(57)【要約】【課題】クロロホスホナゾ−ＩＩＩを用いたカルシウムの測定の測定において、ＭＲＩ造影剤の影響を軽減させる。【解決手段】クロロホスホナゾ−ＩＩＩを含有する試薬を用いるカルシウムの測定において、クロロホスホナゾ−ＩＩＩとキレートを形成するカルシウム以外の物質に対しキレート形成するキレート剤を該試薬にさらに含有させて測定する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のカルシウムを測定する試薬であって、クロロホスホナゾ−ＩＩＩと、式Ｉで表される基本構造を有するキレート剤またはその塩の１種または２種以上を含む、前記試薬。
【化１】
2010019604.tif 000013
式中、
Ｘは、Ｈ、アルキルアルコール、カルボン酸またはアミン類であり、カルボン酸およびアミン類に含まれるカルボン酸は金属塩を形成してもよく、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基またはベンゼン誘導体であり、Ｒ１およびＲ２がともにアルキル基の場合、Ｒ１とＲ２が結合し、環状構造を形成してもよい。
【請求項２】
キレート剤が、ジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、プロピレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジアミノシクロヘキサン四酢酸、および／またはヒドロキシエチレンジアミン三酢酸である、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
試料が、血液からの試料、尿、髄液、またはリンパ液である、請求項１または２に記載の試薬。
【請求項４】
試料がＭＲＩ造影剤投与後の対象からの試料である、請求項１〜３のいずれかに記載の試薬。
【請求項５】
試料がガドリニウムを含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の試薬。
【請求項６】
試料中のカルシウムを測定するキットであって、クロロホスホナゾ−ＩＩＩを含有する試薬と、式Ｉで表される基本構造を有するキレート剤またはその塩の１種または２種以上を含有する試薬を含む、前記キット。
【化２】
2010019604.tif 000014
式中、
Ｘは、Ｈ、アルキルアルコール、カルボン酸またはアミン類であり、カルボン酸およびアミン類に含まれるカルボン酸は金属塩を形成してもよく、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基またはベンゼン誘導体であり、Ｒ１およびＲ２がともにアルキル基の場合、Ｒ１とＲ２が結合し、環状構造を形成してもよい。
【請求項７】
クロロホスホナゾ−ＩＩＩを含有する試薬を用いて試料中のカルシウムを測定する方法であって、クロロホスホナゾ−ＩＩＩとキレートを形成するカルシウム以外の物質に対しキレート形成する１種または２種以上のキレート剤をさらに試薬に含有させてなる、前記方法。
【請求項８】
キレート剤が、式Ｉで表される基本構造を有するキレート剤またはその塩である、請求項７に記載の方法。
【化３】
2010019604.tif 000015
式中、
Ｘは、Ｈ、アルキルアルコール、カルボン酸またはアミン類であり、カルボン酸およびアミン類に含まれるカルボン酸は金属塩を形成してもよく、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基またはベンゼン誘導体であり、Ｒ１およびＲ２がともにアルキル基の場合、Ｒ１とＲ２が結合し、環状構造を形成してもよい。
【請求項９】
試料がＭＲＩ造影剤投与後の対象からの試料である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
クロロホスホナゾ−ＩＩＩとキレートを形成するカルシウム以外の物質がガドリニウムである、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のカルシウムを測定する方法、および、かかる方法に用いられる測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中のカルシウムはそのほとんどが骨、歯牙に含まれている。血液中に存在するカルシウムは生体中の０．１％に過ぎないが、その少量のカルシウムはホルモンの調節など様々な機能の調節に携わっているため、その恒常性が維持されていることは非常に重要である。そのため、臨床検査分野においても血清、血漿、尿などの生体試料に含まれるカルシウムの測定が行われてきた。生体試料中のカルシウムの測定方法としては、キレート滴定法、比色法、原子吸光法、電極法などがあるが、現在は自動分析装置に適用し短時間で多数試料を分析することが可能である比色法が最も普及している。比色法はｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン（ＯＣＰＣ）やメチルキシレノールブルー(ＭＸＢ)に代表されるキレート剤とカルシウムの反応による反応溶液の色調の変化によりカルシウムを定量する方法であり、これらの反応はアルカリ領域で行う必要があるため、試薬自体がアルカリである。
【０００３】
アルカリ性の試薬は、試薬の開栓後に大気中の炭酸ガスを吸収し試薬ｐＨが低下し、測定値に影響を与えることが問題となっている。カルシウム要求酵素を使用し、中性域で測定を可能とした測定試薬も用いられているが、このような酵素や酵素基質はＯＣＰＣやＭＸＢに比して高価で検査コストが高くなるため、このような酵素を用いる方法は普及し難くなっている。
【０００４】
このような問題を回避することを目的として、中性域でカルシウム濃度の測定が可能なアルセナゾ−ＩＩＩを使用したカルシウム測定試薬を、自動分析装置に適用させる方法が報告されている（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２９，  １９９１，  ｐｐ．１９７−２０１）。しかし、アルセナゾ−ＩＩＩはヒ素を含む毒物であるため、一般に使用するには問題があると指摘されている。
【０００５】
このような状況を背景に、クロロホスホナゾ−ＩＩＩを使用したカルシウム測定試薬が開発され、自動分析装置に適用させる方法が報告されている（特許第２５００２３３号、特開２００６−２３１８２号公報、特開２００８−５８０３３号公報）。
【０００６】
一方、ある種のＭＲＩ造影剤を投与した患者試料の測定において、ＯＣＰＣやＭＸＢなどのキレート剤を使用する測定試薬では、血清、血漿、尿中のカルシウム測定値に誤差を生じるとの報告がある（医学検査、Ｖｏｌ．５５、Ｎｏ．１２、２００６）。また、同様に上記のような種々の問題を解消したクロロホスホナゾ−ＩＩＩを用いた測定試薬においても、同様に正誤差を生じる問題があると報告されている（生物試料分析  Ｖｏｌ．３０、Ｎｏ．２、２００７）。
【０００７】
特開２００２−２３８５９８号には、保存安定性向上のために試薬中の共存させるマグネシウムなどのカルシウム以外の金属イオンにより測定が妨害されるのを回避するため、キレート剤を含有してもよいとの記載があるが、クロロホスホナゾ−ＩＩＩを含有する測定試薬を用いるカルシウムの測定において、これまでにかかる問題を解消できたという報告はない。
【０００８】
【特許文献１】特許第２５００２３３号明細書
【特許文献２】特開２００２−２３８５９８号公報
【特許文献３】特開２００６−２３１８２号公報
【特許文献４】特開２００８−５８０３３号公報
【非特許文献１】Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２９，  １９９１，  ｐｐ．１９７−２０１
【非特許文献２】高尾晶子、外７名、「特定のＭＲＩ造影剤が及ぼすカルシウム測定方法間の測定値乖離について」、医学検査、第５５巻、第１２号、１３１２−１３１８、２００６年
【非特許文献３】外園栄作、外６名、「クロロホスホナゾ−ＩＩＩを用いた血清カルシウム測定試薬の開発」、生物試料分析、第３０巻、第２号、１６４−１７１、２００７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の課題は、クロロホスホナゾ−ＩＩＩを含有する試薬を用いた試料中のカルシウムの測定において、上記問題を解決し、カルシウムの測定誤差をより小さくし、より正確な測定を可能にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進める中で、クロロホスホナゾ−ＩＩＩを含有する試薬に、クロロホスホナゾ−ＩＩＩとカルシウム以外の物質とのキレート形成を妨げるキレート剤をさらに含有させることにより、測定誤差を解消できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、試料中のカルシウムを測定する試薬であって、クロロホスホナゾ−ＩＩＩと、式Ｉで表される基本構造を有するキレート剤またはその塩の１種または２種以上を含む、前記試薬
【化１】
2010019604.tif 000002
式中、
Ｘは、Ｈ、アルキルアルコール、カルボン酸またはアミン類であり、カルボン酸およびアミン類に含まれるカルボン酸は金属塩を形成してもよく、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基またはベンゼン誘導体であり、Ｒ１およびＲ２がともにアルキル基の場合、Ｒ１とＲ２が結合し、環状構造を形成してもよい。
に関する。
【００１２】
また本発明は、キレート剤が、ジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、プロピレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジアミノシクロヘキサン四酢酸、および／またはヒドロキシエチレンジアミン三酢酸である、前記試薬に関する。
【００１３】
さらに本発明は、試料が、血液からの試料、尿、髄液、またはリンパ液である、前記試薬に関する。
【００１４】
また本発明は、試料がＭＲＩ造影剤投与後の対象からの試料である、前記試薬に関する。
【００１５】
さらに本発明は、試料がガドリニウム（Ｇｄ）を含有する、前記試薬に関する。
【００１６】
また本発明は、試料中のカルシウムを測定するキットであって、クロロホスホナゾ−ＩＩＩを含有する試薬と、式Ｉで表される基本構造を有するキレート剤またはその塩の１種または２種以上を含有する試薬を含む、前記キット
【化２】
2010019604.tif 000003
式中、
Ｘは、Ｈ、アルキルアルコール、カルボン酸またはアミン類であり、カルボン酸およびアミン類に含まれるカルボン酸は金属塩を形成してもよく、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基またはベンゼン誘導体であり、Ｒ１およびＲ２がともにアルキル基の場合、Ｒ１とＲ２が結合し、環状構造を形成してもよい。
に関する。
【００１７】
さらに本発明は、クロロホスホナゾ−ＩＩＩを含有する試薬を用いて試料中のカルシウムを測定する方法であって、クロロホスホナゾ−ＩＩＩとキレートを形成するカルシウム以外の物質に対しキレート形成する１種または２種以上のキレート剤をさらに試薬に含有させてなる、前記方法に関する。
【００１８】
また本発明は、キレート剤が、式Ｉで表される基本構造を有するキレート剤またはその塩である、前記方法
【化３】
2010019604.tif 000004
式中、
Ｘは、Ｈ、アルキルアルコール、カルボン酸またはアミン類であり、カルボン酸およびアミン類に含まれるカルボン酸は金属塩を形成してもよく、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基またはベンゼン誘導体であり、Ｒ１およびＲ２がともにアルキル基の場合、Ｒ１とＲ２が結合し、環状構造を形成してもよい。
に関する。
【００１９】
さらに本発明は、試料がＭＲＩ造影剤投与後の対象からの試料である、前記方法に関する。
【００２０】
また本発明は、クロロホスホナゾ−ＩＩＩとキレートを形成するカルシウム以外の物質がガドリニウムである、前記方法に関する。
【発明の効果】
【００２１】
上記構成を採ることにより、試料中のカルシウムとクロロホスホナゾ−ＩＩＩとの反応による色調変化をカルシウム濃度として測定する試薬において、試料中、特に血清、血漿、尿、髄液、リンパ液等の体液検体中の、例えばＭＲＩ造影剤による影響を受けることなく、カルシウム濃度を正確に測定することができるため、健康状態の把握のために僅かな変化をも見逃せないカルシウムの測定誤差の少ない測定を可能にするばかりでなく、本発明の測定試薬によりＭＲＩ造影剤の投与の前後を問わず試料中のカルシウム測定が可能となるため、病院などにおける測定上の管理等が飛躍的に合理化される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明のカルシウム濃度測定試薬は、最終的に試料中のカルシウムとの反応溶液が構成されればよく、１試薬で構成されていても２試薬以上で構成されていてもよい。濁り成分等検体由来の妨害物質の影響を受けないようにするために、２試薬以上で構成されているのが好ましく、短時間に多数の検体の測定を実施できる自動分析装置へ適用する場合、２試薬で構成されているのが最も好ましい。
【００２３】
本発明の試薬は、いずれの試薬構成においても、ガドリニウムの影響を回避するためのキレート剤を１種または２種以上含有する。
【００２４】
キレート剤は、式Ｉで表される構造を含むキレート剤が好ましい。式中、ＸはＨ、アルキルアルコール、カルボン酸またはアミン類であり、カルボン酸およびアミン類に含まれるカルボン酸は金属塩を形成してもよい。
【００２５】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれアルキル基、ベンゼン誘導体であり、アルキル基の場合、Ｒ１とＲ２が結合して環状構造を形成してもよい。
【００２６】
このようなキレート剤としては、例えばジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、プロピレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸などが挙げられる。なかでも、カルシウムの測定感度に影響を与えないジエチレントリアミン五酢酸およびトリエチレンテトラミン六酢酸が好ましい。
【００２７】
キレート剤の含有量は０．００５〜１００ｍｍｏｌ／ｌの範囲であり、そのキレート剤によって異なるが、反応溶液中、ジエチレントリアミン五酢酸の場合、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０３５〜３０ｍｍｏｌ／ｌがさらに好ましく、０．１５〜７ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。トリエチレンテトラミン六酢酸の場合、０．０３〜５０ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．１５〜３０ｍｍｏｌ／ｌがさらに好ましく、１．５〜１０ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００２８】
ガドリニウムはＭＲＩ造影剤に使用されている。ガドリニウムを含有するＭＲＩ造影剤は、例えば、ガドジアミドを主成分とするオムニスキャン（登録商標）、ガドペンテト酸メグルミンを主成分とするマグネビスト（登録商標）、ガドテリドールを主成分とするプロハンス（登録商標）、ガドテル酸メグルミンを主成分とするマグネスコープ（登録商標）などがある。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕
【００３０】
ガドリニウムによる測定誤差に対する各種キレート剤の回避効果を、以下に示す条件で測定した。
【００３１】
試料：
（１）ヒトプール血清９容量に、生理食塩水１容量を添加し、生理食塩水添加検体とした。
（２）ヒトプール血清９容量に、２０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸ガドリニウム（和光純薬（株））水溶液１容量を添加し、Ｇｄ添加検体とした。
【００３２】
試薬１：
５０ｍｍｏｌ／ｌコハク酸緩衝液ｐＨ５．０、０．３％アニオン系界面活性剤、キレート剤（濃度は表中に記載する）
試薬２：
５０ｍｍｏｌ／ｌコハク酸緩衝液ｐＨ５．０、１．３５ｍｍｏｌ／ｌクロロホスホナゾ−ＩＩＩ
【００３３】
測定機器：
Ｈ−７１７０Ｓ（（株）日立ハイテクノロジーズ製）を以下の表に記載の測定パラメーターで用いて測定した。
【００３４】
【表１】
2010019604.tif 000005
【００３５】
キレート剤は、以下に記載するものを使用した。
【表２】
2010019604.tif 000006
【００３６】
【表３】
2010019604.tif 000007
【００３７】
カルシウムの測定結果（検体測定値）を、以下の表に記す。
【表４】
2010019604.tif 000008
【００３８】
キレート剤無添加の試薬では、生理食塩水添加およびガドリニウム添加の検体測定値間に２０ｍｇ／１００ｍｌ程度の測定誤差が生じたが、化学式Ｉで表される基本構造を有するキレート剤であるＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡおよびＥＤＴＡ−ＯＨを添加した試薬では、かかる測定誤差に改善が認められた。一方、化学式Ｉで表される基本構造を有しないキレート剤であるＥＤＴＰＯなどを添加した試薬では、ガドリニウムに対する安定度定数が高いキレート剤であるにもかかわらず、かかる測定誤差の改善には至らなかった。
〔実施例２〕
【００３９】
ＭＲＩ用造影剤（オムニスキャン（登録商標）、第一三共株式会社）による測定誤差のＤＴＰＡによる回避効果を、以下に示す条件で測定した。
【００４０】
試料：
Ａ：ヒトプール血清９容量に、生理食塩水を１容量添加した。
Ｂ：ヒトプール血清９容量に、オムニスキャン希釈液（Ｇｄとして２０ｍｍｏｌ／ｌ）を１容量添加した。
【００４１】
上記試料ＡおよびＢを下表に示す割合で混合し、検体とした。
【表５】
2010019604.tif 000009
【００４２】
試薬１：
５０ｍｍｏｌ／ｌコハク酸緩衝液ｐＨ５．０、０．３％アニオン系界面活性剤、ＤＴＰＡ（０、０．５または１．０ｍｍｏｌ／ｌ）
試薬２：
５０ｍｍｏｌ／ｌコハク酸緩衝液ｐＨ５．０、１．３５ｍｍｏｌ／ｌクロロホスホナゾ−ＩＩＩ
【００４３】
測定機器および測定パラメーターは実施例１と同様とした。
【００４４】
カルシウムの測定結果（検体測定値、mg/100ml）を、以下の表に記す。
【表６】
2010019604.tif 000010
【００４５】
ＤＴＰＡ無添加の試薬では、検体中のＧｄ濃度の増加に伴って測定値が増加した。一方、ＤＴＰＡ添加試薬では検体中のＧｄ濃度の増加しても測定値は増加せず、ＤＴＰＡを添加した試薬によりオムニスキャンによるカルシウム測定値の測定誤差に改善が認められた。
〔実施例３〕
【００４６】
他の測定法におけるガドリニウムによる測定誤差のＤＴＰＡによる回避効果を、以下に示す条件で測定した。
【００４７】
試料：
実施例２と同様にして、検体を調製した。
【００４８】
試薬：
ＯＣＰＣ法においてはシカオートＣａ（関東化学）、ＭＸＢ法においてはＥ−ＨＲ  Ｃａワコー（和光純薬）を用いた。試薬１中にＤＴＰＡを添加した（無添加、０．１、１、１０、１００μｍｏｌ／ｌ）。
【００４９】
メーカー推奨の測定パラメーターを用いて測定した。
【００５０】
各測定法のカルシウムの測定結果（検体測定値）を、以下の表に記す。
【表７】
2010019604.tif 000011
【００５１】
【表８】
2010019604.tif 000012
【００５２】
試薬１中のＤＴＰＡ濃度を１００μｍｏｌ／ｌとした場合、ＯＣＰＣ法、ＭＸＢ法ともに感度が大幅に低下したので、試薬１中のＤＴＰＡ濃度を０．１、１、１０μｍｏｌ／ｌとして検体中のＣａ濃度を測定した。その結果、ＤＴＰＡ無添加の試薬、添加の試薬ともにＧｄ濃度が増加しても測定値が同様に減少し、ＯＣＰＣ法およびＭＸＢ法においてはオムニスキャンによるカルシウム測定値の誤差改善に至らなかった。