(57)【要約】【課題】従来とは異なる方法で、体外的にＳ−エクオールを生成することができるＳ−エクオールの製法およびそれに用いる微生物を提供する。【解決手段】６−ヒドロキシダイゼインを、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens) により発酵させ、Ｓ−エクオールを生成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
６−ヒドロキシダイゼインを、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens) により発酵させ、Ｓ−エクオールを生成することを特徴とするＳ−エクオールの製法。
【請求項２】
上記アドレクラウチア・エクオーリファシエンスが、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８(Adlercreutzia equolifaciens KI0628 ,NITE P-527)である請求項１記載のＳ−エクオールの製法。
【請求項３】
上記６−ヒドロキシダイゼインが、グリシテインをユーバクテリウム・リモサム(Eubacterium limosum) により発酵させて得られたものである請求項１または２記載のＳ−エクオールの製法。
【請求項４】
上記グリシテインが、大豆由来のイソフラボンである請求項３記載のＳ−エクオールの製法。
【請求項５】
上記６−ヒドロキシダイゼインとともに、ダイゼインを基質とし、上記発酵を行う請求項１〜４のいずれか一項に記載のＳ−エクオールの製法。
【請求項６】
上記ダイゼインが、大豆由来のイソフラボンである請求項５記載のＳ−エクオールの製法。
【請求項７】
ダイゼイン、ジヒドロダイゼインおよび６−ヒドロキシダイゼインからなる群から選ばれた少なくとも一種のイソフラボンを資化してＳ−エクオールを産生する能力を有することを特徴とするアドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８(Adlercreutzia equolifaciens KI0628 ,NITE P-527)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ−エクオールの製法およびそれに用いる微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
大豆に含まれるイソフラボン（大豆イソフラボン）は、女性ホルモン作用や抗酸化作用を有しており、大豆イソフラボンを摂取すると、乳がん、前立腺がん、女性の更年期障害等の予防・症状緩和が認められるとの報告が多数なされている。エクオールは、大豆イソフラボンの腸内代謝産物であり、もとのイソフラボンよりも女性ホルモン作用や抗酸化作用が強いことが知られている（非特許文献１および２参照）。また、エクオールには光学異性体（Ｓ体とＲ体）が存在し、Ｓ体かＲ体かによって、エストロゲン受容体α，βへの結合活性が異なることが知られており、その違いから、Ｓ体のエクオール（Ｓ−エクオール）のほうが生体には有用であると考えられている（非特許文献３参照）。
【０００３】
今日、植物等の食材にエクオールがそのまま含まれているとの報告は殆どないが、例えば、大豆を食物として摂取すると、大豆イソフラボンの一種であるダイゼインが、体内の腸内細菌によって発酵され、その活性型代謝産物としてエクオールが生成されることが知られている。しかし、人間の場合、イソフラボンの代謝には個人差があり、上記のようなエクオール産生能を有する腸内細菌を保有する人は少なく、その保有率は、日本人で約５割、欧米人で約３割程度であることが研究によりわかってきている（非特許文献４および５参照）。そのため、エクオール産生菌を保有しない人の場合、大豆（大豆加工食品を含む）を摂取しても、所望の女性ホルモン作用や抗酸化作用の効果は期待できないと考えられる。このような人において所望の効果を発現させるためには、エクオールそのものを摂取させればよいと考えられる。
【０００４】
以上のことから、近年、ダイゼインに、乳酸菌等の細菌を作用させ、体外的にエクオールを生成する研究が各種なされている。このように体外的に生成されたエクオールを摂取することにより、エクオール産生能を有する腸内細菌を保有する人でなくとも、容易にエクオールを摂取することができるようになる（例えば、特許文献１〜４参照）。
【特許文献１】特許第３８６４３１７号公報
【特許文献２】ＷＯ９９／０３９２公報
【特許文献３】特開２００６−２０４２９６公報
【特許文献４】特表２００６−５０４４０９公報
【非特許文献１】ＫＤ  Ｓｅｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｎｕｔｒ，１３２，３５７７−３５８４
【非特許文献２】Ｎ  Ｓａｔｈｙａｍｏｏｒｔｈｙ  ａｎｄ  ＴＴ  Ｗａｎｇ（１９９７）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，３３，２３８４−２３８９
【非特許文献３】ＲＳ  Ｍｕｔｈｙａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，１２，１５５９−１５６７
【非特許文献４】Ｙ  Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，１０，１２７−１３５
【非特許文献５】ＫＤ  Ｓｅｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｎｕｔｒ，１３３，１０２７−１０３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、大豆イソフラボンには、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、およびこれらに糖が付加した配糖体（上記３つのイソフラボンに対し、それぞれ３種類ずつ）が存在する。このように、大豆イソフラボンは、ダイゼインをはじめとし、１２種類が存在する。これに対し、上記特許文献に開示のエクオール生成方法は、その殆どがダイゼインを基質とするエクオールの生成法であり、例えばグリシテインおよびその配糖体を基質として体外的にエクオールを生成する方法は、いまだ確立されていない。
【０００６】
グリシテインおよびその配糖体は、大豆種子中のイソフラボンの約１０％を占め、大豆胚軸中においては、その胚軸中のイソフラボンの約４０％を占める。そのため、これらを基質として用いた場合であってもエクオール（特に、生体に有用であるＳ−エクオール）を生成することができれば、大豆イソフラボンを基質とするエクオール産生能を高めることができるため、その製法の確立が期待されている。
【０００７】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、従来とは異なる方法で、体外的にＳ−エクオールを生成することができるＳ−エクオールの製法およびそれに用いる微生物をその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明は、６−ヒドロキシダイゼインを、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens) により発酵させ、Ｓ−エクオールを生成するＳ−エクオールの製法を第一の要旨とする。
【０００９】
また、本発明は、ダイゼイン、ジヒドロダイゼインおよび６−ヒドロキシダイゼインからなる群から選ばれた少なくとも一種のイソフラボンを資化してＳ−エクオールを産生する能力を有するアドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８(Adlercreutzia equolifaciens KI0628 ,NITE P-527)を第二の要旨とする。
【００１０】
すなわち、ダイゼインを基質とするエクオールの生成法は、先に述べたように、各種乳酸菌等を作用させる方法等が既に確立されているが、例えばグリシテインおよびその配糖体を基質として体外的にエクオールを生成する方法は、いまだ確立されていないのが現状である。一方、グリシテインおよびその配糖体を、各種微生物や酵素を作用させることにより、体外的に、６−ヒドロキシダイゼインを生成する方法は既に確立されている（例えば、ＨＧ  Ｈｕｒ  ａｎｄ  Ｆ  Ｒａｆｉｉ（２０００）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，１９２，２１−２５等を参照）。この知見に基づき、本発明者らは、６−ヒドロキシダイゼインを基質としてエクオールを生成する能力を有する微生物が、動物の腸内細菌にあるのではないかと想起し、各種実験を重ねた。その結果、本発明者らは、各種腸内細菌のなかから分離し選定されたアドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens) に、その能力があることを突き止めた。また、本発明者らは、上記アドレクラウチア・エクオーリファシエンスにより６−ヒドロキシダイゼインを発酵させて得られたエクオールが、生体に有用なＳ−エクオールのみであることを突き止めた。上記エクオールがＳ体であることは、例えば、クロマトグラムによる溶出時間の違いによって確認することができる。そして、このように６−ヒドロキシダイゼインからＳ−エクオールを生成する方法が確立されたことにより、グリシテインおよびその配糖体から、体外的にＳ−エクオールを生成する方法も確立されるようになる。しかも、アドレクラウチア・エクオーリファシエンスは、各種実験により、ダイゼインを基質としてもＳ−エクオールを生成する能力を有することが明らかになったことから、本発明の製法を適用することにより、Ｓ−エクオールを効率良く生成することができるようになることを見いだし、本発明に到達した。
【発明の効果】
【００１１】
以上のように、本発明のＳ−エクオールの製法は、６−ヒドロキシダイゼインを、アドレクラウチア・エクオーリファシエンスにより発酵させることにより行われる。これにより、従来確立されていなかった、６−ヒドロキシダイゼインからＳ−エクオールを体外的に生成する方法を確立することができ、さらに、グリシテインおよびその配糖体から体外的に６−ヒドロキシダイゼインを生成する方法と組み合わせることにより、従来確立されていなかったグリシテインおよびその配糖体から体外的にＳ−エクオールを生成する方法も確立することができる。そして、本発明の製法により得られたＳ−エクオールは、骨粗鬆症、前立腺がん、女性の更年期障害等の予防およびその症状の緩和に優れた効果を発揮することができる。
【００１２】
特に、上記アドレクラウチア・エクオーリファシエンスが、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８(Adlercreutzia equolifaciens KI0628 ,NITE P-527)であると、Ｓ−エクオールの生成効率がより優れるようになる。
【００１３】
また、上記６−ヒドロキシダイゼインが、グリシテインをユーバクテリウム・リモサム(Eubacterium limosum) により発酵させて得られたものであると、グリシテインからの６−ヒドロキシダイゼイン生成が効率良くなされ、６−ヒドロキシダイゼインを基質としてＳ−エクオールを生成する本発明の製法を、より有利に行うことができる。
【００１４】
さらに、上記グリシテインが、大豆由来のイソフラボンであると、本発明の製法への適用により、安価にＳ−エクオールを生成することができる。
【００１５】
また、上記６−ヒドロキシダイゼインとともに、ダイゼインを基質とし、上記発酵を行うと、ダイゼインからもＳ−エクオールを生成することができ、Ｓ−エクオールの生成効率がより優れるようになる。
【００１６】
さらに、上記ダイゼインが、大豆由来のイソフラボンであると、本発明の製法への適用により、安価にＳ−エクオールを生成することができる。
【００１７】
なお、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８(Adlercreutzia equolifaciens KI0628 ,NITE P-527)は、本出願人が新たに発見した新規微生物であり、この菌株は、ダイゼイン、ジヒドロダイゼインおよび６−ヒドロキシダイゼインからなる群から選ばれた少なくとも一種のイソフラボンを資化してＳ−エクオールを産生する能力を有する。そのため、上記のように、本発明のＳ−エクオールの製法に有利に用いることができる。また、この菌株は、ダイゼインやジヒドロダイゼインのみを資化してＳ−エクオールを産生することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
つぎに、本発明の実施の形態について説明する。
【００１９】
本発明のＳ−エクオールの製法は、先に述べたように、６−ヒドロキシダイゼインを、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens) により発酵させて行うことを特徴としている。なお、上記発酵により、６−ヒドロキシダイゼインが直ちにＳ−エクオールに変換されるのではなく、下記の化学式で示されるエクオールの生成経路からも明らかなように、６−ヒドロキシダイゼインは、中間代謝物であるダイゼイン, ジヒドロダイゼイン（ＤＨＤ）を経て、Ｓ−エクオールに変換される。なお、本発明の製法により得られたエクオールがＳ体のエクオールであることは、例えば、クロマトグラムによる溶出時間の違いによって確認することができる。
【００２０】
【化１】
2010104241.tif 000002
【００２１】
また、本発明のＳ−エクオールの製法では、６−ヒドロキシダイゼインとともに、ダイゼイン, ジヒドロダイゼイン（ＤＨＤ）を基質として用いることもできる。特に、ダイゼインは、大豆中にもそのまま含まれているイソフラボンであり、また、市販品としての入手も容易であるため、上記６−ヒドロキシダイゼインとともにダイゼインを併用することにより、Ｓ−エクオールの生成をより有利に行うことができるようになる。なお、大豆中には、ダイゼインのほか、ダイゼインの配糖体も含まれるが、各種微生物や酵素を作用させることにより、上記配糖体から糖を外すことができ、これにより、上記配糖体を容易にダイゼインに変換することができる。このように、上記ダイゼインが、大豆由来のイソフラボンであると、本発明の製法への適用により、安価にＳ−エクオールを生成することができるため、好ましい。
【００２２】
ところで、本発明のＳ−エクオールの製法において基質として用いられる６−ヒドロキシダイゼインは、下記の化学式で示される生成経路からも明らかなように、グリシテインを変換することにより得ることができる。そして、この変換は、好ましくは、グリシテインを、ユーバクテリウム・リモサム(Eubacterium limosum) により発酵させることにより行われる。すなわち、ユーバクテリウム・リモサムは、グリシテインから効率良く６−ヒドロキシダイゼインを生成する能力を有することから、上記発酵により、６−ヒドロキシダイゼインを基質としてＳ−エクオールを生成する本発明の製法を、より有利に行うことができるようになる。
【００２３】
【化２】
2010104241.tif 000003
【００２４】
なお、上記グリシテインは、大豆中にそのまま含まれているイソフラボンであり、また、市販品としての入手も可能である。大豆中には、グリシテインのほか、グリシテインの配糖体も含まれるが、各種微生物や酵素を作用させることにより、上記配糖体から糖を外すことができ、これにより、上記配糖体を容易にグリシテインに変換することができる。このように、上記グリシテインが、大豆由来のイソフラボンであると、本発明の製法への適用により、安価にＳ−エクオールを生成することができるため、好ましい。
【００２５】
また、上記グリシテインおよびその配糖体から６−ヒドロキシダイゼインを生成する工程は、前記の６−ヒドロキシダイゼインからＳ−エクオールを生成する工程とは別に行うこともできるが、同一培地内で同時に行うことも可能である。また、これらの工程を別に行う場合、６−ヒドロキシダイゼインの生成後、その生成に用いた微生物を殺菌あるいは除去してから、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス、好ましくはアドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８(NITE P-527)を加えて培養することが好ましい。なお、アドレクラウチア・エクオーリファシエンスを加える前に、上記６−ヒドロキシダイゼインを抽出し、それを、上記Ｓ−エクオール生成の際の基質として用いることもできる。
【００２６】
本発明のＳ−エクオールの製法に用いられるアドレクラウチア・エクオーリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens) としては、例えば、本出願人が、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した菌株であるアドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８(Adlercreutzia equolifaciens KI0628 ,NITE P-527)、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６３４(Adlercreutzia equolifaciens KI0634 ,NITE P-528)、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＹＫ−１２(Adlercreutzia equolifaciens YK-12,NITE P-526)等が用いられる。なかでも、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８は、Ｓ−エクオール産性能が最も高いことから、この微生物を使用することにより、Ｓ−エクオールの生成効率がより優れるようになり、好ましい。
【００２７】
上記のアドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８から抽出したＤＮＡの、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、以下の通りである。
【００２８】
〔ＫＩ０６２８株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（塩基対：１４５８ｂｐ）〕
TGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATTAAGACGGCTTCGGYCGTGTATAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGACCAACCTGCCCCGCGCTCCGGGACAACCGCTGGAAACGGCGGCTAATACCGGATGCTCCGGGGAGGCCCCATGGCCTCCCCGGGAAAGCCCCGACGGCGCGGGATGGGGTCGCGGCCCATTAGGTAGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGCCCGCGATGGGTAGCCGGACTGAGAGGTCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGCGCAATGGGGGRAACCCTGACGCAGCAACGCCGCGTGCGGGACGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTCAGCAGGGAAGACATAGACGGTACCTGCAGAAGAAGCTCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCGAGCGTTATCCGGATTCATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCCGCCTAAGCGGAACCTCTAATCCCGGGGCTCAACCTCGGGCCGGGTTCCGGACTGGGCGGCTCGAGTGCGGTAGAGGCAGGCGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCGGGAAGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCTGCTGGGCCGCCACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCTGGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCCAGCCGTAAACGATGGACGCTAGGTGTGGGGGGACCATCCCCCCGTGCCGCAGCCAACGCATTAAGCGTCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATGCGAGTGAAGCCGCGGAGACGCGGTGGCCGAGAGGAGCTCGCGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCCGTCCCGTGTTGCCAGCATTGAGTTGGGGACTCGCGGGAGACTGCCGGCGTCAAGCCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGCCCTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCCACCCCGCGAGGGGGAGCGGATCCCGGAAAGCCGGTCCCAGTTCGGATCGCAGGCTGCAACCCGCCTGCGTGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACCCGAGTCGTCTGCACCCGAAGCCGCCGGCCGAACCCTTCTGGGGCGGAGGCGTCGAAGGTGTGGAGGGTAAGGGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGG
【００２９】
上記塩基配列を、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）の核酸データベースでＢＬＡＳＴプログラムを用いて相同性検索を行ったところ、ＫＩ０６２８株は、アドレクラウチア・エクオーリファシエンスの基準株であるアドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＦＪＣ−Ｂ９T (Adlercreutzia equolifaciens  FJC-B9T ,Accession No.AB306661）と９９. ８％の相同性を示す。また、核酸データベースより入手した、アドレクラウチア(Adlercreutzia) 属と相同性の高い、エガセラ(Eggerthella) 属、デニトロバクテリウム(Denitrobacterium)属、スラキア(Slackia) 属に属する菌種の各基準株の塩基配列を多重整列後、ＮＪ法により分子系統樹を作成したところ、ＫＩ０６２８株は、アドレクラウチア・エクオーリファシエンスの基準株と同じクラスターを形成し、エガセラ属、デニトロバクテリウム属、スラキア属とは別のクラスターを形成する。このような分子系統解析から、ＫＩ０６２８株はアドレクラウチア・エクオーリファシエンスに属するものと判断される。
【００３０】
また、ＫＩ０６２８株の分類学的性質は、以下に示すとおりである。
１．グラム陽性桿菌
２．カタラーゼ陰性
３．運動性なし
４．内生胞子なし
５．絶対嫌気性
６．至適発育温度：３７℃
７．至適発育ｐＨ：７. ０
８．糖分解性状：Ｌ−アラビノース    （−）
Ｄ−キシロース      （−）
Ｄ−グルコース      （−）
シュクロース        （−）
Ｌ−ラムノース      （−）
Ｄ−ラフィノース    （−）
Ｄ−マンニトール    （−）
インドール          （−）
ラクトース          （−）
マルトース          （−）
サリシン            （−）
ゼラチン            （−）
グリセリン          （−）
Ｄ−セロビオース    （−）
Ｄ−マンノース      （−）
Ｄ−メレチトース    （−）
Ｄ−トレハロース    （−）
【００３１】
なお、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６３４、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＹＫ−１２も、上記アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８と同様、ＤＮＡによる菌種の同定により、アドレクラウチア・エクオーリファシエンスに属するものであることが確認されている。
【００３２】
本発明のＳ−エクオールの製法は、例えば、つぎのようにして行うことができる。
【００３３】
すなわち、まず、一般的な嫌気性菌の培養に用いられる培地（例えば、Ｄｉｆｃｏ社製のＢＨＩ培地、日水盤薬社製のＧＡＭ培地等）を殺菌後、その培地に、６−ヒドロキシダイゼイン溶液を添加する。続いて、この培地にアドレクラウチア・エクオーリファシエンスを植菌し、３０〜５０℃で１〜１０日間嫌気的に培養して発酵を促した後、抽出を行うことにより、目的とするＳ−エクオールを生成することができる。
【００３４】
また、上記６−ヒドロキシダイゼイン溶液とともに、ダイゼイン溶液を添加し、上記発酵を行うと、Ｓ−エクオールの生成効率がより優れるようになる。
【００３５】
上記のようにして得られたＳ−エクオールは、医薬品ないしサプリメントとして提供する場合、その製剤化には、通常製剤化に用いられる各種の成分が使用され、例えば、デンプン、デキストリン、乳糖、コーンスターチ、無機塩類等が用いられる。
【００３６】
また、上記医薬品ないしサプリメントとして提供する際の剤型としては、例えば、アンプル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、輸液、ドリンク剤等があげられる。
【００３７】
さらに、上記のようにして得られたＳ−エクオールは、飲食品に添加することにより、飲食品に関与させた形態としても提供することができる。上記飲食品としては、例えば、健康食品、清涼飲料、お茶、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、パン、ケーキ、シュークリーム、ハム、ミートソース、カレー、シチュー、チーズ、バター、ドレッシング等があげられる。
【００３８】
なお、上記製法では、培地や基質等からＳ−エクオールの抽出を行っているが、最終製品である医薬品、サプリメント、飲食品等に、上記培地等が含まれていてもよい場合、前記アドレクラウチア・エクオーリファシエンスによる発酵後、その培地ごと上記最終製品の材料に用いることができる。また、上記製法では、効率良くＳ−エクオールを生成するため、実験に汎用される培地が用いられているが、上記のように培地ごと最終製品の材料に用いる場合、食用に適した材料（ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、無機塩類、ツイーン８０、牛乳、脱脂粉乳、豆乳、野菜ジュース、アミノ酸、糖質等。また、必要に応じて、ｐＨ調節剤、還元物質等）を用いることが好ましい。
【００３９】
つぎに、実施例について説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【００４０】
まず、実施例に先立ち、下記に示すように、基質溶液である６−ヒドロキシダイゼイン溶液およびダイゼイン溶液を調製した。
【００４１】
〔６−ヒドロキシダイゼイン溶液の調製〕
６−ヒドロキシダイゼイン（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製（フランス）、４’, ６, ７−トリヒドロキシイソフラボン）１．２ｍｇを、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液１．５ｍｌに溶解し、６−ヒドロキシダイゼイン溶液を調製した。
【００４２】
〔ダイゼイン溶液の調製〕
ダイゼイン（フジッコ社製（大豆由来））１．２ｍｇを、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液１．５ｍｌに溶解し、ダイゼイン溶液を調製した。
【実施例１】
【００４３】
Ｄｉｆｃｏ社製のＢＨＩ培地に０．０５％のシステイン塩酸塩を加えて殺菌し、培地（液体培地）を調製した。この培地１ｍｌに対し、上記調製の６−ヒドロキシダイゼイン溶液またはダイゼイン溶液５μｌを添加した後、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８(Adlercreutzia equolifaciens KI0628 ,NITE P-527)を植菌（生菌数：１×１０6 ）し、３７℃で３日間、アネロパックケンキ（三重ガス化学社製）を用いて嫌気的に培養した。上記培養により、培地中の基質（６−ヒドロキシダイゼインまたはダイゼイン）の発酵を促した後、上記培地に対し１．５倍量の酢酸エチルを加えて２回の抽出を行い、その酢酸エチル層を減圧遠心濃縮乾固した。このようにして得られた乾固物を、５０％アセトニトリル水溶液８ｍｌに溶解した。この溶液を試料とし、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）（ＡＰＩ−２０００、アプライドバイオシステムズ社製）による分析を行い、スタンダード溶液の分析結果より、上記試料１ｍｌ当たりに含まれる各代謝物量（ｎｇ／ｍｌ）（培地に添加した基質５００ｎｇに対し、その基質が上記発酵により変換された結果得られた各代謝物の量）を定量した。
【実施例２】
【００４４】
アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８に代えて、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６３４(Adlercreutzia equolifaciens KI0634 ,NITE P-528)を植菌した。それ以外は、実施例１と同様にして発酵を行い、試料１ｍｌ当たりに含まれる各代謝物量（ｎｇ／ｍｌ）を定量した。
【実施例３】
【００４５】
アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８に代えて、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＹＫ−１２(Adlercreutzia equolifaciens YK-12,NITE P-526)を植菌した。それ以外は、実施例１と同様にして発酵を行い、試料１ｍｌ当たりに含まれる各代謝物量（ｎｇ／ｍｌ）を定量した。
【００４６】
上記定量の結果、６−ヒドロキシダイゼインを基質として使用したときの各実施例の代謝物量は、下記の表１に示すとおりである。また、ダイゼインを基質として使用したときの各実施例の代謝物量は、下記の表２に示すとおりである。なお、表１および表２の値は、平均値（Ｎ＝２）±標準偏差で示す（但し、表１の実施例３のみ、Ｎ＝１）。また、表において「ＮＤ」と記したものは、検出されなかったもの（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ）を表す。
【００４７】
【表１】
2010104241.tif 000004
【００４８】
【表２】
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【００４９】
上記表１の結果より、６−ヒドロキシダイゼインを基質として使用した場合に、全ての実施例において、エクオールが生成されていることがわかる。特に、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６２８により発酵を行った実施例１では、そのエクオール生成量が極めて高いことがわかる。なお、最終生成物であるエクオールや、基質として残った６−ヒドロキシダイゼイン以外にも、エクオール生成までの中間代謝物であるダイゼイン, ジヒドロダイゼイン（ＤＨＤ）も検出されていることがわかる。
【００５０】
また、上記表２の結果より、ダイゼインを基質として使用した場合にも、全ての実施例において、エクオールが生成されていることがわかる。この場合、実施例１よりも、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス  ＫＩ０６３４により発酵を行った実施例２のほうが、エクオール生成量が高かった。
【００５１】
一方、各実施例において得られたエクオールがＳ体かＲ体かを調べるため、ダイセル化学工業社製のカラム（Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ−ＲＨ、４. ６ｍｍ×１５０ｍｍ）を使用した液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＭＲＭモード）（ＡＰＩ−２０００、アプライドバイオシステムズ社製）によるクロマトグラムにより、エクオールの溶出時間の違いをみた。
【００５２】
すなわち、図１は、実施例１において得られたエクオールを上記手法により分析したクロマトグラムである。また、図２は、実施例２において得られたエクオールを上記手法により分析したクロマトグラムである。また、図３は、実施例３において得られたエクオールを上記手法により分析したクロマトグラムである。
【００５３】
これに対し、図４は、Ｓ−エクオールの純品を上記手法により分析したクロマトグラムである。また、図５は、Ｒ−エクオールの純品を上記手法により分析したクロマトグラムである。
【００５４】
上記クロマトグラムの比較からも明らかなように、図４に示すＳ体のエクオールと、図５に示すＲ体エクオールとでは、溶出時間が若干違うことがわかる。この結果をもとに、図１〜図３のエクオールのピークをみたところ、図４に示すＳ体のエクオールと同じ溶出時間でピークがみられることがわかる。このことから、全ての実施例において得られたエクオールがＳ体であると判断することができる。
【００５５】
なお、上記実施例に使用の６−ヒドロキシダイゼインの試薬（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製、４’, ６, ７−トリヒドロキシイソフラボン）に代えて、大豆由来のグリシテインをユーバクテリウム・リモサム(Eubacterium limosum) により発酵させて得られた６−ヒドロキシダイゼインを用いた場合であっても、上記実施例と同様の結果が得られることを、実験により確認した。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の製法の一例により得られたエクオールを分析したクロマトグラムである。
【図２】本発明の製法の他の例により得られたエクオールを分析したクロマトグラムである。
【図３】本発明の製法の他の例により得られたエクオールを分析したクロマトグラムである。
【図４】Ｓ−エクオールの純品を分析したクロマトグラムである。
【図５】Ｒ−エクオールの純品を分析したクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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