(57)【要約】【課題】特定の器官または組織にホーミングし得る分子を同定すること。【解決手段】本発明は、種々の正常な器官または組織（肺、膵臓、皮膚、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸を含む）に選択的にホーミングする分子を提供し、そして腫瘍を保有する器官または組織（膵臓腫瘍を有する膵臓または肺腫瘍を有する肺を含む）に選択的にホーミングする分子を提供する。本発明はまた、部分に連結した器官または組織ホーミング分子を含む結合体を提供する。このような機能基は、例えば、治療的薬剤または検出可能な薬剤であり得る。本発明はまた、肺内皮細胞に選択的にホーミングする、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）−結合ホーミング分子を同定する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９８年３月１３日に出願された米国出願番号第０９／０４２，１０７号の一部継続出願であり、この内容の全体を本明細書中に参考として援用する。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられる助成金番号ＣＡ  ７４２３８およびＣＡ  ３０１９９のもとで政府支援が行われた。
【０００３】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、分子医学および薬物送達の分野に、そしてより詳細には特定の器官または組織にホーミングする分子に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景情報）
特定の病理学の効果はしばしば、罹患した人の身体全体に現れるが、一般に、基礎になる病理は、単一の器官または組織のみに影響を与え得る。しかし、薬物または他の処置が、罹病器官または罹病組織のみを標的化することは稀である。より一般的には、処置は、例えば、患者の身体全体での全身毒性効果に起因して、望ましくない副作用をもたらす。例えば、標的器官または標的組織に関連した疾患の処置のために器官または組織を選択的に標的化することが望ましい。詳細には、器官または組織の標的化は、遺伝子の発現を、特定の器官または組織に指向させるために有用であり得る。なぜなら、非標的細胞への外来遺伝子の取り込みは、望ましくない副作用（例えば、悪性トランスフォーメーション）を生じ得るからである。
【０００５】
大部分の治療物質は、標的器官または標的組織に循環を介して送達される。血管の内部表面の内側を覆う内皮は、標的器官または標的組織における循環治療物質が遭遇する最初の細胞型である。これらの細胞は、治療を器官または組織へと選択的に指向するための標的を提供する。
【０００６】
内皮は、独特の形態および生化学的マーカーを種々の組織において有し得る。リンパ系の血管は、例えば、リンパ球のホーミングを導くように作用する種々の接着タンパク質を発現する。例えば、リンパ節に存在する内皮細胞は、Ｌ−セレクチンについてのリガンドである細胞表面マーカーを発現し、そしてパイアー斑細静脈における内皮細胞は、α4β7インテグリンについてのリガンドを発現する。これらのリガンドは、それらのそれぞれのリンパ系器官への特異的リンパ球ホーミングに関与する。従って、薬物をＬ−セレクチンまたはα4β7インテグリンに連結することにより、この薬物を、それぞれ、罹病リンパ節またはパイアー斑へと標的化するための手段を提供し得る。ただし、これらの分子は、有意な数の他の器官または組織において存在する類似のリガンドには結合しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非リンパ系組織の血管に存在するホーミング分子は明確には規定されていないが、リンパ球の循環の特定の観察によって、器官特異的内皮マーカーおよび組織特異的内皮マーカーが存在することが示唆される。同様に、特定の器官または組織への特定の型の腫瘍細胞のホーミングまたは転移は、器官特異的マーカーおよび組織特異的マーカーが存在し得ることをさらに示唆する。従って、このような器官特異的マーカーまたは組織特異的マーカーに結合し得、それゆえ、この器官または組織にホーミングし得る分子を同定する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、種々の正常な器官または組織（肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸を含む）に選択的にホーミングする分子を提供する。例えば、本発明は、ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）を含む肺ホーミングペプチド（例えば、ＧＦＥモチーフを含む肺ホーミングペプチド）；ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）のような皮膚ホーミングペプチド；ペプチドＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）のような膵臓ホーミングペプチド；ならびにペプチドＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）およびＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６）を含む網膜ホーミングペプチド（例えば、ＲＤＶモチーフを含む網膜ホーミングペプチド）を提供する。
【０００９】
本発明はまた、部分に連結された器官ホーミング分子または組織ホーミング分子を含む、結合体を提供する。このような部分は、毒素、細胞死を阻害する薬剤、細胞による有害もしくは有用な物質の産生もしくは活性を変化させる薬剤、またはこの薬剤に曝露された細胞の増殖を変更する薬剤のような治療的薬剤であり得る。部分はまた、放射性核種のような検出可能な薬剤、または室のあるマイクロデバイスまたは不溶性クロマトグラフィー支持体のようなタグであり得る。本発明のこのような結合体は、この部分を選択された器官または組織へ指向させるために有用である。
【００１０】
本発明はまた、選択された器官または組織にホーミングする分子を、病理を有するかまたは病理を有する疑いのある被験体に投与することによって、本発明の器官ホーミング分子を使用して、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸の病理を診断または処置する方法を提供する。例えば、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸の病理は、この病理を有する被験体に、治療的薬剤に連結した、適切な器官ホーミング分子を含む結合体を投与することによって処置され得る。同様に、検出可能な薬剤に連結した適切な器官ホーミング分子を含む結合体を被験体に投与することにより、選択された器官もしくは組織を同定する方法、または選択された器官における病理を診断する方法。
【００１１】
本発明はさらに、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸のホーミング分子に対する標的分子の選択的結合を検出することにより、それぞれ、肺、膵臓、皮膚、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸における標的分子を同定する方法を提供する。例えば、肺に選択的にホーミングするペプチドは、固体マトリックスに結合され得、肺のサンプルが入手され得、そしてこの標的分子の特異的結合を可能にする条件下でアフィニティーマトリックスに通過させられ得、そして標的分子が収集および同定され得る。従って、本発明はまた、器官ホーミング分子、特に、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸のホーミング分子を結合する標的分子を提供する。このような標的分子は、例えば、この標的分子に特異的な抗体を惹起するために有用であり得る。
【００１２】
本明細書中ではまた、肺内皮に選択的にホーミングする分子である、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）結合ホーミング分子を同定する方法が提供される。この方法は、ＭＤＰを１以上の分子と接触させる工程；およびこのＭＤＰへの分子の特異的な結合を決定する工程を包含し、ここで、特異的結合の存在は、この分子を、肺内皮に選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子として同定する。本発明の１つの方法では、このＭＤＰは、例えば、その天然の状態にあり得るか、または実質的に精製され得、そして所望であれば、支持体に固定化される。膜ジペプチダーゼは、任意の哺乳動物ＭＤＰ、例えば、配列番号４４８を有するヒトＭＤＰであり得る。
【００１３】
本発明によってさらに、肺内皮に選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子に連結された部分を含む結合体を被験体に投与し、それによって、この部分がこの被験体における肺内皮に選択的に指向されることによる、被験体において、部分を肺内皮に選択的に指向させる方法が提供される。このような方法は、例えば、肺への薬物標的化に有用であり得る。本発明の１つの方法では、ＭＤＰ結合ホーミング部分は、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１以上の分子と接触させる工程；およびこのＭＤＰへの分子の特異的な結合を決定する工程によって同定され、ここで、特異的結合の存在は、この分子を、肺内皮に選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子として同定する。種々の部分は、本発明の方法に従って肺内皮に選択的に指向され得る。本発明において有用な部分は、例えば、遺伝子治療ベクターまたは薬物であり得る。
【００１４】
１つの実施態様では、本発明は、肺内皮へ部分を選択的に指向するための方法を提供し、ここで、ＭＤＰ結合ホーミング分子は、配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）を含むペプチドであり、ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸である。このようなＭＤＰ結合ホーミングペプチドとしては、例えば、配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）またはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）が挙げられ得る。
【００１５】
別の実施態様では、本発明は、肺内皮へ部分を選択的に指向するための方法を提供し、ここで、ＭＤＰ結合ホーミング分子は、以下の構造１：
【００１６】
【化３】
2010031038.tif 000002
を含み、ここで、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ、３〜１０個の炭素原子および１〜１５個の炭素原子の範囲の炭化水素ラジカルであり；これらのＲ2炭化水素鎖もしくはＲ3炭化水素鎖のいずれか１つでは、１〜６個の水素がハロゲンによって置換され得るか、または非末端メチレンが酸素もしくは硫黄（硫黄の酸化型形態を含む）によって置換され得；さらに、Ｒ3の末端水素もまたヒドロキシルもしくはチオールによって置換され得、これは、アシル化もしくはカルバモイル化され得；あるいは、この水素はアミノによって置換され得、これはアシルアミノ基、ウレイド基、アミジノ基、グアニジノ（ｑｕａｎｉｄｉｎｏ）基もしくはアルキル基または置換されたアミノ基（四級窒素基化を含む）におけるように誘導体化され得；あるいはカルボン酸基、ホスホン酸基もしくはスルホン酸基のような酸性基、またはそれらのエステルもしくはアミド、またはシアノによる置換が存在し得；あるいは末端アミノ酸基化のようなそれらの組み合わせ；ならびにＲ1は、水素もしくは低級アルキル（Ｃ1-6）もしくはジアルキルアミノアルキル、または薬学的に受容可能な陽イオンである。肺転移を低減または予防するためのこのようなＭＤＰ結合ホーミング分子は、例えば、シラスタチンとしても公知の、７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸であり得る。
【００１７】
ＭＤＰ結合ホーミング分子は、例えば、Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭素が第三級ではあり得ないという制限を有する、分枝したアルキルまたはシクロアルキルである、構造１を有する化合物であり得る。
【００１８】
ＭＤＰ結合ホーミング分子はまた、例えば、Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭素が第三級ではあり得ないという制限を有する、分枝したアルキルまたはシクロアルキルであり、そしてＲ3が第四級窒素、アミン誘導体またはアミノ酸誘導基である末端置換基を有する、ｎ−アルキル（１〜９個の炭素）またはｎ−アルキル（１〜９個の炭素）である、構造１を有する化合物であり得る。ＭＤＰ結合ホーミング分子は、例えば、Ｒ2が、２，２−ジメチルシクロプロピルもしくは２，２−ジクロロシクロプロピルであり、そしてＲ3が、末端置換基を有さないか、またはトリメチルアンモニウム、アミジノ、グアニジノもしくは２−アミノ−２−カルボエチルチオである末端置換基を有する、３〜７個の炭素原子の炭化水素鎖である、構造１を有する化合物であり得る。
【００１９】
本発明において有用な、構造１を有する例示的なＭＤＰ結合ホーミング分子としては、以下が挙げられる：Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルクロロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−ウレイド−２−オクテン酸；Ｚ−８−（１−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸（ラセミ形および右旋性形）；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−へプテン酸；および６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘキセン酸。
【００２０】
本発明はまた、被験体に膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）結合ホーミング分子を投与することによって、癌を有する被験体において、肺転移を低減または予防する方法を提供する。好ましい実施態様では、ＭＤＰ結合ホーミング分子は、配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）を含みむ肺ホーミングペプチドである（ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸（例えば、配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）またはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）を含むペプチド）である）。
【００２１】
別の好ましい実施態様では、ＭＤＰ結合ホーミング分子は、本明細書中上記の、構造１を含む分子である。このようなＭＤＰ結合ホーミング分子は、例えば、シラスタチンとして通常公知の、７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸であり得る。
【００２２】
１つの実施態様では、本発明において有用なＭＤＰ結合ホーミング分子は、ＭＤＰインヒビターである。このようなＭＤＰインヒビターは、例えば、ＭＤＰに対して、１０００ｎＭ以下のＫｉを示し得る。別の実施態様では、肺転移を低減または予防する際に有用なＭＤＰインヒビターは、ＭＤＰに対して１００ｎＭ以下のＫｉ、またはＭＤＰに対して１ｎＭ以下のＫｉを示す。
【００２３】
本発明はまた、被験体にＭＤＰ陰性調節因子を投与することによって、癌を有する被験体において、肺転移を低減または予防する方法を提供する。本発明において有用なＭＤＰ陰性調節因子は、例えば、可溶性ＭＤＰポリぺプチド、またはＭＤＰと選択的に反応する抗体であり得る。
【００２４】
本明細書中でさらに、被験体にＭＤＰ陰性調節因子を投与することによって、被験体において、肺内皮への細胞ホーミングを低減または予防する方法が提供される。肺内皮への細胞ホーミングを低減または予防するために有用なＭＤＰ陰性調節因子は、例えば、可溶性ＭＤＰポリぺプチド、またはＭＤＰと選択的に反応する抗体であり得る。
【００２５】
本発明はまた、肺転移を低減または予防する分子を同定する方法を提供し、この方法は、膜ジアミノペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１以上の分子と接触させる工程；およびこの分子の存在下でのＭＤＰ活性をコントロール値と比較して決定する工程を包含し、ここで、この分子の存在下での減少したＭＤＰ活性は、肺転移を低減または予防する分子としてこの分子を同定する。膜ジアミノペプチダーゼは、例えば、実質的に精製され得る。ＭＤＰ活性は、例えば、Ｇｌｙ−Ｄ−ＰｈｅからのＤ−Ｐｈｅの放出により決定され得る。
【００２６】
１つの実施態様において、本発明は、以下の工程によって肺転移を減少または予防する分子を同定する方法を提供する；ＭＤＰを１つ以上の分子と接触させる工程；コントロール値と比較して、その分子の存在下でＭＤＰ活性を決定する工程；癌を有する被験体に、その分子を投与する工程；および転移のコントロールレベルと比較して、被験体における肺転移をアッセイする工程であって、ここでその分子の存在下においてＭＤＰ活性の減少が、その分子を、肺転移を減少または予防する分子として同定する工程。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）  前立腺の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
（項目２）  ＳＭＳＩＡＲＬ（配列番号２１）、ＶＳＦＬＥＹＲ（配列番号２２）およびＲＧＲＷＬＡＬ（配列番号２７９）からなる群から選択される、項目１に記載のペプチド。
（項目３）  部分に連結された項目１に記載のペプチドを含む、結合体。
（項目４）  前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグからなる群から選択される、項目３に記載の結合体。
（項目５）  前立腺を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）組織または器官を、項目１に記載のペプチドと接触する工程；および
ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それにより、該器官または該組織を前立腺として同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目６）  前立腺により発現される標的分子を同定する方法であって、該方法が、項目５に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程：
ｃ）前記前立腺のサンプルを得る工程；および
ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目７）  被験体における前立腺病理を処置する方法であって、該方法が、項目１に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ペプチドが前立腺に選択的にホーミングし、それによって、該前立腺病理を処置する、方法。
（項目８）  以下のアミノ酸配列を有する肺ホーミングペプチドであって：
Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）
ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立的して選択される１〜１０個のアミノ酸である、肺ホーミングペプチド。
（項目９）  ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）からなる群から選択される、項目８に記載の肺ホーミングペプチド。
（項目１０）  ＣＴＬＲＤＲＮＣ（配列番号１５）およびＣＩＧＥＶＥＶＣ（配列番号１６）からなる群から選択される、肺ホーミングペプチド。
（項目１１）  ＣＬＡＫＥＮＶＶＣ（配列番号１３）、ＣＶＧＮＬＳＭＣ（配列番号３７）、ＣＫＧＱＲＤＦＣ（配列番号３９）、ＣＮＭＧＬＴＲＣ（配列番号４１）、ＣＨＥＧＹＬＴＣ（配列番号４２）、ＣＬＲＰＹＬＮＣ（配列番号４５）、ＣＭＥＬＳＫＱＣ（配列番号４７）、ＣＬＦＳＤＥＮＣ（配列番号５２）、ＣＷＲＧＤＲＫＩＣ（配列番号５６）、ＣＭＳＷＤＡＶＳＣ（配列番号６４）、ＣＫＷＳＲＬＨＳＣ（配列番号６５）、ＣＴＶＮＥＡＹＫＴＲＭＣ（配列番号７５）、ＣＲＬＲＳＹＧＴＬＳＬＣ（配列番号７６）、ＣＲＰＷＨＮＱＡＨＴＥＣ（配列番号８２）、ＣＳＥＡＡＳＲＭＩＧＶＣ（配列番号８４）、ＣＷＥＥＨＰＳＩＫＷＷＣ（配列番号８５）、ＣＧＶＧＣＰＧＬＣＧＧＡＣ（配列番号１０４）およびＣＧＧＡＣＧＧＶＣＴＧＧＣ（配列番号１１４）からなる群から選択される、肺ホーミングペプチド。
（項目１２）  部分に連結された項目８、項目９、項目１０または項目１１に記載の肺ホーミング分子を含む、結合体。
（項目１３）  前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグからなる群から選択される、項目１２に記載の結合体。
（項目１４）  肺を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）組織または器官を、項目８、項目９、項目１０または項目１１に記載の肺ホーミングペプチドと接触する工程；および
ｂ）該肺ホーミングペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それにより、該器官または該組織を肺として同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目１５）  肺により発現される標的分子を同定する方法であって、該方法が、項目１４に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程：
ｃ）該肺のサンプルを得る工程；および
ｄ）前記肺ホーミングペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、を包含する、方法。
（項目１６）  被験体における肺病理を処置する方法であって、該方法が、項目８、項目９、項目１０または項目１１に記載の肺ホーミングペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該肺ホーミングペプチドが肺に選択的にホーミングし、それによって、該肺病理を処置する、方法。
（項目１７）  皮膚の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
（項目１８）  アミノ酸配列ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）を有する、項目１７に記載のペプチド。
（項目１９）  ＣＷＮＩＣＰＧＧＣＲＡＬＣ（配列番号１７５）、ＣＫＧＴＣＶＬＧＣＳＥＥＣ（配列番号１７７）、ＣＳＳＧＣＳＫＮＣＬＥＭＣ（配列番号１８１）、ＣＡＶＲＣＤＧＳＣＶＰＥＣ（配列番号１８４）およびＣＧＧＧＣＱＷＧＣＡＧＥＣ（配列番号１９１）からなる群から選択される、項目１７に記載のペプチド。
（項目２０）  部分に連結された項目１７に記載のペプチドを含む、結合体。
（項目２１）  前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグからなる群から選択される、項目２０に記載の結合体。
（項目２２）  皮膚を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）組織または器官を、項目１７に記載のペプチドと接触させる工程；および
ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それにより、該器官または該組織を皮膚として同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目２３）  皮膚により発現される標的分子を同定する方法であって、該方法が、項目２２に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程：
ｃ）該皮膚のサンプルを得る工程；および
ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目２４）  被験体における皮膚病理を処置する方法であって、該方法が、項目１７に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ペプチドが皮膚に選択的にホーミングし、それによって、該皮膚病理を処置する、方法。
（項目２５）  網膜の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
（項目２６）  以下のアミノ酸配列を有する、項目２５に記載のペプチドであって：
Ｘ1−Ｒ−Ｄ−Ｖ−Ｘ2（配列番号３２）
ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立的して選択される１〜１０個のアミノ酸である、ペプチド。
（項目２７）  ＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）およびＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６）からなる群から選択される、項目２６に記載のペプチド。
（項目２８）  ＣＧＥＦＫＶＧＣ（配列番号１４）、ＣＭＤＳＱＳＳＣ（配列番号２２８）、ＣＮＱＲＴＮＲＥＳＧＮＣ（配列番号２３１）、ＣＬＬＮＹＴＹＣ（配列番号２３８）、ＣＱＡＳＡＳＤＨＣ（配列番号２４２）、ＣＶＴＳＮＬＲＶＣ（配列番号２５０）およびＣＲＡＲＩＲＡＥＤＩＳＣ（配列番号２６３）からなる群から選択される、項目２５に記載のペプチド。
（項目２９）  部分に連結された項目２５に記載のペプチドを含む、結合体。
（項目３０）  前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグからなる群から選択される、項目２９に記載の結合体。
（項目３１）  網膜を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）組織または器官を、項目２５に記載のペプチドと接触する工程；および
ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それにより、該器官または該組織を網膜として同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目３２）  網膜により発現される標的分子を同定する方法であって、該方法が、項目３１に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程：
ｃ）前記網膜のサンプルを得る工程；および
ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目３３）  被験体における網膜病理を処置する方法であって、該方法が、項目２５に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ペプチドが網膜に選択的にホーミングし、それによって、該網膜病理を処置する、方法。
（項目３４）  膵臓の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
（項目３５）  アミノ酸配列ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）を有する、項目３４に記載のペプチド。
（項目３６）  アミノ酸配列ＧＬＣＮＧＡＴＣＭ（配列番号１２３）を有する、項目３４に記載のペプチド。
（項目３７）  部分に連結された項目３４に記載のペプチドを含む、結合体。
（項目３８）  前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグからなる群から選択される、項目３７に記載の結合体。
（項目３９）  膵臓を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）組織または器官を、項目３４に記載のペプチドと接触させる工程；および
ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それにより、該器官または該組織を膵臓として同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目４０）  膵臓により発現される標的分子を同定する方法であって、該方法が、項目３９に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程：
ｃ）前記膵臓のサンプルを得る工程；および
ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４１）  被験体における膵臓病理を処置する方法であって、該方法が、項目３４に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ペプチドが膵臓に選択的にホーミングし、それによって、該膵臓病理を処置する、方法。
（項目４２）  腸の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
（項目４３）  以下のアミノ酸配列を有する、項目４２に記載のペプチドであって：
Ｙ−Ｓ−Ｇ−Ｋ−Ｗ−Ｘ1（配列番号４３３）
ここで、Ｘ1は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸である、ペプチド。
（項目４４）  ＹＳＧＫＷＧＧ（配列番号９）およびＹＳＧＫＷＧＷ（配列番号１５６）からなる群から選択される、項目４３に記載のペプチド。
（項目４５）  以下のアミノ酸配列を有する、項目４２に記載のペプチドであって：
Ｘ1−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｘ2（配列番号４３４）
ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸である、ペプチド。
（項目４６）  ＶＲＲＧＳＰＧ（配列番号１６４）、ＧＧＲＧＳＷＥ（配列番号１６７）およびＦＲＶＲＧＳＰ（配列番号１６９）からなる群から選択される、項目４５に記載のペプチド。
（項目４７）  ＹＡＧＦＦＬＶ（配列番号１５０）、ＳＲＲＱＰＬＳ（配列番号１５３）、ＭＳＰＱＬＡＴ（配列番号１５９）、ＷＩＥＥＡＥＲ（配列番号１６１）およびＧＩＳＡＶＬＳ（配列番号１６６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、項目４２に記載のペプチド。
（項目４８）  部分に連結された項目４２に記載のペプチドを含む、結合体。
（項目４９）  前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグからなる群から選択される、項目４８に記載の結合体。
（項目５０）  腸を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）組織または器官を、項目４２に記載のペプチドと接触させる工程；および
ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それにより、該器官または該組織を腸として同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目５１）  腸により発現される標的分子を同定する方法であって、該方法が、項目５０に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程：
ｃ）該腸のサンプルを得る工程；および
ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目５２）  被験体における腸病理を処置する方法であって、該方法が、項目４２に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ペプチドが腸に選択的にホーミングし、それによって、該腸病理を処置する、方法。
（項目５３）  卵巣の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
（項目５４）  ＥＶＲＳＲＬＳ（配列番号１０）およびＲＶＧＬＶＡＲ（配列番号１１）からなる群から選択される、項目５３に記載のペプチド。
（項目５５）  部分に連結された項目５３に記載のペプチドを含む、結合体。
（項目５６）  前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグからなる群から選択される、項目５５に記載の結合体。
（項目５７）  卵巣を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）組織または器官を、項目５３に記載のペプチドと接触させる工程；および
ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それにより、該器官または該組織を卵巣として同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目５８）  卵巣により発現される標的分子を同定する方法であって、該方法が、項目５７に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程：
ｃ）該卵巣のサンプルを得る工程；および
ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目５９）  被験体における卵巣病理を処置する方法であって、該方法が、項目５３に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ペプチドが卵巣に選択的にホーミングし、それによって、該卵巣病理を処置する、方法。
（項目６０）  副腎の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
（項目６１）  以下のアミノ酸配列を有する、項目６０に記載のペプチドであって：
Ｘ1−Ｌ−Ｐ−Ｒ−Ｘ2（配列番号４３１）
ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸である、ペプチド。
（項目６２）  ＬＭＬＰＲＡＤ（配列番号２７）およびＬＰＲＹＬＬＳ（配列番号２８）からなる群から選択される、項目６１に記載のペプチド。
（項目６３）  以下のアミノ酸配列を有する、項目６０に記載のペプチドであって：
Ｘ1−Ｌ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｘ2（配列番号４３２）
ここで、Ｘ1は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸であり、ここで、Ｘ2は、独立して選択される０〜１０個のアミノ酸である、ペプチド。
（項目６４）  Ｒ（Ｙ／Ｆ）ＬＬＡＧＧ（配列番号４０４）およびＲＹＰＬＡＧＧ（配列番号３８９）からなる群から選択される、項目６３に記載のペプチド。
（項目６５）  ＦＳＤＶＨＦＷ（配列番号３８１）およびＧＹＶＡＶＭＴ（配列番号４００）からなる群から選択される、項目６０に記載のペプチド。
（項目６６）  部分に連結された項目６０に記載のペプチドを含む、結合体。
（項目６７）  前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグからなる群から選択される、項目６６に記載の結合体。
（項目６８）  副腎を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）組織または器官を、項目６０に記載のペプチドと接触させる工程；および
ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それにより、該器官または該組織を副腎として同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目６９）  副腎により発現される標的分子を同定する方法であって、該方法が、項目６８に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程：
ｃ）該副腎のサンプルを得る工程；および
ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目７０）  被験体における副腎病理を処置する方法であって、該方法が、項目６０に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ペプチドが副腎に選択的にホーミングし、それによって、該副腎病理を処置する、方法。
（項目７１）  肝臓の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
（項目７２）  ＶＫＳＶＣＲＴ（配列番号１２）、ＳＲＲＦＶＧＧ（配列番号４０６）、ＶＧＳＦＩＹＳ（配列番号４１１）およびＷＲＱＮＭＰＬ（配列番号４１８）からなる群から選択される、項目７１に記載のペプチド。
（項目７３）  部分に連結された項目７０に記載のペプチドを含む、結合体。
（項目７４）  前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグからなる群から選択される、項目７３に記載の結合体。
（項目７５）  肝臓を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）組織または器官を、項目７０に記載のペプチドと接触させる工程；および
ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それにより、該器官または該組織を肝臓として同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目７６）  肝臓により発現される標的分子を同定する方法であって、該方法が、項目７５に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程：
ｃ）該肝臓のサンプルを得る工程；および
ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目７７）  被験体における肝臓病理を処置する方法であって、該方法が、項目７０に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ペプチドが肝臓に選択的にホーミングし、それによって、該肝臓病理を処置する、方法。
（項目７８）  ＡＧＣＳＶＴＶＣＧ（配列番号３１５）、ＧＳＣＳＭＦＰＣＳ（配列番号３１７）、ＳＥＣＡＹＲＡＣＳ（配列番号３１９）、ＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号３２０）、ＧＬＣＱＩＤＥＣＲ（配列番号３２９）、ＤＲＣＬＤＩＷＣＬ（配列番号３３１）、ＰＬＣＭＡＴＲＣＡ（配列番号３３３）、ＲＤＣＳＨＲＳＣＥ（配列番号３３４）、ＮＰＣＬＲＡＡＣＩ（配列番号３３５）、ＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号３３６）、ＬＥＣＶＡＮＬＣＴ（配列番号３３７）、ＲＫＣＧＥＥＶＣＴ（配列番号３３８）、ＥＰＣＴＷＮＡＣＬ（配列番号３３９）およびＱＱＣＱＤＰＹＣＬ（配列番号３４４）からなる群から選択される、リンパ節ホーミングペプチド。
（項目７９）  部分に連結された項目７８に記載のペプチドを含む、結合体。
（項目８０）  前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグからなる群から選択される、項目７９に記載の結合体。
（項目８１）  リンパ節を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）組織または器官を、項目７８に記載のペプチドと接触させる工程；および
ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それにより、該器官または該組織をリンパ節として同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目８２）  リンパ節により発現される標的分子を同定する方法であって、該方法が、項目８１に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程：
ｃ）該リンパ節のサンプルを得る工程；および
ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目８３）  被験体におけるリンパ節病理を処置する方法であって、該方法が、項目７８に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ペプチドがリンパ節に選択的にホーミングし、それによって、該リンパ節病理を処置する、方法。
（項目８４）  肺内皮細胞に選択的にホーミングする、ＭＤＰ−結合ホーミング分子を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１以上の分子に接触させる工程；および
ｂ）分子の該ＭＤＰへの特異的な結合を決定する工程、
を包含し、
ここで、特異的結合の存在が、肺内皮細胞に選択的にホーミングするＭＤＰ−結合ホーミング分子として、該分子を同定する、方法。
（項目８５）  前記ＭＤＰが、実質的に精製されている、項目８４に記載の方法。
（項目８６）  前記実質的に精製されたＭＤＰが、支持体に固定されている、項目８５に記載の方法。
（項目８７）  前記ＭＤＰが、配列番号４４８を有するヒトＭＤＰである項目８４に記載の方法。
（項目８８）  被験体において、部分を肺内皮細胞に選択的に指向する方法であって、該被験体に、項目８４の方法によって同定されたＭＤＰ−結合ホーミング分子に連結された部分を有する結合体を投与する工程、を包含し、
それにより、該被験体において、該部分が肺内皮細胞に選択的に指向される、方法。
（項目８９）  前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下の配列：
Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）
ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立的に選択される１〜１０個のアミノ酸を含むペプチドである、項目８８に記載の方法。
（項目９０）  前記ＭＤＰ−結合ホーミングペプチドが、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）からなる群から選択される配列を含む、項目８９に記載の方法。
（項目９１）  前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下の構造１：
【化１】
2010031038.tif 000003
、または薬学的に受容可能な陽イオンを包含し、ここで、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ、３〜１０個の炭素原子および１〜１５個の炭素原子の範囲の炭化水素ラジカルであり；これらのＲ2炭化水素鎖もしくはＲ3炭化水素鎖のいずれか１つにおける１〜６個の水素が、ハロゲンによって置換されていてもよいか、または非末端メチレンが酸素もしくは酸化型形態を含む硫黄によって置換されてもよく；さらに、Ｒ3の末端水素もまたヒドロキシル基もしくはチオール基によって置換されていてもよく、そのヒドロキシル基もしくはチオール基は、アシル化もしくはカルバモイル化されていてもよく；あるいは、該水素はアミノ基によって置換されていてもよく、このアミノ基はアシルアミノ基、ウレイド基、アミジノ基、クアニジノ基もしくはアルキル基、または置換されたアミノ基におけるように誘導体化されていてもよく、四級窒素基を含み；あるいは、カルボン酸基、ホスホン酸基もしくはスルホン酸基のような酸性基、またはそれらのエステルもしくはアミドまたはシアノ；あるいは末端アミノ酸基のようなそれらの組み合わせにより置換されていてもよく；そしてＲ1は、水素もしくは低級アルキル（Ｃ1-6）もしくはジアルキルアミノアルキルである、項目８８に記載の方法。
（項目９２）  前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸である、項目９１に記載の方法。
（項目９３）  前記Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭素が第三級ではないというように限定された、分枝したアルキルまたはシクロアルキルである、項目９１に記載の方法。
（項目９４）  前記Ｒ3が、第四級窒素、アミノ誘導体もしくはアミノ酸誘導基である末端置換基を有する、ｎ−アルキル（１〜９個の炭素）もしくはｎ−アルキル（１〜９個の炭素）である、項目９３に記載の方法。
（項目９５）  前記Ｒ2が、２，２−ジメチルシクロプロピルもしくは２，２−ジクロロシクロプロピルであり、そして前記Ｒ3が、末端置換基を有さないか、またはトリメチルアンモニウム、アミジノ、グアニジノ、もしくは２−アミノ−２−カルボエチルチオである末端置換基を有する、３〜７個の炭素原子の炭化水素鎖である、項目９４に記載の方法。
（項目９６）  前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下：
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；
Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−ウレイド−２−オクテン酸；
Ｚ−８−（１−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸（ラセミ形および右旋性形）；
Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；
７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−へプテン酸；および
６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルクロロプロパンカルボキサミド）−２−ヘキセン酸、
からなる群から選択される、項目９５に記載の方法。
（項目９７）  前記部分が遺伝子治療ベクターである、項目８８に記載の方法。
（項目９８）  前記部分が薬物である、項目８８に記載の方法。
（項目９９）  癌を有する被験体において、肺転移を減少または防止する方法であって、該被験体に膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）−結合ホーミング分子を投与する工程を包含する、方法。
（項目１００）  前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下の配列：
Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）
を含む肺ホーミングペプチドであり、ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸である、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）  前記ＭＤＰ−結合ホーミングペプチドが、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）からなる群から選択される配列を含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）  前記ＭＤＰ−結合ホーミングペプチドが、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）からなる群から選択されるペプチドである、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）  前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下の構造１：
【化２】
2010031038.tif 000004
、または薬学的に受容可能な陽イオンを包含し、ここで、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ、３〜１０個の炭素原子および１〜１５個の炭素原子の範囲の炭化水素ラジカルであり；これらのＲ2炭化水素鎖もしくはＲ3炭化水素鎖のいずれか１つにおける１〜６個の水素がハロゲンによって置換されていてもよい、または非末端メチレンが酸素もしくは酸化型形態を含む硫黄によって置換されていてもよく；さらに、Ｒ3の末端水素もまたヒドロキシル基もしくはチオール基によって置換されていてもよく、これらのヒドロキシル基もしくはチオール基は、アシル化もしくはカルバモイル化されていてもよく；あるいは、該水素はアミノ基によって置換されていてもよく、このアミノ基はアシルアミノ基、ウレイド基、アミジノ基、クアニジノ基、もしくはアルキル基、または置換されたアミノ基におけるように誘導体化されていてもよく、第四級窒素基を含み；あるいは、カルボン酸基、ホスホン酸基もしくはスルホン酸基のような酸性基、またはそれらのエステルもしくはアミド、またはシアノ；あるいは末端アミノ酸基のようなそれらの組み合わせにより置換されていてもよく；そしてＲ1は、水素もしくは低級アルキル（Ｃ1-6）もしくはジアルキルアミノアルキルである、項目９９に記載の方法。
（項目１０４）  前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸である、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）  前記Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭素が第三級ではないというように限定された、分枝したアルキルまたはシクロアルキルである、項目１０３に記載の方法。
（項目１０６）  前記Ｒ3が、第四級窒素、アミノ誘導体もしくはアミノ酸誘導基である末端置換基を有する、ｎ−アルキル（１〜９個の炭素）もしくはｎ−アルキル（１〜９個の炭素）である、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）  前記Ｒ2が、２，２−ジメチルシクロプロピルもしくは２，２−ジクロロシクロプロピルであり、前記Ｒ3が、末端置換基を有さないか、またはトリメチルアンモニウム、アミジノ、グアニジノもしくは２−アミノ−２−カルボエチルチオである末端置換基を有する、３〜７個の炭素原子の炭化水素鎖である、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）  前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下：
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；
Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−ウレイド−２−オクテン酸；
Ｚ−８−（１−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸（ラセミ形および右旋性形）；
Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；
７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−へプテン酸；および
６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルクロロプロパンカルボキサミド）−２−ヘキセン酸、
からなる群から選択される、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）  前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、ＭＤＰインヒビターである、項目９９に記載の方法。
（項目１１０）  前記ＭＤＰインヒビターが、高くとも１０００ｎＭのＭＤＰに対するＫｉを示す、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）  前記ＭＤＰインヒビターが、高くとも１００ｎＭのＭＤＰに対するＫｉを示す、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）  前記ＭＤＰインヒビターが、高くとも１ｎＭのＭＤＰに対するＫｉを示す、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）  前記癌が黒色腫である、項目９９に記載の方法。
（項目１１４）  癌を有する被験体において、肺転移を減少または防止する方法であって、該被験体に膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）陰性調節因子を投与する工程を包含する、方法。
（項目１１５）  前記ＭＤＰ陰性調節因子が可溶性ＭＤＰポリぺプチドである、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）  前記ＭＤＰ陰性調節因子がＭＤＰと選択的に反応する抗体である、項目１１４に記載の方法。
（項目１１７）  被験体において、肺内皮細胞への細胞ホーミングを減少または防止する方法であって、該被験体に膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）陰性調節因子を投与する工程を包含する、方法。
（項目１１８）  前記ＭＤＰ陰性調節因子が可溶性ＭＤＰポリぺプチドである、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）  前記ＭＤＰ陰性調節因子がＭＤＰと選択的に反応する抗体である、項目１１７に記載の方法。
（項目１２０）  肺転移を減少または防止する分子を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１以上の分子と接触させる工程；および
ｂ）該分子の存在下でのＭＤＰ活性をコントロール値と比較して決定する工程、
を包含し、
ここで、該分子の存在下での減少したＭＤＰ活性は、該分子を肺転移を減少または防止する分子として同定する、方法。
（項目１２１）  前記ＭＤＰが実質的に精製されている、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）  ＭＤＰ活性が、Ｇｌｙ−Ｄ−ＰｈｅからのＤ−Ｐｈｅの放出により決定される、項目１２０に記載の方法。
（項目１２３）  項目１２０に記載の方法であって、該方法が、さらに、以下：
ｃ）前記分子を癌を有する被検体に投与する工程；および
ｄ）該被験体における肺転移を、コントロールレベルの転移と比較してアッセイする工程、
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、肺にホーミングする分子を同定するためのＣＸ6Ｃ（配列番号２６）ライブラリーの３回のインビボパンニングの結果を示す。マウスの尾静脈への１０10形質導入単位の注射の５分後に肺から回収したファージを増幅し、そして２回継続して再注射した。１グラムの肺、腎臓または脳当たりの回収したファージの数を、３連のプレーティングからの平均の標準誤差を示すバーとともに、各回について示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、肺（図２Ａおよび２Ｂ）、皮膚（図２Ｃ）または膵臓（図２Ｄ）ホーミングペプチドを提示するファージの選択性を示す。肺（図２Ａ、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ、配列番号１、「ＧＦＥ−１」；図２Ｂ，ＣＧＦＥＬＥＴＣ、配列番号２、「ＧＦＥ−２」）；皮膚（図２Ｃ、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ、配列番号３）または膵臓（図２Ｄ、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ、配列番号４）にホーミングするペプチドを発現する選択したファージを個々に増幅し、マウスに注射し、そして回収した（実施例Ｉ）。１グラムの肺、皮膚または膵臓あるいはコントロール腎臓または脳当たりの回収された、選択したペプチドを提示するファージの量を決定した。肺、皮膚、膵臓、腎臓または脳から回収した非選択（コントロール）ファージの量もまた決定した。バーは、３連のプレーティングからの平均の標準誤差を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、肺または皮膚ホーミングペプチドを提示するファージのホーミングにおける、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−（ＧＳＴ）−融合タンパク質の同時投与の効果を示す。  図３Ａにおいて、１００μｇもしくは５００μｇのＧＳＴ−ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１、「ＧＦＥ−１」）または５００μｇのＧＳＴを、肺ホーミング配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）を提示する個々に増幅したファージの１０9形質導入単位で、マウスに同時注射した。循環の５分後に肺および腎臓からのファージ回収を、３連のプレーティングからの平均の標準誤差を示すバーとともに、決定した。  図３Ｂにおいて、肺ホーミングペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１、「ＧＦＥ−１」）もしくはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２、「ＧＦＥ−２」）または皮膚ホーミングペプチドＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）のいずれかを提示する個々に増幅したファージの１０9形質導入単位を、５００μｇの同族ＧＳＴ融合ペプチドとともにマウスに同時注射した。コントロールマウス（示さず）に、選択したファージおよび５００μｇのＧＳＴを注射した。ＧＳＴに比較して、同族ＧＳＴ融合ペプチドの存在下で肺または皮膚にホーミングする選択されたファージの阻害の割合を示す。
【図４】図４は、肺抽出物からの５５ｋＤａ細胞表面タンパク質が、ＧＦＥ−１ペプチドアフィニティーカラムに特異的に結合することを示す。インビボでビオチン化した肺抽出物を、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）ペプチドカラムまたはコントロールペプチドカラム（ＧＲＧＥＳＰ；配列番号４４２）上に分画し、洗浄し、そしてＧＦＥ−１ペプチドで溶出した。洗浄画分（「−」）、ＧＦＥ−１ペプチド溶出物、および８Ｍ尿素溶出物からのアリコート（３０μｌ）を、還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分子量マーカー（ｋＤａ）を、各パネルの右側に示す。
【図５】図５は、Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅの加水分解により生じたＤ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）の蛍光検出の経時変化を示す。ＧＦＥ−１ペプチドアフィニティーカラムからの洗浄画分（白丸）およびＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）ペプチド溶出物（黒丸）からのサンプルを、Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ基質とのＭＤＰ活性についてアッセイした。Ｄ−Ｐｈｅの蛍光化合物への時間依存性変換を示す。
【図６】図６は、ファージ保有ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）またはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２；ＧＦＥ−２）のＣＯＳ−１細胞発現膜ジペプチド（ＭＤＰ）への結合を示す。  図６Ａにおいて、ＣＯＳ−１細胞を、ＭＤＰ発現ベクターまたはベクター単独でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞抽出物を調製し、そしてＭＤＰ活性について分析した。  図６Ｂにおいて、ＭＤＰ発現ベクターまたはコントロール空ベクターのいずれかでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞を、コントロールファージ（ｆｄ−ｔｅｔ）または皮膚ホーミングペプチドＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３；「ｓｈｐ−１」）、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１、ＧＦＥ−１）ペプチド、もしくはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２；ＧＦＥ−２）ペプチドを保有するファージのいずれかの等量の存在下で結合アッセイに供した。各場合において、これらの細胞からレスキューしたファージ形質導入単位の総数を示す。エラーバーは、３連のプレーティングからの平均の標準偏差を示す。
【図７】図７は、ＧＦＥ−１ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）によるＭＤＰ活性の阻害を示す。ＭＤＰを発現するＣＯＳ−１細胞からの抽出物を、漸増濃度のＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）（黒丸）またはＣＡＲＡＣコントロールペプチド（配列番号４４３）（（白丸）として示す）の存在下でＭＤＰ活性についてアッセイした。
【図８】図８は、ＧＦＥ−１（配列番号１）が、ヒト黒色腫細胞の肺転移を阻害することを示す。肺重量は、１０5のＣ８１６１ヒト黒色腫細胞単独（「ビヒクル」）；２５０μｇのＧＦＥ−１ペプチド配列番号１（「ＧＦＥ−１ペプチド」）と同時投与した１０5のＣ８１６１細胞；または２５０μｇのＣＡＲＡＣペプチド配列番号４４３（「コントロールペプチド」）と同時投与した１０5のＣ８１６１細胞を注射した５週間後のマウスについて示される。
【図９Ａ】図９は、５つの種由来の膜ジペプチダーゼの推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。ヒト（「ＨＵＭ」；配列番号４４８）；ブタ（「ＰＩＧ」；配列番号４４９）；ラット（「ＲＡＴ」；配列番号４５０）；およびマウス（「ＭＯＵ」；配列晩胞４５１）ＭＤＰのアミノ酸配列を、ウサギＭＤＰ（「ＲＡＢ」；配列番号４５２）の配列とともに整列する。アステリスクは、ヒトＭＤＰにおけるＮ結合型グリコシル化部位を示す。囲まれた残基Ｇｌｕ125およびＨｉｓ219は、活性に必須である（Ａｄａｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１６３：４２−４８（１９９３）；Ｋｅｙｎａｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４９：５０−５４（１９９４））。下線を付した残基は（−１〜−１６）はシグナルペプチドを示す。Ｃ末端において囲まれた残基は、成熟タンパク質においてグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって置換される疎水性シグナルを示す。ＧＰＩアンカー付加の部位を、矢印によって示す。
【図９Ｂ】図９は、５つの種由来の膜ジペプチダーゼの推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。ヒト（「ＨＵＭ」；配列番号４４８）；ブタ（「ＰＩＧ」；配列番号４４９）；ラット（「ＲＡＴ」；配列番号４５０）；およびマウス（「ＭＯＵ」；配列晩胞４５１）ＭＤＰのアミノ酸配列を、ウサギＭＤＰ（「ＲＡＢ」；配列番号４５２）の配列とともに整列する。アステリスクは、ヒトＭＤＰにおけるＮ結合型グリコシル化部位を示す。囲まれた残基Ｇｌｕ125およびＨｉｓ219は、活性に必須である（Ａｄａｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１６３：４２−４８（１９９３）；Ｋｅｙｎａｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４９：５０−５４（１９９４））。下線を付した残基は（−１〜−１６）はシグナルペプチドを示す。Ｃ末端において囲まれた残基は、成熟タンパク質においてグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって置換される疎水性シグナルを示す。ＧＰＩアンカー付加の部位を、矢印によって示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、器官および組織ホーミング分子、ならびに選択された器官または組織に部分を標的とするためにこれらの分子を使用する方法を提供する。本発明の分子は、インビボパンニングの方法（１９９７年４月２２日に発行された、米国特許第５，６２２，６９９号、これを本明細書中で参考として援用する）によって本質的に同定され、種々の正常器官または組織（肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸を含む）および腫瘍を保有する器官（肺腫瘍を保有する肺および膵臓腫瘍を保有する膵臓を含む）にホーミングするペプチドを含む。例えば、本発明は、肺ホーミングペプチドを提供し、このペプチドとしては、ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）（これらの各々は、トリペプチドＧＦＥモチーフを含む）、ならびにペプチドＧＩＧＥＶＥＶＣ（配列番号８）が挙げられる。本発明はまた、ペプチドＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）のような皮膚ホーミングペプチド；ペプチドＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）のような膵臓ホーミングペプチドならびにペプチドＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）およびＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６）のような網膜ホーミングペプチド（これらの各々は、トリペプチドＲＤＶモチーフを含む）を提供する。前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓および腸にホーミングするペプチドの例もまた提供される（表２〜１１を参照のこと）。特定の器官ホーミングペプチドに共通のモチーフがこのペプチドの単純な検査によって同定され得ることが認識されるべきである。例えば、表９の検査は、以下のことを明らかにする：ペプチドＡＧＣＳＶＴＶＣＧ（配列番号３１５）およびＡＧＣＶＱＳＱＣＹ（配列番号３７０）はＡＧＣモチーフを共有する；ペプチドＬＥＣＲＲＷＲＣＤ（配列番号３２８）およびＬＥＣＶＡＮＬＣＴ（配列番号３３７）はＬＥＣモチーフを共有する；ならびにペプチドＳＥＣＡＹＲＡＣＳ（配列番号３１９）およびＳＥＣＹＴＧＳＣＰ（配列番号３７５）はＳＥＣモチーフを共有する。さらに、これらのペプチドのいくつかは、１回を超えて単離され（表９のアスタリスクを参照のこと）、このことは、そのようなモチーフが、選択的にホーミングするペプチドの能力に関連することを示す。本明細書中に開示される特定のモチーフ、および開示されたペプチドの検査によって同定可能な他のモチーフを含むペプチドは、このモチーフがＲＧＤモチーフではない場合、本願発明の範囲内であると考えられる。
【００２９】
本発明のホーミング分子は、特定の器官または組織に部分を標的とするために有用である。従って、本発明は、部分に連結される器官ホーミング分子を含む結合体を提供する。このような部分は、ウイルスのような治療剤；ウイルス遺伝子療法ベクター；薬物；放射性核種のような検出可能化剤もしくは画像化剤；またはビオチンのようなタグであり得る。本明細書中に開示されるように、本発明のそのような器官ホーミング分子（特に、本発明の結合体）は、選択された器官もしくは組織を検出もしくは可視化するため、または選択された器官もしくは組織における病理を診断もしくは処置するために使用され得る。本発明の器官ホーミング分子はまた、選択された器官もしくは組織において発現され、そして器官ホーミング分子を結合する標的分子を単離するために使用され得る。便宜上、選択された器官または分子にホーミングする本発明の分子は、「器官ホーミング分子」と称される。
本明細書中で使用されるように、用語「分子」は、１つ以上の異なる基を置換することによって変化され得る少なくとも１つの反応基を有する有機化合物を意味するために幅広く使用される。有機分子は、薬物；核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡを含む）；ペプチド；改変体もしくは修飾ペプチドまたはペプチド模倣物；タンパク質もしくはそのフラグメント；オリゴ糖；脂質；糖脂質；あるいはリポタンパク質であり得る。
【００３０】
有機分子は、天然に存在する分子であり得、これは、有機分子を含む基およびその基を連結する結合が生物学的プロセスによって産生される天然の産物であり得る。例えば、天然に存在する有機分子は、ＲＮＡ分子またはそのフラグメントであり得、これは、細胞から単離され得るか、または組換え核酸分子から発現され得る。同様に、ペプチドは、化学合成によって産生される場合でさえ、天然に存在する有機分子であると考えられる。なぜなら、アミノ酸基およびその基に連結する結合は、通常の生物学的プロセスによって産生され得、そしてペプチド自体が、例えば、ペプチドを含有するタンパク質のタンパク質分解性分解に起因して細胞中で産生され得るからである。
【００３１】
有機分子はまた、天然には存在しない分子であり得る。このような分子は、生物学的プロセスによって天然に産生されない化学基または結合を有する。例えば、天然に存在しないヌクレオシドアナログ、またはヌクレオチドを連結しそしてヌクレアーゼによる分解に対して保護するホスホロチオエート結合を含む核酸配列は、天然に存在しない分子の例である。通常のヒドロキシル基のかわりに、リボース残基の２’炭素原子に結合される２−メチル基を含むリボヌクレオチドは、酵素分解および化学分解に対して耐性である天然に存在しないＲＮＡ分子の例である。天然に存在しない有機分子の他の例としては、ＲＮＡ含有２’−アミノピリミジンが挙げられ、そのようなＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡと比較して、ヒト血清および尿素において１０００倍を超えて安定である（Ｌｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：５２２９−５２３４（１９９４）；およびＪｅｌｌｉｎｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：１１３６３−１１３７２（１９９５）（これらの各々を本明細書中で参考として援用する）を参照のこと）。
【００３２】
便宜上、用語「ペプチド」は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびタンパク質のフラグメントを意味するように本明細書中で広く使用される。本発明に有用な他の分子としては、ペプトイド、ペプチド模倣物などが挙げられる。本発明の器官または組織ホーミングペプチドに関して、ペプチド模倣物（これは、化学修飾されたペプチド、天然に存在しないアミノ酸分子を含むペプチド様分子、ペプトイドなどを含む）は、ペプチド模倣物が由来する器官ホーミングペプチドの結合活性を有する（例えば、「Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」第５版、第１〜３巻（Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ編；Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５）（これを本明細書中で参考として援用する）を参照のこと）。ペプチド模倣物は、ペプチドを超える様々な利点を提供し、この利点としては、ペプチド模倣物は、被験体に投与される場合、例えば、消化管を通過する間安定であり得、それゆえ経口投与に有用であることが挙げられる。
【００３３】
ペプチド模倣物を同定する方法は当該分野で周知であり、そして、その方法には、例えば、可能性のあるペプチド模倣物のライブラリーを含むデータベースのスクリーニングが挙げられる。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅは、公知の結晶構造を有する３００，０００より多くの化合物の収集物を含む（Ａｌｌｅｎら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｂ項，３５：２３３１（１９７９））。この構造寄託は、新しい結晶構造が決定されるにつれて絶えず更新され、そして適切な形状、例えば、器官もしくは組織ホーミング分子と同じ形状を有する化合物について、ならびに器官もしくは組織ホーミングペプチドによって結合された標的分子への可能性のある幾何学的および化学的に相補性についてスクリーニングされ得る。ホーミングペプチド、または器官もしくは組織ホーミング分子を結合する標的分子の結晶構造が利用可能でない場合、構造は、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））を使用して生成され得る。別のデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ  ＣＡ）は、市販されている約１００，０００化合物を含み、そしてまた器官または組織ホーミング分子の可能性のあるペプチド模倣物を同定するために検索され得る。
【００３４】
用語「核酸分子」はまた、２つ以上のヌクレオチドの任意のポリマーを意味するために幅広く使用され、このヌクレオチドは、ホスホジエステル結合のような共有結合、チオエステル結合、またはヌクレオチドを連結するために有用かつ有効であることが当該分野で公知の任意の様々な他の結合によって連結される。このような核酸分子は、線状、環状、またはスーパーコイルであり得、そして一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡであり得るか、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。
【００３５】
本明細書中で使用されるように、用語「ライブラリー」は、分子の収集物を意味する。ライブラリーは、少数または多数の異なる分子を含み得、約２〜約１０15分子以上まで変動する。ライブラリーの分子の化学構造は、互いに関連し得るか、または多様であり得る。所望される場合、ライブラリーを構成する分子は、共通タグまたは独特のタグに連結され得、このタグは、分子の回収および／または同定を促進し得る。
【００３６】
ペプチド、ペプトイド、およびペプチド模倣物のような分子の種々の型の多様な集団を含むライブラリーを調製するための方法は、当該分野で周知であり、そして種々のライブラリーが市販されている（例えば、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３５１−３６０（１９９５）、ならびにＢｌｏｎｄｅｌｌｅら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１４：８３−９２（１９９５）、およびその中で引用される参考文献（それらの各々が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと；ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ，Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，「Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」第１巻（Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ編；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９５），８０３−８６１頁、ならびにＧｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１（１９９４）（それらの各々が参考として本明細書中に援用される）も参照のこと）。ある分子が、ペプチド、タンパク質、またはそのフラグメントである場合、その分子は、インビトロで直接生成され得るか、またはインビトロで生成され得る核酸から発現され得る。合成ペプチドおよび核酸化学の方法は当該分野で周知である。
【００３７】
ペプチド分子のライブラリーはまた、例えば、目的の細胞、組織、器官、または生物から集められたｍＲＮＡからｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築することによって産生され得る。このようなライブラリーを産生する方法は当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）（これは参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。好ましくは、ｃＤＮＡによってコードされるペプチドは、ｃＤＮＡを含む細胞またはウイルスの表面上で発現される。例えば、ｃＤＮＡは、融合物５（実施例Ｉ）のようなファージベクター中にクローン化され得、ここで、発現の際、コードされたペプチドは、そのファージの表面上で融合タンパク質として発現される。
【００３８】
さらに分子のライブラリーは、核酸分子のライブラリーであり得、この核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのアナログであり得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、目的の細胞、組織、器官、または生物から収集されるｍＲＮＡからか、または制限エンドヌクレアーゼもしくはゲノムＤＮＡを無作為にフラグメント化する方法を使用して適切な大きさのフラグメントを生じるように処理され得る、ゲノムＤＮＡを収集することによって構築され得る。ＲＮＡ分子を含むライブラリーはまた、細胞由来のＲＮＡを収集することによってか、またはＲＮＡ分子を化学的に合成することによって構築され得る。核酸分子の多様なライブラリーは、分子中の無作為化された領域の産生を容易にする、固相合成を使用して作製され得る。所望される場合、無作為化は、分子中の位置で特定の割合の１以上のヌクレオチドを含む核酸分子のライブラリーを生じるように偏られ得る（米国特許第５，２７０，１６３号、１９９３年１２月１４日発行、これは、本明細書中で参考として援用される）。
【００３９】
所望の場合、核酸分子は、ヌクレアーゼによる分解に感受性がより低い、核酸アナログであり得る。例えば、リボース残基に２’−Ｏ−メチルプリン置換を、および３’末端および５’末端に短いホスホロチオエートキャップを含むＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼに対して抵抗性の増強を示す（Ｇｒｅｅｎら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：６８３〜６９５（１９９５）、これは、本明細書中で参考として援用される）。同様に、２’−アミノ−２’−デオキシピリミジンまたは２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンを含むＲＮＡは、ヌクレアーゼ活性に対してより感受性が低い（Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８〜７３（１９９７）、これは、本明細書中で参考として援用される）さらに、Ｌ−ＲＮＡ（これは、天然に生じるＤ−ＲＮＡの立体異性体である）は、ヌクレアーゼ活性に対して抵抗性である（Ｎｏｌｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：１１１６〜１１１９（１９９６）；Ｋｌｏｂｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：１１１２〜１１１５（１９９６）これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。このようなＲＮＡ分子およびこれらを産生する方法は、周知でありかつ慣用的である（ＥａｔｏｎおよびＰｉｅｋｅｒｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４：８３７〜８６３（１９９５）を参照のこと。これは、本明細書中で参考として援用される）。オリゴヌクレオチドに連結されるホスホロチオエートを含むＤＮＡ分子は、ヌクレアーゼ抵抗性である（Ｒｅｅｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：６５６５〜６５７０（１９９０）、これは、本明細書中で参考として援用される）。ホスホジエステル結合のホスホロチオエート−３’ヒドロキシプロピルアミン改変はまた、ヌクレアーゼ分解に対するＤＮＡ分子の感受性を減少する（Ｔａｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２：９７７〜９８６（１９９４）（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。所望される場合、ＤＮＡライブラリーの多様性は、チミジンを５−（１−ペンチニル）−２’−デオキソウリジンと置換することによって増強され得る（Ｌａｔｈａｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２８１７〜２８２２（１９９４）、これは、本明細書中で参考として援用される）。このような改変された核酸分子は、ライブラリーの製造またはタグとする目的のために有用であり得る（下記）。
【００４０】
本明細書中で開示されるように、器官または組織のホーミング分子を同定するためのインビボでのパニングは、被検体にライブラリーを投与する工程、器官または組織のサンプルを収集する工程および当該分野にて周知の種々の方法を使用して、器官または組織のホーミング分子を同定する工程を包含する。一般に、収集された器官または組織中の器官または組織ホーミング分子の存在は、ライブラリー中に存在する分子に共通である、１以上の特性に基づいて同定され、次いで、特定の器官または組織のホーミング分子の構造を、決定し得る。
【００４１】
高感度の検出方法（例えば、質量分析（ＭＳ））は、単独またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）のような方法との組合せのいずれかで、選択された器官または組織中に少量存在する場合であっても、密接に関連したホーミング分子を同定するために使用され得る。例えば、ＭＳとの組み合わせでＧＣを使用して、ラットへのリドカインの注射および尿の分析の後に、２つの主要なリドカイン代謝物および４つの微量なリドカイン代謝物を同定した（Ｃｏｕｔｔｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒ．４２１：２６７〜２８０（１９８７）、これは、本明細書中で参考として援用される）。同様に、ライブラリーが、有機分子（例えば、薬物）の構造に一般的に基づく多様な分子を含む場合、器官または組織のホーミング分子は、特定分子のもとのピークの存在を決定することによって同定され得る。
【００４２】
所望される場合、選択された器官または組織は、ＨＰＬＣのような方法を使用して処理され得、これらの方法は、規定された範囲の分子量または極性などを有する分子の濃縮した画分を、複雑な混合物から得るために使用され得る。次いで、分子の濃縮した画分は、器官または組織のホーミング分子を同定するためにさらに分析され得る。例えば、ＧＣおよびＭＳと連結したＨＰＬＣを使用して、ラットへのジヒドロタキステロール３の注射および単離され灌流された腎臓の分画後に、ビタミンＤアナログの７つの代謝物を同定した（Ｐｏｒｔｅｏｕｓら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  １６：８７〜９２（１９８８）、これは、本明細書中で参考として援用される）。ＨＰＬＣについての条件は、特定の分子の構造に依存し、そしてその分子の知識に基づいて、当業者により最適化され得る。
【００４３】
収集された器官または組織のサンプル中に存在する、器官のホーミング分子は、規定された塩濃度および温度を有する溶液中でのインキュベーションにより、そのサンプルから回収され得る。選択的な抽出もまた使用して、１以上の溶液中で収集されたサンプルを連続してインキュベーションすることによって有機分子の異なる画分を入手し得る。このような溶液は、異なる塩濃度を有し得るか、または特定の温度で有機ホーミング分子の抽出をもたらし得る。収集されたサンプルから得られた溶出液を、別々に収集し得るか、または１以上の画分中にプールし得、そして器官のホーミング分子を検出および同定し得る。同様に、潜在的に妨害する細胞性物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質または炭水化物）の大量除去のための方法は、当該分野で周知である。このような方法を使用して、収集されたサンプル中の潜在的に混入している物質から、特定の器官のホーミング分子を濃縮し得、そしてその分子を検出する感度を上昇させ得る。
【００４４】
器官または組織のホーミング分子、特にタグ化されていない分子の同定の容易さは、種々の因子に依存し、この因子としては、潜在的に混入しているバックグラウンド細胞性物質の存在が挙げられる。例えば、ホーミング分子が非タグ化ペプチドである場合、細胞性タンパク質のバックグランドを超える特定のペプチドを同定するために、より多数が、器官または組織にホーミングしなければならない。対照的に、はるかに少量の非タグ化ホーミング分子（例えば、薬物）が同定可能である。なぜなら、このような分子は通常、体内において、一般に存在しないか、または非常に少数で存在するからである。この状況において、高感度の方法（例えば、ＭＳ）を使用して、器官のホーミング分子を同定し得る。当業者は、分子を同定する方法が、部分的に、特定の分子の構造に依存することを認識する。
【００４５】
本明細書中で開示されるように、インビボでのパニングの間に、十分な数の分子が、この分子を容易に同定し得るように、選択された器官または組織に選択的にホーミングする。例えば、特定の収集された器官において、ペプチドが２回以上同定された（表１を参照のこと）。例えば、種々の選択された器官から配列決定された４０個のクローンのうち、腸のホーミングペプチドであるＹＳＧＫＷＧＫ（配列番号９）は、そのクローンの２２％に存在した；卵巣のホーミングペプチドであるＥＶＲＳＲＬＳ（配列番号１０）およびＲＶＧＬＶＡＲ（配列番号１１）の各々は、クローンの２２％に存在した；そして肝臓のホーミングペプチドであるＶＫＳＶＣＲＴ（配列番号１２）は、クローンの１１％に存在した（表１を参照のこと）。同様に、肺のホーミングペプチドであるＣＬＡＫＥＮＶＶＣ（配列番号１３）およびＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）；皮膚のホーミングペプチドであるＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）；および網膜のホーミングペプチドであるＣＧＥＦＫＶＣ（配列番号１４）の各々は、他の器官のホーミングペプチド（表２〜１１；ペプチドをアステリスクで印を付ける）のように、それぞれの器官のインビボでのパニングの間に、数回独立して単離された。こららの結果は、同定された器官のホーミング分子の実質的な画分が同じ構造を有するか、または、多くの場合、保存されたモチーフを共有することを実証する。
【００４６】
種々のインビボでのパニングスクリーニングの後に、数十万から数百万のホーミングペプチドを発現するファージを、それぞれの器官または組織から回収した。一般に、１回のインビボでのパニングから収集されたファージを、寒天上に播種し、約２５０〜約３００個のクローンを選択し、５ｍｌ培養で増殖させ、次いでプールし、そしてインビボでのパニングの引き続く回のために再投与した（「規則的な方法」）。しかし、いくつかの実験において、１０００個のクローンを選択し、２ｍｌ培養中で増殖させ、次いでプールし、そしてスクリーニングの引き続く回のために投与するか；または寒天プレート全体をこすり取り、そして全てのファージを一緒に培養し、そしてスクリーニングの引き続く回のために投与した。種々の単離されたファージのペプチド挿入物を、ホーミングした数百万のうちの、少数の配列のみを同定するように測定した。これらの結果は、特定の型のホーミング分子が、インビボでのホーミングの後に器官または組織中に相対的に高い比率で存在し得、これによってその分子を同定し得る容易さを増大させることを示す。
【００４７】
器官または組織のホーミング分子が核酸分子である場合、種々のアッセイ方法を使用して、その分子を実質的に単離または同定し得る。例えば、ＰＣＲは、ホーミング分子の存在を同定するために特に有用である。なぜなら、原理的に、ＰＣＲは、単一の核酸分子の存在を検出し得るからである（例えば、Ｅｒｌｉｃｈ、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。ＰＣＲはまた、インビトロで所定の標的に結合する核酸分子を増幅するために使用されており、核酸がヌクレアーゼに抵抗性になり、そして被検体に投与される場合に、それらは、生物学的プロセス（例えば、インビボでのリンパ球輸送）を調節した（例えば、Ｈｉｃｋｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２６８８〜２６９２（１９９６）（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。これらの知見は、インビボでのパニングを使用して、インビボで器官または組織に選択的にホーミングする核酸分子を同定するように、被検体の循環中に投与される場合、この核酸分子が十分に安定であることを示す。
【００４８】
ライブラリーの分子は、タグ化され得、これは、器官のホーミング分子の回収または同定を容易にし得る。本明細書中で使用される場合、用語「タグ」とは、そのライブラリーの分子に連結されている、それぞれプラスチックまたは金属マイクロビーズ、オリゴヌクレオチド、またはバクテリオファージのような物理的部分、化学的部分、または生物学的部分を意味する。分子をタグ化する方法は当該分野で周知である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）、これは参考として本明細書中に援用される）。分子とタグとの間の結合は、共有結合または非共有結合であり得、そして所望される場合、この結合は、その分子から選択的に切断可能であり得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「共有されたタグ」とは、ライブラリー中の各々の分子に共通である、物理的部分、化学的部分、または生物学的部分を意味する。共有されたタグを使用し、サンプル中のそのライブラリーの分子の存在を同定し得るか、またはインビボでのパニングの後に、サンプルからその分子を実質的に単離し得る。例えば、多様な分子（例えば、核酸）の集団を含むライブラリーを、共有されたタグに結合し得る。例えば、共有されたタグがビオチンである場合、核酸ホーミング分子は、例えば、ストレプトアビジンアフィニティーカラムに結合することによって、選択された器官または組織から実質的に単離され得る。器官または組織のホーミング核酸分子の存在はまた、標識されたストレプトアビジンと結合することによって検出され得る。血球凝集素抗原のようなペプチドはまた、共有されたタグであり得、これは、ライブラリー中の各分子に結合されている場合、選択された器官または組織からホーミング分子を実質的に単離する、血球凝集素抗原に特異的である抗体の使用を可能にする。さらに、分子または分子を含む支持体は、４−エトキシ−メチレン−２−フェニル−２−オキサゾリン−５−オン（ｐｈＯｘ）のようなハプテンに結合され、これはホーミング分子を回収する手段として、磁気ビーズに連結された抗ｐｈＯｘ抗体により結合され得る。ｐｈＯｘ標識された結合体を精製するための方法は、当該分野で公知であり、そしてこれらの手順を実行するための材料は、市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）。
【００５０】
共有されたタグはまた、サンプル中のそのライブラリーの分子の存在を同定するために、またはサンプルからのライブラリーの分子を実質的に単離するために使用され得る核酸配列であり得る。例えば、ライブラリーの各々の分子は、共有されたタグを構成する、選択された同じヌクレオチド配列に結合され得る。次いで、共有されたタグに相補的なヌクレオチド配列を含むアフィニティーカラムは、その分子に結合した共有されたタグにハイブリダイズすることにより、器官または組織のサンプルからホーミング分子を単離するために使用され得る。共有されたタグの一部に相補的なヌクレオチド配列もまた、共有されたタグを含む分子の存在が、ＰＣＲによってサンプル中で同定され得るように、ＰＣＲプライマーとして使用され得る。
【００５１】
タグはまた、特異的タグまたは独特のタグであり得る。本明細書中で使用される場合、用語「特異的タグ」とは、ライブラリー中である分子に連結される物理的、化学的、または生物学的タグを意味し、そしてその特定の分子に対して独特である。特異的タグは、それが容易に同定可能であるならば、特に有用である。あるライブラリーの特定の分子に独特であるヌクレオチド配列は、特異的タグ（例えば、あるライブラリーまたはペプチドの各ペプチドに連結された独特のオリゴヌクレオチドタグ（例えば、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８９：５３８１−５３８３  （１９９２）を参照のこと、これは参考として本明細書中に援用される））の例である。器官または組織へのホーミングの際、そのホーミングペプチドは、独特のオリゴヌクレオチドタグの配列を、例えば、ＰＣＲを用いて決定することによって同定され得る（例えば、Ｅｒｌｉｃｈ，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）を参照のこと、これは参考として本明細書中に援用される）。同様に、ファージで提示されるペプチドをコードする核酸配列は、特異的な核酸タグの別の例である。なぜなら、核酸の配列決定が、発現されたペプチドのアミノ酸配列を同定するからである（実施例Ｉを参照のこと）。そのような独特のオリゴヌクレオチド配列タグは、分子の他のライブラリーに連結される場合、それに連結されたホーミング分子の配列を同定するために使用され得る。
【００５２】
共有されたタグおよび特異的タグは、組み合わせると、ホーミング分子がわずかな量で存在する場合、器官または組織のホーミング分子を単離し、そして同定するために特に有用であり得る。例えば、あるライブラリーの各分子は、２つの部分を含むオリゴヌクレオチドタグに連結され得る；内部の独特のヌクレオチド配列タグおよびＰＣＲにおける使用のためのプライマー結合部位として作用する共有の隣接５’および３’ヌクレオチドタグ。従って、各分子は、そのホーミング分子を同定するための独特の部分、およびＰＣＲプライマー結合部位を提供するための共有部分を有するオリゴヌクレオチドタグを含む。このようなタグ化分子は、選択された器官または組織へのホーミングの際に、共有された隣接５’および３’ヌクレオチドタグにハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを実行すること、次いでＤＮＡ配列決定を行って内部の独特の配列タグのヌクレオチド配列を決定することによって、同定され得る。そのＰＣＲ産物は、ＰＣＲプライマーの一つを用いて直接配列決定され得るか、またはそのＰＣＲ産物は、ベクターにクローニングされ得、そしてそのＤＮＡ配列は、当該分野で周知の慣用方法によって決定され得る。
【００５３】
共有されたタグおよび独特のタグの種々の他の組合せが使用され得る。例えば、あるライブラリーにおけるその分子の各々は、特定のヌクレオチド配列タグに連結され得る（例えば、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ、前出、１９９２を参照のこと）。これはまた、共有された３’ヌクレオチド配列を含み、その配列は、ＰＣＲにおける使用のためのプライマー結合部位であり得、そしてビオチンのような共有されたタグへとさらに連結され得る。器官または組織へのホーミングの際に、その特定のホーミング分子は、ビオチンタグに基づいて、器官または組織のサンプルから実質的に単離され得る。次いで、単離された分子は、例えば、そのヌクレオチドタグの共有された３’ヌクレオチド配列をプライマー結合部位として用いて、ＰＣＲに基づいた特異的タグのＤＮＡ配列決定によって同定され得る。
【００５４】
タグはまた、支持体として役立ち得る。本明細書中で使用される場合、用語「支持体」とは、分子が付着され得る所定の表面を有するタグを意味する。一般に、支持体として有用なタグは、共有されたタグである。例えば、支持体は、ウイルスまたはバクテリオファージのようなウイルス様粒子（「ファージ」）；Ｅ．
ｃｏｌｉのような細菌；あるいは酵母、昆虫、または哺乳動物細胞のような真核生物細胞のような生物学的タグであり得；あるいはリポソームまたはマイクロビーズのような物理的タグであり得、これは、プラスチック、アガロース、ゼラチン、または他の生物学的もしくは人工的物質から構成され得る。所望であれば、支持体として有用な共有されたタグは、特異的タグをそこに連結し得る。
【００５５】
本明細書において示されるように、選択された正常な器官もしくは組織（例えば、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸）へ、または腫瘍を含む器官もしくは組織（例えば、肺腫瘍を含む肺もしくは膵臓腫瘍を含む膵臓）へホーミングし得ることが疑われるペプチドは、融合タンパク質のＮ末端として発現され、ここで、Ｃ末端は、ファージ被覆タンパク質からなった（実施例Ｉを参照のこと）。その融合タンパク質の発現の際に、融合タンパク質の発現の際、Ｃ末端コートタンパク質は、Ｎ末端ペプチドがその器官または組織において標的分子と相互作用する位置にあるように、ファージの表面に対して融合タンパク質を連結した。従って、共有されたタグを有する分子を、ペプチドのファージへの連結によって形成し、ここで、ファージは生物学的支持体を提供し、ペプチド分子は融合タンパク質として連結され、融合タンパク質のファージコード部分はスペーサー分子として作用し、そしてそのペプチドをコードする核酸は、器官および組織のホーミングペプチドの同定を可能にする特異的タグを提供した。
【００５６】
分子が支持体に連結される場合、タグ化された分子は、支持体の表面に付着された分子を含み、その結果、被験体において細胞中の標的分子と相互作用し得る疑いのある分子の一部が、相互作用に関与し得るように配置される。例えば、ホーミング分子が増殖因子レセプターのリガンドである疑いがある場合、支持体に付着された分子の結合部分は、器官または組織における細胞上の増殖因子レセプターと相互作用し得るように配置される。所望であれば、適切なスペーサーが、分子と支持体との間に配置され得、その結果、可能性のある器官または組織のホーミング分子が標的分子と相互作用する能力は妨害されない。スペーサー分子はまた、反応性基を含み得、これは分子を支持体に連結する便利かつ効率的な手段を提供し、そして所望であれば、分子の回収または同定を容易にし得るタグを含み得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、前出、１９９６を参照のこと）。
【００５７】
一般的に、支持体は、その支持体が、被験体に存在するキャピラリーベッドを通して比較的妨害されずに通過し得、そして循環を塞ぎ得ないように、その最短の寸法で約１０μｍ未満から約５０μｍの直径を有するべきである。さらに、支持体は、生物学的に不活性であり得、そのため、細胞表面分子の正常発現または被験体の正常生理状態を混乱させない。さらに、支持体は、特にインビボパニングに使用される被験体が選択された器官または組織をのサンプルを収集するために屠殺されない場合には、分泌性であり得るか、または生分解性であり得る。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、器官または組織のホーミング分子の同定に関して使用される場合に、用語「インビボパニング」とは、ライブラリーを被験体に投与する工程、および被験体において器官または組織に選択的にホーミングする分子を同定する工程によって、ライブラリーをスクリーニングする方法を意味する（米国特許第５，６２２，６９９号、前出を参照のこと）。分子のライブラリーまたはこのようなライブラリーの一部に関して使用される場合、用語「被験体に投与する（こと）」は、ライブラリーが、一般的に脊椎動物、特にヒトのような哺乳動物である被験体において選択された器官または組織に送達されることを意味するために、その最も広義に使用される。分子のライブラリーは、投与の任意の経路または手段（例えば、静脈内、筋肉内、経口的、眼科的、眼球的、腹膜内、鼻内、膣内、直腸内、子宮内、眼の房内、中枢神経系内または末梢神経系内、吸入により、局所投与により、あるいは任意の正常な器官もしくは組織、あるいは腫瘍または病因に関与する器官もしくは組織のような病理学的領域（特に、その器官または組織の循環系）への注射による）によって投与され得る。
【００５９】
ライブラリーは、例えば、分子が選択された器官または組織を透過するように被験体の循環中にライブラリーを注射することによって被験体に投与され得；適切な時間の後、循環は、例えば、心臓を通る灌流によって、あるいはその器官または組織のサンプルを取り出すことによって終結される（実施例Ｉ；米国特許第５，６２２，６９９号  前出、１９９７；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４−３６６（１９９６）もまた参照のこと、これらは、本明細書において参考として援用される。）。あるいは、カニューレが被験体の血管中に挿入され得、その結果、ライブラリーは適切な時間の灌流によって投与され、その後、そのライブラリーはカニューレを通して循環から取り出され得るか、またはその被験体が器官サンプルまたは組織サンプルを収集するために屠殺され得るか、あるいは麻酔にかけられ得る。ライブラリーはまた、被験体における適切な血管のカニュレーションによって、選択された器官または組織を含む１つまたはいくつかの器官または組織を通して分流され得る。ライブラリーがまた単離された潅流した器官または組織に投与され得ることが認識される。単離された潅流した器官または組織におけるこのようなパニングは、その器官または組織に結合する分子を同定するために有用であり得る。
【００６０】
器官または組織のホーミング分子を同定するためのインビボパニングの使用は、マウスにおいてファージペプチド提示ライブラリーをスクリーニングすること、および網膜へホーミングするペプチドについて、ラットにおいて肺、膵臓、皮膚などに選択的にホーミングするペプチドを同定することによって、本明細書中で例示される（実施例ＩおよびＩＩ）。しかし、例えば、抗体または抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆｄ、またはＦａｂフラグメント）；増殖因子レセプターのようなホルモンレセプター；またはインテグリンまたはセレクチンのような細胞接着レセプターを含む、他のタンパク質分子を提示するファージライブラリーはまた、本発明を実施するために使用され得る。このような分子の改変体は、ランダム、部位特異的、またはコドンに基づく変異誘発のような周知の方法を使用して構築され得（Ｈｕｓｅ，１９９３年１１月２３日に発行された米国特許第５，２６４，５６３号を参照のこと、これは本明細書中で参考として援用される）、そして所望であれば、ペプチドは、ファージの発現後であるが被験体への投与の前に、例えば、ジスルフィド架橋を導入することによって、化学的に改変され得る。従って、多くの異なるタイプのファージ提示ライブラリーが、インビボパニングによってスクリーニングされ得る。
【００６１】
ファージ提示技術は、ランダムまたは選択的にランダムにされたペプチドの多様な集団を発現する手段を提供する。ファージ提示の種々の方法およびペプチドの多様な集団を産生する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｌａｄｎｅｒら（１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号、これは本明細書中で参考として援用される）は、ファージの表面上の結合ドメインの異なる集団を調製する方法を記載する。特に、Ｌａｄｎｅｒらは、ファージ提示ライブラリーを産生するために有用なファージベクター、ならびに可能性のある結合ドメインを選択しそしてランダムにまたは選択的に変異した結合ドメインを産生する方法を記載する。
【００６２】
同様に、ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２２８−２５７（１９９３）；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）もまた参照のこと、その各々は本明細書中で参考として援用される）は、ファージペプチド提示ライブラリーを産生する方法（発現されるペプチドの集団を多様化させるベクターおよび方法を含む）を記載する（Ｈｕｓｅ，ＷＯ  ９１／０７１４１およびＷＯ９１／０７１４９もまた参照のこと、その各々は本明細書中で参考として援用される；実施例Ｉもまた参照のこと）。ファージ提示技術は、例えば、コドンに基づく変異誘発法とともに使用される場合、特に強力であり得、これはランダムペプチドまたはランダムにもしくは所望して偏ったペプチドを産生するために使用され得る（Ｈｕｓｅ，米国特許第５，２６４，５６３号，前出，１９９３）。これらまたは他の周知の方法は、ファージ提示ライブラリーを産生するために使用され得、このファージ提示ライブラリーは、選択された器官または組織へホーミングするペプチドを同定するために、本発明のインビボパニング方法に供され得る。
【００６３】
ファージ提示ライブラリーをスクリーニングすることに加えて、インビボパニングは、種々の他のタイプのライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。例えば、細胞表面レセプターに結合する核酸分子が記載されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５８８３−５８８７（１９９６）；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５−５１０（１９９０）；Ｇｏｌｄら、前出（１９９５）を参照のこと、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。これらのインビトロの結果は、核酸分子のライブラリーもまた、インビボパニングによって試験されて、選択された器官または組織へホーミングする核酸分子を同定し得ることを示す。スクリーニングに適したさらなるライブラリーは、例えば、オリゴサッカリドライブラリー（Ｙｏｒｋら、Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．２８５：９９−１２８（１９９６）；Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１５２０−１５２２（１９９６）；およびＤｉｎｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７６：２６１−２６９（１９９５）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）；リポタンパク質ライブラリー（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．３９９：２３２−２３６（１９９６）、これは、本明細書において参考として援用される。）；糖タンパク質または糖脂質のライブラリー（Ｋａｒａｏｇｌｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１３０：５６７−５７７（１９９５）、これは、本明細書において参考として援用される。）；または化学物質ライブラリー（例えば、薬物または他の薬学的因子を含む）（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３７：１３８５−１４０１（１９９４）；ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３５１−３６０（１９９５）；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。）。そのようなライブラリーは、所望であれば、タグ化され得、これは、以前に記載したように器官または組織からのその分子の回収あるいはその同定を容易にし得る。
【００６４】
インビボパニングは、器官または組織へ選択的にホーミングし得る分子を直接同定する方法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ホーミングする」または「選択的にホーミングする」とは、特定の分子が、被験体への投与後にその器官または組織（特に、その器官または組織に存在する脈管）に存在する標的分子に比較的特異的に結合することを意味する。一般に、選択的ホーミングは、コントロール器官または組織と比較して、器官または組織への分子の少なくとも２倍（２×）大きな選択的結合を検出することによって、一部特徴づけられる。
【００６５】
選択された器官または組織への分子の選択的ホーミングは、その器官または組織における細胞上に存在する細胞表面タンパク質のような、特定の細胞標的分子の分子による選択的認識に起因し得る。ホーミングの選択性は、１つまたはいくつかのみの異なる細胞型において発現される特定の標的分子に依存し、そのため、その分子は、１つまたはいくつかのみの器官または組織へホーミングする。この点に関して、ほとんどの異なる細胞型、特に、器官または組織について独特である細胞型は、独特の標的分子を発現し得る。従って、肝臓、脾臓またはリンパ節のような、その器官について特異的な細胞によって形成される洞様毛細血管を通じて血液が循環する器官において、インビボパニングは、その特定の器官または組織へホーミングする分子を同定するために有用であり得る。
【００６６】
いくつかの場合には、分子は、器官または組織に非特異的に局在し得ることが認識されるべきである。例えば、ファージ提示ライブラリーのインビボパニングは、肝臓および脾臓のような器官において高いバックグラウンドを生じ得、これは細網内皮系（ＲＥＳ）の顕著な成分を含む。従って、そのような器官または組織のＲＥＳによる取り込みに起因する分子の非特異的結合は、器官または組織のホーミング分子を同定することをより困難にし得る。しかし、本明細書において開示したように、潜在的な非特異的結合は、例えば、選択された器官または組織を収集する前に、心臓を灌流することによって、回避され得る（実施例Ｉ）。
【００６７】
さらに、選択的ホーミングは、異なる個々のファージが器官または組織へホーミングする能力における相違を検出することによって、非特異的結合から容易に識別され得る。例えば、選択的ホーミングは、推定のホーミング分子（例えば、ファージ上に発現されたペプチド）と、過剰の非感染性のファージまたは選択していないペプチドを発現する約５倍過剰のファージとを組み合せること、この混合物を、被験体に注射すること、およびその器官または組織のサンプルを収集することによって、同定され得る。後者の場合において、例えば、器官または組織のホーミングペプチドがその標的分子について満足するようなものではない程度に十分低い、注射されたファージの部分の場合、器官または組織において約２０％を超えるファージがその推定のホーミング分子を含むということが決定されることは、そのファージによって発現されるペプチドが、選択的な器官または組織のホーミング分子であるという実証的な証拠である。さらに、非特異的な局在化は、例えば、推定の器官または組織のホーミングペプチドを発現するファージを、過剰量の「遊離」ペプチドと組み合せて使用した競合実験を行うことによって、選択的なホーミングから識別可能であり得る（実施例ＩＩを参照のこと）。
【００６８】
種々の方法が、ＲＥＳの成分を含む器官または組織のような器官または組織への分子の非特異的な局在化を防止するために使用され得る。例えば、本明細書中に開示されるように、ファージ循環の開始直後に心臓を通した溶液の灌流は、バックグラウンドの結合を減少させ、そして肺および肝臓（これらの両方はＲＥＳの成分を含む）に選択的にホーミングするペプチドの同定を可能にした（実施例ＩＩを参照のこと）。さらに、ファージディスプレイライブラリーと、非複製性コントロールファージとの同時投与は、肝臓および脾臓のような器官（これらはまた、ＲＥＳの成分を含む）において非特異的ファージ捕捉を減少させた。このアプローチは、肝臓へ選択的にホーミングする分子の同定を可能にした（実施例ＩＩ）。従って、支持体に付着した分子のライブラリーは、過剰な支持体とともに被験体へ同時投与され、器官または組織における非特異的な結合を阻害し得る。
【００６９】
ＲＥＳの成分による非特異的取り込みはまた、ＲＥＳによる取り込みを阻害するブロッキング剤を投与することによって防止され得る。例えば、ポリスチレンラテックス粒子またはデキストラン硫酸は、ライブラリーの投与前に被験体に投与され得る（Ｋａｌｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０：１７１〜１７４（１９９３）；Ｉｌｌｕｍら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７５：１６〜２２（１９８６）；Ｔａｋｅｙａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１００：３７３〜３７９（１９９７）を参照のこと。これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。デキストラン硫酸５００またはポリスチレンミクロスフェアのこのような前投与（ｐｒｅ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、肝臓のＲＥＳ成分であるクッパー細胞による試験物質の非特異的取り込みをブロックするために使用されている（Ｉｌｌｕｍら、前出、１９８６）。同様に、ＲＥＳによる薬剤の非特異的取り込みは、炭素粒子またはシリカ（Ｔａｋｅｙａら、前出、１９７７）またはゼラチンコロイド（Ｋａｌｉｎら、前出、１９９３）を使用してブロックされている。従って、ＲＥＳによる非特異的取り込みを阻害するために有用な多くの方法が当該分野において公知であり、そして慣用的に使用される。
【００７０】
非特異的ファージ捕捉を減少させる方法は、特定の器官または組織への低いバックグラウンド結合を示すファージの使用を含む。例えば、Ｍｅｒｒｉｌｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ９３：３１８８−３１９２（１９９６）、これは本明細書中で参考として援用される）は、ＲＥＳによって取り込まれず、そして結果として延長された時間にわたり循環中に残存する、λ型ファージを選択した。例えば、匹敵する糸状ファージ改変体は、類似の方法を使用して選択され得る。
【００７１】
選択的ホーミングは、選択された器官または組織に対するホーミング分子が比較的特異的であるか否かを決定することによって実証され得る。例えば、選択された器官または組織におけるホーミング分子の量は、コントロールの器官または組織、あるいは異なる器官または組織と比較され得る。選択的ホーミングはまた、インビボパニングの１ラウンドによって同定されるように、器官または組織へホーミングする分子が、インビボパニングのそれに続くラウンドにおいて富化されることを示すことによって、証明され得る。例えば、ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）を発現するファージを、肺からのインビボパニングの第２ラウンドおよび第３ラウンドのために富化し、そして選択されていないファージと比較した場合、それぞれ３５倍および９倍の富化を示した（実施例ＩＩ．Ｂを参照のこと）。さらに、腎臓または脳に対する選択的なホーミングは、検出されなかった。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、用語「選択された器官または組織」は、分子が選択的にホーミングされ得る、正常器官もしくは組織、または病状を有する器官もしくは組織（例えば、肺腫瘍を含む肺）を意味するその最も広い意味において使用される。従って、用語「器官または組織」は、正常な細胞型または癌細胞のような病的細胞型を含み、この場合選択された器官または組織は原発性腫瘍または転移病巣であり得る、任意の組織または器官を意味するように広く使用される。
【００７３】
一般に、選択された器官または組織は、細胞（これは、脈管構造細胞であり得る）を含み、これは、ホーミング分子が結合し得る細胞表面タンパク質のような、特定の標的分子を発現する。少なくとも２ラウンドのインビボパニングを実施することによって、選択された器官または組織についての分子のホーミングの選択性が決定され得る。しかし、以下で議論されるように、いくつかの場合において、ホーミング分子は１つより多くの選択された器官または組織にホーミングし得、この場合において、この分子は一群の選択された器官または組織に選択的にホーミングし得ると考えられる。しかし一般に、本発明のホーミング分子の利点は特定の器官または組織の標的化を可能にすることであるので、１つより多くの、またはいくつかの異なる器官または組織にホーミングする分子は、特に有用ではない。
【００７４】
用語「コントロールの器官または組織」は、選択された器官または組織以外の器官または組織を意味するために使用される。コントロールの器官または組織は、器官または組織のホーミング分子がコントロールの器官または組織にホーミングできない点で特徴付けられ、従って、コントロールの器官または組織は、選択された器官または組織への分子の選択的な結合を同定するために有用である（実施例ＩＩ）。器官または組織のホーミング分子が、器官または組織における病的病巣にホーミングするその能力に基づいて同定される場合、コントロールの器官または組織は、病的病巣を示さない、選択された器官または組織の対応する部分であり得る。
【００７５】
コントロールの器官または組織は、例えば、分子の非特異的結合を同定するため、またはこの分子のホーミングの選択性を決定するために収集され得る。さらに、非特異的結合は、例えば、器官または組織へホーミングしないことが公知であるが可能性のあるホーミング分子に化学的に類似するコントロール分子を投与することによって、同定され得る。あるいは、投与される分子が支持体に連結される場合、支持体単独の投与もまた、非特異的結合を同定するために使用され得る。例えば、ペプチド融合タンパク質を含まないファージが被験体に投与され得、そして選択された器官または組織がファージ支持体の非特異的結合のレベルを決定するために調べられ得る。
【００７６】
被験体にライブラリーを投与する工程、選択された器官または組織を収集する工程、およびその器官または組織にホーミングする分子を同定する工程は、インビボパニングの単一のラウンドを構成する。必要ではないが、インビボパニングの１つ以上の追加のラウンドが、一般的に実施される。インビボパニングの追加のラウンドが行われる場合、それまでのラウンドにおいて、選択された器官または組織から回収された分子が、被験体に投与され、この被験体は、その器官または組織の一部のみが収集されたそれまでのラウンドで使用された同じ被験体であり得る。
【００７７】
インビボパニングの第２ラウンドを行うことによって、第１ラウンドから回収された分子の相対的な結合選択性は、同定された分子を被験体に投与する工程、選択された器官または組織を収集する工程、および第１ラウンド後に回収されたものと比較して、特定の分子を提示する、より多くのファージが、スクリーニングの第２ラウンド後に器官または組織から回収されるかどうかを決定する工程によって決定され得る。必要ではないが、コントロールの器官または組織もまた収集され得、そして選択された器官または組織から回収された分子は、コントロールの器官または組織から回収された分子と比較され得る。理想的には、たとえあったとしても、分子は、インビボパニングの第２ラウンドまたはその後のラウンド後にコントロールの器官または組織からほとんど回収されない。しかし、一般には、一定の割合の分子は、コントロールの器官または組織にも存在する。この場合には、コントロールの器官と比較した場合の、選択された組織または器官における分子の比（選択された：コントロール）が決定され得る。インビボパニングの追加ラウンドは、特定の分子が、選択された器官もしくは組織にのみホーミングするのか、あるいはもともと選択された器官もしくは組織において標的と同一であるかまたは標的に十分に類似する、１つ以上の他の器官もしくは組織において発現される標的を認識し得るのかを決定するために使用され得る。
【００７８】
一般に、無作為なまたは選択的に無作為化された目的の分子の多様な集団を含む、分子のライブラリーが調製され、次いで被験体に投与される。投与のいくらかの時間の後、選択された器官または組織が収集され、そしてこの選択された器官または組織中に存在する分子が同定される（実施例Ｉを参照のこと）。所望であれば、１つ以上の、コントロールの器官または組織、あるいはコントロールの器官または組織の一部が同様にサンプリングされる。例えば、ファージペプチドディスプレイライブラリーを注射して約１〜５分後のマウスを麻酔し、次いで素早く凍結するかあるいは心臓を通して灌流するかのいずれかでファージの循環を終結させた。肺、膵臓もしくは他の器官または組織および１つ以上のコントロールの器官をそれぞれから収集し、そして選択された器官およびコントロールの器官に存在するファージを収集した。それぞれの器官または組織に選択的にホーミングするペプチドを同定した（実施例ＩＩおよび表１〜１１）。
【００７９】
本明細書中において例示されるように、実験動物を屠殺して、選択された器官もしくは組織またはコントロールの器官もしくは組織を収集した。しかし、器官または組織にホーミングする分子を回収するために、その器官または組織の一部しか収集する必要ないことを理解するべきである。同様に、器官または組織の一部しかコントロールとして収集する必要がない。従って、例えば、分子のライブラリーの被験体への投与に続いて、選択された器官または組織の一部が生検によって収集され得、ホーミング分子が回収され得、所望であれば、インビボパニングの第２ラウンドのために、同じ被験体に増幅および再投与され得る。同じ被験体へ２回目に投与されるべき分子が、タグ化されるかまたは例えば支持体に連結される場合、そのタグまたは支持体は、スクリーニングのその後のラウンドを妨害しないように、生物学的に不活性かつ生分解性または排泄性（ｅｘｃｒｅｔａｂｌｅ）であるべきである。
【００８０】
ファージライブラリーのインビトロスクリーニングは、以前に、抗体または細胞表面レセプターに結合するペプチドを同定するために使用された（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、前出、１９９３）。例えば、ファージペプチドディスプレイライブラリーのインビトロスクリーニングは、インテグリン接着レセプター（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２４：３７３−３８０（１９９４ａ）、これは参考として本明細書中に援用される）、およびヒトウロキナーゼレセプター（Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９１：７１２９−７１３３（１９９４）、これは参考として本明細書中に援用される）に特異的に結合した新規ペプチドを同定した。同様に、核酸分子のインビトロスクリーニングは、抗体、細胞表面レセプターまたは有機分子に特異的に結合する分子を同定した（Ｇｏｌｄら、前出、１９９３、１９９５、１９９７）。例えば、ＨＩＶ−１逆転写酵素に特異的に結合するＲＮＡ分子は、精製されたＨＩＶ−１逆転写酵素を標的分子として使用して同定された（Ｇｒｅｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４７：６０〜６８（１９９５）、これは参考として本明細書中に援用される）。これらのインビトロ方法は、人工の系において、規定され、十分に特徴付けられた標的分子を使用して実施された。しかし、このようなインビトロ研究は、インビトロで結合する分子がまたインビボで標的に結合し得るか否かについての見識を提供しない。例えば、培養中で増殖させた内皮細胞は、その組織特異的差異を失う傾向にある（ＰａｕｌｉおよびＬｅｅ、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：３７９〜３８７（１９８８）、これは参考として本明細書中に援用される）。従って、インビトロで細胞上の標的に結合する分子は、インビボで結合しないかもしれない。なぜなら、この標的はこの細胞上に存在しないかもしれないからである。さらに、このようなインビトロ方法は、標的分子に関する事前の知識を必要とし、そしてインビボでの有用性に関する情報は、あるにしてもほとんど得られない点で制限される。例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎら（前出、１９９４）は、培養された細胞を利用して組換えウロキナーゼレセプターを発現させ、結合ペプチドを得た。しかし、このウロキナーゼレセプターは多くの異なる器官および組織の細胞において発現し、従って、ウロキナーゼレセプターに結合する分子は多くの器官または組織と相互作用し得、そして本発明の範囲内の器官または組織のホーミング分子とは考えられない。
【００８１】
インビトロパニング法と対照的に、インビボパニングは、事前の知識も、インビボで発現される標的分子に結合する分子を同定するための公知の標的分子の利用可能性をも必要としない。また、「標的化されていない」器官または組織がスクリーニングの間に存在するので、ホーミングの選択性を欠失した器官または組織のホーミング分子を単離する見込みは、非常に減少する。さらに、インビボパニングによって器官または組織のホーミング分子を得る際に、例えば、代謝活性に起因してインビボでの循環における分解に対して特に感受性であり得る任意の分子が、選択され、そして回収されない。従って、インビボパニングは、インビボで選択的にホーミングする分子を同定することによって、以前の方法を超えて有意な利点を提供し、そして所望であれば、標的分子は、選択された器官または組織上に存在する。
【００８２】
特定の器官または組織において、種々の正常組織および病的病巣に選択的にホーミングする、器官ホーミング分子の同定は、本明細書中で例示されるように、選択された器官または組織で発現される内皮細胞の特定の標的分子が、この器官または組織の生理学的状態または病理学的状態を反映することを示す。器官または組織において生じる特定の生理学的状態または病理学的状態に基づいてこの器官または組織に選択的にホーミングする、このような器官ホーミング分子は、インビボパニング法を使用して同定され得、そしてこの器官または組織の生理学的状態または病理学的状態に対するホーミング分子の選択性は、免疫組織学的分析によって確認され得る（実施例ＩＩＩ）。例えば、膵炎に罹患した膵臓にホーミングする分子は、膵炎を有する被験体のインビボパニングによって同定され得、そしてホーミング分子の選択性は、正常膵臓におけるこの分子のホーミングと、膵炎を罹患した膵臓におけるホーミングとを比較する免疫組織化学を使用することによって、確認され得る。
【００８３】
正常器官または組織あるいは病理学的状態を示す器官または組織に選択的であるホーミング分子は、病状の存在または非存在を検出するために有用であり得る。例えば、被験体に対して画像化部分に結合体化された前立腺ホーミング分子の投与の後に、前立腺が可視化され得る。画像が異常な場合、例えば、前立腺のサイズが、大きさおよび年齢が一致する被験体に予測されるサイズとは異なる場合、この画像化の結果は、前立腺を冒す異常な生理学的状態または病理学的状態を示し得る。例えば、画像化剤、および正常な前立腺にはホーミングするが異常な前立腺にはホーミングしない前立腺ホーミング分子を含む結合体が、被験体に投与され得る。例えば、このホーミング分子を結合しない前立腺の領域の同定は、前立腺における異常な血流の出現を示し得、そして前立腺腫瘍の存在のような病理学的状態の診断であり得る。前立腺腫瘍組織にホーミングするが正常な前立腺にはホーミングしない分子を含む結合体は、前立腺腫瘍を直接的に画像化するために使用され得る。
【００８４】
器官または組織について選択性のホーミング分子は、その器官または組織へ治療剤を送達するために使用され得る。薬剤のこのような選択的標的化は、その標的器官または標的組織へ送達される薬剤の有効量を増加し得る一方、その薬剤が他の器官または組織に対して副作用を有する可能性を低減させる。例えば、嚢胞性線維症患者の肺に対して、嚢胞性線維症膜貫通レセプター（ＣＦＴＲ）（これは、嚢胞性線維症において欠損している）をコードする遺伝子を送達するために肺ホーミング分子を使用し得る。従って、本発明の器官ホーミング分子は、インビボの遺伝子治療のために特に有用である。なぜなら、それらは遺伝子を所望の標的器官に対して方向づけるための手段を提供し、それによって標的細胞がその遺伝子を受容する可能性を増大し、そして正常な非標的である細胞が副作用を受ける可能性を低減するからである。肺ホーミング分子はまた、治療剤を肺に対して方向付けるために使用され得、それによって非標的器官または組織をその薬剤の毒性作用から免れさせる。例えば、肺胞細菌性肺炎において、肺ホーミング分子は、肺の罹患した領域へ抗生物質を方向付けるために有用であり得、従って所望の部位での薬物の有効量を増大させる。
【００８５】
細胞性レセプター、および特定のレセプターに結合するリガンドの保存された性質に起因して、マウスもしくはラットにおいてインビボパンニングを使用して同定される器官または組織ホーミング分子がまた、ヒトもしくは他の哺乳動物種の選択された器官または組織において対応する標的分子に結合し得ることを当業者は理解する。実験的動物を使用して同定されるそのようなホーミング分子は、例えば、その分子がまた、ヒト被験体から得られる選択された器官または組織のサンプルに対してインビトロで選択的に結合し得ることを実証することによって、ヒト被験体の対応する器官または組織に結合するその能力について容易に試験され得る。あるいは、ヒト器官または組織由来の初代細胞または確立された細胞株は、そのホーミング分子のインビトロでの結合について試験するために使用され得る。同様に、特定のヒト器官もしくは組織の病理を反映する初代細胞または確立された細胞株は、その病理に対して選択的なホーミング分子の結合を試験するために使用され得る。ヒト病理の動物モデル（例えば、霊長類モデル）が公知であり、そしてインビボでのパンニングを使用する分子のホーミングについて試験するために使用され得る。従って、実験的動物におけるインビボパンニングを使用して同定された器官または組織ホーミング分子がまた、ヒト被験体における器官または組織特異的標的分子を結合し得ることを確認するために、慣用的な方法が使用され得る。さらに、選択された器官、組織、または病理を含むことが疑われるサンプルとのホーミング分子のインビトロ接触は、サンプルにおける選択された器官、組織、または病理の存在を同定し得る。インビボパンニングによって標的分子を同定したので、当業者はその標的分子が器官ホーミング分子についての真の標的であることを知り、従って、その標的分子をインビトロで使用して、インビボでその標的分子に対して特異的である可能性を有するさらなる器官ホーミング分子を同定し得るということを知る。次いで、そのような潜在能のある器官ホーミング分子をインビボパンニングによって試験して、器官ホーミング能力を確認し得る。
【００８６】
インビボパンニングを使用して、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸、および肺腫瘍を含有する肺、または膵臓腫瘍を含有する膵臓に対して選択的にホーミングするファージによって発現されるペプチドを同定した（実施例ＩＩおよびＩＶ；表２〜１１もまた参照のこと）。ファージの大きなサイズ（３００ｎｍ）、およびそのファージを循環させる時間の短さに起因して、実質的に多くのファージが循環系に存在していたことはないようである。実際、種々の器官および組織のホーミング分子の免疫組織化学的研究は、この分子が、血管系の内皮細胞表面マーカーに主にホーミングし、そしてそれに結合することを実証した。従って、本発明は、選択された器官または組織の血管系に選択的にホーミングするペプチドのような分子を提供する。
【００８７】
ファージペプチド提示ライブラリーを、本質的に、ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ（前出、１９９３；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：２６５−２７０（１９９５）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４５：３４６−３６９（１９９４ｂ）もまた参照のこと。これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）に記載のように構築した。いくつかのライブラリーにおいて、システインをコードする少なくとも１つのコドンもまた各オリゴヌクレオチド内に含ませた。その結果、ジスルフィド結合を通して環状ペプチドを形成し得る（実施例Ｉ）。インビボパンニングの実施に際して、肺、膵臓、皮膚、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓もしくは腸、または肺腫瘍を含有する肺、または膵臓腫瘍を含有する膵臓に対して選択的にホーミングするペプチドが得られた。従って、本発明は特定の器官または組織に対して選択的にホーミングする種々の器官ホーミング分子を提供する。
【００８８】
注目すべきことに、インビボパンニング手順の１回の間に、いくつかの器官ホーミングペプチドは独立して４回以上まで回収された（例として、表１を参照のこと）。さらに、特定の器官または組織にホーンミングする種々のペプチドは、保存されたアミノ酸配列モチーフを共有した。例えば、いくつかの肺ホーミングペプチドはＧＦＥモチーフを共有し；いくつかの網膜ホーミングペプチドはＲＤＶモチーフを共有し；そしていくつかの副腎ホーミングペプチドは、ＬＰＲモチーフを共有した（それぞれ、表２、表６、および表１１を参照のこと）。例えば、トリペプチドＲＧＤモチーフは、インテグリン結合に十分であることが公知であるので（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６９７（１９９６）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９５；ＷＯ  ９５／１４７１４）、本明細書中に開示されるこの結果は、多くのリガンド／レセプター相互作用は、トリペプチドと同じほど小さい認識モチーフからそれらの特異性を誘導し得ることを示す。
【００８９】
【表１】
2010031038.tif 000005
2010031038.tif 000006
開示された器官ホーミングペプチドの配列はいずれも、内皮細胞レセプターについての既知のリガンドと有意な類似性を示さなかった。多くの器官ホーミングペプチドが、より大きなペプチドまたはタンパク質内に含まれ得るが、そのより大きな分子上でホーミング機能をそれらが提供し得るか否かは公知ではない。しかし、より大きなペプチドおよびタンパク質内に存在する場合に、ＲＧＤがインテグリン結合を媒介するという以前の知見に基づいて、より大きなペプチドまたはタンパク質内に局在化された場合にそのようなホーミングペプチドおよびモチーフがホーミング機能を提供し得るということを当業者は認識する。しかし、そのような天然に存在する内因性のペプチドおよびタンパク質は、本発明内の器官または組織ホーミング分子であると見なされない。
【００９０】
本明細書中に例示される器官または組織ホーミングペプチド分子は、サイズが長さ約７〜１３アミノ酸の範囲である。しかし、例えば、それ自体によりまたは大きなタンパク質内に存在する場合にインテグリン結合を媒介するＲＧＤインテグリン結合モチーフの能力に基づいて、本発明の器官ホーミング分子がまた、有意により長いポリペプチド配列の状況下でそれらの器官ホーミング能力を維持することが予期され得ることが認識される。従って、本発明の器官ホーミングペプチドは、少なくとも３アミノ酸、一般的には少なくとも６アミノ酸、または７以上のアミノ酸であり得、そして有意により長く、例えば、約２０〜５０アミノ酸または１００以上のアミノ酸であり得る。
【００９１】
本発明は、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）（これらは、ＧＦＥモチーフを共有する）；ＣＴＬＲＤＲＮＣ（配列番号１５）；ならびにＣＩＧＥＶＥＶＣ（配列番号１６；表１を参照のこと）（これは、ＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）に存在するＥＬＥモチーフに類似性であるＥＶＥモチーフを含む）のような肺ホーミングペプチドを提供する。例示された肺ホーミングペプチドは、ＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）、ＣＸ7Ｃ（配列番号２４）またはＣＸ6Ｃ（配列番号２６）の環状ライブラリーのマウスへの注射によって同定された（実施例ＩＩ）。肺ホーミングペプチドであるＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）は、選択されていないファージと比較した場合に、それぞれ６０倍および９倍の富化を示し、腎臓または脳においてほとんどファージは検出されなかった（実施例ＩＩ；図１および２、ならびに表１もまた参照のこと）。さらに、肺ホーミングペプチドであるＣＴＬＲＤＲＮＣ（配列番号１５）およびＣＩＧＥＶＥＶＣ（配列番号１６）は、選択されていないファージよりもそれぞれ８倍および６倍の富化を示した（表１）。コグネイトＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）ペプチドを発現するファージとのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−（ＧＳＴ−）ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）融合ペプチドの同時注射はホーミングを７０％阻害し、そして（配列番号２）を発現するファージとのＧＳＴ−ＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）の同時注射は肺ホーミングを３０％阻害した（図３）。肺ホーミングペプチドを提示するファージのマウスへの投与後の肺の免疫組織化学的染色は、肺胞毛細血管内の染色を明らかにした。肺のいずれの特定領域へのファージのホーミングについても明らかな優先性は観察されなかった；しかし、細気管支管腔壁またはいくつかのより大きな血管において（実施例ＩＩＩ）、あるいは分析された多くの他の組織において、染色は全く観察されなかった。これらの結果は、インビボパンニングを使用して、肺内の内皮細胞特異性を同定および分析し、それによって示差的に肺を標的化するための手段を提供し得ることを示す。
【００９２】
本発明はまた、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３；表５）（これは、ＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）環状ライブラリーのマウスへの注射によって同定された（実施例ＩＩ））のような皮膚ホーミングペプチドを提供する。皮膚ホーミングペプチド配列ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）は、選択されていないファージよりも、ならびに脳および腎臓におけるバックグランドよりも皮膚に対して７倍の選択性を示した（図２；表１もまた参照のこと）。ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）を発現するファージとのＧＳＴ−ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）の同時注射は、皮膚へのホーミングを５５％阻害したが、ＧＳＴ単独との同時注射は、ホーミングに対して全く効果を有さなかった（図３Ｂを参照のこと）。皮膚ホーミングペプチドを提示するファージ投与後の皮膚の免疫組織化学的染色は、染色が皮下組織に局在化し；真皮には全く染色が観察されないことを明らかにした（実施例ＩＩＩ）。
【００９３】
本発明はさらに、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４；表３）のような膵臓ホーミングペプチドを提供する。例示された膵臓ホーミング分子は、ＣＸ7Ｃ（配列番号２４）またはＸ2ＣＸ4ＣＸ（配列番号２３）の環状ライブラリーのマウスへの注射によって同定された（実施例ＩＩ）。膵臓ホーミングペプチドであるＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）は、選択されていないファージおよび脳よりも膵臓に対して２０倍の選択性を示した（表１；図２）。しかし、ＧＳＴ−ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）の同時注射は、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）の膵臓ホーミングを阻害しなかった。これはおそらく、膵臓ホーミングペプチドに対するＧＳＴの立体配座的効果に起因する。膵臓ホーミングペプチドを提示するファージの投与後の膵臓の免疫組織化学的染色は、染色が毛細血管および外分泌膵臓のより大きな血管に局在化し；内分泌血管系において有意な染色が全く観察されなかったことを明らかにした（実施例ＩＩＩ）。この結果は、特定の器官内の組織学的および生理学的に識別可能な領域が、本発明の器官ホーミング分子に対する標的を提供する特有の標的分子を発現し得ることを実証する。従って、本発明の器官ホーミング分子は、選択された器官または組織の特異的領域を示差的に標的化するための手段を提供する。
【００９４】
網膜ホーミングペプチド（例えば、ＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）およびＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６））もまた提供される（表６を参照のこと）。例示された網膜ホーミング分子は、ＣＸ7Ｃ（配列番号２４）環状ライブラリーのラットへの注射によって同定された（実施例ＩＩ）。網膜ホーミングペプチドであるＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）およびＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６）は、コントロールｆｄＡＭＰＬＡＹ８８ファージと別々に注射された場合に、網膜においてそれぞれ３倍および２倍の富化を示した（実施例ＩＩ）。しかし、免疫組織化学的染色は、網膜染色の欠如を明らかにした。これはおそらく、標的組織におけるこの網膜ホーミングファージの比較的多くない蓄積に起因する。
【００９５】
本発明はまた、ＳＭＳＩＡＲＬ（配列番号２１）およびＶＳＦＬＥＹＲ（配列番号２２）（これらは、Ｘ7（配列番号２９）ライブラリーのマウスへの注射によって同定された）のような前立腺ホーミングペプチドを提供する（表７）。このペプチドは、正規の方法によってより単離された。前立腺ホーミングペプチドであるＳＭＳＩＡＲＬ（配列番号２１）およびＶＳＦＬＥＹＲ（配列番号２２）は、脳と比較した場合に、前立腺へのホーミングにおいてそれぞれ３４倍および１７倍の富化を示した（表１）。
【００９６】
Ｘ7（配列番号２９）ライブラリーのマウスへの注射によって同定された、ＲＶＧＬＶＡＲ（配列番号１１）およびＥＶＲＳＲＬＳ（配列番号１０）のような卵巣ホーミングペプチドもまた提供される。このペプチドを、正規の方法によって単離した（表８）。卵巣ホーミングペプチドのＲＶＧＬＶＡＲ（配列番号１１）およびＥＶＲＳＲＬＳ（配列番号１０）は、各々、配列決定された４０クローンの２２％を含み、そして脳と比較した場合に卵巣においてそれぞれ５倍および３倍の富化を示した（表１）。
【００９７】
本発明はまた、ＬＰＲモチーフ（表１１を参照のこと）を共有するＬＭＬＰＲＡＤ（配列番号２７）およびＬＰＲＹＬＬＳ（配列番号２８）、またはモチーフＬＡＧＧ（配列番号４３０；表１０を参照のこと）を共有するペプチドＲ（Ｙ／Ｆ）ＬＬＡＧＧ（配列番号４０４）およびＲＹＰＬＡＧＧ（配列番号３８９）のような副腎ホーミングペプチドを提供する。例示された副腎ホーミングペプチドを、Ｘ7（配列番号２９）ライブラリーのマウスへの注射によって同定した。このペプチドを、正規の方法によって単離した。この副腎ホーミングペプチドＬＭＬＰＲＡＤ（配列番号２７）は、脳と比較した場合に副腎において５０倍の富化を示した（表１）。
【００９８】
肝臓ホーミングペプチドもまた提供される。そのようなペプチドを、Ｘ7（配列番号２９）ライブラリーのマウスへの注射によって同定した。このペプチドを、正規の方法によって単離した（以下の実施例ＩＩ、表１、および表１１を参照のこと）。
【００９９】
さらに、ＡＧＣＳＶＴＶＣＧ（配列番号３１５）のようなリンパ節ホーミングペプチドを提供する（以下の表９を参照のこと）。そのようなペプチドを、Ｘ2ＣＸ4ＣＸ（配列番号２３）ライブラリーのマウスへの注射によって同定した。このペプチドを、正規の方法によって単離した。
【０１００】
本発明はまた、Ｘ7（配列番号２９）ライブラリーのマウスへの注射によって同定された、ＹＳＧＫＷＧＫ（配列番号９）およびＹＳＧＫＷＧＷ（配列番号１５６）（表１および４）（これらは、最後のアミノ酸位置においてのみ異なる）のような腸ホーミングペプチドを提供する。このペプチドを、正規の方法によって単離した。腸ホーミングペプチドのＹＳＧＫＷＧＫ（配列番号９）は、配列決定された４０クローンの２２％で存在し、そして脳と比較した場合に腸において３０倍の富化された（表１）。さらに、ＶＲＲモチーフを共有するＱＶＲＲＶＰＥ（配列番号１５５）およびＶＲＲＧＳＰＱ（配列番号１６４）のような腸ホーミングペプチドを、ＲＧＳモチーフを共有するペプチドＶＲＲＧＳＰＱ（配列番号１６４）、ＧＧＲＧＳＷＥ（配列番号１６７）、およびＦＲＶＲＧＳＰ（配列番号１６９）と同様に同定した。
【０１０１】
本発明の器官ホーミング分子は、部分に連結された器官ホーミング分子を含む結合体として特に有用である。従って、本発明の肺ホーミング分子、皮膚ホーミング分子、膵臓ホーミング分子、網膜ホーミング分子、前立腺ホーミング分子、卵巣ホーミング分子、リンパ節ホーミング分子、副腎ホーミング分子、肝臓ホーミング分子、または腸ホーミング分子は、部分に結合され得、そのような結合体は、この部分を特定の選択された器官に指向するために有用である。
【０１０２】
本明細書中で使用される用語「部分」は、器官ホーミング分子または組織ホーミング分子に連結される物理学的物質、化学的物質、または生物学的物質を意味するように広く使用される。一般に、器官ホーミング分子に連結される部分は、ホーミング分子に生物学的に有用な機能を与える。部分は、任意の天然または非天然の物質、例えば、ペプチドまたはポリペプチド配列、有機分子もしくは無機分子または有機組成物もしくは無機組成物、核酸分子、炭水化物、脂質、あるいはそれらの組み合わせからなり得る。
【０１０３】
部分は、物理学的物質、化学的物質または生物学的物質（例えば、ウイルス、ウイルス遺伝子治療ベクター、細胞、リポソーム、マイクロカプセル、マイクロポンプまたは他の空洞のある（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ）マイクロデバイス）であり得、これは、例えば、薬物送達系として使用され得る。一般に、このようなマイクロデバイスは、生物学的に不活性であるべきであり、所望であれば、生分解性または排出可能であるべきである。マイクロカプセルを含む種々の部分（薬剤を含み得る）、および部分または空洞のあるマイクロデバイスを本発明の有機分子に連結させる方法は、当該分野で周知であり、そして市販されている（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９０）、第８９−９１章；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）を参照のこと、これらはそれぞれ本明細書において参考として援用される；Ｈｅｒｍａｓｏｎ、前出、１９９６もまた参照のこと）。部分のさらなる例は、当業者に公知であり、そしてそれらが本発明のホーミング分子に連結される場合に、生物学的に有用な機能を有する限り、この用語の意味に含まれることが意図される。
【０１０４】
選択された器官または組織に部分を指向する目的のために器官ホーミング分子にこの部分を連結することが、脳ホーミングペプチドの赤血球（ＲＢＣ）への連結（ここで、このペプチドは、脳へのＲＢＣのホーミングを指向した）によって実証された（米国特許第５，６２２，６９９号、前出、１９９７）。これらの結果は、本発明の器官ホーミング分子または組織ホーミング分子が、この部分を選択された器官または組織に指向するために、別の部分に連結され得ることを示す。例えば、肝臓ホーミング分子または肺ホーミング分子は、ＣＦＴＲ遺伝子をコードする核酸に連結され得、そして被験体への投与の際に、ＣＦＴＲの発現が、それぞれ肝臓または肺に標的化される。同様に、肺ホーミング分子は、肺ホーミング分子およびプロテアーゼインヒビターを含む結合体を被験体に投与する際に、このプロテアーゼインヒビターが肺に標的化されるように、プロテアーゼインヒビターに連結され得る。そのような結合体は、例えば、肺における過剰なプロテアーゼ産生および器官の自己消化によって特徴付けられる気腫を罹患する被験体を処置するために有用であり得る。
【０１０５】
本発明の器官ホーミング分子および組織ホーミング分子は、選択された組織または器官に、治療剤、診断剤、または画像化剤、タグまたは不溶性支持体、例えば透過性もしくは半透過性膜を含むリポソームまたはマイクロカプセル（ここで、選択された器官または組織に送達されるべき薬物のような薬剤は、リポソームまたはマイクロカプセル内に含まれる）を指向するために有用であり得る。当該分野において公知のこれらの部分および他の部分は、本明細書中に開示されるような本発明の結合体において、および本発明の方法において使用され得る。
【０１０６】
１つの実施態様において、部分は、選択された器官または組織の検出または可視化を可能にする、放射性核種または画像化剤のような検出可能な薬剤であり得る。従って、本発明は、検出可能な薬剤に連結された、肺ホーミング分子、皮膚ホーミング分子、膵臓ホーミング分子、網膜ホーミング分子、前立腺ホーミング分子、卵巣ホーミング分子、リンパ節ホーミング分子、副腎ホーミング分子、肝臓ホーミング分子、または腸ホーミング分子を含む結合体を提供する。選択される検出可能な薬剤の型は、適用に依存する。例えば、被験体における肺のインビボ診断画像化研究のために、肺ホーミング分子は、被験体への投与の際に被験体に対して外側で検出可能である薬剤に連結され得る。そのような内部器官または組織（例えば、前立腺）の検出のために、γ線放出放射性核種（例えば、インジウム−１１３、インジウム−１１５またはテクネチウム−９９）は、前立腺ホーミング分子に連結され得、そして被験体への投与後に、固体シンチレーション検出器を用いて可視化され得る。あるいは、被験体の外部表面またはその近傍の器官または組織（例えば、網膜）について、フルオレセイン標識した網膜ホーミング分子は、網膜の内皮構造が検眼鏡（ｏｐｔｈａｌａｍｏｓｃｏｐｅ）および適切な光学システムを使用して可視化され得るように、使用され得る。
【０１０７】
器官または組織中の病理学的病変に選択的にホーミングする分子は、同様に、その病変のサイズおよび分布が可視化され得るように適切な検出可能な薬剤に連結され得る。例えば、器官ホーミング分子または組織ホーミング分子が正常な器官または組織にホーミングするが、器官または組織における病理学的病変にホーミングしない場合、病理学的病変の存在は、器官または組織の異常な画像または異型の画像（例えば、病変領域における検出可能な薬剤の非存在）を同定することによって検出され得る。
【０１０８】
検出可能な薬剤はまた、インビトロにて検出を容易にする薬剤であり得る。例えば、適切な基質が存在する場合に可視シグナルを生じる酵素に連結されたホーミング分子を含む結合体は、ホーミング分子が指向される器官または組織の存在を検出し得る。そのような結合体（例えば、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼなどを含み得る）は、免疫組織化学のような方法において有用であり得る。そのような結合体はまた、例えば標的分子の精製の間に、サンプル中の器官ホーミング分子が結合する標的分子の存在を検出するために使用され得る。
【０１０９】
別の実施態様において、部分は治療剤であり得る。従って、本発明は、治療剤に連結された、肺ホーミング分子、皮膚ホーミング分子、膵臓ホーミング分子、網膜ホーミング分子、前立腺ホーミング分子、卵巣ホーミング分子、リンパ節ホーミング分子、副腎ホーミング分子、肝臓ホーミング分子、または腸ホーミング分子を含む結合体を提供する。
【０１１０】
治療剤は、本発明の器官ホーミング分子に連結される場合、選択された器官または組織の部位でその機能を働かせる任意の生物学的に有用な薬剤であり得る。例えば、治療剤は、連結された器官ホーミング分子に起因して標的細胞に連結される際に、それがその機能をもたらし得る細胞によってインターナリゼーションを受ける有機低分子であり得る。治療剤は、所望される場合、選択される器官または組織における細胞生存、細胞増殖、または細胞死を刺激または阻害することに関与するタンパク質をコードする核酸分子であり得る。例えば、アポトーシスを阻害するＢｃｌ−２のようなタンパク質をコードする核酸分子を使用して、細胞生存を促進し得るが、アポトーシスを刺激するＢａｘのようなタンパク質をコードする核酸分子を使用して、標的細胞の細胞死を促進し得る。
【０１１１】
細胞死を刺激するのに特に有用な治療剤は、本発明の器官ホーミング分子に連結される場合に、過剰増殖性障害（例えば、癌）を処置するのに有用であり得るリシンである。本発明の器官ホーミング分子、および抗生物質（例えば、アンピシリン）または抗ウイルス剤（例えば、リバビリン）を含む結合体は、例えば、選択された器官または組織における細菌感染またはウイルス感染を処置するために有用であり得る。
【０１１２】
治療剤はまた、その発現または欠損が病理学に関連する生物学的分子の産生または活性を阻害または促進し得る。従って、プロテアーゼインヒビターは、器官ホーミング分子に連結される場合、選択された器官または組織（例えば、膵臓）でのプロテアーゼ活性を阻害し得る治療剤であり得る。選択された器官または組織におけるタンパク質の産生を補給または回復させ得るｃＤＮＡのような遺伝子またはその機能的等価物もまた、病理学の重篤度を改善するために有用な治療剤であり得る。治療剤はまた、その発現が有害なタンパク質の産生を阻害するアンチセンス核酸分子であり得るか、または有害なタンパク質の活性を阻害し得るドミナントネガティブタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸分子であり得る。
【０１１３】
別の実施態様において、本発明は、タグに連結された肺ホーミング分子、皮膚ホーミング分子、膵臓ホーミング分子、網膜ホーミング分子、前立腺ホーミング分子、卵巣ホーミング分子、リンパ節ホーミング分子、副腎ホーミング分子、肝臓ホーミング分子、または腸ホーミング分子を含む結合体を提供する。タグは、例えば、クロマトグラフィーマトリクスのような不溶性支持体、またはビオチン、赤血球凝集素抗原、ポリヒスチジン、Ｔ７、もしくは当該分野において公知の他の分子のような分子であり得る。タグを含むそのような結合体は、器官ホーミング分子が結合する標的分子を単離するために有用であり得る。
【０１１４】
被験体に投与される場合、器官ホーミング分子および部分を含む結合体は、例えば、結合体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物として投与される。薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野で周知であり、そして例えば、水溶液（例えば、水または生理学的緩衝化生理食塩水）、あるいは他の溶媒またはビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール、オイル（例えば、オリーブオイル）もしくは注射可能な有機エステル）を含む。
【０１１５】
薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、複合体の吸収を安定させるか、または増加させるように作用する、生理学的に受容可能な化合物を含み得る。このような生理学的に受容可能な化合物は、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、スクロースもしくはデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸もしくはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定剤もしくは賦形剤を含む。当業者には、薬学的に受容可能なキャリア（生理学的に受容可能な化合物を含む）の選択が、例えば、組成物の投与経路に依存することを理解する。薬学的組成物はまた、所望される場合、薬剤（例えば、ガン治療剤または他の治療剤）を含み得る。
【０１１６】
当業者は、器官ホーミング分子を含む薬学的組成物が、種々の経路（例えば、経口または非経口（例えば、静脈内）を含む）により被験体に投与され得ることを理解する。組成物は、注射または挿管により投与され得る。薬学的組成物はまた、例えば細胞死を促進または阻害する薬物を中に取り込み得る部分（例えば、リポソームまたは他のポリマーマトリクス）に連結された器官ホーミング分子であり得る（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１巻（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  １９８４）、これは、本明細書中に参考として援用される）。例えば、リン脂質または他の脂質からなるリポソームは、作製および投与するのが比較的簡単な、非毒性の、生理学的に受容可能、かつ代謝可能なキャリアである。
【０１１７】
本明細書中で開示される診断方法または治療方法の実施において、器官ホーミング分子を含む結合体の有効量が、被験体に投与されなければならない。「有効量」は、所望の効果を生じる結合体の量である。有効量は、例えば、器官ホーミング分子に連結された成分、および意図される用途に依存する。例えば、細胞殺傷が所望される場合、治療目的のために投与される放射性標識分子の量と比較して、より少ない量の放射性標識ホーミング分子が画像化に必要とされ得る。特定の目的のための特定結合体の有効量は、当業者に周知の方法を用いて決定され得る。
【０１１８】
器官分子の投与経路は、部分的に、器官ホーミング分子の化学構造に依存する。例えば、ペプチドは、それらが消化管において分解され得るので、経口的に投与される場合、特に有用ではない。しかし、ペプチドを内因性プロテアーゼによる分解にあまり受けないようにするか、または消化管を通してより吸収可能にするように、ペプチドを化学的に改変するための方法は、周知である（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、前出、１９９５；ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ、前出、１９９５；ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ、前出、１９９５を参照のこと）。このような方法は、選択された器官または組織へホーミングするペプチド上で行われ得る。さらに、Ｄ−アミノ酸；ペプチド構造を模倣する有機分子からなるペプチド模倣物；またはペプトイド（例えば、ビニロガス（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ペプトイド）を含むペプチドのような、ペプチドアナログのライブラリーを調製するための方法は、上記に記載され、そして被験体への経口投与に安定なホーミング分子を同定するために使用され得る。
【０１１９】
本発明は、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸を含む結合体および検出可能薬剤を被験体に投与することにより、選択された器官または組織を同定する方法を提供する。検出可能成分結合体に連結される本発明の器官ホーミング分子を含む結合体は、被験体に投与され得、そして選択された器官または組織を同定または可視化するために用いられ得る。器官、特に内臓器官を可視化する能力は、選択された器官または組織の病状を診断する手段を提供する。例えば、インジウム−１１３に連結する前立腺ホーミング分子は、被験体に投与され、前立腺を画像化し得る。このような方法は、特に有益で有り得る。なぜなら、前立腺を画像化するための方法は限定されているからである。前立腺の病理症状の存在は、前立腺の領域が結合体を含まず、従って、その領域への循環における異常を示すことを検出することによるか、または前立腺が異常に増大されるか、もしくはその正常な境界を欠くことを検出することにより明らかにされ得る。網膜のような器官または組織（検眼鏡を用いて直接可視化され得る）について、フルオレセインに連結する網膜ホーミング分子を含む結合体が、被験体に投与され得、そして網膜における血管統合性および循環を試験するために用いられ得る。網膜画像の正常なまたは代表的なパターンの非存在は、この領域における網膜病理症状の存在を示し得る。例えば、異常な網膜パターンは、過剰増殖性病理または変性性病理を示す血管の変化を反映し得る。
【０１２０】
原則として、本発明の器官ホーミング分子は、分子の投与が直接の生物学的効果を提供するように固有の生物学的特性を有し得る。例えば、器官ホーミング分子は、器官ホーミング分子が天然のリガンドの活性を模倣する標的分子について天然に存在するリガンドと十分に類似であり得る。このような器官ホーミング分子は、天然のリガンドの活性を有する治療剤として有用であり得る。例えば、器官ホーミング分子が、選択された器官または組織により発現されるレセプターを結合する成長因子（例えば、上皮増殖因子の活性を模倣する皮膚ホーミング分子）の活性を模倣する場合、器官ホーミング分子の投与は、器官または組織において細胞増殖を生じ得る。本発明の器官ホーミング分子のこのような固有の生物学的活性は、選択された器官または組織の細胞をホーミング分子と接触させること、および生物学的効果（例えば、細胞増殖、または固有の活性が毒性効果である場合、細胞死）の証明のために細胞を試験することにより同定され得る。
【０１２１】
さらに、本発明の器官ホーミング分子は、対応するリガンドがレセプターに結合し得ないように特定の標的分子を結合する固有の活性を有し得る。例えば、種々の型の癌細胞が特定の器官または組織に転移することは、癌細胞がその転移する器官内で標的分子に結合するリガンドを発現することを示すことが、公知である。従って、例えば、肺に転移する腫瘍を有する被験体への、肺ホーミング分子の投与は、潜在的に転移性の癌細胞が肺において樹立されたるのを防ぐ手段を提供し得る。しかし、一般的に、本発明の器官ホーミング分子は、選択された器官または組織、特に肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸への成分の標的化に特に有用である。従って、本発明は、治療剤に連結する本発明の器官ホーミング分子を含む結合体を、病状を有する被験体に投与することにより、選択された器官または組織における病状を処置する方法を提供する。
【０１２２】
例えば、肺の特異的障害は、治療剤に連結する肺ホーミング分子を含む結合体を、被験体に投与することにより処置され得る。本発明の肺ホーミング分子は、肺の毛細血管および肺胞に局在化し得るので、これらの領域に関連する障害は、特に、肺ホーミング分子を含む結合体で処置することが可能である。例えば、細菌性肺炎は、しばしば肺の肺胞および毛細血管において始まる（ＲｕｂｉｎおよびＦａｒｂｅｒ、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  第２版、（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，１９９４））。従って、適切な抗生物質に結合体化された肺ホーミング分子は、肺炎を処置するために被験体に投与され得る。同様に、嚢胞性線維症は、ＣＦＴＲの欠損に起因して、肺において病理的損傷を生じる。従って、ＣＦＴＲをコードする核酸分子に結合体化される肺ホーミング分子の投与は、インビボにおける遺伝子治療処置方法として肺へ核酸分子を指向するための手段を提供する。
【０１２３】
本発明はまた、病理症状を有する被験体に、皮膚ホーミング分子および治療剤を含む結合体を投与することにより皮膚の病状を処置する方法を提供する。例えば、火傷の被災者は、上皮性増殖因子に連結した皮膚ホーミング分子を含む結合体または増殖因子に由来する血小板を投与され得、その結果、増殖因子が上皮性および深在真皮の再生または修復を促進し得、増殖因子は、皮膚に局在化される。さらに、本発明の方法は、抗生物質に連結される皮膚ホーミング分子を含む結合体を被験体に投与することによって、細菌性感染、特に皮下組織および真皮を通じて伝播する感染、またはそれらの領域に局在化される感染により生じる皮膚の病状を処置するために有用であり得る。
【０１２４】
本発明はまた、病状を有する被験体に、治療剤に連結する膵臓ホーミング分子を含む結合体を投与することにより、膵臓の病状を処置する方法を提供する。特に、本発明の膵臓ホーミング分子は、膵臓外分泌部に局在化し得るので、膵臓外分泌部に関連する病状は処置され得、そしてある場合には、膵臓内分泌部に有害に影響し得ない。本発明の方法は、分泌されたプロテアーゼが器官を傷害することにより生じる膵臓外分泌部の炎症性状態である急性膵炎を処置するために特に有用であり得る。プロテアーゼインヒビターに連結される膵臓ホーミング分子を含む結合体は、組織のプロテアーゼ媒介性崩壊を阻害するために用いられ得、従って、病状の重篤度を軽減する。このような結合体において有用な適切なプロテアーゼインヒビターは、膵炎に関連する酵素を阻害するものであり、これには、例えば、トリプシンのインヒビター、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼおよび膵臓リパーゼのインヒビターが挙げられる。本発明の方法はまた、膵臓にホーミングする分子に連結する治療剤を含む結合体を被験体に投与することにより、膵臓癌（例えば、腺管癌）を有する被験体を処置するために用いられ得る。
【０１２５】
本発明の方法はまた、病状を有する被験体に、治療剤に連結する網膜ホーミング分子を含む結合体を投与することにより、眼、特に網膜の病理症状を処置するために用いられ得る。例えば、増殖性網膜症は、網膜虚血（例えば、糖尿病に起因する）に対する応答における網膜の新生血管形成と関連する。従って、アポトーシスを刺激する遺伝子（例えば、Ｂａｘ）に連結する網膜ホーミング分子を含む結合体の投与は、増殖性網膜症を処置するために用いられ得る。同様に本発明の方法は、本明細書において開示される適切な器官または組織のホーミング分子を、単独かあるいは所望の成分と連結してかのいずれかで用いて、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸の病状を診断または処置するために用いられ得る。
【０１２６】
器官または組織のホーミング分子は、例えば、選択された器官または組織に対して、治療剤または検出剤を標的化するために有用である。さらに、器官または組織のホーミング分子は、サンプル中の標的分子の存在を同定するために用いられ得る。本明細書中において用いる場合、用語「サンプル」は、身体から単離される細胞、組織、器官またはその部分を意味する最も広い意味で用いられる。サンプルは、例えば、生検により得られた組織切片もしくは標品もしくは組織培養に置かれるかまたはそれに適応される細胞であり得る。
【０１２７】
所望される場合、サンプルは、例えば、器官または組織のホーミング分子に結合する標的分子を単離するための最初の工程であり得るホモジナイズ（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）により処理され得る。
【０１２８】
本明細書において開示されたように得られる器官ホーミング分子は、ホーミング分子により認識される標的分子（特に細胞表面タンパク質）の存在を同定するために、または標的分子を実質的に単離するために有用で有り得る。従って、本発明は、肺ホーミング分子、皮膚ホーミング分子、膵臓ホーミング分子、網膜ホーミング分子、前立腺ホーミング分子、卵巣ホーミング分子、リンパ節ホーミング分子、副腎ホーミング分子、肝臓ホーミング分子または腸ホーミング分子を選択的に結合する標的分子の同定の方法を提供する。このような方法は、選択された器官または組織（例えば、前立腺）のサンプルを前立腺ホーミング分子に接触する工程、そしてサンプルの成分の選択的結合を検出する工程を包含する。ここで、このような結合は、標的分子の存在を確認する。
【０１２９】
前立腺ホーミングペプチドのような器官または組織のホーミング分子は、タグ（例えばクロマトグラフィーマトリックスのような固体支持体）に連結され得る。次いで、固定された器官ホーミング分子は、特定の標的分子に対して前立腺ホーミング分子の特異的結合を可能にする条件下で、マトリックスを含有するカラムに、前立腺組織の適切に処理されたサンプルを通過させることによりアフィニティークロマトグラフィーに用いられ得る（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，編．Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０），第１８２巻（これは、参考として本明細書において援用されている）を参照のこと；例えば、３５７〜３７９頁を参照のこと）。未結合物質および非特異的結合物質は、取り除かれ得、そして標的分子（前立腺ホーミング分子と複合体を形成する）は、カラムから溶出され、そして実質的に単離された形態で収集される。次いで、実質的に単離された前立腺標的分子は、周知の方法を用いて特徴付けられ得る。器官または組織のホーミング分子はまた、検出可能な因子（例えば、放射性核種、蛍光分子、酵素または標識化ビオチンタグ）に連結され得、そして例えば、標的分子の存在を検出するためにか、またはその単離工程の間に標的分子を追跡するために、サンプルをスクリーニングするために用いられ得る。
【０１３０】
選択された器官または組織の標的分子を同定するために、器官または組織のサンプルを用いることに替えて、選択された器官もしくは組織に由来する培養細胞の抽出物、または培養された内皮細胞の抽出物が、開始物質として用いられ得る。標的分子を含有する細胞の選択は、結合アッセイおよび細胞接着アッセイを用いることにより決定され得る（Ｂａｒｒｙら．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：２９９〜３０５  １９９６（これは参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。標的分子を含有するそれらの細胞は、上記のように、標的分子の単離および同定のための抽出物を調製するために用いられ得る。
【０１３１】
標的分子を発現する適切な細胞株を同定する際に、標的分子は、放射性標識されたアミノ酸を含有する培地中において細胞を増殖させることにより標識され得る。放射性標識化アミノ酸は、標的分子に組み込まれ、従って、これは、精製の間のその同定を容易にする。次いで、標識化細胞は、オクチルグルコシドで抽出され得、そしてこの抽出物は、セファロースのようなマトリックスに結合した膵臓ホーミング分子を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより分画され得る。例えば、ヒト臍静脈内皮細胞から調製された抽出物が、コントロールとして用いられ得る。次いで、精製された標的分子はマイクロ配列決定され得、そして抗体が調製され得る。所望の場合、オリゴヌクレオチドプローブが調製され得、そして標的レセプターをコードするｃＤＮＡクローンを単離するために使用され得る。あるいは、抗レセプター抗体を使用して、発現ライブラリーからｃＤＮＡクローンを単離し得る（Ａｒｇｒａｖｅｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：１１８３−１１９０（１９８７）（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１３２】
標的分子を生化学的に単離することに加えて、標的分子をコードする核酸が、例えば、標的分子を発現するクローンについての膵臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするための化学的プローブとして膵臓ホーミング分子を用いることにより単離され得る。例えば、膵臓ｃＤＮＡライブラリーを発現する細菌は、膜に付着され、溶解され、そして例えば、比色シグナルまたは蛍光シグナルを産生する酵素に結合体化された膵臓ホーミング分子を用いてスクリーニングされ得る。標的分子を発現している細菌性クローンは、同定され、そして標的分子をコードするｃＤＮＡが単離され得る。さらに、ＣＯＳ細胞系のような哺乳動物細胞発現クローニング系が、標的分子を同定するために用いられ得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、発現ベクターにクローニングされ得る膵臓初代細胞由来のｍＲＮＡを用いて調製され得る。次いで、標的分子をコードするｃＤＮＡを発現している細胞は、例えば、プレートに付着する膵臓ホーミングペプチドに対する細胞クローンのパニングにより、プローブとして、膵臓ホーミングペプチドを用いて、選択され得る。あるいは、ファージは、膵臓ホーミングペプチドを提示するために用いられ得、そして、例えば、抗Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてコートされた磁気ビーズに付着され得る。次いで、膵臓ホーミングペプチドに結合する標的分子を発現する細胞が、回収され、そしてレセプターをコードするプラスミドが、単離され得る。回収されたプラスミド調製物はプール中へ分割され得、そしてＣＯＳ細胞トランスフェクションにおいて試験され得る。この手順は、ＣＯＳ細胞が膵臓ホーミングペプチドを結合するのを可能にする単一のプラスミドが得られるまで繰り返され得る。
【０１３３】
本発明はまた、肺内皮に選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子を同定する方法を提供する。この方法は、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１つ以上の分子と接触させる工程；および分子のＭＤＰへの特異的結合を決定する工程を包含し、ここで特異的結合の存在により、肺内皮に選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子として、その分子を同定する。本発明の方法において、膜ジペプチダーゼは、実質的に精製され得、そして例えば、支持体に固定され得る。この膜ジペプチダーゼは、任意の哺乳動物ＭＤＰ（例えば、配列番号４４８を有するヒトＭＤＰ）であり得る。
【０１３４】
本明細書中に記載されるように、このＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）ペプチドは、静脈注射後、マウス肺血管系に選択的に結合し得る（実施例ＩＩＡ）。さらに、実施例ＩＶＢに記載されるように、ＧＦＥ−１（ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ；配列番号１）を選択的に結合する５５ｋＤａの肺細胞表面タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーを用いてラット肺抽出物から単離した。トリプシン処理による消化および質量分析による配列決定は、５５ｋＤａのタンパク質由来の２つのペプチドが、ラット膜ジペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．１３．１９）の一部分に完全に同一であることを明らかにした。さらなる実験が、ラットの肺細胞抽出物のＧＦＥ−１（配列番号１）アフィニティー精製画分が、特異的ＭＤＰ基質Ｇｌｙ−Ｄ−ＰｈｅのＤ−Ｐｈｅへの時間依存的な変換によって示されるように、膜ジペプチダーゼ活性を有することを示した（実施例ＩＶＣおよび図５）。さらに、ＧＦＥ−１ファージ（ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ；配列番号１）の、およびより少ない程度では、ＧＦＥ−２ファージ（ＣＧＦＥＬＥＴＣ；配列番号２）の、膜ジペプチダーゼでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞への結合は、関連しないペプチド配列を有するファージの結合より、有意に高かった（実施例ＩＶＤおよび図６Ｂ）。このことは、膜ジペプチダーゼがＧＦＥ−１（配列番号１）レセプターであることを示す。
【０１３５】
従って、本明細書中で開示されるように、肺メタロプロテアーゼ、膜ジペプチダーゼは、肺内皮に対する分子の選択的ホーミングについてのレセプターとして働く。膜ジペプチダーゼを標的化することによって、肺内皮に選択的にホーミングする分子の例証的な分類は、ＧＦＥモチーフ（例えば、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１））を保有するペプチドの分類である。
【０１３６】
膜ジペプチダーゼ（腎性ジペプチダーゼ、ミクロソームジペプチダーゼ、デヒドロペプチダーゼ−１、またはＭＤＰとしてもまた知られ、そして近年ＥＣ３．４．１３．１９（以前は、ＥＣ３．４．１３．１１）として分類された）は、形質膜グリコシルホスファチジルイノシトール−固定化糖タンパク質である（Ｋｅｙｎａｎら、Ｈｏｏｐｅｒ編、Ｚｉｎｃ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｏｎｄｏｎ、２８５−３０９頁（１９９６）、これは、本明細書中に参考として援用される）。このジンクメタロプロテアーゼ（これは主に、肺および腎臓刷子縁において発現される）は、インビボでは、グルタチオンの腎臓代謝、およびペプチジルロイコトリエンの肺代謝に関与する。さらに、ＭＤＰは、哺乳動物β−ラクタマーゼの唯一公知の例である。ＭＤＰは、ジスルフィド結合ホモダイマーを形成し、これは、起源種に依存して約４８〜５９ｋＤａの範囲の分子量のモノマーを有する（Ｋｅｙｎａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：１２５１１−１２５１７（１９９６）、これは、本明細書中で参考として援用される；また実施例ＩＶＢを参照のこと）。
【０１３７】
膜ジペプチダーゼの発現は、いくつかの組織において検出されているが、主に肺および腎臓において発現される。肝臓、膵臓、小腸および脳由来の全抽出物において低いレベルのＭＤＰ活性の報告が存在しているが、他では、これらの器官において検出可能な活性は見出されていない。マウスにおいて、４つの異なるＭＤＰ  ｍＲＮＡが存在し、そしてそれらは、いくつかの器官において示差的に発現される（Ｈａｂｉｂら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６２７３−１６２８０（１９９６））。ブタＭＤＰ  Ｎ結合グリコシル化の性質および程度の器官特異的差異もまた、報告されている（Ｈｏｏｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２４：１５１−１５７（１９９７））。
【０１３８】
腎臓において、ＭＤＰ発現は、近位細管の刷子縁領域における上皮細胞に制限される。肺において、ＭＤＰ発現は、内皮細胞ならびに誘導気道、肺胞管、毛細管、ならびに肺胞および終末細気管支の基底膜を含む、多くの細胞型において検出されている（Ｈａｂｉｂら、前出、１９９６）；Ｉｎａｍｕｒａら、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ５０：８５−９２（１９９４））。ＭＤＰ発現はまた、ヒト気管における粘膜下微細血管の内皮細胞において観察されている（Ｙａｍａｙａら、Ｒｅｓｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１：１０１−１０９（１９９８）。ＭＤＰ活性のレベルは、肺において最も高い（Ｈｉｒｏｔａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６０：５２１−５２５（１９８６）；Ｈａｂｉｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４８５９−４８６３（１９９８））。この発現パターンは、ＧＦＥ−１（配列番号１）のような分子の強力な肺の分子のホーミングと相関する。
【０１３９】
本明細書中で使用される、用語「膜ジペプチダーゼ」とは、「ＭＤＰ」と同義であり、そして近年ＥＣ  ３．４．１３．１９（以前はＥＣ  ３．４．１３．１１）として分類され、そして腎性もしくはミクロソームのジペプチダーゼまたはデヒドロペプチダーゼ−１としてもまた公知である酵素をいう。この用語、膜ジペプチダーゼは、任意の哺乳動物の膜ジぺプチダーゼ（例えば、ヒト、ブタ、マウス、ラットおよびウサギのホモログを含み、これらは、図９中の配列番号４４８〜４５２に示されるアミノ酸配列を有する）、ならびにこれらのポリペプチドの１つに対して実質的なアミノ酸配列類似性を有する関連ポリペプチドを含む。このような関連ポリペプチドは、他のジンクメタロプロテアーゼまたはペプチダーゼ（例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）に対してよりも、配列番号４４８、４４９、４５０、４５１、または４５２に対してより大きな配列類似性を示し、そして、ＭＤＰの代替的にスプライスされた形態および図９に示されるアミノ酸配列のアイソタイプ改変体を含む。従って、用語ＭＤＰは、異なる哺乳動物種から得られた相同なポリペプチド、ならびに他の改変体および一般に配列番号４４８、４４９、４５０、４５１または４５２の約６５％より大きな、好ましくは、約７０％より大きな、およびより好ましくは約８０％または９０％より大きな、アミノ酸同一性を有する関連ポリペプチドを含む。本発明の方法は、好ましくは、ヒト膜ジペプチダーゼ（配列番号４４８）を使用する。
【０１４０】
膜ジペプチダーゼポリペプチドに関して本明細書中で使用される、用語「実質的に精製される」とは、ポリぺプチドが、混入脂質、核酸、非関連ポリペプチドおよび細胞中で膜ジペプチダーゼと通常結合しない他の細胞物質を比較的含まない形態であることを、意味する。
【０１４１】
ＭＤＰ結合ホーミング分子を同定するための本発明の方法は、インビボまたはインビトロで実施され得、そして膜ジペプチダーゼは多くの供給源から得られ得る。膜ジペプチダーゼの供給源としては、細胞全体あるいは内因性ＭＤＰまたは外因性ＭＤＰを含む細胞抽出物が挙げられる。ＭＤＰのさらなる供給源は、部分的に精製された細胞抽出物；生化学的に精製された酵素（例えば、アフィニティー精製されたＭＤＰ）；組換えポリペプチド；およびトランスフェクトされた細胞株を含む。
【０１４２】
アフィニティークロマトグラフィーは、本発明の方法における使用のための膜ジペプチダーゼを精製または部分的に精製するために特に有用であり得る。例えば、膜ジペプチダーゼは、実施例ＩＶＣにおいてマウスおよびラット膜ジペプチダーゼについて記載されるように、固定化ＧＦＥ−１ペプチド（配列番号１）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって肺細胞抽出物から精製され得る。同様に、膜ジペプチダーゼは、他の固定化リガンド（例えば、シラスタチン）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって得られ得る。例えば、膜ジペプチダーゼは、Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５７：３６１−３６７（１９８９）；およびＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１４５８６−１４５９０（１９８４）（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、シラスタチン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーに結合した細菌性ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）による、ＭＤＰの選択的放出を通じて、２つの工程で効率的に精製され得る。
【０１４３】
組換え膜ジペプチダーゼもまた、本発明の方法において有用であり得る。種々のＭＤＰホモログのアミノ酸配列および核酸配列は、当該分野において公知である。図９に示される膜ジペプチダーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースからかまたは文献（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号第Ｄ１３１３９号および同第２８５１５０号；Ａｄａｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３９９２−３９９５（１９９０）；Ｒａｃｈｅｄら、１９９０；Ｋｅｙｎａｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．３４９：５０−５４（１９９４）；Ｓａｔｏｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
１１６３：２３４−２４２（１９９３）；Ａｄａｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３２：３１１−３１４（１９９２）；Ａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２２６：３３７−３４０（１９４）；ならびにＩｇａｒａｓｈｉおよびＫａｒｎｉｓｋｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：７１−７８（１９９１）、これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）から得られ得る。新規な膜ジペプチダーゼｃＤＮＡは、分子生物学の分野において周知の方法を使用して、ヌクレオチド配列を、プローブまたはプライマーとして用いて、さらなる哺乳動物種から単離され得る（Ｉｎｎｉｓら（編）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９０）；Ｅｒｌｉｃｈ、前出、１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１９８９、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。当業者は、ＭＤＰのコード核酸の発現および、後の組換えＭＤＰポリペプチドの単離のための種々の方法を知っている。
【０１４４】
肺内皮へ選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子を同定するための本発明の方法において、分子のＭＤＰへの特異的結合は、その分子を、肺内皮に選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子として同定する。分子およびＭＤＰに関して本明細書中で使用される用語「特異的結合」とは、その分子が、非特異的相互作用とは測定可能に異なるＭＤＰの親和性を有することを意味する。特異的結合は、例えば、コントロール分子の結合と比較した分子の結合の決定によって、測定され得る。これは、一般的に、結合活性を有さない類似した構造の分子、例えば、ＧＦＥモチーフを欠失した類似した大きさのぺプチドである。この場合、特異的結合は、分子がコントロール分子より、膜ジペプチダーゼに対して測定可能により高い親和性を有するかどうかが示される。結合の特異性はまた、例えば、ＭＤＰに結合することが公知であるコントロール分子（例えば、ＧＦＥモチーフを含むペプチド）との競合によって決定され得る。
【０１４５】
本明細書中で使用される用語、特異的結合とは、低い親和性特異的結合および高い親和性特異的結合の両方を含む。特異的結合は、例えば、膜ジペプチダーゼについて約１０-4Ｍ〜約１０-7ＭのＫdを有する低親和性ＭＤＰ結合ホーミング分子によって提示され得る。特異的結合はまた、高い親和性ＭＤＰ結合ホーミング分子（例えば、膜ジペプチダーゼについて少なくとも約１０-7Ｍ、少なくとも約１０-8Ｍ、少なくとも約１０-9Ｍ、少なくとも約１０-10Ｍ、または少なくとも約１０-11Ｍもしくは１０-12Ｍまたはそれより大きいＫdを有するＭＤＰ結合ホーミング分子）によって提示され得る。配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）（ここでＸ1およびＸ2各々が独立して選択された１〜１０のアミノ酸である）を含むＭＤＰ結合ホーミングペプチドは、例えば、膜ジペプチダーゼについて約２×１０-5Ｍ〜１０-7ＭのＫd、例えば約１０-6〜１０-7ＭのＫdを有し得る。肺内皮に選択的にホーミングする、低親和性ＭＤＰ結合ホーミング分子および高親和性ＭＤＰ結合ホーミング分子の両方が、以下にさらに記載されるように、被験体において部分を肺内皮に選択的に指向するのに有用であり得る。
【０１４６】
種々の当該分野で公知の技術を用いて、本発明の方法に従う膜ジペプチダーゼへの分子の特異的結合を決定し得る。特異的結合に適切な条件が、例えば実施例ＩＶＢにおいて記載される。特異的結合はまた、ＭＤＰ発現欠損細胞を、例えば、実施例ＩＶＤに記載されるように、ＭＤＰを用いてトランスフェクトすることによって決定され得る。この場合、特異的結合は、一部には、分子の非トランスフェクト細胞への結合よりもＭＤＰトランスフェクト細胞への結合が有意に高いことによって、決定される。
【０１４７】
本発明は、ＭＤＰ結合分子が他の組織（例えば、腎臓）におけるＭＤＰ発現にも関わらず、肺血管系に特異的にホーミングするという、驚くべき発見に関する。本明細書中に開示されるように、ＭＤＰ結合ＧＦＥ−１（配列番号１）保有ファージのマウスの循環への注射によって、隣接細胞上でいくらかの拡散染色を伴って、ファージの肺微小血管系への迅速な結合を生じた。同じ結果が、ＧＦＥ−１（配列番号１）保有ファージのラット循環への注射によって得られた。特に、例えば、ＭＤＰ結合ＧＦＥ−１ファージは、腎近位細管の刷子縁（高いレベルのＭＤＰを発現する）に結合しなかった。これらの結果は、肺内皮細胞の管腔表面上のＭＤＰの発現が、ＭＤＰ結合ファージが循環から肺内皮へホーミングするのを媒介し得、一方、ＭＤＰ結合ファージは、腎臓ＭＤＰに接近し得ずかつホーミングし得ないことを示す。従って、ＭＤＰは、分子が他の内皮細胞に優先して、肺内皮に選択的ホーミングすることを媒介する。
【０１４８】
ＧＥＦ−１（配列番号１）保有ファージの肺血管系への選択的ホーミングは、ファージのような部分が、ＭＤＰ結合ホーミング分子に結合され得、それによって肺内皮へ選択的に指向され得ることをさらに示す。従って、本発明は、肺の障害の処置のために肺内皮に対して、部分（例えば、ファージ、遺伝子治療ベクター、または抗生物質）を選択的に標的化する方法を提供する。
【０１４９】
被験体における部分を肺内皮に選択的に指向させるための本発明の方法は、肺内皮へ選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子に連結された部分を含む結合体を被験体に投与し、それによって、その部分が被験体中の肺内皮に選択的に指向される工程を含む。ＭＤＰ結合ホーミング分子は、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１つ以上の分子と接触させること；および分子のＭＤＰとの特異的結合を決定することによって同定され、ここで、特異的結合の存在が、その分子を肺内皮へ選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子として同定する。本発明の方法は、例えば、肺炎；ぜん息；気腫；呼吸器感染；慢性気管支炎；慢性間質性肺疾患；肺癌；胸膜炎または嚢胞性線維症に罹患している被験体の肺への遺伝子または薬物を標的化することのために有用であり得る。所望される場合、本発明の方法は、予防的に、例えば部分を、肺障害の家族歴を有する個体、または例えば、肺感染に感受性の個体の肺内皮に選択的に指向させるように、使用され得る。
【０１５０】
肺内皮に選択的に指向されるべき部分は、物理的、化学的または生物学的材料（例えば、ウイルス、ウイルス遺伝子治療ベクター、細胞、リポソーム、マイクロカプセル、マイクロポンプまたは他のチャンバー化マイクロデバイス）であり得、これらは、例えば薬物送達システムとして使用され得る。このようなマイクロデバイスは、一般に、生物学的に不活性であり、そして所望される場合、これらは生分解性または排出可能であり得る。薬剤を含み得る種々の部分（マイクロカプセルを含む）、および部分またはチャンバー化マイクロデバイスを有機分子に連結させるための方法は、当該分野において周知であり、そして本明細書上記に記載のように市販されている。治療用結合体を生成するために、肺内皮に選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子に連結され得る例示的な部分は、治療的抗菌性バクテリオファージ；アンピシリンのような抗生物質；およびリバビリンのような抗ウイルス剤を含む（上記を参照のこと）。
【０１５１】
本発明の方法に従って肺内皮に選択的に指向される部分は、例えば、治療的バクテリオファージ（「ファージ」）であり得る。ファージは、無毒であることが示されており（Ｏｃｈｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５０：２５５９−２５６８（１９７１）、これは本明細書中に参考として援用される）、そしてファージ療法の使用は、細菌感染（例えば、抗生物質耐性感染）の処置について当該分野で公知である（ＢａｒｒｏｗおよびＳｏｏｔｈｉｌｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：２６８−２７１（１９９７）；Ｓｌｏｐｅｋら、Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．３５：５５３−５６１（１９８７）；およびＭｅｒｒｉｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ９３：３１８８−３１９２（１９９６）、これらの各々は本明細書中に参考として援用される；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａもまた参照のこと）。例えば、抗生物質療法で首尾よく処置されなかった大部分である一連の５５０人の患者において、ファージ療法は、種々の感染（気道化膿性感染および気管支肺炎（ｂｒｏｎｃｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（Ｓｌｏｐｅｋら、前出、１９８７）を含む）を軽減するにおいて７５〜１００％の成功を生じた。ファージ療法は、院内感染および多剤耐性感染を処置するにおいて特に有用であり得る。
【０１５２】
研究は、予防および処置の両方ともが、細菌に接種するよりも少ないファージを使用して可能であることを示した。この研究は、ファージがインビボで増殖することを示す。従って、ファージ療法は、ファージがインビボで複製する能力のために、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、およびスルファフラゾール）による従来の処置より有効であり得る。所望であれば、ＭＤＰ結合ホーミング分子を含有するファージ結合体での処置が、抗生物質薬物療法と組み合わせられ得る。
【０１５３】
好ましくは、肺内皮に選択的に指向されるファージ部分は、溶解性ファージである。このようなファージは、肺内皮に選択的に指向される結合体を生成するためにＭＤＰ結合ホーミングペプチド（例えば、ＧＦＥ−１（配列番号１））をコードするように、標準的な遺伝子技術によって容易に改変され得る。本発明の方法において有用なファージは、例えば、Ｔ４関連ファージ（これはまた、「Ｔ偶数ファージファミリー」のメンバーとして公知である）を含む。当業者は、処置される感染に特徴的な細菌に対するレセプター特異性を有するファージ部分（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対するレセプター特異性を有するファージ）が、選択されることを理解する。所望であれば、病原性細菌は、分類化され得、そしてファージ感受性についてモニタリングされ得る。耐性細菌の処置のために、ファージ結合体は、所望であれば、種々のタイプの細菌に対する異なるレセプター特異性を有するファージの混合物を含み得る。
【０１５４】
ファージ／ＭＤＰ結合ホーミング結合体は、被験体に、例えば、静脈内で投与され得る。このような結合体はまた、例えば、各食事の一時間半前に、１０ｍｌ滅菌ファージ溶解物として経口投与され得る。胃液が、Ｖｉｃｈｙ水、重曹、またはゼラチンによって中和される。経口投与後、ファージ／ＭＤＰ結合ホーミング結合体は、血液に接近し、続いて肺内皮に選択的に指向される。必要であれば、投与は、数週間または数ヶ月の期間にわたって毎日繰り返され得る。ファージ結合体の適当な用量は、当業者によって容易に決定され得、そして一般に、約１００〜約１０10プラーク形成単位（ｐｆｕ）、通常、約１００〜１０6ｐｆｕの範囲内である。
【０１５５】
遺伝子治療のために肺内皮に選択的に指向される部分は、遺伝子治療ベクターであり得る。本明細書中で使用される用語「遺伝子治療ベクター」は、宿主細胞に送達されたとき、インビボでその宿主細胞においてコードされる遺伝子産物を一過的または永続的に発現する核酸成分を含有するベクターを意味する。
【０１５６】
ＭＤＰ結合ホーミング分子を用いて肺内皮に選択的に指向され得る種々の遺伝子治療ベクターもまた、当該分野で公知である。このようなベクターには、ウイルスおよび非ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスベクター、およびリポソームプラスミドベクターが挙げられる（Ｃｈａｎｇ、Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ  （１９９５）、その各々は、本明細書中に参考として援用される）。レトロウイルスベクターおよびＡＡＶベクターは、例えば、永続的な発現のために有用であり得、一方、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびリポソーム−プラスミドベクターは、一般に、一過性発現を与える。例えば、アデノウイルスベクターは、肺において、嚢胞性線維芽症膜貫通レセプター（ＣＦＴＲ）および組換えα１−アンチトリプシンを発現させるために使用されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３  （１９９２）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１  （１９９１）、これらの各々は、本明細書中に参考として援用されている）。リポソームＤＮＡ複合体もまた、肺への遺伝子移入を生じさせるために使用されている（例えば、Ｚｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２０９（１９９３）（これは、本明細書中に参考として援用されている）を参照のこと）。ファージベクターもまた、所望の核酸をインビボで発現させるために有用であり得る（例えば、Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４４８：４５０−４６２（１９９９）；Ｉｖａｎｅｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４４８：４６３−４７２（１９９９）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用されている）を参照のこと）。
【０１５７】
ＭＤＰ結合ホーミング分子（例えばＧＦＥ−１（配列番号１））を含有する結合体を用いて肺内皮に部分を選択的に指向させるための、本発明の方法は、種々の肺障害の治療的取り扱いにおいて有用であり得る。例えば、サイトカインをコードする遺伝子治療ベクターを肺内皮に選択的に指向させることにより、本発明の方法は、免疫療法のために有用であり得る。種々のサイトカインまたはケモカインは、本発明の方法に従って投与された場合、免疫応答（例えば、抗癌免疫応答もしくは抗ウイルス免疫応答）の刺激において有用であり得る。このようなサイトカインまたはケモカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、またはＤＣ−ＣＫ１（Ｐａｒｄｏｌｌ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：３９９−４１５（１９９５）；Ｈｕｎｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  １４：３１４−３２１（１９９３）；Ｃｈａｎｇ、前出、１９９５、これらの各々は、本明細書中に参考として援用されている）を含む。本発明の方法は、循環中のサイトカインの半減期が短いことおよびそれらの肺への標的化がないことに起因して、組換えサイトカインの投与よりも有効であり得る。
【０１５８】
上記で考察したように、本発明の方法は、ファージ部分もしくは抗生物質薬物（例えば、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、もしくはスルファフラゾール）を肺内皮へ選択的に指向させることにより肺感染を治療するために有用であり得る。例えば、本発明の方法は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）または嚢胞性線維症に続発性の感染を処置するために有用であり得る。
【０１５９】
肺内皮に部分を選択的に指向させるための、本発明の方法はまた、肺障害（例えば、α１−アンチトリプシン欠損および嚢胞性線維症）の置換遺伝子治療のために使用され得る（ＡｌｔｏｎおよびＧｅｄｄｅｓ、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５８：３８−４０（１９９７）；Ｗｏｏｄ、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２０４：１−１０（１９９７）、これらの各々は、本明細書中に参考として援用されている）。野生型α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）および嚢胞性線維症膜貫通レセプター（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子が、単離されており（Ｒｉｏｒｄａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：１０６６−１０７３（１９８９）；Ｒｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４７：３５８：６３（１９９０）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）、これらの各々は、本明細書中に参考として援用されている）、そしてＭＤＰ結合ホーミング分子（例えば、ＧＦＥ−１（配列番号１））に連結された遺伝子治療ベクターにおいて肺に選択的に移入され得る。
【０１６０】
１つの実施態様では、本発明は、部分を肺内皮に選択的に指向させる方法であって、ここでＭＤＰ結合ホーミング分子が配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）（ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、１〜１０の独立して選択されたアミノ酸である）を含むペプチドである、方法を提供する。このようなＭＤＰ結合ホーミングペプチドは、例えば、配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）またはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）を含み得る。
【０１６１】
別の実施態様では、本発明は、部分を肺内皮に選択的に指向するための方法であって、ここでＭＤＰ結合ホーミング分子が以下の構造１を含む、方法を提供する：
【０１６２】
【化４】
2010031038.tif 000007
ここでＲ2およびＲ3はそれぞれ、３〜１０炭素原子および１〜１５炭素原子の範囲の炭化水素ラジカルであり；これらＲ2またはＲ3炭化水素鎖のいずれか一方で、１〜６の水素が、ハロゲンで置換され得るか、または非末端メチレンが、酸素または硫黄（後者の酸化型を含む）で置換され得；さらに、Ｒ3中の末端水素もまた、ヒドロキシルまたはチオール（これはアシル化またはカルバモイル化され得る）で置換され得；あるいは、水素が、アミノ（これは、アシルアミノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、もしくはアルキルにおけるように誘導体化され得る）または置換アミノ基（第４級窒素基（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含む）で置換され得る；あるいは、酸基（例えば、カルボン酸基、ホスホン酸基、またはスルホン酸基）またはそれらのエステルもしくはアミド、またはシアノによる置換が存在し得る；あるいは、それらの組み合わせ（例えば、末端アミノ酸基を含む）；そしてＲ1は、水素もしくは低級アルキル（Ｃ1-6）もしくはジアルキルアミノアルキル、または薬学的に受容可能なカチオンである。このようなＭＤＰ結合ホーミング分子は、例えば、７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸（ｈｅｐｔｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（シラスタチンとしても公知であ
る）であり得る。
【０１６３】
ＭＤＰ結合ホーミング分子は、例えば、Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭素が第三級であり得ないという限定を伴う、分枝アルキルまたはシクロアルキルである、構造１を有する化合物であり得る。
【０１６４】
ＭＤＰ結合ホーミング分子はまた、例えば、Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭素が第三級であり得ないという限定を伴う、分枝アルキルまたはシクロアルキルであり、そしてＲ3が、ｎ−アルキル（１〜９炭素）、または第４級窒素、アミン誘導体、もしくはアミノ酸誘導基である末端置換基を有するｎ−アルキル（１〜９炭素）である、構造１を有する化合物であり得る。ＭＤＰ結合ホーミング分子は、例えば、例えば、Ｒ2が、２，２−ジメチルシクロプロピルまたは２，２−ジクロロシクロプロピルであり、そしてＲ3が、末端置換基を有さない３〜７炭素原子の炭化水素鎖であるか、またはトリメチルアンモニウム、アミジノ、グアニジノもしくは２−アミノ２−カルボエチルチオである末端置換基を有する３〜７炭素原子の炭化水素鎖である、構造１を有する化合物であり得る。
【０１６５】
本発明において有用である、構造１を有する例示のＭＤＰ−結合ホーミング分子には、以下が含まれる：Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−ウレイド−２−オクテン酸；Ｚ−８−（１−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸（ラセミ型および右旋性型）；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸；および６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘキセン酸。
【０１６６】
上述のように、肺に処置を標的化するための、本発明の方法は、ＭＤＰ結合ホーミング分子を用いて実施され得、このＭＤＰ結合ホーミング分子は、以下の構造１を有する、Ｚ−２−アシルアミノ−３−モノ置換プロペネートである：
【０１６７】
【化５】
2010031038.tif 000008
ここでＲ2およびＲ3はそれぞれ、３〜１０炭素原子および１〜１５炭素原子の範囲の炭化水素ラジカルである。これら炭化水素ラジカルＲ2およびＲ3のいずれか一方で、６までの水素が、ハロゲンで置換され得るか、または非末端メチレンが、酸素または硫黄（後者の酸化型を含む）で置換され得る。
【０１６８】
Ｒ3中の末端水素もまた、ヒドロキシル基またはチオール基（これはアシル化（例えば、１〜８炭素原子のアルカノイル酸を有するように）またはカルバモイル化（アルキルおよびジアルキルカルバメート誘導体を含む）され得る）で置換され得；あるいは、水素が、アミノ基（これは、アシルアミノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、またはアルキルもしくは置換アルキルアミノ基（第４級窒素基を含む）におけるように誘導体化され得る）で置換され得る；あるいは、酸基（例えば、カルボン酸基、ホスホン酸基、またはスルホン酸基）またはそれらのエステルもしくはアミド、ならびにシアノによる置換が存在し得る；あるいは、それらの組み合わせ（例えば、末端アミノ酸基を含む）。
【０１６９】
構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子において、Ｒ2は、好ましくは、カルボニルに隣接した炭素が第三級であり得ないという限定を伴う、分枝アルキルまたはシクロアルキルラジカル（Ｃ3-10）である。Ｒ3が、１〜４炭素原子の直鎖低級アルキルである場合、Ｒ2は、フェニルまたは１〜４炭素原子の直鎖低級アルキルではあり得ない。Ｒ1は、水素、低級アルキル（Ｃ1−Ｃ6）またはジアルキルアミノアルキル（例えば、−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（Ｃ2Ｈ5）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）Ｎ（ＣＨ3）2）である。
【０１７０】
上記構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子は、不斉型を有し得る。ラセミＺ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸が、分離されている。活性は、右旋性異性体に存在する。これはＳ−配置を有する。
【０１７１】
構造１を有する化合物のＲ2の定義において、以下の部分基が含まれる：
−Ｒ4
ここで、Ｒ4は、３〜１０炭素原子の直鎖、分枝、または環状の炭化水素ラジカルであり、これは、Ｒ2の定義において上述したように置換され得る；
−Ｒ5Ｒ6
ここで、Ｒ5は、３〜６炭素原子のシクロアルキルであり、そしてＲ6は、結合してシクロアルキル基上に別の環を形成し得る１または２のいずれかのアルキル置換基であるか、あるいは、Ｒ5およびＲ6は、Ｒ2の定義において上述したように置換され得る；そして
−Ｒ7Ｒ8
ここで、Ｒ7は、１〜３炭素原子のアルキレン基であり、そしてＲ8は、３〜６炭素原子のシクロアルキルであり、この炭素原子は、Ｒ2およびＲ3の定義において上述したように置換され得る。
【０１７２】
構造１におけるＲ2の定義内で特に好ましい置換基は、２，２−ジメチルシクロプロピル基および２，２−ジクロロシクロプロピル基を含む。
【０１７３】
構造１におけるＲ3の定義内で、化合物の特に好ましい群は、ｎ−アルキル（１〜９炭素）、および４級窒素、アミン誘導体、またはアミノ酸由来基である、末端置換基を有するｎ−アルキル（１〜９炭素）を含む。
【０１７４】
用語「４級窒素」は、構造１に関して、正に帯電した４置換型（ｔｅｔｒａｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）窒素または複素環式芳香族の窒素を意味するために本明細書中で使用される。これは１〜７個の炭素原子を有する炭化水素基（それらは同じまたは異なり得る）で置換された、アンモニウム部分を意味する。
【０１７５】
構造１に関して本明細書中で使用されるように、用語「アミノ誘導体」とは、そのアミノ誘導体、アシルアミノ誘導体、ウレイド誘導体、アミジノ誘導体、グアニジノ誘導体およびアルキル（１〜７個の炭素原子）誘導体のような基を意味する。
【０１７６】
構造１に関して本明細書中で使用されるように、用語「アミノ酸由来基」とは、システイニル（−ＳＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ）またはサルコシル（−Ｎ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＯＯＨ）のような部分を意味し、ここで、公知のアミノ酸Ｏ、ＮまたはＳに結合する水素は置換される。
【０１７７】
構造１を有する特に好ましいＭＤＰ−結合ホーミング分子は、Ｒ2が２，２−ジメチルシクロプロピルまたはジクロロシクロプロピルであり、かつＲ3が末端置換基を有さない３〜７個の炭素原子の炭化水素鎖であるか、あるいはトリメチルアンモニウム、アミジノ、グアニジノ、または２−アミノ−２−カルボキシエチルチオである末端置換基を有する３〜７個の炭素原子の炭化水素鎖である、ホーミング分子である。
【０１７８】
本発明において有用な模範的なＭＤＰ−結合ホーミング分子は、以下を含む；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシアミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−ホルムアミジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−ウレイド−２−オクテン酸；Ｚ−８−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸（ラセミ型および右旋回型）；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸；および６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘキセン酸。
【０１７９】
構造１を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子を調製するための方法は、本明細書中に開示され、そして当該分野で公知である。このようなＭＤＰ−結合ホーミング分子を調製するためのいくつかの方法は、実施例ＶＩに示される（また、Ｋａｈａｎらに対する米国特許第４，６１６，０３８号（本明細書中で参考として援用される）も参照のこと）。
【０１８０】
当該分野で公知のさらなるＭＤＰ−結合ホーミング分子もまた、本発明の方法に従って、肺内皮に対して選択的に遺伝子または医薬を標的にするために使用され得る。このようなＭＤＰ−結合ホーミング分子は、以下の構造２：
【０１８１】
【化６】
2010031038.tif 000009
を含む、置換型２−アルケン酸（ここで、ｎは３〜５までの整数であり、かつＹは複素環式基またはフェニル基であり、これは置換されてもよく、置換されなくてもよい）、ならびに低級アルキル（Ｃ1〜Ｃ6）エステルおよびその薬学的に受容可能な塩を含む。
【０１８２】
構造２に関して本明細書中で使用されるように、用語「複素環式」とは、ピリジル、ピリミジニル、テトラゾリル、イミダゾリル、チアゾリニルなどを意味する。このような複素環式環およびフェニル環は、置換されなくてもよく、あるいはヒドロキシル、オキソ、カルボニル、またはメチルで置換されてもよい。構造２におけるＹ基としては、例えば、２−ピリジニル；４−ピリジニル；３−ヒドロキシ−２−ピリジニル；３−カルボキシ−２−ピリジニル；５−カルボキシ−２−ピリジニル；２−カルボキシフェニル；１−メチル−１，２，３，４−テトラゾール−５−イル；および４−カルボキシ−６−ヒドロキシ−２−ピリミジニルが挙げられる。
【０１８３】
構造２を有する置換型２−アルケン酸ＭＤＰ−結合ホーミング分子のシクロプロピル中心の立体配置は、好ましくは、Ｓ（＋）であるが、化合物のＲ，Ｓ（＋／−）ラセミ混合物もまた、本発明の方法において使用され得る。
【０１８４】
このクラスの特に活性なＭＤＰ−結合ホーミング分子は、ｎが４であり、かつＹが３−カルボキシ−２−ピリジルまたは３−ヒドロキシ−２−ピリジル（各々Ｓ形態の）である、ホーミング分子である。構造２を有する模範的なＭＤＰ−結合ホーミング分子は、以下を含む：Ｚ−７−（３−ヒドロキシ−２−ピリジルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシアミド）−２−ヘプテン酸およびＺ−（５−カルボキシ−２−ピリジルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシアミド）−２−ヘプテン酸。
【０１８５】
構造２を有するＭＤＰ結合ホーミング分子、ならびに種々の薬学的に受容可能な誘導体（例えば、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩またはアミン塩など（これらもまた本発明において有用である））は、慣用的な方法を使用して当業者により調製され得る。構造２を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子は、例えば、Ａｓｈｔｏｎらに対する米国特許第４，４０６，９０２号（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載のように、例えば、ブロモアルケン酸を適切なメルカプタンであるＹＳＨと、周囲温度で炭酸水素ナトリウム存在下の水中で縮合することにより調製され得る。
【０１８６】
本発明において有用であるＭＤＰ−結合ホーミング分子はまた、以下の構造３：
【０１８７】
【化７】
2010031038.tif 000010
または以下の構造４：
【０１８８】
【化８】
2010031038.tif 000011
を有するホスフィン酸であり得、
ここで：
Ｒ1は、
（ａ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝の非置換型アルキル；
（ｂ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝の置換型アルキル；
（ｃ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝のモノアルケニル；
（ｄ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝のアルキニル；
（ｅ）Ｃ7〜Ｃ20のアラルキルであって、ここで、そのアルキル鎖が直鎖または分枝のＣ1〜Ｃ8であり、かつそのアリール部分がＣ6〜Ｃ12である、アラルキル；
（ｆ）Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル；
（ｇ）Ｃ4〜Ｃ10シクロアルキルアルキル（構造４に対してのみ）；
であって、ここで、（ａ）を除いて、Ｒ1についての上記の価が、以下：Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシ、Ｃ6〜Ｃ12のアリールオキシ、Ｃ1〜Ｃ4のアルキルチオ、Ｃ6〜Ｃ12のアリールチオ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキルオキシ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキルチオ、Ｃ7〜Ｃ10のアラルキルオキシ、Ｃ7〜Ｃ16のアラルキルチオの１以上のものにより置換され得；
Ｒ2は、
（ａ）ＨまたはＣ1〜Ｃ12の直鎖または分枝のアルキル；
（ｂ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝のモノアルケニル；
（ｃ）Ｃ7〜Ｃ20のアラルキルであって、ここで、そのアルキル鎖が直鎖または分枝のＣ1〜Ｃ8であり、かつそのアリール部分がＣ6〜Ｃ12である、アラルキル；
（ｄ）複素環式アルキルであって、ここで、そのアルキル鎖が直鎖または分枝のＣ1〜Ｃ8であり、かつその複素環部分は５〜６員の、必要に応じて、ベンゼン環と融合される完全芳香族であり、以下：Ｏ、ＮまたはＳのヘテロ原子の１〜２個を含む、複素環式アルキル；
（ｅ）Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル；
（ｆ）Ｃ4〜Ｃ10シクロアルキルアルキル；
であって、ここで、Ｒ2についての上記の価が、以下：ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシカルボニル、Ｃ7〜Ｃ16のアリールアルコキシカルボニル、Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル、Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシ、Ｃ6〜Ｃ12のアリールオキシ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキルオキシ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキルチオ、アミノ、Ｃ1〜Ｃ8のモノ−またはジ−アルキルアミノ、チオ、Ｃ1〜Ｃ4のアルキルチオ、Ｃ6〜Ｃ12のアリールチオ、Ｃ7〜Ｃ16のアラルキルチオ、またはラジカル−Ｓ−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨに示す１以上のものにより置換され得；
Ｒ5は、
（ａ）ＨまたはＣ1〜Ｃ12の直鎖または分枝のアルキル；
（ｂ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝のモノアルケニル；
（ｃ）Ｃ7〜Ｃ20のアラルキルであって、ここで、そのアルキル鎖が直鎖または分枝のＣ1〜Ｃ8であり、かつそのアリール部分がＣ6〜Ｃ12である、アラルキル；
（ｄ）複素環式アルキルであって、ここで、そのアルキル鎖が直鎖または分枝のＣ1〜Ｃ8であり、かつその複素環部分は５〜６員の、必要に応じて、ベンゼン環と融合される完全芳香族であり、以下：Ｏ、ＮまたはＳのヘテロ原子の１〜２個を含む、複素環式アルキル；
（ｅ）Ｃ4〜Ｃ10シクロアルキルアルキル；
（ｆ）Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル；
であって、ここで、Ｒ5についての上記の価が、以下：ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシカルボニル、Ｃ7〜Ｃ16のアリールアルコキシカルボニル、Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル、Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシ、Ｃ6〜Ｃ12のアリールオキシ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキルオキシ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキルチオ、アミノ、Ｃ1〜Ｃ8のモノ−またはジ−アルキルアミノ、チオ、Ｃ1〜Ｃ4のアルキルチオ、Ｃ6〜Ｃ12のアリールチオ、Ｃ7〜Ｃ16のアラルキルチオ、またはラジカル−Ｓ−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨに示す１以上のものにより置換され得る；
そして、その構造３および４のＭＤＰ−結合立体異性体ならびにラセミ化合物を含む、ホスフィン酸であり得る。
【０１８９】
構造３または４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子において、（ａ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝の非置換型アルキルについてのＲ1の価は、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、イソ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシルなどを含む。この系列においては、ｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルが好ましい。
【０１９０】
構造３または４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子において、（ｂ）Ｃ1〜Ｃ12の直鎖または分枝の置換型アルキルについてのＲ1の価は、上記に定義された置換基により置換された、Ｒ1（ａ）についての上記の価を含み、これは以下の好ましい置換基を含む：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオ、シクロペンチルオキシ、シクロペンチルチオ、シクロプロピルチオ、ベンジルチオ、２−フェネチルチオ、２−フェネチルチオなど。
【０１９１】
構造３または４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子において、（ｅ）Ｃ2〜Ｃ2の直鎖または分枝のモノアルキルについてのＲ1の価は、エテニル、プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、２−メチル−２−ブテニルなどを含む。
【０１９２】
構造３または４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子において、（ｄ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝のアルキニルについてのＲ1の価は、エチニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、２−メチル−３−ペンチニルなどを含む。
【０１９３】
（ｄ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝のアルキニルについてのＲ1の価は、エチニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、２−メチル−３−ペンチニルなどを含む。
【０１９４】
（ｅ）Ｃ7〜Ｃ20のアラルキルについてのＲ1の価は、ベンジル、２−フェニルエチル、１−フェニルエチル、４−メチルフェニル−メチルなどを含む。この系列においては、ベンジルが好ましい。
【０１９５】
（ｆ）Ｃ4〜Ｃ10のシクロアルキルアルキルについてのＲ1の価は、以下を含む：シクロヘキシルメチル、シクロペンチルメチル、２−シクロヘキシルエチル、２−シクロオクチルエチルなど。この系列においては、シクロペンチルメチルおよびシクロヘキシルメチルが好ましい。
【０１９６】
（ｇ）Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキルについてのＲ1の価は、以下を含む：シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど。この系列においては、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが好ましい。
【０１９７】
好ましいＲ1の置換基の価は、以下を含む：メトキシ、エトキシ、フェノキシ、メチルチオ、エチルチオ、フェニルチオ、ベンジルオキシ、２−フェニルエチルオキシ、ベンジルチオ、２−フェニルエチルチオなど。
【０１９８】
任意の変数により示される、Ｒ2およびＲ5についてのアルキル、アルケニル基の価は、他で示される場合を除いて、直鎖または分枝の、２〜１２炭素原子からのアルキルおよびモノアルケニルおよび鎖状炭化水素ラジカル（例えば、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−ノニル、４，４−ジメチルペンチル、またはビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、５−ヘキセニルなど）を含む。イソプロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘプチルまたは１−ブテニルが好ましい。
【０１９９】
Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキルおよびＣ4〜Ｃ10のシクロアルキルアルキルの価は、以下を含む：シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンチル−メチル、シクロペンチルエチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、シクロプロピルなど。
【０２００】
上記の変数により表されるアラルキル基は、アルキル部分に１〜８の炭素原子を有し、そしてここで示される「アリール」は、フェニル、ナフチル、またはビフェニルを表す。代表的な例としては、ベンジル、フェネチル、４−フェニル−ｎ−ブチル、１−フェニル−ｎ−オクチルなどが挙げられる。
【０２０１】
構造３または４を有する本発明のＭＤＰ−結合ホーミング分子において、芳香族複素環、すなわち「ヘテロアリール」置換基は、同義であり、そして上記に引用されるものは、１〜３個のＯ、ＮまたはＳヘテロ原子、好ましくは、１個のＯまたはＳあるいは１〜３個のＮヘテロ原子を含む、５員または６員の芳香環、例えば、ピリジル、チエニル、フリル、イミダゾリル、およびチアゾリルならびにこれらの任意の二環式基誘導体（ここで、上記の任意の複素環式環は、ベンゼン環（例えば、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンジミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフリル、およびベンゾチエニルのような）に融合される）を表す。
【０２０２】
名前を挙げたＲ2およびＲ5のアルキル鎖ならびにアルケニル鎖上の置換基は、アラルキル基、複素環アルキル基およびヘテロアリール基における芳香環上にも同様に存在し得る。置換部位は、任意の利用可能な部位であり得、そして置換は、１以上の同じかまたは異なる基を含み得る。
【０２０３】
置換基は、以下のものである：ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する）；ヒドロキシ；カルボキシ；Ｃ1〜Ｃ4の直鎖または分枝のアルコキシカルボキシ（例えば、メトキシカルボニルおよびエトキシカルボニル）；Ｃ7〜Ｃ16のアリールアルコキシカルボニル（例えば、ベンジルオキシカルボニル、ｎ−ブチルオキシカルボニル）；Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル（例えば、シクロペンチルおよびシクロヘキシル）；Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシ（例えば、ｔ−ブトキシおよびエトキシ）；Ｃ6〜Ｃ12のアリールオキシ（例えば、ビフェニルオキシ、ベンジルオキシ）；アミノ；モノ−またはジ−Ｃ1〜Ｃ8のジアルキルアミノ（例えば、メチルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、イソへキシルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ、メチル−ｔ−ブチルアミノ、ジ−ｎ−オクチルアミノ；チオ；Ｃ1〜Ｃ4のアルキルチオ（例えば、メチルチオ、エチルチオ）；Ｃ6〜Ｃ12のアリールチオ（例えば、フェニルチオ）；Ｃ7〜Ｃ16のアラルキルチオ（例えば、ベンジルチオ、ナフチル−メチルチオ）；ラジカル−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨおよび−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ（両方とも、好ましくはＬ立体配置）；そしてチオ置換基が存在する場合、Ｒ2またはＲ5は、少なくとも１つのＣ2のアルキル基でなければならない。アリールまたはヘテロアリール基が、置換基に存在する場合、環上の炭素は、以下の１以上のものによりさらに置換され得る：直鎖または分枝のＣ1−Ｃ4アルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル）；トリハロメチル（「ハロ」は、上記と同じ意味を有する）（例えば、トリクロロメチル、トリフルオロメチル）；ニトロ、シアノまたはスルホンアミド。
【０２０４】
好ましいのは、Ｒ1がシクロヘキシルメチル、シクロペンチルメチル（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｈｎｅｔｈｙｌ）、ｎ−ペンチル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル、イソブチルであり、Ｒ2およびＲ3は：Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル；置換しているかまたは置換していない、Ｃ1−Ｃ10直鎖または分枝アルキル；置換しているかまたは置換していない、Ｃ7−Ｃ14アラルキルである化合物である。ここで、これらの基は、ハロ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4直鎖または分枝アルキルアミノ、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、Ｃ5−Ｃ6シクロアルキル、Ｃ6−Ｃ10アリロキシ（ａｒｙｒｏｘｙ）、チオ、Ｃ1−Ｃ4直鎖または分枝アルキルチオ、Ｃ6−Ｃ10アリールチオ、Ｃ7−Ｃ14アラルキルチオ、−Ｓ−（ＣＨ2−）n−ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯ2Ｈで置換され得；ここで、このアリール基環炭素はさらに、直鎖または分枝Ｃ1−Ｃ4アルキルによって置換され得；Ｒ3およびＲ4は、水素、Ｃ1−Ｃ4直鎖または分枝アルキル、例えば、メチル、エチル、またはＣ7−Ｃ14アラルキル（例えば、ベンジル）である。
【０２０５】
構造３または４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子において、炭素は、好ましくは（Ｒ）または（ＲＳ）立体配置のＲ1に、より好ましくは（Ｒ）に結合され、そしてＲ2に結合した炭素は、（Ｒ）、（ＲＳ）または（Ｓ）立体配置、好ましくは（ＲＳ）または（Ｓ）であり、そしてＲ5が存在する場合、その二重結合は好ましくはＺ立体配置にある。当業者は、構造３に基づくＭＤＰ−結合ホーミング分子が、無機または有機の酸および塩基に由来する塩の形態において使用され得ることを理解する。
【０２０６】
構造３または構造４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子を調製する方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２３：１１０７〜１１１５（１１９１）；および米国特許第５，１４５，９９０号を参照のこと。これらのそれぞれは、本明細書中において参考として援用される。
【０２０７】
当該分野で公知の他の種々のＭＤＰ−結合ホーミング分子はまた、本発明の方法に従って、遺伝子または薬剤を選択的に肺内皮に指向させるために有用であり得る。このようなＭＤＰ−結合ホーミング分子は、Ｋａｈａｎら、米国特許第４，６１６，０３８；Ａｓｈｔｏｎら、米国特許第４，４０６，９０２号；Ｐａｒｓｏｎｓら、米国特許第５．１４５，９９０号；Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２３：１１０７〜１１１５（１９９１）；Ｕｃｈｉｄａら、米国特許第５，０６１，７３０号；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ＸＬＩＩＩ：２８１〜２８５（１９９０）；およびＴａｋａｓｅら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ＸＬＩＩＩ：３８〜４２（１９９０）に記載される分子を含み、これらの各々は本明細書中で参考として援用される。
【０２０８】
転移性の細胞は、細胞接着分子のレパートリーの変更を示し、これは、原発性腫瘍からの逸脱、細胞外マトリックスの接着および突出、ならびに微小血管系への侵入を可能にする。大部分のこのような細胞は、通常肺中で、狭い毛細管の網とのそれらの細胞の最初の衝突に際して、幾何学的および血流力学的な力によって破壊される。肺への転移の頻度は単に腫瘍細胞塞栓の機械的な捕捉に起因しているが、特定の腫瘍細胞型は、特定の標的器官に転移することを好むことが長期にわたって観察されてきた。
【０２０９】
いくつかの系統の証拠は、転移の標的器官の選択が、血液に由来する癌細胞とその標的器官の内皮との間の特異的な相互作用によって媒介されることを示す（Ａｌｂｅｌｄａ，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６８：４〜１７（１９９３）；Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：１４９２〜１４９６（１９８７）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３９４〜３９９（１９９１）、これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。肺においては、２つの血管のレセプターが転移細胞の接着を媒介することが見出されている。ＬｕＥＣＡＭ−１は、塩素チャネルと相同な配列を有する内皮表面タンパク質であり、悪性のメラノーマ細胞の肺内皮への接着を媒介する（Ｅｌｂｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７８５３〜２７８６１（１９９７）、これは、本明細書中で参考として援用される）。さらに、プロテアーゼである、肺内皮ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ／ＣＤ  ２６）は、転移性の乳癌細胞および前立腺癌細胞の肺へのホーミングを促進する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：１４２３〜１４３２（１９９３）、これは、本明細書中で参考として援用される）。転移細胞の表面に存在するフィブロネクチンは、乳癌細胞の肺血管へのＤＰＰ  ＩＶ依存性ホーミングのためのリガンドであることが示された（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４２０７〜２４２１５（１９９８）、これは、本明細書中で参考として援用される）。これらの結果は、器官選択的ホーミングが、古典的な細胞接着分子および他の分子によって媒介され得ることを示す。
【０２１０】
本明細書中で開示されるように、インビボでのＧＦＥ−１（配列番号１）の肺内皮への選択的ホーミングは、細胞表面プロテアーゼであるＭＤＰによって媒介される。本明細書中でさらに開示されるように、ＧＦＥ−１（配列番号１）の投与は、マウスにおける２つのメラノーマ細胞系統（ヒトＣ８１６１およびマウスＢ１６）の実験的肺転移を阻害し得る。これは、ＧＦＥ−１（配列番号１）が、同じレセプターに結合することについて腫瘍細胞を転移させることと競合し得ることを実証する（図８を参照のこと）。これらの結果は、ＭＤＰが肺血管において腫瘍細胞を転移させるためのレセプターをして働くこと、およびＭＤＰ−結合ホーミング分子が、肺転移の固着を減少させ得るか、または妨害し得ることを示す。
【０２１１】
従って、本発明は、癌を有する患者に膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）−結合ホーミング分子を投与することによって、その患者における肺転移を減少させるか、または妨害する方法を提供する。一般に肺に拡散した原発性腫瘍は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、精巣癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、腎細胞癌、および前立腺癌、骨原性肉腫、軟部組織肉腫およびメラノーマを含む（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｎｕｒｓ、１４：１７８〜１８６（１９８８）、これは、本明細書中で参考として援用される）。本発明の方法は、例えば、乳癌、腎臓癌、メラノーマ、膀胱癌、子宮頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、または肺癌の肺転移を減少または妨害するために使用され得る。
【０２１２】
本明細書中で使用される場合、用語「転移」は、細胞が増殖性の病巣を形成後、１つの部位から、直接的にその部位と連絡していない別の部位への悪性細胞の移動を意味する。従って、転移細胞は、原発性腫瘍から剥離するようになり、身体の他の部分に移動し、そして別個の腫瘍の塊として増殖する。当業者は、悪性細胞が、器官内の第１の部位から同じ器官内の第２の部位に局所的に移動し得るか、または身体内の異なる器官に離れて移動し得ることを理解する。さらに、転移の悪性細胞は、それ自体がさらなる転移を生じ得る。
【０２１３】
用語「肺転移」は、本明細書中で使用される場合、細胞が肺の中で増殖性の病巣を形成後、第１の部位とは直接的には連絡していない肺の中の１つ以上の部位への悪性細胞の移動をいう。肺の中で生じる癌細胞の剥離した塊は、肺「転移」または二次腫瘍と呼ばれる。肺転移は、種々の原発性腫瘍から生じ得、これは、それらが一般的に組織学的に類似するものである。例えば、乳癌、腎臓癌、およびメラノーマは、しばしば肺に転移する。さらに、膀胱癌、子宮頸部癌、卵巣癌、および前立腺癌は肺に転移し、より少ない頻度では、結腸直腸癌、または原発性肺癌は、肺における１つ以上の第２の部位に転移する。
【０２１４】
用語「減少するかまたは妨害する」は、肺転移に関連して本明細書中で使用される場合、肺転移の速度または程度が減少されることを意味する。従って、肺転移は、肺転移の発生が完全に防止されるか、もしくは顕著に遅延された場合に減少または妨害されるか；または肺転移の大きさもしくは数が顕著に減少した場合に、減少または妨害される。当業者は、肺転移の発生の遅延または肺転移の大きさもしくは数の減少が、本発明の方法に従って、ＭＤＰ−結合ホーミング分子を用いて処置していない１以上のコントロール被験体における肺転移の速度または程度と比較して、測定されることを理解する。
【０２１５】
さらに、検出可能な癌を有さない被験体は、将来肺転移が起こることを減少または防止するために、ＭＤＰ−結合ホーミング分子を用いて予防的に処置され得る。このようは被験体は、例えば、癌を有することが疑われ得るか、または家族が癌の病歴を有し得る。
【０２１６】
上記に示したように、ＭＤＰ−結合ホーミング分子は、肺内皮に選択的なホーミングを示し、そして部分的には、膜ジペプチダーゼに対して特異的結合を示すことによって特徴付けられる。肺転移を減少または妨害するうえで有用なＭＤＰ−結合ホーミング分子は、本明細書中上記に記載したように、ＭＤＰへの特異的結合によって容易に同定され得る。所望の場合、さらなるＭＤＰ−結合ホーミング分子はまた、公知のＭＤＰ−結合ペプチド（例えば、ＧＦＥ−１（配列番号１））または細胞（例えば、Ｃ８１６１細胞）の膜ジペプチダーゼへの結合を競合的に阻害する能力によって同定され得る。
【０２１７】
１つの実施態様において、肺転移を減少または妨害するうえで有用なＭＤＰ−結合ホーミング分子は、配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）を含む肺ホーミングペプチドである。ここで、Ｘ1およびＸ2のそれぞれは、１〜１０の独立して選択されるアミノ酸であり、例えば、配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）またはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）を含むペプチドである。このようなＭＤＰ−結合ホーミング分子は、例えば、ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）またはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）であり得る。配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）を含むさらなるＭＤＰ−結合ホーミング分子（ここで、Ｘ1およびＸ2のそれぞれは、１〜１０の独立して選択されるアミノ酸である）は、以下に記載するように、例えば、不変の残基としてモチーフＧＦＥを含むコンビナトリアルペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。
【０２１８】
別の実施態様において、ＭＤＰ−結合ホーミング分子は、膜ジペプチダーゼインヒビターである。本明細書中で使用される場合、用語「膜ジペプチダーゼインヒビター」は、「ＭＤＰインヒビター」と同義語であり、そして膜ジペプチダーゼの酵素活性を選択的に減少させる有機分子を意味する。一般的に、ＭＤＰインヒビターは、ＭＤＰの活性部位に結合する分子である。ＭＤＰインヒビターは、薬物；ペプチド；修飾ペプチドもしくはペプチド模倣物；タンパク質またはタンパク質フラグメント；核酸分子（例えばリボ核酸もしくはデオキシリボ核酸）；オリゴサッカリド；脂質；糖脂質；またはリポタンパク質のような有機分子であり得る。本明細書中に開示される例示的なＭＤＰインヒビターは、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびシラスタチンである。
【０２１９】
用語「選択的なインヒビター」は、ＭＤＰインヒビターに関連して本明細書中で使用される場合、インヒビターが、他のプロテアーゼのような関連するが異なる酵素と比較した場合、ＭＤＰ酵素に対して選択的な様式でＭＤＰ活性を減少させることを意味する。従って、ＭＤＰインヒビターは、例えば、亜鉛メタロプロテアーゼの非特異的インヒビターとは異なる。従って、ＭＤＰインヒビターは、ＭＤＰ活性を選択的に減少させ得るが、例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性にはほとんど効果を有さないか、または全く効果を有さない。
【０２２０】
ＭＤＰ酵素活性を測定するためのアッセイは、当該分野で公知である。ＭＤＰは、Ｎ−末端アミノ酸がＬ−立体配置にあり、かつブロックされていないジペプチド基質を切断する。Ｃ−末端アミノ酸は、Ｌ−またはＤ−立体配置のいずれかにあり、この酵素は、Ｄ−立体配置のＣ−末端残基を有する基質をより迅速に加水分解する。ＭＤＰ活性は、例えば、グリシル−Ｄ−フェニルアラニン（Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ）を基質として使用してアッセイされ得る（Ｋｅｙｎａｎら、前出、１９９６；Ｐａｒｓｏｎｓら、前出、１９９１）。ＭＤＰ酵素活性のための便利な特異的蛍光測定アッセイは、基質としてＧｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅを使用し、そして遊離したＤ−ＰｈｅとのＤ−アミノ酸オキシダーゼの引き続く反応を使用する（例えば、実施例ＩＶＥを参照のこと；また、ＨｅｙｗｏｏｄおよびＨｏｏｐｅｒ、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：１０〜１４（１９９５）を参照のこと、これは、本明細書中で参考として援用される）。
【０２２１】
膜ジペプチダーゼインヒビターは、天然のＭＤＰ基質に対する構造的な相同性を示す分子であり得る。例えば、γ−グルタミルトランスペプチダーゼによって、トリペプチドグルタチオンを切断して、グルタメートおよびシステイニルグリシン（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）を形成した後、ジペプチドＣｙｓ−Ｇｌｙは、ジペプチドのみを切断するＭＤＰにより認識され、そして切断される。グルタチオンのアミノ酸配列は、ＧＦＥ−１（配列暗号１）のＮ−末端部分と類似しており、ここで最初の２つのアミノ酸は、Ｃｙｓ−Ｇｌｙである。図７に示すように、ＧＦＥ−１（配列番号１）は、用量依存性の様式でＧｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ基質の加水分解を阻害し、これは、ＧＦＥを含むペプチド（例えば、ＧＦＥ−１（配列番号１））が、ＭＤＰインヒビターであり得ることを示す。これらの結果はさらに、ＭＤＰインヒビターは、天然に存在するＭＤＰ基質に構造的に類似し得ることを示す。
【０２２２】
種々のＭＤＰインヒビターは、当該分野で公知である。例えば、ＭＤＰインヒビターは、本明細書中上記にＭＤＰ−結合ホーミング分子（例えば、構造１、構造２、構造３、または構造４を有するＭＤＰ−結合分子）であり得る。
【０２２３】
本発明において有用なＭＤＰインヒビターは、例えば、膜ジペプチダーゼに対して、約１０-4Ｍ〜約１０-12ＭのＫｉを有し得る。例えば、配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列暗号１７）を含むＭＤＰインヒビター（ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、１〜１０の独立して選択されるアミノ酸である）は、例えば、膜ジペプチダーゼに対して、約２×１０-5Ｍ〜１０-7Ｍ、例えば、約１０-6〜１０-7ＭのＫｉを有し得る。
【０２２４】
本発明において有用なＭＤＰインヒビターは、例えば、ＭＤＰに対して１０００ｎＭ以下のＫｉを示し得る。肺転移を減少するかまたは妨害する際に有用なＭＤＰインヒビターはまた、例えば、ＭＤＰに対して１００ｎＭ以下のＫｉ、または１ｎＭ以下のＫｉを示し得る。例えば、構造３または構造４を有するＭＤＰインヒビターは、例えば、約０．５ｎＭ〜１０ｎＭのＫｉを有する強固に結合するインヒビターであり得る。従って、構造３または構造４を有するＭＤＰインヒビターは、癌を有する被験体にＭＤＰインヒビターを投与することによって肺転移を減少するかまたは妨害するための本発明の方法において特に有用であり得る。
【０２２５】
別の好ましい実施態様において、ＭＤＰインヒビターは、構造１を含み、ここでＲ2およびＲ3は、それぞれ３〜１０および１〜１５の炭素原子の範囲の炭化水素ラジカルである；これらのＲ2またはＲ3炭化水素鎖のいずれの１つにおいても、１〜６の水素が、ハロゲンによって置換され得るか、または非末端メチレンが、酸素もしくはイオウで置換され得、これらには後者の酸化型が含まれる；さらに、Ｒ3における末端水素はまた、ヒドロキシルまたはチオールによって置換され得、これは、アシル化され得るか、またはカルバモイル化され得る；あるいは、水素は、アミノで置換され得、これは、アシルアミノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ（ｑｕａｎｉｄｉｎｏ）、またはアルキル、あるいは置換されたアミノ基（４級窒素基を含む）において誘導体化され得；あるいはこれらはカルボキシル基、ホスホン酸基、またはスルホン酸基のような酸性基、またはそのエステルもしくはそのアミド、またはシアノ；あるいはその組み合わせ（例えば、末端アミノ基）によって置換され得；そしてＲ1は、水素または低級アルキル（Ｃ1-6）またはジアルキルアミノアルキル、あるいは薬学的に受容可能なカチオンである。肺転移を減少するかまたは妨害するためのこのようなＭＤＰインヒビターは、例えば、７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸（シラスタチンとしてもまた公知）であり得る。
【０２２６】
ＭＤＰインヒビターは、例えば、構造１を有する化合物であり得、ここでＲ2は、カルボニルに隣接する炭素が３級ではあり得ないという限定を有する、分枝アルキルまたはシクロアルキルである。
【０２２７】
例えば、ＭＤＰインヒビターはまた、Ｒ2が、カルボニルに隣接する炭素が三級ではありえないという制限を有する分枝アルキルまたはシクロアルキルであり、そしてＲ3が、ｎ−アルキル（１−９炭素）または４級の窒素、アミン誘導体またはアミノ酸誘導基である末端置換基を有するｎ−アルキル（１−９炭素）である構造１を有する化合物であり得る。例えば、ＭＤＰインヒビターは、Ｒ2が２，２−ジメチルシクロプロピルまたは２，２−ジクロロシクロプロピルであり、そしてＲ3は、末端置換基を有さないかまたはトリメチルアンモニウム、アミジノ、グアニジノもしくは２−アミノ−２−カルボエチルチオである末端置換基を有する３〜７の炭素原子の炭化水素鎖である構造１を有する化合物であり得る。
【０２２８】
本発明において有用な構造１を有する模範的なＭＤＰインヒビターとしては、以下が挙げられる：Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチル水酸化アンモニウム−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチル水酸化アンモニウム−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−ウレイド−２−オクテン酸；Ｚ−８−（１−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸（ラセミ形態および右旋性形態）；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸；および６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシアミド）−２−ヘキセン酸。
【０２２９】
本発明はまた、ＭＤＰの負の調節薬剤を被験体に投与することによって、癌を有する被験体において肺転移を減少するかまたは予防する方法を提供する。本発明に役立つＭＤＰの負の調節薬剤は、例えば、可溶性ＭＤＰポリペプチドまたはＭＤＰと選択的に反応する抗体であり得る。
【０２３０】
さらに本明細書中で提供されるものは、ＭＤＰの負の調節薬剤を被験体に投与することによって被験体内の肺内皮への細胞ホーミングを減少するかまたは予防する方法である。肺内皮への細胞ホーミングを減少するか予防するのに有用なＭＤＰの負の調節薬剤は、例えば、可溶性ＭＤＰポリペプチドか、またはＭＤＰと選択的に反応する抗体であり得る。
【０２３１】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＭＤＰの負の調節薬剤」とは、直接的または間接的にＭＤＰの発現または活性を選択的に減少する有機分子を意味する。例えば、このようなＭＤＰの負の調節薬剤は以下であり得る：薬物；リボ核酸分子およびデオキシリボ核酸分子を含む核酸分子；ペプチド；改変体または改変化ペプチドもしくはペプチド模倣物；タンパク質またはそれらのフラグメント；抗体またはそれらのフラグメント；オリゴ糖類；脂質；糖脂質；またはリポタンパク質。
【０２３２】
ＭＤＰの負の調節薬剤が、ＭＤＰの発現または活性を選択的に減少するために種々の機構によって作用し得ることを当業者は理解する。ＭＤＰの負の調節薬剤は、例えば、肺内皮において発現された機能的ＭＤＰの量を減少するように作用する有機分子であり得る。このような薬剤は、ＭＤＰの転写または翻訳を選択的に減少し得て、そして、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＭＤＰの発現を負に調節する転写因子、またはこのような転写因子をコードする核酸であり得る。
【０２３３】
ＭＤＰの負の調節薬剤はまた、例えば、野生型の膜ジペプチダーゼと効率的に競合し、転移細胞もしくは他の細胞が肺内皮におけるＭＤＰへ選択的にホーミングすることを減少するかまたは予防するＭＤＰのフラグメントであり得る。可溶性の細胞外で発現される形態のＭＤＰ、またはＭＤＰの他の優性な負のフラグメントは、本発明において有用なＭＤＰの負の調節薬剤であり得る。ＭＤＰ調節薬剤はまた、ＭＤＰ模倣物であり得る。ＭＤＰ模倣物は、ＭＤＰまたはその下位区分（ｓｕｂｐａｒｔ）と三次構造的相同性を共有するタンパク質または他の有機分子であり、そしてＭＤＰ模倣物は、発現される場合、転移細胞またはリンパ球のような他のホーミング細胞へ結合するために、内因性ＭＤＰと競合する。ＭＤＰ模倣物は、転移細胞と接触するＭＤＰの領域に構造的に共通点があり得；ＭＤＰ模倣物は、例えば、ＭＤＰの活性部位に構造的に共通点があり得る。
【０２３４】
１つの実施態様において、ＭＤＰの負の調節薬剤は、ＭＤＰと選択的に反応する抗体である。本明細書中で使用される場合、「ＭＤＰと選択的に反応する」抗体とは、別の亜鉛金属プロテアーゼのような無関係のポリペプチドに対してよりも、膜ジペプチダーゼに対して実質的により高い親和性で結合する。用語「抗体」は、その最も広範な意味では、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに少なくとも約１×１０5Ｍ-1の膜ジペプチダーゼに対する選択的親和性を保持する抗体のポリペプチドフラグメントを含むように本明細書中で使用される。Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖフラグメントのような抗体フラグメントは、膜ジペプチダーゼと選択的に反応し得、それ故に、本明細書中で定義される場合、用語抗体の意味の範囲内に含まれる。用語抗体は、本明細書中で使用される場合、膜ジペプチダーゼと選択的に反応する天然に存在する抗体、ならびにキメラ抗体およびヒト化抗体のような天然に存在しない抗体ならびにフラグメントを含む。
【０２３５】
抗体を産生するための方法は、当該分野で慣用的である。上記のような天然の供給源から調製され得るかまたは組換え的に産生され得る膜ジペプチダーゼあるいはそのフラグメント（例えば合成ペプチド）は、免疫原として用いられ得る。非免疫原性フラグメントまたは合成ペプチドは、ハプテンをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリア分子と結合することによって、免疫原性にされ得る。さらに、種々の他のキャリア分子およびキャリア分子とハプテンを結合する方法は、例えば、本明細書中で参考として援用されるＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）に記載されるように当該分野において周知である。キメラ抗体およびヒト化抗体のような天然に存在しない抗体を含む抗体はまた、固相ペプチド合成を用いて構築され得るか、組換え的に生成され得るか、または例えば、本明細書中で参考として援用されるＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）によって記載されるような可変性の重鎖および可変性の軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。
【０２３６】
別の実施態様において、ＭＤＰの負の調節薬剤は、可溶性ＭＤＰポリペプチドである。本明細書中で使用される場合、用語「可溶性ポリペプチド」とは、膜に結合しないポリペプチドを意味する。本発明において有用な可溶性ＭＤＰポリペプチドは分泌され、したがって細胞外で発現される。
【０２３７】
本発明において有用な可溶性ＭＤＰポリペプチドは、例えば、ＧＰＩアンカーの付加のために必要とされる１つ以上のＣ末端残基を欠失する短縮型または変異型ＭＤＰポリペプチドであり得る（図９を参照のこと）。特定の短縮型または変異型ＭＤＰ誘導体は可溶性であるかどうか決定するために、その誘導体は、例えば、ＣＯＳ細胞において発現され得、そしてトランスフェクトした細胞および上清はその後、ＭＤＰ活性についてアッセイされ、ＭＤＰが膜に結合されるか、または可溶性であるかを決定され得る。
【０２３８】
本発明はまた、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１つ以上の分子と接触する工程；およびこの分子の存在下でＭＤＰ活性を、コントロール値と比較して決定する工程によって、肺転移を減少するかまたは予防する分子を同定する方法を提供する。ここで、この分子の存在下で減少したＭＤＰ活性は、この分子を肺転移を減少するかまたは予防する分子と同定する。膜ジペプチダーゼは、例えば、実質的に精製され得る。ＭＤＰ活性が、例えば、Ｇｌｙ−Ｄ−ＰｈｅからのＤ−Ｐｈｅの放出によって決定され得る。
【０２３９】
本発明の１つの実施態様において、肺転移を減少するかまたは予防する分子は、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１つ以上の分子と接触する工程；この分子の存在下でのＭＤＰ活性を、コントロール値と比較して決定する工程；この分子を、癌を有する被験体に投与する工程；およびこの被験体における肺転移を、転移のコントロールレベルと比較してアッセイする工程によって同定され得る。ここでこの分子の存在下で減少したＭＤＰ活性は、この分子を肺転移を減少するかまたは予防する分子と同定する。
【０２４０】
以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、本発明を限定するようには意図されない。
【実施例】
【０２４１】
（実施例Ｉ  インビボパニング）
本実施例は、ファージディスプレイライブラリーを調製し、そしてインビボパニングを使用してライブラリーをスクリーニングし、選択された器官または組織へホーミングするペプチドを発現するファージを同定する方法を示す。
【０２４２】
（Ａ．ファージライブラリーの調製）
ファージディスプレイライブラリーを、Ｋｏｉｖｕｎｅｎら（前出、１９９５；またＫｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９４ｂを参照のこと）によって記載されるように融合５ベクターを使用して構築した。ＣＸ6Ｃ（配列番号２６）、ＣＸ7Ｃ（配列番号２４）、ＣＸ10Ｃ（配列番号３０）、およびＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）、Ｘ2ＣＸ4ＣＸ（配列番号２３）、およびＸ7（配列番号２９）と命名したペプチドをコードするライブラリーを調製した。ここで「Ｃ」はシステインを示し、そして「ＸN」は別々に選択したアミノ酸の所定の数を示す。これらのライブラリーは、少なくとも２つのシステイン残基がペプチド内に存在する場合、環状ペプチドを表し得る。
【０２４３】
規定したシステイン残基を含むライブリーを、「Ｃ」がコドンＴＧＴによってコードされ、そして「ＸN」がＮＮＫによってコードされるように（ここで、「Ｎ」はＡ、Ｃ、Ｇ，およびＴの等モル混合物であり、そしてここで「Ｋ」はＧおよびＴの等モル混合物である）構築したオリゴヌクレオチドを使用して作製した。従って、ＣＸ6Ｃ（配列番号２６）によって表されるペプチドを、配列ＴＧＴ（ＮＮＫ）6ＴＧＴ（配列番号３１）を有するオリゴヌクレオチドによって表し得る。オリゴヌクレオチドを３サイクルのＰＣＲ増幅によって２本鎖にし、精製し、そして、発現に際して、ペプチドが遺伝子ＩＩＩタンパク質のＮ末端に融合タンパク質として存在するように融合５ベクター中に遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードする核酸に連結した。
【０２４４】
ベクターをＭＣ１０６１細胞へエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。細菌を２０μｇ／ｍｌテトラサイクリンの存在下で２４時間培養し、次いでファージをポリエチレングリコールを使用して２回沈澱させることによって上清から回収した。各ライブラリーは、約１０12形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ；個々の組換えファージ）を含んだ。
【０２４５】
（Ｂ．ファージのインビボパニング）
肺および膵臓について、１０10  ＴＵを含むファージライブラリーの混合物を、２００μｌ  ＤＭＥＭで希釈し、そして麻酔したＢＡＬＢ／ｃマウス（２ヶ月齢；Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）の尾静脈に注射した；ＡＶＥＲＴＩＮ  （０．０１７ｍｌ／ｇ）を麻酔薬として使用した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、前出、１９９６）。１〜４分後、マウスを液体窒素中で急速凍結した。あるいはファージの循環の約５分後、このマウスを５〜１０ｍｌのＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）で心臓を通して灌流した。ファージを回収するために、灌流したマウスからの器官、または急速凍結したマウスから部分的に解凍した器官を、回収しそして重量を測定し、次いで１ｍｌ  ＤＭＥＭ−ＰＩ（プロテアーゼインヒビター（ＰＩ）；フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ；１ｍＭ）、アプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ）中でホモジナイズした。
【０２４６】
器官サンプルを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む氷冷ＤＭＥＭ−ＰＩで３回洗浄し、次いで１ｍｌ  Ｋ９１−ｋａｎ細菌とともに１時間直接的にインキュベートした。０．２μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１０ｍｌのＮＺＹ培地（ＮＺＹ／ｔｅｔ）を、細菌培養物に添加し、混合物を３７℃振盪機中で１時間インキュベートし、次いで２００μｌアリコートを、４０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む寒天プレート（ｔｅｔ／寒天）にプレートした。
【０２４７】
皮膚のインビボパニングのために、２ヶ月齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、毛による汚染を回避するために用いた。このマウスに、上に記載されるようにファージを静脈注射し、心臓を通した灌流後、皮膚を大きな切片で切り出し、そして皮下組織を上に向けて氷冷プレート上に置いた。この皮膚をメスでかき出し、大部分の皮下組織を除去した。次いで皮膚を、以下に記載されるようにファージを回収するためにプロセス化した。
【０２４８】
網膜のインビボパニングのために、２ヶ月齢の雌のＳｉｍｏｎｓｏｎ  Ａｌｂｉｎｏ  ラットを、マウスよりも大きな組織サンプルを提供するために用いた。このラットを、フェノバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、そして深い麻酔下の間に、ラットの腹腔を開腹し、そして１０10ＴＵのファージライブラリーを横隔膜を通じて心臓の左心室へ注射した。ファージの循環の２〜５分後、目をとり出し、次いで７０％ＥｔＯＨで一回およびＰＢＳで一回洗浄した。角膜および水晶体と共に前眼房をとり出し、そして網膜を残りの後眼房から剥がした。組織を秤量し、プロテアーゼインヒビター（１ｍＭのＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび１μｇ／ｍｌのロイペプチン；全てＳＩＧＭＡ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯから）を含む１ｍｌの氷冷ＤＭＥＭ中でシリンジバルブ（ｂｕｌｂ）を用いてホモジナイズした。組織を１ｍｌのＤＭＥＭで３回洗浄し、そしてファージを以下に記載されるように回収した。
【０２４９】
種々の器官または組織から回収したファージを含む約２５０〜３００の個々の細菌コロニーを、５ｍｌのＮＺＹ／ｔｅｔ中にて１６時間増殖した。いくつかの実験において、ファージを含む約１０００の個々の細菌を精選し、そしてファージを２ｍｌのＮＺＹ／ｔｅｔ中で増幅するか、またはファージを含むプレート全体をかき出し、プールし、大量に増殖し、そして注射のためにプロセシングした。ファージを別々に培養した場合、この培養物をプールし、そしてファージを、２回目のインビボパニングについて上に記載されるように、マウスまたはラットへ注射した。いくつかの実験において、３回目または４回目のパニングを行った。ファージＤＮＡを、得られた個々の細菌コロニーから精製し、そして選択されたファージによって発現されたペプチドをコードするＤＮＡ配列を決定した（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９４ｂを参照のこと）。
【０２５０】
（実施例２：選択された器官にホーミングするペプチドの特徴付け）
この実施例は、器官または組織にホーミングする本発明のペプチドが、選択された器官または組織（ＲＥＳの成分を含む器官を含む）に選択的にホーミングすることを実証する。
【０２５１】
（Ａ．肺は、選択された器官である）
２回または３回、環状ＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）ファージディスプレイライブラリーまたは環状ＣＸ6Ｃ（配列番号２６）ファージディスプレイライブラリーを注射したマウスのインビボパニングの後に、肺にホーミングする４つのペプチドを同定した。ペプチド配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２；ＧＦＥ−２）は、肺に繰り返し出現し、そしてＣＸ6Ｃ（配列番号２６）ライブラリー由来の２つのペプチド配列ＣＴＬＲＤＲＮＣ（配列番号１５）およびＣＩＧＥＶＥＶＣ（配列番号１６）もまた、肺にホーミングすることが見出された（以下の表２を参照のこと）。
【０２５２】
同定された個々のペプチドの肺ホーミングの特異性を決定するために、ペプチドをディスプレイするファージを個々に増幅し、同じ投入力価に希釈し、そしてマウスに投与した。投与後、コントロールの腎臓器官および脳器官を取り出し、そして肺、腎臓および脳におけるファージのＴＵ数を決定した。図２に示された結果は、ペプチド配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）を有する１０×および３５×を超えるファージが、それぞれ、腎臓および脳より、肺に結合したことを示す。図２はまた、ＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２；ＧＦＥ−２）が、１２×および２０×より高いレベルで、それぞれ、腎臓および脳より、肺において見出されたことを示す。肺ホーミングペプチド、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）、ＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２；ＧＦＥ−２）、ＣＴＬＲＤＲＮＣ（配列番号１５）およびＣＩＧＥＶＥＶＣ（配列番号１６）は、非選択ファージに対して、肺において、それぞれ３５×、９×、６×、および５×に富化される（図２を参照のこと）。従って、コントロールの脳および腎臓と比較して、そして非選択ファージと比較して、肺に結合するファージの実質的な富化が観察された。
【０２５３】
肺ホーミングペプチドに対する特異性もまた、ＧＳＴ融合ペプチドを用いた競合実験によって決定した。ＧＦＥ−１（配列番号１）を同時投与したＧＳＴ−ＧＦＥ−１（配列番号１）融合ペプチドは、肺にホーミングするＧＦＥ−１（配列番号１）を阻害した一方で、ＧＳＴは、ホーミングに対する効果を有さなかった（図３Ａ）。さらに、ＧＳＴ−ＧＦＥ−１（配列番号１）のホーミングに対する阻害効果は、用量依存性であり；５００μｇのＧＳＴ−ＧＦＥ−１（配列番号１）融合タンパク質を注射した場合、７０％のホーミング阻害が生じた（図３Ｂ）。ＧＳＴ−ＧＦＥ−２（配列番号２）のＧＦＥ−２（配列番号２）との同時注射は、より少ない程度にホーミングを阻害し；５００μｇのＧＳＴ−ＧＦＥ−２（配列番号２）融合タンパク質を注射した場合、３０％のホーミング阻害が生じた（図３Ｂ）。興味深いことに、ＧＳＴ−ＧＦＥ−１（配列番号１）融合物は、肺にホーミングするＧＦＥ−２（配列番号２）の阻害においてより有効であった；５００μｇのＧＳＴ−ＧＦＥ−１（配列番号１）融合タンパク質を注射した場合、６０％のＧＦＥ−２（配列番号２）ホーミング阻害が生じた（図３Ｂ）。しかし、ＧＳＴ−ＧＦＥ−２（配列番号２）を同時注射した場合、ＧＦＥ−１（配列番号１）ホーミングの阻害効果は全く観察されなかった。このことは、ＧＦＥ−２（配列番号２）より、共有標的分子に対してより高い親和性を有するＧＦＥ−１（配列番号１）によって説明され得る。
【０２５４】
さらなる肺ホーミングペプチドを獲得し、そしてそのアミノ酸配列を挿入のために決定した（表２を参照のこと）。ＧＦＥモチーフを含むペプチドが優勢であった（表１を参照のこと；配列番号１および２）。肺に１回を超えて存在した他のペプチドを、表２（以下）中でアスタリスクをつけて示し、そして残りのペプチドは、各々１回同定された。
【０２５５】
これらの結果は、ＧＦＥモチーフを含むペプチドの選択が、ＧＦＥ配列を有するペプチドをディスプレイするいくつかの独立したファージの選択的な結合を示し、そして例えば、ファージ増幅に起因する人為的結果ではないことを示す。さらに、いくつかの場合、同じアミノ酸配列を有するペプチドを発現するファージは、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドによってコードされ、従って、肺に特定のファージがホーミングすることが、このファージで発現された特定のペプチドに起因することを確認した。
【０２５６】
これらの結果は、肺にホーミングするペプチド（ＲＥＳの成分を含む）を発現するファージを同定するために、インビボパニングを使用して、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングし得ることを実証する。
【０２５７】
（Ｂ．皮膚は選択された組織である）
２回または３回、環状ＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）ファージディスプレイライブラリーを注射したマウスのインビボパニング後に、ペプチド配列ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）（これは、皮膚に繰り返し出現した）を同定した（表１）。配列ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）の皮膚ホーミングの特異性を決定するために、ペプチドをディスプレイするファージを個々に増幅し、同じ投入力価に希釈し、そしてマウスに投与した。投与後、コントロールの腎臓器官および脳器官を取り出し、そして皮膚、腎臓および脳におけるファージのＴＵ数を決定した。
【０２５８】
結果は、ペプチド配列ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）をディスプレイする７×を超えるファージが、腎臓および脳より、皮膚に結合したことを示す（図２；表１を参照のこと）。配列ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）は、非選択ファージに対して、皮膚において、７×に富化された（図２）。従って、コントロールの脳および腎臓と比較して、そして非選択ファージと比較して、皮膚に結合するファージの実質的な富化が観察された。
【０２５９】
さらなる皮膚ホーミングペプチドを、環状ＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）ファージディスプレイライブラリーまたは環状ＣＸ10Ｃ（配列番号３０）ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって得た；アミノ酸配列を、以下の表５に示すように、挿入のために決定した。スクリーニングの間に１回を超えて同定されたペプチドを、アスタリスクをつけて示す。例えば、頭皮にホーミングした、回収したＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）ファージの１４％は、配列ＣＶＤＶＣＣＤＧＣＰＶＣＣ（配列番号４３７）を有した。配列ＲＶＰＬＳＧＤＶＥＨ（配列番号４３８）、ＬＲＶＭＳＦＴＳＧＱ（配列番号４３９）、またはＲＦＳＶＧＳＬＦＧＳ（配列番号４４０）を有するファージは、各々、頭皮にホーミングする、回収したＣＸ10Ｃ（配列番号３０）ファージの１４％を構成した。尾部皮膚にホーミングすることに対するスクリーニングは、回収したＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）ファージの１２％が、配列ＣＧＡＴＣＥＭＱＣＰＳＧＣ（配列番号４４１）を有したことを示した。
【０２６０】
皮膚ホーミングペプチドに対する特異性もまた、ＧＳＴ融合ペプチドを用いた競合実験によって決定した。図３Ｂは、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）を同時投与したＧＳＴ−ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）融合ペプチドが、皮膚へのホーミングを阻害した一方で、ＧＳＴは、ホーミングに対する効果を全く有さなかったことを示す。５００μｇのＧＳＴ−ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）融合タンパク質を注射した場合、ホーミングに対するＧＳＴ−ＧＦＥ−１の阻害効果は、約５５％であった（図３）。
【０２６１】
これらの結果は、皮膚にホーミングし、そしてこのようなホーミングが特異的であるペプチドを発現するファージを同定するために、インビボパニングを使用して、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングし得ることを実証する。
【０２６２】
（Ｃ．膵臓は、選択された器官である）
２回または３回、環状ＣＸ7Ｃ（配列番号２４）ファージディスプレイライブラリーを注射したマウスのインビボパニングの後に、種々の膵臓ホーミングペプチドを同定した（表３）。特に、ペプチド配列ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）は、膵臓に繰り返し出現した。ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）の特異性を決定するために、この配列をディスプレイするファージを、個々に増幅し、同じ投入力価に希釈し、そしてマウスに投与した。投与後、コントロールの脳器官を取り出し、そして各膵臓におけるファージのＴＵ数を決定した。図２に示された結果は、ペプチド配列ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）をディスプレイする１０×を超えるファージが、脳より膵臓に結合したことを示し、そしてさらなる実験は、脳と比較して、膵臓において２０×まで富化されたことを示した（表１）。さらに、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）は、非選択ファージと比較した場合、膵臓への２２×のファージの富化を示した（図２を参照のこと）。従って、コントロール組織（脳）と比較して、そして非選択ファージと比較して、膵臓に結合するファージの実質的な富化が観察された。
【０２６３】
これらの結果は、インビボパニングを使用して、膵臓に選択的にホーミングする分子を同定し得ることを実証する。さらに、これらの結果は、インビボパニングが、同じペプチドをコードする独立したファージを同定することを示す。
【０２６４】
（Ｄ．網膜は、選択された組織である）
環状ＣＸ7Ｃ（配列番号２４）ファージディスプレイライブラリーを注射したラットをインビボパニングに供し、３回行った後に、ペプチド配列ＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）およびＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６）を網膜において同定した。組織サンプルのサイズが小さいため、単離したファージを正確に定量できなかった。従って、これらのペプチドをディスプレイするファージの選択性を、これらの配列をディスプレイするファージを個々に増幅し、そしてこのファージを、コントロールファージｆｄＡＭＰＬＡＹ８８とともに、ラットに投与することにより決定した。このｆｄ−アンピシリンファージは、同じ感染性を有するという点で、ｆｄ−テトラサイクリン（融合５型（ｆｕｓｅ  ５−ｂａｓｅｄ））に類似である。
【０２６５】
等量のＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）またはＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６）およびｆｄＡＭＰＬＡＹ８８ファージをラットに注射した。投与後、網膜へのホーミングを、網膜から回収したテトラサイクリンプレート上で選択したファージのＴＵ数、およびアンピシリンプレート上でのｆｄＡＭＰＬＡＹ８８のＴＵ数を比較することによって評価した。
【０２６６】
結果は、コントロールのｆｄＡＭＰＬＡＹ８８ファージと比較して、網膜においてＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）が３×の富化を示し、そしてＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６）が２×の富化を示したことを示した。従って、コントロールファージと比較して、網膜に結合するファージの実質的な富化が観察された。
【０２６７】
さらなる網膜ホーミングペプチドを獲得し、そしてそのアミノ酸配列を挿入のために決定した（以下の表６）。１回を超えて出現したペプチドを示す。特に、ＲＤＶトリペプチドモチーフは、いくつかの異なる配列状況において存在し、このことは、このペプチドをコードする核酸が、多くの独立したファージに由来することを示した。
【０２６８】
これらの結果は、ＲＤＶモチーフを含むペプチドの選択が、ＲＤＶ配列を有するペプチドをディスプレイするいくつかの独立したファージの選択的な結合を示し、そして例えば、ファージ増幅に起因する人為的結果ではないことを示す。さらに、いくつかの場合で、同じアミノ酸配列を有するペプチドを発現するファージは、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドによってコードされ、従って、網膜に特定のファージがホーミングすることが、このファージで発現された特定のペプチドに起因することを確認した。
【０２６９】
これらの結果は、インビボパニング方法が、同定するライブラリー（例えば、選択された器官または組織（ＲＥＳの成分を含む器官および組織を含む）にホーミングするペプチドを発現するファージ）をスクリーニングするために、一般に適用可能な方法であることをさらに実証する。データベース検索は、内皮細胞レセプターについての公知のリガンドに対する、膵臓、肺、皮膚または網膜にホーミングするペプチドの有意な相同性を全く示さなかった。
【０２７０】
（実施例３：肺、膵臓および皮膚のホーミングペプチドの免疫組織学的分析）
この実施例は、肺、膵臓および皮膚のホーミング分子の所在を免疫組織学的試験を用いて実証する。
【０２７１】
ホーミングペプチドをディスプレイするファージを、肺、膵臓または皮膚のホーミングペプチドを発現するファージ（「ペプチドファージ」）をマウスに投与して５分後に得た組織切片を免疫染色することによって、肺、膵臓および皮膚において検出した。ペプチド−ファージの投与後、マウスを上記のように取り扱い、そして種々の器官（肺、膵臓および皮膚を含む）を取り出し、そしてブワン（Ｂｏｕｉｎ’ｓ）溶液（Ｓｉｇｍａ）中で固定した。組織切片を調製し、そして抗Ｍ１３（ファージ）抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；米国特許第５，６２２，６９９号、前出、１９９７；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、前出、１９９６を参照のこと）と反応させた。製造業者の指示に従って、ペルオキシダーゼ結合体化２次抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて、結合した抗Ｍ１３抗体の可視化を行った。
【０２７２】
肺ホーミングペプチドであるＧＦＥ−１（配列番号１）をディスプレイするファージをマウスに静脈投与し、そして循環させて５分後に肺を単離し、そして上記のように処理した。肺胞毛細管の免疫組織化学的染色を観察し、そしていずれの解剖部分に対する優勢も検出されなかった。しかし、気管壁およびいくつかの大きな血管の染色では、存在しなかった。非選択ファージを注射したマウスは、肺染色を示さず、そしてＧＦＥ−１（配列番号１）の注射後の膵臓および皮膚においては、染色が観察されなかった。
【０２７３】
同様の実験を、膵臓ホーミングペプチドであるＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）をディスプレイするファージを使用して、膵臓において行った。これらの実験において、膵臓ならびにコントロール器官および組織の組織学的サンプル（肺および皮膚を含む）を調製し、そして上記のように、免疫染色によって試験した。結果は、外分泌膵臓の毛細管およびより大きな血管において染色が検出された一方で、内分泌膵臓の染色は、（あるとしても）ほとんど検出されないことを示した。再び、非選択ファージは膵臓を染色せず、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）をディスプレイするファージを注射したマウスの肺および皮膚も染色が全く観察されなかった。興味深いことに、子宮内の血管のいくらかの染色がＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）ペプチドについて観察された。さらに、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）をディスプレイするファージの静脈内注射後に、非選択ファージと比較して、６×高いレベルでファージを子宮から回収した。従って、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）は、膵臓および子宮の両方にホーミングする。
【０２７４】
皮膚ホーミングペプチドＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）をディスプレイするファージを用いて、皮膚において実験を行った。これらの実験において、皮膚ならびにコントロールの器官および組織（肺および膵臓を含む）由来の組織学的サンプルを調製し、そして上記のように免疫染色によって試験した。結果は、皮下組織の血管において染色が示された一方で、真皮の染色は（あったとしても）ほとんど検出されないことを示した。再び、非選択ファージは、これらの血管を染色せず、そしてＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）をディスプレイするファージを注射したマウスのコントロールの肺および膵臓において染色は全く観察されなかった。
【０２７５】
全てのファージ（非選択ファージを含む）は、肝臓および脾臓の染色を引き起こした。この結果は、以前記載されたＲＥＳの成分によるファージの捕捉と一致する。
【０２７６】
これらの結果は、肺、膵臓および皮膚のホーミングペプチドは、肺、膵臓および皮膚（特に血管系）に選択的にホーミングすることを実証する。さらに、これらの結果は、器官および組織は、特定の領域（おそらく、器官または組織内の標的分子の異なる発現を反映する）内での染色パターンの差異を示し得ることを示す。免疫組織化学的分析は、肺、膵臓および皮膚のホーミングペプチドを発現するファージの所在および分布を同定するための簡便なアッセイを提供する。
【０２７７】
（実施例ＩＶ：ＧＦＥ−１肺ホーミングペプチドについてのレセプターは、膜ジペプチダーゼである）
本実施例は、ＧＦＥ−１（配列番号１）のようなペプチドを含む「ＧＦＥ」についてのレセプターが、膜ジペプチダーゼであることを実証する。本実施例は、さらにＧＦＥ−１（配列番号１）が結合し、そして膜ジペプチダーゼの活性を阻害することを実証する。
【０２７８】
（Ａ．ＧＦＥ−１ファージは、肺始原細胞に選択的に結合する）
上述のように、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）ファージは、インビボで注射した場合、マウスの肺血管系に結合する。肺始原細胞に対するファージ結合アッセイを行ない、インビボで、肺組織に結合するＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）ファージの特異性が、インビトロにおいて再構成され得るかどうかを決定した。
【０２７９】
始原細胞へのファージの結合は、以下のように行なった。簡潔には、Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）を、Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉ．４５：１９９−２０４（１９９５）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、０．０１７ｍｌ／ｇのアベルチンを用いて麻酔した。深い麻酔の下で、マウスは、心臓を通して１０ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）で灌流した。次いで、肺、腎臓および脳を採取し、細かく刻み、０．５％ＢＳＡ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ；Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）および０．５μｇ／ｍｌのコラゲナーゼＶ（ＳＩＧＭＡ）を含む２ｍｌのＤＭＥＭ中に置き、そして３７℃で２５分間インキュベートした。コラゲナーゼでの処理に続いて、組織を７０μＭの細孔の細胞濾過機（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅ、ＮＪ）を強制的に通した。濾過した細胞を、１０％の血清を補給した１０ｍｌのＤＭＥＭを用いて１回洗浄した。結合アッセイに使用したファージ粒子を、増幅および精製し、そしてファージディスプレイされたインサートを、ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、前出、１９９３に記載されるように配列決定した。試験されるべき異なるファージの等しい投入量を保証するために、ファージを、数回Ｋ９１Ｋａｎ細菌を使用して力価決定した（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、前出、１９９３）。
【０２８０】
結合反応のために、１０9形質導入単位（ＴＵ）のファージを、１０％血清を補給した１ｍｌのＤＭＥＭ中に５×１０6細胞でインキュベートした。結合を４℃で２時間やさしく攪拌しながら行なった。結合反応の後、細胞を１０％の血清を補給した１ｍｌのＤＭＥＭで、室温にて４回、各回につき５〜１０分間洗浄した。細胞を遠心分離し、そして細胞ペレットを１００μｌのＤＭＥＭに再懸濁し、そして新しいチューブに移した。細胞に結合したファージを、１ｍｌのＫ９１Ｋａｎ細菌培養液（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、前出、１９９３）の添加により採取し、続いて３０分間室温でインキュベートした。次いで、細菌を、０．２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補給した１０ｍｌのＬＢ培養培地で希釈し、そしてさらに３０分間室温でインキュベートした。細菌培養の段階希釈物を４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢプレートにプレートした。プレートを、一晩３７℃でインキュベートした後、コロニーを計数した（形質導入単位、ＴＵ）。
【０２８１】
インビトロにおける肺始原細胞に対するファージの結合アッセイの結果は、肺始原細胞が、インサートを欠くｆｄ−ｔｅｔファージよりも約６０倍多くのＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）ファージを結合することを示した。腎臓細胞へのＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）ファージの結合もまた、ｆｄ−ｔｅｔ結合よりも高かった（ｔ検定、ｐ＜０．０２）が、この結合は、肺細胞に対するＧＦＥ−１（配列番号１）の結合よりもずっと低かった。インビボ研究において、ＧＦＥ−１（配列番号１）のファージを静脈内に注射した場合、腎臓に対する特異的なファージのホーミングは検出されなかった。ＧＦＥ−１（配列番号１）ファージは、インビトロにおいて始原脳細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒａｉｎ  ｃｅｌｌ）に対して特異的な結合を示さなかった。
【０２８２】
肺細胞に対するＧＦＥ−１（配列番号１）ファージの結合は、１５０μＭのＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドの存在下でおよそ７０％阻害されたが、一方同じ濃度のコントロールペプチドであるＧＲＧＥＳＰ（配列番号４４２）は、効果を有さなかった。インサートを欠くｆｄ−ｔｅｔファージの非特異的結合は、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドまたはコントロールペプチドの存在により影響されなかった。これらの結果は、肺内皮に対するＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチド配列の選択的なインビボでの結合を全肺始原細胞に対するインビトロアッセイにおいて再構成し得ること、および全肺細胞抽出物が単離のために十分な量のＧＦＥ−１レセプターを含むことを実証する。
【０２８３】
（Ｂ．ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドは、５５ｋＤａの表面タンパク質と結合する）
ＧＦＥ−１（配列番号１）に結合する細胞表面分子のみを検出するために、マウスの肺内皮表面タンパク質を、インビボでビオチン化し、そして全肺抽出物を調製した。標識した抽出物を、最初にＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドに対するアフィニティーカラムで分画し；続いて、カラムを洗浄し、そして結合タンパク質を、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチド溶液で溶出した。
【０２８４】
インビボでの内皮細胞表面タンパク質のビオチン化を、以前にＤｅ  Ｌａ  Ｆｕｅｎｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７２：Ｌ４６１−Ｌ４７０（１９９７）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、いくつかの変更を伴って行なった。簡潔には、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、アベルチンで麻酔し、そして０．５ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を含む約１５ｍｌのＰＢＳで１０〜１５分間心臓を通してゆっくりと灌流した。次いで、よく灌流した肺または脳のような制御組織を、採取し、そして氷上で２０分間インキュベートした。次いで、この組織をさらに以下に記載されるように抽出物を調製するためにホモジナイズした。
【０２８５】
抽出物の調製のために、マウスまたはラットの肺を、最初に細かく刻み、次いで、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、２０μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび１μｇ／ｍｌのロイペプチンを含む１００ｍＭのＮ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含む最小溶容量（２．５ｍｌ／ｇの組織）の冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／オクチルグルコシド）中で、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｈｏｍｏｇｅｉｚｅｒ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ；Ｗｅｓｂｕｒｙ、ＮＹ）を用いてホモジナイズした。ホモジナイズした組織を、氷上で２時間インキュベートし、次いで、細胞の細片を取り除くために１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。プールした上清を、アフィニティークロマトグラフィーの前にあらゆる細片を取り除いた。
【０２８６】
ＧＦＥ−１（配列番号１）アフィニティークロマトグラフィーを、ＲＧＤペプチドクロマトグラフィーによるインテグリンの単離のためにＰｙｔｅｌａらにより確立された一般的な原則に従って、行なった（Ｐｙｔｅｌａら、Ｃｅｌｌ  ４０：１９１−１９８（１９８５）；Ｐｙｔｅｌａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍ．１４４：４７５−４８９（１９８７）、これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。全ての工程を、４℃で行なった。簡潔には、ＧＦＥ−１（配列番号１）またはコントロールペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を、製造者の手引書（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に従って、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに結合させた。このマトリックスは、およそ２ｍｇ／ｍｌのペプチドを含有した。２匹のマウス肺からのビオチン標識化抽出物を、カラム緩衝液（５０ｍＭのオクチルグリコシドおよび１ｍＭＰＭＳＦを含むＰＢＳ）中で平衡化した５００μｌのアフィニティーマトリックスに添加した。この抽出物をカラムに添加し、そして素通りした画分を、９０分間の期間にわたって再添加した。次いで、このカラムを２０容量のカラム緩衝液で洗浄した。合成ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドでの溶出を、１ｍｇ／ｍｌのＧＦＥ−１ペプチド（配列番号１）を補充した２倍量のカラム緩衝液を用いて、１時間以上カラムをゆっくりと洗浄することにより行なった。このカラムに結合した残りのタンパク質を、８Ｍの尿素で溶出した。
【０２８７】
溶出物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０，０００  ＭＷＣＯカラム（Ａｍｉｃｏｎ；Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて５倍に濃縮した。次いで、各溶出物のアリコートを、成形済みのポリアクリルアミド４〜１２％ゲル（Ｎｏｖｅｘ；Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ビオチン標識化抽出物を用いて行なう実験のために、このタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に転写し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてブロットし、そしてＥＣＬ化学発光システム（ＮＥＮ；Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて発色させた。
【０２８８】
図４に示したように（左のパネル）、５５ｋＤａのビオチン化タンパク質は、ＧＦＥ−１（配列番号１）により選択的に溶出された。溶出の前に、カラムからの洗浄物は、検出可能なビオチン化タンパク質を示さなかった；続いて、８Ｍの尿素の添加が、カラム中に非特異的に保持されている多くのビオチン化タンパク質を溶出した。コントロールペプチド（ＧＲＧＥＳＰ；配列番号４４２）カラムに対して同じ手順で行なった後では、５５ｋＤａの範囲のタンパク質は、検出されなかった（図４；右のパネル）。さらなるコントロールとして、インビボビオチン化脳細胞抽出物を、同じ条件下で、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドカラムを通して分画した；ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドカラムに特異的に結合する、脳抽出物からのビオチン化タンパク質はなかった（データは示さず）。
【０２８９】
これらの結果は、ＧＦＥ−１ペプチド（配列番号１）が、５５ｋＤａの肺血管表面タンパク質に特異的に結合することを示す。非還元条件下では、５５ｋＤａのタンパク質を１１０ｋＤａのバンドとして移動した（データ示さず）。従って、これらの結果は、ＧＦＥレセプターが、ジスフィルド結合ホモ二量体であることをさらに示す。
【０２９０】
（Ｃ．５５ｋＤａのＧＦＥ−１（配列番号１）レセプターは、膜ジペプチダーゼである）
ＧＦＥ−１（配列番号１）ファージは、循環中に注射した場合、ラットの肺血管を選択的に標的し得る。マウス組織から入手し得るよりも大量の５５ｋＤａタンパク質を精製するために、非ビオチン化抽出物を１００個の凍結ラット肺から調製した（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ｒｏｇｅｒｓ、ＡＲ）。大規模な抽出物を、ＰＢＳ／オクチルグリコシドの最小量を有するペレットの第２の抽出物の添加と共に、基本的には上記のように調製した。
【０２９１】
大規模な抽出物を、３ｍｌのアフィニティーマトリックスを用いて、上述のようにＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドアフィニティーカラム上で分画した。クマシーブルー染色により検出可能な５５ｋＤａのタンパク質を、配列番号１のＧＦＥ−１ペプチドによりカラムから抽出した（データは示さず）。マウスの肺から単離された５５ｋＤａの表面タンパク質と共に移動したこのタンパク質を、トリプシン消化に供し、そしてＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  四重極（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）イオントラップ質量分析計上でマイクロキャピラリー逆相ＨＰＬＣ直列質量分析（μＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）による、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）での質量分析により、配列決定した。
【０２９２】
５５ｋＤａタンパク質由来の２つのトリプシンペプチドである、ＹＰＤＬＩＡＥＬＬＲ（配列番号４４４）およびＴＴＰＶＩＤＧＨＮＤＬＰＷＱＭＬＴＬＦＮＮＱＬＲ（配列番号４４５）は、ミクロソームジペプチダーゼ、デヒドロペプチダーゼ−１またはＭＤＰとしてもまた公知のラット膜ジペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．１３．１９）と完全な同一性を示した。いくつかの他のペプチド配列は、サンプル中でラットＩｇＧの存在を示した。ＩｇＧでのサンプルの汚染は、この分子量範囲で予期され、非灌流肺からの抽出物中に大量のＩｇＧを生じた。
【０２９３】
膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）が、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチド結合タンパク質であることを確認するために、５５ｋＤａタンパク質を膜ジペプチダーゼ活性についてアッセイした。アフィニティークロマトグラフィー洗浄画分およびＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチド溶出物（図４）からのサンプルを、特定のＭＤＰ基質Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅの存在下でインキュベートし、そしてＤ−Ｐｈｅを、ＨｅｙｗｏｏｄおよびＨｏｏｐｅｒ、前出、１９９５（Ｋｅｙｎａｎら、前出、１９９６もまた参照のこと）に記載されるように正確に蛍光的に検出した。簡潔には、サンプルを、まずＭＤＰ基質、Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ（１ｍＭ；ＳＩＧＭＡ）とともに３７℃で３時間インキュベートした。次いで、放出されたＤ−Ｐｈｅを、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｉ型；ＳＩＧＭＡ）およびペルオキシダーゼ（ＶＩ型；ＳＩＧＭＡ；ＨｅｙｗｏｏｄおよびＨｏｏｐｅｒ、前出、１９９５）の存在下で、６，６’−ジヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３，３’−二酢酸に変換した。蛍光を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）からのｆｍａｘ蛍光マイクロプレートリーダーを使用して測定した。
【０２９４】
図５は、上記（図４）のアフィニティークロマトグラフィー洗浄画分およびＧＦＥ−１ペプチド溶出物からのサンプル中での蛍光化合物へのＤ−Ｐｈｅの変換の時間経過を示す。洗浄画分は、蛍光の基準線レベルのみを示したが、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチド溶出物は、Ｄ−Ｐｈｅの時間依存的変換によって例示したように高い膜ジペプチダーゼ活性を含んだ（図５参照のこと）。さらに、ラットの肺抽出物から単離したＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチド溶出物もまた、強いＭＤＰ活性を示した（データは示さず）。ＭＤＰ活性をまた、全肺抽出物においても検出したが、ＧＦＥ−１ペプチド（配列番号１）溶出物（２００ｎｍｏｌ  Ｄ−Ｐｈｅ／ｍｉｎ／ｍｇ）についての比活性は、ラットの全肺抽出物（０．３４ｎｍｏｌ  Ｄ−Ｐｈｅ／ｍｉｎ／ｍｇ）についての比活性よりも約６００倍高かった。
【０２９５】
（Ｄ．ＧＦＥ−１（配列番号１）およびＧＦＥ−２（配列番号２）ファージは、ＭＤＰでトランスフェクトした細胞に結合する）
低レベルまたは検出できないレベルのＭＤＰ活性を有することが公知の、ＣＯＳ−１細胞株を広範に使用して、ＭＤＰの構造および機能を研究した（Ｋｅｙｎａｎら、前出、１９９６；Ｋｅｙｎａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：４７−５１（１９９７））。ＣＯＳ−１細胞をマウスＭＤＰでトランスフェクトし、そして以下に記載するように、配列番号１および２への結合をアッセイするために使用した。
【０２９６】
ＣＯＳ−１細胞へのトランスフェクションのために、マウスＭＤＰ発現ベクターを以下のように調製した。全マウス肺ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）を使用して単離し、そして逆転写酵素ならびにランダムヘキサマーおよびポリｄＴオリゴヌクレオチドの混合物（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いる第一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用した。マウスＭＤＰ  ｃＤＮＡ（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３０：１１８９−１１９６（１９９５））を、以下のオリゴヌクレオチド対を使用してＰＣＲにより、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからのＴａｑポリメラーゼを使用して、ｃＤＮＡプールから増幅した：ＫｐｎＩアダプターを含む、ＣＣＧＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧＡＣＣＴＴＧ（配列番号４４６）ＸｂａＩアダプターを含む、ＴＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧ（配列番号４４７）。増幅した１．３ｋｂのマウスＭＤＰ  ｃＤＮＡを、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）からのＤＮＡ制限酵素およびＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の同じ部位に挿入した。マウスＭＤＰｃＤＮＡの首尾よいクローニングを、ＤＮＡ配列決定により確認した。ＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションを、ＱｉａｇｅｎからのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、製造者により推奨されるように行なった。
【０２９７】
ＭＤＰでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞へのファージの結合を、以下のように決定した。簡潔には、１０7のＣＯＳ−１細胞を、１０μｇのＭＤＰ発現ベクターか、またはベクターのみのいずれかでトランスフェクトした。４８時間後、細胞をディッシュから穏やかにはがし、１回洗浄し、そして上述のファージ結合アッセイまたは膜ジペプチダーゼ活性アッセイに供した。ファージ結合アッセイのために、ファージインプットの５×１０6細胞および１０10形質導入単位（ＴＵ）を使用した。膜ジペプチダーゼ活性の測定のために、１０6細胞を、プロテアーゼインヒビターを含まない１００μｌのＰＢＳ／オクチルグリコシド中に溶解した。抽出物の１０μｌのアリコートを使用して、ＭＤＰ活性を測定した。
【０２９８】
図６Ａに示すように、マウスＭＤＰでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞は、偽トランスフェクト細胞よりも少なくとも１５倍高いＭＤＰ活性を示した。さらに、ＧＦＥ−１（配列番号１）ファージは、ＭＤＰでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞に結合した。図６Ｂに示すように、ＧＦＥ−１（配列番号１）ファージは、偽トランスフェクト細胞よりも、ＭＤＰトランスフェクト細胞に４倍より多く結合した。ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドの構造特性に類似した構造特性を有するペプチドを提示する、ネガティブコントロールファージである、ｆｄ−ｔｅｔファージおよび皮膚ホーミングファージ（ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ；配列番号３）は、偽トランスフェクト細胞と比較した場合、ＭＤＰ発現細胞への特異的な結合を示さなかった。さらに、図６Ｂは、ＧＦＥ−２（配列番号２）ファージもまた、ＭＤＰトランスフェクト細胞に結合し；この結合は、上述のインビボ肺ホーミングデータと同様に、ＧＦＥ−１（配列番号１）の結合よりも弱かったことを示す。ＧＦＥ−１（配列番号１）ファージおよびＧＦＥ−２（配列番号２）ファージの両方のＭＤＰトランスフェクト細胞への結合は、ＧＦＥ−１ペプチドにより完全に阻害された（配列番号１；データ示さず）。これらの結果は、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドおよびＧＦＥ−２（配列番号２）ペプチドが、同じレセプターに結合することを示す。
【０２９９】
（Ｅ．ＧＦＥ−１（配列番号１）は、ＭＤＰ活性を阻害し得る）
トリペプチドグルタチオンの代謝は、グルタミン酸およびシステニルグリシン（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）を形成するためのγ−グルタミルトランスペプチダーゼによるトリペプチドの切断を含む。ジペプチドＣｙｓ−Ｇｌｙは、実質的に認識され、そしてＭＤＰによって切断され、これは、ジペプチドのみを切断する。グルタチオンのアミノ酸配列は、ＧＦＥ−１ペプチドのＮ末端部分、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）と類似しており、これは、Ｃｙｓ−Ｇｌｙである最初の２つのＧＦＥ−１の第一のアミノ酸を有する。
【０３００】
ＧＦＥ−１（配列番号１）をＭＤＰによるＧｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅの加水分解を阻害する能力についてアッセイした。Ｄ−Ｐｈｅの蛍光定量的検出を上記のように実施した。図７は、ＧＦＥ−１（配列番号１）が用量依存的な様式でＧｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ基質（０．５ｍＭ）の加水分解を阻害したことを示す。コントロールの環状ペプチド（ＣＡＲＡＣ；配列番号４４３）は、この酵素を阻害しなかった。
【０３０１】
これらの結果は、ＧＦＥ−１（配列番号１）がＭＤＰ活性の拮抗阻害剤として作用し得ることを示す。
【０３０２】
（実施例Ｖ：ＧＦＥ−１（配列番号１）は、肺転移を阻害する）
この実施例は、ＧＦＥ−１ペプチド（配列番号１）がマウスにおける実験的な肺転移を阻害し得ることを実証する。
【０３０３】
実験的な肺転移を、Ａｒａｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７−３８０（１９９８）およびＰａｓｑｕａｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１１：１１９７−１２０３（これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）に本質的に記載されるように、Ｃ８１６１ヒト黒色腫細胞を使用して、マウスにおいて誘導した。簡潔には、Ｃ８１６１細胞を７５％のコンフルエンスまで培養し、次いで、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで収集する。Ｃ８１６１癌細胞を雌ヌードＢＡＬＢ／ｃマウス（２ヶ月齢）の尾静脈中に、動物当たり１０5細胞の濃度で注射した。２組の５匹のマウスをこの細胞のみ；２５０μｇのコントロールＣＡＲＡＣペプチド（配列番号４４３）を有する細胞、または２５０μｇのＧＦＥ−１ペプチド（配列番号１）を有する細胞で注射した。各注射は、２００μｌの総容量であった。
【０３０４】
黒色腫細胞およびペプチド混合物のアリコートを一晩培養し、このペプチドが腫瘍細胞の生存度に影響しないことを確認した。ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドまたはＣＡＲＡＣ（配列番号４４３）ペプチドは、黒色腫細胞に対する毒性を両方とも示さなかった（データを示さず）。
【０３０５】
マウスを注射後、５週間で屠殺し、そして肺を収集し、秤量した。図８に示すように、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドを投与されたマウスの肺重量は、黒色腫細胞単独（「ビヒクル」）またはコントロールペプチドＣＡＲＡＣ（配列番号４４３、（「コントロールペプチド」））を有する黒色腫細胞を投与されたマウスにおいて認められる肺重量より有意に少なかった。これらの結果は、ＧＦＥ−１が、ヒト癌細胞の肺転移を阻害し得ることを示す。
【０３０６】
同様の肺転移実験を、Ｒａｊｏｔｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：４３０−４３７（１９９８）（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように調製した、ＧＦＥ−１（配列番号１）グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を使用して、実施した。ＧＦＥ−１（配列番号１）グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、肺重量の増加を阻害し、この増加は、図８に示したように配列番号１のペプチドで観察された結果と類似の様式で、Ｃ８１６１ヒト黒色腫細胞の注射から得られる。
【０３０７】
これらの結果は、ＧＦＥ−１（配列番号１）が肺転移を阻害し得、そしてＭＤＰが肺血管系における腫瘍細胞の転移のためのレセプターとして作用することを示す。
【０３０８】
（実施例ＶＩ：Ｚ−２アシルアミノ−３−モノ置換プロペン酸ＭＤＰ結合ホーミング分子の調製）
この実施例は、構造１を有するＭＤＰ結合分子の調製のいくつかの方法を実証する。
【０３０９】
（Ａ．構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子の調製方法）
構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子を、以下の適切な２−ケト酸およびアミドを直接縮合することによって作製する。
【０３１０】
【化９】
2010031038.tif 000012
ここで、Ｒ2およびＲ3は、規定された通りである。一般的な反応条件は、不活性溶媒（例えば、トルエンまたはメチルイソ吉草酸）中で約１４：１の割合の酸対アミドを混合する工程、および３〜４８時間、好ましくは５〜２４時間、水の共沸除去を伴った還流加熱する工程を包含する。通常、冷却された場合、この溶液は、結晶形態の産物を生じる。所望の場合、この産物を、塩基抽出プロセスを使用して単離する。この産物を一般に公知の技術を使用して再結晶化する。
【０３１１】
この手順の必要に応じた改変は、反応中に触媒として、さらなる少量のｐ−トルエンスルホン酸を必要とする。
【０３１２】
（Ｂ．構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子の調製方法）
構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子を、以下の酸塩化物を伴う反応においてα−アミノ酸、ｔ−ブチルエステルを使用して調製する：
【０３１３】
【化１０】
2010031038.tif 000013
この反応は、塩基（例えば、トリエチルアミン）の存在下、塩化メチレンのような溶媒中で生じる。次いで、生じたＮ−アセチル化産物をｔ−ブチル次亜塩素酸塩での処理、続いてナトリウムメトキシドの添加によって酸化する。これは、α，β−不飽和エステルである、２−メトキシ誘導体またはその脱離産物を生じる。無水塩酸でのさらなる処理は、この２−メトキシ誘導体か、またはこの不飽和エステルのいずれか（または両方の混合物）を、所望のα，β不飽和遊離酸に変換する。
【０３１４】
【化１１】
2010031038.tif 000014
Ｒ3がアミノ、４級の窒素、チオールまたはカルボキシルである末端置換を有する、いくつかの化合物、誘導体を、末端の臭素を有する中間体から最も都合良く作製し得る。この場合、この中間体は、以下の構造を有し：
【０３１５】
【化１２】
2010031038.tif 000015
ここで、ｎは、所望の炭化水素鎖（例えば、３〜７）の炭素数である。
【０３１６】
末端のトリメチルアンモニウム置換基を有するＲ3を調製するために、臭素中間体をトリメチルアミンと反応させる；アミノを得るために、この臭素中間体をアンモニアと反応させる；グアニジノ反応をグアニジンで行う；２−アミノ−２−カルボキシエチルチオを含むチオ誘導体を調製するために、この臭素化合物をシステイン塩酸塩または適切なメルカプタンと反応させる。誘導体化したアミノ（例えば、ホルムアミジノ、ウレイドおよびアシルアミド（アセトアミド））をｏ−ベンジルホルムイミデート塩酸塩、シアン酸カリウムおよび適切なアシル無水物（無水酢酸）とそれぞれ反応させることによって、アミノ基を有する化合物から作製する。
【０３１７】
（Ｃ．構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子の調製方法）
Ｒ3が末端に置換されたチオ誘導体である場合、化合物を調製するための別の経路は、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸の存在下での還流におけるトルエン中で以下：
【０３１８】
【化１３】
2010031038.tif 000016
の所望のアミドでの反応において以下：
【０３１９】
【化１４】
2010031038.tif 000017
のようなクロロケトエステル中間体を利用する。生じた中間体を酸で加水分解する；次いで、塩素基を適切なメルカプタンとの反応で置換する。この反応は、キラルアミドの使用を許容し、それによって、官能化された側鎖を調製するので価値があり。あるいは、メルカプタン縮合後に調製された、ＺおよびＥアイソマーの混合物を、約３のｐＨまで酸を添加し、そして約９０℃まで、３０分間加熱することによって、Ｚ型に直接異性化する。Ｚ型のみが残存し、そして回収は、単純かつ複雑でない。
【０３２０】
（Ｄ．Ｚ−７−（Ｌ−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシアミド）−２−へプテン酸ナトリウムの調製）
（１．エチル−７−クロロ−２−オキソヘプタン酸のグリニャール調製）
等モル量（各８モル）の１−ブロモ−５−クロロペンタンおよびマグネシウムを２５℃でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（９６０ｍｌ）中で反応させる。このフラスコをＴＨＦ中でマグネシウムと共に装填し、そして臭化ブロモペンタンを１時間にわたって添加し、次いで２時間熟成した。反応が終了したと判断した後、この反応溶液を添加する（−１５℃で冷却し、１８５６ｍｌのＴＨＦ中で１６モルのジエチルシュウ酸となるまで、１０℃で温度を維持しながら）。３Ｎ  塩酸を、２５℃未満の温度を保ちながら、添加し、反応をクエンチする。溶媒をストリッピングした後、計算された収量は、４８．８％のエチル−１−クロロ−６−オキソペプタン酸であった。
【０３２１】
（２．縮合および加水分解）
Ｓ−２、２−ジメチルシクロプロピルカルボキシアミド（１０１７ｇ）、２１４３．６ｇのエチル−７−クロロ−２−ケトヘプタン酸、９リットルのトルエンおよび１２ｇのｐ−トルエンスルホン酸を２２Ｌのフラスコに装填し、そして攪拌しながら、加熱して還流する。２３時間後、液体クロマトグラフィーは、予期した産物の割合を示し、そして４Ｌのトルエンをわずかな減圧下で除去する。このポットを水で装填し、２ＮのＮａＯＨでｐＨ７に中性化し、そして約５リットルの最終ポット容量を残して、減圧蒸留する。これを１７６０ｇの５０％  ＮａＯＨ水溶液（水、４リットル）を加え、そして一晩攪拌することによって加水分解する。このフラスコを４Ｌの塩化メチレンで装填し、そしてｐＨをＨＣｌを用いて８．８に調整する。未反応のアミドを結晶化する。有機層を水から分離し、次いで蒸発させる。粘着性の残査を７２０ｇの５０％  ＮａＯＨを含む８Ｌの水中で溶解し、そしてこの溶液に１８１８ｇのＬ−システイン塩酸塩、水、２ｋｇの氷、２４８４ｇの５０％  ＮａＯＨおよび１Ｌの水を装填する。室温で一晩熟成後、この溶液のｐＨは、濃縮した塩酸で３．０に調整し、そして生じた粘着性の懸濁液を９５℃に加熱し、透明な溶液を生じる。３０分後、１ｃによって検出されたＥアイソマーはなかった。混合および精製の後、産物は全体で２０６０ｇであり、８７％の収量であった。この物質をアセトニトリルから再結晶させる。１５００ｇの再結晶物質を６Ｌの水および９１０ｍｌの３．８８Ｎ  ＮａＯＨ中で溶解し、次いで、ｐＨ７に中性化し、そして凍結乾燥し、１５６９ｇ（９８．６％）の標記の化合物を生じる。
【０３２２】
【化１５】
2010031038.tif 000018
括弧中、または別の方法で上記に提供される全ての学術文献、参考文献および特許の引用は、以前に述べられようとなかろうと、本明細書中で参考として援用される。
【０３２３】
本発明は、上記で提供される実施例に対する参考と共に記載されるが、種々の改変が本発明の精神から逸脱することなく行われ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、特許請求の範囲によってのみ制限される。
【０３２４】
【表２】
2010031038.tif 000019
2010031038.tif 000020
【０３２５】
【表３】
2010031038.tif 000021
【０３２６】
【表４】
2010031038.tif 000022
【０３２７】
【表５】
2010031038.tif 000023
【０３２８】
【表６】
2010031038.tif 000024
2010031038.tif 000025
【０３２９】
【表７】
2010031038.tif 000026
【０３３０】
【表８】
2010031038.tif 000027
【０３３１】
【表９】
2010031038.tif 000028
2010031038.tif 000029
【０３３２】
【表１０】
2010031038.tif 000030
【０３３３】
【表１１】
2010031038.tif 000031
【図１】
2010031038.tif 000032
【図２】
2010031038.tif 000033
【図３】
2010031038.tif 000034
【図４】
2010031038.tif 000035
【図５】
2010031038.tif 000036
【図６】
2010031038.tif 000037
【図７】
2010031038.tif 000038
【図８】
2010031038.tif 000039
【図９Ａ】
2010031038.tif 000040
【図９Ｂ】
2010031038.tif 000041