(57)【要約】【課題】野生型ニトリルヒドラターゼの改良により、耐熱性及びアミド化合物耐性がより一層向上したニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質を提供する。【解決手段】以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。（Ａ） 野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において特定のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質（Ｂ） 上記（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、上記特定のアミノ酸残基を除き、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されており、
（ａ）βサブユニットのアミノ酸配列のうち、Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて６３残基上流のアミノ酸残基
（ｂ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１１残基上流のアミノ酸残基
（ｃ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１７３残基上流のアミノ酸残基
下記（ｄ）〜（ｏ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置されたアミノ酸配列を含み、
（ｄ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２残基上流のアミノ酸残基
（ｅ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１４残基上流のアミノ酸残基
（ｆ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１５残基上流のアミノ酸残基
（ｇ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて９８残基上流のアミノ酸残基
（ｈ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて９９残基上流のアミノ酸残基
（ｉ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１１６残基上流のアミノ酸残基
（ｊ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２３残基上流のアミノ酸残基
（ｋ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２５残基上流のアミノ酸残基
（ｌ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２６残基上流のアミノ酸残基
（ｍ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１３０残基上流のアミノ酸残基
（ｎ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１３５残基上流のアミノ酸残基
（ｏ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて２１５残基上流のアミノ酸残基
且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
（Ｂ）（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、前記置換後のアミノ酸残基を除き、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の下記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されており、
（ａ）βサブユニットのアミノ酸配列のうちＣ末端のアミノ酸残基から数えて６３残基
上流のアミノ酸残基
（ｂ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１１残基上流のアミノ酸残基
（ｃ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１７３残基上流のアミノ酸残基
（ｄ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１１６残基上流のアミノ酸残基
（ｅ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２３残基上流のアミノ酸残基
下記（ｆ）〜（ｏ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基とが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、
（ｆ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２残基上流のアミノ酸残基
（ｇ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１４残基上流のアミノ酸残基
（ｈ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１５残基上流のアミノ酸残基
（ｉ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて９８残基上流のアミノ酸残基
（ｊ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて９９残基上流のアミノ酸残基
（ｋ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２５残基上流のアミノ酸残基
（ｌ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２６残基上流のアミノ酸残基
（ｍ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１３０残基上流のアミノ酸残基
（ｎ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１３５残基上流のアミノ酸残基
（ｏ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて２１５残基上流のアミノ酸残基
且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
（Ｂ）（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、前記置換後のアミノ酸残基を除き、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載の遺伝子ＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養して得られる培養物から採取されるニトリルヒドラターゼ。
【請求項７】
請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを含むニトリルヒドラターゼの製造方法。
【請求項８】
請求項１又は２記載のタンパクをニトリル化合物に接触させることを含むアミド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良型（変異型）のニトリルヒドラターゼ、及びその製造方法に関する。さらには、当該酵素をコードする遺伝子DNA、当該遺伝子DNAを含む組換えベクター、及び当該組換えベクターを有する形質転換体、並びにアミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、当該酵素又は当該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が開示されている。この製造方法は、従来の化学合成法と比較し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いことで知られている。
【０００３】
ニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、クレビシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属等に属する微生物を挙げることができる。中でもロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株はアクリルアミドの工業的生産に使用されており、有用性が実証されている。また、その菌株が産生するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子も明らかとなっている（特許文献１参照）。
【０００４】
一方、自然界に存在する微生物から単離したニトリルヒドラターゼやその遺伝子を利用するのみならず、ニトリルヒドラターゼに対して、活性、基質特異性、Ｖｍａｘ、Ｋｍ、熱安定性、基質に対する安定性、生成物に対する安定性等を変化させる目的でニトリルヒドラターゼに変異を導入することが試みられており（特許文献２参照）、本発明者らによって耐熱性又はアミド化合物耐性を共に向上させたニトリルヒドラターゼ遺伝子が取得されている（特許文献３及び４参照）。
しかし、耐熱性及びアミド化合物耐性の向上したニトリルヒドラターゼを開発し、アミド化合物の製造に用いることは、触媒コスト等の生産コストの観点などから非常に有用であり、より耐性の向上した酵素の取得は、反応時の酵素量の削減及びコスト削減等の観点から開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３１６２０９１号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／０５６９９０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／１１６２０６号パンフレット
【特許文献４】特開２００７−１４３４０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、ニトリルヒドラターゼの改良により、耐熱性及びアミド化合物耐性がさらに向上したニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質を提供することである。また、本発明の目的は、当該タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ、当該遺伝子DNAを含む組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、当該形質転換体の培養物から採取されるニトリルヒドラターゼ及びその製造方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、当該培養物又は当該培養物の処理物を用いたアミド化合物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列のうち、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したタンパク質が、ニトリルヒドラターゼ活性を有するとともに、耐熱性及びアミド化合物耐性が向上したものであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されており、
（ａ）βサブユニットのアミノ酸配列のうち、Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて６３残基上流のアミノ酸残基
（ｂ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１１残基上流のアミノ酸残基
（ｃ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１７３残基上流のアミノ酸残基
下記（ｄ）〜（ｏ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置されたアミノ酸配列を含み、
（ｄ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２残基上流のアミノ酸残基
（ｅ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１４残基上流のアミノ酸残基
（ｆ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１５残基上流のアミノ酸残基
（ｇ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて９８残基上流のアミノ酸残基
（ｈ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて９９残基上流のアミノ酸残基
（ｉ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１１６残基上流のアミノ酸残基
（ｊ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２３残基上流のアミノ酸残基
（ｋ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２５残基上流のアミノ酸残基
（ｌ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２６残基上流のアミノ酸残基
（ｍ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１３０残基上流のアミノ酸残基
（ｎ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１３５残基上流のアミノ酸残基
（ｏ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて２１５残基上流のアミノ酸残基
且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
（Ｂ）（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、前記置換後のアミノ酸残基を除き、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、耐熱性及びアミド化合物耐性が向上した新規な改良型（変異型）ニトリルヒドラターゼを提供することができる。耐熱性及びアミド化合物耐性がいずれもより向上した当該改良型ニトリルヒドラターゼは、アミド化合物の製造効率が高くなるので非常に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
なお本明細書においては、特記した場合を除き、「上流」及び「上流側」とは、アミノ酸配列に関しては「Ｎ末端側」を意味し、塩基配列に関しては「５'末端側」を意味する。また、「下流」及び「下流側」とは、アミノ酸配列に関しては「Ｃ末端側」を意味し、塩基配列に関しては「３'末端側」を意味する。
１．野生型ニトリルヒドラターゼ
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、野生型ニトリルヒドラターゼの改良型（変異型）であり、その由来は特に限定されるものではない。ここで、「野生型ニトリルヒドラターゼ」とは、自然界の生物（例えば、土壌細菌等の微生物）より分離され得るニトリルヒドラターゼを指し、当該酵素を構成するアミノ酸配列、及び当該酵素をコードする遺伝子の塩基配列が、人為的に欠失又は挿入せず、あるいは、他のアミノ酸又は塩基で置換されておらず、天然由来の特性を保持したままのニトリルヒドラターゼを意味する。既知の微生物由来のニトリルヒドラターゼのみならず、未知の生物由来のニトリルヒドラターゼも上記「野生型ニトリルヒドラターゼ」に含まれる。
【００１２】
「野生型ニトリルヒドラターゼ」は、αサブユニット及びβサブユニットのドメインが集合してなる高次構造をとり、補欠分子として非ヘム鉄原子、又は非コリン核コバルト原子を有している。これらのニトリルヒドラターゼは、それぞれ鉄型ニトリルヒドラターゼ及びコバルト型ニトリルヒドラターゼという呼称で区別されている。
【００１３】
鉄型ニトリルヒドラターゼとしては、ロドコッカス属Ｎ−７７１株由来のものをその代表例として挙げることができる。この鉄型ニトリルヒドラターゼは、Ｘ線結晶構造解析がなされ、その立体構造が明らかになっている。その結果、当該酵素は、活性中心を形成するαサブユニットのシステインクラスター（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（配列番号２３））中の４つのアミノ酸残基を介して非へム鉄と結合している。
【００１４】
コバルト型ニトリルヒドラターゼとしては、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株（以下「Ｊ１菌」と称する場合がある）由来のもの、又はシュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来のものを代表例として挙げることができる。Ｊ１菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼは、活性中心を形成するαサブユニットのシステインクラスター（Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（配列番号２４））で示される領域を介してコバルト原子と結合している。なお、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのシステインクラスターは、上記Ｊ１菌由来のシステインクラスターにおける上流側（Ｎ末端側）から第４番目のシステイン（Ｃｙｓ）がシステインスルフィン酸（Ｃｓｉ）であり、最も下流側（Ｃ末端側）の第６番目のシステイン（Ｃｙｓ）がシステインスルフェン酸（Ｃｓｅ）である。
【００１５】
上述の通り、補欠分子は、αサブユニット中のシステインクラスター「Ｃ（Ｓ／Ｔ）ＬＣＳＣ」で表される領域と結合している。このような補欠分子結合領域を含むニトリルヒドラターゼとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）、ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４）、ロドコッカス・ロドクロウスＭ３３（ＶＫＭ  Ａｃ−１５１５Ｄ）、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ３９４８４（特開２００１−２９２７７２）、バチルス・スミシ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）（特開平９−２４８１８８）、シュードノカルディア・サーモフィラ（特開平９−２７５９７８）  又はジオバチルス・サーモグルコシダシアス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）由来のアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ及び遺伝子配列でコードされるニトリルヒドラターゼが挙げられる。
【００１６】
一方、βサブユニットの機能については構造の安定性に関与していると考えられている。各種微生物由来の野生型ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸（一文字表記）配列のアライメントを、図２、３及び４に示した。各アミノ酸配列は、図２、３及び４に示す順に繋がっているものとする。なお、図２〜４のそれぞれにおいて、上のアミノ酸配列から順に、配列番号５〜２２に示す。
２．改良型ニトリルヒドラターゼ
本発明は、野生型ニトリルヒドラターゼにアミノ酸置換を施した改良型（変異型）ニトリルヒドラターゼである。置換を施す対象となる野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）等のＮＣＢＩのデータベースに公表されている。
例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）由来のαサブユニットは、アミノ酸配列及び塩基配列が配列番号１で示される。また、βサブユニット（配列番号１）のアクセッション番号は「Ｐ２１２２０」である。また、ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４）  由来のαサブユニットのアクセッション番号は「ＡＴＴ７９３４０」であり、βサブユニットのアクセッション番号は「ＡＡＴ７９３３９」である。さらに、シュードノカルデァ・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＪＣＭ３０９５由来のαサブユニットのアクセッション番号は「１ＩＲＥ  Ａ」であり、βサブユニットのアクセッション番号は「１ＩＲＥ  Ｂ」である。
【００１７】
また、特定のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列において、１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸残基（但し、上記置換後のアミノ酸残基を除く）が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有する改良型ニトリルヒドラターゼも本発明の範囲である。
【００１８】
本発明における「改良型ニトリルヒドラターゼ」としては、野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において下記（a）、（b）及び（c）の三箇所が置換された上で、さらに、（ｄ）〜（ｏ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質が挙げられる。なお、下記（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）及び（ｏ）のアミノ酸残基は、それぞれ、各種野生型ニトリルヒドラターゼの中でもロドコッカス・ロドクロウス種に属する細菌由来の、野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列中のアミノ酸残基であることが好ましい。
【００１９】
（ａ）βサブユニットのアミノ酸配列のうちＣ末端のアミノ酸残基から数えて６３残基
上流のアミノ酸残基
（ｂ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１１残基上流のアミノ酸残基
（ｃ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１７３残基上流のアミノ酸残基
（ｄ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２残基上流のアミノ酸残基
（ｅ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１４残基上流のアミノ酸残基
（ｆ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１５残基上流のアミノ酸残基
（ｇ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて９８残基上流のアミノ酸残基
（ｈ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて９９残基上流のアミノ酸残基
（ｉ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１１６残基上流のアミノ酸残基
（ｊ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２３残基上流のアミノ酸残基
（ｋ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２５残基上流のアミノ酸残基
（ｌ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１２６残基上流のアミノ酸残基
（ｍ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１３０残基上流のアミノ酸残基
（ｎ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１３５残基上流のアミノ酸残基
（ｏ）上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて２１５残基上流のアミノ酸残基。
【００２０】
また、本発明の改良型ニトリルヒドラターゼとしては、上記タンパク質の中でも、置換されるアミノ酸残基が以下に列挙するアミノ酸残基であるものが好ましく挙げられる。
・上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸残基と、上記（ｄ）〜（ｏ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基
・上記（ａ）〜（ｃ）、及び（ｉ）のアミノ酸残基と、上記（ｄ）〜（ｈ）及び（ｊ）〜（ｏ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基
・上記（ａ）〜（ｃ）、及び（ｊ）のアミノ酸残基と、上記（ｄ）〜（ｉ）及び（ｋ）〜（ｏ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基
・上記（ａ）〜（ｃ）、及び（ｌ）のアミノ酸残基と、上記（ｄ）〜（ｋ）及び（ｍ）〜（ｏ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基
・上記（ａ）〜（ｃ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｌ）のアミノ酸残基と、上記（ｄ）〜（ｈ）、（ｋ）及び（ｍ）〜（ｏ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの一例としては、Ｊ１菌由来の野生型ニトリルヒドラターゼにおいて、本発明のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列におけるＣ末端のアミノ酸残基から数えて６３残基上流のアミノ酸残基（アスパラギン）、上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１１残基上流のアミノ酸残基（バリン）、及び上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１７３残基上流のアミノ酸残基（セリン）が他のアミノ酸（例えばリジンなど）に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質が好ましく挙げられる。このようなアミノ酸置換の態様の表記例としては、「Ｎβ←６３Ｓ，Ｖβ←１１Ａ，Ｓβ←１７３Ｒ、Ｋβ←１１６Ｙ」等が挙げられる。
【００２１】
また、上記一例としての改良型ニトリルヒドラターゼは、Ｊ１菌由来の野生型ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列においてＮ末端側から第１６７番目のアミノ酸残基（アスパラギン）、βサブユニットのアミノ酸配列においてＮ末端側から第２１９番目のアミノ酸（バリン）、βサブユニットのアミノ酸配列においてＮ末端側から第５７番目のアミノ酸（セリン）、及びβサブユニットのアミノ酸配列においてＮ末端側から第１１４番目のアミノ酸（リジン）が他のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質である、と言うこともできる。
【００２２】
なお、アミノ酸のアルファベット表記は通常の１文字で表すことができ、置換箇所までのアミノ酸残基数を表す数字（例えば「２６」）の左側に表示したアルファベットは、置換前のアミノ酸の１文字表記を示し、右側に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の１文字表記を示している。
【００２３】
具体的には、配列番号１に示すβサブユニットのアミノ酸配列に関して、「Ｎβ←６３Ｓ」と表記した場合は、βサブユニットのアミノ酸配列（配列番号１）のうちＣ末端のアミノ酸残基から数えて（当該Ｃ末端のアミノ酸残基を含めて数えて）６３番目のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に置換された改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様を意味する。ここで、「β←」という表記は、置換位置が上記Ｃ末端のアミノ酸残基からみて上流にある（当該Ｃ末端のアミノ酸残基を含めて数えてＮ末端側にある）ことを意味する。
【００２４】
さらに、本発明の改良型ニトリルヒドラターゼとしては、上記タンパク質の中でも、置換されるアミノ酸残基が表１に列挙するアミノ酸残基であるものがより好ましく挙げられる。
【００２５】
【表１】
2010172295.tif 000002
これらの中でも、上記１３〜２９の態様でアミノ酸置換が施された改良型ニトリルヒドラターゼがさらに好ましく、上記２５〜２９の態様でアミノ酸置換が施された改良型ニトリルヒドラターゼが特に好ましい。
【００２６】
上記アミノ酸置換を生じさせるための塩基置換としては、以下の表２〜表４の態様が好ましく挙げられる。
【００２７】
【表２】
2010172295.tif 000003
【００２８】
【表３】
2010172295.tif 000004
【００２９】
【表４】
2010172295.tif 000005
例えば、野生型ニトリルヒドラターゼのβ←12、β←14、β←15、β←98、β←99、β←116、β←123、β←125、β←126、β←130、β←135、β←215、β←63、β←11及びβ←173の置換部位は、それぞれ、Ｊ１菌のβサブユニット（配列番号１）においては、２１８番目、２１６番目、２１５番目、１３２番目、１３１番目、１１４番目、１０７番目、１０５番目、１０４番目、１００番目、９５番目、１５番目、167番目、２１９番目及び５７番目のアミノ酸残基に相当する。
３．ニトリルヒドラターゼ活性
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの活性は、天然由来の特性を保持したままの野生型ニトリルヒドラターゼの活性に対して耐熱性及びアミド化合物耐性が向上している。
【００３０】
ここで、「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、ニトリル化合物を、対応するアミド化合物に変換する水和反応（ＲＣＮ＋Ｈ2Ｏ→ＲＣＯＮＨ2）を触媒する酵素である。活性測定は、基質であるニトリル化合物をニトリルヒドラターゼと接触させ、対応するアミド化合物に変換した後、当該アミド化合物を定量することにより算出することができる。基質としては、ニトリルヒドラターゼが反応すればいかなるニトリル化合物でも使用できるが、アクリロニトリルが好ましい。
反応条件としては、基質濃度は２．５％、反応温度は１０℃から３０℃、反応時間は１０分から３０分の範囲で行う。酵素反応はリン酸を添加して停止させる。その後、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により、生成したアクリルアミドを分析することでアミド化合物の定量を行うことができる。
また、ニトリルヒドラターゼ活性の有無は活性染色法によって簡便に調べることができる。例えば、基質にアントラニロニトリル（ａｎｔｈｒａｎｉｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）を使用すれば、ニトリルヒドラターゼによって変換されたアントラニルアミド（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｍｉｄｅ）は蛍光を有するので高感度に簡便に検出することができる（Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ    ８０（２）：１６９−１８３，２００１参照）。
「耐熱性及びアミド化合物耐性の向上」とは、親株（野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において上記（a）、（b）及び（c）の三箇所が置換されたタンパク質）が失活する高濃度のアミド化合物存在下で加熱処理条件において、親株以上のニトリルヒドラターゼ活性を維持することができることを意味する。改良型ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の培養物又は当該形質転換体から単離した改良型ニトリルヒドラターゼを、アクリルアミド等のアミド化合物の存在下で、加熱処理を行う。
加熱処理の方法としては、当該容器をウォーターバスやインキュベーター等の加熱装置に入れ一定時間保温すればよい。この時、酵素の安定性を高める為のニトリル化合物やアミド化合物を添加して加熱処理を実施してもよい。
加熱処理の条件としては処理温度と処理時間を適宜検討し、親株の活性が検出できない条件を設定するのが好ましい。加熱処理後のニトリルヒドラターゼ活性は、活性染色法や活性測定で確認することができる。
具体的には、３０〜５０％のアクリルアミド溶液に培養した形質転換体を懸濁し、５０℃から７０℃の範囲で、５分から６０分加熱処理を行う。加熱処理後、基質となるニトリルを含む基質溶液を添加し、活性染色法にてニトリルヒドラターゼ活性が保持されているか調べればよい。
親株が完全に失活する処理条件において、ニトリルヒドラターゼ活性が確認できた変異型酵素を耐熱性及びアミド化合物耐性が向上したと評価した。ここで、本発明における親株とは、変異導入する鋳型プラスミドが導入された形質転換体を意味する。
【００３１】
アミド化合物としては、例えば、下記一般式（１）：
Ｒ−ＣＯＮＨ2    （１）
(ここで、Ｒは、置換されていてもよい炭素数１〜１０の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基又はアルケニル基、置換されていてもよい炭素数３〜１８のシクロアルキル基又はアリール基、あるいは、置換されていてもよい飽和又は不飽和複素環基である。)
で表されるアミド化合物が挙げられる。特に、式中、Ｒが「ＣＨ2＝ＣＨ−」であるアクリルアミドが好ましい。
【００３２】
上記の改良型ニトリルヒドラターゼは、野生型ニトリルヒドラターゼをアミノ酸置換することで得られるものであり、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株由来のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列（配列番号１及び／又は２）を改変し、耐熱性及び／又はアミド化合物耐性の向上したニトリルヒドラターゼを選択することにより得られる。
なお、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に昭和６２（１９８７）年９月１８日付けで国際寄託されている。
【００３３】
Ｊ１菌以外のニトリルヒドラターゼにおいても上述の変異の位置、変異するアミノ酸種、ＤＮＡ配列によって耐熱性及び／又はアミド化合物耐性が向上すると考えられる。その様な菌としては、好ましくは、ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４）、ロドコッカス・ロドクロウスＭ３３（ＶＫＭ  Ａｃ−１５１５Ｄ）又はロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ３９４８４（特開２００１−２９２７７２）、バチルス・スミシ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）（特開平０９−２４８１８８）、シュードノカルディア・サーモフィラ（特開平０９−２７５９７８）、ジオバチルス・サーモグルコシダシアス等が挙げられる。
なお、ロドコッカス・ロドクロウスＭ３３（ＶＫＭ  Ａｃ−１５１５Ｄ）は、上記Ｍ８菌（ＳＵ１７３１８１４）から自然突然変異によって構成的にニトリルヒドラターゼを発現する株として選抜された菌株である。そのニトリルヒドラターゼ自体のアミノ酸配列及び遺伝子配列に変異はない（米国特許第５，８２７，６９９号）。
４．アミノ酸残基置換方法
野生型ニトリルヒドラターゼをアミノ酸置換する方法としては、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物にハイドロキシルアミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触・作用させる方法、紫外線照射により変異を誘発する方法、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子にＰＣＲを用いてランダムに変異を導入するError prone PCR方法等を採用することができる。
変異体を用いたタンパク質の機能、性質を研究する方法の一つに、ランダム変異導入法がある。ランダム変異導入法とは、特定のタンパク質をコードする遺伝子に対してランダムな変異を導入し、変異体を作製する方法である。ＰＣＲによるランダム変異導入法では、ＤＮＡ増幅時に厳密度（ストリンジェンシー）の低い条件を設定して、塩基の変異を導入する（Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）ことができる。
このＥｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲでは、増幅されるＤＮＡの全域に対して任意の部位に変異が導入される。そうすると、得られた任意の部位に変異が導入された変異体の機能を検討することによって、タンパク質固有の機能に重要なアミノ酸やドメインの情報を得ることができる。
【００３４】
Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの鋳型となるニトリルヒドラターゼは、野生株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子、Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲによる増幅産物であるＤＮＡを用いることができる。
【００３５】
Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの反応条件としては、例えば、反応液中のｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ又はｄＴＴＰ）のいずれか１種、２種又は３種の配合割合を他のｄＮＴＰに比べて減らした組成とする条件が挙げられる。これにより、ＤＮＡ合成の際、配合割合を減らしたｄＮＴＰが必要な箇所においては、誤って他のｄＮＴＰが用いられる可能性が高くなり、変異が導入される。また、他の反応条件としては、反応液中のＭｇＣｌ２及び／又はＭｎＣｌ２量を増やした組成とする条件も好ましく挙げられる。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼには、表１に示す変異を導入したタンパク質をコードした遺伝子が含まれる。
【００３６】
このような改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡは、野生型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を基に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）等に記載の部位特異的変位誘発法に従って調製することができる。ＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法や  Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
【００３７】
また、本発明の遺伝子としては、当該遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
【００３８】
このような改良型ニトリルヒドラターゼ遺伝子は、上記の通り野性型遺伝子に変異を導入することにより得ることができるが、当該遺伝子配列若しくはその相補配列、又はこれらの断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることもできる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用することが可能であり、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを利用することも可能である。
【００３９】
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が３００〜２０００ｍＭ、温度が４０〜７５℃、好ましくは塩濃度が６００〜９００ｍＭ、温度が６５℃の条件を意味する。例えば、２×ＳＳＣで５０℃等の条件を挙げることができる。本発明のニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡを得るための条件は、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、適宜設定することができる。
【００４０】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））等を参照することができる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、本発明の遺伝子ＤＮＡに対して少なくとも４０％以上、好ましくは６０％、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分断片が挙げられる。
【００４１】
野性型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列のうちの特定のアミノ酸残基を置換するアミノ酸（置換後のアミノ酸）の種類は、いずれも、置換後のアミノ酸を含むポリペプチド（タンパク質）がニトリルヒドラターゼ活性を有する範囲で適宜選択することができ、限定はされない。
５．組換えベクター、形質転換体
ニトリルヒドラターゼ遺伝子は、形質転換される宿主生物において発現可能なように、ベクターに組み込むことが必要である。例えば、ベクターとしてはプラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。
【００４２】
また、本発明において使用し得る宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的のニトリルヒドラターゼを発現することができる限り特に限定されるものではない。例えば、大腸菌及び枯草菌等の細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を用いることができる。大腸菌を宿主とする場合、発現効率の高い発現ベクター、例えばｔｒｃプロモーターを有する発現ベクターｐｋｋ２３３−２（アマシャムバイオサイエンス社製）又はｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス社製）などを用いることが好ましい。
【００４３】
ベクターには、ニトリルヒドラターゼ遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばカナマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４４】
細菌を宿主とする場合、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が挙げられ、ロドコッカス菌としては、例えばロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１７８９５、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１９１４０等が挙げられる。これらのＡＴＣＣ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手できる。
【００４５】
ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体の作製に際し、宿主に大腸菌を使用した場合、発現した大部分のニトリルヒドラターゼがインクルージョンボディーとなり不溶化するため、菌体活性の低い形質転換体が得られる。一方、ロドコッカス菌を宿主として使用した場合、ニトリルヒドラターゼは可溶性画分に存在するため、高活性な形質転換体が得られる。これらの形質転換体は目的に応じて選択すれば良いが、厳しい条件で改良型酵素を選抜する場合は高活性なロドコッカス菌の形質転換体を用いるのが好ましい。
【００４６】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４７】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００４８】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００４９】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
【００５０】
植物細胞を宿主とする場合は、タバコＢＹ−２細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
６．培養物及び改良型ニトリルヒドラターゼの製造方法
本発明において、改良型ニトリルヒドラターゼは、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から採取することにより製造することができる。
【００５１】
本発明は当該培養物から改良型ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、改良型ニトリルヒドラターゼの製造方法をも含む。
【００５２】
本発明において、「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的の改良型ニトリルヒドラターゼは、上記培養物中に蓄積される。
【００５３】
本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース及びデンプン等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、エタノール及びプロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸、若しくは有機酸のアンモニウム塩、又はその他の含窒素化合物が挙げられる。
その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地にはニトリルヒドラターゼの補欠分子であるコバルトイオンや鉄イオンを添加し、酵素の誘導剤となるニトリル類やアミド類を添加してもよい。
【００５４】
培養中、ベクター及び目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加したり、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いたりしてもよい。
また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
【００５５】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＡＡ等を培地に添加することができる。
【００５６】
形質転換体の培養条件は、目的の改良型ニトリルヒドラターゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば特段限定されるものではないが、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３７℃で５〜１００時間行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、例えば大腸菌であれば６〜９に調整する。
培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、特に大腸菌形質転換体を培養する場合には、振盪培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましい。
【００５７】
上記培養条件で培養すると、高収率で本発明の改良型ニトリルヒドラターゼを上記培養物中、すなわち、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積することができる。
【００５８】
培養後、改良型ニトリルヒドラターゼが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより、目的の改良型ニトリルヒドラターゼを採取することができる。菌体又は細胞の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。
破砕後、必要に応じて菌体又は細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製した改良型ニトリルヒドラターゼ溶液とすることができる。
【００５９】
また、改良型ニトリルヒドラターゼが菌体内又は細胞内に生産される場合、菌体や細胞そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
【００６０】
改良型ニトリルヒドラターゼが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体又は細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から改良型ニトリルヒドラターゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
【００６１】
形質転換体を培養して得られたニトリルヒドラターゼの生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）やニトリルヒドラターゼ活性測定などにより確認することができるが、特段限定されるものではない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。また、ニトリルヒドラターゼ活性は、上述した活性の値を適用することができる。
【００６２】
また、本発明においては、生細胞を全く使用することなく、無細胞タンパク質合成系を採用して改良型ニトリルヒドラターゼを産生することが可能である。
【００６３】
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
【００６４】
この場合、上記の宿主に対応する生物は、下記の細胞抽出液の由来する生物に相当する。ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。
【００６５】
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
【００６６】
上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる改良型ニトリルヒドラターゼは、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。
７．アミド化合物の製造方法
上述のように製造された改良型ニトリルヒドラターゼは、酵素触媒として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、上記改良型ニトリルヒドラターゼを接触させることにより、アミド化合物を生成する。そして、接触により生成されるアミド化合物を採取する。これにより、アミド化合物を製造することができる。
【００６７】
酵素触媒としては、前述のように分離精製されたニトリルヒドラターゼを使用することができる。また、前述のように適当な宿主内で改良型ニトリルヒドラターゼ遺伝子が発現するように遺伝子導入を行い、宿主を培養した後の培養物、又は当該培養物の処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の細胞をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。
【００６８】
ここで、「接触」とは、改良型ニトリルヒドラターゼとニトリル化合物を同一の反応系又は培養系に存在させることを意味し、例えば、分離精製した改良型ニトリルヒドラターゼとニトリル化合物を混合すること、改良型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現する細胞の培養容器にニトリル化合物を添加すること、当該細胞をニトリル化合物の存在下で培養すること、当該細胞の抽出液をニトリル化合物と混合することなどが含まれる。
【００６９】
基質として使用されるニトリル化合物は、酵素の基質特異性、酵素の基質に対する安定性等を考慮して選択される。ニトリル化合物としては、アクリロニトリルが好ましい。反応方法、及び反応終了後のアミド化合物の採取方法は、基質及び酵素触媒の特性により適宜選択される。
【００７０】
酵素触媒は、その活性が失活しない限り、リサイクル使用することが好ましい。失活の防止やリサイクルを容易にすることに鑑み、酵素触媒は処理物の形態で使用されることが好ましい。
【実施例】
【００７１】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕
改良型ニトリルヒドラターゼ遺伝子の取得
（１）変異遺伝子ライブラリーの構築
鋳型となるプラスミドとしては、βサブユニットのアミノ酸配列（配列番号１）のＣ末端のアミノ酸残基から数えて６３残基上流のアミノ酸残基をアスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）に変異し、且つ、上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１１残基上流のアミノ酸残基をバリン（Ｖ）からアラニン（Ａ）に変異し、且つ、上記Ｃ末端のアミノ酸残基から数えて１７３残基上流のアミノ酸残基をセリン（Ｓ）からリジン（Ｒ）に変異した特開２００７−１４３４０９号記載のプラスミドｐＥＲ２０５（図１）を用いた。
【００７２】
次に、ニトリルヒドラターゼ遺伝子へのランダム変異導入を行った。
【００７３】
ランダム変異導入は、ＰＣＲにおけるヌクレオチドの誤取り込みによる塩基置換（Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）を利用した。
【００７４】
ニトリルヒドラターゼ遺伝子へのＥｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＰＥバイオサイエンス社）を用いて以下の条件で行った。
【００７５】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
鋳型プラスミド（ｐＥＲ２０５）（１０ｎｇ）           １μｌ
１０×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＩＢＣＯ社製）      １０μｌ
５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ＧＩＢＣＯ社製）              ３μｌ
プライマーＮＨ−１９（５０μＭ）                    １μｌ
プライマーＮＨ−２０（５０μＭ）                    １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘ                          ８μｌ
１０ｍＭ  ｄＩＴＰ                                  ２μｌ
１０ｍＭ  ｄＢｒａＵＴＰ                            ２μｌ
滅菌水                                              ７１μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ社製）        １μｌ
＜プライマー＞
ＮＨ−１９         GCCTCTAGATATCGCCATTCCGTTGCCGG    （配列番号３）
ＮＨ−２０         ACCCTGCAGGCTCGGCGCACCGGATGCCCAC  （配列番号４）
＜反応条件＞
（９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で３分）×３０サイクル
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、２．５ｋｂのＰＣＲ増幅産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を含む反応終了液をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製し、制限酵素ＸｂａＩとＳｓｅ８３８７Ｉで切断を行った。制限酵素処理済みのＰＣＲ産物を０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、２．５  Ｋｂ付近のバンドを回収した。回収したＰＣＲ産物は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造）を用いてベクターｐＳＪ０３４（ＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ部位）と結合した。
この結合生成物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。結合生成物と１００μｌの大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルを混ぜ４℃で３０分保温し、４２℃で４０秒ヒートショックを行った。その後、これに０．５ｍｌのＳＯＣ培地（２％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２％  グルコース、ｐＨ７．０）を添加し、３７℃で１時間培養した。この培養液２５０μｌをＬＢプレート（１％  ＮａＣｌ、１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、２％  寒天、５０ｍｇ／Ｌ  アンピシリン）にプレーティングし、３７℃で１日培養した。ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む大腸菌ＪＭ１０９形質転換体が得られた。
【００７６】
次に、プレート上に生育した大腸菌のコロニーをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社）のＰ１溶液（キアゲン社）に懸濁して全て回収し、操作手順に従ってプラスミド溶液を回収し、変異遺伝子ライブラリーを作製した。
【００７７】
ｐＳＪ０３４はロドコッカス菌においてニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドである。ｐＳＪ０３４は、ｐＳＪ０２３より特開平１０−３３７１８５号公報に示す方法で作製した。
【００７８】
なお、ｐＳＪ０２３は形質転換体「Ｒ．  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３」であり、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２３２として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成９（１９９７）年３月４日付けで国際寄託されている。
（２）ロドコッカス菌形質転換体の作製
ロドコッカス・ロドクロウス  ＡＴＣＣ  １２６７４  株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。上記（１）で調製したプラスミド  １μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合して氷冷し、キュベットにプラスミドＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）により２．０ＫＶ、２００  ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。
電気パルス処理液の入ったキュベットを氷冷下１０分間静置し、３７℃で１０分間ヒートショクを行った。その後、キュベットにＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％  Ｋ２ＨＰＯ４  、０．２％  ＫＨ２ＰＯ４  ）５００μｌ  を加え、３０℃、５時間静置した後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布した。３０℃、３日間培養後のコロニーを形質転換体とした。
【００７９】
同様に親株としてｐＥＲ２０５の形質転換体を作製した。
（３）ロドコッカス菌形質転換体のアミド処理
スクリーニングには、上記（２）で得られたニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むロドコッカス菌形質転換体、及び野生型ニトリルヒドラターゼを産生するロドコッカス菌形質転換体ＡＴＣＣ１２６７４／  ｐＥＲ２０５を使用した。ＧＧＰＫ培地（１．５％  グルコース、１％  グルタミン酸ナトリウム、０．１％  酵母エキス、０．０５％  Ｋ２ＨＰＯ４  、０．０５％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１％  ＣｏＣｌ２、０．１％  尿素、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ７．２）を１ｍｌずつ入れた９６穴ディープウェルプレートに上記菌株を各々接種し、３０℃で３日間液体培養した。
【００８０】
次に、得られた培養液の５０μｌを９６穴プレートに分注し、遠心分離によって培地を除き、最後に５０％アクリルアミド溶液を４０μｌ添加し、菌を懸濁した。
高濃度アクリルアミド溶液に懸濁した組換え菌をインキュベーター中に置き、６０℃の温度下、３０分間の加熱処理で比較となる親株を完全に失活させた。残存ニトリルヒドラターゼ活性の有無は下記の活性染色法で確認した。
次に、０．１％（ｗ／ｖ）  ａｎｔｈｒａｎｉｌｏｎｉｔｒｉｌｅ／５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）溶液２００μｌを各ウェルに添加し、室温で１時間放置した。１時間後、ＵＶトランスイルミネーターの上にき、蛍光の発色を観察し、発色するウェルを選んだ。
上記の条件において比較例であるｐＥＲ２０５は１時間放置後にも発色しなかった。
上記の方法でランダムに変異導入したニトリルヒドラターゼ遺伝子を有する数万個の形質転換体についてスクリーニングを行い、高濃度アクリルアミドに耐性を有する変異酵素２１株を選抜した。
（４）塩基配列の確認
塩基配列の確認をするため、得られた選抜株からプラスミドを回収した。
ロドコッカス株を、１０ｍｌのＭＹＫ培地（ポリペプトン０．５％、バクトイーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、グルコース１％、カナマイシン  ５０μｇ／ｍｌ）に植菌した。２４時間培養した後に終濃度２％となるように滅菌した２０％グリシン溶液を添加し、さらに２４時間培養した。
その後、遠心分離により菌体を回収し、菌体をＴＥＳ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−１０ｍＭＮａＣｌ−１ｍＭＥＤＴＡ）緩衝液で洗浄後、２ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−１２．５％シュークロース−１００ｍＭ  ＮａＣｌ−１ｍｇ／ｍｌリゾチームに懸濁し、３７℃にて３時間振盪した。これに０．４ｍｌの１０％ＳＤＳを加え室温で穏やかに１時間振盪し、さらに２．１ｍｌの５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）を添加し氷中で１時間静置した。その後、４℃にて１０，０００ｘｇ、１時間遠心し上清を得た。これに２．５倍量のエタノールを加え、−２０℃で３０分静置した後、１０，０００ｘｇ、２０分間遠心した。沈澱物を１０ｍｌの７０％エタノールで洗浄した後、１００μｌのＴＥ緩衝液に溶解しＤＮＡ溶液を得た。
次に、ニトリルヒドラターゼを含む配列をＰＣＲ法で増幅した。
【００８１】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
鋳型プラスミド                                    １μｌ
１０×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ社製）        １０μｌ
プライマーＮＨ−１９（５０μＭ）                  １μｌ
プライマーＮＨ−２０（５０μＭ）                  １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘ                        ８μｌ
滅菌水                                            ７９μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）          １μｌ
＜反応条件＞
（９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で３分）×３０サイクル。
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、２．５ｋｂのＰＣＲ増幅産物の検出を行った。ＰＣＲ反応液はＥｘｏ−ＳＡＰ処理（アマシャムファルマシア）後、サイクルシークエンシング法により配列解析用サンプルを調整し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣＥＱ−２０００ＸＬで解析を行った。結果を表５にまとめた。
【００８２】
【表５】
2010172295.tif 000006
これらの変異酵素はｐＳＪ０３４やｐＥＲ２０５が完全失活する高濃度アクリルアミド溶液での加熱処理においてニトリルヒドラターゼ活性を保持していた。よって耐熱性及びアミド化合物耐性が向上したニトリルヒドラターゼであった。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により、改良型ニトリルヒドラターゼが提供される。本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、耐熱性及び／又はアミド化合物耐性が向上している。このため、本発明の改良型ニトリルヒドラターゼを用いることで、ニトリル化合物からアミド化合物を効率良く製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】プラスミドｐＥＲ２０５の構成図である。
【図２】各種微生物由来の野生型ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列（Ｎ末端側の一部）を示す図である。
【図３】図２と同様のアミノ酸配列を示す図であり、図２のアミノ酸配列に続く配列（Ｃ末端側の一部）を示している。
【図４】図２と同様のアミノ酸配列を示す図であり、図３のアミノ酸配列に続く配列（Ｃ末端側の一部）を示している。
【００８５】
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１：ロドコッカス・ロドクロウスＪ１由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットの塩基配列及びアミノ酸配列
配列番号２：ロドコッカス・ロドクロウスＪ１由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットの塩基配列及びアミノ酸配列
配列番号３： プライマー：ＮＨ−１９
配列番号４：プライマー：ＮＨ−２０
配列番号５：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ８７１−ＡＮ０４２由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号６：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ８７１−ＡＮ０５３由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号７：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＡＲＧ−ＡＮ０２４由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号８：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＡＲＧ−ＡＮ０２５由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号９：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＩＦＯ１５５６４由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１０：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ６７−ＢＥＮ００１由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１１：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＡＮＴ−ＡＮ００７由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１２：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ８７０−ＡＮ０１９由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１３：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＥＮＧ−ＡＮ０３３由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１４：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  １２２−ＡＮ０６５由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１５：Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｅｒｏｓｉｓ  ＩＦＯ１２６６８由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１６：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＢＲ４９９由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１７：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１８：Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ＪＣＭ３０９５由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１９：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｃｒ４由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号２０：Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号２１：Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ  Ｑ６由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号２２：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｍ８由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号２３：ロドコッカス属Ｎ７１１株由来鉄型ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのシステインクラスター
配列番号２４：ロドコッカス・ロドクロウスＪ１菌由来由来コバルト型ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのシステインクラスター
【図１】
2010172295.tif 000007
【図２】
2010172295.tif 000008
【図３】
2010172295.tif 000009
【図４】
2010172295.tif 000010
【配列表】
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