(57)【要約】【課題】本発明は、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸誘導体のハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒による変換によって、４−置換−３−ヒドロキシ酪酸誘導体を調製するための方法および組成物を提供すること。【解決手段】本発明は、さらに、４−ハロ−３−ケト酪酸誘導体のケトレダクターゼ触媒による変換によって、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸誘導体を調製するための方法および組成物を提供する。本発明は、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを供給する工程、および４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよびシアニドと接触させる工程を包含する。【選択図】図１
2010172348.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書または図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項の元で、２００２年８月９日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４０２，４３６（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）の利益を主張する。      
【０００２】
（著作権の通知）
本特許文献の開示の一部分は、著作権の対象である題材を含む。著作権者は、特許商標張の特許ファイルまたは記録に明らかであるように、特許文書または特許開示のいずれによっても、ファクシミリでの複写に対する拒絶を有さず、どのようなものでも全ての著作権を保有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、４−置換３−ヒドロキシ酪酸誘導体を調製するための、新規な酵素的方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
４−置換３−ヒドロキシ酪酸誘導体は、薬学的物質の合成において、市場で重要な中間体である。非ラセミ体のキラルな４−置換３−ヒドロキシ酪酸エステルは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター（例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、およびイタバスタチン）の合成において利用され得る。例えば、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルは、コレステロール低下剤であるアトルバスタチンの生成のための重要な中間体である。特定の４−置換３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成するための方法が、記載されている。Ｉｓｂｅｌｌら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，７２：３０１（１９７９）は、スレオニンのカルシウム塩の一水和物と臭化水素とを反応させて、スレオニンのジブロモ誘導体を生成し、次いで、この誘導体をビシナルブロモヒドリンに転換することによる、（Ｒ）４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの合成のための方法を報告する。このブロモヒドリンのヒドロキシル基は、シアン化ナトリウムとの反応の前に、保護される。同書。
【０００５】
Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，Ｂ３７，３４１（１９８３）は、４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートを、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチレートから生成するための方法を報告し、この方法は、シアン化ナトリウムとの反応の前に、ヒドロキシ基を保護基で保護することを必要とする。４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートエステルの最近の合成経路は、４−ブロモ−または４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートエステルの、ヒドロキシル基の保護なしでの、シアン化物塩を用いる、触媒作用されない化学反応を包含する。しかし、副生成物が、塩基性のシアン化物陰イオンによって生じる塩基性条件下で形成され、この副生成物は、生成物から除去することが、特に問題である。４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートエステルは、高沸点の液体であり、そして４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートエステルをこれらの副生成物から分離するために、減圧分画蒸留が必要とされる。この蒸留条件は、さらなる副生成物を生成しやすく、そしてこの蒸留は、首尾よく操作することが困難である。
【０００６】
４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの合成における出発物質として使用することは、４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの使用よりも、経済的により魅力的であるが、ブロモ置換基と比較したクロロ置換基のより低い反応性に起因して、そのシアン化物塩との反応において、より強制的な条件を必要とする。４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートエステルのシアン化は、シアン化アルカリおよび高温を用いて進行するが、これらの強制的な条件は、かなりの副生成物形成を導き、過度の単離および精製の手順を必要とし、このことにより、さらなる収率の損失が生じる。米国特許第５，９０８，９５３号は、未反応の出発物質に加えて、粗製の（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸の低級アルキルエステルが、ヒドロキシアクリレート、シアノアクリレート、３−シアノブチロラクトン、３−ヒドロキシブチロラクトン、γ−クロトノラクトン、３−シアノ−４−ヒドロキシブチレート低級アルキルエステル、３，４−ジシアノブチレート低級アルキルエステル、および高沸点の特徴付けられていない化合物を含有し得ることを開示する。米国特許第５，９０８，９５３号は、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸の低級エステルの精製方法をさらに記載し、この方法は、１０トルにおいて５０℃〜１６０℃の沸点を有する溶媒の存在下での、粗製混合物の蒸留を包含する。このような蒸留方法を使用して、未反応の出発物質の分解は最小にされると記載されており、この物質は、そうでなければ、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸低級アルキルエステルの生成の全体の劇的な損失を生じ得る。米国特許第６，１４０，５２７号は、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ楽酸の粗製低級アルキルエステルを処理するための代替のアプローチを記載し、このアプローチは、脱水副生成物（例えば、４−ヒドロキシクロトン酸エステル）の、化学反応による除去を包含し、この化学反応は、これらの化合物を水溶性かつ抽出可能にする。従って、これらの方法は、容易に入手可能な出発物質を利用するが、有意な収率損失および生成物の精製の要件が、これらの方法を、市場で望ましくなくしている。従って、非ラセミ体のキラルな４−置換３−ヒドロキシ酪酸エステルを、よりマイルドな条件下で生成するための、より効率的な方法が、非常に望ましい。
【０００７】
ハロヒドリンデハロゲナーゼ（ハロアルコールデハロゲナーゼまたはハロヒドリンハロゲン化水素リアーゼともまた称される）は、ハロゲン化水素の、プロトンおよびハロゲン化物イオンとしての、ビシナルハロヒドリンからの脱離を触媒して、対応するエポキシドを生成する。これらの酵素はまた、逆の反応を触媒する。Ｎａｇａｓａｗａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第３６巻（１９９２）、４７８〜４８２頁は、特定のハロヒドリンハロゲン化水素リアーゼの、他のビシナルハロヒドリンのうちでもとりわけ、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルに対する活性を開示する。Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍ．第１８０巻（１９９１）１２４〜１３０頁およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ第５０巻（１９９４）１１８２１〜１１８２６頁は、ハロヒドリンハロゲン化水素リアーゼが、特定のエポキシドのシアン化物との反応を触媒して、対応するβ−ヒドロキシニトリルを形成する活性を開示する。これらの参考文献および米国特許第５，２１０，０３１号において、Ｎａｋａｍｕｒａらは、エピハロヒドリンとシアン化アルカリとの、特定のハロヒドリンハロゲン化水素リアーゼの存在下での反応（これは、対応する４−ハロ−３−ヒドロキシ−ブチロにトリルを生成する）を開示する。米国特許５，１６６，０６１号において、Ｎａｋａｍｕｒａらは、１，３−ジハロ−２−プロパノールの、シアン化アルカリとの、特定の脱ハロゲン化酵素の存在下での反応（これは、対応する４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成する）を開示する。Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ第５０巻（１９９４）１１８２１〜１１８２６頁において、Ｎａｋａｍｕｒａらは、１，３−ジクロロ−２−プロパノールの、シアン化物との、精製されたハロヒドリンハロゲン化水素リアーゼとの反応（これは、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成する）を開示する。
【０００８】
Ｌｕｔｊｅ−Ｓｐｅｌｂｅｒｇら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．第２巻（２００１）４１〜４３頁は、ハロヒドリン脱ハロゲン化酵素が、特定のスチレンオキシドの、アジドとの反応を触媒して、対応する１−フェニル−２−アジド−エタノールを形成する活性を開示する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドから生成するための方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを提供する工程であって、ここで、このハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素から選択される、工程；ならびに
（ｂ）４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよびシアン化物と、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドに転換するための反応混合物を形成するために充分な条件下で接触させる工程、
を包含する。
【００１０】
本発明のさらなる局面において、工程（ａ）における４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドは、以下：
４−ハロ−３−ケト酪酸のエステルまたはアミドを提供する工程であって、ここで、このハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択される、工程；ならびに
４−ハロ−３−ケト酪酸のエステルまたはアミドを、ケトレダクターゼ、補因子、および補因子再生系と、４−ハロ−３−ケト酪酸のエステルまたはアミドを４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドに転換するための反応混合物を形成するために充分な条件下で、接触させる工程、
を包含する方法によって、提供される。
【００１１】
別の局面において、本発明は、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルから生成するための方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）４−ハロ−３−ケト酪酸エステルを提供する工程であって、ここで、このハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択される、工程；ならびに
（ｂ）−ハロ−３−ケト酪酸エステルを、ケトレダクターゼ、補因子、補因子再生系、シアン化物、およびハロヒドリンデヒドロゲナーゼと接触させて、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに転換させるための反応混合物を形成する工程、
を包含する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドから生成するための方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを提供する工程であって、ここで、このハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択される、工程；ならびに
（ｂ）４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよび求核試薬と、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを、４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸またはアミドに転換するための反応混合物を形成するために適切な条件下で接触させる工程、
を包含する。
【００１３】
さらなる実施形態において、本発明は、４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを生成するための方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）４−ハロ−３−ケト酪酸のエステルまたはアミドを提供する工程であって、ここ
、このハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択される、工程；ならびに
（ｂ）４−ハロ−３−ケト酪酸のエステルまたはアミドを、ケトレダクターゼ、補因子、補因子再生系、求核試薬、およびハロヒドリンデハロゲナーゼと接触させて、４−ハロ−３−ケト酪酸のエステルまたはアミドを、４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドに転換するための反応混合物を形成する工程、
を包含する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、以下：
（ａ）ハロヒドリンデハロゲナーゼ；
（ｂ）求核試薬；および
（ｃ）４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミド、
を含有する組成物に関する。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１）
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルから４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを、生成するための方法であって、該方法は、以下、
（ａ）４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを供給する工程であって、
ここで、ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程；ならびに
（ｂ）該４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物を形成するために十分な条件下で、該４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよびシアニドと接触させる工程を包含する、方法。
（項目２）
前記４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルが、非ラセミ体キラル４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記シアニドが、シアン化水素によって供給される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記シアニドが、シアニド塩によって供給される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの前記ハロ置換基が、塩素および臭素から選択される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルが、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルが、低級アルキルエステルである、項目１に記載の方法。
（項目８）
項目１に記載の方法であって、ここで、
（１）前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルが、構造：
【化１】
2010172348.tif 000003
を有し、そして、
（２）前記４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルが、構造：
【化２】
2010172348.tif 000004
を有し、ここで、
Ｘは、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択されるハロゲンであって、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、フッ素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたアリールアルキル、アミノ、必要に応じて置換された低級アルキルアミノ、必要に応じて置換されたシクロアルキルアミノ、必要に応じて置換された低級アルコキシ、必要に応じて置換されたシクロアルコキシ、必要に応じて置換されたアリールオキシ、および必要に応じて置換されたアリールアルコキシからなる群から選択され；そして、
Ｒ５は、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群から選択される、
方法。
（項目９）
前記ハロヒドリンデハロゲナーゼが、天然に存在するハロヒドリンデハロゲナーゼである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ハロヒドリンデハロゲナーゼが、天然には存在しないハロヒドリンデハロゲナーゼである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、約５〜約９の範囲のｐＨで維持される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、約５〜約８の範囲のｐＨで維持される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、約８以下のｐＨで維持される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、さらに、ｐＨ緩衝液を含有する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
項目１に記載の方法であって、さらに、
（ｃ）前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物を、約５以上のｐＨで維持するために十分な塩基を添加する工程、
を包含する、方法。
（項目１６）
前記塩基が、水酸化物塩、炭酸塩、および重炭酸塩から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記塩基が、シアニド塩から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
項目１に記載の方法であって、さらに、前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物から、該４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを回収する工程を包含する、方法。
（項目１９）
項目１６に記載の方法であって、さらに、前記４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを精製する工程を包含する、方法。
（項目２０）
項目１に記載の方法であって、工程（ａ）が、
４−ハロ−３−ケト酪酸エステルを供給する工程であって、
ここで、前記ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程；そして、
該４−ハロ−３−ケト酪酸エステルを４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物を形成するために十分な条件下で、該４−ハロ−３−ケト酪酸エステルを、ケトレダクターゼ、補因子、および補因子再生系と接触させる工程、
を包含する、方法。
（項目２１）
前記補因子がＮＡＤ／ＮＡＤＨである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記補因子がＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨである、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記ケトレダクターゼが天然に存在するケトレダクターゼである、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記ケトレダクターゼが天然には存在しないケトレダクターゼである、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記補因子再生系がグルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含有する、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記グルコースヒドロゲナーゼが天然に存在するグルコースデヒドロゲナーゼである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記グルコースデヒドロゲナーゼが天然には存在しないグルコースデヒドロゲナーゼである、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記補因子再生系がギ酸塩およびギ酸デヒドロゲナーゼを含有する、項目２０に記載の方法。
（項目２９）
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが天然に存在するギ酸デヒドロゲナーゼである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが天然には存在しないギ酸デヒドロゲナーゼである、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
項目２０に記載の方法であって、ここで、
前記４−ハロ−３−ケト酪酸エステルが、構造：
【化３】
2010172348.tif 000005
を有し、そして、
前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルが、構造：
【化４】
2010172348.tif 000006
を有し、そして、
前記４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルが、構造：
【化５】
2010172348.tif 000007
を有し、ここで、
Ｘは、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択されるハロゲンであって；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素、フッ素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたアリールアルキル、アミノ、必要に応じて置換された低級アルキルアミノ、必要に応じて置換されたシクロアルキルアミノ、必要に応じて置換された低級アルコキシ、必要に応じて置換されたシクロアルコキシ、必要に応じて置換されたアリールオキシ、および必要に応じて置換されたアリールアルコキシからなる群から選択され、そして、
Ｒ５は、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群から選択される、
方法。
（項目３２）
前記４−ハロ−３−ケト酪酸エステルを４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、約５〜約１０の範囲のｐＨで維持される、項目２０に記載の方法。
（項目３３）
前記４−ハロ−３−ケト酪酸エステルを４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、さらに、緩衝液を含有する、項目２０に記載の方法。
（項目３４）
項目２５に記載の方法であって、さらに、
前記４−ハロ−３−ケト酪酸エステルを４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物を、約５以上のｐＨで維持するために十分な塩基を添加する工程、を包含する、方法。
（項目３５）
４−ハロ−３−ケト酪酸エステルから４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成するための方法であって、該方法は、以下、
（ａ）４−ハロ−３ケト酪酸エステルを供給する工程であって、
ここで、ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程；ならびに
（ｂ）該４−ハロ−３−ケト酪酸エステルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物を形成するために、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルを、ケトレダクターゼ、補因子、補因子再生系、シアニド、およびハロヒドリンデハロゲナーゼ
と接触させる工程、
を包含する、方法。
（項目３６）
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドから４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸アミドを生成するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドを供給する工程であって、
ここで、ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程；および
（ｂ）該４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは該４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドを４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸または４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸アミドに変換するための反応混合物を形成するために、適した条件下で、該４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは該４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドを、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよび求核試薬と接触させる工程、
を包含する、方法。
（項目３７）
項目３６に記載の方法であって、ここで、
前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは前記４−ハロ−３−ヒドロキシ
酪酸アミドが、構造：
【化６】
2010172348.tif 000008
を有する４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルであって、そして、
（２）前記４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは前記４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸アミドが、構造：
【化７】
2010172348.tif 000009
を有する４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルであって、ここで、
Ｘは、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択されるハロゲンであって；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、フッ素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたアリールアルキル、アミノ、必要に応じて置換された低級アルキルアミノ、必要に応じて置換されたシクロアルキルアミノ、必要に応じて置換された低級アルコキシ、必要に応じて置換されたシクロアルコキシ、および必要に応じて置換されたアリールオキシ、必要に応じて置換されたアリールアルコキシからなる群から選択され；そして、
Ｒ５は、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群から選択され；そして
Ｎｕは、−ＣＮ、−Ｎ３および−ＯＮＯからなる群から選択される、
方法。
（項目３８）
項目３６に記載の方法であって、ここで、
（１）前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドが、構造：
【化８】
2010172348.tif 000010
を有する４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドであって、そして、
（２）前記４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドが、構造：
【化９】
2010172348.tif 000011
を有する４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルであって、ここで、
Ｘは、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択されるハロゲンであって；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立に、水素、フッ素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたアリールアルキル、アミノ、必要に応じて置換された低級アルキルアミノ、必要に応じて置換されたシクロアルキルアミノ、必要に応じて置換された低級アルコキシ、必要に応じて置換されたシクロアルコキシ、必要に応じて置換されたアリールオキシ、および必要に応じて置換されたアリールアルコキシからなる群から選択され；そして、
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、水素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群から選択され；そして
Ｎｕは、−ＣＮ、−Ｎ３および−ＯＮＯからなる群から選択される、
方法。
（項目３９）
項目３６に記載の方法であって、工程（ａ）が、
４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ケト酪酸アミドを供給する工程であって、
ここで、前記ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程；そして、
該４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドを前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは前記４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドに変換するための反応混合物を形成するために適した条件下で、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドを、ケトレダクターゼ、補因子、および補因子再生系と接触させる工程、
を包含する、方法。
（項目４０）
４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドを生成するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ケト酪酸アミドを供給する工程であって、
ここで、ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程；および
（ｂ）該４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたは該４−ハロ−３−ケト酪酸アミドを４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸アミドに変換するための反応混合物を形成するために、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ケト酪酸アミドを、ケトレダクターゼ、補因子、補因子再生系、求核試薬およびハロヒドリンデハロゲナーゼと接触させる工程、
を包含する、方法。
（項目４１）
組成物であって、以下：
（ａ）ハロヒドリンデハロゲナーゼ；
（ｂ）求核試薬；および
（ｃ）４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミド
を含有する、組成物。
（項目４２）
求核試薬がシアニドである、項目４１に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例２１に記載されるような、種々のｐＨの水溶液中での、ハロヒドリンデヒドロゲナーゼ（ＨＨＤＨ）の存在下または非存在下での、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルのシアン化物との試験反応において分析された、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（クロロヒドリン）および４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（シアノヒドリン）の量を示す。
【図２】図２は、ｐ１５Ａ複製起点（ｐ１５ｏｒｉ）、ｌａｃＩレプレッサ、Ｔ５プロモーター、Ｔ７リボソーム結合部位（Ｔ７ｇ１０）、およびクロラムフェニコール体制遺伝子（ｃａｍＲ）を含む、本発明の３９４４ｂｐの発現ベクター（ｐＣＫ１１０７００）を示す。
【図３】図３は、ｐ１５Ａ複製起点（ｐ１５ｏｒｉ）、ｌａｃＩレプレッサ、ＣＡＰ結合部位、ｌａｃプロモーター（ｌａｃ）、Ｔ７リボソーム結合部位（Ｔ７ｇ１０ＲＢＳ）、およびクロラムフェニコール体制遺伝子（ｃａｍＲ）を含む、本発明の４０３６ｂｐの発現ベクター（ｐＣＫ１１０９００）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、対応する４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル基質および４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミド基質に由来する種々の４−置換された３−ヒドロキシ酪酸エステルおよび４−置換された３−ヒドロキシ酪酸アミドを生成するための酵素的方法を提供する。
【００１７】
（１．４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸誘導体のハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒変換）
本発明は、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドに由来する４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸アミドを生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）４−ハロ−３ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３ヒドロキシ酪酸アミドを提供する工程であって、
ここで、そのハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程；ならびに
（ｂ）その４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドを、４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸アミドに変換するための反応混合物を形成するために適切な条件下で、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドを、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよび求核剤と接触させる工程。重要なことには、本発明の方法は、４−置換３−ヒドロキシ酪酸エステルおよび４−置換３−ヒドロキシ酪酸アミドの製造のためのプロセスを提供し、この方法において、副生成物形成は、最小にされる。
【００１８】
本発明の実施において使用するために適した求核剤は、その４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル基質または４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミド基質のハロ置換基を置換し得る求核剤である。本発明において利用される代表的な求核剤は、アニオン性求核剤である。例示的な求核剤としては、シアニド（ＣＮ−）、アジド（Ｎ３−）、および亜硝酸（ＯＮＯ−）が挙げられる。
【００１９】
特定の実施形態において、本発明は、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドから、ハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒反応を介して、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸アミドを生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドを提供する工程であって、
ここで該ハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択される、工程；
ならびに
（ｂ）その４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドを、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸アミドに変換するための反応混合物を形成するために適した条件下で、その４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドと、ハロヒドリンおよびデハロゲナーゼおよびシアニドとを接触させる工程。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「シアニド」とは、シアニドアニオン（ＣＮ−）、シアン化水素（ＨＣＮ）およびこれらの混合物をいう。シアニドは、シアニド塩、代表的には、アルカリ塩（例えば、ＮａＣＮ、ＫＣＮなど）の形態において、シアン化水素（気体または溶液中）、あるいはこれらの混合物の形態において提供され得る。
【００２１】
本発明の実施において使用される４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルおよび４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸は、本明細書中に記載される方法に従って調製され得るか、または代わりに当業者に周知の方法に従って調製され得る。このような方法は、例えば、米国特許第５，８９１，６８５号；Ｈａｌｌｉｎａｎら，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ
Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１２：１７９−１９１（１９９５）；Ｒｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，４１：７４０（１９７２）；Ｋａｔａｏｋａら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８：６９９−７０３（１９９７）；および米国特許第５，４３０，１７１号に記載される。
【００２２】
本発明の実施において使用される適切な４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル基質および４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミド基質は、それぞれ、構造ＩＡおよびＩＢを有する基質を包含する：
【００２３】
【化１０】
2010172348.tif 000012
ここでＸは、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択されるハロゲンであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して、水素、フッ素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたアリールアルキル、アミノ、必要に応じて置換された低級アルキルアミノ、必要に応じて置換されたシクロアルキルアミノ、必要に応じて置換された低級アルコキシ、必要に応じて置換されたシクロアルコキシ、必要に応じて置換されたアリールオキシ、および必要に応じて置換されたアリールアルコキシからなる群より選択され；そして
Ｒ５は、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群より選択され；そして
Ｒ７およびＲ８は、各々独立して、水素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群より選択される。
【００２４】
「必要に応じて置換された」とは、水素を一価のラジカルで置換することをいう。適切な置換基としては、例えば、ヒドロキシル、アルキル、低級アルキル、アルコキシ、低級アルコキシ、アルケニル、低級アルケニル、ニトロ、アミノ、シアノ、ハロゲン（すなわち、ハロ）、チオなどが挙げられる。
【００２５】
用語「低級アルキル」とは、置換されていないか、または例えば、１つ以上のハロ、ヒドロキシルまたは他の基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、トリフルオロメチルなどが挙げられる）で置換された、１個〜約６個の炭素原子を有する分枝状または直鎖状のアルキル基をいうために本明細書中で使用される。用語「シクロアルキル」とは、３個〜約６個の炭素原子を有する炭素環式アルキル部分、および３個〜約６個の原子を有する複素環式アルキル部分をいい、ここで少なくとも１つの環原子は、ヘテロ原子であり、他の原子は、炭素原子である。「ヘテロ原子」とは、本明細書中で、酸素、窒素または硫黄をいう。
【００２６】
用語「低級アルケニル」とは、１個以上の二重結合および２個〜約６個の炭素原子を有する分枝状または直鎖状の基をいうために本明細書中で使用される。本発明の実施において使用される低級アルケニル基は、本明細書中に記載される基（例えば、ハロ、ヒドロキシル、低級アルキルなどを含む）で必要に応じて置換されていてもよい。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「低級アルコキシ」とは、Ｒが低級アルキルまたは低級アルケニルである−ＯＲをいう。本発明の実施において使用される適切な低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、トリフルオロメトキシなどが挙げられる、用語「アリールオキシ」とは、本明細書中で、ＲがアリールであるＲＯ−をいう。本明細書中で使用される場合、用語「アリール」とは、３〜約１４個の骨格炭素またはヘテロ原子を有する単環式芳香族基および多環式芳香族基をいい、炭素環式アリール基および複素環式アリール基の両方を含む。炭素環式アリール基は、芳香族環における全ての還元しが炭素であるアリール基である。複素環式アリール基は、芳香族環における環原子として１個〜約４個のヘテロ原子を有し、環原子の残りが炭素原子であるアリール基である。本発明において置換基として使用される例示的なアリール基としては、例えば、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ナフチルなどが挙げられる。
【００２８】
用語「アリールアルキル」とは、本明細書中で、アリール基で置換されたアルキル基をいう。例示的なアリールアルキル基としては、ベンジル、ピコリルなどが挙げられる。置換されたアリールアルキル基は、アリールアルキル基のアリール部分およびアルキル部分のいずれかまたは両方が置換され得る。本明細書中で使用される場合、用語「アリールアルコキシ」とは、ＲがアリールアルキルであるＲＯ−をいう。
【００２９】
用語「シクロアルコキシ」とは、本明細書中で、Ｒが必要に応じて置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルであるＲＯ−をいう。用語「アミノ」とは、基−ＮＨ２をいうために本明細書中で使用される。用語「低級アルキルアミノ」とは、本明細書中で、Ｒが水素または低級アルキルであり、Ｒ’が低級アルキルである基−ＮＲＲ’をいう。用語「シクロアルキルアミノ」とは、本明細書中で、Ｒが必要に応じて置換された、３個〜約８個の炭素原子を有する二価脂肪族ラジカルであり、よって、ＮおよびＲが、環式構造（例えば、ピロリジノ、ピペリジノなど）を形成する、基−ＮＲをいう。
【００３０】
本発明の実施において使用され得る化合物ＩＡの特定の４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルとしては、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルエステル（すなわち、Ｘが塩素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ６が水素であり、Ｒ５がエチルである）、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸メチルエステル（すなわち、Ｘが塩素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ６が水素であり、Ｒ５がメチルである）、４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸エチルエステル（すなわち、Ｘが臭素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ６が水素であり、Ｒ５がエチルである）、４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸メチルエステル（すなわち、Ｘが臭素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ６が水素であり、Ｒ５がメチルである）、ｔ−ブチル−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル（すなわち、Ｘが塩素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ６が水素であり、Ｒ５がｔ−ブチルである）、ｔ−ブチル−４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸エステル（すなわち、Ｘが臭素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ６が水素であり、Ｒ５がｔ−ブチルである）、およびｔ−ブチル−４−ヨード−３−ヒドロキシ酪酸エステル（すなわち、Ｘがヨウ素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ６が水素であり、Ｒ５がｔ−ブチルである）が挙げられる。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ６のうちの少なくとも１つは、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、またはプロピルである）である。
【００３１】
本発明の実施において使用され得る化合物ＩＢの適切な４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドとしては、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸アミド（すなわち、Ｘが塩素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が水素である）、４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸アミド（すなわち、Ｘが臭素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が水素である）、４−ヨード−３−ヒドロキシ酪酸アミド（すなわち、Ｘがヨウ素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が水素である）が挙げられる。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ６のうちの少なくとも１つは、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、またはプロピルである）である。
【００３２】
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル基質および４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミド基質の４−ハロ置換基は、好ましくは、エンドおよび臭素から選択される。特に好ましいのは、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル基質および４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸アミド基質である。
【００３３】
本発明の方法において生成される４−置換−ヒドロキシ酪酸エステルおよび４−置換−ヒドロキシ酪酸アミドは、それぞれ、以下の構造ＩＩＡおよびＩＩＢを有する基質を包含する：
【００３４】
【化１１】
2010172348.tif 000013
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、構造ＩＡおよびＩＢにおいて規定されるとおりであり；そして
Ｎｕは、−ＣＮ、−Ｎ３、および−ＯＮＯからなる群から選択される。
【００３５】
化合物ＩＡの構造を有する４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル基質を、シアニドおよびハロヒドリンデハロゲナーゼと反応させる場合、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステル生成物が生成され、以下の化合物ＩＩＩの構造を有する：
【００３６】
【化１２】
2010172348.tif 000014
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、構造ＩＡにおいて規定されるとおりである。
【００３７】
ハロヒドリンデハロゲナーゼは、求核剤の存在下で、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドを、対応する４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸アミドに変換することを触媒するために本発明の実施において使用される。用語「ハロヒドリンデハロゲナーゼ」および「ＨＨＤＨ」は、本発明のプロセスにおいて、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルおよび／または４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドを、シアニドのような求核剤の存在下で、それぞれ、４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルおよび／または４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸アミドへ変換することを触媒する酵素をいうために、本明細書中で交換可能に使用される。適切なハロヒドリンデハロゲナーゼとしては、天然に存在する（野生型）ハロヒドリンデハロゲナーゼ、ならびにヒトの操作によって生成される天然に存在しないハロヒドリンデハロゲナーゼが挙げられる。例示的な天然に存在するハロヒドリンデハロゲナーゼおよび天然に存在しないハロヒドリンデハロゲナーゼならびに天然に存在するハロヒドリンデハロゲナーゼコードポリヌクレオチドおよび天然に存在しないハロヒドリンデハロゲナーゼコードポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるものを包含する。
【００３８】
天然に存在するハロヒドリンデハロゲナーゼコード遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＤ１（ｈｈｅＣ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ｈａｌＢ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．（ｈｈｅＡコードＩａおよびｈｈＢコードＩｂ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．（ｈｈｅＡＡＤ２）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＧＰ１（ｈｈｅＢＧＰ１）において同定された。Ｓｅｅ  ｖａｎ  Ｈｙｌｃｋａｍａ  Ｖｌｉｅｇ，Ｊ．Ｅ．Ｔ．，Ｌ．Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｈ．Ｌｕｔｊｅ  Ｓｐｅｌｂｅｒｇ，Ｔ．Ｓｍｉｌｄａ，Ｇ．Ｊ．Ｐｏｅｌａｒｅｎｄｓ，Ｔ．Ｂｏｓｍａ，Ａ．Ｅ．Ｊ．ｖａｎ  Ｍｅｒｏｄｅ，Ｍ．Ｗ．Ｆｒａａｉｊｅ＆Ｄｉｃｋ  Ｂ．Ｊａｎｓｓｅｎ，「Ｈａｌｏｈｙｄｒｉｎ  Ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｓｅｓ  ａｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ（２００１）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８３：５０５８−５０６６（アラインメントにおいてこれらのハロヒドリンデハロゲナーゼのアミノ酸配列を提供する）を参照のこと。
【００３９】
これらの天然に存在するハロヒドリンデハロゲナーゼは、ある程度まで特徴づけられている。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＤ１に由来するＨＨＤＨは、２８ｋＤサブユニットのホモ四量体である。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｎ−１０７４は、２つのＨＨＤＨ酵素を生成し、そのうちの一方は、２８ｋＤサブユニット（Ｉａ）から構成される一方で、他方は、３５ｋＤおよび／または３２ｋＤ（Ｋｂ）の関連するサブユニットから構成される。それらのサブユニットの解離をもたらすプロセスにおいて、酸化条件下で容易に不活性化される、いくつかの供給源に由来するＨＨＤＨは、ｐＨ８〜９の広い至適ｐＨおよび５０℃の至適温度を有する（Ｔａｎｇ，Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）３０：２５１−２５８；Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１０：３６５−３６９）を参照のこと。ＨＨＤＨ触媒エポキシド形成のための至適ｐＨは、８．０〜９であり、その至適温度は、４５〜５５℃の範囲である（Ｖａｎ  Ｈｙｌｃｋａｍａ  Ｖｌｉｅｇら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００１）１８３：５０５８−５０６６；Ｎａｋａｍｕｒａら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９４）６０：１２９７−１３０１；Ｎａｇａｓａｗａら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９２）３６：４７８−４８２）。逆反応のための至適ｐＨ、塩素による開環は、２つのＣｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｎ−１０７４酵素について報告されており、７．４（Ｉａ）または５（Ｉｂ）である。ＡＤ１に由来するハロヒドリンデハロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、本明細書中に、配列番号１３、１５および１７として提供される。配列番号１３、１５、および１７に対応するそのポリヌクレオチドは、同じアミノ酸配列をコードする改変体である（その転写された配列は、配列番号１４、１６および１８として提供される）。
【００４０】
天然に存在しないハロヒドリンデハロゲナーゼは、公知の方法を使用して生成され得る。その公知の方法としては、例えば、変異誘発、指向性進化などが挙げられる。いくつかの例示的方法が、本明細書中以降に記載される。その酵素は、実施例４に記載される方法を使用して、活性について容易にスクリーニングされ得る。このようなスクリーニング方法はまた、他の天然に存在するハロヒドリンデハロゲナーゼの同定に容易に適用され得る。適切な天然に存在しないハロヒドリンデハロゲナーゼは、配列番号２４（ＨＨＤＨ  Ｂ−０３）、配列番号２６（ＨＨＤＨ  Ｃ−０４）、配列番号２８（ＨＨＤＨ  Ｅ−０１）、配列番号３０（ＨＨＤＨ  Ｇ−０８）、３２（ＨＨＤＨ２Ｇ５）、配列番号３４（ＨＨＤＨ  Ｍｚｌ．１Ａ５）、配列番号３６（ＨＨＤＨ  ｃｙｓ１．１０）、配列番号３８（ＨＨＤＨ  ｃｙｓ２．１２）、配列番号７４（ＨＨＤＨ  Ｂ−１２）、配列番号７６（ＨＨＤＨ  Ｍｚｌ／４Ｈ６）、配列番号７８（ＨＨＤＨ  Ｆ−０４）、配列番号８０（ＨＨＤＨ  Ａ−０８）、配列番号８２（ＨＨＤＨ  Ｇ９）、配列番号８４（ＨＨＤＨ  Ｆ９）、配列番号８６（ＨＨＤＨ  Ｈ１０）、配列番号８８（ＨＨＤＨ  Ａ１）、配列番号９０（ＨＨＤＨ  Ａ−０３）、および配列番号９２（ＨＨＤＨ  Ｅ−０３）に対応するものを包含する。これらのハロヒドリンデハロゲナーゼをコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、および配列番号９１に対応するポリヌクレオチド配列を包含する。本発明の実施において使用するために適切した、さらなる天然に存在しないハロヒドリンデハロゲナーゼは、代理人整理番号０３５３．１１０ＵＳに対応し、米国特許出願第          号が付与されたする、標題「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｈａｌｏｈｙｄｒｉｎ  Ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」という特許出願（２００３年８月１１日）（その全体が本明細書中に参考として援用される）に提供される。
【００４１】
本発明の実施において使用するために適したハロヒドリンデハロゲナーゼは、天然に存在しても、天然に存在しなくても、実施例４に記載される方法を用いて、当業者によって容易に同定され得る。本発明の実施において使用されるハロヒドリンデハロゲナーゼは、代表的には、目的の４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル基質または４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミド基質を使用して、実施例４に記載されるアッセイにおいて、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇの活性を示す。本発明の実施において使用されるハロヒドリンデハロゲナーゼは、実施例４に記載されるアッセイにおいて、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、ときおり、少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇの活性、および約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇまでもしくはそれ以上の活性を示し得る。
【００４２】
ハロヒドリンデハロゲナーゼは、精製酵素、細胞抽出物、細胞溶解物、またはハロヒドリンデハロゲナーゼをコードする遺伝子で形質転換された全細胞の形態において、反応混合物に提供され得る。ハロヒドリンデハロゲナーゼコード遺伝子で形質転換された全細胞ならびに／またはその細胞抽出物および／もしくは細胞溶解物は、種々の異なる形態（固体（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）または半固体（例えば、粗製ペースト）が挙げられる）において使用され得る。その細胞抽出物または細胞溶解物は、沈澱（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など）、その後の凍結乾燥前の脱塩手順（例えば、限外濾過、透析など）によって、部分的に精製され得る。任意の細胞調製物が、公知の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）または固相（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃなど）への固定化を用いて架橋することによって安定化され得る。
【００４３】
固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、種々の異なる形態（粉末（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）、溶液、エマルジョン、懸濁液などを含む）において提供され得る。この反応物は、当業者に公知の方法および装置を用いて、容易に凍結乾燥または噴霧乾燥され得る。例えば、そのタンパク質溶液は、少量のアリコートにおいて−８０℃で凍結され得、次いで、予め冷却した凍結乾燥チャンバに入れられ、続いて、真空適用される。サンプルから水分を除去した後、温度は、代表的には、真空を取り除いて凍結乾燥サンプルを回収する前に、２時間にわたって４℃まで上昇される。
【００４４】
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル基質または４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸基質を対応する４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステル生成物または４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸アミド生成物へ変更することを行うにあたって、その基質は、代表的には、溶媒中のハロヒドリンデハロゲナーゼおよび求核剤と接触される。４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸アミドを、４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたは４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸アミドに変換することを行うための適切な溶媒としては、水、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン性液体（例えば、１−エチル４−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェートなど）、および共溶媒系（水性共溶媒系などを含む）が挙げられる。好ましい溶媒は、水性溶媒（水および水性共溶媒系を含む）である。
【００４５】
例示的な水性共溶媒系は、水および１種以上の有機溶媒を有する。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、その有機溶媒成分が、本発明の方法において使用される酵素触媒を不活性化しないように選択される。適切な共溶媒系は、実施例４に記載される酵素アッセイを利用して、候補溶媒系において、目的の基質で酵素活性を測定することによって容易に同定され得る。
【００４６】
水性共溶媒系の有機溶媒成分は、水性成分と混和性であり得、単一の液体相を提供するか、あるいは水性成分と部分的に混和性または非混和性であり得、２つの液体相を提供する。代表的には、水性共溶媒系が使用される場合、二相であるように選択され、水が有機溶媒中に分散されるか、またはその逆である。一般的に、水性共溶媒系が利用される場合、水相から容易に分離され得る有機溶媒を選択することが望ましい。一般的に、共溶媒系中の水：有機溶媒の比は、代表的に、約９０：１０〜約１０：９０（ｖ／ｖ）の範囲の有機溶媒：水、および８０：２０と２０：８０（ｖ／ｖ）との間の有機溶媒：水である。共溶媒系は、反応混合物に添加する前に予め形成され得るか、または反応容器中でインサイチュで形成され得る。
【００４７】
水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝化され得るかまたは緩衝化されない。４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの、４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへの変換は、約５以上のｐＨで実行され得る。一般的に、この変換は、約１０以下のｐＨ、または通常、約５〜約１０の範囲で、実行される。代表的に、この変換は、約９以下のｐＨ、通常、約５〜約９の範囲である。好ましくは、この変換は、約８以下のｐＨ、通常、約５〜約８の範囲、より好ましくは、約６〜約８の範囲である。この変換はまた、約７．８以下のｐＨ、または７．５以下で実行され得る。あるいは、この変換は、中性のｐＨ、すなわち、約７で実行され得る。
【００４８】
変換の過程の間、反応混合物のｐＨは、変化し得る。反応混合物のｐＨは、変換の過程の間、酸または塩基の添加によって、所望のｐＨまたは所望のｐＨの範囲で維持され得る。あるいは、ｐＨの変化は、緩衝液を含む水性溶媒を使用することによって制御され得る。所望のｐＨ範囲を維持するための適切な緩衝液は、当該分野で公知であり、例えば、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液などが挙げられる。緩衝剤および酸または塩基の添加の組み合わせがまた使用され得る。
【００４９】
上に記載されるように、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸誘導体への変換が所望される場合、シアニドは、シアニド塩、代表的にアルカリ塩（例えば、ＮａＣＮ、ＫＣＮなど）の形態で、ヒドロシアン酸（気体または溶液）の形態で、あるいはこれらの混合物で提供され得る。ヒドロシアノ酸は、弱酸である。そのｐＫａ（ｐＫａ＝水中で９．１）のいくつかのｐＨ単位内の水溶液で、シアニドは、平衡濃度において、ＣＮ−およびＨＣＮの両方として存在する。約９以下のｐＨ値で、シアニドは、主にＨＣＮとして存在する。
【００５０】
シアニドがシアニド塩によって提供される場合、反応混合物は、代表的に、緩衝化または酸性化またはその両方で、所望のｐＨを提供する。塩基性シアニド塩溶液の酸性化のための適切な酸としては、有機酸（例えば、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸など）、鉱酸（例えば、ヒドロハロ酸（例えば、塩酸）、硫酸、リン酸など）、酸性塩（例えば、リン酸二水素塩（例えば、ＫＨ２ＰＯ４）、重硫酸塩（例えば、ＮａＨＳＯ４）など、ならびにシアン化水素が挙げられる。シアン化物塩を酸性化するために使用される酸または酸塩は、得られる溶液中で緩衝液を提供するために選択され得る。例えば、リン酸またはリン酸二水素塩での酸性化は、リン酸緩衝液範囲（約ｐＨ６〜８）においてＨＣＮのリン酸緩衝化溶液を提供するために使用され得る。
【００５１】
シアン化物がシアン化水素およびそのように作製されるよりも高いｐＨによって提供される場合、反応混合物は、代表的に、所望のｐＨを提供するために、緩衝されるか、または塩基を添加することによって、あまり酸性にされない。シアン化水素の中和のための適切な塩基は、有機塩基（例えば、アミン、アルコキシドなど）、および無機酸（例えば、水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）、重炭酸塩（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４）など、ならびにシアン化物塩である。
【００５２】
シアン化物が主にＨＣＮとして存在する約９以下のｐＨ値について、式（１）は、非緩衝化水性反応混合物中での４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルとＨＣＮとのハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒反応を記載する。
【００５３】
【化１３】
2010172348.tif 000015
シアン化水素の消費、弱い酸（ｐＫａ約９）およびハロ水素酸の放出、強酸（ｐＫａ＜０）は、水性ハロ水素酸（Ｈ＋＋Ｘ−）がそれ以外で中和されない場合、反応混合物のｐＨを低下させる。反応混合物のｐＨは、標準的な緩衝化技術によって所望のレベルに維持され得、ここで、この緩衝液は、提供される緩衝化能力まで、または変換の過程で同時に塩基の添加によって、中和される。このような添加は、反応混合物のｐＨをモニターしながら手動で、またはより簡便には、ｐＨスタットのような自動滴定器を使用することによってなされ得る。部分緩衝化能力および塩基添加の組み合わせがまたプロセス制御のために使用され得る。
【００５４】
ｐＨが変換の過程にわたって緩衝化または塩基の添加によって維持される場合、水性ハロ水素酸よりもハロゲン化物塩が、全体のプロセスの生成物である。例えば、式（２）は、水性水酸化ナトリウム（Ｎａ＋＋ＯＨ−）が、最初のｐＨを約９以下に維持するために反応の過程にわたって添加される場合、全体のプロセスを表す。
【００５５】
【化１４】
2010172348.tif 000016
シアン化物塩が塩基として添加されて、生成物であるハロ水素酸を中和する実施形態において、中和は、ＨＣＮを再生し、全体のシアン化物濃度（ＨＣＮ＋ＣＮ−）ならびに反応混合物中のｐＨを維持する。これは、そうでなければ、変換の速度が、シアン化物濃度が減少するにつれて、減少する場合、有利であり得る。例えば、式（３）は、水性シアン化ナトリウム（Ｎａ＋＋ＣＮ−）が、最初のｐＨを維持するために反応の過程にわたって添加される場合、全体のプロセスを表す。シアン化物が反応混合物中において主にＨＣＮとして存在する間、ＨＣＮ濃度は、維持されるが、一方、正味のこの変換は、添加される塩基シアン化物塩を消費する。
【００５６】
【化１５】
2010172348.tif 000017
塩基の添加が、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへのハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒反応の間に放出されるハロ水素酸を中和するために使用される場合、この変換の進行は、ｐＨを維持するために添加される塩基の量によってモニターされ得る。代表的には、変換の過程にわたって、非緩衝化または部分的に緩衝化した反応混合物へ添加される塩基は、水溶液中で添加される。
【００５７】
求核剤が、反応溶液の初期ｐＨより有意に下のｐＫａを有する強酸の共役アニオンである場合、求核剤は、主にそのアニオン形態で存在し、その結果、ＨＣＮとは異なり、その反応においてプロトンが放出されない。従って、このような求核剤の反応における反応混合物ｐＨは、化学量論の緩衝液または塩基の添加無しに維持され得る。例えば、アジドの共役酸、アジ化水素酸は、４．７のｐＫａを有し、亜硝酸塩の共役酸、亜硝酸は、３．３のｐＫａを有する。従って、中性ｐＨにおいて、求核剤は、それぞれ、Ｎ３−およびＯＮＯ−由来のアニオン形態で主に存在する。すなわち、中性反応混合物は、それぞれ、水性アジドおよび亜硝酸塩を含む。このような混合物中でのこれらの反応は、ハロゲン化物アニオンを放出して、水性ハロゲン化物塩を形成し、水性ハロ水素酸を形成しない。
【００５８】
当業者は、例えば、実施例４の方法によって決定されるＨＨＤＨの活性に基づく、使用されるＨＨＤＨ、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド基質および求核剤の量、所望の生成物の量などを、容易に、決定し得る。説明するために、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの量は、約１０ｍｇ〜約３０ｇのハロヒドリンデハロゲナーゼを使用して、約１０〜約５００ｇ／Ｌの範囲であり得る。求核剤の化学量論量は、容易に決定され得る。さらなる例示的な例を本明細書中に提供する。
【００５９】
本発明のＨＨＤＨ触媒変換を実行するための適切な条件は、ＨＨＤＨ、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド基質、および求核剤を、実験ｐＨおよび温度で接触させ、そして例えば、本明細書中に提供される実施例に記載される方法を使用して、生成物を検出することを含む、慣用的な実験によって容易に最適化され得る。４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの、４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへのＨＨＤＨ触媒変換は、代表的に、約１５℃〜約７５℃の範囲の温度で実行される。より代表的には、この反応は、約２０℃〜約５５℃の範囲、代表的には、約２０℃〜約４５℃の範囲の温度で実行される。この反応はまた、周囲条件で実行され得る。
【００６０】
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの、４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドのＨＨＤＨ触媒変換は、一般的に、基質の本質的に完全なまたは完全近くの変換まで、進行し得る。基質の生成物への変換は、基質および／または生成物を検出することによって、公知の方法を使用してモニターされ得る。適切な方法としては、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが挙げられる。反応混合物中で生成される４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの収率は、一般的に、約５０％よりも大きく、約６０％よりも多くあり得、約７０％よりも多くあり得、約８０％よりも多くあり得、しばしば、約９０％よりも多い。
【００６１】
４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドは、反応混合物から収集され得、必要に応じて、当業者に周知の方法および実施例に記載の方法を使用して精製され得る。
【００６２】
本発明の好ましい４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド基質は、キラルであり、３位においてステレオジェン（ｓｔｅｒｅｏｇｅｎｉｃ）があり、ラセミまたは非ラセミであり得る。本発明のプロセスにおいて使用される特定のハロヒドリンデハロゲナーゼ酵素は、キラル基質を４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドに、ステレオジェンの３位における絶対的な立体化学を保持して、変換する。非ラセミキラル４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド基質は、立体純度をほとんどまたは全く失わずに、実質的に等しい非ラセミ４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドに変換され得る。実施例は、本発明の実施形態が高いエナンチオ純度を提供することを示す。（立体化学を指定するための決まり事に起因して、（Ｓ）として指定されるエチル４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートのエナンチオマーおよび（Ｒ）として指定されるエチル４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートは、３−位において同一の立体化学を有する）。
【００６３】
本発明の他の実施形態において、特定のハロヒドリンデハロゲナーゼ酵素は、キラル４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド基質の１つの立体異性体について立体特異的であり得る。このような立体特異的な酵素を使用する本発明のプロセスは、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの立体異性体混合物（例えば、ラセミ混合物）の１つの立体異性体と反応し、一方で、他の立体異性体を実質的に未反応のままにして混合物の動力学的分割を提供するために使用され得る。
【００６４】
本発明のさらに有意な特徴は、生成される４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド生成物の純度が、大規模な精製手順（例えば、減圧蒸留）の必要なしに非常に高いことである。代表的に、本発明の方法によって精製される４−求核剤置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド生成物の純度は、少なくとも約８０％、通常、少なくとも約９０％、代表的に、少なくとも約９５％である。生成物の純度は、ＨＰＬＣまたはガスクロマトグラフィーのような従来の方法によって決定され得る。
【００６５】
（ＩＩ．ハロヒドリンのケトレダクターゼ触媒生成）
本発明は、さらに、以下による、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドを作製するための酵素方法を提供する：
（ａ）４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドを提供する工程であって、ここで、このハロ置換基が、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択される、工程；および
（ｂ）４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドを４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドに変換するための反応混合物を形成するのように適切な条件下で、この４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドをケトレダクターゼ、補因子、および補因子再生系と接触させる、工程。
【００６６】
用語「ケトレダクターゼ」および「ＫＲＥＤ」は、本発明のプロセスにおいて、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドの、対応する４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへの還元を触媒する酵素をいうために、本明細書中で交換可能に使用される。このような酵素活性は、本明細書中以下で実施例４に記載されるようなアッセイで検出され得る。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、用語「補因子」は、目的の反応を触媒する酵素と組み合わせて操作する非タンパク質化合物をいう。本発明の実施において使用される適切な補因子としては、ＮＡＤＰ＋（ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドホスフェート）、ＮＡＤＰＨ（すなわち、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの還元形態）、ＮＡＤ＋（すなわち、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、およびＮＡＤＨ（すなわち、ＮＡＤ＋の還元形態）などが挙げられる。補因子の還元形態は、補因子再生系を用いて酸化された補因子を還元することによって再生される。
【００６８】
本発明のプロセスにおいて、ケトレダクターゼは、補因子の還元形態による、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドの還元を触媒する。式（４）は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨによる４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドのケトレダクターゼ触媒還元を記載する。
【００６９】
【化１６】
2010172348.tif 000018
４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドの、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへの還元を実行するための適切なケトレダクターゼは、天然に存在するケトレダクターゼ、およびヒトの操作によって生成される非天然のケトレダクターゼの両方を含む。例示的な天然および非天然のケトレダクターゼおよびケトレダクターゼコードポリヌクレオチドとしては、本明細書中に記載されるものが挙げられる。
【００７０】
天然に存在するＫＲＥＤ酵素は、幅広い範囲の細菌および酵母において見いだされ得る。いくつかの天然に存在するＫＲＥＤ遺伝子および酵素の配列は、文献において報告されている：例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ．ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ１６０７９９；ＧＩ  ６５３９７３４）。Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ由来のケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１（ＣＲ２−５）、３（ＣＲ１−２）、５（ＣＲ１−３）、および７（ＣＲ２−４）として提供される。配列番号１（ＣＲ２−５）、５（ＣＲｌ−３）、および７（ＣＲ２−４）は、Ｃ．ｍａｇｎｃｌｉａｅタンパク質をコードする改変体である（配列番号：２、６、および８）。配列番号３（ＣＲｌ−２）は、１つのアミノ酸変化によってＣ．ｍａｇｎｃｌｉａｅタンパク質とは異なる改変体をコードする。β−ケトエステルの酵素的還元は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（Ｐｅｔｅｒｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９２）３８：３３４−３４０；Ｚｅｌｉｎｓｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９４）３３：２８３−２９２）由来のカルボニルレダクターゼ、Ｓｐｏｒｏｂｏｒｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ  ＡＫＵ  ４４２９（Ｓｈｉｍｉｚｕ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）１２：５９３−５９６；Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９０）５６：２３７４−２３７７）由来のアルデヒドレダクターゼについて報告されている。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）５６：４７７８；Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４）５８：２２３６）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ（１９９２）１１２２：５７）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９３）５７：３０３；Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐａｔｅｎｔ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＪＰ２５６６９６０）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９３）５７：３０３）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．（１９９２）２９４−４６９）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｉｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９２）１４：７３１）は、エチル４−クロロ−３−アセトアセテート（ＥＣＡＡ）の還元のために使用されている。米国特許第６，１６８，９３５号は、グリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９８８）２９：２４５３）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ（ＪＡＣＳ（１９８５）１０７：４０２８）、またはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ���ｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９１）１３：３１）またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（米国特許第５，３８５，８３３号；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）５７：１５２６）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の使用を記載する。
【００７１】
適切な非天然ケトレダクターゼは、公知の方法（変異誘発、指向された進化などを含む）を適用し、実施例４に記載の方法を使用して、活性についてスクリーニングすることによって容易に同定され得る。例えば、これらの方法は、天然に存在するケトレダクターゼ（本明細書中に記載されるものを含む）に対して容易に適用され得る。例示的な非天然ケトレダクターゼは、配列番号４０（ＫＲＥＤ  ｋｒｈ１３３ｃ）、４２（ＫＲＥＤ  ｋｒｈ２１５）、４４（ＫＲＥＤ  ｋｒｈ２６７）、４６（ＫＲＥＤ  ｋｒｈ２８７）、４８（ＫＲＥＤ  ｋｒｈ３２０）、５０（ＫＲＥＤ  ｋｒｈ３２６）、５２（ＫＲＥＤ  ｋｒｈ４０８）、５４（ＫＲＥＤ  ｋｒｈ４１７）、５６（ＫＲＥＤ  ｋｒｈ４８３）、５８（ＫＲＥＤ  ｋｒｈ４７６）、および６０（ＫＲＥＤ  ｋｒｈ４９５）として本明細書中で提供される。それらをコードするポリヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、および配列番号５９として、本明細書中で提供される。本発明の実施において使用するのに適したさらなる非天然のケトレダクターゼは、２００３年８月１１日に出願された、代理人整理番号０１９０．１１０ＵＳ／１５０７７ＵＳ０１に対応し、米国出願番号 として割り当てられた、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題された特許出願（これは、その全体が、本明細書中において参考として援用される）に提供される。
【００７２】
本発明の実施において使用されるケトレダクターゼは、代表的に、目的の４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミド基質を使用して、実施例４に記載されるアッセイにおいて少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇの活性を示す。本発明の実施において使用されるケトレダクターゼは、少なくとも１μｍｏｌ／分／ｍｇ〜約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、時々、少なくとも１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇ以上までの活性を示し得る。
【００７３】
本発明の実施において使用される４−ハロ−３−ケト酪酸エステルおよびアミドは、容易に購入され得るかまたは公知の方法を使用して合成され得る。例示的な４−ハロ−３−ケト酪酸エステル基質としては、構造ＩＶ：
【００７４】
【化１７】
2010172348.tif 000019
を有するものが挙げられ、ここで：
Ｘは、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択されるハロゲンであり；そして
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、構造１Ａについて記載されるように選択される。
【００７５】
本発明の実施において使用され得る特定の４−ハロ−３−ケト酪酸エステルとしては、エチル４−クロロ−３−ケト酪酸エステル（すなわち、Ｘが塩素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が各々水素であり、そしてＲ５がエチルである）、メチル４−クロロ−３−ケト酪酸エステル（すなわち、Ｘが塩素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が各々水素であり、そしてＲ５がメチルである）、エチル４−ブロモ−３−ケト酪酸エステル（すなわち、Ｘが臭素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が各々水素であり、そしてＲ５がエチルである）、エチル４−ヨード−３−ケト酪酸エステル（すなわち、Ｘがヨウ素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が各々水素であり、そしてＲ５がエチルである）、メチル４−ブロモ−３−ケト酪酸エステル（すなわち、Ｘが臭素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が各々水素であり、そしてＲ５がメチルである）、メチル４−ヨード−３−ケト酪酸エステル（すなわち、Ｘがヨウ素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が各々水素であり、そしてＲ５がメチルである）、ｔ−ブチル４−クロロ−３−ケト酪酸エステル（すなわち、Ｘが塩素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が各々水素であり、そしてＲ５がｔ−ブチルである）、ｔ−ブチル４−ブロモ−３−ケト酪酸エステル（すなわち、Ｘが臭素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が各々水素であり、そしてＲ５がｔ−ブチルである）、ならびにｔ−ブチル４−ヨード−３−ケト酪酸エステル（すなわち、Ｘがヨウ素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が各々水素であり、そしてＲ５がｔ−ブチルである）が挙げられる。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つが、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、またはプロピル）である。
【００７６】
化合物ＩＶの構造を有する４−ハロ−３−ケト酪酸エステル基質が、本発明のＫＲＥＤ触媒変換の間に減少される場合、構造Ｖを有する４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸が生成される：
【００７７】
【化１８】
2010172348.tif 000020
ここで、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、構造ＩＶについて記載される通りである。
【００７８】
次いで、本発明のケトレダクターゼ触媒還元法によって生成される４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドは、本発明のハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒変換に直ちに使用され得る。例えば、構造Ｖに対応する４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルは、シアニドの存在下で、ＨＨＤＨによる変換の基質として使用されて、構造ＶＩを有する４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成し得る：
【００７９】
【化１９】
2010172348.tif 000021
ここで、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化合物Ｖについて記載される通りである。
【００８０】
本明細書中で、用語「補因子再生系」とは、酸化型の補因子（例えば、ＮＡＤＰＨに対してＮＡＤＰ）を還元する反応に参加する一連の反応物質をいう。４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドのケトレダクターゼ触媒還元によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元型で再生される。補因子再生系は、還元性水素等価物の供給源でありかつ補因子の酸化型を還元し得る化学量論還元剤を含む。補因子再生系は、還元によって補因子の酸化型の還元を触媒する触媒（例えば、酵素触媒）をさらに含み得る。ＮＡＤまたはＮＡＤＰからＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、それぞれ、当該分野で公知であり、本発明で使用され得る。
【００８１】
本発明の実施において使用される適切な補因子再生系は、グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーセ、ホルメートおよびホルメートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートおよびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、イソプロピルアルコールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼなどを含み、補因子としてＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ／ＮＡＤＨのいずれかと組み合わせて使用され得る。
【００８２】
本明細書中で、用語「グルコースデヒドロゲナーゼ」および「ＧＤＨ」は、それぞれ、Ｄグルコースのグルコン酸への変換およびＮＡＤのＮＡＤＨへの変換を触媒するＮＡＤ依存性酵素、あるいはＮＡＤＰのＮＡＤＰＨへの変換を触媒するＮＡＤＰ依存性酵素をいうために同義的に使用される。式（５）は、グルコースによるＮＡＤまたはＮＡＤＰのグルコースデヒドロゲナーゼ触媒還元を記載する。
【００８３】
【化２０】
2010172348.tif 000022
本発明の実施において使用するのに適切なグルコースデヒドロゲナーゼは、天然に生じるグルコースデヒドロゲナーゼ、および非天然に生じるグルコースデヒドロゲナーゼの両方を含む。遺伝子をコードしている天然に生じるグルコースデヒドロゲナーゼは、文献に報告されている。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ６１２９７ＧＤＨ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され、その天然の宿主中で生成される酵素と同一の物理化学特性を示すことが報告された（Ｖａｓａｎｔｈａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：７８５）。Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．番号Ｍ１２２７６に相当するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＤＨ遺伝子の遺伝子配列は、Ｌａｍｐｅｌらによって報告され（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８６）１６６：２３８−２４３）、ＹａｍａｎｅらによってＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．番号Ｄ５０４５３として訂正型が報告された（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）１４２：３０４７−３０５６）。天然に生じるＧＤＨ遺伝子はまた、  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ由来のＧＤＨをコードする遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ（２００３）４２３：８７−９１；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．番号ＡＥ０１７０１３）およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＧＤＨをコードする遺伝子（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１７４：４８５−４９０、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．番号Ｘ１２３７０；Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９０）７０：３６３−３６９、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．番号ＧＩ２１６２７０）を含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．由来のグルコースデヒドロゲナーゼは、本明細書中で、配列番号１０および１２（それぞれ、配列番号９および１１に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされる）として提供される。
【００８４】
非天然に生じるグルコースデヒドロゲナーゼは、例えば、変異誘発、有向進化などのような公知の方法を使用して生成され得る。天然に生じようと非天然に生じようと、適切な活性を有するＧＤＨ酵素は、実施例４に記載されるアッセイを使用して容易に同定され得る。例示的な非天然に生じるハロヒドリンデハロゲナーゼは、本明細書中で、配列番号６２（ＧＤＨ２３１３）、配列番号６４（ＧＤＨ２３３１）、配列番号６６（ＧＤＨ２２７９）、および配列番号６８（ＧＤＨ２３７９）として提供される。これらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で、それぞれ、配列番号６１、６３、６５、および６７として提供される。本発明の実施において使用するために適切なさらなる非天然に生じるグルコースデヒドロゲナーゼは、２００３年８月１１日に提出された代理人明細書番号０３５２．１１０ＵＳ／１５０７６ＵＳ０１および譲渡された米国出願の出願番号＿＿＿＿＿に対応するタイトル「改良型グルコースデヒドロゲナーゼポリペプチドおよび関連するポリヌクレオチド（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」の特許出願（その全体が本明細書中に参考として援用される）において提供される。
【００８５】
本発明の実施において使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、実施例４に記載されるアッセイにおいて、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、時折少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇまたは約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０４μｍｏｌ／分／ｍｇまであるいはそれ以上の活性を示し得る。
【００８６】
グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼが、補因子再生系として使用される場合、４−ハロ−３−ケト酪酸またはアミドがケトレダクターゼおよびＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨによって還元されるように、得られるＮＡＤまたはＮＡＤＰは、グルコースの共役酸化により、グルコースデヒドロゲナーゼによってグルコン酸に還元される。正味の反応は、式（６）（これは、式（４）と式（５）の総和である）によって記載される：
【００８７】
【化２１】
2010172348.tif 000023
４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドのケトレダクターゼ触媒還元は、一般的に溶媒中で実行される。溶媒は、例えば、水性共溶媒系のような共溶媒系であり得る。この変換を実行するために適切な溶媒（共溶媒系を含む）は、上記の４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへの４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドのＨＨＤＨ触媒変換のための溶媒と同一である。
【００８８】
水性溶媒（水または水性共溶媒）は、ｐＨ緩衝化されていてもｐＨ緩衝化されていなくてもよい。４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへの４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドの変換は、約５またはそれ以上のｐＨで実行され得る。一般的には、変換は、約１０またはそれ以下のｐＨ、通常は、約５〜約１０の範囲内で実行される。代表的には、変換は、約９またはそれ以下のｐＨ、通常は、約５〜約９の範囲内で実行される。好ましくは、変換は、約８またはそれ以下のｐＨ、通常は、約５〜約８の範囲内、より好ましくは、約６〜約８の範囲内で実行される。あるいは、変換は、中性のｐＨ（すなわち、約７）で実行され得る。
【００８９】
グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ補因子再生系が使用される場合、式（６）に示されるようなグルコン酸の副生成（ｐＫａ＝３．６）は、生じる水性グルコン酸がそれ以外の方法では中和されない場合に反応混合物のｐＨを低下させる。反応混合物のｐＨは、標準的な緩衝技術（ここで、緩衝液は、提供される緩衝能力までグルコン酸を中和する）によってか、または変換の経過と共に塩基を添加することによって所望のレベルに維持され得る。一連の変換中に、緩衝化のために適切な緩衝液および手順ならびに塩基の添加のために適切な塩基および手順は、上記の４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルおよびアミドへの４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルおよびアミドのＨＨＤＨ触媒変換のためのものと同一である。
【００９０】
補因子再生のためにグルコース／グルコースデヒドロゲナーゼを使用する４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドのケトレダクターゼ触媒還元において、一連の変換にわたってｐＨが緩衝化または塩基の添加によって維持される場合、水性グルコン酸ではなく水性グルコン酸塩が、全体のプロセスの生成物である。例えば、式（７）は、ｐＨを維持するために水酸化ナトリウム（Ｎａ＋＋ＯＨ−）が一連の反応にわたって添加される場合の全体のプロセスを示す：
【００９１】
【化２２】
2010172348.tif 000024
塩基の添加が、グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ補因子再生系を使用する４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドのケトレダクターゼ触媒還元中に放出されるグルコン酸を中和するために使用される場合、その変換のプロセスは、ｐＨを維持するために添加される塩基の量によってモニターされ得る。一連の変換にわたって緩衝化されていないかまたは部分的に緩衝化された反応混合物に添加される代表的な塩基は、水溶液として添加される。
【００９２】
用語「ホルメートデヒドロゲナーゼ」および「ＦＤＨ」は、それぞれ、ホルメートの二酸化炭素への変換およびＮＡＤのＮＡＤＨへの変換を触媒するＮＡＤ依存性酵素、あるいはＮＡＤＰのＮＡＤＰＨへの変換を触媒するＮＡＤＰ依存性酵素をいうために、本明細書中で同義的に使用される。本発明の実施において使用するために有用なホルメートデヒドロゲナーゼは、天然に生じるホルメートデヒドロゲナーゼ、および非天然に生じるホルメートデヒドロゲナーゼの両方を含む。ホルメートデヒドロゲナーゼとしては、配列番号７０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）および７２（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）（それぞれ、配列番号６９および７１に相当するポリヌクレオチド配列によってコードされる）に相当するホルメートデヒドロゲナーゼが挙げられる。天然に生じようと非天然に生じようと、本発明の実施において使用されるホルメートデヒドロゲナーゼは、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇ、時折少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇまであるいはそれ以上の活性を示し得、そして実施例４に記載されるアッセイで活性について選別され得る。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、用語「ホルメート」とは、ホルメートアニオン（ＨＣＯ２−）、ギ酸（ＨＣＯ２Ｈ）、およびそれらの混合物をいう。ホルメートは、塩の形態（代表的には、アルカリ塩またはアンモニウム塩（例えば、ＨＣＯ２Ｎａ、ＫＨＣＯ２ＮＨ４など））、ギ酸の形態（代表的には、水性ギ酸）、またはそれらの混合物の形態で提供され得る。ギ酸は、中程度の酸である。そのｐＫａ（水中でｐＫａ＝３．７）に関していくつかのｐＨ群の範囲内の水溶液中で、ギ酸は、平衡濃度においてＨＣＯ２−およびＨＣＯ２Ｈの両方として存在する。約４以上のｐＨにて、ホルメートは、ＨＣＯ２−として優先的に存在する。ホルメートがギ酸として提供される場合、反応混合物は、代表的には所望のｐＨ（代表的には、約５またはそれ以上のｐＨ）を提供するために塩基を添加することによって緩衝化されるかまたは酸性が弱められる。ギ酸の中和のために適切な塩基は、上記でシアン化水素の中和のために記載されるような塩基である。
【００９４】
ホルメートがＨＣＯ２−として優先的に存在する約５以上のｐＨ値について、式（８）は、ホルメートによるＮＡＤまたはＮＡＤＰのホルメートデヒドロゲナーゼ触媒還元を記載する：
【００９５】
【化２３】
2010172348.tif 000025
ホルメートおよびホルメートデヒドロゲナーゼが、補因子再生系として使用される場合、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドがケトレダクターゼおよびＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨによって還元されるように、得られるＮＡＤまたはＮＡＤＰが、ホルメートデヒドロゲナーゼによる二酸化炭素へのホルメートの共役酸化によって還元される。正味の反応は、式（９）（この式は、式（４）および式（８）の総和である）によって記載される：
【００９６】
【化２４】
2010172348.tif 000026
式（９）は、ホルメート／ホルメートデヒドロゲナーゼ補因子再生系が、約５以上のｐＨを有する水溶液中で４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドの還元のために使用される場合に、溶液中のプロトンが消費され、反応が、それ以外の方法では緩衝化も再酸性化もされない場合に反応混合物のｐＨの上昇を引き起こすことを示す。反応混合物のｐＨは、標準的な緩衝技術（ここで、緩衝液は、提供される緩衝能力までプロトンを放出する）によってか、または変換の経過と共に酸を添加することによって、所望のレベルに維持され得る。一連の反応中にｐＨを維持するために添加するのに適切な酸としては、有機酸（例えば、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸など）、無機酸（例えば、ハロゲン化水素酸（例えば、塩酸）、硫酸、リン酸など）、酸性塩（例えば、二水素リン酸塩（例えば、ＫＨ２ＰＯ４）、重硫酸塩（例えば、ＮａＨＳＯ４））などが挙げられる。特に好ましくは、ギ酸であり、これによってホルメート濃度および溶液のｐＨの両方が維持される。例えば、式（１０）は、ギ酸（ＨＣＯ２Ｈ）が一連の反応にわたって最初の約５以上のｐＨを維持するために添加される場合の、全体プロセスを示す。ホルメートは、反応混合物中でＨＣＯ２−として優先的に存在するが、ＨＣＯ２−濃度は添加したギ酸の正味の消費において変換の間、維持される。
【００９７】
【化２５】
2010172348.tif 000027
酸の添加が、ホルメート／ホルメートデヒドゲナーゼ補因子再生系を使用する４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドのケトレダクターゼ触媒還元中に、ｐＨを維持するために使用される場合、その変換のプロセスは、ｐＨを維持するために添加された酸の量によってモニターされ得る。一連の反応にわたって緩衝化されていないかまたは部分的に緩衝化された反応混合物に添加される代表的な酸は、水溶液として添加される。
【００９８】
本発明の方法を実行することにおいて、酸化型の補因子または還元型の補因子のいずれかが最初に提供され得る。上記のように、補因子再生系は、酸化された補因子をその還元型に変換し、これは次いで、ケトレダクターゼ基質（すなわち、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミド）の対応するハロヒドリンへの還元に使用される。
【００９９】
ハロヒドリンデハロゲナーゼと同様に、ケトレダクターゼおよび補因子再生系の酵素は、精製した酵素、細胞抽出物、細胞溶解物、またはケトレダクターゼおよび補因子再生系の酵素をコードする遺伝子で転換された細胞全体の形態において、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドを変換するために反応混合物に提供され得る。酵素をコードする遺伝子は、別個にか、または同じ宿主細胞に一緒にかのいずれかで、宿主細胞に転換され得る。例えば、１つの実施形態において、一組の宿主細胞は、遺伝子をコードするケトレダクターゼで転換され得、別の組の宿主細胞は、遺伝子をコードする補因子再生系の酵素（例えば、ＧＤｈ、ＦＤＨなど）で転換され得る。両方の組の転換細胞は、それらに由来する細胞全体または細胞溶解物または細胞抽出物の形態における反応混合物中で一緒に使用され得る。あるいは、宿主細胞は、ケトレダクターゼおよび補因子再生系の酵素の両方をコードする遺伝子で転換され得、その結果、各々の細胞が、ケトレダクターゼおよび補因子再生系の酵素の両方を発現する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、ケトレダクターゼ、補因子再生系の酵素、およびハロヒドリンデハロゲナーゼをコードする遺伝子で転換され得る。これらの細胞は、細胞全体、細胞溶解物、または細胞抽出物の形態で酵素を提供するために本発明の方法において使用され得る。ＨＨＤＨ触媒法の反応混合物について記載されるように、固体反応物（すなわち、酵素、塩、補因子再生系、補因子など）は、種々の異なる形態（粉末（例えば、凍結乾燥された粉末、噴霧乾燥された粉末など）、溶液、乳濁液、懸濁液など）で提供され得る。
【０１００】
還元工程で使用される反応物の量は、一般的に、望まれる４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの量、および付随して使用されるケトレダクターゼ基質の量に依存して変化する。以下の指針は、使用されるケトレダクターゼ、補因子、および補因子再生系の量を決定するために使用され得る。一般的に、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドは、１０ｍｇ〜約５ｍｇのケトレダクターゼおよび約２５ｍｇ〜約５ｍｇの補因子を使用して、約１０〜５００グラム／リットルの濃度で使用される。当業者は、これらを所望のレベルの生産性および生成スケールに調整するために、これらの量を変化させる方法を理解している。適切な量の補因子再生系は、使用される補因子および／またはケトレダクターゼの量に基づく慣用的な実験によって容易に決定され得る。一般的に、還元剤（例えば、グルコース、ホルメート）は、ケトレダクターゼ基質の実質的に完全な変換または完全に近い変換を達成するために、ケトレダクターゼ基質の等モルレベル以上のレベルで使用される。
【０１０１】
反応物の添加の順序は、重要ではない。反応物は、溶媒（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など）中に同時に添加され得るか、あるいは、反応物のうちいくつかは別個に添加され得、そしていくつかは異なる時間に一緒に添加され得る。例えば、補因子再生系、補因子、ケトレダクターゼ、およびケトレダクターゼ基質は、最初に溶媒に添加され得る。
【０１０２】
水性共溶媒系が使用される場合の改善した混合効率のために、補因子再生系、ケトレダクターゼ、および補因子は、通常は、最初に水相に添加されて混合される。次いで、有機相が、添加されて混合され、その後、ケトレダクターゼ基質が添加される。あるいは、ケトレダクターゼ基質は、水相に添加される前に、有機相中で予備混合される。
【０１０３】
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルおよびアミドのハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒変換に関して、本発明の４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルおよびアミドのケトレダクターゼ触媒還元を実行するために適切な条件は、当業者によって容易に決定し得る広範な条件を含む。還元工程を実行するために適切な温度は、代表的には、約１５℃〜約７５℃の範囲である。通常は、反応は、約２０℃〜約５５℃の範囲、好ましくは、約２０℃〜約４５℃の温度で実行される。反応はまた、周囲条件下で実行され得る。
【０１０４】
ハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒反応の場合、ケトレダクターゼ触媒反応は、当該分野で公知の方法を使用して本質的に基質の完全な変換が観察されるか、または完全に近い基質の変換が観察されるまで進行することを可能にされる。ハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒反応の場合、ケトレダクターゼ触媒反応の進行は、上記のように、それ以外の方法では特定の補因子再生系によって生じ得るｐＨの変化に対抗するために添加される塩基または酸の量をモニターすることによってモニターされ得る。
【０１０５】
４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミド基質のケトレダクターゼ触媒還元は、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド生成物の３位での新しい立体性炭素を生成する。代表的には、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドは、３位での比較的高い立体選択性を伴って生成される。従って、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドのケトレダクターゼ触媒還元によって生成される４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドは、代表的に、キラルでありかつラセミ体ではない。本発明で使用されるケトレダクターゼ反応は、代表的には、少なくとも約９０％ｅ．ｅ．、好ましくは約９５％ｅ．ｅ．、そして代表的には９９％ｅ．ｅ．のｅ．ｅ．を有する、好ましい非ラセミ体のキラルな４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生じる。実施例は、９９％ｅ．ｅ．を超えるｅ．ｅ．を有するエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートを提供する実施形態を示す。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、用語「鏡像体過剰率」または「ｅ．ｅ．」とは、メジャーな鏡像異性体（Ｆ（＋））のモル比もしくは重量比と、マイナーな鏡像異性体（Ｆ（−））のモル比もしくは重量比との間の絶対的な差（すなわち、｜Ｆ（＋）−Ｆ（−）｜）（ここで、Ｆ（＋）−Ｆ（−）＝１である）をいう。鏡像異性の組成物は、本明細書中以下の実施例６に記載されるガスクロマトグラフィー法、および当該分野で公知の方法を使用することによって容易に特徴付けされ得る。
【０１０７】
上記のように、これらの非ラセミ化キラル４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドが本発明のハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒反応において基質として使用される場合、得られる４−置換−４−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドは、立体純度においてほとんど減少しないか、または、全く減少せずに、実質的に同等に非ラセミ化されている。非ラセミ化４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドのケトレダクターゼ触媒生成の高度な立体選択性と、対応する非ラセミ化４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへの、これらのハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒の変換の高度な立体フィデリティーの組み合わせは、例えば（ｅ．ｅ．）、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドからの、高度な非ラセミ化４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの生成全体のために特に魅力的な本発明のプロセスを提供する。
【０１０８】
本発明のさらに有意な特徴は、作製されるキラル生成物の収率が非常に高いことである。代表的に、本発明の方法に従って作製される４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド、および、４−求核性置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド生成物の収率は、少なくとも約７０％、通常は少なくとも約８０％、代表的には少なくとも約９０％であり、そして、少なくとも約９５％であり得る。得られる生成物の組成物は、提供される最初の物質量と、反応混合物中に形成される生成物の量に基づく。生成物４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドは、必要に応じて、ハロヒドリンデハロゲナーゼと接触させる前に、精製され得る。本明細書中で使用される場合、用語「精製される」とは、分離プロセスが混合物に適用され、混合物中での一方の成分の他の成分に対する濃度の増加を生じるプロセスを指す。本発明の実施において採用される適切な精製プロセスとしては、例えば、濾過、固相または液相抽出、蒸留などが挙げられる。
【０１０９】
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドが、ケトレダクターゼ反応混合物から精製される場合、引き続いて、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよび求核性が溶媒（例えば、単相性溶媒、二相性水性共溶媒系）に添加される。
【０１１０】
（ＩＩＩ．単一の反応容器内での、４−ハロ−３−ケト酪酸エステル／アミドの４−求核性置換−３−ヒドロキシ酪酸エステル／アミドへの酵素的変換）
本発明は、単一の反応容器内での、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルおよびアミドの、対応する４−求核性置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルおよびアミドへの変換を行うための方法を提供し、この方法は、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドを、ケトレダクターゼ、補因子、補因子再生系、求核性、およびハロヒドリンデハロゲナーゼと接触させて、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドを４−求核性置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへ変換するための反応混合物を形成する工程を包含する。
【０１１１】
機構的には、この単一容器法は、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドのケトレダクターゼ触媒変換によって進行し、インサイチュで４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドを提供し、その後、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの対応する４−求核性置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへの有意なハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒変換が続く。有意なことには、ケトレダクターゼ触媒反応により生成する４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドは、４−求核性置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへの変換のためにハロヒドリンデハロゲナーゼおよび求核性（例えば、シアニドなど）と接触する前に、分離または回収されない。
【０１１２】
適切な反応物質（基質、酵素、補因子）、溶媒、ｐＨ、温度および他の反応条件、ならびに、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドの４−求核性置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへの単一容器変換のための手順は、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルおよびアミドの、対応する４−求核性置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルおよびアミドへのハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒変換を実施するために、上記されたものと同じである。
【０１１３】
グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼを、補因子再生系として使用し、そして塩基の２つの等価物が反応の過程で添加され、グルコン酸および生成されるヒドロハロ酸（ｈｙｄｒｏｈａｌｉｃ  ａｃｉｄ）の両方を中和し、そして、反応混合物の最初のｐＨ（約５〜約９の範囲の最初のｐＨ）を維持する場合、単一容器反応における全プロセスは、等式（１０）により説明され、この等式は、等式（２）および（７）の和であり、水酸化ナトリウム水溶液が、塩基として例示される。
【０１１４】
【化２６】
2010172348.tif 000028
他の単一容器の全プロセス等式は、別個に実施される反応について上記されたように、ハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒反応（例えば、塩基としてシアニド塩を使用する）および／またはケトレダクターゼ反応（例えば、補因子再生系としてギ酸塩およびギ酸デヒドロゲナーゼを使用する）を実施するための他の選択肢を記載する等式を合計することによって生じ得る。
【０１１５】
同じ単一容器の結果が、最初に、上記のように別個にケトレダクターゼ反応を実施し、次いで、その後、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよびシアニドをケトレダクターゼ反応混合物に添加することによって、そして、ケトレダクターゼ反応成分の存在下で、ハロヒドリンデハロゲナーゼ反応を実施することによって、得られ得ることがまた、理解される。
【０１１６】
４−ハロ−３−ケト酪酸エステルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルへの変換のための単一容器プロセスの実施形態を、実施例２４に例示する。
【０１１７】
（ＩＶ．組成物）
本発明はさらに、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの４−求核性置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへの酵素的変換に有用な組成物を提供する。これらの組成物は、ハロヒドリンデハロゲナーゼ、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド、および、求核電子を含む。好ましい組成物において、求核電子は、シアニドである。
【０１１８】
さらなる実施形態において、本発明は、ケトレダクターゼ、補因子再生系、補因子、およびハロヒドリンデハロゲナーゼを有する、４−求核性置換−３−ヒドロキシ酪酸エステルおよびアミドを調製するために有用な組成物を提供する。これらの組成物はさらに、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミドを含み得る。
【０１１９】
任意の以前に記載されたケトレダクターゼ、補因子再生系の成分、補因子、ハロヒドリンデハロゲナーゼ、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルまたはアミド、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドおよび求核電子が、これらの組成物において使用され得る。
【０１２０】
本発明の組成物は、固体（例えば、散剤）または液体（例えば、溶液、エマルジョン、懸濁液など）の形態であり得る。例えば、この組成物は、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥された散剤の形態であり得る。あるいは、この組成物はさらに、溶媒を含み得る。
【０１２１】
この組成物はさらに、ｐＨ調整または加工可能性のための成分（例えば、塩、酸、塩基、緩衝液、溶解剤などが挙げられる）を含み得る。
【０１２２】
（Ｖ．ハロヒドリンデハロゲナーゼ、ケトレダクターゼおよび補因子再生系の酵素および対応するポリヌクレオチド）
本明細書中に記載される特定の酵素およびポリヌクレオチドに加えて、当業者は、公知の技術が、本発明の実施における用途に適する酵素をコードする、天然に存在するポリヌクレオチドおよび天然に存在しないポリヌクレオチドの両方の発見に、容易に適用され得ることを認識する。例えば、以下を参照のこと：
【０１２３】
【化２７】
2010172348.tif 000029
これらおよび他の方法が、本明細書中に記載されるアッセイと一緒に、例えば、本明細書中に記載される活性、ならびに、他の望ましい特性（例えば、変更された温度および／またはｐＨ最適条件、耐溶剤性など）を有する他のケトレダクターゼおよびハロヒドリンデハロゲナーゼ、および、補因子再生系を同定するために、容易に適用され得る。例えば、ケトレダクターゼは、一方の補因子型が、他方に勝る優先傾向（例えば、ＮＡＤ  対  ＮＡＤＰ、または、逆もまた同じである）を有するケトレダクターゼを同定するためにスクリーニングされ得る。
【０１２４】
本発明において使用される酵素をコードするポリ核酸配列は、発現について選択された宿主生物からの最適な生成物について最適化されたコドンであり得る。当業者は、広範囲の生物についてのコドン参照情報を提供する表および他の参考文献が容易に入手可能であることを認識する。例えば、ＨｅｎａｕｔおよびＤａｎｃｈｉｎ，「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９６）ｐｐ．２０４７〜２０６６を参照のこと。
【０１２５】
本発明の実施において使用される酵素は、ハロヒドリンデハロゲナーゼまたは補因子再生系の酵素をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを、周知の分子生物学的技術を使用して宿主細胞に形質転換することによって生成され得る。
例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｖｏｌ．１〜３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；ならびに「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間のジョイントベンチャー（１９９９から補遺）を参照のこと。酵素を作製するための方法は、実施例１および２に例示される。
【０１２６】
本発明の以上および他の局面は、以下の非限定的な実施例と組み合せてより良く理解され得る。
【実施例】
【０１２７】
（実施例１：ハロヒドリンデハロゲナーゼ、ケトレダクターゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼの発現のための発現構築物の構築）
（１）ハロヒドリンデハロゲナーゼ（ＨＨＤＨ）
ハロヒドリンデハロゲナーゼについての遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種由来のハロヒドリンデハロゲナーゼのアミノ酸配列に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現するためにコドン最適化した。この遺伝子を、６０マーのオリゴマーを使用して合成し、Ｔ５プロモーターの制御下で、発現ベクターｐＣＫ１１０７００（図２に示す）にクローニングした。このベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、このＥ．ｃｏｌｉから、標準的な方法を使用してプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、プラスミドＤＮＡを、標準的な方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）（発現宿主）に形質転換した。いくつかのクローンが、活性なＨＨＤＨを発現する発現ライブラリーにおいて見出された。これらのクローンからの遺伝子を配列決定した（配列番号１３（ＨＨＤＨ．１）、１５（ＨＨＤＨ．２）、および１７（ＨＨＤＨ．１６）を参照のこと）、これらは、それぞれ、配列番号１４、１６および１８のポリペプチド配列をコードする）。
【０１２８】
（２）ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）
ケトレダクターゼについての遺伝子は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅに由来するケトレダクターゼのアミノ酸配列に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化した。この遺伝子を、６０マーのオリゴマーを使用して合成し、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下で、発現ベクターｐＣＫ１１０９００（図３に示す）にクローニングした。この発現ベクターは、ｐ１５Ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。このプラスミドを、標準的な方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ発現宿主に形質転換した。いくつかのクローンが、活性なケトレダクターゼを発現することが見出され、それらの遺伝子を、配列決定して、ＤＮＡ配列を確認した（配列番号１（ケトレダクターゼ１）、３（ケトレダクターゼ２）、５（ケトレダクターゼ３）および７（ケトレダクターゼ４）（これらは、それぞれ、配列番号２、４、６および８のポリペプチド配列をコードする）を参照のこと）。
【０１２９】
（３）グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）
グルコースデヒドロゲナーゼについての遺伝子を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のゲノムＤＮＡ調製物からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅した。増幅反応のためのプライマーを、公開されているＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子配列を使用して設計し、これらは、以下の通りであった：
【０１３０】
【化２８】
2010172348.tif 000030
ＰＣＲ生成物を、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下で、発現ベクターｐＣＫ１１０９００（図３に示す）のＳｆｉＩクローニング部位にクローニングした。この発現ベクターは、ｐ１５Ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。このプラスミドを、標準的な方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ発現宿主に形質転換した。いくつかのクローンが、活性なＧＤＨを発現することが見出され、それらの遺伝子を、配列決定して配列を確認した（配列番号９（グルコースデヒドロゲナーゼＳ０６−３）および１１（グルコースデヒドロゲナーゼＭ０２−６（これらはそれぞれ、配列番号１０および１２のポリペプチド配列をコードする）を参照のこと）。
【０１３１】
（４）葉酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）
葉酸デヒドロゲナーゼについての遺伝子を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種株１０１（タンパク質データベース登録番号２ＮＡＤ＿Ａ）およびＣａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＣＡＡ０９４６６）由来の葉酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化した。これらの遺伝子を、６０マーのオリゴマーを使用して合成し、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下で、発現ベクターｐＣＫ１１０９００（図３に示す）のＳｆｉＩクローニング部位にクローニングした。この発現ベクターは、ｐ１５Ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。このプラスミドを、標準的な方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ発現宿主に形質転換した。いくつかのクローンが、活性な葉酸デヒドロゲナーゼを発現することが見出され、その遺伝子を、配列決定してＤＮＡ配列を確認した（配列番号６９および７１（これらは、それぞれ、配列番号７０および７２のポリペプチド配列をコードする）。
【０１３２】
（実施例２：酵素の生成）
（１）ＨＨＤＨ酵素：
通気撹拌した発酵槽において、０．５２８ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム；７．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物；３．７ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム；２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母エキス；０．０５ｇ／Ｌ  硫酸鉄；および３ｍｌ／Ｌの微量元素溶液（２ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌ  硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌ  硫酸銅六水和物および０．１ｇ／ｌ  ホウ酸ナトリウム十水和物を含有する）および０．５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡを含有する１０．０Ｌの増殖培地を、３０℃の温度にした。発酵槽を、実施例１に記載したように、ＨＨＤＨポリヌクレオチドを含有するプラスミドを備えたＥｓｃｈｅｒｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の最指数的培養物で接種し、次いで、ＬＢ、１％グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する振盪フラスコ中で、０．５〜２．０の６００ｎｍでの開始光学濃度（ＯＤ６００）まで増殖させた。発酵槽を、５００〜１５００ｒｐｍで撹拌し、１．０〜１５．０Ｌ／分にて発酵容器に空気を補充し、３０％以上の飽和溶解酸素レベルを維持した。２０％ｖ／ｖの水酸化アンモニウムを添加することによって、培養物のｐＨを７．０に調整した。培養物が、４０のＯＤ６００に到達した後、温度を２５℃まで下げ、ハロヒドリンデハロゲナーゼの発現を、イソプロピル−β−ジチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により、１ｍＭの最終濃度まで誘導した。培養物をさらに１５時間増殖させた。誘導後、遠心分離により細胞を回収し、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。細胞ペーストを、下流の回収プロセスにおいて直接使用するか、または、使用まで−８０℃にて保存した。
【０１３３】
（ケトレダクターゼ酵素）
通気攪拌発酵槽において、０．５２８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、７．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物、３．７ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母抽出物、０．０５ｇ／Ｌの硫酸鉄（ＩＩ）、および３ｍｌ／Ｌの微量元素溶液（２ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌの硫酸銅（ＩＩ）七水和物、０．１ｇ／Ｌホウ酸ナトリウム十水和物および０．５ｇ／ＬのＥＤＴＡを含む）を含む、１０．０Ｌの増殖培地を、温度３０℃にした。
【０１３４】
この発酵槽に、ＬＢ、１％グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む振盪フラスコ中で増殖させた、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ｐＣＲ２−５）の対数増殖後期培養物を、６００ｎｍにおける開始光学密度（ＯＤ６００）０．５〜２．０まで接種した。この発酵槽を、５００〜１５００ｒｐｍにて攪拌し、そして空気を、１．０〜１５．０Ｌ／分にて発酵容器に供給し、そして培養物のｐＨを、２０％ｖ／ｖ水酸化アンモニウムの添加により７．０にて制御した。培養物がＯＤ６００  ４．０に達した後に、温度を２５℃まで低下させ、そしてグルコースデヒドロゲナーゼの発現を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を最終濃度１ｍＭまで添加することにより、誘導した。培養物を、さらに１５時間増殖させた。この誘導の後、細胞を遠心分離により採集し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。細胞ペーストを、下流回収プロセスにおいて直接使用したか、または使用するまで−８０℃にて保存した。
【０１３５】
（（３）グルコースデヒドロゲナーゼ酵素）
通気攪拌発酵槽において、０．５２８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、７．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物、３．７ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母抽出物、０．０５ｇ／Ｌの硫酸鉄（ＩＩ）、および３ｍｌ／Ｌの微量元素溶液（２ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌの硫酸銅（ＩＩ）七水和物、０．１ｇ／Ｌホウ酸ナトリウム十水和物および０．５ｇ／ＬのＥＤＴＡを含む）を含む、１０．０Ｌの増殖培地を、温度３０℃にした。
【０１３６】
この発酵槽に、ＬＢ、１％グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む振盪フラスコ中で増殖させた、（ｐＧＤＨＳ０６またはｐＧＤＨＭ０２）の対数増殖後期培養物を、６００ｎｍにおける開始光学密度（ＯＤ６００）０．５〜２．０まで接種した。この発酵槽を、５００〜１５００ｒｐｍにて攪拌し、そして空気を、１．０〜１５．０Ｌ／分にて発酵容器に供給し、そして培養物のｐＨを、２０％ｖ／ｖ水酸化アンモニウムの添加により７．０にて制御した。培養物がＯＤ６００  ４．０に達した後に、温度を２５℃まで低下させ、そしてグルコースデヒドロゲナーゼの発現を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を最終濃度１ｍＭまで添加することにより、誘導した。培養物を、さらに１５時間増殖させた。この誘導の後、細胞を遠心分離により採集し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。細胞ペーストを、下流回収プロセスにおいて直接使用したか、または使用するまで−８０℃にて保存した。
【０１３７】
（（４）ギ酸デヒドロゲナーゼ）
通気攪拌発酵槽において、３．５ｇ／ＬのＮａＮＨ４ＨＰＯ４／４Ｈ２Ｏ、７．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏおよび３．７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４（Ｌａｇｅｖｅｅｎら、１９８８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：２９２４（１９８８）参照）、２ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、０．５２８ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０、５ｍｌ／ＬのＲ２微量元素（Ｒｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９０  ３４：７７参照）、２０ｍｌ／Ｌの１０％酵母抽出物水溶液、５ｍｌ／Ｌ  １Ｍ  ＭｇＳＯ４、および４０ｍｌ／Ｌの５０％グルコース水溶液を含む、１０．０Ｌのオートクレーブ済み最小培地を、添加した。この培地の温度を、温度３０℃にした。
【０１３８】
クロラムフェニコールを、濃縮ストック溶液から、最終濃度３０μｇ／ｍｌまで添加した、この発酵槽を、Ｒ２微量元素溶液（ｐＨ７．０）、０．２％酵母抽出物、１％グルコース、および３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む、上記最小培地を含む振盪フラスコ中で増殖させた、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ｐＦＤＨＰｓ３またはＰＦＤＨＣｂ１３）の一晩培養物を、６００ｎｍにおける開始光学密度（ＯＤ６００）０．０４〜１．０まで接種した。空気を、５．０Ｌ／分にて発酵容器に供給し、そして培養物のｐＨを、水酸化カリウム濃縮水溶液を使用して７．０にて維持した。この培養物をＯＤ６００  １２〜１５まで増殖させ、その時点で、５０％グルコース、６％塩化アンモニウムおよび０．５％の硫酸マグネシウムの供給溶液を、３０〜４０％の空気飽和の最終溶存酸素濃度を生じる速度にて開始した。供給ポンプ速度を、気流速度１０Ｌ／分および攪拌速度６００ｒｐｍにて発酵槽中の溶存酸素が約３０％で維持されるように、制御した。培養物がＯＤ６００  １５に達して供給レジメンに２〜３時間曝露された後に、ギ酸デヒドロゲナーゼの発現を、１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより、誘導した。培養物を、さらに８〜１８時間増殖させた後、培養物を遠心分離により採集した。
【０１３９】
（実施例３：酵素調製）
（（１）ケトレダクターゼ）
細胞ペーストを、１容量の湿重量の細胞ペーストを３容量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／硫酸（ｐＨ７．２）中に懸濁し、その後、Ｓｏｒｖａｌ  １２ＢＰ中で５０００ｇにて４０分間遠心分離することによって、洗浄した。洗浄した細胞ペーストを、２容量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／硫酸（ｐＨ７．２）中に懸濁した。細胞内ＫＲＥＤを、最初の通過のために圧力１４，０００ｐｓｉｇを使用し２回目の通過のために圧力８，０００ｐｓｉｇを使用してこの懸濁物をホモジナイザーに２回通過させることにより、細胞から放出させた。溶解物を室温まで加温し、その後、１０％ｗ／ｖのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液（ｐＨ７．２）を、最終ＰＥＩ濃度０．７５％まで溶解物に添加し、３０分間攪拌した。処理したホモジネートを、Ｂｅｃｋｍａｎ実験室遠心機中で１０，０００ｒｐｍにて６０分間遠心分離した。上清をデカントし、浅い容器中に分配し、−２０℃にて凍結し、そして凍結乾燥した。
【０１４０】
（（２）グルコースデヒドロゲナーゼ）
細胞ペーストを、１容量の湿重量の細胞ペーストを３容量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／硫酸（ｐＨ７．２）中に懸濁し、その後、Ｓｏｒｖａｌ  １２ＢＰ中で５０００ｇにて４０分間遠心分離することによって、洗浄した。洗浄した細胞ペーストを、２容量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／硫酸（ｐＨ７．２）中に懸濁した。細胞内ＨＨＤＨを、最初の通過のために圧力１４，０００ｐｓｉｇを使用し２回目の通過のために圧力８，０００ｐｓｉｇを使用してこの懸濁物をホモジナイザーに２回通過させることにより、細胞から放出させた。ホモジネートを、Ｂｅｃｋｍａｎ実験室遠心機中で１０，０００ｒｐｍにて６０分間遠心分離した。上清をデカントし、浅い容器中に分配し、−２０℃にて凍結し、そして凍結乾燥した。
【０１４１】
（（３）ハロヒドリンデハロゲナーゼ）
細胞ペーストを、１容量湿重量の細胞ペーストを３容量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／硫酸（ｐＨ７．２）中に懸濁し、その後、Ｓｏｒｖａｌ  １２ＢＰ中で５０００ｇにて４０分間遠心分離することによって、洗浄した。洗浄した細胞ペーストを、２容量の１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ／硫酸（ｐＨ７．２）中に懸濁した。細胞内ＨＨＤＨを、最初の通過のために圧力１４，０００ｐｓｉｇを使用し２回目の通過のために圧力８，０００ｐｓｉｇを使用してこの懸濁物をホモジナイザーに２回通過させることにより、細胞から放出させた。細胞溶解物を、ホモジナイザーを通す通過の間に４℃まで冷却させた。ホモジネートを、Ｂｅｃｋｍａｎ実験室遠心機中で１０，０００ｒｐｍにて６０分間遠心分離した。上清をデカントし、浅い容器中に分配し、−２０℃にて凍結し、そして凍結乾燥した。
【０１４２】
発酵後の調製物の品質を評価するために、発現したハロヒドリンデハロゲナーゼ酵素を含む細胞溶解物を、以下のプロトコルに従ってアッセイした。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣＮ，ｐＨ８．０中の清澄化した細胞溶解物約５０μｌを、１０ｍＭのエチル−（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯまたは本明細書中に記載されるケトレダクターゼ触媒法に従って調製）と混合した。総反応容量は、０．２ｍｌであった。この反応物を、室温にて３０分間〜１時間インキュベートした。この反応物を、７容量の酢酸エチルで抽出し、有機層を１．８ｍｌ  ＧＣバイアルに取り出した。この有機層を、エチル−（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート生成物の存在についてＧＣにより分析した。生成した生成物の量を、調製した標準曲線との比較により決定し、同じ条件下で分析した。
【０１４３】
（（４）ギ酸デヒドロゲナーゼ）
発現したギ酸デヒドロゲナーゼを含む細胞溶解物を、１容量の１００ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．０）中に細胞ペーストを４℃にてホモジナイゼーションすることによって、調製した。細胞溶解物を、ホモジナイザーを通す間に４℃まで冷却させた。細胞溶解物を、４℃にて遠心分離によって清澄化した。清澄化した溶解物を、実施例４に記載したようにアッセイした。
【０１４４】
（実施例４．酵素活性の特徴付け）
（ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ））
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中のエチル−４−クロロ−３−ケト酪酸エステルの溶液に、同じ緩衝液中に予め溶解した溶液としてケトレダクターゼ酵素を添加した。この反応を、ＮＡＤＰＨ（最終１ｍＭ）を添加することにより開始し、反応の経過を、３４０ｎｍでの吸光度の減少を測定することにより追跡した。この吸光度は、ＮＡＤＰＨ濃度に対応する。結果を、吸光度単位（ＮＡＤＰＨ）  対  時間としてプロットし、プロットの傾き（吸光度単位／分）を決定した。吸光度  対  時間  プロットの傾きを、ＮＡＤＰＨの吸光係数を使用して濃度単位へと変換し、ケトレダクターゼの活性を、μｍｏｌ（生成したＮＡＤＰＨ）／分／ｍｇ（総ケトレダクターゼ触媒）にて決定した。この測定はまた、ＮＡＤＰＨについて３４０ｎｍの励起を使用する蛍光検出を使用して実施し得、放出を４５５ｎｍにて測定した。目的の他の基質で、エチル４−クロロ−３−ケト−酪酸エステルを置換して、他の基質に関するケトレダクターゼ活性を評価し得る。
【０１４５】
（（２）グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ））
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の５０ｍＭグルコースの溶液に、同じ緩衝液中に予め溶解した溶液としてグルコースデヒドロゲナーゼ酵素を添加した。この反応を、ＮＡＤＰＨ（最終１ｍＭ）を添加することにより開始し、反応の経過を、３４０ｎｍでの吸光度の増加を測定することにより、または蛍光（励起３４０ｎｍ、放出４５５ｎｍ）の増加を測定することにより、追跡した。結果を、吸光度単位（ＮＡＤＰＨ）  対
時間としてプロットし、プロットの傾き（吸光度単位／分）を決定した。吸光度  対  時間  プロットの傾きを、ＮＡＤＰＨの吸光係数を使用して濃度単位へと変換し（上記（１）参照）、グルコースデヒドロゲナーゼの活性を、μｍｏｌ（消費したＮＡＤＰＨ）／分／ｍｇ（総グルコースデヒドロゲナーゼ触媒）にて決定した。
【０１４６】
（（３）ハロヒドリンデハロゲナーゼ（ＨＨＤＨ））
３００ｍＭリン酸カリウム中のエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸（１０ｍＭ）溶液、３００ｍＭ  ＮａＣＮ緩衝液（ｐＨ８．０）に、同じ緩衝液中に予め溶解した溶液としてハロゲンデヒドロゲナーゼ酵素を添加した。経時的に、この混合物のアリコートを取り出し、３容量の酢酸エチルで抽出した。その後、その有機層を、下記実施例６において記載されるように、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析した。サンプルを種々の時点で採取し、生成物であるシアノヒドリン，エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸のピーク面積を、時間の関数としてプロットした。ピーク面積を、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸について調製した標準曲線を使用して、濃度単位へと変換した。ハロヒドリンデハロゲナーゼの活性を、μｍｏｌ（生成したシアノヒドリン）／分／ｍｇ（総ハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒）の単位で決定した。目的の他の求核試薬および／または基質でシアン化物を置換して、他の求核試薬および／または基質に関してハロヒドリンデハロゲナーゼ活性を評価し得る。
【０１４７】
（（４）ギ酸デヒドロゲナーゼ）
１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）中の１５０ｍＭギ酸溶液に、同じ緩衝液中に予め溶解した溶液としてギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を添加した。この反応を、ＮＡＤの添加（最終２ｍＭ）により開始し、反応の経過を、３４０ｎｍでの吸光度の増加を測定することにより、または蛍光（励起３４０ｎｍ、放出４５５ｎｍ）の増加を測定することにより、追跡した。結果を、吸光度単位（ＮＡＤＨ）  対  時間としてプロットし、プロットの傾き（吸光度単位／分）を決定した。吸光度  対  時間  プロットの傾きを、ＮＡＤＨの吸光係数を使用して濃度単位へと変換し（上記（１）参照）、ギ酸デヒドロゲナーゼの活性を、μｍｏｌ（生成したＮＡＤＨ）／分／ｍｇ（総ギ酸デヒドロゲナーゼ触媒）にて決定した。
【０１４８】
（実施例５：エチル４−クロロアセトアセテートからの（エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートを経由する）エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートの調製）
室温の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７）の十分に攪拌した溶液（１Ｌ）に、グルコース（１６０ｇ、８３０ｍｍｏｌｅ、１．１当量）を添加した。これに、ケトレダクターゼ（配列番号２）（０．９ｇ）、グルコースデヒドロゲナーゼＳ０６（配列番号１０）（０．５ｇ）およびＮＡＤＰ（０．５ｇ）を、凍結乾燥粉末として添加した。一旦溶解すると、酢酸エチル（５００ｍＬ）を添加してエマルジョンを形成させた。このエマルジョンに、酢酸ブチル（５００ｍＬ）中のエチル４−クロロアセトアセテート（１００ｇ、６０８ｍｍｏｌｅ）の溶液を、３時間にわたって滴下した。そのｐＨを、Ｎａ２ＣＯ３（水中２Ｍ、合計約１６０ｍＬ）を供給する自動滴定器により、６．８と７との間に維持した。４０時間後、塩基の自動添加を停止した。ガスクロマトグラフィーによって、残留出発物質は存在しなかった。これらの層を分離し、水相を、酢酸エチル（５００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機物を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてロータリーエバポレーターでエバポレートして、本質的に純粋な（約９７％の）エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートを得た。
【０１４９】
３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、３００ｍＭ  ＮａＣＮ  ｐＨ８．０中のエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（８．２５ｇ、５０ｍｍｏｌｅ）の十分に攪拌した溶液（１Ｌ）（３０℃）に、ハロヒドリンデハロゲナーゼ（配列番号１４）（９ｇ）を、凍結乾燥粉末として添加した。５７時間後、混合物を酢酸エチルで（２５０ｍＬで２回）洗浄し、合わせた有機物を、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。混合物を濾過し、ロータリーエバポレーターにてエバポレートして、ガスクロマトグラフィー法および本明細書中以下の実施例６に記載される溶出時間のデータを使用して決定すると、本質的に純粋なエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートを得た。
【０１５０】
この実施例は、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル（エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート）をハロヒドリンデハロゲナーゼおよびシアン化物（シアン化塩であるＮａＣＮにより提供される）と接触させることによって、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステル（エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート）が生成される本発明のプロセスを示す。本実施例はさらに、４−ハロ−３−ケト酪酸エステル（エチル４−クロロアセトアセテート）をケトレダクターゼ、補因子（ＮＡＤＨにより提供されるＮＡＤＰＨ）および補因子再生系（グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼ）と接触させることによって、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルが提供される本発明のプロセスを示す。本実施例はさらに、アキラルエチル４−クロロアセトアセテートからの非ラセミキラルエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートを、高価な精製手順を伴わずに、高い収量かつ高純度で全体的に生成することを示す。
【０１５１】
（実施例６：エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートの特徴付け）
実施例５において生成したエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−５カラム、３０ｍ長、０．２５μｍ内径を使用し、以下のプログラムを使用する、水素炎イオン化（ＦＩＤ）検出によるガスクロマトグラフィーを使用して分析した：１００℃にて１分間、５℃／分を１０分間；２５℃／分を２分間；その後、２００℃にて２分間。入口温度および出口温度は、両方とも３００℃であった。流量は、２ｍｌ／分であった。これらの条件下で、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートは、６．２５分で溶出し、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートは、４．５分で溶出し、エチル４−クロロアセトアセテートは、４．１分で溶出する。
【０１５２】
上記の種の化学純度を、ガスクロマトグラフィーの結果からの積分したピーク面積を使用して測定した。
【０１５３】
エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートに関するハロヒドリンデハロゲナーゼ（ＨＨＤＨ）のエナンチオ選択性を、Ｒｅｓｔｅｋ  ｇａｍｍａＤｅｘ  ＳＡカラム（３０ｍ長、０．３２μｍ内径）を使用し、以下のプログラムを使用する、ガスクロマトグラフィーおよびＦＩＤ検出によって測定した：１６５℃にて２５分間および流量２ｍｌ／分。入口温度および出口温度は、両方とも、２３０℃であった。これらの条件下で、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートは、１９．６分で溶出し、エチル（Ｓ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートは、１９．２分で溶出する。
【０１５４】
（実施例７；エチル４−クロロアセトアセテートからのエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートの調製）
機械的攪拌器を備え、ｐＨ電極による自動滴定器および塩基添加用供給チューブに接続された、３首ジャケット付き３Ｌフラスコに、トリエタノールアミン（６．６ｍＬ）およびＨ２Ｏ（４９２ｍＬ）を充填して、１００ｍＭトリエタノールアミン溶液を生成した。そのｐＨを、３７％ＨＣｌを用いて７に調整した。その後、Ｄ−グルコース（１２５ｇ）を添加した。フラスコジャケットに循環する水を、３０℃に設定した。１０分間後、ケトレダクターゼ（配列番号２）（５．７ｇ）およびグルコースデヒドロゲナーゼＳ０６（配列番号１０）（３．１ｇ）の粉末を、添加した。１０分間後、β−ＮＡＤ（１２５ｇ）を添加し、生じた混合物を、５分間攪拌させた。その後、酢酸ブチル（２５０ｍＬ）を充填した。添加漏斗を使用して、２．４Ｍのエチル４−クロロアセトアセテート（２５０ｍＬ、酢酸ブチル１６７ｍＬ中１００ｇ）を、３時間かけてゆっくり添加した。そのｐＨを、自動滴定器により２ＭのＮａ２ＣＯ３（１５２ｍＬ）を１５時間かけて添加することによって、７に維持した。セライト（１６ｇ）を添加し、反応混合物を１０分間攪拌させた。その溶液をセライトパッドに通して濾過し、有機層を分離した。水層を酢酸ブチル（２×２００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、溶媒をロータリーエバポレーションにより真空下で除去して、８７ｇのエチル（Ｓ）４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートを得た。エナンチオマー過剰は、実施例８においてそれをエチル（Ｒ）−シアノ−３−ヒドロキシブチレートに変換した後に決定すると、＞９９％であった。
【０１５５】
（実施例８：エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの調製
機械撹拌機を備え、ｐＨ電極および塩基の添加のための供給管によって自動滴定装置に接続した３つ首ジャケット付き３Ｌフラスコに、Ｈ２Ｏ（１２００ｍＬ）、ＮａＣＮ（３７．２５ｇ）およびＮａＨ２ＰＯ４（１２５ｇ）をチャージし、溶液をｐＨ７にした。水循環器を４０℃に設定した。１０分後、ハロヒドリンデハロゲナーゼ配列番号３２を細胞可溶化物（２５０ｍＬ）として加えた。反応混合物を、５分間撹拌した。添加漏斗を用い、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラート（実施例７からの物質４５ｇ）をゆっくりと１時間にわたって加えた。自動滴定機による１０Ｍ  ＮａＯＨ（２７ｍＬ）の１７時間にわたる添加によって、ｐＨを７に維持した。その後、反応サンプルのガスクロマトグラフィーにより、生成物への完全な変換が見られた。セライト（１６ｇ）をフラスコに加え、次いで、ダイアフラムに接続し、その排気を５Ｍ  ＮａＯＨ（２００ｍＬ）中で泡立て、ＨＣＮを除去した。この混合物を、１００ｍｍ  Ｈｇの圧力下で６０℃まで過熱した。１時間後、水中の空気バブラーを溶液に加え、ＨＣＮの除去を補助した。３時間後、ＨＣＮ検出器は、着たい廃棄物中５ｐｐｍ  ＨＣＮ未満を示した。この混合物を、室温まで冷却し、次いでセライトのパッドを通して濾過した。濾液を酢酸ブチル（３×８００ｍＬ）で抽出し、そして合わせた有機層を、活性炭のパッドを通して濾過した。この溶媒を、回転蒸発により真空化で除去し、２８．５ｇのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートを得た。純度は、ＨＰＬＣで９８％（ｗ／ｗ）であり、鏡像異性の過剰は＞９９％であった（キラルＧＣにより、Ｓ鏡像異性体は検出されなかった）。
【０１５６】
（実施例９：エチル４−クロロ−アセトアセテートからのエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートの調製）
ｐＨ電極および塩基の添加のための供給管によって自動滴定機に接続した１００ｍＬ容器に、１００ｍＭトリエタノールアミンｐＨ７緩衝液中グルコース（７．５ｇ）溶液をチャージした。この溶液に、ケトレダクターゼ配列番号４２（１００ｍｇ）；５０ｍｇ  ＧＤＨ配列番号６６およびＮＡＤＰ（６．２５ｍｇ）をチャージした。次いで、酢酸ブチル（１０ｍｌ）をチャージした。次いで、酢酸ブチル（１０ｍｌ）中エチル４−クロロアセトアセテート（６ｇ）をチャージした。自動滴定機による４Ｍ  ＮａＯＨ（７．５ｍＬ）の７時間にわたる添加によって、ｐＨを７に維持した。反応混合物のサンプルを、等量の酢酸ブチルで抽出し、そして有機層をＧＣによって分析した。この分析は、エチル４−クロロアセトアセテートからエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートへの９９％の変換を示した。
【０１５７】
（実施例１０：エチル４−クロロ−アセトアセテートからのエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートの調製）
この手順は、４００ｍｇのケトレダクターゼ配列番号４２を使用したことおよびＮＡＤＰの代わりにＮＡＤ＋（１２．５ｍｇ）を添加したことを除き、実施例９の手順と同一であった。自動滴定機によるＮａＯＨ溶液の添加は、１１時間で完了し、そしてＧＣ分析は、エチル４−クロロアセトアセテートからエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートへの９９％の変換を示した。
【０１５８】
（実施例１１：エチル４−クロロ−アセトアセテートからのエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートの調製）
ｐＨ電極および塩基の添加のための供給管によって自動滴定機に接続した１００ｍＬ容器に、水（３０ｍＬ）中グルコース（１２ｇ）溶液をチャージした。この溶液に、ケトレダクターゼ配列番号４２（１００ｍｇ）；５０ｍｇＧＤＨ配列番号６６およびＮＡＤＰ（６．２５ｍｇ）をチャージした。次いで、酢酸ブチル（１０ｍｌ）をチャージした。次いで、エチル４−クロロアセトアセテート（１０ｇ）を、以下のシリンジポンプを介してチャージした：１ｍＬを迅速にチャージし、次いで残りをａｎｄｔｈｅ１ｍＬ／時間の速度でチャージした）。自動滴定機による４Ｍ  ＮａＯＨの１８時間にわたる添加によって、ｐＨを７に維持した。撹拌を止め、そして相を分離させた。有機層は、幾らかのエマルジョンを含んだ。この有機層（幾らかのエマルジョンを含む）を、分離し、そして１０ｍＬの水で洗浄した。合わせた水層を、２０ｍＬの酢酸ブチルで２度抽出した。この有機抽出物を合わせ、そして減圧下で回転蒸発し、水を除去した。さらなる酢酸ブチルを、蒸発の間に添加し、水の除去を補助した。水が除去されたとき、酢酸ブチル溶液を固体からフラスコにデカントした。次いで、減圧下での溶媒の蒸発は、非常に純度の高い８．８５ｇのエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラート（収率８７．４％）を生じた。
【０１５９】
（実施例１２：エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの調製）
ｐＨ電極および塩基の添加のための供給管によって自動滴定機に接続した１７０ｍＬ容器に、ＮａＣＮ（１．５ｇ，３１ｍｍｏｌ）および水（５０ｍＬ）をチャージした。この容器を密封し、そしてヘッドスペースを窒素で脱気した。濃Ｈ２ＳＯ４（０．９ｍＬ）の添加により、ｐＨを７に調整した。この反応混合物を、４０℃まで過熱し、そしてハロヒドリンデヒドロゲナーゼ配列番号３２の溶液（４２μＬの１４Ｍ  β−メルカプトエタノール含有水１０ｍＬ中１．２ｇ）で処理した。次いで、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラート（１．８ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して添加した。自動滴定機による２Ｍ  ＮａＯＨの添加により、ｐＨを７で維持した。１５時間後、反応は完了し、計４．６ｍＬの２Ｍ  ＮａＯＨを加えた。反応混合物のサンプルを、等量の酢酸ブチルで抽出した。有機抽出物のＧＣ分析は、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートへの変換が＞９９％であったことを示した。
【０１６０】
（実施例１３：エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの調製）
この手順は、２Ｍ  ＮａＯＨの代わりに４Ｍ  ＮａＣＮを塩基として使用したことを除き、実施例１２の手順と同一であった。８時間後、反応は完了し、計２．３ｍＬの４Ｍ  ＮａＣＮを加えた。ＧＣ分析により、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートへの変換は＞９９％であったことを示した。
【０１６１】
この実施例は、アルカリシアン化物を塩基として使用する本発明のプロセスが、反応混合物定数のｐＨおよびシアン化物濃度の両方を維持することを示す。
【０１６２】
（実施例１４：エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからのエチル−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの調製）
ｐＨ電極および塩基（７．５Ｍ  ＮａＯＨ）の添加のための供給管によって自動滴定機に接続した２５０ｍＬ容器に、水（８３．５ｍＬ）および０．７ｇのハロヒドリンデハロゲナーゼ配列番号２４をチャージした。この混合物を３０分間撹拌した。滴定機を活性化させ、そしてｐＨ７を維持するように設定した。次いで、ＨＣＮ  ２５％水溶液（９．２６ｍｌ、８．６ｇ）を、２０分間に渡ってチャージし、２．３％  ＨＣＮ溶液を作製した。この混合物を４０℃で１０分間過熱し、次いでエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラート（５ｇ）を１時間に渡ってチャージした。自動滴定機による２Ｍ  ＮａＯＨの添加により、ｐＨを７で維持した。２０時間後、反応サンプルの酢酸ブチル抽出物のＧＣ分析は、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートへの変換が９５％であったことを示した。
【０１６３】
この実施例は、シアン化物の供給源としてシアン化水素水溶液を用いた本発明の過程を示す。
【０１６４】
（実施例１５：エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの調製）
２０ｍＬスクリューキャップ容器に、ＮａＣＮ（２５０ｍｇ）およびＮａＨ２ＰＯ４（８３０ｍｇ）を添加した。水（１０ｍＬ）を加え、その後ハロヒドリンデハロゲナーゼ配列番号３２を凍結乾燥粉末（２００ｍｇ）で加えた。次いで、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラート（３００ｍｇ）を加えた。容器にふたをし、湯浴中で４０℃で加熱した。４時間後、反応サンプルの酢酸ブチル抽出物のＧＣ分析は、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートへの５４％の変換を示した。７２時間後、ＧＣ分析は、変換の完了を示した。
【０１６５】
（実施例１６：エチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからのエチル（Ｓ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの調製）
この手順は、（Ｓ）−鏡像異性体の代わりにエチル４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートの（Ｒ）−鏡像異性体を反応させたことおよび全ての反応成分の量を半分にしたこと除き、実施例１５の手順と同一であった。１時間の反応時間後、ＧＣ分析は、エチル（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからエチル（Ｓ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートへの５５％変換を示した。
【０１６６】
前の実施例と組み合わせて、この実施例は、本発明のプロセスが、ヒドロキシ酪酸エステルのいずれかの鏡像異性体を、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの対応する鏡像異性体に変換するために使用し得ることを示す。
【０１６７】
（実施例１７：メチル４−クロロ−アセトアセテートからのメチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートの調製）
この手順は、エチル４−クロロアセトアセテートの代わりに等モル量のメチル４−クロロアセトアセテートを反応させたことおよび使用した酵素がケトレダクターゼ配列番号５０およびグルコースデヒドロゲナーゼ配列番号６２であったことを除き、実施例９の手順と同一であった。この反応は、１１時間で完了し、そしてＧＣ分析は、＞９９％のメチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートを示した。生成物を酢酸ブチルへの抽出によって単離し、そして溶媒蒸発およびその同一性を１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲによって確認した。
【０１６８】
（実施例１８：メチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからのメチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの調製）
この手順は、エチル（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートの代わりに等モル量のメチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラート（実施例１７で調製）を反応させたことを除き、実施例１６の手順と同一であった。１時間の反応時間後、ＧＣ分析はメチル（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからメチル（Ｓ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートへの３８％の変換を示した。この生成物を、１Ｈおよび１３Ｃ
ＮＭＲによって特徴付けた。
【０１６９】
（実施例１９：エチル（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチラートからのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの調製）
この手順は、エチル（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートの代わりに等モル量のエチル（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチラートを反応させたことを除き、実施例１６の手順と同一であった。１時間の反応時間後、ＧＣ分析はエチル（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチラートからエチル（Ｓ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートへの９０％の変換を示した。この生成物を、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲによって特徴付けた。
【０１７０】
この実施例は、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルのハロ置換基が臭素である、本発明のプロセスを示す。
【０１７１】
（実施例２０：エチルアセトアセテートからのエチル３−ヒドロキシブチラートの調製）
この手順は、メチル４−クロロアセトアセテートの代わりに等モル量のエチルアセトアセテートを反応させたことならびに２００ｍｇのケトレダクターゼ配列番号５０および１００ｍｇグルコースデヒドロゲナーゼ配列番号６２を使用したことを除き、実施例１７の手順と同一であった。反応は６時間で完了した。生成物を、酢酸ブチル中への抽出および溶媒蒸発により単離し、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲによって特徴付けた。
【０１７２】
前の実施例と組み合わせて、この実施例は、本発明の実施形態において、エチルアセトアセテートからエチル３−ヒドロキシブチラートへの還元のための活性を有する酵素であるケトレダクターゼは、４−ハロ−３−ケト酪酸エステルから４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルへの還元のために有用であることを実証する。
【０１７３】
（実施例２１：エチル４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートとシアン化物の酵素的試験反応および非酵素的試験反応のオフプロフィール）
２５ｍｇ／ｍＬシアン化ナトリウムを含む水溶液を、８５％リン酸の添加により、ｐＨメーターでモニタリングしながらｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５およびｐＨ９．０で調製した。ハロヒドリンデハロゲナーゼ配列番号３８（２０ｍｇ）を各容器に添加し、その後エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラート（５０ｍｇ，０．３０ｍモル）を添加した。火酵素的反応実験について、手順は、酵素を省いたことを除き同一であった。容器にふたをし、そして湯浴中で５５℃で３時間加熱し、次いで取り出して室温で冷却した。核反応混合物の０．４ｍＬサンプルを１ｍＬ酢酸ブチルで抽出し、そして抽出物を、ガスクロマトグラフィーで分析した。
【０１７４】
各容器の基質および生成物の分析した量を表Ｉに示し、そしてｐＨに対するグラフを図１に示す。どちらにおいても、クロロヒドリンは、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートを、シアノヒドリンはエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートを，そしてクロトネートはエチル４−ヒドロキシ黒とネートを意味する。表において、ＮＤは、検出されないことを意味する。
【０１７５】
（表Ｉ：ハロヒドリンデハロゲナーゼ使用または不使用で試験反応において分析されたミリモルのクロロヒドリン、シアノヒドリンおよびクロトネート副生成物。実施例２１参照）
【０１７６】
【表１】
2010172348.tif 000031
最終試験反応混合物のｐＨを、再測定した。ハロヒドリンデハロゲナーゼを含有し、ｐＨ７以上である混合物（クロロヒドリンからシアノヒドリンへほぼ変換が完了した混合物）について、最終混合物のｐＨは、最初のｐＨより０．４〜０．６のｐＨ単位下回った。他の混合物は、その最初の値からｐＨにおいてずっと低く示された。
【０１７７】
これらの反応条件および時間におけるデータは、８未満の試験したいかなるｐＨにおいても、シアン化物によるエチル４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートの測定可能な非酵素的反応はなかった。ｐＨ８以上において、シアン化物によりエチル４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートを形成する非酵素的反応は、ｐＨが上昇するにつれ増加し、そしてエチル４−ヒドロキシクロトネート副生成物の形成の増加によって達成された。対照的に、ハロヒドリンデハロゲナーゼによる酵素的反応は、５より高い全ての試験ｐＨで生じ、試験したいかなるｐＨでもエチル４−ヒドロキシクロトネートの測定可能な形成はなかった。さらに、酵素的試験および非酵素的試験の両方について、８より高いｐＨにおけるモルＧＣ分析生成物の総量は、最初に提供された０．３０ｍモルから減少した（エチル４−クロロ−３−ヒドロキシブチラート反応物として）。このことは、８より高いｐＨの上昇により、分析不可能な副産物の形成が増加することを示す。反応物および生成物のエステル基は、８より高いｐＨで次第に加水分解されてカルボン酸基になり、生じたカルボン酸は、ＧＣにより分析された反応混合サンプルの抽出物に抽出されない。実施例２２を参照。
【０１７８】
（実施例２２：エチル４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの非酵素的加水分解）
リン酸水溶液を、４０ｍＬ水中に０．４８ｇのＮａＨ２ＰＯ４を溶解し、そしてｐＨメーターによりモニタリングしながら２Ｍ  ＮａＯＨを添加してｐＨの調整し、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、およびｐＨ９．０で作製した。５ｍＬの各溶液を、別々の２０ｍＬスクリューキャップ容器にチャージした。次いで、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラート（４６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を添加した。この容器にふたをし、そして湯浴中で５５℃で３時間加熱し、そして室温で冷却した。０．４ｍＬの各反応混合物を、１ｍＬの酢酸ブチルで抽出し、この抽出物を、ＧＣによって分析した。外部標準のために、二連のｐＨ７．０混合物を、新しく調製し、そしてただちに抽出した。各容器中のエチル４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの分析した量を、表ＩＩに示す。その加水分解の産物は、反応サンプル抽出物中に検出されなかった。このエステルの加水分解のカルボン酸生成物が、ＧＣによって分析された抽出物中に抽出されないことは、別々に確立された。
【０１７９】
（表ＩＩ：試験加水分解反応において分析したミリモルのクロロヒドリンおよびシアノヒドリン。実施例２２を参照）
【０１８０】
【表２】
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最終試験混合物のｐＨを、再測定した。最初のｐＨが各々８．０、８．５、および９．０である混合物は、７．４の最終ｐＨを有した。最初のｐＨが７．５である混合物は、７．３の最終ｐＨを有し、そして最初のｐＨが７である混合物は、変わらなかった。高いｐＨサンプルにおいてカルボン酸の生成が起きる事実は、リン酸緩衝化範囲における溶液の中和をもたらす。
【０１８１】
この実施例は、実施例２１と共に、８より高いｐＨにおいてｐＨの上昇につれてエチル４−シアノ−３−ヒドロキシ−ブチラートが加水分解されることを示し、ここでエチル４−シアノ−３−ヒドロキシ−ブチラートは、エチル４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートのシアン化物による非酵素的反応によって生成される。
【０１８２】
（実施例２３：エチル４−クロロアセトアセテートからのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの調製（エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートを介する））
ｐＨ電極および塩基（４Ｍ  ＮａＯＨ）の添加のための供給管によって自動滴定機に接続した１００ｍＬ容器に、１００ｍＭトリエタノールアミンｐＨ７緩衝液中グルコース（７．５ｇ）溶液（２５ｍＬ）をチャージした。この溶液に、ケトレダクターゼ配列番号５０（５０ｍｇ）；５０ｍｇ  グルコースデヒドロゲナーゼ配列番号６２およびＮＡＤＰ（１．５ｍｇ）をチャージした。次いで、さらなる酢酸ブチル（１０ｍｌ）中酢酸ブチル（１０ｍｌ）およびエチル４−クロロアセトアセテート（６ｇ）をチャージした。自動滴定機による４Ｍ  ＮａＯＨの撹拌混合物への１３時間にわたる添加によって、ｐＨを７に維持した。次いで、相を３０分間分離させ、そしてエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラート中間体を含む有機層（２５ｍＬ）を取り出した。
【０１８３】
ｐＨ電極および塩基（２Ｍ  ＮａＯＨ）の添加のための供給管によって自動滴定機に接続した１７０ｍＬ容器に、シアン化ナトリウム（１．５ｇ）をチャージし、続いて水（５０ｍＬ）をチャージした。この容器を密封し、そしてヘッドスペースを窒素で脱気した。濃Ｈ２ＳＯ４（０．９ｍＬ）の添加により、ｐＨを７に調整した。この反応混合物を、４０℃まで過熱し、そしてハロヒドリンデヒドロゲナーゼ配列番号３２の溶液（４２μＬの１４Ｍ  β−メルカプトエタノール含有水１０ｍＬ中１．２ｇ）で処理した。次いで、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートを、シリンジを介して添加した。撹拌混合物への自動滴定機による２Ｍ  ＮａＯＨの添加により、ｐＨを７で維持した。示したように、１５時間後、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートからエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートへの変換は、計５ｍＬの塩基の添加により、３３％であった（完全な変換に１５ｍＬ必要であると予測される）。
【０１８４】
（実施例２４：エチル４−クロロアセトアセテートからのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートの調製（エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートを介する））
２０ｍＬの容器に、ＮａＨ２ＰＯ４（４１５ｍｇ、３．４６ｍｍｏｌ）およびグルコース（７５０ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）を加えた。水（５ｍＬ）を加え、その後ＮＡＤＰ（２ｍｇ）、ケトレダクターゼ配列番号５６（５０ｍｇ）、グルコースデヒドロゲナーゼ配列番号６２（５０ｍｇ）、およびハロヒドリンデハロゲナーゼ配列番号３２（１００ｍｇ）を加えた。次いで、０．５ｍＬ酢酸ブチル中エチル４−クロロ−アセトアセテート（２４ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。この容器にふたをし、油浴中で３０℃で加熱した。１時間後、反応サンプルの酢酸ブチル抽出物のＧＣ分析は、エチル４−クロロ−アセトアセテートからエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチラートへの１００％の変換を９６％の選択性で、そしてエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラートを４％の選択性で示した。次いで、反応容器を、４０℃で１５時間過熱した。次いで、酢酸ブチル抽出物のＧＣ分析は、２％のエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ−ブチレート残渣を、開始エチル４−クロロアセテートに基づき、全体でエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチラート収率９８％で示した。
【０１８５】
この実施例は、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステル（エチル４−シアノ−３−（Ｒ）−ヒドロキシブチラート）が、中間４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル（エチル４−クロロ−３−（Ｓ）−ヒドロキシブチラート）を介して、４−ハロ−３−ケト酪酸エステル（エチル４−クロロアセトアセテート）の、ケトレダクターゼ、補因子（ＮＡＤＰとして提供されるＮＡＤＰＨ）、補因子再生成系（グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼ）、ハロヒドリンデハロゲナーゼ、およびシアン化物（シアン化物塩ＮａＣＮによって提供される）との接触により生成され、全ての反応物が、反応混合物中で同時に提示される、本発明のプロセスを示す。
【０１８６】
全ての刊行物、特許、特許出願および本明細書中に挙げた他の文献は、本明細書によりその全体が、各々独立の刊行物、特許出願または特許が、その全体が個別に全ての目的で参考として援用されることを示されるのと同じ程度に、本明細書中で全ての目的で参考として援用される。
【０１８７】
本発明の好ましい実施形態が説明および記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変が種々の改変がなされ得ることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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