(57)【要約】【課題】抗原および／または遺伝子に基づく予防剤および治療剤の送達のためのポリマー微粒子中の抗原および／または核酸のような、生物活性薬剤のカプセル化のための改善された技術を提供することを課題とする。【解決手段】上記課題は、生物活性薬剤を、水中（油中水）型エマルジョンに基づく方法において、そして酢酸エチルを含む溶媒を用いてポリマー微粒子中にカプセル化することで解決された。一部は、０．５ｄｌ／ｇ未満のｉ．ｖ．を有する、低固有粘度（ｉ．ｖ．）ＰＬＧを含む微粒子およびそれらの調製のための方法もまた記載される。ＤＮＡ放出は、低ｉ．ｖ．ＰＬＧの使用を通して改変される。規模拡大のための粒子生成方法は、カプセル化されるＤＮＡに対する過度の剪断損傷を回避するブレンダーを用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の生物活性薬剤をカプセル化するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン接種および遺伝子治療のための生物活性薬剤、例えば、抗原、薬物、およびＤＮＡのカプセル化の改善に関する。特に、本発明は、水溶液中の抗原および／またはＤＮＡを、ポリマー微粒子中にカプセル化し、その結果、レシピエントに投与された場合に、微粒子は抗原をレシピエントの抗原提示細胞に送達し、そして／またはレシピエントの抗原提示細胞中でこのＤＮＡの発現を誘導するための方法に関する。本発明はまた、微粒子および微粒子を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在のマイクロカプセル化技術は、現在まで少なくとも１０年間の歴史があるが、多くの公表された進歩にも関わらず、商業的に成功した製品を全く生みだしていないようである。実際、ＷＯ−Ａ−９７／１７０６３（本発明と同じ発明者による）は別として、公表された方法は、効率的でなくかつ信頼性がないことが見出されてきた。
【０００３】
多くの公表された特許および出願は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＲＩ）の名前でなされている。特に、ＵＳ−Ａ−５４０７６０９は、実施例７において、中空の粒子の製造のためのエマルジョンに基づく方法を記載すると主張する。タンパク質（具体的にはＢＳＡ）を含む粒子を製造するための別のエマルジョンに基づく方法は、非特許文献１に記載されている。これらの粒子が、カプセル化された生物活性薬剤の腸上皮中の抗原提示細胞への投与の手段として使用される場合、そのサイズが直径１０ミクロン未満であることが非常に重要である。より大きな粒子は、標的とされた腸の細胞によってエンドサイトーシスを受けずに、効果をもたらすことなく腸を通過する。
【０００４】
しかし、ＵＳ−Ａ−５４０７６０９に詳述される方法およびＳａｈらによって記載される方法は、比較的大きな粒子、または少なくとも広範な範囲のサイズにわたる粒子の作製に成功した。ここで、粒子の有意な部分は、生物学的活性のカットオフ点である１０ミクロンよりも大きい。粒子のサイズの広がりが大きいことは、ＵＳ−Ａ−５４０７６０９に見られるように、必然的に、大部分のカプセル化された薬剤が、貪食作用に適切でないサイズの粒子に取り込まれることになる。なお悪いことに、Ｓａｈらは、見かけの最小直径が約１０ミクロンである粒子サイズの混合物を得た。両方の当該技術の方法とも、従って、抗原提示細胞による取り込みのために利用可能なカプセル化製品を製造するために具体的に設計されたわけではない。Ｓａｈによって使用されたカプセル化方法はまた、カプセル化の間に非常に高い剪断速度を必要とし、剪断速度は、ＤＮＡのような薬剤のカプセル化に有害な効果を有し、従って、これらのカプセル化に不適切である。
【０００５】
ＵＳ−Ａ−５４０７６０９は、微小の泡様の粒子の構築に言及するが、水溶性の薬剤は、カプセル化された薬剤が粒子の内部の含有物を最終的に構成するエマルジョンの部分の外側に移動する傾向のために、そのような粒子には容易にカプセル化されないことを強調する。この問題を克服するために、ＵＳ−Ａ−５４０７６０９は、エマルジョンが形成されるとすぐに、速やかに大容量の抽出媒体（すなわち、水）を添加することを必要とする。しかし、そのようにすることによって、粒子サイズの制御は失われ得る。
【０００６】
Ｓａｈの方法を用いて作製された微粒子の内部構造は、単純な中空の微小の泡様の構造ではなく、Ｓａｈの論文に添付された写真において図解されているような、一般的に蜂の巣状のマトリックスである。溶媒抽出工程および引き続く凍結乾燥の間にこれらのマトリックスの内部からの溶媒および／または水の除去が不完全であると、粒子のポリマーの未熟な分解、および任意のカプセル化された水溶液の対応するｐＨの低下を生じ得、このことは、カプセル化された薬剤の損害をもたらす。
【０００７】
投与された微粒子の生物活性薬剤の放出プロフィールは、ＰＬＧポリマー中に存在するラクチドおよびグリコリドの相対量を変化させることによって以前に変更された。しかし、このデータの多くは、「マイクロスフェア」技術に基づき、ここではカプセル化された薬剤は、ポリマーマトリックスの全体にわたって分配され、そして微小の泡状の粒子の放出プロフィールの制御に関連する公知の先行技術は存在しない。ＰＬＧポリマー中に存在するラクチドおよびグリコリドの相対量を変化させることは、短期での限定された成功を示したが、放出プロフィールを制御する代替的な手段を提供することが所望されている。
【０００８】
ＷＯ−Ａ−９７／１７０６３は、微粒子へのＤＮＡの取り込みの有意なレベルを得るための方法を記載する。しかし、本発明者らは、この取り込みの効率を改善したい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓａｈら、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、１９９５、第１２巻、第１号、５９−６９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って本発明は、当該分野で見られる問題を克服するか、または少なくとも改善することを追求する。特に、本発明の好ましい実施態様は、抗原および／または遺伝子に基づく予防剤および治療剤の送達のためのポリマー微粒子中の抗原および／または核酸のような、生物活性薬剤のカプセル化のための改善された技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明は、ポリマー微粒子中にＤＮＡをカプセル化する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：
溶媒にポリマーを溶解して、ポリマー溶液を形成する工程；
ＤＮＡの水溶液を調製する工程；
ポリマー溶液とＤＮＡ溶液とを攪拌しながら合わせて、油中水型エマルジョンを形成する工程；
この油中水型エマルジョンを、安定剤または界面活性剤を含むさらなる水相に攪拌しながら添加し、水中（油中水）型エマルジョンを形成する工程；
この水中（油中水）型エマルジョンを、過剰の水相に添加して溶媒を抽出し、それによって直径１０ミクロンまでのサイズのポリマー微粒子を形成し、この微粒子はＤＮＡを含有している、工程；
ここでこのＤＮＡは、コード配列を含み、そして投与後にレシピエント中でコード配列の発現を誘導し、そしてここでこの溶媒は、酢酸エチルを含む。
【００１２】
この方法に従って、微粒子から回収されたＤＮＡを使用する形質転換アッセイおよびトランスフェクションアッセイによって確認されたように、ＤＮＡがそのコード配列の発現を誘導する能力を保持するような様式でカプセル化された微粒子の調製物が得られ得ることが有利に見出される。この調製物は、適切な抗原をコードするＤＮＡの経口投与後に、レシピエントにおいて防御免疫を誘導するために適切である。微粒子のサイズは一般的に直径１０ミクロン未満であり、従って、抗原提示細胞に利用可能な薬剤の比率を増加させる（Ｅｌｄｒｉｄｇｅ  Ｊ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、第１１巻、１９９０、２０５−２１４頁）。また、微粒子へのＤＮＡの取り込み効率は改善され、本発明の好ましい実施態様において８０％に近づくことが見出され、この後者の数字は、当該分野を超える有利な進歩を表す。
【００１３】
従って、本発明の方法は、本質的には溶媒抽出法であり、ここでは第２のエマルジョン段階後（すなわち、水中（油中水）型エマルジョン形成後）の溶媒の抽出が、微粒子のポリマーを強固にするか、または強化する。「ポリマー微粒子を形成する」との言及は、方法全体を言及することを意図し、ここでは微粒子が最初にエマルジョンを介して形成され、次いで、微粒子のポリマーの殻が、溶媒抽出によって強固にされるか、または強化される。
【００１４】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）  ポリマー微粒子中に生物活性薬剤をカプセル化するための方法であって、以下：
溶媒中にポリマーを溶解してポリマー溶液を形成させる工程；
生物活性薬剤の水溶液を調製する工程；
該ポリマーと水溶液とを、攪拌しながら合わせて油中水型エマルジョンを形成させる工程；
該油中水型エマルジョンを、攪拌しながらさらなる水相に添加して、水中（油中水）型エマルジョンを形成させる工程；
該水中（油中水）型エマルジョンを、過剰の水相に添加して該溶媒を抽出し、それによって直径１０ミクロンまでのサイズのポリマー微粒子を形成させる工程であって、該微粒子が、水溶液中に生物活性薬剤を含み；
ここで該溶媒が酢酸エチルを含む、工程、
を包含する、方法。
（項目２）  前記油中水型エマルジョンの形成における溶媒：水相の比が、４：１から２０：１（容量：容量）の範囲にある、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記油中水型エマルジョンの形成における溶媒：水相の比が、５：１から１２：１（容量：容量）の範囲にある、項目２に記載の方法。
（項目４）  前記ポリマーがＰＬＧであり、そして前記溶媒が、酢酸エチルおよび該溶媒中に溶解され得るＰＬＧの量を増加させる共溶媒を含む、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）  前記ポリマーおよび水溶液の攪拌を維持して、大多数が直径１０ミクロンまでのサイズである微粒子を得るように長時間にわたって前記油中水型エマルジョンを形成させる工程を包含する、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）  前記ポリマーおよび水溶液の攪拌を維持して、大多数が直径１０ミクロンまででかつ直径１ミクロンを超えるサイズである微粒子を得るように長時間にわたって前記油中水型エマルジョンを形成させる工程を包含する、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）  前記ポリマーが、７０ｋＤより大きな分子量のＰＬＧである、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）  前記ポリマーが、５０ｋＤ未満の分子量のＰＬＧである、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目９）  前記生物活性薬剤が、ＲＮＡ、タンパク質抗原、非タンパク質抗原、タンパク質結合体化多糖またはペプチド結合体化多糖、ペプチド−ＤＮＡ複合体についてのタンパク質、合成ペプチド、合成タンパク質、ＤＮＡウイルス、サイトカイン、癌治療薬、ミニ遺伝子、および水溶性薬品から選択され、必要に応じて賦形剤および／またはアジュバントが伴い、その一例がミョウバンである、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）  ポリマー微粒子中にＤＮＡをカプセル化する方法であって、以下：
溶媒中にポリマーを溶解してポリマー溶液を形成させる工程；
生物活性薬剤の水溶液を調製する工程；
ＤＮＡの水溶液を調製する工程；
該ポリマーとＤＮＡ溶液とを、攪拌しながら合わせて油中水型エマルジョンを形成させる工程；
該油中水型エマルジョンを、攪拌しながらさらなる水相に添加して、水中（油中水）型エマルジョンを形成させる工程；
該水中（油中水）型エマルジョンを、過剰の水相に添加して該溶媒を抽出し、それによって直径１０ミクロンまでのサイズのポリマー微粒子を形成させる工程であって、該微粒子が、水溶液中にＤＮＡを含み；
ここで該ＤＮＡがコード配列を含み、そして経口投与後にレシピエントにおいて該コード配列の発現を誘導し、そしてここで該溶媒が酢酸エチルを含む、工程、
を包含する、方法。
（項目１１）  前記油中水型エマルジョンの形成における溶媒：水相の比が、４：１から２０：１（容量：容量）の範囲にある、項目１０に記載の方法。
（項目１２）  前記油中水型エマルジョンの形成における溶媒：水相の比が、５：１から１２：１（容量：容量）の範囲にある、項目１１に記載の方法。
（項目１３）  前記溶媒が、酢酸エチルおよび該溶媒中に溶解され得るポリマーの量を増加させる共溶媒を含む、項目１０〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）  前記ポリマーが、ポリ−（ＤＬラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）であり、前記ポリマー溶液中のＰＬＧの濃度が、少なくとも１０％
ｗ／ｖである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）  前記ポリマーおよび水溶液の攪拌を維持して、大多数が直径１０ミクロンまでのサイズである微粒子を得るように長時間にわたって前記油中水型エマルジョンを形成させる工程を包含する、項目１０〜１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）  前記ポリマーおよび水溶液の攪拌を維持して、大多数が直径１０ミクロンまででかつ直径０．１ミクロンを超えるサイズである微粒子を得るように長時間にわたって前記油中水型エマルジョンを形成させる工程を包含する、項目１０〜１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）  前記ポリマーが、７０ｋＤより大きな分子量のＰＬＧである、項目１０〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）  前記ポリマーが、５０ｋＤ未満の分子量のＰＬＧである、項目１０〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目１９）  直径１０ミクロン未満の微粒子を含む組成物であって、該微粒子は、外部ポリマー殻および生物活性薬剤の内部水溶液を含み、該組成物は、該ポリマーが８０ｋＤを超える分子量のＰＬＧである微粒子を含む、組成物。
（項目２０）  直径１０ミクロン未満の微粒子を含む組成物であって、該微粒子は、外部ポリマー殻および生物活性薬剤の内部水溶液を含み、該組成物は、前記ポリマーが４０ｋＤ未満の分子量のＰＬＧである微粒子を含む、組成物。
（項目２１）  直径１０ミクロン未満の微粒子の混合物を含む組成物であって、該微粒子は、外部ポリマー殻および生物活性薬剤の内部水溶液を含み、該組成物は、前記ポリマーが４０ｋＤ未満の分子量のＰＬＧである第１の微粒子、および前記ポリマーが８０ｋＤを超える分子量のＰＬＧである第２の微粒子を含む、組成物。
（項目２２）  前記生物活性薬剤が、タンパク質抗原、非タンパク質抗原、タンパク質結合体化多糖またはペプチド結合体化多糖、ペプチド−ＤＮＡ複合体についてのタンパク質、合成ペプチド、合成タンパク質、ＤＮＡウイルス、サイトカイン、癌治療薬、ミニ遺伝子、および水溶性薬品から選択され、該生物活性薬剤が、さらに賦形剤および／またはアジュバントを伴い得、その一例がミョウバンである、項目１９〜２１のいずれかに記載の組成物。
（項目２３）  前記生物活性薬剤が、コード配列を含むＤＮＡであり、ここで前記微粒子が、経口投与された場合に該コード配列の発現を誘導する、項目１９〜２１のいずれかに記載の組成物。
（項目２４）  組成物として使用するため、または組成物をワクチン接種する際に使用するための微粒子を作製する方法であって、項目１〜１８のいずれかに記載の方法に従う工程を包含し、ここで該微粒子が、抗原をコードするＤＮＡを含む、方法。
（項目２５）  組成物として使用するため、または組成物をワクチン接種する際に使用するための組成物であって、項目１９〜２３のいずれかに記載の組成物を含み、ここで前記微粒子が、抗原をコードするＤＮＡを含む、組成物。
（項目２６）  ワクチン接種のための医薬の製造における、項目１９〜２３のいずれかに記載の組成物の使用であって、ここで前記微粒子が、免疫原をコードするＤＮＡを含む、使用。
（項目２７）  ポリマー微粒子中に生物活性薬剤をカプセル化するための方法であって、以下：
溶媒中にポリマーを溶解してポリマー溶液を形成させる工程；
生物活性薬剤の水溶液を調製する工程；
該ポリマーと水溶液とを、攪拌しながら合わせて油中水型エマルジョンを形成させる工程；
該油中水型エマルジョンを、攪拌しながらさらなる水相に添加して、水中（油中水）型エマルジョンを形成させる工程；
該水中（油中水）型エマルジョンを、過剰の水相に添加して該溶媒を抽出し、それによって直径１０ミクロンまでのサイズの微粒子を形成させる工程であって、該微粒子が、水溶液中に生物活性薬剤を含み；
ここで該攪拌工程が、該溶液またはエマルジョンを、ブレンダーのブレンディング区画において攪拌する工程、および該ブレンディング区画の内容物のブレンドおよび混合の両方を行うブレンディングブレードを用いる工程を含む、工程
を包含する、方法。
（項目２８）  前記ブレンディングが、大多数が直径１０ミクロンまでのサイズである微粒子を得るように長時間にわたって継続される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）  生物活性薬剤をポリマー微粒子中にカプセル化するための方法であって、以下：
溶媒中にポリマーを溶解してポリマー溶液を形成させる工程；
生物活性薬剤の水溶液を調製する工程；
該ポリマーと水溶液とを、攪拌しながら合わせて油中水型エマルジョンを形成させる工程；
該油中水型エマルジョンを、攪拌しながらさらなる水相に添加して、水中（油中水）型エマルジョンを形成させる工程；
該水中（油中水）型エマルジョンを、過剰の水相に添加して該溶媒を抽出し、それによって直径１０ミクロンまでのサイズの微粒子を形成させる工程であって、該微粒子が、水溶液中に生物活性薬剤を含み；
ここで該ポリマーが、分子量４０ｋＤ以下のＰＬＧを含むかまたは分子量４０ｋＤ以下のＰＬＧからなる、工程
を包含する、方法。
（項目３０）  生物活性薬剤をポリマー微粒子中にカプセル化するための方法であって、以下：
溶媒中にポリマーを溶解してポリマー溶液を形成させる工程；
生物活性薬剤の水溶液を調製する工程；
該ポリマーと水溶液とを、攪拌しながら合わせて油中水型エマルジョンを形成させる工程；
該油中水型エマルジョンを、攪拌しながらさらなる水相に添加して、水中（油中水）型エマルジョンを形成させる工程；
該水中（油中水）型エマルジョンを、過剰の水層に添加して該溶媒を抽出し、それによって直径１０ミクロンまでのサイズの微粒子を形成させる工程であって、該微粒子が、水溶液中に生物活性薬剤を含み；
ここで該ポリマーが、分子量８０ｋＤ以上のＰＬＧを含むかまたは分子量８０ｋＤ以上のＰＬＧからなる、工程、
を包含する、方法。
（項目３１）  項目１〜９のいずれかに記載の方法によって入手可能な微粒子。
（項目３２）  項目１０〜１８のいずれかに記載の方法によって入手可能な微粒子。
（項目３３）  項目２７〜２８のいずれかに記載の方法によって入手可能な微粒子。
（項目３４）  項目２９に記載の方法によって入手可能な微粒子。
（項目３５）  項目３０に記載の方法によって入手可能な微粒子。
（項目３６）  直径１０ミクロンまでのサイズでかつ生物活性薬剤を含むポリマー微粒子であって、ここで該ポリマーが、０．５ｄｌ／ｇ未満の固有粘度のＰＬＧを含む、微粒子。
（項目３７）  前記生物活性薬剤が、コード配列を含むＤＮＡである、項目３６に記載の微粒子。
（項目３８）  前記ＰＬＧの固有粘度が、０．１ｄｌ／ｇ〜０．４ｄｌ／ｇの範囲にある、項目３６および３７に記載の微粒子。
（項目３９）  前記生物活性薬剤のうちの少なくとも３０％が、投与後２０日以内に放出される、項目３６〜３８のいずれかに記載の微粒子。
（項目４０）  前記生物活性薬剤のうちの少なくとも３０％が、投与後１０日以内に放出される、項目３６〜３８のいずれかに記載の微粒子。
（項目４１）  生物活性薬剤をポリマー微粒子中にカプセル化する方法であって、装置において、該生物活性薬剤の水溶液をポリマーの溶液と合わせて、水中（油中水）型エマルジョンを形成させる工程を包含し、ここで該装置が、以下：
混合される液体のための容器；
該容器中の液体を混合するためのブレード；
を備え、ここで該ブレードが、回転軸のまわりで回転し、そして回転軸に実質的に沿った方向で液体を駆動させることを含む混合作用を発揮し、そしてそれによって水中（油中水）型エマルジョンの形成を促進する、方法。
（項目４２）  前記ブレードが、該ブレードから上方および下方に伸びる複数のブレード末端チップを備える、項目４１に記載の方法。
（項目４３）  前記ブレード末端チップが、該ブレード表面に対して３０°と６０°との間で傾斜している、項目４２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ジクロロメタン（先行技術の溶媒）および酢酸エチル（本発明に従う）を用いて調製された微粒子から回収されたＤＮＡの物理的状態を示すアガロースゲルである。
【図２】図２は、高分子量ポリマーまたは低分子量ポリマーから調製されたＰＬＧ微粒子からのＤＮＡの放出プロフィールを示す。
【図３】図３ａおよび３ｂは、先行技術の微粒子および本発明の微粒子の走査型電子顕微鏡写真を示す。
【図４】図４ａおよび４ｂは、先行技術の微粒子および本発明の微粒子の走査型電子顕微鏡写真を示す。
【図５】図５は、異なる固有粘度のＰＬＧから作製した微粒子の調製物のＤＮＡ放出プロフィールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ポリマーを溶解するために使用される溶媒は、水中（油中水）型エマルジョンから、多数の方法で抽出され得る。以下に記載する本発明の方法の特定の実施例において、水中（油中水）型エマルジョンは、大容量（１００ｍｌ〜１ｌ）の温水（実施例中では摂氏３７度が使用される）中でクエンチされ、それによってポリマーから水への溶媒のエバポレーションが容易にされる。溶媒抽出の他の例は公知であり、それには、より大容量の室温の水の使用およびロータリーエバポレーターの使用が含まれる。
【００１７】
本発明の方法の取り込み効率を決定する１つの方法は、光学吸収分光学によって、既知の重量の微粒子から放出されたＤＮＡの量を正確に測定すること、および使用されたＤＮＡの元々の量に対するこの量を関連付けることである。光学的測定のこの方法を使用して、本発明の好ましい実施態様において、代表的には６０〜７０％の取り込み効率が達成されることが観察され、このことは先行技術の方法を超える有意な進歩を表す。
【００１８】
この微粒子中に含有されるＤＮＡは、代表的には、二本鎖ＤＮＡを含む。本発明における使用のための適切なＤＮＡ配列の構築は、当業者に認識され、そしてＷＯ−Ａ−９７／１７０６３に記載される。この配列は、転写プロモーターおよび遺伝子コード配列の両方を含むことが好ましい。このＤＮＡ配列は、コード配列の下流に転写終結およびポリアデニル化を提供することがさらに好ましい。
【００１９】
このＤＮＡは、二本鎖、環状、およびスーパーコイルであることが特に好ましい。微粒子の製造の間に、そのＤＮＡは剪断力を受けることが観察されてきた。本発明の粒子製造条件を用いて、本発明者らは、機能的なＤＮＡの有意な量を保持することを成し遂げたが、前もってスーパーコイル化されたＤＮＡは、このプロセスの間に部分的に開環型に転換され得ることが観察された。カプセル化プロセスがＤＮＡを変性させる程度は、ネイティブな（スーパーコイル）ＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動を使用して、部分的に変性した（開環型）ＤＮＡおよび変性した（ニックが入り、そして分解した）ＤＮＡから分離することによって評価され得る。このような分離の代表的な例を、図１に例示する。ここでは、明確に規定されたバンドが、調製物中のＤＮＡの２つの最も豊富な形態（スーパーコイル（下のバンド）および開環型（上のバンド））に対応する。ＤＮＡの全体の分解は、通常、２つの通常の形態に対応するバンドの消失から説明される。
【００２０】
カプセル化されたＤＮＡの生物学的活性の保持、好ましい物理的状態の保持の尺度は、微粒子からのＤＮＡの放出後に、既知量のＤＮＡが培養中にコンピテント細菌を形質転換する能力、または真核生物細胞をトランスフェクトする能力のいずれかを測定することにより評価され得る。この形質転換アッセイは、プラスミドに存在し、そして感受性の細菌にアンピシリン耐性を付与する機能的な抗生物質耐性遺伝子（例えば、β−ラクタマーゼ）の導入を測定する。この遺伝子の発現は、ＤＮＡ構造の全体の保持を示す。トランスフェクションアッセイは、培養中の適切に操作された細胞中の目的の遺伝子の発現を誘導する、プラスミドの機能を具体的に測定する。両方の場合において、得られる活性の指標は、対応する蓄えられている等価な量のＤＮＡの活性と比較される。
【００２１】
プラスミドＤＮＡまたは従来の操作によってそれから誘導されるＤＮＡは、特に適切である。プラスミド製造に関する多数の文献が存在するので、当業者は、容易に本発明の微粒子のために適切なプラスミドを調製し得る。一般的に、任意の真核生物プロモーター配列または原核生物プロモーター配列を組み込むプラスミドが適切である。
【００２２】
本発明の微粒子を調製するために最も適切なポリマーは、代表的には、多くの特性を示す。このようなポリマーは、低毒性であり、理想的には薬学的に受容可能かつ採用された溶媒（例えば、共溶媒を含むか、または含まないかのいずれかである酢酸エチル）中に、好ましくは少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌのレベルまで溶解するべきである。さらに、それらは、代表的には、生体適合性でありかつ生物分解性であるが、胃の酸条件を通過するに十分に安定であることが好ましい。それにもかかわらず、本発明は、その最も広い局面において特定の単一のポリマーに限定されることを意図しない。ポリ（アミノ酸／アミノ酸の誘導体）に基づくポリマーは適切であり、そしてこれらのいくつかの具体的な例は、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）および／またはポリ（ラクチド−コ−グリコリド）を含むポリマーである。本発明の特定の実施態様において、以下でより詳細に記載されるように、そのポリマーは、ポリ−（ＤＬ  ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）であり、そしてポリマー溶液中のＰＬＧの濃度は、代表的には少なくとも１０％重量／容量である。本発明の別の特定の実施態様において、以下にまた記載されるように、そのポリマーは、ポリカプロラクトンである。
【００２３】
本発明の微粒子を製造するために適切なＰＬＧ中におけるラクチドとグリコリドとの比は重要でなく、そして市販のポリマーは、２５：７５、５０：５０、および７５：２５のラクチド：グリコリド比を含むが、その比は０：１００〜１００：０の範囲の適切な数値をとり得る。本発明の特に好ましい実施態様において、そのポリマーは分子量７０ｋＤより大きいか、または５０ｋＤより小さいＰＬＧである。本発明に従う微粒子のための他の適切なポリマー処方物は、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリ（ヒドロキシブトレート／バレレート）、エチルセルロース、デキストラン、多糖、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリ−メチル−メタクリレート、ポリ（ｅ−カプロラクトン）、ポリヒドラジン、およびこれらの成分のすべての混合物を含む。
【００２４】
本発明のさらなる局面は、微粒子を調製するために使用される方法の汎用性に関する。具体的には、本発明者らは、基本的な方法論の実質的な改変なしで、広範な分子量の範囲にわたるポリマーを使用して微粒子を作製した。従って、本発明は、以下の工程を包含する、生物活性薬剤をポリマー微粒子中にカプセル化する方法を提供する：
溶媒にポリマーを溶解して、ポリマー溶液を形成する工程；
生物活性薬剤の水溶液を調製する工程；
ポリマー溶液と生物活性薬剤溶液とを攪拌しながら合わせて、油中水型エマルジョンを形成する工程；
この油中水型エマルジョンを、安定剤または界面活性剤を含むさらなる水相に攪拌しながら添加し、水中（油中水）型エマルジョンを形成する工程；
この水中（油中水）型エマルジョンを、過剰の水相に添加して溶媒を抽出し、それによって直径１０ミクロンまでのサイズのポリマー微粒子を形成し、この微粒子は生物活性薬剤を含有している、工程；ここでこのポリマーは、分子量４０ｋＤ以下のＰＬＧを含むか、またはこのＰＬＧからなる。
【００２５】
好ましくは、ＰＬＧの分子量は３０ｋＤ以下であり、そして本発明の特定の実施態様において、微粒子は３ｋＤのＰＬＧ、６ｋＤのＰＬＧ、９ｋＤのＰＬＧ、２２ｋＤのＰＬＧおよびそれらの混合物を含む。適切なポリマーの分子量の範囲は、１．５ｋＤ〜２５０ｋＤである。本発明者らは、３、６、９、１２、１８、２２、６０、６５、および９０ｋＤの市販の調製物を使用した。ポリマーの加水分解速度は分子量に関係し、従ってより低分子量のポリマーは、より迅速に分解する。
【００２６】
Ｓａｈらによって提案されたように、微粒子が蜂の巣状の構造である場合、ポリマーマトリックス中の水相は、凍結乾燥工程の間に凍結乾燥されない。このことは、湿ったポリマーがグリコール酸および乳酸に加水分解されるので、頻繁に観察される先行技術の調製物の生物学的薬剤の変性およびｐＨの減少を説明し得る。本発明者らは、本発明に従って作製した微粒子が、乱暴に扱った場合に崩壊することを観察した。このことは、本発明の微粒子が、水が除去された空の内部を有することを示唆する。
【００２７】
本発明の微粒子は、実際殻状であり（図３ｂ）、中実の蜂の巣状ではなく、または、水和された場合に、水以外の何らかの種の物質相を封入している。さらに、本発明の微粒子は、例えば凍結乾燥によって、球状構造を損なうことなく乾燥され得る（図４ａ）。従って、本発明は、水性調製物よりもはるかに安定である乾燥ｐＤＮＡを含む微粒子の調製を可能にする。
【００２８】
本発明の微粒子の製造は、任意の水溶性物質（任意の水分散可能な物質でさえ）の微粒子への組み込みを可能にするが、好ましくは、その生物活性薬剤は、以下から選択される：ＲＮＡ、タンパク質抗原、非タンパク質抗原、タンパク質結合体化多糖またはペプチド結合体化多糖、タンパク質−ＤＮＡ複合体またはペプチド−ＤＮＡ複合体、合成ペプチド、合成タンパク質、ＤＮＡウイルス、サイトカイン、癌治療薬、ミニ遺伝子、および水溶性薬品。生物活性薬剤はさらに、賦形剤および／またはアジュバントを伴い得、その１つの例はミョウバンである。
【００２９】
実質的に任意の組換えタンパク質抗原およびネイティブなタンパク質抗原（特に、任意の病原性生物に対して免疫するために有用な任意の組換え抗原またはネイティブな抗原）は、本発明の方法を用いてカプセル化され得る。例示のみの目的で、本発明の微粒子への取り込みのためのタンパク質抗原は、必要に応じて以下から選択される：
（ａ）表４に従う以下の抗原：ＦＨＡ、ＰＴ、６９ｋＤ−Ｐｅｒｔａｃｔｉｎ、破傷風毒素、ｇｐ４８、ＮＳ１、Ｃａｐｓｉｄ、ｇｐ３５０、ＮＳ３、ＳＡ、Ｉ、ＮＰ  Ｅ、Ｍ、ｇｐ３４０、Ｆ、Ｈ、ＨＮ、３５ｋＤタンパク質、ＢＰ１、Ｅ１、Ｅ２、Ｃ、Ｍ、Ｅ、およびＭＳＨＡ；ならびに
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの免疫原性フラグメント、改変体、および誘導体。
【００３０】
これらの抗原についての遺伝子配列の登録番号の詳細は、表４に列挙される。
【００３１】
本発明の水中（油中水）型エマルジョン系において、ＤＮＡまたは生物活性薬剤を含む水滴は、それ自体が第２の水相に分散される油中に分散される。このことは、「ぶどうバン（ｃｕｒｒａｎｔ  ｂｕｎ）」の形成を生じ得る。ここでぶどうは水相およびＤＮＡであり、そしてバンはポリマーである。本発明において、この最初の油中水型エマルジョンの生成およびその第２の水相へのその分散は、最終的な微粒子の形成および性質における主要な役割を果たす。本発明者らの微粒子の生成は、最初の乳化段階によって非常に影響される。なぜなら、生じる微粒子は、分散されたＤＮＡ含有水相または生物活性薬剤含有水相からの個々の小滴に対応するからである。ポリマーが濃縮されるのはこのあたりである。本発明の好ましい実施態様において、このポリマーの濃度および最初の水相に対するポリマー溶液の比は、得られる微粒子に影響を与えるように制御される。
【００３２】
具体的には、本発明の好ましい実施態様において、油中水型エマルジョンの形成における溶媒：水相の比は、４：１〜２０：１（容量：容量）、より好ましくは５：１〜１５：１、なおより好ましくは、５：１〜１２：１（容量：容量）の範囲である。これらの範囲内での比の選択は、生じる微粒子のサイズの範囲および構造を決定するための手段である最初の油中水型エマルジョンの形成を決定し、そして微粒子へのＤＮＡの取り込み効率を改善する。溶媒：水相の比が約４：１より下になった場合、生物活性薬剤（例えば、ＤＮＡ）の微粒子への取り込みの顕著な減少が存在する。このことは、不十分なポリマー含有相が、水滴を効率よく被覆するために利用可能であり、従って殻形成および生物活性薬剤の、第２のエマルジョン相の水環境への損失を妨害する場合の結果である。この取り込み効率は、少なくとも４：１、そして好ましくは少なくとも５：１の比で増加する。この比が約２０：１よりも高くなったならば、Ｓａｈの論文中に示されるような「ぶどうバン」型の構造の形成を妨害することが極端に困難になる。このことは、過剰なポリマー含有相の結果であり、これは、「ぶどうバン」構造への凝集を生じる個々の殻構造の解離およびポリマーマトリックスの内部を示す中実微粒子のパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ）である。その構造は、直径が１０ミクロンよりも何倍も大きく、本発明に従う経口免疫には全く適していない。約２０：１より下、そして好ましくは約１５：１より下では、本方法についての、これらの「ぶどうバン」型構造を産生する傾向は低下し、そして直径１０ミクロンまでの微粒子がより容易に形成される。
【００３３】
そのポリマーを溶解する上で使用するのに適切な溶媒は、好ましくは低毒性であり、そして理想的には、薬学的な使用のために認可された溶媒のカテゴリーＩＩＩリストから選択される。カテゴリーＩＩリストの溶媒もまた使用され得るが、ヒトに対する使用のためには、通常、そのような粒子が薬学的に認可され得る前に、粒子中に残存する溶媒の量を決定することが必要である。そのような溶媒は、好ましくは、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌのポリマーを溶解し、そして実質的に水と混和しないべきであり、それによって水中（油中水）型エマルジョンの形成を容易にする。本発明の好ましい実施態様において、溶媒は、高い蒸気圧を示し、その結果、最終溶媒抽出工程が迅速に実行され得る。本発明の方法における使用のために適切な溶媒の例としては、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、プロピレンカーボネート、およびそれらの混合物が挙げられる。アセトンもまた、溶媒混合物中で（すなわち、共溶媒として）使用され得るが、それ自体は、水と混和するので使用され得ない。
【００３４】
溶媒中に溶解され得るポリマーの量を増加させる共溶媒を伴うか、または共溶媒を伴わないかのいずれかで、溶媒が酢酸エチルを含むことがさらに好ましい。混合物の大部分の比率が酢酸エチル（または、別の薬学的に受容された溶媒）であるならば、多くの共溶媒の組み合わせが適切である。共溶媒系を使用することについての利点は２倍である。第１に、溶媒の組み合わせは、単一成分の溶媒におけるよりも多くの量のポリマーを溶解させる。このことは、最初のエマルジョンの生成において溶媒水相の比を減少させる試みにおける場合に有利である。第２に、共溶媒は、高分子量ポリマーの溶解を容易にし、このことは、より溶解度が低いポリマーを用いて重要な溶媒水相比の維持を可能にする。このような共溶媒の例としては、プロピレンカーボネートおよびアセトンが挙げられる。より一般的には、本発明はまた、微粒子の調製における使用のためのポリマー溶液の調製のための任意の適切な溶媒と組み合わせた、共溶媒の使用を提供する。従って本発明の方法は、酢酸エチルを必然的に含む溶媒に限定されない。例えば、ジクロロメタン単独によって溶解されるよりも多い重量のポリマーを溶解する、ジクロロメタンおよびアセトンの組み合わせである溶媒は、本発明の別の局面である。本発明のさらなる局面は、それによって組み合わせた溶媒が薬学的に受容可能な溶媒単独でよりも多くの重量のポリマーを溶解する、共溶媒（例えば、アセトン）と組み合わせた任意の薬学的な溶媒の使用を含む。
【００３５】
ＤＮＡがカプセル化される場合に、本方法の乳化工程が、減少された剪断化ストレス条件下で実行されることがまた特に好ましく、そしてこのことは、必要に応じて、乳化エネルギーの使用（例えば、乳化ミキサーの場合における速度、これはエマルジョンを得るために十分であり、そして所望のサイズ範囲における微粒子を形成するために十分であるが、過度の剪断によってすべてのＤＮＡが損傷するほどには高くない）によって達成される。本発明の１つの実施態様において、以下に記載されるように、乳化ミキサーの速度は改変され、その結果、ＤＮＡの生物学的活性の少なくとも２５％（コンピテント細菌の形質転換または培養細胞のトランスフェクションによってアッセイされた）が、ＤＮＡを含む得られた微粒子中で保持される。適切なミキサー速度は、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーの場合、８０００ｒｐｍより下であり、好ましくは６０００ｒｐｍより下であり、そして以下に記載する特定の実施態様においては、その速度は約３０００ｒｐｍまたは約２０００ｒｐｍより上である。エマルジョン相を生成するために使用され得る装置のすべてのバリエーションは、異なる速度における、そして異なる条件下での評価を必要とする。当業者にとって、装置の各部品についての乳化の最適速度および継続時間を同定することが残されている。Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｓｅｒを８０００ｒｐｍより上の速度で使用する場合、ＤＮＡに有意な損傷が存在し、そして約２０００ｒｐｍより下で使用する場合、直径１０ミクロン以下のサイズの微粒子の形成はほとんど見られないか、または全く見られない。Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーを使用するミキサー速度の効果のより詳細な分析は、ＷＯ−Ａ−９７／１７０６３に見出される。
【００３６】
従って、微粒子の形成に先立つか、または微粒子の形成の間の工程は、所望のサイズの範囲（代表的には、０．０１〜１０ミクロン）の微粒子を形成するために十分なエネルギーであるが、しかしＤＮＡまたは生物活性薬剤が、このプロセスの間に損傷を受けるほど大きくはないエネルギーを入力するために適合される。より強い攪拌（例えば、より高速のミキサー速度を通して）であるほど、より小さい微粒子サイズを生じるというような必要とされるバランスが存在する。しかし、ＤＮＡは、乳化の間の過度の攪拌によって損傷され得る。一方、エマルジョン形成の間にエネルギー入力を減少させることは、エマルジョンが形成されず、そして微粒子が得られ得ないという効果を有し得る。本発明は、これらの競合する因子のバランスをとることを可能にして、受容可能な程度の生物学的活性を保持する微粒子の形成を提供する。
【００３７】
本発明のさらなる実施態様において、本方法は、直径１０ミクロンのサイズまでの微粒子を生じる高い比率の水相の小滴を得るために、ポリマーおよび水溶液の乳化を維持して、より長い時間にわたって最初の油中水型エマルジョンを形成する工程を包含する。このことは、油中水型エマルジョンの形成の間により長い攪拌を用いて、微粒子のサイズ分布がより均一になるという利点を有する。
【００３８】
より長い乳化は、１０ミクロンより大きい微粒子の比率を減少する。さらに、異なる乳化エネルギーにおける乳化の延長は、異なる点の付近を中心とするサイズ分布を産生する（より高いエネルギーは、より小さい平均微粒子サイズを産生する）。従って、本方法は、所望されるサイズに得られるサイズを仕立てるために改変され得る。いくつかの先行技術は、Ｐｅｙｅｒのパッチを通しての微粒子の取り込みとともに、１〜５ミクロンの微粒子および５〜１０ミクロンの微粒子は、異なって取り込まれることを示唆し、そして本発明は、任意の選択された平均直径を有する微粒子の製造を容易にする。大部分の微粒子が、そして好ましくは実質的にすべての微粒子が、直径１０ミクロンまでのサイズ、そして直径０．１ミクロンより大きい、微粒子を得るために、ポリマーおよび水溶液の攪拌を維持して、より長い時間にわたって油中水型エマルジョンを形成させることもまた、好ましい。この文脈において、実質的にすべての粒子との言及は、数で粒子の少なくとも４分の３、そして好ましくは少なくとも９０％が、選択された直径のサイズであることを意味することを意図する。
【００３９】
エマルジョンの攪拌の間に発生する任意の熱の蓄積を消散させ、それによってカプセル化された生物学的薬剤に対する損害を減少させるために、エマルジョンサイクルの間に休止時間を挿入することもまた好ましい。
【００４０】
本発明の特定の実施態様において、以下にさらに詳細に記載されるように、以下の工程を包含する、ポリマー微粒子中に生物活性薬剤をカプセル化するための方法が提供される：
溶媒にポリマーを溶解して、ポリマー溶液を形成する工程；
生物活性薬剤の水溶液を調製する工程；
ポリマー溶液と水溶液とを攪拌しながら合わせて、油中水型エマルジョンを形成する工程；
この油中水型エマルジョンを、さらなる水相に攪拌しながら添加し、水中（油中水）型エマルジョンを形成する工程；
この水中（油中水）型エマルジョンを、過剰の水相に添加して溶媒を抽出し、それによって直径１０ミクロンまでのサイズのポリマー微粒子を形成する工程；ここでこのポリマー溶液と水溶液との攪拌、ならびに油中水型エマルジョンとさらなる水相との攪拌は、ブレンダー中で実行される。
【００４１】
本発明はさらに、乳化工程を実行するためのブレンディング装置を使用して、本発明のポリマー微粒子中にカプセル化された生物活性薬剤を調製する方法を提供する。ブレンディング装置は以下を備える：
混合される液体のための容器；
その容器中で液体を混合させるためのブレード；
ここで、このブレードは、回転軸の周りを回転し、そして実質的に回転軸に沿った方向で液体を駆動させることを包含する混合動作を行う。
【００４２】
このブレードの回転動作は、チャンバー内の液体中で迅速な循環する渦巻きを確立することによって、この液体に乳化エネルギーを与える。従って、この装置の作用は、次に乳化スクリーンを通して押し出される液体を引き上げるスピニングプローブを使用する他のミキサーと区別される。このような作用は、有意な剪断力を生成し、そしてＤＮＡに高度に損傷を与える。本発明の装置の利点は、ＤＮＡのような生物活性薬剤が、カプセル化の間に、より低い剪断力および他のストレスに供せられることである。この装置のブレンディング作用はまた、超音波パルスを使用して液体にエマルジョンエネルギーを与えるソニケーションミキサーから区別される。超音波もまたＤＮＡに損傷を与え、そしてポリヌクレオチド鎖のフラグメント化を引き起こし得る。
【００４３】
エマルジョン工程は、好ましくは、Ｗａｒｉｎｇ（ＲＴＭ）型のブレンダー／ミキサーである装置を使用して実行される。従って、そのブレンダーは、エマルジョンのブレンディングおよび混合のためのチャンバーを備え、そしてさらに、そのチャンバー中に固定可能にマウントされる回転可能なブレードを備える。このブレードは、ブレードから上方および／または下方に延びる複数のブレード端チップを備え、そしてそれは、ブレードに対しておよそ３０〜６０度であり得るか、またはブレードに対して垂直（従って回転軸に対して平行）でさえあり得る。
【００４４】
実験的な目的に適切な小容量の液体についてのみ適切なホモジナイザーの使用とはっきりと対照的に、本方法が工業的な微粒子の製造へのスケールアップのために適切であることは、本発明に従う装置の使用の利点である。
【００４５】
本発明はまた、粒子内容物の放出速度の改変を達成するためのポリマー殻の改変に関する。
【００４６】
従って、本発明は、外部のポリマー殻および内部の生物活性薬剤の水溶液を含む、直径１０ミクロンより小さい微粒子を含む組成物を提供する。この組成物は微粒子を有し、ここでこのポリマーは、５０ｋＤより小さく、そして好ましくは１．５ｋＤまで小さい分子量のＰＬＧである。
【００４７】
本発明はさらに、外部のポリマー殻および内部の生物活性薬剤の水溶液を含む、直径１０ミクロンより小さい微粒子を含む組成物を提供する。この組成物は微粒子を有し、ここでこのポリマーは、７０ｋＤより大きく、そして好ましくは２５０ｋＤまで大きい分子量のＰＬＧである。
【００４８】
本発明はなおさらに、外部のポリマー殻および内部の生物活性薬剤の水溶液を含む、直径１０ミクロンより小さい微粒子の混合物を含む組成物を提供する。この組成物は第１の微粒子（ここでこのポリマーは、５０ｋＤより小さい分子量のＰＬＧである）および第２の微粒子（ここでこのポリマーは、７０ｋＤより大きい分子量のＰＬＧである）である。個々の型のポリマー粒子の非常に複雑な混合物が、組み合わせワクチンまたは治療剤として混合および使用され得る。
【００４９】
しかし、可能な場合、本発明における使用のために適切なポリマーの分子量分布は、固有の粘度（ｉ．ｖ．）によって引用される。このｉ．ｖ．は、容易に測定される定量可能な値であり、分子量分布に相関することが公知である。従って、「平均分子量」の値よりもポリマーの分子量分布の記載が、しばしばより正確である。このｉ．ｖ．は、単位質量あたりの容量の関数として測定され、そして一般的に、グラムあたりのデシリットル（ｄｌ／ｇ）で表現される。
【００５０】
本発明の１つの局面において、直径１０ミクロンまでのサイズであり、そして生物活性薬剤を含有するポリマー微粒子が提供され、ここでそのポリマーは０．５ｄｌ／ｇ未満の固有の粘度のＰＬＧである。生物活性薬剤は、レシピエントへの投与後に発現されるポリペプチドをコードするか、またはアンチセンス配列をコードするＤＮＡのようなＤＮＡであり得る。
【００５１】
このことは、この微粒子がレシピエントの内部で一度分解され、そして抗原提示細胞によって取り込まれ得るが、それは有意な割合のＤＮＡが分解される前であるという利点を与える。
【００５２】
微粒子の大部分が細胞によって取り込まれ、そしてインターナライズされた場合に、カプセル化されたＤＮＡの最大量が放出される放出プロフィールを得ることが好ましい。本発明の好ましい実施態様の代表的な放出プロフィールは、動物への投与後に、１日目と２０日目との間で、より好ましくは２日目と１０日目との間で、カプセル化されたＤＮＡの３０〜４０％の放出を提供する。投与が経口経路を介する場合、有意なＤＮＡ放出が、微粒子が動物の胃を通して腸内への通過後に起こる。次いで、そこで微粒子はＰｅｙｅｒパッチのＭ細胞によって取り込まれ、次いで、ここで微粒子は分解し、カプセル化されたＤＮＡを放出する。
【００５３】
上記で、低いｉ．ｖ．（代表的には低分子量）のＰＬＧの使用が、より迅速な粒子の分解および粒子の内容物の放出によって、いかにして標準的な６０ｋＤ  ＰＬＧ（高いｉ．ｖ．を有する）を使用するよりも改善された免疫を与え得るかを議論した。それにもかかわらず、ｉ．ｖ．の範囲（従って、分子量の範囲）を有する微粒子を含む組成物が使用された場合、この組み合わせは有利な免疫効果を産生するということが利点であり得る。
【００５４】
本発明の特定の実施態様において、微粒子についての放出プロフィールは、ｉ．ｖ．および／またはポリマーの分子量分布を調整することによって操作され得る。以下により詳細に記載される本発明の特定の実施例において、この調整は、より高いｉ．ｖ．値およびより低いｉ．ｖ．値のＰＬＧ調製物を組み合わせることによりなされ、中間体ｉ．ｖ．の複合ポリマーを産生する。中間体ｉ．ｖ．ＰＬＧから作られた微粒子は、改変されたＤＮＡ放出プロフィールを示し、ここで存在するより低いｉ．ｖ．ポリマーの割合がより大きいほど、より迅速にＤＮＡが放出される。このようにして、経口および他の投与経路に適切な所望の放出プロフィールを示す本発明の微粒子は産生される。
【００５５】
好ましくは、ｉ．ｖ．は、０．１〜０．４ｄｌ／ｇの範囲である。本発明の特定の実施態様において、この範囲内のｉ．ｖ．を有するＰＬＧからなるポリマー殻を有する微粒子が、良好なＤＮＡ放出プロフィールおよび保持された良好な粒子構造を示すことが、走査型電子顕微鏡の下で調べた場合に見出された。以下に記載される本発明の特定の実施例において、粒子は、０．１９ｄｌ／ｇおよび０．３９ｄｌ／ｇのｉ．ｖ．を有するＰＬＧの混合物で作製され、そしてこれらの粒子は、経時的に非常に良好な放出プロフィールを示した。
【００５６】
本発明はまた、ワクチン接種治療および本発明の微粒子を用いる方法に関する。従って、本発明はさらに、以下の本発明の方法を含むワクチン接種用組成物としての使用またはその組成物における使用のための微粒子の作成方法を提供し、ここでこの微粒子は、抗原をコードするＤＮＡを含む。
【００５７】
なおさらに本発明は、ワクチン接種用組成物としての使用またはその組成物における使用のための組成物を提供し、これは、以前に列挙されたような本発明の組成物を含み、ここでこの微粒子は抗原をコードするＤＮＡを含み、そして本発明はワクチン接種のための医薬の製造における本発明を含む組成物の使用を提供し、ここでこの微粒子は免疫源をコードするＤＮＡを含む。
【００５８】
本発明の特定の実施態様において、その微粒子はマトリックスの内部に位置するか、またはマトリックスによって囲まれる。このようなマトリックスは、好ましくは時間とともに分解して、定常的な流れまたは断続的なパルスのいずれかにおいて微粒子を放出する生物分解性材料から作られる。本発明のデポット（ｄｅｐｏｔ）は、代表的には、皮下投与されるか、または身体の他の部分に移植され得る。このデポットは部分的に再水和に抵抗性であって、その結果コア中に位置する粒子がそれらが放出されるまで脱水状態で残っており、それによってカプセル化されたＤＮＡがデポットの実質的に全寿命の間に高い完全性であることを確実にすることが好ましい。このようなデポットの製造のために適切な材料の例は、当該分野で一般的に公知であり、そしてポリヒドロキシ酪酸；ポリカプロラクトン；シリコーン；エチレンビニルアセテートおよびポリビニルアセテートを含むがこれらに限定されない。
【００５９】
本発明の好ましい実施態様の方法に従って、得られる微粒子の大部分（代表的には９０％以上）は、１０ミクロン以下のサイズ範囲にある。微粒子調製物の電子顕微鏡写真は、これらの大部分が殻であるように見えることを示す（図３ｂ）。より小さい微粒子の存在は、調製物の効力に対して有害ではない。なぜなら、１マイクロメートルより小さい微粒子はなお、Ｍ細胞によって活性に食作用を受け、続いて消化管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ）の細胞に移動することが公知であるからである。実際、小さい（直径２ミクロン未満）サイズの微粒子は、腸の食細胞およびＭ細胞による取り込みを促進することにおいて有利であることが示唆されてきた。活性な生物活性分子を含む小さな粒子を調製するための主な障壁は、所望のサイズ分布を調製するために、大量の潜在的な損傷的エネルギーを導入する必要性であった。本発明の明確な利点は、ブレンダー技術を使用するエネルギー入力のさらなる制御が、この生物活性分子を変性させることなく小さな粒子の生成を可能にすることである。これはまた、これらの強力に改善された送達ビヒクルの大規模産生の可能性を提供する。
【００６０】
微粒子のサイズは、Ｍ細胞による微粒子の貪食作用のプロセスにおいて、そして細胞間移動に非常に重要である。１０ミクロンを超えるサイズの微粒子は取り込まれず、そして腸の上皮を横切って輸送されないことが公知である。先行技術に従って作製されたいくつかの調製物では、本発明者らは、１０ミクロン〜６０ミクロンの直径を有する、すなわち、必要とされる最適サイズよりも大きな、有意な数の微粒子を調べた。スフェアの容量が立法関数（ｃｕｂｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に基づいて算出されるとみなされる場合、このような調製物において、大部分のｐＤＮＡが、大きな殻の内部に含まれ得ることが全体に実現可能である。このことは、この調製物を、免疫系に対して利用不能にし、従って用量を、予想されるよりもかなり低くし得、１０ミクロンまでの所望のサイズ範囲の大多数の微粒子を有する微粒子調製物をもたらす、本発明に記載される方法に従って、本明細書において問題を克服する。
【００６１】
本発明の微粒子の放出特性の制御が検討されている。生物活性薬剤が正確にはどのようにして微小殻から放出されるかは、不明である−おそらく、一旦、殻が加水分解によって分解した場合の、バーストとしてである。このことは、微粒子の分解が異なる時点で起きるに従って持続放出をもたらす。時間範囲は、考えられるところでは、以前に意図された時間よりも短い期間を超え得、そして記載されるようなポリマー分子量を通して制御可能である。
【００６２】
ある範囲の界面活性剤は、本発明の方法における使用に適切であり、そして本発明は、実施例において使用される特定の界面活性剤であるポリビニルアルコールに限定されない。他の受容可能な界面活性剤が当該分野で公知であり、そしてメチルセルロースがさらなる例である。界面活性剤は、二重エマルジョンを安定化する役割を有する。水性界面活性剤の選択は、当業者の問題であり、そしてこの選択は、ポリマーおよびポリマー溶媒の選択に関して行なわれ得る。
【００６３】
腸におけるＭ細胞による微粒子の取り込みについての他の関係のある背景は、以下に提供される：Ｊｅｐｓｏｎ  ＭＡら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９３，第１巻，２４５−２４９頁；Ｈｏｗａｒｄ  ＫＡら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９４，第４巻，２０７−２１６頁；Ｎｅｕｔｒａ  ＭＲら，Ｃｅｌｌ，１９９６，第８６巻，３４５−３４８頁；Ｆｌｏｒｅｎｃｅ  ＡＴ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７．第１４巻，２５９頁以下参照；Ｏ’Ｈａｇａｎ  ＤＴ，Ｊ．Ａｎａｔ．，１９９６，第１８９巻，４７７−４８２頁；およびＫｒｅｕｔｅｒ  Ｊ，Ｊ．Ａｎａｔ．，１９９６，第１８９巻，５０３−５０５頁。
【００６４】
本発明はここで、添付の図面を参照して特定の実施態様において記載される。
【００６５】
図１は、ジクロロメタン（先行技術：レーン３）または酢酸エチル（本発明に従う：レーン４（高分子量ＰＬＧ）、レーン５（低分子量ＰＬＧ））のいずれかを用いて調製した、等しい重量のＰＬＧ微粒子から回収されたＤＮＡの相対量および相対的な物理状態を示すアガロースゲルを示す。レーン２は、大きな比率のスーパーコイル形態（下のバンド）を示すコントロールＤＮＡ（ストック）であり、そしてレーン１および６は、分子量マーカーである。レーン３とレーン４および５との比較は、酢酸エチルがＤＮＡのカプセル化を促進するだけでなく、開環形態（上のバンド）と比較してスーパーコイル形態（下のバンド）のより大きな比率の保持をももたらすことを示唆する。レーン４（高分子量ＰＬＧ）において分析された調製物におけるＤＮＡの取り込みがより小さいのは、酢酸エチル中でのポリマーのより低い溶解度に起因する、制限されたポリマーの存在における微粒子形成の結果であることに留意すべきである。
【００６６】
図２は、本発明のＰＬＧ微粒子のインビトロでの放出反応速度論を示す。微粒子を、高分子量ＰＬＧ（黒四角）または低分子量ＰＬＧ（白四角）を用いて調製した。３７℃に維持した緩衝液中に懸濁した微粒子の滅菌インキュベーションから提供された上清のアリコートにおけるＤＮＡ濃度を、光学吸光度分光法を用いて測定した。
【００６７】
図３ａは、凍結乾燥した粉末としてＥＭ標本グリッドに適用したＰＬＧ微粒子の調製物（本発明に従って調製される）を示す。球形構造の均一性は、この粒子が凍結乾燥によって有害な影響を受けないことを示す。
【００６８】
図３ｂは、最適な条件下で調製されたＰＬＧ微粒子（本発明に従う）「殻様」構造を実証する。標本を、フリーズフラクチャーした。これらの粒子の中空の内部が明らかに見られ得、そしてこれは先行技術において与えられる例とは非常に異なる。
【００６９】
図４ａは、室温にてＥＭ標本グリッド上で、水和されたスラリーから乾燥されたＰＬＧ微粒子（本発明に従って調製された）の調製物を示す。蒸発した水として遭遇するストレスは、種々の程度まで構造的崩壊を誘導した。このことは、微粒子が、中空の内部を有する「殻様」構造を有し得ることを示す。
【００７０】
図４ｂは、過剰（４：１より大きい）溶媒：水相比の条件下で調製された微粒子の内部構造を示す。調製物を、液体窒素を用いて凍結させ、そして標本を、凍結している間にフラクチャーし、粒子が種々の精巧な内部構造を有することを示した。
【００７１】
図５は、種々の固有粘度のＰＬＧ調製物から作製されたＰＬＧ微粒子から経時的に放出されたＤＮＡの百分率を示す。低固有粘度ＰＬＧを、ＲＧ５０２と称し、そしてより高い固有粘度のＰＬＧをＲＧ５０３と称す。５０：５０および７５：２５のＲＧ５０２およびＲＧ５０３混合物から作製された微粒子からのＤＮＡ放出もまた示し、そしてＲＧ５０２の固有粘度とＲＧ５０３の固有粘度との中間の固有粘度のＰＬＧ調製物を表す。
【実施例】
【００７２】
（実施例１）
（微量カプセル化の標準的方法）
微粒子を、ここで示す方法に従って調製した。この方法は、微量カプセル化の標準的方法（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ）と呼ばれる。
【００７３】
１．酢酸エチル（炭酸ナトリウム上で乾燥させた）中の１０％（ｗ／ｖ）の５０：５０低ｉｖ（６０ｋＤ）ＰＬＧ溶液を、この混合物を約３７℃まで加熱し、そして溶解が完了するまで回転させることによって調製する。
【００７４】
２．プラスミドＤＮＡ溶液を、ＳＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＩ、ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１５０ｍＭ  ＮａＣＩ）中で１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調製する。
【００７５】
３．このＰＬＧ酢酸エチル溶液（４ｍｌ）を、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザーを用いて３０００ｒｐｍにてホモジナイズし、そしてプラスミドＤＮＡ（６００マイクロリットル）を添加する。得られる混合物を、さらに２．５分間ホモジナイズする。
【００７６】
４．８％（ｗ／ｖ）水性ポリビニルアルコール溶液（９２ｍｌ）を、丸底フラスコ中で約３０００ｒｐｍでホモジナイズし、最初のエマルジョンを添加し、そして得られる混合物をさらに２．５分間ホモジナイズする。
【００７７】
５．このエマルジョンを、３７℃の２回蒸留水（１００ｍｌ〜１Ｌ）に注ぎ、そして少なくとも２０分間攪拌する。
【００７８】
６．この微粒子を、１０，０００ｒｐｍにて２５分間、２５℃で遠心分離することにより回収する。
【００７９】
７．この微粒子を、２回蒸留水中に再懸濁し、そして遠心分離することによって洗浄する。この洗浄工程を繰り返して、その結果、合計５回の回転を行い、溶媒およびエマルジョン安定剤の除去を促進する。
【００８０】
８．５回目の回転の後、ペレット化した微粒子を、最少量の２回蒸留水中のスラリーとして回収し、そして凍結乾燥する。代表的な調製物を、図３ａに示す。
【００８１】
（標準的な方法に対するバリエーション）
上記の標準的な方法に基づいて、多数のバリエーションを、工程および／または成分に対して行った。結果は以下の通りである：
１．酢酸エチル中の５０：５０の低い（５０ｋＤ以下）ＭＷおよび５０：５０の高い（７０ｋＤ以上）ＭＷの両方のＰＬＧ溶液を研究し、そして１０ミクロンまでのサイズの微粒子調製物が生成されることが見出された。他のＰＬＧ組成（例えば、７５：２５）および高ＭＷまたは低ＭＷを有するポリマーもまた、本発明の微粒子および方法に適切である。
【００８２】
２．ＰＬＧ対ＥＡのｗ／ｖ比を研究した。高ＭＷポリマーを用いて、０．０４ｇ／ｍｌまでの低減は、取り込み効率の著しい減少を導いた（図１）。試験した最大量は０．１２５ｇ／ｍｌであった。これは、カプセル化を改善し、１ミクロン〜１０ミクロンのサイズ範囲の微粒子を生成したが、カプセル化の前に混濁溶液をもたらした。
【００８３】
３．有機相におけるＰＬＧの濃度を増加させるための共溶媒の使用を研究した。共溶媒（例えば、酢酸エチルと組み合わせた炭酸プロピレンおよびアセトン）は、油（溶媒）相中に溶解された増加した量のポリマーを有する、初期油中水型エマルジョンの調製を可能にした。このことは、微粒子へのＤＮＡの取り込みを効率的に改善することが有利に見出された。
【００８４】
４．最初の乳化工程における水相対ポリマー相の比は、特定の範囲内で変更され、そしてハニカム構造が回避され、そして微粒子のサイズが制御され得、粒子の調製物を実質的に全て所望の範囲内にし、そして所望の構造を有することをもたらすことが見出された。
【００８５】
５．最初の乳化のためのホモジナイゼーションの速度を変更した。Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーを用いて、いくらかのＤＮＡの生存能力を依然として保持しながら、ホモジナイゼーションの速度を４０００ｒｐｍまで増加させることが可能である。しかし、２０００ｒｐｍが、良好なＤＮＡ生存能力を与え、そしてこの速度における長時間のホモジナイゼーションについて充分非損傷的であり、狭いサイズ分布を有する微粒子の形成を可能にしながらも有意なＤＮＡ損傷を導かない。３０００ｒｐｍはまた、有意なＤＮＡ損傷を伴わずに長時間にわたって用いられ得る。
【００８６】
６．用いられるＰＶＡの濃度は、過剰であると考えられ、そして２％の濃度が適切であることが示唆されている。このことはまた、微粒子の安定性およびサイズにもまた影響を与え得る、混合物の粘度に対して効果を有する。
【００８７】
７．最終段階で好首尾に用いられる最少容量の水は、１５０ｍｌである。攪拌を、最初に３７℃の水を用いて室温で実施し、そして攪拌を２０分間〜１．５時間の時間にわたって継続したが、攪拌時間についての理論的上限は存在しないようである。
【００８８】
８．この手順を実施する温度は、溶液の粘度および他の相における試薬の溶解度のようなパラメーターをもたらす。酢酸エチルを用いて４℃で実施した単一の実験は、より低い取り込みをもたらした。
【００８９】
（実施例２）
（溶媒ならびに高分子量および低分子量の５０：５０  ＰＬＧの比較）
以下の実験を、標準的な方法を用いて実施した。ここでは、ＥＡ＝酢酸エチル、そしてＤＣＭ＝ジクロロメタンである。各場合におけるＰＬＧ容量は４ｍｌであった。ＥｔＯＨは、実験のいずれにおいても用いなかった。結果を表１に示す。
【００９０】
【表１】
2010270121.tif 000002
（実施例３）
（微粒子から回収されたＤＮＡの物理的状態）
図１は、ジクロロメタンおよび酢酸エチルを用いて調製された微粒子から回収されたＤＮＡの物理的状態を示す。一番下のバンドは、スーパーコイルＤＮＡである。このバンドの強度が強いほど、ＤＮＡの統合性がより高く保持された。
【００９１】
（実施例４）
（トランスフェクションの結果）
実験を、Ｖｅｒｏ細胞を用いて行った。ＤＮＡを微粒子から回収し、そしてＶｅｒｏ細胞を、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）を用いてトランスフェクトした。
【００９２】
ｖｅｒｏ細胞を、ＤＮＡを含む微粒子で、しかしトランスフェクションを増強するさらなる試薬を用いずにトランスフェクトして、さらなる実験を行った。トランスフェクションの程度を、市販のルシフェラーゼアッセイシステムを用いて評価した。結果を表２に示す。
【００９３】
【表２】
2010270121.tif 000003
（実施例５）
（ＰＬＧ濃度の効果）
以下の表３は、低分子量（６０ｋＤ）ＰＬＧの濃度を低減させた場合に得られた結果を示す。これらの比較実験では、酢酸エチルを溶媒として用い、有機相の容量を４ｍｌで保持した。３０００ｒｐｍというホモジナイゼーションの速度を全ての場合で用いた。
【００９４】
【表３】
2010270121.tif 000004
（実施例６）
（共溶媒の使用）
高分子量ＰＬＧは、酢酸エチル中で１０％  ｗ／ｖ以上では全体として可溶性でない。ＰＬＧ濃度を増加させるため、溶媒の混合物（例えば、酢酸エチルおよび炭酸プロピレン）の適用を調査した。
【００９５】
８０％酢酸エチル：２０％炭酸プロピレンは、１０％  ｗ／ｖ  ＰＬＧの清澄な溶液を与えた。
【００９６】
（実施例７）
（放出反応速度）
高分子量および低分子量のポリマーを使用して酢酸エチルを用いて調製した微粒子のサンプルを研究して、放出特性を決定した。この微粒子を滅菌ＳＴＥ緩衝液に添加し、そして適切な抗菌剤を用いて３７℃にて維持した。サンプルを間隔をおいて取り出し、そして放出されたＤＮＡおよび保持されたＤＮＡを決定した。このデータから、時間プロフィールとともに放出百分率を決定した。この結果を以下の図２に示す。
【００９７】
（実施例８）
（ポリマーとしてポリカプロラクトンを用いて調製した微粒子）
微粒子を、以下の方法に従って、ポリカプロラクトンポリマーを用いて調製する。
【００９８】
１．酢酸エチル中のポリカプロラクトンの１００ｍｇ／ｍｌ溶液（平均ＭＷ＝１４ｋＤ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を、溶解が完了するまでボルテックスすることにより調製する。
【００９９】
２．プラスミドＤＮＡ溶液を、９．９ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＳＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で調製する。
【０１００】
３．ポリカプロラクトン酢酸エチル溶液（４ｍｌ）を、Ｗａｒｉｎｇブレンダー中で低出力でホモジナイズし、そしてプラスミドＤＮＡ（４００マイクロリットル）を添加する。得られる混合物を、１５秒間の休止期間を間に挟んで１５秒間のサイクルで４回ホモジナイズする。
【０１０１】
４．８％（ｗ／ｖ）水性ポリビニルアルコール溶液（６６ｍｌ）を、Ｗａｒｉｎｇブレンダー中で低出力でホモジナイズし、最初のエマルジョンを添加し、そして得られる混合物を、１５秒間の休止期間を間に挟んで１５秒間のサイクルで４回ホモジナイズする。
【０１０２】
５．このエマルジョンを、３７℃の２回蒸留水（３００ｍｌ）中に注ぎ、そして少なくとも２０分間攪拌する。
【０１０３】
６．微粒子を、２５℃にて１０，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離することにより回収する。
【０１０４】
７．この微粒子を、２回蒸留水中に再懸濁し、そして遠心分離することにより洗浄する。この洗浄工程を繰り返し、その結果、合計５回の回転を行い、溶媒およびエマルジョン安定剤の除去を促進する。
【０１０５】
８．５回目の回転の後、ペレット化した微粒子を、最少量の２回蒸留水中のスラリーとして回収する。微粒子は、主に直径１ミクロン〜１０ミクロンのサイズ範囲で得られ、次いで貯蔵のために凍結乾燥される。
【０１０６】
（実施例９）
（ポリマーの固有粘度を変更することによる、ＰＬＧ微粒子の放出プロフィールの改変）
実施例８の手順は、以下のＰＬＧ調製物を用いて以下の通りであった：
（ａ）０．１９ｄｌ／ｇの固有粘度（ＲＧ５０２、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから）
（ｂ）０．３９ｄｌ／ｇの固有粘度（ＲＧ５０３、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから）
（ｃ）０．１９ｄｌ／ｇおよび０．３９ｄｌ／ｇの固有粘度のＰＬＧの５０：５０（重量による）の混合（ＲＧ５０２およびＲＧ５０３の混合）
（ｄ）０．１９ｄｌ／ｇおよび０．３９ｄｌ／ｇの固有粘度のＰＬＧの７５：２５（重量による）の混合（ＲＧ５０２およびＲＧ５０３の混合）．
主に１ミクロン〜１０ミクロンのサイズの微粒子を得て、そしてこの粒子からのＤＮＡの放出のプロフィールを測定し、そして図５に図示する。
【０１０７】
（実施例１０）
以下の改変を加えた実施例８のプロトコールに従った：８ｍｌのポリマー溶液および０．８ｍｌのプラスミド溶液を用い、そして１３２ｍｌ  ＰＶＡを用いて第１のエマルジョンを安定化させた。
【０１０８】
プラスミドを、以下の通りにＰＬＧ中にカプセル化した：
（ａ）５０：５０のＲＧ５０２：ＲＧ５０３の混合；
（ｂ）この（ａ）の混合を繰り返した；
（ｃ）７０：３０のＲＧ５０２：ＲＧ５０３の混合；
（ｄ）この（ｃ）の混合を繰り返した。
【０１０９】
主に直径１ミクロン〜１０ミクロンのサイズの微粒子が得られ、そしてＤＮＡ取り込み効率について試験された。（ａ）および（ｂ）の微粒子から、６５％が、カプセル化されたＤＮＡとして回収され、そして（ｃ）および（ｄ）の微粒子から、６９％が、カプセル化されたＤＮＡとして回収された。この％の数字は、ある比率のＤＮＡが、粒子の単離において（例えば、遠心分離によって）失われ、そして結果として、回収率は１００％の効率ではあり得ないという事実を考慮していない。従って、これらの実施例において達成された数字は、非常に高い取り込み効率を表す。
【０１１０】
従って、本発明は、生物活性薬剤（特に、ＤＮＡ）のカプセル化のさらなる、そして改善された方法を提供し、そしてさらに、遺伝子治療および／またはワクチン接種のため、ならびに他の適用のための、生物活性薬剤を含む微粒子を含む改善された組成物を提供する。
【０１１１】
【表４】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図３】
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