(57)【要約】【課題】１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするペパーミントから単離された核酸分子を提供する。【解決手段】本発明は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質をコードする、単離されたＤＮＡ配列に関する。さらに、本発明は、単離された１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質に関する。他の局面において、本発明は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする核酸配列を含む複製可能な組換えクローニングビヒクル、本発明の組換えクローニングビヒクルおよび／または本発明のＤＮＡ配列によって形質転換され、トランスフェクトされ、感染され、そして／または注射された改変宿主細胞に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする核酸配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
イソプレノイドは、ホルモン、光合成色素、電子キャリアー、および膜成分として植物において重要な役割を果たし、そして伝達および防御にも働く、大きくかつ構造的に多様な群の化合物である（Ｈａｒｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂ．（１９９１）  Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ（Ｈａｒｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂ．、およびＴｏｍａｓ−Ｂａｒｂｅｒａｎ、Ｒ．Ａ．、編）頁３９９−４２６、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。最近までずっと、全てのイソプレノイドは、アセテート／メバロネート経路を介して合成されることが、広く受け入れられていた（Ｓｐｕｒｇｅｏｎ．Ｓ．Ｌ．およびＰｏｒｔｅｒ，Ｊ．Ｗ．（１９８３）Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｊ．Ｗ．、およびＳｐｕｒｇｅｏｎ，Ｓ．Ｌ．、編）第１巻、頁１−４６、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０００３】
しかし、イソペンテニルジホスフェート（イソプレノイド生合成の主要な中間体）が、いくつかの真正細菌（Ｒｏｈｍｅｒ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９５，５１７−５２４（１９９３）；Ｂｒｏｅｒｓ，Ｓ．Ｔ．Ｊ．（１９９４）博士学位論文、Ｅｉｄｇｅｎｏｅｓｓｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ，Ｚｕｅｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｒｏｈｍｅｒ，Ｍ．，ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８，２５６４−２５６６（１９９６）），藻類（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ，Ｊ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６，７３−８０（１９９６））および植物プラスチド（Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｍ．Ｋ．（１９９４）博士学位論文、Ｅｉｄｇｅｎｏｅｓｓｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ，Ｚｕｅｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ，Ｈ．Ｋ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４００，２７１−２７４（１９９７））において、新しいメバロネート独立経路を介してピルベートおよびＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートから生じる証拠が、ここ数年にわたり現れた。この新規の経路における第１の段階は、ピルベートおよびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートのトランスケトラーゼ型縮合反応を含み、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートを産生する（図１）。この反応を触媒する酵素（デオキシキシルロースホスフェートシンターゼ）をコードする遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１２８５７−１２８６２（１９９７）；Ｌｏｉｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，２１０５−２１１０（１９９８））、ペパーミント（ｐｅｐｐｅｒｍｉｎｔ）（Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）（Ｌａｎｇｅ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，２１００−２１０４（１９９８））およびコショウ（ｐｅｐｐｅｒ）（Ｂｏｕｖｉｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１７，１４２３−１４３１（１９９８））からクローン化された。
【０００４】
メバロネート独立経路の第２段階は、分子内転位およびそれに続くデオキシキシルロースホスフェートの還元を含み、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートを産生すると考えられる（Ｄｕｖｏｌｄ，Ｔ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８，４７６９−４７７２（１９９７）；Ｄｕｖｏｌｄ，Ｔ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８，６１８１−６１８４（１９９７）；Ｓａｇｎｅｒ，Ｓ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９，２０９１−２０９４（１９９８））（図１）。Ｓｅｔｏおよび共同研究者（非特許文献１）は、最近、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のレダクトイソメラーゼ遺伝子の単離と特徴付けを報告した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，９８７９−９８８４（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするペパーミントから単離された核酸分子を提供する。 
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
前述に従って、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするｃＤＮＡが、単離され、そして配列決定され、そして対応するアミノ酸配列が推定された。従って、本発明は、植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの発現をコードする単離されたＤＮＡ配列（例えば、Ｍｅｎｔｈａ属の植物を含む精油植物由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの発現をコードする単離されたＤＮＡ配列）に関する。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの発現をコードする単離された、Ｍｅｎｔｈａ  ＤＮＡ配列の代表的な例は、配列番号１において示され、これは、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質（配列番号２）をコードする。さらに、本発明は、単離された植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質（Ｍｅｎｔｈａ属の植物のような精油植物由来の単離された１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質を含む）に関し、配列番号２において示されるアミノ酸配列を有するペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質を含む。
【０００８】
別の局面において、本発明は、ストリジェントな条件下で、配列番号１において示される配列を有する核酸分子と、またはその相補物と（すなわち、配列番号１において示される配列と、配列において相補的であるアンチセンス分子と）ハイブリダイズする核酸分子に関する。他の局面において、本発明は、核酸配列（例えば、植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするＤＮＡ配列、またはそれとハイブリダイゼーション可能な、植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１部分に十分に相補的なヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ配列（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーとして、または植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ遺伝子もしくは関連する遺伝子についてのプローブとして有用である、植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子の１部分に相補的なアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡのフラグメント））を含む複製可能な組換えクローニングビヒクルに関する。本発明のさらなる他の局面において、本発明の組換えクローニングビヒクルおよび／またはＤＮＡ配列を用いて、形質転換され、トランスフェクトされ、感染され、そして／または注入された改変された宿主細胞が、提供される。
【０００９】
従って、本発明は、植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの組換え発現を提供し、そして本発明の概念は、植物、微生物または動物における１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの発現、または増大された発現を得るという引き続く使用のために、組換え１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（またはその１次酵素産物）の有意な量の産生、単離および生成を容易にするために使用され得るか、またはさもなければ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの調節または発現が、この酵素、またはその酵素産物、もしくはその誘導体の産生に所望される環境において使用され得る。
【００１０】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）  ストリジェントな条件下において、配列番号１の核酸分子と、または配列番号１の核酸分子の相補物とハイブリダイズする単離された核酸分子であって、但し、該単離された核酸分子は、配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される核酸配列または配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される核酸配列に相補的な核酸配列からならない、単離された核酸分子。
（項目２）  前記ストリジェントな条件が、５０℃にて３０分間、２．０×ＳＳＣ中で洗浄する工程を包含する、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目３）  項目１に記載の単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質をコードする、核酸分子。
（項目４）  項目１に記載の単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、精油植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質をコードする、核酸分子。
（項目５）  項目４に記載の単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、Ｍｅｎｔｈａ  １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質をコードする、核酸分子。
（項目６）  項目１に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が、配列番号２において示されるアミノ酸配列を含む１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質をコードする、核酸分子。
（項目７）  配列番号１に記載の核酸配列を含む、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目８）  単離された植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質。
（項目９）  項目８に記載の単離された精油植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質。
（項目１０）  項目８に記載の単離されたＭｅｎｔｈａ  １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質。
（項目１１）  項目８に記載の単離されたＭｅｎｔｈａ  １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質であって、該タンパク質が配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
（項目１２）  ストリジェントな条件下で、配列番号１において示される核酸配列からなる第２の核酸分子と、または配列番号１において示される核酸配列の相補物からなる第３の核酸分子と、ハイブリダイズする第１の核酸分子を含む複製可能なベクターであって、但し該第１の核酸分子が配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される核酸配列または配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される核酸配列に相補的な核酸配列からならない、複製可能なベクター。
（項目１３）  前記第１の核酸分子が植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質をコードする、項目１２に記載の複製可能なベクター。
（項目１４）  前記第１の核酸分子がＭｅｎｔｈａ  １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質コードする、項目１２に記載の複製可能なベクター。
（項目１５）  前記第１の核酸分子が、配列番号２において示されるアミノ酸配列を含む１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質をコードする、項目１２に記載の複製可能なベクター。
（項目１６）  前記第１の核酸分子が、配列番号１において示される核酸配列、または配列番号１において示される核酸配列の相補物を含む、項目１２に記載の複製可能なベクター。
（項目１７）  項目１２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目１８）  項目１６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目１９）  前記宿主細胞が植物細胞である、項目１７に記載の宿主細胞。
（項目２０）  前記宿主細胞が植物細胞である、項目１８に記載の宿主細胞。
（項目２１）  宿主細胞において、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質の発現のレベルを増大する方法であって、該宿主細胞において該タンパク質の発現を可能にする条件下において１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質をコードする核酸分子を含む複製可能な発現ベクターを該宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
（項目２２）  項目２１に記載の方法であって、ここで１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質をコードする前記核酸分子が、ストリジェントな条件下で配列番号１に記載の核酸分子の相補物とハイブリダイズし、該ストリジェントな条件が、５０℃にて３０分間、２．０×ＳＳＣ中で洗浄する工程を包含する、方法。
（項目２３）  宿主細胞における１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質の発現のレベルを低減する方法であって、ストリジェントな条件下で、配列番号１に記載の核酸配列とハイブリダイズするＲＮＡ分子を発現する核酸分子を含む複製可能な発現ベクターを、該宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
（項目２４）  前記ストリジェントな条件が、５０℃にて３０分間、２．０×ＳＳＣ中で洗浄する工程を包含する、項目２３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、イソペンテニルジホスフェートの生合成についてのピルベート／グリセルアルデヒド−３−ホスフェート経路の概要および、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートの、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートへの変換における１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの提唱された反応機構を示す。丸を付けられたＰは、ホスフェート部分を示す。破線の矢印は、まだ同定されない段階のいくつかを示す。
【図２Ａ】図２は、（Ａ）組換えペパーミント１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（配列番号２）により生成される脱リン酸生合成産物のトリメチルシリルエーテル誘導体（Ｒt＝７．１±０．１分）、および（Ｂ）同一に調製される標準の２−Ｃ−メチル−Ｄ，Ｌ−エリスリトールのトリメチルシリルエーテル誘導体（Ｒt＝７．１±０．１分）のＧＣ−ＭＳ分析を示す。
【図２Ｂ】図２は、（Ａ）組換えペパーミント１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（配列番号２）により生成される脱リン酸生合成産物のトリメチルシリルエーテル誘導体（Ｒt＝７．１±０．１分）、および（Ｂ）同一に調製される標準の２−Ｃ−メチル−Ｄ，Ｌ−エリスリトールのトリメチルシリルエーテル誘導体（Ｒt＝７．１±０．１分）のＧＣ−ＭＳ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」は、全ての天然に存在するＬ−α−アミノ酸またはそれらの残基をいう。アミノ酸は、１文字または３文字の指定のいずれかによって同定される。
【００１３】
【化１】
2010104384.tif 000002
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、糖部分（ペントース）、ホスフェートおよび窒素複素環式塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡのモノマー単位を意味する。この塩基は、グリコシド炭素（ペント−スの１’炭素）を介して糖部分に連結し、そして塩基および糖のその組合せは、ヌクレオシドと呼ばれる。塩基は、アデニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）およびチミン（「Ｔ」）であるＤＮＡの４つの塩基でヌクレオチドを特徴付ける。イノシン（「Ｉ」）は、４つの、天然に生じる塩基（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）のいずれかを置換するのに使用され得る合成塩基である。４つのＲＮＡ塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。本明細書中に記載されるヌクレオチド配列は、隣接するペントースの３’炭素と５’炭素との間のホスホジエステル結合により結合されるヌクレオチドの線状アレイを含む。
【００１４】
「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合を介して連結されるデオキシリボヌクレオチドの、短い長さの１本鎖配列または２本鎖配列をいう。オリゴヌクレオチドは、公知の方法により化学的に合成され、そして例えばポリアクリルアミドゲル上で精製される。
【００１５】
用語「１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ」は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートから２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートを形成可能な酵素を意味するために、本明細書中で使用される。
【００１６】
用語「ストリジェントな条件下でハイブリダイズする」およびその文法的に同等の語句は、ＤＮＡブロットまたはＲＮＡブロット（例えば、サザンブロットまたはノザンブロット）上に固定された標的核酸分子とハイブリダイズした核酸分子が、ストリジェントな条件下でこのブロットの洗浄の間、このブロット上に固定された標的分子とハイブリダイズしたままであることを意味する。この状況において、例示的なハイブリダイズ条件は、５×ＳＳＣ中で、６５℃にて、１６時間のハイブリダイゼーションである。例示的に高いストリジェントな洗浄条件は、１回の洗浄あたり２×ＳＳＣ中で、２３℃にて２０分間の２回の洗浄、それに引き続き、２．０×ＳＳＣ中で、５０℃にて３０分間の１回の洗浄である。例示的に非常に高いストリジェントな洗浄条件は、１回の洗浄あたり、２×ＳＳＣ中で、２３℃にて１５分間の２回の洗浄、それに引き続き１．０×ＳＳＣ中で、６０℃にて２０分間の２回の洗浄である。
【００１７】
省略形「ＳＳＣ」は、核酸ハイブリダイゼーション溶液において使用される緩衝液をいう。１リットルの２０Ｘ（２０回濃縮）ストックＳＳＣ緩衝溶液（ｐＨ７．０）は、１７５．３ｇの塩化ナトリウムおよび８８．２ｇ  のクエン酸ナトリウムを含む。
【００１８】
用語「精油植物」は、高レベルのモノテルペノイドオイルおよび／またはセスキテルペノイドオイルおよび／もしくはジテルペノイドオイル、ならびに／あるいは高レベルのモノテルペノイド樹脂および／またはセスキテルペノイド樹脂および／もしくはジテルペノイド樹脂、を産生する植物種の群をいう。上記のオイルおよび／または樹脂は、それらを産生する精油植物の生重量の約０．００５％より大きい量を占める。精油および／または樹脂は、例えば、Ｅ．Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｔｈｅ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｏｉｌｓ、第１巻〜第６巻、Ｒ．Ｅ．Ｋｒｉｅｇｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｎ．  Ｙ．、１９７５（本明細書中で参考として援用される）において、より十分に記載される。精油植物としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：
Ｌａｍｉａｃｅａｅ（以下の種が挙げられるがこれらに限定されない：Ｏｃｉｍｕｍ（メボウキ），Ｌａｖａｎｄｕｌａ（ラベンダー），Ｏｒｉｇａｎｕｍ（オリガノ），Ｍｅｎｔｈａ（ハッカ），Ｓａｌｖｉａ（セージ）、Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ（ローズマリー）、Ｔｈｙｍｕｓ（タイム）、Ｓａｔｕｒｅｊａ（サボリー）、Ｍｏｎａｒｄａ（バーム）およびＭｅｌｉｓｓａ）。
【００１９】
Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ（以下の種が挙げられるがこれらに限定されない：Ｃａｒｕｍ（カラウェー）、Ａｎｅｔｈｕｍ（イノンド）、ｆｏｅｎｉｃｕｌｕｍ（ウイキョウ）およびＤａｕｃｕｓ（ニンジン））。
【００２０】
Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）（以下の種が挙げられるがこれらに限定されない：Ａｒｔｅｍｉｓｉａ（タラゴン、セージブッシュ（ｓａｇｅ  ｂｒｕｓｈ））、Ｔａｎａｃｅｔｕｍ（（タンジー）ｔａｎｓｙ））。
【００２１】
Ｒｕｔａｃｅａｅ（例えば、柑橘植物）；Ｒｏｓａｃｅａｅ（例えば、バラ）；Ｍｙｒｔａｃｅａｅ（例えば、ユーカリ、，コバノブラッシノキ（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ））；ｔｈｅ  Ｇｒａｍｉｎｅａｅ（例えば、Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ（コウスイガヤ））；Ｇｅｒａｎａｃｅａｅ（ゲンノショウコ）および特定の針葉樹（Ａｂｉｅｓ（例えば、カナディアンバルサム（Ｃａｎａｄｉａｎ  ｂａｌｓａｍ））、Ｃｅｄｒｕｓ（シーダー）、コノテガシワ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ、Ｐｉｎｕｓ（マツ）およびＰｉｃｅａ（エゾマツ）を含む）。
【００２２】
精油植物の範囲は、Ｅ．Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｔｈｅ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｏｉｌｓ，第１巻〜第６巻、Ｒ．Ｅ．Ｋｒｉｅｇｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．,Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｎ．Ｙ．、１９７５（本明細書中で参考として援用される）においてより十分に示される。
【００２３】
用語「変更」、「アミノ酸配列変更」、「改変体」および「アミノ酸配列改変体」は、対応する、ネイティブな、すなわち、天然に存在する１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼと比較した場合、それらのアミノ酸配列においていくつかの違いを有する１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ分子をいう。元々、改変体は、対応するネイティブな１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼと少なくとも約７０％の相同性を保有し、そして好ましくは、この改変体は、対応するネイティブな１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼと少なくとも約８０％の相同性がある。本発明の範囲内にある１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼのアミノ酸配列改変体は、特定の位置に、置換、欠損、および／または挿入を保有する。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの配列改変体は、所望の増幅された酵素活性または所望の低減された酵素活性、改変された位置化学（ｒｅｇｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）または改変された立体化学、あるいは変更された基質利用または変更された産物の分布を達成するために使用され得る。
【００２４】
置換１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ改変体は、ネイティブな１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ配列において少なくとも１つのアミノ酸残基を除去され、そして異なるアミノ酸を、同じ位置の除去された場所に挿入された改変体である。置換は１つであり得、ここで分子中の１つのアミノ酸のみが置換されているか、またはその置換が複数であり得、ここで２つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換されている。本発明の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ分子の活性における実質的な変化は、ネイティブなアミノ酸の側鎖とは電荷および／または構造において有意に異なる側鎖を有するアミノ酸を置換することによって得られ得る。この型の置換は、ポリペプチド骨格の構造および／または置換の領域における分子の電荷もしくは疎水性に影響することが期待される。
【００２５】
本発明の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ分子の活性における穏やかな変化は、ネイティブな分子の側鎖と、電荷および／または構造において類似である側鎖を有するアミノ酸を置換することによって予期される。保存的置換と呼ばれるこの型の置換は、ポリペプチドの骨格の構造、または置換の領域における分子の電荷もしくは疎水性のいずれかを実質的に変更するとは予期されない。
【００２６】
挿入１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ改変体は、ネイティブな１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ分子の特定の位置のアミノ酸の、すぐ隣に挿入される１つ以上のアミノ酸を有する改変体である。アミノ酸のすぐ隣とは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに結合することを意味する。挿入物は、１つ以上のアミノ酸であり得る。通常、挿入物は、１つまたは２つの保存的アミノ酸からなる。挿入の部位に隣接するアミノ酸と電荷および／または構造において類似のアミノ酸は、保存的として規定される。あるいは、本発明は、挿入の部位と隣接するアミノ酸とは  実質的に異なる電荷および／または構造を有するアミノ酸の挿入を含む。
【００２７】
欠失改変体は、ネイティブな  １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ分子における１つ以上のアミノ酸が除去された改変体である。通常、欠失改変体は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ分子の特定の領域における１つまたは２つのアミノ酸欠失を有する。欠失改変体は、全てまたはほとんどのトランシット（ｔｒａｎｓｉｔ）配列が除去された改変体を含む。
【００２８】
用語「生物学的活性」、「生物学的に活性な」、「活性」および「活性な」は、本発明の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼが１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートの還元および転位により、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートの形成を触媒する能力をいう。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ活性は、酵素活性アッセイ（例えば、本明細書中の実施例３に記載されるアッセイ）において測定される。本発明の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼのアミノ酸配列改変体は、所望される得る変更された生物学的活性（例えば、変更された反応速度論、基質利用、産物分布または位置化学および立体化学のような他の特性を含む）を有し得る。
【００２９】
用語「ＤＮＡ配列コード」、「ＤＮＡコード」、「核酸分子コード」および「核酸コード」は、デオキシリボ核酸の１本鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順番または配列をいう。これらのデオキシリボヌクレオチドの順番は、翻訳されたポリペプチド鎖に沿って、アミノ酸の順番を決定する。従って、ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードする。
【００３０】
用語「複製可能なベクター」「複製可能な発現ベクター」および「発現ベクター」は、ＤＮＡの１断片（通常、２本鎖）をいい、これは、ＤＮＡの別の断片（挿入ＤＮＡ）（例えば、それに限定されないが、ｃＤＮＡ分子）を、そのＤＮＡの１断片に挿入し得る。ベクターは、適切な宿主細胞に挿入ＤＮＡを運搬するために使用される。挿入ＤＮＡは、宿主細胞に由来し得るか、または異なる細胞または異なる生物体に由来し得る。一旦宿主細胞において、ベクターが、宿主染色体ＤＮＡとは独立してかまたは一致して複製し得れば、そしてベクターおよびその挿入ＤＮＡのいくつかのコピーが生成され得る。用語「複製可能な発現ベクター」および「発現ベクター」は、挿入ＤＮＡのポリペプチドへの転写および翻訳を可能にする必要な要素を含む複製可能なベクターをいう。従って、挿入ＤＮＡによりコードされるポリペプチドの多くの分子は、迅速に合成され得る。
【００３１】
用語「形質転換された宿主細胞」、「形質転換された」および「形質転換」は、細胞へのＤＮＡの導入をいう。細胞は、「宿主細胞」と呼ばれ、そしてそれは、原核細胞または真核細胞であり得る。代表的な原核宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株が挙げられる。代表的な真核宿主細胞は、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または動物細胞である。導入されるＤＮＡは、通常、挿入されるＤＮＡ断片を含む、ベクターの形態である。導入されるＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種由来、または宿主細胞とは異なる種由来であり得るか、もしくはハイブリッドＤＮＡ配列（いくつかの異種ＤＮＡおよび宿主種由来のいくつかのＤＮＡを含む）であり得る。
【００３２】
使用される他の省略は、：ｂｐ、塩基対；ＧＣ、ガスクロマトグラフィー；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＩＰＴＧ、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ｋｂ、キロベースペア；ＭＳ．、質量分析；Ｔｒｉｓ、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタンである。
【００３３】
本発明によれば、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするｃＤＮＡを、以下の様式で単離し、そして配列決定した。ｃＤＮＡライブラリーを、単離されたペパーミント油腺分泌細胞（必須の油生合成のために高度に特殊化された細胞型）由来のｍＲＮＡから構築した。ＰＣＲプライマーを設計し（Ｐ１、５’−ＣＧＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣ−３’（配列番号３）；Ｐ２、５’−ＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＡＡＣＣＣＴＴＧ−３’、そしてペパーミント油腺ライブラリーｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、いくらかの類似性（約５０％）をＥ．ｃｏｌｉレダクトイソメラーゼ遺伝子に対して有する、ｐＭＰＤＸＲ１（配列番号５）と命名された、２２３ｂｐのフラグメントを増幅した。ペパーミント油腺ｃＤＮＡライブラリー（２．５×１０4プラーク）を、ｐＭＰＤＸＲ１（配列番号５）由来の標識したプローブを用いてスクリーニングすることにより、配列番号１に示す核酸配列を有するｃＤＮＡを含む、５つの全長クローンを得た。
【００３４】
さらに、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするｃＤＮＡ分子を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａから、以下の様式で単離した。２×１０4プラークのＡ．ｔｈａｌｉａｎａ花芽ｃＤＮＡライブラリー（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＣｅｎｔｅｒからのＣＤ４−６（ｈｔｔｐ：／／ａｉｍｓ．ｃｐｓ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ａｉｍｓ／））を、ｐＭＰＤＸＲ１（配列番号５）を用いてスクリーニングし、そして配列番号７に示すアミノ酸配列を有する、５’短縮タンパク質をコードする、配列番号６に示す配列を有するクローンを含む、２０個のポジティブなクローンを得た。
【００３５】
全長ペパーミント１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼｃＤＮＡ（配列番号１に示す配列を有する）は、本明細書中の実施例３に記載のように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能的１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質（配列番号２）を発現した。
【００３６】
ペパーミントからの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするｃＤＮＡの単離は、この機能的酵素についての効率的な発現系の開発を可能にし；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの発生調節について調べるための有用なツールを提供し；この酵素の反応機構の調査を可能にし、そして他の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（例えば、他の植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ）の単離を可能にする。１−デオキシＤ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼｃＤＮＡの単離はまた、イソプレノイドの合成および代謝を増強するかさもなければ変更するための、広範な生物の形質転換を可能にする。
【００３７】
例えば、１つの局面では、本発明は、宿主細胞（例えば、植物細胞）における１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの発現レベルを増強する方法を提供し、この方法は、宿主細胞における１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの発現を可能にする条件下で、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質をコードする核酸分子を含む複製可能な発現ベクターを宿主細胞に導入する工程を含む。代表的な例として、本明細書中の配列番号１に示す配列を有する核酸分子に加えて、Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５５（１−２）：１４０−１４４（１９９９）（この刊行物は、本明細書中に参考として援用される）に報告される、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質をコードする核酸分子は、本発明のこの局面において有用である。Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒらのタンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＣＡＢ４３３４４でＧｅｎｂａｎｋデータベースに寄託されている。本発明のこの局面の１つの実施形態では、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする核酸配列は、配列番号１に示す核酸配列のアンチセンス相補物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００３８】
さらに、非限定的な例として、別の局面では、本発明は、宿主細胞（例えば、植物細胞）における１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの発現レベルを減少させる方法を提供し、この方法は、配列番号１に示す核酸配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子を含む、複製可能な発現ベクターを宿主細胞に導入する工程を含む。従って、例えば、本明細書中の配列番号１に示す核酸配列のアンチセンス相補物に加えて、本発明のこの局面において有用な代表的な核酸分子としては、以下の核酸分子（それらのＧｅｎｂａｎｋデータベース登録番号によって同定される）のアンチセンス相補物が挙げられる：ＡＩ７８１０９６、ＡＷ２５６２８４、ＡＷ０６５０５７、ＡＷ２８６４８６、ＡＩ７２７２０７、ＡＩ９０１０５６．
本明細書中に開示されるペパーミントｃＤＮＡによってコードされる１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質は、この酵素を色素体に導くが、この酵素の推定標的化配列の、当該分野で周知の他の輸送配列（例えば、以下の刊行物（その引用部分は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと：ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８０：５３５−５４５，１９８９；  Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐ．７６９［１９８８］）での置換は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼを他の細胞位置または細胞外位置へと導くために用いられ得る。
【００３９】
ネイティブな植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼアミノ酸配列に加えて、欠失、置換、変異および／または挿入ならびに短縮化によって生成される配列の改変体は、先行技術によって限定される範囲を除いて、本発明の範囲内であると意図される。本発明の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼアミノ酸配列改変体は、野生型酵素をコードするＤＮＡ配列を変異させることによって（例えば、通常、部位特異的変異誘発と呼ばれる技術を用いることによって）構築され得る。本発明の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする核酸分子は、当業者に周知の種々のＰＣＲ技術によって変異され得る（例えば、以下の刊行物を参照のこと（その引用部分は、本明細書中に参考として援用される）：「ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．ＧｅｌｆａｎｄおよびＪ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ編，１９９５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（第１４章）；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｊ．ＳｎｉｎｓｋｙおよびＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）。
【００４０】
非限定的な例として、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットにおいて利用される２つのプライマー系は、部位特異的変異誘発を、本発明の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ遺伝子に導入するために用いられ得る。この系における標的プラスミドの変性に続いて、２つのプライマーは、プラスミドに対して同時にアニーリングされる；これらのプライマーのうちの一方は、所望の部位特異的変異を含み、他方は、プラスミドにおける別の点で変異を含み、制限部位の除去をもたらす。次いで、第２鎖合成が行われてこれらの２つの変異を強固に連結し、そして得られるプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＳ株に形質転換される。プラスミドＤＮＡは、形質転換された細菌から単離され、適切な制限酵素を用いて制限処理され（それにより、変異していないプラスミドを直鎖化し）、次いでＥ．ｃｏｌｉ中に再度形質転換される。この系は、一本鎖ファージミドのサブクローニングまたは作製の必要性を伴わずに、発現プラスミドにおいて直接的に変異の作製を可能にする。２つの変異の強固な結合およびその後の、変異していないプラスミドの直鎖化は、高い変異効率をもたらし、そして最少のスクリーニングを可能にする。最初の制限部位プライマーの合成後、この方法は、変異部位１つあたり１つのみの新たなプライマー型の使用を必要とする。各位置変異体を別々に調製するよりも、１セットの「設計された縮重」オリゴヌクレオチドプライマーを、全ての所望の変異を所定の位置に同時に導入するために合成され得る。形質転換体は、変異誘発した領域を通してプラスミドＤＮＡを配列決定することによりスクリーニングされて、変異体クローンを同定および選別し得る。次いで、各変異体ＤＮＡは、完全に配列決定または制限処理され得、そしてＭｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔゲル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）での電気泳動によって（変異誘発していないコントロールと比較したバンドシフトによって）分析されて、この配列において他の変異が生じていないことが確認され得る。
【００４１】
さらに、非限定的な例として、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅTM  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットにおいて利用される２つのプライマー系は、本発明の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ遺伝子に部位特異的変異体を導入するために用いられ得る。標的変異部位を保有する挿入物を含む二本鎖プラスミドＤＮＡを変性させ、そして標的変異部位でプラスミドＤＮＡのいずれかの鎖に相補的である２つのオリゴヌクレオチドと混合する。アニーリングしたオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長され、それにより、ねじれ型のニックを含む、変異したプラスミドを作製する。温度サイクリング（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ）の後、変異していない親ＤＮＡテンプレートは、制限酵素ＤｐｎＩを用いて消化される。ＤｐｎＩは、メチル化またはヘミメチル化した（ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）ＤＮＡを切断するが、メチル化されていないＤＮＡを切断しない。親のテンプレートＤＮＡは、ほぼ常にメチル化またはヘミメチル化されている。なぜなら、テンプレートＤＮＡを得る大部分のＥ．ｃｏｌｉ株が、必要とされるメチラーゼ活性を含むからである。残存する、所望の変異を含む、アニーリングしたベクターＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換される。
【００４２】
変異した１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、変異タンパク質の高レベルの生成および標準的なプロトコルによる精製のためのＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株）を形質転換するために用いられ得る、ｐＥＴ（または他の）過剰発現ベクターにクローニングされ得る。本発明の高レベルの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質を発現するために用いられ得るプラスミドベクターおよびＥ．ｃｏｌｉ株の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９），第１７章（本明細書中に参考として援用される）に示される。ＦＡＢ−ＭＳマッピングの方法は、変異体発現の忠実度を迅速にチェックするために用いられ得る。この技術は、タンパク質全体にわたってセグメントを配列決定するために用いられ、そして配列割り当てにおける必要な忠実度を提供する。この型のマッピング実験において、タンパク質は、プロテアーゼを用いて消化される（その選択は、改変されるべき特異的領域に依存する。なぜなら、このセグメントは、主な興味深いセグメントであり、そして残りの地図は、変異誘発していないタンパク質の地図と同一であるべきである）。切断フラグメントのセットは、マイクロボア（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）ＨＰＬＣ（改変されるべき特異的領域に再度依存して、逆相またはイオン交換）によって分画されて、各画分においていくつかのペプチドを提供し、このペプチドの分子量は、ＦＡＢ−ＭＳによって決定される。次いで、この分子量は、推定配列の消化から期待されるペプチドの分子量と比較され、そしてこの配列の正しさが迅速に確認される。本明細書中に示される例示的な変異誘発技術が、部位特異的変異を生成するので、質量分析器が予想と一致した場合、変更されたペプチドの配列決定は、必要でないはずである。変化した残基を確認することが必要な場合、ＣＡＤタンデムＭＳ／ＭＳは、問題の混合物中のペプチドを配列決定するために用いられ得るか、または標的ペプチドは、改変の位置に依存して差引きＥｄｍａｎ分解またはカルボキシペプチダーゼＹ消化について精製され得る。
【００４３】
特定の部位特異的変異誘発実験の設計では、非保存的置換（例えば、Ｃｙｓ、ＨｉｓまたはＧｌｕについてＡｌａ）を最初に行い、そして結果として活性が大いに損なわれたか否かを決定することが一般に所望される。次いで、変異誘発されたタンパク質の特性が、変更された機能の感受性指標としてＫmおよびｋcatという反応速度パラメーターに特に注意を向けて調べられる。そこから、結合および／または触媒作用自体における変化が、ネイティブな酵素に対する比較によって推論され得る。この残基が、この手段によって、活性の損失（すなわち、ノックアウト）に重要であると実証された場合、保存的置換（例えば、側鎖長を変更するための、ＧｌｕについてのＡｓｐ、ＣｙｓについてのＳｅｒまたはＨｉｓについてのＡｒｇ）が行われ得る。疎水性セグメントについては、有用に変更されるのは主にサイズであるが、芳香族もまた、アルキル側鎖を置換し得る。正常な生成物の分布における変化は、反応順序のどの工程が変異によって変更されたかを示し得る。疎水性ポケットの改変は、基質についての結合コンホメーションを変更するために用いられ得、レジオ化学（ｒｅｇｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）および／または立体化学の変化をもたらし得る。
【００４４】
他の部位特異的変異誘発技術はまた、本発明のヌクレオチド配列とともに用いられ得る。例えば、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化、続いて連結は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ［１９８９］（本明細書中に参考として援用される）の１５．３節に記載されるように、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの欠失改変体を作製するために用いられ得る。類似のストラテジーを用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出の第１５．３節に記載されるように、本発明の改変体を構築し得る。
【００４５】
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発はまた、本発明の置換改変体ならびに短縮型を調製するために用いられ得る。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発をまた用いて、本発明の欠失改変体および挿入改変体を便利に調製し得る。この技術は、本明細書中に参考として援用される、Ａｄｅｌｍａｎら（ＤＮＡ  ２：１８３  ［１９８３］）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，１９９１，Ｗｉｌｅｙ（ＮＹ），Ｆ．Ｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｄ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．ＳｍｉｔｈおよびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ編に記載されるように当該分野で周知である。
【００４６】
一般に、少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いて、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ分子中に２以上のヌクレオチドを挿入、欠失または置換する。最適なオリゴヌクレオチドは、変異をコードするヌクレオチドのいずれかの側に、１２〜１５の完全に一致したヌクレオチドを有する。野生型１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼを変異誘発するために、このオリゴヌクレオチドを、一本鎖ＤＮＡテンプレート分子に、適切なハイブリダイゼーション条件下でアニーリングする。次いで、ＤＮＡ重合酵素（通常、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント）が添加される。この酵素は、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ＤＮＡの変異保有鎖の合成を完了する。従って、ヘテロ二重鎖分子は、ＤＮＡの一方の鎖が、ベクター中に挿入された野生型酵素をコードするように形成され、そしてＤＮＡの第２鎖は、同じベクターに挿入された変異した形態の酵素をコードする。次いで、このヘテロ二重鎖分子は、適切な宿主細胞中に形質転換される。
【００４７】
置換された１より多くのアミノ酸を有する変異体は、いくつかの方法のうちの１つにおいて作製され得る。アミノ酸がポリペプチド鎖において一緒に近くに位置する場合、これらは、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて同時に変異され得る。しかし、このアミノ酸が互いにいくらか離れて存在する（例えば、１０より多くのアミノ酸によって隔てられる）場合、所望の変化の全てをコードする単一オリゴヌクレオチドを作製することはより困難である。その代わり、２つの代替的方法のうちの一方が用いられ得る。第１の方法では、別個のオリゴヌクレオチドが、置換されるべき各アミノ酸について作製される。次いで、このオリゴヌクレオチドは、一本鎖テンプレートＤＮＡに同時にアニーリングされ、そしてテンプレートから合成されるＤＮＡの第２鎖は、所望のアミノ酸置換の全てをコードする。代替的方法は、所望の変異体を生成するために２回以上の変異誘発を含む。１回目は、単一変異体について記載した通りである：野生型１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼＤＮＡは、テンプレートにのために用いられ、第１の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドは、このテンプレートにアニーリングされ、次いでヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子が作製される。２回目の変異誘発は、最初の回の変異誘発において生成された変異したＤＮＡをテンプレートとして利用する。従って、このテンプレートは既に、１以上の変異を含む。次いで、さらなる所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドは、このテンプレートにアニーリングされ、そして得られるＤＮＡ鎖はここで、１回目および２回目の変異誘発の両方に由来する変異体をコードする。この得られるＤＮＡは、３回目の変異誘発などにおいてテンプレートとして用いられ得る。
【００４８】
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする遺伝子（または他の核酸分子）は、任意の生物（インタクトな植物、動物、微生物など）中に、またはそれら由来の細胞培養物に含まれ得る。酵素１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートの、イソペンテニルジホスフェートへの変換における第１の関与する工程を触媒し、次いでイソペンテニルジホスフェートは、種々の分子（例えば、カロテノイドを含む）、ならびにクロロフィル、プラストキノンおよびトコフェロールのプレニル側鎖に変換される。従って、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ遺伝子（または他の核酸分子）は、以下を含むがこれらに限定されない、種々の目的で任意の生物に導入され得る：１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼまたはその産物２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートの生成；フィトール側鎖の合成を増加させることによる、クロロフィル精製の増強；病原体、昆虫および他の草食動物に対する防御を改善するためのテルペノイド、フィトアレキシン、毒素および妨害化合物の生成の増強；香味プロフィールおよび芳香プロフィールを改善するため、または植物から抽出される香味化合物および芳香化合物の収量を改善するための、芳香油植物、果実および野菜におけるモノテンペン香味化合物およびモノテルペン芳香化合物の生成の増強；産業用途のための植物および微生物における合成中間体の調製（例えば、接着剤、インキおよびポリマーの合成）；植物における天然色素（例えば、カロテノイド）の生成の増強、および医学的または臨床的な用途のために植物から抽出される天然色素の収量の改善；抗癌特性または他の栄養医学（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）特性を有する化合物（例えば、ビタミンＡおよびビタミンＥ）の、植物における収量の増強；ならびに酵素的または化学的中間体としての、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールホスフェートの生成。本発明の核酸分子は、任意の生物に導入され得るが、本発明の核酸分子は好ましくは、植物種に導入される。
【００４９】
真核生物発現系は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの生成に利用され得る。なぜなら、これらは、必要とされる任意の翻訳後修飾を行い得、そしてこの酵素を適切な細胞区画に導き得るからである。この目的のための代表的な真核生物発現系は、組換えバキュロウイルスである、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ；Ｍ．Ｄ．ＳｕｍｍｅｒｓおよびＧ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ［１９８６］；Ｌｕｃｋｏｗら，Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７−５５［１９８７］）を、本発明の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの発現のために使用する。昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ種細胞）の、組換えバキュロウイルスでの感染は、大量の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質の生成を可能にする。さらに、このバキュロウイルス系は、組換え１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの生成のための他の重要な利点を有する。例えば、バキュロウイルスは、ヒトには感染せず、それゆえ安全に大量に取り扱いされ得る。バキュロウイルス系では、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするＤＮＡセグメントおよびベクターを含むＤＮＡ構築物が調製される。このベクターは、バキュロウイルスの多角体遺伝子プロモーター領域、組換えの間の適切な交差に必要なバキュロウイルス隣接配列（この隣接配列は、プロモーター配列に隣接する約２００〜３００塩基対を含む）およびこの構築物が細菌において複製するのを可能にする細菌の複製起点を含み得る。このベクターは、（ｉ）ＤＮＡセグメントが、多核体遺伝子プロモーターに隣接して（または作動可能に連結されるかまたは「下流に」または「制御下に」）配置され、そして（ｉｉ）プロモーター／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの組み合わせが、２００〜３００塩基対のバキュロウイルスＤＮＡ（隣接配列）に両方の側で隣接するように構築される。
【００５０】
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼＤＮＡ構築物を生成するために、全長１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを、本明細書中に記載される方法のような方法を用いて得る。このＤＮＡ構築物を、宿主細胞中で、適切なバキュロウイルスの（すなわち、構築物中にコードされるプロモーターと同じバキュロウイルス種の）バキュロウイルスＤＮＡと、組換えがもたらされる条件下で接触させる。得られる組換えバキュロウイルスは、全長１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする。例えば、昆虫宿主細胞は、ＤＮＡ構築物および機能的バキュロウイルスを用いて同時トランスフェクトまたは別々にトランスフェクトされ得る。次いで、得られる組換えバキュロウイルスは、単離され得、そして細胞を感染させるために使用されて１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの産物をもたらし得る。宿主昆虫細胞としては、例えば、バキュロウイルスによって発現される１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼを生成し得る、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞が挙げられる。次いで、本発明の組換えバキュロウイルスを用いて感染させた昆虫宿主細胞は、バキュロウイルスによってコードされる１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの発現を可能にする条件下で培養される。次いで、このようにして生成される１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼは、この細胞から、当該分野で公知の方法を用いて抽出される。
【００５１】
他の真核微生物（例えば、酵母）はまた、本発明を実施するために用いられ得る。パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、通常用いられる酵母であるが、いくつかの他の株が利用可能である。プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９［１９７９］；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，Ｇｅｎｅ  ７：１４１［１９７９］；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら，Ｇｅｎｅ，１０：１５７［１９８０］）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現ベクターとして通常用いられる。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母変異株（例えば、株ＡＴＣＣ番号４４，０７６およびＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２［１９７７］））についての選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を含む。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの不在下での増殖による形質転換を検出するために有効な環境を提供する。酵母宿主細胞は一般に、Ｈｉｎｎｅｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１９２９［１９７８］）によって記載されるような、ポリエチレングリコール法を用いて形質転換される。さらなる酵母形質転換プロトコールは、Ｇｉｅｔｚら，Ｎ．Ａ．Ｒ．，２０（１７）：１４２５（１９９２）；Ｒｅｅｖｅｓら，ＦＥＭＳ，９９（２−３）：１９３−１９７，（１９９２）（この両方の刊行物は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００５２】
酵母ベクターにおける適切な促進配列としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３［１９８０］）または他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９［１９６８］；Ｈｏｌｌａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００［１９７８］）（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ）についてのプロモーターが挙げられる。適切な発現プラスミドの構築の際には、これらの遺伝子に関連した終結配列もまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供するために発現されることが所望される配列の３’において、この発現ベクターに連結される。増殖条件によって制御される転写というさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素および上記のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼならびにマルトース利用およびガラクトース利用を担う酵素についてのプロモーター領域である。酵母に適合性のプロモーター、複製起点および終結配列を含む任意のプラスミドベクターが適切である。
【００５３】
多細胞生物（例えば、植物）に由来する細胞培養物は、本発明を実施するための宿主として用いられ得る。トランスジェニック植物は、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼおよび選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシンに対する耐性をコードするｋａｎ遺伝子）をコードするプラスミドを、ヘルパーＴｉプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓにＨｏｅｃｋｅｍａら，Ｎａｔｕｒｅ，３０３：１７９−１８１［１９８３］に記載されるように移入し、そしてこのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を、形質転換されるべき植物の葉のスライスまたは他の組織もしくは細胞とともに、Ａｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，８１：３０１−３０５［１９８６］に記載されるように培養することによって入手され得る。培養された植物宿主細胞の形質転換は通常、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓを通して達成される。堅い細胞膜障壁を有さない哺乳動物宿主細胞および他の宿主細胞の培養は通常、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：５４６［１９７８］）によって最初に記載され、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら，前出の第１６．３２節〜第１６．３７節に記載されるように改変されたリン酸カルシウム法を用いて形質転換される。しかし、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法（例えば、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（ＫａｗａｉおよびＮｉｓｈｉｚａｗａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：１１７２［１９８４］）、プロトプラスト融合（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：２１６３［１９８０］）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１：８４１［１９８２］）、および核への直接マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，２２：４７９［１９８０］））もまた用いられ得る。さらに、動物形質転換ストラテジーは、本明細書中に参考として援用される、Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ  Ｇ．Ｍ．およびＲｏｂｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９５に概説される。形質転換された植物カルスは、この細胞を、例えば、カナマイシンならびにカルスおよびシュートの誘導のための適切な量の植物ホルモン（例えば、ナフタレン酢酸およびベンジルアデニン）を含む培地で増殖させることによって、選択マーカーを通して選択され得る。次いで、植物細胞は再生され得、そして得られる植物は、当業者に周知の技術を用いて土壌に移植され得る。
【００５４】
さらに、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ生成を調節する遺伝子は、誘導性である、必要なプロモーターとともに植物中に込みこまれ得る。本発明のこの実施形態の実施では、特定の外部刺激または内部刺激にのみ応答するプロモーターは、標的ｃＤＮＡに融合される。従って、この遺伝子は、特定の刺激に応答したとき以外は転写されない。この遺伝子が転写されない限り、その遺伝子産物は生成されない。
【００５５】
本発明の実施において使用され得る応答性のプロモーター系の例は、トウモロコシにおけるグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系である。ＧＳＴは、プレエマージェント（ｐｒｅ−ｅｍｅｒｇｅｎｔ）除草剤としてしばしば使用される多数の疎水性求電子性の化合物を解毒し得る酵素のファミリーである（Ｗｅｉｇａｎｄら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７：２３５−２４３［１９８６］）。研究は、ＧＳＴが、この増大した除草剤耐性を引き起こすことに直接関与することを示している。この作用は、主に、特異的な１．１ｋｂのｍＲＮＡ転写産物を介して媒介される。手短には、トウモロコシは、外部刺激に応答し得、そして遺伝子産物を産生するように誘導し得る、すでに存在する天然に存在する静止遺伝子を有する。この遺伝子は、以前に同定され、そしてクローン化されている。従って、本発明の１つの実施形態において、そのプロモーターは、ＧＳＴ応答性遺伝子から除去され、そして以前にその天然のプロモーターが除去されている１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ遺伝子に結合している。この操作された遺伝子は、外部化学刺激に応答するプロモーターと、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの首尾良い産生を担う遺伝子の組み合わせである。
【００５６】
上記の方法に加えて、いくつかの方法が、クローン化ＤＮＡを広範な種々の植物種（裸子植物、被子植物、単子葉植物、および双子葉植物を含む）（例えば、ＧｌｉｃｋおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ［１９９３］（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）に移入するために当該分野で公知である。代表的な例には、電気パルスが細胞膜を一過的に透過性に、種々の生物学的分子（組換えＤＮＡを含む）の取り込みを可能にする、プロトプラストによるエレクトロポレーション促進ＤＮＡ取り込み（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０（４８４９）：２０４−２０７［１９８８］）；ポリエチレングリコールでのプロトプラストの処理（Ｌｙｚｎｉｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３：１５１−１６１［１９８９］）；および細胞壁を貫通するために爆発力または圧縮ガスによって推進されるＤＮＡ担持マイクロプロジェクタイルでの細胞のボンバードメント（Ｋｌｅｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４［１９８９］およびＢｏｙｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０（４８５８）：１５３４−１５３８［１９８８］）が含まれる。木質種の形質転換が、例えば、Ｈａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９５：１８７−１９６（１９９４）（本明細書中に参考として援用される）に示される方法を利用することによって達成され得る。ライムギ（Ｒｙｅ）植物（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）に適用されている方法は、選択マーカー遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを、発達している花の分げつ枝に直接注入することである（ｄｅ  ｌａ  Ｐｅｎａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：２７４−２７６（１９８７））。さらに、植物ウイルスが、遺伝子を植物細胞に移入するためのベクターとして使用され得る。植物を形質転換するためのベクターとして使用され得る植物ウイルスの例には、カリフラワーモザイクウイルス（Ｂｒｉｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４（１９８４）が含まれる。さらに、植物形質転換のストラテジーおよび技術は、Ｂｉｒｃｈ，Ｒ．Ｇ．，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，４８：２９７（１９９７）；Ｆｏｒｅｓｔｅｒら、Ｅｘｐ．Ａｇｒｉｃ．，３３：１５−３３（１９９７）において概説されている。多数の刊行物が、ハッカ（Ｍｅｎｔｈａ)種に首尾良く適用されている形質転換技術を記載する。ハッカ形質転換技術を開示する代表的な刊行物は、Ａ．Ｓｐｅｎｃｅｒら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：９１１−９１９（１９９３）；Ｃ．Ｂｅｒｒｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ．４４：１７７−１８１（１９９６）；Ｊ．Ｃ．Ｃａｉｓｓａｒｄら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１６：６７−７０（１９９６）；Ｘ．Ｎｉｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１７：１６５−１７１（１９９８）；Ｆ．Ｄｉｅｍｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１３８：１０１−１０８（１９９８）である。植物形質転換技術を開示する上述の刊行物は、本明細書に参考として援用され、そして軽微な改変が、これ��の技術を広範な植物種に適用可能とする。
【００５７】
これらの技術の各々は、利点および欠点を有する。その技術の各々において、プラスミド由来のＤＮＡは、目的の遺伝子のみでなく、選択可能かつスクリーニング可能なマーカー遺伝子もまた含むように、遺伝子操作される。選択マーカー遺伝子は、そのプラスミド（目的の遺伝子および選択可能な遺伝子およびスクリーニング可能な遺伝子が１ユニットとして移入されるように構築されている）のコピーを組み込まれた細胞のみを選択するために使用される。スクリーニング可能な遺伝子は、目的の遺伝子を保有する細胞のみの首尾良い培養についての別のチェックを提供する。一般に使用される選択マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ  ＩＩ）である。この遺伝子は、細胞が増殖する増殖培地に直接添加され得る化合物であるカナマイシンに対する耐性を運搬する。植物細胞は、カナマイシンに対して通常感受性であり、その結果、死滅する。ＮＰＴ  ＩＩ遺伝子の存在により、カナマイシンの効果が克服され、そしてこの遺伝子を有する各細胞は、生存したまま残存する。本発明の実施に利用され得る別の選択マーカー遺伝子は、除草剤グルホシネート（Ｂａｓｔａ）に対する耐性を付与する遺伝子である。一般に使用されるスクリーニング可能な遺伝子は、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である。この遺伝子の存在は、推定上形質転換された細胞のサンプルがＧＵＳアッセイ溶液で処理される組織化学的反応を使用して特徴づけられる。適切なインキュベーション後に、ＧＵＳ遺伝子を含有する細胞は、青くなる。
【００５８】
１つ以上のこれらの遺伝子を含有するプラスミドは、以前に言及された技術のいずれかによって、植物のプロトプラストまたはカルス細胞のいずれかに導入される。そのマーカー遺伝子が選択可能な遺伝子である場合、そのＤＮＡパッケージを組み込んだ細胞のみが、適切な植物毒性の薬剤での選択を生き延びる。一旦、適切な細胞が同定され、そして増殖されると、植物が再生される。その形質転換された植物からの子孫は、そのＤＮＡパッケージが植物ゲノム中に首尾良く組み込まれたことを確実にするために試験されなければならない。
【００５９】
哺乳動物宿主細胞はまた、本発明の実施において使用され得る。適切な哺乳動物細胞株の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株２９３Ｓ（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９［１９７７］）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＵｒｌａｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４２１６［１９８０］）；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３［１９８０］）；サル腎臓細胞（ＣＶＩ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ５１）；ラット肝癌細胞（ＨＴＣ，ＭＩ．５４，Ｂａｕｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８５：１［１９８０］）；およびＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４［１９８２］）が含まれる。これらの細胞の発現ベクターは、通常、（必要な場合）複製起点、発現されるべき遺伝子の前に位置するプロモーター、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結部位の、ＤＮＡ配列を含む。
【００６０】
哺乳動物発現ベクターに使用されるプロモーターは、しばしばウイルス由来のものである。これらのウイルスプロモーターは、一般に、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、および最も頻繁には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。ＳＶ４０ウイルスは、初期プロモーターおよび後期プロモーターと呼ばれる２つのプロモーターを含有する。これらのプロモーターは、特に有用である。なぜなら、これらは、両方とも、このウイルスから、ウイルスの複製起点をもまた含む１つのＤＮＡフラグメントとして簡単に入手されるからである（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３［１９７８］）。より小さいかまたはより大きいＳＶ４０  ＤＮＡフラグメントもまた使用され得る。但し、それらは、ウイルスの複製起点に位置するＢｇｌＩ部位に向かってＨｉｎｄＩＩＩ部位から延びる約２５０ｂｐの配列を含む。
【００６１】
あるいは、外来の遺伝子に天然に結合するプロモーター（相同なプロモーター）は、それらが形質転換について選択された宿主細胞株と適合性である限り、使用され得る。
【００６２】
複製起点は、外来の供給源（例えば、ＳＶ４０またはその他のウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＶＳＶ、ＢＰＶ））から得られ得、そしてクローニングベクターに挿入され得る。あるいは、複製起点は、宿主細胞染色体複製機構によって提供され得る。外来遺伝子を含むベクターが宿主染色体に組み込まれた場合、後者はしばしば充分である。
【００６３】
二次的なＤＮＡコード配列の使用により、形質転換細胞株における１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの産生レベルが増強され得る。この二次的なコード配列は、代表的には、酵素ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を含む。ＤＨＦＲの野生型は、通常、化学物質メトトレキサート（ＭＴＸ）によって阻害される。細胞におけるＤＨＦＲ発現のレベルは、培養宿主細胞に添加されるＭＴＸの量に依存して変化する。ＤＨＦＲを二次的な配列として特に有用とするＤＨＦＲのさらなる特徴は、ＤＨＦＲが、形質転換細胞を同定するための選択マーカーとして使用され得ることである。ＤＨＦＲの２つの形態（野生型ＤＨＦＲおよびＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ）は、二次的な配列としての使用のために利用可能である。特定の宿主細胞において使用されるＤＨＦＲの型は、その宿主細胞がＤＨＦＲ欠損性である（それによって、その細胞が非常に低レベルのＤＨＦＲを内因的に産生するか、または機能的なＤＨＦＲを全く産生しないかのいずれかである）か否かに依存する。ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（前出）によって記載されるＣＨＯ細胞株のようなＤＨＦＲ欠損細胞株は、野生型ＤＨＦＲコード配列で形質転換される。形質転換後、これらのＤＨＦＲ欠損細胞株は、機能的なＤＨＦＲを発現し、そして栄養素であるヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠失する培養培地において増殖可能である。形質転換していない細胞は、この培地において生存しない。
【００６４】
ＤＨＦＲのＭＴＸ耐性形態は、ＭＴＸ感受性である正常な量の機能的ＤＨＦＲを内因的に産生する宿主細胞の中の形質転換された宿主細胞を選択する手段として使用され得る。ＣＨＯ−ＫＩ細胞株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＬ６１）は、これらの特徴を有し、従って、この目的のために有用な細胞株である。細胞培養培地へのＭＴＸの添加は、ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲをコードするＤＮＡで形質転換された細胞のみが増殖することを可能にする。形質転換されていない細胞は、この培地中で生存し得ない。
【００６５】
原核生物はまた、本発明の初期クローニング段階のための、または本発明のタンパク質の発現のための、宿主細胞として使用され得る。これらは、大量のＤＮＡの迅速な産生のため、部位特異的変異誘発に使用される一本鎖ＤＮＡテンプレートの産生のため、多くの変異体を同時にスクリーニングすることのため、および生成される変異体のＤＮＡ配列決定のために、特に有用である。適切な原核生物宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株９４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７，３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ｎｏ．３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｂが含まれる。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉの多くの他の株（例えば、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９）ならびに原核生物の多くの他の種および属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのような桿菌）、他の腸内細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａｎｓ）、および種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種は、全て、宿主として使用され得る。原核生物宿主細胞または堅い細胞壁を有する他の宿主細胞は、好ましくは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）の１．８２節に記載される塩化カルシウム法によって形質転換される。あるいは、エレクトロポレーションが、これらの細胞の形質転換のための使用され得る。原核生物形質転換技術は、Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２：２７５−２９６，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，１９９０；Ｈａｎａｈａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｏｌ．，２０４：６３（１９９１）に示される。
【００６６】
代表的な例として、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするｃＤＮＡ配列は、異種宿主としてのＥ．ｃｏｌｉ中での過剰発現のための市販の（Ｎｏｖａｇｅｎから）（Ｈｉｓ）6＊Ｔａｇ  ｐＥＴベクターに移入され得る。このｐＥＴ発現プラスミドは、高レベルでの異種発現系において、いくつかの利点を有する。所望のｃＤＮＡインサートは、６個のヒスチジンおよび続いて高度に特異的なプロテアーゼ認識部位（トロンビン）（これらは、標的タンパク質のアミノ末端コドンに結合されている）をコードするプラスミドベクター配列にインフレームで連結される。発現された融合タンパク質のヒスチジン「ブロック」は、固定された金属イオンへの非常に堅固な結合を促進し、そして固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによるその組換えタンパク質の迅速な精製を可能にする。次いで、ヒスチジンリーダー配列が、トロンビンでの精製タンパク質の処理により、特定のタンパク質分解部位で切断され、そして１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼが、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによって再び（今度は、組換えレダクトイソメラーゼを、ヒスチジンブロックが未だ吸着されたままで溶出するために、より浅いイミダゾール勾配を使用）精製される。この過剰発現精製系は、高い能力、良好な分離力を有し、そして迅速で、かつ類似の結合振る舞いを示す（トロンビンタンパク質分解の前および後）Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質の混入の機会が非常に少ない。
【００６７】
当業者に明らかなように、宿主細胞と適合性である種に由来するレプリコン配列および制御配列を含有する任意のプラスミドベクターもまた、本発明の実施のために使用され得る。このベクターは、通常、複製部位、形質転換細胞において表現型選択を提供するマーカー遺伝子、１つ以上のプロモーター、および外来ＤＮＡの挿入のためのいくつかの制限部位を含有するポリリンカー領域を有する。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換のために代表的に使用されるプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣＩ１８、ｐＵＣ１１９およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１３が含まれ、これらの全てがＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）の１．１２−１．２０節に記載される。しかし、多くの他の適切なベクターもまた利用可能である。これらのベクターは、アンピシリン耐性および／またはテトラマイシン耐性をコードする遺伝子（これらは、これらのベクターで形質転換された細胞が、これらの抗生物質の存在下で増殖するのを可能にする）を含有する。
【００６８】
原核生物ベクターにおいて最も一般的に使用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３７５：６１５［１９７８］）；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８：１０５６［１９７７］）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４［１９７９］）およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，８：４０５７［１９８０］）；ＥＰＯ出願公開第３６，７７６号）、およびアルカリホスファターゼ系が含まれる。これらは、最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターが利用されてきており、そしてこれらのヌクレオチド配列についての詳細は、公開されており、当業者がこれらを機能的にプラスミドベクター中に連結することを可能にしている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ，２０：２６９［１９８０］を参照のこと）。
【００６９】
通常、細胞から分泌される多くの真核生物タンパク質は、内因性分泌シグナル配列をアミノ酸配列の一部として含有する。従って、通常細胞質に見出されるタンパク質は、シグナル配列をそのタンパク質に連結することによって分泌されるように標的化され得る。これは、シグナル配列をコードするＤＮＡをそのタンパク質をコードするＤＮＡの５’末端に連結し、次いでこの融合タンパク質を適切な宿主細胞において発現することによって容易に達成される。そのシグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を有するタンパク質をコードする任意の遺伝子から、制限フラグメントとして得られ得る。従って、原核生物、酵母、および真核生物のシグナル配列が、本発明を実施するために利用される宿主細胞の型に依存して、本明細書において使用され得る。いくつかの真核生物遺伝子（例えば、ヒト成長ホルモン、プロインスリン、およびプロアルブミンを含む）のシグナル配列部分をコードするＤＮＡおよびアミノ酸配列が公知であり（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐ．７６９［１９８８］を参照のこと）、そして適切な真核生物宿主細胞におけるシグナル配列として使用され得る。例えば、酸ホスファターゼ（Ａｒｉｍａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１：１６５７［１９８３］）、α因子、アルカリホスファターゼ、およびインベルターゼのような酵母シグナル配列は、酵母宿主細胞からの分泌を指向するために使用され得る。例えば、ＬａｍＢまたはＯｍｐＦ（Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ，６８：１９３［１９８８］）、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、またはβ−ラクタマーゼ、ならびに他の遺伝子をコードする遺伝子由来の原核生物シグナル配列は、原核生物細胞からのタンパク質を培養培地へ標的化するために使用され得る。
【００７０】
植物、動物、および微生物由来のトラフィッキング配列は、本発明の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質を細胞質、小胞体、ミトコンドリア、または他の細胞成分に指向するために、あるいは、培地に移出するためにそのタンパク質を標的化するために、本発明の実施において利用され得る。これらの考慮は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの過剰発現、および任意の所望の位置での遺伝子産物機能を可能にする細胞またはインタクトな生物内での発現の指向に当てはまる。
【００７１】
複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子をコードするＤＮＡ、および目的の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼＤＮＡを含有する適切なベクターの構築は、標準的な組換えＤＮＡ手順を使用して調製される。単離されたプラスミドおよびＤＮＡフラグメントは、当該分野で周知のように（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと）、所望のベクターを生成するために特定の順序で、切断され、調整され、そして連結される。
【００７２】
本発明の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質は、例えば、本発明の核酸分子（ｃＤＮＡ分子のような）を発現ベクターに組み込み、その発現ベクターを宿主細胞に導入し、そしてその核酸分子を発現してタンパク質を産生することによって単離され得る。宿主細胞および発現ベクターの代表的な例を本明細書に示す。次いで、そのタンパク質は、当該分野で認識されている手段によって精製され得る。粗タンパク質抽出物が、はじめに調製される場合、その抽出物中に１つ以上のプロテイナーゼインヒビターを含むことが所望され得る。プロテイナーゼインヒビターの代表的な例には、セリンプロテイナーゼインヒビター（例えば、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））、ベンズアミド、ベンズアミジンＨＣｌ、ε−アミノ−ｎ−カプロン酸およびアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ））；システインプロテイナーゼインヒビター（例えば、ｐ−ヒドロキシメルクリ安息香酸ナトリウム）；競合的プロテイナーゼインヒビター（例えば、アンチパインおよびロイペプチン）；共有結合プロテイナーゼインヒビター（例えば、ヨード酢酸およびＮ−エチルマレイミド）；アスパラギン酸（酸性）プロテイナーゼインヒビター（例えば、ペプスタチンおよびジアゾアセチルノルロイシンメチルエステル（ＤＡＮ）；メタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＥＧＴＡ［エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸］、およびキレーターの、１，１０−フェナントロリンを含むことが所望され得る。
【００７３】
タンパク質を生物学的材料から精製または部分的に精製するための当該分野で認識されている技術の代表的な例は、排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および固定化金属アフィニティークロマトグラフィーである。
【００７４】
疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーは、サンプルの疎水性部分とクロマトグラフィーマトリックス上に存在する不溶性の固定化疎水性基との間の相互作用に基づく、２つの別々の方法である。疎水相互作用クロマトグラフィーにおいて、そのマトリックスは、親水性であり、そして短鎖フェニルまたはオクチルの非極性基で置換される。その移動相は、通常水性の塩溶液である。逆相クロマトグラフィーにおいて、そのマトリックスは、より長いｎ−アルキル鎖で置換されたシリカ（通常Ｃ8（オクチルシリル）またはＣ18（オクデシルシリル））である。そのマトリックスは、その移動相よりも極性ではない。その移動相は、通常、水とより極性ではない有機修飾基との混合物である。
【００７５】
疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス上での分離は、通常、一般的に、非変性条件である水性塩溶液において行われる。サンプルは、マトリックス上に、高塩緩衝液中でロードされ、そして下降塩勾配によって溶出される。逆相媒体上での分離は、通常、しばしば、変性条件である水性と有機性の溶媒の混合物中で行われる。タンパク質および／またはペプチドの精製の場合、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、表面疎水性基に依存し、そしてそのタンパク質分子の完全性を維持する条件下で行われる。逆相クロマトグラフィーは、そのタンパク質のネイティブの疎水性に依存し、そしてほとんど全ての疎水性基をマトリックスに曝露する条件（すなわち、変性条件）下で行われる。
【００７６】
イオン交換クロマトグラフィーは、特にイオン性またはイオン化可能な化合物の分離のために設計される。固定相（カラムマトリックス材料）は、化学結合によって固定相に固定されたイオン化可能官能基を保有する。これらの固定された電荷は、反対の記号の対イオンを保有する。この対イオンは、固定されておらず、そして置換され得る。イオン交換クロマトグラフィーは、置換可能な電荷の記号に基づいて命名される。従って、アニオンイオン交換クロマトグラフィーにおいて、固定された電荷は、正であり、そしてカチオンイオン交換クロマトグラフィーにおいて、固定された電荷は、負である。
【００７７】
イオン交換クロマトグラフィーカラム上での分子の保持は、固定された電荷とその分子の電荷との間の静電的相互作用を含み、結合は、その分子での固定されていないイオンの置換を含む。溶出は、次いで、、その分子よりも固定された電荷に対して大きい親和性を有する新たな対イオンによる固定された電荷からのその分子の置換を含み、これは次に、新たな固定されていないイオンとなる。
【００７８】
対イオン（塩）が、固定化電荷に結合した分子を置換する能力は、その分子と塩との両方の固定された電荷と固定されていない電荷との間の親和性における差異の関数である。親和性は、次いで、いくつかの変数（分子の正味の電荷の大きさおよび置換のために使用される塩の濃度およびタイプを含む）によって影響を受ける。
【００７９】
イオン交換クロマトグラフィーに使用される固相パッキングは、セルロース、デキストラン、アガロース、およびポリスチレンを含む。使用される交換基は、イオン化した場合に正味で正の電荷を有し、それゆえ、アニオンに結合しそしてアニオンを交換する弱塩基である、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）；イオン化した場合に、負電荷を有し、カチオンに結合してカチオンを交換する弱酸である、ＣＭ（カルボキシメチル）を含む。弱アニオン交換体の別の形態は、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）官能基を含有する。この材料は、最も通常には、薄層シート上に見出され、それらのｐＩを超えるｐＨ値で結合タンパク質に有用である。そのポリスチレンマトリックスは、強塩基アニオン交換のために４級アンモニウム官能基を伴なって、または強酸カチオン交換のためにスルホン酸官能基を伴って得られ得る。中間のおよび弱いイオン交換材料もまた利用可能である。イオン交換クロマトグラフィーは、カラムを使用して行われる必要はなく、そしてビーカーのような容器中で固定相のスラリーを用いるバッチイオン交換クロマトグラフィーとして行われ得る。
【００８０】
ゲル濾過は、クロマトグラフィー支持体として多孔性のビーズを使用して行われる。このようなビーズから構成されたカラムは、２つの測定可能な液体体積を有する：ビーズ間の液体からなる排除体積、およびビーズの孔内の液体からなる内部体積。大きな分子は、外部体積とのみ平衡化し、一方、小さい分子は、外部および内部体積の両方と平衡化する。分子（例えば、タンパク質）の混合物は、ゲル濾過カラムの上部の別個の体積またはゾーンに適用され、そしてそのカラムを通して浸透される。大きな分子は、内部体積から排除され、そして従って、カラムから最初に現れるが、一方、内部体積にアクセスし得るより小さな分子は、より後に現れる。タンパク質精製のために使用される従来のマトリックスの体積は、代表的には、分画化されるサンプルの容量の３０〜１００倍である。カラム溶出物の吸光度は、フローモニターを使用して所望の波長で連続的にモニターされ得る。
【００８１】
タンパク質の精製にしばしば適用される技術は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。ＨＰＬＣは、伝統的なクロマトグラフィーシステムの操作理論および作製の両方における進歩である。生物学的高分子の分離のためのＨＰＬＣシステムは、伝統的なカラムクロマトグラフィーシステムから３つの点において異なる；（１）カラムパッケージ材料は、より大きな力学的強度を有する、（２）カラムパッケージ材料の粒径は、１／５から１／１０に減少しており、吸着−脱着動力学を増強し、そしてビーズが広がることを減少させる、および（３）そのカラムは、１０〜６０倍高い移動相速度で操作される。従って、非限定的な例示として、ＨＰＬＣは、排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを利用し得る。タンパク質およびペプチドの精製のために当該分野で認識されている技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１８２，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ．  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編（１９９０）に示され、この文献は、本明細書に参考として援用される。
【００８２】
別の局面において、本発明は、宿主細胞（例えば、植物細胞）において、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質の発現のレベルを減少させる方法に関する。多くの方法が、植物において遺伝子発現を阻害するために使用され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡが、都合良く使用され得る。遺伝子発現を阻害する発達的系のためのアンチセンスＲＮＡ技術の首尾良い利用は、以前に実証されている（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら、１９９０  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４５７；Ｖｉｓｓｅｒら、１９９１，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５：２８９；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：２８４；Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら、１９９０，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：３０１３；Ｈｕｄｓｏｎら、１９９２、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９８：２９４；米国特許第４，８０１，３４０号、同第５，７７３，６９２号、同第５，７２３，７６１号、および同第５，９５９，１８０号）。例えば、ポリガラクトウロナーゼは、トマトの成熟の後期段階の間の、果実軟化のプロセスに関連づけられている（Ｈａｉｔｔら、１９８９、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｅｔｌｏｗ編，ｐ４９；Ｓｈｅｅｈｙら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８８０５；Ｓｍｉｔｈら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：７２４）。トマトゲノムへのアンチセンス構築物の組み込みは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下にて、遺伝子発現の９０％の抑制をもたらしている。
【００８３】
アンチセンス遺伝子は、その正常な転写の方向とは逆向きにされているＤＮＡ配列であり、そしてそのようにして、宿主細胞内で発現された標的ｍＲＮＡ分子に相補的なＲＮＡ転写物を発現する（すなわち、そのアンチセンス遺伝子のＲＮＡ転写物は、ワトソン−クリック塩基対形成を介して標的ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズし得る）。アンチセンス遺伝子は、標的遺伝子（例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ遺伝子）の発現を妨害し得る限り、多くの異なる様式で構築され得る。アンチセンス遺伝子は、標的遺伝子のコード領域（またはその部分）を、その正常な転写の方向に対して逆転し、その相補物の転写を可能にすることによって構築され得、従って、そのアンチセンス遺伝子およびセンス遺伝子によってコードされるＲＮＡは、相補的である。
【００８４】
アンチセンス遺伝子は、一般に、標的遺伝子の少なくとも一部に実質的に同一である。しかし、この配列は、発現を阻害には完全に同一である必要はない。概して、より短いアンチセンス遺伝子の使用を補償するには、より高い相同性が使用され得る。アンチセンス遺伝子は、一般に、標的遺伝子に実質的に同一（ただし、アンチセンス方向であるが）である。最小同一性は、代表的には約６５％より大きいが、同一性が高いほど、内因性配列の発現のより効果的な抑制をもたらし得る。実質的には、約８０％より大きい同一性が好ましいが、完全同一に対して約９５％が最も好ましい。
【００８５】
さらに、アンチセンス遺伝子は、標的遺伝子と同じイントロンパターンまたはエキソンパターンを有する必要はなく、そして標的遺伝子の非コードセグメントは、標的遺伝子発現のアンチセンス抑制を達成するにおいて、コードセグメントと同等に効果的であり得る。通常、少なくとも約３０または４０ヌクレオチドのＤＮＡ配列が、アンチセンス遺伝子として用いられるはずであるが、より長い配列が好ましい。次いで、この構築物は１つ以上の植物細胞（これから、植物全体が本明細書に記載のように再生され得る）中に形質転換され、そしてＲＮＡのアンチセンス鎖が生成される。
【００８６】
触媒性ＲＮＡ分子またはリボザイムもまた、標的遺伝子の発現を阻害するために用いられ得る。標的ＲＮＡと特異的に対を形成し、そして特異的な位置でホスホジエステル骨格を切断し、これにより標的ＲＮＡを機能的に不活性化するＲＮＡリボザイム、をコードするリボザイムトランスジーンを設計することが可能である。この切断を実行するにおいて、このリボザイム自体は変更されない、従って、このリボザイムは、リサイクリングし、他の分子を切断し得る。アンチセンスＲＮＡ内へのリボザイム配列の包含は、そこでＲＮＡ切断活性を付与し、それによりアンチセンス構築物の活性を増大させる。
【００８７】
リボザイムの１つのクラスは、植物内で自己切断かつ複製し得る多数の小さい環状ＤＮＡから誘導される。ＲＮＡは、単独で（ウイロイドＲＮＡ）またはヘルパーウイルス（サテライトＲＮＡ）とともにのいずれかで複製される。例としては以下が挙げられる：アボガドサンブロッチ（ａｖｏｃａｄｏ  ｓｕｎｂｌｏｔｃｈ）ウイロイド由来のＲＮＡ、ならびにタバコリングスポットウイルス、ルーサントランジエントストリーク（ｌｕｃｅｒｎｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｓｔｒｅａｋ）ウイルス、ビロードタバコ斑点（ｖｅｌｖｅｔ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｔｔｌｅ）ウイルス、ナスノディフローラム斑点（ｓｏｌａｎｕｍ  ｎｏｄｉｆｌｏｒｕｍ  ｍｏｔｔｌｅ）ウイルスおよび地下クローバー斑点（ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ  ｃｌｏｖｅｒ  ｍｏｔｔｌｅ）ウイルス由来のサテライトＲＮＡ。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計および使用は、Ｈａｓｅｌｏｆｆら（１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５〜５９１）（米国特許第５，６４６，０２３号もまた参照のこと）（この両方の刊行物は、参考として本明細書に援用されている）に記載されている。Ｔａｂｌｅｒら（１９９１，Ｇｅｎｅ  １０８：１７５）は、１つの構築物中において、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイム技術の利点を組み合わせることにより触媒性ＲＮＡの構築をかなり簡略にした。リボザイム触媒には、より小さい領域の相同性が必要である。従って、これは、切断部位が保存される場合、より大きい遺伝子ファミリーの異なるメンバーの抑制を促進し得る。
【００８８】
標的遺伝子発現の別の方法は、センス抑制である。センス方向に一致された核酸分子の導入は、現在、標的遺伝子の転写をブロックするのに有効な手段であることが示されている。内因性遺伝子の発現を調節するためのこの方法の使用の例については、Ｎａｐｏｌｉら（１９９０  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９〜２８９）、および米国特許第５，０３４，３２３号、同第５，２３１，０２０号、同第５，２８３，１８４号、および同第５，９４２，６５７号（それぞれの刊行物は、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。センス抑制については、導入された配列（完全同一性ほどは必要としない）はまた、一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡのいずれかに対して、全長である必要はない。これは過剰発現体であるいくつかの植物の同時産生を回避することが好ましくあり得る。全長配列よりも短く同一性が高いほど、より長く同一性の少ない配列について補償しうる。さらに、導入された配列は、同じ同じイントロンパターンまたはエキソンパターンを有する必要はなく、そして非コードセグメントの同一性は、等しく有効である。通常、アンチセンス調節について上記されるサイズの範囲の配列が使用される。
【００８９】
より最近では、標的遺伝子の発現を抑制する新しい方法が開発されている。この方法は、自己アニーリングして二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ構造を形成するｍＲＮＡの産生を指向する逆方向反復トランスジーンの宿主細胞への導入を包含する（Ｖｉｏｎｎｅｔら、１９９８  Ｃｅｌｌ  ９５：１７７〜１８７；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３９５９〜１３９６４；Ｍｉｓｑｕｉｔｔａら、１９９９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４５１〜１４５６；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２：１０９〜１１３；Ｓｈａｒｐ，１９９９  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１３：１３９〜１４１）。このｄｓＲＮＡ分子は、未知の様式で、ｄｓＲＮＡに対して相同な内因性遺伝子の転写後発現を妨害する。ｄｓＲＮＡの相同性の領域は、標的遺伝子のエキソン部分に相同である領域を含むはずであることが示されている。従って、ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の非コード部分に相同である配列を含み得る。あるいは、遺伝子抑制的ｄｓＲＮＡはまた、２つの異なるトランスジーン（１方はセンスＲＮＡを発現し、そしてもう一方は相補的なアンチセンスＲＮＡを発現する）で細胞を形質転換することにより産生され得る。
【００９０】
標的遺伝子の転写された配列の逆方向反復を含む構築物は、例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９８）前出、により提供されるガイダンスに従って、形成され得る。構築物の逆方向反復は、ヘッドからヘッド、またはテールからテール配列において反復された転写された約２００〜１５００ｂｐのＤＮＡを含む。この反復は、約２００〜１５００ｂｐの非反復ＤＮＡ（これはまた、標的遺伝子の転写された領域の一部であり得るか、または異なる遺伝子由来であり得る）により分離され、そしておそらくイントロンを含む。適切な逆方向反復構築物は、以下の順での結合により作成され得る：植物プロモーター；「センス」方向に配向された標的ｃＤＮＡからの３’領域；標的ｃＤＮＡからの５’領域；標的ｃＤＮＡコード領域の同じ３’領域（ただし、「アンチセンス」方向に配向された）；および最後にポリＡ付加シグナル。標的植物への逆方向トランスジーンの導入から得られる転写ＲＮＡは、抑制されるべき標的遺伝子由来の配列を含む内部ｄｓＲＮＡ領域を形成する能力を有する。ｄｓＲＮＡ配列は、単数の、またはおそらくは複数の標的遺伝子を抑制するように選択される。いくつかの場合、ｄｓＲＮＡ形成の能力を有する配列は、２つ以上の関連する標的遺伝子（例えば、遺伝子ファミリーのメンバー）に由来し得る。
【００９１】
標的遺伝子活性の抑制に適切なさらなるストラテジーは、ドミナントネガティブ変異の生成のための一般的基準に従って、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の変異したかまたは部分的に欠失した形態のセンス発現を引き起こす（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ  Ｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：２１９〜２２（１９８７））。ドミナントネガティブな変異を生成したストラテジーの例が提供されている（Ｍｉｚｕｋａｍｉ，１９９６；Ｅｍｍｌｅｒ，１９９５；Ｓｈｅｅｎ，１９９８；および  Ｐａｚ−Ａｒｅｓ，１９９０）。
【００９２】
野生型標的遺伝子の機能はまた、標的遺伝子に隣接するＤＮＡ領域を用いることにより排除または減弱され、標的遺伝子コード配列の挿入的破壊を媒介し得る（Ｍｉａｏら、１９９５；Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：３５９〜３６５；Ｋｅｍｐｉｎら、１９９７  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：８０２〜８０３）。標的された遺伝子置換は、標的遺伝子に隣接するＤＮＡ領域を含む形質転換ベクター中の配列と対応する染色体配列との間の相同組換えにより媒介される。選択マーカー（例えばカナマイシン、ｂａｒまたはｐａｔ）、または選択マーカー（例えば、β−グルコシダーゼ（ＧＵＳ））は、標的遺伝子隣接領域の間に含まれる。これらのマーカーは、標的遺伝子置換を受けた細胞の同定を容易にする。
【００９３】
以下の実施例は、本発明を実施するために現在考えられる最良の形態を例示するが、本発明を限定するとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
（ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするｃＤＮＡ分子の単離）
精油生合成のために高度に特化された細胞型である、単離されたペパーミント油（ハッカ油）腺分泌細胞由来のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築した（Ｌａｎｇｅ，Ｂ．Ｍ．およびＣｒｏｔｅａｕ，Ｒ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２：１３９〜１４４（１９９９））。レダクトイソメラーゼ遺伝子のおそらく保存された領域に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計し（Ｐ１，５’−ＣＧＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣ−３’（配列番号３）；Ｐ２、５’−ＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＡＡＣＣＣＴＴＧ−３’（配列番号４））、そしてテンプレートとしてハッカ油腺ライブラリーｃＤＮＡとともに使用して、Ｅ．ｃｏｌｉレダクトイソメラーゼ遺伝子に有意な相同性を有するｐＭＰＤＸＲ１（配列番号５）と名付けられた２２３ｂｐフラグメントを増幅した。ｐＭＰＤＸＲ１（配列番号５）に由来する標識したプローブを用いてハッカ油腺ｃＤＮＡライブラリー（２．５×１０4プラーク）をスクリーニングすることにより、配列番号１に示す核酸配列を有するｃＤＮＡ分子を含む、５つの全長クローンを得た。
【００９５】
（実施例２）
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするｃＤＮＡ分子の単離）
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ花蕾ｃＤＮＡライブラリー（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ａｉｍｓ．ｃｐｓ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ａｉｍｓ／由来のＣＤ４−６）をｐＭＰＤＸＲ１（配列番号５）でスクリーニングし、そして２０の陽性クローン（例えば、配列番号６に示される配列を有するｃＤＮＡ分子、その全てはわずかに５’短縮されている）を得た。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ花蕾ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための条件は以下であった：５×ＳＳＣで６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション、その後、２×ＳＳＣ中で、室温で、１回の洗浄あたり２０分、２回の洗浄、次いで、１×ＳＳＣ中で、５５℃３０分間の洗浄１回。
【００９６】
（実施例３）
（ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）およびＥ．ｃｏｌｉ由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの機能的発現）
さらなるプライマーセット（Ｐ３，５’−ＧＴＣＴＣＡＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＧＡＡＧＣＡＡＣＴＣＴＣＡＣ−３’（配列番号８）およびＰ４、５’−ＣＴＣＴＧＴＡＧＣＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＧＡＧＡＣ−３’（配列番号９））を使用して、全長Ｅ．ｃｏｌｉレダクトイソメラーゼ遺伝子を増幅し、そして得られたアンプリコンを、酵素の機能的発現における陽性コントロールとしての使用のためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）に挿入した。
【００９７】
この全長ペパーミント１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼｃＤＮＡ（ｐＭＰＤＸＲ１８（配列番号１）と名付けられる）およびＥ．ｃｏｌｉレダクトイソメラーゼクローン（ｐＥＣＤＸＲ２０）を、再配列を触媒する能力および１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートから２−Ｃ−メチル−エリスリトール−４−ホスフェートへのピリジンヌクレオチド依存性還元を触媒する能力について、Ｅ．ｃｏｌｉ中の発現により評価した。
【００９８】
図２は、（Ａ）組換えペパーミント１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（配列番号２）により生成された脱リン酸化生合成産物のトリメチルシリルエーテル誘導体（Ｒt＝７．１±０．１分）、および（Ｂ）同じく調製された標準の２−Ｃ−メチル−Ｄ，Ｌ−エリスチトールのトリメチルシリルエーテル誘導体（Ｒt＝７．１±０．１分）のＧＣ−ＭＳ分析を示す。スペクトルＡ中のｍ／ｚ  １１６、１３１、１４７クラスター中の相対的イオン強度のわずかな差異は、生合成産物の場合の混入のバックグラウンドの差引に起因する。ここで全イオン量は標準の１／１０未満であった（Ｂ）。酵素調製のために、形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞を適切な抗生物質を補充した５０ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で３７℃で０．５のＡ600まで増殖させた。次いで、ペパーミント１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼｃＤＮＡ（配列番号１）を保有する細胞を、２０℃で２時間インキュベートし、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、そして１５時間２０℃に維持した。Ｅ．ｃｏｌｉ由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする核酸配列を保有する細胞を、同様に誘導し（ただし、１ｍＭ  ＩＰＴＧ）、そして３７℃で５時間維持した。遠心分離により細菌を収集し、１ｍｌのアッセイ緩衝液（２ｍＭ  ＭｎＣｌ2および０．５ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含有する、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で洗浄し、１ｍｌのアッセイ緩衝液中に再懸濁し、次いで、０〜４℃での短い超音波処理により破壊した。得られたホモジネートを遠心分離して、ペレット破片にし、各調製物のアリコート（１５μｌ）を０．１ｍｍｏｌの［１−14Ｃ］デオキシキルロースホスフェート（１８．５ｋＢｑ）とともに２３℃で１０分間インキュベートした。反応混合物に、５０μｌの１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3を添加し、この懸濁液をＮａｎｏｓｅｐカラム（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ；３０，０００ｋＤａカットオフ）を通して濾過し、そして濾液を、イオン対試薬として１０ｍＭ
テトラブチル酢酸アンモニウムを用いる、エスタブリッシュド逆相イオン対放射性ＨＰＬＣ法（ＭｃＣａｓｋｉｌｌ，ＤおよびＣｒｏｔｅａｕ，Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１５：１４２〜１４９（１９９８）の変法により分析した。両方の供給源からの酵素アッセイは、上記の半調製ＨＰＬＣにより単離した、Ｒｔ＝３４．０分での新しい放射標識産物の存在を示した。減圧下での溶媒の除去後、残りの物質を５０μｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、ここに１０単位の小麦胚芽酸性ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、その後２３℃で２時間インキュベートした。反応を５０μｌのアセトンで終止し、次に、遠心分離し、上清を移し、そして減圧下で溶媒を除去した。残留物質を２０μｌの無水ジエチルアステルに溶解し、そして以前に記載の様にＧＣ−ＭＳ分析のためにトリメチルシリルエーテル誘導体に変換した（Ｌａｎｇｅ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，２１００〜２１０４（１９９８））。組換えペパーミント１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（配列番号２）およびＥ．ｃｏｌｉレダクトイソメラーゼに由来する産物の質量スペクトルは同一であった。
【００９９】
両方の供給源からの誘導産物は、同一に誘導された２−Ｃ−メチル−Ｄ，Ｌ−エリスロイルの基準試料として、同じ保持時間（７．１±０．１分）、および質量スペクトルを示した（図２Ｂ）。これにより、植物１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホシフェートレダクトイソメラーゼ（配列番号２）の同一性を確認し、そして植物酵素（配列番号２）がプレタンパク質形態で活性であることを示す。
【０１００】
ケトール酸レダクトイソメラーゼにより触媒される反応（１−デオキシ−Ｄ−キルロース−５−ホシフェートレダクトイソメラーゼにより触媒される反応に似ている）は、順序付けられた機構に従う。ここでは、ＮＡＤＰＨおよび金属イオン補因子がまず結合し、次がアセトヒドロキシ酸基質である（Ｃｈｕｎｄｕｒｕ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８、４８６〜４９３（１９８９））。ＮＡＤＰＨおよびマンガン（またはマグネシウム）はまた、メチルエリスリトールホスフェートへのデオキシキシルロースホスフェートの酵素変換（メチルエリスロースホスフェートのような中間体は、これらの補因子の存在下または非存在下で観察されなかった）に必要であり、類似の反応機構がデオキシキシルロースホスフェートレダクトイソメラーゼについて想定され得る。
【０１０１】
（実施例４）
（ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの配列分析）
ペパーミント１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼｃＤＮＡ（配列番号１）は、４７５推定アミノ酸残基（配列番号２）のタンパク質をコードする、１４２５ｂｐのオープンリーディングフレームを含む。最初の７３アミノ酸は、プラスチドの標的配列の代表的特徴を示し（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０，５３５〜５４５（１９８９））、これは、植物プラスチド（メバロネート依存性経路が作動する）中のこの酵素の細胞内の局在化と一致している（Ｓｃｈｗａｒｚ、Ｍ．Ｋ．（１９９４）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｅｉｄｇｅｎｏｅｓｓｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ，Ｚｕｅｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ，Ｈ．Ｋ．、Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ，Ｊ．，Ｄｉｓｃｈ，ＡおよびＲｏｈｍｅｒ，Ｍ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４００，２７１〜２７４）。推定の移行ペプチドを規定する残基が排除される場合、成熟酵素のサイズは、約４３．５ｋＤａと推定される。翻訳された配列の整列（適切な場合、プラスチド標的ペプチドを欠く）は、ペパーミント１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（配列番号２）とＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来の推定の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼフラグメント（配列番号７）との間（８８．０％類似性／８４．２％同一性）、ならびにシアノバクテリウムＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３由来のＳＬＬ００１９との間（７２．３／６３．７％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＢＧ１３４０９（５６．９／４５．５％）、Ｅ．Ｃｏｌｉのレダクトイソメラーゼとの間（５３．４／４３．０％）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＨＩＯ８０７との間（５５．５／４１．８％）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲｖ２８７９ｃとの間（５２．８／４３．６％）およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来のＨＰ０２１６との間（５０．７／３８．１％）の有意な相同性を示す。このペパーミントｃＤＮＡ（配列番号２）はまた、受託番号Ｔ４３９４９としてＧｅｎｂａｎｋデータベースに寄託された、機能未知の非常に短縮されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡフラグメント（配列番号１０）に、そして受託番号ＡＢ００９０５３としてＧｅｎｂａｎｋデータベースに寄託された、機能未知のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムクローンのエキソン部分（配列番号１１）に対して、有意な相同性を示す。配列番号１１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムクローンのネガティブ（すなわち、非コード）鎖の配列に示されることに注意のこと。
【０１０２】
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼの反応機構およびケトール酸レダクトイソメラーゼの反応機構（分枝鎖アミノ酸の生合成において、２−アセトラクテートの、２，３−ジヒドロキシイソバリレートへの再抗生および還元、ならびに２−アセト−２−ヒドロキシブチレートの２，３−ジヒドロキシ−３−メチルバリレートへの再構成および還元を触媒する（Ｍｒａｃｈｋｏ，Ｇ．Ｔ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９４，４４６〜４５３（１９９２）））は、いくつかの類似性を共有するが、これらの酵素の推定アミノ酸配列は、全く別個である（約３５％類似性）。しかし、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ配列のＮ末端は、ケトール酸レダクトイソメラーゼの推定されたＮＡＤＰＨ結合部位のサイン配列（ＧＸＧＸＸＧＸＸＸＧ）（配列番号１３）に同じ相同性を有する保存されたモチーフ（ＧＳＴＧＳＩＧ）（配列番号１２）を含む（Ｒａｎｅ，Ｍ．Ｊ．およびＣａｌｖｏ，Ｋ．Ｃ．．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３８，８３〜８９（１９９７））。
【０１０３】
ペパーミント由来のデオキシキシルロースホスフェートシンターゼ（Ｌａｎｇｅ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，２１００〜２１０４（１９９８））および１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（配列番号１）の両方をコードするｃＤＮＡの単離は、植物プラスチドおよびいくつかの真正細菌におけるピルビン酸／グリセルアルデヒド−３−ホスフェート経路における類似の触媒性機構の操作のための実質的な証拠を提供する。この本質的な経路は、植物および細菌に存在するが動物には明白に存在しないので、シンターゼおよびレダクトイソメラーゼの両方は、非常に特異的な除草剤、抗マラリア剤（Ｊｏｍａａ，Ｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５７３〜１５７６（１９９９）および抗生物質（Ｋｕｚｕｙａｍａ、Ｔら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９，７９１３〜７９１６（１９９８））の新規のクラスの開発のための標的である。デオキシキシルロースホスフェートは、高等植物におけるチアミン（Ｊｕｌｌｉａｒｄ，Ｊ．Ｈ．およびＤｏｕｃｅ，Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，２０４２〜２０４５（１９９１））およびおそらくはピリドキソール（ｐｙｒｉｄｏｘｏｌ）（Ｈｉｌｌ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３０４２６〜３０４３５（１９９６））、ならびにイソペンテニルジホスフェート（ＭｃＣａｓｋｉｌｌ，Ｄ．およびＣｒｏｔｅａｕ，Ｒ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．４０．６５３〜６５６（１９９９））の生合成のための前駆体として働くが、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼは、葉緑素およびプラストキノンのカロチノイドおよびプレニル側鎖を含む、この一般的中間体のプラスチドのイソプレノイドへの変換における最初の関係付けられた工程を触媒する（Ｂｏｕｖｉｅｒ、Ｆ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１７，１４２３〜１４３１（１９９８））。この特異的形質転換は、プラスチドにおけるイソプレノイド生合成の調節された（そして可能性としては律速段階の）工程であることが予期され得る。
【０１０４】
（実施例５）
（本発明の現在好ましい１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質の物質的な特徴）
表１は、本発明の現在好ましい１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼタンパク質の物質的な特徴を示す。
【０１０５】
【表１】
2010104384.tif 000003
（実施例６）
（本発明の他の核酸配列に対するペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼｃＤＮＡ（配列番号１）の一部のハイブリダイゼーション）
ヌクレオチド２３０〜ヌクレオチド１４９６に伸びるペパーミント１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼｃＤＮＡクローン（配列番号１）の一部、およびその相補的な核酸鎖を放射線標識し、そして以下の植物から単離されたフィルター保有ＲＮＡサンプルをプローブするために用いた：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの葉組織；トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の葉組織；トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）の葉組織；およびベイモミ（Ｇｒａｎｄ  ｆｉｒ）（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）針葉。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ編）の９．５２〜９．５５頁（この引用ページは参考として本明細書に援用される）に記載のように、ニトロセルロースフィルターまたはナイロンメンブレン上に固定された核酸へ放射性標識核酸プローブをハイブリダイズする技術を利用して、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を実施した。ハイブリダイゼーションは、３×ＳＳＣ中で６５℃で１６時間、その２×ＳＳＣ中で後１回洗浄について２３℃で２０分間を２回、続いて０．５×ＳＳＣ中で５５℃で３０分間を１回であった。
【０１０６】
各ＲＮＡサンプル中（推定１．７ｋｂ〜２．０ｋｂサイズ範囲中）で、単一のｍＲＮＡバンドを検出した。クローニングしたペパーミントのｃＤＮＡ（配列番号１）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｃＤＮＡ（配列番号６）に対応するｍＲＮＡの推定サイズは、約１．７ｋｂである。これらの結果は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするｍＲＮＡ分子の配列が広範な系統学的に異なる植物種の間で高度に保存されていることを示す。
【０１０７】
本発明の好ましい実施形態は例示され、そして記載されているが、種々の変化が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、そこでなされ得ることが明白である。
【０１０８】
前述の局面および本発明の付随する多くの有用性は、以下の詳細な説明の参照によってより理解されるのと同様に、付随する図面と関連して理解される場合、より容易に理解されるようになり、ここで以下である。
【図１】
2010104384.tif 000004
【図２Ａ】
2010104384.tif 000005
【図２Ｂ】
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【配列表】
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