(57)【要約】【課題】より簡単かつ確実に被検光路のずれを検出できるようにする。【解決手段】光源１４からの照明光は、走査ユニット２１により偏向されて試料１３上を走査する。ハーフミラー１９は、光源１４から走査ユニット２１に入射する照明光の一部を抽出してハーフミラー３４に入射させる。また、ハーフミラー３４は、ハーフミラー１９からの照明光の一部を反射させて光電検出素子３５に受光させるとともに、照明光の一部を透過させて光電検出素子３６に受光させる。コンピュータ２９は、光電検出素子３５における照明光の受光位置および光電検出素子３６における照明光の受光位置に基づいて、照明光の光路のずれを検出する。本発明は、レーザ走査顕微鏡に適用することができる。【選択図】図１
2010014837.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの照明光を前記試料上で走査させる走査手段と、
前記照明光が前記試料に照射されることで前記試料から生じた観察光を受光する観察光受光手段と、
前記光源から前記試料までの間の前記照明光の光路上に配置され、前記照明光の一部を抽出して、少なくとも２つの光路に分岐させる分岐手段と、
前記分岐手段から所定の距離の位置に配置され、前記分岐手段により分岐された前記照明光である第１の分岐光を受光する第１の分岐光受光手段と、
前記分岐手段から前記所定の距離とは異なる距離の位置に配置され、前記分岐手段により分岐された前記照明光である第２の分岐光を受光する第２の分岐光受光手段と
前記第１の分岐光が受光された前記第１の分岐光受光手段の受光面上の第１の受光位置と、前記第２の分岐光が受光された前記第２の分岐光受光手段の受光面上の第２の受光位置とに基づいて、前記照明光の光路の基準光路に対するずれを検出する検出手段と
を備えた光走査顕微鏡であって、
前記走査手段、前記観察光受光手段、および前記分岐手段は、１つのユニット内に設けられている
ことを特徴とする光走査顕微鏡。
【請求項２】
前記照明光の光路上であって、前記光源と前記分岐手段の間に配置され、前記照明光の光路のずれを補正する補正手段をさらに備える
ことを特徴とする請求項１に記載の光走査顕微鏡。
【請求項３】
前記検出手段は、前記第１の受光位置および前記第２の受光位置に基づいて、前記照明光の光路の前記基準光路に対する角度のずれ、および前記照明光の光路の、前記光路に垂直な方向への前記基準光路に対するずれを検出し、
前記補正手段は、
前記角度のずれの検出結果に基づいて、前記照明光の光路を傾斜させることで、前記角度のずれを補正するチルト補正手段と、
前記垂直な方向へのずれの検出結果に基づいて、前記照明光の光路を、その光路と垂直な方向に平行移動させることで前記垂直な方向へのずれを補正するシフト補正手段と
を備える
ことを特徴とする請求項２に記載の光走査顕微鏡。
【請求項４】
前記分岐手段と、前記第１の分岐光受光手段との間に配置され、前記分岐手段からの前記第１の分岐光を、前記第１の分岐光受光手段の受光面上に集光する集光手段をさらに備える
ことを特徴とする請求項１に記載の光走査顕微鏡。
【請求項５】
前記ユニットに設けられ、前記光源に接続された光ファイバから入射した前記照明光の前記ユニットへの入射位置および入射角度を調整する調整手段をさらに備える
ことを特徴とする請求項１に記載の光走査顕微鏡。
【請求項６】
複数の前記光源と、
前記複数の前記光源からの前記照明光のそれぞれを合成する合成手段と、
前記照明光のそれぞれが同一光軸上を通るように、各前記光源から射出される前記照明光の出射位置および出射角度を調整する調整手段と
をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の光走査顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光走査顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
レーザ走査顕微鏡において、２光子励起法により試料から光を発生させて試料を観察する場合に、短パルスレーザ光源が用いられることがよく知られている。この短パルスレーザ光源からの照明光は、例えば、ミラー等の光学部材により空間伝播されて、レーザ走査顕微鏡に取り付けられたスキャンヘッドに導かれ、さらにスキャンヘッドにより試料上で走査される。
【０００３】
また、共焦点顕微鏡のレーザ光源は、温度変化や、波長切り替え時に生じる光源内部の光学素子の位置の変化によりレーザ光の出射角度や出射位置が変化して、レーザ光の光路にずれが生じるので、そのずれを検出するためにレーザ光源とビームエキスパンダの間に光ずれ検知装置を設け、検出されたずれ量を補正手段により補正している（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−３２４６７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、共焦点顕微鏡では、レーザ光源、スキャナ及び光検出器を含むスキャンヘッド、レーザ光源とスキャンヘッドとの間に配置された光学部材は、それぞれ個別ユニットとされる。
【０００６】
そのため、各ユニット間の温度差や振動が生じた場合や、観察者がそれらのユニットに誤って接触した場合などには、各ユニットの相対的な位置や角度がずれて被検光路にずれが生じてしまう。各ユニット間のレーザ光の伝播を光ファイバによらず空間伝播とした場合、そのずれはそのまま光路ずれとなってしまう。また、そのずれが大きい場合は、試料に照射される照明光の光量が低下するとともに所望の部位に照明光が照射されなくなってしまう。
【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、より簡単かつ確実に被検光路のずれを検出することができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の光走査顕微鏡は、光源からの照明光を前記試料上で走査させる走査手段と、前記照明光が前記試料に照射されることで前記試料から生じた観察光を受光する観察光受光手段と、前記光源から前記試料までの間の前記照明光の光路上に配置され、前記照明光の一部を抽出して、少なくとも２つの光路に分岐させる分岐手段と、前記分岐手段から所定の距離の位置に配置され、前記分岐手段により分岐された前記照明光である第１の分岐光を受光する第１の分岐光受光手段と、前記分岐手段から前記所定の距離とは異なる距離の位置に配置され、前記分岐手段により分岐された前記照明光である第２の分岐光を受光する第２の分岐光受光手段と前記第１の分岐光が受光された前記第１の分岐光受光手段の受光面上の第１の受光位置と、前記第２の分岐光が受光された前記第２の分岐光受光手段の受光面上の第２の受光位置とに基づいて、前記照明光の光路の基準光路に対するずれを検出する検出手段とを備えた光走査顕微鏡であって、前記走査手段、前記観察光受光手段、および前記分岐手段は、１つのユニット内に設けられていることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、より簡単かつ確実に被検光路のずれを検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。
【００１１】
［第１の実施の形態］
【００１２】
図１は、本発明を適用した２光子顕微鏡付き共焦点顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。
【００１３】
この２光子顕微鏡付き共焦点顕微鏡（以下、単に共焦点顕微鏡という）は、光を走査させるスキャンヘッド１１を顕微鏡１２に取り付けて通常の１光子励起による共焦点観察と、２光子励起法による観察を実現する観察するシステムである。
【００１４】
共焦点顕微鏡では、観察対象の試料１３に照射する照明光（励起光）の光源１４として、例えば、２光子励起法が用いられる場合は短パルスレーザ光源が用いられる。光源１４から出射した照明光は、ビームエキスパンダ１５によりビーム径が拡大するように整形されて平行光線とされ、さらにミラーホルダ１６に把持された全反射ミラー１７で反射される。全反射ミラー１７で反射された照明光は、入射位置シフタ１８を介してスキャンヘッド１１に入射する。
【００１５】
このようにして、空間伝播によりスキャンヘッド１１に導かれた照明光は、スキャンヘッド１１に設けられたハーフミラー１９、ダイクロイックミラー２０、走査ユニット２１、およびリレーレンズ２２を介して顕微鏡１２に入射する。そして、顕微鏡１２に入射した照明光は、顕微鏡１２内のダイクロイックミラー２３および対物レンズ２４を介してステージ２５上に載置された試料１３に照射される。
【００１６】
このとき、走査ユニット２１は、ダイクロイックミラー２０から入射した照明光を、図中、左右方向および奥行き方向に偏向させることにより、試料１３上で照明光を走査させる。試料１３に照明光が照射されると、試料１３からは観察光となる蛍光が発生し、この蛍光は対物レンズ２４を介してダイクロイックミラー２３に入射する。
【００１７】
２光子励起法の場合、集光点のごく近傍からしか蛍光が発生せず、それ自体で高い空間分解能を有するため、ピンホールは不要である。そのため、蛍光をより高い効率で検出するために、試料になるべく近い位置に検出器を置く構成が可能となる。そのような構成の場合は、ダイクロイックミラー２３は、必要に応じて対物レンズ２４からの蛍光を反射して、集光レンズ２６に入射させる。つまり、ダイクロイックミラー２３は、物理的に移動するようになされており、２光子励起法により試料１３から発生した蛍光をそのまま観察するときには、照明光の光路上、つまり被検光路上に配置され、通常の１光子励起法による蛍光を共焦点方式により観察するときには、被検光路上には配置されない。
【００１８】
ダイクロイックミラー２３が被検光路上に配置されている場合、ダイクロイックミラー２３は、リレーレンズ２２からの照明光を透過させるとともに、試料１３からの蛍光を反射して、集光レンズ２６に入射させる。
【００１９】
集光レンズ２６に入射した蛍光は、集光レンズ２６により集光されて光電検出素子２７に受光され、さらに光電検出素子２７により光電変換される。そして光電変換により得られた電気信号は、光電検出素子２７から制御部２８を介してコンピュータ２９に供給される。コンピュータ２９は、制御部２８からの電気信号に基づいて、試料１３の画像である観察画像の画像信号を生成して表示部３０に供給し、表示部３０に観察画像を表示させる。
【００２０】
一方、ダイクロイックミラー２３が被検光路上に配置されない場合、リレーレンズ２２からの照明光は、対物レンズ２４を介して試料１３に照射される。そして、試料１３からの蛍光は、照明光の光路を逆方向に通ってダイクロイックミラー２０に入射する。すなわち、試料１３から対物レンズ２４に入射した蛍光は、リレーレンズ２２および走査ユニット２１を介してダイクロイックミラー２０に入射する。
【００２１】
ダイクロイックミラー２０は、走査ユニット２１からの蛍光を反射して集光レンズ３１に入射させる。このダイクロイックミラー２０は、照明光の波長の光を透過させて、蛍光の波長の光を反射する。
【００２２】
ダイクロイックミラー２０から集光レンズ３１に入射した蛍光は、集光レンズ３１により集光され、共焦点絞り３２に設けられたピンホールを通って、光電検出素子３３に受光される。そして、光電検出素子３３が受光した蛍光を光電変換することにより得られた電気信号は、光電検出素子３３から制御部２８を介してコンピュータ２９に供給される。コンピュータ２９は、制御部２８からの電気信号に基づいて観察画像の画像信号を生成し、表示部３０に供給する。これにより、表示部３０に観察画像が表示される。
【００２３】
１光子励起法による共焦点観察の場合はこの経路、つまり対物レンズ２４から光電検出素子３３までの経路をとり、また、２光子励起法による観察の場合もピンホールを開放にすることで、この経路による検出が可能である。
【００２４】
また、被検光路上の入射位置シフタ１８と、ダイクロイックミラー２０との間には、ハーフミラー１９が配置されている。ハーフミラー１９は、入射位置シフタ１８からの照明光の一部を反射してハーフミラー３４に入射させるとともに、残りの照明光を透過させてダイクロイックミラー２０に入射させる。
【００２５】
ハーフミラー３４は、ハーフミラー１９からの照明光の一部を反射して光電検出素子３５に入射させるとともに、残りの照明光を透過させて光電検出素子３６に入射させる。すなわち、ハーフミラー３４は、被検光路のずれを検出するためにハーフミラー１９により抽出された照明光を２つの光（光路）に分岐させる。
【００２６】
ここで、光電検出素子３５は、ハーフミラー３４から光電検出素子３５の受光面までの照明光の光路長がＬ１となる位置に配置され、光電検出素子３６は、ハーフミラー３４から光電検出素子３６の受光面までの照明光の光路長が、Ｌ１より長いＬ２となる位置に配置される。また、光電検出素子３５および光電検出素子３６は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Devices）等の撮像素子、ＰＳＤ（Position Sensing Detector）、４分割フォトダイオードなどの受光位置を検出可能な素子とされる。
【００２７】
光電検出素子３５は、ハーフミラー３４からの照明光を受光して光電変換し、光電変換により得られた検出信号Ｄ１をＡ／Ｄ（Analog/Digital）変換器３７に供給する。この検出信号Ｄ１は、受光面上の各位置に入射した光の強度を示す信号であり、Ａ／Ｄ変換器３７によりアナログ信号からデジタル信号に変換された後、制御部２８を介してコンピュータ２９に供給される。
【００２８】
光電検出素子３６は、ハーフミラー３４からの照明光を受光して光電変換し、光電変換により得られた検出信号Ｄ２をＡ／Ｄ変換器３７に供給する。この検出信号Ｄ２は、受光面上の各位置に入射した光の強度を示す信号であり、Ａ／Ｄ変換器３７によりアナログ信号からデジタル信号に変換された後、制御部２８を介してコンピュータ２９に供給される。
【００２９】
コンピュータ２９は、制御部２８からの検出信号Ｄ１および検出信号Ｄ２のデジタル信号に基づいて、光電検出素子３５の受光面上における照明光の受光位置Ｐ１と、光電検出素子３６の受光面上における照明光の受光位置Ｐ２とを検出する。
【００３０】
また、コンピュータ２９は、検出された受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２に基づいて、照明光のチルト量、つまりチルトの角度（および方向）を演算処理により求め、駆動部３８に供給する。さらに、コンピュータ２９は、検出された受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２に基づいて、照明光のシフト量、すなわちシフトの大きさおよび方向を演算処理により求め、駆動部３９に供給する。
【００３１】
なお、コンピュータ２９が、検出された受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２を示す画像を表示部３０に表示させたり、演算処理により求められたチルト量およびシフト量を表示部３０に表示させたりするようにしてもよい。
【００３２】
駆動部３８は、コンピュータ２９から供給されたチルト量に基づいて、照明光のチルトが打ち消されるように、全反射ミラー１７を駆動する。すなわち、ミラーホルダ１６には、全反射ミラー１７を支持する互いに直交する２つの回転軸が設けられており、ミラーホルダ１６は、駆動部３８の制御に基づいて、それらの回転軸を中心として全反射ミラー１７を回動させる。これにより、照明光が傾けられ（あおられ）て被検光路が傾斜し、照明光の角度のずれがなくなるように被検光路が補正される。
【００３３】
駆動部３９は、コンピュータ２９から供給されたシフト量に基づいて、照明光のシフトが打ち消されるように、入射位置シフタ１８を駆動する。すなわち、入射位置シフタ１８には、例えば、互いに直交する方向に回転する２枚の電動ハービング板が設けられており、入射位置シフタ１８は、駆動部３９の制御に基づいて、それらの電動ハービング板を回動させる。これにより、照明光が平行移動されて、被検光路と垂直な方向への光路のずれがなくなるように、被検光路が補正される。
【００３４】
以上において説明した共焦点顕微鏡では、ハーフミラー１９乃至リレーレンズ２２、集光レンズ２６、光電検出素子２７、集光レンズ３１乃至Ａ／Ｄ変換器３７が、照明光を走査する１つのユニット内、つまりスキャンヘッド１１の筐体内に設けられている。そして、このスキャンヘッド１１が、顕微鏡１２に一体的に連結するように取り付けられている。
【００３５】
次に、共焦点顕微鏡による照明光のチルト検出、シフト検出の原理および補正方法について説明する。
【００３６】
光源１４からハーフミラー１９までの照明光の光路でチルトが生じると、図２Ａに示すように、照明光の光路は、照明光が本来通るべき光路である基準光路に対して傾く。なお、図２Ａでは、実線は照明光の基準光路を示しており、点線は照明光の実際の光路を示している。
【００３７】
光電検出素子３５および光電検出素子３６のそれぞれの受光面の中心の位置を、照明光が本来受光されるべき基準位置であるとすると、チルトの発生により照明光の光路は基準光路に対して傾くので、受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２は、それぞれ基準位置からずれた位置となる。
【００３８】
ここで、光電検出素子３５に入射する照明光と、光電検出素子３６に入射する照明光とは共通光路を有し、ハーフミラー３４において分岐される。したがって、図２Ｂに示すように、光電検出素子３５に入射する照明光の基準光路の延長上に光電検出素子３６が等価配置され、光電検出素子３５に入射した照明光が、そのまま直進し、光電検出素子３６の受光面に到達すると仮想的に考えることができる。
【００３９】
この場合、照明光は、基準光路に対して角度θだけ傾いて、図中、下側から光電検出素子３５の受光面上の受光位置Ｐ１に入射し、その後、光電検出素子３６の受光面上の受光位置Ｐ２に入射する。なお、図２Ｂにおいて、実線は照明光の光路を示しており、点線は基準光路を示している。
【００４０】
ここで、光電検出素子３５から光電検出素子３６までの距離を△Ｌとすると、基準位置から受光位置Ｐ２までの距離と、基準位置から受光位置Ｐ１までの距離との差分△Ｐは、次式（１）で表される。
【００４１】
△Ｐ＝△Ｌ×ｔａｎθ              ・・・（１）
【００４２】
式（１）における距離△Ｌは、ハーフミラー３４から光電検出素子３５までの照明光の光路長Ｌ１と、ハーフミラー３４から光電検出素子３６までの照明光の光路長Ｌ２との差であるから、距離△Ｌは既知の光路長Ｌ１および光路長Ｌ２から求められる。また、差分△Ｐも受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２から求められる。
【００４３】
したがって、光路長Ｌ１、光路長Ｌ２、受光位置Ｐ１、および受光位置Ｐ２から式（１）により、照明光のチルトの角度θが求められる。なお、照明光のシフトが生じていたとしても、受光位置Ｐ２と受光位置Ｐ１との基準位置からの距離の差分△Ｐは変わらないので、すなわち、差分△Ｐは、照明光のチルトの角度θにより定まるので、シフトの発生によらず、式（１）から角度θが求められる。
【００４４】
コンピュータ２９は、受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２に基づいて、式（１）を計算して角度θを求める。例えば、図２Ｂの例では、角度θは、チルトの方向が図中、右方向であり、チルトの角度の大きさがθとなる角度である。
【００４５】
コンピュータ２９は、チルト量（角度θ）を求めると、求めたチルト量を駆動部３８に供給する。なお、より詳細には、図２Ｂに示した、図中、左右方向へのチルトだけでなく、奥行き方向へのチルトも生じるので、奥行き方向へのチルト量も求められて、駆動部３８に供給される。
【００４６】
駆動部３８は、コンピュータ２９から供給されたチルト量に基づいて、全反射ミラー１７を駆動する。すると、ミラーホルダ１６は、駆動部３８の制御に基づいて、照明光のチルトの方向とは反対方向に、チルトの角度θの大きさだけ、つまり角度（−θ）だけ全反射ミラー１７を回動させて、照明光の光路を補正する。これにより、チルトが補正され、補正後の照明光の光路にはシフトだけが生じている状態となる。
【００４７】
次に、コンピュータ２９は、被検光路にシフトだけが残っている状態において、光電検出素子３５および光電検出素子３６から供給された検出信号Ｄ１および検出信号Ｄ２に基づいて、照明光の受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２を検出する。そして、コンピュータ２９は、受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２の検出結果から照明光のシフトを検出する。
【００４８】
例えば、光源１４からハーフミラー１９までの照明光の光路でシフトが生じると、図３Ａに示すように、照明光の光路は基準光路に対して、基準光路と垂直な方向に平行移動する。なお、図３Ａでは、実線は照明光の基準光路を示しており、点線は照明光の実際の光路を示している。
【００４９】
ここで、図３Ｂに示すように、図２Ｂにおける場合と同様に光電検出素子３５に入射する照明光の基準光路の延長上に光電検出素子３６が等価配置され、光電検出素子３５に入射した照明光が、そのまま直進し、光電検出素子３６の受光面に到達すると仮想的に考える。
【００５０】
この場合、照明光は、基準光路と平行に、つまり光電検出素子３５の受光面に対して垂直に、その受光面上の受光位置Ｐ１に入射し、その後、光電検出素子３６の受光面上の受光位置Ｐ２に入射する。なお、図３Ｂにおいて、実線は照明光の光路を示しており、点線は基準光路を示している。
【００５１】
図３Ｂでは、被検光路にチルトは生じていないので、基準位置から受光位置Ｐ１までの距離と、基準位置から受光位置Ｐ２までの距離とは同じとなり、その距離が照明光のシフト量Ｓである。例えば、図３Ｂの例では、シフト量Ｓは、図中、右方向への大きさＳのずれ量を示す値である。
【００５２】
コンピュータ２９は、受光位置Ｐ１（または受光位置Ｐ２）からシフト量Ｓを求めると、求めたシフト量を駆動部３９に供給する。なお、より詳細には、図３Ｂに示した、図中、左右方向へのシフトだけでなく、奥行き方向へのシフトも生じるので、奥行き方向へのシフト量も求められて、駆動部３９に供給される。
【００５３】
駆動部３９は、コンピュータ２９から供給されたシフト量に基づいて、入射位置シフタ１８を駆動する。すると、入射位置シフタ１８は、駆動部３９の制御に基づいて、照明光のシフトの方向とは反対方向に、シフト量Ｓの大きさの距離だけ照明光の光路が平行移動するように電動ハービング板を回動させる。これにより、補正後の照明光の光路は、基準光路と重なった状態、つまり基準光路そのものとなった状態となる。
【００５４】
このようにして、共焦点顕微鏡では、被検光路のずれが検出されて、そのずれがなくなるように被検光路が補正される。
【００５５】
つまり、共焦点顕微鏡は、ハーフミラー１９から、互いに照明光の光路長の異なる位置に配置された光電検出素子３５および光電検出素子３６において、それぞれ照明光を受光することにより、被検光路の基準光路からのずれを検出し、そのずれが打ち消されるように被検光路を補正する。
【００５６】
このように、光電検出素子３５および光電検出素子３６のそれぞれにおいて、照明光を受光することにより、被検光路のずれをより簡単かつ確実に検出することができる。
【００５７】
しかも、被検光路から照明光の一部を抽出するためのハーフミラー１９は、スキャンヘッド１１内部に設けられているため、照明光が光源１４からスキャンヘッド１１内部に入射するまでに生じる光路のずれを検出することができる。したがって、被検光路をより正確に補正することができるようになる。
【００５８】
すなわち、スキャンヘッド１１は、顕微鏡１２に固定されるため、スキャンヘッド１１内部から試料１３までの照明光の光路には、光路ずれが生じることは稀である。また、ハーフミラー１９が、スキャンヘッド１１の外部に設けられていたとすると、照明光がハーフミラー１９からスキャンヘッド１１に入射するときに生じる光路のずれを検出できなくなってしまう。特に、照明光がスキャンヘッド１１に入射するときに、照明光の光路ずれが発生しやすい。
【００５９】
したがって、光源１４からスキャンヘッド１１の内部に照明光が入射するまでの照明光の光路のずれを検出できればよいことになる。そこで、共焦点顕微鏡では、スキャンヘッド１１内部にハーフミラー１９を設けることで、被検光路において生じる光路のずれの大部分を検出することができる。
【００６０】
さらに、検出された被検光路のずれに基づいて、全反射ミラー１７および入射位置シフタ１８を駆動することで、より簡単かつ確実に被検光路のずれがなくなるように、被検光路を補正することができる。これにより、試料１３の所望の部位に充分な光量の照明光を照射することができ、観察画像の画質の劣化を防止するとともに、試料１３における観察者の所望する部位の観察画像を得ることができる。また、被検光路のずれ検出し、検出されたずれをなくすように被検光路を補正することができるので、光軸調整のためのメンテナンスが不要となるとともに、画像分解能や画像品質などの諸性能の安定した、より信頼性の高い共焦点顕微鏡を実現することができる。
【００６１】
なお、共焦点顕微鏡における被検光路のずれの検出および補正のタイミングは、例えば、光源１４の導入時、つまり光源１４の設置時や、照明光の波長の切り替え時などとすることができる。これにより、光源１４の設置や照明光の波長の切り替えにより生じる被検光路のずれを確実に補正することができる。また、光源１４の導入後、例えば試料１３の観察中などに、定期的に被検光路のずれの検出および補正を行うようにすれば、よりよい観察環境で試料１３の観察を行うことができるようになる。
【００６２】
また、以上においては、全反射ミラー１７および入射位置シフタ１８を用いて被検光路を補正すると説明したが、その他、例えば、併進動作と回転動作が可能な２枚の全反射ミラーにより被検光路の補正を行うようにしてもよい。そのような場合、２枚の全反射ミラーは、併進方向および回動方向が互いに直行するように配置される。
【００６３】
さらに、以上においては、チルトの補正を行った後、シフトを検知する例について説明したが、コンピュータ２９が、検出信号Ｄ１および検出信号Ｄ２に基づいて、照明光のチルト量およびシフト量を同時に求めるようにしてもよい。そのような場合、チルトの補正およびシフトの補正も同時に行われる。
【００６４】
さらに、また、被検光路のずれを検出するために照明光の一部を抽出するハーフミラー１９は、被検光路上の光源１４と試料１３との間であれば、どこに配置されてもよい。但し、より確実に被検光路のずれの検出を行うためには、ハーフミラー１９がスキャンヘッド１１内に設けられることが望ましい。
【００６５】
［第２の実施の形態］
【００６６】
図４は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施の形態の構成例を示す図である。なお、図４において、図１における場合と対応する部分には、同一の符号を付してあり、その説明は適宜、省略する。
【００６７】
図４に示す共焦点顕微鏡は、ハーフミラー３４と光電検出素子３６との間に結像レンズ６１が設けられている点で、図１の共焦点顕微鏡と異なる。
【００６８】
結像レンズ６１は、ハーフミラー３４から入射した照明光を光電検出素子３６の受光面上に集光する。ここで、照明光のチルトが発生していない場合には、結像レンズ６１に入射した照明光としての平行光束群は、光電検出素子３６の受光面の中心である基準位置に集光されるようになされている。
【００６９】
図４に示す共焦点顕微鏡では、例えば、被検光路のずれの検出および補正時において、コンピュータ２９は、まず照明光のチルトを検出して補正した後、照明光のシフトを検出し、補正する。
【００７０】
被検光路にチルトが生じると、図５Ａに示すように、照明光の光路は基準光路に対して傾く。なお、図５Ａでは、実線は照明光の基準光路を示しており、点線は照明光の実際の光路を示している。
【００７１】
図５Ａの例では、照明光の実際の光路が基準光路に対して角度θだけ傾いている。また、照明光のチルトが生じているので、照明光は光電検出素子３６の受光面上の基準位置とは異なる位置に集光されている。
【００７２】
ここで、光電検出素子３５に入射する照明光と、光電検出素子３６に入射する照明光とは共通光路を有し、ハーフミラー３４において分岐される。したがって、図５Ｂに示すように、光電検出素子３５に入射する照明光の基準光路の延長上に結像レンズ６１および光電検出素子３６が等価配置され、光電検出素子３５に入射した照明光が、さらに結像レンズ６１を通って光電検出素子３６の受光面に到達すると仮想的に考えることができる。
【００７３】
この場合、照明光は、基準光路に対して角度θだけ傾いて、光電検出素子３５の受光面に入射し、その後、結像レンズ６１により、光電検出素子３６の受光面上の受光位置Ｐ２に集光される。なお、図５Ｂにおいて、実線は照明光の光路を示しており、点線は基準光路を示している。
【００７４】
結像レンズ６１に入射した照明光である平行光束は、照明光のシフト量によらず、光電検出素子３６の受光面上の１点に集光される。換言すれば、照明光が集光される位置、つまり受光位置Ｐ２は、チルトの方向および角度θだけに依存する。
【００７５】
また、照明光の光束のうち、結像レンズ６１の中心を通る光束は、そのまま直進して受光位置Ｐ２に到達するので、その光束と、光電検出素子３６の受光面に垂直な直線とがなす角度は、照明光のチルトの角度θとなる。したがって、基準位置から受光位置Ｐ２までの距離Ｗは、次式（２）により表される。
【００７６】
Ｗ＝Ｆ１×ｔａｎθ              ・・・（２）
【００７７】
なお、式（２）において、Ｆ１は、結像レンズ６１の後側主点から光電検出素子３６の受光面までの距離を示している。つまり、距離Ｆ１は、結像レンズ６１の焦点距離に相当する。
【００７８】
式（２）における距離Ｗは、受光位置Ｐ２から求めることができ、また距離Ｆ１は既知であるため、受光位置Ｐ２および距離Ｆ１から式（２）を用いて、照明光のチルトの角度θが求まる。
【００７９】
そこで、コンピュータ２９は、受光位置Ｐ２および距離Ｆ１から、式（２）を計算して角度θを求める。例えば、図５Ｂの例では、角度θは、チルトの方向が図中、右方向であり、チルトの角度の大きさがθとなる角度である。
【００８０】
コンピュータ２９は、チルト量（角度θ）を求めると、求めたチルト量を駆動部３８に供給する。なお、より詳細には、図２Ｂに示した、図中、左右方向へのチルトだけでなく、奥行き方向へのチルトも生じるので、奥行き方向へのチルト量も求められて、駆動部３８に供給される。
【００８１】
駆動部３８にチルト量が供給されて全反射ミラー１７が駆動され、チルトが補正されると、補正後の照明光の光路にはチルトはなくなり、シフトだけが生じている状態となる。
【００８２】
その後、さらに、コンピュータ２９は、チルトの補正後に得られた検出信号Ｄ１に基づいて受光位置Ｐ１を検出し、その検出結果から照明光のシフトを検出する。
【００８３】
例えば、被検光路において、シフトだけが生じている場合、図６Ａに示すように、照明光の光路は基準光路に対して、基準光路と垂直な方向に平行移動する。なお、図６Ａでは、実線は照明光の基準光路を示しており、点線は照明光の実際の光路を示している。
【００８４】
ここで、図６Ｂに示すように、図５Ｂにおける場合と同様に、光電検出素子３５に入射する照明光の基準光路の延長上に結像レンズ６１および光電検出素子３６が等価配置され、光電検出素子３５に入射した照明光が、さらに結像レンズ６１を通って光電検出素子３６の受光面に到達すると仮想的に考える。
【００８５】
この場合、被検光路にはシフト量Ｓのシフトが生じているが、チルトは生じていないので、照明光は結像レンズ６１により光電検出素子３６の受光面の基準位置に集光される。なお、図６Ｂにおいて、実線は照明光の光路を示しており、点線は基準光路を示している。
【００８６】
また、照明光のシフトだけが生じると、照明光の入射する光電検出素子３５の受光面上の受光位置Ｐ１は、基準位置からシフト量Ｓだけずれた位置となる。そこで、コンピュータ２９は、受光位置Ｐ１から、照明光のシフト量を求めて駆動部３９に供給する。
【００８７】
駆動部３９にシフト量が供給されて入射位置シフタ１８が駆動され、シフトが補正されると、補正後の照明光の光路にはチルトもシフトもなくなった状態となる。
【００８８】
このように、ハーフミラー３４および光電検出素子３６の間に結像レンズ６１を設けることにより、被検光路のチルトおよびシフトを完全に分離して検出することができるようになる。つまり、シフトが生じているか否かによらず、光電検出素子３６からの検出信号Ｄ２に基づいて、被検光路のチルトを検出することができる。
【００８９】
なお、図４に示した共焦点顕微鏡においても、被検光路のシフトおよびチルトが同時に検出されるようにしてもよい。
【００９０】
［第３の実施の形態］
【００９１】
図７は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施の形態の構成例を示す図である。なお、図７において、図１における場合と対応する部分には、同一の符号を付してあり、その説明は適宜、省略する。
【００９２】
図７に示す共焦点顕微鏡は、スキャンヘッド１１と光源１４とが光ファイバ９１により接続される点で、図１の共焦点顕微鏡と異なる。
【００９３】
図７のスキャンヘッド１１には、光源１４からの照明光をスキャンヘッド１１の内部に導くための入射口９２が設けられており、入射口９２には、ファイバカプラ９３が取り付けられている。このファイバカプラ９３には、照明光を平行光線としてスキャンヘッド１１内部のハーフミラー１９に入射させるコリメートレンズ９４と、コリメートレンズ９４に入射する照明光の位置および角度を調整するための調整部９５とが設けられている。
【００９４】
また、共焦点顕微鏡では、光ファイバ９１の一方の端が光源１４に接続され、他方の端が調整部９５に接続されている。したがって、光源１４から射出された照明光は、光ファイバ９１を介してコリメートレンズ９４に入射し、さらにコリメートレンズ９４により平行光線とされてハーフミラー１９に入射する。
【００９５】
このようにして、照明光は、光源１４からスキャンヘッド１１に導かれる。また、コンピュータ２９は、光電検出素子３５および光電検出素子３６からの検出信号Ｄ１および検出信号Ｄ２に基づいて、被検光路のチルトおよびシフトを検出し、その検出結果を表示部３０に表示させる。
【００９６】
すると、観察者は、表示部３０に表示された被検光路のチルト量およびシフト量を見ながら調整部９５を動かして、被検光路に生じたチルトおよびシフトの補正を行う。
【００９７】
すなわち、調整部９５は、ファイバカプラ９３に対して、図中、上下方向および奥行き方向に、平行移動および回動するようになされている。観察者は、調整部９５を移動させたり、あおったり（回動させたり）して照明光のコリメートレンズ９４への入射位置および入射角度を調整することにより、被検光路のずれを補正する。
【００９８】
ところで、短パルスレーザ光源は、高価で大型な装置であり、出力光のパワーも大きいため、取り扱いに注意を要する装置である。そこで、光源１４として短パルスレーザ光源を用いる場合、被検光路の調芯時、例えば、スキャンヘッド１１の組み立ての光学調整時には、短パルスレーザ光源ではなく、単一波長で連続発振するレーザ光源など、低出力で安価なレーザ光源を用いるようにするとよい。
【００９９】
被検光路の調芯時に、光源１４として低出力のレーザ光源を用いる場合、光源１４としてのレーザ光源は光ファイバ９１に接続される。そして、光源１４（レーザ光源）から射出された光は、光ファイバ９１およびコリメートレンズ９４を介して、ハーフミラー１９に入射する。
【０１００】
また、被検光路の調芯時においては、観察者は、調整部９５の操作による被検光路のずれの補正を行わずに、試料１３の所望する部位に、充分に照明光が照射されるように、つまり所望する観察画像が得られるように被検光路の光学調整を行う。すなわち、例えば、観察者は、被検光路が試料１３を観察するのに最適な状態となるように、ダイクロイックミラー２０などの光学部材の配置位置や角度を調整する。
【０１０１】
さらに、被検光路の調整後、コンピュータ２９は、光電検出素子３５および光電検出素子３６からの検出信号Ｄ１および検出信号Ｄ２に基づいて、被検光路のずれ、つまり被検光路のシフト量およびチルト量を求めて記憶しておく。
【０１０２】
図７に示す共焦点顕微鏡では、光源１４からハーフミラー１９までの照明光の光路のずれを検出することはできるが、ハーフミラー１９から試料１３までの照明光の光路のずれを検出することはできない。そこで、被検光路の調芯時に、調整部９５の操作を行わずに、照明光の光路が最良と思われる状態となるように、被検光路の光学調整を行い、その時点における被検光路のずれを示す情報を記憶しておけば、試料１３の観察時に、その情報を用いて最良の被検光路の状態を再現できる。
【０１０３】
すなわち、試料１３の観察時において、検出される被検光路のずれが、記憶させておいた情報に示される値となるように被検光路の調整を行えば、その調整後の被検光路は、調芯時における被検光路の調整完了時の被検光路と全く同じ光路となり、観察者の所望する観察画像の取得が可能となる。
【０１０４】
例えば、観察者は、調芯時に、被検光路の調整を行った後、ファイバカプラ９３をスキャンヘッド１１から取り外し、試料１３の観察に用いる光源１４としての短パルスレーザ光源と、その短パルスレーザ光源からの照明光をスキャンヘッド１１に導くための光学部材を配置する。
【０１０５】
そして、観察者は、共焦点顕微鏡を操作して、コンピュータ２９に記憶されている、調芯時に求めた被検光路のシフト量およびチルト量を表示部３０に表示させる。さらに、観察者は、現時点で新たにコンピュータ２９により求められて表示部３０に表示された被検光路のシフト量およびチルト量が、調芯時における被検光路の調整完了時点のずれ量と同じ値になるように、被検光路のずれの補正を行う。
【０１０６】
例えば、被検光路のずれの補正は、短パルスレーザ光源と、スキャンヘッド１１との間に配置された光学部材の位置や角度を調整することにより行われる。
【０１０７】
このようにして、調芯時に求めた被検光路のシフト量およびチルト量を記憶させておくことで、スキャンヘッド１１の調芯時の光学調整が完了した時点での最良な被検光路の状態を簡単に再現することができる。
【０１０８】
なお、調芯時において求めた被検光路のシフト量およびチルト量を記憶させておくと説明したが、受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２を記憶させておくようにしてもよい。そのような場合でも、受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２を用いて、調芯時の被検光路の状態を再現することができる。
【０１０９】
さらに、被検光路のずれを示す情報をスキャンヘッド１１の出荷前に求めておき、スキャンヘッド１１の出荷時に、その情報をスキャンヘッド１１の固有調整量としてスキャンヘッド１１に添付するようにしてもよい。これにより、観察者は、共焦点顕微鏡のセットアップ時に、スキャンヘッド１１に添付された情報を用いて、簡単に被検光路のずれの補正を行うことができるようになる。
【０１１０】
［第４の実施の形態］
【０１１１】
図８は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施の形態の構成例を示す図である。なお、図８において、図１における場合と対応する部分には、同一の符号を付してあり、その説明は適宜、省略する。
【０１１２】
図８に示す共焦点顕微鏡は、照明光を射出する光源として、複数のレーザ光源１３１乃至レーザ光源１３３が設けられている点で、図１の共焦点顕微鏡と異なる。レーザ光源１３１乃至レーザ光源１３３は、互いに異なる波長の照明光を射出するレーザ光源とされる。
【０１１３】
レーザ光源１３１から射出された照明光は、ダイクロイックミラー１３４を透過して、ビームエキスパンダ１５に入射する。また、レーザ光源１３２から射出された照明光は、ダイクロイックミラー１３５およびダイクロイックミラー１３４において反射されてビームエキスパンダ１５に入射する。
【０１１４】
さらに、レーザ光源１３３から射出した照明光は、ダイクロイックミラー１３６において反射され、その後、ダイクロイックミラー１３５を透過し、さらにダイクロイックミラー１３４において反射されてビームエキスパンダ１５に入射する。
【０１１５】
このように、ビームエキスパンダ１５には、レーザ光源１３１乃至レーザ光源１３３のそれぞれからの波長の異なる照明光が入射する。つまり、レーザ光源１３１乃至レーザ光源１３３のそれぞれからの照明光が、ダイクロイックミラー１３４において合成される。
【０１１６】
光軸微調整機構１３７は、観察者に操作され、レーザ光源１３１乃至レーザ光源１３３のそれぞれについて、個別に照明光の出射位置および出射角度を調整する。
【０１１７】
このように、複数のレーザ光源１３１乃至レーザ光源１３３からの照明光を合成して試料１３に照射させる場合、それらの照明光ごとに個別に被検光路のずれの補正が行われる。
【０１１８】
すなわち、観察者は、レーザ光源１３１だけから照明光を射出させて、その照明光の被検光路のずれ、つまり照明光のシフト量およびチルト量を表示部３０に表示させる。そして、観察者は、光軸微調整機構１３７を操作して、レーザ光源１３１からの照明光の出射位置および出射角度を調整することで、被検光路のずれを補正する。
【０１１９】
同様にして、観察者は、レーザ光源１３２だけから照明光を射出させて、光軸微調整機構１３７により照明光の出射位置および出射角度を調整し、さらにレーザ光源１３３だけから照明光を射出させて、光軸微調整機構１３７により照明光の出射位置および出射角度を調整する。これにより、観察者は、簡単な操作で、より確実にレーザ光源１３１乃至レーザ光源１３３のそれぞれからの照明光が同一光軸上を通るようにすることができる。
【０１２０】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。
【図２】チルトの検出について説明する図である。
【図３】シフトの検出について説明する図である。
【図４】本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施の形態の構成例を示す図である。
【図５】チルトの検出について説明する図である。
【図６】シフトの検出について説明する図である。
【図７】本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施の形態の構成例を示す図である。
【図８】本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施の形態の構成例を示す図である。
【符号の説明】
【０１２２】
１１  スキャンヘッド，  １２  顕微鏡，  １６  ミラーホルダ，  １７  全反射ミラー，  １８  入射位置シフタ，  １９  ハーフミラー，  ２９  コンピュータ，  ３０  表示部，  ３４  ハーフミラー，  ３５  光電検出素子，  ３６  光電検出素子，  ３８  駆動部，  ３９  駆動部，  ６１  結像レンズ，  ９１  光ファイバ，  ９３  ファイバカプラ，  ９５  調整部，  １３１  レーザ光源，  １３２  レーザ光源，  １３３  レーザ光源，  １３７  光軸微調整機構
【図１】
2010014837.tif 000003
【図２】
2010014837.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2010014837.tif 000008
【図７】
2010014837.tif 000009
【図８】
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