(57)【要約】【課題】化学的に安定な金電極上に高い安定性を有するシトクロムｃ５５２がその電子伝達能を保持したまま固定化された長期安定利用可能なタンパク質固定化電極およびその製造方法を提供する。【解決手段】金電極１１上に疎水性チオールおよび親水性チオールを用いて自己組織化単分子膜１２を形成する。自己組織化単分子膜１２を形成した金電極１１をシトクロムｃ５５２溶液中に浸漬することにより、金電極１１上に自己組織化単分子膜１２を介してシトクロムｃ５５２  １３が固定化されたタンパク質固定化電極を作製する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金電極とこの金電極に固定化されたシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体とを有するタンパク質固定化電極。
【請求項２】
上記シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体はその疎水性部分を上記金電極側に向けて固定化されている請求項１記載のタンパク質固定化電極。
【請求項３】
上記シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体と上記金電極とは自己組織化単分子膜を介して結合している請求項２記載のタンパク質固定化電極。
【請求項４】
上記自己組織化単分子膜は疎水性チオールおよび親水性チオールを用いて形成されたものである請求項３記載のタンパク質固定化電極。
【請求項５】
上記疎水性チオールはＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ3 （ｎ＝５，８，１０）、上記親水性チオールはＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ2 ＯＨ（ｎ＝５，８，１０）である請求項４記載のタンパク質固定化電極。
【請求項６】
上記自己組織化単分子膜中のＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ2 ＯＨの含有量が６０％以上９０％以下である請求項５記載のタンパク質固定化電極。
【請求項７】
上記疎水性チオールはＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3 、上記親水性チオールはＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨである請求項４記載のタンパク質固定化電極。
【請求項８】
上記疎水性チオールはＨＳ（ＣＨ2 ）m ＣＨ3 、上記親水性チオールはＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ2 ＯＨ（ｍ＜ｎ）である請求項４記載のタンパク質固定化電極。
【請求項９】
金電極にシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を固定化するようにしたタンパク質固定化電極の製造方法。
【請求項１０】
上記シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体をその疎水性部分が上記金電極側に向くように固定化する請求項９記載のタンパク質固定化電極の製造方法。
【請求項１１】
上記シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を自己組織化単分子膜を介して上記金電極と結合する請求項１０記載のタンパク質固定化電極の製造方法。
【請求項１２】
上記金電極上に上記自己組織化単分子膜を形成した後、シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体と緩衝液と１０ｍＭ以上３０ｍＭ以下の塩化カリウムとを含む溶液に上記自己組織化単分子膜が形成された上記金電極を浸漬することにより上記シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を上記自己組織化単分子膜を介して上記金電極と結合するようにした請求項１１記載のタンパク質固定化電極の製造方法。
【請求項１３】
金電極とこの金電極に固定化されたシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体とを有するタンパク質固定化電極を有する機能素子。
【請求項１４】
金電極上にシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を固定化してタンパク質固定化電極を形成する工程を有する機能素子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびにこのタンパク質固定化電極を用いた機能素子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質固定化電極の需要が高まってきている。例えば、生体内では数多くのタンパク質カップル間で電子伝達反応が行われているが、そのタンパク質カップル間の複合体形成における配向や電子伝達のメカニズムを調べる際にタンパク質固定化電極が使われる。この場合、あるタンパク質を電極に固定化し、このタンパク質との間でもう一つのタンパク質が特異的な相互作用をしたときにのみ、タンパク質固定化電極を通して電流を検知するといった使い方をされる。
【０００３】
また、近年、タンパク質を光電変換素子に利用することも注目されている。例えば、亜鉛シトクロムｃ（馬心筋シトクロムｃの鉄を亜鉛に置換したもの）を金電極に固定化したタンパク質固定化電極から光電流が得られることが示され、このタンパク質固定化電極を用いた光電変換素子が提案されている（特許文献１参照。）。しかし、タンパク質は生体外では不安定であるため、この光電変換素子の長期安定化を図ることができれば非常に有意義ではあるものの、本発明者らの知る限り、これまでそういった報告はない。
【０００４】
好熱菌Thermus thermophilus由来シトクロムｃ５５２は、馬心筋シトクロムｃと同様に生体内では電子伝達体として働いている。シトクロムｃ５５２は、馬心筋シトクロムｃに比べて非常に高い熱安定性を持っていることが知られている（非特許文献１参照。）。例えば、一般的なタンパク質の変性中点は５０〜６０℃、馬心筋シトクロムｃの変性中点は８５℃であるのに対し、シトクロムｃ５５２の変性温度は一般的な水溶液中（温度の上限は１００℃）では計測不能であることから、少なくとも１００℃以上と高い。また、グアニジン塩酸塩（変性剤）４．２Ｍ存在下におけるシトクロムｃ５５２の変性中点は６０〜７０℃と報告されている。
【０００５】
シトクロムｃ５５２はこのように高い熱安定性を有することによりデバイス材料として適している。シトクロムｃ５５２と馬心筋シトクロムｃとは、構成アミノ酸、立体構造は似ているが、電子伝達を行う活性中心ヘムポケットの環境が異なる。具体的には、馬心筋シトクロムｃでは正電荷を持つリジン残基が分子の全体に分散しているが、シトクロムｃ５５２ではリジン残基数こそ馬心筋シトクロムｃと同程度であるものの、リジン残基はヘムポケットの周りには配置されていない。シトクロムｃ５５２の生体内レドックスパートナーとの複合体構造から、この複合体形成は疎水性相互作用がメインであることが報告されている（非特許文献２参照。）。したがって、シトクロムｃ５５２をその電子伝達能を保持したまま電極へ固定化するには、その特異な条件検索が必要である。
【０００６】
馬心筋シトクロムｃを電極に固定化する方法としては、単分子膜（ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＯＯ- 、１−カルボキシ−１０−デカンチオール）を用いる方法が知られている。そこで、シトクロムｃ５５２の固定化にこの固定化法を用いることが考えられる。しかし、馬心筋シトクロムｃの固定化法に用いられている単分子膜を用いてシトクロムｃ５５２を電極に固定化する方法では、これまで、シトクロムｃ５５２の酸化還元電流は得られていない。
【０００７】
フランスの研究グループは、シトクロムｃ５５２を銀電極に固定化し、このタンパク質固定化電極を用いてタンパク質由来の酸化還元電流を得ることに成功したと報告している（非特許文献３参照。）。しかし、このタンパク質固定化電極を用いて得られたサイクリックボルタモグラムでは酸化波と還元波との間のピーク分離が著しいことから、タンパク質の配向制御に問題がある。また、電極素材としての銀は、通常環境の利用においても容易に腐食、酸化が起こりうる。すなわち、銀電極は、長期安定利用には向かないため、銀電極の代わりに、化学的に安定な電極を利用する必要がある。
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２２０４４５号公報
【非特許文献１】Fee,J.A.and 13 others, Protein Sci. 9, 2074 (2000)
【非特許文献２】Muresanu,L.and 13 others, J.Biol.Chem. 281, 14503 (2006)
【非特許文献３】Bernad,S.and 3 others, Eur.Biophys.J. 36, 1039  (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、この発明が解決しようとする課題は、化学的に安定な金電極上に高い安定性を有するシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体がその電子伝達能を保持したまま固定化された長期安定利用可能なタンパク質固定化電極およびその製造方法を提供することである。
この発明が解決しようとする他の課題は、化学的に安定な金電極上に高い安定性を有するシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体がその電子伝達能を保持したまま固定化された長期安定利用可能なタンパク質固定化電極を用いる機能素子およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行う中で、全く偶然に、金電極に対してシトクロムｃ５５２をその電子伝達能を損なうことなく固定化することができることを見出し、この発明を案出するに至ったものである。
すなわち、上記課題を解決するために、この発明は、
金電極とこの金電極に固定化されたシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体とを有するタンパク質固定化電極である。
この発明はまた、
金電極にシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を固定化するようにしたタンパク質固定化電極の製造方法である。
【００１１】
この発明はまた、
金電極とこの金電極に固定化されたシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体とを有するタンパク質固定化電極を有する機能素子である。
この発明はまた、
金電極上にシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を固定化してタンパク質固定化電極を形成する工程を有する機能素子の製造方法である。
ここで、機能素子は、シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を用いるものである限り特に限定されないが、例えば、光電変換素子や、光電変換機能を有する各種の電子素子などが挙げられる。
【００１２】
この発明において、シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体は、典型的には、その疎水性部分を金電極側に向けて固定化される。典型的には、シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体と金電極とは自己組織化単分子膜を介して結合される。シトクロムｃ５５２の誘導体は、シトクロムｃ５５２の骨格のアミノ酸残基、またはヘムが化学修飾されたものである。シトクロムｃ５５２の変異体は、シトクロムｃ５５２の骨格のアミノ酸残基の一部が他のアミノ酸残基に置換されたものである。
【００１３】
上述のように構成されたこの発明においては、金電極は化学的に安定であるため、タンパク質固定化電極の使用時に電極の腐食や酸化などが起きるのを防止することができる。また、金電極に固定化した際にシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体の電子伝達能が損なわれないようにすることができる。
【発明の効果】
【００１４】
この発明によれば、化学的に安定な金電極上に高い安定性を有するシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体がその電子伝達能を保持したまま固定化された長期安定利用可能なタンパク質固定化電極を実現することができる。そして、このタンパク質固定化電極を用いて高性能な種々の機能素子を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、発明を実施するための最良の形態（以下実施の形態とする）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態（タンパク質固定化電極およびその製造方法）
２．第２の実施の形態（光電変換素子）
【００１６】
〈１．第１の実施の形態〉
［タンパク質固定化電極］
図１に第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極を示す。
図１に示すように、このタンパク質固定化電極においては、金電極１１上に自己組織化単分子膜（self-assembled monolayer，ＳＡＭ）１２を介してシトクロムｃ５５２  １３が固定化されている。この場合、シトクロムｃ５５２  １３は、その疎水性部分１３ａを金電極１１側に向けて固定化されている。シトクロムｃ５５２  １３の内部にあるヘム１３ｂには、中心金属として鉄（Ｆｅ）が配位している。
【００１７】
図２Ａにシトクロムｃ５５２の構造を模式的に示す。図２Ａはシトクロムｃ５５２のヘムとその軸配位子ヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）とリジン残基（正電荷アミノ酸）とを棒モデルで示したものである。このシトクロムｃ５５２の軸配位子ヒスチジン（Ｈｉｓ）が右に来る向きを正面としたとき、図２Ａはヘムの正面図である。図２Ｂに図２Ａに示すシトクロムｃ５５２の表面電荷分布図を示す。図３Ａにシトクロムｃ５５２をヘム背面側から見た図を示す。図３Ｂに図３Ａに示すシトクロムｃ５５２の表面電荷分布図を示す。
【００１８】
比較のために、図４Ａに馬心筋シトクロムｃのヘム正面側から見た図を、図４Ｂに図４Ａに示す馬心筋シトクロムｃの表面電荷分布図を、図５Ａに馬心筋シトクロムｃのヘム背面側から見た図を、図５Ｂに図５Ａに示す馬心筋シトクロムｃの表面電荷分布図を示す。
【００１９】
図４Ｂおよび図５Ｂに示すように、馬心筋シトクロムｃでは、正電荷が分子全体に散在しているのに対し、図２Ｂおよび図３Ｂに示すように、シトクロムｃ５５２では、正電荷はヘム背面に集中している。また、シトクロムｃ５５２のヘム正面は疎水性残基と中性極性残基とが占める。シトクロムｃ５５２  １３の疎水性部分１３ａはこのヘム正面の部分を指す。
【００２０】
図６に、金電極１１上に自己組織化単分子膜１２を介して固定化されたシトクロムｃ５５２  １３を模式的に示す。図６においては、シトクロムｃ５５２  １３の軸配位子ヒスチジンは手前側にあり、また、リジン残基を棒モデルで示した。
図７は、金電極１１上に自己組織化単分子膜１２を介して固定化されたシトクロムｃ５５２  １３を金電極１１側から見た図を示し、軸配位子ヒスチジンは右側にある（ヘム正面）。図７においては、アミノ酸側鎖を棒モデルで示した。
【００２１】
自己組織化単分子膜１２は三つの部分から構成される。第１の部分は、この自己組織化単分子膜１２を固定化しようとする金電極１１の表面の原子と反応する結合性官能基（例えば、チオール基（−ＳＨ）など）である。第２の部分は通常はアルキル鎖であり、自己組織化単分子膜１２の二次元的な規則構造は主としてこのアルキル鎖間のファン・デル・ワールス力によって決まる。そのため、一般に、アルキル鎖の炭素数がある程度以上多い場合に、安定・高密度・高配向な膜が形成される。第３の部分は末端基であり、この末端基を機能性官能基とすることにより固体表面の機能化が可能となる。
【００２２】
自己組織化単分子膜１２は、例えば、疎水性チオールおよび親水性チオールを用いて形成されたものであり、これらの疎水性チオールおよび親水性チオールの割合により、シトクロムｃ５５２  １３と金電極１１との間の結合のしやすさが変わる。親水性チオールの親水基は、例えば、−ＯＨ、−ＮＨ2 、ＳＯ3 - 、ＯＳＯ3 - 、ＣＯＯ- 、ＮＨ4 + などである。これらの疎水性チオールおよび親水性チオールは必要に応じて選択される。
【００２３】
これらの疎水性チオールおよび親水性チオールの組み合わせの好適な例を挙げると、疎水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ3 （ｎ＝５，８，１０）、親水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ2 ＯＨ（ｎ＝５，８，１０）である。具体的には、例えば、疎水性チオールが１−ウンデカンチオール（ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3 ）、親水性チオールが１−ヒドロキシ−１１−ウンデカンチオール（ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨ）である。疎水性チオールおよび親水性チオールの他の組み合わせの例としては、疎水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）m ＣＨ3 、親水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ2 ＯＨ（ただし、ｍ＜ｎ、ｍは例えば５以上、ｎは例えば１０以下）の例も挙げられる。具体的には、例えば、疎水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）9 ＣＨ3 、親水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨの例である。
【００２４】
図８に疎水性チオールおよび親水性チオールを用いて形成された自己組織化単分子膜１２の構造を模式的に示す。図８に示すように、疎水性チオール１２ａおよび親水性チオール１２ｂのチオール基（−ＳＨ）側が金電極１１の表面に結合する。また、疎水性チオール１２ａの疎水基および親水性チオール１２ｂの親水基（図８において○で示す）側が、シトクロムｃ５５２  １３の疎水性部分１３ａと結合する。
【００２５】
［タンパク質固定化電極の製造方法］
このタンパク質固定化電極の製造方法の一例について説明する。
まず、金電極１１を上記の疎水性チオールおよび親水性チオールを所定の割合で混ぜた溶液（溶媒は例えばエタノール）に浸漬することによって、図１に示すように、自己組織化単分子膜１２を金電極１１の表面に形成する。
次に、こうして自己組織化単分子膜１２を形成した金電極１１をシトクロムｃ５５２
１３と緩衝液と必要に応じて塩化カリウム（ＫＣｌ）などの塩とを含む溶液に浸漬することによって、自己組織化単分子膜１２上にシトクロムｃ５５２  １３をその疎水性部分１３ａが金電極１１側を向くように吸着固定する。
以上のようにして、目的とするタンパク質固定化電極が製造される。
【００２６】
［実施例］
このタンパク質固定化電極（以下「シトクロムｃ５５２固定化電極」と言う。）の実施例について説明する。
１．試料の作製
疎水性チオールとしての１−ウンデカンチオール（ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3 ）と親水性チオールとしての１−ヒドロキシ−１１−ウンデカンチオール（ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨ）とを２５：７５の割合で混ぜた０．１ｍＭエタノール溶液を調製した。この溶液に清浄な金ドロップ電極または金平板電極を浸漬し、室温で一昼夜放置する。こうして、自己組織化単分子膜が金ドロップ電極または金平板電極の表面に形成される。
【００２７】
これらの電極を超純水でリンスした後、５０μＭシトクロムｃ５５２溶液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ  ＫＣｌ）に浸漬し、室温で３０分以上インキュベートする。こうして、自己組織化単分子膜を介して金ドロップ電極または金平板電極の表面にシトクロムｃ５５２が固定化されたシトクロムｃ５５２固定化電極が作製される。
【００２８】
こうして作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いてサイクリックボルタンメトリーを行った。その結果を図９および図１０に示す。図９および図１０において、Ｉは電流（Ａ）、Ｅは参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対する電位（Ｖ）である（以下同様）。図９および図１０に示すように、ピーク分離のない典型的な吸着型のサイクリックボルタモグラムを描いていることが分かる。ここで、図９に示すサイクリックボルタモグラムは、電位掃引速度を１０〜１００ｍＶ／ｓの範囲で１０ｍＶ／ｓずつ変えて測定した結果を示す。また、図１０に示すサイクリックボルタモグラムは、電位掃引速度を１００〜１０００ｍＶ／ｓの範囲で１００ｍＶ／ｓずつ変えて測定した結果を示す。
【００２９】
図９および図１０から分かるように、このシトクロムｃ５５２固定化電極では、電位掃引速度が１０〜１０００ｍＶ／ｓの範囲ではピーク分離が生じていない。これは、このシトクロムｃ５５２固定化電極においては、シトクロムｃ５５２のヘムポケットが金電極に対して最適に配向していることを示している。
【００３０】
図１１はこのシトクロムｃ５５２固定化電極を室温でタンパク質溶液中に保存したときの電流値（アノーディック電流Ｉpaおよびカソーディック電流Ｉca）の経日変化を示す。図１１に示すように、このシトクロムｃ５５２固定化電極は、タンパク質溶液中において室温で１カ月間保存した後でも、同じ酸化還元電流値が得られる。これに対し、馬心筋シトクロムｃを使った同様の実験では、時間が経つごとに電流値が減少し、サイクリックボルタモグラムにおけるピーク分離も起こる。
【００３１】
次に、シトクロムｃ５５２固定化電極におけるシトクロムｃ５５２のヘムの向きが、実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極におけるシトクロムｃ５５２のヘムの向きと反対、すなわち金電極と反対側を向いている場合の比較データについて説明する。より具体的には、末端の異なる自己組織化単分子膜を用いてシトクロムｃ５５２を金電極に固定化した場合、すなわち正しくない配向でシトクロムｃ５５２を固定化した場合のデータについて説明する。
【００３２】
具体的には、末端（−Ｒ）の異なる炭素数１０のチオール（ＨＳ（ＣＨ2 ）10Ｒ）を用いてシトクロムｃ５５２を金電極に固定化したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いてサイクリックボルタンメトリーを行った。得られたサイクリックボルタモグラムを図１２に示す。ただし、緩衝液としては１０ｍＭリン酸−Ｎａ溶液（ｐＨ７．０）を用い、電位掃引速度は５０ｍＶ／ｓとした。
【００３３】
図１２より、末端（−Ｒ）が−ＣＯＯ- である場合に、タンパク質らしい酸化還元のピークが見られるが、酸化還元サイクルを繰り返すと、いずれ消滅する。このことから、シトクロムｃ５５２を正しくない配向で金電極に固定化した場合には、シトクロムｃ５５２の機能を保持することができないことが分かる。
【００３４】
次に、上記のシトクロムｃ５５２固定化電極を作製する際に用いるシトクロムｃ５５２溶液中のＫＣｌ濃度を変化させてサイクリックボルタンメトリーを行った結果について説明する。
測定に際しては、緩衝液として１０ｍＭリン酸−Ｎａ溶液（ｐＨ７．０）を用い、電位掃引速度は５０ｍＶ／ｓとした。シトクロムｃ５５２固定化電極としては、上記と同様にＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3 およびＨＳ（ＣＨ3 ）10ＣＨ2 ＯＨを用いて形成した自己組織化単分子膜を介して金ドロップ電極にシトクロムｃ５５２を固定化したものを用いた。ただし、金ドロップ電極の直径は２．５ｍｍである。
【００３５】
得られたサイクリックボルタモグラムを図１３に示す。ただし、シトクロムｃ５５２溶液中の緩衝液は１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を用いた。シトクロムｃ５５２を固定化することができるシトクロムｃ５５２溶液中のＫＣｌ濃度の範囲は０〜２００ｍＭであるので、この範囲でＫＣｌ濃度を変化させてサイクリックボルタンメトリーを行った。
【００３６】
図１４は、図１３に示すサイクリックボルタモグラムのカソーディック電流（下向きのピーク）を積分し、総電荷量を求め、ＫＣｌ濃度に対してプロットしたグラフを示す。図１４より、ＫＣｌ濃度は１０〜３０ｍＭが最適濃度であることが分かる。この最適濃度の場合、シトクロムｃ５５２溶液中にＫＣｌが存在しない場合、すなわちＫＣｌ濃度が０ｍＭである場合、あるいは、ＫＣｌ濃度が５０ｍＭ以上の場合に比べ、シトクロムｃ５５２の固定化量は約１．５倍になる。ＫＣｌ濃度が１００ｍＭより高い場合には、シトクロムｃ５５２および自己組織化単分子膜の脱離が見られるようになる。
【００３７】
次に、自己組織化単分子膜を形成する際に用いる、ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3 とＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨとを混ぜたエタノール溶液中のＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3 とＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨとの比率を変えて自己組織化単分子膜を形成した。そして、この自己組織化単分子膜を介してシトクロムｃ５５２を金電極に固定化したシトクロムｃ５５２固定化電極のサイクリックボルタンメトリーを行った。ただし、測定に際しては、緩衝液として１０ｍＭリン酸−Ｎａ溶液（ｐＨ７．０）を用い、電位掃引速度は５０ｍＶ／ｓとした。
【００３８】
得られたサイクリックボルタモグラムを図１５に示す。図１５の脚注の数値は（［ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3 ］／［ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨ］）を示し、例えば、（２０／８０）はＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3 が２０％、ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨが８０％であることを意味する。
【００３９】
図１５に示す結果を踏まえて、ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3 とＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨとの全体におけるＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨの含有量を６０〜９５％の範囲で５％刻みで細かく変化させて調べた。その結果を図１６に示す。
図１５および図１６に示す結果の、酸化還元ピークにおける電流値をＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨの含有量に対してプロットしたグラフを図１７に示す。図１７より、ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨの含有量が６０〜９０％の範囲でシトクロムｃ５５２の固定化を良好に行うことが可能であることが分かる。詳細は省略するが、別途行った実験により、疎水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ3 （ｎ＝５，８，１０）、親水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ2 ＯＨ（ｎ＝５，８，１０）である場合全般について、ＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ2 ＯＨの含有量が６０〜９０％の範囲でシトクロムｃ５５２の固定化を良好に行うことが可能であることが確認されている。
【００４０】
次に、自己組織化単分子膜を形成する際に用いる疎水性チオールおよび親水性チオールの長さを変化させてサイクリックボルタンメトリーを行った結果について説明する。具体的には、疎水性チオールとして末端がメチル基で炭素数が５または１０のＨＳ（ＣＨ2 ）5 ＣＨ3 、ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3 、親水性チオールとして末端がヒドロキシメチル基で炭素数が５または１０のＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨ、ＨＳ（ＣＨ2 ）5 ＣＨ2 ＯＨを用い、これらを組み合わせて自己組織化単分子膜を作製した。そして、この自己組織化単分子膜を介して金電極にシトクロムｃ５５２を固定化した。こうして作製されたシトクロムｃ５５２固定化電極を用いてサイクリックボルタンメトリーを行った。得られたサイクリックボルタモグラムを図１８に示す。
【００４１】
図１８に示す曲線（１）、（２）、（３）、（７）において、タンパク質由来のピークが０Ｖ付近に見られる。これは、自己組織化単分子膜を形成する際に用いる疎水性チオールおよび親水性チオールにおける疎水性チオールのメチル基と親水性チオールのヒドロキシル基とのバランス、すなわち、自己組織化単分子膜の表面における疎水基と親水基との分布のバランスが保たれれば、疎水性チオールおよび親水性チオールの炭素数を変えてもシトクロムｃ５５２を同様な配向で固定化することができることを示している。親水性チオールについては、親水基の炭素数は５の場合より１０の場合の方がより良好な結果が得られている。
【００４２】
以上のように、この第１の実施の形態によれば、化学的に安定な金電極１１上に高い安定性を有するシトクロムｃ５５２  １３をその疎水性部分１３ａが金電極１１側を向くように自己組織化単分子膜１２を介して固定化するようにしている。このため、シトクロムｃ５５２  １３がその電子伝達能を保持したまま金電極１１に固定化された長期安定利用可能なタンパク質固定化電極を実現することができる。
【００４３】
〈２．第２の実施の形態〉
［光電変換素子］
図１９に示すように、この光電変換素子においては、第１の実施の形態と同様に、金電極１１上に自己組織化単分子膜１２を介してシトクロムｃ５５２  １３が固定化されたタンパク質固定化電極を有する。さらに、このシトクロムｃ５５２  １３には、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein,ＧＦＰ）１４が静電的に結合している。
【００４４】
この光電変換素子においては、外部から入射した光（ｈν）が緑色蛍光タンパク質１４に入射すると、この光の入射により緑色蛍光タンパク質１４の電子が励起される。励起された電子はシトクロムｃ５５２  １３に移動し、金基板１１から光電流として外部に取り出される。こうして光電変換が行われる。
上記以外のことは第１の実施の形態と同様である。
この第２の実施の形態によれば、長期安定利用可能なタンパク質固定化電極を用いた新規な光電変換素子を実現することができる。
【００４５】
以上、この発明の実施の形態について具体的に説明したが、この発明は、上述の実施の形態に限定されるものではなく、この発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
例えば、上述の実施の形態において挙げた数値、構造、構成、形状、材料などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、構造、構成、形状、材料などを用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極を示す略線図である。
【図２】この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極において用いられるシトクロムｃ５５２の構造を示す略線図である。
【図３】この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極において用いられるシトクロムｃ５５２の構造を示す略線図である。
【図４】馬心筋シトクロムｃの構造を示す略線図である。
【図５】馬心筋シトクロムｃの構造を示す略線図である。
【図６】この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極のシトクロムｃ５５２の構造の詳細を示す略線図である。
【図７】この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極のシトクロムｃ５５２の構造の詳細を示す略線図である。
【図８】この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極の自己組織化単分子膜の構造を示す略線図である。
【図９】実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。
【図１０】実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。
【図１１】実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極を室温でタンパク質溶液中に保存したときの電流値の経日変化を示す略線図である。
【図１２】実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。
【図１３】実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。
【図１４】シトクロムｃ５５２溶液中のＫＣｌ濃度を変えて作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。
【図１５】自己組織化単分子膜の形成に用いるＨＳ（ＣＨ3 ）10ＣＨ2 ＯＨの含有量を変えて作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。
【図１６】自己組織化単分子膜の形成に用いるＨＳ（ＣＨ3 ）10ＣＨ2 ＯＨの含有量を変えて作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。
【図１７】自己組織化単分子膜の形成に用いる原料中のＨＳ（ＣＨ3 ）10ＣＨ2 ＯＨの含有量を変えて作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーにより得られたサイクリックボルタモグラムにおけるピークにおける電流値をＨＳ（ＣＨ3 ）10ＣＨ2 ＯＨの含有量に対してプロットした略線図である。
【図１８】自己組織化単分子膜の形成に用いる疎水性チオールおよび親水性チオールの長さを変えて作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。
【図１９】この発明の第２の実施の形態による光電変換素子の構造を示す略線図である。
【符号の説明】
【００４７】
１１…金電極、１２…自己組織化単分子膜、１２ａ…疎水性チオール、１２ｂ…親水性チオール、１３…シトクロムｃ５５２、１３ａ…疎水性部分、１３ｂ…ヘム、１４…緑色蛍光タンパク質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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