(57)【要約】【課題】簡便な操作で液体中の磁性微粒子を十分に分散させることができる磁性微粒子含有液の撹拌方法、該撹拌方法を適用した標的物質の分析方法、該分析方法への使用に好適な、前記撹拌方法を適用した表面修飾磁性微粒子の製造方法の提供。【解決手段】容器４外に第一の磁気発生手段７１を配置し、容器４内の液体４０中において、磁性微粒子１を捕捉して、所定箇所に集合させ、容器４外の、第一の磁気発生手段７１の配置箇所とは異なる箇所に、第二の磁気発生手段７２を配置し、容器４内の液体４０中において、磁性微粒子１を捕捉して、その一部を前記集合箇所から移動させ、全ての磁性微粒子１が移動する前に、容器４中の液体４０を撹拌する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器中の磁性微粒子含有液の撹拌方法であって、
前記容器外に第一の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、所定箇所に集合させる工程と、
前記容器外の、前記第一の磁気発生手段の配置箇所とは異なる箇所に、第二の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、その一部を前記集合箇所から移動させる工程と、
全ての磁性微粒子が移動する前に、容器中の液体を撹拌する工程と、
を有することを特徴とする磁性微粒子含有液の撹拌方法。
【請求項２】
前記磁性微粒子を集合させる工程と、前記磁性微粒子を移動させる工程との間に、さらに、
前記磁性微粒子を捕捉したまま、容器内の液体を除去する工程と、
液体が除去された容器内に、液体を添加する工程と、
を有することを特徴とする請求項１に記載の磁性微粒子含有液の撹拌方法。
【請求項３】
前記磁性微粒子を移動させる工程の直前に、
さらに、前記第一の磁気発生手段を容器から離間させ、磁性微粒子の捕捉を解除する工程を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の磁性微粒子含有液の撹拌方法。
【請求項４】
前記磁性微粒子の液体中における移動距離が最大となるように、前記第二の磁気発生手段を配置することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の磁性微粒子含有液の撹拌方法。
【請求項５】
検出対象である標的物質と、該標的物質と特異的に結合する特異的結合部を表面に備えた磁性微粒子とを、容器内の液体中で混合する混合工程と、
前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質を検出する検出工程と、
を有する標的物質の分析方法であって、
前記混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする標的物質の分析方法。
【請求項６】
前記混合工程が、前記標的物質と、前記磁性微粒子と、前記標的物質と特異的に結合してこれを標識する、特異的標識物質とを容器中で混合する工程であり、
前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質に結合した特異的標識物質のシグナルを検出する工程であることを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法。
【請求項７】
前記混合工程が、前記標的物質と、前記磁性微粒子とを容器中で混合する第一混合工程と、該第一混合工程で得られた混合液に、前記標的物質と特異的に結合してこれを標識する、特異的標識物質を混合する第二混合工程とを有し、
前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質に結合した特異的標識物質のシグナルを検出する工程であり、
前記第一混合工程及び／又は第二混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法。
【請求項８】
前記混合工程が、前記標的物質と、前記磁性微粒子と、前記標的物質が標識された標識標的物質とを容器中で混合する工程であり、
前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標識標的物質のシグナルを検出する工程であることを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法。
【請求項９】
前記標的物質、特異的標識物質又は標識標的物質が発光酵素で標識されたものであり、
前記混合工程において、さらに該発光酵素が作用する発光基質を最後に添加し、
前記検出工程において、前記発光酵素に由来する発光シグナルを検出することを特徴とする請求項５〜８のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法。
【請求項１０】
磁性微粒子の表面と反応し得る修飾物質と、前記磁性微粒子とを反応させる表面修飾磁性微粒子の製造方法であって、
前記修飾物質及び磁性微粒子を、容器内の液体中で混合する混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする表面修飾磁性微粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性微粒子含有液の撹拌方法、並びに該撹拌方法を適用した標的物質の分析方法及び表面修飾磁性微粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学、薬学、化学の分野では、薬品の開発、診断、検体の品質検査等において、免疫反応等の特異性の高い反応を利用して、検出対象の標的物質を検出する技術が利用されている。さらに、検出時の操作を容易にするために、標的物質と特異的に結合するように修飾された磁性微粒子を利用する技術が種々開示されている。この場合は、通常、磁性体を使用して磁性微粒子を捕捉して固液分離を行うが、磁性微粒子を含有する液体の量が微量である場合などは、液体の撹拌が困難で、磁性微粒子を液体中に十分に分散させることが困難になる。これに対して、磁性体を使用して磁性微粒子を液体中で分散させる方法が開示されている（特許文献１参照）。
【０００３】
この方法では、磁性微粒子含有液を充填したマイクロチップに対して、磁力が異なる二つの磁性体を使用する。具体的には、マイクロチップの一面より磁力が大きい方の磁性体を近接させて磁性微粒子を液体中で捕捉した後、この磁性体を離間させ、磁力が小さい方の磁性体を近接させて、そのままの状態でさらに一度離間させた磁力が大きい方の磁性体を再度近接させることで、液体中の磁性微粒子を分散させる。この方法によれば、微小空間においても、磁性微粒子と液体の混合・撹拌を確実に行うことができるとされている。
【特許文献１】特開２００７−１０１３１８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献１に記載の方法では、二つの磁性体の磁力、動作、動作のタイミングを厳密に設定する必要があり、特に、磁性体の動作に伴う五つの工程が存在し、大きな困難が伴うという問題点があった。また、このような厳密な動作設定が必要な方法を実現するために、使用する装置の構成が煩雑となり、高コストになるという問題点があった。さらに、撹拌効率も十分とは言えず、磁性微粒子の分散性にも改善の余地があるという問題点があった。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便な操作で液体中の磁性微粒子を十分に分散させることができる磁性微粒子含有液の撹拌方法、該撹拌方法を適用した標的物質の分析方法、該分析方法への使用に好適な、前記撹拌方法を適用した表面修飾磁性微粒子の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、容器中の磁性微粒子含有液の撹拌方法であって、前記容器外に第一の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、所定箇所に集合させる工程と、前記容器外の、前記第一の磁気発生手段の配置箇所とは異なる箇所に、第二の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、その一部を前記集合箇所から移動させる工程と、全ての磁性微粒子が移動する前に、容器中の液体を撹拌する工程と、を有することを特徴とする磁性微粒子含有液の撹拌方法である。
請求項２に記載の発明は、前記磁性微粒子を集合させる工程と、前記磁性微粒子を移動させる工程との間に、さらに、前記磁性微粒子を捕捉したまま、容器内の液体を除去する工程と、液体が除去された容器内に、液体を添加する工程と、を有することを特徴とする請求項１に記載の磁性微粒子含有液の撹拌方法である。
請求項３に記載の発明は、前記磁性微粒子を移動させる工程の直前に、さらに、前記第一の磁気発生手段を容器から離間させ、磁性微粒子の捕捉を解除する工程を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の磁性微粒子含有液の撹拌方法である。
請求項４に記載の発明は、前記磁性微粒子の液体中における移動距離が最大となるように、前記第二の磁気発生手段を配置することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の磁性微粒子含有液の撹拌方法である。
請求項５に記載の発明は、検出対象である標的物質と、該標的物質と特異的に結合する特異的結合部を表面に備えた磁性微粒子とを、容器内の液体中で混合する混合工程と、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質を検出する検出工程と、を有する標的物質の分析方法であって、前記混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする標的物質の分析方法である。
請求項６に記載の発明は、前記混合工程が、前記標的物質と、前記磁性微粒子と、前記標的物質と特異的に結合してこれを標識する、特異的標識物質とを容器中で混合する工程であり、前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質に結合した特異的標識物質のシグナルを検出する工程であることを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法である。
請求項７に記載の発明は、前記混合工程が、前記標的物質と、前記磁性微粒子とを容器中で混合する第一混合工程と、該第一混合工程で得られた混合液に、前記標的物質と特異的に結合してこれを標識する、特異的標識物質を混合する第二混合工程とを有し、前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質に結合した特異的標識物質のシグナルを検出する工程であり、前記第一混合工程及び／又は第二混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法である。
請求項８に記載の発明は、前記混合工程が、前記標的物質と、前記磁性微粒子と、前記標的物質が標識された標識標的物質とを容器中で混合する工程であり、前記検出工程が、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標識標的物質のシグナルを検出する工程であることを特徴とする請求項５に記載の標的物質の分析方法である。
請求項９に記載の発明は、前記標的物質、特異的標識物質又は標識標的物質が発光酵素で標識されたものであり、前記混合工程において、さらに該発光酵素が作用する発光基質を最後に添加し、前記検出工程において、前記発光酵素に由来する発光シグナルを検出することを特徴とする請求項５〜８のいずれか一項に記載の標的物質の分析方法である。
請求項１０に記載の発明は、磁性微粒子の表面と反応し得る修飾物質と、前記磁性微粒子とを反応させる表面修飾磁性微粒子の製造方法であって、前記修飾物質及び磁性微粒子を、容器内の液体中で混合する混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の撹拌方法で行うことを特徴とする表面修飾磁性微粒子の製造方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、磁性微粒子を液体中の広範囲に渡って分散させることができるので、磁性微粒子が関与する反応を、効率的且つ高い確率で進行させることができる。これにより、標的物質の分析においては、検出感度を向上させることができる。また、表面修飾磁性微粒子の製造においては、磁性微粒子一つあたりの表面修飾率を向上させることができるので、標的物質を一層高感度に検出できる。さらに、液量によらずこれらの優れた効果が得られる。そして、工程数が少なく、条件設定も簡便であり、特殊な機器等も不要なので、短時間且つ低コストで行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
＜磁性微粒子含有液の撹拌方法＞
本発明に係る磁性微粒子含有液の撹拌方法は、容器中の磁性微粒子含有液の撹拌方法であって、前記容器外に第一の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、所定箇所に集合させる工程（以下、集合工程と略記する）と、前記容器外の、前記第一の磁気発生手段の配置箇所とは異なる箇所に、第二の磁気発生手段を配置し、容器内の液体中において、前記磁性微粒子を捕捉して、その一部を前記集合箇所から移動させる工程（以下、移動工程と略記する）と、全ての磁性微粒子が移動する前に、容器中の液体を撹拌する工程（以下、撹拌工程と略記する）と、を有することを特徴とする。
上記のように本発明は、磁気を利用した磁性微粒子の移動と、液体の撹拌とを組み合わせることで、磁性微粒子含有液を短時間で効率的に撹拌し、磁性微粒子を液体中の広範囲に渡って分散させるものである。そして、液量の多量及び微量を問わず、優れた効果が得られる。
【０００９】
本発明の撹拌方法において、「磁性微粒子」とは、単に磁性微粒子自体だけでなく、磁性微粒子表面が化学物質で修飾されたもの等も含むものとする。ここで、「磁性微粒子表面が化学物質で修飾される」とは、共有結合、疎水結合等の分子間引力等により、化学物質が磁性微粒子表面に結合することを指す。
以下、図面を参照しながら、本発明について詳しく説明する。
【００１０】
［集合工程］
図１は、本発明の撹拌方法を説明するための概略図である。
集合工程では、図１（ａ）に示すように、容器４外に第一の磁気発生手段７１を配置し、容器４内の液体４０中において、磁性微粒子１を捕捉して、所定箇所に集合させる。この時、磁性微粒子１は、第一の磁気発生手段７１に近い容器４の内壁面４ａ上又は内壁面４ａ近傍に集合する。なお、ここでは、磁性微粒子１を、多数のものが集まった状態で示している。
【００１１】
ここでは、容器４として、略球状のものを例示しているが、これに限定されず、例えば、角筒状、丸筒状等、所望の形状のものを使用できる。
容器４の材質は、磁性微粒子１の磁気発生手段による捕捉を妨げないものであれば、特に限定されない。好ましいものとして具体的には、各種樹脂、ガラス等が例示できる。例えば、後述するように本発明の撹拌方法を利用して、液体４０中の光シグナルを検出する場合には、透光性の材質であることが好ましい。
【００１２】
磁性微粒子１は公知のもので良いが、好ましいものとして、金属を含む材質からなる微粒子の表面を高分子等でコーティングしたものが例示できる。
金属を含む材質としては、四酸化三鉄（Ｆｅ3 Ｏ4 ）；三酸化二鉄（γ−Ｆｅ2 Ｏ3 ）；各種フェライト；鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロム等の金属；コバルト、ニッケル、マンガン等を含む合金が例示できる。
また、表面をコーティングする高分子等としては、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレート等の疎水性重合体；ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレート等の親水性重合体；２〜４種程度の前記重合体の共重合体等のラテックス；ゼラチン；リポソームが例示できる。
【００１３】
磁性微粒子１の大きさは、目的に応じて適宜調整すれば良い。例えば、本発明の撹拌方法を、後述する標的物質の検出等、微量成分の解析に使用する場合には、粒径が０．１〜１０μｍであることが好ましく、０．５〜５μｍであることがより好ましい。
磁性微粒子１の数は、液体４０の量等に応じて適宜選択すれば良い。
【００１４】
第一の磁気発生手段７１は、磁性微粒子１とは異なる極性を有する強磁性体を使用しても良いし、電磁石を使用しても良い。好ましい強磁性体として具体的には、ネオジウム磁石、フェライト磁石、アルニコ磁石、サマリウムコバルト磁石が例示できる。
第一の磁気発生手段７１の磁力は、液体４０の量等を考慮して適宜調整すれば良い。
第一の磁気発生手段７１は、容器４の外壁面４ｂ近傍又は外壁面４ｂ上に配置することが好ましい。特に、図１に示すように、容器の最下部近傍に配置することが好ましい。
第一の磁気発生手段７１の数は、目的に応じて適宜選択すれば良いが、通常一つで良い。
第一の磁気発生手段７１を配置する時間は、特に限定されないが、全ての磁性微粒子１を集合させるために、３秒以上であることが好ましく、５秒以上であることがより好ましい。
【００１５】
液体４０の量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択すれば良い。例えば、１Ｌ以上のような多量でも良いし、１ｍＬ以下のような微量でも良い。例えば、１Ｌ以上の液量が好適である具体例として、後述するように磁性微粒子表面を修飾物質で修飾する際に、本発明の撹拌方法を適用する場合が挙げられる。１ｍＬ以下の液量が好適である具体例として、後述するように免疫反応等を利用して所望の微量な標的物質を検出する際に、本発明の撹拌方法を適用する場合が挙げられる。従来の方法では、液量によっては磁性微粒子を十分に分散させることができなかったのに対し、本発明の撹拌方法では、液量によらず十分広範囲に分散させることができる。
また、図１では、液体４０が容器４内の空間をほぼすべて満たすように充填されているが、これに限定されず、空隙部を残すようにして充填されていても良い。
【００１６】
図２は、本発明において好適な容器の他の例として、マイクロチップを例示する概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図である。
マイクロチップ１５は微量の液体を取り扱うものであり、二つの注出入口１７，１７によって外部と連通された液体充填部１６が設けられている。注出入口１７，１７は、マイクロチップ１５の上面に開口されている。液体充填部１６は、扁平な略円柱状であり、通常、容量が好ましくは５〜５０μＬ、より好ましくは１０〜２０μＬ程度であり、高さは好ましくは１〜２ｍｍ程度である。また、材質は透光性を有する樹脂が好ましい。
このようなマイクロチップは、液体充填部の容量が微小であるだけでなく、高さが低いため、従来の撹拌方法では特に撹拌効率が低くなってしまう。しかし、本発明の撹拌方法によれば、このような容器を使用しても、短時間で効率的に撹拌できる。
【００１７】
液体４０は、あらかじめ公知の方法で撹拌されたものでも良い。この時の撹拌方法は特に限定されず、液体４０中に撹拌翼等の撹拌手段を設けて撹拌する方法でも良いが、液体４０中に撹拌手段を設ける必要がない方法が好ましく、振動撹拌機、超音波振動機等の加振手段を使用する撹拌方法が特に好ましい。
【００１８】
［移動工程］
移動工程では、図１（ｂ）に示すように、前記容器４外の、前記第一の磁気発生手段７１の配置箇所とは異なる箇所に、第二の磁気発生手段７２を配置し、容器４内の液体４０中において、前記磁性微粒子１を捕捉して、その一部を前記集合箇所から移動させる。この時、磁性微粒子１は、集合工程で集合した箇所から、第二の磁気発生手段７２に近い容器４の内壁面４ａ上又は内壁面４ａ近傍に移動する。そして、撹拌工程の所でも後述するように、全ての磁性微粒子１が移動する前に、移動工程を終了する。なお、ここで「磁性微粒子を移動させる」とは、磁性微粒子を第二の磁気発生手段で捕捉して、集合工程で集合した箇所から、その動きが止まるまで位置を変化させることを指す。したがって、第二の磁気発生手段の配置箇所で決定される、磁性微粒子の動き得る最大の距離が移動距離となる。
【００１９】
第二の磁気発生手段７２は、第一の磁気発生手段７１と同様のもので良い。そして、その磁力も、液体４０の量等を考慮して適宜調整すれば良い。
第二の磁気発生手段７２の数は、目的に応じて適宜選択すれば良い。例えば、液体４０の量等を考慮して調整することが好ましく、１ｍＬ以下のような微量である場合には、通常一つで十分であるが、１Ｌ以上のような多量である場合には複数であることが好ましく、二〜四つであることがより好ましい。
第二の磁気発生手段７２は、容器４の外壁面４ｂ近傍又は外壁面４ｂ上に配置することが好ましい。特に、配置箇所に制限が無い場合であれば、磁性微粒子１の液体４０中における移動距離が最大となるような箇所に配置することが好ましい。したがって、液体４０の保持形状に応じて配置箇所を決定することが好ましく、例えば、図１に示すように保持形状が略球状である場合には、磁性微粒子１の集合箇所の、球の中心に対して概ね点対称の位置（容器の最上部近傍）に配置することが好ましい。
【００２０】
本発明においては、移動工程の直前に、さらに、前記第一の磁気発生手段７１を容器４から離間させ、磁性微粒子１の捕捉を解除する工程を有していても良い。
すなわち、図１（ｂ）に示すように、第一の磁気発生手段７１を配置したまま、第二の磁気発生手段７２を配置しても良いし、図１（ｃ）に示すように、第一の磁気発生手段７１を容器４から離間させ、磁性微粒子１の捕捉を解除してから、第二の磁気発生手段７２を配置しても良い。さらに、第一の磁気発生手段７１を容器４から離間させながら、磁性微粒子１の捕捉を解除しつつ、第二の磁気発生手段７２を配置しても良い。
【００２１】
第一の磁気発生手段７１を配置したままとする場合には、磁性微粒子１を移動させるために、第二の磁気発生手段７２は、第一の磁気発生手段７１よりも磁力が大きいことが必要である。
【００２２】
これに対して、第一の磁気発生手段７１を容器４から離間させる場合のうち、磁性微粒子１の捕捉を解除してから第二の磁気発生手段７２を配置する場合であれば、離間させてから第二の磁気発生手段７２を配置するまでの時間は、特に限定されるものではない。ただし、長過ぎると集合させた磁性微粒子１が、液体４０中で拡散する可能性があるため、３０秒以下であることが好ましく、２０秒以下であることがより好ましく、１５秒以下であることが特に好ましい。特に、液体４０の量が１ｍＬ以下等の微量である場合には、上記範囲とすることで、一層優れた効果が得られる。
一方、磁性微粒子１の捕捉を解除しつつ、第二の磁気発生手段７２を配置する場合であれば、第一の磁気発生手段７１による磁性微粒子１の捕捉を完全に解除するタイミングは、目的に応じて任意に調整できる。
【００２３】
本発明においては、後述する撹拌工程によって、磁性微粒子１が液体４０中の広範囲に渡って分散するような分布状態で移動工程を終了することが好ましい。このような分布状態は、具体的には、集合箇所にある磁性微粒子１と、移動中及び／又は移動後の磁性微粒子１とが、液体４０中で広い範囲に存在している状態である。移動工程終了時の磁性微粒子１の分布状態は、液体４０の量や、第一の磁気発生手段７１及び第二の磁気発生手段７２の種類、配置箇所及び配置時間等の条件によって異なる。例えば、液体４０の量が１ｍＬ以下等の微量であり、第一の磁気発生手段７１による磁性微粒子１の捕捉を解除してから、第二の磁気発生手段７２を配置する場合、好ましい分布状態を実現するために、第二の磁気発生手段７２の配置時間は、概ね１〜６０秒であることが好ましく、１〜４０秒であることがより好ましい。また、液体４０の量が１〜１０Ｌ程度と多量であり、第一の磁気発生手段７１による磁性微粒子１の捕捉を解除してから、第二の磁気発生手段７２を二〜四つ配置する場合、好ましい分布状態を実現するために、第二の磁気発生手段７２の配置時間は、概ね５〜２０秒であることが好ましく、８〜１５秒であることがより好ましい。
【００２４】
［撹拌工程］
撹拌工程では、図１（ｄ）に示すように、全ての磁性微粒子１が移動する前に、容器４中の液体４０を撹拌する。
撹拌工程によって、磁性微粒子１が液体４０中の広範囲に渡って分散する。
撹拌工程での撹拌方法は、集合工程で説明した方法と同様で良い。
撹拌時間は特に限定されず、撹拌方法や液体４０の量等に応じて、磁性微粒子１が十分液体４０中に分散するように設定すれば良い。例えば、液体４０の量が１ｍＬ以下等の微量である場合には、３〜３０秒であることが好ましく、３〜１５秒であることがより好ましい。また、液体４０の量が１〜１０Ｌ程度と多量である場合には、５〜５０秒であることが好ましく、１０〜３０秒であることがより好ましい。
【００２５】
本発明においては、前記集合工程と、前記移動工程との間に、さらに、前記磁性微粒子１を捕捉したまま、容器４内の液体４０を除去する工程（以下、除去工程と略記する）と、液体４０が除去された容器４内に、液体４０’を添加する工程（以下、添加工程と略記する）と、を有することが好ましい。
除去工程及び添加工程を行うことで、固液分離を行い、磁性微粒子１を洗浄できる。このような固液分離を行うことは、本発明の撹拌方法を、後述する免疫反応に利用する場合に、標的物質を高精度かつ高感度に検出するために、特に重要である。
【００２６】
［除去工程］
除去工程で液体４０を除去する方法は特に限定されず、液体４０の量等に応じて適宜選択すれば良い。例えば、特に液体４０の量が１ｍＬ以下等の微量である場合には、ピペット、シリンジ等を使用する吸引除去が好ましい。
吸引時間は、磁性微粒子１の集合箇所からの拡散を妨げない限り、特に限定されないが、上記のように液体４０の量が微量である場合には、通常５〜３０秒程度で十分である。
【００２７】
［添加工程］
添加工程で添加する液体４０’の種類や量は、除去した液体４０と同じでも良いし、異なっていても良く、目的に応じて適宜選択すれば良い。
液体４０’を添加する方法も、液体４０’の量等に応じて適宜選択すれば良いが、特に上記のように液体４０の量が微量である場合には、ピペット、シリンジ等を使用する添加方法が好ましい。
添加時間も、磁性微粒子１の集合箇所からの拡散を妨げない限り、特に限定されず、除去工程での除去時間と同様で良い。
【００２８】
本発明において、前記除去工程及び添加工程を行い、さらに第一の磁気発生手段７１を容器４から離間させ、磁性微粒子１の捕捉を解除してから、第二の磁気発生手段７２を配置する場合には、添加工程後に第一の磁気発生手段７１を離間させるのが好ましい。
この場合、第一の磁気発生手段７１を離間させてから、第二の磁気発生手段７２を配置するまでの時間は、上記と同様である。
【００２９】
本発明の撹拌方法によれば、磁性微粒子含有液を短時間で効率的に撹拌でき、磁性微粒子を液体中の広範囲に渡って分散させることができる。特に、液量によらず優れた効果が得られる。また、工程数が少なく、条件設定も簡便であり、特殊な機器等も不要なので、低コストで撹拌できる。
【００３０】
＜標的物質の分析方法＞
本発明に係る標的物質の分析方法は、検出対象である標的物質と、該標的物質と特異的に結合する特異的結合部を表面に備えた磁性微粒子とを、容器内の液体中で混合する混合工程と、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質を検出する検出工程と、を有する標的物質の分析方法であって、前記混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、上記本発明の撹拌方法で行うことを特徴とする。
上記本発明の撹拌方法を適用する対象は、前記磁性微粒子、及び／又は特異的結合部に標的物質が結合した磁性微粒子を含有する液体である。すなわち、このような磁性微粒子含有液を使用するのであれば、前記混合工程中の如何なる段階においても、本発明の撹拌方法を適用し得る。なお、磁性微粒子は、上記本発明の撹拌方法におけるものと同様である。
【００３１】
［混合工程］
混合工程では、検出対象である標的物質と、該標的物質と特異的に結合する特異的結合部を表面に備えた磁性微粒子とを、容器内の液体中で混合する。
標的物質は、後述する検出工程において検出可能なものであれば特に限定されない。例えば、天然由来の成分や、これら成分を化学的に修飾したもの、あるいは非天然の成分でも良く、目的に応じて適宜選択できる。ここで、「化学的に修飾する」とは、官能基を変換、付加又は除去したり、骨格を変化させる等、成分の構造を改変することを指す。
【００３２】
標的物質は、それ自体が未修飾の状態でシグナルを発生するものでも良いし、シグナルを発生し得る標識化合物で、標識されたものでも良い。検出するシグナルは、光シグナルが好ましく、蛍光、表面増強ラマン散乱光等が例示できる。
蛍光を発生する標識化合物（蛍光性物質）としては、フルオレセイン（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等）、ローダミン（ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡ等）、アクリフラビン、アレクサ（アレクサ６４７等）、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）等が例示できる。
また、表面増強ラマン散乱光を発生する標識化合物としては、ローダミン１２３、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ等の化学物質を、金、銀、白金、ニッケル等の金属粒子表面に固定化したもの等が例示できる。
本発明において、標的物質は、蛍光シグナルで検出することが特に好ましい。
【００３３】
混合に供する標的物質は一種類でも良いし、複数種類でも良い。複数種類である場合には、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に選択できる。
さらに、標的物質が標識化合物で標識されたものである場合には、一種類の未修飾の標的物質を複数種類の標識化合物で別々に標識したものを併用しても良いし、複数種類の未修飾の標的物質を一種類の標識化合物で標識したものを併用しても良い。さらに、複数種類の未修飾の標的物質を複数種類の標識化合物で別々に標識したものを併用しても良い。
【００３４】
磁性微粒子は、標的物質と特異的に結合する特異的結合部を表面に備えたものであり、標的物質と特異的に結合する物質で表面を修飾したものが例示できる。この場合、表面を修飾している前記物質の、修飾に関与していない標的物質との結合部が特異的結合部に該当する。ここで「特異的に結合する」とは、抗原−抗体反応や、核酸塩基の塩基対形成のように、高い選択性で結合を形成することを指す。例えば、抗原−抗体反応で結合を形成することにより、免疫複合体が得られる。また、「表面を修飾する」とは、共有結合、疎水結合等の分子間引力等により、表面に結合を形成することを指す。
本発明においては、標的物質と抗原−抗体反応で特異的に結合する物質を、表面に共有結合させて、特異的結合部を設けることが好ましい。
【００３５】
標的物質と特異的に結合する物質で磁性微粒子表面を修飾する場合には、例えば、当該物質中の官能基と、磁性微粒子表面中の官能基との間で、共有結合等の化学結合を形成させ、当該物質と磁性微粒子とを結合させれば良い。共有結合を形成させる方法は、アミド結合を形成させる方法、エステル結合を形成させる方法等、公知の方法を適用できる。
【００３６】
磁性微粒子一つあたりの特異的結合部の数は特に限定されず、一つでも良いし、複数でも良い。複数とした場合には、磁性微粒子の使用量が少なくても、標的物質を効率的に結合できる。
【００３７】
また、標的物質が複数種類である場合には、磁性微粒子一つあたりの特異的結合部は、一種類でも良いし、これら複数種類の標的物質に対応した複数種類でも良い。
磁性微粒子一つあたりの特異的結合部を一種類とする場合には、複数種類の標的物質に対応して、特異的結合部の種類が異なる複数種類の磁性微粒子を併用すれば良い。
磁性微粒子一つあたりの特異的結合部を複数種類とする場合には、一つの磁性微粒子に全ての標的物質に対応して、複数種類の特異的結合部が備えられていても良いし、複数種類のうちの一部の標的物質に対応して、複数種類の特異的結合部が備えられた磁性微粒子を複数種類併用し、これら複数種類の磁性微粒子で、全ての標的物質を結合できるようにしても良い。
【００３８】
また、磁性微粒子も、一種類でも良いし、複数種類でも良い。複数種類である場合には、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に選択できる。
例えば、材質が異なる複数種類の磁性微粒子を併用しても良いし、同じ材質で形状及び／又は大きさが異なる複数種類の磁性微粒子を併用しても良い。さらに、材質と、形状及び／又は大きさがいずれも異なる複数種類の磁性微粒子を併用しても良い。
【００３９】
磁性微粒子は、市販品でも良いし、公知の方法で製造したものでも良い。また、後述する本発明の表面修飾磁性微粒子の製造方法でも製造できる。
【００４０】
混合工程では、例えば、標的物質を含有する検体と、前記磁性微粒子とを混合すると良い。
検体としては、生体から採取した血液、尿等の体液をそのまま使用しても良いし、これら体液や組織切片等のサンプルを適宜溶媒中に分散又は溶解させたものを使用したり、これらサンプルからの抽出液等を使用しても良く、目的に応じて適宜選択すれば良い。
混合時の温度等の条件は、標的物質と磁性微粒子との特異的結合の形成を妨げない範囲で任意に設定できる。
【００４１】
混合工程で、本発明の撹拌方法を適用するのは、少なくとも磁性微粒子を含有する液体である。例えば、磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を、本発明の方法で撹拌して混合することが好ましい。
混合工程では、標的物質と、磁性微粒子中の特異的結合部とが特異的に結合して、二重複合体を形成する。この時、本発明の撹拌方法を適用して液体を撹拌することにより、磁性微粒子が液体中の広範囲に渡って分散するので、二重複合体を効率的且つ高い確率で形成できる。
【００４２】
［検出工程］
検出工程では、前記磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質を検出する。
検出方法は、標的物質のシグナルの種類に応じて選定すれば良い。例えば、励起光を標的物質に照射して、その結果生じた光シグナルを検出する方法が挙げられる。
【００４３】
（競合法）
本発明においては、混合工程において、標的物質が標識された標識標的物質をさらに混合すること、すなわち、標的物質と標識標的物質とを併用することにより、競合法で標的物質を検出しても良い。ここで「標識標的物質」とは、混合工程で述べた、標識化合物で標識された標的物質と同様である。
この場合、例えば、磁性微粒子、標的物質及び標識標的物質を含有する液体を、本発明の方法で撹拌して混合すると良い。また、磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を撹拌し、次いでさらに標識標的物質を添加して撹拌する際に、いずれか一方又は両方の撹拌を、本発明の方法で行っても良い。
競合法においても、本発明の撹拌方法を適用することで、磁性微粒子が液体中の広範囲に渡って分散し、上記と同様の効果が得られる。
【００４４】
競合法を適用する場合には、前記標識標的物質を併用すること以外は、上記と同様の方法で検出を行えば良い。ただし検出工程では、磁性微粒子の特異的結合部に結合している標識標的物質のシグナルを検出することで、標的物質を間接的に検出することになる。
【００４５】
（１ステップサンドイッチ法）
また本発明においては、混合工程において、標的物質と特異的に結合してこれを標識する、特異的標識物質をさらに混合することにより、サンドイッチ法（１ステップサンドイッチ法）で標的物質を検出しても良い。この時使用する特異的標識物質としては、標的物質と特異的に結合する物質が、標識化合物で標識されたものが例示できる。ここで、「標的物質と特異的に結合する物質」、「標識化合物」とは、いずれも先に説明したものと同様である。
この場合、例えば、磁性微粒子、標的物質及び特異的標識物質を含有する液体を、本発明の方法で撹拌して混合すると良い。
【００４６】
サンドイッチ法を適用する場合には、前記特異的標識物質を併用すること以外は、上記と同様の方法で検出を行えば良い。ただし検出工程では、磁性微粒子の特異的結合部に結合している標的物質に結合した特異的標識物質のシグナルを検出することで、標的物質を間接的に検出することになる。
【００４７】
１ステップサンドイッチ法においても、本発明の撹拌方法を適用することで、上記と同様の効果が得られる。例えば、サンドイッチ法では上記のように、磁性微粒子、標的物質及び特異的標識物質が結合した三重複合体を形成する。そして、本発明の撹拌方法を適用して液体を撹拌することにより、磁性微粒子、及び標的物質と結合した磁性微粒子が、液体中の広範囲に渡って分散するので、三重複合体を効率的且つ高い確率で形成できる。
【００４８】
（２ステップサンドイッチ法）
また、本発明においては、混合工程を第一混合工程及び第二混合工程の二段階とし、第一混合工程では、標的物質と磁性微粒子とを混合し、得られた混合液に対して第二混合工程では、特異的標識物質を混合することにより、２ステップサンドイッチ法で標的物質を検出しても良い。
この場合、例えば、磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を撹拌し（第一混合工程）、次いでさらに特異的標識物質を添加して撹拌する（第二混合工程）際に、いずれか一方又は両方の撹拌を、本発明の方法で行うと良い。
【００４９】
２ステップサンドイッチ法においても、第一混合工程及び／又は第二混合工程において、本発明の撹拌方法を適用することで、上記と同様の効果が得られる。例えば、第一混合工程では二重複合体を、第二混合工程では三重複合体を、それぞれ効率的且つ高い確率で形成できる。
【００５０】
（発光シグナルの検出）
本発明においては、標的物質、特異的標識物質又は標識標的物質として発光酵素で標識されたものを使用して、検出工程において該発光酵素に由来する発光シグナルを検出するようにしても良い。
この場合、混合工程において、さらに前記発光酵素が作用する発光基質を最後に添加することが好ましい。
【００５１】
前記発光酵素は、公知のもので良く、好ましいものとしてアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等が例示できる。
【００５２】
このように発光基質を添加する場合には、例えば、以下のように行うと良い。
（Ｉ）発光酵素で標識された標的物質を使用する場合には、二重複合体を形成するために該標的物質及び磁性微粒子を含有する液体を撹拌し（第一の撹拌）、二重複合体を形成していない前記標的物質を除去し、さらに発光基質を添加して撹拌する（第二の撹拌）際に、第一及び第二の撹拌のいずれか一方又は両方の撹拌を、本発明の方法で行うと良い。
（ＩＩ）発光酵素で標識された特異的標識物質を併用する場合には、三重複合体を形成するために磁性微粒子、標的物質及び特異的標識物質を含有する液体を撹拌し（第一の撹拌）、三重複合体を形成していない特異的標識物質を除去し、さらに発光基質を添加して撹拌する（第二の撹拌）際に、第一及び第二の撹拌のいずれか一方又は両方の撹拌を、本発明の方法で行うと良い（発光酵素を使用した１ステップサンドイッチ法）。
（ＩＩＩ）または、二重複合体を形成するために磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を撹拌し（第一の撹拌）、二重複合体を形成していない標的物質を除去し、次いで三重複合体を形成するために特異的標識物質を含有する液体を添加して撹拌し（第二の撹拌）、三重複合体を形成していない特異的標識物質を除去し、さらに発光基質を添加して撹拌する（第三の撹拌）際に、第一〜第三の撹拌のいずれか一以上の撹拌を、本発明の方法で行うと良い（発光酵素を使用した２ステップサンドイッチ法）。
（ＩＶ）発光酵素で標識された標識標的物質を併用する場合には、二重複合体を形成するために磁性微粒子、標的物質及び標識標的物質を含有する液体を撹拌し（第一の撹拌）、二重複合体を形成していない標識標的物質を除去し、さらに発光基質を添加して撹拌する（第二の撹拌）際に、第一及び第二の撹拌のいずれか一方又は両方の撹拌を、本発明の方法で行うと良い（発光酵素を使用した競合法）。
【００５３】
これらの方法においてはいずれも、特に、発光基質を添加した後の撹拌（（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＶ）における第二の撹拌、又は（ＩＩＩ）における第三の撹拌）を本発明の方法で行うことが好ましい。その理由は、磁性微粒子を含む複合体が、液体中の広範囲に渡って分散するので、発光基質との反応が効率的且つ高い確率で進行し、標的物質の検出感度が向上するためである。
【００５４】
本発明の分析方法では、上記本発明の撹拌方法において、前記除去工程及び添加工程を行うことが好ましい。これにより、標的物質の検出に必要な成分以外の不純物を除去できるので、二重複合体又は三重複合体の形成や、発光酵素と発光基質との反応が、高い確率で進行する。
【００５５】
前記除去工程及び添加工程を行う回数は、一回でも良いし、複数回でも良く、目的に応じて適宜選択すれば良い。
添加工程で添加する液体は、各種緩衝液等の水溶液で、洗浄を目的としたものが例示できる。
また、特異的標識物質又は標識標的物質を併用する場合（競合法、２ステップサンドイッチ法）には、これらを含有する液体を添加工程で添加しても良い。
【００５６】
具体的には、標識標的物質を併用する場合（競合法）であれば、磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を前記集合工程に供し、標識標的物質を含有する液体を添加工程に供する方法が例示できる。さらに、除去工程と、標識標的物質を含有する液体を添加する添加工程との間に、洗浄を目的とする添加工程及び除去工程を一〜複数回追加しても良い。
特異的標識物質を併用する場合（２ステップサンドイッチ法）であれば、磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を前記集合工程に供し、特異的標識物質を含有する液体を添加工程に供する方法が例示できる。さらに、除去工程と、特異的標識物質を含有する液体を添加する添加工程との間に、洗浄を目的とする添加工程及び除去工程を一〜複数回追加しても良い。
【００５７】
さらに、発光酵素由来の発光シグナルを検出する場合であれば、二重複合体又は三重複合体を混合工程で形成させ、二重複合体又は三重複合体を形成していない前記標的物質を除去工程で除去し、発光基質を含有する液体を添加工程で添加する方法が例示できる。この場合、上記と同様にさらに、除去工程と、発光基質を含有する液体を添加する添加工程との間に、洗浄を目的とする添加工程及び除去工程を一〜複数回追加しても良い。
【００５８】
本発明の分析方法として好ましい具体例を、以下に例示する。
（１）発光酵素を使用した１ステップサンドイッチ法
「磁性微粒子、標的物質及び発光酵素で標識された特異的標識物質を含有する液体を使用する集合工程→除去工程→洗浄液を添加する添加工程→添加した洗浄液を除去する除去工程→発光基質を含有する液体を添加する添加工程→移動工程→撹拌工程→発光シグナルを検出する検出工程」を行う方法。
（２）発光酵素を使用した２ステップサンドイッチ法
「磁性微粒子及び標的物質を含有する液体を使用する集合工程→除去工程→洗浄液を添加する添加工程→添加した洗浄液を除去する除去工程→発光酵素で標識された特異的標識物質を含有する液体を添加する添加工程→移動工程→撹拌工程→集合工程→除去工程→洗浄液を添加する添加工程→添加した洗浄液を除去する除去工程→発光基質を含有する液体を添加する添加工程→移動工程→撹拌工程→発光シグナルを検出する検出工程」を行う方法。
（３）発光酵素を使用した競合法
「磁性微粒子、標的物質及び発光酵素で標識された標識標的物質を含有する液体を使用する集合工程→除去工程→洗浄液を添加する添加工程→添加した洗浄液を除去する除去工程→発光基質を含有する液体を添加する添加工程→移動工程→撹拌工程→発光シグナルを検出する検出工程」を行う方法。
【００５９】
本発明の分析方法によれば、磁性微粒子を液体中の広範囲に渡って分散させることができるので、二重複合体や三重複合体等の形成や、発光酵素と発光基質との反応を、効率的且つ高い確率で進行させることができ、標的物質の検出感度を向上させることができる。さらに、短時間で分析できる。特に、液量によらず優れた効果が得られる。また、工程数が少なく、条件設定も簡便であり、特殊な機器等も不要なので、低コストで分析できる。
【００６０】
＜表面修飾磁性微粒子の製造方法＞
本発明に係る表面修飾磁性微粒子の製造方法は、磁性微粒子の表面と反応し得る修飾物質と、前記磁性微粒子とを反応させる表面修飾磁性微粒子の製造方法であって、前記修飾物質及び磁性微粒子を、容器内の液体中で混合する混合工程において、前記磁性微粒子を含有する液体の撹拌を、上記本発明の撹拌方法で行うことを特徴とする。
前記修飾物質は特に限定されず、目的に応じて選択すれば良いが、好ましいものとして、特定の物質と抗原−抗体反応で特異的に結合し得る物質が例示できる。ただし、特定の物質との特異的な結合部位は、磁性微粒子表面との反応に関与しないものとする。この場合、上記本発明の分析方法で使用する磁性微粒子を好適に製造できる。
【００６１】
［混合工程］
混合工程において、本発明の撹拌方法を適用するのは、如何なる段階でも良い。
例えば、標的物質に代わり前記修飾物質を使用し、特異的結合部を表面に備えた磁性微粒子に代わり前記修飾物質と反応し得る磁性微粒子を使用すること以外は、上記本発明の分析方法における混合工程と同様に行う方法が例示できる。この時、前記撹拌工程後に、さらに公知の撹拌方法で撹拌しても良い。ただし、当該方法では、前記除去工程及び添加工程を行わない。なお、ここで公知の撹拌方法は、上記と同様である。当該方法では、磁性微粒子が液体中の広範囲に渡って分散した状態となるので、修飾物質と磁性微粒子との反応率が向上し、磁性微粒子表面を高い確率で修飾できる。
また、前記修飾物質を含有せず、磁性微粒子を含有する液体を本発明の撹拌方法で撹拌し、その後、前記修飾物質を添加して、公知の撹拌方法で撹拌する方法が例示できる。この場合も、あらかじめ磁性微粒子が液体中の広範囲に渡って分散した状態で、修飾物質を添加することで、磁性微粒子表面を高い確率で修飾できる。この場合は、前記除去工程及び添加工程は行っても行わなくても良い。また、ここで公知の撹拌方法は、上記と同様である。
【００６２】
混合工程で、前記除去工程及び添加工程を行う場合には、その回数は一回でも良いし、複数回でも良く、目的に応じて適宜選択すれば良い。
添加工程で添加する液体は、各種緩衝液等の水溶液で、洗浄を目的としたものが例示できる。この場合には、不純物を除去できるので、前記修飾物質と磁性微粒子との反応性が向上し、磁性微粒子表面を高い確率で修飾できる。
また、添加する液体は、前記修飾物質を含有する液体でも良い。さらに、前記除去工程及び添加工程を複数回行う場合には、前記水溶液と、前記修飾物質を含有する液体とを、別々に併用しても良い。
【００６３】
本発明の製造方法では、前記修飾物質と磁性微粒子とを反応させるが、これらの間で共有結合を形成させることが好ましい。共有結合としては、アミド結合、エステル結合等が例示できるが、安定性の観点から、アミド結合が特に好ましい。
反応は公知の方法を適用すれば良い。この時、前記修飾物質中の官能基と磁性微粒子中の官能基とを反応させるが、例えば、アミド結合を形成させる場合であれば、アミド結合を形成するカルボキシル基とアミノ基はそれぞれ、前記修飾物質及び磁性微粒子のどちらに含まれていても良い。
また、前記修飾物質と磁性微粒子とは、リンカーを介して結合しても良く、この場合には、リンカーを形成する物質をさらに添加して反応を行えば良い。
温度、撹拌時間等の反応条件は、前記修飾物質や化学反応の形式等に応じて、適宜設定すれば良い。
【００６４】
本発明の製造方法は、前記混合工程以外に、必要に応じてその他の工程を有していても良い。その他の工程として、具体的には、洗浄工程が例示できる。洗浄工程は、公知の方法で行えば良く、例えば、本発明の撹拌方法における前記除去工程及び添加工程を適用して、固液分離を行っても良い。
【００６５】
本発明の製造方法として好ましい具体例を、以下に例示する。
（１）前記修飾物質及び磁性微粒子を含有する液体を本発明の撹拌方法で撹拌する方法
「前記修飾物質及び磁性微粒子を含有する液体を使用する集合工程→移動工程→撹拌工程→公知の撹拌方法で撹拌する工程」を行う方法。公知の撹拌方法で撹拌する工程の終了後に集合工程以降を再度行うことで、この方法を複数回繰り返しても良い。
（２）前記修飾物質を含有せず、磁性微粒子を含有する液体を、本発明の撹拌方法で撹拌する方法
「磁性微粒子を含有する液体を使用する集合工程→除去工程→添加工程→移動工程→撹拌工程→前記修飾物質を添加する工程→公知の撹拌方法で撹拌する工程」を行う方法。公知の撹拌方法で撹拌する工程の終了後に集合工程以降を再度行うことで、この方法を複数回繰り返しても良い。
【００６６】
本発明の製造方法によれば、磁性微粒子を液体中の広範囲に渡って分散させることができるので、前記修飾物質との反応を、効率的且つ高い確率で進行させることができ、磁性微粒子一つあたりの表面修飾率を向上させることができる。特に、液量によらず優れた効果が得られる。
【実施例】
【００６７】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
容量２０μＬのチャンバー内へ、磁性微粒子を含有する液体２０μＬを添加した。
次いで、チャンバー下面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子をチャンバー内下部に集合させた後、第一の磁性体をチャンバー下面から離間させた。
次いで、チャンバー上面の外壁面上にネオジウム磁石（第二の磁性体）を３秒間配置した後、ネオジウム磁石をチャンバー上面から離間させ、直ちに超音波によりチャンバー内の液体を５秒間撹拌した。超音波による撹拌直後の、チャンバー内のデジタルカメラによる撮像データを図３（ａ）に示す。
【００６８】
（比較例１）
ネオジウム磁石の配置及び超音波による液体の撹拌を行わなかったこと以外は、実施例１と同様に行った。第一の磁性体をチャンバー下部から離間させた直後の、チャンバー内の撮像データを図３（ｂ）に示す。
【００６９】
（比較例２）
ネオジウム磁石の配置を行わなかったこと以外は、実施例１と同様に行った。超音波による撹拌直後の、チャンバー内の撮像データを図３（ｃ）に示す。
【００７０】
（比較例３）
超音波による液体の撹拌を行わなかったこと以外は、実施例１と同様に行った。ネオジウム磁石をチャンバー上部から離間させた直後の、チャンバー内の撮像データを図３（ｄ）に示す。
【００７１】
図３から明らかなように、実施例１では、磁性微粒子がチャンバー内で均一に分散していた。これに対し、比較例１では、磁性微粒子がチャンバー内の中心付近に偏って存在し、比較例２では、磁性微粒子が十分に分散せず、チャンバー内の中心付近で塊りを形成しており、比較例３では、チャンバー内の上部に磁性微粒子が偏って存在していた。すなわち、実施例１では、液体が十分に撹拌されていたが、比較例１〜３では、液体の撹拌が不十分であった。
【００７２】
（実施例２）
＜１ステップサンドイッチ法＞
マイクロチューブ内に、ＴＳＨ抗原を含有する液体サンプル（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）１００μＬ、ＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子を含有する液体（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒ１）５０μＬ及びアルカリホスファターゼ標識ＴＳＨ抗体を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒ２）５０μＬを添加し、ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、マイクロチューブを立てた状態とし、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液を添加及び除去し、アルカリホスファターゼ基質を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ０００６  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１００μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、光電子増倍管により発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
【００７３】
（比較例４）
第二の磁性体を配置しなかったこと以外は、実施例２と同様に、発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
【００７４】
表１から明らかなように、免疫反応を利用する標的物質の検出においては、本発明により磁性微粒子含有液の撹拌効率が向上し、それに伴って免疫反応率も向上して、標的物質の検出感度が向上することが確認された。
【００７５】
（実施例３）
＜２ステップサンドイッチ法＞
マイクロチューブ内に、ＴＳＨ抗原を含有するサンプル（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）１００μＬ及びＴＳＨ抗体修飾磁性体粒子を含有する液体（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒ１）５０μＬを添加して反応させた。
次いで、マイクロチューブを立てた状態とし、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ０００５  Ａｓｓａｙ  Ｗａｓｈ）１００μＬを添加して除去し、アルカリホスファターゼ標識ＴＳＨ抗体を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒ２）５０μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、再度マイクロチューブを立てた状態で、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液を添加及び除去して、アルカリホスファターゼ基質を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ０００６  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１００μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、光電子増倍管により発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
【００７６】
（比較例５）
第二の磁性体を二回とも配置しなかったこと以外は、実施例３と同様に、発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
【００７７】
表１から明らかなように、実施例２と同様に、本発明により磁性微粒子含有液の撹拌効率が向上し、それに伴って免疫反応率も向上して、標的物質の検出感度が向上することが確認された。
【００７８】
（実施例４）
＜競合法＞
マイクロチューブ内に、ＴＳＨ抗原を含有するサンプル（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）１００μＬ、ＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子を含有する液体（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒ１）５０μＬ及びアルカリホスファターゼ標識ＴＳＨ抗原を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒ２）５０μＬを添加し、ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、マイクロチューブを立てた状態とし、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液を添加及び除去し、アルカリホスファターゼ基質を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ０００６  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１００μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、光電子増倍管により発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
【００７９】
（比較例６）
第二の磁性体を配置しなかったこと以外は、実施例４と同様に、発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
【００８０】
表１から明らかなように、実施例２と同様に、本発明により磁性微粒子含有液の撹拌効率が向上し、それに伴って免疫反応率も向上して、標的物質の検出感度が向上することが確認された。
【００８１】
（実施例５）
＜マイクロチップを利用した２ステップサンドイッチ法＞
図２に示す容量１０μＬのマイクロチップ１５内に、ＴＳＨ抗原を含有するサンプル（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）５μＬ及びＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子を含有する液体（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒ１）５μＬを添加し、反応させた。
次いで、マイクロチップ下面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子をマイクロチップ内下部に集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ０００５  Ａｓｓａｙ  Ｗａｓｈ）１０μＬを添加及び除去し、アルカリホスファターゼ標識ＴＳＨ抗体を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒ２）１０μＬを添加した。
次いで、第一の磁性体をマイクロチップから離間させた後、マイクロチップ上面の外壁面上に第二の磁性体を３秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチップから離間させ、直ちに５秒間超音波撹拌を行った。
次いで、再度マイクロチップ下面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液を添加及び除去して、アルカリホスファターゼ基質を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ０００６  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１０μＬを添加した。
次いで、第一の磁性体をマイクロチップから離間させた後、マイクロチップ上面の外壁面上に第二の磁性体を３秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチップから離間させ、直ちに５秒間超音波撹拌を行った。
次いで、光電子増倍管により発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
【００８２】
（比較例７）
第二の磁性体を配置しなかったこと以外は、実施例５と同様に、発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
【００８３】
表１から明らかなように、実施例２と同様に、本発明により磁性微粒子含有液の撹拌効率が向上し、それに伴って免疫反応率も向上して、標的物質の検出感度が向上することが確認された。
【００８４】
（実施例６）
＜ＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子の作製＞
（Ａ）容器に、表面がカルボキシル基により活性化された磁性微粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  （Ｃａｒｂｏｘｙｌ））の溶液５００ｍＬと、ＭＥＳ緩衝液（３０ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６．０）７５０ｍＬを添加した。
（Ｂ）次いで、容器の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、再度ＭＥＳ緩衝液７５０ｍＬを添加した。
（Ｃ）次いで、第一の磁性体を容器から離間させ、直ちに第一の磁性体の配置箇所とは異なる容器の外壁面上の三箇所に第二の磁性体をそれぞれ１０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体を容器から離間させ、直ちに６０秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
（Ｄ）次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（２．５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ  ｉｎ  ｄＨ２Ｏ）を２５０ｍＬ添加し、室温で１０分間ボルテックス（登録商標）撹拌した後、抗ＴＳＨ抗体（２ｍｇ／ｍｌ）を３７．５ｍＬ添加して、３時間ボルテックス（登録商標）撹拌した。そして、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０１％含有するＰＢＳを２Ｌ添加した。
（Ｅ）さらに（Ｂ）〜（Ｄ）を二回繰り返した。ただし、二回目は、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０１％含有するＰＢＳの添加を行わなかった。
（Ｆ）次いで、１ＬのＰＢＳを添加して再懸濁させ、ＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子を作製した。
【００８５】
（比較例８）
第二の磁性体を配置しなかったこと以外は、実施例６と同様に、ＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子を作製した。
【００８６】
（実施例７）
＜２ステップサンドイッチ法＞
マイクロチューブ内に、ＴＳＨ抗原を含有するサンプル（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）１００μＬ、及び実施例６で作製したＴＳＨ抗体修飾磁性粒子の懸濁液５０μＬを添加して反応させた。
次いで、マイクロチューブを立てた状態とし、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ０００５  Ａｓｓａｙ  Ｗａｓｈ）１００μＬを添加して除去し、アルカリホスファターゼ標識ＴＳＨ抗体を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ２０１０１０  ＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒ２）５０μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、再度マイクロチューブを立てた状態で、その側面の外壁面上に第一の磁性体を配置して、磁性微粒子を捕捉して集合させ、磁性微粒子を捕捉したままの状態で溶液を除去し、洗浄液を添加及び除去して、アルカリホスファターゼ基質を含有する溶液（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＳＲ０００６  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１００μＬを添加した。
次いで、マイクロチューブを立てたまま、第一の磁性体をマイクロチューブから離間させた後、直ちに第一の磁性体の配置箇所に略対向する外壁面上に第二の磁性体を３０秒間配置して、磁性微粒子を分散させた後、第二の磁性体をマイクロチューブから離間させ、直ちに３秒間ボルテックス（登録商標）撹拌を行った。
次いで、光電子増倍管により発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
【００８７】
（実施例８）
実施例６で作製したＴＳＨ抗体修飾磁性粒子の懸濁液に代わり、比較例８で作製したＴＳＨ抗体修飾磁性粒子の懸濁液を使用したこと以外は、実施例７と同様に、発光シグナルを検出した。検出値を表１に示す。
【００８８】
表１から明らかなように、本発明により作製したＴＳＨ抗体修飾磁性微粒子は、磁性微粒子含有液の撹拌効率が向上し、それに伴って修飾率も向上することが確認された。
【００８９】
【表１】
2010127887.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、薬品の開発、診断、検体の品質検査等、医学、薬学、化学の分野で幅広く利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の撹拌方法を説明するための概略図である。
【図２】本発明において好適な容器の例として、マイクロチップを例示する概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図である。
【図３】（ａ）実施例１における超音波による撹拌直後、（ｂ）比較例１における第一の磁性体をチャンバー下部から離間させた直後、（ｃ）比較例２における超音波による撹拌直後、（ｄ）比較例３におけるネオジウム磁石をチャンバー上部から離間させた直後、のチャンバー内のデジタルカメラによる撮像データである。
【符号の説明】
【００９２】
１，・・・磁性微粒子，４・・・容器、４ａ・・・内壁面、４ｂ・・・外壁面，４０，４０’・・・液体，７１・・・第一の磁気発生手段、７２・・・第二の磁気発生手段、
【図１】
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【図２】
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【図３】
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