(57)【要約】【課題】優良な台木として利用可能な核果類植物をスクリーニングする方法、この方法によって選抜された耐ストレス性核果類植物、前記方法によって耐ストレス性核果類植物を選抜するためのプライマーセット、及びスクリーニングキットを提供する。【解決手段】この発明の耐ストレス性核果類植物のスクリーニング方法は、（１）核果類植物から組織サンプルを採取する採取工程と、（２）採取した組織サンプルから、鋳型となるゲノムDNA及びcDNAの少なくとも一方を調製する鋳型調製工程と、（３）鋳型と、配列番号１及び配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドなどからなるプライマーセットとを使用してマーカーDNA断片を増幅する増幅工程と、（４）マーカーDNA断片を検出する検出工程と、を含む方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核果類植物のゲノムDNA及びcDNAの少なくとも一方を鋳型とし、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドからなる一対のプライマーを使用して増幅できる増幅DNA断片の一部又は全部を含むマーカーDNA断片を増幅するように設計されたプライマーセット。
【請求項２】
配列番号１で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドからなる請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
（１）核果類植物から組織サンプルを採取する採取工程と、
（２）採取した組織サンプルから、鋳型となるゲノムDNA及びcDNAの少なくとも一方を調製する鋳型調製工程と、
（３）鋳型と、請求項１又は２の何れかに記載のプライマーセットとを使用してマーカーDNA断片を増幅する増幅工程と、
（４）マーカーDNA断片を検出する検出工程と、
を含む耐ストレス性核果類植物のスクリーニング方法。
【請求項４】
（１）核果類植物から組織サンプルを採取する採取工程と、
（２）採取した組織サンプルから、鋳型となるゲノムDNA及びcDNAの少なくとも一方を調製する鋳型調製工程と、
（３）鋳型と、配列番号３で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットとを使用してDNA断片を増幅する予備増幅工程と、
（４）予備増幅工程により増幅されたDNA断片と、請求項１又は２の何れかに記載のプライマーセットとを使用してマーカーDNA断片を増幅する増幅工程と、
（５）マーカーDNA断片を検出する検出工程と、
を含む耐ストレス性核果類植物のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載の耐ストレス性核果類植物のスクリーニング方法によって、選抜された耐ストレス性核果類植物。
【請求項６】
請求項５に記載の耐ストレス性核果類植物の子孫、クローン、又は形質転換体である耐ストレス性核果類植物。
【請求項７】
請求項１又は請求項２に記載のプライマーセットを含む耐ストレス性核果類植物のスクリーニングキット。
【請求項８】
配列番号３及び配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドを含む請求項７に記載の耐ストレス性核果類植物のスクリーニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、乾燥、塩害、凍害等の環境ストレスに強い耐ストレス性核果類植物のスクリーニング方法等に関し、特に環境ストレスに強い核果類植物台木のスクリーニングを効率よく行うことができるスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
梅などの核果類植物を含む果樹の場合、優良な形質（味、大きさ等）を備えた品種は、野菜とは異なり、果実から採取した種子を播いて育てても同じ性質の品種はできない。そのため、優良な品種を増やすためには、台木を用意して、この台木に優良な品種の枝（穂木）を接木するのが一般的である。
【０００３】
さて、優良な果実を継続して一定量生産するためには、優れた穂木に加えて、乾燥、塩害、凍害、病害虫等の環境ストレスに対して耐性のある台木が必要である。このように、果樹栽培において台木は重要な役目を負っている。
【０００４】
それにもにもかかわらず、従来は台木については、特にスクリーニングすることなく実生台木を使用していた。そのため、穂木に優良な品種を使用しても、果実の生産量が安定しないことが多かった（非特許文献１）。
【非特許文献１】河瀬憲次著編  「果樹台木の特性と利用」  農文協  第８章  ウメ  p.383−391
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、この発明は優良な台木として利用可能な核果類植物をスクリーニングする方法、この方法によって選抜された耐ストレス性核果類植物、前記方法によって耐ストレス性核果類植物を選抜するためのプライマーセット、及びスクリーニングキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは、核果類植物の遺伝子と耐ストレス性との関係について鋭意検討したところ、核果類植物が有する特定の遺伝子には複数の種類があり、その種類の違いと核果類植物の耐ストレス性との間に強い関連性があることを発見した。
【０００７】
なお、前記特定遺伝子とは、Asr（Abscisic acid stress ripening）遺伝子のことであある。また、Asr遺伝子は植物の乾燥、低温ストレス応答や耐性の獲得、種子の成熟、休眠、発芽などの生理機能に関与する植物ホルモンであるアブシジン酸（ABA）により発現量が調節されることが、既に知られている。
【０００８】
そこで、発明者らは、核果類植物が有するAsr遺伝子の種類を調べることによって、耐ストレス性が強く、台木に適した核果類植物をスクリーニングできることを思いつき、この発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、請求項１に記載のプライマーセットは、核果類植物のゲノムDNA及びcDNAの少なくとも一方を鋳型とし、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドからなる一対のプライマーを使用して増幅できる増幅DNA断片の一部又は全部を含むマーカーDNA断片を増幅するように設計されたものである。
【００１０】
請求項２に記載のプライマーセットは、請求項１に記載のプライマーセットであって、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドからなるものである。
【００１１】
請求項３に記載の耐ストレス性核果類植物のスクリーニング方法は、（１）核果類植物から組織サンプルを採取する採取工程と、（２）採取した組織サンプルから、鋳型となるゲノムDNA及びcDNAの少なくとも一方を調製する鋳型調製工程と、（３）鋳型と、請求項１又は２の何れかに記載のプライマーセットとを使用してマーカーDNA断片を増幅する増幅工程と、（４）マーカーDNA断片を検出する検出工程と、を含む方法である。
【００１２】
請求項４に記載の耐ストレス性核果類植物のスクリーニング方法は、（１）核果類植物から組織サンプルを採取する採取工程と、（２）採取した組織サンプルから、鋳型となるゲノムDNA及びcDNAの少なくとも一方を調製する鋳型調製工程と、（３）鋳型と、配列番号３で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットとを使用してDNA断片を増幅する予備増幅工程と、（４）予備増幅工程により増幅されたDNA断片と、請求項１又は２の何れかに記載のプライマーセットとを使用してマーカーDNA断片を増幅する増幅工程と、（５）マーカーDNA断片を検出する検出工程と、を含む方法である。
【００１３】
請求項５に記載の耐ストレス性核果類植物は、請求項３又は請求項４に記載の耐ストレス性核果類植物のスクリーニング方法によって選抜されたものである。
【００１４】
請求項６に記載の耐ストレス性核果類植物は、請求項５に記載の耐ストレス性核果類植物の子孫、クローン、又は形質転換体である。
【００１５】
請求項７に記載の耐ストレス性核果類植物のスクリーニングキットは、請求項１又は請求項２に記載のプライマーセットを含むものである。
【００１６】
請求項８に記載の耐ストレス性核果類植物のスクリーニングキットは、請求項７に記載の耐ストレス性核果類植物のスクリーニングキットであって、配列番号３及び配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドを含むものである。
【発明の効果】
【００１７】
この発明の核果類植物のスクリーニング方法等を利用することにより、環境ストレスに強い核果類植物を高い確率でスクリーニングすることができる。そして、選抜された核果類植物を台木に使用すれば、梅などの果実を安定して生産することができ、これによって栽培農家の生活を安定・向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１.プライマーセット
この発明に係るプライマーセットは、核果類植物のゲノムDNA又はｃDNAを鋳型とし、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドからなる一対のプライマーを使用して増幅できる増幅DNA断片の一部又は全部を増幅するように設計されたものである。
【００１９】
このプライマーセットとしては、具体的には、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが例示できる。また、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチド、配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドの端部にある一つ又は複数の塩基が削除されたオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが例示できる。さらに、Asr遺伝子の塩基配列のうち、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドに挟まれた塩基配列の一部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットであって、前記挟まれた塩基配列の一部を増幅できるプライマーセットが例示できる。
【００２０】
２．スクリーニング方法
この発明の耐ストレス性核果類植物スクリーニング方法は、（１）採取工程と、（２）鋳型調製工程と、（３）予備増幅工程と、（４）増幅工程と、（５）検出工程の各工程を含んでいる。そこで、各工程について以下に詳説する。
【００２１】
（１）採取工程
採取工程は、核果類植物から組織サンプルを採取する工程である。また、核果類とは子房壁が発達して果実になる果樹であって、梅、杏、サクランボ、スモモ、桃などが例示できる。また、採取する組織としては、特に限定する必要はないが、採取が容易であることから葉が好ましく、中でも植物の育成に要する時間を短縮できることから子葉が好ましい。さらに、採取方法は、葉等を手でちぎる、メスや鋏で切り取るなどの公知の方法であれば特に限定することなく使用できる。
【００２２】
（２）鋳型調製工程
鋳型調製工程は、採取した組織サンプルから、サンプル組織を粉砕したのち、鋳型となるゲノムDNA及びcDNAの少なくとも一方を調製する工程である。サンプル組織の粉砕は、液体窒素でサンプル組織を凍結したのち、乳鉢やビーズ式細胞粉砕装置を使用して粉砕する方法等、既存の方法であれば特に限定することなく使用できる。
【００２３】
また、ゲノムDNAの調製方法は、既存の方法、例えばCTAB法、であれば特に限定することなく使用できる。さらに、cDNAの調製方法は、既存の方法、例えば、mRNAのpolyA構造と特異的に結合するオリゴdTプライマーと逆転写酵素等を使用して、mRNA の 3'側から選択的にcDNA を調製する方法、であれば特に限定することなく使用できる。
【００２４】
（３）予備増幅工程
予備増幅工程は、鋳型と、配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドASR-F及び配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドASR-Rからなるプライマーセットとを使用してDNA断片を増幅する工程である。DNA断片の増幅はPCR法によって行い、その反応条件、反応試薬、反応装置等は鋳型の品質や量に合わせて自由に設定できるが、反応条件を調節ことによって非特異的な増幅を減らすことができる。
【００２５】
（４）増幅工程
増幅工程は、（３）予備増幅工程で増幅されたDNA断片を鋳型と、この発明のプライマーセットとを使用してマーカーDNA断片を増幅する工程である。DNA断片の増幅は、PCR法によって行い、その反応条件、反応試薬、反応装置等はDNA断片の品質や量に合わせて特に限定することなく自由に設定することできるが、反応条件を調節ことによって非特異的な増幅を減らすことができる。なお、（４）増幅工程における反応条件、具体的にはアニーリング温度等を調節することによって、（３）予備増幅工程を省略して、鋳型からマーカーDNA断片を直接増幅してもよい。
【００２６】
（５）検出工程
検出工程は、増幅されたマーカーDNA断片を検出する工程であり、具体的には、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルで電気泳動したのち、エチジウムブロマイドなどの染料でDNA断片を染色し、バンドの数を数えることによって行う。なお、バンドの数が３本の場合は耐ストレス性が強いと判断し、バンドの数が１本の場合には耐ストレス性が弱いと判断する。
【００２７】
３．核果類植物
この発明の核果類植物は、この発明の選抜方法によってスクリーニングされた核果類植物、その子孫、そのクローン、その形質転換体である。なお、子孫、クローンは、有性生殖、挿し木、組織培養などの公知の方法によって得られる。
【００２８】
また、形質転換体は、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法、アグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法等の公知の方法によって得られる。
【００２９】
４．スクリーニングキット
この発明のスクリーニング方法で使用するプライマーセット、酵素、緩衝液の各構成要素は別々に合成・購入して使用してもよい。しかし、これらを組み合わせて予めスクリーニングキットとしておけば、各構成要素を別々に購入する手間を省き、スクリーニングをより容易に行うことができる。なお、同じ理由から、スクリーニングキットが鋳型の調製に必要な試薬等を含んでいてもよい。
【００３０】
以下に、この発明を実施例により具体的に説明するが、この発明の特許請求の範囲は如何なる意味においても下記の実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
１．梅（二青）のAsr遺伝子の同定
梅の耐塩ストレスに関連する遺伝子を同定するため、同じ核果類植物であり、すでにその塩配列が分かっている桃と杏のAsr遺伝子の塩基配列に基づいて、梅（二青）のAsr遺伝子を吊り上げ、その塩基配列を調べた。具体的には以下のようにして行った。
【００３２】
（１）梅の栽培とサンプル採取
暖房なしのビニールハウスにおいて、黄土とパーライトを8：2の割合で含むプラスチックの鉢植え（高さ13cm、直径14cm）で2年間栽培した梅（二青）に、毎日、100ｍM NaCl水溶液200mlを茎の傍の土に散布することによって塩ストレスを与えた。また、コントロールには水200mlを毎日散布した。そして、このようにストレス処理して栽培した梅から、3日（4月16日）後、5日後（4月18日）及び8日（4月21日）後に若葉を0.3gずつ採取してサンプルとした。なお、コントロールはストレス処理する前（4月13日）に同様にして採取した。
【００３３】
（２）鋳型の調製
（ａ）全RNAの抽出
まず、ISOGEN（ニッポンジーン製）を添付の説明書に従って使用し、採取したサンプルから粗全RNA溶液を得た。つぎに、粗全RNA溶液中のゲノムDNAをRQ1 RNase-Free Dnase（プロメガ）を使用して除去し、全RNA溶液を調製した。なお、得られた全RNA溶液は使用するまで-70℃で保存した。
【００３４】
（ｂ）First strand cDNA溶液の調製
T(12)VC（配列番号５）とT(12)VG（配列番号６）からなるアンカープライマーセットと、First strand cDNA Syntesis Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス製)とを取扱説明書に沿って使用し、全RNA溶液からFirst strand cDNAを含むFirst strand cDNA溶液を調製した。
【００３５】
（３）Asr関連遺伝子のクローニング
（ａ）プライマーの合成
データベースにすでに登録されている桃（Prunus persica）と杏（Prunus armeniaca）のAsr遺伝子の配列を比較したところ、その5’及び3’末端の配列にASR-F（配列番号３）及びASR-RV（配列番号４）の共通配列があることが分かった。そこで、これら共通配列を有するプライマーを定法により化学合成した。なお、桃、杏のAsr遺伝子及びプライマーASR-F及びASR-RVの位置関係を図１に示す。
【００３６】
（ｂ）Asr関連遺伝子の増幅
Asr関連遺伝子の増幅は、Gene Taq（ニッポンジーン製）と、鋳型溶液、ASR-FとASR-RVからなるプライマーセット等を使用して、Asr関連遺伝子を増幅した。なお、PCR反応は、92℃で1分間の反応の後、92℃で1分間、45℃で1分間、72℃で1分間の反応を40回、最後に72℃で5分間の反応、という反応条件で行った。
【００３７】
得られたPCR産物を3％（W/V）アガロースゲルで電気泳動した（100V、30分間）。アガロースゲルからDNA断片を含むバンドを切り出して、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を添付の説明書に従って使用し、精製したDNA断片を含むDNA溶液を調製した。DNA溶液を電気泳動した結果を図２に示す。
【００３８】
なお、図２の各レーンは、それぞれM:マーカー、C：コントロール、1：塩ストレス8日目、2:塩ストレス5日目、3:塩ストレス3日目、M:マーカーを電気泳動した結果である。
【００３９】
（ｃ）Asr関連遺伝子のクローニング
pGEM-T（登録商標）Easy vector system(Promega製)を添付の説明書に従って使用して、精製したDNA断片をプラスミドpGEM-T(商標登録) Easy vectorに組換え、E.coli DH5αを形質転換した。この形質転換体をX-gal（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside、和光純薬製）及びIPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside、和光純薬製）を塗布したLB-Amp寒天プレートに播いて、37℃で一晩培養した。
【００４０】
（４）塩基配列の決定
LB-Ampプレート上でコロニーを形成した株のうち、白いコロニーを選抜し、爪楊枝を用いてLB-Amp液体培地2mlに接種し、37℃、15時間培養した。培養液から、QIAGEN plasmid  Midi kit（QIAGEN製)を使用して、プラスミドを単離した。単離したプラスミドに含まれるDNA断片の塩基配列を、BigDye(登録商標) Terminator Sequencing kit(アプライドバイオシステムズ製)、M13プライマー（アプライドバイオシステムズ製）、DNAシーケンサ（ABI PRISM(登録商標) 3100-Avant Genetic Analyzer、アプライドバイオシステムズ製）を使用して決定した。
【００４１】
その結果、二青は３種類のAsr遺伝子P.ume_Niao_1_（配列番号７）、P.ume_Niao_2_（配列番号８）、P.ume_Niao_3_（配列番号９）を含んでいることが分かった。また、これらAsr遺伝子の塩基配列から、P.ume_Niao_2_はP.ume_Niao_1_及びP.ume_Niao_3_に比べて、18塩基短いことが分かった。なお、P.ume_Niao_1_、P.ume_Niao_2_、P.ume_Niao_3_及びプライマーの位置関係を図１に示す。
【実施例２】
【００４２】
２．梅におけるAsr遺伝子型と耐ストレス性との関連性
耐ストレス性の異なる二青（耐ストレス性が強い。）及び南高（耐ストレス性が弱い。）における前記Asr遺伝子P.ume_Niao_1_、P.ume_Niao_2_、P.ume_Niao_3_遺伝子の存在の違いを調べた。なお、比較のため、西洋梅、スモモウメ１号についても同様に調べた。
【００４３】
（１）梅の栽培とサンプル採取
暖房なしのビニールハウスにおいて、黄土とパーライトを8：2の割合で含むプラスチックの鉢植え（高さ13cm、直径14cm）で2年間栽培した梅（二青）に水200mlを毎日散布して栽培し、ストレス処理を行っていない若葉を0.3gづつ採取してサンプルとした。
【００４４】
（２）鋳型の調製
まず、QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN製）を添付の説明書に従って使用し、採取したサンプルからゲノムDNA溶液を得て、鋳型溶液とした。
【００４５】
（３）予備増幅
ゲノムDNA溶液、Gene Taq（ニッポンジーン製）、ASR-FとASR-RVからなるプライマーセット等を添付の説明書に従って使用し、Asr関連遺伝子を増幅した。なお、PCR反応は、92℃で1分間の反応の後、92℃で1分間、45℃で1分間、60℃で1分間の反応を40回、最後に72℃で5分間の反応、という反応条件で行った。
【００４６】
（４）マーカーDNA断片の増幅
得られたPCR産物の一部を鋳型にして、Gene Taq（ニッポンジーン製）、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチドプライマーASR‐SSR(F)及び配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドプライマーASR-SSR(R)からなるプライマーセット等を添付の説明書に従って使用し、Asr関連遺伝子を増幅した。なお、PCR反応は、92℃で1分間の反応の後、92℃で1分間、45℃で1分間、60℃又は65℃で1分間の反応を40回、最後に72℃で5分間の反応、という反応条件で行った。
【００４７】
（５）電気泳動による検出
得えられたPCR産物を4%アガロースゲルにより電気泳動した。その結果を図３に示す。この電気泳動写真から、西洋梅、二青では複数のバンド、南高からは１本のバンドが増幅されたことが分かった。この結果から、ストレスに強い品種（二青）では３つのバンドが増幅され、ストレスに弱い品種（南高）では一つのバンドだけが増幅されていることが分かった。
【００４８】
なお、図３の各レーンは、1:スモモウメ1号、2:西洋梅、3:二青、4：南高、M:マーカーを電気泳動した結果である。また、この電気泳動写真の「Template  DNA」の部分は（３）の予備増幅工程でのPCR産物、「Product(65℃)」の部分は（４）増幅工程におけるアニーリング温度が65℃の場合のPCR産物、「Product(60℃)」の部分は（４）増幅工程におけるアニーリング温度が60℃の場合のPCR産物、の電気泳動写真をそれぞれ示している。
【００４９】
（６）塩基配列の決定
実施例１と同様にして、鋳型に南高を使用した場合に増幅された1本のバンドをプラスミドに組換えて大腸菌に形質転換し、組換えたバンドの塩基配列を調べたところ、その配列から、増幅されたのはP.ume_Niao_1_であることが分かった。
【００５０】
この結果から、耐ストレス性の弱い品種は、Asr遺伝子のうち、P.ume_Niao_1_の遺伝子だけを含んでいることが分かった。また、P.ume_Niao_１_だけを含んでいる品種は、バンドの数が1本になることから、PCR法によりバンドの数を調べれば耐ストレス性が判別できると推定した。そこで、以下の実施例によりこの推定を確認した。
【実施例３】
【００５１】
３．核果類におけるAsr遺伝子型と耐ストレス性との関連性
梅、杏、桃の核果類について、実施例２と同様にして、Asr遺伝子の種類と耐ストレス性との関連性について調べた。その結果である電気泳動写真を図４に示す。なお、電気泳動写真の各レーンの品種は、以下のとおりである。
【００５２】
1:織姫（耐性が強い。）、2:甲州最小（耐性が弱い。）、3:西洋梅（耐性が強い。）、4:太平（耐性が弱い。）、5:豊後（耐性が強い。）、6:白加賀（耐性が弱い。）、7:緑軸（耐性が弱い。）、8：紅さし（耐性が強い。）、9:地蔵（耐性が弱い。）、10:養青（耐性が弱い。）、11:鶯宿（耐性が弱い。）、12:四川（耐性が弱い。）、13:ST(耐性が弱い、台湾原産。)、14:SC(タイ原産で、耐性が強い。)、15:座論梅（耐性が強い。）、16：鹿児島紅（耐性が弱い。）、17:加賀地蔵（耐性が弱い。）、18：玉英（耐性が弱い。）、19：八郎（耐性が弱い。）、20：奥野（耐性が弱い。）、21：地蔵（耐性が弱い。）、22：十郎（耐性が弱い。）、23：伊那豊後（耐性が強い。）、24：高田（耐性が弱い。）、25：‘二青’（耐性が強い。）、26：白粉梅（耐性が弱い。）、27：アンズ平和（耐性が弱い。）、28：スモモソルダム（耐性が弱い。）、29：スモモ‘大石早生’（耐性が弱い。）、30：スモモ‘サンダローザ’（耐性が強い。）、31：‘ミロバラン’実生（耐性が弱い。）、32：モモ‘白鳳’（耐性が弱い。）、M：マーカー。
【００５３】
この電気泳動写真から、実施例２と同様に、ストレスに強い品種においては3本のバンドが増幅され、ストレスに弱い品種においては1本のバンドだけが増幅されることが確認できた。
【実施例４】
【００５４】
４．雑種第１代におけるAsr遺伝子型の多様性
耐ストレス性の強い二青と耐ストレス性の弱い南高との雑種を作出し、実施例２と同様にして、Asr遺伝子の種類を調べた。その結果を図５の電気泳動写真に示す。この写真から、同じ親から生じた雑種第一代目であっても、含んでいるAsr遺伝子の種類、すなわち耐ストレス性に違いがあることが分かった。
【００５５】
以上の結果から、mRNA中又はゲノムDNA中におけるAsr遺伝子、P.ume_Niao_1_、P.ume_Niao_2_、P.ume_Niao_3_の存在の有無を調べることによって、核果類の耐ストレス性が予測できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】梅、桃、杏、スモモのAsr遺伝子及びプライマーの位置関係を示す図である。
【図２】耐ストレス性の異なる梅のcDNAを鋳型にして、Asr遺伝子をPCR反応により増幅し、そのPCR産物を電気泳動した結果を示す電気泳動写真である。
【図３】耐ストレス性の異なる梅のゲノムDNAを鋳型にして、Asr遺伝子をPCR反応により増幅し、そのPCR産物を電気泳動した結果を示す電気泳動写真である。
【図４】耐ストレス性の異なる核果類のAsr遺伝子の違いを調べた結果を示す電気泳動写真である。
【図５】耐ストレス性の異なる二青と南高とを交配してなる雑種第１代のAsr遺伝子の違いを調べた結果を示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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