(57)【要約】【課題】高い分解能およびコントラストを備えつつ、デコンボリューション処理を簡易化させてリアルタイムでの観察が可能な共焦点顕微鏡を提供する。【解決手段】本発明に係る共焦点顕微鏡２０は、ライン状の照明光を標本８における被観察面８ａ上に照射する照明光学系と、照明光を被観察面８ａ上で走査方向Ｓに移動させるスキャナ６と、照明領域Ｌから射出した射出光を結像する結像光学系と、被観察面８ａに対して共役面に配設されて射出光を検出する複数の画素を備えた撮像カメラ１０と、照明領域Ｌに対して共役な位置にある撮像カメラ１０上の特定画素において実際に検出された特定画素信号、および特定画素に対して走査方向Ｓに隣接する隣接画素において実際に検出された隣接画素信号を用いて、特定画素と共役な位置にある照明領域Ｌからの射出光のフォーカス信号を算出するコンピュータ１１とを備える。【選択図】図１
2010164635.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ライン状の照明光を被観察物における被観察面上に照射する照明光学系と、
前記照明光を前記被観察面上で所定方向に移動させる走査手段と、
前記被観察面における前記照明光が照射された照明領域から射出した射出光を結像する結像光学系と、
前記被観察面に対して共役面に配設されて前記結像光学系により結像された前記射出光を検出する複数の画素を備えた光検出手段と、
前記照明領域に対して共役な位置にある前記光検出手段上の特定画素において検出された特定画素信号、および前記特定画素に対して前記所定方向に隣接する隣接画素において検出された隣接画素信号を用いて、前記特定画素と共役な位置にある前記照明領域からの前記射出光の合焦信号成分を算出する信号算出手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、
前記信号算出手段は、前記隣接画素信号を適切に補正するためのパラメータを決定する操作手段を有し、
前記特定画素信号をＳＡとし、前記隣接画素信号をＳａとし、前記操作手段により決定される前記パラメータをαとし、所定定数をｋとし、前記合焦信号成分をＦＡとしたとき、次式
ＦＡ＝（ＳＡ−α×Ｓａ）／（１−α×ｋ）
に基づいて、前記信号算出手段において前記合焦信号成分が算出されることを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記所定定数は、前記共焦点顕微鏡の光学特性を基にして決定されることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被観察物の画像をライン毎に検出する共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、被観察物の形状を高精度で測定できる装置として、共焦点顕微鏡がある。共焦点顕微鏡の一例として、対物レンズの後ろ側焦点位置にピンホールを置くことにより、焦点近傍以外から出る光を除去してコントラストの高い画像が得られるように構成されたものがある。例えば、被観察物に対して焦点を水平方向に一定量ずつ相対移動させて被観察物の走査画像（断面画像データ）をポイント毎に取得すれば、焦点面と一致した部分だけが明るくなる画像が高さ毎に得られ、特に生物の断面を観察する場合に有効な装置として知られている。
【０００３】
上記ピンホールを用いた共焦点顕微鏡に対して、被観察物の像をライン毎に検出するライン走査型の共焦点顕微鏡も知られており、ライン状に集光された照明光で被観察物を照明し、被観察物上の照明された領域で生じた光をＣＣＤ等の光検出器で検出するように構成されている（例えば、特許文献１を参照）。また、このライン状の照明光を被観察物上で所定方向に走査させながら、照明された領域で生じた光を光検出器で検出することで、被観察物の２次元画像データを取得することができる。
【０００４】
このように、ピンホールを用いてポイント毎に検出するように構成された共焦点顕微鏡に対して、被観察物からの光をライン毎に検出することにより、被観察物の画像データの取得を短時間で行うことができる。このとき、被観察物上の焦点面からの光のみならず、焦点面の上下位置等からの光も光検出器で検出されるため、得られた画像はボケた画像となってしまう。このボケた画像からボケ成分を取り除くいわゆるデコンボリューション処理を行うことで、本来の（ボケのない）画像に復元することができ、分解能およびコントラストの高い画像を得ることが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開番号ＷＯ２００８／０９９７７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、上記デコンボリューション処理を行うことで、分解能およびコントラストの高い画像を得ることができる一方で、この演算処理を高精度に行うためにはそれに応じて処理時間を要し、測定された被観察物の画像をリアルタイムで観察することが困難であるという課題があった。
【０００７】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、高い分解能およびコントラストを備えつつ、デコンボリューション処理を簡易化させてリアルタイムでの観察が可能な共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような目的達成のため、本発明に係る共焦点顕微鏡は、ライン状の照明光を被観察物における被観察面上に照射する照明光学系と、前記照明光を前記被観察面上で所定方向に移動させる走査手段と、前記被観察面における前記照明光が照射された照明領域から射出した射出光を結像する結像光学系と、前記被観察面に対して共役面に配設されて前記結像光学系により結像された前記射出光を検出する複数の画素を備えた光検出手段と、前記照明領域に対して共役な位置にある前記光検出手段上の特定画素において検出された特定画素信号、および前記特定画素に対して前記所定方向に隣接する隣接画素において検出された隣接画素信号を用いて、前記特定画素と共役な位置にある前記照明領域からの前記射出光の合焦信号成分を算出する信号算出手段とを備えた共焦点顕微鏡であって、前記信号算出手段は、前記隣接画素信号を適切に補正するためのパラメータを決定する操作手段を有し、前記特定画素信号をＳＡとし、前記隣接画素信号をＳａとし、前記操作手段により決定される前記パラメータをαとし、所定定数をｋとし、前記合焦信号成分をＦＡとしたとき、次式（１）に基づいて、前記信号算出手段において前記合焦信号成分が算出される。
【０００９】
ＦＡ＝（ＳＡ−α×Ｓａ）／（１−α×ｋ）  …（１）
【００１０】
なお、上述の共焦点顕微鏡において、前記所定定数は、前記共焦点顕微鏡の光学特性を基にして決定されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、デコンボリューション処理を簡易化させてリアルタイムでの観察が可能な共焦点顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る共焦点顕微鏡の概略構成図である。
【図２】標本の拡大図である。
【図３】２次元ＣＣＤをビームスプリッタ側から見た図である。
【図４】標本と２次元ＣＣＤとの位置関係を示した図である。
【図５】上記図４で示した標本および２次元ＣＣＤを、９０度異なる方向から見た図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を用いて説明する。まず、図１および２を参照しながら、本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡２０の全体構成について説明する。図１に共焦点顕微鏡２０の概略構成図を、図２に観察対象である標本８の拡大図をそれぞれ示している。
【００１４】
共焦点顕微鏡２０は、レーザ光源１、シリンドリカルレンズ３、ビームスプリッタ４、レンズ５、スキャンミラー６ａを内蔵したスキャナ６、対物レンズ７、カメラ本体１０ａとこのカメラ本体１０ａの撮像面に配設された２次元ＣＣＤ１０ｂからなる撮像カメラ１０およびコンピュータ１１を主体に構成される。この共焦点顕微鏡２０は、コンピュータ１１において観察対象である標本８の２次元画像データが得られるようになっており、この画像データがモニタ１２に出力されて表示されることで、目視で標本８の２次元形状を観察できるようになっている。
【００１５】
レーザ光源１から射出したレーザ光（照明光束）は、シリンドリカルレンズ３を通過することによりライン状に集光される。このライン状に集光されたレーザ光は、ビームスプリッタ４を通過した後、レンズ５に入射することで平行光に変換される。レンズ５を通過したレーザ光は、標本８上を２次元に走査するスキャナ６に入射する。なお、スキャナ６としては、照明光束であるレーザ光の光路に挿入したガルバノミラーを駆動させたり、ピエゾ素子を駆動機構として用いたステージを利用したりする等、様々な方法が利用可能である。
【００１６】
スキャナ６に入射したレーザ光は、スキャンミラー６ａにより対物レンズ７の方向に反射され、対物レンズ７を介して標本８上のライン状の領域（照明領域Ｌ）に集光される。標本８上で集光されたレーザ光が、標本８に予め含まれている蛍光色素を励起することで、標本８（照明領域Ｌ）から蛍光が発せられる。標本８で発せられた蛍光は、対物レンズ７で集光された後、スキャンミラー６ａ、レンズ５を介して、ビームスプリッタ４に入射する。ビームスプリッタ４に入射した蛍光は、ビームスプリッタ４により撮像カメラ１０（２次元ＣＣＤ１０ｂ）の方向に反射されて、２次元ＣＣＤ１０ｂ上における照明領域Ｌと共役な位置関係にある画素上に、上記照明領域Ｌの像を形成する。
【００１７】
２次元ＣＣＤ１０ｂは、この照明領域Ｌの像の輝度分布を検出するとともに、検出結果を輝度分布データとしてコンピュータ１１に出力するようになっている。コンピュータ１１は、レーザ光源１、スキャナ６および撮像カメラ１０と接続されてこれらの駆動制御を行うとともに、２次元ＣＣＤ１０ｂから入力された輝度分布データを基に標本８の２次元画像データを生成するようになっている。
【００１８】
図２に照明領域Ｌで走査される標本８の拡大図を示しており、この図２では、標本８中の被観察面８ａにレーザ光が集光された状態を例示している。スキャナ６は、スキャンミラー６ａの配置角度を変化（スキャンミラー６ａを回転）させることで、標本８上の照明領域Ｌを走査方向Ｓへ移動できるようになっている。標本８上において照明領域Ｌが走査方向Ｓへ移動されると、２次元ＣＣＤ１０ｂには標本８上の異なる照明領域Ｌの像が投影されることになる。このように標本８上で照明領域Ｌを移動させながら、２次元ＣＣＤ１０ｂで異なる照明領域Ｌの像の輝度分布を検出することで、コンピュータ１１において標本８の２次元画像データを得ることができる。
【００１９】
具体的には、コンピュータ１１は上記のように２次元画像データを取得した後、スキャナ６にスキャンミラー６ａを一定角度回転させる命令を出力する。この命令を受けてスキャナ６は、スキャンミラー６ａを一定角度回転させて、標本８上の照明領域Ｌを走査方向Ｓへ移動させる。この回転が完了後に２次元画像データの取得を行うことで、異なる照明領域Ｌの２次元画像データを取得することができる。このように「スキャンミラー６ａを一定角度回転させる」、「２次元画像データを取得する」という操作を繰り返すことで、コンピュータ１１において標本８の２次元画像データが取得され、モニタ１２に２次元画像表示されて目視で標本８の蛍光像を観察することができる。
【００２０】
以上、共焦点顕微鏡２０の全体構成について説明した。ところで、上述の共焦点顕微鏡２０を用いて、例えば標本8の被観察面８ａを観察した場合、図２に示す照明領域Ｌからのみならず、この照明領域Ｌの上下位置からも蛍光が発せられる。この照明領域Ｌの上下位置から発せられた蛍光は、２次元ＣＣＤ１０ｂの手前または奥に集光するので、２次元ＣＣＤ１０ｂ上にボケた像を形成することになる。よって、照明領域Ｌと共役な位置関係にある画素には、照明領域Ｌの像とともに照明領域Ｌの上下位置のボケた像が重なって形成される。
【００２１】
そこで、本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡２０では、コンピュータ１１において、ボケた画像を本来の画像（照明領域Ｌの画像）に復元する処理を行っている。以下、この処理の一例について、図３〜５を追加参照して説明する。なお、図３は撮像カメラ１０をビームスプリッタ４側から見た図を、図４は標本８と撮像カメラ１０（２次元ＣＣＤ１０ｂ）との位置関係を、図５は上記図４に示した標本８および２次元ＣＣＤ１０ｂを９０度異なる方向から見た図を、それぞれ示している。
【００２２】
図４および５に示す被観察面８ａにおける照明領域Ｌから発せられた蛍光は、この照明領域Ｌと共役な位置関係にある画素Ａ１〜Ａ５において像を形成する（図３参照）。画素Ａ３の走査方向Ｓには、画素ａ１および画素ａ２が隣接して配設されている。図４および５に示す点Ａ〜Ｅは、照明領域Ｌを含んで形成される同一平面内に位置している点を例示的に示したものである。照明領域Ｌ上に位置した点Ａと画素Ａ３、照明領域Ｌ上に位置した点Ｂと画素Ａ４とはそれぞれ共役な位置関係にあり、ここで点Ａを注目点とすると、この点Ａに対して標本８の厚み方向に点Ｃおよび点Ｄ、点Ｂに対して標本８の厚み方向に点Ｅが位置している。
【００２３】
このような状態において、注目点Ａから発せられる蛍光は、画素Ａ３上で集光した（焦点の合った）フォーカス信号ＦＡとして検出される。点Ｃ、点Ｄから発せられる蛍光は、デフォーカス信号として画素Ａ２〜Ａ４、ａ１およびａ２で検出され、点Ｅから発せられる蛍光は、デフォーカス信号として画素Ａ３〜Ａ５、ｂ１およびｂ２で検出される。ここで、画素Ａ３に注目すると、画素Ａ３では、上記フォーカス信号ＦＡの他に、照明領域Ｌ上の注目点Ａ以外の点Ｂの上下方向（例えば、点Ｅ等）から発せられたボケ成分の蛍光が、デフォーカス信号ＤＯＡとして検出される。なお、照明領域Ｌ上の注目点Ａの上下方向（例えば、点Ｃや点Ｄ）から発せられた蛍光のデフォーカス信号は、画素Ａ３で検出されるが、ここでは考慮せず無視するものとする。なぜならば、このデフォーカス信号は、コンフォーカル顕微鏡においても同様に無視されているからである。
【００２４】
また、画素ａ１においては、照明領域Ｌ上の注目点Ａの上下方向に位置した点（例えば、点Ｃや点Ｄ）から発せられる蛍光がデフォーカス信号ＤＡａとして検出されるとともに、照明領域Ｌ上の注目点Ａ以外の点Ｂの上下方向（例えば、点Ｅ等）から発せられたボケ成分の蛍光が、デフォーカス信号ＤＯａとして検出され、画素ａ２においても同様にデフォーカス信号ＤＡａおよびデフォーカス信号ＤＯａが検出される。なお、図５に示す点Ｃ、点Ｄ、点Ｅの結像状態は一例であって、例えばこれらの点と照明領域Ｌとの上下方向距離に応じて変化する。
【００２５】
このとき、画素Ａ３で検出される全ての信号を共役位置信号ＳＡとし、画素ａ１で検出される全ての信号を隣接位置信号Ｓａとすると、これら共役位置信号ＳＡおよび隣接位置信号Ｓａは、次式（２）および（３）で表される。
【００２６】
ＳＡ＝ＦＡ＋ＤＯＡ  …（２）
Ｓａ＝ＤＡａ＋ＤＯａ  …（３）
【００２７】
ここで、共焦点顕微鏡２０の装置構成から決定される固有定数ｋ、および観察者が例えばコンピュータ１１に対して任意に入力可能なパラメータαを用いて、デフォーカス信号ＤＡａおよびデフォーカス信号ＤＯＡが、次式（４）および（５）のように表されるものと仮定する。
【００２８】
ＤＡａ＝ｋ×ＦＡ  …（４）
ＤＯＡ＝α×ＤＯａ  …（５）
【００２９】
上記式（４）から分かるように、固有定数ｋは、照明領域Ｌ上の点から発せられた蛍光に関して、フォーカス信号ＦＡに対しデフォーカス信号ＤＡａがどの程度の割合で入り込むかを表す定数である。なお、固有定数ｋは、共焦点顕微鏡２０を用いて実験を行い、共焦点顕微鏡２０の光学特性に応じた値に決定されることが望ましいが、観察者によって最適な値に設定される構成でも良い。
【００３０】
式（２）に式（５）を、式（３）に式（４）をそれぞれ代入すると、式（２）および（３）は次式（６）および（７）のように表される。
【００３１】
ＳＡ＝ＦＡ＋α×ＤＯａ  …（６）
Ｓａ＝ｋ×ＦＡ＋ＤＯａ  …（７）
【００３２】
上式（７）を変形することで、次式（８）が得られる。
【００３３】
ＤＯａ＝Ｓａ−ｋ×ＦＡ  …（８）
【００３４】
上式（８）を式（６）に代入することにより、次式（９）が得られる。そして、この式（９）を変形することで次式（１０）が得られ、式（１０）の左辺を変形することで次式（１１）、さらに式（１１）を変形することで次式（１２）が得られる。
【００３５】
ＳＡ＝ＦＡ＋α×（Ｓａ−ｋ×ＦＡ）  …（９）
ＦＡ−α×ｋ×ＦＡ＝ＳＡ−α×Ｓａ  …（１０）
（１−α×ｋ）ＦＡ＝ＳＡ−α×Ｓａ  …（１１）
ＦＡ＝（ＳＡ−α×Ｓａ）／（１−α×ｋ）  …（１２）
【００３６】
上式（１２）において、固有定数ｋは既知の値なので、観察者が入力するパラメータαに値に応じたフォーカス信号ＦＡが算出され、このフォーカス信号ＦＡを基に画素Ａ３における画像が得られる。例えば、共役位置信号ＳＡの中に比較的多くのデフォーカス信号ＤＯＡ（ボケ成分）が含まれているような場合、パラメータαとして比較的大きな値を入力することで、このボケ成分が取り除いてフォーカス信号ＦＡを算出することができる。つまり、分解能およびコントラストの高い画像を得ることができる。
【００３７】
このようなフォーカス信号ＦＡの算出および画像の生成を、照明領域Ｌと共役な位置関係にある画素Ａ１〜Ａ５の各々について行う。例えば画素Ａ４におけるフォーカス信号ＦＡを算出する際には、画素Ａ４に対して走査方向Ｓに隣接する画素ｂ１の隣接位置信号Ｓａが用いられる。このフォーカス信号ＦＡの算出とスキャンミラー６ａの回転駆動とを同期させて行い、２次元ＣＣＤ１０ｂの各画素において得られた画像を平面状に並べることで標本８の蛍光像が得られる。
【００３８】
なお、画素Ａ３のフォーカス信号ＦＡを算出する際、画素ａ１の隣接位置信号Ｓａに代えて画素ａ２の隣接位置信号Ｓａを用いることも可能であり、同様に、画素Ａ４のフォーカス信号ＦＡを算出する際に画素ｂ２の隣接位置信号Ｓａを用いることも可能である。
【００３９】
式（１２）に示すように、フォーカス信号ＦＡは複雑な演算処理を行うことなく算出できるので、観察者の入力したパラメータαに応じた標本８の蛍光像を、リアルタイムで即座にモニタ１２に表示させることが可能となり、装置の操作性を向上させることができる。観察者は、表示された標本８の蛍光像を観察し、この蛍光像がもし所望の分解能およびコントラストで表示されていないと判断した場合には、コンピュータ１１に対して別の値のパラメータαを入力し、このパラメータαに応じた標本８の蛍光像を表示させる。上記の「観察」および「パラメータαの入力」を繰り返すことにより、簡便な操作でありながら短時間のうちに所望の蛍光像をモニタ１２に表示させることが可能となる。
【００４０】
上述の実施形態において、本発明は図１に示す共焦点顕微鏡２０の構成に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜改良可能である。例えば、ビームスプリッタ４に代えてダイクロイックミラーを配設するとともに、必要に応じてフィルタを追加して配設する構成も可能である。
【符号の説明】
【００４１】
Ｌ  照明領域
６  スキャナ（走査手段）
８  標本（被観察物）
８ａ  被観察面
１０  撮像カメラ（光検出手段）
１１  コンピュータ（信号算出手段、操作手段）
２０  共焦点顕微鏡
【図１】
2010164635.tif 000003
【図２】
2010164635.tif 000004
【図３】
2010164635.tif 000005
【図４】
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【図５】
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