(57)【要約】【課題】  哺乳動物における皮膚疾患、酸化的損傷、および、ＤＮＡ損傷を防止する手段を提供する。【解決手段】  ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを、哺乳動物の皮膚疾患、酸化的損傷、ＤＮＡ損傷などを防止する薬剤の製造において使用する。【選択図】  図５９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
紫外線に曝した哺乳動物の皮膚の海綿状態、水疱形成、または、異常角化症を防止する薬剤を製造するためのＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２】
ヒトの皮膚の紫外線照射誘発性損傷の修復を高める薬剤を製造するためのＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３】
哺乳動物における酸化的損傷を軽減する薬剤を製造するためのＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４】
前記薬剤が、皮膚投与用である請求項３に記載の使用。
【請求項５】
哺乳動物の細胞中のＤＮＡ損傷を軽減する薬剤を製造するためのＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの使用であって、当該ＤＮＡ損傷が、放射線照射またはＤＮＡ損傷化学物質に起因する、ことを特徴とする使用。
【請求項６】
前記細胞が、上皮細胞である請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、一本鎖である請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、５'-ホスフェートを含む請求項５に記載の使用。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドの濃度が、１μＭ〜５００μＭである請求項５に記載の使用。
【請求項１０】
生理的に許容される担体をさらに用いる請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は２００２年４月１２日に出願された出願第１０／１２２,６３０号の一部係属出願であり、出願第１０／１２２,６３０号は、合衆国を指定国とし、２００１年３月３０日に出願され、英国で公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０１６２の一部係属出願であり、出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０１６２は２０００年３月３１日出願の出願第０９／５４０,８４３号の一部係属出願であり、出願第０９／５４０,８４３号は現在米国特許第６,１４６,０５６号である、１９９８年３月２６日に出願された出願第０９／０４８,９２７の一部係属出願であり、出願第０９／０４８,９２７は１９９６年６月３日に出願され英国で公開され、米国特許出願第０８／９５２,６９７号に譲渡され、現在放棄された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０８３８６の米国国内段階の一部係属出願であり、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０８３８６は、現在米国特許第５,９５５,０５９号である１９９５年６月６日出願の出願第０８／４６７,０１２号の一部係属出願である。上記出願の全教示は参考として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
哺乳動物細胞はＤＮＡ損傷に対する複雑な反応並びに緻密に調節された複製的老化プログラムを有し、これら全ては癌に対する基礎的防御であることが示唆される［カンピシ(Ｃａｍｐｉｓｉ  Ｊ)、Ｃｅｌｌ  ８４巻、ｐ．４９７-５００］。哺乳動物において、細胞の老化は、染色体の両端にある(グレイダ(Ｇｒｅｉｄｅｒ,Ｃ．Ｗ．)(１９９６)Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５巻、ｐ．３３７-３６５)、ＤＮＡ複製が繰り返されるごとに短くなっていくテロメア、すなわちＤＮＡ配列ＴＴＡＧＧＧのタンデム・リピート配列の決定的な短縮によって起きる。生殖細胞系細胞および大部分の癌細胞における不死性は、テロメラーゼ(ＴＴＡＧＧＧリピートを３'末端を介して染色体末端に付加する酵素複合体)によるテロメア長の維持と関連がある［フェング(Ｆｅｎｇ,Ｊ)ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９巻、ｐ．１２３６-１２４１；ハリントン(Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ,Ｌ．)ら(１９９７)Ｓｃｉｅｎｃｅ２７５巻、ｐ．９７３-９７７；ナカムラ(Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．Ｍ．)ら(１９９７)Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７巻、ｐ．９５５-９５７］。テロメラーゼの触媒的サブユニットは概して正常な体細胞には発現せず［グレイダ(１９９６)Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５巻、ｐ．３３７-３６５］、複数の細胞分割周期を経た後に、詳細なメカニズムは不明ではあるが、決定的に短縮したテロメアが複製的老化またはアポトーシスによる死の引き金を引く；これは細胞型によって大きく左右される［デランジェ(ｄｅ  Ｌａｎｇｅ,Ｔ．)(１９９８)Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９巻、ｐ．３３４-３３５］。テロメアがＤＮＡ損傷応答に関与するメカニズムはあまり明らかでない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
先進国ではヒトにおける癌の発生率が人口の高齢化につれて増加している。メラノーマおよびその他の皮膚癌は、大量の日光にさらされ続けている高齢者の間で著しく増加している。ある種の癌および診断時の病期、疾病率および死亡率は近年、広範囲の研究にもかかわらず顕著には改善されていない。環境的ダメ-ジを修復する細胞の天然のメカニズムを利用できる別の治療法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
本発明の一実施形態は、ヒトにおける過増殖性疾患を治療する方法であって、ヒトテロメア・オーバーハング・リピートと少なくも５０％のヌクレオチド配列が一致する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物をヒトに投与する方法である。ここでオリゴヌクレオチドがテロメア・オーバーハング・リピートに相同であると言う場合、それは、そのオリゴヌクレオチドがヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有することを意味する。この方法では、オリゴヌクレオチドは少なくも２ヌクレオチド長、例えば２-２００ヌクレオチド長でよく、または少なくも３ヌクレオチド長、例えば３-２０オリゴヌクレオチド長でよく、好ましくは２-２０ヌクレオチド長、より好ましくは５-１１ヌクレオチド長である。５'ホスフェート基を有するオリゴヌクレオチドが好ましい。５'ホスフェートがそのオリゴヌクレオチドの一部である場合、所定の配列に対し５'から３'ヌクレオチドへと続く配列の前に「ｐ」を置くことによって示される。過増殖性疾患の治療における好ましいオリゴヌクレオチド類はｐＴＴ、ｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)、ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)、ｐＧＧＧＴＴＡＧＧＴＴ(配列番号：１３)、およびｐＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧ(配列番号：１４)である。本発明の方法は哺乳動物に適用できるが、より特殊な実施形態においてはヒトに適用することができる。
【０００５】
上記の方法の一部はヒトにおける癌細胞の増殖を阻止する方法であって、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと同一のヌクレオチド配列を少なくとも５０％有する１種類以上のオリゴヌクレオチド類を含む有効量の組成物をヒトに投与する工程を包含する、方法である。癌細胞は任意の細胞型から誘導し得るが、特殊の実施形態において、それはリンパ腫、骨肉腫、メラノーマ、白血病または癌腫である。
【０００６】
本発明のまた別の部分は、哺乳動物の悪性腫瘍細胞の分化を促進する方法であって、(ＴＴＡＧＧＧ)nと一致する少なくとも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、方法である。
【０００７】
癌の治療に有効なその他の方法は、ヒトのガン細胞の分化を指示する１種類以上の表面抗原の発現を高める方法であって、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致するヌクレオチド配列を少なくとも５０％有する１種類以上のオリゴヌクレオチドの有効量をヒトに投与する工程を包含する、方法である。この方法における細胞は例えばメラノーマであり、前記抗原は例えばＭＡＲＴ-１、チロシナーゼ、ＴＲＰ-１またはｇｐ-１００などでよい。細胞は乳癌細胞でもよく、抗原はエストロゲン受容体αでもよい。本発明に使用されるその他のオリゴヌクレオチドはｐＴＴであり；１種類以上のテロメア-相同性オリゴヌクレオチドとｐＴＴとの組み合わせも使用できる。ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)はこの方法に適用できるオリゴヌクレオチドである。
【０００８】
ヒト・テロメア・オーバーハング・リピート配列と一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド類は、通常は主としてまたは専ら胚の発生時に発現する遺伝子の発現を減少させることが判明した。この遺伝子は正常な分化細胞には発現しないか、ごくわずかに発現するが、癌細胞には発現する。例えばｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)は実施例４４に記載されるようなメラノーマ細胞系におけるリビン／ＭＬ-ＩＡＰの発現を低減する。
【０００９】
さらに、本発明はヒトにおいて癌細胞のアポトーシスを誘発する方法であって、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物をヒトに投与する工程を包含する、方法である。この方法はメラノーマやリンパ腫などに適用できる。
【００１０】
テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％の配列を有する本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド類の癌細胞に対するさらなる影響は老化の誘発である。実施例４１、４３および４８に説明されるように、オリゴヌクレオチド類で治療した乳癌細胞、卵巣癌細胞、線維肉腫細胞は、老化に典型的な形態変化およびβ-ガラクトシダーゼの発現の変化を伴って反応した。こうして、本発明の別の方法は、哺乳動物(例えばヒト)の癌細胞に老化を誘発する方法であって、哺乳動物のテロメア・オーバーハング・リピートのヌクレオチド配列と一致する少なくとも５０％の配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、方法である。
【００１１】
また本発明の一部は、ヒトの癌細胞の増殖を阻止する方法であって、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物をヒトに投与する段階を含む方法である。
【００１２】
本発明のまた別の局面は、ヒトの癌細胞の増殖を阻止する方法であって、癌細胞におけるｐ５３遺伝子生成物の存在または活性を必要としない方法で、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物をヒトに投与する工程を包含する、方法である。
【００１３】
本発明のその他の局面は、ヒトの癌細胞の増殖を阻止する方法であって、前記細胞におけるＳ相停止を起こす方法であり、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物をヒトに投与する工程を包含する、方法である。使用するオリゴヌクレオチド類は種々の長さでよいが、一実施形態においてはそのオリゴヌクレオチドは６ヌクレオチド未満の長さである。
【００１４】
本明細書には紫外線に曝露した後の哺乳動物の皮膚の海綿状態、水疱形成または異常角化症を防止する方法であって、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を皮膚に塗布する工程を包含する、方法も記載されている。この方法は例えばｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)またはオリゴヌクレオチドｐＴＴ、またはオリゴヌクレオチド類の組み合わせを使用できる。
【００１５】
ヒトにおける皮膚癌の発生を低減する方法も記載されている。この方法はヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を皮膚に塗布することを含む。このようなオリゴヌクレオチドは例えばｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)でよい。ｐＴＴもこの方法に使用でき、またはオリゴヌクレオチド類の組み合わせが使用できる。
【００１６】
ヒトにおける皮膚癌の発生を低減するための上記方法の特殊の局面は、色素性乾皮症またはその他の遺伝的に決まる癌素因のあるヒトにおける皮膚癌の発生を低減する方法であって、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を皮膚に適用する工程を包含する、方法である。一局面において、オリゴヌクレオチドはｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)である。
【００１７】
本発明のその他の特殊の局面は色素性乾皮症またはその他の遺伝的に決まる素質を有するヒトの皮膚癌の発生を低減する方法であって、ｐＴＴを含む有効量の組成物を皮膚に適用する方法である。
【００１８】
ヒトの皮膚の紫外線照射誘起性損傷の修復を高める方法であって、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を皮膚に適用する方法も本発明に含まれる。使用できる特定のオリゴヌクレオチドはｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)である。この方法に使用できるまた別のものはｐＴＴである。
【００１９】
本発明の一局面として、哺乳動物の酸化的損傷を低減する方法であって、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を哺乳動物に投与する方法も含まれる。そのような一つのオリゴヌクレオチドはｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)である。ｐＴＴもこの方法に使用できる。この方法の特殊の局面において、上記組成物は皮膚に投与できる。
【００２０】
ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物のメラノーマを治療する方法を提供することも本発明の目的である。この方法はヒトに適用できる。この方法に使用するオリゴヌクレオチド類はテロメア相同性オリゴヌクレオチドｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)である。ｐＴＴも使用できる。オリゴヌクレオチド類の種々の組み合わせもこの方法に使用できる。
【００２１】
ヒト皮膚のケラチノサイトの増殖を低減するための方法であって、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を皮膚に適用する工程を包含する、方法も、本発明の目的である。この方法の特殊の適用において、治療すべきヒトは脂漏性角化症、紫外線角化症、ボ-エン病、扁平上皮癌、または基底細胞癌にかかったヒトである。この方法の特殊の局面において、組成物はｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)を含む。関連する方法は、ヒトの皮膚のケラチノサイトの増殖を低減する方法であって、ｐＴＴを含む有効量の組成物を皮膚に適用する工程を包含する、方法である。
【００２２】
また別の実施形態は、上皮細胞におけるＤＮＡ修復を高めることを含み、このためには前記細胞を少なくも１種類のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物と接触させることを含み、その際上記オリゴヌクレオチドは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１２、および前記諸配列の任意の配列の隣接部分からなる群から選択される塩基配列を含む。また別の実施形態は、上皮細胞の増殖を阻止することを含み、そのために前記細胞を少なくも１種類のオリゴヌクレオチドを含んでなる有効量の組成物と接触させることを含み、その際オリゴヌクレオチドは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１２、および前記諸配列の任意の配列の隣接部分からなる群から選択される塩基配列を含む。
【００２３】
本発明には上に順次明らかにした上記オリゴヌクレオチド類の短縮型も含まれる。本発明のオリゴヌクレオチド類は、非短縮オリゴヌクレオチドの少なくも２つの隣接ヌクレオチドが残っている限り、５'末端、３'末端、または５'末端と３'末端の両方で１つ以上のヌクレオチドが短縮されてもよい。短縮されたオリゴヌクレオチド類は非短縮ヌクレオチド類に見られる１０、９、８、７、６、５、４、３または２つの隣接ヌクレオチドを有することが好ましい。
【００２４】
また、本発明の一部は、生理的に容認される担体中に１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む組成物である；その際上記オリゴヌクレオチドは配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、１１、１２、１３、１４、１６、１７または１８の塩基配列を含む。さらに、本発明は生理的に容認される担体中に１種類以上のオリゴヌクレオチドを含み、その際オリゴヌクレオチドは配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、１１、１２、１３、１４、１６、１７または１８の塩基配列からなる。
【００２５】
細胞増殖の阻止を所望する用途のためには、配列番号：１または配列番号：６を含むオリゴヌクレオチド類、または配列番号：１または配列番号：６からなるオリゴヌクレオチド類が好ましい。アポトーシスを所望する用途のためには、配列番号：５の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド類、または配列番号：５からなるオリゴヌクレオチド類が好ましい。
【００２６】
オリゴヌクレオチドと生理的に容認される担体とを含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチドがｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)、ｐＣＡＴＡＣ(配列番号：６)、ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)、ｐＧＧＧＴＴＡＧＧＴＴ(配列番号：１３)、ｐＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧ(配列番号：１４)、ｐＴＴＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡ(配列番号：１６)、ｐＴＴＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１７)またはｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡ(配列番号：１８)である組成物も本発明の一部分として提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞をＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類または同様な化合物で処理すると、細胞増殖が阻止され、またはＤＮＡ修復が誘発され、またはＵＶ照射または発癌性化学物質被曝に対する防御反応を誘起し得るという発見に基づくものである。ｐＴｐＴは、ＵＶ照射に対する防御反応である、皮膚におけるメラニン産生(タンニング)反応を誘起する(米国特許第５,６４３,５５６号、この教示は参考としてそのまま本明細書に組み込まれる)。
【００２８】
より詳細に述べれば、本発明はＤＮＡ断片、ポリヌクレオチド類、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類またはジヌクレオチドダイマー類または同様な化合物などの化合物類を使用して細胞増殖を阻止またはＤＮＡ修復を誘発することに関するものである。ここに使用する細胞増殖の阻止とは、この分野で標準的試験によって、および実施例に記載されるように測定された細胞分割の完全な排除、細胞分割の部分的阻害および細胞分割の一時的阻止を含む。本発明は、非制限的に癌および前癌状態を含む過増殖性疾患の防止および／または治療に関係する；前記過増殖性疾患は任意の器官の細胞および任意の胚性起源の細胞に影響を与える。治療後の再増殖または再発した転移性腫瘍および癌並びに原発性腫瘍は本発明の方法によって治療できる。特殊の実施形態において、治療すべき疾患および状態には、哺乳動物、特にヒトの乾癬および過増殖性、前癌性またはＵＶ誘起性皮膚炎などの皮膚疾患がある。
【００２９】
本発明はさらに本発明の化合物を使用して光老化(一部にはＤＮＡ損傷の蓄積によるプロセス)を減らし、酸化的ストレスおよび酸化的損傷を低減することに関係する。本発明は哺乳動物における皮膚癌の発生に対する予防、または前記発生の可能性の減少にも関係する。その上、本発明の化合物類を使用して遺伝的突然変異を維持する細胞例えば悪性腫瘍または癌細胞または紫外線角化症細胞などの細胞類にアポトーシスを起こすことができる。本発明はさらに前記化合物を含む組成物も提供する。
【００３０】
あらゆる型の細胞、および特殊の実施形態における上皮細胞は、本明細書に記載される代表的インビトロおよびインビボ実施例によって明らかにされるように、本発明の方法に反応することが期待される。本発明の方法に適した上皮細胞には、表皮細胞、呼吸上皮細胞、鼻上皮細胞、口腔細胞、耳上皮細胞、眼上皮細胞、性器尿管細胞および食道細胞などがある。消化管細胞も本明細書に記載されるように本発明の方法において考慮される。
【００３１】
損傷-または突然変異ＤＮＡを含む細胞には、例えば紫外線角化症細胞、癌細胞、ＵＶなどの照射を受けた細胞、およびＤＮＡ損傷性化学物質またＤＮＡ損傷性条件にさらされた細胞などがある。ここに記載のように、アレルギ-性炎症には、アトピ-性皮膚炎、接触皮膚炎、アレルギ-性鼻炎およびアレルギ-性結膜炎などに症状が含まれる。
【００３２】
一実施形態において、本発明の組成物は約２-２００塩基長のＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。これを適切なビヒクルと共に哺乳動物(ヒトなど)に投与することができる。また別の実施形態において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは約２ないし約２０ヌクレオチド長である。また別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは約５ないし約１１ヌクレオチド長である。また別の実施形態において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは約２-５ヌクレオチド長である。ここに使用する用語「ＤＮＡ断片」とは、一本鎖ＤＮＡ断片、二本鎖ＤＮＡ断片、または一本鎖-および二本鎖ＤＮＡ断片の混合物を指す。
【００３３】
その他の塩基含有配列も本発明に使用することができ、その際塩基は例えばアデニン、チミン、シトシン、グアニンまたはウラシルであることが理解される。一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを含む。本発明の１種類以上のオリゴヌクレオチドの組み合わせも使用できる。
【００３４】
実施例に示すように、本発明のある種のＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチドおよびジヌクレオチドは、細胞を本発明のＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチドおよびヌクレオチドと接触させた際に、増殖阻止、メラニン産生、ＴＮＦｓ産生および細胞のアポトーシス誘発を起こした。例えば、チミジンジヌクレオチド(ｐＴｐＴ)は扁平上皮癌、子宮頸部癌、メラノーマ、新生児ケラチノサイトおよび正常新生児線維芽細胞を含む数種のヒト細胞の増殖を阻止する(それぞれ実施例１-５)。ｐＴｐＴはインビボモルモットモデルにおいても表皮細胞増殖を減少させた(実施例６)。さらに、細胞のｐＴｐＴ処理はｐ５３の核の局在化を起こした(実施例７)、そしてＤＮＡ修復に関係する遺伝子のような、ｐ５３調節遺伝子を誘導した(実施例８)。ｐＴｐＴで細胞を前処理すると、ＵＶ照射によるおよび化学的発癌性ベンズピレン(ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎ)によるＤＮＡ損傷を修復するそれら細胞の能力は高まった(実施例８および９)。ｐＴｐＴは、処理２日以内に、ｐ５３、ＰＣＮＡおよびＸＰＡタンパク質のレベルを２ないし３倍にアップレギュレートした(実施例９)。ＸＰＡはｐ５３で調節されないことは公知であり、ｐ５３が存在しない細胞においてもＤＮＡ修復の増加が起き得ることが明らかにされたことは注目すべきである。マウス皮膚のｐＴｐＴによる前処理もインビボでＵＶ誘起性ＤＮＡ損傷レベルを低下させた(チミジンダイマー類)(実施例１４)。
【００３５】
チミジンジヌクレオチド、ｐＴｐＴ、はＵＶ光の幾つかの効果、例えばメラニン産生の誘発およびケラチノサイトのＴＮＦα産生の刺激などに酷似している(実施例４)。ｐＴｐＴもＴＮＦαを誘発し、インビボ接触過感作を低減する(実施例１０)。ＵＶＢ照射は接触過感作(ＣＨ)の誘導期の強力なインヒビタであり、ＴＮＦαはこの抑制効果の媒体である。ＵＶＤ誘起性チミジンダイマー形成のための基質であるチミジンジヌクレオチド(ｐＴｐＴ)は、培養メラノサイトにおけるチロシナーゼ発現およびメラニン含有量およびモルモットにおける皮膚タンニングの増加を含む幾つかの効果を刺激する。実施例１０に示すように、本発明の化合物はマウスモデルにおける接触過感作に与えるＵＶＢの抑制効果にも酷似する。本発明によって明らかにされるように、ｐＴｐＴの局所適用のための皮内注射は接触過感作の誘発を阻止し、インビボＴＮＦα遺伝子を活性化することができる。
【００３６】
実施例１０は、ｐＴｐＴが、ＩＬ-１０ｍＲＮＡおよび、同種混合リンパ球アッセイでＴ細胞増殖を活発に阻止するタンパク質の産生を誘起することも証明する。ヒト皮膚において、ＩＬ-１０並びにＴＮＦαは接触性過敏症および遅延型過敏症反応に対する特異的耐性を誘発する。そこで、本発明のＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類およびヌクレオチドダイマー類はインビボで接触過敏症および遅延型過敏症の阻止などの免疫抑制効果を有することが理論的に期待される。
【００３７】
さらに別の実施例において、９-ヌクレオチドオリゴマー、ＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)はヒトメラノサイトにおけるメラニン産生を刺激し、扁平上皮癌細胞系において増殖抑制遺伝子産物であるｐ２１．Ｗａｆ／Ｃｉｐ１の発現を誘発した。さらにＴＡＧＧＡＧＧＡＴ(配列番号：２；テロメア・オーバーハング・リピートと５／９の一致)、およびオリジナル９-マー、ＡＧＴＡＴＧＡ(配列番号：３)およびＧＴＡＴＧ(配列番号：４)の短縮型もヒトメラノサイトのメラニン産生を刺激した(実施例１１)。その上、配列ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)はクロードマンＳ９１黒色腫細胞の色素沈着を刺激し(実施例１２)、ヒトＴ-細胞系にアポトーシスを誘起した(実施例１３)。ここに明らかにされるように、ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)はアポトーシスを受けるヒトＴ-細胞を誘発し、他方配列番号：９および１０(ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣおよびｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ)はこれらの細胞におけるアポトーシスを有意には増強しなかった(実施例１３)。配列番号：６-１２を有するオリゴヌクレオチド類は少なくも若干のメラニン産生誘発能力を示した(実施例１１-１３)。
【００３８】
ここに明らかにするように、ジヌクレオチド(例えばｐＴｐＴ)および約２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド類のように小さいオリゴヌクレオチドも使用できる。なぜならばこれらの長さのオリゴヌクレオチド類は細胞内に取り込まれることが証明されているからである。また別の実施形態において、５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを使用して、皮膚障壁を通過し、メラニン産生を効果的に誘発し、細胞増殖を阻止し、免疫抑制を引き起こすことができる。９-マーはマウス皮膚を光損傷から防御することが示された(実施例２５)。
【００３９】
これらの結果は、これらの化合物のインビトロ効果が、対象の細胞または組織を本発明の化合物と接触させる際にはインビボでもあらわれることを証明している。例えば細胞増殖阻止、ＴＮＦ-α産生およびメラニン産生の効果に関してここに示されるように、本発明の化合物類によるこれら活性のインビトロ誘発は、これら化合物がインビボでも同じ効果をもたらす能力をもつことを示唆している。本発明の化合物類が細胞または組織に接触するような、上記化合物類の生物へのいかなる適切な投与法も有効であることが理論的に期待される。これらの効果は日常的最適化プロトコルを使用して最適化することができる。
【００４０】
したがって本発明の化合物は、細胞増殖を阻止する方法に有用であり、ＤＮＡ修復の増強によって、および皮膚ではメラニン産生増加による色素沈着の促進によって、癌、光老化および酸化ストレスを予防する方法に有用である。メラニンはＵＶ領域で光子を吸収することが知られており、したがってその存在は癌および光老化のリスクを低減する。
【００４１】
ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドおよびジヌクレオチドダイマーは任意の適切なソ-スから得ることもできるし、または合成してもよい。ＤＮＡ断片を作るためには、例えばサケ精子ＤＮＡを水に溶解し、その後混合物をオートクレーブで加熱してＤＮＡを断片化することができる。一実施形態において、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはジヌクレオチドダイマーは５'ホスフェートを含む。
【００４２】
本発明の化合物は細胞に対するＵＶＡ誘起性酸化的損傷を防御する役割も演じる(実施例１５)。実施例１５に記載されているように、ｐＴｐＴで３日間処理し、その後５×１０-5または５×１０-4Ｈ2Ｏ2で刺激した一次新生児線維芽細胞は、希釈剤で処理した対照に比較してより高い細胞収率を示す。ｍＲＮＡおよびタンパク質の分析は、ｐＴｐＴ処理細胞においてＣｕ／Ｚｎス-パ-オキシドジスムターゼの上昇を明らかにした。この酵素は酸素ラジカル消滅過程に関与する。したがって本発明の一実施形態において、本発明の化合物類を酸化的損傷を防ぐために投与する。一実施形態において、これらの化合物は個体の表皮に局所的に投与される。
【００４３】
本明細書に用いる「ｐ５３タンパク質活性を高める作用物質」は、ｐ５３タンパク質の活性を高める作用物質、したがって、例えばＰＣＮＡ、ＸＰＢおよびｐ２１タンパク質などのＤＮＡ修復に関係するタンパク質の誘導によって、ヌクレオチド切除修復などのＤＮＡ修復メカニズムの増強を誘起する作用物質(例えば薬剤、分子、核酸断片、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドなど)である。ｐ５３タンパク質の活性は、ｐ５３をコ-ドするＤＮＡの転写またはｐ５３特異的ＭＲＮＡの翻訳を直接刺激することによって、ｐ５３タンパク質の発現または産生を増加することによって、ｐ５３タンパク質の安定性を高めることによって、ｐ５３ｍＲＮＡまたはタンパク質の分解抵抗を高めることによって、ｐ５３を細胞の核内に蓄積させることによって、存在するｐ５３量の増加によって、ｐ５３のセリン１５残基のリン酸化によって、またはその他のやり方でｐ５３の活性を高めることによって高められる。ｐ５３の活性を高める１種類以上の作用物質の組み合わせを使用することができる。或いは、またはそれに加えて、ｐ５３の活性を増加する作用物質を、上記のようにＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、またはジヌクレオチドと組み合わせて使用することができる。
【００４４】
紫外線照射はＤＮＡ光産物を生成する。それを直ちに除去しないと突然変異および皮膚癌が発生し得る。ＵＶ誘起性ＤＮＡダメ-ジの修復には、光生成物を十分に除去してＤＮＡ複製中のエラーを回避することが必要である。老化によるＤＮＡ修復能力の減退は、ＵＶ誘起性光生成物の除去に必要なｐ５３およびその他の核除去修復(ＮＥＲ)タンパク質の構成的レベルの減少に関係がある。本発明において明らかにされたように、本発明の化合物類は、ヒト皮膚細胞において、ＵＶ照射前に細胞をこれらの化合物で処理した場合、ＮＥＲタンパク質が誘発された(実施例１６)。老化によりＮＥＲタンパク質は減少したが、新生児から９０歳までの全ての年齢のドナ-の細胞中においてＮＥＲタンパク質は２００-４００％誘発された。チミンダイマーおよび光生成物の修復率の有意な減少が細胞サンプルの老化につれて起きる；しかし、本発明の化合物で前処理し、その後ＵＶ照射した細胞は、光生成物の３０-６０％をより効果的除去した。このように小さいＤＮＡオリゴヌクレオチドにより細胞を処理するとＤＮＡ修復能の加齢関連性減少は一部分相殺される。本発明の化合物のインビボ効果を考慮すると、本発明の化合物によるヒト皮膚の処理により、内因性ＤＮＡ修復能は高まり、太陽の紫外線照射からの発癌リスクは減少すると予想することは合理的である。この方法は細胞性ＤＮＡ修復能が多分減少している高齢者に特に有用である。
【００４５】
ＵＶ照射の結果を阻止し、皮膚癌の発生を減らし、酸化的損傷を減少させまたはＵＶ誘起性損傷の修復を高めるための方法において、皮膚に適用されるＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはジヌクレオチドダイマーは、単独で、或いは生理的に容認される担体、例えば溶媒、香料または色素、安定剤、サンスクリ-ンまたはその他の成分と組み合わせて、医療または美容の用途に使用することができる。これらは水、食塩液、またはその他の適切な送達ビヒクル中で適用することができる。上記送達ビヒクルは、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチド、またはジヌクレオチドダイマーを送達する任意の適切なビヒクルでよい。一実施形態において、オリゴヌクレオチドの濃度は１０μＭ-１００μＭである。
【００４６】
この組成物の活性成分をより深部の皮膚細胞に送達するために、皮膚の角膜層などの外部層の透過性を改善したビヒクルが有用である。この目的のためのビヒクル構成物は、非制限的に、エタノール、イソプロパノール、ジエチレングリコールエーテル類、例えばジエチレングリコールモノエチルエーテルなど、アゾン(１-ドデシルアザシクロヘプタン-２-オン)、オレイン酸、リノレイン酸、プロピレングリコール、高張濃度のグリセロール、乳酸、グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸などである。一実施形態において、プロピレングリコールが送達ビヒクルとして使用される。好ましい一実施形態において、３％ベンジルスルホン酸および５％オレイルアルコールを含むプロピレングリコール：エタノール：ミリスチン酸イソプロピル(１：２．７：１)の混合物が使用される。
【００４７】
また別の実施形態においてリポソーム製剤が使用できる。リポソーム製剤は対象の細胞または角膜層を透過するリポソームを含んでなり、細胞膜と融合し、リポソームの内容物を細胞に送達することができる。例えば、ヤロシュ(Ｙａｒｏｓｈ)の米国特許第５,０７７,２１１号、レジニアク(Ｒｅｄｚｉｎｉａｋ)らの米国特許第４,６２１,０２３号またはレジニアクらの米国特許第４,５０８,７０３号に記載されるようなリポソーム類を使用できる。皮膚の状態を標的とする本発明の組成物は、哺乳動物の皮膚を、酸化的損傷を起こすＵＶまたは作用物質に曝露する前、曝露中、または曝露後に投与できる。その他の適切な組成物はニオソーム類を含むことができる。ニオソームはほとんど非イオン性脂質からなる膜を有する、リポソームに似た脂質ビヒクルであり、その幾つかの型は化合物類を角膜層を通して効果的に運ぶ。
【００４８】
主として皮膚を対象にするその他の適切な送達法は、オリゴヌクレオチド(類)と共に水性または水性-アルコール性メジウムおよびゲル化剤を含んでなるヒドロゲル組成物の使用を含む。適切なゲル化剤にはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマー(カルボポル)、ハイパン、ポリアクリレート、およびグリセロールポリアクリレートなどがある。
【００４９】
一実施形態において、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、ジヌクレオチドダイマー類または前記の１つ以上を含む組成物を皮膚表面に局所的に適用する。その他の実施形態において、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、ジヌクレオチドダイマー類、または前記の１つ以上を含む組成物を体内のその他の細胞または組織、例えば上皮細胞などに送達する。皮膚に比べて、このような物質の侵入に対してより低いバリヤを有すると認識されている組織の細胞は次のように治療できる；例えば口腔では経口的に；呼吸上皮には噴霧によって；膀胱上皮には点滴注入によって；腸(上皮)には点滴または座薬によって、または体内のその他の細胞または組織にはその他の局所的または表面適用、例えば点眼、点鼻、および例えば血管形成術を使用する適用などがある。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド類は静脈内に投与したり、対象の組織に直接皮内注射、皮下注射、筋肉内注射または腹腔内注射したりすることもできる。加えて、血球の治療のために、本発明の化合物類を静脈内投与したり、または細胞の体外循環中に例えばフォトフォーレシス・デバイスなどによって投与したりすることができる。ここに明らかにされるように、対象の細胞を本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触させることが必要な全てであり、その際細胞と接触するオリゴヌクレオチド類はジヌクレオチドのように小さくてよい。
【００５０】
ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、ジヌクレオチドダイマー類、分化を促進する作用物質、ｐ５３活性を高める作用物質または１種類以上の前記の化合物を含む組成物が適切な方法で対象の細胞に投与される(前記対象の細胞に導入するか、前記細胞と接触させる)。ここに使用する用語「対象の細胞」とは、過増殖性疾患または前癌状態にかかったか、またはかかっている細胞、または酸化的ストレス、ＵＶ照射などのＤＮＡ損傷状態になった細胞、またはベンズピレンのようなＤＮＡ損傷化学物質を被曝した細胞である。本発明に特に包含されるのは、メラノサイトおよびケラチノサイトなどの上皮細胞、並びに口腔、呼吸器、膀胱および子宮頸部上皮細胞のようなその他の上皮細胞である。ここに明らかにするように、本発明の方法および組成物は多数のソ-スからの上皮細胞において増殖を阻止し、メラニン生成を誘起し、ＴＮＦα産生を引き起こす。
【００５１】
オリゴヌクレオチド類、ＤＮＡ断片類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、ジヌクレオチドダイマー類、分化を促進する作用物質、ｐ５３活性を高める作用物質または前記の１種類以上を含む有効量の組成物を適切な時期に適用する。「適切な時期」は、使用するオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチド、ジヌクレオチドダイマーのまたはその他の作用物質の種類および分子量、治療または予防すべき状態、求められる結果および個々の患者に応じて種々様々である。ここに使用する「有効量」は、測定可能の所望結果に達するために十分な量または濃度である。有効量は、使用するオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチド、ジヌクレオチドダイマーまたはその他の作用物質の種類および分子量、治療または予防すべき状態、求められる結果および個々の患者に依存する。例えば、乾癬の治療または予防、または過増殖、癌状態または前癌状態、またはＵＶ-誘起性皮膚炎のためには、有効量はその疾患のいずれかの症状を軽減または除去し、または疾患に侵された細胞の量、面積または数を減らし、または過増殖性疾患にかかった細胞の増殖速度を低下させるのに必要な量である。濃度は約２-３００μＭでよい。また別の実施形態において、作用物質(例えばオリゴヌクレオチド)の濃度は約５０-２００μＭである；また別の実施形態において、濃度は約７５-１５０μＭである。幾つかの用途ではオリゴヌクレオチドの濃度は約１０-１００μＭでよい。
【００５２】
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチド類、一本鎖ＤＮＡ断片などのＤＮＡ断片類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、またはジヌクレオチドダイマー類、ｐ５３活性を高める作用物質、分化を促進する作用物質、または上記の１種類以上を含むことができる組成物を、適切な送達ビヒクル中で、哺乳動物の対象細胞に投与し、上皮細胞を侵している過増殖性疾患を治療または阻止する。ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、ジヌクレオチドダイマー類、分化を促進する作用物質、ｐ５３活性を高める作用物質、または上記の１種類以上を含む組成物を全身投与することができ、または侵襲領域に直接投与することができ、または過増殖性疾患に一般的に侵される領域に予防的に投与することができる。
【００５３】
また別の実施形態において、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、ジヌクレオチドダイマー類、ｐ５３活性を高める作用物質、分化を促進する作用物質、または前記の１種類以上を含む組成物を表皮に適用し、酸化的ストレスの治療または防止、または過増殖性疾患、癌-または前癌状態、またはＵＶ-反応性皮膚炎を治療または防止する。
【００５４】
さらに別の実施形態において、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、ジヌクレオチドダイマー類、分化を促進する作用物質、ｐ５３活性を高める作用物質、または前記の１種類以上を含む組成物を単独で、または適切な送達ビヒクル中で、表皮に適用し、光老化を軽減し、皮膚癌の発生の可能性を予防しまたは軽減することができる。ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、ジヌクレオチドダイマー類、分化を促進する作用物質、ｐ５３活性を促進する作用物質、または前記の１種類以上を含む組成物を局所的にまたは皮内注射で適切な時期に(すなわち皮膚をＵＶ照射にさらす前に)投与することができる。ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、ジヌクレオチドダイマー類、分化を促進する作用物質、ｐ５３活性を促進する作用物質、または前記の１種類以上を含む組成物を、ＵＶ放射線などの発癌物質に曝露する前、曝露中または曝露後に適用できる。それらは毎日、または規則的にまたは間欠的間隔で適用できる。一実施形態において、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、ジヌクレオチドダイマー類、分化を促進する作用物質、ｐ５３活性を促進する作用物質、または前記の１種類以上を含む組成物を、日中、日光にさらされる皮膚に毎日適用することができる。
【００５５】
本発明のまた別の実施形態において、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類、デオキシヌクレオチド類、ジヌクレオチド類、ジヌクレオチドダイマー類、分化を促進する作用物質、ｐ５３活性を高める作用物質、前記の１種類以上を含む組成物を適切な送達ビヒクル中で、ある個体(例えば個体の上皮細胞またはその他の細胞)に投与し、過増殖性、癌-または前癌状態を治療または防止し、またはベンズピレンなどのＤＮＡ損傷化学物質によって起きるＤＮＡ損傷を修復または防止する。
【００５６】
本明細書中に示すように、本発明の化合物はそれらの未修飾形で、例えばホスホジエステル結合によって連結した未修飾オリゴヌクレオチドの配列の形で、インビトロおよびインビボにおいて活性である。ここに使用する用語「オリゴヌクレオチド」、「ジヌクレオチド」、「ＤＮＡ断片」などは、糖としてデオキシリボ-スを有し、(別の結合または主鎖が指示されていない限り)天然に生ずるようなホスホジエステル結合(「ホスフェート主鎖」)を有する分子を言う。
【００５７】
さらに、本発明のＵＶ擬似効果を引き出すためには必ずしも必要ではないが、生体中の本発明の化合物の半減期を延長しおよび／または対象細胞へのこれら化合物の取り込みを増やすために、本発明の化合物を修飾したり、誘導体化することができ、またはその他の試薬と組合わせることもできる。修飾試薬には例えば脂質またはカチオン性脂質がある。一実施形態において、本発明の化合物類は親油性基、アダマンシ-部分で共有結合によって修飾される。本発明の化合物を、体内の特異的組織に標的化するために修飾することができる。例えば、脳組織を標的とするためには、この化合物をビオチンと共役結合させ、その共役結合化合物を、血液脳障壁を通過する送達を容易にする作用物質、例えばストレプトアビジンに結合した抗トランスファー受容体などと共に使用する。
【００５８】
実施例１７-２０に記載した実験結果から、アポトーシス、細胞周期停止、およびメラニン生成を誘起するためのｐＴｐＴの活性およびテロメア・オーバーハング・リピート相同体オリゴヌクレオチド１１マー１(配列番号：５)の活性のためには、それらが加水分解されることが必要である、と結論づけられる。これらのオリゴヌクレオチドの非加水分解性ホスホロチオエート形は加水分解性分子の活性を阻害する性質を有し、インビボならびにインビトロにおける細胞内反応をブロックするために使用できる。
【００５９】
実施例、特に実施例３１によって、テロメア相同オリゴヌクレオチド類が確立されたヒトリンパ球系およびヒトメラノーマ細胞系においてＳ相停止およびアポトーシスを誘起する(ただし相補的または関連のないＤＮＡ配列はこれらを誘起しない)ことが明らかになる。これらの効果はテロメア相同体の選択的取り込みによるものではない。なぜならば本研究において対照配列も同様に取り込まれるからである。３'オーバーハング配列に部分的に相同のオリゴヌクレオチド類は質的に同じ反応を生起するが、その程度はより低く、しかも高濃度においてのみ起きる。例えばテロメア・オーバーハング・リピート配列と５５％の一致を有する１１塩基オリゴヌクレオチドは、アポトーシスの生起に関して、１１マー１(１００％のヌクレオチド配列がテロメア・リピートと一致する)と１１-マー２(テロメア・リピートに相補的)または１１マー-３(テロメア・リピートに関連のない)との中間体である。ＴＴＡＧＧＧ(配列番号：１１)リピート配列の３分の１に対応するｐＴＴは細胞周期停止に与える１１マー-１の効果を４倍の高濃度で倍加する。ｐＴＴを、(ＴＴＡＧＧＧ)nに５６％一致する配列を有する９塩基オリゴヌクレオチドと比較した研究において、５６％の配列一致を有するこのオリゴヌクレオチドはｐＴＴに匹敵する能力を有し、４０％濃度で(４０μＭ対１００μＭｐＴＴ)ｐ５３およびｐ５３-調節遺伝子を誘発することが判明した。
【００６０】
オリゴヌクレオチドｐＴＴはｐ５３を誘発し、活性化し、多数の遺伝子を転写的にアップレギュレートすることが示された。これら遺伝子の全てとはいわないまでも多くはｐ５３によって調節されている。１１マー１完全相同体に関する実験は、Ｓ相停止がｐ９５／Ｎｂｓ１タンパク質のリン酸化から生ずる結果を誘導することを示す。前記タンパク質は電離放射線照射後のＳ相停止も媒介する。これが機能性ｐ５３欠損細胞の増殖を低減することは注目される。さらに、ｐ９５／Ｎｂｓ１がＡＴＭキナーゼによってリン酸化されるという事実から期待されるように(ガテイ(Ｇａｔｅｉ,Ｍ．)ら(２０００)、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５巻、ｐ．１１５-１１９；ウー(Ｗｕ,Ｘ．)ら、(２０００)、Ｎａｔｕｒｅ  ２５巻、ｐ．４７７-４８２；リム(Ｌｉｍ,Ｄ．Ｓ．)ら(２０００)、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４巻、ｐ．６１３-６１７；ザオ(Ｚｈａｏ,Ｓ．)ら(２０００)、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５巻、ｐ．４７３-４７７)、このオリゴヌクレオチド効果はＡＴＭも必要とし、ＡＴＭキナーゼが突然変異した毛細管拡張性運動失調患者から得た細胞では認められなかった。
【００６１】
実験的テロメア崩壊［カールセダ(Ｋａｒｌｓｅｄｅｒ,Ｊ．)ら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８３巻：ｐ．１３２１-１３２５］および早老を起こす細胞操作、例えばｒａｓ癌遺伝子のトランスフェクションまたは酸化的ストレスへの曝露など、は３'テロメアオーバーハングを消化し、および／または全体的テロメア長を短縮することが知られている。対照的に、本研究で細胞をテロメア相同オリゴヌクレオチドに曝露すると、平均テロメア長(ＭＴＬ)は増加する。単純なメカニズムによって束縛されるものではないが、これらのデータは、オリゴヌクレオチド類が多分ＴＥＲＴの誘発によってテロメラーゼを活性化することを示唆し、テロメラーゼの一過性活性化が、ＡＴＭキナーゼの活性化とその後のｐ５３およびｐ９５／Ｎｂｓ１によるシグナリングを含む生理的テロメア-ベ-スのＤＮＡ損傷反応の一部分であることを暗示するものである。ＤＮＡ損傷およびテロメア崩壊がない場合にこの反応を誘起するオリゴヌクレオチドの明らかな能力は、最近ＴＥＲＴをトランスフェクトした線維芽細胞を含むヒト皮膚の同等の構成物において報告されたように、異所的にテロメラーゼを発現する正常細胞にさえも認められる発癌リスクを高めることなく、テロメア伸長によって細胞を「若返り」させる可能性を与える。同様に、この現象は、ｐ５３過剰発現マウスに認められる種類の強いＤＮＡ損傷反応の利点と、トランスジェニック動物にも認められる早老とを分離できることを示唆する(タイナー(Ｔｙｎｅｒ,Ｓ．Ｄ．)ら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  ４１５巻：ｐ．４５-５２３)。このような「若返り」が、または、決定的なテロメア短縮と関連する老化の表現型の獲得の遅れが、ＴＴＡＧＧＧ(配列番号：１１)反復配列に一部または完全に相同なオリゴヌクレオチドによる治療から生ずるらしいその他の利益に加わる。インビボ並びにインビトロの広範な研究に基づき、これらはサンレス(日光のない)日焼けおよび関連する光防御、ＤＮＡ修復能の増加、癌の予防および治療、および免疫調節を含むものと理解される。
【００６２】
正常状態では、３'テロメア・オーバーハングＤＮＡ配列は折り返され、ＴＲＦ２によって安定化されるループ構造中に隠れていると考えられている［グリフィス(Ｇｒｉｆｆｉｔｈ,Ｊ．Ｄ．)ら(１９９９)、Ｃｅｌｌ  ９７巻、ｐ．５０３-５１４］。しかし、もしもループ-バック構造を不安定にし得る例えば紫外線(ＵＶ)誘起性チミンダイマー、またはグアニン残基を含む発癌性付加物(シスプラチンまたはベンズピレンを含むような)によってテロメアがよじれると、この配列は露出するかも知れない。ＴＴＡＧＧＧ(配列番号：１１)リピート配列の露出は種々のＤＮＡ損傷反応に導く初期シグナルとなり得る。これらのＤＮＡ損傷反応は細胞型並びに上記シグナルの強度および／または持続時間に依存する。これらの反応には、細胞周期停止、アポトーシス、およびより分化し、時には適応した表現型、例えばメラニン産生増加(日焼け)などがある。図３５を参照されたい。
【００６３】
提案されたモデルは、テロメアＤＮＡ損傷を修復できなければ損傷反応の増大、例えばｐ５３誘発およびアポトーシスなどが起きることを予想している；このことはＤＮＡ光生成物を効率的に除去できないＵＶ-照射-乾皮症の色素性細胞について報告されている(ドゥマツ(Ｄｕｍａｚ,Ｎ．)ら、１９９８、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １９巻：ｐ．１７０１-１７０４)。このモデルは、正常を超える(ｓｕｐｒａ-ｎｏｒｍａｌ)ｐ５３活性を有するトランスジェニックマウスが腫瘍に強く抵抗するが、早期に老化することを示した最近の研究結果(タイナーら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  ４１５巻：ｐ．４５-５２３)とも一致する。ＤＮＡ損傷認識メカニズムは、主としてチミジンおよびグアニン塩基を含むように展開するらしい。ＴＴＡＧＧＧ(配列番号：１１)リピート配列はＤＮＡ損傷のすぐれた標的である。なぜならばジチミジン部位が大抵の場合ＵＶ光生成物の形成に関与しており(セットロー(Ｓｅｔｌｏｗ,Ｒ．Ｂ．)およびキャリア(Ｗ．Ｌ．Ｃａｒｒｉｅｒ)、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７巻：ｐ．２３７-２５４)、グアニンは８-オキソグアニンを形成する酸化的損傷の主要部位であり［カサイ(Ｋａｓａｉ,Ｈ)およびニシムラ(Ｓ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ)１９９１「酸化的ストレス：酸化剤および抗酸化剤(Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ：Ｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ)」、ｐ．９９-１１６、シーズ(Ｈ．Ｓｉｅｓ)編集(ロンドン、アカデミック・プレス社)］並びに大部分の発癌物質がこの塩基と付加物を形成するからである［フリードバーグ(Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ,Ｅ．Ｃ．)ら、１９９５、ｐ．１-５８、フリ-ドバ-グ、ウォルカー(Ｇ．Ｃ．Ｗａｌｋｅｒ)およびシード(Ｗ．Ｓｉｅｄｅ)編集(ワシントン  Ｄ．Ｃ．、ＡＳＭプレス)］。
【００６４】
仮定された、テロメアで開始するシグナル形質導入経路は、高等生物における発癌に対する次のような数種の明確な防御のための一つの発展的手掛かりを与えてくれる：統計的根拠だけに基づいて長期環境的曝露中およびＤＮＡ複製および細胞分割の連続ラウンド中にゲノム全体に複数の突然変異が蓄積していることが予想される細胞の増殖能の永久的喪失(老化)；ＤＮＡ複製の再開前に修復のために使える時間を延長するために、細胞周期の一時的停止；損傷が修復能力を超える場合、組織から細胞を除去するための細胞自滅プログラムの活性化(急性テロメア損傷はゲノム全体のＤＮＡ損傷程度を反映すると予想され)；ＤＮＡ光生成物の形成を軽減するために日焼けなどの適応反応を数日間にわたって誘発し、および／または将来の同様な出来事から生じる損傷を防止するためにＤＮＡ修復能力を高めること。
【００６５】
本発明は哺乳動物における過増殖性異常を治療する方法を含み、その治療は上記哺乳動物に脊椎動物のテロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を前記哺乳動物に投与することを含む。これらの方法は特に人間に適用できる。過増殖性異常は細胞の正常範囲を超える良性増殖によって特徴づけられ、時には良性腫瘍または乾癬のように広がった表皮肥厚を起こすこともある。癌もこれらの方法で治療すべき種々の過増殖性疾患の一つであり、それは種々の形であらわれ、子宮頸部癌、リンパ腫、骨肉腫、メラノーマおよび皮膚に発生するその他の癌、および白血病など、皮膚体内の種々の細胞型および器官に発生する。乳房、肺、肝臓、前立腺、膵臓、卵巣、膀胱、子宮、結腸、脳、食道、胃および甲状腺も、この治療の対象となる癌細胞型に入る。
【００６６】
オリゴヌクレオチドは、ここに記載の治療法において１種類のオリゴヌクレオチドとして、または１種類以上の異なるオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与できる。５'ホスフェートのないオリゴムクレオチドもこれら治療法のいずれにも使用でき、ここに記載の疾患または異常の発生を治療もしくは予防する。しかし５'ホスフェートを有するオリゴヌクレオチドがより好ましい、なぜならば５'ホスフェートは細胞内へのオリゴヌクレオチドの取り込みを改善することが示されたからである。オリゴヌクレオチドの長さは少なくも２ヌクレオチド長であり、より好ましくは２-２００ヌクレオチド、より好ましくは２ないし２０ヌクレオチド長である。５-１１ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドがより好ましい。
【００６７】
脊椎動物のテロメア・オーバーハング・リピート配列は(ＴＴＡＧＧＧ)nである。本発明は、治療のために投与されるオリゴヌレオチドが前記テロメア・リピート配列に一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有するという方法を含む。少なくも６０％のヌクレオチド配列の一致を有するオリゴヌクレオチドが好ましい。少なくも７０％のヌクレオチド配列の一致を有するオリゴヌクレオチドがより好ましい。少なくも８０％のヌクレオチド配列の一致を有するオリゴヌクレオチドがさらにより好ましい。少なくも９０％のヌクレオチド配列の一致を有するオリゴヌクレオチドが非常により好ましい。最も好ましいのは少なくも１００％のヌクレオチド配列が(ＴＴＡＧＧＧ)nに一致するオリゴヌクレオチドである。特定のテロメア・リピート相同体ｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)、ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５；ここでは「１１マー１」および「Ｔ-オリゴ」とも呼ばれる)、ｐＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴ(配列番号：１３)およびｐＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧ(配列番号：１４)は、テロメア・リピート配列と少なくも５０％一致するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを使用したい場合に特に好ましい。テロメア・オーバーハング・リピート配列と一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有するその他のオリゴヌクレオチド類を抗増殖剤として使用することができる。それらは例えばｐＴＡＧＧＡＧＧＡＴ(配列番号：２)、ｐＡＧＴＡＴＧＡ(配列番号：３)、ｐＧＴＡＴＧ(配列番号：４)、ｐＴＴＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡ(配列番号：１６)、ｐＴＴＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１７)、およびｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡ(配列番号：１８)などである。
【００６８】
オリゴヌクレオチドは比較的短いポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドはヌクレオチドモノマーの線状ポリマーであり、上記ヌクレオチド類は１つのヌクレオチドの３'位置と隣接ヌクレオチドの５'位置との間でホスホジエステル結合によって結合している。特に指示しない限り、本発明の「オリゴヌクレオチド」はホスホジエステル主鎖を有する。
【００６９】
経皮的送達を高めるために、本発明のオリゴヌクレオチドを修飾してそれらの負電荷を遮蔽または低減し、またはそれ以外にもそれらの化学的特性を改変することができる。これは例えば入手しやすい試薬および当業者に公知の方法を使用してオリゴヌクレオチドのアンモニウム塩を製造するというやり方で実現する。オリゴヌクレオチドの好ましいアンモニウム塩はトリメチルー、トリエチルー、トリブチルー、テトラメチルー、テトラエチルーおよびテトラブチルーアンモニウム塩を含む。アンモニウムおよびその他の正電荷基はオリゴヌクレオチドに共有結合し、角質層を経由するその送達を容易にする。その際、生きている表皮層の細胞内に到達したときにオリゴヌクレオチドを放出する酵素によって分解できる結合を用いる。
【００７０】
オリゴヌクレオチドの負電荷を遮蔽または低減するその他の方法は、当業者に公知の方法および試薬を使用してオリゴヌクレオチドの５'ホスフェート基および／またはオリゴヌクレオチドの内部ホスフェートにポリオキシエチレン・スペ-サを付加することを含む。これは要するに、６-または１２-炭素修飾体(リンカー)をホスフェートに付加することで、その結果正味負電荷は＋１だけ減り、オリゴヌクレオチドの親水性はより小さくなる。その他の負電荷減少は、ポリオキシエチレン・リンカーの末端にホスホロアミダイトを付加し、それによってさらに中性にする正電荷を与えるというやり方で達成される。
【００７１】
本発明のオリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖を修飾または合成して負電荷を低減することもできる。好ましい方法はメチルホスホン酸(またはキラルーメチルスルホネート)を使用し、それによってホスホネート中の負に帯電した酸素原子の１つをメチル基に置換することを含む。これらのオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに類似している。後者はメチル基の代わりにスルフェートを含み、本発明の範囲内でもある。
【００７２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの塩基がペプチド主鎖によって互いに結合する、ペプチド核酸(ＰＮＡ)の形をとることもできる。
【００７３】
例えば米国特許第６,５３７,９７３号および第６,５０６,７３５号(この両特許公報は、このなかに記載される全てのオリゴヌクレオチド修飾について参考として本明細書に組み込まれる)に記載されているようなオリゴヌクレオチド類のその他の修飾などは当業者には容易に理解される。
【００７４】
上記オリゴヌクレオチドは、２個以上の化学的に明確な主鎖結合の組み合わせをもつように合成され、その１個はホスホジエステルである「キメラ」オリゴヌクレオチドでもよい。一実施形態において、３'末端に１つ以上のホスホジエステル結合を有するキメラオリゴヌクレオチドがある。また別の実施形態には、３'および５'末端に１つ以上のホスホジエステル結合を有するキメラオリゴヌクレオチド類がある。
【００７５】
実施例４６に報告するように、配列番号：５を有する１１-マーオリゴヌクレオチドは、全体にホスホジエステル結合、全体にホスホロチオエート結合、または結合の組み合わせを含むように合成される。一つのオリゴヌクレオチドは５'末端に２個のホスホロチオエート結合を有し、もう一つのオリゴヌクレオチドは３'末端に２個のホスホロチオエート結合を有し；また別のオリゴヌクレオチドは各端に２個のホスホロチオエート結合を有する。３'末端にホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドは線維芽細胞の老化と関連する諸反応を最も効果的に刺激することが判明した。そのため、そのオリゴヌクレオチドの３'末端における酵素的切断は老化反応の誘発における一段階であるかも知れない。
【００７６】
配列の一致は問題のオリゴヌクレオチドと(ＴＴＡＧＧＧ)nとのベスト・フィット・アラインメントによって決定される。複数の配列を各位置で比較し、「一致する」または「一致しない」の確認を各ヌクレオチド位置で行う。各配列の欠失または挿入に分類することなく決定された「一致する」パーセントが、問題のオリゴヌクレオチドに沿って数えた際の配列一致のパーセントである。こうして、図によると、配列番号：５は(ＴＴＡＧＧＧ)nと１００％の配列の一致を有する。配列番号：１では(ＴＴＡＧＧＧ)nとの配列一致は５／９である。配列番号：４は(ＴＴＡＧＧＧ)nとの３／５の配列一致を有する。ｐＴＴは(ＴＴＡＧＧＧ)nとは、１００％の配列相同体である。
【００７７】
抗増殖効果を有し、したがって哺乳動物の細胞増殖を低減する方法に適切に使用できることが判明した特定分子の例はオリゴヌクレオチド・チミジン・ジヌクレオチド(「ｐＴｐＴ」または「ｐＴＴ」または「Ｔ2」)およびｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)である。
【００７８】
本発明のまた別の部分は、哺乳動物における悪性腫瘍細胞の分化を促進する方法であって、哺乳動物に、(ＴＴＡＧＧＧ)nと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与する方法である。分化状態は、多くの面で悪性腫瘍状態に対置するものと考えることができる。細胞型に依存して、分化は多数の異なる遺伝子の発現の調節を含み、例えばある酵素活性や細胞表面タンパク質を増加または減少させる。例えばメラノサイトはチロシナーゼ発現を増加させるオリゴヌクレオチドに反応する。
【００７９】
ここで、テロメア・リピート配列に一致する配列を有するオリゴヌクレオチドを取り込んだ細胞によって生ずる癌細胞の増殖阻止と、癌細胞よりむしろ分化細胞に典型的な抗原の細胞表面への出現増加との間に関連性が見いだされている。こうして本発明のその他の方法は哺乳動物における癌細胞の分化を示唆する１種類以上の表面抗原の発現を高めることであり、前記方法は、ここに記載される１種類以上のオリゴヌクレオチド、例えば脊椎動物のテロメア・オーバーハング・リピートとの一致が少なくも５０％のヌクレオチド配列である１種類以上のオリゴヌクレオチドの有効量を哺乳動物に投与することを含む。
【００８０】
これら細胞をより分化した状態に誘導する、または細胞が分化の１つ以上の特性を獲得することは、免疫療法の方法で研究できる。分化状態に関連する表面抗原、その断片、または表面抗原の外部に露出したループの研究から誘導される合成ペプチドをワクチンに組み込んで、細胞表面抗原をあらわす細胞に対する細胞傷害性Ｔリンパ球の生成を癌患者に誘発することができる。例えば、メラノーマ細胞において、その細胞がテロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを取り込んだ際に、細胞表面抗原ＭＡＲＴ-１、チロシナーゼ、ＴＲＰ-１またはｇｐ-１００、またはこれらの組み合わせが細胞表面上で増加し得る。実施例２９を参照されたい。これらの細胞表面抗原は、前記抗原の表面ループに由来するアミノ酸配列を有する分離した細胞表面抗原またはペプチドを予防接種することによって、免疫療法の標的となり得る。イェーゲル(Ｊ  ｇｅｒ,Ｅ．)ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６６巻：ｐ．４７０-４７６、１９９６；カワカミ,Ｋ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４巻：ｐ．３９６１-３９６８、１９９５；およびデブリース(ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ,Ｔ．Ｊ．)ら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９３巻：ｐ．１３-２０、２００１。
【００８１】
テロメラーゼは酵素のＲＮＡ部分に結合するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを使用する理論に基づく抗増殖法の標的である。しかし、ここに記載の治療法は、標的細胞中のテロメラーゼの存在または機能には無関係に使用できる。テロメア・リピート・オーバーハング相同体ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)は正常線維芽細胞および骨肉腫細胞系Ｓａｏｓ-２の細胞においてＳ相細胞周期停止を引き起こす。これらのいずれの細胞もテロメラーゼ活性をもたない。実施例３２および３４を参照されたい。例えば、癌細胞(大部分はテロメラーゼ活性を有するが若干の細胞はテロメラーゼ活性をもたない)では、本発明の方法をテロメラーゼ活性には無関係に使用できる。癌細胞の増殖阻止は、細胞周期の停止、アポトーシス、および／またはより分化した状態への分化によって特徴づけられる。操作的にテロメラーゼ(＋)またはテロメラーゼ(-)状態には無関係な、哺乳動物(ヒトなど)における癌細胞の増殖阻止法は、その哺乳動物に、テロメア・オーバーハング・リピート配列と少なくも５０％は一致するヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与することである。
【００８２】
実施例３４に記載される実験は、テロメア・リピート配列に一致する少なくも５０％の配列を有するオリゴヌクレオチドで処理した腫瘍または腫瘍細胞にＳ相細胞周期停止をもたらすために野生型ｐ５３タンパク質の機能は必要ないことを明らかにしている。ｐ５３ｎｕｌｌ骨肉腫細胞系はｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)の添加に対してＳ相停止をもって反応することが示された。こうして、哺乳動物(ヒトなど)における癌細胞の増殖を阻止する方法であって、テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を前記哺乳動物に投与する工程を包含する、方法は、標的細胞が正常ｐ５３機能を有するか否かには関係なく実施できる。
【００８３】
本発明はさらに、哺乳動物の皮膚を紫外線に曝露した結果-海綿状態、水疱形成または異常角化症、またはこれらの任意の組み合わせ-を、その皮膚に、テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与することによって防止する方法を含む。この方法の諸段階をヒトにおける皮膚癌の発生率の低下のためにも使用でき、特に色素性乾皮症またはその他の皮膚癌の遺伝的素因を有する患者における皮膚癌の発生を低減するために使用できる。皮膚に、テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を適用する方法は、皮膚に対する紫外線照射性損傷の修復を高めるための方法でもある。ここに記載され、ヒトに見いだされたテロメア・リピート配列に一致する少なくも５０％の配列を有するという特徴をもつ任意のオリゴヌクレオチド----オリゴヌクレオチドｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)、ｐＣＡＴＡＣ(配列番号：６)、ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)、ｐＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴ(配列番号：１３)またはｐＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧ(配列番号：１４)などがこの方法に使用できる。さらにオリゴヌクレオチドｐＴＴおよびｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)もこの方法に使用できる。
【００８４】
酸化的損傷は、過酸化水素、ヒドロキシラジカルおよびス-パ-オキシドなどの反応性酸素種(ＲＯＳ)を有する細胞に見いだされる分子反応の反応産物によって特徴づけられる。酸化的損傷は正常細胞代謝、ＵＶＡ照射、電離放射線、または種々の化学物質への曝露などから起こり得る。反応性酸素種は多数の方法によって測定できる。一測定法はプローブ、ジクロロフルオレッセインジアセテート(モレキュラー・プローブ社)を使用する。これは、細胞に取り込まれ、ＲＯＳによって酸化されると蛍光を発する無色試薬である。蛍光濃度は細胞内ＲＯＳ濃度と相関関係にある。
【００８５】
出願人は、哺乳動物における酸化的損傷を軽減する方法であって、哺乳動物、特に哺乳動物の皮膚に、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を適用する方法も記載した。オリゴヌクレオチドがｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)である実施形態が好ましい。ｐＴＴもこの方法において有効である。オリゴヌクレオチド治療が細胞の酸化的ＤＮＡ損傷修復能力を高めることを示唆する実施例１５、２１、２２、２３および５２の結果を参照されたい。
【００８６】
出願人はさらに、哺乳動物におけるメラノーマを治療する方法であって、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物をヒトに投与する方法も記載した。特殊の場合において、オリゴヌクレオチドはｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：１)でよい；ｐＴＴもこの方法に使用できる。出願人は、マウスモデルでヒトメラノーマ細胞を用いて、オリゴヌクレオチド療法の有効性を示した。実施例３０、４９、５０および５１を参照されたい。
【００８７】
本発明のその他の局面は、ヒト皮膚におけるケラチノサイトの増殖を軽減する方法に関係する。この場合、上記方法は、ヒト・テロメア・オーバーハング・リピートと一致する少なくも５０％のヌクレオチド配列を有する１種類以上のオリゴヌクレオチドを含む有効量の組成物を皮膚に適用することを含む。この方法は皮膚におけるケラチノサイトの増殖によって特徴づけられる皮膚の異常、例えば脂漏性角化症、光線性角化症、ボ-エン病、扁平上皮細胞癌または基底細胞癌などに適用できる。ｐＴＴはこの方法に有効である。
【００８８】
本発明は哺乳動物における疾患または異常を治療する方法を含む。その際上記疾患および異常は細胞の異常増殖が特徴であり、非制限的に癌、充実性腫瘍、血液性腫瘍(例えば白血病)、腫瘍転移、良性腫瘍(例えば血管腫、聴神経鞘腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫)および乾癬などである。過増殖性疾患は、強皮症および瘢痕性蟹足腫(すなわちケロイド)などの、線維芽細胞の過剰または異常刺激によって特徴づけられる。
【００８９】
癌のような過増殖性疾患を軽減するための治療に用いられるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類を、薬物学的または生理的に容認できる担体と組み合わせて使用できる。このような組成物はその他に希釈剤、充填剤、塩類、緩衝剤、安定剤、溶解剤、および当業者に公知のその他の物質も含むことができる。カチオン性脂質、例えばＤＯＴＡＰ［Ｎ-(２、３-ジオレオイルオキシ)プロピル］-Ｎ,Ｎ,Ｎ-トリメチルアンモニウム塩などをオリゴヌクレオチド類と共に使用して安定性を高めることができる。オリゴヌクレオチド類は、ＰＬＧＡ／ＰＬＡコポリマー類、キトサンまたはフマール酸／セバシン酸コポリマー類と錯化合物を形成し、バイオアベイラビリティを改善することができる｛ここでＰＬＧＡは［ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)］であり；ＰＬＡはポリ(Ｌ-ラクチド)である｝。用語「薬物学的に容認できる」および「生理的に容認できる」は、活性成分(類)の生物学的活性の有効性を阻害しない無毒性物質を意味する。担体の特性は投与経路に依存する。
【００９０】
抗増殖剤として使用される組成物はさらに、オリゴヌクレオチド(類)の活性を高めるか、または治療におけるその活性またはその使用を補充するその他の作用物質、例えば化学療法剤または放射性物質などを含むことができる。このような追加的因子および／または作用物質を上記組成物中に入れ、オリゴヌクレオチド(類)との共力効果をもたらし、または副作用を最小にすることができる。さらに、本発明の組成物の投与はその他の治療と同時に行うことができる、例えば化学療法または放射線治療法と組み合わせて行うことができる。
【００９１】
ここに記載されるオリゴヌクレオチド類は、病気を治療するためのその他の組成物および方法と組み合わせて使用できる。例えば腫瘍は、オリゴヌクレオチド療法と組み合わせた手術、放射線照射、化学療法または免疫療法で従来通り治療し、その後オリゴヌクレオチドを引き続き患者に投与して微小転移の休止状態を延ばし、残っている原発腫瘍の増殖を安定化し、阻止する。
【００９２】
本発明の組成物は、本発明のオリゴヌクレオチド(類)が、その他の薬物学的に容認される担体に加えて、両親媒性作用物質(例えばミセルとして凝集した形で存在する脂質など)、不溶性単相、液晶、または水溶液中のラメラ層と一緒になったリポソームの形でよい。リポソーム組成物のために適切な脂質としては非制限的にモノグリセリド類、ジグリセリド類、スルファチド類、リソレシチン、燐脂質類、サポニン、胆汁酸などがある。
【００９３】
オリゴヌクレオチド類を含む医薬組成物をつくり、抗増殖療法に使用することができる。このような医薬組成物の投与は当業者に公知の種々の一般的方法、例えば経口摂取、エアゾ-ルなどの吸入、局所的または経皮的適用、または頭蓋内、脳血管内、脳内、膣内、子宮内、経口、直腸または非経口(例えば静脈内、髄腔内、皮下または筋肉内)経路によって、または皮内、皮下、腹腔内、非経口または静脈内注射によって実施される。投与経路は腫瘍の部位、標的となる腫瘍、増殖または損傷の部位によって決まる。
【００９４】
１種類以上のオリゴヌクレオチドの有効量を含む組成物を増殖または腫瘍の部位に送達するために、その部位に直接注射することができる。或いは、アクセスできる粘膜部位の場合は、マイクロメータ直径を有するビーズ上にオリゴヌクレオチド類をコーティングすることによって、または口腔内噴射注入デバイスによって、バリスティック・送達を利用することができる。
【００９５】
遺伝子治療におけるＤＮＡ送達のためのウィルスベクターは多年にわたる研究の対象である。レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ワクチンウィルスおよび植物特異的ウィルスをシステムとして使用し、癌またはその他の増殖を治療するためのヌクレオチドをパッケ-ジし、送達することができる。複製することはできないが細胞に感染する能力を保持するアデノ随伴ウィルスベクターが開発された。長所の一つは、免疫原性が低く、反復投与できることである。送達システムは例えばページ(Ｐａｇｅ,Ｄ．Ｔ．)およびクドモア(Ｓ．Ｃｕｄｍｏｒｅ)の、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ６巻：ｐ．９２-１０１０(２００１)に記述されている。
【００９６】
標的核酸(アンチセンス・オリゴヌクレオチド類)の機能をオリゴヌクレオチドが阻止することに関する理論に基づいてオリゴヌクレオチドを使用して行われた諸研究(これらの研究の大部分はホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドで行われた)は、標的細胞への効果的送達法を見いだした。臨床試験において食塩溶液中のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが特別な送達・ビヒクルを使わずに投与された(ホグレフ(Ｈｏｇｒｅｆｅ,Ｒ．Ｉ．)アンチセンスおよび核酸薬剤の開発(Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ)９巻：ｐ．３５１-３５７、１９９９)。
【００９７】
非経口投与に適した組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、殺菌剤および、前記組成物をレシピエントの体液と等張にする溶質を含むことができる水性および非水性滅菌注射用溶液；および懸濁剤および濃化剤を含むことができる水性または非水性滅菌懸濁液を含む。前記組成物は単一投与量または多数回投与量容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに入っていてもよいし、組成物の使用直前に水などの注射用滅菌液体担体の添加だけを必要とするような凍結乾燥(ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ)状態で保存してもよい。即座に使用できる注射用溶液および懸濁液は前に記載したような種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製できる。静脈内、皮内、または皮下注射のために好ましい医薬組成物は本発明のオリゴヌクレオチドの他に、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性ビヒクル、または当業者に公知のその他のビヒクルを含まなければならない。本発明の医薬組成物は安定剤、保存料、緩衝剤、抗酸化剤または当業者に公知のその他の添加剤も含むことができる。
【００９８】
定時放出または持続的放出送達システムの使用も本発明に含まれる。このようなシステムは手術が難しいか不可能な状態、例えば高齢のためにまたは疾患経過それ自体のために衰弱している患者など、またはリスク-利益分析が治癒よりもコントロールを指示している場合には非常に有益である。一つの方法は移植可能のポンプを使用して測定量の組成物をある期間、腫瘍部位などに送達することである。
【００９９】
特に増殖または腫瘍の局所的治療では持続的放出基質がオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の送達法として使用できる。それは、酵素的または酸／塩基加水分解によってまたは溶解によって分解し得る物質、通常はポリマーから作られる基質である。体内にひとたび挿入されると、その基質は酵素および体液によって活性化される。持続的放出基質はリポソーム、ポリラクチド類(ポリ乳酸)、ポリグリコリド(グリコール酸のポリマー)、ポリラクチド-コ-グリコリド(乳酸のコポリマー類およびグリコール酸)ポリ酸無水物、ポリ(オルト)エステル類、ポリタンパク質類、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸類、脂肪酸類、燐脂質類、多糖類、核酸類、ポリアミノ酸類、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸類、ポリヌクレオチド類、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコ-ンなどの生体適合性物質から選択される。好ましい生体内分解性基質は、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチド-コグリコリド(乳酸およびグリコール酸のコポリマー類)のいずれか一つの基質である。
【０１００】
本発明の医薬組成物中の本発明のオリゴヌクレオチドの量は、治療すべき状態の性質および重症度、および患者がこれまでに受けた治療の性質によって決まる。ヒトの患者の場合、主治医がここの患者それぞれを治療する本発明のオリゴヌクレオチド量を決定する。最初に、主治医が少量を投与し、患者の反応を観察する。その患者で最適治療効果が得られるまで投与量を増やし、最適治療効果が得られた時点でそれ以上投与量を増やさない。本発明の医薬組成物を使用する治療期間は、治療すべき疾患の重症度、各個々の患者の状態および潜在的特異体質反応によって変動する。
【０１０１】
本発明を下記の非制限的実施例によってさらに詳しく説明する。
【実施例】
【０１０２】
実施例１：ヒト扁平上皮癌細胞への適用。
【０１０３】
ヒト扁平上皮癌細胞系ＳＣＣ１２Ｆ細胞を一次ケラチノサイト培地(３００ｍｌ  ＤＭＥ、１００ｍｌ  Ｆ-１２栄養補充物質、５０ｍｌ  １０×アデニン、５０ｍｌ  ウシ胎児血清、５ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシン  ストック、および０．５ｍｌ  １０μｇ／ｍｌ上皮成長因子および最終濃度１．４μｇ／ｍｌになる量のヒドロコ-チゾン)に保持し、水(希釈剤)、１００μＭ  ｐＴｐＴ(Ｔ2、ミドランド・サーティファイド・リアジェント・カンパニー(Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ)、ミドランド、ＴＸ)または１００μＭｐｄＡｐｄＡ(Ａ2)のいずれかを投与した。投与前(０日)、投与後１、３、４、５日目に細胞を採取し、クールター(Ｃｏｕｌｔｅｒ)(商標)カウンターで数えた。採取後、細胞を総ＲＮＡ分離のために処理し、ノーザンブロット法で分析した。図１に示すように、ヒト扁平上皮癌細胞にｐＴｐＴを添加すると細胞成長率が著しく減少した。対照デオキシアデニンジヌクレオチド(ｐｄＡｐｄＡ)(ｐＴｐＴに非常に似ている化合物であるが、ＵＶ照射によって二量体化しにくく、したがってＵＶ誘起性ＤＮＡの修復過程において滅多に除去されない)の添加は効果を示さない。
【０１０４】
第二の実験において、ＳＣＣ１２Ｆ細胞を上記のように培養した。播種後２または３日後、融合前の培養物に１００μＭ  Ｔ2または対照としての希釈剤を補充した新鮮培地を与えた。細胞を毎日トリプシン化によって集め、クールター(商標)カウンターによって数えた。Ｔ2処理した培養器における細胞収率は、５日後、対応する対照培養物に比較して７５％減少した(図２)。これは、Ｔ2-処理細胞の細胞集団の倍加１に対して対照細胞では細胞集団の倍加２．３に相当する。これらの結果は、Ｔ2ＤＮＡ断片の添加は癌細胞の増殖も含めた細胞増殖を阻止することをさらに証明している。
【０１０５】
第三の実験において、ヒト扁平上皮癌細胞にＴ2を２４-７２時間添加すると、少なくも３つの遺伝子(成長停止およびＤＮＡ損傷(ＧＡＤＤ４５)、老化誘導性インヒビタ(ＳｄｉＩ)、および切除修復クロス-コンプリメンティング遺伝子(ＥＲＣＣ-３))のアップレギュレーションが起きることが示された。１対のＳＣＣ１２Ｆ細胞培養物を、１０％ウシ胎児血清(ハイクロン・ラボ(Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ)ローガン、ＵＴ)および上皮成長因子(ホランダ-(Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ,Ｍ．Ｃ．)ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８巻：ｐ．３２８-３３６(１９９２))を上記のように補充したダルベッコ改良イーグル培地をベースにしたケラチノサイト増殖培地(ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ガイサースバーグ、ＭＤ)に保持した。融合前の培養物に、１００μＭ  Ｔ2または等量の希釈剤どちらかを補充した新鮮培地を加えた。添加後、細胞を毎日集め、製造者のプロトコルにしたがってＴｒｉ-試薬抽出法(モレキュラー・リサーチ・センター、シンシナチ、ＯＨ)を使用して、総ＲＮＡ分離のために処理した。各サンプルからの１０μｇのＲＮＡをゲル電気泳動にかけ、ナイロンフィルタに移し、既述のように試験した(ナダ(Ｎａｄａ,Ａ．)ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２１１巻：ｐ．９０-９８(１９９４))。ＧＡＤＤ４５のｃＤＮＡを、ヒトＧＡＤＤ４５遺伝子配列に基づくプライマー類を使用するＰＣＲによって作製した(ミツドミ(Ｍｉｔｓｕｄｏｍｉ,Ｔ．)ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ７巻：ｐ．１７１-１８０(１９９２))。ＥＲＣＣ-３のｃＤＮＡはアメリカ培養コレクション(ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ)から購入した。ＳＤＩ１ｃＤＮＡはスミス博士(Ｄｒ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ)から贈られたものであり、既に記載した(ワルワ-ス(Ｗａｌｗｏｒｔｈ,Ｎ．Ｃ．)およびベルナルド(Ｂｅｒｎａｒｄｓ,Ｒ．)Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１巻：ｐ．３５３-３５６(１９９６))。
【０１０６】
希釈剤対照に比較して、Ｔ2処理細胞では、ＧＡＤＤ４５、ＥＲＣＣ-３およびＳＤＩ１のｍＲＮＡは早くも２４時間でアップレギュレートし、数日間は増加したままであった。対照Ａ2の添加はこれらの遺伝子の誘導に関しては効果がより小さいかまたは無効であった。Ｓ９１メラノーマ細胞と正常ヒト線維芽細胞の実験で匹敵するデータが得られた。
【０１０７】
誘導の時間的経過は、これを研究した２遺伝子［ＧＡＤＤ４５およびｐ２１(ＳｄｉＩとも呼ばれる)］ではＵＶ照射後に認められたものと同様であり、メラノサイト(メラニン形成細胞)およびメラノーマ細胞におけるＴ2によるチロシナーゼ遺伝子の誘導の時間的経過と同様である。ＳｄｉＩは細胞周期調節に、特に細胞分割の阻止に関係があることは公知である。ＧＡＤＤ４５およびＥＲＣＣ-３(ヒトＤＮＡ修復酵素)はＵＶ誘起性ＤＮＡ損傷の修復に関係することは公知である。Ｔ2に対する反応はこれら細胞系のＵＶ照射後に認められたものと同じであり、種々の代謝阻害薬、例えば過増殖性皮膚疾患の治療に臨床的に有効であるメトトレキセートなど、に対する反応に類似している。
【０１０８】
実施例２：ヒト子宮頸部癌細胞への適用
ヒト子宮頸部癌細胞(Ｈｅｌａ細胞)をＤＭＥ＋１０％コウシ血清中に保持し、水(希釈剤)または１００μＭ  Ｔ2を投与した。投与後１、４および６日目に細胞を集め、クールター(商標)カウンターによって数えた。
【０１０９】
ヒト子宮頸部癌細胞へのＴ2の添加は、図３に示すように細胞増殖の顕著な減少を引き起こした。
【０１１０】
実施例３：ヒトメラノーマ細胞への適用
ヒトメラノーマ細胞系ＣＲＬ１４２４、Ｍａｌｍａ、Ｓｋ  Ｍｅｌ２、およびＳｋ  Ｍｅｌ２８はアメリカ培養コレクション(ＡＴＣＣ)から得た。この細胞系をＤＭＥ＋２％コウシ血清中に保持し、水(希釈剤)をＤＭＥと共に与えるか、またはＤＭＥ中１００μＭのＴ2を与えた。投与１週間後、細胞を集め、クールター(商標)カウンタによって数えた。
【０１１１】
４種類のヒトメラノーマ細胞系のいずれにＴ2を添加しても、図４に示すように細胞収率の顕著な低下が起きる。
【０１１２】
実施例４：ヒトケラチノサイトへの適用
正常ヒト新生児ケラチノサイトを実施例１においてＳＣＣ１２Ｆ細胞について記載したように培養し、１００μＭ  Ｔ2、または対照としての希釈剤のいずれかで処理した。細胞を採取して細胞を数えた。Ｔ2処理培養基の細胞収率は３日後、対照培養物のそれに比較して６３％減少した。(図５)これは対照細胞ではこの期間に細胞集団の倍加１に相当し、他方、Ｔ2処理細胞の数は同じままであった。これらの結果は、ＤＮＡ断片の適用が細胞増殖を阻止することを証明する。
【０１１３】
Ｔ2で２４-７２時間処理した正常ヒトケラチノサイトのノーザンブロット分析は、腫瘍壊死因子アルファ遺伝子(ＴＮＦα)の誘導を示した。ＵＶ照射によって誘発することが知られているこの免疫調節サイトカインは、このようにＴ2によって誘導されるのかも知れない。局所的に適用されるＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはジヌクレオチドダイマーの使用は、皮膚反応の免疫調節に有用であり、免疫媒介体に関係する病気または状態の治療または予防に有用である。
【０１１４】
実施例５：ＤＮＡ断片による正常新生児線維芽細胞の細胞増殖の阻止
正常ヒト新生児線維芽細胞をファルコンＰ３５培養皿に９×１０4細胞／皿の密度で培養した。培養培地はＤＭＥ＋１０％コウシ血清、２ｍｌ／プレートである。培養後１日目に培養物にＤＭＥ中１００μＭ  Ｔ2またはＤＭＥ中１００μＭ  Ａ2、または水(対照)を補充した。２枚のプレートを集め、添加の前に計数し、開始時または「０日」の読みを得る。補充物の添加後５日目まで、各状態の二重のプレートを採取し、細胞数を決定した。全ての細胞の計数はクールター(商標)カウンタで行われた。２実験の結果は図６および図７に示される。結果は、ＤＮＡ断片の適用が細胞増殖を阻害することを示す。
【０１１５】
第二の実験において、正常ヒト新生児線維芽細胞を、実施例１でＳＣＣ１２Ｆについて記載したようにプレーティングし、培養した。培養物に１００μＭ  Ｔ2または水(対照)を補充し、細胞を採取して細胞計数を行った。Ｔ2処理した線維芽細胞培養物における細胞収率は３日後、対応する対照培養物のそれと比較して４０％減少した(図８)。これは、対照細胞ではこの期間に細胞集団の４倍加があったのに対して、Ｔ2処理細胞では３．６の倍加であったことに相当する。これらの結果はさらに、対象の細胞を本発明のＤＮＡ断片と接触させると細胞増殖が阻害されることを明らかにする。
【０１１６】
実施例６：上皮細胞増殖に対するｐＴｐＴの効果
モルモットに１日または１日１回または２回、１００μＭｐＴｐＴを、または対照としてビヒクルだけを３日間局所的に適用した。４日目に、パンチ生検切片を得、１０μＣｉ／ｍｌ 3Ｈ-チミジン(比放射能９.０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ)を補充した一次ケラチノサイト培地に７または８時間保持した。増殖細胞は新しく合成されたＤＮＡに3Ｈ-チミジンを取り込むと予想される。組織を冷培地ですすぎ、１０％リン酸緩衝ホルマリン中で固定した。一連の脱水工程後、組織をパラフィンに埋封した。６μｍ切片を切り、ガラススライドに載せ、ＮＴＢ-２ニュークレア・トラック(Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｃｋ)乳濁液に浸し、４℃で、暗所に７日間保存した。切片をコダックＤ-１９現像液で現像し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＤＮＡ複製および細胞増殖の尺度である標識指数を、１００個の基礎ケラチノサイト中の標識された核のパーセントを計算することによって測定した。結果は表１に示される。
【０１１７】
【表１】
2010031051.tif 000003
【０１１８】
両方の実験において、標識指数(上皮細胞増殖の尺度)はｐＴｐＴ処理皮膚の方がビヒクル処理皮膚よりも低かった(ｐ＜０.０３、対Ｔ検定)。これらの結果は、対象の細胞と本発明のＤＮＡ断片との接触により細胞増殖は阻害されることを示している。
【０１１９】
実施例７：ＤＮＡ修復におけるｐ５３の役割
ＧＡＤＤ４５およびＳＤＩ１遺伝子の両方共、腫瘍サプレッサタンパク質ｐ５３によって転写的に調節されることは公知である。ＵＶ-およびγ-照射後、並びにＤＮＡ損傷性化学物質で細胞を処理した後、ｐ５３の急速な安定化、リン酸化および核蓄積があり、その後このタンパク質は特異的プロモータ・コンセンサス配列に結合し、調節された遺伝子の転写を調節する。最近のデータは、ｐ５３が小一本鎖ＤＮＡｓ並びにある種のペプチド類および抗体類がこのタンパク質のカルボキシル末端に結合することによっても活性化されることを示唆している。細胞増殖に対するジヌクレオチドｐＴｐＴの阻害的効果が一部分はｐ５３によって媒介されるのかどうかを確認するために、ｐ５３ｎｕｌｌ細胞系、Ｈ１２９９肺癌細胞、の増殖反応を試験した。ｐ５３ｎｕｌｌＨ１２９９細胞(サンチェス(Ｓａｎｖｈｅｚ,Ｙ．)ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１巻：ｐ．３５７-３６０(１９９６))を１０％コウシ血清を含むＤＭＥＭに保持した。融合前の培養物に１００μＭｐＴｐＴか希釈剤かどちらかを補充した新鮮培地を与えた。細胞をトリプシン化によって毎日連続的に集め、クールター(商標)カウンタによって計数した。図９に示すように、希釈剤処理対象に比較して、ｐＴｐＴ処理Ｈ１２９９細胞に増殖阻害は認められなかった。
【０１２０】
また別の実験において、ｐＴｐＴはｐ５３に依存する様態でＳＤＩ１ｍＲＮＡの発現を誘発することが判明した。Ｈ１２９９細胞の融合前の培養物に、ヒトサイトメガロウィルス・プロモータ／エンハンサのコントロール下で野生型ヒトｐ５３ｃＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトした(ベルト・フォゲルスタイン博士(Ｄｒ．Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ)、ジョンホプキンス・オンコロジー・センター)。ｐ５３ｃＤＮＡを除去したベクターを用いて対照トランスフェクションが行われた。トランスフェクションはリポフェクチン試薬キット(ギプコ社(ＧＩＢＣＯ)／ＢＲＬ)を使用して行われた。トランスフェクションの１日目に細胞を集め、記載されるように２０μｇ総タンパク質を用いてウエスタンブロット分析を行った(ヤ-ル(Ｙａａｒ,Ｍ)ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４巻：ｐ．１５５０-１５６２(１９９４))。ｐ５３は、ｍＡｂ４２１、フォースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合した抗マウスＩｇ(アマーシャム、アーリントンハイツ、ＩＬ)およびＥＣＬキット(アマーシャム)を使用して製造者の指示にしたがって検出された。タンパク質採取時に、ｐ５３発現ベクター(「ｐ５３」と記される)または対照ベクター(「Ｃｔｒｌ」と記される)をトランスフェクトした二重のＨ１２９９細胞培養物に希釈剤(ＤＭＥＭ)または１００μＭ  ｐＴｐＴを与えた。２４時間後、細胞を集め、処理してＲＮＡを分離し、ＳＤＩ１ｃＤＮＡプローブでノーザンブロット分析を行った。オートラジオグラフをマッキントッシュＩＩｓｉコンピュータおよびマッキントッシュ・ワン・スキャナーを使用して走査し、オートラジオグラフシグナルの差を最大にあらわすように輝度およびコントラストを調節した。結果は、ｐ５３ｎｕｌｌＨ１２９９細胞は非常に低レベルのＳＤＩ１転写体を発現し、このレベルはｐＴｐＴの添加によって影響を受けないことを示した。これら細胞に野生型ｐ５３発現ベクターをトランスフェクトすると、ＳＤＩ１レベルは増加し、この転写体がｐＴｐＴの添加によって誘導できるようになった。ウエスターン分析により、Ｈ１２９９細胞は通常ｐ５３を発現せず、トランスフェクトされたＨ１２９９細胞は高レベルのｐ５３を発現することが確認された。これらのデータは、ｐＴｐＴがｐ５３の転写活性を高めることを示唆する。
【０１２１】
正常新生児の線維芽細胞中のｐ５３の濃度および細胞内分布に与えるｐＴｐＴの効果を,ｐ５３特異的モノクローナル抗体(ｍＡｂ４２１、オンコジーン、ケンブリッジ、ＭＡ)を用いてイムノペルオキシダーゼ染色によって試験した。融合前細胞を１００μＭｐＴｐＴまたは希釈剤のどちらかで２４時間処理し、その後細胞染色した。細胞を先ず最初にヒストチョイス固定液(アムレスコ(Ａｍｒｅｓｃｏ)、ソロン、ＯＨ)中で１分間固定し、その後ＰＢＳ中で５分間すすいだ。ｐ５３は、ベクタステイン・エライトＡＢＣキット(ベクターラボラトリ-ズ(Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)、バーリンガム、ＣＡ)およびｐ５３特異的モノクローナル抗体ｍＡｂ４２１を使用して検出された。ＵＶ照射後に報告されたのと同様に、２４時間内に、希釈剤処理細胞に比較して核内ｐ５３の増加がｐＴｐＴ処理細胞に検出された。これらの結果は線維芽細胞並びにＳＣＣ１２Ｆ細胞におけるｐ５３調節遺伝子ＧＡＤＤ４５およびＳＤＩ１(ｐ２１)のｐＴｐＴによる誘発と一致する。
【０１２２】
実施例８：ＤＮＡ修復の増強
ＳＶ４０プロモータおよびエンハンサのコントロール下における、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)遺伝子を含むＵＶ損傷-リポータプラスミドの発現は、老化や若年性皮膚癌と関連するヒトリンパ球における低下したＤＮＡ修復能を検知することが既に示された。このリポータプラスミドを使用して正常新生児のヒト皮膚由来線維芽細胞およびケラチノサイトのＤＮＡ修復能を測定した。
【０１２３】
新生児からのケラチノサイトは記載のように(スタヌリス-プレーゲル(Ｓｔａｎｕｌｉｓ-Ｐｒａｅｇｅｒ,Ｂ．Ｍ．)およびギルチュレスト(Ｇｉｌｃｈｒｅｓｔ,Ｂ．Ａ．)、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３９巻：ｐ．１１６-１２４(１９８９))、ラインワルド(Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ)およびグリーン(Ｇｒｅｅｎ)の方法の改良法(ギルチュレスト(Ｇｉｌｃｈｒｅｓｔ,Ｂ．Ａ．)ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０１巻：ｐ．６６６-６７２)によって確立された。一次培養ケラチノサイトを非分化性低Ｃａ2+培地に保持した(Ｋ-Ｓｔｉｍ、コラボラティブ・バイオメディカル・プロダクツ、ベドフォード、ＭＡ)。線維芽細胞は皮膚外植物から記載のように確立し(ラインワルドおよびグリーン、Ｃｅｌｌ  ６巻：ｐ．３３１-３４３(１９７５))、１０％ウシ血清を補充したＤＭＥＭ培地に保持された。細胞をトラスフェクションの前に５日間、１００μＭｐＴｐＴまたは、等量の希釈剤(ＤＭＥＭ)で処理した。各条件下で保持された二重の培養物をリポフェクチン試薬キット(ギプコ／ＢＲＬ)および５μｇリポータＤＮＡ、ｐＣＡＴ-コントロールベクター(プロメガ社、マジソン、ＷＩ)を使用してトラスフェクトした。トラスフェクションの前に、ベクターＤＮＡを模擬照射するか、または１ＫＷキセノン・アーク・ソーラー・スティミュレータ(ＸＭＮ１０００-２１、オプティカル・ラディエーション社、アズザ、ＣＡ)からの１００ｍＪ／ｃｍ2ＵＶＢ照射に曝露し、記載のように(ヤールら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８５巻：ｐ．７０-７４)リサーチラジオメータ(ＩＬ１７００Ａ型、インターナショナルライト(Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｌｉｇｈｔ)社、ニューベリーポート、ＭＡ)を使用して２８５±５ｎｍで計測した。製造者のプロトコルにしたがってＣＡＴ酵素アッセイシステム(プロメガ、マジソン、ＷＩ)中で作った溶解緩衝液中でトラスフェクションを行い、２４時間後に細胞を集めた。ＣＡＴ酵素活性を、液体シンチレーションカウンティング・プロトコルおよびアッセイシステムキットの成分を使用して測定した。標識クロラムフェニコール［５０-６０ｍＣｌ(１．８５-２．２２ＧＢｑ)ｍｍｏｌ］はニュ-イングランド・ニュ-クレア(Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ)(ボストン、ＭＡ)から購入した。細胞抽出物中のタンパク質濃度はブラッドフォード法(Ａｎｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２巻：ｐ．２４８(１９８６))によって測定した。ＣＡＴ活性はｃ．ｐ．ｍ．／１００μｇタンパク質としてあらわされ、模擬照射された損傷のないプラスミドをトラスフェクトした細胞の活性に対するパーセントとして表された。
【０１２４】
予備的実験において、トラスフェクションの前に、そのプラスミドを太陽光を模した照射線量(１００ｍＪ／ｃｍ2、２８５ｎｍで測定)にさらすと、トラスフェクション後１６-２４時間に細胞溶解物中に測定されるＣＡＴ活性は、対の培養物にトラスフェクトした模擬照射プラスミドに比較して、約７５パーセント減少することが確認された。しかしトラスフェクションの前に５日間１００μＭｐＴｐＴで前処理したケラチノサイト(図１０)および線維芽細胞(図１１)は、模擬照射したトランスフェクテド対照のＣＡＴ活性より５０％以上大きいＣＡＴ活性を示した。リポータプラスミドは複製しないので、ＣＡＴ活性のレベルはＵＶ損傷ＣＡＴ遺伝子の、その生物学的活性を回復するＤＮＡ修復程度を直接反映する。これらのデータは正常ヒト線維芽細胞およびケラチノサイトのｐＴｐＴ処理が細胞のＵＶ誘起性ＤＮＡ損傷の２４時間にわたる修復能力を２倍以上にすることを示すものである。ｐＴｐＴ処理細胞におけるＵＶ照射プラスミドの高められた発現はこれらの細胞におけるプラスミド転写の全般的増加に起因するものではなかった。なぜならば模擬照射プラスミドの発現は非ｐＴｐＴ処理細胞ではより高くなかったからである。
【０１２５】
実施例９：ｐ５３の活性化およびベンズピレンＤＮＡ付加物の修復。
【０１２６】
細胞培養
新生児ヒトケラチノサイトはラインワルトおよびグリーンの方法(Ｃｅｌｌ  ６巻：ｐ．３３１-３４３(１９７５))の改良法(スタニスラスら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９０巻：ｐ．７４９-７５４(１９９８))を使用して確立された。一次培養ケラチノサイトを低濃度のカルシウムイオンを含む非分化性培地(Ｋ-Ｓｔｉｍ、コラボラティブ・バイオメディカル・プロダクツ社、ベッドフォード、ＭＡ)に保持した。
【０１２７】
ｐ５３-ｎｕｌｌ  Ｈ１２９９肺癌細胞系(アメリカ培養コレクション、ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ)は１０パーセントウシ血清(ハイクローン・ラボ、ローガン、ＵＴ)を補充したダルベッコの改良イ-グル培地(ＤＭＥＭ；ギプコ／ＢＲＬ)に保持した。
【０１２８】
Ｈ１２９９細胞へのｐ５３発現ベクターのトランスフェクション。
【０１２９】
Ｈ１２９９細胞の融合前培養物に野生型ヒトｐ５３ｃＤＮＡを含む発現ベクターを、ヒトサイトメガロウィルス  プロモータ／エンハンサのコントロール下でトランスフェクトした(ベルト・フォゲルスタイン博士、ジョンホプキンス・オンコロジー・センター)。対照トランスフェクションはｐ５３ｃＤＮＡの欠如した同じベクターを使用して行われた。トランスフェクションは既述のように行った。トランスフェクション後１日目に細胞を集め、既述のように２０μｇ総タンパク質を使用してウエスタンブロット分析を行った。ｐ５３は、活性型および不活性型の両方のタンパク質を検出することが知られているモノクローナル抗体ＤＯ-１(Ａｂ-６)(オンコジーン、ケンブリッジ、ＭＡ)、フォースラディッシュペルオキシダーゼに結合した抗マウスＩｇ(アマーシャム、アーリントンハイツ、ＩＬ)およびＥＬＣ-キット(アマーシャム)を使用して製造者の指示にしたがって検出された。
【０１３０】
ｈＧＨリポータプラスミドを使用するｐ５３アッセイ
製造者によって指示されたリポフェクタミン試薬キット(ギプコ／ＢＲＬ)を使用し、０．５μｇｐＰＧ-ＧＨを各ｐ３５培養皿に加えて、正常ヒトケラチノサイトにヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)リポータプラスミド(ｐＰＧ-ＧＨ)をトランスフェクトした。ｐＰＧ-ＧＨはチミジンキナーゼ(ＴＫ)のコントロール下にあるｈＧＨコ-ディング領域と、ｐ５３コンセンサス配列とを含む。ｈＧＨタンパク質の産生はｐ５３活性に比例することは公知である(ケルンら、１９９２)。トランスフェクションは１００μＭｐＴｐＴ(ミドランド・サ-ティファイド・リアジェント社、ミドランド、ＴＸ)または等量の希釈剤の存在下で行われた。同時に、ＰＳＶ-β-ガラクトシダーゼ対照ベクター(プロメガ社、マジソン、ＷＩ)を同時トランスフェクトし、トランスフェクション効率を測定した(ノートンおよびコフィン、１９８５)。トランスフェクションの４時間後に、培地を除去し、１００μＭｐＴｐＴを含むＫ-Ｓｔｉｍ培地またはこれを含まない培地に代えた。トランスフェクションおよびｐＴｐＴ処理の２４時間後に、４００μｌの培地を各３５ｍｍ培養皿から採取し、１００μｌの125Ｉ-ｈＧＨ抗体溶液(ニコールズ・インスティチュート・ディアグノスティックス(Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ)、サン・ジュアン・カピストラノ、ＣＡ)を加え、分泌したｈＧＨを下記のように検出した。製造者によって提供されたプロトコルを使用して、細胞をリポータ溶解緩衝液(Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ)(プロメガ社)中に採取し、この溶解物１５０μｌを使用して、β-ガラクトシダーゼアッセイキット(プロメガ)を用いてβ-ガラクトシダーゼアッセイを行った。三重の培養皿の各々から得たサンプルについてｈＧＨおよびβ-ガラクトシダーゼ合成を評価した。
【０１３１】
Ｈ１２９９細胞にｐ５３発現ベクターまたは対照ベクターを同様にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後にこれらの細胞にｐＰＧ-ＧＨおよびＰＳＶ-β-ガラクトシダーゼ対照ベクターを同時トランスフェクトし、１００μＭｐＴｐＴで処理した。２４時間後、２５０μｌの培地および細胞溶解物を採取し、上記のように処理した。
【０１３２】
ＣＡＴアッセイ
ｐＣＡＴベクター(プロメガ)をベンズピレン-７,８-ジオ-ルー９,１０-エポキシド(ＢＰ)で記載のように処理すると(アタス(Ａｔｈａｓ)ら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１９９１)、比較的損傷の少ないプラスミドとより多く損傷したプラスミドが生成した(これはヒト細胞の種々の修復能力を試験する研究において、有益であることが既に判明している)。ＤＮＡへの3Ｈ-ＢＲＤＥ挿入に基づき、損傷の少ないプラスミドは５ｋｂプラスミドあたり２５付加物を含み、損傷のより多いプラスミドは５０付加物を含むことが判明した。この非複製ベクターは、ＳＶ４０プロモータおよびエンハンサ配列のコントロール下のクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。ヒトケラチノサイトおよびｐ５３トランスフェクテドＨ１２９９細胞を１００μＭｐＴｐＴで、または等量の希釈剤(ＤＭＥＭ)単独で４８時間前処理し、その後ＢＰ修飾ｐＣＡＴ-対照ベクター(０．５μｇ／ｍｌ)または未修飾ベクター(０．５μｇ／ｍｌ)とＰＳＶ-β-ガラクトシダーゼ対照ベクター(０．５μｇ／ｍｌ)とを一緒にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞をリポータ溶解緩衝液(プロメガ)中に集めた。ＣＡＴ酵素活性を、液体シンチレーション計数プロトコルおよびアッセイシステムキット(プロメガ)の構成成分を使用して測定した。14Ｃ-標識クロラムフェニコール［５０-６０ｍＣｉ(１．８５-２．２２ＧＢｑ)／ｍｍｏｌ］はニュ-イングランド・ニュ-クレア社(ボストン、ＭＡ)から購入した。ＣＡＴ活性はβ-ガラクトシダーゼ活性で標準化した。
【０１３３】
ウエスタンブロット分析
細胞を１００μＭ  ｐＴｐＴまたは等量の希釈剤単独で４８時間処理し、総細胞タンパク質を０．２５ＭトリスＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．３７５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％トリトンＸ-１００、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭフェニルメチルフッ化スルホニル、および０．１ｍｇ／ｍｌアプロチニンからなる緩衝液中に集めた。タンパク質(サンプルあたり１００μｇ)を７．５-１５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移した(シュライヘル(Ｓｈｌｅｉｃｈｅｒ)＆シュエル(Ｓｈｕｅｌｌ)、キ-ン、ＮＨ)。移した後、ゲルをク-マシ-ブルーで染色し、残留高分子タンパク質による可視化によって担持物を確認した。膜を５％ミルクを含む０．０５％ツイ-ン２０／ＰＢＳ中でブロックした(ビオ-ラド・ラボラトリ-ス、ヘラクレス、ＣＡ)。抗体反応を下記の抗体類で行った：抗ｐ５３(ＡＢ-６)、抗ＰＣＮＡ(Ａｂ-２)(オンコジーン・サイエンス)および抗ＸＰＡ(ＦＬ-２７３)(サンタクルーズ・バイオテクノロジー)。フォースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合させたヒツジ抗マウスＩｇ(アマーシャム、ア-リントンハイツ、ＩＬ)(ｐ５３およびＰＣＮＡのために)およびヤギ抗ウサギＩｇＧ(ビオ-ラド)(ＸＰＡのために)を二次抗体として使用した。結合はＥＣＬ検出キット(アマーシャム)によって検出した。
【０１３４】
ＢＰ  ＤＮＡ付加物の修復を測定するために、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)遺伝子を含む非修復性ＢＰ損傷リポータ・プラスミド・システムを実施例８に記載したように使用した。一次培養ヒトケラチノサイトでは、同時トランスフェクテドβ-ガラクトシダーゼ発現ベクターによって測定したトランスフェクション効率は４０-７０％であった。ＢＰ-損傷の比較的少ない(約２５付加物／プラスミド)またはＢＰ-損傷の比較的多い(約５０付加物／プラスミド)ベクターのどちらかをトランスフェクトした場合、希釈剤処理細胞に比較して、ｐＴｐＴ処理ヒトケラチノサイトは、非損傷-対照ＣＡＴベクターをトランスフェクトした対の培養物に対して、ＣＡＴ発現を大体２倍にすることが判明した。
【０１３５】
第二のアッセイにおいてｐＴｐＴによるｐ５３の活性化を確認するために、ｐ５３誘導性プロモータの影響下においてヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)遺伝子を発現するリポータプラスミドを使用した、ｐ５３の活性化はプラスミド中のコンセンサス配列へのｐ５３の結合を増加させ、ｈＧＨコ-デイング配列の転写、および最後にはｈＧＨの培地への分泌に導く。
【０１３６】
ｐＴｐＴ処理ヒトケラチノサイトは希釈剤処理細胞に比較して、ｈＧＨ分泌の４５％±２５％の増加を示した。これらのデータは、ｐＴｐＴが正常ヒトケラチノサイト並びにｐ５３トランスフェクテドＨ１２９９細胞においてｐ５３を活性化することを示す。
【０１３７】
ｐＴｐＴが、少なくも一部分はｐ５３活性化によってＢＰ-ＤＮＡ付加物の修復を高めることを確認するために、ｐ５３-ｎｕｌｌ  Ｈ１２９９細胞にｐ５３発現ベクターをトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にｐ５３タンパク質発現をウエスタンブロット分析によって確認した。ｐ５３＋Ｈ１２９９細胞において、修復は正常ケラチノサイトに認められるものに匹敵した；そして低レベルのＢＰ損傷を含むプラスミドは、ｐＴｐＴ前処理細胞において希釈剤処理細胞に比較して８０％±５０％もより効率的に修復された；そして高レベルのＢＰ損傷を含むプラスミドは３倍以上も効率的に修復された。しかしｐ５３-Ｈ１２９９細胞において、修復能力は両処理群において同じであった。これらのデータは、ｐＴｐＴによる高められたＢＰ-ＤＮＡ付加物の修復にはｐ５３が関係していることを示す。
【０１３８】
ｐ５３応答性ｈＧＨを一過性にトランスフェクトしたＨ１２９９細胞におけるｐ５３によるｐＴｐＴ活性化は、希釈剤処理細胞に比較して、ｈＧＨ分泌の４０％の増加をもたらした。これらのデータは、ｐＴｐＴが、ｐ５３のＤＮＡコンセンサス配列への高められた結合によってｐ５３転写活性を高めることを示している。
【０１３９】
ウエスタンブロット分析を利用して、ＤＮＡ修復に関係することが知られている選択された遺伝子の発現に対するｐＴｐＴ処理の効果を試験した。正常ヒトケラチノサイトをｐＴｐＴで２日間処理し、その後細胞性タンパク質を採取した。ｐＴｐＴはｐ５３、ＰＣＮＡおよびＸＰＡタンパク質の濃度を処理２日以内に２ないし３倍にアップレギュレートした。
【０１４０】
実施例１０：ネズミモデルにおける免疫抑制および接触過敏症の阻止
Ｃ５７Ｂ１６マウスを腹部皮膚への局所適用によって下記の処理にさらし、その後アレルゲンＤＮＦＢで感作した；前処理なし、ＵＶＢ照射(２００Ｊ／ｍ2／日×４日)、ｐＴｐＴ、ｐＡｐＡ、またはビヒクル(１００μＭ  を３０μｌ、１日２回、×５日)。ＵＶＢまたはｐＴｐＴで前処理したマウスは、未処理またはビヒクル処理動物(４．３±０．６および３．３±０．２)に比較して、ＤＮＦＢ攻撃に対する耳の腫張が顕著に抑制され(０．６±０．２および０．９±０．３)、ｐＡｐＡ処理マウスは中間の反応をあらわした(２．５±０．６)。
【０１４１】
ｐＴｐＴの免疫抑制効果をヒトケラチノサイトを使用してインビトロ試験した。主要ヒトケラチノサイトの二重の培養物をｐＴｐＴ、希釈剤またはＵＶＢ照射(２００Ｊ／ｍ2)または模擬照射で処理した。細胞を処理後種々の時間に集め、ＥＬＩＳＡによってＩＬ-１０ｍＲＮＡを分析し、ＲＴ-ＰＣＲによってＩＬ-１０ｍＲＮＡを分析した。照射細胞ではＩＬ-１０ｍＲＮＡの増加が６時間後に検出され、ｐＴｐＴ処理細胞では４８時間後に検出された。ＩＬ-１０タンパク質の１８ｐｇ／ｍｌの増加が照射２４時間後に検出され、ｐＴｐＴ処理後７２時間には１５±２ｐｇ／ｍｌの増加が検出された。以前の研究は、同種混合リンパ球反応(ＭＬＲ)アッセイのＩＬ-１０による機能的阻害を証明した。同種ＭＬＲでは、Ｔ細胞活性化は、3Ｈチミジンの取込みによって測定したリンパ球増殖として測定される。７２時間ｐＴｐＴサンプルからの培養培地のＩＬ-１０活性は、＞１０ｋＤコンポ-ネント(１８ｋＤ  ＩＬ-１０タンパク質を含む)の添加によって測定された。Ｔ細胞増殖の８０±５％の減少が証明された。これに対して希釈剤処理対照培養物では８±３％の阻害であった。こうしてＵＶ照射と同様に、ｐＴｐＴもヒトケラチノサイトにＩＬ-１０を誘導する。これはＴＮＦαと共力してｐＴｐＴ処理皮膚における接触過敏症を阻止するらしい。
【０１４２】
また別の実験において、完全ＴＮＦαプロモータおよび３'-未翻訳領域を有するＣＡＴリポータ導入遺伝子を担うマウスを利用して、ＴＮＦα遺伝子の活性化を測定した。トランスジェニックマウスを、ＣＡＴ発現のための皮膚アッセイの前に下記の処理にさらした：ＵＶＢ照射(２００-７００Ｊ／ｍ2)、ｐＴｐＴ(１００μＭ)の皮内注射；陽性対照としてのリポ多糖(ＬＰＳ１μｇ／ｍｌ)、またはビヒクル単独。ＣＡＴ活性はＵＶＢ、ＬＰＳ、またはｐＴｐＴで処理した皮膚に検出された(ビヒクル単独では検出されなかった)。
【０１４３】
実施例１１：オリゴヌクレオチド依存性ＵＶ様活性：
メラニン生成およびｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現
クロードマンＳ９１マウスメラノーマ細胞における、５ヌクレオチドオリゴマーＣＡＴＡＣ(配列番号：６)および９ヌクレオチドオリゴマー、ＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)によるメラニン生成の誘発を試験した。二重のクロードマンＳ９１ネズミメラノーマ細胞を１００μＭオリゴまたは等量の希釈剤(Ｈ2Ｏ)と共に５日間インキュベートした。それから細胞を集め、数え、同数の細胞をペレット化してメラニンを分析した。３実験において、９マー、５マーおよびｐＴｐＴとのインキュベ-ション後の色素含有量は対照レベルの４１８％±２６７％、６１％±６０％および１５５％±６０％だけそれぞれ増加した。９マーはヒトメラノサイト中のメラニン生成も刺激し、１週間の培養後には５１-６２％の増加をもたらしたが、５マーは刺激しなかった。このオリゴヌクレオチドの変形型を評価した：スクランブルド９マー(ＴＡＧＧＡＧＧＡＴ；配列番号：２)および２種類の短縮バ-ジョン、７マー(ＡＧＴＡＴＧＡ；配列番号：３)および第二の５マー(ＧＴＡＴＧ；配列番号：４)。両方の９マーは等しく活性であり、メラニン含有量の８００％の増加を誘起した。短縮されたバ-ジョン(配列番号：３および配列番号：４)も活性で、それぞれ６４０％および６７０％の増加を誘起した。ｐＴｐＴの場合のように、配列番号：１(９マー)オリゴヌクレオチドは扁平上皮癌細胞系において４８時間以内にｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１遺伝子の発現を誘起し、このｍＲＮＡレベルを２００-３００％高めたが(ｐＴｐＴからの１００-１５０％の増加に比較)、配列番号：６(５マー)は上記発現を誘起しなかった。
【０１４４】
これらのデータをまとめると、ｐＴｐＴのＵＶ様活性はその他のオリゴヌクレオチド類によって劇的に倍加されることが判明する。
【０１４５】
実施例１２
メラニン生成
クロードマンＳ９１メラノーマ細胞の培養物を配列番号：１、配列番号：６、陽性対照としてのｐＴｐＴ、または陰性対照としての等量の水で５日間処理した。オリゴヌクレオチド処理後のＳ９１細胞ペレットの分光光度法分析は、ｐＴｐＴ処理細胞のメラニン含有量が対照細胞の２５５±６０％であることを示した(図２)。配列番号：６はメラニンをわすかに、すなわち対照レベルの１６５±７７％にまで増加させた。配列番号：１はメラニン含有量を対照レベルの６００±２６０％にまで増加させた。
【０１４６】
オリゴヌクレオチド５'ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ３'(配列番号：５)、５'ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ３'(配列番号：９)、または５'ｐＧＴＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ３'(配列番号：１０)(各々５'ホスフェートを含む)を実施例１１に記載のようにクロードマンＳ９１メラノーマ細胞に加えた。
【０１４７】
これらの細胞において色素生成を刺激することがすでに示されているｐＴｐＴを標準処理として使用し、希釈剤だけを陰性対照として用いた。上記ヌクレオチド類による５日間の処理後、細胞を集め、数え、同数の細胞をペレット化してメラニン分析を行った。図１７に示すデータは、１０μＭ  ｐＴｐＴがメラニン含有量を対照の希釈剤処理細胞の３倍に増やしたことを示すものである。テロメア・オーバーハング配列を示す配列番号：５は、やはり１０μＭで、対照細胞の１０倍もメラニン濃度を高めた。配列番号：９(テロメア・オーバーハング相補体)および配列番号：１０(関連のない配列)は濃度１０μＭまでは色素含有量の顕著な変化をもたらさなかった。配列番号：５の短縮されたバ-ジョン(ＴＴＡＧＧＧを含む)も高度にメラニン生成性であったが、逆相補的配列ＣＣＣＴＡＡ(配列番号：１２)は活性がより低かった(図１８)、その際両方のオリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを含む。
【０１４８】
本発明の化合物を皮膚浸透性およびインビボメラニン生成活性について試験した。マウスをプロピレングリコール中蛍光標識ｐＴｐＴまたは配列番号：１(５'ホスフェートを含む)で４時間処理し、それから耳の皮膚を切り取り、共焦点性顕微鏡検査によって試験した。任意のオリゴヌクレオチドによる処理は、明るく染色された上皮および毛包を生じた。このようにｐＴｐＴおよび配列番号：１は、同様に皮膚障壁を通過する。
【０１４９】
また別の実施形態において、マウスに１日１回、プロピレングリコール中の１００μＭｐＴｐＴ、または５'ホスフェートを含む配列番号：１を一つの耳に与え、もう一つの耳にはビヒクルだけを与えた。１５日後、耳の切片を切り取りホンタナマッソン(Ｆｏｎｔａｎａ  Ｍａｓｓｏｎ)で染色し、メラニンを検出し、ビヒクル対照と比較したところ、ｐＴｐＴ処理耳には色素生成の７０％の増加があり、配列番号：１では２５０％の増加があった。こうして２ヌクレオチドを含む化合物も９ヌクレオチドを含む化合物も両方ともインビトロＵＶ様効果をインビボでも有効に発揮した。
【０１５０】
ｐ５３活性化および細胞増殖
ｐＴｐＴは、少なくも一部はｐ５３の活性化およびその後のサイクリン依存性キナーゼインヒビタｐ２１のアップレギュレーションによって、細胞周期進行を阻止することがすでに判明している。ヒトケラチノサイト系ＳＣＣ１２Ｆの培養物をｐＴｐＴ、配列番号：１、配列番号：６または陰性対照としての希釈剤だけで処理し、集め、４８時間後に数え、処理してｐ２１ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析を行った。配列番号：１はｐ２１ｍＲＮＡのレベルを対照レベルのほぼ３倍に高めることが判明し、一方ｐＴｐＴ処理細胞は対照細胞の２倍のｐ２１ｍＲＮＡレベルを示した(図１３)。配列番号：６で処理した細胞はｐ２１ｍＲＮＡレベルの１０-２０％の増加を示した。これらの対の皿において、配列番号：１は２日後、細胞数の約５０％の減少も誘起し、ｐＴｐＴおよび配列番号：６はそれぞれ４０％および２５％の減少を誘起した(図１４)。こうして本発明の配列は、ｐＴｐＴの結果と同様に、ｐ５３を活性化し、細胞増殖を阻止した。
【０１５１】
サイズおよび配列の効果
Ｓ９１細胞を希釈剤のみ、ｐＴｐＴ  ｐ９マー(配列番号：１)、ｐ７マー(ＡＧＴＡＴＧＡ：配列番号：７)またはｐ５マー＃２(配列番号：４)の存在下で培養した。５日後、細胞を集め、数え、同数の細胞をペレット化してメラニン分析を行った(図１５)。ｐＴｐＴはメラニン含有量の中程度の増加をもたらし、配列番号：１はより大きい増加をもたらした。さらに配列番号：４および配列番号：７もメラニン生成を強力に刺激した。配列番号：４および配列番号：７は両方ともメラニンを７-８倍増加させた。あるｐ５マーがメラニン産生を遥かにより効果的に誘導したため(配列番号：４および配列番号：６の結果を比較されたい)、これらのデータは、オリゴヌクレオチド配列がそのメラニン生成活性の決定にある役割を演じていることを示唆する。
【０１５２】
ｐ２０マーは、４塩基配列ＧＣＡＴの３リピートおよびその後の２リピートＴＡＣＧで合成され(ｐＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＴＡＣＧＴＡＣＧ；配列番号：８)、真核細胞におけるチミジンダイマーの除去修復中に切り取られる２７-２９塩基断片に似た内部ｐＴｐＴを有するオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは色素生成を刺激し、対照細胞のレベルの２倍にした(図１６)。
【０１５３】
５'リン酸化の効果
Ｓ９１細胞をチミジンジヌクレオチドまたは配列番号：１の存在下で、５'ホスフェートまたは陰性対照としての希釈剤単独の存在下、またはそれらの不在下で５日間培養した。５'ホスフェートを除去するとｐＴｐＴのメラニン生成活性は両側スチュデントｔ検定によってそれぞれ８０％、そして９マーのメラニン生成活性は６０％(ｐ＜０．０４およびｐ＜０．０３)有意に減少した(図１６)。これらのデータはこれらオリゴヌクレオチドの細胞内作用部位と一致し、十分な細胞内取り込みのために５'ホスフェートが必要であるという報告とも一致する。
【０１５４】
５'リン酸化はオリゴヌクレオチド取り込みを増加させる。
【０１５５】
フルオレッセインホスホルアミダイト(ＦＡＭ)標識オリゴヌクレオチドをＳ９１細胞の培養物に４時間加え、細胞を標本にして共焦点性顕微鏡検査した。ヨウ化プロピジウムで染色することによって確認される核は、赤く見え、ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドは緑色に見えた。赤および緑色シグナルの共存にはコンピューターによって黄色を割り当てた。５'ホスフェートを有するオリゴヌクレオチドはこの部分が欠如しているオリゴヌクレオチドに比べてより多い細胞内取り込みを示した。共焦点性顕微鏡検査はこれら細胞のＴｐＴの取り込み、および蛍光細胞分離(ＦＡＣＳ)分析を検出できず、未処理細胞で見られたものに類似したプロフィ-ルが得られた。ｐＴｐＴ処理細胞は、細胞質に強い緑色蛍光を示したが、核内には少量示したに過ぎない。ＦＡＣＳ分析は、ＴｐＴ処理細胞に比較して蛍光強度のピ-クの移動を示し、より強く染色された細胞を示す。同様に、配列番号：１の５'末端にホスフェートが存在すると、Ｓ９１細胞へのその取り込みは著しく高まった。５'リン酸化のない配列番号：１は中程度の取り込みを示したに過ぎず、主として細胞質内に存在し、少数の細胞に希薄な核染色があった。その一方で、５'リン酸化配列番号：１は、核に濃く局在する強い染色を示した。５'リン酸化のない配列番号：１のＦＡＣＳ分析は、実質的に二つの細胞集団による広範囲の染色強度を示し、共焦点性画像と一致する。リン酸化配列番号：１を含む細胞もある範囲の染色強度を示したが、より多くの細胞がより強い蛍光強度を示した。リン酸化配列番号：８で処理した細胞は共焦点性顕微鏡およびＦＡＣＳ分析の両方によって、リン酸化配列番号：１で見られるものに非常に類似した蛍光パターンを示し、メラニン生成アッセイにおけるその比較的低い活性を低い取り込みのせいにすることができないことが示唆される。これらのデータは、これらオリゴヌクレオチドのＳ９１細胞による取り込みが５'ホスフェートの存在によって著しく容易になり、メラニン生成活性は、核内作用部位と一致する一方、核内局在にだけ依存するものではないことを示すものである。また、試験したＤＮＡｓのなかで、総細胞内蛍光はオリゴヌクレオチド長の増加につれて明らかには増加しなかったとはいえ、より大きいオリゴヌクレオチドはより容易に細胞核内に蓄積する。６および２４時間後にオリゴヌクレオチド取り込みのプロフィ-ルに変化はなかった。
【０１５６】
実施例１３：オリゴヌクレオチドはアポトーシスを誘起し得る
テロメア・オーバーハング・リピート配列に相同なオリゴヌクレオチド(ＴＴＡＧＧＧ；配列番号：１１)、この配列(１１マー-２：ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；配列番号：９)に相補的な配列(１１マー-１：ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)およびテロメア配列に関係のない配列(１１マー-３：ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ；配列番号：１０)を、ヒト細胞の一系列であるジャ-カット細胞(テロメア溶解に反応してアポトーシスを受けると報告された細胞型の一つ)の培養物に加えた。４８時間以内に、４０μＭの配列番号：５で処理した細胞の５０％がＳ相に蓄積した。これに対して対照細胞では２５-３０％の蓄積であった(ｐ＜０．０００３、不対ｔ-検定；図１９Ａ-１９Ｄを参照されたい)。７２時間までにこれら細胞の１３％が、ｓｕｂ-Ｇ0／Ｇ1  ＤＮＡ含有量による測定でアポトティックになった。これに対して対照ではアポトーシスは２-３％であった(ｐ＜０．００７、不対ｔ-検定；図１９Ｅ-１９Ｈを参照されたい)。その不思議な効果の説明としての１１マー-１の優先的取り込みを排除するために、ジャ-カット細胞を、３'末端をフルオレッセインホスホルアミダイトで標識したオリゴヌクレオチドで処理し、その後共焦点性顕微鏡検査およびＦＡＣＳ分析にかけた。細胞のフルオレッセイン強度は全処理後４時間および２４時間では同じであった。ウエスタンブロット分析は１１マー-１の添加後２４時間までにｐ５３が増加することを示し(１１マー-２または１１マー-３では示さなかった)、Ｅ２Ｆ１転写因子(アポトーシスの誘発においてｐ５３と共力し、ヒト線維芽細胞にｐ５３依存性様態で老化表現型を誘発し、Ｓ相チェックポイントを調節することが知られている)のレベルが同時に高まることを示した。
【０１５７】
実施例１４：インビボ  ＤＮＡ突然変異の頻度に与えるＤＮＡ断片の影響
ＬａｃＺリポータプラスミドの複数のゲノムコピ-を担うトランスジェニックマウスを使用した。ポリプロピレングリコール中１００μＭ  ｐＴｐＴを片方の耳に毎日４回塗布し、もう片方の耳にはビヒクルだけを塗布した。５日目に両方の耳を１００ｍＪ／ｃｍ2ＵＶＢ光に曝露した。この処理を毎週３、５、または７週繰り返した(３匹マウス／群)。最後の照射後１週間目に耳の上皮からＬａｃＺプラスミドを採取した。当業者に公知の方法を使用して、プラスミドをゲノムＤＮＡから制限酵素消化およびＬａｃＩタンパク質への特異的結合によって回収した。突然変異体ＬａｃＺプラスミドを細菌へのトランスフェクションおよび選択培地における増殖によって完全に選択し、突然変異の頻度を決定した。３、５、および７週後、ｐＴｐＴ処理皮膚は希釈剤処理皮膚に比べて２０-３０％低い突然変異頻度を示した(それぞれ２００対２９３、１５５対２１６、および２６１対３２２)。これらのデータは、ｐＴｐＴによって高められたＤＮＡ修復の結果インビボ  ＵＶ誘起性突然変異が減少することを示し、局所的適用を使用して発癌物質被曝ヒト皮膚における突然変移率を低減し得ることを示唆するものである。
【０１５８】
実施例１５：ＤＮＡ断片は酸化的損傷を防御する
一次新生児線維芽細胞を１０μＭ  ｐＴｐＴまたは対照としての希釈剤で３日間処理し、その後５×１０-5または５×１０-4ＭＨ2Ｏ2で処理した。Ｈ2Ｏ2曝露７２時間以内にｐＴｐＴ前処理培養物の細胞収率は、希釈剤処理対照サンプルに比較してそれぞれ４５±１％および１３９±５％高かった。低量Ｈ2Ｏ2曝露後７２時間目には希釈剤前処理細胞の９．６±２．４％だけが生き残った。これに対してｐＴｐＴ前処理は５×１０-4Ｍ  Ｈ2Ｏ2の際に細胞生存率を２-９倍高め、低投与量で完全に防御した。酸素ラジカルの消滅プロセスに関与する酵素であるＣｕ／Ｚｎス-パ-オキシドディスムターゼのｍＲＮＡレベルは、ｐＴｐＴ処理後４８時間および７２時間で３倍以上増加し、ｐＴｐＴ除去後(実験の打ち切り時)少なくも２４時間は増加したままであった。
【０１５９】
実施例１６：ＤＮＡ修復能力の加齢による減少はオリゴヌクレオチドによって逆転する。
【０１６０】
新生児、若年者(２５-３５歳)および高齢者(６５-９０歳)ドナ-に由来するヒト皮膚線維芽細胞(ｆｂ)を１０μＭ  ｐＴｐＴ、または５'ホスフェートを含む配列番号：１または対照としての希釈剤で２４時間前処理した。それらサンプルをその後５、１０および３０ｍ／ｃｍ2でＵＶ照射した。ＤＮＡおよびタンパク質を０時およびＵＶ後２４時間まで集めた。ｐ５３、ｐ２１、ＸＰＡ、ＲＰＡ  ＥＲＣＣ／ＰＦおよびＰＣＮＡタンパク質の構成的およびＵＶ誘起性レベルは加齢に関連して減少した。しかし全ての年齢群において、オリゴヌクレオチドによる前処理はこれらタンパク質の構成的およびＵＶ誘起性レベルを２００-４００％アップレギュレートした。さらに、チミンダイマーおよび(６-４)光生成物に特異的なスロットブロット分析により、ＵＶ後最初の１６時間にＤＮＡ修復状態が加齢につれて有意に減少することが示された。オリゴヌクレオチドによる前処理は光生成物の除去を３０-６０％増加した。
【０１６１】
実施例１７：テロメア・オーバーハング相同体１１マー-１のホスホロチオエート変形体はアポトーシスを誘発しない
ジャルカット・ヒトＴ細胞の培養物を希釈剤、１１マー-１(配列番号：５)またはホスホロチオエート１１マー-１(１１マー-１-Ｓ)で９６時間処理し、集め、ＦＡＣＳ分析にかけた。オリゴヌクレオチドは２種類の濃度、０．４μＭ(図２０Ａ-２０Ｃ)および４０μＭ(図２０Ｄ-２０Ｆ)で試験した。０．４μＭ濃度ではいずれのオリゴヌクレオチドもジャルカット細胞の予想される指数的に増殖する細胞周期プロフィ-ルに影響を与えなかった。４０μＭでは１１マー-１がこれらの細胞に、ｓｕｂ-Ｇ0／Ｇ1ピ-クによって示される、広汎なアポトーシスを誘発した。その一方で１１マー-１-Ｓは効果を与えなかった。
【０１６２】
実施例１８：１１マー-１のホスホロチオエート変形体は、ホスフェート主鎖１１マー-１によるＳ相停止の誘発を阻止する
ケラチノサイト細胞系(ＳＳＣ１２Ｆ、１００,０００細胞／３８ｃｍ2)を１１マー-１だけで、または漸増濃度の１１マー-１-Ｓの存在下における１１マー１で４８時間処理した。すでに実施例１３に示したように、１１マー１はＳ相停止を誘発し、それはＦＡＣＳ(ベクトン-ジキンソン(Ｂｅｃｔｏｎ-Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ)ＦａｃＳｃａｎ)によって証明された。対照の希釈剤処理細胞の２６％に対し、細胞の４３パーセントがＳ相であった。しかし、これらの細胞に加えるホスホロチオエート１１マー１の濃度を高めていくと、停止する細胞の数はより少なくなった(図２１Ａ-２１Ｇ)。この停止の完全な阻止は、１１マー-１：１１マー-１-Ｓの比率が２：１の際に認められた。１１マー-１-Ｓ自体はＳ相停止を誘発しなかった。
【０１６３】
実施例１９：テロメア・オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート形は構成的およびＵＶ誘起性色素生成を減少させ、メラニン生成を刺激しない
Ｓ９１マウスメラノーマ細胞(１００,０００細胞／３８ｃｍ2)の培養物を１００μＭ  ｐＴｐＴまたはホスホロチオエートｐＴｐＴ(ｐＴｓｐＴ)(図２２)または４０μＭ１１マー-１またはホスホロチオエート１１マー１(１１マー-１-Ｓ)(図２３)で６日間処理し、その後集め、分析してメラニンを計数した。ｐＴｐＴおよび１１マー-１(それぞれ図２２および図２３)はこれらの細胞中のメラニン生成を刺激したが、ｐＴｓｐＴおよび１１マー-１-Ｓは刺激しなかった(それぞれ図２２および図２３)。さらにｐＴｓｐＴ(図２２)および１１マー-１-Ｓ(図２３)はこれらの細胞における構成的色素生成を減らした。
【０１６４】
実施例２０：ホスホロチオエートｐＴｓｐＴはＵＶ誘起性メラニン生成を阻害する
Ｓ９１細胞(１００,０００細胞／３９ｃｍ2)の二重の培養物を模擬照射するか、またはリサ-チ・ラジオメ-タ(ＩＬ１７００Ａ型、イターナショナル・ライト、ニュ-ベリ-ポート、ＭＡ)を用いて２８５±５ｎｍに調節した１ｋＷキセノンア-ク・ソ-ラー・シミュレータ(ＸＭＮ１０００-２１、オプティカル・ラディエ-ション、アズザ、ＣＡ)からの５ｍＪ／ｃｍ2の太陽光を模する光で照射した。２つの模擬照射された培養細胞に１００μＭ  ｐＴｓｐＴを補充し、２つの照射された培養細胞を同様にｐＴｓｐＴ処理した。１週間後、細胞を集め、数え、細胞ペレットを１Ｎ  ＮａＯＨに溶解して４７５ｎｍで光学密度を計るという方法でメラニン量を分析した。ＵＶ照射はこれらの細胞のメラニン含有量を約４０％高めた。しかし、ＵＶ照射によるメラニンの増加はｐＴｓｐＴの添加によって阻止された(図２４)。その上、これら細胞の構成的色素生成は模擬照射培養細胞ではｐＴｓｐＴによって減少した。これは図２２および図２３に示されるデータと一致する。
【０１６５】
実施例２１：ｐＴｐＴは線維芽細胞におけるＳＯＤ２タンパク質レベルを誘導する
線維芽細胞(ヒト新生児)を、１０％コウシ血清(ＣＳ)および１００μＭｐＴｐＴまたは対照としての希釈剤を補充したダルベッコの改良イ-グル培地(ＤＭＥＭ)に保持した。刺激後、総細胞タンパク質を種々の間隔で採取し、処理してウエスタンブロット分析を行った。ブロットを抗ＳＯＤ２抗体(ザ・バインディング・サイト(Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ)社、サンジエゴ、ＣＡ)と反応させた。新鮮培地の補充は、希釈剤処理対照培養細胞においては一時的に３７ｋＤａ  ＳＯＤ２を誘発し、一方、ｐＴｐＴ処理培養細胞ではＳＯＤ２誘発は少なくも３２時間(実験停止時)持続した。ゲル上のク-マッシ-ブルー染色残留バンドによって、異なるレーンの均一添加が確認された。
【０１６６】
実施例２２：ｐＴｐＴによる前処理は酸化的損傷を防御する
十分に分化した扁平上皮癌細胞系ＳＣＣ１２Ｆからの細胞(ジェ-ムス・ラインハルト博士、ハ-バ-ド大学、から寄贈された)を１００μＭ  ｐＴｐＴまたは対照としての希釈剤で３日間処理した。それから細胞をｐＴｐＴを含まない培地に再培養し、１０Ｊ／ｃｍ2ＵＶＡ(セラス・サンライト(Ｓｅｌｌａｓ  Ｓｕｎｌｉｇｈｔ)ＵＶＡランプ)で模擬-またはＵＶ照射した。細胞収量をＵＶ照射後種々の時間間隔で測定した。図２５は、ｐＴｐＴまたは希釈剤で前処理したＵＶＡ処理細胞の収率をあらわす。各々はそれ自体の模擬照射対照のパーセントとしてあらわされている。ｐＴｐＴ前処理はＵＶＡ照射細胞の収率を高めた。
【０１６７】
実施例２３：ｐＴｐＴは線維芽細胞にアプリン酸エンドヌクレアーゼ-１(ＡＰＥ-１)タンパク質を誘発する
線維芽細胞(ヒト新生児)を１００μＭｐＴｐＴ、１０μＭまたは６０μＭオリゴヌクレオチドｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)、または希釈剤(対照として)を含む１０％ＣＳ補充ＤＭＥＭに保持した。補充後、総細胞タンパク質を種々の間隔で採取し、ウエスタンブロット分析のために処理した。８-オキソグアニン(酸化的ＤＮＡ損傷の主要形)修復時の律速酵素であるＡＰＥ-１の発現を調べた。ブロットを抗ＡＰＥ-１抗体(ＡＰＥ／Ｒｅｆ-１モノクローナルＩｇＧ２ｂ、ノバス・バイオロジカルス(Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ)社)と共にインキュベートした。ｐＴｐＴまたは、配列番号：５のヌクレオチド配列を有する１１マーオリゴヌクレオチドの補充後２４時間以内に、希釈剤対照に比して上記オリゴヌクレオチドで刺激したサンプルに３７ｋＤａ  ＡＰＥ-１タンパク質が誘発された。この誘発は少なくも４８時間(このとき実験が打ち切られた)は持続した。ゲル上のク-マシ-ブルー染色残留バンドが異なるレーンの均一添加を確認した。
【０１６８】
実施例２４：ｐＴｐＴはｐＣＭＶ-Ｌｕｓプラスミドに対するＵＶＡ損傷の修復を誘発する
プラスミドｐＣＭＶ-Ｌｕｓは強い構成的サイトメガロウイルス・プロモータ(ヘダヤチ博士(Ｄｒ．Ｈｅｄａｙａｔｉ)(ジョンホプキンス大学)からの寄贈品)のコントロール下でリポータ遺伝子、ルシフェラーゼ、を含む非複製ベクターである。このプラスミドに光増感剤メチレンブルーの存在下、種々の時間間隔(０分、１０分および２０分)で可視光を照射することによって、このプラスミドにシングレット酸素誘起性ＤＮＡ損傷を生成した。１００μＭ  ｐＴｐＴまたは希釈剤単独で４８時間前処理した線維芽細胞(ヒト新生児)に、リポフェクトアミン(商標)(プロメガ社、マジソン、ＷＩ)を用いて、０．５μｇのｐＣＭＶ-Ｌｕｓをトランスフェクトした。２日後、プラスミド-コーデドールシフェラーゼ活性を細胞抽出物で測定した(プロメガ・ルシフェラーゼ・アッセイ)。ｐＴｐＴによる前処理は１０ｍＪ／ｃｍ2および２０ｍＪ／ｃｍ2ＵＶＡ照射後のシングレット酸素誘起性ＤＮＡ損傷の修復をそれぞれ１７９％および２２８％高めた。図２６はルシフェラーゼ活性を、模擬照射プラスミドをトランスフェクトした線維芽細胞において測定されたルシフェラーゼ活性のパーセントとしてあらわしている。
【０１６９】
実施例２５：ＤＮＡオリゴヌクレオチドはネズミ皮膚を光損傷から防御する
突然変異した色素性乾皮症群Ａ(ＸＰＡ)遺伝子を有する患者はＵＶ誘起性皮膚癌のリスクが１０００倍以上高い。ＸＰＡ-/-マウスはヒト症候群によく似ている［クレーマ(Ｋｒａｅｍｅｒ,Ｋ．)ら、ｐ．２５６-２６１：老化の分子生物学(ボール(Ｂｏｈｒ,Ｖ．Ａ．ら編集)ムンクスガ-ド、コペンハ-ゲン、１９９９)。我々は以前、オリゴヌクレオチド、特に、テロメア・オーバーハング・タンデム・リピートであるチミジン・ジヌクレオチド(ｐＴＴ)およびｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)がヌクレオチド除去修復に関係するタンパク質のレベルを高め、ＤＮＡ修復速度を高めることを示した。オリゴヌクレオチドのインビボ効果を確認するために、ＸＰＡ+/+およびＸＰＡ-/-マウスを１００μＭｐＴＴ、４０μＭ  ｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)、または希釈剤のみで４日間毎日処理した。９０％ポリプロピレングリコール／１０％ＤＭＳＯ中オリゴヌクレオチドまたは希釈剤３０μｌをマウスの脊柱稜線に沿った皮膚の３ｃｍ2面積に塗布した。５日目にマウスを、あらかじめ決めた紅斑生成性ＵＶＢ線量でＵＶ照射した。処理コース--各週の１日目のオリゴヌクレオチドで始まる４日間のオリゴヌクレオチド(または希釈剤)投与、５日目のＵＶ照射--を全部で４週間繰り返した。最後のＵＶ照射の７２時間後にマウス皮膚を組織学的に処理し、全般的形態、増殖(Ｋｉ-６７)［オウイケ(Ｏｈｉｋｅ  Ｎ．)およびモロホシ(Ｔ．Ｍｏｒｏｈｏｓｈｉ)、Ｐａｔｈｏｌ  Ｉｎｔ(２００１)、５１巻：７７０-７７７；ビルグレン(Ｂｉｌｌｇｒｅｎ,Ａ．Ｍ．)ら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ(２００２)、７１巻：ｐ．１６１-１７０］、特異的抗体結合によって測定されるシクロブタンピリミジン・ダイマー(ＣＰＤｓ)、および進行中のＤＮＡ修復［増殖性細胞核抗原(ＰＶＮＡ)；サビオ(Ｓａｖｉｏ,Ｍ．)ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ(１９９８)１９巻：ｐ．５９１-５９６；ルドルフ(Ｒｕｄｏｌｐｈ,Ｐ．)ら、Ｈｕｍ  Ｐａｈｏｌ(１９９８)２９巻：ｐ．１４８０-１４８７］を評価した。
【０１７０】
希釈剤処理ＸＰＡ+/+およびＸＰＡ-/-皮膚は、海綿状態、水疱形成および異常角化症を示したのに対し、オリゴヌクレオチド処理サンプルにはこれらの特徴はなかった。７２時間後の、ＸＰＡ-/-希釈剤処理サンプルだけがＣＰＤｓを含んでいた：４００×顕微鏡視野あたり１５±５(＋)細胞。その一方で、ｐＴＴまたは配列番号：１で処理したマウスのサンプルにはＣＰＤｓは全くなかった(ｐ＜０．０００１)。ＸＰＡ+/+サンプルはＣＰＤｓを含んでいなかった。Ｋｉ６７(＋)細胞はオリゴヌクレオチド処理ＸＰＡ-/-皮膚におけるよりも希釈剤処理皮膚に多かった。これはＵＶＢ損傷後の過増殖性「リバウンド」に一致する：１４±４対５±２(ｐ＜０．００５)。しかし、ＰＣＮＡ(＋)細胞はＸＰＡ+/+およびＸＰＡ-/-オリゴヌクレオチド処理皮膚の両方により多かった：３８±２対５２±６(ｐ＜０．０１)および１２５±８対８９±１１(ｐ＜０．００１)。これは進行中のＤＮＡ修復におけるＰＣＮＡの役割と一致し、既に報告されたオリゴヌクレオチドによるＰＣＮＡのインビトロアップレギュレーションに一致する。
【０１７１】
これらのデータは、テロメア相同オリゴヌクレオチド類の局所的適用が、大部分はＤＮＡ修復能の増加によって、反復ＵＶＢ損傷を修復する皮膚の力を高めることを明らかにする。光防御効果が修復度の高い動物にも、修復が著しく不十分な動物にも認められ、癌予防における治療的役割を示唆する。
【０１７２】
実施例２７：３'オーバーハングテロメア配列に相同の一本鎖ＤＮＡはミトコンドリアの遺伝子発現に対するＵＶ効果を模する
ケラチノサイトをＵＶ照射に曝露すると、細胞周期停止、ＤＮＡ損傷およびサイトカイン産生に影響があらわれる。テロメア３'オーバーハングと配列が相同である一本鎖オリゴヌクレオチドは、細胞内に取り込まれた際、これらのＵＶ効果を模する。同様に調節されるその他の遺伝子を確認するために、ケラチノサイト由来の細胞(ＳＣＣ１２Ｆ；ハーバード大学のジェームス・ラインワルト博士から提供されたヒト扁平上皮細胞癌系列)を太陽光擬似照射(ＳＳＲ)(２０ｍＪ／ｃｍ2、２８５±５ｎｍで測定)に、テロメア・オーバーハング・リピート配列(Ｔ-オリゴ)に相同の１１塩基オリゴヌクレオチド(ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)に、または対照としての相補的配列［ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；(配列番号：９)対照オリゴヌクレオチド］に曝露した。ＳＳＲと同様に、Ｔ-オリゴは細胞増殖を実質的に阻止し、細胞周期のＳ相の細胞の４３％以上を停止させた(対照細胞では＜２３％であった)。老化およびストレス条件によって調節されることが公知である＞７００遺伝子を含むＤＮＡマイクロアレーチップを使用して、ＳＳＲおよびＴ-オリゴ処理によって＞５０％だけダウンレギュレートされる(だが模擬照射または対照オリゴ処理によってはダウンレギュレートされない)８遺伝子を確認した。特に、調節される遺伝子は、ＵＶ、およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼによって転写的にダウンレギュレートされるミトコンドリア酵素ＡＴＰａｓｅおよびチトクロームｃオキシダーゼのサブユニットをコ-ドする。これらはミトコンドリア転写遺伝子であり、それらのコ-ドするタンパク質は細胞呼吸に関与している。半定量的ＲＴ-ＰＣＲおよびノーザンブロット分析は上記のデータを確認し、上記遺伝子類がＳＳＲおよびＴ-オリゴ処理によってそれぞれ２４時間および４８時間も早く相対的にダウンレギュレートされることを示した。多くの遺伝子の発現を同時に分析するための迅速な手段を提供するマイクロアレーチップを使用して、呼吸に関係する、ミトコンドリアによってコードされる遺伝子産物がＵＶ照射およびテロメア３'オーバーハングに相同のＤＮＡによって同様に調節されることが証明された。
【０１７３】
実施例２８：テロメア・オーバーハング・オリゴヌクレオチドによるＳ相停止およびアポトーシスの誘発
実施例２８-３７に使用する材料および方法
オリゴヌクレオチド
３種類のＤＮＡオリゴヌクレオチドを最初に設計する：１つはテロメア・オーバーハングに相同であり(１１マー-１：ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)、１つはこの配列に相補的であり(１１マー-２：ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；配列番号：９)１つは関係のないもの(１１マー-３：ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ；配列番号：１０)であった。後の実験のために、その他の次のような１１塩基オリゴヌクレオチド類を設計した：１１マー-１の単純な置換体：同数のＧ残基を有するがオーバーハング(ｐＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧ；配列番号：１４)に１００％相同でなく大体５０％相同であるもの；大体５０％のオーバーハング相同性を有するがシトシン塩基も含むもの(ｐＣＧＧＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号：１５)(ミドランド・サ-ティファイド・リアジェント社、ミドランド、テキサス)。
【０１７４】
細胞供給源および培養
ヒト新生児線維芽細胞を確立し、既述のように培養した(エラー(Ｅｌｌｅｒ,Ｍ．Ｓ．)ら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４巻：ｐ．１２６２７-１２６３２)。ナイミ-ヘン染色体不安定症候群(ＮＢＳ)患者(＃ＧＭ０７１６６)および年齢的に匹敵する対照(ＧＭ０３３９９)からの線維芽細胞をＮＩＧＭＳヒューマン・セル・レポジトリ(Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ)、コリール・インスティチュート・フォア・メディカル・リサーチ(Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ)、カンデン、ＮＪ)から購入し、ＤＭＥＭ／１５％ＦＢＳに培養した。Ｓａｏｓ２細胞はアメリカ培養コレクション(ＡＴＣＣ；マナサス、ＶＡ)から購入した。ＳＣＣ１２Ｆ細胞はジェ-ムズ・ラインワルド博士(ハ-バ-ド大学)から寄贈された。
【０１７５】
細胞周期分析
ジャルカット細胞と呼ばれる確立されたヒトＴリンパ球系(１８０,０００細胞／ｍｌ)を、３％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地１６４０に培養した(両方ともギプコ／ＢＲＬ、ガイザースバーグ、ＭＤ、から入手した)。二重の培養物を、最終濃度４０μＭのオリゴヌクレオチドまたは対照としての同量の希釈剤(水)で処理した。細胞を処理後９６時間まで集め、ヨウ化プロピジウムで染色し、ベクトン-ジキンソン-ファックススキャン(ＦａｃｓＳｃａｎ)およびセルクエスト(ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ)ソフトウエアによって分析した。
【０１７６】
カスパーゼ活性
ジャルカット細胞の培養物を二重に培養し、上記のようにオリゴヌクレオチドで処理した。処理４８、７２および９６時間に、細胞を遠心分離によって集め、洗い、それからペレットを凍結-融解の反復サイクルによって溶解した。溶解物をその後遠心分離によって澄明にし、その上清液を使用して、プロメガ社(マジソン、ウィスコンシン)からの熱量測定ＣａｓｐＡＣＥアッセイ装置の構成部品および説明書を用いてタンパク質分析およびカスパーセ-３活性の分析を行った。そのアッセイは基質Ａｃ-ＤＥＶＤ-ｐＮＡを使用し、遊離ｐＮＡの放出を熱量測定する。カスパーゼ活性は、生成したｐＮＡ(ｐｍｏｌ)／時間／μｇタンパク質であらわされる。
【０１７７】
アポトーシス細胞の検出のためのＴＵＮＥＬ分析
３％ＦＢＳを補充したＰＲＭＩ  １６４０培地に細胞を１８０,０００細胞／ｍｌの密度で培養した。細胞をいずれかの上記オリゴヌクレオチド４０μＭで７２時間処理した。それから細胞を集め、洗い、４％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、０．１％トリトンＸ-１００で２分間処理して透過可能にした。ＴＵＮＥＬ(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰ-ビオチン-ニック端標識化)アッセイを、ベーリンガーマンハイム社のフルオレッセイン標識ｄＵＴＰを用いてＩｎ  Ｓｉｔｕ細胞死検出キット(Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ)の構成成分および説明書を使用して行った。ＴＵＮＥＬ陽性細胞をＦＡＣＳ分析および共焦点性顕微鏡検査によって検出した。
【０１７８】
オリゴヌクレオチドの細胞内取込み
共焦点性分析のために、ジャルカット細胞をパ-マノックス(Ｐｅｒｍａｎｏｘ)・チェンバ・スライド(Ｌａｂ-Ｔｅｋ、ネイパービル、ＩＬ)上に培養し、フルオレッセイン・ホスホルアミダイト(ＦＡＭ)標識オリゴヌクレオチド(リサ-チ・ゲネティックス社、ハンツビル、ＡＬ)で４時間処理した。付着性細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ヨウ化プロピジウム(ＰＩ)で染色し、核を確認し、ルローフェード(Ｓｌｏｗｆａｄｅ)試薬(モレキュラー・プローブス、ユージーン、ＯＲ)で固定し、カバースリップで覆い、４℃で暗所に保存した。オリゴヌクレオチドの取り込みは、５-１０μｍ切片で、カールツァイスＬＳＭ５１０共焦点性レーザー顕微鏡によって評価された。コンピューター画像は、ＦＡＭオリゴヌクレオチドには緑を、ＰＩには赤を、シグナル類の共存には黄色を与える。ＦＡＣＳ分析は、ＦＡＭ-オリゴヌクレオチド類で４時間同一に処理し、その後４％パラホルムアルデヒド０．５ｍｌ中で一晩４℃で固定したジャルカット細胞で行われた。蛍光はＦＬ-１チャンネルで測定した。
【０１７９】
ウエスタンブロット分析および抗体
ウエスタンブロット分析を既述のようで行った［エラー(Ｅｌｌｅｒ,Ｍ．Ｓ．)ら(１９９６)、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３巻、ｐ．１０８７-１０９２］。抗体Ａｂ-６(ＤＯ-１クローン、オンコジーン・リサ-チ・プロダクツ、ケンブリッジ、ＭＡ)はｐ５３を検出し；抗体ＫＨ９５(サンタクルズ・バイオテクノロジー社、サンタクルズ、ＣＡ)はＥ２Ｆ１を検出；抗体Ａｂ-４(オンコジーン・リサ-チ・プロダクツ社)はｐ７３を検出した。ホスフォーｐ５３(セリン１５)は＃９２８４ポリクローナル抗体を使用して検出され、ホスフォーｐ９５／Ｎｂｓ１(セリン３４３)はホスフォーｐ９５／Ｎｂｓ１-特異的ポリクローナル抗体によって検出された。この両抗体はセル・シグナリング・テクノロジー社(ビバリ-、ＭＡ)から入手された。ｐ９５／Ｎｂｓ１抗体(＃ＮＢ-１００-１４３、ノヴス・バイオロジカルス社、リトルトン、ＣＯ)およびアクチン抗体(Ｉ-１９、サンタクルズ・バイオロジー社、サンタクルズ、ＣＡ)も使用した。
【０１８０】
ｐ９５／Ｎｂｓ１の修飾
ジャルカットおよびＳＣＣ１２Ｆ細胞を上記のように培養し、オリゴヌクレオチドで処理した。指定の時間後、総タンパク質を集め、８％ＰＡＧＥおよび、ｐ９５／Ｎｂｓ１に対するポリクローナル抗体(＃ＮＢ-１００-１４３、ノヴスバイオロジカルス社、リトルトン、ＣＯ)を用いるウエスタンブロット法によって分析した。免疫沈降法およびセリン／スレオニンホスファターゼ処理をリムらの記述通り行った［Ｌｉｍ,Ｄ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４巻：ｐ．６１３-６１７、２０００］。
【０１８１】
ＴＲＦ２DNの一過性トランスフェクションおよび発現
Ａｄ  ＴＲＦ２DN発現ベクターはチチア・デランジェ博士(ロックフェラー大学)の寄贈品であった。対照ベクター、ｐＣＭＶ  ＬＵＣはヘダヤティ(Ｍ．Ｈｅｄａｙａｔｉ)博士(ジョンホプキンス大学)の寄贈品であった。細胞を３．５×１０3細胞／ｃｍ2の密度で平板培養した。１日後、製造者から提供されたプロトコルにしたがって、フギ-ン(Ｆｕｇｅｎｅ)６トランスフェクション試薬(ロッシュ・モレキュラー・バイオメディカルス、インディアナポリス、ＩＮ)を使用して、その培養物に１μｇプラスミドＤＮＡ／３５ｍｍ培養皿をトランスフェクトした。トランスフェクション後、指定された時間に細胞を集め、上述のようにｐ９５／Ｎｂｓ１をウエスタンブロット法によって試験した。
【０１８２】
テロメア長
正常ヒト線維芽細胞を希釈剤または４０μＭ１１マー-１、２、または-３の存在下で５日間培養した。その後細胞を集め、ＤＮｅａｓｙ組織キット(キアゲン社、バレンシア、ＣＡ)を用いてゲノムＤＮＡを分離した。テロメア長は、ロッシュモレキュラーバイオメディカルス(インディアナポリス、インディアナ)から提供されるテロ(Ｔｅｌｏ)ＴＡＧＧＧテロメア長アッセイおよび製造者から提供されるプロトコルを使用して実質的にヴァンステンセル(ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｓｅｌ,Ｂ．)およびデランジェ(Ｔ．ｄｅ  Ｌａｎｇｅ)(１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５巻：ｐ．７４０-７４３)の記載通りに決定された。平均テロメア長(ＭＴＬ)を密度計によって、ハ-レイ(Ｈａｒｌｅｙ,Ｃ．Ｂ．)らの方法(１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５巻：ｐ．４５８-４６０)を使用して計算した。
【０１８３】
３'オーバーハング・アッセイ
正常ヒト線維芽細胞を４０μＭ  １１マー-１の存在下で、７日間まで培養した。細胞を処理前(０時)と処理３、５および７日目に集めた。ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙキットを用いて分離した。３'オーバーハングの検出はヴァンステンセル、スモゴルゼウスカ(Ｓｍｏｇｏｒｚｅｗｓｋａ)およびデランジェ(ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｓｅｌ,Ｂ．ら、１９９８、Ｃｅｌｌ  ９２巻：ｐ．４０１-４１３)。プローブ(［ＴＴＡＧＧＧ］４)をゲノムＤＮＡにハイブリッド化し、テロメア二本鎖ＤＮＡへのハイブリダイゼ-ションのための標準とした。試験プライマー(［ＣＣＣＴＡＡ］４)を用いてオーバーハングを検出した。
【０１８４】
３'オーバーハング配列に相同のオリゴヌクレオチド類(１１マー-１：ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)、この配列に相補的なオリゴヌクレオチド類(１１マー-２：ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；配列番号：９)およびテロメア配列に関係のないオリゴヌクレオチド類(１１マー-３：ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ；配列番号：１０)を合成した。３種類の１１マーオリゴヌクレオチドを、ヒトＴリンパ球の確立された細胞系であるジャルカット細胞の培養物に加えた。この細胞型はテロメア崩壊［カールセダー(Ｋａｒｌｓｅｄｅｒ,Ｊ．)ら(１９９９)Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３巻、ｐ．１３２１-１３２５］およびＤＮＡ損傷性電離放射線(ＩＲ)［ヴィゴリト(Ｖｉｇｏｒｉｔｏ,Ｅ．)ら(１９９９)Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒ  ４１巻、ｐ．１５３-１６１］に反応してアポトーシスを受けると報告されている。二重のジャルカット細胞培養物を最終濃度４０μＭの１１マー-１、２、または-３オリゴヌクレオチド類または対照としての等容量の希釈剤(水)で処理した。細胞を処理後９６時間まで集め、ヨウ化プロピジウムで染色し、ＦＡＣＳにより分析した。図１３および図１９-１９Ｈも参照されたい。
【０１８５】
アポトーシスはＤＮＡ末端標識ＴＵＮＥＬアッセイによっても検出された。ジャルカット細胞を４０μＭオリゴヌクレオチドで７２時間処理した。細胞を集め、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。オーバーハング相同体配列番号：５で処理したジャルカット細胞だけが、ＦＡＣＳ分析および共焦点性顕微鏡検査によって見られる末端標識の組込みによる蛍光増加を示した。アポトーシスのまた別のマーカーであるカスパス-３の活性化も試験した。ジャルカット細胞の二重の培養物を培養し、上に記載のように、４８、７２および９６時間オリゴヌクレオチドで処理し、カスパス-３活性を測定した。カスパス-３の活性は処理４８時間後には対照と比較して５０％高く、７２および９６時間にはこれら細胞における上記活性は３-４倍高かった(図２７)。このように、テロメア３'オーバーハングに相同のオリゴヌクレオチドは、これら細胞のＳ相停止およびアポトーシスを特異的に引き起こす。
【０１８６】
実施例２９：アポトーシスにおけるｐ７３の役割の証明
ｐ５３転写因子および腫瘍抑制タンパク質は、テロメアループ崩壊後のアポトーシスに特異的に関係していた［カールセダ-ら(１９９９)、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３巻、ｐ．１３２１-１３２５］。しかし、テロメアループ崩壊後のネズミ胚線維芽細胞のアポトーシスにおけるｐ５３の役割が実験的に証明されたとはいえ、同じ研究における、傷害されたと推定されるｐ５３を有する細胞のアポトーシスにおけるｐ５３の推定的役割には言及されていない［カールセダーら(１９９９)、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３巻、ｐ．１３２１-１３２５］。ｐ５３相同体ｐ７３も数種の細胞型においてアポトーシスを媒介することが示され［リッシー(Ｌｉｓｓｙ,Ｎ．Ａ．)ら、(２０００)、Ｎａｔｕｒｅ  ４０７巻：ｐ．６４２-６４４、アーウィン(Ｉｒｗｉｎ,Ｍ．)ら(１９９７)、Ｎａｔｕｒｅ  ４０７巻：ｐ．６４５-６４８］、しかもテロメア相同体ＤＮＡは両方のタンパク質を誘発するので、オリゴヌクレオチド誘導性細胞死にこのタンパク質が寄与しているかどうかを調べる実験を設計した。
【０１８７】
ＨＴＬＶ-１感染は、ｐ７３経路［レマッソン(Ｌｅｍａｓｓｏｎ,Ｉ．およびナイボーグ(Ｎｙｂｏｒｇ,Ｊ．Ｋ．)、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６巻、ｐ．１５７２０-１５７２７、カイダ(Ｋａｉｄａ,Ａ．)ら(２０００)、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９巻：ｐ．８２７-８３０］並びにｐ５３経路［アカギ(Ａｋａｇｉ,Ｔ．)ら(１９９７)、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４０６巻、ｐ．２６３-２６６］を傷つけることが示されたので、野生型ｐ５３を発現することが知られているヒトメラノーマ系ＭＭ-ＡＮを研究のために選択した。ヒトメラノーマ細胞系ＭＭ-ＡＮの対応培養物(ベイヤーズ(Ｈ．Ｒ．Ｂｅｙｅｒｓ)、ボストン大学)を、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに増殖させ、４０μＭ  １１マー-１、１１マー-２または希釈剤のみで２４-４８時間処理し、間隔をおいて採取し、ＦＡＣＳ分析およびウエスタンブロット法を行った。
【０１８８】
ジャルカット細胞のように、ＭＭ-ＡＮは最初にＳ相停止に入り、７２時間までに細胞の大部分がアポトーシスを受けた。これはｓｕｂ-Ｇ0／Ｇ1ＤＮＡ含有量によって示された。タンパク質は、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用する変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)によって分析し、Ｅ２Ｆ１特異的モノクローナル抗体でウエスタンブロット分析を行った(ＫＨ９５サンタクルズ・バイオテクノロジー、サンタクルズ、ＣＡ)。ｐ７３はポリクローナル抗体(オンコジーン・リサ-チ・プロダクツ(サンジエゴ、ＣＡ)からのＡＢ-４)を使用して分析した。ウエスタンブロット分析は、Ｅ２Ｆ１およびｐ７３について、観察されたアポトーシスにおけるこれらタンパク質の基礎的役割と一致する、ジャルカット細胞と同じような誘導パターンをあらわした。細胞死に対するｐ７３の関与を確認するために、ＭＭ-ＡＮメラノーマ細胞に優性のネガティブｐ７３(ｐ７３DN)(ア-ウィン(Ｉｒｗｉｎ)ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２巻：ｐ．６４５-６４８)構成物または対照としてのエンプティベクター(ｐ７３DN-含有ベクター、ウィリアム・ケ-リン博士(ダナ・ファーバー・インスティチュート、ボストン))をしっかりとトランスフェクトし、対の培養物に４０μＭ  １１マー-１または希釈剤のみを補充し、７２時間目に採取してＦＡＣＳ分析を行った。ｐ７３ＤＭを発現する細胞は対照細胞の半分の速度でアポトーシスを受け、このプロセスにｐ７３が独占的ではないが実質的に役割を演じていることが確認された。さらに、ウエスタンブロットによって分化マーカーＭａｒｔ-１、チロシナーゼ、ＴＲＰ-１およびｇｐ-１００が、ＭＭ-ＡＮメラノーマ細胞のＴ-オリゴ処理後４８-７２時間にアップレギュレートされた。上記の分化マーカー類は正常ヒトメラノサイトに発現される。これらの抗原の発現喪失が、ある種のヒトメラノーマが免疫学的監視防御を逃れるために使用するメカニズムである。これらの抗原からの数種のペプチドは腫瘍侵潤性細胞傷害性リンパ球の標的である。上記の抗原類からの抗原性ペプチドを使用する種々のワクチン法でインビボで有望な結果が得られている。
【０１８９】
実施例３０：ＳＣＩＤマウスにおけるＭＭ-ＡＮ細胞の腫瘍形成性に対するＴ-オリゴの効果
ＭＭ-ＡＮ細胞の腫瘍形成性に対するＴ-オリゴ(ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)の効果を研究するために、細胞を５％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)を含むＤＭＥＭ中で増殖させ、４０μＭ  Ｔ-オリゴ、相補体、または希釈剤のみで４８時間処理した。その後細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで採取し、生育能力パーセントをトリパンブルー排除法で測定した。全ての際細胞集団は注射時に、９０％以上の生育能力を有した。これらのメラノーマ細胞の腫瘍形成性は、平衡塩溶液中の１×１０6の生育可能細胞をＳＣＩＤマウス(５匹ずつ３群)の右肩甲骨上に皮下注射して腫瘍を生成することによって測定された。処理後１８日目に動物をＣＯ2吸入によって殺し、腫瘍の大きさをカリパ-で測定した。腫瘍を処理してヘマトキシリンおよびエオシン染色し、腫瘍のメラノサイト性起源を、ＨＭＢ-４５モノクローナル抗体を用いる損傷の免疫組織学的染色によって確認した。この方法はヒトメラノーマの普遍的マーカーであるｇｐ-１００を識別する。
【０１９０】
その他の群では希釈剤処理した細胞の注射部位に、１０日目および１２日目までに腫瘍が触診された。１８日目に動物を殺し、全ての腫瘍を取り出し、測定した。希釈剤処理群における腫瘍の平均的大きさは、Ｔ-オリゴ処理群における５６±１３ｍｍ3に対して、３２２±４５ｍｍ3であった(ｐ＝０．０４)。対照オリゴヌクレオチドで処理した動物では腫瘍の大きさは２３８±５０ｍｍ3であり、希釈剤対照より有意に小さくはなかった(図２８)。ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって、豊富な色素性細胞質と、過度色素沈着を示す大きい不規則な核と、大きい核小体を有する大きい類上皮細胞からなる皮下組織内に、大きい腫瘍が存在することが明らかになった。それらの腫瘍は、それらのメラノサイト起源を確認するＨＭＢ-４５免疫組織化学的染色が陽性であったため、メラノーマであることが確認された。
【０１９１】
メラノーマ細胞の転移力に対するＴ-オリゴの効果を研究するために、上記のようにＭＭ-ＡＮ細胞の培養物をＴ-オリゴ、相補体または希釈剤のみで４８時間処理し、採取した。平衡塩溶液中の１×１０6細胞を生後５週のＳＣＩＤマウス(５匹ずつ３群)の側方尾静脈に注射した。４０日後、マウスをＣＯ2吸入で殺し、剖検を行い、臓器を顕微鏡検査し、目に見える転移病巣を調査した。
【０１９２】
希釈剤のみまたは対照オリゴヌクレオチドで処理した５匹の動物には多数の転移が発生した。これに対してＴ-オリゴ処理群では５匹の動物中１匹のみに転移がみられた。対照動物では転移は副腎、骨、脳、褐色脂肪体、腎臓、肝臓、肺、膵臓およびその他の部位に見られた。動物１匹あたりの目に見える腫瘍の平均数はＴ-オリゴ前処理群では０．８であり、それに対して希釈剤および対照オリゴ前処理群ではそれぞれ１５．８(ｐ＝０．００３)および９．６(ｐ＝０．０５)であった。肉眼的転移腫瘍の平均量もＴ-オリゴ処理動物では、希釈剤処理および相補体処理動物に比較してそれぞれ約８５％および８０％に有意に減少することが判明した(図２９)。
【０１９３】
【表２】
2010031051.tif 000004
【０１９４】
実施例３１：活性はテロメア・オーバーハング配列に対する相同性に依存する
テロメア・オーバーハング配列に対するこれらの反応の特異性をさらに確認するために、３種類のバリエーションを試験した。１１マー-１のように、その順列ｐＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴ(配列番号：１３)はオーバーハングの正確な相同体であり、したがって等しく活性であることが予想される。第二のオリゴヌクレオチド、ｐＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧ(配列番号：１４)は１１マー-１と同様にＧ-豊富(１１塩基中５)であり、９-マーオリゴヌクレオチド、ｐＧＡＧＴＡＴＧＡＧ(配列番号：１)と同様にオーバーハングに５５％相同である。後者(配列番号：１)はｐ５３および色素形成を誘導し、ＤＮＡ修復能力を高めることが最近証明された(実施例１２を参照されたい)。第三のオリゴヌクレオチド、ｐＣＧＧＧＣＴＴＡＹＹＧ(配列番号：１５)もオーバーハングに５５％の相同性を有するが、オーバーハング配列にはないシトシン塩基を１８％含むという点で他のオリゴヌクレオチド類とは異なる。これらのオリゴヌクレオチドをジャルカット細胞の培養物に最終濃度１０μＭになるように個々に加えた。７２時間後細胞を集め、ＦＡＣＳ分析のために処理した。各実験条件は三重に行われた。図３０Ａ-３０Ｈに示されるデータは２実験のうち１つの代表的実験からのものである。７２時間までに希釈剤処理細胞およびシトシン含有オリゴヌクレオチド処理細胞の２％がＦＡＣＳ分析によりアプトティックであった。しかし相同体処理細胞の１３％および部分相同体処理細胞の１０％がアプトティックであった。９６時間後、相同体処理細胞の２８％がアポプトティックであり、それに対して部分相同体処理細胞の１６％およびシトシン含有オリゴヌクレオチドまたは希釈剤のみで処理した培養細胞の２-４％がアポプトティックであった。別の対培養物において、２つの完全テロメア・オーバーハング相同体［ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)およびｐＧＧＧＴＴＡＧＧＴＴ(配列番号：１３)］は活性が等しいことが判明した。これらのデータは、オリゴヌクレオチド活性は主として、例えばＧ含有量よりむしろテロメア相同性の関数であることを示唆している。さらに、オリゴヌクレオチド中のシトシンの存在は相同性には無関係にその活性を低減する。ｐＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧ(配列番号：１４)およびｐＣＧＧＧＣＴＴＡＹＹＧ(配列番号：１５)が同様なテロメアオーバーハング相同性を有するとはいえ、後者のオリゴヌクレオチドはアプトーシスを誘発することができず、中程度のＳ相停止を引き起こしたに過ぎない。これは２-２０塩基オリゴヌクレオチドのその他のＵＶ擬似ＤＮＡ損傷反応を誘起する能力を比較する実施例１２記載の研究と一致する。
【０１９５】
３３％の６塩基テロメア・タンデム・リピート配列をあらわすｐＴＴがジャルカット細胞において、完全テロメア・リピート配列と同じ様態でＳ相停止を誘起するかどうかを確認するために、我々はｐＴＴおよび１１マー１の効果をジャルカット細胞で比較した。ｐＴＴおよび１１マー-１の相対的効率を調べるために、ジャルカット細胞培養物を希釈剤、２０μＭまたは５μＭ  ｐＴＴまたは１１マー-１で７２時間処理し、集めてＦＡＣＳ分析を行った。各実験条件を三重に行った。細胞周期の各相における細胞のパーセンテージ(平均値および標準偏差としてあらわされる)を三重の結果から決定した。３実験のうち１つの代表的実験を図３１Ａ-３１Ｅに示す。２０μＭ濃度では、ｐＴＴ-および１１マー-１-処理ジャルカット細胞の細胞周期プロフィールは７２時間目にはほぼ同じで、処理細胞のそれぞれ５３±１％および５８±１％がＳ相であった。しかし、５μＭでは、１１マー１処理細胞の６１％が７２時間以内にＳ相に蓄積し、それに対しｐＴＴ処理細胞では４５％、および希釈剤処理細胞で３６％であった。より高い１１マー-１用量(４０μＭ、図１９Ｆ)で処理したジャルカット細胞でも７２時間でＳ相にある細胞のパーセントは同様であった(３８％)とはいえ、これらの培養細胞はそれに加えた１３％のアプトティック(＜Ｇ0)細胞も含んでいた。２０μＭ  ｐＴＴで処理したジャルカット培養細胞には９６時間経ってもアプト-シスは検出されなかった。このようにｐＴＴとテロメア・オーバーハング相同体はジャルカット細胞の細胞周期に同様な効果を有する。ただし不完全配列ではより高濃度が必要である。これらのデータは、図３０のデータ並びに２-２０塩基長のその他のオリゴヌクレオチドに関するその他のデータ(実施例１２)と共に、部分的相同性のみを有する多くの配列も有用な効果を有するとはいえ、これらオリゴヌクレオチドのＤＮＡ損傷反応誘発能力がテロメア・リピート配列への相同性の程度に直接関係することを示唆している。
【０１９６】
実施例３２：正常ヒト線維芽細胞におけるＳ相停止、Ｅ２Ｆ１、およびｐ５３タンパク質レベルおよびｐ５３のリン酸化の誘発
正常新生児ヒト線維芽細胞の融合前の培養物をオリゴヌクレオチド(４０μＭ)または希釈剤のみで処理し、２４時間後に集めてＦＡＣＳ分析(図３２Ａ-３２Ｄ)またはウエスタンブロット分析を行った。図３２Ａ-３２Ｄに示される平均および標準偏差を三重のサンプルから測定した３実験のうちの代表的１実験を示す。正常新生児ヒト線維芽細胞は２４時間以内にテロメア・オーバーハング相同体オリゴヌクレオチド、１１マー-１に、Ｓ相チェックポイントの活性化によって反応したが、アポプトティック細胞は処理後７２時間までは検出されなかった。テロメア・オーバーハングに相補的なオリゴヌクレオチド(１１マー-２)、または関係のないオリゴヌクレオチド(１１マー-３)は細胞に効果を示さなかった。テロメア相同体オリゴヌクレオチドの選択的効果を、選択的取込みに帰することはできない。なぜならば同様な取込みが、配列には無関係に、同じ長さのオリゴヌクレオチドに示されたからである。
【０１９７】
セリン-１５のリン酸化によって示されるようなｐ５３の活性化を、ホスフォーｐ５３(ｓｅｒ-１５)特異的抗体１６Ｇ８を用いてウエスタンブロット分析によって確認した。そのブロットを剥がし、パントロピックｐ５３ＤＯ-１で再プローブ化した。ゲルのレーンは、希釈剤単独、１１マー-１または１１マー-２で処理して２４、４８または７２時間目に集めた線維芽細胞からのタンパク質を含んでいた。陽性対照として、別のドナ-からの線維芽細胞を模擬-またはＸ-線照射(１０Ｇｙ)し、３時間後に集めた。密度計分析は、１１マー-１処理線維芽細胞におけるＥ２Ｆ１が希釈剤または１１マー-２処理対照に比較して２４時間目に１７０-２５０％増加したことを示した。ｐ５３は１１マー-１処理後、希釈剤または１１マー-２処理対照と比較して、４８時間目に６０-３００％、７２時間目に２４０-３８０％増加した。全ての数値はβアクチンを基準とし、独立的２実験に基づいている。処理線維芽細胞のウエスターン分析により、ｐ５３およびＥ２Ｆ１がテロメア・オーバーハング相同体によって選択的に誘発されることが示された。
【０１９８】
Ｅ２Ｆ１の増加は１１マー-１の添加の早くも４時間後に見られ、１２-２４時間後にはピ-クに達し、その後対照レベルに戻った。Ｅ２Ｆ１転写因子はアポトーシスの誘発においてｐ５３と共力し(コワリク(Ｋｏｗａｌｉｋ,Ｔ．Ｆ．)ら、１９９５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６９巻：ｐ．２４９１-２５００、コワリクら、１９９８、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ９巻：ｐ．１１３-１１８)、ヒト線維芽細胞における老化表現型をｐ５３依存性様態で誘導する(ディムリ(Ｄｉｍｒｉ,Ｇ．Ｐ．)ら、２０００、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０巻：ｐ．２７３-２８５)ことが知られている。さらに、Ｅ２Ｆ１はＩＲによるＤＮＡ損傷によってＡＴＭキナーゼ依存性様態で誘発される(リン(Ｌｉｎ,Ｗ．Ｃ．)ら、２００１、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１５巻：ｐ．１８３３-１８４４)。１１マー-１がｐＴＴのように(エラーら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４巻：ｐ．１２６２７-１２６３２：マエダら、１９９９、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  ４３３巻：ｐ．１３７-１４５)ｐ５３を活性化し、誘導するかどうかを調べるために、我々はｐ５３リン酸化を調べた。ｐ５３リン酸化は種々の形のＤＮＡ損傷後のｐ５３の転写活性化のマーカーである(ランベルト(Ｌａｍｂｅｒｔ,Ｐ．Ｅ．)ら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３巻：ｐ．３３０４８-３３０５８、ドゥマズ(Ｄｕｍａｚ,Ｎ．)およびミ-ク(Ｄ．Ｗ．Ｍｅｅｋ)１９９９、ＥＭＢＯ  Ｊ  １８巻：ｐ．７００２-７０１０、チベッツ(Ｔｉｂｂｅｔｔｓ,Ｒ．Ｓ．)ら１９９９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３巻：ｐ．１５２-１５７、カスパリら、２０００、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １０巻：ｐ．３１５-３１７、ウンガ(Ｕｎｇｅｒ,Ｔ．)ら、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８巻；ｐ．３２０５-３２１２)。１１マーに反応してセリン１５がリン酸化されたｐ５３タンパク質には顕著な選択的増加があった。これは４時間後に初めて検出され、少なくも４８時間は持続した。
【０１９９】
実施例３３：ｐ５３リン酸化およびＥ２Ｆ１誘発はＡＴＭに依存する
ｐ５３のセリン１５部位は電離照射(ＩＲ)後、ＡＴＭ依存的様態でリン酸化されることが知られているので、我々はＥ２Ｆ１誘発におけるＡＴＭの役割および１１マー-１に反応したｐ５３セリン１５のリン酸化を研究することにした。機能的ＡＴＭタンパク質が欠如していることが知られている毛細血管拡張性運動失調(ＡＴ)患者からの線維芽細胞および年齢的にマッチした正常対照線維芽細胞(Ｎ)を希釈剤、４０μＭ１１マー-１、模擬照射またはＩＲ(１０Ｇｙ)で処理した。細胞を３時間後(模擬照射またはＩＲ)または４８時間後(希釈剤、１１マー-１)に集めてウエスタンブロット分析を行い、セリン１５-リン酸化ｐ５３および総ｐ５３を検出した。正常線維芽細胞において、１１マー１はセリン１５上のｐ５３リン酸化レベルを希釈剤処理対照に比較して１０-１５倍増加させた。対照的に、１１マー-１によるＡＴ線維芽細胞処理では５０％未満の増加に過ぎなかった。新生児線維芽細胞のｐ５３誘発に対して、若い成人からのこれら正常線維芽細胞では、１１マー-１は最小の総ｐ５３レベルを誘発した。これは既述のように成人細胞対新生児細胞でＵＶ誘起性ＤＮＡ損傷に対する反応が減少することと一致する。予想通り、ＡＴ線維芽細胞ではＩＲに反応したｐ５３セリン１５のリン酸化が非常に小さかった。１１マー-１は正常対照線維芽細胞ではＥ２Ｆ１レベルも誘発するが、ＡＴ線維芽細胞では誘発しなかった。これらのデータは、テレモア・オーバーハングＤＮＡに対するこれら反応にはＡＴＭキナーゼが必要であることを明らかにしており、ＴＲＦ２DNによるＡＴＭ依存性ｐ５３誘発と一致する(カールセダら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３巻：ｐ．１３２１-１３２５)。
【０２００】
実施例３４：細胞周期停止はｐ５３に依存しない
これらのオリゴヌクレオチドがその他のヒト細胞型に同様に影響をあたえるかどうかを確認するために、そしてｐ５３の役割を研究するために、我々は、突然変異したと推定されるｐ５３(エラーおよびギルヒレスト(Ｂ．Ａ．Ｇｉｌｃｈｒｅｓｔ)ら、２０００、Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１３巻：ｐ．９４-９７)を過剰発現する扁平上皮癌細胞系(ＳＣＣ１２Ｆ)(ラインワルドら、１９８３、Ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、ｐ．８６-９６、アカデミックプレス(ニューヨーク))およびｐ５３-ｎｕｌｌ骨肉腫細胞系(Ｓａｏｓ-２)(ワング(Ｗａｎｇ,Ｌ．Ｈ．)ら、１９９８、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８巻：ｐ．３２１-３２５)を希釈剤のみ、１１マー-１、１１マー-２または１１マー-３で処理した。４８時間後培養細胞をＦＡＣＳによって分析した(図３３Ａ-３３Ｈ)。ジャルカット細胞および正常線維芽細胞の場合のように、テロメア・オーバーハング相同体は４８時間以内にこれらの細胞型の両方に選択的にＳ相停止を誘発した。１１マー-１処理ＳＣＣ１２ＦおよびＳａｏｓ-２細胞におけるＳ相細胞のパーセンテージは実質的に同じであったが(それぞれ５３±６％および５２±１％)、２種類の細胞型のＧ0／Ｇ1およびＧ2／Ｍ含有量は幾らか異なっていた。これは、用量依存的差に通ずるオリゴヌクレオチドの取り込みの差を反映し、および／またはこれらの細胞において細胞周期をコントロールするように作用する経路が異なることを反映するものである。どちらの細胞型でも７２時間以内にはオリゴヌクレオチドに対するアポプトティック反応は検出されなかった。これらのデータは、１１マー-１が上皮起源および間葉起源の両方の細胞に影響を与え、１１マー-１に反応するＳ相停止がｐ５３に依存しないことを示すものである。しかし、野生型ｐ５３を有する多くの細胞型はＤＮＡ損傷後アポトーシスに比較的抵抗するため(シオノフ(Ｓｉｏｎｏｖ,Ｒ．Ｖ．)およびハウプト(Ｙ,Ｈａｕｐｔ)、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８巻：ｐ．６１４５-６１５７)、これらのデータは１１マー-１に対するアポトーシス反応(これは傷害されたと推定されるｐ５３を発現するジャルカット細胞では明らかに起きる)におけるｐ５３の役割には取り組んでいない(アカギら、１９９７、ＦＥＢＳ  ４０６巻：ｐ．２６３-２６６)。
【０２０１】
実施例３５：機能的ｐ９５／Ｎｂｓ１欠乏細胞は、テロメア・オーバーハング相同体に反応したＳ相チェックポイントを活性化しない
ＩＲに反応したＳ相停止におけるｐ９５／Ｎｂｓ１の役割およびこれとテロメアＤＮＡとの公知の関係を明らかにするために、次に、テロメア・オーバーハング相同体に反応してあらわれるＳ相停止におけるその役割を調べた。線維芽細胞は、ｐ９５／Ｎｂｓ１が検出レベルより低いＮＢＳ(ナイミ-ヘン染色体不安定症候群)患者から得た。融合前培養物または正常(対照)線維芽細胞およびＮＢＳ線維芽細胞を４０μＭのオリゴヌクレオチドで処理し、４８時間後に集めてＦＡＣＳ分析した(図３４Ａ-３４Ｈ)。平均値および標準偏差を各条件の三重の培養物から計算した。３実験のうちの代表的１実験から得たＦＡＣＳプロフィ-ルが示される。予想通り、１１マー-１処理正常細胞は、２４時間以内にＳ相増殖停止を示し、その一方で希釈剤単独、１１マー-２または１１マー-３で処理した同じ細胞は影響を受けない。
【０２０２】
関係のないオリゴヌクレオチドで処理したＮＢＳ細胞および希釈剤のみで処理したＮＢＳ細胞は正常細胞のＳ相停止に似たＦＡＣＳプロフィールを示し、希釈剤単独で処理したＮＢＳ細胞に比較して、それらの増殖は１１マー-１によりごくわずかの影響を受けた。これらのデータはｐ９５／Ｎｂｓ１がＳ相の正常進行におけるこれまでは未確認の役割を有し、ＤＮＡ合成が機能的ｐ９５／Ｎｂｓ１の不在下では長引くことを示唆する。また興味深いことに、統計的に有意でないとはいえ(ｐ＜０．０８)、１１マー処理ＮＢＳ培養細胞におけるＳ相細胞の数が希釈剤処理細胞に比較して８％増加することは、ｐ９５／Ｎｂｓ１以外の因子がＤＮＡ損傷後または１１マー-１処理後の停止に寄与していることを示唆する。例えばＳ相中の予定外のＥ２Ｆ１活性がＳ相チェックポイントの活性化に導くことが示されている(クレク(Ｋｒｅｋ,Ｗ．)ら、１９９５、Ｃｅｌｌ  ８３巻：ｐ．１１４９-１１５８)。
【０２０３】
ＤＮＡ損傷後のＳ相チェックポイントの活性化と因果関係を有する、ＡＴＭによるｐ９５／Ｎｂｓ１のリン酸化が、ＰＡＧＥによってゲル中のタンパク質移動の微妙な遅延として検出できる(リムら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４巻：ｐ．６１３-６１７、ザオら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５巻：ｐ．４７３-４７７、ウー(Ｗｕ,Ｘ．)ら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５巻：ｐ．４７７-４８２)。ウエスタンブロット分析は１１マー-１の添加後４８時間、７２時間および９６時間後にジャルカット細胞から採取したタンパク質のｐ９５／Ｎｂｓ１移動にそのようなシフトを検出した(しかし１１マー-２または１１マー-３添加の場合には検出されなかった)。ｐ９５／Ｎｂｓ１の見かけの分子量のこの変化--多分このタンパク質の共有結合修飾に起因する-は、ＦＡＣＳ分析によって確認されるＳ相停止と同時に起こる。ｐ９５／Ｎｂｓ１移動におけるこのシフトは前に報告したようにＩＲ照射後のこれら細胞にも起こり、タンパク質のリン酸化に帰せられる(リムら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４巻：ｐ．６１３-６１７、ザオら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５巻：ｐ．４７３-４７７、ウ-(Ｗｕ,Ｘ．)ら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５巻：ｐ．４７７-４８２)。ＳＣＣ１２Ｆ細胞は１１マー１の添加に同一に反応し、このときもそれらのＳ相チェックポイントの活性化と一致する時間枠内で反応する。ＳＣＣ１２Ｆ細胞におけるシフトは、１１マー-１で処理し、照射した細胞からの免疫沈降ｐ９５／Ｎｂｓｌではより明白であり、ＩＲに反応してリン酸化されたｐ９５／Ｎｂｓｌについて報告されたように(リムら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４巻：ｐ．６１３-６１７)、免疫沈降したタンパク質をセリン／スレオニンホスファターゼで処理することによって除去される。希釈剤-およびオリゴヌクレオチド処理線維芽細胞からのタンパク質類のウエスタンブロットをホスフォーｐ９５／Ｎｂｓ１特異的抗体で検査すると、ｐ９５／Ｎｂｓ１のリン酸化がテロメア・オーバーハング相同体オリゴヌクレオチド１１マー-１によって誘発されることがさらに示された。
【０２０４】
実施例３６：ＴＲＦ２DNによるテロメア崩壊はｐ９５／Ｎｂｓ１修飾に導く
カールセダら(１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３巻：ｐ．１３２１-１３２５)は以前、テロメア・ループを崩壊し、３'オーバーハングを露出する、ＴＲＦ２DNの異所性発現が、ある種の細胞型ではｐ５３増加およびアポトーシスを引き起こすことを証明した。ｐ９５／Ｎｂｓ１修飾がテロメア崩壊によっても誘起されるかどうかを調べるために、新生児ヒト線維芽細胞にＴＲＦ２DN発現ベクターまたはＴＲＦＤＮ挿入物のない対照ベクターを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間まで細胞を集め、ｐ９５／Ｎｂｓ１をウエスタンブロット法によりホスフォーｐ９５-特異的抗体を使用して分析した。トランスフェクション後２４時間までに、ＩＲ(１０Ｇｙ)曝露後に見られるようなｐ９５／Ｎｂｓ１の明白なシフトが検出される。より大きい分子量へのこのシフトは４０時間後でもまだ明らかである。これらのデータは、テロメア崩壊もテロメア３'オーバーハングの相同体による処理も両方ともｐ９５／Ｎｂｓ１の修飾を誘起することを証明し、したがって３'オーバーハングの露出が種々のテロメア処理後に認められるＤＮＡ損傷反応の主要シグナルであるという我々の仮説を支持するものである。
【０２０５】
実施例３７：テロメア・オーバーハング・オリゴヌクレオチドはテロメア長を低減せず、または３'オーバーハングを変化させない
１１マー-１オリゴヌクレオチドはテロメアループ構造を崩壊し、ＴＲＦ２DNトランスフェクション後に報告されるような決定的なテロメア短縮および／または３'オーバーハング分解に導く(カールセダ、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３巻：ｐ．１３２１-１３２５)という可能性を排除するために、我々は正常ヒト線維芽細胞をオリゴヌクレオチドで５日間(ｐ５３およびＳ相チェックポイントの誘発に必要な日数よりも長い日数)処理した後、平均テロメア長を分析した。正常ヒト線維芽細胞を希釈剤単独、４０μＭ  １１マー-１、１１マー-２または１１マー-３で５日間処理した。線維芽細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを分離した。テロメア長の分析を希釈剤処理細胞、１１マー-１処理細胞、１１マー-２処理細胞、１１マー-３処理細胞および後期継代培養の(ｌａｔｅ  ｐａｓｓａｇｅ)線維芽細胞(細胞集団の＞５０の倍加)で行い、高分子および低分子テロメアで比較した。ハ-レイ(Ｈａｒｌｅｙ,Ｃ．Ｂ．)ら(Ｎａｔｕｒｅ  ３４５巻：ｐ．４５８-４６０、１９９０)が報告したように計算した各実験条件におけるＭＴＬ値(キロベ-ス)は次のようである：１０．５９(希釈剤)、１２．２５(１１マー-１)、１０．４５(１１マー-２)、１０．２２(１１マー-３)、８．８６(老化)、１０．１９(高分子標準)、４．０４(低分子標準)。３'オーバーハングアッセイを、３、５、または７日間４０μＭ  １１マー-１で処理した新生児線維芽細胞で行った。
【０２０６】
平均テロメア長(ＭＴＬ)が減少したオリゴヌクレオチドはなかった。実際、１１マー-１処理細胞は５日間の実験中に約２０％というわずかなＭＴＬ増加を示した。さらに、１１マー-１オリゴヌクレオチドで線維芽細胞を７日間まで処理すると、ＴＲＦ２DNによるテロメア崩壊後に認められたようなテロメア３'オーバーハングの分解は起きなかった(カールセダ、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３巻：ｐ．１３２１-１３２５)。これらのデータは、１１マー-１がテロメアの一体性に影響を与えず、このプロセスによって生成するシグナルを模することを強く示唆する。同様に、１１マー-１効果を、例えば偽基質として作用し、したがってテロメア伸長を防止することによるテロメラーゼ阻害のせいにすることはできない。なぜならばこの効果を容易に観察できる細胞である正常ヒト線維芽細胞は、触媒性サブユニットＴＥＲＴを発現しないからである(グライダ(Ｇｒｅｉｄｅｒ,Ｃ．Ｗ．)１９９６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５巻：ｐ．３３７-３６５)。さらに、テロメラーゼ阻害によるテロメア崩壊は、長時間後、既報によると５０以上の集団倍加後(ナカ(Ｎａｋａ,Ｋ)ら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５５巻：ｐ．７５３-７５８、マルシク(Ｍａｒｕｓｉｃ,Ｌ．)ら、１９９７、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  １４４巻：ｐ．５８９-６０１)、ここに報告した２４-４８時間よりもはるかに長い時間後に始めてあらわれると予想され、いかなる場合にも認められていない。
【０２０７】
実施例３８：ＳＣＩＤマウスのＩｎ  Ｓｉｔｕメラノーマの、種々の送達法によるオリゴヌクレオチド治療(仮説)
ＭＭ-ＡＮ細胞を５％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ中で増殖させ、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで採取し、生育能力パーセントをトリパンブルー排除によって測定する。９０パーセント以上の生育能力を有する細胞集団だけを実験に使用する。これらのメラノーマ細胞の腫瘍形成性を、平衡塩溶液中１×１０6生育細胞をＳＣＩＤマウスの後肢に皮下注射し、皮下腫瘍を生成するというやり方によって測定する。これらの研究のために、３群のマウス(５匹マウス／群)を使用する。第１群には２００μｇのＴ-オリゴを１週間に５回、細胞の注射２４時間後に始めて、腹腔内(ＩＰ)注射する。第２群には対照オリゴヌクレオチド２００μｇを１週間に５回腹腔内注射し、第３群には希釈剤を注射する。ＩＰによって送達されたオリゴヌクレオチドはマウスの皮下メラノーマの大きさを効果的に低減することが判明した(マッソド(Ｍａｓｓｏｄ,Ｒ．)ら、Ｂｌｏｏｄ  ９６巻：ｐ．１９０４-１９１３、２００１)。腫瘍の大きさはマウスの１週間２回の検査およびカリパ-による腫瘍測定でモニターする。マウスを注射後４週間目に殺し、腫瘍を処理してヘマトキシリンおよびエオシン染色する。
【０２０８】
ＭＭ-ＡＮメラノーマ細胞を上記のように処理し、採取する。オリゴヌクレオチドはＩＰによる送達に代わって、アルゼット(Ａｌｚｅｔ)ポンプによって送達される。５００μｇ／日のＴ-オリゴまたは対照オリゴが４週間注入される。腫瘍の大きさは前記のように評価される。アルゼットポンプはマウスの皮下メラノーマ腫瘍の治療に有効であることが判明した(ヒジヤ(Ｈｉｊｉｙａ,Ｎ．)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１巻：ｐ．４４９９-４５０３、１９９４)。
【０２０９】
ＭＭ-ＡＮメラノーマ細胞を上記のように処理し、採取した。第１群には１週間に３回２００μｇＴ-オリゴを静脈注射した。第２群には２００μｇの対照オリゴヌクレオチドを１週間に３回静脈注射し、第３群には希釈剤を注射した。マウスを注射後４週間目に殺し、腫瘍の大きさを上記のように評価した。
【０２１０】
実施例３９：メラノーマ転移および腫瘍形成に対するオリゴヌクレオチドの効果(仮説)
腫瘍の最大後退を起こすパイロット実験プロトコルを選択する。ＭＭ-ＡＮメラノーマ細胞を上記のように処理し、採取する。平衡塩溶液中１×１０6細胞を齢４週間のＳＣＩＤマウスの側方尾静脈に注射する。上記各処理群には２５匹ずつのマウスからなる３群がある。第１群にはＴ-オリゴを注射し；第２群には対照オリゴヌクレオチドを注射し、第３群には希釈剤を注射する。処理は全て細胞注入の２４時間後に開始される。６週間後、マウスをＣＯ2吸入によって殺し、剖検を行い、臓器を肉眼で検査し、目に見える傷害を調べた。特に重視したのは肝臓、膵臓および脳である。なぜならばこれらの臓器はＭＭ-ＡＮ細胞転移の主要部位であることが判明しているからである。検査および切片生成のために、臓器をＰＢＳ中ですすぎ、１０％ホルマリンに４８時間固定する。臓器を切開用顕微鏡下で調べ、腫瘍性結節の数を数えた。腫瘍の組織学的特徴を、ホルマリンに固定し、パラフィンに埋封した組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片で検査した。
【０２１１】
ＭＭ-ＡＮメラノーマ細胞を上記のように処理し、採取する。腫瘍の最大後退を起こすパイロット実験プロトコルを選択する。これらのメラノーマ細胞の腫瘍形成性を、平衡塩溶液中１×１０6生育細胞をＳＣＩＤマウスの後肢領域に皮内注射し、皮下腫瘍を生成するという方法で確認する。腫瘍の大きさはマウスの１週間に２回の検査およびカリパーによる腫瘍測定によってモニターする。マウスを注射後４週間目に殺し、腫瘍を取り出し、測定し、処理してヘマトキシリン-エオシン染色を行う。マウス３群を使用する。第１群はＴ-オリゴで処理し、第２群は対照オリゴヌクレオチドで処理し、第３群は希釈剤で処理する。上記のマウス群において腫瘍のアポトーシスをＴＵＮＥＬ法によって確認する。分化マーカーｇｐ-１００、ＴＲＰ-１およびＭａｒｔ-１の発現も、上記の３群の被検マウスから摘出した腫瘍で研究する。
【０２１２】
実施例４０：６ヌクレオチド長より小さいテロメア相同体オリゴヌクレオチドはヒト骨肉腫細胞系の増殖を阻止する
ヒトＳａｏｓ-２細胞をｐ３５培養皿中の１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥに培養し、４０μＭの５マー(ＴＴＡＧＧ)、３マー(ＴＴＡ)１１マー-１(ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)または対照として希釈剤のみを投与し、オリゴヌクレオチドまたは希釈剤の添加後、さらに３６時間培養した。細胞をトリプシン化によって集め、クールターカウンターによって数えた。図３６のグラフは二重の培養細胞で測定した添加後の細胞集団倍加の平均値と平均の標準誤差とをあらわす。
【０２１３】
実施例４１：Ｔ-オリゴは、アポトーシスおよび老化の誘発によって、乳癌細胞増殖を阻止する
Ｔ-オリゴに曝露することによる乳癌増殖の阻止
乳癌細胞に４０μＭ  Ｔ-オリゴ(ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)、対照オリゴヌクレオチド(ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；配列番号：９)または希釈剤単独を１回与えた。４日間にわたって、１回のＴ-オリゴ処置はＭＣＦ-７(ｐ＜０．００６)(図３７)およびＢＴ-２０(ｐ＜０．００６)(図３８)細胞の細胞収量を、対照オリゴまたは希釈剤単独と比較して有意に減らした。
【０２１４】
ＭＣＦ-７細胞に、培養後１日目にＴ-オリゴ(４０μＭ)を補充し、その後３日目に新鮮培地および希釈剤のみ、またはＴ-オリゴを含む新鮮培地を与えた。二重の培養細胞に連続的に培地および希釈剤のみを補充し、前記培養細胞は７日目に融合に達した。Ｔ-オリゴ除去後でさえ、前記処理ＭＣＦ-７細胞は少なくも実験終了時までの１４日間は増殖を回復することができなかった(図３９)。
【０２１５】
Ｔ-オリゴへの曝露はアポトーシスおよび老化を誘発する。
【０２１６】
ＭＣＦ-７(図４０)およびＢＴ-２０(図４１)細胞を上記のようにＴ-オリゴ、対照オリゴまたは希釈剤単独の存在下で保持した。両細胞系において、Ｔ-オリゴ処理培養細胞におけるＴＵＮＥＬ分析はＤＮＡ鎖の切断を示唆する蛍光ピークのシフトを示した。Ｔ-オリゴ処理ＭＣＦ-７細胞は老化関連性β-ガラクトシダーゼ(Ｓ．Ａ．β-ｇａｌ)活性の顕著な増加をで示す(図４２)。Ｓ．Ａ．β-ｇａｌ活性は老化細胞および非増殖細胞をインビボおよびインビトロにおいて確認する公知の特異的マーカーである(ディムリ(Ｄｉｍｒｉ,Ｇ．Ｐ．)ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０巻：ｐ．２７３-２８５、２０００)。
【０２１７】
Ｔ-オリゴはｐ５３のレベルおよび活性を誘発する。
【０２１８】
ＭＣＦ-７細胞を上記のようにＴ-オリゴと共に保持した。総細胞タンパク質を処理してウエスタンブロット分析を行った。ブロットを最初にホスフォーｐ５３(セリン-１５)に対する抗体(活性を示すと考えられているタンパク質型である)と反応させた。剥離後、ブロットを総ｐ５３を識別する抗体と反応させ、その後ｐ２１(ｐ５３によって転写的に調節される遺伝子産物)に対する抗体と反応させた。４８時間以内にＴ-オリゴはｐ５３およびｐ５３活性を誘発した。これはｐ５３リン酸化およびｐ２１誘発によって測定された。同様な結果はＢＴ-２０細胞でも得られた。
【０２１９】
Ｔ-オリゴは乳癌細胞増殖阻止に関してシスプラチンおよびＩＣＩ  １８２,７８０に匹敵する。
【０２２０】
ＭＣＦ-７およびＢＴ-２０細胞を上記のように保持した。細胞にＴ-オリゴ(４０μＭ)、シスプラチン(１０μＭ)(ルディン(Ｒｕｄｉｎ,Ｃ．Ｍ．)ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３巻：ｐ．３１２-３１８、２００３およびデング(Ｄｅｎｇ,Ｘ．)ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９６巻：ｐ７９２-７９８、２００２)、抗エストロゲンＩＣＩ  １８２,７８０と共に(１０-６Ｍ、ＭＣＦ-７細胞のみ)(バルマ(Ｖａｒｍａ,Ｈ．)ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２巻：ｐ．３９８５-３９９１、２００２；およびサン(Ｓｕｎ,Ｊ．)ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４３巻：ｐ．９４１-９４７、２００２)、または希釈剤を補充した。細胞増殖に与えるＴ-オリゴの効果は、卵巣癌および乳癌の治療に一般的に用いられる化学療法剤であるシスプラチンのそれに匹敵する(ブルスタイン(Ｂｕｒｓｔｅｉｎ,Ｈ．Ｊ．)ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２８巻：ｐ．３４４-３５８、２００１；ジャケツ(Ｊａｋｅｓｚ,Ｒ．)ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３８巻：ｐ．３２７-３３２、２００２；オット(Ｏｔｔｏ,Ａ．Ｍ．)ら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２２巻：ｐ．６０３-６１２、１９９６；およびサウター(Ｓａｕｔｅｒ,Ｃ．)ら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４３巻：ｐ．４６-４９、１９８６)。細胞増殖に対するＴ-オリゴの効果もＭＣＦ-７のようにエストロゲン受容体陽性細胞の増殖をコントロールするために使用される抗エストロゲン類の効果に匹敵する(オットら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２２巻：ｐ．６０３-６１２、１９９６)。図４３および図４４を参照されたい。
【０２２１】
実施例４２：Ｔ-オリゴはヒト膵臓腺癌細胞のインビトロ増殖を阻止する。
【０２２２】
ＨＰＡＣ細胞--管起源の中位ないし十分分化した膵臓腺癌にかかった女性患者に由来するヒト膵臓腺癌上皮細胞系--をアメリカ培養コレクション(マナサス、バージニア；ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＲＬ-２１１９)から購入した。それら細胞を３５ｍｍ皿に平板培養し、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．００２ｍｇ／ｍｌインスリン、０．００５ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、４０ｎｇ／ｍｌヒドロコ-チゾン、１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子および５％ＦＢＳを補充した、ダルベッコ改良イ-グル培地(ＤＭＥＭ)と１．２ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを含むＨａｍ'ｓｆ１２培地との１：１混合物中に保持した。培養２４時間後に三重の皿に４０μＭ  ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(Ｔ-オリゴ；配列番号：５)、４０μＭ  ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(対照オリゴヌクレオチド；配列番号：９)または希釈剤のみを補充した。細胞収量を毎日測定した。Ｔ-オリゴは図４５にプロットされた結果からわかるように、ＨＰＡＣ細胞増殖を実質的に阻止した。
【０２２３】
実施例４３：Ｔ-オリゴは乳癌細胞および卵巣癌細胞の増殖を阻止する
２種類のＤＮＡオリゴヌクレオチドを実験用に設計し、ミドランド・サ-ティファイド・リアジェント社(ミドランド、テキサス)から購入した：その一つはテロメア・オーバーハング・リピートに相同であり(Ｔ-オリゴ：ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)他はこの配列に相補的であり(ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；配列番号：９)、対照として使用される。
【０２２４】
これらのオリゴヌクレオチドは一部ずつ-２０℃で保存され、細胞処理直前に培養培地で希釈された。
【０２２５】
癌細胞系
研究にはヒト卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ５(タヤバ・ハサン博士(ハーバード医科学校)から入手)および乳癌細胞系ＭＣＦ-７(ＡＴＣＣヒューマン・セル・レポジトリーから入手)を使用した。これらの細胞を１０％コウシ血清(ＣＳ)を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地に保持し、５％ＣＯ2を含む加湿空気中で３７℃で培養し、実験用プレートに移し、２４時間培養した。２４時間後に細胞を処理した。
【０２２６】
細胞の培養
ＲＰＭＩ  １６４０培地およびトリプシン-ＥＤＴＡ(１０×；０．５％トリプシン、５．３ｍＭ  ＥＤＴＡ)はライフ・テクノロジー、ロックヴィル、ＭＤ、から入手し、コウシ血清(ＣＳ)はウィタカー・バイオプロダクツ(Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ)(ウォ-カースビル、ＭＤ)から入手した。
【０２２７】
癌細胞は単層として１０％コウシ血清(ＣＳ)を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地に保持した。全ての細胞は３７℃で、５％ＣＯ2および１００％湿度下で培養された。
【０２２８】
最初に培地を真空フラスコと連結したガラスピペットで除去した。リン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)を１０分間加え、その後除去した。皿をＥＤＴＡで２回洗い、その後０．５％トリプシン１ｍｌを加え、細胞が脱着するまでインキュベートすることによってトリプシン化した。１０％ＣＳ  １ｍｌを加えてトリプシンの作用を停止し、栄養源とした。溶液を除去し、その一方で懸濁細胞を試験管に一気に入れた。この懸濁液を３５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、上清液を除去した。細胞ペレットを新鮮培地２ｍｌに再懸濁した。細胞を数え、細胞を３０の培養プレートに分配した。１０％ＣＳを含む培地を新しいプレートに加え、それをそのまま２４時間インキュベートした。
【０２２９】
細胞の処理
平板培養２４時間後に細胞を４０μＭ  Ｔ-オリゴ、対照の相補体オリゴ、または等量の希釈剤で処理し、１０％ＣＳを含む培地２ｍｌに加えた。細胞をその後３、４および５日間インキュベートし続けた。
【０２３０】
実験計画
表３および表４に示すように、２組の実験を行った。一つは細胞増殖を追跡するためのもので、他の一つは染色して老化のマーカーであるβ-ガラクトシダーゼ活性を調べるものである。
【０２３１】
細胞増殖の測定
ＯＶＣＡＲ５およびＭＣＦ-７細胞の増殖阻止をクールター細胞カウンタを使用して確認した。処理後３、４および５日目に細胞を集め、ペレット化し、１ｍｌ培地に再懸濁した。この細胞懸濁液５０μｌを等張液１０ｍｌに加え、この溶液中の細胞を細胞カウンタを使用して数えた。これは各サンプルで２回ずつ行われ、これらの数値から平均値および標準偏差を計算した。
【０２３２】
老化関連性β-ガラクトシダーゼの組織化学的染色
また別の組の細胞を染色し、老化関連性β-ガラクトシダーゼ(Ｓ．Ａ．β-ｇａｌ)活性を検出した。老化細胞は、Ｘｇａｌ基質(５-ブロモ-４-クロロー３-インドイルβ-Ｄ-ガラクトピラノシド)を切断して青色の生成物にするβ-ガラクトシダーゼを発現する。
【０２３３】
細胞をＰＢＳ溶液で２度洗い、４３ｍｌＰＢＳ中２．７ｍｌ  ２％ホルムアルデヒドおよび４ｍｌ  ０．２％グルタールアルデヒドから調製される溶液で５分間固定した。染色液は、１ｍｌのジメチルホルムアルデヒド中１ｍｇ／ｍｌＸ-ｇａｌ、４ｍｌの０．２Ｍクエン酸／リン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０)、１ｍｌの１００ｍＭヘキサシアノ鉄(ＩＩＩ)酸カリウム溶液、１ｍｌの１００ｍＭヘキサイシアノ鉄(ＩＶ)酸カリウム溶液、６００μｌの５Ｍ塩化ナトリウム、４０μｌの１Ｍ塩化マグネシウムおよび１３．４ｍｌの蒸留水を用いて毎日新たに調製された。
【０２３４】
各プレートに２ｍｌの染色液を加えた。プレートをその後パラフィンで密封して染色剤の蒸発を防ぎ、３日間まで３７℃でインキュベートした。新鮮な染色溶液を毎日加えた。分析のために細胞をＰＢＳで２度洗い、染色陽性の細胞を測定した。
【０２３５】
細胞カウントデータ
ＯＶＣＡＲ５細胞カウントから得たデータの分析によると、希釈剤処理した対照プレートに比較してＴ-オリゴ処理細胞には卵巣癌細胞数の減少が見られ、Ｔ-オリゴが老化を暗示する複製停止を誘起することが示された(表５および図４６)。
【０２３６】
対照相補体オリゴヌクレオチドで処理した培養細胞における細胞数には軽度の減少があった。この増殖阻止の理由は明らかでないが、培養培地中におけるＤＮＡの存在にある種の細胞型が敏感であることに起因するらしい。
【０２３７】
ＭＣＦ-７細胞から得られるデータの分析から、希釈剤で処理した対照プレートに比較して、Ｔ-オリゴで処理した乳癌細胞数も減少することがわかる。ここでも対照相補体オリゴヌクレオチドで軽度の細胞増殖阻止が見られた(表６および図４７)。
【０２３８】
Ｓ．Ａ．β-ガラクトシダーゼの染色結果
老化マーカーであるβ-ガラクトシダーゼを発現する細胞は非常に大きく、多核性であるのが普通である。これらは両方とも老化を示唆する形態学的特徴である。正常ヒト線維芽細胞はＴ-オリゴ処理後、Ｓ．Ａ．β-ｇａｌ染色が陽性である。
【０２３９】
ＯＶＣＡＲ５細胞において、希釈剤で処理した細胞およびその相補体オリゴは生成するβ-ガラクトシダーゼによる青色を示さず、それらは老化の表現型を何も示さなかった。Ｔ-オリゴ処理細胞では１個の細胞だけが青色に染まった。しかし、１０×倍率で見た際には、これらの細胞は対照処理された細胞に比べて大きく、これら細胞の多くが多核性でもあった。
【０２４０】
ＭＣＦ-７細胞において、対照(希釈剤処理)プレートで青色に染まった細胞のパ-センテ-ジは５．９７５％であり、Ｔ-オリゴで処理したプレートのそれは６６．７５％で、相補的オリゴで処理したプレートではそのパ-センテ-ジは６．６７５％であった。Ｔ-オリゴ処理プレートの細胞は多核性で比較的大きく、その他の２種類のプレートの細胞は老化を示唆するこの形態を発現しないことも判明した。
【０２４１】
要するに、Ｔ-オリゴは試験した卵巣癌細胞および乳癌細胞の両方において細胞増殖を阻止し、より大きい、平らな、多核性形態を誘発する。さらに、Ｔ-オリゴはＭＣＦ-７乳癌細胞においてＳ．Ａ．β-ｇａｌの発現を誘導する。
【０２４２】
実施例４４：メラノーマ細胞に与えるＴ-オリゴの効果
オリゴヌクレオチド類
５'リン酸基およびホスホジエステル結合を有する次に挙げる３種類のオリゴヌクレオチドを試験するための実験を計画した：３'テロメア・オーバーハング・リピート配列に相同であるもの(Ｔ-オリゴ：ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)、この配列に相補的であるもの(ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ；配列番号：９)およびテロメア配列に関係のないもの(ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ；配列番号：；１０)(ミドランド・サ-ティファイド・リアジェント社、ミドランド、テキサス)。
【０２４３】
細胞培養物および細胞周期分析
ＭＭ-ＡＮ、ＭＵ、ＰＭ-ＷＫ、ＭＭ-ＲＵ、ＭＭ-ＭＣおよびＲＰＭ-ＥＰメラノーマ細胞を１０％ＦＢＳを含むイ-グル最小必須培地(ＭＥＭ)(両方ともギプコ／ＢＲＬ、(ガイザ-スバ-グ、ＭＤ)から)に増殖させた。正常新生児ヒトメラノサイトが確立され、既述のように対照として培養された(ギルヒレストら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８３巻：ｐ．３７０-３７６、１９８４)。二重のメラノーマ細胞培養物を５％ＦＢＳを含むＭＥＭに増殖させ、最終濃度４０μＭの、テロメア３'オーバーハング配列に相同の１１マーオリゴヌクレオチド、上記に相補的な１１マーオリゴヌクレオチド、または上記に関係のない１１マーオリゴヌクレオチドで、または対照として等容量の希釈剤(水)で９６時間処理した。細胞を集め、ヨウ化プロピジウムで染色し、ベクトン・ジキンソンＦＡＣＳスキャンおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアによって分析した。
【０２４４】
ＴＵＮＥＬ分析
ＤＮＡ末端標識によってアポトーシスを検出するために、細胞を増殖させ、上記のようにオリゴヌクレオチドで処理した。処理の７２時間後に、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、０．１％トリトンＸ-１００で２時間、透過性にした。ベーリンガー・マンハイムから得たフルオレッセイン標識ｄＵＴＰを用いる細胞死検出キットを使用してＴＵＮＥＬアッセイを行った。ＴＵＮＥＬ陽性細胞をＦＡＣＳによって検出した。
【０２４５】
ウエスタンブロット分析および抗体類
メラノーマ細胞を５％ＦＢＳを含むＭＥＭ中で培養し、４０μＭ  Ｔ-オリゴ、相補的オリゴヌクレオチド、関係のないオリゴヌクレオチド、または等容量の希釈剤(水)で種々の時間処理した。タンパク質を変性ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)およびウエスタンブロット分析によって既述のように分析した(エラーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３巻：ｐ．１０８７-１０９２、１９９６)。その際アンチ・チロシナーゼ・モノクローナル抗体(クローンＴ３１１、ノヴァ-カストラ、ニュ-カッスル・アポン・タイン、ＵＫ)；アンチ・ＴＲＰ-１モノクローナル抗体(クローンＴａ９９、シグネット、デドハム、ＭＡ)；アンチ-ｇｐ１００モノクローナル抗体(ＭＯ６３４、ダコ社、カーピンテリア、ＣＡ)およびアンチ・ＭＡＲＴ-１／Ｍｅｌａｎ-Ａモノクローナル抗体(クローンＭ２-７Ｃ１０、シグネット、デドハム、ＭＡ)；アンチ-リヴィン／ＭＬ-ＩＡＰヤギモノクローナル抗体(ＡＢ７９８ノヴス・バイオロジカルス社、リットルトン、ＣＯ)を使用した。
【０２４６】
動物類
重篤複合免疫不全(ＳＣＩＤ)マウスをフォックス-チェ-ス癌センター(フィラデルフィア、ＰＡ)から購入し、ボストン大学医科学センターの無病原菌動物施設で飼育した。
【０２４７】
メラノーマ転移に対するＴ-オリゴの影響
ＦＡＣＳ分析およびＴＵＮＥＬ染色によって分析した際、４０μＭのＴ-オリゴ(ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)は、６種類のヒトメラノーマ細胞系(ＭＭ-ＡＮ、ＭＵ、ＰＭ-ＷＫ、ＭＭ-ＲＵ、ＭＭ-ＭＣおよびＲＰＭ-ＥＰ)からの細胞に、７２-９６時間内に３０％-７０％のアポトーシスを誘発した。その一方で、相補的または関係のない配列を有する１１塩基オリゴヌクレオチドは効果を及ぼさなかった。
【０２４８】
ＭＭ-ＡＮ細胞の転移能力に対するＴ-オリゴの効果を研究するために、これらの細胞を５％ＦＢＳを有するＭＥＭ中で４０μＭＴ-オリゴ、相補的オリゴヌクレオチドまたは希釈剤で４８時間処理した。その後細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで採取し、生育性パーセントをトリパンブルー排除染色によって測定した。９０％以上の生育能力を有する細胞集団だけをこの研究に使用した。平衡塩溶液中の１×１０6細胞を生後５週のＳＣＩＤマウスの側方尾静脈に注射した。３群が５匹ずつのマウスからなっていた。第１群にはＴ-オリゴ処理細胞を注射し、第２群には相補的対照オリゴ処理細胞を注射し、第３群には希釈剤処理細胞を注射した。４０日後、マウスをＣＯ2吸入によって安楽死させ、剖検を行い、臓器の目に見える病巣を肉眼で調べた。カリパーによる病巣の測定も行った。特に重視したのは肺、膵臓、脳、褐色脂肪、腎臓および骨であった。なぜならばこれらの臓器はＭＭ-ＡＮの転移の主要部位であることがわかっているからである(バイエルス(Ｂｙｅｒｓ,Ｈ．Ｒ．)ら、Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ  ３巻：ｐ．２４７-２５３、１９９３)。検査と切片作成のために臓器をＰＢＳ中ですすぎ、１０％ホルマリン中で４８時間固定した。臓器を切開用顕微鏡下で検査し、腫瘍結節の数を数えた。組織学的検査のために、腫瘍をホルマリン中で固定し、パラフィンに埋封した。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。メラニン色素の存在によって転移の起源がメラノサイトであることが確認された。
【０２４９】
腫瘍形成性に対するＴ-オリゴの効果を研究するためにＳＣＩＤマウスの治療。
【０２５０】
ＭＭ-ＡＮメラノーマ細胞を、５％ＦＢＳを含むＭＥＭ中で培養し、トリプシン／ＥＤＴＡで採取した。これらのメラノーマ細胞の腫瘍形成性を、平衡塩溶液中２×１０6生育細胞をＳＣＩＤマウスの脇腹領域に皮内注射することによって調べた。６匹／群の３群を研究した。メラノーマ細胞注入後７２時間にオリゴヌクレオチドの１日２回の腫瘍内注射が開始された。第１群にはＴ-オリゴ(ＰＢＳ１５０μｌ中２１０μｇ＝６０ｎｍｏｌｅｓ)が与えられ、第２群には相補的対照オリゴが与えられ；第３群には希釈剤のみが注射された。腫瘍をカリパ-で測定し、１０％ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ｇｐ-１００およびＴＲＰ-１モノクローナル抗体を使用して腫瘍の免疫組織化学的染色が行われた。技術的理由からチロシナーゼおよびＭＡＲＴ-１の発現をこれら腫瘍において評価することはできなかった。アポトーシスの分析は、インターゲン(Ｉｎｔｅｒｇｅｎ)(パーチャス、ＮＹ)からのＡｐｏｐＴａｇキットを使用して、腫瘍断面のＴＵＮＥＬ分析によって行われた。
【０２５１】
Ｔ-オリゴはメラノーマ細胞にアポトーシスを誘発する。
【０２５２】
ＭＭ-ＡＮメラノーマ細胞を希釈剤、４０μＭ  Ｔ-オリゴ、４０μＭ相補的オリゴヌクレオチドまたは４０μＭ  関係のないオリゴヌクレオチドで処理した。細胞を９６時間後に集め、ヨウ化プロピジウムで染色し、ＦＡＣＳ分析した。データは、アポプトティック集団をよりよく可視化できるロガリズム・スケ-ルであらわす(図４８)。Ｔ-オリゴ処理後、ｓｕｂＧ0／Ｇ1細胞集団によって示されるように、細胞の６５％がアポプトティックであった。ＭＭ-ＡＮ細胞を上記のように処理し、ＴＵＮＥＬ分析にかけた。蛍光は、アポトーシスのマーカーである断片化ＤＮＡの標識化が選択的にＴ-オリゴ処理細胞にあらわれることを示している(図４９)。正常ヒトメラノサイトを上記のように希釈剤またはオリゴヌクレオチドで処理し、処理後２４および９６時間目に集め、ＦＡＣＳ分析を行った。データは直線スケ-ルであらわされ、Ｓ相停止を示す(図５０)。比較のために、同様に処理され、図４８にロガリズム・スケ-ルであらわされるＭＭ-ＡＮ細胞もここでは白色で同じＦＡＣＳ曲線上に示される。
【０２５３】
Ｔ-オリゴ処理後２４および４８時間目に、ＭＭ-ＡＮ細胞は他の細胞型で以前に報告されたようにＳ相においてブロックされる(エラーら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２７６巻：ｐ．１８５-１９３、２００２；エラーら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １７巻：ｐ．１５２-１６２、２００３)。７２時間目に、Ｓ相停止は続いていたが、ＭＭ-ＡＮ細胞の２２％が、アポトーシスを示すＦＡＣＳ曲線のｓｕｂＧ0／Ｇ1領域にあらわれ、９６時間目までにアポトーシス細胞のパーセントは６５％に増加した(図４８)。７２時間内に、ＴＵＮＥＬ分析はＴ-オリゴ処理細胞の蛍光強度の明白な増加を示し、アポトーシスの広がりが確認された(図４９)。対照オリゴヌクレオチドも希釈剤のみでも細胞に影響を与えなかった。ＭＭ-ＡＮ細胞は検出可能レベルのｐ５３を発現しないが、既報のように(エラーら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ２７６巻：ｐ．１８５-１９３、２００２)Ｔ-オリゴ誘発性アポトーシスの起こる前にＥ２Ｆ１およびｐ７３転写因子が増加し、Ｔ-オリゴ誘発性アポトーシスはｐ７３の優性阻害型を異所性に発現するＭＭ-ＡＮ細胞では５０％までに阻止された。これはアポトーシスが少なくも一部分はＥ２Ｆ１とｐ５３相同体であるｐ７３との相互作用によって媒介されることを示唆する。対照的に、Ｔ-オリゴは正常ヒトメラノサイトでは９６時間以内にアポトーシスを誘発しなかった。ただしこれらの細胞において２塩基チミジンジヌクレオチドで以前報告されたように(ペド-(Ｐｅｄｅｕｘ,Ｒ．)ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１巻：ｐ．４７２-４７７、１９９８)、そしてその他の主要な細胞型および確立された細胞系において１１-塩基Ｔ-オリゴで報告されたように(エラーら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ２７６巻：ｐ．１８５-１９３、２００２；エラーら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １７巻：ｐ．１５２-１６２、２００３)、Ｔ-オリゴは２４時間で非常にはっきりとＳ相停止を誘起した(図５０)。ＭＭ-ＡＮ細胞反応が特異であったかどうかを確認するために、その他の５種類のメラノーマ細胞系を試験した。これらのなかで、４種類がＴ-オリゴ処理後９６時間目にアポトーシスを受け、アポトーシス率はＦＡＣＳ分析によって測定して３０％ないし６０％の範囲であった。
【０２５４】
タンパク質リビン(ＭＬ-ＩＡＰまたはアポトーシスタンパク質インヒビタとも呼ばれる)はメラノーマ細胞では一般的にアップレギュレートするタンパク質ファミリの一メンバ-であり、少なくもある種の細胞系では化学療法誘起性の細胞死に対する抵抗に大きく寄与する(カソフ(Ｋａｓｏｆ,Ｇ．Ｍ．)ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６巻：ｐ．３２３８-３２４６、２００１；ヴシク(Ｖｃｉｃ,Ｄ．)ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ  １０巻：ｐ．１３５９-１３６６、２０００；リ(Ｌｉ,Ｊ．)ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２巻：３７０-３８０、２００１；ササキ(Ｓａｓａｋｉ,Ｈ．)ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０巻：ｐ．５６５９-５６６６、２０００)。
【０２５５】
Ｔ-オリゴはリビン／ＭＬ-ＩＡＰの発現を低減する。
【０２５６】
ＭＭ-ＡＮ細胞を４０μＭ  Ｔ-オリゴ、相補的オリゴヌクレオチド、関係のないオリゴヌクレオチド、または等容量の希釈剤単独で２４、４８または７２時間処理した。細胞を採取し、リビン／ＭＬ-ＩＡＰの抗体を使用してウエスタンブロット分析を行った。ＭＭ-ＡＮ細胞は高い構成レベルのリビン／ＭＬ-ＩＡＰを発現し、Ｔ-オリゴ処理は７２時間以内にその発現を選択的かつ劇的に低減した。そこで、この細胞型ではＴ-オリゴに対するアポプトティック反応は既報のように(エラーら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２７６巻：ｐ．１８５-１９３、２００２)プローアポプトティックタンパク質Ｅ２Ｆ１およびｐ７３の誘発によって調節されるだけでなく、リビン／ＭＬ-ＩＡＰのダウン-レギュレーションによっても調節されるようにみえる。
【０２５７】
メラノーマの進行はメラノサイト特異的抗原の喪失に関連することが多く、前記喪失が腫瘍細胞を免疫学的監視から逃れさせ、免疫治療の試みを失敗に終わらせると推測される。(スリングラフ(Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ,Ｃ．Ｌ．,Ｊｒ)ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８巻：ｐ．６６１-６７２、２０００)。メラノサイトの分化は、Ｔ-オリゴ処理後に認められるように緩徐な細胞増殖と関連があり(エラーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３巻：ｐ．１０８７-１０９２、１９９６；ハドシ-(Ｈａｄｓｈｉｅｗ,Ｉ．Ｍ．)ら、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １１１巻：ｐ．４７２-４７７、１９９８)、テロメア・オーバーハング・リピート配列と少なくも５０％のヌクレオチド配列の一致を有するオリゴヌクレオチド類はヒトメラノサイトおよびＳ９１ネズミメラノーマ細胞の分化(メラニン形成)を高めるので(エラーら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２巻：ｐ．４１３-４１４、１９９４；エラーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３巻：ｐ．１０８７-１０９２、１９９６；ペド-(Ｐｅｄｅｕｘ,Ｒ)ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１巻：ｐ．４７２-４７７、１９９８)、我々は免疫療法の標的であるメラノサイト分化抗原の発現を研究した。
【０２５８】
Ｔ-オリゴはメラノサイト分化のマーカーを誘発する。
【０２５９】
細胞を上記のように処理し、ＴＲＰ-１、ｇｐ-１００、トリプシナーゼ、およびメラン-Ａ／ＭＡＲＴ-１のタンパク質発現について分析した。
【０２６０】
Ｔ-オリゴは、メラノサイト-関連分化マーカー、チロシナーゼ関連タンパク質１(ＴＲＰ-１またはｇｐ-１００)および糖タンパク質１００(ｇｐ１００)を誘発した。これら２抗原の発現は、より攻撃的な、分化度の低いメラノーマでは失われることがよくある(スリングラフら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４８巻：ｐ．６６１-６７２、２０００)。Ｔ-オリゴはメラニン生成における律速酵素であるチロシナーゼを誘発し［この酵素は正常ヒトメラノサイトにおいて(エラーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３巻：ｐ．１０８７-１０９２、１９９６)、およびヒトおよびネズミのメラノーマ細胞において(エラーら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：ｐ．４１３-４１４、１９９４；エラーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３巻：ｐ．１０８７-１０９２、１９９６；ペド-ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１：ｐ．４７２-４７７、１９９８)テロマー・オーバーハング・リピートと少なくも５０％のヌクレオチドが同一である配列を有するその他のオリゴヌクレオチドによって誘発されることがわかっている］、およびＭＡＲＴ-１(メラノサイトおよびメラノーマに発現するタンパク質であって、メラノーマ免疫療法におけるリンパ球の一サブクラスのための認識された標的である)(リボルチニ(Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ,Ｌ)ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４巻：ｐ．２２５７-２２６５、１９９５)も誘発する。
【０２６１】
上記のデータは、テロメア・オーバーハング・リピートと少なくとも５０％のヌクレオチド配列が一致するオリゴヌクレオチドはインビボ  ＭＭ-ＡＮ腫瘍形成および転移を低減することを示唆した。この可能性を探査するために、ＭＭ-ＡＮ細胞を４０μＭ  Ｔ-オリゴ、相補的オリゴヌクレオチドまたは希釈剤のみで４８時間処理し、その後集め、洗い、無オリゴヌクレオチド培地に入れた。オリゴヌクレオチド類また希釈剤のみで４８時間処理した細胞(１回の注射に生育可能細胞１０6を使用)をＳＣＩＤマウス(５匹マウス／群)の尾静脈に注入した。生育可能性はトリパンブルー排除によって確認した。注射の４０日後にマウスを安楽死させ、剖検を行い、脳、肝臓、膵臓および骨の肉眼的転移の平均数および大きさを目で調べて確認した。対照細胞を注射した動物とは異なり、Ｔ-オリゴ処理細胞を注射した動物では実質的に腫瘍はなく、５匹中４匹のマウスに検出できる転移はなかった。注射前のＭＭ-ＡＮ細胞のＴ-オリゴ処理は転移の平均容量も、対照群に比較して８０-８５％減らし(図５１)、転移腫瘍の平均数は９０-９５％低減した(図５２)。悪性腫瘍細胞の前処理は、すでに確立されたインビボ転移の治療とは等しくないとはいえ、これらのデータは、比較的短期間のＴ-オリゴ曝露が、組織環境によっては逆転できないこれら細胞に長期間持続する効果を与え得ること示している。生理的ホスホジエステル結合を有するこの大きさのオリゴヌクレオチドは約４-６時間の培養半減期を有するので(ライト(Ｗｒｉｇｈｔ,Ｗ．Ｅ．)ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１５巻：ｐ．１７３４-１７４１、１９９６)、これらの実験におけるＭＭ-ＴＮ細胞のＴ-オリゴへの効果的曝露時間は多分４８時間より遥かに短い。
【０２６２】
Ｔ-オリゴが既存の腫瘍の増殖に影響を与え得るかどうかを調べるために、２×１０6ＭＭ-ＴＮ細胞をＳＣＩＤマウス(６マウス／群)の脇腹に皮下注射した。７２時間後(そのとき小さい腫瘍結節が初めてあらわれる)から始めて、その部位に６０ｎｍｏｌのＴ-オリゴ(０．４ｍＭ溶液１５０μｌ)、対照としての相補的オリゴヌクレオチド、または等容量の希釈剤のみを１日２回注射した。２２日後、動物を安楽死させ、腫瘍の大きさを測定した。希釈剤と対照オリゴ処理マウスには腫瘍の大きさに差はなかったが、Ｔ-オリゴ処理は、カリパ-による腫瘍測定によって、腫瘍量をそれぞれ８４％および８８％減らした。対照マウスには大きい腫瘍が発生したが、Ｔ-オリゴ処理マウスには非常に小さい(３匹マウス)または検出不可能(３匹マウス)の腫瘍が発生した。最後の注射後２４時間目に得られた組織横断面で測定した際にも、Ｔ-オリゴが腫瘍細胞アポトーシスを起こしたことが、最後の注射後２２、２４時間目にＴＵＮＥＬ分析によって判明した。Ｔ-オリゴ処理は小さい残留腫瘍結節における分化関連タンパク質ｇｐ１００およびＴＲＰ-１の発現も大きく上昇させた。免疫染色切片で見られるように、注入された腫瘍結節周囲の組織は全ての動物で正常であるようにみえた。
【０２６３】
Ｔ-オリゴの影響は、最初にインビトロでＭＭ-ＡＮ細胞を４８時間暴露後、インビボで少なくも４０日間持続した；そしてこのＴ-オリゴの影響は、Ｔ-オリゴ曝露前にインビボで確立されたＭＭ-ＡＮ細胞腫瘍と、その後１日２回局所的注射を受けた後のＭＭ-ＡＮ細胞腫瘍において同等程度に認められた。
【０２６４】
実施例４５：メラノーマ細胞のアポトーシスの誘発に与えるオリゴヌクレオチド配列の影響
【０２６５】
【表７】
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【０２６６】
テロメア・オーバーハング・リピートと少なくも５０％のヌクレオチド配列が一致する配列を有するオリゴヌクレオチド(全ては５'ホスフェートを有する)を有する配列を合成した。ヒトメラノーマ系ＭＭ-ＡＮの培養細胞を濃度４０μＭのこれらのオリゴヌクレオチドで７２時間および９６時間処理し、アポトーシス細胞のパーセントをＦＡＣＳ分析によって測定した。全てのオリゴヌクレオチドはアポトーシスを誘発した(表７)。
【０２６７】
実施例４６：Ｔ-オリゴの加水分解は活性のために必要である
配列番号：５のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド１はホスホロチオエート主鎖で完全に合成した。オリゴヌクレオチド２は各端に２つのホスホロチオエート結合を有し、真ん中にあるその他の結合はホスホジエステル結合であった。オリゴヌクレオチド３は５'末端に２つのホスホロチオエート結合を有し(５'末端はブロックされる)、残りの結合はホスホジエステル結合である。オリゴヌクレオチド４は３'末端に２つのホスホロチオエート結合をもち(３'末端はブロックされる)、残りの結合はホスホジエステル結合である(図５３参照)。
【０２６８】
これらのオリゴヌクレオチドを正常新生児線維芽細胞の培養器に加えた。４８時間後、細胞を集めてウエスタンブロット法によってｐ５３セリン１５リン酸化およびｐ９５／Ｎｂｓ１リン酸化を分析した。その他の培養物を１週間オリゴヌクレオチドの存在下に置き、その後それら細胞を老化関連βガラクトシダーゼ活性(Ｓ．Ａ．β-Ｇａｌ)について染色した。β-ガラクトシダーゼ陽性細胞を数え、総細胞のパーセントとしてあらわした(図５４)。
【０２６９】
ヌクレアーゼが接近しやすい、３'末端を有するオリゴヌクレオチドはｐ５３およびｐ９５／Ｎｂｓ１リン酸化のような「早期」反応を最も効果的に刺激する。しかしヌクレアーゼに接近しやすい、５'末端を有するオリゴヌクレオチドも１週間後には老化表現型を誘導するが、４８時間後にリン酸化反応を誘導しない。これは３'→５'のヌクレアーゼ感受性が老化誘発活性のためにより好ましいことを示唆する。
【０２７０】
実施例４７：Ｔ-オリゴは分化を誘発する
ＢＴ-２０細胞--ヒト乳癌エストロゲン受容体陰性細胞--をアメリカ培養コレクション(ＡＴＣＣ、受付番号ＨＴＢ-１９)から購入し、２ｍＭ  Ｌ-グルタミンおよび、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、９０％；ウシ胎児血清１０％を含むように調節されたア-ル(Ｅａｒｌｅ'ｓ)ＢＳＳを補充した最小必須培地(イ-グル)に保持した。平板培養後２４時間目に皿に４０μＭ  Ｔ-オリゴｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)、４０μＭｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(配列番号：９)対照オリゴヌクレオチド、または希釈剤のみを補充した。総細胞タンパク質を７日後に採取し、ウエスタンブロット分析のために処理した。ブロットを抗エストロゲン受容体α抗体と反応させた。４０μＭのｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)は、希釈剤処理またはｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(配列番号：９)処理細胞における受容体レベルに比較して、エストロゲン受容体αのレベルを実質的に誘発した。この実験は、テロメア・オーバーハング・リピート配列と少なくも５０％ヌクレオチド配列が一致するオリゴヌクレオチドによる処理が乳癌細胞の分化を誘発し、それらを抗エストロゲン処理感受性にすることを示す。
【０２７１】
実施例４８：Ｔ-オリゴはヒト線維肉腫細胞における老化関連性β-ガラクトシダーゼ(ＳＡ-β-Ｇａｌ)活性を誘発する
ヒト線維肉腫細胞を希釈剤のみ、４０μＭＴ-オリゴ(ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)、または相補的オリゴヌクレオチドｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(配列番号：９)で４日間処理し、その後Ｘ-ｇａｌで染色し、ディムリらの記載の方法(Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２巻：ｐ．９３６３-９３６７、１９９５)によってＳＡ-β-Ｇａｌを分析した。
【０２７２】
また別の実験において、平行培養物を希釈剤のみ、４０μＭ  Ｔ-オリゴ(ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ；配列番号：５)、または相補的オリゴヌクレオチドｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(配列番号：９)で４日間処理した。細胞をＰＢＳで１回洗い、再び完全培地で２４時間または４８時間増殖させ、Ｘ-ｇａｌで染色してＳＡ-β-Ｇａｌ活性を分析した。Ｔ-オリゴ処理-線維肉腫細胞はクローン原性能力を失う
ヒト線維肉腫細胞を希釈剤、４０μＭ  Ｔ-オリゴまたは相補的オリゴヌクレオチドで１週間処理し、その後トリプシン化し、数える。３００個の細胞を６０ｍｍ培養皿に三重に播種し、その後完全培地４ｍｌ中で２週間インキュベートした；培地を１週間に２回取り換えた。その後、培地を除去し、細胞を４ｍｌメタノール中で５分間固定した。メタノールを除去し、培養皿を水で短時間すすぎ、細胞コロニ-をＰＢＳ中４％(ｗ／ｖ)メチレンブルー溶液４ｍｌで１０分間染色し、水で１回洗い、数えた。培養細胞のパ-センテ-ジとしてのコロニ-収率は、希釈剤処理細胞では約１００％、Ｔ-オリゴ処理細胞では約６％、そして相補的オリゴヌクレオチド処理細胞では約９１％であった。
【０２７３】
Ｔ-オリゴはｐ５３およびｐＲｂの両経路を活性化する
ヒト線維肉腫細胞を希釈剤、４０μＭ  Ｔ-オリゴまたは相補的オリゴヌクレオチドで４日間処理し、その後集めて、条件ごとに総タンパク質３０μｇを使用してウエスタンブロット法によるタンパク質分析を行い、総ｐ５３、ホスフォーｐ５３(セリン１５)およびホスフォーｐＲｂ(セリン７８０)について試験した。ｐ５３検出のために、ブロットをまず、ホスフォーｐ５３(セリン１５)について検査し、その後剥離し、パントロピックｐ５３抗体ＤＯ-１で再検査した。
【０２７４】
３種類全てのタンパク質標本からのタンパク質はｐ５３抗体ＤＯ-１によって結合した。希釈剤処理細胞からのタンパク質および相補的オリゴヌクレオチド処理細胞からのタンパク質はセリン７８０でリン酸化したｐＲｂに対する抗体によって結合した。Ｔ-オリゴ処理細胞からのタンパク質だけがセリン１５でリン酸化したｐ５３に対する抗体によって結合した。
【０２７５】
実施例４９：ｐＴＴによる前処理は腫瘍形成を遅らせ、ＸＰＣ+/-マウスのＵＶＢ誘発性腫瘍の数を低減する
ＳＫＨ１無毛野生型(ＷＴ)およびＸＰＣ+/-ノックアウト(ＫＯ)マウス(８匹動物／処理群)をチミジンジヌクレオチド(ｐＴＴ、１００μＭ)または希釈剤(プロピレングリコール７５％／ＤＭＳＯ２５％)単独で１日１回５日間局所的に前処理し、その後３週間は５日間に１日１回ＵＶＤ照射を行った(ＷＴマウスは２５ｍＪ／ｃｍ2で、ＫＯマウスは５ｍＪ／ｃｍ2太陽光擬似ＵＶ(２８５±５ｎｍ)で照射した)。
【０２７６】
マウスは１週間毎日局所的ｐＴＴ(または希釈剤単独)とその後の３週間の毎日のＵＶ照射の連続５サイクル(１５０日)を受けた。１週間の前処理およびその後の３週間のＵＶＢを１サイクルとして設計した。最初のＵＶＢ線量２５ｍＪ／ｃｍ2をその後のサイクルには１．５倍に増やした。最初のＵＶＢ照射の１６０日後にマウスを安楽死させた。腫瘍の広がりおよび多数性を最初のＵＶＢ照射後５週目に開始し、週１回のベ-スで評価した。
【０２７７】
６週目までに、２５％の希釈剤処理マウスにＵＶＢ照射領域に腫瘍が発生したが、ｐＴＴ処理マウスの全てにおいてＵＶＢ後１２週まで腫瘍はなかった。１２週までに希釈剤処理マウスの７５％にすでに腫瘍があった。最初のＵＶＢ照射後１６０日(そのとき全てのマウスを安楽死させた)には、希釈剤処理マウスの全てに１個以上の腫瘍が発生しており、その一方でｐＴＴ-処理マウスの３３％は腫瘍が発生しないままであった。図５５を参照されたい。
【０２７８】
希釈剤処理に比較して、ｐＴＴ処理は、最初のＵＶＢ照射後１６０日目のＷＴおよびＸＰＣ+/-マウスの腫瘍平均数を半分に減らし、７．２５±０．８７対３±０．９４(それぞれ希釈剤対ｐＴＴ、ｐ＜０．００６)とした。実験動物数は少なかったとはいえ、ｐＴＴ処理マウス対希釈剤処理マウスでは、第１２週-第１６週の間に１匹あたりの平均腫瘍数にも統計的有意差が検出された(ｐ＜０．０５)。図５６を参照されたい。
【０２７９】
照射マウス皮膚表面上の少なくも１ｍｍ2の大きさの全ての腫瘍を安楽死の際に切除し、ホルマリン固定し、埋封し、垂直切片を作り、ヘマトキシリンとエオシンとで染色した。皮膚病理学者が、どの処理群(ｐＴＴまたはビヒクル対照)で腫瘍が発生しているかを知ることなく盲検的に各腫瘍切片を光顕微鏡(４０ｘ)検査した。正常、前癌状態および悪性腫瘍病巣を判断するためには、核の異形程度、細胞の分化不能、細胞の基底膜通過および真皮への侵入などの一般的病理学的基準を使用をした。予想通り前癌状態の紫外線角化症が侵襲性扁平上皮細胞癌より多かったが、これら２種類の病巣はｐＴＴ処理動物に比較して希釈剤処理動物に２倍多く認められた。図５７参照。
【０２８０】
実施例５０：ＵＶ誘発性腫瘍はｐｔｔの腫瘍内注射後、後退する。
【０２８１】
無毛ＸＰＣホモ接合体ノックアウト(ＫＯ)マウスを１週５日、１２週間ＵＶＢ照射した。最初のＵＶ誘発性腫瘍が７週後にあらわれ始め、１回目のＵＶＢ照射後１６０日までに表面にあらわれている腫瘍部分が大部分の腫瘍で２-４ｍｍ2より大きかった。４匹の動物を２匹ずつの２群に分けた。動物ごとに同じ大きさで同じ外観を有する腫瘍３個を選び、希釈剤およびｐＴＴを腫瘍内に注射した。
【０２８２】
腫瘍にｐＴＴ(４０μＭ)または希釈剤１５-２０μｌまたは希釈剤を１週３回、２週間注射した。最初の腫瘍内注射後１１および１９日目に腫瘍を測定した。
【０２８３】
処理条件ごとに全部で６個の腫瘍について、希釈剤またはｐＴＴの腫瘍内注射後の増殖パターンの変化を評価した。１１日目にはすでにｐＴＴ注射はＵＶ誘発性腫瘍サイズの統計的有意な減少に導いた。１９日目までに、腫瘍の幾つかは完全に消失した(ｐ＜０．００３)。希釈剤処理腫瘍では悪性増殖の阻害は検出されなかった。１９日目までに、この治療群における腫瘍サイズの約２５％の増加があった。図５８参照。
【０２８４】
実施例５１：ｐＴＴ処理は、単回および慢性ＵＶ照射後の野生型およびＸＰＣノックアウトマウスの皮膚におけるＵＶ誘発性突然変異を低減する
無毛野生型(ＷＴ)およびホモ接合体ＸＰＣノックアウト(ＫＯ)マウス(ＬａｃＺ／ｐＵＲ２８８突然変異インジケ-タ遺伝子に関してトランスジェニックでもある)(２-５匹動物／処理群)をチミジンジヌクレオチド(ｐＴＴ、１００μＭ)または希釈剤単独で、１日１回、１０日間前処理した。それらマウスを１回ＵＶＢ照射した(ＷＴマウスは２５ｍＪ／ｃｍ2の、ＫＯマウスは５ｍＪ／ｃｍ2の太陽光模擬ＵＶ照射；２８５±５ｎｍ)。１４日後、動物を安楽死させた。上皮性ＤＮＡを分離し、処理してＬａｃＺ遺伝子に生ずる突然変異を分析した。ベースライン突然変異頻度は両遺伝子型のマウスで同様であった。ＵＶ照射は、希釈剤処理ＵＶ照射マウスの上皮におけるＬａｃＺ遺伝子突然変異頻度を約１０倍増加させた(ＷＴおよびＫＯマウスそれぞれにおいて)。ｐＴＴ処理ＷＴマウス皮膚の突然変異分析は、突然変異頻度の３１±５％の減少を示した。希釈剤前処理対照ＫＯマウスに比較して、ｐＴＴ前処理ＫＯマウスは２６％低い突然変異を示した。ただしこれは統計的に有意ではなかった。
【０２８５】
マウスに、一週間毎日ｐＴＴまたは希釈剤単独を局所適用し、その後３週間毎日ＵＶ照射するというサイクルを５サイクル行った(１５０日)。１６０日後、マウスの突然変異頻度を評価した。慢性ＵＶ照射後、マウス皮膚の突然変異頻度は単回ＵＶ照射後より１０倍高かった。希釈剤処理に比べて、ｐＴＴ処理は照射ＷＴおよびＫＯマウス皮膚における突然変異頻度を２８％および３１％減らした(それぞれｐ＜０．０８およびｐ＜０．０４)。ＬａｃＺトランスジェニック培養マウス線維芽細胞に関する最初のデータは、Ｔ-オリゴ前処理がＵＶ誘発性突然変異頻度を低減することを示した。
【０２８６】
実施例５２：テロメア３'オーバーハングに相同のオリゴヌクレオチドは酸化的損傷に対するｐ２１依存性適応反応を刺激する
線維芽細胞を４０μＭ  Ｔ-オリゴｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)に曝露すると、ｐ５３のセリン１５上リン酸化によって測定した際、２４および４８時間までにｐ５３が活性化され、ｐＴＴ(１００μＭ)によってあらわれる反応より３倍高い反応を示す(ウエスタンブロット)。ジクロロフルオレッセイン  ジアセテート  アッセイは、対照オリゴヌクレオチドｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(配列番号：９)およびｐＣＣまたは希釈剤単独による処理に比較して、ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)およびｐＴＴで処理した場合は３６時間以内に反応性酸素種が増加することを示した(ｐ＜０．００２)。野生型対照細胞と比較してｐ２１-ｎｕｌｌマウス胚線維芽細胞では、特異的ＮＡＤＰＨオキシダーゼインヒビタ塩化ジフェニルヨードニウムは反応性酸素種産生を阻止し、Ｔ-オリゴは反応性酸素種を誘発できなかった。４８および７２時間以内に、ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)は老化関連性-β-ガラクトシダーゼ染色を軽度に誘発した(ｐＴＴは誘発しなかった)。これは長時間Ｔ-オリゴ処理(≧７日)が線維芽細胞の老化を誘発する能力と一致する。線維芽細胞において、生成するこれら効果はテロメア３'オーバーハングとの相同の程度並びに処理時間に左右されるようにみえる：長時間の曝露のみが老化に導き、≦７２時間の曝露は反応性酸素種レベルをｐ５３-およびｐ２１依存的に誘発し、スーパーオキシドジスムターゼ(ＳＯＤ)酵素を誘発する。
【０２８７】
正常新生児線維芽細胞をｐＴＴまたは対照としての希釈剤で４日間まで処理し、採取してＲＮＡを分離した。ノーザンブロット分析は、ｐＴＴがＳＯＤ２ｍＲＮＡを誘発することを示した。
【０２８８】
正常新生児線維芽細胞をｐＴＴまたは対照としての希釈剤で３２時間まで処理し、採取してウエスタンブロット分析のためのタンパク質を抽出した。結果は、ＳＯＤ２タンパク質がｐＴＴによって誘発されることを示した。
【０２８９】
正常新生児線維芽細胞をｐＴＴまたは対照としての希釈剤で４日間まで処理し、採取してＲＮＡを分離した。ノーザンブロット分析はＳＯＤ１ｍＲＮＡがｐＴＴによって誘発されることを示した。
【０２９０】
正常新生児線維芽細胞をｐＴＴまたは対照としての希釈剤で３２時間まで処理し、採取してウエスタンブロット分析のためのタンパク質を抽出した。結果は、ＳＯＤ１タンパク質がｐＴＴによって誘発されることを示した。
【０２９１】
新生児線維芽細胞を４０μＭＴ-オリゴ、ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)または対照としての希釈剤で処理し、採取してＲＮＡ分離およびノーザンブロット分析を行った。ＳＯＤ２の２種類の公知の転写体の両方がＴ-オリゴ処理中に誘発された。
【０２９２】
正常新生児線維芽細胞をｐＴＴまたは対照としての希釈剤で３日間まで処理し、等しい密度に再播種し、ＤＭＥ中５０μＭ過酸化水素溶液または対照としてのＤＭＥ単独に曝露した。細胞を８、２４、４８および７２時間に採取し、クールターカウンタによって細胞収量を測定した。ｐＴＴによる前処理は耐過酸化水素性を刺激するように見えた。
【０２９３】
新生児線維芽細胞をｐＴＴまたは対照としての希釈剤で２日間処理し、１０Ｊ／ｃｍ2ＵＶＡで照射した。細胞を２００細胞／１００ｍｍ皿で再培養し、１５日間増殖させた。細胞コロニーを固定し、メチレンブルーで染色し、数えた。ｐＴＴによる前処理は、コロニー形成-効率によって測定した際、ＵＶ照射による酸化的ストレス後の細胞生育可能性を高めた。
【０２９４】
実施例５３：Ｔ-オリゴはＤＮＡ修復能力を高め、線維芽細胞におけるＤＮＡ光生成物の除去を促進する
２種類のＤＮＡ修復アッセイを用いて、Ｔ-オリゴ(４０μＭ)、２種類の対照オリゴヌクレオチド(４０μＭ)または希釈剤対照で前処理した後２日目の培養一次新生児ヒト線維芽細胞におけるＤＮＡ修復を評価した。
【０２９５】
最初のアッセイはプラスミドｐＣＭＶｌｕｃを使用する宿主細胞再活性化アッセイであった。このアッセイにおいては、このプラスミドをインビトロ  ＵＶＢ照射し、その後リポフェクタミンを用いてヒト線維芽細胞にトランスフェクトした。ＵＶＢ誘発性ＤＮＡ損傷(ＤＮＡ光生成物；主としてチミンダイマー類および６,４-光生成物)は、プラスミド-コーデドールシフェラーゼが発現する前に、細胞性ＤＮＡ修復酵素によって修復されるに違いない。そのため、トランスフェクション後２日目の細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性が宿主細胞のＤＮＡ光生成物修復効率を反映する。
【０２９６】
宿主細胞再活性化(これはＤＮＡ修復能力を反映する)は、未照射対照プラスミドをトランスフェクトした対応サンプル中のルシフェラーゼ活性に比較した、ルシフェラーゼ活性として示される。三重のサンプルで行った典型的一実験の結果を平均値±標準偏差として図５９に示す。異なるドナ-からの細胞で行った反復実験は同様な結果を示した。Ｔ-オリゴは線維芽細胞におけるＤＮＡ修復能力を高める。
【０２９７】
第二のアッセイでは照射後種々の時刻における線維芽細胞サンプル中のＤＮＡ光生成物の量を測定した。細胞を２Ｊ／ｍ2ＵＶＢで照射し、直後、または２、４、または６時間後に溶解した。細胞ＤＮＡのアルカリ性溶出を、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ(これはチミジンダイマーのある部位でＤＮＡを切断する)の存在下で行った。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ部位の数(＝ピリジンダイマーの数)を定量的に測定するために、公知の数のＤＮＡ損傷を有する標準サンプルを較正のために使用した。３ないし５個の独立的線維芽細胞サンプルの結果が平均値±標準偏差として図６０に示される。Ｔ-オリゴは線維芽細胞においてＤＮＡ光生成物の除去を促進する。
【０２９８】
均等物
本発明をその好ましい実施形態に関して詳細に示し、説明したが、添付の請求項に包含される本発明の範囲を逸脱することなく形および細部に種々の変更を加え得ることは当業者には当然である。
【図面の簡単な説明】
【０２９９】
【図１】水(希釈剤)、または１００μＭ  ｐＴｐＴ(Ｔ2)または１００μＭｐｄＡｐｄＡ(Ａ2)を投与したヒト扁平上皮癌細胞の細胞増殖速度のグラフである。０日は投与前、１、３、５日は投与後の日数である。
【図２】水(希釈剤)、または１００μＭ  ｐＴｐＴ(Ｔ2)を投与した正常ヒト線維芽細胞の細胞増殖速度のグラフである。０日は投与前、１、３、４、５日は投与後の日数であり、数値は２回ずつの培養の平均値±標準偏差をあらわす。
【図３】水(希釈剤)、または１００μＭ  ｐＴｐＴ(Ｔ2)を投与したヒト子宮頸部癌細胞の細胞増殖速度のグラフである。０日は投与前、１、４、６日は投与後の日数である。
【図４】希釈剤または１００μＭ  ｐＴｐＴ(Ｔ2)を投与したヒト・メラノーマ細胞系の細胞収量のグラフである。
【図５】水(希釈剤)、または１００μＭ  ｐＴｐＴ(Ｔ2)を投与した正常ヒトケラチノサイトの細胞増殖速度のグラフである。０日は投与前、８、２４、４８および７２は投与後の時間であり、数値は２回ずつの培養の平均値±標準偏差を示す。
【図６】水、Ｔ2またはＡ2のいずれかを投与したヒト新生児の線維芽細胞の平均細胞数のグラフである。
【図７】水、Ｔ2またはＡ2のいずれかを投与したヒト新生児の線維芽細胞の平均細胞数のグラフである。
【図８】水(希釈剤)または１００μＭ  ｐＴｐＴ(Ｔ2)を投与した正常ヒト線維芽細胞の細胞増殖速度のグラフである。０日は投与前であり、数値は２回ずつの培養の平均値±標準偏差をあらわす。
【図９】水(希釈剤)または１００μＭ  ｐＴｐＴ(Ｔ2)を投与したｐ５３-ｎｕｌｌ  Ｈ１２９９肺癌細胞の細胞増殖速度のグラフである。０日は投与前で、１、２、３および４は投与後の日数であり、数値は２回ずつの培養の平均値±標準偏差をあらわす。
【図１０】ｐＴｐＴで処理したヒト・ケラチノサイトにおけるリポータプラスミドのＤＮＡ修復の向上を示すグラフである。白い棒は模擬照射された対照プラスミド、斜線の棒はＵＶ照射プラスミドをあらわす。
【図１１】ｐＴｐＴで処理したヒト線維芽細胞におけるリポータプラスミドのＤＮＡ修復向上を示すグラフである。ここで白い棒は模擬-照射対照プラスミド、斜線の棒はＵＶ照射プラスミドをあらわす。
【図１２】指示されたオリゴヌクレオチド１００μＭ、または同量の希釈剤で５日間処理したクロードマン(Ｃｌｏｕｄｍａｎ)Ｓ９１細胞のメラニン含有量である。データは希釈剤処理-対照のパーセントとして計算した、２回ずつの培養の平均値である。
【図１３】指示されたオリゴヌクレオチドまたは同量の希釈剤で４８時間処理したＳＣＣ１２Ｆ細胞のノーザンブロット分析によって検出される、ｐ２１発現のデンシトメトリ分析を示す。
【図１４】図１３のサンプル類の細胞収量を、平均値±標準偏差として示す。
【図１５】指示されたオリゴヌクレオチド１００μＭまたは同量の希釈剤で５日間処理したクロードマンＳ９１細胞のメラニン含有量を、３回の独立的実験で希釈剤処理対照のパーセントとして示す(平均値±標準偏差)。
【図１６】指示されたオリゴヌクレオチド１００μＭまたは同量の希釈剤で処理したクロードマンＳ９１細胞のメラニン含有量を、図１２と同様に示す。ここで数値は３回の独立的実験を示し、＊＝ｐ＜０．００４、＊＊＝ｐ＜０．０３である(両側スチュデントｔ-検定)。
【図１７】指示されたオリゴヌクレオチドで処理したクロードマンＳ９１細胞のメラニン含有量を示す。
【図１８】指示されたオリゴヌクレオチドで処理したクロードマンＳ９１のメラニン含有量を示す。
【図１９】Ａ-Ｈは、希釈剤(図１９Ａおよび１９Ｅ)、４０μＭ  １１マー-１ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)(図１９Ｂおよび１９Ｆ)；４０μＭ１１マー２ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(配列番号：９)(図１９Ｃおよび１９Ｇ)；４０μＭ１１マー３ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ(配列番号：１０)(図１９Ｄおよび１９Ｈ)でそれぞれ処理したヨウ化プロピジウム染色ジャルカット(Ｊｕｒｋａｔ)細胞のＦＡＣＳ(蛍光細胞分析分離装置)分析を示す。
【図２０】Ａ-Ｆは、細胞に下記の添加を行った場合の蛍光細胞分析分離法の結果を示すグラフである：図２０Ａ、希釈剤；図２０Ｂ、０．４μＭ  １１マー-１-Ｓ；図２０Ｃ、０．４μＭ  １１マー-１-Ｓ；図２０Ｄ、希釈剤；図２０Ｅ、４０μＭ  １１マー-１；図２０Ｆ、４０μＭ  １１マー-１-Ｓ。
【図２１】Ａ-Ｇは、下記を細胞に添加した際の蛍光細胞分析分離法の結果を示すグラフである：図２１Ａ、希釈剤；図２１Ｂ、１０μＭ  １１マー１；図２１Ｃ、１０μＭ  １１マー-１および１μＭ  １１マー１-Ｓ；図２１Ｄ、１０μＭ  １１マー-１および５μＭ  １１マー-１-Ｓ；図２１Ｅ、１０μＭ  １１マー-１および１０μＭ  １１マー-１-Ｓ；図２１Ｆ、２０μＭ  １１マー-１-Ｓ；図２１Ｇ、１０μＭ  １１マー-１-Ｓ。
【図２２】希釈剤、ｐＴｐＴまたはｐＴｓＴで処理した細胞のメラニン含有量(ｐｇ／細胞)を示す棒グラフである。
【図２３】希釈剤、１１マー-１または１１マー-１-Ｓで処理した細胞のメラニン含有量(ｐｇ／細胞)を示す棒グラフである。
【図２４】模擬処理(照射なし、オリゴヌクレオチドなし)または紫外線照射(ＵＶ)処理した、または照射はしないがｐＴｓｐＴを与えた、またはＵＶ照射しｐＴｓｐＴを与えた細胞類のメラニン含有量(ｐｇ／細胞)を示す棒グラフである。
【図２５】扁平上皮癌細胞系ＳＣＣ１２Ｆの希釈剤処理(四角)細胞またはｐＴｐＴ処理(ダイヤ型)細胞に関して、関連する模擬照射対照に対する細胞パーセントとしてあらわされた生細胞数を、紫外線照射後の時間の関数として示したグラフである。
【図２６】ＵＶＡ誘起性損傷およびｐＴｐＴ処理後の、正常ヒト線維芽細胞の修復能を、非複製ベクターｐＣＭＶ-Ｌｕｃにおける遺伝子発現から生ずるルシフェラーゼ活性として示した棒グラフである。模擬照射対照のパーセントとしてあらわされるルシフェラーゼ活性を、１０または２０分照射した線維芽細胞の希釈剤処理(黒棒)およびｐＴｐＴ処理(白棒)に関してプロットした。実施例２４を参照されたい。
【図２７】希釈剤、テロメア配列に相同のオリゴヌクレオチド、テロメア配列に相補的なオリゴヌクレオチドまたは関連のないオリゴヌクレオチド(左から右に順次示す棒)で処理したジャルカット細胞のカスパーゼ-３活性の測定結果を示す棒グラフである。カスパーゼ-３活性(ｐｍｏｌｐＮＡ／ｈｒ／μｇタンパク質(このアッセイから生ずるタンパク質))を、細胞とオリゴヌクレオチド類とのインキュベ-ション４８時間、７２時間および９６時間にプロットした。
【図２８】希釈剤、配列ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(配列番号：９)を有する「相補的」オリゴヌクレオチド、または配列ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)を有する「Ｔ-オリゴ」で前処理したＭＭ-ＡＮ細胞を注射したＳＣＩＤ(重症複合免疫不全症)マウスに生成した、原発腫瘍の平均量を示す棒グラフである。
【図２９】希釈剤、「相補的」オリゴヌクレオチド、または「Ｔ-オリゴ」で前処理したＭＭ-ＡＮ細胞を注射したＳＣＩＤマウスに生起した、転移腫瘍の平均量を示す棒グラフである。実施例３０を参照されたい。
【図３０】Ａ-Ｈは、ジャルカット細胞に下記を添加した際の蛍光細胞分析分離法によって測定した蛍光強度のプロフィ-ルである：図３０Ａおよび３０Ｅ、希釈剤；図３０Ｂおよび３０Ｆ、１０μＭｐＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴ(配列番号：１３)；図３０Ｃおよび３０Ｇ、１０μＭｐＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧ(配列番号：１４)；図３０Ｄおよび３０Ｈ、１０μＭｐＣＧＧＧＣＴＴＡＴＴＧ(配列番号：１５)。細胞を集め、オリゴヌクレオチド添加後７２時間目(図３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃおよび３０Ｄ)またはオリゴヌクレオチド添加後９６時間目(図３０Ｅ、３０Ｆ、３０Ｇおよび３０Ｈ)に処理してＦＡＣＳ分析を行った。実施例３１を参照されたい。
【図３１】Ａ-Ｅは、ジャルカット細胞に下記を添加した際の蛍光細胞分析分離法によって測定した蛍光強度のプロフィールである：図３１Ａ、希釈剤；図３１Ｂおよび３１Ｄ、それぞれ２０μＭおよび５μＭのｐＴＴ；図３１Ｃおよび３１Ｅ、それぞれ２０μＭおよび５μＭのｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)。実施例３１を参照されたい。
【図３２】Ａ-Ｄは、あらかじめ融合した正常新生児ヒト線維芽細胞に下記を添加した際の蛍光細胞分析分離法によって測定した蛍光強度のプロフィールである：図３２Ａ、希釈剤；図３２Ｂ、４０μＭのｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)、図３２Ｃ、４０μＭのｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(配列番号：９)；図３２Ｄ、４０μＭのｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ(配列番号：１０)。オリゴヌクレオチド類または希釈剤の添加後２４時間に、細胞をＦＡＣＳ分析した。
【図３３】Ａ-Ｈは、(図３３Ａ-３３Ｄ)ＳＣＣ１２Ｆ細胞または(図３３Ｅ-３３Ｈ)Ｓａｏｓ-２細胞に下記を添加した際の蛍光細胞分析分離法によって測定した蛍光強度のプロフィールである：図３３Ａおよび３３Ｅ、希釈剤；図３３Ｂおよび３３Ｆ、ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)；図３３Ｃおよび３３Ｇ、ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(配列番号：９)；図３３Ｄおよび３３Ｈ、ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ(配列番号：１０)。４０μＭオリゴヌクレオチド類の添加後４８時間目にＦＡＣＳにより細胞を分析した。
【図３４】Ａ-Ｈは、(図３４Ａ-３４Ｄ)正常対照線維芽細胞または(図３４Ｅ-３４Ｈ)ＮＢＳ線維芽細胞に下記を添加した際の蛍光細胞分析分離法によって測定した蛍光強度のプロフィールである：図３４Ａおよび３４Ｅ、希釈剤；図３４Ｂおよび３４Ｆ、ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)；図３４Ｃおよび３４Ｇ、ｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(配列番号：９)；図３４Ｄおよび３４Ｈ、ｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ(配列番号：１０)、４０μＭオリゴヌクレオチド類または希釈剤の添加後４８時間にＦＡＣＳ法によって細胞を分析した。
【図３５】一本鎖テロメアＤＮＡ配列の曝露によって老化、細胞周期停止、適応性分化またはアプトーシスが誘発される提唱されるメカニズムの図である。３'テロメア・オーバーハングは、通常、ＴＲＦ２によって安定化されるループ構造内に隔離されて、「キャップド」またはサイレントテロメアを形成する。ＵＶ照射または化学的付加物によるＤＮＡ損傷、ＴＲＦ２DNの発現、または老化中に徐々に起きる侵襲によるこのループ構造の不安定化がこの一本鎖ＤＮＡ(ＴＴＡＧＧＧのリピート；配列番号：１１)を露出させ、このテロメアを「アンキャッピング」すると仮定されている。ＴＲＦ２タンパク質の転置は生理的条件下でループ崩壊を伴うかも知れないし、伴わないかも知れない。この一本鎖ＤＮＡはその後これまでは未確認のセンサ-分子によって検出される。このセンサート３'オーバーハングとの相互作用がＡＴＭ活性化、その後のｐ５３活性化およびｐ９５／Ｎｂｓｌ修飾を含む一連の事象を開始し、細胞周期停止に導く。細胞型および／またはシグナルの強度および持続時間によって、これらの事象は老化、適応性分化またはアプト-シスを偶発的発生に導くことがある。オーバーハング配列に相同のＤＮＡオリゴヌクレオチド類は同じセンサー分子によって認識され、テロメア崩壊が起きない場合の上記一連の事象の引き金を引くことがある。
【図３６】実施例４０に記載するように、オリゴヌクレオチドで３６時間処理したＳａｏｓ-２細胞の二重の培養で、添加後の細胞集団倍加の平均を平均値の標準誤差と共にあらわした棒グラフである。
【図３７】Ｔ-オリゴ(ダイヤモンド形)、対照オリゴヌクレオチド(四角)または希釈剤(三角)で単回投与処理し、４日間にわたり細胞と接触させたままにした後のＭＣＦ-７細胞の収量を示すグラフである。実施例４１を参照されたい。
【図３８】Ｔ-オリゴ(ダイヤモンド形)、対照オリゴヌクレオチド(四角)または希釈剤(三角)で単回投与処理し、４日間にわたり細胞と接触させたままにした後のＢＴ-２０細胞の収量を示すグラフである。実施例４１を参照されたい。
【図３９】Ｔ-オリゴ(ダイヤモンド形)、対照オリゴヌクレオチド(四角)または希釈剤(三角)で複数回処理した後の１日目と３日目のＭＣＦ-７細胞の収量を示すグラフである。実施例４１を参照されたい。
【図４０】Ｔ-オリゴ、対照オリゴヌクレオチドまたは希釈剤添加後７２時間保持したＭＣＦ-７細胞について蛍光細胞分析分離法によって測定した蛍光強度のプロフィールである。実施例４１を参照されたい。
【図４１】Ｔ-オリゴ、対照オリゴヌクレオチドまたは希釈剤を培地に添加後、９６時間保持したＢＴ-２０細胞について、蛍光細胞分析分離法によって測定した蛍光強度のプロフィールである。実施例４１を参照されたい。
【図４２】４０μＭｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)で処理し、染色前１週間培地に保持したＭＣＦ-７細胞の培養物中のβ-ガラクトシダーゼ活性染色が陽性であった細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。実施例４１を参照されたい。
【図４３】培地に保持し、希釈剤、Ｔ-オリゴ、シスプラチン、またはＩＣＩ１８２,７８０を補充し、処理後１、２、３、４および５日間保持したＭＣＦ-７細胞の細胞収量を示す棒グラフである。実施例４１を参照されたい。
【図４４】培地に保持され、希釈剤、Ｔ-オリゴ、シスプラチンまたはＩＣＩｃ１８２,７８０を補充し、処理後１、２、３、４および５日間保持したＢＴ-２０細胞の細胞収量を示す棒グラフである。実施例４１を参照されたい。
【図４５】実施例４５は、４０μＭ  ｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ［Ｔ-オリゴ；配列番号：５(四角)］、４０μＭｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ［対照オリゴヌクレオチド；配列番号：９(三角)］または希釈剤のみ(ダイヤモンド形)で処理したＨＰＡＣ細胞の培養字の細胞収量を示すグラフである。実施例４２を参照されたい。
【図４６】０日目に４０μＭ  Ｔ-オリゴ(四角)、相補体オリゴ(三角)、または希釈剤(ダイヤモンド形)で処理したＯＶＣＡＲ５細胞の培地中の細胞数をあらわすグラフである。細胞は処理後３、４および５日目に数えた。実施例４３を参照されたい。
【図４７】０日目に４０μＭ  Ｔ-オリゴ(四角)、相補的オリゴ(三角)、または希釈剤(ダイヤモンド形)で処理したＭＣＦ-７細胞の培地中の細胞数をあらわすグラフである。細胞は処理後３、４および５日目に数えた。実施例４３を参照されたい。
【図４８】そこに示されるように、オリゴヌクレオチド類または希釈剤で処理したＭＭ-ＡＮ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示すプロフィールである。実施例４４を参照されたい。
【図４９】そこに示されるように、オリゴヌクレオチド類または希釈剤で処理したＭＭ-ＡＮ細胞に関するＴＵＮＥＬアッセイの結果を示すプロフィールである。実施例４４を参照されたい。
【図５０】そこに示されるようにオリゴヌクレオチド類または希釈剤で処理したＭＭ-ＡＮ細胞およびメラノサイトの、処理後２４時間および９６時間後のＴＵＮＥＬアッセイの結果を示すプロフィールである。実施例４４を参照されたい。
【図５１】Ｔ-オリゴ、相補的オリゴヌクレオチド、または希釈剤であらかじめ処理したＭＭ-ＡＮ細胞を注射した後４０日目のＳＣＩＤマウスに発生した腫瘍の平均腫瘍量を示す棒グラフである。実施例４４を参照されたい。
【図５２】Ｔ-オリゴ、相補的オリゴヌクレオチド、または希釈剤であらかじめ処理したＭＭ-ＡＮ細胞を注射した後４０日目のＳＣＩＤマウスに発生した腫瘍の平均数を示す棒グラフである。実施例４４を参照されたい。
【図５３】ホスホロチオエート結合で合成されたヌクレオチド配列の配列番号：５のオリゴヌクレオチドの図である。実施例４６を参照されたい。
【図５４】正常新生児のヒト線維芽細胞の培養細胞の老化(β-ガラクトシダーゼ活性陽性染色の細胞によって示される)の誘起における、図５３に記載のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド１、２、３および４の効果の試験結果を示す棒グラフである。図５４のオリゴヌクレオチド「１１-１」は、完全にホスホジエステル結合で合成されたｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)で処理した線維芽細胞培養物を示す。図５４の「Ｄｉｌ」は、オリゴヌクレオチドを含まない希釈剤で処理した線維芽細胞培養物を示す。実施例４６を参照されたい。
【図５５】１週間毎日局所的ｐＴＴ(または希釈剤のみ)を与え、その後３週間毎日ＵＶ照射するというサイクルを連続５サイクル(１５０日)ＸＰＣ+/-マウスに行った実験結果を示すグラフである。データは、実験開始後の期間、腫瘍が発生しなかったｐＴＴ-マウスまたは希釈剤投与マウスのパーセンテージとしてプロットされたものである。実施例４９を参照されたい。
【図５６】１週間毎日局所的ｐＴＴ(または希釈剤のみ)を与え、その後３週間毎日ＵＶ照射するというサイクルを連続５サイクル(１５０日)ＸＰＣ+/-マウスに行った実験の結果を示す棒グラフである。データは、実験開始後の期間観察したＸＰＣ+/-マウス１匹あたりの平均腫瘍数としてプロットされる。実施例４９を参照されたい。
【図５７】実施例４９に記載するように、１週間毎日局所的ｐＴＴ(または希釈剤のみ)を与え、その後３週間毎日ＵＶ照射するというサイクルを連続５サイクル(１５０日)ＸＰＣ+/-マウスに行った実験の結果を描く棒グラフである。マウス１匹あたりの腫瘍数が、希釈剤またはｐＴＴ処理したマウスで示される。(ＡＫ＝紫外線角化症；ＳＣＣ＝扁平上皮癌)
【図５８】ＵＶ照射によって誘発された腫瘍に０日目にｐＴＴを注射した実験の結果を示す棒グラフである。腫瘍量を０日目に対してプロットした。実施例５０を参照されたい。
【図５９】ｐＣＭＶｌｕｃプラスミドを紫外線Ｂ照射し、照射プラスミドを線維芽細胞にトランスフェクションした後の、このプラスミド上のＤＮＡ修復を示すアッセイ結果のグラフである。細胞を、トランスフェクションの２日前に４０μＭ(黒丸)Ｔ-オリゴｐＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ(配列番号：５)、(白菱形)対照オリゴヌクレオチドｐＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣ(配列番号：９)、(白三角)関係のないオリゴヌクレオチドｐＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴ(配列番号：１０)、または(白四角)希釈剤を用いて処理した。
【図６０】４０μＭオリゴヌクレオチドまたは希釈剤で前処理した線維芽細胞に存在するＤＮＡ光生成物を測定するアッセイの結果を示すグラフである。記号の説明は図５９と同じである。
【配列表フリ−テキスト】
【０３００】
<210> 1
<213> 人工配列
<223> 合成ＤＮＡ断片
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<210> 18
<213> 人工配列
<223> 合成ＤＮＡ断片
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【配列表】
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