(57)【要約】【課題】低分子量薬物及びペプチドやタンパク質などの高分子化合物を注射以外の方法で効率良く投与するために使用され得る医薬組成物、並びにかかる組成物を製造するための方法を提供すること。【解決手段】（ａ）所定のｐＨで正若しくは負の電荷を有する薬物、（ｂ）医薬上許容される微粒子及び（ｃ）該ｐＨで帯電しうる医薬上許容される表面被覆ポリマーを含む経粘膜投与用医薬組成物であって、該表面被覆ポリマーは該微粒子の表面を被覆しており、該薬物は該表面被覆ポリマーを介して該微粒子の表面に固定化されており、且つ、該微粒子と該表面被覆ポリマーとが非共有結合的に相互作用し、同時に該表面被覆ポリマーと該薬物とが互いに静電相互作用することにより複合体を形成することを特徴とする、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）所定のｐＨで正若しくは負の電荷を有する薬物、（ｂ）医薬上許容される微粒子及び（ｃ）該ｐＨで帯電しうる医薬上許容される表面被覆ポリマーを含む経粘膜投与用医薬組成物であって、該表面被覆ポリマーは該微粒子の表面を被覆しており、該薬物は該表面被覆ポリマーを介して該微粒子の表面に固定化されており、且つ、該微粒子と該表面被覆ポリマーとが非共有結合的に相互作用し、同時に該表面被覆ポリマーと該薬物とが静電相互作用することにより複合体を形成することを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記微粒子と前記表面被覆ポリマーとの非共有結合的な相互作用が静電相互作用であることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
所定のｐＨが投与部位の生理的ｐＨである、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
前記薬物がペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、多糖、抗原及び低分子量薬物からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
前記薬物が薬効或いはワクチン効果をもたらしうる薬物である、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
前記薬物がインスリンである、請求項４記載の組成物。
【請求項７】
前記薬物がブロムヘキシン、ゾルミトリプタン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種類の薬物である、請求項４記載の組成物。
【請求項８】
前記表面被覆ポリマーが前記所定のｐＨにおいて単独では難水溶性である、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
前記表面被覆ポリマーがキトサン、ポリアルギニン、ポリアクリル酸、ポリガンマグルタミン酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種類のポリマーである、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
前記表面被覆ポリマーが粘膜付着性であり、且つ／又は経粘膜吸収促進因子として機能する、請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
前記微粒子がカルボキシル基又はアミノ基を含むポリマーを含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
前記微粒子がポリ乳酸グリコール酸共重合体からなる、請求項１〜１１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１３】
前記所定のｐＨにおける前記複合体の平均粒径が１０ｎｍ以上５０μｍ以下である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
請求項８記載の組成物の製造方法であって、
（ａ）前記表面被覆ポリマーが易水溶性であるｐＨで、前記薬物、前記微粒子及び前記表面被覆ポリマーを混合し、
（ｂ）該混合液のｐＨを前記所定のｐＨに調整することを特徴とする、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の組成物の製造方法であって、
（ａ）前記薬物と前記表面被覆ポリマーとが同符号の電荷を持つようなｐＨ条件下で、前記薬物、前記表面被覆ポリマー及び前記微粒子を混合した後、
（ｂ）該混合物のｐＨを前記薬物の電荷が反対符号に変化するようなｐＨに調整すること
を含み、ここで前記薬物は両性薬物である、方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の製造方法であって、
前記工程（ａ）のｐＨ条件において、前記微粒子が、前記薬物及び前記表面被覆ポリマーの電荷と反対符号に帯電していることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の組成物の製造方法であって、
（ａ）前記微粒子材料の有機溶媒溶液を前記表面被覆ポリマーの水溶液中へ滴下し、
（ｂ）該有機溶媒を揮散させた後、
（ｃ）前記薬物を添加して混合し、
（ｄ）該混合液のｐＨを前記所定のｐＨに調整することを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経粘膜投与用医薬組成物及びその製造方法に関する。より詳細には、本発明は、薬物、微粒子及び表面被覆ポリマーからなる複合体を含み、ここで該表面被覆ポリマーは該微粒子の表面を被覆しており、該薬物は該表面被覆ポリマーを介して該微粒子の表面に固定化されており、且つ、該微粒子と該表面被覆ポリマーとが非共有結合的に相互作用し、同時に該表面被覆ポリマーと該薬物とが静電相互作用することにより該複合体を形成することを特徴とする新規経粘膜投与用医薬組成物；並びにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーの発達は、ペプチド、タンパク質、多糖、ポリ核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ、抗体、抗原、低分子量薬物などの多くの治療化合物の発見をもたらした。しかしながら、これらの化合物の多くは、その物理化学的特性（例えば、大きな分子量、親水性、不安定性など）のために、注射以外の方法による体内への投与が難しい。これらの化合物のなかには注射により毎日複数回投与する必要があるものがあるが、若年患者は必ずしも、そのような化合物についてのこの服用計画を順守するわけではないことが特に問題となっている(非特許文献１及び２)。
【０００３】
経口経路、或いは肺、口腔、膣及び鼻などの粘膜を通じたその他の粘膜送達経路による投与において、そのような薬物は、その物理的大きさや親水性によって吸収されにくい。更に、それらの薬物は、ペプチダーゼやプロテアーゼなどの酵素による分解を受けやすく、特に消化管においてそのことが問題となる。それらの薬物の粘膜表面を通じた輸送を改善するために、吸収促進剤を含有する製剤が使用されてきたが、そのような製剤は特に経鼻経路及び肺経路による送達においてある程度の成功を収めてきた。しかしながら、より大きな分子量を持つ化合物の粘膜表面を通じた輸送を達成するための効果的な方法及び組成物の開発が望まれている。
【０００４】
ペプチドやタンパク質などの高分子薬物の粘膜表面を通じた輸送のための手段として、ナノ粒子などの微粒子を使用するシステムが広く検討されてきた（非特許文献３−５）。ペプチド及びタンパク質薬物の場合、ナノ粒子のマトリックス内に薬物を封入しなければ安定性が低いことが示されてきたが、それらの化合物のサイズが大きいことやナノ粒子のマトリックス内が通常疎水的環境であることから、それらの化合物のナノ粒子への封入は困難であり、その結果、通常非常に低い担持能となっており、従って粘膜表面に多量のナノ粒子を投与する必要がある。更には、粘膜を通じたナノ粒子の輸送は容易に達成されるものではないことが、文献において明らかにされている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Drug Discovery Today, Vol.7, pp.1184-1189 (2002)
【非特許文献２】J. Control. Rel., Vol.87, pp.187-198 (2003)
【非特許文献３】J. Pharm. Sci., Vol.96, pp.473-483 (2007)
【非特許文献４】Biomaterials, Vol.23, pp.3193-3201 (2002)
【非特許文献５】Int. J. Pharm., Vol.342, pp.240-249 (2007)
【非特許文献６】J. Pharm. Sci., Vol.96, pp.473-483 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、低分子量薬物又はペプチドやタンパク質などの高分子化合物を注射以外の方法で効率良く投与するために使用され得る医薬組成物を提供することにある。より詳細には、本発明の目的は、低分子量薬物又はペプチドやタンパク質などの高分子薬物を鼻などの粘膜を通じた経路で効率良く投与するための微粒子を含む医薬組成物であって、これまでの経粘膜投与用微粒子製剤と比較して優れた薬物の担持率及び担持能を有すると同時に薬物の安定性向上も達成した微粒子含有医薬組成物を提供することにある。本発明はまた、かかる医薬組成物を製造するための方法を提供することもその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、薬物（例えば、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、多糖、抗体、抗原、低分子量化合物など）を注射以外の方法で効率良く投与するための方法として、ナノ粒子などの微粒子システムを使用した経粘膜投与に着目し鋭意検討を重ねた。その結果、薬物と表面被覆ポリマー（即ち、微粒子の表面に付着するポリマー）との間の静電相互作用によって形成されている薬物−表面被覆ポリマー複合体が、微粒子と表面被覆ポリマーとの間の非共有結合的な相互作用によって微粒子表面に固定化されている複合体を含む組成物を作製することにより、同じ薬物の溶液製剤と比較して著しく薬物の安定性が向上することを見出した。更に、該組成物は、薬物を封入するタイプの微粒子製剤と比較して、優れた薬物担持能を有することも見出した。これらの知見から、該組成物を使用することにより、従来法より優れた薬物送達システムを達成することが可能であることを本発明者らは見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の通りである。
【０００８】
［１］（ａ）所定のｐＨで正若しくは負の電荷を有する薬物、（ｂ）医薬上許容される微粒子及び（ｃ）該ｐＨで帯電しうる医薬上許容される表面被覆ポリマーを含む経粘膜投与用医薬組成物であって、該表面被覆ポリマーは該微粒子の表面を被覆しており、該薬物は該表面被覆ポリマーを介して該微粒子の表面に固定化されており、且つ、該微粒子と該表面被覆ポリマーとが非共有結合的に相互作用し、同時に該表面被覆ポリマーと該薬物とが静電相互作用することにより複合体を形成することを特徴とする、組成物。
［２］前記微粒子と前記表面被覆ポリマーとの非共有結合的な相互作用が静電相互作用であることを特徴とする、上記［１］記載の組成物。
［３］所定のｐＨが投与部位の生理的ｐＨである、上記［１］又は［２］記載の組成物。
［４］前記薬物がペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、多糖、抗原及び低分子量薬物からなる群より選択される、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の組成物。
［５］前記薬物が薬効或いはワクチン効果をもたらしうる薬物である、上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の組成物。
［６］前記薬物がインスリンである、上記［４］記載の組成物。
［７］前記薬物がブロムヘキシン、ゾルミトリプタン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種類の薬物である、上記［４］記載の組成物。
［８］前記表面被覆ポリマーが前記所定のｐＨにおいて単独では難水溶性である、上記［１］〜［７］のいずれか１つに記載の組成物。
［９］前記表面被覆ポリマーがキトサン、ポリアルギニン、ポリアクリル酸、ポリガンマグルタミン酸及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種類のポリマーである、上記［１］〜［８］のいずれか１つに記載の組成物。
［１０］前記表面被覆ポリマーが粘膜付着性であり、且つ／又は経粘膜吸収促進因子として機能する、上記［１］〜［９］のいずれか１つに記載の組成物。
［１１］前記微粒子がカルボキシル基又はアミノ基を含むポリマーを含む、上記［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の組成物。
［１２］前記微粒子がポリ乳酸グリコール酸共重合体からなる、上記［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の組成物。
［１３］前記所定のｐＨにおける前記複合体の平均粒径が１０ｎｍ以上５０μｍ以下である、上記［１］〜［１２］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４］上記［８］記載の組成物の製造方法であって、
（ａ）前記表面被覆ポリマーが易水溶性であるｐＨで、前記薬物、前記微粒子及び前記表面被覆ポリマーを混合し、
（ｂ）該混合液のｐＨを前記所定のｐＨに調整することを特徴とする、方法。
［１５］上記［１］〜［１３］のいずれか１つに記載の組成物の製造方法であって、
（ａ）前記薬物と前記表面被覆ポリマーとが同符号の電荷を持つようなｐＨ条件下で、前記薬物、前記表面被覆ポリマー及び前記微粒子を混合した後、
（ｂ）該混合物のｐＨを前記薬物の電荷が反対符号に変化するようなｐＨに調整すること
を含み、ここで前記薬物は両性薬物である、方法。
［１６］上記［１５］記載の製造方法であって、
前記工程（ａ）のｐＨ条件において、前記微粒子が、前記薬物及び前記表面被覆ポリマーの電荷と反対符号に帯電していることを特徴とする方法。
［１７］上記［１］〜［１３］のいずれか１つに記載の組成物の製造方法であって、
（ａ）前記微粒子材料の有機溶媒溶液を前記表面被覆ポリマーの水溶液中へ滴下し、
（ｂ）該有機溶媒を揮散させた後、
（ｃ）前記薬物を添加して混合し、
（ｄ）該混合液のｐＨを前記所定のｐＨに調整することを特徴とする、方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の組成物を使用することにより、これまで注射以外の方法で投与することが難しかった低分子量薬物及びペプチドやタンパク質などの高分子薬物を効率良く経粘膜投与することが可能となる。本発明の組成物中に含有された薬物は、反対電荷の表面被覆ポリマー、及び微粒子と複合体を形成することにより、溶液製剤に含有された場合よりも高い安定性（例えば、対酵素安定性、保存安定性）を有し、尚且つ、微粒子のマトリックス中に薬物を封入した微粒子製剤と比較して、高い薬物担持能を有する。更に、微粒子表面で薬物と複合体を形成する表面被覆ポリマーの種類によって、薬物の徐放性及び速放性を達成すること、並びに経粘膜吸収性の調節をすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】インスリン−キトサン複合体で表面被覆されたＰＬＧＡコア粒子からなる表面被覆微粒子（表面キャリアシステム）の作製のメカニズムを説明する図である。
【図２】ＰＬＧＡ微粒子表面でのインスリン−キトサン複合体の形成について試験した結果を示す図である。左のヒストグラムはｐＨ ６．０の緩衝液中のインスリンの放出、右のヒストグラムはｐＨ ４．５の緩衝液中のインスリンの放出を示しており、縦軸は放出されたインスリン量（μｇ）を表す。
【図３】インスリン−キトサン複合体で表面被覆されたＰＬＧＡコア粒子の、飛行時間型２次イオン質量分析（Time of Flight Secondary Ion Mass Spectrometry; ToF-SIMS)での分析結果を示す図である。上段は各試料（ＰＬＧＡ、キトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）及び表面被覆微粒子（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ））中のｍ／ｚ＝３３ピークの検出結果を示し（横軸：ｍ／ｚ；縦軸：検出強度）、下段は、観察視野における表面被覆微粒子のｍ／ｚ＝３３ピークの分布画像（左図）と全イオンの分布画像（右図）をそれぞれ示す。
【図４】培養後にキモトリプシン溶液中に残った分解されなかったインスリンの割合（％）を示す図である。上の棒は遊離インスリン溶液の場合、下の棒はＰＬＧＡ／キトサン／インスリン表面被覆微粒子の場合に対応する。
【図５】ブタ鼻粘膜に対するインスリン透過試験に用いた方法を説明する模式図である。
【図６】ブタ鼻粘膜に対するインスリン透過試験の結果を示す図である。横軸は透過試験開始後の時間（分）を示し、縦軸は所定の時間までにブタ鼻粘膜を透過したインスリン量（ｎｇ／ｃｍ２）を示す。
【図７】表面被覆微粒子或いはキトサン／インスリン混合物の粒子径を測定した結果を示す図である。（ａ）は表面被覆微粒子（コア粒子を有する；ＰＬＧＡ１００／キトサン／インスリン＝１２５０／９００／２００  μｇ／ｍｌ）の粒子径分布、（ｂ）はキトサン／インスリン混合物（コア粒子を持たない；キトサン／インスリン＝９００／２００  μｇ／ｍｌ）の粒子径分布を示す。横軸は粒子の半径（ｎｍ）を示し、縦軸は強度を示す。
【図８】表面被覆微粒子（ＰＬＧＡ１００／キトサン／インスリン＝２５０／１８０／４０  μｇ／ｍｌ）の凍結乾燥前及び凍結乾燥再懸濁後の粒子径を測定した結果を示す図である。（ａ）は凍結乾燥前の表面被覆微粒子の粒子径分布、（ｂ）は凍結乾燥再懸濁後の表面被覆微粒子の粒子径分布を示す。横軸は粒子の半径（ｎｍ）を示し、縦軸は強度を示す。
【図９】実施例７の試料及び比較対照の試料をラットに経鼻投与した後の血中グルコースレベルを示す。結果は試料投与前グルコースレベルを１００％として、相対的なグルコースレベル低下を％表示した。平均値±標準誤差で示した。
【図１０】実施例８の試料を用いたインビトロ放出試験（Ｎ＝３）（５ｍＭ ＭＥＳ等張バッファ（ｐＨ６）、３７℃）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、（ａ）所定のｐＨで正若しくは負の電荷を有する薬物、（ｂ）医薬上許容される微粒子及び（ｃ）該ｐＨで帯電しうる医薬上許容される表面被覆ポリマーを含む経粘膜投与用医薬組成物を提供する。該組成物において、該表面被覆ポリマーは該微粒子の表面を被覆しており、該薬物は該表面被覆ポリマーを介して該微粒子の表面に固定化されており、且つ、該微粒子と該表面被覆ポリマーとが非共有結合的に相互作用し、同時に該表面被覆ポリマーと該薬物とが静電相互作用することにより複合体（該複合体を以下、「表面被覆微粒子」ともいう）を形成する。
【００１２】
「経粘膜投与用医薬組成物」とは、処置（treatment）及び／又は治療（therapy）を必要とする対象の粘膜に対して、塗布、スプレー、噴霧、貼付など適切な方法で投与され、薬物が粘膜組織へと、又は粘膜組織を通して循環器系或いは免疫系へと送達されることにより薬効或いはワクチン効果をもたらし得る医薬組成物を意味する。経粘膜投与用医薬組成物は、例えば、全身送達のために、粘膜を通して吸収され得る。粘膜の例としては、肺、口腔、眼、膣、胃腸管及び鼻などの粘膜が挙げられる。投与の簡便さの観点から、前記粘膜としては鼻粘膜が好ましい。
【００１３】
表面被覆微粒子を構成する上記（ｃ）の医薬上許容される表面被覆ポリマーは、上記の通り、微粒子の表面を被覆する。ここでいう「被覆」は、該表面被覆ポリマーが、該微粒子の内部ではなく、該微粒子の表面に、該微粒子と該表面被覆ポリマーとの間の非共有結合的な相互作用によって付着していることを単に意味しており、該微粒子の表面全体が該表面被覆ポリマーによって覆われることを必ずしも意味しない。
表面被覆ポリマーは、生体適合性であることが望ましい。本明細書において、用語「生体適合性」とは、ある物質及びその分解産物が、生体組織又は生体システム（例、血液循環系、神経系、免疫系など）に対して中毒的又は損傷的な影響を与えないことを意味する。生体適合性のポリマーは、ヒト又は他の動物への投与に適したものである。該表面被覆ポリマーはまた、生分解性であることがより好ましい。本明細書において、用語「生分解性」とは、ある物質が、酵素的、化学的若しくは物理的プロセスなどにより生体内で許容される時間内に分解されて、より小さな化学種を形成することを意味する。ある物質の生体適合性及び生分解性を検査する方法は、当該技術分野において周知である。
【００１４】
表面被覆ポリマーは、天然ポリマーであっても、或いは合成ポリマーであっても良い。表面被覆ポリマーは、所定のｐＨにおいて、微粒子の表面で薬物とイオン結合するため、該所定のｐＨで該薬物と反対電荷を有するポリマーでなければならない。該所定のｐＨで同じ符号に帯電しうるポリマー同士であれば、必要に応じて２種類以上のポリマーを表面被覆ポリマーのために併用することもできる。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、例えば後述する製造法により製造され得るが、当該製造法により製造する場合、前記所定のｐＨにおいて単独では難水溶性であっても、表面被覆ポリマーが易水溶性であるｐＨで薬物及び微粒子と混合した後、該混合液のｐＨを前記所定のｐＨに調整することによって製造が可能である。従って、表面被覆ポリマーのために、前記所定のｐＨにおいて易水溶性であるポリマーだけでなく、前記所定のｐＨにおいて難水溶性であるポリマーも使用され得る。
【００１６】
表面被覆ポリマーに使用され得るポリマーは、以下に限定されないが、ポリアニオン性又はポリカチオン性の多糖、ポリアミノ酸及びその他の帯電したポリマーから選択され得る。該ポリマーは、使用される薬物の種類、表面被覆ポリマーの電荷、および薬物の電荷などに応じて適宜選択される。
【００１７】
本発明に使用され得るポリアニオン性の多糖とは、カルボキシル基、硫酸基又はリン酸基などの１つ以上の酸性極性基を構成単位中に有する多糖類である。そのようなポリアニオン性の多糖の例としては、以下に限定されないが、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ペクチン、ヒアルロン酸、これらの誘導体や塩などが挙げられる。
【００１８】
本発明に使用され得るポリカチオン性の多糖とは、アミノ基などの１つ以上の塩基性極性基を構成単位中に有する多糖類である。そのようなポリカチオン性の多糖の例としては、以下に限定されないが、キチン、キトサン、これらの誘導体や塩などが挙げられる。キトサンおよびキトサン誘導体は、様々な分子量及び脱アセチル化の程度のものから選択することができ、また、キトサン誘導体については、様々な置換の程度のものから選択することができる。
【００１９】
本発明に使用され得るポリアニオン性のポリアミノ酸とは、等電点が生理的ｐＨよりも酸性側にあるポリアミノ酸であり、その例としては、以下に限定されないが、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、これらの誘導体や塩などが挙げられる。
【００２０】
本発明に使用され得るポリカチオン性のポリアミノ酸とは、等電点が生理的ｐＨよりも塩基性側にあるポリアミノ酸であり、その例としては、以下に限定されないが、ポリリジン、ポリアルギニン、これらの誘導体や塩などが挙げられる。
【００２１】
表面被覆ポリマーに使用され得るポリマーとして、上記の多糖及びポリアミノ酸以外に、ポリエチレンイミンやポリアクリル酸、これらの誘導体や塩なども挙げられる。
【００２２】
表面被覆ポリマーは、ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）及び／又はグリコシル化されていても良い。
【００２３】
表面被覆ポリマーは、更に、粘膜付着性であってもよく、且つ／又は経粘膜吸収促進因子として機能しても良い。粘膜付着性ポリマーとしては、例えば、キトサン、ポリアクリル酸、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースなどの他に、それらのＰＥＧ化されたポリマー類などが挙げられる。また、経粘膜吸収促進因子として機能するポリマーとしては、例えば、キトサン、ポリアクリル酸、ポリアルギニン、これらの塩や誘導体などが挙げられる。
【００２４】
表面被覆ポリマーの分子量は、分解速度、機械強度、溶解度、表面被覆ポリマーと共に複合体を形成することになる薬物の種類などの要素を考慮して当業者は決定することができる。典型的には、ゲル浸透クロマトグラフィー法により測定した表面被覆ポリマーの重量平均分子量は、好ましくは１，０００Ｄａ以上、より好ましくは２，０００Ｄａ以上であるべきであり、また、好ましくは１，０００，０００Ｄａ以下、より好ましくは５００，０００Ｄａ以下であるべきである。従って、典型的には、表面被覆ポリマーの重量平均分子量は、好ましくは１，０００−１，０００，０００Ｄａであり、より好ましくは２，０００−５００，０００Ｄａである。例えば、キチン又はキトサンの重量平均分子量は、１，０００−１，０００，０００Ｄａであり得、キチン又はキトサンの脱アセチル化の程度は、２０−１００％であり得る。
【００２５】
本発明の組成物は、表面被覆ポリマーの選択により、徐放性又は速放性の組成物として薬物の放出速度の制御、及び薬物の経粘膜吸収性の調節が可能となる。当業者は、該組成物が所望の薬動力学的特性を持つよう、表面被覆ポリマーを適切に選択することができる。
【００２６】
本発明の組成物に使用される薬物は、その使用目的に応じて選択される。本発明の組成物において、薬物は、微粒子の表面で適切な表面被覆ポリマーとイオン結合するため、該組成物において使用され得る薬物は、所定のｐＨで正若しくは負に帯電する（即ち、表面被覆ポリマーと反対の電荷を有する）薬物でなければならない。かかる条件を満足する限り、任意の薬物が本発明の組成物で使用され得る。なお該所定のｐＨで同じ符号に帯電しうる薬物同士であれば、必要に応じて２種類以上の薬物を併用することもできる。
【００２７】
該薬物は、以下に限定されないが、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、多糖、抗体、抗原、低分子量化合物などであり得る。本発明の医薬組成物は、例えば後述する製造法により製造され得るが、当該製造法により製造する場合、薬物が表面被覆ポリマーと静電相互作用しない帯電条件でそれらをよく混合した後にｐＨ変化により薬物と表面被覆ポリマーとの間にイオン結合を生じさせることが可能であるため、ｐＨの変化により調製過程で帯電（符号又は強さ）を変化させることができる薬物が特に好適であり得る。そのような薬物としては、ｐＨによって正にも負にも帯電するペプチドやタンパク質などの両性薬物、調製過程と組成物中に存在する場合とで帯電の強さが大きく変化するような酸解離定数（ｐＫａ）又は塩基解離定数（ｐＫｂ）を有する薬物、及び水に溶解して、ｐＨにあまり依存しない電荷を有し得る塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩など塩形態の低分子量薬物が挙げられる。
【００２８】
薬物としては、以下に限定されないが、例えば、抗高血圧剤、抗低血圧剤、鎮痛剤、抗精神病剤、抗鬱剤、抗躁剤、抗不安剤、鎮静剤、催眠剤、抗癲癇剤、オピオイドアゴニスト、喘息治療剤、麻酔剤、抗不整脈剤、関節炎治療剤、鎮痙剤、ＡＣＥインヒビター、鬱血除去剤、抗生物質、抗狭心症剤、利尿剤、抗パーキンソン病剤、気管支拡張剤、分娩促進剤、抗利尿剤、抗高脂血症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、制吐剤、抗感染症剤、抗新生物剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗糖尿病剤、抗アレルギー剤、解熱剤、抗腫瘍剤、抗痛風剤、抗ヒスタミン剤、止痒剤、骨調節剤、心血管剤、コレステロール低下剤、抗マラリア剤、喫煙を中止するための薬剤、鎮咳剤、去痰剤、粘液溶解剤、鼻詰り用薬剤、ドパミン作動剤、消化管用薬剤、筋弛緩剤、神経筋遮断剤、副交感神経作動剤、プロスタグランジン、興奮薬、食欲抑制剤、甲状腺剤又は抗甲状腺剤、ホルモン、抗偏頭痛剤、抗肥満剤、及び抗炎症剤などが挙げられる。薬物は予防的ワクチン、免疫療法、抗体治療、遺伝子治療、遺伝子発現抑制などを目的とした様々なペプチド、タンパク質、多糖、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子量薬物などから選択しても良い。
【００２９】
薬物の具体例としては、以下に限定されないが、インスリン、グルカゴン、ロイプロリド、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、血管内皮成長因子、エリスロポエチン、ヘパリン、シクロスポリン、オキシトシン、チロシン、エンケファリン、チロトロピン放出ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、バソプレシン、バソプレシン類似体、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキンＩＩ、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、メラニン細胞刺激ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−２、カタカルシン、コレシステキニン−１２、コレシステキニン−８、エキセンディン、ゴナドリベリン関連ペプチド、インスリン様タンパク質、ロイシン−エンケファリン、メチオニン−エンケファリン、ロイモルフィン、ニューロフィジン、コペプチン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＡＦ、ＰＡＣＡＰ関連ペプチド、膵臓ホルモン、ペプチドＹＹ、ウロテンシン、腸ペプチド、副腎皮質刺激ペプチド、上皮成長因子、プロラクチン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨアゴニスト、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、エンドルフィン、アンジオテンシン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、ヘパリナーゼ、インフルエンザワクチン用抗原、破傷風毒素、癌ワクチン用ペプチド、β−アミロイド、免疫グロブリン、肝硬変治療用ｓｉＲＮＡ、癌治療用ｓｉＲＮＡ、ブロムヘキシン、グラニセトロン、ゾルミトリプタン、スマトリプタンなどの低分子量薬物やそれらの薬学的に許容される塩などが挙げられる。
【００３０】
上述したように、薬物及び表面被覆ポリマーは、微粒子表面において静電相互作用により結合して薬物−表面被覆ポリマー複合体を形成する。該複合体を形成する薬物と表面被覆ポリマーとの組み合わせについて、所定のｐＨにおいて正電荷を有する薬物と負電荷を有する表面被覆ポリマーとの組み合わせであっても良く、或いは所定のｐＨにおいて負電荷を有する薬物と正電荷を有する表面被覆ポリマーとの組み合わせであっても良い。
【００３１】
前記医薬上許容される微粒子（本明細書において、用語「微粒子」は、上記（ｂ）の微粒子を意味しているが、「表面被覆微粒子」との区別を特に明確にするために、該微粒子を「コア微粒子」と呼ぶこともある）は、生体適合性のポリマーからなることが望ましい。該ポリマーは、生分解性であっても非生分解性であっても良いが、生体に対する安全性の観点から、生分解性のものが好ましい。また、該ポリマーは、天然ポリマーであっても、或いは合成ポリマーであっても良い。
【００３２】
微粒子のために使用され得る生体適合性且つ生分解性のポリマーとしては、以下に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ＰＥＧとＰＬＧＡとのブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、ポリ無水化合物、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリヒドロキシブチラート、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリジアキサノン、ポリエステルアミド、ポリホスファゼン、ポリシアノアクリラート、キトサン、キトサン誘導体、スターチ、スターチ誘導体、アルブミン、フィブリン、フィブリノゲン、セルロース、コラーゲン、ヒアルロン酸、これらの物質の混合物及びコポリマー類などが挙げられる。
【００３３】
微粒子のために使用され得る生体適合性且つ非生分解性のポリマーとしては、以下に限定されないが、例えば、ポリアクリラート、ポリアクリラートエステル、ポロキサマー、テトロニクス、ポリエチレン、ポリメチルメタクリラート、ポリメチルメタクリラートエステル、ポリスチレン、エチレンビニルアセタート、アシル化酢酸セルロース、ポリウレタン、塩化ポリビニル、これらの物質の混合物及びコポリマー類などが挙げられる。
【００３４】
上記微粒子は、親水性であっても疎水性であっても良い。水系での微粒子の調製過程及び表面被覆微粒子の調製過程において、微粒子の形状及び大きさを維持するのが容易という観点から、疎水性の微粒子が好ましい。好適な例として、カルボキシル基又は第１級、第２級若しくは第３級アミノ基を有する疎水性ポリマーが微粒子に使用され得る。
【００３５】
該微粒子のためのポリマーの分子量は、分解速度、機械強度、溶解度などの要素を考慮して当業者によって決定され得る。典型的には、ゲル浸透クロマトグラフィー法により測定した該ポリマーの重量平均分子量として、１，０００Ｄａ（ダルトン）以上が好ましく、２，０００Ｄａ以上がより好ましく、また、１，０００，０００Ｄａ以下が好ましく、５００，０００Ｄａ以下がより好ましい。従って、典型的には、該ポリマーの重量平均分子量として、１，０００−１，０００，０００Ｄａが好ましく、２，０００−５００，０００Ｄａがより好ましい。
【００３６】
コア微粒子の大きさとしては、１ｎｍ以上、好ましくは５ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上の平均粒径を持ち、尚且つ５０μｍ以下、好ましくは２０μｍ以下、より好ましくは１０μｍ以下の平均粒径を持つ粒子が挙げられる。
なお、ここでいう粒径は、微粒子を前記“所定のｐＨ”の水溶液中に分散させて測定した値である。粒径は、粒子径測定装置により測定し、粒子の形状を球であると仮定して算出した直径のことである。粒子径測定装置及び平均粒径の算出方法は、粒子サイズに応じて使い分ける。即ち、動的光散乱測定装置において測定可能な粒子サイズの場合（通常７μｍ以下）は、動的光散乱測定装置において測定し、散乱強度分布から求めた流体力学的直径の平均値を平均粒径として採用する。動的光散乱測定装置により測定できない大きい粒子サイズの場合（通常７μｍよりも大きい場合）は、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定し、頻度分布を算術平均して求めた平均径を平均粒径として採用する。
ここで、コア微粒子の平均粒径が、例えば、１０ｎｍ以上であるとは、上記の動的光散乱測定装置の散乱強度分布の各粒子径ピークの割合（全ピーク累積散乱強度に対する各粒子径ピークの累積散乱強度の割合）、又は上記のレーザー回折式粒度分布測定装置における頻度分布の各粒子径ピークの割合（全ピーク累積頻度に対する各粒子径ピークの累積頻度の割合）において、粒子径ピークの平均粒径のうちの１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上が１０ｎｍ以上であることをいう。
【００３７】
本発明の組成物を粘膜に投与したとき、表面被覆微粒子は、粘膜表面に達するか又は粘膜組織に取り込まれ得、そこで薬物を放出する。薬物はその後、血流に輸送される。微粒子が十分小さい場合（例えば、微粒子の粒径が２０ｎｍ以下）、細胞間隙を通過して血流に到達する可能性がある。或いは、微粒子は、鼻又は腸などの一部の粘膜においてＭ細胞又はＭ様細胞に取り込まれて免疫系或いはリンパ系に輸送され得る。
【００３８】
上記微粒子の製造は、文献に記載された様々な方法により行うことができる。該文献としては、例えば、Champion JA. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.104, pp.11901-4 (2007); Chattopadhyay P. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., Vol.59, pp.443-53 (2007); Zhou WY et al., J. Mater. Sci. Mater. Med., Vol.19, pp.103-110 (2008); Schaffazick SR et al., Pharmazie, Vol.62, pp.354-60 (2007); Almeida AJ et al., Adv. Drug Deliv. Rev., Vol.59, pp.478-90 (2007); Muller, R.H., “Colloidal Carriers for Controlled Drug Delivery and Targeting: Modification, Characterization and In vivo Distribution”, CRC Press (1991); Jorg Kreuter (ed.), Colloidal Drug Delivery Systems, Marcel Dekker (1994)などが挙げられる。該微粒子の製造に使用され得る方法としては、例えば、ナノ沈殿（nanoprecipitation）、相分離、乳化、自己集合、高圧均質化、複合体形成（complexation）、イオンゲル化などが挙げられる。
【００３９】
上述した通り、微粒子は、表面被覆ポリマーと非共有結合的に相互作用して表面被覆微粒子を生成するものである必要がある。ここでいう非共有結合的な相互作用とは、静電相互作用、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合など、共有結合によらない相互作用のことである。このうち例えば静電相互作用を利用する場合には、該微粒子は、静電相互作用するため、所定のｐＨで表面被覆ポリマーと逆の符号の電荷を有するポリマーでなければならない。従って、組成物に使用する薬物、表面被覆ポリマー及び微粒子のためのポリマーの選択に関して、所定のｐＨにおいて正の電荷を有する薬物、負の電荷を有する表面被覆ポリマー、及び正の電荷を有する微粒子のためのポリマーの組み合わせ、或いは所定のｐＨにおいて負の電荷を有する薬物、正の電荷を有する表面被覆ポリマー、及び負の電荷を有する微粒子のためのポリマーの組み合わせとなる。そのような組み合わせとなるために薬物、表面被覆ポリマー及び微粒子のためのポリマーが満たすべき等電点（ｐＩ）又は酸解離定数（ｐＫａ）若しくは塩基解離定数（ｐＫｂ）に関する条件はそれぞれ以下の通りである：薬物及び微粒子のためのポリマーのｐＩ又はｐＫａ若しくは（１４−ｐＫｂ）の値が製造後の組成物のｐＨよりも高く、且つ表面被覆ポリマーのｐＩ又はｐＫａ若しくは（１４−ｐＫｂ）の値が製造後の組成物のｐＨよりも低い；或いは薬物及び微粒子のためのポリマーのｐＩ又はｐＫａ若しくは（１４−ｐＫｂ）の値が製造後の組成物のｐＨよりも低く、且つ表面被覆ポリマーのｐＩ又はｐＫａ若しくは（１４−ｐＫｂ）の値が製造後の組成物のｐＨよりも高い。各化合物について、等電点及び／又は酸解離定数を決定することは当業者の通常の技術的範囲内である。或いは、水中で溶解して帯電しうる塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩など塩形態の低分子量薬物の場合は、該組成物は、水中での薬物の帯電とは逆の符号の電荷を有する表面被覆ポリマー、水中での薬物の帯電と同じ符号の電荷を有する微粒子とを、帯電した薬物と組み合わせて調製してもよい。
【００４０】
前記所定のｐＨ、即ち製造後の組成物のｐＨは、局所刺激を回避するために、投与部位の生理的ｐＨに設定することが望ましい。上述したように、本発明の組成物は、肺、口腔、眼、膣、腸及び鼻などの粘膜に投与され得るが、これらの様々の粘膜の生理的ｐＨは様々である。例えば、胃腸管の生理的ｐＨは、その長さに沿って、胃における約ｐＨ１から、結腸におけるｐＨ８まで上昇する；口腔は、６．８付近のｐＨを有する；鼻の流体のｐＨは、約ｐＨ５．５〜６．５の範囲にわたる；膣のｐＨは、４．５付近である。例えば、本発明の組成物が鼻粘膜投与用である場合、その好ましいｐＨ値として約６．０が挙げられる。
【００４１】
上述した通り、本発明の組成物における薬物として、インスリンが使用され得る。該組成物のｐＨが６．０である場合、インスリンの等電点は約ｐＨ５．３であるため、インスリンは組成物中で負に帯電している。従って、表面被覆ポリマーとしてはｐＨ６．０で正電荷を有するポリマーである必要がある。非共有結合性の相互作用として静電相互作用を利用して表面被覆ポリマーと微粒子を相互作用させる場合は、微粒子としてはｐＨ６．０で負電荷を有するポリマーからなる微粒子を好適な一例として用いることができる。かかる表面被覆ポリマーとしてはキトサンが挙げられ、微粒子のためのポリマーとしてはポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）が挙げられる。
上述した通り、本発明の組成物における薬物として、ブロムヘキシン、ゾルミトリプタン及びそれらの塩が使用され得る。該組成物のｐＨが６．０〜７．０である場合、該薬物は水中で正符号に帯電するため、表面被覆ポリマーとしては該ｐＨで負電荷を有するポリマーである必要がある。非共有結合性の相互作用として静電相互作用を利用して表面被覆ポリマーと微粒子を相互作用させる場合は、微粒子としては該ｐＨで正電荷を有するポリマーからなる微粒子を好適な一例として用いることができる。かかる表面被覆ポリマーとしてはポリアクリル酸及び又はポリガンマグルタミン酸又はそれらの塩が例として挙げられ、微粒子としてはキトサン微粒子やアミノ修飾したポリスチレン粒子が一例として挙げられる。
【００４２】
表面被覆微粒子の大きさとしては、１０ｎｍ以上、好ましくは２０ｎｍ以上、より好ましくは４０ｎｍ以上の平均粒径を持ち、尚且つ５０μｍ以下、好ましくは２０μｍ、より好ましくは１０μｍ以下の平均粒径を持つ粒子が挙げられる。
なお、ここでいう粒径は、表面被覆微粒子を前記“所定のｐＨ”の水溶液中に分散させて測定した値である。具体的には、表面被覆微粒子が懸濁液の場合は、懸濁液と同じｐＨ（前記所定のｐＨ）の水溶液で測定に適した濃度に希釈して測定する。表面被覆微粒子の剤型が、ドライパウダー、シート剤など、懸濁液以外の剤型に加工されていて、そのままでは粒径を測定できない場合は、水、又は適当なｐＨ緩衝液を加えて、前記“所定のｐＨ”の懸濁液に調製した後に粒径を測定する。粒径は、粒子径測定装置により測定し、粒子の形状を球であると仮定して算出した直径のことである。粒子径測定装置及び平均粒径の算出方法は、粒子サイズに応じて使い分ける。即ち、動的光散乱測定装置において測定可能な粒子サイズの場合（通常７μｍ以下）は、動的光散乱測定装置において測定し、散乱強度分布から求めた流体力学的直径の平均値を平均粒径として採用する。動的光散乱測定装置により測定できない大きい粒子サイズの場合（通常７μｍよりも大きい場合）は、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定し、頻度分布を算術平均して求めた平均径を平均粒径として採用する。
ここで、表面被覆微粒子の平均粒径が、例えば、１０ｎｍ以上であるとは、上記の動的光散乱測定装置の散乱強度分布の各粒子径ピークの割合（全ピーク累積散乱強度に対する各粒子径ピークの累積散乱強度の割合）、又は上記のレーザー回折式粒度分布測定装置における頻度分布の各粒子径ピークの割合（全ピーク累積頻度に対する各粒子径ピークの累積頻度の割合）において、粒子径ピークの平均粒子径のうちの１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上が１０ｎｍ以上であることをいう。
【００４３】
本発明の組成物における表面被覆微粒子は、コアとしての微粒子が存在することにより、単純に表面被覆ポリマーと薬物とを混合して複合体を形成させた場合と比べて、粒子径が単分散である。従って、本発明のような表面被覆微粒子の構成をとることによって、特性の揃った製剤の調製が容易となる。かかる特徴も本発明の利点である。
【００４４】
本発明の組成物は、表面被覆微粒子が、標的粘膜部位に直接到達できる製剤として送達される必要がある。該製剤の例としては、経肺投与剤、経口投与剤、口腔内投与剤、眼内投与剤、膣内投与剤、鼻腔内投与剤、坐剤などが挙げられる。
【００４５】
経肺投与剤としては、肺用吸入器により肺胞に送達される吸入剤が好ましい。
【００４６】
経口投与剤としては、通常の経口投与製剤、例えば錠剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤などであるが、小腸内で薬物が放出されるように工夫された剤型、例えば腸溶性錠剤、腸溶性顆粒剤、腸溶性カプセル剤、腸溶性細粒剤が好ましい。
【００４７】
口腔内投与剤、眼内投与剤及び鼻腔内投与剤としては、口腔錠剤、口腔スプレー、点眼剤、点鼻剤、エアゾール、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、液剤、懸濁液剤、ローション剤、ドライパウダー剤、シート剤、貼付剤などが挙げられる。
【００４８】
膣内投与剤及び坐剤としては、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、液剤、懸濁液剤、ローション剤、ドライパウダー剤、シート剤、カプセル剤などが挙げられる。
【００４９】
上記の剤形に製する方法としては、当該分野で一般的に用いられている公知の製造方法を適用することができる。また、上記の剤形に製する場合には、必要に応じて、特定の剤形に製する際に通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤などの担体、甘味剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤、着色剤、保存剤、安定剤などの各種製剤添加物などを適宜、適量含有させて製造することができる。また、本発明の組成物は、懸濁液を凍結乾燥するなどしてドライパウダー化した状態で保存し、使用時に該ドライパウダーに水を加えて再懸濁することもできる。かかる方法を採ることにより、組成物の保存安定性を向上させるために薬物、微粒子のためのポリマー、及び／又は表面被覆ポリマーの加水分解を回避することが可能となる。
【００５０】
本発明の組成物において、微粒子のためのポリマー、表面被覆ポリマー及び薬物の好適な組成比は、使用する微粒子、表面被覆ポリマー及び薬物によって変動するため一概には言えないが、例えば、微粒子のためのポリマーとしてポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、表面被覆ポリマーとしてキトサン、薬物としてインスリンを使用する場合、組成物中の重量比として、ＰＬＧＡ：キトサン：インスリン＝１：０．１〜１００：０．０１〜１００であり得る。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、安定かつ低毒性で安全に使用することができる。その投与頻度及び１回の投与量は、使用する薬物、患者の状態や体重、投与経路、治療方針などによって異なり一概には言えないが、例えば、糖尿病などの患者に薬物としてインスリンを使用した本発明の組成物を経鼻投与する場合には、一つの治療方針として、成人（体重約６０ｋｇ）に対して有効成分（インスリン）として約２ｍｇから約６ｍｇを毎食の前に投与することができる。
【００５２】
本発明はまた、上述した医薬組成物を製造する方法を提供する。本発明の方法は、適当なｐＨの溶液中で薬物と表面被覆ポリマーと微粒子とを混合し、任意でｐＨを変化させて、薬物と表面被覆ポリマーとの間で静電相互作用させ、表面被覆ポリマーと微粒子との間で非共有結合的に相互作用させることを含む。該方法は、加熱処理などが必要なく、簡便である。
【００５３】
該方法においては、事前に、薬物、表面被覆ポリマー及び微粒子のためのポリマーの組み合わせ並びに本発明の組成物のｐＨ（所定のｐＨ）を決定しておく。これらの要素の決定は、本発明の組成物の説明において上述した通りに行うことができる。また、通常、薬物、表面被覆ポリマー及び微粒子を混合する前に、上述した方法により微粒子を作製しておく。次いで、薬物と表面被覆ポリマーと微粒子との混合、及び任意でｐＨの調整を行い、本発明の表面被覆微粒子を製造する。混合及び任意でのｐＨ調整は、以下のａ）〜ｃ）からなる群から選択されるいずれか１つ：
ａ）薬物と表面被覆ポリマーとを、それらの複合体が形成されないｐＨを持つ溶液中で混合し、次いで微粒子を該溶液中に加えた後、溶液のｐＨを変化させて薬物と表面被覆ポリマーとの複合体形成及び微粒子表面への薬物−表面被覆ポリマー複合体の固定化を促進すること；
ｂ）薬物と表面被覆ポリマーとを、それらの複合体が形成されるｐＨを持つ溶液中で混合した後、微粒子を該溶液中に加えて薬物−表面被覆ポリマー複合体を微粒子表面に固定化させること；
ｃ）微粒子と表面被覆ポリマーとを、溶液中で混合して表面被覆ポリマーを微粒子の表面に固定化させ、次いで薬物を該溶液に加えた後、溶液のｐＨを調整して微粒子表面に固定化された表面被覆ポリマーと、薬物との複合体形成を促進すること、
を含む。
【００５４】
特に、表面被覆ポリマーが所定のｐＨにおいて単独では難水溶性である場合、まず、（ａ）前記表面被覆ポリマーが易水溶性であるｐＨで、前記薬物、前記微粒子及び前記表面被覆ポリマーを混合し、次いで、（ｂ）該混合液のｐＨを前記所定のｐＨに調整することが望ましい。
【００５５】
また、本発明の医薬組成物に用いる薬物として、ｐＨに応じて帯電の符号が変わる、いわゆる両性薬物を用いる場合には、本発明の医薬組成物の製造方法として、次の方法を用いることもできる。即ち、第一段階として、薬物の電荷と表面被覆ポリマーの電荷とが同符号となるようなｐＨ条件下で、薬物、表面被覆ポリマー及び微粒子を混合することで、薬物及び表面被覆ポリマーの両方を微粒子の表面に静電相互作用などの非共有結合性相互作用により引き寄せることができる。その上で、第二段階として、該混合物のｐＨを薬物の電荷が反対符号に変化するようなｐＨに調整すれば、微粒子表面において、そこに集められた薬物と表面被覆ポリマーとの間で効率よく静電相互作用による結合を形成させ、本発明の医薬組成物を効率よく製造することができる。この製造方法は、副生成物としての遊離の薬物−表面被覆ポリマー複合体（微粒子表面に固定化されていない）の生成を抑制できるので有用である。
この方法をインスリン（薬物；等電点：約５．３）、キトサン（表面被覆ポリマー）、ＰＬＧＡ微粒子（微粒子）を例にして説明すると、インスリンが正に帯電する“等電点未満のｐＨ”（例えば、ｐＨ４．５など）でインスリン、キトサン、ＰＬＧＡ微粒子を混合した後に、インスリンが負に帯電する“等電点より高いｐＨ”（ｐＨ６．０など）にｐＨを調整するという方法である。ｐＨ４．５及びｐＨ６．０のいずれにおいてもキトサンは正帯電、ＰＬＧＡ粒子は負帯電であるが、インスリンの電荷はｐＨ４．５で正帯電、ｐＨ６．０で負帯電になるので、ｐＨ６．０において、互いにイオン結合したキトサン及びインスリンがＰＬＧＡ微粒子の表面に固定化された本発明の組成物の一つを製造することもできる。なお、図１は、この実施態様を説明している。
即ち、本発明は、本発明の組成物の製造方法であって、
（ａ）薬物と表面被覆ポリマーとが同符号の電荷を持つようなｐＨ条件下で、薬物、表面被覆ポリマー及び微粒子を混合した後、
（ｂ）該混合物のｐＨを薬物の電荷が反対符号に変化するようなｐＨに調整すること
を含み、ここで該薬物は両性薬物である方法を提供する。
【００５６】
或いは、また別の製造方法として、特にコア粒子の粒子径を小さくすることで産物としての表面被覆微粒子の粒子径を小さく制御したい場合に有用な方法として、次の方法も利用できる。この方法では、予め微粒子を調製しておくのではなく、微粒子の調製と、微粒子及び表面被覆ポリマーとの静電相互作用とを同時に開始させる。具体的には、この方法では、上記したような微粒子の材料（例、ポリマー）を含む適当な有機溶媒溶液（例、アセトン溶液など）を表面被覆ポリマー水溶液中へ滴下し、攪拌などにより溶液中から有機溶媒を揮散させることで、コア粒子としての微粒子生成と、表面被覆ポリマーによる微粒子被覆とを開始させる。そこに薬物を添加し、混合した上で、任意でｐＨを変化させて、薬物と表面被覆ポリマーとの間並びに表面被覆ポリマーと微粒子の間で静電相互作用を促進させることで、表面被覆微粒子を製造する。
即ち、本発明は、本発明の組成物の製造方法であって、
（ａ）前記微粒子材料の有機溶媒溶液を前記表面被覆ポリマーの水溶液中へ滴下し、
（ｂ）該有機溶媒を揮散させた後、
（ｃ）前記薬物を添加して混合し、
（ｄ）該混合液のｐＨを前記所定のｐＨに調整することを特徴とする方法を提供する。
【００５７】
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例などによって制限されない。
【実施例】
【００５８】
作製例１：様々な粒子径のポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）微粒子の作製
ラクチド：グリコリド比が５０：５０であるＰＬＧＡ（ＲＥＳＯＭＥＲ  ＲＧ  ５０２Ｈ，Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を使用して、ＰＬＧＡ微粒子を作製した。ＨＰＬＣグレードのアセトンにＰＬＧＡを必要濃度で溶解した。ＰＬＧＡ／アセトン溶液を純水に１：３の割合となるまで、常時撹拌しながら滴下で加えた。アセトンが完全に蒸発するまで（約４時間）混合液を撹拌した。
その結果得られた微粒子の粒子径の分布を動的光散乱測定装置（ＤＬＳ  ８０２，Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）により測定した。ＰＬＧＡの濃度と得られた粒子の直径との関係を表１に示す。最初の有機溶媒溶液中のポリマー濃度を低くすることで、より微小な粒子が容易且つ再現性良く得られることが明らかとなった。
【００５９】
【表１】
2010031003.tif 000002
【００６０】
実施例１：２種類の緩衝系における薬物−表面被覆ポリマー複合体で表面被覆された微粒子システムの作製
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてキトサンを使用した。
ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，１６０μｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）１．５ｍｌをキトサン（Ｂｉｏｎｅｅｒ  １４３ｋＤａ，０．７２ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）１．５ｍｌに加え、最低３０分間室温で放置した。作製例１に記載したようにして作製したＰＬＧＡ微粒子（直径  約１００ｎｍ；以下、「ＰＬＧＡ  １００」ともいう）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５；ＰＬＧＡ微粒子濃度：５００μｇ／ｍｌ）の懸濁液３ｍｌをキトサン／インスリン溶液に加え、最低１時間室温で放置した。ＮａＯＨ（０．１−２．５Ｎ）を加えてｐＨを６．０に上昇させ、塩及び添加物を加えて、懸濁液の溶媒組成を表２又は表３に記載の緩衝液と同じ組成とした。
【００６１】
【表２】
2010031003.tif 000003
【００６２】
【表３】
2010031003.tif 000004
【００６３】
表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をそれぞれＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）及びＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した（表４）。
表４から分かるように、２種類の緩衝系について同様且つ好適な粒子径及びゼータ電位が得られた。また、２種類の表面被覆微粒子は、被覆していない微粒子の約２倍の粒子径で、ゼータ電位は大きな正の電位であった。両方の表面被覆微粒子はコロイド懸濁液として安定であることが分かった。
【００６４】
【表４】
2010031003.tif 000005
【００６５】
実施例２：２種類のインスリン濃度での２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝系における薬物−表面被覆ポリマー複合体で表面被覆された微粒子システムの作製
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてキトサンを使用した。
ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，１６０μｇ／ｍｌ又は８００μｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）２ｍｌをキトサン（Ｂｉｏｎｅｅｒ  １４３ｋＤａ，０．７２ｍｇ／ｍｌ又は３．６ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）２ｍｌに加え、最低３０分間室温で放置した。作製例１に記載したようにして作製したＰＬＧＡ微粒子（直径  約１００ｎｍ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５；ＰＬＧＡ微粒子濃度：０．５ｍｇ／ｍｌ又は２．５ｍｇ／ｍｌ）の懸濁液４ｍｌをキトサン／インスリン溶液に加え、最低１時間室温で放置した。ＮａＯＨ（０．１〜２．５Ｎ）を加えてｐＨを６．０に上昇させ、塩及び添加物を加えて、懸濁液の溶媒組成を表５に記載の緩衝液と同じ組成とした。
【００６６】
【表５】
2010031003.tif 000006
【００６７】
表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をそれぞれＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）及びＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。両方の表面被覆微粒子サンプル共に好適な粒子径及びゼータ電位（表６）を示し、粒子径は被覆していない粒子（表４）の約２倍、ゼータ電位は大きな正の電位であった。また、両方の表面被覆微粒子はコロイド懸濁液として安定であった。
【００６８】
【表６】
2010031003.tif 000007
【００６９】
実施例３：表面被覆ポリマーとしてポリ−Ｌ−アルギニンを使用した表面被覆ＰＬＧＡ微粒子システムの作製
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてポリ−Ｌ−アルギニンを使用した。
ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，４０μｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ６．０）３ｍｌをポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ  １２５ｋＤａ，Ｓｉｇｍａ；２．８８ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ６．０）３ｍｌに加え、最低３０分間室温で放置した。作製例１に記載したようにして作製したＰＬＧＡ微粒子（直径  約１００ｎｍ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ６．０；ＰＬＧＡ微粒子濃度：２５０μｇ／ｍｌ）の懸濁液６ｍｌをポリ−Ｌ−アルギニン／インスリン溶液に加え、最低１時間室温で放置した。塩及び添加物を加えて、懸濁液の溶媒組成を表５に記載の緩衝液と同じ組成とした。表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をそれぞれＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）及びＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は２８５．９±９０．６ｎｍ、ゼータ電位は＋４８．３±０．９ｍＶであった。
【００７０】
実施例４：表面被覆ポリマーとしてキトサン及びポリ−Ｌ−アルギニンを使用した表面被覆ＰＬＧＡ微粒子システムの作製
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてキトサン及びポリ−Ｌ−アルギニンを使用した。
ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，８００μｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）２ｍｌをキトサン（ＭＷ  １４３ｋＤａ，０．３６ｍｇ／ｍｌ）及びポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ  １２５ｋＤａ，Ｓｉｇｍａ；１．８ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）の混合液２ｍｌに加え、最低３０分間室温で放置した。作製例１に記載したようにして作製したＰＬＧＡ微粒子（直径  約１００ｎｍ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５；ＰＬＧＡ微粒子濃度：２．５ｍｇ／ｍｌ）の懸濁液４ｍｌをキトサン／ポリ−Ｌ−アルギニン／インスリン溶液に加え、最低１時間室温で放置した。塩及び添加物を加えて、懸濁液の溶媒組成を表７に記載の緩衝液と同じ組成とした。表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をそれぞれＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）及びＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は３３６．１±２０．８ｎｍ、ゼータ電位は＋４０．３±３．４ｍＶであった。
【００７１】
【表７】
2010031003.tif 000008
【００７２】
実施例５：他の作製法を用いたインスリン／キトサン表面被覆ＰＬＧＡ微粒子システムの作製
０．１％  ｗ／ｖポリスチレン微粒子（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ，カルボキシル化ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）３ｍｌをキトサン(Ｂｉｏｎｅｅｒ  １４３ｋＤａ，１８０μｇ／ｍｌ)の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）３ｍｌに加え、最低１時間室温で放置した。ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，２０μｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）６ｍｌをポリスチレンとキトサンとの上記混合液に加え、最低１時間室温で放置した。ＮａＯＨ（０．１−２．５Ｎ）を加えてｐＨを６．０に上昇させ、塩及び添加物を加えて、懸濁液の溶媒組成を表５に記載の緩衝液と同じ組成とした。
表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をそれぞれＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）及びＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は３０２．０±６８．６ｎｍ、ゼータ電位は＋２７．９±１．７ｍＶであった。また、ポリスチレンコア粒子の直径は１９６．７±２７．５ｎｍであったが、これはポリスチレンコア粒子の周囲に厚さ約５０ｎｍの層があることを示している。
【００７３】
実施例６：他の作製法を用いたインスリン／キトサン表面被覆ＰＬＧＡ微粒子システムの作製
ラクチド：グリコリド比が５０：５０であるＰＬＧＡ（ＲＥＳＯＭＥＲ  ＲＧ  ５０２Ｈ，Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）のアセトン溶液（ＰＬＧＡ０．０１％（ｗ/ｖ）：約２０ｎｍのＰＬＧＡ粒子を調製することができる濃度）１．８ｍｌをキトサン（Ｂｉｏｎｅｅｒ  ７３ｋＤａ，０．２５ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）６ｍｌに加え、アセトンが完全に蒸発するまで室温で放置した。このＰＬＧＡ／キトサン懸濁液３ｍｌにウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，１６０μｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）３ｍｌを加え、最低１時間室温で放置した。ＮａＯＨ（０．１−２．５Ｎ）を加えてｐＨを６．０に上昇させ、塩及び添加物を加えて、懸濁液の溶媒組成を表２に記載の緩衝液と同じ組成とした。表面被覆微粒子の粒子径をＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）により測定した。該粒子の平均径は１４６．１±３５．８ｎｍであった。該粒子はコロイド懸濁液として安定であった。
【００７４】
実施例７：動物実験用のインスリン／キトサン表面被覆ＰＬＧＡ微粒子システムの作製
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてキトサンを使用した。動物実験用に高濃度試料（インスリン濃度６ｍｇ／ｍＬ）として調製した。
キトサン水溶液（甲陽ケミカル製、コーヨーキトサンＦＬ−８０、１．４４ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ４．５）１５ｍｌにウシインスリン水溶液（Ｓｉｇｍａ，３２０μｇ／ｍｌ、ｐＨ  ４．５）１５ｍｌと５０ｍＭクエン酸水溶液０．０２ｍｌを加えて、ｐＨを４．５±０．１に調整し約１時間静置した。その後ＰＬＧＡ微粒子懸濁液（粒子径約１００ｎｍ、ＰＬＧＡ微粒子濃度１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ４．５）３０ｍｌ、５０ｍＭクエン酸水溶液０．０２ｍｌを加え、ｐＨを４．５に調整した。１時間静置した後にｐＨを６．０に調整し、マルトース（０．４２１ｇ）を加えて溶解、ｐＨ６であることを確認した。この調製液を液体窒素で凍結後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥品は凍結乾燥前の溶液の１／１５ボリュームの蒸留水で再分散させた。再懸濁液を遠心分離し（１９４００×Ｇ、３時間、４℃）４／５容量の上清を除くことで粒子分画を濃縮して、動物実験用のサンプル（インスリン濃度６ｍｇ／ｍＬ）を得た。
表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は２５２ｎｍ、ゼータ電位は＋１０．６ｍＶであった。該粒子はコロイド懸濁液として安定であった。また、本実施例の表面被覆微粒子に結合しているインスリンの割合を後述する方法にて測定したところ担持率は９３％であった。
【００７５】
実施例８：放出試験用のインスリン／キトサン表面被覆ＰＬＧＡ微粒子システムの作製
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてキトサンを使用した。
キトサン水溶液（甲陽ケミカル製、コーヨーキトサンＦＬ−８０、１．４４ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ４．５）１５ｍｌにウシインスリン水溶液（Ｓｉｇｍａ，３２０μｇ／ｍｌ、ｐＨ  ４．５）１５ｍｌと５０ｍＭクエン酸水溶液０．０２ｍｌを加えて、ｐＨを４．５±０．１に調整し約１時間静置した。その後ＰＬＧＡ微粒子懸濁液（粒子径約１００ｎｍ、ＰＬＧＡ微粒子濃度１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ４．５）３０ｍｌ、５０ｍＭクエン酸水溶液０．０２ｍｌを加え、ｐＨを４．５に調整した。１時間静置した後にｐＨを６．０に調整し、マルトース（０．４２１ｇ）を加えて溶解、ｐＨ６であることを確認した。
【００７６】
実施例９：表面被覆ポリマーとしてカチオン系キトサン誘導体を使用した表面被覆ＰＬＧＡ微粒子システム（ｐＨ８）の作製
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてカチオン系キトサン誘導体を使用した。
ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，０．３２ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）２ｍｌをカチオン系キトサン誘導体（大日精化製、カチオン系キトサン誘導体水溶液，１．４４ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）２ｍｌに加え、最低３０分間室温で放置した。作製例１に記載したようにして作製したＰＬＧＡ微粒子（直径  約１００ｎｍ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５；ＰＬＧＡ微粒子濃度：１．０ｍｇ／ｍｌ）の懸濁液４ｍｌをカチオン系キトサン誘導体／インスリン溶液に加え、最低１時間室温で放置した。１０％ｗ／ｖの濃度となるようにマルトースを添加し、ＮａＯＨを添加してｐＨを８に調整した。
表面被覆微粒子の粒子径をＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は２３０ｎｍであった。該粒子はコロイド懸濁液として安定であった。また、本実施例の表面被覆微粒子に結合しているインスリンの割合を後述する方法にて測定したところ担持率は７４％ｗ／ｗであった。
【００７７】
実施例１０：表面被覆ポリマーとしてカチオン系キトサン誘導体を使用した表面被覆ＰＬＧＡ微粒子システム（ｐＨ７）の作製
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてカチオン系キトサン誘導体を使用した。
ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，０．３２ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ７．０）２ｍｌをカチオン系キトサン誘導体（大日精化製、カチオン系キトサン誘導体水溶液，１．４４ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ７．０）２ｍｌに加え、最低３０分間室温で放置した。作製例１に記載したようにして作製したＰＬＧＡ微粒子（直径  約１００ｎｍ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ７．０；ＰＬＧＡ微粒子濃度：１．０ｍｇ／ｍｌ）の懸濁液４ｍｌをカチオン系キトサン誘導体／インスリン溶液に加え、最低１時間室温で放置した。１０％ｗ／ｖの濃度となるようにマルトースを添加し、ｐＨ７であることを確認した。
表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は２３４ｎｍ、ゼータ電位は＋１１．３ｍＶであった。該粒子はコロイド懸濁液として安定であった。また、本実施例の表面被覆微粒子に結合しているインスリンの量を後述する方法にて測定したところ担持率は６５％ｗ／ｗであった。
【００７８】
実施例１１：正帯電薬物と負帯電表面被覆ポリマーを使用した表面被覆微粒子システムの作製
正帯電の低分子量薬物としてゾルミトリプタン（ｐＫａ＝９．５）を使用し、負に帯電した表面被覆ポリマーとしてポリアクリル酸を用いた。
ポリアクリル酸水溶液（和光純薬製、平均分子量２５万、１．４４ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌにトリメチルアミン修飾ポリスチレン粒子（ｍｉｃｒｏｍｅｒ  ＮＲ３＋  １００ｎｍ、コアフロント株式会社）の水懸濁液（１ｍｇ／ｍｌ）４ｍｌを加え軽く混ぜ、約１時間後にゾルミトリプタン水溶液（６４０μｇ／ｍｌ）２ｍｌを加え、軽く混ぜた後にｐＨを６．０に調整した。
表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は３３０ｎｍ、ゼータ電位は−７５ｍＶであった。該粒子はコロイド懸濁液として安定であった。また、本実施例の表面被覆微粒子に結合している薬物の量を後述する方法に準じて（ＨＰＬＣ条件は別条件）測定したところ担持率は１４％ｗ／ｗであった。
【００７９】
実施例１２：正帯電薬物と負帯電表面被覆ポリマーを使用した表面被覆微粒子システムの作製
正帯電の低分子量薬物としてブロムヘキシン塩酸塩を使用し、負に帯電した表面被覆ポリマーとしてポリアクリル酸ナトリウムを用いた。
ポリアクリル酸ナトリウム水溶液（重合度２，７００〜７，５００，和光純薬製、１．４４ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌにブロムヘキシン塩酸塩水溶液（６４０μｇ／ｍｌ）１ｍｌと蒸留水１ｍｌを加えて軽く混ぜ、約１時間後にトリメチルアミン修飾ポリスチレン粒子（ｍｉｃｒｏｍｅｒ  ＮＲ３＋  １００ｎｍ、コアフロント株式会社）の水懸濁液（１ｍｇ／ｍｌ）４ｍｌを加え、軽く混ぜた後にｐＨを６に調整した。
表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は１６０ｎｍ、ゼータ電位は−５７ｍＶであった。該粒子はコロイド懸濁液として安定であった。また、本実施例の表面被覆微粒子に結合している薬物の量を後述する方法に準じて（ＨＰＬＣ条件は別条件）測定したところ担持率は８８％ｗ／ｗであった。
【００８０】
実施例１３：正帯電薬物と負帯電表面被覆ポリマーを使用した表面被覆微粒子システムの作製
正帯電の低分子量薬物としてブロムヘキシン塩酸塩を使用し、負に帯電した表面被覆ポリマーとしてポリガンマグルタミン酸ナトリウムを用いた。
ポリガンマグルタミン酸ナトリウム水溶液（平均分子量２０万〜５０万，和光純薬製、１．４４ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌにブロムヘキシン塩酸塩水溶液（６４０μｇ／ｍｌ）１ｍｌと蒸留水１ｍｌを加えて軽く混ぜ、約１時間後にトリメチルアミン修飾ポリスチレン粒子（ｍｉｃｒｏｍｅｒ  ＮＲ３＋  １００ｎｍ、コアフロント株式会社）の水懸濁液（１ｍｇ／ｍｌ）４ｍｌを加え、軽く混ぜた後にｐＨを６に調整した。
表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は２０３ｎｍ、ゼータ電位は−６３ｍＶであった。該粒子はコロイド懸濁液として安定であった。また、本実施例の表面被覆微粒子に結合している薬物の量を後述する方法に準じて（ＨＰＬＣ条件は別条件）測定したところ担持率は３２％ｗ／ｗであった。
【００８１】
試験例１：微粒子表面での薬物と表面被覆ポリマーとの相互作用の評価
表５に記載の緩衝液中のインスリン／キトサン表面被覆ＰＬＧＡ微粒子の懸濁液（ＰＬＧＡ  １００／キトサン／インスリン＝５００／３６０／８０μｇ／ｍｌ）１ｍｌをマイクロチューブに入れ、１８０００ｒｐｍ（２３９００×ｇ）で６０分間遠心分離した。沈殿物を表５に記載の緩衝液で洗った。更に、沈殿物にｐＨ  ４．５又はｐＨ６．０の解離用緩衝液を加え、それぞれのチューブを２時間室温で振盪した。懸濁液を同条件で１５分間再び遠心分離し、上清を回収した。その後、各上清緩衝液中のインスリン濃度をＥＬＩＳＡで定量した。
キトサン及びインスリンが共に正に帯電するため静電力による両者の引力相互作用が弱いｐＨ  ４．５の緩衝液の場合、両者が逆電荷を持つため静電引力が強くなるｐＨ６．０の場合と比べてインスリン量が顕著に多かった（図２）。なお、遊離のインスリン及びキトサンは、解離の実験をする前の上記洗浄操作により除去されている。これらの結果は、微粒子表面にキトサン／インスリン複合体が存在することを示している。
【００８２】
実施例１に記載の方法にて調製した、表２に記載の緩衝液中のインスリン／キトサン表面被覆ＰＬＧＡ微粒子の懸濁液（ＰＬＧＡ  １００／キトサン／インスリン＝２５０／１８０／４０μｇ／ｍｌ）１ｍｌをマイクロチューブに入れ、１８０００ｒｐｍ（２３９００×ｇ）で６０分間遠心分離した。沈殿物を表２に記載の緩衝液で洗った。洗浄後の沈殿物をバッファーにて再懸濁したものを、ガラス板上に塗り広げ、約４８時間自然乾燥させて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ用試料とした。比較対照として、インスリン、キトサン、又は作製例１の方法で調製したＰＬＧＡ  １００をガラス板上に塗り広げた試料も用意した。
これらの各試料について、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ  ＩＶ装置（ＩＯＮ−ＴＯＦ  ＧｍｂＨ）にて、インスリンのシステイン残基のＳＨに相当するピーク（ｍ／ｚ＝３３）の有無を測定した。その結果、ＰＬＧＡとキトサンからはｍ／ｚ＝３３のピークは有意なレベルで検出されなかったが、上記の洗浄済み表面被覆微粒子の試料とインスリンの試料とでは強いピークが検出された。各試料についての測定結果を図３上段に示す。
また、上記の洗浄済み表面被覆微粒子については、観察視野中のｍ／ｚ＝３３の分布（図３下段左）とトータルイオンの分布（図３下段右）の様子も確認し、両者の分布パターンが一致すること、すなわち、粒子からｍ／ｚ＝３３が検出されていることも確認した。
以上の特異性に関する測定結果と、粒子分布画像の結果は、洗浄済み表面被覆微粒子の表面にインスリンが存在することを示している。
【００８３】
試験例２：薬物担持率及び担持能の評価
試験に供したサンプルは以下のようにして作製した。
【００８４】
［ＰＬＧＡ／キトサン／インスリン（１０００／７２０／１６０μｇ／ｍｌ）表面被覆微粒子（表８に記載の緩衝液中）］
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてキトサンを使用した。
ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，０．６４ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）４．５ｍｌをキトサン（Ｂｉｏｎｅｅｒ  １４３ｋＤａ，２．８８ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）４．５ｍｌに加え、最低３０分間室温で放置した。作製例１に記載したようにして作製したＰＬＧＡ微粒子（直径  約１００ｎｍ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５；ＰＬＧＡ微粒子濃度：２．０ｍｇ／ｍｌ）の懸濁液９ｍｌをキトサン／インスリン溶液に加え、最低１時間室温で放置した。ＮａＯＨ（０．１−２．５Ｎ）を加えてｐＨを６．０に上昇させ、グルコースを加えて、懸濁液の溶媒組成を表８に記載の緩衝液と同じ組成とした。
【００８５】
【表８】
2010031003.tif 000009
【００８６】
表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をそれぞれＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）及びＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は２４８．８±９４．２ｎｍ、ゼータ電位は＋８．７±０．５ｍＶであった。
【００８７】
［ＰＬＧＡ／キトサン／インスリン（２５０／９０／４０μｇ／ｍｌ）表面被覆微粒子（表８に記載の緩衝液中）］
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてキトサンを使用した。
ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，１６０μｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）３ｍｌをキトサン（Ｂｉｏｎｅｅｒ  １４３ｋＤａ，０．３６ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）３ｍｌに加え、最低３０分間室温で放置した。作製例１に記載したようにして作製したＰＬＧＡ微粒子（直径  約１００ｎｍ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５；ＰＬＧＡ微粒子濃度：５００μｇ／ｍｌ）の懸濁液６ｍｌをキトサン／インスリン溶液に加え、最低１時間室温で放置した。ＮａＯＨ（０．１−２．５Ｎ）を加えてｐＨを６．０に上昇させ、グルコースを加えて、懸濁液の溶媒組成を表８に記載の緩衝液と同じ組成とした。
【００８８】
表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をそれぞれＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）及びＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は２５３．７±３１．３ｎｍ、ゼータ電位は＋６．４±１．８ｍＶであった。
【００８９】
［ＰＬＧＡ／ポリ−Ｌ−アルギニン／インスリン（１２５／７２０／４０μｇ／ｍｌ）表面被覆微粒子（表５に記載の緩衝液中）］
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてポリ−Ｌ−アルギニンを使用した。
ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，１６０μｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ６．０）３ｍｌをポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ  １２５ｋＤａ，Ｓｉｇｍａ；２．８８ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ６．０）３ｍｌに加え、最低３０分間室温で放置した。作製例１に記載したようにして作製したＰＬＧＡ微粒子（直径  約１００ｎｍ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ６．０；ＰＬＧＡ微粒子濃度：２５０μｇ／ｍｌ）の懸濁液６ｍｌをポリ−Ｌ−アルギニン／インスリン溶液に加え、最低１時間室温で放置した。塩及び添加物を加えて、懸濁液の溶媒組成を表５に記載の緩衝液と同じ組成とした。表面被覆微粒子の粒子径及びゼータ電位をそれぞれＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）及びＺｅｔａ  ｓｉｚｅｒ  ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。該粒子の平均径は４９７．４±１４１．９ｎｍ、ゼータ電位は＋４４．３±２．１ｍＶであった。
【００９０】
インスリンの担持率及び担持能を以下に記載する方法により測定した。
［結合したインスリンの解析法］
上記各サンプル０．５ｍｌ又は１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、遠心分離した（１５０００ｒｐｍ（２１９００×ｇ），１８０分，４℃）。上清を回収し、上清中のインスリン濃度をインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  Ｂｏｖｉｎｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ）及び希釈緩衝液（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ）又はＨＰＬＣを使用して測定した（当該インスリン濃度をＡとする）。コントロールとして、１．５ｍｌマイクロチューブ中の上記各サンプル０．５ｍｌ又は１ｍｌを４℃で１８０分間静置し、全サンプル中のインスリン濃度を同様にして測定した（当該インスリン濃度をＢとする）。
担持率及び担持能は以下のようにして計算される：
担持率（％）＝１００×（（Ｂの平均値）−Ａ）／（Ｂの平均値））；
担持能（％）＝コア粒子総質量に対する結合したインスリンの質量
＝１００×（（Ｂの平均値）−Ａ）／コア粒子総質量
（コア粒子総質量＝粒子数×４／３×３．１４×（コア粒子の半径）３×密度）
【００９１】
上記方法によるインスリン担持の解析結果を表９に示す。
【００９２】
【表９】
2010031003.tif 000010
【００９３】
試験例３：微粒子表面で複合体化したインスリンの安定性評価
試験例２で使用した、表８に記載の緩衝液中のＰＬＧＡ／キトサン／インスリン（１０００／７２０／１６０μｇ／ｍｌ）表面被覆微粒子を本試験のサンプルとして使用した。また、コントロールとして、表８に記載の緩衝液と同じ溶媒組成のインスリン溶液（ｐＨ  ６；インスリン濃度：１６０μｇ／ｍｌ）を使用した。
【００９４】
酵素反応させるサンプルの調製は以下のようにして行った。
ウシの膵臓由来のα−キモトリプシン（Ｆｌｕｋａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ；ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２７２７０）を濃度が４０μｇ／ｍｌになるまで５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液(ｐＨ  ６．０)に溶解した。サンプル１ｍｌを３７℃で１５分間温めた後、同様にして温めておいた５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．０）０．６ｍｌ及び同様にして温めておいたα−キモトリプシンの５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ  ６．０；α−キモトリプシン濃度：４０μｇ／ｍｌ）０．４ｍｌを加えた。混合物を３７℃で３０分間振盪培養した後、氷で冷却した氷酢酸１ｍｌを加えて酵素反応を停止させた。次いでミキサーで１分間混合し、１時間以上室温で放置した後、フィルター径０．１μｍのフィルターでろ過して、ＨＰＬＣ分析用試料を得た。
【００９５】
一方、酵素を含有しない比較対照サンプルの調製は以下のようにして行った。
サンプル１ｍｌを５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．０）１ｍｌ及び氷酢酸１ｍｌと混合した。次いで、混合物をミキサーで１分間混合し、１時間以上室温で放置した後、フィルター径０．１μｍのフィルターでろ過して、ＨＰＬＣ分析用試料を得た。
【００９６】
また、インスリン定量の検量線用標準サンプルの調製は以下のようにして行った。
インスリン溶液（４０−１６０μｇ／ｍｌ）１ｍｌを５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．０）１ｍｌ及び氷酢酸１ｍｌと混合し、ミキサーで混合した。該混合物をＨＰＬＣ分析の検量線用の標準サンプルとして使用した。
【００９７】
サンプルのＨＰＬＣ分析は以下の条件で行った：
Ｃ１８カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２，５μｍ，２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）；
移動相Ａ：０．１％  ＴＦＡ水溶液，移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ  ＣＨ３ＣＮ溶液；
グラジエント条件（移動相Ｂ濃度）：０分時：３０％，１０分時：４０％，１１分時：３０％，１６分時：３０％;
カラムオーブン温度：４０℃，流速：１．０ｍｌ／分，注入量：２０μｌ，検出：ＵＶ２７５ｎｍ
【００９８】
上記条件による分析の結果、酵素反応後に残存していたインスリン量の割合は、ＰＬＧＡ／キトサン／インスリンについて８３．９％±２．３％、インスリン溶液について６１．８％±２．０％であった。即ち、遊離のインスリン溶液での３８．２％に対して、表面被覆複合体化したインスリンの１６．１％のみが、本実験の時間中に分解された（図４）。
この結果は、酵素反応に対するインスリン安定性が大きく向上したことを示している。
【００９９】
試験例４：表面被覆微粒子を使用したブタ鼻粘膜に対するインスリン透過試験
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてキトサン及びポリ−Ｌ−アルギニンを使用した。表面被覆微粒子の作製は、実施例４に記載したのと同様にして行った。また、コントロールとして、表７に記載の緩衝液と同じ溶媒組成のインスリン溶液（ｐＨ  ６；インスリン濃度：２００μｇ／ｍｌ）を使用した。鼻の呼吸部粘膜組織をブタの鼻腔（呼吸部）から摘出した。摘出した組織は、水平拡散チャンバに配置するまで、実施例４で使用したものと同じ組成の緩衝液（酸素処理して冷却したもの）の中で保存した。当該組織を適当な大きさに切断し、図５に示すように水平拡散チャンバ中のドナーセルとレセプターセルとの間に配置した（粘膜の有効面積：０．７９ｃｍ2）。新鮮な（上記の）緩衝液（酸素処理して冷却したもの）をドナーセル及びレセプターセルに注入し、両セルを２９±１℃に加温した循環水で３０分間温めて、組織を平衡化させた。透過試験の間も、ドナーセル及びレセプターセルに注入した緩衝液を酸素処理し、また、２９±１℃に加温した循環水で両セルを温めた。透過試験の前後で、組織が生存していること、及び損傷を受けていないことをＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  Ａｓｓａｙ及び組織のＴＥＥＲ値の測定により確かめた。
ドナーセル中の全ての緩衝液を同量の各サンプルに置換することにより透過試験を開始した。選択した時点において、２００μｌのサンプルをレセプターセルから採取し、同量の新鮮な緩衝液（酸素処理後、２９±１℃に加温しておいたもの）で置換した。レセプターセルから採取したサンプルをインスリンＥＬＩＳＡキット及び希釈緩衝液を使用して分析した。分析結果を図６に示す。図６は、コントロールのインスリン溶液を投与した場合と比較して、キトサン／ポリ−Ｌ−アルギニン／インスリン表面被覆ＰＬＧＡ微粒子を投与した場合により多くのインスリンが摘出鼻呼吸部粘膜組織を透過したことを示している。
【０１００】
試験例５：表面被覆微粒子の粒子径分布の測定
タンパク質薬物としてインスリン（ｐＩ  約５．３）を使用し、正に帯電した表面被覆ポリマーとしてキトサンを使用した。
ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ，０．８ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）１．５ｍｌをキトサン（Ｂｉｏｎｅｅｒ  １４３ｋＤａ，３．６ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）１．５ｍｌに加え、最低３０分間室温で放置した。作製例１に記載したようにして作製したＰＬＧＡ微粒子（直径  約１００ｎｍ；以下、「ＰＬＧＡ  １００」ともいう）の０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５；ＰＬＧＡ微粒子濃度：２．５ｍｇ／ｍｌ）の懸濁液３ｍｌ、或いは単なる０．５ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ４．５）をキトサン／インスリン溶液に加え、最低１時間室温で放置した。ＮａＯＨ（０．１−２．５Ｎ）を加えてｐＨを６．０に上昇させ、塩及び添加物を加えて、懸濁液の溶媒組成を表２に記載の緩衝液と同じ組成とした。表面被覆微粒子或いはキトサン／インスリン混合物の粒子径をＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）により測定した。
その結果を図７に示す。図７（ａ）は表面被覆微粒子、図７（ｂ）はキトサン／インスリン混合物についての粒子径分布を示しており、また、そのそれぞれについて、ピーク領域における強度のパーセンテージ、粒子径及び標準偏差を表１０及び１１に示す。
【０１０１】
【表１０】
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【０１０２】
【表１１】
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【０１０３】
ＰＬＧＡ粒子を添加した場合は、単分散の粒子径が得られたのに対して、ＰＬＧＡ粒子を添加しなかった場合は、粒子径の大きなものも含む多分散の粒子径分布となった。この結果より、コア粒子の存在により、粒子径の揃った表面被覆微粒子が得られることがわかる。
【０１０４】
試験例６：表面被覆微粒子懸濁液をドライパウダーとして製剤化する可能性の確認
実施例１の方法にて、［ＰＬＧＡ１００／キトサン／インスリン（２５０／１８０／４０μｇ／ｍｌ）表面被覆微粒子（表２に記載の緩衝液中）］を調製した。この懸濁液を凍結乾燥し、凍結乾燥前と同量の水で再懸濁させた。凍結乾燥前の粒子径、及び凍結乾燥再懸濁後の粒子径をＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）を用いて測定した。粒子径の測定結果を図８に示す。図８（ａ）は凍結乾燥前、図８（ｂ）は凍結乾燥再懸濁後の粒子径分布を示しており、また、そのそれぞれについて、ピーク領域における強度のパーセンテージ、粒子径及び標準偏差を表１２及び１３に示す。
【０１０５】
【表１２】
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【０１０６】
【表１３】
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【０１０７】
凍結乾燥前の粒子径は１８３．０±２１．２ｎｍ、凍結乾燥再懸濁後の粒子径は２２９．４±４７．９ｎｍであり、凍結乾燥と再懸濁の操作により主成分の粒子径は有意に変化せず、目だった凝集物も生成していないことがわかる。この結果より、本発明の表面被覆微粒子は懸濁液としてだけでなく、ドライパウダーなど他の剤型としても使用可能であることがわかる。
【０１０８】
試験例７：表面被覆微粒子を使用したラット鼻腔に対するインビボ投与試験
試験にはラット（系統：ＳＤラット、７週齢、オス、ブリーダー：日本エスエルシー）を用いた。ラットは試験前日の夕方から絶食させた。試験は筋肉注射及び腹腔点滴による麻酔の下で行った。血中グルコース濃度が安定化してから、鼻腔へのサンプル投与を行い、投与してから１０、２０、３０、６０、９０、１２０分後に尾静脈からの採血を行い、血中グルコース検出キット（テルモ製、メディセーフミニ）を用いて血中グルコースレベルを測定した。
試料として実施例７に記載の表面被覆微粒子を２０μｌ／体重３００ｇ（４００μｇインスリン／ｋｇ体重）の量だけラット鼻腔に投与した。また、コントロールとして、いずれも実施例７と同じ溶媒組成である、クエン酸０．５ｍＭマルトース１０％ｗ／ｖ溶液（ｐＨ６）（バッファー液）、インスリン溶液（ｐＨ６；インスリン濃度：６ｍｇ／ｍｌ、クエン酸０．５ｍＭマルトース１０％ｗ／ｖ）、キトサン／インスリン混液（ｐＨ６；キトサン濃度：２７ｍｇ／ｍｌ、インスリン濃度：６ｍｇ／ｍｌ、クエン酸０．５ｍＭマルトース１０％ｗ／ｖ）も同様にラット鼻腔に投与した。
試験結果を図９に示す。図９は、コントロールのバッファー液やインスリン溶液を投与した場合と比較して、大きく血中グルコースレベルが低下していること、また、キトサン／インスリン混液と比べても初期の血中グルコースレベルの低下が早いことを示しており、いずれも本発明の実施例がペプチド薬物の経粘膜デリバリーにおいて優れた促進効果を有することを示している。
【０１０９】
試験例８：表面被覆微粒子を使用したインビトロ放出試験
実施例８の試料０．５ｍＬをエッペンドルフチューブ１．５ｍＬに添加し遠心分離（１３６００ｒｐｍ（１９４００ｘＧ）、３ｈｒ、４℃）して沈殿物を得た。放出試験液として５ｍＭ  ＭＥＳ  １５２ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ  ６．０、生理的等張イオン強度１５４ｍＭ）を準備した。
該沈殿物に放出試験液０．５ｍＬを添加し、ピペッティングとミキサーにより再分散させたものを１０ｍＬ容ガラスバイアルに移した。エッペンドルフチューブを新たな放出試験液０．５ｍＬで洗い、洗い液も上記ガラスバイアルに移した（懸濁液合計１ｍＬ）。懸濁液入りガラスバイアルを３７℃、７５ｒｐｍにて振盪することで放出試験を行った。所定時間（０、０．５、３時間）後、懸濁液を０．１μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）にてろ過し、ろ液を得た。ろ液とその１／２容量の５％リン酸をミキサーを用いて混合し、放出インスリン量分析用のＨＰＬＣ試料とした。
また、放出前のインスリン含量を定量する目的で、該沈殿物に蒸留水１ｍＬと５％リン酸０．５ｍＬを加えてミキサー混合し、４℃にて一夜放置した。再度ミキサー混合した後に０．１μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でろ過して、該沈殿物中インスリン量定量用のＨＰＬＣ試料とした。
前記のインスリンＨＰＬＣ分析条件を用いてインスリン定量を行った。
放出率（％）＝１００×（放出液中のインスリン量／放出前沈殿中のインスリン量）
放出試験の結果を図１０に示す。該沈殿物に含まれるほぼ全てのインスリンが放出試験の３時間以内に放出された。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明の組成物を使用することにより、これまで注射以外の方法で投与することが難しかった低分子量薬物及びペプチドやタンパク質などの高分子薬物を効率良く経粘膜投与することが可能となる。本発明の組成物中に含有された薬物は、表面被覆ポリマー及び微粒子と複合体を形成することにより、溶液製剤に含有された場合よりも高い安定性（例えば、対酵素安定性、保存安定性）を有し、尚且つ、微粒子のマトリックス中に薬物を封入した微粒子製剤と比較して、高い薬物担持能を有する。更に、微粒子表面で薬物と複合体を形成する表面被覆ポリマーの種類によって、薬物が徐放性及び速放性を示す表面被覆微粒子を作製すること、並びに経粘膜吸収性の調節をすることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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