(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫グロブリンに対する改善された結合特異性を有する修飾された免疫グロブリン結合タンパク質の提供。【解決手段】ブドウ球菌プロテインＡの１つ又はそれ以上の単離されたＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺドメインを含み、前記１つ又はそれ以上の単離されたドメインが、（ｉ）ドメインがＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ若しくはＣドメインである場合には、アラニン若しくはトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換された、少なくとも２９位のグリシン残基、又は（ｉｉ）ドメインがＺドメインである場合には、グリシン又はトリプトファン以外のアミノ酸で置換された、少なくとも２９位のアラニンを含む単離された免疫グロブリン結合タンパク質であって、前記免疫グロブリン結合タンパク質は免疫グロブリンのＦｃ部分を結合するが、免疫グロブリンのＦａｂ部分への低下した結合を示す免疫グロブリン結合タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブドウ球菌プロテインＡの１つ又はそれ以上の単離されたＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺドメインを含み、前記１つ又はそれ以上の単離されたドメインが、（ｉ）ドメインがＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ若しくはＣドメインである場合には、アラニン若しくはトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換された、少なくとも２９位のグリシン残基、又は（ｉｉ）ドメインがＺドメインである場合には、グリシン又はトリプトファン以外のアミノ酸で置換された、少なくとも２９位のアラニンを含む単離された免疫グロブリン結合タンパク質であって、前記免疫グロブリン結合タンパク質は免疫グロブリンのＦｃ部分を結合するが、２９位にアラニン又はグリシンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への低下した結合を示す、前記単離された免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項２】
アラニン、グリシン又はトリプトファン以外のアミノ酸残基がロイシン、リジン及びアルギニンからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項３】
少なくとも２９位のグリシン残基がアラニン、トリプトファン及びトレオニン以外のアミノ酸残基で置換されており、又は少なくとも２９位のアラニンがグリシン、トリプトファン及びトレオニン以外のアミノ酸で置換されている、請求項１に記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項４】
少なくとも２９位のグリシン残基又は２９位のアラニンが、リジン、アルギニン、ロイシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、バリン及びチロシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項１に記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項５】
ブドウ球菌プロテインＡのカルボキシ末端領域の少なくとも一部をさらに含む、請求項１に記載の単離された免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項６】
固体支持体へ連結された、請求項１に記載の単離された免疫グロブリン結合タンパク質を含むクロマトグラフィーマトリックス。
【請求項７】
請求項１に記載の免疫グロブリン結合タンパク質を含むポリペプチドのライブラリー。
【請求項８】
１つ又はそれ以上の単離されたドメイン中に、別のアミノ酸残基でのアスパラギンの置換をさらに含む、請求項１に記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項９】
前記アスパラギンが２３位に存在する、請求項８に記載の免疫グロブリン結合タンパク質
【請求項１０】
免疫グロブリンがＩｇＧ又はその断片である、請求項１に記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１に記載の免疫グロブリン結合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１３】
（ａ）１つ又はそれ以上の免疫グロブリンを含む試料を準備する工程；
（ｂ）前記１つ又はそれ以上の免疫グロブリンがマトリックスに結合するような条件下で、請求項６に記載のマトリックスと試料を接触する工程；及び
（ｃ）適切な条件下で溶出することによって、１つ又はそれ以上の結合された免疫グロブリンを回収する工程；
を含む、試料から１つ又はそれ以上の免疫グロブリンをアフィニティー精製する方法。
【請求項１４】
ブドウ球菌プロテインＡの１つ又はそれ以上の単離されたＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺドメインを含み、前記１つ又はそれ以上の単離されたドメインは、（ｉ）ドメインがＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ若しくはＣドメインである場合には、アラニン以外のアミノ酸残基で置換された、少なくとも２９位のグリシン残基を、又は（ｉｉ）ドメインがＺドメインである場合には、グリシン以外のアミノ酸で置換された、少なくとも２９位のアラニンを含む単離された免疫グロブリン結合タンパク質であって、該免疫グロブリン結合タンパク質は免疫グロブリンのＦｃ部分を結合し、及び２９位にアラニンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への増加した結合を示す、前記単離された免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項１５】
少なくとも２９位のグリシン又は２９位のアラニンがトレオニン又はトリプトファンで置換されている、請求項１４に記載の単離された免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項１６】
固体支持体へ連結された、請求項１４に記載の単離された免疫グロブリン結合タンパク質を含むクロマトグラフィーマトリックス。
【請求項１７】
（ａ）１つ又はそれ以上の免疫グロブリンを含む試料を準備する工程；
（ｂ）前記１つ又はそれ以上の免疫グロブリンがマトリックスに結合するような条件下で、請求項１６に記載のマトリックスと試料を接触する工程；及び
（ｃ）適切な条件下で溶出することによって、１つ又はそれ以上の結合された免疫グロブリンを回収する工程；
を含む、試料から１つ又はそれ以上の免疫グロブリンをアフィニティー精製する方法。
【請求項１８】
免疫グロブリンがＩｇＧ、ＩｇＡ若しくはＩｇＭ又はこれらの断片からなる群から選択される、請求項１４に記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
【請求項１９】
免疫グロブリンのＦｃ部分がＦｃ融合タンパク質の一部である、請求項１に記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年８月１１日に出願された米国仮特許出願６１／１８８，５４９号および２００９年４月１６日に出願された米国仮特許出願６１／２１２，８１２号（これらの各々の内容全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、免疫グロブリンに対して改善された結合特異性を有する、修飾された免疫グロブリン結合タンパク質、例えば、ブドウ球菌プロテインＡ、並びにこれを製造及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）は、細菌スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の４２ｋＤａのマルチドメインタンパク質である。ＳｐＡは、そのカルボキシ末端細胞壁結合領域（Ｘドメインと称される。）を介して、細菌の細胞壁へ結合されている。ＳｐＡは、アミノ末端領域に、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣと称される５つの免疫グロブリン結合ドメインを含む（Ｓｊｏｄｈａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｅｐ；７８（２）：４７１−９０（１９７７）；Ｕｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．Ｆｅｂ  １０；２５９（３）：１６９５−７０２（１９８４））。これらのドメインの各々は、約５８アミノ酸残基を含有し、６５から９０％のアミノ酸配列同一性を共有する。ＳｐＡのＺドメインは、ＳｐＡのＢドメインの加工された類縁体であり、２９位のグリシン残基の代わりにアラニンを含む。
【０００４】
ＳｐＡをベースとする試薬には、バイオテクノロジーの分野において、例えば、抗体の捕捉及び精製用のアフィニティークロマトグラフィーにおいて並びに抗体検出法において幅広い用途が見出されている。現在、ＳｐＡをベースとするアフィニティー媒体は、おそらく、モノクローナル抗体及びその断片を細胞培養物などの様々な試料から単離するために最も幅広く使用されているアフィニティー媒体である。従って、例えば、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）−ｖＡＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙ、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）−ｖＡＵｌｔｒａ及びＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）ＵｌｔｒａＰｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びプロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＸｔｒａＴＭ及びＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（Ｒ）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの、プロテインＡリガンドを含む様々なマトリックスが市販されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｊｏｄｈａｌ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｅｐ、７８（２）、１９７７年、ｐｐ．４７１−９０
【非特許文献２】Ｕｈｌｅｎ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２５９（３）、１９８４年２月１０日、ｐｐ．１６９５−７０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、少なくとも１つには、免疫グロブリンのＦｃ部分を結合する能力を保持しながら、以前に公知のＳｐＡ変異物と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への減少した又は増加した結合を示す新規及び改善されたＳｐＡ変異物を提供する。
【０００７】
幾つかの実施形態において、本発明は、Ｆａｂを結合する（時折、望ましくない特性）、プロテインＡをベースとする多くの市販の試薬と比べて、低減したＦａｂ結合を示す、新規及び改善されたＳｐＡ変異物を提供する。
【０００８】
一実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合ドメインは、少なくとも２９位のアミノ酸を置換するために修飾されたＳｐＡの１つ又はそれ以上のドメイン（すなわち、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＺ）を基礎としている。ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣの場合には、２９位のアミノ酸はグリシンであり、アラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸で置換されている。ドメインＺの場合には、２９位のアミノ酸はアラニンであり、グリシン又はトリプトファン以外のアミノ酸で置換されている。特定の実施形態において、２９位のグリシンは、アラニン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸で置換されており、又は２９位のアラニンはグリシン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸で置換されている。
【０００９】
従って、一実施形態において、少なくとも２９位のグリシン残基がアラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されているＳｐＡの少なくともＥドメインを含む単離された免疫グロブリン結合タンパク質（該免疫グロブリン結合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分への結合を示すが、２９位にアラニン又はグリシンの何れかを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への低下した結合を示す。）が提供される。特定の実施形態において、Ｅドメインの２９位のグリシン残基は、アラニン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されている。
【００１０】
別の実施形態において、少なくとも２９位のグリシン残基がアラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されているＳｐＡの少なくともＤドメインを含む単離された免疫グロブリン結合タンパク質（該免疫グロブリン結合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分への結合を示すが、２９位にアラニン又はグリシンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への低下した結合を示す。）が提供される。特定の実施形態において、Ｄドメインの２９位のグリシン残基は、アラニン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されている。
【００１１】
さらに別の実施形態において、少なくとも２９位のグリシン残基がアラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されているＳｐＡの少なくともＡドメインを含む単離された免疫グロブリン結合タンパク質（該免疫グロブリン結合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分への結合を示すが、２９位にアラニン又はグリシンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への低下した結合を示す。）が提供される。特定の実施形態において、Ａドメインの２９位のグリシン残基は、アラニン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されている。
【００１２】
別の実施形態において、少なくとも２９位のグリシン残基がアラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されているＳｐＡの少なくともＢドメインを含む単離された免疫グロブリン結合タンパク質（該免疫グロブリン結合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分への結合を示すが、２９位にアラニン又はグリシンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への低下した結合を示す。）が提供される。特定の実施形態において、Ｂドメインの２９位のグリシン残基は、アラニン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されている。
【００１３】
さらに別の実施形態において、少なくとも２９位のグリシン残基がアラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されているＳｐＡの少なくともＣドメインを含む単離された免疫グロブリン結合タンパク質（該免疫グロブリン結合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分への結合を示すが、２９位にアラニン又はグリシンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への低下した結合を示す。）が提供される。特定の実施形態において、Ｃドメインの２９位のグリシン残基は、アラニン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されている。
【００１４】
別の実施形態において、少なくとも２９位のアラニン残基がグリシン又はトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されているＳｐＡの少なくともＺドメインを少なくとも含む単離された免疫グロブリン結合タンパク質（該免疫グロブリン結合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分への結合を示すが、２９位にアラニン又はグリシンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への低下した結合を示す。）が提供される。特定の実施形態において、Ｚドメインの２９位のアラニン残基は、グリシン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されている。
【００１５】
幾つかの実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、２以上の修飾されたＳｐＡドメイン又はその公知の変異物（例えば、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ及び／又はＺ並びにこれらのあらゆる組み合わせの２以上）を含み、各ドメインは別のアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン又はトリプトファン以外のアミノ酸で置換された２９位のグリシン（すなわち、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインの場合）又はアラニン（すなわち、Ｚドメインの場合）を含む。特定の実施形態において、２９位のグリシン又はアラニンは、アラニン、グリシン、トリプトファン及びトレオニン以外のアミノ酸で置換されている。
【００１６】
幾つかの実施形態において、単離されたＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインの１つ若しくはそれ以上の中の２９位のグリシン（Ｇ）又は単離されたＺドメイン中の２９位のアラニンは、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はこれらの機能的変異物若しくは誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、１つ又はそれ以上の単離されたＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺドメインを含み、前記１つ又はそれ以上の単離されたドメインは、ロイシン、リジン及びアルギニン又はこれらの機能的変異物若しくは誘導体からなる群から選択されるアミノ酸残基で置換された２９位のグリシン残基（例えば、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインの場合）又は２９位のアラニン（例えば、Ｚドメインの場合）を含む。
【００１８】
さらなる実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、ＳｐＡのカルボキシ末端領域（Ｘドメインと表記される。）の少なくとも一部をさらに含む。
【００１９】
幾つかの実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、別のアミノ酸で置換された（例えば、２３位の）アスパラギンをさらに含む。
【００２０】
別の実施形態において、ブドウ球菌プロテインＡの１つ又はそれ以上の単離されたＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺドメインを含み、前記１つ又はそれ以上の単離されたドメインは、（ｉ）ドメインがＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ若しくはＣドメインである場合には、アラニン以外のアミノ酸残基で置換された、少なくとも２９位のグリシン残基、又は（ｉｉ）ドメインがＺドメインである場合には、グリシン以外のアミノ酸で置換された、少なくとも２９位のアラニンを含む、単離された免疫グロブリン結合タンパク質（該免疫グロブリン結合タンパク質は免疫グロブリンのＦｃ部分を結合し、及び２９位にアラニンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への増加した結合を示す。）が提供される。
【００２１】
幾つかの実施形態において、本発明の単離された免疫グロブリン結合タンパク質は、２９位にトレオニン又はトリプトファンを含み、前記免疫グロブリン結合タンパク質は免疫グロブリンのＦｃ部分を結合し、及び２９位にアラニンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分への増加した結合を示す。幾つかの実施形態において、Ｆｃ部分はＦｃ融合タンパク質の一部であり得る。
【００２２】
本明細書に記載されている様々な免疫グロブリン結合タンパク質によって結合され得る免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭの１つ又はそれ以上を含む。
【００２３】
他の実施形態において、免疫グロブリン又は抗体の単離のために有用なクロマトグラフィーマトリックスが提供される。一実施形態において、本発明のクロマトグラフィーマトリックスは、固体支持体に結合された、本明細書中に記載されている単離された免疫グロブリン結合タンパク質を含む。
【００２４】
本明細書に記載されている様々な免疫グロブリン結合タンパク質をコードする核酸分子及びこのような核酸分子を含む宿主細胞も本明細書において提供される。幾つかの実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。
【００２５】
さらに、本発明は、本明細書に記載されている１つ又はそれ以上の免疫グロブリン結合タンパク質及びその機能的変異物を含むポリペプチドのライブラリーを包含する。さらに別の実施形態において、本発明は、本発明によって包含される１つ若しくはそれ以上の免疫グロブリン結合タンパク質をコードするか又はその機能的変異物をコードする核酸分子のライブラリーを提供する。
【００２６】
本明細書に記載されている免疫グロブリン結合タンパク質を使用する方法も、本明細書において提供される。幾つかの実施形態において、（ａ）１つ又はそれ以上の免疫グロブリンを含む試料を準備する工程と、（ｂ）前記１つ又はそれ以上の免疫グロブリンが、免疫グロブリン結合タンパク質を含むクロマトグラフィーマトリックスに結合するような条件下で、本明細書に記載されているように、前記クロマトグラフィーマトリックスと前記試料を接触させる工程と、及び適切なｐＨで溶出することによって、前記１つ又はそれ以上の結合された免疫グロブリンを回収する工程とを含む、１つ又はそれ以上の免疫グロブリンを試料からアフィニティー精製する方法が提供される。
【００２７】
本明細書中に記載されている様々な実施形態において、１つ又はそれ以上の結合された免疫グロブリンが溶出される適切なｐＨは酸性ｐＨである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、配列番号１から５によって表される、ＳｐＡの野生型（ｗｔ）ＩｇＧ結合ドメインに対する核酸配列を図示している。配列番号１は、ｗｔＥドメインに対する核酸配列を表す。配列番号２は、ｗｔＤドメインに対する核酸配列を表す。配列番号３は、ｗｔＡドメインに対する核酸配列を表す。配列番号４は、ｗｔＢドメインに対する核酸配列を表す。配列番号５は、ｗｔＣドメインに対する核酸配列を表す。
【図２】図２は、配列番号６によって表される、ＳｐＡのＺドメインに対する核酸配列を図示する。
【図３】図３は、２９位にグリシンを含むＳｐＡの野生型（ｗｔ）ＩｇＧ結合ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣ）のアミノ酸配列並置を図示する。配列番号７は、ｗｔＥドメインのアミノ酸配列を表し、配列番号８は、ｗｔＤドメインのアミノ酸配列を表し、配列番号９は、ｗｔＡドメインのアミノ酸配列を表し、配列番号１０は、ｗｔＢドメインのアミノ酸配列を表し、及び配列番号１１は、ｗｔＣドメインのアミノ酸配列を表す。
【図４】図４は、配列番号１２によって表されるＺドメインのアミノ酸配列を図示する。
【図５】図５は、プラスミドｐＪ５６：８６２０の模式図を表す。
【図６】図６は、２９位のグリシンがロイシン、リジン又はアルギニンによって置換されている３つのＳｐＡＢドメイン変異体に対する核酸配列を図示する。配列番号１３は、ＳｐＡ変異体Ｇ２９Ｌに対する核酸配列を表し、配列番号１４は、ＳｐＡ変異体Ｇ２９Ｋに対する核酸配列を表し、及び配列番号１５は、ＳｐＡ変異体Ｇ２９Ｒに対する核酸配列を表す。
【図７】図７は、２９位のグリシンがロイシン、リジン又はアルギニンによって置換されている３つのＳｐＡＢドメイン変異体に対するアミノ酸配列を図示する。配列番号１６は、ＳｐＡＢドメイン変異体Ｇ２９Ｌに対するアミノ酸配列を表し、配列番号１７は、ＳｐＡＢドメイン変異体Ｇ２９Ｋに対するアミノ酸配列を表し、及び配列番号１８は、ＳｐＡＢドメイン変異体Ｇ２９Ｒに対するアミノ酸配列を表す。
【図８】図８は、ニワトリＩｇＹ抗プロテインＡ抗体を用いて、イー・コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中のベクターＰＥＴ１１ａ：８６２０からのプロテインＡの発現が検出された典型的なウェスタンブロット実験を図示している。
【図９】図９は、ニッケル樹脂単独への（陰性対照）又はＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（Ｒ）クロマトグラフィー媒体（陽性対照）への免疫グロブリンのＦｃ及びＦ（ａｂ）２部分の結合を評価する代表的な実験、これに続く図示されているＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図示している。Ｅは、溶出液又はクロマトグラフィー後の結合された画分を表し、Ｓは上清又はクロマトグラフィー後の非結合画分を表す。左から右へ、レーン１は分子量マーカーを表し、レーン２から５は、ニッケル樹脂へのＦ（ａｂ）２（レーン２（Ｅ）、３（Ｓ））又はＦｃ（レーン４（Ｅ）、５（Ｓ））の何れかの結合を表し、レーン６から９はＦ（ａｂ）２（レーン６（Ｓ）、７（Ｅ））又はＦｃ（レーン８（Ｓ）、９（Ｅ））のＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（Ｒ）の結合を表し、並びにレーン１０及び１１はＦ（ａｂ）２及びＦｃのみを表す。Ｆ（ａｂ）２は約１８ｋＤａと２０ｋＤａの二重バンドとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を走行し、Ｆｃは約２２ｋＤａのＳＤＳＰＡＧＥ上を走行する。それぞれレーン２（Ｅ）及び４（Ｅ）中に示されているように、Ｆ（ａｂ）２及びＦｃは何れも、ニッケル樹脂（陰性対照）へ弱いないし無結合を示す。また、レーン７（Ｅ）に示されているように、Ｆ（ａｂ）２はＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（Ｒ）への結合を示すのに対して、ＦｃはＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（Ｒ）（陽性対照）への顕著な結合を示す。
【図１０】図１０は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーの後に図示されているＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて、Ｈｉｓタグ付加された野生型ＳｐＡ（ｗｔＳｐＡ）又は２９位のグリシンの代わりにアラニンを含むＨｉｓタグ付加されたＢドメイン変異物（Ｇ２９Ａ）への、免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２及びＦｃ部分の結合を評価する代表的な実験の結果を図示している。ＦはプロテインＡの供給を表している。ＦＴはプロテインＡ流出画分を表し、ＳはＦｃ又はＦａｂ結合工程後の上清（非結合画分）を表し、及びＥは溶出画分（結合された画分）を表す。左から右へ、レーン１は分子量マーカーを表し、レーン２はＦ（ａｂ）２又はＦｃへのｗｔＳｐＡの結合を評価する実験から得られたＦ画分を図示し、レーン３から５はＦＴ（レーン３）、Ｓ（レーン４）及びＥ（レーン５）画分中のＦ（ａｂ）２へのｗｔＳｐＡの結合を図示し、レーン６から８はＦＴ（レーン６）、Ｓ（レーン７）及びＥ（レーン８）画分中のＦｃへのｗｔＳｐＡの結合を図示し、レーン９はＦ（ａｂ）２又はＦｃへのＧ２９Ａの結合を評価する実験から得られたＦ画分を図示し、レーン１０から１２はＦＴ（レーン１０）、Ｓ（レーン１１）及びＥ（レーン１２）画分中のＦ（ａｂ）２へのＧ２９Ａの結合を図示し、並びにレーン１３から１５はＦＴ（レーン１３）、Ｓ（レーン１４）及びＥ（レーン１５）画分中のＦｃへのＧ２９Ａの結合を図示する。
【図１１】図１１は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーの後に図示されているＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、２９位のグリシンの代わりにロイシンを含むＨｉｓタグ付加されたＢドメイン変異物（Ｇ２９Ｌ）への、免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２及びＦｃ部分の結合を評価する代表的な実験の結果を図示している。ＦはプロテインＡの供給を表している。ＦＴはプロテインＡ流出画分を表し、ＳはＦｃ又はＦ（ａｂ）２結合工程後の上清（非結合画分）を表し、及びＥは溶出画分（結合された画分）を表す。左から右へ、レーン１は分子量マーカーを表し、レーン２はＦ画分を図示し、レーン３から５はＦＴ（レーン３）、Ｓ（レーン４）又はＥ（レーン５）画分中のＧ２９ＬへのＦ（ａｂ）２の結合を図示し、レーン６から８はＦＴ（レーン６）、Ｓ（レーン７）及びＥ（レーン８）画分中のＧ２９ＬへのＦｃの結合を図示する。
【図１２】図１２は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーの後に図示されているＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、２９位のグリシンの代わりにリジンを含むＨｉｓタグ付加されたＢドメイン変異物（Ｇ２９Ｋ）への及び２９位のグリシンの代わりにアルギニンを含むＨｉｓタグ付加されたＢドメイン変異物（Ｇ２９Ｒ）への、免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２及びＦｃ部分の結合を評価する代表的な実験の結果を図示している。ＦはプロテインＡの供給を表している。ＦＴはプロテインＡ流出画分を表し、ＳはＦｃ又はＦ（ａｂ）２結合工程後の上清（非結合画分）を表し、及びＥは溶出画分（結合された画分）を表す。左から右へ、レーン１は分子量マーカーを表し、レーン２はＦ（ａｂ）２及びＦｃへのＧ２９Ｋの結合を評価する実験から得られたＦ画分を図示し、レーン３から５はＦＴ（レーン３）、Ｓ（レーン４）又はＥ（レーン５）画分中のＧ２９ＫへのＦ（ａｂ）２の結合を図示し、レーン６から８はＦＴ（レーン６）、Ｓ（レーン７）及びＥ（レーン８）画分中のＧ２９ＫへのＦｃの結合を図示し、レーン９はＦ（ａｂ）２及びＦｃへのＧ２９Ｒの結合を評価する実験から得られたＦ画分を表し、レーン１０から１２はＦＴ（レーン１０）、Ｓ（レーン１１）又はＥ（レーン１２）画分中のＧ２９ＲへのＦ（ａｂ）２の結合を図示し、並びにレーン１３から１５はＦＴ（レーン１３）、Ｓ（レーン１４）及びＥ（レーン１５）中のＧ２９ＲへのＦｃの結合を図示する。
【図１３Ａ】図１３Ａから１３Ｅは、表面プラズモン共鳴分析を用いて、免疫グロブリンのＦｃ部分への、本発明のＳｐＡ変異物の結合をさらに評価する代表的な実験の結果を図示している。これらの図面は、野生型プロテインＡ（図１３Ａ）及びＧ２９Ａ（図１３Ｂ）対照への、並びに構築物Ｇ２９Ｋ（図１３Ｃ）、Ｇ２９Ｒ（図１３Ｄ）及びＧ２９Ｌ（図１３Ｅ）への、４５ｎＭから１８５ｐＭの範囲にわたる濃度のＦｃの結合を図示する。
【図１３Ｂ】図１３Ａから１３Ｅは、表面プラズモン共鳴分析を用いて、免疫グロブリンのＦｃ部分への、本発明のＳｐＡ変異物の結合をさらに評価する代表的な実験の結果を図示している。これらの図面は、野生型プロテインＡ（図１３Ａ）及びＧ２９Ａ（図１３Ｂ）対照への、並びに構築物Ｇ２９Ｋ（図１３Ｃ）、Ｇ２９Ｒ（図１３Ｄ）及びＧ２９Ｌ（図１３Ｅ）への、４５ｎＭから１８５ｐＭの範囲にわたる濃度のＦｃの結合を図示する。
【図１３Ｃ】図１３Ａから１３Ｅは、表面プラズモン共鳴分析を用いて、免疫グロブリンのＦｃ部分への、本発明のＳｐＡ変異物の結合をさらに評価する代表的な実験の結果を図示している。これらの図面は、野生型プロテインＡ（図１３Ａ）及びＧ２９Ａ（図１３Ｂ）対照への、並びに構築物Ｇ２９Ｋ（図１３Ｃ）、Ｇ２９Ｒ（図１３Ｄ）及びＧ２９Ｌ（図１３Ｅ）への、４５ｎＭから１８５ｐＭの範囲にわたる濃度のＦｃの結合を図示する。
【図１３Ｄ】図１３Ａから１３Ｅは、表面プラズモン共鳴分析を用いて、免疫グロブリンのＦｃ部分への、本発明のＳｐＡ変異物の結合をさらに評価する代表的な実験の結果を図示している。これらの図面は、野生型プロテインＡ（図１３Ａ）及びＧ２９Ａ（図１３Ｂ）対照への、並びに構築物Ｇ２９Ｋ（図１３Ｃ）、Ｇ２９Ｒ（図１３Ｄ）及びＧ２９Ｌ（図１３Ｅ）への、４５ｎＭから１８５ｐＭの範囲にわたる濃度のＦｃの結合を図示する。
【図１３Ｅ】図１３Ａから１３Ｅは、表面プラズモン共鳴分析を用いて、免疫グロブリンのＦｃ部分への、本発明のＳｐＡ変異物の結合をさらに評価する代表的な実験の結果を図示している。これらの図面は、野生型プロテインＡ（図１３Ａ）及びＧ２９Ａ（図１３Ｂ）対照への、並びに構築物Ｇ２９Ｋ（図１３Ｃ）、Ｇ２９Ｒ（図１３Ｄ）及びＧ２９Ｌ（図１３Ｅ）への、４５ｎＭから１８５ｐＭの範囲にわたる濃度のＦｃの結合を図示する。
【図１４Ａ】図１４Ａから１４Ｅは、表面プラズモン共鳴分析を用いて、免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２部分への、本発明のＳｐＡ変異物の結合をさらに評価する代表的な実験の結果を図示している。これらの図面は、様々なプロテインＡ構築物への、４５ｎＭから１８５ｐＭの範囲にわたる濃度のＦ（ａｂ）２の結合を図示する。野生型プロテインＡに対して、強力な結合が観察され（図１４Ａ）、Ｇ２９Ａ対照に対して、弱い結合が見られる（図１４Ｂ）。Ｇ２９Ｋ（図１４Ｃ）、Ｇ２９Ｒ（図１４Ｄ）及びＧ２９Ｌ（図１４Ｅ）に対しては、結合が検出されなかった。
【図１４Ｂ】図１４Ａから１４Ｅは、表面プラズモン共鳴分析を用いて、免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２部分への、本発明のＳｐＡ変異物の結合をさらに評価する代表的な実験の結果を図示している。これらの図面は、様々なプロテインＡ構築物への、４５ｎＭから１８５ｐＭの範囲にわたる濃度のＦ（ａｂ）２の結合を図示する。野生型プロテインＡに対して、強力な結合が観察され（図１４Ａ）、Ｇ２９Ａ対照に対して、弱い結合が見られる（図１４Ｂ）。Ｇ２９Ｋ（図１４Ｃ）、Ｇ２９Ｒ（図１４Ｄ）及びＧ２９Ｌ（図１４Ｅ）に対しては、結合が検出されなかった。
【図１４Ｃ】図１４Ａから１４Ｅは、表面プラズモン共鳴分析を用いて、免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２部分への、本発明のＳｐＡ変異物の結合をさらに評価する代表的な実験の結果を図示している。これらの図面は、様々なプロテインＡ構築物への、４５ｎＭから１８５ｐＭの範囲にわたる濃度のＦ（ａｂ）２の結合を図示する。野生型プロテインＡに対して、強力な結合が観察され（図１４Ａ）、Ｇ２９Ａ対照に対して、弱い結合が見られる（図１４Ｂ）。Ｇ２９Ｋ（図１４Ｃ）、Ｇ２９Ｒ（図１４Ｄ）及びＧ２９Ｌ（図１４Ｅ）に対しては、結合が検出されなかった。
【図１４Ｄ】図１４Ａから１４Ｅは、表面プラズモン共鳴分析を用いて、免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２部分への、本発明のＳｐＡ変異物の結合をさらに評価する代表的な実験の結果を図示している。これらの図面は、様々なプロテインＡ構築物への、４５ｎＭから１８５ｐＭの範囲にわたる濃度のＦ（ａｂ）２の結合を図示する。野生型プロテインＡに対して、強力な結合が観察され（図１４Ａ）、Ｇ２９Ａ対照に対して、弱い結合が見られる（図１４Ｂ）。Ｇ２９Ｋ（図１４Ｃ）、Ｇ２９Ｒ（図１４Ｄ）及びＧ２９Ｌ（図１４Ｅ）に対しては、結合が検出されなかった。
【図１４Ｅ】図１４Ａから１４Ｅは、表面プラズモン共鳴分析を用いて、免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２部分への、本発明のＳｐＡ変異物の結合をさらに評価する代表的な実験の結果を図示している。これらの図面は、様々なプロテインＡ構築物への、４５ｎＭから１８５ｐＭの範囲にわたる濃度のＦ（ａｂ）２の結合を図示する。野生型プロテインＡに対して、強力な結合が観察され（図１４Ａ）、Ｇ２９Ａ対照に対して、弱い結合が見られる（図１４Ｂ）。Ｇ２９Ｋ（図１４Ｃ）、Ｇ２９Ｒ（図１４Ｄ）及びＧ２９Ｌ（図１４Ｅ）に対しては、結合が検出されなかった。
【図１５Ａ】図１５Ａから１５Ｂは、ＳｐＡクロマトグラフィー樹脂に対する代表的なＦｃ及びＦａｂパルス実験の結果を図示する。図１５Ａでは、Ｆｃの非結合画分は７カラム容積（ＣＶ）で出現し、結合されたＦｃは２３カラム容積で溶出する。
【図１５Ｂ】図１５Ａから１５Ｂは、ＳｐＡクロマトグラフィー樹脂に対する代表的なＦｃ及びＦａｂパルス実験の結果を図示する。図１５Ｂでは、Ｆ（ａｂ）２の非結合画分は７カラム容積で出現し、結合されたＦｃは２３から２５ＣＶの間で溶出する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、少なくとも１つには、免疫グロブリンのＦｃ部分を結合する能力を保持しながら、野生型ＳｐＡ及び以前に記載されたＳｐＡの変異物より低い親和性で、免疫グロブリンのＦａｂ部分を結合するＳｐＡの変異物を提供する。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されているＳｐＡの変異物は、２９位にアラニンを有するＳｐＡより高い親和性で、免疫グロブリンのＦａｂ部分を結合する。
【００３０】
Ｉ．定義
本開示をより容易に理解できるようにするために、まず、ある種の用語を定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通じて記載する。
【００３１】
本明細書において使用される「免疫グロブリン結合タンパク質」という用語は、野生型ＳｐＡ（ｗｔＳｐＡ）又はＳｐＡの公知の変異物ドメイン（例えば、Ｚドメイン）と比べて、免疫グロブリン又はＩｇ分子のＦａｂ部分への低下した結合を示す、ＳｐＡの１つ又はそれ以上の修飾されたドメイン（例えば、修飾されたＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺの１つ又はそれ以上）を含む「ＳｐＡ」又は「スタフィロコッカス・オーレウスのプロテインＡ」のアミノ酸配列変異物を表す。幾つかの実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は１つ又はそれ以上の修飾されたドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺを含み、各ドメインは２９位にアミノ酸置換を含む。ドメインＥ、Ｄ、Ｂ、Ａ又はＣの場合には、２９位のグリシンはアラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸で置換され、Ｚドメインの場合には、２９位のアラニンは、グリシン又はトリプトファン以外のアミノ酸で置換される。幾つかの実施形態において、２９位のグリシンは、アラニン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸で置換され、２９位のアラニンはグリシン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸で置換される。幾つかの実施形態において、アミノ酸配列変異物は、親アミノ酸配列内の何れかの場所における１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入において、当該アミノ酸配列変異物が得られた親アミノ酸配列と異なり得、少なくとも２９位におけるアミノ酸残基の置換を含む。幾つかの実施形態において、アミノ酸配列変異物は、親配列（すなわち、ｗｔＳｐＡドメイン又はＺドメイン）と少なくとも約７０％又は少なくとも約８０％又は少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％又は少なくとも約９６％又は少なくとも約９７％又は少なくとも約９８％の同一性を有し、このような変異物は、免疫グロブリンのＦｃ部分を結合するが、２９位にグリシン又はアラニンを含むＳｐＡアミノ酸配列と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分へ低下した結合を示す。
【００３２】
別の実施形態において、２９位のグリシン又はアラニンは、トレオニン又はトリプトファンで置換されており、前記免疫グロブリン結合タンパク質は免疫グロブリンのＦｃ部分を結合し、及び２９位にアラニンを含むＳｐＡアミノ酸配列と比べて、免疫グロブリンのＦａｂ部分へ増加した結合を示す。
【００３３】
「配列同一性」という用語は、初期設定ギャップウエイトを使用して、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどによって、最適に並置されたときに、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列が少なくとも７０％の配列同一性又は少なくとも８０％の配列同一性又は少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性又は少なくとも９５％の配列同一性又はそれ以上を共有することを意味する。配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列（例えば、親配列）として作用し、これに対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要であれば、サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列に対する％配列同一性を計算する。
【００３４】
比較のための配列の最適な並置は、例えば、「Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）」の局所的相同性アルゴリズムによって、「Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）」の相同性並置アルゴリズムによって、「Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）」の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実装によって、又は視覚的試験（全般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）によって行うことができる。％配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、「Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）」に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて、公に入手可能（国立衛生研究所ＮＣＢＩインターネットサーバを通じて公にアクセス可能）である。典型的には、配列比較を実施するために、初期設定プログラムパラメータを使用することができるが、特別設計されたパラメータを使用することもできる。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴプログラムは、３のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを初期設定として使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）参照）を使用する。
【００３５】
一実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、アラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換された、少なくとも２９位のグリシンアミノ酸残基を含むｗｔＳｐＡの単離されたドメイン（すなわち、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ又はＣ）を基礎としており、前記免疫グロブリン結合タンパク質は、２９位にアラニン又はグリシンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、Ｉｇ分子のＦａｂ部分への低下した結合を示す。別の実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、グリシン又はトリプトファン以外のアミノ酸で置換された、少なくとも２９位のアラニン残基を含むＳｐＡのＺドメインを基礎とする。別の実施形態において、２９位のグリシン残基（すなわち、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインの場合）は、アラニン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されており、２９位のアラニン残基（すなわち、Ｚドメインの場合）は、グリシン、トレオニン及びトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されており、前記免疫グロブリン結合タンパク質は、２９位にアラニン又はグリシンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、Ｉｇ分子のＦａｂ部分への低下した結合を示す。
【００３６】
幾つかの実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＺと表記されるドメインの少なくとも２つ若しくはそれ以上又は少なくとも３つ若しくはそれ以上又は少なくとも４つ若しくはそれ以上又は少なくとも５つ若しくはそれ以上を含み、前記ドメインの２つ若しくはそれ以上又は３つ若しくはそれ以上又は４つ若しくはそれ以上又は５つ若しくはそれ以上の各々が、グリシン、アラニン、トリプトファン及びトレオニン以外のアミノ酸残基で置換された、少なくとも２９位のグリシン（例えば、ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣの場合）又はアラニン（Ｚドメインの場合）を含み、及び免疫グロブリン結合タンパク質は、２９位にグリシン又はアラニンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比べて、Ｉｇ分子のＦａｂ部分への低下した結合を示す。
【００３７】
幾つかの実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、同じドメインの多量体（例えば、Ｅドメインの２つ又はそれ以上、Ｄドメインの２つ又はそれ以上、Ａドメインの２つ又はそれ以上、Ｂドメインの２つ又はそれ以上、Ｃドメインの２つ又はそれ以上、及びＺドメインの２つ又はそれ以上）を含み、単量体のそれぞれは、グリシン、アラニン、トリプトファン及びトレオニン以外のアミノ酸で置換された、少なくとも２９位のグリシン又はアラニンを含み、前記免疫グロブリン結合タンパク質は、２９位にアラニン又はグリシンを含む免疫グロブリン結合タンパク質に比べて、Ｉｇ分子のＦａｂ部分へ低下した結合を示す。
【００３８】
２９位のグリシン又はアラニンを置換するための適切なアミノ酸には、グリシン、アラニン及びトリプトファンを除く（ある種の実施形態では、グリシン、アラニン、トリプトファン及びトレオニンを除く）、天然に存在する標準的アミノ酸の何れもが含まれる。幾つかの実施形態において、天然に存在するアミノ酸には、リジン、アルギニン及びロイシンの１つが含まれる。他の実施形態において、天然に存在するアミノ酸には、リジン、アルギニン、ロイシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、セリン、バリン及びチロシンの１つが含まれる。２９位のグリシン又はアラニンを置換するためにも、本分野において周知である天然に存在しないアミノ酸及びアミノ酸誘導体を使用することができる。
【００３９】
典型的なＳｐＡドメインの修飾が表１に示されている。本発明によって包含される免疫グロブリン結合タンパク質は、ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＺ）の１つ若しくはそれ以上、２つ若しくはそれ以上、３つ若しくはそれ以上、４つ若しくはそれ以上、５つ若しくはそれ以上又は６つ若しくはそれ以上のあらゆる組み合わせを含み得、各ドメインは２９位に修飾を含み、並びに２９位のグリシン又はアラニンはグリシン、アラニン及びトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されており、幾つかの実施形態においては、グリシン、アラニン、トリプトファン及びトレオニン以外のアミノ酸で置換されている。同じ種類の２つ又はそれ以上のドメイン（例えば、２つ又はそれ以上のＥドメイン、２つ又はそれ以上のＤドメイン、２つ又はそれ以上のＡドメイン、２つ又はそれ以上のＢドメイン、２つ又はそれ以上のＣドメイン及び２つ又はそれ以上のＺドメイン）を含み、各ドメインが２９位に修飾を含み、２９位のアミノ酸残基がグリシン、アラニン及びトリプトファン以外のアミノ酸残基で置換されており、並びに幾つかの実施形態においては、グリシン、アラニン、トリプトファン及びトレオニン以外のアミノ酸で置換されている、免疫グロブリン結合タンパク質も本発明によって包含される。
【００４０】
【表１】
2010075175.tif 000002
2010075175.tif 000003
2010075175.tif 000004
【００４１】
本明細書において互換的に使用される、「Ｅドメイン」、「ＳｐＡのＥドメイン」及び「ブドウ球菌プロテインＡのＥドメイン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号７に記載されているポリペプチド又は例えば、配列番号１に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを表す。「Ｅドメイン」は、三らせん束構造へ折り畳まれる５１アミノ酸のポリペプチドである。「Ｅドメイン」は、ヘリックス１及び２の表面上の残基を介してＦｃを結合することが可能であり、又はヘリックス２及び３の表面上の残基を介してＦａｂを結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＥドメインは、配列番号７に記載されているアミノ酸配列と、配列において、少なくとも７０％同一、又は少なくとも８０％同一、又は少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％又はそれ以上同一である。
【００４２】
本明細書において互換的に使用される、「Ｄドメイン」、「ＳｐＡのＤドメイン」及び「ブドウ球菌プロテインＡのＤドメイン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号８に記載されているポリペプチド又は例えば、配列番号２に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを表す。「Ｄドメイン」は、三らせん束構造へ折り畳まれる６１アミノ酸のポリペプチドである。「Ｄドメイン」は、ヘリックス１及び２の表面上の残基を介してＦｃを結合することが可能であり、又はヘリックス２及び３の表面上の残基を介してＦａｂを結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＤドメインは、配列番号８に記載されているアミノ酸配列と、配列において、少なくとも７０％同一、又は少なくとも８０％同一、又は少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％又はそれ以上同一である。
【００４３】
本明細書において互換的に使用される、「Ａドメイン」、「ＳｐＡのＡドメイン」及び「ブドウ球菌プロテインＡのＡドメイン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号３に記載されているポリペプチド又は例えば、配列番号９に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを表す。「Ａドメイン」は、三らせん束構造へ折り畳まれる５８アミノ酸のポリペプチドである。「Ａドメイン」は、ヘリックス１及び２の表面上の残基を介してＦｃを結合することが可能であり、又はヘリックス２及び３の表面上の残基を介してＦａｂへ結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＡドメインは、配列番号３に記載されているアミノ酸配列と、配列において、少なくとも７０％同一、又は少なくとも８０％同一、又は少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％又はそれ以上同一である。
【００４４】
本明細書において互換的に使用される、「Ｂドメイン」、「ＳｐＡのＢドメイン」及び「ブドウ球菌プロテインＡのＢドメイン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号１０に記載されているポリペプチド又は例えば、配列番号４に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを表す。「Ｂドメイン」は、三らせん束構造へ折り畳まれる５８アミノ酸のポリペプチドである。「Ｂドメイン」は、ヘリックス１及び２の表面上の残基を介してＦｃを結合することが可能であり、又はヘリックス２及び３の表面上の残基を介してＦａｂへ結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＢドメインは、配列番号１０に記載されているアミノ酸配列と、配列において、少なくとも７０％同一、又は少なくとも８０％同一、又は少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％又はそれ以上同一である。
【００４５】
本明細書において互換的に使用される、「Ｃドメイン」、「ＳｐＡのＣドメイン」及び「ブドウ球菌プロテインＡのＣドメイン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号１１に記載されているポリペプチド又は例えば、配列番号５に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを表す。「Ｃドメイン」は、三らせん束構造へ折り畳まれる５８アミノ酸のポリペプチドである。「Ｃドメイン」は、ヘリックス１及び２の表面上の残基を介してＦｃを結合することが可能であり、又はヘリックス２及び３の表面上の残基を介してＦａｂへ結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＣドメインは、配列番号１１に記載されているアミノ酸配列と、配列において、少なくとも７０％同一、又は少なくとも８０％同一、又は少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％又はそれ以上同一である。
【００４６】
本明細書において互換的に使用される、「Ｚドメイン」、「ＳｐＡのＺドメイン」及び「プロテインＡのＺドメイン」という用語は、プロテインＡのＢドメインの変異物である、三らせんの５９アミノ酸のポリペプチドを表す。Ｚドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２に記載されている。典型的なＺドメインは、「Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．，１：１０７−１１３（１９９７）」（その内容全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
【００４７】
「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」又は「抗体」（本明細書において互換的に使用される。）という用語は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる基本的な４ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質（前記鎖は、例えば、抗原を特異的に結合する能力を有する鎖間ジスルフィド結合によって安定化されている。）を表す。「一本鎖免疫グロブリン」又は「一本鎖抗体」（本明細書において互換的に使用される。）という用語は、１つの重鎖及び１つの軽鎖からなる２ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質（前記鎖は、例えば、抗原を特異的に結合する能力を有する鎖間ペプチドリンカーによって安定化されている。）を表す。「ドメイン」という用語は、例えば、β−プリーツシート及び／又は鎖内ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループを含む（例えば、３から４のペプチドループを含む）１つの重鎖及び１つの軽鎖ポリペプチドの球状領域を表す。本明細書において、「定常」ドメインの場合における様々なクラスメンバーのドメイン内での配列変動の相対的欠如又は「可変」ドメインの場合における様々なクラスメンバーのドメイン内での著しい変動に基づいて、ドメインは、さらに、「定常」又は「可変」と称される。本分野において、抗体又はポリペプチド「ドメイン」は、しばしば、抗体又はポリペプチド「領域」と互換的に表記される。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域又は「ＣＬ」ドメインと互換的に表記される。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域又は「ＣＨ」ドメインと互換的に表記される。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域又は「ＶＬ」ドメインと互換的に表記される。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域又は「ＶＨ」ドメインと互換的に表記される。
【００４８】
免疫グロブリン又は抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得、単量体又は多量体の形態（例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体及び／又は単量体、二量体又は多量体形態で存在するＩｇＡ抗体）で存在し得る。「断片」という用語は、無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の一部又は部分を表す。断片は、無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処置を介して得ることができる。断片は、組換え手段によって取得することも可能である。組換え的に産生される場合、断片は、単独で、又は融合タンパク質と称されるより大きなタンパク質の一部として発現され得る。典型的な断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ及び／又はＦｖ断片が含まれる。典型的な融合タンパク質には、Ｆｃ融合タンパク質が含まれる。
【００４９】
「抗原結合断片」という用語は、抗原を結合する又は抗原結合（すなわち、特異的結合）に関して無傷の抗体と（すなわち、抗原結合断片が由来する無傷の抗体と）競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチドの一部を表す。結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又は無傷の免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断によって作製することができる。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖及び一本鎖抗体が含まれる。
【００５０】
本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、あらゆる長さのヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの何れか）のポリマー形態を表す。これらの用語には、一本鎖、二本鎖若しくは三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド又はプリン及びピリミジン塩基又は他の天然の、化学的に若しくは生化学的に修飾された、非天然の若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。ポリヌクレオチドの骨格は、（ＲＮＡ又はＤＮＡ中に、典型的に見出され得るような）糖及びホスファート基又は修飾された若しくは置換された糖若しくはホスファート基を含むことができる。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖を徐冷することによって、又は適切なプライマーとともにＤＮＡポリメラーゼを使用して、新規に相補鎖を合成することによって、化学的合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。核酸分子は、多くの異なる形態（例えば、遺伝子又は遺伝子断片、１つ又はそれ以上のエキソン、１つ又はそれ以上のイントロン、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐したポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー）を採ることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類縁体、ウラシル、フルオロリボース及びチオアートなどの他の糖及び連結基並びにヌクレオチド分岐などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。本明細書において使用される「ＤＮＡ」又は「ヌクレオチド配列」には、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧが含まれるのみならず、メチル化されたヌクレオチド、帯電していない連結及びチオアートなどのヌクレオチド間修飾、糖類縁体の使用並びにポリアミドなどの修飾された及び／又は代替的骨格構造など、これらの塩基の類縁体又は修飾された形態の何れもが含まれる。特定の実施形態において、核酸分子は、ＳｐＡの変異物をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
本明細書において使用される「低下した結合」という用語は、２９位にアラニン又はグリシンアミノ酸残基を含む免疫グロブリン結合タンパク質と比較した、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質による免疫グロブリン分子のＦａｂ（又はＦ（ａｂ）２）部分への結合におけるあらゆる減少を表す。例えば、Ｆａｂ部分への結合は、２９位にグリシン又はアラニンアミノ酸残基を含む免疫グロブリン結合タンパク質と比較して、約１０％又は約２０％又は約３０％又は約４０％又は約５０％又は約６０％又は約７０％又は約８０％又は約９０％又は約９５％又は約９６％又は約９７％又は約９８％又は約９９％又はそれ以上減少され得る。幾つかの実施形態において、免疫グロブリン分子のＦａｂ部分への結合は、２９位にグリシン又はアラニンを含む免疫グロブリンタンパク質による結合と比較して、少なくとも５０％又はそれ以上低下される。別の実施形態において、免疫グロブリン分子のＦａｂ部分への結合は、少なくとも７０％又はそれ以上低下される。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン分子のＦａｂ部分への結合は、少なくとも９０％若しくはそれ以上又は少なくとも９５％若しくはそれ以上又は少なくとも９９％若しくはそれ以上低下される。一実施形態において、免疫グロブリン分子のＦａｂ部分への結合は、本分野における慣用技術及び本明細書中に記載されている技術を用いて検出することができない。免疫グロブリン分子への結合は、本明細書に記載されているものを含む、並びに例えば、アフィニティークロマトグラフィー及び表面プラズモン共鳴分析を含む（但し、これらに限定されない。）周知の技術を用いて検出することができる。幾つかの実施形態において、本発明によって包含される免疫グロブリン結合タンパク質は、単一のＩｇＧ結合ドメインに対して少なくとも約１０−８Ｍの解離定数で、又は５つの直列ＩｇＧ結合ドメインに対して約１０−１１Ｍの解離定数で、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を結合する。他の実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、単一の免疫グロブリン結合ドメインに対して約１０−５Ｍの解離定数で、又は５つの直列結合ドメインを有する無傷のプロテインＡに対して約１０−６Ｍの解離定数で、免疫グロブリン分子のＦａｂ部分に結合する。
【００５２】
本明細書において使用される「増加した結合」という用語は、２９位にアラニンアミノ酸残基を含む免疫グロブリン結合タンパク質と比較した、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質による免疫グロブリン分子のＦａｂ（又はＦ（ａｂ）２）部分への結合におけるあらゆる増加を表す。例えば、Ｆａｂ部分への結合は、２９位にアラニンアミノ酸残基を含む免疫グロブリン結合タンパク質と比較して、約１０％又は約２０％又は約３０％又は約４０％又は約５０％又は約６０％又は約７０％又は約８０％又は約９０％又は約９５％又は約９６％又は約９７％又は約９８％又は約９９％又はそれ以上増加され得る。幾つかの実施形態において、免疫グロブリン分子のＦａｂ部分への結合は、２９位にアラニンを含む免疫グロブリンタンパク質による結合と比較して、少なくとも５０％又はそれ以上増加される。別の実施形態において、免疫グロブリン分子のＦａｂ部分への結合は、２９位にアラニンを含む免疫グロブリンタンパク質によるＦａｂ結合と比較して、少なくとも７０％又はそれ以上増加される。さらに別の実施形態において、免疫グロブリン分子のＦａｂ部分への結合は、２９位にアラニンを含む免疫グロブリンタンパク質によるＦａｂ結合と比較して、少なくとも９０％若しくはそれ以上又は少なくとも９５％若しくはそれ以上又は少なくとも９９％若しくはそれ以上増加される。典型的な実施形態において、２９位にアラニンを含む免疫グロブリン結合タンパク質と比較して増加したＦａｂ結合を示す免疫グロブリン結合タンパク質は、２９位にトレオニン又はトリプトファンを含む。免疫グロブリン分子への結合は、本明細書に記載されているものを含む、並びに例えば、アフィニティークロマトグラフィー及び表面プラズモン共鳴分析を含む（但し、これらに限定されない。）周知の技術を用いて検出することができる。
【００５３】
「Ｆｃ結合」、「Ｆｃ部分へ結合する」又は「Ｆｃ部分への結合」という用語は、抗体の結晶化可能部分（Ｆｃ）へ結合する、本明細書中に記載されている免疫グロブリン結合タンパク質の能力を表す。幾つかの実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、少なくとも１０−７Ｍ又は少なくとも１０−８Ｍ又は少なくとも１０−９Ｍの親和性で抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４）Ｆｃ部分を結合する。
【００５４】
本明細書中において使用される「アフィニティー分離」又は「アフィニティー精製」という用語は、本明細書に記載されているように、その上に免疫グロブリン結合タンパク質を担持する固体支持体へ、標的分析物（例えば、免疫グロブリン）を含有する試料を添加することを含むあらゆる精製又はアッセイ技術を表す。
【００５５】
本明細書中において使用される「クロマトグラフィー」という用語は、測定すべき分析物（例えば、免疫グロブリン）を混合物中の他の分子から分離し、分析物の単離を可能とするあらゆる種類の技術を表す。
【００５６】
本明細書中において使用される「アフィニティークロマトグラフィー」という用語は、分離されるべき分析物が、分析物と特異的に相互作用する分子（例えば、免疫グロブリン結合タンパク質）とのその相互作用によって単離されるクロマトグラフィーの様式を表す。
【００５７】
ＩＩ．ＳｐＡ構造及び免疫グロブリン結合部位
ＳｐＡは、細菌スタフィロコッカス・オーレウスに由来する約４２ｋＤａのタンパク質であり、Ｎ末端に５つの直列の高度に相同な細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）結合ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣと表記される。）を含有する。ＳｐＡの各細胞外ドメインは、異なるＩｇ結合部位を有する。１つの部位はＦｃγ（ＩｇのＩｇＧクラスの定常領域）に対するものであり、他の部位は、ある種のＩｇ分子のＦａｂ部分（抗原認識に必要なＩｇの部分）に対するものである。ドメインの各々がＦａｂ結合部位を含有すると報告されている。ＳｐＡの非Ｉｇ結合部分はＣ末端に位置しており、Ｘ領域又はＸドメインと表記される。
【００５８】
ＳｐＡをコードする遺伝子のクローニングは、米国特許第５，１５１，３５０号（その内容全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）中に記載されている。
【００５９】
ＩＩＩ．ＳｐＡ変異物の作製及び発現
本発明のＳｐＡ変異物は、本分野において公知のあらゆる適切な方法を用いて作製することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇという題名の研究室マニュアル中に記載されているものなどの、核酸の部位特異的突然変異誘発のための標準的な技術を例えば使用し得る。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発を含む標準的な分子生物学技術を使用し得る。
【００６０】
幾つかの実施形態において、ＳｐＡ変異物は、標準的な遺伝子工学技術を用いて作製される。例えば、適切な宿主細胞中で発現させるために、ＳｐＡのドメイン又はその一部をコードする核酸分子を適切なベクター中にクローニングすることができる。適切な発現ベクターは本分野において周知であり、変異物ＳｐＡコード配列の転写及び翻訳のために必要な要素を通例含む。
【００６１】
本明細書に記載されているＳｐＡ変異物は、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）又はＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アプローチなどの固相ペプチド合成法（例えば、米国特許第６，０６０，５９６号；米国特許第４，８７９，３７８号；米国特許第５，１９８，５３１号；米国特許第５，２４０，６８０号）などの本分野において周知の方法を用いて、断片に対するアミノ酸前駆体から化学的に合成することもできる。
【００６２】
ＳｐＡ変異物の発現は、酵母、昆虫若しくは哺乳動物などの真核生物宿主由来の細胞中で、又は原核生物宿主細胞（例えば、イー・コリなどの細菌）中で達成することができる。
【００６３】
幾つかの実施形態において、各ファージがファージ表面上に提示された各ＳｐＡ変異物をコードするＤＮＡ配列を含有するように、ＳｐＡ変異物は、バクテリオファージの表面上に発現され得る。このアプローチでは、これらの位置に様々なアミノ酸を生成するために選択されるＳｐＡ配列中の選択された位置に無作為な又は半無作為なオリゴヌクレオチドを合成することによって、ＳｐＡ変異物のライブラリーが作製される。コードＤＮＡは、適切なファージベクター中に挿入され、ファージ粒子中にパッケージされ、適切な細菌宿主を感染させるために使用される。従って、配列の各々が１つのファージベクター中にクローニングされ、（例えば、パニングとして知られる方法により）Ｆｃへ結合するが、Ｆａｂへ結合しないファージを見出すことによって、（例えば、２９位に変異を有する）目的のＳｐＡ変異物を選択することができる。このようにして回収されたファージは増幅することができ、この選択は繰り返すことができる。また、ファージを単離し、ヌクレオチド配列決定によって、選択されたＳｐＡ変異物をコードするヌクレオチド配列を決定することができる。
【００６４】
ＩＶ．Ｆｃ及びＦａｂへのＳｐＡ変異物の結合
ＳｐＡ変異物の作製に続いて、免疫グロブリンのＦａｂ又はＦｃ部分へのＳｐＡ変異物の結合特異性は、本分野における標準的な技術及び本明細書中に記載されている技術を用いて決定される。
【００６５】
例えば、ＳｐＡ変異物は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによる固定化のために、ヒスチジンタグ（（Ｈｉｓ）６−タグ）とともに構築され得る。次いで、適切な断片を樹脂に添加することによって、Ｆｃ及びＦａｂ結合に関して、ニッケル結合されたＳｐＡを試験することができる。結合されていない材料は洗浄除去され、Ｆｃ及びＦａｂは、ゲル電気泳動によって、溶出試料中に検出される。
【００６６】
あるいは、Ｆｃ及びＦａｂ結合は、表面プラズモン共鳴分析によって測定することができる。ＳｐＡ変異物は、アミン反応性化学を用いてチップ上に固定化され、チップ上にＦｃ又はＦａｂ断片が流される。Ｆｃ又はＦａｂが結合すれば、表面プラズモン共鳴シグナルの増加が観察される。
【００６７】
ＳｐＡは、クロマトグラフィービーズ上にも固定化され得る。Ｆｃ又はＦａｂ結合は、ＳｐＡ樹脂に対して流出及び溶出ピークを比較することによって観察される。
【００６８】
Ｖ．クロマトグラフィーマトリックスを作製するためのＳｐＡ及びその変異物の使用
本発明は、抗体のＦｃ部分に対する親和性を有し、及び抗体のＦａｂ部分に対して低下した親和性を有する又は親和性を有さない少なくとも１つの免疫グロブリン結合タンパク質を含むクロマトグラフィーマトリックスを調製する方法も提供する。一実施形態において、このような方法は、（ａ）単離されたＳｐＡドメイン（例えば、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＺ）をコードする核酸配列を準備すること；（ｂ）アラニン又はトリプトファン以外のアミノ酸によって、少なくとも２９位のグリシンが置換されている変異物タンパク質をコードするように前記核酸配列を変異させること；（ｃ）宿主細胞（例えば、適切な原核細胞又は真核細胞）中の変異物タンパク質を発現させること；（ｄ）変異物タンパク質を宿主細胞から回収すること；及び（ｅ）固体支持体へ変異物タンパク質を連結させることを含む。
【００６９】
固体支持体マトリックスには、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、アガロース、メタクリラート及びポリスチレンが含まれるが、これらに限定されない。タンパク質は、例えば、アミン反応性又はチオール反応性化学によってマトリックスに連結することができる。
【００７０】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、以下の実施例は限定的なものと解釈すべきでない。本願を通じて引用されている全ての参考文献、特許及び公開された特許出願の内容並びに図面は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００７１】
（実施例１）
ＳｐＡ変異物を含有するベクターの構築
プロテインＡの「Ｂドメイン」をコードする遺伝子は、ＤＮＡ合成装置を用いた標準的な方法によって合成される。遺伝子の５’末端は、開始メチオニンに対するコドンを含み、及び遺伝子の３’末端に６つのヒスチジンコドンを含む。この遺伝子は、ベクターｐＪ５６：８６２０中に与えられる。親ベクターｐＪ５６は、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール及びゲンタマイシンに対する耐性を付与する。続いて発現ベクター中に遺伝子をクローニングするための適切な制限酵素部位が、遺伝子の５’末端及び３’末端の両方に導入される。ベクターのプラスミド地図が図５に示されている。
【００７２】
２９位のグリシンは、ＰｈｕｓｉｏｎＨｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いるＰＣＲをベースとする方法によって、１９の他のアミノ酸のそれぞれへ変異を受ける。リン酸化されたプライマーは、ＴｒｉｓＥＤＴＡ緩衝液中の１００μＭ溶液として、ＩＤＴＤＮＡ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入される。変異原性プライマーは、配列：５’（Ｐ）ＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＣＡＡＣＮＮＮＴＴＣＡＴＴＣＡＧＡ（配列番号１９）（ＮＮＮは、２９位のアミノ酸をコードする３つの塩基を表す。）を有する。非変異原性プライマーは、配列５’（Ｐ）ＧＴＴＣＡＧＧＴＴＣＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＴ（配列番号２０）を有する。ＰＣＲは、ｄＮＴＰ（それぞれ、０．２ｍＭ）、各プライマー０．５ｍＭ、テンプレートプラスミド１０ｐｇ及びＰｈｕｓｉｏｎ酵素１Ｕを含有する反応物５０μＬ中で行われる。ＰＣＲは、表ＩＩに要約されているスキームに従って行われる。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
野生型バックグラウンドを低下させるために、ＰＣＲ反応物は、制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で処理される。各ＰＣＲ反応物５０μＬに、ＤｐｎＩ酵素約１μＬを添加し、試料を３７℃で約１時間温置する。
【００７５】
ＤｐｎＩで処理されたＰＣＲ反応物２μＬで、イー・コリＮＥＢ５α形質転換受容性細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を形質転換する。細胞を氷上で溶かし、ＰＣＲ反応物２μＬを細胞２５μＬに添加する。氷上で約３０分の温置後、約４２℃で３０秒間、細胞に熱ショックを施す。氷上で約５分間、細胞を回復させ、次いで、ＳＯＣ培地１２５μＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を添加する。３７℃で約１時間、細胞を温置し、次いで、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレート（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗｉｎｓｌｏｗ，ＭＥ）上に１００μＬを播種し、約３７℃で一晩増殖させる。精製されたＤＮＡを得るために、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ中で一晩培養するために、各コロニーを拾い上げる。Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）のｓｐｉｎ  ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐキットを用いてＤＮＡを精製する。ミニプレップ処理されたＤＮＡを配列決定し、各クローンの正体を確認するために、プライマーｐＪＲ（５’ＧＡＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＧ）（配列番号２１）を使用する（ＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈ，ＨｕｎｔｓｖｉｌｌｅＡＬ）。
【００７６】
様々なクローンの配列確認に続いて、細菌細胞中で変異物を発現させるために、各ＳｐＡ変異物に対する遺伝子をプラスミド中にサブクローニングする。適切な制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）でプラスミドを消化し、１％アガロースＲｅｌｉａｎｔＦａｓｔＬａｎｅゲル（ＬｏｎｚａＩｎｃ．，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）上で挿入物をゲル精製する。関連するバンドをゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）のゲル抽出キットを用いて精製される。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、適切な発現ベクターの骨格中に精製された挿入物を連結する。上述のように、イー・コリＮＥＢ５α形質転換受容性細胞を形質転換するために、得られたプラスミドを使用する。
【００７７】
（実施例２）
プロテインＡ変異物の発現及び精製
様々なＳｐＡ変異物を発現させるために、あらゆる適切な細菌発現系を使用することができる。例えば、タンパク質は、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）などのｐＥＴベクターから、株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）などのエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）中で発現され得る。プレートから単一コロニーを拾い上げ、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ培地中において、約３７℃で一晩増殖させる。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する新鮮なＬＢ培地中に、一晩培養物を１００倍希釈し、６００ｎｍの光学密度が０．８であるような細胞密度まで増殖させる。１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加後、細胞をさらに２時間増殖させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びウェスタンブロッティングによって発現を確認する。典型的なプロテインＡウェスタンブロットが図８に示されており、図８は、イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中のベクターＰＥＴ１１ａ：８６２０からのプロテインＡの発現がニワトリＩｇＹ抗プロテインＡ抗体を用いて検出されることを示している。
【００７８】
遠心（４０００ｒｐｍ、４℃、５分）によって細胞を採集し、２０ｍＭイミダゾールを含有するリン酸緩衝化生理的食塩水の３ｍＬ中に再懸濁する。音波処理によって、細胞を溶解し、遠心（４０００ｒｐｍ、４℃、３０分）によって、細胞破砕物を沈降させる。ＮｉＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、スピンカラム当り細胞溶解液４００μＬを適用して、ＳｐＡ変異物を精製する。２０ｍＭイミダゾールを含有するリン酸緩衝化生理的食塩水６００μＬで２回、カラムを洗浄し、２００ｍＭイミダゾールを含有するリン酸緩衝化生理的食塩水２００μＬ×２中に、ＳｐＡを溶出する。ＰＢＳ中に一晩、ＳｐＡを透析する。Ｄｃタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用し、ウシ血清アルブミンを用いて調製された標準曲線と比較して、タンパク質濃度を確認する。
【００７９】
（実施例３）
Ｆｃ及びＦａｂ断片へのＳｐＡ変異物の結合
続いて、ＮｉＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、Ｆｃ及びＦａｂを結合する能力に関して、各ＳｐＡ変異物を試験する。ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ）から、Ｆｃ及びＦ（ａｂ）２断片を入手する。２０ｍＭイミダゾールを含有するリン酸緩衝化生理的食塩水中に、０．１１ｍｇ／ｍＬの濃度まで各ＳｐＡ変異物を希釈し、０．４４ｍｇ／ｍＬの濃度までＦｃを希釈し、０．９２ｍｇ／ｍＬの濃度までＦ（ａｂ）２を希釈する。ＮｉＮＴＡアガロース樹脂を再懸濁し、樹脂スラリー約２０μＬを、０．５ｍＬの微小遠心管中にピペットで分注する。続いて、樹脂を沈降させ、上清を廃棄する。２０ｍＭイミダゾールを加えたＰＢＳ約１００μＬで樹脂を洗浄し、室温で約１５分間温置し、再度沈降させる。上清を廃棄する。約２５０μＬの０．１１ｍｇ／ｍＬの各ＳｐＡ変異物又はＰＢＳ対照を、２つ組みで、樹脂カラム上に搭載し、室温で約３０分間温置する。樹脂を沈降させ、分析のために上清を保存する。毎回、２０ｍＭイミダゾールを加えたＰＢＳ１００μＬで、沈降物を３回洗浄し、５分間温置し、再度沈降させる。上清を廃棄する。樹脂とともに約３０分間温置することによって、ＳｐＡ変異物の各々又はＰＢＳ対照との結合に関して、Ｆｃ又はＦ（ａｂ）２の約１００μＬを試験する。続いて、樹脂を沈降させ、分析のために上清を保存する。毎回、２０ｍＭイミダゾールを加えたＰＢＳ約１００μＬで、樹脂を再度３回洗浄し、５分間温置し、沈降させる。今回は、上清を廃棄する。２０ｍＭイミダゾールを加えたＰＢＳ約１００μＬで、結合された画分を溶出し、約１５分間温置し、沈降させる。さらなる分析のために、上清を保存する。続いて、図９から１２に図示されているように、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡから購入した４から１５％勾配のゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、試料を分析する。
【００８０】
表面プラズモン共鳴バイオセンサー分析によって、Ｆｃ及びＦ（ａｂ）２への５つのプロテインＡ変異物の結合を試験する。全ての実験は、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）中で実施する。５００ＲＵのレベルまで連結させるアミン化学を介して、ＰｒｏｔｅＯｎＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に、プロテインＡ変異物を固定化する。４５ｎＭから１８５ｐＭの範囲のタンパク質濃度で、Ｆｃ及びＦ（ａｂ）２断片（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ）の３倍希釈系列を調製し、各濃度を２つ組みで分析する。Ｆｃ又はＦ（ａｂ）２の各濃度を２５０秒間注入した後、解離速度を測定するために、ＰＢＳを３．５時間注入する。オン速度及びオフ速度（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）を得るために、異種２部位モデルへデータを適合させる。図１３Ａから１３Ｅに図示されているように、野生型グリシン２９タンパク質並びにＧ２９Ａ、Ｇ２９Ｒ、Ｇ２９Ｋ及びＧ２９Ｌの各々がＦｃを結合する。図１４Ａから１４Ｅは、野生型Ｇ２９がＦａｂを結合することが観察され、及びＧ２９Ａが弱いが、検出可能なＦ（ａｂ）２結合を示すことを示している。Ｇ２９Ｒ、Ｇ２９Ｋ又はＧ２９Ｌに関しては、Ｆ（ａｂ）２結合は観察されない。
【００８１】
クロマトグラフィー樹脂上へのＳｐＡ変異物の固定化後に、Ｆｃ及びＦａｂ結合も評価する。国際ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０９２３７号（その内容全体が、参照により、本明細書中に取り込まれる。）に記載されている、固体支持体へプロテインＡを結合させるための方法に従って、制御細孔ガラスビーズ（それぞれ５０ｍＬ、６０μＬの平均粒子サイズ、８００Åの平均孔直径）をプロテインＡ又はプロテインＡ変異物で官能化する。リガンド結合後、それぞれ、（順に）、０．１５ＭＮａＣｌを加えた０．１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８、続いて０．０５Ｍ酢酸のそれぞれ１５０ｍＬ容量で、試料を３回洗浄する。その後、試料を平衡化し、アジ化物を加えたＰＢＳ中に保存する。
【００８２】
対応するリガンドで固定化された制御細孔ガラスアフィニティー樹脂を、６．６ｍｍ内径×７０ｍｍＬＯｍｎｉＦｉｔカラム中に充填する。この実験で使用された緩衝液は、（Ａ）５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２並びに（Ｂ）５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ２であり、流速は１．２ｍＬ／分である。開始緩衝液Ａ中にカラムを平衡化させた後、緩衝液Ａ中の１から２ｍｇ／ｍＬのＦ（ａｂ）２又はＦｃ１００μＬ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ）をカラム中に注入する。緩衝液Ａの１０カラム容積（ＣＶ）後、線形勾配で、２０ＣＶにわたって、緩衝液Ｂを混合する。６Ｍ塩酸グアニジンの２ＣＶによってカラムを再生する前に、緩衝液Ｂの１０カラム容積超をカラムに走行させる。図１５Ａ及び１５Ｂに図示されているように、野生型グリシン２９タンパク質並びにＧ２９Ａ、Ｇ２９Ｒ、Ｇ２９Ｋ及びＧ２９Ｌの各々がＦｃを結合する。野生型Ｇ２９はＦａｂを結合することが観察され、Ｇ２９Ａは、弱いが、検出可能なＦ（ａｂ）２結合を示す。Ｇ２９Ｒ、Ｇ２９Ｋ又はＧ２９Ｌに対しては、Ｆ（ａｂ）２結合は見られない。
【００８３】
別の典型的な実験において、ＮｉＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上にプロテインＡ変異物の完全な組を捕捉することによって、Ｆｃ及びＦａｂ結合に関して、プロテインＡ変異物の完全な組を試験する。簡潔に述べると、ｗｔＳｐＡの２９位にアミノ酸置換を有するＨｉｓタグ化プロテインＡ変異物を樹脂へ過剰に添加し、２０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳで樹脂を洗浄した後、免疫グロブリンのＦｃ又はＦａｂ部分を添加する。２０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳで、樹脂を再度洗浄した後、２００ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳでＳｐＡ及びＩｇＧ断片を溶出する。４から２０％勾配のゲル（ＢｉｏＲａｄ）後のクマシーブルー染色（Ｐｉｅｒｃｅ）上で、得られた溶出画分を分析する。プロテインＡなしの樹脂を陰性対照として使用する。典型的な実験の結果が、以下の表ＩＩＩに要約されている。異なる変異物間に、Ｆｃ結合の明白な差は観察されないが、変異物の多くに対して、Ｆａｂ結合は顕著に低下する。変異物の多くは、野生型と比べて１５％未満であるＦａｂ結合を示す。変異物の３つ（Ｇ２９Ａ、Ｇ２９Ｔ及びＧ２９Ｗ）に対して、２４％又はそれ以上の残存Ｆａｂ結合が観察される。
【００８４】
【表３】
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【００８５】
本明細書は、参照により本明細書中に組み込まれる、本明細書中に引用されている参考文献の教示に照らして最も完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明における実施形態の例示を与えるものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。多くの他の実施形態が本発明によって包含されることが、当業者に容易に認識される。全ての公報及び発明の全体が、参照により組み込まれる。参照によって組み込まれた資料が本明細書と矛盾し又は不一致である程度まで、本明細書はかかる一切の資料に優先する。本明細書中でのあらゆる参考文献の引用は、かかる参考文献が本発明に対して従来技術であることを認めたものではない。
【００８６】
別段の記載がなければ、特許請求の範囲を含む本明細書中において使用される、成分の量、細胞培養、処理条件などを表す全ての数字は、全ての事例で、「約」という用語によって修飾されているものと理解すべきである。従って、別段の記載がなければ、数的パラメータは近似であり、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る。別段の記載がなければ、要素の系列に先行する「少なくとも」という用語は、その系列中のあらゆる要素を表すものと理解される。当業者は、本明細書中に記載されている本発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識し、定型的な実験操作のみを用いて多くの均等物を確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【００８７】
当業者に自明であるように、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの修飾及び変形を施すことが可能である。本明細書に記載されている具体的な実施形態は例として与えられているものに過ぎず、いかなる意味においても、限定を意味するものではない。本明細書及び実施例は例示に過ぎないと考えられることが意図され、本発明の真の範囲及び精神は、以下の特許請求の範囲によって示される。
【００８８】
参考文献：
Fab binding: Melissa A. Starovasnik, Mark P. O’connell, Wayne J. Fairbrother, And Robert F. Kelley (1999). Antibody variable region binding by Staphylococal proteinA: Thermodynamic analysis and location of the Fv binding site on E-domain. Protein Science 8, 1423-1431.
Fc binding constant: Susanne Gulich, Mathias Uhlen, Sophia Hober (2000) Protein engineering of an IgG-binding domain allows milder elution conditions during affinity chromatography. Journal of Biotechnology 76, 233-244
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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