(57)【要約】【課題】 カラム耐久性が良く、しかも、安定型ＨｂＡ１ｃを、精度良く短時間で分離可能なヘモグロビン類の測定方法を提供する。【解決手段】 カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピックイオンを含有し、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩を含有する溶離液を用い、カラム圧力を９．８×１０4Ｐａ〜３．９×１０6Ｐａに設定して測定を行うことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、
カオトロピックイオンを含有し、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩を含有する溶離液を用い、
カラム圧力を９．８×１０4Ｐａ〜３．９×１０6Ｐａに設定して測定を行うことにより、安定型ＨｂＡ１ｃから不安定型ＨｂＡ１ｃを分離することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【請求項２】
請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法であって、
グラディエント溶出法を用いて上記溶離液の送液を行なうことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は、血液中の糖が赤血球に入った後に、ヘモグロビンと不可逆的に結合して生成したものであり、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な血糖値（血液中のグルコース濃度）を反映する。このため、ＨｂＡ１ｃは、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握する等の糖尿病診断の指標として広く利用されている。
【０００３】
ＨｂＡ１ｃは、血液中のグルコースとヘモグロビンＡ（以下、ＨｂＡという）とが、反応して生成された糖化ヘモグロビン（以下、ＧＨｂという）であり、これが可逆的に反応したものを不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（unstable HbA1c：以下、不安定型ＨｂＡ１ｃという）と呼び、不安定型ＨｂＡ１ｃを経て不可逆的に反応したものを安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（stable HbA1c：以下、安定型ＨｂＡ１ｃという）と呼んでいる。そして、上記糖尿病診断の指標としては、安定型ＨｂＡ１ｃを用いることが好ましく、臨床検査分野では、高精度で、しかも、短時間に安定型ＨｂＡ１ｃの比率を測定しうる方法の開発が望まれていた。
【０００４】
従来、ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、一般に液体クロマトグラフィー法や免疫法が用いられており、液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１ｃの測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）の順に溶出される。
【０００５】
このうち、糖尿病の診断の指標として使用されるのは、最近では、上記したとおり安定型ＨｂＡ１ｃであり、安定型ＨｂＡ１ｃ値は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。
【０００６】
従って、安定型ＨｂＡ１ｃ値を正確に測定するためには、安定型ＨｂＡ１ｃのピークのみを高精度に分離する技術が必要であるが、従来においては、安定型ＨｂＡ１ｃのピークの近傍に出現する不安定型ＨｂＡ１ｃのピークやアセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂという）、カルバミル化ヘモグロビン（以下ＣＨｂという）などの修飾ヘモグロビンのピークと、安定型ＨｂＡ１ｃのピークとを高精度かつ短時間に分離するのは極めて困難とされていた。
【０００７】
そこで、特開昭６３−２９８０６３号公報に記載があるように、赤血球および／または、ヘモグロビンを含む試料を、リン酸縮合体および／またはリン酸縮合体の塩を含む解離溶媒質と接触させて、不安定型ヘモグロビンをヘモグロビンとグルコースに解離して測定する方法が従来より知られている。しかしながら、この方法では、安定型ＨｂＡ１ｃの分離が不十分となり、測定精度が悪いという欠点があった。
【０００８】
一方、不安定型ＨｂＡ１ｃ及び修飾ヘモグロビンと、安定型ＨｂＡ１ｃとを測定時間２．２分という短時間で分離できる方法も開発されている（全自動グリコヘモグロビン分
析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ型の基礎的検討：日本臨床自動化学会会誌２１（１９９６） ８４０−８４３）。
この方法は、上述の従来法における解離剤を用いずに、非多孔性充填剤を用い、しかも、充填剤の粒径を２．５μｍと非常に小さくして測定サンプルのカラム内での拡散を小さくすることにより、安定型ＨｂＡ１ｃの分離を可能にしている。しかし、このような、粒径の非常に小さい充填剤を充填したカラムをヘモグロビン類の測定に用いると、測定初期のカラム圧力が非常に高い（例えば、約９．８×１０6Ｐａ）ため測定装置に耐圧性が必要になりコストアップになるという欠点が存在した。
【０００９】
また、連続測定したとき、目詰まりが大きいためカラム圧力上昇が高く、カラム耐久性が悪いという欠点があった。さらに、この方法においては、充填剤の粒径を大きくすることによりカラム圧力を低くすると、測定サンプルがカラム内で拡散し分離が不十分になってしまう問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開昭６３−２９８０６３号公報
【非特許文献１】全自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ型の基礎的検討：日本臨床自動化学会会誌 ２１ （１９９６） ８４０−８４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、上記従来におけるヘモグロビン類の測定方法の問題点に鑑み、カラム耐久性が良く、しかも、安定型ＨｂＡ１ｃを、精度良く短時間で分離可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
請求項１記載の発明は、 カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピックイオンを含有し、かつｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩を含有する溶離液を用い、カラム圧力を９．８×１０4Ｐａ〜３．９×１０6Ｐａに設定して測定を行うことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１３】
請求項２記載の発明は、請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法であって、グラディエント溶出法を用いて上記溶離液の送液を行なうことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１４】
以下、本発明について詳説する。
【００１５】
本発明においては、カオトロピックイオン、及び、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩を含有する溶離液を用いる。この溶離液は、単一種の溶離液であってもよいが、好ましくは、溶出力が異なる、例えばカオトロピックイオンの濃度やｐＨが異なる、２種以上の溶離液を用いる。
【００１６】
上記カオトロピックイオンとは、水溶液に解離して生じたイオンにより水の構造が破壊され、疎水性物質と水が接触したときに起こる、水のエントロピー減少を抑制するものである。
【００１７】
具体的には、陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられ、またその他に尿素等が挙げられる。
【００１８】
また、陽イオンのカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。
【００１９】
上記カオトロピックイオンの中でも、安定型ＨｂＡ１ｃの測定精度をより向上させるために、好ましくは、陰イオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン等が挙げられ、陽イオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオン等が用いられる。より好ましくは、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用いられる。
【００２０】
また、これらカオトロピックイオンは、単一種で用いても、また複数種混合して用いてもよい。
【００２１】
上記カオトロピックイオンの溶離液中の濃度は、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、より好ましくは１ｍＭ〜１０００ｍＭ、特に好ましくは１０ｍＭ〜５００ｍＭである。これは、濃度が０．１ｍＭ未満であると、ヘモグロビン類の測定において、分離効果が低下し測定精度が悪くなるためであり、また、濃度が３０００ｍＭを超えてもヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しないためである。
【００２２】
また、カオトロピックイオンを溶離液以外の測定試料と接触する液、例えば、試料希釈液、溶血液等に添加して用いてもよい。
【００２３】
本発明における上記ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩としては、以下のものが挙げられる。
【００２４】
上記無機酸としては、例えば、リン酸、炭酸等が挙げられる。また、上記有機酸としては、例えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、カコジル酸、アミノ酸、ピロリン酸等が挙げられる。
【００２５】
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられる。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン等が挙げられる。
【００２６】
上記無機酸または有機酸の塩としては、公知のものでよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００２７】
上記無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩は、単独種でもまた、複数種混合して用いても良い。
【００２８】
上記無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩の溶離液中の濃度は、水に溶解された状態で、溶離液のｐＨを４．０〜６．８にする緩衝作用がある範囲であればよく、好ましくは１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは１０ｍＭ〜５００ｍＭである。
【００２９】
本発明における溶離液のｐＨは、４．０〜６．８であり、より好ましくは４．５〜５．８である。ｐＨが４．０未満では、ヘモグロビンが変性する可能性があり、ｐＨが６．８を超えると、ヘモグロビン類のプラス電荷が減少し、カチオン交換基に保持されにくくなり、分離能が悪くなるためである。
【００３０】
上記溶離液には、以下に示す（１）無機塩類、（２）ｐＨ調節剤、（３）有機溶媒、（４）安定剤、（５）アミン類、（６）界面活性剤、（７）防腐剤等を添加してもよい。
【００３１】
（１）無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの塩類の溶離液中の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
【００３２】
（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を添加してもよい。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、また、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の溶離液中の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。
【００３３】
（３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどの水溶性有機溶媒と混合してもよい。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０体積％であり、カオトロピックイオン、無機酸、有機酸、これらの塩などが析出しない程度で用いるのが好ましい。
【００３４】
（４）ヘモグロビンの安定剤として、公知の安定剤を添加してもよい。該安定剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム等の還元剤・酸化防止剤等が挙げられる。
【００３５】
（５）ヘモグロビンの非特異的吸着を少なくするために、アミン類を添加してもよい。該アミン類としては、公知のものが用いられ、好ましくは、分子量２０〜５００の第１級アミン、第２級アミン及び第３級アミンが挙げられる。
【００３６】
（６）界面活性剤として、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤等を添加してもよい。界面活性剤を用いることにより、溶血を効率よく行うだけでなく、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で測定を行う場合、溶血試薬の通過する流路等を洗浄する効果がある。
上記界面活性剤は、好ましくはノニオン性界面活性剤が使用され、例えば、ポリオキシエチレン類（以下、ポリオキシエチレンをＰＯＥ、エチレンオキシド付加モル数を（ｎ）で表す。）、ＰＯＥ（７）デシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）セチルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル、ＰＯＥ（１７）セチルステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オクチルフェニルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ノニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノラウリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノパルミチン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノステアリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。これらの界面活性剤は、単独種でもまた複数種混合して用いてもよい。これらの界面活性剤の添加量は、好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００３７】
（７）防腐剤として、アジ化ナトリウム、チモールなどを添加しても良い。
【００３８】
本発明では、溶出力が異なる２種以上の溶離液を用いる場合、これらの溶離液をグラディエント溶出法により送液を行うのがより好ましい。グラディエント溶出法としては、例えば、段階溶出法（ステップアップグラディエント溶出）、リニアグラディエント溶出法、または、それらを組み合わす方法があり、いずれの方法にも限定されるものではない。
【００３９】
上記段階溶出法によって測定を行う場合のクロマトグラフィー装置の構成例を図１に示した。溶離液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、各々溶出力の異なる溶離液であり、電磁弁１によって設定時間ごとに各溶離液に切り替えられるように、構成されている。溶離液は、送液ポンプ２により、試料注入部３から導入された試料とともにカラム４に導かれ、各成分が検出器５により検出される。各ピーク面積、高さ等はインテグレータ６により算出される。
【００４０】
本発明の測定方法により分離されるヘモグロビン類のうち、ＨｂＡ等からなるＨｂＡ０は、ＨｂＡ１ｃより後に溶出し、強く充填剤に保持されるため、測定時間を長くさせる傾向にある。このため、ＨｂＡ０の溶出には、上述の溶離液よりも溶出力の強い溶離液、すなわちｐＨがヘモグロビン等電点（ヘモグロビンの等電点については、理化学事典（第４版、１９８７年９月、岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記載あるように、ｐＨ６．８〜７である）よりアルカリ側にある溶離液を用いるのが好ましい。
【００４１】
すなわち、溶離液のｐＨが、ヘモグロビンの等電点より酸性側からアルカリ性側に変わることによって、ヘモグロビンの表面の総電荷がプラスからマイナスに変わり、これによって充填剤表面のカチオン交換基との電気的反発がおこり、ＨｂＡ０成分を迅速に溶出することができるのである。
【００４２】
上記の如くＨｂＡ０成分を溶出するための溶離液としては、カラム耐久性の向上と測定時間短縮のため、カラムに流入する際のｐＨがヘモグロビンの等電点よりアルカリ側になるように、ｐＨを６．８以上に設定した少なくとも１種以上の緩衝液を用いるのが好ましい。
【００４３】
上記溶離液のｐＨは、好ましくは７〜１２であり、さらに好ましくは、７．５〜１１、またさらに好ましくは８〜９．５である。これは、溶離液のｐＨが６．８以下になるとＨｂＡ０成分の溶出が不十分となり易く、ｐＨが１２より高いと充填剤の分解が考えられるためである。また、充填剤の分解が測定に影響ない場合は、溶離液のｐＨを１２以上にするのが好ましく、より好ましくは、１０〜１３．５である。但し、溶離液のｐＨを１２以上にした時、充填剤の分解が測定に影響する場合であっても、溶離液を流す時間を短くすることにより、充填剤の分解を最小限に抑えることができる。
【００４４】
ＨｂＡ０成分の溶出に好適に用いられる、ｐＨが６．８以上で緩衝能をもつ溶離液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩；クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチルグルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩からなる緩衝液が挙げられる。その他、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。また、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴＡ緩衝液も使用できる。また、イミダゾール等のイミダゾール類；エチレンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアミン類；グリシン、β−アラニ
ン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類；等の有機物も使用できる。
【００４５】
上記の無機酸・有機酸、あるいはその塩または有機物等の濃度は、水に溶解された状態で溶離液のｐＨを６．８以上にする緩衝作用がある範囲であればよく、好ましくは、１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。
【００４６】
また、より効果的にＨｂＡ０成分を、溶出するためには、上記ＨｂＡ０の溶出に好適に用いられる溶離液に、カオトロピックイオンを添加することが好ましい。上記カオトロピックイオンは、前述したのと同様のものを用いることができる。カオトロピックイオンの溶離液中の濃度は、１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、より好ましくは１０ｍＭ〜１０００ｍＭ、特に好ましくは、５０ｍＭ〜５００ｍＭである。
【００４７】
上記溶離液には、前述した溶離液に添加されるのと同様の各種添加剤、例えば、（１）無機塩類、（２）ｐＨ調節剤、（３）有機溶媒、（４）安定剤、（５）アミン類、（６）界面活性剤、（７）防腐剤等を添加してもよい。
【００４８】
本発明においては、カラム圧力を９．８×１０4Ｐａ〜３．９×１０6Ｐａ（１ｋｇｆ／ｃｍ2〜４０ｋｇｆ／ｃｍ2）に設定して測定を行う。カラム圧力のより好ましい範囲は、２．０×１０5Ｐａ〜３．４×１０6Ｐａ（２ｋｇｆ／ｃｍ2〜３５ｋｇｆ／ｃｍ2）であり、更に好ましい範囲は、４．９×１０5Ｐａ〜２．９×１０6Ｐａ（５ｋｇｆ／ｃｍ2〜３０ｋｇｆ／ｃｍ2）である。これは、カラム圧力が９．８×１０4Ｐａより小さいと圧力変動が大きいため、安定型ＨｂＡ１ｃを精度良く測定できなくなるためである。また、カラム圧力が３．９×１０6Ｐａより高くなると短時間測定で連続測定したとき、カラム圧力上昇が大きくなり、カラム耐久性が悪化してしまうためである。
【００４９】
本発明でいうカラム圧力とは、分離用カラムに流入する溶離液の液圧を意味するものであり、液体クロマトグラフィー装置において、分離用カラムに流入する溶離液の流路上に設けられた圧力計により計測されるものである。このカラム圧力を計測する圧力計は、液体クロマトグラフィー装置において一般的に用いられているものであれば、特に限定されるものではないが、例えばＪＩＳ Ｂ ７５０５−１９８０に規格が定められているプルドン管圧力計が好適に用いられる。
【００５０】
上記カラム圧力の設定は、カラム圧力の大きさに影響を与える諸条件を調節することにより行なう。具体的には、溶離液の流速、カラムに充填される充填剤の粒径の大きさ、カラム内径及びカラム長などを適宜調節することにより、上記範囲内となるように設定する。また、粒径の小さい充填剤（例えば、粒径３μｍ以下の充填剤：多孔性充填剤及び非多孔性充填剤を含む）を用いる場合、上記カラム圧力範囲内になるように、溶離液の流速を調節しても良いし、また、粒径の小さい充填剤を充填するカラムサイズを適宜小さくしても良い（例えば、カラム内径０．１ｍｍ〜４ｍｍ、カラム長さ５ｍｍ〜２００ｍｍ程度）。
【００５１】
例えば、他の条件を同一にして溶離液の流速のみを変化させる場合、カラム圧力を高めるためには、溶離液の流速を上げればよいし、カラム圧力を低めるためには、溶離液の流速を下げればよい。また、充填剤の粒径の大きさのみを変化させる場合は、カラム圧力を高めるためには、充填剤の粒径を小さくすればよいし、カラム圧力を低めるためには、充填剤の粒径を大きくすればよい。
【００５２】
本発明における、他の測定条件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは０．００１〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．０１〜４ｍｌ／分、特に好ましくは０．１〜３ｍｌ／分である。
【００５３】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において用いられる充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られるものである。
【００５４】
上記カチオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。また、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。
【００５５】
上記充填剤粒子の直径は、好ましくは０．５〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。また、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均直径×１００（％））として、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下である。
【００５６】
充填剤粒子は、必要に応じて、上記に示した範囲の充填剤を複数種混合して用いても良い。
【００５７】
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
【００５８】
上記高分子粒子は、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００５９】
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができ、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。
【００６０】
また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
【００６１】
また、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させてもよい。
【００６２】
更に、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させても良い。
【００６３】
上記充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用できるが、スラリー充填法を用いるのがより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行う。
【００６４】
本発明の測定方法を実施するのに用いられる液体クロマトグラフィー装置は、公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器などから構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００６５】
また、セミミクロタイプの装置を用いても良い。その１例としては、資生堂社製のＮＡＮＯＳＰＡＣＥシリーズがあり、送液ポンプ：イナートポンプ２００１ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ  ＳＩ-１、オートサンプラー２００３、検出器ＵＶ-ＶＩＳ検出器２００２などで構成される。
【００６６】
上記カラムの材質は、公知のもので良く、例えば、ガラス、ステンレス、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）等の樹脂が挙げられる。
【００６７】
また、カラムに装着されるフィルターの素材も公知のもので良い。カラムの両端に設けられるフィルターは、ヘモグロビン類の吸着を少なくするために、不活性（イナート）な素材のものが好ましい。例えば、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレン、テフロン（登録商標）、チタンなどがある。また、ステンレス製のフィルターのように、ヘモグロビン類の吸着が大きいものは、表面をシリコーン処理、または、公知のブロッキング試薬（アルブミン、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチンなど）でブロッキングしても良い。上記のフィルターは、プレフィルターとして用いても良い。
【００６８】
また、カラムの充填剤とカラムが接する部位を、不活性な素材で被覆してもよく、その素材としては、例えばＰＥＥＫ、ポリエチレン、テフロン（登録商標）、チタン化合物、珪素化合物、シリコン膜等が挙げられる。
【００６９】
上記測定方法における他の測定条件としては公知の条件でよく、特に限定されないが、好ましくは以下の条件を用いる。ヘモグロビン類の検出については、４１５ｎｍの可視光を用いるのが好ましい。測定試料は、通常、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いるのが好ましい。液体クロマトグラフィー装置への試料注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。
【００７０】
本発明におけるヘモグロビン類の測定方法の１実施態様を以下に示す。
溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにＨｂＡ０などのピークが出現する。
【００７１】
ここでは、溶出力の異なる３種の溶離液Ａ〜Ｃ（溶離液Ａ＜溶離液Ｂ＜溶離液Ｃの順に溶出力が高くなるよう設定したもの）を用い、まず、溶離液Ａで、ＨｂＡ１ａ〜ＨｂＦまで溶出させ、不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃをカラムに強く保持させて分離する。次に、より溶出力の強い溶離液Ｂをステップグラディエント溶出法で流し、カラムに強く保持させて分離した不安定型ＨｂＡ１ｃピークと安定型ＨｂＡ１ｃピークをシャープに溶出させる。最後に、カラムに最も強く保持しているＨｂＡ０を、最も溶出力の強い溶離液Ｃをステップグラディエント溶出法で流して溶出させ、その後、次の測定に備えて溶離液Ａをカラムへ流し、測定系に悪影響が無い程度に溶離液Ａでカラム内を平衡化させる。
【００７２】
［作用］
従来、粒径の大きな充填剤を充填したカラムでは、カラム内での測定サンプルの拡散が大きいために、不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃを分離できなかったが、本発明では、溶離液にカオトロピックイオンを添加することにより、分離溶出挙動が非常に近い不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃのカラムとの相互作用の差を拡大させ、従来法で安定型ＨｂＡ１ｃを分離測定できなかった粒径の大きな充填剤でも、安定型ＨｂＡ１ｃを分離測定することができる。また、粒径の大きな充填剤を充填したカラムは、カラム圧力が非常に低いので、測定試料がカラムに目詰まりしづらく、そのため、連続測定してもカラム圧力上昇が小さく、カラム耐久性に優れている。さらに、グラディェント溶出法を組み合わすことにより、より高精度に安定型ＨｂＡ１ｃを分離測定できる。
【発明の効果】
【００７３】
本発明のヘモグロビン類の測定方法は上述の構成からなるので、カラム耐久性に優れ、しかも、安定型ＨｂＡ１ｃを、精度良く短時間で分離、測定することができる。
【実施例】
【００７４】
次に、実施例、比較例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００７５】
［実施例１］
（１）充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解させた。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合させた。次いで、反応系を３５℃に冷却させた後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍＬを添加し、１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温して１．３時間重合した。重合後、洗浄して乾燥し、分級して平均粒径９μｍの粒子を得た。
【００７６】
（２）カラムへの充填
（１）で得られた充填剤をカラムに以下のようにして充填した。充填剤粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６ｍｍ×長さ３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2で定圧充填した。
【００７７】
（３）ヘモグロビン類の測定
（２）で得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
圧力計：ストレンゲージ式圧力変換器
溶離液：溶離液Ａ：５６ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｂ：２７５ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４０）
送液パターン：測定開始より０〜１．２分の間は溶離液Ａを送液し、１．２〜１．３分の間は溶離液Ｂを送液し、１．３〜１．９分の間は溶離液Ａを送液した。
流速：２．２ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
カラム圧力：２．９×１０6Ｐａ（３０ｋｇｆ／ｃｍ2）
【００７８】
（測定試料）
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
【００７９】
（４）測定結果
上記測定条件により、得られたクロマトグラムを図２に示した。ピーク１１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク１２はＨｂＦ、ピーク１３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１５はＨｂＡ０を示す。図２より、測定時間１．９分で安定型Ａ１ｃを分離測定できたことが分かる。
【００８０】
［実施例２］
（１）充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解させた。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合させた。次いで、反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍＬを添加し１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し１．３時間重合した。重合後、洗浄して乾燥し、分級して平均粒径１１μｍの粒子を得た。
【００８１】
（２）カラムへの充填
上記実施例１と同様に行った。
【００８２】
（３）ヘモグロビン類の測定
以下に示した項目以外は、実施例１と同様に行った。
溶離液：溶離液Ａ：５６ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｂ：７０ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｃ：２７５ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４０）
送液パターン：測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａを送液し、０．６〜１．２分の間は溶離液Ｂを送液し、１．２〜１．３分の間は溶離液Ｃを送液し、１．３〜１．６分の間は溶離液Ａを送液した。
カラム圧力：７．８×１０5Ｐａ（８ｋｇｆ／ｃｍ2）
【００８３】
（４）測定結果
上記測定条件により、得られたクロマトグラムを図３に示した。ピーク１１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク１２はＨｂＦ、ピーク１３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１５はＨｂＡ０を示す。図３より、測定時間１．６分で安定型Ａ１ｃを分離測定できた。
【００８４】
［比較例１］
（１）充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解させた。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合させた。次いで、反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍＬを添加し１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し、１．３時間重合させた。重合後、洗浄して乾燥し、分級して平均粒径３μｍの粒子を得た。
【００８５】
（２）カラムへの充填
上記実施例１と同様に行った。
【００８６】
（３）ヘモグロビン類の測定
以下に示した項目以外は、上記実施例１と同様に行った。
カラム圧力：７．８×１０6Ｐａ（８０ｋｇｆ／ｃｍ2）
【００８７】
（４）測定結果
比較例１により得られたクロマトグラムは図２と同様であった。
【００８８】
［比較例２］
（１）充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解させた。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合させた。次いで、反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍＬを添加し１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し１．３時間重合させた。重合後、洗浄して乾燥し、分級して平均粒径３０μｍの粒子を得た。
【００８９】
（２）カラムへの充填
上記実施例１と同様に行った。
【００９０】
（３）ヘモグロビン類の測定
以下に示した項目以外は、実施例１と同様に行った。
カラム圧力：４．９×１０4Ｐａ（０．５ｋｇｆ／ｃｍ2）
【００９１】
（４）測定結果
上記測定条件によりヘモグロビン類の測定を試みたが、測定出来なかった。
【００９２】
［実施例３］
（１）充填剤の調製
上記比較例１と同様に行った。
【００９３】
（２）カラムへの充填
上記比較例１と同様に行った。
【００９４】
（３）ヘモグロビン類の測定
（２）で得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
圧力計：ストレンゲージ式圧力変換器
溶離液：溶離液Ａ：６２ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４０）
溶離液Ｂ：７０ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４０）
溶離液Ｃ：２７５ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４０）
送液パターン：測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａを送液し、０．６〜１．２分の間は溶離液Ｂを送液し、１．２〜１．３分の間は溶離液Ｃを送液し、１．３〜１．６分の間は溶離液Ａを送液した。
流速：１．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
カラム圧力：３．８×１０6Ｐａ（３９ｋｇｆ／ｃｍ2）
【００９５】
（４）測定結果
上記測定条件により得られたクロマトグラムは、図３と同様であり、測定時間１．６分で安定型Ａ１ｃを分離測定できた。
【００９６】
［実施例４］
（１）充填剤の調製
上記比較例１と同様に行った。
【００９７】
（２）カラムへの充填
（１）で得られた充填剤をカラムに以下のようにして充填した。充填剤粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍｌに分散させ、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４０ｍｍ×長さ３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2で定圧充填した。
（３）ヘモグロビン類の測定
（２）で得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
圧力計：ストレンゲージ式圧力変換器
溶離液：溶離液Ａ：５８ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４０）
溶離液Ｂ：６８ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４０）
溶離液Ｃ：２７５ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭアジピン酸−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４０）
送液パターン：測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａを送液し、０．６〜１．２分の間は溶離液Ｂを送液し、１．２〜１．３分の間は溶離液Ｃを送液し、１．３〜１．６分の間は溶離液Ａを送液した。
流速：１．１ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
カラム圧力：３．５×１０6Ｐａ（３６ｋｇｆ／ｃｍ2）
【００９８】
（４）測定結果
上記測定条件により得られたクロマトグラムは、図３と同様であり、測定時間１．６分で安定型Ａ１ｃを分離測定できた。
【００９９】
［実施例５］
（１）充填剤の調製
上記比較例１と同様に行った。
【０１００】
（２）カラムへの充填
（１）で得られた充填剤をステンレス製の空カラム（内径１．５ｍｍ×長さ３５ｍｍ）に充填した以外は、実施例４と同様に行った。
（３）ヘモグロビン類の測定
（２）で得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：イナートポンプ２００１：NANOSPACE SI-1（資生堂社製）
オートサンプラ：オートサンプラー２００３（資生堂社製）
検出器：ＵＶ−ＶＩＳ検出器２００２（資生堂社製）
溶離液：溶離液Ａ：４９ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭコハク酸−４７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３０）
溶離液Ｂ：６０ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭコハク酸−４７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３０）
溶離液Ｃ：２５０ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭコハク酸−４７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４０）
送液パターン：測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａを送液し、０．６〜１．２分の間は溶離液Ｂを送液し、１．２〜１．３分の間は溶離液Ｃを送液し、１．３〜１．６分の間は溶離液Ａを送液した。
流速：０．１８ｍｌ/分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：２μｌ
カラム圧力：２．２×１０6Ｐａ（２２ｋｇｆ／ｃｍ2）
（４）測定結果
上記測定条件により得られたクロマトグラムは図３と同様であり、測定時間１．６分で安定型Ａ１ｃを分離測定できた。
【０１０１】
［カラム耐久性の評価］
実施例１〜４と比較例１〜２のカラムについて、上記に示したそれぞれの測定条件で５００検体連続測定してカラム耐久性を評価した。
測定試料としては、健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
【０１０２】
［カラム耐久性評価の結果］
安定型ＨｂＡ１ｃの測定値の変動を指標として、カラム耐久性を評価し、図４に示した。
その結果、実施例１〜４では、５００検体連続測定しても、安定型ＨｂＡ１ｃ値の変動は、ほとんど無かった。しかし、比較例１では、１００検体連続測定した後から、安定型ＨｂＡ１ｃ値が次第に高くなった。
これは、カラム圧力を高く設定すると、カラム内に測定試料の一部が詰まり、カラム洗浄が不十分になる結果カラムが劣化し、安定型ＨｂＡ１ｃと不安定型ＨｂＡ１ｃの分離が不十分になったのが原因であると考えられた。
尚、比較例２では、カラム圧力が低すぎて安定型ＨｂＡ１ｃ値を測定出来なかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】液体クロマトグラフィー装置の１例を示した図
【図２】実施例１での測定結果を示した図
【図３】実施例２での測定結果を示した図
【図４】カラム耐久性評価の結果を示した図
【符号の説明】
【０１０４】
Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ ： 溶離液Ａ〜Ｄ
１ ： 電磁弁
２ ： 送液ポンプ
３ ： 試料注入部
４ ： カラム
５ ： 検出器
６ ： インテグレータ
１１ ： ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ
１２ ： ＨｂＦ
１３ ： 不安定型ＨｂＡ１ｃ
１４ ： 安定型ＨｂＡ１ｃ
１５ ： ＨｂＡ０
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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