(57)【要約】【課題】細胞またはコロニーの培養環境を維持しながら培養中の細胞集団から所望の細胞またはコロニーを回収可能な細胞またはコロニーの採取装置及び細胞またはコロニーの採取方法を提供すること。【解決手段】内壁面に細胞が付着して培養された培養容器の内部に少なくとも先端２１ａを挿入可能な筒部材２１と、前記細胞を前記内壁面から剥離するための剥離液３０を先端２１ａから吐出可能な吐出機構であると共に剥離液３０によって剥離された前記コロニーを構成する細胞を先端２１ａから筒部材２１の内部へ吸引する吸引機構であるシリンジポンプ２３とを備え、剥離液３０が、前記細胞の培養に用いられる培養液よりも比重及び粘度が高い。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内壁面に細胞が付着して培養された培養容器の内部に少なくとも先端を挿入可能な筒部材と、
前記細胞を前記内壁面から剥離するための剥離液を前記先端から吐出可能な吐出機構と、
前記剥離液によって剥離された前記コロニーを構成する細胞を前記先端から前記筒部材の内部へ吸引する吸引機構と、
を備え、
前記剥離液が、前記細胞の培養に用いられる培養液よりも比重及び粘度が高いことを特徴とする細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項２】
前記剥離液が、前記細胞の細胞外基質を変性可能な酵素を含む請求項１に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項３】
前記剥離液が、グリセリンと、糖と、塩との少なくとも一つを含む請求項１または２に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項４】
前記剥離液の比重が１．００５〜１．４の間にある請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項５】
前記剥離液の比重が１．０１〜１．１の間にある請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項６】
前記剥離液の粘度が１．０４ｃＰ〜３００ｃＰの間にある請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項７】
前記剥離液の粘度が１．１ｃＰ〜１５０ｃＰの間にある請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項８】
前記所定の細胞またはコロニーを観察可能な顕微鏡をさらに備え、
前記顕微鏡が、視野の少なくとも一部の所定領域に熱線を照射可能な加熱機構を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項９】
前記加熱機構が、
前記顕微鏡の光源からなる熱源と、
前記顕微鏡の光路に熱線吸収フィルターを挿脱可能な挿脱機構と、
を有する請求項８に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項１０】
前記加熱機構が、
前記所定領域の温度を測定する測定部を有し、
前記測定部による測定結果に基づいて前記所定領域の温度が所定温度になるように前記熱線の照射量を調整する温度調整機構を有する請求項８または９に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項１１】
前記所定温度が、前記酵素の酵素活性に対する至適温度である請求項１０に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項１２】
前記培養容器における前記所定の細胞またはコロニーの位置を検出する位置検出機構と、
前記位置検出機構によって検出された前記位置に前記筒部材の先端を誘導する誘導機構と、
前記筒部材の内部に吸引された前記細胞を複数の前記所定の細胞またはコロニーごとに分取する分取機構と、
をさらに備える請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項１３】
少なくとも前記培養容器の内部を前記細胞の培養に適した温度及び二酸化炭素濃度に維持するインキュベーターをさらに備える請求項１２に記載の細胞またはコロニーの採取装置。
【請求項１４】
培養液に浸漬されて培養される細胞または複数の前記細胞からなるコロニーが付着する付着面から前記細胞または前記コロニーを採取する細胞またはコロニーの採取方法であって、
前記培養液よりも高い比重及び粘度を有する剥離液を前記培養液の内部で前記細胞または前記コロニーに対して吐出する吐出工程と、
前記吐出工程に続いて前記剥離液によって前記細胞または前記コロニーを前記付着面から剥離する剥離工程と、
前記剥離工程に続いて前記付着面から剥離された前記細胞または前記コロニーを回収する回収工程と、
を備える細胞またはコロニーの採取方法。
【請求項１５】
前記吐出工程に続いて、前記所定の細胞またはコロニーの近傍に吐出された前記剥離液を加熱する加熱工程をさらに備える請求項１４に記載の細胞またはコロニーの採取方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞またはコロニーの採取装置及び細胞またはコロニーの採取方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、付着性細胞の細胞培養法では、付着性細胞の増殖に応じて培養容器内の付着面から付着性細胞を剥離し、新たな培養容器に播種する継代作業や、剥離された付着性細胞を回収して実験を行うことが知られている。
【０００３】
一般的に、培養容器内の付着面に付着した付着性細胞を剥離する際には、付着性細胞が浸漬された培養液を、付着性細胞の接着因子を分解するための分解酵素等を含有する緩衝液に置換する方法が知られている。このとき、培養液に溶存する蛋白質を除去するために、蛋白質を含有しない緩衝液で付着面を洗浄することが必要であると考えられている。
【０００４】
近年、細胞培養の工程を自動化し、手作業が介在することによる交差汚染の危険性を抑制しながら多様な細胞の培養ができる多検体細胞自動培養装置が開発されている。例えば特許文献１には、接着性細胞における継代操作などにおいて接着性細胞を剥離することができる培養細胞の剥離方法、並びに接着性細胞を自動的に剥離することができる細胞剥離判断装置及び自動細胞培養装置が記載されている。
【０００５】
特許文献１に記載の培養細胞の剥離方法は、培養容器から培養細胞を剥離させるための剥離液を培養容器に投入するステップと、培養細胞の剥離を判断するステップと、培養容器に剥離停止液を投入するステップとを有している。この培養細胞の剥離方法によれば、培養細胞が剥離されたことを判断して剥離停止液を投入することで、人が介在しなくても培養細胞の剥離を判断することが可能となり、培養細胞の剥離を自動化することができる。
【０００６】
一方、細胞培養法において、生体から採取された初代培養細胞あるいは人為的に改変を加えた培養細胞から所望の形質を有する培養細胞または培養細胞集団（以下「コロニー」と称する）を採取するために、培養容器の内部に播種された培養細胞の所望の一部を採取する装置が知られている。
【０００７】
例えば、特許文献２には、スライドグラス上に塗布された細胞から標的対象物となる所望の細胞を回収する標的対象物の自動探索回収装置が記載されている。この特許文献２に記載の自動探索回収装置は、対象物を検査して対象物の画像を撮影可能な顕微鏡と、顕微鏡による検査可能領域内に配置され対象物を顕微鏡に対して相対移動可能な状態で支持する試料台と、対象物のうち回収対象となる標的対象物を回収するノズルとを備え、さらに標的対象物の画像及びノズルの画像を解析する解析部並びに標的対象物及びノズルに関する画像データ及びその位置を記憶する記憶部が設けられた画像処理ユニットと、前記対物レンズによる前記探索済みの標的対象物と前記ノズルに対する焦点を合わせると共に前記試料板と前記ノズルとのＸＹ面内における相対位置を制御する制御ユニットとを有している。
【０００８】
この特許文献２に記載の標的対象物の自動探索回収装置によれば、標的対象物となる細胞を選択した後、自動的にこの細胞を回収することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−２７５０３０号公報
【特許文献２】特開２００５−２０７９８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１に記載の自動細胞培養装置では、培養容器の内部に剥離液を投入して剥離させるもので、一般的な細胞剥離方法と同様に培養容器内のすべての細胞を剥離させるようになっている。そのため所望の細胞またはコロニーを選択して採取することができないという問題があった。
【００１１】
また、特許文献２には、スライドガラス上に塗布された例えば血液から標的対象物となる細胞を回収するようになっており、細胞の周囲には固定液が配置されていることが記載されている。したがって、特許文献２に記載の標的対象物の自動探索回収装置では、これらの細胞の培養環境を劇的に変化させてしまうため、標的対象物とならなかった他の細胞を標的対象物の回収前と同様の培養条件で継続して培養することができないという問題があった。
【００１２】
上述の問題点により、特許文献２に記載の装置を特許文献１に適用させても、培養細胞の培養に至適化された培養用条件での培養を継続しながら所望の細胞またはコロニー（以下「細胞等」と称する）を回収することは困難である。
【００１３】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、その第１の目的は細胞等の培養環境を維持しながら培養中の細胞集団から所望の細胞等を回収可能な細胞またはコロニーの採取装置及び細胞またはコロニーの採取方法を提供することにある。
【００１４】
また、本発明の第２の目的は、細胞等の培養環境を維持しながら特定の細胞等を自動的に回収可能な細胞またはコロニーの採取装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、この発明は以下の手段を提案している。
本発明の細胞またはコロニーの採取装置は、内壁面に細胞が付着して培養された培養容器の内部に少なくとも先端を挿入可能な筒部材と、前記細胞を前記内壁面から剥離するための剥離液を前記先端から吐出可能な吐出機構と、前記剥離液によって剥離された前記コロニーを構成する細胞を前記先端から前記筒部材の内部へ吸引する吸引機構とを備え、前記剥離液が、前記細胞の培養に用いられる培養液よりも比重及び粘度が高いことを特徴としている。
【００１６】
この発明によれば、筒部材の先端から吐出される剥離液は、培養液よりも比重及び粘度が高く設定されている。そのため、剥離液が培養液中に吐出された際に、剥離液は培養容器内において鉛直下方へ沈下して滞留する。したがって、培養容器内で培養液に浸漬され培養面に付着している細胞等に対してこの剥離液を吐出すると、剥離液は、細胞等の周囲の培養液を押しのけて滞留し、細胞の周囲の限局された領域において培養液が剥離液に置換される。その結果、前述の限局された領域に含まれる細胞等が選択的に培養容器から剥離される。さらに、培養容器から剥離された細胞等は吸引機構によって筒部材の内部に吸引採取される。
【００１７】
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置は、前記剥離液が、前記細胞の細胞外基質を変性可能な酵素を含むことが好ましい。
この場合、剥離液に細胞外基質を変性可能な酵素を含むことによって、酵素が細胞と培養容器との間の結合因子を変性させ、迅速に細胞を培養容器から剥離させることができる。
【００１８】
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置は、前記剥離液が、グリセリンと、糖と、塩との少なくとも一つを含むことが好ましい。
これにより、剥離液の比重及び粘度が緩衝液や培養液等に対して高くなるように調整されている。このとき、グリセリン、糖及び塩はいずれも細胞毒性が極めて低いので、細胞培養中の培養細胞に対する悪影響を低減しつつ剥離液の比重及び粘度を高く調製することができる。
【００１９】
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置は、前記剥離液の比重が１．００５〜１．４の間にあることが好ましく、前記剥離液の比重が１．０１〜１．１の間にあることがより好ましい。
剥離液の比重が１．００５よりも小さいと培養液の中で効果的に沈下できない。また、剥離液の比重が１．４よりも大きいと剥離液の取り扱いが困難になる。剥離液の比重が１．００５〜１．４の間にあることで、内径が細い筒部材を通じて剥離液を培養液中に効果的に吐出させて沈下させることができる。
【００２０】
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置は、前記剥離液の粘度が１．０４ｃＰ〜３００ｃＰの間にあることが好ましく、前記剥離液の粘度が１．１ｃＰ〜１５０ｃＰの間にあることがより好ましい。
剥離液の粘度が１．０４ｃＰ以下であると、剥離液が培養液中に拡散しやすいため剥離液中で細胞の剥離作用を生じる物質の濃度が低下する。すると、目的とする細胞等が充分に剥離されない場合や、目的とする細胞等の周辺領域まで拡散した剥離液によって目的外の細胞等が剥離されてしまう可能性がある。また、剥離液の粘度が３００ｃＰよりも大きい場合には、筒部材の内部を通じた剥離液の移動が困難になる。
【００２１】
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置は、前記細胞または前記コロニーを観察可能な顕微鏡をさらに備え、前記顕微鏡が、視野の少なくとも一部の所定領域に熱線を照射可能な加熱機構を有することが好ましい。
この場合、加熱機構により顕微鏡で確認可能な細胞等に対して熱線を照射することによりこれら細胞等の近傍の温度を上昇させることができる。このとき、剥離液が吐出された部分では剥離液の活性が高まることにより細胞の剥離が促進される。したがって、細胞の剥離に要する時間を短縮することができる。
【００２２】
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置は、前記加熱機構が、前記顕微鏡の光源からなる熱源と、前記顕微鏡の光路に熱線吸収フィルターを挿脱可能な挿脱機構とを有することが好ましい。
この場合、顕微鏡に標準的に装備されている光源を加熱機構の熱源とできるので、装置を簡易に構成することができる。細胞観察時と細胞剥離時とに応じて熱線吸収フィルターを顕微鏡の光路に対して挿入及び抜脱できるので、細胞の観察からその細胞の剥離に移る際にフィルター操作のみで熱線を照射することができ、装置の操作性を高めることができる。
【００２３】
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置は、前記加熱機構が、前記所定領域の温度を測定する測定部を有し、前記測定部による測定結果に基づいて前記所定領域の温度が所定温度になるように前記熱線の照射量を調整する温度調整機構を有することが好ましい。
この場合、加熱機構による細胞の暖めすぎを防止することができ、細胞への傷害を防止することができる。したがって、使用者に所定領域の温度管理のために加熱機構を逐次操作させる必要がないので作業性が向上する。
【００２４】
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置は、前記所定温度が、前記酵素の酵素活性に対する至適温度であることが好ましい。
この場合、剥離する対象の細胞またはコロニーがある所定領域が、酵素の最大活性を引き出すことができる温度に維持される。このため細胞等に対して酵素を作用させる時間を短縮させても効果的に細胞等を剥離することができる。また、所定領域を暖めすぎることによる酵素の失活を抑制することもできる。
【００２５】
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置は、前記培養容器における所定の細胞またはコロニーの位置を検出する位置検出機構と、前記位置検出機構によって検出された前記位置に前記筒部材の先端を誘導する誘導機構と、前記筒部材の内部に吸引された前記細胞を複数の前記所定の細胞またはコロニーごとに分取する分取機構とをさらに備えることが好ましい。
この場合、所定の細胞等が指定された後に、培養容器における所定の細胞等の位置まで筒部材の先端が誘導されて所定の細胞等が分取機構へと採取される。さらに、この発明によれば複数の所定の細胞等を一度に指定し、引き続いて所定の細胞等のそれぞれを分取することができるので、使用者が採取すべき細胞等を一括で指定した後は、採取動作が自動化されて指定された細胞等が分取される。
【００２６】
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置は、少なくとも前記培養容器の内部を前記細胞の培養に適した温度及び二酸化炭素濃度に維持するインキュベーターをさらに備えることが好ましい。
この発明によれば、細胞の剥離作業がインキュベーターの管理下で温度及び二酸化炭素濃度が維持された状態で行われる。したがって、細胞培養における重要な培養条件である温度と二酸化炭素濃度とが至適に維持された環境下で培養容器内の細胞等を剥離して採取することができる。このため、培養容器の内部にある複数の細胞等を採取することによって処理時間がかかってもその間の培養容器内の温度及びに二酸化炭素濃度が至適条件に維持され、培養環境の変化が抑制されるので細胞の性質を適切に維持管理することができる。
【００２７】
本発明の細胞またはコロニーの採取方法は、培養液に浸漬されて培養される細胞または複数の前記細胞からなるコロニーが付着する付着面から前記細胞または前記コロニーを採取する細胞またはコロニーの採取方法であって、前記培養液よりも高い比重および粘度を有する剥離液を前記培養液の内部で前記細胞または前記コロニーに対して吐出する吐出工程と、前記吐出工程に続いて前記剥離液によって前記細胞または前記コロニーを前記付着面から剥離する剥離工程と、前記剥離工程に続いて前記付着面から剥離された前記細胞または前記コロニーを回収する回収工程とを備えることを特徴としている。
この発明によれば、まず、培養液の内部に剥離液を吐出する。すると比重の重い剥離液は培養液の内部で沈下して所定の細胞等に到達する。続いて粘度の高い剥離液は培養液に拡散されることなく所定の細胞等の近傍に滞留する。続いて、剥離工程において剥離液の作用によって剥離液と接触している細胞等は付着面から剥離される。続いて付着面から剥離された細胞等が回収される。このようにして、培養容器中で、蛋白質等を含有する培養液を除去することなく、所望の細胞等を選択して剥離し、回収することができる。
【００２８】
また、本発明の細胞またはコロニーの採取方法は、前記吐出工程に続いて、前記所定の細胞またはコロニーの近傍に吐出された前記剥離液を加熱する加熱工程をさらに備えることが好ましい。
この場合、剥離液を加熱することによって剥離液の活性を至適化し、剥離液による細胞の剥離時間を短縮することができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の細胞またはコロニーの採取装置及び細胞またはコロニーの採取方法によれば、培養中の細胞集団から所望の細胞またはコロニーを回収することができる。
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置によれば、細胞またはコロニーを自動的に回収することができる
また、本発明の細胞またはコロニーの採取装置によれば、細胞等の培養環境を維持しながら特定の細胞等を自動的に回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】（Ａ）は本発明の第１実施形態の細胞またはコロニーの採取装置の側面を示す構成図、（Ｂ）は同採取装置を一部破断して示す正面図である。
【図２】同採取装置の一部の構成を示す拡大図である。
【図３】（Ａ）ないし（Ｃ）は同採取装置の使用時の動作を示す図である。
【図４】（Ａ）ないし（Ｄ）は同採取装置の使用時の動作を示す図である。
【図５】（Ａ）は本発明の第２実施形態の細胞またはコロニーの採取装置の側面を示す構成図、（Ｂ）は同採取装置を一部破断して示す正面図である。
【図６】（Ａ）ないし（Ｄ）は同採取装置の使用時の動作を示す図である。
【図７】本発明の第３実施形態の細胞またはコロニーの採取装置を示す構成図である。
【図８】（Ａ）ないし（Ｃ）は同採取装置の使用時の動作を示す図である。
【図９】本発明の第４実施形態の細胞またはコロニーの採取装置を示す構成図である。
【図１０】同採取装置の使用時の動作を示すフローチャートである。
【図１１】（Ａ）ないし（Ｃ）は本発明の細胞またはコロニーの採取方法の実施例における一過程を示す顕微鏡写真である。
【図１２】（Ａ）ないし（Ｄ）は本発明の細胞またはコロニーの採取方法の実施例における一過程を示す顕微鏡写真である。
【図１３】（Ａ）及び（Ｂ）は本発明の細胞またはコロニーの採取方法の実施例における一過程を示す顕微鏡写真である。
【図１４】（Ａ）ないし（Ｃ）は本発明の細胞またはコロニーの採取方法の実施例における一過程を示す顕微鏡写真である。
【図１５】（Ａ）及び（Ｂ）は本発明の細胞またはコロニーの採取方法の実施例における一過程を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（第１実施形態）
以下、本発明の第１実施形態の細胞またはコロニーの採取装置について図１から図４を参照して説明する。
図１は、本実施形態の細胞またはコロニーの採取装置（以下「採取装置１００」と称する）の構成を模式的に示す構成図である。図１（Ａ）は採取装置１００を示す側面図であり、図１（Ｂ）は採取装置１００を一部破断して示す正面図である。
【００３２】
図１（Ａ）及び図１（Ｂ）に示すように、採取装置１００は、培養細胞の観察等に使用される顕微鏡装置１０と、培養容器から細胞を採取するための採取機構２０とを備える。
【００３３】
顕微鏡装置１０には、実体顕微鏡や位相差顕微鏡等の周知の生物顕微鏡を選択して使用することができる。顕微鏡装置１０は、対象物に可視光を照射可能な光源１１と、光源１１からの光が入射可能な対物レンズ１２とを備える。また、顕微鏡装置１０には、使用者が対象物を観察するための接眼レンズ１３あるいは対象物の画像を取得して表示するディスプレイ機構１４の少なくともいずれかが設けられていることが好ましい。
【００３４】
顕微鏡装置１０には、対象物を載置するステージ１５が設けられている。ステージ１５は、対象物が載置されて対物レンズ１２との間で相対移動可能な構成になっている。
【００３５】
採取機構２０は、先端開口２１ａと基端開口２１ｂとを有する筒部材２１（図２参照）と、筒部材の基端開口２１ｂと連通するように一端が接続されたチューブ２２と、チューブ２２の他端と連通されたシリンジポンプ２３とを備える。
【００３６】
筒部材２１は、ガラスあるいは樹脂からなる筒状の部材で、先端開口の内径は２００μｍ程度に形成されていることが好ましい。なお、先端開口２１ａと基端開口２１ｂとのそれぞれの内径は、同径でも異径でもよい。また、筒部材２１は、少なくとも先端において光を透過可能であることが好ましい。これは、顕微鏡下において筒部材２１の内部に取り込まれた対象物等を確認可能にするためである。なお、筒部材２１は無色透明であってもよいし、着色されていてもかまわない。
【００３７】
シリンジポンプ２３は、詳細は図示しない外筒及びプランジャーを有する周知のシリンジと、外筒に対してプランジャーを進退移動させるための進退操作部２４とが設けられている。
【００３８】
また、筒部材２１は、支持部２５によって支持されている。支持部２５は、直交する３軸線上で進退動作可能な構成になっており、例えば互いに相対移動可能な軸２５ａ、２５ｂ、２５ｃを備えて軸２５ａに固定された筒部材２１を当該３軸に沿って移動させる構成を採用することができる。
【００３９】
なお、本実施形態の採取装置１００は、クリーンルームの中、クリーンベンチの中、あるいは空気清浄機能を有するフードの中など、落下菌による汚染が防止可能な環境下で使用されることが好ましい。
【００４０】
次に、本実施形態において細胞の剥離に使用される剥離液について詳述する。
剥離液３０は、培養容器の内壁である付着面に付着して培養された培養細胞等を付着面から剥離するための液体である。剥離液３０は、燐酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline、以下「ＰＢＳ」と称する）と、エチレンジアミン四酢酸（Ethylenediaminetetraacetic acid、以下「ＥＤＴＡ」と称する）と、グリセリンとを含有する液体であるＰＢＳ−ＥＤＴＡ−グリセリン溶液を採用することができる。なお、剥離液３０は、剥離液容器３１（図１（Ｂ）参照）の内部に貯留されて使用される。
【００４１】
ＰＢＳは、培養細胞の培養液と等張に調製された周知の緩衝液である。また、ＥＤＴＡは、培養細胞の細胞表面の接着因子からカルシウムイオンを奪うことによって接着因子による接着力を弱める作用を有する。ＥＤＴＡは、その使用時の最終濃度が０．０２％程度となるように調製されていることが好ましい。また、グリセリンは、親水性を有し前述のＰＢＳに溶解されることで溶液の比重及び粘度を高める作用を有する。グリセリンは、その使用時の最終濃度が１０％から５０％の間に調整されていることが好ましい。
【００４２】
さらに、剥離液３０には、細胞表面の接着因子あるいは細胞外基質を分解可能なプロテアーゼを含有することが好ましい。このようなプロテアーゼには、コラゲナーゼやトリプシン等を剥離対象となる細胞に合わせて選択して採用することができる。例えばトリプシンを含有して使用する際には、トリプシンの濃度は使用時の最終濃度で０．０５％から０．５％の間に調整されて使用されることが好ましい。
【００４３】
また、剥離液３０には、培養液と異なる色に着色可能な着色料を添加することができる。このような着色料としては、ブロモフェノールブルーやフェノールレッド等のｐＨ指示薬等を採用することができる。また、このような着色料としては、細胞傷害性のない着色料であればｐＨ指示薬に限定されるものではない。
【００４４】
剥離液３０使用時の比重は１．００５〜１．４の間にあることが好ましく、これは培養細胞の培養液の比重よりも大きく設定されている。より好ましくは、剥離液３０の使用時の比重は１．０１〜１．１の間に設定され、培養液の内部で沈下可能になっている。
【００４５】
また、剥離液３０の使用時の粘度は、１．０４ｃＰ〜３００ｃＰの間にあることが好ましい。剥離液３０の使用時の粘度は、培養液の粘度よりも高く、かつ筒部材２１等の内部で剥離液３０を流動可能になっている。より好ましくは、剥離液３０の粘度は１．１ｃＰ〜１５０ｃＰの間に設定されている。このようにすると、培養液よりも十分に粘度が高く、剥離液３０に含有されるトリプシン等が培養液内で拡散するのが抑制されると共に、筒部材２１の内部で剥離液３０を流動させることができる。
【００４６】
以上に説明する構成の、採取装置１００の作用について、図３及び図４を参照しながら説明を行う。
図３は、培養容器４０の内部で培養された細胞Ｃを付着面４１から剥離する工程を示す図である。
図３（Ａ）に示すように、細胞Ｃは培養容器４０の内部で付着面４１に付着して培養されており、培養液Ｍに浸漬されている。使用者は培養容器４０を周知の顕微鏡あるいは顕微鏡装置１０のステージ１５上に配置し、周知の方法で細胞Ｃの培養状態を観察し、採取すべき細胞Ｃ（例えば細胞Ｃ２）を決定する。
【００４７】
続いて、使用者は落下菌の進入が防止できる手段を有する場所で培養容器４０のキャップ４２を取り外す。以降、培養容器４０のキャップ４２が空いている間の操作は無菌操作であることが好ましい。
【００４８】
続いて、使用者は筒部材２１の先端開口２１ａを剥離液容器３１の内部に挿入し、剥離液３０に浸漬させる。続いてシリンジポンプ２３の進退操作部２４を操作して剥離液３０を所定量だけ筒部材２１の先端から吸引する。筒部材２１の内部に吸引する剥離液３０の量は採取する対象となる細胞Ｃ２の量（すなわちコロニーの大きさ）に応じて適宜調整される。
【００４９】
続いて、図３（Ｂ）に示すように、剥離液３０が筒部材２１の内部に保持された状態でシリンジポンプ２３の動作を停止させ、筒部材２１の先端開口２１ａを培養容器４０の開口部４３から内部へ挿入する。使用者は、顕微鏡装置１０によって得られた細胞Ｃ２の像を頼りにして筒部材２１の先端開口２１ａを細胞Ｃ２の近傍に誘導する。このとき、筒部材２１の先端開口２１ａは細胞Ｃを培養するための培養液Ｍに浸漬された位置関係にある。
【００５０】
続いて、図３（Ｃ）に示すように、使用者はシリンジポンプ２３の進退操作部２４を操作して筒部材２１の先端開口２１ａから剥離液３０を吐出させる（吐出工程）。すると、筒部材２１の先端開口２１ａから吐出された剥離液３０は、培養液Ｍの内部で重力に従って沈下し、細胞Ｃ２に重層される。ここで、剥離液３０は培養液Ｍよりも粘度が高いので、剥離液３０は細胞Ｃ２の近傍にあった培養液Ｍを押しのけるようにして細胞Ｃ２の近傍に留まる。
【００５１】
図４は、剥離液３０が吐出されてから細胞Ｃ２が採取されるまでの動作を示す図である。図４（Ａ）に示すように、剥離液３０に含有されたＥＤＴＡやプロテアーゼは、剥離液３０と培養液Ｍとの界面では培養液Ｍに含有される蛋白質の一部を分解する作用を生じ、剥離液３０と細胞Ｃ２との接触面では細胞Ｃ２の細胞表面の蛋白質を分解する作用を生じる。このとき、剥離液３０の粘性が高く培養液Ｍ中で拡散することが抑制されているため、剥離液３０による蛋白質の分解は剥離液３０が吐出された細胞Ｃ２の近傍に限局されている。したがって、剥離液３０が培養液Ｍ内に拡散する前に剥離液３０が細胞Ｃ２と培養容器４０の付着面４１との間及び細胞Ｃ２のそれぞれの間に浸透して細胞表面の接着因子等の蛋白質が分解され、細胞Ｃ２は付着面４１から離間する（剥離工程）。
【００５２】
剥離工程が完了したか否かは、使用者が顕微鏡装置１０等によって細胞Ｃ２を観察することで確認することができる。剥離工程が完了した後に、使用者は、シリンジポンプ２３の進退操作部２４を操作して筒部材２１の先端開口２１ａから剥離液３０を吸引し、剥離液３０と共に細胞Ｃ２を筒部材２１の内部へ吸引する。このとき、剥離液３０が作用した範囲の細胞Ｃ２のみが付着面４１から剥離しているので剥離液３０によって剥離された細胞Ｃ２のみが吸引されている（図４（Ｂ）参照）。
【００５３】
続いて、筒部材２１の内部に細胞Ｃ２が吸引された状態で進退操作部２４を停止させて筒部材２１の内部に細胞Ｃを保持する（回収工程）。さらに筒部材２１を培養容器４０の開口部４３から抜去する（図４（Ｃ）参照）。
続いて、筒部材２１の先端開口２１ａを例えば滅菌された採取容器５０まで誘導する。採取容器５０の内部に筒部材２１の先端開口２１ａを挿入し、シリンジポンプ２３の進退操作部２４を操作して細胞Ｃ２を採取容器５０の中へ吐出する（図４（Ｄ）参照）。
【００５４】
必要に応じて、採取容器５０の内部で筒部材２１の内部を共洗いして筒部材２１の内部に残留した細胞Ｃ２を採取容器５０に移す操作を行うことができる。また、必要に応じて、筒部材２１の内部を図示しない洗浄液（例えばＰＢＳ）で洗浄し、筒部材２１の内部に残留した細胞Ｃ２を除去してもよい。
【００５５】
採取すべき細胞Ｃ２をすべて採取したら、キャップ４２を培養容器４０の開口部４３に取り付け、培養容器４０を適宜の培養環境が設定された図示しない培養装置に戻して一連の作業を完了する。採取された細胞Ｃ２は、拡大培養や実験、あるいは検査等の所望の工程に引き渡される。
【００５６】
以上説明したように、本実施形態に係る細胞またはコロニーの採取装置及び細胞またはコロニーの採取方法によれば、培養液Ｍに比して比重及び粘度が高く設定された剥離液３０を用い、剥離液３０を培養液Ｍに沈下させて剥離液３０を特定の細胞Ｃ２に対して選択的に作用させるようになっている。
【００５７】
一般的に、細胞培養法において培養容器から培養細胞を剥離する際には、培養容器内にある培地を除去し、蛋白質等を含有しない緩衝液（例えばＰＢＳ）で培養細胞を数回洗浄する必要がある。これは、従来の剥離液は培養液の内部に吐出された際に剥離液が専ら培養液に含有された蛋白質を分解するに止まることを抑制するためである。
【００５８】
一方、本実施形態の剥離液は、培養液Ｍの中で沈下すると共に培養液Ｍの中で拡散せずに培養液Ｍを押しのけて留まるので、剥離液３０が吐出された位置の近傍に限局されて剥離液３０による剥離作用が及ぶようになっている。したがって、剥離液が細胞の剥離に効果的に作用するようになっているために、培養液の存在下においても細胞を付着面から剥離することができる。
【００５９】
このため、従来必須であった培養液を除去する工程と、培養細胞を緩衝液で洗浄する工程とを省くことができるので、試薬の削減による低コスト化と、工程の削減による汚染確率の低減とが可能になる。
【００６０】
さらに、培養細胞が培養液に浸漬された状態で培養細胞の採取が可能であるので、採取対象とならなかった細胞に対して、培養液に浸漬された状態から何ら培養条件を変更せずに培養を継続することが可能になる。これは、培養液を緩衝液に置換することによる培養環境の変化を防止しながら所望の培養細胞を適宜採取できるという効果を奏する。
【００６１】
（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態の細胞またはコロニーの採取装置について図５及び図６を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態において、上述した第１実施形態の細胞またはコロニーの採取装置と構成を共通とする箇所には同一符号を付けて、説明を省略することにする。
【００６２】
本実施形態の細胞またはコロニーの採取装置２００は、採取機構２０に代えて採取機構２２０を備える点で第１実施形態と構成が異なっている。
また、剥離液３０に代えて、上述のプロテアーゼ等の酵素を含有する剥離液３０ａが採用されている。
【００６３】
採取機構２２０は、チューブ２２に代えて、筒部材２１の基端開口２１ｂに一端が接続されたチューブ２２２ａと、チューブ２２２ａの他端に接続されて剥離液３０ａが貯留された剥離液容器２３１と、剥離液容器２３１からシリンジポンプ２３まで連通され、中間部に滅菌フィルターを有するチューブ２２２ｂとを備えている。
【００６４】
剥離液容器２３１には、剥離液３０ａが貯留されており、チューブ２２２ａの他端は剥離液３０ａに浸漬されている。また、チューブ２２２ｂの開口端部は剥離基容器２３１の内部の空気層に開口する位置関係に配置されている。
【００６５】
本実施形態のシリンジポンプ２３は、進退操作部２４を操作することによってチューブ２２２ｂを通じて剥離液容器２３１に気体を送出し、あるいは剥離液容器２３１から気体を吸引することができる。
【００６６】
また、本実施形態では、顕微鏡装置１０の視野の少なくとも一部を加熱する加熱機構２６０を有する。加熱機構２６０は、顕微鏡装置１０の光源１１から観察対象まで至る光路の一部に、光源１１によって生じる赤外線等の熱線を吸収するための熱線吸収フィルタ１６を挿脱可能な挿脱機構２１６を有する。なお、挿脱機構２１６は熱線吸収フィルタ１６が顕微鏡装置１０の光路に対して挿入状態と脱離状態とそれぞれの位置関係を生じさせることができればよいもので、駆動手段を備える構成であっても手動により挿脱する構成であっても本発明の効果を奏するものである。
すなわち、本実施形態の加熱機構２６０は、顕微鏡装置１０の視野のうち細胞等がある位置の近傍を加熱することができるものであって、このための熱源として顕微鏡装置１０に搭載された光源１１を用いることができるようになっているものである。
【００６７】
以下では、本実施形態の採取装置２００の使用時の動作を、採取機構２２０の動作を中心に図６（Ａ）から図６（Ｄ）を参照して説明する。図６（Ａ）から図６（Ｄ）は採取装置２００による細胞の採取の一過程をそれぞれ模式的に示すである。
【００６８】
まず、使用者はシリンジポンプ２３の進退操作部２４を操作して筒部材２１の内部における剥離液３０ａの位置関係を初期状態に設定する。初期状態では、筒部材２１の内部に剥離液３０ａが充填されており、筒部材２１の先端開口２１ａにおいて剥離液３０ａのメニスカスが生じている位置関係を目安として調整されることが好ましい。
【００６９】
続いて、図６（Ａ）に示すように、使用者は培養容器４０の内部における採取すべき所望の細胞Ｃ２を決定し、使用者は筒部材２１の先端開口２１ａを培養容器４０の内部へ挿入し、筒部材２１の先端開口２１ａを細胞Ｃ２の位置まで誘導する。
【００７０】
筒部材２１の先端開口２１ａは培養容器４０の中で培養液Ｍに浸漬された状態にある。この状態で、シリンジポンプ２３の進退操作部２４を動作させて、チューブ２２２ｂの内部を陽圧にする。するとチューブ２２２ｂを通じて剥離液容器２３１の空気層に対して空気が送り込まれる。これによって剥離液容器２３１の内部の圧力が上昇する。すると空気層が剥離液容器２３１の内部の剥離液３０ａを押し下げることによって剥離液３０ａは剥離液容器２３１からチューブ２２２ａへと押し出され、その結果、剥離液３０ａは、チューブ２２２ａ及び筒部材２１を通じて筒部材２１の先端開口２１ａから吐出される。
【００７１】
図６（Ｂ）に示すように筒部材２１の先端開口２１ａから吐出された剥離液３０ａは、培養液に対して比重及び粘度が高いので、第１実施形態と同様に培養液Ｍの内部で沈下して培養容器４０の付着面４１に留まる。このように剥離液３０ａは細胞Ｃ２によるコロニーの近傍に限局されて配置されている。
【００７２】
使用者は、顕微鏡装置１０の視野絞り（不図示）を操作して採取対象となる細胞Ｃ２を囲繞する位置関係まで視野を絞り、さらに挿脱機構２１６を操作して熱線吸収フィルター１６を光路から外す。すると、それまで赤外線等の熱線が吸収されていた状態から熱線が透過可能な状態に切り替わるので、熱線は上記の視野に到達し、採取対象となる細胞Ｃ２の周辺の温度が上昇する。一方で、視野絞りによって光が遮断された領域には、熱線が到達しないのでこの領域において温度上昇は起こらない。
【００７３】
一般的に、顕微鏡によって培養細胞の観察を行う際には、特別な保温手段がない場合には、培養容器の内部の培養液の温度は室温（生物学分野では、一般的に２５℃から２６℃程度の温度を指して室温と称することが多い。）まで徐々に低下してゆき平衡化する。本実施形態の剥離液に含まれる酵素は、細胞を剥離するための活性が最大となる温度が室温よりも高い。例えば、トリプシンの場合には、トリプシンを作用させる部位の温度が３６℃から３８℃程度の間にある場合に、効率よく細胞を剥離することができる。
【００７４】
加熱機構２６０によって加熱する際の上記領域の温度は、採取対象の細胞Ｃ２の培養至適温度と酵素が最大活性を示す温度とのいずれも超えない温度であることが好ましい。また、培養液Ｍ中に、特に高温にさらされることが好ましくない物質を含有する場合にはその物質によって上限温度が規定される。
【００７５】
なお、上記領域の温度を至適条件に維持する温度調整機構として、上記領域の温度を測定する測定部を備え、測定部によって測定された温度情報に基づいて加熱機構２６０の動作、すなわち挿脱機構２１６による熱線吸収フィルターの挿脱を制御する構成を採用することができる。この場合、測定部は、上記領域に対して非接触で温度を測定する構成であることが好ましい。
【００７６】
使用者は、図６（Ｃ）に示すように、剥離液３０ａによる細胞剥離が起こるのを待つ間に、筒部材２１の先端開口２１ａを培養液から取り出し、さらにシリンジポンプ２３の進退操作部２４を操作することによって筒部材２１の先端開口２１ａに空気Ａを吸引させる。空気Ａを吸引する量は適宜である。ただし、最大値でも筒部材２１の内部に充填される量であることが好ましく、剥離液容器２３１の内部までは吸引されないほうが好ましい。
【００７７】
剥離液３０ａが添加され、加熱機構２６０によって熱線が照射された細胞Ｃ２は、剥離液３０ａの作用によって付着面４１から剥離される。一方で、剥離液３０ａが添加されても加熱機構によって熱線が照射されなかった領域では、図示していないが熱線が照射された領域と比較して酵素活性が弱く作用しているため、細胞等の剥離が緩やかになっているかまったく剥離されていない。したがって、顕微鏡装置１０の視野絞りを絞ることで特定の細胞Ｃ２が選択的に剥離される。
【００７８】
図６（Ｄ）に示すように、使用者は、筒部材２１の先端開口２１ａを再び培養液Ｍに浸漬し、筒部材２１の先端開口２１ａを剥離された細胞Ｃ２まで誘導する。続いて、シリンジポンプ２３の進退操作部２４を操作して剥離液３０ａと細胞Ｃ２とを筒部材２１の先端開口２１ａから吸引する。このとき、筒部材２１の内部では、剥離液容器２３１から続く未吐出の剥離液３０ａと、培養容器４０から吸引された剥離液３０ａ・細胞Ｃ２の混合液との間に空気層Ａが介在されている。このため、筒部材２１の内部に吸引された細胞Ｃ２は未吐出の剥離液３０ａ側へと拡散しない。
【００７９】
続いて、使用者は筒部材２１の先端を、第１実施形態で示したような採取容器５０まで誘導し、筒部材２１から剥離液３０ａ・細胞Ｃ２の混合液を吐出させる。こうして一連の作業を完了する。採取すべき他の細胞等がある場合には、筒部材２１の先端開口２１ａの内部及び外部をＰＢＳ等の緩衝液で洗浄した後に上述の操作を繰り返す。
【００８０】
本実施形態の採取装置２００によれば、剥離液容器２３１からチューブ２２２ａを通じて筒部材２１へと剥離液３０ａを送液する構成であるので、第１実施形態の採取装置１００と比較して、細胞等の採取前に必要量の剥離液３０ａを筒部材２１の先端開口２１ａから吸引する工程を廃することができる。これは、複数の細胞またはコロニーを順次採取するような作業において作業量を減らして作業に係る手間と時間を減らすことができるという効果を奏する。また、細胞の剥離に係る一連の作業時間を減少させることは、細胞培養において温度や二酸化炭素濃度等の培養条件が異なる環境下に置かれる時間を減少させることにつながり、細胞培養条件を至適条件に維持しながら細胞を採取することができる。
【００８１】
また、加熱機構２６０によって採取対象の細胞等の近傍を加熱して剥離液３０ａの活性を高めて細胞を剥離することができるので、細胞を剥離するのにかかる時間を短縮できる。一般的に、顕微鏡に設けられた熱線吸収フィルターは、細胞の観察等において悪影響となる熱線を除去するためのフィルターであり、顕微鏡によって細胞を取り扱う際に熱線吸収フィルターを顕微鏡の光路から外すこと自体想定されていないものであった。
【００８２】
本実施形態の採取装置では、熱線吸収フィルター１６を挿脱する挿脱機構２１６を有し、かつ顕微鏡装置１０の視野絞りによって熱線の照射範囲を制限することができるので、剥離対象となる細胞等に対して選択的に酵素の作用を高めて剥離することができる。これは、粘度及び比重が高められて剥離対象の細胞等の近傍に留まる剥離液３０ａの作用範囲をさらに制限することによって細胞またはコロニーの選択採取の精度を高めることができるという効果を奏する。
さらに、加熱機構２６０が顕微鏡装置１０の光源１１を熱源として転用可能に構成されているので、装置構成を簡略化できるという効果もある。
【００８３】
（第３実施形態）
次に、本発明の第３実施形態の細胞またはコロニーの採取装置について図７及び図８を参照して説明する。
本実施形態の細胞またはコロニーの採取装置３００（以下採取装置３００と称する）は、第２実施形態の採取装置２００に対して、採取機構２２０に代えて採取機構３２０を備える点で構成が異なっている。より詳しくは、チューブ２２２ａの中間部に介在された電磁弁３０１と、電磁弁３０１に一端が連通されたチューブ３０２と、チューブ３０２の他端が開口された密閉容器状の採取容器３５０と、採取容器３５０の内部に連通されると共にシリンジポンプ２３に連通されるように接続されたチューブ３０３とを備える点で構成が異なっている。
【００８４】
図８は、採取装置３００の使用時の動作を模式的に示す図である。図８（Ａ）に示すように、採取装置３００では、電磁弁３０１によって剥離液容器２３１から筒部材２１に至る経路が選択された状態で剥離液３０を採取対象の細胞Ｃ２の近傍に吐出する。
【００８５】
続いて図８（Ｂ）に示すように、筒部材２１の先端開口２１ａを培養液Ｍから取り出して、さらに筒部材２１の内部にある剥離液３０を剥離液容器２３１まで引き戻す。
【００８６】
続いて、図８（Ｃ）に示すように、筒部材２１から採取容器３５０までを連通させるように電磁弁３０１を動作させ、筒部材２１の先端開口２１ａを細胞Ｃ２まで再び誘導した後にシリンジポンプ２３によって細胞Ｃ２を採取容器３５０の内部に吸引する。
本実施形態の採取装置３００でも、上述の各実施形態の採取装置と同様に所望の細胞またはコロニーを選択して採取することができる。
【００８７】
なお、本実施形態では、採取された細胞Ｃ２が採取容器３５０に貯留される構成を説明したが、これにかぎらず採取された細胞を他の検査・実験工程に移送することもできる。例えば培養容器４０から採取した細胞Ｃ２を所定個数ごとに培養容器に分取するセルソーターや、細胞Ｃ２の形状や表面抗原の差異によって分析するフローサイトメーター等に接続して使用することが可能である。
【００８８】
なお、本実施形態では電磁弁３０１によって剥離液３０等の流路を切り替える構成が採用されているが、これに限らず、手動で流路を切り替える三方活栓等を有する構成を採用することもできる。
【００８９】
（第４実施形態）
次に、本発明の第４実施形態の細胞またはコロニーの採取装置について図９を参照して説明する。
本実施形態の細胞またはコロニーの採取装置４００（以下採取装置４００と称する）は、細胞培養における培養条件のうち少なくとも温度と二酸化炭素濃度とを制御可能なインキュベーター４０１を備える点で上述の各実施形態と構成が異なっている。インキュベーター４０１はＨＥＰＡフィルターを有する空気清浄機構４０２を備えている。さらに、採取機構２０、２２０、３２０に代えて採取機構４２０を備える。
【００９０】
採取機構４２０は、電磁弁３０１から分岐されて接続されたチューブ３０２の先端には、培養容器４０の付着面４１から剥離された細胞を回収するための分取機構４５０が設けられている。
【００９１】
分取機構４５０は、軸回りに回転することでチューブ３０２の先端に対して相対移動可能で、周知のサンプルチューブや試験管等を配置可能なテーブル４５２と、テーブル４５２を回転させる回転駆動部（不図示）とを備える。また、サンプルチューブや試験管等の開口部を封止可能な栓体４５３及び栓体駆動部４５４が設けられている。テーブル４５２は、後述するコンピュータ４０３に制御されて断続的に軸回りに回転するようになっている。
【００９２】
また、本実施形態では、支持部２５に代えて、直交する３軸線上でそれぞれ進退動作可能な駆動部を有する可動支持部４２５と、ステージ１５に代えて、周知のＸＹステージとしての機能を有する可動ステージ４１５とを備えている。このため、可動支持部４２５に支持された筒部材２１の先端開口２１ａと可動ステージ４１５上に配置される培養容器とは相対移動可能になっている。
【００９３】
また、本実施形態では、シリンジポンプ２３は、外部からの駆動信号の入力によってその動作が制御される構成になっており、駆動信号に基づいて、筒部材２１の先端開口２１ａから流体を吸引吐出できるようになっている。
【００９４】
さらに、採取装置４００には、コンピュータ４０３が接続されている。コンピュータ４０３は、対物レンズ１２を通じて詳細は図示しない撮像部４１４によって取得された培養容器内の細胞の画像情報を受信し、同時に可動ステージ４１５と筒部材２１の先端開口２１ａとの相対位置情報を受信する。コンピュータ４０３は、この画像情報と相対位置情報とに基づいて採取対象となる細胞等の位置を記憶可能である。また、コンピュータ４０３は可動ステージ４１５及び可動支持部４２５に、培養容器内の細胞の位置に筒部材２１の先端開口２１ａを誘導する駆動信号を送信可能になっている。
【００９５】
また、コンピュータ４０３は、分取機構４５０における上述の回転駆動部に対して断続的に駆動信号を送信してテーブル４５２を回転動作可能になっている。
【００９６】
以上に説明する構成の、採取装置４００の作用について、図１０を参照しながら説明を行う。図１０は採取装置４００の動作を示すフローチャートである。
培養細胞が培養されている培養容器は、インキュベーター４０１の内部において可動ステージ４１５上にセットされている（配置工程Ｓ４０１）。このとき、培養容器４０のキャップ４２は緩められている。
続いて、使用者はコンピュータ４０３を操作し、培養容器４０の付着面に付着した細胞を走査するように観察する。このとき、採取すべき細胞が画面上に確認できたら、その位置を指示し、コンピュータ４０３に記憶させながら、採取すべき細胞等を順次選択してゆく。（選択工程Ｓ４０２）
採取すべき細胞等の選択が完了したら、これらの細胞等の採取を開始する。
【００９７】
まず、使用者は培養容器４０のキャップ４２を取り外し、開口部４３を開放する。（開放工程Ｓ４０３）。以下の工程は、コンピュータ４０３から送信される駆動信号に基づいた動作である。
【００９８】
まず、筒部材２１の内部に剥離液３０を充填させる。これは、電磁弁３０１によって剥離液容器２３１と筒部材２１とが連通された状態でシリンジポンプ２３が駆動されることによって行われる。このとき、筒部材２１の先端から洩出する剥離液３０を所定の位置で回収するようにしてもよい。
【００９９】
続いて、可動支持部４２５及び可動ステージ４１５を動作させることによって、前述のように使用者が指定した細胞またはコロニーのうち最初の細胞等のある位置に筒部材２１の先端２１ａが培養容器４０の内部に挿入されて誘導される（誘導工程Ｓ４０５）。
【０１００】
続いて、筒部材２１の先端開口２１ａから剥離液３０が培養液Ｍの内部に吐出される（吐出工程Ｓ４０６）。すると、上述の各実施形態と同様に剥離液３０は培養液Ｍの内部で沈下し、採取対象となる細胞Ｃ２の近傍に留まる。したがって採取対象となる細胞Ｃ２が培養容器４０の付着面から剥離される。本実施形態では、インキュベーター４０１によって培養容器４０の内部の温度が培養細胞の培養に適した温度に維持されている。このとき、剥離液３０に含まれる酵素の酵素活性が十分に高められているので剥離液３０が接触している細胞Ｃ２は付着面４１から速やかに剥離される。
【０１０１】
なお、筒部材２１の先端開口２１ａから剥離液３０が吐出されてから細胞Ｃ２が付着面４１から剥離されるまでの間に、筒部材２１の先端開口に空気Ａが吸引される。より詳しくは、吐出工程Ｓ４０６に続いて筒部材２１の先端開口２１ａが移動されて培養液Ｍから取り出される（筒部材移動工程Ｓ４０７）。さらに続いて、筒部材２１の先端から空気Ａが吸引されて電磁弁３０１を超えて剥離液容器２３１側まで空気Ａが吸引されたところで停止される（空気吸引工程Ｓ４０８）。
続いて電磁弁３０１の経路が分取機構４５０側の経路に切り替えられる（流路切替工程Ｓ４１０）。さらに筒部材２１の先端開口２１ａは前述の細胞等の位置へと再び誘導される。
【０１０２】
なお、細胞等の剥離にかかる時間は細胞の種類と付着面の種類とが主な要因となって変動する。したがって、細胞が十分に剥離されたかどうかは、使用者の目視によって判断され、細胞が十分に剥離された際に、使用者がコンピュータ４０３に対して細胞等の剥離が完了したことを示す入力を行う（確認工程Ｓ４０９）。
【０１０３】
すると、コンピュータ４０３は、シリンジポンプ２３を駆動させて筒部材２１の内部に剥離液３０・細胞Ｃ２混合液を吸引する（回収工程Ｓ４１１）。すると、細胞Ｃ２は、筒部材２１の先端開口２１ａからチューブ２２２ａ、電磁弁３０１、チューブ３０２を通じて分取機構４５０へと移送され、分取機構４５０に設けられたサンプルチューブあるいは試験管の一つに回収される。
【０１０４】
なお、必要に応じて、筒部材２１の先端開口２１ａから適宜の量の培養液Ｍが吸引されサンプルチューブあるいは試験管に剥離液３０と共に移送されるように、筒部材２１の先端開口２１ａが培養液Ｍに浸漬されたまま細胞Ｃ２の吸引を行うこともできる。この場合、サンプルチューブあるいは試験管の内部において剥離液３０と培養液Ｍとが攪拌され、剥離液３０中の酵素は培養液Ｍ中の蛋白質等を分解する。したがって、サンプルチューブあるいは試験管に回収された細胞Ｃ２の膜表面蛋白質の分解作用が低減された状態になっている。
【０１０５】
細胞等が分取機構４５０に回収されたら、分取機構４５０のテーブル４５２が回転し、チューブ３０２が挿入可能な位置に別のサンプルチューブが位置される。また、筒部材２１の先端開口２１ａの外面が図示しないＰＢＳ等の洗浄液で洗浄される（洗浄工程Ｓ４１２）。また電磁弁３０１の経路が再び筒部材２１と剥離液容器２３１とを連通する経路へと切り替えられ、筒部材２１に剥離液３０が充填されることによって初期状態に戻る（復帰工程Ｓ４１３）。さらに、筒部材２１の先端開口２１ａが、採取対象となる次の細胞またはコロニーの位置へと誘導され、次の細胞等が上述と同様に分取機構４５０に回収される。
【０１０６】
使用者が定めた所定の細胞等の採取が完了したら、筒部材２１が培養容器４０の外へ引き抜かれて一連の工程を完了する。
【０１０７】
本実施形態の採取装置４００によれば、使用者は画面を見ながら所望の細胞に対して採取するかどうかを決定し、続く採取作業はコンピュータ４０３によって指示されて動作するようになっている。したがって、使用者は、細胞等が剥離されたかどうかを画面上で確認して作業を継続させるだけでよいので使用者にかかる負担を低減する事ができる。また、剥離に係る作業に人手が介在しないので、使用者の熟練度によらず安定して細胞を採取することができる。
【０１０８】
また、インキュベーター４０１の内部において、培養容器４０ごと温度、二酸化炭素濃度の制御を行っているので、培養容器４０内の培養細胞に対して培養条件の大きな変動を生じさせることを抑制することができる。したがって、多数の細胞またはコロニーを順次採取する場合においても培養条件を至適条件に維持したまま細胞等を採取することができる。
【０１０９】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、本発明の第４実施形態の細胞またはコロニーの採取装置では、インキュベーターは、温度および二酸化炭素濃度を至適条件となるように制御する構成であるが、これに代えて窒素濃度あるいは酸素濃度を制御する構成が付加されたインキュベーターを採用することもできる。
【０１１０】
また、細胞等の採取が短時間で済むことが予想される場合には、二酸化炭素濃度を制御する構成を備えずに温度を制御する構成のみを備えたインキュベーターを採用してもよい。なお、温度のみを調整するインキュベーターには、顕微鏡の中座としてのサーモプレートの概念が含まれている。
【０１１１】
また、本発明の第４実施形態では、細胞が付着面からはがれたことを使用者が確認して処理を継続させる構成を採用した。本発明は、この構成に限られるものではなく、例えば採取対象の細胞等が剥離されたかどうかを確認するステップを設けずに、剥離液の吐出から所定時間だけ経過した後に細胞の吸引を開始する構成とすることもできる。この場合、使用者は採取すべき所定の細胞またはコロニーを選択するだけよいので作業性を大幅に向上させることができる。
【０１１２】
さらに、採取対象の細胞等を特定する手段として、コンピュータ４０３において受信さされた細胞等の画像情報に基づいて所定の特徴を有する細胞を認識してその細胞またはコロニーの位置を記憶する構成を採用することもできる。
例えば、採取対象の細胞において特異的に発現している物質に対応して生じる蛍光や着色を検知する構成や、採取対象の細胞の大きさや形状があらかじめ設定した範囲にあることを認識して採取対象として設定する構成等を採用することができる。
この場合、使用者が採取対象の細胞を選択する工程を削減できるので、定量的な判断基準で採取対象となる細胞等を選択することができると共に、使用者の作業量を低減することができる。
【０１１３】
また、採取対象となる細胞等が剥離されたか否かを判断する判断機構をさらに備えることもできる。例えば、コンピュータ４０３による画像解析によって、付着性細胞によるコロニーが付着面から剥離されている際にその外部形状が略球形となることを検知して細胞等が剥離されたことを判断することができる。この場合、当該コロニーのうち略球形となった細胞が所定割合以上に達したことが判断されたことに基づいて当該細胞の採取を行うことができる。
【０１１４】
次に、以下に示す各実施例に基づいて、細胞またはコロニーの採取についてより詳細に説明する。
【実施例１】
【０１１５】
図１１は、本発明の細胞またはコロニーの採取方法により付着性細胞を付着面から剥離して採取する一過程を撮影した顕微鏡写真である。
【０１１６】
本実施例では、細胞にはヒト子宮頸癌由来の培養細胞株であるＨｅＬａ（２５株）が用いられた。培養容器には、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製の組織培養プレートで直径３．５ｃｍのものが用いられた。培養液は、Ｇｉｂｃｏ社製のＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）に体積比で１０％のＧｉｂｃｏ社製ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｃｏｗ  Ｓｅｒｕｍ）を混合したものが用いられた。
【０１１７】
採取装置には、筒部材として、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ社製のガラス製細管である開口径２００μｍのガラスキャピラリーが用いられた。
【０１１８】
剥離液には、Ｇｉｂｃｏ社製の０．５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液に体積比１０％となるようにナカライテスク社製のグリセリンが添加されたものが用いられた。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液の粘度は無視できる程度であり、グリセリンの粘度は１５００ｃＰである。したがって、本実施例のように体積比１０％のグリセリンを含有する剥離液の粘度は１５０ｃＰである。また、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液の比重は約１であり、グリセリンの比重は１．２６１であるので、本実施例の剥離液の比重は約１．０２６である。
【０１１９】
図１１（Ａ）は、培養容器の付着面にＨｅＬａ細胞が付着した様子が撮影された顕微鏡写真である。図１１（Ａ）に示すように、ＨｅＬａ細胞は、培養容器内でコンフルエントな状態で付着面に付着している。
【０１２０】
図１１（Ｂ）は、本発明の細胞またはコロニーの採取方法によってコンフルエントなＨｅＬａ細胞の一部の区画のみを剥離して細胞を採取した後の様子が撮影された顕微鏡写真である。図１１（Ｂ）に示すように、コンフルエントな細胞の層の一部に細胞が剥離された領域が認められる。
【０１２１】
図１１（Ｃ）は、本発明の細胞またはコロニーの採取方法によって採取された細胞を他の容器に吐出したものが撮影された顕微鏡写真である。図１１（Ｃ）に示すように、容器内に細胞塊が認められる。
【実施例２】
【０１２２】
本実施例では、ＨｅＬａ細胞からなるコロニーを採取する具体的な例を図１２を参照して説明する。
本実施例では、図１２（Ａ）に矢印で示すように、例えば培養容器内に薄まきにされたり、薬剤選択によって選択培養されることによってコロニーが形成されている。
図１２（Ｂ）に示すように、コロニーの近傍にキャピラリーの先端が誘導され、トリプシン及びグリセリンを含有する剥離液がコロニーに向けて吐出された。
図１２（Ｃ）に示すように、コロニーは培養容器の付着面から剥離されて、キャピラリーの内部に吸引されている。
図１２（Ｄ）に示すように、別の採取容器においてコロニーが吐出され、コロニーの採取が完了した。
【実施例３】
【０１２３】
本実施例では、培養容器内で任意のコロニーを選択して採取する具体的な例を図１３を参照して説明する。
図１３（Ａ）は、培養容器の付着面に付着して培養されたＨｅＬａ細胞を示す顕微鏡写真である。図１３（Ａ）に示すように、採取すべきコロニーが視野の中心に配置されている。図１３（Ｂ）は図１３（Ａ）に示すＨｅＬａ細胞に対して本発明の細胞またはコロニーの採取方法によって細胞の採取を行った後の顕微鏡写真である。図１３（Ｂ）に示すように、剥離液の作用によって採取すべきコロニーが選択的に剥離され、培養容器から回収された。このとき、採取すべきコロニーの周囲の他のコロニーは剥離が抑制されていた。
【実施例４】
【０１２４】
本実施例では、実施例２で用いた構成に加えて、加熱機構を備えた例を図１４を参照して示す。
図１４（Ａ）は培養容器の付着面に付着して培養されているＨｅＬａ細胞を撮影した顕微鏡写真である。図１４（Ａ）に示すように、採取すべきコロニーが視野の中心に配置されている。
図１４（Ｂ）に示すように、視野絞りが絞られることによって視野のうち中心部分に光及び熱線が照射されている。
図１４（Ｃ）に示すように、剥離液の作用によって採取すべきコロニーが選択的に剥離され、培養容器から回収された。このとき、採取すべきコロニーの周囲の他のコロニーの剥離は不完全になっており剥離が抑制されていた。
【実施例５】
【０１２５】
本実施例では、剥離液が着色された具体例を図１５を参照して示す。
本実施例では、剥離液に対して１％の濃度になるように、ブロモフェノールブルーを含有させたものが用いられた。
図１５（Ａ）は、剥離液の吐出前を示す顕微鏡写真であり、図１５（Ｂ）は剥離液が吐出された状態を示す顕微鏡写真である。
図１５（Ｂ）に示すように、培養液中に吐出された剥離液は、上面視略円形でキャピラリーの先端近傍に限局していた。さらに、ブロモフェノールブルーによって着色された剥離液と培養液との界面が明瞭であり、剥離液が培養液中に拡散することなく留まっていることが分かった。
【符号の説明】
【０１２６】
１００、２００、３００、４００  細胞またはコロニーの採取装置
１０  顕微鏡装置
１１  光源（熱源）
２１  筒部材
２３  シリンジポンプ（吐出機構、吸引機構）
３０、３０ａ  剥離液
２６０  加熱機構
２１６  挿脱機構
４０１  インキュベーター
４０３  コンピュータ（位置検出機構）
４１５  可動ステージ（誘導機構）
４２５  可動支持部（誘導機構）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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