(57)【要約】【課題】共焦点観察と全反射蛍光観察が可能で大型化や高コスト化を抑えた顕微鏡装置等を提供する。【解決手段】照明光束で標本５面を走査する走査手段３２を含み、光源からの前記照明光束を標本５へ導く照明光学系と、標本５からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、前記照明光学系内に配設され、前記照明光束を標本５へ導く複数の蛍光キューブと、を有しており、前記蛍光キューブの少なくとも１つは、すり鉢状の凹み部を備えた板状光学部材５１と、光軸を中心とした略同一円周上に隣接する複数の同形状のレンズ部５２ａを有してなる光学部材５２とを備え、前記照明光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行になるようにし、かつ前記照明光束を対物レンズ８の瞳位置の光軸から離れた所定の輪帯領域内の適宜の位置に集光するための集光位置変換手段を有する。【選択図】図１
2010145586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光束で標本面を走査する走査手段を含み、光源からの前記照明光束を標本へ導く照明光学系と、
前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
前記照明光学系内に配設され、前記照明光束を前記標本へ導く複数の蛍光キューブと、を有しており、
前記蛍光キューブの少なくとも１つは、すり鉢状の凹み部を備えた板状光学部材と、光軸を中心とした略同一円周上に隣接する複数の同形状のレンズ部を有してなる光学部材とを備え、前記照明光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行になるようにし、かつ前記照明光束を対物レンズの瞳位置の光軸から離れた所定の輪帯領域内の適宜の位置に集光するための集光位置変換手段を有することを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記集光位置変換手段を有する前記蛍光キューブは、前記照明光束を前記対物レンズへ導き、かつ前記標本からの反射光と蛍光とを分離するダイクロイックミラーをさらに備えていることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記集光位置変換手段を有する前記蛍光キューブを光路中に配置した際に、前記照明光束を前記対物レンズの瞳面上の所定位置へ導くべく前記走査手段を制御する制御手段を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記集光位置変換手段を有する前記蛍光キューブは、前記板状光学部材に替えて、円錐側面形状の反射部材と、中心部分に貫通口を備えたすり鉢形状の反射部材と、を有することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
落射照明光源からの落射照明光束を前記対物レンズを介して前記標本へ導く落射照明光学系を有することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
蛍光顕微鏡の照明光学系の光路中に交換可能に配置される蛍光キューブであって、
すり鉢状の凹み部を有する板状光学部材と、光軸を中心とした略同一円周上に隣接する複数の同形状のレンズ部を有してなる光学部材とを備え、当該蛍光顕微鏡の光路に配置されたときに、対物レンズを介して標本に照射する照明光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行になるようにし、かつ前記照明光束を前記対物レンズの瞳位置の光軸から離れた所定の輪帯領域内の適宜の位置に集光するための集光位置変換手段を含むことを特徴とする蛍光キューブ。
【請求項７】
前記照明光束を前記対物レンズへ導き、かつ前記標本からの前記反射光と前記蛍光とを分離するダイクロイックミラーをさらに備えていることを特徴とする請求項６に記載の蛍光キューブ。
【請求項８】
前記板状光学部材に替えて、円錐側面形状の反射部材と、中心部分に貫通口を備えたすり鉢形状の反射部材とを有することを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の蛍光キューブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置、蛍光キューブに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、共焦点顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡は、生体細胞等の標本を観察するために広く使用されており、近年では共焦点観察と全反射蛍光観察を切り替えて行うことが可能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。
【特許文献１】特開２００５−１２１７９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら上述のような従来の顕微鏡において、共焦点観察と全反射蛍光観察との切り替えは、照明光を対物レンズの瞳面の全反射条件領域に集光させるための光学部材を照明光学系中に挿脱することによって行われる。したがって従来の顕微鏡は、これを実現するための大掛かりな切り替え機構が必要となり、大型化や高コスト化を招いてしまうという問題があった。
【０００４】
そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、共焦点観察及び全反射蛍光観察を行うことが可能で、大型化や高コスト化を抑えた顕微鏡装置、蛍光キューブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために本発明は、
照明光束で標本面を走査する走査手段を含み、光源からの前記照明光束を標本へ導く照明光学系と、
前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
前記照明光学系内に配設され、前記照明光束を前記標本へ導く複数の蛍光キューブと、を有しており、
前記蛍光キューブの少なくとも１つは、すり鉢状の凹み部を備えた板状光学部材と、光軸を中心とした略同一円周上に隣接する複数の同形状のレンズ部を有してなる光学部材とを備え、前記照明光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行になるようにし、かつ前記照明光束を対物レンズの瞳位置の光軸から離れた所定の輪帯領域内の適宜の位置に集光するための集光位置変換手段を有することを特徴とする顕微鏡装置を提供する。
また本発明は、
蛍光顕微鏡の照明光学系の光路中に交換可能に配置される蛍光キューブであって、
すり鉢状の凹み部を有する板状光学部材と、光軸を中心とした略同一円周上に隣接する複数の同形状のレンズ部を有してなる光学部材とを備え、当該蛍光顕微鏡の光路に配置されたときに、対物レンズを介して標本に照射する照明光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行になるようにし、かつ前記照明光束を前記対物レンズの瞳位置の光軸から離れた所定の輪帯領域内の適宜の位置に集光するための集光位置変換手段を含むことを特徴とする蛍光キューブを提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、共焦点観察及び全反射蛍光観察を切り替えて行うことが可能で、大型化や高コスト化を抑えた顕微鏡装置、蛍光キューブを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の各実施形態に係る顕微鏡装置を添付図面に基づいて詳細に説明する。
（第１実施形態）
図１は本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置の概略を示す図であり、図２は本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置の光学系を示す図である。
図１に示すように本実施形態に係る顕微鏡装置１は、倒立型の顕微鏡本体２と、制御装置３とから構成されている。
【０００８】
顕微鏡本体２は、上方から光軸に沿って順に、後述する透過照明光源４からの光を標本５へ導く透過照明光学系６、標本５を載置するステージ７、倍率の異なる複数の対物レンズ８を回転切り替え可能に備えたレボルバ９、蛍光キューブホルダ１０、結像光学系１１、及び接眼鏡筒１２を備えている。
蛍光キューブホルダ１０は、公知の回転機構によって蛍光キューブ１６と全反射照明用の蛍光キューブ５０（以下、「全反射蛍光キューブ５０」という。）を選択的に回転切り替え可能に備えた保持部材である。蛍光キューブ１６は、ダイクロイックミラー１６ａと、その透過光路上に配置されたエミッションフィルタ１６ｂと、入射光路上に配置された波長選択フィルタ１６ｃとからなる。なお、全反射蛍光キューブ５０については後述する。
結像光学系１１は、図２に示すように蛍光キューブホルダ１０側から順に、結像レンズ１７、公知のスライド機構によって光路内へ挿脱可能なプリズム１８、ミラー１９ａ、リレーレンズ２０ａ、ミラー１９ｂ、及びリレーレンズ２０ｂからなる。
接眼鏡筒１２は、レンズ２１、ミラー２２、及び不図示の接眼レンズからなる。
【０００９】
顕微鏡本体２の外部には、図１に示すように標本５を透過照明するための透過照明光源４が上方に備えられており、側方には標本５を共焦点観察するための共焦点観察装置２５、標本５を落射照明するための落射照明装置２６、及び撮像素子２７が備えられている。なお、図２において透過照明光源４、透過照明光学系６、及び制御装置３は図示を省略している。
共焦点観察装置２５は、図２に示すように蛍光キューブホルダ１０側から順に、結像レンズ２９、公知のスライド機構によって光路内へ挿脱可能なダイクロイックミラー５５、瞳リレーレンズ３１、光を二次元的に走査する二次元スキャナ（ガルバノミラー）３２、ビームスプリッタ３３、コレクタレンズ３４、光ファイバ３５、及び不図示のレーザ光源、そしてビームスプリッタ３３の反射光路上に配置された結像レンズ３６、ピンホール３７、及び受光素子（ＰＭＴ）３８からなる。
【００１０】
落射照明装置２６は、図２に示すようにダイクロイックミラー５５側から順に、視野絞り４２、コレクタレンズ４３、光ファイバ４４、及び不図示の落射照明光源からなり、結像レンズ２９は共焦点観察装置２５と共用している。なお、本実施形態において落射照明光源にはレーザ光源が用いられているが、これに限られず高圧水銀ランプやキセノンランプ等を使用することもできる。
制御装置３は、顕微鏡本体２に搭載された各種装置を制御するパーソナルコンピュータ（ＰＣ）４５、及びモニタ４６等からなる。
【００１１】
斯かる構成の本実施形態に係る顕微鏡装置１では、図２及び図３を参照して以下に述べるように、標本５を透過照明して透過光を観察する透過照明観察、標本５を落射照明して蛍光を観察する落射蛍光観察、照明光で標本５の表面を二次元的に走査して、標本５から発する蛍光を観察する走査型蛍光観察、照明光で標本５の表面を二次元的に走査して反射光を観察する共焦点観察、及び標本５を全反射照明して蛍光を観察する全反射蛍光観察を適宜切り替えて実施することができる。なお、図３は本発明の第１実施形態において標本５の全反射蛍光観察を行う際の顕微鏡装置１の光学系を示す図である。
【００１２】
本実施形態に係る顕微鏡装置１によって標本５の透過照明観察を行う際には、予め、蛍光キューブホルダ１０の蛍光キューブ１６と全反射蛍光キューブ５０、及びプリズム１８を光路外へ退避させる。
この前提の下、透過照明光源４からの照明光は透過照明光学系６を介してステージ７上の標本５に照射され、標本５を透過した透過光（観察光）はレボルバ９に搭載されている対物レンズ８によって集光される。この観察光は、結像光学系１１の結像レンズ１７とミラー１９ａを介して一次像面Ｑに結像された後、リレーレンズ２０ａ、ミラー１９ｂ、リレーレンズ２０ｂを順に経て接眼鏡筒１２へ入射する。接眼鏡筒１２へ入射した観察光は、レンズ２１、ミラー２２を介して不図示の接眼レンズへ導かれる。これにより観察者は、不図示の接眼レンズを覗いて標本５の透過像を観察することが可能となり、即ち標本５の透過照明観察を行うことが可能となる。
【００１３】
本実施形態に係る顕微鏡装置１によって標本５の落射蛍光観察を行う際には、予め、蛍光キューブホルダ１０の蛍光キューブ１６、プリズム１８、及びダイクロイックミラー５５を光路内へ配置する。
この前提の下、不図示の落射照明光源からのレーザ光は、光ファイバ４４で導かれその端面より射出された後、コレクタレンズ４３を介して略平行光束となり、視野絞り４２を経てダイクロイックミラー５５で反射される。そしてこの略平行な光束は、結像レンズ２９で集光され、蛍光キューブ１６の波長選択フィルタ１６ｃを透過しダイクロイックミラー１６ａで反射されることで所定の励起波長の光が選択された後、対物レンズ８を介してステージ７上の標本５に照射される。
【００１４】
これによって標本５で発現した蛍光は、対物レンズ８で集光され、蛍光キューブ１６のダイクロイックミラー１６ａとエミッションフィルタ１６ｂを透過することで不要波長の光がカットされる。そしてこの蛍光は、結像光学系１１の結像レンズ１７を経てプリズム１８で反射され、撮像素子２７の撮像面上に結像される。これにより撮像素子２７では標本５の蛍光像が撮像され、これをＰＣ４５が画像処理してモニタ４６に表示させる。このようにして観察者は、本顕微鏡装置１によって標本５の落射蛍光観察を行うことが可能となる。
【００１５】
本実施形態に係る顕微鏡装置１によって標本５の走査型蛍光観察及び共焦点観察を行う際には、予め、蛍光キューブホルダ１０の蛍光キューブ１６、及びプリズム１８を光路内へ配置し、ダイクロイックミラー５５を光路外へ退避させる。
この前提の下、不図示のレーザ光源からのレーザ光は、光ファイバ３５で導かれその端面より射出された後、コレクタレンズ３４を介して略平行光束となってビームスプリッタ３３を透過する。そしてこの略平行光束は、二次元スキャナ３２で反射され、瞳リレーレンズ３１によって像面Ｒに結像された後、結像レンズ２９を介して再び略平行光束となる。このようにして略平行光束となったレーザ光は、蛍光キューブ１６の波長選択フィルタ１６ｃを透過しダイクロイックミラー１６ａで反射されることで所定の波長の光が選択された後、対物レンズ８で集光されてステージ７上の標本５に照射される。なおこのレーザ光は、二次元スキャナ３２で二次元的に走査されるため、標本５の観察領域全体にわたって照射されることとなる。これにより標本５は、レーザ光によって照明されて蛍光を発現するとともに、レーザ光を反射することとなる。
【００１６】
標本５で発現された蛍光は、対物レンズ８で集光され、蛍光キューブ１６のダイクロイックミラー１６ａとエミッションフィルタ１６ｂを透過することで不要波長の光がカットされる。そしてこの蛍光は、結像光学系１１の結像レンズ１７を経てプリズム１８で反射され、撮像素子２７の撮像面上に結像される。これにより撮像素子２７では標本５の蛍光像が撮像され、これをＰＣ４５が画像処理してモニタ４６に表示させる。このようにして観察者は、本顕微鏡装置１によって標本５の走査型蛍光観察を行うことが可能となる。
【００１７】
一方、標本５で反射されたレーザ光は、対物レンズ８で集光され、蛍光キューブ１６のダイクロイックミラー１６ａで反射された後、波長選択フィルタ１６ｃを透過する。そしてこのレーザ光は、結像レンズ２９と瞳リレーレンズ３１を経て、二次元スキャナ３２とビームスプリッタ３３で順に反射された後、ピンホール３７を通過して受光素子３８へ達する。なお、この受光素子３８へ達する光は二次元スキャナ３２によってデスキャンされるため、受光素子３８では標本５の観察領域全体にわたる観察光が検出されることとなる。これによりＰＣ４５は、受光素子３８で得られたレーザ光の強度信号に基づいて標本５の二次元画像を生成しモニタ４６に表示させる。このようにして観察者は、本顕微鏡装置１によって標本５の共焦点観察を行うことが可能となる。
なお、本実施形態に係る顕微鏡装置１では、撮像素子２７から得られた蛍光画像と、受光素子３８から得られた共焦点画像とをモニタ４６に重ねて表示して観察することもできる。
【００１８】
本実施形態に係る顕微鏡装置１によって標本５の全反射蛍光観察を行う際には、予め図３に示すように、蛍光キューブホルダ１０の全反射蛍光キューブ５０、及びプリズム１８を光路内へ配置し、ダイクロイックミラー５５を光路外へ退避させる。
ここで、本実施形態における蛍光キューブホルダ１０の全反射蛍光キューブ５０は、図４（ａ）に示すように照明光の入射側から順に、光軸に対して所定の角度だけ傾斜した照明光を光軸に対して略平行にする全周楔５１、全周楔５１からの照明光を対物レンズ８の瞳面Ｐ上に集光させる複数のレンズ部５２ａを備えた全周レンズ５２、及びダイクロイックミラー５０ａを有し、さらに観察光の透過光路上に配置されたエミッションフィルタ５０ｂを有してなる。なお、全周楔５１及び全周レンズ５２の詳細な構成については後述する。
【００１９】
上記前提の下、図３において不図示のレーザ光源からのレーザ光は、光ファイバ３５で導かれその端面より射出され、コレクタレンズ３４によって略平行光束に変換された後、ビームスプリッタ３３を透過し二次元スキャナ３２で反射される。なお、このとき二次元スキャナ３２の反射角度は、該二次元スキャナ３２で反射された略平行光束が図５（ｂ）に示すように対物レンズ８の瞳面Ｐ上の全反射条件領域内に位置する光軸から距離ｄだけ偏心した位置（位置Ｄ）へ入射するように、ＰＣ４５によって制御されている。
ここで、全反射条件領域とは、対物レンズ８の瞳面Ｐに光を入射させた際に、この光を標本５とカバーガラスの境界面に対して全反射角で入射させることが可能な瞳面Ｐ上の輪帯形の範囲をいう。また、上記距離ｄは、対物レンズの種類によって異なる全反射条件領域に応じて設定されるものである。
【００２０】
二次元スキャナ３２で反射された略平行光束は、瞳リレーレンズ３１によって像面Ｒに結像された後、結像レンズ２９を介して再び略平行光束となり、光軸に対して傾斜角度αだけ傾斜して全反射蛍光キューブ５０内の全周楔５１に入射する。全周楔５１に入射した略平行光束は、該全周楔５１によって屈折されることで、その光軸Ｉ１が結像レンズ２９の光軸に対して略平行で距離ｄだけ偏心した略平行光束となる（図５（ｂ）も参照。）。この略平行光束は、全周レンズ５２におけるレンズ部５２ａを介し、ダイクロイックミラー５０ａで反射されることで所定の波長の光が選択された後、対物レンズ８の瞳面Ｐ上における全反射条件領域内の位置Ｄに集光される。なお、本顕微鏡装置１によって走査型蛍光観察及び共焦点観察を行う場合には、図５（ａ）に示すように結像レンズ２９からの点線で示す（＋）最大画角光束、実線で示す像中心光束、及び破線で示す（−）最大画角光束は、いずれも対物レンズ８の瞳位置Ｐに集光されることがない。
【００２１】
このようにして対物レンズ８の瞳面Ｐ上の全反射条件領域に集光されたレーザ光は、対物レンズ８を介して標本５へ全反射角で入射する、詳しくは標本５の媒質と標本５を保持する不図示のガラス基板（カバーガラス）との境界面において全反射される入射角度でもって標本５へ入射し、これによって標本５の全反射照明を実現することができる。
【００２２】
標本５が全反射照明されると、前記境界面においてエバネッセント光が発生し、このエバネッセント光によって標本５の境界面近傍部分が照明されて蛍光が発現する。この蛍光は、対物レンズ８で集光され、全反射蛍光キューブ５０のダイクロイックミラー５０ａとエミッションフィルタ５０ｂを透過することで不要波長の光がカットされる。そしてこの蛍光は、結像光学系１１の結像レンズ１７を経てプリズム１８で反射され、撮像素子２７の撮像面上に結像される。これにより撮像素子２７では標本５の蛍光像が撮像され、これをＰＣ４５が画像処理してモニタ４６に表示させる。このようにして観察者は、本顕微鏡装置１によって標本５の全反射蛍光観察を行うことが可能となる。
【００２３】
ここで、上述の全反射蛍光キューブ５０における全周楔５１及び全周レンズ５２の構成について詳細に説明する。図４（ｂ）、（ｃ）はそれぞれ本発明の第１実施形態における全反射蛍光キューブ５０の全周レンズ５２、全周楔５１を照明光の入射側から見た図である。
【００２４】
全周楔５１は、図４（ａ）に示すように平行平面板形状のプリズム部材にすり鉢状の凹み部を形成してなり、前記凹み部を照明光の入射側へ向けている。そして全周楔５１は、図５（ｂ）,（ｃ）に示すように結像レンズ２９の光軸に対して傾斜角度αで当該全周楔５１に入射する照明光束（略平行光束）を、その光軸Ｉ１が結像レンズ２９の光軸に対して略平行となるように屈折するために、次の関係式（１）を満足するように構成されている。
（１）    α＝（ｎ−１）×δ
ただし、
α：全周楔５１に入射する照明光の結像レンズ２９の光軸に対する傾斜角度
δ：全周楔５１の頂角（全周楔５１における照明光の入射面と射出面とのなす角度）
ｎ：全周楔５１を構成する媒質のｄ線（波長５８７．６ｎｍ）に対する屈折率
【００２５】
全周レンズ５２は、図４（ａ）,（ｂ）に示すように複数の同形状のレンズ部５２ａを光軸を中心とする略同一円周上に隣接して備える、即ち各レンズ部５２ａが光軸から距離ｄだけ偏心して隣接配置されたガラス部材からなる。なお、本実施形態においてレンズ部５２ａは１２個の平凸レンズ部からなり、凸面を照明光の入射側へ向けて配置されている。
なお、上記構成の全周楔５１及び全周レンズ５２は、それぞれの中心部分に照明光を入射させる必要がないため、中心部分をくり貫いた形状としてもよい。全周楔５１及び全周レンズ５２の材料は、ガラスやプラスチックに限られるものではない。全周レンズ５２はフレネルレンズによって構成することも可能であり、全周楔５１は図４（ｄ）に示すように同じ形状の複数の楔プリズムを張り合わせて構成することも可能である。
【００２６】
以上は、全反射蛍光キューブ５０における全周レンズ５２中の１つのレンズ部５２ａに照明光を入射させ、対物レンズ８の瞳面Ｐにおける全反射条件領域内の１点（位置Ｄ）に照明光を集光させることにより、標本５を一方向側からのみ全反射照明する場合について説明している。本実施形態に係る顕微鏡装置１はこれに限られず、ＰＣ４５によって二次元スキャナ３２による照明光の反射角度を制御することで、全周レンズ５２中の任意のレンズ部５２ａに照明光を入射させ、全反射条件領域内の任意の１点に照明光を集光させることも可能である。これにより、標本５を任意の方向から全反射照明することができる。
【００２７】
また、本実施形態に係る顕微鏡装置１では、ＰＣ４５によって二次元スキャナ３２を制御して照明光を走査することで、全周レンズ５２中の複数のレンズ部５２ａ（より好ましくは全てのレンズ部５２ａ）に照明光を順次入射させ、全反射条件領域内の複数点に照明光を集光させることも可能である。これにより、標本５を複数の方向から順次全反射照明することが可能となり、光ファイバ３５から対物レンズ８までの光路中に配置されている各光学素子の表面反射等に起因して生じるスペックルパターン、即ち照明光の強度ムラを解消してより均一な全反射照明を実現することができる。なお、斯かる場合には照明光を走査する度に標本５の画像を取得し、取得した複数の画像をＰＣ４５で積算して平均化することで、良好な標本５の画像を取得することが可能となる。
【００２８】
なお、本実施形態に係る顕微鏡装置１において、レボルバ９に備えられた複数の対物レンズを切り替えて全反射蛍光観察を行う場合には、上記構成の全反射蛍光キューブを対物レンズ毎に予め用意して蛍光キューブホルダ１０に搭載し、対物レンズとともに全反射蛍光キューブを切り替えることで容易に全反射蛍光観察を実現することができる。なお、斯かる場合においても、対物レンズと全反射蛍光キューブの切り替えに伴い、ＰＣ４５が二次元スキャナ３２による照明光の反射角度を制御することで、対物レンズ毎に異なる全反射条件領域内の位置Ｄへ照明光を適切に入射させることが可能である。
【００２９】
以上のように本実施形態に係る顕微鏡装置１では、標本５の透過照明観察、落射蛍光観察、走査型蛍光観察、共焦点観察、及び全反射蛍光観察を適宜切り替えて実施することができる。
そして本実施形態に係る顕微鏡装置１では、一般的な蛍光顕微鏡に通常備えられている蛍光キューブホルダ１０に上記構成の全反射蛍光キューブ５０を搭載し、これを用いて共焦点観察と全反射蛍光観察との切り替えを実現しているため、従来技術の顕微鏡のような大掛かりな切り替え機構が不要となり、顕微鏡本体２の大型化や高コスト化を効果的に抑えることができるとともに、共焦点観察と全反射蛍光観察との切り替えを簡便で迅速に行うことができる。
また、本実施形態に係る顕微鏡装置１によって全反射蛍光観察を行う際には、上述のように標本５を一方向側からのみ全反射照明するだけでなく、任意の方向や複数の異なる方向から適宜全反射照明することが可能であるため、スペックルパターンを解消したより良好な標本５の画像を取得することができる。
【００３０】
（第２実施形態）
本実施形態において、上記第１実施形態と同様の構成である部分には同じ符号を付して説明を省略し、異なる部分について詳細に説明する。図６は本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置の光学系を示す図である。なお、図６において透過照明光源４、透過照明光学系６、及び制御装置３は図示を省略している。
【００３１】
図６に示すように本実施形態に係る顕微鏡装置６０は、顕微鏡本体２における蛍光キューブホルダ１０と対物レンズ８との間に、公知のスライド機構によって光路内へ挿脱可能な第１ダイクロイックミラー６１を備えている。そして第１ダイクロイックミラー６１の反射光路上には、エミッションフィルタ６２、結像レンズ６３、及び撮像素子２７からなる撮像部６４を備えている。
また、顕微鏡本体２における結像光学系１１の結像レンズ１７とミラー１９ａとの間に、上記第１実施形態のプリズム１８に代えて、公知のスライド機構によって光路内へ挿脱可能な第２ダイクロイックミラー６５を備えている。そして第２ダイクロイックミラー６５の反射光路上には、上記第１実施形態と同様の共焦点観察装置２５が配置されている。
なお、顕微鏡本体２において蛍光キューブホルダ１０の照明光の入射光路上には、上記第１実施形態と同様の落射照明装置２６のみが配置されている。
【００３２】
蛍光キューブホルダ１０には、上記第１実施形態の全反射蛍光キューブ５０に代えて、図７（ａ）に拡大図を示す全反射蛍光キューブ６６が備えられている。本実施形態における全反射蛍光キューブ６６は、照明光の入射側（結像レンズ１７側）から順に、上記第１実施形態と同様の構成の全周楔５１と全周レンズ５２とを有してなる。
【００３３】
斯かる構成の本実施形態に係る顕微鏡装置６０では、以下に述べるように標本５の透過照明観察、落射蛍光観察、走査型蛍光観察、共焦点観察、及び全反射蛍光観察を適宜切り替えて実施することができる。
本実施形態に係る顕微鏡装置６０によって標本５の透過照明観察を行う際には、予め、蛍光キューブホルダ１０の蛍光キューブ１６及び全反射蛍光キューブ６６、第１ダイクロイックミラー６１、及び第２ダイクロイックミラー６５を光路外へ退避させる。この前提の下、観察者は上記第１実施形態と同様に標本５の透過照明観察を行うことが可能となる。
【００３４】
本実施形態に係る顕微鏡装置６０によって標本５の落射蛍光観察を行う際には、予め蛍光キューブホルダ１０の蛍光キューブ１６、及び第１ダイクロイックミラー６１を光路内へ配置する。
この前提の下、光ファイバ４４より射出されたレーザ光は、コレクタレンズ４３を介して略平行光束となって視野絞り４２を通過する。この略平行光束は、結像レンズ２９で集光され、蛍光キューブ１６の波長選択フィルタ１６ｃを透過しダイクロイックミラー１６ａで反射されることで所定の励起波長の光が選択された後、第１ダイクロイックミラー６１を透過し、さらに対物レンズ８を介して標本５に照射される。
【００３５】
これによって標本５で発現した蛍光は、対物レンズ８で集光され、第１ダイクロイックミラー６１で反射されエミッションフィルタ６２を透過することで不要波長の光がカットされる。そしてこの蛍光は、結像レンズ６３によって撮像素子２７の撮像面上に結像される。これにより撮像素子２７では標本５の蛍光像が撮像され、これがモニタ４６に表示されることで観察者は標本５の落射蛍光観察を行うことが可能となる。
【００３６】
本実施形態に係る顕微鏡装置６０によって標本５の走査型蛍光観察及び共焦点観察を行う際には、予め、第１ダイクロイックミラー６１及び第２ダイクロイックミラー６５を光路内へ配置し、蛍光キューブホルダ１０の蛍光キューブ１６と全反射蛍光キューブ６６を光路外へ退避させる。
この前提の下、光ファイバ３５より射出されたレーザ光は、上記第１実施形態と同様に像面Ｒに結像された後、第２ダイクロイックミラー６５で反射されることで所定の波長の光が選択される。このレーザ光は、結像レンズ１７を介して再び略平行光束となり、対物レンズ８で集光されて標本５に照射される。なおこのレーザ光は、上記第１実施形態と同様に二次元スキャナ３２で二次元的に走査される。したがって標本５は、レーザ光によって励起されて蛍光を発現するとともに、当該レーザ光を反射することとなる。
【００３７】
標本５で発現された蛍光は、対物レンズ８で集光され、第１ダイクロイックミラー６１で反射されエミッションフィルタ６２を透過することで不要波長の光がカットされる。そしてこの蛍光は、結像レンズ６３を介して撮像素子２７の撮像面上に結像される。これにより撮像素子２７では標本５の蛍光像が撮像され、これがモニタ４６に表示されることで観察者は標本５の走査型蛍光観察を行うことが可能となる。
一方、標本５で反射されたレーザ光は、対物レンズ８で集光されて、第１ダイクロイックミラー６１と結像レンズ１７を経た後、第２ダイクロイックミラー６５で反射され、上記第１実施形態と同様に受光素子３８へ達する。なお、受光素子３８へ達する光は二次元スキャナ３２によってデスキャンされる。そして、受光素子３８で得られた光の強度信号に基づく標本５の二次元画像がモニタ４６に表示されることで、観察者は標本５の共焦点観察を行うことが可能となる。
【００３８】
本実施形態に係る顕微鏡装置６０によって標本５の全反射蛍光観察を行う際には、予め、図６に示すように蛍光キューブホルダ１０の全反射蛍光キューブ６６、第１ダイクロイックミラー６１、及び第２ダイクロイックミラー６５を光路内へ配置する。
この前提の下、光ファイバ３５より射出されたレーザ光は、上記第１実施形態と同様に像面Ｒに結像された後、第２ダイクロイックミラー６５で反射されることで所定の波長の光が選択される。なお、このとき二次元スキャナ３２の反射角度は、上記第１実施形態と同様、反射光が対物レンズ８の瞳面Ｐにおける全反射条件領域内の位置Ｄへ入射するようにＰＣ４５で制御されている。斯かるレーザ光は、結像レンズ１７を介して再び略平行光束となり、光軸に対して傾斜角度αだけ傾斜して全反射蛍光キューブ６６へ入射する。
【００３９】
全反射蛍光キューブ６６へ入射した略平行光束は、上記第１実施形態と同様、全周楔５１で屈折されることで光軸に対して略平行で距離ｄだけ偏心した略平行光束となり、さらに全周レンズ５２を介することで、第１ダイクロイックミラー６１を透過した後、対物レンズ８の瞳面Ｐにおける全反射条件領域内の位置Ｄに集光される。このレーザ光は、対物レンズ８を介して標本５へ全反射角で入射し、これによって標本５の全反射照明を実現することができる。
【００４０】
標本５が全反射照明されると、上記第１実施形態と同様に標本５から蛍光が発現する。この蛍光は、対物レンズ８によって集光された後、第１ダイクロイックミラー６１で反射されエミッションフィルタ６２を透過することで不要波長の光がカットされ、さらに結像レンズ６３を経て撮像素子２７の撮像面上に結像される。これにより撮像素子２７では標本５の蛍光像が撮像され、これがモニタ４６に表示されることで観察者は標本５の全反射蛍光観察を行うことが可能となる。
なお、上記第１実施形態と同様に本顕微鏡装置６０においても、標本５を一方向側からのみ全反射照明することに限られず、ＰＣ４５によって二次元スキャナ３２の照明光の反射角度を制御することで、任意の方向や複数の異なる方向から適宜標本５を全反射照明することが可能であるため、スペックルパターンを解消したより良好な標本５の画像を取得することができる。
【００４１】
以上のように本実施形態に係る顕微鏡装置６０では、標本５の透過照明観察、落射蛍光観察、走査型蛍光観察、共焦点観察、及び全反射蛍光観察を適宜切り替えて実施することが可能であり、上記第１実施形態と同様の効果を奏することができる。また、上記構成の全反射蛍光キューブ６６は、上記第１実施形態の全反射蛍光キューブ５０におけるダイクロイックミラー５０ａを備える必要がないため、全周楔５１と全周レンズ５２とをより容易に収納及び配置することが可能である。
【００４２】
本実施形態に係る顕微鏡装置６０において、標本５の全反射蛍光観察時に用いられる全反射蛍光キューブ６６の構成は上述のものに限られず、例えば図７（ｂ）を参照して以下に述べる全反射蛍光キューブ６７を用いることもできる。
図７（ｂ）に示すように全反射蛍光キューブ６７は、結像レンズ１７側から順に、コーン型ミラー６８、すり鉢状ミラー６９、及び上記第１実施形態と同様の構成の全周レンズ５２を有している。
【００４３】
コーン型ミラー６８は、円錐部材の側面にミラー面を形成してなる反射部材であって、当該ミラー面を結像レンズ１７側へ向けて光軸上に配置されている。すり鉢状ミラー６９は、平行平面板部材にすり鉢状の凹み部を設けてミラー面を形成し、さらにこのミラー面の中心部分に貫通口を設けてなる反射部材であって、当該ミラー面をコーン型ミラー６８側へ向けて光軸上に配置されている。なお、斯かるコーン型ミラー６８とすり鉢状ミラー６９の間隔、及び各ミラー面の角度は、光軸上を進行する略平行光束を光軸に対して略平行で距離ｄだけ偏心させるように設定されている。
【００４４】
上記構成の全反射蛍光キューブ６７を用いて標本５の全反射蛍光観察を行う場合、光軸上を進行して全反射蛍光キューブ６７へ入射した照明光（略平行光束）は、すり鉢状ミラー６９の貫通口を通過し、コーン型ミラー６８及びすり鉢状ミラー６９で順に反射されることにより、結像レンズ１７の光軸に略平行なリング状の照明光となって全周レンズ５２の各レンズ部５２ａへ入射する。そしてレンズ部５２ａを経た照明光は、対物レンズ８の瞳面Ｐにおける全反射条件領域内の位置Ｄ、即ち全反射条件領域内の光軸を中心とした半径が距離ｄの円周上に集光される。したがってリング状の照明光は、対物レンズ８を介して全反射角で標本５に照射されることとなり、これによってスペックルパターンを効果的に解消した良好な全反射照明を実現することが可能となる。また斯かる場合には、二次元スキャナ３２によって照明光を走査する必要がなく、また標本５の画像を複数枚撮影して積算する必要もないため、全反射蛍光観察をより迅速に行うことが可能となる。
【００４５】
以上、上記各実施形態によれば、共焦点観察及び全反射蛍光観察を行うことが可能で、大型化や高コスト化を抑えた顕微鏡装置、及びこれに用いられる蛍光キューブを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置１の概略を示す図である。
【図２】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置１の光学系を示す図である。
【図３】本発明の第１実施形態において標本５の全反射蛍光観察を行う際の顕微鏡装置１の光学系を示す図である。
【図４】（ａ）は本発明の第１実施形態における全反射蛍光キューブ５０の構成を示す図であり、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）はそれぞれ全周レンズ５２、全周楔５１、全周楔５１の変形例を照明光の入射側から見た図である。
【図５】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置１において、結像レンズ２９と対物レンズ８の瞳面Ｐとの間の照明光の振る舞いを示す図であり、（ａ）は走査型蛍光観察時及び共焦点観察時、（ｂ）は全反射蛍光観察時を示し、（ｃ）は（ｂ）の部分拡大図を示している。
【図６】本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置６０の光学系を示す図である。
【図７】（ａ）は本発明の第２実施形態における全反射蛍光キューブ６６の構成を示す図であり、（ｂ）はその変形例を示す図である。
【符号の説明】
【００４７】
１，６０      顕微鏡装置
２            顕微鏡本体
３            制御装置
４            透過照明光源
５            標本
８            対物レンズ
１０          蛍光キューブホルダ
１２          接眼鏡筒
１６          蛍光キューブ
１８          プリズム
２５          共焦点観察装置
２６          落射照明装置
３２          二次元スキャナ
５０          全反射蛍光キューブ
５１          全周楔
５２          全周レンズ
６６，６７    全反射蛍光キューブ
６８          コーン型ミラー
６９          すり鉢状ミラー
Ｐ            対物レンズ８の瞳面
Ｒ            像面（光源像）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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