(57)【要約】      （修正有）【課題】高眼圧症または高眼内圧、および関連症状、例えば緑内障の予防および／または治療のための方法および化合物を提供する。【解決手段】ＧＰＣＲ様タンパク質、並びに阻害／拮抗化合物および該タンパク質のこのような阻害剤／拮抗剤を含んでなる組成物。このような化合物は、高眼内圧および高眼内圧に伴う症状、例えば緑内障を治療するために用いうる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの実質的に純粋なペプチド化合物：
Ｚ１‐Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐Ｚ２        Ｉ
上記式中：
Ｘ１は、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ３は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ４は、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたはＨ結合形成基を含む側鎖を有したＴｈｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ５は、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ７は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｃｙｓおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ８は、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｚ１は、式Ｈ２Ｎ‐、ＲＨＮ‐またはＲＲＮ‐のＮ末端基である；
Ｚ２は、式‐Ｃ（Ｏ）ＯＨ、‐Ｃ（Ｏ）Ｒ、‐Ｃ（Ｏ）ＯＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＲＲのＣ末端基である；
Ｒは、各存在箇所で、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニルまたは置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニルから独立して選択される；および
“‐”は共有結合である。
【請求項２】
実質的に純粋な合成ペプチド化合物または組換えペプチド化合物であって、該化合物は式IIのドメインを有している：
‐Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐        II
上記式中：
Ｘ１は、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ３は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ４は、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたはＨ結合形成基を含む側鎖を有したＴｈｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ５は、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ７は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｃｙｓおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ８は、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
“‐”は共有結合である。
【請求項３】
化合物が、ＦＳＬＴＱＫＹＣ；ＨＩＩＣＳＰＬＲ；およびＩＦＤＳＴＥＣＷからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ドメインが、ＦＳＬＴＱＫＹＣ；ＨＩＩＣＳＰＬＲ；およびＩＦＤＳＴＥＣＷからなる群より選択される請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項で記載された化合物の有効量を患者へ投与することからなる、患者で眼内圧を低下させる方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項で記載された化合物の有効量を患者へ投与することからなる、高眼内圧に伴う症状を患者で治療する方法。
【請求項７】
症状が緑内障である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
方法が、患者の目へ化合物を投与することからなる、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
患者が哺乳動物である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
患者がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
製薬上許容されるキャリアと共に、請求項１〜４のいずれか一項で記載された化合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項１２】
組成物が患者の目への投与用に処方されている、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
使用のための説明書と一緒に、請求項１〜４のいずれか一項で記載された化合物を含んでなる、商業パッケージ。
【請求項１４】
使用が：
(ａ)患者で眼内圧を低下させる；および
(ｂ)高眼内圧に伴う症状を治療する、
ことからなる群より選択される、請求項１３に記載の商業パッケージ。
【請求項１５】
症状が緑内障である、請求項１４に記載の商業パッケージ。
【請求項１６】
請求項２〜４のいずれか一項で記載されたドメインをコードする配列を含んでなる、単離核酸。
【請求項１７】
転写調節要素へ作働可能に連結されている請求項１６で記載された核酸を含んでなるベクター。
【請求項１８】
請求項１７で記載されたベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１９】
ペプチド化合物の発現を可能にする条件下で、請求項１８で記載された宿主細胞を培養することからなる、請求項２または４で記載されたペプチド化合物を産生する方法。
【請求項２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少くとも２７８アミノ酸を含んでなるポリペプチドをコードする配列を含んでなる、単離核酸。
【請求項２１】
ポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含んでなる、請求項２０に記載の単離核酸。
【請求項２２】
核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含んでなる、請求項２１に記載の単離核酸。
【請求項２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少くとも２７８連続アミノ酸を含んでなる、実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項２４】
ポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含んでなる、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
転写調節要素へ作働可能に連結されている請求項２０〜２２のいずれか一項で記載された核酸を含んでなるベクター。
【請求項２６】
請求項２５で記載されたベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２７】
ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項２６で記載された宿主細胞を培養することからなる、請求項２３または２４で記載されたポリペプチドを産生する方法。
【請求項２８】
(ｉ)患者で眼内圧を低下させる；
(ii)高眼内圧に伴う症状を治療する；または
(iii)(ｉ)および(ii)の双方；
のための化合物を同定するための方法であって、
(ａ)Ｒ‐１４を発現する細胞を用意し；
(ｂ)その細胞を試験化合物と接触させ；および
（ｃ）Ｒ‐１４活性が上記試験化合物の存在下で減少するかどうかを調べることからなり、その際に活性の上記減少は、該化合物が：
(ｉ)患者で眼内圧を低下させること；
(ii)高眼内圧に伴う症状を治療すること；または
(iii)(ｉ)および(ii)の双方
について有用であることの指標である方法。
【請求項２９】
活性の減少が、化合物がＲ‐１４拮抗剤であることの指標である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒ‐１４が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含んでなるポリペプチド、その活性断片、またはそれと実質的に同一の配列を含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
(ａ)患者で眼内圧を低下させる；
(ｂ)高眼内圧に伴う症状を治療する；または
(ｃ)(ａ)および(ｂ)の双方
のための、請求項１〜４のいずれか一項で記載された化合物あるいは請求項１１または１２で記載された組成物の使用。
【請求項３２】
薬剤の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項で記載された化合物あるいは請求項１１または１２で記載された組成物の使用。
【請求項３３】
薬剤が：
(ａ)患者で眼内圧を低下させる；
(ｂ)高眼内圧に伴う症状を治療する；または
(ｃ)(ａ)および(ｂ)の双方
のためである、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
症状が緑内障である、請求項３１または３３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、高眼圧症または高眼内圧、および関連症状、例えば緑内障の予防および／または治療のための方法および化合物に関する。
【発明の背景】
【０００２】
緑内障および眼内圧
緑内障は、周辺視力の喪失および時には中心視力の喪失に至ることがある、視神経頭陥凹により特徴付けられる。緑内障は世界中で二番目に大きな視力喪失原因である；推定で６６８０万人が原発性緑内障を有し、６７０万人がこの障害のせいで両眼失明する。米国で緑内障は永久失明の二番目に大きな原因、アフリカ系アメリカ人では筆頭原因である。緑内障は治療可能で、視力喪失は防止しうるが、一度視力喪失が生じると、それは不可逆的である。高眼内圧（ＩＯＰ）は緑内障の進行の主リスクファクターであるが、その疾患をもつすべての患者でみられるわけではない（Sommer,A.et al.,Arch.Ophthalmol.109:1090-1095(1991)）。高ＩＯＰを伴う緑内障は３つの主カテゴリー：開放隅角、閉塞隅角および発達に分類される。これらカテゴリーの各々は、開始の年齢により、一次および二次型に更に分類される。ＩＯＰを低下させる薬物、例えばプロスタグランジンＦ２αおよびβ２アドレナリンレセプターを標的とするラタノプロスト、ウノプロスト、チモロールは、緑内障患者で眼変性を予防および遅延するために現在用いられている。
【０００３】
したがって、眼障害、例えば緑内障の予防および治療のための標的、ひいては製品を同定および特徴付ける必要性が続いているのである。
【発明の要旨】
【０００４】
本発明は、眼内圧を低下させうるＲ‐１４核酸、ポリペプチドおよび化合物、およびその使用に関する。
【０００５】
したがって、一面において、本発明は式Ｉの実質的に純粋なペプチド化合物を提供する：
Ｚ１‐Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐Ｚ２        Ｉ
上記式中：
Ｘ１は、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ３は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ４は、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたはＨ結合形成基を含む側鎖を有したＴｈｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ５は、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ７は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｃｙｓおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ８は、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｚ１は、式Ｈ２Ｎ‐、ＲＨＮ‐またはＲＲＮ‐のＮ末端基である；
Ｚ２は、式‐Ｃ（Ｏ）ＯＨ、‐Ｃ（Ｏ）Ｒ、‐Ｃ（Ｏ）ＯＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＲＲのＣ末端基である；
Ｒは、各存在箇所で、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニルまたは置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニルから独立して選択される；および
“‐”は共有結合である。
【０００６】
本発明は実質的に純粋な合成ペプチド化合物または組換えペプチド化合物を更に提供し、その化合物は式IIのドメインを有している：
‐Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐        II
上記式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８および“‐”は上記と同義である。
【０００７】
各態様において、化合物はＦＳＬＴＱＫＹＣ；ＨＩＩＣＳＰＬＲ；およびＩＦＤＳＴＥＣＷからなる群より選択される。各態様において、ドメインはＦＳＬＴＱＫＹＣ；ＨＩＩＣＳＰＬＲ；およびＩＦＤＳＴＥＣＷからなる群より選択される。
【０００８】
本発明は、患者で眼内圧を低下させる方法を更に提供し、その方法は有効量の上記化合物を上記患者へ投与することからなる。
【０００９】
本発明は、高眼内圧に伴う症状を患者で治療する方法を更に提供し、その方法は有効量の上記化合物を上記患者へ投与することからなる。
【００１０】
各態様において、その方法は上記患者の目へ上記化合物を投与することからなる。
【００１１】
本発明は、製薬上許容されるキャリアと共に上記の化合物を含んでなる医薬組成物を更に提供する。一態様において、その組成物は患者の目への投与用に処方される。
【００１２】
本発明は、使用のための説明書と一緒に上記の化合物を含んでなる商業パッケージを更に提供する。各態様において、使用は：(ａ)患者で眼内圧を低下させる；および(ｂ)高眼内圧に伴う症状を治療することからなる群より選択される。
【００１３】
本発明は、上記のドメインをコードする配列を含んでなる単離核酸を更に提供する。本発明は、転写調節要素へ作働可能に連結された核酸を含んでなるベクターを更に提供する。本発明は、そのベクターを含んでなる宿主細胞を更に提供する。
【００１４】
本発明は、ペプチド化合物の発現を可能にする条件下で、上記の宿主細胞を培養することからなる、上記のペプチド化合物を産生する方法を更に提供する。
【００１５】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少くとも２７８アミノ酸を含んでなるポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離核酸を更に提供する。一態様において、そのポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含んでなる。一態様において、その核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはそれと実質的に同一の配列を含んでなる。
【００１６】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少くとも２７８連続アミノ酸を含んでなる、実質的に純粋なポリペプチドを更に提供する。別な態様において、そのポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含んでなる。
【００１７】
本発明は、転写調節要素へ作働可能に連結された上記の核酸を含んでなるベクターを更に提供する。本発明は、上記のベクターを含んでなる宿主細胞を更に提供する。
【００１８】
本発明は、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、上記の宿主細胞を培養することからなる、上記のポリペプチドを産生する方法を更に提供する。
【００１９】
本発明は：(ｉ)患者で眼内圧を低下させる；(ii)高眼内圧に伴う症状を治療する；または(iii)(ｉ)および(ii)の双方のための化合物を同定するための方法を更に提供し、その方法は(ａ)Ｒ‐１４を発現する細胞を用意し；(ｂ)その細胞を試験化合物と接触させ；およびＲ‐１４活性が上記試験化合物の存在下で減少するかどうかを調べることからなり、その際に活性の上記減少は、該化合物が：(ｉ)患者で眼内圧を低下させること；(ii)高眼内圧に伴う症状を治療すること；または(iii)(ｉ)および(ii)の双方について有用であることの指標である。一態様において、活性の上記減少は、上記化合物がＲ‐１４拮抗剤であることの指標である。一態様において、Ｒ‐１４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含んでなるポリペプチド、その活性断片、またはそれと実質的に同一の配列を含んでなる。
【００２０】
本発明は：(ａ)患者で眼内圧を低下させる；(ｂ)高眼内圧に伴う症状を治療する；または(ｃ)(ａ)および(ｂ)の双方のための上記化合物の使用を更に提供する。
【００２１】
本発明は、薬剤の製造のための上記化合物または上記組成物の使用を更に提供する。一態様において、その薬剤は：(ａ)患者で眼内圧を低下させる；(ｂ)高眼内圧に伴う症状を治療する；または(ｃ)(ａ)および(ｂ)の双方のためである。
【００２２】
一態様において、上記の症状は緑内障である。
【００２３】
一態様において、上記の患者は哺乳動物、別な態様ではヒトである。
【００２４】
別な態様において、Ｚ１は、プロトン、１〜３アミノ酸の配列、または遮断基、例えばカルバメート基、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、１〜８炭素の短い直鎖および分岐アルキル基のような疎水性部分から構成されるアシル基からなる群より選択される。別な態様において、Ｚ２は、プロトン、ＮＨ２、１〜３アミノ酸並びにアリールアルキルアミン、例えばベンジルアミン、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミン、および１〜８炭素の短い直鎖および分岐アルキル基を有する脂肪族アミンからなる群より選択される。
【００２５】
別な面において、本発明は薬剤を処方するための方法を提供し、その方法は本発明の化合物を製薬上許容されるキャリアと混合することからなる。
【００２６】
別な面において、本発明は患者で眼内圧を低下させる方法を提供し、その方法は患者でＲ‐１４タンパク質の発現および／または活性を阻害することからなる。一態様において、Ｒ‐１４タンパク質は：
(ａ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチド；および
(ｂ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチドをコードしうる第二の核酸と実質的に同一である第一の核酸によりコードされるポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドを含んでなる。一態様において、第二の核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で記載されている通りである。
【００２７】
一態様において、上記の方法はＲ‐１４活性を調節しうる剤の有効量を患者に投与することからなる。一態様において、その剤は本発明の化合物である。別な態様において、その方法は上記組成物の治療有効量を患者に投与することからなる。一態様において、その用量は約０．００１〜約１００ｍｇである。
【００２８】
本発明は、患者で眼内圧を低下させる方法を更に提供し、その方法は本発明の化合物の有効量を患者に投与することからなる。一態様において、その方法は上記組成物の治療有効量を患者に投与することからなる。一態様において、その用量は約０．００１〜約１００ｍｇである。
【００２９】
本発明は高眼内圧に伴う症状を患者で予防または治療する方法を更に提供し、その方法は患者でＲ‐１４タンパク質の発現および／または活性を阻害することからなる。一態様において、Ｒ‐１４タンパク質は：
(ａ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチド；および
(ｂ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチドをコードしうる第二の核酸と実質的に同一である第一の核酸によりコードされるポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドを含んでなる。一態様において、第二の核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で記載されている通りである。
【００３０】
一態様において、その方法はＲ‐１４活性を調節しうる剤の有効量を患者に投与することからなる。一態様において、その剤は本発明の化合物である。別な態様において、その方法は上記組成物の治療有効量を患者に投与することからなる。一態様において、その用量は約０．００１〜約１００ｍｇである。
【００３１】
本発明は、高眼内圧に伴う症状を患者で予防または治療する方法を更に提供し、その方法は本発明の化合物の有効量を患者に投与することからなる。別な態様において、その方法は上記組成物の治療有効量を患者に投与することからなる。一態様において、その用量は約０．００１〜約１００ｍｇである。
【００３２】
本発明は：
(ａ)患者で眼内圧を低下させる；
(ｂ)高眼内圧に伴う症状を予防または治療する；または
(ｃ)(ａ)および(ｂ)の双方；
のための説明書と一緒に、Ｒ‐１４活性を調節しうる剤を含んでなる商業パッケージを更に提供する。
【００３３】
一態様において、Ｒ‐１４タンパク質は：
(ａ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチド；および
(ｂ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチドをコードしうる第二の核酸と実質的に同一である第一の核酸によりコードされるポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドを含んでなる。
【００３４】
本発明は、眼内圧を低下させるための化合物を同定および／または特徴付けするための方法を更に提供し、その方法は、Ｒ‐１４拮抗剤として作用する化合物を同定するために、試験化合物の存在下でＲ‐１４の活性をアッセイすることからなり、その際に拮抗活性は試験化合物が眼内圧を低下させる上で有用であることの指標である。
【００３５】
本発明は、眼内圧を低下させるための化合物を同定および／または特徴付けするための方法を更に提供し、その方法では：
(ａ)(ｉ)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチド；および
(ii)ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチドをコードしうる第二の核酸と実質的に同一である第一の核酸によりコードされるポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドを発現する宿主細胞と試験化合物を接触させ；および
(ｂ)Ｒ‐１４拮抗剤として作用する化合物を同定するために、試験化合物の存在下でＲ‐１４の活性をアッセイするが、その際に拮抗活性は試験化合物が眼内圧を低下させる上で有用であることの指標である。一態様において、その化合物は高眼内圧に伴う症状の予防および／または治療のために用いうる。
【００３６】
一態様において、上記の患者は哺乳動物、別な態様ではヒトである。
【００３７】
一態様において、上記の症状は緑内障である。
【００３８】
本発明の他の目的、利点および特徴は、添付図面を参考にして、好ましい態様の下記非制限的記載を読むことで、より明らかになるであろうが、それらは例示であって、本発明の範囲を制限すると解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】例１で記載されたような、ＰＣＲ増幅により得られた〜９６０ｂｐ産物（矢印）のアガロースゲル電気泳動分離。−Ｂａｃ：無プラスミドＤＮＡ；＋Ｂａｃ：プラスミドＤＮＡ含有（０．１μｇ）；ＭＷ  ｓｔｄ：λＨｉｎｄIII切断物。
【図１Ｂ】（Ｂ）Ｒ‐１４リーディングフレームのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
【図１Ｃ】Ｒ‐１４ポリペプチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。
【図２】例２で記載されたような、Ｒ‐１４発現分析用ＲＴ‐ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動分析．虹彩：虹彩組織から得られたサンプル；ＨＴＭ：ヒト小柱網組織から得られたサンプル。
【図３】例３で記載されたような、ヒト細胞におけるクローン化ヒトＲ‐１４レセプターの発現のイムノブロット分析．矢印はＲ‐１４免疫反応バンドを示している。
【図４Ａ】例４で記載されたような、Ｒ‐１４タンパク質の阻害剤の同定および特徴のグラフ結果。
【図４Ｂ】例４で記載されたような、Ｒ‐１４タンパク質の阻害剤の同定および特徴のグラフ結果。
【図５】例５で記載されたような、ペプチド１４０５とラタノプロストおよびチモロールとの効力の比較のグラフ結果。
【図６】例６で記載されたような、ペプチド１４０２および１４０５の選択性の分析のグラフ結果。
【図７Ａ】例７で記載されたような、ウサギの眼内圧におよぼすペプチド１４０２の効果のグラフ結果。
【図７Ｂ】例７で記載されたような、ウサギの眼内圧におよぼすペプチド１４０５の効果のグラフ結果。
【発明の詳細な説明】
【００４０】
新規ＧＰＣＲの同定
低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション、ディファレンシャル・ディスプレー、マイクロアレー、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション、および組織で分化発現された遺伝子のクローニングにより追跡される他の技術の使用で、新規Ｇタンパク質カップリングレセプターについて潜在的にコードしうるいくつかの新規ｃＤＮＡを明らかにした。ヒトゲノムのドラフト配列の解明後（Venter,J.C.et al.Science.291:1304-1351(2001)；International Human Genome Sequencing Consortium.Nature.409:860-921(2001)）、多くのＧＰＣＲ様配列がそれらの規定７貫膜トポロジーおよび保存タンパク質モチーフに基づき同定された（Howard,DA et al.,2001.Trends Pharmacol.Sci.22(3):132-140）。これらのユニークなＧＰＣＲ様配列は〜１０００であり、そのうち非嗅覚ＧＰＣＲ配列は〜６１６と見積もられる。
【００４１】
Gonzalez et al.（Gonzalez,P.et al.,2000.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.41:3678-3673）は、（ＨＴＭＩ‐００２５と称され、ヒト染色体１１ワーキングドラフト配列でみられる配列Ｈｓｌｌ ９４６４およびＨｓｌｌ ２４４３８に相当する）ＭＡＳ関連Ｇタンパク質カップリングレセプターと相同性を有する配列を含めて、ヒト小柱網から単離された１０６０ｃＤＮＡクローンのシングルパス配列決定を行った。
【００４２】
Dong et al.（Dong,X.et al.2001.Cell 106:619-632）は、ニューロゲニン遺伝子を欠くマウス胚からいくつかのｍａｓ関連ｃＤＮＡをクローニングし、次いで（Ｈｓ ｍｒｇＸ１‐４と称される）４つの関連遺伝子を現わす配列をヒトゲノムの中から探し出した。
【００４３】
ＧＰＣＲの生理学的リガンドが未知であるとき、それはオーファンＧＰＣＲと称されている。これらオーファンＧＣＰＲのリガンドを発見するために、組織から単離された天然ペプチドを含有するランダムライブラリー、あるいはコンビナトリアル化学により産生されたまたは天然源からの小さな分子を含有するものが、細胞ベースでおよびインビトロアッセイでスクリーニングされる。オーファンＧＰＣＲの選択的モジュレーターが、適切な動物モデルを用いて、生理学および病態生理学でその機能を評価するために用いうる。オーファンＧＰＣＲの機能を見出すことが、新規薬物標的としてその可能性を分析する際の第一ステップである。
【００４４】
ここで記載された研究は、小柱網で発現される新規ＧＰＣＲタンパク質、それをコードしうる核酸、および眼組織の現象、特に眼内圧を調節しうるペプチド化合物に関する。
【００４５】
一面において、本発明は、ｍＲＮＡおよびタンパク質を発現できて、動物で眼流出の役割に関与する、単離されたＧＰＣＲ様リーディングフレームを提供する。本発明は、眼内圧を低下させるために、ひいては高眼内圧に伴う障害、例えば緑内障および関連症状の予防／治療のために用いうる、ＧＰＣＲの拮抗剤３種を更に提供する。
【００４６】
ここで記載されているように、本発明者らはＢＡＣクローンから長さ０．９７ＫｂのゲノムＤＮＡ断片をクローニングし、それが３２２アミノ酸長タンパク質をコードする単一エキソンを含有していることを示した。このタンパク質はＲ‐１４と称される。インシリコ(in silico)分析から、Ｒ‐１４は、７つのプロミネント貫膜ドメインおよびＧタンパク質カップリングレセプターの多くのタンパク質モチーフを含有した、内在性膜タンパク質であるらしい。ＲＴ‐ＰＣＲを用いることにより、Ｒ‐１４  ｍＲＮＡはヒト小柱網で発現されることが示されたが、別な眼組織、虹彩では発現されない。Ｒ‐１４リーディングフレームが哺乳動物発現ベクター中にクローニングされて、一時的かつ安定的にＨＥＫ２９３細胞で発現された。これらの細胞を用いて、４０ｋＤａのタンパク質が組換えＲ‐１４遺伝子によりコードされていると確認された。更に、選択的ペプチドリガンドを用いて、Ｒ‐１４レセプターの阻害が、ブタ小柱網で、基礎ホスホイノシチドレベルではなく、基礎サイクリックＡＭＰ合成の低下、最も重要なことには、ウサギ、成体ブタ目および麻酔仔ブタで基礎眼内圧の低下に至ることを、本発明者らは示した。この情報に基づき、Ｒ‐１４レセプターが、高眼内圧に伴う症状、例えば緑内障および関連症状の治療に有用な降眼圧薬のスクリーニングに有用な標的として特定された。
【００４７】
更に、降眼圧薬および緑内障治療薬として、またはこのような薬物の開発向けのリード化合物として用いうる可能性のある、Ｒ‐１４レセプターの選択的阻害剤を含有した組成物が記載されている。降眼圧薬および緑内障治療薬へ最適化しうるＲ‐１４リガンドを提供するためのリード化合物を特定する上で、化学化合物ライブラリーをスクリーニングするために用いうるバイオアッセイが記載されており、そこでは宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）が組換え発現Ｒ‐１４を含有している。
【００４８】
定義
便宜上、明細書、例および添付された請求項で用いられている、ある用語および語句の意味は、以下で示されている。
【００４９】
ここで用いられている“作働剤”という用語は、Ｒ‐１４生活性の少くとも一面を増強する剤に関する意味である。Ｒ‐１４生活性は、例えば、野生型活性およびシグナル導入を刺激することで増加しうるか、またはシグナル導入カスケードに関与する他のタンパク質と野生型Ｒ‐１４タンパク質をより効果的に相互作用させうる。
【００５０】
ここで用いられている“拮抗剤”とは、少くとも１つのＲ‐１４生活性を阻害する剤に関する意味である。Ｒ‐１４拮抗剤は、Ｒ‐１４タンパク質と他の分子との相互作用を阻害または減少させるか、Ｒ‐１４ポリペプチドの合成および発現を減少させるか、あるいはＲ‐１４分子の生活性を阻害する化合物である。拮抗剤には、核酸分子、例えばＲ‐１４のドミナントネガティブ形、Ｒ‐１４アンチセンス分子、Ｒ‐１４ｍＲＮＡと特異的に相互作用しうるリボザイム、またはＲ‐１４ポリペプチドと結合する分子、例えばペプチド、抗体、小分子がある。
【００５１】
“Ｒ‐１４活性を調節しうる剤”とは、Ｒ‐１４タンパク質を含む系中へ導入されたときに、Ｒ‐１４活性または機能の少くとも一面を変えうる、あらゆる化合物に関する。このような剤には、Ｒ‐１４タンパク質のリガンド、別な態様では前記のような作働剤または拮抗剤がある。このような剤は、Ｒ‐１４タンパク質で直接、あるいはＲ‐１４活性の調節に至るプロセスまたは活性を調節することで間接的に作用する。ある系（例えば、インビボ）において、このような剤は、作用部位でその到達時または前に活性型へ代謝されるプロドラッグでもよい。Ｒ‐１４活性の例は以下で示されている。
【００５２】
ここで用いられている“アミノ酸”という用語には、天然アミノ酸のＬおよびＤ双方の異性体（表１）、並びにペプチドの合成アナログを製造するためにペプチド化学で用いられる他の非タンパク質アミノ酸を含む。天然アミノ酸の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンなどである。一方、非タンパク質アミノ酸はノルロイシン、ノルバリン、シクロヘキシルアラニン、ビフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、オルト、パラおよびメタ位でアルコキシ、ハロゲンまたはニトロ基で置換されたフェニルアラニンなどである。これらの化合物はペプチド化学業者に知られている。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
“生物活性”、“生活性”、“活性”または“生物機能”は、互換的に用いられ、ここでの目的にとり、Ｒ‐１４ポリペプチドまたその断片により直接または間接的に発揮される機能を意味する。この例として、Ｒ‐１４の生物活性には、他の分子への結合、他のタンパク質との相互作用、シグナル導入の変化、例えばＧαタンパク質によるグアニンヌクレオチド結合、カルシウム異常流出、ｃＡＭＰ合成、リン酸イノシトール合成、Ｒ‐１４ポリペプチドのインターナリゼーション、細胞膜における他の細胞内タンパク質または被覆小胞との会合、眼内圧の変化、シュレム管の房水通過量上昇などがある。
【００５５】
“細胞”、“宿主細胞”または“組換え宿主細胞”は、ここでは互換的に用いられる用語である。このような用語は特定の細胞のみならず、そのすべての子孫に関する、と理解される。その用語の範囲内には、哺乳動物（例えば、ヒト）、両生類、真菌（例えば、酵母）および細菌（例えば、大腸菌）源の細胞も属する。
【００５６】
“融合ポリペプチド”は一般式Ｘ‐（Ｒ‐１４）‐Ｙで表わされ、ここでＲ‐１４はＲ‐１４ポリペプチドから誘導されるポリペプチドの一部を表わし、ＸおよびＹはアミノ酸配列であり、融合ペプチドに独立して存在するかまたは不在である。
【００５７】
ここで用いられている“核酸”という用語は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および、適切であればリボ核酸（ＲＮＡ）に関する。
【００５８】
“タンパク質”および“ポリペプチド”という用語は、遺伝子産物に関するとき、ここでは互換的に用いられる。
【００５９】
“Ｒ‐１４核酸”という用語は、Ｒ‐１４タンパク質をコードしうる核酸、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する核酸並びにその断片およびそれと実質的に同一の配列に関する。
【００６０】
“Ｒ‐１４ポリペプチド”および“Ｒ‐１４タンパク質”という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたはその断片、変種およびホモログを包含した意味である。
【００６１】
“相同性”および“相同的”とは、２ペプチドまたは２核酸分子間の配列類似性に関する。相同性は、並置配列で各位置を比較することにより調べられる。核酸間またはアミノ酸配列間の相同性の程度は、各配列の共通位置における同一または対応ヌクレオチドまたはアミノ酸の数の相関である。“非関連”または“非相同的”配列は、本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または２と、４０％以下の同一性、好ましくは約２５％以下の同一性を有する。
【００６２】
実質的に相補性の核酸とは、ある分子の“相補物”が他の分子と実質的に同一である核酸である。２つの核酸またはタンパク質配列は、最適に並べられたとき、それらが少くとも約７０％の配列同一性を有していれば、“実質的に同一”とみなされる。別な態様において、配列同一性は、例えば、少くとも７５％、少くとも８０％、少くとも８５％、少くとも９０％または少くとも９５％である。同一性の比較のための配列の最適な並置は、様々なアルゴリズム、例えばSmith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482,the homology alignment algorithm of Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443,the search for similarity method of Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444のローカルホモロジーアルゴリズム、およびこれらアルゴリズムのコンピューター処理（例えば、Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,Madison,WI,U.S.A.のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）を用いて行われる。配列同一性は、Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215:403-10で記載されている（公表されたデフォルトセッティングを用いる）ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて調べてもよい。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Information（インターネットでhttp://www.ncbi.nim.nih.gov/）から入手しうる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、データベース配列で同一長さのワードと並べたときに、一部のポジティブ閾値スコアＴと合うかまたはそれを満たす長さＷの短いワードをクエリー配列で特定することにより、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に特定する。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される。初期隣接ワードヒットは、長いＨＳＰを見つける上で、開始サーチ用のシードとして作用する。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増すかぎり、各配列に沿い両方向へ延長される。各方向におけるワードヒットの延長は、下記パラメーターに出会ったときに止められる：累積アライメントスコアは量Ｘによりその最大到達値から低下する；累積スコアは、１以上のネガティブスコアリング残基アライメントの蓄積のせいで、ゼロまたはそれ以下に下がる；または配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアライメントの感度および速度を定める。ＢＬＡＳＴプログラムでは、デフォルトとして、１１のワードレンクス（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）（または１または０．１または０．０１または０．００１または０．０００１）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を用いてもよい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いた２配列間の統計的類似性の１尺度は、２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を呈する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。本発明の別な態様において、最小合計確率が試験配列の比較で約１以下、好ましくは約０．１以下、更に好ましくは約０．０１以下、最も好ましくは約０．００１以下であるならば、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は実質的に同一とみなされる。
【００６３】
２つの核酸配列が実質的に相補的である別な指標は、適度なストリンジェント、または好ましくはストリンジェントな条件下で、２つの配列が互いにハイブリッド形成することである。適度なストリンジェント条件下でのフィルター結合配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、６５℃で０.５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で行い、４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄する（Ausubel,et al.(eds),1989,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.,New York,p.2.10.3参照）。一方、ストリンジェント条件下でのフィルター結合配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、６５℃で０.５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で行い、６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄する（Ausubel,et al.(eds),1989,前掲参照）。ハイブリダイゼーション条件は、対象の配列に応じて公知の方法に従い修正してもよい（Tijssen,1993,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2”Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”(ハイブリダイゼーションの原理および核酸プローブアッセイの戦略の概観),Elsevier,New York参照）。通常、ストリンジェント条件は、規定イオン強度およびｐＨで特定配列の熱融点より約５℃低くなるように選択される。
【００６４】
ここで用いられている“相互作用”という用語は、分子間の検出可能な結びつきまたは会合（例えば、生化学的相互作用）、例えば、種類としてタンパク質‐タンパク質、タンパク質‐核酸、核酸‐核酸、およびタンパク質‐小分子または核酸‐小分子間の相互作用を含めた意味である。
【００６５】
ここで用いられている“調節”という用語は、アップレギュレーション（即ち、活性化または刺激（例えば、作働または増強することによる））およびダウンレギュレーション（即ち、阻害または抑制（例えば、拮抗、減少または阻害することによる））の双方に関する。
【００６６】
“ペプチド”という用語は、少くとも２つのアミノ酸から最大で５０のアミノ酸まで含有した直鎖ポリマーを意味する。別な態様において、ペプチドは２〜２５のアミノ酸、２〜２０のアミノ酸、２〜１５のアミノ酸、２〜１０のアミノ酸または８つのアミノ酸を含有している。アミノ酸には天然または合成分子がある。このような分子の例は、Ｌ‐アミノ酸、Ｄ‐アミノ酸、および非タンパク質アミノ酸を含む、それに限定されない天然アミノ酸の合成アナログである。
【００６７】
“ペプチドミメティック”という用語は、ペプチドの構造および／または機能特徴と似た分子に関する。当業者はペプチドのペプチドミメティックを誘導する様々な方法：合成化学存在物による個別アミノ酸の置換、非タンパク質アミノ酸アナログ、アミノ酸の欠損、付加、βターンミメティックのようなスカホールドまたは公知のファーマコフォア(pharmacophore)によるペプチドの１以上のアミノ酸の置換を用いる。一般的方法の記載はPeptidomimetic protocols（Methods in molecular medicine,Vol.23）W.M.Kazmierski(eds.),Humana Press and Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics,Vol.1&2,A.Abell(Ed)でみられる。
【００６８】
“組換えタンパク質”という用語は、組換えＤＮＡ技術により産生された本発明のポリペプチドに関し、通常、Ｒ‐１４ポリペプチドをコードするＤＮＡが適切な発現ベクター中へ挿入され、次いでそれが宿主細胞を形質転換させて異種タンパク質を産生するために用いられる。“組換え”とは何かが組み換えられたことを意味し、そのため核酸構築物に言及するとき、その用語は一緒に結合されたかまたは分子生物学技術により産生された核酸配列から構成される分子に関する。“組換え”という用語は、タンパク質またはポリペプチドに言及するとき、分子生物学技術により作製された組換え核酸構築物を用いて発現されるタンパク質またはポリペプチド分子に関する。“組換え”という用語は、遺伝子組成物に言及するとき、親ゲノムで生じない対立遺伝子の新規組合せを有する配偶子、子孫、細胞またはゲノムに関する。組換え核酸構築物は、性質上連結されない、または性質上異なる位置で連結される核酸配列へ連結された、またはそれと連結するように操作されたヌクレオチド配列を含んでもよい。したがって、‘組換え’として核酸構築物に言及するときは、核酸分子が遺伝子工学を用いて、即ちヒトの介入により操作されたことを示している。組換え核酸構築物は、例えば形質転換により宿主細胞中へ導入される。このような組換え核酸構築物は、単離して宿主種の細胞中へ再導入された、同一宿主細胞種または異なる宿主細胞種に由来する配列を含有してもよい。組換え核酸構築物配列は、宿主細胞の初回形質転換の結果またはそれ以後の組換えおよび／または修復現象の結果として、宿主細胞ゲノム中へ組み込まれるようになる。
【００６９】
“ベクター”という用語は、それが連結された別の核酸を輸送しうる核酸分子に関する。好ましいベクターの１タイプはエピソーム、即ち染色体外複製しうる核酸である。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製および／または発現を行いうるものである。それらが作働可能に連結された遺伝子の発現を指示しうるベクターは、ここでは“発現ベクター”と称される。
【００７０】
本発明の組換え発現ベクターは、例えばSambrook et al.(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manualでみられる、当業者に知られた標準技術により構築しうる。様々な戦略がＤＮＡの断片を連結するために利用しうるが、その選択はＤＮＡ断片の末端の性質に依存しており、当業者であれば容易に決定しうる。本発明のベクターは、細菌および宿主細胞でベクター増殖および選択を促すために、他の配列要素も含有してよい。加えて、本発明のベクターは１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位向けヌクレオチドの配列を含んでもよい。選択マーカーおよびリポーター遺伝子向けのようなコード配列は、当業者に周知である。
【００７１】
本発明の核酸配列を含んでなる組換え発現ベクターは宿主細胞中へ導入されるが、それには規定の組換え発現ベクターからタンパク質コード領域を発現しうる生細胞がある。生細胞には培養細胞および生物内の細胞の双方がある。したがって、本発明は本発明の組換え発現ベクターを含有した宿主細胞も提供する。“宿主細胞”および“組換え宿主細胞”という用語はここでは互換的に用いられる。このような用語は特定の対象細胞のみならず、このような細胞の子孫または潜在的子孫にも関する。ある修飾が変異または環境的影響のせいで次世代に生じうるため、このような子孫は親細胞と事実上同一でないかもしれないが、ここで用いられている用語の範囲内になお属する。
【００７２】
ベクターＤＮＡは慣用的な形質転換またはトランスフェクション技術で細胞中へ導入しうる。“形質転換”および“トランスフェクション”という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共同沈降、ＤＥＡＥ‐デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびウイルス仲介トランスフェクションを含めた、外来核酸を宿主細胞中へ導入するための技術に関する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために適した方法は、例えばSambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))および他の実験マニュアルでみられる。インビボで哺乳動物細胞中へＤＮＡを導入するための方法も知られており、眼内圧を低下させるおよび／または緑内障のような関連症状を治療する遺伝子療法で患者へ本発明のベクターＤＮＡを送達させるために用いられる。
【００７３】
“転写調節配列／要素”とは、開始および終結シグナル、エンハンサーおよびプロモーター、スプライシングシグナル、作働可能に連結されたタンパク質コード配列の転写を誘導または制御するポリアデニル化シグナルのような、ＤＮＡ配列に関する遺伝用語である。本発明において、Ｒ‐１４遺伝子の１つの転写は、細胞タイプで組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列のコントロール下にある。第一の核酸配列が第二の核酸配列との機能的関係下に置かれたとき、第一の核酸配列は第二の核酸配列と“作働可能に連結”されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与えるならば、プロモーターはコード配列へ作働可能に連結されている。通常、作働可能に連結されたＤＮＡ配列は隣接しており、２つのタンパク質コード領域を結ぶために必要であれば、リーディングフレーム内にある。しかしながら、例えばプロモーターから数キロ塩基離されたときでもエンハンサーは通常機能し、イントロン配列は様々な長さであるため、一部のポリヌクレオチド要素は隣接せずに作働可能に連結させてもよい。
【００７４】
ここで用いられている“トランスフェクション”という用語は、核酸仲介遺伝子トランスファーによるレシピエント細胞中への、例えば発現ベクターを介した、核酸の導入を意味する。
【００７５】
外来核酸（例えば、外来または異種ＤＮＡ〔例えば、ＤＮＡ構築物〕）が導入された細胞（例えば、宿主細胞または指示細胞）、組織、臓器または生物は、“形質転換された”、“トランスフェクトされた”または“トランスジェニック”とみなされる。トランスジェニックまたは形質転換された細胞または生物には、その細胞または生物の子孫、および、親としてトランスジェニック生物を用いて組換え核酸構築物の存在に起因した改変表現型を示すブリーディングプログラムから産生された子孫も含める。したがって、トランスジェニック生物とは異種核酸で形質転換された生物、またはトランスジーンを含むこのような生物の子孫である。導入されたＤＮＡは細胞ゲノムの染色体ＤＮＡ中へ組み込んでも、あるいは（例えば、プラスミドで）エピソームとして維持してもよい。トランスフェクションの方法は当業界で周知である（Sambrook et al.,1989,前掲；Ausubel et al.,1994,前掲）。
【００７６】
哺乳動物細胞の安定的トランスフェクションでは、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、小さな画分の細胞のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノム中へ取込むことが知られている。これらの成分を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質への耐性）をコードする遺伝子が、対象の遺伝子と共に、宿主細胞中へ導入される。ここで用いられている“選択マーカー”という用語は、特定可能な特性を指示細胞へ付与するマーカーに言及するために、広く用いられている。選択マーカーの非制限例として、生存度、代謝、増殖、形態などに影響を与えるマーカーがある。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメソトレキセートのような薬物への耐性を付与するものがある。選択マーカーをコードする核酸は、ペプチド化合物をコードするものと同一のベクターで宿主細胞中へ導入しても、または別のベクターで導入してもよい。導入核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択により同定される（選択マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生き残り、他の細胞は死ぬ）。
【００７７】
化合物が自然に付随する成分から分離されたとき、化合物は“実質的に純粋”である。典型的には、サンプル中全物質の少くとも６０重量％、更に一般的には７５％または９０％以上であるとき、化合物は実質的に純粋である。そのため、例えば、化学的に合成または組換え技術で産生されたポリペプチドは、一般的に、その自然に付随する成分から実質的に分離される。本発明のＤＮＡが由来する生物の天然ゲノムで通常隣接するコード配列と核酸分子が直に隣接（即ち、共有結合）していないとき、核酸分子は実質的に純粋である。実質的に純粋な化合物は、例えば、天然源からの抽出により；ポリペプチド化合物をコードする組換え核酸分子の発現により；または化学合成により得られる。純度は、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣなどのような、いずれか適切な方法を用いて測定しうる。
【００７８】
ここで用いられている“小分子”とは、約１ｋＤ以下、最も好ましくは約０．４ｋＤ以下の分子量を有する構造体に関する意味である。小分子には、ヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ペプチドミメティック、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）分子がある。多くの製薬会社は、本発明のアッセイのいずれかでスクリーニングしてＲ‐１４生活性を調節する化合物を同定しうる、化学および／または生物混合物、多くの場合は真菌、細菌または藻類抽出物の膨大なライブラリーを有している。
【００７９】
“アルキル”という用語は、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基を含めた、飽和脂肪族基に関する。典型的なアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ‐ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどがあるが、それらに限定されない。アルキル基は（Ｃ１‐Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ１‐Ｃ３）アルキルである。“置換アルキル”は、炭化水素主鎖の１以上の炭素で水素の代わりに置換基を有している。このような置換基には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、ケトン（アルキルカルボニルおよびアリールカルボニル基を含む）およびエステル（アルキルオキシカルボニルおよびアリールオキシカルボニル基を含む））、チオカルボニル、アシルオキシ、アルコキシル、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アシルアミノ、アミド、アミジン、イミノ、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アラルキルまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分がある。炭化水素鎖上で置換された部分は、適切であれば、それ自体が置換されてもよい。例えば、置換アルキルの置換基には、アミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネートおよびホスフィネートを含む）、スルホニル（サルフェート、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホネートを含む）およびシリル基、並びにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレートおよびエステルを含む）、‐ＣＦ３、‐ＣＮなどの置換および非置換形がある。例示の置換アルキルは以下で記載されている。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、‐ＣＦ３、‐ＣＮなどで更に置換されてもよい。
【００８０】
“アルケニル”および“アルキニル”という用語は、上記のアルキルと長さおよび可能な置換が似ているが、少くとも１つの二重または三重結合を各々含有した、不飽和脂肪族基に関する。“アルケニル”は、少くとも１つの炭素‐炭素二重結合を有した不飽和の分岐、直鎖または環式炭化水素基である。その基は二重結合でシスまたはトランスコンホメーションをとる。典型的なアルケニル基にはエテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、tert‐ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどがあるが、それらに限定されない。“アルキニル”は、少くとも１つの炭素‐炭素三重結合を有した不飽和の分岐、直鎖または環式炭化水素基である。典型的なアルキニル基にはエチニル、プロピニル、ブチニル、イソブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなどがあるが、それらに限定されない。
【００８１】
“治療有効量”とは、例えば眼内圧の低下および緑内障のような関連障害で、望ましい治療結果を得るために、必要な用量および期間で、有効な量に関する。本発明の化合物の治療有効量は、個体の病状、年齢、性別および体重、および個体で望ましい応答を引き出せる化合物の能力のようなファクターに応じて変わる。投与法は最適な治療応答を発揮するように調整してよい。治療有効量は、化合物の毒性または有害作用が治療上有益な効果より優らないものでもある。“予防有効量”とは、例えば高眼内圧を予防または低下し、更には緑内障のような関連障害を予防または治療するような、望ましい予防結果を得るために、必要な用量および期間で、有効な量に関する。予防有効量は治療有効量に関して前記されたように定めうる。どのような患者でも、具体的な投与法は、個別の必要性および組成物の投与を実施または管理する者の専門的判断に従い、経時的に調整しうる。
【００８２】
ここで用いられている“製薬上許容されるキャリア”または“賦形剤”には、生理的に適合しうる、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などがある。一態様において、キャリアは非経口投与に適している。一方、キャリアは静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下または経口投与にも適する。製薬上許容されるキャリアには、無菌水溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末がある。薬学的に活性な物質向けのこのような媒体および剤の使用は、当業界で周知である。いかなる慣用的な媒体または剤も活性化合物と不適合でないかぎり、本発明の医薬組成物でその使用が考えられる。補助活性化合物も組成物中へ配合しうる。
【００８３】
Ｒ１４核酸
上記のように、本発明は、ヒト核酸をコードする、“Ｒ‐１４”と称されるタンパク質をコードしたヒト遺伝子の発見に一部基づいている。インシリコ分析では、Ｒ‐１４が７つのプロミネント疎水性ドメインおよびＧタンパク質カップリングレセプターの多くのシグネチャーモチーフを含有した内在性膜タンパク質であることを示した。Ｒ‐１４のタンパク質および核酸は、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ分析によると、ヒト、マウスおよびラットＭＡＳ関連Ｇタンパク質カップリングレセプターと強い相同性を示す。（Sanger Center,ＵＫから得られた）ＢＡＣ  ＲＰ１１‐２０６ｃｌの０．９６ｋｂサブクローンが完全に配列決定され、Ｒ‐１４の全コード領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含有することがわかった。ヒトＲ‐１４コード配列は大きさが０．９６６ｋｂであり、イントロンを含まない。９６６ｂｐオープンリーディングフレーム（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は３２２アミノ酸ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をコードする。ｄＢＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴＮ分析では、ＨＴＭＩ‐００２５Ｆ１と称されるＥＳＴ（GenBank Acc.：ＢＥ４３９４０９）とほぼ同一性を示し、核酸配列はＨＴＭＩ‐００２５Ｆ１と同一であるが（Gonzalez,P.et al.,前掲）、但し６６１１５８位でＧｌｎからＰｒｏへ変わるＡからＣへの２つのヌクレオチド変化がある（ＮＴ ００９３０７．３（Ｈｓｌｌ ９４６４））。
【００８４】
本発明は、単離されたＲ‐１４核酸、そのホモログ、およびその部分を提供する。好ましい核酸は、Ｒ‐１４遺伝子のヌクレオチド配列、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示された配列と少くとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％および９５％相同的な配列を有する。好ましい核酸は脊椎動物Ｒ‐１４核酸である。特に好ましい脊椎動物Ｒ‐１４核酸は哺乳動物、一態様においてヒトである。一態様において、好ましい核酸は、対象Ｒ‐１４ポリペプチドの少くとも１つの生活性を有するポリペプチドをコードしたｃＤＮＡである。
【００８５】
Ｒ１４ポリペプチド
本発明は、ポリペプチドが自然に発現される細胞または組織、あるいは組換えＲ‐１４核酸の遺伝子トランスファーを用いてＲ‐１４ポリペプチドが無細胞抽出物または精製膜画分として発現される細胞で産生され、それから単離される、Ｒ‐１４ポリペプチドを特徴とする。機能型の対象ポリペプチドは、ここで記載されているようなクローン化遺伝子を用いることにより、精製物として調製される。本発明の好ましいＲ‐１４タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列と少くとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一のまたは相同的なアミノ酸配列を有する。好ましい態様において、本発明のＲ‐１４タンパク質は哺乳動物Ｒ‐１４タンパク質である。特に好ましい態様において、Ｒ‐１４タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として示されている。ある翻訳後修飾、例えばホスホリル化などは、未修飾ポリペプチド鎖と比較して、Ｒ‐１４タンパク質の見掛け分子量を増やすことがある、と理解されるであろう。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で掲載されたＲ‐１４のスプライス変種によりコードされるタンパク質イソ型も、本発明の範囲内に属する。このようなイソ型は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で特定されたＲ‐１４タンパク質により保有されるものから、追加の生物活性を有することもある。
【００８６】
Ｒ１４ポリペプチド融合体、変異タンパク質およびそのホモログ
一面において、本発明は、細胞および組織の富化画分として、あるいは天然、組換え産生または化学合成ポリペプチドの実質的に純粋な調製物としての、Ｒ‐１４ポリペプチドに関する。本発明のＲ‐１４ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で記載されたような全鎖長タンパク質を含んでなるか、あるいは１以上の特定モチーフ／ドメインに相当するそれより小さな断片、または長さが少くとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００アミノ酸の断片を含有した融合タンパク質を含んでなる。対象Ｒ‐１４タンパク質には、その範囲内に、修飾タンパク質、例えば、タンパク質のグリコシル化、ミリスチル化、パルミチル化およびホスホリル化のような翻訳後修飾を特定の変異が防ぐか、あるいは作働剤、拮抗剤またはシグナル導入に関与する細胞内タンパク質とＲ‐１４変異タンパク質との相互作用を変異が防止または増強するようなタンパク質も含む。
【００８７】
別な態様において、本発明のＲ‐１４ポリペプチドは、最少数のその連続アミノ酸により規定されるような、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチドの断片を含んでもよい。したがって、各態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少くとも１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、２７８、２８０、２９０、３００、３０５、３１０、３１５、３２０連続アミノ酸を含んでなるＲ‐１４ポリペプチドに関する。
【００８８】
別な面において、本発明はＲ‐１４タンパク質を産生するための組換え発現系に関する。細胞、組織および動物で発現のために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されたような核酸が哺乳動物発現ベクター中にクローニングされたが、そこではＲ‐１４核酸が転写調節配列、例えば少くとも１つの転写プロモーター（構成性発現用）、スプライシングおよび転写終結に必要な配列へ作働可能に連結されていた。このような調節配列は、Ｒ‐１４核酸分子と一緒になって、遺伝子発現に有用なベクターをもたらした。当業者であれば、Ｒ‐１４タンパク質を産生するためのインビトロ（例えば、細胞培養）およびインビボ（例えば、トランスジェニック）法により、適切な発現ベクターでトランスフェクトされた原核および真核宿主細胞でＲ‐１４タンパク質を発現させるために、類似した戦略を用いうる。
【００８９】
本発明は対象Ｒ‐１４ポリペプチドを産生する方法に更に関する。例えば、対象ポリペプチドをコードしたヌクレオチド配列の発現を指示する核酸“ベクター”でトランスフェクトされた“宿主細胞”は、ペプチドの発現を生じさせるために適切な条件下で培養しうる。細胞培養に適した培地は当業界で周知である。組換えＲ‐１４ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動およびこのようなペプチドに特異的な抗体によるイムノアフィニティ精製を含めた、タンパク質を精製するために当業界で知られた技術を用いて、細胞培地、宿主細胞または双方から単離しうる。好ましい態様において、組換えＲ‐１４ポリペプチドは、Ｒ‐１４タンパク質のポリヒスチジン融合体のような、その精製を促すドメインを含有した融合タンパク質である。
【００９０】
本発明は、融合タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質またはβ‐アレスチンへ接合されたＲ‐１４も提供する。このような融合タンパク質によれば、細胞、組織および生物でＲ‐１４ポリペプチドの検出を行える。Ｒ‐１４タンパク質との緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の融合体は、凝集、他の細胞タンパク質との会合、インターナリゼーション、トラフィッキング、エンドサイトーシス小胞、生または固定細胞での分解のような、Ｒ‐１４の力学性を確認または解明するために用いうる。ＧＦＰおよびルシフェラーゼのＲ‐１４融合体は、ダイマーおよびオリゴマー形成、他のシグナリング分子との会合を研究およびモニターするために用いうる。Ｒ‐１４‐Ｇαタンパク質融合体は作働剤または拮抗剤に応答したＧタンパク質によるＧＴＰ結合および加水分解を測定するために用いられ、これらの方法は、当業者に公知であるが、作働または拮抗剤活性について小分子化合物ライブラリーをスクリーニングおよび／または試験するために用いられる。これらの例は、限定されないが、可能性のある融合パートナーと基礎および応用科学研究でのそれらの使用とを説明するために提示されている。
【００９１】
更に、ある状況下で、天然型のタンパク質の生物活性の一部のみを促進または阻害するために、Ｒ‐１４作働剤（ミメティック）またはＲ‐１４拮抗剤のうち一方として限られた能力で機能する、対象Ｒ‐１４ポリペプチドの１つのホモログを提供することが有利であることは、通常明らかであろう。対象Ｒ‐１４タンパク質の各々のホモログは、変異誘発、例えば離散点変異またはトランケーションにより作製しうる。例えば、変異は、由来するＲ‐１４ポリペプチドのリガンド非依存活性の向上、または実質的に同様のもしくは単に一部の生物活性を示すホモログを生じうる。一方、例えばＲ‐１４レセプターと競合的に結合することで、天然型のタンパク質の機能を阻害しうる、拮抗型のタンパク質も作製しうる。
【００９２】
Ｒ１４活性およびその活性のアッセイ
一面において、本発明はＲ‐１４“活性”を調節しうる化合物を同定するための方法を提供する。このような方法では試験または候補化合物の存在下でＲ‐１４タンパク質の活性を調べる。このような方法は、例えば、眼内圧を低下させる上で、更には高眼内圧に伴う症状、例えば緑内障および関連症状を治療する上で有用な、Ｒ‐１４拮抗剤を同定するために用いられる。Ｒ‐１４活性の様々な面が、ここと例で記載されているように、これに関してアッセイしうる。
【００９３】
一態様において、Ｒ‐１４“活性”の測定では、Ｒ‐１４とその結合パートナーとの相互作用を妨げうる化合物を同定するために、Ｒ‐１４ポリペプチドとＲ‐１４結合パートナーとの相互作用をアッセイするが、その際に試験化合物はＲ‐１４ポリペプチドと結合しうるかもしれない。一態様において、このような方法は（ａ）（ｉ）Ｒ‐１４ポリペプチド、（ii）Ｒ‐１４結合パートナーおよび(iii)試験化合物を含有した混合物を形成する；および（ｂ）Ｒ‐１４ポリペプチドとＲ‐１４結合パートナーとの相互作用またはＲ‐１４ポリペプチド“活性”の少くとも一面の変化を検出するステップを含んでいる。試験化合物の不在下の場合と比較した、試験化合物の存在下におけるＲ‐１４活性の統計的に有意な変化（増強または阻害）は、試験化合物についてＲ‐１４生活性の作働剤または拮抗剤（阻害剤）の可能性を各々示す。反応混合物は、無細胞タンパク質調製物、例えば再調製タンパク質混合物または細胞溶離物または精製細胞成分、またはＲ‐１４ポリペプチドまたはその断片を組換えで発現する培養細胞である。当業者であれば、Ｒ‐１４ポリペプチドとＲ‐１４結合パートナーとの相互作用を検出するために、このような競合的結合アッセイを用いうる。一態様において、Ｒ‐１４ポリペプチドおよびＲ‐１４結合パートナーの少くとも一方は検出可能な標識を有し、Ｒ‐１４とＲ‐１４結合パートナーとの相互作用は複合体の標識を検出することにより定量される。検出可能な標識は、例えばラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素または酵素補因子である。
【００９４】
無細胞アッセイ
無細胞アッセイは、Ｒ‐１４タンパク質と相互作用することで、Ｒ‐１４タンパク質の活性を調節しうる化合物を同定するために用いられる。このような化合物は、例えば、Ｒ‐１４タンパク質の構造を変化させて、その活性に影響を与える。無細胞アッセイは、Ｒ‐１４タンパク質とＲ‐１４結合パートナーとの相互作用を調節する化合物を同定するためにも用いられる。好ましい態様において、このような化合物を同定するための無細胞アッセイは、Ｒ‐１４タンパク質、Ｒ‐１４結合パートナーおよび試験化合物を含有した反応混合物から本質的になる。試験化合物は、例えばＲ‐１４ポリペプチドまたはＲ‐１４結合パートナーの誘導体である。
【００９５】
したがって、本発明の１つの例示スクリーニングアッセイは、（ａ）（ｉ）Ｒ‐１４ポリペプチド、（ii）Ｒ‐１４結合パートナーおよび(iii)試験化合物を含有した反応混合物を形成する；および（ｂ）Ｒ‐１４とＲ‐１４結合タンパク質との相互作用を検出するステップを含んでいる。検出目的のために、結合パートナーは放射性核種、蛍光化合物または酵素のような特殊なマーカーで標識しうる。そのとき、試験化合物とＲ‐１４タンパク質またはその断片との相互作用は、インキュベートステップおよび洗浄ステップの後で、マーカー標識のレベルを調べることにより検出される。Ｒ‐１４ポリペプチドおよびＲ‐１４結合パートナーは、ここで記載されているように、組換えで産生され、供給源、例えば血漿から精製されるか、または化学的に合成される。試験化合物の不在下の相互作用と比較した、試験化合物の存在下におけるＲ‐１４およびＲ‐１４結合タンパク質の相互作用の統計的に有意な変化（増強または阻害）は、試験化合物についてＲ‐１４生活性の作働剤（ミメティックまたは増強剤）または拮抗剤（阻害剤）の可能性を示す。放射線標識サンプルはシンチレーションスペクトロホトメトリーでカウントおよび定量される。結合リガンドはアセチルコリンエステラーゼのような酵素へ接合させて、結合したＲ‐１４結合パートナーが酵素アッセイにより定量される。
【００９６】
無細胞アッセイは、Ｒ‐１４タンパク質と相互作用して、Ｒ‐１４タンパク質の活性を調節する化合物を同定するために用いてもよい。したがって、一態様において、Ｒ‐１４タンパク質が試験化合物と接触されて、Ｒ‐１４の生活性がモニターされる。無細胞アッセイにおけるＲ‐１４タンパク質の生活性として、ＧＴＰ結合、ＧＴＰ加水分解、Ｇ□タンパク質の解離、アデニル酸シクラーゼ活性、ホスホリパーゼ（Ａ２、β、γおよびＤイソ型）活性、リン脂質加水分解、ｃＡＭＰ合成などがあり、Ｒ‐１４タンパク質の生活性についてこれらの変化を測定する方法は当業者に周知である。
【００９７】
細胞ベースアッセイ
上記のような無細胞アッセイに加えて、本発明で提供されるようなＲ‐１４タンパク質は、例えば、Ｒ‐１４活性を調節しうる剤、例えば小分子作働剤または拮抗剤を同定するための、細胞ベースアッセイの作製を容易にさせる。細胞ベースアッセイは、例えば、Ｒ‐１４タンパク質の活性、Ｒ‐１４遺伝子、またはＲ‐１４タンパク質の生活性増加または減少に応答して誘導または抑制される遺伝子の発現を調節する化合物を同定するために用いうる。したがって、一態様において、Ｒ‐１４を産生しうる細胞がＲ‐１４の天然または合成作働剤／拮抗剤の存在または不在下で試験化合物とインキュベートされ、Ｒ‐１４の生活性が測定される。Ｒ‐１４の生活性で生じる変化は、試験化合物と接触されなかったコントロールＲ‐１４産生細胞と比較される。これらの測定は、Ｒ‐１４生活性の調節に関して試験化合物の効力、親和性、作用を評価するために用いられる。
【００９８】
本発明の具体的な態様では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示されているようなＲ‐１４タンパク質の使用を伴う無細胞および細胞ベースアッセイが、眼内圧の低下および緑内障の治療のための治療剤として用いる上で最適化させうる小分子を評価および選択するスクリーニングシステムの不可欠な部分になるであろう。
【００９９】
キット
本発明は、診断、あるいはＲ‐１４結合パートナーまたは緑内障治療剤を提供するスクリーニング方法で使用のためのキットを更に提供する。例えば、キットは（１）標識Ｒ‐１４結合パートナーおよび／または（２）Ｒ‐１４発現宿主細胞、Ｒ‐１４発現組織またはＲ‐１４タンパク質を自然にもしくは組換えＤＮＡ法により発現する全細胞から単離された膜を含有する無細胞溶離物または細胞画分および／または（３）Ｒ‐１４タンパク質またはｍＲＮＡを検出しうる剤および／または（４）Ｒ‐１４タンパク質、ｍＲＮＡまたは生活性の量を調べるための手段およびサンプル中のＲ‐１４タンパク質、ｍＲＮＡまたは生活性の量を標準と比較するための手段を含むことができる。化合物または剤は適切な容器に詰められる。キットは、Ｒ‐１４ｍＲＮＡまたはタンパク質またはその生活性を検出する上でキットを用いるための説明書を更に含んでもよい。このようなキットは、例えば、Ｒ‐１４遺伝子またはその対立遺伝子変種、またはその変異型の少くとも一部と特異的にハイブリッド形成しうる１以上の核酸プローブを含んでもよい。
【０１００】
高眼圧症における薬物標的としてのＲ‐１４
ここで記載されている本発明者らの結果は、眼内圧を低下させる上で有用な、ひいては高眼内圧に伴う症状、例えば緑内障および関連症状の治療に有用なＲ‐１４調節剤を提供するという観点から、Ｒ‐１４タンパク質が薬物標的となることを示している。更に好ましい態様において、本発明は、Ｒ‐１４遺伝子およびタンパク質が哺乳動物細胞のような宿主細胞で発現されて、高眼内圧および緑内障のような関連症状と診断された患者を治療する上で有用な医薬組成物を提供するに際して小分子またはペプチドリード化合物の発見にその細胞が用いられる、という方法を提供する。
【０１０１】
Ｒ‐１４拮抗剤、医薬組成物、その使用
本発明者らは、Ｒ‐１４活性を調節しうる、例えばＲ‐１４活性のペプチド拮抗剤として作用しうる剤（例えば、ペプチド化合物）を更に同定および特徴づけた。したがって、本発明は眼内圧を低下させる上で使用のペプチド化合物を提供する。別な態様において、本発明は、緑内障のような高眼内圧に伴う症状および関連症状の治療に使用のペプチド化合物を提供する。本発明は、患者で眼内圧を低下させる方法、および緑内障のような高眼内圧に伴う症状および関連症状の治療のための方法を更に提供し、その方法は本発明のペプチド／ペプチド化合物または本発明のペプチドを含んでなる組成物の有効量を患者、例えばそれの必要な患者に投与することからなる。一態様において、患者は哺乳動物、別な態様ではヒトである。
【０１０２】
したがって、一面において、本発明は式Ｉの実質的に純粋なペプチド化合物を提供する：
Ｚ１‐Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐Ｚ２        Ｉ
上記式中：
Ｘ１は、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ３は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ４は、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたはＨ結合形成基を含む側鎖を有したＴｈｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ５は、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ７は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｃｙｓおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｘ８は、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐおよび関連アミノ酸からなる群より選択される；
Ｚ１は、式Ｈ２Ｎ‐、ＲＨＮ‐またはＲＲＮ‐のＮ末端基である；
Ｚ２は、式‐Ｃ（Ｏ）ＯＨ、‐Ｃ（Ｏ）Ｒ、‐Ｃ（Ｏ）ＯＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＲＲのＣ末端基である；
Ｒは、各存在箇所で、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニルまたは置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニルから独立して選択される；および
“‐”は共有結合である。
【０１０３】
別な態様において、Ｚ１は、プロトン、１〜３アミノ酸の配列、または保護基、例えばカルバメート基、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、１〜８炭素の短い直鎖および分岐アルキル基のような疎水性部分から構成されるアシル基からなる群より選択されるＮ末端基である。別な態様において、Ｚ２は、プロトン、ＮＨ２、１〜３アミノ酸、並びにアリールアルキルアミン、例えばベンジルアミン、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミン、および１〜８炭素の短い直鎖および分岐アルキル基を有する脂肪族アミンからなる群より選択されるカルボキシ末端基である。
【０１０４】
本発明は実質的に純粋な合成ペプチド化合物または組換えペプチド化合物を更に提供し、その化合物は式IIのドメインを有している：
‐Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐        II
上記式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８および“‐”は上記と同義である。
【０１０５】
各態様において、ペプチド化合物は：
ＮＨ２‐Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ‐ＯＨ（ＦＳＬＴＱＫＹＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）；
ＮＨ２‐Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ‐ＯＨ（ＨＩＩＣＳＰＬＲ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；および
ＮＨ２‐Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ‐ＯＨ（ＩＦＤＳＴＥＣＷ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
からなる群より選択される配列を含んでなる。
【０１０６】
本発明は上記ペプチドの活性断片を更に提供する。“活性断片”とは、Ｒ‐１４タンパク質の活性を調節しうる本発明のペプチドの断片に関し、そのＲ‐１４タンパク質は：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチド；および
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチドをコードしうる第二の核酸と実質的に同一の第一の核酸によりコードされるポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドを含んでなる。
【０１０７】
本発明は、個別アミノ酸の保存置換を含んだ合成ポリペプチドおよびそのペプチドミメティックである、上記の誘導体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４および５）を更に提供する。
【０１０８】
本発明は、例えば上記のような培地、産生、単離および精製方法を用いた、本発明のペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４および５で示されるもの）を含んでなるペプチドの発現／産生のための、上記のような組換え発現系、ベクターおよび宿主細胞を更に提供する。このようなベクターは、転写調節配列へ作働可能に連結されたこのようなペプチドをコードしうる核酸配列を含んでなる。一態様において、そのペプチドはその精製を促すドメイン、例えばポリヒスチジンドメインを含有した融合ペプチドである。
【０１０９】
本発明は、Ｒ‐１４ポリペプチド生活性の少くとも一面を阻害する態様において、化合物が調節しうる、製薬上許容されるキャリアと共にペプチドまたはペプチドミメティック化合物を含んでなる医薬組成物を提供することも目的とする。
【０１１０】
本発明は、化合物が眼内圧を低下させうる、製薬上許容されるキャリアと共にペプチドまたはペプチドミメティック化合物を含んでなる医薬組成物を提供することも目的とする。
【０１１１】
本発明の範囲内には、Ｒ‐１４生活性の少くとも一面を調節しうる化合物を含んでなる組成物の薬学上有効量を患者に（例えば、局所または全身）投与することからなる、高眼内圧および／または緑内障と診断された患者を治療するための医薬組成物も属する。
【０１１２】
Ｒ‐１４拮抗剤、活性断片、そのペプチドミメティック
本発明は、Ｒ‐１４タンパク質活性の作働剤または拮抗剤である、ミメティック、例えばペプチドまたは非ペプチド剤、例えば小分子を作製するための、Ｒ‐１４拮抗剤の断片の改変も提供する。
【０１１３】
治療用に本発明で記載されたＲ‐１４拮抗剤を改善するために、側鎖の構造または機能：芳香族、脂肪族、正または負電荷という点で第一のアミノ酸と関連した第二のアミノ酸である“関連アミノ酸”で第一のアミノ酸を置換することにより、ペプチドのいくつかの修飾が行える。関連アミノ酸の例は下記表２および３で示されている。
【表２】
2010075205.tif 000003
【０１１４】
一方、本発明のＲ１４拮抗剤の置換の別なグループは、少くとも１つのアミノ酸残基が除かれて、異なる残基が下記表２に従いその箇所で挿入されたものである。置換の別なグループは、下記５つのグループのうち１つの中で交換しうるものとしてここでは規定されている：
【表３】
2010075205.tif 000004
【０１１５】
上記括弧内の３アミノ酸残基はタンパク質構築で特別な役割を有している。Ｇｌｙは側鎖を欠く唯一の残基であり、そのため鎖に柔軟性を付与する。しかしながら、これはα‐ヘリックス以外の二次構造の形成を促す傾向がある。Ｐｒｏは、その珍しい幾何学性のために、鎖を強く拘束する。それはβターン様構造を通常促す傾向がある。Ｃｙｓはジスルフィド結合形成に関与しうる。Ｔｙｒは、その水素結合の可能性のために、ＳｅｒおよびＴｈｒなどと大きな類似性を有している。
【０１１６】
加えて、上記ペプチドの成分を表わすいかなるアミノ酸も、同様だが、反対キラリティーのアミノ酸で置き換えてよい。そのため、（化学的存在物の構造に応じてＲまたはＳと称することもある）Ｌ配置で天然に存在するいかなるアミノ酸も、その組成および化学的配置に応じて、Ｄ‐アミノ酸と通常称されるが、Ｒ‐またはＳ‐とそれ以外で称しうる、同様の化学構造タイプだが、反対キラリティーのアミノ酸と置き換えてよい。追加のバリエーションとして、化学グループの異なる空間的配置をもたらすｂ‐およびｇ‐アミノ酸がある。
【０１１７】
上記の置換に加えて、類似の側鎖官能基をもたらす合成アミノ酸がペプチド中へ導入しうる。例えば、芳香族アミノ酸はＤ‐またはＬ‐ナフチルアラニン、Ｄ‐またはＬ‐フェニルグリシン、Ｄ‐またはＬ‐２‐チエニルアラニン、Ｄ‐またはＬ‐１‐、２‐、３‐または４‐プレニルアラニン、Ｄ‐またはＬ‐３‐チエニルアラニン、Ｄ‐またはＬ‐（２‐ピリジニル）‐アラニン、Ｄ‐またはＬ‐（３‐ピリジニル）‐アラニン、Ｄ‐またはＬ‐（２‐ピラジニル）‐アラニン、Ｄ‐またはＬ‐（４‐イソプロピル）‐フェニルグリシン、Ｄ‐（トリフルオロメチル）‐フェニルグリシン、Ｄ‐（トリフルオロメチル）‐フェニルアラニン、Ｄ‐ｐ‐フルオロフェニルアラニン、Ｄ‐またはＬ‐ｐ‐ビフェニルアラニン、Ｄ‐またはＬ‐ｐ‐メトキシビフェニルアラニン、Ｄ‐またはＬ‐２‐インドール（アルキル）アラニン、およびＤ‐またはＬ‐アルキルアラニンで置き換えてもよく、ここでアルキルは置換または非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、イソペンチル基である。非制限例としてホスホノ‐または硫酸化（例えば‐ＳＯ３Ｈ）アミノ酸のような、負電荷を有する非カルボキシレートアミノ酸も作製しうる。
【０１１８】
他の置換には、アルキル基をいずれかの天然アミノ酸と結合させることで作られた非天然アルキル化アミノ酸がある。リジン、アルギニンのような塩基性天然アミノ酸は、ＮＨ２においてアルキル基で置換してもよい。他は、アスパラギンまたはグルタミンのニトリル誘導体（例えば、ＣＯＮＨ２の代わりにＣＮ部分を含む）、およびメチオニンのスルホキシド誘導体である。加えて、ペプチドのいかなるアミド結合も、（‐Ｃ＝Ｏ）‐ＮＨ‐）の代わりに、ケトメチレン、ヒドロキシエチル、エチル／還元アミド、チオアミドまたは逆アミド部分、例えば（‐Ｃ＝Ｏ）‐ＣＨ２‐）、（‐ＣＨＯＨ）‐ＣＨ２‐）、（ＣＨ２‐ＣＨ２‐）、（‐Ｃ＝Ｓ）‐ＮＨ‐）または（‐ＮＨ‐（‐Ｃ＝Ｏ）で置換しうる。
【０１１９】
本発明の化合物は、例えば、他の保存アミノ酸残基、即ち類似の物理的、生物学的または化学的性質を有した残基で、本発明のペプチド化合物またはドメインのアミノ酸残基を置換するか、それを欠損または挿入させ、生物機能についてスクリーニングすることにより製造しうる。生物学的に同等のポリペプチドを得るために、そのペプチドの生物機能を実質的に変えることなく、一部の修飾および変化がポリペプチドの構造に加えうることは、当業界で周知である。本発明のペプチド、リガンドおよびドメインは、保存アミノ酸置換により本発明の新規リガンドの配列の一部と異なった、生物学的に同等のペプチド、リガンドおよびドメインにも及ぶ。ここで用いられている“保存アミノ酸置換”という用語は、置換が関連機能の実質的喪失なしに行われる、ペプチドの所定位置におけるあるアミノ酸から他への置換に関する。このような変化を行わせる上で、類似アミノ酸残基の置換は側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらのサイズ、電荷、疎水性、親水性などに基づき行え、このような置換はルーチンの試験によりペプチドの機能に及ぼすそれらの効果についてアッセイされる。
【０１２０】
一部の態様では、アミノ酸残基が類似の親水値（例えば、±２．０の値内）を有する他のものと置き換えられる保存アミノ酸置換が行われるが、以下は約−１．６のハイドロパシー・インデックス（hydropathic index）を有するアミノ酸であり、例えばＴｙｒ（−１．３）またはＰｒｏ（−１．６）が（参考のためここに組み込まれる米国特許Ｎｏ．４，５５４，１０１で詳述されているような）アミノ酸残基で示されている：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｐｒｏ（−０．５）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）；およびＴｒｐ（−３．４）。
【０１２１】
別な態様では、アミノ酸残基が類似のハイドロパシー・インデックス（例えば、±２．０の値内）を有する他のものと置き換えられる保存アミノ酸置換が行われる。このような態様において、各アミノ酸残基には下記のようにその疎水性および電荷特徴に基づきハイドロパシー・インデックスが付される：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）；およびＡｒｇ（−４．５）。
【０１２２】
別な態様では、アミノ酸残基が同一クラス内の他のもので置き換えられる保存アミノ酸置換が行われ、アミノ酸は下記のように非極性、酸性、塩基性および中性クラスに分類される：非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ。
【０１２３】
保存アミノ酸変化には、対応Ｄ‐アミノ酸、保存Ｄ‐アミノ酸またはアミノ酸の天然非遺伝コード型によるＬ‐アミノ酸の置換、およびＬ‐アミノ酸の保存置換もある。天然非遺伝コードアミノ酸には、β‐アラニン、３‐アミノプロピオン酸、２，３‐ジアミノプロピオン酸、α‐アミノイソ酪酸、４‐アミノ酪酸、Ｎ‐メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリン、ｔ‐ブチルアラニン、ｔ‐ブチルグリシン、Ｎ‐メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２‐ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３‐ベンゾチエニルアラニン、４‐クロロフェニルアラニン、２‐フルオロフェニルアラニン、３‐フルオロフェニルアラニン、４‐フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４‐テトラヒドロイソキノリン‐３‐カルボン酸、β‐２‐チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ‐アセチルリジン、２‐アミノ酪酸、２‐アミノ酪酸、２，４‐ジアミノ酪酸、ｐ‐アミノフェニルアラニン、Ｎ‐メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、システイン酸、ε‐アミノヘキサン酸、δ‐アミノ吉草酸または２，３‐ジアミノ酪酸がある。
【０１２４】
別な態様において、保存アミノ酸変化には、親水性または疎水性、サイズまたは容積、または電荷の考慮に基づく変化がある。アミノ酸は、主にアミノ酸側鎖の性質に応じて、疎水性または親水性として通常特徴付けされる。Eisenberg et al.（J.Mol.Bio.179:125-142,1984）の標準化コンセンサス疎水性スケールに基づくと、疎水性アミノ酸はゼロより大きな疎水性を示し、親水性アミノ酸はゼロより小さな親水性を示す。遺伝コード疎水性アミノ酸にはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＭｅｔおよびＴｒｐがあり、遺伝コード親水性アミノ酸にはＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＬｙｓがある。非遺伝コード疎水性アミノ酸にはｔ‐ブチルアラニンがあり、非遺伝コード親水性アミノ酸にはシトルリンおよびホモシステインがある。
【０１２５】
疎水性または親水性アミノ酸は、それら側鎖の特徴に基づき更に細分類できる。例えば、芳香族アミノ酸は、少くとも１つの芳香族またはヘテロ芳香族環を含有する側鎖を有した疎水性アミノ酸であり、該環は１以上の置換基、例えば‐ＯＨ、‐ＳＨ、‐ＣＮ、‐Ｆ、‐Ｃｌ、‐Ｂｒ、‐Ｉ、‐ＮＯ２、‐ＮＯ、‐ＮＨ２、‐ＮＨＲ、‐ＮＲＲ、‐Ｃ（Ｏ）Ｒ、‐Ｃ（Ｏ）ＯＨ、‐Ｃ（Ｏ）ＯＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＨ２‐、‐Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ‐、‐Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどを含有してもよく、ここでＲは独立して（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５‐Ｃ２０）アリール、置換（Ｃ５‐Ｃ２０）アリール、（Ｃ６‐Ｃ２６）アリカリール、置換（Ｃ６‐Ｃ２６）アリカリール、５‐２０員ヘテロアリール、置換５‐２０員ヘテロアリール、６‐２６員アルクヘテロアリール（alkheteroaryl）または置換６‐２６員アルクヘテロアリールである。遺伝コード芳香族アミノ酸にはＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｙｐがあり、非遺伝コード芳香族アミノ酸にはフェニルグリシン、２‐ナフチルアラニン、β‐２‐チエニルアラニン、１，２，３，４‐テトラヒドロイソキノリン‐３‐カルボン酸、４‐クロロフェニルアラニン、２‐フルオロフェニルアラニン、３‐フルオロフェニルアラニンおよび４‐フルオロフェニルアラニンがある。
【０１２６】
無極性アミノ酸とは、生理的ｐＨで無電荷である側鎖を有し、２原子で共有された電子対が通常２原子の各々で等しく保有された結合を有している（即ち、側鎖が極性でない）、疎水性アミノ酸である。遺伝コード無極性アミノ酸にはＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＡｌａおよびＭｅｔがあり、非遺伝コード無極性アミノ酸にはシクロヘキシルアラニンがある。無極性アミノ酸は、脂肪族炭化水素側鎖を有した疎水性アミノ酸である脂肪族アミノ酸を含むように、更に細分類できる。遺伝コード脂肪族アミノ酸にはＡｌａ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅがあり、非遺伝コード脂肪族アミノ酸にはノルロイシンがある。
【０１２７】
極性アミノ酸とは、生理的ｐＨで無電荷である側鎖を有するが、２原子で共有された電子対が一方の原子でより多く保有された１つの結合を有している、親水性アミノ酸である。遺伝コード極性アミノ酸にはＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎがあり、非遺伝コード極性アミノ酸にはシトルリン、Ｎ‐アセチルリジンおよびメチオニンスルホキシドがある。
【０１２８】
酸性アミノ酸とは、７より低い側鎖ｐＫａ値を有した親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失のせいで、生理的ｐＨで負電荷の側鎖を有している。遺伝コード酸性アミノ酸にはＡｓｐおよびＧｌｕがある。塩基性アミノ酸とは、７より大きな側鎖ｐＫａ値を有した親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合のせいで、生理的ｐＨで正電荷の側鎖を有している。遺伝コード塩基性アミノ酸にはＡｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓがあり、非遺伝コード塩基性アミノ酸には非環式アミノ酸のオルニチン、２，３‐ジアミノプロピオン酸、２，４‐ジアミノ酪酸およびホモアルギニンがある。
【０１２９】
上記の分類は絶対ではなく、アミノ酸は２以上のカテゴリーに分類してもよい。加えて、アミノ酸は、公知の挙動性および／または特定のアッセイに基づくまたは既に同定されたアミノ酸と比較した特徴的な化学的、物理的または生物学的性質に基づき分類しうる。アミノ酸は、アミノ酸様側鎖を有した二官能性部分を含有してもよい。
【０１３０】
保存変化には、例えばアミノ酸の官能側基の反応による、非誘導残基に代わる化学的誘導部分の置換も含める。そのため、これらの置換には、遊離アミノ基がアミンヒドロクロリド、ｐ‐トルエンスルホニル基、カルボベンゾイル基、ｔ‐ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基に誘導された化合物がある。同様に、遊離カルボキシル基は塩、メチルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステルもしくはヒドラジドを形成するように誘導でき、側鎖は遊離ヒドロキシル基に代わりＯ‐アシルもしくはＯ‐アルキル誘導体またはヒスチジンのイミダゾール窒素に代わりＮ‐イムベンジルヒスチジンを形成するように誘導できる。ペプチドアナログには、例えば、メチル化により、アルキルアミン、例えばエチルアミン、エタノールアミンまたはエチレンジアミンによるＣ末端アミノ酸のアミド化により、またはアミノ酸側鎖のアシル化もしくはメチル化（例えば、リジンのε‐アミノ基のアシル化）により化学的に改変されたアミノ酸もある。ペプチドアナログには、置換アミド（例えば、式‐Ｃ（Ｏ）‐ＮＲの基；ここでＲは（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニルまたは置換（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニル）またはアミド結合のアイソスター（例えば、‐ＣＨ２ＮＨ‐、‐ＣＨ２Ｓ‐、‐ＣＨ２ＣＨ２‐、‐ＣＨ＝ＣＨ‐（シスおよびトランス）、‐Ｃ（Ｏ）ＣＨ２‐、‐ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２‐または‐ＣＨ２ＳＯ‐）によるペプチドのアミド結合の置換も含める。
【０１３１】
Ｒ‐１４拮抗剤の薬学的特徴を改善するために、ペプチドのサイズは、１以上のアミノ酸を欠損させて、非ペプチド結合をもつアミノ酸ミメティックまたはジペプチドミミックを用いることにより、小さくしてもよい。これらの目的のためにベンゾジアゼピン、アゼピン、置換γ‐ラクタム環、ケト‐メチレンプソイドペプチド、βターンジペプチドコアおよびβ‐アミノアルコールのような分子スカホールドを用いる例はペプチド化学者に知られており、Peptidomimetic protocols（Methods in molecular medicine,Vol.23）W.M.Kazmierski(ed.),Humana Press and Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics,Vols.1 & 2 A.Abell(Ed.)で記載されている。
【０１３２】
このようにペプチドの共有結合修飾も本発明の範囲内に含まれる。このような修飾は、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を選択された側鎖または末端残基と反応しうる有機誘導剤と反応させることにより、Ｒ‐１４拮抗剤中へ導入される。化学誘導体の下記例は説明のために示されており、限定のためではない。システイニル残基は、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得るために、α‐ハロアセテート（および対応するアミン）、例えば２‐クロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させる。ヒスチジル残基は、例えばｐＨ５．５‐７．０でジエチルプロカーボネートのような化合物との反応により誘導でき、その理由はこの剤がヒスチジル側鎖に比較的特異的だからであるが、ｐ‐ブロモフェナシルブロミドも用いてよい；例えば、反応は好ましくはｐＨ６．０で０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。リシニルおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物のような化合物と反応させてもよい。α‐アミノ含有残基を誘導するために適した他の試薬には、イミドエステルのような化合物、例えばメチルピコリンイミデート；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ‐メチルイソ尿素；２，４‐ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応がある。
【０１３３】
アルギニル残基は、公知方法のステップに従い、１種または数種の慣用的試薬、特にフェニルグリオキサール、２，３‐ブタンジオン、１，２‐シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応により修飾してもよい。アルギニル残基の誘導では、グアニジン官能基の高ｐＫａのせいで、反応がアルカリ条件下で行われることを要する。更に、これらの試薬はリジンの基およびアルギニンε‐アミノ基と反応させてもよい。チロシニル残基自体の特殊な修飾、例えば、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりチロシニル残基中へスペクトル標識を導入することも、周知である。Ｎ‐アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンは、Ｏ‐アセチルチロシニル種および３‐ニトロ誘導体を各々形成するために用いうる。
【０１３４】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ′‐Ｎ＝Ｃ＝Ｎ‐Ｒ′）、例えば１‐シクロヘキシル‐３‐（２‐モルホリニル‐（４‐エチル）カルボジイミドまたは１‐エチル‐３‐（４‐アゾニア‐４，４‐ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により、選択的に修飾してもよい。更に、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基へ変換してもよい。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応グルタミルおよびアスパルチル残基へしばしば脱アミド化される。本発明におけるペプチドの他の修飾には、公知方法のステップによる、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニンおよびヒスチジンのα‐アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのヒスチジン側鎖アセチル化、主鎖アミド残基のメチル化（またはＮ‐メチルアミノ酸での置換）、および一部の場合には、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化がある。
【０１３５】
ペプチドへの脂肪酸（Ｃ６‐Ｃ１８）の共有結合は、プロテアーゼ耐性、血漿タンパク質結合、血漿半減期延長、細胞内透過などのような追加の生物学的性質を付与する。Ｒ１４拮抗ペプチドの上記修飾は、アプローチの範囲も、工学処理しうる可能な修飾も限定しない。
【０１３６】
ペプチドまたはペプチドアナログは、標準化学技術、例えば、液または固相合成方法を用いた自動合成により合成しうる。自動ペプチドシンセサイザーは市販されており、当業界で周知の技術を用いている。ペプチドおよびペプチドアナログは、標準方法で組換えＤＮＡ技術を用いて製造してもよい。したがって、本発明は本発明のペプチド化合物をコードする核酸を更に提供する。このような核酸は、安定または一時的発現用の標準組換え技術を用いて、発現用の細胞中へ導入される。本発明の核酸分子には、天然または非天然ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含めた、２以上のヌクレオチドのあらゆる鎖を含む。
【０１３７】
治療の方法
本発明は、高眼内圧および／または緑内障および関連症状を有する患者を処置する、予防および治療双方の方法を提供する。したがって、本発明は、患者で眼内圧を低下させるための、または緑内障および関連症状のような高眼内圧に伴う症状を治療するための方法を更に提供し、その方法はＲ‐１４拮抗活性を発揮しうる剤の投与からなる。予防剤の投与は、緑内障が予防されるか、またはその進行が遅れるように、Ｒ‐１４異常を特徴とする症状の発現前に行われる。一般的に、予防または治療方法は、野生型Ｒ‐１４活性に拮抗しうるか、または変異（欠陥）Ｒ‐１４活性を作働しうる化合物の有効量を患者へ投与することからなる。適切な化合物の例には、ここで詳細に記載された拮抗剤、作働剤またはホモログがある。
【０１３８】
有効量
Ｒ‐１４活性を調節しうる剤、例えばＲ‐１４作働剤または拮抗剤の毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０（母集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（母集団の５０％で治療上有効な用量）を調べるために、実験動物で標準薬学操作により調べられる。毒性および治療効果間の用量比が治療係数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表示しうる。大きな治療係数を示す化合物が好ましい。このような化合物の用量は、ほとんどまたは全く無毒性でＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変えうる。用量は、インビトロおよび半ビボアッセイおよび動物研究で調べたＩＣ５０（即ち、症状の半最大抑制に達する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲に達するよう、動物モデルで処方しうる。このような情報はヒトで有用な用量をより正確に調べるために用いうる。血漿中におけるＲ‐１４治療剤のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定される。Ｒ‐１４治療剤（作働剤または拮抗剤）の有効量は０．０１μｇ〜１００ｍｇであり、投与経路、医薬製剤および送達様式により決まる。
【０１３９】
処方および使用
本発明による使用向けの医薬組成物は、１種以上の生理学上許容されるキャリアまたは賦形剤を用いて、常法で処方される。そのため、化合物およびそれらの生理学上許容される塩および溶媒和物は、例えば注射、吸入（口または鼻から）、経口、経口腔、非経口または経直腸投与による投与用に処方される。技術および処方はReminington’s Pharmaceutical Sciences,Meade Publishing Co.,Easton,Paで全般的にみられる。局所投与の場合、本発明のＲ‐１４治療剤は、当業界で通常知られているように、溶液、軟膏、膏剤、ゲルまたはクリームに処方される。例えば、Ｒ‐１４治療剤を含有した溶液は、眼内圧を低下させるために、目へ直接的に滴剤として適用される。
【０１４０】
一態様において、このような組成物は、眼内圧を低下させるために十分な治療または予防上有効な量の、Ｒ‐１４拮抗剤のようなＲ‐１４活性を調節しうる剤と、製薬上許容されるキャリアとを含有している。
【０１４１】
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適した他の規則的構造物として処方しうる。キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）および適切なそれらの混合物を含めた、溶媒または分散媒体である。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合には所要粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持できる。多くの場合で、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含有させることが好ましいであろう。吸収を遅らせる剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含有させることで、注射用組成物の吸収長期化が生じうる。更に、Ｒ‐１４拮抗剤は、例えば徐放性ポリマーを含有した組成物で、時間放出型処方として投与しうる。活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含めた制御放出処方物のように、化合物を速い放出から防ぐキャリアで製造しうる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸、ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）が用いうる。このような処方物の製造のための多くの方法が特許化されているか、または当業者に通常知られている。
【０１４２】
無菌注射液は、適切な溶媒中所要量で活性化合物（例えば、Ｒ‐１４拮抗剤）を上記成分の１つまたは組合せと配合し、次いで必要であれば濾過滅菌することにより製造しうる。通常、分散液は、上記のものから基本的分散媒体および必要な他の成分を含有した無菌ビヒクル中に活性化合物を配合することにより製造される。無菌注射液の製造向け無菌粉末の場合に、好ましい製造方法は、既に滅菌濾過された溶液から活性成分の粉末＋追加の望ましい成分を生じさせる真空乾燥および凍結乾燥である。本発明の別な面によると、Ｒ‐１４拮抗剤はＲ‐１４拮抗剤の溶解性を高める１種以上の追加化合物と処方してもよい。
【０１４３】
投与の別な形は目に対するものである。Ｒ‐１４活性を調節しうる剤または化合物、例えばＲ‐１４拮抗剤は、角膜および目の内部領域、例えば前眼房、後眼房、硝子体、房水、硝子液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜／網膜および強膜に化合物を透過させるために十分な時間にわたり化合物が眼表面と接触し続けるように、薬学上許容される眼用ビヒクルで送達してもよい。薬学上許容される眼用ビヒクルは、例えば、軟膏、植物油またはカプセル化物質である。一方、本発明の化合物は硝子および房水中へ直接注射してもよい。それ以外に、化合物は、目の治療用に、例えば静脈内注入または注射により、全身投与してもよい。
【０１４４】
本発明の別な面は、本発明のペプチド化合物をコードする核酸分子を患者へ投与することにより、患者で眼内圧を低下させるおよび／または高眼内圧に伴う症状（例えば、緑内障）を予防および／または治療する方法である。適切な投与方法には遺伝子療法がある。
【０１４５】
本発明の核酸は、すべてが遺伝子療法ベクターの使用を要する、ＤＮＡの直接注入、レセプター仲介ＤＮＡ取込み、ウイルス仲介トランスフェクションまたは非ウイルストランスフェクションおよび脂質ベーストランスフェクションのような方法を用いて、インビボで細胞へ送達される。直接注入はインビボで細胞中へ裸のＤＮＡを導入するために用いられた（例えば、Acsadi et al.(1991)Nature 332:815-818；Wolff et al.(1990)Science 247:1465-1468参照）。インビボでＤＮＡを細胞中へ注入するための送達装置（例えば、“遺伝子ガン”）も用いてよい。このような装置は市販されている（例えば、BioRadから）。裸のＤＮＡは、細胞表面レセプター用のリガンドへカップリングされたポリリジンのようなカチオンへＤＮＡを複合化させることにより、細胞中へ導入してもよい。（例えば、Wu,G.and Wu,C.H.(1988)J.Biol.Chem.263:14621；Wilson et al.(1992)J.Biol.Chem.267:963-967；ＵＳ特許Ｎｏ．５，１６６，３２０参照）。レセプターへのＤＮＡ‐リガンド複合体の結合は、レセプター仲介エンドサイトーシスによるＤＮＡの取込みを促しうる。エンドソームを壊すことで物質を細胞質中へ放出させるアデノウイルスキャプシドへ連結されたＤＮＡ‐リガンド複合体は、細胞内リソソームによる複合体の分解を避けるために用いうる（例えば、Curiel et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8850；Cristiano et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2122-2126参照）。
【０１４６】
欠陥レトロウイルスは、遺伝子療法ベクターとして使用向けに、詳しく特徴付けられている（考察のためMiller,A.D.(1990)Blood 76:271参照）。組換えレトロウイルスを産生するための、およびインビトロまたはインビボで細胞をこのようなウイルスで感染させるためのプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.et al.(eds.)Greene Publishing Associates,(1989),Sections 9.10-9.14および他の標準実験マニュアルでみられる。適切なレトロウイルスの例には、当業者に周知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭがある。適切なパッケージングウイルス系の例には、．ｐｓｉ．Ｃｒｉｐ、．ｐｓｉ．Ｃｒｅ、．ｐｓｉ．２および．ｐｓｉ．Ａｍがある。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボで、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含めた多くの異なる細胞タイプ中へ様々な遺伝子を導入するために用いられてきた（例えばEglitis,et al.(1985)Science 230:1395-1398；Danos and Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464；Wilson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018；Armentano et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6141-6145；Huber et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8039-8043；Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-8381；Chowdhury et al.(1991)Science 254:1802-1805；van Beusechem et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7640-7644；Kay et al.(1992)Human Gene Therapy 3:641-647；Dai et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895；Hwu et al.(1993)J.Immunol.150:4104-4115；ＵＳ特許Ｎｏ．４，８６８，１１６；ＵＳ特許Ｎｏ．４，９８０，２８６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；ＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３参照）。
【０１４７】
遺伝子療法ベクターとして使用の場合、アデノウイルスのゲノムは、それが本発明のペプチド化合物をコードおよび発現するが、正常溶離ウイルスライフサイクルで複製しうるその能力が不活化されるように操作してよい。例えば、Berkner et al.(1988)BioTechniques 6:616；Rosenfeld et al.(1991)Science 252:431-434；Rosenfeld et al.(1992)Cell 68:143-155参照。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ｄ１３２４またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、それらが有効な遺伝子送達ビヒクルとなる上で分裂細胞を要せず、気道上皮（Rosenfeld et al.(1992)，前掲）、内皮細胞（Lemarchand et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6482-6486）、肝細胞（Herz and Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2812-2816）および筋肉細胞（Quantin et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584）を含めた様々な細胞タイプへ感染させるために用いうるという点で、有利である。
【０１４８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も、遺伝子療法目的でＤＮＡの送達用に遺伝子療法ベクターとして用いてよい。ＡＡＶは、効率的複製および産生ライフサイクル用のヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような他のウイルスを要する、天然欠陥ウイルスである（Muzyczka et al.Curr.Topics in Micro.and Immunol.(1992)158:97-129）。ＡＡＶは非分裂細胞中へＤＮＡを組み込むために用いうる（例えば、Flotte et al.(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356；Samulski et al.(1989)J.Virol.63:3822-3828；McLaughlin et al.(1989)J.Virol.62:1963-1973参照）。Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5:3251-3260で記載されたようなＡＡＶベクターも、ＤＮＡを細胞中へ導入するために用いうる（例えば、Hermonat et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470；Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.4:2072-2081；Wondisford et al.(1988)Mol.Endocrinol.2:32-39；Tratschin et al.(1984)J.Virol.51:611-619；Flotte et al.(1993)J.Biol.Chem.268:3781-3790参照）。レンチウイルス遺伝子療法ベクターも本発明の使用向けに適合させてよい。
【０１４９】
遺伝子療法のための一般的方法は当業界で知られている。例えば、AndersonらのＵＳ特許Ｎｏ．５，３９９，３４６参照。遺伝物質を送達するための生体適合性カプセルは、BaetgeらのＰＣＴ公開ＷＯ９５／０５４５２で記載されている。造血細胞中への遺伝子トランスファーの方法も既に報告されている（Clapp,D.W.,et al.,Blood 78:1132-1139(1991)；Anderson,Science 288:627-9(2000)；Cavazzana-Calvo et al.,Science 288:669-72(2000)参照）。
【０１５０】
本発明は、本発明のペプチド化合物をコードしうる核酸を含んでなる細胞を患者中へ導入する移植方法に更に関する。核酸は上記のようなベクターに存在してもよく、ベクターは、例えば上記の方法を用いて、インビトロで細胞中へ導入される。一態様において、細胞は自家であり、患者から得られる。各態様において、細胞は同種間または異種間である。
【０１５１】
各態様において、治療法は診断法と一緒に用いてもよい。例えば、高眼内圧に伴う症状（例えば、緑内障）に罹った患者は、診断法を用いて同定または診断され、次いで治療法を用いて治療される。更に、その治療法は、治療の進行をモニターするために用いられる診断または予後法と一緒の処置に用いてもよい。
【０１５２】
本発明の別な面によると、Ｒ‐１４拮抗剤を含んでなる本発明の治療組成物は、高眼内圧および関連障害、例えば緑内障の予防および／または治療用としてＲ‐１４拮抗剤の使用のための説明書を更に含んでなる、容器または市販パッケージとして提供してもよい。
【０１５３】
したがって、本発明は、高眼内圧および関連障害、例えば緑内障の予防および／または治療用の説明書と一緒に、Ｒ‐１４拮抗剤または上記組成物を含んでなる市販パッケージを更に提供する。
【０１５４】
本発明は、患者で眼内圧を低下させるための、および／または高眼内圧および関連障害、例えば緑内障の予防および／または治療用のための、上記ペプチド、化合物および組成物の使用を更に提供する。
【０１５５】
本発明は、患者で眼内圧を低下させるための、および／または高眼内圧および関連障害、例えば緑内障の予防および／または治療用のための薬剤の製造に関する、上記ペプチド、化合物および組成物の使用を更に提供する。
【０１５６】
本発明の様々な態様がここでは開示されているが、当業者の一般的知識に従い本発明の範囲内で多くの改変および修正が行いうる。このような修正には、実質的に同様の手法で同様の結果を出すために、本発明のあらゆる面で公知の等価の置換を含む。数的範囲には範囲を画定する数自体も含む。請求項において、“含んでなる”という用語は、制限なしの用語として用いられており、“含むが、限定されない”という語句と実質的に同等である。下記例は本発明の様々な面の例示にすぎず、ここで開示されているような本発明の広い面を制限するものではない。
【例】
【０１５７】
例１：Ｒ‐１４をコードする核酸のクローニングおよび特徴
ＢＬＡＳＴ‐Ｎ（ｖ．２．２．１）プログラムを用いたヒトゲノムに対するＥＳＴ＃ＨＴＭ１‐０２５Ｆ１（GemBank Acc.：ＢＥ４３９４０９）のインシリコ分析では、染色体１１のコンティグＮＴ ００９３０７．３，ＡＣ０２０５６８．４におけるＨＴＭ１‐０２５Ｆ１と９９．８％類似性のヒットに至った。遺伝子特異性プライマー５′ＧＡＴＴＣＡＡＣＣＡＴＣＣＣＡＧＴＣＴＴＧＧＧＴＡＣＡＧ  ３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）および５′ＴＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＧＡＣＡＧＣ  ３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を用いて、ＰＣＲにより、Sanger Center,ＵＫから得られたＢＡＣクローン、ＲＰ１１‐２０６Ｃ１から、９６６ｂｐ断片を増幅させた。ＰＣＲは、製造業者により示されたプロトコール（６０℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で８０秒間の伸長：全サイクル‐３５）に従い、Ｔａｑ  ＨｉＦｉ（Invitrogen,ＣＡ）を用いて行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルを用いて分離させた。ゲルの写真は図１（Ａ）で示されている。−Ｂａｃ：無プラスミドＤＮＡ；＋Ｂａｃ：プラスミドＤＮＡ含有（０．１μｇ）；ＭＷ  ｓｔｄ：λＨｉｎｄIII切断物。〜９６０ｂｐ断片（矢印で示されている）を製造業者の指示に従いｐｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘ  ＴＯＰＯ  ＴＡ（Invitrogen,ＣＡ）中へクローニングした。クローン化インサートの向きは、ベクター特異性および遺伝子特異性プライマー（５′ＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴ  ３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）ベクターの発現エピトープコード配列および５′ＴＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＧＡＣＡＧＣ  ３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）遺伝子特異性３′末端プライマー）を用いて、ＰＣＲにより評価した。３クローンをジデオキシ配列決定法により配列決定した。
【０１５８】
Ｒ‐１４リーディングフレームのヌクレオチド配列は図１（Ｂ）で示されている。２クローンから得られた配列は、６２６位の（Ａに代わる）Ｃを除き、ＨＴＭＩ‐００２５（Gonzalez et al.,前掲）と９９．５％相同性であった。Ｒ１４．０タンパク質配列は、マウスおよびヒトゲノムにおけるｍａｓ癌遺伝子関連配列のサーチに際して同定された遺伝子配列ＭＧＲｘ３と９９．４％相同性であった（Dong X et al.[2000]Cell.106:619）。
【０１５９】
Ｒ‐１４ポリペプチド配列は図１（Ｃ）で示されている。７つの下線部分の配列は、潜在的な疎水性貫膜ドメインを示している。陰影部分の残基は、潜在的なホスホリル化部位：ＰＫＡ（Ｒ‐Ｘ１‐２‐Ｓ／Ｔ‐Ｘ）またはＰＫＣ（Ｘ‐Ｓ／Ｔ‐Ｘ‐Ｒ／Ｋ）を表わしている。
【０１６０】
例２：ヒト小柱網組織におけるＲ‐１４ｍＲＮＡの発現
方法：ヒト小柱網（ＨＴＭ）およびヒト虹彩（ＨＩ）組織から単離された全ｍＲＮＡのＲＴ‐ＰＣＲ。全ＲＮＡの一部（１μｇ）を（５０℃で３０分間）逆転写し、遺伝子特異性プライマーSuperScript One-Step RT-PCT（InVitrogen）を用いて反応混合物を３５サイクル（６０℃で３０秒間）で増幅させた。アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の分離では、虹彩組織からではなく、ＨＴＭ組織からの１Ｋｂの単一ＤＮＡ断片を示した。ＨＴＭ組織からのＤＮＡ断片の配列決定では、Ｒ‐１４リーディングフレームを含有している１Ｋｂ断片を同定した。
【０１６１】
例３：ヒト細胞におけるクローン化ヒトＲ‐１４レセプターの発現
細胞培養：ＨＥＫ２９３細胞を完全ＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清、０．１％ペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、０．５μｇ／ｍｌフンギゾン、５μｇ／ｍｌゲンタマイシン）中で〜７０％集密まで増殖させた。製造業者の推奨に従いLipofectamine 2000（InVitrogen）を用い、ＤＭＥＭ中ＤＮＡ１２．５μｇおよびLipofectamine２５μＬを用いて細胞をトランスフェクトした。培地を５００μｇ／ｍｌ  Zeocinで補充された完全ＤＭＥＭへ４８時間後に代えた（Ｒ‐１４の一時的発現を検出するために、直ちに細胞をプロセッシングした）。培養３週間後、Zeocin耐性細胞（Ｒ１４／２９３）を分別し、１００μｇ／ｍｌ  Zeocin入り完全ＤＭＥＭで培養した。
【０１６２】
Ｒ‐１４タンパク質のイムノブロッティング：プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有したＴＮＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．８５％  ＮａＣｌ、１％ＮＰ‐４０）緩衝液中で集密細胞を溶離させた。上澄の一部（１００μｇタンパク質）を５分間の煮沸によりＳＤＳ含有緩衝液５０μＬ中で変性させ、１０％ＳＤＳ‐アクリルアミドゲルで分離させた。タンパク質をエレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜へ移し、５％ドライミルクＢＬＯＴＴＯで１時間にわたりブロックし、マウス抗ＨＩＳ（１／２０００）と１時間インキュベートし、洗浄し、次いでＴＢＳＴ中ヤギ抗マウスＨＲＰ（１／２０００）と１時間インキュベートした。膜をＴＢＳですすぎ、ＤＡＢ／ＣＮ基質（Pierce）を用いて比色分析により展開した。イムノブロッティングの詳細はMoore D et al(Ed)Current protocols in molecular biology 1987.John Wiley & sons inc.で示されている。図３によると、Ｒ１４＋は組換えＲ１４融合タンパク質（ＨＩＳ‐ｔａｇ）を発現するＨＥＫ２９３細胞に関し、Ｒ１４−は天然Ｒ‐１４レセプターを含有しない親ＨＥＫ２９３細胞に関する。免疫反応Ｒ‐１４バンドは矢印で示されている。
【０１６３】
例４：Ｒ‐１４タンパク質のペプチド阻害剤の同定および特徴
方法：薬物投与向けの気管切開および右大腿静脈のカテーテル挿入のために、新生ブタ（１〜３日齢）を１．５％ハロタンで麻酔した。動物をHarvard小動物レスピレーターにより２５％Ｏ２および７５％Ｎ２のガス混合物で通気した。ハロタンを外科処置後に中断し、その直後に動物をα‐クロラロース（５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）で鎮静させ、パンクロニウム（０．１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）で麻痺させた。動物を輻射暖熱機下に置いて、それらの体温を３７℃に保った。バタフライ針（２４Ｇ）を両目の前眼房中へ挿入し、Gouldマルチチャンネルレコーダーへ接続されたStatham圧力変換器へ接続する。次いで眼内圧を１５分間安定化させる。ペプチドをペプチド合成の標準化学法により製造した。塩水に溶解されたペプチドを下眼瞼下へ滴剤として局所適用し、拡散させた。眼内圧を１５分間モニターし、その際に最大効果を観察した。
【０１６４】
（Ａ）仔ブタで眼内圧におよぼすペプチドの効果。塩水に溶解されたペプチドを眼内圧の１５分間安定化後に目へ適用し、圧の変化を１５分間モニターした。偏差（降圧はマイナス）を時間(min)の関数としてプロットした。試験されたペプチドの中では、１４０１、１４０２および１４０５は適用から数分以内で眼圧の低下を示し、一方１４０６および１４０７は動物で基礎ＩＯＰに影響を与えなかった。
【０１６５】
（Ｂ）仔ブタで眼内圧に対する１４０２および１４０５ペプチドの用量応答。実験は上記のように行ったが、但し用いられたペプチドの用量に対して眼内圧をプロットした。仔ブタの基礎ＩＯＰに対するペプチドの用量応答では、１４０２および１４０５について各々８６．４および３４１．６ｎＭのＩＣ５０値を示した。
【０１６６】
【表４】
2010075205.tif 000005
【０１６７】
例５：１４０５とラタノプロストおよびチモロールとの効力の比較
方法：安楽死の直後に、ウサギ眼球を摘出し、１５ｍｌ臓器浴（Radnoti Glass,Monrovia,ＣＡ）中に入れた。浴をKrebs（ｍＭの組成：ＮａＣｌ  １２０、ＫＣｌ  ４．５、ＣａＣｌ２  ２．５、ＭｇＳＯ４  １．０、ＮａＨＣＯ３  ２７、ＫＨ２ＰＯ４  １．０およびグルコース１０，ｐＨ７．４）で満たし、３７℃で維持し、９５％Ｏ２で泡立てた。角膜を上へ向けて眼球を適所に維持した。バタフライ針（２４Ｇ）を目の前眼房中へ挿入し、Gouldマルチチャンネルレコーダーへ接続されたStatham圧力変換器へ接続する。次いで眼内圧を塩水で人為的に３５ｍｍＨｇに高める。局所適用剤の不在下（コントロール）または存在下における回復率（２０ｍｍＨｇに戻る）を評価した。双方とも回復の比較的直線的な部分で、２回の測定を平均化した。コイントロール測定を２回繰り返して、同一の結果を得た。すべての値は同一ウサギ目で得た。塩水中のペプチド１４０５（０．１％）に加えて、ラタノプロスト（０．０３％）およびチモロール（０．５％）の眼用製剤を、目へ滴剤として適用した。ペプチド１４０５は、チモロールの場合と類似した効力で、但しラタノプロストより有意に速く、実験誘導性高眼圧を反転させた。
【０１６８】
例６：ペプチド１４０２および１４０５の選択性
方法：比較的乱れのない網膜脈管構造の原位置応答を研究するために成体ブタ眼杯調製物を用いる。簡単には、網膜の最少の取扱いで前区および硝子体を除去するために、鋸状縁の後３〜４ｍｍで環状切開を行う。残りの眼杯を、２１％Ｏ２および５％ＣＯ２で平衡化されたKrebs緩衝液（ｐＨ７．３５‐７．４５）を含有する２０ｍｌ組織浴中のワックスベースへピンで固定する。調製物を３０〜４５分間安定化させ、その間にそれらを新鮮緩衝液で２または３回すすいだ。異なる剤に対する累積的濃度‐応答曲線を、新鮮組織の非灌流一次細動脈（１００〜２００μｍ直径）で別々に作成する。外部血管直径を解剖顕微鏡（モデルＭ‐４００、Zeiss）に装備されたビデオカメラで記録し、応答をデジタル画像アナライザー（Sigma Scan software,Jandel Scientific,Corte Madera,ＣＡ）で定量する。管径を各濃度の剤の局所適用前およびその１０分後に記録するが、そのときに安定的応答に通常達する。各測定は３回繰返し、変動は＜１％である。追加の実験は２０分間の前処理後に様々な遮断または調節剤で行える。応答は、基準からの血管の外径の変化率として、または収縮剤（その最大効果の７０％を生じる濃度のトロンボキサンレセプター作働剤Ｕ４６６１９）の反転率として表示する。
【０１６９】
ラタノプロストおよびチモロールは双方とも平均７〜８％でブタ成体網膜細動脈を収縮させた（図６Ａ）。Ｒ‐１４拮抗剤ペプチド１４０２および１４０５を、公知の降眼圧化合物ラタノプロストおよびチモロールと比較したこれら化合物の相対的選択性を測定するために試験した。１４０２および１４０５ペプチドは双方とも、ラタノプロスト（１〜５％）またはチモロール（＜１％）により生じる収縮を反転させなかった。
【０１７０】
例７：ウサギの眼内圧におよぼすペプチド１４０２（Ａ）および１４０５（Ｂ）の効果
点眼剤の適用およびフルオレセイン圧力測定による眼内圧（ＩＯＰ）の測定に際して、静かにしていられるよう、ニュージーランド白ウサギを訓練した。ペプチドを指示濃度でリン酸緩衝液中で新鮮なままで調製し、滴剤（５０μＬ）を目の虹彩‐角膜アングルで適用した。ＩＯＰ測定は異なる時間に行った。図７で示されているように、両ペプチドの適用でＩＯＰの即時低下があり、ＩＯＰは４時間以内に正常値へ戻った。ペプチドの繰返し適用でＩＯＰの類似低下を生じ、効果はペプチドの消失で可逆性となる。
【０１７１】
この明細書の全体を通して、本発明の属する技術内容を更に詳細に説明する上で、様々な文献が参照される。これら文献の開示は参考のため本開示へ組み込まれる。
【図１Ｂ】
2010075205.tif 000006
【図１Ｃ】
2010075205.tif 000007
【図４Ａ】
2010075205.tif 000008
【図４Ｂ】
2010075205.tif 000009
【図５】
2010075205.tif 000010
【図６】
2010075205.tif 000011
【図７Ａ】
2010075205.tif 000012
【図７Ｂ】
2010075205.tif 000013
【図１Ａ】
2010075205.tif 000014
【図２】
2010075205.tif 000015
【図３】
2010075205.tif 000016
【配列表】
2010075205000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月18日(2009.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの実質的に純粋なペプチド化合物：
Ｚ１‐ＨＩＩＣＳＰＬＲ‐Ｚ２        Ｉ
上記式中：
Ｚ１は、式Ｈ２Ｎ‐、ＲＨＮ‐またはＲＲＮ‐のＮ末端基である；
Ｚ２は、式‐Ｃ（Ｏ）ＯＨ、‐Ｃ（Ｏ）Ｒ、‐Ｃ（Ｏ）ＯＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＲＲのＣ末端基である；
Ｒは、各存在箇所で、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニルまたは（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニルから独立して選択される；および
“‐”は共有結合である；
上記ペプチド化合物は、哺乳動物の眼内圧を低下させる機能を有する。
【請求項２】
アミノ酸５０までの実質的に純粋なペプチド化合物または組換えペプチド化合物であって、該化合物は式IIのドメインを含んでいる：
‐ＨＩＩＣＳＰＬＲ‐        II
上記式中：
“‐”は共有結合である；
上記ペプチド化合物は、哺乳動物の眼内圧を低下させる機能を有する。
【請求項３】
化合物が、ＨＩＩＣＳＰＬＲである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
製薬上許容されるキャリアと共に、請求項１〜３のいずれか一項で記載された化合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項５】
組成物が患者の目への投与用に処方されている、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
（ａ）患者で眼内圧を低下させる；
（ｂ）高眼内圧に伴う症状を治療する；または
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の双方
の使用のための説明書と一緒に、請求項４または５に記載の医薬組成物を含んでなる、商業パッケージ。
【請求項７】
症状が緑内障である、請求項６に記載の商業パッケージ。
【請求項８】
請求項２で記載されたドメインをコードする配列を含んでなる、単離核酸。
【請求項９】
転写調節要素へ作働可能に連結されている請求項８で記載された核酸を含んでなるベクター。
【請求項１０】
請求項９で記載されたベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
ペプチド化合物の発現を可能にする条件下で、請求項１０で記載された宿主細胞を培養することからなる、請求項２で記載された組換えペプチド化合物を産生する方法。
【請求項１２】
薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれか一項で記載された化合物あるいは請求項４または５で記載された組成物の使用。
【請求項１３】
薬剤が：
（ａ）患者で眼内圧を低下させる；
（ｂ）高眼内圧に伴う症状を治療する；または
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の双方
のためである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
症状が緑内障である、請求項１３に記載の使用。