(57)【要約】      （修正有）【課題】フコイダンを低分子化させるのみならず脱硫酸化させる手段・方法、およびかかる手段・方法により、脱硫酸化された低分子化フコイダンを提供する。【解決手段】フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌、例えばＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７４、Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  ＡＰ−６７５、ＡＰ−６７６等の、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＬｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ属の菌体またはその抽出物を、フコイダンに作用させる、脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌の菌体またはその抽出物をフコイダンに作用させることを特徴とする、脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法。
【請求項２】
フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ属の細菌の菌体またはその抽出物をフコイダンに作用させることを特徴とする、脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法。
【請求項３】
細菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７４として寄託されたＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株である請求項１記載の方法。
【請求項４】
細菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７５として寄託されたＬｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  Ｈ１８株である請求項２記載の方法。
【請求項５】
細菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７６として寄託されたＬｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株である請求項２記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法により得られる脱硫酸化された低分子化フコイダン。
【請求項７】
請求項５記載の方法により得られる、分子量１４万以下である脱硫酸化された低分子化フコイダン。
【請求項８】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７４として寄託された、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株。
【請求項９】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７５として寄託された、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  Ｈ１８株。
【請求項１０】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７６として寄託された、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規フコイダン資化性細菌、それにより得られる低分子化フコイダンに関する。本発明のフコイダン資化性細菌は、フコイダンの低分子化活性と脱硫酸化活性を併せ持つユニークなものである。
【背景技術】
【０００２】
天然物質であるフコイダンは、オキナワモズク、モズク、ワカメ、昆布などの褐藻海草類に含まれる「ぬめり」成分であり、癌細胞の死滅、免疫系の調節、組織再生の促進など、様々な生物活性を有することが明らかになっている。また、フコイダンは肌を引き締める作用を有していたり、保湿作用を有していたりすることから、化粧品にも利用されている。このように、フコイダンは、健康食品、機能性食品、サプリメント、化粧品および医薬品などの原料あるいは成分として需要が増大している。
【０００３】
フコイダンが有するこれらの多様な生理活性は、フコイダン分子の硫酸化度と相関性があるといわれているが、硫酸基が多いと生理活性が認められなくなる例もある。分子量で３２，０００の硫酸基含量が少ないフコイダンは正常リンパ球の増殖を促進するとともに、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−６等のサイトカインの産生を増強するのに対し、同じ分子量で硫酸基含量が多いフコイダンはこれらの生理活性が認められないとの報告がある（非特許文献１参照）。
【０００４】
このように、フコイダンの分子量と硫酸基の数はフコイダンの生理活性に大きく影響している。フコイダンの低分子化については、これまで加熱処理、酸加水分解、微生物または酵素による分解などが報告されている（特許文献１、非特許文献２〜７参照）。これらの報告において、フコイダンの低分子化に関与する酵素、遺伝子が単離されている例もある。しかし、いずれの場合も酵素的なフコイダンの脱硫酸化反応には言及していない。さらに、水熱反応を利用したフコイダンの低分子化例もあり、水熱反応による低分子化では硫酸基の脱離が認められない（特許文献２参照）。
【０００５】
かかる事情から、フコイダンの低分子化方法または手段であって、しかも硫酸基を脱離させる（脱硫酸化させる）ことのできる方法または手段が開発されれば、従来の加熱、水熱、酸処理、酵素処理等の方法では調製できない硫酸化度が低いフコイダンを取得でき、フコイダンの生理活性の解明や、本来の活性とは異なる活性を有する、あるいは本来の活性が増強された、低硫酸化度かつ低分子化フコイダンの製造が可能になる。
【特許文献１】米国特許第６４８９１５５号公報
【特許文献２】特願２００８−５０５３４明細書
【非特許文献１】日本栄養・食糧学会誌、５８，２７３−２８０（２００５）
【非特許文献２】Marine Biotechnology, 5, 70-78 (2003)
【非特許文献３】Marine Biotechnology, 5, 536-544 (2003)
【非特許文献４】Marine Biotechnology, 6, 335-346 (2004)
【非特許文献５】Marine Biotechnology, 8, 27-39 (2006)
【非特許文献６】Glycobiology, 16, 1021-1032 (2006)
【非特許文献７】J. Microbiol. Biotechnol., 18, 616-623 (2008)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、フコイダンを低分子化させるのみならず脱硫酸化させる手段・方法を開発すること、およびかかる手段・方法により低硫酸化度の低分子化フコイダンを得ることを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性微生物を海水から単離することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は：
（１）フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌の菌体またはその抽出物をフコイダンに作用させることを特徴とする、脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法；
（２）フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ属の細菌の菌体またはその抽出物をフコイダンに作用させることを特徴とする、脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法；
（３）細菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７４として寄託されたＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株である（１）記載の方法；
（４）細菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７５として寄託されたＬｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  Ｈ１８株である（２）記載の方法；
（５）細菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７６として寄託されたＬｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株である（２）記載の方法；
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の方法により得られる脱硫酸化された低分子化フコイダン；
（７）（５）記載の方法により得られる、分子量１４万以下である脱硫酸化された低分子化フコイダン；
（８）独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７４として寄託された、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株；
（９）独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７５として寄託された、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  Ｈ１８株；
（１０）独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７６として寄託された、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌による、脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法が提供される。本発明の製造方法を用いて、様々な分子量の硫酸化度の異なる低分子化フコイダンを調製することができ、それらの生理活性を検討することにより、フコイダンの構造と機能の相関性を明らかにすることができる。そして、本発明により得られた低分子化フコイダンは、本来の活性とは異なる活性を有する、あるいは本来の活性が増強された、脱硫酸化された低分子化フコイダンとして用い得る。さらに本発明によれば、本発明の脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法に適した細菌株も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、１の態様において、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌の菌体またはその抽出物をフコイダンに作用させることを特徴とする、脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法を提供するものである。本発明の脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法に用いる微生物の菌体またはその抽出物は、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性微生物のものであれば、いずれの微生物のものであってもよいが、好ましくは細菌、より好ましくはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌（さらに好ましくはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ種）、あるいはＬｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ属の細菌（さらに好ましくはＬｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ種）の菌体またはその抽出物を用いることができる。
【００１０】
したがって、本発明は、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌の菌体またはその抽出物をフコイダンに作用させることを特徴とする、脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法を提供する。さらに本発明は、もう１つの態様において、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ属の細菌の菌体またはその抽出物をフコイダンに作用させることを特徴とする、脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法を提供する。
【００１１】
本発明の脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法に用いる、最も好ましい微生物の菌体またはその抽出物は、下記の３株の細菌の菌体またはその抽出物である：
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７４として寄託されたＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株、
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７５として寄託されたＬｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  Ｈ１８株、あるいは
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７６として寄託された、フコイダンの脱硫酸化活性と低分子化活性を有するフコイダン資化性細菌Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株。
【００１２】
本発明に用いるフコイダン資化性微生物は、フコイダンの低分子化活性と脱硫酸化活性を併せ持つ点で、従来のものとは異なる。本発明のフコイダン資化性細菌を用いることにより、硫酸基を脱離させつつフコイダンを低分子化させることができる。しかも、これらの細菌のフコイダンの脱硫酸化パターンとフコイダンの低分子化パターンが異なるので、これらの細菌を適宜用いることによって、フコイダンの分子量および脱硫酸化度を調節することができる。本明細書において、フコイダンの低分子化活性とは、フコイダンの糖鎖を切断して低分子化させる能力をいい、フコイダンの脱硫酸化活性とは、フコイダンの糖残基に結合した硫酸基を遊離させる能力をいう。脱硫酸化とはフコイダンの硫酸基の全部が脱離している場合のみならず、一部が脱離した状態も包含する。さらに、本明細書で用いる他の用語は、当業者に通常理解されている意味を有するものである。
【００１３】
上記の最も好ましい３株の本発明のフコイダン資化性細菌は、鳥取市白兎海岸にて採取した海水、海草および土壌中の微生物を、フコイダンを単一炭素源とする培地、ならびに単一炭素源および単一硫黄源とする培地にて培養、スクリーニングすることにより、得られたものである。分離菌株からＤＮＡを抽出し、各菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅させ、塩基配列を決定することにより、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株、Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  Ｈ１８株、Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株と同定、命名した。これらの菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、それぞれ、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７４、ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７５、ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７６を付与された（受領日はいずれも２００８年１１月１４日）。以下において、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａをＦ．  ｌｉｍｉｃｏｌａと、Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅをＬ．  ａｌｇａｅと略称することがある。
【００１４】
本発明のフコイダン資化性細菌またはその抽出物を用いてフコイダンを脱硫酸化および低分子化させることができる。本発明の脱硫酸化された低分子化フコイダンの製造方法に供するフコイダンは精製品であってもよく、粗精製品または部分精製品であってもよく、蛋白類、脂質類、他の糖類などの夾雑物質を含むものであってもよい。例えば、もずく、こんぶ、わかめ、ひじきなどの海草類をそのまま、あるいはそれらの粗抽出物をフコイダンとして本発明の方法に使用してもよい。好ましくは、フコイダンは水溶液として処理される。微生物またはその酵素の特性を考慮して、かかる水溶液に塩類、バッファーなどの物質を添加してもよい。
【００１５】
本発明のフコイダン資化性微生物の菌体をフコイダンに直接作用させてもよい。この場合、試験管やフラスコ等の器具を用いて通常どおり培養を行ってもよい。スケールアップを図るにはバイオリアクターやタンクを用いて培養を行ってもよい。本発明の細菌は好気的に培養することが好ましく、振盪培養または通気培養が適している。培地にはフコイダンのほか、微生物の成育および酵素活性を促進あるいは制御するために、例えば、塩類、バッファー、ビタミン、フコイダン以外の栄養源などを適宜添加してもよい。本発明のフコイダン資化性細菌の培養温度は通常約１５℃〜約４０℃、好ましくは約２０℃〜約３７℃、さらに好ましくは約２５℃〜約３３℃であり、培養のｐＨは通常約６〜約１０、好ましくは約７〜約９、さらに好ましくは海水のｐＨの範囲、例えばｐＨ約７．５〜約８．５である。これらの条件は当業者が簡単な試験を行うことにより適宜定めうる。菌体量とフコイダン量の割合も適宜定め得る。フコイダンに作用させる本発明の菌体は１種類であってもよく、２種類またはそれ以上の種類であってもよい。
【００１６】
培養時間の経過に伴ってフコイダンの低分子化と脱硫酸化が見られる。フコイダンの分子量、フコイダンの硫酸化度（脱硫酸化度）は公知の方法にて測定することができる。フコイダンの分子量は、例えばゲルろ過ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いて測定することができ、硫酸化度を測定するには、例えば硫酸バリウム沈殿法により硫酸基を定量すればよい。
【００１７】
本発明のフコイダンの脱硫酸化および低分子化方法において、本発明のフコイダン資化性細菌の菌体の抽出物をフコイダンに作用させてもよい。フコイダン資化性細菌の抽出物は公知の方法により得ることができる。例えば、菌体を超音波または破砕機を用いて破砕したものをそのまま抽出物として用いることができる。あるいは、前記破砕物の上清を抽出物として用いることもできる。さらに、本発明のフコイダン資化性細菌の抽出物を公知の方法により精製して、脱硫酸化活性、低分子化活性の強いフラクションを得て、これを抽出物として使用してもよい。このように、抽出物は粗酵素であってもよく、あるいは単一にまで精製された酵素であってもよい。このような精製は公知の方法にて行うことができ、例えば硫安分画、あるいはイオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどを用いることができる。これらの抽出物、粗酵素、精製フラクションの形状は特に限定されず、液体であってもよく、凍結乾燥物のような粉末または固体であってもよい。
【００１８】
上記のごとく得られた抽出物を、フコイダン、好ましくはフコイダン水溶液に添加して、脱硫酸化と低分子化を行うことができる。反応を促進あるいは制御するためにバッファー、塩類などを適宜反応系に添加してもよい。反応温度は通常約１５℃〜約４０℃、好ましくは約２０℃〜約３７℃、さらに好ましくは約２５℃〜約３３℃であり、反応のｐＨは通常約６〜約１０、好ましくは約７〜約９、さらに好ましくは約７．５〜約８．５である。反応は撹拌しながら行うことが好ましい。これらの条件は当業者が簡単な試験を行うことにより適宜定めうる。抽出物量とフコイダン量の割合も適宜定めうる。培養時間の経過に伴ってフコイダンの低分子化と脱硫酸化が見られる。フコイダンの分子量、フコイダンの硫酸化度（脱硫酸化度）は公知の方法にて測定することができる（上記参照）。フコイダンに作用させる本発明の菌体の抽出物は１種類であってもよく、２種類または３種類であってもよい。
【００１９】
上述のごとく、本発明のフコイダン資化性細菌はいずれもフコイダンの低分子化活性と脱硫酸化活性を併せ持っているが、脱硫酸化パターンと低分子化パターンにはこれらの株において相違が見られる。Ｆ．  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株の抽出物による硫酸基の遊離はフコイダンの分子量が２万程度になってから始まるのに対し、Ｌ．  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株の抽出物を用いた場合はフコイダンの分子量約１４万の段階で硫酸基の遊離が見られる。Ｌ．  ａｌｇａｅ  Ｈ１８株の場合はＦ．  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株の場合の似た結果が得られる。
【００２０】
したがって、Ｆ．  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株またはＬ．  ａｌｇａｅ  Ｈ１８株の菌体またはその抽出物を用いた場合には、脱硫酸化された比較的低分子のフコイダンを得ることができ、Ｌ．  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株の菌体またはその抽出物を用いた場合には、脱硫酸化された比較的高分子のフコイダンを得ることができる。また、Ｌ．  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株の菌体またはその抽出物は他の２株に比べて脱硫酸化活性が高い。
【００２１】
本発明の微生物またはその抽出物を用いて、様々な分子量の硫酸化度の異なる低分子化フコイダンを調製することができる。それらはフコイダンの構造と機能の相関性を調べるための材料として用いることができる。そして、本発明により得られた低分子化フコイダンは、本来の活性とは異なる活性を有する、あるいは本来の活性が増強された、低硫酸化度かつ低分子化フコイダンとして用い得る。ここにフコイダンの本来の活性とは、免疫賦活、抗腫瘍、コレステロールや中性脂肪の低下、胃粘膜の保護、肝機能改善、抗酸化活性などが例示されるが、これらに限定されない。したがって、本発明により得られた低分子化フコイダンは、健康食品、機能性食品、サプリメント、化粧品および医薬品などの原料あるいは成分として用いることができる。
【００２２】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２３】
菌株の単離と同定
フコイダンを単一炭素源として生育できる微生物の単離には下記のＦ培地を用いた。Ｆ培地は蒸留水１Ｌ当たり、フコイダン（（株）海産物のきむらや製）２．５ｇ、リン酸水素二カリウム４．０ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸アンモニウム２．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．４１ｇ、金属混合液−Ｆ  １０ｍｌ、ビタミン混合液−Ｆ  １ｍｌを含み、ｐＨを７．４に調整したものである。金属混合液−Ｆは蒸留水１Ｌ当たり、塩化ナトリウム１ｇ、塩化カルシウム２ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）０．５ｇ、硫酸亜鉛０．５ｇ、塩化マンガン四水和物０．５ｇ、硫酸銅（ＩＩ）０．０５ｇ、モリブデン酸ナトリウム二水和物０．１ｇ、タングステン酸ナトリウム二水和物０．０５ｇを含む溶液である。ビタミン混合液−Ｆは蒸留水１Ｌ当たり、ビオチン１００ｍｇ、チアミン塩酸塩１００ｍｇ、リボフラビン１００ｍｇ、パントテン酸カルシウム１００ｍｇ、ピリドキサールリン酸１００ｍｇ、ニコチンアミド１００ｍｇ、パラ安息香酸ナトリウム２０ｍｇ、シアノコバラミン１０ｍｇ、リポ酸１０ｍｇを含む溶液である。
【００２４】
フコイダンを単一炭素源および単一硫黄源として生育できる微生物の単離には下記のＡＦ培地を用いた。ＡＦ培地は蒸留水１Ｌ当たり、フコイダン（（株）海産物のきむらや製）２．５ｇ、リン酸水素二カリウム４．０ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、塩化アンモニウム１．０ｇ、塩化マグネシウム０．２ｇ、金属混合液−ＡＦ  １０ｍｌ、ビタミン混合液−ＡＦ  １ｍｌを含み、ｐＨを７．４に調整したものである。金属混合液−ＡＦは蒸留水１Ｌ当たり、塩化ナトリウム１ｇ、塩化カルシウム２ｇ、塩化鉄（ＩＩ）０．５ｇ、塩化亜鉛０．５ｇ、塩化マンガン四水和物０．５ｇ、塩化銅（ＩＩ）０．０５ｇ、モリブデン酸ナトリウム二水和物０．１ｇ、タングステン酸ナトリウム二水和物０．０５ｇを含む溶液である。ビタミン混合液−ＡＦは蒸留水１Ｌ当たり、パントテン酸カルシウム４００ｍｇ、イノシトール２００ｍｇ、ピリドキサールリン酸２００ｍｇ、ニコチンアミド４００ｍｇ、パラ安息香酸ナトリウム２００ｍｇ、シアノコバラミン０．５ｍｇを含む溶液である。
【００２５】
土壌、モズク藻体、海水濃縮物などのサンプルを、オートクレーブしたＦ培地、ＡＦ培地に懸濁し、３０℃で振とうし、培地の濁度上昇が認められたサンプルを新たな培地に植え継いだ。この操作を１０回以上繰り返しても濁度上昇が認められるサンプルを、液体培地と同一組成で寒天を１．５％含む平板培地に塗布し、単一コロニーが得られれば、再びそのコロニーから液体培地へ植菌した。これらの操作を繰り返すことにより、フコイダン資化性微生物を純化し、Ｆ培地を用いた系からＦ３１株、Ｈ１８株と名付けた２株、ＡＦ培地を用いた系からＳＷｉ−１−Ｙと名付けた１株の目的微生物を単離した。Ｆ３１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、平成２０年１１月１４日付けで受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７４を付与された。Ｈ１８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、平成２０年１１月１４日付けで受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７５を付与された。ＳＷｉ−１−Ｙ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、平成２０年１１月１４日付けで受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６７６を付与された。
【００２６】
分離菌株から定法に従いＤＮＡを抽出し、それぞれの菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅させ、塩基配列を決定した。その結果、Ｆ３１株、Ｈ１８株についてはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅの１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子とどちらも９７％の相同性を有していたことより、これらの菌株をＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株、Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  Ｈ１８株と同定、命名した。また、ＳＷｉ−１−Ｙ株についても同じ実験を行い、Ｌｕｔｅｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株と同定、命名した。
【実施例２】
【００２７】
粗酵素の調製と酵素反応
（１）粗酵素の調製方法および酵素反応方法
上記菌株をスクリーニングに用いた培地５００ｍｌで培養し、増殖が停止する時点で遠心分離により菌体を集めた。生理食塩水で菌体を洗った後、２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に菌体を懸濁し、超音波処理により菌体の破砕を行い、その遠心上清を粗酵素とした。
【００２８】
酵素反応は、０．２５％フコイダン、１００ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を含む反応液に粗酵素を蛋白質濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３０℃で行った。熱処理（８０℃、５分）により酵素を失活させて反応を停止させた後、反応液中のフコイダンの分子量と遊離硫酸基の定量を行った。
【００２９】
フコイダンの分子量はゲルろ過ＨＰＬＣにおけるピークトップのリテンションタイムを基に算出した。プルランを分子量スタンダードとして使用した。ＨＰＬＣ条件は、カラム：ＴＳＫ−Ｇｅｌ  ＧＭＰＷＸＬ（φ  ７．８ｍｍ  ｘ  ３００ｍｍ）（ＴＯＳＯＨ）、検出法：ＲＩ、移動相：０．１Ｍ  ＮａＮＯ３（ｐＨ４．９）、流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００３０】
硫酸基の定量は、Ｄｏｄｇｓｏｎの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，８４，３５０−３５６（１９６２））に従い、塩化バリウム−ゼラチン溶液を加えることにより生じる硫酸バリウムの沈殿量を、５００ｎｍにおける濁度を測定することにより行った。
また、酵素反応の進行によって生成する糖の還元末端を定量することによっても酵素活性を測定した。酵素反応液にフェリシアン化カリウム溶液を加え、１５分加熱した後の４２０ｎｍの吸光度を測定することにより還元末端量を定量した。
【００３１】
（２）Ｆ．  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株の粗酵素を用いたフコイダンの低分子化と脱硫酸化
Ｆ．  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株の粗酵素によるフコイダンの低分子化・脱硫酸化反応は図１のように進行した。この反応によりフコイダンの低分子化に伴い糖の還元末端の遊離が認められた。脱硫酸化反応はフコイダンの分子量が２万程度になってから始まることがわかった。
【００３２】
３種類の分離菌株の粗酵素を用いて、２４時間まで酵素反応を実施したところ、フコイダンの分子量と遊離硫酸基量は表１、図２のように推移した。Ｆ．ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株の粗酵素による硫酸基の遊離はフコイダンの分子量が２万程度になってから始まるのに対し、Ｌ．  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株の粗酵素を用いた場合はフコイダンの分子量約１４万の段階で硫酸基の遊離が見られた。そしてＬ．  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株の粗酵素を用いた場合は、他の２株の粗酵素を用いた場合に比べて硫酸基の遊離量が多い傾向が見られた。Ｌ．  ａｌｇａｅ  Ｈ１８株の場合はＦ．ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株の場合の結果と似ていた。また、Ｌ．  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株の粗酵素は他の２株の粗酵素に比べて脱硫酸化活性が高かった。
【表１】
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上の四角で囲ったデータは脱硫酸化反応が確認された時点のデータ、下の四角で囲ったデータは反応２４時間後のデータであることを示す。
【００３３】
（３）Ｆ．  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株の粗酵素を用いた低分子化・脱硫酸化フコイダンの取得
フコイダンを４００ｍｇ（（株）海産物のきむらや製、分子量２０万、硫酸基含有率１９％）、Ｆ．  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株の粗酵素を蛋白質重量として３２０ｍｇを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を酵素反応液として、３０℃で３．５時間、攪拌子で混合しながら酵素反応を行った。
【００３４】
８０℃、１５分の熱処理により酵素反応を停止させた後、その遠心上清から分画分子量５０，０００と１０，０００の限外ろ過膜により高分子化合物と塩を分離し、分子量８，５００の低分子化されたフコイダンを得た。この溶液を凍結乾燥させ、８４ｍｇの粉末サンプルを得た。このサンプルを１．７Ｍ塩酸存在下で１００℃、５時間熱処理することにより、硫酸基の脱離を行い、遊離されてきた硫酸基を定量したところ、得られた低分子化フコイダンの硫酸基含有率は１６％と求められた。
【００３５】
（４）Ｌ．  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株の粗酵素を用いた低分子化・脱硫酸化フコイダンの取得
フコイダンを５００ｍｇ（（株）海産物のきむらや製、分子量２０万、硫酸基含有率１９％）、Ｌ．  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株の粗酵素を蛋白質重量として４００ｍｇ含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を酵素反応液として、３０℃で２８時間、攪拌子で混合しながら酵素反応を行った。
【００３６】
８０℃、１５分の熱処理により酵素反応を停止させた後、その遠心上清から分画分子量５０，０００の限外ろ過膜により高分子化合物を分離した。さらにＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂゲルろ過クロマトグラフィー（φ  ２ｃｍ  ｘ  ９０ｃｍ、移動相は蒸留水）により脱塩を行い、分子量４，０００の低分子化されたフコイダンを得た。この溶液を凍結乾燥させ、３２ｍｇの粉末サンプルを得た。このサンプルを１．７Ｍ塩酸存在下で１００℃、５時間熱処理することにより、硫酸基の脱離を行い、遊離されてきた硫酸基を定量したところ、得られた低分子化フコイダンの硫酸基含有率は８．３％と求められた。
【００３７】
上記実験例が示すように、本発明の新規微生物が有する酵素を用いることにより硫酸化度が異なる低分子化フコイダンを生成させることができた。Ｌ．  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株を用いた場合には、比較的高分子のフコイダンであっても脱硫酸化反応が認められたので、他の２株を用いた場合よりも高分子量の脱硫酸化フコイダンが得られることがわかった。微生物量または抽出物（酵素）量、反応時間、その他の反応条件を適宜選択することにより、フコイダンの分子量および硫酸化度をコントロールできることもわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、フコイダンの活性と分子量と硫酸化度との関係を調べるための研究材料を提供する。さらに本発明により得られる低分子化フコイダンは健康食品、機能性食品、サプリメント、化粧品および医薬品などの原料あるいは成分として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】Ｆ．  ｌｉｍｉｃｏｌａ  Ｆ３１株の粗酵素によるフコイダンの低分子化（フコイダン分子量）、脱硫酸化反応（遊離硫酸基量）および還元末端量の経時的変化を示すグラフである。
【図２】Ｌ．  ａｌｇａｅ  ＳＷｉ−１−Ｙ株、Ｌ．  ａｌｇａｅ  Ｆ３１株およびＬ．  ａｌｇａｅ  Ｈ１８株の粗酵素によるフコイダンの低分子化（フコイダン分子量）および脱硫酸化反応（遊離硫酸基量）の経時的変化を示すグラフである。上段のグラフにおける３時間までの反応の進行を、下段のグラフに示した。
【図１】
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【図２】
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