(57)【要約】【課題】より精度の高い画像を取得する。【解決手段】共焦点顕微鏡１１は、標本１２に光を集光する対物レンズ２２と、所定の開口径の領域の光を通過させるピンホール、および、ピンホールの開口径と略同一の内径で、かつ、ピンホールの開口径よりも大きな外径のリング状の領域の光を通過させる開口部が設けられたピンホールターレット４６とを備えて構成される。そして、ピンホールターレット４６を回転駆動させることで、対物レンズ２２の焦点と略共役な位置で標本１２からの光を通過させ、標本１２の観察に用いるために、ピンホールと開口部とで切り替えられ、光検出ユニット１６において、その切り替えに応じて、それぞれのピンホールを通過した光が検出される。本発明は、例えば、共焦点レーザ顕微鏡に適用できる。【選択図】図１
2010014839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本に光を集光する対物レンズと、
所定の開口径の領域の光を通過させるピンホールと、
前記ピンホールの開口径と略同一の内径で、かつ、前記ピンホールの開口径よりも大きな外径のリング状の領域の光を通過させる開口部と、
前記対物レンズの集光焦点と略共役な位置で前記標本からの光を通過させ、前記標本の観察に用いるために、前記ピンホールと前記開口部とで切り替える切替手段と、
前記切替手段による切り替えに応じて、前記ピンホールを通過した光と、前記開口部を通過した光とをそれぞれ検出する検出手段と
を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記ピンホールを通過した光に基づく第１の画像データ、および、前記開口部を通過した光に基づく第２の画像データに基づいて、前記第１および第２の画像データとはセクショニング分解能が異なる画像データを作成する演算手段
をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記開口部は、光の透過可能な透明部材に、前記内径を決める領域と前記外径を決める領域とに光の透過を遮断する遮断部材が設けられて構成されている
ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
前記ピンホールおよび前記開口部は回転可能なターレットに設けられており、
前記切替手段は、前記ターレットを回転させる回転部材である
ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項５】
前記切替手段は、前記ピンホールまたは前記開口部に向かうように前記標本からの光の光路を変更する光路変更部材である
ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡に関し、特に、より精度の高い画像を取得することができるようにした共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、共焦点顕微鏡では、生体標本などの試料に照明光を集光させると共に、その照明光が集光するスポット（集光部）を走査させ、スポットから射出する光束を共焦点絞り面に集光させて、その共焦点絞りを通過した光束の光量が光検出器で検出されることにより、その試料の二次元の画像が取得される。
【０００３】
また、共焦点顕微鏡は、共焦点面にピンホール部材を配置し、そのピンホール（開口）内に集光する光のみを通過させることで、試料の特定の高さから射出した光のみが光検出器に入射し、その高さ以外の部分から射出した光がカットされるよう構成されている。これにより、共焦点顕微鏡では、試料の特定の高さに位置する薄い層にのみ限定（セクショニング）された画像を取得することができる。
【０００４】
そして、共焦点顕微鏡では、ピンホール部材の開口径を変更することにより、セクショニング分解能（観察対象となる層の厚み）を変更することができ、開口径を大きくすると、セクショニング分解能を低くすることができ、開口径を小さくするとセクショニング分解能を高くすることができる。
【０００５】
また、例えば、特許文献１に開示されている共焦点顕微鏡では、試料から射出する観察光を分離させて、開口径が異なるピンホールをそれぞれ通過させ、それぞれの光を光検出器で検出することにより、セクショニング分解能の異なる複数の画像が取得される。そして、それらのセクショニング分解能の異なる複数の画像に基づいて、それらの画像とはセクショニング分解能の異なる画像が作成される。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２７４５９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、特許文献１に開示されている共焦点顕微鏡では、観察光が通過するピンホールごとに光検出器を設ける必要があり、光検出器ごとの感度のばらつきによって、開口径が異なるピンホールを通過した光検出器への入力光に対する出力信号を補正する必要があり、手間がかかり、補正しないと、作成される画像の演算が正しく行われず、画像取得後のセクショニングを変える重み関数とセクショニング値の精度が低下することがあった。
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、より精度の高い画像を取得することができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の共焦点顕微鏡は、標本に光を集光する対物レンズと、所定の開口径の領域の光を通過させるピンホールと、前記ピンホールの開口径と略同一の内径で、かつ、前記ピンホールの開口径よりも大きな外径のリング状の領域の光を通過させる開口部と、前記対物レンズの集光焦点と略共役な位置で前記標本からの光を通過させ、前記標本の観察に用いるために、前記ピンホールと前記開口部とで切り替える切替手段と、前記切替手段による切り替えに応じて、前記ピンホールを通過した光と、前記開口部を通過した光とをそれぞれ検出する検出手段とを備えることを特徴とする。
【００１０】
本発明の共焦点顕微鏡においては、対物レンズにより標本に光が集光され、対物レンズの集光焦点と略共役な位置で標本からの光を通過させて標本の観察に用いるために、所定の開口径の領域の光を通過させるピンホールと、このピンホールの開口径と略同一の内径で、かつ、このピンホールの開口径よりも大きな外径のリング状の領域の光を通過させる開口部とで切り替えられる。そして、その切り替えに応じて、ピンホールを通過した光と、開口部を通過した光とがそれぞれ検出される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の共焦点顕微鏡によれば、開口径が異なるピンホールなどを通過した光検出器への入力光に対する出力信号を補正することなく、精度の高い画像を取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１３】
図１は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。
【００１４】
図１において、共焦点顕微鏡１１は、標本１２を下方から観察する倒立顕微鏡１３、標本１２に照射されるレーザ光の光源を有するレーザ光源ユニット１４、共焦点観察を行うための光学系を内蔵する共焦点観察ユニット１５、標本１２から発せられる観察光（蛍光）を検出する光検出ユニット１６、および、共焦点顕微鏡１１の各部を制御するコントローラ１７を備えて構成される。また、コントローラ１７には、観察者の操作に応じた操作信号をコントローラ１７に供給するコンピュータ１８が接続され、観察画像を表示するためのモニタ１９がコンピュータ１８を介して接続されている。
【００１５】
また、共焦点顕微鏡１１において、レーザ光源ユニット１４と共焦点観察ユニット１５とが光ファイバ２０ａを介して接続されており、共焦点観察ユニット１５と光検出ユニット１６とが光ファイバ２０ｂを介して接続されている。また、共焦点観察ユニット１５は、倒立顕微鏡１３の下方に直接取り付けられており、鉛直方向に延びる光軸Ｌに沿って、共焦点観察ユニット１５から倒立顕微鏡１３にレーザ光が入射し、標本１２から発せられる観察光が倒立顕微鏡１３から共焦点観察ユニット１５に入射する。
【００１６】
倒立顕微鏡１３では、ステージ２１に標本１２が載置され、ステージ２１の下方に複数の対物レンズ２２を装着可能なターレット２３が配設されている。ターレット２３は、所定の回転軸を中心に回転可能に構成されており、観察者によるコンピュータ１８の操作に応じて、ターレット２３が回転駆動することで、所望の対物レンズ２２が光軸Ｌ上に配置される。対物レンズ２２により集光された標本１２からの光は、図示しない光学系を介して鏡筒内で結像し、接眼レンズ２４により、観察者が肉眼で観察することができるように拡大される。
【００１７】
また、倒立顕微鏡１３では、ターレット２３の鉛直方向の下方には、結像レンズ２５が配設されており、結像レンズ２５を介して、対物レンズ２２により集光された標本１２からの光が共焦点観察ユニット１５に入射する。
【００１８】
また、共焦点顕微鏡１１では、標本１２の鉛直方向の上方に照明部２６が設けられており、透過光観察において、照明部２６は、標本１２を透過させる透過光を、標本１２の上方から照射する。一方、共焦点顕微鏡１１では、蛍光観察において、標本１２の下方から、標本１２に含まれる蛍光物質を励起させるためのレーザ光が、レーザ光源ユニット１４から共焦点観察ユニット１５を介して照射される。
【００１９】
レーザ光源ユニット１４は、それぞれ波長の異なるレーザ光を発する２つのレーザ光源３１ａおよび３１ｂを有している。レーザ光源３１ａから発せられたレーザ光は、レーザ光の照射をオン／オフするためのシャッタ３２ａを介してハーフミラー３３に入射し、ハーフミラー３３により反射されて集光レンズ３４を介して光ファイバ２０ａに入射する。また、レーザ光源３１ｂから発せられたレーザ光は、シャッタ３２ｂを介してミラー３５に入射し、ミラー３５により反射されてハーフミラー３３および集光レンズ３４を介して光ファイバ２０ａに入射する。
【００２０】
レーザ光源ユニット１４から発せられたレーザ光は、光ファイバ２０ａを介して、共焦点観察ユニット１５のコリメータレンズ４１に入射し、コリメータレンズ４１により平行光とされる。共焦点観察ユニット１５内の光軸Ｌ上には、倒立顕微鏡１３側から順に、スキャナレンズ４２、ガルバノスキャナ４３、ハーフミラー４４、集光レンズ４５、およびピンホールターレット４６が設けられている。
【００２１】
光ファイバ２０ａを介して入射し、コリメータレンズ４１により平行光とされたレーザ光は、ハーフミラー４４により光軸Ｌの鉛直方向の上方に向かって反射され、ガルバノスキャナ４３により光軸Ｌに直交する平面でスキャンされ、スキャナレンズ４２を介して倒立顕微鏡１３に入射する。
【００２２】
レーザ光が照射されたことにより標本１２から発せられる観察光（蛍光）は、対物レンズ２２を介して光軸Ｌに沿って鉛直方向の下方に向かい、結像レンズ２５およびスキャナレンズ４２を介してガルバノスキャナ４３に入射する。そして、観察光は、ガルバノスキャナ４３によりデスキャンされ、ハーフミラー４４を透過して集光レンズ４５により、対物レンズ２２の焦点位置とほぼ共役な位置（共焦点位置）に集光される。
【００２３】
その共焦点位置には、ピンホールターレット４６が配置されている。ピンホールターレット４６には、図２を参照して後述するように、開口径の異なる複数のピンホールと、それぞれのピンホールとペアで用いられるリング状の開口部とが設けられている。ピンホールターレット４６は、駆動部４７に接続された回転軸を中心に回転可能とされており、駆動部４７により駆動されて、光軸Ｌ上に観察に用いるピンホールを配置する。そして、そのピンホールを通過した観察光は、光ファイバ２０ｂに入射する。
【００２４】
光検出ユニット１６では、光ファイバ２０ｂから射出される観察光が、コリメータレンズ５１を介してダイクロイックミラー５２ａに入射し、第１の波長領域の観察光がダイクロイックミラー５２ａにより反射されて、バリアフィルタ５３ａにより標本１２や光学系からの反射光がカットされて観察光のみが透過される。その後、第１の波長領域の観察光は、集光レンズ５４ａにより集光されて、ＰＭＴ（photo multiplier tube：光電子増倍管）５５ａに入射する。
【００２５】
また、ダイクロイックミラー５２ａを通過した観察光は、ダイクロイックミラー５２ｂに入射し、第２の波長領域の観察光がダイクロイックミラー５２ｂにより反射されて、バリアフィルタ５３ｂによりフィルタリングされた後、集光レンズ５４ｂにより集光されてＰＭＴ５５ｂに入射する。また、ダイクロイックミラー５２ｂを通過した第３の波長領域の観察光は、バリアフィルタ５３ｃによりフィルタリングされた後、集光レンズ５４ｃにより集光されてＰＭＴ５５ｃに入射する。
【００２６】
そして、ＰＭＴ５５ａ乃至５５ｃは、それぞれ受光した観察光を検出し、その光量に応じた電圧の検出信号をコントローラ１７に供給する。なお、標本１２に照射されるレーザ光は、上述したようにガルバノスキャナ４３によりスキャンされるので、ＰＭＴ５５ａ乃至５５ｃは、標本１２の観察領域（二次元平面）にわたる観察光を検出する。
【００２７】
コントローラ１７では、画像処理部６１により、ＰＭＴ５５ａ乃至５５ｃから供給される検出信号に基づいて、観察光の第１乃至第３の波長領域ごとの観察画像が組み立てられ、コンピュータ１８を介してモニタ１９に表示されるとともに、コンピュータ１８に内蔵される記録部（図示せず）に記録される。
【００２８】
また、コントローラ１７には、レーザ光源ユニット１４を制御する制御部６２、共焦点観察ユニット１５を制御する制御部６３、および、倒立顕微鏡１３を制御する制御部６４が設けられている。
【００２９】
例えば、制御部６２は、レーザ光源ユニット１４のシャッタ３２ａおよび３２ｂの開閉を制御して、標本１２へのレーザ光の照射のオン／オフを制御する。
【００３０】
制御部６３は、ガルバノスキャナ４３の駆動を制御して、レーザ光による標本１２のスキャンを制御する。制御部６４は、例えば、観察者が、コンピュータ１８を操作して観察に用いる対物レンズ２２を指定すると、ターレット２３を回転駆動させ、観察者が指定した対物レンズ２２を光軸Ｌ上に配置させる。
【００３１】
また、制御部６３には、例えば、ターレット２３に装着される複数の対物レンズ２２それぞれのＮＡおよび倍率と、それらの対物レンズ２２を用いた観察において使用するピンホールなど（リング状の開口部とピンホールとのペア）とが対応付けられて記憶されており、観察者により指定された対物レンズ２２のＮＡおよび倍率に対応付けられているピンホールなどが、光軸Ｌ上に配置されるように、駆動部４７を制御してピンホールターレット４６を回転駆動させ、光軸Ｌ上に配置されるピンホールなどを変更する。
【００３２】
また、共焦点顕微鏡１１では、ピンホールとリング状の開口部とがペアで用いられ、制御部６３は、例えば、ピンホールを通過する観察光が検出された後に、ピンホールターレット４６を回転駆動させて、リング状の開口部を通過する観察光を検出させる。
【００３３】
次に、図２を参照して、ピンホールターレット４６に設けられているピンホールについて説明する。
【００３４】
図２Ａは、ピンホールターレット４６の平面図であり、図２Ｂは、図２Ａに示されている矢印方向におけるピンホールターレット４６の断面図である。
【００３５】
ピンホールターレット４６には、開口径がそれぞれ異なる３つのピンホール７１乃至７３と、内径および外径がそれぞれ異なる３つのリング状の開口部７４乃至７６とが設けられている。また、ピンホール７１乃至７３およびリング状の開口部７４乃至７６のそれぞれの中心は、ピンホールターレット４６の回転中心と同心の円上に配置されている。
【００３６】
また、上述したように共焦点顕微鏡１１による観察では、ピンホールとリング状の開口部とがペアで用いられる。
【００３７】
例えば、ピンホール７１の開口径は200μｍとされ、ピンホール７１とペアで用いられるリング状の開口部７４は内径200μｍで外径400μｍとされる。即ち、リング状の開口部７４は、ピンホール７１において観察光が通過する直径200μｍ以下の領域の観察光の通過を遮断し、直径が200〜400μｍのリング状（ドーナッツ状）の領域の観察光を通過させる。
【００３８】
また、例えば、ピンホール７２の開口径は300μｍとされ、ピンホール７２とペアで用いられるリング状の開口部７５は内径300μｍで外径500μｍとされる。また、例えば、ピンホール７３の開口径は400μｍとされ、ピンホール７３とペアで用いられるリング状の開口部７６は内径400μｍで外径600μｍとされる。
【００３９】
リング状の開口部７４乃至７６は、それぞれ同様に構成されており、図２Ｂに示されているリング状の開口部７５の断面図を参照して、その構成を説明する。
【００４０】
リング状の開口部７５が、ピンホールターレット４６に固定されている位置には、リング状の開口部７５の外径より大きな穴７５ａが形成されている。リング状の開口部７５は、光を透過するガラス７５ｂと、光を反射する反射膜７５ｃおよび７５ｄとにより、リング状に観察光を透過するように形成される。即ち、ガラス７５ｂの表面の全面に反射膜が蒸着され、その反射膜のうちの観察光を透過させるリング状の領域（リング状の開口部７５では、直径300〜500μｍのリング状の領域）だけエッチングにより反射膜が除去される。
【００４１】
これにより、エッチングされた領域より外側に、リング状の開口部７５の外径を決める反射膜７５ｃが形成され、エッチングされた領域より内側に、リング状の開口部７５の内径を決める反射膜７５ｄが形成される。このように、直径300〜500μｍのリング状の領域の観察光を通過させる、即ち、直径300μｍ以下および直径500μｍ以上の領域の観察光の通過を遮断するリング状の開口部７５が形成される。
【００４２】
共焦点顕微鏡１１では、このようなピンホールとリング状の開口部とがペアで用いられ、それぞれのピンホールを通過した観察光による２枚の画像が取得される。即ち、ピンホールを通過した観察光と、リング状の開口部を通過した観察光とが、ピンホールターレット４６の回転駆動に応じて、それぞれ光検出ユニット１６に入射し、光検出ユニット１６では、ピンホールとリング状の開口部との切り替えに応じて、時分割で、それぞれのピンホールを通過した観察光による２枚の画像を得るための観察光が検出される。
【００４３】
次に、図３は、図１の共焦点顕微鏡１１が画像を取得するする処理を説明するフローチャートである。
【００４４】
例えば、観察者が、ステージ２１に標本１２をセットし、共焦点顕微鏡１１を起動させると処理が開始され、観察者が、コンピュータ１８を操作して、標本１２の観察に用いる対物レンズ２２を指定すると、ステップＳ１１において、コンピュータ１８は、観察者が指定した対物レンズ２２を示す情報をコントローラ１７の制御部６４に供給する。制御部６４は、倒立顕微鏡１３の図示しない駆動部を制御し、観察者が指定した対物レンズ２２が光軸Ｌ上に配置されるように、ターレット２３を回転駆動させ、処理はステップＳ１２に進む。
【００４５】
ステップＳ１２において、コンピュータ１８は、観察者が指定した対物レンズ２２を示す情報をコントローラ１７の制御部６３に供給し、制御部６３は、その情報に基づいて、観察者が指定した対物レンズ２２のＮＡおよび倍率に対応付けられているピンホールおよびリング状の開口部を決定する。
【００４６】
ステップＳ１２の処理後、処理はステップＳ１３に進み、制御部６３は、駆動部４７を制御してピンホールターレット４６を回転駆動させ、ピンホール７１乃至７３のうちの、ステップＳ１２で決定したピンホールを光軸Ｌ上の共焦点位置に配置させ、処理はステップＳ１４に進む。
【００４７】
ステップＳ１４において、制御部６２は、レーザ光源ユニット１４を制御して標本１２にレーザ光を照射させ、制御部６３は、ガルバノスキャナ４３を制御して、そのレーザ光をスキャンさせる。レーザ光が照射された標本１２から発する観察光のうちの、標本１２から発した光が、ステップＳ１３で共焦点位置に配置されたピンホールを通過する。そして、そのピンホールを通過した観察光は、光ファイバ２０ｂを介して光検出ユニット１６に入射して検出され、その光量に基づいた第１の画像が画像処理部６１により取得され、コンピュータ１８の記録部に記録される。このとき、ピンホールの大きさに応じた標本の厚み情報を持った画像が取得される。
【００４８】
ステップＳ１４の処理後、処理はステップＳ１５に進み、コントローラ１７の制御部６３は、駆動部４７を制御してピンホールターレット４６を回転駆動させ、リング状の開口部７４乃至７６のうちの、ステップＳ１２で決定したリング状の開口部を光軸Ｌ上の共焦点位置に配置させ、処理はステップＳ１６に進む。
【００４９】
ステップＳ１６において、ステップＳ１４と同様の処理が行われ、標本１２から発した光が、ステップＳ１５で共焦点位置に配置されたリング状の開口部を通過する。そして、そのリング状の開口部を通過した観察光の光量に基づいた第２の画像が画像処理部６１により取得され、コンピュータ１８の記録部に記録されると、処理は終了される。このとき、リング状の開口部の大きさに応じた標本の厚み情報を持った画像が取得される。
【００５０】
以上のように、共焦点顕微鏡１１では、ピンホールを通過した観察光から得られるセクショニング分解能が高い（観察対象となる層が薄い）第１の画像データと、リング状の開口部を通過した観察光から得られるセクショニング分解能が低い（観察対象となる層が厚い）第２の画像データとが、コンピュータ１８の記録部に記録される。
【００５１】
そして、コンピュータ１８は、記録部に記録されているセクショニング分解能が高い第１の画像データと、セクショニング分解能が低い第２の画像データとを用いた演算を行うことで、観察者により指定される任意のセクショニング分解能の画像データを作成し、その画像をモニタ１９に表示させることができる。
【００５２】
例えば、セクショニング分解能が高い第１の画像データをＤａとし、セクショニング分解能が低い第２の画像データをＤｂとすると、任意のセクショニング分解能の画像データＤは、Ｄ＝Ｄａ＋αＤｂで算出される。ここで、αは、重み関数であり、観察者は、−１から＋１の範囲でαを指定することで、第１の画像データのセクショニング分解能から第２の画像データのセクショニング分解能までの範囲の任意のセクショニング分解能の画像を作成させることができる。
【００５３】
このように、共焦点顕微鏡１１では、セクショニング分解能が高い第１の画像データとセクショニング分解能が低い第２の画像データとを得て、任意のセクショニング分解能の画像を作成することができる。その際、ピンホールターレット４６を回転駆動させて観察に用いるピンホールを切り替えるので、第１の画像データと第２の画像データとは、いずれも１つの光検出ユニット１６により検出された観察光から取得することができる。これにより、光検出器の入力光に対する出力信号の感度は同一なので、２つの画像データを演算して任意のセクショニング分解能の画像を得るときの重み関数αとセクショニング値の精度を向上させることができる。
【００５４】
即ち、例えば、観察光を分離させて、それぞれ開口径の異なるピンホールを通過させ、それぞれのピンホールを通過した観察光を異なる光検出器で検出して第１の画像データと第２の画像データとを取得するような共焦点顕微鏡では、それぞれの光検出器の特性（ゲインや、オフセット、波長感度など）の校正を行わなければならず、それらの校正を行ったとしても、同一の条件で画像を取得することは困難である。このように、画像を取得する条件が異なるため、それらの画像に基づいてセクショニング分解能の異なる画像を作成したとしても、重み関数αとセクショニング値の定量的な精度は低いものであった。
【００５５】
これに対し、共焦点顕微鏡１１では、光検出ユニット１６により、ピンホールを通過した観察光と、リング状の開口部を通過した観察光を検出するので、同一の条件で画像を取得することができ、重み関数αとセクショニング値の定量的な精度の高い画像を作成することができる。
【００５６】
また、複数の光検出器を用いる共焦点顕微鏡では、それぞれの光検出器の置かれている環境や、計時変化などについても考慮する必要があり、画像の取得が煩雑なものになっていたが、共焦点顕微鏡１１では、それらを考慮する必要はなく、画像の取得を容易に行うことができる。
【００５７】
また、共焦点顕微鏡１１は、ピンホールとリング状の開口部を通過したそれぞれの観察光を検出するための複数の光検出ユニットを用いることなく構成されるので、複数の光検出器を用いる共焦点顕微鏡よりも、小型化することができるとともに、構成が複雑化することを回避することができ、ひいては、低コスト化を図ることができる。
【００５８】
また、共焦点顕微鏡１１では、光検出ユニット１６において、波長領域ごとに観察光が分離されて、波長領域ごとの画像を取得することができるので、波長領域ごとに所望のセクショニング分解能の画像を作成し観察することができる。
【００５９】
また、上述したように、ピンホールターレット４６には、３種類のペアとなるピンホールとリング状の開口部とが配置されている。そして、使用する対物レンズ２２のＮＡおよび倍率に基づいて、ピンホールの開口径が決まるので、低倍率でＮＡの小さな対物レンズ２２を使用する場合には、開口径の大きなピンホール（例えば、ピンホール７３およびリング状の開口部７６）を用いて画像を取得するように、対物レンズ２２に最適なピンホールを選択する。そして、画像を取得した後、重み関数αを変えることで所望のセクショニング分解能で定量性の高いセクショニング値で共焦点観察を行うことが可能である。
【００６０】
さらに、所定の観察スケジュールに基づいて、あらかじめ設定された間隔で観察を行うタイムラプス観察において、ピンホールとリング状の開口部とを切り替えて画像を取得するように設定することで、所望のセクショニング分解能でのタイムラプス観察による共焦点観察を行うことが可能である。
【００６１】
なお、図２に示されているリング状の開口部７４乃至７６は、ガラスと反射膜により構成されているが、リング状の開口部は、このようの構成に限られるものではなく、例えば、金属板により構成することができる。
【００６２】
例えば、図４には、金属片により構成されているリング状の開口部が示されている。リング状の開口部は、中央領域の光を遮断してリング状の開口部の内径を決める遮断部と、外周領域の光を遮断してリング状の開口部の外径を決める遮断部とが、３箇所の幅が細いブリッジ部により繋がれる形状の金属片により構成される。このように金属片を形成することで、光を通過させる領域がリング状の開口部（ブリッジ部により分断された３箇所の穴）となる。例えば、金属片の厚みは、0.1ｍｍ程度とされ、リング状の開口部は、円盤状の金属片をエッチングすることにより形成される。
【００６３】
このように、リング状の開口部を形成する金属片を、例えば、図２Ｂに示されているリング状の開口部を構成するガラス７５ｂ並びに反射膜７５ｃおよび７５ｄに替えて、ピンホールターレット４６に取り付けることができる。または、ピンホールターレット４６に形成される穴７５ａ（図２Ｂ）に変えて、図４に示されているようなリング状の開口部を形成してもよい。
【００６４】
なお、図１の共焦点顕微鏡１１は、ピンホールターレット４６を回転させることにより共焦点位置に配置されるピンホールを切り替えているが、例えば、ピンホールの位置を固定したまま、観察光の光路を振り分けることで、共焦点位置に配置されるピンホールを切り替えることができる。
【００６５】
即ち、図５は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施の形態の構成例を示すブロック図である。
【００６６】
図５において、共焦点顕微鏡１１’は、ガルバノスキャナ４８、コンバイナ８１、並びに光ファイバ２０ｃおよび２０ｄを備える点で、図１の共焦点顕微鏡１１と異なっており、図１の共焦点顕微鏡１１と同様に構成されているブロックは、同一の符号を付し、その説明は、適宜省略する。
【００６７】
共焦点顕微鏡１１’では、ガルバノスキャナ４８が、共焦点観察ユニット１５内の光軸Ｌ上の集光レンズ４５とピンホールターレット４６との間に設けられており、集光レンズ４５を介して入射する観察光を、ガルバノスキャナ４８により、ピンホールターレット４６のピンホールとリング状の開口部とに高速で振り分けることだができる。そして、例えば、ピンホールターレット４６のピンホールを通過した観察光は、光ファイバ２０ｃを介してコンバイナ８１に入射し、ピンホールターレット４６のリング状の開口部を通過した観察光は、光ファイバ２０ｄを介してコンバイナ８１に入射する。
【００６８】
コンバイナ８１では、光ファイバ２０ｃから射出される観察光は、コリメータレンズ８２を介してハーフミラー８３に入射し、ハーフミラー８３により反射されて集光レンズ８４を介して光ファイバ２０ｂに入射する。また、光ファイバ２０ｄから射出される観察光は、コリメータレンズ８５を介してミラー８６に入射し、ミラー８６により反射されてハーフミラー８３および集光レンズ８４を介して光ファイバ２０ｂに入射する。このように、コンバイナ８１において、ピンホールを通過した観察光と、リング状の開口部を通過した観察光との光路が統合され、観察光は、光ファイバ２０ｂにより伝送されて光検出ユニット１６に導入される。
【００６９】
このように、共焦点顕微鏡１１’では、ガルバノスキャナ４８により高速に観察光を振り分けて、観察に使用するピンホールを高速に切り替えることができるので、例えば、ピンホールターレット４６を回転駆動させる場合よりも、ピンホールを介した観察光に基づいた画像と、リング状の開口部を介した観察光に基づいた画像との２枚の画像を取得する際のタイムラグを減らすことができる。
【００７０】
さらに、ガルバノスキャナ４８により高速に観察光を振り分けることで、例えば、ピンホールを介した観察光から取得される画像の１ラインと、リング状の開口部を介した観察光から取得される画像の１ラインとを交互に取得することができるので、２枚の画像を取得する際のタイムラグをさらに減らすことができる。なお、１画素ごとに、観察に用いるピンホールを切り替えてもよい。
【００７１】
このように、２枚の画像を取得する際のタイムラグを減らすことで、例えば、標本１２が、生きている生物標本であっても、セクショニングの異なる２枚の画像を、ほぼ同じ構図で取得することができる。
【００７２】
なお、図１の共焦点顕微鏡１１は、ピンホールターレット４６のピンホールを通過した観察光が、光ファイバ２０ｂを介して光検出ユニット１６に導入されるように構成されているが、例えば、ピンホールターレット４６のピンホールの直後に、観察光を検出する検出器を配置して、ピンホールを通過した光を直接的に検出した検出信号から画像を組み立てるようにしてもよい。
【００７３】
また、上述のフローチャートを参照して説明した各処理は、必ずしもフローチャートとして記載された順序に沿って時系列に処理する必要はなく、並列的あるいは個別に実行される処理（例えば、並列処理あるいはオブジェクトによる処理）も含むものである。
【００７４】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。
【図２】ピンホールターレット４６に設けられているピンホールを説明する図である。
【図３】共焦点顕微鏡１１が画像を取得するする処理を説明するフローチャートである。
【図４】リング状の開口部の他の実施の形態を示す図である。
【図５】本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施の形態の構成例を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００７６】
１１  共焦点顕微鏡，  １２  標本，  １３  倒立顕微鏡，  １４  レーザ光源ユニット，  １５  共焦点観察ユニット，  １６  光検出ユニット，  １７  コントローラ，  １８  コンピュータ，  １９  モニタ，  ２０ａ乃至２０ｄ  光ファイバ，  ２１  ステージ，  ２２  対物レンズ，  ２３  ターレット，  ２４  接眼レンズ，  ２５  結像レンズ，  ２６  照明部，  ３１ａおよび３１ｂ  レーザ光源，  ３２ａおよび３２ｂ  シャッタ，  ３３  ハーフミラー，  ３４  集光レンズ，  ３５  ミラー，  ４１  コリメータレンズ，  ４２  スキャナレンズ，  ４３  ガルバノスキャナ，  ４４  ハーフミラー，  ４５  集光レンズ，  ４６  ピンホールターレット，  ４７  駆動部，  ４８  ガルバノスキャナ，  ５１  コリメータレンズ，  ５２ａおよび５２ｂ  ダイクロイックミラー，  ５３ａ乃至５３ｃ  バリアフィルタ，  ５４ａ乃至５４ｃ  集光レンズ，  ５５ａ乃至５５ｃ  ＰＭＴ，  ６１  画像処理部，  ６２乃至６４  制御部，  ７１乃至７３  ピンホール，  ７４乃至７６  リング状の開口部，  ８１  コンバイナ，  ８２  コリメータレンズ，  ８３  ハーフミラー，  ８４  集光レンズ，  ８５  コリメータレンズ，  ８６  ミラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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