(57)【要約】【解決手段】半導体上に反応ゲート絶縁部として絶縁層が形成された電界効果型トランジスタの絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機単分子膜を形成し、有機単分子膜に塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡを、反応性官能基を介して結合させ、プローブＤＮＡに対し、ターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーション反応させ、ハイブリダイゼーション反応により形成された二本鎖ＤＮＡを金属カチオンで修飾した後、金属カチオンで修飾された二本鎖ＤＮＡを緩衝液に接触させて、ハイブリダイゼーション反応によるプローブＤＮＡの負電荷の変化により生じる絶縁層の表面電位変化を検出する。【効果】本発明のＤＮＡセンシング方法は、オンチップでの高感度のＤＮＡセンシングとして非常に効果的であり、完全相補配列を有するＤＮＡ及び一塩基多型等のミスマッチ配列のＤＮＡの解析を、高感度かつ高精度で実施することができる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む絶縁層が形成された電界効果型トランジスタの上記絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機分子で構成された有機単分子膜を形成し、該有機単分子膜に塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡを、上記反応性官能基を介して、直接又は架橋分子を介して結合させ、上記プローブＤＮＡに対し、該プローブＤＮＡの完全相補配列を有するＤＮＡ又は該完全相補配列に対して１〜３個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡであるターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーション反応させて、該反応によるプローブＤＮＡの負電荷の変化により生じる絶縁層の表面電位変化を検出するＤＮＡセンシング方法であって、
上記ハイブリダイゼーション反応により形成された二本鎖ＤＮＡを金属カチオンで修飾した後、該金属カチオンで修飾された二本鎖ＤＮＡを緩衝液に接触させて、上記表面電位変化を検出することを特徴とするＤＮＡセンシング方法。
【請求項２】
上記金属カチオンが、希土類金属カチオンであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡセンシング方法。
【請求項３】
上記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水であることを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡセンシング方法。
【請求項４】
上記有機単分子膜が、アミノ系官能基、カルボキシル系官能基又はメルカプト系官能基を有する炭素数３〜２０の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランの単分子膜であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載のＤＮＡセンシング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電界効果型トランジスタを用いたＤＮＡのセンシング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンシングデバイスは医療・環境・創薬分野において広く利用されている。特に、昨今のゲノミクス分野の発展に伴い、遺伝子治療・テーラーメード医療等を目的としたＤＮＡセンシングデバイスの開発が望まれている。
【０００３】
従来、ＤＮＡセンシングにおいては、レーザースキャナーなどを用いた蛍光・発光によるセンシングが主流であり、最近では電気化学反応を用いた電流・電位検出も試みられるようになってきている。また、半導体検出においては、従来のシリコン窒化膜／シリコン酸化膜／シリコン構造を有するイオン感応性電界効果型トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）をベースとしているものが挙げられる。
【０００４】
しかしながら、これらの方法において、ＤＮＡの検出・測定は、電極部の実行表面積の増加や反応物質の固定化量の増加、増感ラベル剤・インターカレーター分子の導入といった量的な効果によるものがほとんどであり、デバイス自体の改良例は非常に乏しい。また、レーザースキャナーを用いた検出や電気化学検出は、集積化・微細化によって応答感度（強度、応答速度など）が減少する傾向があり、問題点を抱えている。
【０００５】
このように、ＤＮＡセンシングにおいて、オンチップ化、微小化、集積化といった要求を満たす上で、また、一塩基多型などを検出する上で、最大限の効果を引き出すには更なる改良が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−４００７号公報
【特許文献２】特開２００５−９１０１４号公報
【特許文献３】特開２００５−２１８３１０号公報
【特許文献４】特開２００７−２３２６８３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄａｉｓｕｋｅ  Ｎｉｗａ，Ｔａｋａｙｕｋｉ  Ｈｏｍｍａ，Ｔｅｔｓｕｙａ  Ｏｓａｋａ，Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１Ａ／Ｂ，２００４，ｐｐ．Ｌ１０５−Ｌ１０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、有機単分子膜を一体化させた有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を有する半導体デバイスによる高感度のＤＮＡセンシングを可能にするＤＮＡセンシング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、プローブＤＮＡ／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として有する半導体デバイスにより、塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応によるプローブＤＮＡの負電荷の変化により生じる絶縁層の表面電位変化を検出する際、ハイブリダイゼーション反応により形成された二本鎖ＤＮＡを希土類金属カチオン等の金属カチオンで修飾し、これをリン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液に接触させて、上記表面電位変化を検出することにより、従来に比べて、高い感度で検出が可能となることを見出し、本発明をなすに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、以下のＤＮＡセンシング方法を提供する。
［１］  半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む絶縁層が形成された電界効果型トランジスタの上記絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機分子で構成された有機単分子膜を形成し、該有機単分子膜に塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡを、上記反応性官能基を介して、直接又は架橋分子を介して結合させ、上記プローブＤＮＡに対し、該プローブＤＮＡの完全相補配列を有するＤＮＡ又は該完全相補配列に対して１〜３個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡであるターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーション反応させて、該反応によるプローブＤＮＡの負電荷の変化により生じる絶縁層の表面電位変化を検出するＤＮＡセンシング方法であって、
上記ハイブリダイゼーション反応により形成された二本鎖ＤＮＡを金属カチオンで修飾した後、該金属カチオンで修飾された二本鎖ＤＮＡを緩衝液に接触させて、上記表面電位変化を検出することを特徴とするＤＮＡセンシング方法。
［２］  上記金属カチオンが、希土類金属カチオンであることを特徴とする［１］記載のＤＮＡセンシング方法。
［３］  上記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水であることを特徴とする［１］又は［２］記載のＤＮＡセンシング方法。
［４］  上記有機単分子膜が、アミノ系官能基、カルボキシル系官能基又はメルカプト系官能基を有する炭素数３〜２０の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランの単分子膜であることを特徴とする［１］乃至［３］のいずれかに記載のＤＮＡセンシング方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＤＮＡセンシング方法は、オンチップでの高感度のＤＮＡセンシングとして非常に効果的であり、完全相補配列を有するＤＮＡ及び一塩基多型等のミスマッチ配列のＤＮＡの解析を、高感度かつ高精度で実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスを示す断面図であり、（Ａ）は電界効果型トランジスタ、（Ｂ）は電界効果型トランジスタのゲート電極の絶縁層上に有機単分子膜を形成した状態、（Ｃ）は有機単分子膜に架橋分子を介してプローブＤＮＡが固定化された状態を示す。
【図２】オンチップデバイスのユニット構成例を示し、（Ａ）は部分平面図、（Ｂ）はその拡大断面図である。
【図３】本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスを用いたハイブリダイゼーション反応に基づくＤＮＡ検出の概念図である。
【図４】実施例１，２で測定した、電流−電圧曲線から求めた電圧応答の差を示すグラフである。
【図５】実施例１，２で測定した、発光波長２８０ｎｍによるＴｂ3+の蛍光スペクトルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について更に詳しく説明する。
本発明における半導体ＤＮＡセンシングデバイスは、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む絶縁層（第１の絶縁層）が形成された電界効果型トランジスタの上記絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機分子で構成された有機単分子膜（第１の有機単分子膜）を形成し、有機単分子膜に塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡを、上記反応性官能基を介して、直接又は架橋分子を介して結合させてなる、プローブＤＮＡ／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである。
【００１４】
本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスは、プローブＤＮＡ／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造（架橋分子を介している場合は、架橋分子が結合したプローブＤＮＡ／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造）を検出部として備えるが、このうち、絶縁層／半導体構造部分は、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む絶縁層が形成された電界効果型トランジスタを利用することができ、その構成は、従来公知のものを利用することができる。この電界効果型トランジスタとしては、例えば、図１（Ａ）に示されるようなものが例示される。なお、図１中、１はシリコン基板、２はシリコン酸化物又は無機酸化物（ガラス、アルミナなど）を含む絶縁層、４はゲート電極、５はソース電極、６はドレイン電極、７はチャンネル領域を示す。
【００１５】
そして、図１（Ｂ）に示されるように、絶縁層２上に有機単分子膜３が形成される。ここで、本発明においては、基本原理として、絶縁層表面上のＤＮＡハイブリダイゼーション反応に伴う表面電位変化を電気信号として検出する構成とする。なお、上記絶縁層は１０〜１００ｎｍ、特に１０〜５０ｎｍの厚さに形成することができる。
【００１６】
有機単分子膜は、絶縁層上に直接形成される。この有機単分子膜は、有機分子を絶縁層上に気相化学反応又は液相反応によって形成し、その最適化、例えば、有機分子の自己集積化機能によって有機単分子が細密パッキングされた膜が形成される。
【００１７】
この場合、有機単分子膜としては、例えば、反応性官能基、特にアミノ系の官能基（−ＮＨ2、−ＮＨ−、Ｃ5Ｈ5Ｎ−、Ｃ4Ｈ4Ｎ−等）、カルボキシル系の官能基（−ＣＯＯＨ等）又はメルカプト系の官能基（−ＳＨ等）を少なくとも１個含有する炭素数３〜２０の直鎖状炭化水素基（アルキル基等）を有するアルコキシシランを用いることが好適である。これらのアルコキシシランは、特に、絶縁層としてシリコン酸化物が形成されたものを用いた場合、シリコン酸化物と結合させることができるため好適である。
【００１８】
また、アミノ系の官能基、カルボキシル系の官能基、メルカプト系の官能基等の反応性官能基に置換可能な基、例えば−Ｂｒ、−ＣＮ等のアミノ誘導基を有するアルコキシシランを用いて単分子膜を形成後、これらアミノ誘導基をアミノ基に置換する方法で導入することもできる。
【００１９】
なお、絶縁層としてシリコン酸化物が形成されたものを用いる場合、アルコキシシランとしては、密着性等の点でトリアルコキシシランが好ましく、またアルコキシ基としては炭素数１〜３のアルコキシ基（−ＯＲ：Ｒは一価炭化水素基を表す）、特にメトキシ基（−ＯＣＨ3）、エトキシ基（−ＯＣ2Ｈ5）が好ましい。より具体的には、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）3Ｓｉ（ＯＣＨ3）3、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）3Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）3、ＨＳ（ＣＨ2）3Ｓｉ（ＯＣＨ3）3、ＨＳ（ＣＨ2）3Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）3等の反応性官能基を有するトリアルコキシシランが挙げられる。
【００２０】
そして、本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスにおいては、有機単分子膜に塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）が直接又は架橋分子を介して結合されており、例えば、図１（Ｃ）に示されるように、有機単分子膜に塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡ１１が架橋分子１２を介して結合される。
【００２１】
プローブＤＮＡの官能基と、有機単分子膜を構成する有機分子の反応性官能基とが反応して結合し得る組合せの場合には、両者を直接反応させて結合し、固定化することができる。一方、プローブＤＮＡの官能基と、有機単分子膜を構成する有機分子の反応性官能基とを反応させて結合させることができない組合せの場合には、架橋分子を介してプローブＤＮＡを、有機単分子膜を構成する有機分子と結合させることができる。この場合、例えば、反応性官能基としてアミノ基を有する有機分子の単分子膜を用いる場合、例えば、グルタルアルデヒド等の両末端にアルデヒド基を有する有機分子を用い、一方のアルデヒド基を有機単分子膜と、他方のアルデヒド基をプローブＤＮＡのアミノ基と反応させて結合し、固定化することができる。また、反応性官能基としてメルカプト基を有する有機分子の単分子膜を用いる場合、例えば、２，２’−ジピリジルジスルフィドなどを用いて固定化することができる。なお、プローブＤＮＡとしては、塩基鎖のみからなるＤＮＡの他に、アミノ基やメルカプト基などを修飾したＤＮＡを用いることも可能である。
【００２２】
なお、架橋分子は、架橋分子を含む溶液中に電界効果型トランジスタを浸漬し、絶縁層上に形成された有機単分子膜に架橋分子を接触させることで導入可能である。一方、プローブＤＮＡは、プローブＤＮＡが含まれる溶液に電界効果型トランジスタを必要に応じて架橋分子を導入した後に浸漬し、絶縁層上に形成された有機単分子膜に接触させる又は架橋分子に接触させることで導入可能である。
【００２３】
本発明においては、上記電界効果型トランジスタの半導体上に、更に、参照ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第２の絶縁層を形成することができる。この第２の絶縁層の上には、上記プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡのいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜を形成し、この有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることができる。なお、反応ゲート絶縁部と参照ゲート絶縁部とを、電位変化測定において互いに影響を与えない程度に離間させれば、反応ゲート絶縁部の第１の絶縁層と参照ゲート絶縁部の第２の絶縁層とを同一層内に設けることもできる。
【００２４】
図２は有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部９及び参照部８に適用したオンチップデバイスのユニット構成例を示す。なお、図２中、１はシリコン基板、２は絶縁層、１０はテンプレート部である。このデバイスのユニット構成は図示した構成に限定されず、検出部と参照部とは必ずしも１対１の関係で配置する必要はなく、必要に応じて検出部及び参照部の数及び組合せを適宜変更して配置することができる。また、検出部及び参照部は各々数〜数１０μｍのサイズで形成可能である。
【００２５】
参照部の第２の絶縁層上には、プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡのいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜が形成されるが、この有機単分子膜としては、炭素数８〜２２の直鎖状アルキル基又はフッ化アルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜が好ましい。
【００２６】
この場合の有機単分子膜としては、絶縁層上に均一な膜を形成させるため、自己集積化膜であることが望ましい。より具体的には、アルキルシラン：ＣＨ3（ＣＨ2）17Ｓｉ（ＯＣＨ3）3、ＣＨ3（ＣＨ2）17Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）3、フッ素化アルキルシラン：ＣＦ3（ＣＦ2）7（ＣＨ2）2Ｓｉ（ＯＣＨ3）3、ＣＦ3（ＣＦ2）7（ＣＨ2）2Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）3等が挙げられる。また、有機単分子膜としてアルコキシシランを用いる場合、絶縁層がシリコン酸化物で形成されたものが好適である。
【００２７】
なお、第１及び第２の有機単分子膜は、パターニングにより所望の位置に形成することができる。特に、オンチップでの集積化デバイスを形成するためには、有機単分子膜のパターニングが有効である。例えば、検出部の絶縁層表面には、ＤＮＡ固定化のために反応性官能基を有する有機分子で構成された第１の有機単分子膜を、一方で、参照部、更には非ゲート部（テンプレート部）においては、ＤＮＡの非特異的な吸着を避けるために、プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡのいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜をパターニングにより位置選択的に形成する。
【００２８】
パターニング手法としては、まず基板上の絶縁層全面にテンプレートとなるプローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡに対する活性をもたない有機分子の有機単分子膜を形成後、粒子線（紫外線、電子線、Ｘ線など）レジストを塗布し、粒子線によって検出部上方のレジスト部分を取り除くようにパターニングを行う。その後、レジストパターン開口部に露出した有機単分子膜を酸素プラズマエッチングなどの手法を用いて除去し、二次的に、検出部に反応性官能基を有する有機分子の有機単分子膜を形成すればよい。
【００２９】
なお、プローブＤＮＡの固定化については、緩衝液に溶解したプローブＤＮＡを用いることが好ましい。この際、緩衝液は中性から酸性であることがより望ましい。架橋分子を介してプローブＤＮＡを固定化する場合、架橋分子を有機単分子膜に反応させた後に、非特異的に吸着しているプローブＤＮＡを、緩衝液を用いて洗浄することが好ましい。
【００３０】
本発明においては、上記半導体ＤＮＡセンシングデバイスのプローブＤＮＡに対し、該プローブＤＮＡの完全相補配列を有するＤＮＡ又は該完全相補配列に対して１〜３個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡであるターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーション反応させて、該反応によるプローブＤＮＡの負電荷の変化により生じる絶縁層の表面電位変化を検出する。
【００３１】
プローブＤＮＡの固定後、ターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーション反応させる際には、緩衝液、好ましくはプローブＤＮＡの固定化の際に用いたものと同等の緩衝液に溶解したターゲットＤＮＡを用いることができる。また、測定においてもターゲットＤＮＡの固定化に用いたものと同等の緩衝液を用いることが好ましい。なお、複数のプローブＤＮＡを固定化する場合や、ターゲットＤＮＡを複数の検出部を設けたデバイスに別々に反応させる場合はスポッティングなどの手法を用いることができる。
【００３２】
本発明においては、ハイブリダイゼーション反応により形成された二本鎖ＤＮＡを金属カチオンで修飾する。ハイブリダイゼーション反応により形成された二本鎖ＤＮＡの金属カチオンによる修飾は、二本鎖ＤＮＡを、所望の金属カチオンを含む水溶液に接触させればよく、例えば、二本鎖ＤＮＡが形成された半導体ＤＮＡセンシングデバイスの検出部を、金属カチオンを含む水溶液に浸漬させる方法などにより可能である。
【００３３】
金属カチオンとしては、遷移金属カチオン、希土類金属カチオン等が用いられ、特に希土類金属カチオンが好ましい。金属（Ｍ）カチオンとしては、１〜３価の金属カチオン、即ち、Ｍ+、Ｍ2+、Ｍ3+が好適である。金属カチオンのなかでも、とりわけテルビウム（Ｔｂ）が好ましく、３価のテルビウム（Ｔｂ3+）が特に好ましい。
【００３４】
このような金属カチオンを含む水溶液は、水溶液中に、当該金属カチオンを供給することができる塩化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、酢酸塩などの金属化合物、例えば、金属カチオンがＴｂであれば、ＴｂＣｌ3などを用いて調製することができる。この水溶液の濃度は、金属カチオンの種類、接触（浸漬）時間、処理温度などによって選定され、特に限定されるものではないが、通常、金属カチオン濃度として１×１０-5〜１×１０-2ｍｏｌ／Ｌである。また、接触（浸漬）時間は、通常０．５〜４時間であり、接触（浸漬）の際の処理温度は、通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜３８℃である。
【００３５】
また、本発明においては、ハイブリダイゼーション反応により形成された二本鎖ＤＮＡを金属カチオンで修飾した後、金属カチオンで修飾された二本鎖ＤＮＡを緩衝液に接触させて、ハイブリダイゼーション反応によるプローブＤＮＡの負電荷の変化により生じる絶縁層の表面電位変化を検出する。この緩衝液としては、通常、ｐＨ４〜９、特に６〜８の緩衝液が好ましく、好ましくはリン酸緩衝液、特にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が用いられる。この表面電位変化を検出する際の、緩衝液の温度（測定温度）は通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜３８℃である。
【００３６】
図３は本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスを用いたハイブリダイゼーション反応に基づくＤＮＡ検出の概念を示すものである。このＤＮＡセンシングでは、有機単分子膜上に架橋分子を介して固定化されたプローブＤＮＡに対し、プローブＤＮＡと同等の長さを有する完全相補配列を有するＤＮＡ又は該完全相補配列に対して１〜３個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡをターゲットＤＮＡとして反応させ、この反応によるプローブＤＮＡの負電荷の変化により生じる絶縁層の表面電位変化を電気信号として検出する。なお、図３中、１３はターゲットＤＮＡである。また、他の構成は、図１と同一の参照符号を付して、その説明を省略する。
【００３７】
ここで、ＤＮＡはリン酸基由来の負電荷が存在するため、完全相補配列を有するＤＮＡを反応させた場合、二重らせん化が円滑に生じ、ゲート電極上の表面電位は反応によって負に移行する。この場合、たとえばｐ型の電界効果型トランジスタを用いた場合、正方向に閾値電圧がシフトする。電流一定下においては電位シフトを、電圧一定下においては電流のシフトをシグナルとして検出することができる。なお、ｎ型の電界効果トランジスタを用いた場合、閾値電圧のシフトは正方向になり、ｐ型の電界効果トランジスタを用いた場合と逆になる。
【００３８】
一方、ミスマッチ分子をターゲットＤＮＡとして用いた場合、二重らせん化反応の進行、程度、二重らせん構造に違いが生じることから、完全相補ＤＮＡとの反応とは異なる閾値電圧でシフトし、この程度の差により、ＤＮＡ内の塩基ミスマッチを検出することができる。
【００３９】
更に、特に限定されるものではないが、金属カチオンには電位変化の増感作用があり、ハイブリダイゼーション反応により形成された二本鎖ＤＮＡには、負電荷が存在するため、これに金属カチオンが結合し、結合した金属カチオンに対して、緩衝液中のアニオン（例えばリン酸緩衝液であれば、リン酸イオン（ＰＯ43-））が配位することとなると考えられる。即ち、金属カチオンは、ＤＮＡの負電荷と、緩衝液中のアニオンとの架橋物質として作用していると考えられ、金属カチオンの存在により配位した緩衝液中のアニオンにより、結果として電荷が更に負にシフトし、電位変化が大きくなるものと考えられる。
【００４０】
そして、金属カチオン、特にＴｂ等の希土類金属のカチオンには、完全相補配列を有するＤＮＡと、ミスマッチ配列を有するＤＮＡとの間の親和性が異なるため、これらの間の電位変化量の差が更に大きくなる。これにより、完全相補配列を有するＤＮＡと、ミスマッチ配列を有するＤＮＡとを、従来に比べてより容易、かつ高感度に区別して検出することが可能となる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４２】
なお、実施例において用いたデバイスは、プローブＤＮＡ（架橋分子）／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部（検出部サイズ：１５μｍ×１ｍｍ）として、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部として備える半導体ＤＮＡセンシングデバイスである。具体的には、公知の電界効果型トランジスタ（ＦＥＴ）を用い、絶縁層をシリコン酸化物とし、検出部の第１の有機単分子膜にはＨＳ（ＣＨ2）3Ｓｉ（ＯＣＨ3）3で公知の方法により形成したメルカプト系単分子膜を、参照部の第２の有機単分子膜には、ＣＦ3（ＣＦ2）7（ＣＨ2）2Ｓｉ（ＯＣＨ3）3で公知の方法により形成したフッ化アルキル単分子膜を用い、更に、検出部及び参照部（ゲート電極）以外の部分（テンプレート部）には、ＣＦ3（ＣＦ2）7（ＣＨ2）2Ｓｉ（ＯＣＨ3）3で公知の方法により形成したフッ化アルキル単分子膜を形成したものを用いた。
【００４３】
［実施例１］
メルカプト系単分子膜が修飾されている検出部のゲート電極にプローブＤＮＡの固定化を行った。まず、有機単分子膜のメルカプト基とプローブＤＮＡとを架橋するための架橋分子として、２，２’−ジピリジルジスルフィド（ＤＰＤＳ）を反応させた。反応は、１ｍｇ／ｍｌのＤＰＤＳ水溶液中に、末端がメルカプト基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で２時間浸漬することにより実施した。その後、架橋分子に、メルカプト基で修飾された２０塩基対からなるプローブＤＮＡ（HS-3'-ACGAACATAGCCCGCCTTAC-5'（配列番号１））を含むリン酸緩衝液（プローブＤＮＡ濃度：１×１０-6ｍｏｌ／Ｌ）中、室温で２４時間反応させることで、プローブＤＮＡを固定化した。基板洗浄後、ここで一旦、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．３ｍｌ中、２５℃で、プローブＤＮＡ固定化デバイスの電流−電圧曲線を、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、半導体パラメーターアナライザー（アジレント社製、４１５５Ｃ）で測定した。
【００４４】
続いて、完全相補配列を有する２０塩基対からなるターゲットＤＮＡ（5'-TGCTTGTATCGGGCGGAATG-3'（配列番号２））を含むリン酸緩衝液（ターゲットＤＮＡ濃度：１×１０-6ｍｏｌ／Ｌ）中、室温で１時間ハイブリダイゼーションを行った。基板洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．３ｍｌ中、２５℃で、ハイブリダイズ後の電流−電圧曲線を、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、半導体パラメーターアナライザー（アジレント社製、４１５５Ｃ）で測定し、ハイブリダイゼーション反応前後の電圧応答の差を評価した。
【００４５】
続いて、ハイブリダイゼーションで形成された二本鎖ＤＮＡをＴｂ3+で修飾した。反応は、ＴｂＣｌ3水溶液（Ｔｂ3+濃度として１×１０-4ｍｏｌ／Ｌ）中に、ハイブリダイゼーションで形成された二本鎖ＤＮＡを有するデバイスの検出部を室温で２時間浸漬することにより実施した。基板洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．３ｍｌ中で、Ｔｂ3+で修飾後の電流−電圧曲線を、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、半導体パラメーターアナライザー（アジレント社製、４１５５Ｃ）で測定し、Ｔｂ3+で修飾前後の電圧応答の差を評価した。また、ターゲットＤＮＡ、プローブＤＮＡ、及びＴｂ3+を含む溶液（ターゲットＤＮＡ濃度及びプローブＤＮＡ濃度：１×１０-6ｍｏｌ／Ｌ、Ｔｂ3+濃度：１×１０-4ｍｏｌ／Ｌ）を調製し、発光波長２８０ｎｍによる蛍光スペクトルを、分光蛍光光度計（日本分光株式会社製  ＦＰ−６５００）で、室温にて測定した。
【００４６】
［実施例２］
ターゲットＤＮＡを１個の塩基のミスマッチを含む一塩基多型ＤＮＡ（5'-TGCTTGTATCGTGCGGAATG-3'（配列番号３））とした以外は、実施例１と同様にして、ハイブリダイゼーションを実施し、Ｔｂ3+を修飾した。また、実施例１と同様にして、電圧応答の差の評価し、また、蛍光スペクトルの測定を実施した。
【００４７】
電圧応答の差の評価結果を図４に、蛍光スペクトルの測定結果を図５に示す。図４から、金属カチオンの修飾により、ターゲットＤＮＡが完全相補配列の場合も、一塩基多型の場合も電圧応答の差が金属カチオンの修飾前よりも大きくなり、特に、完全相補配列の場合に顕著で、両者の差がより大きくなることがわかる。また、図５に示される蛍光スペクトルの測定結果から、一塩基多型の場合より、完全相補配列の場合の方が、多くのＴｂ3+が結合し、電圧応答の差が金属カチオンの架橋作用により発揮されていることが推測される。
【符号の説明】
【００４８】
１  シリコン基板
２  絶縁層
３  有機単分子膜
４  ゲート電極
５  ソース電極
６  ドレイン電極
７  チャンネル領域
８  参照部
９  検出部
１０  テンプレート部
１１  プローブＤＮＡ
１２  架橋分子
１３  ターゲットＤＮＡ
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
配列番号１：Designed oligonucleotide. 3'- end is terminated by SH group.
配列番号２：Designed oligonucleotide.
配列番号３：Designed oligonucleotide.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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