(57)【要約】【課題】目的成分の分取に他の成分の混入を防止するとともに、予期しない成分も漏れなく分取して貴重な試料のロスを回避する。【解決手段】クロマトグラム作成部２１はＭＳ検出器１４による検出信号に基づいてリアルタイムでクロマトグラムを作成し、ピーク検出部２２はピークの開始点と終了点を検出する。分画制御部２４はピークが検出されるまでは等時間間隔の時間分画を行うようにフラクションコレクタ９を制御するが、ピーク開始点検出信号が得られると直ちにその時点での分画を終了し次の分画に移行する。その後、ピーク終了点が検出されるまでは所定時間毎の時間分画又は１つの分画を実行し、ピーク終了点検出信号が得られると直ちにその時点での分画を終了し、元の等時間間隔の時間分画に戻る。これにより、目的成分と他の積分が近接して溶出しても両者の混合を防止でき、且つ、全ての成分を漏れなく回収することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の成分を分離するカラムと、該カラムからの溶出液中の成分を検出する検出器と、前記溶出液を分画して異なる容器に採取するフラクションコレクタと、を具備する分取液体クロマトグラフ装置において、
a)目的試料に対する分析の進行に伴い前記検出器により順次得られる検出信号に基づいて作成されるクロマトグラム上で、ピークの開始点又は終了点の少なくともいずれか一方を検出するピーク検出手段と、
b)ピークがない期間では予め設定された１乃至複数の時間間隔で時間分画を実行し、前記ピーク検出手段によりピークの開始点又は終了点の少なくともいずれか一方が検出されたときにその時点で実行している分画を終了して次の分画に移行するように、前記フラクションコレクタによる分画のタイミングを制御する制御手段と、
を備えることを特徴とする分取液体クロマトグラフ装置。
【請求項２】
請求項１に記載の分取液体クロマトグラフ装置であって、
前記制御手段は、或る１つのピークの開始点から終了点までの期間を１つの分画とするように前記フラクションコレクタによる分画のタイミングを制御することを特徴とする分取液体クロマトグラフ装置。
【請求項３】
請求項１に記載の分取液体クロマトグラフ装置であって、
前記制御手段は、各ピークの開始点から終了点までのピークがある期間中には、ピークがない期間とは異なる時間間隔での時間分画を実行するように、前記フラクションコレクタによる分画のタイミングを制御することを特徴とする分取液体クロマトグラフ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カラムで分離された成分を含む溶出液を分画し、複数の容器に分けて採取する分取液体クロマトグラフ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を利用して、液体試料に含まれる複数の成分を分画して採取する、いわゆる分取液体クロマトグラフ装置が知られている（特許文献１、非特許文献１など参照）。こうした分取液体クロマトグラフ装置では、フラクションコレクタで溶出液を分画するタイミングを手動又は自動で決める必要がある。
【０００３】
比較的多量の試料を用意できる場合には、その試料について予備的なLC分析を実行してクロマトグラムを作成し、オペレータがそのクロマトグラムを見て分画のタイミングを決める。そして、分画制御のためのプログラムを作成し、そのプログラムに従って再び同試料についてLC分析を実行しながら分画・分取を行うことができる。しかしながら、例えば試料が少量しかない場合や高価で貴重な場合には、予備的なLC分析を行うことができず、１回のLC分析で成分分離された溶出液を分画・分取する必要がある。
【０００４】
そうした場合の分画制御方法として大別して、試料成分によるピークの有無とは無関係に予め決めた一定時間間隔又はランダムな時間間隔で分画を行う時間分画と、ピークの開始点や終了点を自動的に検出してそのピークの部分を抜き出して分画するピーク分画とが、知られている。ピーク分画では、ピーク検出条件を適切に設定すれば目的成分を他の成分の混入なしに分取することができる。しかしながら、ピーク検出条件の設定が適切でないと少量の成分を回収できず、貴重な試料をロスすることになる。これに対し、時間分画は特に、目的成分を含め全ての成分を漏れなく採取したい場合に利用されることが多く、オペレータが全く予期しないような少量の成分が含まれている場合でもこれを採取することができるという利点がある。しかしながら、時間分画では、目的成分と時間的に近接して別の不純物成分が溶出した場合に、目的成分と不純物成分とが混じった分画となるおそれがあった。
【０００５】
【特許文献１】特開平３−２９８５０号公報
【非特許文献１】「島津アプリケーションニュース  No.C56 分取LC-MSによる分画と超高速LC-MSによる画分の確認」、[online]、株式会社島津製作所、[平成２０年６月２７日検索]、インターネット＜URL : http://www.an.shimadzu.co.jp/support/lib/an/200710/c56.pdf＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その主な目的は、目的成分は当然のことそれ以外の予期しないような成分をも漏らすことなく採取し、且つ目的成分の分取に他の成分の混入を防止することができる分取液体クロマトグラフ装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために成された本発明は、試料中の成分を分離するカラムと、該カラムからの溶出液中の成分を検出する検出器と、前記溶出液を分画して異なる容器に採取するフラクションコレクタと、を具備する分取液体クロマトグラフ装置において、
a)目的試料に対する分析の進行に伴い前記検出器により順次得られる検出信号に基づいて作成されるクロマトグラム上で、ピークの開始点又は終了点の少なくともいずれか一方を検出するピーク検出手段と、
b)ピークがない期間では予め設定された１乃至複数の時間間隔で時間分画を実行し、前記ピーク検出手段によりピークの開始点又は終了点の少なくともいずれか一方が検出されたときにその時点で実行している分画を終了して次の分画に移行するように、前記フラクションコレクタによる分画のタイミングを制御する制御手段と、
を備えることを特徴としている。
【０００８】
本発明に係る分取液体クロマトグラフ装置の一態様として、前記制御手段は、或る１つのピークの開始点から終了点までの期間を１つの分画とするように前記フラクションコレクタによる分画のタイミングを制御する構成とすることができる。
【０００９】
また本発明に係る分取液体クロマトグラフ装置の別の態様として、前記制御手段は、各ピークの開始点から終了点までのピークがある期間中には、ピークがない期間とは異なる時間間隔での時間分画を実行するように、前記フラクションコレクタによる分画のタイミングを制御する構成とすることもできる。
【００１０】
即ち、本発明に係る分取液体クロマトグラフ装置では、クロマトグラム上でピークがない期間、つまりピーク検出手段がピークの開始点を検出したときからその終了点を検出するまでの期間を除く期間においては、制御手段は時間分画を実行するようにフラクションコレクタを制御する。但し、ピークがない期間の中で、明らかに何らの有意な成分がないと判断できる期間、例えば試料を移動相中に注入してから最初の成分が溶出してくるまでの期間、或いは、全ての成分が溶出し終えた後の期間には、分画を実行せずに溶出液を廃棄してもよい。
【００１１】
上述のようにピークのない（厳密に言えばピーク検出手段が検出できるような強度のピークがない）期間には、基本的に時間分画が実行されるから、仮にピークとして検出されない少量の成分が存在した場合、その成分はいずれかの容器に必ず分取される。例えばピーク検出手段がピーク開始点を検出すると、制御手段の制御の下にフラクションコレクタは、その直前の分画を終了して次の分画に移行するから、そのピークを生じた成分はそれよりも前に溶出した成分とは確実に分画される。また、ピーク検出手段がピーク終了点を検出すると、制御手段の制御の下にフラクションコレクタは、その直前の分画を終了して次の分画に移行するから、そのピークを生じた成分はそれよりも後に溶出した成分とも確実に分画される。つまり、ピークを生じた成分は時間的に前後に存在する成分とは確実に分画され、混じることはない。
【発明の効果】
【００１２】
このように本発明に係る分取液体クロマトグラフ装置によれば、ピーク検出手段により検出されないような小さなピークに対応した成分も漏れなく容器に回収することができ、一方、ピーク検出手段により検出される比較的大きなピークに対応した目的成分の分画には他の成分が混じらないようにすることができる。それにより、目的成分の分取を効率よく行うことができる。また、もともと分取の予定のなかった成分やオペレータが予期しない未知の成分などについても分取しておくことができるため、それらについても後で詳細な調査を行うことができ、貴重な試料の損失を防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の一実施例である分取液体クロマトグラフ装置を、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例の分取クロマトグラフ装置の要部の構成図である。
【００１４】
この分取液体クロマトグラフ装置において、送液ポンプ２は移動相容器１に貯留されている移動相を吸引し、一定流量でインジェクタ３を介し分離カラム４へと送給する。インジェクタ３において移動相中に試料液が注入されると、試料液は移動相に乗って分離カラム４に導入され、分離カラム４を通過する間に時間方向に分離されて溶出する。この溶出液は溶出流路５を通して、スプリッタ６、紫外可視分光（ＵＶ）検出器８を経てフラクションコレクタ９に導入される。スプリッタ６よりも下流側の溶出流路５には、溶出液の流れを時間遅延させるためのループ管７が設けられている。ＵＶ検出器８は通過する溶出液中の試料成分を検出し、検出信号を後述のデータ処理部２０へと送る。
【００１５】
フラクションコレクタ９は、溶出液をオン・オフする分注バルブ９１及び排液バルブ９５、多数の容器９２が収容された容器ラック９３、溶出液を滴下する分注ノズルを２軸方向に移動させることで溶出液を採取する容器を切り替える駆動部９４、及び、排液バルブ９がオンしたときに溶出液を回収する廃液容器９６、を備える。フラクションコレクタ９では、駆動部９４が分画制御部２３の指示に応じて分注ノズルを適宜移動させることで、順次流れて来る溶出液を複数の容器に順に分取することができる。本明細書中における「次の分画に移行する」とは、この例では、分注ノズルを次の容器の上に移動させることをいう。もちろん、分注ノズルを移動させる代わりに容器を移動させてもよいし、或いはバルブによる流路の切替えによって「次の分画に移行する」ことも可能である。
【００１６】
メイクアップポンプ１１は、別の移動相容器１０に貯留されている移動相を吸引し検出流路１２に流す。検出流路１２はスプリッタ６を経て、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器１３と質量分析（ＭＳ）検出器１４とに接続されている。スプリッタ６はいわゆるアクティブスプリッタであり、溶出流路５に流れる高流量の溶出液の一部を所定のスプリット比でもって分割して検出流路１２に導く。この分割された一部の溶出液はメイクアップポンプ１１により送給される移動相の流れに乗って、円滑にＰＤＡ検出器１３及びＭＳ検出器１４に導入される。ＰＤＡ検出器１３、ＭＳ検出器１４はいずれも検出流路１２を経て供給される分割された溶出液中の試料成分を検出する。
【００１７】
ＵＶ検出器８、ＰＤＡ検出器１３、ＭＳ検出器１４による検出信号はいずれもデータ処理部２０に送られる。この実施例の装置では、フラクションコレクタ９における溶出液の分画制御にはＰＤＡ検出器１３又はＭＳ検出器１４による検出信号が利用され、ＵＶ検出器８による検出信号は、フラクションコレクタ９への溶出液の到達時間の確認やループ管７によるピーク形状の変化の確認などに利用される。
【００１８】
データ処理部２０においてクロマトグラム作成部２１は、ＰＤＡ検出器１３又はＭＳ検出器１４により順次得られる検出信号に基づいてクロマトグラムをリアルタイムで作成する。ＭＳ検出器１４による検出信号が用いられる場合、所定のm/z又はm/z範囲のイオンの検出結果に基づくマスクロマトグラム又は全イオンの検出結果に基づくトータルイオンクロマトグラムが作成される。ピーク検出部２２は、上記クロマトグラムに対してピークの開始点及び終了点の検出をリアルタイムで行う。ここでは、信号強度の閾値ＬＶを予め設定し、クロマトグラムの信号強度が閾値ＬＶを超えた時点をピークの開始点と判断し、その後、信号強度が閾値ＬＶを下回った時点をピークの終了点と判断する。もちろん、これ以外に、ピークのカーブの傾きを判断してピークの開始点、終了点をそれぞれ検出してもよく、信号強度の大きさとピークカーブの傾きとを併用してピークの開始点、終了点を検出してもよい。
【００１９】
ピーク検出部２２はピークの開始点又は終了点を検出すると、直ちに分画制御部２３にその旨を知らせる。分画制御部２３は分画条件設定部２４により設定された分画条件と、ピーク開始点及び終了点の検出信号とに基づいて分画の切替えタイミングを決定し、それに従って分注バルブ９１や駆動部９４の動作を制御する。
【００２０】
本実施例の分取液体クロマトグラフ装置における分画動作を説明する前に、一般的な等時間間隔の時間分画について、図３により簡単に説明する。図３は、等時間間隔の時間分画におけるクロマトグラム波形（ａ）と分画タイミング（ｂ）の一例を示す図である。ここでは、図３（ａ）に示すように、目的成分のピークＰａに時間的に近接して別の成分のピークＰｂが存在する場合を想定する。このような成分を含む溶出液に対し、図示するように一定時間ｔａ間隔で時間分画を実行すると、フラクションコレクタでは、［＃１］〜［＃８］の各分画期間のクロマトグラムに対応した成分を含む溶出液がそれぞれ異なる容器に分取される。そのため、［＃５］の分画期間に対応して分取された溶出液には、目的成分のみならず別の成分も混入してしまうことになる。
【００２１】
本実施例の分取液体クロマトグラフ装置は、上記のような目的成分と他の成分との混合を防止しつつ、オペレータが予期しない成分を含めて全ての成分を確実に分取できるようにしたものである。その分画の制御動作を図２により説明する。（ａ）は図３（ａ）と同じクロマトグラム波形であり、（ｂ）〜（ｄ）はそれぞれ異なる分画タイミングの例を示す図である。まず図２（ｂ）の例について説明する。
【００２２】
オペレータは分取作業に先立って、ピークがない期間における時間分画の時間間隔ｔａ、ピークがある期間における時間分画の時間間隔ｔｂ、ピーク検出条件である閾値ＬＶ、などを含めた分画条件を分画条件設定部２４より入力しておく。入力された閾値ＬＶはピーク検出部２２の内部に記憶され、時間分画の時間間隔ｔａ、ｔｂは分画制御部２３の内部に記憶される。分取作業が開始されると、上述したように送液ポンプ２により一定流量で送給される移動相中にインジェクタ３から試料液が注入される。フラクションコレクタ９ではこの試料注入と同時に溶出液の分取を開始してもよいが、実際には最も速い試料成分が到達するまでに或る程度時間が掛かるので、分取の開始タイミングはずらしてもよい。分取を開始するまでは、排液バルブ９５を開いて溶出液を廃液容器９６に回収すればよい。
【００２３】
ここでは図２中にｔ０で示した時点から分取を開始するものとする。即ち、時刻ｔ０において分画制御部２３は、駆動部９４により所定の容器上に分注ノズルを移動させ、排液バルブ９５を閉じて分注バルブ９１を開放する。これにより、溶出流路５を経てフラクションコレクタ９に到達した溶出液が１番目の容器に分取される。そして分画制御部２３は時間間隔ｔａが経過すると、駆動部９４により次の所定の容器上に分注ノズルを移動させ、その容器内に溶出液を分取する。こうして、ピークがない期間には、時間間隔ｔａが経過する毎に所定の順番でそれぞれ異なる容器に溶出液を採取する。
【００２４】
移動相中に注入された試料液中の各種成分は分離カラム４を通過する間に分離され、時間差がついて分離カラム４から溶出する。溶出液の一部はスプリッタ６により分割され、その分割された溶出液中の成分がＭＳ検出器１４で検出される。クロマトグラム作成部２１はＭＳ検出器１４による検出信号に基づきマスクロマトグラムをリアルタイムで作成し、ピーク検出部２２はそのクロマトグラムの信号強度が閾値ＬＶを超えると（時刻ｔ１）ピーク開始点であると判断し、ピーク開始点検出信号を分画制御部２３へ送る。
【００２５】
分画制御部２３はピーク開始点検出信号を受けるとすぐに、その時点で行われていた分画を終了して次の分画へ移行する。つまり、駆動部９４により次の容器上に分注ノズルを移動させる。したがって、図２（ｂ）に示すように、その直前の分画期間［＃３］は時間分画のための時間間隔ｔａよりも短く、このときに容器に採取される溶出液の量も少なくなる。分画制御部２３はピーク開始点検出信号を受けた後に、時間間隔をｔａからｔｂに変更した時間分画を開始する。つまり、時間間隔ｔｂが経過する毎に、駆動部９４により次の所定の容器上に分注ノズルを移動させ、その容器内に溶出液を分注する。
【００２６】
ピーク開始検出時点から時間が経過して、クロマトグラムの信号強度が閾値ＬＶを下回ると（時刻ｔ２）、ピーク検出部２２はピーク終了点であると判断し、ピーク終了点検出信号を分画制御部２３へ送る。分画制御部２３はピーク終了点検出信号を受けると直ちに、ピーク開始点検出時と同様に、その時点で行われていた分画を終了して次の分画へ移行させる。つまり、駆動部９４により次の容器上に分注ノズルを移動させる。したがって、図２（ｂ）に示すように、その直前の分画期間［＃６］はピークあり期間中の時間分画の時間間隔ｔｂよりも短く、このときに容器に採取される溶出液の量も少なくなる。
【００２７】
分画制御部２３はピーク終了点検出信号を受けた後に、時間間隔を再びｔａに戻した時間分画を実行する。但し、図２（ａ）の例では、ｔａが経過する前に次のピークＰｂのピーク開始点検出信号がピーク検出部２２で得られ、これに応じて分画制御部２３はその直前の分画を終了し次の分画に移行する。したがって、ピークＰａの終了点である時刻ｔ２からピークＰｂの開始点である時刻ｔ３までの短い分画期間［＃７］に対応した溶出液が１つの容器に分取され、ピークＰｂの開始点が検出された以降の溶出液は別の容器に分注される。ピークＰｂの終了点はピークＰｂの開始点からｔｂが経過するよりも前に検出されるから、ピークＰｂの開始点から終了点までの分画期間［＃８］に対応した溶出液は１つの容器のみに採取される。そして、ピークＰｂの終了点が検出された以降は、再び時間間隔ｔａ毎の時間分画が実行される。
【００２８】
上記分画制御動作によれば、ピークＰａを生じた目的成分を含む溶出液は、［＃４］、［＃５］、［＃６］の分画期間に対応した３つの容器にそれぞれ分取され、その溶出液には他の成分の混入はない。また、ピークＰｂを生じた成分を含む溶出液は、［＃８］の分画期間に対応した１つの容器のみに分取され、その溶出液には他の成分が混入していない。これにより、純粋性の高い成分の分取が可能となる。また、信号強度がＬＶを超えないように小さなピークを生じた成分もいずれかの容器に必ず分取されているので、オペレータが予期しない成分が少量含まれていた場合でもそれを廃棄することなく、あとで調査に供することができる。
【００２９】
上記のようにピークがある期間中にも時間分画を実行することで、容器に採取される溶出液の最大量を予め決めることができる。つまり、この最大量は移動相の流量（流速）と時間間隔ｔａ、ｔｂで決まる。したがって、容器の容量が不足して溶出液が溢れ出てしまうことを回避できる。一方、１つの成分を含む溶出液が複数の容器に分割される可能性があり、必要な容器の数が多くなる。
【００３０】
そこで、ピークがある期間中、つまり１つのピークの開始点から終了点までの期間中については、上記のように時間分画を行わずに例えば１つの容器に分注するように制御してもよい。この例が図２（ｃ）である。即ち、ピークＰａについてピーク開始点から終了点までが１つの分画期間［＃４］とされ、この分画期間に相当する溶出液は全て１つの容器に分注される。そのため、容器の容量が不足していたり、ピークの拡がりが大きく開始点から終了点までの時間が予期せず長くなった場合には、溶出液が容器に入り切れずに溢れ出ることがあり得る点に注意を要する。
【００３１】
また、それ以外にも、ピーク検出部２２はピークの開始点と終了点以外にピークトップを検出し、図２（ｄ）に示すように、ピークトップが検出されたならば（時刻ｔ５）その時点までの分画を終了して次の分画に移行するようにしてもよい。これにより、ピークＰａの成分を含む溶出液は２つの容器に分けて採取されるから、少なくとも上記のような溶出液の溢れの問題は小さくなる。
【００３２】
なお、上記説明では、ＭＳ検出器１４による検出信号に基づいて作成されたマスクロマトグラムに現れるピークを利用して分画の制御を行っていたが、ＰＤＡ検出器１３による検出信号に基づいて作成されたクロマトグラムに現れるピークを利用して分画の制御を行うこともできる。
【００３３】
また、スプリッタ６により分割した溶出液中の成分を検出する構成ではなく、フラクションコレクタ９に到達する前の溶出液中の成分を直接検出し、その検出信号に基づいて作成されるクロマトグラムに現れるピークを利用して分画の制御を行うこともできる。即ち、図１中のＵＶ検出器８の検出信号を用いることもできる。但し、その場合には、時間調整のためのループ管７はＵＶ検出器８とフラクションコレクタ９との間に設けるようにする。
【００３４】
また、それ以外の点について、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の一実施例による分取液体クロマトグラフ装置の要部の構成図。
【図２】本実施例による分取液体クロマトグラフ装置における分画動作を説明するためのクロマトグラム波形図（ａ）及び分画タイミング図（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）。
【図３】一般的な時間分画の動作におけるクロマトグラム波形図（ａ）及び分画タイミング図（ｂ）。
【符号の説明】
【００３６】
１、１０…移動相容器
２…送液ポンプ
１１…メイクアップポンプ
１２…検出流路
１３…ＰＤＡ検出器
１４…ＭＳ検出器
２０…データ処理部
２１…クロマトグラム作成部
２２…ピーク検出部
２３…分画制御部
２４…分画条件設定部
３…インジェクタ
４…分離カラム
５…溶出流路
６…スプリッタ
７…ループ管
８…ＵＶ検出器
９…フラクションコレクタ
９１…分注バルブ
９２…容器
９３…容器ラック
９４…駆動部
９５…排液バルブ
９６…排液容器
【図１】
2010014559.tif 000003
【図２】
2010014559.tif 000004
【図３】
2010014559.tif 000005