遺伝子は、別々のフラグメントとして発現される。
【０２６２】
Ｆａｂフォーマットに関する選択は、Ｆａｂのモノマーの出現が粗タンパク質画分との結合（オフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ））の速度論のために、多数のクローンの迅速なスクリーニングを可能にする考えに基づいていた。これは、ファージミドライブラリー由来の選択された単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体（Ｖａｕｇｈａｎら，（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４，３０９−３１４；Ｓｈｅｅｔｓら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，６１５７−６１６２）、または他のファージライブラリー由来のＦａｂフラグメント（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，７２５−７３４）を必要とする選択後分析と比較した場合、劇的にその分析の時間を減少させる。
【０２６３】
本発明のＦａｂライブラリーは、試験された６個の抗原に対する平均１４個の異なるＦａｂを産生した。これらとしては、破傷風毒素、ハプテンフェニルオキサゾロン、乳癌関連ＭＵＣ１抗原および３つの非常に関連した糖タンパク質ホルモン：ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヒト黄体化ホルモン（「ｈＬＨ」）およびヒト卵胞刺激ホルモン（「ｈＦＳＨ」）が挙げられる。糖タンパク質ホルモンに関して、本発明のＦａｂライブラリーは、ホルモン特異的抗体または交差反応性抗体のパネルを産生した。従って、精巧な選択プロトコルを使用することなく、ホルモン特異的Ｆａｂならびに交差反応性Ｆａｂｇが、これらの非常に相同なグリコホルモン（ｇｌｙｃｏｈｏｒｍｏｎｅ）に対して回収され、このライブラリーが、抗体特異性の豊富な供給源であることを示した。抗グリコホルモン抗体の親和性は、２．７ｎＭと３８ｎＭとの間で変化した。最終的に、Ｆａｂフォーマットは、事実、粗画分を用いたオフ速度に基づく、迅速なスクリーニングおよび個々のクローンの確実なランキングを可能にする。
【０２６４】
さらに、ゴナドトロピンにおける選択により得られる抗体の特異性は、独特であり：ｈＬＨとｈＣＧとの間の相同性の高い程度に起因して、ハイブリドーマ技術を用いたｈＣＧ特異的モノクローナル抗体を単離することは非常に難しいが、一方ほとんどｈＬＨ抗体は存在しない（Ｍｏｙｌｅら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，８５１１−８５１８；Ｃｏｌｅ（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３，２２３３−２２４３）。簡単な選択手順を用いて、予防策をとらずに交差反応性Ｆａｂの選択を避け、本発明者らは、全ての可能な特異性（３つのホルモンｈＣＧ、ｈＬＨおよびｈＦＳＨのいずれかに特異的なＦａｂ、および一般的なα鎖またはｈＣＧおよびｈＬＨにより共有されるβ鎖におけるエピトープを認識する交差反応性Ｆａｂ）を有するフラグメントを容易に単離した。これらの選択は、単一の抗原分子内の異なるエピトープに対して指向される抗体が、ライブラリーから回収され得ることを実証した。本発明のＦａｂライブラリーは、ポリクローナルファージ調製物を用いた選択のモニタリングおよび精製されていないＦａｂフラグメントを用いた抗体オフ速度の大規模のスクリーニングを可能にする。
【０２６５】
全体として、１０-2〜１０-4ｓ-1のオーダーにおけるオフ速度および２．７ｎＭまでの親和性を有する抗体が回収された。これらのファージ抗体の速度論は、２次免疫応答と関連する抗体と同じ大きさのオーダーである。
【０２６６】
Ｆａｂライブラリー由来の抗体が、親和性に関してｓｃＦｖライブラリー由来の抗体と類似かまたはより良く振るまう兆候は、同一の条件下で同じ２つの抗原における異なるライブラリーの選択の比較に由来する。大きいｎａＶｖｅ  ｓｃＦｖライブラリー（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，４３２４−４３３２）由来の選択されるＭＵＣ１に対する抗体は、より速いオフ速度を有し、その上、本研究において記載されるライブラリーから単離された等価のＦａｂを有する。さらに、この抗体は、非常に異なるＶ遺伝子の使用方法を示し、そして異なる緻密な特異性を有する。同様に、マーカー上皮糖タンパク質２に対するファージ抗体のオフ速度を比較する場合、現在のライブラリーから選択されるＦａｂの１つは、最も良いｓｃＦｖより１０分の１の遅いオフ速度を有するようである（Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４，３０９−３１４）。
【０２６７】
しかし、選択された抗体フラグメントの親和性は、選択のために使用された抗原に非常に依存する。Ｓｈｅｅｔｓおよび同僚は、抗Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｔｙｐｅ  Ａフラグメントに対して特異的な選択されたｓｃＦｖフラグメントに対して２６ｎＭと７１ｎＭとの間で変化する親和性を報告したが、一方ヒトＥｒｂＢ−２の細胞外ドメインに対する抗体に関して、０．２２ｎＭと４．０３ｎＭとの間のＫdが見出された（Ｓｈｅｅｔｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，６１５７−６１６２）。本発明者らのライブラリーから選択されたゴナドトロピン特異的Ｆａｂの親和性は、２．７ｎＭと３８ｎＭとの間で変化し、これは、ＶａｕｇｈａｎらおよびＳｈｅｅｔｓらにより作製されたｎａＶｖｅライブラリー由来のタンパク質結合ｓｃＦｖ’ｓと比較可能であり、そして抗体の種類において最も良い抗体の親和性の値に近づく。
【０２６８】
本発明のＦａｂライブラリーのサイズは、親和性に関して重要であるばかりでなく、大きな１組の異なる抗原に対する抗体の選択の首尾良い速度もまた決定する。これに関して、本発明のＦａｂライブラリーは、ハプテンｐｈＯｘに対する２４個の抗体に対して非常に良好に実施し、そして平均、他の抗原に対する１３個の抗体が選択された。
【０２６９】
配列決定された１４個のＦａｂクローンの制限されたセットにおいて、本発明者らは、全ての大きいＶ遺伝子ファミリー（ＶH1/3/4、Ｖ61/3およびＶ81/2を含む）由来の可変領域遺伝子を用いて抗体を同定するが、ファミリーＶH6、Ｖ62/7およびＶ87のより頻繁には使用されないセグメントもまた回収された。生殖細胞系列のＶ領域の最も最近の配列情報において設計された、可変領域遺伝子プライマーの伸長されたセットの使用および／または、分離クローニングと部分的に組み合わされた分離ＰＣＲは、おそらくヒトＶ遺伝子レパートリーの非常に多様なサンプルへのアクセスを保証する。
【０２７０】
本発明に従って、ライブラリーは、所望される特異的結合対メンバーをコードすることが可能なポリヌクレオチドから調製される。種々の技術が、ライブラリーを調製するために存在し、このライブラリーは、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかから調製され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（これは、参考として本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。細胞は、目的の特異的結合対メンバーをコードするポリヌクレオチドの供給源として役目を果たす。遺伝子を含む領域を増幅するための富化手順および手段が、使用され得る。例えば、所望される特異的な結合対メンバーが抗体である場合、ＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡは、例えば以下から調製され得る：非免疫動物から得られた脾臓細胞、目的の標的を用いて免疫された動物、ハイブリドーマ細胞、またはリンパ芽球細胞。免疫されていない動物から得られた抗体のライブラリーは、抗体レパートリーの全体の片寄らない提示を含むが、免疫された動物から得られた抗体のライブラリーは、標的のエピトープに対して指向された抗体の片寄った集団を含む。脾臓細胞、あるいは他の組織または循環系由来の免疫細胞は、種々の動物種（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウシ、トリなど）から得られ得る。
【０２７１】
目的の細胞（例えば、脾臓細胞またはハイブリドーマ細胞）から単離されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の増幅は、例えば以下において概説されるプロトコルに従って実施され得る：米国特許第４，６８３，２０２号、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３８３３−３８３７（１９８９），Ｓａｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５７２８−５７３２（１９８９），およびＨｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９），Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．およびＳｉｍｏｎ，Ｍ．（編），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２６７巻，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６），Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（編），Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（各々が参考として本明細書中で援用される）。増幅プロトコルにおいて有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、独特であるかまたは縮重し得、あるいは縮重位置においてイノシンを取り込み得る。従って、多重鎖免疫グロブリンに対して、プライマーは、一般に、重鎖および軽鎖両方の可変領域をコードする配列の増幅のために使用される。制限エンドヌクレアーゼ認識配列は、プライマー中に取り込まれ、発現のために予め決定されたリーディングフレームにおいて、ベクター中に増幅されたフラグメントのクローニングを可能にする。
【０２７２】
増幅されたｃＤＮＡを含む発現ライブラリーは、代表的に、ベクター（例えば、バクテリオファージまたはファージミド）において調製される。適切なバクテリオファージまたはファージミドの特徴は、使用される特定の実施形態に依存し、そして一般に、インビトロでのパッケージングまたは形質転換により、宿主細胞中への組換えポリヌクレオチドの挿入を簡便に可能にするものである。
【０２７３】
次いで、宿主細胞は、ファージまたはファージミドおよびへルパーファージを用いて感染され、そしてファージ粒子の発現およびアセンブリを可能にする条件下で培養される。１つの実施形態において、本発明のバクテリオファージまたはファージミドのために適切な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株であり、いくつかの適切なベクターのどれかに依存した特定の例が選択される。もちろん、Ｅ．ｃｏｌｉ以外の細菌宿主を有するファージまたはファージミドもまた使用され得る。
【０２７４】
所望される特異的結合対メンバーをコードするクローン化されたライブラリー配列を含むファージ粒子またはファージを富化するかまたは単離するために、従って、最終的に、核酸配列自体を単離するために、宿主細胞から収集されたファージ粒子またはファージが、アフィニティーで精製される。標的または所望された特異的結合対メンバーに対する結合パートナーが、アフィニティー精製のために使用される。例えば、所望される特定的結合対メンバーが、特定の標的に特異的に結合する抗体である場合、標的は、その外側表面上に所望される抗体を有するファージ粒子またはファージを回収するために使用される。標的は、代表的に、不溶性基材（例えば、粒子またはビーズまたはプレート）に吸着される。次いで、そのように得られるファージ粒子またはファージは、（ファージミドを含むファージ粒子のためのへルパーファージを用いて）宿主細胞中に感染することにより増幅され得る。アフィニティー富化および増幅の付加的なラウンドが、富化の所望されるレベルに到達するか、または所望されるファージ粒子またはファージが、バックグラウンドのファージ粒子またはファージと比較してもはや富化されないまで使用され得る。
【０２７５】
富化された抗体ファージ粒子またはファージもまた、さらなる検出技術（例えば、発現プラーク（またはコロニー）リフト）を用いてスクリーニングされ（本明細書中で参考として援用される、例えば、ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２：７７８−７８２（１９８３）を参照のこと）、これにより、同じまたは別の結合パートナーが、プローブとして使用される。スクリーニングは、さらなるアッセイ（例えば、触媒活性に対する）を使用し得、このアッセイは、インサイチュで、所望される特徴を有するプラーク発現特異的結合対メンバーを検出するために使用される。このスクリーニングプロトコルから得られたファージ粒子またはファージは、細胞中に感染され、増殖され、そしてファージ粒子またはファージＤＮＡが単離され、そして配列決定され、そして／または原核生物または真核生物における遺伝子発現のために意図されるベクター中に再クローン化され、大量の選択された特異的結合対メンバーを得た。
【０２７６】
別の実施形態において、ライブラリーにコードされる特異的結合対メンバー（または上記特異的結合対メンバーを含む複数の鎖）が、宿主細胞の細胞質外区画（通常、細胞周辺腔）に輸送され、プロセシングおよび／または適当なアセンブリを促進する。所望される特異的結合対メンバーの細胞外質輸送が使用される場合、特異的結合対メンバーをコードする配列が、適切な転写シグナルおよび翻訳シグナルならびに成熟鎖をペリプラズムに指向するシグナルペプチドリーダーに隣接してクローン化される。上記のように、少なくとも１つの鎖が、ファージコートタンパク質と共に融合タンパク質としてクローン化され、その結果、そのファージコートタンパク質は、実質的に、親和性富化プロトコルにおいて使用される標的に結合する、目的の特異的結合対メンバーの能力を妨げない。
【０２７７】
この実施形態の好ましい実施例は、バクテリオファージｆｄのマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩのＮ末端領域における、特異的結合対の配置である。ファージに取り込まれる前に、ｐＩＩＩは、宿主細胞の内膜に存在し、Ｎ末端がペリプラズムに突出する。この構造において、ｐＩＩＩのＮ末端における特異的結合対メンバーのポリペプチドは、目的の特異的結合対メンバーを構成する他のポリペプチド鎖への結合に利用可能である。次いで、この複合体が細胞から出ると、この複合体は、成熟ファージ粒子またはファージ中に取り込まれ、そしてそのＣ末端は、ファージ粒子またはファージのコートにおいて包埋される。
【０２７８】
この実施形態において、ポリヌクレオチドの合成および増幅は、上記と同様であり、次いで、コートタンパク質をコードするベクター配列中またはこの近傍でクローン化され、ここでこのベクターは、糸状ファージ（ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、Ｍ１３など）であるかまたはそれに由来する。好ましい実施形態において、糸状ファージは、ｆｄ−ｔｅｔである。このファージベクターは、ファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩコートタンパク質のような）をコードする遺伝子の５’領域に位置するクローニング部位を含むように選択される。適切なベクター（例えば、以下に記載されるｆｄ−ｔｅｔＢ１）が、異種配列の方向付けられたクローニングを可能にし、その結果、異種配列が、成熟コートタンパク質のＮ末端においてまたはその近くで発現される。
【０２７９】
ライブラリーが、ドナー細胞由来のポリヌクレオチド（例えば、ＶH領域）を、コートタンパク質遺伝子（例えば、遺伝子ＩＩＩ、「ｇＩＩＩ」）のクローニング部位中でクローン化することにより構築される。例えば、ＶHドメインのクローン化された配列は、集合されたファージ粒子またはファージの外側の、アクセス可能表面上に、成熟コートタンパク質のＮ末端に融合されるポリペプチドまたはタンパク質として最終的に発現される。
【０２８０】
所望されるタンパク質は、多鎖（ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｉｎ）タンパク質（例えば、抗体またはその結合フラグメント）である場合、ファージコートタンパク質中にクローン化されない鎖をコードするポリヌクレオチドが、第一の鎖コートタンパク質ライブラリーを含むベクターの適切な部位（以下に記載されるような）中に直接クローン化され得るか；または、好ましくは、引き続く鎖は、異なるプラスミドベクターにおいて分離ライブラリーとしてクローン化され得、増幅され得、そして引き続き、フラグメントは、第一の鎖コートタンパク質ライブラリーベクター中に組み込まれる。例えば、第一の鎖が、抗体重鎖またはその結合フラグメントである場合、軽鎖ＶL  ｃＤＮＡ配列の最終的な行き先は、コートタンパク質遺伝子におけるＶH配列をすでに含むベクター中であり、従って、単一のベクター中で、ＶHおよびＶL 配列がランダムに再結合する。
【０２８１】
所望される多鎖タンパク質（例えば、ＶL）の第２鎖または引き続く鎖がクローン化され、その結果、宿主細胞のペリプラズム中に分泌を指向するシグナルペプチドリーダー配列と共に発現される。例えば、いくつかのリーダー配列が、以下における抗体の配列の分泌を指向することが示された：Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＯｍｐＡ）（Ｈｓｉｕｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：９９１−９９５（１９８６））、ｐｅｌＢ（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８））、ｐｈｏＡ（ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４３（１９８８））、β−ラクタマーゼ（Ｚｅｍｅｌ−ＤｒｅａｓｅｎおよびＺａｍｉｒ，Ｇｅｎｅ  ２７：３１５−３２２（１９８４））、およびＡｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．およびＳｉｍｏｎ，Ｍ．（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６７巻、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）およびＫａｙ，Ｂ．Ｋ．、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（編）、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）において記載されたもの（これらの各々が参考として本明細書中に援用される）。
【０２８２】
一般に、ファージコートタンパク質（例えば、糸状ファージｆｄのｐＩＩＩ）を利用した首尾良いクローニングストラテジーは、以下を提供する：（１）全長サイズ（またはほとんど全長サイズの）コートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩ）のＮ末端に融合されるタンパク質鎖（または所望されるタンパク質が、多鎖化される場合の第一のポリペプチド鎖、例えば、ＶH鎖）の発現および細胞周辺腔に突出する鎖を含み、そして第２または引き続く鎖（例えば、Ｆａｂフラグメントを形成するためのＶL）との相互作用に利用可能であるＮ末端と共に、宿主の内膜（ここでコートタンパク質のＣ末端の疎水性ドメインがこの膜に融合タンパク質を係留する）への輸送（従って、第２または引き続く鎖は、コートタンパク質に付着される）；ならびに（２）第２または引き続く、ポリペプチド鎖（例えば、ＶL）が存在する場合のそれらの適切な発現およびペリプラズムの可溶性区画へのこの鎖の輸送。
【０２８３】
所望されるクローンの親和性富化に関する１つの実施形態において、約１０3〜１０4個のライブラリー等価物（ライブラリー等価物は、各組換え体の１つである−−１０9個のメンバーのライブラリーの１０4個の等価物は、１０9×１０4＝１０13個のファージ粒子またはファージである）が、所望される特定の結合対メンバー（例えば、抗体）が探索される標的と共にインキュベートされる。標的は、親和性富化スキームに適切ないくつかの形態の１つである。１つの実施例において、標的は、表面または粒子上に固定化され、抗体結合部位との自由な相互作用を可能にするために、表面から十分に離れて標的を保持するために十分な長さ（例えば、３〜１２炭素）の留め具（ｔｅｔｈｅｒ）により、必要に応じて係留される。次いで、抗体を保持するファージ粒子またはファージのライブラリーが、一般に、例えば以下に示される当該分野で周知の手順に従って、固定化された標的においてパニングされる：Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．およびＳｉｍｏｎ，Ｍ．（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２６７巻，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６），Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（編），Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）。
【０２８４】
標的の提示の第２の実施例は、（再び、必要に応じて、いくつかの長さの留め具を用いて）認識可能なリガンドに結合される標的である。このようなリガンドの特定の例は、ビオチンである。そのように修飾された標的は、ファージ粒子またはファージのライブラリーと共にインキュベートされ、そして結合が溶液中で、両方の反応物により起こる。次いで、得られた複合体は、ビオチン部分を介してストレプトアビジン（またはアビジン）に結合される。ストレプトアビジンは、プラスチックプレートのような表面においてまたは粒子において固定化され得、この場合、複合体は、物理的に保持されるか；またはストレプトアビジンは、蛍光体を用いて標識され得、例えば、探索手順（例えば、蛍光活性化細胞ソーターにおいて）により、検出および／または単離のために活性ファージ／抗体をタグ化する。
【０２８５】
１つの実施形態において、所望の特異性を有さないファージ粒子またはファージ保有抗体を、種々の手段（例えば、洗浄）によって除去する。必要とされる洗浄の程度およびストリンジェンシーは、目的の特異的な結合対のメンバーの各々に対して決定される。特定の程度の制御は、結合インキュベーションそして引続く洗浄の条件を調節することによって、回収された抗体の結合特徴に対して発揮され得る。洗浄の温度、ｐＨ、イオン強度、二価陽イオンの濃度、ならびに体積および持続時間を、ハプテンに対する特定の範囲内の親和性の抗体について選択する。遅い解離速度に基づく選択（これは、通常高い親和性の指標である）が、最も実用的な方法である。これは、飽和量の遊離したハプテンの存在下における連続したインキュベーション、または洗浄の体積、数および長さを増加させるかのいずれかによってなされ得る。各場合において、解離した抗体−ファージの再結合が妨げられ、そして時間が増加するにつれて、ますます親和性の高い抗体−ファージが、回収される。
【０２８６】
特定の触媒活性を有する抗体は、反応物（基質および中間体）に対して高い親和性を有するが生成物に対して低い親和性を有する抗体の群の中で、富化され得る。これらの特徴を有する抗体を富化するための二重スクリーニングは、特定の反応を触媒する抗体を見出す際に有用であり得る。さらに、特定の切断反応をし得る触媒抗体がまた、選択され得る。そのような反応の１つの分類は、分子からの特異的末端基の切断である。例えば、特異的アミノ酸をペプチドの末端から切断する触媒抗体は、ペプチドを固定化し、結合を促進するが切断は促進しないことが予測される条件下（例えば、末端基の性質および切断反応に依存する、低い温度、特定のイオン強度、ｐＨ、陽イオン濃度など）で抗体ライブラリーをパニングし、そして、続いて洗浄することによって選択され得る。これは、末端基を認識する抗体が結合し固定されるのを可能にし、そしてこの抗体群から、切断が可能ば抗体が得られる。切断可能な抗体を見出すために、条件は、切断に好ましい条件にシフトされる。この工程は、固定化ペプチドがないそれ自身の切断が可能な抗体−ファージを放出する。
【０２８７】
これを達成する代替的な方法は、切断される結合（例えば、非ペプチド結合）とは異なる結合にその末端基を結合させることによって、特異的末端基に結合する抗体についてパニングすることである。切断条件下において適切な結合を介して結合された末端基上での（第１のスクリーニング由来の陽性ファージの）引続くパニングによって、非結合画分は、所望の触媒活性を有する画分について富化される。
【０２８８】
固定化された標的から活性な抗体−ファージ粒子またはファージを溶出するために、適切なストリンジェンシーでの洗浄後、結合した（活性な）ファージ粒子またはファージが、ｐＨをシフトさせて溶出することによって回収され得る。例えば、ｐＨ２またはｐＨ１１を使用し得る。これが、次いで中和され、そして溶出されたファージは、宿主細胞を感染または形質転換することによって増幅される。次いで、細胞を、テトラサイクリン耐性コロニーとして増殖させる。このコロニーをすくいとり、そして溶出されたファージを、以前のような標準的な手順によって精製する。次いで、これらのファージを別の回の親和性富化（パニング）に使用し、そして所望のレベルの富化が達成されるか、または標的ファージがバックグラウンドのファージ粒子またはファージと比較してもはや富化されなくなるまで、このサイクルが反復される。個々のクローンを単離するために、最終回のパニングおよび溶出由来のファージ粒子またはファージを、細胞に感染させるか、または、それらのＤＮＡを細胞に形質転換し、そして寒天（通常Ｌアガー）および抗生物質（通常ｔｅｔ）上で増殖させて十分に隔てられた個々のコロニーを形成させる（これらの各々は、ＶHおよびＶL配列の両方を有するベクターを保有するクローンである）。各コロニーから押し出されたファージ粒子またはファージ由来の一本鎖ＤＮＡが単離され得、そしてＶHおよびＶLフラグメントをコードするＤＮＡが配列決定される。複製形態のファージＤＮＡ（二本鎖）が、標準的な手段によって単離され得、そして、クローニング部位（ＶHおよびＶL配列）中のＤＮＡが、スクリーニングプロセス中で選択された特定の抗体をより多量に得るための、原核生物または真核生物中での遺伝子産物発現のために設計されたベクターへ、再クローニングされ得る。
【０２８９】
標的リガンドによって認識される抗体を有するとして同定されたファージは、使用される特定のファージベクターに適切であるとして増殖される。ｆｄ−ｔｅｔに関して、これは、抗生物質（Ｔｅｔ）選択を用いたリッチ培地（例えば、Ｌ−ブロス）の液体培養中で実施される。ファージが収集され、そしてＤＮＡが調製され、標準的な方法によって配列決定されて特定の抗体のＤＮＡおよびアミノ酸配列が決定される。
ＤＮＡは、適切な真核生物または原核生物の発現ベクターに再クローニングされ得、そして多量のタンパク質の生成のために適切な宿主にトランスフェクトされ得る。抗体は、標準的な手順を用いて発現系から精製される。抗体の結合親和性は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．およびＳｉｍｏｎ，Ｍ．（編），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６７巻、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（編）、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）に記載されるように、標的抗原または触媒活性を用いる周知の免疫アッセイによって確認される。
【０２９０】
別の実施形態において、所望の特異的結合対のメンバーを提示するファージ粒子またはファージは、以下のようにアフィニティー精製される：約１０3〜１０4のファージ粒子またはファージのライブラリー等価体を、１μｇの精製された抗体と４℃で一晩反応させる。この混合物は、以下のような手順によってパニングされる。ポリスチレンペトリプレートが、１ｍｌのストレプトアビジン溶液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．６、０．０２％  ＮａＮ3中１ｍｇ／ｍｌ）を用いてコーティングされ、そして４℃で一晩インキュベートされる。次の日、ストレプトアビジン溶液を除去する。このプレートを１０ｍｌのブロッキング溶液（３０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．２、０．０２％ＮａＮ3中３μｇ／ｍｌのストレプトアビジン）で満たし、そして室温で２時間インキュベートする。２μｇのビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＲＬ）が抗体反応ライブラリーに添加され、そして４℃で２時間インキュベートされる。パニングの直前に、ブロッキング溶液をストレプトアビジンでコーティングされたプレートから除去し、そしてこのプレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いて３回洗浄する。次いで、抗体反応ライブラリーをこのプレートに添加し、そして室温で３０分間インキュベートする。ストレプトアビジンでコーティングされたアガロースビーズ（ＢＲＬ）をまた、このアフィニティー精製に使用し得る。このライブラリー溶液を除去し、そしてこのプレートを６０分間かけてＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いて１０回洗浄する。結合したファージを、溶出緩衝液（１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１Ｎ  ＨＣｌ、グリシンを用いて２．２に調整されたｐＨ）をペトリプレートに添加し、そして１０分間インキュベートして免疫複合体を解離させることによって除去する。溶出物が取り出され、２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ未調整）を用いて中和され、そして対数期のＦ’含有細菌細胞の感染に使用される。次いで、これらの細胞はテトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレートにプレートされ、そして３７℃で一晩増殖される。ファージ−粒子またはファージは記載されるようにこれらのプレートから単離され、そしてアフィニティー精製プロセスがを２〜３回反復された。最終回の精製後、溶出物の一部を使用して細胞を感染させ、そしてＬＢテトラサイクリンプレートに低密度でプレートする。個々のコロニーを２ｍｌのＬＢテトラサイクリンを含む培養チューブに移し、そして飽和するまで増殖される。ファージまたはファージミドのＤＮＡは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎに対して設計された方法（ＭａｒｄｉｓおよびＲｏｅ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：８４０−８５０（１９８９））を用いて単離され、これは、９６ウェルマイクロタイタープレートを使用する。一本鎖ＤＮＡを、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およびオリゴヌクレオチド配列決定プライマー（５’−ＣＧＡＴＣＴＡＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＣＴ−３’）（これは、ｆｄＴｅｔＢ１の第２のＢｓｔＸＩ部位の４０ヌクレオチド３’側に位置する配列に相補的である）を用いるジデオキシ法によって配列決定する。
【０２９１】
本発明者らは、新規で非常に大きな抗体ファージライブラリーの構築に取り組むために、以下の多数の変数を考慮した：（ｉ）プライマーの設計を、最大の多様性を維持するために、可変性遺伝子のプールの増幅に対して最適化した；（ｉｉ）高効率の二工程クローニング方法を、非常に大きな未刺激ライブラリーを得るために開発した；（ｉｉｉ）選択されたクローンの迅速な下流の分析を可能にするように抗体形式および適合性のクローニングベクターを選択した。
【０２９２】
可能な限りの多くの異なるヒト重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子セグメントにアクセスすることを達成するために、オリゴヌクレオチドプライマーの新規なセットを開発し（表Ｉ）、その設計は、Ｖ−ｂａｓｅによって提供される最も最近の配列情報に基づいた。
【０２９３】
プライマーは、増幅されなければならない特異的なＶ遺伝子ファミリーにヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントの各５’または３’末端に基づくコード領域に少なくとも７０％の相同性を有する、１つまたはいくつかのコンセンサス配列に対して設計された。プライマーは、以下に記載されるＰＣＲ条件を用いて少なくとも１つのＶ遺伝子セグメントを増幅し、そして１つの実施形態は、Ｆａｂ発現のために、ベクター中にクローニングのために適切に配置された制限部位が追加された。
【０２９４】
プライマーは、全ての通常使用されるＶ遺伝子セグメントを効率的に増幅させるべきである。さらに、本発明の大きなサイズのＦａｂライブラリー（多様性が１０10を超える）を得るために、本発明者らは、二工程クローニング手順を使用した：重鎖可変遺伝子および軽鎖可変遺伝子をまず、消化されたＰＣＲ産物として別々にクローニングし、次いで、制限フラグメントのクローニングによって連結し、大きなＦａｂフラグメントのライブラリーを形成させた。このクローニング手順は、インビボ組み換え系としてしばしば関連するＤＮＡ不安定性を回避しながら、消化されたＰＣＲ産物の比較的非効率な直接クローニングよりも、ライブラリーの構築に対してより効率的な方法であるべきである（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３，３２４５−３２６０）。
【０２９５】
Ｆａｂ形式で抗体フラグメントの段階的なクローニングを可能にする新規ファージミドベクター（ｐＣＥＳｌ（図１））を構築した。このベクター系において、可変性の重鎖領域遺伝子を、ＶH遺伝子フラグメントとしてクローニングし；このベクターは、ヒトγ−１  ＣH1ドメインを有するすべてのＦａｂ’を供給する。ＶH遺伝子フラグメントのベクターへの挿入によって形成されるＶHＣH1は、精製および検出（固定化された金属アフィニティークロマトグラフィーに対するヒスチジンテイル（Ｈｏｃｈｕｌｉら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，１３２１−１３２５）およびｃ−ｍｙｃ誘導タグ（Ｍｕｎｒｏら、Ｈ．Ｒ．（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４６，２９１−３００））のための２つのタグ、続くアンバー終止コドン（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４１３３−４１３７）および糸状ファージｆdの小さい（ｍｉｎｏｒ）コートタンパク質ＩＩＩ）に、（ベクター中で）融合される。抗体軽鎖は、ファージ粒子上のＶHＣH1を用いた選択および組立てに指向される、全長ＶLＣLフラグメントとしてクローニングされる。
【０２９６】
１つの実施形態において、このベクターは、二シストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）または二重シストロン性（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）の発現カセットを有する発現カセットを含み、抗体の軽鎖および重鎖またはそれらの融合物の、連鎖した（二シストロンに関して）または独立した（二重シストロンに関して）発現を可能にし、そのような発現カセットは、以下のエレメントからなる：（１）非誘導性および誘導性（例えば、ｌａｃＺ）の発現に適したプロモーター；（２）軽鎖および重鎖のクローニング領域の前のリボソーム結合部位およびシグナル配列；（３）可能であれば（しかし必ずしもそうではない）５〜６のヒスチジンストレッチのようなタグ配列または抗体によって認識される配列、およびアンバーコドンをコードする、重鎖または軽鎖のクローニング領域の後の領域；（４）重鎖または軽鎖いずれかの３’末端への融合物としてコードされるファージコートタンパク質。
【０２９７】
この新規ファージライブラリーは、本質的に任意の標的に対する抗体の貴重な供給源である。抗体は、研究試薬としてあるいは治療抗体または農芸産物の開発のための出発点として使用され得る。配列決定されたゲノムおよび疾患関連遺伝子産物の一覧が急速に拡大するにつれ、インビトロの、そして最終的には自動化される、抗体を単離するための方法に対する必要性がますます拡大している。抗体は、新規遺伝子産物の性質、局在および精製を調べるための理想的なプローブであったし、これからもそうであるので、このライブラリーは、機能的ゲノム学（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）の領域において標的を確認する際ならびに標的を発見する際に重要な役割を果たすことが、予想される。
【０２９８】
バクテリオファージの表面に発現されるタンパク質改変体は、クロマトグラフィー、パニング、または細胞への吸着を用いて、リガンド（抗原）に対するそれらの親和性に基づいて選択されている。アフィニティーマトリックスからの溶出は、リガンド（抗原または関連する化合物）を用いた特異的溶出、または、例えば１００ｍＭトリエチルアミンを用いた非特異的溶出によって、達成されている。洗浄手順は、非特異的に結合したファージを除去する。ファージはマトリックスに結合し、そして、親和性または結合相互作用の性質に従ってマトリックスから溶出される。次いで、特異的に溶出されたファージが、Ｆ線毛を発現する雄性Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の感染に使用され、所望の結合特徴を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むファージの回収を可能にする。
【０２９９】
選択は、特異性に基づいて行なわれるだけではなく、親和性に基づいても行なわれ得る。分離は、１０-8Ｍの解離定数を有する抗体を発現するファージと１０-5Ｍの解離定数を有する抗体を発現するファージとの間のアフィニティークロマトグラフィーによって容易に達成され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８。免疫レパートリからの後者の抗体の単離は、一次免疫応答に特有の親和性を有する抗体がファージ技術を用いて単離され得ることを証明する。
【０３００】
細胞表面抗原に対する抗体はまた、細胞表面上でのファージの選択的吸着によって単離され得る。同様に、細胞を用いたネガティブ選択を組み込み、細胞表面マーカーとの所望されない交差反応性を除去することが可能であり得る。かなりの困難さで、そして未だにほとんど理解されていない方法が存在するので、精製された抗原に対する選択に基づく方法は、可能な場合いつでも使用されるべきである。
【０３０１】
集団中の結合剤に対する任意の選択は、自動的に、より低い経費で高親和性の集団を富化させながら高親和性改変体を選択する傾向である。これは、近年、未刺激レパートリーからの高親和性のヒト抗体の単離を良好に達成するために使用されている。Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７。最適な選択のために、抗原濃度は、親和定数よりも低くあるべきである。予め定義された特徴を有する抗体を単離する場合、これを気にとめておくべきである。種々の選択方法に関する更なる詳細は、本説明の総説中に提供される。
【０３０２】
単離された抗体のそのような大きなパネルを用いて、各個々の抗体−抗原相互作用の反応速度パラメーターを容易に決定するために利用し得る方法を取ることは有用である。本発明者らは、表面プラズモン共鳴を用いて小さいスケールの培養物から調製されるペリプラズム画分中の精製されていない抗体のオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を迅速かつ正確に決定することが可能であることを示した。この方法を用いて、一連の破傷風トキソイド特異的Ｆａｂ’は、一相性の解離を示した。これは、低密度の抗原表面への真に一相性のＦａｂフラグメント結合について予想される。このオフ速度スクリーニングアッセイを用いて、本発明者らは、最良の破傷風トキソイドおよびＭＵＣ１特異的Ｆａｂ’に対するオフ速度が、１０-2ｓ-1〜１０-4ｓ-1の桁であること示す。
【０３０３】
本発明者らは、ウエスタンブロットを用いてペリプラズム画分から得られた選択されたＦａｂ’の完全性を試験した。非還元性サンプル緩衝液中でインキュベートする場合、ＣＨ１ドメインの末端でｍｙｃタグを認識する９Ｅ１０抗体を用いて２つの産物が検出され、主要な産物は、インタクトなＦａｂ分子であり、ここで分子間ジスルフィド架橋は、重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントを共有結合しており；低分子の産物は、ジスルフィド架橋で結合されていない重鎖由来の可能性が最も高い。抗軽鎖血清を用いた分析によって、類似したパターンが明らかになり、そしてこのクローンがほとんど等しいパーセンテージのκおよびλ鎖を使用することが示された（それぞれ、試験された全１３個のうちの６および７個のクローンに見出された）。精製された機能的抗原結合Ｆａｂの還元の際、等量の重鎖および軽鎖が見られたが、非還元状態において、主要な産物は、ジスルフィド結合Ｆａｂ分子によって表され、等量の非共有結合ＶHＣH1およびＶLＣL産物が可視である。選択されたホルモン特異的Ｆａｂ’の生成された収量は、１リットル培養物あたり１６０μｇのＦａｂと１．４３ｍｇのＦａｂとの間で変化し、これは、選択されていないＦａｂに関して見出された範囲と同じであった。
【０３０４】
１４個の抗原特異的Ｆａｂ’のパネル（３個の抗ＭＵＣ１抗体；１１個の抗性腺刺激ホルモン抗体）を、完全に配列決定した。重鎖遺伝子は、４つの最も大きいＶHファミリー（ＶH1、ＶH3、ＶH4およびＶH6）から誘導され；ＶL遺伝子は、４つのＶκファミリーのうちの１つまたは３つのＶλファミリーのうちの１つに属した。鎖の乱雑さは、α鎖特異的クローンのＳＣ＃４Ｇ、α／β−ＬＨ特異的クローンのＬＨ＃２ＨおよびＬＨ＃３Ｇ、そしてβ−ＦＳＨ特異的クローンのＦＳ＃８Ｂに見出され、これらの全ては、異なる重鎖フラグメントと結合された高い相同性のＶκ2軽鎖遺伝子セグメントを使用した。３個の抗ＭＵＣ１抗体は、２つの異なるＶＨおよびＶ６ファミリーに由来する重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を使用し；クローンＭＵＣ＃９は、２つのセグメントの交差を有するＶＨを使用する。
【０３０５】
本発明はさらに、以下の実施例に示される。本開示を考慮して、当業者は、多くの他の実施形態およびバリエーションが、本発明の範囲内でなされ得ることを理解する。従って、本発明のより広範な局面が、以下の実施例の開示に制限されないことが意図される。
【０３０６】
リンパ組織の供給源として、本発明者らは、４人の健康なドナー由来の末梢血リンパ球および胃癌を有する患者から取り出され腫瘍がない脾臓の一部を使用した。Ｂリンパ球を２Ｌの血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｃｑｕｅ勾配で単離した。ＲＮＡの単離に関して、細胞ペレットを、５０ｍｌの８Ｍグアニジニウムチオシアネート／０．１Ｍの２−メルカプトエタノールにすぐに溶解した（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８，５２９４−５２９９）。染色体ＤＮＡを、狭いシリンジ（１．２／０．５ｍｍゲージ）を通過させることによって完全に剪断し、そして不溶性破片を低速度の遠心分離（１５分、２，９３４×ｇ、室温）によって除去した。ＲＮＡを、ＣｓＣｌブロック勾配（５．７Ｍ  ＣｓＣｌ／０．１Ｍ  ＥＤＴＡの３．５ｍｌの層の上に１２ｍｌの上清；全部で４つのチューブ）を介して、ＳＷ４１ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中、１２５，０００×ｇ、２０℃で２０時間遠心分離することによってペレットにした。全ＲＮＡの収量は、約６００μｇであった。ＲＮＡを、エタノール中−２０℃で保存した。
【０３０７】
脾臓から、２ｇの組織を２０ｍｌの８Ｍグアニジニウムチオシアネート／０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール中でのポリトロンを用いたホモジナイゼーションに使用した。体積の合計を、グアニジニウムチオシアネート緩衝液を用いて８０ｍｌに増やし、剪断のために狭いシリンジを通過させ、そして破片を除去した後、ＲＮＡを、ＳＷ２８．１ローター中、８５，０００×ｇ、２０ＥＣで１５時間（５  ＳＷ２８．１チューブ中、３．５ｍｌの５．７Ｍ  ＣｓＣｌ／０．１Ｍ  ＥＤＴＡ上に１２ｍｌの上清）以外は、前記のようにペレットにした。２ｇの組織から、３ｍｇの総ＲＮＡが抽出された。
【０３０８】
ランダムプライムｃＤＮＡを、２５０μｇのＰＢＬ  ＲＮＡを用いて調製し、一方、別個の反応では、３００μｇの脾臓ＲＮＡをテンプレートとして使用した。ＲＮＡを２０μｇのランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下、５分間６５℃で熱変性させ、引き続いて、緩衝液およびＤＴＴを供給業者の指示書（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に従って添加し、そして２５０μＭ  ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、８００Ｕ  ＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）および２，０００Ｕ  ＭＭＬＶ−ＲＴ（２００Ｕ／μｌ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を５００μｌの全量で添加した。４２℃で２時間後、フェノール／クロロホルム抽出によってインキュベーションを停止し；ｃＤＮＡを沈澱させ、そして８５μｌの水に溶解した。
【０３０９】
ヒト重鎖および軽鎖Ｖ領域のＰＣＲ増幅に使用されるオリゴヌクレオチドは、図２に記載される。ＩｇＭ誘導性重鎖可変領域を、ＩｇＭ定常領域プライマーを用いる一次ＰＣＲによって得た。別のＢＡＣＫプライマーおよび組み合わされたＦＯＲプライマーを用いてすべての一次ＰＣＲを行い、最大の多様性を維持した。ＰＣＲ産物を、ＶHの３’末端にアニーリングするＪＨＦＯＲプライマーおよび５’末端にアニーリングするＳｆｉタグ化ＶＨＢＡＣＫプライマーの組み合わせを用いて再増幅し、引き続いてＶHフラグメントとしてクローン化した。κおよびλファミリーの軽鎖Ｖ遺伝子を、定常ドメインの３’末端にアニーリングするＣΚＦＯＲプライマーまたはＣλＦＯＲプライマーのセット、およびＶ領域の５’末端にプライミングするＢＡＣＫプライマーを用いるＰＣＲにより得た。制限部位でタグ化されたプライマーを用いてＤＮＡセグメントを再増幅し、そしてＶΚＣΚフラグメントおよびＶλＣλフラグメントとしてクローン化した。
【０３１０】
ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）および５００ｐＭの各プライマーを使用して、５０μｌの量でＰＣＲを、２８サイクル（９４EＣで１分間、５５EＣで１分間および７２EＣで２分間）行い、２μｌのランダムにプライムされたｃＤＮＡ（６μｇのＰＢＬ  ＲＮＡまたは７μｇの脾臓ＲＮＡに相当する）を各反応の鋳型として用いて、９の異なるＩｇＭ誘導性ＶＨ増幅物を産生した。軽鎖ファミリーについて、６の異なるＶΚＣΚ産物および１１のＶλＣλ産物（ＣΛ2プライマーおよびＣλ7プライマーが各反応で組み合わせた）を得た。すべての産物をＱＩＡｅｘ−ＩＩ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースゲルから精製した。制限部位に導入する再増幅のための投入量として、１００〜２００ｎｇの精製ＤＮＡフラグメントを、１００μｌの反応量において鋳型として使用した。多様性の維持を保証する多量の投入量を、アガロースゲルでの４λｌの「非増幅された」ＰＣＲ混合物の分析によってチェックした。
【０３１１】
一次重鎖の構築物および２つの一次軽鎖レパートリーの構築のために、制限部位が付加されたＰＣＲ産物をゲル精製し、消化した。そして異なるＶHファミリー、ＶκファミリーおよびＶλファミリーは、３グループに組み合わされた。ＶκＣκフラグメントおよびＶλＣλフラグメントをＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩで消化し、そしてファージミドベクターｐＣＥＳ１にクローン化した。ＶHフラグメント（合計で１．５μｇ）をＳｆｉＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、そして９ＵのＴ4−ＤＮＡリガーゼを用いて、室温で１００〜２００μｌの反応混合物中で、４μｇのゲル精製されたベクターｐＵＣ１１９−ＣＥＳ１（ベクターｐＣＥＳ１に類似ではあるが、ｐＩＩＩ遺伝子は欠失されている）に連結した。軽鎖または重鎖プールについて脱塩された連結結合物をＥ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１のエレクトロポレーションに使用し、１本鎖ライブラリーを作製した。
【０３１２】
Ｆａｂライブラリーを、ＶHフラグメントのクローニングによって得た。このフラグメントを、重鎖レパートリーから調製されたプラスミドＤＮＡから、軽鎖レパートリーを含むプラスミド収集物に消化した。ＶHライブラリーの少なくとも３×１０9細菌から単離されたプラスミドＤＮＡを、ＳｆｉＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、ベクター（λおよびκ軽鎖ライブラリーを既に含んだベクター）にクローニングした。Ｖλ＿における内部ＢｓｔＥＩＩ部位を有するクローンを維持するために（この部位は、いくつかのλ生殖系列Ｖセグメントにおいて比較的頻繁であり（Ｐｅｒｓｉｃら、（１９９７）Ｇｅｎｅ  １８７、９−１８）、そしてλファミリーの定常ドメインの１つにもある）、ベクターを含むλ軽鎖レパートリーにおけるＶHＣH1のクローニングがまた、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩクローニング部位を使用して行われ、制限がより少なく偏ったＶλ＿ライブラリーを作製した。
【０３１３】
ヘルパーファージＭ１３−ＫＯ７を有するファージミド粒子のレスキューを、１０−Ｌのスケールで（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７）に従い、接種のためにライブラリーから代表的な数の細菌を使用し、播種の開始の際、各クローン由来の少なくとも１０の細菌の存在を確実にして行った。選択について、１０13ｃｆｕ（コロニー形成ユニット）を、免疫チューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ）（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｔｕｒｂｅｓ、Ｎｕｎｃ）に固定化された抗原と共に使用したか（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７）、または可溶性ビオチン化抗原と共に使用した（Ｈａｗｋｉｎｓら、（１９９２ｂ）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６，８８９−８９６）。固定化された抗原破傷風トキソイドおよびハプテンフェニルオキサゾロン（１７対１の比でＢＳＡに結合される）の量は、後の選択ラウンド（ラウンド１で１００μｇ／ｍｌで始まる）の間に１０倍減少した。溶液中のビオチン化した抗原を用いた捕捉を、ＭＵＣ１のタンデム反復の５つのコピーをコードする１００マーのペプチドについて使用した（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，４３２４−４３３２）か、またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト黄体化ホルモン（ｈＬＨ）、ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）およびそのキメラ誘導体（ｈＦＳＨのβサブユニットに融合された、ｈＣＧ  βサブユニットからのカルボキシ末端ペプチドを含むｈＦＳＨ−ＣＴＰ）と共に使用した。抗原を、業者の推奨に従って、１０対２０分子ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）（分子抗原あたり）の比でビオチン化した。他に述べられない限り、抗原を、１００ｎＭ、３０ｎＭおよび１０ｎＭの濃度で、それぞれラウンド１、２および３の間、選択のために使用した。ｈＦＳＨ−ＣＴＰ５０について、１５および１０ｎＭをそれぞれ使用した；ＭＵＣ１ペプチドについて、５００、１００、２０、および５ｎＭを使用した。
【０３１４】
可溶性Ｆａｂを、上記のように（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７）個々のクローンから産生した。直接コーティングした抗原または固定化されたビオチン化ＢＳＡストレプトアビジンを介して間接的に捕捉されたビオチン化抗原を用いたＥＬＩＳＡにおいて、培養上清を試験した。破傷風トキソイドおよびｐｈＯｘ−ＢＳＡを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3  ｐＨ９．６中で１０μｇ／ｍｌで、１６時間４℃でコーティングした。ｈＣＧおよびｈＦＳＨ−ＣＴＰのコーティングについて、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3  ｐＨ９．６中で４μｇ／ｍｌの濃度を使用した。ビオチン化抗原の捕捉について、ビオチン化ＢＳＡをＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌで、１時間３７℃でコーティングした。ＰＢＳ−０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を用いた３度の洗浄後、プレートを１時間ストレプトアビジン（ＰＢＳ／０．５％ゼラチン中、１０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，４３２４−４３３２）。上記のように洗浄した後、ビオチン化抗原を、４℃で、ＭＵＣ−１ペプチドについては０．５μｇ／ｍｌ、ｈＬＨについては３μｇ／ｍｌ、およびｈＦＳＨについては０．６μｇ／ｍｌの濃度で一晩のインキュベーションに添加した（ｈＣＧへの結合は、直接コーティングした抗原を用いて試験した）。２％（ｗ／ｖ）セミスキムミルクパウダー（Ｍａｒｖｅｌ）（ＰＢＳ中）を用いてプレートを３０分間室温でブロックした。培養上清を、２％（ｗ／ｖ）Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ中で１または５倍に希釈し、そして２時間インキュベートした；重Ｆｄ鎖のカルボキシ末端でｍｙｓペプチドタグを認識する抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（５μｇ／ｍｌ）およびウサギ抗マウスＨＲＰ結合体（ＤＡＫＯ）を用いて、結合したＦａｂを検出した（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７）。最後のインキュベーションに続いて、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびＨ2Ｏ2を、基質として用いて染色を行い、そして半分量の２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4の添加によって停止した；光学密度を、４５０ｎｍで測定した。ＥＬＩＳＡでポジティブシグナルを示すクローン（バックグラウンドの２倍を超える）を、ＰＣＲ産物のＢｓｔＮＩフィンガープリントによって分析した（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７）。このＰＣＲ産物は、オリゴヌクレオチドプライマー、Ｍ１３−ｒｅｖｅｒｓｅおよびＧｅｎｅＩＩＩ−ｆｏｒｗａｒｄを用いた増幅により得た。
【０３１５】
個々のクローンからの可溶性Ｆａｂフラグメントの大規模誘導を、２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含む）において５０ｍｌスケールで行った。３７℃で０．９のＯＤ600まで増殖した後、細胞をペレット化し（２，９３４×ｇで１０分間）、そしてアンピシリンおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む２×ＴＹに再懸濁した。３０℃で３．５時間増殖させた後、遠心分離によって細菌を収集し（上記のように）；ペリプラズム画分を１ｍｌの氷冷ＰＢＳ中に細胞ペレットを再懸濁することによって調製した。２〜１６時間、４℃で回転して転倒混和後、２度の遠心分離工程によってスフェロプラストを除去した：１０分間３，４００×ｇでスピンした後、１０分間、１３，０００×ｇのさらなる遠心分離工程（エッペンドルフ遠心分離機中）によって上清を清浄化した。表面プラスモン共鳴による優れた特異性の決定またはウエスタンブロット研究のために、得られたペリプラズム画分を直接使用した。
【０３１６】
配列決定のために、ＬＢ培地中（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含む）で３０℃で増殖された５０ｍｌの培養物から、ＱＩＡＧＥＮ  ｍｉｄｉ−ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを調製した。ＣＹ５標識プライマーＣＨ１ＦＯＲ（５’ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＧＧＣ−３’）およびＭ１３ＲＥＶ（５’−ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣ−３’）を用いるサーモサイクリングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、配列決定を行った；サンプルをＡＬＦ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。Ｖ遺伝子配列をＶ−ｂａｓｅ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、Ｖ−ＢＡＳＥ，ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９７，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ）またはＳａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｑｕｅｒｙ，１９９７，ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｄａｔａ  Ｓｅａｒｃｈ／ｇｑ−ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）に整列させた。
【０３１７】
尿から精製されたｈＣＧ調製物および免疫アフィニティー精製された組換えｈＬＨ、ｈＦＳＨおよびｈＦＳＨ−ＣＴＰ（ＣＨＯ細胞において産生された）（Ｍａｔｚｕｋら、（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９，１４２９−１４３８；Ｍｕｙａｎら、（１９９６）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０，１６７８−１６８７）を（Ｍｏｙｌｅら、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，８５１１−８５１８）に記載されるようにウエスタンブロット研究に使用した。０．５と１μｇとの間の各ホルモンをレーン毎にロードした；タンパク質を非還元性サンプル緩衝液中に希釈し、そして５分煮沸したか、または熱処理なしでゲルに直接かけた；電気転写（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）によって、タンパク質をブロッティング膜に転写した。引き続いて、ＰＢＳ／４％Ｍａｒｖｅｌ中で１０倍に希釈したペリプラズム画分と共に、ブロットを１６時間室温でインキュベートした。抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（５μｇ／ｍｌ）および４，０００倍に希釈した抗マウスアルカリホスファターゼ結合体（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、基質、５−ブロモ−１−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）およびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を視覚化（ｖｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎ）のために使用して、結合したＦａｂを検出した。
【０３１８】
Ｆａｂの特異性を、表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００、Ｂｉａｃｏｒｅ）によって、さらに特徴付けた。組換えｈＬＨ、ｈＦＳＨおよび尿中のｈＣＧを、ＮＨＳ／ＥＤＣキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、ＣＭ−ｃｈｉｐのフローセル上に固定化し、ｈＬＨについて１９０６ＲＵ、ｈＦＳＨについては１５２９ＲＵおよびｈＣＧについては１３７５ＲＵの表面を得た。ペリプラズム画分をＨｅｐｅｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＨＢＳ；１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中に３倍に希釈し、そして１０μｌ／分の流速を使用して分析した。
【０３１９】
５０ｍｌの培養物からの総細菌タンパク質の再フォールディングによって、Ｆａｂを得た（ｄｅ  Ｈａａｒｄら（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１１：１２６７−１２７６）。簡単には、５０ｍｌの誘導された細菌培養物からペレット化した細胞を８ｍｌの８Ｍ尿素（ＰＢＳ中）に再懸濁した。超音波処理の後、混合物を３０分間回転して転倒混和し、そして不溶性物質を３０分間１３，０００×ｇでの遠心分離によって除去した。上清を４回の緩衝液の変えてＰＢＳに対して透析した。不溶性タンパク質を遠心分離によって除去し、そして０．２μｍ膜を通した濾過より得たフロースルー画分を、直ぐにｈＣＧカラム（ベッド容量０．３ｍｌ）にロードした。供給者（Ｐｉｅｃｅ）の指示に従って、８．４ｍｇのタンパク質の１グラムのＴｒｅｓｙｌセファロースへの結合によって、カラム材料を調製した。カラム（１ｍｌのカラム材料）を、１０容量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５で洗浄し、続いて１０容量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ９．５で、そして２容量の０．９％  ＮａＣｌで洗浄した。結合したＦａｂを２容量の０．１Ｍ  ＴＥＡで溶出し、そして０．５容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５で直ぐに中和した。Ｆａｂ画分を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ３０遠心透析フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して、ＰＢＳに対して透析した。最後に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でゲル濾過分析を行った。２８０ｎｍでの光学密度の測定（Ｆａｂについて１３のモル吸光係数を使用する）によって、収量を決定した。
【０３２０】
結合の速度論を、３つの異なるｈＣＧ表面上の表面プラスモン共鳴によって分析した（ネガティブコントロールとしての別のフローセル上の４９５５ＲＵ  ＢＳＡと共に、固定化された３０３ＲＵ、６１５ＲＵおよび７６７ＲＵ）。粗製のペリプラズム抽出物中に存在するＦａｂを、上記（Ｋａｚｅｍｉｅｒら、（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９４，２０１−２０９）のように、精製抗ヒトＦａｂポリクローナル抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）の高密度の表面について定量化した。ｈＣＧカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって抗ｈＣＧ  Ｆａｂコントロールを精製し（上記のように）、そしてシステムを較正するために使用した。
【０３２１】
Ｆａｂライブラリーを、２工程で構築した。第１の工程において、４名の健康なドナーのＰＢＬ由来の約４×１０8のＢ細胞から、そしておそらくよりひどく変異したＩｇＭ抗体の供給源として、約１．５×１０8のＢ細胞を含む胃癌を有する患者から除去した（腫瘍のない）脾臓のセグメントから、可変領域遺伝子プールを増幅した（Ｒｏｉｔら、（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｇｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ）。このアイソタイプの第１の定常ドメインに位置したオリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅の使用によってＩｇＭ誘導性ＶHセグメントのみを増幅した。これらの産物を、ＶLについてファージミドベクターｐＣＥＳ１に、そしてＶHについてｐＵＣ１１９−ＣＥＳ１にクローン化した（クローニングは、より小さいサイズのベクターにおいてより効率的であり、このベクターにおいて遺伝子ＩＩＩは欠失している）。ＰＢＬおよび脾臓誘導性ＶH、ＶκおよびＶλライブラリーを、別々にクローン化し、多様性を維持し、ＰＣＲフラグメントのクローニングによって作製したライブラリーについての代表的なサイズで１本鎖ライブラリーを得た（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７）：重鎖についての１．７５×１０8の個々のクローン、Ｖκについての９．４×１０7のクローン、およびＶλについての５．２×１０7のクローン。第２の工程において、第１のＶHレパートリーから単離されたプラスミドＤＮＡ由来の重鎖フラグメントを消化し、そして軽鎖レパートリーを含むベクターにクローン化した（ＰＢＬおよび脾臓誘導性レパートリーについて再び別々に）。この効率的なクローニング手順を使用して、ライブラリーを組み合わせ、３．７×１０10の個々のクローンを有するｎａＶｖｅ  Ｆａｂレパートリーを作製した（４．３×１０10組換えクローン、その８６％は、全長Ｆａｂ挿入物を有する）。クローンの７０％は、κ軽鎖を保持し、３０％はλ鎖を保持する。試験された全長Ｆａｂ挿入物を有する２０クローンのすべては、９Ｅ１０抗体を用いたドットブロット分析においてポジティブを記録し、少なくとも０．２ｍｇ／Ｌの可溶性Ｆａｂの発現レベルを示す。
【０３２２】
本発明者らは、異なる抗体での選択によってライブラリーを評価した。第１に、３つのモデル抗原、タンパク質の破傷風トキソイド、ハプテンの２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、２７１−２７５）、およびペプチドのＭＵＣ１からの結果を議論する。破傷風トキソイドに対する３ラウンドのバイオパニングは、一連の４７の破傷風トキソイドに結合するＦａｂにおいて、多様なセットのＥＬＩＳＡポジティブＦａｂを産生し、少なくとも２１は、ＢｓｔＮＩフィンガープリントに関して異なった。同様に、ｐｈＯｘ特異的Ｆａｂの広いパネルを、３ラウンドのパニング後に取り出した；少なくとも２４の異なるクローンを、一連の５０のＥＬＩＳＡポジティブクローンにおいて同定した。ビオチン化ＭＵＣ１ペプチドを有する溶液の捕捉は、３ラウンド後に選択された３７のＥＬＩＳＡポジティブクローンのうちの１４の異なる抗体フラグメントの選択を生じた。
【０３２３】
ライブラリーの性能をアッセイするための抗体のよりストリンジェントな試験パネルとして、本発明者らは、３つの構造的に関連した糖タンパク質に抗体を誘導することを選択した：ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト黄体化ホルモン（ｈＬＨ）およびヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）（（Ｃｏｌｅ，（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３，２２３３−２２４３）に概説される）。これらのホルモンは、９２のアミノ酸残基を有する同一のα鎖を共有するヘテロダイマーであるが、しかし異なる組成および長さのβサブユニットを有する。ｈＣＧのβ鎖は、１４５のアミノ酸残基を含み、そしてｈＬＨからのβ鎖は、１２１残基のみであり、後者はβ−ｈＣＧに対する８５％の相同性を示す。ｈＦＳＨのβ鎖は、１１１アミノ酸のみであり、そしてｈＣＧとの３６％の残基を共有する。ｈＣＧを特異的に検出する抗体が、妊娠試験（Ｃｏｌｅ（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３，２２３３−２２４３）、および癌の診断（Ｍａｓｕｒｅら、（１９８１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．５３，１０１４−１０２０；Ｐｅｐａｐｅｔｒｏｕら、（１９８０）Ｃａｎｃｅｒ  ４５、２５８３−２５９２）に広く使用されている。これらの標的に対する大きなセットの抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して得られたホルモン特異的（特に、ｈＬＨに対する）抗体の限定された数を広げる（Ｃｏｌｅ，（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３，２２３３−２２４３）。精巣癌および膀胱癌の画像化および治療にヒト起源の抗体を使用する場合、これらは有益であり得る（Ｍａｓｕｒｅら、（１９８１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．５３，１０１４−１０２０；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、（１９８０）Ｃａｎｃｅｒ  ４５、２５８３−２５９２）。
【０３２４】
従って、ビオチン化した尿のｈＣＧ、組換えｈＬＨ、ｈＦＳＨおよびｈＦＳＨ−ＣＴＰ（後者は、ＦＳＨのβ鎖に融合されたβ−ｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドを含むキメラ分子である）に対する選択を行った（Ｆａｒｅｓら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，４３０４−４３０８）。３ラウンド対１ラウンドにおいて溶出されたファージ粒子の数の増加に関する濃縮の最も高い程度は、ｈＣＧ（１０，０００倍）について見出され、ｈＦＳＨ−ＣＴＰ（１．０００倍）、ｈＦＳＨ（３００倍）およびｈＬＨ（１５０倍）が続いた。固定化されたホルモンを備えたセンサチップを使用して、選択された集団のポリクローナルファージを結合について試験した（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９６）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７、９７−１０５）。ｈＣＧで選択されたポリクローナルファージは、３つのタンパク質のすべて（すなわち、ｈＣＧ、ｈＬＨおよびｈＦＳＨ）に対しての２および３ラウンドの選択の後に結合を示した。最も強力なシグナルは、ｈＣＧについてみられた。ｈＦＳＨについて３ラウンドの選択されたポリクローナルファージの集団の類似の分析は、ｈＦＳＨ特異的結合の優位を示したが、ｈＦＳＨ−ＣＴＰについての選択は、ｈＦＳＨおよびｈＣＧの両方に対するバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）を生じた。ｈＬＨに対する選択は、ｈＦＳＨおよびｈＣＧに反応性である抗体を産生した。従って、このポリクローナルファージスクリーニングは、選択されたレパートリーにおけるクローンの全体の質を調べるための迅速な試験を提供し、そして、次の選択ラウンドの条件の選択を導くためにもまた使用され得る（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９６）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７、９７−１０５）。
【０３２５】
モノクローナルファージ抗体のＥＬＩＳＡによって、ｈＣＧでの３ラウンドの選択が、ゴナドトロピンについてポジティブなクローンの高い割合（７４％）の単離を実際に生じることが明らかになった。これらのクローンの２７％は、ｈＬＨ交差反応性であった；ストレプトアビジンに対しては反応性ではなかった。ＥＬＩＳＡポジティブクローンのＢｓｔＮＩ−フィンガープリント分析は、高度な多様性（８の異なるパターン）を示した。代表的なｈＣＧ特異的クローン（ＣＧ＃４Ｆとコードされる）およびｈＬＨ交差反応性クローン（ＣＧ＃５Ｃ）から、非精製可溶性Ｆａｂフラグメントを使用して、ＢＩＡｃｏｒｅにおいて、特異性を試験した。クローンＣＧ＃４は、ｈＣＧに対して高い応答を示し、ｈＬＨとｈＦＳＨ−ＣＴＰのいずれに対しても目に見える結合は示さなかった。対照的に、クローンＣＧ＃５Ｃは、ｈＣＧおよびｈＬＨに結合したが、ｈＦＳＨ−ＣＴＰには結合しなかった。非還元形態で異なるホルモンを用いたウエスタンブロットは、クローンＣＧ＃４ＦによるｈＣＧのβサブユニットの特異的な認識を示したが、交差反応性クローンＣＧ＃５Ｃは、ｈＣＧおよびｈＬＨの両方のβサブユニットと反応した。
【０３２６】
ホルモンｈＬＨでの選択は、ｈＬＨ特異的クローンおよびｈＣＧ交差反応性クローンの単離を生じた。ＥＬＩＳＡでの選択ラウンド３からの個々のクローンの検査によって、ｈＬＨ特異的クローンの大きな画分（６９％）、および交差反応性のクローンの小数の群（１６％）が明らかになった；ストレプトアビジン反応性のクローンは、選択されなかった。特定のクローンの群内での、異なる種の大きなアレイ（２１より多い）は、フィンガープリント分析を用いて区別され得たが、すべての交差反応性の種は、単一のパターンを有した。代表的なクローンＬＨ＃２ＨおよびＬＨ＃３Ｇについて、独特のｈＬＨ特異性が確認され、表面プラスモン共鳴において示された；およびウエスタンブロットで示された。ＬＨ＃３Ｇのみが、ｈＬＨのインタクトなα／βヘテロダイマーを認識する。ＥＬＩＳＡにおけるパニング（ｐａｎ）反応性抗体の２つの代表的なクローン（ＬＨ＃１ＣおよびＬＨ＃３Ｆとコードされる）は、ｈＦＳＨ−ＣＴＰ、ｈＣＧおよびｈＨＬとＢＩＡｃｏｒｅで反応し、そして３つのホルモンのすべてからのα鎖と、ウエスタンブロット分析で反応した。
【０３２７】
選択の間、ｈＦＳＨが抗原として使用した場合、ライブラリーから６の異なる抗体を単離した。１つの型（クローンＦＳ＃８Ｂと表される）は、選択された集団に優位であった。このＦａｂのみが、ＢＩＡｃｏｒｅにおいてｈＦＳＨを認識し、そしてウエスタンブロット分析が示したように、特にそのβユニットを認識した。さらに、α鎖結合クローン、ＳＣ＃２Ｂの特異性を、ＢＩＡｃｏｒｅおよびウエスタンブロットにおいて確認した。
【０３２８】
ＦＳＨ−ＣＴＰを用いた選択の際に、クローンにコードされるＳＣ＃２Ｂ、ＳＣ＃２Ｆ、ＳＣ＃２ＧおよびＳＣ＃４Ｇがより詳細に調べられたフィンガープリント分析によって、７個の異なるα鎖特異的Ｆａｂが同定された。組換えＦａｂを検出抗体として用いた免疫ブロット分析によって、α鎖特異性が確認された。
【０３２９】
アフィニティー精製したｈＣＧ反応性Ｆａｂ（ＬＨ＃１Ｃ、ＳＣ＃２Ｂ、ＬＨ＃３ＦおよびＣＧ＃５Ｃ）のアフィニティーおよびオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を決定した。大部分のＦａｂについてのオフ速度は、１０-2ｓ-1および１０-3ｓ-1の桁であった。粗ペリプラズム画分を用いて得られたオフ速度の値は、精製したＦａｂについて見出された値と良く一致した。このことは、未精製のＦａｂフラグメントでのオフ速度スクリーニングの有用性を確認する。親和性（α−サブユニット特異的抗体ＬＨ＃１Ｃおよびβ−サブユニットｈＣＧ／ｈＬＨ−交差反応性抗体ＣＧ＃５Ｃについてそれぞれ、２３ｎＭおよび３８ｎＭ）は、マウス免疫ファージ抗体ライブラリー（Ｈ．ｄ．Ｈ．、Ｂ．Ｋａｚｅｍｉｅｒら、未発表）から選択された抗体の親和性に匹敵し；α鎖特異的Ｆａｂ  ＳＣ＃２Ｂについての２．７ｎＭという最高の親和性は、最良の抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ｈ．ｄ．Ｈ．、Ｂ．Ｋａｚｅｍｉｅｒら、未発表）の値に近づく。
【０３３０】
この手順の目的は、免疫チューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）の表面にコーティングされた抗原に対するファージ−抗体について選択および富化することである。この抗原は、免疫チューブ（例えば、Ｎｕｎｃ−免疫チューブ）にコーティングされ、そしてファージライブラリーと共にインキュベートされる。結合していないファージは洗浄除去され、そして結合しているファージは溶出され、それゆえ、このファージライブラリーは、この抗原に特異的に結合するファージ抗体について富化されることになる。
【０３３１】
この手順の目的は、タンパク質またはペプチドをビオチン化することである。中性以上のｐＨで、１級アミン基は、ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎと反応し、そしてＮ−ヒドロキシスルホスクシミドが遊離される。このタンパク質のＮ末端の遊離したＮＨ2基ならびにリジン（Ｋ）は、このｐＨ範囲においてＮＨＳ−Ｓ−Ｓ−Ｂｉｏｔｉｎと反応する。
【０３３２】
ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎは、約２４．３Å長の伸長したスペーサーアームを有する、独特のビオチンアナログであり、ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎのスペーサーアームは、２２．４Åである。これらの長鎖のアナログは、アビジンまたはストレプトアビジンに対するビオチン化分子の結合に関連した立体障害を減少させる。
【０３３３】
ＮＨＳ−Ｓ−Ｓ−ＢｉｏｔｉｎにおけるＳ−Ｓリンカーの存在は、還元剤（ＤＴＴ、ＤＴＥ、Ｂ−メルカプトエタノール）を用いた結合の破壊を可能にする。ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎは、還元剤に感受性でないビオチン化タンパク質／ペプチドが必要とされる場合に用いられる。
【０３３４】
この手順の目的は、ビオチン化抗原に対するファージ抗体を選択することである。この選択は溶液中で行われ、そして固体表面にコーティングした場合に変性しやすい抗原に対するファージ抗体を選択するために用いられ得る。
【０３３５】
第１に、ビオチン化抗原は、ファージ抗体ライブラリーと共にインキュベートされる。ストレプトアビジンでコーティングしたＤｙｎａｂｅａｄ（Ｄｙｎａｌ）の添加後、抗原−抗体複合体のビオチンは、ストレプトアビジンに結合する。このＤｙｎａｂｅａｄ−抗原−抗体−複合体は、磁石（例えば、Ｄｙｎａｌ磁石）を用いて取り出され、それゆえ、特異抗体を含むはずである。
【０３３６】
この手順の目的は、細胞膜中に存在する抗原に結合する抗体を、接着性の増殖中の細胞または懸濁している細胞を用いてライブラリーから選択することである。この方法は、（腫瘍）細胞株上に発現された標的に対する抗体の選択に用いられ得る。
【０３３７】
細胞全体、細胞小器官または膜画分を、多様性の高いファージ抗体レパートリー（例えば、本発明のＦａｂライブラリー（ＰＥＧ沈澱によって濃縮される））と共にインキュベートすることによって、細胞膜の表面上で曝露された分子のうちの１つに対して適切な抗体のみが（またはこの抗体が優先的に）保持され、一方、結合していないファージ抗体は、細胞、細胞小器官または膜画分に結合した抗体から（細胞、細胞小器官または膜画分を溶液中の分子から分離するための当該分野で周知の方法によって）分離される。保持されるファージ集団は、細胞関連分子について特異的であるクローンについて富化される。原則として、以下の因子は、個々のクローンの富化に対して正に影響を与える：親和性、抗原の量、およびＴＧ１宿主に対する抗体構築物の低い毒性。
【０３３８】
この手順の目的は、Ｅ．ｃｏｌｉ．のペリプラズムから可溶性抗体フラグメントを調製することである。ペリプラズムでは、以下の通りである：細胞質または上清においてよりもプロテアーゼ活性が低い、夾雑タンパク質が低い、そして抗体がより濃縮されている。それゆえ、ペリプラズムの調製物は、培養上清よりも安定でかつ純粋である。
【０３３９】
ＩＰＴＧを有する低グルコース培地中でのファージミド含有細菌培養物の誘導の結果として、可溶性抗体フラグメントが産生され、そしてペリプラズムに対して指向され、ペリプラズムでは、このフラグメントは、４時間以内に濃縮される。これらの環境における一晩の培養は細菌の膜を漏出性にし、そして抗体が上清中に見出される。ペリプラズム画分の調製のために、細菌の細胞壁を冷浸透圧ショック（氷冷ＴＥＳ）によって最初に溶解させ、次いで、低浸透強度の冷却溶液（ＴＥＳ／Ｈ2Ｏ）中に迅速に希釈させる。ＥＤＴＡは、外膜をより透過性にし、そして冷たいことによってプロテアーゼ活性を阻害する。続いて、細菌細胞をスピンダウンし、次いで、上清がペリプラズムタンパク質を含む。
【０３４０】
ペリプラズム画分中の抗体は「粗抽出物」として用いられ得るか、またはこの抗体は、当該分野で周知の従来の手段（例えば、第５．６節および第５．７節に記載される手段）によって精製され得る。
【０３４１】
この手順の目的は、Ｈｉｓ６タグで標識された抗体を、実施例６．１８において記載された通りに作製されたＦａｂのペリプラズム画分から精製することである。
【０３４２】
ネイティブな条件下での組換え６×Ｈｉｓタグ化タンパク質の精製のための、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）：組換えヒスチジンタグ化タンパク質は、金属（大部分は、Ｎｉ2+またはＣｏ2+）に対するヒスチジンの遊離のＮ原子の配位を通してキレート化金属含有樹脂上に捕捉される。夾雑タンパク質および他の細胞構成要素を洗浄除去した後、ｈｉｓタグ化タンパク質は、金属イオンに対するヒスチジン残基の結合について競合するイミダゾールを用いて樹脂から特異的に溶出される。
【０３４３】
本発明は、例示された実施形態による範囲に限定されない。これらの実施形態は、本発明の１つの局面の例示であることが意図され、そして機能的に等価である組成物および方法は、本発明の範囲内にある。実際、本発明の実施における多数の改変および変更が、本発明の好ましい実施形態を考慮すれば、当業者の心に浮かぶことが予測される。結果として、本発明の範囲に対してかけられるべき唯一の限定は、添付の特許請求の範囲において明らかな限定である。
【０３４４】
本明細書の本文内で引用される全ての参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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