(57)【要約】【課題】Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎを高含有するナシ亜科植物葉抽出物の製造法を提供すること。【解決手段】ナシ亜科植物葉を６０容量％〜１００容量％のエタノールを含有する水溶液で抽出して粗抽出液を得る工程；得られた粗抽出液をナシ亜科植物葉の乾燥物に対し１０〜２０質量％の活性炭で処理し、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量を高めた処理液を得る工程；得られた処理液を乾燥させ、乾燥物に対し１００から２００質量部の水および有機溶媒を加えることにより混合し、有機層を回収して濃縮物を得る工程；濃縮して得られた濃縮液中の沈殿物を分離し、沈殿物を回収する工程を包含する、乾燥質量換算で２５質量％以上のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを含有するナシ亜科植物葉抽出物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナシ亜科植物葉を６０容量％〜１００容量％のエタノールを含有する水溶液で抽出して粗抽出液を得る工程；得られた粗抽出液をナシ亜科植物葉の乾燥物に対し１０〜２０質量％の活性炭で処理し、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量を高めた処理液を得る工程；得られた処理液を乾燥させ、乾燥物に対し１００から２００質量部の水および有機溶媒を加えることにより混合し、有機層を回収して濃縮物を得る工程；濃縮して得られた濃縮液中の沈殿物を分離し、沈殿物を回収する工程を包含する、乾燥質量換算で２５質量％以上のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを含有するナシ亜科植物葉抽出物の製造方法。
【請求項２】
上記請求項１のナシ亜科植物葉がリンゴ，ナシ，カリンの葉である，乾燥質量換算で２５質量％以上のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを含有するナシ亜科植物葉抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ナシ亜科植物葉を６０容量％〜１００容量％のエタノールを含有する水溶液で抽出して粗抽出液を得る工程；得られた粗抽出液をナシ亜科植物葉の乾燥物に対し１０〜２０質量％の活性炭で処理し、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量を高めた処理液を得る工程；得られた処理液を乾燥させ、乾燥物に対し１００から２００質量部の水および有機溶媒を加えることにより混合し、有機層を回収して濃縮物を得る工程；濃縮して得られた濃縮液中の沈殿物を分離し、沈殿物を回収する工程を包含する、乾燥質量換算で２５質量％以上のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを含有するナシ亜科植物葉抽出物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ナシ亜科（学名  Ｍａｌｏｉｄｅａｅ）とはバラ科の下位分類の一つでザイフリボク、ボケ、サンザジ、カマツカ、ナナカマド、リンゴ、ナシ、カリンなど日本で古くから親しまれている花木類である。リンゴ（学名Ｍａｌｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  ｖａｒ．ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）はカザフスタン南部、キルギスタン、タジキスタン、中国のシンチャンウイグル自治区など中央アジアの山岳地帯、コーカサスから西アジアにかけての寒冷地原産とされるバラ科ナシ亜科植物属の落葉高木である。カリン（学名Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）は中国東部原産とされるバラ科ボケ属の落葉高木である。ナシ（学名Ｐｙｒｕｓ  ｐｙｒｉｆｏｌｉａ  ｃｖｓ．）は大きく分けて和なし（日本なし）、中国なし、洋なし（西洋なし）がある。ここでは和なしについて説明する。和なしは、日本の中部地方以南や朝鮮半島南部、中国原産とされる野生種ニホンヤマナシを基本とする栽培品種群でバラ科ナシ属の落葉高木である。日本に原生するナシ属には他に、イワテヤマナシ、アオナシなどがある。【０００３】  一方、ナシ亜科植物については成分を含め様々な検討がなされており、この中でもＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎは、ＳＧＬＴ阻害活性、プロテインキナーゼＣ阻害活性、抗オキシダント活性、メラニン産生抑制活性、抗酸化活性、骨量減少抑制作用、糖尿病の予防や改善、肥満の予防、改善やダイエット等が報告されており、注目を集めている。【０００４】  これまでＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎの調製法としては、主にリンゴの果皮や果実を原料とした方法がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  しかし、ナシ亜科植物から得られる抽出物、特にＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを高含有するナシ亜科植物抽出物を得ることは、原料の違いや抽出条件、調製法の違いで十分な含有量を得ることが難しい。【０００６】  また、原料としてナシ亜科植物の葉を利用することで、今まで特に利用されてこなかった未利用資源の有効利用になる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  そこで本発明者等は、ナシ亜科植物葉からＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを高含有する抽出物を得る方法について鋭意検討を重ねた結果、ナシ亜科植物葉を６０容量％〜１００容量％のエタノールを含有する水溶液で抽出して粗抽出液を得る工程；得られた粗抽出液をナシ亜科植物葉の乾燥物に対し１０〜２０質量％の活性炭で処理し、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量を高めた処理液を得る工程；得られた処理液を乾燥させ、乾燥物に対し１００から２００質量部の水および有機溶媒を加えることにより混合し、有機層を回収して濃縮物を得る工程；濃縮して得られた濃縮液中の沈殿物を分離し、沈殿物を回収する工程を包含する、乾燥質量換算で２５質量％以上のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量の高いナシ亜科植物葉抽出物を得られることを見出し、本発明に至った。【０００８】  すなわち本発明は、ナシ亜科植物葉を６０容量％〜１００容量％のエタノールを含有する水溶液で抽出して粗抽出液を得る工程；得られた粗抽出液をナシ亜科植物葉の乾燥物に対し１０〜２０質量％の活性炭で処理し、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量を高めた処理液を得る工程；得られた処理液を乾燥させ、乾燥物に対し１００から２００質量部の水および有機溶媒を加えることにより混合し、有機層を回収して濃縮物を得る工程；濃縮して得られた濃縮液中の沈殿物を分離し、沈殿物を回収する工程を包含する、乾燥質量換算で２５質量％以上のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを含有するナシ亜科植物葉抽出物の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】  本発明により、ナシ亜科植物葉を６０容量％〜１００容量％のエタノールを含有する水溶液で抽出して粗抽出液を得る工程；得られた粗抽出液をナシ亜科植物葉の乾燥物に対し１０〜２０質量％の活性炭で処理し、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量を高めた処理液を得る工程；得られた処理液を乾燥させ、乾燥物に対し１００から２００質量部の水および有機溶媒を加えることにより混合し、有機層を回収して濃縮物を得る工程；濃縮して得られた濃縮液中の沈殿物を分離し、沈殿物を回収する工程を包含する、乾燥質量換算で２５質量％以上のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを含有するナシ亜科植物葉抽出物を得ることができる。また、上記と同様の操作からＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎ以外のＰｈｌｏｒｅｔｉｎ配糖体も得ることができることが予想される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  以下本発明について説明する。なお、以下に説明する構成は、本発明を限定するものではなく、発明の趣旨の範囲で種々改変することができるものである。【００１１】  本発明の組成物の原料として使用されるナシ亜科植物（学名  Ｍａｌｏｉｄｅａｅ）はバラ科の下位分類の一つでザイフリボク、ボケ、サンザジ、カマツカ、ナナカマド、リンゴ、ナシ、カリンなど日本で古くから親しまれている花木類である。原料としては生葉を乾燥して用いる。ナシ亜科植物葉は腐食しやすいため、収穫した後に直ちに乾燥させて、乾燥物とするのが好ましい。生葉の乾燥は自然乾燥または風乾のいずれであってもよいが、好ましくは風乾により、強制的に乾燥させることが好ましい。乾燥は、水分含量が２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下となるように行うことで、微生物の腐食を防止し、ナシ亜科植物葉中の成分を安定に保持させることができる。【００１２】  この乾燥物は、以下に述べる工程、（ａ）エタノール水溶液による抽出工程、（ｂ）活性炭による処理工程、（ｃ）分液操作により濃縮する工程、（ｄ）濃縮して沈殿物を回収する工程を行うことで、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎを高含有するナシ亜科植物葉抽出物を得ることができる。【００１３】（ａ）エタノール水溶液による抽出工程
まず、乾燥物をエタノール水溶液で抽出を行い、粗抽出液を得る。抽出には、乾燥物をそのまま抽出してもよいが粉砕または細断して抽出することで効率よく抽出することができる。乾燥物の粉砕には、カッター、スライサー、ダイサーなどの当業者に公知の任意の機械または道具により粉砕する。粉砕した乾燥物の粒径は２０ｍｍ以下、好ましくは１０ｍｍ以下、最も好ましくは１ｍｍ以下である。乾燥物からのアルコール水溶液による抽出は、アルコールの含有量が６０〜１００容量％となるように調製し、乾燥物へ添加する。アルコール含有量が６０容量％より低いと、乾燥物からＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎが溶出しにくくなり、結果として得られる粗抽出物中のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量が低下するためである。抽出のためにエタノール水溶液を添加する量または抽出の温度及び抽出の方法は特に制限されるわけではないが、乾燥物から溶液中にＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎが溶出されるように調製する。乾燥物へ添加するエタノール水溶液の量は、好ましくは乾燥物１質量部に対し１０質量部以上であり、合計二回以上の繰り返し抽出操作により乾燥物から効率よくＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを溶出することができる。抽出の温度は室温でも十分であるが、エタノール水溶液が沸騰する温度以下で、好ましくは３０℃〜８０℃、より好ましくは、５０℃〜８０℃で加熱し、必要に応じて加熱還流とすることでエタノールの蒸発を防ぎながら、より効率よく抽出を行うことができる。また、攪拌を行うことで抽出の効率を高めることができ、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎを高含有する抽出液を得ることができる。また、後に述べる活性炭による処理の前に抽出液中の不溶物を除去してもよい。【００１４】（ｂ）活性炭による処理工程
次いで、得られた粗抽出液を活性炭へ接触させ、夾雑物を除去することによってＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを高含有した処理液を得る。通常、活性炭は脱色等を目的として使用されるが、本発明においては、処理液の固形分中のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量を高める目的で使用する。活性炭は、好ましくは表面積が２００〜８００ｍ２／ｇのものを使用することで、抽出液中の夾雑物を効率よく吸着させることができ、結果として溶液中のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量が高められる。この範囲の表面積を有する活性炭であれば、各種の市販品を使用することができ、具体的には、カヤマックス（日本化薬株式会社）、活性炭カルボラフィン（武田薬品工業株式会社）などを挙げることができる。活性炭の量は、抽出に用いたナシ亜科植物葉の乾燥物あたり１０〜２０質量％を添加する。活性炭の量がより多い場合は、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎも活性炭に吸着され、含有量が低下すると考えられるが、１０質量％よりも少ないと、夾雑物の除去には不十分で、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎの含有量を高めることが難しくなる。【００１５】  活性炭と抽出液の接触の方法は、当業者が通常用いる方法、例えばカラム法やバッチ法等で行うことが可能である。なお、活性炭で処理する場合は、処理時の温度を室温から５０℃程度で処理を行うことて、抽出液に含まれる固形分中のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量を高めることができ、可能であれば、加熱還流することが好ましい。【００１６】  カラム法を用いて処理するには、例えば、まず、活性炭をカラムに充填し、そのカラムに抽出液を通液し、溶出してきた液を回収する。さらに必要に応じて充填した活性炭の体積に対し、１〜１０倍量の抽出時に用いたものと同じ濃度のエタノール水溶液を通液させ、好ましくはこの操作を繰り返し、還流させる。これにより、多くの夾雑物は活性炭に吸着され、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎはカラムから十分溶出されるので、得られた溶液の固形分中のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量を高くすることができる。【００１７】  バッチ法を用いて処理するには、粗抽出液に活性炭に加え、攪拌または還流しながら３０分〜１時間接触させた後に、濾過または遠心分離により液層を回収する。さらに、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎの収率を挙げるために、残渣を抽出時に用いたものと同じ濃度のエタノール水溶液で洗浄し、洗浄液を回収することもできる。【００１８】（ｃ）分液操作により濃縮する工程
次いで得られた処理液を濃縮乾固し、分液操作により処理液中のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎの含有量を高める。分液操作は、液体の組み合わせを変えて二回実施する。一例を示すと、一回目に水と酢酸エチルを用いることで酢酸エチル層にＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを回収し、二回目に６０％メタノールとジクロロメタンを用いることで６０％メタノール層にＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを回収できることが判っているが、この範囲に限定されるものではない。各液の混和及び分離の方法は、分液漏斗や撹拌槽、遠心機など溶液のスケールに合わせて、当業者が通常用いる方法によって行うことができるが、抽出物質量の１００容積％以上の液量を用いることが好ましく、３回の繰り返しを行うことで各段階におけるＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎの回収率を向上させることができる。【００１９】（ｄ）濃縮して沈殿物を回収する工程
次いで得られた処理液を濃縮し、濃縮して得られた濃縮液中の沈殿物を分離し、沈殿物を回収する。濃縮の方法は、加熱乾燥や減圧濃縮等、当業者が通常用いる方法によって行うことができるが、好ましくは減圧濃縮により行うことで処理液中の成分の変性を抑えることができる。濃縮は、濃縮液中のエタノール濃度が６０容量％以下、好ましくは０〜６０容量％となるまで濃縮する。得られた濃縮液には、エタノールの含有容量が低下することによって、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎが優先的に沈殿した沈殿物が生じるため、沈殿物に含まれるＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量は飛躍的に向上する。また、沈殿物を十分生じさせるために、１℃〜５０℃で１時間〜２４時間、静置してもよい。この沈殿物を濃縮液から遠心分離や濾過等の当業者が通常用いる方法で分離し、沈殿物を回収することでＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを高含有するナシ亜科植物葉抽出物を得ることができる。なお、濃縮工程にて得られた沈殿物、すなわちナシ亜科植物葉抽出物を６０容量％以下、好ましくは３０容量％以下のエタノール水溶液で洗浄し、夾雑物を除去することで、ナシ亜科植物葉抽出物中のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含有量を高めることもできる。【００２０】  このようにして得られたナシ亜科植物葉抽出物は、このまま飲料等に使用することもできるが、エタノールが含有されているため、好ましくは乾燥し、粉末化する。乾燥には、熱風乾燥、高圧蒸気乾燥、減圧濃縮乾固、電磁波乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥などの当業者が通常用いる任意の方法により行われるが、好ましくは減圧濃縮乾固または凍結乾燥及び噴霧乾燥である。乾燥は、固形分中の水分含量が１０質量％以下、好ましくは５質量％以下となるまで乾燥することが好ましい。噴霧乾燥を行う場合は、必要に応じてデキストリン、シクロデキストリン、デンプン、マルトースのような賦形剤を添加して行われる。好適にはデキストリンが用いられ、抽出物とデキストリンとの比は、乾燥物質量比で１：５〜１０：１が好ましい。【００２１】  なお、乾燥して得られた抽出物の乾燥物は、固まりを形成することが多いため、乾燥後に粉砕したナシ亜科植物葉抽出粉末とすることが好ましい。粉末化することで、様々な形態に応用がしやすくなるだけでなく、食品として摂取した場合においては、吸収の効率が高くなり、優れた生理活性を得られやすくなる。【００２２】  粉砕は、上記にて述べたナシ亜科植物葉の粉砕方法と同様の方法を採用することが可能である。【００２３】  粉砕によって得られる粉末は、好ましくは１０００μｍ以下、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは２０〜２００μｍとすることで、高い生理活性を得ることが可能である。【００２４】  このようにして得られたナシ亜科植物葉抽出物は、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎを高含有し、抽出物の乾燥質量でＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを２５質量％以上、好ましくは２５質量％〜８０質量％含有し得る。また、所定量の活性炭で処理することによって、ナシ亜科植物葉の独特な風味が除去され、さらには、ナシ亜科植物葉中の好ましくない成分も除去されていると考えられ、安全性が高く、かつ汎用的な食品原料として使用しやすい抽出物となる。【００２５】  本発明によって得られた、ナシ亜科植物葉抽出物及びこの粉末は、そのまま用いられるか、あるいは賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などと混合され得る。例えば、ローヤルゼリー、プロポリス、ビタミン類（Ａ、Ｂ群、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、葉酸、パントテン酸、ビオチン、及びこれらの誘導体等）ミネラル（鉄、マグネシウム、カルシウム、亜鉛等）、セレン、キチン・キトサン、レシチン、ポリフェノール（カテキン類、アントシアニン類、プロアントシアニジンなどの縮合型タンニン、ガロタンニン等の加水分解型タンニン、フラボノイド類及びこれらの誘導体等）、カロテノイド（リコピン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、ルテイン等）、サポニン（イソフラボン、ジンセサノイド、グリチルリチン酸等）、キサンチン誘導体（カフェイン等）、脂肪酸、アミノ酸、タンパク質（コラーゲン、エラスチン等）、ムコ多糖類（ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタン、ヘパラン、ヘパリン、ケタラン、ならびにこれらの塩等）、アミノ糖（グルコサミン、アセチルグルコサミン、ガラクトサミン、アセチルガラクトサミン、ノイラミン酸、アセチルノイラミン酸、ヘキソサミン、およびそれらの塩等）、食物繊維（難消化性デキストリン、アルギン酸、グアガム、ペクチン、グルコマンナン等）、オリゴ糖（イソマルトオリゴ糖、環状オリゴ糖等）リン脂質及びその誘導体（フォスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、セラミド等）、含硫化合物（アリイン、セパエン、タウリン、グルタチオン、メチルスルホニルメタン等）、糖アルコール、キノン類（コエンザイムＱ１０等）、リグナン類（セサミン等）及びこれらを含有する動植物抽出物、ウコン、ショウガ等の根菜類、麦若葉末等のイネ科植物やケール等のアブラナ科植物の緑葉等、他の食品素材と組み合わせられる。そしてさらに、ハードカプセル、ソフトカプセルなどのカプセル剤、錠剤、丸剤に成型されるか、または粉末、顆粒、ティーバッグなどの形態にする。これらは、その形状または好みに応じて、種々の食品（例えばハム、ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、パン、バター、粉乳、菓子など）に添加して使用したり、水、酒類、果汁、牛乳、清涼飲料水等の飲物に添加して使用してもよい。【００２６】  また、本発明の抽出物または抽出物の粉末は、食品だけでなく、医薬品、医薬部外品、動物飼料、化粧品、トイレタリー用品などに広く適用し得る。例えば、化粧水、化粧クリーム、乳液、パック、ヘアトニック、シャンプー、ヘアリンス、トリートメント、ボディーシャンプー、洗顔剤、石鹸、ファンデーション、口紅、育毛剤、軟膏、入浴剤、歯磨剤、マウスウォッシュ、シップ、ゲルなどが挙げられ、当業者が用いることのできる基材や動植物抽出物を用いることができる。【００２７】  本発明の抽出物の食品や化粧品などの外用剤への添加量は特に制限はないが、食品としては、好ましくは０．００１〜１００質量％、より好ましくは０．０１質量％〜７０質量％含有される。また、外用剤としては、好ましくは外用剤中に０．００００１質量％〜５０質量％、好ましくは０．０００１質量％〜３０質量％含有させれば、抽出物の持つ生理作用を得ることが可能である。
【実施例】
【００２８】  以下に本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。【００２９】  被験試料としてリンゴ葉を用いた。
［実施例１］
リンゴ葉１ｋｇへ７０Ｌの８５容量％エタノールを加え、室温（２０〜３０℃）にて３日間静置し、減圧下で濾過し抽出液を得た。さらに残渣に７０Ｌの８５容量％エタノールを加え、３日後に減圧下で濾過し、この濾液を抽出液と合わせ、粗抽出液を得た。この粗抽出液を、活性炭カルボラフィン（武田薬品工業株式会社製）を１００ｇ添加し、２４時間室温にて撹拌後、減圧下にてろ過処理液を得た。この処理液を減圧乾固後、分液操作に供した。つまり、得られた抽出物の１００容積％の水および酢酸エチルを加えて混和し、静置した後に回収した酢酸エチル層を減圧乾固して、６０％メタノールとジクロロメタンで同様の操作を繰り返すことで６０％メタノール層を回収した。この処理液を減圧下にて１０Ｌまで濃縮したところで濃縮を止め、２０℃にて一晩放置したところ、沈殿物と上澄み液とに分離した。この液を、遠心分離機を用いて沈殿を回収し、得られた沈殿物を、再度３０容量％エタノール５Ｌ中にて室温にて撹拌洗浄し、減圧下にてろ過し沈殿物を得た。この沈殿物を、６０℃減圧下にて一晩乾燥したところ、乾燥物として２９．６ｇを得た。得られた黄〜橙色の乾燥物中のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含量を、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定したところ、Ｐｈｌｏｒｉｄｚｉｎ含量は２８．４％であった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】  本発明により、乾燥質量換算で２５質量％以上のＰｈｌｏｒｉｄｚｉｎを含有するナシ亜科植物葉抽出物の製造方法を提供することが可能となった。