(57)【要約】【課題】セルロース系基質を原料としたエタノール生産の効率及び収率の向上に資するため、担子菌を用いてセルロースの部分分解物であるセロビオース，セロトリオース，セロテトラオース等を基質としてエタノールを生産する方法を提供すること。【解決手段】セルロース系基質を、担子菌を用いて発酵処理することによるエタノールを生産するために、酵素で分解され易いように結晶構造を壊したセルロースや、セロオリゴ糖などからエタノールを生産できる担子菌として、エノキタケを用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース系基質を、エノキタケを用いて発酵処理することを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項２】
セルロース系基質として、水溶性セロオリゴ糖含有基質を用いることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
【請求項３】
水溶性セロオリゴ糖含有基質として、セロビオース，セロトリオース，及びセロテトラオースから選ばれる１種又は２種以上を含有する基質を用いることを特徴とする請求項２記載のエタノールの製造方法。
【請求項４】
発酵処理が、嫌気的処理であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノールの製造方法に関し、より詳しくは、セロビオース等のセルロース系基質を、エノキタケを用いて発酵処理することを特徴とするエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化対策として二酸化炭素排出量を抑える必要があり、カーボンニュートラルとなるバイオ燃料の利用が求められている。特にセルロース系バイオマスからのエタノール変換技術は二酸化炭素削減効果が大きく、食料とも競合しないため重要である。従来、セルラーゼを用いる酵素法や、硫酸などを用いる酸糖化法などによりセルロースを分解・糖化して得られるグルコースを、グルコースなどの単糖から効率よくエタノールを生産することができるサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を含む酵母や、ザイモモナス（Zymomonas）属又はザイモバクター（Zymobacter）属の細菌を用いて発酵処理し、セルロース系基質からエタノールを生産することが知られていたが、セルロースやセロビオース等のセロオリゴ糖から直接エタノールを生産する方法ではなかったため、効率的なエタノールの生産方法ではなかった。
【０００３】
近年、微生物学や遺伝子工学の発展により、セルロース系バイオマスや、多糖からエタノールを生産する方法が開発されてきた。例えば、セロオリゴ糖を資化することができないザイモバクター属の微生物に対し、β−グルコシダーゼ遺伝子を導入することによりセロオリゴ糖からエタノールを生産できる形質転換微生物（例えば、特許文献１参照）が提案されている。また、セルロース，ヘミセルロース及びデンプンを基質として、加水酸又はセルラーゼ，β-グルコシダーゼ，アミラーゼ及びグルコアミラーゼ等の加水分解酵素を添加し、セロビオース及びグルコースの両方をエタノールへ発酵させる能力を有する種である酵母の一種ブレタノミセス クステルシィ（Brettanomyces custersii）を接種して同時進行糖化・発酵によりエタノールを回収するバイオマス材料からのエタノールの改良された収量及び生産速度を示す同時進行糖化・発酵方法（例えば、特許文献２参照）が提案されている。
【０００４】
一方、エノキタケ（Flammulina velutipes）は、担子菌に属するキノコの一種であり、担子菌には種々の薬効成分が含まれている。例えば、エノキタケ等の茸を溶媒で抽出した生理活性物質を有効成分とする抗癌性薬剤（例えば、特許文献３参照）や、エノキタケを主成分とする高血圧症治療剤（例えば、特許文献４参照）が提案されている。
【０００５】
また、アミラーゼ活性及びアルコール脱水素酵素活性を有する担子菌によってアルコール発酵を行うアルコール飲料の製法において、担子菌としてアガリクスタケ，ブナシメジ，マツタケ，ツクリタケ，ヒラタケ，マンネンタケの具体例に加えて、担子菌として数多く列挙されている中の一つにエノキタケが記載されているアルコール飲料の製法（例えば、特許文献５参照）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２６１４２２号公報
【特許文献２】特開平５−２０７８８５号公報
【特許文献３】特開２００３−２３１６４４号公報
【特許文献４】特開２００４−８９１２８号公報
【特許文献５】特許３３６２３１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来、セルラーゼはその生産性の高さからトリコデルマ（Trichoderma）属の酵素が通常用いられるが、トリコデルマ属はβ−グルコシダーゼの生産性が低く、セルロースを単糖であるグルコースにするためにはセルラーゼ製剤に更にβ−グルコシダーゼ製剤を加える必要があり、酵素の価格が高価なものとなる原因の一つになっている。酸による糖化は分解率を上げるために過剰に反応させると糖の回収率が低下し、その結果、エタノールの生産効率が悪くなるなどの問題があるというのが現状である。このため、セルロース系バイオマスを原料としたエタノール生産の収率を向上させるには、エタノール生産に用いられる微生物が、セルロースの部分分解物でありβ−１，４−グルコシド結合しているセロオリゴ糖等を基質として、エタノールを生産する能力を具備する必要がある。
【０００８】
本発明の課題は、セルロース系基質を原料としたエタノール生産の効率及び収率の向上に資するため、セルロースやセルロースの部分分解物である水溶性セロオリゴ糖からエタノールを生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、セロビオース，セロトリオース，セロテトラオース等の水溶性セロオリゴ糖や、酵素で分解され易いように結晶構造を壊したセルロースなどからエタノールを生産できる担子菌を取得するため、鋭意研究を進めていたが、エノキタケの培養培地にエタノールが産生することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、（１）セルロース系基質を、エノキタケを用いて発酵処理することを特徴とするエタノールの製造方法に関する。
【００１１】
また本発明は、（２）セルロース系基質として、水溶性セロオリゴ糖含有基質を用いることを特徴とする上記（１）記載のエタノールの製造方法や、（３）水溶性セロオリゴ糖含有基質として、セロビオース，セロトリオース，及びセロテトラオースから選ばれる１種又は２種以上を含有する基質を用いることを特徴とする上記（２）記載のエタノールの製造方法や、（４）発酵処理が、嫌気的処理であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のエタノールの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、エノキタケを用いて、セロビオース等の水溶性セロオリゴ糖や、酵素で分解され易いように結晶構造を壊したセルロースを発酵すると、グルコースを発酵した場合とほぼ同様に、効率よく、かつ高収率でエタノールを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】エノキタケＦｖ−１株を用い、３種のセロオリゴ糖とグルコースを基質とした場合の培養液中のそれぞれのエタノール濃度の測定結果を示す図である。
【図２】エノキタケＦｖ−１株を用い、グルコースを基質とした場合の培養液中のグルコース濃度・エタノール変換率の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明におけるエタノールの製造方法としては、セルロース系基質を、エノキタケを用いて発酵処理するエタノールを製造する方法であれば特に制限されず、上記エノキタケとしては、セロビオース，セロトリオース，セロテトラオース等の水溶性セロオリゴ糖を含有する基質や、酵素で分解され易いように結晶構造を壊したセルロースを含有する基質などから発酵処理によりエタノールを製造できるものであれば特に制限されないが、β−グルコシダーゼ活性を有するエノキタケが好ましく、具体的にはエノキタケＦｖ−１株等を挙げることができる。エノキタケがβ−グルコシダーゼ活性を有するかどうかは、例えばＰＮＰ−β−Ｄ−グルコピラノシドを酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）等の適当なバッファー中でインキュベートし、３７℃で反応させた後、０．２Ｍ炭酸ナトリウムを５０μｌ添加することにより反応を停止させ、４００ｎｍの吸光度を測定する等の公知の方法で容易に確認することができる。また、上記エノキタケとしては、β−グルコシダーゼ活性に加えて、セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）活性，エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）活性等のセルラーゼ活性を有するものが好ましい。
【００１５】
本発明のエタノールの製造方法において用いられるセルロース系基質としては、水溶性セロオリゴ糖又は水不溶性セロオリゴ糖を含有する基質や、セルロースを含有する基質を挙げることができるが、水溶性セロオリゴ糖含有基質が好ましく、水不溶性セロオリゴ糖やセルロースは酵素で分解され易いように結晶構造を壊したものを有利に用いることができる。上記水溶性セロオリゴ糖含有基質としては、水溶性のセロオリゴ糖、例えば、セロビオース（Ｇ２），セロトリオース（Ｇ３），セロテトラオース（Ｇ４），セロペンタオース（Ｇ５），セロヘキサオース（Ｇ６）等の水溶性のセロオリゴ糖を炭素源として含有する基質を例示することができるが、セロビオース，セロトリオース，及びセロテトラオースから選ばれる１種又は２種以上を含有する基質を好適に例示することができる。かかる水溶性セロオリゴ糖としては、市販のものを利用しうる他、化学的方法や酵素的方法（特開平１−２５６３９４号公報，特開平５−１１５２９３号公報，特公平６−９５９４３号公報，特公平８−２３１２号公報，特開２００１−１１２４９６，特開２００５−６８１４０号公報等）により製造したものを利用することができる。
【００１６】
上記発酵処理は一般微生物の培養方法に準じて行なうことができ、通常液体培地による嫌気条件下での培養、例えば、静置培養が有利である。培養温度は約１５〜３５℃、好ましくは約２０〜３０℃前後を好適に例示することができ、培地のｐＨは約４〜８、好ましくは約５〜５．５を好適に例示することができ、ｐＨの調整には、例えば、水酸化ナトリウムや塩酸などが用いられる。培養期間は培地の組成，温度条件に応じて適宜設定されるが、通常約３〜１４日、好ましくは約５〜１０日前後を好適に例示することができる。また、エノキタケの培養培地組成の内、炭素源としては、水溶性セロオリゴ糖や、結晶構造を壊した水不溶性セロオリゴ糖やセルロースの他、必要に応じて、セルロース，グルコース，デンプン水解物，デンプン，糖蜜，グリセリン等を挙げることができ、窒素源としては酵母エキス，肉エキス，ポリペプトン，グルテンミール，麦芽抽出物，綿実粕，大豆粉，落花生粉，魚粉，コーンスチプリカー，尿素，塩化アンモニウム，硫酸アンモニウム，硝酸アンモニウムその他の有機，無機窒素源を挙げることができる。また、培地には必要に応じて金属塩を添加することができ、かかる金属塩として、ナトリウム，カリウム，マグネシウム，カルシウム，亜鉛，鉄等の燐酸塩，硫酸塩，硝酸塩，塩化物，炭酸塩等を挙げることができ、中でも、ＫＨ２ＰＯ４，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏなどを好適に例示することができる。
【００１７】
本発明のエタノールの製造方法において、必要に応じて、他種のセルラーゼや（培地にデンプンを添加する場合など）グルコアミラーゼ，α−アミラーゼ，α−グルコシダーゼ等のデンプン分解酵素などを併用することができる。そして、本発明のエタノールの製造方法により、培養液中のエタノール濃度は１v/v％以上、好ましくは５v/v％以上、より好ましくは１０v/v％以上となるように、また、収率は６０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上でエタノールを製造することができる。
【００１８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
［エノキタケＦｖ−１株の培養］
供試菌として用いたエノキタケＦｖ−１株は、富山県森林研究所から入手した。エノキタケＦｖ−１株を寒天培地（グルコース０．３％、麦芽エキス０．３％、酵母エキス０．３％；ｐＨ６．５）に植菌し、２５℃にて７〜１４日培養した。エノキタケＦｖ−１株が十分に生育した寒天培地を、ポリトロンを用いて均一に粉砕し、液体培地（グルコース１％，酵母エキス１％，ペプトン１％，ＫＨ２ＰＯ４０．１％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０１％；ｐＨ６．５）に添加し、２５℃にて１２０ｒｐｍで７日間撹拌培養した。
【００２０】
［エノキタケＦｖ−１株のエタノール発酵］
上記エノキタケＦｖ−１株の培養７日目の培養液から菌体を回収し、水で洗浄した。得られたエノキタケＦｖ−１株菌を、１％セロビオース又は１％グルコースを添加した、エタノール発酵液体培地（酵母エキス０．３％，ペプトン０．３％，ＫＨ２ＰＯ４０．１％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０１％）に、湿量基準で２０w/w％接種し、２５℃にて８日間静置培養し、エタノール濃度、糖濃度（還元糖量）の測定を行った。
【００２１】
［エノキタケＦｖ−１株培養液中のエタノール濃度測定］
エタノール濃度はＦ−キットエタノール（Ｊ．Ｋ．インターナショナル社製）を用いて測定した。培養上清は測定範囲内に収まるように１〜２００倍に適宜希釈して測定した。１％セロテトラオース，１％セロトリオース，１％セロビオース，又は１％グルコースをそれぞれ添加した場合における各培養上清中のエタノール濃度の経時変化の結果を図１に、また１０日培養後のエタノール変換率を以下の表１に示す。その結果、セロビオース，セロトリオース，又はセロテトラオースそれぞれを添加した場合、グルコースを添加した場合とほぼ同等の高いエタノール変換率を示した。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
［エノキタケＦｖ−１株培養液中の糖濃度測定］
糖濃度（還元糖量）はＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法（Somogyi, M.(1952)J. Biol. Chem., 195, 19等参照）により測定した。１％グルコースを添加した場合における培養上清中のエタノール変換率及び糖濃度（還元糖量）の経時変化の結果を図２に示す。
【図１】
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【図２】
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