(57)【要約】【課題】  薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者の重症薬疹易罹患性を、重症薬疹発症前に迅速かつ容易に検出するための重症薬疹易罹患性診断用マーカー、重症薬疹易罹患性の診断方法および重症薬疹易罹患性診断用キットを提供する。【解決手段】  薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者における重症薬疹易罹患性の指標となるマーカーであって、前記マーカーが被験者から採取した血清に含まれるグラニュライシンである。【選択図】  図１
2010286375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者における重症薬疹易罹患性の指標となるマーカーであって、前記マーカーが被験者から採取した血清に含まれるグラニュライシンである、重症薬疹易罹患性診断用マーカー。
【請求項２】
薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者から採取した血清に含まれるグラニュライシンの量を重症薬疹易罹患性の指標とする、重症薬疹易罹患性の診断方法。
【請求項３】
薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者から採取した血清を希釈する工程と、
標識物質により標識した抗グラニュライシン抗体である標識抗体に前記希釈した血清に含まれるグラニュライシンを結合させて標識抗体−グラニュライシン複合体を形成させる工程と、
担体上に固定した抗グラニュライシン抗体である捕捉抗体に前記標識抗体−グラニュライシン複合体を結合させて形成させた標識抗体−グラニュライシン−捕捉抗体複合体を検出する工程と
を有するイムノクロマトグラフィーを用いる、請求項２に記載の重症薬疹易罹患性の診断方法。
【請求項４】
血清の希釈倍率が５倍以上である、請求項３に記載の重症薬疹易罹患性の診断方法。
【請求項５】
薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者から採取した血清に含まれるグラニュライシンの量が１０ｎｇ／ｍＬ以上で易罹患性とする、請求項２から請求項４のいずれかに記載の重症薬疹易罹患性の診断方法。
【請求項６】
担体と、標識物質により標識した抗グラニュライシン抗体である標識抗体と、前記担体上に固定した抗グラニュライシン抗体である捕捉抗体とを含んでなる、重症薬疹易罹患性診断用キット。
【請求項７】
標識抗体がマウス由来抗体産生細胞クローンＲＢ１が産生する抗グラニュライシン抗体であり、かつ捕捉抗体がマウス由来抗体産生細胞クローンＲＣ８が産生する抗グラニュライシン抗体である、請求項６に記載の重症薬疹易罹患性診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者の重症薬疹易罹患性を重症薬疹発症前に診断するための重症薬疹易罹患性診断用マーカー、重症薬疹易罹患性の診断方法および重症薬疹易罹患性診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬疹とは、薬物に反応してできる皮疹をいい、すべての薬物は薬疹を引き起こす可能性がある。薬疹によって生命に危険を及ぼすような重症な薬疹を重症薬疹といい、その最重症型であるＳｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）および中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）は、高熱と広範な表皮細胞の壊死を特徴とする、非常に予後の悪い疾患である。ＳＪＳでは、口唇、眼粘膜、外陰部などの皮膚粘膜移行部で重症の粘膜疹および皮膚の紅斑が見られ、体表のびらん、水疱、表皮剥離は体表面積の１０％以下である。ＳＪＳはしばしばＴＥＮへと移行する。ＴＥＮにはＳＪＳから移行したサブタイプも含まれ、その症状はＳＪＳと類似であるが全体としてＳＪＳより重篤であり、体表面積の１０％以上でびらん、水疱、表皮剥離が見られる。ＴＥＮの致死率は２０〜２５％とされている。
【０００３】
これらの重症薬疹の初期症状は、表皮に多型滲出性紅斑を呈する軽症薬疹の症状と酷似していることから、早期の診断が非常に困難であることが問題となっており、高い致死率の一因となっている。そのため、重症薬疹に罹患しやすいか否かを重症薬疹発症前に診断することができる診断方法の確立が急務とされており、研究開発がなされている。
【０００４】
例えば、ＳＪＳ／ＴＥＮを発症している被験者の血清中の可溶性Ｆａｓリガンド濃度が、軽症薬疹を発症している被験者または薬疹を発症していない被験者の血清中の可溶性Ｆａｓリガンド濃度に比べて有意に上昇していることが本発明者らにより見出され、重症薬疹の発症率の高い薬剤を前もって投薬予定患者のリンパ球に添加して培養し、培養液中の可溶性Ｆａｓリガンドを測定する、重症薬疹の発症を予測する方法が提案されている（非特許文献１）。また、ＳＪＳあるいはＴＥＮを発症する被験者の、発症前の血清中の可溶性Ｆａｓリガンド濃度が、軽症薬疹を発症している被験者または薬疹を発症していない被験者の血清中の可溶性Ｆａｓリガンドの濃度に比べて有意に上昇していることがＪ．Ｍｕｒａｔａらにより見出され、血清中の可溶性Ｆａｓリガンドを測定する、重症薬疹の発症を早期に診断する方法が提案されている（非特許文献２）。
【０００５】
一方、グラニュライシンは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）や細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、癌細胞、移植細胞、あるいは微生物などの標的細胞に対し、アポトーシスを引き起こすために放出する殺細胞活性分子であり、生体防御において重要な役割を果たしていることが知られている。
【０００６】
グラニュライシンを検出し、被験者の免疫状態を診断する方法がいくつか提案されている。例えば、特開２００１−２４９１２６号公報には、ＮＫ細胞やＣＴＬにおけるグラニュライシンを検出して検体提供者の免疫状態を診断する方法が開示されており（特許文献１）、ＷＯ２００３／０５２４１７号公報には、体液におけるグラニュライシンを検出して検体提供者の免疫状態を診断する方法が開示されている（特許文献２）。
【０００７】
また、ＳＪＳあるいはＴＥＮを発症している被験者の患部水疱においてグラニュライシンが高発現していること、およびグラニュライシンが表皮細胞の壊死を引き起こす原因物質であることがＷ．Ｈ．Ｃｈｕｎｇらにより明らかにされている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−２４９１２６号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００３／０５２４１７号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】阿部理一郎、日皮アレルギー、第１３巻、第５３〜５７頁、２００５年
【非特許文献２】Ｊ．Ｍｕｒａｔａら、Ｊ ＡＬＬＥＲＧＹ ＣＬＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬ、第１２２巻、第９９２〜１０００頁、２００８年
【非特許文献３】Ｗ．Ｈ．Ｃｈｕｎｇら、ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＤＶＡＮＣＥ ＯＮＬＩＮＥ ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２３ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、重症薬疹に罹患しやすいか否かを重症薬疹発症前に診断する信頼性の高い方法が望まれているが、非特許文献１において提案されている診断方法では、投薬予定者の細胞培養作業などの手間が掛かることから、重症薬疹易罹患性を短時間で診断することが困難であり、非特許文献２において提案されている診断方法では、被験者の血清中に存在する可溶性Ｆａｓリガンドの絶対量が少量であるため、検出が困難である。また、特許文献１および特許文献２において開示されている診断方法は、重症薬疹に罹患しやすいか否かを重症薬疹発症前に診断する方法に用いられておらず、非特許文献３においては、重症薬疹発症前における被験者の血清中のグラニュライシン濃度が、将来重症薬疹を発症しない被験者のそれと比較して高い値を示すとの記載はない。
【００１１】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者の重症薬疹易罹患性を、重症薬疹発症前に迅速かつ容易に検出するための重症薬疹易罹患性診断用マーカー、重症薬疹易罹患性の診断方法および重症薬疹易罹患性診断用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、重症薬疹発症前における被験者の血清中のグラニュライシン濃度が、将来、重症薬疹を発症しない被験者と比較して、有意に高値であることを見出し、下記の各発明を完成した。
【００１３】
（１）薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者における重症薬疹易罹患性の指標となるマーカーであって、前記マーカーが被験者から採取した血清に含まれるグラニュライシンである、重症薬疹易罹患性診断用マーカー。
【００１４】
（２）薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者から採取した血清に含まれるグラニュライシンの量を重症薬疹易罹患性の指標とする、重症薬疹易罹患性の診断方法。
【００１５】
（３）薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者から採取した血清を希釈する工程と、標識物質により標識した抗グラニュライシン抗体である標識抗体に前記希釈した血清に含まれるグラニュライシンを結合させて標識抗体−グラニュライシン複合体を形成させる工程と、担体上に固定した抗グラニュライシン抗体である捕捉抗体に前記標識抗体−グラニュライシン複合体を結合させて形成させた標識抗体−グラニュライシン−捕捉抗体複合体を検出する工程とを有するイムノクロマトグラフィーを用いる、（２）に記載の重症薬疹易罹患性の診断方法。
【００１６】
（４）血清の希釈倍率が５倍以上である、（３）に記載の重症薬疹易罹患性の診断方法。
【００１７】
（５）薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者から採取した血清に含まれるグラニュライシンの量が１０ｎｇ／ｍＬ以上で易罹患性とする、（２）から（４）のいずれかに記載の重症薬疹易罹患性の診断方法。
【００１８】
（６）担体と、標識物質により標識した抗グラニュライシン抗体である標識抗体と、前記担体上に固定した抗グラニュライシン抗体である捕捉抗体とを含んでなる、重症薬疹易罹患性診断用キット。
【００１９】
（７）標識抗体がマウス由来抗体産生細胞クローンＲＢ１が産生する抗グラニュライシン抗体であり、かつ捕捉抗体がマウス由来抗体産生細胞クローンＲＣ８が産生する抗グラニュライシン抗体である、（６）に記載の重症薬疹易罹患性診断用キット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る重症薬疹易罹患性診断用マーカー、重症薬疹易罹患性の診断方法および重症薬疹易罹患性診断用キットによれば、薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者の重症薬疹易罹患性を、重症薬疹発症前に迅速かつ容易に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）または中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）（以下、これらを併せて「重症薬疹」という場合がある。）を発症した被験者、薬疹を発症しなかった被験者および軽症薬疹の発症にとどまった被験者から採取した血清に含まれるグラニュライシンの濃度を示す図である。図中、「ｄａｙ−４〜−２」は重症薬疹発症前４日目から発症前２日目の被験者、「ｄａｙ−１〜２」は重症薬疹発症前１日目から発症２日目の被験者、「ｄａｙ３〜５」は重症薬疹発症３日目から発症５日目の被験者、「ｄａｙ６〜１０」は重症薬疹発症６日目から発症１０日目の被験者の、それぞれ採取された血清（検体）を示す。
【図２】本実施例におけるグラニュライシン検出キットの構造を示す上面図および模式図である。
【図３】本実施例におけるグラニュライシン検出キットの構造を表す上面図および側面図である。
【図４】本実施例におけるグラニュライシン検出キットにおいて陽性反応および陰性反応を示した場合の状態図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明に係る重症薬疹易罹患性診断用マーカー、重症薬疹易罹患性の診断方法および重症薬疹易罹患性診断用キットについて詳細に説明する。本発明に係る重症薬疹易罹患性診断用マーカーは、薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者における重症薬疹易罹患性の指標となるマーカーであって、前記マーカーが被験者から採取した血清に含まれるグラニュライシンであることを特徴とする。
【００２３】
すなわち、本発明に係る重症薬疹易罹患性診断用マーカーは、薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者から採取した血清に含まれるグラニュライシンであり、「重症薬疹易罹患性の指標となる」とは、例えば、採取した血清におけるグラニュライシンの濃度や量を測定ないし検出し、グラニュライシン濃度が高い被験者やグラニュライシン量の多い被験者を重症薬疹に罹患しやすいと判定することができることをいう。グラニュライシンの濃度や量を比較する際には、統計学上のあらゆる検定法を用いることができ、例えば、χ二乗検定、Ｆ検定、Ｚ検定、Ｔ検定、ベイズ検定、ターキー・クレイマー法などの多重比較検定などを用いることができる。
【００２４】
ここで、本発明における「重症薬疹易罹患性」とは、重症薬疹に罹患し易いことをいうが、重症薬疹易罹患性を有する場合であっても、将来において重症薬疹に罹患するとは限らず、重症薬疹に罹患し得る状態を維持する場合がある。また、「軽症薬疹」とは、一般には、薬疹によって生命に危険を及ぼすようなことのない、短期間で治癒する軽症な薬疹をいうが、特に本発明においては、重症薬疹ではない薬疹をいう。
【００２５】
なお、生体内におけるグラニュライシンには、分子量１５ｋＤａの前駆体と、プロセッシングを受けて生成した分子量９ｋＤａの活性体とが知られているが、本発明におけるグラニュライシンは、これらのいずれかに限定されない。
【００２６】
次に、本発明に係る重症薬疹易罹患性の診断方法は、薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者から採取した血清に含まれるグラニュライシンの量を重症薬疹易罹患性の指標とすることを特徴とする。
【００２７】
本発明において、被験者から血清を採取すべき時期は、重症薬疹を発症していない状態であれば特に限定されないが、重症薬疹の発症前４日目から発症前２日目に採取した場合に顕著な結果が発明者らによって得られていることから、継続して血清を採取することが好ましい。
【００２８】
本発明において、重症薬疹に罹患し易いと診断される被験者の血清に含まれるグラニュライシンの濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。また、被験者から採取した血清を希釈する場合、稀釈倍率は３倍以上であることが好ましく、擬陽性の可能性を低減し、かつ検出感度を確保するためには、５倍以上であることがより好ましい。なお、使用する希釈液は、重症薬疹易罹患性の診断方法を損なわない限り、特に限定されるものでないが、定法に従って調製したブロッキングバッファーが好ましい。
【００２９】
本発明において、血清に含まれるグラニュライシンの量の検出方法は、当業者によって適宜選択することができ、特に限定されないが、例えば、血清に試薬を加えて化学反応させ、色の変化などを分析し、グラニュライシンの濃度を測定する方法や、電気泳動により血清タンパク質を分画し、グラニュライシンの濃度を測定する方法、グラニュライシンに特異的に結合する抗グラニュライシン抗体と血清に含まれるグラニュライシンとの抗原抗体反応を利用する方法などを挙げることができる。また、抗原抗体反応を利用する方法としては、イムノクロマトグラフィー法、エライザ法、ラジオイムノアッセイ法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法を利用した解析法などを挙げることができるが、イムノクロマトグラフィー法が好ましい。
【００３０】
イムノクロマトグラフィー法を用いる場合、例えば、メンブレン担体の中央部に捕捉抗体を予め固定してテストラインを形成するとともに、色素粒子により標識された標識抗体をコンジュゲートパッドに含浸させて前記メンブレン担体の一端（前方と後方とを問わない）に配置し、これに液体状のサンプル（血清）を滴下してコンジュゲートパッドに浸潤させ、サンプルと標識抗体との混合物をメンブレン担体中にて、テストラインに向けて展開させるという方法を挙げることができる。サンプルに抗原が含まれる場合、コンジュゲートパッドにおいて、抗原と前記標識抗体とが抗原抗体反応により複合体を形成し、次いで、テストラインにおいて、抗原抗体反応により前記複合体が捕捉抗体に捕捉され、集積して発色する。したがって、テストラインにおける呈色の度合いを目視で観察することができ、サンプル中の抗原の有無を判定することができる。
【００３１】
なお、イムノクロマトグラフィー法を用いる場合に使用する展開溶媒は、必要に応じ、各種添加剤を懸濁、乳濁、あるいは溶解などして調製することができる。
【００３２】
本発明において、イムノクロマトグラフィー法などの抗原抗体反応を利用する方法を用いる場合、グラニュライシンに特異的に結合する抗グラニュライシン抗体を用いるが、抗グラニュライシン抗体は定法に従って製造することができ、その種類は特に限定されない。このような抗グラニュライシン抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメントならびにその模倣物などを挙げることができる。
【００３３】
本発明における抗グラニュライシン抗体は、必要に応じて、定法に従い、標識物質により標識し、標識抗体とすることができる。標識物質は、例えば、着色粒子、酵素、蛍光物質、アイソトープなどを挙げることができる。また、本発明における抗グラニュライシン抗体は、担体上に固定した状態で用いることができる。担体としては、例えば、マイクロプレート、ビーズ、アガロース、セルロースメンブレンなどを挙げることができ、固定方法は担体の種類に応じて、定法に従って行うことができる。例えば、マイクロプレートを用いる場合、定法に従った物理的な非特異的吸着法を用いて、これに抗体を固定することができる。また、ビーズやアガロースを用いる場合、化学的な架橋剤を用いてこれらに抗体を固定する方法や、固定化された抗イムノグロブリン抗体やプロテインＡなどの、抗体に親和性のあるタンパク質を用いて固定する方法を挙げることができる。
【００３４】
本発明におけるイムノクロマトグラフィー法は、薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者から採取した血清を希釈する工程と、標識物質により標識した抗グラニュライシン抗体である標識抗体に前記希釈した血清に含まれるグラニュライシンを結合させて標識抗体−グラニュライシン複合体を形成させる工程と、担体上に固定した抗グラニュライシン抗体である捕捉抗体に前記標識抗体−グラニュライシン複合体を結合させて形成させた標識抗体−グラニュライシン−捕捉抗体複合体を検出する工程とを有する。
【００３５】
「標識抗体−グラニュライシン複合体」とは、標識抗体のパラトープとグラニュライシンのエピトープとが、水素結合、イオン結合、疎水結合、あるいはファンデルワールス結合により非共有的に結合することにより、標識抗体とグラニュライシンとが結合し、標識された一つの分子と化したものをいう。
【００３６】
また、「標識抗体−グラニュライシン−捕捉抗体複合体」とは、補足抗体のパラトープと、標識抗体−グラニュライシン複合体におけるグラニュライシンのエピトープとが、水素結合、イオン結合、疎水結合、あるいはファンデルワールス結合により非共有的に結合することにより、標識抗体−グラニュライシン複合体と補足抗体とが結合し、担体上に固定された一つの分子と化したものをいう。
【００３７】
なお、本発明に係る重症薬疹易罹患性の診断方法には、本発明に係る重症薬疹易罹患性の診断方法の特徴を損なわない限り、他の工程を有してもよく、例えば、インキュベート工程や洗浄工程などを有してもよい。
【００３８】
次に、本発明に係る重症薬疹易罹患性診断用キットは、担体と、標識物質により標識した抗グラニュライシン抗体である標識抗体と、前記担体上に固定した抗グラニュライシン抗体である捕捉抗体とを含んでなる。本発明に係る重症薬疹易罹患性診断用キットは、イムノクロマトグラフィー法を利用して被験者の血清に含まれるグラニュライシンを検出することにより、薬疹を発症していない被験者または軽症薬疹を発症している被験者の重症薬疹易罹患性を、重症薬疹発症前に検出するために用いられる。
【００３９】
本発明に係る重症薬疹易罹患性診断用キットは、担体と、標識物質により標識した抗グラニュライシン抗体である標識抗体と、担体上に固定した抗グラニュライシン抗体である捕捉抗体とを含んでいれば、その構成は特に限定されないが、例えば、台紙の上にメンブレンが重なり、その上にサンプルパッド、コンジュゲートパッドおよび給水紙が順に並び、コンジュゲートパッドには赤色粒子で標識した抗グラニュライシン抗体（標識抗体）が含まれ、メンブレンに形成されたテストラインには抗グラニュライシン抗体（捕捉抗体）が固定され、メンブレンに形成されたコントロールラインには抗マウス抗体が固定されるという構成をとることができる。
【００４０】
このような構成において用いられるサンプルパッドとしては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどの多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、濾紙および綿布などの紙または織布、不織布などを挙げることができる。
【００４１】
吸水紙としては、液体を吸収、保持できる材質のものであればよく、例えば、濾紙、綿布、あるいはポリエチレンポリプロピレンなどからなる多孔質プラスチック不織布などを挙げることができる。
【００４２】
コンジュゲートパッドとしては、標識抗体を含浸させ、かつ血清を浸潤させることができるものであればよく、例えば、セルロース類布、ガラス繊維不織布、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの多孔質プラスチック布類などを挙げることができる。
【００４３】
メンブレンとしては、補捉抗体を固定することができ、かつサンプル（血清）を展開できるものであればよく、例えば、ニトロセルロース膜、セルロース膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜などを用いることができる。
【００４４】
なお、本発明に係る重症薬疹易罹患性診断用キットには、その特徴を損なわない限り、あらゆる構成を含んでもよく、例えば、グラニュライシンの免疫学的検出手段の実施に有用な物質や緩衝液などを含んでもよい。
【００４５】
以下、本発明に係る重症薬疹易罹患性診断用マーカー、重症薬疹易罹患性の診断方法および重症薬疹易罹患性診断用キットについて、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４６】
＜実施例１＞ＳＪＳまたはＴＥＮを発症した被験者から採取された血清のグラニュライシン濃度の測定
薬疹を発症していないまたは軽症薬疹を発症しているがその後Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）または中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）を発症した被験者、薬疹を発症しなかった被験者および軽症薬疹の発症にとどまった被験者から採取された血清のグラニュライシン濃度の測定を、株式会社ビー・エム・エルに委託した。
【００４７】
被験者がＳＪＳまたはＴＥＮを発症した日からの日数は、皮膚や粘膜の潰瘍、あるいは眼の充血などの眼の症状が初めて確認された日を発症１日目として算出した。また、薬疹を発症していないまたは軽症薬疹を発症しているがその後ＳＪＳまたはＴＥＮを発症した被験者については、ＳＪＳを発症した被験者１２名とＴＥＮを発症した被験者６名の、ＳＪＳまたはＴＥＮの発症前４日目から発症前２日目（−４日目〜−２日目）、発症前１日目から発症２日目（−１日目〜２日目）、発症３日目から発症５日目（３日目〜５日目）および発症６日目から発症１０日目（６日目〜１０日目）から選択される１または複数回の時期に採取された血清を検体として、グラニュライシン濃度を測定した。それぞれの検体数は、−４日目〜−２日目が３、−１日目〜２日目が１２、３日目〜５日目が１０、６日目〜１０日目が１１であった。さらに、薬疹を発症しなかった被験者３２名および軽症薬疹の発症にとどまった被験者２５名から採取された血清を検体として、グラニュライシン濃度を測定した。その結果を図１に示す。なお、各群間の多重比較はターキー・クレイマー法により行った。図１中、★印はＰ＜０．０５を示す。
【００４８】
その結果、−４日目〜−２日目の３検体、−１日目〜２日目の１２検体、３日目〜５日目の１０検体、６日目〜１０日目の１１検体、薬疹を発症しなかった被験者の３２検体および軽症薬疹の発症にとどまった被験者の２５検体におけるグラニュライシン濃度の平均値は、それぞれ、２３．１ｎｇ／ｍＬ、１２．７ｎｇ／ｍＬ、４．２ｎｇ／ｍＬ、４．５ｎｇ／ｍＬ、１．６ｎｇ／ｍＬおよび３．５ｎｇ／ｍＬ、標準偏差はそれぞれ、±１６．６ｎｇ／ｍＬ、±１６．４ｎｇ／ｍＬ、±３．０ｎｇ／ｍＬ、±４．５ｎｇ／ｍＬ、±０．６ｎｇ／ｍＬおよび±３．４ｎｇ／ｍＬであった。
【００４９】
また、図１に示すように、薬疹を発症していないまたは軽症薬疹を発症しているがその後重症薬疹を発症した被験者における検体のグラニュライシン濃度は、重症薬疹を発症する前の−４日目〜−２日目において１０ｎｇ／ｍＬ以上の高い値を示すことが確認された（Ｐ値＜０．０１）。また、−１日目〜２日目においては、−４日目〜−２日目と比較して高い値を示す検体が確認されるものの、１０ｎｇ／ｍＬ未満の低い値を示す検体が多いことが確認され、３日目〜５日目および６日目〜１０日目においては、−４日目〜−２日目と比較して、ほとんどすべての検体が１０ｎｇ／ｍＬ未満の低い値を示すことが確認された。さらに、薬疹を発症しなかった被験者および軽症薬疹の発症にとどまった被験者の検体のグラニュライシン濃度もまた、−４日目〜−２日目と比較して、すべての検体が１０ｎｇ／ｍＬ未満の低い値を示すことが確認された。
【００５０】
以上の結果より、薬疹を発症していないまたは軽症薬疹を発症しているがその後重症薬疹を発症した被験者のうち、重症薬疹を発症する前である−４日目〜−２日目の被験者から採取された血清のグラニュライシン濃度は、重症薬疹発症前−１日目の被験者、重症薬疹発症後の被験者、薬疹を発症しなかった被験者および軽症薬疹の発症にとどまった被験者と比較して１０ｎｇ／ｍＬ以上の高い値を示すことから、採取された血清に含まれるグラニュライシンの量を指標とすることにより、重症薬疹に罹患し易いか否かを診断できることが示された。
【００５１】
＜実施例２＞グラニュライシン検出用キットの作製および検討
被験者から採取された血清に含まれるグラニュライシンをイムノクロマトグラフィーを用いて検出するキットを作製し、このキットを使用する際の血清の希釈率およびグラニュライシンの最小検出濃度を検討した。
【００５２】
（１）グラニュライシン検出用キットの作製
被験者から採取された血清に含まれるグラニュライシンを検出するキットを、株式会社イムノ・ダイアグノスティック・ラボラトリーにおいて作製した。その構造を図２および図３に示す。
【００５３】
図２に示すように、キットにはイムノクロマトグラフィー法が用いられており、図３に示すように、台紙の上にメンブレンが重ねられて配設されている。そのメンブレンの前方には、上から順に、サンプルパッド、コンジュゲートパッドが重ねられ、さらにメンブレンの後方には給水紙が重ねられて配設されている。また、このキットの上面は、図示しないカバーシールと呼ばれる透明なフィルムで覆われている。コンジュゲートパッドには、図２および図３に示すように、赤色粒子で標識された抗グラニュライシン抗体（標識抗体）が含浸されており、また、メンブレン上に形成されたテストラインには、抗グラニュライシン抗体（捕捉抗体）が、コントロールラインには抗マウス抗体が固定されている。なお、本実施例におけるキットに用いられる抗体を表１に示す。
【００５４】
【表１】
2010286375.tif 000003
【００５５】
サンプルパッドに滴下した血清は、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、メンブレン、給水紙の順に浸潤、展開するため、血清にグラニュライシンが含まれる場合、まず、コンジュゲートパッドにて赤色粒子で標識された標識抗体とグラニュライシンとにより標識抗体−グラニュライシン複合体が形成される。次いで、形成された標識抗体−グラニュライシン複合体はコンジュゲートパッドからメンブレンへ浸潤、展開し、メンブレンに形成されたテストラインにおいて、テストラインに固定された捕捉抗体と標識抗体−グラニュライシンとにより標識抗体−グラニュライシン−捕捉抗体複合体が形成される。標識抗体は赤色粒子で標識されているため、標識抗体−グラニュライシン−捕捉抗体複合体が形成された場合、テストラインに赤色のラインが現れることから、グラニュライシン陽性の確認が目視で可能となる。さらに、余分な標識抗体や標識抗体−グラニュライシン複合体はメンブレンに形成されたコントロールラインに展開する。コントロールラインには、抗マウス抗体が固定されているため、余分な標識抗体や標識抗体−グラニュライシン複合体と抗マウス抗体とにより（グラニュライシン−）標識抗体−抗マウス抗体複合体が形成されて、コントロールラインに赤色のラインが現れる。グラニュライシン陽性ないし陰性とコントロールラインにおける呈色との状態を図３に示す。
【００５６】
（２）グラニュライシン検出キット使用時の血清の希釈率の検討
本実施例（１）で作製したグラニュライシン検出キットにおける、非特異的反応を抑制するための血清の希釈率について検討した。
【００５７】
薬疹を発症しなかった被験者から採取した血清に、２５０ｎｇ／ｍＬとなるようグラニュライシン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ ＭＡｂ；コード ３１３８−ＧＮ／ＣＦ；ロット ＯＨＢ０５０８０４１；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加した。これを、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）、０．１ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０および０．２ｗ／ｖ％スキムミルクにより調製したブロッキングバッファーを用いて、それぞれ、希釈なし、３倍希釈（グラニュライシン濃度約８３ｎｇ／ｍＬ）、１０倍希釈（グラニュライシン濃度２５ｎｇ／ｍＬ）、３０倍希釈（グラニュライシン濃度約８．３ｎｇ／ｍＬ）の血清を調製した。また、薬疹を発症しなかった被験者から採取した血清にグラニュライシンを添加しないで、同様にブロッキングバッファーを用いて、それぞれ、希釈なし、３倍希釈、１０倍希釈、３０倍希釈した血清を調製し、コントロールとして用いた。これらを、本実施例（１）で作製したグラニュライシン検出キットのサンプルパッドにそれぞれ７０μＬ滴下し、１５分後にテストラインにおける赤色ラインの有無を、すなわちグラニュライシン陽性ないし陰性を確認した。その結果を表２に示す。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
表２に示すように、希釈なしおよび３倍希釈では、グラニュライシンを添加した血清か否かにかかわらず、テストラインにおいて赤色ラインが検出され、グラニュライシン陽性と確認された。１０倍希釈および３０倍希釈では、グラニュライシンを添加した血清について、テストラインにおいて赤色ラインが検出され、グラニュライシン陽性と確認されたが、グラニュライシンを添加した血清については、テストラインにおいて赤色ラインが検出されず、グラニュライシン陰性と確認された。
【００６０】
以上の結果より、本実施例（１）で作製したグラニュライシン検出キットにおいて、希釈しない血清および３倍希釈した血清では、非特異的にグラニュライシン陽性と検出されるが、１０倍希釈および３０倍希釈した血清では、擬陽性が抑えられ、グラニュライシン特異的に陽性と検出されることが確認された。
【００６１】
（３）グラニュライシン検出キット使用時の血清の希釈率および血清に含まれるグラニュライシンの最小検出濃度の検討
本実施例（１）で作製したグラニュライシン検出キットにおける、非特異的反応を抑制するための血清の希釈率について、より詳細に検討し、かつ血清のグラニュライシン濃度を変化させることにより、最小検出濃度について検討した。
【００６２】
薬疹を発症しなかった被験者から採取した血清に、それぞれ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬとなるようグラニュライシン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ ＭＡｂ；コード ３１３８−ＧＮ／ＣＦ;ロット ＯＨＢ０５０８０４１；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加した。これを、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）、０．１ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０および０．２ｗ／ｖ％スキムミルクにより調製したブロッキングバッファーを用いて、それぞれ、３倍希釈、５倍希釈、１０倍希釈の血清を調製した。また、薬疹を発症しなかった被験者から採取した血清にグラニュライシンを添加しないで、同様にブロッキングバッファーを用いて、それぞれ、３倍希釈、５倍希釈、１０倍希釈した血清を調製し、コントロールとして用いた。これらを、本実施例（１）で作製したグラニュライシン検出キットのサンプルパッドにそれぞれ７０μＬ滴下し、１５分後にテストラインにおける赤色ラインの有無を、すなわちグラニュライシン陽性ないし陰性を確認した。その結果を表３に示す。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
表３に示すように、３倍希釈した血清では、希釈する前の血清グラニュライシン濃度が０ｎｇ／ｍＬおよび５ｎｇ／ｍＬの場合で、わずかながらグラニュライシン陽性が検出され、同濃度が１０ｎｇ／ｍＬ以上の場合、いずれもグラニュライシン陽性が検出された。５倍希釈した血清では、希釈する前の血清グラニュライシン濃度が０ｎｇ／ｍＬおよび５ｎｇ／ｍＬの場合でグラニュライシン陽性が検出されず、同濃度が１０ｎｇ／ｍＬ以上の場合、いずれもグラニュライシン陽性が検出された。１０倍希釈した血清では、希釈する前の血清グラニュライシン濃度が０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬの場合でグラニュライシン陽性が検出されず、同濃度が２０ｎｇ／ｍＬ以上の場合、いずれもグラニュライシン陽性が検出された。  
【００６５】
以上の結果より、本実施例（１）で作製したグラニュライシン検出キットにおいて、３倍希釈した血清では、擬陽性と検出される場合があり、この擬陽性反応を抑制するため、５倍希釈した血清を用いることが好適であると確認された。また、５倍希釈した血清においては、希釈する前の血清グラニュライシン濃度が５ｎｇ／ｍＬの場合、陽性と検出されず、同濃度１０ｎｇ／ｍＬ以上の場合で陽性と検出されることから、希釈しない被験者の血清に含まれるグラニュライシンの濃度が１０ｎｇ／ｍＬ以上であることが好適であると確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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