(57)【要約】【課題】ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物、その治療用組成物を含有する治療用薬剤、および中枢神経髄鞘形成促進方法を提供すること。【解決手段】中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物に、ＭＡＰＫ経路活性化阻害物質、例えばＭＡＰＫＫ活性阻害物質を含有させる。その治療用組成物を含有する治療用薬剤を中枢神経髄鞘形成不全の患者に投与することによって、中枢神経髄鞘形成を促進し、中枢神経髄鞘形成不全症状を改善することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物であって、
ＭＡＰＫ経路活性化を阻害するための阻害物質を含有する治療用組成物。
【請求項２】
前記阻害物質がＭＡＰＫリン酸化酵素（ＭＡＰＫＫ）活性阻害物質であることを特徴とする、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項３】
前記ＭＡＰＫＫ活性阻害物質が、Ｕ０１２６および／またはＰＤ９８０５９であることを特徴とする、請求項２に記載の治療用組成物。
【請求項４】
請求項１または２または３に記載の治療用組成物を含有する、中枢神経髄鞘形成不全の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物および中枢神経髄鞘形成促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Pelizaeus-Merzbacher（ペリツェウス・メルツバッハ）病（ＰＭＤ）は、先天性の中枢神経髄鞘形成不全疾患である（例えば、非特許文献１参照）。ＰＭＤ患者は精神、言語、運動に強い精神障害を発症し、具体的病症として、頭部振戦、眼振、歩行時のふらつき、言語障害、視神経萎縮、進行性運動障害、精神運動発達退行等がみられる。
【０００３】
この髄鞘形成不全の原因の一つとしてＸ染色体上に存在するProteolipid protein１（ＰＬＰ１）遺伝子が知られる。ＰＬＰ１遺伝子の重複、変異、欠失等の異常、および、その他原因不明の異常によって、中枢神経に特異的なグリア細胞であるオリゴデンドロサイトによる髄鞘形成不全が引き起こされ、ＰＭＤを発症する（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００４】
しかしながら、現在までのところ、ＰＭＤの有効な治療薬および治療方法はなく、その開発が待ち望まれている。
【非特許文献１】Duncan ID, Journal of the Neurological Science, 228: 204-205 (2005)
【非特許文献２】Inoue K, Neurogenetics, 6 (1): 1-16 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物、その治療用組成物を含有する治療用薬剤、および中枢神経髄鞘形成促進方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＰＬＰ１タンパク質の過剰発現によって髄鞘形成不全を起こしたオリゴデンドロサイトにＭＡＰＫリン酸化酵素（ＭＡＰＫＫ）活性阻害物質であるＵ０１２６および／またはＰＤ９８０５９を作用させることによって、髄鞘形成不全症状が正常レベルまで改善されることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００７】
なお、本明細書で、「ＭＡＰＫ」とは、マイトジェン活性化タンパク質リン酸化酵素（mitogen-activated protein kinase）ＥＲＫを意味する。また、「酵素の活性を阻害する」とは、「活性化酵素自体の活性を阻害する」こと、および「不活性の酵素の活性化を阻害する」ことの両方の意味を含む。例えば、「ＭＡＰＫＫ活性阻害物質」とは、活性化ＭＡＰＫＫの活性を阻害することによって、ＭＡＰＫ経路におけるＭＡＰＫＫの下流に位置するタンパク質の活性化を阻害する物質、および、不活性のＭＡＰＫＫに作用することによって、ＭＡＰＫＫ活性化を阻害することによって、ＭＡＰＫ経路におけるＭＡＰＫＫの下流に位置するタンパク質の活性化を阻害する物質、の両方を意味する。
【０００８】
すなわち、本発明に係るＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物は、ＭＡＰＫ経路活性化を阻害するための阻害物質を含有する。前記阻害物質はＭＡＰＫＫ活性阻害物質であってもよく、さらに、ＭＡＰＫＫ活性阻害物質は、Ｕ０１２６および／またはＰＤ９８０５９であってもよい。なお、上記中枢神経髄鞘形成不全はPelizaeus-Merzbacher（ペリツェウス・メルツバッハ）病（ＰＭＤ）であってもよい。
【０００９】
さらに、本発明に係るＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療剤は、前記本発明に係る中枢神経髄鞘形成不全の治療組成物を含有することを特徴とする。なお、上記中枢神経髄鞘形成不全はPelizaeus-Merzbacher（ペリツェウス・メルツバッハ）病（ＰＭＤ）であってもよい。
【００１０】
本発明に係る中枢神経髄鞘形成促進方法は、in vitroで、及び、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物において、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって中枢神経髄鞘形成不全を生じたオリゴデンドロサイトにおいて中枢神経髄鞘形成を促進する方法であって、ＭＡＰＫ経路活性化を阻害する工程を含有する。また、ＭＡＰＫ経路活性化の阻害は、ＭＡＰＫＫ活性を阻害することによって行ってもよい。さらに、上記ＭＡＰＫＫ活性の阻害は、Ｕ０１２６および／またはＰＤ９８０５９を投与することによって行ってもよく、Ｒａｆ活性を阻害することによって行ってもよい。
【００１１】
本発明にかかるＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療方法は、ＭＡＰＫ経路活性化を阻害するための阻害物質を患者に投与する工程を含む。前記阻害物質はＭＡＰＫＫ活性阻害物質であってもよく、さらに、ＭＡＰＫＫ活性阻害物質は、Ｕ０１２６および／またはＰＤ９８０５９であってもよい。なお、上記中枢神経髄鞘形成不全はPelizaeus-Merzbacher（ペリツェウス・メルツバッハ）病（ＰＭＤ）であってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物および治療用薬剤、および中枢神経髄鞘形成促進方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されない。
【００１４】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１６】
＝＝中枢神経髄鞘形成不全治療用組成物＝＝
本発明に係る、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全治療用組成物は、ＭＡＰＫ経路活性化を阻害するための阻害物質のいずれか、もしくは、それらのうち２つ以上の組み合わせを含有することを特徴とする。この阻害物質は、ＭＡＰＫ経路の因子（例えば、K-Ras、H-Ras、N-Ras、A-Raf、B-Raf、c-Raf、ＭＡＰＫＫ、ＭＡＰＫ、など）の活性を阻害することにより、ＭＡＰＫの活性を阻害する物質であれば制限はなく、その物質は、低分子化合物やドミナントネガティブ型タンパク質変異体などであってもよいが、ＭＡＰＫＫ活性阻害物質であることが好ましく、Ｕ０１２６（1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis (2-aminophenylthio) butadiene）またはＰＤ９８０５９（2′-Amino-3′-methoxyflavone）であることがさらに好ましい。
【００１７】
＝＝中枢神経髄鞘形成不全治療剤＝＝
前記中枢神経髄鞘形成不全治療組成物のいずれか、もしくはそれらのうち２つ以上の組み合わせは、当業者に周知の薬学的に許容される担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物を用いて剤形化することができる。その形態は治療に適切な剤形であれば特に特定されず、例えば、経口剤として、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等に剤形化してもよい。また、注射剤に剤形化してもよく、例えば、溶液性注射剤、乳濁性注射剤、または固形注射剤等が挙げられる。本治療剤には、上記製剤用添加物の他、異なる医薬組成物を配合することもできる。
【００１８】
中枢神経髄鞘形成不全治療剤を投与する対象の疾患は、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物において、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって中枢神経において髄鞘が形成不全になる疾患であれば限定されないが、Pelizaeus-Merzbacher（ペリツェウス・メルツバッハ）病（ＰＭＤ）であってもよい。ここで、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進は、ＰＬＰ１タンパク質の過剰発現によるものでもよく、タンパク質自体の活性亢進によるものでもよい。
なお、中枢神経髄鞘形成不全治療剤の患者への投与方法および投与量は、投与目的、剤形、患者の状態などに応じ、当業者が適宜選択可能である。
【実施例】
【００１９】
（１）ＰＬＰ１過剰発現によるオリゴデンドロサイトの髄鞘形成不全
本実施例では、まず、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって中枢神経において髄鞘が形成不全になる疾患のモデルとして、ＰＬＰ１を過剰発現させることで、髄鞘形成不全を起こすオリゴデンドロサイトを作製した。
【００２０】
妊娠１６日目のラット（Sprague-Dawley系）から胎仔の大脳を摘出した後、嗅球海馬、髄膜、血管を取り除いた。この大脳皮質を、２ｍｌのディスパーゼ（３Ｕ／ｍｌ、Roche社）溶液に入れ、３７℃のＣＯ２インキュベータ内で５分間処理した後、１ｍｌの０．０５％ＤＮａｓｅを加えた。再びインキュベータ内で１０分間静置後、ピペッティングによってオリゴデンドロサイトを分散した。
【００２１】
このように単離したオリゴデンドロサイトを、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Hyclone社）添加ＭＥＭ培地に約１×１０７／１０ｍｌの細胞密度で播種し、１０ｃｍ径の培養皿で初代培養した。
【００２２】
６〜７日後、初代培養細胞を５ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。そこへ０．０５％トリプシン―ＥＤＴＡ（２ｍｌ／培養皿）を加え、３７℃のＣＯ２インキュベータ内で８分間静置した後、さらに培養皿を強く振盪して細胞を剥離させた。この細胞を、２ｍｌの１０％ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中でピペッティングにより分散させ、遠心（１００×ｇ、５分）によって３回洗浄した。次いで１０％ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地を加えてピペッティングした後、約８×１０６／１０ｍｌの細胞密度で１０ｃｍの培養皿に播種し、培養した。
【００２３】
さらに６〜７日後、再度継代し、約３×１０６／１０ｍｌの細胞密度で播種し、培養した。
【００２４】
一方、ヒトＰＬＰ１遺伝子FLJ45458（TOYOBO社）を鋳型に、下記の配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ExTaq polymerase（タカラバイオ社）でPCR増幅した。増幅したヒトＰＬＰ１遺伝子をpRetroX-IRES-ZsGreen１ベクター（Clontech-Takara Bio社、カタログ番号632520）のマルチクローニングサイトのBamHI切断（タカラバイオ社）部位に導入し、ＰＬＰ１組換えベクターを作製した。この組換えベクターを、Retro-X system (Clontech-Takara Bio社  カタログ番号631530)で産生されたレトロウイルスを介して、上述のように取得した培養オリゴデンドロサイトにトランスフェクトした。なお、pRetroX-IRES-ZsGreen１ベクターには、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子が組み込まれており、ＰＬＰ１を発現する細胞は緑色蛍光を発する。
プライマーＳ： ccgggatccatgggcttgttagagtgctgtgcaagatgtctg  （配列番号１）
プライマーＡＳ： ccgggatcctcagaacttggtgcctcggcccatg  （配列番号２）
【００２５】
対照群として、ＰＬＰ１遺伝子を導入していない非組換えpRetroX-IRES-ZsGreen１ベクターを、上述と同様にして培養オリゴデンドロサイトにトランスフェクトした。
【００２６】
各オリゴデンドロサイトを４％パラホルムアルデヒドで固定し、髄鞘形成のマーカーであるＭＢＰを認識する抗ＭＢＰ抗体（Millipore社、 カタログ番号AB15542、１００倍希釈）を用いて髄鞘を標識した。なお、二次抗体として、Alexa Fluor 594抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes 社、カタログ番号A-11005、５００倍希釈）を用いた。その結果を図１に示す。
【００２７】
なお、図１Ａ、Ｂ、Ｃ、または図１Ｄ、Ｅ、Ｆは、それぞれ、異なる波長光の下で同一の領域を観察したものである。また、図１Ｃ及び図１Ｆは、それぞれ、図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｄと図１Ｅの重ね合わせである。
【００２８】
図Ａ〜Ｃに示すように、ＰＬＰ１を発現していない対照群において、ＧＦＰで標識されたオリゴデンドロサイト（図１Ｂ、矢印）は抗ＭＢＰ抗体によっても標識された（図１Ａ、矢印）。すなわち、ＰＬＰ１非発現オリゴデンドロサイトは髄鞘を正常に形成していた。
【００２９】
一方、図１Ｄ〜Ｆに示すように、ＰＬＰ１を過剰発現しているオリゴデンドロサイトでは、ＧＦＰで標識されたオリゴデンドロサイト（図１Ｅ、矢印）は抗ＭＢＰ抗体によっては標識されなかった（図１Ｄ、破線丸）。このように、ＰＬＰ１を過剰発現するオリゴデンドロサイトでは髄鞘形成不全が生じていた。
【００３０】
（２）ＭＡＰＫＫ活性阻害剤による髄鞘形成不全症状の改善
次に、ＭＡＰＫＫ活性阻害剤によって、この髄鞘形成不全症状が正常レベルまで改善されることを示す。
【００３１】
ＰＬＰ１組換えベクター、および非組換えベクターをレトロウイルスを介してオリゴデンドロサイトにトランスフェクトし、その２４時間後、ＭＡＰＫＫ活性阻害剤であるＵ０１２６（1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis (2-aminophenylthio) butadiene、１０ μＭ、メルク社、カタログ番号662005）、またはＰＤ９８０５９（2'-Amino-3'-methoxyflavone、１０ μＭ、メルク社、カタログ番号513000）のＤＭＳＯ溶液を培地中に加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで７２時間インキュベートした。なお、対照群として、遺伝子導入培養オリゴデンドロサイトの培地中に同量のＤＭＳＯを加え、同様にしてインキュベートした。
【００３２】
インキュベート後のオリゴデンドロサイトを、上記のように抗ＭＢＰ抗体で染色し、染色後の細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、標識細胞を計数した。その結果を図２に示す。
【００３３】
ＰＬＰ１を強制発現させたオリゴデンドロサイト群を、ＭＡＰＫＫ活性阻害剤であるＵ１２０６またはＰＤ９８０５９で処理すると、図２に示すように、ＧＦＰ陽性オリゴデンドロサイトに対するＭＢＰ陽性細胞の割合がＰＬＰ１非発現対照群と同等のレベルまで改善された。
【００３４】
さらに、遺伝子導入培養オリゴデンドロサイト髄鞘形成不全症状が、上述のＭＡＰＫＫ活性阻害剤により改善されたことを確認するため、ウエスタンブロット法によりＭＢＰの発現を解析した。
【００３５】
上記のようにＭＡＰＫＫ活性阻害剤で処理した培養細胞を、細胞溶解バッファー（50 mM HEPES-NaOH pH 7.5、20 mM MgCl2、150 mM NaCl、1 mM dithiothreitol、1 mM phenylmethane sulfonylfluoride、1 μg/ml leupeptin、1 mM EDTA、1 mM Na3VO4、10 mM NaF、0.5% NP-40）に懸濁した後、遠心分離した（Miyamoto et al.、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA、103、10444-10449、2006を参照）。ここで得られた上清に、あらかじめ抗ＭＢＰ抗体（５００倍希釈、Millipore社、カタログ番号05-675）と結合させたプロテインＧ樹脂ビーズを混合し、上清中のＭＢＰを沈降させ、回収した。この回収タンパク質を変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に移行した後、膜上のタンパク質を抗ＭＢＰ抗体（カタログ番号：05-675、Millipore社、５００倍希釈）で標識し、ECL Advance Western Blotting Detection kit（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社、カタログ番号RPN2135）を用いて検出した。
【００３６】
図３に示すように、ＰＬＰ１を過剰発現したオリゴデンドロサイトではＭＢＰの発現が検出できず（レーンＢ）、この細胞群で髄鞘形成不全が生じていた。一方、ＰＬＰ１を過剰発現した細胞群を、Ｕ０１２６（レーンＤ）またはＰＤ９８０５９（レーンＦ）で処理した場合、ＰＬＰ１非発現群（レーンＡ、Ｃ、Ｅ；ＣとＥはそれぞれＵ０１２６、ＰＤ９８０５９処理群）と同等レベルのＭＢＰの発現が検出された。これは、これらのＭＡＰＫＫ活性阻害剤によって髄鞘形成不全症状が正常レベルまで改善されたことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の一実施例で、ＰＬＰ１非発現オリゴデンドロサイト群（Ａ、Ｂ、Ｃ）およびＰＬＰ１過剰発現群（Ｄ、Ｅ、Ｆ）において、ＭＢＰ（Ａ、Ｄ）とＧＦＰ（Ｂ、Ｆ）の局在、および、それらの図の重ね合わせ（Ｃ、Ｆ）を示した図である。
【図２】本発明の一実施例で、ＰＬＰ１非発現群（Ａ）、ＰＬＰ１過剰発現群（Ｂ〜Ｄ）において、Ｕ０１２６（Ｃ）、ＰＤ９８０５９（Ｄ）処理、あるいは、溶媒のＤＭＳＯで処理（Ａ、Ｂ）した場合のＧＦＰ陽性オリゴデンドロサイト数に対するＭＢＰ陽性細胞率を示した図である。なお、データは平均値＋標準偏差で示す（＊ｐ＜０．０１、Student’s t-test法）。
【図３】本発明の一実施例において、ＰＬＰ１非発現群（Ａ、Ｃ、Ｅ）、ＰＬＰ１過剰発現群（Ｂ、Ｄ、Ｆ）に対し、溶媒のＤＭＳＯ処理（Ａ、Ｂ）、Ｕ０１２６処理（Ｃ、Ｄ）、あるいはＰＤ９８０５９処理（Ｅ、Ｆ）した場合のＭＢＰの発現（矢印）を示したウエスタンブロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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