(57)【要約】      （修正有）【課題】制御環境下における細胞の応答を測定するデバイスの提供。【解決手段】上面を含むバイオセンサーと、バイオセンサーを覆うチャンバ１３５と、を含むデバイス１００。マイクロ流体を利用し、特定の環境条件下において細胞の信号伝達を調べる。短期間作用型リガンドと長期間作用型リガンドとを区別し、受容体の再感作に関する動力学と受容体の信号伝達の機能的な回復とを決定し、層流によって誘起された応力に対する細胞のタイプの感度を区別する。従来の静的無標識細胞分析との組合せによって、広範囲の薬物化合物の研究、生体細胞に作用する薬理学に使用。【選択図】図１ａ
2010154847.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルス刺激に対する少なくとも１つの細胞の応答を観測するデバイスであって、
上面を含むバイオセンサーと、
前記バイオセンサーを囲繞し且つ底面を含む内側表面を含むチャンバと、
前記チャンバの前記内側面と流体連通し且つバルブを含む少なくとも１つの流入口と、
前記チャンバの前記内側面と流体連通する少なくとも１つの流出口と、を含み、
前記チャンバの前記底面は前記バイオセンサーの前記上面と同一か又は前記バイオセンサーの前記上面の近傍にあり、前記バルブは少なくとも２つの貯蔵溶液と流体連通していることを特徴とするデバイス。
【請求項２】
請求項１に記載の前記デバイスを複数個含み且つマルチウェルプレートを含むマルチプレートシステム。
【請求項３】
上面を含むバイオセンサーと、前記バイオセンサーを取り囲み且つ底面を含む内側表面を含むチャンバと、前記チャンバの前記内側面と流体連通し且つバルブを含む少なくとも１つの流入口と、前記チャンバの前記内側面と流体連通する少なくとも１つの流出口と、を含むデバイスであって、前記チャンバの前記底面は前記バイオセンサーの前記上面と同一か又は前記バイオセンサーの前記上面の近傍にあり、前記バルブは少なくとも２つの貯蔵溶液と流体連通するデバイスを用いて、細胞にパルス刺激を与える方法であって、
少なくとも１つの細胞を前記デバイスの前記チャンバに導入するステップと、
少なくとも１つの細胞を前記チャンバの底面に付着せしめるステップと、
第１期間中に、前記チャンバ内を流れる第１溶液に前記細胞を接触させるステップと、
第２期間中に、前記第１溶液に置換されるべく前記チャンバ内を流れる第２溶液に前記細胞を接触させるステップと、
前記第１及び第２溶液に対する前記細胞の応答を観測するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
上面を含むバイオセンサーと、前記バイオセンサーを取り囲み且つ底面を含む内側表面を含むチャンバと、前記チャンバの前記内側面と流体連通し且つバルブを含む少なくとも１つの流入口と、前記チャンバの前記内側面と流体連通する少なくとも１つの流出口と、を含むデバイスであって、前記チャンバの前記底面は前記バイオセンサーの前記上面と同一か又は前記バイオセンサーの前記上面の近傍にあり、前記バルブは少なくとも２つの貯蔵溶液と流体連通するデバイスを用いて、機械的な力によって誘起された細胞信号伝達を観測する方法であって、
少なくとも１つの細胞を前記デバイスの前記チャンバに導入するステップと、
少なくとも１つの細胞を前記チャンバの底面に付着せしめるステップと、
第１期間中に、段階的に増大する流速で前記チャンバ内を流れる第１溶液に前記細胞を接触させるステップと、
機械的な力によって誘起された細胞信号伝達に対して、前記第１溶液に対する前記細胞の応答を観測するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
機械的な力によって誘起された細胞信号伝達が検出された後に、化合物、ペプチド、タンパク質、ホルモン又は他の成分を含み且つ前記チャンバ内を流れる第２溶液に前記細胞を接触させるステップと、
前記第２溶液に対する前記細胞の応答を観察するステップと、をさらに含み、
前記第１溶液の流速は、前記細胞の分離を生じせしめる閾値流速以下であり、前記バイオセンサーは、共鳴導波グレイティングバイオセンサ、表面プラズモン共鳴ベースのバイオセンサー、光学干渉計ベースのバイオセンサー、又は電気バイオセンサーであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は２００８年１１月２５日に出願された米国仮出願第６１／１１７６９５号の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、制御環境下における細胞の振る舞いを調べる方法に関し、特に、制御された刺激を生体細胞に対して送るマイクロ流体を使用する方法に関する。
【０００３】
生体細胞を調べることができることは、細胞生物学において創薬と基礎研究の双方で重要である。従来の細胞ベースの分析の多くは、ミクロタイタプレートにおいて刺激を印加された生体細胞の応答及び振る舞いを調べることを含む。しかしながら、従来のミクロタイタプレートにおける細胞は、本来の環境とは見なせない環境において生存している。
【０００４】
第１に、人体の内部において、小さいチューブ、管路、及び血管を含むマイクロ流体の例はたくさんあり、例えば、循環系のマイクロメータスケールの毛細血管や、肺のより繊細であり且つ同様のサイズの気道等である。受容体及び他の細胞のターゲットを調節する分子は、血流及び／又は他の生体流体を通してターゲットとされた細胞に一般的に供給される。また、これら分子を用いて刺激を与える期間は細胞、生体組織、器官によって大きく変動する。
【０００５】
第２に、細胞信号伝達は細胞の基本的な活性を支配し且つ細胞の活動を調整する複雑な伝達システムの一部である。細胞が自身のミクロ環境に対して感知し且つ正確に応答する能力は、発生、生体組織の修復、免疫、並びに、正常生体組織の定常性に関して基礎となるものである。多くの細胞信号は、１つの細胞によって放出された分子によって運ばれ、別の細胞に接触するように移行する。例えば、化学シナプス又はシナプス末端は、特殊化された接合である。かかる接合を介して、神経系細胞は互いに信号を伝達し且つ筋肉や分泌腺等の非神経細胞に信号を伝達する。化学シナプスによって、中枢神経系のニューロンは相互接続された神経回路を形成することができる。内分泌腺の信号はホルモンと称されている。ホルモンは内分泌細胞によって作り出され、それらは、血液を介して移動して、身体のすべての部分に到達する。いくつの細胞のみが特定のホルモンに応答し得る場合、信号伝達の選択性が制御され得る。パラクリンは発光細胞の近傍に存在する細胞のみをターゲットにする。神経伝達物質が一例となる。自己分泌信号は発光細胞と同じタイプの細胞のみに影響を与える。自己分泌信号の一例は免疫細胞において見出される。ジャクスタクリン信号はタンパク質又は膜に不可欠の脂質成分を介して細胞膜に沿って伝送され、発光細胞又は直接隣接する細胞のうち一方に影響を及ぼし得る。
【０００６】
細胞は、受容体として知られるタンパク質群を介して細胞環境から情報を受け入れる。多くの受容体が細胞表面のタンパク質であるものの、いくつかの受容体はエストロゲン受容体等の細胞内部で見出される。エストロゲンは、細胞膜の脂質二重層を通り抜けることができる疎水性分子であり、エストロゲン受容体を活性化する。他の信号伝達分子は、自身の親水性の性質に帰属して、疎水性の細胞膜を透過することはできないので、それらのターゲット受容体は膜上で発現される。かかる信号伝達分子がその受容体を活性化するときには、信号は通常ｃＡＭＰ等の第２の伝令体によって細胞内へと伝達される。いくつかの信号伝達分子はホルモン及び神経伝達物質として機能し得る。例えば、エピネフリンとノルエピネフリンは副腎から放出されるとホルモンとして機能し得るし、血流を通して心臓に伝達される。また、ノルエピネフリンはニューロンによって生産されて、脳内の神経伝達物質として機能し得る。エストロゲンは卵巣によって放出され、かつ、ホルモンとして機能し又はパラ分泌若しくは自己分泌信号伝達を介し局所的に作用する。受容体を活性化する（ある場合抑制する）分子は、ホルモン、神経伝達物質、シトカイン、成長因子として分類され得るが、これら全てが受容体リガンドと称されている。リガンド受容体の相互作用の詳細は細胞信号伝達においては基本的なことである。
【０００７】
生体細胞は雑音性の又は確率論的な生化学反応体質であると考えられている。細胞から細胞への変化の多くは、限定的な数の反応分子に関係する確率的スイッチ又は低速度の反応チャネルの存在に起因する。確率的スイッチは増幅カスケードに対する入力を与え、その増幅カスケードは、川下にある大多数のエフェクタ分子に単一分子事象を移動させる。タンパク質又はｍＲＮＡ分子が比較的に多数存在する真核細胞において、確率的影響は主として遺伝子作用の制御をその原因とする。変化に関して可能性のある別の原因としては、受容体の活性化であり得る。低刺激において、細胞から細胞への信号伝達において重要である事は、活性化した受容体の個数は、川下における信号伝達に対してかなりの雑音をもたらすには全く少ないということである。細胞から細胞への変化度が高いことは、免疫防御について１つの武器となり得る。ウイルス及び他の病原体においてコード化された比較的簡単なプログラムによって克服するために、かかる非確定的防御はより困難である。（タンパク質の破壊に通じる）確率的な遺伝子の活性化と（例えば、集団的な転位に通じる）確率的な細胞の活性化は、細胞の調整において「確率的ロバストネス」に通じる。所定の遺伝子が活性化される場合、タンパク質の十分な活性レベルを確保する目的によって、タンパク質が大きく壊れてしまう。確率的ロバストネスは信号に対する最小量の応答を保証する。信号強度が低減すると、応答の確率が大きく低減してしまい、応答細胞がより少数となってしまう。確率的ロバストネスによって、細胞は同一の刺激に対して異なって応答し得るが、細胞の個々の応答がより明確化される。両効果は初期の免疫応答において重要であるかもしれない。すなわち、細胞応答の多様性によって、生体組織の防御は、ウイルス及び他の病原体においてコード化された比較的簡単なプログラムによって克服することがより難しくせしめられる。より集中された単一細胞の応答により、細胞は、増殖又はアポトーシス等の細胞自身の運命を決定することに関して幇助される。
【０００８】
マイクロ流体デバイス、すなわち、マイクロメータのスケールにおけるチャンネルとウェル内において流体を操作するシステムは、試薬及びサンプルを正確に空間制御し、解析時間を高速とすることを可能となし、自動化され、希釈することなくピコリットル体積の物質を正確に操作することができる。したがって、マイクロ流体技術によって、分析生化学、創薬及び薬物の開発、並びに、細胞及び生体組織研究及び技術における進歩が期待できる。例えば、マイクロ流体システムは、内皮細胞の形態及び機能にとって重要である脈管系において流速を与える。しかしながら、細胞ベースの研究に対するマイクロ流体デバイスの大部分は、細胞の培養、細胞の分類、細胞の閉じ込め、細胞を溶解させること、チップ上で細胞の成分を分離すること、及び単一細胞の分析に、主に集中している。
【０００９】
したがって、細胞を包囲し且つ正確に制御された環境において生体細胞に及ぼす分子及び化合物の影響を研究する方法があるのが望ましいであろう。
【発明の概要】
【００１０】
実施形態において、以下のデバイスを提供する。すなわち、パルス刺激に対する少なくとも１つの細胞の応答を観測するデバイスであって、上面を含むバイオセンサーと、前記バイオセンサーを取り囲み且つ底面を含む内側表面を含むチャンバと、前記チャンバの前記内側面と流体連通し且つバルブを含む少なくとも１つの流入口と、前記チャンバの前記内側面とと流体連通する少なくとも１つの流出口と、を含み、前記チャンバの前記底面は前記バイオセンサーの前記上面と同一か又は前記バイオセンサーの前記上面の近傍にあり、前記バルブは少なくとも２つの貯蔵溶液と流体連通していることを特徴とするデバイスを提供する。前記バイオセンサーのデバイスは、共鳴導波グレイティングバイオセンサ、表面のプラズモン共鳴ベースのバイオセンサー、光学干渉計ベースのバイオセンサー、又は電気バイオセンサーである。デバイスは、一連の多数のデバイス、例えば、マイクロタイタープレートフォーマット（例えば、４ウェルマイクロタイタープレート、６ウェルマイクロタイタープレート、２４ウェルマイクロタイタープレート、９６ウェルマイクロタイタープレート、又は３８４ウェルマイクロタイタープレート、）を形成するように配列され、一連のバイオセンサーを含む単一のボトムインサートが、使用される。かかるアレイの形態において、各デバイスは自身の（複数の）流入口及び（複数の）流出口を有し得る。あるいは、かかるアレイの形態において、デバイスのいくつか又はすべては、共有の廃棄貯蔵器に互いに相互接続され且つ連結された共通の流出口を共有し得るので、放出された全ての溶液は共有された廃棄貯蔵器に排出され得る。
【００１１】
実施形態において、以下の方法を提供する。すなわち、細胞にパルス刺激を与える方法であって、少なくとも１つの細胞をデバイスのチャンバに導入するステップと、少なくとも１つの細胞を前記チャンバの底面に付着せしめるステップと、第１期間中に、前記チャンバ内を流れる第１溶液に前記細胞を接触させるステップと、第２期間中に、前記第１溶液に置換されるべく前記チャンバ内を流れる第２溶液に前記細胞を接触させるステップと、前記第１及び第２溶液に対する前記細胞の応答を観測するステップと、を含み、前記デバイスは、上面を含むバイオセンサーと、前記バイオセンサーを取り囲み且つ底面を含む内側表面を含むチャンバと、前記チャンバの前記内側面と流体連通し且つバルブを含む少なくとも１つの流入口と、前記チャンバの前記内側面と流体連通する少なくとも１つの流出口と、を含み、前記チャンバの前記底面は前記バイオセンサーの前記上面と同一か又は前記バイオセンサーの前記上面の近傍にあり、前記バルブは少なくとも２つの貯蔵溶液と流体連通していることを特徴とする方法を提供する。第１溶液は、化合物を含むか又は含まない緩衝化分析溶液であり得る。第２溶液は細胞刺激因子を含み、かかる細胞刺激因子は、例えば、例えば、Ｇタンパク質共役型受容体に対する作用薬、増殖因子受容体、又は細胞表面受容体である。また、細胞刺激因子は、生細胞における検出可能なバイオセンサー出力信号を誘因し得る化学物質、生化学物質、生物製剤、又は生物（例えば、ウイルス、バクテリア、又は細胞）であってもよい。
【００１２】
実施形態において、以下の方法を提供する。すなわち、機械的な力によって誘起された細胞信号伝達を観測する方法であって、少なくとも１つの細胞をデバイスのチャンバに導入するステップと、少なくとも１つの細胞を前記チャンバの底面に付着せしめるステップと、第１期間中に、段階的に増大する流速で前記チャンバ内を流れる第１溶液に前記細胞を接触させるステップと、機械的な力によって誘起された細胞信号伝達に対して、前記第１溶液に対する前記細胞の応答を観測するステップと、を含み、前記デバイスは、上面を含むバイオセンサーと、前記バイオセンサーを取り囲み且つ底面を含む内側表面を含む前記チャンバと、前記チャンバの前記内側面と流体連通し且つバルブを含む少なくとも１つの流入口と、前記チャンバの前記内側面と流体連通している少なくとも１つの流出口と、を含み、前記チャンバの前記底面は前記バイオセンサーの前記上面と同一か又は前記バイオセンサーの前記上面の近傍にあり、前記バルブは少なくとも２つの貯蔵溶液と流体連通していることを特徴とする方法を提供する。その方法は、機械的な力によって誘起された細胞信号伝達が検出された後に、化合物、ペプチド、タンパク質、ホルモン又は他の成分を含み且つ前記チャンバ内を流れる第２溶液に前記細胞を接触させるステップと、前記第２溶液に対する前記細胞の応答を観察するステップと、をさらに含み、前記第１溶液の流速は、前記細胞の分離を生じせしめる閾値流速以下であり、前記バイオセンサーは、共鳴導波グレイティングバイオセンサ、表面プラズモン共鳴ベースのバイオセンサー、光学干渉計ベースのバイオセンサー、又は電気バイオセンサーである。
【００１３】
本開示のさらなる特徴及び利点は以下の発明の詳細な説明において説明されるであろうし、その説明から当業者には十分容易に部分的に理解されるであろうし、或いは、発明の詳細な説明、それに続く特許請求の範囲、及び添付図面を含む明細書に開示されているように、本発明を実施することによって認識されるであろう。
【００１４】
上述の概略的説明および以下の簡単な説明は本発明の実施形態を表しており、特許請求の範囲に記載された発明の本質と性質を理解するための概略又は骨組みを与える目的であることが理解されるべきである。添付図面が、更なる理解を与え且つ本明細書の一部を構成するよう含まれている。添付図面は、本発明の様々な実施形態を例示しており、明細書の記述とともに本発明の原理及び作用を説明するために役立つであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】図１ａは細胞応答を調べるためのデバイスの側面図である。
【図１ｂ】図１ｂは細胞応答を調べるためのデバイスの平面図である。
【図２ａ】図２ａは細胞応答を調べるためのデバイスの平面図である。
【図２ｂ】図２ｂは細胞応答を調べるためのデバイスの側面図である。
【図３】図３は、異なる動作状態下における感度に関するマイクロ流体−ＲＷＧバイオセンサーシステムの特性を示すプロット図である。
【図４ａ】図４ａは、マイクロフルイディクス−ＲＷＧバイオセンサーシステムを横切ってスキャンされた異なる領域における細胞応答を示す蛍光スキャンの図である。
【図４ｂ】図４ｂは、マイクロフルイディクス−ＲＷＧバイオセンサーシステムを横切ってスキャンされた異なる領域における細胞応答を示す蛍光スキャンの図である。
【図５】図５は、静止Ａ４３１細胞層を有するマイクロ流体−ＲＷＧバイオセンサーシステムの異なる流速における信号変動に及ぼす緩衝液の流体移動の効果を示すグラフである。
【図６ａ】図６ａは、２マイクロリットル／分の流速において３０秒のトレーサー注入に対するマイクロフルイディクス−ＲＷＧバイオセンサーシステムの流動パターンを示す流動力学シミュレーションのプロット図である。
【図６ｂ】図６ｂは、注入体積及び流速の関数として細胞の処理時間のマップを示す流動力学シミュレーションプロット図である；
【図７ａ】図７ａは、マイクロプレートベースのＲＷＧバイオセンサー細胞分析を使用して測定された静的Ａ４３１細胞のエピネフリン誘起の光学ＤＭＲ応答に及ぼす化学パルス刺激の影響を示すプロット図である。
【図７ｂ】図７ｂは、マイクロプレートベースのＲＷＧバイオセンサー細胞分析を使用して測定された静的Ａ４３１細胞のエピネフリン誘起の光学ＤＭＲ応答に及ぼす化学パルス刺激の影響を示すプロット図である。
【図８ａ】図８ａは、マイクロ流体−ＲＷＧバイオセンサーシステムを使用して、２ｎＭエピネフリンを用いたパルス刺激下で静的Ａ４３１細胞のＤＭＲ信号を示すプロット図であり、２ｎＭの維持された刺激条件下のエピネフリン応答と比較されている。
【図８ｂ】図８ｂは、システムを使用して、２ｎＭエピネフリン及び１００ｎＭサルブタモールを用いたパルス刺激下における静的Ａ４３１細胞のＤＭＲ信号を示すプロット図である。
【図９ａ】図９ａは、マイクロ流体‐バイオセンサーマイクロプレートシステムを使用して、１０ＭＳＦＬＬＲ‐アミドの暴露に対して応答したＡ５４９細胞のＤＭＲ信号を示すプロット図であり、１０ＭＳＦＬＬＲ‐アミドの暴露に続いて、ＳＦＬＬＲ−アミド刺激の３０分後にＳＦＬＬＲ−アミド溶液は１ｘＨＢＳＳ（ハンクの平衡型塩溶液、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．１）に置換された。
【図９ｂ】図９ｂは、マイクロ流体‐バイオセンサーマイクロプレートシステムを使用して、５ｕｎｉｔ／ｍｌトロンビンの暴露に対して応答したＡ５４９細胞のＤＭＲ信号を示すプロット図である、５ｕｎｉｔ／ｍｌトロンビンの暴露に続いて、トロンビン刺激の３０分後にトロンビン溶液を１ｘＨＢＳＳに置換した。
【図１０ａ】図１０ａは、マイクロ流体‐バイオセンサーマイクロプレートシステムを使用して、１０ＭＳＦＬＬＲ‐アミドの暴露に応答したＡ５４９細胞のＤＭＲ信号を示すプロット図であり、１０ＭＳＦＬＬＲ‐アミドの暴露に続いて、ＳＦＬＬＲ‐アミドを１ｘＨＢＳＳに置換し、１ｘＨＢＳＳを１０ユニット／ｍｌのトロンビンに置換した。
【図１０ｂ】図１０ｂは、マイクロ流体‐バイオセンサーマイクロプレートシステムを使用して、５ｕｎｉｔ／ｍｌトロンビンの暴露に対して応答したＡ５４９細胞のＤＭＲ信号を示すプロット図であり、５ｕｎｉｔ／ｍｌトロンビンの暴露に続いて、トロンビン溶液を１ｘＨＢＳＳに置換し、１ｘＨＢＳＳを１０ユニット／ｍｌのトロンビンに置換した。
【図１１】図１１は、本開示のデバイスに係る４×４列の上面図である。
【図１２ａ】図１２ａは、複数のデバイスを有するマルチウェルを含むマルチウェルプレートシステムの上面図である。
【図１２ｂ】図１２ｂは、複数のデバイスを有するマルチウェルを含むマルチウェルプレートシステムの断面透視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態を以下に詳細に説明し、その実施例が添付図面に図示されている。可能な限り、同一の参照番号が図面中で使用されて、同一または類似する部分が参照されるであろう。
【００１７】
本開示は現行の細胞ベースの分析の欠点に対処しており、非限定的な実施例により信号伝達とリガンドの薬理学を調べるための無標識バイオセンサー細胞分析を含む。これら細胞ベースの分析は、マイクロ‐タイタプレートに培養された細胞を細胞検査のために通常使用する。これら分析において細胞の刺激は一般に広範囲の刺激である。たとえば、細胞内の受容体又は細胞のターゲットは、注入された分子によって非選択的に調節される。また、刺激は平衡条件下でほぼ行われる。その上、ターゲットの下流にある細胞の事象に依存して、刺激は特定の期間行われる。分析時間は、数秒（例えば、Ｃａ２＋の移動）、数分（例えば、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ：ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ）レベルの変化）、又は数時間（例えば、遺伝子発現）であり得る。化合物は、一般に除去することなく一旦注入されて、持続的期間の刺激が生成される。
【００１８】
本開示は制御環境下で細胞の応答を測定するデバイスを開示する。また、本開示はかかるデバイスの分析方法を提供する。また、本開示は、本システムのデバイスを使用して、細胞信号伝達を研究する方法を提供する。マイクロ流体又は流体を利用することによって、本開示によって、特定の環境条件下において細胞の信号伝達を調べることが可能となる。かかる能力は、以下に使用され得る。すなわち、短期間作用型リガンドと長期間作用型リガンドとを区別し、受容体の再感作に関する動力学と受容体の信号伝達の機能的な回復とを決定し、作用薬の機能的選択性を区別し、層流によって誘起された応力に対する細胞のタイプの感度を区別することに使用される。従来の静的無標識細胞分析との組合せによって、広範囲の薬物化合物が詳細に研究され、その結果、生体細胞に作用する薬理学について完全に説明され得る。
【００１９】
実施形態において、上面を含むバイオセンサーと、バイオセンサーを覆うチャンバ１３５と、を含むデバイス１００が提供される（図１ａ及び図１ｂ）。チャンバ１３５は内側面を含み得る。チャンバ１３５において、内側面は底面を含む。底面１１１はバイオセンサーの上面の近傍にあり得るし、底面１１１がバイオセンサーの上面と同一であってもよい。バイオセンサーは、例えば、共鳴導波グレイティングバイオセンサ、表面プラズモン共鳴ベースのバイオセンサー、光学干渉計ベースのバイオセンサー、又は電気バイオセンサーであり得る。チャンバ１３５は少なくとも２つの流入口１４１及び１４２を含み、それぞれがチャンバの内側面と流体連通し得る。そして、その少なくとも２つの流入口１４１及び１４２の各々が貯蔵溶液と独自に流体連通している。チャンバ１３５はさらに少なくとも１つの流出口１５０を含む。共鳴導波グレイティングバイオセンサが図１ａ及び図１ｂで示すように使用されているとき、バイオセンサーは例えばガラス又はプラスチックで作られた基板１０５を含み得る。かかるガラス又はプラスチックに、グレイティング構造が埋め込まれ得る。グレイティング構造とは、導波１１０薄膜、光源１１２，及び得られた屈折光を検知し且つ処理する手段１１３である。光学ベースのバイオセンサーに対しては、検出ゾーン内の質量再分配及び細胞１３０の底部のみが直接測定される。細胞１３０はチャンバ１３５の底面に直接的に培養され得るし、又は、チャンバ１３５の底面に直接的に接触するよう移動され得る。マイクロポンプが使用されて、デバイス１００のチャンバ内に流体の流れ１６０が生じせしめられ得る。
【００２０】
実施形態において、図２ａ及び２ｂに図示するように、上面を含むバイオセンサーと、バイオセンサーを覆うチャンバ２３５と、を含むデバイス２００が提供される。チャンバ２３５は内側面を含み得る。かかるチャンバ２３５内において、内側面は底面を含む。チャンバ２３５の底面１１１はバイオセンサーの上面の近傍にあり得るし、チャンバ２３５の底面１１１がバイオセンサーの上面であってもよい。チャンバ２３５は、チャンバの内側面と流体連通する少なくとも１つの流入口２４１と、チャンバの内側面と流体連通する少なくとも１つの流出口２５０とを含み得る。流入口２４１は、流入口２４１と接続され若しくは流入口２４１に装着され若しくは流入口２４１内に形成されたバルブ２４２を、さらに含む。バルブ２４２は、少なくとも１つのチューブ又はチャンネルを介して少なくとも１つの貯蔵溶液と流体連通し得る。非限定的な例として、図２ａは、３個のチューブ若しくはチャンネル２４４，２４５，及び２４６に接続された弁２４２を示している。システム２００の所望の使用に依存して、バルブ２４２に装着されるチューブの数はいかなる数であってもよいことが十分理解されるであろう。流入口２４１と溶液貯蔵器（すなわち、２４４，２４５，および２４６）に接続する少なくとも１つのチューブとの間に、バルブ２４２が接続され得る。マイクロポンプが使用されて、バルブ／注入口を介して、デバイスのチャンバ内に流体の流れ２６０が生じせしめられ得る。
【００２１】
マイクロ流体及び流体という用語は、層流が生ずるバイオセンサーシステムの寸法をいう。尚、本明細書にはマイクロ流体及び流体という用語が用いられているが、マイクロ流体及び流体の双方を意味していることを意味している。一般に、マイクロ流体は、小さなスケール、通常はサブミリメートルスケールに幾何学上制約されている流体の振る舞い、精密制御、及び操作に対処する。本開示の実施形態において、チャンバの高さは、約５０マイクロメートルから数マイクロメートルであり得る。本開示は、マイクロ流体又は流体下における生体細胞の検査方法を提供する。生体細胞は一般に大きいので（直径で約数ミクロンから１０ミクロンである）、デバイス１００又はデバイス２００のチャンバの幅と高さの両方が大きくてもよく、使用されたバイオセンサーと、必要なサンプルの量と、及び、検査される細胞に対する適正な細胞培養条件（これらに限定されない）等の他の事項とに基づいて異なる。例示実施形態において、チャンバは、約１００ミクロンから１０ミリメートル、又は約５００ミクロンから５ミリメートルまでの幅を有する。あるいは、チャンバは約１ミリメートルから約５ミリメートル又は約２ミリメートルから約１０ミリメートルまでの高さを有する。代替的例示実施形態において、チャンバは約５０ミクロンから約５ミリメートルまでの高さ又は約２００ミクロンから約２ミリメートルまでの高さを有する。あるいは、チャンバは、約１００ミクロンから約５００ミクロンまでの幅、又は約２００ミクロンから約１ミリメートルまでの幅を有し得る。チャンバの幾何学的構造に対する上記範囲において、乱流の存在を特徴付けるレイノルズ数は、非常に低く、したがって、層流が維持され得る。したがって、ともに合流する２つの流体は、乱流によっては容易には混じり合わないであろうし、拡散のみによって、２つの流体は混じり合わされるはずである。尚、典型的マイクロ流体を使用することで生成された層流は有用であるものの、本開示には必ずしも必要でない。実際、いくつかの実施形態では、チャンバの高さ及び溶液の流れについて適切に抑制することによって層流を排除することは有用であり得る。チャンバの所望の寸法は、過度の実験をすることなく、デバイスの所望の用途に基づいて、熟練職人によって決定され得る。したがって、上記範囲は、基準として与えられているにすぎず、制限することを意味するものではない。
【００２２】
実施形態において、デバイス１００及び／又はデバイス２００は複数のチャンバ１３５及び／又はチャンバ２３５を含み得る。デバイス１００及び／又はデバイス２００は、各々が独自に少なくとも２つの流入口と１つの流出口を含み、あるいは、少なくとも２つのデバイス１００及び／又はデバイス２００は流入口及び／又は流出口を共有している。また、システムは、バルブ１４２及び／又は２４２が２以上のチャンバを制御するのに使用され得るように、構成され得る。マイクロ流体‐バイオセンサアレイシステムは、ＳＢＳ（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）規格のマイクロプレート（例えば、４ウェルマイクロタイタープレート、６ウェルマイクロタイタープレート、２４ウェルマイクロタイタープレート、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレート、）に準拠した形態を有し得る。かかるマイクロ流体‐バイオセンサアレイシステムにおいて、一連のバイオセンサーを含む単一のボトムインサート（すなわち、ウェルのないマイクロタイタープレートの底部分）が、使用されている。
【００２３】
実施形態において、複数のデバイス１００及び／又はデバイス２００を含むシステムが提供される。そのシステムは、マイクロタイタープレートの形態であってもよい。しかしながら、当業者であればデバイス１００及び／又はデバイス２００を所定の設定に構成し得ることが十分理解されるであろう。例示的な構成が図１１に示されている。システム９００は複数のデバイス１００及び／又はデバイス２００を含む。システム９００の複数のデバイス１００及び／又はデバイス２００は流入口９４１を共有し得る。かかるシステム９００において、流入口９４１は複数のチャンバと流体連通する。共有された流入口９４１は、流入口９４１と接続され若しくは流入口９４１に装着され若しくは流入口９４１内に形成されたバルブ９４２を、含み得る。バルブ９４２は、少なくとも１つのチューブ又はチャンネルを介して貯蔵溶液と流体連通し得る。非限定的な例として、図１１は、３個のチューブ若しくはチャンネル９４４，９４５，及び９４６に接続されたバルブ９４２を示している。システム９００の所望の使用に依存して、バルブ９４２に装着されるチューブの数はいかなる数であってもよいことが十分理解されるであろう。流入口９４１と溶液貯蔵器（すなわち、９４４，９４５，および９４６）に接続する少なくとも１個のチューブとの間に、バルブ９４２が接続され得る。マイクロポンプが使用されて、バルブ／注入口を介して、デバイスのチャンバ内に流体の流れが生じせしめられ得る。あるいは、システム９００のデバイス１００及び／又はデバイス２００は、各々が独自に少なくとも２つの流入口（図１及び図２を参照）と１つの流出口９５０を有し得るし、その各注入口は貯蔵器と流体連通する。
【００２４】
実施形態において、マルチウェルプレート１０００（図１２ａ及び図１２ｂ）が提供される。かかるマルチウェルプレート１０００は、標準サイズのマイクロウェルプレート１０６０に内臓されたデバイス１００及び／又は２００を含み得る。図１２ａに示されているように、マルチウェルプレートシステム１０００は、デバイス１００及び／又はデバイス２００を有する平坦の最下層１０６１を有する標準サイズのマイクロウェルプレート１０６０を含み得る。図１２ｂに示されているように、バイオセンサー１０７０は最下層１０６１内に内臓されている、バイオセンサー１０７０において、チャンバはチャンバの底部を形成するバイオセンサー自身によってバイオセンサーを覆っている。チャンバの最上部上に、バイオセンサーチャンバシステム１００又は２００の流入口に接続する複数のウェル１０６２がある。マルチウェルプレートプレート１０６０の複数のウェル１０６２がデバイス１００及び／又はデバイス２００の注入口と流体連通し得る。ウェル１０６２は、デバイス１００及び／又はデバイス２００の貯蔵器として機能し得る。さらに、デバイス１００及び／又はデバイス２００は流出口１０５０を含み得る。その流出口１０５０は、マルチウェルプレートのフットプリント内にあるマイクロプレート１０６０のエッジに設けられ得る。デバイス１００及び／又はデバイス２００の各々が独自に流出口１０５０を含むものとして、図１２ａに示されているものの、２以上のデバイス１００及び／又はデバイス２００は流出口１０５０を共有し得る。６つのウェル１０６２が表されているものの、細胞１０６２の個数は、熟練した職人の希望に応じて、いなかる個数であってもよいことが十分理解されるであろう。非限定的な例において、ウェル１０６２は、９６，３８４又は１５３６マルチウェルプレートの標準間隔パターンで配置され得る。かかる標準マルチウェルプレートの使用によって、高処理能力細胞培養実験を自動的に制御する従来のロボットシステムが使用可能となる。
【００２５】
実施形態において、バイオセンサーは無標識細胞に基づいた分析に使用され得る。一般に、無標識細胞に基づく分析は、リガンドによって誘起された生体細胞の応答を観測するためにバイオセンサーを採用している。バイオセンサーは、光学的、電気的、熱的、音響的、磁気的トランスデューサ等のトランスデューサを通常利用して、分子の認識の事象又はバイオセンサーに接触された細胞においてリガンドによって誘起された細胞の変化を定量化可能な信号に変換する。これら無標識バイオセンサーは分子の相互作用の分析に使用され得る。その分子の相互作用の分析は、分子複合体が時間とともに或いは細胞応答に対してどのように形成し且つ分離するのかを特徴付けることを含み、細胞が刺激に対してどのように反応するのかを特徴付けることを含む。デバイスのバイオセンサーは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）及ぶ共鳴導波グレイティング（ＲＷＧ：ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｇｒａｔｉｎｇ）バイオセンサーや光学干渉計ベースのバイオセンサー等の光学的バイオセンサーシステム、並びにバイオインピーダンスシステム等の電気バイオセンサーシステムであってもよいが、これらに限定されない。
【００２６】
ＳＰＲは、電気的に伝導する金属膜（例えば、金）を有する平面ガラス基板に偏光のウェッジを指向させるプリズムに依存しており、入射角度の範囲に及んで、表面プラズモンを励起する。得られたエバネセント波は、金の層内の自由電子雲と相互作用し、且つ、電子電荷密度波（すなわち、表面プラズモン）を生成し且つ反射光の強度の低減を生じせしめて、かかる自由電子雲によって吸収される。この強度の最小化が生ずる共鳴角度は、センサー表面に対して反対の表面上にある金の層の近傍にある溶液の屈折率の関数となっている。
【００２７】
ＲＷＧバイオセンサーは、例えば、埋め込まれたグレイティング構造を有する基板（例えば、ガラス）、導波薄膜、及び細胞層を含む。ＲＷＧバイオセンサーは回折格子を用いて導波部に対する光の共鳴結合を利用し、かかる光の共鳴結合によって、溶液表面の界面において全内反射が生じ、全反射によって界面において次々に電磁場が形成される。この電磁場は事実上エバネッセントであり、電磁場はセンサーの表面から指数関数的に減衰することを意味している。電磁場が初期値に関して１／ｅに減衰する距離は、侵入深さとして知られており、特定のＲＷＧバイオセンサーの設計に関する関数であるものの、通常約２００ｎｍのオーダーである。このタイプのバイオセンサーは、かかるエバネセント波を利用して、センサーの表面の近傍の若しくはセンサーの表面における細胞層に関してリガンドによって誘起された細胞変化を特徴付けている。
【００２８】
ＲＷＧ装置は角度シフト測定若しくは波長シフト測定に基づいて複数のシステムに細分化され得る。波長シフト測定において、角度を一定に保ちつつ、入射波長の範囲に及ぶ偏光が、導波路を照射するのに使用される。特定波長を有する光は導光路内で結合され、導波導光路に沿って伝播する。あるいは、角度シフト装置において、センサーは単色光によって照射され、光が共鳴結合される角度が測定される。共鳴条件は、バイオセンサー表面と直接接触する細胞層（例えば、細胞の密集度、細胞の付着性、及び細胞状態）によって影響される。リガンド又は分析物が生体細胞内の細胞のターゲット（例えば、ＧＰＣＲ、キナーゼ）と相互作用するときに、細胞層の局所的な屈折率変化が、共鳴角度のシフト（又は共鳴波長のシフト）として検知され得る。
【００２９】
Ｃｏｒｎｉｎｇ社登録商標Ｅｐｉｃ社登録商標システムは、無標識生化学的又は細胞ベースの分析にＲＷＧバイオセンサーを使用している（コーニング株式会社、コーニング、ニューヨーク州）。Ｅｐｉｃ社登録商標システムは、ＲＷＧプレートリーダーと、ＳＢＳ（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）規格サイズのマイクロタイタープレートと、から成り、その各々が底部にＲＷＧバイオセンサーを含む。プレートリーダーにおける検出システムは、リガンドによって誘起された細胞の変化の結果として入射光の波長シフトを測定するために、統合されたファイバ光学装置を利用している。一連の照光‐検出ヘッドが直線的に配置されているので、反射スペクトルが、３８４ウェルのマイクロプレートのカラム内の各ウェルから同時に収集される。各センサーが複数回扱われ得るように、全プレートが走査され、各カラムは連続して扱われる。入射された光の波長が、収集されて、分析に使用される。温度変動に帰属する入射波長の不要なシフトを最小化するために、温度制御装置が装置に含まれ得る。測定された応答は、多数の細胞について平均化された応答を表している。
【００３０】
電気バイオセンサーは、基板（例えば、プラスチック）、電極、及び細胞層から成る。この電気的な検知手法において、細胞は基板上に並べられた小さな金の電極上で培養され、システムの電気インピーダンスが経時的に調べられる。インピーダンスは細胞層の電気伝導率の変化の指標である。通常、周波数を固定し若しくは周波数を変動させて、一定の小電圧が、電極又は一連の電極に印加され、回路を介した電流が時間とともに観測される。リガンドによって誘起された電流変化によって、細胞の応答に関する指標が与えられる。細胞全体について検出するためのインピーダンス測定は１９８４年に最初に実現された。それ以来、インピーダンスベースの測定は、細胞の付着及び拡散、細胞の微小運動、細胞の構造変化、及び細胞の死を含む広い範囲における細胞の事象を研究するために利用されてきた。古典的なインピーダンスシステムは、使用される検出電極が小さく且つ基準電極が大きいことが原因で、分析に関する変動性が大きくなってしまうという欠点を有する。この変動性を克服するために、ＣｅｌｌＫｅｙシステム（ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ、南サンフランシスコ、カリフォルニア州）やＲＴ‐ＣＥＳ（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ株式会社、サンディエゴ、カリフォルニア州）等の最新世代のシステムは、ミクロ電極アレイを有する集積回路を利用している。
【００３１】
ＳＰＲ画像システム、エリプソメトリ画像システム、及びＲＷＧ画像システムを含む光学バイオセンサー画像システムにより、高空間分解能が得られ、望ましくは、これらシステムは本開示に使用される。例えば、ＳＰＲイメージャ登録商標ＩＩ（ＧＷＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ有限会社）は、プリズム結合ＳＰＲを使用して、入射角を固定してＳＰＲ測定を行い、ＣＣＤカメラを用いて反射光を収光している。表面の変化は反射率の変化として記録される。したがって、ＳＰＲ撮像は同時に、アレイのすべての要素に対して測定値を同時に収集する。
【００３２】
あるいは、ＲＷＧバイオセンサーに基づく可変波長光学送受観察（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）システムは撮像ベースのアプリケーションに採用され得る。このシステムにおいて、高速可変波長レーザ源は、センサー又はマイクロプレートの形態のＲＷＧバイオセンサーアレイを照明するのに使用され得る。レーザ波長がスキャンされると、時間の関数としてセンサーから反射された光の強度を検出することによって、センサーのスペクトルが取得され得るし、コンピューター化された共振波長送受観測モデリングによって測定されたデータの分析によって、固定された受容体又は細胞層を有するバイオセンサーの空間分解画像が形成される。画像センサーの使用によって、自然に撮像ベースの送受観測システムが得られる。２次元の無標識画像が部品を移動させることなく取得され得る。
【００３３】
あるいは、また、垂直偏波又はｐ偏光ＴＭ０モードを有する角度型送受観測システムが使用され得る。このシステムは一連の光ビームを生成する発光システムから構成されており、各々が約２００μｍｘの３０００μｍまたは２００μｍｘ２０００μｍの寸法のＲＷＧセンサーを照射する。また、このシステムは、これらセンサーから反射された光ビームの角度変化を記録するＣＣＤカメラベースの受信システムから構成されている。一連の光ビームが回折光学レンズと組み合わされたビーム分割器によって取得される。このシステムによって、最大で４９個のセンサ（７×７のウェルセンサアレイ）が３秒毎に同時にサンプリングされ得る。
【００３４】
あるいは、走査型波長送受システムも使用され得る。このシステムにおいて、角度を一定に維持しつつ入射波長の範囲に及ぶ偏光が、導波グレイティングバイオセンサを照明し且つ走査するのに使用され、各位置における反射光が同時に記録され得る。走査を通して、バイオセンサーの高分解能画像が得られる。
【００３５】
例えば、通常数十ミクロンを有する比較的大きい寸法の細胞は、動的な物体である。ＲＷＧバイオセンサーは、細胞の底部におけるリガンドによって誘起された変化の検出を可能にし、かかる変化は、エバネセント波の侵入深さによって決定される。その上、光学バイオセンサーの空間分解能は、入射光源のスポットサイズ（約１００ミクロン）によって決定される。したがって、一般に、非常に密集した細胞層が、最適な分析結果を得るのに使用され、センサーの構成は、３層の導波複合体と見なされ得る。かかる３層の導波複合体は、例えば基板、導波薄膜、及び細胞層を含む。細胞生物物理学と組み合わせて３層導波バイオセンサー理論に従って、我々は、細胞全体を検出するためには、リガンドによって誘起された有効屈折率変化、すなわち検出された信号Ｎは数式（１）によって規定されることを見出した。
【００３６】
[数式１]
2010154847.tif 000003
【００３７】
ここで、Ｓ（Ｃ）は細胞層に対するシステムの感度であり、Δｎｃはバイオセンサーによって検知された細胞層の局所的屈折率におけるリガンドによって誘起された屈折率変化である。ΔＺｃは細胞層への侵入深さであり、αは特定の屈折率の増大率（タンパク質に対しては約０．１８／ｍＬ／ｇ）であり、ｚｉは、質量の再分布が生ずる距離であり、ｄは細胞層内の薄片の架空の厚さである。ここで、細胞層は垂直方向において均等に離間された部分に分割される。我々は、検出された信号が細胞層の底部分の屈折率変化Δｎｃに一次的に正比例することを想定した。細胞内の所定の容積の屈折率は、主にタンパク質等の生物分子の濃度によって主に決定されると仮定すると、同様に、Δｎｃは検出容積内の細胞のターゲット又は分子集合の局所濃度変化に正比例する。指数関数的に減衰するエバネッセント波の特性を考慮して、重み付け因子ｅｘｐ（−ｚｉ／ΔＺｃ）は、生ずる局所的タンパク質濃度の変化が考慮されている。したがって、検出された信号は、センサーの表面から異なる距離で生じる集団再分布の和であり、各々が全ての応答に対して不均一に貢献する。数式（１）が提案していることは、ＲＷＧバイオセンサーを用いて検出された信号は主として垂直な集団再分布に対して敏感であることであり、これは局所的なタンパク質濃度の変化に起因する。検出された信号は、動的集団再分布（ＤＭＲ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｓｓ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）信号と称されている。
【００３８】
典型的なインピーダンスベースの細胞分析において、細胞は移動されて培養ウェルの底に並べられた金の電極に接触される。センサーシステムの総インピーダンスはバイオセンサーを囲むイオン環境によって主として決定される。電界を印加すると、イオンは電界によって指向された運動を行い、濃度勾配による拡散を受ける。細胞全体について検出するためには、全電気インピーダンスは４つの成分を有する。すなわち、電界溶液の抵抗、細胞のインピーダンス、電極／溶液界面におけるインピーダンス、電極／細胞界面におけるインピーダンスである。さらに、細胞のインピーダンスは２つの成分を含む。すなわち、抵抗及びリアクタンスである。細胞のイオン強度に関する伝導特性は抵抗成分を与えるものの、不完全なコンデンサとして作用する細胞膜は周波数に依存する反応成分に寄与する。したがって、全インピーダンスは多くの因子の関数として表される。かかる因子は、例えば、細胞の生存能力、細胞の密集度、細胞の数、細胞の形態、細胞の付着度、イオン環境、細胞内の水分、検出周波数等を含む。したがって、また、刺激下の生体細胞のバイオインピーダンス信号は、細胞の積分された応答である。
【００３９】
その積分化特性の故に、ＤＭＲ信号等のバイオセンサー出力信号は、異なる刺激条件下で信号を伝達する細胞を研究するのに使用され得る。
【００４０】
本開示は、パルス刺激下で細胞信号伝達を観測するさらなる方法を提供する。本開示の方法はマイクロ流体又は流体を使用して、細胞を包囲する環境を制御し、細胞に暴露された刺激の持続期間及び時間を制御する。これは、細胞の信号伝達及びリガンドの薬理学等の細胞の振る舞い及び機能を研究するためであるが、これらの研究に限定されない。１つの態様において、マイクロ流体又は流体は、比較的低速の層流若しくは存在しない層流において操作され得るので、流れ自身が細胞の応答を誘因しない。したがって、流れと、刺激によって誘起された応答との干渉が最小化される。採用されと、マイクロ流体デバイスの層流に関して１つの重要な一面として、層流によって複数の流体が混ざることなく並列に流されることがあげられ、この事は生物系においては共通な特徴である。
【００４１】
実施形態において、制御された手法によって細胞に対して刺激を伝達し、パルス刺激を与える方法が提供されている。かかる方法は、少なくとも１つの細胞をデバイスのチャンバに導入するステップと、少なくとも１つの細胞を前記チャンバの底面に付着せしめるステップと、第１期間中に、前記チャンバ内を流れる第１溶液に前記細胞を接触させるステップと、第２期間中に、前記第１溶液に置換されるべく前記チャンバ内を流れる第２溶液に前記細胞を接触させるステップと、前記第１及び第２溶液に対する前記細胞の応答を動力学的に観測するステップと、を含み、前記デバイスは、上面を含むバイオセンサーと、前記バイオセンサーを取り囲み且つ底面を含む内側表面を含むチャンバと、前記チャンバの前記内側面と流体連通し且つバルブを含む少なくとも１つの流入口と、前記チャンバの前記内側面と流体連通する少なくとも１つの流出口と、を含み、前記チャンバの前記底面は前記バイオセンサーの前記上面と同一か又は前記バイオセンサーの前記上面の近傍にあり得るし、前記バルブは少なくとも２つの貯蔵溶液と流体連通していることを特徴とする方法である。バイオセンサーは、例えば、共鳴導波グレイティングバイオセンサ、表面プラズモン共鳴ベースのバイオセンサー、光学干渉計ベースのバイオセンサー、又は電気バイオセンサーであり得る。
【００４２】
第１及び第２溶液は、流入口を通してチャンバに注入され、チャンバ内を流れ且つ少なくとも１つの細胞を接触し、流出口に向ってチャンバ内を流れる。チャンバは少なくとも２つの流入口及び少なくとも１つの流出口を含み得る。あるいは、チャンバは少なくとも１つの流入口と、少なくとも１つの流出口と、流入口に接続され、装着され、或いは流入口内に構築されたバルブと、を含み得る。バルブは、少なくとも２つのチューブを介して少なくとも２つの貯蔵溶液と流体連通し得る。その少なくとも２つのチューブは第１溶液と第２溶液のそれぞれの貯蔵器に装着されている。
【００４３】
細胞はチャンバの底面に直接的に培養され得るし、又は、チャンバの底面に接触するよう移動され得る。どちらの場合であっても、少なくとも１つの細胞が前記チャンバの底面に付着される。細胞が付着された後に、第１溶液がチャンバへと注入され、流入口の１つを介して流れ、細胞と接触し、そして流出口を介してチャンバから流出する。第１期間の後に、第２溶液が第２流入口を介して若しくは第２貯蔵容器に切り替えることによってチャンバ内に注入される。第２溶液は第１溶液と共に注入され得るし、又は、チャンバ内の第１溶液に置換されるべく、第１溶液と第２溶液とが連続して注入され得る。第２溶液は、流出口からチャンバを出る前に、細胞と接触し得る。第２期間の後に、第２溶液を交換して、第１溶液がチャンバ内へと注入され得るし、又は、第２溶液の流量が停止される。マイクロポンプが、溶液をチャンバ内に注入するのに使用され得る。溶液の流速は、非限定的な例によって、約０．５マイクロリットル／分から約５マイクロリットル／分までであってもよい。第１及び第２溶液は交替され得るし、幾度もチャンバ内を流され得ることが十分理解されるであろう。さらに、２以上の溶液はチャンバ内へと注入されうることが十分理解されるであろう。非限定的な例として、第２溶液を交換して、第３溶液がチャンバ内へと注入され得る。あるいは、第２溶液を注入する前に、第２溶液を交換して、第１溶液がチャンバ内へと注入され得る。いかなる貯蔵溶液の組み合わせも熟練した職人によって使用され得ることが十分理解されるであろう。別の実施例では、第１及び第２溶液は独立する２つの流入口を介して並列に注入され得る。その２つの溶液はチャンバ内における層流という特性に起因して混合しないだろう。第１期間の後に、しばらくの間、第１溶液を第２溶液と交換して、第１溶液の流量が停止され得る。第１溶液及び第２溶液に暴露された領域間において、細胞の応答が記録され且つ比較され得る。
【００４４】
実施形態において、第１溶液は、チャンバ内の細胞に対して影響を及ぼし得ない中性緩衝液である。第２溶液は、受容体のきっ抗薬若しくは作用薬、ホルモン、又は例えば、薬物の候補物質等の化学化合物等の刺激物である。代替的例示実施形態において、第１溶液は興奮剤を含み得るものの、第２溶液は中性緩衝液であり得る。さらに別の例示実施形態において、第１溶液は、化学物質又は薬物の候補物質等、成分において第２溶液と異なり得る。さらに別の例示実施形態において、２以上の溶液が連続的なステップ手法及び複数ステップ手法によって使用され得る。さらに別の例示実施形態において、２以上の溶液が連続的なステップ手法及び複数ステップ手法によって使用され得る。
【００４５】
本開示の方法は、前記第１及び第２溶液に対する前記細胞の応答を観測するステップを有する。先に説明したように、バイオセンサーを使用して細胞の応答を観測する方法が従来技術において知られている。ＲＷＧを使用して細胞の応答を観測する実施例が、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３５３９，ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００８５８２，及びＰＣＴ／ＵＳ２００８／００２３１４に開示されており、その明細書の全体が本明細書によって参考として組み入れられている。細胞応答の観測は、質的又は量的に実行され得る。例えば、化合物の初期のスクリーニングは質的なモニタリングを使用して実行され得る。一方、量的に初期のスクリーンからの対象となる化合物についてさらに観測され得る。
【００４６】
本開示の流体又はマイクロ流体デバイスは、勾配の生物系等の不均一性と複雑な信号伝達の研究を可能にする。不均一性は、恐らく、生物学的に最も関連する問題であり、マイクロプレートベースの細胞分析等の従来のシステムによっては達成され得ない。
【００４７】
本開示のマイクロ流体及びデバイスは、制御された方法によって細胞に対して刺激を伝えのに使用されて、細胞がパルス刺激にのみ暴露され得る。したがって、刺激溶液を緩衝化溶液に交換することによって、細胞は短期間刺激にのみ暴露され得る。パルス刺激は、短期間作用型リガンドと長期間作用型リガンドとを区別し、持続的刺激によって誘起された細胞事象と短期的刺激によって誘起された細胞信号伝達とを区別するのに使用される。その上、また、パルス刺激は繰り返して印加され得る。これは、受容体のクロストーク、受容体の再感作処理、並びに薬理学及びリガンドの機能的選択性の複雑性を研究するためである。さらに、デバイスによって、試薬の流れが一定に維持され、副産物が除去され得る。かかる能力は、開口分泌関連のセル事象及び受容体の転写促進を研究する際に重要であり得る。例えば、多くの場合、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ：Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）活性化によって、膜結合性ＥＧＦリガンドの酵素の放出を介して、表皮成長因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）受容体の転写が促進される。溶液の流れを一定にすることによって、放出されたＥＧＦリガンドは除去され得る。したがって、転写促進による細胞応答は最小化され得る。
【００４８】
実施形態において、機械的な力によって誘起された細胞信号伝達及び機械的な力によって誘起された細胞信号伝達に関して後に生ずる化学的な干渉を観測する方法を提供する。かかる方法は、少なくとも１つの細胞をデバイスのチャンバに導入するステップと、少なくとも１つの細胞を前記チャンバの底面に付着せしめるステップと、第１期間中に、段階的に増大する流速で前記チャンバ内を流れる第１溶液に前記細胞を接触させるステップと、機械的な力によって誘起された細胞信号伝達に対して、前記第１溶液に対する前記細胞の応答を観測するステップと、を含み、前記デバイスは、上面を含むバイオセンサーと、前記バイオセンサーを取り囲み且つ底面を含む内側表面を含む前記チャンバと、前記チャンバの前記内側面と流体連通し且つバルブを含む少なくとも１つの流入口と、前記チャンバの前記内側面と流体連通する少なくとも１つの流出口と、を含み、前記チャンバの前記底面は前記バイオセンサーの前記上面と同一か又は前記バイオセンサーの前記上面の近傍にあり得るし、前記バルブは少なくとも２つの貯蔵溶液と流体連通していることを特徴とする方法。一旦、細胞の信号伝達が誘起されると、高い流速は維持され、化合物若しくは他の成分を含む第２溶液がチャンバ内に注入されて細胞と接触し、機械的な力によって誘起された細胞の信号に影響を及ぼす化合物若しくは他の成分の作用が決定され得る。あるいは、化学物質又は薬剤の候補分子を含む溶液がチャンバ内に流されて、段階的に流速を増大させることにより細胞に接触するので、細胞に対する機械的な力によって誘起された細胞の信号伝達に影響を及ぼす化合物若しくは他の成分の作用が直接的に決定され得る。分子若しくは薬剤の候補分子の存在又は不存在により生ずる機械的な力によって誘起された信号伝達に対する流速の閾値は、細胞の機械的な検知に介入する分子の能力に関する指標として使用され得る。
【００４９】
[実施例]
本開示を、以下の実施例によってさらに説明する。
【００５０】
[実験方法]
材料：
ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス、ミズーリ州）からエピネフリン、ノルエピネフリン、サルメテロール、シクロヘキシミド、フォルモテロール、サルブタモール、トロンビン、及びグリセリンが取得された。Ｂａｃｈｅｍ（キング・オブ・プロシア、ペンシルベニア州）からＳＦＬＬＲ−アミドが取得された。Ｃｏｒｎｉｎｇ社登録商標Ｅｐｉｃ社登録商標の３８４ウェルバイオセンサーインサート及び９６ウェルバイオセンサーインサートがコーニング株式会社（コーニング、ニューヨーク州）から取得され、使用する前に高強度のＵＶ光（ＵＶＯクリーナー、Ｊｅｌｉｇｈｔ株式会社、ラグナヒル、カリフォルニア州）に暴露することによって６分間洗浄された。ＣｏｒｎｉｎｇＥｐｉｃ社登録商標３８４ウェルバイオセンサーの細胞培養互換性マイクロプレートは、コーニング社から取得され、付加的処理もせずに使用された。
【００５１】
ＰＤＭＳチャンバの製造とバイオセンサーデバイスのアセンブリ：
製造の第１ステップは、シリコンマスタを作成することから成る。これはシリコン［１００］ウエハに対するフォトリソグラフィによって得られた。簡潔には、レジストが適用される直前にＰ−２０によって４インチのシリコーンウエハが準備された。１μｍの厚さのＳｈｉｐｌｅｙ１８１３レジストが、３０秒間、３０００ｒｐｍでウエハ上で回転され、１１０℃で１分間ホットプレート上で穏やかに焼成された。ウエハは、ＣＡＤ図面として設計された所望の構造を有するクロムマスクを介してＭＡ６（カールツァイス）マスクアライナを使用するＵＶ光に暴露された。８０℃で２分の予備加熱した後に、ウエハは、最終的に形成されて（６０−１００ｓ、ＭＦ−３１９，Ｓｈｉｐｌｅｙ）、水で徹底的に洗浄され、乾燥された。２００μｍの流体チャンネルと細胞培養チャンバの金型が、Ｐｌａｓｍａ  Ｔｈｅｒｍ７２のフッ素ベースの反応性イオンエッチング装置を使用してシリコーンとなるようエッチング処理された。フォトレジスト除去と洗浄の後に、シリコーンマスタは、表面安定化処理のため、２時間、トリクロロ（１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ）−ペルフルオロオクチル蒸気に暴露された。
【００５２】
構造のＰＤＭＳレプリカは、４インチのシリコンマスタ全面にわたってＰＤＭＳ前駆体を注ぐことによって製造された（プレポリマに対する硬化剤の割合が１：１０，Ｓｙｌｇａｒｄ１８４，ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ、米国）。その後、それは８０分間、７０℃で硬化された。硬化されたＰＭＤＳは、製造を完成するべくシリコーンの金型から取り除かれた。その結果、４×６のチャンバのアレイを有するＰＤＭＳデバイスが、製造された。そのチャンバの各々が１つの流入口と１つの流出口を有した。
【００５３】
一度、ＰＤＭＳチャンバが製造されると、これら基板は、Ｏ２プラズマ洗浄を３０秒に５００ｍＴｏｒｒの圧力で使用することで表面酸化処理され、バイオセンサーインサート上に装着されて、チャンバ内において、チャンバの中心内に位置するバイオセンサーが存在する。その後、各チャンバは３０秒間７５％のエタノールで二度充満され、それに続いて、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄され乾燥された。ＰＤＭＳチャンバデバイスの４×６のアレイは９６ウェルバイオセンサーのインサートに装着されて、各チャンバ内において、チャンバの中心に位置するバイオセンサーがあった。９６ウェルバイオセンサーインサートは、ＳＢＳ互換性のある９６ウェルマイクロプレートであるフットプリントの形態で、８×１２のバイオセンサーのアレイから成る。各チャンバは流入口及び流出口を有する。バルブは流入口に接続され、またポンプと接続されている。バイオセンサー寸法は約３ｍｍｘ３ｍｍである。各チャンバの寸法は、流入口から流出口までの長さ〜９ｍｍを有し、〜５ｍｍの幅を有し、〜２００ミクロンの高さを有する。同様に３８４ウェルバイオセンサーもまた使用され得る。
【００５４】
細胞の培養：
すべての細胞株はアメリカンタイプカルチャーコレクション（マナッサス、バージニア州）から取得された。使用された細胞培養媒体はダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）であった。かかるダルベッコ変法イーグル培地には、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルのブドウ糖、２ｍＭグルタミン、及び人体の類表皮癌Ａ４３１と人体の肺癌Ａ５４９の双方に対する抗生物質が添加されている。
【００５５】
細胞は、バイオセンサーマイクロプレート内の対応する５０マイクロリットルの培養培地に浮遊した３−１５のパッセージにおいて〜１×１０４個から２×１０４個の細胞を使用して培養された。３７℃で空気／５％ＣＯ２下で〜１日間培養された。無血清のＤＭＥＭ内で継続的に培養することにより〜２０時間で死んでしまうＡ４３１を除いて、Ａ４５９細胞は死ぬことなく直接検査された。分析時のすべての細胞の密集度は〜９５％から１００％であった。マイクロ流体‐バイオセンサーチャンバシステム内の細胞の培養において、１０％のＦＢＳを含む１０マイクロリットルの溶媒に浮遊された〜４×１０４個の細胞が、チャンバに注入され、〜９５％の細胞密集度が得られるまで、３７℃で空気／５％ＣＯ２下で培養された。培養中の乾燥を防ぐために、バイオセンサーデバイスはカバーを有するペトリ皿内及びペトリ皿内の付加的な細胞培地内に保管された。
【００５６】
細胞の生物学的な状態（例えば、細胞の変化、細胞の密集度、及び付着度）は、質量の再分布に関する測定に影響を与えるので、細胞の質が、光学顕微鏡及び光学システムを使用することで調べられた。光学システムによって、例えば、Ｆａｎｇ、Ｙ．他の共有の米国特許出願第１２／１２８，２６７号では、に開示されているように、１つの細胞と同じ解像度でセンサー全体の共鳴画像を収集することができる。その開示の全体が本明細書に組み入れられている。
【００５７】
バイオセンサーデバイス内の化学勾配の変化度：
バイオセンサーデバイスの特性を明らかにするために、バイオセンサーデバイスはグリセリン及び水からなるパルス流を受けた。バルクの屈折率変化に起因するバイオセンサーの出力が、記録され且つ分析された。あるいは、数理的モデリングも、バイオセンサーシステム内の流動について特性化するために適用された。
【００５８】
無標識バイオセンサー分析法：
コーニング社のＲＷＧ（共鳴導波グレイティング）画像システムが、無標識バイオセンサー細胞分析に使用された。掃引波長送受観測に基づく画像システムは、高分解能の撮像が可能である。すなわち、結合光の伝播路に対して垂直な方向において６ミクロンの空間的分解能を有し、結合光の伝播路に対して平行な方向において約１５０ミクロン若しくは６ミクロンの分解能を有する。センサー全体を横切った細胞応答がリアルタイムで、各ピクセル（６ミクロンｘ６ミクロン）で記録された。バイオセンサー表面の確定位置又は領域において、細胞の応答が、検出領域内の多数の細胞の応答を生成するべく、平均化された。
【００５９】
あるいは、また、コーニング登録商標Ｅｐｉｃ登録商標走査型波長送受観測システムは「緩衝液交換（ｂｕｆｆｅｒ  ｓｗａｐｐｉｎｇ）」手法とともに使用された。これは、短期間作用型リガンドと長期間作用型リガンドとを区別するためである。
【００６０】
Ａ４３１細胞は、分析前に高密集化され、無血清培地を用いると一晩で死ぬことがあった。Ａ５４９細胞に対しては、細胞は高密集化されるよう成長され、死ぬことなく分析に使用された。分析前に、細胞培地は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝溶液を有する１ｘハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ：Ｈａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に置換され、約１時間、画像システム内で培養された。チャンバは６．６のマイクロリットルの緩衝溶液で満たされた。ＨＢＳＳ溶液は、注入口からチャンバ内に初め注入され、安定したベースラインに達するまで制御ポンプを使用して低流速（通常は１μｌ／分、すなわち１マイクロリットル／分）でバイオセンサーに流れた。そして、第１溶液、すなわち、通常、受容体作用薬又はＨＢＳＳ緩衝液に溶解された化合物を含む溶液が、バルブを切り換えることによって、流入され、しばらく間（例えば、１分、５分、又は３０分）、バイオセンサーに流された。その後に、ＨＢＳＳバッファ溶液が再注入されバイオセンサーに流されて、第１溶液が置換された。ある期間の後に、通常、受容体作動薬又は化合物を含む溶液であって、第１溶液とは異なるか或いは同一の第２溶液が、注入されバイオセンサーに継続的に流されて、細胞の応答が誘因された。流速は、通常は比較的遅いので（〜０．５マイクロリットル／分から約５マイクロリットル／分）、機械的に敏感な細胞の応答は誘起されず、観測された細胞応答は、主に溶液内の化学物質に帰属するものであった。これらステップの異なる組み合わせが、分析の目的に依存して、利用され得る。分析中の細胞応答は、高解像画像システムを使用して記録された。使用されたバイオセンサーインサートに依存して、バイオセンサーは３ｍｍｘの３ｍｍ又は２ｍｍｘ２ｍｍの寸法を有する。チャンバは、流入口から流出口までの長さ約９ｍｍ、５ｍｍの幅、センサー表面からチャンバの底面まで１００ミクロンの高さの寸法を有する。チャンバを満杯にするのに必要な溶液の総量は約６マイクロリットルである。
【００６１】
ＲＷＧバイオセンサーは、そのエバネッセント波を、リガンドによって誘起された細胞の動的集団再分布（ＤＭＲ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｓｓ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）信号を測定するに利用している。エバネセント波は、細胞内部に広がり且つ距離とともに指数関数的に減衰し、約１５０ｎｍの特性的な検知ボリュームが得られる。これは、受容体の活性化を介して介在されたいかなる光学応答も、エバネセント波がサンプリングする細胞部分にわたった平均を表しているにすぎないことを意味している。バイオセンサーを用いたかかるサンプリングは、異なる刺激条件下で、生体細胞内の異なる種類の受容体の信号伝達を区別するには十分である。
【００６２】
ＳＰＲのように、ＲＷＧバイオセンサーは、屈折率、すなわち、生物分子の固有特性に敏感である。細胞内の所定の容積の屈折率は、タンパク質等の生物分子の濃度によって主に決定されるので、３層の導波グレイティング理論に基づいて、リガンドによって誘起された光学応答は動的集団再分布と大きく関連づけられることを、我々は見出した。センサーの表面に向かう細胞のターゲットの再配置（例えば、基底膜表面で活性化された受容体に対する細胞内のターゲットの再配置）は、ＤＭＲ（Ｐ−ＤＭＲ）に対して正に寄与し、逆に、センサーの表面から離間された細胞のターゲットの運動（例えば、受容体の内部化）はＤＭＲ（Ｎ−ＤＭＲ）に対して負に寄与する。これらの事象の合算によって、リガンドによって誘起されたＤＭＲの動力学及び振幅が決定される。しかしながら、ＰＷＲ技術とセンサー表面上に固定されたＧタンパク質共役型受容体であって生体外で再構成されたＧタンパク質共役型受容体を使用した最近の研究によれば、受容体脂質膜システムにおいてリガンドによって誘起された光学応答は２つの成分、すなわち、質量密度の変化と構造変化から成ることが示されている。本明細書で使用されたＲＷＧバイオセンサーは、これらの成分の寄与を区別できないので、生体細胞内の生物分子の組織においてリガンドによって誘起されたかかる組織の変化は、測定された応答の全体に寄与し得る。
【００６３】
バイオセンサー細胞分析に対して、ベースラインが最初に、確立された。すべての研究が、被制御温度（２２℃）にて実行され、特に言及されない場合、各測定に対して３つの再現性ある結果が得られた。
【００６４】
実施例１：（マイクロ）流体‐ＲＷＧバイオセンサーシステムの特性
（マイクロ）流体‐バイオセンサーシステムの流動について特性化するために、グリセリン及び水の代替的流量が使用され、それら光学応答が記録された。バイオセンサーシステムは、以下の寸法を有した。チャンバは２つの流入口及び１つの流出口を含み、流入口と流出口との間の距離は約９ミリメートルであった。幅は約４ミリメートルであった。高さは約２００ミクロンであった。チャンバを充満させた全容積は、約６マイクロリットルであった。チャンバの中心内に位置するバイオセンサーは２ミリメートル×２ミリメートルであった。あるいは、蛍光染料溶液と水の代替的流量が生成され、蛍光顕微鏡法を使用して調べられた。
【００６５】
第１に、１マイクロリットル／分の流速における異なる体積の注入プラグの滞留時間が観測された。ここで、所定の体積を有する一連の２％グリセリン溶液が一定流のＨＢＳＳ緩衝溶液間のチャンバ内に流された。グリセリン溶液がチャンバ内に流されると、バルクの屈折率変化によって、共鳴波長が増大した。センサー全体を横切るように細胞応答が記録され且つ時間の関数としてプロットされた（図３）。緩衝溶液の流れの間に注入されたグリセリン溶液の総体積が図３に示されており、１マイクロリットル（３００）、２マイクロリットル（３０２）、４マイクロリットル（３０３）、及び９マイクロリットル（３０４）である。
【００６６】
蛍光顕微鏡の観察に対して、スルホローダミン（ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ）Ｂ溶液（ＨＢＳＳ緩衝溶液において０．３ｍＭ）が、緩衝液により予め充填されたマイクロ流体チャンバに注入された。濃度分布に関する主な興味は、ＲＷＧバイオセンサー領域に関連するので、バイオセンサー上の４００μｍ離間された４つの異ななるラインで測定が行われた。スルホローダミンＢ溶液の注入に続いて、１マイクロリットル／分で緩衝液洗浄が実行された。バイオセンサー上の蛍光強度の典型的な結果が図４に示されている。図４ａはバイオセンサーを横切る４つの異なる領域４１１、４１２、４１３、及び４１４（流入口に最も近い領域から流出口に最も近い領域に至る）の蛍光強度分布を示している。かかる傾向強度分布は、緩衝液、染料溶液、及び緩衝液を１マイクロリットル／分の流速で交互に流し、染料溶液の量は１マイクロリットルである。図４ｂはバイオセンサーを横切る４つの異なる領域４２１、４２２、４２３、及び４２４（流入口に最も近い領域から流出口に最も近い領域に至る）の蛍光強度分布を示している。かかる傾向強度分布は、緩衝液、染料溶液、及び緩衝液を１マイクロリットル／分の流速で交互に流し、染料溶液の量は４マイクロリットルである。
【００６７】
蛍光測定（蛍光）とバイオセンサー画像システム（光学的）に対して、異なる領域間のピーク形状、滞在時間、及び時間遅延が比較されている。データを表１にまとめている。結果が示すことは、両方法によって、マイクロ流体‐バイオセンサーチャンバ内において、同程度の流体特性が得られたことがあげられる。
【００６８】
[表１]マイクロ流体‐バイオセンサーチャンバ内の流れの特性。
2010154847.tif 000004
【００６９】
第２に、バイオセンサー測定に与える溶液流の影響、特にシステムの背景ノイズ、並びに、温度変動、及び／又は、フローによって生成された機械的な力に対する細胞の応答、が検査された。ＲＷＧ画像システムが、異なる組み合わせの流体の運動に対するバイオセンサーの応答をリアルタイム観測するのに使用された。主な結果が図５に示されている。図５は、異なる流速における緩衝液の流動に対する、静止Ａ４３１細胞層を有するマイクロ流体−ＲＷＧバイオセンサーシステムの信号変動を示している。異なるスキャン（５０１，５０２，５０３，及び５０４）は、４つの再現的実験を示している。視覚目的のために、信号はスタート位置においてゼロとなるように規格化されなかった。これらの結果が示すことは、バックグラウンド信号は、ＲＷＧバイオセンサー細胞ベースの分析において通常の変分幅内にあり、検査された範囲内における流速は細胞の基本信号に対して影響をほとんど及ぼさないことである。しかしながら、調べられた流速のうち最高流速においては、細胞は、機械的な力によって誘起された細胞の信号伝達とおそらく関連づけられた検出可能なレベルにて応答する。したがって、以下の研究に対しては、低流速が、リガンドの薬理学及び受容体の生物学を研究するのに通常使用された。
【００７０】
化合物を用いた刺激を与えた細胞の持続時間は、受容体の形質導入を研究し、薬物の薬理学を理解する点において重要であるので、流体力学シミュレーションが流体‐バイオセンサー細胞システム上で動かされた。かかるモデリングによって、異なる流速で異なる体積の化合物を注入する際に、流体の流量、滞留時間、チャンバ内の剪断応力に関する予想が可能となる。流体の流量をシミュレーションするために、ＣＦＤパッケージＦｌｕｅｎｔ６．３が、定常状態のナヴィエ・ストークス方程式を数値的に解くのに使用された。標準圧力速度結合スキーム（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ）は、ＳＩＭＰＬＥであった。流体物性はＨＢＳＳ緩衝液のものに設定された。ＨＢＳＳ緩衝液は非圧縮性の、等温のニュートン流体としてモデル化された。ドメインは二次元平面として定義された。速度流入境界条件が使用された。流出口境界条件はゼロ圧力アウトフローであった。ウォールは「ｎｏ−ｓｌｉｐ」ウォールであった。境界層は、１．２比及び４３ミクロンの深さをともなって、１ミクロンでスタートして、メッシュ化された。シミュレーション結果はモデルメッシュの微調整に大きく依存しているのが見出された。最終的なモデルメッシュは１６７６００の有限体積メッシュ要素を含んだ。細胞数のさらなる増加によっても、同一のシュミレーション結果が得られた。典型的なシュミレーション結果が図６に示された。図６ａは、２マイクロリットル／分の流速における３０秒のトレーサー注入を示している。結果が示すことは、流体運動の端部の大部分は直線的でなく、流入口から流出口に至るチャンバの中心領域は、データを収集し且つ分析するのにより適切であることである。得られたシミュレーション結果は、蛍光色素注入実験で得られたものと比較された。それにもかかわらず、バイオセンサーの寸法が各チャンバの寸法よりもはるかに小さく、各バイオセンサーはチャンバの中心内に位置されているので、流速が調べられた範囲内にある場合には、流体の動力学は一定であると考えられ得るし、流体の流れはバイオセンサー領域上で一定である。
【００７１】
次に、バイオセンサー上に位置された細胞の理論上のタイム露光が、異なる流速及び異なる注入体積で、計算された。図６ｂは、注入体積及び流速の関数として細胞の処理時間のマップを示している。露光時間は、異なる剪断応力条件が必要である場合、注入された化合物の体積によって又は流速によって効果的に制御され得る。
【００７２】
実施例２：ベータ２−アドレナリン受容体に対して長期間作用型作用薬を研究するための緩衝液交換手法
現行のバイオセンサー分析は化合物を用いて持続的な刺激の下で細胞の応答を一般に測定する。化合物は、ピペットで取ることによって或いは搭載型液体ハンドリング装置又はオフライン型液体ハンドリング装置を使用して、センサーの表面に接触された細胞を有するウェルに添加され、化合物は分析中に溶液内に残存する。薬物の薬理学を研究するために、特に、受容体を介した長期間作用に対するリガンド（作用薬又は拮抗薬）の能力を研究するために、緩衝液交換手法が開発された。ここで、リガンド溶液が、センサー表面に培養された細胞を有するウェルに注入されたすぐ後に、リガンド溶液は自動ピペッター又は単に振り払うことによって素早く除去された。その後、緩衝溶液が、細胞を覆うよう再び添加された。かかる緩衝液の交換に対する細胞の呼吸及び／又は細胞の応答に起因して、細胞は３０分から６０分間、緩衝溶液内に維持された。最終的に、第２の作用薬溶液が注入された。第２作用薬によって誘起されたバイオセンサーの出力信号に及ぼす第１リガンドを用いた初期パルス刺激の影響は、ターゲットにされた受容体及びリガンドの双方を介した長期間作用する第１リガンドの能力に対する指標として使用され得る。
【００７３】
かかる手法を使用して、２アドレナリン受容体（２ＡＲ：２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）作用薬のパネルが調査された。結果が図７にまとめられた。図７ａは、２ｎＭエピネフリンによって誘起された静的Ａ４３１細胞のＤＭＲ信号を示し、細胞は、１５０秒間、異なる作用薬によるパルス刺激を用いて前処理された。かかる異なる作用薬は、緩衝液（７１１）、２ｎＭエピネフリン（７１２）、０．５ｎＭサルメテロール（７１３）、１ｎＭＣＧＰ１２１７７（７１４）、及び０．１ｎＭホルメテロール（７１５）である。ここで、エピネフリン及びホルメテロールは２ＡＲに対して完全なる作用薬であるが、これに対して、０．５ｎＭのサルメテロールとＣＧＰ１２１７７は２ＡＲに対して部分的な作用薬となる。エピネフリン以外、他の３つの全作用薬は、２ＡＲに対する長期間作用型作用薬ではない。結果が示すことは、ＣＧＰ１２１７７とホルメテロールの両方を有する細胞に対して与えた１５０秒のパルス刺激によって、エピネフリン応答が抑制されたものの、これに対して、０．５ｎＭのサルメテロールはエピネフリン応答を部分的に減衰させた。逆に、短期作用型作用薬エピネフリンによって、エピネフリンによる第２刺激に対する細胞の敏感性が低下された。これは持続的な刺激条件下で得られたものと矛盾する。２ｎＭエピネフリンを用いて予め処理されたＡ４３１細胞は、２ｎＭエピネフリンを用いた第２刺激に完全に感度を低減されるようになる（データは示していない）。これら結果が提案することは、エピネフリンではなく、ＣＧＰ１２１７７，ホルメテロール又はサルメテロールが、長期作用型作用薬として作用し、緩衝液交換手法を介して、リガンドが長期作用するか否かを決定するのにパルス刺激は使用され得ることである。
【００７４】
図７ｂは、２ｎＭエピネフリンによって誘起された静的Ａ４３１細胞のＤＭＲ信号を示し、細胞は、６秒間、異なる作用薬を用いたパルス刺激によって前処理された。かかる異なる作用薬は、緩衝液（７２１）、２ｎＭエピネフリン（７２３）、１００ｎＭノルエピネフリン（７２４）、１００ｎＭサルブタノール（７２５）、及び１００ｎＭサルメテロール（７２６）である。ここで、ノルエピネフリンは、２ＡＲに対して、部分的に強作用薬であるものの、短期作用型作用薬であるものの、これに対して、１００ｎＭのサルメテロールは、２ＡＲに対して完全な作用薬であるものの、長期間作用型作用薬である。結果が示すことは、１００ｎＭサルメテロールを用いた細胞のかかる短期間パルス刺激によって、エピネフリン応答が部分的に阻害された。これに対して、他のものは、エピネフリン応答に対してほとんど影響を及ぼさなかった。これらの結果が示すことは、サルメテロールは真に長期間作用型作用薬であり、２ＡＲに対する長期間作用型作用薬を区別するために、送信パルス刺激の持続時間はかかる分析の感度に対しては重要であることである。それにもかかわらず、これら結果が提案することは、かかる緩衝液交換手法によって、少なくとも２ＡＲに対して、長期間作用型作用薬の区別が可能にされることである。
【００７５】
実施例３：パルス刺激によって誘起された静的Ａ４３１細胞のＤＭＲ信号
上記緩衝液交換手法によって、パルス刺激下の細胞応答は直接的には測定されない。この原因は部分的には、緩衝液交換手法が、パルス刺激のほかに、不必要な細胞応答を誘因するからである。かかる不要応答によって、通常約３０分間続いてしまうので、パルス刺激によって誘起された応答について無標識バイオセンサーの測定を妨げられてしまう。
【００７６】
ここで、マイクロ流体‐バイオセンサーシステムが、パルス刺激によって誘起された細胞の信号伝達を直接的に測定するのに使用された。そうするために、静的Ａ４３１細胞の融合層を有するマイクロフルイディクスバイオセンサーシステムは、１ｘＨＢＳＳ緩衝液にあらかじめ充満された。定流量ＨＢＳＳ緩衝液が２分間作用薬溶液と置換され、それに続いて、緩衝溶液に戻された。全ての溶液の流速は１マイクロリットル／分であった。
【００７７】
図８は、異なる作用薬によるパルス刺激下における静的Ａ４３１細胞のＤＭＲ信号を示している。かかる異なる作用薬とは、２ｎＭエピネフリン（８０２，および８０３）及び１００ｎＭサルブタモール（８０４）であり、持続的な刺激条件（８０１）下におけるエピネフリン応答と比較されている。２ｎＭエピネフリン溶液が、分析の間、バイオセンサーを横切るように流された。パルス刺激に対して、同じエピネフリン応答が得られ且つ再現性があることが見出された。結果が示すことは、低流速下における持続的エピネフリン応答はマイクロプレートベースの持続的応答（図７の７１１）を使用して得られたものと同程度であることである。さらに、パルス刺激下において、エピネフリンとサルブタモールの両方において、応答は、はるかに小さいものであった。これは恐らく、かかる短期間の下において、短時間作用型作用薬の双方は特にＧタンパク質‐独立信号伝達に対して、持続的な細胞応答を誘因することはできないことに起因する。そのＧタンパク質‐独立信号伝達は、Ｇタンパク質依存信号伝達と比較して、刺激の後に、はるかに遅く通常生ずる。
【００７８】
実施例４：パルス刺激によって誘起されたＡ５４９細胞の無標識光学信号
プロテアーゼの活性受容体（ＰＡＲｓ）は、これまでＰＡＲ１，ＰＡＲ２，ＰＡＲ３，及びＰＡＲ４を含む４つＧのタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲｓ）の一群から成る。ＰＡＲｓは、かなり多くの正常及び悪性生体組織並びに皮膚、血小板、内皮細胞、胃腸管、脳、及び肺を含む細胞内で見出されている。可逆的なリガンド結合を介して活性化されることに代わって、ＰＡＲｓは固有のタンパク質分解機構を活性化に利用している。トロンビン及びトリプシン等のプロテアーゼは、部位特異性的に、細胞外のＮ−端末外部ドメイン内の受容体を分裂させる。活性化分裂部分は、人体のＰＡＲ１，ＰＡＲ２，ＰＡＲ３，およびＰＡＲ４に対する残留物４１−４２（Ｒ↓ＳＦＬＬＲＮ）、３６−３７（Ｒ↓ＳＬＩＧＫＶ）、３８−３９（Ｋ↓ＴＦＲＧＡＰ）、及び４７−４８（Ｒ↓ＧＹＰＧＱＶ）である。分裂によって、新規Ｎ末端が暴露され、同様に一連の係留リガンド配列として作用する。係留リガンドドメインは、受容体と細胞内結合し且つ受容体を活性化させるので、その結果、信号伝達を開始する。ＰＡＲｓを活性化するプロテアーゼは、
凝固因子（例えば、トロンビン、凝固因子ＶＩＩａ及びＸａ）、炎症細胞からのプロテアーゼ（例えば、肥満細トリプターゼ、好中球カテプシンＧ）、及び上皮の組織からの酵素（例えば、トリプシン）を含む。ＰＡＲ１，ＰＡＲ３，及びＰＡＲ４はトロンビンによって主に活性化されるものの、ＰＡＲ２は、肥満細胞トリプターゼや凝固因子Ｘａ等のトリプシンのようなプロテアーゼによって活性化される。例えば、ＳＦＬＬＲ−アミド等の一連の係留リガンドの第１の５または６つのアミノ酸に対応する合成ＰＡＲ活性化ペプチド（ＰＡＲ−ＡＰｓ）は、ＰＡＲ３を除いて、ＰＡＲｓを直接的に活性化し得る。これら合成ペプチドはタンパク質加水分解とは独立して受容体作用薬として機能するので、ＰＡＲ−ＡＰｓは、ＰＡＲｓの生理的及び病態生理学機能を研究に有益である。これら作用薬ペプチドは完全な応答を顕在化するように見えるが、作用薬ペプチドがトロンビンのようにＰＡＲ１を活性化しないことを提案する一連の証拠がある。
【００７９】
古典的な受容体理論はモデルを提示する。かかるモデルにおいて、単一の機能的応答は所定のＧＰＣＲに本質的に関連づけられる。しかしながら、種々の信号伝達応答が拡散的なリガンドとの相互作用に応答する単一のＧＰＣＲｓによって呼び出され得るであることが明確になりつつある。「作用薬のトラフィッキング」、「リガンドによって誘起された機能的選択性」又は「機能的選択性」に関するこの現象は、従来の受容体薬理学と厳密に対比して、有効である。
【００８０】
セロトニン、２アドレナリン、ドーパミン、オクトパミンその他等の受容体は、機能的な選択性を証明する受容体ファミリーの多様性を拡張し続けている。しかしながら、従来の細胞分析は、「持続的」シミュレーション条件下で通常実行されている。したがって、これら細胞の分析において、様々なリガンドについて機能的な選択性を区別するのは困難である。図９ａ及び９ｂに示されているように、２つのＰＡＲ１受容体作動薬、すなわち、５ｕｎｉｔ／ｍｌ（図９ｂ）のトロンビン及び１０マイクロモルのＳＦＬＬＲ−アミド（図９ａ）は、共にＥＣ１００の濃度において、ほとんど区別できないＡ５４９細胞のＤＭＲ信号を誘因した。すなわち、１分あたり１マイクロリットルの定流量下でＲＷＧバイオセンサーを使用して測定されたように、両方の作用薬によって、Ｐ−ＤＭＲ信号は、バイオセンサーの共振波長におけるシフトに関して、約４００ピコメートルの最大振幅を生じた。
【００８１】
刺激の３０分後に、作用薬溶液をＨＢＳＳ緩衝液に置換することによって、本バイオセンサー細胞分析によって、トロンビン又はＳＦＬＬＲ−アミドによって介在された細胞信号伝達を区別することが直接的に可能である。ＨＢＳＳ（９０）に再度切り替えた後に、ＳＦＬＬＲ−アミドで処理された細胞は、ベースライン上の約１２０ピコメートルであるプラトーレベルまでの低減衰信号に対して応答した。すなわち、バイオセンサーの検出ゾーン内で増大された大集団が、バイオセンサーの表面から離間された（図９ａ）ことを示している。対照的に、ＨＢＳＳ（９５）に再度切り替えた後に、トロンビンで処理された細胞は、高信号レベルを維持した（図９ｂ）。この結果が提案することは、トロンビンによって誘因された細胞応答の大部分は不可逆的であり、この事はトロンビンがＰＡＲ１受容体のＮ−端末を分裂させ、受容体を分解させる事実と一致することである。逆に、ＳＦＬＬＲ−アミドによって誘因された細胞応答の大部分は可逆的であり、これは、ＳＦＬＬＲ−アミドがＰＡＲ１に結合し且つＰＡＲ１を活性化して、受容体の内部化及び再利用化につながる事実に一致している。ＳＦＬＬＲ−アミドを取り除いた後に、細胞は、自身の不活性状態に戻ることが可能である。
【００８２】
これらの調査結果をさらに確認するために、１０ユニット／ｍｌのトロンビンによる第２の反復的刺激が、初期パルス刺激の後に調べられた。結果が図１０ａ及び１０ｂに示されている。ここで、Ａ５４９細胞は、ＳＦＬＬＲ−アミド（１０マイクロモル）（図１０ａ）又はトロンビン（５ｕｎｉｔ／ｍｌ）（図１０ｂ）の内の一方に、３０分間、最初に暴露された。ＨＢＳＳ緩衝溶液がチャンバ（１００）（１１０）内に注入されて、作用薬が置換され、約２時間バイオセンサーを横切るように継続的に流された。その後、１０ｕｎｉｔ／ｍｌのトロンビン（１０５）（１１５）による第２刺激は、バイオセンサーを横切るようにトロンビン溶液を継続的に流すことによって実行された。分析中、すべての溶液流速は１分あたり約１マイクロリットルであった。結果が示すことは、ＳＦＬＬＲ−アミド処理された細胞は、トロンビンによる第２刺激に対して、わずかに小さな強度でもって反応することが可能であった（図１０ａ）ものの、トロンビンで処理された細胞は、第２のトロンビン被曝による反復刺激に対して、少しの応答を生じたに過ぎない（図１０ｂ）ことである。これら結果が提案することは、トロンビンで処理された細胞は再敏感になり、恐らく、内在化された受容体を細胞表面に再利用することに起因することを意味している。一方、トロンビンで処理された細胞は再敏感になる能力をほとんど失っており、これは、トロンビンによって誘起された内側面化受容体の分解に起因する。
【００８３】
Ａ４５９細胞の微笑な応答の原因となる細胞機構をさらに解明するために、第２トロンビン刺激による反復的な刺激に対して、１０マイクロモルのシクロヘキシミドが、ＨＢＳＳ緩衝溶液、第１作用薬溶液（ＳＦＬＬＲ−アミドまたはトロンビン）、及び第２作用薬トロンビン溶液の各溶液に含まれており、等しい量のシクロヘキシミドが分析中に存在することが保証された。シクロヘキシミドは真核有機体におけるタンパク質の生合成の阻害物質である。シクロヘキシミドは、蛋白質の合成（２つのｔＲＮＡ分子とリボソームの関連するｍＲＮＡの運動）における転流ステップを妨げることによって、効果を生じ、その結果、並進伸張が避けられる。シクロヘキシミドは、試験管内で研究された真核細胞内の蛋白質合成を抑制するのに生物医学研究において広く使用される。それは安価であり且つ急速に作用する。その効果は、培養培地からそれを単に除去することによって、急速に反転される。結果が示すことは、シクロヘキシミドの存在によって、ＳＦＬＬＲ−アミドで処理された細胞ではなく、トロンビンで処理されたＡ５４９細胞の第２応答が第２トロンビン溶液による反復刺激に対して主に排除された（データは示されていない）ことである。これら結果が示すことは、トロンビン処理の後に、Ａ５４９細胞は自身の細胞表面ＰＡＲ１受容体のほとんどすべてを失い、トロンビンで前処理された細胞の第２応答（すなわち、図１０ｂ）はＰＡＲ１受容体のデノボ合成に主に起因することである。
【００８４】
まとめると、これらの結果が示すことは、本開示の（マイクロ）の流体‐バイオセンサーシステムを使用する本パルス刺激バイオセンサー細胞分析によって、受容体再感作及び感度を低減する処理、特に、従来の細胞の分析を使用して証明することが困難であった研究に対して、リガンドによって指定された機能選択性を区別する研究が可能となる。
【００８５】
本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本開示に対して様々な改良及び変形を行うことが可能であることが当業者には十分理解できるであろう。したがって、本開示は、添付した請求の範囲及びその均等物の範囲内にある限り、改良したもの及び変形したものに及ぶことが意図されている。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【外国語明細書】
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