(57)【要約】【課題】金属消光を効果的に防止し、かつ増強された電場を効率よく利用して、高感度に光信号を検出する。【解決手段】センサ部１４に液体試料Ｓ中の被検出物質Ａの量に応じた量の標識結合物質ＢＦを結合させ、センサ部１４上に増強された光電場Ｄ内において、標識の励起に起因して生じる信号光Ｌｆの量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法において、標識Ｆとして、光応答性物質ｆを、光応答性物質ｆから生じる光Ｌｆを透過する誘電体１６により包含してなる標識物質Ｆを用い、センサ部１４上に、複数の断片化された抗体Ｂ１を介して標識結合物質ＢＦを結合させる。【選択図】図１
2010043934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面に設けられた金属層を含むセンサ部とを備えたセンサチップを用意し、
前記センサ部に液体試料を接触させることにより、該センサ部上に、該液体試料中の被検出物質の量に応じた量の標識結合物質を結合させ、
前記センサ部に励起光を照射することにより、該センサ部上に増強した光電場を生じさせ、該増強した光電場内において前記標識結合物質の前記標識から生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記標識として、光応答性物質を、該光応答性物質から生じる光を透過する誘電体により包含してなる標識物質を用い、
前記センサ部上に、複数の断片化された抗体を介して前記標識結合物質を結合させることを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記断片化された抗体として、タンパク質分解酵素により断片化され、該断片化によりジスルフィド結合及び／又はチオール基が露出された抗体であり、該抗体の少なくとも１つの末端に、前記被検出物質と特異的に結合可能な抗原決定基を有する抗体を用いることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記断片化された抗体として、Ｆａｂフラグメント，Ｆ（ａｂ’）２フラグメント，Ｆａｂ’フラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の抗体フラグメントを用いることを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記センサ部の試料接触面に前記金属層の少なくとも一部が露出しており、
前記標識結合物質を前記センサ部上に、前記露出した金属層の金属原子に直接結合された前記断片化された抗体を介して結合させることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の検出方法。
【請求項５】
前記標識結合物質として、前記標識物質表面に前記被検出物質及び／又は前記断片化された抗体と特異的に結合可能な断片化された抗体が結合されたものを用いることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の検出方法。
【請求項６】
前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、
前記光応答性物質として蛍光色素分子を用い、前記標識から生じる前記光として、前記蛍光色素分子の励起に起因して生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載の検出方法。
【請求項７】
前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、
前記光応答性物質として蛍光色素分子を用い、前記標識から生じる前記光として、前記蛍光色素分子の励起に起因して生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載の検出方法。
【請求項８】
前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、
前記光応答性物質として蛍光色素分子を用い、前記標識から生じる前記光として、前記蛍光色素分子の励起に起因して生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載の検出方法。
【請求項９】
前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、
前記光応答性物質として蛍光色素分子を用い、前記標識から生じる前記光として、前記蛍光色素分子の励起に起因して生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載の検出方法。
【請求項１０】
誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面に設けられた金属層と、該金属層上に設けられた光導波層とを備えたセンサ部とからなるセンサチップを用意し、
前記センサ部に液体試料を接触させることにより、該センサ部上に、該液体試料中の被検出物質の量に応じた量の標識結合物質を結合させ、
前記センサ部に励起光を照射することにより、前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記センサ部上に増強した光電場を生じさせ、該増強した光電場内において前記標識結合物質の前記標識から生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記標識結合物質を前記センサ部上に、断片化された抗体を介して結合させることを特徴とする検出方法。
【請求項１１】
請求項１から１０いずれか１項に記載の検出方法に用いる検出装置であって、
誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面に設けられた金属層を含むセンサ部とを備え、該センサ部上に前記複数の断片化された抗体が結合されたセンサチップと、
前記センサ部に前記励起光を照射する励起光照射光学系と、
該励起光の照射により該センサ部上に生じた前記増強した光電場における、前記標識結合物質の前記標識から生じる光を検出する光検出手段とを備えたことを特徴とする検出装置。
【請求項１２】
請求項１から１０いずれか１項に記載の検出方法において使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部として設けられた誘電体プレートと、該プレートの試料接触面に設けられた少なくとも金属層を含むセンサ部とからなるセンサチップ部とを備えてなり、
前記センサ部の前記プレートの反対側の面が、複数の前記断片化された抗体が結合されたものであることを特徴とする検出用試料セル。
【請求項１３】
前記センサ部において、前記金属層上に光導波層を有することを特徴とする請求項１２に記載の検出用試料セル。
【請求項１４】
前記流路内の前記センサ部より上流側に固定された、光応答性物質を該光応答性物質から生じる光を透過する誘電体により包含してなる標識物質を、前記標識として含む前記標識結合物質を有することを特徴とする請求項１２又は１３に記載の検出用試料セル。
【請求項１５】
請求項１２又は１３に記載の試料セルと、
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に、前記流路内に流下される、光応答性物質を、該光応答性物質から生じる光を透過する誘電体により包含してなる標識物質を、前記標識として含む前記標識結合物質を含んだ標識用溶液を備えてなることを特徴とする検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法、及び検出用試料セル、検出用キット、検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識されて被検出物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち被検出物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
バイオ測定においては、例えば、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上に被検出物質と特異的に結合する１次抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより、１次抗体に被検出物質を特異的に結合させ、次いで、被検出物質と特異的に結合する、蛍光標識が付与された２次抗体を添加し、被検出物質と結合させることにより、１次抗体―被検出物質―２次抗体の、所謂サンドイッチを形成し、２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出するサンドイッチ法や、被検出物質と競合して１次抗体と特異的に結合する、蛍光標識された競合２次抗体を被検出物質と競合的に１次抗体と結合させ、１次抗体と結合した競合２次抗体からの蛍光を検出する競合法などのアッセイがなされる。
【０００４】
この際、基板上に固定された１次抗体と被検出物質を介して結合した２次抗体、あるいは直接結合した競合２次抗体のみからの蛍光を検出するために、エバネッセント光により蛍光を励起するエバネッセント蛍光法が提案されている。エバネッセント蛍光法は、基板表面で全反射する励起光を基板裏面から入射し、基板表面に滲み出すエバネッセント波により蛍光を励起してその蛍光を検出するものである。
【０００５】
エバネッセント蛍光法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１、非特許文献１などに提案されている。表面プラズモン増強蛍光法は、プラズモン共鳴を生じさせるため、基板上に金属層を設け、基板と金属層との界面に対して基板裏面から、全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光信号を増大させてＳ／Ｎを向上させるものである。
【０００６】
同様に、エバネッセント蛍光法において、センサ部の電場を増強する効果を有するものとして、導波モードによる電場増強効果を利用する方法が非特許文献２に提案されている。この光導波モード増強蛍光分光法（OWF：Optical waveguide mode enhanced fluorescence spectroscopy)は、基板上に金属層と、誘電体などからなる光導波層とを順次形成し、基板裏面から全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により光導波層に光導波モードを生じさせ、その電場増強効果によって、蛍光信号を増強させるものである。
【０００７】
また、特許文献２および非特許文献３には、表面プラズモンにより増強された電場において励起された蛍光標識からの蛍光を検出するのではなく、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起して生じる放射光（SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission)をプリズム側から取り出す方法が提案されている。
【０００８】
上記したエバネッセント蛍光法で増強される電場は、増強場の発生面からの距離に対して急激に減衰することが知られている。図２０は、本発明者らが、プリズム（ＰＭＭＡ）−金膜（膜厚５０ｎｍ）−溶媒（水）系において、波長６５６ｎｍのレーザを入射角７２．５°の条件で入射させた時の電場増強効果の増強場発生面（金属面）からの離間距離依存性をシミュレーションした結果を示すグラフである。図２０からも確認されるように、表面プラズモン蛍光検出（ＳＰＦ）やＳＰＣＥでは、１００ｎｍ程度の離間で強度が半減する。従って、蛍光標識はできるだけ増強場発生面に近接していることが好ましい。
【０００９】
一方、上記エバネッセント蛍光法のうち、試料接触面に金属層が露出している場合は、試料中の蛍光色素と金属膜とが接近し過ぎていると、蛍光色素内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得る。従って、試料接触面に金属層が露出している場合は、蛍光色素と増強場発生面とを金属消光を生じない程度離間させるか、金属層上に金属酸化物層やポリマー層等の誘電体層や、カルボキシメチルデキストラン(ＣＭＤ)膜等の３次元膜を設けることにより、蛍光色素と金属膜とを離間させる必要がある（非特許文献４等）。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００５３９７４号明細書
【非特許文献１】W.Knoll他、Analytical Chemistry 77(2005), p.2426-2431
【非特許文献２】2007年春季  応用物理学会  予稿集  Ｎo.３,P.1378
【非特許文献３】Thorsten Liebermann Wolfgang Knoll, "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy" Colloids and Surfaces A 171(2000)115-130
【非特許文献４】W.Knoll他、Analytical Chemistry 76(2004)  p.6765
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のように、増強電場の有効利用と金属消光の防止とは相反する関係にあるため、より高感度な検出を実現するために、金属消光を効果的に防止し、かつ増強された電場を効率よく利用する検出方法が求められている。かかる課題は、蛍光検出のみならず、光応答性物質を標識として用いた検出方法に総じて存在する課題である。
【００１１】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、金属消光を防止しつつ、高効率に信号強度を増幅して、高感度に蛍光や散乱光等の光信号を直接、あるいは間接的に検出する検出方法および装置を提供することを目的とするものである。  
また、本発明は検出方法に用いられる試料セルおよび検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の検出方法は、誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面に設けられた金属層を含むセンサ部とを備えたセンサチップを用意し、
前記センサ部に液体試料を接触させることにより、該センサ部上に、該液体試料中の被検出物質の量に応じた量の標識結合物質を結合させ、
前記センサ部に励起光を照射することにより、該センサ部上に増強した光電場を生じさせ、該増強した光電場内において前記標識結合物質の前記標識から生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記標識として、光応答性物質を、該光応答性物質から生じる光を透過する誘電体により包含してなる標識物質を用い、
前記センサ部上に、複数の断片化された抗体を介して前記標識結合物質を結合させることを特徴とするものである。
【００１３】
ここで「標識結合物質」は被検出物質の量に応じた量だけセンサ部上に結合する標識された結合物質であり、例えば、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する結合物質と標識とから構成され、競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合する結合物質と標識とから構成される。
【００１４】
本明細書において、「光応答性物質」とは、励起光照射により光を生じる物質を意味し、有機系蛍光色素，量子ドット等の無機系蛍光色素，金属微粒子等が挙げられる。光応答性物質から生じる光としては、蛍光、燐光、散乱光等が挙げられる。
【００１５】
また、「被検出物質の量を検出する」とは被検出物質の存在の有無を含み、定量的な量のみならず、定性的な量を含むものとする。
【００１６】
ここで「光電場」とは、励起光の照射により生じるエバネッセント光もしくは近接場光に起因する電場をいうものとする。  
また、「増強した光電場を生じさせる」とは、光電場を増強させることによって、増強した光電場を形成することを意味するものであり、光電場を増強させる方法は、プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。
【００１７】
また、「前記標識結合物質の前記標識から生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する」方法としては、標識からの光を直接検出するものであってもよいし、間接的に検出するものであってもよい。  
具体的には、以下の態様（１）〜（４）が挙げられる。
【００１８】
（１）前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、前記標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該標識から生じる光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。  
（２）前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、前記標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該標識から生じる光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。  
（３）前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、前記標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該標識から生じる光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。  
（４）前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、前記標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該標識から生じる光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。
【００１９】
（１）および（２）においては、前記金属層を金属膜とし、金属膜と基板との界面に基板裏面から全反射角度以上の角度でｐ偏光の励起光を入射させ、金属膜表面に表面プラズモンを励起するものであってもよいし、前記金属層を、励起光の波長よりも小さい周期の凹凸を表面に有する金属微細構造体あるいは、励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドにより構成し、励起光の照射により、金属微細構造体あるいは金属ナノロッドに局在プラズモンを励起するものであってもよい。
【００２０】
本明細書において、断片化された抗体とは抗体分子の一部であり、前記被検出物質と特異的に結合可能な抗原決定基を少なくとも１つ有しているものである。断片化された抗体としては、タンパク質分解酵素により断片化され、該断片化によりジスルフィド結合及び／又はチオール基が露出された抗体であり、該抗体の少なくとも１つの末端に、前記標識結合物質と結合可能な抗原決定基を有する抗体であることが好ましい。かかる抗体としては、Ｆａｂフラグメント，Ｆ（ａｂ’）２フラグメント，Ｆａｂ’フラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の抗体フラグメント等が挙げられる。
【００２１】
前記センサ部の試料接触面に前記金属層の少なくとも一部が露出しており、前記露出した金属層の金属原子にジスルフィド結合やチオール基が露出している抗体、即ち、Ｓ原子が露出した抗体を断片化された抗体として用いる場合は、上記のように、前記標識結合物質を前記センサ部上に、直接結合された前記断片化された抗体を介して結合させることができる。
【００２２】
また、前記標識結合物質として、前記標識表面に前記被検出物質及び／又は前記断片化された抗体と特異的に結合可能な断片化された抗体が結合されたものを用いることが好ましい。
【００２３】
本発明の第２の検出方法は、誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面に設けられた金属層と、該金属層上に設けられた光導波層とを備えたセンサ部とからなるセンサチップを用意し、前記センサ部に液体試料を接触させることにより、該センサ部上に、該液体試料中の被検出物質の量に応じた量の標識結合物質を結合させ、前記センサ部に励起光を照射することにより、前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記センサ部上に増強した光電場を生じさせ、該増強した光電場内において前記標識結合物質の標識を励起し、該標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、前記標識結合物質を前記センサ部上に、断片化された抗体を介して結合させることを特徴とするものである。
【００２４】
本発明の検出装置は、上記本発明の検出方法に用いる検出装置であって、誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面に設けられた金属層を含むセンサ部とを備え、該センサ部上に前記複数の断片化された抗体が結合されたセンサチップと、
前記センサ部に前記励起光を照射する励起光照射光学系と、
該励起光の照射により該センサ部上に生じた前記増強した光電場における、前記標識の励起に起因して生じる光を検出する光検出手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００２５】
本発明の検出用試料セルは、上記本発明の検出方法に用いられるものであって、液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の、前記注入口と前記空気孔との間に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の少なくとも一部として設けられた誘電体プレートと、該プレートの試料接触面に設けられた少なくとも金属層を含むセンサ部とからなるセンサチップ部とを備えてなり、前記センサ部の前記プレートの反対側の面が、複数の前記断片化された抗体が結合されたものであることを特徴とするものである。
【００２６】
さらに、前記センサ部において、前記金属層上に光導波層が備えられていてもよい。
【００２７】
また、本発明の検出用試料セルは、前記流路内の前記センサ部より上流側に固定された、光応答性物質が、該光応答性物質からの光を透過する誘電体により包含されてなる標識物質を、前記標識として含む前記標識結合物質を有することが好ましい。
【００２８】
本発明の試料セルにおいて、前記標識結合物質が、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質を含み、前記被検出物質を介して断片化された抗体と結合するものであれば、サンドイッチ法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００２９】
また、本発明の試料セルにおいて、前記標識結合物質は、前記断片化された抗体と特異的に結合する第３の結合物質を含み、前記被検出物質と競合して前記断片化された抗体と結合するものであれば、競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００３０】
本発明の検出用キットは、上記本発明の検出用試料セルと、前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に、前記流路内に流下される、光応答性物質を、該光応答性物質からの蛍光を透過する材料により包含してなる標識物質を、前記標識として含む前記標識結合物質を含んだ標識用溶液を備えてなることを特徴とするものである。
【００３１】
本発明は、近接場光を用いた電場増強蛍光分光法等のアッセイにおいて、増強電場の利用効率を低下させて検出感度や検出限界を制限している要因として、金属消光防止及び抗原捕捉のための抗体導入に起因する離間距離に着目し、金属消光防止機能を有し且つ光応答性物質を包含する物質及び断片化抗体を用いることにより、従来の構成に比して格段に光応答性物質を電場増強面に近接させることに成功したものである。
【００３２】
文献”A.Toby A. Jenkins et al. Surface Plasmon Fluorescence Measurements of Human Chorionic Gonadotrophin: Role of Antibody orientation in Obtaining Enhanced Sensitivity and Limit of Detection. Anal. Chem. 77, 2426 (2005).”には、表面プラズモン電場増強蛍光分光法によるサンドイッチアッセイにおいて、センシング面に抗原を補足するために用いる抗体にFab抗体を用いることにより、抗原決定基（エピトープ，抗原認識部位）の配向を制御し、補足できる抗原（ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)）及び標識抗体の量を増やし、検出限界の向上が可能になることが記載されている。
【００３３】
上記文献では、Ｙ字形状の通常の抗体の立体障害による固定部位のばらつきに起因する、補足抗原及び標識抗体の減少を抑制するために、直鎖状の断片化抗体Fabを用いて立体障害をなくして抗体の配向性を制御している。従って、表面プラズモン増強蛍光分析法において抗体として断片化抗体を用いることは公知である。しかしながら、文献の実施形態では、電場増強面からの距離を短縮しすぎると金属消光により信号を減衰させてしまうことから、蛍光物質を電場増強面に、より近づけようという思想は存在しない。
【００３４】
また、特開2001-108678号公報には、ラテックス免疫試薬として、ポリスチレンラテックス粒子に抗ＡＦＰ抗体としてF(ab’)2を固定化したものを用いることが記載されているが、F(ab’)2による粒子と抗原との距離の短縮については一切記載がない。
【００３５】
更に、断片化抗体を用いることだけでは、上記した本発明が解決しようとする課題を解決することはできるものではなく、金属消光防止機能を有する標識物質を合わせて用いることによりはじめて解決し得たものである。従って、本発明は上記文献より容易に発明し得たものではない。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の検出方法では、センサ部上に、試料に含有される被検出物質の量に応じて結合される標識結合物質の標識として、光応答性物質を、該光応答性物質からの光を透過する誘電体により包含してなる標識物質を用いている。かかる標識物質は、内部に光応答性物質を包含しているためセンシングに利用できる光応答性物質の量が多いためより強い光信号を得ることができる上、それ自身に金属消光防止機能を有しているため、標識物質をセンサ部の増強場発生面に可能な限り近づけることができる。
【００３７】
また、本発明の検出方法では、標識結合物質をセンサ部上に、断片化された抗体を介して結合させるので、標識と増強場発生面との距離が、通常の抗体を介して結合させる場合に比して短くなる。更に、断片化された抗体は立体障害が少なく、断片化によりジスルフィド結合及び／又はチオール基が露出された抗体の場合は、抗原決定基が検体側に配向しやすいので、抗体の固定化密度が高い上非特異吸着も少ない。
【００３８】
従って、本発明によれば、金属消光を効果的に防止し、かつ増強された電場を効率よく利用して、高感度に光信号を直接、あるいは間接的に検出することができる。
【００３９】
また、本発明の検出用試料セルあるいは検出用キットを用いれば、本発明の検出方法を容易に実施することができ、増強された光電場を有効に利用し、高感度に被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。  
「検出方法および装置」
本発明の検出方法は、エバネッセント光や近接場光を用いた増強光電場を利用した光検出法、例えば図１に示すように、誘電体プレート１１と、該プレート１１の一面に設けられた少なくとも金属層１２を含むセンサ部１４とを備えたセンサチップ１０を用い、センサ部１４に液体試料Ｓを接触させることにより、該センサ部１４上に、液体試料Ｓに含有される被検出物質Ａの量に応じた量の標識結合物質（蛍光標識結合物質）ＢＦを結合させ、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射することにより、センサ部１４上に増強した光電場Ｄを生じさせ、該増強した光電場Ｄ内において、標識結合物質ＢＦの標識（蛍光標識）Ｆを励起し、標識Ｆの励起に起因して生じる信号光Ｌｆの量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法であって、標識Ｆとして、光応答性物質（蛍光色素分子）ｆを、光応答性物質ｆからの光を透過する誘電体により包含してなる標識物質（蛍光物質）Ｆを用い、センサ部１４上に、複数の断片化された抗体Ｂ１を介して標識結合物質ＢＦを結合させることを特徴とするものである。
【００４１】
なお、センサ部１４に、標識結合物質ＢＦを結合させた後に、液体試料Ｓ中の、センサ部１４に結合せずに滞留あるいは非特異吸着している標識結合物質ＢＦをセンサ部１４上から除去し、その後、被検出物質Ａの量を検出することが望ましい。
【００４２】
以下に示す本発明に係る一実施形態の検出装置１〜５は、上記検出方法を実施するためのものであって、センサチップ１０を収容する収容部１３と、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射する励起光源２１を含む励起光照射光学系２０と、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１４上に生じた増強した光電場Ｄにおける、標識ｆの励起に起因して生じる信号光Ｌｆの量を検出する光検出手段３０とを備えている。
【００４３】
本発明の検出方法において、センサチップ１０のセンサ部１４と標識結合物質ＢＦとの間に介在させる断片化された抗体Ｂ１は、予めセンサチップ１０のセンサ部１４上に固定されたものを用いてもよいし、光検出の過程で、センサ部１４上に固定してもよい。以下に示す蛍光検出装置の態様では、断片化された抗体Ｂ１が予めセンサチップ１０のセンサ部１４上に固定された場合を例に示している。
【００４４】
本発明の検出方法は、励起光の照射によりセンサ部上に増強した光電場を生じさせ、その増強した光電場において標識が励起されることによって生じる光を検出するものであるが、光電場を増強させる方法は、表面プラズモン共鳴あるいは局在プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。また、標識から生じる光信号を直接検出してもよいし、間接的に検出してもよい。具体的な態様については、以下の各実施形態で説明する。以下に示す実施形態においては、標識として蛍光標識を用い、蛍光標識として、複数の蛍光色素分子を、複数の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光標識物質を用い、該蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質の量を検出する場合を例に説明するが、標識及び検出する光はこれに限られるものではない。例えば、光応答性物質として金属微粒子を用いる場合は、金属微粒子による励起光の散乱光の量に基づいて、被検出物質の量を検出すればよい。光信号は、その種類によらず増強された光電場によりその信号量は高められ、且つ、金属消光の問題を有している。従って、光応答性物質の種類や光信号の種類によらず、本発明の検出方法は適用される。
【００４５】
＜第１の実施形態＞
第１実施形態の検出方法および装置について図１を参照して説明する。図１は第１の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。
【００４６】
本実施形態の蛍光検出方法では、誘電体プレート１１およびその一面の所定領域に少なくとも金属層１２として金属膜が設けられ、金属層１２上に複数の断片化された抗体Ｂ１が固定されてなるセンサ部１４を備えたセンサチップ１０を用い、このセンサチップ１０上に液体試料Ｓを保持する試料保持部（収容部）１３が備えられ、センサチップ１０と液体試料を保持可能な収容部１３による箱状の試料セルを用いている。
【００４７】
図１に示される蛍光検出装置１は、センサチップ１０を収容する収容部１３と、収容部１３に収容されたセンサチップ１０の誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に直線偏光の励起光Ｌｏを全反射角以上の入射角度で、センサチップ１０の金属膜形成面とは反対の他面側から入射させる励起光照射光学系２０と、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１２上に生じた、増強した光電場Ｄにおける、蛍光標識Ｆの励起に起因して生じる信号光Ｌｆを検出する光検出手段３０とを備えている。
【００４８】
誘電体プレート１１の構成材料としては、励起光Ｌｏに対して透光性を有するものであれば特に制限なく、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ＨｆＯ２などの無機酸化膜、ポリスチレン、ＰＭＭＡなどの有機ポリマーが好ましい。本明細書において、透光性を有するとは、所定の波長の光を透過することと定義する。
【００４９】
金属膜１２は、所定領域に開口を有するマスクをプレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。なおここで、「主成分」は、含量９０質量％以上の成分と定義する。
【００５０】
図２は、センサ部１４の表面を拡大して示した図である。図示されるように、センサ部１４は、金属層１２上に、複数の断片化された抗体Ｂ１が固定されてなる。断片化された抗体Ｂ１は、上記したように、抗体分子の一部であり、被検出物質Ａと結合可能な抗原決定基Ｂａを少なくとも１つ有しているものである（図中のＢｂはＢａ以外のポリペプチド鎖）。図２はサンドイッチ法により蛍光標識結合物質ＢＦにより標識して被検出物質Ａの量を検出する構成の例を示している。
【００５１】
断片化された抗体（断片化抗体）Ｂ１としては、例えば、分析対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から生成された免疫グロブリン画分、又はその分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体の断片（Ｆａｂフラグメント，Ｆ（ａｂ’）２フラグメント，Ｆａｂ’フラグメント，Ｆｖ等）が挙げられる。
【００５２】
抗体は、Ｙ字型の４本鎖構造を基本構造としており、２つの重鎖と２つの軽鎖とからなる。この重鎖と軽鎖がジスルフィド結合で結びついてヘテロダイマーを形成し、更にこのヘテロダイマー同士が２つのジスルフィド結合を含むヒンジ部により結びついてＹ字型のヘテロテトラマーを形成している。Ｙ字型の上半分のＶ字部分をＦａｂ領域（Ｆａｂフラグメント）、下半分の直線部分をＦｃ領域（Ｆｃフラグメント）という。
【００５３】
これらの断片化抗体の調製は常法により行うことができる。例えば、タンパク質分解酵素により断片化することができる。タンパク質分解酵素により断片化され、該断片化によりジスルフィド結合及び／又はチオール基が露出された抗体であり、該抗体の少なくとも１つの末端に、前記蛍光標識結合物質と結合可能な抗原決定基Ｂａを有する抗体であることが好ましい。かかる抗体としては、Ｆａｂフラグメント（Ｉ字型），Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｖ字型），Ｆａｂ’フラグメント及びＦｖフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の抗体フラグメント等が挙げられる。ジスルフィド結合及び／又はチオール基が露出された抗体は、金膜等の金属膜とＳＡＭ等を介さずに直接結合させることができるため、より電場増強面と蛍光標識結合物質との距離を短くすることができ、好ましい。図１及び図２、また第２実施形態以降に示される図面上では、断片化抗体としてＶ字型のＦ（ａｂ’）２フラグメントを例に示してあるが、これに限られるものではない。
【００５４】
図３に断片化抗体の調製の例を模式的に示す。図中、簡略化のためＦａｂ領域の各鎖は１本で示してある。図示されるように、断片化抗体は、タンパク質分解酵素パパインで処理されることにより、２つのＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに分解され、またタンパク質分解酵素ペプシンで処理されることにより、２つのＦａｂフラグメントがジスルフィド結合により結合されたＦ（ａｂ’）２フラグメントと断片化されたＦｃフラグメントに分解される。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを更に２−メルカプトエチルアミン等の還元剤で処理することによりＦａｂフラグメントに分解される。
【００５５】
これら以外にも、抗体フラグメントを作製する酵素としては、フィシン，リシルエンドペプチターゼ，Ｖ８プロテアーゼ，ブロメライン，クロストリパイン，メタロエンドペプチターゼ，パパインを活性化処理した活性化パパイン等がある。  
上記した酵素を用いた断片化以外にも、化学処理や遺伝子工学的手法による断片化も採用することができる。
【００５６】
Ｙ字型の完全な抗体分子のＦｃ領域の末端部分の疎水性部分は、他の末端部分に比べれば金属膜上に結合されやすいが、Ｙ字型の立体障害等によりＹ字型が横倒しになって結合されたり、逆に抗原決定基が金属膜表面に結合されることがよくある。これに比して断片化された抗体は、Ｙ字型の完全な抗体分子に比して立体障害が少なく、また断片化によりジスルフィド結合及び／又はチオール基が露出された抗体は、露出されたＳ原子が金属と結合しやすいため、抗原決定基が検体側に配向しやすいので、抗体の固定化密度が高くなり、更に非特異吸着も少なくなる。
【００５７】
蛍光標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａの量に応じた量だけセンサ部１４上に結合する蛍光標識された結合物質であり、図１，図２で示すように、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質Ａと特異的に結合する結合物質Ｂ２と上述の蛍光物質Ｆとから構成されるものであり、後記する競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質Ａと競合する結合物質と蛍光物質Ｆとから構成されるものである。より具体的には、センサチップ１０として、センサ部１４に被検出物質Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ１（断片化された抗体）が固定層として固定されたものを用いた場合、サンドイッチ法では、蛍光標識結合物質ＢＦとして、被検出物質Ａと特異的に結合する第２の結合物質Ｂ２と、この結合物質Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆとからなるものを用い、競合法では、蛍光標識結合物質として、被検出物質Ａと競合して第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質と、この結合物質が修飾された蛍光物質Ｆとからなるものを用いる。被検出物質Ａが抗原である場合、第１の結合物質Ｂ１として所謂１次抗体を用い、蛍光標識結合物質として所謂標識２次抗体を用いればよい。
【００５８】
第２の結合物質Ｂ２は、通常の完全な抗体分子であってもよいが、上記した１次抗体と同様に断片化された抗体を用いる方が、より結合距離が短くなり好ましい。
【００５９】
上記したように、蛍光標識Ｆは、複数の蛍光色素分子ｆを、該複数の蛍光色素分子ｆからエバネッセント光（光電場Ｄ）により励起される蛍光Ｌｆを透過する誘電体１６により包含してなる蛍光物質である。
【００６０】
蛍光標識Ｆの粒径は特に制限ないが、蛍光量およびセンサ部上への最密充填密度の観点および、表面プラズモンの擾乱の観点から７０ｎｍ〜９００ｎｍのものがさらに好ましく、１３０ｎｍ〜５００ｎｍのものが特に好ましい。本明細書において、蛍光標識Ｆの粒径は、略球状の粒子の場合にはその直径であり、球状でない粒子の場合にはその最大幅と最小幅との平均の長さで定義するものとする。
【００６１】
誘電体１６としては、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ、励起光のエバネッセント光（光電場Ｄ）及び蛍光Ｌｆを透過可能なものであれば特に制限なく、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられる。
【００６２】
蛍光色素分子ｆとしては、特に制限なく、有機系色素及び量子ドット等の無機系色素も含まれる。バイオ測定の用途では自家蛍光（吸収）を生じるサンプルを対象とすることから、長波長域において蛍光を発する蛍光色素を用いることが好ましい。赤外励起可能な蛍光色素としては、林原生物化学研究所  ＮＫ−５２９(励起波長〜６４０ｎｍ)、ＮＫ−１８３６(励起波長〜６５０ｎｍ)、ＮＫ−２０１４(励起波長〜７８０ｎｍ)、Dyomics社製  ＤＹ−７８５−Ｌ (励起波長〜７６０ｎｍ)、ＤＹ−７８５−Ｌ (励起波長〜７７０ｎｍ)、等が挙げられる。
【００６３】
蛍光標識（蛍光物質）Ｆは、所望の波長で励起可能な複数の蛍光色素分子ｆを、この蛍光色素分子ｆからエバネッセント光（光電場Ｄ）により励起される蛍光Ｌｆを透過する誘電体１６により包含してなる蛍光物質であれば特に制限されない。
【００６４】
例えば、蛍光標識（蛍光物質）Ｆは、以下のようにして作製することができる。  
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１―０５０）を調液して０．１％ｓｏｌｉｄ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。  
次に、蛍光色素分子(林原生物化学研究所  ＮＫ−２０１４(励起  〜７８０ｎｍ))０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。  
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。以上の工程により、ポリスチレンにより蛍光色素を内包してなる蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された蛍光物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００６５】
また、例えば、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製蛍光ビーズ(品番ＦＣ０３Ｆ／８６３２、直径５１０ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６９０ｎｍ)、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製蛍光ビーズ（品番Ｆ８８０７、直径２００ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６８０ｎｍ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製蛍光ビーズ（品番Ｆ８８１６、直径１０００ｎｍ、励起波長６２５ｎｍ、蛍光波長６４５ｎｍ、）等の市販の蛍光ビーズを使用することもできる。
【００６６】
蛍光色素分子が金属層に接近しすぎた場合に生じる消光は、金属へのエネルギー移動に伴うものであり、このエネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、金属層１２と蛍光色素分子ｆとの間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。  
「背景技術」の項目において述べたように、従来金属消光を防止する方法としては、蛍光色素と金属層が露出した増強場発生面とを金属消光を生じない程度離間させるか、金属層上に金属酸化物層やポリマー層等の誘電体層や、カルボキシメチルデキストラン(ＣＭＤ)膜等の３次元膜を設けることにより、蛍光色素と金属膜とを離間させる方法がなされてきたが、金属膜上にこれらの金属消光を防止するための処理を施すのは、センサチップ作製工程を複雑なものとし、非常に手間がかかる。一方、蛍光物質Ｆを用いれば、金属層１２と所定以上の距離を保つことができるため、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止することができる。
【００６７】
本実施形態では、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して入射させる。励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる励起光源２１と、励起光Ｌｏを直線偏光（ｐ偏光）とする偏光調整素子２３と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射するように誘電体プレート１１内に励起光Ｌｏを導光するものである。
【００６８】
偏光調整素子２３は、ｐ偏光のみを取り出す偏光子である。励起光源２１の偏光が主にp偏光である場合には偏光調整阻止２３は必ずしも配置しなくてよい。プリズム２２の構成材料としては特に制限なく、ガラスやポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等が好ましい。  
なお、本実施形態ではプリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。励起光源２１は、プリズム２２の他の一面からセンサチップ１０の試料接触面１０ａで励起光Ｌｏが全反射角以上で、かつ金属膜１２で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間には必要に応じて導光部材を配置してもよい。また、プリズム２２と誘電体プレート１１とが一体的に形成されていてもよい。
【００６９】
収容部１３は、センサチップ１０を収容する際に、センサチップのセンサ部１４がプリズム２２上に配置され、光検出手段３０で蛍光が検出できるよう構成されている。収容部１３の構成材料としては、励起光Ｌｏ及び信号光（蛍光）Ｌｆに対して透光性を有するものであれば特に制限されず、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ＨｆＯ２などの無機酸化膜、ポリスチレン、ＰＭＭＡなどの有機ポリマーが挙げられる。収容部１３中のセル（センサチップ１０）は交換可能である。
【００７０】
蛍光（信号光）Ｌｆは、収容部１３のプリズム２２と反対側の面側（図示上方）から、光検出手段３０により検出する。光検出手段３０としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等の光検出器を適宜用いることができ、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができる。
【００７１】
以下に、蛍光検出装置１を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。  
ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被測定物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。
【００７２】
センサチップ１０として、センサチップ１０の金属膜１２上に、抗原Ａと特異的に結合する１次抗体として断片化抗体Ｂ１（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）が固定層として修飾されているものを用意する。  
まず、収容部１３中に検査対象である液体試料Ｓを流し、センサチップ１０の金属膜１２上に試料Ｓを接触させる。次いで同様に抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２と誘電体１６中に複数の蛍光色素分子ｆを内包する蛍光標識Ｆとからなる蛍光標識結合物質（標識２次抗体）ＢＦを含む溶液を流す。この場合、金属膜１２に表面修飾される断片化１次抗体Ｂ１と蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２として、被検出物質である抗原Ａに対して互いに別の部位に結合するものを用いる。
【００７３】
試料Ｓ中に抗原Ａが存在すれば、断片化１次抗体Ｂ１に抗原Ａが特異的に結合し、さらに抗原Ａに蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２が結合して、断片化１次抗体Ｂ１−抗原Ａ−２次抗体Ｂ２結合体（以下、サンドイッチ結合体という。）が形成される。
【００７４】
その後、サンドイッチ結合体と、未反応の蛍光標識結合物質ＢＦを分離するため、残りの液体試料Ｓあるいは別に流した緩衝液により未反応の蛍光標識結合物質を排除する。
【００７５】
被検出物質（抗原Ａ）への標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を断片化１次抗体Ｂ１に結合させる前に、予め試料に蛍光標識Ｆを添加しておいてもよい。
【００７６】
その後、センサチップ１０の誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。励起光Ｌｏの入射により金属層１２上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この表面プラズモンにより増強され、金属層上に光電場増強領域Ｄが形成される。電場増強領域Ｄ、特に金属膜１２表面近傍においては、蛍光標識Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。表面プラズモンによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。
【００７７】
光検出手段３０によりこの蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【００７８】
また、センサ部１４上にサンドイッチ結合物を形成させ、サンドイッチ結合物と、未反応の蛍光標識結合物質ＢＦとを分離する工程は、センサチップ１０を検出装置１の収容部１３にセットする前に行ってもよいし、セット後に行ってもよい。
【００７９】
上記した本発明の検出方法では、センサ部１４上に、試料Ｓに含有される被検出物質Ａの量に応じて結合される蛍光標識結合物質ＢＦの蛍光標識として、複数の蛍光色素分子ｆを、蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する誘電体１６により包含してなる蛍光物質Ｆを用いている。蛍光物質Ｆは、内部に複数の蛍光色素分子ｆを包含しているためセンシングに利用できる蛍光色素分子の数が多いためより強い蛍光を得ることができる上、それ自身に金属消光防止機能を有しているため、蛍光物質Ｆをセンサ部１４の増強場発生面（金属層１２の表面）に可能な限り近づけることができる。
【００８０】
また、本発明の検出方法では、蛍光標識結合物質ＢＦをセンサ部１４上に、断片化された抗体Ｂ１を介して結合させるので、蛍光標識Ｆと増強場発生面（金属層１２の表面）との距離が、通常の抗体（断片化されていない完全な抗体分子）を介して結合させる場合に比して短くなる。更に、断片化された抗体は立体障害が少なく、また断片化によりジスルフィド結合及び／又はチオール基が露出された抗体の場合は、抗原決定基が検体側に配向しやすいので、抗体の固定化密度が高い上非特異吸着も少ない。
【００８１】
従って、本発明によれば、金属消光を効果的に防止し、かつ増強された電場を効率よく利用して、高感度に蛍光を直接、あるいは間接的に検出することができる。
【００８２】
＜第１の実施形態の設計変更例＞
上述の各実施形態においては励起光Ｌｏとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、図４に模式的に示すような、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズム１２２とプリズム上の金属膜１１２との界面に対して、角度θ―Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、金属膜１１２に表面プラズモンを励起することができる。金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の媒質の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する。上述の実施形態のように平行光を励起光として用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、図４に示すような、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
【００８３】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態である検出方法および装置について図５を参照して説明する。図５は第２の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、局在プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。なお、以下においては、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
【００８４】
図５に示す蛍光検出装置２は、用いられるセンサチップ１０’と、励起光照射光学系２０’とが上述の第１の実施形態の蛍光検出装置１とは異なる。
【００８５】
センサチップ１０’は誘電体プレート１１上に設けられる金属層１２’として、励起光の照射を受けて、所謂局在プラズモンを生じる、表面に励起光Ｌｏの波長よりも小さい凹凸構造を有する金属微細構造体、あるいは、励起光Ｌｏの波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドを備えている。このような局在プラズモンを生じさせる金属層１２’を備えた場合には、励起光を金属層１２’と誘電体プレート１１との界面に全反射するように入射させる必要はなく、ここでは、励起光照射光学系２０’は、誘電体プレート１１上方から励起光Ｌｏを照射するよう構成されている。
【００８６】
励起光照射光学系２０’は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、励起光Ｌｏを直線偏光（ｐ偏光）とする偏光調整素子２３と、励起光Ｌｏを反射してセンサチップ１０’へ導光するハーフミラー２３とを備えている。ハーフミラー２３は、励起光Ｌｏを反射し、蛍光Ｌｆを透過するものである。
【００８７】
センサチップ１０’の具体例を図６Ａ〜図６Ｃに斜視図で示し説明する。  
図６Ａに示すセンサチップ１０Ａは、誘電体プレート１１と、該プレート１１の所定領域上にアレイ状に固着された複数の金属粒子７３ａからなる金属微細構造体７３で構成されている。金属粒子７３ａの配列パターンは適宜設計できるが、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属粒子７３ａの平均的な径及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
【００８８】
図６Ｂに示すセンサチップ１０Ｂは、誘電体プレート１１と、該プレートの上の所定領域に設けられた、金属細線７４ａが格子状にパターン形成された金属パターン層からなる金属微細構造体７４で構成されている。金属パターン層のパターンは適宜設計でき、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属細線７４ａの平均的な線幅及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
【００８９】
図６Ｃに示すセンサチップ１０Ｃは特開２００７−１７１００３号公報に記載のような、Ａｌなどの金属７６の陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に成長させた複数のマッシュルーム状の金属７５ａからなる金属微細構造体７５により構成されている。ここでは金属酸化物体７７が誘電体プレートに相当する。この金属微細構造体７５は、金属体（Ａｌ等）の一部を陽極酸化して金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３等）とし、陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に各々金属７５ａをメッキ等により成長させて得ることができる。  
図６Ｃに示す例では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が粒子状であり、サンプルプレート表面から見れば、金属微粒子が配列されたような構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が凸部であり、その平均的な径およびピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
【００９０】
なお、励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じる金属層１２’としては、その他、特開２００６−３２２０６７号公報、特開２００６-２５０９２４号公報などに記載の金属体を陽極酸化して得られる微細構造体を利用した種々の形態の金属微細構造体を用いることができる。
【００９１】
さらには、局在プラズモンを生じさせる金属層は、表面が粗面化された金属膜により構成されていてもよい。粗面化方法としては、酸化還元等を利用した電気化学的な方法等が挙げられる。また、金属層を、サンプルプレート上に配置された複数の金属ナノロッドにより構成してもよい。金属ナノロッドのサイズは、短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さを励起光の波長よりも小さいサイズとする。金属ナノロッドについては、例えば特開２００７-１３９６１２号公報に記載されている。
【００９２】
なお、金属層１２’として用いられる、金属微細構造体あるいは金属ナノロッドとしては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００９３】
本実施形態では、金属層１２’の表面に、第1実施形態と同様に断片化１次抗体Ｂ１が直接結合されている。本実施形態において、センサチップ１０’の各構成要素の好ましい材料は第１実施形態と同様であり、金属層１２’以外の構成要素については好ましい層厚等も第１実施形態と同様である。
【００９４】
蛍光検出装置２を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。  
センサチップを用意し、抗原―抗体反応をさせる工程は、第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。以下の実施形態において同様とする。  
センサチップ１０’を収容部１３にセットした状態で、センサチップ１０’の誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０‘により励起光Ｌｏを照射する。光源２１から出射された励起光Ｌｏはハーフミラー２３により反射されてセンサチップ１０’の試料接触面上に入射される。この励起光Ｌｏの照射により、金属層１２’の表面で局在プラズモンが励起される。励起光Ｌｏの入射により金属層１２’上に生じている光電場（近接場光に起因する電場）が、この局在プラズモンにより増強され、金属層上に光電場増強領域Ｄが形成される。電場増強領域Ｄ、特に金属膜１２’表面近傍においては、蛍光標識Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。このとき、局在プラズモンによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光検出手段３０によって、この蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【００９５】
本実施形態においても、第１実施形態と同様に、複数の蛍光色素分子ｆを、蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質Ｆを用い、蛍光標識結合物質ＢＦをセンサ部１４上に、断片化された抗体Ｂ１を介して結合させるので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００９６】
＜第３の実施形態＞
第３の実施形態の検出方法および装置について図７を参照して説明する。図７は第３の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する放射光検出方法および装置である。
【００９７】
図７に示す放射光検出装置３は、第１の実施形態の蛍光検出装置と光検出器の配置が異なる。本放射光検出装置３においては、光検出手段３０が、増強された電場において励起された蛍光が、金属層１２に新たに表面プラズモンを誘起することによって誘電体プレート１１の金属層形成面と反対の面側（図示下方側）から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光Ｌｐを検出するように配置されている。
【００９８】
放射光検出装置３を用いた本実施形態の放射光検出方法について説明する。  
センサチップ１０を収容部１３にセットした状態で、第１実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。励起光Ｌｏの入射により金属層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この表面プラズモンにより増強され、金属層上に光電場増強領域Ｄが形成される。電場増強領域Ｄ、特に金属膜１２表面近傍においては、蛍光標識Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。本実施形態では、金属膜１２上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側から特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出手段３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識結合物質ＢＦと結合した被検出物質Ａの有無および／または量を検出することができる。
【００９９】
放射光Ｌｐは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常励起光Ｌｏの波長と蛍光の波長とは異なることから、蛍光により励起される表面プラズモンは、励起光Ｌｏにより生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射光Ｌｐは放射される。
【０１００】
本実施形態においても、第１実施形態と同様に、複数の蛍光色素分子ｆを、蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質Ｆを用い、蛍光標識結合物質ＢＦをセンサ部１４上に、断片化された抗体Ｂ１を介して結合させるので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１０１】
さらに、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができる。したがって、例えば血液における光吸収をほぼ無視することができ、血液を遠心分離し赤血球などの着色成分を除去したり、血球フィルタを通して血清あるいは血漿状態にしたりするという前処理を行うことなく測定が可能となる。
【０１０２】
＜第４の実施形態＞
第４の実施形態の検出方法および装置について図８を参照して説明する。図８は第４の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。
【０１０３】
図８に示す蛍光検出装置５の構成は、第１の実施形態の蛍光検出装置の構成と同じであるが、用いられるセンサチップが異なり、このセンサチップの違いにより、光電場増強のメカニズムが異なる。
【０１０４】
センサチップ１０”は金属層１２ａ上に光導波層１２ｂを備えている。光導波層１２ｂの層厚は、特に制限されることはなく、光導波モードが誘起されるように、励起光Ｌｏの波長、入射角度および光導波層１２ｂの屈折率等を考慮して定めることができる。例えば、上記と同様に励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、光導波層１２ｂとして１層のシリコン酸化膜からなるものを用いる場合には、５００〜６００ｎｍ程度が好ましい。なお、光導波層１２ｂは、１層以上の誘電体等の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造であってもよく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。
【０１０５】
センサチップ１０”において、光導波層１２ｂの最表面が金属層である場合は、第１実施形態と同様に、蛍光色素分子ｆが直接光導波層１２ｂ表面に近づくと金属消光を生じる。従って、光導波層１２ｂの最表面に、第1実施形態と同様に断片化１次抗体Ｂ１が直接結合させ、蛍光標識として複数の蛍光色素分子ｆを、該複数の蛍光色素分子ｆからエバネッセント光（光電場Ｄ）により励起される蛍光Ｌｆを透過する誘電体１６により包含してなる蛍光物質Ｆを用いることにより、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。本実施形態において、センサチップ１０”の各構成要素の好ましい材料は第１実施形態と同様であり、金属層１２’以外の構成要素については好ましい層厚等も第１実施形態と同様である。
【０１０６】
蛍光検出装置５を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
【０１０７】
センサチップ１０”を収容部１３にセットした状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起される。励起光の入射により光導波層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この光導波モードにより増強され、光導波層上に光電場増強領域Ｄが形成される。電場増強領域Ｄ、特に金属膜１２表面近傍においては、蛍光標識Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。このとき、光導波モードによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光検出手段３０によって、この蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【０１０８】
本実施形態においても、第１実施形態と同様に、複数の蛍光色素分子ｆを、蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質Ｆを用い、蛍光標識結合物質ＢＦをセンサ部１４上に、断片化された抗体Ｂ１を介して結合させるので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１０９】
さらに、光導波モードの励起により生じる光増強電場分布は、表面プラズモンにより生じる光増強電場分布と比較して表面からの距離に伴う電場減衰の程度が緩やかであることから、蛍光標識として、複数の蛍光色素分子を内包する径の大きな蛍光物質を用いた場合、表面プラズモンによる光電場増強を用いるよりも大きな蛍光量増加効果を得ることができる。
【０１１０】
＜第５の実施形態＞
第５の実施形態の検出方法および装置について図９を参照して説明する。図９は第５の実施形態の検出装置の概略構成示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する放射光検出方法および装置である。
【０１１１】
図９に示す本実施形態の放射光検出装置６は、第３の実施形態の放射光検出装置と同様の構成であり、本実施形態の検出方法において用いられるセンサチップは第４の実施形態の蛍光検出方法で用いられるセンサチップと同様である。
【０１１２】
放射光検出装置６を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
【０１１３】
センサチップ１０”を収容部１３にセットした状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起される。励起光の入射により光導波層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この光導波モードにより増強され、光導波層上に光電場増強領域Ｄが形成される。電場増強領域Ｄ、特に金属膜１２表面近傍においては、蛍光標識Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。このとき、光導波モードによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光導波層１２ｂ上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側から特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出手段３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識Ｆが標識された被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【０１１４】
本実施形態においても、第１実施形態と同様に、複数の蛍光色素分子ｆを、蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質Ｆを用い、蛍光標識結合物質ＢＦをセンサ部１４上に、断片化された抗体Ｂ１を介して結合させるので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１１５】
また、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができ、第３の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１１６】
さらに、光導波モードの励起による電場増強を用いていることから、第４の実施形態と同様に蛍光量増加効果を得ることができる。
【０１１７】
第４及び第５実施形態のセンサチップ１０”において、光導波層１２ｂの最表面が誘電体層である場合は、断片化抗体がＢ１を直接光導波層１２ｂの表面に結合させることができない。従って、この場合は、光導波層１２ｂの最表面に、自己組織化膜（ＳＡＭ）を形成するなどの表面処理を施してから断片化１次抗体Ｂ１を結合させる必要がある。
【０１１８】
また、この場合、蛍光色素分子ｆがセンサチップ表面に近づいても金属消光は生じにくい。最上層の誘電体層の層厚が充分に厚く、蛍光色素分子ｆからの蛍光信号にそれほど影響を及ぼさない場合は、上記蛍光物質Ｆを用いずに、蛍光標識として複数の蛍光色素分子（光応答性物質）ｆを用いてもよい。しかしながら、蛍光色素分子ｆを、該複数の蛍光色素分子ｆからエバネッセント光（光電場Ｄ）により励起される蛍光Ｌｆを透過する誘電体１６により包含してなる蛍光物質Ｆを用いれば、内部に複数の蛍光色素分子ｆを包含しているためセンシングに利用できる蛍光色素分子の数が多く、より強い蛍光を得ることができる。
【０１１９】
なお、上記した第１〜第５実施形態においては、蛍光標識として、図１０に示すように、さらに、誘電体１６の表面に蛍光を透過する厚みの金属皮膜１９が設けられたものを（Ｆ’）用いてもよい。金属被膜１９は、誘電体１６の全表面を覆うものであってもよいし、全表面を覆うものでなく、一部表面が露出するように設けられたものであってもよい。金属被膜１９の材料としては、上述の金属層と同様の金属材料を用いることができる。
【０１２０】
蛍光物質の表面に金属被膜１９を備えた場合、センサチップ１０、１０’の金属層１２、１２’に発生した表面プラズモンあるいは局在プラズモンが蛍光物質Ｆ’の金属被膜１９のウィスパリング・ギャラリー・モードにカップリングし、蛍光物質Ｆ’内の蛍光色素分子ｆをさらに高効率に励起できる。なお、ウィスパリング・ギャラリー・モードとは、ここで用いられるφ５３００ｎｍ以下程度の蛍光物質のような微小球の球表面に局在し、周回する電磁波モードである。
【０１２１】
蛍光物質への金属被膜方法の一例を挙げる。  
まず、前述手順により消光防止性蛍光物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（エポミン、日本触媒社）を修飾する。  
次に、粒子表面のＰＥＩに粒径１５ｎｍのＰｄナノ粒子(平均粒径１９ｎｍ、徳力本社)を吸着させる。  
Ｐｄナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(ＨＡｕＣｌ４、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Ｐｄナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
【０１２２】
「検出用試料セル」
本発明の検出方法のセンサチップとして使用される検出用試料セルについて説明する。
【０１２３】
＜第１の実施形態の試料セル＞
図１１（Ａ）は、サンドイッチ法によるアッセイに適した第１の実施形態の試料セル５０の構成を示す平面図、図１１（Ｂ）は試料セル５０Ａの側断面図である。  
検出用試料セル５０Ａは、誘電体プレートからなる基台５１と、該基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した試料を排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とから構成され、流路５２の注入口５４ａと空気孔５４ｂとの間の試料接触面となる基台５１の所定領域上に設けられた金属層５８ａからなるセンサ部５８が備えられている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。
【０１２４】
本実施形態の試料セル５０Ａにおいては、基台５１上に流路５２上流側から、被検出物質である抗原と特異的に結合する２次抗体（第２の結合物質）Ｂ２と該２次抗体Ｂ２が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる蛍光標識結合物質ＢＦ（以下、「標識２次抗体ＢＦ」という。）が物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７、被検出物質である抗原と特異的に結合する１次抗体（断片化抗体）Ｂ１が固定された測定エリア５８が設けられている。この測定エリア５８がセンサ部に相当する。本例では、センサ部に１つの測定エリアを設けた例を挙げているが、測定エリアは２つ以上設けてもよい。
【０１２５】
基台５１上の測定エリア５８にはそれぞれ金属層として、金（Ａｕ）膜５８ａが形成されている。測定エリア５８のＡｕ膜５８ａ上にはさらに断片化１次抗体Ｂ１が固定されている。
【０１２６】
試料セル５０Ａは、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法においてもセンサチップに代えて同様に使用することができる。
【０１２７】
試料セル５０において、測定エリアをもう１つ設け、収容部１９において励起光照射光学系２０および検出器３０に相対的にＸ方向に移動可能として、測定エリア５８からの蛍光もしくは放射光の検出測定の後に検出位置に移動させて第２の測定エリアからの蛍光もしくは放射光の検出を行うように構成し、変動要因の較正等を行ってもよい。
【０１２８】
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用試料セル５０Ａを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１２を参照して説明する。
【０１２９】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓo中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図１２中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。  
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。  
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１２中において血漿Ｓは斜線領域で示している。  
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと標識２次抗体ＢＦとが混ぜ合わされ、血漿中の抗原Ａが標識２次抗体ＢＦの２次抗体Ｂ２と結合する。  
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、２次抗体Ｂ2と結合した抗原Ａが、測定エリア５８上に固定されている断片化１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが断片化１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２（標識２次抗体ＢＦ）で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。  
このように、血液を注入口から注入し、測定エリア５８上に抗原Ａが断片化１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢFで挟まれたサンドイッチが形成されるまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ５の後、測定エリア５８からの蛍光もしくは放射光強度（以下、「信号」という。）を検出する。
【０１３０】
本実施形態においては、基台５１が誘電体プレートから構成され、センサ部の誘電体プレートを兼ねているが、基台としては、センサ部が構成される部分のみ誘電体プレートで構成されたものを用いてもよい。
【０１３１】
試料セル５０Ａは、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法において使用することができる。
【０１３２】
＜第２実施形態の試料セル＞
図１３は、競合法によるアッセイに適した第２の実施形態の試料セルの側断面を示すものである。本実施形態の試料セル５０Ｂにおいては、基台５１上には流路５２上流側から、被検出物質である抗原Ａとは結合せず、後述の断片化１次抗体と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）と該２次抗体Ｃ３が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる蛍光標識結合物質ＣＦ（以下、「標識２次抗体ＣＦ」という。）を物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７’、被検出物質である抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３と特異的に結合する断片化１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）が固定された測定エリア５８’が設けられている。
【０１３３】
基台５１上の測定エリア５８’にはそれぞれ金属層として、金（Ａｕ）膜５８ａが形成されている。測定エリア５８’のＡｕ膜５８ａ上にさらに断片化１次抗体Ｃ１が固定されている。
【０１３４】
抗原Ａと２次抗体Ｃ３とは、測定エリア５８’に固定されている断片化１次抗体Ｃ１に競合的に結合するものである。
【０１３５】
試料セル５０Ｂは、既述の試料セル５０Ａと同様に、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法においてセンサチップに代えて同様に使用することができる。
【０１３６】
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用試料セル５０Ｂを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１４を参照して説明する。
【０１３７】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図１４中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。  
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。  
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１４中において血漿Ｓは斜線領域で示している。  
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと標識２次抗体ＣＦとが混ぜ合わされる。  
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、抗原Ａと標識２次抗体ＣＦの２次抗体Ｃ3とが競合して、測定エリア５８’上に固定されている断片化１次抗体Ｃ１と結合する。  
このように、血液を注入口から注入し、測定エリア５８’上の断片化１次抗体Ｃ１に抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３が競合結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ５の後、測定エリア５８’からの蛍光もしくは放射光強度などの信号を検出する。
【０１３８】
競合法においては、被検出物質Ａの濃度が高ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が少なく、すなわち金属層上の蛍光物質Ｆの数が少なくなるため蛍光強度が小さくなり、一方、被検出物質Ａの濃度が低ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が多く、すなわち金属膜上の蛍光物質Ｆの数が多くなるため蛍光強度が大きくなる。競合法は被検出物質にエピトープが一つあれば測定が可能であることから、低分子量の物質の検出に適している。
【０１３９】
（試料セルの設計変更例）
光導波モードによる光電場増強を利用する検出方法および装置に用いる試料セルの断面図を図１５に示す。図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）に示した第１の実施形態の試料セルの構成と略同一であるが、センサ部の金属層５８ａ上にさらに光導波層５８ｂを備えている。  
この試料セルも適宜、センサ部に第１の結合物質を、センサ部上流側に蛍光標識結合物質を固定し使用することができる。
【０１４０】
「検出用キット」
本発明の検出方法に使用される検出用キットについて説明する。
【０１４１】
図１６は蛍光検出用キット６０の構成を示す模式図である。
【０１４２】
検出用キット６０は、試料セル６１と、蛍光検出測定を行うにあたり、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、試料セル６１の流路内に流下される、抗原Ａと特異的に結合する２次抗体（第２の結合物質）Ｂ２と、該２次抗体Ｂ２が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる蛍光標識結合物質ＢＦ（以下、「標識２次抗体ＢＦ」という。）を含む標識用溶液６３とを備えている。
【０１４３】
試料セル６１は、試料セル内に、蛍光標識結合物質ＢＦを物理吸着した物理吸着エリアを備えていない点でのみ上述の第２の実施形態の試料セル５０Ａと異なり、その他は試料セル５０Ａと略同一の構成である。
【０１４４】
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用キット６０を用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１７を参照して説明する。
【０１４５】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓo中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。図１７中において全血Ｓoは網掛け領域で示している。  
ｓｔｅｐ２：全血Ｓoはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液（血漿）Ｓが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１７中において血漿Ｓは斜線領域で示している。  
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、血漿Ｓ中の抗原Ａが、測定エリア５８上に固定されている断片化１次抗体Ｂ１と結合する。  
ｓｔｅｐ４：標識２次抗体ＢＦを含む標識用溶液６３を供給口５４ａから注入する。  
ｓｔｅｐ５：標識２次抗体ＢＦが毛細管現象により流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。  
ｓｔｅｐ６：標識２次抗体ＢＦは徐々に下流側に流れ、該標識２次抗体ＢＦの２次抗体Ｂ２が抗原Ａと結合し、抗原Ａが断片化１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【０１４６】
このように、血液を注入口から注入し、抗原が断片化１次抗体および２次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、測定エリア５８からの信号を検出する。
【０１４７】
蛍光物質への２次抗体の修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。  
前述の手順で作製した蛍光物質溶液（蛍光物質の直径５００ｎｍ、励起波長５０２ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファーおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
【０１４８】
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。  
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。  
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により、表面修飾された蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、表面修飾された蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
【０１４９】
（検査用キットの設計変更例）
光導波モードによる光電場増強を利用する検出方法および装置に用いる試料セルとしては、図１５に示す、センサ部の金属層５８ａ上にさらに光導波層５８ｂを備え、試料セルの光導波層５８ｂ上に、それぞれ断片化１次抗体Ｂ１を固定したものを用いればよい。
【０１５０】
また、さらに、競合法によるアッセイを行う場合には、試料セルとして、断片化１次抗体Ｂ１、断片化１次抗体Ｂ２に代えて、被検出物質である抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３と特異的に結合する断片化１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）をセンサ部上に固定したものを用い、標識用溶液として、被検出物質である抗原Ａとは結合せず、後述の断片化１次抗体と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）と該２次抗体Ｃ３が表面修飾された蛍光物質とからなる蛍光標識結合物質ＣＦを含むものを用いればよい。
【０１５１】
上記実施形態の検出用試料セルあるいは検出用キットを用いれば、上記本発明の検出方法を容易に実施することができ、増強された光電場を有効に利用し、高感度に被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することができる。
【実施例】
【０１５２】
本発明に係る実施例について説明する。  
（実施例１）
図１に示される検出装置と同様の構成の検出装置において、表面に膜厚５０ｎｍの金膜を備えたＰＭＭＡプリズムを用い、試料溶液の溶媒として水を用いた場合を仮定し、蛍光標識として直径３１０ｎｍの蛍光ビーズを用い、波長６５６ｎｍのレーザを入射角７２．５°の条件で入射させた時の電場増強効果の増強場発生面（金属面）からの離間距離依存性をシミュレーションにより求めた。センサ上に固定する1次抗体及び蛍光標識に固定する２次抗体は、エピトープが互いに異なる１次抗体用F(ab’)2及び２次抗体用F(ab’)2とした。１次抗体はセンサ上にＡｕ−Ｓ結合により直接固定されているものとして計算した。
【０１５３】
（実施例２）
金膜表面にＳＡＭ（膜厚０．２ｎｍ）を介して１次抗体用F(ab’)2を固定した以外は実施例１と同様にして電場増強効果の増強場発生面（金属面）からの離間距離依存性をシミュレーションした。
【０１５４】
（比較例１）
１次抗体として断片化する前の1次抗体（抗ｈＣＧモノクロナール抗体）を用いた以外は実施例２と同様にして電場増強効果の増強場発生面（金属面）からの離間距離依存性をシミュレーションした。
【０１５５】
（比較例２）
蛍光標識に固定する２次抗体として断片化する前の２次抗体を用いた以外は比較例１と同様にして電場増強効果の増強場発生面（金属面）からの離間距離依存性をシミュレーションした。
【０１５６】
（結果及び考察）
図１８に、シミュレーション結果を示す。金膜と蛍光物質（蛍光ビーズ）下端間の距離と金膜表面に蛍光ビーズを直接置いて得られる蛍光強度に対する強度比を示す。金膜と蛍光物質（蛍光ビーズ）下端間の距離は、金膜表面に固定化されたそれぞれの１次抗体，蛍光標識に固定化された２次抗体，及びＳＡＭの長さから見積もった値とした。
【０１５７】
図１８に示されるように、金膜からの距離が約１０ｎｍの場合は、電場増強面の蛍光信号量の約９０％程度が得られている。一方、1次抗体に断片化抗体を利用しない比較例では、信号強度が２５％以上減衰している。
【０１５８】
また、図１９は、1次抗体にも２次抗体にも通常の断片化されていない抗体を用いた比較例２で得られた蛍光信号量に対する実施例及び比較例１の蛍光信号量比を示したものである。  
図１９において、２次抗体のみ断片化された抗体を用いた比較例１では、1次抗体，２次抗体共に通常の抗体を用いた比較例２に比して２割程度蛍光信号量が増強されており、２次抗体に断片化された抗体を用いることによる効果が確認された。
【０１５９】
また、１次抗体及び２次抗体に断片化された抗体を用いた実施例１及び実施例２では、比較例２に比して４割程度蛍光信号量が増強されており、1次抗体に断片化された抗体を用いることによる高い信号量の増強効果が確認された。
【０１６０】
更に、ＳＡＭを介して断片化された１次抗体を結合させた実施例２よりもＳＡＭを介さずに直接結合させた実施例１の方が蛍光信号量の増強効果が高いことも図１９には示されている。ＳＡＭを介さずに直接断片化された１次抗体を結合させられることは、増強場の有効利用だけでなく、ＳＡＭの形成工程も不要となりプロセス上も簡略化できるという点でメリットがある。  
以上より、本発明の有効性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明の表面プラズモンセンサは、バイオセンサ等として好ましく利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】本発明の第１実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図
【図２】図１の蛍光検出装置のセンサ部の拡大図
【図３】断片化抗体の調製法の一例を示す模式図
【図４】励起光照射光学系の設計変更例を示す図
【図５】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図
【図６Ａ】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置に用いられるセンサチップのセンサ部を示す概略構成図
【図６Ｂ】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置に用いられるセンサチップのセンサ部を示す概略構成図
【図６Ｃ】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置に用いられるセンサチップのセンサ部を示す概略構成図
【図７】本発明の第３実施形態による検出装置を示す概略構成図
【図８】本発明の第４実施形態による検出装置を示す概略構成図
【図９】本発明の第５実施形態による検出装置を示す概略構成図
【図１０】金属被膜を有する蛍光物質を示す模式図
【図１１】本発明の第１の実施形態の試料セルを示す（Ａ）平面図および（Ｂ）側断面図
【図１２】第１の実施形態の試料セルを用いたサンドイッチ法によるアッセイ手順を示す図
【図１３】本発明の第２の実施形態の試料セルを示す側断面図
【図１４】第２の実施形態の試料セルを用いた競合法によるアッセイ手順を示す図
【図１５】試料セルの設計変更例を示す側断面図
【図１６】本発明の１実施形態の蛍光検出用キットの構成を示す模式図
【図１７】蛍光検出用キットを用いたサンドイッチ法によるアッセイ手順を示す図
【図１８】実施例と比較例の蛍光信号量比を示す図
【図１９】比較例２の蛍光信号量に対する実施例及び比較例１の信号量比を示す図
【図２０】表面プラズモンによる電場増強効果の離間距離依存性を示す図
【符号の説明】
【０１６３】
１、２、３、４、５、６    検出装置
１０、１０’、１０”    センサチップ
１１    誘電体プレート
１２    金属層（金属膜）
１２’    金属層（金属微細構造体）
１６    誘電体
１９    金属被膜
２０、２０’    励起光照射光学系
２１    励起光源
２３    偏光調整素子
３０    光検出手段
５０、５０Ａ、５０Ｂ、６１、７０    試料セル
５１    誘電体プレート
５２    流路
５３    スペーサ
５４    上板
５７    標識２次抗体吸着エリア
５８、５９    検出エリア
６０    検出用キット
６３    検出用標識溶液
Ａ    抗原（被検出物質）
Ｂ１、Ｃ１  断片化１次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２、ＣＦ  ２次抗体（第２の結合物質）
ＢＦ    標識２次抗体（蛍光標識結合物質）
Ｃ３    ２次抗体（第３の結合物質）
Ｆ    蛍光物質（蛍光標識）
ｆ    蛍光色素分子
Ｌｏ    励起光
Ｌｆ    蛍光
Ｌｐ    放射光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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