(57)【要約】      （修正有）【課題】過酸化水素を含有する気体環境における微生物の存在を試験する方法、およびカセット含むキットの提供。【解決手段】工程：（ｉ）ピルビン酸の塩を含有する寒天生育培地に過酸化水素を含有する気体環境を接触させる（ｉｉ）微生物のコロニーの生育に好都合な環境に生育培地を置くこと（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の間に生育した微生物のコロニーの存在を測定する。カセットはピルビン酸の塩を含有する寒天生育培地を有する。【選択図】図２
2010075206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
空気または他の気体環境のサンプルを採取するための装置への連結手段を含み、１重量％より多く、５重量％までのピルビン酸の塩を含有する寒天生育培地が設置されているカセットまたはボックス。
【請求項２】
過酸化水素を含有する気体環境における微生物の存在を試験するためのキットであって、
（ｉ）気体環境のサンプルを採取するための装置への連結手段を含むカセットおよび（ｉｉ）１重量％より多く、５重量％までのピルビン酸の塩を含有する寒天生育培地を含む前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は過酸化水素を含有する気体環境中の微生物の存在の試験方法、並びに本方法において実施されるように適合された寒天生育培地を有するカセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の工業的工程、特に製薬工程の実施のためには、限定された製造領域、例えば外界から分離され無菌化されている単離装置において、種々の作業や操作を実施しなければならないことはよく知られている。
【０００３】
上記した限定された領域に存在する気体環境、通常は空気、の無菌性を試験するためには、微生物、細菌、酵母または黴を含有する可能性のある気体試料を採取し、これらを容器またはカセット内に充填された寒天の層に適用し、そして次にこれらの微生物が裸眼で目視可能なコロニーを形成するような温度で所定時間容器をインキュベートすることが一般的に行なわれている。即ち分析された空気中に存在する微生物のコロニーを可視化し、計数し、そして適宜同定することが可能である。
【０００４】
これらの限定された領域を滅菌するためには、気体状態の特定の過酸化水素を使用することが可能である。無菌性を目的として気体環境中に導入された過酸化水素は本明細書中では「外来性過酸化水素」と称する。
【０００５】
即ち、特に単離装置の滅菌のためには、以下の３工程、即ち：
＊  約１５から２０分間単離装置の周囲空気を乾燥するための脱湿工程；
＊  特定の量の過酸化水素を単離装置の内部環境に接触させるための気化工程；および、
＊  過酸化水素を除くための通気工程；
を実施するのが一般的である。
【０００６】
この滅菌サイクルの終了時に、単離装置内の空気のサンプルを採取して微生物濃度の試験を行なうことにより、その滅菌性を確認する。
【０００７】
しかしなお、特に通気工程において注意を払ったにも関わらず、気体環境がかなりの量の残存過酸化水素を含んでおり、微生物量の試験結果をゆがめ、これにより虚偽陰性結果を与える可能性があることを我々は発見した。
【０００８】
従って我々は、虚偽陰性の危険性を回避するためにかなりの量の過酸化水素の存在下で限定された領域の微生物の存在および／または量を試験する際の問題点を解決するための方法を開発することを模索した。
【０００９】
ストレス下にある微生物はそれらがなお活性ではあるが生育培地中で増殖できないという状態に入る場合あることも知られている。とりわけ、ストレスによりこれらの微生物はそのカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ活性を失う。即ち富栄養培地に置かれた場合に、培養時に自ら生産する、または、生育培地中に存在する特定の化合物の光化学反応または自己酸化により形成される過酸化物、特に過酸化水素を排除するために利用できる手段をもはや有さない。以下の記述においては、「内因性過酸化水素」とは微生物自身により、或いは、生育培地を構成する化合物の関与する反応の結果として形成される過酸化水素を指すものとする。
【００１０】
一部の研究者等は、ストレス現象にも関わらず環境中に存在する微生物を同定および／または計数することを目的として、カタラーゼのような内因性過酸化水素を分解することが知られている化合物、またはα−ケトグルタール酸、３，３’−チオジプロピオン酸およびピルビン酸ナトリウムのような非酵素化合物を生育培地に添加することを提案している。
【００１１】
即ち、Ｒ．Ｍ．Ｌｅｅ等はＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．５２，  Ｆｅｂ．  １９８９，  ｐｐ．１１９−１２１において、食品および水の試料からの大腸菌類の回収率を増大させるために寒天生育培地にピルビン酸ナトリウムを漸増量で添加することを記載している。
【００１２】
Ｊ．Ｐ．Ｃａｌａｂｒｅｓｅ等はＣａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．３６，  １９９０，  ｐｐ．５４４−５５０において、カタラーゼ、ピルビン酸ナトリウムまたはその組み合わせを添加することにより、酸性の水によるストレスを受けた大腸菌群の回収率を増大させることができることを報告している。Ｓ．Ｃｚｅｃｈｏｗｉｃｚ等のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３３  （１９９６），  ｐｐ２７５−２８４およびＹ．Ｍｉｚｕｎｏｅ等のＡｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂ．  （１９９０）  １７２：６３−６７によれば、カタラーゼ、α−ケトグルタール酸、３，３’−チオジプロピオン酸およびピルビン酸ナトリウムを用いることにより、食料の枯渇または熱ストレスの何れかにより衰退したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの回収率が増大する。
【００１３】
上記した通り明らかにされている問題点を解決するという観点から、出願人は当初はカタラーゼを添加した寒天生育培地の使用を意図した。
【００１４】
しかしながら、これは、前述した文献が遭遇したことのない、外来性の過酸化水素を含有する気体環境中の微生物の存在および量の試験の問題点に特有であると思われる困難に遭遇することになった。即ち、上記した一部の研究者に習って出願人は当初はカタラーゼを生育培地に添加していた。しかしながら実際には、カタラーゼによる過酸化水素の分解によりかなりの量の酸素気泡が生育培地の寒天の表面および内部に形成され、これらの気泡が微生物コロニーの可視化を極めて困難にしていることが判明した。さらにまた、８０００ＩＵ／プレート（即ち寒天生育培地当たり）までの量でカタラーゼを使用することは、後に定義する微生物回収率を６０％のオーダー程度の比較的低値とするだけであった。より高濃度のカタラーゼは出願人の意図するものではなかった。その理由は、それが微生物コロニーの可視化をなおより困難にするか、不可能にするような量の酸素気泡の形成をもたらすと考えられたためである。更にまたカタラーゼは、経済的見地からは大量に使用することは避けたい高額な製品であり、それが回収率を改善するという保証も無い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｒ．Ｍ．Ｌｅｅ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．５２，  Ｆｅｂ．  １９８９，  ｐｐ．１１９−１２１
【非特許文献２】Ｊ．Ｐ．Ｃａｌａｂｒｅｓｅ等、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．３６，  １９９０，  ｐｐ．５４４−５５０
【非特許文献３】Ｓ．Ｃｚｅｃｈｏｗｉｃｚ等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３３  （１９９６），  ｐｐ２７５−２８４
【非特許文献４】Ｙ．Ｍｉｚｕｎｏｅ等、Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂ．  （１９９０）  １７２：６３−６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
出願人は研究を継続し、本発明の第１の観点を構成する方法を用いることにより上記した問題を解決できることを発見した。
【００１７】
即ち、本発明は下記工程：
（ｉ）ピルビン酸の塩を含有する寒天生育培地に過酸化水素を含有する気体環境を接触させること；
（ｉｉ）微生物のコロニーの生育に好都合な環境に生育培地を置くこと；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の間に生育した微生物のコロニーの存在を測定すること；
を包含することを特徴とする過酸化水素を含有する気体環境における微生物の存在の試験方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
ピルビン酸の塩は虚偽陰性の危険性を伴うことなく、気体環境に存在する微生物の存在の試験を実行可能とする。
【００１９】
更にまた、そしてカタラーゼの使用により観察することができたものとは対照的に、ピルビン酸の塩は微生物のコロニーの測定を妨げず、高値の回収率を可能にする。
【００２０】
このことが予測できなかった理由は、上記した研究者の一部は内因性の過酸化水素の存在下で微生物のコロニーの生育を可能とするために、カタラーゼまたはピルビン酸ナトリウムが添加されている生育培地を無計画に使用していたためである。
【００２１】
本発明を以下の記述および図面により、これより詳細に説明する。
【００２２】
図１は微生物の回収率に対する過酸化水素０．３ｐｐｍの濃度の作用を示す棒グラフである。
【００２３】
図２は微生物の回収率に対する８ｐｐｍの濃度の過酸化水素の存在下におけるピルビン酸ナトリウムの作用を示す棒グラフである。
【００２４】
図３は微生物の回収率に対するγ線照射による滅菌後のピルビン酸ナトリウムの作用を示す棒グラフである。
【００２５】
図４は微生物の回収率に対する３ｐｐｍの過酸化水素の存在下の漸増濃度のカタラーゼの作用を示す棒グラフである。
【００２６】
図５は微生物の回収率に対する過酸化水素非存在下の２．５％から１０％のＴＳＡ寒天生育培地中漸増重量濃度のピルビン酸ナトリウムの作用を示す棒グラフである。
【００２７】
図６は微生物の回収率に対する５ｐｐｍから１５ｐｐｍの過酸化水素の存在下の１％から５％のＴＳＡ寒天生育培地中漸増重量濃度のピルビン酸ナトリウムの作用を示す棒グラフである。
【００２８】
本発明の意味においては、「微生物の回収率」とは、一方で既知数の微生物（ｃｆｕ）を含有する水性懸濁液が適用された特定の気体環境に事前に曝露された寒天生育培地上に形成された微生物のコロニー数（ｃｆｕ）と、一方で同じ水性微生物懸濁液が適用された寒天生育培地上、ただしこの寒天栄養培地は予め滅菌雰囲気中に維持されており特定の気体環境には曝露されていないがそれ以外は同等であるもの、に形成された微生物のコロニー数（ｃｆｕ）との、間の比を意味するものとする。
【００２９】
過酸化水素は一般的には、気体環境中において蒸気化または噴霧される。
【００３０】
意外にも出願人は過酸化水素を蒸気化した場合よりも噴霧した場合のほうが微生物の生育の抑制が高度になることを発見した。
【００３１】
通常過酸化水素を含有する気体環境は周囲空気、特に単離装置のような限定された領域内の周囲空気である。
【００３２】
気体環境中の過酸化水素の濃度は１ｐｐｍ（百万分の一部）から４００ｐｐｍ、好ましくは、０．１ｐｐｍから２０ｐｐｍ、より好ましくは０．２ｐｐｍから１０ｐｐｍであってよい。過酸化水素１ｐｐｍは１．４ｍｇ過酸化水素／ｍ３に相当する。
【００３３】
寒天生育培地は、寒天以外に、カゼイン、植物粉または酵母エキスのような蛋白の酵素消化産物を含有してよい。
【００３４】
寒天生育培地は下記成分：
＊  カゼインの膵液消化物                        １５ｇ
＊  大豆粉のパパイン消化物                        ５ｇ
＊  塩化ナトリウム                                ５ｇ
＊  寒天                                        １５ｇ
＊  水                                全容を１０００ｍＬとする量
を含有するＴＳＡ（トリプトン大豆寒天）培地よりなる。
【００３５】
適切なＴＳＡ生育培地は２３６９５０という参照番号の下にＤＩＦＣＯ社より販売されている。
【００３６】
寒天生育培地はピルビン酸塩の少なくとも１種を０．１重量％から３重量％、好ましくは０．５重量％から１．５重量％含有してよい。
【００３７】
本発明の趣旨において使用することのできるピルビン酸塩はナトリウムまたはカリウムのようなアルカリ金属の塩、カルシウムまたはマグネシウムのようなアルカリ土類金属の塩、またはこれらの塩の２種以上の混合物であってよい。好ましくは、ピルビン酸ナトリウムを使用する。
【００３８】
高濃度または極めて高濃度、即ち１５ｐｐｍから３００ｐｐｍ、更には４００ｐｐｍの過酸化水素の使用により特に強力な滅菌を望む場合も本発明の方法を適用することができる。このような高濃度の過酸化水素は必要以上に短い時間で滅菌サイクルを実施する場合にも生じる。これはユーザーがこのような滅菌サイクルの実施に際して指示書を遵守しなかったり、ユーザーが過酸化水素含量を適切にモニタリングしない場合に生じる。
【００３９】
このような条件下、気体環境中に高濃度の過酸化水素が存在する場合、寒天生育培地中の大量のピルビン酸塩を本発明の方法に従って用いることにより、生育微生物の回収が良好に行なえる。即ちピルビン酸塩の量は１重量％より多く５重量％まで、好ましくは３重量％から５重量％であることができる。
【００４０】
このように大量のピルビン酸塩の使用が可能であることは、当該分野においてはこのことが生育微生物の回収に対して有利であるよりはむしろ抑制的であると考えられていたことを考慮すると、意外なことであった。
【００４１】
更に意外な点は、微生物の生育が、上記した通りの生育微生物回収を抑制する高濃度の過酸化水素の存在下で、このような量のピルビン酸塩を用いた場合にも生じ得るという点である。
【００４２】
寒天生育培地は好ましくは１ｍｍから２０ｍｍ、好ましくは５ｍｍから８ｍｍの厚みを有する。
【００４３】
生育培地は単にその構成成分を混合することにより当業者の知る方法で調製してよい。
【００４４】
本発明の方法によれば、寒天生育培地の表面を過酸化水素を含有する気体環境の制御された、実質的に一定の流量を有している流動に好都合に接触させる。このように制御された流動を所定時間適用することにより、寒天生育培地表面に適用することが望ましく、そしてそれにより本発明の方法に再現性を付与するような、空気または他の気体環境の量を選択することができる。
【００４５】
このように制御された流動はポンプのような吸引手段並びに寒天生育培地を設置するカセットまたはボックスを保持する手段を包含し、これにより空気を寒天の表面に接触できるようにしたサンプル採取装置を用いることにより達成してよい。
【００４６】
このような装置はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓ．Ａ．の仏国特許出願９８０７２９９号および９８０５１６６号に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。このような装置はまた、商標Ｍ  Ａｉｒ  ＴＴＭ  Ｉｓｏｌａｔｏｒの下にＭｉｌｌｉｐｏｒｅより販売されている。
【００４７】
気体環境に接触させた生育培地の培養は温度制御インキュベーターのような如何なる適切な装置で行なってもよい。
【００４８】
一般的に、本発明の方法の工程（ｉｉｉ）の終了時において、コロニー数を計数し、および／または、コロニーを構成する微生物の性質を当業者の知る方法で同定する。
【００４９】
一般に、コロニーの計数を容易にするために、寒天生育培地が充填されたグリッド型のカセットまたはボックスを用いることができる。
【００５０】
本発明の他の観点によれば、この発明は、ピルビン酸塩を含む寒天生育培地が配備され、前述のように、空気または他の気体環境のサンプルを採取するための装置への連結手段が設置されたカセットまたはボックスから成る。
【００５１】
従来の寒天生育培地を含有するこのようなカセットはそれ自体知られている。これは商標Ｍ  ａｉｒ  ＴＴＭの下にＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社から販売されている。
【００５２】
本発明のカセットは上記した方法において使用してよい。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は微生物の回収率に対する過酸化水素０．３ｐｐｍの濃度の作用を示す棒グラフである。
【図２】図２は微生物の回収率に対する８ｐｐｍの濃度の過酸化水素の存在下におけるピルビン酸ナトリウムの作用を示す棒グラフである。
【図３】図３は微生物の回収率に対するγ線照射による滅菌後のピルビン酸ナトリウムの作用を示す棒グラフである。
【図４】図４は微生物の回収率に対する３ｐｐｍの過酸化水素の存在下の漸増濃度のカタラーゼの作用を示す棒グラフである。
【図５】図５は微生物の回収率に対する過酸化水素非存在下の２．５％から１０％のＴＳＡ寒天生育培地中漸増重量濃度のピルビン酸ナトリウムの作用を示す棒グラフである。
【図６】図６は微生物の回収率に対する５ｐｐｍから１５ｐｐｍの過酸化水素の存在下の１％から５％のＴＳＡ寒天生育培地中漸増重量濃度のピルビン酸ナトリウムの作用を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下の実施例の目的は本発明を説明することである。
【００５５】
実施例１（非本発明）
種々の微生物のコロニーの形成に対する気体過酸化水素の痕跡の影響を試験するために、滅菌環境を与え、過酸化水素非含有である層流空気フード内で空気１ｍ３の試料を先ず採取した。この方法で得た空気試料を２３６９５０の参照番号でＤＩＦＣＯ社より販売されているＴＳＡ生育培地の表面に充満させた。
【００５６】
生育培地の表面に所定数の微生物を含有する水性懸濁液を塗布した。
【００５７】
次にＴＳＡ生育培地を温度制御されたインキュベーター中にいれ、微生物のコロニーが生育できるようにした。
【００５８】
０．３ｐｐｍの噴霧過酸化水素を含有する気体１ｍ３を充満させたＴＳＡ生育培地を用いた以外は上記の通り試験を反復した。
【００５９】
得られた結果は図１に示すとおりであり、ここでｘ軸は寒天生育培地の表面に生育した微生物の性質を示し、ｙ軸は回収率、即ち、過酸化水素存在下中で測定されたｃｆｕ数と滅菌環境中で測定されたｃｆｕ数の間の比を示す。
【００６０】
得られた結果によれば、低い過酸化水素含有量は微生物コロニー形成を抑制し、このため虚偽陰性結果をもたらしている。
【００６１】
実施例２（非本発明）
今回は漸増量のカタラーゼ（０から８０００ＩＵ／プレート）を添加したＴＳＡ生育培地上に充満させた（０．３ｐｐｍではなく）３ｐｐｍの過酸化水素を含有する空気１ｍ３を用いた以外は実施例１と同様に行なった。使用した唯一の微生物はスタフイロコッカス・アウレウスであった。
【００６２】
得られた結果は図４に示す通りであり、ここでｘ軸はカタラーゼの量、ｙ軸は回収率を示す。
【００６３】
高用量（８０００ＩＵ／プレート）で使用したカタラーゼは最大回収率６０％を与えたが、スタフィロコッカス・アウレウスでの１２０％にもなった回収率をもたらした本発明の方法で得られた結果より有意に低値であった。
【００６４】
更にまたカタラーゼはｃｆｕの計数を困難にする酸素気泡の形成をもたらした。
【００６５】
実施例３
第１にＴＳＡ生育培地上に、そして第２にピルビン酸ナトリウム塩１重量％を添加したＴＳＡ培地上に充満させた８ｐｐｍの（噴霧過酸化水素ではなく）過酸化水素蒸気を含有する空気１ｍ３を用いた以外は実施例１と同様に行なった。
【００６６】
得られた結果は図２に示す通りであり、ここでｘ軸は微生物の性質、ｙ軸は回収率を示す。
【００６７】
ピルビン酸ナトリウムが微生物コロニーの形成と計数を可能にしたのに対し、これを含有しない生育培地は微生物コロニーの形成をもたらさなかった。
【００６８】
更にまた、回収率は対象となる微生物に関わらず常時８０％以上であったため、極めて良好であったことがわかった。
【００６９】
実施例４
実施例３と同様に行なったが、第１に、γ線照射による滅菌を行なわないピルビン酸ナトリウム１重量％添加の同様のＴＳＡ生育培地上に先ず充満させた８ｐｐｍ過酸化水素を含有する空気１ｍ３のサンプルを採取した。第２に、上と同じ試験を繰返したが、ここでは、γ線照射の作用により滅菌した同じ生育培地について試験した。
【００７０】
得られた結果は図３に示すとおりであり、ここでｘ軸は微生物の本質、ｙ軸は回収率を示す。
【００７１】
生育培地がγ線照射により滅菌されているか否かに関わらず、ピルビン酸ナトリウムはその作用を維持していることがわかる。
【００７２】
実施例５
気体環境中過酸化水素の存在下または非存在下において、高濃度のピルビン酸塩（≧１％）を用いて実施例３と同じ条件下に行なった。
【００７３】
１  ピルビン酸塩漸増濃度に対する微生物ミクロコッカス・ルテウスとシュードモナス・アエルギノーサの寛容性（試験は過酸化水素非存在下にて実施）：
２．５％、５％および１０％のピルビン酸塩濃度を与えたＴＳＡ培地上に生育するミクロコッカス・ルテウスとシュードモナス・アエルギノーサの回収率を実施例３の対照群を用いて過酸化水素非存在下でモニタリングした。
【００７４】
ミクロコッカス・ルテウスとシュードモナス・アエルギノーサの回収率（％比）は寒天生育培地に添加したピルビン酸塩の種々の濃度との相関として図５の棒グラフでそれぞれ記載する。
【００７５】
両方の場合において、ピルビン酸塩濃度が寒天培地の５重量％を超えた場合にミクロコッカス・ルテウスとシュードモナス・アエルギノーサの回収に対する有意な抑制作用が観察されている。
【００７６】
２  気体環境中５ｐｐｍから１５ｐｐｍの過酸化水素の存在下におけるピルビン酸塩の漸増濃度に対向する微生物ミクロコッカス・ルテウスとシュードモナス・アエルギノーサの寛容性：
５ｐｐｍから１５ｐｐｍの過酸化水素の存在下で上記した試験と同様に行なった。ＴＳＡ寒天生育培地にはそれぞれ、ピルビン酸塩１％、２％、３％、４％および５％を添加した。
【００７７】
各例におけるミクロコッカス・ルテウスとシュードモナス・アエルギノーサの双方の回収率を図６の棒グラフで示す。
【００７８】
３  気体環境中３００ｐｐｍまで過酸化水素を増量し、そして、ピルビン酸塩の濃度を寒天生育培地の５重量％までのとした場合の過酷な条件下におけるミクロコッカス・ルテウスの寛容性：
過酸化水素の濃度をそれぞれ１００ｐｐｍおよび３００ｐｐｍとし、ＴＳＡ寒天生育培地に対するピルビン酸塩の濃度を１重量％から５重量％とした場合のミクロコッカス・ルテウスの生育をモニタリングした。
【００７９】
これらの条件下で得られた結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
2010075206.tif 000003
【００８１】
表１からわかる通り、高濃度の過酸化水素（３００ｐｐｍ）および重要な濃度のピルビン酸塩（５％）の双方があることにより、ミクロコッカス・ルテウスの生育が可能となることがわかる。
【００８２】
実施例５に示した結果を総合すると、高濃度のピルビン酸塩は高濃度の過酸化水素の存在下における微生物生育の抑制を軽減する強力な能力を有することがわかる。
【００８３】
したがって、本発明によれば、高濃度の過酸化水素を含有する気体環境中の微生物の存在を試験することが可能となる。
【図１】
2010075206.tif 000004
【図２】
2010075206.tif 000005
【図３】
2010075206.tif 000006
【図４】
2010075206.tif 000007
【図５】
2010075206.tif 000008
【図６】
2010075206.tif 000009