(57)【要約】【課題】  臨床的に安全性が高い、良質なシート状の細胞培養物を得るための方法を提供する。【解決手段】  （ｉ）細胞を基材上に播種する工程、（ｉｉ）細胞を基材に対して加圧する工程、（ｉｉｉ）細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および（ｉｖ）形成された培養物を基材から遊離させる工程を含む、遊離したシート状細胞培養物の製造方法、および同方法により製造された細胞培養物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）細胞を基材上に播種する工程、
（ｉｉ）細胞を基材に対して加圧する工程、
（ｉｉｉ）細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および
（ｉｖ）形成された培養物を基材から遊離させる工程
を含む、遊離したシート状細胞培養物の製造方法。
【請求項２】
細胞が、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で播種される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、筋芽細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
基材が細胞非接着性の表面を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
加圧が、遠心力によって行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
加圧が、２〜２０００Ｇの力で行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
培養が、無血清培地中で行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかの方法により製造された細胞培養物。
【請求項９】
疾病、傷病の治療に用いる、請求項８に記載の細胞培養物。
【請求項１０】
製造工程由来不純物を実質的に含まない、請求項８または９に記載の細胞培養物。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞培養物を含む移植片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を基材に対して加圧することを含む、シート状細胞培養物を製造する方法、およびかかる方法により製造されたシート状細胞培養物、特に、製造工程由来不純物を実質的に含まないシート状細胞培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患では、心筋組織に十分な酸素が行き渡らなくなり、この状態が長時間続くと心筋組織に傷害が生じる。元来成体の心筋細胞は自己複製能に乏しいため、一旦傷害を受けると心筋の修復はできないか、例え修復できたとしてもごく限られた回復しか期待できず最終的に心不全に陥ってしまう。
【０００３】
心不全の有効な治療方法として心臓移植があるが、移植までの待機中にブリッジとして左室補助人工心臓を装着するケースが多い。
しかし心臓移植は、免疫抑制治療に伴う感染症の危険性、遠隔期の冠動脈硬化病変の出現、絶対的なドナー不足などが深刻な問題となっており、また現在の補助人工心臓は、血栓塞栓症・感染などの合併症、装置の耐久性の問題から患者ＱＯＬが非常に制限され、長期補助が困難である。
【０００４】
このような中で新たな治療法として研究が進められているのが、心筋組織への骨格筋芽細胞移植である。
骨格筋に含まれる筋芽細胞は、筋肉が損傷を受けたとき分裂し修復を行う。心筋と骨格筋は構造、機能などに類似する部分が多く、そのため骨格筋由来の筋芽細胞は傷害心筋も修復し得ると考えられている。海外では自己骨格筋芽細胞の心筋への移植が臨床的に応用されつつある。
【０００５】
骨格筋芽細胞の移植による心機能の低下抑制に関するメカニズムは明らかでないが、筋芽細胞を拍動している心筋に移植することで、メカニカル・ストレッチが加わる場で細胞の配列に配向性が生じ適切な分化が行われていることが考えられ、またＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）などのサイトカイン・デリバリー・システムとして機能している可能性も考えられている。
【０００６】
しかしながら、梗塞心臓に対するシングル・セルとしての筋芽細胞懸濁液の移植では、移植細胞の障害損失、レシピエント心の注入時の組織障害、レシピエント心への組織供給効率、不整脈の発生、梗塞部位全体への治療困難などの欠点が指摘されており、これらに対応すべく筋芽細胞のシート化が渇望された。
【０００７】
これに対し、特定の培養条件によって細胞を増殖させることにより予想以上に組織化が進展し、且つ培養皿から剥離し易いという性質をもった人工組織が見出され、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元組織構造体としての細胞シートと、その製造方法が提供された（特許文献１参照）。
【０００８】
ところで、公知の製造方法で使用される細胞培養液は、目的とする細胞が増殖する限りどのような培地でも良いとされており、公知のウシ胎仔由来血清等の血清が添加されている培地でも良いとされている（例えば、特許文献１参照）。
【０００９】
また、心筋前駆細胞等の増殖に用いる細胞培養液には、ウシ胎仔血清、ウマ血清、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２を用いることが公知されている（特許文献２参照）。
【００１０】
このように、シート状の細胞培養物の形成は、通常、細胞を増殖させて行っており、細胞の増殖促進のため、異種血清成分以外に成長因子の添加が一般に行われているが、一方で、例えば、コンフルエントになると分化する傾向がある骨格筋芽細胞などでは、増殖した細胞の分化への移行を抑制するため、骨格筋芽細胞の培養液にはステロイド剤を添加することが一般的である。ステロイド剤を添加しないと、骨格筋芽細胞は１６時間程度の培養で分化を始めて、管状の筋管を形成してしまい、シート状の細胞培養物を得ることが不可能となる。
さらに、培養液には、抗酸化作用を目的としたセレンの添加が行われる場合がある。
【００１１】
しかし臨床への適用を考えると、異種血清成分などの非自己血清成分にはレシピエントに感染し得るウイルスなどの病原体が含まれる恐れがあり、成長因子も、通常は微生物を利用して組換え的に製造されることを考えると、残存した場合に製造工程由来不純物となり得るため、安全性の観点からそのまま移植に利用することはできない。
【００１２】
また、セレンは生体にとって抗酸化酵素の合成に必要な必須元素であり、セレノシステインとして蛋白質に組み込まれ、主にセレノプロテインとして働き、ビタミンＥやＣと協調して活性酸素やラジカルから生体を防御すると考えられている。しかし、セレンは、適正量と中毒量との幅が非常に狭く、過剰症として悪心、吐き気、下痢、食欲不振、頭痛、免疫抑制、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）減少などの症状が知られている。さらに、亜セレン酸は「毒物及び劇物指定令」（昭和４０年１月４日  政令第２号）で毒物指定品目に指定されている。一方ステロイド剤は、その副作用として副腎皮質機能不全、クッシング症候群などが知られており、いずれも製造工程由来不純物として移植に際して除去することが好ましい成分である。
【００１３】
これらの製造工程由来不純物は、通常、細胞培養物をこれらの物質を含まない媒体で洗浄することによって除去するが、細胞培養物は機械的に極めて脆弱であり、洗浄時の水流などにより容易に破壊されるため、細胞培養物における製造工程由来不純物を臨床上障害とならないレベルまで洗浄することはこれまで極めて困難であった。
さらに、自己血清は、非自己血清による上記のようなリスクは有しないものの、事前にレシピエントから採血する必要があるなど、レシピエントや医療従事者に身体的・時間的負担を強いるものであり、レシピエントの状態によっては、入手が困難なケースもある。
【００１４】
しかも、かかる細胞培養物を培養基材から剥離するには、ピペッティングやスクレーピングなどによる機械的手法や、トリプシンなどによる酵素処理といった通常の付着細胞剥離法では、細胞培養物の構造が壊れたり、細胞が損傷したりするため、従来は温度応答性材料がコートされた培養皿で細胞を培養し、温度を変化させて同材料の疎水性を変化させることにより細胞培養物を剥離させていた（特許文献１）。しかしながら、かかる培養皿は高価であるうえ、培養皿が温度低下するまでの待機時間や細胞による剥離状態の多様性に起因する、剥離時の細胞培養物構造の破壊や、細胞の損傷などの問題を完全に解消するには至っていない。
したがって、臨床的に安全性が高い、良質なシート状の細胞培養物を得るための方法的改善が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２００８−１６１１８３号公報
【特許文献３】特開２００１−１２８６６０号公報
【特許文献４】特開２００４−１６６６０３号公報
【特許文献５】特開２００４−１６６６０４号公報
【特許文献６】特開２００４−２８３０１０号公報
【特許文献７】特表２０００−５１６８０２号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Kato et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85(24):9552-6
【非特許文献２】Ballock and Reddi, J Cell Biol. 1994;126(5):1311-8
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、臨床への適用に障害となり得る製造工程由来不純物成分を含まない良質な細胞培養物、およびその製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記課題解決のために鋭意研究を続けたところ、細胞を基材上に播種した後、基材に対して加圧してから培養することにより、血清要求性の細胞種においても無血清培地でシート状の細胞培養物を得ることができ、しかも、得られた細胞培養物を、シートの形態のまま基材から容易に剥離することが可能となることを見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
肝細胞に遠心力や水圧を負荷して中空糸などの容器や、容器中のインサートに充填して細胞凝集体を形成し、これを種々の添加物を含む培地中で培養する技術は、例えば、特許文献３〜６などに記載されているが、これらの技術は、細胞を容器から遊離させずに、容器ごと使用することを前提としたものである。また、軟骨細胞や間葉始原細胞を遠心管に入れて遠心し、そのまま遠心管中で、種々の添加物を含む培地とともに培養して軟骨組織様ペレットを作製する技術は、例えば、特許文献７、非特許文献１、非特許文献２などに記載されているが、遊離したシート状細胞培養物の作製については何ら教示するところはない。したがって、本発明者らの上記知見は驚くべきものである。
【００２０】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）（ｉ）細胞を基材上に播種する工程、
（ｉｉ）細胞を基材に対して加圧する工程、
（ｉｉｉ）細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および
（ｉｖ）形成された培養物を基材から遊離させる工程
を含む、遊離したシート状細胞培養物の製造方法。
（２）細胞が、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で播種される、上記（１）の方法。
（３）細胞が、筋芽細胞を含む、上記（１）または（２）の方法。
（４）基材が細胞非接着性の表面を有する、上記（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）加圧が、遠心力によって行われる、上記（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）加圧が、２〜２０００Ｇの力で行われる、上記（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）培養が、無血清培地中で行われる、上記（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８）上記（１）〜（７）のいずれかの方法により製造された細胞培養物。
（９）疾病、傷病の治療に用いる、上記（８）の細胞培養物。
（１０）製造工程由来不純物を実質的に含まない、上記（８）または（９）の細胞培養物。
（１１）上記（８）〜（１０）のいずれかの細胞培養物を含む移植片。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、シート状細胞培養物の製造にあたって、一般に細胞増殖に必要な因子として添加する血清や成長因子を含有しない非細胞増殖系の培養液での培養が可能となるため、血清中の有害成分や、通常は組換え品である成長因子に含まれ得るエンドトキシンなどの混入を避けることができるうえ、分化抑制剤として添加するステロイド剤が不要となる。さらに本発明により、酸化防止のためのセレンまたはその誘導体が不要となる。この結果、製造工程由来不純物を含まない、臨床において安全性の高い細胞培養物を提供することが可能となるとともに、異種血清の代替物としての自己血清を調製する必要もなくなる。
【００２２】
また、基材上に形成された細胞培養物は、ピペッティングなどの簡単な操作で基材から遊離させることができるため、従来のように剥離時に細胞培養物の構造が壊れることがない。しかも、基材には、細胞非接着表面を有する市販の培養容器を利用することができるため、高価な温度応答性培養皿を入手する必要がなくなる。
しかも、血清や成長因子などを含まない培地で培養した場合、作製した細胞培養物の損傷が懸念される製造工程由来不純物の除去を目的とした洗浄などの操作が不要となり、細胞培養物のより確実で安定した製造が可能となるうえ、得られた細胞培養物のタンパク質分解酵素に対する強度を高めることができる。
さらに、本発明の方法により、所望の大きさ・形状の細胞培養物が短期間で製造できるため、細胞培養物を利用した生体の処置をより柔軟かつ容易に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、温度応答性培養皿にて、無血清培地で培養した細胞培養物を示した写真図である（×２００）。
【図２】図２は、細胞非接着性表面を有する基材に細胞を遠心により加圧した後、血清含有培地で培養した細胞培養物を示した写真図である。上段は遠心をしなかったサンプル、中段は５０Ｇ（５００ｒｐｍ）で遠心したサンプル、下段は４５０Ｇ（１５００ｒｐｍ）で遠心したサンプルを、左列は基材から剥離させたサンプル、右列は広げた状態のサンプル（×４０）をそれぞれ示す。
【図３】図３は、細胞非接着性表面を有する基材に細胞を遠心により加圧した後、無血清培地で培養した細胞培養物を示した写真図である。上段は遠心をしなかったサンプル、中段は５０Ｇ（５００ｒｐｍ）で遠心したサンプル、下段は４５０Ｇ（１５００ｒｐｍ）で遠心したサンプルを、左列は基材から剥離させたサンプル、右列は広げた状態のサンプル（×４０）をそれぞれ示す。
【図４】図４は、細胞非接着性表面を有する基材に細胞を遠心により加圧した後、血清含有培地（右）または無血清培地（左）で培養した細胞培養物を示した写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、（ｉ）細胞を基材上に播種する工程、（ｉｉ）細胞を基材に対して加圧する工程、（ｉｉｉ）細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および（ｉｖ）形成された培養物を基材から遊離させる工程、を含む、遊離したシート状細胞培養物の製造方法に関する。
本発明における細胞には、細胞培養物、特にシート状の細胞培養物を形成し得る任意の細胞が含まれる。かかる細胞の例としては、限定されずに、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、心筋細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、上皮細胞、内皮細胞などが含まれる。これらのうち、本発明においては、単層の細胞培養物を形成するもの、例えば、筋芽細胞が好ましい。細胞は、細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。また、本発明の方法に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上である。
【００２５】
本発明において、「基材」は、細胞をそれに対して加圧し得る表面または界面を有するものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形、半固形もしくは液体の表面または界面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。また、容器は、その内部に固形、半固形もしくは液体の表面または界面を有してもよい。固形の表面としては、種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリクスなどが、液体の表面としては、高粘性の液体媒体、液体の界面としては、比重の異なる液体間に生じる界面、例えば、密度勾配法による細胞分離用の比重液（ショ糖、塩化セシウム、硫酸セシウム、Percoll(R)、Ficoll(R)、Nycodenz(R)、OptiPrepTM、ISolateTM、ISOLYMPHなどの溶液）における界面などが挙げられる。
上記表面または界面は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、典型的には、１〜２００ｃｍ２、好ましくは２〜１００ｃｍ２、より好ましくは３〜５０ｃｍ２である。
【００２６】
本発明の好ましい態様において、基材は細胞非接着性の表面または界面を有する。ここで、「細胞非接着性」とは、付着細胞が接着しないか、または接着しにくいことを意味する。例えば、付着細胞は、接する表面の疎水性または親水性がある程度以上高いと接着しにくくなることが知られている。したがって、本発明における細胞非接着性の表面または界面は、ある程度以上の疎水性または親水性を有することが好ましい。表面の疎水性または親水性の程度は、例えば、水接触角で表すことができるが、本発明において、細胞非接着性表面の水接触角は、好ましくは７０°以上または５０°以下、特に７５°以上または４０°以下である。
【００２７】
細胞非接着性の材料としては、例えば、限定することなく、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミドなどを挙げることができる。また、市販の浮遊細胞培養用の容器は細胞非接着性の表面を有するため、これを本発明の基材として用いることもできる。さらにまた、表面を改質して細胞非接着性とすることもできる。具体的には、例えば、表面に親水性または疎水性の分子をコーティングしたり、表面に温度変化により疎水性または親水性となる温度応答性材料（特開平２−２１１８６５参照）を被覆したりすることができる。しかし、本発明の一態様において、基材は温度応答性材料から構成される表面を有しない。
【００２８】
温度応答性材料としては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーが挙げられる。
【００２９】
本発明の好ましい態様において、細胞は、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で播種する。「実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」とは、成長因子を含まない非増殖系の培養液で培養した場合に、シート状細胞培養物を形成することができる細胞密度を意味する。例えば、骨格筋芽細胞の場合、成長因子を含む培養液を用いる従来法では、シート状細胞培養物を形成するために、約６，５００個／ｃｍ２の密度の細胞をプレートに播種していたが（例えば、特許文献１参照）、かかる密度の細胞を、成長因子を含まない培養液で培養してもシート状の細胞培養物を形成することはできない。したがって、本態様における細胞密度は、成長因子を含む培養液を用いる従来法におけるものよりも高いものである。具体的には、例えば、骨格筋芽細胞については、かかる密度は典型的には３００，０００個／ｃｍ２以上である。細胞密度の上限は、細胞培養物の形成が損なわれず、細胞が分化に移行しなければ特に制限されないが、骨格筋芽細胞については、例えば、１，０００，０００個／ｃｍ２である。当業者であれば、本発明に適した細胞密度を、実験により適宜決定することができる。培養期間中、細胞は増殖してもしなくてもよいが、増殖するとしても、細胞の性状が変化する程には増殖しない。例えば、骨格筋芽細胞はコンフルエントになると分化を開始するが、本発明においては、骨格筋芽細胞は、細胞培養物は形成するが、分化に移行しない密度で播種される。本発明の好ましい態様において、細胞は計測誤差の範囲を超えて増殖しない。細胞が増殖したか否かは、例えば、播種時の細胞数と、細胞培養物形成後の細胞数とを比較することにより評価することができる。本態様において、細胞培養物形成後の細胞数は、典型的には播種時の細胞数の３００％以下、好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、さらに好ましくは１２５％以下、特に好ましくは１００％以下である。
【００３０】
本発明において、「基材に対して加圧する」とは、細胞を所定の大きさの力で基材、または、基材に直接もしくは他の細胞を介して接触している他の細胞に接触させることを意味する。力の種類は、上記作用を奏するものであれば特に限定されず、例えば、遠心力や圧力などが挙げられる。
遠心力を負荷する場合、基材と細胞とを含む容器などを遠心分離器を用いて遠心することができる。負荷する遠心力は、典型的には約２〜２０００Ｇ、好ましくは約５〜１０００Ｇ、より好ましくは約１０〜８００Ｇ、特に好ましくは５０〜４５０Ｇである。細胞に損傷を与えない程度で、より強い遠心力を負荷することにより、細胞培養物の均一性をより高めること、すなわち、細胞培養物の空隙をより少なくすることができる。遠心時間は、典型的には２〜６０分間、好ましくは３〜１５分間、より好ましくは３〜５分間であり、遠心温度は、典型的には２〜３７℃、より好ましくは４〜２５℃である。
【００３１】
圧力の負荷は、例えば、透過性の基材に向けて細胞に水圧を負荷することにより行うことができる。水圧は、シリンジやポンプなどにより負荷することができる。負荷する水圧は、典型的には１０〜１００ｍｍＨｇ、好ましくは２０〜８０ｍｍＨｇ、より好ましくは３０〜５０ｍｍＨｇであり、負荷時間は、典型的には３〜９０分間、好ましくは５〜６０分間、より好ましくは５〜１５分間であり、負荷温度は、典型的には２〜３７℃、より好ましくは４〜２５℃である。
【００３２】
本発明において、細胞の培養は、対象となる細胞がシート状の細胞培養物を形成するのに適した条件で行われる。
本発明において、「シート状の細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１つの細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも機械的に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも機械的に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
【００３３】
本発明のシート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本発明の細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本発明の細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
【００３４】
本発明の一態様において、細胞の培養は、所定の期間内、好ましくは、細胞が分化に移行しない期間内に行われる。したがって、この態様において、細胞は、培養期間中、未分化の状態に維持される。細胞の分化への移行は、当業者に知られた任意の方法で評価することができる。例えば、骨格筋芽細胞の場合は、ＭＨＣの発現や、細胞の多核化を分化の指標とすることができる。本発明の好ましい態様において、培養期間は４８時間以内、より好ましくは４０時間以内、さらに好ましくは２４時間以内である。
【００３５】
培養に用いる細胞培養液（単に「培養液」もしくは「培地」と呼ぶ場合もある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本発明の一態様において、培養液は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。一例として、下記表１にＭＣＤＢ１３１およびＤＭＥＭの組成を示す。
【００３６】
【表１】
2010226962.tif 000002
【００３７】
【表２】
2010226962.tif 000003
基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本発明に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。
【００３８】
基礎培地に含まれるアミノ酸としては、限定されずに、例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンなどが、ビタミン類としては、限定されずに、例えば、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ビオチン、リポ酸、ビタミンＢ１２、アデニン、チミジンなどが、そして、電解質としては、限定されずに、例えば、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＳＯ４、Ｎａ２ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮａＶＯ３、ＮｉＣｌ２、ＺｎＳＯ４などがそれぞれ含まれる。基礎培地には、これらの成分のほか、Ｄ−グルコースなどの糖類、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬、プトレシンなどを含んでもよい。
【００３９】
本発明の一態様において、基礎培地に含まれるアミノ酸の濃度は、Ｌ−アルギニン：６３．２〜８４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン：３５〜６３ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン：４．４〜５８４ｍｇ／Ｌ、グリシン：２．３〜３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン：４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン：６６〜１０５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン：１０５〜１３１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン：１４６〜１８２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン：１５〜３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン：３３〜６６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−セリン：３２〜４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トレオニン：１２〜９５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン：４．１〜１６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン：１８．１〜１０４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン：９４〜１１７ｍｇ／Ｌである。
また、本発明の一態様において、基礎培地に含まれるビタミン剤の濃度は、Ｄ−パントテン酸カルシウム：４〜１２ｍｇ／Ｌ、塩化コリン：４〜１４ｍｇ／Ｌ、葉酸：０．６〜４ｍｇ／Ｌ、ｉ−イノシトール：７．２ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド：４〜６．１ｍｇ／Ｌ、リボフラビン：０．００３８〜０．４ｍｇ／Ｌ、チアミン：３．４〜４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン：２．１〜４ｍｇ／Ｌである。
【００４０】
細胞培養液は、上記のほか、血清、成長因子、ステロイド剤成分、セレン成分などの１種または２種以上の添加物を含んでもよい。しかし、これらの成分は臨床においてはレシピエントに対するアナフィラキシーショック等の副作用要因となり得ることが否定できない製造工程由来不純物であり、臨床への適用にあたっては排除すべき成分である。したがって、本発明の好ましい態様において、細胞培養液は、これらの添加物の少なくとも１種の有効量を含まない。また、本発明のより好ましい態様において、細胞培養液は、これらの添加物の少なくとも１種を実質的に含まない。さらに、本発明の特に好ましい態様において、細胞培養液は、添加物を実質的に含まない。したがって、細胞培養液は、基礎培地のみを含んでもよい。
【００４１】
本発明の好ましい一態様において、細胞培養液は血清成分を実質的に含まない。血清成分を実質的に含まない細胞培養液のことを、本明細書中で「無血清培地」と呼ぶこともある。血清成分としては、異種血清成分および同種血清成分が挙げられる、ここで「異種血清成分」は、細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する血清成分を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清成分に該当する。また、「同種血清成分」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する血清成分を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト血清が同種血清成分に該当する。同種血清成分は、自己血清成分、すなわち、レシピエントに由来する血清成分を含む。したがって、「血清成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの血清の含量が、細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度（例えば、細胞培養物中の血清アルブミン含量が５０ｎｇ未満となる量）であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないことを意味する。なお、本明細書中で、自己血清以外の血清、すなわち、異種血清と同種非自己血清を他家血清または非自己血清と総称することもある。
【００４２】
本発明の一態様において、細胞培養液は有効量の成長因子を含まない。ここで、「成長因子」は、細胞の増殖を、それがない場合に比べて促進する任意の物質を意味し、例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などを含む。また、「有効量の成長因子」とは、細胞の増殖を、成長因子がない場合に比べて、有意に促進する成長因子の量、または、便宜的に、当該技術分野において細胞の増殖を目的として通常添加する量を意味する。細胞増殖促進の有意性は、例えば、当該技術分野で知られた任意の統計学的手法、例えば、ｔ検定などにより適宜評価することができ、また、通常の添加量は当該技術分野の種々の公知文献から知ることができる。具体的には、骨格筋芽細胞の培養におけるＥＧＦの有効量は、例えば０．００５μｇ／ｍＬ以上である。
【００４３】
したがって、「有効量の成長因子を含まない」とは、本発明における培養液における成長因子の濃度がかかる有効量未満であることを意味する。例えば、骨格筋芽細胞の培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは０．００５μｇ／ｍＬ未満、より好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ未満である。本発明の好ましい態様においては、培養液における成長因子の濃度は、生体における通常の濃度未満である。かかる態様においては、例えば、骨格筋芽細胞の培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは５．５ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは１．３ｎｇ／ｍＬ未満、さらに好ましくは、０．５ｎｇ／ｍＬ未満である。さらに好ましい態様において、本発明における培養液は、成長因子を実質的に含まない。ここで、実質的に含まないとは、培養液中の成長因子の含量が、細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液に成長因子を積極的に添加しないことを意味する。したがって、この態様においては、培養液は、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度の成長因子を含まない。
【００４４】
本発明の一態様において、細胞培養液は、ステロイド剤成分を実質的に含まない。ここで「ステロイド剤成分」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。したがって、「ステロイド剤成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの化合物の含量が、細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの化合物を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のステロイド剤成分を含まないことを意味する。
【００４５】
本発明の一態様において、細胞培養液は、セレン成分を実質的に含まない。ここで「セレン成分」は、セレン分子、およびセレン含有化合物、特に、生体内でセレン分子を遊離し得るセレン含有化合物、例えば、亜セレン酸などを含む。したがって、「セレン成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの物質の含量が、細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のセレン成分を含まないことを意味する。具体的には、例えば、ヒトの場合、培養液中のセレン濃度は、ヒト血清中の正常値（例えば、１０．６〜１７．４μｇ／ｄＬ）に、培地中に含まれるヒト血清の割合を乗じた値よりも低い（すなわち、ヒト血清の含量が１０％（ｖ／ｖ）であれば、セレン濃度は、例えば、１．０〜１．７μｇ／ｄＬ未満である）。
【００４６】
本発明の上記好ましい態様においては、生体に適用する細胞培養物を作製する場合に従来必要であった、成長因子、ステロイド剤成分、異種血清成分などの製造工程由来不純物を、洗浄などにより除去する工程が不要となる。したがって、本発明の方法の一態様は、この製造工程由来不純物を除去する工程を含まない。
ここで、「製造工程由来不純物」とは、典型的には、製造各工程に由来する以下に列挙するものが含まれる。すなわち、細胞基材に由来するもの（例えば、宿主細胞由来蛋白質、宿主細胞由来ＤＮＡ）、細胞培養液に由来するもの（例えば、インデューサー、抗生物質、培地成分）、あるいは細胞培養以降の工程である目的物質の抽出、分離、加工、精製工程に由来するものなどである（例えば、医薬審発第５７１号参照）。
【００４７】
細胞の培養は、当該技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。培養期間は、細胞培養物の十分な形成、および、細胞分化防止の観点から、好ましくは４８時間以内、より好ましくは４０時間以内、さらに好ましくは２４時間以内である。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。本発明の方法において、細胞は実質的に増殖しないため、従来の方法のように細胞培養物が所望の大きさに成長するのを待つことなく、所望の大きさおよび形状の細胞培養物を短期間で得ることが可能となる。細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。
細胞培養物の基材からの遊離は、細胞培養物が少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている基材から遊離できれば特に限定されないが、典型的には、ピペッティングなどによって行う。また、細胞を、温度によって表面の親水性が変化する温度応答性基材上で培養し、形成された細胞培養物を温度変化により、非酵素的に遊離することもできる。
【００４８】
本発明の方法は、細胞の採取から、細胞の増殖および細胞培養物の作製を経て、細胞培養物の適用に至る、再生治療の一工程として位置づけることもできる。したがって、本発明は、
（ｉ）対象から採取した組織または生体液から所望の細胞を単離する工程、
（ｉｉ）単離した細胞を増殖させる工程、
（ｉｉｉ）細胞を基材上に播種する工程、
（ｉｖ）細胞を基材に対して加圧する工程、
（ｖ）細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および
（ｖｉ）形成された培養物を基材から遊離させる工程、
を含む、再生治療用シート状細胞培養物の製造方法にも関する。
【００４９】
本発明はまた、上記製造方法によって作製された細胞培養物、さらには、他家血清、成長因子、ステロイド剤および／またはセレン成分を実質的に含まない細胞培養物、特にシート状の細胞培養物に関する。好ましい態様において、本発明の細胞培養物は、上記成分を含む製造工程由来不純物を実質的に含まない。この細胞培養物は、細胞を、他家血清、成長因子、ステロイド剤および／またはセレン成分を実質的に含まない培養液で培養して、細胞培養物を形成させることにより作製することができる。ここで、細胞培養物が他家血清、成長因子、ステロイド剤および／またはセレン成分を実質的に含まないとは、細胞培養物が、これらの成分を、レシピエントに悪影響を与える濃度で含まないことを少なくとも意味するが、細胞培養物の形成を、他家血清、成長因子、ステロイド剤および／またはセレン成分を実質的に含まない培養液で行うことにより、かかる条件を充足することができる。さらに好ましい態様において、本発明の細胞培養物は、製造工程由来不純物のほか、自己血清も実質的に含まない。ここで、「実質的に含まない」の意味は、上記と同様である。
本発明の細胞培養物は、対象の疾病、傷病の治療に用いることができる。例えば、骨格筋芽細胞による細胞培養物は、心疾患、例えば、心筋梗塞、拡張型心筋症などに、移植片などの形態で用いることができる。したがって、本発明の別の態様は、上記細胞培養物を含む移植片に関する。
【実施例】
【００５０】
以下に、本発明を具体例に基づいてさらに説明するが、かかる具体例は、本発明の例示であり、本発明を限定するものではない。
【００５１】
比較例１  無血清培地の検討
血清成分を含まないＭＣＤＢ１３１培地、ＩＭＤＭ培地（GIBCO製）、ＣＤハイブリドーマ培地（GIBCO製）、乳腺上皮細胞用培地（GIBCO製）または神経幹細胞用培地（GIBCO製）に０．０１μｇ／ｍＬ上皮成長因子（Invitrogen製）、４μｇ／ｍＬリン酸デキサメタゾンナトリウム注射液（第一三共製薬製）を添加した後、各々２ｍＬにヒト筋芽細胞３．０×１０６〜３．１×１０６個ずつを懸濁し、φ３．５ｃｍ温度応答性培養皿（セルシード製）にそれぞれ播種した。
播種後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養を行い１８時間後に状態観察を実施した結果、いずれの培養細胞においても、シート状の細胞培養物の形成は認められなかった。
図１に、無血清培地を用いた細胞培養１８時間後の外観図を示す。この結果から、従来の手法では、シート状細胞培養物の作製に血清成分が不可欠であることが明らかとなった。
【００５２】
実施例１  血清含有培地での検討
ヒト骨格筋芽細胞（Lonza製、Lot 6F4296）を２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地（GIBCO製）で増殖させた後、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地で液体窒素中で凍結保存した。細胞を３７℃で急速融解後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地で懸濁し、細胞非接着性表面を有する浮遊系細胞用のマルチウェルTMＴＣプレート４８ウェル（BD製、code: 351178）に１．２×１０６個／ウェルの密度で播種した。プレートを遠心機（RL-603、TOMY製、TS-9ローター）にセットして、５０Ｇ（５００ｒｐｍ）または４５０Ｇ（１５００ｒｐｍ）、２０℃で５分遠心後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２２時間培養した。培養後、ピペッティングによりシート状になった細胞培養物をプレートから剥離させた（図２、右列）。さらに、３５ｍｍぺトリディッシュ（BD製）に細胞シートを移し、シートを広げた（図２、左列）。各図が示すとおり、遠心しなかったサンプルは、細胞培養物に多数の大きな空隙が存在しているうえ、非常にもろく、実用に耐えないものであったのに対し、遠心したすべてのサンプルで、臨床的に使用できる品質のシート状の細胞培養物の形成が認められた。また、回転数を上げる（遠心加速度を増大させる）ことにより、細胞培養物の均一性が改善された。さらに、シート状の構造は細胞の接着能により形成されており、細胞が死んでしまうとかかる構造は形成されないところ、遠心したすべてのサンプルでシート状の細胞培養物が維持されていることは、これを構成する細胞の生存率が高いことを示すものである。
さらに、ここで用いたマルチウェルTMＴＣプレート４８ウェルの蒸留水に対する接触角を測定接触角測定器G-I型(エルマ社製)で測定したところ、７５〜８０°であった。
【００５３】
実施例２  無血清培地での検討
ヒト骨格筋芽細胞（Lonza製、Lot 6F4296）を２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地（GIBCO製）で増殖させた後、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地で液体窒素中で凍結保存した。細胞を３７℃で急速融解後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、血清を添加していないＤＭＥＭ／Ｆ１２（GIBCO製）で懸濁し、細胞非接着性表面を有する浮遊系細胞用のマルチウェルTMＴＣプレート４８ウェル（BD製、code: 351178 ）に１．２×１０６個／ウェルで播種した。遠心機（RL-603、TOMY製、TS-9ローター）にセットして、５０Ｇ（５００ｒｐｍ）または４５０Ｇ（１５００ｒｐｍ）、２０℃で５分遠心後、３７℃、５％ＣＯ２で４６時間培養した（図３、上側）。培養後、ピペッティングによりシート状になった細胞培養物をプレートから遊離させた。さらに、３５ｍｍぺトリディッシュ（BD製）に細胞シートを移し、シートを広げた（図３、下側）。各図が示すとおり、遠心しなかったサンプルは、細胞培養物に多数の大きな空隙が存在しており、実用に耐えないものであったのに対し、遠心したすべてのサンプルで、臨床的に使用できる品質のシート状の細胞培養物の形成が認められた。また、回転数を上げる（遠心加速度を増大させる）ことにより、細胞培養物の均一性が改善された。さらに、上記のとおり、遠心したすべてのサンプルにおいて、細胞の生存率が高いことも示された。
さらに、ここで用いたマルチウェルTMＴＣプレート４８ウェルの蒸留水に対する接触角を測定接触角測定器G-I型(エルマ社製)で測定したところ、７５〜８０°であった。
【００５４】
実施例３  無血清培地と血清含有培地との比較検討
ヒト骨格筋芽細胞（Lonza製、Lot 6F4296）を２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地（GIBCO製）で増殖させた後、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地で液体窒素中で凍結保存した。細胞を３７℃で急速融解後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、（１）血清を添加していないＤＭＥＭ／Ｆ１２（GIBCO製）または（２）２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地で懸濁し、細胞非接着性表面を有する浮遊系細胞用のマルチウェルTMＴＣプレート４８ウェル（BD製、code: 351178）に１．２×１０６個／ウェルで播種した。遠心機（RL-603、TOMY製、TS-9ローター）にセットして、４５０Ｇ（１５００ｒｐｍ）、２０℃で５分遠心後、３７℃、５％ＣＯ２で４６時間培養した（図４）。培養後、ピペッティングによりシート状になった細胞培養物をプレートから遊離させ、３５ｍｍぺトリディッシュ（BD製）に細胞培養物を移した。さらに、細胞培養物を浮遊させているＨＢＳＳを取り除き、トリプシン様酵素消化液（トリプルセレクト、GIBCO製）を１．５ｍＬ添加後、振盪機（TAITEC製）上に設置し、細胞培養物を１００ｒｐｍで振盪した。
１５分後に細胞の外観を確認したところ、血清含有培地で作製した細胞培養物はばらばらになっていたが（図４、右側）、無血清培地で作製した細胞培養物は、形状を維持しており（図４、左側）、より強度が高いことが明らかとなった。
さらに、ここで用いたマルチウェルTMＴＣプレート４８ウェルの蒸留水に対する接触角を測定接触角測定器G-I型(エルマ社製)で測定したところ、７５〜８０°であった。
【００５５】
実施例４  密度勾配液中での遠心
ヒト骨格筋芽細胞（Lonza社製、Lot 6F4296）を２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地で増殖させた後、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地で液体窒素中で凍結保存する。細胞を３７℃で急速融解後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、血清を添加していないＤＭＥＭ／Ｆ１２（GIBCO製）で懸濁して、細胞懸濁液を調製する。比重が１．０７７〜１．３１９ｇ／ｍＬのFicoll-Paque PLUS（GEヘルスケア  バイオサイエンス製）を遠心管に入れ、調製した細胞懸濁液をバンド状に静かに重層する。遠心管を、超遠心機で４００Ｇで３０分間、２０℃で遠心し、自己密度勾配形成法により密度勾配を形成させ、細胞を所定の層に集める。ここで、細胞は、密度勾配液中の特定の比重の層からなる界面に押し当てられる。遠心管中の細胞は、そのまま、３７℃、５％ＣＯ２で２４〜４８時間培養して、シート状細胞培養物を形成する。あるいは、遠心管中の細胞懸濁液を含むバンドをデカンテーションにより取り出し、必要に応じて軽く洗浄した後、無血清培地または血清含有培地中、３７℃、５％ＣＯ２で２４〜４８時間培養して、シート状細胞培養物を形成する。このように密度勾配液中で遠心することにより、細胞を所定の層に集め、培養することで、シート状細胞培養物を形成することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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