(57)【要約】      （修正有）【課題】ＭＤＰ１という１種類のタンパク質を凝集促進剤として用いることで、特別な装置を使用せずに、簡便かつ高効率に細胞を収集するための方法を提供する。【解決手段】ＭＤＰ１、あるいはＭＤＰ１の１個または複数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失したポリペプチドを用いて、該ＭＤＰ１あるいは該ポリペプチドと相互作用する炭水化物もしくは炭水化物誘導体を有する物質または細胞を、凝集および／または沈殿させる分離方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＰ１、あるいはＭＤＰ１の１個または複数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失したポリペプチドを用いて、該ＭＤＰ１あるいは該ポリペプチドと相互作用する炭水化物もしくは炭水化物誘導体を有する物質または細胞を、凝集および／または沈殿させることを特徴とする該物質または該細胞の分離方法。
【請求項２】
上記の物質または細胞が、上記の炭水化物および／または炭水化物誘導体を２分子以上有する請求項１に記載の分離方法。
【請求項３】
上記の炭水化物または炭水化物誘導体が、単糖類、２〜２０個の単糖からなるオリゴ糖類および２１個以上の単糖からなる多糖類よりなる群から選ばれる少なくとも１種の糖質である請求項１〜２のいずれかに記載の分離方法。
【請求項４】
上記単糖類が、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、エリトロース、トレオース、エリトルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、キシルロース、リブロース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、デオキシリボースおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の単糖である請求項３に記載の分離方法。
【請求項５】
上記多糖類が、硫酸化多糖類ならびにヒアルロン酸（ヒアルロナン）、ヘパリン、フコイダン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、キチン、キトサン、アガロース、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、カードラン、カラギーナン、マンナン、ガラクトマンナン、キサンタンガム、グアーガム、プルラン、ペクチンおよびキシログルカンからなる群から選択される少なくとも１種の多糖類である請求項３に記載の分離方法。
【請求項６】
上記の凝集および／または沈殿が、フラッシュ遠心またはスピンダウンすることによって促進される請求項１〜５のいずれかに記載の分離方法。
【請求項７】
上記の凝集および／または沈殿が、さらに上記の物質または細胞と相互作用する固体支持体を添加することによって、促進される請求項１〜６のいずれかに記載の分離方法。
【請求項８】
上記固体支持体が、抗体が固定化された粒子である請求項７に記載の分離方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の分離方法を用いて、生物由来の検体、培養液または細胞含有溶液から細胞を単離することを特徴とする細胞単離方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の分離方法を用いて、生物由来の検体、培養液または細胞含有溶液から細胞の有無を、凝集および／または沈殿によって検出することを特徴とする細胞検出方法。
【請求項１１】
少なくとも下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする核酸抽出方法：
工程（Ａ）：請求項１〜８のいずれかに記載の分離方法を用いて、生物由来の検体、培養液または細胞含有溶液から細胞を単離する工程、および
工程（Ｂ）：該工程（Ａ）を経て得られた細胞を溶解して、核酸を遊離させる工程。
【請求項１２】
上記工程（Ｂ）が、加熱処理、超音波照射処理および化学試薬処理からなる群から選択される少なくとも１種の処理を要する請求項１１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法に用いられることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＤＰ１、あるいはＭＤＰ１の１個または複数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失したポリペプチドを用いて、炭水化物または炭水化物誘導体を有する物質または細胞を凝集および／または沈殿させることにより、該物質または細胞を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床や基礎研究の現場で、検体や培養液から細胞を分離する、あるいは収集する作業は、日常的に行われている。臨床現場では、血液検査をするにあたり、まず血球成分と血漿成分の分離が行われ、細菌検査の場合は菌の分離から始まる。研究の場においてもＤＮＡ、タンパク質を問わず、その調整はまず培養液から細胞を回収することから始まる。このように、細胞の分離は臨床においても研究においても必須な工程となっている。
【０００３】
従来、細胞の分離は遠心分離法で行われる。遠心分離以外の方法としては、例えば特許文献１に記載された抗体、電気、超音波、誘引物質などによる方法がある。
また血液検査において、前処理として血球と血漿との分離が行われるが、そのための種々の装置が開発されている。例えば、特許文献２のように、マイクロ空間内で重力を利用して血球と血漿とを分離する小型の装置や、特許文献３のように、特殊な流路を用いて血球と血漿を分離する装置が開示されている。このように細胞を分離するいずれの場合にも、何かしらの装置が用いられることが多い。
【０００４】
一方で、特許文献４のように、特別な装置を用いずに、カチオン性ポリマーによって、細胞の凝集を誘導する方法が開示されている。しかしながら、この方法では、ポリマー２種を特別な混合比で用いる必要があり、調整が面倒である。
【０００５】
他方、病原性抗酸菌に対する免疫原性を有するポリペプチド（ＭＤＰ１）およびそのワクチンまたは治療剤への利用が開示されている（特許文献５）。
【特許文献１】国際公開第２００１／６７０８４号パンフレット
【特許文献２】特開２００８−８９３８１号公報
【特許文献３】特開２００５−２９２０９２号公報
【特許文献４】特表２００３−５０７０３２号公報
【特許文献５】特開２０００−２１９６９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、ＭＤＰ１という１種類のタンパク質を凝集促進剤として用いることで、特別な装置を使用せずに、簡便かつ高効率に細胞を収集するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意検討した結果、ＭＤＰ１と、単糖類、オリゴ糖類または多糖類をその表面に有する細胞とを混合し静置するだけで、該細胞が凝集および沈殿することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の分離方法は、ＭＤＰ１、あるいはＭＤＰ１の１個または複数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失したポリペプチドを用いて、該ＭＤＰ１あるいは該ポリペプチドと相互作用する炭水化物もしくは炭水化物誘導体を有する物質または細胞を、凝
集および／または沈殿させることによって、該物質または該細胞を分離することを特徴とする。
【０００９】
上記の物質または細胞は、上記の炭水化物および／または炭水化物誘導体を２分子以上有することが好ましい。
上記の炭水化物または炭水化物誘導体は、単糖類、２〜２０個の単糖からなるオリゴ糖類および２１個以上の単糖からなる多糖類よりなる群から選ばれる少なくとも１種の糖質であることが好ましい。
【００１０】
上記単糖類は、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、エリトロース、トレオース、エリトルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、キシルロース、リブロース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、デオキシリボースおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の単糖であってもよい。
【００１１】
上記多糖類は、硫酸化多糖類ならびにヒアルロン酸（ヒアルロナン）、ヘパリン、フコイダン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、キチン、キトサン、アガロース、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、カードラン、カラギーナン、マンナン、ガラクトマンナン、キサンタンガム、グアーガム、プルラン、ペクチンおよびキシログルカンからなる群から選択される少なくとも１種の多糖類であってもよい。
【００１２】
上記の凝集および／または沈殿は、フラッシュ遠心またはスピンダウンすることによって促進することができる。
上記の凝集および／または沈殿は、さらに上記の物質または細胞と相互作用する固体支持体を添加することによって、促進することができる。
【００１３】
上記固体支持体は、抗体が固定化された粒子であることが好ましい。
また、本発明の細胞単離方法は、上記分離方法を用いて、生物由来の検体、培養液または細胞含有溶液から細胞を単離することを特徴とする。
【００１４】
本発明の細胞検出方法は、上記分離方法を用いて、生物由来の検体、培養液または細胞含有溶液から細胞の有無を、凝集および／または沈殿によって検出することを特徴とする。
【００１５】
本発明の核酸抽出方法は、少なくとも下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする。
工程（Ａ）：請求項１〜８のいずれかに記載の分離方法を用いて、生物由来の検体、培養液または細胞含有溶液から細胞を単離する工程、および
工程（Ｂ）：該工程（Ａ）を経て得られた細胞を溶解して、核酸を遊離させる工程。
【００１６】
上記工程（Ｂ）は、加熱処理、超音波照射処理および化学試薬処理からなる群から選択される少なくとも１種の処理を要することが好ましい。
本発明のキットは、上記の分離方法、細胞単離方法、細胞検出方法および核酸抽出方法それぞれに用いられることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、ＭＤＰ１の添加で引き起こされる凝集シグナル（すなわち、視認できるほどの大きさを有する凝集塊および／または沈殿塊）を、または該シグナルを増強させたものを検出することで、細胞の存在を簡便に同定することができる分離方法を提供することが
できる。
【００１８】
また、本発明は、遠心分離フリーで、細胞を分離（例えば、血球血漿分離など）する方法を提供することができる。
さらに、本発明は、ＭＤＰ１の代わりに、ＭＤＰ１とは異なる種々のタンパク質をＭＤＰ１に融合した融合タンパク質を用いることによって、様々な応用を可能とする。例えば、標的物質Ａと結合するタンパク質をＭＤＰ１に融合した融合タンパク質を用いることによって、標的物質Ａを特異的に凝集させることが可能になる。また、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質をＭＤＰ１に融合した融合タンパク質を用いることで、細胞の凝集シグナルを可視化することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に、本発明の分離方法について具体的に説明する。
＜分離方法＞
本発明の分離方法は、ＭＤＰ１、あるいはＭＤＰ１の１個または複数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失したポリペプチドを用いて、該ＭＤＰ１あるいは該ポリペプチドと相互作用する炭水化物もしくは炭水化物誘導体を有する物質または細胞を、凝集および／または沈殿させることによって、該物質または該細胞を分離することを特徴とするものである。
【００２０】
（炭水化物／炭水化物誘導体）
本発明に係る炭水化物および炭水化物誘導体は、それぞれＭＤＰ１または上記ポリペプチドと相互作用するものであり、単糖類、２〜２０個の単糖からなるオリゴ糖類および２１個以上の単糖からなる多糖類よりなる群から選ばれる少なくとも１種の糖質であることが好ましい。
【００２１】
本発明において、「炭水化物」とは、単糖を構成成分とする有機化合物の総称であって、分子式としてＣmＨ2nＯnで表されるものをいう。なお、該分子式を満たすものであっても、単糖を構成成分としていないホルムアルデヒド（ＣＨ2Ｏ；ｍ＝ｎ＝１）は炭水化物
には含まれない。
【００２２】
また、本発明において、「炭水化物誘導体」とは、糖誘導体、または単糖と糖誘導体とを構成成分とする有機化合物の総称である。
このような「糖誘導体」としては、例えば、デオキシリボース（Ｃ5Ｈ10Ｏ4）、硫酸化多糖類などが挙げられる。
【００２３】
このような「単糖類」としては、例えば、三炭糖（トリオース）、四炭糖（テトロース）、五炭糖（ペントース）、六炭糖（ヘキソース）などが挙げられ、具体的には、
グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン等の三炭糖；
エリトロース、トレオース、エリトルロース等の四炭糖；
リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、キシルロース、リブロース等の五炭糖；
アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等の六炭糖などであってもよい。
【００２４】
これらは１種単独で用いることも、２種併用することもできる。
「オリゴ糖類」としては、例えば、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース等の二糖類；ラフィノース、パノース、メレジトース、ゲンチアノース等の三糖類；スタキオース等の四糖類などが挙げられる。これらは１種単独で用いることも、２種併用す
ることもできる。
【００２５】
「多糖類」としては、例えば、ヒアルロン酸（ヒアルロナン）、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケタラン硫酸、ラムナン硫酸、デキストラン硫酸等の硫酸化多糖類；ヒアルロン酸（ヒアルロナン）、ヘパリン、フコイダン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、キチン、キトサン、アガロース、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、カードラン、カラギーナン、マンナン、ガラクトマンナン、キサンタンガム、グアーガム、プルラン、ペクチン、キシログルカンなどが挙げられる。これらは１種単独で用いることも、２種併用することもできる。
【００２６】
（ＭＤＰ１）
「ＭＤＰ１」は、２０５個のアミノ酸からなるタンパク質であって、ＢＣＧ東京株から分離精製することができるが、本発明に用いるＭＤＰ１は、該株に限定されず、ＢＣＧ東京株以外のＢＣＧ株、結核菌などのマイコバクテリウム属細菌から分離精製して得られるタンパク質であってもよい。
【００２７】
このようなＭＤＰ１は、炭水化物または炭水化物誘導体と相互作用する部位はもとより、ＭＤＰ１自らと相互作用する部位を含み、該部位は、ＭＤＰ１タンパク質自身の多量体形成能を有している。このことから、ＭＤＰ１との結合ドメインを２つ以上有する物質、細胞などにＭＤＰ１を添加すると、連鎖的に大きな複合体が形成されるので、簡便に凝集させることが可能になる（図２参照）。
【００２８】
さらには、凝集促進因子がタンパク質であることから、融合などの修飾が容易で、上記特許文献４のように単に沈殿させるだけでなく、融合パートナーの性質によって、特定部位に集める、可視化させるなどの応用が可能となる。
【００２９】
「数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２個または３個程度を意味する。
ＭＤＰ１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸を欠失、置換または付加などの変異を誘発する技術としては、例えば、部位特異的突然変異／ＰＣＲ法などの周知の技術（Ｓ.Ｎ.Ｈｏら,Ｇｅｎｅ,７７巻,５１頁（１９８９年）；西郷薫と佐野弓子共訳,Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓコンパクト版,分子生物学実験プロトコールＩ,１９９７年６月,丸善）を用いることができる。
【００３０】
「組換えタンパク質」または「修飾タンパク質」（以下「ｒＭＤＰ１」ともいう。）として、６×ヒスチジン融合タンパク質、ＧＳＴ融合タンパク質といった組換えタンパク質の態様が好適である。このような組換えタンパク質を作製する場合は、まず、ＭＤＰ１をコードするＤＮＡを入手する必要がある。ＭＤＰ１をコードするＤＮＡの入手、該ＤＮＡの塩基配列などについては、特開２０００−２１９６９９号公報（上記特許文献５）に記載されている。このＤＮＡをプラスミドなどの適当な発現ベクターに組み込み、大腸菌や酵母に導入することにより、組換えタンパク質として発現させることができる。また、発現させた組換えタンパク質は、アフィニティクロマトグラフィーによって分離精製することができる。具体的には、ＭＤＰ１をコードするＤＮＡを、例えば、ｐＱＥ３０、ｐＧＥＸなどのプラスミドに組み込み、これを大腸菌、ＢＣＧなどの細菌または酵母などの細胞に導入して形質転換体として培養することによって、ｒＭＤＰ１が産生される（特許文献５）。
【００３１】
（相互作用）
本発明において「相互作用」とは、炭水化物および／または炭水化物誘導体と、ＭＤＰ１および／またはｒＭＤＰ１の３１〜５０番目のアミノ酸部分との間に分子間力が働き、
それらが会合または結合することをいう。ただし、共有結合は、「相互作用」には含まれない。
【００３２】
（炭水化物または炭水化物誘導体を有する物質／細胞）
「炭水化物または炭水化物誘導体を有する物質または細胞」とは、本発明においては、上記炭水化物および／または上記炭水化物誘導体を有する物質または細胞であれば、特に限定されず、例えば、原核生物（真正細菌、古細菌）のみならず、真核生物（藻類、原性生物、菌類、粘菌）、ウイルスや、ワムシのようなごく小型の動物も含まれる。
【００３３】
なお、菌類などでは肉眼的なコロニーを作るものであっても、カビのように、その体の構成単位が顕微鏡的大きさであるものは、細胞として扱われる。また、単細胞生物は元より、多細胞生物を構成する１つ１つの細胞も、細胞に包含される。
【００３４】
このような物質または細胞は、該炭水化物および／または上記炭水化物誘導体を２分子以上有すると、連鎖的に凝集または沈殿を誘導できるので好ましい。
（凝集／沈殿）
本発明において「凝集」とは、当該技術分野で通常用いられる意味で用いられ、上記物質または上記細胞が表面同士で、一時的、一定の時間または長時間にわたって集結し塊を形成する現象をいう。
【００３５】
なお、凝集は、「濃縮」と異なり、凝集した上記物質または上記細胞は一群の物体を形成するが、濃縮においては、濃縮された上記物質または上記細胞は、依然として個々の上記物質または上記細胞が分離独立しており、ばらばらに存在している状態である。
【００３６】
上記「凝集および／または沈殿」は、フラッシュ遠心もしくはスピンダウンすることによって、および／または、さらに上記の物質または細胞と相互作用する固体支持体を添加することによって、促進することができる。すなわち、凝集および／または沈殿は、このような操作を行うことにより、より短時間に「塊」を形成することができる。
【００３７】
「フラッシュ遠心またはスピンダウン」としては、卓上遠心機などの小型遠心機を用いて、好ましくは８００×ｇ程度の遠心力を、１〜数秒間作用させることが望ましい。このような短時間の遠心操作であることから、温度を制御する必要は特になく、そのため遠心機も大掛かりでないもので足りる。
【００３８】
「固体支持体」とは、上記の物質または細胞と相互作用し、その凝集物および／または沈殿物を、シグナルとして視認可能な程度に増強させ、より視認し易くさせる、水または水溶液に不溶のものをいい、上記のタンパク質またはポリペプチド以外の、上記の物質または細胞と相互作用する基質と、該基質を固定化することができる支持体とからなることが好ましい。
【００３９】
「基質」としては、上記の物質または細胞と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば、細胞表面に提示されたタンパク質を抗原とする（モノクローナル／ポリクローナル）抗体、レクチンなどが挙げられる。これらのうち、基質とのアフィニティーが高いことから、上記抗体が好ましい。
【００４０】
このような「抗体」としては、例えば、抗ＣＤモノクローナル抗体、抗ＣＤポリクローナル抗体、などが挙げられる。
「支持体」としては、従来公知の支持体またはマトリックスに使用されている材料であってもよく、有機化合物、無機化合物、金属、金属酸化物またはこれらを組み合わせた複合材料を含む。
【００４１】
「有機化合物」としては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリアミド、ラテックス等の合成有機高分子；コラーゲン、コラーゲン−グリコサミノグリカン共沈物、セルロース、キチン、キトサン、ペクチン、ペクチン酸、寒天、アガロース、キサンタンゴム、ゲラン、アルギン酸、アルギネート、ポリマンナン、ポリグリカン、デンプン、天然ゴム等の天然有機高分子などが挙げられる。
【００４２】
「無機化合物」としては、例えば、ガラス、シリカ、二酸化珪素、窒化珪素などが挙げられる。
「金属」としては、例えば、ステンレス、ジルコニアなどが挙げられる。
【００４３】
「金属酸化物」としては、例えば、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化ナトリウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛などが挙げられる。
これらのうち、ポリスチレン、ラテックス、アガロース、ガラスおよびシリカが好ましく、特にポリスチレンが好ましい。
【００４４】
上記支持体の形状としては、例えば、粒子状、棒（繊維、毛細管）状、板状、シート（膜）状などが挙げられ、なかでも、反応効率に優れることから粒子状が好ましい。
固体支持体としては、上記の物質または細胞に対する抗体が固定化された粒子であることが好ましく、支持体が磁気を帯びている磁性粒子であってもよい。
【００４５】
「粒子状」の形態としては、例えば、ビーズ（球体）形、楕円体形、錐体形、立方体形、直方体形などが考えられるが、ビーズ形粒子の支持体は、他の形態と比較して製造が容易であり、また使用時に、固体支持体の回転撹拌が容易なことからも好ましい。
【００４６】
ビーズ形粒子の平均粒子径は、好ましくは０．５〜１０μｍ、より好ましくは２〜６μｍである。平均粒子径が１０μｍを超える場合、固体支持体が水性媒体中において容易に沈降するため、上記物質または微生物を捕捉する際に媒体を撹拌する操作が必要となることがある。また、支持体体積に対する表面積が相対的に小さくなるため、上記物質または微生物を充分に捕捉することが困難となる場合がある。
【００４７】
上記支持体に上記基質を固定化する方法としては、従来公知の方法を適用することができる。これらのうち、ビーズ形粒子に抗体を共有結合させる方法が好ましい。具体的には、ビーズ形粒子の表面に露出するトシル基に、ヒスチジンからなるタグを介し抗体を共有結合させることにより固定化する方法；ビーズ形粒子の表面に露出するコバルトまたはニッケルと、ヒスチジンからなるタグを有する抗体とを配位結合させて固定化することにより固定化する方法；ビーズ形粒子の表面に露出するトシル基、エポキシ基またはカルボキシル基（アンカーされた無水マレイン酸など）に、抗体が有するアミノ基を共有結合させて固定化する方法；ビーズ形粒子の少なくともその表面を構成するポリスチレンにアンカーされた活性マレイミド基と、抗体が有するスルフヒドリル基とをチオエーテル結合させて固定化する方法；ラテックスからなるビーズ形粒子の少なくともその表面を構成するポリスチレンに、抗体を物理的に吸着させる方法などが挙げられる。
【００４８】
＜細胞単離方法＞
本発明の細胞単離方法は、上記「分離方法」を用いて、生物由来の検体、培養液または細胞含有溶液から細胞を単離することを特徴とする。
【００４９】
（生物由来の検体／培養液／細胞含有溶液）
「生物由来の検体」としては、生物の一部または全部を直接採取したものであれば、特
に制限されない。具体例として、血液、喀痰、唾液、尿、肺胞などが挙げられる。
【００５０】
「培養液」としては、上記生物由来の検体を構成する細胞や組織の一部、または微生物を人工的な環境下で育てたものであれば、特に制限されない。具体例として、ＢＣＧ溶液などが挙げられる。
【００５１】
「細胞含有溶液」としては、上記生物由来の検体に人工的な処理を施して得られたものであれば、特に制限されない。具体例として、血漿、血清、肺胞組織破砕溶解液などが挙げられる。
【００５２】
これらは、流体の形態が好ましく、通常は、溶液または懸濁液である。
（操作手順）
本発明の細胞単離方法の構成として、その具体的な操作手順を以下に例示するが、この態様に限定されるものではない。
【００５３】
培養液としてヒト上皮細胞（例えば、ヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９など）が入っているエッペンドルフチューブに、結合バッファーのＰＢＳに混合されたＭＤＰ１を添加し（ＭＤＰ１の最終濃度は、好ましくは１〜５μｇ／ｍＬ）、該チューブを転倒混和する。この後、数分間静置してもよいし、フラッシュ遠心またはスピンダウン（８００×ｇで１〜数秒程度の遠心操作）してもよい。ヒト上皮細胞はＭＤＰ１を介して凝集し、エッペンドルフチューブの底部に沈殿する。上清を除くと細胞を単離することができる。
【００５４】
また、上述の態様において、例えば、糖類を有する微生物群と糖類を有さない細胞とを含む細胞含有溶液を用いた場合、ＭＤＰ１を添加しても対象とする細胞は沈殿しないので、沈殿を除くことによって対象とする細胞を単離することができる。
【００５５】
＜細胞検出方法＞
本発明の細胞検出方法は、上記「分離方法」を用いて、生物由来の検体、培養液または細胞含有溶液から細胞の有無を、凝集および／または沈殿によって検出することを特徴とする。
【００５６】
上記の「生物由来の検体」、「培養液」および「細胞含有溶液」は、上記「細胞単離方法」で記載した「生物由来の検体」、「培養液」および「細胞含有溶液」と同義である。
（凝集／沈殿による細胞の有無の検出）
凝集および／または沈殿による、対象とする細胞の有無は、例えば、濁度を測定することによって検出することができる。すなわち、凝集した細胞の有効性は、濁度の減少率（％ＲＴ）に換算して計測することができる。「％ＲＴ」とは、凝集前の吸光度と比較した凝集後の懸濁媒体の吸光度（６００ｎｍ）の減少をいい、下記式から求められる。
【００５７】
％ＲＴ＝（（Ａ1−Ａ2）×１００）／Ａ1
（式中、Ａ1は、凝集前の懸濁媒体の６００ｎｍでの吸光度を表し、Ａ2は、炭水化物または炭水化物誘導体と相互作用するタンパク質またはポリペプチドを添加し、１５分間沈降させた後の懸濁媒体の６００ｎｍでの吸光度を表す。）
このような濁度の減少率（％ＲＴ）は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは実質的に１００％である。
【００５８】
または、好ましい態様として、上記の物質または細胞と相互作用する固体支持体を添加し、細胞の凝集および／または沈殿を、そのシグナルとして、視認可能な程度に増強することができる。
【００５９】
＜核酸抽出方法＞
本発明の核酸抽出方法は、少なくとも下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする。
【００６０】
工程（Ａ）：上記「分離方法」を用いて、生物由来の検体、培養液または細胞含有溶液から細胞を単離する工程、および
工程（Ｂ）：該工程（Ａ）を経て得られた細胞を溶解して、核酸を遊離させる工程。
【００６１】
（工程（Ａ））
工程（Ａ）とは、上記「分離方法」を用いて、生物由来の検体、培養液または細胞含有溶液から細胞を単離する工程である。
【００６２】
上記の「生物由来の検体」、「培養液」および「細胞含有溶液」は、上記「細胞単離方法」で記載した「生物由来の検体」、「培養液」および「細胞含有溶液」と同義である。
（工程（Ｂ））
工程（Ｂ）とは、上記工程（Ａ）を経て得られた細胞を溶解して、核酸を遊離させる工程であり、好ましくは、該工程（Ａ）を経て得られた細胞に対して、加熱処理、超音波照射処理、化学試薬処理またはこれらを併用することによって、その細胞膜を破壊し、核酸を細胞外に放出させ、これを核酸溶液として分離回収する工程である。
【００６３】
このような工程（Ｂ）は、遠心分離、ろ過、減圧処置などのような操作を含まないため、簡便かつ迅速に核酸を抽出することができる。
細胞膜を破壊し、核酸を細胞外に放出するための処理として、公知の様々な物理的処理または化学的処理を施すことができる。
【００６４】
物理的処理としては、加熱処理、超音波照射処理、凍結・溶融処理などが挙げられる。
化学的処理としては、化学試薬処理、例えば、消化酵素、カオトロープ試薬、界面活性剤、溶菌剤等を用いる変性処理などが挙げられる。核酸を抽出した後の工程において悪影響を及ぼす化学試薬を用いなければ、該化学試薬を除く必要はなく、細胞から核酸を高収率で抽出することができる。なお、特許第２６２５３４０号明細書中の表１および２には、マイコバクテリウムなどを溶菌するための様々のプロトコールがまとめられている。
【００６５】
加熱処理とは、その温度範囲、すなわち７０〜１２０℃、好ましくは８０〜１２０℃、より好ましくは８０〜１００℃で、２０秒〜１０分間、好ましくは２０秒〜３００秒間施すことをいう。加熱する温度および時間は、細胞または菌の種類（大きさ、細胞膜の組成と厚さなど）によって異なるため、上記範囲の中から適宜選択する。加熱する手段は、あらゆる適切な加熱手段により行なわれ、例えば、ドライ・ヒートブロック、湯浴、マイクロウェーブ・オーブン、各種ヒーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
超音波照射処理を施す場合、溶菌に有効である超音波の照射条件を適宜設定する必要がある。照射量は、使用する超音波照射装置の定格出力、照射する細胞の量、照射する時間から計算することができる。例えば、超音波の周波数は、細胞含有溶液量、撹拌条件などによって選択されるが、好ましくは１０〜１００ｋＨｚ、より好ましくは１５〜４５ｋＨｚであり、この周波数にて、少なくとも５分間、好ましくは５〜３０分間程度照射することが望ましい。
【００６７】
細胞膜を破壊し、核酸を細胞外に放出するために施すより好ましい処理は、加熱処理と超音波照射処理との併用による態様である。このような態様は、上記のそれぞれの処理条件よりもさらに温和な条件で溶菌が達成できる。ただし、加熱処理または超音波照射処理
により、核酸が少なくとも変性しない範囲である。
【００６８】
＜キット＞
本発明のキットは、上記の「分離方法」、「細胞単離方法」、「細胞検出方法」および「核酸抽出方法」それぞれに用いられることを特徴とする。
【００６９】
すなわち、本発明のキットは、本発明の「分離方法」、「細胞単離方法」、「細胞検出方法」および「核酸抽出方法」のいずれかを実施するために必要とされる器材一式、具体的には、各種試薬、固体支持体、細胞単離および核酸抽出・精製に必要な器具を含むものである。これらの試薬の中には、サンプルを溶解（または希釈）するための溶解（または希釈）液、洗浄液、各種の緩衝液なども含まれる。本発明の「分離方法」、「細胞単離方法」、「細胞検出方法」および「核酸抽出方法」のいずれかを実施するために必要とされる固体支持体、結合バッファー、細胞洗浄バッファー（細胞洗浄液）、溶解バッファー（再懸濁液）、核酸洗浄バッファー（核酸洗浄液）、核酸溶出バッファー（溶出液）がそれぞれ容器にあらかじめ封入されている態様のキットが望ましい。必要な器材一式の中には、さらに細胞を固体支持体に付着または結合させ、その細胞膜を破壊して内部に含まれる核酸を抽出する専用の器具を、キットの構成要素として含めてもよい。これらの器具を用いて上記の本発明の「分離方法」、「細胞単離方法」、「細胞検出方法」および「核酸抽出方法」のいずれかを実施することができる。
【００７０】
本発明の「分離方法」、「細胞単離方法」、「細胞検出方法」および「核酸抽出方法」のいずれかを実施するためには上記以外の用具または機器を必要とすることもあるが、これらは適宜、本発明のキットの構成要素として含められる。固液分離には遠心力を利用してもよく、その場合、卓上遠心機などの小型遠心機を使用することができる。
【００７１】
本発明の細胞単離方法および核酸抽出方法では、少なくとも２種の緩衝液が使用される。結合バッファーは、例えば、塩として塩化ナトリウム、酢酸カリウム、またＥＤＴＡ、界面活性剤などを含んでもよいリン酸系、酢酸系またはトリス系の緩衝液が挙げられ、具体的には、ＰＢＳ、ＴＢＳなどである。細胞洗浄バッファーは、上記結合バッファーを４〜５倍に希釈したものを用いてもよいが、異なる種類のバッファーを別途に用意してもよい。溶解バッファーとしては、水または緩衝液、または塩を含有する緩衝液が例示され、特にＴＥバッファーが好適である。キットには、従来技術において核酸抽出に用いられてきたクロロホルム、フェノールなどの有機溶媒、カオトロープ試薬、溶菌剤などは含まれない。
【００７２】
本発明の「分離方法」、「細胞単離方法」、「細胞検出方法」および「核酸抽出方法」のいずれかを実施する際には、消耗品とともに撹拌のためのミキサー、撹拌子、加熱するためのヒーターまたは超音波発生器、磁気処理による固液分離に使用する磁石、磁気選別機なども、必要に応じて使用される。具体的には、撹拌は試験管ミキサーによる振動、または容器を回転する転倒混和が望ましく、磁石は棒磁石であってもよい。磁石の種類は電磁石、永久磁石のいずれでもよいが、簡便性、操作性から永久磁石、特に磁力の強さからネオジム磁石が好ましい。
【００７３】
これらは、通常、検査室に備えられている機器であり、それらの機器をキットとともに使用して本発明の「分離方法」、「細胞単離方法」、「細胞検出方法」および「核酸抽出方法」のいずれかを実施することができる。さらに必要であれば、そうした機器の一部をキットの構成物として含めてもよい。なお、本発明の「分離方法」、「細胞単離方法」、「細胞検出方法」および「核酸抽出方法」のそれぞれに用いられるキットの構成は、同一でもよく、また異なっていてもよい。
【００７４】
上記固体支持体、キットの全体または一部についても、構造、構成、配置、形状形態、寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々のものにすることができる。
【実施例】
【００７５】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されない。
［調製例１］（組換えＭＤＰ１タンパク質）
ヒスチジンタグを付加された組換えＭＤＰ１タンパク質（ｒＭＤＰ１）は、以前報告された方法（Ａｏｋｉら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,２７９：３９７９８頁〜３９８０６頁，２００４年）に従って調製した。その概要は次の通りである。
【００７６】
まず、ｒＭＤＰ１発現ベクター（ｐＥＴ２２Ｂ−ＭＤＰ１）で、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ(インビトロジェン（株）製)を形質転換した。この形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）および３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）を含むＬＢ液体培地中、２２℃で培養し、６００ｎｍでの吸光度が０.３〜０.６になったとき、最終濃度が０.１ｍＭに
なるようにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して７時間培養することで、ｒＭＤＰ１を発現させた。
【００７７】
遠心分離で回収した該形質転換体は、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ  ＵＣＤ−２００ｔ（東ソー（株）製）による超音波処理を行うことによって粉砕し、再び８，０００×ｇ、３０分間の遠心分離をした後、上清を溶出タンパク質として回収した。この上清を、０.２２μｍ
のメンブレンフィルターに通すことで、ゴミ等を除去した後、１００ｍＭの硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ4）がチャージされ、５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム（ｐＨ８.０）、１０ｍＭのイミダゾールおよび０.５Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）で平衡化された金属キ
レートアフィニティークロマトグラフィー担体（商品名「Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ」／（株）キアゲン製）に添加した。該担体を洗浄することで、非特異的に吸着しているタンパク質を取り除いた後に、５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム（ｐＨ８.０）、３０
０ｍＭのイミダゾール、０.５Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０１％のＴｗｅｅｎ２０と
からなる溶出バッファーで、ｒＭＤＰ１を溶出した。
【００７８】
その後透析により、その溶出バッファーをＰＢＳに置換した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した後に、得られたゲルをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）染色した結果、精製されたｒＭＤＰ１の濃度は、１ｍｇ／mＬであった。
【００７９】
［実施例１］（ＭＤＰ１タンパク質による糖類含有粒子の凝集・沈殿）
ＢＵＧＳ’ｎ  ＢＥＡＤＳ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｐｏｉｎｔ  ＡＳ社製）に含まれる磁性体ビーズ（糖類修飾粒子）３００μｇに、結合バッファー（ＰＢＳ）に混合されたｒＭＤＰ１タンパク質（８μｇ）を添加し、撹拌混合した後に静置した。
【００８０】
０、３、５および１５分後に挙動を観察したところ、時間の経過とともに凝集および沈殿が観察された。その結果を図１のレーン３に示す。
［比較例１］
実施例１において、結合バッファー（ＰＢＳ）に混合されたｒＭＤＰ１タンパク質の代わりに、ｒＭＤＰ１タンパク質を混合していない結合バッファー（ＰＢＳ）を添加した以外は実施例１と同様にして撹拌混合した後に静置した。
【００８１】
０、３、５および１５分後に挙動を観察したが、時間の経過とともに凝集または沈殿は
観察されなかった。その結果を図１のレーン１に示す。
［比較例２］
実施例１において、ｒＭＤＰ１タンパク質の代わりに、ＢＳＡを用いた以外は実施例１と同様にして撹拌混合した後に静置した。
【００８２】
０、３、５および１５分後に挙動を観察したが、時間の経過とともに凝集または沈殿は観察されなかった。その結果を図１のレーン２に示す。
［比較例３］
実施例１において、磁性体ビーズの代わりに、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ｅｐｏｘｙ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ社製）（未修飾粒子）を用い、さらに、結合バッファー（ＰＢＳ）に混合されたｒＭＤＰ１タンパク質の代わりに、ｒＭＤＰ１タンパク質を混合していない結合バッファー（ＰＢＳ）を添加した以外は実施例１と同様にして撹拌混合した後に静置した。
【００８３】
０、３、５および１５分後に挙動を観察したが、時間の経過とともに凝集または沈殿は観察されなかった。その結果を図１のレーン４に示す。
［比較例４］
実施例１において、磁性体ビーズの代わりに、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ｅｐｏｘｙ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ社製）（未修飾粒子）を用いた以外は実施例１と同様にして撹拌混合した後に静置した。
【００８４】
０、３、５および１５分後に挙動を観察したが、時間の経過とともに凝集または沈殿は観察されなかった。その結果を図１のレーン５に示す。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の方法は、臨床検査現場において、簡便かつ迅速な血球血漿分離の方法として好適である。また本発明の方法は、実験室において、簡便かつ迅速な細胞分離の方法として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、左から比較例１、比較例２、実施例１、比較例３および比較例４の結果を示す画像であり、上からビーズにタンパク質（ただし、（−）の系ではタンパク質成分は含まれていない。）を添加した直後（０分）、３分後、５分後および１５分後のものを示す図である。
【図２】図２は、本発明の特徴を示す概略図であり、ＭＤＰ１の、多糖類を有する細胞に相互作用する性質と、ＭＤＰ１同士が相互作用する性質とを利用して、多糖類を有する細胞が凝集する反応機構を示す図である。
【符号の説明】
【００８７】
ＧＰ  ｂｅａｄｓ・・・ＢＵＧＳ’ｎ  ＢＥＡＤＳ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｐｏｉｎｔ  ＡＳ社製）に含まれる磁性体ビーズ（多糖類修飾粒子）
Ｅｐｏｘｙ  ｂｅａｄｓ・・・Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ｅｐｏｘｙ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ社製）（未修飾粒子）
（−）・・・ＢＳＡおよびＭＤＰ１のいずれも添加していない系
ＢＳＡ・・・ＢＳＡを添加した系
ＭＤＰ１・・・ＭＤＰ１を添加した系
【図１】
2010104250.tif 000002
【図２】
2010104250.tif 000003