(57)【要約】【課題】分離培養拡張ヒト間葉幹細胞の、試験管内あるいは生体外系列指向誘導をもたらす方法および組成物を提供すること。【解決手段】ヒト間葉幹細胞、および間葉幹細胞の分化を単一特定系列に誘導する生物活性因子あるいは因子の組合せを含むことを特徴とする組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離ヒト間葉幹細胞の系列指向分化を単一特定間葉系列に誘導する一つの組成物であって、前記組成物が、ヒト間葉幹細胞と、および間葉幹細胞の分化を単一特定系列に誘導する１個またはそれ以上の生物活性因子とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求の範囲第１項記載の組成物であって、ここで前記組成物が、生物活性因子の混合物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求の範囲第１項記載の組成物であって、ここで生物活性因子が、骨形成、軟骨形成、腱形成、靭帯形成、筋形成、骨髄ストロマ形成、脂肪細胞形成および皮膚形成の各間葉系列よりなるグループから選択された間葉系列に、分離ヒト間葉幹細胞の分化を誘導することを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求の範囲第１項記載の組成物であって、更に薬理許容担体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求の範囲第４項記載の組成物であって、ここで薬理許容担体が、注射可能液であることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求の範囲第４項記載の組成物であって、ここで薬理許容担体が、硬質多孔性容器であることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求の範囲第４項記載の組成物であって、ここで薬理許容担体が、ゲルであることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求の範囲第１項記載の組成物であって、ここで生物活性因子が、ヒト間葉幹細胞の骨形成系列分化を誘導する骨誘導因子であることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求の範囲第８項記載の組成物であって、ここで骨誘導因子が、骨形態形成タンパク質であることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求の範囲第９項記載の組成物であって、ここで骨形態形成タンパク質が、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３よりなるグループから選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求の範囲第８項記載の組成物であって、ここで骨誘導因子が、繊維芽細胞増殖因子であることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求の範囲第１１項記載の組成物であって、ここで繊維芽細胞増殖因子が、塩基性繊維芽細胞増殖因子であることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求の範囲第８項記載の組成物であって、ここで骨誘導因子が、グルココルチコイドであることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求の範囲第１３項記載の組成物であって、ここでグルココルチコイドが、デキサメタゾンであることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求の範囲第８項記載の組成物であって、ここで骨誘導因子が、プロスタグランジンであることを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求の範囲第１５項記載の組成物であって、ここでプロスタグランジンが、プロスタグランジンＥ１であることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求の範囲第８項記載の組成物であって、更に分離ヒト間葉幹細胞を付随因子と接触させることを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求の範囲第１７項記載の組成物であって、ここで付随因子が、アスコルビン酸およびその類似体ならびにグリセロホスフェートよりなるグループから選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求の範囲第１項記載の組成物であって、ここで生物活性因子が、ヒト間葉幹細胞の軟骨形成系列分化を誘導する軟骨誘導因子であることを特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求の範囲第１９項記載の組成物であって、ここで軟骨誘導因子が、形質転換増殖因子−βスーパーファミリーの一員であることを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求の範囲第２０項記載の組成物であって、ここで形質転換増殖因子−βスーパーファミリーの一員が、ＴＧＦ−β１であることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求の範囲第２０項記載の組成物であって、ここで形質転換増殖因子−βスーパーファミリーの一員が、インヒビンＡであることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求の範囲第２０項記載の組成物であって、ここで形質転換増殖因子−βスーパーファミリーの一員が、軟骨形成刺激活性因子であることを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求の範囲第２０項記載の組成物であって、ここで形質転換増殖因子−βスーパーファミリーの一員が、骨形態形成タンパク質であることを特徴とする組成物。
【請求項２５】
請求の範囲第２４項記載の組成物であって、ここで骨形態形成タンパク質が、ＢＭＰ−４であることを特徴とする組成物。
【請求項２６】
請求の範囲第１９項記載の組成物であって、ここで軟骨誘導因子がコラーゲン細胞外マトリックスの成分であることを特徴とする組成物。
【請求項２７】
請求の範囲第２６項記載の組成物であって、ここでコラーゲン細胞外マトリックス成分が、コラーゲンＩであることを特徴とする組成物。
【請求項２８】
請求の範囲第２７項記載の組成物であって、ここでコラーゲンＩが、ゲル形態であることを特徴とする組成物。
【請求項２９】
請求の範囲第１９項記載の組成物であって、ここで骨誘導因子が、ビタミンＡ類似体であることを特徴とする組成物。
【請求項３０】
請求の範囲第２９項記載の組成物であって、ここでビタミンＡ類似体が、レチノイン酸であることを特徴とする組成物。
【請求項３１】
請求の範囲第１項記載の組成物であって、生物活性因子が、ヒト間葉幹細胞のストロマ形成系列分化を誘導するストロマ誘導因子であることをと特徴とする組成物。
【請求項３２】
請求の範囲第３１項記載の組成物であって、ここでストロマ誘導因子がインターロイキンであることを特徴とする組成物。
【請求項３３】
請求の範囲第３２項記載の組成物であって、ここでインターロイキンがインターロイキン１αおよびインターロイキン２よりなるグループから選択されることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はヒトあるいは他の種の病的状態の治療に試験管で培養された間葉幹細胞を移植する前あるいは移植の時点でこれらの細胞を特異的細胞系列経路に分化するよう指向する組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）は骨髄、血液、真皮、および骨膜で見出される形態形成多能性芽細胞あるいは胚状細胞であり、それらは脂肪結合組織、骨結合組織、軟骨結合組織、弾性結合組織、筋結合組織および繊維結合組織を含む間葉あるいは結合組織の特異な型に分化できる。これらの細胞が入り込む特異的な分化経路は機械的作用およびもしくは成長因子、サイトカインなどの内因性生物活性因子、およびもしくは宿主の組織に定着した局部微環境条件からの各種の作用に依存する。これらの細胞は通常骨髄で非常に低い頻度で存在するけれども、組織培養におけるこれらの細胞の母集団を分離し、精製し、また有糸分裂で拡張する方法がキャプラン、他、合衆国特許番号５，１９７，９８５号および５，２２６，９１４号で報告されている。
【０００３】
出生前生物において、特殊化結合組織細胞へのＭＳＣｓ分化は十分に定着している。例えば胚ひな、マウスあるいはヒトの肢芽間葉細胞は軟骨および他の結合組織に分化する（非特許文献１−５）。加えてクローンラット胎児頭蓋冠細胞系もまた筋、脂肪、軟骨、および骨に分化することが示された（非特許文献６）。出生後生物におけるＭＳＣｓの存在は後胚細胞のいくつかの中胚葉表現型への分化を示す目的について広範には研究されていなかった。これまでになされた数少ない研究は骨髄細胞による骨および軟骨の形態形成に続く拡散チャンバでの入れこならびに生体内移植を含む（非特許文献７、８）。最近では若いラビット（８００−１，０００ｇ）から得た骨髄誘導細胞は生体内で脂肪細胞および骨形成細胞を形成することが示され（非特許文献９）、また出生後マウスのクローン化骨髄ストロマ細胞は脂肪細胞および骨原細胞を形成することが示された（非特許文献１０）。同様にひな骨膜からの細胞は分離され、培養で拡張され、また試験管内での高密度条件の下で軟骨および骨に分化することが示された（非特許文献１１）。ラット骨髄誘導間葉細胞は生体内で移植された時には骨芽細胞および軟骨細胞に分化する能力を持つことが示された（非特許文献１２、６）。出生後生物の各種骨髄源から得た細胞は多核性外観がた易く培養内で特徴的に認識されると共に筋形成は決して観察されなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】合衆国特許番号５，１９７，９８５号
【特許文献２】合衆国特許番号５，２２６，９１４号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】キャプラン，エイ．アイ．：発生生物学協会３９回年次シンポジウム，エス．サブテルニーおよびユー．アボット編，３７６８ページ。ニューヨーク，アラン・アール・リス・インコーポレイテッド，１９８１年
【非特許文献２】エルマー他、奇形学、２４巻、２１５−２２３ページ、１９８１年
【非特許文献３】ハウシュカ，エス．ディー．，発生生物学，３７巻，３４５−３６８ページ、１９７４年
【非特許文献４】サラーシュ他、発生生物学、８３巻、９−１９ページ、１９８１年
【非特許文献５】スウォラ他、発生生物学、１１６巻、３１−３８ページ、１９８６年
【非特許文献６】五島他、臨床整形外科関連研究、２６９巻、２７４−２８３ページ、１９９１年
【非特許文献７】アシュトン他、臨床整形外科関連研究、１５１巻、２９４−３０７ページ、１９８０年
【非特許文献８】ブルーダー他、骨ミネラル、１１巻、１４１−１５１ページ、１９９０年
【非特許文献９】ベネット他、細胞科学ジャーナル、９９巻、１３１−１３９ページ、１９９１年
【非特許文献１０】ベナヤフ他、細胞生理学ジャーナル、１４０巻、１−７ページ、１９８９年
【非特許文献１１】中原他、実験細胞研究、１９５巻，４９２−５０３ページ、１９９１年
【非特許文献１２】デニス他、細胞移植、１巻、２３３２ページ、１９９１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒトあるいは他の種の病的状態の治療に試験管で培養された間葉幹細胞を移植する前あるいは移植の時点でこれらの細胞を特異的細胞系列経路に分化するよう指向する組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
最初の見地において、この発明は分離培養拡張ヒト間葉幹細胞の系列指向誘導をもたらす組成物を提供し、この組成物は間葉幹細胞を選択の系列に分化を誘導するのに有効な一つの生物活性因子あるいは因子の組合せと接触させることを含む。より詳細には、この組成物は生物活性因子が骨形成、軟骨形成、腱形成、靭帯形成、筋形成、骨髄ストロマ形成、脂肪細胞形成および皮膚形成の各間葉系列よりなるグループから選択される間葉系列にこのような細胞を誘導する組成物である。望ましくは、細胞はこの見地で１個もしくはそれ以上の生物活性因子に生体外で接触させられ、これによりいずれかの生物活性因子の生体内投与と関連する何らのリスクもない組成物を提供する。
【０００８】
もう一つの見地において、この発明は更に分離培養拡張ヒト間葉幹細胞および選択の系列へのそのような細胞の分化を誘導するのに有効な一つの生物活性因子を含む組成物を、それを必要とする個人に投与することを提供する。望ましくは、間葉幹細胞および生物活性因子は一緒に投与され、あるいはそれらは選択肢として別個に投与される組成物であることもできる。とりわけ、この組成物の見地は分離自己ヒト間葉幹細胞よりなる組成物がこれまでに、現在、あるいはこれから投与される個人に対し生物活性因子を投与することを含む。
【０００９】
もう一つの見地において、この発明はヒトサイトカインの生体内生産をそれを必要とする個体に誘導する組成物を提供し、それは分離培養拡張ヒト間葉幹細胞およびそのような細胞を誘導するために有効な生物活性因子をそのような個体のサイトカイン生産間葉系列子孫に分化するために投与することを含む。望ましくは、間葉幹細胞および生物活性因子は組成物として一緒に投与され、あるいはそれらは選択肢として別個の組成物として投与される。
【００１０】
これらの見地の特異的に望ましい実施例において、生物活性因子は骨形態形成タンパク質であり、ヒトＭＳＣｓは軟骨形成系列に向けられる。生物活性因子はインターロイキン１であり、またヒトＭＳＣｓはストロマ細胞系列に向けられる（望ましくはインターロイキン１はインターロイキン１αである）。生物活性因子はデキサメタゾン、アスコルビン酸−２−リン酸塩、およびグリセロホスフェートであり、ヒトＭＳＣｓは骨形成系列に向けられる。あるいは生物活性因子は５−アザシチジン、５−アザデオキシシチジンおよびそのいずれかの類似体よりなるグループから選択され、またヒト間葉幹細胞は筋形成系列に向けられる。
【００１１】
この発明のもう一つの見地は、分離培養拡張ヒト間葉幹細胞の分化を選択の系列に導入するのに有効なそのような細胞および生物活性因子あるいは組合せよりなる組成物を提供する。望ましくは、この組成物は更に組織培養培地よりなる。選択肢として、組成物はそれを必要とする動物、とりわけヒトへの投与に適した適切な培地を含むことができる。この発明の見地は、前に記載したそれと関連する系列への系列誘導に関して前に確認した生物活性因子を用いて特異的な実施例を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
この発明は多くの用途および利点を有する。まず最初は、自己宿主に戻す移植に先立ちＭＳＣ分化に向けかつ加速する能力に見出される。例えば骨形成細胞になるように試験管に向けられるＭＳＣｓはまず系列内に補充され次いで主要分化段階を経て進行しなければならないＭＳＣｓよりもより急速にかつ均質に移植部位で骨基質を合成するであろう。このような生体外処置はまた精製ＭＳＣｓに対する生物活性因子の均質で統制のとれた適用を提供し、均質な系列方向付けおよび分化に導く。内因性生物活性因子の生体内利用は容易に保証しあるいは統制することができない。ここで開示されるような前処理段階はこれを阻止する。加えて移植の前にＭＳＣｓを前処理することにより、外因性生物活性因子の全身あるいは局所投与と関連する潜在的に有害な副作用は回避できる。この手法のも一つの用途は、細胞が移植の時点にある時、分化の段階にもとづく組織再生に向かわせる能力に存在する。つまり骨および軟骨と関連して、移植の際に細胞の状態が形成される最後の組織の型を制御する。肥厚性軟骨細胞はそのマトリックスをミネラル化し、結局血管流入に道を開き、これが最終的に新しい骨形成に帰着する。明らかに正常な硝子質軟骨を修復する目的で移植されたＭＳＣｓは全系列以下で進行しないはずである。しかし関節表面欠損を修復するよう意図された移植片およびその下にある助軟骨下骨は二成分方式からの利益を得ることができ、ここで将来の骨の領域にある細胞は生体外で肥厚性軟骨細胞になるように向けられ、一方将来の関節形成表面の領域にある細胞はただ軟骨芽細胞になるように向けられる。ストロマ再構築の領域においては、分化の生体外制御は個体の要求に欠くことのできない段階特異的サイトカインの同化のためにＭＳＣ細胞母集団を最適化することができる。筋形態発生は同じように指示にもとづいて速いあるいは遅い単収縮繊維を創り出すように指向することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】間葉幹細胞が各種の系列経路に分化することによる間葉形成過程を図形で示す。
【図２Ａ】骨形成分化経路を図形で示す。
【図２Ｂ】骨形成分化経路を図形で示す（図２Ａの続き）。
【図３】実施例１で報告される当初の研究においてアルカリ性ホスファターゼ活性の増加を培養における時間の関数としてグラフで示す。
【図４】実施例１で報告される次の研究からの成果を示す。
【図５】軟骨形成分化経路を図形で示す。
【図６】実施例４の実験にもとづきインターロイキン１刺激の有無でヒト間葉幹細胞サイトカイン発現の範囲を示す。
【図７】（ＦＩＧ．７Ａ）５−ａｚａ−ＣＲに露出後誘導される多核細胞を示すＭＳＣｓの生体培養の位相差顕微鏡写真。この顕微鏡写真は１０μＭの５−ａｚａ−ＣＲで処置２週後の培養を示す。細胞内で多くの核（矢印）が観察されるが、横紋は識別できない。
【００１４】
（ＦＩＧ．７Ｂ）生後１７日のラット胎児の後脚から調製された正常ラット胎児筋細胞の生体培養の位相差顕微鏡写真。骨髄ＭＳＣｓ誘導筋管と同じく識別できる横紋は明らかでない。スケールバー５０μｍ。
【図８】５−ａｚａ−ＣＲに露出後ラット骨髄ＭＳＣｓから誘導される筋管における筋特異的ミオシンの免疫蛍光染色。ミオシン抗体は横断横紋を視覚化しないが、この抗体は縦軸繊維を明らかにする。スケールバー３０μｍ。
【図９】５−ａｚａ−ＣＲに露出２週後［（Ａ）および（Ｂ）］ならびに５週後［（Ｃ）および（Ｄ）］にラット骨髄ＭＳＣｓから誘導される筋管。位相差顕微鏡写真［（Ａ）および（Ｃ）］ならびにミオシンの免疫蛍光染色［（Ｂ）および（Ｄ）］。（Ａ）および（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）は同じ視野である。５−ａｚａ−ＣＲ露出２週後の筋管は抗ミオシン抗体で染色されるが、５週後のものは染色されていない。スケールバー５０μＭ。
【図１０】細胞質内に小滴を含む５−ａｚａ−ＣＲ処置ＭＳＣｓの顕微鏡写真。この培養はスダンブラックで染色された。（Ａ）脂肪細胞のクラスター（矢印）が観察された。スケールバー２００μＭ。（Ｂ）小滴はブラウンからブラックに染色され（矢印）、これは小滴が脂質であることを示唆している。スケールバー１００μＭ。
【図１１】５−ａｚａ−ＣＲ露出後ラット骨髄ＭＳＣｓから誘導された筋形成細胞の生体培養の位相差顕微鏡写真。５−ａｚａ−ＣＲへの露出に続き、これらの細胞はｂＦＧＦ、４ｎｇ／ｍｌで１０日培養された。大型筋管を見ることができる。スケールバー３００μｍ。
【図１２】Ａ−Ｄは、実施例６で報告される実験で観察されたＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＳＣＦの発現をそれぞれ図形で示す。
【図１３】Ａ−Ｃは実施例６で報告される実験で観察されたＬＩＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−１１の発現をそれぞれ図形で示す。
【図１４】実施例６で報告される実験で観察されたＧＭ−ＣＳＦ発現の用量依存ＩＬ−１α誘導を図形で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ヒト間葉幹細胞の分離と精製
ここに記載されたように分離精製されたヒト間葉幹細胞は、例えば骨、骨髄、血液、真皮あるいは骨膜から誘導することができる。骨髄から得られる時には、これは股関節あるいは膝置換手術の間に変形性関節症の患者から得られる大腿骨頭海綿質片の栓子、あるいは将来の骨髄移植に備えて骨髄を収穫された正常なドナーおよび腫瘍患者から得られた吸引骨髄からの栓子を含む数多くの異なった源より得られた骨髄であることができる。収穫された骨髄は次いで細胞培養に備えられる。分離工程は、分化なしで間葉幹細胞成長を可能にするだけでなく培養器のプラスチックあるいはガラス表面への間葉幹細胞のみの直接付着をも可能にする作用薬を含む特別に用意された培地の使用を伴う。非常に微量の間葉組織サンプル内に存在する望ましい間葉幹細胞の選択的付着を可能にする培地を創り出すことにより、次いでもとの間葉細胞に存在する他の細胞（すなわち赤血球、白血球、他の分化間葉細胞、等）から間葉幹細胞を分離することが可能となった。
【００１６】
骨髄は長骨の骨髄腔、いくつかのハヴァーズ管、および海綿質の小柱の間の空間を占める軟組織である。骨髄には二つの型がある。初期の生命ではすべての骨にまた成人期には限定された場所（すなわち海綿質）に存在することが見出され、また血球の生産（すなわち造血）およびヘモグロビン（かくして赤色）と関連する赤色骨髄、および主として脂肪細胞（かくして黄色）更に結合組織よりなる黄色骨髄がそれである。
【００１７】
全体として骨髄は、造血幹細胞を含む造血細胞、および赤血球、白血球ならびにその前駆体；また間葉幹細胞、繊維芽細胞、網赤血球、脂肪細胞、および「ストロマ」と呼ばれる結合組織網に寄与する内皮細胞を含む細胞のグループよりなる複合組織である。ストロマからの細胞は細胞面タンパク質および成長因子の分泌を経る直接の相互作用を通じて造血細胞の分化を調節し、骨構造の基礎および支持に係る。動物モデルを用いる研究は、骨髄が軟骨、骨、および他の結合組織細胞に分化する能力を持つ「前ストロマ」細胞を含むことを示唆している（ベレスフォード、Ｊ．Ｎ．：骨形成幹細胞および骨と骨髄のストロマシステム、臨床整形外科、２４０巻、２７０ページ、１９８９年）。最近の証拠は、多能性支質幹細胞あるいは間葉幹細胞と呼ばれるこれらの細胞が、数多くの生物活性因子の影響に依存して、活性化に際しいくつかの異なった種類の細胞系（すなわち骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、等）に生成する能力を持つことを示している。しかし間葉幹細胞は非常に広範な種類の他の細胞（すなわち赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単核細胞、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、等）で非常に少ない量で組織に存在する。
【００１８】
結果として、分化に先立ち組織からヒト間葉幹細胞を分離精製し次いで筋骨格治療のための貴重な用具を生産する間葉幹細胞を培養拡張する一つの方法（プロセス）が開発された。このような処置の目的は間葉幹細胞の数を大きく増加させ、これらの細胞を身体の正常な回復能力に再指向させおよびもしくはその強化のために利用することである。間葉幹細胞は大きな数に拡張され、また再生およびもしくは修復のための生体内成長を高めあるいは刺激し、続く活性化および分化を通して各種人工器官装置への移植片の接着を改善し、あるいは造血細胞生産を高める、などのために結合組織損傷の領域に適用される。
【００１９】
これらの線に沿って、細胞を骨格欠損の部位で注入し、細胞を人工器官で保温しその人工器官を移植するなどを含む修復、移植、等の部位で培養拡張精製間葉幹細胞を移転し、固定し、活性化するために各種の手順が考えられる。かくして分化に先立ち細胞を分離し、精製し、細胞数を大きく増加させることにより、また組織損傷部位での細胞の位置付けによるかあるいは細胞の移植の先立ち試験管内での前処理によって分化方法を活発に制御することで、培養拡張間葉幹細胞は数多くの代謝骨疾病、骨格異形成、軟骨欠損、靭帯および腱損傷ならびに他の筋骨格および結合組織疾患における細胞、分子、および遺伝子疾患を軽減するなどの各種の治療目的のために利用することができる。
【００２０】
望ましい選択的付着にとりわけよく適しており以下に記載される血清で補充された時には「完全培地」としてここで引用されるいくつかの培地が用意された。そのような一つの培地はよく知られており容易に商業的に利用できるダルベッコ修飾イーグル培地−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）の増加版である。
【００２１】
商業的製剤は、重炭酸ナトリウム３７００ｍｇ／ｌおよび０．８５％食塩水でペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン、およびファンジゾン（登録商標）としてのアンホテリシンＢを用いるペニシリン１０，０００単位（塩基）、ストレプトマイシン１０，０００μｇ（塩基）およびアンホテリシンＢ／ｍｌ、２５μｇを含む１００Ｘ抗生−抗真菌剤１０ｍｌ／ｌで補充される。
【００２２】
前に記載の培地は作成されすぐに使用されるまで４℃で１００ｍｌビン当り９０ｍｌあるいは５００ｍｌビン当り４５０ｍｌで貯蔵される。使用に際しては、（選択されたロットから）胎児ウシ血清１０ｍｌあるいは５０ｍｌが最終血清量１０％になるように培地のビンに加えられる。培地は使用に先立ち３７℃にあたためられる。
【００２３】
この点に関して、胎児ウシ血清１０％（カリフォルニア、ウッドランド、Ｊ．Ｒ．サイエンティフィック、あるいは他の供給業者）のロットでテストされ選択されたＢＧＪｂ 培地（ニューヨーク、グランドアイランド、ジブコ）がこの発明の用途に適していた。「完全培地」でもあったこの培地は、分化なしで間葉幹細胞を刺激しペトリ皿のプラスチック表面に間葉幹細胞のみの特異的タンパク質結合部位等の選択的付着を可能にする因子を含んでいたことが発見された。
【００２４】
加えて、Ｆ−１２栄養素混合物培地（ハム）（ニューヨーク、グランドアイランド、ジブコ）が選択的間葉幹細胞分離のために望ましい性質を示したことも発見された。
前に示したように、完全培地は細胞培養分離に収穫骨髄を準備するために当初の収穫過程の特異な型に依存して数多くの異なった分離過程を利用することができる。この点に関して、海綿質骨髄の栓子が利用される場合には、骨髄は完全培地に加えられ、分散を形成するために渦動され、次いで骨片等から骨髄細胞を分離するために遠心分離された。骨髄細胞（主として赤色骨髄および黄色骨髄で、一部微量の間葉幹細胞、等よりなるもの）は次いで一連の１６、１８、および２０ゲージ針を装備した注射器を通じて骨髄細胞を含む完全培地を連続的に通過させることにより単一細胞に解離された。他の酵素分離過程と対比して機械的分離過程の利用を通じて生産される利点は、機械的過程が殆ど細胞の変化をもたらさなかったのに対し、一方酵素過程が培養付着および選択的分離に必要なタンパク質結合部位に対し、およびもしくは前記間葉幹細胞に特異的なモノクローナル抗体の生産に必要なタンパク質部位に対しとりわけ細胞損傷を産み出すこととなったと考えられる。単一細胞懸濁液（約５０−１００×１０６有核細胞で形成されたもの）は次いで引き続き懸濁液で見出される残存細胞から間葉幹細胞を選択的に分離しおよびもしくは隔離する目的で１００ｍｍ皿にプレートされた。
【００２５】
吸引された骨髄がヒト間葉幹細胞の源として利用された時、（骨破片を殆どもしくは全然含まず大量の血液を含む）骨髄細胞は完全培地に加えられ実施例１でより詳細に説明されるパーコル（ミズーリ、セントルイス、シグマ）勾配で分画された。パーコル勾配は骨髄誘導間葉幹細胞を含む低密度の血小板画分から大きい割合の赤血球および単核造血細胞を分離した。この点に関して約３０−５０×１０６細胞を含む血小板画分は、骨髄ドナーの年齢に依存して限定されない量の血小板、３０−５０×１０６単核細胞、および僅か約５０−５００の間葉幹細胞で構成されていた。低密度血小板画分は次いで細胞粘着にもとづく選択的分離のためにペトリ皿で平板培養された。
【００２６】
これに関して、海綿質あるいは腸骨吸引液（すなわち一次培養）から得られた骨髄細胞は完全培地で成長し、下記の実施例１で設定された条件に従って１乃至７日目ペトリ皿表面に付着が可能となった。最小細胞付着が３日後に観察されたために、３日が標準時間長として選択され、その時点で非粘着細胞は元の完全培地を新鮮な完全培地で置換することにより培養から除去された。続く培地変更は通常１４−２１日を必要とする培養皿が密集になるまで４日毎に行われた。これは未分化ヒト間葉幹細胞数が１０３−１０４倍増加したことを示していた。
【００２７】
細胞は次いでＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）と混和したトリプシン（トリプシン０．２５％、ＥＤＴＡ（１Ｘ）１ｍＭ、ニューヨーク、グランドアイランド、ジブコ）のような剥離剤を利用して培養皿から剥離された。剥離剤は次いで不活性化され、剥離培養未分化間葉幹細胞は次の使用のために完全培地で洗浄された。
【００２８】
これら未分化細胞が別個の系列路に入る能力は間葉形成過程として引用され、図１で図形で表わされる。間葉形成過程において、ＭＳＣは特異的な多段系列路に入るように補充され、この系列路が骨、軟骨、腱、筋、真皮、骨髄ストロマ、および他の間葉結合組織などの機能分化組織を最終的に作り出す。例えば骨形成細胞の分化路についての詳細なスキームが図２で示される。この系列地図は、ＭＳＣｓを骨形成系列に補充し、前骨芽細胞の複製を促進し、分化をどこでも最終段階骨細胞に段階状に仕向ける個々の制御要素の存在を意味している。この複合路の各段階が異なった生物活性因子により制御されるという考え方を支持するかなりの作業が報告されている。
【００２９】
類似の系列図表が軟骨細胞分化のために展開されており、図５で示されている。また各系列段階の進行状況は必ずしもそれに限定されないが骨形態形成タンパク質の科の制御下にある。分化過程の各修飾物質は骨、軟骨、筋、あるいは他のいずれかの間葉組織においてであろうとも系列進行の割合に影響を与え、およびもしくは路に沿った個別段階に特異的に影響を与える。つまり細胞が発生期に特異的な系列を委託され、生物合成活性状態にあり、あるいは最終段階表現型に進行するかどうかは局所環境にある生物活性因子の種類およびタイミングに依存するであろう。
【００３０】
新鮮な拡張されたヒト間葉幹細胞の骨および軟骨系列潜在能（つまり骨軟骨潜在能）はヌードマウスの２個の生体内検定を用いて測定された。一つの検定は培養間葉幹細胞を負荷した多孔性リン酸カルシウムセラミックの皮下移植を含んでいた。他のものは培養間葉幹細胞で接種した拡散チャンバの腹腔内移植を含んでいた。全骨髄およびパーコル勾配分離吸引画分もこれら生体内検定で分析された。組織学的評価は大腿頭および腸骨稜から誘導された培養間葉幹細胞で移植されたセラミックで骨および軟骨形成を示していた。５×１０６細胞／ｍｌのヒト間葉幹細胞で負荷されたセラミックは空隙内で骨を形成し、一方１０×１０６細胞／ｍｌのヒト間葉幹細胞で負荷されたセラミックは空隙内で軟骨を形成した。ヌードマウスの皮下部位でセラミックの複合移植片として位置する時に全骨髄が骨形成することが示される一方、形成される骨の量は培養拡張骨髄誘導間葉幹細胞が使用される時に見られるほどには十分に生産されなかった。
【００３１】
これらの結果は、ある条件の下で培養拡張間葉幹細胞が多孔質リン酸カルシウムセラミックの移植片として接種された時に骨あるいは軟骨に分化する能力を持つことを示している。間葉幹細胞の骨あるいは軟骨細胞への分化に影響する環境因子は部分的には、多孔性リン酸カルシウムセラミックにある脈管構造により供給される成長および栄養素因子への間葉幹細胞の直接接近であるようにみえる。脈管構造と培養に密接に関連する細胞は骨細胞に分化し、一方脈管構造から隔離されている細胞は軟骨細胞に分化する。濃縮ヒト間葉幹細胞で負荷されたセラミックの孔からの脈管構造の除外は骨形成分化を妨げ軟骨形成許容の条件を提供した。
【００３２】
その結果分離され培養拡張された間葉幹細胞はある特異的な条件の下でおよびもしくはある因子の影響の下で分化し結合組織修復あるいは再生およびもしくは各種人工器官装置の移植のために必要とされる望ましい細胞表現型を生産するために利用することができる。例えば培養拡張ヒト間葉幹細胞で充填された多孔性セラミック立方体を用いてセラミックの多孔内での骨形成は免疫適合宿主の皮下培養後に生成された。最近の研究（１３）において、多孔セラミックを用いる複合移植のラット骨髄はラットの大腿骨の分節欠損を充填するために使用された。骨はセラミックの多孔を充填しセラミック骨髄移植片を宿主の骨に固着することを示した。
【００３３】
この発明に従って分離ヒト間葉幹細胞から骨形成を刺激する（すなわち骨誘導性である）因子は、以下のものを含む分子のいくつかのクラスで存在する；ＢＭＰ−２（１４）およびＢＭＰ−３（１５）などの骨形態形成タンパク質；塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの増殖因子；デキサメタゾン（１６）などのグルココルチコイド；およびプロスタグランジンＥ１（２２）などのプロスタグランジン。更にアスコルビン酸−２−リン酸塩（１７）などのアスコルビン酸およびその類似体ならびにβ−グリセロホスフェート（１８）などのリン酸グリセロールは単独では骨形成分化を誘導しないけれども有効な付随因子である。
【００３４】
ヒトＭＳＣｓに対する骨誘導活性を持つ因子は更に下記のものを含むいくつかのクラスに存在する：（i）ＴＧＦ−β１（１９）、（ii）インヒビンＡ（２０）、（iii）骨形成刺激活性因子（ＣＳＡ）（２１）および（iv）ＢＭＰ−４（２２）などの骨形態形成タンパク質などの形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）上科内の化合物；タイプＩコラーゲン、とりわけゲル（２３）としてのそれを含むコラーゲン細胞外基質分子；およびレチノイン酸（２４）などのビタミンＡ類似体。
【００３５】
ヒトＭＳＣｓに関するストロマ形成誘導活性を持つ因子は更に特にＩＬ−１α（２５）およびＩＬ−２（２６）などのインターロイキンなどのいくつかの分子クラスに存在する。
【００３６】
ヒトＭＳＣｓに関する筋形成誘導活性を持つ因子もまたいくつかの分子のクラス、とりわけ５−アザシチジンおよび５−アザ−２’−デオキシシチジンなどのシチジン類似体に存在する。
【００３７】
ヒトＭＳＣｓに関するこれらの調節因子の作用ははじめてここで開示される。これは分化を特定の系列に誘導する潜在的に有用な調節因子をすべて含む表を表すものではなくて、分離ヒト間葉幹細胞分化の段階的進行を促進する目的のための有用な生物学的活性を有する各種の化合物を例示するものである。
【実施例】
【００３８】
実施例１
生体内ＭＳＣｓの誘導骨形成分化
この実施例で記載される実験の目的は、間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）が組織培養培地において適切な生物活性因子を提供することにより試験管内で骨形成系列路に沿って指向されたことを示すことであった。この組の実験はＭＳＣｓがどのように骨形成系列に向けて指向され得るかについてのただ一つの例を示す。
【００３９】
最初の研究
ヒトＭＳＣｓは前に記載の通り骨髄から収穫され分離された。これらの細胞は予備選択された１０％の胎児ウシ血清（完全培地）を含むＤＭＥＭ−ＬＧで培養拡張された。新鮮完全培地は培養が密集近くになるまで３−４日毎にとり替えられ、密集の時点で細胞はトリプシンで平板から遊離され、約４０％の密集（１００ｍｍ皿当り４００，０００細胞）で新しい皿に再接種された。これらの再平板培養ＭＳＣｓは一晩付着を許され、その後完全培地はＤＭＥＭ−ＬＧ、１０％の胎児ウシ血清、および１００ｎＭのデキサメタゾンのみ、あるいは１００ｎＭのデキサメタゾンと５０μＭのアスコルビン酸−２−リン酸塩のいずれか、および１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート（骨形成補充剤）よりなる培地でとり替えられた。骨形成補充剤は３日毎にとり替えられた。細胞は毎日形態変化を検討された。選択された平板は次いで骨形成系列に入る細胞のマーカーである細胞表面アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）活性を分析された。骨マトリックス合成に引き続き責任があったのはこれらの細胞である。標準酵素組織化学および生化学試薬がこの細胞表面タンパク質の活性を示すために使用された。追加の標本が成熟骨芽細胞母集団の連続した分化および表現型発現に相関するミネラル化細胞外基質小節の存在を評価された。骨小節内でのリン酸カルシウム結晶への硝酸銀沈殿が標準フォン・コッサ染色法を通じて達成された。
【００４０】
この結果は、デキサメタゾンへの露出の僅か３日後に培養内でＭＳＣｓが既にその表面にアルカリ性ホスファターゼの発現を開始したことを示している。培養の６日までに、細胞の約８０％はＡＰ正であった。培養皿の全組織は１日目の繊維芽細胞状細胞の密集近い渦巻き形からお互いにトップに積重なった数多くの地域での多角形細胞に変化した。９日までに、複屈折細胞外基質の数多くの小さな小節が多層の多角形細胞のこれらフォーカス（細胞増殖巣）と関連していた。これらの地域はミネラルのためのフォン・コッサ法により正に染色された。完全培地のみ補給された対照培養はこれらのミネラル化骨小節を決して展開しなかったし、またほんの僅かＡＰ正の細胞を含んでいた。対照的に骨形成補充剤で処理されたＭＳＣｓはＡＰ活性を均一に獲得しまたミネラル化細胞外マトリックス小節を皿全体に合成した。それ自身骨誘導性ではなく、完全骨形成補充剤でのアスコルビン酸−２−ホスフェートおよびβ−グリセロホスフェートの存在は更に細胞外マトリックスの成熟およびミネラル沈着をそれぞれ支持する。図３は培養内での時間の関数としてアルカリ性ホスファターゼ酵素活性における増加を図で示している。８日までおよびそれ以上で骨補充剤（ＯＳ）に露出された細胞において対照培地で培養されたものよりかなり多い酵素活性が観察される。
【００４１】
これらをまとめてこの研究は、ＭＳＧｓが試験管内骨形成系列に沿って分化するために急速かつ均一に刺激することができることを示している。更にＭＳＣｓがＡＰ発現により立証された系列内の初期の段階に補充されるだけでなく、ＭＳＣｓは骨状細胞外マトリックスを分泌しミネラル化する成熟骨芽細胞になるように系列を通じて進行する。この更なる証拠は、ひなＭＳＣｓが骨形成補充剤で処理される時それは段階特異的細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体染色により決定されるように図２で描かれる骨形成系列の段階を通じて進行するという観察から得られる。
【００４２】
次の研究
公開技術を使用して、ＭＳＣｓは３人の異なった患者（年齢２６−４７才）から精製され、培養拡張され（２７）、選択されたロットからの１０％のＦＢＳを加えたＤＭＥＭ−ＬＧで２０％の密集で４８ウエル培養皿に一晩接種された。比較のための基礎培地は、ＤＭＥＭ−ＬＧ、ＢＧＪｂ 、αＭＥＭおよびＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）であった。各検定のための三組の培養が「骨形成補充剤」（ＯＳ）（デキサメタゾン１００ｎＭ、アスコルビン酸−２−リン酸塩５０μＭおよびβ−グリセロホスフェート１０ｍＭ（２８））の存在あるいは不在下でＦＢＳ１０％で成長した。培地は３日毎にとり替えられた。各組の培地は細胞数をクリスタル紫検定により、細胞表面アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）を組織化学により、またミネラル化小節形成をフォン・コッサ染色により検定された。ＡＰ酵素活性は生体培養をｐ−ニトロフェニルホスフェート５ｍＭでトリス５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ｐＨ９．０で保温培養し、サンプルを４０５ｎｍでエリザ平板リーダーでスキャンニングにより比色反応を定量化することで計数された。ＡＰ酵素活性は製品／分／１０３ 細胞のナノモルで発現された。各ウエルにおけるＡＰ正細胞の割合は染色培養から測定され、ミネラル化小節の数はウエル当りで計数された。検定は１６日培養期間で４日毎に行われた。対の２個サンプルｔ−テストが選択されたサンプルで行われた。図４のデータは１人の患者のものを表すが類似の結果はすべての標本から得られた。
【００４３】
平板に均一に付着されたＭＳＣｓはその特徴的な紡錐形の形態をとり、増殖して８日で密集に到達した。この期間およびそれを越えて、ＯＳ処理細胞はその密度を増すにつれ、多重層を形成し、立方体の形態を展開した。透明性については、前に記載したパラメータの選択された見地のみが図４でグラフで示されている。ＢＧＪｂ＋ＯＳで成長した標本はすべて３日以内に死滅したが、ＢＧＪｂ培養のものは試験記録の期間生存した。このためすべてのＢＧＪｂデータはこのグラフから除かれた。この研究のハイライトはαＭＥＭにおける増殖がＤＭＥＭ／Ｆ−１２あるいはＤＭＥＭのみ（すなわち１６日でＰ＜０．０１およびＰ＜０．０５）に比べて相当大きかったことを示す。αＭＥＭ培地へのＯＳの追加は、８日および１２日（Ｐ＜０．０４およびＰ＜０．０３）で増殖を阻害したが、１６日までにはそうでなかった（Ｐ＞０．０５）。αＭＥＭ＋ＯＳはまた、ＤＭＥＭで維持されたＭＳＣｓ（８日でＰ＜０．０２。１６日でＰ＜０．０１）に比べるとその表面でＡＰを発現する細胞の大きい割合を刺激する。しかしαＭＥＭ＋ＯＳとＯＳなしのαＭＥＭ（８日でＰ＞０．２、１６日でＰ＞０．０５）との間ではＡＰ細胞の割合に著しい差異は観察されない。注目すべきことはαＭＥＭ＋ＯＳがαＭＥＭあるいはＤＭＥＭ（すなわち１６日でＰ＜０．００４およびＰ＜０．００２）を含むいずれかの他の培地よりも培養期間を通じてより大きなＡＰ活性を誘導するということである。しかし研究期間を通じてαＭＥＭおよびＤＭＥＭ＋ＯＳ（つまり１６日でＰ＞０．２）の間ではＡＰ活性に差はなかった。試験されたすべての培地について、１６日でミネラル化小節の数はＤＭＥＭ＋ＯＳ（ＤＭＥＭに比較してＰ＜０．０２）において最大であった。
【００４４】
これらの調査は、精製され培養拡張されたヒトＭＳＣｓが試験管内で骨形成系列に誘導でき、それによりヒト骨芽細胞分化のモデルを確立するということを示している。培養期間の初期（８日）においては、ＡＰ細胞表面染色で見られるようにαＭＥＭ＋ＯＳのみがＭＳＣｓのかなりの骨芽細胞補充（＞５０％）を誘導した。しかし１６日までにはＤＭＥＭを除くすべての培養がＡＰ染色細胞＞６０％を含んでいた。研究されたすべての培地において、ＯＳの追加は４日を越えるとより大きなＡＰ活性を産み出した。大抵の培地で大きな割合の細胞が１６日でＡＰ染色されたが、ＡＰ活性検定における実質的な差異は細胞表面における酵素の量、および従って骨芽細胞系列への進行度合を反映しているように見える。少なくともＯＳはこの骨芽細胞表面マーカーの発現を上向き調節することができる。興味深いことに、ＡＰ活性が少ないのにも拘らず、ＤＭＥＭ＋ＯＳ細胞はαＭＥＭ＋ＯＳよりも多いミネラル化小節を生成した。この観察は１６日の培養期間内にＤＭＥＭ＋ＯＳがαＭＥＭ＋ＯＳ以上のＭＳＣｓの骨形成分化を支持することを示唆している。十分な時間が与えられれば、αＭＥＭ＋ＯＳはＤＭＥＭ＋ＯＳよりもミネラル化細胞増殖巣を培養することも可能である。ＭＳＣ特異的免疫染色により立証されるＭＳＣ表現型（ＤＭＥＭ）の維持を容易にする培地の差異、あるいはＡＰ正細胞およびＡＰ活性により示される骨形成系列（αＭＥＭ＋ＯＳ）への最大補充および誘導はもともと興味深いものであり更なる検討を保証する。この誘導現象の間特異的細胞および基質成分に対する各種のモノクローナルおよびポリクローナル抗体の使用は現在進行中であり、試験管内分化過程の分子的性質に更なる洞察を提供するであろう。
【００４５】
実施例２
ヒト骨形成細胞に対するモノクローナル抗体の生成は生体内胚骨形成および試験管内精製間葉幹細胞の分化を明らかにする
骨髄から誘導される間葉始原細胞が骨芽細胞に分化できることはこれまでに十分確立されている。加えてこれら間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）は更に軟骨、腱、靭帯、筋、および他の組織を生み出す。しかしこれら各種の系列に沿ってＭＳＣｓの委託および分化に伴う各段階の知識は、骨形成あるいは他の分化路内での各段階と細胞に特異的なプローブの欠除により部分的に制約されてきた。モノクローナル抗体が分化を研究するための有用なプローブであるために、試験管内骨形成系列に誘導するヒト骨髄誘導ＭＳＣｓの無傷生細胞調製物を用いて我々はマウスを免疫化した。我々は精製ＭＳＣｓに対するハイブリドーマコロニー、骨形成分化を進行中のＭＳＣｓ、および長骨が軟骨原基痕跡の周りに発達中である胚ヒト肢の凍結部分を検査した。この検査実験記録は試験管内分化進行中のＭＳＣｓおよび生体内ヒト骨形成細胞で反応する抗体の選択を有利にする。このアプローチを用いて、我々はヒト骨髄ＭＳＣｓから誘導される骨形成細胞についての系列段階特異的表面抗原に対するモノクローナル抗体を生成した。
【００４６】
公開技術を用いて、ＭＳＣｓは５人の異なった患者（年齢２８−４６才）から精製され、培養拡張され（２９）、ＦＢＳ１０％および「骨形成補充剤」（デキサメタゾン１００ｎＭ、アスコルビン酸−２−リン酸塩５０μＭ、およびβ−グリセロホスフェート（２８））を伴うＤＭＥＭ−ＬＧで成長した。培養３日および６日、アルカリ性ホスファターゼ発現の初期の間、およびミネラル化小節形成前（３０）に、細胞はＥＧＴＡ、５ｍＭで平板から遊離された。約４百万個の３日および６日細胞はＢａｌｂｃ／Ｊマウスに５回の週毎免疫のそれぞれでプールされた。標準技術を用いてモノクローナルハイブリドーマが生産され、培養上澄みは精製ＭＳＣｓに対し半定量エリザにより検査され、またＭＳＣｓは骨形成補充剤で３日あるいは６日培養された。要約すると、ＭＳＣｓは９６ウエル培養皿で平板培養され、骨形成補充剤に露出され、次いで培養上澄みで続いてホースラディッシュペルオキシダーゼに接合されたヤギ抗マウスＩｇＧにより反応された。二次抗体はすすぎ洗いされ、またＯ−フェニレンジアミンが平板に加えられた。一次抗体マウスモノクローナル抗体結合はウエルを４９０ｎｍでエリザ平板リーダーでスキャンニングすることで定量化される比色反応により評価された。対象となるコロニーは対照ＭＳＣｓおよびＭＳＣｓから誘導される骨形成細胞への差別的結合にもとづき選択された。選択されたコロニーは更にヒト胚肢の非固定凍結切片で免疫蛍光法により検査された。対象となるハイブリドーマコロニーはクローンされ更に免疫細胞化学分析がヒト、ラット、ラビット、ひな、およびウシなどの源からの各種の正常および実験誘導組織で実施された。
【００４７】
約１０，０００個のハイブリドーマコロニーが前に記載した修飾エリザ実験記録により検査された。精製ＭＳＣｓ、あるいは骨形成補充剤とともに３日および６日培養されたＭＳＣｓの差別的結合にもとづいて、２２４個のコロニーが５５−６０日胚ヒト肢に対する免疫蛍光検査のために選択された。これら２２４コロニーの大部分は発達中の肢に存在する多重組織型と反応するか、あるいは発達中の骨には検出されなかった。ここまでには９個のコロニーが骨形成系列の細胞に対し特異的な免疫反応を示すものとして確認された。反応性のパターンは変化する。つまりあるハイブリドーマ上澄みは骨形成環および骨始原細胞含有骨膜内の大型母集団と反応し、一方他のものは基質合成に活性的に含まれるようにみえるこれらの細胞のみと反応する。２個のハイブリドーマコロニーは骨形成細胞と同じく肥厚性軟骨細胞と反応するように見える。この結果は表１で示される。
【００４８】
【表１】
2010012331.tif 000003
【００４９】
表１は未処理ＭＳＣｓ、あるいは骨形成補充剤で３日あるい６日培養されたＭＳＣｓに対する選択されたハイブリドーマコロニーの免疫活性を示す。数値は前に記載されたエリザ検定で結合された抗体の相対量を反映する。
【００５０】
これらの研究はトリ骨形成細胞で詳細に説明されたもの（３１）と類似したヒト骨形成系列段階特異的細胞表面分化マーカーの存在を示している。発達中の肢の骨形成細胞の染色は、骨形成補充剤で培養されたＭＳＣｓが培養内で「真正」骨芽細胞になることを支持している。試験管内骨形成分化はかくしてＡＰ発現およびミネラル化小節形成の伝統的な規準を越えて拡張する分子プローブにより確認される。抗原発現の詳細な試験管内観察および生体内分析の相関は骨形成の更なる研究に有用である。特異的な組織培養要素、すなわち骨形成系列段階を通じて細胞の進行を促進する生物活性因子の特徴付けはきわめて重大である。骨形成細胞表面およびもしくは細胞外マトリックス抗原の確認は間違いなく骨細胞生理学への更なる洞察を提供する。これらおよび現在研究中の他のモノクローナル抗体は将来ＭＳＣ分化の研究に有用であることを実証するであろう。
【００５１】
実施例３
試験管内ＭＳＣｓの誘導軟骨形成分化
この実施例で記載される実験の目的は、間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）が組織培養培地内で適切な生物活性因子を提供することにより試験管内軟骨形成系列路に向けて指向されるということを示すことであった。この組の実験はＭＳＣｓがどのようにして軟骨形成系列に指向できるのかのただ一つの実施例を表す。ヒトＭＳＣｓが収穫され、前に記載された通り骨髄から分離された。細胞は予備選択された胎児ウシ血清１０％を含むＤＭＥＭ−ＬＧ培地（完全培地）で培養拡張された。培養が密集に近付くまで新鮮培地が３−４日毎にとり替えられ、密集の地点で細胞はトリプシンで平板から遊離され、約５０％の密集（１００ｍｍ皿当り５００，０００個の細胞）で平板に再接種された。これらの再平板培養ＭＳＣｓは一晩付着され、その後完全培地は胎児ウシ血清１０％およびマーシャル・アール・ユーリスト博士により提供された部分的精製骨形態形成タンパク質（軟骨形成補充剤）５ｍｇ／ｍｌとともにＤＭＥＭ−ＬＧでとり替えられた。この軟骨形成補充剤は３日毎にとり替えられた。細胞は毎日形態形成変化を調べられた。選択された平板は次いで軟骨系列に入った細胞のマーカーであるＣＳＰＧ−Ｍを免疫組織化学的に分析された。次いで軟骨のタイプIIコラーゲンマトリックスを合成するため駆動されたのはこれらの細胞である。標準免疫組織化学試薬が細胞外マトリックスタンパク質の存在を示すために使用された。追加の標本が成熟軟骨細胞母集団の連続分化および表現型発現と相関付けるトルイジンブルー染色小節の存在を評価された。肥厚性軟骨細胞のミネラル化小節の存在のためのフォン・コッサ染色は負であった。
【００５２】
この結果は、軟骨形成補充剤に露出僅か３日後に、培養のＭＳＣｓは既にその細胞外マトリックスへのＣＳＰＧ−Ｍ発現を開始したことを示していた。培養皿の全組織は１日目の繊維芽状細胞の渦巻きから軟骨膜に似た繊維芽細胞の薄層に囲まれた多層円形あるいは多角形細胞の数多くの細胞増殖巣に変化した。これら小節の細胞外マトリックスはタイプIIコラーゲンに対し強力に免疫活性であった。完全培地のみを供給された対照培地はこれらの軟骨小節を決して発達させなかった。まとめてみると、これらの研究はＭＳＣｓが試験管内軟骨形成系列に沿って分化するように刺激されたことを示している。更にＭＳＣｓがＣＳＰＧ−Ｍ発現により立証された系列内の初期の段階に再補充されるだけでなく、ＭＳＣｓはタイプIIコラーゲン濃縮細胞外マトリックスを分泌する成熟軟骨細胞になるように系列に沿って進行した。かくしてここまでは、石灰化基質における肥厚性細胞により立証されるＭＳＣｓから誘導された軟骨細胞の末端分化は試験管内では観察されなかった。この発見はこの末端分化段階を促進するよう特異的に意図された軟骨形成補充剤を設計する必要性を反映する。興味深いことに、パチフィチおよび共同研究者（３２）は試験管内ひな軟骨細胞の末端分化を刺激するレチノイン酸を含む培地を考察した。
【００５３】
前記の実施例で軟骨形成補充剤を構成する完全培地への添加物は試験管内軟骨形成細胞分化あるいは増殖を刺激する既知の因子のただ一つのものである。
実施例４
試験管内ＭＳＣｓの誘導骨髄ストロマ細胞分化
この実施例に記載される試験の目的はヒト骨髄誘導ＭＳＣｓが培養培地に適切な生物活性因子を提供することにより試験管内支質形成系列路に沿って指向されることを示すことであった。ヒト骨髄誘導ＭＳＣｓは骨髄から分離され、前に記載の通り培養で拡張された。ヒトＭＳＣｓが骨髄ストロマ細胞系列に誘導される能力を示すために、特異的サイトカイン発現が分化のマーカーとして測定された。ＭＳＣｓは、予備選択された胎児ウシ血清１０％を含むＤＭＥＭ−ＬＧ（完全培地）よりなる培地を用いて分化なしでＭＳＣ増殖を有利にする条件、あるいは完全培地プラスインターロイキン−１α（ＩＬ−１α）（ストロマ形成補充剤（ＳＳ））１０Ｕ／ｍｌよりなる培地を用いて骨髄ストロマ表現型への発現および分化を有利にする条件の下で成長した。これらの組織培養母集団からの条件付き培養培地は商業的サンドイッチエリザ生物検定（アールアンドディー・システムズ）を用いてサイトカインの存在を分析された。
【００５４】
検定されるサイトカインはストロマ細胞により分泌されるものとして知られるものであり、また造血に影響を与えるものである。これらはインターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、果粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、果粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および形質転換増殖因子−ベータ−２（ＴＧＦ−β２）を含む。それぞれの場合、第二継代ＭＳＣｓは約３０％の密集（３５ｍｍ平板当り３０，０００個の細胞）の密度で３５ｍｍ培養平板に平板培養された。一晩細胞を付着させた後、培養培地は除去され、完全培地あるいは完全培地プラスストロマ形成補充剤のどちらかでとり替えられた。図６は二つの平板培養条件の下でのヒトＭＳＣｓのサイトカイン発現を図示する。ＩＬ−１α不在下では、ＭＳＣｓはＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦおよびＳＣＦを非常に低い水準で発現したがＩＬ−６は非常に豊富に発現する。比較して、ＩＬ−１−α刺激の３日後、劇的に高い水準のサイトカインが前記の種のすべてで検出された。ＭＳＣｓは２腫の培養条件のいずれにおいてもＩＬ−３あるいはＴＧＦ−β２を発現しなかった。これらのデータは、ＩＬ−１−αが造血幹細胞の分化を支持するように例証されたサイトカインプロファイルのＭＳＣ発現を向上させ、またそれが分化骨髄ストロマ細胞の特徴であることを示している。
【００５５】
実施例５
試験管内ＭＳＣｓの誘導筋形成分化
この実施例に記載される研究の目的は、５−アザシチジンが筋形成系列に沿って分化するために間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）を誘導することを示すことであった。
【００５６】
シチジンの類似体である化合物、５−アザシチジン（５−ａｚａ−ＣＲ；ミズーリ、セントルイス、シグマ・ケミカル・カンパニー）は表現型特異的遺伝子の活性化に含まれるＤＮＡにあるある種のシトシンの低メチル化を生じさせる。マウス胚細胞系、Ｃ３Ｈ／１０Ｔｌ／２  Ｃ１８およびスイス３Ｔ３は５−ａｚａ−ＣＲに露出後３個の異なった中胚葉細胞系列、筋芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞に転換されることが示された（３３−３４）。部分的には、５−ａｚａ−ＣＲが筋形成遺伝子を活性化する機構はＭｙｏＤ１を含むように見える（３５−３６）。前記を心にとめながら、我々はラット骨髄誘導ＭＳＣｓを５−ａｚａ−ＣＲに露出し、我々の分析をそれの筋形成表現型との応答のやりとりに集中させた。
【００５７】
平均体重１００ｇのオスフィッシャーラット（インディアナ、インディアナポリス、チャールズ・リバー）の大腿および脛骨が収集され、癒着性軟組織が除去された。骨髄細胞のいくつかの分離株が２５０ｇのラットから得られた。筋形成前駆体が骨髄調製物にもち込まれないことを確実にするために、軟組織を除去するための長骨の綿密な解剖が行われた。この点に関して筋形成細胞は未処理のＭＳＣ培養では決して観察されなかった。骨の両端は骨用鋏で骨幹から切り取られた。骨髄栓子は、胎児ウシ血清１０％（ＦＣＳ；カリフォルニア、ウッドランド、アイアール・サイエンティフィック・インコーポレイテッド）、ウマ血清５％（ＨＳ；カンサス、レネクサ、ヘイズルトン・バイオロジクス−インコーポレイテッド）および抗生物質（ジブコ・ラボラトリーズ；ペニシリンＧ、１００Ｕ／ｍｌ；ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ；アンホテリチンＢ、０．２５μｇ／ｍｌ）の選択されたロットを含むＤＭＥＭよりなる完全培地で充填された１０ｍｌの注射器に固定された１８ゲージ針の挿入により骨から流体静力学的に放出された。針は大腿の遠位端および脛骨の近位端に挿入され、骨髄栓子は反対端から放出された。骨髄栓子は１８ゲージ、２０ゲージ、および２２ゲージ針を通じて連続継代により構成要素に分解され、これら分散細胞は遠心分離され完全培地で２度再懸濁された。細胞が血球計算器で計数された後、完全培地の７−１０ｍｌの５×１０７細胞が１００ｍｍペトリ皿に誘導された。３日後、培地はとり替えられ非癒着性細胞は廃棄された。培地は３日毎に完全にとり替えられた。接種の約１０日後、皿は殆ど密集となり癒着性細胞はＥＤＴＡナトリウム１ｍＭ（ニューヨーク、グランドアイランド、ジブコ・ラボラトリーズ）内にトリプシン０．２５％で皿からとりはずされ、１：３に分割され新鮮平板に接種された。これらの一度継代した細胞が殆ど密集になった後、それは収穫され下記に記載する実験に使用された。我々はこれらの細胞をラット骨髄誘導ＭＳＣｓとして引用する。全体で８個の異なったラット骨髄誘導ＭＳＣ調製物がこの研究で使用された。完全培地で３７℃でＣＯ２、５％の加湿雰囲気の下で日常的に決まったやり方で培養された。
【００５８】
２代継代ＭＳＣｓは３種の細胞密度、皿当り５００、５，０００、および５０，０００細胞で３５ｍｍ皿に接種された。接種２４時間後の初めに、これらの培養は各種濃度の５−ａｚａ−ＣＲを含む完全培地よりなる筋形成培地で２４時間処理された。培養物がタイロード平衡塩溶液（シグマ・ケミカル・カンパニー）で２度洗浄された後、培地は５−ａｚａ−ＣＲを加えることなしに完全培地にとり替えられ続いて処理４０日後実験が終了するまで１週２回とり替えられた。結果で詳細に記載しているように、各種の培養条件は５−ａｚａ−ＣＲ作用を最適化、とりわけ筋形成を最適化する試みで試験された。
【００５９】
２代継代ラット骨髄ＭＳＣｓが５，０００細胞／皿で３５ｍｍ皿に接種され、５−ａｚａ−ＣＲで前に記載されたのと同じ方法で５−ａｚａ−２′−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣＲ；シグマ・ケミカル・カンパニー）の４種の濃度（０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭおよび１０μＭ）で処理された。処理の間いろいろな時期に培養の形態変化が観察された。
【００６０】
生体培養は毎日位相差顕微鏡（日本、東京、オリンパス光学株式会社）で検討され、最終的には培養のいくつかは組織学あるいは免疫細胞化学のため固定された。筋細胞はまず多核筋管の存在により位相差で形態学的に確認され、続いて骨格筋特異的タンパク質ミオシンの存在により免疫組織化学的に確認された。推定上の筋細胞の収縮はタイロードのアセチルコリン１ｍＭ（シグマ・ケミカル・カンパニー）の１滴で刺激された。免疫組織化学として、培養細胞は１０分、−２０℃メタノール（ニュージャージー、フェアローン、フィッシャー・サイエンティフィック・カンパニー）で固定され、ＢＳＡ、０．１％（ウシ血清アルブミン；シグマ・ケミカル・カンパニー）を含むＰＢＳ（食塩加リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）内のラット迅速単収縮骨格ミオシン（シグマ・ケミカル・カンパニー；腹水、１／４００希釈液）に対してマウスモノクローナル抗体で保温された。第２の抗体はビオチン接合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ペンシルバニア、ウエストチェスター、オーガノン・テクニカ・コーポレイション、１／５０希釈液）であり続いてテキサスレッド接合アビジン（オーガノン・テクニカ・コーポレイション、１／４，０００希釈液）により処理された。すべての保温は３０分室温で行われ、そのそれぞれは保温の前に５分、ＢＳＡ１％を含むＰＢＳで遮断され、次いで５分ＰＢＳで洗浄された。細胞はフルオロマウントＧ（ペンシルバニア、ピッツバーグ、フィッシャー・バイオテック）にのせられ、蛍光発光を備えたオリンパス顕微鏡（ＢＨ−２）で観察され、コダックＴＭＡＸ４００フィルムで撮影された。
【００６１】
第２継代ラット骨髄ＭＳＣｓが１細胞／ウエルの限定希釈で９６ウエルプレートに平板培養された。細胞は完全培地５０％および馴化培地５０％よりなる培地で平板培養され、それは２日間全培地で培養された密集に近いラット骨髄細胞から得られた。全体で３８４ウエルから５０コロニーが検出された。これらは継代培養され、維持され、最終的には４個が生存した。これら４個のクローンは前に述べた通り５−ａｚａ−ＣＲで処理され、筋形成あるいは脂肪細胞形態構造として記録された。
【００６２】
第１継代ラット骨髄細胞は５−ａｚａ−ＣＲに２４時間露出され、前の通り１細胞／ウエルの限定希釈で９６ウエル平板に平板培養された。脂肪細胞（スーダン黒正）あるいは筋形成、多核細胞形態構造を示すクローンの数が測定された。
【００６３】
骨髄ＭＳＣｓの各種中胚葉表現型への転換能力を純粋繊維芽細胞のそれと比較するために、我々はラット脳繊維芽細胞を５−ａｚａ−ＣＲあるいは５−ａｚａ−ｄＣＲのいずれかに露出した。３匹のオスフィッシャーラットの脳の全大脳が頭蓋の内側から収集され、鋭いメスで小片に切断された。これらの小片は５０ｍｌの円錐形遠心分離管に移され、５００×ｇで１０分遠心分離され、タイロード平衡塩溶液１０ｍｌに再懸濁され緩いダウンスホモジナイザーで均質化された。ホモジネートはコラーゲナーゼ０．１％（ＣＬＳ２、２４７Ｕ／ｍｇ；ニュージャージー、フリーホールド、ワージントン・バイオケミカル・カンパニー）で３７℃、３時間保温され、その間にこれは３０分毎に３０秒渦動された。処理の後、遊離細胞はナイテックスフィルター１１０μｍを通過され、遠心分離され、ＦＣＳ１０％を含む、低グルコースＤＭＥＭ−ＬＧ（ジブコ・ラボラトリーズ）１０ｍｌで再懸濁され、３個の１００ｍｍ培養皿で３７℃でＣＯ２ 恒温器で培養された。培地は週２回とり替えられ、細胞は皿が密集に到達するまで培養された。
【００６４】
第３継代ラット脳繊維芽細胞は５０，０００細胞／皿の密度で３５ｍｍ皿に接種され、ラット骨髄ＭＳＣｓと同じ方法で５−ａｚａ−ＣＲ、１μＭ、３μＭあるいは１０μＭもしくは５−ａｚａ−ＣｄＲ、０．１μＭ、０．３μＭあるいは１μＭで処理された。２４時間後培地は５−ａｚａ−ＣＲあるいは５−ａｚａ−ＣｄＲの追加なしでＦＣＳ１０％、ＨＳ５％およびヒドロコルチゾン５０ｎＭを含むＤＭＥＭ−ＬＧにとり替えられ、実験が終了するまで１週２回とり替えられた。
【００６５】
ラット骨髄ＭＳＣｓから誘導された筋形成細胞は正常な胎児ラット筋形成細胞と比較された。というのは後者の方がかなりのデータベースが存在するからである。筋細胞が生後１７日のフィッシャーラット胎児の後肢筋からカルシウムおよびマグネシウムのないタイロード内でのトリプシン０．２％（シグマ・ケミカル・カンパニー）を用いて３５分、３７℃で時々攪拌しながら解離された。それを１１０μｍナイテックスフィルターを通した後、繊維芽細胞の濃度はフォルコンプラスチック皿で３０分細胞懸濁液を保温することにより減少し、皿は繊維芽細胞の選択的付着に帰着する。被覆されていない皿に付着しなかった５×１０５  単一細胞の懸濁液が、ＤＭＥＭ７９％、ＦＣＳ１０％、ＨＳ１０％および非必須アミノ酸１％（ジブコ・ラボラトリーズ）よりなる２ｍｌを含むコラーゲン被覆（ゼラチン０．１４％の１．５ｍｌ、ニュージャージー、フィリップバーグ、Ｊ．Ｔ．ベーカー・ケミカル・カンパニー）３５ｍｍプラスチック培養皿で平板培養された。細胞は３７℃、加湿ＣＯ２５％で成長した。
【００６６】
ラット骨髄誘導ＭＳＣｓ（５，０００細胞／３５ｍｍ皿）が細胞を培養皿に接種２４時間後に各種濃度の５−ａｚａ−ＣＲ（０、１、３、１０、２０、および５０μＭ）に露出された。５−ａｚａ−ＣＲを含む培地は２４時間の露出期間後に除去され、５−ａｚａ−ＣＲを欠いている培地でとり替えられた。この露出の７日後、長多核細胞が５−ａｚａ−ＣＲ、３μＭ以上で処理されたいくつかの皿で観察された（図７Ａ）。これら培養における細胞は約８０％の密集であった。このような多核細胞の数はコロニーあるいは群生体を分離するにつれて増加し、最初の処理の２週後に最大（１０個の３５ｍｍ皿の９コロニー）に達した。この細胞数は処理５週後までに減少（１０個の３５ｍｍ皿の６コロニー）した。７個は多分その収縮および皿からの分離によるものであり、またこの期間に４個の新しいコロニーが出現した。かなりの割合の多核細胞が最初の露出の４０日後まで残っていたがこれは最長の観察期間であった。生体培養の位相差顕微鏡により観察された多核細胞の形態（図７Ａ）は培養におけるラット筋のそれと類似していた。我々は胚ひな筋形成細胞でよく観察される識別できる横紋を観察しなかったが、もっとも正常な胎児ラット肢から得られた筋形成細胞から誘導される筋管も横紋を示さなかった（図７Ｂ）。かくしてＭＳＣｓから誘導される筋管あるいは正常ラット胚から得られるもののいずれもこれらの研究に採用される条件下では横紋を示さない。これら多核細胞のいずれかの自発の収縮あるいは単収縮の波は生体培養を見る時に観察された。これらの細胞の収縮は更にこれらの細胞にアセチルコリン溶液の一滴をおくことで刺激され、それは更にこれらの細胞が筋形成性であることを示すものとなる。
【００６７】
これら多核細胞の同一性を更に確認するために、骨格筋特異的ミオシンに対する抗体がこれら培養の固定標本に提供された。図８は抗ミオシン抗体で正に染色された筋管を示す。再び横断横紋は観察できなかった。我々はまた抗ミオシン抗体で５−ａｚａ−ＣＲ処理２週および５週後の筋管を染色した。処理２週後の筋管は強い正に染色（図９Ａおよび９Ｂ）されたが、処理５週後のものは弱く染色された（図９Ｃおよび９Ｄ）。
【００６８】
５−ａｚａ−ＣＲの作用はＭＳＣｓに提供された濃度に依存するように見えた。０あるいは１μＭの５−ａｚａ−ＣＲで処理された皿では筋管は発見されなかったが、３−５０μＭの５−ａｚａ−ＣＲで処理されたものでは、筋管は比較できる出現率で観察された（表２）
【００６９】
【表２】
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【００７０】
ラット骨髄細胞の第２次培養は３５ｍｍ皿当り５，０００細胞で平板培養され、指示された濃度の５−ａｚａ−ＣＲで処理され、また処理１４日後に観察された。筋管および脂肪細胞の出現率の数は観察される表現型確認群生体数および試験される培養皿の全数を示す。
【００７１】
５−ａｚａ−ＣＲの存在下で生存指数（ＳＩ＊）を測定するために、ＭＳＣｓは２００細胞／３５ｍｍ皿で接種され、平板培養２４時間後に５−ａｚａ−ＣＲで処理された。１４日後、１０細胞以上を含むコロニーが計数され、この数はパーセンテージを得るため１００％で乗じられ２００で除された。
【００７２】
細胞が５−ａｚａ−ＣＲのより高い濃度で処理された時、平板上の細胞数は、筋形成細胞および細胞生存の最大数に関して１０μＭがもっとも有効な濃度として減少した（表２についての平板効率）。かくしてこれに続くすべての実験は５−ａｚａ−ＣＲの１０μＭで行われた。
【００７３】
５−ａｚａ−ＣＲのデオキシ類似体である５−ａｚａ−２′−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣＲ）の作用を試験するために、ラット骨髄ＭＳＣｓが５−ａｚａ−ＣＲと同じ方法で５−ａｚａ−ｄＣＲ、０．３μＭ、１μＭ、および１０μＭで処理された。試験された濃度の内、５−ａｚａ−ｄＣＲ、０．３μＭが筋形成転換の最高の出現率を与え、観察された出現率は５−ａｚａ−ＣＲに露出した細胞よりもずっと高かった（表３）。
【００７４】
【表３】
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【００７５】
ラット骨髄細胞の第２次培養は３５ｍｍ皿当り５，０００細胞で平板培養され、指示された濃度の５−ａｚａ−ｄＣＲあるいは５−ａｚａ−ＣＲで処理され、処理１４日後に観察された。筋管の出現率の数は観察される表現型確認群生体数および試験される培養皿の全数を示す。
【００７６】
５−ａｚａ−ｄＣＲあるいは５−ａｚａ−ＣＲの存在下で生存指数を測定するために、ＭＳＣｓは２００細胞／３５ｍｍ皿で接種され、平板培養２４時間後に５−ａｚａ−ｄＣＲあるいは５−ａｚａ−ＣＲで処理された。１４日後１０細胞以上を含むコロニーが計数され、この数はパーセンテージを得るために１００％で乗じられ２００で除された。
【００７７】
骨髄収穫時に周囲の筋誘導筋芽細胞による汚染の可能性を除去するために、第２継代ラット骨髄ＭＳＣｓはここに記載された通りクローンされた。見分けのつかない形態の４匹のクローンがこの方法で獲得され、５−ａｚａ−ＣＲに２４時間露出された。強調すべきことは、これらのクローンにある細胞は５−ａｚａ−ＣＲへの露出の前は筋状特性あるいは筋特異的ミオシンに対する正の免疫染色を示さなかったことであった。５−ａｚａ−ＣＲに露出した４個のクローンの内、１個のクローンは筋管および脂肪細胞の示差的な形態を示し、これは非筋細胞が筋芽細胞あるいは脂肪細胞に転換されたかあるいはそれになるべく影響されたものと我々は解釈する。
【００７８】
ラット骨髄誘導ＭＳＣｓは、５−ａｚａ−ＣＲ、１０μＭに２４時間露出されクローンされた。全体で７６８のウエルから１３６のコロニーが検出された。１３６コロニーの内、７個（５％）は筋形成表現型を示し、２７個（２０％）は脂肪細胞表現型を示し、また他のコロニーは識別できる表現型に明らかに関連する形態を欠いていた。
【００７９】
非ＭＳＣ標本に対する５−ａｚａ−ＣＲおよび５−ａｚａ−ｄＣＲの作用を試験するために、我々は脳繊維芽細胞をこれと同じ試薬に露出した。ラット脳繊維芽細胞は３５ｍｍ皿に５０，０００細胞／皿の密度で接種され、ラットＭＳＣｓの場合と同じ方法で５−ａｚａ−ＣＲ、１μＭ、３μＭ、あるいは１０μＭ、もしくは５−ａｚａ−ｄＣＲ、０．１μＭ、０．３μＭ、あるいは１μＭで処理された。各グループは９個の皿を持ち、細胞は露出１４日後まで調査された。７日目に、５−ａｚａ−ＣＲ、１０μＭで処理されたグループを除きすべての皿は密集に到達した。観察の期間中には脂肪細胞あるいは筋管はいずれの皿からも発見されなかった。
【００８０】
ＭＳＣｓは子（生後４週、１００ｇ）および成体（生後３ケ月、２５０ｇ）のドナーラットから収集され、継代され、５−ａｚａ−ＣＲに露出後筋形成表現型のコロニー数が比較された（表４）。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
ラット骨髄ＭＳＣｓの第２培養が３５ｍｍ皿当り５，０００細胞で平板培養され、５−ａｚａ−ＣＲ  μＭで処理され２４時間後異なった水準のＦＣＳ、ＨＳ、あるいはＨＣ、５０μＭとともにＤＭＥＭに変更され、５−ａｚａ−ＣＲ露出１４日後に観察され終了した。筋管の出現率の数は試験される培養皿の全数を示す。
【００８３】
若いドナーラットから得たＭＳＣｓは成体ラットから得たものよりもより多くの筋形成コロニーを得た。５−ａｚａ−ＣＲに露出された若いドナーＭＳＣｓの第２継代培養は第１から第４継代まで試験された成体ドナーからのＭＳＣｓに比べてより多くの筋形成コロニーを生産した。
【００８４】
各種の培養条件が５−ａｚａ−ＣＲに露出された培養ＭＳＣｓの筋形成表現型の発現を最適化するための試みとして試験された。露出された細胞は各種の濃度のＦＣＳ、ＨＳ，基本繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）およびヒドロコルチゾンを含む培地で培養された。表４はＦＣＳ、１０％、ＨＳ５％、およびヒドロコルチゾンを含む培地が筋形成性のＭＳＣ発現には最適であるように見えることを示している。ｂＦＧＦを含む培地は筋形成表現型の発現を増加させるように見えた（表５）が、もっともこれは始原細胞からの転換の増加とは反対に、筋芽細胞分割による筋芽細胞の数の増加と関連している。
【００８５】
【表５】
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【００８６】
細胞はｂＦＧＦありもしくはなしでＦＣＳ、１０％、ＨＳ５％およびＨＣ５０μＭを持つＤＭＥＭで培養された。筋管の出現率の数は、観察される表現型確認可能コロニーあるいは群生体の全数および試験される培養皿の全数を示している。ＭＳＣは子（１００ｇ）あるいは成体（２５０ｇ）ラットから得られた。
【００８７】
加えて、骨髄誘導ＭＳＣｓは５００細胞／皿、５，０００細胞／皿、および５０，０００細胞／皿で平板培養され、次いで５−ａｚａ−ＣＲに露出された。５００細胞／皿においては、筋形成細胞はまず処理２０日後に観察され、細胞は処理２５日に密集になった。筋形成細胞の２個の房（クラスター）が処理２９日後の５個の皿で観察された。５，０００細胞／皿においては、筋形成細胞はまず７日に観察され、細胞は処理１０日後に密集となった。３個の房が処理１４日後４個の皿で観察された。５０，０００細胞／皿においては、筋形成細胞は６日に観察され、細胞は処理７日後に密集となった。１０個の房が処理１４日後５個の皿で観察された。
【００８８】
ここで提示された観察は、ラット骨髄ＭＳＣｓが５−ａｚａ−ＣＲへの短い露出に続き試験管内筋形成系列に分化する能力を持つことを示している。観察された筋形成細胞は、自発的に収縮し、アセチルコリンに露出すると収縮し、骨格筋特異的ミオシンに対するモノクローナル抗体で正に染色される筋管の特徴的な多核形態を示したが、もっともこの筋管は明らかな横紋を示さなかった。しかし胎児ラット筋から収集された正常ラット筋芽細胞は我々の手許にあるものでは培養で明らかに横紋入り筋管を形成しなかった。我々は骨髄収穫の時点で骨から付着軟組織を綿密に除去することにより指向筋形成細胞による汚染の可能性を除去するように試みた。重要なことは、我々は５−ａｚａ−ＣＲの十分なる濃度に露出されたものを除き、数百の標本でラット骨髄のいずれの培養にも筋管を観察していないということである。加えてラット骨髄ＭＳＣｓのクローンが５−ａｚａ−ＣＲの処理後筋形成表現型および脂肪細胞表現型に転換されたが、これは我々は非筋始原細胞がこれら２個の表現型に転換されたことを意味するものと解釈する。骨格筋が骨髄内で観察されなかったため、５−ａｚａ−ＣＲがこれらの骨髄誘導ＭＳＣｓを筋形成細胞に転換するものであることを我々は確信する。
【００８９】
実施例６
試験管内ヒト骨髄誘導間葉幹細胞によるサイトカイン発現：ＩＬ−１αおよびデキサメタゾンの作用
この研究の目的はサイトカイン発現プロファイルの確認を通じて培養ＭＳＣｓの表現型特徴を更に確立することであった。我々は各種間葉表現型の細胞分割、分化、あるいは発現の調節に重要であるとして知られているサイトカインの発現水準を確認し測定する商業的エリザを使用した。我々はこれまでに報告した条件の下でＭＳＣサイトカイン発現を確認し、それはＭＳＣが分化なしで有糸分裂で拡張すること（構造的培養拡張培地）を可能にした。加えて、我々はデキサメタゾンあるいはＩＬ−１αで補充された培養培地でＭＳＣｓによるサイトカイン発現を検定した。デキサメタゾンは骨始原細胞の骨芽細胞への分化を誘導すると報告されている。対照的に、炎症応答の間に各種の細胞により骨髄徴環境に分泌されるＩＬ−１αは、造血を支持する骨髄ストロマの能力を高めるものと報告されており、かくして骨髄ストロマ繊維芽細胞の分化およびもしくは発現を制御する役割を演じる。
【００９０】
これらの分析データは培養ＭＳＣｓがユニークなサイトカインプロファイルを発現することを示す。加えて、デキサメタゾンおよびＩＬ−１αは異なった方法でＭＳＣサイトカイン発現プロファイルを変更する。これらのデータは我々の理解にユニークなＭＳＣｓの表現型プロファイルを追加し、更にＭＳＣｓが骨形成系列あるいは骨髄ストロマ表現型に向けてその表現型を分化しあるいは調節するようにその表現が発展的に調節される巨大分子を確認する。
【００９１】
材料および方法
〔ＭＳＣ分離および培養拡張〕
骨髄は異なった年齢の３人の男性および３人の女性の６人のヒトドナーから得られた（表６）
【００９２】
【表６】
2010012331.tif 000008
【００９３】
各ドナーは癌からの寛解期にあり、将来のオートロガス（自己由来）骨髄移植に備え骨髄収穫を受けていた。約１０ｍｌの未分画骨髄が収穫物から得られ、この研究の検定に使用された。ＭＳＣｓは精製されこれまでに報告された方法の修飾により培養された。簡単に言うと、骨髄吸引物は注射器から完全培地２５ｍｌを含む５０ｍｌの円錐形管に移され、この培地は選択されたロットから胎児ウシ血清（ＦＢＳ）で補充されたダルベッコ修飾イーグル培地よりなり、最終量が１０％になるようにされた。管はベックマン卓上型遠心分離機で１２００ｒｐｍ、ＧＳ−６旋回バケットローターで５分回転され細胞をペレットにした。サンプルの表面に形成する脂肪層および上澄みは血清ピペットを用いて吸引され廃棄された。細胞ペレットは完全培地で５ｍｌの量になるよう再懸濁され、次いでパーコル７０％の予備形成勾配のトップに移された。サンプルはソーバルＧＳ−３４型固定角ローターにのせられ、ソーバル高速遠心分離機で４６０  ｘ  ｇで１５分遠心分離された。約１５ｍｌ（プール密度＝１．０３ｇ／ｍｌ）の低密度画分が各勾配から収集され完全培地３０ｍｌが加えられた５０ｍｌの円錐形管に移された。管は細胞をペレット化するため１２００ｒｐｍで遠心分離された。上澄みが廃棄され、細胞は完全培地２０ｍｌで再懸濁され赤血球を酢酸４％で溶解させた後血球計算器で計数された。細胞は７ｍｌ当り５×１０７細胞の濃度に調節され平板当り７ｍｌで１００ｍｍ培養平板に接種された。
【００９４】
〔骨髄誘導ＭＳＣｓの培養および継代〕
骨髄誘導ＭＳＣｓは空気９５％およびＣＯ２ ５％を含む加湿雰囲気で３７℃で完全培地で培養され、培地は３−４日毎にとり替えられた。第１次培養皿が密集近くなると、５分３７℃でＥＤＴＡ、１ｍＭ（ジブコ）を含むトリプシン０．２５％で分離された。トリプシンの酵素活性はＦＢＳ、１／２量の追加で停止した。細胞は計数され、１：３に分割され、７ｍｌの完全培地に再平板培養された。これらの第１継代細胞は、それらが密集近くなるまで４−６日で分割を許された。密集近接第１継代細胞はトリプシン化され、下記に記載される検定形式に再平板培養された。
【００９５】
〔定量エリザ〕
ＭＳＣｓによるサイトカイン発現の水準は定量エリザを用いて測定された。下記のサイトカインに対する抗体特異性を持つエリザキット（ミネソタ、ミネアポリス、アールアンドディー・システムズ）が購入された；インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、果粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および形質転換増殖因子−ベータ−２（ＴＧＦ−β−２）。密集近くになると、第１継代ＭＳＣｓは平板当り５０，０００細胞で３５ｍｍ平板に再平板培養され一晩付着することを許された。培養条件は次いで３個の試験条件の一つに変更された：新鮮完全培地；完全培地と骨形成補充剤；および完全培地と支質形成補充剤がそれである。培養は２４時間あるいは４８時間で試験培地で保温することを許され、その時点で上澄みが収集され、ドライアイス−エタノールで急速冷凍されすべてのサンプルが一緒に分析を準備されるまでレブコフリーザーで−７０℃で貯蔵された。検定は培養上澄み１００μｌをエリザ平板のウエル上に適用することで実施され、続いて製造業者の指示にもとづき平板を処理することがなされた。標準曲線はキットで供給される標準サイトカインを用いて生成され、適切な濃度に希釈された。ある場合（とりわけＩＬ−６検定）では、上澄みは標準曲線から正確に定量化できる十分に低い吸光測定値を生成するために大幅に希釈されねばならなかった。
【００９６】
〔細胞数の定量化〕
結果
〔構造性培養拡張培地条件〕
９個の検定されたサイトカインの６個の検出水準が構造性培養拡張条件に露出２４時間後に存在した。（図１２Ａ−１２Ｄおよび１３Ａ−１３Ｃならびに下記の表７−１０を参照のこと）。
【００９７】
【表７】
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【００９８】
【表８】
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【００９９】
【表９】
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【０１００】
【表１０】
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【０１０１】
最低から最高まで２４時間あるいは４８時間でｐｇ／１０，０００細胞に関して発現されるサイトカインは：Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＬＩＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１１およびＩＬ−６である。構造性培養拡張条件下で上澄みに３個のサイトカインが検出されなかったが、それはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＴＧＦ−β２であった。他のサイトカインの発現の平均水準と比較して、大きな差異が各サイトカインの平均サイトカイン発現で観察された。極端に言えば、Ｇ−ＣＳＦ発現の平均検出水準（１０ｐｇ／１０，０００細胞／２４時間）はＩＬ−６発現の平均検出水準（７４２１ｐｇ／１０，０００細胞／２４時間）よりも７００倍以上も低かった。
【０１０２】
〔骨形成補充剤培養条件〕
骨形成補充剤の完全培地への追加は対照と関連してＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＳＣＦに検出可能な変化を生み出さなかった（図１２Ａ−１２Ｄおよび１３Ａ−１３Ｂ；表７−１０）。対照的にＯＳ培地は、２４時間構造性培養拡張培地条件の下でのこれらサイトカインの発現と関連して、ＬＩＦ（ｐ＜．０１）、ＩＬ−６（ｐ＜．００１）およびＩＬ−１１（ｐ＜．００５）の発現を著しく下向き調節した。これらの水準は構造性培養拡張培地条件で４８時間のサイトカイン水準よりも統計的に低い段階に留まった（図１２Ａ−１２Ｄおよび１３Ａ−１３Ｃ；表７−１０）。ＯＳ培地媒介阻害の量は３個のサイトカインで変化した。２４時間の時点で構造性培養拡張培地条件に関連してＯＳ培地におけるサイトカイン発現の平均水準は以下のようであった；ＬＩＦ発現、５５％±５４％，ＩＬ−６、１６％±９％およびＩＬ−１１、１％±３％。ＬＩＦパーセント変化における大きな標準偏差は主として１人のドナー（ドナー＃４）からの測定に起因し、ここではＬＩＦ発現の水準は構造性培養拡張条件に関連してＯＳ培養条件下で事実上高かったためであった（表７）。一定のドナーに対して、あるサイトカインの平均絶対阻害水準に関連してそのサイトカインの阻害パーセントは、平均絶対阻害水準に関連して他の２個の阻害パーセントとは無関係であった（表７−１０）。加えて、サイトカインのそれぞれに対して、母集団における６個の個体の間の一定のサイトカインのための阻害パーセントは、構造性培養拡張条件の下での発現の当初の水準とは無関係であった（図１２Ａ−１２Ｄおよび１３Ａ−１３Ｃ；表７−１０）。
【０１０３】
〔ストロマ補充剤培養条件〕
ＳＳ培地は濃度依存方法でＭＳＣｓによるいくつかのサイトカインの発現を増加した。図１４はＧＭ−ＣＦＳの発現に関してＩＬ−１αの増加する濃度に対する第２継代ＭＳＣｓの２４時間応答を図解する。０．１−１０．０Ｕ／ｍｌの間での培養培地でＩＬ−１αの水準が増加するにつれてＭＳＣｓによるＧＭ−ＣＳＦ分泌の水準に線形に近い増加が存在する。培養培地へのＩＬ−１αでの追加のログの増加はＧＭ−ＣＳＦ発現での追加の増加を殆どもたらさない。これらのデータは下記に記載される実験で培養培地に補充するＩＬ−１αの濃度を確認するために使用された。以下続くすべての検定に対し、ＩＬ−１α、１０Ｕ／ｍｌが培養培地に加えられた。
【０１０４】
ＩＬ−１α、１０Ｕ／ｍｌを補充された培養培地は、構造性培養拡張培地で培養される細胞と関連し統計的に有意な上向き調節をＧ−ＣＳＦ（ｐ＜．０５）、Ｍ−ＣＳＦ（ｐ＜０．０２）、ＬＩＦ（ｐ＜０．０２）、ＩＬ−６（ｐ＜０．０１）およびＩＬ−１１（ｐ＜０．０６）の発現で誘導した。加えてＩＬ−１αは構造性培養拡張培地で検出されなかったＧＭ−ＣＳＦの発現を誘導した。対照的にＩＬ−１αは構造性培養拡張培地条件の下での発現の水準に関連してＳＣＦの発現には何らの統計的に有意な作用をもたらさなかった。ＩＬ−１αに応じる倍増はサイトカインに依存して変化した。ＩＬ−６（２５．１＋／−１３．４倍増加）が最大の範囲で刺激され、次いでＬＩＦ（９．２±６．９倍）、Ｍ−ＣＳＦ（５．２±１．７倍）およびＩＬ−１１（４．９±３．３倍）の順となった。Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの平均倍増は計算されなかった。というのはこれらのサイトカインがあるものあるいはすべての構造性培養拡張培地で検出されなかったためであった。
【０１０５】
検討
この研究におけるＭＳＣｓについての我々の継続した分析は追加の表現型特性を確認し、ＭＳＣｓが分化あるいは表現型調整を生じさせる調節分子に露出された時にこの表現型がいかに変化するかを決定することを意図したものである。この研究において、我々は構造性培養拡張条件下で、またＯＳあるいはＳＳの存在下でＭＳＣｓのサイトカイン発現を特徴付けるためにエリザ検定を使用した。
【０１０６】
ＭＳＣｓは構造性培養拡張条件下でＧ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＳＣＦ，ＬＩＦ，ＬＩ−６およびＬＩ−１１を含むサイトカインのユニークプロファイルを発現する。それはこれらの条件下ではＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３、およびＴＧＦ−β２  を発現しない。ＯＳはＬＩＦ，ＩＬ−６およびＩＬ−１１の発現を下向き調節するが、構造性培養条件下で発現された他のサイトカインの発現に影響しない。ＯＳはこの研究で検定されたいずれかのサイトカインの発現を上向きに調節することが観察されなかった。対照的にＳＳはＧ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＬＩＦ，ＩＬ−６およびＩＬ−１１の発現を上向き調節し、また構造性培養拡張条件下で検出されなかったＧＭ−ＣＳＦの発現を誘導する。ＳＳはＳＣＦ発現に影響を与えなかったし、またこの研究で検定されたいずれかのサイトカインを下向き調節することが観察されなかった。これらのデータを通じてＭＳＣｓを他の間葉表現型から区別するのに役立ち得るユニークなサイトカイン発現プロファイルが生成された。サイトカインプロファイルの確認は、これらの細胞が造血を支持する誘導的かつ調節的情報を提供する骨髄の微環境で果たす役割を決定する手がかりを提供するに違いない。加えて、ＯＳおよびＳＳに対応するこのサイトカインにおける変更は、ＭＳＣＳ が調節分子に対応して分化しその表現型を調節するようにその発現の水準が変化する特異的なサイトカインを確認する。
【０１０７】
炎症応答中に各種の細胞型による骨髄微環境で放出されるＩＬ−１αは、果粒細胞（Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）、単核細胞／破骨細胞（ＧＭ−ＣＳＦ，ＬＩＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＩＬ−６）および骨髄巨核球（ＩＬ−１１）などの分化を支持するサイトカインの発現を上向き調節するＭＳＣｓを誘導する。ＩＬ−１αは骨髄を放射性消耗あるいは血液消耗から保護することが示されている。ＭＳＣｓによるサイトカイン発現のＩＬ−１α誘導上向き調節はＩＬ−１αの保護作用の機構で役割を果たすものと思われる。
【０１０８】
ＭＳＣｓを骨芽細胞に分化するよう誘導するデキサメタゾンは単核細胞／破骨細胞（ＬＩＦ，ＩＬ−６）および骨髄巨核球（ＩＬ−１１）支持サイトカインの発現を弱め、また果粒細胞始原細胞（Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ）を支持するサイトカインの発現に何らの作用ももたらさない。デキサメタゾンにより阻害される３種のサイトカインはそのそれぞれが信号経路でｇｐ１３０を使用するレセプターを通じてその信号を仲介するために重要である。
【０１０９】
引用文献
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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