(57)【要約】【課題】キク属植物の種を識別する方法、およびそれに用いるプライマーセットを提供すること。【解決手段】キク属植物の反復ＤＮＡまたはｒＤＮＡのＩＧＳ領域内に設計されたプライマーセットを用いて、キク属植物由来のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物の電気泳動パターンを解析することを特徴とする、キク属植物の種を識別する方法、およびそれに用いるプライマーセット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キク属植物の反復ＤＮＡまたはｒＤＮＡのＩＧＳ領域(Intergenic Spacer region)内に設計されたプライマーセットを用いて、キク属植物由来のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物の電気泳動パターンを解析することを特徴とする、キク属植物の種を識別する方法。
【請求項２】
前記反復ＤＮＡが、配列番号１に示されるｐＮＮ８０６のＤＮＡ配列、または配列番号２および配列番号３に示されるＤＮＡ配列を含むｐＭＢ５７８のＤＮＡ配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｒＤＮＡのＩＧＳ領域が配列番号４に示されるＤＮＡ配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーが、以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）
（ｂ）５９Ｒ（配列番号７）および６７Ｆ（配列番号８）
（ｃ）１６０Ｒ（配列番号９）および１６２Ｆ（配列番号１０）
（ｄ）１９２Ｒ（配列番号１１）および１９３Ｆ（配列番号１２）
（ｅ）１９６Ｒ（配列番号１３）および１９７Ｆ（配列番号１４）
（ｆ）１７６Ｒ（配列番号１５）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｇ）１７９Ｒ（配列番号１７）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｈ）１８０Ｒ（配列番号１８）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｉ）１８７Ｒ（配列番号１９）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｊ）１４３Ｒ（配列番号２０）および１４５Ｆ（配列番号２１）
【請求項５】
識別されるキク属の種が、Ajania latifolia（種略：AL）、Ajania rupestre（種略：AR）、Chrysanthemum pacificum（種略：DP）、Chrysanthemum shiwogiku（種略：DS）、Chrysanthemum boreale（種略：DB）、Chrysanthemum indicum（種略：DI4）、Chrysanthemum chanetii（種略：DC4）、Chrysanthemum zawadskii（種略：DZ4およびDZ6）、Chrysanthemum zawadskii var. latilobum（種略：DZL）、Chrysanthemum weyrichii（種略：DWy）、Chrysanthemum arcticum ssp. maekawanum（種略：DA）、Chrysanthemum makinoi（種略：DM）、Chrysanthemum yoshinaganthum（種略：DY）、Chrysanthemum wakasaense（種略：DW）、Chrysanthemum japonense（種略：DJ）、Chrysanthemum ornatum（種略：DJO）、Chrysanthemum crassum（種略：DJL）、Chrysanthemum vestitum（種略：DV）、およびChrysanthemum morifolium（種略：DG）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
増幅産物の電気泳動パターンの解析を、以下の増幅産物の有無の表と比較することにより行い、キク属植物の種を特定することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【表１】
2010154802.tif 000008
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを含み、請求項１〜６のいずれかに記載の方法に用いられる、キク属植物の種識別用プライマー。
（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）
（ｂ）５９Ｒ（配列番号７）および６７Ｆ（配列番号８）
（ｃ）１６０Ｒ（配列番号９）および１６２Ｆ（配列番号１０）
（ｄ）１９２Ｒ（配列番号１１）および１９３Ｆ（配列番号１２）
（ｅ）１９６Ｒ（配列番号１３）および１９７Ｆ（配列番号１４）
（ｆ）１７６Ｒ（配列番号１５）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｇ）１７９Ｒ（配列番号１７）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｈ）１８０Ｒ（配列番号１８）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｉ）１８７Ｒ（配列番号１９）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｊ）１４３Ｒ（配列番号２０）および１４５Ｆ（配列番号２１）
【請求項８】
請求項７に記載の（ａ）〜（ｊ）の少なくとも１つのプライマーセットを含むキット。
【請求項９】
プライマーセット（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）を用いて、生物由来のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物の電気泳動パターンを解析することを特徴とする、生物種を識別する方法。
【請求項１０】
プライマーセット（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）であって、請求項９に記載の方法に用いられる、生物種識別用プライマーセット。
【請求項１１】
請求項１０に記載のプライマーセットを含むキット。
【請求項１２】
プライマーセット（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）を用いて、ナス科植物由来のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物の電気泳動パターンを解析することを特徴とする、ナス科植物の属、種もしくは品種を識別する方法。
【請求項１３】
プライマーセット（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）であって、請求項１２に記載の方法に用いられる、ナス科植物の属、種もしくは品種の識別用プライマーセット。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプライマーセットを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キク属植物の種を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キク属植物は東アジアに広く分布し、約３０種が分化している。１９００年代初頭に高次倍数体シリーズをもつ植物として紹介され、以来細胞学的に数多くの研究がなされてきた。ゲノム分析からは、典型的な同質倍数体植物であることが明らかにされた。しかし、種間交雑では染色体がお互いに対合するとともに、倍数性の異なる交雑では同親対合を引き起こすことから、細胞学的にゲノム分化を調べることに完全に行き詰まってしまった。また、世界中で多くの人に観賞されている栽培ギクについて細胞学的にあるいは遺伝学的に解析されようとしてきたが、同質倍数体であることと品種のほとんどが染色体数六〜七倍体（２ｎ＝５４〜６３）と高次倍数体であることから全くと言っていいほど進展していない。例えば白花の遺伝子がどの染色体に乗っているかといった基本的な事すら判っていない。このようにキク属の遺伝学的な研究の基盤となる連鎖地図は全く作成されておらず、ゲノム研究は非常にたち遅れている。
【０００３】
多くの栽培植物では品種や種を識別するためのＰＣＲバンドマーカーが同定され、複雑な種群の遺伝的関係などの解明等に実際に利用されてきた（非特許文献１〜１１）。また、珍しい植物や商業的な栽培品種で優良なものは盗難や偽装販売の危機にさらされており、これらを同定する技術基盤の確立が求められている。イネなどではすでにこの同定技術が確立されて実用化されている。一方、キク属は世界で最も多くの人々に観賞されている花卉の一つであるイエギク（栽培ギク）を含んでおり、今なお園芸品種が非常に多く作出され続けている。分子レベルでの研究が急速に発達してきた今、あらためて、野生ギクおよび栽培ギクのゲノム分化を明らかにするとともに、さらに染色体ゲノム上の遺伝子地図を作製していくことの重要性が問われてきている。しかし、キク属植物に関するこの種の報告は非常に限られている。キク属植物では野生種シマカンギクでＲＡＰＤやＩＳＳＲプライマーを用いてみられた多型性を利用していくつかのゲノム分化研究がなされているにすぎない（非特許文献１２、１３）。
【０００４】
また、１種類のプライマーセットを用いてあらゆる生物の遺伝的な多型を検出することができれば、自分が調べたい生物群の遺伝的な多型を簡単に調べることができるので、極めて画期的である。現実的には広範囲の生物においてＰＣＲで増幅できるプライマーはほとんど知られていない。しかし、ごく限られたＤＮＡ種において、すなわちｒＤＮＡやトランスポゾンなどの中には生物種を超えて、広く塩基配列の共通性の高い領域を示すものがある。ｒＤＮＡは単型バンドとして出現する場合がほとんどで、一般的に識別に向いていない。一方、トランスポゾン自体は動植物を超えて類似の配列を示すこともあるが、１種類のプライマーセットではある程度広い生物群（たとえば被子植物）で多型バンドとしてみられても、生物群全体に及ぶことはなかった。
【０００５】
【非特許文献１】Soltis DE, Soltis PS. 1995. “The dynamic nature of polyploid genomes.” Proceedings of the National Academy of Sciences,  USA 92: 8089-8091
【非特許文献２】Lowe AJ, Abbott RJ. 1996. “Origins of the new allopolyploid species Senecio cambrensis (Asteraceae) and its relationship to the Canary Islandsendemic Senecio teneriffae.” American Journal of Botany 83: 1365-1372.
【非特許文献３】Brochmann C, Xiang Q, Brunsfeld SJ, Soltis DE, Soltis PS. 1998. “Molecular evidence for polyploid origins in Saxifraga (Saxifragaceae): the narrow arctic endemic S. svalbardensis and its widespread allies.” American Journal of Botany 85: 135-143.
【非特許文献４】Cook LM, Soltis PS, Brunsfeld SJ, Soltis DE. 1998. “Multiple independent formations of Tragopogon tetraploids (Asteraceae): evidence from RAPD markers.” Molecular Ecology 7: 1293-1302.
【非特許文献５】Wallace LE. 2003. “Molecular evidence for allopolyploid speciation and recurrent origins in Platanthera huronensis (Orchidaceae).” Journal of Plant Science 164: 907-916.
【非特許文献６】Awasthi AK, Nagaraja GM, Naik GV, Kanginakudru S, Thangavelu K, Nagaraju J. 2004. “Genetic diversity and relationships in mulberry (genus Morus) as revealed by RAPD and ISSR marker assays.” BMC Genetics 5: 1.
【非特許文献７】Budak H, Shearman RC, Parmaksiz I, Dweikat I. 2004. “Comparative analysis of seeded and vegetative biotype buffalograsses based on phylogenetic relationship using ISSRs, SSR, RAPD, and SRAPs.” Theoretical and Applied Genetics 109: 280-288.
【非特許文献８】Souframanien J, Gopalakrishna T. 2004. “A comparative analysis of genetic diversity in blackgram genotypes using RAPD and ISSR markers.” Theoretical and Applied Genetics 109: 1687-1693.
【非特許文献９】Guo YP, Saukel J, Mittermayr R, Ehrendorfer F. 2005. “AFLP analyses demonstrate genetic divergence, hybridization, and multiple polyploidization in the evolution of Achillea (Asteraceae-Anthemideae).” New Phytologist 166: 273-290.
【非特許文献１０】Chang-Xing Ma, George Casella, Zuo-Jun Shen, Thomas C. Osborn and Rongling Wu. 2002. “A Unified Framework for Mapping Quantitative Trait Loci in Bivalent Tetraploids Using Single-dose Restriction Fragments: A Case Study from Alfalfa”, Genome Res. 12: 1974-1981.
【非特許文献１１】Dachuang Cao, Thomas C. Osborn, and Rebecca W. Doerge 2004. “Correct Estimation of Preferential Chromosome Pairing in Autotetraploids”, Genome Res. 14: 459-462.
【非特許文献１２】Dai SL, Zhong Y, Zhang XY. 1995. “Study on numerical taxonomy of some Chinese species of Chrysanthemum (DC.) Des Moul.” Journal of Beijing Forestry University 17: 9-14.
【非特許文献１３】Dai SL, Chen JY. 1997. “Cladistic study on some Chrysanthemum spp. In China.” Journal of WuhanBotanical Research 15: 27-34.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、キク属植物の種を識別する方法およびそれに用いるプライマーセットを提供することにある。また、生物種を識別する方法およびそれに用いるプライマーセット、ならびにナス科植物の属、種または品種を識別する方法およびそれらに用いるプライマーセットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、キク属植物の遺伝子マーカーを探索し、キク属植物では全く作成されていない遺伝子地図の作成に取り組んできた。その過程で、反復ＤＮＡ等のクローニングを行い、これを元に一次的なプライマーを設計し、この過程で区別された種特異的な塩基配列から二次的に多くのプライマーを設計し、多くの多型変異を確認したところ、キク属植物の種の識別に用い得るプライマーセットを選定することに成功し、本発明を完成するに至った。また、生物種の識別に用い得るプライマーセット、およびナス科植物の属、種または品種の識別に用い得るプライマーセットを選定することにも成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち本発明は、以下の発明を包含する。
〔１〕キク属植物の反復ＤＮＡまたはｒＤＮＡのＩＧＳ領域(Intergenic Spacer region)内に設計されたプライマーセットを用いて、キク属植物由来のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物の電気泳動パターンを解析することを特徴とする、キク属植物の種を識別する方法。
【０００９】
〔２〕前記反復ＤＮＡが、配列番号１に示されるｐＮＮ８０６のＤＮＡ配列、 または配列番号２および配列番号３に示されるＤＮＡ配列を含むｐＭＢ５７８のＤＮＡ配列からなる、〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記ｒＤＮＡのＩＧＳ領域が配列番号４に示されるＤＮＡ配列からなる、〔１〕に記載の方法。
【００１０】
〔４〕前記プライマーが、以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選択される少なくとも１つである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）
（ｂ）５９Ｒ（配列番号７）および６７Ｆ（配列番号８）
（ｃ）１６０Ｒ（配列番号９）および１６２Ｆ（配列番号１０）
（ｄ）１９２Ｒ（配列番号１１）および１９３Ｆ（配列番号１２）
（ｅ）１９６Ｒ（配列番号１３）および１９７Ｆ（配列番号１４）
（ｆ）１７６Ｒ（配列番号１５）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｇ）１７９Ｒ（配列番号１７）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｈ）１８０Ｒ（配列番号１８）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｉ）１８７Ｒ（配列番号１９）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｊ）１４３Ｒ（配列番号２０）および１４５Ｆ（配列番号２１）
【００１１】
〔５〕識別されるキク属の種が、Ajania latifolia（種略：AL）、Ajania rupestre（種略：AR）、Chrysanthemum pacificum（種略：DP）、Chrysanthemum shiwogiku（種略：DS）、Chrysanthemum boreale（種略：DB）、Chrysanthemum indicum（種略：DI4）、Chrysanthemum chanetii（種略：DC4）、Chrysanthemum zawadskii（種略：DZ4およびDZ6）、Chrysanthemum zawadskii var. latilobum（種略：DZL）、Chrysanthemum weyrichii（種略：DWy）、Chrysanthemum arcticum ssp. maekawanum（種略：DA）、Chrysanthemum makinoi（種略：DM）、Chrysanthemum yoshinaganthum（種略：DY）、Chrysanthemum wakasaense（種略：DW）、Chrysanthemum japonense（種略：DJ）、Chrysanthemum ornatum（種略：DJO）、Chrysanthemum crassum（種略：DJL）、Chrysanthemum vestitum（種略：DV）、およびChrysanthemum morifolium（種略：DG）からなる群から選択される、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
【００１２】
〔６〕増幅産物の電気泳動パターンの解析を、後記の表２の増幅産物の有無の表と比較することにより行い、キク属植物の種を特定することを含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
【００１３】
〔７〕以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを含み、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法に用いられる、キク属植物の種識別用プライマーセット。
（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）
（ｂ）５９Ｒ（配列番号７）および６７Ｆ（配列番号８）
（ｃ）１６０Ｒ（配列番号９）および１６２Ｆ（配列番号１０）
（ｄ）１９２Ｒ（配列番号１１）および１９３Ｆ（配列番号１２）
（ｅ）１９６Ｒ（配列番号１３）および１９７Ｆ（配列番号１４）
（ｆ）１７６Ｒ（配列番号１５）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｇ）１７９Ｒ（配列番号１７）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｈ）１８０Ｒ（配列番号１８）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｉ）１８７Ｒ（配列番号１９）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｊ）１４３Ｒ（配列番号２０）および１４５Ｆ（配列番号２１）
〔８〕〔７〕に記載の（ａ）〜（ｊ）の少なくとも１つのプライマーセットを含むキット。
【００１４】
〔９〕プライマーセット（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）を用いて、生物由来のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物の電気泳動パターンを解析することを特徴とする、生物種を識別する方法。
〔１０〕プライマーセット（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）であって、〔９〕に記載の方法に用いられる、生物種識別用プライマーセット。
【００１５】
〔１１〕〔１０〕に記載のプライマーセットを含むキット。
〔１２〕プライマーセット（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）を用いて、ナス科植物由来のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物の電気泳動パターンを解析することを特徴とする、ナス科植物の属、種もしくは品種を識別する方法。
〔１３〕プライマーセット（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）であって、〔１２〕に記載の方法に用いられる、ナス科植物の属、種もしくは品種の識別用プライマーセット。
〔１４〕〔１３〕に記載のプライマーセットを含むキット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＤＮＡ鑑定による、キク属の野生種１７種および栽培種１種を識別する方法およびそれに用いるプライマーセットが提供される。またキク属植物由来のプライマーセットを用いた、生物種を識別する方法およびそれに用いるプライマーセット、ならびにナス科植物の属、種もしくは品種を識別する方法およびそれらに用いるプライマーセットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（１）キク属植物の種を識別する方法
本発明のキク属植物の種を識別する方法は、キク属植物の反復ＤＮＡまたはｒＤＮＡのＩＧＳ領域(Intergenic Spacer region)から一次的なプライマーを設計し、この過程で区別された種特異的な塩基配列から二次的に設計されたプライマーセットを用いて、キク属植物由来のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物の電気泳動パターンを解析することを特徴とする。
【００１８】
本発明のキク属植物の種を識別する方法に供する対象は、具体的には表１に示す１８
種２０分類群（表１の最終行のイエギク（Chrysanthemum morifolium）は栽培種、それ以外は野生種）である。なお本明細書では、キク属の種名を、表１の「種略」で表すことがある。
【００１９】
【表１】
2010154802.tif 000002
【００２０】
キク属植物の種を識別するには、まずキク属植物からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡは、キク個体より採取した任意の組織（例えば、葉、茎、花弁、萼片、根、カルスなど）から、公知の手法に従って抽出し、必要に応じて精製し、供試試料として調製すればよい。ＤＮＡ抽出方法として、例えば、フェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法等が挙げられ、適宜改変してもよい。ＤＮＡの抽出後、クロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈澱、フェノール／クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈澱などの精製処理を行ってもよい。ゲノムＤＮＡの抽出には、市販の植物ゲノムＤＮＡ抽出キット（例えば、Plant Genomic DNA Extraction Mini（VIOGENE社製））を用いることもできる。
【００２１】
本発明において増幅に用いる「キク属植物の反復ＤＮＡまたはｒＤＮＡのＩＧＳ領域内に設計されたプライマー」とは、増幅反応の際にキク属植物の反復ＤＮＡの配列内またはｒＤＮＡのＩＧＳ領域の配列内の所定の位置に特異的にアニーリングするように、それらの部分配列もしくはその変異配列（またはそれらの相補配列）を含むように作製したオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。
【００２２】
プライマーの設計に用いられる「反復ＤＮＡ」としては、具体的には、本発明者によりキク属の同質倍数体ゲノムの分化を遺伝的な多型を利用して解析を試みる途上で発見された、ハマギク（Nipponanthemum nipponicum）EK1由来ＤＮＡの、Hind III制限酵素で分解して得られた反復配列（７８９ｂｐ、配列番号１、本明細書ではｐＮＮ８０６ということがある。）、リュウノウギク（Chrysanthemum makinoi）ｘアブラギク（Chrysanthemum boreale）雑種MB43由来ＤＮＡの、Hind III制限酵素で分解して得られたＤＮＡ配列（約２０００ｂｐ、配列番号２および配列番号３を含む。配列番号２と配列番号３の間に塩基配列未解読部分を含む。本明細書ではｐＭＢ５７８ということがある。）が挙げられる。
【００２３】
また、プライマーの設計に用いられる「ｒＤＮＡのＩＧＳ領域」としては、具体的には：リュウノウギク（Chrysanthemum makinoi）IP2由来ＤＮＡの、２５Ｓ−１８Ｓ  ＩＧＳ領域のＤＮＡ配列（２８２２ｂｐ、配列番号４、本明細書ではｐＤＭ２９０７ということがある。）が挙げられる。
【００２４】
本発明のプライマーセットを構成する各プライマーは、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基の長さを有する。また、各プライマーは、オリゴヌクレオチドにさらに修飾が施されていてもよい。例えば、本発明のプライマーは、その５’末端又は３’末端に当該プライマーの検出や増幅を容易にするための標識物質（例えば、蛍光色素、放射性同位元素、ジゴキシゲニンやビオチン等の有機化合物など）を有していてもよいし、５’末端でリン酸化又はアミン化されていてもよい。
【００２５】
本発明において特に好適に使用できるプライマーセットの例として、以下の（ａ）〜（ｊ）が挙げられる（Ｒはリバースプライマー、Ｆはフォワードプライマーを示す）。
（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）
（ｂ）５９Ｒ（配列番号７）および６７Ｆ（配列番号８）
（ｃ）１６０Ｒ（配列番号９）および１６２Ｆ（配列番号１０）
（ｄ）１９２Ｒ（配列番号１１）および１９３Ｆ（配列番号１２）
（ｅ）１９６Ｒ（配列番号１３）および１９７Ｆ（配列番号１４）
（ｆ）１７６Ｒ（配列番号１５）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｇ）１７９Ｒ（配列番号１７）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｈ）１８０Ｒ（配列番号１８）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｉ）１８７Ｒ（配列番号１９）および７１Ｆ（配列番号１６）
（ｊ）１４３Ｒ（配列番号２０）および１４５Ｆ（配列番号２１）
なお、本明細書では、例えば、５８Ｒおよび６６Ｆのプライマーセットを５８Ｒ６６Ｆのように記載することがある。
【００２６】
上記プライマーセットを用いたキク属植物由来のゲノムＤＮＡの増幅は、公知の核酸増幅法、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を利用することができる。増幅反応でプライマーセットを２つ以上用いる場合、１つの反応液中で複数のプライマーセットを用いて反応させることもできるが、プライマーセット毎に別個の反応液を用いて反応させることがより好ましい。増幅を行う際の反応液組成やサイクリング条件は、当業者であれば、使用する核酸増幅法、プライマーのＴｍ値、サーマルサイクラーの仕様などに合わせて適宜定めることができる。例えば、鋳型となるＤＮＡに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーを添加し、約９０〜９６℃の変性、約４０〜７０℃のアニーリング、約７０〜７５℃の伸長の３工程を２０〜６０サイクル繰り返す。これは一例にすぎず、ＰＣＲ反応液の組成、反応温度や時間は、プライマーとなるオリゴヌクレオチド配列の長さや塩基組成などに応じて適宜設定することができる。これらＰＣＲの一連の操作は、市販のＰＣＲキットやＰＣＲ装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。また、Sambrookら（1989）, Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubelら(1995) , Short Protocols In Molecular Biology, third edition, John Wiley &Sons, Inc.を参照することができる。
【００２７】
上記増幅により得られた増幅産物を電気泳動に供し、得られた電気泳動パターンを解析して、キク属植物の種を識別する。電気泳動方法としては、アガロースゲル、変性及び非変性のアクリルアミドゲルを用いる方法等が挙げられる。バンドの検出はエチジウム染色により行うが、標識物質を用いた場合はその標識に応じて、例えば蛍光色素（FAM、NED、HEX等）を付加したプライマーを用いた場合は、蛍光発色を指標として行ってもよい。キク属植物の電気泳動像の例を図１および図２に示す。
【００２８】
「電気泳動パターン」とは、上記増幅産物を電気泳動して得られたバンドのパターンを意味する。そのパターンには、バンド（核酸断片）の有無、バンドの分子量サイズもしくは塩基長（バンドの位置）、または存在量（絶対量、相対量もしくはバンドの濃淡）が含まれる。
【００２９】
「増幅産物の電気泳動パターンを解析する」とは、例えば、実施例に示すような、種が明らかであるキク属植物を鋳型サンプルとして、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅産物の電気泳動パターンを予め得ておき、その電気泳動パターンと、検査対象のキク属植物の電気泳動パターンとを比較して行うことをいう。また、各キク属植物の種について、プライマーセットとバンドの有無をまとめたもの（例えば表２）と、検査対象の電気泳動パターンとを照合することにより、キク属植物の種を識別することができる。
【００３０】
本発明の方法を実施するにあたり、上記キク属植物の種と、その種の電気泳動のバンドのパターンとを関連付けたデータベースを作成し（例えば表２の内容をデータとして組み込む）、検査対象のキク属植物の電気泳動のバンドのパターンを、データベースに含まれるバンドのパターンと比較し、キク属植物の種を識別することも可能である。
【００３１】
【表２】
2010154802.tif 000003
【００３２】
（ａ）〜（ｊ）の１０種のプライマーセットは、キク属種間を区別するために、現在までに供試したプライマーセットから選択されたものである。表２および図１と図２に示すとおり、１０種のプライマーセットにより出現した１２バンドから、キク属１８種２０分類群２２系統のすべてが区別された。それぞれのプライマーセットは種間での出現に対して特徴的であり、例えば、１８７Ｒ７１Ｆプライマーでは、ＤＭに強いシグナルのバンドがみられ、ＤＭに非常に近縁なＤＹとＤＷに弱いシグナルのバンドがみられる、非常に特定の種に限定された出現をしていた。一方、１７６Ｒ７１Ｆ、１８０Ｒ７１Ｆ、１６０Ｒ１６２Ｆ、５８Ｒ６６Ｆ（増幅産物のサイズ約４２０ｂｐ）プライマーで出現した各バンドはほとんどの種に出現し、極一部の種で出現しない特徴がみられた。その他のプライマーはその中間的なもので特定の分類群に対応している傾向が見られた。そしてこれらのバンドの出現の組み合わせにより、全ての種、分類群、株が区別された。また、バンドの位置や濃度以外にも、例えばバンドのパターンで見た場合、ＮＮ種（ハマギク（Nipponanthemum nipponicum））ＥＫ０１株では５８Ｒ６６Ｆプライマーには強いシグナルのスメアーなバンドとして現れる。一方、ＤＩ４種ＮＤＬ１株では５８Ｒ６６Ｆプライマーに反応してバンドが現れるので、両種両株を互いに識別することができる。表２に示したｒの表示は単に技術的な問題ではなく、量的に異なることを示しているものである。このことは反復ＤＮＡを対象としてマーカーの探索をした結果によるものと考えられる。このように、バンドの位置、数や濃さもそれぞれの種、株によって相違が見られるのでこれらの多型を解析することで互いの種、株を識別することができる。
【００３３】
上記のプライマーセットは多くのプライマーセットの比較から種を区別する組み合わせとして選抜したものであり、キット化することもできる。本発明のキットには、上記プライマーセットを少なくとも含むものであればよく、必要に応じて、ＤＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液やＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ用試薬（プライマーを除く）、染色剤や電気泳動用ゲル等の検出用試薬、説明書などを含んでいてもよい。
【００３４】
（２）生物種を識別する方法
上記キク属植物の反復ＤＮＡ（ｐＮＮ８０６、配列番号１）由来のプライマーセット５８Ｒ６６Ｆは、生物種の多型性を調べるために使用することができ、また、生物由来のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物の電気泳動パターンを解析して、生物種を識別する方法にも使用することができる。
【００３５】
本発明の生物種を識別する方法の対象となる生物種は特に限定されないが、例えば以下の表３に示す動物、菌類、コケ植物、裸子植物、被子植物等が挙げられる。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
本発明の生物種を識別する方法における、ＤＮＡ抽出、プライマーセット５８Ｒ６６Ｆを用いたＰＣＲ法による増幅、電気泳動は、上記の方法に従って行うことができる。なお、ＤＮＡ抽出の材料は、動物の場合、例えば上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織等の各種組織に含まれる各種の細胞を用いる。菌類、植物の場合は、菌体、植物の任意の組織を用いればよい。表３に示した各生物種の増幅産物の電気泳動像の例を図３に示す。生物種の識別は、ヒト等について予め電気泳動のバンドパターンを得ておき、そのパターンと検査対象のパターンとを比較して行うことができる。
【００３８】
すなわち、ＰＣＲ法により増幅されるバンドの位置、数や濃さ等のパターンが異なるためそれらを比較することでどの生物種かを見極めることができる。また、プライマーセット５８Ｒ６６Ｆは幅広い生物種に反応しバンドを示すことから、生物種か否かの識別に使用することもできる。
プライマーセット５８Ｒ６６Ｆは、生物種識別用キットにすることもできる。キットには、上述のＤＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液等を含んでいてもよい。
【００３９】
（３）ナス科植物の属、種もしくは品種を識別する方法
上記キク属植物の反復ＤＮＡ（ｐＮＮ８０６、配列番号１）由来のプライマーセット５８Ｒ６６Ｆは、ナス科植物の多型性を調べるために使用することができ、また、ナス科植物由来のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物の電気泳動パターンを解析して、ナス科植物の属、種もしくは品種の識別にも使用することができる。
【００４０】
本発明のナス科植物の属、種もしくは品種を識別する方法の対象となるナス科植物は特に限定されないが、例えば以下の表４に示す植物が挙げられる。
【００４１】
【表４】
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【００４２】
本発明のナス科植物の属、種または品種を識別する方法における、ＤＮＡ抽出、プライマーセット５８Ｒ６６Ｆを用いたＰＣＲ法による増幅、電気泳動は、上記の方法に従って行うことができるが、ＤＮＡ抽出の材料は、例えば、ナス科植物個体より採取した任意の組織（例えば、葉、茎、花弁、萼片、根、カルスなど）を用いればよい。表４に示した各ナス科植物の増幅産物の電気泳動像を図４に示す。ナス科植物の属、種または品種の識別は、これらの植物について予め電気泳動のバンドパターンを得ておき、そのパターンと検査対象のパターンとを比較して行うことができる。
【００４３】
また、プライマーセット５８Ｒ６６Ｆは、ナス科植物の属、種または品種識別用キットにすることもできる。キットには、上述のＤＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  キク属植物の種の識別
（１）材料
本実施例で用いたキク属（Chrysanthemum）の２０分類群は表１に示すとおりである。これらのＤＮＡは、現在、広島大学大学院理学研究科付属植物遺伝子保管実験施設（〒739-8526 広島県東広島市鏡山１−４−３）から提供可能である。
【００４５】
（２）ＤＮＡ抽出
キク属植物のＤＮＡの抽出はMurray and Thompson(1980)の方法を基本として、発明者によって改変された微量標本抽出法によって行った。
【００４６】
葉片をカミソリにて３ｘ３０ｍｍに調整し、手際よく０．５ｘ３ｍｍにカットした。それを０．１％（v/v）メルカプトエタノール添加ＣＴＡＢ抽出バッファー（100mM Tris-HCl (pH8.0)、20mM EDTA、1.4M NaCl、2.0%CTAB）５００μＬの入った１．５ｍｍチューブに入れた。ボルテックスで軽く数回混和した後、５５℃で２０分間インキュベートした。チューブにクロロホルムとイソアミルアルコール混液（２４：１）を５００μＬ添加後、室温で１０分転倒混和し、これを室温で６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離（DISKBOY, KURABO INDUSTRIES LTD, 日本製）した。ピペットで中間層の沈殿をとらないように上層をとり、新しいチューブに移した（約４５０μＬ）。１μＬ ＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で２０分〜３時間インキュベートした。クロロホルムとイソアミルアルコール混液を４５０μＬを添加し、室温で１０分転倒混和し、これを室温で６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離（DISKBOY）した。ピペットで中間層の沈殿をとらないように上層をとり、新しいチューブに移した（約３５０μＬ）。等量（３５０μＬ）のイソプロピルアルコールを添加後、室温で１０分転倒混和し、これを室温で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離（DISKBOY）した。上澄みを除去し、沈殿を残し、７０％エタノールを１０００μＬ添加し、沈殿を洗浄した。室温で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離（DISKBOY）後、上澄みを、転倒して除去後、５分間、吸引乾燥した。ＴＥを５０μＬ添加した。ここから５μＬとり、１００μＬ ＴＥを加え、ＰＣＲ用保存液とした。
【００４７】
（３）プライマーの設計
上記広島大学の保管実験施設に保管されているＤＮＡ系統２８種４４４６系統を用いて、反復ＤＮＡと、ｒＤＮＡの５Ｓ、１８Ｓ、ＩＴＳ領域(Internal Transcribed Spacer region)およびＩＧＳ領域について、常法を用いてクローニングし、塩基配列の解析を行った。解析された塩基配列のうち、新規に見出された反復ＤＮＡのｐＮＮ８０６（配列番号１）、反復ＤＮＡのｐＭＢ５７８（配列番号２および配列番号３を含む。）、およびｒＤＮＡのＩＧＳ領域（配列番号４）について、まず一次的なプライマーを設計し、この過程で区別された種特異的な塩基配列から二次的にプライマーを設計し、種々のプライマーを設計した。種を区別するために有効なプライマーセットから、最終的に表５に示すプライマー、および表６に示すプライマーセットを選択した。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
【表６】
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【００５０】
（４）ＰＣＲ
ＰＣＲはＰＣＲ装置（ＡＢＩ社製：GeneAmp PCR System 9700）を以下の２条件に設定して行った。一つは９４℃、２分１５秒の変性のあと、変性（９４℃、４５秒）、アニーリング（４９℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を５サイクル、次いで変性（９４℃、４５秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、２分）を３０サイクル、最後に７２℃、１０分の伸長条件を設定した。もう一つは９４℃、２分１５秒の変性のあと、変性（９４℃、４５秒）、アニーリング（５７℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３０サイクル、最後に７２℃、１０分の伸長条件を設定した。前者の条件は、表６の５８Ｒ６６Ｆ、５９Ｒ６７Ｆのプライマーセットを用いた場合、後者の条件は、それ以外の表６のプライマーセットを用いた場合の反応条件として使用した。
【００５１】
（５）クローニングと塩基配列解析
上記（２）の方法により抽出された表１のキク属各種のゲノムＤＮＡを、表６に記載のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物の塩基配列の解析を行った。該解析は、(i)ゲノムＤＮＡからプライマーで直接増幅されたＰＣＲ産物について、直接、塩基配列を調べる方法、(ii)ゲノムＤＮＡからプライマーで増幅されたＰＣＲ産物をＴＡ法によりpGEM-Tベクター（プロメガ社製）にライゲーションして、大腸菌株DH5aを使用してＤＮＡライブラリを作製し、ライブラリから挿入サイズの同じ５系統（挿入サイズに多型が見られる場合はそれぞれのサイズ群から５系統）を選抜し、ベクタープライマーで増幅して、塩基配列を調べる方法の二通りによって行った。
【００５２】
(i)の方法では、増幅ＤＮＡが１バンドの場合は精製したＤＮＡを直接、複数バンドの場合は切り出して精製後、一方、(ii)の方法では、ベクタープライマー（AGCGGATAACAATTTCACACAGG（配列番号２２）、およびCCCAGTCACGACGTTGTAAAACG（配列番号２３））で増幅したＤＮＡを精製後、ＤＮＡシークエンサー（ABI社製PRISM 3100-Genetic Analyzer）で塩基配列の解析を行った。
【００５３】
（６）電気泳動およびパターン解析
ＰＣＲ終了後、２％アガロースゲル（SeaKemMe、ＦＭＣ社）、電気泳動装置Mupid(ADVANCE社)を用いて、電圧５０Ｖで６０分間泳動した。泳動後のゲルはEOS D30（キャノン社）で撮影した。例として、図１に、（ａ）５８Ｒ（配列番号５）および６６Ｆ（配列番号６）、（ｂ）５９Ｒ（配列番号７）および６７Ｆ（配列番号８）、（ｅ）１９６Ｒ（配列番号１３）および１９７Ｆ（配列番号１４）、（ｈ）１８０Ｒ（配列番号１８）および７１Ｆ（配列番号１６）、（ｃ）１６０Ｒ（配列番号９）および１６２Ｆ（配列番号１０）、（ｇ）１７９Ｒ（配列番号１７）および７１Ｆ（配列番号１６）、（ｄ）１９２Ｒ（配列番号１１）および１９３Ｆ（配列番号１２）、（ｉ）１８７Ｒ（配列番号１９）および７１Ｆ（配列番号１６）のプライマーセットを用いた増幅産物の電気泳動像を示す。図２に、（ｊ）１４３Ｒ（配列番号２０）および１４５Ｆ（配列番号２１）、（ｆ）１７６Ｒ（配列番号１５）および７１Ｆ（配列番号１６）のプライマーセットを用いた増幅産物の電気泳動像を示す。なお、レーンの「ＤＰ」などのアルファベットは、表１のキク属の種の「種略」を示す。また「ＮＮ」はハマギク（Nipponanthemum nipponicum）、「ＬＬ」はホソバノセイタカギク（Leucanthemella linealis）であり、いずれもキク科キク属の近縁種を示し、ＬＬはキク属と交雑不能、ＮＮは極少数の交雑種ができるものである。「Ｍ」は分子量マーカーを示す。電気泳動のバンドを整理、解析し、上記表２を作成した。
【００５４】
〔実施例２〕  生物種の識別
本実施例では、プライマーセット５８Ｒ６６Ｆ（配列番号５および配列番号６）を用いて、対象種をキク属以外の分類群に広げ、動物、菌類、コケ植物、裸子植物、被子植物とし、生物種の識別について検討した。
【００５５】
表３に示した生物を用い、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ、電気泳動を実施例１と同様にして行った。なおヒトＤＮＡは、血球細胞であり、該ヒトＤＮＡと菌類のＤＮＡは、予め抽出されたＤＮＡを入手して用いた。図３に電気泳動像を示す。レーンの番号は、それぞれ表３の番号に一致する。
【００５６】
表３に記載されている各種の株のＤＮＡは、現在、広島大学大学院理学研究科付属植物遺伝子保管実験施設（〒739-8526 広島県東広島市鏡山１−４−３）に保管しており、提供可能である。
【００５７】
すべての生物種において強バンドから弱バンドまで多型的な増幅バンドがみられた。動物１種（ヒト）、原生動物２種、菌類４種、コケ植物から被子植物全体に及ぶ１７種のすべてが多バンドを示し、１セットのプライマーで、非常に広範囲の生物群に適用できることが確かめられた。また、属以上の分類群間ですべて異なるパターンを示した。属内の原生動物の２種においては、高い共通性を示す約８００ｂｐの強バンドと約９００ｂｐと約１３００ｂｐの弱バンド、およびお互いの種に特異的ないくつかのバンド（ＥｐｌＷ；約２０００ｂｐ以上のやや強いバンド、ＥｐｌＡ；約１２００ｂｐの強いバンドが区別された。
【００５８】
〔実施例３〕
本実施例では、プライマーセット５８Ｒ６６Ｆ（配列番号５および配列番号６）を用いて、ナス科植物の属、種及び品種の識別について検討した。
【００５９】
表４に示したナス科植物を用い、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ、電気泳動を実施例１と同様にして行った。図４に電気泳動図を示す。レーンの番号は、それぞれ表４の番号に一致する。
表４に記載されている各種の株のＤＮＡは、現在、広島大学大学院理学研究科附属植物遺伝子保管実験施設（〒739-8526 広島県東広島市鏡山１−４−３）に保管しており、提供可能である。
【００６０】
属間、種間、変種間で特徴的なパターンを示した。栽培種の属間では明瞭に異なるパターンを示すが、属内の種間では共通性の高いバンドが多くみられた。また、変種内、種内、属内のそれぞれの分類階級に応じて類似性の高さの対応が認められた。さらに変種内の品種間では非常に共通性が高いものであったが、一部の品種間では区別が可能であった。
【００６１】
ナス科のこれら３属には他にも多くの種を含むが、以上の変異パターンから他の種についてもいくつかのグループに区別できることは容易に想像できることである。
【００６２】
以上の結果から、一つのプライマーセットでキク属以外の生物界全体に広げて多型性を調べることが可能となった。このことは未知の多くの生物群に最初にこのプライマーでダイレクトに多型性を調べることができることを意味しており遺伝的特性を調べる時に有効な技術になるものと考えられる。さらに細かいゲノム特性を識別したい場合は、特異性を示すバンドを目的に応じて再クローニングすることによりさらに高度な識別が可能となるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】キク属植物由来のゲノムＤＮＡをＰＣＲで増幅した増幅産物の電気泳動像を示す。
【図２】キク属植物由来のゲノムＤＮＡをＰＣＲで増幅した増幅産物の電気泳動像を示す。
【図３】生物界各種のゲノムＤＮＡをＰＣＲで増幅した増幅産物の電気泳動像を示す。
【図４】ナス科植物由来のゲノムＤＮＡをＰＣＲで増幅した増幅産物の電気泳動像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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