(57)【要約】【課題】ＮｇＲ１媒介性の成長円錐崩壊およびその結果もたらされる神経突起伸長阻害を阻害するための分子および方法を提供すること。【解決手段】本発明は、Ｓｐ３５ポリペプチドおよびその融合タンパク質、Ｓｐ３５抗体およびその抗原結合フラグメントならびにそれらをコードする核酸を提供する。本発明はまた、このようなＳｐ３５抗体、その抗原結合フラグメント、Ｓｐ３５ポリペプチドおよびその融合タンパク質を含有する組成物ならびにこのようなＳｐ３５抗体、その抗原結合フラグメント、Ｓｐ３５ポリペプチドおよびその融合タンパク質の製造方法および使用方法を提供する。【選択図】図３
2010154861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経学、神経生物学および分子生物学に関する。より詳細には、本発明は、神経学的疾患、神経学的障害および神経学的損傷（例えば、脊髄損傷）の処置のための分子および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
軸索および樹状突起は、ニューロンから伸長する。伸長する軸索または神経突起の遠位端は、成長円錐として公知の特定の領域を含む。成長円錐は、局所的環境を感じ取り、ニューロンの標的細胞に向かう軸索成長を誘導する。成長円錐は、環境の合図（例えば、表面への接着、成長因子、神経伝達物質および電場）に応答する。上記成長円錐は、一般的に、一日に１ｍｍ〜２ｍｍの速度で成長する。上記成長円錐は、ラメリポディウムおよび糸状足として分類される伸長手段によって、その前方領域およびいずれもの側方領域を探索する。伸長部が不都合な表面に接触する場合、その伸長部は引っ込む。伸長部が、都合のよい成長表面と接触する場合、その伸長部は、伸長を続け、上記成長円錐をその方向に誘導する。上記成長円錐が適切な標的細胞に到達する場合、シナプス結合が生成される。
【０００３】
神経細胞機能は、ニューロンとそれらの隣接環境における他の細胞との間の接触により、影響される（非特許文献１）。これらの細胞としては、特定の神経膠細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）における希乏突起神経膠細胞ならびに末梢神経系（ＰＮＳ）におけるシュヴァン細胞が挙げられ、これらの細胞は、神経軸索がミエリンで覆われている（非特許文献２）。
【０００４】
ＣＮＳニューロンは、損傷後に再生成する固有の潜在能力を有するが、ＣＮＳニューロンは、ミエリンに存在する阻害タンパク質によって損傷後に再生成することを阻害される（非特許文献３；非特許文献４）。
【０００５】
希乏突起神経膠細胞において見出されたいくつかのミエリン阻害タンパク質が、特徴付けられている。ミエリン阻害タンパク質の公知の例としては、ＮｏｇｏＡ（非特許文献５）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）（非特許文献６）および希乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＯＭ−ｇｐ）（Ｍｉｋｏｌら，１９９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：１２７３−１２７９）が挙げられる。これらのタンパク質の各々は、ニューロンのＮｇＲ１に対するリガンドであることが、別々に示されている（非特許文献７；非特許文献８；２００２年６月２８日にインターネット上で公開された，Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉら，Ｎｅｕｒｏｎ  ２００２）。
Ｎｏｇｏレセプター−１（ＮｇＲ１）は、８個のロイシンリッチ繰返し配列を含むＧＰＩ−固定膜タンパク質である（非特許文献９）。阻害タンパク質（例えば、ＮｏｇｏＡ、ＭＡＧおよびＯＭ−ｇｐ）と相互作用すると、上記ＮｇＲ１複合体は、成長円錐崩壊および神経突起伸長阻害を引き起こすシグナルを伝達する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒら，１９８８，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．６８：８１９
【非特許文献２】Ｌｅｍｋｅ，１９９２，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｚ．Ｈａｌｌ編，２８１頁，Ｓｉｎａｕｅｒ
【非特許文献３】Ｂｒｉｔｔｉｓら，２００１，Ｎｅｕｒｏｎ  ３０：１１−１４；Ｊｏｎｅｓら，２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：２７９２−２８０３
【非特許文献４】Ｇｒｉｍｐｅら，２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．：２２：３１４４−３１６０
【非特許文献５】Ｃｈｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３，４３４−４３９；Ｇｒａｎｄｐｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０３，４３９−４４４
【非特許文献６】ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒら，１９９４，Ｎｅｕｒｏｎ  １３：８０５−８１１；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら，１９９４，Ｎｅｕｒｏｎ  １３：７５７−７６７
【非特許文献７】Ｗａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１７，９４１−９４４；Ｇｒａｎｄｐｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０３，４３９−４４４
【非特許文献８】Ｃｈｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３，４３４−４３９
【非特許文献９】Ｆｏｕｒｎｉｅｒら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＮｇＲ１媒介性の成長円錐崩壊およびその結果もたらされる神経突起伸長阻害を阻害するための分子および方法に関する必要性は、未だ満たされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
発明者らは、「Ｓｐ３５」と称されるポリペプチド（発明者らが命名）に関する種々の発見を行ってきた。Ｓｐ３５のための代替的な名称としては、「ＬＩＮＧＯ」および「ＬＩＮＧＯ−１」が挙げられる。発明者らの発見は、以下を含む。Ｓｐ３５は、ＮｇＲ１に結合する。Ｓｐ３５は、同型相互作用で、それ自体に結合する。Ｓｐ３５−Ｆｃ融合タンパク質は、顆粒状ニューロンにおいて、線維束性攣縮を誘導または促進する。Ｓｐ３５−Ｆｃ融合タンパク質は、赤核脊髄路半側切除損傷モデルおよび視神経離断モデルの両方において、ニューロンの生存を促進する。Ｓｐ３５レトロウイルス感染皮質初代細胞は、脊髄損傷ラットに送達される場合、ニューロン生存の促進、軸索のβＩＩＩチューブリン染色の増大およびミエリン含量の上昇をもたらす。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
単離された核酸であって、該核酸が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、：（ａ）該ポリペプチドが（ｉ）Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン、（ｉｉ）該ＬＲＲドメインに対してＣ末端側のＳｐ３５塩基性領域および（ｉｉｉ）該塩基性領域に対してＣ末端側のＳｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、を含み；そして（ｂ）該ポリペプチドが、膜貫通ドメインを欠く、核酸。
（項目２）
単離された核酸であって、該核酸が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ポリペプチドが、Ｓｐ３５  Ｉｇドメインを含み、そして、Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く、核酸。
（項目３）
単離された核酸であって、該核酸が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ポリペプチドが、Ｓｐ３５  ＬＲＲドメインを含み、そして、Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く、核酸。
（項目４）
項目１に記載の核酸であって、前記Ｓｐ３５ポリペプチドが、細胞質ドメインを欠く、核酸。
（項目５）
項目１に記載の核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基３４〜５３２を含む、核酸。
（項目６）
項目１〜３のいずれか１項に記載の核酸であって、前記ポリペプチドが、非Ｓｐ３５部分を含む融合ポリペプチドである、核酸。
（項目７）
項目６に記載の核酸であって、前記非Ｓｐ３５部分が、Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分および精製容易化部分からなる群より選択される、核酸。
（項目８）
項目７に記載の核酸であって、前記非Ｓｐ３５部分がＩｇ部分である、核酸。
（項目９）
項目８に記載の核酸であって、前記Ｉｇ部分がＦｃ部分である、核酸。
（項目１０）
項目１〜３のいずれか１項に記載の核酸であって、前記ヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に結合される、核酸。
（項目１１）
項目１０に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目１２）
項目１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目１３）
単離されたポリペプチドであって：（ａ）該ポリペプチドが（ｉ）Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン、（ｉｉ）該ＬＲＲドメインに対してＣ末端側のＳｐ３５塩基性領域および（ｉｉｉ）該塩基性領域に対してＣ末端側の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、を含み；そして（ｂ）該ポリペプチドが、膜貫通ドメインを欠く、ポリペプチド。
（項目１４）
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが、Ｓｐ３５  Ｉｇドメインを含み、そして、ＬＲＲドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く、ポリペプチド。
（項目１５）
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが、Ｓｐ３５  ＬＲＲドメインを含み、そして、Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く、ポリペプチド。
（項目１６）
項目１３に記載のポリペプチドであって、ロイシンリッチ繰返し配列のうちの１つが、カルボキシ末端ロイシンリッチ繰返し配列（ＬＲＲＣＴ）である、ポリペプチド。
（項目１７）
項目１３に記載のポリペプチドであって、ロイシンリッチ繰返し配列のうちの１つが、アミノ末端ロイシンリッチ繰返し配列（ＬＲＲＮＴ）である、ポリペプチド。
（項目１８）
項目１３に記載のポリペプチドであって、前記Ｓｐ３５ポリペプチドが、細胞質ドメインを欠く、ポリペプチド。
（項目１９）
項目１３に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基３４〜５３２を含む、ポリペプチド。
（項目２０）
項目１３、１４または１５に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、非Ｓｐ３５部分を含む融合ポリペプチドである、ポリペプチド。
（項目２１）
項目２０に記載のポリペプチドであって、前記非Ｓｐ３５部分が、Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分および精製容易化部分からなる群より選択される、ポリペプチド。
（項目２２）
項目２１に記載のポリペプチドであって、前記非Ｓｐ３５部分がＩｇ部分である、ポリペプチド。
（項目２３）
項目２２に記載のポリペプチドであって、前記Ｉｇ部分がＦｃ部分である、ポリペプチド。
（項目２４）
項目１３、１４または１５に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、ポリマーに結合される、ポリペプチド。
（項目２５）
項目２４に記載のポリペプチドであって、前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群より選択される、ポリペプチド。
（項目２６）
項目２５に記載のポリペプチドであって、前記ポリマーがポリアルキレングリコールである、ポリペプチド。
（項目２７）
項目２６に記載のポリペプチドであって、前記ポリアルキレングリコーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、ポリペプチド。
（項目２８）
項目２４に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、１つ、２つ、３つまたは４つのポリマーに結合される、ポリペプチド。
（項目２９）
項目２８に記載のポリペプチドであって、前記ポリマーの総分子量が、２０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａである、ポリペプチド。
（項目３０）
ＮｇＲ１によるシグナル伝達を阻害する方法であって、該方法が、該ＮｇＲ１と有効量のＳｐ３５ポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
（項目３１）
中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの軸索成長阻害を減少する方法であって、該方法が、該ニューロンと有効量のポリペプチドとを接触させる工程を包含し、該ポリペプチドが、Ｓｐ３５ポリペプチド、抗Ｓｐ３５抗体および抗Ｓｐ３５抗体の抗原結合フラグメントからなる群より選択される、方法。
（項目３２）
ＣＮＳニューロンの成長円錐崩壊を阻害する方法であって、該方法が、該ニューロンと有効量のポリペプチドとを接触させる工程を包含し、該ポリペプチドが、Ｓｐ３５ポリペプチド、抗Ｓｐ３５抗体および抗Ｓｐ３５抗体の抗原結合フラグメントからなる群より選択される、方法。
（項目３３）
哺乳動物におけるＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷を処置する方法であって、該方法が、治療有効量のポリペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含し、該ポリペプチドが、Ｓｐ３５ポリペプチド、抗Ｓｐ３５抗体および抗Ｓｐ３５抗体の抗原結合フラグメントからなる群より選択される、方法。
（項目３４）
項目３０〜３３のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｓｐ３５ポリペプチドが、以下、
ポリペプチドであって：（ａ）該ポリペプチドが（ｉ）１２個〜１４個のＳｐ３５ロイシンリッチ繰返し配列を含むＬＲＲドメイン、（ｉｉ）該ＬＲＲドメインに対してＣ末端側のＳｐ３５塩基性領域および（ｉｉｉ）該塩基性領域に対してＣ末端側の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、を含み；そして（ｂ）該ポリペプチドが、膜貫通ドメインを欠く、ポリペプチド；ならびに
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、Ｓｐ３５  Ｉｇドメインを含み、そして、ＬＲＲドメイン、塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く、ポリペプチド
からなる群より選択される、方法。
（項目３５）
項目３３に記載の方法であって、前記ＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷が、脊髄損傷または視覚神経損傷である、方法。
（項目３６）
項目３３に記載の方法であって、前記ポリペプチドが局所投与される、方法。
（項目３７）
項目３３に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、脊髄損傷の４８時間以内に最初に投与される、方法。
（項目３８）
項目３６に記載の方法であって、前記ポリペプチドの治療有効量が、１０μｇ〜１０ｍｇである、方法。
（項目３９）
哺乳動物におけるＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷を処置する方法であって、該方法が、（ａ）組換えＳｐ３５ポリペプチドを発現する培養宿主細胞を提供する工程；および（ｂ）該ＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷の部位またはその近傍で、該哺乳動物中に該宿主細胞を導入する工程、を包含する、方法。
（項目４０）
項目３９に記載の方法であって、前記疾患、障害または損傷が脊髄損傷である、方法。
（項目４１）
項目３９に記載の方法であって、前記培養宿主細胞が、前記処置されるべき哺乳動物由来である、方法。
（項目４２）
項目３９に記載の方法であって、前記組換えＳｐ３５ポリペプチドが、全長Ｓｐ３５ポリペプチドである、方法。
（項目４３）
ＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷の部位での髄鞘形成を促進する方法であって、該方法が、該ＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷の部位を有効量のＳｐ３５ポリペプチドと接触させる工程を包含する、方法。
（項目４４）
項目４３に記載の方法であって、前記Ｓｐ３５ポリペプチドが、Ｓｐ３５  ＬＲＲドメインを含み、そして、Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く、方法。
（項目４５）
インビボ遺伝子治療によってＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷を処置する方法であって、該方法が、該疾患、障害または損傷の部位あるいはその近傍で、哺乳動物にウイルスベクターを投与する工程を包含し、該ウイルスベクターが、Ｓｐ３５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより、該Ｓｐ３５ポリペプチドが、該哺乳動物において、該損傷の部位またはその近傍のニューロンによる軸索伸長阻害を減少するために十分な量で、該ヌクレオチド配列から発現される、方法。
（項目４６）
項目３６に記載の方法であって、前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルスベクターからなる群より選択される、方法。
（項目４７）
項目４５に記載の方法であって、前記疾患、障害または損傷が、脊髄損傷および視覚神経損傷からなる群より選択される、方法。
（項目４８）
項目４５に記載の方法であって、前記ウイルスベクターが、局所投与、眼内投与、非経口投与、くも膜下腔内投与、硬膜下投与および皮下投与からなる群より選択される経路によって投与される、方法。
（項目４９）
ポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドが、Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン、塩基性領域、Ｉｇドメイン、連結配列および膜貫通ドメインを含み：そして、機能性細胞質ドメインを欠く、核酸。
（項目５０）
項目４９に記載の核酸であって、該核酸が、本質的に、配列番号２のアミノ酸１〜５７６からなるポリペプチドをコードする、核酸。
（項目５１）
死の危険性にあるニューロンの生存を促進する方法であって、該方法が、該ニューロンと有効量のＳｐ３５ポリペプチドを接触させる工程を包含する、方法。
（項目５２）
項目５１に記載の方法であって、前記ニューロンがインビトロである、方法。
（項目５３）
項目５１に記載の方法であって、前記ニューロンが、神経変性疾患、神経変性障害または神経変性損傷を有する哺乳動物中に存在する、方法。
（項目５４）
項目５３に記載の方法であって、前記神経変性疾患、神経変性障害または神経変性損傷が、多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、脳卒中、外傷性脳損傷および外傷性脊髄損傷からなる群より選択される、方法。
（項目５５）
神経変性疾患、神経変性障害または神経変性損傷を有する哺乳動物において、死の危険性にあるニューロンの生存を促進する方法であって、該方法が、（ａ）組換えＳｐ３５ポリペプチドを発現する培養宿主細胞を提供する工程；および（ｂ）該ニューロン部位で、該哺乳動物中に該宿主細胞を導入する工程、を包含する、方法。
（項目５６）
死の危険性にあるニューロンの生存を促進するインビボ遺伝子治療方法であって、該方法が、該ニューロン部位またはその近傍で、哺乳動物にウイルスベクターを投与する工程を包含し、該ウイルスベクターが、Ｓｐ３５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより、該Ｓｐ３５ポリペプチドが、該哺乳動物において、該ニューロンの生存を促進するために十分な量で該ヌクレオチド配列から発現される、方法。
（項目５７）
項目５１に記載の方法であって、前記Ｓｐ３５ポリペプチドが可溶性である、方法。
【０００９】
これらの発見に部分的に基づいて、本発明は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を特徴とし：（ａ）このポリペプチドは（ｉ）Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン、（ｉｉ）このＬＲＲドメインに対してＣ末端側のＳｐ３５塩基性領域および（ｉｉｉ）この塩基性領域に対してＣ末端側のＳｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、を含み；そして（ｂ）このポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠く。上記Ｓｐ３５  ＬＲＲドメインは、カルボキシ末端ＬＲＲ（ＬＲＲＣＴ）、アミノ末端ＬＲＲ（ＬＲＲＮＴ）またはその両方を含み得る。本発明のいくつかの実施形態において、上記コードされたＳｐ３５ポリペプチドは、細胞質ドメインを欠く。いくつかの実施形態において、上記コードされたＳｐ３５ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基３４〜５３２を含み、アミノ酸残基５３３〜６１４を欠く。
【００１０】
本発明はまた、ポリペプチドをコードする核酸を含み、このポリペプチドは、Ｓｐ３５
Ｉｇドメインを含み、そして、Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く。
【００１１】
本発明はまた、ポリペプチドをコードする核酸を含み、このポリペプチドは、Ｓｐ３５
ＬＲＲドメインを含み、そして、Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く。
【００１２】
本発明はまた、ポリペプチドをコードする核酸を含み、このポリペプチドは、機能性細胞質ドメインを欠くが、全ての他のＳｐ３５ドメインを含む。例えば、上記コードされたポリペプチドは、（シグナル配列のプロセシング前に）配列番号２のアミノ酸１〜５７６を含み得る。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態において、上記コードされたポリペプチドは、非Ｓｐ３５部分を含む融合タンパク質である。上記非Ｓｐ３５部分は、例えば、Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分または精製容易化部分であり得る。好ましい非Ｓｐ３５部分は、Ｉｇ部分（例えば、Ｆｃ部分）である。
【００１４】
上記ヌクレオチド配列は、例えば、発現ベクターにおいて、発現制御配列に作動可能に結合され得る。本発明はまた、本発明のＳｐ３５ポリペプチドを発現するベクターにより形質転換される宿主細胞を含む。
【００１５】
本発明はまた、上に記載される核酸のいずれかによりコードされるＳｐ３５ポリペプチドを含む。
【００１６】
本発明はまた、ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチド）に結合されたＳｐ３５ポリペプチドを含む。好ましいポリマーは、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））である。上記ポリペプチドは、１つ、２つ、３つまたは４つのポリマーに結合され得る。好ましくは、上記結合されたポリマーの総分子量は、Ｓｐ３５ポリペプチド当たり２０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａである。
【００１７】
本発明はまた、ＮｇＲ１によるシグナル伝達を阻害する方法を含む。上記方法は、上記ＮｇＲ１と有効量のＳｐ３５ポリペプチドとを接触させる工程を包含する。上記方法における使用のための好ましいポリペプチドとしては、以下が挙げられる：
（ａ）Ｓｐ３５ポリペプチドであって：（ａ）このポリペプチドが（ｉ）Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン、（ｉｉ）このＬＲＲドメインに対してＣ末端側のＳｐ３５塩基性領域および（ｉｉｉ）この塩基性領域に対してＣ末端側のＳｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、を含み；そして（ｂ）このポリペプチドが、膜貫通ドメインを欠く、ポリペプチド；ならびに
（ｂ）Ｓｐ３５  Ｉｇドメインを含み、そして、Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠くＳｐ３５ポリペプチド。
【００１８】
本発明はまた、中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの軸索成長阻害を減少する方法を含む。上記方法は、上記ニューロンと有効量のポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５ポリペプチド、抗Ｓｐ３５抗体または抗Ｓｐ３５抗体の抗原結合フラグメント）とを接触させる工程を包含する。
【００１９】
本発明はまた、ＣＮＳニューロンの成長円錐崩壊を阻害する方法を含む。上記方法は、上記ニューロンと有効量のポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５ポリペプチド、抗Ｓｐ３５抗体または抗Ｓｐ３５抗体の抗原結合フラグメント）とを接触させる工程を包含する。
【００２０】
本発明はまた、哺乳動物におけるＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷を処置する方法を含む。上記方法は、治療有効量のポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５ポリペプチド、抗Ｓｐ３５抗体または抗Ｓｐ３５抗体の抗原結合フラグメント）を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、上記ＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷は、脊髄損傷である。上記Ｓｐ３５ポリペプチドは、局所投与され得る。上記方法のいくつかの実施形態において、上記Ｓｐ３５ポリペプチドは、脊髄損傷の４８時間以内に最初に投与される。局所投与のために、上記治療有効量の上記ポリペプチドは、好ましくは、１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。全身投与のために、上記治療有効量の上記ポリペプチドは、好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
【００２１】
本発明はまた、哺乳動物におけるＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷を処置するエキソビボ遺伝子治療方法を含む。上記方法は（ａ）組換えＳｐ３５ポリペプチドを発現する培養宿主細胞を提供する工程；および（ｂ）上記ＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷（例えば、脊髄損傷）の部位で、上記哺乳動物中にこの宿主細胞を導入する工程、を包含する。上記培養宿主細胞は、処置されるべき哺乳動物由来であり得る。このエキソビボ遺伝子治療方法において、上記組換えＳｐ３５ポリペプチドは、全長Ｓｐ３５ポリペプチドであり得る。
【００２２】
本発明はまた、上記ＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷の部位での髄鞘形成を促進する方法を含む。上記方法は、上記ＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷の部位と有効量のＳｐ３５ポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５  ＬＲＲドメインを含み、そして、Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠くポリペプチド）とを接触させる工程を包含する。
【００２３】
本発明はまた、ＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷をインビボ遺伝子治療により処置するインビボ遺伝子治療方法を含む。上記方法は、上記疾患、障害または損傷の部位あるいはその近傍で、哺乳動物にウイルスベクターを投与する工程を包含し、このウイルスベクターは、Ｓｐ３５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより、このＳｐ３５ポリペプチドは、この哺乳動物において、損傷の部位またはその近傍のニューロンによる軸索伸長阻害を減少するために十分な量で、このヌクレオチド配列から発現される。上記ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよび単純疱疹イルスベクターであり得る。上記疾患、障害または損傷は、例えば、脊髄損傷または視覚神経損傷であり得る。上記ウイルスベクターは、例えば、局所投与、眼内投与、非経口投与、くも膜下腔内投与、硬膜下投与および皮下投与のような経路により投与され得る。
【００２４】
本発明はまた、死の危険性にあるニューロンの生存を促進する方法を含む。上記方法は、上記ニューロンと有効量のＳｐ３５ポリペプチドとを接触させる工程を包含する。上記Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５の可溶性形態（例えば、Ｓｐ３５−Ｆｃ融合タンパク質）であり得る。上記ニューロンは、インビトロまたはインビボ（例えば、神経変性疾患、神経変性障害または神経変性損傷（例えば、多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、脳卒中、外傷性脳損傷および外傷性脊髄損傷）を有する哺乳動物中）であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、上記Ｓｐ３５ポリペプチドは、以下により間接的に投与される：（ａ）組換えＳｐ３５ポリペプチドを発現する培養宿主細胞を提供する工程；および（ｂ）上記ニューロンの部位で、上記哺乳動物中にこの宿主細胞を導入する工程。本発明のいくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、インビボ遺伝子治療を介して間接的に投与される。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ニューロンの部位またはその近傍にウイルスベクターを投与する工程を包含し、このウイルスベクターは、Ｓｐ３５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより、このＳｐ３５ポリペプチドは、上記哺乳動物において、このニューロンの生存を促進するために十分な量で、このヌクレオチド配列から発現される。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「全長ヒトＳｐ３５ポリペプチド」とは、そのアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸３４〜６１４であるポリペプチドを意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「異種部分」とは、全長Ｓｐ３５ポリペプチドに存在しないアミノ酸配列を意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「ｎｏｇｏレセプター−１」とは、その配列がＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＧ５３６１２の下で公的に入手可能であるポリペプチドを意味する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド」とは、天然に生じるＳｐ３５の生物学的活性を阻止、阻害または妨害するＳｐ３５ポリペプチドを意味する。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「Ｓｐ３５塩基性領域」とは、以下のアミノ酸モチーフを意味する：
【００３０】
【化１】
2010154861.tif 000003
最上列のアミノ酸（太字；配列番号４）は、好ましいＳｐ３５塩基性領域配列であり、任意の置換を示す変異体を、下に示す（配列番号５、６、７および８）。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「Ｓｐ３５融合タンパク質」とは、異種部分に融合されたＳｐ３５部分を含む融合タンパク質を意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン」とは、配列番号２のアミノ酸４３３〜４９３を意味し、ただし、この配列は、５個までの独立したアミノ酸の挿入、欠失または保存的アミノ酸置換を含み得る。以下の置換（配列番号２に基づく番号付け）が、明らかに含まれる：６位のＶからＭ；２９４位のＳからＧ；３４８位のＶからＡ；４１９位のＲからＨ。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン」とは、１０個〜１４個のロイシンリッチ繰返し配列を含むドメインを意味し、このような配列としては、表１に列挙されるＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴが挙げられるが、ただし、５個までのアミノ酸の挿入、欠失または保存的アミノ酸置換が、１０個〜１４個のロイシンリッチ繰返し配列の集合体中に現れ得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「Ｓｐ３５部分」とは、全長Ｓｐ３５ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを意味する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「Ｓｐ３５ポリペプチド」とは、Ｓｐ３５部分またはＳｐ３５部分を含む融合タンパク質を意味する。
【００３６】
別に規定されなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。争いが生じた場合、定義を含む本明細書の記載に従う。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許および他の参考文献が、参考として援用される。
本明細書中に記載される方法および物質と類似または等価な方法および物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および物質は、以下に記載される。上記物質、方法および例は、例示に過ぎず、限定するものとは意図されない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１−１】図１は、全長ヒトＳｐ３５  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である（配列番号１）。
【図１−２】図１は、全長ヒトＳｐ３５  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である（配列番号１）。
【図２】図２は、全長ヒトＳｐ３５ポリペプチドのアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図３】図３は、Ｓｐ３５ドメイン構造およびＮｇＲ１に結合するＳｐ３５配列を同定するための欠失マッピングの概略図である。
【図４】図４は、ラットｐ７５をコードする発現ベクターまたはベクターコントロールをトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞に結合するＳＰ３５に関するデータを要約するヒストグラムである。４８時間後、ＡＰ−ＳＰ３５またはＡＰを、上記細胞とともにインキュベートした。結合したＡＰを、発色ＡＰ検出試薬を用いて検出した。
【図５】図５は、ＮｇＲ１；ＮｇＲ１およびｐ７５；ＮｇＲ１、ｐ７５およびＳＰ３５をコードする発現ベクターまたはベクターコントロールをトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞に対する、ＡＰ−ＯｍｇｐおよびＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６の結合に関するデータを要約するヒストグラムである。４８時間後、ＡＰ−Ｏｍｇｐ、ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６またはＡＰを、上記細胞とともにインキュベートした。結合したＡＰを、発色ＡＰ検出試薬を用いて検出した。
【図６】図６は、インビトロでの神経突起伸長に対するミエリンインヒビターの阻害活性の軽減に関するデータを要約するヒストグラムである。神経突起長を、固定化した基質Ｏｍｇｐ、ミエリンおよびＮｏｇｏ−６６上で培養された、ＤＮ−Ｓｐ３５、全長Ｓｐ３５を発現する生後７日ラット小脳顆粒状ニューロン、またはコントロール生後７日ラット小脳顆粒状ニューロンについて測定した。ＤＮ−Ｓｐ３５を用いてトランスフェクションした細胞は、阻害基質に対する応答の減少を示した。神経突起長を、２回の独立した実験からの処置群あたり１０００ニューロンから定量した（ｐ＜０．０１）。
【図７】図７は、ＳＰ３５−Ｆｃによるミエリンインヒビターの阻害活性の逆転に関するデータを要約するヒストグラムである。生後７日ラット小脳顆粒状ニューロン（１０００ニューロン）の神経突起長を、ＳＰ３５−Ｆｃの存在下または非存在下、固定化した基質ＯＭｇｐ、ミエリンまたはＮｏｇｏ−６６上で培養した。ＳＰ３５−Ｆｃは、Ｏｍｇｐ、Ｎｏｇｏ−６６およびＭＡＧにより引き起こされる神経突起伸長阻害を減少した。神経突起長を、２回の独立した実験からの処置群あたり１０００ニューロンから定量した（ｐ＜０．０１）。
【図８】図８は、くも膜下腔内投与されたＳｐ３５−Ｆｃがラットにおける脊椎半側切除後の機能的回復を改善したことを示す実験からのデータを要約するグラフである。運動性ＢＢＢスコアを、コントロール（ＩｇＧ）ラットまたはＳｐ３５−Ｆｃ処置ラットにおける脊椎半側切除後の時間の関数として測定した（群あたり動物８匹）。脊髄損傷時に、処置を開始した。
【図９】図９は、図８で要約される実験における、４週目の個々の動物のＢＢＢスコアを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（発明の詳細な説明）
天然に生じるヒトＳｐ３５は、６１４アミノ酸を含むグリコシル化ＣＮＳ特異的タンパク質である（図２；配列番号２）。ヒト全長野生型Ｓｐ３５ポリペプチドは、１４個のロイシンリッチ繰返し配列からなるＬＲＲドメイン（Ｎ末端キャップおよびＣ末端キャップを含む）、Ｉｇドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む（図３）。上記細胞質ドメインは、典型的なチロシンリン酸化部位を含む。さらに、上記天然に生じるＳｐ３５タンパク質は、シグナル配列、ＬＲＲＣＴとＩｇドメインとの間の短い塩基性領域およびこのＩｇドメインと上記細胞質ドメインと間の膜貫通領域を含む（図３）。ヒトＳｐ３５遺伝子は、代替的な翻訳開始コドンを含み、それにより、６個のさらなるアミノ酸（すなわち、ＭＱＶＳＫＲ（配列番号９））が、上記Ｓｐ３５シグナル配列のＮ末端に存在していても存在していなくてもよい。表１は、図２の配列（配列番号２）に基づいたアミノ酸残基番号に従って、上記Ｓｐ３５ドメインおよび他の領域を列挙する。
【００３９】
【表１】
2010154861.tif 000004
Ｓｐ３５の組織分布および発生における発現は、ヒトおよびラットにおいて研究されている。Ｓｐ３５生物学は、実験動物モデル（ラット）において研究されている。ラットＳＰ３５の発現は、ノザンブロットおよび免疫組織学的染色により決定される場合、ＣＮＳニューロンおよび脳の希乏突起神経膠細胞に局在している。ラットＳｐ３５  ｍＲＮＡ発現レベルは、発生において調節され、出生直後（すなわち、生後約１日目）がピークである。ラット脊髄離断損傷モデルにおいて、Ｓｐ３５は、ＲＴ−ＰＣＲにより決定される場合、上記損傷部位でアップレギュレートされる。
【００４０】
発明者らは、全長野生型Ｓｐ３５が、ＮｇＲ１に結合することを発見している。Ｓｐ３５の可溶性誘導体は、ＮｇＲ１に結合してその機能を阻止、阻害または妨害し、それにより、ＣＮＳニューロンにおいて正常に起こる軸索伸長のＮｇＲ１媒介性阻害を軽減することにより、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドとして機能する。これは、軸索伸長または神経突起成長が脳または脊髄において必要とされる状態において、有益である。脊髄損傷（部分的または完全な挫傷または切断を含む）は、軸索伸長が必要とされる状態を例示するが、通常、Ｎｏｇｏ経路の操作により阻害される。脳における軸索伸長および／もしくは神経突起成長が有益である疾患または障害の例としては、脳卒中、多発性硬化症および他の神経変性疾患または神経変性障害が挙げられる。
【００４１】
本発明の方法において、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはＳｐ３５ブロッキング抗体（または抗原結合抗体フラグメント）は、事前に形成されたポリペプチドとして直接投与され得るか、または核酸ベクターを介して間接的に投与され得、ＮｇＲ１機能に拮抗し、有益な軸索伸長を可能にする。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態において、可溶性Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドは、以下を包含する処置方法において投与される：（１）移植可能な宿主細胞をＳｐ３５ポリペプチドを発現する核酸（例えば、ベクター）を用いて形質転換またはトランスフェクションする工程；および（２）形質転換された宿主細胞を、哺乳動物中に、疾患、障害または損傷の部位で移植する工程。例えば、上記形質転換された宿主細胞は、脊髄損傷部位に移植され得る。本発明のいくつかの実施形態において、上記移植可能宿主細胞は、哺乳動物から取り出され、一時的に培養され、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドをコードする単離された核酸を用いて形質転換またはトランスフェクションされ、そして、それが取り出された同じ哺乳動物に移植して戻される。上記細胞は、移植される同じ部位から取り出されてもよいが、その必要はない。このような実施形態は、時に、エキソビボ遺伝子治療として公知であり、限定された時間、作用部位に局在化したＳｐ３５ポリペプチドの連続的供給を提供し得る。
【００４３】
本発明は、ＮｇＲ１とＳｐ３５との相互作用およびＳｐ３５同種相互作用の調節因子として有用なオリゴペプチドを提供する。上記オリゴペプチドは、以下のアミノ酸モチーフを含む：
【００４４】
【化２】
2010154861.tif 000005
アミノ酸の最上列（太字；配列番号１０）が好ましい配列であり、任意の置換を含む変異体を、下に示す（配列番号１１、１２および１３）。
【００４５】
種々の例示的なＳｐ３５ポリペプチド、抗Ｓｐ３５抗体および抗体フラグメントならびに本発明の実施のためにこれらの分子を得るための方法および材料を、以下に記載する。
【００４６】
（融合タンパク質および結合されたポリペプチド）
本発明のいくつかの実施形態は、Ｓｐ３５部分が異種ポリペプチド部分に融合されてＳｐ３５融合タンパク質を形成するＳｐ３５ポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド）の使用を含む。Ｓｐ３５融合タンパク質は、種々の目的（例えば、血清半減期の上昇、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官または組織のタイプに対するインビボ標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞分泌の改善、精製の容易化および高いアビディティ）を達成するために使用され得る。達成されるべき目的に依存して、上記異種部分は、不活性であっても生物学的に活性であってもよい。また、上記異種部分は、インビボまたはインビトロにおいて、上記Ｓｐ３５部分に安定に融合されるかまたは切断可能であるように選択され得る。異なる目的を達成するための異種部分は、当該分野において公知である。
【００４７】
Ｓｐ３５融合タンパク質の発現の代替として、選択された異種部分は、事前に形成され、上記Ｓｐ３５部分に化学的に結合され得る。ほとんどの場合、選択された異種部分は、上記Ｓｐ３５部分に融合されていても、または結合されていても、同様に機能する。従って、異種アミノ酸配列の以下の議論において、別に示されなければ、その異種配列は、融合タンパク質の形態かまたは化学結合体として上記Ｓｐ３５部分に結合され得ることが理解されるべきである。
【００４８】
薬理学的に活性なポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５）は、しばしば、迅速なインビボでのクリアランスを示し、身体における治療有効濃度を達成するためには多用量を必要とする。さらに、約６０ｋＤａよりも小さなポリペプチドは糸球体濾過を経験する可能性があり、これは、時に、腎毒性を引き起こす。比較的小さいポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５フラグメント）の融合または結合は、このような腎毒性の危険性を軽減または回避するために用いられ得る。治療ポリペプチドのインビボ安定性（すなわち、血清半減期）を増加するための種々の異種アミノ酸配列（すなわち、ポリペプチド部分または「キャリア」）が公知である。
【００４９】
その長い半減期、広いインビボ分布および酵素的機能または免疫学的機能の欠如に起因して、本質的に全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡフラグメントは、好ましい異種部分である。Ｙｅｈら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１９０４−１９０８およびＳｙｅｄら，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−３２５２に教示されているような方法および材料の適用によって、ＨＳＡは、上記Ｓｐ３５部分に起因する薬理学的活性を示し、一方で、有意なインビボ安定性の増加（例えば、１０倍〜１００倍高い）を示すＳｐ３５融合タンパク質またはＳｐ３５結合体を形成するために使用され得る。好ましくは、上記ＨＳＡのＣ末端は、上記Ｓｐ３５部分のＮ末端に融合される。ＨＳＡは、天然に分泌されるタンパク質であるから、このＨＳＡシグナル配列は、上記融合タンパク質が真核生物（例えば、哺乳動物）発現系において生成される場合、上記Ｓｐ３５融合タンパク質の細胞培養培地への分泌を得るために利用され得る。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態は、Ｓｐ３５部分がＦｃ領域（すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分）に融合されるＳｐ３５ポリペプチドを用いる。Ｓｐ３５−Ｆｃ融合の潜在的な利点としては、可溶性、インビボ安定性および多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）（例えば、二量体化）が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＧのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であり得る。あるいは、使用されるＦｃ領域は、ＩｇＥまたはＩｇＭのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であり得る。ＩｇＧのＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１のＦｃ領域またはＩｇＧ４のＦｃ領域）が好ましい。Ｆｃ融合体をコードするＤＮＡを構築し、発現するための材料および方法は、当該分野において公知であり、過度の実験をすることなくＳｐ３５融合体を得るために適用され得る。本発明のいくつかの実施形態は、Ｃａｐｏｎらの米国特許第５，４２８，１３０号および同第５，５６５，３３５号に記載されるようなＳｐ３５融合タンパク質を用いる。
【００５１】
上記シグナル配列は、小胞体膜を通るタンパク質輸送を開始するアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチドである。免疫融合体（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）を構築するために有用なシグナル配列としては、抗体軽鎖シグナル配列（例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１２５：１９１−２０２））、抗体重鎖シグナル配列（例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら，１９８０，Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４））が挙げられる。あるいは、他のシグナル配列が使用され得る。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：５１４５を参照のこと。上記シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼにより上記小胞体の管腔において切断される。この結果、Ｆｃ領域および上記Ｓｐ３５部分を含む免疫融合体タンパク質の分泌がもたらされる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、上記分泌カセットと上記Ｓｐ３５部分との間のタンパク分解性切断部位をコードする。切断部位は、コードされた融合タンパク質のタンパク分解性切断を提供し、従って、上記Ｆｃドメインを上記標的タンパク質から分離する。有用なタンパク分解性切断部位としては、タンパク分解性酵素（例えば、トリプシン、プラスミン、トロンビン、因子ＸａまたはエンテロキナーゼＫ）により認識されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００５３】
上記分泌カセットは、複製可能発現ベクターに組み込まれ得る。有用なベクターとしては、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターはｐｄＣであり、ここで、上記免疫融合体ＤＮＡの転写は、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーターの制御下で行われる。例えば、Ｌｏら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：７１２；およびＬｏら，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００を参照のこと。適切な宿主細胞は、Ｓｐ３５ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて形質転換またはトランスフェクションされ得、Ｓｐ３５ポリペプチドの発現および分泌のために使用される。好ましい宿主細胞としては、不死化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【００５４】
完全にインタクトな野生型Ｆｃ領域は、本発明に従うＦｃ融合タンパク質において、通常、不必要であり、そして、所望されないエフェクター機能を示す。従って、特定の結合部位は、好ましくは、上記分泌カセットの構築の間に上記Ｆｃ領域から削除される。例えば、上記軽鎖との共発現は不必要であるので、上記重鎖結合タンパク質であるＢｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔら，１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１１４）に対する結合部位は、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから削除され、それにより、この部位は、免疫融合体の有効な分泌を妨害しない。同様に、免疫グロブリンの軽鎖への結合に関与するＦｃ領域に存在するシステイン残基は、削除されるかまたは別のアミノ酸に置換され、それにより、これらのシステイン残基が、免疫融合体として生成される場合に、上記Ｆｃ領域の適切な折り畳みを妨害しないようにするべきである。膜貫通ドメイン配列（例えば、ＩｇＭに存在する膜貫通ドメイン配列）は、削除されるべきである。
【００５５】
ＩｇＧ１のＦｃ領域が好ましい。あるいは、他の免疫グロブリンγサブクラス（γ−２、γ−３およびγ−４）のＦｃ領域が、上記分泌カセットにおいて使用され得る。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、好ましくは、ヒンジ領域（少なくとも一部）、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む分泌カセットにおいて使用される。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域は、ＣＨ２削除されたＦｃであり、これは、ヒンジ領域およびＣＨ３領域の一部を含むが、ＣＨ２領域は含まない。ＣＨ２削除されたＦｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら，１９９０，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，１：４７により記載されている。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭのＦｃ領域が使用される。
【００５６】
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの異なる構造で構築され得る。１つの構造において、上記Ｓｐ３５部分のＣ末端は、上記Ｆｃ部分のＮ末端に直接融合される。わずかに異なる構造において、短いポリペプチド（例えば、２個〜１０個のアミノ酸）が、上記Ｓｐ３５部分のＮ末端と上記Ｆｃ部分のＣ末端との間の融合中に組み込まれる。このようなリンカーは、いくつかの状態において生物学的活性を改善し得る、コンホメーションの柔軟性を提供する。ヒンジ領域の充分な部分が上記Ｆｃ部分において維持される場合、上記Ｓｐ３５−Ｆｃ融合体は、二量体化し、従って、二価の分子を形成する。単量体Ｆｃ融合体の同種の集団は、単一の特異性を有する二価の二量体をもたらす。各々が異なる特異性を有する２つの単量体Ｆｃ融合体の混合物は、２種の特異性を有する二価の二量体をもたらす。
【００５７】
対応するアミノ反応性基およびチオール反応性基を含む任意の数の架橋剤が、Ｓｐ３５を血清アルブミンに結合するために使用され得る。適切なリンカーの例としては、チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳおよびＧＭＢＳ）が挙げられる。他の適切なリンカーは、チオール反応性ハロアセテート基（例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）を挿入する。スルフヒドリル基との反応のための保護チオールまたは非保護チオールを提供し、還元可能な結合を生じるリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡおよびＳＡＴＰが挙げられる。このような試薬は、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００５８】
結合は、Ｓｐ３５ポリペプチドのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分を含まなくてもよい。例えば、Ｓｐ３５−アルブミン融合体は、遺伝子工学的技術を用いて得られ得、上記Ｓｐ３５部分は、そのＮ末端、Ｃ末端または両方で上記血清アルブミン遺伝子に融合される。
【００５９】
Ｓｐ３５ポリペプチドは、異種ペプチドに融合されて、上記Ｓｐ３５部分の精製または同定を容易にし得る。例えば、ヒスチジンタグは、Ｓｐ３５ポリペプチドに融合されて、市販のクロマトグラフィー媒体を用いる精製を容易にし得る。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｓｐ３５融合構築体は、細菌におけるＳｐ３５部分の生成を促進するために使用される。このような構築体において、通常、高レベルで発現および／または分泌される細菌タンパク質が、Ｓｐ３５ポリペプチドのＮ末端融合パートナーとして用いられる。例えば、Ｓｍｉｔｈら，１９８８  Ｇｅｎｅ  ６７：３１；Ｈｏｐｐら，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４；Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅら，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７を参照のこと。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態において、融合構築体としては、Ｓｐ３５部分および第２のヒトＮｇＲ１結合部分（例えば、希乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）部分、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）部分またはＮｏｇｏ６６部分）が挙げられる。このような構築体の利点としては、ＮｇＲ１結合親和性の上昇が挙げられる。
【００６２】
全長ＯＭｇｐアミノ酸配列は、当該分野において公知である（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２３５１５）。Ｓｐ３５−ＯＭｇｐ融合体の具体例としては、以下が挙げられる：
Ｓｐ３５（ａａ  ３４〜５３２）＋ＩｇＧ１  Ｆｃ＋ＯＭｇｐ（アミノ酸残基２５〜４００）；および
Ｓｐ３５（ａａ  ３４〜５３２）＋ＨＳＡ＋ＯＭｇｐ（アミノ酸残基２５〜４００）。
【００６３】
全長ＭＡＧアミノ酸配列は、当該分野において公知である（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ６１０８４）。Ｓｐ３５−ＭＡＧ融合体の具体例としては、以下が挙げられる：
Ｓｐ３５（ａａ  ３４〜５３２）＋ＩｇＧ１  Ｆｃ＋ＭＡＧ（アミノ酸残基１２〜５００）；および
Ｓｐ３５（ａａ  ３４〜５３２）＋ＨＳＡ＋ＭＡＧ（アミノ酸残基１２〜５００）。
【００６４】
全長Ｎｏｇｏアミノ酸配列は、当該分野において公知である（ＮｏｇｏＡ  ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１０２２７９）。Ｓｐ３５−Ｎｏｇｏ融合体の具体例としては、以下が挙げられる：
Ｓｐ３５（ａａ  ３４〜５３２）＋ＩｇＧ１  Ｆｃ＋Ｎｏｇｏ６６（ＮｏｇｏＡ  アミノ酸残基１０５６〜１１２２）；
Ｓｐ３５（ａａ  ３４〜５３２）＋ＨＳＡ＋Ｎｏｇｏ６６（ＮｏｇｏＡ  アミノ酸残基１０５６〜１１２２）；
Ｓｐ３５（ａａ  ３４〜５３２）＋ＩｇＧ１  Ｆｃ＋アミノＮｏｇｏ（ＮｏｇｏＡ  アミノ酸残基１〜９４９）；および
Ｓｐ３５（ａａ  ３４〜５３２）＋ＨＳＡ＋アミノＮｏｇｏ（ＮｏｇｏＡ  アミノ酸残基１〜９４９）。
【００６５】
適切な融合パートナーのアミノ末端およびカルボキシ末端でＳｐ３５部分を融合することにより、Ｓｐ３５ポリペプチドの二価形態または四価形態が得られ得る。例えば、Ｓｐ３５部分は、Ｉｇ部分のアミノ末端およびカルボキシ末端に融合され、２つのＳｐ３５部分を含む二価の単量体ポリペプチドを生成し得る。２つのこれらのモノマーが二量体化されると、Ｉｇ部分により、Ｓｐ３５タンパク質の四価形態が得られる。このような多価形態は、標的に対する結合親和性の上昇を達成するために使用され得る。Ｓｐ３５の多価形態はまた、Ｓｐ３５部分を縦列に配置し、コンカテマーを形成することによって得られ得、これは、単独で用いられ得るかまたは融合パートナー（例えば、ＩｇまたはＨＳＡ）に融合され得る。
【００６６】
（結合ポリマー（ポリペプチド以外））
本発明のいくつかの実施形態は、Ｓｐ３５ポリペプチドを含み、１つ以上のポリマーが、上記Ｓｐ３５ポリペプチドに結合（共有結合）される。このような結合のために適切なポリマーの例としては、（上で議論された）ポリペプチド、糖ポリマーおよびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。代表的に、ポリマーは、以下のうちの１つ以上を改善する目的のために上記Ｓｐ３５ポリペプチドに結合されるが、必ずしもそうでなくてもよい：可溶性、安定性またはバイオアベイラビリティ。
【００６７】
Ｓｐ３５ポリペプチドに対する結合のための好ましいポリマーのクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、特に好ましい。ＰＥＧ部分（例えば、１ＰＥＧポリマー、２ＰＥＧポリマー、３ＰＥＧポリマー、４ＰＥＧポリマーまたは５ＰＥＧポリマー）は、各々のＳｐ３５ポリペプチドに結合されて、上記Ｓｐ３５ポリペプチド単独と比較して、血清半減期を上昇し得る。ＰＥＧ部分は非抗原性であり、本質的に、生物学的に不活性である。本発明の実施において使用されるＰＥＧ部分は、分枝鎖でも、非分枝鎖でもよい。
【００６８】
上記Ｓｐ３５ポリペプチドに結合されるＰＥＧ部分の数および個々のＰＥＧ鎖の分子量は、変化し得る。一般的に、上記ポリマーの分子量が大きくなるほど、上記ポリペプチドに結合されるポリマー鎖は少なくなる。好ましくは、上記Ｓｐ３５ポリペプチドに結合される総ポリマー質量は、２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。従って、１つのポリマー鎖が結合される場合、その鎖の好ましい分子量は、２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。２つの鎖が結合される場合、各々の鎖の好ましい分子量は、１０ｋＤａ〜２０ｋＤａである。３つの鎖が結合される場合、好ましい分子量は、７ｋＤａ〜１４ｋＤａである。
【００６９】
上記ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、上記ポリペプチド上の任意の適切な露出した反応性基を介して、そのＳｐ３５ポリペプチドに結合され得る。上記露出した反応性基は、例えば、Ｎ末端アミノ基もしくは内部リジン残基のεアミノ基または両方であり得る。活性化されたポリマーは、上記Ｓｐ３５ポリペプチド上の任意のフリーのアミノ基において、反応して、共有結合し得る。上記Ｓｐ３５ポリペプチドのフリーのカルボキシル基、適切に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化された炭水化物部分およびメルカプト基はまた（利用可能である場合）、ポリマー結合のための反応性基として使用され得る。
【００７０】
好ましくは、結合反応において、ポリペプチド濃度に依存して、１モルのポリペプチドあたり約１．０モル〜約１０モルの活性化されたポリマーが用いられる。通常、選択される比は、上記反応の最大化と、上記Ｓｐ３５部分の所望される薬理学的活性を損ない得る（しばしば、非特異的な）副反応の最小化との間の均衡を表す。好ましくは、上記Ｓｐ３５ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％（例えば、本明細書中で記載されるかまたは当該分野で公知のあらゆるアッセイにおいて実証される場合）が維持され、最も好ましくは、約１００％が維持される。
【００７１】
上記ポリマーは、従来の化学を用いて上記Ｓｐ３５ポリペプチドに結合され得る。例えば、ポリアルキレングリコール部分は、上記Ｓｐ３５ポリペプチドのリジンεアミノ基に結合され得る。リジン側鎖に対する結合は、Ｎ−ヒドロキシルスクシニミド（ＮＨＳ）活性エステル（例えば、ＰＥＧスクシンイミジルサクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ））を用いて実施され得る。適切なポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳ、ノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾールおよびＰＮＰカーボネートが挙げられる。これらの試薬は、市販されている。さらなるアミン反応性ＰＥＧリンカーは、スクシンイミジル部分に置換され得る。これらとしては、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート、エポキシドおよびベンゾトリアゾールカーボネートが挙げられる。好ましくは、選択性および反応程度（ｅｘｔｅｎｔ  ｏｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を最大化するように、条件が選択される。このような反応条件の最適化は、当該分野における通常の技術内である。
【００７２】
ＰＥＧ化は、当該分野において公知の任意のＰＥＧ化反応により実施され得る。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０，１９９２；公開された欧州特許出願ＥＰ  ０  １５４  ３１６およびＥＰ  ０  ４０１  ３８４を参照のこと。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を用いて、実施され得る。
【００７３】
アシル化によるＰＥＧ化は、一般的に、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体の反応を含む。任意の反応性ＰＥＧ分子が、上記ＰＥＧ化において用いられ得る。好ましい活性化ＰＥＧエステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）に対してエステル化されたＰＥＧである。本明細書中で使用される場合、「アシル化」は、治療タンパク質と水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間の以下のタイプの結合を含むが、これらに限定されない：アミド、カーボネート、ウレタンなど。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応パラメータは、上記Ｓｐ３５ポリペプチドに損傷を与えるかまたは不活性化する温度条件、溶媒条件およびｐＨ条件を避けるように選択されるべきである。
【００７４】
好ましくは、上記連結する結合は、アミドである。好ましくは、結果としてもたらされる生成物のうちの少なくとも９５％が、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化またはトリＰＥＧ化される。しかし、より高い程度のＰＥＧ化を有するいくつかの種が、使用される具体的反応条件に依存した量で形成され得る。必要に応じて、精製されたＰＥＧ化種は、従来の精製方法によってその混合物（特に、未反応種）から分離され、これら従来の精製方法としては、例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび電気泳動が挙げられる。
【００７５】
アルキル化によるＰＥＧ化は、一般的に、還元剤存在下でのＰＥＧの末端アルデヒド誘導体とＳｐ３５との反応を含む。さらに、実質的にＳｐ３５のＮ末端アミノ基においてのみのＰＥＧ化（すなわち、モノＰＥＧ化タンパク質）に都合のよいように上記反応条件を操作し得る。モノＰＥＧ化またはポリＰＥＧ化のいずれかにおいて、上記ＰＥＧ基は、好ましくは、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介して上記タンパク質に結合される。特に−ＣＨ２−基に関して、このタイプの結合は、「アルキル」結合として公知である。
【００７６】
モノＰＥＧ化生成物を生成するための還元的アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化のために利用可能な一級アミノ基の異なるタイプの異なる反応性（リジン対Ｎ末端）を利用する。上記反応は、リジン残基のεアミノ基とタンパク質のＮ末端アミノ基との間のｐＫａの差を利用可能なｐＨにおいて、実施される。このような選択的誘導体化により、反応性基（例えば、アルデヒド）を含む水溶性ポリマーとタンパク質との結合は、制御される：上記ポリマーとの結合は、上記タンパク質のＮ末端で主に起こり、他の反応性基（例えば、上記リジン側鎖アミノ基）の有意な改変は、起こらない。
【００７７】
上記アシル化方法およびアルキル化方法の両方において使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。選択されるポリマーは、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように、好ましくは、重合度が本発明の方法のために提供されるように制御され得るように、改変されるべきである。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水溶性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドまたはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシ誘導体もしくはそのモノＣ１〜Ｃ１０アリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。上記ポリマーは、分枝鎖であっても、非分枝鎖であってもよい。上記アシル化反応のために、選択されるポリマーは、単一の反応性エステル基を有する。還元的アルキル化のために、選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有する。一般的に、上記水溶性ポリマーは、天然に生じるグリコシル残基から選択される。なぜなら、これらは、通常、哺乳動物組換え発現系によって、より都合よく作製されるからである。
【００７８】
ＰＥＧ化Ｓｐ３５を調製するための方法は、一般的に、（ａ）Ｓｐ３５タンパク質またはＳｐ３５ポリペプチドと、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステル誘導体または反応性アルデヒド誘導体）とを、それによってその分子が１つ以上のＰＥＧ基に結合されるようになる条件下で反応させる工程、および（ｂ）その反応生成物を得る工程、を包含する。一般的に、上記アシル化反応のための最適反応条件は、公知のパラメータおよび所望される結果に基づいて、場合に応じて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きくなるほど、ポリＰＥＧ化生成物の百分率は大きくなる。
【００７９】
モノ−ポリマー／Ｓｐ３５の実質的に均一な集団を生成するための還元的アルキル化は、一般的に、以下の工程：（ａ）Ｓｐ３５のＮ末端アミノ基の選択的改変を可能にする（ｐｅｎ−ｎｉｔ）ために適切なｐＨの還元的アルキル化条件下、Ｓｐ３５タンパク質またはＳｐ３５ポリペプチドと、反応性ＰＥＧ分子とを反応させる工程；および（ｂ）その反応性生物を得る工程、を包含する。
【００８０】
モノ−ポリマー／Ｓｐ３５の実質的に均一な集団のために、上記還元的アルキル化反応条件は、上記水溶性ポリマー部分と上記Ｓｐ３５のＮ末端との選択的結合を可能にする反応条件である。このような反応条件は、一般的に、リジン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基との間のｐＫａの差を考慮に入れる。本発明の目的のために、好ましいｐＨは、３〜９の範囲内、好ましくは、３〜６の範囲内である。
【００８１】
Ｓｐ３５ポリペプチドは、タグ（例えば、その後にタンパク分解により放出され得る部分）を含み得る。従って、上記リジン部分は、Ｈｉｓ−タグ改変体と低分子量リンカー（例えば、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ））とが最初に反応することにより、選択的に改変され得、この低分子量リンカーは、そのリジンおよびＮ末端の両方と反応し、次いでｈｉｓタグを放出する。次いで、上記ポリペプチドは、フリーのＳＨ基を含み、このフリーのＳＨ基は、チオール反応性末端基（例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基またはフリーもしくは保護されたＳＨ）を含むＰＥＧにより選択的に改変され得る。
【００８２】
Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬は、ＰＥＧ結合のための特異的部位を設定する任意のリンカーにより置換され得る。例えば、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）により置換され得る。同様に、上記タンパク質と、マレイミドを挿入するアミン反応性リンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳまたはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基を挿入するアミン反応性リンカー（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーとが反応し得、結果として生じた生成物と、フリーのＳＨを含むＰＥＧとが反応し得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、上記ポリアルキレングリコール部分は、上記Ｓｐ３５ポリペプチドのシステイン基に結合される。結合は、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基またはチオール基を用いてもたらされ得る。
【００８４】
必要に応じて、上記Ｓｐ３５ポリペプチドは、不安定な結合を介して、上記ポリエチレングリコール部分に結合される。上記不安定な結合は、例えば、生物化学的加水分解、タンパク分解またはスルフヒドリル切断で切断され得る。例えば、上記結合はインビボ（生理的）条件下で切断され得る。
【００８５】
上記反応は、上記反応性基がＮ末端のαアミノ基上である場合、生物学的に活性な物質と不活性ポリマーとを反応させるために使用される任意の適切な方法により、好ましくは、約ｐＨ５〜８（例えば、ｐＨ５、６、７または８）で行われ得る。一般的に、上記プロセスは、活性化されたポリマーを調製する工程およびその後の上記タンパク質とその活性化されたポリマーとを反応させ、処方物のための適切な可溶性タンパク質を生成する工程を包含する。
【００８６】
（ベクター）
本発明は、Ｓｐ３５ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターおよび本発明の核酸が作動可能に連結する発現制御配列の選択は、所望される機能特性（例えば、タンパク質発現）および形質転換されるべき宿主細胞に依存する。
【００８７】
作動可能に連結されたコード配列の発現調節のために有用な発現制御エレメントは、当該分野において公知である。例としては、誘導性プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナルおよび他の調節エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターが使用される場合、それは、例えば、上記宿主細胞培地における栄養状態変化または温度変化によって制御され得る。
【００８８】
上記ベクターとしては、原核生物レプリコン（すなわち、細菌宿主細胞において、染色体外の組換えＤＮＡ分子の自律的な複製および維持を行う能力を有するＤＮＡ配列）が挙げられ得る。このようなレプリコンは、当該分野において周知である。さらに、原核生物レプリコンを含むベクターはまた、その発現が検出可能マーカー（例えば、薬物耐性）を与える遺伝子を含み得る。細菌薬物耐性遺伝子の例は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与える遺伝子である。
【００８９】
原核生物レプリコンを含むベクターはまた、細菌宿主細胞において、上記コード遺伝子配列の発現を行うための原核生物プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターを含み得る。細菌宿主に適合性のプロモーター配列は、代表的に、発現されるべきＤＮＡセグメントの挿入のために都合のよい制限酵素部位を含むプラスミドベクター中に、提供される。このようなプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適切な原核生物宿主が、本発明のタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現するために、使用され得る。
【００９０】
真核生物細胞発現ベクターは、当該分野において公知であり、市販されている。代表的に、このようなベクターは、所望されるＤＮＡセグメントの挿入のために都合のよい制限酵素部位を含む。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ  ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧ、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５およびＡＡＶベクターが挙げられる。
【００９１】
真核生物細胞発現ベクターは、選択可能マーカー（例えば、薬物耐性遺伝子）を含み得る。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１）は、このような遺伝子の例である。
【００９２】
抗体または抗体フラグメントを発現するために、一部または全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが、発現ベクター（例えば、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなど）に挿入される。上記発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合性であるように選択される。上記抗体軽鎖遺伝子および上記抗体重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入され得る。いくつかの実施形態において、両方の遺伝子は、同じ発現ベクターに挿入される。
【００９３】
都合のよいベクターは、機能的に完全なヒトＣＨ免疫グロブリン配列またはヒトＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターである。好ましくは、制限酵素部位が作製され、それにより、任意のＶＨ配列またはＶＬ配列が、容易に挿入され、発現され得る。このようなベクターにおいて、スプライシングは、通常、挿入されたＪ領域のスプライスドナー部位とヒトＣ領域の前のスプライスアクセプター部位との間で、そしてまた、ヒトＣＨエキソン内に生じるスプライス領域で、生じる。ポリアデニル化および転写終結は、上記コード領域の下流の天然の染色体部位で生じる。上記組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの上記抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。
【００９４】
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント（例えば、レトロウイルスＬＴＲ由来のプロモーターおよびエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ）ならびに強力な哺乳動物プロモーター（例えば、天然の免疫グロブリンプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる記載については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号；Ｂｅｌｌの同第４，５１０，２４５号；およびＳｃｈａｆｆｎｅｒの同第４，９６８，６１５号を参照のこと。
【００９５】
組換え発現ベクターは、宿主細胞においてそのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子を有してもよい。上記選択マーカー遺伝子は、そのベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、Ａｘｅｌの米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、代表的に、上記選択マーカー遺伝子は、上記ベクターが導入された宿主細胞に薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート）に対する耐性を与える。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増殖を用いるｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。
【００９６】
Ｓｐ３５ポリペプチドおよび抗Ｓｐ３５抗体をコードする核酸分子ならびにこれらの核酸分子を含むベクターは、適切な宿主細胞の形質転換のために使用され得る。任意の適切な方法により、形質転換され得る。哺乳動物細胞への外因性ＤＮＡの導入のための方法は、当該分野において周知であり、これらの方法としては、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドの封入および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターにより哺乳動物細胞に導入され得る。
【００９７】
宿主細胞の形質転換は、用いられるベクターおよび宿主細胞にとって適切な従来の方法により達成され得る。原核生物宿主細胞の形質転換のために、エレクトロポレーション法および塩処理法が用いられ得る（Ｃｏｈｅｎら，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−２１１４）。脊椎動物細胞の形質転換のために、エレクトロポレーション法、カチオン性脂質法または塩処置法が用いられ得る。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７；Ｗｉｇｌｅｒら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−１３７６ｆを参照のこと。
【００９８】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野において公知であり、これらの細胞株としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。これらとしては、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞および多くの他の細胞株が挙げられる。
【００９９】
産生細胞株からのポリペプチドの発現は、公知の技術を用いて促進され得る。例えば、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）系は、特定条件下で発現を促進するために、一般的に使用される。例えば、欧州特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号および同第０３２３９９７号ならびに欧州特許出願番号８９３０３９６４．４を参照のこと。
【０１００】
（宿主細胞）
宿主細胞は、原核生物起源または真核生物起源であり得る。好ましい真核生物の宿主細胞としては、限定されないが、酵母細胞および哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨのスイスマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１６５８）、および新生児のハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ））が挙げられる。他の有用な真核生物の宿主細胞としては、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。例示的な原核生物の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである。
【０１０１】
（処方物）
Ｓｐ３５ポリペプチド、抗Ｓｐ３５抗体、または抗Ｓｐ３５抗体の抗原結合フラングメントを含む組成物は、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。例えば、それらは、作用部位への送達のために設計された調製物への、活性化合物の処理を促進する賦形剤および／または補助剤を含み得る。非経口投与のための適切な処方物としては、水溶性形態（例えば、水溶性塩）の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、適切な油状の注射懸濁液のような活性化合物の懸濁液が、投与され得る。適切な新油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド））が挙げられる。水溶性の注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランが挙げられる）を含み得る。必要に応じて、懸濁液はまた、安定剤を含み得る。リポソームもまた、細胞または間隙の空間の中への送達のために本発明の分子をカプセル化するために使用され得る。例示的な薬学的に受容可能なキャリアは、生理学的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。いくつかの実施形態において、組成物は、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、または塩化ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に受容可能な物質（例えば、湿潤剤または少量の補助的な物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤または緩衝液））を含み、これらは、活性成分の貯蔵寿命または有効性を高める。
【０１０２】
本発明の組成物は、例えば、液体（例えば、注射剤および不溶解性溶液）、分散剤、懸濁液、半固形ならびに固形投薬形態を含む、様々な形態であり得る。好ましい形態は、投与および治療の用途の様式に依存する。
【０１０３】
組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散、リポソーム、または高い薬物濃度に適する他の指示される構造として処方され得る。滅菌注射溶液は、上に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒中に、必要とされる量の活性成分を組み込むことによって調製され得、必要な場合、続いて、濾過滅菌される。概して、分散剤は、塩基性分散媒体および上に列挙したものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルの中に活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加えて、前以て滅菌濾過した溶液から任意のさらなる所望の成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性が、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用、分散剤の場合は、必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持され得る。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチン）を組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【０１０４】
活性成分は、制御放出性の処方物またはデバイスを用いて処方され得る。そのような処方物およびデバイスの例としては、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセルに入れられた送達系が挙げられる。生分解性で、生体適合性のポリマー（例えば、酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が、使用され得る。そのような処方物およびデバイスの調製のための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
【０１０５】
注射用の貯蔵処方物は、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド）中でマイクロカプセルに入れられた薬物のマトリックスを形成することによって作製され得る。ポリマーに対する薬物の割合、および使用されるポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度が、制御され得る。他の例示的な生分解性ポリマーは、ポリオルトエステルおよびポリ無水物である。貯蔵注射用処方物はまた、リポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を包括することによって調製され得る。
【０１０６】
補助的な活性化合物は、組成物の中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、Ｓｐ３５ポリペプチド、抗Ｓｐ３５抗体またはそのフラグメントは、抗ＮｇＲ１抗体、もしくはその抗原結合断片、または溶解性のＮｇＲ１ポリペプチドもしくはＮｇＲ１融合タンパク質と一緒に同時投与される。
【０１０７】
投薬レジメンは、最適な所望の反応を提供するように調整され得る。例えば、単一のボーラスが投与され得、いくつかの分割用量が、時間をかけて投与され得るか、または用量は、治療状態の緊急性によって示されるにつれて、比例して減少もしくは増加され得る。投与の容易さおよび投薬量の均一性のための投薬単位形態で、非経口組成物を処方することが有利である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１９８０）を参照のこと。
【０１０８】
活性化合物に加えて、液体投薬形態は、不活性成分（例えば、水、エチルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル）を含み得る。
【０１０９】
（遺伝子治療）
Ｓｐ３５ポリペプチドは、軸策の伸長の阻害を減少させることが治療的に有益であるＣＮＳ疾患、ＣＮＳ障害またはＣＮＳ損傷の処置のための遺伝子治療アプローチを使用して、哺乳動物（例えば、ヒト患者）においてインビボで生成され得る。これは、適切な発現制御配列に作動可能に連結される適切なＳｐ３５ポリペプチドをコードする核酸の投与を含む。好ましくは、これらの配列は、ウイルスベクターの中へ組み込まれる。このような遺伝子治療のための適切なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスベクター、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠損のウイルスベクターであり得る。好ましいアデノウイルスベクターは、そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子に欠損を有し得る。アデノウイルスベクターが使用される場合、好ましくは、哺乳動物は、選択マーカー遺伝子をコードする核酸に曝露されない。
【実施例】
【０１１０】
本発明はさらに、以下の実験の実施例によって例示される。実施例は、例示の目的のためだけに提供され、あらゆる方法においても本発明の範囲または内容を制限すると解釈されるべきではない。
【０１１１】
（実施例１：Ｓｐ３５発現パターン）
ヒトの組織におけるＳｐ３５の発現をノーザンブロット解析によって調べた。１２個のヒトの主要な組織または１４個のヒトのＣＮＳ組織を含む複数の組織ブロットを、Ｐ３２で標識したＳｐ３５プローブ（Ｓｐ３５ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１５０〜４５０）を用いて６８℃で一晩ハイブリダイズした。そのブロットを、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３回洗浄し、次いで、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３回洗浄した。次いで、そのブロットをＸ線フィルムに露光し、ｍＲＮＡレベルをオートラジオグラフィーによって可視化した。
【０１１２】
Ｓｐ３５は、ヒトの脳においては心臓、高度に発現したが、骨格筋、結腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺および末梢血白血球では発現しなかった。Ｓｐ３５は、前頭皮質、後頭皮質、嗅内皮質、海馬、嗅球、線条、視床、小脳、中脳、脳橋、髄質および脊髄から単離された組織を含む、試験した全ての脳組織において発現した。吻／索軸に沿った遺伝子発現の勾配を、Ｓｐ３５について観察し、皮質において最もレベルが高く、そして脊髄において最もレベルが低かった。
【０１１３】
Ｓｐ３５が特定の脳細胞で発現するかどうかを、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を使用して決定した。４％パラホルムアルデヒドで固定したラットの脳、脊髄の切片、または初代顆粒状ニューロン培養物を、示されるようにＳｐ３５に対する一次抗体と一緒にインキュベートし、その後、Ａｌｅｘａ４８０またはＡｌｅｘａ５９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）に結合した二次抗体と一緒にインキュベートした。次いで、その切片を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄに乗せて、蛍光顕微鏡検査によって可視化した。ＩＨＣのために使用される抗Ｓｐ３５特異的抗体を、ＭｏｒＰｈｏｓｙｓ技術を使用してＦａｂファージディスプレイライブラリーから作製した。
【０１１４】
Ｓｐ３５は、ニューロンおよび希突起膠細胞において特異的に発現したが、星状細胞では発現しなかった。このことを、抗星状細胞マーカーＧＦＡＰ、希突起膠細胞マーカー（Ｏ４）に対する抗体、およびニューロンマーカーβＩＩＩチューブリンに対する抗体（全て抗Ｓｐ３５抗体を用いて対比染色を行う）を含む種々の薬剤で、ラットの脳組織切片を染色し、実験において測定した。希突起膠細胞およびニューロンは、抗Ｓｐ３５抗体で強く染色された。星状細胞の染色は、観測されなかった。
【０１１５】
Ｓｐ３５の発現パターンの非依存性の確認として、本発明者らは、ラットの精製した星状細胞、希突起膠細胞、および小脳顆粒状ニューロンの初代細胞培養物から抽出したｍＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ  ｋｉｔ）を使用して半定量的なＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０１１６】
【数１】
2010154861.tif 000006
２６サイクルの後、強いバンドをニューロン由来のｍＲＮＡにおいて観察し、識別可能であるが、弱いシグナルを希突起膠細胞ｍＲＮＡにおいて検出し、星状細胞においてはバンドが観察されなかった。
【０１１７】
（実施例２：Ｓｐ３５−Ｆｃ融合タンパク質）
Ｓｐ３５の生物学的機能を研究するために、ヒトＳｐ３５の細胞外部分（残基１〜５３１）をヒトＩｇＧ１のヒンジ領域およびＦｃ領域と融合して、構築物を作製した。ヒトＳｐ３５を部分的にコードする配列を、
【０１１８】
【数２】
2010154861.tif 000007
を使用してクローン２２７．２（Ｉｎｃｙｔｅ）からＰＣＲによって得た。
【０１１９】
平滑末端ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  ＳＣＲＩＰＴ  ＡＭＰ−ｓｐ３５を作製するためにＰＣＲ  ＳＣＲＩＰＴ  ＡＭＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｒｆＩ部位の中へサブクローニングした。ＳａｌＩフラグメントを、ＰＣＲ  ＳＣＲＩＰＴ  ＡＭＰ−ｓｐ３５から単離し、ＰＣＲＣＡＭＰ  Ｉｇベクター（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅベクターＰＣＲ  ＳＣＲＩＰＴ  ＡＭＰの誘導体で、このベクターでは、Ｆｃγ配列がＳａｌＩ（５’）〜ＮｏｔＩ（３’）フラグメントとしてサブクローンされている）の中へサブクローニングし、インフレームでＳｐ３５シグナル配列および外部ドメイン配列（コドン１〜５３１）をヒトＩｇ１のヒンジ領域およびＦｃ領域をコードする配列と融合した。正しい単離物を同定し、Ｓｐ３５  Ｆｃフラグメントを包含するＮｏｔＩフラグメントを、２９３Ｅ発現ベクター（市販の発現ベクターＲＥＰ４(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体である、ＣＨ
２７４）の単一のＮｏｔ  Ｉクローニング部位の中へサブクローニングした。新しいベクターである、ＣＨ２７４／ｓｐ３５−ＦｃによってコードされるＳｐ３５−Ｆｃ融合を、プラスミドＧＴ１２３としてＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１２０】
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合タンパク質を発現する安定な細胞株を、プラスミドＧＴ１２３を用いてＣＨＯ宿主細胞ＤＧ４４のエレクトロポレーションによって作製した。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、ヌクレオシド非依存性増殖について選択するために、１０％の透析血清および４ｍＭグルタミンの存在下のα−ＭＥＭ中で培養した。トランスフェクションの１４日後、細胞に新鮮な培地を与えた。Ｓｐ３５−Ｆｃを発現する細胞をスクリーニングするために、ＣＨＯ細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）で標識し、ＦＡＣＳ  Ｍｏ−Ｆｌｏ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）において高速フローサイトメトリーソーティングに供した。最も高いレベルのＳｐ３５−Ｉｇを発現した細胞を選択した。これらの細胞を７日間培養液で拡張させて、次いで、再び標識し、再びソートした。最も高いレベルのＳｐ３５−Ｉｇを発現する細胞を、９６−ウェルプレート中の個々のクローンとして単離した。これらのクローンを２週間増殖させ、次いで、発現レベルを検査するために、ＦＡＣＳ解析の１日前に新鮮な培地を与えた。最も高いレベルのＳｐ３５−Ｆｃを発現したクローンを拡張し、凍結して、セルバンクを確立した。その細胞株を、無血清のＢＣＭ１６培地の懸濁培養物中で増殖させるために適合した。これらのクローンによって生成されたＳｐ３５−Ｆｃの力価を、４〜５継代の間、３７℃での増殖細胞株によって測定し、次いで、５０％最大細胞密度まで細胞を増殖させ、生存可能な細胞密度が７５％に落ちるまで、２８℃で１０〜１５日間培養した。この時点で、培地を収集し、遠心分離によって細胞および残屑を除き、プローブとして抗ヒトＩｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）を使用して、ウェスタンブロット解析によってＳｐ３５−Ｆｃレベルについての培養上清を力価測定した。
【０１２１】
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合タンパク質を、以下のような浄化した培養培地から精製した：９ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５を９００ｍｌの馴化培地に添加した。この培地を３ｍｌのプロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に対して４℃で３時間、負荷して一括処理した。樹脂を１．５ｃｍ（Ｉ．Ｄ．）のカラムで回収し、３ｍｌ  ＰＢＳで４回、８００ｍＭ  ＮａＣｌを含む４ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、次いで、３ｍＬのＰＢＳで再び洗浄した。Ｓｐ３５−Ｆｃを、１．５ｍＬ画分において２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ２．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いてカラムから溶出し、７５μＬの０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．６を添加することによって中和した。ピークタンパク質含有画分を、２８０ｎｍでの吸光度によって同定して、プールし、さらに１ｍＬプロテインＡカラム上での精製に供した。負荷するより前に、ＮａＣｌを６００ｍＭまで、そしてＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５を５０ｍＭまで添加した。カラムを、６００μＬの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．５、１Ｍ  ＮａＣｌで２回洗浄し、次いで、１ｍＬ  ＰＢＳで洗浄した。Ｓｐ３５−Ｆｃを、２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ２．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いてカラムから溶出し、０．５ｍＬ画分を回収して、２５μＬの０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．６を添加することによって中和した。ピークタンパク質含有画分を、２８０ｎｍでの吸光度によって同定して、プールした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元することによって、Ｓｐ３５−Ｉｇを９０ｋＤａの見かけの質量を有するシングルバンド（９５％より高い純粋）として移動した。還元していない条件の下で、タンパク質をおよそ１８０ｋＤａの質量を有する二量体として、電気泳動した。精製したＳｐ３５−Ｆｃを等分して、−７０℃で保存した。Ｓｐ３５アミノ酸１〜５３１およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃを含むＧＴ１２３のＮｏｔＩフラグメントを、ＤＢ００２を作製するためにＰＶ９０ベクターのＮｏｔＩ部位の中にサブクローニングした。
【０１２２】
（実施例３：Ｈｉｓ−Ａｐ−Ｓｐ３５融合タンパク質）
Ｓｐ３５についてのレセプターを研究および単離するために、Ｈｉｓタグ化アルカリホスファターゼ（Ｈｉｓ−Ａｐ）融合タンパク質として、ＣＯＳ７細胞およびＣＨＯ細胞においてタンパク質を発現させた。プラスミドを以下のように構築した：Ｓｐ３５の細胞外ドメイン（ａ．ａ．３４〜５３２）を、Ｅｃｏ  ＲＩ切断部位（下線）を含むプライマー（フォワード）
【０１２３】
【数３−１】
2010154861.tif 000008
およびＸｂａ  Ｉ切断部位（下線）を含むプライマー（リバース）
【０１２４】
【数３−２】
2010154861.tif 000009
を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｘｂａ  Ｉで切断し、その結果生じる粘着末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで満たし、次いで、Ｅｃｏ  ＲＩで消化し、そしてゲル精製した。消化した生成物を、Ｈｉｓ−ＡＰ−ｐｃＤＮＡ１．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のＥｃｏ  ＲＩ  Ｈｉｓ−ＡＰフラグメント中に埋め込まれたＨｉｎｄＩＩＩに連結した。Ｈｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５フラグメントを、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化し、満たし、次いで、ベクターｐＶ９０のＮｏｔ  Ｉを満たした部位の中へ連結した。挿入物のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１２５】
ＣＯＳ７細胞をトランスフェクション前日に分けた。Ｈｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５
ベクターＤＮＡ（８μｇ）を、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、５×１０６個の細胞をトランスフェクトするために使用した。馴化培地を、トランスフェクションの４８時間後に、収集した。
【０１２６】
本発明者らは、ｐＶ９０プラスミドを使用してＨｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞株を開発した。ＣＨＯ宿主細胞ＤＧ４４（２×１０６個の細胞）を、エレクトロポレーションによって１００μｇのプラスミドを用いてトランスフェクトした。細胞を、ヌクレオシド非依存性増殖について選択するために、１０％の透析血清および４ｍＭグルタミンの存在下のα−ＭＥＭ中で培養した。トランスフェクションの１４日後、ＦＡＣＳ  Ｍｏ−Ｆｌｏ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）ソーティングによるスクリーニング前に、新鮮な培地を細胞に与えた。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）に対するマウスモノクローナル抗体８Ｂ６で標識した。二次抗体である、ＰＥ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを使用して、トランスフェクトした細胞に特異的なシグナルを生成させた。ＰＥ標識後、細胞を高速フローサイトメトリーソーティングに供し、上位５％を選択した。
【０１２７】
Ｈｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５を含む馴化した培地を生成するために、最も高いレベルのＨＩＳＡｐＳｐ３５を発現した細胞を選択した。細胞株を、無血清の培地（ＢＣＭ１６）の懸濁培養液中で増殖させるために適合させた。これらのクローンによって生成したＨｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５の力価を、４〜５継代の間、３７℃で細胞株を増殖させることによって測定し、次いで、細胞を５０％の最大細胞密度まで増殖させ、これらを生存可能な細胞密度が７５％に落ちるまで、２８℃で１０〜１５日間、培養した。培地を収集し、遠心分離によって、細胞および残屑を除き、培養上清を、プローブとして抗ヒトＡＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）を使用するウェスタンブロット解析によってＨｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５レベルについて力価測定した。
【０１２８】
Ｈｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５を、以下のような馴化培地から精製した：Ｈｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５を発現するＣＨＯ細胞由来の４００ｍＬの馴化培地を４００ｍＬの水で希釈した。トリエタノールアミンｐＨ８．５を、０．５Ｍストックからの２５ｍＭに添加し、サンプルを、６ｍｌのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ（ＥＭ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）アニオン交換樹脂の上に４℃で２時間、負荷して一括処理した。樹脂を、１．５ｃｍ（Ｉ．Ｄ．）カラム中で回収し、６ｍＬの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌで２回洗浄した。ＡＰ−Ｓｐ３５を、２ｍＬ画分において１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌを用いてカラムから溶出した。ピーク画分を、ＡＰ活性のモニタリング、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定した。ＴＭＡＥカラムからの貫流画分をさらに、３００ｍｌの水で希釈し、６ｍｌのＴＭＡＥ樹脂の上で４℃で一晩、一括処理で負荷した。樹脂を回収し、上記のように洗浄して、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。ピーク画分を再び、ＡＰ活性のモニタリング、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定した。第１のカラムからのＨｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５は、５０％純粋で、第２のカラムからのＡＰ−Ｓｐ３５は、９０％純粋であった。還元条件の下で、Ｈｉｓ−Ａｐ−Ｓｐ３５は、１３０ｋＤａの見かけの質量でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動した。９０％純粋な物質は、ほとんどの調査について適切であったが、いくつかの研究については、Ｈｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）でさらに精製した。ＮａＣｌを、ＴＭＡＥカラムからの溶出画分に８００ｍＭ添加し、０．５ＭトリエタノールアミンｐＨ８．５および１ＭイミダゾールｐＨ７．０をそれぞれ、２５ｍＭおよび１５ｍＭまで添加した。４．５ｍｌのサンプルを、４００μＬ  ＮｉＮＴＡカラムの上に負荷した。そのカラムを、２５ｍＭトリエタノールアミン  ｐＨ８．５、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭイミダゾールで３回洗浄し、Ｈｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５を、２００ｍＭイミダゾールｐＨ７．０、３５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いてカラムから溶出し、２００μＬの画分を回収した。ピークＡＰ含有画分をプールし、２５０容量の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌに対して一晩、透析した。ＭｇＣｌ２およびＺｎＣｌ２をそれぞれ２ｍＭおよび０．２５ｍＭまで、保有物に添加した。最終生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％純粋より大きく、還元条件の下でおよそ１４０ｋＤａの質量を有するシングルバンドとして電気泳動した。
【０１２９】
Ｓｐ３５構築物をまた、Ｆｃ融合体として加工した。Ｓｐ−３５ＬＲＲ−Ｆｃ構築物を、プライマー（フォワード）
【０１３０】
【数４】
2010154861.tif 000010
を使用するＰＣＲによって作製した。このＰＣＲ産物を、ＰＶ９０ベクターのＮｏｔＩ部位の中へ挿入した。Ｓｐ３５ＩＧ−Ｆｃ構築物を、プライマー（フォワード）
【０１３１】
【数５】
2010154861.tif 000011
を使用するＰＣＲによって作製した。このＰＣＲ産物を、ＰＶ９０ベクターのＮｏｔＩ部位の中へ挿入した。タンパク質をＣＨＯ細胞において発現させ、プロテインＡセファロースカラムを使用して精製した。
【０１３２】
（実施例４：ＮｇＲ１発現細胞へのＳｐ３５結合）
ＮｇＲ１へのＳｐ３５結合を示すために、４つの異なる方法を使用した。第１に、本発明者らは、アルカリホスファターゼＳｐ３５結合体（ＡＰ−Ｓｐ３５）を、ＮｇＲ１発現細胞と一緒にインキュベートし、色素形成のＡＰ検出試薬を使用して結合を評価する、直接的な結合アッセイにおいて相互作用を検出した。９０％コンフルエントのＣＯＳ７細胞を、１００ｍｍ組織培養皿上で増殖させ、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＮｇＲ１発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクトした細胞を、ＨＢＨ（Ｈａｎｋの平衡化塩緩衝液、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）で１回洗浄し、次いで、ＨＢＨ中の４μｇ／ｍｌのＡＰ−Ｓｐ３５融合タンパク質と一緒に、２３℃で１．５時間インキュベートした。細胞を、氷冷のＨＢＨ緩衝液で、各々３分間で３回洗浄し、次いで、１５分間、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の３．７％ホルムアルデヒドで固定し、ＨＢＨ緩衝液の中へ移して戻した。内因性の熱に不安定なＡＰを、６７℃で２時間、熱不活性化した。結合したＡＰ−Ｓｐ３５を、ニトロブルーテトラゾリウムＮＢＴ（Ｒｏｃｈｅ）と共にインキュベーションすることによって検出した。Ａｐ−Ｓｐ３５は、ヒトＮｇＲ１レセプターを発現するＣＯＳ７細胞に結合したが、ベクター単独でトランスフェクトしたコントロールＣＯＳ７細胞には結合しなかった。ＮｇＲ１についての点状の染色パターンが観測され、このことは、１つの画分のみ、おそらく５０％の細胞がＮｇＲ１でトランスフェクトされたことを反映する。
【０１３３】
結合をよりよく定量化するために、本発明者らは同じ実験を行ったが、並行細胞サンプルとして、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．１２５μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌのＡＰ−Ｓｐ３５を用いて処理した。結合したＡＰを、４−ニトロフェニルホスフェートと一緒にインキュベートし、９６−ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）においてＡＰ活性を測定した。これらのデータから、本発明者らは、ヒトＮｇＲ１へのＡｐ−Ｓｐ３５の結合についてのＥＣ５０が、およそ６ｎＭであると推定した。
【０１３４】
第２に、本発明者らは、ＥＬＩＳＡアプローチにおけるＮｇＲ１へのＳｐ３５の結合を検出した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、３７℃で１時間、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．０において１０μｇ／ｍｌ可溶性ＮｇＲ１−Ｆｃレセプター（ラットＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃと融合したラットＮｇＲ１ペプチド３５〜３１０を含むｓＮｇＲ３１０−ＦｃならびにラットＩｇＧ１と融合したラットＮｇＲ１ペプチド３５〜３４４を含むｓＮｇＲ３４４−Ｆｃ）でコーティングした。そのプレートをブロッキングして、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０、０．１％ＢＳＡ、０．１％オボアルブミン、０．１％脂肪を含まないドライミルクおよび０．００１％ＮａＮ３で洗浄した。ＡＰ−Ｓｐ３５タンパク質４μｇ／ｍｌをプレートに添加して、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、結合したＡＰを、０．１Ｍグリシン、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＺｎＣｌ２  ｐＨ１０．５で希釈した１０μｇ／ｍｌの色素形成の基質であるリン酸４−ニトロフェニルを使用して検出した。ＯＤ４１０を、Ｓｏｆｔｍａｘプログラムを装着するＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において測定した。ＡＰ−Ｓｐ３５は、固定化したｓＮｇＲ−３４４−Ｆｃに結合したが、ｓＮｇＲ−３１０−Ｆｃタンパク質には結合せず、より長い種類のＮｇＲ１が、Ｓｐ３５結合に必要とされることを示した。本発明者らは、１００倍過剰のｓＮｇＲ３４４−Ｆｃと一緒にＡＰ  Ｓｐ３５をプレインキュベートすることによってｓＮｇＲ３４４−Ｆｃ  ＮｇＲ１へのＡＰ−Ｓｐ３５の結合を８０％まで達成し得た。ラットＩｇ融合コントロールタンパク質としてハリネズミＩｇ１融合タンパク質を使用すると、結合の競合は見られなかった。
【０１３５】
第３に、本発明者らは、ＮｇＲ１とＳｐ３５を同時に免疫沈降することによってＮｇＲ１へのＳｐ３５の結合を検出した。この研究のために、１００ｍｍの組織培養皿上で増殖した８０％コンフルエントのＣＯＳ７細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＳｐ３５血球凝集素（Ｓｐ３５−ＨＡ）およびＮｇＲ−ＦＬＡＧをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後、細胞を収集して、４℃で３０分間、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０％グリセロール）中で溶解した。次いで、溶解物を、１５分間１４，０００×ｇで遠心分離し、上清を回収して、抗ＨＡ親和性マトリックス（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、攪拌しながら４℃で一晩インキュベートした。サンプルを、１ｍｌの溶解緩衝液で３回洗浄し、次いで、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で３分間ボイルし、４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いる免疫ブロッティングによって解析した。ＦＬＡＧの存在によって明らかなように、抗ＨＡタグ親和性樹脂から、Ｓｐ３５−ＨＡおよびＦＬＡＧ−ＮｇＲの両方を含む複合体を回収した。この複合体は、細胞をＳｐ３５−ＨＡプラスミドまたはＦＬＡＧ−ＮｇＲ１プラスミド単独で処理したか、またはＦｌａｇ−ＮｇＲ１およびＮｇＲ１に結合しないＨＡタグ化コントロールタンパク質で同時トランスフェクションした、コントロールトランスフェクション由来の溶解物中に見られなかった。
【０１３６】
Ｓｐ３５−ＨＡを以下のように作製した。Ｓｐ３５シグナル配列および細胞外ドメイン（アミノ酸１〜５３１）を、ＸｂａＩ部位およびＳｐｅＩ部位（下線）を含むプライマー
【０１３７】
【数６】
2010154861.tif 000012
を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩおよびＳｐｅＩによって消化し、ＸｂａＩ部位とＳｐｅＩ部位との間のベクターｐＣＧＣＨＡの中へ挿入した。配列の挿入をＤＮＡ配列決定によって確認した。ＦＬＡＧ  ＮｇＲ１構築物はＤｒ．Ｚｈｉｇａｎｇ  Ｈｅ（２００２年、１１月７日、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ４２０）のご好意により提供された。
【０１３８】
第４に、本発明者らは、Ａｐ−Ｓｐ３５が、ＮｇＲ１を発現するラットの小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）に結合することを示した。この実験のために、９０％コンフルエントの出後８日のＣＧＮ細胞を、１００ｍｍ組織培養皿上で増殖した。４８時間後、細胞を、ＨＢＨ緩衝液で一度洗浄し、次いで、２３℃で１．５時間、ＨＢＨ緩衝液中で４μｇ／ｍｌのＡＰ−Ｓｐ３５と一緒にインキュベートした。次いで、細胞を、各々３分間、氷冷のＨＢＨで３回洗浄し、次いで、１５分間、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で３．７％のホルムアルデヒドで固定し、ＨＢＨに移して戻した。内因性の熱に不安定なＡＰを、６７℃で２時間、熱不活性化した。結合したＡＰ−Ｓｐ３５を、ニトロブルーテトラゾリウムＮＢＴ（Ｒｏｃｈｅ）と共にインキュベーションすることによって検出した。ＡＰ−Ｓｐ３５は、ＮｇＲ１を発現する出後８日の小脳顆粒状ニューロンに結合した。ニューロンへのＡＰ−Ｓｐ３５の結合を、ほとんどの膜表面由来のＧＰＩアンカータンパク質を開裂するＰＩＰＬＣ（５単位／ｍｌ）を用いてＣＧＮを処理することによって阻害した。ＮＧＲ１は、ＧＰＩ結合タンパク質であるので、この結果は、Ｓｐ３５が、ＣＧＮ細胞上のＮｇＲ１に結合するという考えをさらに支持する。
【０１３９】
（実施例５：ＮｇＲ１とＳｐ３５の共存）
Ｓｐ３５およびＮｇＲ１が、同じニューロンにおいて発現するかどうかを決定するために、本発明者らは、共存の研究を行った。４％パラホルムアルデヒドで固体したラットのｐ８初代顆粒ニューロン培養物を、Ｓｐ３５およびＮｇＲ１に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と一緒にインキュベートし、次いで、適切なＡｌｅｘａ標識した第２の抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）と一緒にインキュベートした。細胞を共焦点蛍光顕微鏡によって可視化した。ニューロンは、Ｓｐ３５およびＮｇＲ１抗体によって強く染色した。両方のタンパク質が、細胞体およびニューロンの軸策において発現した。共存解析を補助するために、２つの型の抗体について異なる有色のプローブを使用した。染色（ＮｇＲ陽性細胞については赤色そしてＳｐ３５陽性細胞については緑色）を組み合わせると、本発明者らは、２つのタンパク質がニューロン内で共存していることを示す細胞全体にわたる黄色が見えた。
【０１４０】
（実施例６：Ｓｐ３５内のＮｇＲ１結合部位）
本発明者らは、ＮｇＲ１相互作用に関係するＳｐ３５の特異的ドメインを規定するために欠損マッピングを使用した。以下の欠損構築物を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを使用して作製した。本発明者らは、改変した挿入物のＤＮＡ配列決定によって全てのベクター構築物を確認した。
【０１４１】
Ｓｐ３５のロイシンリッチ反復ドメイン、さらに塩基性領域（ａ．ａ３４〜４３２）を含むＨｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５ｂを、ＰＣＲによってＨｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５（ａ．ａ．３４〜５３２）からクローニングした。使用したプライマーは、
【０１４２】
【数７】
2010154861.tif 000013
であった。
【０１４３】
Ｓｐ３５のＩｇドメイン、さらに塩基性領域（ａ．ａ．４１７〜５３１）をコードするＨｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５ｄを、ＰＣＲによってＨｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５ａ（ａ．ａ．３７〜５３１）ベクターからクローニングした。使用したプライマーは、
【０１４４】
【数８】
2010154861.tif 000014
であった。
【０１４５】
Ｉｇドメイン（ａ．ａ４２５〜５３１）のみをコードするＨｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５ｅを、ＰＣＲによってＨｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５（ａａ３４〜５３２）ベクターからクローニングした。使用したプライマーは、
【０１４６】
【数９】
2010154861.tif 000015
であった。
【０１４７】
市販の変異誘発キットおよびプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ）を、ベクターＨｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５（３４〜５３２）におけるＳｐ３５のアミノ酸４５６（アルギニンからグルタミン酸に）およびアミノ酸４５８（ヒスチジンからバリンに）を変異するために使用した。使用したプライマーは、
【０１４８】
【数１０】
2010154861.tif 000016
であった。
【０１４９】
Ｈｉｓ−ＡＰ−Ｓｐ３５欠損構築物（図３）を、ｐＶ９０発現ベクターにおいて加工し、２９３細胞において発現させた。馴化培地を回収し、ＡＰ付加物を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ樹脂およびＮｉＮＴＡアガロースでの一連のクロマトグラフィー工程によって精製した。精製したタンパク質を、ＣＯＳ７細胞上で発現したＮｇＲ１への結合について試験した。３つの構築物は、すべてＳｐ３５に弱く結合した。これらの結果は、Ｓｐ３５  ＬＲＲ反復１〜１４（アミノ酸３４〜４１７）およびＳｐ３５のＩｇドメイン（アミノ酸４２５〜５３１）の両方は、ＮｇＲ１へのＳｐ３５結合に寄与することを示した。Ｉｇドメインは、ＬＲＲドメインより高い親和性を示した。
【０１５０】
Ｓｐ３５のＩｇドメインについての構造モデルを、フレームワークとしてＮＣＡＭ結晶構造を使用して作製した（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０００、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３８９−３９３）。このモデルから、本発明者らは、結合に関与し得るループ（残基数４５４〜４５８、アミノ酸：ＳＰＲＫＨ；配列番号：３４）を観察した。この仮説を試験するために、本発明者らは、４５６での残基Ｒおよび４５８での残基Ｈを、それぞれＥおよびＶに変更したＳｐ３５構築物を作製した。この構築物を、ＮｇＲ１結合について試験すると、本発明者らはシグナルにおいて１０倍より少ない減少を観察した。結合におけるこのループ領域の寄与を試験するための代わりのアプローチとして、本発明者らは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端にシステインを付加することによって環化する配列ＬＳＰＲＫＨ（配列番号：１０）に対応するペプチドを合成した。ＮｇＲ１への結合の際に、このペプチドは、ＮｇＲ１の機能をブロック、阻害、または妨害する。
【０１５１】
（実施例７：Ｓｐ３５はｐ８  ＣＧＮ束形成（ｆａｓｃｉｃｕｌａｔｉｏｎ）を誘発する）
ニューロンにおけるＳｐ３５の生物学的機能を決定するために、本発明者らは、Ｓｐ３５−Ｆｃを、出生後８日目の顆粒状ニューロンと共にインキュベートし、Ｓｐ３５が神経突起の外向きの成長を調節し得るかどうかを観察した。Ｓｐ３５−Ｆｃタンパク質（１６μｇ／ウェルのタンパク質）をスポットする前に、Ｌａｂｔｅｋ培養スライド（８ウェル）を、０．１ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした。このスライドを一晩乾燥させ、次いでリンスし、そして１０μｇ／ｍｌのラミニン（Ｇｉｂｃｏ）でコーティングした。出生後８日目由来の小脳顆粒状ニューロンを解離し、事前コーティングしたスライド上に播種した。このスライド培養物を５％ＣＯ２中３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、このスライドを２０％スクロースを含有する４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして抗βＩＩＩチューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ  ＴＵＪ１）で染色した。２４時間後、ＣＧＮはニューロンの束状化（ｂｕｎｄｌｉｎｇ）で明らかなように、はっきりした束形成形態を示した。この束形成は、未処理細胞コントロールまたはＦｃタンパク質コーティング化サンプルコントロールでは見られなかった。
【０１５２】
（実施例８：ＲｈｏＡ活性化／不活性化についてのＳｐ３５の効果）
Ｓｐ３５−Ｆｃは、束形成を引き起こす出生後の小脳顆粒状ニューロンを誘発した。シグナル伝達分子ＲｈｏＡが束形成に関与することは公知であるので、本発明者らは、Ｓｐ３５−ＦｃがニューロンにおいてＲｈｏＡ機能を調節し得るかどうかを決定した。本発明者らは、以下のようにＲｈｏＡ活性化実験を行った：２９３細胞またはＣＯＳ７細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ  ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＲｈｏＡ、Ｓｐ３５またはＮｇＲ１の組み合わせを含む発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を一晩血清飢餓にし、次いで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、さらにプロテアーゼインヒビターカクテルでリンスした。細胞溶解物を、１３，０００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離によって清澄化し、そして９５％の上清を、４℃で４５分間、２０μｇの固定化ＧＳＴ−Ｒｈｏ結合ドメイン親和性マトリックス（Ｒｈｏｔｅｋｉｎビーズ、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共にインキュベートした。このビーズを、洗浄用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、およびプロテアーゼインヒビター）で３回洗浄した。ＧＴＰ結合Ｒｈｏを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中９５℃で５分間加熱することによって、上記ビーズから溶出させた。結合Ｒｈｏタンパク質、およびＲｈｏタンパク質の全体を、ＲｈｏＡに対するモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を使用してウェスタンブロッティングによって検出した。Ｓｐ３５遺伝子でのトランスフェクション後のブロットで検出されたＲｈｏＡ−ＧＴＰの量の増加によって明らかなように、Ｓｐ３５でトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞およびＨＥＫ２９３細胞は、ＲｈｏＡ活性化を誘発した。ＲｈｏＡ−ＧＴＰのさらなる増加は、Ｓｐ３５−Ｆｃでの処理後に観察された。Ｓｐ３５単独でのトランスフェクト後のＲｈｏＡ−ＧＴＰの増加と対照的に、細胞をＳｐ３５およびＮｇＲ１でトランスフェクトした場合、ＲｈｏＡは部分的に不活性化された。Ｓｐ３５−Ｆｃでのこれらの細胞の処理は、ＲｈｏＡのさらなる不活性化をもたらした。
【０１５３】
本発明者らは、Ｃａ＋＋流入へのＳｐ３５処理の影響を決定するために、ＦＬＩＰＲアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＳｐ３５によるシグナル伝達応答を確認した。本発明者らは、Ｓｐ３５−Ｆｃの処理でＳｐ３５を発現する細胞において有意なＣａ＋＋流入を観察したが、Ｓｐ３５−Ｆｃで処理したコントロール細胞においては有意なＣａ＋＋流入を観察しなかった。ＮｇＲ１およびＳｐ３５で同時トランスフェクトされた細胞がＳｐ３５−Ｆｃ融合タンパク質で処理された場合、このＣａ＋＋流入は減少した。
【０１５４】
（実施例９：Ｓｐ３５タンパク質とＳｐ３５タンパク自体との相互作用）
ＬＲＲドメインはホモタイプな相互作用にしばしば関与し、そして、本発明者らはＳｐ３５でトランスフェクトされた細胞への可溶性Ｓｐ３５の添加がＳｐ３５トランスフェクション単独で観察されたＲｈｏＡ−ＧＴＰの増加を越えるＲｈｏＡ−ＧＴＰの増加を引き起こすことを観察したので、本発明者らは、Ｓｐ３５自体に結合するＳｐ３５について試験した。この試験を行うために、本発明者らは、免疫共沈降を使用した。ＣＯＳ７細胞の８０％コンフルエント（１００ｍｍ組織培養皿上で増殖された）を、Ｆｕｇｅｎｅ  ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、プラスミドＳｐ３５  ＨＡまたはプラスミドＳｐ３５−ＦＬＡＧ、あるいはその両方でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収集し、そして４℃で３０分間、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１０％グリセロール）中に溶解した。次いで、この溶解物を１４，０００×ｇで１５分間遠心分離し、そして上清を収集し、４℃で一晩撹拌しながら抗ＨＡ親和性マトリックス（Ｒｏｃｈｅ）と共にインキュベートした。次いで、このサンプルを１ｍｌの溶解緩衝液で３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で煮沸し、４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして抗ＦＬＡＧ抗体での免疫ブロッティングによって分析した。ウェスタンブロッティングによって決定されたように、この抗ＨＡ抗体樹脂は、Ｓｐ３５−ＦＬＡＧを含んだ複合体を捕獲した。これは、Ｓｐ３５とＳｐ３５自体との直接的な相互作用を示した。本研究者らはまた、Ｓｐ３５−Ｆｃと一緒にＨＡ−Ｓｐ３５でトランスフェクトされた細胞を処理し、そして類似の免疫沈降アプローチを使用して、ＨＡ−Ｓｐ３５がＳｐ３５−Ｆｃに結合することを示した。
【０１５５】
Ｓｐ３５−ＦＬＡＧを、以下のように作製した。Ｓｐ３５遺伝子細胞外ドメイン（ａ．ａ．１〜５３１）を、ＮｏｔＩ部位（下線が引かれている）を含むプライマー：
【０１５６】
【数１１−１】
2010154861.tif 000017
およびプライマー：
【０１５７】
【数１１−２】
2010154861.tif 000018
を使用してＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をＮｏｔＩによって消化し、そしてベクターｐＶ９０のＮｏｔＩ部位に挿入した。この挿入物のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１５８】
（実施例１０：Ｓｐ３５で形質転換された細胞のインビトロ移植）
脊髄損傷ラットにおけるＳｐ３５の生物学的機能を決定するために、本発明者らは、皮質性初代培養細胞（混合培養物）を、（ラット脊髄の損傷中心への送達のため）全長Ｓｐ３５を発現するレトロウイルスまたはレトロウイルスコントロールで感染させた。２×１０６個の細胞を導入し、そしてラットを１０日目に屠殺した。この脊髄を４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、次いで、７０％ＥＴＯＨ中で脱水し、続いて９５％ＥＴＯＨ中で脱水した。組織サンプルをパラフィン中に包埋した。切片（１０ミクロン厚）を、免疫組織化学的染色のために使用した。コントロールと比較して、Ｓｐ３５発現細胞を受け取ったラットは、より少ない軸索退縮を示し、そして上記中心近くに染まったより多くのβチューブリンを示す。Ｓｐ３５を受け取る損傷ラットにおいて、上昇したニューロンの生存が観察された。
【０１５９】
Ｓｐ３５レトロウイルス構築物を、以下のように作製した。Ｓｐ３５遺伝子を、ＸｈｏＩ部位（下線が引かれている）を含むプライマー：
【０１６０】
【数１２−１】
2010154861.tif 000019
およびＥｃｏＲＩ部位（下線が引かれている）を含むプライマー：
【０１６１】
【数１２−２】
2010154861.tif 000020
を使用してＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、レトロウイルスベクターｐＭＩＧ（これは、ＩＰＥＳ−ＧＦＰを含む）に結合し、これをＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで事前に切断した。この新たなベクターを、ｐＭＭＣ０７８と命名した。ｐＭＭＣ０７８の単離物の全てが不注意な点突然変異を含んだので、ｐＭＭＣ０７８のうちの２つの単離物を一緒に結合した。ｐＭＭＣ０７８．６をＸｈｏＩおよびＡｃｃＩで切断し、そしてｐＭＭＣ０７８．７をＸｈｏＩおよびＡｃｃＩで切断した。これらの２つのフラグメントを一緒に結合し、最終修正（ｃｏｒｒｅｃｔ）プラスミドｐＭＭＣ０８９を作製した。この挿入物のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。Ｓｐ３５レトロウイルスを、説明したように作製した。２９３Ｇ細胞は、トランスフェクションの前日に分裂された。８μｇのＳｐ３５−レトロウイルスＤＮＡを、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって５×１０６個の細胞をトランスフェクトするために使用した。この馴化培地を、トランスフェクションの９２時間後に収集した。この馴化培地を、５０００ｇで１０分間遠心分離し、そして上清を、Ｓｐ３５レトロウイルスストックとして使用した。このストックを４℃で１週間、または−８０℃で６ヶ月間保存した。
【０１６２】
（実施例１１：脊髄損傷の動物モデル）
外科的手順の全てを、無菌技術を使用して行う。任意の外科的処置前の一週間、動物を取り扱う。アンピシリン１００ｍｇ／ｋｇを、ＳＣに手術の前および後に予防的に投与し、膀胱感染損傷の発生を減少させた。
【０１６３】
動物を、Ｏ２中イソフルラン２〜３％と共にミダゾラム２．５ｍｇ／ｋｇＩＰを使用して、つま先を挟むことによって測定して深い麻酔にまで麻酔する。動物を、手術および回復の期間、循環水ヒーティングパッド（ｈｅａｔｉｎｇ  ｐａｄ）上で維持する。角膜乾燥を予防するために眼潤滑剤を使用し、そして過剰の唾液分泌を減少させるためにアトロピン０．０５ｍｇ／ｋｇＳＣを与える。小さな切開を皮膚に作製し、そして筋肉を引っ張って椎骨を露出させる。脊髄レベルＬ６の背側椎弓切除（および鞘内カテーテルの置換が必要な場合はＬ７、以下を参照のこと）を行い、Ｌ６／Ｌ７および隣接した棘突起を脊髄フレーム（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に強固に固定した。背部片側切断を、主な背内側皮質脊髄（ｃｏｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ）路（ＣＳＴ）構成要素および少数の背外側皮質脊髄（ｃｏｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ）路（ＣＳＴ）構成要素を完全に遮るよく切れる虹彩切除鋏を使用して、Ｌ６で行った。手術後、露出した脊柱を保護するために椎弓切除部位を保護材料（例えば、Ｄｕｒａｆｉｌｍ）で覆い、そして上にある筋肉を４．０クロミックガット（ｃｈｒｏｍｉｃ  ｇｕｔ）で縫合した。この皮膚を縫合し、ベータダイン溶液でふき取った。
【０１６４】
動物の機能回復ＩＳを、脊髄損傷後のラットを評価するために一般的に使用されるＢａｓｓｏ  Ｂｅａｔｔｉｅ  ａｎｄ  Ｂｒｅｓｎｅｈａｎ（ＢＢＢ）スコアリング法を使用して評価した。この方法は、関節運動能力および体重付加能力の詳細な分析によってラットの後肢機能を定量化する。ラットを、脊髄損傷の翌日に評価し、次いでその後一週間評価する。
【０１６５】
ＣＳＴ切除の直後に、Ｓｐ３５もしくはＧＦＰを発現するアデノウイルスまたはコントロールウイルス（１０１０粒子）を、切除の部位に、ならびに損傷部位のすぐ尾側およびすぐ吻側の領域に注入する。合計で１０μｌのＡｄｖを、５箇所の異なる部位に注入する（４μl／部位）。Ｓｐ３５タンパク質の鞘内投与については、小さな穴を外傷（ｌｅｓ
ｉｏｎ）Ｌ７より２ｍｍ尾側の脊髄の硬膜に開け、そして鞘内カテーテルをＬ７のクモ膜下腔に挿入する。このカテーテルを、外傷より約１ｍｍ尾側の脊髄の向こう側に、ゆっくりかつ徐々に滑らせる。鞘内空間の外側にあるカテーテルの一部を、所定の周辺組織にしっかりと縫合した。試験物質（Ｓｐ３５タンパク質またはコントロールタンパク質）を含むプライムされた小型浸透ポンプ（Ａｌｚａ  ｃｏｒｐ．）をガイドカニューレの露出された端部に連結し、そしてクモ膜下腔に挿入する。手術後、露出した脊柱を保護するために椎弓切除部位を保護材料（例えば、Ｄｕｒａｆｉｌｍ）で覆い、そして上にある筋肉を４．０クロミックガットで縫合した。この皮膚を縫合し、そしてベータダイン溶液でふき取った。
【０１６６】
組織学的分析：路追跡手術は、脊髄損傷を誘発する手術時に起こる。頭部の皮膚を薄く削り、そしてベータダインおよび７０％アルコールでふき取る。この動物を定位固定フレームに配置する。この頭皮を縦方向に切開し、そして骨膜を頭蓋冠からすくい取る。頭蓋骨に直径約１〜２ｍｍの穴をドリルで開け、そしてガラスマイクロリットル針を、運動皮質の８つの位置に垂直に挿入する（座標は、Ｐａｘｉｘｎｏｓ  ａｎｄ  Ｗａｓｔｏｎのラット脳図譜（１９９７）に従って決定される）。約５μｌの路追跡物質（例えば、ビオチンデキストランアミン、１０，０００Ｍ．Ｗｔ）を注入し、そしてさらに５分間にわたって上記針を定位置に置いたままにして、溶液を拡散させる。針の除去後、スクールキャップ（ｓｃｕｌｌ  ｃａｐ）の穴をゲルフォームでふさぎ、そして頭皮を損傷部位をこえてステープル（ｓｔａｐｌｅ）で閉じる。動物を回復させ、そして手術後の治療を受けさせる（以下に記載される）。４〜１０週後、動物を深く麻酔し（ｉｐでイナクチン１００〜１１０ｍｇ／ｋｇ）、そして以下に記載されるような組織学のために還流する。この路追跡物が、脊髄の尾側端部へと向かう皮質性脊髄路を順行性輸送機序を下がることによって行われ、そして皮質脊髄路内の解剖学的結合性を定量するための手段を提供する。
【０１６７】
免疫組織化学的実験については、損傷を誘発する手術の２〜８週間後に動物をイナクチン（ＩＰにおいて１００〜１１０ｍｇ／ｋｇ）で深く麻酔する。胸腔を開き、そして心臓を露出し、灌流させる。１００ｃｃの氷冷ＰＢＳをゆっくりと押出すことによって（流体逃避を可能にするために、穴が右心室に切り込まれる）、カニューレを左心室に挿入する。これの後、眼／耳／つま先の固定が明らかになるまで、４％パラホルムアルデヒド（５０〜１００ｍｌ）のゆっくりとした規則的な点滴を続ける。損傷部位の改変を最小にすることに注意して脊髄を取り出し、ＯＣＴで凍結させ、切片にして、そして免疫組織化学について処置する。必要に応じて、他の組織もまた、後者の分析のために採取する。アデノウイルスＳｐ３５を受け取る動物は、ニューロン軸索を染色するβＩＩＩチューブリンによって決定されるように、上昇した軸索出芽を示した。
【０１６８】
（実施例１２：Ｓｐ−３５ウイルスベクター構築物）
ｐＭＩＧ由来のＳｐ−３５ウイルスベクターを、以下のように作製した。全長Ｓｐ３５コード配列を、ＸｈｏＩ部位を含むプライマー：
【０１６９】
【数１３−１】
2010154861.tif 000021
およびＥｃｏＲＩ部位を含むプライマー：
【０１７０】
【数１３−２】
2010154861.tif 000022
を使用してＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、次いで、レトロウイルスベクターｐＭＩＧ（Ｃｈｅｎｇら、１９９６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４５：５７６）に結合し、これをＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。このベクターをｐＭＭＣ０７８と命名した。ｐＭＭＣ０７８の単離物全てが点突然変異を含んだので、ｐＭＭＣ０７８のうちの２つの単離物を一緒に結合した。ベクターｐＭＭＣ０７８．６をＸｈｏＩおよびＡｃｃＩで切断し、そしてｐＭＭＣ０７８．７をＸｈｏＩおよびＡｃｃＩで切断した。これらの２つのフラグメントを結合し、プラスミドｐＭＭＣ０８９を作製した。
【０１７１】
ｐＭＩＧ由来のＳｐ３５−ＨＡウイルスベクターを以下のように作製した。ＨＡ配列を有するフレーム中のＳｐ３５アミノ酸３２６〜６１４をコードするフラグメントを、ＳａｃＩＩ部位を含むプライマー：
【０１７２】
【数１４−１】
2010154861.tif 000023
および鋳型として機能するｐＭＭＣ０８９を含むプライマー：
【０１７３】
【数１４−２】
2010154861.tif 000024
でのＰＣＲを使用することによって得た。このより長いプライマーは、Ｓｐ３５コドン６１４の後およびＥｃｏＲＩ部位の前のＨＡコード配列（イタリック）を含む。次いで、このＰＣＲ産物を、Ｓａｃ  ＩＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで切断し、そしてｐＭＩＧ由来のレトロウイルスベクター中に野生型Ｓｐ３５コドン３２６〜６１４を含むＳａｃ  ＩＩ−ＥｃｏＲ  Ｉフラグメントを置換するために使用する。
【０１７４】
Ｓｐ３５−バキュロウイルスＨＡベクターを以下のように作製した。Ｓｐ３５−ＨＡレトロウイルスベクター由来のＳｐ３５−ＨＡコード配列を、Ｘｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで切り出し、平滑末端化し、そしてバキュロウイルスシャトルベクターｐＢＶ−ＣＺＰＧ（米国特許第６，１９０，８８７号；および同第６，３３８，９５３号）の、Ｂｇｌ２−フィルインサイト（Ｂｇｌ２−ｆｉｌｌ  ｉｎ  ｓｉｔｅ）にクローン化し、ＣＭＶプロモーターの下でＬａｃＺ遺伝子を置換した。
【０１７５】
Ｓｐ３５アデノウイルスベクターを、以下のように作製した。Ｓｐ３５レトロウイルス由来のＳｐ３５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰコード配列を、ＸｈｏＩ−フィルインサイトおよびＮｈｅ  Ｉで切り出し、次いで、最小限のＣＭＶプロモータ−の下、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５の、ＥｃｏＲ  Ｉ−フィルインサイト／Ｎｈｅ  Ｉ部位にクローン化した。
【０１７６】
（実施例１３：再髄鞘化の動物モデル）
雌性のＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットを、全ての研究に使用する。ラットを、イソフルランを使用して麻酔し、Ｔ３／Ｔ４露出をし、そして背側半椎弓切除を行う。次いで、化学的脱髄剤であるリソレクチン（０．９％生理食塩水中１％リソレクチン３μｌ）を、索表面より０．５〜１ｍｍ下の脊髄の脊柱の右側に注入する。適切な鎮痛処置を手術前後に施す。
【０１７７】
３日後、この注入部位を再び露出させ（イソフルラン麻酔下、適切な鎮痛処置を使用して）、以下の治療を損傷した脊髄に投入し、そしてタンパク質Ｓｐ３５／コントロールタンパク質をコードするアデノウイルスベクターを損傷部位に注入する。Ｓｐ３５をコードするアデノウイルスの１０１０個の粒子、または１０μｌ体積のＧＦＰコントロールを、リソレシチン誘発脱髄の部位またはその周囲の５箇所までの異なる部位における損傷されたラット脊髄に注入する。２μｌ以下の容量を、５箇所の注入部位の各々に注入する。脊髄の脱髄／再髄鞘化の組織学的分析ついては、手術の２週間後、３週間後、４週間後または６週間後、動物をイナクチン（ｉｐにおいて１００〜１１０ｍｇ／ｋｇ）で深く麻酔し、固定液で心臓を介して還流する。次いで、この脊髄を取り出し、分析のために処理する。Ｓｐ３５処置を受ける動物は、抗ＭＢＰタンパク質抗体またはルクソールファーストブルー（ｌｕｘｏｌ  ｆａｓｔ  ｂｌｕｅ）を使用するＩＨＣによって決定されるように、上昇した軸索髄鞘形成を示した。
【０１７８】
（実施例１４：Ｓｐ３５  ＲＮＡｉ）
脳機能におけるＳｐ３５の役割に取り組むために、本発明者らは、レンチウイルスＳｐ３５  ＲＮＡｉを出生後８日目のＣＧＮ細胞に導入した。Ｓｐ３５  ＲＮＡｉ感染細胞は、コントロール細胞よりも短い神経突起を有し、そしてコントロール細胞よりも高い増殖速度を有した。これらの結果は、ＲｈｏＡ活性化を調節することにおけるＳｐ３５についての役割を示す。
【０１７９】
マウスＳｐ３５  ＤＮＡ配列とラットＳｐ３５  ＤＮＡ配列とを比較して相同領域を見出し、候補ｓｈＲＮＡに使用した。ＣＨ３２４を、オリゴヌクレオチドＬＶ１−０３５およびオリゴヌクレオチドＬＶ１−０３６をアニーリングさせ、そしてＨｐａ１およびＸｈｏ１で消化したｐＬＬ３．７に結合することによって構築した。このオリゴヌクレオチドを、ＭＷＧから購入した。この配列は、以下である：
【０１８０】
【数１５】
2010154861.tif 000025
ウイルスを産生する前に、ｐＬＬ３．７由来のＤＮＡまたはｐＬＬ３．７中の候補ｓｈＲＮＡを、６ウェル型中のＣＨＯ細胞に５対１の割合で、マウスＳＰ３５−ＨＡタグ化プラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞溶解物由来のＳＰ３５−ＨＡタグのウエスタンブロット検出によって、および２連のウェルから調製されたＲＮＡ全体のノーザンブロットによって、ノックダウンを分析した。このブロットを、ｍＳＰ３５の０．７ｋｂフラグメントでプローブした。アッセイを、トランスフェクションの４８時間後に行った（データは示していない）。ウイルスを、ラットニューロンの培養物における使用について最善の候補物から産生した。ベクター、さらなる方法論およびウイルス産生は、Ｒｕｂｉｎｓｏｎら「Ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｉｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．」Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３，４０１−６（２００３）に記載されるようなものであった。
【０１８１】
（実施例１５：ＲｈｏＡ活性化）
ＮｇＲ１およびＳＰ３５を共発現するＣＯＳ７細胞は、ＯＭｇｐに応答してＲｈｏＡ／ＧＴＰレベルの変化を示さなかった。これは、ＳＰ３５／ＮｇＲ１複合体がミエリンインヒビターによるシグナル伝達を媒介するのに重要でないことを示唆した。
【０１８２】
本発明者らは、ＳＰ３５／ＮｇＲ１／ｐ７５の三つ組複合体がシグナル伝達を媒介するという可能性を検討した。２つのアプローチを、ＳＰ３５とＮｇＲ１とｐ７５との間の相互作用を評価するために使用した。１つ目は、ＡＰ−ＳＰ３５結合体を使用する直接的な結合アッセイにおいて、結合を評価した。このＡＰ−ＳＰ３５結合体は、ｐ７５発現細胞に弱く結合した。ＡＰ−Ｐ７５は、ＮｇＲ１発現細胞に結合した。ＮｇＲ１およびｐ７５へのＡＰ−ＳＰ３５の結合を、ＥＬＩＳＡによって測定した（図４）。２つ目は、ＮｇＲ１およびｐ７５へのＳＰ３５の結合を、ＳＰ３５、ＮｇＲ１およびｐ７５を共発現するＣＯＳ７細胞からの免疫共沈降によって評価した。抗ＮｇＲ１抗体は、ＳＰ３５およびｐ７５を含む複合体を免疫沈降させた。抗ＳＰ３５抗体はまた、ｐ７５を含む複合体を免疫沈降させた。この相互作用データおよび免疫共沈降データは、ＳＰ３５とＮｇＲ１とｐ７５との間の直接的な相互作用についての証拠を提供した。本発明者らは、共焦点顕微鏡法ならびにＳＰ３５、ｐ７５およびＮｇＲ１に対する抗体を使用し、ＳＰ３５、ＮｇＲ１およびｐ７５が、ラット由来のｐ７  ＣＧニューロンの細胞体および軸索に共に局在することを示した。
【０１８３】
次に、本発明者らは、ＳＰ３５、ＮｇＲ１およびｐ７５の組み合わせが、ミエリンインヒビターの活性に充分であることを示した。非ニューロン性ＣＯＳ７細胞を、３つの構成要素全てを発現するように操作した。これらの細胞を使用して、本発明者らは、ＲｈｏＡ／ＧＴＰレベルがＯＭｇｐによってアップレギュレーションされることを示した。ＯＭｇｐ−Ｆｃ処理は、これらの３つの構成要素の他の組み合わせと比較して、ＳＰ３５／ｐ７５／ＮｇＲ１を共発現する細胞におけるＲｈｏＡ／ＧＴＰレベルを上昇させた。本発明者らは、ＣＯＳ７細胞溶解物のウエスタンブロッティングによってタンパク質の発現を確認した。ＮｇＲ１に結合するミエリンインヒビターの親和力は、ｐ７５の存在によっても、ｐ７５およびＳＰ３５の存在によっても影響を受けなかった。この組み合わせた結果は、ＮｇＲ１、ＳＰ３５およびｐ７５の三つ組複合体が、ＮｇＲ１リガンドの存在下でのＲｈｏＡ調節のために必要とされるというモデルを支持する（図５）。
【０１８４】
ＳＰ３５は、シグナル伝達への潜在的な直接関与または潜在的な間接関与を有する細胞質ドメインを含む。細胞質ドメインの役割を決定するために、本発明者らは、シグナル伝達ができない、非産生的な三つ組複合体を形成することにより、ドミナントネガティブ様式で機能する、ＳＰ３５の細胞質ドメイン切断物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）（配列番号２のアミノ酸３４〜５７６）を産生した。本発明者らは、細胞質ドメイン切断を有するこの分子を「ＤＮ−ＳＰ３５」（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＳＰ３５）と命名した。本発明者らは、出生後７日目の（ｐ７）ＣＧニューロンを、全長ＳＰ３５またはＤＮ−ＳＰ３５でトランスフェクトし、次いで、阻害性ミエリン成分（Ｏｍｇｐ、ミエリンおよびＮｏｇｏ６６）への応答についてアッセイした。図６に示されるように、ＤＮ−ＳＰ３５トランスフェクト細胞は、阻害性ミエリン成分に応答せず、そしてコントロールよりも長い神経突起を示した。対照的に、全長ＳＰ３５構築物でトランスフェクトされた細胞は、阻害性基質への高められた応答を示し、そしてコントロールと比較してより短い神経突起を有した。これは、ＤＮ−ＳＰ３５が、ミエリン成分によって引き起こされる神経突起の伸長阻害を弱めるような競合物として作用することを示した。本発明者らは、外因性の可溶性ＳＰ３５−Ｆｃはまた、ＮｇＲ１と結合し、そして阻害性基質の作用を遮断すると予測した。図７に示されるように、ＳＰ３５−Ｆｃは、Ｏｍｇｐ、Ｎｏｇｏ６６およびＭＡＧによる神経突起伸長阻害を低減させた。
【０１８５】
（実施例１６：神経保護活性）
等数のラットｐ６小脳顆粒ニューロンを、５０ｎＭのｓｐ３５−Ｆｃタンパク質の存在下または非存在下で、１２ウェルの細胞培養プレートの各ウェルにプレートした。これらのポリ−Ｄ−リジンプレートを、１０μｇのＣＮＳミエリンまたは２００ｎｇのＮｏｇｏ６６、ＭＡＧおよびＯＭｇｐまたはコントロール−Ｆｃで事前コーティングした（乾燥させた）。このニューロン培養物を、１〜７日間、３７℃で、および５％ＣＯ２で維持した。ニューロンは、３日後に検査した（ニューロンの特異性マーカー  ＩＩＩチューブリンによって決定した）ところ、十分な神経突起伸長をして、ｓｐ３５−Ｆｃ処理とは無関係に、ＰＢＳコントロールウェルにおいて健常であり、そして良好に成長した。ｓｐ３５−Ｆｃの非存在下では、ニューロンは、ミエリン、Ｎｏｇｏ６６、ＭＡＧおよびＯＭｇｐでコーティングされたウェルにおいて良好に成長しなかった。最小限の神経突起出芽（短く、歪曲した）が存在し、そしてこのニューロンは健常には見えず、丸い細胞体および縮合された核物質を有した。ＤＡＰＩ染色は、これらのウェルで検出されたニューロンの数が、ＰＢＳコントロールウェル中で検出されたニューロンの数よりも少なく、ニューロンの損失を示唆していることを示した。ｓｐ３５−Ｆｃの存在下では、長い神経突起が存在し、そしてこのニューロンは健常に見えた。ＤＡＰＩ染色は、ｓｐ３５−Ｆｃを受け取らなかったウェルよりも、これらのウェル中でニューロンの数がより多いことを実証した。このデータを、以下の表２に要約する。
【０１８６】
【表２】
2010154861.tif 000026
これらのデータは、Ｓｐ３５の可溶性形態（例えば、Ｓｐ３５−Ｆｃ）が、神経保護活性を保有すると示した。
【０１８７】
脊髄を半分切除された（Ｔ９、ＳＣＴ）ラットにおいて、脊髄切片のβ−ＩＩＩチューブリン染色は、損傷部位におけるニューロンの実質的な損失を示した。ｓｐ３５を発現する組換えウイルスは、ＳＣＴ動物を損傷部位において感染させるために使用した。これらの脊髄の組織学的染色は、ベクターウイルスで感染されたコントロールグループと比較して、損傷部位周辺のニューロンの数の増加を示した。これは、上記のインビトロ実験の知見と一致し、そしてＳｐ３５に関連する神経保護特性をさらに示す。
【０１８８】
（実施例１７：脊髄損傷の動物モデルにおけるＳｐ３５）
Ｓｐ３５−Ｆｃは、インビトロでＯＭｇｐ、Ｎｏｇｏ−６６およびＭＡＧによって引き起こされる神経突起成長阻害を低減させたので、本発明者らは、この分子がインビボでＣＮＳ損傷の機能回復を促進することを予測した。これを確かめるために、本発明者らは、脊髄を半分切除したラット（すなわち、急性ＣＮＳ外傷の動物モデル）にＳｐ３５−Ｆｃを投与した。図８および図９に示されるように、Ｓｐ３５−Ｆｃ処置ラットは、ＩｇＧで処置されたコントロールラットと比較して、有意に向上した機能回復を示した。
【０１８９】
脊髄損傷および行動分析を、以下のように行った。外科的手順の全てを、Ｂｉｏｇｅｎ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの指針に従って行った。雌のＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラット（１９０〜２１０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を、２．５ｍｇ／ｋｇのミダゾラム（Ｉ．Ｐ．において）およびＯ２中２〜３％のフルオタンを使用して麻酔した。背部椎弓切除を、脊髄レベルＴ６および脊髄レベルＴ７で行った。背側の片側切除を行い、主な背内側皮質脊髄路（ＣＳＴ）構成要素および少数の背外側皮質脊髄路（ＣＳＴ）構成要素を完全に遮断した。ＣＳＴ切除の直後に、鞘内カテーテルをＴ７のクモ膜下腔に挿入し、そしてクモ膜下腔に挿入されたプライムされた小型浸透ポンプ（Ａｌｚｅｔ  ｍｏｄｅｌ  ２００４）に連結した。小型浸透ポンプは、０．２５μｌ／時間の速度で、Ｈｕ
ＩｇＧアイソタイプコントロールタンパク質（５ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝５、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＢＳ（ｎ＝３）可溶性Ｈｕ  Ｓｐ３５−Ｉｇ融合タンパク質（４．３ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝８）を送達した。手術後、椎弓切除部位を縫合し、そして皮膚の傷をステープルで閉じた。術後処置は、手術後３日間の鎮痛処置（ｓ．ｃ．においてブプレノルフィン０．０５ｍｇ／ｋｇ）および手術後７日間の抗生物質処置（ｓ．ｃ．においてアンピシリン１００ｍｇ／ｋｇを１日に２回）を包含した。膀胱を、研究の期間（２８日）または機能回復まで（その時間を記述した）、１日２回、手動で圧搾した。動物全てを、オープンフィールドＢＢＢスコアリングシステム（Ｂａｓｓｏら，１９９５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １２：１−２１；Ｏｎｏら，２００３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：５８８７−５８９６）を使用して盲目的に採点した。ラットを、ＣＳＴ切除の翌日（２日目）およびその後四週間にわたって毎週、Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ  （ＢＢＢ）歩行運動評価尺度を使用して評価した。調査者を、研究の期間にわたって、処置群に対して盲目的にした。
【０１９０】
（実施例１８：赤核脊髄路（ＲＳＴ）片側切除損傷モデルにおけるニューロンの生存および軸索再生）
本研究者らはまた、歩行運動に直接的に寄与する赤核脊髄路におけるニューロンの再生に対するＳｐ３５処置の効果を調査した。
【０１９１】
成体９週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０ｇ）を、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入によって麻酔した。顕微鏡の操作下で、背部椎弓切除を行い、そして７番目の胸椎（Ｃ７）を同定した。硬膜を開いた後、右側切除を、１つのスプリング鋏を使用して脊髄レベルＣ７において行った。脊髄を半分切除した後、動物に、Ｓｐ３５−Ｆｃの２μｇ／ｍｌ溶液（１０μｌ）、またはヒトＩｇの２μｇ／ｍｌ溶液（１０μｌ）、またはＰＢＳ（１０μｌ）のいずれかで浸漬された１つのゲルフォームを与えた（損傷部位の上に配置した）。手術後、各群の動物を、軸索追跡および行動分析のために細分した。軸索追跡についての動物（各群についてｎ＝５）および行動分析についての動物（各群についてｎ＝７）を、１ヶ月間生存させた。
【０１９２】
フルオロゴールド（ＦＧ、６％ｗ／ｖ、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）を使用して、損傷瘢痕にわたって軸索を再生したＲＳＴを標識し、そして、尾側の脊髄に戻した。損傷後の生存期間（１ヶ月）の末日より２日前、動物を、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入によって麻酔した。背部の椎弓切除を行い、そしてＴ２脊髄断片を同定した。０．５ｍｌ体積のＦＧを、ハミルトンシリンジを使用して右側のＴ２脊髄に手動で注入した。２日後、この動物を、致死用量のケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）で麻酔して屠殺し、そしてこの動物を、正常食塩水で心臓内に還流し、続いて０．１×ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドを含む４００ｍｌの固定液で心臓内に還流した。脳および脊髄を除去し、一晩パラホルムアルデヒド中で事後固定し、次いで、３０％リン酸緩衝化スクロース中に配置した。脳組織および脊髄組織を、クリオスタットにおいて３０ｍｍの切片に切り出し、ゼラチンがコーティングされたスライド上に取り付けた。損傷部位上のＦＧ標識ＲＳＴニューロンの数を、対側のインタクトな側のＦＧ標識ニューロンの合計数の百分率として表した。この群間の百分率を、一方向ＡＮＯＶＡを使用して、続いてＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重比較検定を使用して、統計学的に比較した。表３に示されるように、２μｇ／ｍｌのＳｐ３５−Ｆｃは、赤核脊髄路（ＲＳＴ）ニューロンの生存を促進した。
【０１９３】
【表３】
2010154861.tif 000027
行動分析については、自発性垂直探索（ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ）の間の前肢の使用を、軽度の改変を含む記載されるような（Ｌｉｕら、１９９９）種々の処置の１ヵ月後に試験した。ラットを、５分間の垂直探索について前肢の使用を促進する透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓシリンダー（直径１５ｃｍおよび高さ３０ｃｍ）中に配置した。以下の行動を記録した：（１）シリンダーの壁と接触するための左肢（非障害性）または右肢（障害性）の独立的な使用；および（２）シリンダーの壁と接触する前肢両方の同時使用。以下の点に関して、垂直探索行動が発現された：（１）障害性の肢の使用、非障害性の肢の使用、および両方の肢の使用の合計数に相対する左肢（非障害性）の使用の百分率；（２）障害性の肢の使用、非障害性の肢の使用、および両方の肢の使用の合計数に対する右肢（障害性）の使用の百分率；ならびに（３）障害性の肢の使用、非障害性の肢の使用、および両方の肢の使用の合計数に対する両肢の使用の百分率。群間の差異を、一方向ＡＮＯＶＡによって、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉポストホック分析によって検定した。Ｓｐ３５−Ｆｃ処置動物は、有意に向上した前肢運動を示した：Ｓｐ３５−１−Ｆｃ処置動物においては両肢について３０％の使用  対  コントロール−Ｆｃ処置動物またはＰＢＳ処置動物においては両肢について１０％の使用；Ｓｐ３５−１−Ｆｃ処置動物においては５５％の左肢（非障害性）の使用  対  コントロール−Ｆｃ処置動物またはＰＢＳ処置動物においては８０％の使用；および、Ｓｐ３５−１−Ｆｃ処置動物においては２９％の右肢（障害性）の使用  対  コントロール−Ｆｃ処置動物またはＰＢＳ処置動物においては約１５％の使用。
【０１９４】
（実施例１９：Ｓｐ３５−Ｆｃは、視神経切除モデルにおける網膜神経節細胞（ＲＧＣ）生存を促進する）
本発明者らは、視神経切除モデルを使用してＳｐ３５の活性をさらに確認した。これは、ニューロンの機能に影響を与える因子を調査する。若年成体の雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを、この研究で使用した。各動物の右側の視神経を、眼窩内で、視神経円板から１．５ｍｍ切除した。６％フルオロゴールド（ＦＧ）で浸漬した１つのゲルフォームを、視神経円板の真後ろの新たに切除した部位に適用し、生存網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を標識した。この動物を、６つの群（各群においてｎ＝６）に分割しＳｐ３５−Ｆｃ、ヒトＩｇＧ１、またはＰＢＳのみのいずれかを硝子体内注入によって与えた。各硝子体内注入の体積は、４ｍｌであった。他方、各注入の投与量は２ｍｇであった。この硝子体内注入を、視神経切除の直後に行った。
【０１９５】
全ての動物を１週間生存させた。動物を屠殺する２日前、各動物の左側の視神経を切除し、６％ＦＧを使用して、内部コントロールとして機能する生存ＲＧＣを標識した。動物を、過量のネンブタールで屠殺し、網膜を、４％パラホルムアルデヒド中で解剖した。４つのラジアルカットを、網膜を４つの四分円（上方、下方、鼻側、および頭側）に分割するように作製した。次いで、この網膜を封入剤（Ｄａｋｏ）でフラットに取り付ける前に、この網膜を同じ固定液中で１時間事後固定した。このスライドを、蛍光顕微鏡の下、紫外線フィルター（励起波長＝３３０〜３８０ｎｍ）を使用して試験した。標識ＲＧＣを、２００×２００ｍｍの接眼グリッドの下で、視神経平板から出発して５００ｍｍ間を置いた網膜の末梢境界まで、各四分円の中線に沿って数えた。各処置がもたらした生存ＲＧＣの百分率を、損傷眼における生存ＲＧＣの数と反対側の側眼における生存ＲＧＣの数とを比較することによって表した。全てのデータを、平均±ＳＥＭとして表した。統計学的有意性を、一方向ＡＮＯＶＡによって評価し、続いてＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホック検定によって評価した。差異は、ｐ＜０．０５が有意であると考えられた。Ｓｐ３５−Ｆｃ処置動物は、コントロール−Ｆｃ処置動物またはＰＢＳ処置動物と比較した場合に有意なニューロンの生存（８３％）を示した。コントロールＦｃ処置動物またはＰＢＳ処置動物は各々、約５０％のニューロンの生存を示しただけだった。
【０１９６】
（他の実施形態）
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内である。
【図１−１】
2010154861.tif 000028
【図１−２】
2010154861.tif 000029
【図２】
2010154861.tif 000030
【図３】
2010154861.tif 000031
【図４】
2010154861.tif 000032
【図５】
2010154861.tif 000033
【図６】
2010154861.tif 000034
【図７】
2010154861.tif 000035
【図８】
2010154861.tif 000036
【図９】
2010154861.tif 000037
【配列表】
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