(57)【要約】【課題】担体粒子の非特異的凝集による検出感度の低下を防ぎつつ、検体に含まれる２種類以上の成分をパルスイムノアッセイ法で高感度、迅速、簡便に検出する装置および方法を提供する。【解決手段】検出対象の成分Ａに特異的に結合するタンパク質をその表面に固定化されている直径０.５〜１００μｍの担体粒子１と、検出対象の成分Ｂに特異的に結合するタンパク質をその表面に固定化されている直径０.５〜１００μｍの担体粒子２と検体を含む液体中でパルスイムノアッセイ法を用いる。担体粒子１には正の誘電泳動、担体粒子２には負の誘電泳動が作用する条件下において交流電圧を印加して担体粒子１同士、担体粒子２同士をパールチェーン化させる。その後、交流電圧の印加を停止し、担体粒子１、担体粒子２のそれぞれの凝集状態は光学顕微鏡などを用いて観察する。【選択図】図１
2010164307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれる第１の被検出物質と第２の被検出物質とを検出する装置であって、
前記第１の被検出物質と特異的に結合する第１の担体粒子と、前記第２の被検出物質と特異的に結合する第２の担体粒子とを含む担体粒子、および検体を含む混合溶液を入れるデバイスと、
前記混合溶液をはさむように配置され、交流電圧が印加される一対の電極と、
前記電極および前記担体粒子を撮影する撮像部と、
前記撮像部で撮影された画像から、前記電極と前記担体粒子までの距離と粒子の外観に基づいて、前記第１の担体粒子と前記第２の担体粒子とを区別して、前記混合溶液の中の前記第１の担体粒子の凝集の度合いおよび前記第２の担体粒子の凝集の度合いのそれぞれを検出する制御解析部とを備え、
前記第１の担体粒子と前記第２の担体粒子とは誘電泳動特性が互いに異なる、検出装置。
【請求項２】
前記第１の担体粒子および前記第２の担体粒子の誘電泳動特性はそれぞれ、前記第１の担体粒子および前記第２の担体粒子の直径を０．５μｍ以上１００μｍ以下の範囲で互いに異なるように選択することによって付与される、請求項１に記載の検出装置。
【請求項３】
前記第１の担体粒子および前記第２の担体粒子の誘電泳動特性はそれぞれ、前記第１の担体粒子および前記第２の担体粒子を、ラテックス粒子、セラミックス粒子、シリカ粒子、磁性粒子、金属粒子、金属コート粒子、ベントナイト、カオリン、金コロイド、赤血球細胞、白血球細胞、血小板、ゼラチン、リポソーム、花粉および微生物を含む群から互いに異なるように選択することによって付与される、請求項１に記載の検出装置。
【請求項４】
前記交流電圧の周波数は、１ｋＨｚ以上１０ＭＨｚ以下である、請求項１に記載の検出装置。
【請求項５】
前記交流電圧の電圧値は、波高値で５Ｖ以上１００Ｖ以下である、請求項１に記載の検出装置。
【請求項６】
前記第１の担体粒子の表面には前記第１の被検出物質と特異的に結合する第１の抗体が固定化されており、前記第２の担体粒子の表面には前記第２の被検出物質と特異的に結合する第２の抗体が固定化されている、請求項１に記載の検出装置。
【請求項７】
検体中に含まれる第１の被検出物質と第２の被検出物質とを検出する方法であって、
前記第１の被検出物質と特異的に結合する第１の担体粒子と、前記第２の被検出物質と特異的に結合する第２の担体粒子とを含む担体粒子、および検体を含む混合溶液を準備する工程と、
前記混合溶液をはさむように配置された一対の電極に交流電圧を印加する工程と、
前記交流電圧を印加した後に、前記電極から前記担体粒子までの距離や粒子の外観に基づいて、前記第１の担体粒子と前記第２の担体粒子とを区別して、前記混合溶液の中の前記第１の担体粒子の凝集の度合いおよび前記第２の担体粒子の凝集の度合いのそれぞれを検出する工程とを備え、
前記第１の担体粒子と前記第２の担体粒子とは誘電泳動特性が互いに異なる、検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中に含まれる２種類以上の被検出物質を検出する方法ならびにそれに用いられる装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体に含まれる成分を検出する方法として、抗体などを固定化したラテックス粒子を用いる「ラテックス凝集法」がよく知られている。この方法は、検出対象の成分とラテックス粒子表面の抗体との抗原抗体反応などによりラテックス粒子が凝集することを利用しており、ラテックス粒子の凝集度から検出対象の成分を簡便に検出することができる。この凝集反応は、ブラウン運動に依存して進行するため、ある程度の時間を要する。
【０００３】
上記凝集反応を促進させる方法として、担体粒子（直径０.５〜１０μｍのラテックス粒子など）に交流電圧を印加して誘電分極を生じさせることで、複数の担体粒子を直鎖状に並べる（パールチェーン化させる）「パルスイムノアッセイ法」が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
パルスイムノアッセイ法は、複数の担体粒子を積極的に接触させることで凝集反応を促進させることができるため、ブラウン運動に依存したラテックス凝集法に比べてより迅速かつ高感度に対象成分を検出することができる。
【特許文献１】特開平７−８３９２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１に開示されている方法を用いて２種類以上の被検出物質を１つの測定デバイスの同じ流路中で検出しようすると、第１の検体成分を検出する担体粒子と第２の検体成分を検出する担体粒子がお互いを区別してパールチェーン化することは無い。そのため、２種類以上の被検出物質を同時に感度よく検出することが難しい。
【０００６】
そこで、本発明は２種類以上の誘電泳動特性の異なる担体粒子を用いることで、同デバイス上で高効率に第１の検体成分を検出する担体粒子と第２の検体成分・・・を検出する担体粒子を別々にパールチェーン化させ、高感度、迅速にパルスイムノアッセイを行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の検体中に含まれる第１の被検出物質と第２の被検出物質とを検出する装置は、前記第１の被検出物質と特異的に結合する第１の担体粒子と、前記第２の被検出物質と特異的に結合する第２の担体粒子とを含む担体粒子、および検体を含む混合溶液を入れるデバイスと、前記混合溶液をはさむように配置され、交流電圧が印加される一対の電極と、前記電極および前記担体粒子を撮影する撮像部と、前記撮像部で撮影された画像から、前記電極と前記担体粒子までの距離と粒子の外観に基づいて、前記第１の担体粒子と前記第２の担体粒子とを区別して、前記混合溶液の中の前記第１の担体粒子の凝集の度合いおよび前記第２の担体粒子の凝集の度合いのそれぞれを検出する制御解析部とを備え、前記第１の担体粒子と前記第２の担体粒子とは誘電泳動特性が互いに異なる。これにより、１つの測定デバイスの同じ流路中で２種類以上の担体粒子を識別して各々の凝集度を簡便に求めることが可能となる。
【０００８】
前記第１の担体粒子および前記第２の担体粒子の誘電泳動特性はそれぞれ、前記第１の
担体粒子および前記第２の担体粒子を、ラテックス粒子、セラミックス粒子、シリカ粒子、磁性粒子、金属粒子、金属コート粒子、ベントナイト、カオリン、金コロイド、赤血球細胞、白血球細胞、血小板、ゼラチン、リポソーム、花粉および微生物を含む群から互いに異なるように選択することによって付与されることが好ましい。これらの粒子は市販で比較的手に入り易く、文献に誘電泳動特性が示されているものが多いため用い易い。
【０００９】
前記交流電圧の周波数は、１ｋＨｚ以上１０ＭＨｚ以下であることが好ましい。周波数は、１ｋＨｚ以下では電気浸透流が発生するため誘電泳動が作用しにくく、さらに１０ＭＨｚ以上になると溶液が発熱し易くなるため、１ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲内であることが好ましい。
【００１０】
前記交流電圧の電圧値は、波高値で５Ｖ以上１００Ｖ以下であることが好ましい。電界強度が５Ｖ／ｍｍよりも小さいと、パールチェーン化が生じにくくなり、凝集反応を十分に促進することができない。一方、電界強度が１００Ｖ／ｍｍより大きいと、混合溶液の電気分解が生じやすくなり、検出感度が低下してしまう。
【００１１】
前記第１の担体粒子の表面には前記第１の被検出物質と特異的に結合する第１の抗体が固定化されており、前記第２の担体粒子の表面には前記第２の被検出物質と特異的に結合する第２の抗体が固定化されていることが好ましい。被検出物質と親和性の高い抗体であることにより、抗原を介して担体粒子を凝集させる反応を効率よく行うことができる。
【００１２】
本発明の検体中に含まれる第１の被検出物質と第２の被検出物質とを検出する方法は、前記第１の被検出物質と特異的に結合する第１の担体粒子と、前記第２の被検出物質と特異的に結合する第２の担体粒子とを含む担体粒子、および検体を含む混合溶液を準備する工程と、前記混合溶液をはさむように配置された一対の電極に交流電圧を印加する工程と、前記交流電圧を印加した後に、前記電極から前記担体粒子までの距離や粒子の外観に基づいて、前記第１の担体粒子と前記第２の担体粒子とを区別して、前記混合溶液の中の前記第１の担体粒子の凝集の度合いおよび前記第２の担体粒子の凝集の度合いのそれぞれを検出する工程とを備え、前記第１の担体粒子と前記第２の担体粒子とは誘電泳動特性が互いに異なる。これにより、１つの測定デバイスの同じ流路中で２種類以上の検体成分を同時に簡便、高感度にパルスイムノアッセイ法で検出することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明より、１つの測定デバイスの同じ流路中で２種類以上の検体成分を同時に高感度にパルスイムノアッセイ法で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．本発明の検出方法
本発明の被検出物質を検出する手順（第１ステップ〜第４ステップ）を図１に示す。１）被検出物質の種類に対応して誘電泳動特性が異なり、被検出物質のそれぞれに特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている担体粒子を準備する第１のステップ３１と、２）検体と担体粒子とを含む混合溶液を調製する第２のステップ３２と、３）混合溶液に交流電圧を印加して担体粒子をパールチェーン化させる第３のステップ３３と、４）交流電圧の印加を停止した後に前記担体粒子の凝集状態を画像認識または粒度分布計を用いて観察する第４のステップ３４と、を含み、前記粒子の前記誘電泳動特性を鑑み、交流電圧の周波数、およびまたは、電圧値が選択される。なお、本明細書において「検出」とは、特定の物質の有無を調べる意味だけでなく、特定の物質の濃度や量を測定する意味も含む。また、本明細書においてデバイス部はデバイスと同義である。下記に図１の詳しい説明を記す。
【００１５】
[第１のステップ３１：担体粒子の準備]
第１のステップでは、被検出物質Ａに特異的に結合するタンパク質Ａをその表面に固定化されている第１の担体粒子１０Ａと、第２の被検出物質１０Ｂに特異的に結合するタンパク質Ｂをその表面に固定化されている第２の担体粒子１０Ｂと、被検出物質の種類に応じて担体粒子を準備する。さらに同導電率溶液中、同周波数の交流電圧を印加した場合、担体粒子１０Ａに正の誘電泳動が作用し、担体粒子１０Ｂに負の誘電泳動が作用する条件が最も好ましい。
【００１６】
担体粒子は、タンパク質をその表面に固定化しうるものであれば良い。ラテックス粒子、セラミックス粒子、シリカ粒子、磁性粒子、金属粒子、金属コート粒子、ベントナイト、カオリン、金コロイド、赤血球細胞、白血球細胞、血小板、ゼラチン、リポソーム、花粉または微生物などを用いることができる。ラテックス粒子の例には、ポリスチレン系ラテックス粒子、ポリビニルトルエン系ラテックス粒子、ポリメタクリレート系ラテックス粒子、金属コートラテックス粒子などが含まれる。微生物の例には、大腸菌などが含まれる。これらの粒子は市販で比較的手に入り易く、文献に誘電泳動特性が示されているものが多いため用い易い。２つの異なる担体粒子はそれぞれ異なる誘電泳動を作用させたいため、材質による誘電泳動特性が大きく異なるものを選択するのが好ましい。
【００１７】
担体粒子の直径（平均粒径）は、光学顕微鏡２２０などで識別可能な０.５μｍ以上、かつブラウン運動による分散が容易に生じうる１００μｍ以下であることが好ましく、特に０.５〜１０μｍの範囲内であることが好ましい。後述するように、光学顕微鏡２２０やコールターカウンターなどを用いることで、分光光度計を用いた測定に比べてより正確に担体粒子の凝集状態を調べることができる。担体粒子の直径が１００μｍを超えると、ブラウン運動による分散が生じにくくなるため、第４のステップ３４において凝集状態を観察しにくくなる。担体粒子の直径（平均粒径）は、例えば、光学顕微鏡２２０、蛍光顕微鏡などを用いて観察したり、コールターカウンターを用いて電気抵抗を測定したり、光散乱法で散乱光変化量を測定したりすることで測定することができる。
【００１８】
担体粒子の量（濃度）は、第２のステップ３２において調製される混合溶液において１×１０６〜１×１０１１個／ｍＬの範囲内となることが好ましい。混合溶液における最適な担体粒子の濃度は、使用する担体粒子の直径によって異なる。
【００１９】
担体粒子に固定化されるタンパク質は、被検出物質に特異的に結合するタンパク質であれば良い。例えば、抗体や酵素、補酵素（例えば、ビオチン）、レクチン、糖タンパク質、核酸などを用いることができる。また、タンパク質の代わりに、ヘムやポルフィリンなどの有機合成物も担体粒子に固定化することができる。好ましくは被検出物質と親和性の高い抗体である。これにより、抗原を介して担体粒子を凝集させる反応を効率よく行うことができる。これらのタンパク質を担体粒子に固定化する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。
【００２０】
担体粒子は同じ導電率の溶液中、同じ周波数で異なる誘電泳動特性を示すものであれば良い。さらに、使用する担体粒子の種類は２種類であることが好ましい。さらに、２種類の担体粒子がそれぞれの異なる誘電泳動特性（正の誘電泳動、負の誘電泳動）を示すことが最も好ましい。
【００２１】
担体粒子を含み被検出物質検出するために調整した溶液を試薬とする。試薬は、目的に応じて担体粒子以外の任意の物質を含んでいてもよい。任意の物質としては、例えばグリシン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質、塩化ナトリウムなどの無機塩類、トレハロースなどの糖類、有機化合物、脂質などが挙げられるが、特に限定されたものではない。
【００２２】
試薬は、分散媒を含む液体（懸濁液）であってもよい。この場合、分散媒は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＨＥＳ緩衝液などのＧＯＯＤ'Ｓ緩衝液や、ＴＲＩＳ緩衝液などであることが好ましい。例えば、所定のタンパク質をその表面に固定化されている担体粒子をこれらの緩衝液に懸濁させることで試薬（懸濁液）を調製することができる。試薬のｐＨは特に限定されないが、第２のステップ３２において調製される混合溶液において６.０〜１１.０の範囲内となりうることが好ましく、６.０〜９.０の範囲内となりうることが特に好ましい。ｐＨの調整方法は特に限定されず、塩酸や水酸化ナトリウムを用いて適宜調整すればよい。
【００２３】
また、試薬は、分散媒を含まない固体（固形物）であってもよく、例えば上記のようにして調製された懸濁液を凍結乾燥または風乾乾燥したものであってもよい。このような固形物（懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）は、担体粒子としての性能を維持しており、かつ溶液に容易に溶解しうるものであることが好ましい。このように分散媒を含まないものを使用することで、第２のステップ３２において、混合溶液中の検体の濃度を１００％にすることが可能となり、検体を希釈せず被検出物質の濃度を高く保つことができる。
【００２４】
さらに、試薬は、担体粒子が別個にされており、使用する際に混合する態様のもの（いわゆる「キット」）であってもよい。
【００２５】
[第２のステップ３２：検体と担体粒子を混ぜた混合溶液の調整]
第２のステップ３２では、第１のステップ３１で調製した担体粒子に検体を加えて、混合溶液を調製する。検体は、特に限定されず、例えば、生体関連物質、化学物質やこれらの希釈液などである。
【００２６】
担体粒子と検体との混合方法は、特に限定されず、担体粒子の状態（液体か固体か）に応じて適宜選択すればよい。例えば、第１のステップ３１で調製した担体粒子が懸濁液の場合は、その懸濁液に検体を含む溶液などを適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。また、担体粒子が固形物（懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）の場合は、その固形物に血漿などを適量加えて攪拌し、担体粒子を懸濁させ、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。
【００２７】
混合溶液のｐＨは特に限定されないが、６.０〜１１.０の範囲内であることが好ましく、６.０〜９.０であることが特に好ましい。抗原抗体反応が生じやすくなるからである。ｐＨの調整方法は特に限定されず、塩酸や水酸化ナトリウムを用いて適宜調整すればよい。また、混合溶液の温度は特に限定されないが、２５℃程度が好ましい。
【００２８】
[第３のステップ３３：交流電圧を印加]
第３のステップ３３では、第２のステップ３２で調製した混合溶液に交流電圧を印加して、担体粒子をパールチェーン化させる。混合溶液に外部電場を与えると、担体粒子内で双極子が誘起され、この双極子の相互作用により担体粒子が泳動し（誘電泳動）、担体粒子が電界方向と並行に一列に並ぶ（パールチェーン化）。このとき、混合溶液内に被検出物質が存在すれば、担体粒子はこの成分を介して他の担体粒子に結合するため、複数の担体粒子が凝集することは前に述べた（パルスイムノアッセイ法の原理）。
【００２９】
さらに同じ交流電圧、周波数、溶液導電率という条件下で誘電泳動力を作用させた場合、材質により異なる誘電泳動特性（正の誘電泳動、負の誘電泳動）を示すことが知られている。また、この異なる誘電泳動が作用する担体粒子は正の誘電泳動の作用する担体粒子同士、負の誘電泳動が作用する担体粒子同士でパールチェーン化する性質を持つ。さらに、担体粒子の大きさや材質の違いにより作用する誘電泳動力が異なる。たとえば負の誘電
泳動力が大きく作用する場合、電極から離れた場所にパールチェーンが形成される。一方、負の誘電泳動力が小さくしか作用しない場合、電極から比較的近い場所にパールチェーンが形成される。さらに、正の誘電泳動力が大きく作用する場合、電極から近い場所にパールチェーンが形成される。この誘電泳動特性と誘電泳動力の違いを利用することによりそれぞれの担体粒子のパールチェーンを形成する場所が異なるため、独立して画像を認識することができる。
【００３０】
上記のようにして同デバイス流路中で２種類以上の検体を同時に測定することが可能となる。
【００３１】
混合溶液に印加する交流電圧の波形は、正弦波、矩形波、方形波、三角波などであればよく、連続波でもパルス波でもよい。また、周波数は、１ｋＨｚ以下では電気浸透流が発生するため誘電泳動が作用しにくく、さらに１０ＭＨｚ以上になると溶液が発熱し易くなるため、１ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲内であることが好ましい。さらに好ましいのは１００ｋＨｚ〜１ＭＨｚである。
【００３２】
混合溶液に印加する交流電圧の電界強度は、５〜１００Ｖ（波高値）／ｍｍの範囲内であることが好ましい。さらに好ましいのは３０Ｖ／ｍｍ〜７０Ｖ／ｍｍである。電界強度が５Ｖ／ｍｍよりも小さいと、パールチェーン化が生じにくくなり、凝集反応を十分に促進することができない。一方、電界強度が１００Ｖ／ｍｍより大きいと、混合溶液の電気分解が生じやすくなり、検出感度が低下してしまう。
【００３３】
[第４のステップ：担体粒子の凝集状態の観察３４]
第４のステップでは、交流電圧の印加を停止した後に、担体粒子１０Ａおよび担体粒子１０Ｂの凝集状態を画像認識や粒度分布計などを用いて観察する。交流電圧の印加を停止すると、凝集していない担体粒子はブラウン運動により混合溶液中に分散するが、特異的結合により凝集した担体粒子は凝集した状態が維持される。したがって、混合溶液中の全担体粒子に占める凝集した担体粒子の割合（凝集度）を求めることにより、被検出物質の検出や濃度の測定を行うことができる。このとき、分光光度計を用いて吸光度を測定するのではなく画像認識や粒度分布計などを用いて観察することで、担体粒子の凝集状態をより正確に（１つの担体粒子（単体）と、２つの担体粒子の凝集体とを区別できる程度に）観察することができる。
【００３４】
担体粒子の凝集状態を観察する方法は、画像認識や粒度分布計などを用いて観察すればよい。画像認識による担体粒子の凝集状態の観察には、光学顕微鏡２２０による観察が含まれる。また、粒度分布計を用いた担体粒子の凝集状態の観察には、コールターカウンターや光散乱法を用いた観察を含む。光学顕微鏡２２０およびコールターカウンターは、１つの担体粒子（単体）と、２つの担体粒子の凝集体とを区別できる程度正確に担体粒子の凝集状態を観察できるものであれば、その種類は特に限定されない。
【００３５】
担体粒子１０Ａと担体粒子１０Ｂはその大きさ、形状、材質、色などにより測定時に区別可能であれば、その種類、組み合わせを限定されない。担体粒子１０Ａと担体粒子１０Ｂを概観で区別しにくい場合でも、パールチェーンが形成された場所が電極からどの程度離れているかを測定することにより、担体粒子１０Ａと担体粒子１０Ｂが誘電泳動特性の異なる担体粒子であることを判別することができる。
【００３６】
担体粒子１０Ａおよび担体粒子１０Ｂそれぞれの凝集度の算出方法は、特に限定されず観察方法（装置）に応じて適宜選択すればよいが、例えば、光学顕微鏡２２０に接続したカメラ２３０（ＣＣＤカメラなど）で混合溶液中の担体粒子の凝集状態を撮影し、得られた画像から画像処理プログラムを用いて、凝集度を算出すればよい。凝集度は下記の式を
用いて算出する。
【００３７】
【数１】
2010164307.tif 000003
【００３８】
以上のように、本発明の検出方法は、１）検体を用い、２）検体を含む液体中において同じ周波数において異なる挙動（正の誘電泳動、負の誘電泳動）を示す直径（平均粒径）が０.５〜１００μｍの範囲内の２種類の担体粒子を使用し、３）担体粒子の凝集状態を光学顕微鏡やコールターカウンターなどを用いて観察することで、担体粒子の非特異的凝集による検出感度の低下を防ぎつつ、検出対象物質の成分を検出することができる。
【００３９】
２.本発明の検出装置
図２は検体中に含まれる２種類以上の被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する装置９９の構成を表す模式図である。検出装置９９は、別個に用意され、デバイス１００内に配置された、被検出物質の種類に対応して誘電泳動特性が異なり被検出物質とそれぞれ特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている２種類以上の担体粒子と検体とを含む反応場１５０を有する。反応場１５０の詳細は下記図３、図４に説明されている。検出装置９９では電圧印加部１００と、撮像部２２０と、制御解析部２５０を有する。電圧印加部１００は、反応場１５０に所望の周波数で所望の電圧値を持つ交流電圧を印加する。撮像部２２０は、前記反応場１５０を画像として撮像する。制御解析部２５０は、前記画像の位置に基づいて前記反応場１５０における粒子の凝集率を区別して算出する。
【００４０】
混合溶液に交流電圧を印加する装置およびデバイスならびに方法は、特に限定されず、従来のパルスイムノアッセイ法で用いられてきた装置および方法と同じものであってもよい。図３はデバイス１００の断面図、図４はデバイス１００の上面図の模式図である。図３デバイス１００ように、例えば、１）ガラスなどからなる基板１１０と、前記基板１１０上に対向するように配置された一対の電極１２０と、電極の上にＰＥＴフィルム１３０およびカバーガラス１４０で形成された、前記一対の電極の間に設けられた流路（反応場）１５０とを有する検出デバイス１００を準備し；図４に示すデバイス１００のように  ２）各電極を交流電源１８０に接続し；３）第２のステップで調製した混合溶液を注入口１６０から流路１５０内に提供した後に電極間に交流電圧を印加すればよい。注入口１６０に対し排出口１７０が設置されており、溶液を点着すると毛細管現象により溶液が流路１５０を満たす。
【００４１】
また、前述の検出デバイス１００の流路内に試薬の固形物（懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）を配置してもよい。このように予め流路１５０内に試薬を配置しておくことで、検体を含む溶液を注入口１６０から流路１５０内に提供するのみで第２のステップを終えることができ、本発明の検出方法をより簡便に行うことができる。検出装置９９は、デバイス１００を配置した後は本発明の検出方法に従って被検出物質を容易かつ高感度、迅速に検出することができる。
【００４２】
（実施の形態）
図５、図６、図７は、電圧印加前後の流路内の担体粒子の様子を示す模式図であり、図５は電圧印加前、図６は電圧印加中（パールチェーン化中）、図７は電圧印加停止後の様子を示している。下記に図５、図６、図７の詳しい説明を記す。
図５、図６、図７は電極１２０、流路１５０、交流電源１８０で示している。また、担体粒子１０Ａに正の誘電泳動、担体粒子１０Ｂに負の誘電泳動が作用していると仮定する。図５に示すように、交流電圧を印加する前は、担体粒子１０Ａおよび担体粒子１０Ｂはブラウン運動により完全に分散している。担体粒子はパールチェーンを形成する際、正の誘電泳動が作用する担体粒子同士、負の誘電泳動が作用する担体粒子同士でパールチェーンを形成する性質がある。そのため、正負で異なる誘電泳動がそれぞれ作用している２種類の担体粒子が存在する場合、交流電圧を印加すると、担体粒子１０Ａは担体粒子１０Ａ同士でパールチェーン化する。さらに、担体粒子１０Ｂは担体粒子１０Ｂ同士でパールチェーン化して同じ種類の担体粒子どうしで接触する（図６参照）。
【００４３】
抗原Ａと特異的に反応するタンパク質Ａが担体粒子１０Ａに修飾され、抗原Ｂと特異的に反応するタンパク質Ｂが担体粒子１０Ｂに修飾されている場合を考える。混合溶液内に抗原Ａのみが存在すれば、担体粒子１０Ａは抗原Ａを介して他の担体粒子１０Ａに結合するため、複数の担体粒子１０Ａが凝集する。一方、担体粒子１０Ｂは抗原Ａと反応しないため担体粒子１０Ｂの凝集はおこらない。  
【００４４】
抗原Ａが存在しなければ、担体粒子１０Ａは他の担体粒子１０Ａに結合しないはずである。しかし、非特異的吸着が生じた場合は抗原Ａが存在しなくても担体粒子１０Ａの凝集が生じる。混合溶液内に抗原Ｂが存在する場合、担体粒子１０Ｂは抗原Ｂを介して他の担体粒子１０Ｂに結合するため、複数の担体粒子１０Ｂが凝集する。一方、担体粒子１０Ａは抗原Ｂと反応しないため担体粒子１０Ａの凝集はおこらない。抗原Ｂが存在しなければ、担体粒子１０Ｂは他の担体粒子１０Ｂに結合しないはずである。しかし、非特異的吸着が生じた場合は抗原Ｂが存在しなくても担体粒子１０Ｂの凝集が生じる。抗原Ａおよび抗原Ｂが同時に存在する場合、担体粒子１０Ａは抗原Ａを介して他の担体粒子１０Ａに結合するため、複数の担体粒子１０Ａが凝集する。さらに、担体粒子１０Ｂは抗原Ｂを介して他の担体粒子１０Ｂに結合するため、複数の担体粒子１０Ｂが凝集する（図７）。抗原Ａおよび抗原Ｂが存在しない場合、担体粒子１０Ａおよび担体粒子１０Ｂは他の担体粒子に結合しないはずである。しかし、非特異的吸着が生じた場合は抗原Ａ、Ｂが存在しなくても担体粒子の凝集が生じる。
【００４５】
一方、担体粒子１０Ａおよび担体粒子１０Ｂの両方に正の誘電泳動が作用している場合、または担体粒子１０Ａおよび担体粒子１０Ｂの両方に負の誘電泳動のみが作用している場合、担体粒子１０Ａと担体粒子１０Ｂはお互いの区別無くパールチェーン化する（図１０参照）。
【００４６】
３種類以上の被検出物質を測定する場合、誘電泳動特性の異なる担体粒子を組み合わせていけばよい。担体粒子に作用する誘電泳動力は材質や大きさにより異なることが知られている。この性質を利用し、流路内でパールチェーンを形成する場所を制御してやることも可能である。担体粒子に負の誘電泳動力が作用する場合、負の誘電泳動が大きく作用する担体粒子ほど電極から離れた場所でパールチェーンを形成する。逆に、負の誘電泳動が小さくしか作用しない担体粒子は電極の近くでのみパールチェーンを形成する。さらに、正の誘電泳動が作用する担体粒子は正の誘電泳動が大きく作用する担体粒子ほど電極から離れた場所でもパールチェーンを形成する。逆に、正の誘電泳動が小さくしか作用しない担体粒子は電極の近くでのみパールチェーンを形成する。上記のような担体粒子の誘電泳動特性と誘電泳動力の差を組み合わせていくことでより多種類の担体粒子を区別してパールチェーンを効率よく形成することが可能となる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【００４８】
［実施例１］
［２種類の担体粒子のパールチェーン化の検討（周波数：２ＭＨｚ）］
本実施例では、異なる誘電泳動特性（正の誘電泳動、負の誘電泳動）を示す２種類の担体粒子を用いてパールチェーンをそれぞれ形成するかを確認した。
【００４９】
１．担体粒子１０Ａの作製
大腸菌（Escherichia coli  K-12；独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門）を標準寒天培地（パールコア標準寒天培地  栄研 E-KB07；栄研化学株式会社）上で、インキュベータ（ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ  ＭＩＲ−１５３；ＳＡＮＹＯ）を用いて３０℃で１６時間平面培養を行った。大腸菌にマンニトール０．１Ｍ溶液（和光純薬工業株式会社）を加え懸濁液（１×１０１０個／ｍＬ）を調整した。担体粒子１０Ａの誘電泳動特性はcastellated電極（フォトプレシジョン株式会社）を用いて行った。castellated電極は粒子の誘電泳動特性を確認する際よく用いられ、担体粒子の挙動を簡単に確認できることで知られている。測定溶液はマンニトール０．１Ｍ溶液を混ぜ合わせ溶液導電率が５．０ｍＳ/ｃｍになるように調整した。電圧を５Ｖｐｐ、溶液導電率を５．０ｍＳ/ｃｍに固定し、周波数１００ｋＨｚ、５００ｋＨｚ、１ＭＨｚ、５ＭＨｚに変化させたところ１００ｋＨｚ〜５００ｋＨｚで負の誘電泳動が観察され、１ＭＨｚ〜５ＭＨｚでは正の誘電泳動を得た。
【００５０】
２．担体粒子１０Ｂの作製
直径６μｍのポリスチレン粒子（Bangs Laboratories社）の懸濁液（１.５×１０１０個／ｍＬ）を試験管ミキサー（TRIO HM-1；アズワン株式会社）を用いて１分間以上攪拌した。また、免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂株式会社）を攪拌後のポリスチレン粒子の懸濁液に加え、室温で２時間攪拌し、懸濁液（１．５×１０９個／ｍＬ）を作製した。４℃で一晩静置して、ポリスチレン粒子表面にＭＰＣポリマーを固定化した。懸濁液を遠心機（Chibitan-R；日本ミリポア株式会社）を用いて６２００ｒｐｍで１５分間遠心した後、上澄みを洗浄用水溶液（２０ｍＭグリシン緩衝液，０.１％ＢＳＡ（シグマ社））に置換した。この操作を３回繰り返し、抗体を固定化した担体粒子を調製した。担体粒子１０Ｂの誘電泳動特性はcastellated電極（フォトプレシジョン株式会社）を用いて行った。測定溶液はマンニトール０．１Ｍ溶液を混ぜ合わせ溶液導電率が５．０ｍＳ/ｃｍになるように調整した。電圧を５Ｖｐｐ、溶液導電率を５．０ｍＳ/ｃｍに固定し、周波数１００ｋＨｚ、５００ｋＨｚ、１ＭＨｚ、５ＭＨｚに変化させたところ１００ｋＨｚ〜５ＭＨｚの領域で負の誘電泳動を得た。
【００５１】
３．試薬の調製
グリシン緩衝液に、マンニトール０．１Ｍ、および担体粒子１０Ａ、担体粒子１０Ｂ（上記１、２で調製したもの）を加えて測定用懸濁液を調製した。測定用懸濁液とマンニトール０．１Ｍ溶液を混ぜ合わせ溶液導電率が５．０ｍＳ/ｃｍになるように調整した。このときの微粒子濃度は担体粒子１０Ａ（１×１０9個／ｍＬ）、担体粒子１０Ｂ（４×１０８個／ｍＬ）とした。
【００５２】
４．デバイスの作製
厚さ１ｍｍの石英ガラス基板上に電極パターンを有するステンシルマスク（ステンレス製）を通してスパッタして、電極となる膜厚１００ｎｍの金薄膜を形成した。長辺が対向するように配置された１対の矩形電極間の間隔は０.５ｍｍとした。次いで、流路パターンを有する厚さ１０μｍの両面接着ＰＥＴフィルムを流路部分が電極間に位置するようにガラス基板（および電極）上に貼りあわせ、さらにこのＰＥＴフィルム上に厚さ０.３ｍｍのカバーガラスを貼りあわせてデバイスを作製した。図３、図４は作製したデバイスの模式図であり、図３は断面図、図４は平面図（カバーガラスおよびＰＥＴフィルムは不図示）である。図３に示すように、本実施例で使用したデバイス１００は、ガラス基板１１０
、１対の電極１２０、ＰＥＴフィルム１３０、カバーガラス１４０を有し、１対の電極１２０間に流路１５０が形成されている。図４に示すように、流路１５０は注入口１６０および排出口１７０を有し、一対の電極１２０は交流電源１８０に接続される。
【００５３】
５．測定
図２は、本実施例における測定装置の構成を示すブロック図である。図２に示すように、デバイス１００に印加する電圧およびその周波数と波形を制御するべく、ファンクションジェネレータ（３３１２０Ａ；アジレント・テクノロジー株式会社）２００および高速バイポーラ電源（４０５５；株式会社エヌエフ回路設計ブロック）２１０をデバイス１００に接続した。また、デバイス１００の流路１５０内を観察するべく、倒立型システム顕微鏡（ＩＸ７０；オリンパス株式会社）２２０、カメラ（Ｃ−５０６０；オリンパス株式会社）２３０およびモニタ（ＴＨ−１５ＴＡ２；松下電器産業株式会社）２４０を設置した。
【００５４】
測定用懸濁液１μＬをデバイスの流路の注入口に提供した。注入口に点着された溶液は毛細管現象により流路を満たした。その後、デバイスの１対の電極間に交流電圧（２ＭＨｚ，２０Ｖｐｐ，矩形波）を６０秒間印加して、担体粒子をパールチェーン化させた。電圧の印加を停止してから３０秒後に、流路内の担体粒子の凝集状態を観察した。電圧印加前の凝集状態（図８）、電圧印加中の凝集状態（図９）、電圧印加停止後３０秒での凝集状態を（図１１）を示す。本実施例では、混合溶液内で抗原抗体反応が起きていないため、担体粒子の凝集が生じれば、それはすべて非特異的吸着によるものと考えられる。交流電圧の印加を停止すると、凝集していない担体粒子１０Ａおよび担体粒子１０Ｂはブラウン運動により再度分散する。
【００５５】
６．結果
周波数２ＭＨｚ、溶液導電率を５．０ｍＳ/ｃｍの条件では大腸菌には正の誘電泳動、ポリスチレン粒子には負の誘電泳動が作用している。電圧を印加すると正の誘電泳動が作用している大腸菌（担体粒子１０Ａ）同士でパールチェーンが形成され、負の誘電泳動が作用するポリスチレン粒子（担体粒子１０Ｂ）同士でパールチェーンが形成した（図９）。さらに、電圧印加前においては大腸菌およびポリスチレン粒子が分散した（図８）。電圧印加停止後３０秒においては大腸菌およびポリスチレン粒子が分散した（図１１）。
【００５６】
［比較例１］
［２種類の担体粒子のパールチェーン化の検討（周波数：１００ｋＨｚ）］
本比較例では、担体粒子１０Ａと担体粒子１０Ｂの両方に負の誘電泳動が作用する条件でのパールチェーンの形成状態を得た。
【００５７】
１．担体粒子１０Ａの作製
実施例１と同様の手順により、実施例１と同様の担体粒子を調製した。
【００５８】
２. 担体粒子１０Ｂの作製
実施例１と同様の手順により、実施例１と同様の担体粒子を調製した。
【００５９】
３．試薬の調製
実施例１と同様の手順により、実施例１と同様の試薬を調製した。
【００６０】
４．デバイスの作製
実施例１と同様の手順により、実施例１と同様のデバイスを作製した（図３、図４参照）。
【００６１】
５．測定
測定には、実施例１と同様の装置を使用した。測定用懸濁液１μＬをデバイスの流路の注入口に提供した。測定用懸濁液を点着後、デバイスの１対の電極間に交流電圧（１００ｋＨｚ，２０Ｖｐｐ，矩形波）を６０秒間印加して、担体粒子をパールチェーン化させた。電圧の印加を停止してから３０秒後に、流路内の担体粒子の凝集状態を観察した。
【００６２】
６．結果
周波数１００ｋＨｚ、溶液導電率を５．０ｍＳ/ｃｍの条件では大腸菌（担体粒子１０Ａ）およびポリスチレン粒子（担体粒子１０Ｂ）に負の誘電泳動が作用している。電圧印加前においては大腸菌およびポリスチレン粒子が分散した（図８参照）。電圧を印加すると図１０からもわかるように負の誘電泳動が作用している大腸菌（担体粒子１０Ａ）、負の誘電泳動が作用するポリスチレン粒子（担体粒子１０Ｂ）が織り交ざった状態でパールチェーンが形成された。さらに電圧印加停止後３０秒においては大腸菌およびポリスチレン粒子が分散した（図１１参照）。以上のことから、作用する誘電泳動力の正負が異なる担体粒子を用いることでそれぞれ目的の担体粒子同士でパールチェーンを形成した。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の検出方法および検出装置は、検体に含まれる２種類以上の成分をパルスイムノアッセイ法により迅速、簡便、高感度に検査を行う方法およびそれに用いる方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】被検出物質を検出する手順を示したフローチャート
【図２】実施例で用いた測定装置の構成を示すブロック図
【図３】実施例で用いたデバイスの模式断面図
【図４】実施例で用いたデバイスの模式平面図
【図５】電圧印加前の、流路内の担体粒子の様子を示す模式図
【図６】電圧印加中の、流路内の担体粒子の様子を示す模式図
【図７】電圧印加停止後の、流路内の担体粒子の様子を示す模式図
【図８】電圧印加前の、大腸菌およびポリスチレン担体粒子の流路内の光学像を示す図
【図９】大腸菌に正の誘電泳動、ポリスチレン粒子に負の誘電泳動を印加中における、大腸菌およびポリスチレン担体粒子の流路内の光学像を示す図
【図１０】大腸菌およびポリスチレン粒子に負の誘電泳動を印加中における、大腸菌およびポリスチレン担体粒子の流路内の光学像を示す図
【図１１】電圧印加停止後の、大腸菌およびポリスチレン担体粒子の流路内の光学像を示す図
【符号の説明】
【００６５】
１０Ａ  担体粒子
１０Ｂ  担体粒子
３１  第１のステップ
３２  第２のステップ
３３  第３のステップ
３４  第４のスッテプ
９９  検出装置
１００  デバイス
１１０  ガラス基板
１２０  電極
１３０  ＰＥＴフィルム
１４０  カバーガラス
１５０  反応場
１６０  注入口
１７０  排出口
１８０  交流電源
２００  ファンクションジェネレータ
２１０  バイポーラ電源
２２０  光学顕微鏡
２３０  カメラ
２４０  モニタ
２５０  制御解析部
【図１】
2010164307.tif 000004
【図２】
2010164307.tif 000005
【図３】
2010164307.tif 000006
【図４】
2010164307.tif 000007
【図５】
2010164307.tif 000008
【図６】
2010164307.tif 000009
【図７】
2010164307.tif 000010
【図８】
2010164307.tif 000011
【図９】
2010164307.tif 000012
【図１０】
2010164307.tif 000013
【図１１】
2010164307.tif 000014