(57)【要約】【課題】コウヤマキからの抽出物の有効成分を利用した、ピロリ菌、ニキビ菌、緑膿菌および黄色ブドウ球菌に有効な抗菌剤を提供することにある。【解決手段】  コウヤマキの枝・茎・葉・球果・樹皮・樹幹および根を使用し、溶媒抽出の場合は溶媒として、水・エタノール等のアルコール類の他、プロピレングルコール、グリセリン等を使用して、コウヤマキから抽出した液を、濾過して抽出液を得る。必要に応じ、溶媒を除去したり、あるいはそのまま希釈して使用したり、また乾燥処理して、粉末状の抽出物として使用する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水及び又は有機溶媒に、コウヤマキ科の枝・茎・葉・球果・樹皮・樹幹および根を浸漬し、抽出処理して得られる抽出物、を有効成分とする、抗菌剤であって、ニキビ菌の一種であるアクネ菌に有効な抗菌剤
【請求項２】
請求項１記載の抽出物を有効成分とする抗菌剤であって、ピロリ菌に有効な抗菌剤
【請求項３】
請求項１記載の抽出物を有効成分とする抗菌剤であって、緑膿菌に有効な抗菌剤
【請求項４】
請求項１記載の抽出物を有効成分とする抗菌剤であって、黄色ブドウ球菌に有効な抗菌剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、コウヤマキから抽出物を有効成分とする、ピロリ菌・ニキビ菌・緑膿菌および黄色ブドウ球菌に有効な抗菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コウヤマキからの抽出物が、歯垢予防・除去および歯石沈着防止・溶解に有用なものであること、また、歯周病予防・治療に有用なものであることについては、出願人による特願２００５ー２０３７７４がある。
【０００３】
ピロリ菌（Helicobacter pylori、ヘリコバクター・ピロリ）による感染は、昨今、病院等の医療施設・特殊老人養護ホームにおける院内感染、ホテル等の宿泊施設で大きな話題となったが、このピロリ菌は胃粘膜上皮細胞に定着していることから経口感染するものと考えられており、しかも感染者は４０代・５０代と歳をとるにつれて増加し、その上、近年、慢性胃炎・胃潰瘍・胃癌患者のほとんどが感染していることが判明してきたことから、大きな社会問題となり、特にその対処の重要性が指摘されている。
【０００４】
ピロリ菌による疾患が現れるのは、保菌者の約３割、残りの７割は感染しながらも疾患症状が現れない健康保菌者と考えられている。
ピロリ菌による感染の治療法即ち除菌法には改良が続けられ、現在では抗生物質２種を含めた３剤併用治療が行われている。
【０００５】
青少年少女層に特有の皮膚疾患としてニキビがあり、重症なものになると治癒後にも傷痕が残る場合も多く、特に結婚前の青少年少女にとっては、縁談に支障を来す事情になりかねないことから、精神的にダメージの大きな問題となるばかりでなく、日常生活にも多大な影響を及ぼしかねない問題である。
このため、ニキビの予防・治療に関しては、技術の進歩を反映しながら種々の予防法・治療法が提唱されてきている。
ニキビの原因としては、毛穴に残存しがちな古い角質、過剰な脂肪、それに細菌が考えられ、特に皮膚に常に存在するいわゆる常在菌と言われる細菌のなかのニキビ菌と通称されている細菌が考えられている。
また、ニキビ菌は毛穴に詰まった皮脂や皮膚の表面にたまった古い角質に繁殖する。
したがって、ニキビの予防・治療には、まず、常に皮膚を清潔にすること、脂肪分の多い食べ物を過剰に摂取しないことが大切であるが、ニキビ菌そのものの発生を押さえることも肝要である。
【０００６】
常在菌そのものは肌にとって必要なものであるが、増え過ぎるとニキビ等の肌のトラブルを起しかねないものでもある。
ニキビ菌と言われる常在菌の中には、アクネ菌・黄色ブドウ状菌・マセラチア菌等があり、特にアクネ菌(Propionibacterium acnes)はその筆頭にあげられている。
【０００７】
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は、ピロリ菌と同様、院内感染や日和見感染の原因菌として医学上重要視されている。
緑膿菌は、消毒液や抗生物質に対する抵抗力がもともと高い上に、後天的に薬剤耐性を獲得したものが多いため、一旦発症すると治療が困難となる場合が多い。
緑膿菌はグラム陰性好気性桿菌に属する真正細菌の一種で、自然環境中に存在する代表的は常在菌であり、ヒトに対する病原性があり、健常者に感染することは殆どないが、免疫力の低下した人には感染（日和見感染）する特徴を有する。
また、他の病原菌と比べて、発育には特殊な栄養源を必要としないため、増殖し易いのが特徴である。
さらに、緑膿菌はバイオフィルムを生活の場として、その内部で効率良く増殖・生存し、一方バイオフィルムは物質表面に強く付着するため、その内部で生存している菌（緑膿菌）は、むき出しの状態に比べると、洗い流したり剥がしたりするなどの機械的な除去に対して強くなり、さらに、消毒薬などの薬剤がバイオフィルムを通してバイオフィルム内部に浸透することが困難なため薬剤に強くなり、その上バイオフィルム内部に存在するため他の微生物に捕食されることも少ない。
【０００８】
緑膿菌は、さまざまな蛋白質を菌体外に分泌しており、この中には外毒素、溶血素や分泌酵素として作用するものがあり、これらが緑膿菌の病原性と密接な関連性を有している。
溶血素や分泌酵素は、感染部位の組織を破壊し、さらなる細菌に侵入や増殖を容易にするとともに、出血や壊死などを引き起こす病原因子として働くことになる。
【０００９】
緑膿菌に対しては、逆性石鹸などの消毒薬が古くから使用されてきたが、緑膿菌は自然耐性が強く、消毒液の濃度が低い場合には、その消毒液の中で増殖することもあることも知られている。
また、緑膿菌は後出の黄色ブドウ球菌と同様、副鼻腔疾患からの検出菌として検出量の多い菌として検出されていることから、臨床的意義を重く見るべきだという意見が多く報告されている。
緑膿菌に投与された抗生物質の中には、使用により獲得耐性が生まれ、無効化された抗生物質もある程である。
【００１０】
また、医療施設の院内感染が臨床上の大きな問題となっている。
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）が耐性化すると、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicilin-resistant Staphylococcus aureus、以下「ＭＲＳＡ」という。）となることから、医療施設や特殊老人養護ホームにおいて常在菌である黄色ブドウ球菌の除菌処置は重要な問題である。
黄色ブドウ球菌の病原性はＭＲＳＡとほぼ同等とも言われ、健常者においても皮膚・軟部組織感染症などを起し得るものであり、近年では、健康な人においてもごく一般的な感染症の起炎菌として発見されることもあり、医療施設から街中へと広がってきていると言われている。
【００１１】
上記、ピロリ菌、ニキビ菌、緑膿菌および黄色ブドウ球菌に対して有効な物質や抗菌剤が化学的に作り上げられ治療に用いられているが、ともすると一般に人は化学的に創製された物質や抗菌剤よりも身近にある天然物由来の物質や抗菌剤を好む傾向があり、特に昨今は、抗生物質に対して薬剤耐性を獲得した細菌について云々されることもあり、また近年の自然指向の高まりから、抗菌性の高い天然物由来の抗菌剤が望まれてきており、その要請も高まってきている。
【００１２】
以上のような鑑点から、本願発明者は、既に、歯垢予防・除去および歯石沈着防止・溶解、ならびに歯周病予防・治療に有用なことが実証されたコウヤマキからの抽出液を用い、上記諸細菌に関し、抗菌活性について試験を行い、有用なことを確認した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特願２００５ー２０３７７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本願発明の課題は、上記のような事情のもとで考えだされたもので、コウヤマキ科の枝・茎・葉・球果・樹皮・樹幹および根から抽出処理して得られる抽出物が有する有効成分を利用した、ピロリ菌、ニキビ菌の一種であるアクネ菌、緑膿菌および黄色ブドウ球菌に有効な抗菌剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願発明者は、鋭意探究した結果、コウヤマキ科の枝・茎・葉・球果・樹皮・樹幹および根から抽出処理して得られる抽出物が、歯科医療関係において顕著な効果があることを見いだした（特願２００５ー２０３７７４）が、さらなる研究探究の結果、上記抽出物が、ピロリ菌、ニキビ菌の一種であるアクネ菌、緑膿菌および黄色ブドウ球菌にも極めて有効な薬効を発揮しうることを見いだし、本願発明に至ったものである。
【発明の効果】
【００１６】
本願発明者は、花瓶に長期間入れられ放置され、半ば乾燥したコウヤマキの球果に大きな樹液の塊ができていることを見つけ・注視し、何かの薬効があるのではないかと、種々の抽出方法を試行し、さらに様々の分野に薬効を試みた結果、歯科関係に薬効が顕著なことを見い出し、さらに、今回、ピロリ菌、ニキビ菌の一種であるアクネ菌、緑膿菌および黄色ブドウ球菌にも極めて有効な抗菌剤となりうることを見いだしたものである。
【００１７】
ピロリ菌(Helicobacter pylori)、アクネ菌(Propionibacterium acnes)の抗菌力試験を次のように行なった。
上記両菌を塗布した平板培地の上部４ヵ所に検体１（コウヤマキ抽出液）を滴下し、培養後、発育阻止の有無を観察した。
なお、検体１（コウヤマキ抽出液）との比較検体として、コウヤマキを抽出する際に使用したエタノールを検体２として、検体１と同様の試験を行った。
その結果を、下記表１および培養終了後の試験用平板培地の写真を、ピロリ菌に関して図１・図２に、アクネ菌に関して図３・図４に示す。
これらの結果から、ピロリ菌に対しては相当の抗菌力があり、またアクネ菌に対しても相応の抗菌力があることが判る。
また、これらの細菌は、定着患部において口内炎細菌のようなバイオフィルムとはなっていないので、本願発明の抗菌剤は、これらの細菌に対し、より大きな抗菌力を発揮するものと期待される。
【００１８】
【表１】
2010202607.tif 000002
【００１９】
試験方法は以下の通りである。
検体
検体１：コウヤマキ68％エタノール抽出液
コウヤマキの葉と枝（25:4）の 500g を 68％エタノール 3l に３ヶ月浸漬して作製
検体２：エタノール
試験用培地
BA培地：  ５％馬脱繊維血液添加 Blood Agar Base No.2(0X0ID)
GAMA培地：GAM寒天培地[日本製薬株式会社]
GAMB培地：GAMブイヨン培地[日本製薬株式会社]
試験菌
試験菌１
試験菌(Helicobacter pylori)をBA培地で37℃±1℃、3〜4日間微好気培養後、再度BA培地で37℃±1℃、3〜4日間微好気培養し、菌体を生理食塩水に浮遊させ、菌数が約107/ml となるように調整し、菌液とした。
試験菌２
試験菌(Propionibacterium acnes)をGAMA培地で37℃±1℃、3〜4日間嫌気培養後、GAMB培地で37℃±1℃、22〜26時間嫌気培養した試験菌をGAMB培地を用いて、菌数が約107/ml となるように調整し、菌液とした。
試験用平板培地の作製
試験菌１用
BA培地をシャーレに15ml分注して固化させた後、菌液 0.1 ml を塗布し、試験用平板培地とした。
試験菌２用
GAMA培地をシャーレに15ml分注して固化させた後、菌液 0.1 ml を塗布し、試験用平板培地とした。
試験操作
試験用平板培地上の４ヵ所に検体 10μl を滴下し、試験菌１は37℃±1℃、4日間微好気培養後、試験菌２は37℃±1℃、2日間嫌気培養後、発育阻止の有無を肉眼観察により判定した。
なお、菌液の生菌数を、試験菌１はBA培地を用いた平板塗沫培養法（37℃±1℃、4日間微好気培養）、試験菌２はGAMA培地を用いた混釈平板培養法（37℃±1℃、2〜3日間嫌気培養）により測定し、試験用平板培地１枚当たりの菌濃度に換算した。
【００２０】
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の抗菌活性試験を次のように行なった。
その結果を、下記表２に示す。
なお、表２には、殆どの人が保菌している大腸菌(Escherichia coli)に対する試験結果も、比較参考のため、記載した。
これらの結果から、緑膿菌に対しては顕著な抗菌活性があり、黄色ブドウ球菌に対しても相当な抗菌活性があることが判る。
【００２１】
試料には、抽出液である試料Ａの他、試料Ａに混入していると予測される夾雑物をゲル濾過して除去するとともにゲル濾過して得られた第２ピークおよび第１ピークの分画した試料を用いた。
ゲル濾過は、Sephacryl(登録商標) S-100 High Resolution(Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden)を Column C 26/100(Amersham)に充填し、試料 25 ml を供した。溶出には 0.05M Tris-HCL buffer(pH 7.5)を用いて 15 ml ずつ分画した。
試料Ａ：コウヤマキ（葉25:枝4、500g）を68％エタノール（3l）に３ヶ月浸漬した抽出液
試料Ｂ：試料Ａをゲル濾過して得られた第２ピークの凍結乾燥標品
試料Ｂ１：試料Ｂを 60％エタノールで溶解したもの
試料Ｂ２：試料Ｂを 0.05M phosphate buffer saline(pH 7.5) で溶解、16倍に希釈したもの
試料Ｃ：  試料Ｂと同様にゲル濾過して得られた第１ピークの凍結乾燥標品を、さらに 60％エタノールで溶解したもの
試験菌
試験菌１：Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
試験菌２：Staphylococcus aureus ATCC 12600
抗菌活性測定用培地
TSAY： 0.5% yeast extract(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)を含む trypticase soy agar(BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)平板
TSBY： 0.5% yeast extract(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)を含む trypticase soy broth(BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)平板
試験操作および抗菌活性の測定
TSBY平板で 16時間培養した試験菌 100μl を、溶解して54℃に保っている soft agar 6ml に滴下して混和後、TSAY平板上に流し固めた。次に、試料液の2倍連続希釈液 10μl ずつ滴下して 24時間培養した（図２）。
抗菌活性（数値）は、阻止が認められた滴下部位に滴下した液の最大希釈の逆数（Arbitrary unit、以下 AU という。）で表示した。図２においては、128倍希釈の場合まで、阻止が確認できるので、抗菌活性は 128 AU ということになる。
【００２２】
【表２】
2010202607.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ピロリ菌(Helicobacter pylori)に検体１（コウヤマキ抽出液）を滴下した場合の培養終了時の試験用平板培地の写真である。
【図２】ピロリ菌(Helicobacter pylori)に検体２（エタノール）を滴下した場合の培養終了時の試験用平板培地の写真である。
【図３】アクネ菌(Propionibacterium acnes)に検体１（コウヤマキ抽出液）を滴下した場合の培養終了時の試験用平板培地の写真である。
【図４】アクネ菌(Propionibacterium acnes)に検体２（エタノール）を滴下した場合の培養終了時の試験用平板培地の写真である。
【図５】抗菌活性を、単位:AU で表示する際の試験例を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
抽出原料に使用するコウヤマキは、高野槙・ほんまき・本槙とも記述され、学名「Sciadopitys verticillata」、植物学上は、裸子植物門(PINOPHYTA)、マツ綱(PINOPSIDA)、マツ目(PINALES)、コウヤマキ科(SCIADOPITYACEAE)、コウヤマキ属(Sciadopytys)に属する植物であって、かって地球上広範囲に生育していたものが、現在では日本国だけに取り残されて生育している植物である。
【００２５】
なお、コウヤマキは、その属する科について、「スギ科」あるいは「マツ科」等種々論争があったが、最近では分子生物学的系統進化の見地から１属１種のコウヤマキ科として分類されるようになっている、植物学上も特異な存在の植物である。
【００２６】
抽出原料としては、コウヤマキの枝・茎・葉・球果・樹皮・樹幹および根を使用し、乾燥度合は問題とならない。
さらに、統一的に小さく裁断されたものが望ましく、特に樹の場合は粉砕したものが好ましい。
【００２７】
抽出原料からの抽出方法には、溶媒抽出と乾溜抽出とがあるが、溶媒抽出の方が簡便であることから多用される。
溶媒抽出の場合、溶媒としては、極性溶媒を用いるのが望ましく、例えば、水・水性溶媒・親水性有機溶媒等が挙げられ、これらは単独または２種以上を適宜組合わせて用いられる。
【００２８】
抽出溶媒として用いる水・水性溶媒としては、飲用に供される水の他、日常使用・利用する各種の水や、精製水・リン酸カリウム緩衝液・リン酸ナトリウム緩衝液・生理食塩水等も用いることができる。
【００２９】
抽出溶媒として用いる親水性有機溶媒としては、メタノール・エタノール等のアルコール類の他、プロピレングルコール、グリセリン等、また、エチルエーテル・トルエン・ヘキサン等を使用することができる。
【００３０】
具体的な操作手順としては、公知となっている方式である溶媒を還流させる抽出装置を用いて１〜１０時間程度の加熱処理すればよく、また、熱水あるいは常温の水中に抽出原料を浸漬させても良い。
浸漬時間は、使用する溶媒、溶媒の濃度、溶媒の温度等によって変動する。
装置不要の最も簡便な方法は、果実酒用のアルコール濃度３５％の焼酎に、１ヶ月程度浸漬する方法である。長期間かけて抽出する場合は、浸漬中は時々容器を振ったり、撹拌することが望ましい。抽出後は、濾過して抽出液を得る。
抽出原料と溶媒の量の関係は、溶媒の濃度等にも関係するが、実施例として、後述する。
【００３１】
こうして得られた抽出液は、人体に悪影響のない溶剤の場合は、そのままあるいは希釈して使用することもできるが、さらに、公知の方法で減圧濃縮して抽出物として使用することもでき、さらに乾燥し、粉末状の抽出物とし、植物エキス乾燥物として使用することもできる。
さらに、使用に供する際の使用態様・剤形としては、特に限定されるものではなく、例えば、固形状・粉状・液状・ゲル状（ペースト状）・液状剤・ゲル剤・固形剤（例えば錠剤・散剤・顆粒剤・カプセル剤）・粉末・スプレー剤・ムース剤等、使用用途に応じて種々選択でき、これらへの加工・製剤化は常套的な方法によって行われる。
なお、本願発明の抽出物は、独特の苦味・渋味・色合い等を有することから、適宜甘味料・香味料・着色料を添加することが望ましい。
【００３２】
なお、本願発明にかかる抗菌剤は、本願発明にかかる抽出物からなるものであっても、また、それを有効成分として含有するものであっても良く、本願発明の効果を損なわないかぎり、公知の若しくは将来公知となりうる他の薬効のある成分を組み合わせることもできる。
【００３３】
以下、実施例により本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれらによって何ら制限をうけるものではない。
【実施例１】
【００３４】
もっとも簡単な抽出方法は、次の通りである。
コウヤマキの葉を７５０ｇ、茎を２５０ｇを、アルコール濃度３５％の果実酒用焼酎 ３リットルに、常温で１ヶ月以上浸漬し、時折、瓶を振ったり、内容物を撹拌する。
１ヶ月程度の浸漬で、強くはないが独特の臭・苦味・渋味を有する、濃い茶色の抽出液が得られる。
【実施例２】
【００３５】
エタノールを使用した抽出方法（例１）は、次の通りである。
コウヤマキの葉を３７５ｇ、茎を１２５ｇを、アルコール濃度８０％程度のエタノール ３リットルに、常温で１ヶ月以上浸漬し、時折、瓶を振ったり、内容物を撹拌する。
１ヶ月程度の浸漬で、独特の臭・苦味・渋味を有する、暗緑色の抽出液が得られる。
本実施例の場合は、実施例１に比べアルコール濃度が高いこともあって、実施例１に比べると、独特の臭・苦味・渋味もやや強いものとなる。
【実施例３】
【００３６】
エタノールを使用した抽出方法（例２）は、次の通りで、今回の抗菌力試験に使用した抽出液である。
コウヤマキの葉を４３０ｇ、茎を７０ｇを、アルコール濃度６８％のエタノール ３リットルに、常温で３ヶ月浸漬し、時折、瓶を振ったり、内容物を撹拌する。
本実施例の場合は、実施例２に比べると、アルコール濃度がやや低いが、浸漬期間が長いこともあって、実施例２とほぼ同等の臭・苦味・渋味のものが得られる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
抗菌剤として医療分野や日常生活に有益なものであり、それも広範囲に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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