(57)【要約】【課題】本発明の目的は、血栓溶解活性および抗凝固活性両方を持つ融合タンパク質を提供することである。【解決手段】本発明は、血栓溶解および抗凝固両方の機能を有する融合タンパク質、ならびにこれと接合するペプチドを扱ったものであり、特に、本発明は、抗凝固タンパク質、および、プロフィブリノリシン活性の機能を有するタンパク質分子を扱ったものである。これらは、凝固因子により同定され開裂されるアミノ酸配列を有する該接合ペプチドにより繋がれた。また、本発明はこの融合タンパク質の医学的使用、ならびに、血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を繋げるに有用な、凝固因子により同定される該アミノ酸配列を有する接合ペプチドの使用に関する。【選択図】図１
2010184930.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓溶解タンパク質、抗凝固タンパク質、およびリンカーペプチドを含む融合タンパク質であって、該リンカーペプチドが、アミノ酸配列ＬｅｕＧｌｙＰｒｏＡｒｇ（ＬＧＰＲ）であり、血液凝固因子ＦＩＩａ（トロンビン）により認識され得るか、または、該リンカーペプチドが、ＬＧＰＲを含有するペプチドである融合タンパク質。
【請求項２】
前記血栓溶解タンパク質が、他の血栓溶解因子を活性化させるか、または、それら自体が血栓溶解活性を持っている、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、ウロキナーゼ様プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、およびこれらの変異体を含む群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記血栓溶解タンパク質が、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）またはこれの変異体である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記抗凝固タンパク質が、ヒルジン、抗トロンビンＩＩＩ、およびこれらの変異体を含む群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記抗凝固タンパク質が、ヒルジンまたはこれの変異体である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記融合タンパク質が、リンカーペプチドＧＳＬＧＰＲにより繋がれたスタフィロキナーゼおよびヒルジンの融合タンパク質（ＳＡＫ−ＧＳＬＧＰＲ−ＨＶ２）である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
リンカーペプチドＧＳＩＥＧＲにより繋がれたスタフィロキナーゼおよびヒルジンの融合タンパク質（ＳＡＫ−ＧＳＩＥＧＲ−ＨＶ２）、もしくは、リンカーペプチドＰＲＩＥＧＲにより繋がれた組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）およびヒルジンの融合タンパク質（ｔＰＡ−ＰＲＩＥＧＲ−ＨＶ２）である、融合タンパク質。
【請求項８】
前記融合タンパク質が、リンカーペプチドＧＳＩＥＧＲにより繋がれたスタフィロキナーゼおよびヒルジンの融合タンパク質（ＳＡＫ−ＧＳＩＥＧＲ−ＨＶ２、すなわちＳＦＨ）である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を含む融合タンパク質の調製方法であって、ＩＥＧＲもしくはＬＧＰＲ含有ペプチドをコード化する配列を介して、該血栓溶解タンパク質の遺伝子および該抗凝固タンパク質の遺伝子を繋げて、該融合タンパク質の遺伝子を形成させ、次いで、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、イースト、もしくは動物細胞において該融合タンパク質の遺伝子を発現させ、該融合タンパク質を産生させることを含み、該融合タンパク質が、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質である方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、医薬的に許容可能なキャリアもしくは賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を含む融合タンパク質の調製における、血液凝固因子により認識されるリンカーペプチドの使用であって、該リンカーペプチドが、アミノ酸配列ＬＧＰＲであり、血液凝固因子ＦＩＩａ（トロンビン）により認識され得るか、または、該リンカーペプチドが、ＬＧＰＲを含有するペプチドであり、該融合タンパク質が、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質である使用。
【請求項１２】
血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を含む融合タンパク質の調製における、血液凝固因子により認識されるリンカーペプチドの使用であって、該リンカーペプチドが、ＧＳＩＥＧＲもしくはＰＲＩＥＧＲであり；該融合タンパク質が、請求項７に記載の融合タンパク質である使用。
【請求項１３】
血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質間のリンカーとしての、血液凝固因子により認識され開裂されるリンカーペプチドの使用であって、該リンカーペプチドが、アミノ酸配列ＬＧＰＲであり、血液凝固因子ＦＩＩａ（トロンビン）により認識され得るか、または、該リンカーペプチドが、ＬＧＰＲを含有するペプチドである使用。
【請求項１４】
血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質間のリンカーとしての、血液凝固因子により認識され開裂されるリンカーペプチドの使用であって、該リンカーペプチドが、ＧＳＩＥＧＲであり、該血栓溶解タンパク質が、ＳＡＫであり、該抗凝固タンパク質が、ＨＶ２であるか；または、該リンカーペプチドが、ＰＲＩＥＧＲであり、該血栓溶解タンパク質が、ｔ−ＰＡであり、該抗凝固タンパク質が、ＨＶ２である使用。
【請求項１５】
血栓症に関連した疾患または病状の処置用の薬剤の調製のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は融合タンパク質に関し、これは、血栓溶解タンパク質、抗凝固タンパク質、およびリンカーペプチドから構成される。特に、該融合タンパク質は、抗凝固タンパク質およびプラスミノーゲン活性化活性を持つタンパク質分子から構成され、ここでこれら２つのタンパク質は、リンカーペプチドを介して一緒に繋がれ、これは、血液凝固因子により認識され、開裂され得るものである。本願はまた、該融合タンパク質の医学的使用、ならびに、血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を繋げることにおける、血液凝固因子により認識され得る該リンカーペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓血管疾患は、ヒトの死因の筆頭である。現在、ウロキナーゼおよび組織型プラスミノーゲン活性化因子が、主要な血栓溶解薬剤として臨床において使用される一方、ヘパリンおよびヒルジンが、主要な抗凝固薬剤として使用されている。血栓溶解治療は、血栓症を患う患者の死亡割合を減少させることに成功してはいるが、小さな血の塊の血液循環中への進入のために、再血栓化がしばしば起きる。このため、今では、ヘパリンまたはヒルジンが、血栓治療用血栓溶解剤と組み合わせて、抗凝固剤として使用されている。
【０００３】
しかしながら、血栓溶解剤および抗凝固剤は通常、これらの有する乏しい特異性のために、システマティックな血栓溶解および抗凝固を引き起こし、これにより、システマティックな出血に至る。
【０００４】
特に、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、およびウロキナーゼ様プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）は、プラスミノーゲンを活性化させることができ、これが今度は、血栓部位において血餅を溶解させる。しかしながら、活性化されたこのプラスミノーゲンはまた、非血栓部位においても出血を引き起こす。スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）は天然起源の新たなプラスミノーゲン活性化因子であり、血栓溶解に対してある種の特異性を持っている。
【０００５】
ヒルジン（ＨＶ）は小さなタンパク質であるが、トロンビンに対するその高い親和性および選択的阻害性のために、新たな抗凝固剤と見なされている。しかしながら、ヒルジンは臨床において、システマティックな出血を引き起こす傾向にある。更に、ヒルジンに対するアンタゴニストはない。
【０００６】
このため、副作用を抑え、血栓溶解薬剤の治療効果を向上させるためには、それらの選択性、標的特性、および血栓血餅への局所的集中性を向上させること、ならびに、血栓がない部位への薬剤の集中、もしくは、血栓がない部位での薬剤の作用、および、出血という副作用を抑えることが、重要である。先行技術の融合タンパク質は、出血という副作用を抑えることができない。
【０００７】
このため、抗血栓薬剤の開発は、血栓溶解活性および抗凝固活性両方を持つ「２機能」医薬品に焦点を当てている。血栓溶解活性を抗凝固活性と組み合わせるために、ヒルジンのＳＡＫもしくはＳＫとの融合が研究されてきた。これは、もしヒルジンのＮ末端がＳＡＫもしくはＳＫのＣ末端へと結合されると、該ヒルジンはその抗トロンビン活性を失うであろう一方、血栓溶解タンパク質のプラスミノーゲン活性化活性は保持されるか、もしくは、部分的に保持されること；もしヒルジンのＣ末端がＳＡＫのＮ末端へと結合されると、その後、ＳＡＫのＮ末端のｉｎ  ｖｉｖｏでの急速な分解のために、該融合タンパク質は機能する前に分解してしまうであろうということを示した。このため、血栓治療においては、血栓溶解活性および抗凝固活性両方を持つ融合タンパク質を開発することが、魅力的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、血栓溶解活性および抗凝固活性両方を持つ融合タンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の認識に基づいている。
融合タンパク質は、血液凝固因子認識可能配列を含有するペプチドを介して、血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を繋ぐことにより、構築され得る。こうして構築された融合タンパク質は、以下のような幾つかの利点を提供する。
第１に、該融合タンパク質は、プラスミノーゲン活性化活性を保持し、これ故に血栓溶解活性を保持する。
第２に、ヒルジンのような抗凝固タンパク質のＮ末端が、血栓溶解タンパク質のＣ末端へと繋がれ、このため、該融合タンパク質全体は、血栓のない部位およびｉｎ ｖｉｔｒｏでは抗凝固活性を示さず、これにより、ヒルジンのような抗凝固タンパク質により引き起こされる出血という副作用を除くかもしくは抑える。
第３に、該融合タンパク質は、血栓部位におけるトロンビンに対するヒルジンの高い親和性のために、血餅を標的とすることができる能力を持っており、このためにこれは、血栓部位での薬剤濃度を増加させ、該薬剤の治療に要する量を減らす。
第４に、該融合タンパク質が血栓部位へと循環して行く時に、血栓に含まれ血栓の特徴である血液凝固因子が、設計された認識部位において該融合タンパク質を急速に開裂させ、遊離の血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を解き放ち、これにより、血栓溶解活性および抗凝固活性両方を機能させる。本発明は、以上の利点に鑑みて、確立された。
【００１０】
１つの態様において、本発明は、血栓溶解タンパク質、抗凝固タンパク質、およびリンカーペプチドから構成される融合タンパク質に関する。
【００１１】
もう１つ別の態様において、本発明は、血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を含む融合タンパク質の調製方法に関し、本方法は、ＩＥＧＲまたはＬＧＰＲをコード化する塩基配列を介して、血栓溶解タンパク質遺伝子および抗凝固タンパク質遺伝子を繋ぎ、該融合タンパク質をコード化する遺伝子を形成させること、ならびに、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）、イースト、または動物細胞株において、該融合タンパク質をコード化する該遺伝子を発現させ、該融合タンパク質を産生させることを含む。
【００１２】
更なる態様において、本発明は、該融合タンパク質と、医薬的に許容可能なキャリアもしくは賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【００１３】
更なる態様において、本発明は、血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質を含む融合タンパク質の調製における、血液凝固因子により認識される配列を含有するリンカーペプチドの使用に関する。
【００１４】
更なる態様において、本発明は、血栓溶解タンパク質および抗凝固タンパク質のリンカーペプチドとしての、血液凝固因子により認識され開裂され得る配列の使用に関する。
【００１５】
尚更なる態様において、本発明は、血栓症に関連した疾患もしくは病状の処置法に関し、本方法は、血栓症を患う患者へ、治療に有効な量の該融合タンパク質を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
以下の図面は、本発明を例証するのに提示されるが、本発明を限定するよう意図されるものではない。
【図１】図１は、本融合タンパク質の例示である。
【図２】図２は、本融合タンパク質遺伝子、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）遺伝子、およびヒルジン（ＨＶ２）遺伝子の電気泳動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書中使用される場合、用語「血栓溶解タンパク質」は、血栓溶解活性を持つタンパク質、例えば、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、ウロキナーゼ様プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、毒物、およびこれらの変異体に関し、これらは他の血栓溶解因子を活性化させるか、または、これら自体が血栓溶解活性を持っている。スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）またはこれの変異体が、好ましい。
【００１８】
本明細書中使用される場合、用語「抗凝固タンパク質」は、ヒルジン、抗トロンビンＩＩＩ、毒物、およびこれらの変異体のような、抗凝固活性を持っているタンパク質に関する。ヒルジンまたはこれの変異体が、好ましい。
【００１９】
本明細書中使用される場合、用語「血液凝固因子により認識されるリンカーペプチド」は、テトラペプチドＩＥＧＲ（ＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇ）、該ＩＥＧＲ配列を含有するペプチド、テトラペプチドＬＧＰＲ（ＬｅｕＧｌｙＰｒｏＡｒｇ）、または該ＬＧＰＲ配列を含有するペプチドに関する。
【００２０】
本明細書中使用される場合、用語「血栓症に関連した疾患または病状」は、脳血栓、動脈血栓、発作、および粥状（アテローム）硬化のような、血栓により引き起こされる如何なる疾患または病状にも関する。
【００２１】
本明細書中使用される場合、用語「患者」は動物、特にヒトに関する。
【００２２】
本発明によれば、本発明の融合タンパク質は、好ましくは、ＧＳＩＥＧＲにより繋がれたスタフィロキナーゼおよびヒルジンから構成されるＳＦＨ融合タンパク質（ＳＡＫ−ＧＳＩＥＧＲ−ＨＶ２）、ＰＲＩＥＧＲにより繋がれた組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）およびヒルジンから構成される融合タンパク質（ｔＰＡ−ＰＲＩＥＧＲ−ＨＶ２）、またはＧＳＬＧＰＲにより繋がれたスタフィロキナーゼおよびヒルジンから構成される融合タンパク質（ＳＡＫ−ＧＳＬＧＰＲ−ＨＶ２）である。
【００２３】
本発明によれば、本融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または動物細胞中発現されてよい。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉまたはイースト菌細胞中発現される。
【００２４】
以下の実施例は、本発明を例証すべく意図されるが、本発明を限定することを意味するものではない。
【実施例】
【００２５】
［実施例１：融合タンパク質ＳＦＨ（ＳＡＫ−ＧＳＩＥＧＲ−ＨＶ２）の調製および該ＳＦＨの２機能活性］
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位がそれぞれ、ＳＡＫ遺伝子の２つの末端へと加えられる。停止コドンを持たない該ＳＡＫ遺伝子が、ｐＢＶ２２０ベクター中へと導入され、結果ｐＢＶＳＡＫを与えた。ＰＣＲ法により、該ＢａｍＨＩ制限部位およびＦＸａ認識配列ＧＳＩＥＧＲをコードする配列が、プライマー（５’−ＣＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡＴ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＴＣＧ−３’）を介して、ヒルジン遺伝子の上流に取り込まれる。該ヒルジン遺伝子の下流とマッチされた該プライマーは、１つのＰｓｔＩ制限部位を含有する。ＦＸａ認識配列ＧＳＩＥＧＲを伴った該ヒルジン遺伝子は、２つの酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより消化され、前記ベクターｐＢＶＳＡＫもまた、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより消化される。この消化されたヒルジン断片は、この消化されたｐＢＶＳＡＫベクター中へと挿入され、プラスミドｐＢＶＳＦＨを形成する（図１参照）。これらの２つの遺伝子断片もまた、重複ＰＣＲ法により、繋がれ得る。該プラスミドｐＢＶＳＦＨはＥ．ｃｏｌｉ中へと導入されて形質転換を引き起こし、４２℃において発現するよう誘導される。所望の融合タンパク質（ＳＦＨ）が、イオン交換およびゲル濾過法により、９６％より高い純度において得られる。該ＳＦＨ融合タンパク質は、３つのドメイン、つまり、ＳＡＫ配列、ＦＸａ認識配列ＧＳＩＥＧＲ、およびヒルジンを含む。該ＳＦＨ融合タンパク質のアミノ酸配列は、以下の通り。
１：ｓｓｓｆｄｋｇｋｙｋ  ｋｇｄｄａｓｙｆｅｐ  ｔｇｐｙｌｍｖｎｖｔ  ｇｖｄｇｋｇｎｅｌｌ ｓｐｈｙｖｅｆｐｉｋ
６１：ｐｇｔｔｌｔｋｅｋｉ  ｅｙｙｖｅｗａｌｄａ  ｔａｙｋｅｆｒｖｖｅ  ｌｄｐｓａｋｉｅｖｔ ｙｙｄｋｎｋｋｋｅｅ
１０１：ｓｆｐｉｔｅｋｇ  ｆｖｖｐｄｌｓｅｈｉ  ｋｎｐｇｆｎｌｉｔｋ  ｖｉｉｅｋｋｇｓｉｅ  ｇｒｉｔｙｔｄｃｔｅ  ｓｇｑｄｌｃｌｃｅｇ
１６１：ｓｎｖｃｇｋｇｎｋｃ  ｉｌｇｓｎｇｅｅｎｑ  ｃｖｔｇｅｇｔｐｋｐ  ｑｓｈｎｄｇｄｆｅｅ  ｉｐｅｅｙｌｑ
【００２６】
この精製された融合タンパク質の血栓溶解活性は、色素基質Ｓ−２２５１を使用して求められた。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて該融合タンパク質の血栓溶解活性および抗凝固活性をテストするために、マウスの尾における血栓（ＲＴＴ）が、κ−カラゲナンにより誘導された。その結果は、該ＳＦＨ融合タンパク質の抗凝固活性が、ＳＡＫのそれよりも有意により高いことを示す。特に、κ−カラゲナンによる誘導の２４時間後、ＳＡＫが８時間毎に、体重１ｋｇ当たり１．２ｍｇの投与量にて腹腔内（ｉ．ｐ．）注射され、尾における該血栓の阻害が３６．６％である。しかしながら、当モルのＳＦＨが体重１ｋｇ当たり１．８ｍｇの投与量にて投与されると、尾における該血栓の阻害は１００％である。κ−カラゲナンによる誘導の３６時間後、上記同様に投与されたＳＡＫおよびＳＦＨにより、尾における該血栓の阻害がそれぞれ１８．２％および９０％に到達した。詳細な結果が、表１〜３に示される。
【００２７】
【表１】
2010184930.tif 000003
【００２８】
【表２】
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【００２９】
【表３】
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【００３０】
表１は、該融合タンパク質ＳＦＨが、無操作のスタフィロキナーゼと同じレベルの血栓溶解活性を呈することを示すものである。表２は、無操作の融合タンパク質ＳＦＨが抗凝固活性を呈さず、しかし、一旦血液凝固因子ＦＸａにより開裂されると、完全なる抗凝固活性を示すことを示すものである。表３は、ＳＦＨが有意な血栓阻害効果を持っていることを実証するものである。これ故に、本発明の本融合タンパク質は、血栓溶解活性および抗凝固活性両方を、実際に持っている。
【００３１】
［実施例２：融合タンパク質ｔＰＡ−ＰＲＩＥＧＲ−ＨＶ２の調製］
ＸｈｏＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位がそれぞれ、ｔＰＡ遺伝子の上流および下流へと加えられる。停止コドンを持たない該ｔＰＡ遺伝子が、ｐＰＩＣ９ベクター中へと導入される。ＰＣＲ法を使用して、プライマーを介して、該ＡｖｒＩＩ制限部位およびＦＸａ認識配列をコードする配列が、ヒルジン遺伝子の上流に取り込まれる。該ヒルジン遺伝子の下流とマッチされた該プライマーは、１つのＮｏｔＩ制限部位を含有する。ＦＸａ認識配列を伴った該ヒルジン遺伝子は、２つの酵素ＡｖｒＩＩおよびＮｏｔＩにより消化され、結果得られる断片は、前記のように構築されたベクターｐＰＩＣ９中へと組み込まれ、この導入された断片はｔＰＡ遺伝子の下流に位置し、この融合遺伝子ＰＡＦＨ中へと組み込まれて、ｔＰＡと共に該融合遺伝子ＰＡＦＨを形成する（これを以降、ＴＦＨと略記）。こうして構築されたプラスミドは、ｐＰＩＣ９−ＴＦＨとして表記される。該プラスミドｐＰＩＣ９−ＴＦＨおよびｐＰＩＣ９Ｋは、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにより消化される。該ＴＦＨ遺伝子はその後、ｐＰＩＣ９Ｋ中へと挿入されて、ｐＰＩＣ９Ｋ−ＴＦＨ遺伝子を形成する。該プラスミドｐＰＩＣ９Ｋ−ＴＦＨは直線状にされ、電気による形質転換により、イーストゲノム中へと取り込まれる。その発現を誘導するには、メタノールが使用される。所望の融合タンパク質ＴＦＨは、３つのドメイン、つまり、ｔＰＡ配列、ＦＸａ認識配列、およびヒルジンを含む。
【００３２】
［実施例３：融合タンパク質ＳＴＨ（ＳＡＫ−ＧＳＬＧＰＲ−ＨＶ２）の調製および該ＳＴＨの２機能活性］
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位がそれぞれ、ＳＡＫ遺伝子の２つの末端へと加えられる。停止コドンを持たない該ＳＡＫ遺伝子が、ｐＢＶ２２０ベクター中へと導入され、結果ｐＢＶＳＡＫを与えた。ＰＣＲ法により、プライマーを介して、該ＢａｍＨＩ制限部位およびＦＸＩＩａ認識配列ＧＳＬＧＰＲをコードする配列が、ヒルジン遺伝子の上流に取り込まれる。該ヒルジン遺伝子の下流とマッチされた該プライマーは、１つのＰｓｔＩ制限部位を含有する。ＦＸＩＩａ認識配列ＧＳＬＧＰＲを伴った該ヒルジン遺伝子は、２つの酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより消化され、前記ベクターｐＢＶＳＡＫもまた、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより消化される。この消化されたヒルジン断片は、この消化されたｐＢＶＳＡＫベクター中へと挿入され、プラスミドｐＢＶＳＴＨを形成する。この配列は、酵素による消化により確認される。あるいは、これら２つの遺伝子断片は、重複ＰＣＲ法により繋がれてもよい。該プラスミドｐＢＶＳＴＨはＥ．ｃｏｌｉ中へと導入され形質転換を引き起こし、４２℃において発現するよう誘導される。所望の融合タンパク質（ＳＴＨ）が、イオン交換およびゲル濾過法により、９６％より高い純度において得られる。該ＳＴＨ融合タンパク質は、３つのドメイン、つまり、ＳＡＫ配列、ＦＸＩＩａ認識配列ＧＳＬＧＰＲ、およびヒルジンを含む。
【図１】
2010184930.tif 000006
【図２】
2010184930.tif 000007