(57)【要約】【課題】ガラクトースの資化に関与するＤＮＡ（遺伝子）であって、過剰発現によればガラクトースの資化能を増大させることのできる新規なＤＮＡ（遺伝子）を提供する。【解決手段】過剰発現によりガラクトースの資化能を増大させるＤＮＡ（遺伝子）、これを連結した組み換えベクター、及びこれらを導入した組み換え微生物に関する。さらに、これらを利用してガラクトースを含む炭素源からバイオアルコールを生産する方法、及び過剰発現によってガラクトースの資化性を向上させる酵母の原因遺伝子を選別する方法に関する。上記のＤＮＡ（遺伝子）を過剰発現することによって、ガラクトースの代謝率を顕著に増大させることができる。そのため、ガラクトースを炭素源として、バイオアルコールの生産性を大きく増大させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ、及び
（Ｃ）（Ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡであって、
ガラクトースの資化性を発揮させるＲＮＡをコードする、ＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを連結した、ベクター。
【請求項３】
バクテリア、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス、または相同組み換えにより宿主細胞ゲノム内に挿入可能なＤＮＡ断片である、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
下記の開裂地図に示されたプラスミドである、請求項２または３に記載のベクター。
【化１】
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【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載のベクター（連結された目的ＤＮＡを含む）を利用して形質転換されてなる、微生物。
【請求項６】
バクテリア、カビまたは酵母である、請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
前記酵母は、サッカロマイセス属、パチソレン属、クラビスポラ属、クリヴェロミセス属、デバリオミセス属、シュワニオミセス属、カンジダ属、ピキア属及びデッケラ属からなる群より選ばれる、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
サッカロマイセス  セレビシエ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ／ｐＲＳ４２４−ＳＮＲ８４（受託番号ＫＣＴＣ  １１３８８  ＢＰ）である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
前記ベクター中に連結された目的ＤＮＡである遺伝子が過剰発現されてなる、請求項４〜８のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
ガラクトースを含む炭素源を微生物に資化させることを含むガラクトース資化能の増大方法であって、
請求項１に記載のＤＮＡ、請求項２〜４のいずれか１項に記載のベクター、または請求項５〜９のいずれか１項に記載の微生物を利用することにより、前記ＤＮＡを過剰発現することを特徴とする、ガラクトース資化能の増大方法。
【請求項１１】
ガラクトースを含む炭素源を微生物に資化させることを含むバイオアルコールの生産方法であって、
請求項１に記載のＤＮＡ、請求項２〜４のいずれか１項に記載のベクター、または請求項５〜９のいずれか１項に記載の微生物を利用することを特徴とする、バイオアルコールの生産方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡを過剰発現させて、バイオアルコールの生産性を増大する、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項１３】
前記ガラクトースを含む炭素源は、ガラクトースのみからなるか、またはガラクトース及びグルコースの混合糖からなる、請求項１１または１２に記載の生産方法。
【請求項１４】
前記ガラクトースを含む炭素源は、ガラクトースを４０％以上含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項１５】
遺伝子を過剰発現させてガラクトースの資化能を増大させる、酵母の原因遺伝子の選別方法であって、
トリプトファンを含むマルチコピープラスミドを利用して酵母のゲノムＤＮＡのライブラリーを構築する段階と、
構築した前記ライブラリー中のゲノムＤＮＡを酵母に形質転換させ、酵母の全遺伝子を過剰発現させて、形質転換酵母のライブラリーを製作する段階と、
製作した前記ライブラリー中の形質転換酵母を、ガラクトースを唯一の炭素源として含む培地中で連続継代培養し、巨大コロニーを形成する、形質転換酵母を選別する段階と、
選別した前記形質転換酵母からプラスミドを単離し、単離されたプラスミドに挿入された酵母の遺伝子配列を確認する段階とを含む、酵母の原因遺伝子の選別方法。
【請求項１６】
前記酵母は、サッカロマイセス  セレビシエ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄである、請求項１５に記載の選別方法。
【請求項１７】
前記マルチコピープラスミドは、ｐＲＳ４２４である、請求項１５または１６に記載の選別方法。
【請求項１８】
酵母のゲノムの塩基配列、及びプラスミドに挿入した遺伝子の両末端に存在する所定の長さの遺伝子の塩基配列を比較し、挿入遺伝子の酵母ゲノム上での位置を追跡することにより、過剰発現した遺伝子を確認する段階、並びに／または、
確認した前記遺伝子を含むプラスミドを酵母に再び形質転換し、ガラクトースの資化能の増大が前記遺伝子の過剰発現によるものであることを確認する段階をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の選別方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の選別方法により選別された、過剰発現によってガラクトースの資化性を増大させる、遺伝子。
【請求項２０】
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ、及び
（Ｃ）（Ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡであって、
ガラクトースの資化性を発揮させるＲＮＡをコードする、請求項１９に記載の遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトースの資化能を有するＤＮＡ、これを連結したベクター、及びこれらを導入した微生物に関する。より具体的には、過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によりガラクトースの資化能を増大させるＤＮＡ（遺伝子）、これを連結した組み換えベクター、及びこれらを導入した組み換え微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的に化石燃料を過剰に使用することによる資源枯渇及び環境汚染という虞が増大しつつある。このような状況の下で、安定的且つ持続的にエネルギーを生産・供給可能な、新たな再生エネルギーの登場が求められている。このような代替エネルギー開発の一環として、バイオマスからエネルギーを生産する技術が注目されている。
【０００３】
近年、このようなバイオマスを実現し得る生物として、海藻類に対する関心が高まっている。かかる潜在的な生物と言える海藻類の特長は、自然界に豊富に存在し、且つライフサイクルが短いという点にある。また、海藻類は、二酸化炭素を消費して酸素を排出するという代謝を行うため、エネルギー生産と環境問題とを共に解決できるという長所を有する。しかし、海藻類を広く利用し、代替エネルギーとして一般に供給可能な程度までエネルギーを生産できていないのが現状である。
【０００４】
一方、海藻類（特に紅藻類）由来のバイオマスの加水分解物には、ガラクトースが豊富に存在する。したがって、海藻類由来のバイオマスの加水分解物を、酵母を利用して有用物質へと転換することを実現するためには、加水分解物に多量に含有されているガラクトースの効果的な利用が最先に実現されなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７３９３６６９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bro C, Knudsen S, Regenberg B, Olsson L, Nielsen J. 2005. Improvement of galactose uptake in Saccharomyces cerevisiae through overexpression of phosphoglucomutase: example of transcript analysis as a tool in inverse metabolic engineering. Appl. Environ. Microbiol. 71(11):6465-72
【非特許文献２】Ostergaard S, Walloe KO, Gomes SG, Olsson L, Nielsen J. 2001. The impact of GAL6, GAL80, and MIG1 on glucose control of the GAL system in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 1(1):47-55.
【非特許文献３】Ostergaard S, Olsson L, Johnston M, Nielsen J. Increasing galactose consumption by Saccharomyces cerevisiae through metabolic engineering of the GAL gene regulatory network. 2000. Nat. Biotechnol. 18(12):1283-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、自然界に存在する酵母の場合、ガラクトース代謝はするものの、その代謝速度はグルコースに比べて顕著に小さいため、実用化には程遠いという問題があった。
【０００８】
そこで本発明の目的は、ガラクトースの資化に関与するＤＮＡ（遺伝子）であって、過剰発現によればガラクトースの資化能を増大させることのできる新規なＤＮＡ（遺伝子）を提供する。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、上記の新規なＤＮＡ（遺伝子）で形質転換した酵母を利用して、ガラクトースを含む炭素源からバイオアルコールの生産性を増大させる方法を提供することである。
【００１０】
また、本発明のさらに他の目的は、ガラクトースの資化能を増大することのできる多様な酵母中の原因遺伝子を一度に同定可能な、ゲノムレベルのシステム生命工学的手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するための本発明は、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ、及び（Ｃ）（Ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡであって、ガラクトースの資化性を発揮させるＲＮＡをコードするＤＮＡである。
【００１２】
上記目的を達成するための本発明のベクターは、上記のＤＮＡを連結してなる。
【００１３】
上記目的を達成するための本発明の微生物は、上記のベクター（連結された目的ＤＮＡを含む）を利用して形質転換されてなる。
【００１４】
上記目的を達成するための本発明のガラクトース資化能の増大方法は、ガラクトースを含む炭素源を微生物に資化させることを含むガラクトース資化能の増大方法であって、上記のＤＮＡ、上記のベクター、または上記の微生物を利用することにより、前記ＤＮＡを過剰発現することを特徴とする。
【００１５】
上記目的を達成するための本発明のバイオアルコールの生産方法は、ガラクトースを含む炭素源を微生物に資化させることを含むバイオアルコールの生産方法であって、上記のＤＮＡ、上記のベクター、または上記の微生物を利用することを特徴とする。
【００１６】
上記目的を達成するための本発明の酵母の原因遺伝子の選別方法は、遺伝子を過剰発現させてガラクトースの資化能を増大させる、酵母の原因遺伝子の選別方法であって、トリプトファンを含むマルチコピープラスミドを利用して酵母のゲノムＤＮＡのライブラリーを構築する段階と、構築した前記ライブラリー中のゲノムＤＮＡを酵母に形質転換させ、酵母の全遺伝子を過剰発現させて、形質転換酵母のライブラリーを製作する段階と、製作した前記ライブラリー中の形質転換酵母を、ガラクトースを唯一の炭素源として含む培地中で連続継代培養し、巨大コロニーを形成する、形質転換酵母を選別する段階と、選別した前記形質転換酵母からプラスミドを単離（回収）し、単離（回収）されたプラスミドに挿入された酵母の遺伝子配列を確認する段階とを含む。
【００１７】
上記目的を達成するための本発明の遺伝子は、上記の選別方法により選別された、過剰発現によってガラクトースの資化性を増大させる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、目的ＤＮＡ（遺伝子）の過剰発現によって、ガラクトースの資化性が著しく増大し、同時にエタノールの生産性も顕著に増大させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、添付した図面を参照して本発明を適用した最良の実施形態を説明する。本発明の利点、特徴、及びこれを実現するための筋道は、以下の各実施形態における詳細な説明及び添付された図面を参照することにより、さらに容易に理解できる。しかしながら、本発明は、本明細書における説明以外の多様な形態で実施することもできる。したがって、本明細書で言及した実施形態のみに限定されることはない。
【００２０】
［第１実施形態：ガラクトースの資化性を発揮させるＲＮＡをコードするＤＮＡ］
本発明に係る第１実施形態は、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ、及び（Ｃ）（Ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡであって、ガラクトースの資化能を有するＤＮＡに関する。
【００２１】
本実施形態の対象であるＤＮＡは、ガラクトースの資化性を発揮させるＲＮＡをコードし、さらに、過剰発現によってガラクトース資化能を増大させることのできる遺伝子ということができる。本明細書では以下、上記（Ａ）に係るＤＮＡを「ＳＮＲ８４遺伝子」ともいう。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）に係るＤＮＡのなかでも好ましくは（Ａ）に係るＤＮＡである。
【００２２】
本発明者らは、このようなＳＮＲ８４遺伝子が過剰発現した酵母において、驚くべきことに、ガラクトースの資化能が著しく増大することを最初に確認した。
【００２３】
ここで、本実施形態に係るＤＮＡ（遺伝子）のメカニズムについて説明する。本実施形態に係るＤＮＡは、酵母のＢｏｘ  Ｈ／ＡＣＡ  ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ）をコードしている。換言すれば、本実施形態に係るＤＮＡは、ガラクトースの資化性を発揮させるＲＮＡ（ＳＮＲ８４  ｓｎｏＲＮＡ）をコードするＤＮＡ（ｓｎｒ８４  ＤＮＡ）である。ここで、ｓｎｏＲＮＡとは、核小体内に局在し、リボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）前駆体のスプライシングに関与する比較的低分子のＲＮＡを意味し、２つのグループに類別され、特異的な蛋白質とｓｎｏＲＮＰ（スノープス）を形成している。Ｂｏｘ  Ｈ／ＡＣＡ  ｓｎｏＲＮＡは、そのうちの１グループである。Ｂｏｘ  Ｈ／ＡＣＡ  ｓｎｏＲＮＡは、ＲＮＡの両末端にＢｏｘ  Ｈ及びＡＣＡという共通のｂｏｘ配列を有しており、Ｇａｒ１という共通のタンパク質が結合する。Ｂｏｘ  Ｈ／ＡＣＡ  ｓｎｏＲＮＡは、ｒＲＮＡ（の大きなサブユニット）と短い塩基対を形成し、これによりｒＲＮＡ（の大きなサブユニット）の修飾（シュードウリジン化；ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｙｌａｔｉｏｎ）部位を決定する誘導ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として機能することが明らかとなってきている。
【００２４】
ガラクトースの資化能が著しく増大する理由は明らかではないものの、これまでの試行錯誤の結果より、以下のように推測される。すなわち、本実施形態に係るＤＮＡが過剰発現されてＳＮＲ８４  ＲＮＡの機能が活性化されることにより、ｒＲＮＡのシュードウリジン化が促進され、結果としてガラクトースの資化能が増大されるメカニズムが作用するものと推測される。より具体的にいえば、ｒＲＮＡ（の大きなサブユニット）をシュードウリジン化するＳＮＲ８４遺伝子の機能が活性化することによって、ｒＲＮＡの成熟速度及び生成量が顕著に増大する。そこで、初期対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）で成熟ｒＲＮＡが早期に形成されると、ほとんどの酵素の生成速度が増大するようになる。このようにして、ガラクトース代謝に直接関与する酵素、及びガラクトース代謝に関連する酵素も同様に、多量且つ迅速に生成されることに起因するものと推測される。
【００２５】
上記のガラクトースは、分子式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６で表されるアルドヘキソースの一種であって、酵母において、ガラクトース−１−リン酸を経てグルコース−１−リン酸になった後、発酵過程を経て代謝されることによりアルコールに分解される。このようなガラクトースの代謝過程でのバイオアルコールの生産性を、ガラクトースの消耗時間（ｈ）に対するアルコールの生産速度（ｇ／ｌ）で表すことができる。したがって、ガラクトースの資化能の増大は、別の側面から見れば、バイオアルコールの生産性の増大として評価することができる。
【００２６】
前記（Ａ）に規定される、配列番号：１に示される塩基配列は、上述のように酵母中のＤＮＡに見出すことができる。
【００２７】
また、（Ｂ）に規定されるような、配列番号：１に示される塩基配列において、１個以上の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡも本実施形態における遺伝子に含まれる。本明細書における「１個以上」とは、１個または２個以上（複数個）を意味する。
【００２８】
塩基配列において、１個以上の塩基の欠失、置換、挿入または付加を行う手段としては、部位特異的変異（Nucleic Acid Research Vol 10, pp6487-6500, 1982）などの従来公知の種々な遺伝子工学的手法が挙げられる。
【００２９】
さらに、上記（Ｃ）で規定されるＤＮＡも本実施形態における遺伝子に含まれる。本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ」とは、プローブと共に０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ７．０を示す。）中、６８℃にて１２〜２０時間インキュベートした後に、プローブとハイブリダイズしているＤＮＡをいう。
【００３０】
また、上記（Ｂ）及び（Ｃ）に係るＤＮＡの塩基配列は、上記の配列番号：１で示される塩基配列との配列相同性の程度で表すこともできる。このような配列相同性の程度は、好ましくは６０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
【００３１】
本明細書における「ガラクトースの資化能」とは、ガラクトースの分解能力ないし分解度を意味し、「ガラクトースの資化性」は前記「ガラクトースの資化能」と同義で使用している。
【００３２】
また、本明細書における「過剰発現」とは、多様な方法によって実現することができる。そこで、以下に制限されることはないが、以下に３つの例を挙げる。第１に、本実施形態に係る目的ＤＮＡ（ＳＮＲ８４遺伝子を含む）を挿入したマルチコピープラスミドを酵母に形質転換することによって、酵母内の当該ＤＮＡ（遺伝子）のコピー数を増やし、過剰に発現する方法が挙げられる。第２に、本実施形態に係る目的ＤＮＡ（ＳＮＲ８４遺伝子を含む）の５’末端に過剰発現を実現するような特殊なプロモーターを結合させた上で、前記目的ＤＮＡ（遺伝子）をベクターに挿入する方法が挙げられる。第３に、上記（Ｂ）及び（Ｃ）に係るＤＮＡの塩基配列の中には、配列番号：１で表されるＤＮＡの塩基配列と異なる配列がありうるが、かかる相違した配列に起因して当該目的ＤＮＡが過剰発現するようにする方法が挙げられる。
【００３３】
なお、本実施形態に係るＤＮＡによってコードされる、ガラクトースの資化性を発揮させるＲＮＡもまた、本発明の対象である。そして、前記ＲＮＡは、ガラクトース代謝促進剤（中の有効成分）として用いることができる。
【００３４】
［第２実施形態：第１実施形態のＤＮＡを連結したベクター］
第２実施形態に係るベクターは、上記第１実施形態に係るＤＮＡを連結してなる。なお、以下において、上記第１実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００３５】
本明細書における「ベクター」とは、連結された核酸断片を運搬するのに利用可能な核酸分子を意味する。かかる利用可能なベクターとして、特に制限されることはないが、バクテリア、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス及び挿入可能なＤＮＡ断片（すなわち、相同組み換えにより宿主細胞ゲノム内に挿入可能な断片）を含むことが好ましい。ここで、ベクターの一種である「プラスミド」とは、内部に追加的にＤＮＡ断片を連結されることができる環型の二重鎖ＤＮＡループを意味する。また、「ウイルスベクター」を用いれば、付加したＤＮＡをウイルスゲノム内に連結させることができる。上記したベクターのなかでもより好ましくはプラスミドである。
【００３６】
ここで、前記ベクターは、目的タンパク質をコードする連結された遺伝子の発現を指示できるが、このようなベクターを特に、「発現ベクター」という。一般的に、組み換えＤＮＡ技術の利用において、発現ベクターはプラスミドの形態であるため、本明細書で「プラスミド」と記載している場合、「ベクター」と同義でありうる。しかし、ウイルスベクターのように同一の機能を果たす、プラスミド以外の形態の発現ベクターも含むことができることはいうまでもない。
【００３７】
上記の発現ベクターは、酵母内で発現可能であり、遺伝子がベクター中に連結・挿入されるものである。このような発現ベクターの例としては、２ミクロン、pBM272、pBR322-6、pBR322-8、pCS19、pDW227、pDW229、pDW232、pEMBLYe23、pEMBLYe24、pEMBLYi21、pEMBLYi22、pEMBLYi32、pEMBLYr25、pFL2、pFL26、pFL34、pFL35、pFL36、pFL38、pFL39、pFL40、pFL44L、pFL44S、pFL45L、pFL45S、pFL46L、pFL46S、pFL59、pFL59+、pFL64-、pFL64+、pG6、pG63、pGAD10、pGAD424、pGBT9、pGKl2、pJRD171、pKD1、pNKY2003、pNKY3、pNN414、pON163、pON3、pPM668、pRAJ275、pRS200、pRS303、pRS304、pRS305、pRS306、pRS313、pRS314、pRS315、pRS316、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、pRS423、pRS424、pRS425、pRS426、pRSS56、pSG424、pSKS104、pSKS105、pSKS106、pSZ62、pSZ62、pUC-URA3、pUT332、pYAC2、pYAC3、pYAC4、pYAC5、pYAC55、pYACneo、pYAC-RC、pYES2、pYESHisA、pYESHisB、pYESHisC、pYEUra3、rpSE937、YCp50、YCpGAL0、YCpGAL1、YCplac111、YCplac22、YCplac33、YDp-H、YDp-K、YDp-L、YDp-U、YDp-W、YEp13、YEp213、YEp24、YEp351、YEp352、YEp353、YEp354、YEp355、YEp356、YEp356R、YEp357、YEp357R、YEp358、YEp358R、YEplac112、YEplac181、YEplac195、YIp30、YIp31、YIp351、YIp352、YIp353、YIp354、YIp355、YIp356、YIp356R、YIp357、YIp357R、YIp358、YIp358R、YIp5、YIplac128、YIplac204、YIplac211、YRp12、YRp17、YRp7、pAL19、paR3、pBG1、pDBlet、pDB248X、pEA500、pFL20、pIRT2、pIRT2U、pIRT2-CAN1、pJK148、pJK210、pON163、pNPT/ADE1-3、pSP1、pSP2、pSP3、pSP4、pUR18、pUR19、pZA57、pWH5、pART1、pCHY21、pEVP11、REP1、REP3、REP4、REP41、REP42、REP81、REP82、RIP、REP3X、REP4X、REP41X、REP81X、REP42X、REP82X、RIP3X/s、RIP4X/s、pYZ1N、pYZ41N、pYZ81N、pSLF101、pSLF102、pSLF104、pSM1/2、p2UG、pART1/N795、pYGTなどが挙げられるが、これに限定されるものではない（http://genome-www2.stanford.edu/vectordb/vector.html、及びhttp://pingu.salk.edu/~forsburg/vectors.html参照）。
【００３８】
また、前記ベクターは、下記の開裂地図に示されたプラスミド（pRS42）であることが好ましい。
【００３９】
【化１】
2010104357.tif 000003
【００４０】
上記のベクターは、宿主細胞内に導入されて、上記第１実施形態に係るＤＮＡ（遺伝子）によりコードされたタンパク質（融合タンパク質を含む）またはペプチドを生産できる。所望により、上記のベクターは宿主生物体により認知されるプロモーターを備えてもよい。かようなプロモーターの配列は、原核生物、真核生物またはウイルス起源であり得る。酵母に適切なプロモーターとして、以下に制限されることはないが、GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1、GAL10などが挙げられる。
【００４１】
上記のベクターは更なる調節配列を含むことができる。調節配列の例として、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子のシャイン−ダルガノ配列及びバクテリオファージラムダのｃＩＩのシャイン−ダルガノ配列が代表的なものとして挙げられる。また、発現ベクターは形質転換された宿主細胞を選別するのに必要且つ適切なマーカーを含んでもよい。宿主における形質転換は、当業界において公知の多様な技術やＳａｍｂｒｏｏｋの文献に記述されている技術を使用して行われ得る。
【００４２】
本実施形態に係るベクターは、ガラクトース代謝促進物質ないしガラクトース代謝促進剤（中の有効成分）として用いることもできる。
【００４３】
［第３実施形態：第１実施形態のＤＮＡまたは第２実施形態のベクターを導入した微生物］
第３実施形態に係る微生物（組み換え微生物）は、上記第２実施形態に係るベクター（連結された目的ＤＮＡを含む）を利用して形質転換されてなる。前記目的ＤＮＡに、ＳＮＲ８４遺伝子が含まれることはいうまでもない。かかる組み換え微生物はガラクトースの資化性の増大をもたらし得る。なお、以下において、上記第１実施形態及び第２実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００４４】
また、前記微生物は、前記ベクター中に連結された目的ＤＮＡである遺伝子が過剰発現されてなることが好ましい。
【００４５】
本実施形態に係る微生物は、バクテリア、カビまたは酵母であることが好ましく、各々の具体的な種や属については、当業界に公知のものであればいずれも使用され得る。なかでも、本発明に係るＤＮＡ（遺伝子）が酵母由来のものであることから、形質転換の容易性などを鑑みれば、前記微生物は酵母であることがより好ましい。
【００４６】
前記酵母は、以下に制限されることはないが、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、パチソレン(Pachysolen)属、クラビスポラ(Clavispora)属、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)属、デバリオミセス(Debaryomyces)属、シュワニオミセス(Schwanniomyces)属、カンジダ(Candida)属、ピキア(Pichia)属及びデッケラ(Dekkera)属からなる群より選ばれることが好ましい。
【００４７】
このような組み換え酵母菌株は、第１実施形態に係る遺伝子（ＳＮＲ８４遺伝子を含む）が過剰発現されることによって、グルコース及びガラクトースの混合糖（混合物）、またはガラクトースを唯一の炭素源とする培地中で、ガラクトースを迅速にバイオアルコールに転換（代謝分解）することができる。これは、第１実施形態に係る遺伝子（ＳＮＲ８４遺伝子を含む）の過剰発現に際して、ガラクトースを炭素源にすると、細胞の成長を有意に向上させ得るからである。このようなガラクトースの資化能の増大は、ガラクトースを炭素源とするような代謝経路を有する全ての生物において、アルコールの生産性向上をもたらしうる。
【００４８】
上述のように、本発明で用いられうる酵母の形質転換法は、一般的な形質転換手法であるため、当業者であれば容易に実施可能である。例えば、上記の組み換えベクターの酵母への形質転換過程は、公知の方法に従って実施され得る（Ito, H., Y. Fukuoka, K. Murata, A. Kimura (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bacteriol. 153, 163-168.）。
【００４９】
例えば、異種遺伝子を含むベクターを、サッカロマイセス  セレビシエ（S. cerevisiae） CEN.PK2-1Dに導入して形質転換するために、Yeast Spheroplast Transformation Kit（Bio 101, Vista、カリフォルニア州）を使用することができる。そして、形質転換株は、２０ｇ／ｌのグルコースを含むＹＳＣ（yeast synthetic complete）培地で培養できる。その後、ガラクトース代謝能（資化能）が向上した菌株を、４％ガラクトースを含むＹＳＣ培地で連続培養した後に、固体平板培地中で選別することができる。
【００５０】
また、本実施形態に係る微生物は、受託番号ＫＣＴＣ  １１３８８  ＢＰの組み換え微生物を用いることが好ましい。かかる受託された組み換え微生物は、ガラクトースの資化能に優れた菌株として本発明者らが選別したものである。そして、大韓民国大田市儒城区に在る韓国生命工学研究院遺伝子銀行に、２００８年９月４日付でサッカロマイセス  セレビシエ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ／ｐＲＳ４２４−ＳＮＲ８４と命名して受託し、受託番号：ＫＣＴＣ  １１３８８  ＢＰが付与されたものである。
【００５１】
本実施形態に係る微生物は、ガラクトース代謝促進剤（中の有効成分）として用いることもできる。
【００５２】
［第４実施形態：ガラクトース資化能の増大方法］
第４実施形態に係るガラクトース資化能の増大方法は、ガラクトースを含む炭素源を微生物に資化させることを含むガラクトース資化能の増大方法であって、上記第１実施形態に係るＤＮＡ、上記第２実施形態に係るベクター、または上記第３実施形態に係る微生物を利用することにより、前記ＤＮＡを過剰発現することを特徴とする。前記過剰発現の具体的な手法については、上記第１実施形態で説明した通りである。なお、上記の第１〜第３実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００５３】
［第５実施形態：バイオアルコールの生産方法］
第５実施形態に係るバイオアルコールの生産方法は、ガラクトースを含む炭素源を微生物に資化させることを含むバイオアルコールの生産方法であって、ガラクトースの資化性（資化能）を向上（増大）するために、上記第１実施形態に係るＤＮＡ、上記第２実施形態に係るベクター、または上記第３実施形態に係る微生物を利用することを特徴とする。なお、以下において、上記の第１〜第４実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００５４】
本実施形態に係る生産方法は、上記のＤＮＡ（ＳＮＲ８４遺伝子を含む遺伝子）を過剰発現させて、バイオアルコールの生産性を増大することが好ましい。本実施形態において、上記のＤＮＡ（ＳＮＲ８４遺伝子を含む遺伝子）が過剰発現されることによって、バイオアルコールの生産性が増大しうる。すなわち、上記のバイオアルコールの生産方法によれば、上記のＤＮＡ（ＳＮＲ８４遺伝子を含む遺伝子）の過剰発現により、直接的または間接的にガラクトース代謝に関与する遺伝子の発現が顕著に促進される。これにより、ガラクトースを含む炭素源からガラクトースを迅速にバイオアルコールへと転換（代謝分解）させることができる。
【００５５】
上記の直接的または間接的にガラクトース代謝に関与する遺伝子として、以下に制限されることはないが、例えば、gal2、gal1、gal7、gal10、gal5（pgm1、pgm2）などが挙げられる。また、上記のバイオアルコールの例として、エタノール、プロパノールもしくはブタノール等のアルコール、またはアセトンが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００５６】
上記のガラクトースを含む炭素源は、ガラクトースのみからなるか、またはガラクトース及びグルコースの混合糖からなりうる。後者の場合、混合比率は特に制限されることはないが、ガラクトースを４０％以上含むことが好ましく、５０％以上含むことがより好ましい。このような条件の培地中で、本実施形態に係る生産方法を実施した場合、バイオアルコールの生産性を有意に向上させることができる。
【００５７】
本発明者らが行った実験によると、ガラクトースを含む培地で、上記のＤＮＡ（ＳＮＲ８４遺伝子を含む遺伝子）の過剰発現によりアルコールの生産性が、既存の酵母菌株に比べて有意に増大可能なことを確認した。
【００５８】
上記のガラクトースを含む炭素源（生物資源）は、海藻類バイオマスの加水分解物であり得る。
【００５９】
上記の海藻類は特に制限されなく、紅藻類（例えば、ノリ(Porphyra yezoensis Ueda）、褐藻類（例えば、コンブ（Laminariaceae科の藻類）、ワカメ（Undaria pinnatifida）またはヒジキ（Hizikia fusiforme））及び緑藻類（例えば、アオノリ(Enteromorpha属）を含むことができる。
【００６０】
上記の紅藻類は、例えば天草（Gelidium amansii）、オゴノリ（Gracilaria verrucosa）、ウシケノリ（Bangia atropurpurea）、マルバアマノリ（Porphyra suborbiculata）、スサビノリ（Porphyra yezoensis）、ヒラガラガラ（Galaxaura falcate）、フサノリ（Scinaia japonica）、ヒメテングサ（Gelidium divaricatum）、オオブサ（Gelidium pacificum）、ヒライボ（Lithophylum okamurae）、クサノカキ（Lithothammion cystocarpideum）、カニノテ（Amphiroa anceps）、アンピロアベアヴォイシ（Amphiroa beauvoisii）、サンゴモ（Corallina officinalis）、ピリヒバ（Corallina pilulifera）、フサカニノテ（Marginisporum aberrans）、コメノリ（Carpopeltis prolifera）、ムカデノリ（Grateloupia filicina）、タンバノリ（Grateloupia elliptica）、フダラク（Grateloupia lanceolanta）、ツルツル（Grateloupia turtuturu）、キジノオ（Phacelocarpus japonicus）、フクロフノリ（Gloiopeltis furcata）、イバラノリ（Hypnea charoides）、カギイバラノリ（Hypnea japonica）、サイダイバラ（Hypnea saidana）、コンドロスクリスプス（Chondrus cripspus）、スギノリ（Chondracanthus tenellus）、カバノリ（Gracilaria textorii）、フシツナギ（Lomentaria catenata）、イソハギ（Heterosiphonia japonica）、ユナ（Chondria crassicaulis）、イソムラサキ（Symphyocladia latiuscula）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６１】
海藻類バイオマスを利用してバイオアルコールを生産する方法は特に制限されることはなく、当業界で公知の方法により行える。例えば、紅藻類バイオマスを利用する方法を見てみると、紅藻類を直接糖化させる直接糖化工程や、紅藻類から寒天または繊維素を抽出した後、得られた抽出物を糖化させてガラクトースまたはグルコースを得る間接糖化工程などが利用できる。上記の糖化工程は、ガラクトシダーゼ酵素などを利用した酵素加水分解法または酸加水分解用の触媒を使用する酸加水分解法などが使用され得るが、これに限定されることはない。その後、所定の微生物発酵を通してエタノール、ブタノールなどのアルコール、またはアセトンなどのバイオアルコールを製造することができる。
【００６２】
このように、自然界に豊富に存在する海藻類バイオマスを利用してバイオ燃料を製造する場合、原料の受給が安定的で前処理工程を経る必要がないため、生産効率に大変優れている。
【００６３】
［第６実施形態：酵母の原因遺伝子の選別方法］
第６実施形態に係る酵母の原因遺伝子の選別方法は、遺伝子を過剰発現させてガラクトースの資化能を増大させる、酵母の原因遺伝子の選別方法であって、トリプトファン（ｔｒｐ）を含むマルチコピープラスミドを利用して酵母のゲノムＤＮＡのライブラリーを構築する段階と、構築した前記ライブラリー中のゲノムＤＮＡを酵母に形質転換させ、酵母の全遺伝子を過剰発現させて、形質転換酵母のライブラリーを製作する段階と、製作した前記ライブラリー中の形質転換酵母を、ガラクトースを唯一の炭素源として含む培地中で連続継代培養(Serial subculture)し、巨大コロニーを形成する、形質転換酵母を選別する段階と、選別した前記形質転換酵母からプラスミドを単離（回収）し、単離（回収）したプラスミドを導入した酵母の遺伝子配列を確認する段階とを含む。なお、以下において、上記の第１〜第５実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００６４】
図１は、本実施形態で使用可能な遺伝子の選別方法を模式的に示した図である。図１を参照することにより、本実施形態に係る遺伝子の選別方法の一例を具体的に理解することができる。
【００６５】
上記の酵母は、サッカロマイセス  セレビシエ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄであり得、上記のマルチコピープラスミドはｐＲＳ４２４であり得る。
【００６６】
上記酵母のゲノムＤＮＡライブラリーの製造は、制限酵素などを利用してサッカロマイセス  セレビシエ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１ＤゲノムＤＮＡを切断する段階と、切断されたＤＮＡ断片をマルチコピープラスミド（ｐＲＳ４２４）に導入する段階と、製造されたプラスミドを大腸菌（E. coli）で増幅させる段階とからなり得る。
【００６７】
上記の形質転換酵母ライブラリーの製造において、上記の酵母への形質転換は、一般的な方法（例えば、Ito, H., Y. Fukuoka, K. Murata, A. Kimura (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bacteriol. 153, 163-168.）によって行える。
【００６８】
その後、連続継代培養を通して巨大コロニーを形成するガラクトースの資化能が増大した形質転換酵母を選別した後、巨大コロニーから単離した形質転換酵母からプラスミドに挿入された遺伝子配列を確認する。このとき、遺伝子配列の確認は、Ｇｅｌ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ｇｅｌ  ｄｏｃ）装置またはＨｙｄｒａ装置などを利用して行える。
【００６９】
また、本実施形態に係る遺伝子の選別方法は、下記の段階を更に含んでもよい。すなわち、酵母のゲノムの塩基配列、及びプラスミドに挿入した遺伝子の両末端に存在する所定の長さの遺伝子の塩基配列を比較し、挿入遺伝子の酵母ゲノム上での位置を追跡することにより、過剰発現した遺伝子を確認する段階、並びに／または、確認した前記遺伝子を含むプラスミドを酵母に再び形質転換し、ガラクトースの資化能の増大が前記遺伝子の過剰発現によるものであることを確認する段階である。
【００７０】
上記の追加可能な段階により、選別された遺伝子を明らかにし、ガラクトースの資化能の増大が誘発したことを再び確認することができる。
【００７１】
［第７実施形態：遺伝子］
第７実施形態に係る遺伝子は、上記の第６実施形態に係る選別方法により選別された、過剰発現によってガラクトースの資化性を増大させるものである。また、上記の遺伝子は、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ、及び（Ｃ）（Ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡであって、ガラクトースの資化性を発揮させるＲＮＡをコードするものである。なお、上記の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）に係るＤＮＡのなかでも好ましくは（Ａ）に係るＤＮＡである。また、上記の第１〜第６実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００７２】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例に限定されることはない。
【実施例】
【００７３】
［実施例１］過剰発現によりガラクトースの資化能を増大させる遺伝子の選別
マルチコピープラスミド（ｐＲＳ４２４）（化学式１参照）を利用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１ＤのゲノムＤＮＡライブラリーを製作した。製作したライブラリーのゲノムＤＮＡを酵母に形質転換させることによって、酵母の全遺伝子が過剰発現する形質転換酵母のライブラリーを製作した。その後、ガラクトースを唯一の炭素源として含む培地（最小培地）で構築した形質転換酵母のライブラリーを培養し、連続継代培養法により、ガラクトースの資化能が増大した形質転換酵母を選別した。図２に示したように、ガラクトースの資化能が増大した（エタノールの生成度の高い）＃２、５、３４、３７、４０の酵母菌株のうち、＃４０の形質転換酵母からプラスミドを単離した。そして、クローニングに用いた制限酵素に対応する制限酵素部位の両側の公知の遺伝子の配列情報を利用して単離したプラスミドに導入した酵母遺伝子の配列を確認した。その後、酵母のゲノムの塩基配列と、プラスミドに挿入した遺伝子の両末端に存在する所定の長さの遺伝子の塩基配列とを比較し、導入遺伝子（挿入遺伝子）の酵母ゲノム上での位置を追跡することにより、過剰発現した遺伝子を確認した。その結果、＃４０の酵母菌株に導入した遺伝子の配列は、図３に示したように、酵母の第５染色体のうち１４９２２４１〜１４９４９４８の塩基配列であり、ここにＳＮＲ８４遺伝子配列が含まれていることを確認した。そこで、原因遺伝子（ＳＮＲ８４遺伝子）がガラクトースの資化能の増大に関与するか否かを確認するために、前記原因遺伝子を含むプラスミドを酵母に再び形質転換し、ガラクトースの資化能の増大が前記原因遺伝子の過剰発現によるものであることを確認した。
【００７４】
［実施例２］ガラクトースの資化能の評価
原因遺伝子（ＳＮＲ８４遺伝子）を含む酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の第５染色体１４９２２４１〜１４９４９４８の塩基を、マルチコピープラスミドを利用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ（ＭＡＴａｌｐｈａ；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−２８９；ｌｅｕ２−３＿１１２；ｈｉｓ３  Ｄ１；ＭＡＬ２−８Ｃ；ＳＵＣ２）菌株に形質転換した。４％ガラクトースを含む最小培地中で２０時間、培養した後、ガラクトースの資化能を観察するためにエタノール生成度を観察した。かかる結果を図４及び図５、並びに下記の表１に示した。
【００７５】
【表１】
2010104357.tif 000004
【００７６】
コントロールの菌株の場合、与えられたガラクトースを全部消失（資化）するのに２８時間を要し、その際のエタノール生成度は１７ｇ／ｌだった。また、２０時間培養経過後のコントロールの菌株のエタノール生成度は１４ｇ／ｌであって、８ｇ／ｌのガラクトースが未資化分として残存した。これに対し、ｓｎｒ８４形質転換株（ｓｎｒ８４の過剰発現株）の場合、２０時間培養した時点でガラクトースを全部資化し、その際のエタノール生成度は１８ｇ／ｌであった。
【００７７】
すなわち、ＳＲＮ８４遺伝子が過剰発現された菌株は、コントロールの菌株に比べてガラクトースの分解速度が著しく向上し、エタノールの生成度も同様に顕著に増大した。そして、驚くべきことに、エタノールの生産性は４８％（｛０．９／０．６１｝×１００）も増大した。
【００７８】
本発明の属する分野における通常の知識を有する者であれば、上記の内容に基づき、本発明の範囲内で多種多様な応用や変形を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明の第６実施形態で使用可能な遺伝子の選別方法を模式的に示した図である
【図２】図１による方法で選別された、様々な酵母菌株のエタノール生成量を示したグラフである（４％ガラクトースを含む５ｍｌのＹＳＣ培地中で２０時間培養）。
【図３】ＳＮＲ８４遺伝子を含む酵母の第５染色体の拡大した遺伝子地図である（酵母ゲノムのうち第５染色体の位置１４９２２４１〜１４９４９４８を示す）。
【図４】本発明の実施例２において、コントロールである野生型株を４％ガラクトースで培養したときの、資化能（発酵能）の増大効果を観察したグラフである。
【図５】本発明の実施例２において、ＳＮＲ８４遺伝子の形質転換株（ＳＮＲ８４を過剰発現させた菌株）を４％ガラクトースで培養したときの、資化能（発酵能）の増大効果を観察したグラフである。
【図１】
2010104357.tif 000006
【図２】
2010104357.tif 000007
【図３】
2010104357.tif 000008
【図４】
2010104357.tif 000009
【図５】
2010104357.tif 000010
【配列表】
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