(57)【要約】【課題】ＨＩＶのタンパク質の産出を抑制するｍｉＲＮＡの存在は知られておらず、ｍｉＲＮＡを基にしたＨＩＶ感染症の治療又は予防に有効な核酸の開発が求められていた。【解決手段】本発明は、ＨＩＶプロウイルスから転写されたｍＲＮＡの塩基配列における連続する少なくとも１１塩基からなる塩基配列に結合することによって、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制し得るヒト由来核酸を提供する。本発明のヒト由来核酸は、ＨＩＶ感染症の予防又は治療に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）又は（ｂ）に記載の塩基配列における連続する少なくとも１１塩基からなる塩基配列に結合することによって、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制し得るヒト由来核酸。
（ａ）  配列番号：１〜配列番号：３９のいずれか一の塩基配列
（ｂ）  （ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
【請求項２】
（ｃ）又は（ｄ）に記載の塩基配列に結合することによって、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制し得るヒト由来核酸。
（ｃ）  配列番号：４０〜配列番号：４３のいずれか一の塩基配列
（ｄ）  （ｃ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
【請求項３】
（ｅ）又は（ｆ）に記載の塩基配列を含む、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制し得るヒト由来核酸。
（ｅ）  配列番号：４４〜配列番号：１６１のいずれか一の塩基配列
（ｆ）  （ｅ）の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
【請求項４】
前記ヒト由来核酸がＲＮＡである、請求項１〜３いずれか一項に記載のヒト由来核酸。
【請求項５】
前記ヒト由来核酸がｍｉＲＮＡである、請求項１〜４いずれか一項に記載のヒト由来核酸。
【請求項６】
請求項1〜５いずれか一項に記載のヒト由来核酸をコードする核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項１〜５いずれか一項に記載のヒト由来核酸を含有する医薬組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の発現ベクターを含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制するヒト由来核酸と、その核酸を含む発現ベクター及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ
Ｖｉｒｕｓ）は、免疫細胞であるＴ細胞や、マクロファージに感染、増殖し、免疫細胞を減少させることでＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群、Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を引き起こす。これまで、ＨＩＶの増殖を抑える抗ウイルス薬が多数開発されてきた。
【０００３】
また、ＨＩＶゲノムに対するアンチセンス核酸を用いてＨＩＶのタンパク質の発現を抑制する技術が開発されている。例えば、ＣＸＣＲ4遺伝子又はＣＣＲ遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（特許文献１）や、ｅｎｖ部、ｐｏｌ部、ｇａｇ部の各塩基配列に対するアンチセンスＲＮＡ（特許文献２）、ＤＩＳ領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（特許文献３）などである。
【０００４】
また、発明者らは、ＨＩＶ感染症治療薬としてｐ３５をコードする核酸を含む発現ベクターが効果的であることを見出した（特許文献４）。
【０００５】
その一方で、近年、細胞内でＲＮＡ干渉を引き起こす核酸としてｍｉｃｒｏＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡ）が発見され、注目を集めている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−２９２７９５号公報
【特許文献２】特表２００１−５０２８８４号公報
【特許文献３】特開２００４−２８３０２４号公報
【特許文献４】特開２００７−１９５４４０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Lee RC, Feinbaum RL,Ambros V The C. elegans Heterochronic lin-4 Encodes Small RNAs with AntisenseComplementarity to lin-14. Cell 75: 843-854 (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡにおける標的配列に対して完全に相補的な塩基配列を有していなくても、ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現を抑制することができる。ＨＩＶは変異し易いため、ｍｉＲＮＡを基にしたウイルス感染症の治療薬は有効であると考えられる。しかしながら、ＨＩＶのタンパク質の産出を抑制し、ＨＩＶ感染症の治療又は予防に効果的なｍｉＲＮＡの存在は知られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明による核酸は、ＨＩＶプロウイルスから転写されたｍＲＮＡに結合し、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制し得る核酸に関する。
【００１０】
本発明による核酸は、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の塩基配列における、連続する少なくとも１１塩基からなる塩基配列に結合することによって、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制し得るヒト由来核酸である。
（ａ）  配列番号：１〜配列番号：３９のいずれか一の塩基配列
（ｂ）  （ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
【００１１】
また、本発明の核酸は、以下の（ｃ）又は（ｄ）に記載の塩基配列に結合することによって、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制し得るヒト由来核酸である。
（ｃ）  配列番号：４０〜配列番号：４３のいずれか一の塩基配列
（ｄ）  （ｃ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
【００１２】
さらに、本発明の核酸は、以下の（ｅ）又は（ｆ）に記載の塩基配列を含む、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制し得るヒト由来核酸である。
（ｅ）  配列番号：４４〜配列番号：１６１のいずれか一の塩基配列
（ｆ）  （ｅ）の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
【００１３】
また、本発明の核酸はＲＮＡであってもよく、ｍｉＲＮＡであってもよい。さらに、本発明の発現ベクターは、上記のヒト由来核酸をコードする核酸を含む。さらに、本発明の医薬組成物は、上記のヒト由来核酸又は上記の発現ベクターを含む。
【００１４】
ここで、配列番号：１は、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の５’末端から２，３０１番目の塩基と３，００７番目の塩基との間の塩基配列がコードするＲＮＡの塩基配列である。同様に、配列番号：２は、２３０１番目の塩基と２６８３番目の塩基との間、配列番号：３は、２４４８番目の塩基と２４９７番目の塩基との間、配列番号：４は、２４５０番目の塩基と２４９０番目の塩基との間、配列番号：５は、２４５０番目の塩基と２４７７番目の塩基との間、配列番号：６は、２４６１番目の塩基と２５４３番目の塩基との間、配列番号：７は、２４６１番目の塩基と２５０３番目の塩基との間、配列番号：８は、２５０４番目の塩基と２５４３番目の塩基との間、配列番号：９は、２５１３番目の塩基と２５６３番目の塩基との間、配列番号：１０は、２５１４番目の塩基と２５４３番目の塩基との間、配列番号：１１は、３７３３番目の塩基と４０８０番目の塩基との間、配列番号：１２は、４４０４番目の塩基と４７７２番目の塩基との間、配列番号：１３は、４５７５番目の塩基と４７７２番目の塩基との間、配列番号：１４は、５２７１番目の塩基と５５００番目の塩基との間、配列番号：１５は、５４３１番目の塩基と５５００番目の塩基との間、配列番号：１６は、５４３１番目の塩基と５４９２番目の塩基との間、配列番号：１７は、５７２１番目の塩基と６３７１番目の塩基との間、配列番号：１８は、５７２１番目の塩基と６０６６番目の塩基との間、配列番号：１９は、６０１２番目の塩基と６３７５番目の塩基との間、配列番号：２０は、６０１２番目の塩基と６２１８番目の塩基との間、配列番号：２１は、６０５３番目の塩基と６１２６番目の塩基との間、配列番号：２２は、６０６４番目の塩基と６１０１番目の塩基との間、配列番号：２３は、６０６４番目の塩基と６１６１番目の塩基との間、配列番号：２４は、６０８６番目の塩基と６１３２番目の塩基との間、配列番号：２５は、６５６１番目の塩基と７０５１番目の塩基との間、配列番号：２６は、７０００番目の塩基と７４６４番目の塩基との間、配列番号：２７は、８７３０番目の塩基と８７９５番目の塩基との間、配列番号：２８は、８７５０番目の塩基と８９９５番目の塩基との間、配列番号：２９は、８７５０番目の塩基と８８１４番目の塩基との間、配列番号：３０は、８７５０番目の塩基と８７８０番目の塩基との間、配列番号：３１は、８７５０番目の塩基と８８０６番目の塩基との間、配列番号：３２は、８７６８番目の塩基と８８２４番目の塩基との間、配列番号：３３は、８７８１番目の塩基と８８０６番目の塩基との間、配列番号：３４は、８７８１番目の塩基と８８１４番目の塩基との間、配列番号：３５は、８７６８番目の塩基と８８２４番目の塩基との間、配列番号：３６は、８８８０番目の塩基と８９９４番目の塩基との間、配列番号：３７は、８９４４番目の塩基と９０１４番目の塩基との間、配列番号：３８は、８９６４番目の塩基と９０００番目の塩基との間、配列番号：３９は、９５５０番目の塩基と９９３０番目の塩基との間、配列番号：４０は、２４６８番目の塩基と２４７７番目の塩基との間、配列番号：４１は、２５３２番目の塩基と２５４３番目の塩基との間、配列番号：４２は、８７８８番目の塩基と８８０２番目の塩基との間、配列番号：４３は、８９８１番目の塩基と８９９３番目の塩基との間、のそれぞれの塩基配列がコードするＲＮＡの塩基配列である。
【００１５】
また、配列番号：４４〜配列番号：６４は、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の５’末端から６，０６４番目の塩基と６，１０１番目の塩基との間の塩基配列がコードするＲＮＡに結合する核酸の塩基配列である。また、配列番号：６５〜配列番号：７１は、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の５’末端から８，７８５番目の塩基と８，８０２番目の塩基との間の塩基配列がコードするＲＮＡに結合する核酸の塩基配列である。また、配列番号：７２〜配列番号：８１は、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の５’末端から８，７８８番目の塩基と８，８０４番目の塩基との間の塩基配列がコードするＲＮＡに結合する核酸の塩基配列である。また、配列番号：８２〜配列番号：９３は、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の５’末端から２，４４８番目の塩基と２，４９７番目の塩基との間の塩基配列がコードするＲＮＡに結合する核酸の塩基配列である。また、配列番号：９４〜配列番号：９８は、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の５’末端から２，５１３番目の塩基と２，５６３番目の塩基との間の塩基配列がコードするＲＮＡに結合する核酸の塩基配列である。また、配列番号：９９〜配列番号：１１１は、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の５’末端から８，７３０番目の塩基と８，７９５番目の塩基との間の塩基配列がコードするＲＮＡに結合する核酸の塩基配列である。また、配列番号：１１２〜配列番号：１４７は、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の５’末端から８，７６８番目の塩基と８，８２４番目の塩基との間の塩基配列がコードするＲＮＡに結合する核酸の塩基配列である。また、配列番号：１４８〜配列番号：１６１は、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の５’末端から８，９４４番目の塩基と９，０１４番目の塩基との間の塩基配列がコードするＲＮＡに結合する核酸の塩基配列である。
【発明の効果】
【００１６】
発明者らは、ヒト細胞内でＨＩＶのタンパク質の発現を抑制し得るｍｉＲＮＡを同定し、この知見を基にして本発明に至った。したがって、本発明による核酸は、宿主染色体に組み込まれたＨＩＶゲノム、すなわちＨＩＶプロウイルスから転写されたｍＲＮＡに結合することによって、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制することができる。また、本発明による核酸はｍｉＲＮＡを基に設計されているため、標的のｍＲＮＡとの間の完全な相補性を要求されない。したがって、ＨＩＶの遺伝子に変異が起こったとしても、ＨＩＶのタンパク質発現抑制能を維持する可能性が高い。また、本発明はヒト細胞内に存在するｍｉＲＮＡを基にした核酸であるため、細胞毒性を示さず、安全性に優れると考えられる。
【００１７】
本発明の発現ベクターは、ＨＩＶに感染した細胞に本発明の核酸を発現させることで、ＨＩＶタンパク質の産出を抑制することができる。また、本発明の医薬組成物は、ＨＩＶ感染症の予防又は治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターの構造を示した図である。
【図２】ルシフェラーゼアッセイの概念を説明した図である。
【図３】実施例１におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図４】実施例２におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図５】実施例３において、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２に挿入したＤＮＡの塩基配列を示した図である。
【図６】実施例３におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図７】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の６，０５３番目−６，１２６番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【図８】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の６，０５３番目−６，１２６番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【図９】実施例６において、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターに挿入したＤＮＡの塩基配列を示した図である。
【図１０】実施例６におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図１１】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の８,７８５番目−８,８０２番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【図１２】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の８,７８８番目−８,８０４番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【図１３】実施例８におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図１４】実施例１０におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図１５】実施例１１におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図１６】実施例１１におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図１７】実施例１１におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図１８】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の２，４６８番目−２，４７７番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【図１９】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の２,５３２番目−２,５４３番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【図２０】実施例１４におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図２１】実施例１４におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図２２】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の８，７５０−８，７８０番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【図２３】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の８，７５０−８，７８０番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【図２４】実施例１６におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図２５】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の８，７８８番目−８，８０２番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【図２６】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の８，７８８番目−８，８０２番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【図２７】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の８，７８８番目−８，８０２番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【図２８】実施例１８におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図２９】ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の８，９８１番目−８，９９３番目の塩基配列がコードするＲＮＡとｍｉＲＮＡとの結合状態の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
次に、本発明を実施するための形態について説明する。
【００２０】
なお、本明細書においては、５’末端の塩基を１とし３’末端方向に進むにしたがって１ずつ増加する番号によって、塩基配列中の塩基の位置を記述する。
【００２１】
ＨＩＶの感染は以下のようにして起こると考えられる。まず、ＨＩＶが宿主細胞表面に吸着すると、宿主細胞の細胞膜と融合し、細胞内に侵入する。細胞内で、逆転写酵素により、ＨＩＶのゲノムＲＮＡが鋳型となって２本鎖ＤＮＡが合成され、両端に有するＬＴＲによって宿主のＤＮＡに組み込まれる。ＨＩＶプロウイルスとは、細胞に感染することで該細胞のＤＮＡに組み込まれた状態のＨＩＶの遺伝子をいう。本発明によるＨＩＶのタンパク質の発現を抑制する核酸は、宿主内でＨＩＶプロウイルスから転写されたｍＲＮＡを標的とする。
【００２２】
さらに、ＨＩＶが感染した細胞が何らかの刺激を受けると、ＨＩＶプロウイルスからＨＩＶのタンパク質をコードするｍＲＮＡが転写される。転写されたｍＲＮＡからＨＩＶのタンパク質が合成され、合成されたタンパク質とＨＩＶゲノムとなるＲＮＡとが集合することでウイルスが完成する。完成したウイルスは宿主細胞から発芽し、細胞外へと放出される。
【００２３】
本発明による核酸は、例えばＲＮＡ干渉により、ＨＩＶプロウイルスから転写されたｍＲＮＡの全部又は一部に結合又はハイブリダイズすることで、ｍＲＮＡの分解を促進し又はｍＲＮＡの翻訳を抑制し、ＨＩＶタンパク質の産出を抑制する。本発明による核酸の具体例としてアンチセンス核酸が挙げられ、さらに具体的な例としてｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡとが挙げられる。
【００２４】
ＲＮＡ干渉とは、標的となるｍＲＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列を持つ低分子核酸が、標的となるｍＲＮＡの全部又は一部と相補的な塩基対を形成して結合することによりｍＲＮＡの分解を促進し、タンパク質の発現を抑制する機構をいう。また、ＲＮＡ干渉は、酵母からヒトまで、多くの生物の細胞内で働いていることが知られている。
【００２５】
ｍｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉を引き起こす、タンパク質への翻訳がされないノンコーディングＲＮＡの一種である。ｍｉＲＮＡは、１本鎖として細胞内に存在する。長さは一般的に２０から３０塩基程度であるが、本発明の核酸はその長さに限定されない。ｍｉＲＮＡは特定のｍＲＮＡの３´末端側の非翻訳領域に特異的にハイブリダイズすることで、標的ｍＲＮＡの翻訳の阻害や標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられている。
【００２６】
ｍｉＲＮＡの前駆体は、ヘアピン構造を有する１本鎖のＲＮＡであると考えられている。Ｄｉｃｅｒと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩにより短い断片の２本鎖ＲＮＡに切り出され、さらに、ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）に取り込まれて１本鎖のｍｉＲＮＡとなる。ｍｉＲＮＡを取り込んだＲＩＳＣが標的となるｍＲＮＡと塩基対を形成して結合すると、標的となるｍＲＮＡはＳｌｉｃｅｒと称される酵素により切断される。このようにして、標的となるｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現を抑制することができる。
【００２７】
ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡにおける標的となる塩基配列に対し完全な相補性を有していなくても、ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現を抑制することができる。また、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡにおける標的となる塩基配列に対し、連続した相補性を有していなくても、ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現を抑制することができる。したがって、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡをコードする遺伝子に変異が起こったとしても、タンパク質発現の抑制能を維持する可能性が高い。ＨＩＶには変異が頻繁に起こるため、ＨＩＶ感染症の予防又は治療には本発明による核酸が有効である。
【００２８】
ｓｉＲＮＡとは、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ又はｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡの略称であり、ＲＮＡ干渉を引き起こす、タンパク質への翻訳がされないノンコーディングＲＮＡの一種である。ｓｉＲＮＡの長さは一般的に２０から３０塩基程度であるが、本発明の核酸はその長さに限定されない。ｓｉＲＮＡは特定のｍＲＮＡに結合することで、ｍＲＮＡの翻訳の阻害やｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられている。
【００２９】
ｓｉＲＮＡの前駆体は長鎖の２本鎖ＲＮＡである。前駆体がＤｉｃｅｒによって切り出され、短い２本鎖のｓｉＲＮＡとなる。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣに取り込まれ、標的となるｍＲＮＡの翻訳の阻害や、標的となるｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。
【００３０】
本発明による核酸は、上述のｍｉＲＮＡやｓｉＲＮＡ以外であっても、ＨＩＶ−１のタンパク質の発現を抑制し得るものを用いることができる。具体的には、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイム等である。また、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制し得る効果を有するものであれば、ＲＮＡではなく、ＤＮＡであってもよい。また、ＲＮＡの一部のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換したものであってもよく、ＤＮＡの一部のデオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドで置換したものであってもよい。
【００３１】
本発明による核酸は、ｍＲＮＡにおける標的配列に結合又はハイブリダイズすることでＨＩＶのタンパク質の発現を抑制する。本発明による核酸とｍＲＮＡにおける標的配列との結合又はハイブリダイズは、本発明による核酸の全部又は一部とｍＲＮＡにおける標的配列との間で相補的な塩基対を形成することによりなされる。相補的な塩基対は、核酸を構成するアデニン（Ａ）塩基、シトシン（Ｃ）塩基、グアニン（Ｇ）塩基、チミン（Ｔ）塩基、ウラシル（Ｕ）塩基のうち、Ａ塩基とＴ塩基又はＵ塩基との間、Ｃ塩基とＧ塩基との間の水素結合により形成される。
【００３２】
本発明による核酸とｍＲＮＡにおける標的配列との間には、結合又はハイブリダイズして二本鎖となるのに十分な相補性が必要であるが、完全に相補的である必要はない。本発明による核酸と、標的となるｍＲＮＡとの結合又はハイブリダイズは、哺乳類の細胞内、好ましくはヒト細胞内で、２０℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃の条件で行われる。
【００３３】
本発明による核酸は、ＨＩＶプロウイルスから転写されたｍＲＮＡのうち、連続する少なくとも１１塩基からなる配列を標的として結合又はハイブリダイズすることにより、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制する。本発明による核酸が結合又はハイブリダイズする標的配列は、好ましくは１１塩基から４０塩基である。
【００３４】
本発明による核酸とｍＲＮＡにおける標的配列との結合における結合エネルギーは、−１５ｋｃａｌ／ｍｏｌであることが好ましく、−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌであることがさらに好ましい。
【００３５】
本発明による核酸は、標的となるｍＲＮＡに対して特異的に結合又はハイブリダイズすることが好ましい。標的となるｍＲＮＡに特異的に結合又はハイブリダイズすれば、細胞内における他のタンパク質の発現を抑制することがないためである。
【００３６】
本発明において、欠失とは、配列中の塩基の一部が除去されることをいう。置換とは、配列を構成する塩基のうちの一つが異なるに塩基に置換されることをいう。付加とは、何らかの塩基が配列に挿入されることをいう。欠失、置換又は付加は、配列のいずれの部分で生じてもよい。
【００３７】
本発明による核酸を細胞で発現させるためには、発現させる核酸をコードする核酸を含有する発現ベクターが用いられる。発現ベクターとは、外来の遺伝子を細胞に導入する、いわば遺伝子の運び屋である。本発明では発現ベクターとして、ウイルスベクターやプラスミドベクター等を用いることができる。ウイルスベクターを用いた場合は、外来の遺伝子が染色体に組み込まれるため、細胞内における持続的な発現が期待される。
【００３８】
核酸をコードする核酸とは、例えば、本発明による発現ベクターがＤＮＡベクターであった場合には、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制し得る核酸を転写により合成する際に鋳型となる鎖を含むＤＮＡをいう。ＤＮＡの鋳型となる鎖は、本発明による核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む。
【００３９】
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸をコードする核酸を既知の発現ベクターの特定部位に挿入して構成される。また、発現ベクターは、特定部位に挿入された核酸の転写を誘導するプロモーターを有する。発現ベクター上のプロモーター配列は限定されないが、具体的には、ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ又はＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ系のプロモーター配列を用いることができる。
【００４０】
本発明で用いられるウイルスベクターとしては、具体的にはアデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス、バキュロウイルス、レンチウイルス及びこれらウイルスについて遺伝子組換え技術により無毒化処理や弱毒化処理を施したウイルス等を利用したものが挙げられる。
【００４１】
また、ウイルスベクターは水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶＧ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、狂犬病ウイルス由来のＲＶＧ（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）等の糖タンパク質を外殻に有するように組み換えたものであってもよい。これらの糖タンパク質は細胞膜を形成するリン脂質と結合するため、ウイルスベクターによる遺伝子導入効率を高めることができる。
【００４２】
本発明で用いられるプラスミドベクターとしては、具体的にはｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）、ｐｃｐＧ-ｓｉＲＮＡ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）、ｐｉＧＥＮＥベクター（ｉＧＥＮＥ社）等を用いることができる。
【００４３】
本発明による医薬組成物は、ＨＩＶのタンパク質の発現を抑制するための組成物であって、本発明による核酸又は本発明による発現ベクターを含む。発現ベクターの他には、任意の担体を含むことができる。任意の担体としては、アジュバントとして免疫活性を高めるもの等を用いることができる。
【００４４】
本発明による医薬組成物は、ＨＩＶ感染症治療薬やＨＩＶ感染症予防薬に利用することができる。本発明による医薬組成物は、ヒトに投与した後、本発明による核酸又は発現ベクターを必要な細胞まで送達する機構を含むものであってもよい。具体的にはリボソーム等を用いることができる。
【実施例】
【００４５】
以下、図を参照しながら本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４６】
方法：ルシフェラーゼアッセイ
本発明の実施例で用いられるルシフェラーゼアッセイについて、その原理と方法を、図１及び図２を参照して説明する。図１はｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターの構造を示している。図２はルシフェラーゼアッセイの概念図である。
【００４７】
まず、図１を参照してｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターについて説明する。ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターは、ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲｌｕｃ）とホタルルシフェラーゼ（ｈｌｕｃ＋）と、２種類のルシフェラーゼの遺伝子を有する発現ベクターである。細胞内のｍｉＲＮＡの活性の測定に利用することができる。ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターの、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の下流にあるＰｍｅＩサイトに、細胞内ｍｉＲＮＡによる抑制効果を確認したい遺伝子を挿入する。目的の遺伝子を挿入したベクターを、被験細胞に対しエレクトロポレーション等の方法を用いて導入する。
【００４８】
次に、図２を参照してルシフェラーゼアッセイの原理について説明する。ｐｓｉＣＨＣＥＣＫ−２ベクターを導入した被験細胞内では、ウミシイタケルシフェラーゼとその３´末端に挿入配列を有するｍＲＮＡが転写される。挿入された配列を標的とするｍｉＲＮＡが被験細胞内に存在しない場合には、ウミシイタケルシフェラーゼと挿入配列とが融合したｍＲＮＡが翻訳されるため、ウミシイタケルシフェラーゼによる発光が観察される。一方、挿入された配列を標的とするｍｉＲＮＡが被験細胞内に存在する場合には、ｍＲＮＡの翻訳抑制や分解により、ウミシイタケルシフェラーゼの発光が減弱する。したがって、ウミシイタケルシフェラーゼの発光活性を測定することで、細胞内に挿入配列を標的とするｍｉＲＮＡが存在するか否かが明らかとなる。
【００４９】
また、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターは、被験細胞内でホタルルシフェラーゼを発現する。ホタルルシフェラーゼの発光は対照として用いることができる。
【００５０】
ルシフェラーゼアッセイの具体的手順を説明する。キットとしてＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した。まず、５０×Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを５０倍容のＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈し、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔを調整した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
Ａｓｓａｙ ＳｕｂｓｔｒａｔｅをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩで溶解した溶液 、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ  １００μｌをルミノメーター用チューブに分注し、レポーターアッセイ当たり２秒間の待機後に１０秒間測定するように設定した。１０μｌの被験細胞を溶解させたサンプルを添加し、ルミノメーターＬｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に設置してホタルルシフェラーゼの活性を測定した。次に、ルミノメーターからサンプルチューブを取り出し、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ
１００μｌを添加し、軽くボルテックスした後、サンプルをルミノメーターにセットしてウミシイタケルシフェラーゼの活性を測定した。
【００５１】
実施例１：ｍｉＲＮＡによるＨＩＶ−１タンパク質の発現抑制能の確認
ＨＩＶ−１プロウイルスから転写されたｍＲＮＡの多くは、他のｍＲＮＡの核外への輸送とは異なり、Ｒｅｖタンパク質がｍＲＮＡ上のＲｅｖ
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＲＲＥ）に結合することによって特異的に核外へ輸送される。したがって、ＨＩＶ−１プロウイルス由来のｍＲＮＡに結合するｍｉＲＮＡであっても、該ｍＲＮＡの翻訳を阻害することが可能かどうかは不明であった。そこで発明者らは、Ｒｅｖタンパク質によって輸送されるｍＲＮＡに対し、ｍｉＲＮＡが抑制効果を持つかどうかをルシフェラーゼアッセイにより調べた。
【００５２】
まず、ＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質を発現するベクターを構築した。まず、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを用い、ベクター上のＰｍｅ  ＩサイトにＲｅｖタンパク質をコードする配列を挿入した。さらに、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターを用い、ベクター上のＰｍｅＩサイトにｍｉＲＮＡであるｌｅｔ−７の標的配列を挿入した。ｌｅｔ−７はＨｅｌａ細胞で多く発現することが知られているｍｉＲＮＡである。挿入した配列は、（１）３×Ｂｕｌｇｅ；ｌｅｔ−７の標的配列を３か所含むもの、（２）３×ＢｕｌｇｅＭｕｔ；ｌｅｔ−７の標的配列に変異を含む配列を３か所含むもの、である。さらに、挿入した配列の下流にＲＲＥを正方向又は逆方向に挿入した。正方向にＲＲＥを挿入したものを「ＲＲＥ」、逆方向に挿入したものを「ＲＲＥ（−）」と表す。挿入が確認されたクローンは、シークエンス解析を行い、ベクターの塩基配列を確認した。
【００５３】
Ｈｅｌａ細胞に、遺伝子導入剤ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６を用いて構築したベクターを導入し、ルシフェラーゼアッセイを行った。導入したベクターの組み合わせを表１に示す。
【００５４】
【表１】
2010119385.tif 000002
【００５５】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図３に示す。グラフの値は、挿入配列を含まないｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターを導入したときの、ホタルルシフェラーゼの発光強度に対するウミシイタケルシフェラーゼの発光強度の比をコントロールとし、コントロール（１００）に対する発光強度比を割合で示したものである。ｌｅｔ−７標的配列に変異を入れた３×ＢｕｌｇｅＭｕｔとＲＲＥとを挿入したｐｓｉＣＨＥＣＫ−２を導入したＨｅｌａ細胞では、Ｒｅｖタンパク質の存在下でルシフェラーゼ活性の増加が確認された。その一方で、ｌｅｔ−７標的配列の３×ＢｕｌｇｅとＲＲＥとを挿入したｐｓｉＣＨＥＣＫ−２を導入したＨｅｌａ細胞では、Ｒｅｖタンパク質の存在如何でルシフェラーゼ活性は変化しなかった。したがって、ｍｉＲＮＡは、Ｒｅｖタンパク質が結合したｍＲＮＡに対しても、結合しないｍＲＮＡと同様に抑制効果を有することが明らかになった。以上の結果から、ＨＩＶ−１プロウイスル由来のｍＲＮＡにｍｉＲＮＡが結合すれば、ＨＩＶ−１タンパク質の発現を抑制することができることが示唆された。
【００５６】
実施例２：ｍｉＲＮＡ標的配列の候補探索
発明者らは、ヒト細胞内に存在するｍｉＲＮＡの中にＨＩＶ−１由来のｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡが存在するのではないかと考えた。そこで、ｍｉＲＮＡの公開データベースであるｍｉＲＢａｓｅを用いて、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローン、ＮＬ４−３（ＡＦ３２４４９３）との相同性を検索した。検索結果から、ｍｉＲＮＡの５´末端側と、７塩基以上の相同性を持つＨＩＶ−１（ＮＬ４−３株）ゲノムをｍｉＲＮＡ標的配列候補とした。
【００５７】
さらに、ｍｉＲＮＡ標的配列候補についてルシフェラーゼアッセイを行った。各ｍｉＲＮＡ標的配列をコードするＤＮＡの塩基配列をｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターに挿入し、該ベクターをヒトＴ細胞由来であるＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞に導入した。ベクターの導入には、遺伝子導入試薬ＴａｒｇｅｆｅｃｔＦ−１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いた。
【００５８】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図４に示す。ルシフェラーゼアッセイにより、抑制効果のあった配列を黒いバーで、抑制効果のなかった配列を白いバーで表示する。抑制効果のあった塩基配列は、２,３０１−３,００７番目（配列番号：１）、２，３０１−２，６８３番目（配列番号：２）、２，４６１−２，５４３番目（配列番号：６）、３，７３３−４，０８０番目（配列番号：１１）、４，４０４−４,７７２番目（配列番号：１２）、４，５７５−４，７７２番目（配列番号：１３）、５，２７１−５，５００番目（配列番号：１４）、５，４３１−５，５００番目（配列番号：１５）、５，４３１−５４９２番目（配列番号：１６）、５，７２１−６，３７１番目（配列番号：１７）、５，７２１−６，０６６番目（配列番号：１８）、６，０１２−６，３７５番目（配列番号：１９）、６，０１２−６，２１８番目（配列番号：２０）、６，５６１−７，０５１番目（配列番号：２５）、７，０００−７，４６４番目（配列番号：２６）、８，７５０−８，９９５番目（配列番号：２８）及び９，５５０−９，９３０番目（配列番号：３９）の各塩基配列であった。これらの抑制効果のあった配列のなかから、６，０１２−６，２１８番目（配列番号：２０）及び８，７５１−８，９９５番目（配列番号：２８）の配列を標的とするヒト由来ｍｉＲＮＡを探索した。
【００５９】
実施例３：ｍｉＲＮＡ標的配列の絞り込み（６，０１２番目−６，２１８番目）
ＨＩＶ−１タンパク質の発現を抑制するｍｉＲＮＡを同定するためには、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンＮＬ４−３（ＡＦ３２４４９３）の６，０１２番目から６，２１８番目までがコードするＲＮＡの塩基配列から、さらに標的配列を絞り込む必要があった。そこで、６，０４９番目−６，１２６番目の塩基配列の断片（図５に示す。）をそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターに挿入し、これをＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行った。
【００６０】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図６に示す。４０％程度の抑制がみられたものは、６．０５３番目−６，１２６番目（配列番号：２１）、６，０８６番目−６，１３２番目（配列番号：２４）の各配列であった。３０％程度の抑制がみられたものは、６，０６４番目−６，１０１番目（配列番号：２２）の各配列であった。また、２０％程度の抑制がみられたものは、６，０５３番目−６，０９８番目、６，０５６番目−６，０９１番目の各配列であった。
【００６１】
実施例５：標的配列に結合するｍｉＲＮＡの同定（６，０５３番目−６，１２６番目）
実施例４の結果から、ＨＩＶプロウイルスから転写されるＲＮＡのうち、ｍｉＲＮＡの標的配列を含むと考えられるＨＩＶ−１のＤＮＡクローンＮＬ４−３（ＡＦ３２４４９３）の６，０５３番目から６，１２６番目までがコードする塩基配列（配列番号：２１）に結合するｍｉＲＮＡの同定を行った。ｍｉＲＢａｓｅから取得したｍｉＲＮＡ、及びＬａｎｄｇｒａｆらが非特許文献２で報告したヒトＴ細胞で発現するｍｉＲＮＡを対象とした。相同性検索は、ＲＮＡｈｙｂｒｉｄ（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒ）を用いて行った。検索の条件は、ｍｉＲＮＡの５´末端側の２番目の塩基から７塩基当たり６塩基の相同性を持つものであり、かつ、結合エネルギーが−１５ｋｃａｌ／ｍｏｌより強いもの、とした。これまでの知見から、有効なｍｉＲＮＡの結合エネルギーは、−１５ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも強いことが知られていたためである。
【００６２】
上述の方法により得られたｍｉＲＮＡを表２及び表３に示す。また、これらのｍｉＲＮＡと標的配列との結合状態を予測した模式図が図７及び図８である。図中の「ｔａｒｇｅｔ」には、ＨＩＶプロウイルスから転写されたｍＲＮＡのうち、ｍｉＲＮＡが結合する部分の塩基配列を示す。図中の「ｍｉＲＮＡ」には、同定したｍｉＲＮＡを示す。
【００６３】
非特許文献２
Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, Sewer
A, Iovino N, Aravin A, Pfeffer S, Rice A, Kamphorst AO, Landthaler M, Lin C,
Socci ND, Hermida L, Fulci V, Chiaretti S, Foa R, Schliwka J, Fuchs U, Novosel
A, Muller RU, Schermer B, Bissels U, Inman J, Phan Q, Chien M, Weir DB, Chokｓｉ R, De Vita G,
Frezzetti D, Trompeter HI, Hornung V, Teng G, Hartmann G, Palkovits M, Di Lauro
R, Wernet P, Macino G, Rogler CE, Nagle JW, Ju J, Papavaｓｉliou FN, Benzing T, Lichter P, Tam W, Brownstein MJ, Bosio A,
Borkhardt A, Russo JJ, Sander C, Zavolan M, Tuschl T. A mammalian microRNA expression
atlas based on small RNA library sequencing.Cell 129, 1401-1414 (2007)
【００６４】
【表２】
2010119385.tif 000003
【００６５】
【表３】
2010119385.tif 000004
【００６６】
実施例６：ｍｉＲＮＡ標的配列の絞り込み（８，７５０番目−８，９９５番目）
続いて、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の８，７５０番目から８，９９５番目までの配列がコードするＲＮＡ塩基配列（配列番号：２８）から標的配列を絞り込んだ。図９に示した各配列をそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターへ挿入し、これをＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行った。
【００６７】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図１０に示す。ルシフェラーゼアッセイにより、６０％以上の抑制がみられたものは８，７５０−８，９９５及び８，７５０−８，８７０の各配列であった。また、５０％程度の抑制がみられたものは、８，７５０−８，８１４、８，７５０−８，７７０、８，７８１−８，８１４及び８，７８５−８，８０２の各配列であった。また、３０％程度の抑制がみられたのが、８，７５０−８，７８７、８，７５０−８，７８０、８，７５０−８，７７５、８，７６０−８，７８０、８，７８１−８，８０６、８，７８８−８，８０４、８，８４５−８，８７０及び８，８６１−８，９９５の各配列であった。さらに、１０％程度の抑制がみられたのが、８，７５４−８，７８０、８，８０９−８，８５０、８，８３１−８，８９７及び８，８４０−８，８７０の各配列であった。
【００６８】
実施例７：標的配列に結合するｍｉＲＮＡの同定（８，７８５番目−８，８０２番目、及び８，７８８番目−８, ８０４番目）
実施例６の結果に基づき、ＨＩＶプロウイルスから転写されるＲＮＡにおけるＨＩＶ−１のＤＮＡＮＬ４−３ゲノムの８，７８５−８，８０２及び８，７８８−８, ８０４がコードする塩基配列を標的とするｍｉＲＮＡの同定を、実施例５と同様の方法を用いて行った。得られたｍｉＲＮＡのうち、８，７８５−８，８０２がコードするＲＮＡの塩基配列を標的とするｍｉＲＮＡを表４に示し、８，７８８−８，８０４がコードするＲＮＡの塩基配列を標的とするｍｉＲＮＡを表５に示す。これらのｍｉＲＮＡと標的配列との結合状態を予測した模式図が図１１及び図１２である。
【００６９】
【表４】
2010119385.tif 000005
【００７０】
【表５】
2010119385.tif 000006
【００７１】
実施例８：変異を含む８，７８１−８，８１４の配列に対するｍｉＲＮＡの効果
ウイルスのゲノムには変異が起こりやすいことが知られている。したがって、ｍｉＲＮＡをＨＩＶの治療薬に用いる場合には、変異を含むＨＩＶゲノムに対しても発現抑制効果を発揮するものであることが望ましい。そこで、８，７８１−８，８１４の配列中に変異が生じた場合にも、抑制効果がみられるかどうかを検証した。
【００７２】
表６に示した配列をそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターに挿入し、ルシフェラーゼアッセイにより抑制効果を検証した。変異を導入した塩基は、表６でアンダーラインにより示した。なお、「８８１１−８８１４−ＴＣＡＣ」は、８，７８１−８８１４の配列のうち、８，８１１−８，８１４の配列を「ＴＣＡＣ」に置換したものである。「８８０５−８８０８−ＴＴＴＴ」は、８，８１１−８,８１４の配列のうち、８，８０５−８，８０８の配列を「ＴＴＴＴ」に置換したものである。
【００７３】
【表６】
2010119385.tif 000007
【００７４】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図１３に示す。８７９０−８８１４及び８７９３−８８１４では抑制効果がみられなかったが、その他の配列については、５０％〜７０％の抑制が確認された。この結果から、少なくとも８，７８８−８，８０２の配列が、好ましくは８，７８５−８，８０８の配列が、より好ましくは８，７８１−８，８１４の配列が保存されていれば、本発明の核酸のタンパク質産出抑制効果が維持されることがわかった。また、８，７８８−８，８０２の配列は、ｍｉＲＮＡの標的配列を含むことが示唆された。
【００７５】
実施例９：繰り返し配列に対するｍｉＲＮＡの抑制効果
ｍｉＲＮＡが標的とする配列の近傍に、同種又は異種のｍｉＲＮＡの標的配列があった場合には抑制効果が高まることが報告されている。そこで、８，７８５−８，８０２及び８，７８８−８８０４を３回繰り返した配列をそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターに挿入し、ルシフェラーゼアッセイにより抑制効果を検証した。
【００７６】
ルシフェラーゼアッセイの結果、８，７８５−８，８０２を３回繰り返した配列では約５０％の、８，７８８−８，８０４を３回繰り返した配列では約６０％の抑制効果が確認された。
【００７７】
実施例１０：ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１の阻害実験
実施例５及び実施例７で同定されたｍｉＲＮＡが真に標的配列に結合しているのであれば、ｍｉＲＮＡを阻害すれば標的配列の抑制効果が解除されるはずである。そこで、本発明によるｍｉＲＮＡの中からｈｓａ−ｍｉＲ−２２１に注目し阻害実験を行った。
【００７８】
ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１の標的配列が含まれる６，０６４−６，１０１の配列をｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターに挿入し、また、阻害剤として、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１に特異的に結合するｍｉＲＩＤＩＡＮ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ社）を作成した。阻害剤のネガティヴ・コントロールには、哺乳類のｍｉＲＮＡとは結合しないｍｉＲＩＤＩＡＮ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ＃１を用いた。これらを同時にＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞へ導入し、ルシフェラーゼアッセイを行った。導入した組み合わせを表７に示す。
【００７９】
【表７】
2010119385.tif 000008
【００８０】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図１４に示す。６，０６４−６，１６１／Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌを１００とし、それに対する６０６４−６１０１／Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌの値、及びＣｏｎｔｒｏｌ／Ａｎｔi−ｍｉＲ−２２１の値を１００とし、それに対する６，０６４−６，１０１／Ａｎｔi−ｍｉＲ−２２１の値を示した。６，０６４−６，１０１の領域は阻害剤の非存在下では６０％程度の抑制がみられた。一方、ｍｉＲ−２２１の阻害剤を加えると、ルシフェラーゼ活性の抑制が解除された。以上のように、ｍｉＲ−２２１は６，０６４−６，１０１の配列に結合して活性を抑制していることが証明された。
【００８１】
実施例１１：ｍｉＲＮＡ標的配列の絞り込み（２，４５０−２，５４３番目）
さらに、ＨＩＶ−１のＤＮＡクローンであるＮＬ４−３の２，４５０−２，５４３番目がコードするＲＮＡの塩基配列から標的配列を絞り込んだ。表８に示した各配列をそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターへ挿入し、これをＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行った。
【００８２】
【表８】
2010119385.tif 000009
【００８３】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図１５に示す。コントロールに対し５０％程度の抑制がみられたものは、２，４５０−２，４９０、２，４５０−２，４７７、２，４６１−２，５４３及び２，４６１−２，５０３の各配列であった。また、３０％程度の抑制がみられたのが、２，５０４−２，５４３及び２，５１４−２５４３の各配列であった。
【００８４】
さらに、２４５０−２４９０の配列に変異を挿入して詳しく解析した。表９に示した各配列をそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターへ挿入し、これをＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行った。２４５０−２４９０−ＧＡＴは、２４７９番目の塩基をＧ、２４８１番目の塩基をＡ、２４８４番目の塩基をＴに、２４５０−２４９０−ＴＧＣＣは、２４６８番目の塩基をＴ、２４７１番目の塩基をＧ、２４７４番目の塩基をＣ、２４７７番目の塩基をＣに、２４５０−２４９０−ＴＡＴＴは、２４６８番目の塩基をＴ，２４７１番目の塩基をＡ、２４７４番目の塩基をＴ、２４７７番目の塩基をＴに、それぞれ置き換えたものである。
【００８５】
【表９】
2010119385.tif 000010
【００８６】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図１６に示す。２４５０−２４９０−ＧＡＴでは抑制がみられた一方で、２４５０−２４９０−ＴＧＣＣ及び２４５０−２４９０−ＴＡＴＴでは、抑制がほとんどみられなかった。したがって、２４６８−２４７７がコードするＲＮＡの塩基配列（配列番号：４０、塩基配列：ＡＧＧＵＡＣＡＧＵＡ）は、数塩基の変異で大きく抑制が解除されることから、ｍｉＲＮＡの標的配列であると考えられた。
【００８７】
さらに、２５１４−２５４３の領域に変異を挿入して詳しく解析した。表１０に示した各配列をそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターへ挿入し、これをＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行った。２５１４−２５４３−ＡＧＡＡは、２５３３番目、２５３５番目、２５３６番目、２５４１番目、２５４２番目の塩基にそれぞれ変異を入れたものであり、２５１４−２５４３−Ｃは、２５４０番目の塩基に変異を入れたものであり、２５１４−２５４３−Ａは、２５４０番目の塩基に変異を入れたものであり、２５１４−２５４３−ＴＡは、２５３７番目、２５４０番目塩基にそれぞれ変異を入れたものであり、２５１４−２５４３−ＴＡＣＣは、２５３７番目、２５４０番目、２５４１番目、２５４３番目塩基にそれぞれ変異を入れたものであり、２５１４−２５４３−ＴＡＣＴは、２５３７番目、２５４０番目、２５４１番目、２５４３番目塩基にそれぞれ変異を入れたものである。
【００８８】
【表１０】
2010119385.tif 000011
【００８９】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図１７に示す。１塩基に変異を入れた２４１４−２５４３−Ｃ及び２５１４−２５４３−Ａで抑制がほとんどみられなかった。したがって、２５３２−２５４３がコードするＲＮＡの塩基配列（配列番号：４１、塩基配列：ＧＧＣＵＧＣＡＣＵＵＵＡ）は、ｍｉＲＮＡの標的配列であると考えられた。
【００９０】
実施例１２：標的配列に結合するｍｉＲＮＡの同定（２，４６８番目−２，４７７番目）
２４６８−２４７７がコードするＲＮＡの塩基配列（配列番号：４０）を標的とするｍｉＲＮＡを同定した。２４６８−２４７７を含む２，４４８−２，４９７についてＲＮＡｈｙｂｒｉｄ（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒ）を用いて相同性検索を行い、（１）結合エネルギーが−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも強いもの、又は（２）２〜９塩基のうち７塩基が相補的であるもの、を選択した。得られたｍｉＲＮＡを表１１に示す。さらに、これらのｍｉＲＮＡが標的配列にどのように結合しているかを予測した模式図を図１８に示す。
【００９１】
【表１１】
2010119385.tif 000012
【００９２】
実施例１３：標的配列に結合するｍｉＲＮＡの同定（２,５３２番目−２,５４３番目）
２５３２−２５４３がコードするＲＮＡの塩基配列（配列番号：４１）を標的とするｍｉＲＮＡを同定した。２５３２−２５４３を含む２５１３−２５６３について、ＲＮＡｈｙｂｒｉｄ（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒ）を用いて相同性検索を行い、（１）結合エネルギーが−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも強いもの、又は（２）２〜９塩基のうち７塩基が相補的であるもの、を選択した。得られたｍｉＲＮＡを表１２に示す。さらに、これらのｍｉＲＮＡが標的配列にどのように結合しているかを予測した模式図を図１９に示す。
【００９３】
【表１２】
2010119385.tif 000013
【００９４】
実施例１４：ｍｉＲＮＡ標的配列の絞り込み（８，７５０−８，８１４番目）
さらに、実施例６〜実施例８で解析した８７５０−８８１４がコードするＲＮＡの塩基配列（配列番号：２９）をさらに詳細に検討した。８７５０−８８１４、８７５０−８７８０、８７８１−８８０６の各配列をそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターへ挿入し、これをＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行った。図２０に示すように、それぞれ高い抑制効果を示した。
【００９５】
さらに、８７５０−８７８０の配列に変異を挿入して詳しく解析した。表１３に示した各配列をそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターへ挿入し、これをＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行った。ここで、「８７５０−８７８０−ＣＴＡ」は、８７７３番目〜８７７５番目の塩基に変異を入れたものであり、「８７５０−８７８０−ＧＣＣ」は、８７７２番目、８７７３番目、８７７５番目の塩基にそれぞれ変異を入れたものであり、「８７５０−８７８０−ＣＣＧＣＣ」は、８７６７番目、８７６９番目、８７７２番目、８７７３番目、８７７５番目の塩基にそれぞれ変異を入れたものであり、「８７５０−８７８０−ＡＣＧＣＣ」は、８７６６番目、８７６７番目、８７７２番目、８７７３番目、８７７５番目の塩基にそれぞれ変異を入れたものであり、「８７５０−８７８０−ＣＴＧＣＣ」は、８７６７番目、８７６９番目、８７７２番目、８７７３番目、８７７５番目の塩基にそれぞれ変異を入れたものである。
【００９６】
【表１３】
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【００９７】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図２１に示す。８７５０−８７８０の配列に変異が入るとルシフェラーゼ活性が抑制されなくなることから、８７５０−８７８０がコードするＲＮＡの塩基配列はｍｉＲＮＡの標的配列を含むことが明らかとなった。
【００９８】
実施例１５：ｍｉＲＮＡの同定（８，７５０番目−８，７８０番目）
８７５０―８７８０がコードするＲＮＡの塩基配列（配列番号：３０）を標的とするｍｉＲＮＡを同定した。８７５０−８７８０を含む８７３０−８７９５について、ＲＮＡｈｙｂｒｉｄ（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒ）を用いて相同性検索を行い、結合エネルギーが−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも強いものを選択した。得られたｍｉＲＮＡを表１４に示す。さらに、これらのｍｉＲＮＡが標的配列にどのように結合しているかを予測した模式図を図２２及び図２３に示す。
【００９９】
【表１４】
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【０１００】
実施例１６：ｍｉＲＮＡ標的配列の絞り込み（８，７８１−８，８０６番目）
さらに、８７８１−８８０６の配列（配列番号：３３）に変異を挿入して詳しく解析した。表１５に示した各配列をそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターへ挿入し、これをＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行った。ここで、８７８１−８８１４−ＴＣＡＣは、８８１１番目〜８８１４番目の塩基に変異を入れたものであり、８７８１−８８０８−ＴＴＴは、８８０５番目〜８８０８番目の塩基に変異を入れたものであり、８７８１−８８０６−ＡＧＡ、８７８１−８８０６−ＣＧＡ及び８７８１−８８０６−ＡＡＡは、８７９２番目、８７９５番目、８７９８番目の塩基にそれぞれ変異を入れたものであり、８７８１−８８０６−ＡＡＣＡＣは、８７９３番目、８７９４番目、８７９９番目〜８８０１番目の塩基にそれぞれ変異を入れたものである。
【０１０１】
【表１５】
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【０１０２】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図２４に示す。８８０５番目−８８１４番目に変異を入れた配列ではルシフェラーゼ活性が抑制されたが、８７９２番目−８８０１番目に変異を入れた配列では抑制がみられなかった。したがって、８７８１−８８０６が含む、８７８８−８８０２がコードするＲＮＡの塩基配列（配列番号：４２、塩基配列：ＵＧＧＧＵＧＧＣＡＡＧＵＧＧＵ）は、ｍｉＲＮＡの標的配列であると考えられた。
【０１０３】
実施例１７：ｍｉＲＮＡの同定（８，７８８番目−８，８０２番目）
標的配列と考えられるＨＩＶ−１のＤＮＡＮＬ４−３ゲノムの８７８８番目−８８０２番目がコードするＲＮＡの配列（配列番号：４２）に結合するｍｉＲＮＡを検索した。８７８８―８８０２を含む８７６８−８８２４についてＲＮＡｈｙｂｒｉｄ（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒ）を用いて相同性検索を行い、結合エネルギーが−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも強いものを選択した。得られたｍｉＲＮＡを表１６、表１７、及び表１８に示す。また、ｍｉＲＮＡと標的配列との結合の模式図を、図２５、図２６、及び図２７に示す。
【０１０４】
【表１６】
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【０１０５】
【表１７】
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【０１０６】
【表１８】
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【０１０７】
実施例１８：ｍｉＲＮＡ標的配列の絞り込み（８，９６４−９，０００番目）
８，９６４−９,０００の配列（配列番号：３８）に変異を入れて、ｍｉＲＮＡが標的とする配列を絞り込んだ。表１９に記載した各配列をそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクターへ挿入し、これをＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行った。ここで、８８８０−８９９４−ＡＣＧＣＣは８９８１番目、８９８４番目、８９８７番目、８９９０番目、８９９３番目の塩基にそれぞれ変異が入ったものであり、８９６４−９０００−ＡＣＴ及び８９６４−９０００−ＧＣＣは、８９８７番目、８９９０番目、８９９３番目の塩基にそれぞれ変異が入ったものであり、８９６４−９０００−ＡＴＡＣＴ及び８９６４−９０００−ＡＣＧＣＣは、８９８１番目、８９８４番目、８９８７番目、８９９０番目、８９９３番目の塩基にそれぞれ変異が入ったものである。
【０１０８】
【表１９】
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【０１０９】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図２８に示す。８９８１番目−８９９３番目に変異が入ると抑制されなくなることから、８９８１−８９９３がコードするＲＮＡの塩基配列（配列番号：４３、塩基配列:ＧＧＵＧＧＧＵＵＵＵＣＣＡ）にｍｉＲＮＡの標的配列が含まれることが明らかとなった。
【０１１０】
実施例１９：ｍｉＲＮＡの同定（８，９８１番目−８，９９３番目）
標的配列と考えられるＨＩＶ−１のＤＮＡＮＬ４−３ゲノムの８９８１番目−８９９３番目がコードするＲＮＡの塩基配列（配列番号：４３）に結合するｍｉＲＮＡを検索した。８９８１―８９９３を含む８９４４−９０１４についてＲＮＡｈｙｂｒｉｄ（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒ）を用いて相同性検索を行い、結合エネルギーが−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも強いものを選択した。得られたｍｉＲＮＡを表２０に示す。また、ｍｉＲＮＡと標的配列との結合の模式図を図２９に示す。
【０１１１】
【表２０】
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【０１１２】
以上、本発明の核酸についての実施形態を、実施例を用いて説明してきたが、ここで示された実施形態は本発明の一例に過ぎず、特許請求の範囲の精神及び教示を逸脱しない範囲で他の実施形態が存在することは当業者に容易に理解できよう。例えば、ＲＮＡではなくＤＮＡを用いたものであってもよい。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明の核酸は、ＨＩＶ感染症の予防又は治療に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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