(57)【要約】      （修正有）【課題】サブミリ級の大きさの粒子またはそのクラスタをカプセル化する微小流体デバイスを提供する。【解決手段】カプセル化のための粒子を懸濁状態で含む第１の液相（φ１）を送出するための第１のダクト１０と、前記第１の液相と不混和である第２の液相（φ２）の流れを運ぶための第２のダクト２０とを備え、前記第１のダクトは前記第２のダクト内へと開いて前記第２のダクトと共に流体接合部３０を形成し、かつ本デバイスは、前記第１のダクト内を流れる前記第１の液相を放出するための、前記接合部の上流に配置されかつ懸濁状態の粒子によって少なくとも部分的に塞がれやすい、これにより前記第１のダクト内で圧力を上昇させる口４５、４５’を装備する少なくとも１つの微小流体ダクト４０、４０’を備える。このようなデバイスを含む微小流体システム、及びこのようなデバイスの使用を基礎とするカプセル化の方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブミリ級の大きさの粒子またはこのような粒子のクラスタを制御下でカプセル化するための微小流体デバイス（Ｄ）であって、
・カプセル化のための粒子または粒子クラスタ（Ｃ）を懸濁状態で含む第１の液相（φ１）を送出するための第１の微小流体ダクト（１０）と、
・前記第１の液相と不混和である第２の液相（φ２）の流れを運ぶための第２の微小流体ダクト（２０）であって、前記第１のダクトは前記第２のダクト内へと開いて前記第２のダクトと共に流体接合部（３０、３０’）を形成する第２の微小流体ダクト（２０）と、
・前記第１のダクト内を流れる前記第１の液相を放出するための少なくとも１つの放出微小流体ダクト（４０、４０’、５０、５０’）であって、前記接合部の上流に配置されかつ懸濁状態の粒子または粒子クラスタによって少なくとも部分的に塞がれることに適し、これにより前記第１のダクト内で圧力を上昇させる口（４５、４５’）を装備する少なくとも１つの放出微小流体ダクト（４０、４０’、５０、５０’）と、を備え、
これにより、前記第１のダクトに沿って前記懸濁により取り込まれる粒子または粒子クラスタは前記接合部において蓄積しやすく、前記２つの不混和液相間のインタフェース（Ｉ）で捉えられ、最終的に、前記放出ダクトの口が塞がれていることに起因する圧力上昇によって前記第２のダクト内へ注入される微小流体デバイス（Ｄ）。
【請求項２】
前記第１のダクトの両側に配置される少なくとも１対の微小流体放出ダクトを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
単一のカプセル化ダクト、または単一対のカプセル化ダクトのみを含む、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記カプセル化ダクトの口の断面及び前記口の前記接合部からの距離、及び前記第１のダクトの断面も、前記接合部における単一の粒子または粒子クラスタの到達が、前記第１のダクト内に、前記粒子または粒子クラスタが前記第２のダクト内へ注入されることを有効化するに足る圧力上昇を誘発させるようにして選択される、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記放出ダクトの口の断面及び前記口の前記接合部からの距離、並びに前記第１のダクトの断面は、粒子または粒子クラスタが前記第２のダクト内へ注入されることを有効化するに足る圧力が、予め決められた数の粒子または粒子クラスタが前記接合部において前記２つの不混和液相間のインタフェースによって捕捉されるまで到達されないようにして選択され、前記予め決められる数は１より多く、かつ好適には２から１０までの範囲内である、請求項３に記載のデバイス。
【請求項６】
前記接合部から異なる距離に位置する口を有する少なくとも２つの放出ダクト、または少なくとも２対の放出ダクトを含み、前記放出ダクトの口の断面及び前記口の前記接合部からの距離、及び前記第１のダクトの断面は、粒子または粒子クラスタが前記第２のダクト内へ注入されることを有効化するに足る圧力が、前記少なくとも２つのダクトまたは少なくとも２対のダクトが塞がれる場合にのみ到達されるようにして選択され、これにより、複数の粒子または粒子クラスタが確実に同時に注入されることが可能にされる、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項７】
前記流体接合部（３０）はＴ接合部であり、前記第１及び第２のダクトは両者間に６０゜から９０゜までの範囲内の角度、好適には８０゜から９０゜までの範囲内の角度、かつさらに好適にはほぼ９０゜に等しい角度を形成する、請求項１から６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８】
前記流体接合部（３０）は、微小流体フローの絞り込み接合部である、請求項１から６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項９】
前記第１及び第２のダクトは、カプセル化されるべきものの直径ｄの１１０％から１３０％までの範囲内の断面を呈し、前記放出ダクトは、前記第１のダクトの断面の約３０％から６０％までの断面を呈し、かつ前記放出ダクトまたは放出ダクト対の口の前記接合部からの距離は、カプセル化されるべきものの直径の１０％から５０％までの範囲内である、請求項１から８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１０】
前記放出ダクトの前記口または各口にマイクロピラーアレイ（４５０、４５０’）を含む、請求項１から９のいずれか記載のデバイス。
【請求項１１】
前記第１及び第２のダクト間の流体接合部にマイクロピラーアレイ（４５１）を含む、請求項１から１０のいずかれに記載のデバイス。
【請求項１２】
平面構造を呈し、前記ダクトは、基板内にエッチングまたは成形される溝によって構成される、請求項１から１１のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１３】
三次元構造体を呈し、成形またはエッチングされた平面基板（Ｓ１−Ｓ５）の積層によって構成され、前記第１のダクトは、前記基板を略垂直に通過し、一方で前記第２のダクト及び前記放出ダクトは基板間のインタフェースに前記基板に平行して形成される、請求項１から１１のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１４】
前記ダクトの寸法は、細胞または細菌がカプセル化されることを有効化するように適合化される、請求項１から１３のいずかれに記載のデバイス。
【請求項１５】
サブミリ級の大きさの粒子またはこのような粒子のクラスタを制御下でカプセル化するための微小流体システムであって、
・先行する任意の請求項記載のデバイス（Ｄ）と、
・前記デバイスの第１のダクト内へ、カプセル化のためのサブミリ級の大きさの粒子またはこのような粒子のクラスタを懸濁状態で含む第１の液相を注入するための注入手段（Ｐ１）であって、前記液相は少なくとも１つのカプセル化剤も含む注入手段（Ｐ１）と、
・前記第１のダクト内を流れる前記第１の液相を前記放出ダクトを介して放出するための放出手段と、
・前記デバイスの第２のダクト内へ、前記液相とは不混和である第２の液相を注入するための注入手段（Ｐ２）と、を備え、
前記第１及び第２の液相を注入するための前記注入手段、及び前記第１の液相を放出するための前記放出手段は、前記接合部において前記２つの不混和液相間に安定したインタフェースが形成されることを有効化しかつ前記放出ダクトのうちの１つまたはそれ以上が塞がれた場合に前記インタフェースが破裂することを有効化するように適合化される微小流体システム。
【請求項１６】
前記接合部の下流で前記第２のダクトへ接続されるゲル化ユニット（Ｅ）も含み、前記ユニットは、
・前記第２のダクト内へ注入されて前記第１の液相により構成される薄膜内に包囲される粒子または粒子クラスタを懸濁状態で含む前記第２の液相を入力として受け入れるように適合化され、かつ、
・前記粒子または粒子クラスタを含むカプセルを構成するために、前記薄膜内に含まれるカプセル化剤をゲル化させるように適合化される、請求項１５に記載の微小流体システム。
【請求項１７】
サブミリ級の粒子またはこのような粒子のクラスタを制御下でカプセル化するための微小流体方法であって、
・請求項１から請求項１４のいずれかに記載のデバイスの第１のダクト内へカプセル化のための粒子または粒子クラスタを懸濁状態で含む第１の液相を注入するステップであって、前記液相は少なくとも１つのカプセル化剤も含む、注入するステップと、
・前記第１のダクト内を流れる液相を前記放出ダクトを介して放出するステップと、
・前記デバイスの第２のダクト内へ前記第１の液相と不混和である第２の液相を注入するステップと、を含み、
前記第１及び第２の液相が注入される圧力、及び前記第１の液相の放出流量は、前記接合部において前記２つの不混和液相間に安定したインタフェースが形成されることを有効化しかつ前記放出ダクトのうちの１つまたはそれ以上が塞がれた場合に前記インタフェースが破裂されかつ制御された数の粒子または粒子クラスタが前記第２のダクト内へ注入されることを有効化するようにして選択される方法。
【請求項１８】
前記粒子または粒子クラスタを包囲する中実壁のカプセル（Ｋ’）を形成するために、前記第２のダクト内へ注入される粒子または粒子クラスタを包囲する前記第１の液相によって構成される薄膜内に含まれるカプセル化剤をゲル化するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記粒子は、細胞、特にヒトの細胞及び細菌から選択される、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サブミリメートル級の大きさの粒子またはこのような粒子のクラスタを制御下でカプセル化するための微小流体デバイス、システム及び方法に関する。より具体的には、本発明は、細胞、特にヒトの細胞またはランゲルハンス島等の細胞クラスタをカプセル化することに適する。
【背景技術】
【０００２】
細胞のカプセル化は、マイクロカプセル内の細胞または細胞クラスタを、移植後の免疫系による攻撃から保護するために不動にすることに存する技術である。カプセルは、カプセル化された細胞の代謝にとって不可欠である栄養分子、酸素、他等の低分子量の分子の進入を許容するに足る多孔質であると同時に、免疫系の抗体または細胞等の高分子量の物質の進入を防止するものである必要がある。従って、カプセルのこの選択的透過性は、カプセル化されるドナーからの細胞と、移植レシピエントの免疫系細胞との直接的接触を防止するように設計され、移植によって使用される免疫抑制治療剤は激しい副作用を伴うことから、これにより、その投与の制限を可能にする。その選択的透過性に加えて、製造されるカプセルは生体適合性のあるものでなければならず、機械的強度がありかつカプセル化されるべきものに整合するサイズでなければならない。
【０００３】
カプセル化の数ある用途の中では、膵臓内に位置し、かつインスリンを生成することにより体内の血糖を調整するβ細胞を含む幾つかのタイプの細胞によって構成される脆い細胞の塊であるランゲルハンス島を挙げることができる。これらの島のカプセル化は、インスリンを生成するその固有のβ細胞を免疫系が破壊する自己免疫疾患であるインスリン依存性糖尿病の治療に使用される従来の細胞療法（例えば、膵臓移植または島移植）に代わるものである。
【０００４】
既知の主たるカプセル化方法は、下記の何れかを利用する。即ち、
・  空気または液体の同軸噴流。結果的に生じるカプセルは、４００マイクロメートル（μｍ）から８００μｍまでの範囲内のサイズを有する（但し、生成されるカプセルの平均サイズは４００μｍよりも６００μｍから８００μｍまでの範囲に近い。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ著「ＮＲＭ−、ＣＬＳＭ−及びＡＦＭ−画像化により検認される均一に架橋された機能的アルギン酸マイクロカプセルの製造」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４、２００３年、２０８３−２０９６ページ参照）。または、
・  電位差。これは、カプセルサイズの縮小が優先される場合に最も広範に使用されるカプセル化技術である（よって、カプセルサイズは２００μｍから８００μｍまでの範囲内）。Ｇｏｏｓｅｎ著「体組織カプセル化のための静電液滴の生成：高電圧電源の評価」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．  １３、１９９７年、４９７−５０２ページ参照。もしくは、
・  使用される溶液の粘性によって制限される場合があるという欠点のある振動技術。Ｓｅｉｆｅｒｔ著「細胞不動化のための小型単分散アルギン酸ビーズの製造」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．  １３、１９９７年、５６２−５６８ページ参照。
【０００５】
先行技術において知られるこれらの技術には、下記のような所定の欠点がある。
【０００６】
・  カプセルのサイズが、カプセル化されるべき細胞／島のサイズに必ずしも適さない。
【０００７】
・  カプセルサイズのばらつきが、液滴サイズの縮小に伴って大きくなる。
【０００８】
・  生成されるカプセルは必ずしも球形でなく、よって、再現精度の欠如を招く。
【０００９】
これらの問題点に加えて、現在の大部分のカプセル化技術は、各液滴内に包含される細胞または細胞クラスタの数を制御する方法を提供していない。カプセル化される細胞またはクラスタの数は、カプセル化基質として作用する高分子溶液における細胞（またはクラスタ）の懸濁濃度を調整することにより、専ら統計学的に決定される（この濃度は、カプセル化する粒子のサイズ、及びカプセルとして所望されるサイズに依存する）。従って、従来のシステムは、多数の空のカプセル、並びに可変数の細胞またはクラスタを包含するカプセルを生成する。
【００１０】
空のカプセルの主たる欠点は、移植される必要のある細胞の合計体積を増加させ、かつこれらが組織の脈管再生に特に適すると思われる領域内へ移植されることを妨げることにある。カプセル化細胞は、栄養及び酸素を供給されるために血管網の近くに存在する必要があることから、組織の脈管再生に特に適すると思われる領域内への移植はカプセル化細胞の壊死を回避するために不可欠である。例えば、１型糖尿病の治療の場合、移植用カプセルの合計体積の低減は、カプセル化された島を、立体障害の問題でカプセルが従来的に移植される腹腔よりも脈管再生には有利な領域である肝臓または脾臓内へ移植することを可能にすると思われる。
【００１１】
カプセルが可変数の細胞またはクラスタを包含する場合は、細胞またはクラスタがカプセル表面から突き出す危険性があり、よって、グラフトが拒否される免疫反応をトリガする危険が冒される。カプセルのサイズがカプセル化されるべきもののサイズにぴったりと合っている場合、この問題はさらに悪化する。
【００１２】
上述の従来技術の欠点を解決するために、微小流体技術を基礎とするカプセル化デバイス及び方法が提案されている。例えば、下記を参照されたい。
【００１３】
・Ｗｏｒｋｍａｎら著「不動化されたヒト細胞をカプセル化するためのアルギン酸ビーズの微小流体チップベース合成」Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １、２００７年。この論文は、ほぼ８０μｍから４００μｍまでの範囲内の直径を有するカプセルを、所謂「流体力学的絞り込み」効果によって製造する方法について記述している。
【００１４】
・Ｓｕｇｉｕｒａら著「肝臓細胞を含むアルギン酸カルシウムビーズのマイクロノズルアレイを使用するサイズ制御」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６、２００５年、３３２７−３３３１ページ。この刊行物に記述されている方法では、５０μｍから２００μｍまでの範囲内のサイズのカプセルが、３０μｍの直径を有する「マイクロノズル」を介してアルギン酸塩を油性相内へ注入することにより形成される。
【００１５】
これらの技術は、カプセルサイズのより優れた制御をもたらし、かつ前記サイズは従来技術を使用する場合に比べて低減されるが、カプセル当たりの粒子（細胞またはクラスタ）数の可変性は依然として高い。
【００１６】
現時点で本件発明の発明者が知るところの、隔離された粒子がカプセル化されることを有効化する唯一の技術は、水性相に含まれる細胞がＴ接合部において水／油インタフェースへ向かって移動されることを有効化する、微小流体工学と光ピンセットとの併用に依存している。この技術は、カプセル化細胞のサイズと同程度の大きさであるサイズのカプセルを生成するという優位点も示す。しかしながら、これは、その用途を科学的調査分野以外で存立可能にするに足るカプセル化速度の達成を可能にするものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、先行技術によるこれらの欠点の少なくとも幾つかを解決しようとするものである。
【００１８】
具体的には、本発明は、細胞または細胞クラスタが、制御されかつ再生可能な数でカプセル化されることを有効化しようとするものである。有利には、本発明は、カプセルが、カプセルに含まれる細胞またはクラスタの数によく合うサイズで製造されることを有効化し、一方で、空のカプセルの製造を回避する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明によるデバイスは微小流体型であり、単純な構造体を呈し、かつ従来の微細加工技術によって低コストで製造されることが可能である。
【００２０】
より正確に言えば、本発明は、サブミリ級の大きさの粒子またはこのような粒子のクラスタを制御下でカプセル化するための微小流体デバイスを提供し、本デバイスは、カプセル化のための粒子または粒子クラスタを懸濁状態で含む第１の液相を送出するための第１の微小流体ダクトと、前記第１の液相と不混和である第２の液相の流れを運ぶための第２の微小流体ダクトと、を備え、前記第１のダクトは前記第２のダクト内へと開いて前記第２のダクトと共に流体接合部を形成し、本デバイスはさらに、前記第１のダクト内を流れる前記第１の液相を放出するための少なくとも１つの放出微小流体ダクトを備え、前記少なくとも１つの放出微小流体ダクトは、前記接合部の上流に配置されかつ懸濁状態の粒子または粒子クラスタによって少なくとも部分的に塞がれることに適し、よって前記第１のダクト内で圧力を上昇させる口を装備し、これにより、前記第１のダクトに沿って前記懸濁により取り込まれる粒子または粒子クラスタは前記接合部において蓄積しやすく、前記２つの不混和液相間のインタフェースで捉えられ、最終的に、前記放出ダクトの口が塞がれていることに起因する圧力上昇によって前記第２のダクト内へ注入される。
【００２１】
有利には、本発明によるデバイスは、前記第１のダクトの両側に配置される少なくとも１対の微小流体放出ダクトを含んでもよい。
【００２２】
より正確に言えば、本デバイスは、単一の放出ダクトのみ、または単一対の放出ダクトのみを有してもよい。
【００２３】
第１の実施形態では、前記カプセル化ダクトの口の断面及び前記口の前記接合部からの距離、及び前記第１のダクトの断面も、前記接合部における単一の粒子または粒子クラスタの到達が、前記第１のダクト内に、前記粒子または粒子クラスタが前記第２のダクト内へ注入されることを有効化するに足る圧力上昇を誘発させるようにして選択されてもよい。
【００２４】
第２の実施形態では、前記放出ダクトの口の断面及び前記口の前記接合部からの距離、並びに前記第１のダクトの断面は、前記粒子または粒子クラスタが前記第２のダクト内へ注入されることを有効化するに足る圧力が、予め決められた数の粒子または粒子クラスタが前記接合部において前記２つの不混和液相間のインタフェースにより捕捉されるまで到達されないようにして選択されてもよく、前記予め決められる数は１より多く、かつ好適には２から１０までの範囲内である。
【００２５】
第３の実施形態では、本デバイスは、前記接合部から異なる距離に位置する口を有する少なくとも２つの放出ダクト、または少なくとも２対の放出ダクトを含んでもよく、前記放出ダクトの口の断面及び前記口の前記接合部からの距離、及び前記第１のダクトの断面は、粒子または粒子クラスタが前記第２のダクト内へ注入されることを有効化するに足る圧力が、前記少なくとも２つのダクトまたは少なくとも２対のダクトが塞がれる場合にのみ到達されるようにして選択され、これにより、複数の粒子または粒子クラスタが確実に同時に注入されることが可能にされる。
【００２６】
第４の実施形態では、本デバイスは、前記放出ダクトの前記口または各口にマイクロピラーアレイを含んでもよい。
【００２７】
本デバイスは、前記第１及び第２のダクト間の流体接合部にマイクロピラーアレイを含んでもよい。
【００２８】
前記流体接合部はＴ接合部であってもよく、前記第１及び第２のダクトは両者間に６０゜から９０゜までの範囲内の角度、好適には８０゜から９０゜までの範囲内の角度、かつさらに好適にはほぼ９０゜に等しい角度を形成する。
【００２９】
ある変形例では、前記流体接合部は、微小流体フローの絞り込み接合部であってもよい。
【００３０】
本発明の変形実施形態では、
・前記第１及び第２のダクトは、カプセル化されるべきものの直径ｄの１１０％から１３０％までの範囲内の断面を呈してもよく、前記放出ダクトは、前記第１のダクトの断面の約３０％から６０％までの断面を呈し、かつ前記放出ダクトまたは放出ダクト対の口の前記接合部からの距離は、カプセル化されるべきものの直径の１０％から５０％までの範囲内である。
【００３１】
・前記ダクトは、基板内にエッチングまたは成形される溝によって構成されてもよい。
【００３２】
・或いは、本デバイスは三次元構造体を呈しかつ成形またはエッチングされた平面基板の積層によって構成されてもよく、前記第１のダクトは、前記基板を略垂直に通過し、一方で、前記第２のダクト及び前記放出ダクトは基板間のインタフェースに前記インタフェースに平行して形成される。
【００３３】
・前記ダクトの寸法は、細胞または細菌がカプセル化されることを有効化するように適合化されてもよい。
【００３４】
また本発明は、サブミリ級の大きさの粒子またはこのような粒子のクラスタを制御下でカプセル化するための微小流体システムも提供し、本システムは、先に述べたようなデバイスと、前記デバイスの第１のダクト内へ、カプセル化のためのサブミリ級の大きさの粒子またはこのような粒子のクラスタを懸濁状態で含む第１の液相を注入するための注入手段であって、前記液相は少なくとも１つのカプセル化剤も含む注入手段と、前記第１のダクト内を流れる第１の液相を前記放出ダクトを介して放出するための放出手段と、前記デバイスの第２のダクト内へ、前記液相とは不混和である第２の液相を注入するための注入手段と、を備え、前記第１及び第２の液相を注入するための前記注入手段、及び前記第１の液相を放出するための前記放出手段は、前記接合部において前記２つの不混和液相間に安定したインタフェースが形成されることを有効化しかつ前記放出ダクトのうちの１つまたはそれ以上が塞がれた場合に前記インタフェースが破裂することを有効化するように適合化される。
【００３５】
このようなシステムは、前記接合部の下流で前記第２のダクトへ接続されるゲル化ユニットも含んでもよく、前記ユニットは、前記第２のダクト内へ注入されて前記第１の液相により構成される薄膜内に包囲される粒子または粒子クラスタを懸濁状態で含む前記第２の液相を入力として受け入れるように適合化され、かつ前記粒子または粒子クラスタを含むカプセルを構成するために、前記薄膜内に含まれるカプセル化剤をゲル化させるように適合化される。
【００３６】
また本発明は、サブミリ級の粒子またはこのような粒子のクラスタを制御下でカプセル化するための微小流体方法も提供し、本方法は、先に述べたデバイスの第１のダクト内へカプセル化のための粒子または粒子クラスタを懸濁状態で含む第１の液相を注入するステップであって、前記液相は少なくとも１つのカプセル化剤も含む注入するステップと、前記第１のダクト内を流れる液相を前記放出ダクトを介して放出するステップと、前記デバイスの第２のダクト内へ前記第１の液相と不混和である第２の液相を注入するステップとを含み、前記第１及び第２の液相が注入される圧力、及び前記第１の液相の放出流量は、前記接合部において前記２つの不混和液相間に安定したインタフェースが形成されることを有効化しかつ前記放出ダクトのうちの１つまたはそれ以上が塞がれた場合に前記インタフェースが破裂されかつ制御された数の粒子または粒子クラスタが前記第２のダクト内へ注入されることを有効化するようにして選択される。
【００３７】
また本方法は、前記粒子または粒子クラスタを包囲する中実壁のカプセルを形成するために、前記第２のダクト内へ注入される粒子または粒子クラスタを包囲する前記第１の液相によって構成される薄膜内に含まれるカプセル化剤をゲル化するステップも含んでもよい。
【００３８】
前記粒子は、細胞、特にヒトの細胞及び細菌から選択されてもよい。特に細胞は、β細胞等の膵臓細胞であってもよく、より一般的には、ホルモン、蛋白質または治療関連の他の任意の物質を分泌する細胞であってもよい。また細胞は、幹細胞であってもよい。例として、細胞クラスタはランゲルハンス島であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明の他の特徴、詳細及び優位点は、例として示される添付の図面を参照して行う以下の説明を読めば明らかとなる。
【図１】本発明によるデバイスの異なる４つの実施形態を示す略図である。
【図２】本発明によるデバイスの異なる４つの実施形態を示す略図である。
【図３】本発明によるデバイスの異なる４つの実施形態を示す略図である。
【図４ａ】図１のデバイスにおける液圧分布を示す。
【図４ｂ】図１のデバイスにおける液圧分布を示す。
【図４ｃ】図１のデバイスにおける液圧分布を示す。
【図４ｄ】図１のデバイスにおける液圧分布を示す。
【図４ｅ】図１のデバイスにおける液圧分布を示す。
【図５】本発明によるデバイスの第５の実施形態を示す。
【図６】本発明によるデバイスの第６の実施形態を示す。
【図７】図１から図３、図５または図６のうちの任意の図に示されたデバイスを含むカプセル化システム全体を示す線図である。
【図８】本発明によるデバイスの異なる４つの実施形態を示す略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の微小流体デバイスは２つの不混和相、即ち、例えば、諸図においてφ１で参照されている水性の第１の相と、油性タイプの第２の相φ２とを使用する。例として、第１の相は生物学的緩衝剤または生理学的血清によって構成されてもよく、これは、カプセル化のための細胞または細胞クラスタ（図中のＣ）を懸濁状態で含み、かつ溶液中にアルギン酸ヒドロゲル、キトサン、カラギーナン、アガロースゲル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の任意の適切なポリマ等のカプセル化剤を含む。
【００４１】
第２の相は、植物油（例えば、ひまわり油）、鉱油、シリコン、ペルフルオロ溶媒、他であってもよい。
【００４２】
第１の相が水性タイプであり、かつ第２の相が油性タイプであることは、絶対に不可欠であるわけではない。最も重要な点は、これらの２相が不混和性であるべきことにあり、かつ特殊な用途を除いて、第１の相は細胞または細胞クラスタが生き延びることを有効化すべきであることにある。
【００４３】
本デバイスは、Ｔ接合部３０を形成する、参照数字１０及び２０で示される第１及び第２の主微小流体ダクトを備える。副ダクト４０、４０’、５０、５０’は、接合部３０の近くで第１のダクト１０から離れる。
【００４４】
第１のダクト１０は、水性相φ１を供給され、油性相φ２を供給される第２のダクト２０内へ開いている。従って、これらの２ダクトは流体のＴ接合部を形成する。「Ｔ接合部」という用語は微小流体工学の分野において既知であり、厳密すぎる解釈がされるべきではない。これらの２ダクトが、両者間で正確に９０゜である角度を成すことは必須ではない。例として、この角度は６０゜から９０゜までの範囲内、好適には８０゜から９０゜までの範囲内であってもよく、９０゜により近い値であれば特に好適である。
【００４５】
２つの液相φ１及びφ２は不混和性であることから、接合部３０にはインタフェースＩが形成される。水性相φ１は、前記インタフェースによって第２のダクトへ流れ込むことを防止され、副ダクト４０、４０’、５０、５０’を介して流れ出る。２つの液相の圧力及び流量の値は、インタフェースにおける前記圧力と張力との平衡によりインタフェースＩが安定を保つようにして決められる。
【００４６】
副ダクトまたは放出ダクト４０、４０’、５０、５０’は、チャネル１０へ開いた、かつ断面が主ダクト１０及び２０の断面より小さい個々の口を呈し、細胞Ｃを通過させない。従って、第１の液相φ１によって運ばれる粒子（細胞またはクラスタ）はインタフェースＩで捕獲されて留まり、一方で前記液相は副ダクトを介して放出される。これは、前記粒子が前記副ダクトの口を塞ぐまで続き、これにより圧力が上昇してインタフェースＩが破壊され、１つまたはそれ以上の粒子が第２のダクト内へ注入される。
【００４７】
より正確に言えば、放出ダクトの閉塞は遷移圧力を上昇させ、これにより第１の液相の液滴が第２のダクト内へ注入される。前記液滴は、１つまたは複数の粒子を含む。図中のＫで参照される液滴のサイズは、液滴が包含する細胞またはクラスタのサイズに一致する。即ち、液滴Ｋを、１つまたは複数の粒子を包囲する微細な液膜であると考えることが可能である。この液膜はカプセルの前駆体を構成し、これは、第１の液相内で溶液中に存在するカプセル化剤（例えば、アルギン酸塩）をゲル化することにより、それ自体既知の方法で形成されるべきものである。
【００４８】
２つの微小流体ダクト間のＴ接合部によって不混和液相内に液滴を形成することは、先行技術において既知である。例えば、Ｔ．Ｔｈｏｒｓｅｎら著の論文「小胞発生微小流体デバイスにおける動的パターンの形成」Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８６（１８）、２００１年、４１６３−４１６６ページ参照。
【００４９】
本発明のデバイスは、同時に注入される、及び延ては所定のカプセル内に含まれる粒子（細胞またはクラスタ）の数を正確に制御することを可能にする。これは、３つの例を使用して理解することができる。
【００５０】
図１の実施形態では、２つの副放出ダクト４０、４０’が接合部３０の直近において第１のダクト１０の両側へ対称的に設けられる。前記放出ダクト４０、４０’の口４５、４５’の断面及び接合部３０からのその距離、並びに第１のダクトの断面は、前記接合部における単一粒子の到達が前記放出ダクトを閉塞させるに足るものであり、これにより、著しい圧力上昇が発生して前記粒子の第２のダクト内への注入が有効化されるように選択される。言い替えれば、粒子は、インタフェースＩへ到達すると直ぐに１つずつ注入される。当然ながら、これが発生するためには、粒子は、第１の液相において、接合部へグループではなく個々に到達し得る十分な間隔で存在する必要がある。
【００５１】
図１は、本デバイスの二次元図であるが、実際には、ダクトは有限深さを呈する。当然ながら、前記ダクトの断面の大きさの決定に際しては、この深さを考慮する必要がある。
【００５２】
本デバイスの様々なダクトの深さは、一様であっても、異なってもよい。原則として、第１のダクト１０の末端部分は、放出ダクト４０、４０’の閉塞を有効化するために、カプセル化のための粒子の直径に一致する必要がある。これに対して、第２のダクト２０及び前記ダクト１０の上流に位置する粒子供給ダクト（不図示）は、損失水頭を低減しかつ粒子上の剪断を制限するために、より大きい深さを呈してもよい。これは、細菌等の極小寸法（マイクロメートル級、またはサブマイクロメートル級）の粒子の場合に特に効果的である。
【００５３】
図２の実施形態では、放出ダクト４０、４０’（または、より正確にはその口４５、４５’）は、接合部３０からさらに大きい距離で位置づけられている。この場合、前記放出ダクトを塞ぐためには、インタフェースＩにおいて複数の粒子Ｃが捕捉される必要がある。本図は、副ダクト４０、４０’が閉塞状態になることなく、第１のダクト１０内に既に５つの粒子が積み重なり、φ１−φ２インタフェースにおける表面張力によって前記ダクト１０内に保持されている例を示している。これに対して、６番目の粒子が到着すると、第１のダクト内に閉塞が生じ、延ては圧力が上昇して、ラインまたは「待ち行列」の最初の粒子が第２のダクト内へ注入される。この例の場合も、粒子はやはり１つずつ注入される。
【００５４】
図１の実施形態に比べて、この実施形態には、特に小寸法の隔絶された細胞またはクラスタのカプセル化が所望される場合、技術的に製造が容易であるという優位点がある。即ち、このような状況下で第１の例を実装する場合には、第２のダクトを接合部３０の直近に製造することが要求されることになる。
【００５５】
図２に示すタイプのデバイスは、複数の粒子を同時に注入するためにも使用可能である。即ち、全てがダクトの大きさの決定、及び２つの液相の注入（及び恐らくは放出）圧力に依存する。
【００５６】
また、この第２の実施形態は、注入される粒子が多分散である場合にも、より適する。しかしながら、このような状況下では、各カプセルに包含される粒子数に関する制御の精度は、粒子懸濁が単分散である場合よりも低い。しかしながら、カプセルのサイズは単分散のままであり、かつカプセル形成が生じる場合でも、カプセルは必ず細胞を含み、空になることはない。
【００５７】
さらに、この第２の実施形態は、小寸法の粒子をカプセル化する場合でも、比較的大きい主ダクトの使用を可能にする。これにより、ラプラス圧は下がり、延ては前記粒子に作用する可能性のある有害な圧縮力も下がる。
【００５８】
先に述べたように、放出ダクトの口４５、４５’と接合部３０との距離は、考慮されなければならない唯一のパラメータではない。即ち、（Ｎ＋１）番目の粒子が到達するまで放出ダクトが十分に完全な形で閉塞状態にならないことを保証するためには、前記口及び第１のダクトの断面寸法も適切に決定される必要がある。但し、Ｎは、本デバイスの設計時に正確に決定される。この寸法決めは、注入圧力及び２つの液相の表面張力、並びにカプセル化のための粒子のサイズが全て既知であると想定することによって実行される。
【００５９】
図３に示す第３の実施形態では、接合部３０からの異なる距離に２対の放出ダクト（４０、４０’及び５０、５０’）が設けられる。本デバイスの寸法は、一方のダクト対のみの閉塞では流体インタフェースＩの破裂に不十分であるように決定される。例えば、本図に示すように、第１のダクト対４０、４０’（接合部に近い方のペア）は、接合部に４つの粒子Ｃが蓄積すると塞がれるが、第２のダクト対５０、５０’は第６の細胞が到達するまで塞がらない。
【００６０】
前記第６の細胞が到達すると、第１のダクト内の圧力上昇はインタフェースＩを破裂させるに足るレベルに達し、粒子Ｃが第２のダクト２０内へ注入され始める。従って、第２の放出ダクトの口は空くが、第１のダクトの口は塞がれたままである。その結果、ダクト１０内には引き続き幾分かの圧力が存在する。この圧力は、そのままでは流体インタフェースＩを破壊するほどのものではないが、既に発生した破裂を十分に持続させる。従って、前記インタフェースは、全ての排出ダクトの口が空いた状態にされるまで、即ち、ダクト２０内へ３つの粒子が注入された後まで再形成することができない。
【００６１】
従って、この第３の実施形態は、１以上でありかつ好適には１から１０までの範囲内である制御された数の細胞または細胞クラスタを同時にカプセル化する場合に適する。
【００６２】
図８に示す第４の実施形態では、排出ダクト４０、４０’の口４５、４５’にマイクロピラー４５０、４５０’のアレイが設けられる。細胞が不在であれば、相φ１の流れはこれらのピラー間の隙間を通り抜け、２つの横方向の放出ダクト４０及び４０’内へ放出される。１つまたは複数の細胞が相φ２とのインタフェースの近くに止まると、相φ１の流体力学的抵抗が突然高まり、静止細胞に圧力が加わる。ピラー間及び放出ダクト内の損失水頭の大きさを適切に決めることにより、この圧力上昇は、液滴内に閉じこめられた状態の１つまたは複数の細胞を相φ２内へ押し出すに足るものとなる。ピラーの優位点は、損失水頭が正確に決定されることにあり、かつピラー間の細胞の捕獲が制御されることにもある。細胞は幾分変形可能であることから、細胞はピラー間の隙間に留まる状態となり、よって正確に位置決めが行われる。カプセル化のための細胞の直径をＤで表すとすれば、ピラーの直径は、好適にはＤ／５からＤ／３までの範囲内であり、ダクト１０方向の２ピラー間の間隔は、好適には２Ｄ／３から４Ｄ／５までの範囲内である。
【００６３】
図８に示すように、ダクト１０とダクト２０との間の接合部３０には、細胞を安定させかつ細胞を高精度で静止状態に保つ目的で、追加的なマイクロピラーのアレイ４５１を設けることもできる。この追加的なアレイ４５１は、放出ダクトの口に位置するアレイ４５０及び４５０’とは独立して使用されることも可能である。
【００６４】
図１から図３及び図８に示す４つの実施形態では、放出ダクトは対で、第１のダクト１０を中心に正確に対称配置されている。これは、不可欠であるというわけではなく、非対称の放出ダクト、または双方が第１のダクトの片側だけに配置されるダクトでも使用可能である。しかしながら、第１のダクト内を流れる粒子が片側に配置される放出ダクトに吸い込まれ、これにより時ならぬ閉塞が生じることを回避するために、放出ダクトは、少なくとも略対称配置であることが好適である。
【００６５】
先に述べた類のデバイスの物理的寸法は、意図される用途に依存し、かつ具体的には、カプセル化されるべき粒子のサイズに依存する。例として、隔絶される細胞は、約数マイクロメートルの直径を有してもよく、一方でランゲルハンス島型のクラスタは直径５００μｍに達するものであっても、これを超えるものであってもよい。しかしながら、原則として、本デバイスは微小流体型である必要があり、これは、ダクトの横方向寸法が数マイクロメートルまたは数十マイクロメートルから１ミリメートルまたは最大数ミリメートルまでの範囲内である必要があることを意味する。
【００６６】
図４ａ及び図４ｃは、本発明によるデバイスの接合部３０に直近する領域の拡大図を示す。グレーレベルは、２つの液相φ１及びφ２内の圧力値を表す。図４ｂ及び図４ｄのグラフは、各々図４ａ及び図４ｃに示す状況に関するインタフェースＩを通じた圧力差ΔＰ１、ΔＰ２を示す。
【００６７】
図４ａ及び図４ｂの状況では、２つの液相間のインタフェースＩに単一の粒子Ｃ１が存在する。放出ダクトの口は、接合部から粒子の直径より短い距離に位置づけられている。しかしながら、主ダクトの側面には第１の液相が流れることのできる十分なスペースが残っていることから、前記放出ダクトは部分的にしか塞がれない。この例は、口と接合部との距離が、本デバイスのサイズの決定に際して考慮される必要のあるパラメータの１つでしかないことを明示している。
【００６８】
第２の粒子Ｃ２の到着（図４ｃ）は、液体の放出にとって追加的な障害物となる。必然的に、インタフェースを通じた圧力差は増大し、インタフェースＩの破裂を招く臨界値ΔＰＲより大きい値ΔＰ２に達する。従って、これらの２粒子のうちの少なくとも１つは第２のダクト２０内へ注入される。より正確に言えば、ΔＰ１の値がインタフェースの破裂を持続させるに足るものであれば、双方の粒子が注入され、そうでなければ、１つの粒子Ｃ１（列内の最初の粒子）のみが注入され、次いで直後に安定したインタフェースが再形成される。
【００６９】
図４ｅは、圧力差ΔＰの値がインタフェースＩにおける粒子の数ＮＣに依存する様子を示す。実線は、単に視線をガイドするためのものである。ΔＰは、接合部に粒子が存在しないときにもゼロではないことが分かる。この値ΔＰ（０）は、インタフェースにおける表面張力に等しい。
【００７０】
インタフェースを破裂させる圧力差ΔＰＲは、次式、
【００７１】
【数１】
2010012457.tif 000003
【００７２】
で与えられる。ここで、γ１２は２つの液相間の界面張力であり、ｗ及びｄは各々、矩形断面であることが想定される第１のダクトの幅及び深さである。
【００７３】
図４ｂ、図４ｄ及び図４ｅのグラフにおける圧力値の単位は、パスカル（Ｐａ）である。
【００７４】
図１から図３及び図８の実施形態は、平面形状を有する微小流体チップ型デバイスに関するものである。
【００７５】
このようなデバイスは、シリコン、シリカまたはガラス製の基板上へ、従来の写真平板技術及び超小型電子技術に使用される類のエッチングを使用して製造されることが可能である。シリコン上では、この技術は、高精度であり（マイクロメートル級）かつエッチング深さ及びパターン幅にさほど制限がないという優位点を有する。
【００７６】
ある変形例では、本デバイスは、それ自体が写真平板術により製造される「マスタ」を使用して、プラスチック材料（特にポリジメチルシロキサン−ＰＤＭＳ）を成形することにより製造されてもよい。
【００７７】
原則として、本発明によるデバイスの製造には広範な材料が適する可能性がある。好適には、特に本デバイスを使用して移植可能なカプセルを製造する場合、これらの材料は、消毒できるものである必要がある。
【００７８】
また本デバイスは、微小流体の入口及び出口の全てが同じ平面には存在しない三次元形式で製造されてもよい。このような状況下では、カプセルの形成は、副放出ダクトを塞ぐことにより誘発される局所的な圧力上昇だけでなく、重力により細胞または細胞クラスタ上へ加わる沈降力にも起因する。
【００７９】
図５にその一実施形態が略示されているこのようなデバイスは、エッチングまたは成形されたパターンを有する平面基板Ｓ１−Ｓ５の積層によって構成される。第２のダクト２０及び放出ダクト４０、４０’は、前記エッチングされた、または成形されたパターンによって基板間のインタフェースに、基板に平行して形成される。これに対して、第１のダクト１０は貫通穴の積層によって構成され、よってこれは、前記複数の基板を略垂直に通過する。
【００８０】
図１から図５の実施形態では、第１及び第２のダクトはＴ字形の流体接合部３０を形成する（２つのダクトが互いに直交することは必須でないことから、「Ｔ字形」は広義に理解されるべきである）。しかしながら、これが唯一の可能な形状ではない。従って、図６は、微小流体フローの絞り込み接合部３０’の使用に基づく本発明の代替実施形態におけるデバイスを示す。
【００８１】
このデバイスでは、第２のダクトは、接合部３０’で出合う２つの分岐２０ａ及び２０ｂによって形成される。これらの２つの分岐内では、第２の液相φ２が前記接合部へ向かって流れる。
【００８２】
流体接合部３０’は、図１から図３におけるＴ接合部３０のような３分岐接合部ではなく、４分岐接合部である。即ち、分岐２０ａ及び２０ｂから到来する油性相と、第１のダクトから接合部内へ注入される粒子Ｃとを受け入れる目的で、第１のダクト１０の向かいに第３のダクト６０が設けられる。
【００８３】
微小流体フロー絞り込み（ＭＦＦ）の原理は、Ｓ．Ｌ．Ａｎｎａ、Ｎ．Ｂｏｎｔｏｕｘ及びＨ．Ａ．Ｓｔｏｎｅ共著の論文「マイクロチャネルにおける「フローの絞り込み」を使用する分散形成」Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８２（３）、２００３年、３６４−３６６ページ、から知られる。
【００８４】
図７は、細胞または細胞クラスタをカプセル化するための微小流体システム全体の図である。このようなシステムは、
・  本発明のデバイスＤと、
・  前記デバイスの第１のダクト１０内へ、第１の液相φ１及びカプセル化のための粒子で構成される懸濁液を注入するための注入手段であって、例として、シリンジプッシャＰ１または圧力コントローラを有する注入器をそなえてもよい注入手段と、
・  前記デバイスの第２のダクト２０内へ第２の液相φ２を注入するための注入手段であって、同様にシリンジプッシャＰ２または圧力コントローラを有する注入器をそなえてもよい注入手段と、
・  任意選択として、前記第１の液相を放出ダクト４０、４０’（不図示：ある変形例では、前記液体は大気へ放出されてもよい）を介して吸い込むための吸引手段と、
・  カプセルをゲル化するための微小流体手段Ｅと、を備える。図７において、参照記号Ｋは、まだゲル化されていない、単に第１の液相の薄膜に包囲された細胞または細胞クラスタによって構成される「カプセル」を示すが、参照記号Ｋ’はゲル化されたカプセルを示す。
【００８５】
微小流体手段Ｅは、第２の液相φ２が、ゲル化剤（例えば、アルギン酸塩でカプセル化する場合はＣａ＋イオン）を溶液で含む不混和性の第３の液相φ３に接触するＨ形の微小流体デバイスであってもよい。カプセルＫは、第２及び第３の液相間のインタフェースＩ’を通過し、インタフェースＩ’においてゲル化反応に曝され、次いで患者へ移植するために回収される。このようなデバイスは、文献ＵＳ  ２００６／００５１３２９に記載されている。文献ＷＯ  ２００５／１０３１０６は、本発明のカプセル化デバイスと組み合わせた使用に適する別の微小流体ゲル化デバイスについて記載している。
【００８６】
カプセル化デバイスＤとゲル化デバイスＥは、一体形式で（共通の基板または基板積層上に）製造されてもよく、離散していてもよい。
【００８７】
図７のシステムは、必ずしもカプセル選別ユニットを含まないことが分かる。これは、本発明によるデバイスＤが、極度に均一な大きさ及び内容物のカプセルの達成を可能にし、かつ具体的には、空のカプセルの製造回避を可能にする、という事実に起因する。しかしながら、カプセル化のための粒子またはクラスタを選別するためのデバイスは、有利には、カプセル化ユニットの上流に設けられてもよい。先行技術では、多くの微小流体選別デバイスが知られている。例えば、文献ＷＯ  ２００４／０３７３７４、ＷＯ  ２００６／１０２２５８、ＷＯ  ２００２／０２３１６及び２００８年５月１３日に本件出願の出願者名義で出願された「Ｓｙｓｔeｍｅ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ｐｒｏｃeｄe  ｐｏｕｒ  ｌｅ  ｔｒｉ  ｄ’ａｍａｓ  ｄｅ  ｃｅｌｌｕｌｅｓ  ｅｔ  ｄｅ  ｐｒeｆeｒｅｎｃｅ  ｐｏｕｒ  ｌｅｕｒ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｅｎ  ｃｏｔｉｎｕｅ  ｓｕｉｔｅ  a  ｌｅｕｒ  ｔｒｉ」［細胞クラスタを選別しかつ好適には選別後にこれらを連続してカプセル化するための微小流体システムと方法］と題するフランス特許出願第０８０２５７５号参照。
【００８８】
ゲル化デバイスの存在は、必ずしも必要ではない。患者に移植するための中実壁カプセルを取得することが望まれる場合は、概してこれが必須であるが、（特に、研究分析または生体分析の分野では）「カプセル化された」細胞または細胞クラスタを液滴内に懸濁して置くだけで足りるという状況がある。このような状況下では、第１の液相φ１は必ずしもカプセル化剤を含む必要がない。
【図１】
2010012457.tif 000004
【図２】
2010012457.tif 000005
【図３】
2010012457.tif 000006
【図４ａ】
2010012457.tif 000007
【図４ｂ】
2010012457.tif 000008
【図４ｃ】
2010012457.tif 000009
【図４ｄ】
2010012457.tif 000010
【図４ｅ】
2010012457.tif 000011
【図５】
2010012457.tif 000012
【図６】
2010012457.tif 000013
【図７】
2010012457.tif 000014
【図８】
2010012457.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月24日(2009.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2010012457.tif 000016
【図２】
2010012457.tif 000017
【図３】
2010012457.tif 000018
【図４ａ】
2010012457.tif 000019
【図４ｂ】
2010012457.tif 000020
【図４ｃ】
2010012457.tif 000021
【図４ｄ】
2010012457.tif 000022
【図４ｅ】
2010012457.tif 000023
【図５】
2010012457.tif 000024
【図６】
2010012457.tif 000025
【図７】
2010012457.tif 000026
【図８】
2010012457.tif 000027
【外国語明細書】
2010012457000001.pdf
2010012457000002.pdf
2010012457000003.pdf
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