(57)【要約】      （修正有）【課題】孔表面が化学的に変性されている生物適合性多孔質材料およびこのような材料の製造に関する。【解決手段】本多孔質材料は、その孔表面および外側表面がエポキシド基により修飾されている多孔質基礎材料から出発して、下記2工程で製造される：1)その外側表面のエポキシド基を、求核試薬と、次いで基礎支持体の孔を通過するには大き過ぎる粒径を有する粒子状触媒と反応させる；次いで2)この孔に残存するエポキシド基を反応させ、官能性リガンド、例えば分離エフェクターまたは（生体）触媒を導入することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性外側表面および官能性リガンドにより占拠されている孔表面を有し、下記反応工程によって得ることのできる多孔質材料：
a)多孔質基礎支持体中にエポキシド基を導入する工程であって、基礎支持体がエポキシド基を有していない場合、当該基礎支持体の孔表面および外側表面が修飾される、該工程；
b)塩を含有していない媒質中で、多孔質基礎支持体の平均孔径よりも大きい粒子サイズを有する粒子状触媒を用いて、求核試薬と反応させることによって、上記エポキシド基を触媒的に開環させる工程；
c)工程b)で残存する孔表面のエポキシド基を反応させ、官能性リガンドを導入する工程、ただし当該反応から脂肪族エステルは生成されない。
【請求項２】
多孔質基礎支持体が、粒子状材料である、請求項1に記載の材料。
【請求項３】
多孔質基礎支持体が、膜または布地である、請求項1に記載の材料。
【請求項４】
官能性リガンドとして、分離エフェクターが導入される、請求項1〜3のいずれかに記載の材料。
【請求項５】
官能性リガンドとして、触媒または生体触媒が導入される、請求項1〜3のいずれかに記載の材料。
【請求項６】
少なくとも2種の物質のクロマトグラフイによる分離における、請求項4に記載の多孔質材料の使用。
【請求項７】
液体流中の物質の（生）化学的反応における、請求項5に記載の多孔質材料の使用。
【請求項８】
請求項1〜5のいずれかに記載の多孔質材料の製造方法であって、下記操作工程を有する方法：
a)出発材料にまだ存在していない場合、エポキシド基を、多孔質基礎支持体に導入する工程；
b)塩を含有していない媒質中で、多孔質基礎支持体の平均孔径よりも大きい粒子サイズを有する粒子状触媒の存在下に、多孔質基礎支持体の外側表面で独占的に、上記エポキシド基を求核試薬と反応させる工程；
c)工程b)の後に孔表面に位置している残存エポキシド基を反応させ、官能性リガンドを導入する工程。
【請求項９】
少なくとも2種の物質のクロマトグラフイによる分離方法であって、請求項4に記載の多孔質材料を、吸着剤として使用することを特徴とする分離方法。
【請求項１０】
液体流中の物質を、（生）化学的に反応させる方法であって、この反応を、請求項5に記載の多孔質材料を用いて行うことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その多孔質表面が化学的に変性されている生物適合性多孔質材料およびこれらの材料の製造に関する。
この多孔質材料の外側表面は、電気的中性および親水性であり、他方その孔表面は、種々の官能性リガンドにより修飾されていることができる。
多孔質材料、例えばクロマトグラフイ用吸着剤、中空繊維および膜などは、広範に、また種々の方法で、複雑な生物学的液体、例えば血液、血漿、発酵ブロス、細胞培養上澄み液または組織ホモジネートからの成分の分析、精製および分離に使用されている。これにはまた、有毒または病原性血液成分を分離する場合などの血液の生体外精製が包含される。
【０００２】
これらの材料の選択性は、主としてサイズ排除メカニズムに基づいており、このメカニズムは、適当な孔径により特定される。しかしながら、その表面が官能性リガンド（例えば、分離エフェクター、この場合、リガンドは分配相を構成する）によりさらに修飾されている多孔質材料にはまた、広範な用途が見出される。これらの例には、クロマトグラフイ用支持材料およびイオン交換または逆相物性を有する膜がある。触媒または生体触媒（例えば、酵素またはリボザイム）を官能性リガンドとして不動化する場合、例えば有毒成分を分解することができるか、または解毒することができる触媒的に活性な多孔質材料を調製する。
その表面が官能性リガンド、例えばイオン交換性または疎水性アルキル基などの分離エフェクターなどにより修飾されている多孔質材料と接触させると、細胞構成成分、蛋白質および／または核酸の非特異性吸着および／または変性が、これらの巨大分子を自由に横切ることができる多孔質材料の外側表面（接触表面）でまた生じる。
【０００３】
これは、望ましくないキャパシテイおよび選択性の損失を導き、またこの種の材料を充填分離カラムで、または濾過装置の膜として使用する場合、不可逆的圧力増加を導く。
この生物不適合性は、多孔質材料を医療、診断および臨床治療目的に使用する場合、はるかに格別な重要性を有する。すなわち、例えば多孔質材料を用いる急性または慢性治療法[W.Samtleben、T.Bosch、B.Schmidt、H.J.Gurland,Int.J.Artif.Organs,12(1989)、61〜65] は、免疫原性反応を生じさせないものでなければならず、また凝血カスケードおよび補体系の表面−媒介接触活性化を導かないものでなければならない。H.KlinkmannおよびD.Falkenhagenは、治療目的用の多孔質材料の生物−および血液−適合性にかかわる概説を示した(Adv.Med.Biol.,260(1989),39〜52) 。
【０００４】
記載されている例は、一方で、官能性リガンド（例えば、分配相）により修飾されており、これにより標的成分の選択的吸着または結合が得られるが、他方で、生物学的液体の、または生物学的液体による望ましくない吸着および／または変性を排除する生物適合性外側表面を有する多孔質材料は存在していないことを示している。
従って、本発明は、その多孔質表面が官能性リガンドにより占拠されており、また外側表面が電気的中性で親水性の物性を有する多孔質材料およびこれらの材料の製造方法を提供するという目的に基いていた。
生物適合性外側表面は、（生）化学的に不活性であり、電気的に中性であり、また水性媒質により湿潤可能（親水性）でなければならない。しかしながら、その孔の内部表面は、種々の官能性リガンドにより修飾されていなければならない。ジオール修飾支持体は、（生）化学的に不活性である親水性材料として適することが証明されている。従って、多孔質材料の外側表面の選択された化学的修飾は、粒状触媒の補助下に反応して、隣接するジオール基を生成させるか、または別の親水性基を生成させることができる反応性基であった。
【０００５】
DE 41 30 475 A1 およびJ.Haginaka等(Anal.Chem.,61(1989),2445〜2448) は、多孔質吸着材料の化学酵素的製造方法を開示しており、この材料は、その大きい方の孔のジオール修飾表面（および粒子の外側表面）を有しており、またその小さい方の孔は、疎水性に誘導体化されている。しかしながら、これらの刊行物に記載されている方法による場合、疎水性不活性孔表面を有する材料が得られるのみである；換言すれば、これらの材料は、独占的に、分析用クロマトクラフ目的用であることが記載されている。これらの方法のもう一つの欠点は、それらの制限された基質特異性およびサイズと組合わされている酵素の使用、多工程合成法および労力を要する精製工程にある。
【０００６】
Kimata等は、アルキルシリル化シリカゲルの部分的酸−触媒加水分解に基く合成経路を開示している[J.Chromatogr.,515(1990),73〜84] 。その外側表面上に位置しているアルキル基は、市販の逆相(RF)シリカゲルに対する濃塩酸の作用により、元から存在するシラノール基の生成を伴い、好ましく加水分解される（著者によれば）。後者を次いで、3-グリシドキシプロピルシランと反応させ、次いでそのエポキシド基をジオール基に加水分解させる。このようにして、ジオール置換された外側表面が得られる。しかしながら、この純粋に化学的な多工程法は、加水分解がシラン化されたシリカゲルに限られるという欠点を有し、制御および再現が困難であり、またその上、その孔構造がさらに変更される。
【０００７】
WO 94/09 063は、結果として、大きい方の孔の内部表面が、DE 41 30 475の方法に類似する方法で親水性に修飾されており、他方で、小さい方の孔の内部表面が、エポキシド基の反応により疎水性に修飾されている方法を開示している。従って、開示されている方法は、その孔が相違して変更されている種々の孔を有する多孔質材料をもたらす。孔サイズ間の差は、触媒としてポリマー状高分子量スルホン酸誘導体を用いることによってもたらされる。その製法の結果として、粒子の孔の幅およびポリマー状触媒の分子サイズの両方が著しく散乱した幅を有することから、分布曲線の重複による望ましくない反応が生じる。すなわち、一例として、WO 94/09 063に記載の方法による場合、当該粒子の外側表面のみを親水性に誘導することは、難なく行うことはできない。
【０００８】
従って、本発明は、簡単で、また再現可能な方法で、すなわち基礎材料の化学的性質とは独立して、多孔質材料の望ましい生物適合性外側表面を生じさせることができ、またさらに、均一に修飾されている内部表面を利用できるようにするとともに、当該多孔質材料の外側表面を排他的に親水性に変性する方法を提供するという目的に基いていた。多孔質材料の意図する用途に応じて、種々の官能性リガンドを孔内部表面に組み入れることができたならば、有利である。
WO 94/09 063で使用されているポリマー触媒を、溶媒和された形態で溶液中に存在させる。驚くべきことに、粒状触媒を用いることによって、多孔質材料の外側表面を特異的に反応させることができることが見出された。この場合、触媒の粒径は、多孔質材料の孔幅よりも顕著に大きくなければならない。
【０００９】
本発明は、親水性外側表面および官能性リガンドにより占拠されている孔表面を有し、また下記反応工程によって得られる多孔質材料に関する：
a)多孔質基礎支持体中にエポキシド基を導入する工程；基礎支持体がエポキシド基を有していない場合、当該基礎支持体の孔表面および外側表面が修飾される；  b)多孔質基礎支持体の平均孔径よりも大きい粒子サイズを有する粒子状触媒を用いる求核試薬との反応によって、エポキシド基を触媒的に開環する工程；
c)工程b)において残存する孔表面のエポキシド基を反応させ、官能性リガンドの導入する工程。
本発明はまた、これらの多孔質材料の製造方法およびそれらの使用に関する。  
【００１０】
本発明の実施に適する多孔質基礎材料は、多数が公知であり、また市販されている。これらには、粒子状基礎支持体および非粒子状基礎支持体の両方が包含される。非粒子状基礎支持体は、例えば平坦な膜または中空繊維膜などの膜、もしくは布地である。適当な多孔質基礎支持体は、無機材料、例えば多孔質ガラス(CRC) または SiO２などのオキサイド材料、または有機材料、例えばグリシジルメタアクリレートとエチレンジメタアクリレートとのコポリマー、またはジヒドロキシプロピルメタアクリレートとエチレンジメタアクリレートとのコポリマーなどの架橋ポリマーのどちらかからなることができる。この種の基礎支持体は、グリシジルメタアクリレートとエチレンジメタアクリレートとのコポリマーの場合のように、エポキシド基をすでに含有している。しかしながら、当業者に公知の反応に従い、例えば多孔質基礎支持体を3-グリシドキシプロピルシランによりシラン化することによって、またはジヒドロキシプロピルメタアクリレートとエチレンジメタアクリレートとのコポリマーをエピクロロヒドリンと反応させることによって、多孔質基礎支持体にエポキシド基を導入することもできる。
【００１１】
エポキシド基との反応に適し、この方法で親水性基を導入するのに適する求核試薬は、当業者にとって公知である。これらには、水、一価または多価アルコール（この場合、ヒドロキシル基を、アミノまたはチオール基と置き換えることができる）、例えばエチレングリコール、グリセロール、ペンタエリスリトール、2-アミノエタノール、2-アミノ-1,3- プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン(TRIS)、または4-アミノ-4-(3-ヒドロキシプロピル)-1,7-ペプタンジオールがある。もう一種の適当な求核試薬には、親水性ヘテロ環状誘導体、例えば3-アミノ-1-ヒドロキシ-2-ピロリドンがある。
【００１２】
本発明に従い用いられる粒子状触媒は、これらが、その表面がイオン交換性リガンドにより修飾されている（水−不溶性）多孔質または無孔質支持体からなるという特徴を有する。使用される触媒支持体は、ケイ酸塩含有材料、例えばシリカゲルまたはガラス類であることができる。架橋した天然または合成ポリマーまたはコポリマー、例えば架橋スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーまたは多糖類、例えば架橋セルロースまたはアガロースの粒子もまた、適している。磁化可能な添加物を含有する組合わせ触媒支持体もまた、特に適している。適当な材料は、多数が市場から入手することができる。イオン交換性基が出発材料にすでに存在していない場合、触媒支持体を、公知方法に従って反応させ、適当なイオン交換体を得ることができる。使用することができるイオン交換性基は、弱酸性または強酸性物性を有する基、例えばカルボン酸基もしくはスルホン酸基、または弱塩基性または強塩基性物性を有する基、例えばジメチルアミノエチル(DEAE)もしくはジエチル-(2-ヒドロキシプロピル) アミノエチル(QAE) 基、Ｈ+ 形態で存在するカチオン交換性基、およびＯＨ- 形態で存在するアニオン交換性基である。
【００１３】
磁性触媒粒子は、磁場を用いることによる簡単な方法で、反応混合物から分離することができる。
多孔質基礎支持体の平均孔径およびその孔サイズ分布は、本発明に従い使用される粒子状触媒の粒子サイズを決定する。触媒粒子が、基礎支持体の孔中に侵入できないためには、それらの粒径は、充分に大きくなければならない；このためには、使用される粒子状触媒の（最小）径は、多孔質基礎支持体の（平均）孔径よりも大きくなければならない。このことは、多孔質基礎支持体の孔径の分布曲線と粒子状触媒の粒子サイズとが、重複していないか、または僅かにのみ重複していなければならない。実際に用途において、両方の分布曲線の重複領域が、それぞれ100%に標準化して、分布曲線の10%よりも小さい、特に5%よりも小さいようにする。
【００１４】
多孔質基礎支持体の孔と粒子状触媒の粒子サイズとの大きさ比率にかかわる上記周辺条件が堅持されている場合、本発明による方法を用いて、その外側表面が親水性に変性されており、またその孔内部表面が官能性リガンドにより均一に修飾されている多孔質材料を得ることができる。
本発明に従う粒子状触媒を用いることによる、多孔質基礎支持体の外側表面上のエポキシド基の反応は、塩を含有していない（二重蒸留した）水、または適当な場合、水−混和性有機溶媒、好ましくはイソプロパノール(10%v/v)中で生起する。
本発明による多孔質材料の孔内部表面は、官能性リガンドにより覆われている。官能性リガンドの用語は、例えば分離エフェクター、もしくは別様には、触媒または酵素を意味するものと理解する。
分離エフェクターは、クロマトグラフイ分離または液−液分配などの他の分配法に使用することができる特異的相互反応をもたらす。
【００１５】
孔に存在するエポキシド基は、さらに反応させることができ、また分離エフェクターを導入することができ、これによりイオン交換体、親イオウ性吸着剤または金属キレートまたは疎水性クロマトグラフイおよびアフィニティクロマトグラフイ用の吸着剤、およびまたキラル分離用の吸着剤を提供することができる。この場合、例えばリン酸、アンモニア、ジエチルアミン、トリメチルアミン、亜硫酸または別種の錯化剤、例えばイミノジ酢酸、またはキラル化合物、例えば蛋白質、ペプチドまたは多糖類誘導体を、オキシラン環に付加することができる；この種の反応の例には、下記の反応がある：
a)親イオウ性吸着剤および金属キレートクロマトグラフイ用吸着剤の製造、例えばDE 43 10 964(EP 0 563 978)に記載のアフィニティ支持体の製造。
b)DE 43 33 674(WO 95/09 964)およびDE 43 33 821(WO 95/09 695)に記載のような、イオン交換体を製造することができる反応。
c)DE 43 23 913(WO 95/02 820)に記載のような、疎水性相互反応クロマトグラフイ用吸着剤。
【００１６】
各種吸着剤の製造およびそれらの使用にかかわる詳細は、上記刊行物に見出すことができる。これらの刊行物の関連記載を、引用して本明細書に組み入れる。上記および後記で挙げられている全部の出願書、特許および刊行物の完全記述および1997年9月29日付けで出願された、相当する出願書、DE 197 42 853.3の完全記述を、引用して本明細書に組み入れる。
さらに詳細に説明しなくても、当業者は、上記記載を最も広い可能な範囲で利用することができるものと見做される。しかしながら、好適態様および例は、説明のためのみのものであり、いずれの様相でも制限する記載と見做されるべきではない。
【００１７】
製造例
下記例は、本発明をさらに詳細に説明しようとするものであり、本発明の概念を制限するものではない。下記例において、室温は、15〜25℃を表わす。反応生成物は、ガラス吸引フィルター(GF2)で濾過することによって単離し、次いで洗浄する。
例1 
ヒドロキシル基を含有する基礎支持体中への反応性オキシラン基の導入
多孔質有機コポリマー支持体  TSK HW 40 C(Merck KGaA：粒径：約30〜60μm ；孔径：約6nm ）1 重量部（乾燥重量）を、二重蒸留水4 重量部中に懸濁し、次いで1-クロロ-2,3- エポキシプロパン1.1 重量部で処理する。このエポキシド化は、一定のｐＨ(9.0)において撹拌しながら45℃で4時間の期間にわたり進行させる。このエポキシド化されたゲルを、吸引により濾別し、次いで塩を含有しなくなるまで、二重蒸留水4重量部、メタノール4重量部および二重蒸留水4重量部により順次洗浄し、次いで減圧において40〜50℃で乾燥させる。
【００１８】
例2 
多孔質支持体材料の外側表面上の反応性オキシラン基の反応
例1 からのエポキシド化されたコポリマー支持体1重量部を、二重蒸留水15重量部中に懸濁し、次いで本発明による粒子状触媒［スルホネート化された無孔質ラテックス微小球体；粒径：1μm；ポリビーズ  サルフェート(Polybead Sulfate)（登録商品名），Polysciences,Inc.,Warrington,PA,USA]の2.5重量パーセント水性懸濁液1重量部で処理し、次いでＲＴで20時間、撹拌する。
その使用以前に、この粒子状触媒を、0.1 Ｎ塩酸を用いて対応するＨ+ 形態に変換する。この反応剤を次いで、塩を含有しなくなるまで、二重蒸留水で洗浄する。この粒子状触媒の回収は、コンディショニングの後、または洗浄工程の前後に、遠心分離または濾過により行う。
【００１９】
反応が生じた後、使用した粒子状触媒は、相当する孔度を有するフィルターを用いる濾過により、変性された支持体材料から分離する。本例において、このフィルターは、孔度2を有する焼結ガラスフリットである。この方法で回収された粒子状触媒は、コンディショニングおよび引き続く二重蒸留水による洗浄の後、再使用することができる。
固相反応剤により加水分解されたエポキシド基を、当業者に公知のチオ硫酸Ｎａを用いる滴定によって定量し、出発材料のエポキシド基の5%または20μmol/ 乾燥重量ｇを得た。
【００２０】
例3 
孔内部に残存する反応性オキシラン基とタウリン（アミノエタンスルホン酸）との反応
アミノエタンスルホン酸0.2重量部を、二重蒸留水10重量部中に溶解し、次いでそのｐＨを、水酸化ナトリウム溶液(10M)を用いてｐＨ11に調整し、この混合物を撹拌しながら、例2に従い製造された支持材料1重量部で処理する。反応は、50℃で48時間にわたり生じさせる。得られたゲルを、吸引しながら濾別し、次いでそれぞれ二重蒸留10重量部およびメタノール4重量部により順次2回洗浄し、次いで減圧において40〜50℃で乾燥させる。
その外側表面がジオール基により親水性に被覆されており、またその孔に、強酸性のイオン交換基を有する多孔質材料が得られる；このようにして得られた多孔質材料は、イオン交換体として使用することができる。
【００２１】
例4 
孔の内部に残存する反応性オキシラン基とm-アミノフェニルボロン酸との反応  タウリンの代わりに、m-アミノフェニルボロン酸を用いて、例3を反復する。その外側表面がジオール基により親水性に被覆されており、またその孔に、アフィニティリガンドを有する多孔質材料が得られる；このようにして得られた多孔質材料は、アフィニティ支持体として、例えば炭水化物−含有化合物の分離に使用することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月31日(2009.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性外側表面および官能性リガンドにより占拠されている孔表面を有し、下記反応工程によって得ることのできる多孔質材料：
a)多孔質基礎支持体中にエポキシド基を導入する工程であって、基礎支持体がエポキシド基を有していない場合、当該基礎支持体の孔表面および外側表面が修飾される、該工程；
b)塩を含有していない媒質中で、多孔質基礎支持体の平均孔径よりも大きい粒子サイズを有する粒子状触媒を用いて、求核試薬と反応させることによって、上記エポキシド基を触媒的に開環させる工程；
c)工程b)で残存する孔表面のエポキシド基を反応させ、官能性リガンドを導入する工程、ただし当該反応から脂肪族エステルは生成されない。