(57)【要約】【課題】発光時のフォトンの数が少ないイクオリンのような標準物質を用い、被検体の測定対象物質が低濃度でもその濃度検出が可能な検査用反応カラムを提供する。【解決手段】被検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質が系内に固定化され、系外から被検体および前記測定対象物質と特異的に反応し、標準物質で標識化された第２物質が導入され、標準物質から発光される波長４００〜８００ｎｍの光強度を検出して測定対象物質の濃度を測定する反応カラムであって、液体吸入管および吸引管を有すると共に、これらの管と連通する反応室を内部に有し、かつ光を透過する透明な面を有するカラム本体と、カラム本体の反応室に透明な面と対向して配置される基板と、透明な面と対向する基板表面に固定され、発光波長より細い径を有し、第１物質が固定化される繊維の不織布を備えたことを特徴とする検査用反応カラム。【選択図】    図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質が系内に固定化され、系外から前記被検体および前記測定対象物質と特異的に反応し、標準物質で標識化された第２物質が導入され、前記標準物質から発光される波長４００〜８００ｎｍの光強度を検出して前記被検体の測定対象物質の濃度を測定する反応カラムであって、
液体吸入管および吸引管を有すると共に、これらの管と連通する反応室を内部に有し、かつ光を透過する透明な面を有するカラム本体と、
前記カラム本体の反応室に前記透明な面と対向して配置される基板と、
前記透明な面と対向する前記基板表面に固定され、前記発光波長より細い径を有すると共に前記第１物質が固定化される繊維からなる不織布と
を備えたことを特徴とする検査用反応カラム。
【請求項２】
前記基板が導電性基板で、前記繊維からなる不織布がエレクトロスピニング法で前記基板表面に作製されることを特徴とする請求項１記載の検査用反応カラム。
【請求項３】
前記導電性基板が支持フィルムとこの支持フィルム表面に形成された金属層とから構成されることを特徴とする請求項２記載の検査用反応カラム。
【請求項４】
前記導電性基板が金属酸化物層と反射シートとから構成されることを特徴とする請求項２記載の検査用反応カラム。
【請求項５】
前記繊維がポリスチレン繊維であることを特徴とする請求項１ないし４いずれか記載の検査用反応カラム。
【請求項６】
前記繊維がポリスチレン繊維およびポリウレタン繊維の混合繊維からなることを特徴とする請求項１ないし４いずれか記載の検査用反応カラム。
【請求項７】
前記繊維表面に固定化される第１物質が一次抗体で、前記標準物質で標識化された第２物質がイクオリン標識した二次抗体であることを特徴とする請求項１ないし４いずれか記載の検査用反応カラム。
【請求項８】
前記繊維表面に固定化される第１物質が一次抗体で、前記標準物質で標識化された第２物質がアクリジニウムエステル標識した二次抗体であることを特徴とする請求項１ないし６いずれか記載の検査用反応カラム。
【請求項９】
前記繊維表面に固定化される第１物質が一次抗体で、前記標準物質で標識化された第２物質がルテニウムキレート標識した二次抗体であることを特徴とする請求項１ないし６いずれか記載の検査用反応カラム。
【請求項１０】
請求項１から６いずれか記載の検査用反応カラムと、
前記反応カラムをその液体吸入管が下方に位置するように上下動可能に支持する支持機構と、
前記反応カラムの吸引管に連通する吸引手段と、
前記反応カラムの透明な面と対向して配置される受光器と
を具備したことを特徴とする検査装置。
【請求項１１】
前記検査用反応カラムの液体吸入管の下方に水平方向に往復移動可能に配置され、複数のカートリッジ収納部を有るカートリッジ収納部材と、この収納部材のカートリッジ収納部に着脱可能に収納され、少なくとも被検体および試薬がそれぞれ格納されるカートリッジとをさらに備えることを特徴とする請求項１０記載の検査装置。
【請求項１２】
前記反応カラムの透明な面と前記受光器の間に集光器をさらに備えることを特徴とする請求項１０または１１記載の検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫臨床検査に用いられる検査用反応カラムおよび検査装置に関し、特に検査にあたってイクオリンやアクリジニウムエステルのような標準物質で標識した抗体を用いる検査用反応カラムおよび検査装置に係わる。
【背景技術】
【０００２】
血液中の特定タンパクを測定対象物質とする免疫検査では、ＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法）またはＣＬＩＡ法（化学発光免疫測定法）のような発光を利用した検査方法が用いられている。
【０００３】
ＣＬＥＩＡ法は、次のような方法で測定対象物質を検査することができる。まず、血液を遠心分離した上清である血漿と一次抗体が固定化されたフェライトビーズとを混合し、反応させる。つづいて、一次抗体と特定タンパク質が抗原抗体されたフェライトビーズを磁石で分離し、洗浄する。フェライトビーズにアルカリフォスファターゼ（酵素）標識した二次抗体を反応させ、洗浄する。その後、発光酵素基質であるジオキセタン（例えばＣＰＤ−Ｓｔａｒ：商品名）を反応させる。ジオキセタンは、アルカリフォスファターゼと反応して発光する。発光強度は、測定対象物質の濃度と相関を持ち、発光強度から測定対象物質の濃度を求めることができる。
【０００４】
ＣＬＩＡ法では、アクリジニウムエステル標識した２次抗体を反応させ、トリガー試薬で発光させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ジオキセタンを発光基質とするＣＬＥＩＡ法は、アルカリフォスファターゼがなくても、微量の発光を生じているためノイズレベルが高い。
【０００６】
イクオリン標識した二次抗体の使用においては、カルシウムイオンでの発光が有効である。しかしながら、ジオキセタンによる発光は長時間持続するのに対し、イクオリンは測定に利用できるフォトンの数が少なく、発光は数秒で終了する。このため、ＣＬＥＩＡ法で説明したように一次抗体を固定化したフェライトビーズを用い、血漿と混合、反応させた後、イクオリン標識した二次抗体を反応させ、カルシウムイオンでイクオリンを発光させた場合、フェライトビーズがイクオリンの発光の一部を散乱したり、吸収したりする。その結果、イクオリンの発光は前述したようにフォトンの数が少ないため、被検体の測定対象物質が低濃度である場合、測定対象物質の測定が困難になる。
【０００７】
本発明は、発光時の時間が短いイクオリンやアクリジニウムエステルのような標準物質を用い、被検体の測定対象物質が低濃度でもその濃度検出が可能な検査用反応カラムおよび検査装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１態様によると、被検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質が系内に固定化され、系外から前記被検体および前記測定対象物質と特異的に反応し、標準物質で標識化された第２物質が導入され、前記標準物質から発光される波長４００〜８００ｎｍの光強度を検出して前記被検体の測定対象物質の濃度を測定する反応カラムであって、
液体吸入管および吸引管を有すると共に、これらの管と連通する反応室を内部に有し、かつ光を透過する透明な面を有するカラム本体と、
前記カラム本体の反応室に前記透明な面と対向して配置される基板と、
前記透明な面と対向する前記基板表面に固定され、前記発光波長より細い径を有すると共に前記第１物質が固定化される繊維からなる不織布と
を備えたことを特徴とする検査用反応カラムが提供される。
【０００９】
本発明の第２態様によると、前記第１態様の検査用反応カラムと、
前記反応カラムをその液体吸入管が下方に位置するように上下動可能に支持する支持機構と、
前記反応カラムの吸引管に連通する吸引手段と、
前記反応カラムの透明な面と対向して配置される受光器と
を具備したことを特徴とする検査装置が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、被検体の測定対象物質が低濃度でも高いＳ／Ｎ比でその濃度検出が可能な検査用反応カラムおよび検査装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態に係る検査装置を示す部分断面正面図。
【図２】図１の検査装置に組み込まれた反応カラムを示す斜視図。
【図３】図２のIII−III線に沿う断面図。
【図４】他の実施形態に係る反応カラムを示す断面図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態に係る検査用反応カラムおよび検査装置を図面を参照して詳細に説明する。図１は、実施形態に係る検査用反応カラムを組み込んだ検査装置を示す部分断面正面図、図２は図１の反応カラムの斜視図、図３は図２のIII−III線に沿う断面図である。
【００１３】
水平方向に往復移動可能なステージ１上には、複数（例えば６つ）のカートリッジ収納部２ａ〜２ｆを有するカートリッジ収納部材３が固定されている。６つのカートリッジ４ａ〜４ｆは、カートリッジ収納部材３のカートリッジ収納部２ａ〜２ｆにそれぞれ着脱可能に収納されている。５つのカートリッジ４ａ〜４ｅには、それぞれ被検体の希釈液５ａ、洗浄液５ｂ、イクオリン標識抗体溶液５ｃ、洗浄液５ｄ、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）溶液５ｅが収容され、最左側のカートリッジ４ｆは廃液収容部として用いられている。なお、試薬が収容されたカートリッジ４ｃ、４ｅは開口部にＡｌ蒸着フィルムからなる蓋（図示せず）が溶着されている。
【００１４】
反応カラム１１は、支持機構３１に上下動可能にかつ着脱可能に支持されている。反応カラム１１は、図２および図３に示すように光を透過する透明な窓板１２が開口部に溶着法で固定された有底逆角錐台筒形のカラム本体１３を備えている。カラム本体１３がポリエチレンから作られる場合は、窓板１２は日本ゼオン社製のＺｅｏｎｏｒが適している。カラム本体１３がポリスチレンから作られる場合は、窓板１２もポリスチレン、カラム本体１３がアクリル樹脂から作られる場合は窓板１２もアクリル樹脂から作られる。窓板１２とカラム本体１３で区画された内部には、矩形の反応室１４が形成されている。
【００１５】
液体吸入管、例えば先端をシリンジ針と同様に斜めに切断したオートサンプラー１５はカラム本体１３の下端の傾斜側壁に連結されている。オートサンプラー１５はカラム本体１３の反応室１４と入口流路１６を通して連通されている。オートサンプラー１５の直下には、ステージ１の駆動によりカートリッジ収納部材３に収納した所定のカートリッジが位置される。吸引管１７は、カラム本体１３の上端の傾斜側壁にオートサンプラー１５と対向するように連結されている。吸引管１７は、カラム本体１３の反応室１４と出口流路１８を通して連通されている。
【００１６】
導電性基板、例えばＡｇ薄膜層１９を有するプラスチックフィルム２０は、カラム本体１３の反応室１４内の窓板１２と対向する内壁に固定されている。固定されたフィルム２０上のＡｇ薄膜層１９は窓板１２に対面する。Ａｇ薄膜層１９は、例えば印刷によりプラスチックフィルム２０に形成できる。後述する標準物質からの発光波長より細い径を有する多数の繊維（例えばポリスチレン繊維）からなる不織布２１は、Ａｇ薄膜層１９に反応室１４を満たすように固定化されている。イクオリンを標準物質として用いた場合、イクオリンの発光波長は４７０ｎｍであるため、ポリスチレン繊維（ポリスチレンナノ繊維）は４７０ｎｍより細い、例えば１００ｎｍの径を有する。このようなＡｇ薄膜層１９表面へのナノ繊維の不織布２１の形成は、次に説明するエレクトロスピニング法で行うことができる。まず、ポリスチレンをテトラヒドロフラン、 ジメチルフォルムアミド、トルエン、クロロフォルムのようなで溶媒に溶解してポリスチレン溶液を調製する。つづいて、ノズルを基板（Ａｇ薄膜層）の上方に一定に距離をあけて配置し、Ａｇ薄膜層とノズルの間に高電圧を印加しながら、ポリスチレン溶液をノズルからＡｇ薄膜層に向けて吐出することにより前述した微細径を持つ多数のポリスチレンナノ繊維が基板上に堆積される。
【００１７】
被検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質、例えば一次抗体（図示せず）は、不織布２１の多数のポリスチレン繊維に固定化されている。一次抗体のポリスチレン繊維への固定化は、例えばｐＨ９．６のカーボネートバッファを用いて疎水結合により行うことができる。
【００１８】
前記支持機構３１は、支柱３２を備える。アーム３３は、支柱３２に上下動可能にかつ水平方向に延出して取付けられている。上端封じ円筒形支持部３４は、アーム３３の先端に取付けられている。支持部３４には、その下部からカラム本体２２の吸引管１７が挿着されている。このような支持機構３１において、アーム３３には支持部３４の内部空間と連通する流路（図示せず）が穿設され、かつ支柱３２にはアーム３３の流路と連通する流路（図示せず）が穿設されている。支柱３２の流路は、図示しない排気手段、例えばシリンジポンプに連通されている。すなわち、シリンジポンプは支柱３２およびアーム３３の流路を通して支持部３４の内部空間と連通されている。
【００１９】
受光素子４１は、反応カラム１１の窓板１２と対向して配置されている。集光用光学系４２は窓板１２と受光素子４１の間に配置されている。受光素子４１は、フォトンカウントグレードの光電子増倍管が適している。
【００２０】
次に、前述した図１〜図３に示す反応カラムを組み込んだ検査装置による被検体の測定対象物質、例えば血液の特定タンパク質の濃度測定を説明する。
【００２１】
一次抗体がナノ繊維不織布に固定化された反応カラムはパッケージに入れて保存され、カートリッジも試薬等が入れられた状態で保存される。試薬が収容されたカートリッジ４ｃ、４ｅは、前述したよう開口部がアルミニウム蒸着フィルムからなる蓋で溶着されている。なお、反応カラムは測定毎に交換される。
【００２２】
（工程１）
ステージ１上にカートリッジ収納部材３を配置し、反応カラム１１の吸引管１７を支持機構３１の支持部３４に挿着する。カートリッジ収納部材３のカートリッジ収納部２ａ〜２ｆにカートリッジ４ａ〜４ｆをそれぞれ収納する。５つのカートリッジ４ａ〜４ｅには被検体の希釈液５ａ、洗浄液５ｂ、イクオリン標識抗体溶液５ｃ、洗浄液５ｄ、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）溶液５ｅが収容されている。被検体である血液を予め遠心分離して血漿を作製する。カートリッジ収納部材３のカートリッジ４ａ内の希釈液に作製した血漿を一定量加える。ステージ１を駆動してカートリッジ収納部材３のカートリッジ４ａを反応カラム１１のオートサンプラー１５の直下に移動させる。支持機構３１により反応カラム１１を下降させてオートサンプラー１５の先端部をカートリッジ４ａ内の希釈した血漿に挿入する。この状態で、シリンジポンプ（図示せず）を吸引作動し、支柱３２およびアーム３３の流路、支持部３４の内部空間、反応カラム１１の吸引管１７を通してその反応室１４の空気を吸引することによって、カートリッジ４ａ内の希釈した血漿を反応カラム１１のオートサンプラー１７を通して反応室１４に吸い込んで満たす。希釈した血漿を反応室１４で一定時間インキュベートすることによって、反応室１４内の不織布２１の多数のナノ繊維に固定化された一次抗体と血漿中のタンパク質とを特異的に反応させる。
【００２３】
（工程２）
支持機構３１により反応カラム１１を上昇させた後、ステージ１を駆動してカートリッジ収納部材３の空のカートリッジ４ｆを反応カラム１１のオートサンプラー１５の直下に移動させる。シリンジポンプを吐出作動し、反応カラム１１の反応室１４内の溶液をカートリッジ４ｆに吐出する。ステージ１を駆動して洗浄液が収容されたカートリッジ４ｂを反応カラム１１のオートサンプラー１５の直下に移動させる。支持機構３１により反応カラム１１を下降させてオートサンプラー１５の先端部をカートリッジ４ｂ内の洗浄液に挿入する。シリンジポンプを吸引作動して希釈した血漿の吸引と同様に、カートリッジ４ｂ内の洗浄液をオートサンプラー１７を通して反応カラム１２の反応室１４に吸い込んで満たし、洗浄を行なう。つづいて、反応室１４内の洗浄液を同様な操作によりカートリッジ４ｆに吐出する。このような洗浄、洗浄液の吐出の操作を３回繰り返す。
【００２４】
（工程３）
ステージ１を駆動してイクオリン標識された二次抗体溶液が収容されたカートリッジ４ｃを反応カラム１１のオートサンプラー１５の直下に移動させる。支持機構３１により反応カラム１１を下降させてオートサンプラー１５の先端部をカートリッジ４ｃのＡｌ蒸着フィルムを破ってその内のイクオリン標識された二次抗体溶液に挿入する。シリンジポンプを吸引作動してカートリッジ４ｃ内のイクオリン標識された二次抗体溶液をオートサンプラー１７を通して反応カラム１２の反応室１４に吸い込んで満たす。二次抗体溶液を反応室１４で一定時間インキュベートする。このとき、不織布２１の多数のポリスチレン繊維に固定化された一次抗体と特異的に反応したタンパク質（測定対象物質）がイクオリン標識された二次抗体と特異的に反応する。前記工程２と同様な操作により洗浄と洗浄液の排出を３回繰り返す。
【００２５】
（工程４）
ステージ１を駆動して塩化カルシウム溶液が収容されたカートリッジ４ｄを反応カラム１１のオートサンプラー１５の直下に移動させる。支持機構３１により反応カラム１１を下降させてオートサンプラー１５の先端部をカートリッジ４ｄのＡｌ蒸着フィルムを破ってその内の塩化カルシウム溶液に挿入する。シリンジポンプを吸引作動してカートリッジ４ｄ内の塩化カルシウム溶液をオートサンプラー１７を通して反応カラム１２の反応室１４に吸い込む。このとき、反応カラム１１の反応室１４に吸い込まれた塩化カルシウム溶液中のカルシウムイオンが測定対象物質と特異的に反応した二次抗体の標識物質であるイクオリンと反応し、イクオリンを発光させる。イクオリンの発光は、反応カラム１１の透明な窓板１２から集光用光学系４２を通して受光素子４１で検出される。検出された発光強度を測定することによって、血漿中の測定対象物質の濃度を測定する。
【００２６】
以上説明した実施形態によれば、窓板１２と有底逆角錐台筒形のカラム本体１３の矩形の反応室１４に導電性基板（例えばＡｇ薄膜層１９を有するプラスチックフィルム２０）を配置し、このＡｇ薄膜層１９に標準物質（例えばイクオリン）からの発光波長より細い径を有する多数の繊維（例えばポリスチレン繊維）からなる不織布２１を固定化し、かつ多数のポリスチレン繊維に被検体の測定対象物質と特異的に反応する一次抗体（第１物質）を固定化することによって、不織布２１の表面積はマイクロプレートの数百倍になるため一次抗体を十分な量で固定化できる。つまり、一次抗体の固定化量を飛躍的に向上できる。その結果、被検体中の測定対象物質の濃度が低い場合でも、測定対象物質が一次抗体と特異的に反応する機会を増大でき、結果的にその後に測定対象物質がイクオリン標識された二次抗体（第２物質）と特異的に反応する機会を増大でき、カルシウムイオンの作用によるイクオリンからの発光量を増大できる。
【００２７】
また、反応室１４内でイクオリン標識された二次抗体（第２物質）を測定対象物質と特異的に反応させた後のカルシウムイオンの作用によるイクオリンからの発光において、測定対象物質と特異的に反応した一次抗体を固定化する不織布２１の多数のポリスチレン繊維は径がイクオリンからの発光波長より小さいため、従来のフェライトビーズのようにイクオリンからの発光の吸収、散乱を激減できる。その結果、イクオリンからの発光の殆どを反応カラム１１の透明な窓板１２から集光用光学系４２を通して受光素子４１で検出できる。
【００２８】
また、反応カラム１１の反応室１４内のイクオリンからの発光は指向性がない。このため、実施形態のようにＡｇペースト層１９を有する導電性基板を用いれば、窓板１２と反対の方向に放射された光を図３に示す矢印のようにＡｇ薄膜層１９で反射させて窓板１２から取り出すことができる。さらに、反応カラム１１のカラム本体１３を有底逆角錐台筒形にすることによって、窓板１２と平行な方向に放射された光を図３に示す矢印のようにカラム本体１３の傾斜面で反射させて窓板１２から取り出すことができる。その結果、受光素子４１で検出する光量をより増大できる。
【００２９】
したがって、発光時のフォトンの数が少ないイクオリンのような標準物質を用い、被検体の測定対象物質が低濃度でも高いＳ／Ｎ比でその濃度検出が可能な検査用反応カラムおよび検査装置を提供できる。
【００３０】
なお、実施形態に係る反応カラムは図３に示す構造に限定されない。例えば図４に示すように吸引管１７にＯリング２２を嵌着したり、窓板１２表面に微小凹凸部２３がナノインプリント技術で形成したりしてもよい。吸引管１７へのＯリング２２の嵌着は、支持機構３１の支持部３４との気密性を高めて、吸引効率を向上できる。窓板１２表面への微小凹凸部２３の形成は、窓板１２からの光取り出し効率を向上できる。
【００３１】
不織布２１は、ポリスチレン繊維に限定されない。例えばポリスチレン繊維とポリウレタン繊維の混合繊維からなる不織布であってもよい。ポリウレタンは、熱可塑タイプが有り、軟化点がポリスチレンより低い材料を選ぶことが好ましい。このようなポリウレタンの材料選択によって、導電性基板と不織布２１をポリウレタンの軟化点で熱処理することで、導電性基板と不織布２１の密着性を向上することができる。
【００３２】
反応カラム１１の反応室１４に配置される導電性基板は、プラスチックフィルム、例えばＰＥＴフィルムにＡｇ薄膜層を形成した形態に限定されない。例えばプラスチックフィルムにアルミニウム薄膜のような金属薄膜を蒸着したもの、アルミニウムのような金属板、シリコン板も利用できるが、コスト面ではＰＥＴフィルムにＡｇ薄膜層を印刷で形成したものが好ましい。また、Ａｇ薄膜層の代わりにＩＴＯ付きフィルムを使用することができる。ＩＴＯフィルムを使用する際は、裏面に向かう光を反射するための反射シートを配置する。
【００３３】
また、二次抗体に標識化した標識物質はイクオリンに限らず、発光波長４００〜８００ｎｍのものであればいかなるものも使用できる。例えばイクオリンと同様に発光時のフォトンの数が少なく、発光は数秒で終了するアクリジニウムエステル（発光波長：４２０ｎｍ）やルテニウムキレート（発光波長：４２０ｎｍ）などを用いることができる。また、実施形態に係る反応カラムの反応室に配置される繊維からなる不織布の表面積はマイクロプレートの数百倍になることを利用して、ＣＰＤ−Ｓｔａｒ（商品名）［発光波長：４６６ｎｍ］も標準物質として用いることができる。
【符号の説明】
【００３４】
１…ステージ、３…カートリッジ収納部材、４ａ〜４ｆ…カートリッジ、１１…反応カラム、１２…窓板、１３…カラム本体、１４…反応室、１５…オートサンプラー（液体吸入管）、１７…吸引管、１９…Ａｇ薄膜層、２１…繊維（例えばポリスチレン繊維）からなる不織布、３１…支持機構、３２…支柱、３３…アーム、４１…受光素子。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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