(57)【要約】      （修正有）【課題】骨組織の再生及び再構成を促進するための改善された材料及び方法を提供する。【解決手段】骨治癒組み合わせ材料は、骨細胞、骨芽細胞、間質幹細胞又は骨形成骨芽細胞への分化が決定付けられた幹細胞であり得る培養骨形成細胞を担持するマトリックスを含み、前記マトリックスが、天然コラーゲン含有動物組織から得られる精製コラーゲンマトリックス材料と、実質的に天然骨の結晶構造を有し、内在性有機物質を実質的に含まない天然骨から得られる多孔性骨ミネラルマトリックス材料と、前記精製コラーゲンマトリックス材料及び多孔性骨ミネラルマトリックス材料の組合せ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨細胞、骨芽細胞、間質幹細胞、及び骨形成骨芽細胞への分化が決定付けられた幹細胞からなる群より選択される培養骨形成細胞を担持するマトリックスを含む骨治癒材料であって、前記マトリックスが、実質的に天然骨の結晶構造を有し、内在性有機物質を実質的に含まない天然骨から得られる多孔性骨ミネラルを含む、骨治癒材料。
【請求項２】
前記マトリックスが、天然コラーゲン含有動物組織から得られる精製コラーゲンを更に含む、請求項１記載の材料。
【請求項３】
前記コラーゲンが、コラーゲンＩ、コラーゲンIII又はこれらの混合物を含む、請求項２記載の材料。
【請求項４】
前記コラーゲンが、コラーゲンIIを含む、請求項２記載の材料。
【請求項５】
前記間質幹細胞が骨髄に存在し、前記マトリックスが前記骨髄を担持する、請求項１、２、３、もしくは４記載の材料。
【請求項６】
前記骨形成細胞が培養される、請求項１、２、３、４、もしくは５記載の材料。
【請求項７】
骨組織を再構成するための請求項１、２、３、４、５、もしくは６記載の材料の利用方法であって、骨欠損部と請求項１、２、３、４、５、もしくは６記載の材料とを接触させて、前記骨欠損部における骨組織の再構成を促進させることを含む、該方法。
【請求項８】
前記間質幹細胞が骨髄に存在し、前記マトリックスが前記骨髄を担持する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記骨形成細胞が培養される、請求項７もしくは８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願のクロス−リファレンス）
本出願は、２００２年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／３５７,８３９号の利益を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、骨組織の再構成の分野に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術の説明）
上顎骨及びその他の骨格の骨欠損部における骨組織の再生及び再構成を促進するための材料及び方法に対して当業界での要請が残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の概要）
本発明によれば、骨治癒組合せ材料は、骨細胞、骨芽細胞、間質幹細胞（例えば骨髄に存在する）、及び骨形成骨芽細胞への分化が決定付けられた幹細胞からなる群より選択される骨形成細胞を担持するマトリックスを含む。本発明に使用される前記マトリックスは、天然コラーゲン含有動物組織から得られる精製コラーゲンマトリックス材料と、実質的に天然骨の結晶構造を有し、内在性有機物質又は材料を実質的に含まない天然骨から得られる多孔性骨ミネラルマトリックス材料と、前記精製コラーゲンマトリックス材料及び多孔性骨ミネラルマトリックス材料の組合せとからなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】本発明の一実施形態による骨形成細胞を担持する多孔性骨ミネラル材料の正面略図である。
【図２】本発明により処理された骨欠失領域の部分断面の略図である。
【図３】本発明の一実施形態による骨形成細胞を担持する一層コラーゲンマトリックスを示す側面略図である。
【図４】本発明の他の実施形態による骨形成細胞を担持する二層マトリックスを示す側面略図である。
【図５】本発明の別の実施形態による骨形成細胞を担持する三層マトリックスを示す側面略図である。
【図６】本発明のさらに他の実施形態による骨形成細胞を担持する一層マトリックスを示す側面略図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
（発明の詳細な説明）
上述のように、本発明により使用するためのマトリックス材料は、コラーゲンマトリックス材料、多孔性骨ミネラルマトリックス材料又はこれらの組合せであることができる。
【０００７】
図１は、本発明の一実施形態により、骨形成細胞１２を担持する多孔性骨ミネラルマトリックス材料１０を示す。多孔性骨ミネラルマトリックス材料１０は以下により詳細に記載され、一実施形態により、コラーゲン材料１４と共に任意に充填又は注入される。
図２は、上顎骨又はその他の骨格にあり得る骨１８における骨欠損部１６を示す。図２に示される実施形態では、本発明による骨形成細胞を担持する多孔性骨ミネラルマトリックス材料１０を骨欠損部１６に詰める。骨ミネラルマトリックスの詰め物１０は、いずれかの適当な手段、例えばファスナー２２により膜２０をその場所に保持させることができる。ある実施形態では、膜２０は本発明による骨形成細胞を担持するコラーゲンマトリックスである。他の実施形態では、骨欠損部は、骨ミネラルマトリックス１０を付加せずに、本発明による骨形成細胞を担持するコラーゲンマトリックス２０により覆われる。
【０００８】
一実施形態によれば、上記コラーゲンマトリックス材料は、細胞付着を阻止するために少なくとも一つの平滑面を有し、細胞の通過を防ぐバリヤーとして作用する、少なくとも一つのバリヤー層が含まれるコラーゲン膜材料である。バリヤー層は更に平滑面の反対側に繊維面を有し、この繊維面上には細胞増殖が可能である。平滑面は治療領域から離れた位置にあることが好ましく、繊維面は治療領域の方を向いていることが好ましい。好ましい実施形態では、バリヤー層は、主としてコラーゲンＩ、コラーゲンIII又はこれらの混合物である。適当な一材料は、本発明の譲渡人であるEd. Geistlich Soehne AG fur Chemische Industrieからのビオガイド(Biogide)（登録商標）である。ビオガイド（登録商標）材料は、米国特許第５,８３７,２７８号に記載され、これは参考として本明細書に援用される。ビオガイド（登録商標）は、ブタの腹膜に由来するものであり得る。図３に示される材料は、細胞付着を阻止するために少なくとも一つの平滑面を有し、細胞の通過を防ぐバリヤーとして作用する、少なくとも一つのバリヤー層１１５が含まれる。バリヤー層１１５は更に繊維面１１８を有する。
【０００９】
本発明によって使用され得る多層膜はバリヤー層を含み、また、開孔スポンジ様テクスチャーを有する主としてコラーゲンIIのマトリックス層を更に含む。そのようなコラーゲン膜は、１９９７年１０月１０日出願の英国特許出願第９７２１５８５.９号の優先権主張に基づく、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０２９７６号、２０００年４月７日出願の米国特許出願第０９／５４５,４６５号に記載されている。これらは参考として本明細書に援用される。この膜は図４に示されるようなバリヤー層１１５を含み、また、開孔スポンジ様テクスチャーを有する主としてコラーゲンIIのマトリックス層１２０を更に含む。
【００１０】
本発明によって使用され得るその他の多層膜は、開孔スポンジ様テクスチャーを有する主としてコラーゲンIIの中心マトリックス層を間にはさんだ一対のバリヤー層を含む。この実施形態によると、バリヤー層の平滑面は外側を向いており、バリヤー層の繊維面はマトリックス層の方の内側を向いている。この膜は、図５に示されるような、二つのバリヤー層１１５を含み、それぞれ外側を向いた平滑面１１６と、それらの間にはさまれたコラーゲンIIマトリックス層１２０とを有する。
【００１１】
図６は、単一コラーゲンIIマトリックス層１２０が本発明による骨形成細胞を担持する別の実施形態を示す。
【００１２】
コラーゲンは、動物体内においていくつかの形で存在し、様々な組織は様々な割合でそれぞれのタイプを含む。骨コラーゲンは、主としてコラーゲンＩ及びIIIを含む。軟骨は、少量のコラーゲンVI、IX、Ｘ、XI及びXIIIと共に主としてコラーゲンIIを含む。皮膚及び腱由来のコラーゲン材料は、ほとんどコラーゲンＩ及び／又はIIIから構成されている。
【００１３】
従って、本発明の一態様によれば、主としてコラーゲンIIの繊維を含む軟骨組織の再構成用の再吸収性細胞外マトリックスを提供することにある。
【００１４】
本発明によるコラーゲンIIマトリックスは、少量のコラーゲンVI、IX、Ｘ、XI及びXIII含むことができる。本発明によるマトリックスは、例えばコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸及びヒアルロン酸などのグリコサミノグリカンを含むヒドロゲル様材料も含むことができ、これらは、軟骨細胞が包埋されて増殖できる天然媒質を提供する。本発明によるマトリックスは、０．１〜４０重量％、例えば１〜１５重量％、例えば約２〜３重量％、最も好ましくは約２．５重量％のグリコサミノグルカンを含むことができる。
【００１５】
本発明によるマトリックスは、脱脂及び、グリコサミノグリカンと共にコラーゲン材料を残す他の処理を受けている何れかの天然軟骨材料を含むことができ、あるいは精製コラーゲンの繊維を、グリコサミノグリカン及び／又は何れかの他の添加物と混合させることができる。そのような追加の添加物は、例えば軟骨細胞のコラーゲン繊維への付着を助けるアンコリンII又はコンドロネクチン、並びに軟骨誘導因子（ＣＩＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）及びトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）などの増殖因子を含むことができる。
【００１６】
骨組織の再生を助けるためには、生体内の移植の前又は後の何れかに、マトリックスには骨細胞、骨芽細胞、間質幹細胞（例えば骨髄に存在する）又は骨芽細胞形成幹細胞が注入される。移植直前にマトリックスには、例えば注射（injection）によって細胞が注入され得る。一方、一般には、移植後に細胞の懸濁液の直接注射によってマトリックスに細胞を導入することが見込まれる。この方法で、マトリックスに存在する細胞は、新しい骨の再生をもたらすことができる。
【００１７】
本発明における使用のための骨細胞、骨芽細胞、骨芽細胞形成幹細胞は、骨芽細胞又は骨芽細胞形成幹細胞を含む組織から単離された同種又は自己細胞を含む細胞供給源から得られることができる。同種細胞は、免疫反応及び感染性合併症の潜在性を有するから、自己細胞から骨芽細胞又は骨芽細胞形成幹細胞を単離することが好ましい。細胞を採取する技術は公知であり、酵素的消化又は外増殖（outgrowth）培養が挙げられる。採取した細胞はそれから細胞培養で増やし、その後、体内に再導入する。骨組織の最適な再生をもたらすためには、一般的に、少なくとも１０6、好ましくは少なくとも１０7の細胞をマトリックスに注入するべきである。
【００１８】
これとは別に、間質幹細胞を含む骨髄又は骨髄誘導体をマトリックスに充填することができる。
【００１９】
一般的に、本発明によるマトリックスは、ヒアルロン酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラチン硫酸、デルマタン硫酸などのグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）を含むことが望ましく、これらは、骨芽細胞又は骨芽細胞形成幹細胞が包埋されて増殖することができる天然媒質を提供するのに役立つ。軟骨からのものと必ずしも同じ組成、分子量及び生理的特性をもたない様々な供給源からのグリコサミノグリカンをマトリックスに組み込むことが可能であるが、より好ましいグリコサミノグリカンは軟骨そのものから抽出したものである。
【００２０】
天然コラーゲン組織では、ＧＡＧｓは、少なくとも一部分がプロテオグリカン（ＰＧｓ）の一成分として存在する。ＰＧｓの形でのＧＡＧｓの使用は、ＰＧｓのタンパク質含有量によって生じ得る潜在的な免疫学的問題を考慮して望ましくない。従って、マトリックスは、好ましくはいかなるプロテオグリカンを実質的に含まない。好都合には、これは精製された無テロペプチドのコラーゲン材料とグリコサミノグリカンとの混合物からマトリックスを調製することによって実現され得る。
【００２１】
マトリックスに存在するその他の添加物には、例えば軟骨細胞のコラーゲンII繊維への付着を助けるコンドロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸カルシウム又はアンコリンII、骨及び軟骨細胞増殖促進ホルモン類、並びに軟骨誘導因子（ＣＩＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ホモダイマー又はヘテロダイマーとして存在するトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）などの増殖因子、及び天然又は組み換えヒトＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３（オステオゲニン）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ｂＦＧＦ、ＣＤＭＰなどの骨形成因子（ＢＭＰｓ）、又はその他の骨格マトリックス分子、並びにトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１）、血管内皮増殖因子（ＥＧＦ／ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ／ＩＧＦ−１）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）などのシグナルペプチドが挙げられる。これらをコードする核酸配列、又はこれらの生体内での生成を誘導又は促進可能である核酸配列を、本発明のマトリックス材料に組み込むことができる。
【００２２】
上述のように、本発明に使用する生成物は、骨生成細胞への分化に関与する幹細胞のための担体としても作用することができる。このような幹細胞は、試験管内で増殖させてそれらの数を増やすことができ、増殖因子と共に又は増殖因子を伴うことなく担体マトリックス中で修復部位に適用される。一例としては骨髄間質細胞である。これらをコードする核酸配列、又はこれらの生体内での生成を誘導又は促進可能である核酸配列を、本発明のマトリックス材料に組み込むことができる。
【００２３】
ＢＭＰ−２は、独立的に骨形成の二経路−骨の直接形成と、軟骨の形成（これはその後除去され骨に置き換わる）と−に影響を与える。種々の供給源の皮質骨からの抽出により得られた骨マトリックスを含むＢＭＰｓとコラーゲンとの複合体は、約９０％のコラーゲンと、約１０％の、ＢＭＰ活性用又はＢＭＰ／ＮＣＰ誘導性軟骨形成用の非コラーゲン性タンパク質（ＮＣＰ）とを含む。骨マトリックス不溶性コラーゲン性マトリックス及びラミニン又はフィブロネクチンは、ＢＭＰｓの担体として作用する。一般に、マトリックスは約１００μｇ〜約５ｍｇの増殖因子を含むことができる。これらをコードする核酸配列、又はこれらの生体内での生成を誘導又は促進可能である核酸配列を、本発明のマトリックス材料に組み込むことができる。
【００２４】
本発明により使用するためのマトリックス材料は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、体内のカルシウムの調節に関与するポリペプチドを充填することもできる。これらをコードする核酸配列、又はこれらの生体内での生成を誘導又は促進可能である核酸配列を、本発明のマトリックス材料に組み込むことができる。
【００２５】
上述のように、本発明は、遺伝子又は核酸補充マトリックスを、そこに組み込まれた細胞増殖促進遺伝物質又はＤＮＡと共に含むことができる。マトリックス材料は、細胞増殖促進遺伝物質の持続した放出を提供することができる。マトリックスから体内への放出において、上記遺伝物質は、細胞増殖及び治癒を促進するように体内において細胞を形質転換することができる。
【００２６】
本発明は、細胞増殖促進核酸配列を充填するマトリックス材料、好ましくは単離又は精製された核酸配列を提供することもまたできる。その配列は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列であることができる。特に好ましい実施形態では、マトリックス材料は単離された遺伝子配列、最も好ましくは単離されたＤＮＡを充填する。
【００２７】
本発明により使用するための核酸配列は、軟骨細胞増殖、骨細胞増殖又はその両方を促進することができる。
【００２８】
本発明により使用するための精製された治療用核酸配列は、何れかの適当な供給源から得られることができ、マトリックス材料に充填されて細胞増殖を促進することができる。一実施形態では、レトロウィルスベクター、又は何れかの他の適当な遺伝子運搬（carrying）及び遺伝子導入メカニズムが利用される。例えば、レトロウィルスベクターは、ヒト骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）ｃＤＮＡを間葉系幹細胞に安定的に導入するために利用できる。
【００２９】
遺伝子治療は、治療遺伝子又はその他の遺伝子物質の細胞及び組織への送達を含む。
【００３０】
更に以下に記述されるように、本発明のコラーゲンマトリックスは、水性コラーゲンスラリーの形成、スラリーの任意部分脱水、所望形状へのスラリーの成形、スラリーの乾燥、化学、紫外線（ＵＶ）放射又は熱水架橋によるコラーゲン繊維の部分架橋、及びインプラント材料の滅菌により調製することができる。あるいは、化学架橋などの架橋は、スラリーの調製後及び成形より前に行うことができる。
【００３１】
好ましい実施形態では、成形された材料は凍結乾燥により乾燥され、約０．１〜５００μｍの範囲内の孔サイズを達成する。本発明によるマトリックス用の好ましい孔サイズは、約５０〜４００μｍの範囲内、最も好ましくは約７０〜１２０μｍの範囲内である。
【００３２】
好ましくは凍結乾燥後のマトリックスの密度は、約０．１〜０．３ｇ／ｍ3、好ましくは約０．１８〜０．２２ｇ／ｍ3、最も好ましくは約０．２ｇ／ｍ3の範囲内である。
【００３３】
コラーゲン材料は、凍結乾燥工程の前又は後に架橋させて、マトリックスを安定化することができる。これはマトリックスの機械的安定性を高め、体内による吸収速度を低下させるのにもまた役立つ。理想的には、架橋度は、マトリックスの分解速度が組織再生の速度に合うように決められなければならない。物理的には、架橋は加熱によって行われ得るが、これは望ましくない吸収性減少を避けるために注意深く行わなければならない。１００〜１２０℃の温度に約３０分〜約５時間加熱することが好ましい。より好ましくは、架橋はＵＶランプを使用して、例えば８時間までＵＶ照射を行うことができる。
【００３４】
上述のように、コラーゲンマトリックス材料は、グリコサミノグリカン類（ＧＡＧｓ）を有利に含む。後者は実際にコラーゲンと反応し、若干の架橋を行い、不溶性生成物を生成する。必要ならば、更なる架橋は、上記のように材料の加熱、ＵＶ照射によって、又は更なる化学架橋によって行うことができる。グリコサミノグリカンとコラーゲンとの反応は、周囲温度で、ｐＨ２．５〜３．５範囲で行うことができる。材料はこのような処理後直ぐに凍結及び凍結乾燥にかけるのがよい。
【００３５】
例えば、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）などのＧＡＧｓは、公知の方法を利用して、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用してマトリックスに共有結合させることができる。ＥＤＣ／ＮＨＳ架橋は、デルマタン硫酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸、及びヒアルロン酸、並びに上記のようなＣＳが含まれ得る、ＧＡＧｓをマトリックスに固定するために利用することができる。
【００３６】
スラリー形成は、コラーゲン塊のｐＨを高めることによって行うことができる。この操作では、その塊を約４℃に冷やし、冷ＮａＯＨ水溶液を４℃でｐＨ値が約６．５〜７．５になるまで添加することによりｐＨ値をゆっくりと上昇させる。その後、その塊を周囲温度に約１５〜２５時間保持する。このときに、スラリーが形成され、スラリー形成後、その塊を成形して凍結及び凍結乾燥することができる。
【００３７】
もう一つの別の方法は、空気を除去した後、コラーゲン塊をｐＨ値約６．８〜７．４にまで中性にする。混合物を型に入れ、３７℃で約１５〜２０時間インキュベートする。微細なスラリーが生じ、それをその後凍結及び凍結乾燥することができる。
【００３８】
スラリーの成形後、材料は凍結させる。再現可能な孔サイズを得るために、凍結は注意深く調節しなければならず、凍結速度及び時間、ｐＨ値及び粒子サイズは、正確に調節しなければならない。
【００３９】
次にマトリックスを凍結乾燥し、続いて約１１０〜１３０℃に加熱する。このやり方で、若干の架橋が行われる。その後、凍結乾燥したマトリックスを必要な厚さに調整することができる。次にこのマトリックスを、例えばガンマ照射又はエチレンオキシドによって滅菌する。強い照射、例えば線量２５ｋＧｙの60Ｃｏの照射による滅菌はＢＭＰｓを不活性化することがある。このような状況では、滅菌マトリックスは移植前に滅菌食塩水中のＢＭＰｓを注入することができる。
【００４０】
本発明によるマトリックスの厚さは、約０．２〜２ｃｍ、好ましくは約０．３〜１．５ｃｍ、より好ましくは約０．４〜１ｃｍ、最も好ましくは約０．５〜０．８ｃｍの範囲内であることができる。
【００４１】
架橋を行うときは、化学薬剤を利用して行うことができ、種々のアルデヒド類、例えばヒアルロン酸ポリアルデヒド、ホルムアルデヒド又はグリオキサールを使用することができる。適当な化学架橋薬剤としては、ヒアルロン酸ポリアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ジ−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）又はＥＤＣとＮＨＳとの混合物が挙げられる。
【００４２】
様々な、時として望ましくない特性を有する広範のグリコサミノグリカン及びプロテオグリカンが存在する。従って、軟骨からのグリコサミノグリカンと同一の組成、分子量及び生理的特性をもたない様々な供給源からのグリコサミノグリカンをマトリックスに組み込むことが可能であるが、軟骨そのものからのグリコサミノグリカンを使用することが特に好ましい。
【００４３】
上述のように、マトリックスが水性液体と接触したときに膨潤する範囲を制約し、一方ではマトリックスの再吸収能を保持しておくために、コラーゲンマトリックスをある程度の架橋させておくことが望ましい。そのような膨潤は、強度及び形状を失うことになる。本発明によるマトリックスは、軟骨組織を脱脂し次いで塩基による処理を施し、これによってプロテオグリカン及びグリコサミノグリカンを除去することによって有利に製造することができる。
【００４４】
軟骨材料は、通常には容易に入手可能な動物供給源、例えばウシ、ヒツジ又はブタからの材料である。好ましい材料はブタからのヒアリン軟骨である。これは望ましい比率でコラーゲン及びグリコサミノグリカンを含有し、適当に大量で入手可能である。
【００４５】
軟骨は、屠殺後冷凍し、例えば約８ｍｍの粒子径にサイズを小さくすることが好ましい。サイズを小さくする前に、軟骨を水に浸漬し、そして肉、骨及びその他の所望でない材料を機械的に分離することが好ましい。
【００４６】
次にこの粒子状の軟骨をアセトンなどの水混和性有機溶媒で処理することにより脱水させることが好ましく、これは若干の脂肪を除去するためにも有用である。脱水はコラーゲン繊維を収縮し、相互に分離し、その次の脱脂工程が最適化されるようになる。次に材料を炭化水素などの脂肪溶媒、例えばヘキサン又はハロゲン化炭化水素で脱脂させる。
【００４７】
脱脂後、材料を完全に洗浄し、本来存在していた水量と同じ量を取り込むまで洗浄を続ける。この操作により、この材料は以下の塩基処理のために最適化される。
【００４８】
塩基処理は、強アルカリ、例えばアルカリ金属水酸化物、例えば水酸化ナトリウムで例えば１〜８重量％の濃度で行うことができる。処理時間は、原材料及びアルカリ濃度によって変わるが、一般には１０〜４８時間である。処理温度は一般に２０℃以下である。ｐＨ値は、通常は１２〜１４の範囲である。上述の条件は、ＮａＯＨによる処理に対して最適なものである。他の塩基による処理では、若干変更した条件を必要とすることがある。
【００４９】
塩基処理は以下の効果を有する：
少量の残留脂肪がけん化される。非コラーゲンのアルカリ可溶タンパク質が変性され、破壊され、溶解され、そして除去される。
コラーゲン中のアミド基がけん化され、それによってコラーゲンの電荷及び等電点が変わる。
細菌、プリオン及びウイルスが不活性化され、これによりコラーゲンが滅菌される。
【００５０】
この処理によりプロテオグリカンが、以下のように特徴付けできる有用な修飾を受けることが見い出される：
【００５１】
プロテオグリカン中のグリコサミノグリカンとコアタンパク質との共有結合が開裂される。これによってグリコサミノグリカンを、プロテオグリカンのタンパク質から脱離することができる。これをβ−脱離と称する。
【００５２】
塩基処理により、コアタンパク質が小さいペプチドに分断され、これらは透析又は限外濾過によって反応混合物から除去することができる。
【００５３】
強い負電荷のために、グリコサミノグリカンは水溶性塩を形成し、これらはコラーゲンから部分的に洗浄されることができる。しかしながら、これらは塩基処理では開裂されないか又はごく僅か開裂されるだけであり、透析によりペプチドから分離することができる。グリコサミノグリカンの一部分（コラーゲンの約３重量％）はコラーゲンに結合している。
【００５４】
精製されたグリコサミノグリカンは、塩基処理工程から生じた抽出物を透析又は限外濾過することによって得ることができる。
【００５５】
本発明の操作によれば、酵素的処理は種々の異なる物質が存在することを見込んで一般には使用されない。しかしながら、次の工程には材料を有機酸又は無機酸、例えば塩酸で処理することが含まれる。
【００５６】
これは以下の効果を有する：
必要としない酸感受性材料が除去される。繊維構造が緩められる。
次に材料は、一般には材料のｐＨ値が２．５〜４．０となるまで洗浄される。材料のｐＨ値は正確に調節することが好ましい。材料のｐＨ値は軟骨の横断面にわたって均一にするべきである。
【００５７】
酸処理後、軟骨は水膨潤状態である。次に材料は例えばコロイドミルを用いて機械的にサイズを小さくさせる。次に水性媒質中のコラーゲンの濃度は約２．５〜３．５重量％である。この混合物のｐＨ値は、若干酸性、例えば３．５〜４．５にすべきである。
【００５８】
この点で、１つ以上のグリコサミノグリカンを、精製されたコラーゲン塊に、例えばコラーゲンの０．１〜４０重量％、好ましくは１〜１５重量％の範囲で加えることができる。
【００５９】
コラーゲンに加えるグリコサミノグリカンは、上述のように天然軟骨から抽出されることが好ましい。マトリックスはコラーゲンのほかに、グリコサミノグリカンヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びケラチン硫酸を含む。コンドロイチン硫酸及びケラチン硫酸はコアタンパク質に共有結合されているが、実際にヒアルロン酸はプロテオグリカンに結合されてはいるが共有結合的にではない。
【００６０】
塩基の作用によってコアタンパク質との結合が開裂し、グリコサミノグリカンがタンパク質から遊離される。更に、コアタンパク質は小さいペプチドに開裂され、これらは透析又は限外濾過によって容易に除去される。コアタンパク質が免疫学上活性であり得るから、コアタンパク質が除去されることが重要である。従って、コアタンパク質の除去が、本発明の方法の重要部分である。
【００６１】
塩基抽出物からのグリコサミノグリカンの回収は、以下のように行うことができる：
媒質を６〜８の範囲のｐＨ値に中和する。
非コラーゲンタンパク質をカオリンなどの吸着剤による処理によって除去する。
液体の限外濾過は１００００ダルトン未満の分子量の通過を可能とする膜を用いて行われる。
液体の濃縮は約２〜５重量％の固形分含量まで行われる。
【００６２】
グリコサミノグリカンをコラーゲンと混和した後、材料をコロイドミル中で更に均質化し、固形分含量を１．５〜２．５重量％に調整する。次にこの塊を２つのタイプの製品、即ちスポンジ又はコラーゲンシートの製造に用いることができる。
【００６３】
スポンジの製造には、均質化により得られる塊を冷凍する。冷凍は正確に調節しなければならず、これにより冷凍時間、ｐＨ値及び粒子サイズは再現可能な孔サイズを提供するために正確に維持される。次に、冷凍生成物を凍結乾燥する。凍結乾燥後、スポンジを少なくとも２時間１２０〜１４０℃に加温する。このようにして材料は軽度の架橋によって安定化される。凍結乾燥後、材料を所望の厚さに切断し、必要な形状に打ち抜きし、滅菌し、そして包装する。
【００６４】
不十分な強度のためにスポンジの使用はいくつかの分野で使用が制限されているので、本発明によるコラーゲンマトリックスは広範囲の医療適応で使用するのに適したコラーゲンシートの製造に有利に使用することができる。
【００６５】
コラーゲンシートの製造には、液状懸濁液中の精製コラーゲン繊維の濃度は、０．２〜３重量％、有利には０．５〜２重量％の範囲にあるべきである。空気は除いておくことが好ましい。
【００６６】
次に中間工程としてゲルを形成させる。コラーゲンゲルの製造は、ゲル形成のための既知の様々の技術によって行うことができる。
【００６７】
次にゲルを通常はプレートの上で乾燥させる。このようにして水が除去されるだけではなく、細胞の増殖に非常に有益である不溶性コラーゲン−グリコサミノグリカン生成物が形成される。
【００６８】
上述のように、本発明による使用のためのマトリックスは、多孔性骨ミネラルマトリックス材料又はコラーゲンマトリックス材料と多孔性骨ミネラルマトリックス材料との組合せを含むことができる。本発明により使用されるマトリックス材料を含む骨ミネラルは、本発明によるコラーゲンマトリックス材料に関する上記概要のように何れかの適当な添加物を含んでよい。
【００６９】
精製した骨ミネラルは、例えば国際特許出願第ＷＯ８６／０７２６５号（ＰＣＴ／ＧＢ８６／００３１０）に記載されるような生成物であってもよい。このような生成物は、例えばウシ大腿骨などの粒子状の骨を厳密に脱脂し、アンモニア又は有機アミンで処理して、残ったタンパク質を分解し、続いて大量の水で洗浄することによって調製してもよい。こうした材料は、実施において再吸収可能を維持し、改造プロセスを助ける。
【００７０】
また、粒子状の海綿骨又は皮質骨を例えば９００℃で２４時間、か焼することによって、精製した骨ミネラルを調製することも可能である。このように、か焼した骨ミネラルは、永続的な非再吸収可能なインプラント、例えば顎堤追加物が要求されるときに用いられる。いずれの場合においても、有機材料を除去した後に骨は過度に脆くなり、その強度は本発明による処理によって大きく改善される。
【００７１】
本発明は、上顎骨における、膝および脊椎などの関節における、骨組織の欠損部を再構成するために有用である。
【００７２】
本発明のための骨ミネラル生成物は、多孔性骨ミネラルの粒子及び／又はコラーゲン繊維を含んでもよく、骨芽細胞及び骨細胞に対する基質を与えることによって骨の再生をもたらす。
また、本発明の生成物のコラーゲンは、脆い骨ミネラルに強度を付与する。
【００７３】
本発明の一態様によれば、精製した粒子状の骨ミネラル生成物は、医学用途のために提供され、前記ミネラルの粒子は、あらゆる内因性の有機材料を実質的に含まず、少なくともその表面に再吸収可能で生理的適合性のコラーゲン材料、好ましくはコラーゲンII材料を有する。
【００７４】
屠殺した動物から得られる骨は、大量に入手可能な安価な原材料である。それはコラーゲン組織によって結合される５０〜６０％の非常に細かく結晶化したヒドロキシルアパタイトを含み、かなりの量のタンパク質及びその他の物質、並びに関連する脂肪及び筋肉組織を含む。その生物学的に形成された結晶構造から見て、それは高度に生体適合性の補てつ骨代替品としても考えられる。また大きい比表面積を有することから、それは例えば吸収剤又は緩効性薬のための支持体としても用いることもできる。
【００７５】
天然の骨ミネラルは、特定の程度の結晶性、性質及び大きさ（不規則なプレート様の形態、厚さ５−１０ｍｍ、長さ１０−５０ｍｍ）、並びにカルシウム対リン酸塩の比（３７．５−３８．０％カルシウム及び１５．５−５１９．０％リン）から得られる界面化学を有する微結晶などのヒドロキシアパタイトを含む。また、天然の骨ミネラル中には、少量の非結晶性の相と、ミネラルのブルッシャイト（Brushite）及びニヒトロッカイト（Nihitlockite）及びオクタ−リン酸カルシウムを含むその他のリン酸カルシウム結晶性の相とが存在する。骨の無機相は、天然に生じる微結晶及び有機相の除去により生成された微結晶の間の超微細構造の間隔（１０−１００ｍｍ）を含む多孔性、微細な空間（１−２０ミクロン、骨細胞の裂孔、小管、血管の通路、フォルクマン管、及びハーバース系の管（１００−５００ｍｍ）を含む）を含む。多孔性の尺度である比表面積は、水銀多孔度測定によって決定されるときに５０〜１００ｍ2／ｇｍの範囲である。骨ミネラルの結晶性は、Ｘ線回折と、電子顕微鏡法による多孔性、微結晶の形態及び大きさによって特徴付けることができる。熱重量分析によって少量の非アパタイトの微結晶を検出することができる。
【００７６】
しかしながら、天然の骨ミネラルの組成及び構造は、試験管内で形成した生成物又は予め調製された天然産出のヒドロキシアパタイトによって複製することはできない。天然の骨ミネラルを精製するための２つの方法、即ちか焼及び溶媒抽出が提案されている。
【００７７】
か焼の際に骨の有機構成成分の灰化のために必要とされる温度は、やや高い。これは、かなり粗い結晶の形成と共にミネラル部分の広範囲の再結晶化が起こる。このようにして形成された材料は比較的小さい比表面積を示す。従って、このような材料は、移植において新たな骨を形成するために容易に改造されず、インプラントはいつまでも改造されないままとなるが、これはいくつかの目的に対しては許容可能であり得る。
【００７８】
抽出プロセスにおいては、適当な溶媒を用いて、脱脂した骨からタンパク質を抽出する。次にその結果得られる骨ミネラルを洗浄して溶媒を除去する。
【００７９】
どちらの場合でも、天然の骨から有機不純物が除去されて骨ミネラルのみが残ると、その材料の強度は急激に減少し、その結果、精製した骨ミネラルの個々の断片は極端に脆くなる。これは、材料の取り扱いが難しくなり、移植において望ましくない影響がもたらされるおそれがある。
【００８０】
骨ミネラルは、通常平均直径０．１〜１０ｍｍの範囲の粒子の形である。コラーゲンII繊維に組入れるための粒子は、好ましくはスポンジフォサ（spongifosa）骨であり、一般的には大きさが０．１〜５ｍｍの範囲、好ましくは０．５〜２ｍｍの範囲にある。骨ミネラル粒子を密に詰めるために、２つ以上の粒子の大きさの混合物、例えば０．２５〜１ｍｍ及び１〜２ｍｍ、又は広範囲の例えば０．２５〜２ｍｍの大きさの粒子を用いることが有益であり得る。
【００８１】
精製した骨ミネラルは、例えば上述の方法によって得られてもよい。従って、例えば、エーテル例えばジメチルエーテル、ケトン例えばアセトン、又は炭化水素若しくはハロゲン化炭化水素例えばヘプタン又はメチルシクロヘキサン又はトルエンのような、１つ以上の慣用の脂肪溶媒を用いて脂肪を除去してもよい。
【００８２】
手順を更に進める前に、エタノールなどの水混和性溶媒による中間抽出によって、トルエンなどの抽出用溶媒を除去することが有利であり得る。コラーゲン材料は、好ましくは高温にて、例えばグリセロール中の水酸化カリウムなどの塩基のようなタンパク質分解剤、又は例えばエチレンジアミンなどのアミンのような有機塩基、又はホルムアミドなどのアミドを用いて溶解させてもよい。このような薬剤は水洗による除去を容易にするために水混和性であることが好ましい。特に良好な結果は、還流するエチレンジアミンによって抽出した骨を用いて得られている。
【００８３】
抽出は各段階において、必要であれば溶媒を交換しながら、それ以上の材料が抽出されなくなるまで、例えば１週間から２週間までの間続けることが有利であり得る。最初のタンパク質除去の後、骨は抽出前よりもその段階においてより砕け易くなっているため、更に細かく砕くことが有利であり得る。塩基による処理の後、例えば蒸発及び／又は適当には水洗によって、過剰な溶媒が厳密に除去される。
【００８４】
この材料は通常、乾燥工程にかける。この段階において、例えば更なる精製をもたらし得る熱処理によって材料を滅菌することが便利であり得る。
【００８５】
一般に所有する米国特許第５，５７３，７７１号（参考として本明細書に援用する）は、骨ミネラルをタイプＩコラーゲン（コラーゲンＩ）、又はタイプＩコラーゲンとタイプIIIコラーゲンとの混合物（コラーゲンＩ及びコラーゲンIII）で作られたマトリックスによって強化される医薬用の骨ミネラル生成物を開示する。
【００８６】
コラーゲンは、動物体内においていくつかの形で存在し、様々な組織は様々な割合でそれぞれのタイプを含む。薬品及び化粧品に用いられるコラーゲンスポンジ材料は一般的に皮膚及び腱に由来するものであり、主としてコラーゲンＩ及び／又はコラーゲンIIIを含む。骨コラーゲンは主としてコラーゲンＩ及びコラーゲンIIを含む。
【００８７】
コラーゲンII材料は、実質的に純粋なコラーゲンIIに加えて、コラーゲンIIと共に混合された種々の割合のコラーゲンＩ、コラーゲンIII及びそれらの混合物を含んでもよい。例えばコラーゲンII材料は、約０．１−１０重量％（好ましくは約０．１−５重量％）のコラーゲンIII、及び／又は約１−５０重量％のコラーゲンＩが混合されてもよい。
【００８８】
コラーゲンII材料は、製造及び使用における生成物の取り扱い特性を改善するために、個々の粒子の各々を注入してもよい。その場合には、コラーゲンII材料：精製された骨ミネラルの重量比は、有利には１：４０より大きく、好ましくは１：８より大きく４：１より小さい、好ましくは１：２より小さい。有利には、コラーゲンII材料は、約１−３０重量％、好ましくは約５−１５重量％の本発明の骨ミネラル生成物を含む。コラーゲンII材料は骨ミネラルの多孔性構造に入り込み、骨ミネラルに強度を与えるが、骨ミネラルの移植において免疫組織反応も与える天然の骨にあらかじめ存在する天然タンパク質材料のいくつかを効果的に置換する。
【００８９】
コラーゲンII材料は、成形物を形成し得る粒子状の骨材料用のマトリックスを与えるために用いられてもよい。この場合には、ゼラチンのようなゲル形成高分子物質と共にコラーゲンIIを用いることも可能である。繊維材料：骨ミネラルの重量比は、例えば１：４０〜３：２０の範囲、例えば約１：１０であってもよい。ゲル相は、２〜２０重量％、例えば約５％の骨ミネラルの量であることが有利である。ゲル相としてゼラチンを用いるとき、それは例えば約０．２８のホルムアルデヒドで軽く架橋させてもよい。
【００９０】
骨ミネラルは、スポンジフォサ（spongifosa）骨から得ることが好ましく、コラーゲンII繊維とつながれて、マトリックスに物理的強度を加える。好ましい実施形態では、本発明による骨ミネラル／コラーゲン生成物をマトリックスとして用いて、付加的な骨欠失が存在する関節中の軟骨の欠損部を再生する。
【００９１】
本発明による骨ミネラル生成物は、上顎、膝、足、脊椎などにおける骨の再生のために用いられてもよく、また例えば腰骨から大腿骨部の修正を含む整形外科手術における改造インプラント又は補てつ骨代替品、例えば外傷における骨欠失部の代替、顎顔面手術における改造、又は顎堤追加物を含む歯周の欠損部及び抜歯窩の充填として用いられてもよい。本発明の注入された粒子材料は、種々の骨の窩洞に詰め物をするために用いることができ、その減少した脆さは取り扱い及び詰め物をする手法を助けることにおいて重要である。
【００９２】
本発明は、上顎骨の欠損部の修復や、軟骨とその下にある骨との両方が損傷を受けている関節の欠損部の再生に適用可能である。本発明の骨ミネラル／コラーゲン生成物は、骨の損傷領域を充填するために用いることができ、次いで骨欠損部の充填された領域をコラーゲン膜で覆うことができる。
【００９３】
再生を促進するために、移植前に本発明の骨ミネラル／コラーゲンマトリックスに細胞外で培養した骨芽細胞又は骨芽細胞形成幹細胞を加えることもでき、切開手術又は関節鏡手術の際に、その充填したマトリックスを移植できる。あるいは、又はそれらに加えて、移植したマトリックスをコラーゲンＩ、II及び／又はIIIを含むコラーゲン膜によって覆うことができ、又は合成膜によって覆うことができる。このようなコラーゲン膜又は合成膜は、細胞外で培養した骨芽細胞又は骨芽細胞形成幹細胞と共に代替的又は付加的に充填されてもよく、この膜は切開手術又は関節鏡手術によって充填された骨インプラントの上に適用される。
【００９４】
上述の国際特許出願に示されるように骨が薬剤担体として用いられるとき、骨ミネラルは１つ以上の吸収された薬剤又はその他の生理活性物質を有用に担持することができる。一実施形態によれば、本発明の生成物は、少なくとも１つの吸収された医薬もしくは生物活性物質、又は軟骨及び／又は骨を再生するための細胞に分化する能力を有する間葉幹細胞を含む。
【００９５】
骨ミネラルに吸収され得る生理活性物質は、少なくとも部分的に水溶性であることが好ましく、例えばペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシドなどの抗生物質、スルホンアミド、特にホルムアルデヒドとタウリンアミド又はＮ−置換タウリンアミドとの縮合生成物などの抗菌物質を含む。この後者の化合物は、下記式によって表わされることができ、
【００９６】
【化１】
2010075718.tif 000003
【００９７】
式中、Ｒ1は水素又はＣ1-4アルキル基であり、Ｒ2は水素又は下記式の群であり、
【００９８】
【化２】
2010075718.tif 000004
【００９９】
式中、Ｒ1は上記と同じ意味を有する。
Ｒ1及びＲ2の両方が水素である式（Ｉ）の化合物はタウルルタム（taurultam）であり、一方、Ｒ1が水素でありＲ2が式（II）を有する化合物はタウロリジン（taurolidine）である。これらの化合物は、メチロール転移剤として作用し、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方を破壊するだけでなく、細菌により生産されるエンドトキシン及びエキソトキシンの両方を不活性化することにも効果的である。
【０１００】
その他の有用な生理活性物質は、骨の再生を助力可能なタンパク質及びポリペプチド、特に骨マトリックス及び骨細胞に由来する非コラーゲンタンパク質を含む。それらは、骨格増殖因子及び形態形成及び脈管形成因子、並びにトランスフォーミング骨増殖因子などのマイトジェン因子を含む。オセイン又はより好ましくはオステオポエチンのようなマトリックスによる増殖因子は特に有益である。
【０１０１】
一実施形態によれば、医薬活性物質は、ＢＭＰ−２−８などの骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、又はその他の骨格マトリックス分子、並びにトランスフォーミング増殖因子−β即ちＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）などのシグナルペプチドからなる群より選択される。
【０１０２】
生理活性物質は、例えば注入されたゼラチンなどの高分子物質に代替的又は付加的に組入れられてもよいことが認識される。これは上述の骨増殖因子などのタンパク質に対して特に適当である。
【０１０３】
生理活性物質の吸収及び／又は吸着は、好ましくは滅菌条件下で、処理された骨ミネラルをその水溶液に浸漬することによって行われることが好ましい。活性物質の濃度は、吸着及び／又は吸収を容易にするために比較的高いことが好ましく、その活性材料の溶解度に部分的に依存する。
【０１０４】
上述の生成物のいずれかについて、本発明によるマトリックスは活性物質を補足することができる。従って、水溶性又は水分散性であるいずれの生理活性物質を使用することができる。従って、本マトリックスは、例えばタウロリジン、タウルルタムなどの抗菌剤、又は例えばテトラサイクリン及びゲンタマイシンなどの抗生物質のような医薬物質を有利に含有することができる。
【０１０５】
本発明の一実施形態による方法は、上顎骨又はその他の骨格欠損部における骨欠損部を露出し、損傷骨の領域に大きさを合わせた充填マトリックスを挿入し、及びいずれかの適当な手段、例えば接着剤又は骨欠損部上にマトリックスを縫合することによって損傷骨の領域に大きさを合わせたマトリックスを固定することを含む。
【実施例】
【０１０６】
以下の実施例は、説明の手段にのみ提供するものである。
（実施例１）
新たに屠殺したブタの凍結軟骨を冷水に浸し、完全に洗浄し、肉残渣、骨及び硬質断片から機械的に精製した。続いて、その材料を流水下で３０分間洗浄した。
続いて、その材料をホモジナイザー中で３回粉砕した。大きさを縮小させた後の光学的粒子の大きさは約８ｍｍであった。
この軟骨断片をアセトンで各８時間ずつ４回洗浄することにより脱水した。次いで軟骨をｎ−ヘキサンで４回抽出することにより脱脂した。各処理は少なくとも８時間続けた。ヘキサン：軟骨の比は１：１０であった。
脱脂後、軟骨を飲料水中で膨潤させた。水：材料の比は１０：１であり、処理時間は２４時間であった。
次いでその材料をＮａＯＨ（５重量％）で処理し、これによって軟骨：液体の比は１：４であり、処理時間は３２時間であった。処理の間、軟骨断片を十分に撹拌した。続いて、アルカリを軟骨から洗浄した。これにより、もとのｐＨ１４が９〜１１に下がった。溶解した不純物を洗い流して、軟骨から分離した。アルカリ処理によって得られた液体は、グリコサミノグリカンの回収のために集められた。
次いでコラーゲン材料を最初にｐＨ値１．０以下にて強ＨＣｌ（約３重量％）で処理を行った。処理時間は４〜６時間であった。
続いて、材料を冷水でｐＨ値が３〜３．５に上昇するのに十分な時間洗浄した。
すべての不純物が除去され、生成物はスポンジ又はその他のコラーゲン材料の生成に適当な塩を含まないコラーゲン塊であった。上記目的のために、意図される結果によりこの軟骨塊を脱気し、凍結及び凍結乾燥してもよい。
【０１０７】
（実施例２）
実施例１におけるアルカリ処理によって得られた抽出物は、グリコサミノグリカン、アルカリ、変性タンパク質及び塩を含んでいた。抽出物を最初にＨＣｌで中和し、中和後のｐＨ値は６となった。次いで抽出物を、変性タンパク質を除去する作用を有する濾過助剤、即ちケイ藻土で処理した。０．５重量％のケイ藻土を抽出物中に導入し、変性タンパク質と一緒に濾過によって除去した。
次いでその上清を約１００００ダルトンにて分子量カットオフを有する膜を使用して限外濾過を行った。これにより塩は除去され、精製されたグリコサミノグリカンが残った。
このように得られたグリコサミノグリカン溶液を上記コラーゲン材料と混合して、グリコサミノグリカンを含むコラーゲンIIマトリックスを得た。
【０１０８】
（実施例３）
（１）コラーゲンスポンジ及びフリース中のヘキソサミン及びアミノ酸残基の測定
正確に秤量した各々の試料（約１０ｍｇ）を密封管中の１０ｍｌの３Ｍ又は６ＭのＨＣｌ中で、精製窒素下、１．０５℃で１５又は２０時間で加水分解した。その管を冷蔵庫中で冷却し管を開封した後、内容物を２５ｍｌの長頸フラスコに移し、真空回転乾燥器（Rotavapor RE 120, Buchi, Switzerland）中で水ジェット真空下、４０℃で乾燥させた。残留物を５ｍｌの水に溶解した後、残留物を再度水ジェット真空下で乾燥させた。次いで、残留物をｐＨ２．２の５ｍｌローディング緩衝液（Ｎａ+に関して０．２Ｍ）に溶解した。グルコサミン及びガラクトサミン値の測定には、アリコート（aliquot）とローディング緩衝液と（１＋１０）の前希釈後、３ＭのＨＣｌで加水分解した１５０μｌの試料をアミノ酸分析器（AlphaPlus，4151型，Pharmacia-LKB，Freiburg）のカートリッジに注入し、コンピュータ（Shimadzu，Dusseldorf）を用いて標準と比較することにより評価した。同じ手順を６ＭのＨＣｌで加水分解した試料で行い、この場合は５０μｌを更に試験用カートリッジに注入した。ヘキソサミン及びチロシンについての最高値は３ＭのＨＣｌによる加水分解後にのみ得られ、一方バリン、イソロイシン及びロイシンについての最高値は６ＭのＨＣｌによる加水分解後にのみ得られるので、３Ｍ及び６ＭのＨＣｌにおける二重の加水分解がヘキソサミン及びアミノ酸分析の最適化に必要である。
【０１０９】
（２）コラーゲンスポンジ及びフリース中の天然コラーゲン含量の測定
試料の２５〜３０ｍｇ（正確に秤量した）を、６ｍｇ／ｍｌのトリプシン溶液（ウシ膵臓からの凍結乾燥調製物、Boehringer，Mannheim)の１．５ｍｌを添加した０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（pA，Merck，Darmstadt）ｐＨ８．２の３０ｍｌ中に導入し、振盪水浴（Julabo SWI，Seelbach）中で２３±１℃で８時間インキュベートした。試料を冷室で４℃に冷却した後、４℃で６０Ｔｉ−Ｒｏｔｏｒ(Beckman，Munich)中で３２０００ＲＰＭにて３０分間遠心分離した。残留物を直径２５ｍｍのＤｉａｆｌｏｗ−ＦｉｌｔｅｒＰＭ１０（Amicon，Witten）を通して撹拌限外濾過セル（Mod 8010，Amicon，Witten）において濾過し、１ｍｌの濾液を６ＭのＨＣｌで２０時間１０５℃で加水分解した。加水分解物の更なる処理及び分析は、更に、乾燥状態まで２回蒸発させた後の試料の溶解を１５０μｌのローディング緩衝液中で行い、これにより１５０μｌをアミノ酸分析器の試験用カートリッジに注入すること以外は、上記（１）に記載された手順と同じである。アミノ酸分析後得られるヒドロキシプロリン値（μｍｏｌ／ｇ出発物質）は、試料中の分解性コラーゲンの部分を表す。全コラーゲン含量を表す、加水分解（６ＭのＨＣｌ）及び分析を並行した試料（上記（１）参照）のヒドロキシプロリン値を前記ヒドロキシプロリン値と比較するとき、トリプシン非分解性コラーゲンである「天然」の百分率比が示される。
結果を以下の表に示す：
【０１１０】
【表１】
2010075718.tif 000005
【０１１１】
（実施例４）
ウシ大腿骨を熱湯中できれいになるまで煮沸し、５〜１０ｍｍの粒子径に細かく砕き、ソクスレー（Sohxlet）装置において２４時間トルエンの還流下で抽出した。この材料を更にエタノールで抽出してトルエンを除去し、次いで、高温にてエチレンジアミン及び水（８５：１５）の共沸混合物で、数回溶媒を交換しながら実質的にそれ以上有機材料が抽出されなくなるまで８日間抽出した。次いで生成物を１００℃にて風乾した。
乾燥した生成物を０．２〜２ｍｍの平均粒子径に更に細かく砕き、オートクレーブで滅菌した。典型的に直径が１０ｍｍのウシ大腿骨スポンジフォサ骨の断片を、最終の顆粒化を省略して同じ技術によって精製した。
【０１１２】
（実施例５）
新たに屠殺したブタの凍結軟骨を冷水に浸し、完全に洗浄し、肉の残渣、骨及び硬質断片から機械的に精製した。続いて、その材料を流水下で３０分間洗浄した。
続いて、その材料をホモジナイザー中で３回粉砕した。大きさを減少させた後の光学的粒子の大きさは約８ｍｍであった。
この軟骨断片をアセトンで各８時間ずつ４回洗浄することにより脱水した。次いで軟骨をｎ−ヘキサンで４回抽出することによって脱脂した。各処理は少なくとも８時間続けた。ヘキサン：軟骨の比は１：１０であった。
脱脂後、軟骨を飲料水中で膨張させた。水：材料の比は１０：１であり、処理時間は２４時間であった。
次いでその材料をＮａＯＨ（５重量％）で処理し、これよって軟骨：液体の比は１：４であり、処理時間は３２時間であった。処理の間、軟骨断片を十分に攪拌した。続いて、アルカリを軟骨から洗浄した。これにより、もとのｐＨ１４が９〜１１に下がった。溶解した不純物を洗い流して、軟骨から分離した。アルカリ処理によって得られた液体は、グリコサミノグリカンの回収のために集められた。
次いでコラーゲン材料を最初にｐＨ値１．０以下にて強いＨＣｌ（約３重量％）で処理した。処理時間は４〜６時間であった。
続いて、材料を冷水でｐＨ値が３〜３．５まで上昇するのに十分な時間洗浄した。すべての不純物が除去され、生成物はスポンジ又はその他のコラーゲン材料の生成に適当な塩を含まないコラーゲンの塊であった。上記目的のために、意図される結果によりこの軟骨の塊を脱気し、凍結及び凍結乾燥してもよい。
【０１１３】
（実施例６）
実施例５におけるアルカリ処理によって得られた抽出物は、グリコサミノグリカン、アルカリ、変性タンパク質及び塩を含んでいた。抽出物を最初にＨＣｌで中和し、中和後のｐＨ値は６となった。次いで抽出物を、変性タンパク質を除去する作用を有する濾過助剤、即ちケイ藻土で処理した。０．５重量％のケイ藻土を抽出物中に導入し、変性タンパク質と一緒に濾過によって除去した。
次いでその上清を、約１００００ダルトンにて分子量カットオフを有する膜を用いて限外濾過を行った。これにより塩は除去され、精製されたグリコサミノグリカンが残った。
このように得られたグリコサミノグリカン溶液を上記コラーゲン材料と混合して、グリコサミノグリカンを含むコラーゲンIIマトリックスを得た。
【０１１４】
（実施例７）
実施例６から得られたコラーゲンII材料２．０ｇをブレンダー中で５００ｇの蒸留水とともに細かく砕いた。この分散物を遠心分離し、上清の水を除去した。得られたコラーゲン繊維スラリーに、上記実施例１の手順によって精製されたウシの顆粒化皮質骨１７．５ｇを加え、続いて十分混合して吸水管（７０ｍｍ）により水を除去した。顆粒化骨は粒子径０．５〜１．０ｍｍを有する。水の除去後、９％ｗ／ｗの水性ゼラチン溶液を５ｍｌ加え（３５％水性ホルムアルデヒドの０．６％によって架橋）、混合物を再び吸引して乾燥させた。
スポンジ塊を断片に切断し、６０℃にて真空中で乾燥させた。このスポンジの断片をポリエチレン容器中に詰め、ガンマ照射により滅菌した。
【０１１５】
（実施例８）
実施例１、２、３、４及び７により生成されたマトリックスは、骨細胞、骨芽細胞、骨髄中の間質幹細胞又は骨芽細胞形成幹細胞の懸濁液で充填され、本発明による骨治癒組み合わせ材料を形成する。
骨芽細胞を自己細胞供給源から培養し、実験室外で増殖させ、マトリックスに充填させ、次いで欠損部、例えば歯周及び／又は上顎骨の骨欠失部、又は全身の骨格欠損部に移植する。上記に引用したビオガイド(Biogide)（登録商標）などのバリヤー機能を有し得るコラーゲン膜で移植部位を覆う。
【図１】
2010075718.tif 000006
【図２】
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【図３】
2010075718.tif 000008
【図４】
2010075718.tif 000009
【図５】
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【図６】
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