(57)【要約】【課題】タンパク質等を蛍光試薬などでラベル化する手法において、蛍光団であるクマリンと金属配位子であるNTAを有する蛍光色素は、ヒスタグ配列（標的タンパク質）と選択的に結合して蛍光増大するという機能を有するため、未反応の蛍光試薬を洗浄、除去するといった手数を要することなく、簡便かつ迅速に可逆的標識が可能となるという利点を有するが、クマリンを蛍光団として用いるため紫外光による励起を必要とし、生細胞への応用には制約が大きいという課題があった。【解決手段】 本発明は、金属錯体を形成し、金属配位性ペプチドに対する特異的結合能を発揮する配位子と、前記配位子が形成する金属錯体における中心金属に対して配位能を有する蛍光団とを含み、リンカーを介して前記配位子と蛍光団を結合した蛍光色素において、蛍光団としてキサンテン誘導体を用いた化合物からなることを特徴とする蛍光色素である。【選択図】  図２
2010043207.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属錯体を形成し、金属配位性ペプチドに対する特異的結合能を発揮する配位子と、前記配位子が形成する金属錯体における中心金属に対して配位能を有する蛍光団とを含み、リンカーを介して前記配位子と蛍光団を結合した蛍光色素において、蛍光団としてキサンテン誘導体を用いた以下の化学式で表される化合物からなることを特徴とする蛍光色素。
【化１】
2010043207.tif 000009
（図中Ｍn+は、金属イオンを示す。R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11及びR12は、それぞれ独立に水素原子、アミノ基、ヒドロキシ基、イミノ基、オキソ基、カルボキシル基、ハロゲン原子、ニトロ基、C1-6アルキル基を示し、mは0-10の整数を示す。）
【請求項２】
金属錯体を形成し、金属配位性ペプチドに対する特異的結合能を発揮する配位子と、前記配位子が形成する金属錯体における中心金属に対して配位能を有する蛍光団とを含み、リンカーを介して前記配位子と蛍光団を結合した蛍光色素において、蛍光団としてキサンテン誘導体を用いた以下の化学式で表される化合物からなることを特徴とする蛍光色素。
【化２】
2010043207.tif 000010
（図中Ｍn+は、金属イオンを示す。R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10及び R11は、それぞれ独立に水素原子、アミノ基、ヒドロキシ基、イミノ基、オキソ基、カルボキシル基、ハロゲン原子、ニトロ基、C1-6アルキル基を示し、mは0-10の整数を示す。）
【請求項３】
金属錯体を形成し、金属配位性ペプチドに対する特異的結合能を発揮する配位子と、前記配位子が形成する金属錯体における中心金属に対して配位能を有する蛍光団とを含み、リンカーを介して前記配位子と蛍光団を結合した蛍光色素において、蛍光団としてキサンテン誘導体を用いた以下の化学式で表される化合物からなることを特徴とする蛍光色素。
【化３】
2010043207.tif 000011
【請求項４】
金属錯体を形成し、金属配位性ペプチドに対する特異的結合能を発揮する配位子と、前記配位子が形成する金属錯体における中心金属に対して配位能を有する蛍光団とを含み、リンカーを介して前記配位子と蛍光団を結合した蛍光色素において、蛍光団としてキサンテン誘導体を用いた以下の化学式で表される化合物からなることを特徴とする蛍光色素。
【化４】
2010043207.tif 000012
【請求項５】
金属錯体を形成し、金属配位性ペプチドに対する特異的結合能を発揮する配位子と、前記配位子が形成する金属錯体における中心金属に対して配位能を有する蛍光団とを含み、リンカーを介して前記配位子と蛍光団を結合した蛍光色素において、蛍光団としてキサンテン誘導体を用いた以下の化学式で表される化合物からなることを特徴とする蛍光色素。
【化５】
2010043207.tif 000013
【請求項６】
金属錯体を形成し、金属配位性ペプチドに対する特異的結合能を発揮する配位子と、前記配位子が形成する金属錯体における中心金属に対して配位能を有する蛍光団とを含み、リンカーを介して前記配位子と蛍光団を結合した蛍光色素において、蛍光団としてキサンテン誘導体を用いた以下の化学式で表される化合物からなることを特徴とする蛍光色素。
【化６】
2010043207.tif 000014
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド又はタンパク質の標識に利用される蛍光色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を蛍光試薬などでラベル化する手法は数多く開発され、生化学的、生物物理学的研究において重要な役割を果たしてきた。中でも蛍光性タンパク質GFP (Green Fluorescent Protein)を用いた手法は、遺伝的導入による蛍光標識が可能であるという利点を持ち、生きた細胞内でタンパク質の動態や機能を解析することができるため、汎用的に用いられている。しかし、GFP自身が27 kDaという巨大分子であるため、目的タンパク質本来の構造や機能に影響を及ぼす可能性が指摘されており、その応用範囲は限定されているのが現状である。
【０００３】
そこで、タンパク質への影響を最小限に抑えるため、短いタグペプチド配列を遺伝的にタンパク質に導入し、その配列と選択的に結合する蛍光有機小分子を用いる方法が提案され、この提案に沿っていくつかの分子が開発されたが、報告された分子の多くは、タグとの結合前後で蛍光強度に差がないため、未反応の蛍光試薬を洗浄、除去しなければならないといった不都合があった。
【０００４】
このような状況下、本願発明の発明者等は、特開2007-231124号（特許文献１）において、上記不都合のない蛍光色素を提案した。すなわち、標的タンパク質と選択性の高い相互作用として、「オリゴヒスチジンからなるヒスタグ (His)6 」と「金属-NTA（ニトリロ三酢酸）錯体」の相互作用に着目し、蛋白質と結合することで蛍光強度が増大する分子をデザインし、蛍光団であるクマリンと金属配位子であるNTAを有する蛍光色素を合成し、これらの分子がヒスタグ配列を選択的に認識し、蛍光増大するという機能を有することを明らかにした。
【０００５】
これにより、未反応の蛍光試薬を洗浄、除去するといった手数を要することなく、簡便かつ迅速に可逆的標識が可能な蛍光色素と、この蛍光色素を用いる標識方法が達成された。
【非特許文献１】：Wang, W.; Rusin, O.; Xu, X.; Kim, K. K.; Escobedo, J. O.; Fakayode, S. O.; Fletcher, K. A.; Lowry, M.; Schowalter, C. M.; Lawrence, C. M.; Fronczek, F. R.; Warner, I. M.; Strongin, R. M. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 15949
【非特許文献２】：Kim, J.-S.; Raines, R. T. Protein Sci., 1993, 2, 348, Raines, R. T. Chem. Rev., 1998, 98, 1045
【特許文献１】特開2007-231124号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記説明した本発明者等の提案した蛍光色素は、クマリンを蛍光団として用いるため紫外光による励起を必要とし、細胞障害性や自家蛍光が大きいという問題点がある。
【０００７】
本発明はこの課題を解決するためになされたもので、簡便かつ迅速に可逆的標識が可能であり、かつ、励起に可視光を用いることが出来る蛍光色素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために本発明は、金属錯体を形成し、金属配位性ペプチドに対する特異的結合能を発揮する配位子と、前記配位子が形成する金属錯体における中心金属に対して配位能を有する蛍光団とを含み、リンカーを介して前記配位子と蛍光団を結合した蛍光色素において、蛍光団としてキサンテン誘導体を用いた以下の化学式(化１)〜（化６）で表される化合物からなることを特徴とする蛍光色素である。
【０００９】
なお、化学式（化３，化５）は、一般式（化１）で示される化合物に含まれる特定の化合物の事例を示し、また、化学式（化４，化６）は、一般式（化２）で示される化合物に含まれる特定の化合物の事例を示す。また、化学式（化３，化４）については、実施例として、合成プロセスや蛍光測定の実験例を示す。
【化１】
2010043207.tif 000003
（図中Ｍn+は、金属イオンを示す。R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11及びR12は、それぞれ独立に水素原子、アミノ基、ヒドロキシ基、イミノ基、オキソ基、カルボキシル基、ハロゲン原子、ニトロ基、C1-6アルキル基を示し、mは0-10の整数を示す。）
【化２】
2010043207.tif 000004
（図中Ｍn+は、金属イオンを示す。R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10及び R11は、それぞれ独立に水素原子、アミノ基、ヒドロキシ基、イミノ基、オキソ基、カルボキシル基、ハロゲン原子、ニトロ基、C1-6アルキル基を示し、mは0-10の整数を示す。）
【化３】
2010043207.tif 000005
【化４】
2010043207.tif 000006
【化５】
2010043207.tif 000007
【化６】
2010043207.tif 000008
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、金属錯体を形成し、金属配位性ペプチドに対する特異的結合能を発揮する配位子と、前記配位子が形成する金属錯体における中心金属に対して配位能を有する蛍光団とを含み、リンカーを介して前記配位子と蛍光団を結合した蛍光色素において、前記蛍光団を上記の化学式(化１)〜（化６）で表される化合物としたことを特徴とする蛍光色素であるから、簡便かつ迅速に可逆的標識が可能であり、かつ、励起に可視光を用いるため、生細胞内でタンパク質の動態や機能を解析することが容易に達成できるという効果を奏する。
【００１１】
また本発明は、前記蛍光団を以下の化学式（化２，化４，化６）で表されるキサンテン誘導体化合物からなることを特徴とする蛍光色素であるから、ヒスタグ認識部位を２カ所導入できるため、ヒスタグに対する親和性・選択性が向上する。
【００１２】
さらに、化学式（化５、化６）の構造とすることにより、タグ結合前の蛍光色素がより弱蛍光性になり、タグ結合時の識別性が向上するといった効果が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明による蛍光色素は、ヒスタグ認識部位である金属-NTA錯体とキサンテン誘導体を併せ持つ。以下、本発明の蛍光色素として、化学式（化３、化４）で示す２種類の化合物を合成し、これらを用いてヒスタグ認識機能に関する検討を行い、本発明が実現可能であり、期待通りの効果を奏することを示す。
【００１４】
なお、本発明は、以下の実施例で具体的に示す物質や反応方法、反応条件などに限定されるものではなく、技術的思想の範囲内において、その他の適宜な物質や反応方法、反応条件などに置換えることができる。
【実施例】
【００１５】
図１(a),(b)を用いて、化学式（化３）で示す蛍光色素（NTA１X）の合成プロセスを説明する。4’-Fluoresceincarboxyaldehydeは、（非特許文献１：Wang, W.; Rusin, O.; Xu, X.; Kim, K. K.; Escobedo, J. O.; Fakayode, S. O.; Fletcher, K. A.; Lowry, M.; Schowalter, C. M.; Lawrence, C. M.; Fronczek, F. R.; Warner, I. M.; Strongin, R. M. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 15949）に従って合成した。N-α-Bis(2-ethoxy-2-oxoethyl)-L-ornithine methyl esterは、先行出願特許（特許文献１：梅澤直樹、鴨東美絵、樋口恒彦「ペプチド又は蛋白質標識用の蛍光色素、及び該蛍光色素を利用した標識方法」）に従って合成した。
【００１６】
NTA１X esterの合成  (図１(a))：
4’-Fluoresceincarboxyaldehyde (50 mg, 0.14 mmol)N-α-Bis(2-ethoxy-2-oxoethyl)-L-
ornithine methyl ester (70 mg, 0.22 mmmol)をCH3OH (2 mL) とCHCl3 (2 mL)の混合溶媒に溶解し、室温で５時間撹拌した。溶媒を留去後、反応混合物をdichloroethane (3 mL)に溶かし、NaBH(OAc)3(58 mg, 0.28 mmol) を加え一晩撹拌した。 溶媒を留去後、得られた混合物オイルをシリカゲルカラム(MeOH/CH2Cl21:19→1:9, v/v)で精製し、淡黄色オイル (56.8 mg)を得た（収率62.1%）。 
【００１７】
機器データは以下の通り。
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ 8.10 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.75-7.70 (m, 2H), 7.24 (d, J=7.3 Hz, 1H), 6.95-6.87 (m, 2H), 6.69-6.62 (m, 2H), 4.55-4.47 (m, 1H), 4.16 (q, J = 2.0 Hz, 4H), 3.69 (s, 3H), 3.68 (s, 4H), 3.63-3.58 (m, 1H), 3.29-3.23 (m, 2H), 2.09-1.84 (m, 4H), 1.27 (t, J=2.0 Hz, 6H)
13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ 173.94, 173.17, 155.63, 155.46, 133.84, 132.41, 131.20, 130.92, 128.48, 127.83, 118.98, 116.71, 113.34, 113.06, 106.54, 104.00, 65.19, 61.99, 54.02, 52.11, 49.85, 48.08, 42.57, 41.43, 28.09, 24.06, 22.24, 14.49,
HRMS (FAB): m/z : calcd. for C35H38N2O11:663.25629 [M+H]+; found: 663.25543
IR (film): ν 3196, 1736, 1578, 1549 cm-1
【００１８】
２）NTA１Xの合成（図１(b)）：
NTA１X ester (12 mg, 0.018 mmmol)をCH3OH (1 mL)とH2O (1 mL)の混合溶媒に溶解し、氷冷下、0.1 N LiOH (1.1 mL)を加え３時間撹拌した。30% AcOHで酸性にした後、溶媒を留去した。得られた加水分解生成物を逆相HPLCで精製し、黄色固体  (6.27 mg)を得た（収率 49.3%）。
<精製条件> column; Inertsil ODS-3, speed; 1 mL/min, detector; 220 nm, 
gradient; 10:90 to 60:40 CH3CN/H2O (0.1% TFA) over 50 minutes
【００１９】
機器データは以下の通り。
1H-NMR (400MHz, CD3OD): δ 8.03 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.74-7.70 (m, 1H), 7.23 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.64 (m, 4H), 5.22-5.07 (m, 2H), 4.22-4.02 (m, 5H), 3.43-3.44 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.08-2.03 (m, 1H), 1.95-1.86 (m, 1H)
13C-NMR (150 MHz, CD3OD): δ 173.95, 171.37, 161.31, 153.88, 153.75, 152.46, 136.55, 131.18, 131.15, 130.07, 129.82,128.35, 128.19, 125.89, 125.35, 114.07, 113.79, 111.72, 111.52, 111.29, 103.77, 103.67, 64.71, 55.64, 48.02, 40.95, 40.85, 22.50
MS (FAB): m/z : 592 [M]+
IR (KBr): ν 3133, 1748, 1615, 1438 cm-1
【００２０】
図２(a),(b)を用いて、化学式（化４）で示す蛍光色素（NTA２X）の合成プロセスを説明する。
4’,5’-Fluoresceindicarboxyaldehydeは、蛍光色素（NTA１X）の場合と同様に、非特許文献１に従って合成した。
【００２１】
1) NTA２X esterの合成  (図２(a))：
4’,5’-Fluoresceindicarboxyaldehyde(30mg,0.077mmolとN-α-Bis(2-ethoxy-2-oxoethyl)-L-ornithine methyl ester (422 mg, 1.32 mmmol)をCHCl3 (2 mL)に溶解し、モレキュラーシーブ4Aを数粒入れ一晩撹拌した。溶媒を留去後、反応混合物をdichloroethane (2 mL)に溶かし、NaBH(OAc)3 (100 mg, 0.47 mmol)を加え一晩撹拌した。溶媒を留去後、得られた混合物オイルをシリカゲルカラム(MeOH/CH2Cl22:98→1:9, v/v)で精製し、淡黄色オイル (70 mg)を得た（収率 91.2% ）。
【００２２】
機器データは以下の通り。
1H-NMR (600 MHz, CD3OD): δ 8.10 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.84-7.76 (m, 2H), 7.25 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 6.76 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.68-4.60 (m, 4H), 4.19-4.11 (m, 8H), 3.74 (s, 6H), 3.68 (s, 8H), 3.63-3.59 (m, 2H), 3.36-3.34 (m, 4H), 2.13-1.85 (m, 8H), 1.28 (t, J = 2.8 Hz, 12H)
13C-NMR (150 MHz, CD3OD): δ 173.90, 173.34, 164.42, 155.88, 131.91, 131.40, 129.33, 121.04, 117.26, 112.22, 106.83, 65.18, 62.04, 54.06, 52.17, 48.58, 41.64, 28.19, 24.15, 14.49
MS (FAB): m/z : 993 [M+H]+
IR (film): ν 2722, 1739, 1680, 1438 cm-1
【００２３】
NTA２Xの合成  (図２(ｂ))：
NTA２X ester (28.9 mg, 0.029 mmmol)をCH3OH (2 mL)とH2O (2 mL)の混合溶媒に溶解し、氷冷下、1 N LiOH (0.7 mL)を加え４時間撹拌した。30% AcOHで酸性にした後、溶媒を留去した。得られた加水分解生成物を逆相HPLCで精製し、黄色固体  (11.4 mg)を得た（ 収率 36.1%）。
<精製条件> column; Inertsil ODS-3, speed; 1 mL/min, detector; 220 nm, 
gradient; 10:90 to 50:50 CH3CN/H2O (0.1% TFA) over 40 minutes
【００２４】
機器データは以下の通り。
1H-NMR (600 MHz, D2O): δ 8.12 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.11-7.03 (m, 2H), 6.89 (m, 2H), 4.95-4.88 (m, 2H), 4.24-4.01 (m, 4H), 3.74-3.64 (m, 4H), 3.48 (m, 2H), 3.24-3.20 (m, 4H), 2.41 (m, 4H), 2.04-1.81 (m, 4H)
13C-NMR (150 MHz, D2O): δ 167.72, 166.00, 165.77, 156.70, 155.97, 141.44, 137.59, 137.49, 136.13, 133.49, 130.95, 130.48, 130.03, 118.24, 115.99, 70.43, 67.14, 66.00, 56.97, 51.72, 49.72, 49.53, 47.41, 43.01, 42.81, 32.45, 29.16, 26.55, 25.07, 22.43
IR (KBr): ν 2959, 1735, 1648, 1433, 1402 cm-1
【００２５】
図３(a),(b)に、His連続配列を有する認識ペプチド（(His)6-S-peptide）及びネガティブコントロールとなるペプチド（S-peptide）の合成を示す（配列表番号１参照）。
【００２６】
His連続配列を有する認識ペプチド（(His)6-S-peptide）及びネガティブコントロールとなるペプチド（S-peptide）は、一般的なFmoc固相合成法に従い合成した。カップリング反応の進行は、毎回Kaiser testで確認した。
【００２７】
次に、以下の実験により、本発明の蛍光色素がペプチドに導入されたヒスタグ配列を認識して蛍光変化を示し、実用に供し得る物理化学的特性を有するものであることを示す。
【００２８】
1)蛍光色素の金属添加による蛍光変化
nitrilotriacetic acid(NTA)のコバルト錯体やニッケル錯体はヒスタグ配列と選択的な相互作用を示すことが知られている。そこで、蛍光色素にコバルトイオン及びニッケルイオンを添加して蛍光応答を観察した。
<測定条件>
Ex(励起光波長)：490 nm (NTA１X), Ex(励起光波長)：500 nm (NTA２X), Em(蛍光発光波長)：510 nm,
photomlutiplier voltage 700V, slit width 5/5 nm, 25 ℃,
[NTA-X]=1.0 μM,
[Metal ions]=0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 3.0, 4.0 μM, 
Stock solution (0.2 mM, 1 mM); Co2+or Ni2+
<測定方法>
1.0 μM NTA-Xの50 mM Tris buffer (pH 7.4)溶液 (3mL)に、0.2 mM及び1 mMの金属イオン水溶液を3 μLごと加えた。蛍光が安定するまで、コバルトイオンでは８分間、ニッケルイオンでは２０分間撹拌した後に、蛍光強度を１分間測定し、その平均値を求めた。
【００２９】
図４(a),(b)に、二種の蛍光色素(NTA１X)と(NTA２X)それぞれについての測定結果を示す。図において、縦軸は蛍光強度（a.u.）を示し、横軸は金属イオン濃度を示す。どちらの蛍光色素も２種の金属イオンの添加により大幅な蛍光減弱が見られた。金属イオンの種類による差はほとんどみられなかったが、NTA２Xの方が蛍光減弱幅が大きかった。
【００３０】
3)蛍光色素-金属錯体のペプチド添加時の蛍光応答
次に、金属イオン添加により蛍光を減弱させた蛍光色素-金属錯体に、ヒスタグ配列からなるペプチド（H-(His)6-Tyr-NH2）を添加して、蛍光の回復が見られるかを検証する。蛍光色素（NTA１X）については、蛍光減弱に関わるNTA構造は１カ所であるが、蛍光色素（NTA２X）については、金属イオンと錯体を形成するNTA構造を２つ有している。そこで、この検討を行うに際しては、以下の測定条件、測定方法に示すように、蛍光色素（NTA１X）については金属イオンを１等量、蛍光色素（NTA２X）については金属イオンを２等量それぞれ対応させて溶液を作成した。
【００３１】
<測定条件>
Ex(励起光波長)：490 nm (NTA１X), Ex(励起光波長)：500 nm (NTA２X), Em(蛍光発光波長)：510 nm,
photomlutiplier voltage 700V, slit width 5/5 nm, 25 ℃,
[NTA-X -metal complexes]=1.0 μM,
[Model peptide]=0, 0.2, 0.6, 1.0, 1.4, 1.8, 2.0, 4.0 μM,
Model peptide (0.2, 1.0 mM); H-(His)6-Tyr-NH2
<測定方法>
NTA-X -metal(Co2+, Ni2+)complexes 1.0 μM(50mM) Tris buffer (pH 7.4)溶液 (2mL)に、0.2 mM及び1 mMのヒスタグ配列からなるペプチド（H-(His)6-Tyr-NH2）水溶液を4 μLごと加えた。蛍光が安定するまで、２０分間撹拌した後に、蛍光強度を１分間測定し、その平均値を求めた。
【００３２】
図５(a),(b)に、２種の蛍光色素(NTA１X)と( NTA２X)それぞれについての測定結果を示す。図において、縦軸は蛍光強度（a.u.）を示し、横軸は、ヒスタグ配列からなるペプチド（H-(His)6-Tyr-NH2）濃度を示す。実験の結果、蛍光色素-Ni2+錯体では大幅な蛍光回復がみられなかった。一方、蛍光色素-Co2+錯体ではヒスタグ配列からなるペプチド（H-(His)6-Tyr-NH2）濃度に対応した大幅な蛍光回復がみられた。
【００３３】
4) 蛍光色素-金属錯体のタグペプチド添加時の蛍光応答
上述の検討で、蛍光色素-Co2+錯体が、ヒスタグ配列からなるペプチド（H-(His)6-Tyr-NH2）の添加により大幅な蛍光回復を示すことが明らかとなった。そこで、次に、１５残基程度の短いペプチドにヒスタグ配列を付与したペプチド（(His)6-S-peptide：図３(a)）と、ヒスタグ配列を持たないペプチドを添加して、ペプチド中のタグ配列を認識して蛍光回復がみられるか、比較検討を行った。短いペプチド配列としては、配列中に１つのヒスチジン残基を有するS-peptide（図３(b)）を選択した。
<測定条件>
Ex(励起光波長)：490 nm (NTA1X), Ex(励起光波長)：500 nm (NTA２X), Em(蛍光発光波長)：510 nm,
photomlutiplier voltage 700V, slit width 5/5 nm, 25 ℃,
[NTA-X -metal complexes]= 1.0 μM
[Model peptide]= 0, 0.2, 0.6, 1.0, 1.4, 1.8, 2.0, 4.0 μM,
Model peptide (0.2, 1.0 mM); (His)6-S-peptide, S-peptide
<測定方法>
1.0 μM NTA-X -Co2+の50 mM Tris buffer (pH 7.4)溶液 (2mL)に、0.2 mM及び1 mMのペプチド水溶液を4 μLごと加えた。蛍光が安定するまで、２０分間撹拌した後に、蛍光強度を１分間測定し、その平均値を求めた。
【００３４】
図６(a),(b)に、二種の蛍光色素(NTA１X)と(NTA２X)それぞれについての測定結果を示す。図において、縦軸は蛍光強度（a.u.）を示し、横軸は、モデルペプチド（(His)6-S-peptide, S-peptide）の濃度を示す。結果として、どちらの蛍光色素-Co2+錯体も、ヒスタグ配列を付与したペプチド((His)6-S-peptide)添加時のみ、大幅な蛍光回復がみられ、ヒスタグ配列を持たないペプチド(S-peptide)添加時には蛍光回復は見られなかった。この結果より、蛍光色素-Co2+錯体は、ペプチド構成中のヒスタグ配列を認識して蛍光回復していることが確認できた。
【００３５】
5) 蛍光色素-金属錯体のタグタンパク質添加時の蛍光応答
上述した通り、タグペプチドを用いた検討で、蛍光色素-Co2+錯体は、ヒスタグ配列選択的に、大幅な蛍光回復がみられることが確認できた。そこで、さらに、ヒスタグ配列を付与したタンパク質と、ヒスタグ配列を持たないタンパク質を用いて上述のペプチドと同様な比較実験を行い、蛍光色素-金属錯体が、タグ配列を認識して蛍光回復するかを確認する実験を行った。実験に用いるタグタンパク質として、S-peptideとS-proteinが形成する強固な複合体(RNase)に着目した。S-peptideは、１５残基からなるペプチドで、リボヌクレアーゼA由来のS-protein（１０４アミノ酸残基）に高い親和性で結合し、結合して初めて酵素活性が再構成されることが知られている（非特許文献２：Kim, J.-S.; Raines, R. T. Protein Sci., 1993, 2, 348, Raines, R. T. Chem. Rev., 1998, 98, 1045）。したがって、S-peptideのさらにN末端にペプチドを導入することで様々なタグ融合タンパク質を作成することができる。S-proteinについては、Novagen社より購入した（Merck, cat. No. 69215-3, S-Tag Grade S-protein）。
<測定条件>
Ex(励起光波長)：490 nm, Em(蛍光発光波長)：510 nm,
photomlutiplier voltage 700V, slit width 5/5 nm, 25℃,
[NTA1X -1Co2+ complex]=0.5 μM, 
stock solution:
NTA1X -1Co2+ complex (1 μM in 50 mM Tris buffer (pH 7.4))
Protein (15 μM in 50 mM Tris buffer (pH 7.4)); (His)6-RNase, RNase
<測定方法>
1 μM NTA1X -1Co2+の50 mM Tris buffer (pH 7.4)溶液と、15 μM タンパク質の50 mM Tris buffer (pH 7.4)溶液を目的とする濃度になるように混和した。３０分間経過後に、蛍光スペクトルを測定した。
【００３６】
図７(a),(b)は、ヒスタグを導入したタンパク質（(His)6-RNase）と導入しないタンパク質(RNase)それぞれを、NTA1X -1Co2+溶液に添加したときの、添加濃度ごとの蛍光強度（a.u.）と蛍光スペクトル(nm)の関係を示すグラフである。NTA1X -Co2+錯体に、ヒスタグ配列導入タンパク質（(His)6-RNase）を添加した所、蛍光の大幅な蛍光回復がみられた。最大で、タンパク添加前の約２．6倍まで蛍光が増大した。一方、タグ配列を持たないタンパク質(RNase)を添加しても蛍光スペクトルは全く変化を示さなかった。このことから、本発明の蛍光色素- Co2+錯体を用いて、ヒスタグ導入タンパク質の蛍光検出も可能であることが確認された。
【００３７】
以上の通り本発明は、新規タンパク質ラベル化蛍光プローブの開発を目指したものであり、実施例に示したように、可視光励起の蛍光団を有する蛍光プローブを合成し、合成した化合物の物理化学的性質を検討したところ、ヒスタグを導入したタンパク質の添加により、大幅な蛍光増大を示すことが確認できた。この結果より、本発明の蛍光プローブは実現可能であり、期待通りの効果を奏するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】（ａ）,（ｂ）は、蛍光色素（NTA１X）の合成プロセスを示す図である。
【図２】（ａ）,（ｂ）は、蛍光色素（NTA２X）の合成プロセスを示す図である。
【図３】（ａ）,（ｂ）は、His連続配列を有する認識ペプチド（(His)6-S-peptide）及びネガティブコントロールとなるペプチド（S-peptide）の合成を示す図である。
【図４】（ａ）,（ｂ）は、二種の蛍光色素(NTA１X)と(NTA２X)それぞれについて、蛍光色素の金属添加による蛍光変化を示す図である。
【図５】（ａ）,（ｂ）は、二種の蛍光色素(NTA１X)と(NTA２X)それぞれについて、金属(Co2+, Ni2+)錯体溶液にヒスタグ配列からなるペプチド（H-(His)6-Tyr-NH2）の水溶液を4 μLごと加えたときの蛍光強度の測定結果を示す図である。
【図６】（ａ）,（ｂ）は、二種の蛍光色素(NTA１X)と(NTA２X)それぞれについて、蛍光色素- Co2+錯体のタグペプチド添加時の蛍光応答の測定結果を示す図である。
【図７】（ａ）,（ｂ）は、ヒスタグを導入したタンパク質（(His)6-RNase）と導入しないタンパク質(RNase)それぞれを、NTA１X -1Co2+溶液に添加したときの、添加濃度ごとの蛍光強度（a.u.）と蛍光スペクトル(nm)の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３９】
NTA１X：蛍光減弱に関わるNTA構造を１つ有する蛍光色素
NTA２X：蛍光減弱に関わるNTA構造を２つ有する蛍光色素
(His)6  ：ヒスタグ
(His)6-S-peptide：ヒスタグ配列を付与したペプチド
S-peptide：ヒスタグ配列を持たないペプチド
(His)6-RNase：ヒスタグを導入したタンパク質
RNase：ヒスタグを導入しないタンパク質
Co2+：コバルトイオン
Ni2+：ニッケルイオン
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図３】
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