(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚、特に顔の皮膚の艶の輝きを増強及び／又は取り戻すために皮膚への局所塗布のための化粧品組成物の提供。更に、該化粧品組成物の有効量の問題となる皮膚の部分への塗布を含む、艶の輝きを増強及び／又は取り戻すための皮膚、特に顔の皮膚の美容ケアの方法の提供。【解決手段】下記式（Ｉ）の構造を有するリポクロマン−６を有効成分として含有する組成物。リポクロマン−６の濃度が０．００１重量％から５重量％の間の量を含有する組成物。2010043077.tif 000012【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポクロマン−６を含むことを特徴とする化粧用薬剤。
【請求項２】
皮膚の艶の輝きを増強若しくは取り戻す又はその両方のためのものであることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記活性剤が、前記組成物の皮膚への塗布後に皮膚細胞中の酸化されたタンパク質の割合の低減を生じるのに十分な量で使用されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記活性剤が、メチオニンスルホキシド還元酵素（Ｍｓｒ）をコードする遺伝子の発現及び／又はタンパク質の機能性を回復させるためのメチオニンスルホキシド還元酵素の酸化障害修復活性を刺激するのに十分な量で使用されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
前記活性剤が顔の皮膚の美容ケアのためのものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化粧用薬剤を美容用に活性な薬剤の１つとして含むことを特徴とする、化粧品組成物。
【請求項７】
前記活性剤が、前記組成物の皮膚への塗布後に皮膚細胞中の酸化されたタンパク質の割合の低減を生じるのに十分な量で前記組成物中に存在することを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記化粧品組成物のリポクロマン−６濃度が、組成物の０．００１重量％から５重量％の間であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
前記化粧品組成物のリポクロマン−６濃度が、組成物の０．０１重量％から１重量％の間であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、皮膚、特に顔の艶の輝きを増強するためのリポクロマン−６の化粧品組成物における使用に関する。
【０００２】
リポクロマン−６は、式（Ｉ）の化合物である。
【０００３】
【化１】
2010043077.tif 000002
【０００４】
それは、先行技術において抗酸化剤として、遊離ラジカルスカベンジャーとして、脂質過酸化阻害剤として及びペルオキシナイトライトによって誘導される障害に対しての細胞用の保護剤として記載されている。それは、化粧品組成物において抗老化剤として使用される。
【０００５】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、全ての細胞成分、炭水化物、ＤＮＡ、脂質及びタンパク質を酸化する能力を有し（Ｄａｖｉｅｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９８７，２６２（２０）：９８９５〜９０１；Ｈａｌｌｉｗｅｌｌら、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ，１９９３，５７（５  Ｓｕｐｐｌ）：７１５Ｓ〜２４Ｓ；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２４Ｓ〜２５Ｓ；Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９９５，２５８：３７９〜９３）、その変質を招く。
【０００６】
このため細胞は、さまざまな酸化種に対して、それらの種の生成部位に対して、及びそれらの生物学的標的に対して特異的な抗酸化防御機構を発達させている。
【０００７】
これらの機構は、一方でメラトニン、リポ酸、コエンザイムＱ、メラニン、ビタミンＣ及びＥ、並びにグルタチオン（ＧＳＨ）などの低分子量の化合物を用いる非酵素的抗酸化防御を含み、次にスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキレドキシン、スルフィレドキシン、及びチオレドキシン／チオレドキシン還元酵素系などの酵素的抗酸化防御を含む。
【０００８】
タンパク質は、酸化変化の好適な標的である。酸化されたタンパク質は、分解されるか又は修復されるかのいずれかであり得る。酸化されたタンパク質の分解に関与する１つの主な系は、プロテアソームである（Ｄａｖｉｅｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ；２００１，８３（３〜４）：３０１〜１０）。酸化されたタンパク質を修復するための唯一の系は、メチオニンスルホキシド還元酵素（Ｍｓｒ）系であり、メチオニンスルホキシドをメチオニンに還元することによって酸化過程を逆行させる。
【０００９】
ヒトにおける必須アミノ酸、メチオニンは、生理的条件下で細胞の酸化種の大部分と非常に迅速に反応することから、「トラップ」又は「スカベンジャー」系とも称されるＲＯＳの解毒に対する優れた作用物質を構成する（Ｈ２Ｏ２、ＯＨ・、ペルオキシナイトライト、クロラミン、次亜塩素酸（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６，９３（２６）：１５０３６〜４０；Ｂｅｒｌｅｔｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９７，２７２（３３）：２０３１３〜６；Ｔｉｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９，９６（１４）：７８０９〜１４）。
【００１０】
タンパク質のほとんどは、それらの一次配列に少なくとも１つのメチオニンを含有し、これらのメチオニンの酸化は、タンパク質の活性の減少を生じさせる。一例は、皮膚のレベルでエラスターゼ活性を阻害するタンパク質である。これは、この阻害タンパク質のアミノ酸の一次配列中のメチオニンの酸化がエラスチンの保護についてそれを無効にするためである。
【００１１】
タンパク質中のメチオニンの酸化変化は、Ｍｓｒ（メチオニンスルホキシド還元酵素）系の一部を構成する酵素であるＭｓｒＡ及びＭｓｒＢの作用によって可逆的に修復され得る。
【００１２】
酵素ＭｓｒＡ及びＭｓｒＢ（まとめてＭｒｓと称される）は、身体組織の至る所に遍在する。それらの役割は、メチオニンを再び形成するために、メチオニンのメチオニンスルホキシド（Ｍｅｔ−Ｓ（Ｏ））への最初の酸化反応を逆行させることである。これは、可逆的酸化の稀な現象の１つである。それらの活性部位の３次元構造は、対称的である。２つの酵素それぞれが、メチオニンスルホキシドのジアステレオマーの１つを特異的に認識する（Ｓ型はＭｓｒＡ及びＲ型はＭｓｒＢ）。したがってそれらの役割は、相補的ではあるが、非常に特異的である。
【００１３】
酸化されたタンパク質は、酸化されていないタンパク質とは異なる光学的性質を有する。円二色性の技術は、酸化されたタンパク質によって反射される光が、酸化されていないタンパク質によって反射されるものとは異なることを示している（Ｆｒｉｇｕｅｔら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９９４，３１１：１６８〜７３）。より疎水性になることから、それらは、より容易に凝集を生じ、且つ異常に相互に架橋する場合もある。
【００１４】
酸化されたタンパク質とは別に、リポフスチンなどの蛍光化合物も細胞内に蓄積し得る（Ｂｒｕｎｋら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ，２００２，３３：６１１〜９）。
【００１５】
タンパク質及び脂質残基の酸化及び凝集から形成される蛍光色素、リポフスチンは、今日、細胞老化のマーカーであると見なされている（Ｔｅｒｍａｎら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００４，３６：１４００〜４）。
【００１６】
結果として、酸化されたタンパク質及び／又はリポフスチンの蓄積は、皮膚レベルでの細胞周期の調節異常を生じさせ、その生得の、遺伝的に決定された色に変化を生じさせることによって皮膚及び、より具体的には皮膚の艶に、並びに観察者によるその視覚的認知に影響を有する場合がある。その時、艶は、「くすんだ」と称される。
【００１７】
内因的、すなわち遺伝的に決定された、又は外因的、すなわちＵＶなどの外部要因によって生じるかにかかわらず、この変化は、皮膚の老化現象に関連し得る。その原因は、疾患、ストレス、喫煙又は細胞レベルでのタンパク質の酸化を誘導し得る任意の他の要因にもある場合がある。
【００１８】
本発明の発明者らは、リポクロマン−６が、この分子で処置された皮膚細胞における酸化されたタンパク質の割合の低減を、タンパク質にそれらの機能を回復させるために、酵素ＭｓｒＡ及びＭｓｒＢをコードする遺伝子の発現を刺激することによってのみならず、酸化障害へのその可逆的修復活性を刺激することによっても生じさせることを驚くべきことに示している。
【００１９】
皮膚への塗布のためのこれらの化粧品組成物におけるリポクロマン−６の使用は、したがって、細胞の適切な機能に有害な影響を与えるこれらの酸化されたタンパク質の蓄積によって生じた障害を限定でき、したがって、艶の改善に寄与する。
【００２０】
リポクロマン−６の使用に由来する表皮細胞の機能の改善は、細胞再生の均一化、及び基低層から角質層に移動する角化細胞の分化の均一化も導く。角質層の細胞再生のこの均一化現象は、この角質層の表面をより均一的且つ滑らかにする。したがって入射光は、皮膚の（角質層によって形成された）表面によって、より良く反射され、観察者による、より高い輝度、より明るい皮膚の艶の視覚認知が生じる。
【００２１】
したがって本発明は、第１に、艶の輝きを増強する目的のための、顔の皮膚の少なくとも一部分への塗布のための化粧品組成物中における活性剤としてのリポクロマン−６の使用を提供する。
【００２２】
本発明は、皮膚、特に艶の変化が皮膚の老化に関連している部位の艶の輝きを増強及び／又は取り戻すための、身体又は顔の皮膚の少なくとも一部分への塗布のための化粧品組成物中の活性剤としてのリポクロマン−６の使用をさらに提供する。
【００２３】
この新規使用の目的は、特に、前記組成物を塗布する顔の皮膚の艶の輝きを増強及び／又は取り戻すことである。
【００２４】
本発明の他の目的は、皮膚の艶の輝きを増強及び／又は取り戻すための美容ケアの方法を提供することである。
【００２５】
したがって、第１の本質的特徴により本発明は、皮膚、特に顔の皮膚の艶の輝きを増強及び／又は取り戻すための活性剤としてのリポクロマン−６の化粧品組成物における使用を提供する。
【００２６】
本発明の有利な一実施形態により、この活性剤は、前記組成物の皮膚への塗布の後に、皮膚細胞における酸化されたタンパク質のレベルの低減を生じさせるのに十分な量で前記組成物中に含有される。
【００２７】
本発明の他の有利な実施形態において、この活性剤は、タンパク質にそれらの機能を回復させるために、酵素、メチオニンスルホキシド還元酵素（Ｍｓｒ）をコードする遺伝子の発現及び／又はその酸化障害修復活性を刺激するのに十分な量で使用される。
【００２８】
以下の実施例から明らかである通り、活性剤は、Ｍｓｒａ及びＭｓｒｂの両方に作用し、特にＭｓｒｂに作用する。
【００２９】
リポクロマン−６は、組成物の０．００１重量％から５重量％の間、好ましくは０．０１重量％から１重量％の間の濃度で化粧品組成物中に存在する。
【００３０】
第２の本質的特徴により、本発明は、艶の輝きを増強及び／又は取り戻すための、皮膚の、より具体的には顔の皮膚の美容ケアの方法に関する。この方法は、皮膚の艶の輝きを増強する及び／又は取り戻すための薬剤としてリポクロマン−６を含む化粧品組成物の有効量の、問題の皮膚の部分への塗布を含む。
【００３１】
本発明の他の特徴及び有利点は、実施例及びこれらの実施例が参照する図に関連して示される、以下の詳細な記載において明らかになる。
【００３２】
より正確には、図１、２（２ａから２ｅ）及び３は、それぞれ以下を表す。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例２に関連して表され、リポクロマン−６のＭｓｒ活性への作用を表す。
【図２ａ】実施例３に関連して表され、酸化されたタンパク質のレベル及び細胞の数を評価する画像分析のさまざまなステップ（図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ）を表す。
【図２ｂ】実施例３に関連して表され、酸化されたタンパク質のレベル及び細胞の数を評価する画像分析のさまざまなステップ（図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ）を表す。
【図２ｃ】実施例３に関連して表され、酸化されたタンパク質のレベル及び細胞の数を評価する画像分析のさまざまなステップ（図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ）を表す。
【図２ｄ】実施例３に関連して表され、酸化されたタンパク質のレベル及び細胞の数を評価する画像分析のさまざまなステップ（図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ）を表す。
【図２ｅ】実施例３に関連して表され、酸化されたタンパク質のレベル及び細胞の数を評価する画像分析のさまざまなステップ（図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ）を表す。
【図３】実施例３に関連して表され、表皮細胞中の酸化されたタンパク質の量へのリポクロマン６の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
実施例１が、遺伝子Ｍｓｒａ及びＭｓｒｂの発現でのリポクロマン−６の効果を明らかに示すこと、及び実施例２がメチオニンスルホキシド還元酵素の活性へのこの同じリポクロマン−６の効果を明らかに示すことは注目される。
【００３５】
同様に実施例３は、リポクロマン−６の存在下でのタンパク質の酸化のレベルの低減を示す。
【００３６】
リポクロマン−６のこれら全ての効果は、実施例４から６において例示される組成物で得られる艶の増強の優れた特性によって確認される。
【００３７】
したがって、本発明の発明者らによって示された新たな特性は、皮膚、より具体的には顔の皮膚の艶の輝きの増強が望まれる部位での全ての塗布においてリポクロマン−６を使用する可能性をもたらす。
【実施例】
【００３８】
実施例１：タンパク質ＭｓｒＡ及びＭｓｒＢをコードする遺伝子の発現でのリポクロマン−６の効果
タンパク質ＭｓｒＡ及びＭｓｒＢをコードする遺伝子の基礎発現でのリポクロマン−６の効果を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ；ＲＴ−Ｑ−ＰＣＲ）の方法によって評価する。
【００３９】
選択されたモデルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養された正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＫ）である。
【００４０】
最初に細胞毒性試験を角化細胞について実施する。
【００４１】
ＭＴＴ生存率検査の結果及び細胞層の観察は、検査の残り部分についての無細胞毒性濃度の選択を導く。
【００４２】
装置及び方法
１．生物学的モデル
型：正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＫ）
培養培地：ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
上皮増殖因子（ＥＧＦ）０．２５ｎｇ／ｍｌ及び下垂体抽出物（ＰＥ）２５μｇ／ｍｌ（ＥＧＦ、ＰＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ゲンタマイシン２５μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）
検査培地：ＥＧＦ及びＰＥを含まないＳＦＭ培地（ＳＦＭ−ＰＥ−ＥＧＦ）
【００４３】
２．検査生成物
リポクロマン−６：エタノール中１０ｍｇ／ｍｌ保存溶液、検査培地に０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度で希釈
【００４４】
３．初期細胞毒性
９６ウェルプレート
細胞／ウェル：ＳＦＭ−ＰＥ−ＥＧＦ培地中に１５０００ＮＨＫ
評価パラメーター：ＭＴＴ加水分解、形態学的観察
【００４５】
４．培養及び処置
角化細胞を播種し、完全ＳＦＭ培養培地中（２４ウェルプレート）で２４時間前培養し、次いでＳＦＭ−ＰＥ−ＥＧＦ培地に入れる。
【００４６】
コンフルエンスで、細胞を検査生成物で処置するか又はせず（対照）、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。各処置は、３回反復で実施する。次いで培養上清を回収し、細胞層をＰＢＳ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でリンスし、次いでトリ−リージェント（ｔｒｉ−ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｓｉｇｍａ）３００μｌを加える。次にプレートを−８０℃で凍結する。
【００４７】
５．定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ−Ｑ−ＰＣＲ）
遺伝子ｍｓｒａ及びｍｓｒｂの発現を、各処置の細胞層から抽出するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に基づいてＲＴ−Ｑ−ＰＣＲによって評価する。各処置について、ＲＮＡの抽出の前に試料３個を１つに合わせる。
【００４８】
５．１．逆転写
手順の主なステップは以下の通り：
供給元の手順書に従ってトリ−リージェントを使用する全ＲＮＡの抽出
ＤＮＡ−フリーシステム（ＤＮＡ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｍｂｉｏｎ）での処置による混入の可能性がある微量のＤＮＡの除去
プライマーオリゴ（ｄＴ）及び酵素スーパースクリプトＩＩ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）（Ｇｉｂｃｏ）の存在下での逆転写反応の実行
ＰＣＲ反応は、以下のプライマーを用いて実施する：
【００４９】
【化２】
2010043077.tif 000003
【００５０】
本研究のための参照マーカーは、以下の遺伝子である：
【００５１】
【表１】
2010043077.tif 000004
【００５２】
５．２．定量的ＰＣＲ
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）反応を、ライトサイクラーシステム（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）で、供給元によって推奨される手順に従って定量的ＰＣＲにより実施する。正確に実施するために、この分析系は、さまざまなプライマーの分析条件の事前開発を必要とする。この系は、２つの主な要素から構成される：急速な熱伝達が可能である最適化されたサーモサイクラー、及びＤＮＡに組み込まれた蛍光強度を継続的に測定する蛍光光度計（５２１ｎｍで検出）。各試料についての反応混合物（最終１０μｌ）は、以下の通り：
１／１０に希釈したｃＤＮＡ  ２．５μｌ
使用された異なるマーカーのプライマー
酵素ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、マーカーＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（伸長ステップの過程で二重鎖ＤＮＡに組み込まれるフルオロフォア）及びＭｇＣｌ２を含有する反応混合物（Ｒｏｃｈｅ）
【００５３】
５．３．Ｑ−ＰＣＲの分析
増幅されたＤＮＡへの蛍光の取り込みは、ＰＣＲサイクルの間、継続的に測定する。この系は、ＰＣＲサイクルの関数としての蛍光の測定曲線を作成し、したがって各マーカーについての相対発現値の評価を可能にする。サイクル数は、蛍光曲線の「出口」点に基づいて決定する。所与のマーカーの分析について、試料の出口が遅くなると（高いサイクル数）、ｍＲＮＡの初期コピー数が低下する。相対発現（ＲＥ）値は、以下の式：
（１／２サイクル数）×１０６
に従って任意単位（ＡＵ）で表される。
【００５４】
結果：遺伝子ｍｓｒａ及びｍｓｒｂの発現でのリポクロマン−６の効果
【００５５】
結果を表２及び３に示す。
【００５６】
【表２】
2010043077.tif 000005
【００５７】
【表３】
2010043077.tif 000006
【００５８】
結論：結果は、リポクロマン−６が、遺伝子ｍｓｒｂの発現に関してより強い誘導活性を示すことを、ｍｓｒａに関して測定された活性と比較して表している。この結果は、メチオニンスルホキシドのＲ型の還元における作用の特異性を述べている。
【００５９】
実施例２：リポクロマン−６によるメチオニンスルホシド還元酵素（Ｍｓｒ）の活性の調節
装置及び方法
１．培地及び試薬
角化細胞培養
補充Ｋ−ＳＦＭ：
Ｌ−グルタミンを含むケラチノサイト−ＳＦＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ケラチノサイト−ＳＦＭ補充（ギブコ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）×１０  ｐＨ７．２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
ジメチルスルホキシドＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ギブコ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ試薬（ＢｉｏＲａｄ）
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
ＤＴＴジチオスレイトール（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
セルリティック（ＣｅｌＬｙｔｉｃ）（商標）Ｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
酢酸エチル（ＶＷＲ）
シグマ−フルオルハイ（Ｓｉｇｍａ−Ｆｌｕｏｒ  Ｈｉｇｈ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｎ−アセチル−（３Ｈ）−メチオニン−Ｒ，Ｓスルホキシド基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
【００６０】
２．細胞培養
角化細胞は、健康な４７歳の提供者の腹部由来の皮膚の移植片から得る。
【００６１】
それらを完全ＫＳＦＭ培地（ＫＳＦＭｃ）で３７℃、５％ＣＯ２で培養し、次いで液体窒素中で凍結する。
【００６２】
細胞の融解
細胞を融解する前に、水浴の温度を３７℃に設定し、補充ＫＳＦＭ培養培地（Ｋ−ＳＦＭ−Ｓ）を予熱する。凍結チューブを液体窒素から取り出し、３７℃の水浴に融解するまで置き、次いで開ける前に７０％エタノールで洗浄する。ＤＭＳＯを除くために、細胞を滅菌的手順で回収し、予熱した培地１０ｍｌ中に入れ、次いで転倒により再懸濁する。
【００６３】
遠心分離を２００ｇ、５分間、４℃で実施する。上清を除き、細胞沈澱をＫ−ＳＦＭ−Ｓ培養培地２ｍｌに回収し、Ｔ７５フラスコに入れ、それを培養培地で１０ｍｌにする。
【００６４】
細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で湿式インキュベーターに置く。培養培地を翌日交換する。
【００６５】
細胞継代
コンフルエンスに達した細胞をトリプシンの作用ではく離し、計数し、Ｔ７５培養フラスコ当たり細胞２．５×１０６個で再播種する。
【００６６】
トリプシンでの細胞の処理
培地を出して除去する。細胞をＰＢＳ緩衝液２ｍｌで洗浄し、それを出して除去する。洗浄を２回繰り返す。予熱した０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液  １ｍｌを加え、ＰＢＳ緩衝液で１／２に希釈する。フラスコを５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに１から２分間置く。トリプシンの作用をＫ−ＳＦＭ−Ｓ、５０％（ＦＢＳ）培地２ｍｌの添加によって停止させる。
【００６７】
細胞を２００ｇ、５分間、４℃で遠心分離する。上清を出し、細胞沈澱を培養培地４ｍｌに回収する。細胞をＣｈｅｍｏｍｅｔｅｃ（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ）からのヌクレオカウンター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ）で計数し、Ｔ７５フラスコ当たり細胞２．５×１０６個でＫ−ＳＦＭ−Ｓ培養培地１０ｍｌ中に播種する。細胞を培養物中で継代Ｐ３まで維持する。継代Ｐ３で、細胞を培養物中に一晩保持し、翌日に活性物での処置に使用する。
【００６８】
３．リポクロマン−６での細胞の処置
リポクロマン−６溶液の調製
リポクロマン−６粉末（供給元：Ｌｉｐｏｔｅｃ）をまず無水エタノール２０μｌに希釈する。次いで保存溶液をＫ−ＳＦＭ−Ｓ培地中に１０ｍｇ／ｍｌで調製する。
【００６９】
リポクロマン−６希釈系列の調製
１ｍｇ／ｍｌの中間溶液（２０μｌをＫ−ＳＦＭ−Ｓ培地２００μｌ中に希釈）をリポクロマン−６保存溶液から調製する。
【００７０】
希釈は、１ｍｇ／ｍｌの中間溶液に基づいてＫ−ＳＦＭ−Ｓ培地中に実施する。
【００７１】
リポクロマン−６濃度系列は以下の通り。
【００７２】
【表４】
2010043077.tif 000007
【００７３】
リポクロマン−６での角化細胞の処置
培地を細胞フラスコ（継代Ｐ３）から出し、異なる希釈での活性物を含有する培地で置き換える。２４時間の処置後、細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、次いでトリプシンで処理する。最後に細胞をＣｈｅｍｏｍｅｔｅｃ（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ）からのヌクレオカウンターで計数する。
【００７４】
処置は、フラスコ当たり細胞３．２から３．７×１０７個で実施する。
【００７５】
４．ブラッドフォード法によるプロテインアッセイ：
タンパク質抽出物の調製、細胞溶解
細胞を９００ｇ、１０分間、４℃で遠心分離する。細胞沈澱をＰＢＳ緩衝液１ｍｌに回収し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れ、次いで４５０ｇ、５分間、４℃で遠心分離する。沈澱をセルリティック（商標）−Ｍ緩衝液１５０μｌに回収する。次に細胞を５℃に温度設定した撹拌器で１５分間インキュベートし、１５分間、１２０００ｇで遠心分離する。タンパク質上清を新たなエッペンドルフチューブに移し、５℃に保つ。
【００７６】
プロテインアッセイ
標準系列の調製
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｇ／ｍｌでの保存溶液
系列は、以下の表に従って調製する。
【００７７】
【表５】
2010043077.tif 000008
【００７８】
試料の調製
タンパク質抽出物を１／１０に希釈し、アッセイを１０μｌについて、水で１００μｌにして実施する。各チューブは、使用時に水で１／５に希釈するＢｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１ｍｌと混合する。均一化及び外気温度、５分間のインキュベート後、試料の吸光度を５９５ｎｍで分光光度計（Ｋｏｎｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で測定する。
【００７９】
５．Ｍｓｒ活性の測定
アッセイの原理
Ｍｓｒ活性を、基質Ｎ−アセチル−（３Ｈ）−メチオニン−（Ｒ，Ｓ）スルホキシドを使用することによって、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ  ＤＴＴを含有する反応混合物３０μｌ中、３７℃でタンパク質抽出物について測定する。反応は、１Ｎ  ＨＣｌ  ５００μｌの添加によって停止させる。反応の生成物は、酢酸エチル１．２ｍｌで抽出する。
【００８０】
手順
所要量のタンパク質を取り、氷中に保存した２ｍｌエッペンドルフチューブ中で、水で２０．８μｌの反応容量にする。０．７５μｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５＋３μｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋０．４５μｌの１５ｍＭ  ＤＴＴ、続いて、水中に１／１００に希釈した放射活性基質５μｌを加える。チューブを撹拌し、３７℃で３０分間から２時間、酵素の動力学的状態に応じてインキュベートする。反応を１Ｎ  ＨＣｌ  ５００μｌで停止させる。反応の生成物を酢酸エチル１．２ｍｌで抽出し、チューブを乳濁液が得られるまで１分間撹拌する。
【００８１】
外気温度での１５０００ｇ、５分間の遠心分離に続いて、上部の有機層１ｍｌを取り、シンチレーションバイアル中で計数し、シグマフルオルシンチラント（Ｓｉｇｍａ  Ｆｌｕｏｒ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）２ｍｌと混合する。
【００８２】
６．動力学的状態の決定
Ｍｓｒ活性のアッセイを各点について３回反復で実施し、２回繰り返す。アッセイの状態は、以下の通り：タンパク質３０μｇ、３７℃、９０分間インキュベート。
【００８３】
結果
Ｍｓｒ活性におけるリポクロマン−６の作用を図１に示す。
【００８４】
結論
培養中のヒト角化細胞へのリポクロマン−６の添加は、これらの細胞のＭｓｒ活性を刺激する。０．０５％の用量で、活性は、４４％まで増大する。
【００８５】
実施例３：表皮細胞の酸化されたタンパク質含有量でのリポクロマン−６の効果
装置及び方法
１．細胞培養
細胞操作は、層流フード下の滅菌条件で実施する。
【００８６】
２名の異なる提供者（以下、ＫＨＮ００２及びＫＨＮ９７２６と表示）で採取を実施するヒト皮膚から単離する正常ヒト角化細胞（ＮＨＫ）をＴ７５フラスコ、完全ＫＳＦＭ培地（ＫＳＦＭｃ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧＩＢＣＯ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養し、８ウェル  ラブ−テック  ＩＩ培養系（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で１ウェル当たり細胞２００００個で播種する。
【００８７】
２．処置
４８時間培養後、細胞を処置溶液（以下を参照）で処置する。
【００８８】
リポクロマン−６保存溶液の調製
０．００４％重量／容量リポクロマン−６溶液を調製する（溶液Ａ）。
【００８９】
これは、リポクロマン−６粉末（供給元：Ｌｉｐｏｔｅｃ）２０ｍｇをエタノール２ｍｌに溶解する（１０ｍｇ／ｍｌ溶液）ことによって行われる。溶液Ａを得るために、この溶液を（保存溶液４０μｌをＫＳＦｍ培地１０ｍｌに）希釈する。
【００９０】
処置溶液の調製
処置溶液は、リポクロマン−６の正確な百分率を得るために、ＫＳＦＭｃ培地中に上記で調製した溶液Ａを希釈することによって調製する。
処置は、細胞型当たり３ウェル実施する。
対照：ＫＳＦＭｃ
溶媒対照：ＫＳＦＭｃ培地中のエタノールの０．１％溶液
０．００１％リポクロマン
０．００２％リポクロマン
【００９１】
３．酸化されたタンパク質の免疫染色
４８時間の処置後、ＫＳＦＭｃを出す。細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ＰＢＳ錠、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧＩＢＣＯ）でリンスし、次いでホルマリン（中性緩衝１０％ホルマリン溶液、Ｓｉｇｍａ）で１０分間、外気温度で固定する。ＰＢＳでのリンス後、培養容器を０．１％トライトン（ｔｒｉｔｏｎ）溶液（トライトンＸ−１００、Ｓｉｇｍａ）で１０分間満たし、次いでＰＢＳでリンスする。
【００９２】
次に培養容器を分解し、スライドをエタノール／硫酸混合物（９８．５ｍｌ／１．５ｍｌ）中の２，４−ジニトロフェニルヒドラジンの溶液（ＤＮＰＨ（Ｆｌｕｋａ）３００ｍｇ）中に３０分間浸漬する。
【００９３】
ＤＮＰＨは、酸化されたタンパク質のカルボニル基と以下の反応に従って反応する：
【００９４】
【化３】
2010043077.tif 000009
【００９５】
スライドをＰＢＳでリンスする。次に細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液（１０ｇ／ｌ）で３０分間、外気温度で覆う。
【００９６】
酸化されたタンパク質に固定化されたジニトロフェニル（ＤＮＰ）基は、抗ＤＮＰ一次抗体によって認識される。
【００９７】
この目的のために、第１ステップで、スライドを、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中に１／５００に希釈した一次抗体（マウスモノクローナル抗ＤＮＰ抗体、Ｓｉｇｍａ）の溶液で覆い、オーブン中で６０分間、外気温度でインキュベートし、次いで０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−ＰＢＳ溶液（ツイーン２０、Ｍｅｒｃｋ）でリンスする。第２ステップで、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中の二次抗体溶液（アレクサフルオロ（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ）５４６ヤギ抗マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で覆い、遮光して６０分間インキュベートする。スライドを、次にＰＢＳ−ツイーンで、次いでＰＢＳでリンスする。
【００９８】
第３ステップで、水性封入剤（フルオレッセントマウンティングメディウム（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＡＫＯ）を数滴スライドに乗せ、次に４℃、暗所で保存する。
【００９９】
４．共焦点顕微鏡での画像の取得
レーザーシャープ２０００ソフトウェア（ＬａｓｅｒＳｈａｒｐ  ２０００  ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ＢｉｏＲａｄ）を用いて共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓからのアキシオプランマイクロスコープ（Ａｘｉｏｐｌａｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）及びＢｉｏＲａｄからのクリプトン−アルゴンレーザー）によって写真を作成する。各条件について、写真３枚を×４０レンズで、同一の取得パラメーター（ゲイン、絞り）に従って作成する。
【０１００】
蛍光色素の励起波長は、５４６ｎｍであり、発光波長は、５７３ｎｍである。
【０１０１】
実際に、５４６ｎｍの励起蛍光を細胞に共焦点レーザーによって当てる。酸化されたタンパク質を示す蛍光色素アレクサフルオロ５４６は、特定のフィルターによって回収され、且つ観察できる５７３ｎｍに蛍光を発光する。したがって測定される蛍光は、酸化されたタンパク質の量に直接比例する。
【０１０２】
５．画像分析
写真は、ライカＱＷｉｎ（Ｌｅｉｃａ  ＱＷｉｎ）画像分析ソフトウェアを用いて分析する。プログラムは、酸化されたタンパク質のレベル及び細胞数を評価するためのＤＮＰＨ染色の定量を可能にする。
【０１０３】
プログラムは、酸化されたタンパク質の蛍光染色を検出する。可能な限り代表的な（数、大きさ、細胞密度、標識の強度）検出域を画定する。画定した領域中の酸化されたタンパク質の蛍光を測定し、同領域の細胞を細胞核を数えることによって計数する（図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ及び２ｅを参照されたい）。
工程は、順に以下のステップを含む：
分析する画像を開く（図２ａ）
酸化されたタンパク質の染色の検出（図２ｂ）
検出域の追跡（図２ｃ）及び染色域の減算（図２ｄ）
細胞の照合（図２ｅ）。
【０１０４】
結果
酸化されたタンパク質でのリポクロマン−６の効果を、２つの型の正常ヒト角化細胞（ＮＨＫ）について測定する。これは、画像処理システムを使用して、酸化されたタンパク質の染色の表面積、測定領域の表面積及び測定表面積中の細胞数を推定することによって行う。
【０１０５】
１．統計的方法
欠測データ、外れ値
基数が「／ｎ＝５」と示される、欠測値又は応答の欠如の場合以外は、これらの反応したヒト（ｎ＝６）に基づいて百分率を算出する。対応のある検定については、１つの対象に欠測値がある場合は、その対象を分析から外す。ディクソン検定を外れ値を決定するために使用する。
【０１０６】
統計的検定の有意性の程度
統計的分析を誤差リスクα＝５％で実行する。
ｐは、検定の有意性を示す：
＊ｐ≦０．０５の場合→Ｓ（有意）、ｐの値を角括弧内に記す。
＊０．０５≦ｐ≦０．１０の場合→Ｓlim（境界有意）、ｐの値を角括弧内に記す。
＊ｐ＞０．１０の場合→ＮＳ（有意でない）、ｐの値は、記さない。
【０１０７】
定性データの分析
定性的課題の分散ソーティングは、総数を記録するステップ及び次いで他の可能な反応の頻度（百分率として表す）を算出するステップを含む。χ２検定を百分率を比較するために使用する。
【０１０８】
定量データの分析
最初に記述的分析を実施する。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を要素のモダリティーの手法（ｍｅａｎｓ）を比較するために使用する。スチューデント検定を使用する場合、「Ｔ」によって示す。
【０１０９】
ソフトウェア
ウィンドウズＮＴ（Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴ）でのスタットグラフィックスプラスセンチュリオンパッケージ（Ｓｔａｔｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｐｌｕｓ  Ｃｅｎｔｕｒｉｏｎ  ｐａｃｋａｇｅ）及びユニウィン６．０（Ｕｎｉｗｉｎ  ６．０）。
【０１１０】
２．皮膚細胞の酸化されたタンパク質含有量でのリポクロマン−６での処置の効果
両側検査（対照／溶媒対照）を使用する溶媒対照を除いて、片側検査を有意性を算出するために使用する。
【０１１１】
【表６】
2010043077.tif 000010
【０１１２】
リポクロマン−６溶液で処置した細胞における酸化されたタンパク質の割合を図３に示す。
【０１１３】
結論
タンパク質の酸化でのリポクロマン−６の顕著な効果が、各検査について観察される。リポクロマン−６の濃度が増大すると、標識された酸化されたタンパク質の表面積が低下する。したがって、酸化されたタンパク質の割合は、どちらか一方のリポクロマン−６溶液での処置後に有意に減少する（リポクロマン−６の０．００１％又は０．００２％溶液についてそれぞれ−１９．４３％及び−４８．９７％）。
【０１１４】
以下の表は、リポクロマン−６での処置の有効性の有意性を対照と比較して区別する。
【０１１５】
【表７】
2010043077.tif 000011
【０１１６】
実施例４−艶の明るさを高めるしわ取りデイクリーム
組成物は、リポクロマン−６を含む水中油型乳剤である（組成物の重量と比較した重量で示す％）：
リポクロマン−６                                ０．０５
センテラ・アジアティカ抽出物                    ０．５
ステアレス−２１                                ２．５
ステアリン酸グリセリル                          １．１
ステアリルアルコール                            ５
トリカプリン酸グリセロール／カプリル酸        １１．５
ブチレングリコール                              ３
グリセロール                                    ２
保存剤                                          ０．５
香料濃縮物                                      ０．５
ＵＶフィルター                                  ７．５
水                                              ｑｓ１００
クリームは、顔に、好ましくは朝に塗布する。
【０１１７】
実施例５−リポクロマン−６を含む「ラジアンスショット」ローション
化粧品組成物は、ローションである（組成物の重量と比較した重量で示す％）：
リポクロマン−６                                ０．０５
ブチレングリコール                              ３
ＥＤＴＡ                                        ０．１
可溶化剤                                        １
香料濃縮物                                      ０．３
エタノール                                      ５
ＵＶフィルター                                  ０．１
水                                              ｑｓ１００
例えば一日の終わりの夜に、顔に塗布する場合にローションは、顔の輝きを取り戻す。
【０１１８】
実施例６−リポクロマン−６を含む化粧用パウダー
化粧品組成物は、固めた粉末である（組成物の重量と比較した重量で示す％）：
リポクロマン−６                                ０．０５
保湿活性物（グリセロール）                      ２．４
粘着剤                                          ３．５
ＵＶフィルター                                １８
質感剤                                        ４９
結合剤                                        １６
香料濃縮物                                      ０．１
保存剤                                          ０．６
色素                                            ６
賦形剤（タルク、マイカ）                        ｑｓ１００
顔に塗布される場合にパウダーは、着色効果を与え、顔の輝きを取り戻す。
【図１】
2010043077.tif 000013
【図２ａ】
2010043077.tif 000014
【図２ｂ】
2010043077.tif 000015
【図２ｃ】
2010043077.tif 000016
【図２ｄ】
2010043077.tif 000017
【図２ｅ】
2010043077.tif 000018
【図３】
2010043077.tif 000019
【配列表】
2010043077000001.app
【外国語明細書】
2010043077000001.pdf