(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸塩基配列中のＧＣの頻度が全領域に亘って一様であり、連続した２０塩基以上の部分配列が既存データベース上の天然由来の配列とは一致せず、１０塩基以上の連続した繰り返し配列を含まないことを特徴とし、さらに高次構造を形成しない塩基配列からなる核酸標準物質の提供。【解決手段】ＧＣ含量に偏りにない１０，０００塩基長以上の核酸標準物質、典型的には特定の配列に示される核酸及びそのフラグメントからなる核酸標準物質は、天然に存在する配列と一致する配列を連続して２０塩基以上有せず、１０塩基以上連続した繰り返し配列を有せず、かつ高次構造をとらない優れた核酸標準物質であり、数千から数万塩基長の塩基配列からなる、ＧＣ含量が一定である核酸標準物質を作成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
数千から数万塩基の塩基配列からなる、ＧＣ含量が一定である核酸標準物質の作成方法であって、下記（１）〜（５）の工程に従って作成する方法；
（１）ＧＣ含量が３０〜７０％の範囲で一定の値に設定された、３６塩基長のオリゴヌクレオチドをランダムに複数種類生成する工程、
（２）当該オリゴヌクレオチドのうち、下記（ａ）〜（ｃ）に該当するオリゴヌクレオチドを除外する工程、
（ａ）既存データベースに登録された塩基配列と比較し、３６塩基中１８塩基以上一致した配列、
（ｂ）当該オリゴヌクレオチド間で互いに塩基配列を比較し、他の配列と１８塩基以上一致した配列、
（ｃ）同一の塩基が４塩基以上の連続する配列、
（３）前記工程（２）で残った複数のオリゴヌクレオチドを任意の順序で繋ぎあわせ、数千から数万塩基長のポリヌクレオチドを得る工程、
（４）前記工程（３）で得られたポリヌクレオチドの塩基配列中で、下記（ｄ）〜（ｇ）に該当する配列を検索し、対応する領域を除去する工程、
（ｄ）２０塩基中１５塩基以上の類似配列を持つ繰り返し配列、
（ｅ）配列を相補鎖に変換した場合、もとの配列と２０塩基中１５塩基以上一致する配列、および１０塩基以上連続して一致する配列、
（ｆ）既存データベースに登録された配列と比較し、１００塩基中５０塩基以上一致した配列、および２０塩基以上連続して他の領域の配列と一致した配列、
（ｇ）同じ塩基が４塩基以上連続する配列、
（５）前記工程（４）で得られたポリヌクレオチドの塩基配列及び対応するアミノ酸配列が既存のデータベースに登録された配列と５０％以上一致しないことを確認する工程。
（６）必要に応じて、得られた長鎖の配列を任意の長さに切り分ける工程。
【請求項２】
配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなる核酸，又はその任意の位置の少なくとも１５塩基連続した部分配列もしくはその相補的配列を含む核酸。
【請求項３】
配列番号４〜８のいずれかに示される塩基配列を含む核酸。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の核酸が組み込まれた組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターが導入された形質転換微生物。
【請求項６】
配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなる核酸，又はその任意の位置の少なくとも２０塩基連続した部分配列を含む核酸を、核酸標準物質として含有する標準核酸試料。
【請求項７】
配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列の任意の位置の少なくとも１５塩基の部分配列及び／又はその相補配列を含む１本鎖の核酸からなる核酸標準物質検出用のプローブ又はプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸定量系、特にＰＣＲやＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）による核酸定量系、とりわけマルチプレックスＰＣＲの系において標準物質として使用するのに最適なＤＮＡ・ＲＮＡ、および該ＤＮＡからなる標準ＤＮＡ試料または該ＲＮＡからなる標準ＲＮＡ試料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、テイラーメイド医療への急速なニーズの高まりにともなって、ＳＮＰｓやトランスクリプトーム等のＤＮＡ・ＲＮＡに関する遺伝子多型の判別と、それらに対する核酸定量技術が医療分野において盛んに導入されている。病原性ウイルスや細菌等に由来する核酸（遺伝子）の定量的検出による感染症診断や薬剤投与後の予後診断にも複数の対象をターゲットとした核酸定量が欠かせない。食品、農林水産分野、環境分野においても、核酸を指標とした微生物定量検査や品種混入評価のための核酸定量技術が導入され始めている。
現在、特定の配列を持つ核酸の定量のため、定量的ＰＣＲ法をはじめＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）技術等様々な定量的核酸評価手法が用いられている。定量的ＰＣＲにおいては、標的核酸を検出するためのプライマーによるＰＣＲを行い、その標的の存在量を定量的に評価する。また、ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子発現量などを定量的に評価するため、各ｍＲＮＡを標的とし特異的にハイブリダイズするプローブを多数配列させ、遺伝子発現量を相対的に定量するものである。
これらの核酸定量技術においては、定量操作そのものに問題が無いことを判定するための基準として、核酸標準物質が用いられる。また、ＤＮＡマイクロアレイや競争的ＰＣＲ等により相対定量を行う場合には、被験核酸とは異なった塩基配列を持つ核酸を内部標準物質として添加し、測定値を標準化する。ここで使用する核酸標準物質としては従来、天然に存在する遺伝子配列の一部が使用されてきたが、これら従来の核酸標準物質は、様々な手法・装置・キット間で共通に定量結果を比較するのに十分な性能を備えていなかった。
【０００３】
これらを解決するために、非天然で高次構造をとらない塩基配列からなるＤＮＡを設計する方法が開発されている。この方法では、互いにミスハイブリダイゼーションを起こしにくいＤＮＡ配列を効率よく設計するものである。この方法は、所定の長さのＤＮＡ配列を、ＧまたはＣとＡまたはＴを０と１からなるビット列（テンプレート）で表わした場合、各テンプレート間、各テンプレートの逆配列間、これらをシフトした配列間、これらの連結配列間とのハミング距離が、いずれも所定値以上になるテンプレートを選択し、該テンプレートが表現するＤＮＡ配列の集合の中から、ＤＮＡ配列同士が少なくとも前記ハミング距離ｋを保つＤＮＡ配列の集合を選定するというものである（特許文献１、２参照。）
さらに、本発明者らは、これらの原理を利用し、塩基配列中の塩基に偏りがなく、しかも非天然で高次構造をとらない塩基配列からなるＤＮＡを設計する方法を開発した(特許文献３)。この方法では、一定の長さと一定のＣＧ含量を有するＤＮＡを複数組み合わせてデザインした多数のＤＮＡから、データベースに登録されている既存の塩基配列と一致するものを除き、そのＤＮＡを組み合わせて作成する。具体的には、特許文献１の方法を用い、ＧＣ含量５０％で長さが１２ｍｅｒの塩基配列を複数設計し、さらにこれらの配列をつなぎ合わせて、約６００塩基の塩基配列をデザインし、このようにデザインした複数の候補配列の中で、核酸塩基配列および翻訳産物の配列が既存の核酸・蛋白質データベースのレコードと６０％以上一致しないものを選択したものである。
【０００４】
ところで、核酸標準物質として、既知の遺伝子配列を利用することに起因して生じる主な問題点としては、例えば以下のものが考えられる。
１）天然に存在する塩基配列を有する核酸標準物質の場合、核酸定量系に予期せず混入するＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイズする等の恐れがあり、これがＰＣＲ等の増幅効率や検出系に影響を与え、定量値が正確でない可能性がある。
２）核酸標準物質における塩基配列やＧＣ含量、高次構造の形成しやすさ、といった性質がＰＣＲ等の増幅効率に影響を与え、使用する核酸標準物質中の標的配列が異なっている場合には、定量値に違いが生じる恐れがある。
３）従来、校正等の目的で定量装置・定量手法ごとに異なった標準物質が使われてきた。それら種類が異なった標準物質の、塩基配列も物性も異なったサイトに対してプライマー、プローブを設計することから、増幅やハイブリの効率は各種核酸定量装置ごと・定量手法ごとに異なる。このため定量値を客観的に比較・校正することは難しく、各手法・装置・キット等による定量性の優劣を比較すること、また、異なった手法・装置・キット等で得られた定量値を評価、比較することは非常に困難であった。
【０００５】
特許文献３の手法は上記のような問題点を解決すべく本発明者らにより開発された手法であり、当該手法で得られたＤＮＡ配列は非天然の配列であって、上記１）〜３）の問題の一部は回避できる核酸標準物質である。しかしながら、当該ＤＮＡ配列中には依然として天然に存在する配列と連続して２０塩基以上一致する配列が複数箇所含まれているため、当該ＤＮＡ配列の検出用核酸プローブ、プライマーを作製するために、当該ＤＮＡ配列又はその相補配列中の部分配列を用いようとすると、当該類似配列部分を選択する可能性が高く、結果として天然に存在する配列を同時に検出してしまう問題を残している。また、当該ＤＮＡ配列はたかだか６００塩基長であり、ＤＮＡマイロアレイなどによる測定時においてより長い配列が標準物質として使用とされる場合、またマルチプレックスによる核酸定量系において、同一性能を有する複数種類の核酸標準物質が同時に必要とされる場合に対応できないという問題もあった。
【特許文献１】特開２００４−３５５２９４号公報
【特許文献２】ＷＯ２００３／０３８０９１
【特許文献３】特開２００７−６０９６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、上記した従来の核酸標準物質の使用に起因して生ずる問題点を解消する点にあり、核酸の定量値が正確で、各種核酸定量装置により得られた定量値を客観的な値に校正することが可能であって、このため、各核酸定量装置間の定量能力を比較、評価でき、あるいは異なる核酸定量装置で得られた定量値を、客観的に評価、比較可能にし得る新規な標準核酸試料を提供することにある。
具体的には、塩基配列中の塩基が一定であり、しかも天然に存在する配列と類似する配列を連続して２０塩基以上有せず、１０塩基以上連続した繰り返し配列を有せず、さらに高次構造をとらない数千から数万塩基長の塩基配列からなる標準核酸物質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、下記（１）〜（６）の核酸標準物質を作成するためのストラテジーを構築し、当該ストラテジーに沿って、数千から数万塩基長の塩基配列からなるＤＮＡを設計したところ、３種類のＤＮＡ（配列番号１〜３）を得ることができた。これら各ＤＮＡは、塩基配列中の塩基が一定であり、しかも天然に存在する配列と一致する配列を連続して２０塩基以上有せず、１０塩基以上連続した繰り返し配列を有せず、さらに高次構造をとらない塩基配列であることが確認できた。そして、当該ＤＮＡ又は対応するＲＮＡが核酸標準物質として極めて良好な性能を有することを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明の核酸標準物質を作成するための手順は以下の通りである。
（１）ＧＣ含量が３０〜７０％の範囲で一定の値に設定された、３６塩基長のオリゴヌクレオチドをランダムに複数種類生成する工程、
（２）当該オリゴヌクレオチドのうち、下記（ａ）〜（ｃ）に該当するオリゴヌクレオチドを除外する工程、
（ａ）公共塩基配列データベースに登録されている既存の塩基配列と類似性を示す配列（３６塩基中１８塩基以上既知の配列と一致した配列）、
（ｂ）当該オリゴヌクレオチド間で互いに塩基配列を比較し、他の配列と１８塩基以上一致した配列、
（ｃ）同一の塩基が４塩基以上の連続する配列、
（３）前記工程（２）で残った複数のオリゴヌクレオチドを任意の順序で繋ぎあわせ、数千から数万塩基長のポリヌクレオチドを得る工程、
（４）前記工程（３）で得られたポリヌクレオチドの塩基配列中で、下記（ｄ）〜（ｇ）に該当する配列を検索し、対応する領域を除去する工程、
（ｄ）２０塩基中１５塩基以上の一致した配列を持つ繰り返し配列、
（ｅ）配列内で２本鎖構造（２次構造）を形成する可能性のある配列（２０塩基中１５塩基以上結合する配列（相補配列）、および１０塩基以上連続して結合する可能性のある配列（相補配列））、
（ｆ）公共塩基配列データベースに登録されている既存の塩基配列と類似性を示す配列（１００塩基中５０塩基以上既知の配列と一致した配列、および２０塩基以上連続して他の配列と一致した配列）、
（ｇ）同じ塩基が４塩基以上連続する配列、
（５）前記工程（４）で得られたポリヌクレオチドの塩基配列及び対応するアミノ酸配列が既存のデータベースのレコードと５０％以上一致しないことを確認する工程。
（６）必要に応じて、得られた長鎖の配列を任意の長さに切り分ける工程。
なお、本発明において「既存のデータベース」というとき、塩基配列に関しては「公共塩基配列データベース」、すなわち日本（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）、米国（ＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋ）、及び欧州（ＢＩ／ＥＭＢＬ）において管理されているＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベース（２００８年６月現在）、アミノ酸配列に関しては、「公共アミノ酸配列データベース」、すなわち、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ等の公共データベースを含み、かつ公共塩基配列データベースをアミノ酸配列に変換したものを含む統合データベース（２００８年6月現在）を指す。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の〔１〕〜〔７〕に係るものである。
〔１〕  数千から数万塩基長の塩基配列からなる、ＧＣ含量が一定である核酸標準物質の作成方法であって、下記（１）〜（５）の工程に従って作成する方法；
（１）ＧＣ含量が３０〜７０％の範囲で一定の値に設定された、３６塩基長のオリゴヌクレオチドをランダムに複数種類生成する工程、
（２）当該オリゴヌクレオチドのうち、下記（ａ）〜（ｃ）に該当するオリゴヌクレオチドを除外する工程、
（ａ）既存データベースに登録された塩基配列と比較し、３６塩基中１８塩基以上一致した配列、
（ｂ）当該オリゴヌクレオチド間で互いに塩基配列を比較し、他の配列と１８塩基以上一致した配列、
（ｃ）同一の塩基が４塩基以上の連続する配列、
（３）前記工程（２）で残った複数のオリゴヌクレオチドを任意の順序で繋ぎあわせ、数千から数万塩基長のポリヌクレオチドを得る工程、
（４）前記工程（３）で得られたポリヌクレオチドの塩基配列中で、下記（ｄ）〜（ｇ）に該当する配列を検索し、対応する領域を除去する工程、
（ｄ）２０塩基中１５塩基以上の類似配列を持つ繰り返し配列、
（ｅ）配列を相補鎖に変換した場合、もとの配列と２０塩基中１５塩基以上一致する配列、および１０塩基以上連続して一致する配列、
（ｆ）既存データベースに登録された配列と比較し、１００塩基中５０塩基以上一致した配列、および２０塩基以上連続して他の領域の配列と一致した配列、
（ｇ）同じ塩基が４塩基以上連続する配列、
（５）前記工程（４）で得られたポリヌクレオチドの塩基配列及び対応するアミノ酸配列が既存のデータベースに登録された配列と５０％以上一致しないことを確認する工程。
（６）必要に応じて、得られた長鎖の配列を任意の長さに切り分ける工程。
〔２〕  配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなる核酸，又はその任意の位置の少なくとも１５塩基連続した部分配列もしくはその相補的配列を含む核酸。
〔３〕  配列番号４〜８のいずれかに示される塩基配列を含む核酸。
〔４〕  前記〔２〕又は〔３〕に記載の核酸が組み込まれた組換えベクター。
〔５〕  前記〔４〕に記載の組換えベクターが導入された形質転換微生物。
〔６〕  配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなる核酸，又はその任意の位置の少なくとも２０塩基連続した部分配列を含む核酸を、核酸標準物質として含有する標準核酸試料。
〔７〕  配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列の任意の位置の少なくとも１５塩基の部分配列及び／又はその相補配列を含む1本鎖の核酸からなる核酸標準物質検出用のプローブ又はプライマー。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の核酸標準物質は、配列中のＧＣ含量のバラツキや高次構造の有無によりＰＣＲ増幅等が影響されることがなく、天然に存在する目的以外のＤＮＡが校正実験の定量系に予期せず混入しても、それによりＰＣＲ増幅等に与える影響は少なく、正確なＤＮＡ定量が可能となる上、どの部分を検出用核酸プローブあるいはプライマーとして選択したとしても、天然に存在する配列を同時に検出・増幅してしまう問題がない。また、本発明の核酸標準物質は、いずれも１０，０００塩基長という長い配列なので、任意の位置のフラグメントとして、同一のＧＣ含量を示す様々な長さの核酸標準物質を複数種類作成することができ、これら標準物質は同時に使用してもお互いの検出を阻害することがない。これらの核酸標準物質は、各種核酸定量装置により得られた定量値を客観的な値に校正することができるので、各核酸定量装置間の定量能力の比較、評価、あるいは異なる核酸定量装置で得られた定量値を、客観的に評価、比較することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
１．用語の定義
本発明において、「核酸」とは、ヌクレオチドがリン酸基を介して直鎖状に複数個エステル結合したポリヌクレオチドを指し、オリゴヌクレオチドなど短い鎖も含み、一本鎖の状態及び相補鎖と共に二本鎖が形成された状態も含まれる。ヌクレオチドの種類は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡであるが、一部のヌクレオチドがメチル基などで修飾されている場合、酸素がイオウに置換している場合、ＰＮＡ、ＬＮＡなどの人工核酸も包む。なお、本発明の核酸の塩基配列を各配列番号で示す際には、表記される一本鎖ＤＮＡの塩基配列をそれぞれ対応する塩基配列に読み替える。例えば、二本鎖ＤＮＡの場合は相補配列との対として、一本鎖ＲＮＡの場合はチミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）として読み替える。
本発明において、「核酸標準物質」というとき、下記２．の設計方法に従って得られた、ＧＣ含量に偏りのない塩基配列を有し、かつ、非天然で高次構造をとらない塩基配列を有することを特徴とする１０，０００塩基以上の塩基配列からなる核酸、例えば配列番号１〜３に示される核酸のみならず、当該核酸の任意の位置の連続した３０塩基以上の塩基配列からなる核酸、さらにはこれら核酸を基板、ビーズなどの表面に固定化処理するための修飾が施された核酸、標識用タグが付加された核酸などを包含する。
【００１２】
本発明の「核酸標準物質」は、ＧＣ含量が一定のオリゴヌクレオチドを組み合わせ、全体の核酸の塩基配列はもちろん、その一部の領域においてもＧＣ含量は一定であるように設計しているので、配列中のＧＣ含量のバラツキや高次構造の有無によりＰＣＲ増幅等が影響されることがなく、また、天然の核酸の塩基配列とは異なる塩基配列を有するために、天然に存在する目的以外のＤＮＡが校正実験の定量系に予期せず混入しても、それによりＰＣＲ増幅等に与える影響は少なく、これらの点で、正確なＤＮＡ定量が可能となる。さらに、天然に存在する配列と一致する配列を連続して２０塩基以上有せず、どの部分を検出用核酸プローブあるいはプライマーとして選択したとしても、天然に存在する配列を同時に検出・増幅してしまう問題を回避している。また、核酸標準物質の長さが長いことから、様々な長さを有する核酸標準物質を複数種類作成することが可能である。
本発明の「核酸標準物質」は、相補の塩基配列を有するＤＮＡと共に構成される２本鎖ＤＮＡの状態で、定量ＰＣＲ法をはじめとするＤＮＡ定量手法・装置・キットに使用する標準ＤＮＡ試料として好適に使用できる。その際のＤＮＡの長さには特に制限はないが、プローブを用いない定量実験の標準ＤＮＡ試料として使用する場合、最短で２０塩基対程度の長さがあればよい。また、本発明の核酸標準物質をＲＮＡとして合成したもの、あるいは本核酸標準物質の相補鎖をＲＮＡとして合成したものは、ＲＮＡ定量装置に使用する標準ＲＮＡ試料として好適に使用できる。本発明におけるＲＮＡはその長さに特に制限はなく、プローブを用いない定量実験の標準ＲＮＡ試料として使用する場合、最短で２０塩基程度の長さがあればよい。
【００１３】
本願発明において、「標準核酸試料」、すなわち「標準ＤＮＡ試料」又は「標準ＲＮＡ試料」とは、下記５．で詳細に述べるが、本発明の「核酸標準物質」を核酸定量分析の対象となる被検核酸試料の定量値を客観的な値に校正するために用いられる。その際、通常は緩衝液などに溶解し、溶液状態で用いられる。本発明の「核酸標準物質」は内部配列に１０塩基以上連続した繰り返し配列を有しないことから、複数種類の標準物質を作成し同時に使用してもお互いの検出を阻害することがない。これらの核酸配列は各種核酸定量装置により得られた定量値を客観的な値に校正することが可能であって、このため、各核酸定量装置間の定量能力の比較、評価、あるいは異なる核酸定量装置で得られた定量値を、客観的に評価、比較することが可能になる。
【００１４】
２．本発明の「核酸標準物質」の設計方法
本発明の核酸標準物質を作成するためには、以下の（１）〜（６）の工程の手順に従って塩基配列がデザインされ、得られた塩基配列に従ってＤＮＡ合成又はＲＮＡ合成をする。
（１）ＧＣ含量が３０〜７０％の範囲で一定の値に設定された、３６塩基長のオリゴヌクレオチドをランダムに複数種類生成する工程、
（２）当該オリゴヌクレオチドのうち、下記（ａ）〜（ｃ）に該当するオリゴヌクレオチドを除外する工程、
（ａ）公共塩基配列データベースに登録されている既存の塩基配列と類似性を示す配列（３６塩基中１８塩基以上既知の配列と一致した配列）、
（ｂ）当該オリゴヌクレオチド間で互いに塩基配列を比較し、他の配列と１８塩基以上一致した配列、
（ｃ）同一の塩基が４塩基以上の連続する配列、
（３）前記工程（２）で残った複数のオリゴヌクレオチドを任意の順序で繋ぎあわせ、数千から数万塩基長のポリヌクレオチドを得る工程、
（４）前記工程（３）で得られたポリヌクレオチドの塩基配列中で、下記（ｄ）〜（ｇ）に該当する配列を検索し、対応する領域を除去する工程、
（ｄ）２０塩基中１５塩基以上の一致した配列を持つ繰り返し配列、
（ｅ）配列内で２本鎖構造（２次構造）を形成する可能性のある配列、すなわち２０塩基中１５塩基以上結合する配列（相補配列）、および１０塩基以上連続して結合する可能性のある配列（相補配列）、
（ｆ）公共塩基配列データベースに登録されている既存の塩基配列と類似性を示す配列、すなわち１００塩基中５０塩基以上既知の配列と一致した配列、および２０塩基以上連続して他の配列と一致した配列、
（ｇ）同じ塩基が４塩基以上連続する配列、
（５）前記工程（４）で得られたポリヌクレオチドの塩基配列及び対応するアミノ酸配列が既存のデータベースのレコードと５０％以上一致しないことを確認する工程。
（６）必要に応じて、得られた長鎖の配列を任意の長さに切り分ける工程。
つまり、このような本発明の核酸標準物質の設計方法は、一定の長さと一定のＣＧ含量を有するＤＮＡを複数組み合わせてデザインした多数のＤＮＡから、データベースに登録されている既存の塩基配列と類似するものを削除し、それらを結合させた後、結合配列から天然に存在する既知の塩基配列と類似する配列をさらに削除したものであり、また、選択した一定の長さの配列が高次構造をとらないことを確認し、高次構造の形成を促進すると思われる該当配列を削除し、さらに、核酸配列中に繰り返し配列を有しないことを確認するものである。
なお、上記（ａ）、（ｆ）工程など、既存のデータベース内の塩基配列と比較する場合、ＲＮＡ配列中のウラシルはチミンと読み替える。
【００１５】
３．本発明の「核酸標準物質」に用いることのできる核酸
上記２．に示される手順に従い、本発明の、ＧＣ含量に偏りのない塩基配列を有し、かつ、非天然で高次構造をとらない塩基配列として、配列番号１〜３に示される塩基配列を設計することができた。
本発明の「核酸標準物質」に用いることのできる核酸は、上記２．に示される手順に従えば多種類の塩基配列からなる核酸が設計可能であるが、当該配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列又はその部分配列からなる核酸は、本発明の典型的な核酸標準物質として用いることができる。
具体的には、配列番号１のＤＮＡの塩基配列は、ＧＣ含量５０％で長さが３６塩基の塩基配列を複数ランダムに生成、公共塩基配列データベースに登録されている既存の塩基配列と類似性を示す配列（３６塩基中１８塩基以上の類似した配列）を除外し、作成した配列間で３６塩基中１８塩基以上が一致する配列も同じく除外し、さらに、同じ塩基が４塩基以上連続する配列を除外した。その結果、約６，０００種類の塩基配列が得られた。これらをつなぎ合わせて生成した配列から、２０塩基中１５塩基以上一致する配列を含んだ繰り返し配列部分を削除した。その後、配列内で２本鎖構造（２次構造）を形成する可能性のある部分配列を検索し削除した（２０塩基中１５塩基以上一致する配列を含む領域を削除）。さらに、１０塩基以上連続した繰り返し配列を削除した。その結果生成された配列中から、既存の公共塩基配列データベースに登録されている天然由来の核酸塩基配列と類似性を示す配列（１００塩基中５０塩基以上既知の配列と一致する配列、および２０塩基以上連続して他の配列と一致する配列）を削除した。さらに、同じ塩基が４塩基以上連続する配列を除外した。最終的に得られた核酸塩基配列は５１，５００塩基からなり、既存のデータベース上に登録された核酸塩基配列および転写翻訳産物のアミノ酸配列などと５０％以上一致しないものであることを確認している。
【００１６】
同様に、配列番号２のＤＮＡの塩基配列は、ＧＣ含量４０％で長さが３６塩基の塩基配列を複数ランダムに生成し、上記と同様の過程を経てデザインされた１０，５００塩基の塩基配列であり、核酸塩基配列および翻訳産物の配列が既存の核酸・蛋白質データベースのレコードと５０％以上一致しないものであることを確認している。同じく、配列番号３のＤＮＡの塩基配列は、ＧＣ含量６０％で長さが３６塩基の塩基配列を複数ランダムに生成し、上記と同様の過程を経てデザインされた１１，５００塩基の塩基配列であり、核酸塩基配列および翻訳産物の配列が既存のデータベース上に登録された核酸塩基配列および転写翻訳産物のアミノ酸配列などと５０％以上一致しないものであることを確認している。
【００１７】
これらの配列番号１〜３の塩基配列は天然には存在せず、また、該塩基配列中のＧＣ含量は、１２塩基程度の長さであれば、どの領域の部分をとってもほぼ均等である。したがって、これらの塩基配列中の任意の領域の部分塩基配列からなるものであっても、少なくとも２０塩基の長さを有する核酸であれば、標準核酸試料の構成核酸となりうる。このような核酸標準物質として適したフラグメントの典型例としては、配列番号１のフラグメントに相当する配列番号４〜８に示される塩基配列からなる核酸を示すことができる。
【００１８】
４．本発明の核酸標準物質として用いる核酸の合成方法、保存方法
このように設計された本発明の核酸のうち、ＤＮＡについては、それ自体周知の方法により合成可能である。また、現在ではこのようなＤＮＡの委託製造元が多数あり、これらに委託して入手することも可能である。
得られたＤＮＡは、該ＤＮＡと相補ＤＮＡとで２本鎖ＤＮＡとし、これをＤＮＡ定量装置において標準ＤＮＡ試料として使用するが、この２本鎖ＤＮＡも、上記ＤＮＡを鋳型鎖としてＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖を合成することにより得られ、従来周知の方法により得ることができる。本発明の標準ＤＮＡ試料は適当なプラスミド等のベクターに連結しておくことが便利である。このような組み換えベクターは、大腸菌等の宿主に導入して、凍結乾燥等により保存でき、必要なとき、宿主微生物を増殖させることにより組み換えベクターを得、これから、本発明の標準ＤＮＡ試料をＰＣＲ的に増幅することにより、大量に供給できる。また、実施例１に示すように、本発明の配列の両側に任意のプライマーサイトを付与できる。本発明の標準ＤＮＡ試料を、異なるＤＮＡ定量装置間において使用して、上記増幅曲線を求め、これを比較することにより、その感度、正確性等の性能比較を行うことができ、また、各定量装置の校正も可能となる。
【００１９】
また、本発明のＤＮＡを基に同じ配列を有する（ただしチミンをウラシルに変換）ＲＮＡを合成し、ＲＮＡ標準物質として使用することも可能である。このようなＲＮＡは、それ自体周知の方法により合成可能である。また、現在ではこのようなＲＮＡの委託製造元が多数あり、これらに委託して入手することも可能である。一般には、作成したＤＮＡ配列上流部位にＴ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼの認識配列を付加し、ＲＮＡ合成をＲＮＡポリメラーゼにより行えばよい。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ合成系を利用すれば、本ＲＮＡを大量に合成可能である。また、本発明のＤＮＡ配列の相補ＤＮＡ配列の上流にＲＮＡポリメラーゼの認識部位を付加することによって、相補ＲＮＡ鎖を合成することも可能である。
【００２０】
５．本発明の核酸標準物質を用いた標準核酸試料の調整方法
本発明の核酸標準物質は、ＤＮＡ定量装置に使用する標準ＤＮＡ試料として、またＲＮＡ定量装置に使用する標準ＲＮＡ試料として好適に使用できる。
ＲＮＡの場合も、ＲＮＡ定量装置において標準ＲＮＡ試料として使用することができる。本発明の標準ＲＮＡ試料を、異なるＲＮＡ定量装置間において使用して、これを比較することにより、その感度、正確性等の性能比較を行うことができ、また、各定量装置の校正も可能となる。
ここで、ＤＮＡ定量装置は、定量的ＰＣＲ装置やＤＮＡマイクロアレイ装置などが想定される。また、ＲＮＡ定量装置は、同じくＲＮＡ分子を標的とした定量的ＰＣＲ装置やＤＮＡマイクロアレイ装置が想定される。
標準ＤＮＡ試料および標準ＲＮＡ試料を調整するためには、滅菌水又は緩衝液に核酸標準物質を所定量溶解した溶液として利用可能である。また、その試料には複数種類の核酸標準物質を混合して利用することもできる。
これらの核酸定量技術において、定量操作そのものに問題が無いことを判定するための基準として、本発明の核酸標準物質を利用することができる。また、ＤＮＡマイクロアレイや定量的ＰＣＲ等により核酸の相対定量を行う場合には、本発明の核酸標準物質を内部標準物質として添加し、測定値の標準化を行うことが可能となる。
さらに、ＤＮＡマイクロアレイ装置においては、本発明の核酸標準物質を１本鎖の状態で、標的となる被検核酸試料と同一もしくは異なる基板又はビーズ表面に固定化し、被検核酸試料の各種解析を行う際の対照試料として用いることができる。全長のどの位置の塩基配列に対応する核酸を選択しても、基板表面に高密度で固定化しても天然に存在する配列を検出してしまう可能性がほとんどないため、被検核酸試料と同一基板上に固定化したチップなどでのバックグラウンド補正やＤＮＡマイクロアレイの品質管理にも用いることができる。その場合の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの長さは、通常１５〜１，０００塩基長、好ましくは２０〜５００塩基長である。
【００２１】
６．本発明の核酸標準物質を検出するためのプローブまたはプライマー
また、本発明の核酸標準物質の部分配列を利用することで、核酸標準物質自体を検出するためのプローブもしくはプライマーを設計できる。上記装置などを利用した核酸定量においては、標的である核酸配列を検出するための、標的核酸配列の一部に相補的な配列を有するＤＮＡプローブを利用する。また、定量的ＰＣＲ装置などを利用する場合、核酸標準物質そのものを増幅するためのＰＣＲプライマーが必要となる。これらのプローブおよび、又はプライマーは、各核酸定量装置の感度、正確性等の性能比較、各定量装置の校正や、定量操作そのものに問題が無いことを判定するための基準として評価する際不可欠なものである。プローブの場合は、本発明の配列番号１〜３のいずれかに示される任意の位置の連続した１５塩基以上の部分配列の相補ＤＮＡ鎖として提供できる。これらのプローブは、定量的ＰＣＲ装置での検出用蛍光プローブや、ＤＮＡマイクロアレイ装置において基板上に配列するプローブとして利用される。その際の塩基長は通常１５〜５００塩基長、好ましくは２０〜５０塩基長である。プライマーの場合、本発明の配列番号１〜３のいずれかに示される任意の位置の増幅したい領域の両端に対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖由来の連続した１５塩基以上の部分配列、もしくはさらに任意のプライマーサイトを結合したプライマーセットとして提供できる。その際の塩基長は通常１５〜１００塩基長、好ましくは２０〜５０塩基長である。これらのプライマーは、定量的ＰＣＲ装置でのＰＣＲ増幅時や、その他の核酸定量装置に供する試料の準備において核酸増幅を行う場合利用される。
【実施例】
【００２２】
以下本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕
以下に、標準用ＤＮＡ配列の作成例を示す。配列番号１のＤＮＡの塩基配列は、ＧＣ含量５０％で長さが３６塩基の塩基配列を乱数表を基に複数ランダムに生成（約５万種類）、公共塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  国際塩基配列データベース）に登録されている既存の塩基配列（２００８年６月時点）と一致する配列（３６塩基中１８塩基以上既知の配列と一致する配列）は除外し、作成した配列間で３６塩基中１８塩基以上が一致した配列も同じく除外し、さらに、同じ塩基が４塩基以上連続する配列を除外した。その結果、約６，０００種類の塩基配列が得られた。これらをつなぎ合わせて生成した配列から、２０塩基中１５塩基以上の類似配列を含んだ繰り返し配列部分を削除した。その後、配列内で２本鎖構造（２次構造）を形成する可能性のある部分配列を検索し削除した（２０塩基中１５塩基以上一致した配列を含む領域を削除）。さらに、１０塩基以上連続した繰り返し配列を削除した。その結果生成された配列中から、既存の公共塩基配列データベースに登録されている天然由来の核酸塩基配列と類似性を示す配列（１００塩基中５０塩基以上既知の配列と一致する配列、および２０塩基以上連続して他の配列と一致する配列）を削除した。さらに、同じ塩基が４塩基以上連続する配列を除外した。最終的に得られた核酸塩基配列は５１，５００塩基からなり、既存のデータベース上に登録された核酸塩基配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  国際塩基配列データベースで検索）および転写翻訳産物のアミノ酸配列など（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ等の公共データベースを含み、かつ公共塩基配列データベースをアミノ酸配列に変換したものを含む統合データベースで検索）と５０％以上一致しないものであることを確認した（２００８年６月時点）。
【００２３】
〔実施例２〕
次の作成例として、配列番号２のＤＮＡの塩基配列は、ＧＣ含量４０％で長さが３６塩基の塩基配列を実施例１と同様の手法により複数ランダムに生成し、公共塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  国際塩基配列データベース）に登録されている既存の塩基配列（２００８年６月時点）と一致する配列（３６塩基中１８塩基以上既知の配列と一致する配列）は除外し、作成した配列間で３６塩基中１８塩基以上が一致した配列も同じく除外し、さらに、同じ塩基が４塩基以上連続する配列を除外した。約５００種類の塩基配列が得られた。これらをつなぎ合わせて生成した配列から、２０塩基中１５塩基以上の一致する配列を含んだ繰り返し配列部分を削除した。その後、配列内で２本鎖構造（２次構造）を形成する可能性のある部分配列を検索し削除した（２０塩基中１５塩基以上一致する配列を含む領域を削除）。さらに、１０塩基以上連続した繰り返し配列を削除した。その結果生成された配列中から、既存の公共塩基配列データベースに登録されている天然由来の核酸塩基配列と類似性を示す配列（１００塩基中５０塩基以上既知の配列と一致する配列、および２０塩基以上連続して他の配列と一致する配列）を削除した。さらに、同じ塩基が４塩基以上連続する配列を除外した。最終的に得られた核酸塩基配列は１０，５００塩基からなり、既存のデータベース上に登録された核酸塩基配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  国際塩基配列データベースで検索）および転写翻訳産物のアミノ酸配列など（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ等の公共データベースを含み、かつ公共塩基配列データベースをアミノ酸配列に変換したものを含む統合データベースで検索）と５０％以上一致しないものであることを確認した（２００８年６月時点）。
【００２４】
〔実施例３〕
配列番号３のＤＮＡの塩基配列は、ＧＣ含量６０％で長さが３６塩基の塩基配列を実施例１と同様の手法により複数ランダムに生成、公共塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  国際塩基配列データベース）に登録されている既存の塩基配列（２００８年６月時点）と類似する配列（３６塩基中１８塩基以上既知の配列と一致する配列）は除外し、さらに、同じ塩基が４塩基以上連続する配列を除外した。約５００種類の塩基配列が得られた。これらをつなぎ合わせて生成した配列から、２０塩基中１５塩基以上の類似配列を含んだ繰り返し配列部分を削除した。その後、配列内で２本鎖構造（２次構造）を形成する可能性のある部分配列を検索し削除した（２０塩基中１５塩基以上の類似配列を含む領域を削除）。さらに、１０塩基以上連続した繰り返し配列を削除した。その結果生成された配列中から、既存の公共塩基配列データベースに登録されている天然由来の核酸塩基配列と類似性を示す配列（１００塩基中５０塩基以上既知の配列と類似性を示す配列、および２０塩基以上連続して他の配列と類似性を示す配列）を削除した。さらに、同じ塩基が４塩基以上連続する配列を除外した。最終的に得られた核酸塩基配列は１１，５００塩基からなり、既存のデータベース上に登録された核酸塩基配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  国際塩基配列データベースで検索）および転写翻訳産物のアミノ酸配列など（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ等の公共データベースを含み、かつ公共塩基配列データベースをアミノ酸配列に変換したものを含む統合データベースで検索）と５０％以上一致しないものあることを確認した（２００８年６月時点）。
【００２５】
〔実施例４〕
次に実際の標準物質としてのＤＮＡ合成例を示す。タカラバイオ社に製造を依頼して、配列番号４〜８に示す塩基配列を有するＤＮＡを合成し、ｐＵＣ１９ベクターに組み込まれた形（ＩＢＦ−５００−１：ｐＵＣ１９〜ＩＢＦ−５００−５：ｐＵＣ１９）で供給を受けた。作成した配列はＤＮＡシーケンシングを行い配列の確認を行った（図１）。
【００２６】
これらの配列をＢＬＡＳＴサーチにより天然に存在する既知の塩基配列との類似性の評価を行ったところ、全ての配列でヒトゲノムあるいはＥＳＴ配列との類似性で１８塩基以上連続して一致する配列は検出されなかった。また、全長の比較において５０％以上一致する配列も存在しなかった。同様にマウスゲノムおよびＥＳＴ配列においても同様に類似性を示す配列は検出されなかった。他の配列（原核生物やその他の真核生物由来配列）においても、２０塩基以上連続して一致する配列は検出されなかった（図２）。また、全長の比較において５０％以上一致する配列も存在しなかった。また、配列番号４〜８中に同じ塩基が４塩基以上連続する配列は存在せず、お互いに３６塩基中１８塩基一致する配列も検出されなかった。（なお、データベースのサーチ日は２００８年６月１７日である）
【００２７】
一方、特許文献３において配列番号１として公表されているＤＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴサーチにより天然に存在する既知の塩基配列との類似性の評価を行ったところ、２０塩基以上連続して一致する配列が多数検出された（図３）。また、３６塩基中１８塩基一致する配列も同様に検出された。従って、本発明のＤＮＡ配列は既存のＤＮＡ配列に比べ既知の配列との類似性が低く、標準物質として好適に利用できることが判明した。
【００２８】
また、配列番号４〜８の二次構造予測とその結合の自由エネルギー変化を評価したところ、特許文献３において配列番号１として公表されているＤＮＡ配列（５００塩基部位）と同等程度の値を示した。従って、既存のＤＮＡ配列と比較して同等程度に二次構造を形成しにくい配列を作成できていることを示した（図４）。
【００２９】
次に標準物質として合成した標準ＲＮＡの例を示す。鋳型ＤＮＡとしてタカラバイオ社に製造を依頼して、配列番号４〜８に示す塩基配列を有するＤＮＡを合成した。これらは５‘側にＴ７プロモーターの配列、３’末端にポリＡさらにその先に制限酵素の認識配列を付加し、ｐＵＣ１９ベクターに組み込まれた形で供給を受けた。この鋳型ＤＮＡをポリＡ下流で切断する制限酵素によって直鎖化し、アンビオン社のＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔキットにてＲＮＡに転写した。アジレント社のバイオアナライザーで性状を確認したところ、６００塩基長程度のほぼ単一の分子量であることを示すシングルピークが検出された（図５）。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】配列番号４（ＩＢＦ−５００−１）をベクターに組み込み、その配列をＤＮＡシーケンサによって確認した際の塩基配列を示すチャート。
【図２】配列番号４（ＩＢＦ−５００−１）をＢＬＡＳＴサーチに供した結果。
【図３】特許文献３において配列番号１として公表されているＤＮＡ配列をＢＬＡＳＴサーチした結果。
【図４】配列番号４（ＩＢＦ−５００−１）と特許文献３において配列番号１として公表されているＤＮＡ配列（５００塩基部位）の二次構造の予想図とその自由エネルギー変化。
【図５】配列番号４（ＩＢＦ−５００−１）をＲＮＡとして合成した合成品の電気泳動結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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