(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫抑制病(疾患)を処置する製薬剤を製造するための、cAMP（二次メッセンジャー３’，５’−環状アデノシンモノフォスフェート）依存性プロテインキナーゼＡタイプＩの機能を無効とするインヒビター（阻害剤）の提供。【解決手段】cAMP-依存性プロテインキナーゼA（PKA）を阻害するRp-8-Br-cAMPS、Rp-8-Br-モノブチリル-cAMPS、Rp-モノブチリル-cAMPS、Rp-8-(4-クロロフェニルチオ)-cAMPS、およびRp-ピペリジノ-cAMPSからなる群より選ばれるcAMP類似体、リボザイム、アンチセンスDNAおよびPKAのアンカー作用領域に結合するペプチドが挙げられる。【選択図】図１
2010111688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Rp-8-Br-cAMPS、Rp-8-Br-モノブチリル-cAMPS、Rp-モノブチリル-cAMPS、Rp-8-(4-クロロフェニルチオ)-cAMPS、およびRp-ピペリジノ-cAMPSからなる群より選ばれる阻害剤、ならびに一以上の製薬上許容される補助剤または充填剤を含む製剤組成物。
【請求項２】
薬剤として使用するための、請求項１で定義された阻害剤。
【請求項３】
免疫抑制疾患を処置するために使用される、請求項１で定義された阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫抑制病(疾患)を処置する製薬剤を製造するために、cAMP依存性プロテインキナーゼＡタイプＩの機能を無効とするインヒビター（阻害剤）の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほ乳類の免疫系は、種々の可能性のある伝染性因子に対して生体を防御するために異なる戦略で進化した。侵入者に対して、特定かつ既往の応答を獲得し得ることが、養子免疫系の特色である。養子免疫系における主なプレーヤーは、BおよびTリンパ球であり、かつこれらの細胞による抗原の特定の認識は、機能的に非常に異なっているものの、幾らかの構造的類似性を有する受容体によって達成される。異なる受容体特性は、限定された数の遺伝子の体細胞再構成（somatic rearrangement）を経て可能とされ、かつクローン分布する。この系における主要な戦略は、ほとんどの何れも未知な抗原の認識をカバーする非限定的数の特異性を発生させることである。免疫記憶は、部分的に、特殊な抗原と反応するTおよびB細胞のサブセットのクローン的拡張の結果であり、かつ、生体が同一の抗原と二度目に遭遇したとき、より早く応答することを可能とする。
【０００３】
細胞増殖は、免疫活性のパラメータとして使用される。クローン選択説によれば、抗原に対する暴露は、受容体（レセプター）特異性に対応する個々のＢおよびＴ細胞の活性化を導く。しかしながら、一定の抗原に親和性を有する細胞の数は、全細胞数に対して、小さい分率（〜0,001％）である。このため、十分な免疫応答を生じさせるために活性化細胞が増殖（クローン的拡張）可能であることは極めて重大である。このように、増殖は、リンパ球の機能および免疫活性化能力を特徴付ける非常に重要なパラメータである。インビトロ実験では、抗原受容体複合体（TCR／CD3）に対する抗体を使用することにより単離したTリンパ球の全固体群を活性化することが可能となる。これは、T細胞が免疫活性化されて抗原受容体を介してクローン拡張した場合のインビボ状態を模擬しうる。T細胞の増殖は、cAMP信号経路を介して抑制されることが知られている。
【０００４】
サイクリックAMP依存プロテインキナーゼ（PKA）は、全ての細胞中に存在する酵素である。特定の受容体に結合したホルモンおよび神経伝達物質は、二次メッセンジャー3',5'-環状アデノシンモノフォスフェート（cAMP）の発生を刺激する。サイクリックAMPは最も一般的でかつ多機能の二次メッセンジャーの一つであり、PKAに結合することによってその作用を発揮し、かつPKAを活性化する。PKAは、細胞内部の多くの異なるプロテインをリン酸エステル化するセリン／テロミンプロテインキナーゼであり、これによってその活性を制御している。PKAが代謝、増殖、分別および遺伝子転写の調節など莫大な種類の細胞プロセッシングを調節することが知られている。PKAは４個の異なるサブユニット、すなわち調節サブユニット（R）二量体、および二個の触媒サブユニット（C）からなる。さらにまた、PKAアイソザイムの二個の主要なクラス、PKAタイプIとPKAタイプII（それぞれPKAIとPKAII）がすでに説明されている。PKAIおよびPKAIIは、それらのサブユニットR（RIおよびRIIで示される）によって区別される。RIおよびRIIの同形態は、RIα、RIβ、RIIα、RIIβと呼ばれる。さらに、サブユニットCもまた、Cα、CβおよびCγと引用される同形態として存在している。異なるサブユニットは、可能性として18以上の異なる機能の多形態PKA（アイソザイム）を形成することができる。
【０００５】
PKAはリンパ球機能の重要な負の調節剤である。本発明者らおよびその他は、cAMPが、T細胞抗原受容体／CD3複合体（TCR／CD3）によって誘発されるTリンパ球の増殖を抑制することを示した。我々は、T細胞がPKAIおよびPKAIIの両方を発現することを示した。しかしながら、cAMPの抑制効果を達成するには、PKAIの選択的活性化だけで充分である。加えて、我々は、PKAIIではなくPKAIが、TおよびB細胞、およびナチュラルキラー細胞上の抗原受容体によって、シグナルを共局在化し、かつ阻害するために再分布し、さらにTおよびB細胞におけるマイトジェン（有糸分裂誘発性）応答およびNH細胞中における細胞毒性応答を調節することを証明した。このように、PKAIは、抗原受容体を介して開始するリンパ球機能、たとえばマイトジェン様応答および細胞毒性応答などにおける重要な負の調節剤としての役割を果たしている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】G. M. Kammer, Immunol. Today 9, 22-2 (1988).
【非特許文献２】B. S. Skalhegg等, J. Biol. Chem. 267, 15707 (1992).
【非特許文献３】S. Skalhegg等, Science 263, 84 (1994).
【非特許文献４】B. Hofmann, P. Nishanlan, T. Nguyen, P. Insixiengmay, J. L. Fahey, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 6676 (1993).
【非特許文献５】S. Haraguchi, R. A. Good, N. K. Day, Immunol. Today 16, 595 (1995).
【非特許文献６】M. A. Nokta, R. B. Pollard, AIDS Res. Hum. Retroviruses 8, 1255 (1992).
【非特許文献７】Center for disease control and prevention: 1993 revised classification for HIV infection and expanded surveillance case definition for AIDS among adolescents and adults. MMWR 41, 1 (1992).
【非特許文献８】Gjertsen, B.T.等, J. Biol. Chem. 270, 20599-20607 (1995).
【非特許文献９】Hammer, S.M., N. Engl. J. Med, 337, 725-3 )33 ) (1997).
【非特許文献１０】Gulick, R.M., Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy. N. Engl. J. Med. 337, 734-739.
【非特許文献１１】Aukrust, P., Blood. 86:1383-1391 (1995).
【非特許文献１２】Aukrust, P. 等, Clin. Exp. Immunol. 89:211-216 (1992).
【非特許文献１３】Waldman. T.A.., J. Biol. Chem. 266:2681-2684 (1991)
【非特許文献１４】Eisenstein, E.M., J.S. Jaffe and W. Strober, J. Clin. Immunol. 13:247-258 (1993).
【非特許文献１５】Cunningham-Rundles等, N. Enal. J. Med. 33) 1:918-92-1 (1994).
【非特許文献１６】Anastasiou, E.D.等, J. Immunol. 148:2845-2852 (1992).
【非特許文献１７】Munoz, E., J. Exp. Med. 172:95-103) (1990).
【発明の概要】
【０００７】
HIVおよび一般的変異免疫不全（CIV） 
初期および二次免疫不全は、ともに、通性の感染および癌の発生率の増大を誘引し、かつ世界の全ての地域における罹患および死亡の原因を増大させる。ヒト免疫不全ビールス（HIV）は、多数の感染および一定の悪性形態（たとえば、リンパ腫およびカポジ肉腫）の発生を著しく増大させる重度免疫系機能不全を導く慢性感染を誘発する。米国内の多くのコミュニティーでは、HIV感染は「若い」成人の中で、死亡の主要原因である。先進国では、この問題は、さらに大きくなっている。免疫グロブリン(Ig)Ａ不全と並んで、一般的変異免疫不全（CIV）は原発性免疫不全の最も頻繁なタイプである。この形態の原発性ガンマグロブリン血症は、寿命の最初の２年後、重度に減少した血清IgGレベルおよび特に気道におけるバクテリア感染の再発による免疫不全の発症によって特徴付けられる。
【０００８】
免疫不全における細胞欠陥
T細胞の機能不全は、HIV感染の免疫的特徴である。不完全なリンパ球サイトカインの産生および刺激に対する損なわれた（損傷）増殖応答は、これらの患者における免疫不全の初期徴候であり、CD4+リンパ球数の減衰が観察される前でさえ明示される。損なわれた抗体合成をともなうB細胞機能不全は、CVI患者の主要な免疫特性である。しかしながら、CVIにおける免疫異常は、B細胞に限ったものではなく、たとえば刺激に際する損なわれた増殖応答などのT細胞機能不全をも含む。CVI患者におけるB細胞が、本質的にかつ必然的に欠陥があるわけではなく、損なわれたT細胞「ヘルプ」が、これらの患者におけるB細胞欠陥のために重要である。T細胞機能不全は、欠損のある抗体産生に必ずしも関係しない患者において、一定の臨床的徴候、たとえば増大した肉芽腫の発生および悪化のために重要である。
【０００９】
現在の治療法
抗レトロウイルス治療は、HIV感染患者の処置における主要要素である。しかしながら、効能のある抗レトロウイルスコンビネーション治療は、HIV感染患者のCD4+およびCD8+リンパ球数を著しく増大させるが、損なわれたT細胞機能は、実施例１、表１および２Ｂの観察に示されているように、持続しているようにみえる。このように、これらの患者における抗レトロウイルス治療に加えて、免疫調節剤が必要である。免疫グロブリン置換は、CVI患者の処置おける主要要素である。しかしながら、この置換治療は、欠陥のあるTおよびB細胞機能を回復させない。さらにまた、幾らかの臨床併発症、たとえば非チーズ化壊死肉芽腫および持続性ビールス感染において、より直接的にT細胞機能を内部変化させる治療が必要である。
【００１０】
T細胞機能不全をターゲットとした新規薬剤の治療可能性 
損なわれたT細胞機能は、HIV感染およびCVIの双方の良く認識された免疫的特徴であるが、このT細胞損傷における正確な分子メカニズムは知られていない。このような内部細胞欠陥に対する治療法は、これらの患者の処置に特に重要であり、かつHIV感染患者およびCVIを伴う患者における重大な免疫的欠陥を回復する可能性を有している。
【００１１】
ホフマンら（Aids,Vo17;659-664,1993）およびWO9-3／19766号は、AIDSを有していないHIV血清反応陽性個体が、内部細胞cAMPレベルと、HIV血清反応陽性被験者からの粗末梢血液単核細胞（PBMC）におけるPKA活性とにおいて有意な増大を示すことを、証明した。T細胞実験は、おそらくT細胞精製法により誘発されるより大きい変異性のため、データとして報告されておらず、かつ意味を持つに至っていない。彼らの研究は、さらに、2',5'ジデオキシアデノシン（ddAdo）のようなアデノシン類似体がPBMCにおける細胞内cAMPレベルを下げ、かつ細胞増殖を増大させることを示した。しかしながら、このような効果は、６ng/mlの範囲の濃度が有効であり、かつより高い濃度では、抑制されたり、さらにcAMPレベルを阻害しないというように濃度依存性であった。HIV患者のT細胞サンプルにおいて同様の効果は示されず、また単なる濃度／応答の関係性も示されなかった。彼らは実施例において精製したT細胞を使用したが、これらの細胞は健康な血液ドナーから採取され、未成熟T細胞活性を導く陽性セレクションによって精製されたものであった。
【００１２】
Chu-Chung、YS、GenieserHおよびJastorff,B(WO93)/21929-A)は、cAMPの３価のリン酸誘導体を使用し、cAMP依存プロテインキナーゼと拮抗させることによって癌細胞に適用する処置を示している。
【００１３】
概略すれば、生理的状態での免疫応答および細胞増殖に関するＴ細胞におけるcAMPレベルの役割は、従来技術では知られていない。さらにまた、生理的状態でのT細胞機能に関するプロテインキナーゼアイソエンザイムの役割、およびcAMP／PKAIが免疫活性を有するかどうか公知ではない。ホフマンら（上記参照）の結果は、単核細胞における増大cAMPレベルを示唆したが、T細胞における同様の状態をサポートする証拠を示していない。このように、cAMPレベルが、精製T細胞およびHIV＋被験者からの消極的に選択される（活性化されない）T細胞において増大するかどうか、およびCVIに罹患した患者におけるcAMP／PKA経路と何ら関係しないのかどうかについては知られていない。
【００１４】
このため、T細胞内のcAMP/PKA経路を妨害するのに好適な化合物を用いて、ビールス感染性ヒト免疫不全患者および一般変異性免疫不全患者におけるT細胞免疫機能を特に増大させ、かつT細胞機能障害を逆転させることが本発明の目的である。さらにまた、PKAタイプIの免疫調節剤としての役割が、全てのリンパ球細胞（T細胞、B細胞、NK細胞）に分配されるので、cAMP/PKA経路の崩壊はＢおよびNK細胞にも関係し得る。
【００１５】
この目的は、本発明の特許請求の範囲によって特徴付けられる。
プロテインキナーゼ依存のcAMPによって達成される効果の崩壊は以下の方法により行われる。
【００１６】
PKAアイソザイム−特定cAMP拮抗剤 
PKAの活性は、インビボで、cAMPにより、Rサブユニットを介して特に調整される。化学的に変性された拡散cAMPアナログが、cAMPの細胞内レベルを操作するのに使用できる。環状リン酸におけるリンが硫黄に置換した硫黄置換アナログは、ホスホジエステラーゼによる分解に対して耐性の化合物を生じる。さらにまた、硫黄置換アナログは、２個の形態を有することができる。即ち硫黄は、アデノシン環に対して、赤道位置または軸位置にあってもよい。軸状ジアステオロマー（Sp-cAMP-亜リン酸チオエステル、Rp-cAMPSおよび誘導体）はcAMP作用薬として機能するのに対し、赤道ジアステレオマー(Rp-cAMP-亜リン酸チオエステル、Sp-cAMPSおよび誘導体)は、RサブユニットのcAMP結合サイトに競争的に結合するが、酵素を活性化しない。より詳細な特徴は、Rp-cAMPSは、PKAIアイソザイム（RIα2C2、RIβ2C2）の唯一完全拮抗薬として、およびPKAIIアイソザイム（RIα2C2、RIIβ2C2）の半作用薬として作用することが証明された。生体細胞に有用なRp-cAMPSの拡散誘導体の例は、Rp-8-Br-cAMPS、Rp-8-Br-モノブチリル-cAMPS、Rp-モノブチリル-cAMPS、Rp-8-Cl-cAMPS、Rp-8-(4-クロロフェニル-チオ)-cAMPS、Rp-ピペリジノ-cAMPである。
【００１７】
遺伝子機能ノックアウト方法
PKAの特定アイソザイムによって介在される効果は、酵素複合のサブユニット生成を抑制することによって、崩壊しうる。これは、mRNAとハイブリッド形成し、PKAサブユニットの翻訳を遮断する特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することによって、達成できる。もう一つの方法は、サブユニットの合成を抑制するため、PKAのサブユニットのためのmRNAを特に認識し、開裂するハンマーヘッド型リボザイムを使用することである。
【００１８】
リボザイム 
リボザイムは、リン酸エステル結合の形成および開裂を触媒するRNA分子である。エンドリボヌクレアーゼ活性を有する短オリゴヌクレオチドの発見は、特定の遺伝子の発現を阻害する重要なツールを、研究者に提供した。ハンマーヘッドドメインは、遺伝子特異的アンチセンス転写における組み込みのための好適な候補であり、mRNAにおける標的GUCシーケンスにて、酵素的開裂を誘発し、かつ次のmRNAプロテインへの翻訳を崩壊する。リボザイムは、細胞にRNAとしてトランスフェクションされるか、あるいはプロモーターの制御下に細胞内でリボザイムが転写されるミニ遺伝子として導入されうる。さらにまた、リボザイムは、浸透性を向上させるため、リボース部分の２位にアルキル基を付加して化学的に変性されてもよく、あるいは、細胞内効果を2-デオキシ-シトシンまたは2-デオキシ-ウラシルで置換することによって、延長してもよい。
【００１９】
特定のシーケンスアンチセンスオリゴヌクレオチド
特定のmRNAsに対してアンチセンスなオリゴヌクレオチドは、DNA／RNAヘテロ二重鎖におけるRNAに結合し、mRNAのプロテインへの翻訳を、翻訳機構による動き及び読み取りを阻止することによって阻害する。硫黄置換アナログは、分解に対してより安定であり、かつ特定の遺伝子のブロック翻訳にトランスフェクションされうる。
【００２０】
アンカーの破壊
一定の副細胞因子座における特定のcAMP-介在効果が、当該副細胞位置で基質に非常に接近したAキナーゼアンカーリングプロテイン（AKAPs）における両親媒性ヘリックスドメインとの疎水性相互作用を介して、PKAタイプIIのアンカーリングに依存することが示された。22-アミノ酸競争ペプチドによって、リポソーム介在ペプチド翻訳により導入された相互作用ドメインへのアンカーリングを破壊することは、PKAタイプIIによって介在されるアイソザイム特異的効果を喪失することが示された。同様の効果は、現在のところまだ、PKAタイプIでは、示されていない。PKA競争ペプチドの例は、
22-mer  H2N-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Tyr-COOH, (SEQ.ID. NO 1) 
H2N-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-COOH, (SEQ.ID. NO 2) 
H2N-Gln-Val-Ile-Ser-Glu-Ala-Thr-Gln-Val-Leu-Ala-Thr-Thr-Val-Gly-Lys-Val-Ala-Gly-Arg-Val-Cys-Gln-Ala-COOH, -(SEQ.ID. NO 3) および
H2N-Val-Gln-Gly-Asn-Thr-Asp-Glu-Ala-Gln-Glu-Glu-Leu-Ala-Trp-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Ile-Val-Ser-Asp-Val-Met-Gln-Gln-Ala-His-His-Asp-Gln-Pro-Leu-Glu-Lys-Ser-Thr-Lys-Leu-COOH (SEQI.D. NO 4).
本発明によれば、T細胞免疫応答のcAMP-誘発阻害の崩壊は、PKAタイプI／RIαを無効とすることにより得ることができる。次いで、PKAタイプIRIαに対するハンマーヘッド型ヘッドリボザイムを合成し、インビトロで実験し、末梢血液T細胞のトランスフェクションに続いて、完全に活性のあることが示された。リボザイム処理の機能的結果は、抗-CD3誘発増殖として測定され、我々はCAMPへの感度の可逆性を証明した。
【００２１】
PKAタイプIのRIαサブユニットをノックアウトするために設計されたハンマーヘッド型リボザイムは
GUACUGCCACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUCCAUG (SEQ.ID. NO 5) および
GGCGGUACUGCCACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUCCAUGGA (SEQ.ID. NO 6).
RIαへのアンチセンスオリゴの例は、
GTACTGCCAGACTCCATG (SEQ.ID. NO 7) および
GGCGGTACTGCCAGACTC CATGGT (SEQ.ID.NO 8)
これらのアンチセンスヌクレオチドは、ハンマーヘッド型リボザイムの標的シーケンスからなる。
【００２２】
アンカー作用の破壊は、以前にPKAタイプII転座について示されているが、PKAタイプIについては示されていない。PKAタイプIアンカー作用タンパク質のクローニングにより、我々は、血液細胞発現ライブラリーのスクリーニングに際してRIαをプローブとして採用するファーウェスタン技術を用いてきた。さらに、我々は、酵母の2-ハイブリッドシステムを使用して、相互作用タンパク質を検出している。結合ドメインは、欠失性マッピングおよび突然変異分析を特徴としている。AKAPの可溶性フラグメントの発現を導く競争ペプチドおよびトランスフェクションベクターが設計された。
【００２３】
本発明者らが行い刊行した前の観察(2，3)に基づけば、プロテインキナーゼAタイプI（タイプIIアイソザイムではない）の活性化が、免疫機能のcAMP-依存性阻害、例えば抗原受容体により誘発されるTおよびB細胞の増殖、または特異的NK細胞受容体により媒介されるNK細胞毒性を媒介するのに必要かつ充分である。さらに、プロテインキナーゼAタイプIは、TおよびB細胞の活性化およびキャッピングに際して、抗原受容体複合体へ再分布し、かつ該複合体とともに局在化する(3)。プロテインキナーゼAタイプIのこのアンカー作用は、リンパ球上の受容体により媒介される免疫応答の変更における、この特異的アイソザイムの役割を支持している。
【００２４】
本発明に関連して本発明者らが行った発見は、HIV感染またはCVIの患者からのＴ細胞中ではプロテインキナーゼタイプIの活性化が増大することを示している。さらに、PKAのこのアイソザイムの活性化は、PKAのタイプIIではなくタイプIアイソザイムを選択的に阻害することにより逆転可能な免疫機能の阻害に導くことが実証される。これらの知見に基づいて、本発明は、免疫不全(HIV、CVI)におけるプロテインキナーゼAタイプIの不適切な活性化を逆転し、これによってT細胞機能および免疫応答性を快復させることを目的とした化合物の使用と要約することができる。添付の実施例は、以下の処方物が全て、プロテインキナーゼAタイプIのシグナリングと相互作用すること、また、プロテインキナーゼAタイプIの不適切な活性化を標的とし、無効とするために、それらを別個にまたは組み合わせて使用できることを示す。
【００２５】
プロテインキナーゼAタイプIの阻害剤として作用する処方物／配合物は、以下の以下の機能を果たす。
１） プロテインキナーゼAタイプI選択的かつ競争的な、cAMPの完全な拮抗剤を使用して、プロテインキナーゼＡタイプIIではなくプロテインキナーゼAタイプIのリガンド-依存性活性化が阻害される(実施例１、２)。
【００２６】
２） アンチセンス（antisense）オリゴヌクレオチドまたはリボザイムを使用して、プロテインキナーゼAタイプIの機能が、PKAのこのアイソザイムを除去することにより阻害される(実施例３)。
【００２７】
３） プロテインキナーゼAタイプIを、抗原受容体複合体でのそのアンカー作用から立ち退かせる競争ペプチドを使用して、プロテインキナーゼAタイプIの機能が、T細胞中での免疫機能の阻害に対して関連する抗原受容体複合体の基質から活性化酵素を除去することにより阻害される(実施例４)。
【００２８】
従って、本発明によれば、cAMP依存性プロテインキナーゼAタイプIの機能を消滅させる阻害剤を使用して、免疫抑制疾患を処置するための製剤調製物が製造される。
活性化合物は、処置が必要な患者に、この技術分野で公知の全ての全身的投与経路で投与される。従って、本発明に係る薬剤は、活性化合物成分、補助剤、製薬上許容される充填剤から構成され、任意の投与形態の選択により、錠剤、坐剤、注射用液体、注入用液体および粉末を包含する。さらに、活性化合物（１以上）(リボザイム、タンパク質)は遺伝子産物として細胞内に発現され、その発現は、問題の細胞中に導入された遺伝子（１以上）から誘導される。遺伝子発現は、問題の細胞中で活性なプロモーターから誘導され、ゲノム中に組み込むための線状または環状DNAベクターのいずれの形態でも挿入することができ、独立して輻射されるか、あるいは一時的にトランスフェクションされ／発現される。DNAのベクターの送達は、この技術分野で公知の全ての方法で達成できる。
【００２９】
T細胞cAMP-PKA通路を変更するように誘導された化合物の必要条件は、少なくとも、T細胞中への拡散性およびホスホ-ジエステラーゼによる分解に対する抵抗性である。本発明は、Rp-cAMPの誘導体、例えばRp-8-Br-cAMPSはインビトロで、HIV陽性患者からの、および共通の不定免疫不全患者の精製T細胞の増殖を特に増大させることを実証した。HIV患者からのT細胞の、抗-CD3で誘発され非常に減少したT細胞増殖を調査したとき、拮抗剤Rp-8-Br-cAMPSの使用が相補的cAMP作用剤の効果を逆転させるだけでなく、未処置の細胞でのレベルを超えて増殖をさらに増大させることをも本発明者らが観察したという知見は、特に驚くべきことであった。用いた濃度範囲(0〜1000mM)内で、[3H]-チミジン取り込みにより発現されたT細胞増殖は、濃度と相関関係があった。CAMP拮抗剤の使用による増加したT細胞増殖は、正常被験者では示されたかった。
【００３０】
以下に、実施例および図面により本発明をさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】(A)正常健康血液ドナー(n=10)およびHIV-感染患者(n=9)からの末梢血液CD3+Ｔ細胞中の内因性（内存的）cAMPレベル。内因性cAMPレベルは、正常健康血液ドナー(n=10)およびHIV-感染患者(n=9)からの末梢血液CD3+T細胞において試験された。CM+T細胞は陰性選択により４℃で単離された。中央値（水平線）および個別の患者のデータ（白丸）が示される。* はp<0.05を示す。(B)正常健康血液ドナーおよびHIV-感染患者からの末梢血液CM+T細胞のTCR/DC-3刺激増殖は、増加する濃度の8-(4-クロロフェニルチオ)cAMP(8-CPT-cAMP)の存在下での[JH]-チミジン取り込みとして評価された。曲線-フィット分析を行い、IC50値を計算した(統計および個別の患者のデータについては表１および２ａ参照)。正常健康血液ドナー（白丸）および代表的HIV-感染患者（黒丸、表２ａの患者#10）からのＴ細胞増殖の標準化レベルが示される。(IC50値6.11μM対1.78μM)。注：IC50の左シフト（矢印）および変化した曲線の傾斜。増殖の最高レベルは、HIV-感染患者からのＴ細胞で劇的に減少した(表１参照)。
【図２】プロテインキナーゼＡのレベル。(A)正常血液ドナー(レーン１)および症候性HIV-感染患者（レーン２）におけるPKA-サブユニットのmRNAレベルのノーザンブロット分析。総RNAを抽出してノーザンブロット分析にかけ、得られたフィルターをPKAサブユニットRIα、RIIα、CαおよびCβに対する32P-標識プローブでハイブリダイズさせた。28Sおよび18S rRNAの移行は矢頭で示される。シグナル強度は、好適に照射されたオートラジオグラムの密度測定走査で評価され、移動前の臭化エチジウム（エチジウムブロミド）染色ゲルの写真を密度測定走査することにより負荷の差に関して補正された。(B)PKAサブユニットの免疫ブロット分析。２人の正常血液ドナー(レーン１および２)、無症候性HIV感染を有する２人の個々のHIV-感染患者(レーン３および４)、および症候性HIV感染を有する３人の患者（レーン５、６および７）からのCD3+T細胞の試験。矢頭は、PKAサブユニットに対する精製組み換え標準の移行を示す。等しい負荷が、クーマシー染色ゲルの密度測定走査で証明された。免疫ブロットの密度測定分析は、患者サンプル対コントロールのタンパク質レベルに差がないこと(RIα、C)、または僅かな差(RIIα、15%増加、レーン１および２対レーン５〜７）を示した。
【図３】cAMP作用剤（アゴニスト）Sp-8-ブロモ-cAMP-ホスホロチオエート(Sp-8-Br-cAMPS)によるTCR/CD3刺激Ｔ細胞増殖の阻害、および相補的cAMP拮抗剤（アンタゴニスト）Rp-8-ブロモ-cAMP-ホスホロチオエート(Rp-8-Br-cAMPS)による阻害の逆転は、正常健康血液ドナー(A)およびHIV-感染患者(C)において評価された。正常血液ドナー(13)およびHIV患者(D)から単離されたCD3+T細胞のTCR/CD3刺激増殖に対する増加するcAMP拮抗剤投与量の効果は、同じ実験において別に試験された。(A)および(B)は、３人の健康血液ドナーからのプールして精製されたCD3+T細胞の増殖を示す。(Q)および(D)：１人の症候性HIV-感染患者からのＴ細胞増殖。３連測定の平均値±SDが示される。まとめた患者のデータについては表１参照。注：上のパネルおよび下のパネルではスケールが異なる。
【図４】CVI患者および健康コントロールからのＴリンパ球中の内因性cAMPレベル。(A)13人のCVI患者および10人の健康コントロールからの陰性選択したＴリンパ球中のcAMPレベル。データは中央値として示される。誤差バーは、第25〜第75百分位数を示す。* P<0.05対コントロール。(B)1人の代表的CVI患者（黒丸）および１人の健康コントロール（白丸）における抗-CD3刺激Ｔリンパ球増殖に対する、増加する濃度のcAMP作用剤8-(4-クロロフェニルチオ)cAMP(8-CPT-cAMP)の効果が示される。最高増殖は100%に規格化された。曲線-フィット分析はSigmaプロットを用いて行われ、IC50値が計算され、CVI患者からのＴリンパ球の値がコントロールと比較して著しく減少したことを実証した(2.26μM対4.66μM)。CVIグループおよびコントロールとの間の統計については表II参照。注：IC50の左シフト（矢印）および変化した曲線の傾斜(Hill係数)。
【図５】cAMP作用剤および拮抗剤によるＴ細胞増殖の変調。cAMP作用剤(SP-8-Br-cAMPS)によるＴリンパ球の抗-CD3刺激増殖の阻害、およびその相補的PKAタイプＩ選択的拮抗剤(Rp-8-Br-cAMPS)による阻害の逆転が、１人の健康コントロール(A)および１人の代表的CVI患者(C)において示される。抗-CD3刺激Ｔリンパ球増殖に対するRp-8-Br-cAMPSの増加する濃度の効果も別に試験され、１人の健康コントロールおよび１人の代表的CVI患者からの結果が、それぞれパネル(B)および(D)に示される。データは３連測定の平均値±SDとして与えられる。CVIグループおよびコントロールとの間の統計については表II参照。
【図６】Ｔ細胞からのIL-2放出に対するcAMP拮抗剤の効果。選択的PKAタイプＩ拮抗剤Rp-8-Br-cAMPS(Rp)を異なる濃度で添加して、または無添加で、20時間培養した後の抗-CD3刺激Ｔリンパ球からの上澄み液中のIL-2レベルが示される。パネルＡ：健康コントロール。パネルＢ：代表的CVI患者。データは３連測定の平均値±SDとして与えられる。CVIグループおよびコントロールとの間の統計については表４参照。* P<0.001対拮抗剤無添加のIL-2レベル。** P<0.001対拮抗剤無添加のIL-2レベル。
【図７】IL-2およびcAMP拮抗剤によるＴ細胞増殖の変調。抗-CD3刺激Ｔリンパ球増殖に対する1000μMのRp-8-Br-cAMPS(Rp)の添加または無添加での増加する濃度のIL-2（２単位（ユニット）/ng）の効果が、１人の健康コントロール(A)および１人の代表的CVI患者(13)について示される。データは３連測定の平均値±SDとして与えられる。
【図８】プロテインキナーゼＡタイプＩのRIαサブユニットに対するリボザイム(ribozyme)を使用することによる、TUR/CD3刺激Ｔ細胞増殖のcAMP-媒介阻害の逆転。8-CPT-cAMP(12.5μM)の不存在（黒バー）および存在（白バー）において、リポソーム単独（擬似、mock）を用いるか、またはリポソームおよびRIαリボザイム(RIα rbz、10μM)を用いて処置した後の正常健康血液ドナーからの末梢血液CD3+T細胞のTCR/CD3刺激増殖。
【図９】T細胞におけるプロテインキナーゼAタイプIのRIαサブユニットのTCR/CD3関連アンカー作用と競争する競争剤ペプチドを用いたTCR/CD3刺激Ｔ細胞増殖のcAMP-媒介阻害の逆転。リポソーム単独(mock)を用いるか、あるいは増加する濃度(25〜100μM)の、PKAタイプIIに対する競争剤ペプチド(Ht-31)（これはアンカー作用と競争する）またはコントロールペプチド(Ht31-P)を用いて処置した後の正常健康血液ドナーからの末梢血液CD3+T細胞のTCR/CD3刺激増殖。注：コントロールペプチド(Ht-31P)ではなく、Ht31競争剤ペプチドの濃度が増加するにつれて、トランスフェクション後のcAMPに対する感度は減少した。
【図１０】増加する濃度の8-CPT-cAMPの存在における末梢血液CD3+T細胞のTCR/CD3刺激増殖。リポソーム単独で擬似トランスフェクトした（黒丸、連続線）か、あるいはリポソームおよびプロテインキナーゼAタイプIのアンカー作用と競争するHt31ペプチド(35μM)とともにインキュベートした(白丸、点線)、T細胞増殖の規格化レベルが、48時間後の[3H]-チミジン取り込みとして評価された([3H]-チミジンはこの48時間中の最後の18時間に添加された)。注：8-CPT-cAMPの存在においてIC50が1.8から4.8μMまで右にシフト(矢印)。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
実施例においては下記の方法が用いられた。
ヒト末梢血液CD3+T細胞は、正常健康ドナー(Ullevaal University Hospital Blood Center，Oslo，Norway)または患者からのヘパリン処置血液50mlから陰性選択することにより精製された。簡単には、末梢血液単核細胞は密度グラジエント(Lymphoprep，NycoMed，Oslo，Norway)遠心により単離され、次いでCD14およびCD19に対する抗体で直接被覆された単分散磁性ビーズ、およびCD56に対する抗体および磁石で被覆されたラット抗マウス-IgGビーズを用いて陰性選択された。磁性ビーズは全てDynalから入手されたが(Oslo，Norway，それぞれcat．no．111.12、111.04および110.11)、抗-CD56抗体はPharmingenから入手された(San Diego，CA.，cat．no.31660.d)。全ての工程は４℃で行われた。細胞懸濁液は、蛍光性抗体およびFacScan(Becton-Dickinson，San Diego，CA)を用いた流動細胞計算によりルーチンにスクリーニングされ、90%より多いCD3+細胞、および低レベルのCD14+細胞(<2%)、CD19+細胞(<2%)およびCD56+細胞(<5%)からなることが示された。
【００３３】
末梢血液CD3+T細胞の陰性選択
末梢血液CD3+T細胞は、正常健康ドナー(Ullevaal University Hospital Blood Center，Oslo，Norway)または患者からのヘパリン処置血液50mlから陰性選択することにより精製された。簡単には、末梢血液単核細胞は密度グラジエント(Lymphoprep，NycoMed，Oslo，Norway)遠心により単離され、次いでCD14およびCD19に対する抗体で直接被覆された単分散磁性ビーズ、およびCD56に対する抗体および磁石で被覆されたラット抗マウス-IgGビーズを用いて陰性選択された。磁性ビーズは全てDynalから入手されたが(Oslo，Norway，それぞれcat．no．111.12、111.04および110.11)、抗-CD56抗体はpharmingenから入手された(San Diego，CA.，cat．no.31660.d)。全ての工程は４℃で行われた。細胞懸濁液は、流動細胞計算によりルーチンにスクリーニングされ、90%より多いCD3+細胞、および低レベルのCD14+細胞(<2%)、C19+細胞(<2%)およびCD56+細胞(<5%)からなることが示された。
【００３４】
環状AMPの定量
内因性cAMPのレベルは、末梢血液CD3+T細胞において試験された。CD3+T細胞は４℃で陰性選択により単離され、３連のサンプル（2x106細胞）が収穫され、次いで他の文献(8)に記載されたようにしてcAMPが抽出され細胞内cAMP含有量が分析された。cAMPの基底レベルが示され、４℃で粗製末梢血液単核細胞およびCD3+T細胞の両方において120分より長い間（CD3+T細胞の精製に必要な時間間隔）安定であった(データは示されない)。
【００３５】
増殖アッセイ
増殖アッセイは、底部96-ウェルマイクロタイタープレートにおいて100μl体積で0.75x106CM+T細胞/mlのインキュベーションによって行われた。活性化は、続いて、ヒツジ抗-マウスIgGで被覆された単分散磁性ビーズ(Dynal，cat．no．110.02)を１：１の細胞／ビーズ比で添加した後、示された実験について抗CD3（クローンSpvT3b）を１：125,000の最終希釈で添加することにより達成された。抗体の最適濃度は、初期セットアップにおいて注意深く力価測定され、抗体の幾つかの異なる希釈における平行実験が常に行われた。増殖は、細胞を72時間インキュベートすることにより分析され、その間、最後の16時間に[3H]チミジンが添加された。細胞は洗浄され、Scatronハーベスター(Suffolk，UK)を用いてフィルター上で収穫され、次いでβ-シンチレーション計数により分析された。cAMP類似体は、使用される場合、抗-CD33抗体の添加による活性化の前30分に添加された。8-CPT-cAMPはSigorna（ST．Louis，MO）から、Sp-およびRp-8-Br-cAMPSはBioLog Life Science Company(Bermen，Germany)から入手され、全てはPBS中に４〜10mMの濃度に溶解され、濃度は製造者により与えられた消光係数を用いて計算された。
【００３６】
IL-2レベルの決定
IL-2レベルおよびIL-2受容体結合を決定するために、陰性選択されたCD3リンパ球（106/ml，200μl/ウェル）は、異なる濃度のRp-8-Br-cAMPSと一緒の前インキュベーションを行うかまたは行わずに、培地単独中で、または抗-CD3(クローンSpvT3b)で刺激して培養された。抗-CD3抗体は、免疫磁性ビーズで架橋されたか((IL-2レベル；最終抗-CD-3)希釈率１：125000)、あるいはウェル上で前もって被覆された(IL-2受容体；最終希釈率１：1500)。20時間の培養の後、細胞を含まない上澄み液が収穫され、分析するまで-80℃で保存された。上澄み液中のIL-2レベルは、ELISA（R&R Systems，Minneapolis，MN)により決定された。
【００３７】
単球上澄み液中のプロスタグランジンＥ2(PGE)レベルの決定
刺激細胞（大腸菌026B6からのLPS；最終濃度10ng/n-LL，Sigma）および非刺激細胞（3x105単球/mL，200μl/ウェル）は、RPMI 1640(Gibeo)中で10%のヒトAB血清を補充した２mmol/LのL-グルタミンとともに、または血清を含まない培地(X-Vivo;Bio Whittaker，Inc.)中で培養された。細胞を含まない上澄み液が24時間後に収穫され、PGE2がELISA(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)により決定された。
【００３８】
その他
特に言及しない場合、当業者に公知の方法が用いられた。
［実施例１］
環状AMPは、T細胞受容体／CD3-複合体(TCR/C3)により誘発されるT細胞増殖、ならびに抗原受容体の従事に続く初期チロシンリン酸化を完全に消滅させる(1，2)。我々は先に、T細胞シグナリングに対するcAMPの阻害効果を媒介するためには、cAMP-依存性プロテインキナーゼ(PKA)タイプIを活性化することが必要かつ充分であること、また、PKAタイプIはT細胞の活性化およびキャッピングの間に抗原受容体へ再分布し、これらとともに局在化することを示した(2，3)。これは、PKAタイプIを、T細胞抗原応答およびクローン拡張（増大）の急性の負モジュレーター（調節剤）として証明するのに役立つ。T細胞機能不全は、HIV-感染の経過における初期の出来事であり、重い免疫不全の進行における主要なファクターである。しかしながら、それによってHIVがT細胞機能を害する分子メカニズムは、明らかにされていない。最近の二つの刊行物は、HIV-誘導ペプチドが、インビトロでcAMPレベルを増加させうるという指標を提供している(4，5)。さらに、cAMP処置は、HIVリバーストランスクリプターゼ（逆転写酵素）活性を、培養T細胞ラインにおいて５〜10倍増加させた(6)。これは、ともに、HIV-感染T細胞中のサーキュラス・ヴィチオスス(Circulus vitiosus)を証明するのに役立てることができる。しかしながら、cAMPシグナリング経路とHIV-誘発T細胞機能不全との間のつながりは、まだ証明されていない。この理由のため、我々は、高活性抗レトロウイルス療法の前および後のHIV-感染患者からの精製T細胞におけるT細胞免疫機能のcAMP媒介阻害の可能な役割を調査した。我々は、PKAタイプIの増加した活性が、HIV-感染個体からの細胞中でのT細胞増殖を、進行中の有力な抗レトロウイルス療法とは無関係に、有意に阻害すること、また、この効果がPKAタイプIの特異的拮抗剤により逆転できることを実証する。
【００３９】
結果
HIV-感染個体からのＴ細胞中での上昇したcAMPレベル
９人の一貫性HIV-感染患者（臨床的状態とは無関係）からの陰性選択された高度精製T細胞において、cAMPの内因性レベルは、10人のHIV血清陰性血液ドナーから同時に単離されたCM+T細胞中のレベルと比較して、有意に上昇した(1238対688 fmol、106細胞、P<0.05、図１Ａ参照)。さらに、TCR/CD3-誘発増殖に対するcAMP作用剤の効果が、HIVプロテアーゼ阻害剤を用いた有力な抗レトロウイルス療法を受けていない18人の個々のHIV-患者、および８人の血清陰性コントロールにおいて調査された(表１および２ａ参照)。患者は二つのグループに分類され、（7）に従い、一方のグループは無症候性であり、他方は症候性HIV感染であった（AIDSおよび非-AIDS）(表１)。HIV-感染患者からのＴ細胞は、外因的に添加した8-CPT-cAMPによる細胞増殖の阻害に対する感度の極めて有意な増加を明らかにした(図１Ｂ、表１および２ａ、P<0.001、n=18)。
【００４０】
さらに、HIV-感染患者からのT細胞の最大増加率を100%に規格化したとき(図１Ｂ、データは示されない)、明確に左にシフトしたcAMP-阻害曲線に加えて、曲線の勾配が有意に異なることが明らかであった(HIV血清陰性個体からのT細胞では1.19(1.13-1.40)、これに対して正常T細胞では1.59(1.40-1.81)のHill係数、表１、P<0.01、n=18)。cAMP類似体による阻害に対する感度の低下は、PKAタイプIのプライミング（第一）cAMP結合部位Ｂにおける内因性cAMPの上昇、これに続く外因的に添加されたcAMP類似体のためのＡ部位の親和性増加からの寄与を示唆している。曲線勾配が、2-リガンド部位結合の協同的状態から8-CPT-cAMPによる明らかに非-協同的阻害曲線にシフトすることもまた、内因性cAMPによるB-部位占有期間を示している。
HIV-感染患者からのCD3+T細胞中のPKAタイプIの不変レベル
次に我々は、HIV-感染患者におけるPKAサブユニットのレベルを、正常血液ドナーと比較して試験した。図２Ａは、３人の血液ドナーから抽出された総RNA(レーン１)、および症候性HIV-感染を有する10人の患者からのCD3+細胞から抽出された総RNA中のPKAサブユニットのmRNAレベルを示す。正常血液ドナーと比較して、HIV-感染患者におけるRIαおよびCβのmRNAレベルには変化が見られなかった。症候性HIV感染を有する患者におけるRIIaのためのmRNAでは僅かな増加(20%)が見られたのに対し、CαmRNAレベルでは20%の減少が見られた。免疫ブロット分析(図２Ｂ)は、さらに、RIαのタンパク質のレベル（上のパネル）が、２人の正常血液ドナー（レーン１および２）と比較して、非症候性患者(レーン３および４)、ならびに症候性患者（レーン５、６および７）において変化しなかったことを実証した。RIIaのためのタンパク質レベル（中央のパネル）は、密度測定走査により評価した正常コントロールと比較して、症候性HIV感染を有する患者では極めて僅か（15%の減少）であることを明らかにした。Cサブユニットのレベルは、CαおよびCβの両方と反応する抗体により検出したところによれば、変化しなかった(下のパネル)。このように、RIαおよびCαまたはCβで構成されるPKAIのレベルは、変化しないようでありHIV感染患者におけるPKAII(RIIαおよびCで構成される）のレベルでは、極めて緩和な変化だけが見られた。
【００４１】
PKAタイプI拮抗剤はHIV-感染患者からのT細胞のT細胞増殖を改善する
TCR/CD3-誘発T細胞増殖の阻害の特異性をさらに評価するために、我々は、PKAタイプIの完全拮抗剤として働くイオウ置換cAMP類似体(Rp-8-Br-cAMPS)を使用した(8)。図３Ａは、正常血液ドナーからのT細胞において、TCR/CD3-刺激増殖がcAMP作用剤(Sp-8-Br cAMPS)によって阻害されたことを示す。この効果は、増加した濃度の相補的拮抗剤(Rp-8-Br cAMPS)によって殆ど完全に逆転された。しかしながら、拮抗剤単独では、正常T細胞の増殖を変化させなかった(図３Ｂ)。これとは対照的に、HIV-感染患者からのT細胞のTCR/CD3-誘発増殖を調査したとき、我々は、拮抗剤(Rp-8-Br-cAIWPS)の使用が相補的作用剤の効果を逆転させただけでなく、増殖を未処置Ｔ細胞でのレベル以上にさらに増加させたことを観察した(図３Ｃ)。cAMP拮抗剤単独の効果をHIV-感染患者からのＴ細胞において評価したとき、我々は、TCR/CD3-誘発増殖の濃度依存性増加を観察し、これは、より高い濃度のときに２倍を超えた(図３Ｄ)。cAMP拮抗剤での処置後の増殖増加度は、拮抗剤の不存在におけるTCR/CD3-誘発増殖のレベルと反比例し(p<0.001，R=0.78、n=18、表１)、すなわち、T細胞は、殆どがcAMP拮抗剤処置から利益を得るTCR/CD3刺激に対してほとんど応答しなかった。cAMP拮抗剤の刺激効果は、用いた最高濃度においても飽和されなかった(図３Ｄ；同様のデータ（示されない）は表２中の全ての患者で得られた)。これは、化合物の可溶性、細胞への親和性またはその利用可能性が、観察された効果に対する制限ファクターでありうることを示している。このように、より透過性が高く有力なPKAタイプI拮抗剤は、利用可能な場合に、HIV-感染患者からのTCR/CD3-誘発T細胞増殖をさらに改善することができる。
【００４２】
高活性の抗-レトロウイルス療法中の患者はPKAタイプI拮抗剤を用いて改善できる、持続性T細胞機能不全を有する
最近、HIVプロテアーゼ阻害剤は、HIV-1疾患の進行を遅れさせること、および血漿HIV RNAレベルを強力に減少させることが見出された(9，10)。この理由のため、我々は次に、HIVプロテアーゼ阻害剤インジナヴィア(indinavir)をヌクレオシド類似体と組み合わせて用いた有力な抗-レトロウイルス療法を受けた９人の症候性HIV-感染患者からのT細胞増殖、cAMP感度およびT細胞に対するcAMP拮抗剤の効果を試験した。TCR/CD3-誘発増殖応答は、プロテアーゼ阻害剤を受けなかった症候性HIV-感染を有する非治療患者と比較して増大した(p<0.05；表１の下の部分および表２)。しかしながら、治療患者からのＴ細胞の免疫応答は、コントロールと比較して、いっそう有意に減少され(p<0.001)、HIV-特異的Ｔ細胞機能不全は、有力な抗レトロウイルス療法にもかかわらず持続することを示した。さらに、cAMPによる阻害に対する感度は、正常コントロールと比較して、いっそう有意に増大し(p<0.01)、cAMP拮抗剤を用いた高活性の抗レトロウイルス療法中の患者からのT細胞のインキュベーションは、正常個体からのT細胞のインキュベーションと比較して、有意に改善された(p<0.05)。加えて、このグループの単一患者のデータは、有力なレトロウイルス療法を受けた患者間で異質性を明らかにした(表２ｂ)。９人の患者のうち６人からのＴ細胞増殖は、Rp-8-Br cAMPSから投与量依存性様式で利益を受けたが(免疫応答が1.5〜2.8倍の増加)、正常以下の増殖応答を有する３人の患者からのT細胞は、cAMP拮抗剤に応答しなかった(未処置の細胞増殖の0.98〜1.11倍の増殖)。これは、拮抗剤の不存在におけるTCR/CD3-誘発増殖レベルおよびcAMP拮抗剤を用いた処置の効果が反比例することに反映される(p<0.01、R=0.81、n=9)。すなわち、持続性T細胞機能不全を有する患者からのT細胞のみが、cAMP拮抗剤を用いた処置から利益を受けた。表１および２ａにおいて試験した18人の未治療患者のうち４人を高活性抗レトロウイルス療法の開始後に追跡すると、処置の開始後に増加したT細胞増殖応答を示した(表２ａおよび２ｂを比較せよ)。しかしながら、患者の２人からのＴ細胞は、免疫応答がひどく抑制されたままであり(ａおよびｂの符号)、これらの患者からのＴ細胞増殖は、それでもなおcAIVIP拮抗剤とのインキュベーションから利益を受けた。他の２人の患者（ｃおよびｄの符号）からの細胞は、有力な抗レトロウイルス療法の開始後に正常以下のT細胞増殖レベルに達し、Rp-8-Br-cAMPSとのインキュベーションから利益をさらに受けなかった。
【００４３】
【表１】
2010111688.tif 000003
【００４４】
【表２ａ】
2010111688.tif 000004
【００４５】
【表２ｂ】
2010111688.tif 000005
【００４６】
［実施例２］
この研究は、CVI患者からのT細胞中における増加する内在cAMPレベルを初めて示し、かつより重要なことに、PKATの選択的阻害が、阻害T細胞機能を有するCVI患者の抗-CD3-誘発T細胞増殖を、著しく改善しまたはあるケースでは完全に修復たことを示している。これら発見は、CVIにおけるT細胞欠損の可能性のある細胞内機構を示し、かつcAMP/PKAI系がこれら患者における免疫調節治療のために標的となり得ることを示唆する。
【００４７】
PBMC増殖におけるcAMP拮抗剤の効果
CVIの阻害T細胞機能におけるcAMP/PKAI系の可能性のある役割に注目するために、最初に、20人のCVI患者および15人の健康なコントロールにおいて、PKAI(8)の完全拮抗剤として働くイオウ置換cAMP類似体（Rp-8Br-cAMPS）がPBMCの抗-CD3刺激増殖を改善するかどうかを試験した。前出の結果(12、11)を確認すると、刺激リンパ球増殖が、コントロールの被検者（データは示していない）と比較して、CVI集団において有意に阻害されていた。さらに、拮抗剤は、正常血液ドナーから得られたリンパ球の増殖を有意に変化させなかった（パネルA）一方で、Rp-8Br-cAMPSはCVIグループにおける抗-CD3刺激増殖の有意なかつ濃度依存性の改善を誘発した(データは示していない)。しかしながら、CVIグループからの一人の患者のデータは、異質性を明らかにした。これに対し、cAMP拮抗剤をインビトロで細胞に加えた場合、７人のCVI患者で、抗-CD3-誘発-リンパ球増殖の100%を超える増加が見られた一方で、５人の患者では、40%未満の増殖増加であった。重要であるのは、cAMP拮抗剤によるリンパ球増殖が最も著しく増加した患者は、抗-CD3刺激後の増殖応答が最も低下した者（r=-0.85，P<0.001)であったことである。
【００４８】
精製Tリンパ球におけるcAMP作用剤および拮抗剤の効果
CVIにおけるT細胞機能不全の誘導でのcAMP/PKAI系の役割をよりよく研究するために、陰性に選択された精製Tリンパ球の増殖において、内在cAMPレベルと、cAMP作用剤及び拮抗剤の効果とを分析した。最初に13人のCVI患者および10人の健康コントロールからのTリンパ球におけるcAMPを測定し、CVI患者において有意に高いcANTレベルが観察された(図４Ａ)。T細胞増殖のcAMP-依存性阻害に対する感受性も増加し内在cAMPレベルの正の共同効果を示した(図４８)。表３に示された結果は、８人のコントロール被検者における効果と比較した、著しく阻害された抗CD-3刺激T細胞増殖を有する７人の別々のCVI患者における細胞増殖に対する8-CPT/cAMPのこのような効果を示している。外因的に添加されたCVIグループの8-CPT-cAMPによる細胞増殖の阻害に対する感受性の有意な増加は、主に阻害曲線の傾きの変化によって、これら患者におけるIC50値の著しい減少に影響した(Hill係数；表３および図４Ｂ)。
【００４９】
更に抗-CD3刺激T細胞増殖の阻害の特異性に注目するために、cAMP作用剤（Sp-8-Br-cAMPS）および相補的PKAI選択的拮抗剤（Rp-8-Br-cAMPS）を用いた。健康コントロールにおいて、cAMP作用剤の阻害効果はその相補的拮抗剤により完全に逆転（図５Ａ）したが、拮抗剤単独ではT細胞増殖は更に強化されなかった(図５Ｂおよび表３)。これに反して、Rp-8-Br-cAMPSを細胞培地に添加した場合に、CVI患者の抗-CD3刺激増殖における濃度依存性増加が観察された（３人の患者で〉100%増加であり、２人の患者で正常範囲内に達した）(図５Ｃ、図５Ｄおよび表３)。したがって、CVI患者では、阻害抗-CD3刺激増殖を有するTリンパ球は、慢性的に上昇した内在cAMPレベルによって特徴付けられ、選択的PKAI拮抗剤を用いた処置は、これら細胞における抗-CD3刺激増殖を著しく改善し、健康コントロールと対等な増殖レベルを達成した(各々、Rp-8-Br-cAMPSを用いるかまたは用いずに、各々健康コントロールにおける〜25%または75%のレベル)ようである。
【００５０】
CD4+およびCD8+リンパ球の増殖におけるcAMP拮抗剤の効果
次いで、８人の不全リンパ球機能を有するCIV患者および７人のコントロールにて、BrdUを組み込んだ流動細胞計算分析によって、Rp-8-Br-cAMPSの存在下および非存在下でCD4+およびCD8+Tリンパ球のサブセットにおける抗-CD3刺激Tリンパ球DNA合成を試験した。cAMP拮抗剤を細胞培地に添加した場合、CVI患者において、CD4+Tリンパ球はBrdU+の存在下有意に増加した(拮抗剤を用いるかまたは用いない場合に、各々55.8(40.7〜77.0)%対69.6(50.5〜90.0)%、P<0.03)。殆どの患者において、最大の増加が、Rp-8-Br-cAMPSの最高濃度（1000μM）で観察された。健康コントロールからのCD4+リンパ球では、DNA合成におけるRp-8-Br-cAMPSの効果はなかった(データは示されていない)。CD8+リンパ球に付いては、三人のCVI患者において中間的な増加が見られたが、CVI患者およびコントロールの何れにおいても、cAMP拮抗剤の添加後BrdU+細胞の存在下では有意な増加は見られなかった(データは示されていない)。
【００５１】
Tリンパ球のIL-2レベルおよびIL-2レセプター結合におけるcAMP拮抗剤の効果
IL-2は、Tリンパ球の成長および機能において極めて重要な役割を果たし(13)、かつこれら細胞からのIL-2産生減少はCVIの免疫病理学において重要な役割を果たす(14、15)。環状AMPは、Tリンパ球におけるIL-2レセプター産生及びIL-2レセプター発現を減少させる(16、17)。CVIにおけるTリンパ球増殖のcAMP誘発阻害の機構を更に明らかにするために、阻害リンパ球機能を有する７人のCVI患者および８人のコントロールにおいて、抗-CD刺激Ｔリンパ球からの上澄み中のIL-2レベルにおけるRp-8-Br-cAMPSの効果を試験した。コントロール被検者と比較して、CVI患者からのTリンパ球は有意に低いレベルでIL-2を上澄みに放出し(表４)、cAMP拮抗剤存在下で、著しく、かつ濃度依存性のIL-2レベル増加が観察された(表４および図６Ｂ)。CVI T細胞のIL-2レベルにおけるRp-8-Br-cAMPSの効果は、増殖におけるものと非常に類似していた。しかしながら、CVI患者における細胞培地に対してRp-8-Br-cAMPSを添加した後にIL-2レベルが劇的に増加したにもかかわらず、IL-2レベルはなおもコントロール被検者で観察されたものより著しく低かった(表４)。このように、CVI患者において、Tリンパ球増殖は、インビトロ細胞に対するcAMP拮抗剤の添加によるIL-2分泌よりも広範囲となるまで正常化される。
【００５２】
次に、流動細胞計算法によって、Rp-8-Br-cAMPSの細胞培地への添加が、阻害リンパ球機能を有する８人のCVI患者および６人のコントロールからの抗-CI3刺激T細胞におけるIL-2レセプター結合にも影響を与えることができるかどうかを試験した。抗-CD3刺激細胞では、CD4+およびCD8+リンパ球の何れにおいても、CVI患者およびコントロール間でIL-2レセプター結合は、有意な差異がなかった。しかしながら、CVI患者からのCD4+リンパ球（CD8+リンパ球ではない）において、細胞培地へのRp-8-Br-cAMPSの添加後にIL-2レセプター結合が中程度であるが有意に増加した。健康コントロールからの細胞では、このような増加は観察されなかった。
【００５３】
抗-CD3誘発Tリンパ球増殖におけるcAMP拮抗剤と組み合わせた外因的に添加されたIL-2の効果
cAMP拮抗剤の添加によるT細胞増殖の増強におけるIL-2の役割を更に試験するために、阻害リンパ球増殖を有する４人のCVI患者および４人のコントロールにおいて、抗CD3刺激T細胞増殖に、単独でまたはRp-8-cAMPSと組み合わせて外因的に添加したIL-2の効果を試験した。細胞培地へのIL-2の添加後、CVI患者およびコントロールの両方において、著しい増殖増加があった(図７)。しかしながら、cAMP拮抗剤の添加後に達成されたIL-2レベル増加と同等のIL-22濃度（〜0.15ng/mL、図６Ｂ）では、CVI患者およびコントロールの何れにおいても、増殖における有意な効果はなかった(図７)。事実、CVI患者でのcAMP拮抗剤の増強効果は、15ng/mLのIL-2の効果と同等であった(図７)。CVI患者では、Tリンパ球増殖におけるRp-8-Br-cAMPSおよびIL-2の増強効果は、累積的であった(図７)。
【００５４】
【表３】
2010111688.tif 000006
【００５５】
【表４】
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【００５６】
［実施例３］
プロテインキナーゼAのRIαサブユニットに対するリボザイムは、インビトロで発現し、RIα mRNAを完全に開裂することが示された。合成RNAリボザイムとして、または末梢血液CD3+T細胞に2-デオキシシトシンまたは2-デオキシ-ウラシル類似体を組み込むことにより安定化された合成RNAリボザイムとして、トランスフェクションされた場合、リボザイムは、RIα mRNAを除去することによってコントロールレベルの約20％までRIαタンパク質レベルを減少させた。この戦略により、プロテインキナーゼAタイプIの殆どが、T細胞から除去された。次いで、リボザイムを用いてトランスフェクションされたCD3+Ｔ細胞の免疫感応性を、T細胞レセプター/CD3複合体(TCR/CD3)の刺激によるT細胞活性化後のT細胞増殖として測定される、コントロール（mock:モック）トランスフェクションT細胞と比較して調査した。cAMPの上昇させたレベルおよびプロテインキナーゼAタイプIの増加させた活性によって、HIV感染と同様のT細胞機能不全を刺激するために、正常T細胞を低投与量(IC50の12.5あたり)のcAMP類似体8-(4-クロロフェニル)-チオ-cAMPS(8-CPT-cAMP)で処理した。図８から判るように、cAMPは、モックトランスフェクションT細胞において、コントロールの約20%までT細胞増殖を阻害した。それに反して、RIaリボザイムでトランスフェクションしたT細胞は、cAMPによって約40％まで阻害されたにすぎず、即ち、RIaリボザイムの存在下での免疫感応性が二倍増加した。このことは、プロテインキナーゼAタイプI（RIa）の産生を阻害するプロテインキナーゼAのRIaサブユニットに対するリボザイムが、免疫不全症におけるプロテインキナーゼAタイプIの活性化により生じたT細胞機能不全を回復させる治療に有効であり得ることを示す。インビボでの使用のためには、リボザイムを予備処理して、小遺伝子としての細胞取込みまたは細胞内導入を可能とする必要があるであろう。
【００５７】
［実施例４］
T細胞機能不全において、プロテインキナーゼAタイプIを介した増加するシグナリングを無効とするために、プロテインキナーゼAタイプIの局在化をTCR/CD3と競争させて、基質から取り除くことを試みた。
【００５８】
A-キナーゼアンカー作用（アンカリング）タンパク質(AKAP)Ht31(SEQ.ID.NO2)のアミノ酸493-515をカバーするペプチドは、両親媒性αヘリックスを含み、これはAKAPSをアンカー作用するRII-およびRI両方のアンカー作用ドメインが現れ、かつRサブユニット結合ドメインとの相互作用する疎水性表面を形成する。最近のデータは、R.Iccの結合が二重特異的AKAPS(D-AKAPIおよびDAKAP2)に対してであり、かつRI及びRIIのAKAPsへの結合は、インビトロでHt31競合ペプチドと競争し得ることを示す。しかしながら、RIは、RIIのAKAPsに対するより非常に低い親和性で結合する。したがって、より低い濃度では、細胞培地中に、RII-介在効果よりRI-介在効果が競争を行うと予想される。
【００５９】
血液CD3+T細胞を、徐々にHt31(SEQ.ID.NO2)ペプチドの濃度を増加させながらインキュベートした。取り込みを促進するために、細胞を、ペプチドの存在下または非存在下で、リポソームで処理した。DOTAPリポソームの最適濃度は、T細胞の膜安定性および正常なTCR/CD3-依存活性を維持するために、注意深く滴定した。細胞をDOTAP/ペプチドで２０時間インキュベートし、インキュベートは、8-CPT-cAMPの非存在下（中実棒）または存在下（6.25μM、斜線棒）で継続し、活性化してTCR/CD3の刺激で増殖させた。T細胞免疫感応性を[3H]チミジン取り込みとして調査した。この結果は、免疫不全症におけるプロテインキナーゼAタイプIの増加する活性状態をシミュレートするためにcAMPで処置したT細胞では、Ht-3Iペプチドの濃度が、T細胞増殖のcAMP依存阻害を逆転させた（50μMHt-31存在下のcAMPで、モックトランスフェクションと比較して三倍増加増殖した）を示した(図ａ)。これは、競争剤ペプチドがcAMPレベルが上昇した機能不全T細胞の免疫応答を、正常化し得ることを示す。
【００６０】
両親媒性ヘリックスが二つのバリン残基をプロリンで置換することによって破壊されたペプチド(Ht-31P)は右パネルにコントロールとして提示する。この場合、ペプチドの濃度を増加させながらの処理は、cAMP存在下での増殖を増加させなかった。
【００６１】
次に、T細胞増殖における競争剤ペプチド(Ht-31、35μM)の効果を、徐々に8-CPT-cAMPの濃度を増加させる存在下で試験し、同濃度の8-CPT-cAMPで処理したモックトランスフェクション細胞と比較した(図１０)。正常末梢血液T細胞については既に示したように(実施例１および２，図１および図４Ｂ)、8-CPT-cAMPは、約1.8μM（多分増加するリポソームとの浸透性により、トランスファクションしていない細胞と比較してより低いIC50）のICにて、正の協同様式でモックトランスフェクション細胞をも阻害した。Ht-3I競争剤ペプチドの存在下、cAMPによる右方シフト阻害曲線が、4.8μMの見かけのIC50とともに観察された。外因性cAMP活性化PKAタイプIの上昇したレベルにより、HIV-感染患者またはCIVを有する患者からのT細胞で観察された左方シフト曲線と比較すると、ここで観察された右方シフトは、患者の病状を正常化することが予想される。
【００６２】
要約すると、結果は、プロテインキナーゼAタイプIの局在化をTCR/CD3と競争させて、基質から取り除くことは、免疫不全症におけるプロテインキナーゼAタイプIの活性化により生じた、T細胞機能不全を逆転する有用な治療となり得ることを示している。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号1
PKA競争ペプチドの例
配列番号2
PKA競争ペプチドの例
配列番号3
PKA競争ペプチドの例
配列番号4
PKA競争ペプチドの例
配列番号5
ハンマーヘッド型リボザイムの例
配列番号6
ハンマーヘッド型リボザイムの例
配列番号7
RIαへのアンチセンスオリゴの例
配列番号8
RIαへのアンチセンスオリゴの例
【図１】
2010111688.tif 000008
【図２】
2010111688.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
2010111688.tif 000012
【図６】
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【図７】
2010111688.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年1月25日(2010.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
RIαサブユニットに結合し、かつPKAタイプＩαの選択的なまたは特異的な拮抗剤として作用する硫黄置換cAMP類似体（アデノシン-3',5'-サイクリックモノホスホロチオエート誘導体、Rp-アイソマー）であるcAMP拮抗剤である、cAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）タイプＩα（RIα2C2）の機能を消滅させる阻害剤の、免疫抑制疾患治療用の製剤調製物を製造するための使用。
【請求項２】
前記阻害剤がcAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）タイプＩα（RIα2C2）の機能を選択的または特異的に消滅させる、請求項１に記載の阻害剤の使用。
【請求項３】
前記cAMP拮抗剤が、Rp-8-Br-cAMPS、Rp-8-Br-モノブチリル-cAMPS、Rp-モノブチリル-cAMPS、Rp-8-Cl-cAMPS、Rp-8-(4-クロロフェニル-チオ)-cAMPSおよびRp-ピペリジノ-cAMPのいずれかである請求項１〜２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
前記cAMP拮抗剤が、Rp-8-Br-cAMPSまたはRp-8-Cl-cAMPSである請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記免疫抑制疾患が、AIDS、HIV感染またはCVIである請求項１〜４の何れかに記載の使用。
【請求項６】
Rp-8-Br-cAMPS、Rp-8-Br-モノブチリル-cAMPS、Rp-モノブチリル-cAMPS、Rp-8-(4-クロロフェニルチオ)-cAMPS、およびRp-ピペリジノ-cAMPSからなる群より選ばれる阻害剤、ならびに一以上の製薬上許容される補助剤または充填剤を含む製剤組成物。
【請求項７】
薬剤として使用するための、請求項６で定義された阻害剤。
【請求項８】
免疫抑制疾患を処置するために使用される、請求項６で定義された阻害剤。