(57)【要約】【課題】ヒト及び他の動物の発毛を促進するのに適した方法及び組成物を本明細書に開示する。【解決手段】開示する具体例には、アクチン結合ペプチドを備える組成物が含まれる。若干の具体例において、アクチン結合ペプチドは、チモシンβ4の断片を備える。他の具体例において、本開示は、脱毛症及び髪損失に関係する他の症状を処置するのに適するチモシンβ4及び/又は他のアクチン結合ペプチドの断片を備える組成物を提供する。またさらなる具体例において、本開示は、アクチンと結合するチモシンβ4配列のおよそ６つまたは７つのアミノ酸の配列を備える組成物を提供する。【選択図】図１
2010043121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物の髪の成長を促進させる方法であって、対象物の皮膚の目標領域へ完全長配列識別番号1以外のアクチン結合ペプチドからなるポリペプチドへさらすことからなる方法。
【請求項２】
ポリペプチドが、対象物の髪の成長を促進するβ-チモシンの断片、または断片の変異体からなる請求項1記載の方法。
【請求項３】
対象物の髪を促進させる種々の断片が、アクチン結合モチーフの外側の1またはそれ以上のアミノ酸欠失又は置換である請求項２記載の方法。
【請求項４】
変異体が、配列識別番号１と少なくとも70％の相同性を有する請求項２記載の方法。
【請求項５】
β-チモシンの断片がβ4チモシンの断片であり、長さ40アミノ酸残基未満であり、配列識別番号１のアミノ酸残基17-22を含み、チモシンβ４の断片が、０〜５つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項６】
チモシンβ４の断片が、長さ40アミノ酸残基未満であり、配列識別番号１のアミノ酸残基17-23を含み、チモシンβ４の断片が、０〜５つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項７】
チモシンβ４の断片が、長さ20アミノ酸残基未満であり、チモシンβ４の断片が、０〜４つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項５又は6項記載の方法。
【請求項８】
チモシンβ４の断片が、長さ10アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜３つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項５又は6項記載の方法。
【請求項９】
チモシンβ４の断片が、長さ7アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜２つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項５又は6項記載の方法。
【請求項１０】
チモシンβ４の断片が、配列識別番号１のアミノ酸残基17〜22からなる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが、対象物の髪の成長を促進するチモシンβ４の断片又は当該断片の変異体からなる請求項２記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが、配列識別番号１のアミノ酸残基17-23からなる請求項9記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドが、配列識別番号１のアミノ酸残基17-22からなる請求項9記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドが、脱毛症を受けた皮膚の領域へ適応される請求項１記載の方法。
【請求項１５】
脱毛症を受けた皮膚の領域が対象物の頭皮である請求項14記載の方法。
【請求項１６】
アクチン結合ペプチドが、βチモシンの断片、チモシンβ４の断片、T-3からなるが完全長チモシンβではないペプチド、長さ７アミノ酸残基未満のチモシンβ4のアクチン結合領域、長さ６アミノ酸残基未満のチモシンβ4のアクチン結合領域、前述したいずれかの治療的に有効なホモログ又は変異体、及び2つ又はそれ以上のそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
対象物がヒトである請求項1記載の方法。
【請求項１８】
対象物が、非ヒト動物である請求項１記載の方法。
【請求項１９】
髪の成長を促進する組成物であって、当該組成物が、完全長配列識別番号１以外のアクチン結合ペプチドからなるポリペプチドを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２０】
さらに、治療的に適当な担体を含む請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
治療的に適当な担体が、典型的治療製剤である請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
治療的に適当な担体が、ヒドロゲルからなる請求項２０記載の組成物。
【請求項２３】
ポリペプチドが、対象物の髪の成長を促進するチモシンβ４の断片又は当該断片の変異体からなる請求項１９記載の組成物。
【請求項２４】
変異体が、少なくとも配列識別番号１と少なくとも７０％の相同性を有する請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
チモシンβ４の断片が、長さ40アミノ酸残基未満であり、配列識別番号１のアミノ酸残基17-23又は17-22を含み、当該断片が、０〜５つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２３記載の組成物。
【請求項２６】
チモシンβ４の断片が、長さ20アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜４つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
チモシンβ４の断片が、長さ10アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜3つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２５記載の組成物。
【請求項２８】
チモシンβ４の断片が、長さ7アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜2つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２５記載の組成物。
【請求項２９】
チモシンβ４の断片が、長さ６アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜2つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２５記載の組成物。
【請求項３０】
チモシンβ４の断片が、配列識別番号１のアミノ酸残基１７−２３からなる請求項２５記載の組成物。
【請求項３１】
チモシンβ４の断片が、配列識別番号１のアミノ酸残基１７−２２からなる請求項２５記載の組成物。
【請求項３２】
ポリペプチドが、対象物の髪の成長を促進するチモシンβ４の断片又は当該断片の変異体からなる請求項２５記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、ここで参照により組み込む2002年1月25日に出願された米国特許出願60/351,386の優先権を主張する。この開示は、ヒト及び他の動物での髪の成長を促進するのに適した方法及び組成物を提供する。特に、本開示は、脱毛から苦しむ対象物を治療するための方法及び組成物に関する。1つの例において、この開示は、髪の成長を促進するためのチモシンβ4のアクチン結合骨格の外因性輸送に関する。他の例において、本開示は、チモシンβ4のアクチン結合モチーフを含む合成又は蛋白質分解ペプチド断片を使用する髪の成長の促進に関係する。なお他の例において、髪の成長が対象物において、チモシンβ４の7つのアミノ酸残基17-23(以下ここではT-3 という)又はチモシンβ４の６つのアミノ酸残基17-22からなる1又はそれ以上のペプチドで治療することによって促進させる。
【背景技術】
【０００２】
髪の損失は、多くの男性及び女性へ関わることである。多くの個人において、髪の損失(すなわち、脱毛)は、当惑及び/又はうつ病などの心理的問題を引き起こす。脱毛は、女性(女性型脱毛)より男性(男性型脱毛又は男性ホルモン性脱毛症)においてより一般的であるが、男性及び女性の両方へ重大な関心がある。実際に、この問題を解決するために100万ドルもの大金や研究の数え切れない時間が費やされている。成熟髪小胞は、厳しく規制された成長サイクルを有する複合ミニ組織である。出生後成長中に、小胞は、活性ヘアシャフト生産物(発育相)、アポトーシス作用退化(中間期)、鎮静期(テロゲン)の連続的な相を経る(Pausなど、“The Biology of hair hollicles”NEJM  341：491-497（1999）。発育期相の間、活性な髪の成長は、近接小胞上皮細胞において細胞増殖を含み、ついで、延長した小胞の皮下組織への進行、小胞の下地での上皮細胞の分散、及び新しい髪シャフトを増殖させ、発生させる髪マトリックス細胞の形成が生じる。マトリックス細胞の増殖キャパシティーが増大するとき、小胞のより低い部分がプログラムされた細胞死及び退行期を経る髪成長サイクルの規制相(中間相)が生じる。Costsarelisなど、“The hair follicle: dying for attention,”Am. J. Pathol. 151:1505-1509(1997)。この時点で、小胞は、残存期間のテロゲンへ入る。サイクルはその後繰り返される。
【０００３】
頭皮髪小胞は、互いに独立である。100,000頭皮髪の平均において、おおよそ90％が組織再生相(すなわち成長期)である一方、残る10％は、いずれの与えられた時期においてもテロゲン相(すなわち、休止)である。Whiting、“Disorders of Hair,”in Dale and Federman(ed), Scientific American Medicine (from Web MD Scientific American Medicine), New York(1999), pages 2:XIII :1-7.  発育相は、1〜7年の範囲で、約平均3年続く一方、残りの髪が白髪になり新しい髪が成長した後、テロゲン相は平均約3か月続く。頭皮髪成長の平均割合は、およそ0.35ｍｍ/日（すなわち、およそ2-3ヵ月ごとに１インチ）である。発育相において、 頭皮の乳頭を囲む細胞は、活発におよそ12時間ごとに分割し、零列され、より長く成長し、ケラチン化し始める細胞を生産する。発育期とテロゲン期相の間に生じる移行段階中(すなわち、中間期または退化期相)、マイトーシスはもはや生じず、バルブはそれ自体乳頭から分離し、表面に向かって上昇する。テレゴン相において、髪は完全にケラチン化し、押し出される準備ができる。3〜４か月後、別の分裂サイクルが、髪の発芽領域において始まり、別の髪小胞が形成される。
【０００４】
１００頭皮髪/日の平均損失が通常と考えられており、髪が洗浄されたとき、より高い数が落ちる。髪障害の診断において、脱毛が通常であるかどうか落ちた髪が途中で切れたか、根から取れたのかどうか決定する事は需要である。髪は通常根から取れる。しかしながら、髪の外因性障害又は過剰な虚弱は、破壊を生じさせる可能性がある。患者の試験において、髪の引っ張り試験は、異常な脱毛を示した。この試験において、10〜20の髪の群が、人指し指と親指との間で握り、容易に引っ張られた。引っ張られた髪の20％以上の抽出物は潜在的に、異常な脱毛を示し、通常テロゲン髪を含む。テロゲン髪(棍毛)は、それらの白っぽいクラブ型のバルブと根のシースの欠如のために、容易に認識されることができる。通常、発育期の髪は、引き離すのが困難であり、黒っぽく、無傷の根のシースによって根がジグザグ型にされている。(Whiting,Web MD Scientific American Medicine, pages 2: XIII: 1-7(1999))
【０００５】
人において観察される種々の脱毛型がある。もっとも一般的なものは、男性ホルモン性脱毛であり、拡散脱毛、テロゲン放出、発育放出(すなわち、発育アレスト)、円形脱毛症、外傷性脱毛症、抜毛癖、瘢痕性脱毛症及び髪損失の他のタイプも観察される。加えて、癌治療に関連する髪の損失は極めて一般的であり、多くの患者の大きな関心である。実際に、種々の薬(たとえば、α遮断薬、アンギオテンシン転化酵素阻害剤、抗凝血剤、抗けいれん剤、抗甲状腺薬、β遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、コレステロール減少剤、H2レセプター遮断薬、非ステロイド抗炎症剤、レチノイド、レチノール、三環系抗鬱薬)での治療は、かなりの患者に対して髪の損失を生じさせる可能性がある。
【０００６】
重要性に依存して、脱毛症の治療及び処理は、医学的及び外科的治療への観察を続けることから、ヘアピース又はかつらの使用まで広がっている。典型的な2％のミノキシドールは、男性及び女性の両方の用途用に米国食品及び薬品官庁によって認められた。それは、男性及び女性脱毛症患者のおよそ3分の1において視覚可能な髪の成長を、患者のおよそ3分の１において優れた髪の成長を示し、患者のおよそ3分の1においては髪の成長が見られなかった。しかしながら、それは、およそ80％の患者の髪損失を抑制したので、かなり効果的な予防的治療のように見える。Whiting,Web MD Scientific American Medicine, pages 2:XIII: 1-7(1999).  典型的な5％ミノキシドールは、2％溶液よりも短い時間で男性ホルモン性脱毛症患者の45％の可視可能な髪の成長を示した。ミノキシドール投与の副作用は、頭皮炎症及び増加した顔面の髪の毛などを含む。加えて、薬は、それが有効であるかどうかを評価するために少なくとも1年間使用すべきである。もし有効であるなら、薬の使用は無期限に継続されるべきである。
【０００７】
使用が見出された他の化合物は、経口投与されるファイナステロイド(1mg/日)を含む。1mg/日の投与量で、2年間18〜41才までの間の男性患者へ与えて、可視可能な髪の成長は、患者の66％で観察されて、さらに髪損失は83％において防止された。Whiting, Web MD Scientific American Medicine, pages 2: XIII:1-7(1999).しかしながら、更年期の女性への投与は、1年間の期間にわたって与えられた1mg/日の投与では有効的でないことがわかった。ファイナステロイドの副作用は、性欲の欠如、性的能力の欠如、及び精液における穏やかな減少を含む。男性胎児に対する潜在的に厳格な奇形問題のために、薬は予備更年期の女性による使用は禁止されている。
【０００８】
女性における男性ホルモン性脱毛症を治療するための別の薬は、経口の避妊薬（例えば、エチニルエストラジオール-エチノジオールジアセテート、デソゲステリル（desogesterl）ーエチニルエストラジオール、及びエチニルエスタラジオールーノルゲステリメート）を含み、それらは髪の損失を減少させ、時にはわずかな髪の成長を導く。Whiting,Web MD Scientific American Medicine, pages 2:XIII: 1-7(1999).  経口スピロノラクトン及びデキサメタゾンは、女性患者の治療においてもまた使用が見出されている。
【０００９】
脱毛症の他の型に対して、種々の手法がアントラリン、ソラレン、及びウルトラバイオレットＡ，ステロイド、典型的な免疫療法、免疫抑制薬、長期間抗微生物処理などを含む。しかしながら、これらの処理体制のいくつかは、リスク、関連する厳格な副作用が存在する。
【００１０】
これらの組成物へ応答しない場合には、ミニグラフ、マイクログラフでの髪の埋め込みは、頭皮の後ろ及び横で髪の良好な保有地を有する患者に対して選択枝とすることができる。他のケースにおいて、ヘアピースは、第一の選択枝である。実際に、髪損失の上手い処理及び予防の追及における根源の大きな要求にもかかわらず、以前に知られた治療のすべては、深刻な欠点から悩まされている。それゆえ、髪成長を促進するための組成物及び方法の必要性が存在する。
【００１１】
絶えず更新する髪小胞の能力は、分割において2つタイプの娘細胞が発生する多能性幹細胞の存在によって確実にすることができる。娘細胞のいくつかは、同じ多能性表現型のままである一方、他のものは、各新しいサイクルでのオンセット及び髪のシャフトの形成でのより低い小胞の再生成のために識別可能な子孫を提供する迅速-分割転移増幅細胞(ＴＡ)となる。Janes など、“Epidermal stem cells,”J. Pathol. 197:479-494(2002).最近、起毛筋の挿入部に近接して位置する小胞の隆起領域が、幹細胞“ニッチ”と同定された。Lyleなど、“Human follicle bulge cells are biochemically distinct and possess an epithelial stem cell phenotype”, J. Invest. Dermatol. Symp. Proc. 4:296-301(1999); Yaylor など、“Involvement of follicular stem cells are biochemically distinct and possess an epithelial stem cell phenotype,”Cell 102:453-461(2000); Oshimaなど、“Morphofenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells,”Cell 104:233-245(2001)参照.発育期のオンセット時において、隆起が存在する多能性幹細胞又は他のＴＡ娘細胞は、マトリックス細胞になり、新しい髪シャフトを生産するために小胞のベースへ移動する。興味あることには、隆起領域から放出する細胞は、髪マトリックスを再び居住されるために下へ移動し、皮膚上皮細胞を再び補充するために上へも移動し、それゆえ、傷治療プロセスにも貢献することができる。
【００１２】
牛胸腺から単離されたユビキタス4.9ｋＤａポリペプチドである、チモシンβ4は、細胞マイグレーション及び分化のいくつかのタイプの有力な仲介役である。Low など、“Complete amino acid sequence of bovine thymosin, a thymic hormone that induces terminal deoxynucleotidyl trasferase activity in thymocyte populations”Proc. Natl. Acad. Sci. 78:1162-1166(1981); Grant など“Ａ novel role for thymosin beta 4: a Matrigel-induced gene involved in endothelial cell differentiation and angiogenesis”, J. Cell Science 108: 3685-3694(1995); Malinda など、“Thymosin  β4 stimulates directional migration of human umbilical vein endothelial cells,”FASEB J. 11:474-481(1997); Malinda など、“Thymosin β4accelerates wound healing”J.Invest. Dermatol. 113:364-368(1999); Sosneなど、“Thymosin beta 4 promotes corneal wound healing and decreases inflammation in vivo following alkali injury,”Ex. Eye Res. 74:293-299(2002).  チモシンβ４は、初期の内皮細胞チューブ形成中に４〜６倍に規制される遺伝子が同定され、その後、血管形成を促進することが示された。それは傷の液体に存在し、典型的に加えれ、又は系統的に与えらたとき、血管形成を促進し、傷を治療する。Frohmなど、“Biochemical and antibacterial analysis of human wound and blister fluid,”Eur. J. Biochem. 237: 86-92(1996); Malinda など、J. Invest. Dermatol. 113:364-368(1999). それは、潜在的に抗炎症性でもある。Sosneなど、Ex. Eye Res. 74:293-299(2002); Frohm など Eur. J. Biochem. 237: 86-92(1996); Young など、“Thymosin beta 4 sulfoxide is an anti-inflammatory agent generated by monocytes in the presence of glucocoticoids,”Nat. Med. 5: 1424-1427(1999).  さらに、チモシンβ4は、転移性腫瘍における増加したレベルで存在し、低い転移細胞の中へトランスフェクトしたとき、悪性腫瘍が増加する。Clarkなど、“Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC,”Nature 406: 532-535(2000), Kobayashi など“Thymosin-beta 4 regulates motility and metastasis of malignant mouse fibrosarcoma cells”Am J. Pathol. 160: 869-882(2002). 関連するファミリーメンバーであるチモシンβ15は、ある腫瘍タイプの転移においても重要である。Baoなど、“Thymosin beta 15: a novel regulator of tumor cell motility upregulated in metastatic prostate cancer,”Nat. Med. 2:1322-1328(1996); Bao など、“Thymosin beta 15expression in tumor cell lines with varying metastatic potential,”Clin. Exp. Metastasis 16: 227-233(1998). チモシンβ４の転移活性は、その男性ホルモン及びマイグレーション促進活性、及び免疫監視を阻害するためのそのポテンシャルに関係する可能性がある。最近、チモシンβ4は、強力な抗菌薬であることが見出された。Tung など“Antimicrobial peptides from human platelets,”Infect. Immun. 70：6524-6533(2002)。
【００１３】
チモシンβ4は、典型的に、内皮細胞及びケラチン生成細胞のマイグレーションを促進し、細胞外マトリックス分解酵素の生成を増大させる作用がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本開示は、異なる試験管内及び生体内における実験モデルにおいて、髪成長におけるチモシンβ４の役割を証明する。チモシンβ４は、通常のマウスと同様に、老化したもの及びヌードマウスの両方において、髪の成長を促進させた。いかなる特定の理論に拘束されることなしに、隆起領域で生じるマウス皮膚における小胞ケラチン生成細胞の特定のサブセットは、髪成長サイクルの異なるステージ中にかなり調整された手法においてチモシンβ4を発現する。これらのケラチン生成細胞の時間的及び空間的貢献は、幹細胞及び髪サイクルの異なる段階でのそれらの娘TA細胞に対して、Taylor等、Cell  102：453-461(2000)などに報告されたパターンと類似する。ラット鼻毛小胞の隆起成分から単離されたとき、クローン化ケラチン生成細胞はさらに、幹細胞の中間子孫細胞として特徴付けられ、試験管内で培養したとき、チモシンβ4のかなり高いレベルを発現することが見出された。チモシンβ４は、髪クローン化ケラチン生成細胞マイグレーション、及び細胞外マトリックス分解酵素MMP-2 の分泌を促進することが見出された。両方を考慮すると、結果は、その既知の血液形成及び傷治療特性に加えて、チモシンβ４は、髪成長を典型的に生じるモジュレーターである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ここで開示されるのは、チモシンβ４のアクチン結合部分(“Tβ4”)、アクチン(例えば、T-3 又は残基7-22)又はいずれか他のアクチン結合ポリペプチドと結合するチモシンβ4配列の配列部分を含む治療的に有効な量のペプチドを対象物に投与することによって、ヒト及び他の動物における髪成長を促進させる方法である。ある試験において、Tβ4は典型的にヒドロゲル混合物において典型的に投与された。一つの限定されない例において、T-3 は、治療的に有効的な量において投与される。
【００１６】
本開示は、さらに、髪の成長に関連するチモシンβ4配列の最小断片、例えば、“T-3” 断片(残基17-23)又はより短いアクチン結合配列(残基17-22)を提供する。これらの配列を含む断片又はペプチドは、ヒト及び他の動物について髪の成長を促進させるのに使用することができる。いくつかの実施態様において、これらの配列の１又はそれ以上からなるペプチドは、治療すべき領域に典型的に適用される。他の実施態様において、ペプチドは、追加の成分と組み合わせて適用され、限定されないが、抗菌薬、抗寄生虫薬、皮膚及び/又は髪コンディショナー、ソープ、皮膚軟化用クリーム及び他の適当な成分を含む。追加の実施態様において、T-3は担体及び/又はゲルと組み合わせて適用する。さらに他の実施態様において、T-3 は、ヒドロゲルと組み合わせて適用する。
【００１７】
さらなる実施態様において、本開示は、髪成長を促進する際に用途を見出すアクチン結合領域を提供する。これらの配列の変異体又はホモロジー(例えば、保存及び/又は非保存アミノ酸変化をもつ)も髪の成長を促進する際に見出されることも意図する。あるいは、ペプチドは、アクチン結合配列(残基17-22)の外側の１又はそれ以上の保存置換を有する完全長Tβ４配列を含む。アクチン結合ポリペプチド部分のポリマー(例えば、Tβ4のダイマー及びトリマー、又はTβ４のアミノ酸17-22配列を含むペプチド)も、いくつかの融合分子がアクチン結合部分へ結合できるように、向上した髪成長活性を示すことができる。それゆえ、本開示において有益なアクチン結合部分は、多くの方法において発現させることができ、より大きなペプチドの部分、融合分子の部分、又はそのポリマー又は組み合わせを含む。
【００１８】
さらに、別の実施態様において、チモシンβ４の単離されたクローン化可能髪小胞幹細胞への外因性添加は、増加したマイグレーション、向上したマトリックス金属プロテイナーゼ（MMP）活性(具体的に、向上したMMP-2 レベル)を導く。この及び関連する実施態様において、分化を促進するが、増殖させずに、髪小胞幹細胞を活性化させることができる。ある実施態様において、髪成長についての多くの活性重要性は、マイグレーション、プロテアーゼ生成、および分化を含め、幹細胞において促進される。
【００１９】
ソニックヘッジホッグは、髪小胞の発育期への導入を促進することを示した。Satoなど、“Induction of the hair growth phase in postnatal mice by localized transient expression of Sonic hedgehog,”J. Clin. Invest. 104: 855-864(1999). Shhシグナルは髪成長に伴うWntシグナル経路と交差し影響する。Tβ４は、クローン化可能なケラチン生成細胞の原子核に存在し、同様にシグナルを規定する。理論に拘束されないが、チモシンβ４のアクチン結合部分は、ある実施態様において、順に髪小胞を発育期への導入を促進するソニックヘッジホッグ発現を活性化することができる。
【００２０】
チオシンβ４のアクチン結合領域のような血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)は、血管由来である。ＶＥＧＦ又はチモシンβ４のいずれかによって誘導される髪小胞は、より大きいサイズである。Yanoなど、“Control of hair growth and follicle size by VEGF-mediated angiogenesis,”J. Clin. Invest. 107:409-417(2001)。それゆえ、ある実施態様において、チモシンβ４配列のアクチン結合領域、Ｔ−３又は他のアクチン結合ペプチドは、血管形成を促進することによって髪成長及び/又は小胞細胞を向上させる。ここで開示されるペプチドは、また他の髪成長促進成分（局所的又は経口投与的に）、例えばミノキシデール又はフィニステロイドなどと(同時に、又は連続的に)組み合わせて使用することもできる。いかなる理論にも拘束されないが、チモシンβ４のアクチン結合部分は、ある実施態様において、髪小胞を順に発育期へ導入することを促進するＶＥＧＦ発現を活性化する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、ラット皮膚の組織学的断面の顕微鏡写真のデジタルイメージであり、7日後の向上した傷封止及びチモシンβ4で皮膚を治療した後の傷部での追加の髪小胞を示す。
【図２】図２Ａ−２Ｄは、ヒドロゲルにおけるチモシンβ4が7日間の後処理でラット皮膚の新しい髪成長を刺激することを示す顕微鏡写真のデジタル像である。
【図３】図３Ａ−３Ｄは、ヒドロゲルにおけるチモシンβ4が30日間の後処理でラット皮膚の新しい髪成長を刺激することを示す顕微鏡写真のデジタル像を示す図である。ヘモトキシリン及びエオシン（“Ｈ＆Ｅ”）株を使用した。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、チモシンβ4での細胞欠陥ヌードマウスの局所的治療の30日直後の活発に髪小胞の数の増加を示す顕微鏡写真のデジタル像である。増加した数の小胞がヒドロゲル対照例と匹敵して観察された。
【図５】図５Ａ−５Ｄは、ヒドロゲルにおいて0.05％のチモシンβ4での処理7日試験後、チモシンβ4で処理した老化マウスは増加した小胞展開を示す顕微鏡写真のデジタル像である。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、水担体において適用したチモシンβ４（アミノ酸17-23すなわち、配列識別番号１のLeu Lys Lys Thr Glu Thr Gln、ここでＴ−３ともいう）の７アミノ酸断片が、老化マウスにおいて髪小胞展開を刺激することを示す皮膚サンプルの顕微鏡写真のデジタル像である。
【図７】図７Ａ−７Ｆは、対照例及びチモシンβ4処理動物からの皮膚の組織学的出現を示す顕微鏡写真のデジタル像である。図７Ａ−７Ｃは、対照例担体処理皮膚である。図７Ｄ、７Ｅは、チモシンβ４処理皮膚を示す。図７Ａ、７Ｄは両方とも治療7日後のラット皮膚を示す。図７Ｂ、７Ｅは、治療7日後の老化マウス皮膚を示す。図７Ｃ、７Ｆは治療35日後のヌードマウス皮膚を示す。
【図８】図８Ａ−８Ｃは、脱毛誘発髪成長サイクル及びチモシンβ４発現細胞の免疫学的局在化後、正常なマウス皮膚の組織学的出現を示す顕微鏡写真のデジタル像である。(Ｓ＝脂肪質腺、Ｍ＝髪マトリックス、ＡＰ＝立毛筋、矢印は隆起領域及びチモシンβ4プラス染色細胞の場所を示す。)
【図９】図９Ａ−９Ｃは、ラット鼻毛由来のクローン化可能な幹細胞による単離、培養、及び種々のケラチン及びチモシンβ4を示す顕微鏡写真でのデジタル像である。図９Ａは、抗ケラチン１５抗体で免疫染色したことを示す挿入、拡大の隆起領域の場所を示す顕微鏡写真である。（ケラチン１５は、髪小胞幹細胞に対する分子マーカーである。ケラチン５及び１４は幹細胞において発現することも知られている。）図９Ｂは、6日後の幹細胞の培養を示す。２つのクローン化可能な集団が観察されるのに着目。図９Ｃは、幹細胞の抗体を用いたチモシンβ４への免疫染色である。図９Ｄは、単離された幹細胞によってケラチン発現のパターンを示す種々のケラチン抗体を有するクローン化幹細胞のウエスタンブロットである。ケラチン１０（Ｋ１０）の発現、最終分化の初期マーカーの不存在、及び隆起誘導幹細胞に特徴的なＫ５、Ｋ１４及びＫ１５の存在に着目。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、外因性チモシンβ4がクローン化ラット鼻毛幹細胞によってケラチン１５ｍＲＮＡ発現を減少させることを示すブロット及び図である。同様のノーザンブロット及び評価も示される。細胞を血清から16時間枯渇させて、その後、チモシンβ４の異なる濃度の存在又は不存在下において6時間培養した。この処理後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、溶解物を抗ＧＡＰＤＨ抗体で免疫ブロットした(図１０Ａ、上部パネル)。同じ膜を抗ＧＡＰＤＨ抗体で再プローブ化し(図１０Ａ、下部パネル)、結果をデンシトメータで標準化した（図１０Ｂ）。幹細胞マーカーＫ１５の発現における減少は、チモシンβ４が髪小胞幹細胞分化の促進を通じて髪の成長へ貢献することを示唆する。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｃは、外因性チモシンβ4がＭＭＰ−２レベルを増加するが、クローン化幹細胞におけるＭＭＰ−９レベルには影響を与えなかった。ザイモグラフ分析及び評価も示される。破線は、細胞溶解物を示し、実線は、条件培地を現す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（配列リスト）
添付のシークエンスリスティングに記載されたアミノ酸配列は、37 C. F. R. 1.822に定義されているように、アミノ酸用の標準的な3文字コードを使用して示されている。添付のシークエンスリスティングＴβ4は配列番号１として与えられる：Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Serである。
（いくつかの実施態様の詳細な記載）
（略語及び用語）
以下の用語及び方法の説明は、本開示をよりよく説明し、本開示を当業者が実施するガイドラインとするために提供される。ここで及び与えられた特許請求の範囲において、単数型の“a”又は“an”又は“the”は、文脈が他に明らかに指図しないなら、複数の言及を含む。例えば、“a protein”は、このようなタンパク質群の複数を含み、“the antibody”は、当業者に知られた1種又はそれ以上の抗体、及びその同等物、及びその他への言及を含む。
【００２３】
他に説明しない限り、ここで使用するすべての技術的科学的用語は、本開示に属する当業者に一般に理解されるようなものと同じ意味である。
【００２４】
略語：℃(摂氏度)；Ｈ２Ｏ(水)；aa 又はAA(アミノ酸)；bp(塩基対)；kb(着ろベース対)；ｋD又はｋDa（キロダルトン）；gm(グラム)；μg(マイクログラム)；mg(ミリグラム)；ng（ナノグラム）；μl又はμL（マイクロリットル）；ml又はｍL（ミリリットル）；mm（ミリメートル）；nm（ナノメートル）；μm（マイクロメートル）；M（モル）；mM（ミリモル）；μM（マイクロモル）；U（ユニット）；MW（分子量）；sec（秒）；min(s)(分)；hr（s）（時間）； BSA（ウシ血清アルブミン）；PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；PBS（リン酸塩緩衝液[150mM  NaCl、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐH7.2]）；PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）；RT(室温)；SDS（硫酸ドデシルナトリウム）；w/v(重量体積)；v/v(容量体積)H&E（ヘマトキシリン及びエオシン株）HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-２-エタンスルホン酸）；HUVEC(ヒトへその緒血管内皮細胞)；Sigma(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)；American Histolabs(American Histolabs、Gaithersburg,MD)；及びHawkeye-Jensen、Inc.(Hawkeye-Jensen,Inc．,Reading, PA)。
【００２５】
アクチン結合ペプチド：アクチンに結合し髪の成長を促進するペプチドは、限定されないが、アミノ酸のT-3 配列、Tβ4に含まれるアミノ酸残基17-22の配列、アミノ酸Leu Lys Lys Thr Asn Thrの配列、アミノ酸Leu Lys Lys Thr Asn Thr Gluの配列を含むそれらのペプチド、及び２までの保存アミノ酸置換を有する前述の配列のいずれかからなるペプチドを含む。当業者は、実施例１０に記載された技術によって本開示に用途を見出すことができる追加の関連アクチン結合ペプチドを容易に同定することができる。例えば、アクチン結合ペプチドは、管出芽活性を外因性アクチンの添加によって阻害されるそれらのペプチドとして同定することができる。いくつかの実施態様において、約0.3μM、又は0.5μM又は0.5〜2.5μMより大きい解離定数で、有益なアクチン結合ペプチドは、G-アクチンを有する錯体を形成する。
【００２６】
脱毛：髪が通常存在する場所からの髪損失(すなわち、はげ又は髪が薄いこと)
この用語は、いかなる原因から生じた髪の損失をも含むことを意図する。好ましい実施態様において、この用語は、限定されること意図するものではないが、頭皮の髪損失をいう。実際には、この用語は、完全な又は部分的髪の損失、髪が通常存在するいずれかの体の部分で発育期にある小胞の数又は小胞の脱落、又は減少を含むことを意図する。
【００２７】
化学合成：ある者がタンパク質又はペプチドを作ることができる人口的手段。合成タンパク質又はペプチドはそのような人口的手段によって作られるものである。
【００２８】
含む（comprise）：この用語は、含むことを意味する。たとえば、“comprising A or B”は、もし他に明らかに指示しないなら、A,B又はA及びBの両方を含むことを意味する。
【００２９】
促進する(Enhance):何かの質、量、強さを改善すること。１つの実施態様において、もし対象物の髪損失が、阻止、停止、又は反転（すなわち、小胞数の増加又は発育相における小胞数の増加）されているなら、処理は、対象物(例えば、脱毛又は髪損失に関係する他の条件から苦しむヒト)において髪の成長を促進又は増加させる。促進された髪の成長は、髪引っ張り試験などによって測定された減少した根での脱落、断線、虚弱のいずれかも含む。いずれの促進も、当該技術で既知のいずれかの方法、ここで開示するいずれかの方法、例えば、処理した領域又は対照例に対する対象物の量的、質的比較を使用して測定することができる。
【００３０】
断片：Tβ4、T-3又はいずれかの他のペプチドの断片は、完全長配列より少ないアミノ酸残基のいずれの配列も含む。それゆえ、Tβ４の断片は、配列識別番号１に含まれる４２残基までの配列を含むであろう。同様にT-3 の断片は、t-3としてここで定義された配列に含まれる６までのアミノ酸残基を含む。
【００３１】
髪：哺乳類を含め動物に観察される表皮上皮組織の陥入から誘導又は突き出ている特異的ケラチン化構造。したがって、この用語は、種々の非ヒト動物の髪のコート(例えば、毛皮)も含むことを意図するものである。
【００３２】
相同：関連タンパク質の記述。ある好ましい実施態様において、この用語は、ここで開示される種々のアクチン結合ペプチド、及び同様の配列、構造、機能及び/又は他の特性を有する他のタンパク質/ペプチドを参照して使用される。配列同一性/類似性の定義内でのディスカッションを参照。
【００３３】
ヒドロゲル：種々のポリマーのいずれかからなるいずれのヒドロゲル。医学分野において、多くの所有者のヒドロゲル配合が知られている。ある実施態様において、交差結合ポリマーポリマーゲルのヒドロゲルシートが使用される。種々の起源からのヒドロゲルを本方法及び組成物に使用することができ、限定されないが、市場で入手可能なヒドロゲル、傷の使用に適するもの、例えば、TEGAGEL登録商標（３M）、VIGILON登録商標（Bard）、CLEARSITE登録商標(Conmed)、AQUASORB登録商標（DeRoyal）、FLEXDERM登録商標（Bertek[Dow Hickam]）、NU-GEL登録商標（Johnson＆Johnson）、CURAGEL登録商標（Kendall）、DERMA−GEL登録商標(MedLogic Global, United Kingdom)、及び0.2％ポリアクリル酸（Hawkeye-Jensen、Reading PA）．
【００３４】
局所(Local)：“Localized”及び”Local“は、限られた領域の関与をいう。それゆえ、全体のボディが伴う組織的処理(通常、血管及び/又はリンパ系を通じて)とは対照的に、局所的処理は、特異的、限定された領域の処理を伴う。それゆえ、ここでのいくつかの実施態様において、別個の領域は本開示の方法及び組成物を使用して局所的及び/又は限定的に処理される。
【００３５】
薬剤的に適当な担体：薬、薬剤など対象物へ移送するための当該技術で既知及び使用されるいずれかの多くの担体。ここで薬剤的に適当な担体は、特に局所的用途において移送するのに特に適するとすることができ、限定されないが、ヒドロゲル、クリーム、ローション、シャンプー、皮膚軟化剤、85％エタノール/15％エチレングリコール、軟膏(salves)、スプレー、オイル、ドレッシング、ドロップ、軟膏(Ointments)、リポソーム、などを含む。
【００３６】
ポリペプチド：モノマーがアミド結合を通じて結合したアミノ酸残基であるポリマーをいう。アミノ酸が、αアミノ酸の場合、L-光学異性体又はD-光学異性体のいずれかを使用することができ、L-異性体が好ましい。ここで使用するポリペプチド又はタンパク質は、いずれかのアミノ酸配列及び糖タンパク質などの修飾配列を含むことを意図する。用語ポリペプチド及びペプチドは、天然に生じるタンパク質、及び組み換え又は合成的に生産されたものも含むと具体的に意図すべきである。したがって、Tβ４の残基17-22のアミノ酸配列を含むTβ４、T-3、及びペプチド、又はそれらの配列のいずれかのポリマーは、組み換え的に合成されることができ、バクテリア又は酵母菌のものも含む。
【００３７】
「ペプチドの機能的断片」の語は、Tβ4などのポリペプチドの活性を保持するポリペプチドのすべての断片をいう。生化学的に機能的断片は、例えば、抗体分子と結合可能なエピトープのように小さいペプチド断片から特異的誘発に寄与可能な、又は細胞増殖又は分化などに影響する細胞内の表現型変化をプログラムすることが可能な大きいポリペプチドなどサイズにおいて変えることができる。「エピトープ」とは、抗原と接触反応して生じた免疫グロブリンと結合可能なポリペプチドの領域である。
【００３８】
「可溶な」の用語は、細胞膜に挿入されないポリペプチドの型をいう。ここで開示されるポリペプチドは、可溶なポリペプチドとすることができる。
【００３９】
ここで使用する「実質的に精製したポリペプチド」の用語は、他のタンパク質、脂質、炭水化物、又は一般に関連する他の物質が実質的に存在しないポリペプチドをいう。1つの実施態様において、ポリペプチドは、他のタンパク質、脂質、炭水化物、又は一般に関連する他の物質が少なくとも50％、例えば少なくとも80％が存在しないものである。別の実施態様において、ポリペプチドは、他のタンパク質、脂質、炭水化物、又は自然に関連する他の物質が少なくとも90％存在しないものである。さらに別の実施態様において、ポリペプチドは、他のタンパク質、脂質、炭水化物、又は自然に関連する他の物質が少なくとも95％存在しないものである。
【００４０】
保存置換は、大きさにおいて類似の、例えば、疎水性である別のアミノ酸であるアミノ酸を置き換えることである。保存置換の例を以下に示す。
2010043121.tif 000003
【００４１】
保存的であるかどうかアミノ酸変化において生ずるｃDNA配列におけるバリエーションは、コード化されたタンパク質の機能的及び免疫的同一性を保存するために理想的には最小化される。それゆえ、いくつかの限定されない例において、変異体ポリペプチドは、最大２つ、最大５つ、最大１０つ、最大２０、又は最大40の保存置換を含む。タンパク質の免疫学的同一性は、抗体によって認識されるかどうか、このような抗体によって認識される変異体が免疫学的に保存されるかどうかによって決定されることによって評価することができる。いずれのｃDNA配列変異体は、20より少なく、好ましくは10アミノ酸置換より少なく、コード化されたポリペプチドへ好ましく導入される。変異体アミノ酸配列は、例えば、野生型アミノ酸配列と80％、90％、又はさらに95％又は98％同一とすることができる。
【００４２】
促進(promote):ここで使用される“enhance”と同様に解釈される。
【００４３】
サンプル又は標本：本明細書及び特許請求の範囲において、これらの用語はそれらの広い意味において使用される。これらの用語は、ヒト及び他の動物から得られるすべてのタイプのサンプルを含み、限定されないが、尿、血液、糞便物質、中枢神経系の液体、精液、唾液、及び固体組織、髪などを含む。しかしながら、これらのサンプルは、本開示に適用可能なサンプルを限定するものとして考えられるべきではない。
【００４４】
配列同一性/類似性：２つ又はそれ以上の核酸、又は2つ又はそれ以上のアミノ酸配列間の同一性/類似性は、配列間の同一性又は類似性の点で表現される。配列同一性は、より高い割合、さらに同一性の高い配列など、同一性の割合の点で測定することができる。配列類似性は、より高い割合、さらに同様の配列など、類似性の割合(保存アミノ酸置換を考慮して)の点で測定されるべきである。
【００４５】
比較のための配列の補正方法は、当該技術において周知である。種々のプログラム及び補正アルゴリズムは、Smith  ＆  Waterman,  Adv. Appl. Math. 2:482(1981)；Needleman  ＆  Wunsch,  J. Mol. Biol. 48:443(1970); Pearson & Lipman, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988); Higgins & Sharp,Gene, 73:237-44(1988); Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Computer Appls, in the Biosciences 8:155-65(1992); and Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24: 307-31(1994). Altschul et al., Mol. Biol. 215: 403-10(1990)に記載されており、配列調整方法及びホモロジー計算の詳細な考慮が存在する。
【００４６】
NCBI基礎局所調整研究装置（BLAST）(Altschulなど、J.Mol. Biol. 215:403-10(1990)は、配列分析プログラムblastp,blastn,blastx,tblastn及びtblastxと組み合わせて使用して、the National Center for Biological Information( NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD20894),及びインタネット上で、いくつかの起源から入手可能である。追加の情報もNCBIウエブサイトで見出すことができる。
【００４７】
約30アミノ酸より多いアミノ酸配列の比較用に、Blast2配列機能を初期設定パラメータがセットされた初期設定BLOSUM６２マトリックスを使用して用いられる(１１のギャップ存在コスト、及び１のギャップ残基コストごとに)。短いペプチドを調整するとき(約30アミノ酸より短い)、調整は、Blast２配列機能を使用して行うべきであり、初期設定パラメータでセットされたPAM30マトリックスを使用する。(オープンギャップ９、延長ギャップ１ペナルティ)。参照配列により類似するタンパク質は、この方法によって評価したとき、例えば、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、さらに99％配列の同一性など、増加する同一性割合を示すであろう。全体の配列より少ないものが配列同一性用に比較されるとき、ホモログは、10〜20のアミノ酸の短いウインドウに渡り少なくとも75％、参照配列のそれらの同一性に依存して、少なくとも85％、90％、95％、又は98％の配列同一性を典型的に保有する。当該短いウインドウに渡る配列同一性を決定するための方法は、NCBIウエブサイトに記載されている。
【００４８】
タンパク質ホモログは、例えばnr又はスイスプロットデータベースなどのデータベースでギャップしたblastpのNCBIベーシックBlast2.0を使用するアミノ酸配列で完全長調整にわたり計算された少なくとも70％、例えば、75％、80％、85％、90％、95％又はさらに98％配列の同一性を所有することによって典型的に特徴付けられる。Blastnプログラムで調査した概念は、ＤUSTでろ過される(Hancock and Armstrong, Comput, Appl. Biosci. 10:67-70(1994)。他のプログラムは、SEGを使用する。
【００４９】
当業者は、これらの配列同一性の範囲がガイダンスとしてのみ提供されると賞賛するであろう。提供された範囲外にあるかなり意味のあるホモログが得られることが可能である。ここで提供されることは、上述したペプチドホモログ、及び当該ホモログをコード化する核酸分子である。
【００５０】
同一性の高い度合いを示さない核酸配列は、それにもかかわらず、遺伝子コードの縮退のために同一又は類似の(保存された)アミノ酸配列をコード化する可能性がある。核酸配列における変化は、この縮退を使用してなされ、実施的に同一のタンパク質をすべてコード化する多数の核酸分子を生産することができる。当該ホモログぺプチドは、例えば、この方法によって決定される少なくとも75％、80％、90％、95％、98％又は99％の配列同一性を所有する。全配列より少ないものが配列同一性について比較されるとき、ホモログは、例えば、10〜20アミノ酸の短い枠に渡って少なくとも75％、85％、90％、95％、98％又は99％の配列同一性を所有することができる。当該短い枠に渡る配列同一性を決定する方法は、NCBIウエブサイトで見出すことができる。当業者は、これらの配列同一性範囲が、ガイダンスとしてのみ提供されることを賞賛するであろう。この提供された範囲外にある意味のあるホモログ又は他の変異体が得られることができる可能性がある。
【００５１】
対象物：ヒト及び獣医対象物、例えば、哺乳動物、齧歯動物、及び鳥などの両者を含めた生多細胞脊椎動物組織。
【００５２】
治療的に有効な量：所望の生化学的効果を達成するために十分な量、例えば、髪成長を高めるために有効な量。特別の例において、それは、投与される対象、又は髪小胞を含むいずれかの他の生存又は非生存サンプルなどにおいて髪成長を向上させるのに有効なTβ４、T-3又は他のアクチン結合ペプチドの濃度である。
【００５３】
治療的に有効な量は、単一投与又は幾らかの投与、例えば治療の過程中の毎日投与することができる。
【００５４】
ここで記載された方法は、医学及び獣医学環境におけるのと同様の用途を有する。それゆえ、「治療される対象物」の一般的な用語は、髪成長の向上、クローン化可能な幹細胞マイグレーションの増加、幹細胞マイグレーションの増加、又はマトリックス金属プロテイナーゼ（MMP）活性の向上など所望の生物学的効果における増大を要求するすべての動物（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ及びウシなど）を含むと理解されるべきである。
【００５５】
治療的に有効なホモログ：いくつかの「治療的に有効な量」で対象物において髪成長を向上させる相同配列。
【００５６】
チモシンβ４：43アミノ酸の小タンパク質(Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser、配列識別番号１)。この用語は、天然、組み換え、及び合成チモシンβ4を含むことを意図するものである。ここでは、またTβ４又はTβ4という。
【００５７】
T-3：完全長Tβ4配列（すなわち、配列識別番号１）のアミノ酸17-23に相当する7つのアミノ酸配列Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln。この用語は、天然、組み換え、及び合成T-3を含むことを意図するものである。
【００５８】
局所的に適用された：皮膚、粘膜、内臓、髪などの表面への適用。言い換えれば、摂取又は注射されないこと。
【００５９】
局所的活性試薬：適用部位で薬理学的応答及び生物学的効果を引き起こす物質又は組成物。
【００６０】
変異体：一般に「変異体」は、相同ペプチドをいう。
【００６１】
変異体：一般に「変異体」は、相同ペプチドをいう。
【００６２】
チモシンβ４の「変異体」は、1又はそれ以上のアミノ酸(配列識別番号１に明らかにされた配列と比較して)によって変えられたチモシンβ４をコード化する配列と類似するアミノ酸配列をいう。それゆえ、「変異体」は、Tβ４と１００％より低い配列同一性を有するであろう。変異体は、置換アミノ酸が、同様の構造及び化学的特性（例えば、ロイシンのイソロイシンでの置換）を有する「保存」変化を有することができる。もっとまれには、変異体は、「非保存」変化とすることができる(例えば、グリシンのトリプトファンでの置換)。同様の少数の変異体は、アミノ酸欠失又は挿入又はその両方を含むこともできる。アミノ酸残基が生物学的又は免疫学的活性を駄目にすることなしに置換、挿入又は欠失することができることを決定するガイダンスは、当該技術で周知のコンピュータープログラムを使用して見出すことができ、上記「配列同一性/類似性」と関連して議論することができる。
【００６３】
同様に、T-3の「変異体」は、アミノ酸17-23を表現するチモシンβ4の断片に類似するアミノ酸配列であるが、1又はそれ以上のアミノ酸によって変えられている。チモシンβ４の変異体として、変化を保存又は非保存とすることができる。
【００６４】
ここで述べたいずれのアミノ酸配列又は断片は、同様に「変異体」を有する。
【００６５】
（説明）
本開示は、ヒト及び他の動物において髪成長を促進するのに適した方法及び組成物に関する。特に、本開示は、アクチン結合ペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、本開示は、脱毛症の治療又は髪損失に関係する他の状態に適する1又はそれ以上のチモシンβ４断片及び/又は他のアクチン結合ペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの特に好ましい実施態様において、本開示は、アクチンと結合するチモシンβ4配列の６つ又は7つのアミノ酸配列を含む組成物を提供する。
【００６６】
チモシンβ４は、４３アミノ酸の小タンパク質である。(Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser、配列識別番号１)。（Low及びGoldstein, J. Biol. Chem., 257:1000(1982).それは、種々の組織及び細胞型において、１×１０-5〜5.6×１０-1Mの濃度で見出された。チモシンβ４は、種々の動物(例えば、ウシ、ブタ、マウス、ヤギ、ラット、ニワトリ、及びヒトなど)の胸腺から調整されたポリペプチドの部分的精製混合物である「チモシン分画５」（TF5）のマイナー成分(典型的に約１％)である。TF５は、当該技術で知られたいずれかの適当な手段を使用して調整することができる。TF5は、等電点電気泳動(ｐH3.5〜9.5)において観察される少なくとも40〜50の明確なポリペプチドからなることが知られており、本質的に、脂質、炭水化物、エンドトクシンがない。例えば、Hooperなど、Ann. NY Acad. Sci. 249:125(1975)参照。TF5は、胸腺剥離又は免疫剥離動物、始めから免疫欠失を有するヒト、及び免疫抑制癌患者において免疫機能を再構築する際に有効であることが示された。
【００６７】
チモシンβ４は、G-アクチンと相互作用することができ、細胞内のメジャーなアクチン隔離タンパク質である。チモシンβ４は、試験管内の内皮及びケラチン生成細胞マイグレーション、及び生体内における血管生成に対して活性である。チモシンβ４は、正常な動物及び正常を損ない傷があるモデル(すなわち、ステロイド治療ラット、糖尿病マウス、及び老化マウス)の両方においてラットの皮膚の完全な厚さの傷回復をかなり促進させることも見出された。傷の深さ及び幅は、局所的又は組織的チモシンβ４のいずれかでの治療された動物においてかなり減少された。加えて、おそらく、初期の傷へ供給された増加した血液のために、コラーゲン堆積が増加した。チモシンβ４濃度は、傷へ入り、傷部位へ追加の細胞を補充する責任を担う回復因子及び分子を含むそれら顆粒の内容物を放出する最初の細胞の中の血小板においてもっとも高い。しかしながら、メカニズムの理解は、本開示の方法及び組成物を使用するために必ずしも必要ではない。
【００６８】
チモシンβ４は、外傷液中にも存在する。それは、例えば成長因子などの他の修復因子などから以下の点で異なる。すなわち、（１）内皮細胞及びケラチン生成細胞マイグレーションを促進する、（２）マトリックスには結合せず、非常に低分子量である(それは、組織を通じてかなり長い距離を拡散することを可能にする)、及び（３）細胞成長を促進しない。
【００６９】
チモシンβ４の外因性添加又はそのアクチン結合断片の単離されたクローン化可能な髪小胞幹細胞への外因性添加は、マイグレーションの増加、マトリックス金属プロテイナーゼ（MMP）活性(及び、具体的には、MMP-2 レベルの増大)を導く。それゆえ、髪小胞幹細胞は、活性化され、拡散を促進するが、増殖しない。ここで開示された方法は、髪成長へ重要な多くの活性、マイグレーション、プロテアーゼ生産及び拡散を含め、幹細胞において促進される。
【００７０】
ソニックヘッジホッグは、髪小胞が発育期への導入を促進することを示した。Satoなど、“Induction of the hair growth phase in postnatal mice by localized transient expression of Sonic Hedghog”J.Clin.Invest. 104:855-864(1999)。Shh信号経路は、髪成長に伴うWnt信号経路と交差し影響を及ぼす。チモシンβ４は、クローン化可能なケラチン生成細胞の核に存在し、おそらく信号経路を規制している。この理論に拘束されることなしに、チモシンβ４は、ある実施態様において、順に髪小胞の発育期への導入を促進するソニックヘッジホッグを活性化することができる。
【００７１】
チモシンβ４のような血管内皮成長因子(VEGF)は、血管由来である。VEGF又はチモシンβ４によって誘発される髪小胞はより大きいサイズである。Yanoなど,“Control of hair growth and follicle size by VEGF-mediated angiogenesis”J. Clin. Invest. 107:409-417(2001)参照。それゆえ、ある実施態様において、チモシンβ４、T-3又は他のアクチン結合ペプチドの断片は、血管形成によって髪成長及び/又は小胞サイズを向上させる。この理論に拘束されないが、Tβ４は、ある実施態様において、順に血管形成及び髪成長を増大させるVEGF発現を活性化することができる。
【００７２】
最近、髪小胞において発現した別の血管由来の分子、肝細胞成長因子が、髪成長を促進することも見いだされた。Grant等、“Scatter factor induces blood vessel formation in vivo,”Proc, Natl. Acad. Sci USA 90: 1937-1941(1993); Lee 等、“Hepatocyte growth factor(HGF) activator expressed in hair follicles is involved in in citoro HGF-dependent hair follicle elongation”J. Dermatol. Sci. 25:156-163(2001);  Lindner等、“Involvement of hepatocyte growth factor/scatter factor and met receptor signaling in hairfollicle morphogenesis and cycling,”FASEB J. 14:319-332(2000). 肝細胞成長因子は、チモシンβ４発現を規制もする。Oh等“hepatocyte growth factor upregulates thymosin beta 4 in human umbilical vein endothelial cell”Biochem. Biophys. Res. Commun. 296:401-405(2002)。それゆえ、髪成長を促進する肝細胞成長因子の使用は、もし、それがチモシンβ４増大させること及び/又はそれとともに相互作用することによって作用するなら、ここで開示された方法と実際良く似ているか複製とすることができる。
【００７３】
さらに、ステロイドは、髪損失のあるタイプを治療するのに使用されてきた。Shapiroなど、“Hair regrowth. Therapeutic agents,”Dermatol. Clin, 16:341-356(1998).   チモシンβ4は、ステロイド治療単球においおて同定された抗炎症分子である。Young 等、Nat. Med. 5:1424-1427(1999)。それゆえ、ステロイドでの治療もまた、髪成長においてチモシンβ４の活性を伴うことができる。
【００７４】
これらのデータはともに、チモシンβ４のアクチン結合領域は、自然に生ずる傷回復因子であり、血管形成、すなわち、髪成長のプロモーター及びモジュレーターであることを示す結論及び結果を支持した。
【００７５】
実施例においてさらに詳細に述べるように、本方法及び組成物の開発中に、傷回復試験をメスラットにおいて行った。これらの実験において、チモシンβ４を含むヒドロゲル配合物（０．２％ポリアクリル酸）が傷に適用された。対照例動物は、ゲル単独を提供された。傷7日後の傷が視覚的に調べられたとき、傷部位の周囲の髪成長向上が明らかに観察された。この髪成長は、動物の他のそられた領域における周囲の髪より長く、より濃密に視覚可能に現れた。7日後、動物が忌避されて、ゲルを適用した領域の組織部分を調整し当該技術で既知の方法を使用して染色した(H&E及びMasson’s trichrome stains)。図1に示すように、チモシンβ４で治療された回復している傷の端で多くの数の髪小胞が観察された。
【００７６】
加えて、実施例２は、正常な（すなわち、無傷の）メスラット皮膚にチモシンβ４を局所的に適用した効果を直接的にテストするために行われた実験を記述する。実験の終わりにおいて、動物は忌避され、組織分画を10％緩衝ホルマリンにおいて調整し、標準的組織学的染色を使用して染色した。図２及び３に示すように、チモシンβ４は治療後、7日及び30日の両方において新たな髪成長を刺激することを見出した。皮膚の他のすべての点は、治療後30日で影響を受けず、表皮の又は皮膚の厚みにおける多少の変化であった。
【００７７】
さらに実施例３に説明される実験において、胸腺欠損ヌードマウスをチモシンβ４がそれらの背景において髪成長を促進するかどうかを決定するためにテストされた。視覚可能な髪成長は、肉眼的に観察された。チモシンβ４なしの対照例（すなわち、ヒドロゲル）での同様に処理した皮膚において髪成長の向上も他の違いも観察されなかった。
【００７８】
加えて、26月齢メスBALB/ cマウスにおけるチモシンβ４の効果を決定した。図5に示すように、新しい小胞展開が明らかに観察された。これら老化マウスの更なる実験において、7つのアミノ酸配列T-3 を含むチモシンβ４の合成断片を、髪成長を刺激する能力用にテストされた。この結果は、この断片は、水のみで観察された髪小胞展開を増大させることを示した。それゆえ、チモシンβ４の断片が、当該断片を含むポリペプチドも含め、髪再生組成物における使用を見出すであろうことを予期された。
【００７９】
開示された方法は、老化及びヌードマウスの両方における髪成長を促進する。一般に、髪は、より粗大に現れ、これは、治療された皮膚において相対的により多い数の小胞によって組織学的レベルで証明される。新規に活性化された髪小胞においてチモシンβ４の貢献を調べるとき、人は、隆起領域において発現していること、小胞が活動的に成長しているとき、隆起領域から活性化髪成長が開催される球根領域へマイグレートする細胞のサブセットにおいて発現されることを見出す。単離されたクローン化可能な髪小胞幹細胞はチモシンβ４を生産する。これらの細胞へ外因的に加えたとき、増大したマイグレーション及び増大したMMP-2レベルが観察される。これらのデータは、チモシンβ４が髪小胞幹細胞を活性化することによって髪小胞成長を増大することを証明する。再度、開示された方法及び組成物は、髪成長に重要な幹細胞において、マイグレーション、プロテアーゼ生産、及び拡散を含め多くの活性を促進する。
【００８０】
T-3の７つのアミノ酸配列は、アクチン結合領域を含み、アクチン結合領域を含む他のペプチドは、髪成長を促進する際の用途に見出される。この配列のホモログ及びTβ４配列識別番号１の断片(例えば、アクチン結合領域における保存及び又は非保存アミノ酸変化又はアクチン結合領域の独占的に外側で)は、髪成長を促進する際の使用に見出されるであろうと予期される。変化又は疎水性を保存する、例えば、リシンからアルギニン、スレオニンからセリン、又はロイシンからアルギニンなどのアミノ酸配列におけるいずれの保存変化もアクチン結合領域又はアクチン結合領域を含む断片の活性を保存するであろう。限定されないが、種々のチモシン又はその断片（例えば、Tβ4Ala、Tβ4Xen、Tβ9、Tβ9Met、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ12perch、Tβsea urchin、Tβ13(T-3配列Leu Lys Lys Thr Glu Thr Glnを含む前述したすべて)、及びTβscallop及びTβ14、（配列Leu Lys Lys Thr Asn Thr Gln）を含めT-3 の配列又は配列識別番号１の残基17-22を含む他のアクチン結合タンパク質は、本開示において用途を見出すであろう。他の例は、いずれかの配列に対して１〜２の保存アミノ酸置換したT-3 (残基17-23)又は配列識別番号１の残基17-22を含むペプチドである。同様のアクチン結合ペプチドの例は、Tβzebrafish（配列Leu Arg Lys Thr Glu Thr Glnを含む）及びTβ15（配列Leu Lys Lys Thr Asn Thrを含む）において見出されるものである。それゆえ、いずれかの既知のβ-チモシン又はその断片は、事実上、本開示において有益なアクチン結合モチーフを含む。Huffなど“β-Thymosins, small acidic peptides with multiple functions,”Intl. J. Bichem. & Cell Bio. 33:205-220(2001)(β-thymosin abbreviations defined and sequences provided therein; some sequences are also duplicated in Table 2). これら異なる配列の比較は、また、Tβ4アクチン結合領域において形成されることが可能であり、一方でその治療的活性を保存するアミノ酸置換について手引きを与える。例えば、位置1，3及び4での残基は、かなり保存的であるようにみえ、それゆえ、置換の候補としてより低いかもしれない。
【００８１】
加えて、小ペプチドの活性を高めるための当該技術において既知の方法は、髪成長を促進する開示された配列を組み合わせて有益である。当該方法は、対象物において当該ペプチドの半減期を増大させるか、他の理由のために活性を増大させることが可能である。例えば、当該技術において既知の様々な融合分子を使用することができる。アミノポリ(エチレングリコール)（APEG）へ変えられた特におよそ3,000〜9,000gm/molを含む種々の分子量のポリ(エチレングリコール)（PEG）は、Kawasakiなど、“Preparation of [Arg-Gly-Asp]-[Amino-poly(ethylene glycol)]hybrids and their infibitory effect on experimental metastasis,”Chem. Pharm. Bull. 3373-3375(1991).に記載されているように、短いペプチドと結合し向上した活性を生じさせることができる。キトサンも、Hojo等“Preparation of a chitosan hybrid of an antimetastatic laminin-related peptide,”Pharm. Pharmacol, Commun. 5:277-280(1999)に記載されているように、ぺプチドへ結合し向上した活性を生じさせることができる。同様なことは、ウシ血清アルブミン、ブドウ球菌タンパク質A(Maedaなど、J. Biochem. 115:182-189(1994)、フィブロネクチン、及びいずれかの通常の血清タンパク質に対しても当てはまる。したがって、ここで開示されるアクチン結合モチーフの他の分子への融合は、また、対象物において改善された髪成長を生じさせるであろう。
【００８２】
小ペプチドの活性を増大させる他の戦略も、髪成長を促進するためにここで述べた配列の活性を増大させることができる。ペプチド配列の直線又は分岐ポリマーは、単独又は融合分子と組み合わせて活性を増大させることができる。ポリマー血清によって活性を向上させるために、種々の手法が当該技術において知られている。Kawasakiなど、Biochem.and Biophys. Res. Comm. 174:1159-1162(1991); Nomizuなど、Cancer Res. 53:3459-3461(1993); saikiなど、Br. J. Cance 59: 194-197(1989); Murataなど、Int. J. Biol. Macromol. 11:97-99(1989); saikiなど、Cancer Res. 49:3815-3822(1989).ここで述べたアミノ酸配列の活性は、適宜、それらの配列を含むポリマー又は共重合体を作ることによって、あるいは、それらのポリマーを別の分子へ融合させることによって改善させることができる。当該構造は、（T-3）n、（T-3）n−APEG、（T-3）２、（Tβ４）ｎ、（T-3）ｍ−（Tβ４）ｎ、（Leu Lys Lys Thr Asn Thr）n、[(Leu Lys Lys Thr Asn Thr Glu)n、（Lue Lys Lys Thr Asn Thr Gln Glu）n、(Leu Lys Lys Thr Asn Thr Glu)n、(T-3)-Cys-Cys-(T-3)、Cys-(T-3)n-Cys[cyclized through a disulfide bond]、[Ac-(T-3)]8 Lys４ Lys２ Lys Gly -OH,などを含む。但し、ｎは、1より大きい数、例えば、整数(例えば２など)、端数(例えば、2.5など)を表す。特別の例において、ポリマーは、Leu Lys Lys Thr Asn Thr 又はLeu Lys Lys Thr Asn Thr Glnの繰り返しモチーフを有する直線ポリマーであり、いくつかの例において、ｎは、2以上であるが100未満であり、例えば、２〜50又は２〜１０である。この繰り返しモチーフは、当該繰り返しモチーフ以外のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて含まれることができる。
【００８３】
ここでの開示は、Tβ４などの自然に生じる単に完全長のタンパク質というよりは、種々のペプチドの活性領域を単離し及び提供するので、いくつかの利点が、より短いペプチドを使用する開示された方法によって得られる。そのような利点は、自然な全長タンパク質より短くすることが可能な活性ペプチドのより簡単なより経済的な合成を容易にすることを含む。別の利点は、より短いペプチドは、モルベースにおいて同様の活性を有する重量によりより大きい活性を可能として、いくつかの例において、それらの活性部位でのより優れた浸透及び生物学的利用能を有することができる。本方法は、天然のタンパク質より向上した活性、例えば、１以上の活性部位を含むペプチドの使用を可能にさえできる。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は、ある実施態様及び本開示の側面を証明しさらに説明するために提供されるので、その範囲を限定するものとして考慮されるものではない。
【００８５】
実施例１
ラットにおける髪成長の証明
本実施例は、ラットにおけるチモシンβ４による髪成長の促進を証明する。メスラットにおいて傷回復研究を行う過程において、チモシンβ４を含むヒドロゲル配合物を開発した。特に、0.05％チモシンβ４の調製物を0.2％ヒドロゲル(ポリアクリル酸、Hawkeye-Jensen,Inc.)において調製した。この配合物を、アプリケーターとして消毒綿を使用して傷へ適用した。対照例動物はゲル単独に供した。
【００８６】
試験ラットは、実験のはじめに一旦髪をそられ、それらの後ろで可能な限り多くの髪を取り除き、試薬と対照例担体の浸透を可能にした。６つの完全な厚さ８ｍｍパンチ傷を、データポイントあたり３つのラットを使用して、8週齢Sprague Dawleyラットの背中に作った。ヒドロゲルにおけるおよそ25μg/50μlの濃度でのチモシンβ４を傷つけた日、及び傷後48時間において消毒綿で傷へ適用した。適用した正確な体積を見積もったが、薄い塗布標本として適用した。ゲルは傷に完全に適用することが困難であり、幾つかの近接組織はゲルと接触した。傷を視覚的に調べたとき、傷の周りの向上した髪成長が明確に観察された。髪成長が、動物の他のそられた領域において髪を囲むよりより長くより濃密に視覚可能に現れた。7日後、動物を忌避し、ゲルを適用した領域の組織部分を１０％緩衝ホルマリンで固定し、当該技術において既知の方法を使用して染色した（H & E and Masson’s trichrome stains, Histoserv, Gaithersburg, MD）。図1に示すように、組織学データは、対照例ゲル処理動物及び未処理皮膚と比較してチモシンβ４処理動物において観察された髪小胞の数における増大があったことを示唆した。
【００８７】
実施例２
通常のラットでのチモシンβ４の効果
この実施例は、正常(無傷の)なメスラット皮膚で局所的に適用されたチモシンβ４の効果を証明する。これらの実験において、８週令メスSprague Dawley ラットを用いた。チモシンβ４を1週当たり3回(月曜日、木曜日、及び金曜日)ヒドロゲルにおいて0.5mg/mlの濃度で動物のそられた背中に適用した。動物の髪は、30日にわたり観察された。動物のいくつかは、処理開始7日後に忌避される一方、他のものは処理開始30日後に忌避された。組織部分は、実施例１で述べたような当該技術で既知の方法を使用して調整した。組織部分サンプルをすべて読まれ、皮膚病学において熟練された観察者によってブラインドベースで比較した。
【００８８】
図2に示すように、チモシンβ４は、7日で新しい髪成長を刺激するのを見出した。また、図3に示すように、新規髪成長は、適用後30日でチモシンβ４によって刺激された。皮膚のすべての他の側面は、表皮又は皮膚の厚さにおける多少の変化で処理後30日未影響を示した。いくつかの炎症性細胞における増大が観察されたが、コラーゲン堆積における増大も観察されず、血管数も未変化として表れた。
【００８９】
実施例３
メスマウス皮膚におけるチモシンβ４の効果
本実施例は、胸腺欠損メスマウスの皮膚でのチモシンβ４の効果を証明する。皮膚において視覚可能な髪を欠くが、幾らかの小胞を有する胸腺欠損メスマウスは、チモシンβ４が髪成長を促進するかどうかを見るためにテストされた。35日間で1週間当たり3回チモシンβ４で処理した後(以前の実施例に示したのと同じ濃度で)、視覚可能な髪成長を肉眼的に観察し、新規髪小胞の増大した額を組織学によって観察した。図４参照。
【００９０】
チモシンβ４の効果も、26週令メスBALB/cマウスにおいても証明された。これらのマウスは、それが正常なマウス寿命期待値を超えて生存しているときかなり老化したものと考えられる。これらのマウスは、白内障、関節炎、傷治療、及び薄い髪を含め多くの老化の兆候を示した。マウスは、髪をそられ、そられたときと同時及び48時間後にチモシンβ４で上述したように処理された。7日後、皮膚は、実施例１で上述したように、皮膚を収集し、組織学的に調べた。新しい小胞展開を、図5に示すように、はっきりと観察した。
【００９１】
17-23での７つのアミノ三アクチン結合領域を含むチモシンβ４のT-3 部分は完全長Tβ４の活性を有することを証明するために、T-3 ペプチドは、同様の方法において老化したマウスへ適用した。T-3断片を当該技術で既知の自動ペプチド合成機を使用して生産した。
【００９２】
合成T-3ペプチドを、５μg/50μlの濃度/投与量で水溶液/混合物へ適用した。結果は(図6参照)、この断片が水単独を用いて対照処理において観察された以上に髪小胞展開を増大させることを示す。それゆえ、これらアミノ酸からなるチモシンβ４の断片は、髪再生組成において有益である。
【００９３】
実施例４
老化マウス、ヌードマウス、及びラットモデルを使用した髪成長研究
髪成長におけるチモシンβ４の効果をさらに証明するために、0.05％のペプチドをヒドロゲル担体と結合させて、一日おきに局所的に髪をそられたラット、髪をそられた老化マウス(24〜26週令)、及びヌードマウスへ適用した。１つの試験は、チモシンβ４を、髪をそられた領域の1つの側で局所的に、及び反対の側面で対照令担体を適応した髪をそれたラットを使用した。処理の7日後、発育期の髪小胞の増加した数をチモシンβ４で処理したラットにおいて観察された(図７参照)。発育期小胞の数は対照例担体単独で処理したラットにおけるよりおよそ2倍多かった（図７D参照）。髪は未処理領域における髪成長より長くかつ厚く現れ、小胞は直径においてより大きかった。発育期における髪の増加した数は、30日にわたり連続3週間し処理で保持された。しかしながら、処理中止後14日以内で、活性髪小胞の数は、対照例レベルへ減少した。
【００９４】
老化したマウス(22-26週)は、処理の7日後髪小胞成長におけるものと同様の増加を示した(図７B,7E参照)。ヌードマウスの処理は、7日及び35日で処理した領域において増加した髪成長を示した(図７E,7F参照)。これらのデータは、ラット及びネズミモデルへ局所的に適用したとき、チモシンβ４が髪成長を向上させることを証明する。
【００９５】
実施例５
マイグレーションアッセイ(分析)
クローン化可能ケラチン生成細胞マイグレーションを48ウエルBoydenチャンバーにおいて、８μ多孔質ポリカーネート、PVPF、72ｍM  HEPES緩衝液（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含むケラチン生成細胞SFMにおいて希釈した50μg/mlのラット尾コラーゲンタイプ１（BD Biosciences, Bedford, MA）で被膜された膜(Poretics, Livermore,CA)を使用して試験した。被膜された膜は、使用前2時間乾燥した。培養されたコラーゲンケラチン生成細胞は、トリプシン(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して収穫され、以下、すなわち、ケラチン生成細胞SFM、１％ウシ血清アルブミン因子V（Sigma、St。Louis,  Mo）、及び２５ｍM  HEPES緩衝液を含む結合培地において再懸濁された。底チャンバーは、3倍の１又は１００ngの合成Tβ４（FDA）を含む結合培地で満たした。条件化された線維芽細胞培地をポジティブ対照例として使用した。ケラチン生成細胞をウエル当たり30,000細胞の濃度で上部チャンバーへ加えて、分析を37℃で、５％CO2下4.5時間インキュベートした。その後膜を固定し、Diff-Quik(VWR)で染色した。膜の孔を通じて首尾よくマイグレーションした細胞の数は、各ウエルの３ランダムな領域において細胞をカウントし、カウントした細胞数を平均化することによって定量化した。細胞カウントをニコンOptiphot-2 顕微鏡を使用して１０×で行った。この測定を2回繰り返した。
【００９６】
試験管内でのチモシンβ４に対するクローン化可能なケラチン生成細胞マイグレーション
Tβ４は、内皮細胞マイグレーションを促進することを以前に示した。Malindaなど(1997)。Boydenチャンバー測定における培養したクローン化ケラチン生成マイグレーションは、4.5時間後、Tβ４への応答を示した。Tβ４存在下での細胞マイグレーションは、結合培地単独の存在下でのマイグレーションを超えてほとんど2倍(ｐ＜0.0006)増加した(表１)。細胞マイグレーションでのペプチドの効果は、ml当たり１ngで最も大きくなり、より高いTβ４濃度での舞いグレーションにおいて減少を示した。
【００９７】
【表１】
2010043121.tif 000004
【００９８】
実施例６
髪成長中のチモシンβ４タンパク質の実証
脱毛をPaulなど、“Telogen skin contains an infibitor of hair growth,”Br. J. Dermatol. 122:777-784(1990)に記載されているように、残存小胞において髪成長サイクルを誘発させるのに使用した。手短に言えば、（それらのピンク色の皮膚によって同定された）休止期での８週令メスC57/BL６マウスの背中の皮膚を、Hair Remover Wax Strip キット(Del Laboratories, Farmingdale, NY)を使用して脱毛し、発育相髪小胞の同期化展開を行った。皮膚組織サンプルを、0日(未操作皮膚-休止期)、脱毛後4日(初期発育期)、及び脱毛後9日(後期発育期)で、時間点当たり５マウス収集した。サンプルを４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで組み込んだ。
【００９９】
髪小胞細胞のサブセットによるチモシンβ４タンパク質発現
脱毛誘発させ、同期化した成熟C57/BL6 マウスにおける髪サイクル中の髪小胞における内皮チモシンβ４の空間的及び時間的パターンを実証した。これは、チモシンβ４投与の観察された効果を髪成長における内皮チモシンβ４の機能的関与とを関連付けるためになされた。脱毛後1日、低レベルのチモシンβ４タンパク質が、休止（resting）期で小胞において観察された(図８)。これらの小胞において、チモシンβ４発現は、隆起領域に存在する少数の細胞へ限定され、上部及び下部小胞においてチモシンβ４は検出されなかった。脂線は、おそらく抗チモシンβ４抗体の非特異的作用のためすべての段階で染色された。
【０１００】
初期発育相(脱毛後4日)への髪小胞転位は、隆起領域でのチモシンβ４発現細胞の増加した数と関連した(図８)。さらに、いくつかのチモシンβ４プラス染色細胞は、隆起領域とバルブ領域との間の小胞のより低い部分で検出された。後期発育期で(脱毛後8日)、かなりの数の細胞が、チモシンβ４を発現するより低い小胞(マトリックス、及び外部ルートシースを含め)において位置した。これらのデータは、チモシンβ４発現細胞の時間的空間的寄与が、髪小胞茎細胞の位置へ提供されたパターンと類似した(Taylor et al., Cell 102: 453-461(2000)、及びOshima et al., Cell 104: 233-245(2001)。髪成長の開始とともに、チモシンβ４プラス細胞が、それらが隆起領域からマイグレーションするバルブ領域近傍の隆起領域外で観察された。
【０１０１】
実施例７
ラット鼻毛からのクローン化可能ケラチン生成細胞(髪小胞茎細胞)の単離
クローン化可能ケラチン生成細胞を、Kobayashi et al.,“Segregation of keratinocyte colony-forming cells in the bulge region of the rat vibrissa,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7391-7395(1993)に記載されているように、いくつかの修正を加えて、ラット鼻毛小胞から単離した。手短に言えば、Fisher ３４４ラットを二酸化炭素吸収剤によって忌避した。鼻毛パッドを含む上部唇をカットし、その内面をさらした。鼻毛小胞は、両眼のミクロスコープ下分析され、パットから引き抜かれ、その後、無菌培地で保持した。小胞の隆起領域を含む断片を切り出し、30分間コラゲナーゼ/ディスペース(dispase)溶液(1mg/ml; Roche Molecular Biochemicals, Quebec, Canada)において37℃でインキュベートした。上皮コアをその後、コラーゲンカプセルから分離し、さらに、0.05％トリプシン溶液(30分、37℃)でインキュベートし上皮細胞の分離を容易にした。単離した細胞を、EGF、ウシ下垂体抽出物（Invitrogen, Carlsbad, CA）及び10％FCS（Hyclone, Logan, UT）で補完したケラチン生成細胞SFM培地で培養した。
【０１０２】
培養したラット鼻毛クローン化可能ケラチン生成発現チモシンβ４
隆起領域からのラット鼻毛小胞ケラチン生成細胞は、チモシンβ４を発現した。以前に、隆起領域に存在する髪小胞茎細胞は、高い試験管内増殖潜在性を有するケラチン生成細胞として同定された。髪小胞茎細胞は、特異的マーカーのために完全に特徴付けられていないが、それらは、優先的にサイトカイン１５（K15）を発現する。ラット鼻毛隆起領域から単離されたクローン化可能ケラチン生成細胞(図９A、９B)は、単離された細胞がかなりクローン化されることを示した(図９C)。これらの細胞は、茎細胞マーカーK15を発現するが、ターミナルケラチン生成細胞分化の既知の初期マーカーであるサイトカイン１０（K10）に対してはネガティブである(図９A,９D)。さらに、試験管内で培養したとき、これらの細胞は、平均速度26μm/時間で動くことができた。これらの特徴は、これらの方法によって得られた細胞集団が、髪小胞茎細胞の迅速な交代を示すという結論を支持する。これらの細胞は、試験管での培養３〜４日後、チモシンβ４を発現した(図９C)。
【０１０３】
興味深いことに、外因性チモシンβ４を有するクローン化可能ケラチン生成細胞の処理は、K15(図10)のレベルの投与依存減少を引き起こし、チモシンβ４が初期茎細胞分化（すなわち、TAフェノタイプへの転移）に重要であることを示唆する。チモシンβ４による茎細胞増殖への影響は見出されなかった。これらのデータは、チモシンβ４を生産するクローン化可能ケラチン生成細胞としてラット鼻毛から単離された細胞を明確にする。
【０１０４】
実施例８
クローン化可能生成ケラチン細胞は、チモシンβ４の存在下で向上したMMP-2を生産する。
細胞外マトリックス分解は、通常の外皮展開中にハ必要なステップであることが以前に提案された。マトリックス金属プロテイナーゼ（MMP）の活性におけるチモシンβ４の影響をこの実施例において実証した。
【０１０５】
外因性チモシンβ４を有するクローン化可能隆起領域誘導茎細胞の処理は、分泌された細胞誘導MMP-2のレベルにおいて投与依存増加を引き起こす一方、MMP-9レベルでの顕著な影響は観察されなかった(図１１)。これらのデータは、チモシンβ４が隆起領域からの茎細胞の回避に重要であり、それらのバルブ領域へのマイグレーションを容易にするMMP−2活性を活性化することを証明する。
【０１０６】
実施例９
ヒトにおける髪成長の促進
当業者は、上述した処理が人の脱毛症を治療するのに容易に適用できることを容易に認識するであろう。薬剤的に適当な担体、とりわけ局所的用途用に適当なものは、Tβ４、T-3、アクチン結合配列を含むTβ４の断片、いずれかの他のアクチン結合ペプチド、又はその混合物を含むペプチドを、治療的有効な量で投与する担体として使用することができる。当該ペプチドは、担体なしで巧妙に適用されることもできる。もし担体を使用するなら、ペプチドは、いずれかの有効的な量で存在させることができるが、ペプチド又はペプチドの混合物の0.001〜50％の間を含む混合物で通常適用される。より好ましくは、薬剤的に適用可能な担体は、0.01〜5％のペプチド又はペプチド混合物を含む。処理は、脱毛症の提供を受けた局所的な領域へ１又はそれ以上局所的に適用される投与を含むことができる。ある実施例での複数の投与は、毎日、１日おき、1週、2週又は1月当たり１又はそれ以上の回数適用される。局所的投与は、ローション、ゲル、スプレー、又はいずれかの他の有効な形態で適用することができる。
【０１０７】
実施例１０
アクチン結合モチーフの同定
天然に生じるチモシンβ４、タンパク質分解断片、及び合成ペプチドを使用して、チモシンβ４の６又は７つのアミノ酸アクチン結合モチーフが、順に髪成長の促進を容易にする観察された血管由来活性に対して本質的であることが見出された。女性大動脈アーチを使用するヒトへその緒管上皮細胞での舞いグレーション測定、及び管成長測定は、チモシンβ４及びペプチドのアクチン結合モチーフが、約50ｎMで同一の活性を示す一方、アクチンモチーフのいずれかの部分を欠くペプチドは、不活性であることを示す。チモシンβ４の接着及び出現活性は、５〜５０ｎM可溶性アクチンの添加で阻害された。これは、チモシンβ４のチモシンβ４のアクチン結合モチーフが、その血管由来活性に対して本質的部位であることを証明する。このデータは、さらに、細胞表面アクチンは、チモシンβ４のレセプターとして機能することができることを示唆する。
【０１０８】
ここで開示された方法は、いくつかのペプチドにおけるアクチン結合モチーフを同定するのに使用され、当該方法は、髪成長を促進するための他のペプチドにおけるアクチン結合モチーフを同定するのにも容易に使用することができる。
【０１０９】
ペプチド及び断片―合成チモシンβ４は、RegeneRx、Inc., Bethesda、MDによって提供された。チモシンβ４の以下の断片を従来の方法を使用して合成した。すなわち、Tβ４1-15（すなわち、配列識別番号１の最初の１５アミノ酸残基）、Tβ４10-28(すなわち、配列識別番号１のアミノ酸残基１０〜２８)、Tβ４20-43(すなわち、配列識別番号１のアミノ酸残基２０〜４３)、Tβ４13-23(すなわち、配列識別番号１のアミノ酸残基１３〜２３)、Tβ４17-23(すなわち、配列識別番号１のアミノ酸残基１７〜２３、又は以下T-3ともいう)、Tβ４19-26(すなわち、配列識別番号１のアミノ酸残基１９〜２６)、Tβ４13-19(すなわち、配列識別番号１のアミノ酸残基１３〜１９)。自然に生じるβチモシン、スルホキシドチモシンβ４、及びタンパク質分解性ペプチド断片(すなわち、表２の第二グループでの７のペプチド)を、以前にHuff et al., Anal. Chim. Acta 352:239-248(1997);Huff et al., Eur.J Biochem. 230:650-657(1995)に記載されたように調整した。すべてのペプチドは、リン酸緩衝液（PBS） で溶解され、等分して−70℃で貯蔵された。
【０１１０】
細胞−HUVECを単離し、通過細胞２−５で使用した。Grant et al., J. Cell Sci. 108:3685-3694(1995)。細胞を、２０％ウシ血清(Hyclone Laboratories, Logan, UT), 200μg/mlの内皮細胞成長サプリメント（ECGS）（Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA）、0.8M/mlヘパリンナトリウム(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)、ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen, Carlsbad, CA）、10μg/mlゲンタマイシン(Invitrogen, Carlsbad, PA)、及び１％ファン時ゾーン(fungizone)(Invitrogen, Carlsbad, CA)で補完したRPMI1640(Invitrogen, Carlsbad, CA)で培養した。
【０１１１】
細胞接着-イオンがHUVEC接着に必要であることを決定するために、0.１M 炭酸塩緩衝液、ｐH9.4中のラミニン-１ペプチド(50μlで25ng)及び、Tβ４の２つの濃度(50μl中の100ng及び500ng)をU底96-ウエルプレートの底へ一昼夜4℃で結合させた。その後ウエルを2回、PBSで洗浄し、PBS(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)中の150μlの３％BSAで、室温で30分間ブロックした。ウエルを再度洗浄し、個別に又は組み合わせて指示した塩(1mMCa2+、0.5ｍMMg2+及び０．５ｍM Mn2+)を含む50μlの無血清培地において50,000HUVECを各ウエルへ加えた。この実験に使用したHUVECは、使用前2時間血清枯渇させた。プレートを45分間37℃でインキュベートした。結合しなかった細胞を2回のPBS洗浄によって穏やかに取り除いた。残存細胞を、20％メタノール中で、0.2％クリスタルバイオレットで染色し、水で洗浄し過剰な染料を取り除き、37℃で一昼夜乾燥させて、１０％SDSで10分間溶解し、プレートODを600nmで判読した(分子デバイス精密マイクロプレートリーダー)。各条件を3通り測定し、測定を3回繰り返した。
【０１１２】
Boydenチャンバー測定―HUVECマイグレーション測定を以前にSalcedo et al J. Immunol. 166:7571-7578(2001)で述べたように４８ウエルマイクロ走化性チャンバー(Neuro Probe Inc., Cabin John, MD)で行った。手短に言えば、８μm細孔を有する無PVP-ポリカーボネート膜を、２５ｍM  HEPES（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含むRPMI1640中で50μg/mlのラット尾コラーゲン（BD Biosciences, Bedford, MA）で、4℃で一昼夜被膜した。膜を少なくとも使用1時間前に乾燥させた。HUVECを2時間血清-枯渇させ、Versene(Invitorogen, Carlsbad, CA)を使用して収穫し、１％BSA及び２５ｍM HEPESを有するRPMI 1640を含む結合培地中で再懸濁した。チャンバーのより低いウエルを、結合培地中で希釈した１、１０、１００及び１０００ng/mlのチモシンβ４又はペプチド断片で積層した。基本的な繊維芽細胞成長因子（ｂFGF）(200ng/ml)をポジティブ対照例として使用した。細胞をウエル当たり50,000細胞の濃度でチャンバーの上部へ加えた。チャンバーを37℃で4時間インキュベートした。フィルターを固定し、Diff-Quik(VWR, Bridgeport、NJ)を使用して染色した。膜の細孔を通じて首尾よくマイグレーションした細胞をCK-2オリンパス顕微鏡を使用して10×の大きさで手動で定量化した。各条件を3通り測定し、測定を2回繰り返した。
【０１１３】
ひよこ大動脈アーチ測定-13日の女性胎児の大動脈アーチ(arch)を取り除き、RPMI  1640に設置した。周辺の連結組織を除去した後、当該アーチの横軸部を作成した(1mm)。生じた大動脈リングを、ウエル当たり1つのリングで20〜30μlのマトリゲル(Collaborative Biomedical Products)で48ウエルプレートの底へ注意深く取り付けた。リングを設置したので、各リングのルーメンを見ることができた。リングの上へより多くのマトリゲルを加えて、適当な位置でそれらを密閉した。ヒト内皮の100μl体積-１％ペニシリンストレプトマイシンを含むSFM基礎成長培地(Invitrogen)を各ウエルへ加えた。チモシンβ４、ペプチド断片、及び外因性アクチンを無血清培地中のウエルへ加え、各ウエルの最終体積を400μlへ調整した。ECGS(200μg/ml)をポジティブ対照例として使用した。プレートを24時間37℃でインキュベートした。リングを固定し、Diff-Quik溶液IIで染色した。出芽をオリンパス顕微鏡で10×の大きさを使用して観察者によってブラインド測定において記録した。6つのウエルを各テストされた条件に対して使用し、各測定を3回行った。
【０１１４】
チモシンβ４へのアクチン媒介HUVEC細胞接着
マンガンがチモシンβ４への細胞接着に対して要求されることを見出し、それをすべてのその後の接着測定において使用した。
【０１１５】
チモシンβ４は、アクチン結合領域を含んでいるので、アクチンは細胞接着測定に対して加えられた。これは、可溶性アクチンがチモシンβ４への接着をブロックしたことを示した。対照例において、可溶性アクチンは、ラミニン-１-媒介接着での影響はなかった。これらのデータは、アクチンが、チモシンβ４媒介接着をブロックすることができることを実証し、チモシンβ４のアクチン結合部位が、チモシンβ４へ細胞結合において重要であることを示唆する。データは、アクチンがチモシンβ４の細胞表面レセプターとして機能することができることも示唆する。
【０１１６】
チモシンβ４の存在下で出芽するアクチンブロック大動脈リング管
チモシンβ４は、胎児女性大動脈リングモデルを使用して出芽を促進した。アクチンは、このモデル系において血管由来の活性を有することを示した。チモシンβ４もアクチンもどちらも出芽を促進する際にECGSポジティブ対照例と同様に活性ではなかった。チモシンβ４媒介出芽は、外因性アクチンの添加によってかなり阻害された。外因性アクチンのチモシンβ４に対する影響―媒介された血管形成は特異的であった。なぜなら、外因性アクチンはECGS媒介管出芽を阻害しなかったからである。いくつかの出芽の増加が、アクチン及びECGSをともに加えたとき観察された。これらのデータは、チモシンβ４を生体外血管形成を促進し、外因性アクチンはこの活性をブロックすることを実証した。それゆえ、チモシンβ４は、内皮細胞表面上のアクチンへの結合によって作用すると考えられる。
【０１１７】
その血管由来活性に対してチモシンβ４のアクチン結合領域の同定
チモシンβ４の種々の合成ペプチド及びタンパク質分解断片を内皮細胞マイグレーション及び血管出芽に対するTβ4上の活性部位、少なくともここで開示する方法によって髪成長を促進することを担う部分におけるプロセスを決定するために使用した。合成及び自然に生じるチモシンβ４の両方は、両方の測定において活性であった(表２、データ示さず)。スルホキシドチモシンβ４も活性であった。カルボキシル末端部、又はアクチン結合配列のすべて(Tβ41-26、Tβ413-23、Tβ47-43 、Tβ410-28 、Tβ420-43 、及びTβ417-23）のいずれかを含む合成ペプチド及びタンパク質分解性断片は、測定において一般に高い活性であった。対照として、アクチン結合配列(Tβ41-6及びTβ413-19)を欠く合成ペプチド及びタンパク質分解性断片は、Tβ41-15が出芽測定においてのみ非常に弱い活性を示す以外、不活性であった。最も小さい活性合成ペプチド、Tβ417-23は、７つのアミノ酸を含み、マイグレーション及び出芽において完全に活性であった(表２；前述。データ示さず。配列識別番号１のアミノ酸残基17-22は、内皮細胞マイグレーションを促進することを見出した。)。保存アクチン結合領域、すなわち、配列識別番号１のアミノ酸17-22を有するβチモシンのすべてのメンバー(スルホキシドβ４の、β４Ala、β９及びβ10)もまた活性であった(表２)。アミノ酸１３−２３を含むチモシンβ15のアクチン結合領域は、出芽測定において活性であった。これらのデータは、チモシンβ４内に含まれるアクチン結合部位が共通の生理学的活性を有することを実証する。それゆえ、配列相同性を有するこれら及び他の関連するファミリーメンバーは、髪成長促進に対してこの重要な作用を有すると考えられる。
【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
βチモシンファミリー内で、アクチン結合モチーフは、かなり保存されることが知られている。例えば、huff et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 33:205-220(2001)参照。これら分子の異成分の多くは、カルボキシル末端で生じる。アクチン結合配列の保存、及び試験されたβチモシンファミリーの他のメンバーは、上皮細胞マイグレション及び管出芽に対して活性であったという事実に基づいて、ここで提供された配列の多くの同様の変異体及び/又はホモログは、当業者が開示された方法において使用することは明白であろう。さらに、これら及び類似のペプチド用の試験管内活性は、生体内活性と相関関係を有するので、以前の結果は、ペプチドが髪成長を促進する際の用途を見出すであろうことを指示する。
【０１２０】
実施例１１
ウエスタンブロット分析及び免疫化学
以前の実施例において、ウエスタンブロット分析を以下の方法において行った。細胞をRIPA緩衝液の添加によって溶解し、等しいタンパク質に対して標準化された細胞溶解物のサンプルを４-１２％ビスとリスNuPAGEゲル上で分離した（Invitrogen, Carlsbad, CA）。タンパク質を、ニトロセルロース膜(Invitorogen, Carlsbad, CA)へ移し、マウスケラチン１、５，６、１０、１４、１５に対するポリクローナル抗体活性を使用して検出した（Covance Reseach Products, Richmond, CA）。同様の膜を抗GAPDH抗体(Research Diagostics, Flanders, NJ)で再プローブし、結果をNIHイメージソフトウエアを使用して、デンシトメトリーによって標準化した。
【０１２１】
免疫組織化学染色を5μmパラフィン断片上で、完全長チモシンβ４ペプチド配列に対して生じたポリクローナルウサギ抗体(Dr。A。Goldstein,GWU, Washington DCから寄与)を使用して行った。第一抗体をダコEn Vision
キット(DakoCYtomation, Denmark)を使用して検出し、断片のカウンター染色を、ヘマトキシリンを使用して行った。
【０１２２】
ここで開示された方法及び組成物の種々の修正及び変更は、記述された原理の範囲及び要旨を逸脱することなしに当業者にとって明白であろう。発明は具体的実施例と関連して記載されるが、図説された実施態様は、開示の特定の例だけであって、開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されるべきである。実際、関連技術及び/又は分子生物学、皮膚病学、又は関連の分野における当業者へ明らかな本発明を実施するための記載されたモードの種々の修正は、本発明の範囲内にあることを意図する。開示の当該広い範囲は、特許請求の範囲に従う。当方は、それゆえ、これら特許請求の範囲及び要旨内にある当方の発明のすべてを請求する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月26日(2009.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチン結合ペプチドの使用であって、ペプチドは長さにおいて１０個を超えないアミノ酸のチモシンβ４の断片からなり、チモシンβ４の断片は、配列番号１のアミノ酸残基１７−２２を備え、および０から３個までの保存的なアミノ酸置換が備わり、対象物における発毛の増強のための薬の製造においての使用。
【請求項２】
チモシンβ４の断片は、長さにおいて７個を超えないアミノ酸残基であり、断片には、０から２個までの保存的なアミノ酸置換が備わる、請求項１記載の使用。
【請求項３】
チモシンβ４の断片は、配列番号１のアミノ酸残基１７−２３からなる、請求項２記載の使用。
【請求項４】
チモシンβ４の断片は、配列番号１のアミノ酸残基１７−２２からなる、請求項２記載の使用。
【請求項５】
アクチン結合ペプチドは、脱毛症罹患皮膚の領域に局所的に適用される、請求項１記載の使用。
【請求項６】
脱毛症罹患皮膚の領域は対象物の頭皮である、請求項５記載の使用。
【請求項７】
対象物はヒトである、請求項１記載の使用。
【請求項８】
対象物は非ヒト動物である、請求項１記載の使用。
【請求項９】
発毛を促進するための組成物であって、長さにおいて１０個を超えないチモシンβ４の断片からなるアクチン結合ペプチドを備え、チモシンβ４の断片は、配列番号１のアミノ酸残基１７−２２を備え、および０から３個までの保存的なアミノ酸置換が備わる、組成物。
【請求項１０】
さらに薬学上適切な担体を含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
薬学上適切な担体は局所用の薬学上の調製物である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
薬学上適切な担体には、ヒドロゲルが包含される、請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
チモシンβ４の断片は長さにおいて７個を超えないアミノ酸残基であり、断片には０から２個までの保存的なアミノ酸置換が備わる、請求項９記載の組成物。
【請求項１４】
チモシンβ４の断片は長さにおいて６個を超えないアミノ酸残基であり、断片には０から２までの保存的なアミノ酸置換が備わる、請求項９記載の組成物。
【請求項１５】
チモシンβ４の断片は配列番号１のアミノ酸残基１７−２３からなる、請求項９記載の組成物。
【請求項１６】
チモシンβ４の断片は配列番号１のアミノ酸残基１７−２２からなる、請求項９記載の組成物。
【請求項１７】
発毛を促進するための組成物であって、
（ａ）配列番号１のアミノ酸１−２６からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１３−２３からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸７−４３からなるポリペプチド、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸１３−４３からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸１０−２８からなるポリペプチド、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸２０−４３からなるポリペプチド、または
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１９−２６からなるポリペプチド
を備える、組成物。
【請求項１８】
さらに薬学上適切な担体を含む、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
薬学上適切な担体は局所用の薬学上の調製物である、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
薬学上適切な担体には、ヒドロゲルが包含される、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
組成物の使用であって、発毛の増強のための薬の製造における請求項１８記載の組成物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明は下記の出願時の特許請求の範囲の発明に関する。
［請求項１］  対象物の髪の成長を促進させる方法であって、対象物の皮膚の目標領域へ完全長配列識別番号1以外のアクチン結合ペプチドからなるポリペプチドへさらすことからなる方法。
［請求項２］  ポリペプチドが、対象物の髪の成長を促進するβ-チモシンの断片、または断片の変異体からなる請求項１記載の方法。
［請求項３］  対象物の髪を促進させる種々の断片が、アクチン結合モチーフの外側の1またはそれ以上のアミノ酸欠失又は置換である請求項２記載の方法。
［請求項４］  変異体が、配列識別番号１と少なくとも70％の相同性を有する請求項２記載の方法。
［請求項５］  β-チモシンの断片がβ4チモシンの断片であり、長さ40アミノ酸残基未満であり、配列識別番号１のアミノ酸残基17-22を含み、チモシンβ４の断片が、０〜５つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
［請求項６］  チモシンβ４の断片が、長さ40アミノ酸残基未満であり、配列識別番号１のアミノ酸残基17-23を含み、チモシンβ４の断片が、０〜５つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
［請求項７］  チモシンβ４の断片が、長さ20アミノ酸残基未満であり、チモシンβ４の断片が、０〜４つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項５又は6項記載の方法。
［請求項８］  チモシンβ４の断片が、長さ10アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜３つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項５又は6項記載の方法。
［請求項９］  チモシンβ４の断片が、長さ7アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜２つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項５又は6項記載の方法。
［請求項１０］  チモシンβ４の断片が、配列識別番号１のアミノ酸残基17〜22からなる請求項９記載の方法。
［請求項１１］  ポリペプチドが、対象物の髪の成長を促進するチモシンβ４の断片又は当該断片の変異体からなる請求項２記載の方法。
［請求項１２］  ポリペプチドが、配列識別番号１のアミノ酸残基17-23からなる請求項9記載の方法。
［請求項１３］  ポリペプチドが、配列識別番号１のアミノ酸残基17-22からなる請求項9記載の方法。
［請求項１４］  ポリペプチドが、脱毛症を受けた皮膚の領域へ適応される請求項１記載の方法。
［請求項１５］  脱毛症を受けた皮膚の領域が対象物の頭皮である請求項14記載の方法。
［請求項１６］  アクチン結合ペプチドが、βチモシンの断片、チモシンβ４の断片、T-3からなるが完全長チモシンβではないペプチド、長さ７アミノ酸残基未満のチモシンβ4のアクチン結合領域、長さ６アミノ酸残基未満のチモシンβ4のアクチン結合領域、前述したいずれかの治療的に有効なホモログ又は変異体、及び2つ又はそれ以上のそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
［請求項１７］  対象物がヒトである請求項1記載の方法。
［請求項１８］  対象物が、非ヒト動物である請求項１記載の方法。
［請求項１９］  髪の成長を促進する組成物であって、当該組成物が、完全長配列識別番号１以外のアクチン結合ペプチドからなるポリペプチドを含むことを特徴とする組成物。
［請求項２０］  さらに、治療的に適当な担体を含む請求項１９記載の組成物。
［請求項２１］  治療的に適当な担体が、典型的治療製剤である請求項２０記載の組成物。
［請求項２２］  治療的に適当な担体が、ヒドロゲルからなる請求項２０記載の組成物。
［請求項２３］  ポリペプチドが、対象物の髪の成長を促進するチモシンβ４の断片又は当該断片の変異体からなる請求項１９記載の組成物。
［請求項２４］  変異体が、少なくとも配列識別番号１と少なくとも７０％の相同性を有する請求項２３記載の組成物。
［請求項２５］  チモシンβ４の断片が、長さ40アミノ酸残基未満であり、配列識別番号１のアミノ酸残基17-23又は17-22を含み、当該断片が、０〜５つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２３記載の組成物。
［請求項２６］  チモシンβ４の断片が、長さ20アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜４つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２５記載の組成物。
［請求項２７］  チモシンβ４の断片が、長さ10アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜3つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２５記載の組成物。
［請求項２８］  チモシンβ４の断片が、長さ7アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜2つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２５記載の組成物。
［請求項２９］  チモシンβ４の断片が、長さ６アミノ酸残基未満であり、当該断片が、０〜2つの保存アミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２５記載の組成物。
［請求項３０］  チモシンβ４の断片が、配列識別番号１のアミノ酸残基１７−２３からなる請求項２５記載の組成物。
［請求項３１］  チモシンβ４の断片が、配列識別番号１のアミノ酸残基１７−２２からなる請求項２５記載の組成物。
［請求項３２］  ポリペプチドが、対象物の髪の成長を促進するチモシンβ４の断片又は当該断片の変異体からなる請求項２５記載の組成物。
（配列リスト）
添付のシークエンスリスティングに記載されたアミノ酸配列は、37 C. F. R. 1.822に定義されているように、アミノ酸用の標準的な3文字コードを使用して示されている。添付のシークエンスリスティングＴβ4は配列番号１として与えられる：Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Serである。
（いくつかの実施態様の詳細な記載）
（略語及び用語）
以下の用語及び方法の説明は、本開示をよりよく説明し、本開示を当業者が実施するガイドラインとするために提供される。ここで及び与えられた特許請求の範囲において、単数型の“a”又は“an”又は“the”は、文脈が他に明らかに指図しないなら、複数の言及を含む。例えば、“a protein”は、このようなタンパク質群の複数を含み、“the antibody”は、当業者に知られた1種又はそれ以上の抗体、及びその同等物、及びその他への言及を含む。
【外国語明細書】
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【配列表】
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