(57)【要約】【課題】  新規な骨髄線維症治療剤を提供する。【解決手段】  レチノイドを含む、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞用の物質送達担体、および骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を利用した骨髄線維症処置剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイドを標的化剤として含む、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達用担体。
【請求項２】
レチノイド誘導体がレチノールを含む、請求項１に記載の担体。
【請求項３】
レチノイドの含有量が担体全体の０．２〜２０重量％である、請求項１または２に記載の担体。
【請求項４】
リポソームの形態を有し、レチノイドと、リポソームに含まれる脂質とのモル比が８：１〜１：４である、請求項１〜３のいずれかに記載の担体。
【請求項５】
骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を含む、骨髄線維症処置用組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の担体をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物が、ゼラチナーゼＡ、ゼラチナーゼＢおよびアンギオテンシノーゲンからなる群から選択される生理活性物質の活性または産生阻害剤、細胞活性抑制剤、増殖阻害剤、アポトーシス誘導剤、および、細胞外マトリックス構成分子または該細胞外マトリックス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子の少なくとも１つを標的とするｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
細胞外マトリックス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子がＨＳＰ４７である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
薬物と担体とを、医療の現場またはその近傍で混合してなる、請求項５〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物、レチノイド、ならびに、必要に応じてレチノイド以外の担体構成物質を、単独でまたは組み合わせて含む１つまたはそれ以上の容器を含む、請求項６〜９のいずれかに記載の組成物の調製キット。
【請求項１１】
配列番号１３で表される核酸配列の１１３０〜１１４５位、１４８５〜１５００位、１５０１〜１５１６位、１６５４〜１６７８位および１９５１〜１９７８位から選択される部分を標的とするｓｉＲＮＡ。
【請求項１２】
以下のＡ〜Ｅのセンス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせ：
Ａ：５’−ＵＧＧＡＵＧＧＧＡＡＡＧＡＵＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧ−３’（センス鎖、配列番号：１）と、３’−ＵＡＡＣＣＵＡＣＣＣＵＵＵＣＵＡＣＧＵＣＵＵＣＵＵＣＣ−５’（アンチセンス鎖、配列番号：２）との組み合わせ、
Ｂ：５’−ＵＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＵＡＵＵＵＵＵＡＧＡＣＡＧＡＧ−３’（センス鎖、配列番号：３）と、３’−ＵＡＡＣＡＧＡＣＵＣＡＣＣＣＡＵＡＡＡＡＡＵＣＵＧＵＣ−５’（アンチセンス鎖、配列番号：４）との組み合わせ、
Ｃ：５’−ＧＡＵＧＣＧＡＧＡＵＧＡＧＵＵＧＵＡＧＡＧＵＣＣＡＡＧ−３’（センス鎖、配列番号：５）と、３’−ＵＡＣＵＡＣＧＣＵＣＵＡＣＵＣＡＡＣＡＵＣＵＣＡＧＧＵ−５’（アンチセンス鎖、配列番号：６）との組み合わせ、
Ｄ：５’−ＣＡＧＡＡＣＵＧＣＣＣＡＵＣＣＵＵＡＡＡＡＵＧＡＵＡＧ−３’（センス鎖、配列番号：７）と、３’−ＵＡＧＵＣＵＵＧＡＣＧＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＵＵＡＣＵＡ−５’（アンチセンス鎖、配列番号：８）との組み合わせ、
Ｅ：５’−ＧＡＧＡＣＡＡＧＡＵＧＣＧＡＧＡＵＧＡＧＵＵＧＵＡＡＧ−３’（センス鎖、配列番号：９）と、３’−ＵＡＣＵＣＵＧＵＵＣＵＡＣＧＣＵＣＵＡＣＵＣＡＡＣＡＵ−５’（アンチセンス鎖、配列番号：１０）との組み合わせ、
のいずれかから構成される、請求項１１に記載のｓｉＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞を標的とする物質送達用担体、および、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を利用した骨髄線維症処置剤および骨髄線維症の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄線維症は骨髄に広範なびまん性線維化をきたす疾患の総称であり、原因不明の原発性骨髄線維症と基礎疾患がある二次性骨髄線維症とが含まれる。
原発性骨髄線維症は、全身の骨髄の線維化および肝・脾における髄外造血を伴い、末梢血では幼若な顆粒球と赤芽球が出現する白赤芽球症を認めることを特徴とし、慢性骨髄増殖性疾患に属する。原発性骨髄線維症の本態は、造血幹細胞レベルで生じたＪａｋ２の遺伝子変異を含む遺伝子異常による、モノクローナルな造血細胞の増殖とされている。増殖した造血系細胞（主に巨核球）から産生される種々のサイトカインが骨髄間質細胞に作用して、骨髄の線維化、骨硬化、血管新生など、反応性のポリクローナルな骨髄間質細胞の増殖が生じる。その結果、無効造血、末梢血での涙滴状赤血球の出現、白赤芽球症、髄外造血による巨脾などの特徴的な臨床症状を呈する。
原発性骨髄線維症の約４０％には、サイトカインのシグナル伝達に必須なチロシンキナーゼであるＪａｋ２に遺伝子変異が生じ、その結果Ｊａｋ２がサイトカインの刺激がない状態においても恒常的に活性化されている。Ｊａｋ２以外に、ｃ−ｍｐｌ（トロンボポイエチンのレセプター）に遺伝子変異を有する症例も少数存在する。
現時点では原発性骨髄線維症の薬物療法による治癒は困難とされており、同種造血幹細胞移植が唯一の治癒的治療法となっている。しかし、移植関連死亡率は２５〜４８％と高く、それに伴い、総生存率は５０％前後に留まっている。最近になって、治療関連毒性がより少ない骨髄非破壊的幹細胞移植（ミニ移植）の有用性がクローズアップされているが、未だ少数例の検討しかなされておらず、長期予後も不明である。
薬物療法としては、対症療法にとどまるが、ダナゾール、プリモボランなどのタンパク同化ホルモン、サリドマイド、レナリドマイドなどの血管新生抑制剤、ヒドロキシカルバミド、アナグレリド、イマチニブ、２−クロロデオキシアデノシン、メルファラン、ブスルファン、エトポシドなどの抗腫瘍薬、エリスロポエチンなどの薬剤の、貧血や血小板減少症、脾腫への有効性が示されている（非特許文献１および２参照）。
【０００３】
一方、二次性骨髄線維症は、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性赤血球増加症、原発性血小板血症、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、癌腫、全身性エリマトーデス、全身性進行性硬化症などの疾患や、放射線照射などに続発するものであり、原発性骨髄線維症と同様の骨髄像を示す。二次性骨髄線維症の治療は、基礎疾患の改善に焦点が置かれるが、基礎疾患も根治が困難なものが多く、骨髄線維化自体による悪影響の軽減への要求は強い。
こうした状況を受けて、骨髄線維症治療剤の開発に多大な研究努力が注がれてきた。その結果、例えば、チロシンキナーゼＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆの阻害剤、ＴＧＦ−β可溶性レセプターなどのＴＧＦ−β阻害剤、ボルテゾミブなどのＮＦκＢ阻害剤、デシタビンなどのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、トリコスタチンＡなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ベバシズマブなどのＶＥＧＦ阻害剤（非特許文献１参照）、ある種の抗ヒトリンパ球抗体（特許文献１参照）などの薬剤が、骨髄線維症動物モデルまたは臨床試験においてある程度の成果を収めたことが報告されている。しかしながら、いずれの薬剤も未だ満足できるものではなく、さらなる骨髄線維症治療剤の開発が求められていた。
【０００４】
【特許文献１】特公平８−２７９９号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／０６８２３２号パンフレット
【非特許文献１】Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007;2007:346-54
【非特許文献２】日本内科学会雑誌、第９６巻、第７号、２００７年７月１０日、１３９８〜１４０４頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規な骨髄線維症処置剤および骨髄線維症の処置方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、新たな骨髄線維症治療剤を探求する中で、レチノイドを含む担体に細胞外マトリックス産生阻害剤を担持させた組成物の投与により、骨髄線維症を効果的に処置できることを見出し、本発明を完成させた。
ビタミンＡを含む担体が、ビタミンＡを貯蔵する星細胞に薬物を送達することは知られていたが（特許文献２参照）、骨髄線維症との関係についてはこれまで全く知られておらず、また、細胞外マトリックス産生阻害剤を有効成分とする組成物により骨髄線維症を処置できるとの報告もなされていなかったため、今回の知見は驚くべきものである。
【０００７】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）レチノイドを標的化剤として含む、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達用担体。
（２）レチノイド誘導体がレチノールを含む、（１）の担体。
（３）レチノイドの含有量が担体全体の０．２〜２０重量％である、（１）または（２）の担体。
（４）リポソームの形態を有し、レチノイドと、リポソームに含まれる脂質とのモル比が８：１〜１：４である、（１）〜（３）の担体。
（５）骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を含む、骨髄線維症処置用組成物。
（６）（１）〜（４）の担体をさらに含む、（５）の組成物。
（７）骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物が、ゼラチナーゼＡ、ゼラチナーゼＢおよびアンギオテンシノーゲンからなる群から選択される生理活性物質の活性または産生阻害剤、細胞活性抑制剤、増殖阻害剤、アポトーシス誘導剤、および、細胞外マトリックス構成分子または該細胞外マトリックス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子の少なくとも１つを標的とするｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、（５）または（６）の組成物。
（８）細胞外マトリックス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子がＨＳＰ４７である、（７）の組成物。
（９）薬物と担体とを、医療の現場またはその近傍で混合してなる、（５）〜（８）の組成物。
（１０）骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物、レチノイド、ならびに、必要に応じてレチノイド以外の担体構成物質を、単独でまたは組み合わせて含む１つまたはそれ以上の容器を含む、（６）〜（９）の組成物の調製キット。
（１１）配列番号１３で表される核酸配列の１１３０〜１１４５位、１４８５〜１５００位、１５０１〜１５１６位、１６５４〜１６７８位および１９５１〜１９７８位から選択される部分を標的とするｓｉＲＮＡ。
（１２）以下のＡ〜Ｅのセンス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせ：
Ａ：５’−ＵＧＧＡＵＧＧＧＡＡＡＧＡＵＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧ−３’（センス鎖、配列番号：１）と、３’−ＵＡＡＣＣＵＡＣＣＣＵＵＵＣＵＡＣＧＵＣＵＵＣＵＵＣＣ−５’（アンチセンス鎖、配列番号：２）との組み合わせ、
Ｂ：５’−ＵＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＵＡＵＵＵＵＵＡＧＡＣＡＧＡＧ−３’（センス鎖、配列番号：３）と、３’−ＵＡＡＣＡＧＡＣＵＣＡＣＣＣＡＵＡＡＡＡＡＵＣＵＧＵＣ−５’（アンチセンス鎖、配列番号：４）との組み合わせ、
Ｃ：５’−ＧＡＵＧＣＧＡＧＡＵＧＡＧＵＵＧＵＡＧＡＧＵＣＣＡＡＧ−３’（センス鎖、配列番号：５）と、３’−ＵＡＣＵＡＣＧＣＵＣＵＡＣＵＣＡＡＣＡＵＣＵＣＡＧＧＵ−５’（アンチセンス鎖、配列番号：６）との組み合わせ、
Ｄ：５’−ＣＡＧＡＡＣＵＧＣＣＣＡＵＣＣＵＵＡＡＡＡＵＧＡＵＡＧ−３’（センス鎖、配列番号：７）と、３’−ＵＡＧＵＣＵＵＧＡＣＧＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＵＵＡＣＵＡ−５’（アンチセンス鎖、配列番号：８）との組み合わせ、
Ｅ：５’−ＧＡＧＡＣＡＡＧＡＵＧＣＧＡＧＡＵＧＡＧＵＵＧＵＡＡＧ−３’（センス鎖、配列番号：９）と、３’−ＵＡＣＵＣＵＧＵＵＣＵＡＣＧＣＵＣＵＡＣＵＣＡＡＣＡＵ−５’（アンチセンス鎖、配列番号：１０）との組み合わせ、
のいずれかから構成される、（１１）のｓｉＲＮＡ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の骨髄線維症処置用組成物の正確な作用機序は未だ完全には解明されていないが、レチノイドが、骨髄線維芽細胞などの骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への標的化剤として機能し、有効成分、例えば骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物等を同細胞に送達することにより、抗骨髄線維症効果を奏するものと考えられる。
本発明の担体により、有効成分を作用部位、さらには標的細胞に効率的に送達できるため、骨髄線維症、特にこれまで治療が困難であった原発性骨髄線維症などの治癒、進行の抑制または発症の予防が可能となり、ヒト医療および獣医療への貢献は極めて大きい。
さらに、本発明の組成物は、これまで骨髄線維症への有効性が知られていなかった細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を有効成分として含むものであるため、従来とは異なる作用機序で骨髄線維症を処置することが可能となり、従来の作用機序の薬剤では効果がなかった病態の改善や、これら従来の薬剤との併用による治療効果の向上が期待できる。
また、本発明の担体は、任意の薬剤（例えば、既存の骨髄線維症治療薬）と組み合わせてその作用効率を高めることができるため、製剤的な応用範囲が広く、効果的な処置剤の製造を簡便に行うことができるという利点もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、レチノイドを標的化剤として含む、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達用担体に関する。
本発明において、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞は、骨髄に存在する細胞外マトリックス産生能を有する細胞であれば特に限定されないが、典型的には骨髄線維芽細胞を含む。骨髄線維芽細胞はα−ＳＭＡ（α平滑筋アクチン）の発現を特徴としている。本発明における骨髄線維芽細胞は、検出可能に標識された抗α−ＳＭＡ抗体を用いた免疫染色などによって同定されるものである。
【００１０】
本発明におけるレチノイドは、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達を促進するものであれば特に限定されず、例えばレチノール（ビタミンＡ）、エトレチナート、トレチノイン、イソトレチノイン、アダパレン、アシトレチン、タザロテン、パルミチン酸レチノールなどのレチノイド誘導体、およびフェンレチニド（４−ＨＰＲ）、ベキサロテンなどのビタミンＡアナログを用いることができる。
本発明におけるレチノイドは、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への特異的な物質送達を促進するものである。レチノイドによる物質送達促進の機構は未だ完全には解明されていないが、例えば、ＲＢＰ（retinol binding protein）と特異的に結合したレチノイドが、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の細胞表面上に位置するある種のレセプターを介して同細胞に取り込まれることが考えられる。
レチノイドは、４個のイソプレノイド単位がヘッド−トゥー−テイル式に連結した骨格を持つ化合物の群の１員であり（G. P. Moss, “Biochemical Nomenclature and Related Documents,” 2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251（1992）参照）、ビタミンＡは、レチノールの生物学的活性を定性的に示すレチノイドの一般的な記述子である。本発明において用いることができるレチノイドとしては、特に限定されず、例えばレチノール、レチナール、レチノイン酸、レチノールと脂肪酸とのエステル、脂肪族アルコールとレチノイン酸とのエステル、エトレチナート、トレチノイン、イソトレチノイン、アダパレン、アシトレチン、タザロテン、パルミチン酸レチノールなどのレチノイド誘導体、およびフェンレチニド（４−ＨＰＲ）、ベキサロテンなどのビタミンＡアナログを挙げることができる。
これらのうち、レチノール、レチナール、レチノイン酸、レチノールと脂肪酸とのエステル（例えばレチニルアセテート、レチニルパルミテート、レチニルステアレート、およびレチニルラウレートなど）および脂肪族アルコールとレチノイン酸とのエステル（例えばエチルレチノエートなど）は、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への特異的な物質の送達の効率の点で好ましい。
レチノイドのシス−トランスを含む異性体全ては、本発明の範囲内に入る。レチノイドはまた１または２以上の置換基で置換されることもある。本発明におけるレチノイドは、単離された状態のものはもちろんのこと、これを溶解または保持することができる媒体に溶解または混合した状態のレチノイドをも含む。
【００１１】
本発明の担体は、これらのレチノイド自体で構成してもよいし、レチノイドを、これとは別の担体構成成分に結合または包含させることにより構成してもよい。したがって、本発明の担体は、レチノイド以外の担体構成成分を含んでいてもよい。かかる成分としては、特に限定されずに、医薬および薬学の分野で知られる任意のものを用いることができるが、レチノイドを包含し得るか、または、これと結合し得るものが好ましい。
このような成分としては、脂質、例えば、グリセロリン脂質などのリン脂質、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質、コレステロールなどのステロール、大豆油、ケシ油などの植物油、鉱油、卵黄レシチンなどのレシチン類等が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、リポソームを構成し得るもの、例えば、レシチンなどの天然リン脂質、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）などの半合成リン脂質、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、コレステロールなどが好ましい。
【００１２】
特に好ましい成分としては、細網内皮系による捕捉を回避し得る成分、例えば、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４）などのカチオン性脂質が挙げられる。
【００１３】
本発明の担体へのレチノイドの結合または包含は、化学的および／または物理的な方法によってレチノイドを担体の他の構成成分に結合させるかまたは包含させることによっても可能となる。あるいは、本発明の担体へのレチノイドの結合または包含は、該担体の作製時に、レチノイドと、それ以外の担体構成成分とを混合することによっても可能となる。本発明の担体に結合させるかまたは包含させるレチノイドの量は、担体構成成分中の重量比で０．０１％〜１００％、好ましくは０．２％〜２０％、さらに好ましくは１〜５％とすることが可能である。担体へのレチノイドの結合または包含は、該担体に薬物等を担持させる前に行ってもよいし、担体、レチノイド誘導体等および薬物等を同時に混合することなどによって行ってもよいし、または、薬物等を既に担持した状態の担体と、レチノイド誘導体等とを混合することなどによって行ってもよい。したがって、本発明はまた、既存の任意の薬物結合担体や薬物封入担体、例えば、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標）、Ｄｏｘｉｌ、Ｃａｅｌｙｘ（登録商標）、Ｍｙｏｃｅｔ（登録商標）などのリポソーム製剤にレチノイドを結合させる工程を含む、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞特異的な製剤の製造方法にも関する。
【００１４】
本発明の担体の形態は、所望の物質や物体を、標的とする骨髄における細胞外マトリックス産生細胞に運搬できればいずれの形態でもよく、例えば、限定するものではないが、高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、微小球、ナノ小球などのうちいずれの形態をとることもできる。本発明においては、送達効率の高さ、送達できる物質の選択肢の広さや製剤の容易性等の観点から、これらのうちリポソームの形態が好ましく、中でもカチオン性脂質を含むカチオン性リポソームが特に好ましい。担体がリポソームの形態である場合、レチノイドと、これ以外のリポソーム構成脂質とのモル比は、レチノイドの担体への結合または包含の効率性を考慮すると、好ましくは８：１〜１：４、より好ましくは４：１〜１：２、さらに好ましくは３：１〜１：１、特に２：１である。
【００１５】
本発明の担体は、これに含まれるレチノイドが、標的化剤として機能する態様で存在していれば、運搬物を内部に含んでも、運搬物の外部に付着して存在しても、また、運搬物と混合されていてもよい。ここで、標的化剤として機能するとは、レチノイドを含む担体が、これを含まない担体よりも迅速かつ／または大量に、標的細胞である骨髄における細胞外マトリックス産生細胞に到達し、かつ／または取り込まれることを意味し、これは、例えば、標識を付した、または標識を含む担体を標的細胞の培養物に添加し、所定時間後に標識の存在部位を分析することにより容易に確認することができる。構造的には、例えば、レチノイドが、遅くとも標的細胞に到達するまでに、担体を含む製剤の外部に少なくとも部分的に露出していれば、上記要件を充足し得る。レチノイドが、製剤の外部に露出しているか否かは、製剤をレチノイドと特異的に結合する物質、例えば、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）などと接触させ、製剤への結合を調査することにより評価することができる。
【００１６】
本担体が送達する物質や物体は特に制限されないが、投与部位から標的細胞が存在する病変部位へ、生物の体内を物理的に移動できるような大きさであることが好ましい。したがって、本発明の担体は、原子、分子、化合物、タンパク質、核酸等の物質はもとより、ベクター、ウイルス粒子、細胞、１以上の要素で構成された薬物放出システム、マイクロマシン等の物体をも運搬することができる。前記物質または物体は、好ましくは標的細胞に何らかの影響を与える性質を有し、例えば、標的細胞を標識するものや、標的細胞の活性または増殖を制御する（例えば、これを増強または抑制する）ものを含む。
【００１７】
したがって、本発明の一態様においては、担体が送達する物は「骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物」である。ここで、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性とは、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞が示す分泌、取り込み、遊走等の種々の活性を指すが、本発明においては、典型的に、これらのうち特に骨髄線維症の発症、進行および／または再発などに関与する活性を意味する。かかる活性としては、例えば、限定することなく、ゼラチナーゼＡおよびＢ（それぞれＭＭＰ２および９）、アンギオテンシノーゲン等の生理活性物質、コラーゲン、プロテオグリカン、テナスチン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、オステオネクチン、エラスチン等の細胞外マトリックス成分などの産生・分泌などの産生・分泌が挙げられる。
【００１８】
したがって、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とは、骨髄線維症の発症、進行および／または再発に関係する同細胞の物理的、化学的および／または生理的な作用等を直接または間接に抑制する何れの薬物であってもよく、限定されずに、上記生理活性物質の活性もしくは産生を阻害する薬物、バチマスタットなどのＭＭＰ阻害剤、および前記生理活性物質を中和する抗体および抗体断片、前記生理活性物質の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む）などの物質、もしくはドミナントネガティブ変異体等のドミナントネガティブ効果を有する物質、またはこれらを発現するベクター、上記細胞外マトリックス成分などの産生・分泌を阻害する薬物、例えば、細胞外マトリックス成分の発現を抑制する、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む）などの物質、もしくはドミナントネガティブ変異体等のドミナントネガティブ効果を有する物質、またはこれらを発現するベクター、ナトリウムチャンネル阻害剤などの細胞活性抑制剤、アルキル化剤（例えば、イホスファミド、ニムスチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等）、抗腫瘍性抗生物質（例えば、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ等）、代謝拮抗剤（例えば、ゲムシタビン、エノシタビン、シタラビン、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等）、エトポシド、塩酸イリノテカン、酒石酸ビノレルビン、ドセタキセル水和物、パクリタキセル、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン等のアルカロイド、およびカルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン等の白金錯体などの細胞増殖抑制剤、ならびにcompound 861、gliotoxin、ロバスタチン、Beractantなどのアポトーシス誘導剤を包含する。また、本発明における「骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物」は、骨髄線維症の発症、進行および／または再発の抑制に直接または間接に関係する骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の物理的、化学的および／または生理的な作用等を直接または間接に促進する何れの薬物であってもよい。
本発明における「骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物」のうち、好ましいのは、コラーゲン、プロテオグリカン、テナスチン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、オステオネクチン、エラスチン等の細胞外マトリックス成分の産生・分泌を阻害する薬物であり、特に好ましくはＨＳＰ４７（Heat Shock Protein（熱ショックタンパク質）47）の阻害剤、とりわけＨＳＰ４７に対するｓｉＲＮＡである。
【００１９】
本発明の担体の送達物としてはまた、限定されずに、骨髄線維症の発症、進行および／もしくは再発および／または症状を抑制する上記以外の薬物、例えば、限定することなく、ダナゾール、プリモボランなどのタンパク同化ホルモン、サリドマイド、レナリドマイドなどの血管新生抑制剤、ヒドロキシカルバミド、アナグレリド、イマチニブ、２−クロロデオキシアデノシン、メルファラン、ブスルファン、エトポシドなどの抗腫瘍薬、エリスロポエチン、チロシンキナーゼＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆの阻害剤、ＴＧＦ−β可溶性レセプターなどのＴＧＦ−β阻害剤、ボルテゾミブなどのＮＦκＢ阻害剤、デシタビンなどのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、トリコスタチンＡなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ベバシズマブなどのＶＥＧＦ阻害剤、特許文献１に記載の抗ヒトリンパ球抗体などを挙げることができる。
本発明の担体が送達する物質や物体は、標識されていてもいなくてもよい。標識化により、運搬の成否や、標的細胞の増減などをモニタリングすることが可能となり、特に試験・研究レベルにおいて有用である。標識は、当業者に公知な任意のもの、例えば、任意の放射性同位体、磁性体、標識化物質に結合する物質（例えば抗体）、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、および酵素などから選択することができる。
本発明において「骨髄における細胞外マトリックス産生細胞用」または「骨髄における細胞外マトリックス産生細胞送達用」とは、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞を標的細胞として使用するのに適することを意味し、これは例えば、同細胞に、他の細胞、例えば正常細胞よりも迅速、高効率かつ／または大量に物質を送達できることを含む。例えば、本発明の担体は、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞に、他の細胞に比べ、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、さらには３倍以上の速度および／または効率で物質を送達することができる。
【００２０】
本発明はまた、前記骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を含む、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御するための、または骨髄線維症を処置するための組成物、ならびに、前記骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物の、これらの組成物の製造への使用に関する。上記薬物は組成物中に単独で含まれても、薬学的に許容し得る担体とともに含まれてもよい。本発明の組成物は、標的となる、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への効率的な送達のために、同細胞に標的化されていてもよい。標的化は、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞、例えば骨髄線維芽細胞への本発明の組成物の送達を促進するものであれば特に限定されず、例えば、レチノイドの付加を含む。したがって、本発明の組成物の好ましい態様は、レチノイドを標的化剤として含むものであり、さらに好ましくは、上述のレチノイドを標的化剤として含む担体を含むものである。
【００２１】
本発明において骨髄線維症は、原発性骨髄線維症のみならず、二次性骨髄線維症も含む。二次性骨髄線維症は、限定されずに、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性赤血球増加症、原発性血小板血症、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、癌腫、全身性エリマトーデス、全身性進行性硬化症などの疾患や、放射線照射などに続発するものを含む。
本発明における骨髄線維症は、当該技術分野で知られた任意の手法により診断することができる。骨髄線維症の最も特徴的な病態は骨髄の線維化であり、これは、骨髄穿刺で骨髄液を採取できないこと（dry tap）によりある程度判断することができる。確定診断は、骨髄生検により、骨髄の線維化および／または骨梁の増加を確認することにより行う（図１参照）。原発性骨髄線維症では、このほか、貧血、肝脾腫、末梢血における白赤芽球症、涙滴赤血球などの奇形赤血球、芽球、巨大血小板、巨核球の出現、血清ＬＤＨの上昇、骨髄シンチグラフィによる肝脾への取り込みの増加、時に出血傾向、腹部膨満感、発熱、全身倦怠感、体重減少などを認め得る。また、二次性骨髄線維症については、基礎疾患の症状が前面に出てくる場合が多い。基礎疾患の具体的症状は、当業者によく知られている。
【００２２】
本発明の組成物においては、担体に含まれるレチノイドが標的化剤として機能する態様で存在する限り、担体は、送達物をその内部に含んでも、送達物の外部に付着して存在しても、また、送達物と混合されていてもよい。したがって、投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記組成物を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
本発明の組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、肺内、気道内、気管内、気管支内、経鼻、直腸内、動脈内、門脈内、心室内、骨髄内、リンパ節内、リンパ管内、脳内、髄液腔内、脳室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年などを参照）。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
【００２３】
本発明の組成物は、骨髄線維症を治癒し得る、または、その発症、進行および／もしくは再発および／または症状を軽減し得る１種または２種以上の任意の他の薬剤を含んでも、また、かかる薬剤と併用してもよい。かかる薬剤としては、限定されずに、例えば、ダナゾール、プリモボランなどのタンパク同化ホルモン、サリドマイド、レナリドマイドなどの血管新生抑制剤、ヒドロキシカルバミド、アナグレリド、イマチニブ、２−クロロデオキシアデノシン、メルファラン、ブスルファン、エトポシドなどの抗腫瘍薬、エリスロポエチン、チロシンキナーゼＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆの阻害剤、ＴＧＦ−β可溶性レセプターなどのＴＧＦ−β阻害剤、ボルテゾミブなどのＮＦκＢ阻害剤、デシタビンなどのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、トリコスタチンＡなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ベバシズマブなどのＶＥＧＦ阻害剤、特許文献１に記載の抗ヒトリンパ球抗体などが含まれる。併用する場合には、本発明の組成物を、上記他の薬剤と同時に、これより前に、または、これより後に投与することができる。投与経路は、同一であっても、異なってもよい。例えば、本発明の組成物を非経口的に投与する一方、他の薬剤を経口投与するなどしてもよい。
【００２４】
本発明の担体または組成物は、いずれの形態で供給されてもよいが、保存安定性の観点から、好ましくは用時調製可能な形態、例えば、医療の現場またはその近傍において、医師および／または薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供される。この場合、本発明の担体または組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個または２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。
【００２５】
したがって、本発明はまた、レチノイド、および／または送達物、および／またはレチノイド以外の担体構成物質を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む担体もしくは組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される担体または組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の担体および組成物の調製方法や投与方法などに関する説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体などを含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の担体または組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本発明のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
【００２６】
本発明はさらに、前記組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御するための、または骨髄線維症を処置するための方法に関する。ここで、有効量とは、例えば、後者については、骨髄線維症の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、骨髄線維症の発症および再発を予防し、またはこれを治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、担体に含まれるレチノイド、および本発明の方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。
【００２７】
本発明の方法において投与する組成物の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、肺内、気道内、気管内、気管支内、経鼻、直腸内、動脈内、門脈内、心室内、骨髄内、リンパ節内、リンパ管内、脳内、髄液腔内、脳室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる組成物の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間に数回（例えば、１週間に２、３、４回など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
【００２８】
本発明の方法において、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、骨髄線維症の処置が企図される場合には、典型的には骨髄線維症に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。例えば、原発性骨髄線維症の予防が意図される場合は、限定することなく、Ｊａｋ２および／またはｃ−ｍｐｌに遺伝子変異を有する対象が、また、二次性骨髄線維症の予防が意図される場合は、限定することなく、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性赤血球増加症、原発性血小板血症、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、癌腫、全身性エリマトーデス、全身性進行性硬化症などの疾患に罹患した対象や、放射線照射などを受けた対象がそれぞれ典型例となる。
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、骨髄線維症の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、骨髄線維症発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００２９】
本発明はまた、上記担体を利用した、骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への薬物送達方法に関する。この方法は、限定されずに、例えば、上記担体に送達物を担持させる工程と、送達物を担持した担体を骨髄における細胞外マトリックス産生細胞を含む生物や媒体、例えば培養培地などに投与または添加する工程とを含む。これらの工程は、公知の任意の方法や、本明細書中に記載された方法などに従って適宜達成することができる。上記送達方法はまた、別の送達方法、例えば、骨髄を標的とする他の送達方法などと組み合わせることもできる。また、上記方法は、in vitroでなされる態様も、体内の骨髄における細胞外マトリックス産生細胞を標的とする態様も含む。
【００３０】
本発明はまた、マウスＨＳＰ４７に対する新規なｓｉＲＮＡ、好ましくは配列番号１３の１１３０〜１１４５位、１４８５〜１５００位、１５０１〜１５１６位、１６５４〜１６７８位および１９５１〜１９７８位から選択される部分を標的とするものに関する。遺伝子発現抑制のために、当該遺伝子の特定の領域に対するｓｉＲＮＡを設計および作製する方法は当該技術分野で知られているが、遺伝子のどの部分を標的にすべきかを予測することは一般的に不可能であり、実験的に確認していくほかない。本発明においては、そのＨＳＰ４７発現抑制効果の強さから、配列番号１３の１５０１〜１５１６位を標的とするｓｉＲＮＡ、および１９５１〜１９７８位を標的とするｓｉＲＮＡが好ましい。本発明の新規ｓｉＲＮＡのいくつかの好ましい例は、以下のセンス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせから構成される。
配列Ａ：５’−ＵＧＧＡＵＧＧＧＡＡＡＧＡＵＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧ−３’（センス、配列番号：１）と、３’−ＵＡＡＣＣＵＡＣＣＣＵＵＵＣＵＡＣＧＵＣＵＵＣＵＵＣＣ−５’（アンチセンス、配列番号：２）との組み合わせ。
配列Ｂ：５’−ＵＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＵＡＵＵＵＵＵＡＧＡＣＡＧＡＧ−３’（センス、配列番号：３）と、３’−ＵＡＡＣＡＧＡＣＵＣＡＣＣＣＡＵＡＡＡＡＡＵＣＵＧＵＣ−５’（アンチセンス、配列番号：４）との組み合わせ。
配列Ｃ：５’−ＧＡＵＧＣＧＡＧＡＵＧＡＧＵＵＧＵＡＧＡＧＵＣＣＡＡＧ−３’（センス、配列番号：５）と、３’−ＵＡＣＵＡＣＧＣＵＣＵＡＣＵＣＡＡＣＡＵＣＵＣＡＧＧＵ−５’（アンチセンス、配列番号：６）との組み合わせ。
配列Ｄ：５’−ＣＡＧＡＡＣＵＧＣＣＣＡＵＣＣＵＵＡＡＡＡＵＧＡＵＡＧ−３’（センス、配列番号：７）と、３’−ＵＡＧＵＣＵＵＧＡＣＧＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＵＵＡＣＵＡ−５’（アンチセンス、配列番号：８）との組み合わせ。
配列Ｅ：５’−ＧＡＧＡＣＡＡＧＡＵＧＣＧＡＧＡＵＧＡＧＵＵＧＵＡＡＧ−３’（センス、配列番号：９）と、３’−ＵＡＣＵＣＵＧＵＵＣＵＡＣＧＣＵＣＵＡＣＵＣＡＡＣＡＵ−５’（アンチセンス、配列番号：１０）との組み合わせ。
これらのうち、配列ＣおよびＤが、そのＨＳＰ４７発現抑制効果の強さから特に好ましい。
【００３１】
本発明のｓｉＲＮＡは、天然型のＲＮＡ構造を有していてもよいが、生体内安定性の向上や、標的配列との結合性の改善などを目的とする種々の修飾を有していてもよい。かかる修飾としては、限定されずに、末端のアミノ基、チオール基、コレステロール、長鎖アルキル、糖鎖、ペプチド等による修飾、脱塩基部位の形成、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、糖の２’位が修飾されたヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ修飾ヌクレオチド等の修飾核酸の導入などが含まれる。
本発明のｓｉＲＮＡは、マウスにおけるＨＳＰ４７の発現抑制、および、これに伴うコラーゲンの生成抑制に極めて有用であり、特にマウスを用いた研究、実験、試験などに好適に用いることができる。
【実施例】
【００３２】
実施例１  骨髄線維症モデルマウスにおける病態の確認
骨髄線維症のモデルマウスとして、下田和哉博士と原田実根博士が開発したトロンボポイエチン（ＴＰＯ）トランスジェニックマウス（以下、ＴＰＯマウスとも記す（Leukemia Research 29: 761-769, 2005参照））を用いた。本マウスは、ＴＰＯ遺伝子導入細胞からＴＰＯが過剰に産生されるため、骨髄中の巨核球が増多し、増多した巨核球からトランスフォーミング増殖因子β（transforming growth factor-beta、TGF-beta）が過剰に産生され、これが骨髄線維芽細胞を刺激し、線維芽細胞からのコラーゲン分泌を促進して骨髄線維化が起きる（図２参照）。
ＴＰＯマウス（九州大学実験施設部より供与）を通常の飼育条件で飼育し、生後４、７、９または１２ヶ月でマウスを安楽死させ、骨髄を採取して組織標本を作製し、ヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色、ギッター（Ｇｉｔｔｅｒ）染色、または、アザン（Ａｚａｎ）染色でそれぞれ染色し、光学顕微鏡にて骨髄像を観察した。結果を図３〜５に示す。
【００３３】
生後４カ月（４Ｍ）では、骨髄の線維化を全く認めなかったが、生後７カ月（７Ｍ）では、骨梁の肥厚は明らかではないものの（ＨＥ）、細網線維の増生（Ｇｉｔｔｅｒ）とコラーゲンの沈着（Ａｚａｎ）が認められた（図３参照）。
生後９カ月（９Ｍ）および生後１２カ月（１２Ｍ）では、ともに骨梁の肥厚は著明であり（ＨＥ）、細網線維の増生（Ｇｉｔｔｅｒ）とコラーゲンの沈着（Ａｚａｎ）を認めた。なお、１２Ｍでは９Ｍに比べて骨髄線維化と骨梁肥厚が進行（増悪）していた（図４参照）
ＴＰＯマウスの骨髄ＨＥ標本においては、生後９カ月（９Ｍ）から骨梁の肥厚が始まり、生後１２カ月（１２Ｍ）ではさらに骨梁肥厚が増悪していた（図５参照）。
以上のとおり、ＴＰＯマウスにおいて、骨髄線維症の症状が発現することが確認された。
【００３４】
実施例２  ｓｉＲＮＡの作製
骨髄における細胞外マトリックス産生細胞の活性を抑制する薬物として、マウスＨＳＰ４７を標的とするｓｉＲＮＡ（ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ）を作製した。具体的には、以下の配列を有する５種類のＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ（ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ａ〜Ｅ）とＲａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡとを作製し、以後の実験に用いた。なお、ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡは、株式会社ｉＧＥＮＥ（東京）から購入した（ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡのターゲット配列は２００６年１１月登録のデータベースRefseq（GenBank Accession No. NM_009825）からデザインした）。Ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡも、株式会社ｉＧＥＮＥから購入した（商品名：dsRNA scramble）。
ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ａ：５’−ＵＧＧＡＵＧＧＧＡＡＡＧＡＵＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧ−３’（センス、配列番号：１）
３’−ＵＡＡＣＣＵＡＣＣＣＵＵＵＣＵＡＣＧＵＣＵＵＣＵＵＣＣ−５’（アンチセンス、配列番号：２）
ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｂ：５’−ＵＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＵＡＵＵＵＵＵＡＧＡＣＡＧＡＧ−３’（センス、配列番号：３）
３’−ＵＡＡＣＡＧＡＣＵＣＡＣＣＣＡＵＡＡＡＡＡＵＣＵＧＵＣ−５’（アンチセンス、配列番号：４）
ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｃ：５’−ＧＡＵＧＣＧＡＧＡＵＧＡＧＵＵＧＵＡＧＡＧＵＣＣＡＡＧ−３’（センス、配列番号：５）
３’−ＵＡＣＵＡＣＧＣＵＣＵＡＣＵＣＡＡＣＡＵＣＵＣＡＧＧＵ−５’（アンチセンス、配列番号：６）
ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄ：５’−ＣＡＧＡＡＣＵＧＣＣＣＡＵＣＣＵＵＡＡＡＡＵＧＡＵＡＧ−３’（センス、配列番号：７）
３’−ＵＡＧＵＣＵＵＧＡＣＧＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＵＵＡＣＵＡ−５’（アンチセンス、配列番号：８）
ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｅ：５’−ＧＡＧＡＣＡＡＧＡＵＧＣＧＡＧＡＵＧＡＧＵＵＧＵＡＡＧ−３’（センス、配列番号：９）
３’−ＵＡＣＵＣＵＧＵＵＣＵＡＣＧＣＵＣＵＡＣＵＣＡＡＣＡＵ−５’（アンチセンス、配列番号：１０）
Ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡ：５’−ＣＧＡＵＵＣＧＣＵＡＧＡＣＣＧＧＣＵＵＣＡＵＵＧＣＡＧ−３’（センス、配列番号：１１）
３’−ＵＡＧＣＵＡＡＧＣＧＡＵＣＵＧＧＣＣＧＡＡＧＵＡＡＣＧ−５’（アンチセンス、配列番号：１２）
また、蛍光色素６’−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）を５’側に標識したｓｉＲＮＡも作製した。
【００３５】
実施例３  ＴＰＯマウスの初代培養骨髄線維芽細胞の性質
４〜６週齢のＴＰＯマウスの骨髄細胞を１５％のウシ胎仔血清（fetal calf serum、ＦＣＳ）を添加したＭＥＭ（Minimum Essential Medium Eagle、Sigma社）で４週間培養して初代培養の骨髄線維芽細胞を得た。図６に倒立顕微鏡で観察した細胞形態を示すが、細胞は線維芽細胞として典型的な紡錘形をしていた。図７に間葉系細胞のマーカーであるビメンチン（Vimentin）およびαＳＭＡの発現をそれぞれの抗体（anti-Vimentin antibody（Santa Cruz Biotechnology社）、anti-αSMA antibody（Santa Cruz Biotechnology社））を用いたフローサイトメトリーで解析した結果を示すが、両者の発現が認められた。これは、上記培養で得られた細胞が、典型的な骨髄線維芽細胞であることを示すものである。なお、解析に用いたフローサイトメーターはFACS calibur（Becton Dickinson社）であり、測定データはCellQuest software（Becton Dickinson社）を用いて解析した。
【００３６】
実施例４  ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス線維芽細胞株）に対するＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡの効果
１×１０５個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を１０％仔ウシ血清（Calf serum、ＣＳ）を添加したDulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ、Life Technologies社）に浮遊させ、６穴培養プレートに播種した。２４時間後、５０〜６０％コンフルエントになったＮＩＨ３Ｔ３細胞にLipotrust（北海道システム・サイエンス株式会社）を用いてＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。具体的には、２０ｎＭのLipotrustと５０ｎＭのＲａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡまたはＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡをボルテックスで混合したものをトランスフェクションした。トランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、無血清のＯＰＴＩ−ＭＥＭ（GIBCO社）で４時間培養した。このＮＩＨ３Ｔ３細胞をＤＭＥＭで洗浄し、さらに２４時間１０％のＣＳを添加したＤＭＥＭで培養し、タンパク質を抽出した。その後、ウエスタンブロット法でＨＳＰ４７の発現を解析した。すなわち、ＮＩＨ３Ｔ３から抽出したタンパク質を、４／２０  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分画した後、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。まず、ＨＳＰ４７に対する１次抗体（Stressgen社）またはβ-アクチンに対する１次抗体（Cell Signaling Technology社）でプローブし、さらにペルオキシダーゼを結合させた２次抗体（Oncogene Research Product社）でプローブし、最後にＥＣＬ（Amersham Life Science社）を用いて発色させた。
その結果、ＮＩＨ３Ｔ３にＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡを導入後２４時間の時点において、ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−ＣおよびＤがＡ、ＢおよびＥと比較して効果が強いことが明らかとなった（図８のＡ参照）。したがって、以下の実験ではＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡとして、ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−ＣまたはＤを用いた。
【００３７】
実施例５  ＴＰＯマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞に対するＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡの効果
５×１０５個のＴＰＯマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞を１５％のＦＣＳを添加したＭＥＭに浮遊させ、６穴培養プレートに播種した。２４時間後に５０〜６０％コンフルエントになった骨髄線維芽細胞にLipotrustを用いてＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。すなわち、２０ｎＭのLipotrustと５０ｎＭのＲａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡまたは５〜５０ｎＭのＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−ＣもしくはＤをボルテックスで混合したもの、またはこれらをさらに５分後に４０ｎＭのビタミンＡ（レチノール、Sigma社）とボルテックスで混合したものをトランスフェクションした。ビタミンＡ結合またはビタミンＡ非結合リポソームＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした骨髄線維芽細胞を、無血清のＯＰＴＩ−ＭＥＭで４時間培養した。その後、この骨髄線維芽細胞をＭＥＭで洗浄し、１５％のＦＣＳを添加したＭＥＭでさらに４８時間培養し、タンパク質を抽出した。また、別な実験では、５０ｎＭのビタミンＡ結合リポソームＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄ（ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄ、以下では、「ビタミンＡ結合」を「ＶＡ」、「リポソーム」を「Ｌｉｐ」とそれぞれ略す）をトランスフェクションした骨髄線維芽細胞を、無血清のＯＰＴＩ−ＭＥＭで４時間培養した後ＭＥＭで洗浄し、１５％のＦＣＳを添加したＭＥＭでさらに２４〜９６時間培養し、タンパク質を抽出した。その後、抽出したタンパク質をウエスタンブロット法でＨＳＰ４７の発現について解析した。すなわち、骨髄線維芽細胞から抽出したタンパク質を、４／２０  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分画した後、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。その後、実施例４と同様に、ＨＳＰ４７またはβ−アクチンに対する１次抗体でプローブし、さらにペルオキシダーゼを結合させた２次抗体でプローブし、最後にＥＣＬを用いて可視化した。結果を図８のＢおよびＣに示す。
【００３８】
初代培養骨髄線維芽細胞を用いた場合、ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｃ（図８のａ）およびＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄ（図８のｂ）は、何れも単独では効果を認めなかったが、ビタミンＡ（ＶＡ）を結合させることで、ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｃ（ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｃ）では５０ｎＭ、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄでは２５ｎＭ以上の濃度で効果が出現することを確認した。つまり、初代培養骨髄線維芽細胞に効率的にＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡを導入するためには、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡを使用する必要があること、および、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｃに比べてＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄの方が、ＨＳＰ４７の抑制効果が強力であることが明らかとなった。したがって、以後の実験には、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄを用いることにした。
また、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄ（５０ｎＭ）の効果持続時間が７２時間であることが明らかとなった（図８のＣ参照）。
【００３９】
実施例６  リポソーム包埋ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ）のＴＰＯマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞への導入に対するビタミンＡ（ＶＡ）の効果
ＴＰＯマウス由来の初代培養骨髄線維芽細胞を１０％のＣＳを添加したＯＰＴＩ−ＭＥＭの培養液中で、１０ｍｇ／ｍｌの抗レチノール結合タンパク質抗体（anti-RBP-Ab、BD Pharmingen社）の存在下または非存在下で５０ｎＭのカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を結合させたＬｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡまたはＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−ＦＡＭまたはＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−ＦＡＭ）を導入し、３０分後にフローサイトメトリー法で解析した。導入した細胞の平均蛍光強度（mean fluorescence intensity、ＭＦＩ）はFACS caliburで測定し、CellQuest software（Becton Dickinson社）で解析した。５×１０５個のＴＰＯマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞を６穴培養プレートに播種した。２４時間後に、５０ｎＭのＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−ＦＡＭまたはＬｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−ＦＡＭを添加した。これらの細胞を１０％のＦＣＳが添加されたＯＰＴＩ−ＭＥＭで３０分間培養した。その後、これらの細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した（２５℃、１５分間）。固定後、これらの細胞を１分間ＤＡＰＩで核染色した。細胞内のＦＡＭの局在は、蛍光顕微鏡で評価した。代表的なフローサイトメトリーのパターンを図９のＡに、ＦＡＭラベルされたｓｉＲＮＡの細胞内局在の代表的な結果を図９のＢにそれぞれ示す。なお、ＭＦＩは図９のＡに示した通りである。Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡに比べてＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡの方が、ＴＰＯマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞への導入効率に優れることが明らかとなった（ＡおよびＢ）。また、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡの導入がanti-RBP-Abにより部分的に抑制されたこと（Ａ）から、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡの一部は骨髄線維芽細胞のＲＢＰ（レチノール結合タンパク質、Retinol Binding Protein）受容体を介して取り込まれた可能性が示唆された。
【００４０】
実施例７  ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７のＴＰＯマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞のコラーゲン分泌に対する効果
５×１０５個の初代培養骨髄線維芽細胞を１５％のＦＣＳを添加したＭＥＭに浮遊させて、６穴培養プレートに播種した。２４時間後に５０ｎＭのＬｉｐ−ｓｉＲＮＡ  Ｒａｎｄｏｍ（ｓｉＲＮＡ  ｒａｎ）、Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄ（ｓｉＲＮＡ  Ｄ）、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  Ｒａｎｄｏｍ（ＶＡ−ｓｉＲＮＡ  ｒａｎ）またはＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄ（ＶＡ−ｓｉＲＮＡ  Ｄ）を導入した。４時間後に培養液を１５％のＦＣＳを添加したＭＥＭに交換して、さらに４８時間培養した。その後、培養液を除去し、無血清のＯＰＴＩ−ＭＥＭを用いてさらに４時間培養した。その後まず、培養上清中のコラーゲン量をSircol(TM) Collagen Assay kit（Biocolor社）を用いて測定した。すなわち、培養上清をdye solutionと３０分間混和した。その後、この溶液を１０，０００×ｇで１０分間遠心した。結合していないdye solutionを除去した後、結合したdyeに１ｍｌのアルカリ試薬を添加して、ボルテックスで１０分間混和し、吸光度計（５４０ｎｍ）により測定した吸光度に基づいて定量した。次に培養プレートに接着している線維芽細胞に沈着しているコラーゲン量を、Sirius red dyeを添加後、吸光度計（５４０ｎｍ）により測定した吸光度に基づいて定量した。
【００４１】
結果を図１０に示す。なお、図中、「培養上清」は、線維芽細胞の培養上清中のコラーゲン量を、「Ｐｌａｔｅ（培養上清除去後）」は、培養上清除去後の線維芽細胞に沈着しているコラーゲン量を、「Ｔｏｔａｌ」は、「培養上清」と「Ｐｌａｔｅ（培養上清除去後）」との総和をそれぞれ示す。データは、３つの培養物の平均値±標準偏差で表した（＊Ｐ＜０．０５）。
この結果、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄを導入した初代培養線維芽細胞が培養上清中に分泌したコラーゲン量が、その他の細胞に比べて有意に少量であったこと、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄを導入した細胞において、培養プレートに沈着しているコラーゲン量は、その他の細胞と比較して少量であったが、有意差を認めなかったこと、また、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄを導入した線維芽細胞が培養上清中に分泌したコラーゲン量と培養上清除去後に線維芽細胞に沈着しているコラーゲン量との総和は、その他の細胞に比べて有意に少量であったことが明らかとなった。
【００４２】
実施例８  ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７のＴＰＯマウスの骨髄線維化に対するin vivo効果
生後７カ月のＴＰＯマウスを用い、in vivoにおけるＶＡ−Ｌｉｐ−ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄの骨髄線維化改善効果を検討した。ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄ  １２．５ｍｇ／マウスを隔日に合計４回、ツベルクリンシリンジを用いて眼窩静脈叢から静注した。すなわち、ｓｉＲＮＡ  １２．５ｍｇ／マウス（８μＬ）およびLipotrust １２．５ｎＭ（１２．５μＬ）に、ビタミンＡ  ２５ｎＭ（２．５μＬ）を添加し、または添加せずに、さらにRNAase free PBSを添加して合計１００μＬにし、これを１回量としてマウスに投与した。マウスをＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ−Ｄ投与開始後８日目に安楽死させ、骨髄を採取して組織標本を作製し、ヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色、ギッター（Ｇｉｔｔｅｒ）染色、または、アザン（Ａｚａｎ）染色でそれぞれ染色し、光学顕微鏡にて骨髄像を観察した。結果を図１１〜１４に示す。
【００４３】
処置後のＧｉｔｔｅｒ染色標本（図１１）からは、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７を投与した２匹のマウス（ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７（１）および（２））では、無処置マウス（No treatment）、Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７を投与したマウス（Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７）、およびＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  Ｒａｎｄｏｍを投与したマウス（ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ｒａｎ）に比べて、骨髄の細網線維増生が有意に改善していることが明らかとなった。さらに、このｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７による細網線維増生の改善度を、ＫＳ−４００ソフトウエア（Carl Zeiss社）で測定し数値化した。すなわち、処置後のＧｉｔｔｅｒ染色標本から１０視野を選択して、各視野中の全てのドットに占める細網線維のドットの割合（レチクリン線維化領域のパーセンテージ（percentage of reticulin fibrosis area））を、細網線維増生の指標として測定したところ、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７−Ｄを投与したマウス（ＶＡ−ｓｉＲＮＡ  Ｄ）では、無処置マウス（No treatment）、Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７を投与したマウス（ｓｉＲＮＡ  Ｄ）、およびＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  Ｒａｎｄｏｍを投与したマウス（ＶＡ−ｓｉＲＮＡ  ｒａｎ）に比べて、有意に骨髄の細網線維の増生が改善していることが確認された（図１２参照）。
【００４４】
また、図１３に示す処置後のＡｚａｎ染色標本からは、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７を投与した２匹のマウス（ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７（１）および（２））では、無処置マウス（No treatment）、Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７を投与したマウス（Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７）、およびＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  Ｒａｎｄｏｍを投与したマウス（ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ｒａｎ）に比べて、有意に骨髄のコラーゲン増生が改善していることが明らかとなった。
さらに図１４に示す処置後のＨＥ染色標本からは、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７を投与した２匹のマウス（ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７（１）および（２））では、無処置マウス（No treatment）、Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７を投与したマウス（Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７）、およびＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  Ｒａｎｄｏｍを投与したマウス（ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ  ｒａｎ）に比べて、有意に骨梁の肥厚が改善していることが明らかとなった。
以上の結果から、ＨＳＰ４７を標的とするｓｉＲＮＡを用いた骨髄線維症に対する処置は有用な可能性が示唆された。また、ｓｉＲＮＡが基本的に細胞質内で作用することを考慮すれば、上記結果は、レチノイドが骨髄における細胞外マトリックス産生細胞への標的化剤として機能し、同細胞に効率的に薬物を送達することにより、骨髄線維症の病態を顕著に改善したことを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】特発性骨髄線維症状患者の骨髄像を示した写真図である。患者１、患者２ともに、ＨＥ染色（左列）では骨梁の肥厚、Ｇｉｔｔｅｒ染色（中央）では細網線維の増生、Ａｚａｎ染色（右列）ではコラーゲンの沈着をそれぞれ認める。
【図２】骨髄線維症モデルマウスにおける病態の発症原理を示した図である。
【図３】生後４カ月および７カ月のＴＰＯトランスジェニックマウスの骨髄像を示した写真図である。左列がＨＥ染色像、中央がＧｉｔｔｅｒ染色像、右列がＡｚａｎ染色像である。
【図４】生後９カ月および１２カ月のＴＰＯトランスジェニックマウスの骨髄像を示した写真図である。左列がＨＥ染色像、中央がＧｉｔｔｅｒ染色像、右列がＡｚａｎ染色像である。
【００４６】
【図５】ＴＰＯトランスジェニックマウスの骨梁肥厚の推移を示した写真図である。左上が生後４ヶ月（４Ｍ）、右上が生後７ヶ月（７Ｍ）、左下が生後９ヶ月（９Ｍ）、右下が生後１２ヶ月（１２Ｍ）における骨髄のＨＥ染色像である。
【図６】ＴＰＯマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞の倒立顕微鏡で観察した細胞形態を示した写真図である（倍率×４００）。
【図７】ＴＰＯマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞におけるＶｉｍｅｎｔｉｎとαＳＭＡの発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示した図である。縦軸は細胞数（Cell number）を示す。
【図８】種々のｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７のＮＩＨ３Ｔ３（Ａ）およびＴＰＯマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞（Primary fibroblasts、ＢおよびＣ）のＨＳＰ４７発現に対する効果を示したウエスタンブロット像である。
【００４７】
【図９】リポソーム包埋ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡ）のＴＰＯマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞への導入に対するビタミンＡ（ＶＡ）の効果を示した図である。Ａはフローサイトメトリー法による解析結果、Ｂは蛍光顕微鏡像をそれぞれ示す。
【図１０】ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７のＴＰＯマウス由来初代培養骨髄線維芽細胞のコラーゲン分泌に対する効果を示したグラフである。
【図１１】ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７のＴＰＯマウスの骨髄線維化に対するin vivo効果を示す、Ｇｉｔｔｅｒ染色標本の鏡検像である。
【図１２】ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７によるＴＰＯマウスにおける細網線維増生の改善度を画像解析により数値化したグラフである。縦軸は各視野中の全てのドットに占める細網線維のドットの割合を示す。
【図１３】ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７のＴＰＯマウスの骨髄線維化に対するin vivo効果を示す、Ａｚａｎ染色標本の鏡検像である。
【図１４】ｓｉＲＮＡ  ＨＳＰ４７のＴＰＯマウスの骨髄線維化に対するin vivo効果を示す、ＨＥ染色標本の鏡検像である。
【図７】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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