(57)【要約】【課題】光の無い環境下で使用できると共に、電流発生量を増加させることができる微生物燃料電池を提供する。【解決手段】微生物燃料電池１は、一対の電極２と、前記電極２を電気的に接続する外部回路３とを備える。一対の電極２は、容器５内に設けられ、当該容器５内において一方の電極（負極）2a側にはShewanellaを培養した培養液が保持されている。他方の電極（正極）2bには、酸素を含む空気を供給し得るように構成されている。負極2a側に注入された培養液には、ポルフィリンが添加されている。【選択図】図１
2010218690.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一対の電極と、
有機物と、前記有機物を分解し電子を放出する細胞外電子伝達能を有する微生物と、前記電子を前記一対の電極の一方に伝達するメディエータと
を備える微生物燃料電池において、
前記微生物は光が無い環境下でも細胞外電子伝達能を有し、
前記メディエータがポルフィリンを含有する
ことを特徴とする微生物燃料電池。
【請求項２】
前記一対の電極と、前記有機物と、前記微生物と、前記メディエータとは、容器内に設けられており、
前記容器は、微生物を活性化させるための外部光が遮断され、内部を暗室状態にし得るように構成されている
ことを特徴とする請求項１記載の微生物燃料電池。
【請求項３】
前記ポルフィリンが、水溶性ポルフィリンであることを特徴とする請求項１又は２記載の微生物燃料電池。
【請求項４】
前記水溶性ポルフィリンが、カチオン性であることを特徴とする請求項３記載の微生物燃料電池。
【請求項５】
前記水溶性ポルフィリンが、鉄ポルフィリン又はマンガンポルフィリンであることを特徴とする請求項３記載の微生物燃料電池。
【請求項６】
一対の電極と、有機物と、前記有機物を分解し電子を放出する細胞外電子伝達能を有する微生物と、前記電子を前記一対の電極の一方に伝達するメディエータとを備える微生物燃料電池において、前記微生物は光が無い環境下でも細胞外電子伝達能を有し、前記一方の電極はポルフィリンで修飾されていることを特徴とする微生物燃料電池。
【請求項７】
前記一対の電極と、前記有機物と、前記微生物と、前記メディエータとは、容器内に設けられており、
前記容器は、微生物を活性化させるための外部光が遮断され、内部を暗室状態にし得るように構成されている
ことを特徴とする請求項６記載の微生物燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物燃料電池に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物燃料電池は、一対の電極と、前記電極に電気的に接続された外部回路と、前記一対の電極を分離する隔膜とを備え、一方の電極側にはShewanellaなどの細胞外電子伝達能を有する微生物が保持されている。ここで、細胞外電子伝達能とは、金属イオンやその酸化物を電子受容体として利用しこれらを還元する一連の流れによって、生命活動に必要なエネルギーを獲得する能力をいう（非特許文献１）。このような細胞外電子伝達能のひとつとして、細胞膜に局在化したシトクロムを介して体外に電子を放出するという、Shewanella loihica、及び、Shewanella oneidensisのようなShewanella属、Geobacter属等の一部の細菌に特有の電子伝達機構がある（非特許文献２，３）。
【０００３】
このように構成された微生物燃料電池は、微生物が前記一方の電極に電子を伝達することで電気エネルギーを生産するデバイスである。エネルギー源には再生可能なバイオマスや生活排水等に含まれる有機汚染物質を用いることができることから、持続可能なエネルギー源として近年注目されている。また、金属元素を還元、固定する能力を持つ微生物もあり、排水の処理や環境浄化の手段としても注目されている。微生物燃料電池には単一の微生物を用いる系と、排水などに生息する微生物群をそのまま使う混合培養系（例えば、特許文献１）の２つに大別される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−８１９６３号公報
【特許文献２】特開２００５−２３５４８４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lovley D.R. ; Nat.Rev.Microbiol., 2006, 4, 497-508
【非特許文献２】Gralnick,J.A. ; Newman,D.K. ; Molecul.Microbiol. 2007, 65, 1-11
【非特許文献３】Hernandez,M.E. ; Newman,D.K. ; Cell.Mol.Life Sci. 2001, 58, 1562-1571
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１などの従来の微生物燃料電池では、既存の白金を触媒に用いた化学燃料電池と比較して電流密度が極めて低いことが問題となり実用の段階からは遠い、というのが現状である。ここ数年エネルギー密度は向上を続けているが、水素燃料電池などの化学燃料電池と比較すると、少なくともさらに数桁程度、電流密度を向上させなければ実用の段階まで進むことはできない。また、特許文献２に述べられているように色素増感タイプの微生物燃料電池が提案されている。これは微生物の光起電力を用いて発電させる方法が述べられているが、下水処理などで用いる場合必ずしも光照射ができる環境にあるとは限らない。
【０００７】
従来、出力エネルギー密度を増大させるため、一般的には、HNQ(2-hydroxy-1,4-naphthoquinone)などの電子を伝達する電子メディエータ（以下、単にメディエータという）添加も検討されているが、電流発生量は充分でない。また、従来の微生物燃料電池では、負極における反応が光を必要とするので、構成が制限されると共に、光の強度によって電流量が変化してしまうという問題があった。
【０００８】
そこで本発明は上記した問題点に鑑み、光の無い環境下で使用できると共に、電流発生量を増加させることができる微生物燃料電池を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の請求項１に係る発明は、一対の電極と、有機物と、前記有機物を分解し電子を放出する細胞外電子伝達能を有する微生物と、前記電子を前記一対の電極の一方に伝達するメディエータとを備える微生物燃料電池において、前記微生物は光が無い環境下でも細胞外電子伝達能を有し、前記メディエータがポルフィリンを含有することを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項２に係る発明は、前記一対の電極と、前記有機物と、前記微生物と、前記メディエータとは、容器内に設けられており、前記容器は、微生物を活性化させるための外部光が遮断され、内部を暗室状態にし得るように構成されていることを特徴とする。
【００１１】
本発明の請求項３に係る発明は、前記ポルフィリンが、水溶性ポルフィリンであることを特徴とする。
【００１２】
本発明の請求項４に係る発明は、前記水溶性ポルフィリンが、カチオン性であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の請求項５に係る発明は、前記水溶性ポルフィリンが、鉄ポルフィリン又はマンガンポルフィリンであることを特徴とする。
【００１４】
本発明の請求項６に係る発明は、一対の電極と、有機物と、前記有機物を分解し電子を放出する細胞外電子伝達能を有する微生物と、前記電子を前記一対の電極の一方に伝達するメディエータとを備える微生物燃料電池において、前記微生物は光が無い環境下でも細胞外電子伝達能を有し、前記一方の電極はポルフィリンで修飾されていることを特徴とする。
【００１５】
本発明の請求項７に係る発明は、前記一対の電極と、前記有機物と、前記微生物と、前記メディエータとは、容器内に設けられており、前記容器は、微生物を活性化させるための外部光が遮断され、内部を暗室状態にし得るように構成されている
ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の微生物燃料電池によれば、ポルフィリンを通じて微生物から電極へ電子を伝達させることにより、電極から遠く離れて浮遊した微生物からも電子を電極へ伝達させることができるので、電流密度を増加させることができる。また、外部光の無い環境下でも電力を発生させることができるので、下水配管の中での廃棄物を用いた発電などにも活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本実施形態に係る微生物燃料電池の全体構成を示す縦断面図である。
【図２】本実施例に係る電気化学セルの全体構成を示す図であり、（Ａ）斜視図、（Ｂ）縦断面の模式図である。
【図３】本発明の実施例１の結果を示す電流−時間曲線である。
【図４】本発明の実施例２の結果を示す電流−時間曲線である。
【図５】本発明の実施例３の結果を示す電流−時間曲線である。
【図６】本発明の実施例４の結果を示す電流−時間曲線である。
【図７】本発明の実施例５の結果を示す電流−時間曲線である。
【図８】本発明の実施例６の結果（１）を示す電流−時間曲線である。
【図９】本発明の実施例６の結果（２）を示す電流−時間曲線である。
【図１０】本発明の実施例６の結果（３）を示す電流−時間曲線である。
【図１１】本発明の実施例６の結果（４）を示す電流−時間曲線である。
【図１２】本発明の実施例７に係る電気化学セルの全体構成を示す図であり、（Ａ）斜視図、（Ｂ）縦断面の模式図である。
【図１３】本発明の実施例７の結果を示す電圧−時間曲線である。
【図１４】本発明の実施例７の結果を示す電流−電圧、電力曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
微生物燃料電池で電流生成を決定する因子は多様であるが、電極の比表面積や装置スケール、電極材料の選択は化学電池でも共通の因子であるのに対し、微生物から電極への電子移動は微生物燃料電池に特有であることから中でも最も重要である。にもかかわらず、微生物から電極への電子移動反応機構について研究し、それを電流密度の増大につなげた研究報告の例はほぼ皆無である。その理由として、電流生成を行う生きた微生物の電極反応を電気化学的に研究するのに適した系が知られていなかったことがあげられる。本発明者はその点に注目して電気化学的研究を行うことによって本発明を行った。
【００１９】
以下の説明は、細胞外電子伝達能を有する微生物の一種であるShewanellaを例にとって示す。尚、Shewanellaは、本来、深海に生存する微生物であり、光が無い環境下でも細胞外電子伝達能を発揮する。
【００２０】
このShewanellaを用いた微生物燃料電池について検討を行った結果、Shewanellaは有機物である多糖体などを吸収し、細胞膜に局在化したシトクロムから電子を細胞外に放出するが、浮遊している細胞外電子伝達能を有するShewanellaは電極の表面近傍のShewanellaのみで電子伝達が行われ、電極から離れた位置で浮遊しているShewanellaでは電子伝達がほとんど行われず電流生成に寄与していないので、電流量を大きくとることができない原因となっていることを見出した。
【００２１】
図1に示す微生物燃料電池１は、一対の電極２と、前記電極２を電気的に接続する外部回路３と、前記一対の電極２を分離する隔膜４とを備える。一対の電極２は、容器５内に設けられ、当該容器５は前記隔膜４で仕切られている。
【００２２】
隔膜４は、プロトン(H+)を選択的に透過させ得るように構成されている。本実施例では、カチオン交換膜を用いることができ、特に限定されるものではないが、例えば、高分子膜や、無機膜を使ったものを用いることができる。
【００２３】
容器５内には、電解質が収容されており、一方の電極（負極）2a側には微生物としてのShewanellaを培養した培養液及びShewanellaに養分を供給する燃料としての有機物が注入されている。他方の電極（正極）2bには、酸素を含む空気を供給し得るように構成されている。尚、容器５は、Shewanellaを活性化させるための外部光が遮断されており、内部を暗室状態にし得るように構成されている。
【００２４】
有機物は、特に限定されるものではないが、例えば、メタノールやエタノールのようなアルコール類、又は、グルコース等の単糖類、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、マルトース、スクロースや、ラクトース等の多糖類を適用することができる。
【００２５】
上記負極2aにおいて、Shewanellaの代謝を触媒過程として利用し、燃料となる有機物、例えばグルコースを分解し、Shewanellaの代謝廃棄物として出される電子(e-)を伝達することで電気エネルギーを取り出し得るように構成されている。この場合、負極2aにおいて有機物は、二酸化炭素または酢酸などの中間物質に分化される。一方、正極2bでは、酸素還元が起きる。
【００２６】
かかる構成に加え、本実施形態の場合、負極2a側に注入され電解質と混合した培養液には、メディエータとしてのポルフィリンが添加されている。ポルフィリンは、安定な酸化還元特性を有し、メディエータとして通常用いられているHNQと異なり、電荷を変えることができるので使いやすいという利点がある。
【００２７】
上記構成において、Shewanellaは、有機物を捕捉すると、内部で電子(e-)とプロトン(H+)とを生成する。ここで、Shewanellaは、光が無い環境下でも細胞外電子伝達能を発揮するので、暗室状態である容器５内においても電子を生成することができる。
【００２８】
培養液中に添加されたポルフィリンは、Shewanellaに接近して、Shewanellaから電子(e-)を放出させる。放出された電子(e-)は隣接するポルフィリンに伝わり、最終的に負極2aへと運ばれる。これによって、微生物燃料電池１は、ポルフィリンを添加しない場合と比べ大幅な電流生成を生じさせることができる。電子(e-)は、外部回路３を介して、正極2bへ移動する。
【００２９】
また、プロトン(H+)は、隔膜４を透過して正極2b側に移動する。正極2b側に移動したプロトン(H+)は正極2bから電子(e-)を受け取り、空気に含まれる酸素と結合してH2Oを生成する。このようにして、微生物燃料電池１は、暗室状態である容器５内において、正極2b側で、負極2a側から供給される電子(e-)を順次消費することにより、電流生成を生じさせることができる。
【００３０】
ポルフィリンは、シトクロムの活性中心であるヘムと構造類似性を持ち、中心金属により酸化還元特性を変えることができる。また、環外周部への置換基導入が可能で、正電荷、負電荷を持たせることができ、ポルフィリンは効率的なメディエータとして作用する。
【００３１】
ポルフィリンは、Shewanellaが一般的に生存する水に溶ける親水性の方が望ましいが、Shewanellaが親水性以外の液体で生存できるのであれば親水性である必要はない。
【００３２】
一般的に、Shewanellaは負に帯電しているので、ポルフィリンは、正に帯電したカチオン性のほうがShewanellaに接近しやすく電流を増大させる効果がより大きくなる。また、正に帯電したカチオン性のポルフィリンは、より強い相互作用（静電的な相互作用）によって、より効率的な電子授受を行うことが出来る。
【００３３】
また、使用するポルフィリンは、中心金属がマンガン（Mn）、鉄（Fe）といったｃ−シトクロムの酸化還元電位と近いものがより効果がある。
【００３４】
尚、上記実施形態では、Shewanellaを例にとって説明したが、使用する微生物は細胞外電子伝達能をもつものであれば特に限定されるものではない。例えば、微生物単独でなくミックスドカルチャーと呼ばれる混合形の微生物でもよい。
【００３５】
また、上記実施形態では、ポルフィリンを負極2a側のShewanellaが浮遊する培養液中に添加する場合について説明したが、本発明はこれに限らず、負極2aにポルフィリンを修飾させても、同等の電流を増大させる効果が得られる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例について説明する。実施例では、光の無い環境下でも電流発生量を増加させることができることを確認するため、全て暗室条件で微生物電流生成値の測定を行った。微生物としては、光が無い環境下でも細胞外電子伝達能を発揮することができるShewanella loihica PV-4を用いた。Shewanella loihica PV-4はATCC(American Type Culture Collection)より購入した（カタログ番号（２００８年度版）；BAA-1088）。
【００３７】
実施例１〜６は請求項１〜４に対応する。実施例１〜５は、負極2a側に注入された培養液にメディエータとしてのポルフィリンを添加した場合の効果について、種々のポルフィリンを用いてそれぞれ確認した。ここで、ポルフィリンは、MnTMPyP[manganese (III) meso-tetrakis(N-methyl-4-pyridyl)porphyrin]、FeTMPyP[iron (III) meso-tetrakis(N-methyl-4-pyridyl)porphyrin]、MnTPPS[manganese (III) meso-tetrakis(4-sulfonatophenyl)porphyrin]、MnTPP[manganese (III) meso-tetraphenylporphyrin]、及びFeTPP[iron (III) meso-tetraphenylporphyrin]を用いた。
【００３８】
また、実施例６では、培養液に添加するポルフィリンの濃度と微生物電流生成値との関係について調べた。用いたポルフィリンは、MnTMPyPとし、MnTMPyPの濃度は、1, 5, 20, 30mMとした。
【００３９】
さらに、実施例７は、請求項５に対応し、ポルフィリンで修飾した負極を用いた場合の効果を確認した。修飾に用いたポルフィリンは、MnTAPyP [manganese (III) meso-tetrakis(N-aminoethyl-4-pyridyl)porphyrin]である。
【００４０】
尚、以下に述べる実施例は電気化学セルでのデータであり、実際の微生物燃料電池の形状とは異なるが、電流増大効果の発現は変化がない。
【００４１】
（実施例１）MnTMPyPの例
本実施例で用いた電気化学セル10について、図2を参照して説明する。尚、本図(A)は、電気化学セル10の全体斜視図、本図(B)は、(A)における縦断面を模式的に示す図である。
【００４２】
図2に示す電気化学セル10は、上記負極2aに対応する作用極12と、上記正極2bに対応する対極13及び参照極14と、上記容器５に対応する反応槽16とを備え、作用極12と対極13及び参照極14とは外部回路３に電気的に接続されている。
【００４３】
尚、電気化学セル10は隔膜を有さず、反応槽16内が仕切られていない点において、上述した微生物燃料電池１と構成が異なるが、上記したように、電流増大効果の発現は変化がない。実際の使用においては、長期間の使用に耐え得るようにするため、負極2aと正極2bとは隔膜４で仕切るのが好ましいが、以下に述べる実施例では、本発明の特徴的構成であるメディエータとしてポルフィリンを用いた場合の電流値を測定できれば足りるので、隔膜４を有さない電気化学セルを用いた。
【００４４】
また、反応槽16内は、電解質が収容されており、温度調整用配管17a,17bによって反応槽16の周囲を循環する温度調整用媒体によって一定温度に保持される。
【００４５】
本実施例において、反応槽16は、上板18と下板19と、前記上板18及び下板19で保持された筒状部材20とからなる。筒状部材20と下板19との間に、上記作用極12が保持されており、また、上板18に対極13及び参照極14が保持されている。上板18と下板19とはボルト21,21で締結されている。反応槽16内には、MnTMPyPとShewanella loihica PV-4を含む懸濁液が注入され、電解質と混合されている。
【００４６】
Shewanella loihica PV-4は以下の手順で培養した。寒天培地（Marine Broth 20 g L-1, Agar(寒天)15 g L-1）上で保存されているコロニーを1日MB(Marine Broth 20 g L-1) 中、30°Cで前培養した後に、培養液をDM-Lに替え2日間30°Cで培養した。遠心分離を行いMnTMPyPを含んだDM-LでShewanella loihica PV-4を懸濁させ図2に示す電気化学測定用の電気化学セル10のシリコンゴム栓15を貫き反応槽16内に注入した。電気化学セル10内でのMnTMPyPの濃度は10mMとなるようにした。
【００４７】
作用極12にはITO電極（電極面積 3.14 cm2）、対極13には白金線、参照極14にはAg|AgCl|KClsat.電極を用い、電解質は電気化学セル10内がDM-L4.0mLとなるように調製した。
【００４８】
電気測定はHSV-100（Hokuto Denko）を用いた。作用極12の電位は参照極14に対して+0.2Vに固定した。温度は25°Cで行い、電気化学セル10を図示しないシールドケース内に配置し、暗室内で測定した。また、比較として、MnTMPyPを含まない電気化学セル10を用いて測定した。
【００４９】
尚、DMとは、Difined Mediaの略で、その組成（各 gL-1）は、NaHCO3 2.5、CaCl2・2H2O 0.08、NH4Cl 1.0、MgCl2・6H2O 0.2、NaCl 10、2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES、緩衝溶液) 7.2である。Shewanella loihica PV-4への電子供与体としてsodium lactate（ラクテート）を10mM、また本培養時にはShewanella loihica PV-4に必要な微量な養分を供給するため有機物としてyeast extractを0.5gL-1も加えた。以下ラクテートの入ったDM培地をDM-Lと記す。
【００５０】
また、MnTMPyPは、以下の手順で生成した。まず、TMPyPを合成した。TMPyP [meso-tetrakis(N-methyl-4-pyridyl)porphyrin]の金属錯体を合成するにあたり、まず金属フリーのTPyP[meso-tetrakis(4-pyridyl)porphyrin)]を合成した（Ref. A. D. Adler et al J. Org. Chem., 1967, 32, 467.、  R. F. Pasternack et al J. Am. Soc. Chem., 1972, 94, 4511-4517.）。酢酸中にピロールと4-ピリジルカルボキシアルデヒドを加えて120°Cで2時間還流した。減圧して酢酸を留去した後に、カラムクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム・メタノール、充填剤：シリカゲル）で精製後、クロロホルム/メタノールで再結晶させてTPyPを得た。この得られたTPyPをN, N-ジメチルホルムアミド(DMF)に溶かし、p-トルエンスルホン酸メチルを加えて150°Cで12時間還流した。氷冷し濾別にてTMPyPを得た。
【００５１】
このようにして得たTMPyPを用いてMnTMPyPを合成した（Ref. J.-H. Fuhrhop et al Inorg. Chem., 1998, 37, 6052-6059.）。すなわち、TMPyPをDMFに溶かし、酢酸マンガン(II)を加えて140°Cで3時間撹拌した。減圧してDMFを留去した後、純水に溶解しそこにアンモニウムヘキサフルオロホスフェートを加えて沈殿させ濾別した。純水に溶解し陰イオン交換樹脂（塩化物イオン）に通して、エバポレーターで溶媒を除去し、減圧して乾燥させ、MnTMPyPを得た。その結果得られたMnTMPyPとShewanella loihica PV-4を含む懸濁液を電気化学セル10内に注入した。
【００５２】
このようにして構成された電気化学セル10では、Shewanella loihica PV-4がラクテートを捕捉すると、内部で電子(e-)とプロトン(H+)とを生成する。
【００５３】
電気化学セル10内に添加されたMnTMPyPは、Shewanella loihica PV-4に接近して、Shewanella loihica PV-4から電子(e-)を放出させる。放出された電子(e-)は隣接するMnTMPyPに伝わり、最終的に作用極12へと運ばれる。電子(e-)は、外部回路３を介して、対極13へ移動する。
【００５４】
また、プロトン(H+)は、対極13側に移動する。対極13側に移動したプロトン(H+)は対極13から電子(e-)を受け取り、空気に含まれる酸素と結合してH2Oを生成する。このようにして、電気化学セル10は、暗室状態において、作用極12側から対極13側へ電子(e-)が流れることにより発生する微生物電流生成値を測定した。
【００５５】
この結果、得られた電流−時間曲線を図3に示す。MnTMPyPを添加した場合は、MnTMPyPが存在しない（Shewanella loihica PV-4のみ）時に比べて、微生物電流生成値が25倍以上に飛躍的に向上した。尚、10時間以降に見られる電流の減少は、燃料であるラクテートの消費に帰属される。
【００５６】
（実施例２）FeTMPyPの例
実施例１と同様に、Shewanella loihica PV-4を培養したDM-L中にFeTMPyPを添加した懸濁液を電気化学セル10に注入した。電気化学セル10内でのFeTMPyPの濃度は10mMとなるようにした。また、比較として、FeTMPyPを含まない電気化学セル10を用いて測定した。電気化学セル10はシールドケース内に配置し、暗室内で測定した。
【００５７】
尚、FeTMPyPは、以下の手順で生成した（Ref. R. F. Pasternack et al J. Inorg. Nucl. Chem., 1977, 39, 1865-1870.）。すなわち、上記実施例１にて得たTMPyPをDMFに溶かし、塩化鉄(II)を加えて140°Cで8時間撹拌した。減圧してDMFを留去した後、純水に溶解しそこにアンモニウムヘキサフルオロホスフェートを加えて沈殿させ濾別した。純水に溶解し陰イオン交換樹脂（塩化物イオン）に通して、エバポレーターで溶媒を除去し、減圧して乾燥させ、FeTMPyPを得た。
【００５８】
この電気化学セル10を用いたときの電流−時間曲線を図4に示す。FeTMPyPを添加した場合は、FeTMPyPが存在しない（Shewanella loihica PV-4のみ）場合と比べ、微生物電流生成値が15倍以上増加した。
【００５９】
（実施例３）MnTPPSの例
実施例１と同様に、Shewanella loihica PV-4を培養したDM-L中にMnTPPSを添加した懸濁液を電気化学セル10に注入した。電気化学セル10内でのMnTPPSの濃度は、10mMとなるようにした。また、比較として、MnTPPSを含まない電気化学セル10を用いて測定した。電気化学セル10はシールドケース内に配置し、暗室内で測定した。
【００６０】
尚、MnTPPSは、以下の手順で生成した（Ref. A. D. Adler et al J. Org. Chem., 1967, 32, 467.、  M. Tsutsui et al J. Org. Chem., 1973, 38, 2103.、  J.-H. Fuhrhop et al Inorg. Chem., 1998, 37, 6052-6059.）。まず、酢酸中にピロールとベンズアルデヒドを加えて120°Cで2時間還流した。減圧して酢酸を留去した後に、カラムクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム・ヘキサン、充填剤：シリカゲル）で精製後、クロロホルム/ヘキサンで再結晶させてTPP[meso-tetraphenylporphyrin]を得た。このようにして得られたTPPに濃硫酸を加えて90°Cで5時間撹拌した後に、室温でさらに2日間撹拌した。純水で希釈し酸化カルシウムで中和した後、固形分を濾過にて除きエバポレーターで濃縮した。炭酸水素ナトリウムを加えてpHを9とし、固形分を濾過にて除いた後、エバポレーターで溶媒を除去した。純水に溶解し陽イオン交換樹脂（水素イオン）に通して、エバポレーターで溶媒を除去し、TPPS を得た。このTPPSをメタノールに溶かし、ナトリウムメトキシドを加えエバポレーターで溶媒を除去した。残渣を純水に溶解し、酢酸マンガン(II)を加えて85°Cで3時間撹拌した。純水で希釈し陽イオン交換樹脂に通して、エバポレーターで溶媒を除去した。メタノールに溶解、ナトリウムメトキシドを加えエバポレーターで溶媒を除去し、減圧して乾燥させ、MnTPPSを得た。
【００６１】
この電気化学セル10を用いたときの電流−時間曲線を図5に示す。MnTPPSを添加した場合は、MnTPPSが存在しない（Shewanella loihica PV-4のみ）場合に比べ、微生物電流生成値が4倍程度増加した。
【００６２】
（実施例４）MnTPPの例
本実施例は、実施例１に対し、Shewanella loihica PV-4を本培養の際に、MnTPPのN,N-dimethylformamide溶液(1mM)を200mL加えて培養して得たDM-Lを電気化学セル10に注入した点が異なる。また、比較として、MnTPPを含まない電気化学セル10を用いて測定した。電気化学セル10はシールドケース内に配置し、暗室内で測定した。
【００６３】
尚、MnTPPは、以下の手順で生成した（Ref. A. D. Adler et al J. Inorg. Nucl. Chem., 1970, 32, 2443-2445.）。すなわち、上記実施例５にて得たTPPをクロロホルムに溶かし、少量のメタノールに溶かした塩化マンガン(II)を加えて70°Cで8時間還流した。反応混合物を飽和食塩水で洗いクロロホルムで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にエバポレーターで溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム・メタノール、充填剤：シリカゲル）で精製後、クロロホルム/ヘキサンで再結晶させてMnTPPを得た。
【００６４】
この電気化学セル10を用いたときの電流−時間曲線を図6に示す。MnTPPを添加した場合は、MnTPPが存在しない（Shewanella loihica PV-4のみ）場合に比べ、微生物電流生成値が2倍以上増加した。
【００６５】
（実施例５）FeTPPの例
本実施例は、実施例１に対し、Shewanella loihica PV-4 を本培養の際に、FeTPPのN,N-dimethylformamide溶液(1mM)を200mL加えて培養して得たDM-Lを電気化学セル10に注入した点が異なる。また、比較として、FeTPPを含まない電気化学セル10を用いて測定した。電気化学セル10はシールドケース内に配置し、暗室内で測定した。
【００６６】
尚、FeTPPは、以下の手順で生成した（Ref. A. D. Adler et al J. Inorg. Nucl. Chem., 1970, 32, 2443-2445.）。すなわち、上記実施例５にて得たTPPをクロロホルムに溶かし、少量のメタノールに溶かした塩化鉄(II)を加えて70°Cで8時間還流した。反応混合物を飽和食塩水で洗いクロロホルムで抽出、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にエバポレーターで溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム・メタノール、充填剤：シリカゲル）で精製後、クロロホルム/ヘキサンで再結晶させてFeTPPを得た。
【００６７】
この電気化学セル10を用いたときの電流−時間曲線を図7に示す。FeTPPを添加した場合は、FeTPPが存在しない（Shewanella loihica PV-4のみ）場合に比べ、微生物電流生成値が2倍以上増加した。
【００６８】
（実施例６）MnTMPyPの濃度の影響
実施例１と同様に、Shewanella loihica PV-4を培養したDM-L中にMnTMPyPを添加した懸濁液を電気化学セル10に注入し、当該電気化学セル10内の濃度が1, 5, 20, 30mMとなる4種の電気化学セル10を用意した。電気化学セル10はシールドケース内に配置し、暗室内で測定した。
【００６９】
この電気化学セル10を用いたときの電流−時間曲線を図8〜図11に示す。MnTMPyPを添加した場合は、MnTMPyPが存在しない（Shewanella loihica PV-4のみ）場合に比べ、微生物電流生成値がそれぞれ3, 18, 20, 18倍程度増加した。
【００７０】
（実施例７）ポルフィリン（MnTAPyP）で修飾したグラファイト電極を用いた例
本実施例で用いた電気化学セル30について、図12を参照して説明する。尚、本図(A)は、電気化学セル30の全体斜視図、本図(B)は、(A)におけるボルトの長手方向を縦とした場合の縦断面を模式的に示す図である。
【００７１】
電気化学セル30は、負極31と、正極32と、上記容器５に対応する反応槽33とを備え、負極31及び正極32は外部回路３に電気的に接続されている。尚、電気化学セル30は隔膜を有さず、反応槽33内が仕切られていない点において、上述した微生物燃料電池１と構成が異なるが、上記したように、電流増大効果の発現は変化がない。
【００７２】
本実施例において、反応槽33は、上板34と下板35と、筒状部材36と、正極保持部37とを有する。筒状部材36と正極保持部37とは、上板34と下板35とで挟持されている。筒状部材36の側面には、シリコンゴム栓38が設けられており、当該シリコンゴム栓38を通じて負極31が反応槽33内に保持されている。また、正極保持部37は、板状の正極32を反応槽33内に露出した状態で保持し得るように構成されている。上板34と下板35とはボルト21,21で締結されている。この反応槽33内には、微生物、及び有機物を含む電解質が設けられている。
【００７３】
電気化学セル30において、微生物源として水田の土を0.2g(wet)、電解質としてリン酸バッファー(200mM、pH 6.8)12mL、有機物としてstarch、peptone、fish extractを混合したもの(75g COD/L)、負極31としてポルフィリンで修飾したグラファイト電極(1 cm2)、正極32として白金(8 mg/cm2)を保持した炭素シートを使用した空気極(7 cm2)、外部回路３として10 k ohmの外部抵抗を用いた。尚、グラファイト電極はチタン線と接合され、シリコンゴム栓38を通じて電気化学セル30に組み込まれている。このように構成された電気化学セル30は30°C保温庫に配置、暗室条件で測定した。測定にはHA-1510(Hokuto Denko)を用いた。
【００７４】
尚、グラファイト電極は以下のようにして作製した。
【００７５】
まず、グラファイトフェルトを濃硫酸、濃硝酸（３：１）の混酸に浸し超音波処理を６時間行った。グラファイトフェルトを取り出し、純水で酸が出なくなるまで洗ったのち、乾燥させた。
【００７６】
一方、MnTAPyP は、以下の手順で合成した（Ref. S. Asanuma et al Bioconjugate Chem., 2004, 15, 1360-1365.）。すなわち、上記実施例１にて得たTPyPをDMFに溶かし、１−ブロモエチルアンモニウムブロミドを加えて150°Cで12時間還流した。DMFを留去したのちジクロロメタンで洗い純水で抽出した。エバポレーターで溶媒を除去した。得られたTAPyPをDMFに溶解し酢酸マンガン(II)を加え140°Cで3時間撹拌した。減圧してDMFを留去した後、純水に溶解しそこにアンモニウムヘキサフルオロホスフェートを加えて沈殿させ濾別しMnTAPyP を得た。
【００７７】
次いで、上記のMnTAPyPをDMFに溶解し上記のグラファイトフェルトを溶液に浸した。少量のトリエチルアミンを加え、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩と1-ヒドロキシベンゾトリアゾールを加え0°Cで２時間撹拌した後、室温で１日撹拌にした。グラファイトフェルトを取り出し、純水でポルフィリンの色が出なくなるまで洗ったのち、乾燥させた。このようにして、ポルフィリンで修飾したグラファイト電極を作製した。
【００７８】
このグラファイト電極を用いた場合の電圧−時間曲線を図13に示す。ポルフィリンで修飾したグラファイト電極は、ポルフィリンで修飾していない電極に比べて、微生物による起電力値が1.5倍程度増加した。図14に電圧−電流、電力曲線を示す。ポルフィリンで修飾していない電極に比べて、電力が2倍以上増加した。
【００７９】
以上の結果から、ポルフィリンを微生物の培養液に添加することにより、ポルフィリンを添加しない場合に比べ、大きな電流量を得られることが確認できた。また、ポルフィリンで修飾した電極を負極に用いた場合には、ポルフィリンを微生物の培養液に添加した場合と同等の電流量が得られることが確認できた。
【符号の説明】
【００８０】
１    微生物燃料電池
２    電極
2a    負極
2b    正極
３    外部回路
４    隔膜
５    容器
10    電気化学セル
12    作用極
13    対極
14    参照極
15    シリコンゴム栓
16    反応槽
17a    温度調整用配管
18    上板
19    下板
20    筒状部材
21    ボルト
30    電気化学セル
31    負極
32    正極
33    反応槽
34    上板
35    下板
36    筒状部材
37    正極保持部
38    シリコンゴム栓
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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