(57)【要約】【課題】Dysbindinの機能調節作用に基づく、精神疾患の予防及び／又は治療に有用である組成物を提供すること。【解決手段】ディスビンディン(Dysbindin)の機能を調節する物質を含有してなる、Dysbindin機能調節用組成物。前記Dysbindinの機能を調節する物質は、細胞骨格関連遺伝子、転写関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、神経伝達関連遺伝子、シグナル伝達関連遺伝子、その他の機能に関連する遺伝子に分類される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ディスビンディン(Dysbindin)の機能を調節する物質を含有してなる、Dysbindin機能調節用組成物。
【請求項２】
Dysbindinの機能を調節する物質が細胞骨格関連遺伝子である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
細胞骨格関連遺伝子が、microtubule-actin crosslinking factor 1、septin 6、dynactin 1(p150)、chromosome 3 open reading frame 10、及びRAN binding protein 9からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
Dysbindinの機能を調節する物質が転写関連遺伝子である、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
転写関連遺伝子が、NK2 transcription factor related, locus、SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 4、AT rich interactive domain 2、ret finger protein、nuclear transcription factor Y, beta、intersex-like、CREB binding protein、LIM domain only、及びzinc finger protein 74からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
Dysbindinの機能を調節する物質がアポトーシス関連遺伝子である、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
アポトーシス関連遺伝子が、optic atrophy 1、clusterin、及びmacrophage erythroblast attacherからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
Dysbindinの機能を調節する物質が神経伝達関連遺伝子である、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
神経伝達関連遺伝子が、homer homolog 1、及びsorting nexin 5からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
Dysbindinの機能を調節する物質がシグナル伝達関連遺伝子である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
シグナル伝達関連遺伝子が、G protein pathway suppressor 2、COP9 constitutive photomorphogenic homolog subunit 6、guanine nucleotide binding protein, gamma 3、及びguanine nucleotide binding protein, gamma 5からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
Dysbindinの機能を調節する物質が、KIAA0355、dyslexia susceptibility 1 candidate 1、配列Ａで示される遺伝子Ａ(Accession No. NT_010718.15)、配列Ｂで示される遺伝子Ｂ(Accession No. NW_001838493.1)、配列Ｃで示される遺伝子Ｃ(Accession No. NC_001807.4)、及び配列Ｄで示される遺伝子Ｄ(Accession No. NW_927206.1)からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
組成物が精神疾患の予防及び／又は治療用である、請求項１〜１２いずれか記載の組成物。
【請求項１４】
精神疾患が統合失調症である、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
工程(Ａ)：Dysbindinと、Dysbindinの機能を調節する物質及び被検物質とを接触させる工程、
工程(Ｂ)：前記工程(Ａ)で接触させた、Dysbindinと、Dysbindinの機能を調節する物質との結合活性を測定する工程、
工程(Ｃ)：前記工程(Ｂ)で得られた結合活性を、被検物質を接触させない場合の結合活性と比較する工程、ならびに
工程(Ｄ)：前記工程(Ｃ)で行った比較において変動を認める場合に、被検物質はDysbindinと、Dysbindinの機能を調節する物質との結合活性を変化させる物質であると判定する工程
を含む、DysbindinとDysbindinの機能を調節する物質との結合活性を変化させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
工程(ａ)：被検者由来の生体試料において、Dysbindinの機能を調節する物質によってコードされるタンパク質の発現量を測定する工程、
工程(ｂ)：前記工程(ａ)で測定されたタンパク質の発現量を対照者における発現量と比較する工程、ならびに
工程(ｃ)：前記工程(ｂ)で行った比較において変動を認める場合に被検者は統合失調症を発症している可能性が高いと判定する工程
を含む、統合失調症発症の予測方法。
【請求項１７】
microtubule-actin crosslinking factor 1、septin 6、dynactin 1(p150)、chromosome 3 open reading frame 10、RAN binding protein、homer homolog 1、sorting nexin 5、NK2 transcription factor related, locus、SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 4、AT rich interactive domain 2、ret finger protein、nuclear transcription factor Y, beta、intersex-like、CREB binding protein、LIM domain only、zinc finger protein 74、optic atrophy 1、clusterin、macrophage erythroblast attacher、G protein pathway suppressor 2、COP9 constitutive photomorphogenic homolog subunit 6、guanine nucleotide binding protein, gamma 3、guanine nucleotide binding protein, gamma 5、KIAA0355、dyslexia susceptibility 1 candidate 1、配列Ａで示される遺伝子Ａ(Accession No. NT_010718.15)、配列Ｂで示される遺伝子Ｂ(Accession No. NW_001838493.1)、配列Ｃで示される遺伝子Ｃ(Accession No. NC_001807.4)、及び配列Ｄで示される遺伝子Ｄ(Accession No. NW_927206.1)によってコードされたタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質に対する抗体を含有してなる、統合失調症発症の予測用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Dysbindin機能調節用組成物に関する。より詳しくは、Dysbindinの機能を調節する特定の物質を含有し、精神疾患の予防及び／又は治療に用いられる組成物に関する。また、被検物質がDysbindinとDysbindinの機能を調節する物質との結合活性を変化させ得るか否かを評価することによる被検物質のスクリーニング方法、Dysbindinの機能を調節する物質を診断マーカーとして生体試料における該物質の含有量を測定することによる統合失調症発症の予測方法、ならびに前記予測方法に用いられるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の日本社会において、心の問題は非常に注目を集めている。子供を含む若年層においては自閉症、注意欠陥・多動性障害(ＡＤＨＤ)、引きこもり、キレル等、労働者や高齢者を含む大人においても気分障害による自殺、労働力の低下・損失等が非常に大きな問題となっており、早急な対応が求められている。さらに、これらの精神疾患は人口の約10％〔うつ病を中心とした気分障害：7〜8％、統合失調症：1〜2％、自閉症(及び関連疾患)：1％、ＡＤＨＤ：学齢期3〜9％〕が罹患し、日本における入院受療率の第一位(259人/人口10万人)を占めると報告されている。これらの問題を是正するには、早期診断、リスクマネージメントによる発症抑制、治療、的確な治療効果の判定等が非常に重要となる。
【０００３】
現在行われている精神疾患診断方法は、ＤＳＭ−ＩＶ等の精神疾患診断基準に基づく行動異常をもとにした診断が中心である。また、治療においても行動異常・言動異常等に対する対処療法であり、それら症状の変化を元に、治療の開始又は終了時期を決定している。またさらに、治療効果の判定も、行動変化を指標として行われている。
【０００４】
一方、精神疾患関連遺伝子として、dystrobrevinと相互作用するタンパク質として同定されたDysbindinは、統合失調症と関連することが報告されている(非特許文献１、２参照)。また、非特許文献３においては、Dysbindinの発現が、統合失調症患者において減少することが報告されており、これらの発見により、Dysbindinの機能不全は、統合失調症に関係があることが示唆されている。
【非特許文献１】Straub RE, Jiang Y, MacLean CJ, Ma Y, Webb BT, Myakishev MV, et al.、Am. J. Hum. Genet.、2002、71、p337-348
【非特許文献２】Numakawa T, Yagasaki Y, Ishimoto T, Okada T, Suzuki T, Iwata N, et al.、Hum. Mol. Genet.、2004、13、p2699-2708
【非特許文献３】Talbot K, Eidem WL, Tinsley CL, Benson MA, Thompson EW, Smith RJ, et al.、J. Clin. Invest.、2004、113(9)、p1353-63
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の精神疾患の診断方法や治療効果の判定は、行動変化観察等の医師の主観的な判断によるところが大きい。そのため、診断が遅くなることにより治療開始が遅れ病気が長期化すること、さらには根本的な治療薬が存在しないため再発を繰り返すこと、また、投薬を中止させるタイミング、社会復帰させるタイミングを図ることが難しいことから、いたずらに治療を長引かせたり、逆に投薬中止後に再発したりすること等の問題がある。
【０００６】
また、精神疾患の治療に現在用いられている薬剤は、症状に対する対処療法的なものに過ぎないことから、同一の精神疾患であっても各薬剤による効果の個人差は大きく、当初の意図に反して治療途中に薬剤や投与量を変更することも少なくない。一方で、早期に的確な診断と治療が施されれば、薬剤の常用なしに社会生活を送るまでの回復が認められるケースもあることから、早期の、かつ的確な診断・治療への期待が高まっている。
【０００７】
そこで、本発明者らは、統合失調症を中心とした精神疾患を科学的見地から鑑み、これまで行われてきた「症状ベースでの分類」から「分子レベルでの分類」に変更することを提唱し、分子メカニズムに基づいた精神疾患の診断基準及び／又は治療基準の確立を目指し、Dysbindinに着目した。
【０００８】
本発明の課題は、Dysbindinの機能調節作用に基づく、精神疾患の予防及び／又は治療に有用である組成物を提供することにある。また、前記作用に基づいて、精神疾患の予防及び／又は治療に有用である物質をスクリーニングする方法、及び精神疾患発症の予測方法、さらには該予測方法に用いられるキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、酵母ツーハイブリッド(Yeast Two Hybrid:Y2H)法により、特定のタンパク質群がDysbindinの結合因子であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、
〔１〕  ディスビンディン(Dysbindin)の機能を調節する物質を含有してなる、Dysbindin機能調節用組成物、
〔２〕  工程(Ａ)：Dysbindinと、Dysbindinの機能を調節する物質及び被検物質とを接触させる工程、
工程(Ｂ)：前記工程(Ａ)で接触させた、Dysbindinと、Dysbindinの機能を調節する物質との結合活性を測定する工程、
工程(Ｃ)：前記工程(Ｂ)で得られた結合活性を、被検物質を接触させない場合の結合活性と比較する工程、ならびに
工程(Ｄ)：前記工程(Ｃ)で行った比較において変動を認める場合に、被検物質はDysbindinと、Dysbindinの機能を調節する物質との結合活性を変化させる物質であると判定する工程
を含む、DysbindinとDysbindinの機能を調節する物質との結合活性を変化させる物質のスクリーニング方法、
〔３〕  工程(ａ)：被検者由来の生体試料において、Dysbindinの機能を調節する物質によってコードされるタンパク質の発現量を測定する工程、
工程(ｂ)：前記工程(ａ)で測定されたタンパク質の発現量を対照者における発現量と比較する工程、ならびに
工程(ｃ)：前記工程(ｂ)で行った比較において変動を認める場合に被検者は統合失調症を発症している可能性が高いと判定する工程
を含む、統合失調症発症の予測方法、ならびに
〔４〕  microtubule-actin crosslinking factor 1、septin 6、dynactin 1(p150)、chromosome 3 open reading frame 10、RAN binding protein、homer homolog 1、sorting nexin 5、NK2 transcription factor related, locus、SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 4、AT rich interactive domain 2、ret finger protein、nuclear transcription factor Y, beta、intersex-like、CREB binding protein、LIM domain only、zinc finger protein 74、optic atrophy 1、clusterin、macrophage erythroblast attacher、G protein pathway suppressor 2、COP9 constitutive photomorphogenic homolog subunit 6、guanine nucleotide binding protein, gamma 3、guanine nucleotide binding protein, gamma 5、KIAA0355、dyslexia susceptibility 1 candidate 1、配列Ａで示される遺伝子Ａ(Accession No. NT_010718.15)、配列Ｂで示される遺伝子Ｂ(Accession No. NW_001838493.1)、配列Ｃで示される遺伝子Ｃ(Accession No. NC_001807.4)、及び配列Ｄで示される遺伝子Ｄ(Accession No. NW_927206.1)によってコードされたタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質に対する抗体を含有してなる、統合失調症発症の予測用キット
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のDysbindin機能調節用組成物は、統合失調症の発症に関与するDysbindinに結合することにより、Dysbindinの機能を調節することが可能となり、種々の精神疾患の予防及び／又は治療に有用であるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の組成物は、ディスビンディン(Dysbindin)の機能を調節する物質(以下、本発明のDysbindinの結合因子ともいう)を含有するものであり、本発明は、統合失調症の発症に関与するDysbindinの結合因子として、特定のタンパク質群を見出したことに大きな特徴を有する。この結合因子が特定されたことによって、例えば、前記因子を介してDysbindinの機能を調節することにより、統合失調症等の精神疾患の症状を分子レベルで予防及び／又は治療すること、被検物質が前記因子によるDysbindinの機能調節作用に影響しうるか否かをスクリーニングすることにより、精神疾患の予防及び／又は治療に有用な物質を迅速に見出すこと、あるいは、前記因子を診断マーカーとしてサンプル中に存在する該マーカーを検出することにより、サンプル提供者の精神疾患の発症リスクの高低を判定すること等が可能になる。なお、本明細書において、「Dysbindin」及び「Dysbindinの機能を調節する物質」とは、タンパク質である態様と、当該タンパク質をコードする遺伝子である態様のいずれをも意味するものとする。
【００１３】
本明細書において「Dysbindinの機能」とは、Dysbindin及び／又はDysbindinをコードするポリヌクレオチドからの翻訳産物(即ち、ポリペプチド)が有する生物学的機能(活性)を言い、例えば、神経伝達物質の分泌・受容調節作用、細胞死制御作用、転写活性作用、細胞骨格維持作用等を言う。従って、「Dysbindinの機能を調節する」とは、神経伝達物質の分泌・受容調節作用、細胞死制御作用、転写活性作用、細胞骨格維持作用を促進又は抑制することを意味する。また、本明細書において「結合因子」とは、Dysbindinと結合することによりDysbindinの機能を変化させることが可能であるタンパク質であれば特に限定はなく、その機能の変化程度については言及されない。
【００１４】
本発明における、Dysbindinの機能を調節する物質は、酵母ツーハイブリッド(Yeast Two Hybrid:Y2H)法によるスクリーニングにより見出された。具体的には、DysbindinのＮ末端側の配列をbait、human brain cDNA libraryをpreyとして用い、両者を反応させて結合後、産生された必須アミノ酸の生存能により選択を行い、生存したものに対して、β-ガラクトシダーゼ産生量を調べることによって選択をさらに行う。その後、得られたβ-ガラクトシダーゼ産生能の高いものを陽性例と見なし、該陽性コロニー全例に対してシークエンシングにより配列を特定することにより、Dysbindinの機能を調節する物質、即ち、本発明のDysbindinの結合因子をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。Dysbindinの機能を調節する物質を表１に示す。前記ポリヌクレオチドは、その遺伝子によってコードされるタンパク質がDysbindinの結合因子として機能するものであり、その機能から、細胞骨格関連遺伝子、転写関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、神経伝達関連遺伝子、シグナル伝達関連遺伝子、その他の遺伝子に分類することができる。なお、遺伝子Ａ〜Ｄの詳細については、表２に示し、Genbankのような公知配列のデータベース、NCBIホームページ上の Entrez Nucleotide等を参照することにより得ることができる。
【００１５】
【表１】
2010059077.tif 000002
【００１６】
【表２】
2010059077.tif 000003
【００１７】
＜細胞骨格関連遺伝子＞
統合失調症の病因の一つとして、異常な神経発達が提唱されている。例えば、統合失調症関連遺伝子の１つであるDISC1の機能が、細胞骨格タンパク質として示されており、統合失調症の病因における異常な神経発達との関連が示唆されている(Miyoshi K, Honda A, Baba K, Taniguchi M, Oono K, Fujita T, et al., Mol Psychiatry. 2003; 8(7): 685-94.及びHattori T, Baba K, Matsuzaki S, Honda A, Miyoshi K, Inoue K, et al., Mol Psychiatry. 2007; Published online 23 January )。また、DISC1のノックダウンにより、ニューロンの遊走障害などの異常な神経回路形成が生じることも報告されている(Kamiya A, Kubo K, Tomoda T, Takaki M, Youn R, Ozeki Y, et al.,Nat Cell Biol. 2005;7(12):1167-78.)。
【００１８】
本発明において、細胞骨格関連遺伝子としては、microtubule-actin crosslinking factor 1(MACF1)、septin 6(SEPT6)、dynactin 1(p150)(DCTN1)、chromosome 3 open reading frame 10(C3orf10)、及びRAN binding protein 9(RANBP9)が挙げられる。このうち、MACF1は、統合失調症関連因子であるDISC1に結合することが明らかであり、また、DCTN1は、dynactinサブユニットの1つであり、dynein-dynactin複合体の異常は脳回欠損に関連することが報告されている(Faulkner NE, Dujardin DL, Tai CY, Vaughan KT, O'Connell CB, Wang Y, et al.,  Nat Cell Biol. 2000; 2(11):784-91.)。従って、Dysbindinの機能不全による統合失調症の病因は、Dysbindinが結合する細胞骨格関連タンパク質を介した神経回路形成の阻害による可能性が高いと考えられる。
【００１９】
＜転写関連遺伝子＞
本発明において、転写関連遺伝子としては、NK2 transcription factor related, locus(NKX2-2)、SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 4(SMARCA4)、AT rich interactive domain 2(ARID2)、ret finger protein(RFP)、nuclear transcription factor Y, beta(NFYB)、intersex-like(IXL)、CREB binding protein(CREBBP)、及びLIM domain only(LMO2)、zinc finger protein 74が挙げられる。これらの転写関連遺伝子の総数は、表１に示されるDysbindinの機能を調節する全物質の中で最も多いことから、Dysbindinは転写システムに関係があることが示唆される。また、本発明者らがDysbindinの細胞内局在に関して研究したところ、Dysbindinは細胞質のみに存在するのではなく、神経芽細胞腫、SY-5Y細胞の核内にも存在することが明らかになっている。また、同様に、SNAP25の発現に関して、Dysbindinの発現レベルの変化が影響を及ぼすこと、さらにはドーパミン放出を制御する効果についても報告している(Kumamoto N, Matsuzaki S, Inoue K, Hattori T, Shimizu S, Hashimoto R et al., Biochem Biophys Res Commun. 2006;345(2):904-9.)。このことから、Dysbindinの機能不全による統合失調症の病因として、Dysbindinが結合する転写関連タンパク質を介した転写阻害による特定タンパク質の発現量低下が推察される。
【００２０】
＜アポトーシス関連遺伝子＞
統合失調症の脳において、脳の体積が減少することがしばしば報告されているが、神経死が起きているか否かが問題となっている。また、脳の体積の減少は、神経伝達又は神経回路形成の阻害の結果であるかどうかということも明らかでないが、これまでの報告より、細胞の生存にDysbindinが関与していることが示唆されている(Numakawa T, Yagasaki Y, Ishimoto T, Okada T, Suzuki T, Iwata N, et al., Hum. Mol. Genet. 2004; 13: 2699-2708.)。
【００２１】
本発明において、アポトーシス関連遺伝子としては、optic atrophy 1(OPA1)、clusterin(CLU)、及びmacrophage erythroblast attacher(MAEA)が挙げられる。これらの遺伝子産物がDysbindinに結合することができるという本発見により、神経死が統合失調症の原因であるか結果であるかは定かではないが、統合失調症の脳における神経死の存在が示唆される。
【００２２】
＜神経伝達関連遺伝子＞
統合失調症の病因として、Dysbindinの発現の減少と共に、ドーパミンやグルタミン酸などの神経伝達物質の異常な増加が示されている(Harrison PJ, Weinberger DR., Mol Psychiatry. 2005;10(1):40-68)。また、Dysbindinの発現はシナプス前部の機能に影響を及ぼすことも報告されている(Numakawa T, Yagasaki Y, Ishimoto T, Okada T, Suzuki T, Iwata N, et al., Hum. Mol. Genet. 2004; 13: 2699-2708.及びKumamoto N, Matsuzaki S, Inoue K, Hattori T, Shimizu S, Hashimoto R et al.,Biochem Biophys Res Commun. 2006;345(2):904-9.)。一方、BLOC1の１員であるSNAP-associated protein(SNAPIN)が、Dysbindinの結合因子であることも開示されている(Nazarian R, Starcevic M, Spencer MJ, Dell'Angelica EC., Biochem J. 2006; 395(3):587-98.)。これらより、Dysbindin結合因子が神経伝達と密接に関係することが示唆される。
【００２３】
本発明において、神経伝達関連遺伝子としては、homer homolog 1(HOMER1)、及びsorting nexin 5(SNX5)が挙げられる。これらの遺伝子産物がDysbindinに結合することができるという本発見により、統合失調症における異常な神経伝達は、神経伝達に関連のある結合因子を介したDysbindinの機能不全を反映している可能性が高いと考えられる。
【００２４】
＜シグナル伝達関連遺伝子＞
統合失調症において、ERK(Hashimoto R, et al., Hum. Mol. Genet. 2006)、MAPK(Ferguson SS., Trends Neurosci. 2003)、cAMP(Millar JK, et al., Science 2005)等のシグナル伝達に関連する物質の異常が疾患発症に関与していることが示唆される。
【００２５】
本発明において、シグナル伝達関連遺伝子としては、G protein pathway suppressor 2(GPS2)、COP9 constitutive photomorphogenic homolog subunit 6(COPS6)、guanine nucleotide binding protein, gamma 3(GNG3)、及びguanine nucleotide binding protein, gamma 5(GNG5)が挙げられる。なかでも、GPS2はJNK経路に関与し、GNG3及びそのfamilyであるGNG5はG蛋白質の関与する種々のシグナル伝達制御に関係することから、これらの遺伝子産物がDysbindinに結合することができるという本発見により、両者の結合状態の異常がシグナル伝達経路の異常を誘導することにより、Dysbindinの機能不全を反映している可能性が高いと考えられる。
【００２６】
＜その他＞
上記遺伝子以外に、本発明におけるDysbindinの機能を調節する物質としては、KIAA0355、dyslexia susceptibility 1 candidate 1、chromosome 17 genomic contig〔配列Ａで示される遺伝子Ａ(Accession No. NT_010718.15)〕、chromosome 19 genomic contig〔配列Ｂで示される遺伝子Ｂ(Accession No. NW_001838493.1)〕、mitochondrion〔配列Ｃで示される遺伝子Ｃ(Accession No. NC_001807.4)〕及びchromosome 19 clone CTD-2094A2〔配列Ｄで示される遺伝子Ｄ(Accession No. NW_927206.1)〕が挙げられる。これらの遺伝子産物がDysbindinに結合することができるという本発見により、統合失調症の新たなリスク因子としての結合因子群、現状にて解明されていない種々の異常がこれらの遺伝子産物を介してDysbindinの機能不全を反映している可能性が高いと考えられる。
【００２７】
本発明におけるDysbindinの機能を調節する物質としての上記ポリヌクレオチドには、該ポリヌクレオチド以外にも、前記ポリヌクレオチド及びそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドであって、かつ、Dysbindinの機能を調節する作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【００２８】
ここでいう「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの断片をプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(Saline Sodium Citrate：150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム)溶液を用い、65℃でメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Current Protocols in Molecular Biology(1994)(Wiley-Interscience)、DNA Cloning 1:A Practical Approach Core Techniques,Second Edition(1995)(Oxford University Press)などに記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、アデニン(Ａ)又はチミン(Ｔ)のみからなる配列は除外される。
【００２９】
本明細書において「ハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、上記遺伝子の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと少なくとも60％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは95％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書において、相同性は、例えば、Altschulら(The Journal of Molecular Biology,215,403-410(1990))の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより計算することがきる。
【００３０】
また、上記特定の遺伝子においては、単一の遺伝子の変異又は多型で疾患への関与が説明できなくとも、精神疾患への関与が比較的穏やかな遺伝子の変異又は多型が多数存在し、それぞれが組み合わせられて作用することによって精神疾患への関与が説明できる場合もあると考えられる。従って、本発明におけるDysbindinの機能を調節する物質としての遺伝子には、上記特定遺伝子において少なくとも１つの一塩基多型(SNPs)を有する遺伝子も含まれるものとする。なお、SNPsが、DysbindinとDysbindinの機能を調節する物質との結合、及び下流の表現系へ及ぼす影響を検討することでSNPsを用いた診断マーカーの開発が可能となる。
【００３１】
上記ポリヌクレオチドは、既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計し合成したプライマーやプローブを用いて、PCR (Polymerase Chain reaction)法やハイブリダイゼーションによるスクリーニングにより、cDNAライブラリーから単離できる。また、アミノ酸配列に基づいて、該ポリペプチドやポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによっても調製することができる。
【００３２】
なお、かくして得られたポリヌクレオチドを、本発明では、適当な発現ベクターに組み込むことによって用いてもよい。かかるベクターは、真核生物及び原核生物の宿主細胞に形質移入することができるようになり、宿主細胞において、形質移入したポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させることが可能である。発現ベクターには、宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターを用いることができる他、宿主細胞に応じて適宜選択したベクタープラスミドに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入したものを用いることができる。数種類のポリヌクレオチドで同時に一つの細胞を形質転換する場合は、数種類のポリヌクレオチドが一つの発現ベクターに含まれるように構成してもよく、又は各々別々の発現ベクターに含まれるように構成してもよい。所望のポリヌクレオチドを導入した発現ベクターは、DEAE-デキストラン法、リン酸カルシウム-DNA共沈殿法、リポフェクション法等により宿主細胞に取り込ませ、形質転換させることができる。
【００３３】
本発明の組成物におけるDysbindinの機能を調節する物質の含有量としては、本発明の所望の効果の発現が得られるのであれば特に限定はなく、通常1〜100重量％程度である。
【００３４】
本発明の組成物は、Dysbindin機能調節作用を有することから、予防及び／又は治療にDysbindin機能調節作用を要する疾患に有用である。該疾患としては、Dysbindinの機能を調節することにより効果がみられる疾患であれば特に限定はないが、例えば、統合失調症、うつ病、双極性障害等の精神疾患が例示され、なかでも、統合失調症が好適である。
【００３５】
本発明はまた、Dysbindinと、Dysbindinの機能を調節する物質との結合活性を変化させる物質のスクリーニング方法を提供する。
【００３６】
上記スクリーニング方法は、具体的には
工程(Ａ)：Dysbindinと、Dysbindinの機能を調節する物質及び被検物質とを接触させる工程、
工程(Ｂ)：前記工程(Ａ)で接触させた、Dysbindinと、Dysbindinの機能を調節する物質との結合活性を測定する工程、
工程(Ｃ)：前記工程(Ｂ)で得られた結合活性を、被検物質を接触させない場合の結合活性と比較する工程、ならびに
工程(Ｄ)：前記工程(Ｃ)で行った比較において変動を認める場合に、被検物質はDysbindinと、Dysbindinの機能を調節する物質との結合活性を変化させる物質であると判定する工程
を含む。かかる方法により選択される物質は、例えば、統合失調症やうつ病等の精神疾患に対する治療薬となるものと期待される。
【００３７】
上記スクリーニング方法の工程(Ｂ)における結合活性の測定は、当業者においては周知の方法、例えば、酵母ツーハイブリッド(Yeast Two Hybrid:Y2H)法等により、適宜実施することができる。被検物質としては、特に制限はなく、例えば、種々の公知化合物やペプチド、あるいはファージ・ディスプレイ法などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分などもスクリーニングの対象となる。その他、生体組織抽出物、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物などが挙げられるが、これらに特に制限されない。
【００３８】
工程(Ｃ)における結合活性の比較、及びその後の工程(Ｄ)における判定は、被検物質が非存在時のDysbindinとDysbindinの機能を調節する物質との結合活性を100％とした場合に、例えば、被検物質が存在することによって、前記結合活性が好ましくは150％以上となる場合には、当該物質はDysbindinの機能を正常に制御する、例えば、神経伝達物質の分泌・受容調節作用、細胞死制御作用、転写活性作用、細胞骨格維持作用を制御する物質であると判断される。一方、前記結合活性が好ましくは50％以下となる場合には、当該物質はDysbindinの機能、即ち、前記作用の制御機構を破綻させうる物質であると判断される。
【００３９】
また、本発明は、統合失調症発症の予測方法を提供する。本発明のDysbindinの結合因子は、生体内で重要な機能、即ち、Dysbindinと結合することによりDysbindinの機能を調節する作用を有すると考えられる。かかるタンパク質の発現異常は、種々の疾患の原因となり得る。従って、前記タンパク質の発現を指標とすることにより、このような疾患発症の予測を行うことも可能である。
【００４０】
上記予測方法は、具体的には、
工程(ａ)：被検者由来の生体試料において、Dysbindinの機能を調節する物質によってコードされるタンパク質の発現量を測定する工程、
工程(ｂ)：前記工程(ａ)で測定されたタンパク質の発現量を対照者における発現量と比較する工程、ならびに
工程(ｃ)：前記工程(ｂ)で行った比較において変動を認める場合に被検者は統合失調症を発症している可能性が高いと判定する工程
を含む。なお、上記「予測方法」とは、疾患の症状を呈している被検者の治療戦略を立てるための検査のみならず、被検者が疾患にかかりやすいか否かを判断するために行う予防のための検査、又は既に罹患しているか否かの検査も含まれる。
【００４１】
上記予測方法の工程(ａ)における複合体の発現量の測定は、当業者においては周知の方法を用いることができるが、例えば、Elisaプレート等を用いた発現量の測定を行うことで簡便に、迅速に各種蛋白質の量を測定することが出来る。
【００４２】
工程(ｂ)、及びその後の工程(ｃ)における判定においては、上記により得られた複合体の発現量について、対照者における該発現量に基づいて統計学的な解析を行って比較を行い、被験者の発現量が対照者における発現量と比べて、好ましくは10％以上多い、あるいは少ないという変動が認められた場合に統合失調症を発症している可能性が高いと判定する。解析方法としては、特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。なお、本発明において、対照者とは、統合失調症を発症していないと診断される患者のことを言う。
【００４３】
本発明の別の態様では、統合失調症発症の予測を行うためのキットが提供される。
【００４４】
本発明のキットには、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出することができるものであれば全て含まれる。具体的には、microtubule-actin crosslinking factor 1、septin 6、dynactin 1(p150)、chromosome 3 open reading frame 10、RAN binding protein、homer homolog 1、sorting nexin 5、NK2 transcription factor related, locus、SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 4、AT rich interactive domain 2、ret finger protein、nuclear transcription factor Y, beta、intersex-like、CREB binding protein、LIM domain only、zinc finger protein 74、optic atrophy 1、clusterin、macrophage erythroblast attacher、G protein pathway suppressor 2、COP9 constitutive photomorphogenic homolog subunit 6、guanine nucleotide binding protein, gamma 3、guanine nucleotide binding protein, gamma 5、KIAA0355、dyslexia susceptibility 1 candidate 1、配列Ａで示される遺伝子Ａ(Accession No. NT_010718.15)、配列Ｂで示される遺伝子Ｂ(Accession No. NW_001838493.1)、配列Ｃで示される遺伝子Ｃ(Accession No. NC_001807.4)、及び配列Ｄで示される遺伝子Ｄ(Accession No. NW_927206.1)によってコードされたタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質に対する抗体を含有するキットが挙げられ、サンプル中のタンパク質を検出する際に抗体を用いる検出方法であれば、前記キットを用いることができる。なお、前記タンパク質が検出されるのであれば、前記結合因子以外のタンパク質も前記抗体により同時に検出されることがあってもよく、本発明のキットは、統合失調症発症予測の１次スクリーニング用としても利用することが可能である。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
【００４６】
実施例１＜酵母ツーハイブリッド法によるポリヌクレオチドの同定＞
3種類のヒトDysbindin配列、完全長Dysbindin(GenBank寄託番号NM_025772)、N-末端配列(Dysbindinのアミノ酸残基1〜197)及びC-末端配列(Dysbindinのアミノ酸残基198〜351)をbaitとして、pGBKT7(GAL4 DNA-結合ドメインベクター、Clontech、CA、USA)にクローニングした。baitプラスミドで形質転換したAH109酵母細胞株を、ヒト胎児脳cDNAライブラリー(Clontech社製)で前もって形質転換したY187酵母細胞株と接合させ、製造業者のプロトコル(Clontech社製)に従ってスクリーニング法を実施した。
【００４７】
N-末端配列baitを用いたスクリーニングの結果、約200の陽性コロニーが検出され、表１に示す遺伝子29個を見出した。
【００４８】
実施例２＜DysbindinとDysbindinの機能を調節する物質との結合活性を変化させる物質のスクリーニング＞
実施例１において見出したDysbindinの結合因子の一例として、dynactin 1(p150)(DCTN1)を用いて以下の検討を行う。本因子は、微小管を介した物質輸送に関わる因子として知られており、dynactin 1の異常が細胞内小器官の分布異常、神経細胞の移動に異常を来すことなどが知られている。また、神経伝達物質を含むシナプス小胞の輸送、取り込みにも関与する因子であることも明らかとなっている。これらのことから、両者の結合を阻害、又は低下させることで、(1)神経伝達系に異常を来すこと、(2)神経回路の形成時期に異常を示すこと、(3)神経細胞の形態に異常を来すこと、等が予想される。従って、Dysbindin-dynactin 1の結合が持つ意義を検討し、その機能レベルの変化を示す指標を決定することにより、新たな診断マーカーの作製ならびに根治薬の開発を進めることが可能となる。また、Dysbindin、dynactin 1のSNPsが両者の結合、及び下流の表現系に及ぼす影響を検討することでSNPsを用いた診断マーカーの開発が可能となる。
【００４９】
一例として、被検物質がDysbindin- dynactin 1の結合に影響を及ぼすか否かを両者の結合活性を指標としてスクリーニングすることにより、被検物質が、精神疾患の予防及び／又は治療に有用な物質であるか否かを迅速に見出すことができる。また、Dysbindin、Dynactin 1のSNPsを調べることによって診断マーカーを見出すことができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明のDysbindinの機能を調節する物質は、Dysbindinに結合することにより、Dysbindinの機能を調節することが可能となることから、Dysbindinの機能不全により生じる疾患の治療等に好適に用いられる。