(57)【要約】【課題】サッカリド型分子を水酸官能基で修飾された固体担体の表面上にｉｎ  ｓｉｔｕ合成するための方法を提供する。【解決手段】固体担体の表面上にサッカリド型分子をｉｎ  ｓｉｔｕ合成するための方法であって、表面は水酸官能基で修飾されており、方法は、ａ）保護基Ｐで保護された少なくとも一つの水酸基を有する第１のサッカリド部分ＳＭ１を溶媒中に含む溶液と表面の少なくとも一つの区域Ａ１とを接触させることにより、第１のサッカリド部分ＳＭ１を表面の水酸官能基に結合させるステップと、ｂ）未反応の表面の水酸官能基を不活性化するステップと、を備える。【選択図】図２
2010019837.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体担体の表面上に糖鎖を合成するための方法であって、
保護基で保護された少なくとも一つの水酸基を有する第１の糖鎖モノマーを含む溶液と水酸官能基で修飾されている前記表面の少なくとも一つの区域とを接触させ、前記第１の糖鎖モノマーを前記表面の水酸官能基に結合させるステップと、
前記固体担体の前記表面を以下の化学式（Ｉ）で示される少なくとも一つの化合物と接触させ、前記表面の未反応の水酸官能基を不活性化するステップと、
前記第１の糖鎖モノマーの少なくとも一つの水酸基から前記保護基を除去するステップと、
所定の配列の糖鎖が得られるまで、前記第１の糖鎖モノマーに糖鎖モノマーを順次連結するステップと、
前記糖鎖中に残っている前記保護基で保護されている前記水酸基を脱保護するステップと、
を含む方法。
【化１】
2010019837.tif 000007
ここで：
‐Ｙ１及びＹ２は、同じでも異なってもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシラジカル、直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキルラジカル、チオ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカル、ニトロ基、アジド基、トリフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカル、シアノ基、又はアリール環を表し；
‐ｎは、１以上４以下の範囲の整数であり；
‐Ｘは、ハロゲン原子、トリクロロアセトイミド基、Ｒ１が直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキルラジカルを表すキサンテート基−ＳＣ＝ＳＯＲ１、チオ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基、チオアリール基、リン酸基、亜リン酸基、セレノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基、セレノアリール基、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシラジカル、並びにＲ２が直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキルラジカルもしくはアリール環を表すスルホキシド基‐Ｓ（Ｏ）‐Ｒ２からなる群から選択される。
但し、Ｙ１及びＹ２の一方が水素を表し、Ｙ１及びＹ２の他方がメトキシラジカルであるとき、前記メトキシラジカルが−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ鎖をもつ炭素原子に対してパラ位にはない。
【請求項２】
前記第１の糖鎖モノマーを前記表面の水酸官能基に結合させるステップの前に、
前記水酸官能基で修飾される前の前記表面と、少なくとも一つの末端水酸官能基を持つスペーサを溶液と、を反応させるステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも一つの末端水酸官能基をもつスペーサが、次の化学式（ＩＩ‐ａ）又は化学式（ＩＩ‐ｂ）で示されるシラン処理剤である、請求項２に記載の方法。
Ｍ‐（ＣＨ２）ｘ‐Ｏ‐Ｒ６  （ＩＩ‐ａ）
Ｍ‐（ＣＨ２）ｘ‐Ｒ７  （ＩＩ‐ｂ）
ここで、
‐Ｍは、シラン化された（ｓｉｌａｎｉｚｅｄ）基−Ｓｉ（Ｒ３）３、−ＳｉＲ３（Ｒ４）２又はＳｉＲ３Ｒ４Ｒ５を表し、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々独立に、水素もしくはフッ素及び塩素原子のようなハロゲン原子、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシラジカル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカル又はクロロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカルを表し；
‐ｘは、１以上２０以下の範囲の整数であり；
‐Ｒ６は、水酸基の保護基を表し；
‐Ｒ７は、少なくとも一つの水酸基を含む基の前駆体を表す。
【請求項４】
前記シラン処理剤が、５，６‐エポキシヘキシルトリエトキシシラン又はトリフルオロメトキシウンデカントリメトキシシランである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記糖鎖モノマーが、単糖類、二糖類、又はオリゴ糖類である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記糖鎖モノマーが、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、ジエチルエーテル、及びトルエンから選ばれる溶媒に溶かされている、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記化学式（Ｉ）において、
ｉ）ｎ＝１、Ｙ１及びＹ２の一方が水素原子であり、Ｙ１及びＹ２の他方が水素もしくはハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシラジカル、チオ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカル、又はシアノもしくはアジド基であり、Ｘがハロゲン原子又はトリクロロアセトイミド又はチオ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基であるか、
ｉｉ）ｎ＝１、Ｙ１及びＹ２が同じで、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシラジカル又はＣ１〜Ｃ４アルキルラジカルを表し、Ｘがハロゲン原子又はトリクロロアセトイミド基又はチオ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表しているか、
ｉｉｉ）ｎ＝２、Ｙ１及びＹ２の一方が水素原子であり、Ｙ１及びＹ２の他方が水素もしくはハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシラジカル、又はシアノもしくはアジド基であり、Ｘがトリクロロアセトイミド基であるか、
ｉｖ）ｎ＝２、Ｙ１及びＹ２が同じで、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシラジカルを表し、Ｘがトリクロロアセトイミド基を表している、
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
化学式（Ｉ）の化合物が、２，２，２‐トリクロロアセトイミド酸ベンジルエステル、ベンジルクロリド、ベンジルブロミド、２‐（トリフルオロメチル）ベンジルブロミド、３，５‐ジ‐（ｔｅｒｔ‐ブチル）ベンジルブロミド、又は４‐（メチルチオ）ベンジルクロリドである、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の糖鎖モノマーを前記表面の水酸官能基に結合させるステップの前に、
前記水酸官能基で修飾されている表面の少なくとも一部の領域を保護ポリマーでキャップするステップと、
前記表面の前記保護ポリマーでキャップされない領域の前記水酸官能基を、前記化学式（Ｉ）で示される少なくとも一つの化合物で不活性化するステップと、
前記保護ポリマーを除去するステップと、
を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記所定の配列の糖鎖が得られるまで、前記第１の糖鎖モノマーに前記糖鎖モノマーを順次連結するステップが、
前記第１の糖鎖モノマーが結合された領域の一部の領域を保護ポリマーでキャップするステップと、
前記保護ポリマーでキャップされていない前記第１の糖鎖モノマーに前記糖鎖モノマーを連結するステップと、
前記保護ポリマーを除去するステップと、
を含む、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記保護ポリマーが、ポリビニルアルコール類、ポリスチレン類、ポリビニルカルバゾール類、ポリイミド類、又はその誘導体類のポリマー類にからなる、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記保護ポリマーが、ポリヒドロキシスチレンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記保護ポリマーが、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、アセトン、又はジメチルスルホキシドで溶解することにより除去される、請求項９乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記糖鎖を活性化するステップを更に備える、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記糖鎖を活性化するステップにおいて、
前記糖鎖モノマーの前記水酸官能基、アミン官能基、又はカルボキシル官能基上の保護基が除去される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖等のサッカリド型分子により機能化された固体担体（糖鎖チップ、又は炭水化物アレイもしくはオリゴ糖アレイ）を製造するためのプロセスに関する。本発明は、かかる製造プロセスにより直接的に得られる糖鎖チップ、並びに、とりわけ生物学的分析、特にサッカリド又は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）のようなタンパク質のスクリーニングのための、又はサッカリド／タンパク質相互作用の研究のための、それらの利用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡチップ技術の開発は、機能ゲノム学に関するプログラムの大きな進歩を可能にした。これは、ＤＮＡを堆積又は合成する技術が小型化された結果、ＤＮＡ解析が、チップ上で並列に、多数のパラメータに照らして行われるようになったためである。最近になって、プロテオミクスの出現がタンパク質チップの概念を生み出した。後者は、タンパク質／リガンド型相互作用を並列に解析することを可能にした。
【０００３】
さらに最近になって、生物学的研究は「グライコミクス（Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）」、すなわち炭水化物／タンパク質相互作用の系統的な研究、に関心をもつようになった。これは、複合糖質（すなわち、糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカンのようなグリカン類のドメインをもつ任意の分子、より一般的には炭水化物を備える任意の分子）が、特に広い機能レパートリを有するためである。化学的には、これらの炭水化物は、単純なモノマーブロックの組立てにより構築される分子である。これらの組立物は、天然起源であってもよく、随意的にその断片であってもよく、あるいは合成起源であってもよい。炭水化物のファミリに属する分子の様々な機能は、炭水化物構造が非常に多くの分子と相互作用する能力に基づく。炭水化物と他分子との間の認識メカニズムに関する解析は、急速に進展する研究分野である。それは、特に、新規な治療用分子の設計、及びある種の分子の毒性リスクに関するより的確な評価を可能にするものである。現在、サッカリド分子の生成を可能にする系統的な方法は、ほとんど存在しない。このため、分子と炭水化物間との相互作用に係る構造特性の測定、及び相互作用自体の特性解析は、長く退屈な研究に取り組むことを暗に意味する。
【０００４】
したがって、糖鎖等のサッカリド型分子とそれらのリガンド間との相互作用メカニズムの知識を進展させるためには、例えば、特定のリガンドに対するサッカリド型分子のライブラリをスクリーニングできることが必要である。
【０００５】
これが、今日、新規なタイプのバイオチップの出現を目にする理由である。様々なタイプの糖鎖チップ、又は炭水化物アレイもしくはオリゴ糖アレイが、上記と関連するＤＮＡ又はタンパク質チップ開発の構成要素を成し、様々な研究者により提案されてきた。
【０００６】
これらの糖鎖チップは、所与の基板上に天然又は合成サッカリド物質を堆積した結果（ｅｘ  ｓｉｔｕ合成）、又は、例えばヘパランのような、内因性の複合糖質からなるいくつかの大ファミリの分子多様性を代表する様々なオリゴ糖配列を担体上に多数並列合成（コンビナトリアル・ケミストリ）した結果（ｉｎ  ｓｉｔｕ合成）のいずれかである。
【０００７】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ合成については、どのようなチップの特質（ＤＮＡ、タンパク質、サッカリド）であっても、結合サイトにアドレッシングする種々の方法がすでに用いられてきた。
【０００８】
‐手動アドレッシング：例えば、特許文献１は、マイクロロボットを用いた手動アドレッシングを提案しており、これによれば、対応する反応物質（オリゴヌクレオチド）を圧電ポンプで注入することによりオリゴヌクレオチド配列を形成するのに先立って、基板に種々の結合サイトを規定するために、フォトレジスト物質又はマスクを用いて、担体表面上に官能化されたサイトが形成される。
【０００９】
‐単一基板上に多様な構造を有する複数の化合物を合成するためのプロセスを記載した特許文献２に開示されるようなリソグラフィ技術：かかるプロセスは、アレイの選択領域を段階的に作り上げるために、２層のフォトレジストを用いることを含む。このプロセスによれば、次のステップを行う：（ｉ）基板上に配置され不安定な保護基を有する第１分子層上への保護ポリマーコート層の堆積、（ｉｉ）保護材料の層上への放射感受性レジストコート層の堆積、（ｉｉｉ）レジスト層を像様に露光すること、（ｉｖ）第１分子層の一部分を像様に暴露するために現像すること、（ｖ）第１分子層の露光部分を、保護基を除去するために処理すること、及び（ｖｉ）暴露した第１分子に第２分子を結合させること。
【００１０】
‐フォトリソグラフィ技術：一例として、特許文献３は、ポリマー配列のアレイを調製するための方法において、各々のアレイが、既知のモノマー配列をもつ複数の様々な位置的に区別できるポリマー配列を含み、基板表面を、初めに光解離性の保護された官能基で官能化した後、マスク露光で保護基を除去して官能基を活性化し、次に化学モノマーと結合させる方法を記載している。基板上の各領域における活性化及び結合シークエンスが、そこで合成されるポリマーの配列を決定する。このプロセスは、核酸チップの作製に特に適している。
【００１１】
‐化学的マスキング：例えば特許文献４に記載されており、特許文献４は、従来の結合化学を用いて、基板の選択領域に、オリゴヌクレオチド及び関連するポリマー（例えばペプチド核酸）のようなポリマーのアレイを形成する方法を開示している。そして、それは、基板の選択領域にバリア材料のような材料を分配するために選択的印刷技術を使用することを含み、上記バリア材料は、ブラシ、スプレイ技術、印刷技術などを含む様々な技術により、液体又は気体として塗布される。
【００１２】
- 特許文献５に例えば開示される方法による機械的アドレッシング：特許文献５は、複数のマイクロキュベットを有するマイクロプレート形状の基板上に、化学的又は生物学的分子の配列のマトリクスを生成するプロセスを記載している。このプロセスは、官能化したマイクロキュベット上に局所的に保護ポリマーを堆積してすべてのマイクロキュベット上に固体のポリマーキャップを形成することと、引き続き、保護ポリマーをすべてのマイクロキュベットから取り除くのに先立って、非光解離性の保護基による、各々のマイクロキュベットを取り囲む表面をパッシベーションするステップを可能にすることと、を備える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，４７４，７９６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６５８，７３４号明細書
【特許文献３】国際公開第９７／３９１５１号パンフレット
【特許文献４】欧州特許出願公開第０７２８５２０号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第１１６３０４９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかし、上述したすべての方法は、しばしば長くて複雑であり、特定の煩わしい反応物及び材料の使用が必要になる。また、上述した方法は、しばしば、固定化を望む目的分子以外の分子の非特異的吸着のレベルがあまりに高いために、目的とする生物学的分子を充分な感度で固定化できないデバイスをもたらす。官能化された個体担体の感度は、固定化量及び信号検出方法に依存するが、さらにまた特にバックグラウンドのノイズレベル（非特異的信号）にも依存する。バックグラウンドノイズの低減は、信号／ノイズ比を改善する。事実、生物種の存在を表面付近で検出するデバイスでは、バックグラウンドノイズは、固定化を望む目的の生物学的分子以外の分子の非特異的吸着に本質的に由来するため、これを制限する必要がある。
【００１５】
しかし、今日まで、信号／ノイズ比を低減することにより、固定された生物学的分子の信号を再現性よく高感度に検出することを可能にした、糖鎖等のサッカリド型分子で官能化された個体担体を、満足な方法で得ることはできなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
これらの理由から、本発明者らは、かかる担体を製造することを目的として本発明の主題を成すものを開発した。そこで、本発明の第１の主題は、固体担体の表面上に糖鎖モノマーを順次連結することにより、糖鎖等のサッカリド型分子をｉｎ  ｓｉｔｕ合成するための方法である。上記表面は水酸官能基で修飾されており、当該方法は、
【００１７】
ａ）保護基Ｐで保護された少なくとも一つの水酸官能基を有する第１の糖鎖モノマー（第１のサッカリド部分ＳＭ１）を溶媒中に含む溶液と、表面の少なくとも一つの区域Ａ１と、を接触させることにより、第１のサッカリド部分ＳＭ１を表面水酸官能基に結合させることと、
【００１８】
ｂ）固体担体の表面を以下の化学式（Ｉ）で示される少なくとも一つの化合物と接触させることにより、未反応の表面水酸官能基を不活性化することと、を含む。
【００１９】
【化１】
2010019837.tif 000003
【００２０】
ここで：
‐Ｙ１及びＹ２は、同じでも異なってもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシラジカル、直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキルラジカル、チオ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカル、ニトロ基、アジド基、トリフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカル、シアノ基、又はアリール環を表し；
【００２１】
‐ｎは、１以上４以下の範囲の整数であり；
【００２２】
‐Ｘは、ハロゲン原子、トリクロロアセトイミド基、Ｒ１が直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキルラジカルを表すキサンテート基−ＳＣ＝ＳＯＲ１、チオ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基、チオアリール基、リン酸基、亜リン酸基、セレノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基、セレノアリール基、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシラジカル、並びにＲ２が直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキルラジカルもしくはアリール環を表すスルホキシド基‐Ｓ（Ｏ）‐Ｒ２からなる群から選択される。
【００２３】
但し、Ｙ１及びＹ２の一方が水素を表し、Ｙ１及びＹ２の他方がメトキシラジカルであるとき、メトキシラジカルは−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ鎖をもつ炭素原子に対してパラ位にはない。
【００２４】
さらに、当該方法は、ｃ）所定のサッカリド配列の複数のサッカリド型分子が得られるまで結合ステップａ）を繰り返すことにおいて、各々の結合ステップａ）は、表面の少なくとも一つの選択区域Ａ２、Ａ３、Ａ４・・・、Ａｍ上で行われ、上記区域Ａ２、Ａ３、Ａ４・・・、Ａｍは先行する結合ステップの区域と同一又は少なくとも部分的に異なり、保護基Ｐにより保護された少なくとも一つの水酸基をもつ糖鎖モノマー（サッカリド部分）ＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３、ＳＭ４、・・・、ＳＭｍを用い、上記サッカリド部分は先行する結合ステップの間に結合されたサッカリド部分と同一であるか又は異なり、各々の結合ステップａ）の後に、先行する結合ステップの間に結合されたサッカリド部分の少なくとも一つの水酸基から保護基Ｐを除去するサブステップが続くステップと、
【００２５】
ｄ）保護基Ｐでまだ保護されているサッカリド型分子の水酸基を脱保護するステップと、を含む。
【００２６】
固体担体の表面の水酸官能基を不活性化するために用いる化学式（Ｉ）の化合物は、種々のサッカリド部分の結合ステップの間に用いられる条件と両立するものである。したがって、それらは、サッカリド部分の水酸官能基の保護基Ｐを除去するために用いる条件に反応しないため、糖合成の間に表面から除去されない。そのため、化学式（Ｉ）の化合物で不活性化された水酸官能基は、糖合成の間ずっと保護されたままであるため、反応性が非常に低い表面をもつ担体を取扱うことも可能になり、信号／ノイズ比が向上する。
【００２７】
よって、このプロセスにより、信号／ノイズ比が向上した糖鎖チップを再現性のある方法かつ許容できるコストで容易に得ることが可能となり、サッカリド又はタンパク質分子の高感度スクリーニング、及び／又は目的とするタンパク質との相互作用の検出が可能となる。
【００２８】
本発明の形態において使用されうる固体担体の性質は、重要ではない。しかし、個体担体の材料には、ガラス、シリカ、又は水酸官能基により修飾できることが当業者に知られた任意の材料を用いることが好ましい。固体担体は、少なくとも一つの平坦もしくは非平坦、並びに平滑もしくは構造をもつ表面を有し、例えば、スライド、平坦プレート、ウェル付きプレート、キャピラリー、又は多孔質もしくは無孔性ビーズの形状で提供することができる。
【００２９】
本発明の形態において、すでに水酸官能基をもつ表面を有する担体を用いてもよいし、水酸官能基を天然には持たず、したがって表面を水酸官能基で水酸化する予備ステップが必要な担体を用いてもよい。
【００３０】
この場合、本発明の形態に係る方法は、少なくとも選択領域上に水酸官能基により修飾された表面を得るために、固体担体の表面の少なくとも選択領域と、少なくとも一つの末端水酸官能基を持つスペーサを有機溶媒中に含む溶液と、を反応させることにより行われうる、表面の水酸化の予備ステップを備える。
【００３１】
固体担体の表面を修飾するために用いる、少なくとも一つの末端水酸官能基をもつスペーサは、好ましくはその一端に少なくとも一つの水酸官能基をもつシラン処理剤から選ぶことが有利である。かかるシラン処理剤は、より詳しくは次の化学式（ＩＩ‐ａ）又は化学式（ＩＩ‐ｂ）で示される化合物である：
【００３２】
Ｍ‐（ＣＨ２）ｘ‐Ｏ‐Ｒ６  （ＩＩ‐ａ）
Ｍ‐（ＣＨ２）ｘ‐Ｒ７  （ＩＩ‐ｂ）
【００３３】
ここで：
‐Ｍは、シラン化された（ｓｉｌａｎｉｚｅｄ)基−Ｓｉ（Ｒ３）３、−ＳｉＲ３（Ｒ４）２又はＳｉＲ３Ｒ４Ｒ５を表す。なおＲ３、Ｒ４、及びＲ５は各々独立に、水素もしくはフッ素及び塩素のようなハロゲン原子、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシラジカル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカル又はクロロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカルを表す；
【００３４】
‐ｘは、１から２０までを含む範囲の整数である；
【００３５】
‐Ｒ６は、水酸基の保護基を表す；
【００３６】
‐Ｒ７は、エポキシ基のような、少なくとも一つの水酸基を含む群の前駆体を表す。
【００３７】
Ｒ６の水酸保護基には、例えば、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）及びジ（ｐ‐メトキシフェニル）メチルエーテル（ＤＭＴ）のようなエーテル基；アセチル基、並びにさらに一般的にはＴ．Ｗ．グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、第２版，ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げるような、水酸基に対するすべての保護基が使用可能である。
【００３８】
かかるシラン処理剤のうち、特に５，６‐エポキシヘキシルトリエトキシシラン及びトリフルオロメトキシウンデカントリメトキシシランが好ましい。
【００３９】
シラン処理ステップの間に用いる有機溶媒は、例えばトリクロロエチレン及びトルエンから選ぶことができ、トリクロロエチレンが特に好ましい。
【００４０】
ステップａ）及びステップｃ）に用いることができるサッカリド部分の性質は、糖鎖チップに望まれるサッカリド型分子の最終的な性質に依存することになる。
【００４１】
サッカリド部分は、以下から選ぶことができる：
【００４２】
ｉ）単糖類、特にグルコサミン、アジドグルコサミン、Ｄ‐リボース、Ｄ‐キシロース、Ｄ‐アラビノース、Ｄ‐グルコース、Ｄ‐ガラクトース、Ｄ‐マンノース、２‐デオキシリボース、Ｌ‐フコース、Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミン、Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐ガラクトサミン、Ｎ‐アセチルノイラミン酸、Ｄ‐グルクロン酸、Ｌ‐イズロン酸、Ｄ‐ソルビトール、Ｄ‐マンニトール、グルコシド等；
【００４３】
ｉｉ）スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース及びセロビオース、グルコピラノシドなどのような、グルコシド結合により結合した二つの単糖類の組み合わせから形成される二糖類；
【００４４】
ｉｉｉ）３から９までのサッカリド単位をもち、特にヘパランスルファートのフラグメント、ヘパリン、コンドロイチン、及びデルマタンスルファートのサッカリドフラグメント、ルイス抗原等から由来のオリゴ糖類。
【００４５】
上述のように、サッカリド部分の少なくとも一つの水酸基は、保護基Ｐで保護される。これらの保護基は、当業者によく知られており、Ｔ．Ｗ．グリーンらによる著作「有機化学における保護基」（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），第２版，ワイリー・インターサイエンス出版，１９９１に十分に記載されている。
【００４６】
加えて、サッカリド部分の一つ又はそれ以上のアミン官能基及び／又はカルボキシル基も、一つ又はそれ以上の保護基により保護してもよい。これらの保護基も、当業者によく知られており、先に引用したＴ．Ｗ．グリーンらの著作に十分に記載されている。
【００４７】
本発明の有利な形態によれば、これらの保護基は、次の群から選ばれる：アセチル；ｐ‐メトキシベンジル；アリル、特に１から４０までの炭素原子をもつアルキル鎖から選ばれるＲラジカルにより置換されたアリル基；２，２，２‐トリクロロエチルオキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）；ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）；トリクロロアセトアミダート（ＴＣＡ）；ｔｅｒｔ‐ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）及びフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）。それらは、化学式（ＩＩ−ａ）及び化学式（ＩＩ−ｂ）の化合物におけるＲ６の例として挙げた保護基から選ぶこともできる。
【００４８】
ステップａ）及びｃ）の間に用いる溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、ジエチルエーテル、及びトルエンから選ぶことができる。
【００４９】
本発明の形態において、化学式（Ｉ）の化合物におけるＹ１、Ｙ２及びＸに対して指定されるハロゲン原子は、塩素、ヨウ素、臭素及びフッ素原子から選ぶことができ、塩素及びフッ素原子が好ましい。
【００５０】
化学式（Ｉ）の化合物におけるＹ１及びＹ２に対して挙げられるＣ１〜Ｃ４アルコキシラジカルのうち、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、ｎ‐ブチルオキシ及びｔ‐ブチルオキシ基を挙げることができ、メチルオキシ基が好ましい。
【００５１】
化学式（Ｉ）の化合物におけるＸに対して挙げられるＣ１〜Ｃ５アルコキシラジカルのうち、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、ｎ‐ブチルオキシ及びｔ‐ブチルオキシ、並びにｎ‐ペンチルオキシ基を挙げることができ、メチルオキシ基が好ましい。
【００５２】
化学式（Ｉ）の化合物におけるＹ１、Ｙ２及びＸに対して指定される直鎖及び分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキルラジカルのうち、メチル、エチル、プロピル、ｎ‐ブチル及びｔ‐ブチルラジカルを挙げることができる。
【００５３】
化学式（Ｉ）の化合物におけるＹ１、Ｙ２及びＸに対して指定されるチオ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカルのうち、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ｎ‐ブチルチオ及びｔ‐ブチルチオラジカルを挙げることができ、メチルチオ及びエチルチオラジカルが好ましい。
【００５４】
化学式（Ｉ）の化合物におけるＹ１及びＹ２に対して挙げられるトリフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカルのうち、トリフルオロメチルラジカルが特に好ましい。
【００５５】
化学式（Ｉ）の化合物におけるＹ１、Ｙ２及びＸに対して挙げられるアリル、チオアリル、及びセレノアリル基のうち、フェニル、チオフェニル及びセレノフェニル基が特に好ましい。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態の化学式（Ｉ）において、
【００５７】
ｉ）ｎ＝１、Ｙ１及びＹ２の一方が水素原子であり、Ｙ１及びＹ２の他方が水素又はハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシラジカル、チオ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルラジカル又はシアノ又はアジド基であり、Ｘがハロゲン原子又はトリクロロアセトイミド又はチオ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基であるか、
【００５８】
ｉｉ）ｎ＝１、Ｙ１及びＹ２が同じで、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシラジカル又はＣ１〜Ｃ４アルキルラジカルを表し、Ｘがハロゲン原子又はトリクロロアセトイミド基又はチオ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表しているか、
【００５９】
ｉｉｉ）ｎ＝２、Ｙ１及びＹ２の一方が水素原子であり、Ｙ１及びＹ２の他方が水素又はハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシラジカル又はシアノ又はアジド基であり、Ｘがトリクロロアセトイミド基であるか、
【００６０】
ｉｖ）ｎ＝２、Ｙ１及びＹ２が同じで、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシラジカルを表し、Ｘがトリクロロアセトイミド基を表している。
【００６１】
化学式（Ｉ）の具体的な化合物のうち、以下の化合物が特に好ましい。
【００６２】
‐２，２，２‐トリクロロアセトイミド酸ベンジルエステル（Ｘ＝トリクロロアセトイミド酸、Ｙ１＝Ｙ２＝Ｈ、ｎ＝１）；
【００６３】
‐ベンジルクロリド（Ｘ＝Ｃｌ、Ｙ１＝Ｙ２＝Ｈ、ｎ＝１）；
【００６４】
‐ベンジルブロミド（Ｘ＝Ｂｒ、Ｙ１＝Ｙ２＝Ｈ、ｎ＝１）；
【００６５】
‐２‐（トリフルオロメチル）ベンジルブロミド（Ｘ＝Ｂｒ、Ｙ１＝Ｈ、Ｙ２＝ＣＦ３、ｎ＝１）；
【００６６】
‐３，５‐ジ‐（ｔｅｒｔ‐ブチル）ベンジルブロミド（Ｘ＝Ｂｒ、Ｙ１＝Ｙ２＝ｔｅｒｔ‐ブチル、ｎ＝１）；及び
【００６７】
‐４‐（メチルチオ）ベンジルクロリド（Ｘ＝Ｃｌ、Ｙ１＝Ｈ、Ｙ２＝ＣＨ３Ｓ、ｎ＝１）。
【００６８】
化学式（Ｉ）の化合物は、市販されているか、又は、特に「有機合成における保護基」（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），第３版，セオドラ（Ｔｈｅｏｄｏｒａ）  Ｗ．グリーン（Ｇｒｅｅｎ），ピーター（Ｐｅｔｅｒ）  ＧＭ  ウッツ（Ｗｕｔｓ）  著作権１９９９，ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）に記載される方法に従って容易に調製することができる。
【００６９】
本発明の具体的かつ好ましい実施形態によれば、固体担体のすべての表面は、表面水酸官能基により修飾されている。この場合、ステップａ）の前に、以下のサブステップを備えるマスキング／脱マスキングステップが先行することが好ましい。
【００７０】
１）溶媒が蒸発した後に選択領域上に固体ポリマーのキャップが形成されるように、有機溶媒中に溶解した上記ポリマーの液滴をマイクロ堆積することにより、水酸化された表面の少なくとも一つの選択領域に少なくとも一つの保護ポリマーを堆積すること、
【００７１】
２）固体担体の表面の固体ポリマーのキャップで被覆されていない領域の水酸基を、上述のように規定した化学式（Ｉ）で示される少なくとも一つの化合物で保護すること、及び
【００７２】
３）選択領域上における保護ポリマーからなる固体ポリマーのキャップを、有機溶媒中において上記固体キャップを溶解することにより除去すること。
【００７３】
本発明の特定の実施形態は、複数のマイクロウェルを有するプレート形状の固体担体によく適しており、これらのマイクロウェルが保護ポリマーで被覆された選択領域に対応する。
【００７４】
本発明のこのような特定の実施形態は、ステップａ）の間に選択領域をさらに機械的にアドレッシングスする必要はなく、次のステップｃ）の間に固体担体のすべての表面を上記サッカリド部分の溶液に単に浸漬することにより、サッカリド部分の結合を選択領域にだけ生起させることができて有利である。
【００７５】
本発明のまた別の特定の実施形態によれば、固体担体の表面の選択領域は、ステップａ）の前、及び／又は各ステップｃ）の前及び合間に行うマスキング／脱マスキングステップに従って、少なくとも一つの保護ポリマーによりマスクすることもできる。かかるマスキング／脱マスキングステップは、固体担体の表面の選択領域のマスキング／脱マスキングステップによりそれぞれ分離された担体全体を異なるサッカリド部分の溶液に順次浸漬することにより、異なるサッカリド配列を同じ表面上に合成することを可能にする。
【００７６】
この実施形態によれば、マスキング／脱マスキングステップは、少なくとも二つのサブステップに分割され、マスキングサブステップは、ステップａ）の前、及び／又は各ステップｃ）の前及び合間に行い、次に脱マスキングステップは、ステップａ）の後、及び／又は各ステップｃ）の後に行う。このマスキング／脱マスキングステップは、次のサブステップを備える。
【００７７】
１）溶媒が蒸発した後に選択領域上に固体ポリマーのキャップが形成されるように、上記ポリマーの液滴のマイクロ堆積により、固体担体の表面の少なくとも一つの選択領域上に少なくとも一つの保護ポリマーを堆積するマスキングサブステップ、
【００７８】
２）上述のステップａ）に従って第１のサッカリド部分を結合すること、及び／又は上述のステップｃ）に従ってさらなるサッカリド部分を結合すること、及び
【００７９】
３）有機溶媒中で上記固体キャップを溶解することにより、選択領域上の保護ポリマーの固体キャップを除去する脱マスキングサブステップ。
【００８０】
保護ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリビニルカルバゾール、ポリイミド、及びその誘導体のポリマーにより形成される群から選択することができる。保護ポリマーは、ステップａ）の前の担体の表面の水酸化の間に反応に用いる溶媒にも、ステップａ）及びｃ）のサッカリド部分の結合の間に用いる溶媒にも溶解しない。
【００８１】
これらのポリマーのうち、ポリスチレン、ポリビニルカルバゾール、ポリイミド、及びポリエチレンオキサイドと比較してジクロロメタンに溶解しないポリビニルアルコール及びポリヒドロキシスチレン類が、保護ポリマーとして特に好ましい。なお、ポリヒドロキシスチレン類とは、ポリヒドリキシスチレン、及びポリヒドロキシスチレンを骨格として、官能基を付加したものをいう。
【００８２】
マスキングサブステップの終りに、溶媒の蒸発を加速する一方で、保護ポリマーキャップの付着性を向上させるために、５０から８０℃の温度で担体のアニールを一般的に行う。
【００８３】
保護ポリマーのキャップを溶解するために、脱マスキングサブステップの間に用いる有機溶媒は、担体表面上にすでにグラフトされたサッカリド部分に不活性でなければならない。この溶媒は、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、アセトン及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる群から選ばれる。
【００８４】
本発明のまた別の特定の実施形態によれば、固体担体の表面にすでにグラフトされたサッカリド部分上に存在し、その後の結合ステップの間にさらなるサッカリド部分と反応しなかった未反応の水酸基を不活性化するステップは、サッカリド部分の結合ステップｃ）の各々の繰り返しの間に、化学式（Ｉ）で示される少なくとも一つの化合物を用いて行う。これらの繰り返し不活性化ステップは、糖鎖チップの製造の間に切詰められたサッカリド配列が成長するのを防止するのに役立つ。
【００８５】
本発明の形態に係るプロセスは、好ましくは、合成の終りにサッカリド型分子を活性化するさらなるステップを備え、この活性化ステップは、グリコサミノグリカンに対して、さらに担体上に存在するサッカリド型分子とタンパク質間の認識を可能にするのに特に有用である。
【００８６】
この活性化ステップは、サッカリド部分の水酸／アミン／カルボキシル官能基上に存在する異なる保護基を除去することからなる。保護基の除去は、当業者に知られるように、言うまでもなく、それらの性質に適応させられる。したがって、活性化は、保護基の特質に依存して脱アセチル化、脱ベンジル化などにより行うことができる。一例として、保護基がｐ‐メトキシベンジル基のとき、活性化ステップは、好ましくは担体を室温で約１５分の間テトラヒドロフランに浸漬することにより行うことができる。
【００８７】
本発明のまた別の主題は、一つ又はそれ以上のサッカリド型分子により機能化された少なくとも一つの表面を備える固体担体であり、上記担体は本発明の製造プロセスに従って得られることを特徴とする。
【００８８】
かかる担体は、例えば、サッカリド分子、及び、特に、例えば国際公開第０３／００８９２７号に記載される方法を用いて、有益な特定タンパク質を認識するオリゴ糖配列を、スクリーニングにより、特定するために用いることができる糖鎖チップの構成要素を成す。
【００８９】
本発明の形態に係る固体担体は、例えば有益なサッカリドを認識するタンパク質リガンドを、スクリーニングにより特定するためにも用いることができる。
【００９０】
したがって、本発明の付加的な主題は、サッカリド部もしくはタンパク質分子をスクリーニングにより特定するために、又はサッカリド／タンパク質相互作用を研究するために、上述のように規定した少なくとも一つの固体担体を利用することである。
【００９１】
その結果、本発明の最終的な主題は、サッカリド分子と、特にオリゴ糖配列もしくはそれぞれタンパク質リガンドをスクリーニングするためのプロセスであって、少なくとも一つのサッカリド型分子により官能化された少なくとも一つの表面を備えており、上述のように規定された本発明の形態に係る製造プロセスに従って作製された固体担体を、一つもしくはそれ以上の潜在的なサッカリド分子、特にオリゴ糖分子、又はそれぞれ一つもしくはそれ以上の潜在的なタンパク質を含む溶液と接触させる、少なくとも一つの段階を備えることを特徴とする。
【００９２】
これらの具体的な応用において、本発明の形態に係る官能化された個体担体は、担体の表面への固定化が望まれる目的分子以外の分子の非特異的吸着を回避又は制限することにより、スクリーニングプロセスを最適化すること、及びそれにより、治療又はバイオテクノロジ目的で、分子をより効果的、かつより迅速に入手することを可能にする。
【発明の効果】
【００９３】
本発明によれば、目的タンパク質を再現性及び感度のいい方法で固定化すること、及び信号／ノイズ比を制限することにより信号検出することを可能にするサッカリド型分子で官能化された個体担体を満足な方法で得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本発明の実施の形態に係る、化学式（Ｉ）で示される化合物を用いた不活性化ステップを含む製造プロセスにより作製したマンノースチップＭＣ１上でレクチンによるマンノース認識後に観測した蛍光と、化学式（Ｉ）で示される化合物とは異なるベンジル化合物を用いた不活性化ステップを含む製造プロセスにより作製したマンノースチップＭＣ２上で同じ条件により観測した蛍光と、を比較して示す写真である。
【図２】保護ポリマーによるマスキングステップを含むグリコサミノグリカンチップの作製プロセスの反応スキームである。
【図３】本発明の実施の形態に係る、化学式（Ｉ）で示される化合物を用いた不活性化ステップを含む製造プロセスにより作製したグリコサミノグリカンチップ（ＧＡＧ‐Ｃ１及びＧＡＧ‐Ｃ’１）上で、ＨＧＦタンパク質によるグリコサミノグリカン認識後に観測した蛍光と、化学式（Ｉ）で示される化合物とは異なるベンジル化合物を用いた不活性化ステップを含む製造プロセスにより作製したグリコサミノグリカンチップ（ＧＡＧ‐Ｃ２及びＧＡＧ‐Ｃ’２）上で同じ条件により観測した蛍光と、を比較して示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
本発明の実施の形態は、上述の提供物に加えて、いずれも本発明の実施の形態に係るプロセスに従い、以下の添付図によるマンノースチップの作製例、グリコサミノグリカンチップの作製例に言及する以下の記載から明らかになる他の提供物も備える。しかし、当然のことながらこれらの例は、本発明の主題の説明のためだけに示したものであり、いかなる状況においてもこれに限定を加えるものではない。
【実施例】
【００９６】
（実施例１）
本発明の実施例１に係る製造プロセスによる糖鎖チップの作製‐本発明の比較例１に係るプロセスにより作製した糖鎖チップとの比較
以下、説明するように、本発明の実施例１に係る作製方法により、サッカリド部分としてのマンノース誘導体、及び化学式（Ｉ）の不活性化化合物としてベンジル‐２，２，２‐トリクロロアセトイミド酸（Ｂｎ‐ＯＴＣＡ）を用いて、実施例１に係るマンノースチップＭＣ１を作製した。また、比較を目的として、サッカリド部分として同じマンノース誘導体を用いるが、Ｂｎ‐ＯＴＣＡを化学式（Ｉ）の化合物とは異なる不活性化化合物、すなわち、２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐ベンジル‐α‐Ｄ‐グルコピラノシルトリクロロアセトイミド酸（Ｂｎ‐グルコース‐ＯＴＣＡ）に替えた、本発明の比較例１に係るマンノースチップＭＣ２も作製した。
【００９７】
１）材料、方法及び試薬
ａ）糖溶液：
次の化学式をもつ１０ｍｇのマンノース誘導体を１ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液を調製した。
【００９８】
【化２】
2010019837.tif 000004
【００９９】
このマンノース誘導体は、次の反応スキームＡに従ってＤ‐マンノースの原料から調製することができる。
【０１００】
【化３】
2010019837.tif 000005
【０１０１】
Ａｃはアセチルを表し、Ｄ‐マンノースは、初めにピリジン（Ｐｙ）の存在下で無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）によりアセチル化されてアセチル化Ｄ‐マンノース（収率９０％）になる。第２ステップでジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中においてヒドラジン（Ｈ２ＮＮＨ２）及び酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）の存在下でアノマー位が脱アセチル化されて１‐ＯＨ‐アセチル化Ｄ‐マンノース（収率７７％）になる。次に反応のための触媒としてジアザビシクロ‐ウンデセン（ＤＢＵ）を用い、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中においてトリクロロアセトニトリル（ＣＣｌ３ＣＮ）の存在下でマンノース誘導体に変換される（収率６５％）。
【０１０２】
次に、１０ｍｇのマンノース誘導体を１ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解させることにより糖溶液を調製した。
【０１０３】
ｂ）不活性化溶液
次の不活性化溶液を用いた：
‐２ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に１００μＬのＢｎ‐ＯＴＣＡを溶かした実施例に係る不活性化溶液ＰＳ１。
‐２ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に１０ｍｇのＢｎ‐グルコース‐ＯＴＣＡを溶かした比較例に係る不活性化溶液ＰＳ２。
【０１０４】
ｃ）マスキングポリマー溶液
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した５重量％のポリヒドロキシスチレン（ＰＨＳ）を含むマスキングポリマー溶液も調製した。
【０１０５】
ｄ）マンノースチップの作製
実施例１に係るマンノースチップＭＣ１と比較例１に係るマンノースチップＭＣ２は、次のプロセスに従って作製した：
【０１０６】
ｉ）チップ表面の水酸化
厚さ５００ｎｍ、寸法１×１ｃｍで、２４個のマイクロウェル（直径６５０μｍ、深さ１５μｍ及びマイクロウェル間ステップ１５００）をもつ構造化された熱酸化シリコン（Ｓｉ／ＳｉＯｔ）からなる二つの基板を、まず水酸化ナトリウム溶液（ＮａＯＨ  １２ｇ／水５０ｍＬ／エタノール５０ｍＬ）に浸漬することにより水和し、２時間攪拌し、水に続いてエタノールですすぎ、８０℃で１５分間乾燥させた。
【０１０７】
基板は、次にシラン溶液（トルエン３０ｍＬ及びトリエチルアミン４３０μＬ中に５，６‐エポキシヘキシルトリエトキシシラン１３７μＬ）に８０℃で一晩の間浸すことによりシラン処理した。基板は、次に、１１０℃で３時間ベーキングする前にエタノール、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、さらに超音波下において５分間クロロホルムですすいだ。
【０１０８】
シラン処理ステップの終りに、シランのエポキシド部分を対応するジオールに変換するために、５％硫酸を含む水溶液に浸し、室温で２時間攪拌し、水、エタノール、さらに超音波下において５分間水ですすいだ。
【０１０９】
ｉｉ）マスキングステップ
各基板のウェルを、ウェル毎に３０滴のマスキングポリマー溶液を注入することによりマスキングした。マスキングポリマー溶液のポリヒドロキシスチレン（ＰＨＳ）を固化するために、８０℃で２分間基板をベーキングした。次に、各ウェルに再度２０滴、その後８０℃で２分間ベーキングする前に１０滴のマスキングポリマー溶液を埋め合わせた。このようにして、各ウェルを被覆した固体ポリヒドロキシスチレン（ＰＨＳ）キャップを備える基板が得られた。
【０１１０】
ｉｉｉ）チップ表面の水酸基の不活性化ステップ
マスキングした二つの基板の一方は２ｍＬの実施例に係る不活性化溶液ＰＳ１に浸漬し、他方は２ｍＬの比較例に係る不活性化溶液ＰＳ２に浸漬した。次にジクロロメタン（ＤＣＭ）１００μＬに５μＬのトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ）を加えた溶液４０μＬを各々の不活性化溶液に加えた。基板を不活性化溶液に浸漬したまま室温で攪拌しながら１時間放置した。次に、基板を乾燥する前にジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルム、エタノール及び最後に超音波下において５分間クロロホルムですすいだ。
【０１１１】
ｉｖ）ポリヒドロキシスチレン（ＰＨＳ）キャップの除去
基板をテトラヒドロフランに浸漬することにより固化したポリヒドロキシスチレン（ＰＨＳ）キャップを除去した。３分間の超音波ステップの後、基板をエタノールですすぎ、乾燥させた。
【０１１２】
ｖ）糖結合ステップ
基板を糖溶液に浸漬し、１００μＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に２μＬのトリメチルシリルトリフラート（ＴＭＳ‐ＯＴｆ）を加えた溶液１０μＬを各々の浸漬した基板に加えた。反応媒質を室温で３０分間攪拌した。次に、基板をジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルム、エタノール、及び最後に超音波下において５分間クロロホルムですすいだ。メタノール中に１ｍｏｌ／Ｌでナトリウムメタノラートを含む溶液４０μＬに基板を浸漬し、室温で３０分間攪拌した。最後に、基板をメタノールで及びエタノールで超音波下において５分間すすいだ。
【０１１３】
ｖｉ）マンノースによるレクチン認識
基板を５ｍＬの緩衝液Ａ（緩衝液Ａ＝リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．０１ｍｏｌ／Ｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含みｐＨ７．４）に３０ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を溶かした溶液に浸漬し、室温で１時間攪拌した。
【０１１４】
緩衝液Ａによるすすぎステップの後、基板を２ｍＬのレクチン溶液（緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ＝ＰＢＳ  ０．０１ｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋  ０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ及びＭｎ２＋  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌを含む）中の、参照Ｃ２２７２の下、凍結乾燥粉末としてシグマアルドリッチ社が販売するカナバリア・エンシフォルミス（Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）（タチナタマメ）からのコンカナバリンＡとビオチンの複合体、タイプＩＶ：５μＬ）に浸漬した。基板を３７℃で１時間放置した。
【０１１５】
緩衝液Ａによる新たなすすぎステップの後、基板をストレプトアビジン‐Ｃｙ３の溶液（緩衝液Ｒ（緩衝液Ｒ＝ＰＢＳ  ０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｍｏｌ／Ｌ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む）５μＬ中にＣｙ３‐ストレプトアビジン２μｇ）に浸漬した。基板を室温で暗所に２０分間放置し、次に緩衝液Ａですすぎ、乾燥させた。
【０１１６】
ｖｉｉ）蛍光信号の測定
レーザを用いた高スループットのバイオチップイメージャー及び分析器である、ＧｅｎｅＴＡＣ（登録商標）ＬＳ  ＩＶ  バイオチップ・アナライザ（Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（登録商標））を用いて基板をスキャンした。
ＦＩＴＣレクチャー（λｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ＝４９８ｎｍ；λｅｍｉｓｓｉｏｎ＝５１８ｎｍ）
レーザパワーＰＷ＝４２％
【０１１７】
２）結果
このようにして得られた結果に対応する写真を図１に示す。
【０１１８】
これらの結果は、基板の水酸基の不活性化を化学式（Ｉ）の化合物で行う本発明の実施例１に係るプロセスは、化学式（Ｉ）の化合物とは異なる化合物を含む比較例に係る不活性化溶液を用いて作製したマンノースチップ（ＭＣ‐２）をスキャンした時に得られる像と比較して、改良された信号／ノイズ比を示すマンノースチップ（ＭＣ‐１）をもたらすことを示した。具体的には、図１の右側に示す実施例１に係るマンノースチップ（ＭＣ−１）のバックグラウンドは、図１の左側に示す比較例１に係るマンノースチップ（ＭＣ−２）のバックグラウンドより顕著に暗かった。
【０１１９】
（実施例２、３）
本発明の実施例２に係る製造プロセスによるグリコサミノグリカンチップの作製‐本発明の比較例２に係るプロセスにより作製したグリコサミノグリカンチップとの比較
上述した実施例に係る不活性化溶液ＰＳ１及び以下に規定する特定構造の糖ユニットを用いる本発明の実施例２に係る作製プロセスにより、グリコサミノグリカンチップ（ＧＡＧ‐Ｃ１）を作製した。
【０１２０】
比較を目的として、上述した比較例に係る不活性化溶液ＰＳ２を用いる本発明の比較例２に係るグリコサミノグリカンチップ（ＧＡＧ‐Ｃ２）も作製した。
【０１２１】
１）材料及び方法
ａ）糖溶液：
対応するグリコサミノグリカンを固体担体上に合成するために、糖ユニットとしてトリクロロアセトイミド酸メチル  ２―Ｏ―アセチル‐３‐Ｏ‐ベンジル‐４‐Ｏ‐（４‐メトキシベンジル）‐α‐Ｌ‐イドピラノシルウロナート）‐（１→４）‐Ｏ‐６‐Ｏ‐アセチル‐２‐アジド‐３‐Ｏ‐ベンジル‐２‐デオキシ‐Ｄ‐グルコピラノシドを用いた。この糖ユニット（ＧＡＧ）は、以下の化学構造を有する。
【０１２２】
【化４】
2010019837.tif 000006
【０１２３】
この糖ユニットの合成は、すでにボナフェ（Ｂｏｎｎａｆｆｅ）ら，ユーロピアン  ジャーナル  オブ  オーガニック  ケミストリ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２００３，３６０３‐３６２０及びＡ．ルビノー（Ｌｕｂｉｎｅａｕ）ら，ケミカル  ユーロピアン  ジャーナル（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ），２００４，１０，４２６５‐４２８２による論文に報告されている。
【０１２４】
この糖溶液を、８ｍｇの糖ユニット（ＧＡＧ）を５００ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解させて調製した。
【０１２５】
ｂ）不活性化溶液
実施例に係る不活性化溶液ＰＳ１及び比較例に係る不活性化溶液ＰＳ２を用いた。
【０１２６】
ｃ）マスキングポリマー溶液
上述の実施例１のように、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた重量５％のポリヒドロキシスチレン（ＰＨＳ）を含むマスキングポリマー溶液を用いた。
【０１２７】
ｄ）グリコサミノグリカンチップの作製
実施例２に係るグリコサミノグリカンチップＧＡＧ‐Ｃ１及び比較例２に係るグリコサミノグリカンチップＧＡＧ‐Ｃ２は、次のプロセスにより作製した：グリコサミノグリカンチップを作製するための反応スキーム（スキームＢ）を添付図２に示す。
【０１２８】
この実施例では、実施例１と同じ構造化された酸化シリコン基板を用いた。
【０１２９】
ｉ）チップの表面水酸化
チップのすべての表面は、上述の実施例１に開示したプロセスに従って初めに水酸化した。
【０１３０】
ｉｉ）マスキングステップ
各チップのウェルを、上述の実施例１に記載したようにポリヒドロキシスチレン（ＰＨＳ）溶液でマスキングした。
【０１３１】
このようにして、各ウェルを覆う固体ポリヒドロキシスチレン（ＰＨＳ）のキャップを備えるチップが得られた。
【０１３２】
ｉｉｉ）チップ表面の水酸基の不活性化ステップ
一方のチップ上で実施例に係る不活性化溶液ＰＳ１を用い、他方のチップ上で比較例に係る不活性化溶液ＰＳ２を用いる不活性化ステップを上述の実施例１に記載したように行った。
【０１３３】
ｉｖ）ポリヒドロキシスチレン（ＰＨＳ）キャップの除去
固化したポリヒドロキシスチレン（ＰＨＳ）のキャップを上述の実施例１に記載したプロセスに従って各ウェルから除去した。
【０１３４】
ｖ）グリコサミノグリカンの合成
ＧＡＧオリゴマーのチップ上への成長は、次のステップサイクルに従って行った。
【０１３５】
‐ポリヒドロキシスチレン（ＰＨＳ）マスキングステップ：チップの所定の選択領域のウェルを上述の実施例１に記載したプロセスに従って被覆した。
【０１３６】
‐ＧＡＧ結合ステップ：
５００μＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に８ｍｇのＧＡＧを溶かした溶液を反応チャンバに注入した。合成室は−１０℃に維持した。次にトリメチルシリルトリフラート（ＴＭＳ−ＯＴｆ）溶液を注入し（５００μＬ中に１μＬ）、−１０℃で１時間放置した。基板を次にジクロロメタン（ＤＣＭ）ですすいだ。
【０１３７】
不活性化ステップ：
最初のＧＡＧをチップ上に固定したのち、一方のチップ上で実施例に係る不活性化溶液ＰＳ１、他方のチップ上で比較例に係る不活性化溶液ＰＳ２を用いる不活性化ステップを上述の実施例１に記載したように行い、チップ表面の未反応の水酸基を不活性化した。
【０１３８】
四量体を得る場合には、その後、ＧＡＧ結合ステップを１回行った。また、六量体を得る場合には、最初のＧＡＧ結合ステップ及び不活性化ステップの後、ＧＡＧ結合ステップを２回繰り返した。
【０１３９】
ｖｉ）グリコサミノグリカンの活性化
メチルエーテル置換／脱アセチル化
次にチップを２ｍＬのベンジルアルコール（ＢｎＯＨ）中に４０μＬのナトリウムベンジラート（ＢｎＯＮａ）を含む溶液に浸漬した。反応媒質を室温で一晩の間攪拌した。次にチップをメタノール及びエタノールで５分間超音波下においてすすいだ。
【０１４０】
アジド還元
チップを次に１．２ｍＬプロパンジチオール／１．５ｍＬトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）／６ｍＬメタノールの溶液に浸漬した。反応媒質を室温で２日間攪拌した。チップを次にメタノール及びエタノールで５分間超音波下においてすすいだ。
【０１４１】
硫酸化
１０ｍＬのピリジンに２００ｍｇの三酸化硫黄を加えた溶液にチップを浸漬した。反応媒質を室温で１日間攪拌し、次に５５℃の温度で１日間放置した。チップを次にエタノール、水、最後に超音波下において５分間エタノールですすいだ。
【０１４２】
脱ベンジル化
チップをフラスコに入れ、１５ｍＬのプロパノール及び１５ｍＬの水の混合液中に１０ｍｇのＰｄ‐ポリビニルピロリドン（Ｐｄ‐ＰＶＰ）ナノ粒子を含む溶液に浸漬した。フラスコを閉じた後、大気圧の水素ガスを１５分間加えた。フラスコを閉じたまま４５℃の温度で１晩の間保持した。大気圧の水素ガスを再度１５分間加え、フラスコを再度閉じたまま４５℃の温度で一晩の間保持した。チップを次にエタノール、水、最後に超音波下において５分間エタノールですすいだ。
【０１４３】
ｖｉｉ）ＧＡＧによるＨＧＦタンパク質認識
実施例１で上述したような５ｍＬの緩衝液Ａに３０ｍｇのＢＳＡを加えたＢＳＡ溶液にチップを浸漬した。反応媒質を室温で１時間攪拌した。チップを緩衝液Ａですすいだ後、ＰＢＳ中の濃度が７０ｎｍｏｌ／ＬのＨＧＦ溶液（肝細胞増殖因子、ヒトＨ９６６１‐５μｇ）を数滴チップに適用した。チップをプラスチック小片で覆い、室温で２時間放置した。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳ中に０．１％のＢＳＡを含む緩衝液で５０倍に希釈した抗ＨＧＦ（単クローン性抗ＨＧＦ抗体、シグマ、Ｈ１８９６、１ｍＬの緩衝液Ｂ中に５ｍｇ）溶液にチップを浸漬し、その溶液中に３８℃の温度で１時間放置した。インキュベーションの終りに、チップを緩衝液Ａで洗浄し、次にフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）でラベル付けした抗‐抗ＨＧＦ溶液（抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣ，シグマ，Ｆ５６８７‐５ｍＬ（ＰＢＳ中に０．１％のＢＳＡを含む緩衝液により溶液をさらに１００倍希釈）に浸漬した。チップを再び３８℃で１時間インキュベートした。インキュベーション時間の終りに、チップを緩衝液Ａで洗浄し、ＰＢＳで湿らせ、上述の実施例１で用いたＧｅｎｅＴＡＣ（登録商標）ＬＳ  ＩＶ  バイオチップ・アナライザによりスキャンした。
【０１４４】
同じ条件であるが、ＰＢＳ中のＨＧＦの濃度が２００ｎｍｏｌ／ＬのＨＧＦ溶液を用いて同一の実験を行い、実施例３に係るグリコサミノグリカンチップＧＡＧ‐Ｃ’１及び比較例３に係るグリコサミノグリカンチップＧＡＧ−Ｃ’２を得た。
ＦＩＴＣレクチャー（λｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ＝４９８ｎｍ、λｅｍｉｓｓｉｏｎ＝５１８ｎｍ）
レーザパワーＰＷ＝４２％
【０１４５】
２）結果
結果を添付図３に報告する。
【０１４６】
結果は、本発明の実施例２に係る、すなわち、化学式（Ｉ）の不活性化化合物としてＢｎ‐ＯＴＣＡを用いるプロセスにより得られたグリコサミノグリカンチップ（ＧＡＧ‐Ｃ１及びＧＡＧ‐Ｃ’１）は、化学式（Ｉ）の化合物とは異なる化合物を含む不活性化溶液を用いて作製した比較例２に係るグリコサミノグリカンチップ（ＧＡＧ‐Ｃ２及びＧＡＧ‐Ｃ’２）をスキャンしたときに得られる像と比較したとき、信号／ノイズ比が改良されることを示した。具体的には、図３の右上に示す実施例２に係るグリコサミノグリカンチップ（ＧＡＧ‐Ｃ１）のバックグラウンドは、図３の左上に示す比較例２に係るグリコサミノグリカンチップ（ＧＡＧ‐Ｃ２）のバックグラウンドより顕著に暗かった。また、図３の右下に示す実施例３に係るグリコサミノグリカンチップ（ＧＡＧ‐Ｃ１’）のバックグラウンドは、図３の左下に示す比較例３に係るグリコサミノグリカンチップ（ＧＡＧ‐Ｃ２’）のバックグラウンドより顕著に暗かった。
【図１】
2010019837.tif 000008
【図２】
2010019837.tif 000009
【図３】
2010019837.tif 000010