(57)【要約】      （修正有）【課題】Ａｐｏ-２と命名する新規ポリペプチドの同定、単離、及び組換え生産、及び抗Ａｐｏ-２抗体の提供。【解決手段】アポトーシスを変調可能な特定配列を有するＡｐｏ-２新規ポリペプチド。Ａｐｏ-２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９０２１として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコード化されたポリペプチドを発現することにより得られる。また、Ａｐｏ-２キメラ、Ａｐｏ-２をコードしている核酸、Ａｐｏ-２の単離されたデスドメイン配列、及びＡｐｏ-２に対する抗体を含む組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１のアミノ酸残基１〜４１１を含んでなる天然配列Ａｐｏ-２ポリペプチドと、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離Ａｐｏ-２ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１に記載のＡｐｏ-２ポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する請求項２に記載のＡｐｏ-２ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号：１のアミノ酸残基１〜４１１を含んでなる単離Ａｐｏ-２ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号：１のアミノ酸残基５４〜１８２を含んでなるＡｐｏ-２ポリペプチドの単離された細胞外ドメイン配列。
【請求項６】
配列番号：１のアミノ酸残基１〜１８２を含んでなる請求項５に記載の細胞外ドメイン配列。
【請求項７】
配列番号：１のアミノ酸残基３２４〜３９１を含んでなるＡｐｏ-２ポリペプチドの単離されたデスドメイン配列。
【請求項８】
異種性アミノ酸配列に融合した請求項５に記載の細胞外ドメイン配列又は請求項１に記載のＡｐｏ-２ポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項９】
前記異種性アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項８に記載のキメラ分子。
【請求項１０】
前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリン配列である請求項８に記載のキメラ分子。
【請求項１１】
前記免疫グロブリン配列がＩｇＧである請求項１０に記載のキメラ分子。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチド、請求項５に記載の細胞外ドメイン配列、又は請求項７に記載のデスドメイン配列をコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
【請求項１３】
前記ＤＮＡが配列番号：１のアミノ酸残基１〜４１１を含んでなるＡｐｏ-２ポリペプチドをコードする請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項１５】
ベクターで形質転換した宿主細胞により認識される対照配列に作用可能に結合した請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
ＡＴＣＣ寄託受入番号２０９０２１を含んでなる請求項１４に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１４に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１８】
ＣＨＯ細胞を含んでなる請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
大腸菌を含んでなる請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
酵母細胞を含んでなる請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
Ａｐｏ-２ポリペプチドの発現に十分な条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養し、培養物から発現したＡｐｏ-２ポリペプチドを回収することを含んでなるＡｐｏ-２ポリペプチドの生成方法。
【請求項２２】
ＡＴＣＣ寄託受入番号２０９０２１のｃＤＮＡ挿入物によりコードされたポリペプチドを発現させることにより得られた又は得られうるＡｐｏ-２ポリペプチド。
【請求項２３】
Ａｐｏ-２ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する細胞を含む非ヒト、トランスジェニック動物。
【請求項２４】
マウス又はラットである請求項２３に記載の動物。
【請求項２５】
Ａｐｏ-２ポリペプチドをコードする変更遺伝子を有する細胞を含む、非ヒト、ノックアウト動物。
【請求項２６】
マウス又はラットである請求項２５に記載の動物。
【請求項２７】
Ａｐｏ-２を活性化する薬剤に哺乳動物の癌細胞を暴露することを含んでなる哺乳動物の癌細胞を治療する方法。
【請求項２８】
容器と該容器に入れられる組成物を含んでなり、組成物がＡｐｏ-２ポリペプチド又はＡｐｏ-２抗体を含む製造品。
【請求項２９】
インビボ又はエキソビボにおいてＡｐｏ-２ポリペプチド又はＡｐｏ-２抗体を使用するための使用説明書をさらに含んでなる請求項２８に記載の製造品。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
Ａｐｏ-２レセプター
〔発明の分野〕
本発明は、一般に、ここにＡｐｏ-２と命名する新規ポリペプチドの同定、単離、及び組換え生産、及び抗Ａｐｏ-２抗体に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
アポトーシス又は「プログラムされた細胞死」
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死のバランスにより部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特性付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば、Barrら，Bio Technology，12：487-493(1994)；Stellerら，Science，267：1445-1449(1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itohら，Cell，66：233-243(1991)］。アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、癌、狼瘡、疱疹ウイスル感染を含む種々の病理的条件に関連している[Thompson，Science，267:1456-1462(1995)]。アポトーシス性細胞死のレベルの増加は、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、無形成性貧血、心筋梗塞、脳卒中、再灌流傷害、及び毒素誘発性肝疾患を含む様々な他の病理状態に関連している［Thompson，上掲を参照］。
【０００３】
典型的には、アポトーシス性細胞死には、細胞内における一又は複数の特徴的な形態学的及び生化学的変化、例えば細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失が伴う。様々な外因的及び内因的シグナルが、このような形態学的及び生化学的な細胞変化を惹起又は誘発すると考えられている［Raff，Nature，356：397-400(1992)；Steller，上掲；Sachsら，Blood，82：15(1993)］。例えば、ホルモンの刺激、例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン、並びにある種の成長因子の退薬により惹起され得る［Watanabe-Fukunagaら，Nature，356：314-317(1992)］。また、いくつかの同定された発癌遺伝子、例えばｍｙｃ、ｒｅｌ、及びＥ１Ａ、及び腫瘍サプレッサー、例えばｐ５３が、アポトーシスを誘導する役割を有していることも報告されている。ある種の化学療法薬及びある種の放射線も同様にアポトーシス誘導活性を有していることも見出されている［Thompson，上掲］。
【０００４】
サイトカインのＴＮＦファミリー
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」すなわち「リンホトキシン」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、アポ１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、及びＡｐｏ-２リガンド［トレイル(TRAIL)とも称される］が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定された［例えば、Gruss及びDower，Blood，85：3378-3404(1995)；Wileyら，Immunity，3：673−682(1995)；Pittiら，J．Biol．Chem.，271；12687-12690(1996)；1997年1月16日に公開されたWO97/01633］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、アポ１リガンド、及びＡｐｏ-２リガンド(TRAIL)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性死を誘導することが報告されている［Schmidら，Proc．Natl．Acad．Sci.，83：1881(1986)；Dealtryら，Eur．J．Immunol.，17：689(1987)］。ゼングらは、ＴＮＦ-αがＣＤ８ポジティブＴ細胞のポスト刺激性アポトーシスに関与していることを報告している[Zhengら，Nature，377:348-351(1995)]。他の研究者は、ＣＤ３０リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に関与していることを報告している［Amakawaら，プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)］。
【０００５】
マウスのＦａｓ／アポ１レセプター又はリガンド遺伝子(それぞれ１ｐｒ及びｇｌｄと呼称される)における変異がいくつかの自己免疫疾患に関連しており、アポ１リガンドが末梢の自己反応性リンパ球のクローン除去を調節する役割を担っていることを示している［Krammerら，Curr．Op．Immunol.， 6：279-289(1994)；Nagataら，Science，267：1449-1456(1995)］。また、アポ１リガンドは、ＣＤ４ポジティブＴリンパ球及びＢリンパ球においてポスト刺激性アポトーシスを誘導することが報告されており、それらの機能がもはや必要でなくなった際の活性化リンパ球の除去に関与している［Krammerら，上掲；Nagataら，上掲］。アポ１レセプターと特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ-αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている［Yoneharaら，J．Exp．Med.，169：1747-1756(1989)］。
【０００６】
レセプターのＴＮＦファミリー
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。
約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されており［Hohmanら，J．Biol．Chem.，264：14927-14934(1989)；Brockhausら，Proc．Natl．Acad．Sci.，87：3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開されたＥＰ４１７５６３］、双方のレセプター型に対応するヒト及びマウスｃＤＮＡが単離され、特徴付けされている［Loetscherら，Cell，61：351(1990)；Schallら，Cell，61：361(1990)；Smithら，Science，248：1019-1023(1990)；Lewisら，Proc．Natl．Acad．Sci.，88：2830-2834(1991)；Goodwinら，Mol．Cell．Biol.，11：3020-3026(1991)］。広範な多型性が、双方のＴＮＦレセプター遺伝子に関連している［例えば、Takaoら，Immunogenetics，37：199-203(1993)を参照］。双方のＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面のレセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される[Nophar，Yら，EMBO J.，9：3269(1990)；及びKohno，Tら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，87：8331(1990)］。組換え体可溶性ＴＮＦレセプターのクローニングはヘイル(Hale)らにより報告されている［J．Cell．Biochem． 増補15F，1991，p.113(P424)］。
【０００７】
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ2末端から出発して、１〜４とされる４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０のアミノ酸長のものであり、良好に保存された位置に４〜６のシステイン残基を含んでいる［Schallら，上掲；Loetscherら，上掲；Smithら，上掲；Nopharら，上掲；Kohnoら，上掲］。ＴＮＦＲ１において、４つのＣＲＤのおおよその境界は次の通りである：ＣＲＤ１−１４から約５３までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５４から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１３８までのアミノ酸；ＣＲＤ４−約１３９から約１６７までのアミノ酸。ＴＮＦＲ２において、ＣＲＤ１は、１７〜約５４までのアミノ酸を、ＣＲＤ２は約５５から約９７までのアミノ酸を；ＣＲＤ３は約９８から約１４０までのアミノ酸を；ＣＲＤ４は約１４１から約１７９までのアミノ酸を含む[Bannerら，Cell，73：431-435(1993)]。また、リガンド結合におけるＣＲＤの潜在的な役割は前掲のバナー(Banner)らにより記載されている。
【０００８】
ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnsonら，Cell，47：545(1986)；Radekeら，Nature，325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovicら，EMBO J.，8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Malletら，EMBO J.，9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yoneharaら，上掲、及びItohら，上掲］を含むいくつかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Uptonら，Virology，166：20-29(1987)；Smithら，Biochem．Biophys．Res．Commun.，176：335(1991)；Uptonら，Virology，184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研究では、このドメインにおけるＣＲＤ１の欠失［Welcher，A.A．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88：159-163(1991)］又はアミノ酸の挿入［Yan．H及びChao，M.V.，J．Biol．Chem.，266：12099-12104(1991)］は、ＮＧＦ結合にはほとんど又は全く影響を持たないことが示されている［Yan．H及びChao，M.V.，上掲］。ｐ７５ＮＧＦＲはＮＧＦ結合に関与せず、そのＣＲＤ４と膜貫通領域の間に約６０のアミノ酸のプロリンに富んだ伸長部を含む［Peetre，Cら，Eur．J．Hematol.、41：414-419(1988)；Seckinger，Pら，J．Biol．Chem.，264：11966-11973(1989)；Yan．H及びChao，M.V.，上掲］。同様のプロリンに富んだ領域はＴＮＦＲ２に見出されているが、ＴＮＦＲ１にはない。
【０００９】
イトーらは、アポ１レセプターが５５-ｋＤａのＴＮＦＲ１によりシグナル化されるものと同様のアポトーシス性細胞死をシグナル化し得ることを開示している［Itogら，上掲］。また、アポ１抗原の発現は、細胞をＴＮＦ-α又は抗アポ１のマウスモノクローナル抗体で処理した場合に、ＴＮＦＲ１のものと共にダウンレギュレーションされることが報告されている[Krammerら，上掲;Nagataら，上掲]。従って、アポ１及びＴＮＦＲ１レセプターの双方を同時発現する株化細胞が、共通のシグナル伝達経路を通して細胞死滅を媒介しているとの仮説を唱える研究者もいた［同］。
【００１０】
リンホトキシン-αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ-末端は細胞外にある。
これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのレセプター類はＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバーで同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、アポ１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク質分解的に切断され；各場合に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク質分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【００１１】
最近になって、哺乳動物のＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定されている。マースターズ(Marsters)ら、Curr．Biol.，6：750(1996)において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復についてＴＮＦＲファミリーに対して類似性を示し、細胞質デスドメイン配列を含む点でＴＮＦＲ１及びＣＤ９５に似ており、アポ３と称される、ヒトのポリペプチド天然配列の全長を開示している［Marstersら，Curr．Biol.，6：1669(1996)］。他の研究者に依れば、アポ３はＤＲ３、ｗｓｌ-１及びＴＲＡＭＰとも称されている［Chinnaiyanら，Science，274：990(1996)；Kitsonら，Nature，384：372(1996)；Bodmerら，Immunity，6：79(1997)］。
【００１２】
パンらは、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Panら，Science，276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞自殺器を活動させる細胞質デスドメインを含むと報告されている。パンらは、ＤＲ４がＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
【００１３】
アポトーシス誘導性シグナル伝達複合体
現在理解されているように、細胞死プログラムは、少なくとも３つの重要な成分−活性化因子、阻害剤及びエフェクターを含む；線虫(C．elegans)において、これらの成分はそれぞれ３つの遺伝子、Ｃｅｄ-４、Ｃｅｄ-９及びＣｅｄ-３によりコード化されている［Steller，Science，267：1445(1995)；Chinnaiyanら，Science，275：1122-1126(1997)］。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの２つ、ＴＮＦＲ１及びＦａｓ／Ａｐｏｌ(ＣＤ９５)は、アポトーシス性細胞死を活性化し得る［Chinnaiyan及びDixit，Current Biology，6:555-562(1996)；Fraser及びEvan，Cell，85：781-784(1996)］。また、ＴＮＦＲ１は転写因子、ＮＦ-κＢの活性化を媒介することも知られている［Tartagliaら，Cell，74：845-853(1993)；Hsuら，Cell，84：299-308(1996)］。ある程度のＥＣＤ相同性に加えて、これら２つのレセプターは、デスドメインとして知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン(ＩＣＤ)での相同性を共有する［Tartaglia，上掲；Nagata，Cell，88:355(1997)］。また、デスドメインはアポトーシスを調節するいくつかの後生動物タンパク質、すなわちＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１、ＴＲＡＤＤ及びＲＩＰと称されるショウジョウバエタンパク質、リーパー(Reaper)及び哺乳動物タンパク質中においても見出されている［Cleaveland及びIhle，Cell，81：479-482(1995)］。ラベンらは、酵母-二重ハイブリッド系を使用して、ＴＮＦＲ１デスドメインに結合するタンパク質ｗｓｌ-１の同定を報告している[Ravenら，Programmed Cell Death Meeting，9月 20-24，1995、127頁の要約；Ravenら，European Cytokine Network，7.：210頁の要約.82(1996年4-6月)］。ｗｓｌ-１タンパク質はＴＮＦＲ１に相同で(４８％の同一性)、制限的な組織分布を有すると記載されている。ラベン(Raven)らに依れば、ｗｓｌ−１の組織分布は、ＴＮＦＲ１結合タンパク質、ＴＲＡＤＤとは顕著に異なる。
【００１４】
リガンド結合及びレセプターのクラスター形成の際に、ＴＮＦＲ１とＣＤ９５は死誘導性シグナル伝達複合体にＦＡＤＤを補充するものと考えられている。
言われるところによれば、ＣＤ９５はＦＡＤＤに直接結合する一方、ＴＮＦＲＩはＴＲＡＤＤを介して間接的にＦＡＤＤに結合する［Chinnaiyanら，Cell，81：505-512(1995)；Boldinら，J．Biol．Chem.，270：387-391(1995)；Hsuら，上掲；Chinnaiyanら，J．Biol．Chem.，271：4961-4965(1996)］。ＦＡＤＤは、Ｃｅｄ-３-関連プロテアーゼ、ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥ(カスパーゼ８)を、死シグナル伝達複合体に補充するアダプターとなることが報告されている［Boldinら，Cell，85：803-815(1996)；Mizuoら，Cell，85：817-827(1996)］。ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥは、細胞死プログラムのいくつかの重要な側面を実施し得る、インターロイキン-１β変換酵素(ＩＣＥ)及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａを含むアポトーシス性プロテアーゼのカスケードを引き起こすトリガーであると思われる［Fraser及びEvan，上掲］。
【００１５】
プログラム細胞死が、線虫の細胞死遺伝子、ｃｅｄ−３、及び哺乳動物のＩＬ-１-変換酵素、ＩＣＥに関連したシステインプロテアーゼファミリーのメンバーの活性に関与していることが最近開示された。ＩＣＥ及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａプロテアーゼの活性は、牛痘ウイルス遺伝子、ｃｒｍＡの産物により阻害され得る［Rayら，Cell，69：597-604(1992)；Tewariら，Cell，81：801-809(1995)］。最近の研究では、ＣｒｍＡがＴＮＦＲ-及びＣＤ９５-誘導細胞死を阻害し得ることが示されている［Enariら，Nature，375：78-81(1995)；Tewarlら，J．Biol．Chem.，270：3255-3260(1995)］。
【００１６】
テワリ(Tewari)らにより最近レビューされているように、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２及びＣＤ４０は、転写因子、ＮＦ-κＢの活性化により、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する［Tewariら，Curr．Op．Genet．Develop.，6:39-44(1996)］。ＮＦ-κＢは、そのサブユニットが保存Ｒｅ１領域を含有する二量体転写因子のファミリーの原型である［Vermaら，Genes Develop.，9：2723-2735(1996)；Baldwin，Ann．Rev．Immunol.，14：649-681(1996)］。その潜伏形態において、ＮＦ-κＢはＩκＢ阻害剤ファミリーのメンバーと複合化しており;所定の刺激に反応してＩκＢの不活性化の際に、放出されたＮＦ-κＢが、特異的ＤＮＡ配列と結合する核に移行して遺伝子転写を活性化する。
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプターのレビューについては、上掲のグラス(Gruss)及びダゥアー(Dower)を参照されたい。
【００１７】
〔発明の要旨〕
本出願人は、本出願において「Ａｐｏ-２」と命名される新規ポリペプチドをコード化したｃＤＮＡクローンを同定した。Ａｐｏ-２はＴＮＦＲファミリーのメンバーであると信じられる：全長の天然配列ヒトＡｐｏ-２ポリペプチドは、細胞質デスドメイン領域を含むいくつかの既知のＴＮＦＲに対してある程度の類似性を示す。また、全長の天然配列ヒトＡｐｏ-２は、細胞外のシステインに富んだ反復部についてＴＮＦＲファミリーとの類似性を示す。Ａｐｏ-２ポリペプチドは、カスパーゼ(caspase)依存性アポトーシスを惹起しＮＦ-κＢを活性化し得ることが見出された。本出願人は、驚くべきことに、Ａｐｏ-２の可溶性細胞外ドメインがＡｐｏ-２リガンド(「Ａｐｏ-２Ｌ」)に結合し、Ａｐｏ-２リガンドの機能を阻害可能であることを見出した。現在、Ａｐｏ-２リガンドは、少なくとも２つの異なるレセプター、ＤＲ４とここに新たに記載したＡｐｏ-２を介してシグナル化可能であると考えられる。
【００１８】
一実施態様においては、本発明は、単離されたＡｐｏ-２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は、一実施態様においては図１の残基１〜４１１を含んでなるアミノ酸配列(配列番号：１)を含む、単離された天然配列Ａｐｏ-２ポリペプチドを提供する。他の実施態様においては、単離されたＡｐｏ-２ポリペプチドは、図１の残基１〜４１１(配列番号：１)を含んでなる天然配列Ａｐｏ-２ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。場合によっては、Ａｐｏ-２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ ２０９０２１として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコード化されたポリペプチドを発現することにより得られた又は得れうるものである。
【００１９】
他の実施態様において、本発明はＡｐｏ-２の単離された細胞外ドメイン(ＥＣＤ)配列を提供する。場合によっては、単離された細胞外ドメイン配列は図１のアミノ酸残基５４〜１８２(配列番号：１)を含んでなる。
他の実施態様において、本発明はＡｐｏ-２の単離されたデスドメイン配列を提供する。場合によっては、単離されたデスドメイン配列は図１のアミノ酸残基３２４〜３９１(配列番号：１)を含む。
【００２０】
他の実施態様において、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＡｐｏ-２ポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。このようなキメラ分子の例には、免疫グロブリン配列と融合したＡｐｏ-２が含まれる。他の例には、例えば免疫グロブリン配列のような、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＡｐｏ-２の細胞外ドメインが含まれる。
【００２１】
他の実施態様において、本発明はＡｐｏ-２ポリペプチドをコードしている単離核酸分子を提供する。一面において、核酸分子は、Ａｐｏ-２ポリペプチド又はＡｐｏ-２の特定のドメインをコード化したＲＮＡ又はＤＮＡであるか、又はこのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度、場合によっては高いストリンジェント条件下でそれに安定して結合したままである。このような相補的核酸はＲＮＡ又はＤＮＡの全長に対して完全に相補的であり得る。また相補的核酸はＲＮＡ又はＤＮＡヌクレオチド配列のフラグメントにのみ相補的であることも考えられる。一実施態様において、核酸配列は：
(ａ)残基１〜残基４１１をコードする図１の核酸配列(配列番号：２)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド１４０−１４２〜１３７０−１３７２)；
(ｂ)残基１〜残基１８２をコードする図１の核酸配列(配列番号：２)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド１４０−１４２〜６８３−６８５)；
(ｃ)残基５４〜残基１８２をコードする図１の核酸配列(配列番号：２)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド２９９−３０１〜６８３−６８５)；
(ｄ)残基３２４〜残基３９１をコードする図１の核酸配列(配列番号：２)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド１１０９−１１１１〜１３１０−１３１２）;又は、 (ｅ)遺伝コードの縮退の範囲内において(ａ)、(ｂ)、(ｃ)又は(ｄ)配列に相当する配列；
から選択される。単離された核酸には、Ａｐｏ-２ポリペプチドをコード化したヌクレオチド配列を含む、ＡＴＣＣ ２０９０２１として寄託されているベクターのＡｐｏ-２ポリペプチドｃＤＮＡ挿入断片が含まれ得る。
【００２２】
さらなる実施態様において、本発明はＡｐｏ-２ポリペプチド又は特定のＡｐｏ-２ドメインをコード化した核酸分子を含んでなるベクターを提供する。また、ベクター又は核酸分子を含有する宿主細胞も提供する。Ａｐｏ-２の生産方法もさらに提供する。
他の実施態様において、本発明はＡｐｏ-２に特異的に結合する抗体を提供する。抗体はアゴニスト、アンタゴニスト又は中和抗体であってよい。また、Ａｐｏ-２抗体を含有するホモ二量体分子等の二量体分子及び単鎖抗体も提供する。
他の実施態様において、本発明は非ヒト、トランスジェニック又はノックアウト動物を提供する。
本発明のさらなる実施態様では、Ａｐｏ-２又はＡｐｏ-２抗体を含む製造品及びキットが提供される。
【００２３】
さらなる実施形態において、本発明は以下のものも提供する：
１．  配列番号：１のアミノ酸残基１〜４１１を含んでなる天然配列Ａｐｏ-２ポリペプチドと、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離Ａｐｏ-２ポリペプチド。
２．  前記ポリペプチドが少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１に記載のＡｐｏ-２ポリペプチド。
３．  前記ポリペプチドが少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する請求項２に記載のＡｐｏ-２ポリペプチド。
４．  配列番号：１のアミノ酸残基１〜４１１を含んでなる単離Ａｐｏ-２ポリペプチド。
５．  配列番号：１のアミノ酸残基５４〜１８２を含んでなるＡｐｏ-２ポリペプチドの単離された細胞外ドメイン配列。
６．  配列番号：１のアミノ酸残基１〜１８２を含んでなる請求項５に記載の細胞外ドメイン配列。
７．  配列番号：１のアミノ酸残基３２４〜３９１を含んでなるＡｐｏ-２ポリペプチドの単離されたデスドメイン配列。
８．  異種性アミノ酸配列に融合した請求項５に記載の細胞外ドメイン配列又は請求項１に記載のＡｐｏ-２ポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
９．  前記異種性アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項８に記載のキメラ分子。
１０．  前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリン配列である請求項８に記載のキメラ分子。
１１．  前記免疫グロブリン配列がＩｇＧである請求項１０に記載のキメラ分子。
１２．  請求項１に記載のポリペプチド、請求項５に記載の細胞外ドメイン配列、又は請求項７に記載のデスドメイン配列をコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
１３．  前記ＤＮＡが配列番号：１のアミノ酸残基１〜４１１を含んでなるＡｐｏ-２ポリペプチドをコードする請求項１２に記載の核酸。
１４．  請求項１２に記載の核酸を含んでなるベクター。
１５．  ベクターで形質転換した宿主細胞により認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項１４に記載のベクター。
１６．  ＡＴＣＣ寄託受入番号２０９０２１を含んでなる請求項１４に記載のベクター。
１７．  請求項１４に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
１８．  ＣＨＯ細胞を含んでなる請求項１７に記載の宿主細胞。
１９．  大腸菌を含んでなる請求項１７に記載の宿主細胞。
２０．  酵母細胞を含んでなる請求項１７に記載の宿主細胞。
２１．  Ａｐｏ-２ポリペプチドの発現に十分な条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養し、培養物から発現したＡｐｏ-２ポリペプチドを回収することを含んでなるＡｐｏ-２ポリペプチドの生成方法。
２２．  ＡＴＣＣ寄託受入番号２０９０２１のｃＤＮＡ挿入物によりコードされたポリペプチドを発現させることにより得られた又は得られうるＡｐｏ-２ポリペプチド。
２３．  Ａｐｏ-２ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する細胞を含む非ヒト、トランスジェニック動物。
２４．  マウス又はラットである請求項２３に記載の動物。
２５．  Ａｐｏ-２ポリペプチドをコードする変更遺伝子を有する細胞を含む、非ヒト、ノックアウト動物。
２６．  マウス又はラットである請求項２５に記載の動物。
２７．  Ａｐｏ-２ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
２８．  モノクローナル抗体である請求項２７に記載の抗体。
２９．  アゴニスト抗体を含んでなる請求項２７に記載の抗体。
３０．  阻止抗体を含んでなる請求項２７に記載の抗体。
３１．  キメラ抗体を含んでなる請求項２４に記載の抗体。
３２．  前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項２８に記載の抗体。
３３．  前記抗体がＦａｂフラグメントを含んでなる請求項２８に記載の抗体。
３４．  前記抗体がｓｃＦｖフラグメントを含んでなる請求項２８に記載の抗体。
３５．  前記抗体がＦ(ａｂ')２フラグメントを含んでなる請求項２８に記載の抗体。
３６．  前記抗体がヒト抗体を含んでなる請求項２７に記載の抗体。
３７．  ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-１２４５６として寄託されているハイブリドーマ株化細胞により生成されるモノクローナル抗体の生物学的特徴を有している請求項２８に記載の抗体。
３８．  ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-１２４５６として寄託されているハイブリドーマ株化細胞により生成されるモノクローナル抗体に対するエピトープと同じエピトープに結合する請求項２８に記載の抗体。
３９．  請求項２８に記載の抗体を生成するハイブリドーマ株化細胞。
４０．   ＡＴＣＣ受入番号ＨＢ-１２４５６として寄託されているハイブリドーマ株化細胞。
４１．  ＡＴＣＣ受入番号ＨＢ-１２４５６として寄託されているハイブリドーマ株化細胞により生成されるモノクローナル抗体。
４２．  前記抗体が単鎖抗体である請求項２７に記載の抗体。
４３．  前記抗体が１６Ｅ２抗体を含んでなる請求項４２に記載の抗体。
４４．  前記抗体が２０Ｅ６抗体を含んでなる請求項４２に記載の抗体。
４５．  前記抗体が２４Ｃ４抗体を含んでなる請求項４２に記載の抗体。
４６．  前記抗体がエピトープタグ配列に融合している請求項４２に記載の抗体。
４７．  異種性アミノ酸配列に融合している請求項２７に記載の抗体を含んでなるキメラ分子。
４８．  前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリン配列を含んでなる請求項４７に記載のキメラ分子。
４９．  請求項２７に記載のＡｐｏ-２抗体と異種性抗体を含んでなるダイマー分子。
５０．  第１のＡｐｏ-２抗体と第２のＡｐｏ-２抗体を含んでなるホモダイマー分子。
５１．  請求項４３に記載のＡｐｏ-２抗体をコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
５２．  請求項４４に記載の抗体をコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
５３．  請求項４５に記載の抗体をコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
５４．  請求項５１、５２又は５３のいずれか１項に記載の核酸を含んでなるベクター。
５５．  請求項５４に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
５６．  ＤＮＡが発現する条件下で請求項５５に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる、Ａｐｏ-２抗体の生成方法。
５７．  請求項２７に記載の抗体と担体を含んでなる組成物。
５８．  前記キャリアが製薬的に許容可能な担体である請求項５７に記載の組成物。
５９．  請求項２９に記載のＡｐｏ-２アゴニスト抗体の有効量に哺乳動物の癌細胞を暴露させることを含んでなる、哺乳動物の癌細胞においてアポトーシスを誘導させる方法。
６０．  前記アゴニスト抗体が単鎖抗体を含んでなる請求項５９に記載の方法。
６１．  Ａｐｏ-２を活性化する薬剤に哺乳動物の癌細胞を暴露することを含んでなる哺乳動物の癌細胞を治療する方法。
６２．  前記薬剤がＡｐｏ-２アゴニスト抗体を含んでなる請求項６１に記載の方法。
６３．  容器と該容器に入れられる組成物を含んでなり、組成物がＡｐｏ-２ポリペプチド又はＡｐｏ-２抗体を含む製造品。
６４．  インビボ又はエキソビボにおいてＡｐｏ-２ポリペプチド又はＡｐｏ-２抗体を使用するための使用説明書をさらに含んでなる請求項６３に記載の製造品。
【００２４】
好適な実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
ここで使用される際の「Ａｐｏ-２ポリペプチド」及び「Ａｐｏ-２」という用語には、天然配列Ａｐｏ-２及びＡｐｏ-２変異体(ここでさらに定義される)が含まれる。これらの用語には、ヒトを含む種々の哺乳動物由来のＡｐｏ-２が含まれる。Ａｐｏ-２は種々の供給源、例えばヒト組織型又は他の供給源から単離されたもの、あるいは組換え又は合成法により調製されたものであってよい。
【００２５】
「天然配列Ａｐｏ-２」には、天然由来のＡｐｏ-２と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。しかして、天然配列Ａｐｏ-２は、任意の哺乳動物から自然に生じるＡｐｏ-２のアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列Ａｐｏ-２は、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列Ａｐｏ-２」という用語には、特に、Ａｐｏ-２の自然に生じる切断又は分泌形(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異体形(例えば、他のスプライス型)及びＡｐｏ-２の自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。Ａｐｏ-２の自然に生じる変異体形は、図１に示すアミノ酸配列(配列番号：１)において残基４１０でアミノ酸が置換されているＡｐｏ-２を含む。このような自然に生じる変異形の一実施態様では、４１０位のロイシン残基がメチオニン残基により置換されている。図１(配列番号：１)において、４１０位のアミノ酸残基は「Ｘａａ」として同定されており、アミノ酸が、場合によってはロイシンかメチオニンのいずれかであることを示している。図１(配列番号：２)において、１３６７位のヌクレオチドは「Ｗ」として同定されており、ヌクレオチドがアデニン(Ａ)かチミン(Ｔ)あるいはウラシル(Ｕ)のいずれかであることを示している。本発明の一実施態様において、天然配列Ａｐｏ-２は、図１(配列番号：１)のアミノ酸１〜４１１を含有する成熟又は全長天然配列Ａｐｏ-２である。場合によっては、Ａｐｏ-２は、ＡＴＣＣ ２０９０２１として寄託されているベクターのｃＤＮＡ挿入物によりコードされたポリペプチドを発現させることにより得られた又は得られ得るものである。
【００２６】
「Ａｐｏ-２細胞外ドメイン」すなわち「Ａｐｏ-２ＥＣＤ」は、Ａｐｏ-２の膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に有しないＡｐｏ-２の形態を意味する。通常、Ａｐｏ-２ＥＣＤは、膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満だけ有する。場合によっては、Ａｐｏ-２ＥＣＤは、図１(配列番号：１)のアミノ酸残基５４〜１８２又は図１(配列番号：１)のアミノ酸残基１〜１８２を含む。場合によっては、Ａｐｏ-２ＥＣＤは、一又は複数のシステインに富んだドメイン、好ましくはここで同定されたシステインに富んだドメインの一方又は両方(図２Ａを参照)を含有する。当業者であれば、ここでＡｐｏ-２ポリペプチドに対して同定された膜貫通ドメインは疎水性ドメインのそのタイプを同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、ここで特に記載するドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。
【００２７】
「Ａｐｏ-２変異体」とは、全長天然配列ヒトＡｐｏ-２に対して図１に示されている推定アミノ酸配列(配列番号：１)又はここでＡｐｏ-２ＥＣＤ又はデスドメインに対して同定された配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義する生物学的に活性なＡｐｏ-２を意味する。このようなＡｐｏ-２変異体には、例えば、図１の配列(配列番号：１)あるいはＡｐｏ-２ＥＣＤ又はデスドメインに対してここで同定された配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＡｐｏ-２ポリペプチドが含まれる。通常、Ａｐｏ-２変異体は、図１のアミノ酸配列(配列番号：１)又はここでＡｐｏ-２ＥＣＤ又はデスドメインに対して同定されている配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有している。
【００２８】
ここで同定されているＡｐｏ-２配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、Ａｐｏ-２配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばALIGNTM又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００２９】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＡｐｏ-２又はＡｐｏ-２抗体、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さはＡｐｏ-２又はＡｐｏ-２抗体の活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００３０】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、ポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど精製される。
Ａｐｏ-２の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３１】
「単離された」Ａｐｏ-２核酸分子は、同定され、Ａｐｏ-２核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。
単離されたＡｐｏ-２核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＡｐｏ-２核酸分子は、天然の細胞中に存在するＡｐｏ-２核酸細胞とは区別される。しかし、単離されたＡｐｏ-２核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるＡｐｏ-２を通常発現する細胞に含まれるＡｐｏ-２核酸分子を含む。
【００３２】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に関連付けられたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３３】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に関連付けられ」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に関連付けられている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に関連付けられている；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に関連付けられている。一般的に、「作用可能に関連付けられる」とは、関連付けられたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。
そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３４】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に抗Ａｐｏ-２モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び阻止又は中和抗体を含む)、及び多エピトープ特異性抗Ａｐｏ-２抗体組成物を包含している。
【００３５】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対応する。更に、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む通常の(ポリクローナル)抗体とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対応する。
ここで、モノクローナル抗体は、起源の種又は免疫グロブリンクラス又はサブクラスの命名に拘わらず、定常ドメインを有する抗Ａｐｏ-２抗体の可変(過剰可変を含む)ドメイン、又は重鎖を有する軽鎖、他の種由来の鎖を有するある種由来の鎖、あるいは異種タンパク質との融合体をスプライシングすることによって得られるハイブリッド及び組換え抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体断片(例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')2及びＦｖ)を特に含む。例えば、米国特許第４８１６５６７号、及Mageら，Monoclonal Antibody Productuon Techniques and Applications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.:ニューヨーク1987)を参照。
【００３６】
従って、「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler及びMilsteinによって、Nature，256:495(1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは例えば米国特許第４８１６５６７号に記載された組換えＤＮＡ法によって作ることができる。「モノクローナル抗体」は例えばMcCaffetyら，Nature，348：552-554(1990)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
【００３７】
「単鎖Ｆｖ」すなわち「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶH及びＶLドメインを含有し、これらのドメインはポリペプチド単鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗体結合のための所望の構造を形成できるように、ＶHとＶLドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含んでいる。ｓｃＦｖについてのレビューには、例えば、Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Mooreeds．Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)を参照されたい。本発明のｓｃＦｖ抗体フラグメントには、以下に詳細に記載する１６Ｅ２、２０Ｅ６及び２４Ｃ４抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明のｓｃＦｖ抗体の範囲内には、１６Ｅ２、２０Ｅ６及び２４Ｃ４抗体と同定された一又は複数のＣＤＲ領域を含むＶＨ及びＶＬドメインを含有するｓｃＦｖ抗体が含まれる。
【００３８】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそれらの断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ'）2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域又はドメインの少なくとも一部を含んでなる。
【００３９】
ここで意図している「生物学的に活性な」及び「所望の生物学的活性」とは、インビボ又はエキソビボで少なくとも１つの種類の哺乳動物細胞において(作用的又は刺激する形あるいは拮抗的すなわち阻止する形で)アポトーシスを変調する能力を有しているか;(２)Ａｐｏ-２リガンドに結合する能力を有しているか;又は(３)Ａｐｏ-２リガンドのシグナル伝達及びＡｐｏ-２リガンド活性を変調する能力を有していることを意味する。
【００４０】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この活性は、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析、又はＤＮＡ電気泳動法等、全て従来から知られている方法により決定し測定することができる。
【００４１】
ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」とは、治癒的療法及び予防的療法及び防護的療法を称する。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、神経芽腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頚部の癌が含まれる。
ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。本発明の好ましい実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
【００４２】
ＩＩ．本発明の組成物と方法
本発明は、新規に同定され、単離されたＡｐｏ-２ポリペプチド及びＡｐｏ-２抗体を提供する。特に本出願人は、種々のヒトＡｐｏ-２ポリペプチドを同定し、分離した。これらＡｐｏ-２ポリペプチド及び抗Ａｐｏ-２抗体のいくつかのものの性質と特徴は、以下の実施例においてさらに詳細に記載する。ここで開示されるＡｐｏ-２ポリペプチドの性質と特徴に基づき、Ａｐｏ-２はＴＮＦＲファミリーのメンバーであるというのが本出願人の信ずるところである。
【００４３】
Ａｐｏ-２、並びにＡｐｏ-２キメラ分子及び抗Ａｐｏ-２抗体を如何に調製するかにつき、以下に説明する。
Ａ．Ａｐｏ−２の調製
以下の説明は、主として、Ａｐｏ-２核酸を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を培養してＡｐｏ-２を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＡｐｏ-２を調製することはできると考えられる。
【００４４】
１．Ａｐｏ−２をコードするＤＮＡの単離
Ａｐｏ-２をコードするＤＮＡは、Ａｐｏ-２ｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＡｐｏ-２ＤＮＡは、実施例１に記載されたヒトの膵臓及び腎臓ｃＤＮＡのバクテリオファージライブラリのように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。
またＡｐｏ-２コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
【００４５】
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(Ａｐｏ-２に対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングされる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。Ａｐｏ-２をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ方法論を使用するものである［Sambrookら，上掲；Dieffenbachら,PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)］。
【００４６】
スクリーニングの好ましい方法は、種々のヒト組織からｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために選別したオリゴヌクレオチド配列を用いることである。以下の実施例１には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド化時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は、当該分野において良く知られており、32Ｐ標識されたＡＴＰのような放射標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高厳密性を含むハイブリッド化条件は、Sambrookら，上掲に提供されている。
【００４７】
全てのタンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらにより記述されている従来のプライマー伸長法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
Ａｐｏ-２変異体はＡｐｏ-２ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、所望のＡｐｏ-２ポリペプチドを合成することにより、調製することができる。
アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、膜係留特性の変更のように、Ａｐｏ-２の翻訳後過程を改変し得ることは当業者であれば理解されることである。
【００４８】
ここで記載されている天然全長配列Ａｐｏ-２又はＡｐｏ-２の種々のドメインにおける変異は、例えば米国特許第５３６４９３４号に記載された保存的あるいは非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して発生させることができる。変異は、Ａｐｏ-２をコードしている一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であり、天然配列Ａｐｏ-２に対してＡｐｏ-２のアミノ酸配列に変化が生じている。場合によっては、変異は、Ａｐｏ-２分子の一又は複数のドメインにおいて、少なくとも１つのアミノ酸を任意の他のアミノ酸に置換することによりなされる。変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発のような、当該分野において既知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異誘発［Carterら，Nucl．Acids．Res.，13：4331(1986)；Zollerら，Nucl．Acids．Res.，10：6487(1987)］、カセット突然変異［Wellsら，Gene，34：315(1985)］、制限選択的突然変異誘発［Wellら，Philos．Trans．R．Soc．London．SerA，317：415(1986)］又は他の既知の技術をクローンＤＮＡに実施してＡｐｏ-２変異体のＤＮＡを生産することができる。
【００４９】
また、特定のリガンド又はレセプターとの相互作用に関与する、近接配列に沿った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使用することもできる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越えた側鎖が除去されるため、アラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングアミノ酸である。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることも好ましい。さらに、アラニンは埋設及び露出位置の双方に頻繁に見出される［Creighton，The Proteins，(W.H．Freeman & Co.，N.Y.)；Chothla，Ｊ．Mol．Biol.，150：1(1976)］。
アラニン置換により適切な量の変異体を生じない場合には、アイソテリックアミノ酸を使用することができる。
【００５０】
一度選択されたＡｐｏ-２変異体が生産されると、それらを、例えばＡｐｏ-２Ｌと接触させることができ、相互作用があれば測定することができる。Ａｐｏ-２変異体とＡｐｏ-２Ｌとの相互作用は、例えば以下の実施例に記載したようなインビトロアッセイにより測定することができる。天然配列Ａｐｏ-２とＡｐｏ-２変異体の活性と性質を比較するため任意の数の分析的測定法を使用することができ、結合性に対して簡便なものは、天然配列Ａｐｏ-２の解離定数Ｋdと比較したＡｐｏ-２変異体とＡｐｏ-２Ｌとの間に形成された複合体の解離定数Ｋdである。一般に置換残基当り≧３倍Ｋdが増加又は減少すると、置換残基がＡｐｏ-２Ｌとの天然配列Ａｐｏ-２の相互作用において活性であることになる。
場合によっては、突然変異に好適なＡｐｏ-２配列中の代表的な部位には、細胞外ドメイン、特にシステインに富んだドメインの一方又は両方の範囲内の部位が含まれる。このような変異は上述の方法を使用することにより達成される。
【００５１】
２． 複製可能なベクターへの核酸の挿入
Ａｐｏ-２をコードした核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、さらなるクローニング又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる:シグナル配列、複製開始点、一つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
【００５２】
（ｉ）シグナル配列成分
Ａｐｏ-２は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ぺプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＡｐｏ-２ＤＮＡの一部である。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。シグナル配列は、例えばアルカリンホスファターゼ、ぺニシリナーゼ、１ｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＨリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスファターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP 362,179)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際特許第ＷＯ９０／１３６４６号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、における天然配列Ａｐｏ-２プレ配列の発現においては、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、単純ヘルペスグリコタンパク質Ｄシグナルのようなウイルス分泌リーダーのような他の哺乳動物のシグナル配列がタンパク質の直接分泌に使用されるが、インビボにおけるヒト細胞の細胞膜へのＡｐｏ-２の挿入を通常指示する天然Ａｐｏ-２プレ配列が十分である。
このような前駆体領域のＤＮＡは、好ましくは、Ａｐｏ-２をコードするＤＮＡにリーディングフレームが結合される。
【００５３】
(ｉｉ)複製開始点成分
発現とクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(SV40開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる)。
【００５４】
多くの発現ベクターは「シャトル」ベクターである、すなわち、それらは少なくとも一つのクラスの生物において複製可能であるが、発現のために他の生物に形質移入され得る。例えば、大腸菌においてベクターがクローン化され、そのベクターが酵母あるいは哺乳動物細胞に形質移入され、宿主細胞染色体と独立して複製することはできないとしても、発現する。
ＤＮＡは宿主ゲノムに挿入することによって増殖され得る。これは、例えばベクターにバシラスゲノムＤＮＡに見られる配列と相補的なＤＮＡ配列を含めることにより、宿主としてバシラス(Bacillus)種を用いて容易に達成される。このベクターを用いたバシラスの形質移入は、ゲノムとの相同的組換え及びＡｐｏ-２ＤＮＡの挿入をもたらす。しかし、Ａｐｏ-２をコードするゲノムＤＮＡの回収は、Ａｐｏ-２ＤＮＡを切除するのに制限酵母による消化を必要とするために、外来的に複製したベクターの場合よりも複雑である。
【００５５】
(ｉｉｉ)選択ゲノム成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択的マーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択的培地で増殖させた形質転換宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターと共に形質転換していない宿主細胞は培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、(c)例えばバシリ(Bacilli)に対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【００５６】
選択技術の一例においては、宿主細胞の増殖を抑止する薬品が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、抗薬品性を付与し、選択工程を生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、ネオマイシン［southernら，J．Molec．Appl．Genet.，1：327(1982)］、ミコフェノール酸［Mulliganら，Science，209：1422(1980)］又はハイグロマイシン［Sugdenら，Mol．Cell．Biol.，5：410-413(1985)］が使用される。上述した３つの例は、真核生物のコントロール下で細菌遺伝子を用いて、適切な薬品Ｇ４１８又はネオマイシン(ジェネテシン)、ｘｇｐｔ(ミコフェノール酸)、又はハイグロマイシンにそれぞれ耐性を付与する。
【００５７】
哺乳動物の細胞に適切な選択的マーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、Ａｐｏ-２核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるものである。哺乳動物細胞の形質転換細胞は、マーカーを捕捉することによって当該形質転換細胞のみが生存できるような独特に適応化された淘汰圧下に置かれる。淘汰圧は、培地中の選択剤の濃度が次第に変化する条件下で形質転換細胞を培養することにより課し、選択遺伝子とＡｐｏ-２をコードするＤＮＡの双方を増幅させる。増幅は、増殖に重要なタンパク質の生産に対する要求度が高い遺伝子が、組換え細胞の後の世代の染色体内に直列に反復されるプロセスである。増幅されたＤＮＡから増大したＡｐｏ-２量が合成される。増幅可能な遺伝子のほかの例には、メタロチオネインＩ及びＩＩ、アデノシンデアミナーゼ、及びオルニチンデカルボキシラーゼが含まれる。
【００５８】
ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaubほかにより，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77:7216(1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。形質転換した細胞は次に濃度の高いメトトレキセートに接触させる。これによりＤＨＦＲ遺伝子の複数コピーが合成され、同時に、Ａｐｏ-２をコードするＤＮＡのような発現ベクターを含む他のＤＮＡの複数コピーが作られる。この増幅方法は、もしＭｔｘに高度に耐性である変異体ＤＨＦＲ遺伝子が使用されたような場合には内在性ＤＨＦＲの存在にかかわらず、任意の他の適切な宿主、例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１ＣＨＯ−Ｋ１を使用することができる(EP117,060)。
【００５９】
あるいは、Ａｐｏ-２をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択的マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を有する培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照。
【００６０】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら，Nature，282:39(1979)；Kingmanら，Gene，7：141(1979)；Tschemperら，Gene，10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ−１のようなトリプトファン内で増殖する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones，Genetics，85:12(1977)］。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出する有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥を有する酵母株(ATCC 20,622あるいは38,626)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる［Bianchiほか.，Curr．Genet.，12:185(1987)］。より最近では、組換え子ウシのキモシンの大量生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている［Van den Berg，Bio/Technology，8:135(1990)］。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている[Fleerほか.，Bio/Technology，9:968-975(1991)]。
【００６１】
(ｉｖ)プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ａｐｏ-２核酸に作用可能に結びついているプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合しているＡｐｏ-２核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺伝子(一般的に約１００ないし１０００ｂｐ)の開始コドンの上流側(５')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘導的なクラス及び構成的なクラスの２つのクラスに属する。誘導的なプロモーターは、養分の存在あるいは不存在、温度変化等の培養条件の変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを排除し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Ａｐｏ-２をコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然のＡｐｏ-２プロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれもＡｐｏ-２ＤＮＡの直接増幅及び／又は発現に用いることができる。
【００６２】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahngほか.，Nature，275:615(1978)，Goeddelほか.，Nature，281:544(1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel，Nucleic Acids Res.，8:4057(1980);EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む［deBoerほか.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，80:21-25(1983)］。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、よって当業者は、任意の所望の制限部位を提供するためにリンカーあるいはアダプターを使用することでＡｐｏ-２をコードするＤＮＡ［Siebenlistほか.，Cell，20:269(1980)］にそれらを作用可能に結合させることが可能である。細菌系で使用するプロモーターもまたＡｐｏ-２をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【００６３】
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位から２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｘが任意のヌクレオチドであるＣＸＣＡＡＴ領域である。
大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端にポリＡ尾部が付加されていることを示すシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００６４】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzemanほか，J．Biol．Chem.，255:2073(1980)]又は他の糖分解酵素［Hessほか，J．Adv．Enzyme Reg.，7:149(1968)；Holland，Biochemistry，17．:4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００６５】
他の酵母プロモーターとしては、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘導的プロモーターであり、アルコールデヒドロキナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００６６】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＡｐｏ-２転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーター、そしてＡｐｏ-２配列に通常付随するプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
【００６７】
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をさらに含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる［Fiersほか，Nature，273:113(1978);Mulligan及びBerg，Science，209:1422-1427(1980);Pavlakisほか，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78:7398-7402(1981)］。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる［Greenawayほか，Gene，18:355-360(1982)］。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の修飾は米国特許第４６０１９７８号に開示されている［また、サルの細胞での免疫インターフェロンをコードしているｃＤＮＡの発現について、Grayら，Nature，295：503-508(1982)を；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyesら，Nature，297：598-601(1982)を；培養されたマウス及びウサギの細胞におけるヒトインターフェロン遺伝子の発現について、Canaani及びBerg，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79：5166-5170(1982)を；
プロモーターとしてラウス肉腫ウィルスの長い末端反復配列を用いたＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、及びマウスＮＩＨ-３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現について、Gormanほか，Proc．Natl．Acas．Sci．USA，79:6777-6781(1982)を参照のこと］。
【００６８】
(ｖ)エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明のＡｐｏ-２をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００ｂｐで、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。エンハンサーは、相対的に方向及び位置に独立しており、転写ユニットの５'［Laiminsほか，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78:993(1981)］及び３'［Luskyほか，Mol．Cell Bio.，3:1108(1983)］、イントロン内部［Banerjiほか，Cell，33:729(1983)］並びにコード配列自身の内部［Osbornほか，Mol．Cell Bio.，4:1293(1984)］に見出されている。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(ｂｐ１００-２７０)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv，Nature，297:17-18(1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、Ａｐｏ-２コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００６９】
(ｖｉ)転写終止成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終止及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、Ａｐｏ-２をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【００７０】
(ｖｉｉ)ベクターの組立てと分析
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの組立てには標準的なライゲーション技術を用いる。分離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
組立てられたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ATCC 31446)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又はMessingほか，Nucleic Acids Res.，9:309（1981）の方法又はMaximほか，Methods in Enzymology，65:499(1980)の方法によって配列決定する。
【００７１】
(ｖｉｉｉ)一過性発現ベクター
Ａｐｏ-２をコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む[Sambrookほか，上掲]。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、Ａｐｏ-２変異体を同定する目的のために特に有用である。
【００７２】
(ｉｘ)適切な例示的脊椎動物細胞ベクター
組換え脊椎動物細胞培養でのＡｐｏ-２の合成に適応するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingほか，Nature，293:620-625(1981);Manteiほか，Nature，281:40-46(1979);欧州特許第１１７０６０号;及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【００７３】
３．宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は上述の高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリシアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開されたDD 266,710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。
【００７４】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Ａｐｏ-２をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能で有用である。
【００７５】
グリコシル化Ａｐｏ-２の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は、複雑なプロセシング及びグリコシル化活動が可能である。原則的には、脊椎動物であろうと無脊椎動物培養であろうと、任意のより高等の真核生物細胞培養が使用できる。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトウス(蚊)、ドウロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている［例えば、Luckowほか，Bio/Technology，6:47-55(1988);Millerほか，Genetic Engineering，Setlowほか，eds.，Vol．8(Plenum Publishing，1986)，pp.277-279;及びMaedaほか，Nature，31，5:592-594(1985)を参照のこと］。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体とボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ−５株が公に利用できる。
【００７６】
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスのある菌株と共にインキュベートすることによってトランスフェクトされる。A．トウメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、Ａｐｏ-２をコードしているＤＮＡが、植物細胞宿主がトランスフェクトされるようにその植物細胞宿主に移され、そして適切な条件下でＡｐｏ-２をコードしているＤＮＡを発現させる。加えて、例えば、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞と適合しうる調節及びシグナル配列が利用できる[Depickerほか，J．Mol．Appl．Gen.，1:561(1982)]。また、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡを含む植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化又は増強しうる［1989年6月21日公開のEP 321,196］。
【００７７】
培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は、当該分野おいてよく知られている［例えば、Tissue Culture，Academic Press,編者Kruse and Patterson(1973)を参照のこと］。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株(COS-7，ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎臓株[293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamほか，J．Gen Virol.，36:59(1977)]；ハムスター乳児腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)：チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ(CHO，Urlaub及びChasin，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77:4216(1980)］；マウスのセルトリ細胞［TM4，Mather，Biol．Reprod.，23:243-251(1980)］；サルの腎細胞(CVI ATCC CCL 70);アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL2);イヌ腎細胞(MDCK，ATCC CCL34);バッファローラット肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138，ATCC CCL75);ヒト肝細胞(Hep G2，HB 8065);マウス乳房腫瘍細胞(MMT 060562，ATTC CCL51);TRI細胞[Motherほか，Annals N.Y．Acad．Sci.，383:44-68(1982)]；MRC５細胞;FS4細胞である。
【００７８】
宿主細胞をトランスフェクトし、そして好ましくは上述のＡｐｏ-２生成のための発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された常套的栄養培地で培養する。
トランスフェクションは、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り上げを意味する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、ＣａＰＯ4及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
【００７９】
形質転換は、染色体外のエレメントとしてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように、生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookほかにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawほか，Gene，23:315(1983)及び1989年6月29日公開の国際特許第８９／０５８５９号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、1991年1月10日に公開された国際特許第９１／００３５８号に記載されているように、超音波処理を用いて植物にトランスフェクトすることもできる。
【００８０】
このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb，Virology，52:456-457(1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van solingenほか，J．Bact.，130:946(1977)及びHsiaoほか，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，76:3829(1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合も又用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownほか，Methods in Enzymology，185:527-537(1990)及びMansourほか，Nature，336:348-352(1988)を参照のこと。
【００８１】
４． 宿主細胞の培養
本発明のＡｐｏ-２ポリペプチドを生成るために用いられる原核細胞は、前掲のSambrookほかにより記載されているような適切な培地で培養される。
Ａｐｏ-２の生産に用いられる哺乳動物の宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地(「MEM」，Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」Sigma)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物と定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質も又当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００８２】
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnologv:a Practical Approach，M．Butler編(IRL Press，1991)に見出すことができる。
この明細書において言及される宿主細胞は培養中の細胞並びに宿主動物内にある細胞を包含する。
【００８３】
５． 遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77,:5201-5205(1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に32Ｐである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドもまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性ヌクレオチド、蛍光剤又は酵素等のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位として作用する。また、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【００８４】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、又はルミネサンス標識である。
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列Ａｐｏ-２ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＡｐｏ-２ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００８５】
６． Ａｐｏ−２ポリペプチドの精製
Ａｐｏ-２は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。Ａｐｏ-２が膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて膜から引き離すか、又はその細胞外ドメインを酵素的に切断して引き離すことができる。
Ａｐｏ-２がヒト起源以外の組換え細胞でつくられるときは、Ａｐｏ-２はヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含んでいない。しかしながら、Ａｐｏ-２に関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又はポリペプチドからＡｐｏ-２を精製することが望ましい。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Ａｐｏ-２を、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；及びＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
【００８６】
残基が欠失され、挿入され、又は置換されたＡｐｏ-２変異体は、その変異によってしばしば惹起された実質的な性質変化を考慮に入れて、天然配列Ａｐｏ-２と同じようにして回収することができる。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原、免疫グロブリン配列、又はレセプター配列とＡｐｏ-２との融合体の調製は精製を容易にする；配列に対する抗体を含む免疫アフィニティーカラムを、融合ポリペプチドを吸着するために使用することができる。他の種類のアフィニティーマトリックスもまた使用することもできる。
例えばフェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の増殖を防止するために抗生物質を含めることができる。天然配列Ａｐｏ-２に適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるＡｐｏ-２又はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれば分かるであろう。
【００８７】
７． Ａｐｏ−２ポリペプチドの共有結合的修飾
Ａｐｏ-２の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。Ａｐｏ-２の共有結合的修飾の一つの型は、Ａｐｏ-２の標的アミノ酸残基を、Ａｐｏ-２のＮ末端又はＣ末端残基、又は選択された側鎖と反応できる有機誘導体化剤と反応させることによって分子内に導入することができる。
【００８８】
二官能性試薬による誘導体形成は、抗Ａｐｏ-２抗体を精製する方法に使用する水不溶性支持体マトリックス又は表面へのＡｐｏ-２の架橋に有用であり、またその逆も同様である。二官能性試薬による誘導体形成は、Ａｐｏ-２分子を架橋させてＡｐｏ-２二量体を産生するのにも有用である。このような二量体により結合アビディティーが増大させられ、インビボにおける分子の半減期が延びる。通常使用される架橋剤には、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４-アジドサリチル酸とのエステル、３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを包含するホモ二官能性イミドエステル、及びビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタンのような二官能性マレイミドが含まれる。メチル-３-［(ｐ-アジドフェニル)ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生じる。また、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性の水不溶性マトリックス及び米国特許第３９６９２８７号；３６９１０１６号；４１９５１２８号；４２４７６４２号；４２２９５３７号及び４３３０４４０号に記載されている反応性基質がタンパク固定に用いられる。
【００８９】
その他の修飾は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化［T.E．Creighton，Proteins:Structure and Molecular Properties，W.H．Freeman & Co.，San Francisco，PP.79-86(1983)］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。残基の修飾型も本発明の範囲に入る。
本発明の範囲内に含まれるＡｐｏ-２ポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列Ａｐｏ-２に見出される一又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は天然配列Ａｐｏ-２に存在しない一又は複数のグリコシル化部位を付加することを意味することをここでは意図している。
【００９０】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。アスパラギン-ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)というトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、可能性の有るグリコシル化部位が作り出される。
Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシルアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられるが)に、糖類Ｎ-アセチルガラクトーサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味する。
【００９１】
Ａｐｏ-２ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって達成される。この変化は、天然配列Ａｐｏ-２ヘの一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。場合によっては、Ａｐｏ-２アミノ酸はＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳するコドンが産生されるように予め選んだ塩基でＡｐｏ-２ポリペプチドをコードしているＤＮＡを突然変異することによって変更される。このＤＮＡ突然変異は、上記に記載され前掲の米国特許第５３６４９３４号に記載された方法を用いてなされる。
【００９２】
Ａｐｏ-２ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、該ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。用いられる結合様式に応じて、糖(類)は、(ａ)アルギニンとヒスチジンに、(ｂ)遊離のカルボキシル基に、(ｃ)遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、(ｄ)セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基に、(ｅ)フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は(ｆ)グルタミンのアミノ基に結合される。これらの方法は１９８７年９月１１日公開の国際特許第ＷＯ８７／０５３３０号及びAplin及びWriston，CRC Crit．Rev．Biochem.，pp259-306(1981)に記載されている。
【００９３】
Ａｐｏ-２ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的あるいはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異的置換によりなされる。例えば、化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価な化合物へ該ポリペプチドを曝露し、該ポリペプチドを無傷のまま残しながら、結合糖(Ｎ-アセチルグルコサミン又はＮ-アセチルガラクトサミン)を除く殆ど又は全ての糖を開裂させる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddinほか，Arch．Biochem Biophys.，259:52(1987)及びEdgeほか，Anal．Biochem.，118:131(1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakuraほか，Meth．Enzymol.，138:350(1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを使用して達成することができる。
【００９４】
潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Duskinほか，J．Biol．Chem.，257:3105(1982)によって記載されているように、化合物ツニカマイシンを使用して防ぐことができる。ツニカマイシンはタンパク質-Ｎ-グルコシド結合の形成を阻害する。
Ａｐｏ-２の共有結合的修飾の他のタイプは、米国特許番第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載されているように、Ａｐｏ-２ポリペプチドを、種々の非タンパク性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンに結合させることを含む。
【００９５】
８． Ａｐｏ-２キメラ
また本発明は、他の異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＡｐｏ-２を含むキメラ分子を提供する。
一実施態様では、キメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープを提供するタグポリペプチドとのＡｐｏ-２の融合体を含む。エピトープタグは一般にＡｐｏ-２のアミノ又はカルボキシル末端に位置させられる。Ａｐｏ-２のこのようなエピトープタグが付けられた形は、その存在をタグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグを供給すると、Ａｐｏ-２を抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の種類のアフィニティーマトリックスを用いたアフィニティー精製によって直ぐに精製することができる。
【００９６】
タグポリペプチドとその各抗体は従来から良く知られている。例には、ｆｌｕＨＡタグポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５［Fieldほか，Mol．Cell．Biol.，8:2159-2165(1988)］；ｃ-ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evanほか，Molecular and Cellular Biology，5:361O-3616(1985)］；及び単純ヘルペスウィルス糖タンパクＤ(ｇＤ)タグとその抗体［Paborskyほか，Protein Engineering，3(6):547-553(1990)］が含まれる。他のタグポリペプチドには、フラッグ-ペプチド(Flag-peptide)［Hoppほか，BioTechnology，6:1204-1210(1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martinほか，Science，255:192-194(1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinnerほか，J．Biol．Chem.，266:15163-15166(1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパクペプチドタグ［Lutz-Freyermuthほか，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:6393-6397(1990)］が含まれる。ひとたびタグポリペプチドが選択されれば、それに対する抗体を、ここに開示した方法を用いて産生することができる。
【００９７】
一般的に、エピトープタグＡｐｏ-２は、上述した方法に従い作成され生産される。エピトープタグＡｐｏ-２は以下の実施例においてもまた記載されている。Ａｐｏ-２タグポリペプチド融合体は、Ａｐｏ-２タンパク質をインフレームでコードしているｃＤＮＡ配列をタグポリペプチドＤＮＡ配列に融合させ、得られたＤＮＡ融合作成物を適当な宿主細胞に発現させることによって好ましく作成される。通常は、本発明のＡｐｏ-２タグポリペプチドキメラを調製するときは、Ａｐｏ-２をコードしている核酸を、タグポリペプチドのＮ末端をコードしている核酸にその３'末端で融合させるが、５'融合もまた可能である。例えば、約５〜約１０のヒスチジン残基を有するポリヒスチジン配列はＮ末端又はＣ末端で融合され、アフィニティークロマトグラフィーにおける精製ハンドルとして使用される。
エピトープタグＡｐｏ-２は、抗タグ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。アフィニティー抗体が付着されるマトリックスには、例えばアガロース、調製穴明きガラス又はポリ(スチレンジビニル)ベンゼンが含まれる。ついで、エピトープタグＡｐｏ-２は、当該分野において知られた技術を使用して、アフィニティーカラムから溶出される。
【００９８】
他の実施態様において、キメラ分子は免疫グロブリン配列と融合したＡｐｏ-２ポリペプチドを含む。キメラ分子は、また特定のＡｐｏ-２ドメイン配列、例えば免疫グロブリン配列と融合したＡｐｏ-２の細胞外ドメイン配列も含む。これには、モノマー、又はホモ-又はヘテロ-マルチマー、そして特にはホモ-又はヘテロダイマー又は-テトラマー型のものが含まれ；場合によっては、キメラはダイマー型又はホモダイマー重鎖型であり得る。一般的に、これらの構築免疫グロブリンは以下の図に示されるような既知の単位構造を有している。
【００９９】
2010075184.tif 000002
2010075184.tif 000003
2010075184.tif 000004
2010075184.tif 000005
【０１００】
基本的な４鎖の構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する型である。４鎖の単位がより大なる高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭが一般にジスルフィド結合によって一緒になった基本的な４鎖単位のペンタマーとして存在する。ＩｇＡグロブリン、そして時折ＩｇＧグロブリンはまた血清中にマルチマー型で存在する。マルチマーの場合は、各４鎖単位は同一であるか異なっている。
次の図は、いくつかの例示的なモノマー、ホモ-及びヘテロダイマー及びホモ-及びヘテロマルチマー構造を示している。これらの図は単に例証するためのものであって、マルチマーの鎖は、天然免疫グロブリンと同様にジスルフィド結合していると考えられる。
【０１０１】
モノマー：
2010075184.tif 000006
ホモダイマー：
2010075184.tif 000007
ヘテロダイマー：
2010075184.tif 000008
ホモテトラマー：
2010075184.tif 000009
ヘテロテトラマー：
2010075184.tif 000010
及び
2010075184.tif 000011
【０１０２】
上図において、「Ａ」はＡｐｏ-２配列又は異種性配列に融合したＡｐｏ-２配列を意味する；Ｘは、Ａと同一でも異なっていてもよい付加的な薬剤、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの一部で、例えば天然又はキメラ免疫グロブリン可変領域を含む可変領域又は可変領域様ドメイン、例えばシュードモナス外毒素又はリシンのような毒素、又は他のサイトカイン(すなわち、IL-1、インターフェロン-γ)又は細胞表面分子(すなわち、NGFR、CD40、OX40、Fas抗原、ショープ及び粘液腫ポックスウィルスのT2タンパク質)のような他のタンパク質に機能的に結合している配列、又は定常ドメインと通常は結合していないポリペプチド治療剤である；Ｙはリンカー又は他のレセプター配列である；ＶL、ＶH、ＣL及びＣHは免疫グロブリンの軽又は重鎖の可変又は定常ドメインを表す。「Ａ」として少なくとも１つのＡｐｏ-２配列のＣＲＤと、「Ｘ」としてＣＲＤの反復性パターンを有する他の細胞表面タンパク質とを含む構造体が特に含まれる。
【０１０３】
上図は、単に本発明の可能性のあるキメラ構造を例証したものであって、全ての可能性を包括するものではない。例えば、これらの構築のいずれにおいても、望ましくはいくつかの異なった「Ａ」、「Ｘ」又は「Ｙ」があるかもしれない。また、重又は軽鎖定常ドメインは、同一又は異なる免疫グロブリンから由来したものであってもよい。図示された類似の構造のあらゆる可能な組合わせは全て本発明の範囲に入る。
【０１０４】
一般的にキメラ分子は、ある種の抗体からの可変ドメインが他の種の可変ドメインで置換されたキメラ抗体と同様にして作成することができる。例えば、EP 0 125 023；EP 173,494；Munro，Nature，312：597(1984年12月13日)；Neubergerら，Nature，312：604-608(1984年12月13日)；Sharonら，Nature，309：364-367(1984年5月24日)；Morrisonら，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA，81：6851-6855(1984)；Morrisonら，Science，229：1202-1207(1985)；Boulianneら，Nature，312：643-646(1984年12月13日)；Caponら，Nature，337：525-531(1989)；Trauneckerら，Nature，339：68-70(1989)を参照のこと。
【０１０５】
あるいは、キメラ分子は以下のようにして作製することができる。所望の配列、例えばＡｐｏ-２及び／又はＴＮＦＲ配列をコードする領域を含むＤＮＡを、免疫グロブリン様ドメインをコードするドメインの３'末端又はその近傍で、及びＡｐｏ-２又はＴＮＦＲポリペプチドのＮ-末端をコードするＤＮＡもしくはその近傍の点(異なるリーダーの使用が想定される)で、又はＴＮＦＲのＮ末端コード領域もしくはその近傍(そこでは天然シグナルが使用される)で、制限酵素により開裂させる。ついで、このＤＮＡ断片を免疫グロブリン軽又は重鎖定常ドメインをコードするＤＮＡの近傍に直ちに挿入し、必要ならば、得られた作成体を欠失変異誘発により整える。好ましくは、キメラ分子がヒトに対するインビボ治療法を意図したものである場合、Ｉｇはヒト免疫グロブリンである。免疫グロブリン軽又は重鎖定常領域をコードするＤＮＡは既知であるか、ｃＤＮＡライブラリから直ぐに入手できるか合成される。例えば、Adamsら，Biochemistry，19：2711-2719(1980)；Goughら，Biochemistry，19：2702-2710(1980)；Dolbyら，Proc．Natl．Acad．Sci.．USA，77：6027-6031(1980)；Riceら，Proc．Natl．Acad．Sci.，79：7862-7865(1982)；Falknerら，Nature，298：286-288(1982)；及びMorrisonら，Ann．Rev．Immunol.，2：239-256(1984)を参照のこと。
【０１０６】
このような融合体の調製方法のさらなる詳細は、イムノアドヘシンの調製に関する刊行物に見出される。イムノアドヘシン一般、及び特にＣＤ４-Ｉｇ融合分子は、１９８９年４月６日に公開された国際特許第ＷＯ８９／０２９２２号に開示されている。ＩｇＧ重鎖定常領域に結合している、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)のレセプター、ＣＤ４の細胞外部分を含む分子は当該分野において知られており、ＣＤ４の可溶性細胞外部分よりも著しく長い半減期とより低いクリアランスを有することが見出された［Caponら，上掲；Byrnら，Nature，344：667(1990)］。また、特異的キメラＴＮＦＲ-ＩｇＧ分子の作成が、Ashkenaziら，Proc．Natl．Acad．Sci.，88：10535-10539(1991),；Lesslauerら，［J．Cell．Biochem．Supplement 15F，1991，p.115(P432)］；及びPeppelとBeutler，J．Cell．Biochem．Supplement 15F，1991，p.118(P439)］に記載されている。
【０１０７】
Ｂ．Ａｐｏ-２の治療的又は非治療的用途
本明細書に開示されているように、Ａｐｏ-２は、治療的に使用することが可能で、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する。この治療法は、例えばインビボ又はエキソビボの遺伝子療法を使用することによりなすことができ、ここで開示しているデスドメイン配列の使用を含む。また、免疫グロブリン配列を含むＡｐｏ-２キメラ分子（Ａｐｏ-２の細胞外ドメイン配列を含むキメラ分子を含む)も治療的に使用することができ、Ａｐｏ-２Ｌ又はＡｐｏ-２が結合する他のリガンドによりアポトーシス又はＮＦ-κＢ誘導を阻害する。
また、本発明のＡｐｏ-２は非治療的用途においても有用性を有している。Ａｐｏ-２をコードしている核酸配列を、組織特異性の分類のための診断に使用することもできる。例えば、インサイツハイブリダイゼーション、ノーザン及びサザンブロット法、及びＰＣＲ分析のような手順を、Ａｐｏ-２をコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡが評価されている細胞型中に存在しているか否かを決定するために使用することができる。Ａｐｏ-２核酸は、ここに記載されている組換え技術によるＡｐｏ-２の調製にもまた有用である。
【０１０８】
単離されたＡｐｏ-２は、未知量のＡｐｏ-２を含有するサンプルが調製された対照として、定量的診断アッセイに使用され得る。またＡｐｏ-２調製物は、抗体を産生する際、Ａｐｏ-２に対するアッセイにおける標準として(例えば、ラジオイムノアッセイ、ラジオレセプターアッセイ又は酵素結合免疫測定法における標準としての使用のためにＡｐｏ-２を標識することにより)、アフィニティー精製法において、及び例えば放射性ヨウ素、酵素又はフルオロフォアで標識された場合、特に競合型レセプター結合アッセイにおいて有用である。
Ａｐｏ-２の修飾型、例えば前述のＡｐｏ-２-ＩｇＧキメラ分子(イムノアドヘシン)は、抗Ａｐｏ-２抗体の生産における免疫原として使用することができる。
【０１０９】
また、Ａｐｏ-２又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物か「ノックアウト」動物を産生するのに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、Ａｐｏ-２をコードするｃＤＮＡ、又はその適当な配列(例えば、Ａｐｏ-２-ＩｇＧ)を、確立された技術によりＡｐｏ-２をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、Ａｐｏ-２をコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。特にマウス又はラット等のトランスジェニック動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４７３６８６６号や第４８７０００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＡｐｏ-２導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＡｐｏ-２をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＡｐｏ-２をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えば過度のアポトーシスを伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。発明のこの側面においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病状の発病率が低ければ、疾患に対する治療的処置の可能性が示される。他の実施態様において、可溶性型のＡｐｏ-２、例えばＡｐｏ-２ＥＣＤ又はこのような型の免疫グロブリンキメラを有するトランスジェニック動物を作成して、Ａｐｏ-２Ｌ、Ａｐｏ-２のリガンドの慢性的中和の効果をテストすることができる。
【０１１０】
あるいは、Ａｐｏ-２の非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＡｐｏ-２をコードする変更ゲノムＤＮＡと、Ａｐｏ-２をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、Ａｐｏ-２をコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、Ａｐｏ-２をコードするＤＮＡは、確立された技術に従い、Ａｐｏ-２をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。Ａｐｏ-２をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む[例えば、相同的組換えベクターについてはThomas and Capecchi，Cell，51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する[例えば、Liほか，Cell，69:915(1992)参照]。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley，Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach，E．J．Robertson，ed．(IRL，Oxford，1987)，pp．113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば腫瘍の発達を含む、Ａｐｏ-２ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及び病理的状態の発達に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【０１１１】
Ｃ． 抗Ａｐｏ-２抗体の調製
本発明は、さらに抗Ａｐｏ-２抗体を提供するものである。Ａｐｏ-２に対する抗体は以下のようにして調製することができる。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及び異種抱合体抗体が含まれる。
【０１１２】
１．ポリクローナル抗体
Ａｐｏ-２抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、Ａｐｏ-２ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。適切な免疫化剤の例は、Ａｐｏ-２-ＩｇＧ融合タンパク質、例えばＡｐｏ-２ＥＤＣ-ＩｇＧ融合タンパク質である。また、その表面にＡｐｏ-２を発現する細胞を使用してもよい。免疫化されている哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫化剤を抱合させることが有用である。使用され得るそのような免疫原性タンパク質の例は、限定するものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。また、哺乳動物の免疫反応を増強するために、ミョウバンのような凝集剤を使用してもよい。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。哺乳動物から採血し、血清を検定して抗体価を求める。望まれるならば、抗体価が増加又はプラトーするまで哺乳動物に追加免疫を施す。
【０１１３】
２．モノクローナル抗体
あるいは、Ａｐｏ-２抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein,上掲に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、(上述したようにして)免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘導する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【０１１４】
免疫化剤は、典型的にはＡｐｏ-２ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。適切な免疫化剤の例は、Ａｐｏ-２-ＩｇＧ融合タンパク質又はキメラ分子である。Ａｐｏ-２ＥＤＣ-ＩｇＧ免疫原の特定の例は、以下の実施例９に記載している。表面でＡｐｏ-２を発現する細胞もまた使用することができる。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，Academic Press，(1986)pp．59-103]。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット及びマウスの骨髄腫細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親の形質転換細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジン(「ＨＡＴ培地」)を含み、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１１５】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものが望ましい。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これはカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示れている［Kozbor，J．Immunol.，133:3001(1984)、Brodeurほか，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp．51-63］。
【０１１６】
ハイブリドーマ細胞を培養する培地を、Ａｐｏ-２に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard，Anal．Biochem.，107:220(1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定されたら、クローンを制限希釈工程を経てサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding，上掲］。
この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。更に、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培地又は腹水液から分離又は精製される。
【０１１７】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載された方法により作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法によって(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US．Patent No.4816567；Morrisonほか，上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。
【０１１８】
以下の実施例に記載するようにして、抗Ａｐｏ-２モノクローナル抗体を調製した。これらの抗体の一つである３Ｆ１１.３９.７は、ＡＴＣＣに寄託され、寄託受入番号第ＨＢ-１２４５６が付与された。一実施態様において、本発明のモノクローナル抗体は、受入番号ＨＢ-１２４５６で寄託されたハイブリドーマ株化細胞により分泌されるモノクローナル抗体と同じ生物学的特徴を有する。「生物学的特徴」という用語は、モノクローナル抗体のインビトロ及び／又はインビボの活性又は性質、例えばＡｐｏ-２に特異的に結合する能力又はＡｐｏ-２活性を実質的に阻止、誘導又は高める能力を指すために使用される。本明細書に開示されているように、３Ｆ１１.３９.７モノクローナル抗体(ＨＢ-１２４５６)は、アポトーシスを誘導するアゴニスト活性を有し、Ａｐｏ-２レセプターに結合し、以下の実施例に記載されているように阻害活性を有し、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２に対してではなくＤＲ４に対してある程度の交差反応性を有するものとして特徴付けられる。場合によっては、モノクローナル抗体はここで開示された３Ｆ１１.３９.７と同じエピトープに結合する。これは、例えばここや実施例において記載したように、種々のアッセイを行うことにより測定することができる。例えば、モノクローナル抗体が、特に開示された３Ｆ１１.３９.７抗体と同じ特異性を有しているかどうか測定するためには、以下の実施例に記載しているものような、Ａｐｏ-２阻止及びアポトーシス誘導アッセイにおける活性を比較することができる。
【０１１９】
また、本発明の抗体は一価抗体を含む。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連したシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂフラグメントの調製は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。例えば、消化はパパインの使用により行うことができる。パパイン消化の例は、９４／２２／１２に公開された国際特許第ＷＯ９４／２９３４８号、及び米国特許第４３４２５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂフラグメントと呼ばれ、各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合フラグメントと、残りのＦｃフラグメントを生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、抗原の架橋が尚も可能なＦ(ａｂ')2フラグメントが得られる。
【０１２０】
また、抗体の消化により生産されたＦａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン(ＣＨ1)を含む。Ｆａｂ'フラグメントは、抗体のヒンジ領域から一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ1ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が付加されているということで、Ｆａｂフラグメントとは異なっている。Ｆａｂ'-ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでも命名である。Ｆ(ａｂ')2抗体フラグメントは、本来は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ'フラグメントの対として生産された。抗体フラグメントの他の化学的結合もまた知られている。
【０１２１】
３．ヒト化抗体
本発明のＡｐｏ-２抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jonesほか，Nature，321:522-525(1986);Riechmannほか，Nature，332:323-329(1988);及びPresta，Curr．Op Struct．Biol.，2:593-596(1992)]。
【０１２２】
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター及び共同研究者［Jonesほか，Nature，321:522-525(1986)、Riechmannほか，Nature，332:323-327(1988)、Verhoeyenほか，Science，239:1534-1536(1988)］の方法を使用して行える。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(U.S．4,816,567)である。実際には、ヒト化抗体は典型的にはある程度のＣＤＲ残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
【０１２３】
抗原性を軽減するには、ヒト化抗体を生成するために使用するヒトの軽及び重可変ドメインの両方の選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列ライブラリ全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトの配列を次にヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる[Simsほか，J．Immunol.，151:2296(1993);Chothia及びLesk，J．Mol．Biol.，196:901(1987)]。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる［Carterほか，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:4285(1992)；Prestaほか，J．Immunol.，151:2623(1993)]。
【０１２４】
更に、抗体は、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析を可能とする。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性を高めるといった、望ましい抗体特徴が得られるように、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている［1994年、3月3日に公開されたWO 94/04679を参照］。
【０１２５】
免疫化することで、内在性免疫グロブリンが生成されない状態でもヒト抗体の完全リパートリを生成することができるトランスジェニック動物(例えばマウス)を使用することが可能である。このような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列を移すと、抗原による誘導時にはヒト抗体の生成が生じる［例えば、Jakobovitsほか，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:2551-255(1993)；Jakobovitsほか，Nature，362:255-258(1993)；Bruggermanほか，Year in Immuno.，7:33(1993)を参照］。
【０１２６】
また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリ[Hoogenboom及びWinter，J．Mol．Biol.，227:381(1992)；Marksほか，J．Mol．Biol.，222:581(1991)]において産生することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss．p.77(1985)及びBoernerら，J．Immunol.，147(1)：86-95(1991)］。ファージライブラリを調製するための適切な方法がレビューされ、Winterら，Annu．Rev．Immunol.，12：433-55(1994)；Soderlindら，Immunologic al Reviews，130：109-123(1992)；Hoogenboom，Tibtech 1997年2月，Vol．15；Neriら，Cell Biophysics，27：47-61(1995)に記載されている。また、単鎖抗体のライブラリも、国際特許第ＷＯ９２／０１０４７号、国際特許第ＷＯ９２／２０７９１号、国際特許第ＷＯ９３／０６２１３号、国際特許第ＷＯ９３／１１２３６号、国際特許第ＷＯ９３／１９１７２号、国際特許第ＷＯ９５／０１４３８号及び国際特許第ＷＯ９５／１５３８８号に記載されている方法で調製することができる。さらに抗体ライブラリは、例えばCambridge Antibody Technologies(C.A.T.)，Cambridge，UK．から市販されている。Ａｐｏ-２の場合、抗原に対する結合選択は以下の実施例においてさらに詳細に記載されているようにして実施することができる。
【０１２７】
以下の実施例に記載されているように、抗Ａｐｏ-２単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)抗体を、ファージディスプレイライブラリを使用して同定した。ここで１６Ｅ２、２４Ｃ４及び２０Ｅ６と称されるこれら３つの抗体を配列決定して特性付けした。これらの抗体の各ＤＮＡ及びアミノ酸配列及び相補性決定領域を図１５Ａ−１５Ｃ及び１６に示す。本発明の一実施態様において、ｓｃＦｖＡｐｏ-２抗体は、ここで同定した１６Ｅ２、２４Ｃ４又は２０Ｅ６抗体と同じ生物学的特性を有する。「生物学的特性」という用語は、ｓｃＦｖ抗体のインビトロ及び／又はインビボ活性又は性質、例えばＡｐｏ-２に特異的に結合する能力又はＡｐｏ-２活性を実質的に誘導又は高める能力を指すために使用される。本明細書に開示しているように、１６Ｅ２、２４Ｃ４及び２０Ｅ６抗体は、Ａｐｏ-２に結合し、アポトーシスを誘導するアゴニスト活性を有し、ＤＲ４又はＡｐｏ-２リガンドにより認識されるいくつかの他の既知の分子に対する交差反応性がないと特性付けられる。場合によっては、ｓｃＦｖＡｐｏ-２抗体は同じエピトープ又はここで開示されている１６Ｅ２、２４Ｃ４又は２０Ｅ６抗体により認識されるエピトープに結合する。このことは、例えばここや実施例において記載されているもののような種々のアッセイを実施することにより測定することができる。例えば、ｓｃＦｖ抗体が、特に開示されている１６Ｅ２、２４Ｃ４又は２０Ｅ６抗体と同じ特異性を有しているか否かを測定するために、以下の実施例に記載しているもののような、アポトーシス誘導アッセイにおける活性を比較することができる。
場合によっては、Ａｐｏ-２に対するｓｃＦｖ抗体は、１６Ｅ２、２０Ｅ６又は２４Ｃ４抗体に対して図１６において同定された一又は複数の相補性決定領域(ＣＤＲ)アミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗体を含みうる。
【０１２８】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＡｐｏ-２に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を生成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成方法は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Millstein及びCuello，Nature，305:537-539(1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖のランダムな混合のため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成でき、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際特許第９３／０８８２９号、及びTrauneckerほか，EMBO J.，10:3655-3656(1991)に開示されている。
【０１２９】
別のより好ましいアプローチによれば、所望の結合特異性(抗体-抗原組合せ部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。
融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインで起きる。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨｌ)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これは、構築に使用する三つのポリペプチド鎖が不等の比である時に最高の収率が得られる実施態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互比率を調整する際に大なる柔軟性をもたらす。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖が同比率で発現すると高収率が得られる場合や比率が特に重要ではない場合には、一つの発現ベクターに二つ又は三つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することができる。このアプローチの好適な形態では、二重特異性抗体は、一方のアームの第一結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖／軽鎖対(第二の結合特異性をもたらす)からなる。このような非対称的構造は、二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在すると容易な方法で分解できるので、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分解し易くすることが見出された。このアプローチは１９９４年３月３日公開の国際特許第９４／０４６９０号によって開示されている。二重特異性抗体を生成するためのさらなる詳細については、例えばSureshほか，Methods in Enzymology，121:210(1986)を参照されたい。
【０１３０】
５．異種抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有的に結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療(WO 91/00360、WO92/200373;EP 03089)のために提案された。本抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されているものが含まれる。
【０１３１】
６．トリアボディ(Triabodies)
トリアボディも本発明の範囲に入る。このような抗体は、例えばIliadesら，FEBS Letters，409：437-441(1997)及びKorrtら，Protein Engineering，10：423-433(1997)に記載されている。
【０１３２】
７．他の改変
Ａｐｏ-２抗体の他の修飾について考察する。例えば、抗体の治療効果を高めるために、エフェクター機能に関して、本発明の抗体を改変することが望ましい。例えば、システイン残基(類）をＦｃ領域に導入し、この領域において鎖間ジスルフィド結合が形成されるようにする。このようにして産生されたホモダイマー抗体は、内部移行能力が改善され及び／又は補体性細胞死滅性が増加している［例えば、Caronら，J．Exp．Med.，176：1191-1195(1992)；Shopes，J．Immunol.，148：2918-2922(1922)を参照のこと］。また、ホモダイマー抗体は、Wolffら，Cancer Research，53：2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性クロスリンカー(cross-llnkers)を使用して調製することもできる。さらに、Ghetieらは、Proc．Natl．Acad．Sci.，94：7509-7514(1997)において、ＩｇＧ-ＩｇＧホモダイマーの調製について記載しており、このようなホモダイマーがモノマーと比較してア ポトーシス活性を高めることが可能であることを開示している。また、抗体は二重Ｆｃ領域を有するように操作することができる[Stevensonら，Anti-CancerDrugDesign，3：219-230(1989)を参照］。
【０１３３】
ここで開示されている抗体のアミノ酸配列を改変することが望ましい。ｓｃＦｖ相補性決定又はリンカー領域内の配列(図１６に示す)は、例えばこれらの抗体の生物学的活性を変調するために改変することができる。全長ｓｃＦｖ配列、又はここで記載されているｓｃＦｖ分子の種々のドメインにおける変異は、例えば米国特許第５３６４９３４号に記載された保存的あるいは非保存的突然変異に関する方法とガイドラインの任意のものを使用して作製することができる。変異は、天然配列ｓｃＦｖと比較してｓｃＦｖのアミノ酸配列に変化を生じせしめるｓｃＦｖをコードしている一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入でありうる。場合によっては、変異は、ｓｃＦｖ分子の一又は複数のドメインにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が任意の他のアミノ酸に置換されることによりなされる。変異は、オリゴヌクレオチド媒介性(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発のような当該分野において既知の方法を用いて行うこともできる。クローン化ＤＮＡに部位特異的突然変異誘発[Carterら，Nucl．Acids．Res.，13:4331(1986)；Zollerら，Nucl．Acids．Res.，10：6487(1987)]、カセット突然変異誘発［Wellsら，Gene，34：315(1985)］、制限選択的突然変異誘発［Wellら，Philos．Trans．R．Soc．London．SerA，317：415(1986)］又は他の既知の技術を実施して、ｓｃＦｖ変異体ＤＮＡを生産することができる。
【０１３４】
抗体は、一又は複数の化学基に共有的に結合されるか、又は抱合されてもよい。例えば、ポリオールは国際特許第ＷＯ９３／００１０９号に開示されているようなリシン残基を含む、一又は複数のアミノ酸残基で抗体分子に抱合することができる。場合によっては、ポリオールは、ポリ(アルケレングリコール)、例えばポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)であるが、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを、ポリペプチドにＰＥＧを抱合する技術を使用して用いることができることは分かる。ポリペプチドをペギレート化(pegylating)するための種々の方法が記述されている。例えば、低減した免疫原性を有する生理学的に活性な組成物を生成するための、ＰＥＧ及びポリプロピレングリコールへの、多くのホルモン及び酵素の抱合が開示されている米国特許第４１７９３３７号を参照のこと。
また、抗体は他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列、例えばエピトープタグに融合又は結合させてもよい。エピトープタグポリペプチド及びそれらの使用方法は、Ａ部８項に上述されている。ここで記載された任意のタグを抗体に結合させてもよい。例えば、以下の実施例には、Ｈｉｓ-タグ及びｇＤ-タグ単鎖抗体が記載されている。
【０１３５】
Ｄ．Ａｐｏ-２抗体の治療的用途
本発明のＡｐｏ-２抗体は治療的な有用性を有している。例えば、アゴニストＡｐｏ-２抗体は癌細胞においてアポトーシスを活性化又は刺激するために使用することができる。従って、本発明は、このようなＡｐｏ-２抗体を使用する癌の治療方法を提供する。もちろん、本発明の方法は外科術等の他の治療方法と組合せて使用することができると考えられる。
アゴニストは好ましくは担体によって哺乳動物に投与される。適切な担体とそれらの製剤は、Osloらにより編集された、Remington's Pharmaceutical Sciences，16th ed.，1980，Mack Publishing Co.,に記載されている。典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。製薬的に許容可能な担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜８、さらに好ましくは約７〜７．５である。さらに担体には、アゴニストを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の徐放性製剤が含まれ、このマトリックスは、例えばフィルム状、リポソーム状又はマイクロ粒子状等の成形物の形態をしている。例えば投与されるアゴニストの投与経路及び濃度によっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。
【０１３６】
アゴニスト抗体は、注射(例えば、静脈、腹腔内、皮下、筋内)、又は例えば点滴のように、有効な形態で血流への送達を確実にする他の方法で哺乳動物に投与することができる。アゴニストは、また、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、又は病巣周囲経路で投与されて、局所的並びに全身的治療効果を発揮する。局所的又は静脈注射が好ましい。
【０１３７】
アゴニスト抗体を投与するための有効な用量とスケジュールは経験的に決定することができ、このような決定は当業者の技量の範囲に含まれる。当業者であれば、投与されなければならないアゴニストの用量が、アゴニストを受入れる哺乳動物、投与経路、使用されるアゴニストの特定の種類、及び哺乳動物に投与されている他の薬剤に依存して変わりうることは理解できるであろう。抗体アゴニストの適切な投与量の選択における指針は、抗体の治療的用途における文献、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferroneら，eds.，Noges Publications，Park Ridge，N.J.，(1985)ch.22及びpp.303-357；Smithら，Antibodies in Human Diagnos is and Therapy，Haberら，eds.，Raven Press，New York(1977)pp.365-389に見出される。単独で使用されるアゴニストの典型的な一日の投与量は、上述の要因に依存し、１日当たり約１μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重又はそれ以上の範囲である。
【０１３８】
また、アゴニスト抗体は、有効量の一又は複数の他の治療剤と組合せるか、又は放射線治療と共に、哺乳動物に投与してもよい。考えられる治療剤には、化学療法並びにイムノアジュバント及びサイトカインが含まれる。本発明において考慮される化学療法には、当該分野において既知であって市販されている化学物質又は薬物、例えばドキソルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン及びカルポプラチンが含まれる。アゴニストは、一又は複数の他の治療剤と連続して又は同時に投与してもよい。アゴニスト及び治療剤の量は、例えば、使用される薬物の種類、治療される癌、及び投与スケジュールと経路に依存するが、各々が個々に使用される場合よりも一般に少ない。
【０１３９】
哺乳動物にアゴニストを投与した後、哺乳動物の癌及び生理学的状態を、当業者によく知られている種々の方法でモニターすることができる。例えば、腫瘍塊を物理的又は標準的なｘ線画像技術により観察することができる。
また、本発明のＡｐｏ-２抗体は、例えばＡＤＣＣ又は補体結合により、Ａｐｏ-２を発現している細胞における免疫媒介性細胞死を高めるのに有用である。
また、アンタゴニスト抗体は、ＮＦ-κＢの活性化の結果生じるＡｐｏ-２の潜在的自己免疫／炎症効果を阻止するか、又は過度のアポトーシス(例えば、神経変性症)を阻止するために使用することもできる。このようなアンタゴニスト抗体は、上述の治療方法及び技術に従って利用することができる。
【０１４０】
Ｅ．Ａｐｏ-２抗体の非治療的用途
さらに、Ａｐｏ-２抗体はＡｐｏ-２の診断検定法、例えば特異的細胞、組織又は血清における発現を検出する検定法に使用することができる。当該分野において知られている様々な診断検定技術、例えば、競合的結合検定、直接的又は間接的サンドイッチ検定及び不均一又は均一相の何れにおいても実施される免疫沈降検定を使用することができる[Zola，Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques，CRC Press，Inc.，(1987)pp．147-158]。診断検定法に使用される抗体は、検出可能部分で標識することができる。検出可能成分は、直接的に又は間接的に検出可能なシグナルをつくりだすことができなければならない。例えば検出可能成分は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ又は125Ｉ等の放射性同位体、蛍光イソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、もしくはアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ又は酉洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素であってもよい。Hunterほか，Nature，144:945(1962)、Davidほか，Biochemistry，13:1014(1974)、Painほか，J．Immunol．Meth.，40:219(1981)及びNygrenほか，J．Histochem．and Cytochem.，30:407(1982)等に記載されている方法を含み、検出可能部分に抗体を抱合させるための当該分野において知られている任意の方法を使用することができる。
【０１４１】
また、Ａｐｏ-２抗体は天然供給源又は組換え細胞培養由来のＡｐｏ-２のアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、Ａｐｏ-２に対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾過紙のような適当な支持体に固定する。次に、固定された抗体を、精製するＡｐｏ-２を含む試料と接触させ、ついで、固定された抗体に結合したＡｐｏ-２以外の試料内の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、Ａｐｏ-２を抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【０１４２】
Ｆ．Ａｐｏ-２又はＡｐｏ-２抗体を含むキット
本発明のさらなる実施態様においては、例えば上述の治療的又は非治療的用途に使用可能なＡｐｏ-２又はＡｐｏ-２抗体を含むキット及び製造品が提供される。製造品にはラベルが付された容器が含まれる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、上述の治療的又は非治療的用途に有効な活性剤を含む組成物を収容する。組成物中の活性剤は、Ａｐｏ-２又はＡｐｏ-２抗体である。容器のラベルには、組成物が特定の治療的又は非治療的用途に使用されることが示され、また上述のもののようなインビボ又はインビトロのいずれかの使用の指示が示されている。
【０１４３】
本発明のキットは、典型的には、前掲の容器と、商業上及び使用者の観点から望まれる、バッファー、希釈液、フィルター、針、注入器及び使用説明が記されたパッケージ挿入物を含む、材料を含む一又は複数の他の容器を含んでいる。
【０１４４】
★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに援用する。
【０１４５】
実施例
実施例において言及されている全ての制限酵素は、ニューイングランドバイオラボ社(New England Biolabs)から購入し、製造者の使用説明書に従い使用した。実施例で言及されていろ全ての他の市販試薬は、特に示していない限りは、製造者の使用説明書に従い使用した。ＡＴＣＣ受入番号により次の実施例及び明細書全体を通して特定している細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Manassas，VA)である。
【０１４６】
実施例１
ヒトＡｐｏ−２をコードしているｃＤＮＡクローンの単離 発現配列タグ(ＥＳＴ)ＤＮＡデータベース(LIFESEQTM，Incyte Pharmaceuticals，Palo Alto，CA)を検索し、アポ３レセプター［Marstersら，Curr．Biol.，6：750(1996)］のデスドメインに相同であったあるＥＳＴを同定した。ヒト膵臓及び腎臓のｌｇｔ１０バクテリオファージｃＤＮＡライブラリ(両方ともClontech社から購入)を、以下のようにしてｐＲＫベクター中に結合させた。試薬を添加し、１６℃で１６時間インキュベートした：５Ｘ Ｔ４リガーゼバッファー(３ｍｌ)；ｐＲＫ５、Ｘｈｏ１、Ｎｏｔ１消化ベクター、０．５ｍｇ、１ｍｌ）；ｃＤＮＡ(５ｍｌ)及び蒸留水(６ｍｌ)。続いて、さらに蒸留水(７０ｍｌ)と１０ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ(０．１ｍｌ)を添加し、全反応物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(２５：２４：１)により抽出した。水相を取り出し、収集し、５ＭのＮａＣｌ(１０ｍｌ)と無水エタノール(−２０℃、２５０ｍｌ)に希釈した。ついで、これを１４０００ｘｇで２０分間遠心分離し、デカントし、ペレットを７０％エタノール(０．５ｍｌ)に再懸濁し、再度、１４０００ｘｇで２分間遠心分離した。ついで、ＤＮＡペレットをスピードバク中で乾燥させ、次の処理で使用できるように蒸留水(３ｍｌ)に溶解した。
【０１４７】
予め調製しておいた結合ｃＤＮＡ／ｐＲＫ５ベクターＤＮＡを氷上で冷却し、エレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌(Life Tech.，２０ｍｌ)を添加した。ついで、細菌ベクターの混合物を、製造者の推奨に従って電気穿孔法にかけた。続いてＳＯＣ培地(１ｍｌ)を添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ついで、形質転換体を、アンピシリンを含有する２０の標準的な１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間(３７℃)の間インキュベートし、コロニーを成長させた。ついで、陽性コロニーを擦り取り、標準的なＣｓＣｌ勾配性プロトコールを使用して、細菌ペレットからＤＮＡを単離した。
【０１４８】
ついで、濃縮５'-ｃＤＮＡライブラリを作成し、このライブラリに含まれるｃＤＮＡの５'末端を優先的に示すｃＤＮＡフラグメントのバイアスを得た。１０ｍｇのプールした単離全長ライブラリプラスミドＤＮＡ(４１ｍｌ)をＮｏｔ１制限バッファー(New England Biolabs、５ｍｌ)及びＮｏｔ１(New England Biolabs、４ｍｌ)と組合せ、３７℃で１時間インキュベートした。反応物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(２５：２４：１、５０ｍｌ)により抽出し、水相を取り出し、収集し、５ＭのＮａＣｌ(５ｍｌ)と無水エタノール（−２０℃、１５０ｍｌ)中に再懸濁させた。ついでこれを、１４０００ｘｇで２０分間遠心分離し、デカントし、７０％エタノール(０．５ｍｌ)に再懸濁し、再度、１４０００ｘｇで２分間遠心分離した。ついで、上清を取り出し、ペレットをスピードバック中で乾燥させ、蒸留水(１０ｍｌ)に再懸濁させた。
【０１４９】
次の試薬を一緒にし、３７℃で２時間インキュベートした：蒸留水(３ｍｌ)；直線化ＤＮＡライブラリ(１ｍｇ、１ｍｌ)；リボヌクレオチドミックス(インビトロゲン、１０ｍｌ)；転写バッファー(インビトロゲン、２ｍｌ)及びＳｐ６酵素ミックス。ついで反応物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(２５：２４：１、５０ｍｌ）により抽出し、水相を取り出し、収集し、５ＭのＮａＣｌ(５ｍｌ)と無水エタノール(−２０℃、１５０ｍｌ)に再懸濁させ、１４０００ｘｇで２０分間遠心分離した。ついでペレットをデカントし、７０％エタノール(０．５ｍｌ)に再懸濁し、再度、１４００ｘｇで２分間遠心分離し、デカントして、スピードバック中で乾燥させ、蒸留水(１０ｍｌ)に再懸濁させた。
【０１５０】
次の試薬を一緒に添加し、１６℃で１６時間インキュベートした：５Ｘ Ｔ４リガーゼバッファー(Life Tech.，３ｍｌ)：ｐＲＫ５、Ｃｌａ-Ｓａｌ消化ベクター、０．５ｍｇ、１ｍｌ)；ｃＤＮＡ(５ｍｌ）；蒸留水(６ｍｌ)。続いて、さらなる蒸留水(７０ｍｌ)と１０ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ(０．１ｍｌ)を添加し、全反応物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(２５：２４：１、１００ｍｌ)により抽出した。水相を取り出し、収集し、５ＭのＮａＣｌ(１０ｍｌ)と無水エタノール(−２０℃、２５０ｍｌ)で希釈し、１４０００ｘｇで２０分間遠心分離した。ＤＮＡペレットをデカントし、７０％エタノール(０．５ｍｌ)に再懸濁し、再度、１４０００ｘｇで２分間遠心分離した。上清を取り出し、残査ペレットをスピードバック中で乾燥させ、蒸留水(３ｍｌ)に再懸濁させた。結合ｃＤＮＡ／ｐＳＳＴ-ａｍｙ．１ベクターＤＮＡを氷上で冷却し、電子受容性ＤＨ１０Ｂ細菌を添加した(Life Tech.，２０ｍｌ)。ついで、細菌ベクターの混合物を、製造者の推奨により電気穿孔法にかけた。続いてＳＯＣ培地(Life Tech.，１ｍｌ)を添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ついで、形質転換体を、アンピシリンを含有する２０の標準的な１５０ｍｍＬＢプレートに配し、１６時間(３７℃)でインキュベートした。ついで、陽性コロニーをプレートから擦り取り、標準的なプロトコール、例えばＣｓＣｌ勾配を使用し、細菌ペレットからＤＮＡを単離した。
【０１５１】
ｃＤＮＡライブラリを、ＥＳＴに基づく合成オリゴヌクレオチドプローブ：GGGAGCCGCTCATGAGGAAGTTGGGCCTCATGGACAATGAGATAAAGGTGGCTAAAGCTGAGGCAGCGGG(配列番号：３)を用いたハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
３つのｃＤＮＡの全体を配列決定した。ｃＤＮＡの重複コード領域はコドン４１０を除き同一であった(図１の番号付けを使用)；おそらくは多型性であるため、この位置は、両膵臓ｃＤＮＡのロイシン残基(ＴＴＧ)、及び腎臓ｃＤＮＡのメチオニン残基(ＡＴＧ)をコード化した。
【０１５２】
Ａｐｏ-２の全ヌクレオチド配列を図１に示す(配列番号：２)。クローン２７８６８(以下に示されるように、ATCC 209021として寄託され、pRK5-アポ2とも称される)は、ヌクレオチド位置１４０-１４２における見かけ翻訳開始部位を有する単一のオープンリーディングフレームを含み［Kozakら，上掲］、ヌクレオチド部位１３７３-１３７５で見出される終止コドンで終了する(図１；配列番号２)。予想されるポリペプチド前駆物質は４１１アミノ酸長さで、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、約４５ｋＤａの算定分子量を有する。ヒドロパシー分析(図示しない)により、シグナル配列(残基１-５３)、続いて細胞外ドメイン(残基５４-１８２)、膜貫通ドメイン(残基１８３-２０８)、及び細胞内ドメイン(残基２０９-４１１)の存在が示唆された(図２；配列番号：１)。２９３細胞で発現したＡｐｏ-２-ＩｇＧのＮ末端アミノ酸配列分析により、成熟ポリペプチドがアミノ酸残基５４で始まり、実際のシグナル配列は残基１-５３を含むことが示された。Ａｐｏ-２ポリペプチドは、寄託されたＡＴＣＣ２０９０２ｌベクターのｃＤＮＡ挿入物によりコード化される分子を発現させることにより得られるか得られうる。
【０１５３】
ＴＮＦレセプターファミリータンパク質は、典型的には、細胞外領域に複数の(通常は４つ)システインに富んだドメインが存在していることを特徴としており、各システインリッチドメインは約４５アミノ酸長であり、規則的に間隔を開けた約６つのシステイン残基を有している。１型ＴＮＦレセプターの結晶構造に基づき、各ドメインにおけるシステインは、典型的には３つのジスルフィド結合を形成し、通常システイン１と２、３と５、及び４と６が互いに対になっている。
ＤＲ４のように、Ａｐｏ-２は２つの細胞外のシステインに富んだ擬性反復部を含む(図２Ａ)が、これに対し他の同定されている哺乳動物ＴＮＦＲファミリーのメンバーは３又はそれ以上のこのようなドメインを含む［Smithら，Cell，76：959(1994)］。
【０１５４】
Ａｐｏ-２の細胞質領域はデスドメインを含み(図１に示すアミノ酸残基３２４-３９１；さらに図２Ａを参照)、これはＴＮＦＲ１(３０％)；ＣＤ９５(１９％)；又はアポ３／ＤＲ３(２９％)のデスドメインに対してよりも、ＤＲ４(６４％)のデスドメインに対して、顕著により高いアミノ酸配列同一性を示すものである(図２Ｂ)。ＴＮＦＲ１によるシグナル伝達に必要とされる６つのデスドメインの内４つはＡｐｏ-２内に保存されているが、他の２つの残基は半保存されている(図２Ｂを参照)。
全長配列のアラインメント分析(ALIGMTMコンピュータプログラムを使用)に基づくと、Ａｐｏ-２は他のアポトーシス関連レセプター、例えばＴＮＦＲ１(１９％)；ＣＤ９５(１７％)；又はアポ３(ＤＲ３、ＷＳＬ-１又はＴＲＡＭＰとも称される)(２９％)に対してよりも、ＤＲ４(５５％)に対してより高い配列同一性を示す。
【０１５５】
実施例２
Ａ．Ａｐｏ-２ＥＣＤの発現
可溶性の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)融合カセットを調製した。Ａｐｏ-２ＥＣＤ(図１に示すアミノ酸残基１-１８４)をＰＣＲ法により得て、Ｃ末端フラッグエピトープタグ(Sigma)に融合させた。(残基１８３及び１８４は膜貫通領域にあることが予想されていても、Ａｐｏ-２ＥＣＤ作成物は図１に示す残基１８３及び１８４を含んでおり、接合部に可撓性を付与する)。ついで、フラッグエピトープタグ分子をｐＲＫ５に挿入し、ヒト２９３細胞(ATCC CRL 1573)に一過性トランスフェクションして発現させた。
４８時間インキュベートした後、細胞上清を収集し、共沈試験(実施例３を参照)に直接使用するか、製造者(Sigma)の使用説明書に従い、抗フラッグアガロースビーズによるアフィニティークロマトグラフィーによりＡｐｏ-２ＥＣＤ-フラッグの精製を行った。
【０１５６】
Ｂ．イムノアドヘシンとしてのＡｐｏ-２ＥＣＤの発現
可溶性のＡｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシン作成物を調製した。Ａｐｏ-２ＥＣＤ(図１に示すアミノ酸１-１８４)を、過去に記載されているようにして［Ashkenaziら，Proc．Natl．Acad．Sci.，88：10535-10539(1991)］、ｐＲＫ５のヒト免疫グロブリンＧ1重鎖のヒンジ及びＦｃ領域に融合した。イムノアドヘシンは、ヒト２９３細胞に一過性トランスフェクションして発現させ、前掲のAshkenaziらにより記載されたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。
【０１５７】
実施例３
Ａｐｏ-２とＡｐｏ-２リガンド間の結合相互作用を示す免疫沈降アッセイ
Ａｐｏ-２とＡｐｏ-２Ｌが相互作用するか又は互いに結合するかを測定するために、擬似トランスフェクト２９３細胞又はＡｐｏ-２ＥＣＤ-フラッグ(上記の実施例２に記載されたもの)がトランスフェクトした２９３細胞(５ｍｌ)からの上清を、５μｇのポリ-ヒスチジンタグ可溶性Ａｐｏ-２Ｌと室温で３０分間インキュベートし［Pittiら，上掲］、ついで共沈アッセイにより複合体形成について分析した。
【０１５８】
試料を２５μｌの抗フラッグ抱合アガロースビーズ(Sigma)又はニッケル抱合アガロースビーズ(Qiagen)を使用し、免疫沈降にかけた。４℃で１．５時間インキュベートした後、ビーズを遠心沈殿させ、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)で４回洗浄した。抗フラッグアガロースを使用することにより、Ａｐｏ-２ＬをフラッグタグＡｐｏ-２ＥＣＤを通して沈殿させ；ニッケルアガロースを使用することにより、Ａｐｏ-２ＥＣＤをＨｉｓタグＡｐｏ-２Ｌを通して沈殿させた。沈殿したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー中で５分間ビーズを沸騰させることで放出させ、１２％のポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離し、ついでMarstersら，J．Biol．Chem.,(1997)に記載されたようにして、抗Ａｐｏ-２Ｌ又は抗フラッグ抗体(２μｇ／ｍｌ)による免疫ブロットにより検出した。
【０１５９】
図３に示した結果は、Ａｐｏ-２ＥＣＤとＡｐｏ-２Ｌが互いに結合可能であることを示している。
さらに、結合相互作用を、抗フラッグビーズ(実施例２を参照)を用い、トランスフェクションした２９３細胞上清からＡｐｏ-２ＥＣＤを精製し、ついでBIACORETM装置で試料を分析することにより、分析した。BIACORETM分析により、約１ｎＭの解離定数(Ｋｄ)が示された。また、BIACORETM分析により、Ａｐｏ-２ＥＣＤが他のアポトーシス誘導性ＴＮＦファミリーのメンバー、すなわちＴＮＦ-α[Genentech，Inc.，Pennicaら，Nature，312：712(1984)、lymphotoxin−α(Genentech，Inc.)，又はFas/アポ１リガンド(Alexis Biochemicals)]と結合不可能であることが示された。よって、これらのデータは、Ａｐｏ-２がＡｐｏ-２Ｌに特異的なレセプターであることを示している。
【０１６０】
実施例４
Ａｐｏ-２によるアポトーシスの誘導
デスドメインはオリゴマー化界面として機能するため、デスドメインを含むレセプターの過剰発現により、リガンドの不在下においてシグナル伝達が活性化する[Frazerら，上掲，Nagataら，上掲]。Ａｐｏ-２が細胞死を誘導可能であるか否かを測定するために、ヒト２９３細胞又はＨｅＬａ細胞(ATCC CCL 2.2)をリン酸カルシウム沈殿法(２９３細胞)又は電気穿孔法(ＨｅＬａ細胞)により、Ａｐｏ-２及び／又はＣｒｍＡをコードしているｐＲＫ５系プラスミド又はｐＲＫ５ベクターで一過性トランスフェクションした。適用できる場合に、プラスミドＤＮＡの全体量を、ベクターＤＮＡを添加することにより調節した。アポトーシスを、形態学的（図４Ａ)、ＤＮＡ断片化(図４Ｂ)、又はMarstersら，Curr．Biol.，6：1669(1996)に記載されているようなホスファチジルセリン暴露のＦＡＣＳ分析(図４Ｃ)により、トランスフェクション２４時間後に評価した。図４Ａ及び４Ｂに示すように、Ａｐｏ-２トランスフェクション２９３細胞には、顕著なアポトーシスが発生した。
【０１６１】
ＦＡＣＳにより分析される試料に対して、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクション用のマーカーとしてｐＲＫ５-ＣＤ４を同時形質移入させ、ＣＤ４発現細胞におけるアポトーシスを測定した：ＦＡＤＤをＡｐｏ-２プラスミドで同時形質移入した；データは、Marstersら，Curr．Biol.，6:1669(1996)に記載されているように、少なくとも３回の実験の平均値±ＳＥＭである。カスパーゼ阻害剤、ＤＥＶＤ-ｆｍｋ(Enzyme Systems)又はｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋ(Research Biochemicals Intl.)を、トランスフェクション時に２００μＭで添加した。図４Ｃに示すように、カスパーゼ阻害剤ＣｒｍＡ、ＥＶＤ-ｆｍｋ及びｚ-ＶＡＤ-ｆｍｋが、Ａｐｏ-２により誘導されるアポトーシスを阻害し、この反応におけるＣｅｄ-３-プロテアーゼの関与が示された。
【０１６２】
ＦＡＤＤは、ＣＤ９５、ＴＮＦＲ１及びアポ３／ＤＲ３によるアポトーシスの活性化を媒介するアダプタータンパク質である［Nagataら，上掲］が、Ａｐｏ-２Ｌ［Marstersら，上掲］又はＤＲ４［Panら，上掲］によるアポトーシス誘導には必要であるとは思われない。ＣＤ９５、ＴＮＦＲ１又はアポ３／ＤＲ３によるアポトーシス誘導を阻害するＦＡＤＤのドミナントネガティブ変異体型［Frazerら，上掲；Nagataら，上掲；Chinnaylanら，上掲］は、ＨｅＬａ細胞にＡｐｏ-２を同時形質移入させた場合(図４Ｃ)に、Ａｐｏ-２によるアポトーシス誘導を阻害しなかった。これらの結果より、Ａｐｏ-２は、ＦＡＤＤとは独立して、アポトーシスのシグナル伝達をしていることが示唆される。この結論と一致して、Ａｐｏ-２細胞質領域を含むグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ融合タンパク質は、インビトロで転写され翻訳されたＦＡＤＤに結合しなかった(データは示さず)。
【０１６３】
実施例５
可溶性Ａｐｏ-２ＥＣＤによるＡｐｏ-２Ｌ活性の阻害
可溶性Ａｐｏ-２Ｌ(０．５μｇ／ｍｌ、Pittiら，上掲に記載されたようにして調製)を、抗フラッグ抗体(Sigma)と共に、ＰＢＳバッファー又はアフニティー精製されたＡｐｏ-２ＥＣＤ(５μｇ／ｍｌ)と室温で１時間、プレインキュベートし、ＨｅＬａ細胞に添加した。インキュベート５時間後、細胞をＦＡＣＳ(上述)(図４Ｄ)によりアポトーシスについて分析した。
Ａｐｏ-２ＬはＨｅＬａ細胞において顕著なアポトーシスを誘導し、可溶性Ａｐｏ-２ＥＣＤはＡｐｏ-２Ｌの作用を阻止でき、Ａｐｏ-２ＬとＡｐｏ-２との間に特異的な相互作用があることが確認された。同様の結果がＡｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンでも得られた(図４Ｄ)。用量-反応分析では、約０．３ｎＭのＡｐｏ-２イムノアドヘシンで最大半減阻害が示されている(図４Ｅ)。
【０１６４】
実施例６
Ａｐｏ-２によるＮＦ-κＢの活性化
Ａｐｏ-２がＮＦ-κＢを活性化させるか否かを測定するためのアッセイを行った。
ＨｅＬａ細胞を、全長天然配列Ａｐｏ-２、ＤＲ４又はアポ３をコードするｐＲＫ５発現プラスミドでトランスフェクションし、トランスフェクション２４時間後に収集した。核抽出物を調製し、１μｇの核タンパク質を、32Ｐ標識ＮＦ-κＢ特異性合成オリゴヌクレオチドプローブＡＴＣＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧ(配列番号：４)［MacKayら，J．Immunol.，153：5274-5284(1994)も参照のこと］と、単独又は５０倍過剰の非標識プローブと共に、又は関連のない32Ｐ標識合成オリゴヌクレオチドＡＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＴＧＴＧＡＴＡＴＡＴＣＣＴＴＧＡＴ(配列番号：５)と反応させた。いくつかの試料に、ＮＦ-κＢのｐ６５／Ｒｅ１Ａサブユニットに対する抗体(１μｇ／ｍｌ；Santa，Cruz Biotechnology)を添加した。ＤＮＡ結合性を、Hsuら，上掲;Marstersら，上掲、及びMacKayら，上掲に記載されたようにして、電気泳動移動度シフトアッセイにより分析した。
【０１６５】
結果を図５に示す。図５Ａに示すように、電気泳動移動度シフトアッセイにより測定した場合、Ａｐｏ-２とＤＲ４の両方が、ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションの際に、有意なＮＦ-κβの活性化を誘導した；活性化レベルはアポ３／ＤＲ３で観察される活性化に匹敵するものであった。ＮＦ-κＢのｐ６５／Ｒｅ１Ａサブユニットに対する抗体は、ＮＦ-κＢプローブの移動を阻害し、３つの全てのレセプターに対する反応においてｐ６５を示していた。
さらに、Ａｐｏ-２Ｌそれ自体がＮＦ-κＢ活性を調節可能であるか否かを測定するアッセイを行った。ＨｅＬａ細胞又はＭＣＦ７細胞(ヒト胸腺癌株化細胞、ATCCHTB22)を、ＰＢＳバッファー、可溶性Ａｐｏ-２(Pittiら，上掲)又はＴＮＦ-α［Genentech，Inc.，Pennicaら，Nature，312：721(1984)を参照］(１μｇ／ｍｌ)で処理し、上述のようにしてＮＦ-κＢ活性をアッセイした。結果を図５Ｂに示す。Ａｐｏ-２Ｌは、処理されたＨｅＬａ細胞においては有意なＮＦ-κＢ活性化を誘導したが、処理されたＭＣＦ７細胞においては誘導しなかった：ＴＮＦ-αは両方の株化細胞においてより著しい活性化を誘導した。いくつかの研究においては、ＴＮＦによるＮＦ-κＢの活性化で、ＴＮＦ誘導性アポトーシスに対し、細胞を保護できることが開示されている［Nagataら，上掲］。
【０１６６】
また、ＮＦ-κＢインヒビターであるＡＬＬＮ(-アセチル-Leu-Leu-ノルロイシナル)及び転写インヒビターであるシクロヘキサミドの影響を試験した。ＨｅＬａ細胞(6-ウェル皿に蒔いた)を、Ａｐｏ-２Ｌ(１μｇ／ｍｌ)の添加前に、ＰＢＳバッファー、ＡＬＬＮ(Calbiochem)(４０μｇ／ｍｌ)又はシクロヘキサミド(Sigma)（５０μｇ/ｍｌ)と共に、１時間プレインキュベートした。インキュベート５時間後、ＦＡＣＳによりアポトーシスについて分析した(図５Ｃを参照)。
結果を図５Ｃに示す。ＡＬＬＮ及びシクロヘキサミドの両方とも、ＨｅＬａ細胞におけるＡｐｏ-２Ｌ誘導性アポトーシスのレベルを増加させた。データは、Ａｐｏ-２Ｌが保護性ＮＦ-κＢ依存性遺伝子を誘導可能であることを示している。また、データは、Ａｐｏ-２Ｌがある種の株化細胞においてＮＦ-κβを活性化することができ、Ａｐｏ-２とＤＲ４の両方がその機能を媒介し得ることを示している。
【０１６７】
実施例７
哺乳動物組織におけるＡｐｏ-２の発現
Ａ．ノーザンブロット分析
ヒト組織におけるＡｐｏ-２ｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロット分析によって検査した。ヒトＲＮＡブロットを、全長Ａｐｏ-２ｃＤＮＡをベースにした４．６キロベースの32標識ＤＮＡプローブにハイブリダイズした；プローブはＥｃｏＲＩでｐＲＫ５-Ａｐｏ-２プラスミドを消化することにより産生した。ヒト胎児ＲＮＡブロットＭＴＮ(Clontech)、ヒト成人ＲＮＡブロットＭＴＮ-１１(Clonetech)、及びヒト癌株化細胞ＲＮＡブロット(Clonetech)をＤＮＡプローブと共にインキュベートした。ブロットをハイブリダイゼーション用バッファー［5X SSPE；２X デンハード溶液；１００ｍｇ／ｍＬの変性剪断されたサケ精子ＤＮＡ；５０％のホルムアミド；２％のＳＤＳ］に入ったプローブと共に、４２℃で６０時間インキュベートした。ブロットを２Ｘ ＳＳＣ；０．０５％のＳＤＳを用い、室温で１時間、数回洗浄し、ついで０．１ＸＳＳＣ；０．１％のＳＤＳを用い、５０℃で３０分間洗浄した。ブロットを一晩さらした後、展開させた。
【０１６８】
図６Ａに示すように、約４．６キロベースの優性ｍＲＮＡの転写が複数の組織において検出された。発現は、胎児及び成人の肝臓及び肺、及び成人の卵巣及び末梢血白血球(ＰＢＬ)において比較的高かったが、胎児及び成人の脳においてはｍＲＮＡの発現は検出されなかった。中レベルの発現は、成人の大腸、小腸、精巣、前立腺、胸腺、膵臓、腎臓、骨格筋、胎盤、及び心臓において見出された。
Ａｐｏ-２が発現したいくつかの成人組織、例えばＰＢＬ、卵巣及び脾臓は、ＤＲ４を発現することが以前に見出されているが［Panら，上掲］、各レセプターｍＲＮＡの発現の相対レベルが異なっているようである。
【０１６９】
Ｂ．インサイツハイブリダイゼーション
正常及び癌のあるヒト組織におけるＡｐｏ-２の発現を、インサイツハイブリダイゼーションにより検査した。さらに、いくつかの異なるチンパンジー及びアカゲザル組織についてのＡｐｏ-２の発現も検査した。これらの組織には：ヒト胎児組織(E12-E16週)-胎盤、脾帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大動脈、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢；成人ヒト組織-腎臓、膀胱、副腎、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、網膜、肝臓；チンパンジー組織-唾液腺、胃、甲状腺、上皮小体、舌、胸腺、卵巣、リンパ節、及び末梢神経；アカゲザル組織-大脳皮質、海馬、小脳及び陰茎；ヒト腫瘍組織-肺腺癌、精巣、肺癌、乳癌、線維腺腫、柔組織肉腫が含まれる。
【０１７０】
組織の試料をパラフィン包埋し、薄片切断した。後で、薄片切断された組織からパラフィンを取り除き、スライドを水中に配した。スライドを、２Ｘ ＳＳＣで、室温において、５分間、２回すすいだ。すすぎ後、スライドを２０μｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ(Ｒｎアーゼフリーのバッファー中)に３７℃で１５分間、又は８Ｘのプロテイナーゼ(ホルマリン組織用)に３７℃で３０分間配した。ついでスライドを再度０．５Ｘ ＳＳＣですすいで脱水した。ハイブリダイゼーション前に、スライドをバッファー(４Ｘ ＳＳＣ、５０％のホルムアミド)飽和濾紙で裏打ちされたプラスチックボックスに配した。組織を５０μｌのハイブリダイゼーションバッファー(３．７５ｇの硫酸デキストランと６ｍｌの水；２分間攪拌し加熱する；氷上で冷却し、１８．７５ｍｌのホルムアルデヒド、３．７５ｍｌの２０Ｘ ＳＳＣ及び９ｍｌ水を添加する)で被い、４２℃で１〜４時間インキュベートした。
【０１７１】
ハイブリダイゼーションを、配列番号：２のヌクレオチド７０６-１２５９からなる33Ｐ標識プローブを使用して行った。プローブをハイブリダイゼーションバッファー中のスライドに加え、５５℃で一晩インキュベートした。ついで、数回の洗浄工程を以下のようにして連続して行った：２ＸＳＳＣ、ＥＤＴＡバッファー(４００ｍｌの２０Ｘ ＳＳＣ、１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ)で、室温で１０分間に２回：２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡで３７℃で３０分に１回；２Ｘ ＳＳＣ、ＥＤＴＡバッファーで、室温で１０分間に２回：０．１Ｘ ＳＳＣ、ＥＤＴＡバッファーで５５℃で２時間に１回；０．５ＸＳＳＣで室温で１０分間に２回。０．３ＭのＮＨ4ＡＣを含有する５０％、７０％、９０％のエタノールにおいて、各々２分間、脱水した。最後にスライドを２時間空気乾燥させ、フィルムに感光させた。
【０１７２】
胎児組織におけるＡｐｏ-２の発現は、肝臓の肝細胞、発育途上にある腎臓の糸球体、副腎皮質、及び胃腸管の上皮に最も強く現れた。中程度の発現は、肺の上皮細胞、及び骨の成長板の脈管化部位において観察された。比較的低レベルの発現は、甲状腺の上皮細胞及び心室内の細胞において観察された。発現は胸腺髄のリンパ球様細胞、発育途上のリンパ腺及び胎盤細胞栄養芽層細胞において観察された。
成人組織におけるＡｐｏ-２の発現は、原小胞の休止卵母細胞で、低レベルの発現はチンパンジーの卵巣の、発育途上にある小胞の顆粒膜細胞で観察された。
発現は、硬変症のある肝臓の小節縁部の肝細胞(すなわち、ダメージ領域、正常な成人肝臓は陰性であった)で観察された。他の組織では発現はみられなかった。
【０１７３】
検査した癌組織において、Ａｐｏ-２の発現は、２つの肺腺癌及び精巣の２つの生殖細胞腫瘍で見出された。２つの付加的な肺癌(一方は鱗状)では陰性であった。５つの胸癌の一つは陽性であった(正常な胸組織においては発現があった)。
線維腺腫においては、上皮及びストロマエレメントの両方に発現が現れた。また、柔組織肉腫も陽性であった。検査した他の組織は陰性であった。
【０１７４】
実施例８
Ａｐｏ-２遺伝子の染色体局在化
ヒトＡｐｏ-２遺伝子の染色体局在化を、放射線ハイブリッド(ＲＨ)パネル分析により検査した。ＲＨマッピングを、ヒト-マウス細胞の放射線ハイブリッドパネル(Research Genetics)とＡｐｏ-２ｃＤＮＡのコード領域に基づくプライマーを使用するＰＣＲにより、実施した［Gelbら，Hum．Genet.，98：141(1996)］。スタンフォードヒトゲノムセンターデータベースを使用したＰＣＲデータの解析では、Ａｐｏ-２は１１．０５ＬＯＤを有するマーカーＤ８Ｓ４８１に結合しており；Ｄ８Ｓ４８１はＤ８Ｓ２０５５と今度は結合しており、これがヒト染色体８ｐ２１に位置する。また、ＤＲ４の類似した分析においては、ＤＲ４は、ヒト染色体８ｐ２１に位置するマーカーＤ８Ｓ２１２７に結合していることが示された。
本出願人の知る限りでは、今日まで、ＴＮＦＲ遺伝子ファミリーのメンバーで染色体８に位置しているものはなかった。
【０１７５】
実施例９
Ａｐｏ-２に特異的なモノクローナル抗体の調製
０．５μｇ／５０μｌのＡｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンタンパク質(Ribi Immunochemical Research Inc.，Hamilton，MTから購入したMPL-TDMアジュバントで希釈)を、各々の後足の裏の柔らかい部分に、３-４日の間隔で１１回注射することで、Ｂａｌｂ／ｃマウス(チャールズリヴァー研究所から得たもの)を免疫化した。過去に開示されたように［Ashkenaziら、Proc．Natl．Acad．Sci.，38：10535-10539(1991)］、ｐＲＫ５においてヒト免疫グロブリンＧ1重鎖のヒンジ及びＦｃ領域に、Ａｐｏ-２の細胞外ドメイン配列を融合させることにより、Ａｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンタンパク質を産生した。イムノアドヘシンタンパク質を、ヒト２９３細胞に一過性トランスフェクションして発現させ、前掲のAshkenaziらにより記載されたように、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより細胞上清から精製した(上述の実施例２Ｂを参照)。
【０１７６】
最終の追加免疫から３日後に、膝窩リンパ節をマウスから取り除き、単細胞懸濁液を、１％のペニシリン-ストレプトマイシンが補われたＤＭＥＭ培地(Biowhitakker Corp.から得たもの)中で調製した。ついで、リンパ節細胞を３５％のポリエチレングリコールを使用し、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ.１(ATCC CRL 1597)と融合させ、９６-ウェル培養プレートで培養した。融合の結果得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地において選択した。融合から１０日後に、ハイブリドーマ培養の上清をＥＬＩＳＡでスクリーニングし、Ａｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンタンパク質に結合するモノクローナル抗体の有無を試験した。
【０１７７】
ＥＬＩＳＡにおいて、各々のウェルに、ＰＢＳに２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ(Cappel Laboratories社から購入)が入ったものを５０μｌ添加して、９６-ウェルマイクロタイタープレート(Maxisorb;Nunc，Kamstrup，Denmark)をコートし、４℃で一晩インキュベートした。ついでプレートを洗浄用バッファー(０．０５％のトゥイーン２０を含有するＰＢＳ)で３回洗浄した。ついで、マイクロタイタープレートのウェルを、ＰＢＳに２．０％のウシ血清アルブミンが入ったもの５０μｌでブロックし、室温で１時間インキュベートした。ついでプレートを、洗浄用バッファーで、再度３回洗浄した。
【０１７８】
洗浄工程後、アッセイ用バッファーに０．４μｇ／ｍｌのＡｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンタンパク質(上述のもの)が入ったもの５０μｌを各々のウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄用バッファーで３回洗浄した。
洗浄工程に続き、１００μｌのハイブリドーマ上清又は精製した抗体(プロテインＡ-セファロースカラムを使用)(1μｇ／ｍｌ)を、ＣＤ４-ＩｇＧが存在する指定ウェルに添加した。１００μｌのＰ３Ｘ６３ＡｇＵ.１骨髄腫細胞の条件培地を、対照として他の指定ウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄用バッファーで３回洗浄した。
【０１７９】
次に、アッセイ用バッファー［０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％のトゥイーン２０、０．０１％のチメルソール(Thimersol)がＰＢＳに入ったもの］で、１：１０００に希釈されたＨＲＰ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ(Cappel Laboratories社から購入)を50μｌ、各々のウェルに添加し、プレートを振盪装置上で、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄用バッファーで３回洗浄し、ついで各々のウェルに５０μｌの基質(ＴＭＢマイクロウェル・ペルオキシダーゼ基質、Kirkegaard & Perry，Gaithersburg，MD)を添加し、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌのＴＭＢ１-成分終止溶液(ジエチレングリコール，Kirkegaard & Perry)を各々のウェルに添加して反応を終了させ、４５０ｎｍでの吸光度を自動マイクロタイタープレート読取装置で読み取った。
【０１８０】
ＥＬＩＳＡによりスクリ-ニングされたハイブリドーマ上清の内、２２の上清が陽性であると判断された(バックグラウンドの約４倍高いと算出された)。ＥＬＩＳＡで陽性であると判断された上清を、さらに９Ｄ細胞(Ａｐｏ-２を発現するヒトＢリンパ球様株化細胞；Genentech，Inc.)及びＦＩＴＣ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧを使用してＦＡＣＳ分析により分析した。この分析のため、細胞選別用バッファー(１％のＦＣＳと０．０２％のＮａＮ3を含有するＰＢＳ)に懸濁させた２５μｌの細胞(４×１０6細胞／ｍｌ)をＵ字底のマイクロタイターウェルに添加し、１００μｌの培養上清又は精製した抗体(プロテインＡ-セファロースカラムを使用)(１０μｇ／ｍｌ)が細胞選別用バッファーに入ったものと混合し、氷上で３０分間インキュベートした。ついで、細胞を洗浄し、１００μｌのＦＩＴＣ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧと共に、４℃で３０分間インキュベートした。ついで細胞を２回洗浄し、１５０ｍｌの細胞選別用バッファーに再懸濁させ、ＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickinson，Mountain View，CA)により分析した。ＦＡＣＳ分析により、８／２２の上清が抗Ａｐｏ-２抗体に対して陽性であることが示された。
【０１８１】
図７は、３Ｆ１１.３９.７と称されるＡｐｏ-２抗体の一つとインキュベートした９Ｄ細胞のＦＡＣＳ染色を示す。図７に示すように、３Ｆ１１.３９.７抗体は、９Ｄ細胞において発現するＡｐｏ-２レセプターを認識する。
【０１８２】
実施例１０
アポトーシスを拮抗的に誘導するＡｐｏ-２抗体の能力のアッセイ
ハイブリドーマ上清及び精製した抗体(上記の実施例９に記載)について、Ａｐｏ-２媒介性９Ｄ細胞アポトーシスの誘導活性を試験した。９Ｄ細胞(５×１０5細胞／０．１ｍｌ)を、１００μｌの完全ＲＰＭＩ培地に種々の濃度の抗体が入ったものと共に、４℃で１５分間インキュベートした。ついで細胞を３７℃で５分間インキュベートし、３００μｌの完全ＲＰＭＩに１０μｇのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体(Cappel研究所)が入ったものを細胞試料のいくつかに添加した。この時点で、細胞を、７％のＣＯ2の存在下、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１８３】
ついで細胞を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞の生存力を、製造者の推奨(Clontech)に従い、ホスファチジルセリンに結合するＦＩＴＣ-アネキシンＶの染色により測定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、２０μｌの結合用バッファーに再懸濁させた。１０μｌのアネキシン-Ｖ-ＦＩＴＣ(１μｇ/ｍｌ)と１０μｌのヨウ化プロピジウムを細胞に添加した。暗所で１５分間インキュベートした後、９Ｄ細胞をＦＡＣＳにより分析した。
【０１８４】
図８に示すように、３Ｆ１１.３９.７抗体(ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃの不在下において)は、対照抗体と比較して、９Ｄ細胞においてアポトーシスを誘導している。しかし、アゴニスト活性は、ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃの存在下でＡｐｏ-２レセプターが架橋することにより高められた(図９参照)。９Ｄ細胞において、抗体を組合せることによりアポトーシスが高められ(図９)、これはＡｐｏ-２のアポトーシス活性に匹敵する(データは示さず)。
【０１８５】
実施例１１
Ａｐｏ-２リガンド誘導性アポトーシスを阻止する抗体能力のアッセイ
ハイブリドーマ上清及び精製した抗体(上記の実施例９に記載)について、Ａｐｏ-２リガンド誘導性９Ｄ細胞アポトーシスを阻止する活性を試験した。９Ｄ細胞(５×１０5細胞／０．１ｍｌ）を、完全ＲＰＭＩ培地(ＲＰＭＩに１０％ＦＣＳ、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウムを加えたもの)に懸濁させ、個々のファルコン２０５２管に配した。ついで、細胞を、２００μｌの培地に１０μｌの抗体が入ったものと共に、氷上で１５分間インキュベートした。０．２ｍｌのＡｐｏ-２リガンド(２．５μｇ／ｍｌ)(WO 97/25428に記載されているようにして調製された可溶性ＨｉｓタグＡｐｏ-２Ｌ；さらに、Pittiら，上掲を参照)を、完全ＲＰＭＩ培地に懸濁し、ついで９Ｄ細胞が収容された管に添加した。９Ｄ細胞を７％のＣＯ2の存在下、３７℃で一晩インキュベートした。ついでインキュベートされた細胞を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞の生存力を、製造者の推奨(Clontech)に従い、ホスファチジルセリンに結合するＦＩＴＣ-アネキシンＶの染色により測定した。特に、細胞をＰＢＳで洗浄し、２０μｌの結合用バッファーに再懸濁させた。１０μｌのアネキシン-Ｖ-ＦＩＴＣ(１μg/ｍｌ)と１０μｌのヨウ化プロピジウムを細胞に添加した。暗所で１５分間インキュベートした後、９Ｄ細胞をＦＡＣＳにより分析した。
【０１８６】
結果を図１０に示す。９Ｄ細胞はＡｐｏ-２Ｌに対する一を越えるレセプターを発現するため、Ａｐｏ-２Ｌは、Ａｐｏ-２又はＤＲ４レセプターのいずれかと相互作用することにより、９Ｄ細胞においてアポトーシスを誘導することができる。よって、Ａｐｏ-２抗体のあらゆる阻止活性を検出するためには、ＤＲ４とＡｐｏ-２Ｌとの間の相互作用をブロックする必要がある。抗ＤＲ４抗体である４Ｈ６．１７.８(ATCC HB-12455)と組合わせて、Ａｐｏ-２抗体である３Ｆ１１.３９.７は、Ａｐｏ-２Ｌにより誘導されるアポトー
シスの約５０％をブロックすることができた。残った約５０％のアポトーシス活性は、図１０に示されるように、それら自身によるこれら２つの抗体のアゴニスト活性によるもの
であると考えられる。従って、３Ｆ１１.３９.７抗体は、阻止するＡｐｏ-２抗体又はＡｐｏ-２に対するＡｐｏ-２リガンドの結合に競合する形でＡｐｏ-２に結合する抗体であると考えられる。
【０１８７】
実施例１２
他のＡｐｏ-２リガンドレセプターへのＡｐｏ-２抗体の結合性をテストするためのＥＬＩＳＡアッセイ
実施例９に記載したモノクローナル抗体が、Ａｐｏ-２以外の他の既知のＡｐｏ-２Ｌレセプターに結合することができたか否かを測定するためにＥＬＩＳＡを実施した。特に、３Ｆ１１.３９.７抗体の、ＤＲ４［Panら，上掲］、ＤｃＲ１［Sheridanら,上掲］、及びＤｃＲ２［Marstersら，Curr．Biol.，7:1003-1006(1997)］に対する結合性を調べた。ＥＬＩＳＡは、本質的に上述の実施例９に記載したようにして実施した。
結果を図１１に示す。Ａｐｏ-２抗体３Ｆ１１.３９．７はＡｐｏ-２に結合した。また３Ｆ１１.３９.７抗体は、ＤＲ４に対してはいくらかの交差反応性を示したが、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２に対しては示さなかった。
【０１８８】
実施例１３
抗体のアイソタイピング
３Ｆ１１.３９．７抗体(上述のもの)のアイソタイプを決定するため、ヤギ抗マウスＩｇ(Fisher Biotech，Pittsburgh，PA)に特異的なアイソタイプで、マイクロタイタープレートを４℃で一晩かけて被覆した。ついでプレートを洗浄用バッファー(上述の実施例９に記載したもの)で洗浄した。ついで、マイクロタイタープレートのウェルを２００μｌの２％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)で閉塞し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、再度洗浄用バッファーで３回洗浄した。次に、５μｇ／ｍｌの精製３Ｆ１１.３９.７抗体を１００μｌ、指定ウェルに加えた。プレートを室温で３０分インキュベートし、ついで５０μｌのＨＲＰ-抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ(上述したもの)を各々のウェルに添加した。プレートを室温で３０分インキュベートした。プレートに結合したＨＲＰのレベルを、上述のＨＲＰ基質を使用して検出した。
アイソタイピング分析により、３Ｆ１１.３９.７抗体はＩｇＧ１抗体であることが示された。
【０１８９】
実施例１４
単鎖Ａｐｏ-２抗体
Ａ．ストレプトアビジンで被覆した常磁性ビーズを使用した抗体ファージ選択
ファージライブラリを、可溶性ビオチン化抗原及びストレプトアビジン被覆常磁性ビーズを使用して選択した。抗原、上述した実施例２Ｂに記載したようにして調製したＡｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンを、製造者の使用説明書に従い、IMMUNO PURENHS-ビオチン(ビオチニ-Ｎ-ヒドロキシ-スクシンイミド、Pierce)を使用してビオチン化した。
２つのパニング実験を行った。第１の実験は、Ａｐｏ-２に特異的であり、ＤＲ４又はＤｃＲ１と交差反応しないファージクローンを単離するためのものである。３段階のパニングを行った。第１段階において、Cambridge Antibody Technologiesのファージライブラリ１０μｌを、８００μｇのＣＤ４−Ｉｇ、３００μｇのＤＲ４-Ｉｇ、及び２００μｇのＤｃＲ１-Ｉｇを含有するＭＰＢＳＴ(３％のドライミルクパウダー、１Ｘ ＰＢＳ、０．２％のトゥイーン)を用い、室温で回転ホイールで１時間ブロックした［ＣＤ４-Ｉｇ、ＤＲ４、及びＤｃＲ１は、Caponら，Nature，337：525(1989)；パンら，上掲；及びSheridanら，上掲に記載されている］。ついで、ビオチン化Ａｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンを最終濃度が１００ｎＭになるように添加し、ファージを３７℃、１時間で抗原に結合させた。一方、３００ｍｌの、ストレプトアビジン(DYNAL)で被覆されたDYNABEAS M-280を１ｍｌのＭＰＢＳＴで３回洗浄し［DYNAL磁性粒子濃縮器(Magnetic Particle Concentrator)使用］、ついで、ローテータ上で、１ｍｌの新鮮ＭＰＢＳＴを用い、３７℃で２時間ブロックした。ビーズをＭＰＣで収集し、５０μｌのＭＰＢＳＴに再懸濁させ、ファージプラス抗原溶液に添加した。室温で１５分間、ホイールで混合し続けた。ついで、DYNABEADSと付着したファージを、１ｍｌのＰＢＳ-ＴＷＥＥＮで３回、ＭＰＢＳで１回、続いてＰＢＳで３回の合計７回洗浄した。
【０１９０】
１００ｍＭのトリエチルアミン３００μｌを用い、室温で５分間インキュベートすることで、ビーズからファージを溶出させた。ファージ含有上清を取り出し、１Ｍのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ７．４)１５０μｌで中和した。中和ファージを使用し、ｍｉｄ-ｌｏｇ ＴＧ１宿主細胞に感染させ、２％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンが補足された２ＹＴ寒天上に配した。３０℃で一晩増殖させた後、コロニーを１０ｍｌの２ＹＴに擦り取った。５０μｌのこの溶液を使用し、カルベニシリンとグルコースと共に２５ｍｌの２ＹＴに接種し、３７℃で２時間インキュベートし、振盪させた。ヘルパーファージＭ１３ＫＯ7(Pharmacla)を、１０のｍ.ｏ．ｉ.で添加した。吸着後、細胞をペレット状にし、カルベニシリン(１００μｇ／ｍｌ)とカナマイシン(５０μｇ／ｍｌ)を含む２ＹＴ２５ｍｌに再懸濁させ、３０℃で４時間増殖させ続けた。大腸菌を遠心分離によりファージから取り除き、１ｍｌのこれらのファージ（約１０12ｃ.ｆ.ｕ.)を次の選択段階に使用した。
【０１９１】
第２段階の選択において、１ｍｌの収集ファージを３％のドライミルク、１Ｘ ＰＢＳ、０．２％のＴＷＥＥＮで調節し、ついで１００μｇのＤＲ４-Ｉｇ、６５μｇのＤｃＲ１-Ｉｇ、及び５００μｇのＣＤ４−Ｉｇをブロッキングのために添加した。選択のために、ビオチン化Ａｐｏ-２を１０ｎＭで添加した。２サイクルの７回洗浄まで洗浄の厳密性を増加させた。
第３段階の選択において、ファージをＭＰＢＳＴのみでブロックした。ビオチン化Ａｐｏ-２を１ｎＭまで添加し、洗浄の厳密性を、３サイクルの７回洗浄まで増やした。比較的少ないクローンしかこの段階では得られなかった；よって５ｎＭのビオチン化Ａｐｏ-２を使用し、全ての他の条件を上述のように繰り返して、パン２Ｂ、段階３を実施した。
【０１９２】
第２のパニング実験を、段階１及び２において、ファージ溶液のブロックを１．０ｍｇ／ｍｌのＣＤ４-Ｉｇを含有するＭＰＢＳＴ(他のイムノアドヘシンはない)で行い、段階３ではＭＰＢＳＴのみでブロックしたことを除き、上述したものと同様にして実施した。ビオチン化Ａｐｏ-２を、段階１において２００ｎＭで、段階２において６０ｎＭで、及び段階３において１２ｎＭで添加した。各々の段階において、１００ｎＭのトリエチルアミン３００μｌ、ついで０．１Ｍのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ７.５)３００μｌ、さらに１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するグリシン-０．１Ｍ-ＨＣｌ(ｐＨ２．２)３００ｍｌを用いて、ファージを磁性ビーズから溶出させた。３回連続の溶出により得られたファージをプールし、上述の宿主株への感染に使用した。
【０１９３】
Ｂ．選択されたクローンのＥＬＩＳＡスクリーニング
各段階で選択した後、個々のカルベニシリン耐性コロニーをＥＬＩＳＡでスクリーニングし、Ａｐｏ-２結合性ファージをつくりだすものを確認した。二又はそれ以上のアッセイフォーマットで陽性であってクローンのみをさらに研究した。
個々のクローンを９６ウェル組織培養プレートにおいて、２％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンと共に、２ＴＹでインキュベートし、濁るまで増殖させた。ついで培養物に、Ｍ１２ＫＯ７ヘルパーファージを、ｍ.ｏ.ｉ.１０で感染させ、感染細胞をカルベニシリン(１００μｇ／ｍｌ)とカナマイシン(５０μｇ／ｍｌ)を含有する２ＹＴ培地に移し、ゆっくりと振とうしながら３０℃で一晩増殖させた。
【０１９４】
NUNC MAXISORPマイクロタイタープレートを、４℃で一晩、５０ｍＭの炭酸塩バッファー(ｐＨ９．６)中に２μｇ／ｍｌのＣＤ４-ＩｇＧ、又はＡｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンが入ったもので、ウェル当り５０μｌで被覆した。抗原を取り出した後、プレートを、ＰＢＳに３％のドライミルクが入ったもの（ＭＰＢＳ）で、室温で２時間ブロックした。
ファージ培養物を遠心分離し、１００μｌのファージを含有する上清を、２０μｌの６ｘＰＢＳ／１８％のドライミルクで、室温で１時間ブロックした。ブロックをタイタープレートから取り除き、ブロックされたファージを添加し、室温で１時間結合させた。洗浄後、ＭＰＢＳにファージを酉洋わさびペルオキシダーゼ抱合抗Ｍ１３抗体(Pharmacia)が入ったもの、続いて３',３',５',５'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)により検出した。反応をＨ2ＳＯ4を添加することにより終止させ、Ａ460nmからＡ405nmを引いて、読み取りを行った。
【０１９５】
Ｃ．クローンのＤＮＡフィンガープリント法
Ａｐｏ-２結合クローンの多様性を、リーダー配列の上流をアニール化したプライマーｐＵＣ１９Ｒ(５'ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧ３')(配列番号：１２)と、遺伝子ＩＩＩの５'末端がアニール化されたｆｄｔｅｔｓｅｑ(５'ＧＴＣ ＧＴＣ ＴＴＴ ＣＣＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＡＧＴ３')(配列番号：１３)を使用し、ｓｃＦｖ挿入物をＰＣＲ増幅し、ついで頻繁切断制限酵素ＢｓｔＮＩで消化させることにより測定した。
ＤＮＡフィンガープリント法：プロトコール混合物Ａ：ｄＨ２０ ６７μｌ １０ｘａｍｐｌｉＴａｇバッファー １０ ２５ｍＭのＭｇＣｌ２ １０ ＤＭＳＯ、５０％ ２ 前進プライマー １混合物Ｂ： ２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ ８μｌ ＡＭＰＬＩＴＡＱ ０．５ リバースプライマー １．０ ９０μｌの混合物Ａを反応管に入れ、ついで黄色チップを使用し、非常に少量の大腸菌コロニーと共にインキュベートした。ついで、反応混合物をＰＣＢブロックで９８℃まで、３分間加熱し、取り出し、氷上に置いた。ついで、１０μｌの混合物Ｂを添加し、反応混合物を、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分２０秒、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)２４００サーモサイクラーで２５サイクル、サーモサイクルさせた。ついで、１０μｌの結果として生じた反応生成物を取り出し、１％のアガロースゲル上を移動させ、１ｋＢバンドを試験した。残った混合物を１ｘＢｓｔＮＩ反応バッファーにし、５単位のＢｓｔＮＩを添加し、ＤＮＡを６０℃で２時間消化した。ついで、得られた試料をGenegel Excelの１２．５％アクリルアミドゲル(Pharmacia Biotech)の電気泳動にかけた。
【０１９６】
Ｄ．クローンの配列決定
各指紋パターンの代表的クローンのヌクレオチド配列が得られた。コロニーを、２％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンが補足された５０ｍｌのＬＢ培地でインキュベートし、３０℃で一晩増殖させた。ＤＮＡをQiagen Tip-100s及び製造者のプロトコールを使用して単離し、蛍光ジデオキシ鎖ターミネーターでサイクル配列化した(Applied Biosystems)。試料をアプライド・バイオシステムズ３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサーにかけ、プログラム「Sequencher」(Gene Codes Corporatｉon)を使用し、配列を解析した。選択された抗体１６Ｅ２、２０Ｅ６及び２４Ｃ４のヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号：６、配列番号：７及び配列番号：８に示す(図１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃ)。抗体１６Ｅ２、２０Ｅ６及び２４Ｃ４の対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：９、配列番号：１０及び配列番号：１１に示す(また図１６)。加えて、図１６においては、これらｓｃＲＶ分子のシグナル領域、及び重及び軽鎖相補性決定領域(下線を付した)が同定されている。図１６に示されるＣＤＲ領域は、Kabetら，「免疫学的関心のあるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」，NIH Publ．No.91-3242，第5版、の方法に従い割当てられた。
【０１９７】
Ｅ．(ｈｉｓ)6を有するｓｃＦｖの精製
可溶性抗体のタンパク質精製のために、大腸菌株３３Ｄ３をファージミドＤＮＡで形質転換した。カルベニシリンとグルコースを有する５ｍｌの２ＹＴを使用し、３０℃で一晩培養して増殖させた。２．５ｍｌのこれら培養物を、２５０ｍｌの同じ培地で希釈し、ＯＤ600が約１．２になるまで増殖させた。細胞をペレット状にし、ＩＰＴＧ(１ｍＭ)とカルベニシリン(１００μｇ／ｍｌ)を含有する５００ｍｌの２ＹＴに再懸濁させ、発現を誘導し、２２℃でさらに１６時間増殖させた。細胞ペレットを収集し、−２０℃で凍らせた。
【０１９８】
抗体を固定金属キレートアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)で精製した。冷凍ペレットを１０ｍｌの氷冷ショッカート(shockate)バッファー(２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０％のスクロース、１ｍＭのＰＭＳＦ)に、１時間、氷上で振盪することにより再懸濁させた。２０ｍＭになるまでイミダゾールを添加し、遠心分離により、細胞屑を除去した。上清を１ｍＭのＭｇＣｌ2と５０ｍＭのリン酸バッファーｐＨ７．５に調節した。QiagenのＮｉ-ＮＴＡアガロース樹脂を、製造者の使用説明書に従い使用した。樹脂を、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．５で平衡にし、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、及びショッカートを添加した。結合が、バッチモード又は重力流カラムのいずれかで生じた。ついで、樹脂を１０総容積の平衡バッファーで２回、５０ｍＭまで増加させたイミダゾールを含有するバッファーで２回洗浄した。タンパク質の溶出は、５０ｍＭのリン酸バッファー(ｐＨ７．５)、５００ｍＭのNａＣｌ及び２５０ｍＭのイミダゾールで行った。過剰の塩及びイミダゾールをＰＤ-１０カラム(Pharmacia)で除去し、タンパク質を約１ｍｌ容量のCentricom10を使用して濃縮した。
濃度は、Ａ２８０ｎｍで１．０＝０．６ｍｇ／ｍｌであると仮定して、分光光度的に推定した。
【０１９９】
Ｆ．抗Ａｐｏ-２ｓｃＦｖの結合特異性を決定するアッセイ
ｓｃＦｖクローンの各々の特異性を評価するため、ＥＬＩＳＡアッセイを行い、Ａｐｏ-２のＥＣＤ−Ｉｇ、ＤＲ４-Ｉｇ、ＤｃＲ１-Ｉｇ、ＤｃＲ２-Ｉｇ及びＣＤ４-Ｉｇ(上述及び実施例１２に記載)に対する１６Ｅ２、２０Ｅ６及び２４Ｃ４の結合性を評価した。
簡単に述べると、NUNC ELISAプレートを、０．０５Ｍの炭酸ナトリウムバッファー(ｐＨ９．５)に１μｇ／ｍｌのレセプターＩｇイムノアドヘシン分子が入ったもの５０μｌで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。ついでプレートを２８５μｌのＥＬＩＳＡ希釈液(０．５％のＢＳＡ、０．０５％のトゥイーン２０が補足されたＰＢＳ、ｐＨ７．４)で、室温で少なくとも１時間ブロックした。
【０２００】
５０μｌのｓｃＦｖを１：５の段階希釈のプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。この１時間の希釈後に、プレートをＰＢＳ／０．０５％のトゥイーンで６回洗浄した。被覆されたプレートを抗原に結合させた後、可溶性ｓｃＦｖを、ウェル当り１μｇ／ｍｌのＭａｂ ９Ｅ１０（抗ｃ-ｍｙｃ抗体；ATCC CRL 1729)を５０μｌ添加し、プレートを室温で１時間インキュベートすることにより検出した。プレートをＰＢＳ／０．０５％のトゥイーンで６回洗浄した後、ＭＰＢＳに１：５０００希釈度で西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合抗ネズミ抗体(Cappelカタログ：55569)が入ったものを５０μｌ、プレートに添加し、１時間インキュベートした。５０μｌの３',３',５',５'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)ペルオキシダーゼ基質(KPLカタログ＃：50-76-00)を添加することにより、観察可能なシグナルを生じさせた。Ｈ2ＳＯ4を添加することにより反応を終止させ、Ａ450nmからＡ405nmを引いて、読み取りを行った。
【０２０１】
図１２Ａ、１２Ｂ及び１２Ｃに示すように、ＥＬＩＳＡ分析により、各々のこれら抗体が、Ａｐｏ-２に対して比較的高度の特異性を示すことがわかった。
また、トランスフェクション細胞を利用するさらなるアッセイによっても、Ａｐｏ-２に対する１６Ｅ２抗体の特異性が示された。特に免疫組織化学的実験を行い、Ａｐｏ-２及びＤＲ４-トランスフェクションＣＨＯ細胞に対する１６Ｅ２抗体の結合特異性を評価した。ＣＨＯ細胞を、ベクター単独又はＡｐｏ-２又はＤＲ４に対する遺伝子を含むベクターでトランスフェクションした。トランスフェクション細胞を培養プレートから取り出し、ペレット状にし、ＰＢＳで２回洗浄した。ついでペレットを、Ｏ.Ｃ.Ｔ.(Fisher)に再懸濁させ、イソペンテイン及びＬＮ2中でフラッシュ冷凍させ、通常のプロトコールを使用し、後者を薄片に切断した。切断細胞の染色をVectastain Elite ABCキットを使用して行った。
【０２０２】
切断薄片を抗Ａｐｏ-２抗体１６Ｅ２又は負の対照用単鎖抗体と共にインキュベートした。使用した二次抗体は、ビオチン化された抗ｃ-ｍｙｃ ９Ｅ１０抗体、又は抗ペンタＨｉｓ抗体(Quagen)で続いてビオチン化抗マウスＩｇＧである。
この免疫組織化学的アッセイにより、Ａｐｏ-２トランスフェクション細胞は特異的に染色されるが、ＤＲ４トランスフェクション細胞は染色されないことが示された。細胞染色は細胞質が主として染色された。
【０２０３】
実施例１５
アポトーシスを拮抗的に誘導するＨｉｓタグｓｃＦｖの能力のアッセイ
Ａ．アネキシン-Ｖ-ビオチン／ストレプトアビジン-［Ｓ-３５］９６ウェルアッセイ
精製したｓｃＦｖ抗体(上記の実施例１４に記載されたもの)の、Ａｐｏ-２媒介性アポトーシスを誘導する能力について試験した。
簡単には、ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞(ヒト肺癌株化細胞；ATCC HTB 58)又はＨＣＴ１１６細胞(ヒト結腸癌株化細胞；ATCC CCL 247)(４Ｘ１０4細胞／ウェル)を、アッセイ用培地(フェノールレッドフリーのダルベッコ変性イーグル培地と、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補足されたフェノールレッドフリーのハムＦ-１２栄養混合物との１：１混合物)にある９６ウェルに等分し、３７℃で一晩付着させた。ついで培地を除去し、最終濃度が５０ｕｇ／ｍｌであるｓｃＦｖ(１６Ｅ２又は２０Ｅ６)を含有するアッセイ用培地をウェルに０．１ｍｌ添加し(プレートにおいて１：２の連続的希釈を行った)、室温で１時間インキュベートした。他の単鎖抗体：抗組織因子ｓｃＦｖクローン、７Ｄ５、又は１９Ｂ８と称されるｓｃＦｖを負の対照として使用した。ｓｃＦｖ抗体と１時間インキュベートした後、１０ｕｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ(Qiagen、カタログ番号1007671)又は抗-ｃ-ｍｙｃ抗体を０．１ｍｌ、適切なウェルに添加した。架橋抗体を受け入れていないウェルは、培地を単独で受け入れた。ついで、プレートを室温で３０分間インキュベートした。３０分のインキュベート後、１０ｕｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ(ICN cst．No.67-029)を０．１ｍｌ、適切なウェルに添加した。抗ＩｇＧ抗体を受け入れていないウェルは、培地を単独で受け入れている。ついで、プレートを１５分間インキュベーターに配し、ｐＨを７．０に戻した。正の対照用として、ｐＨ７．０のリン酸カリウムバッファーにＡｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ-２Ｌ)(実施例１１で記載したようにして調製)が入った２ｕｇ／ｍｌ溶液を適切なウェルに添加し、プレートで２倍の段階希釈を行った。負の対照用ウェルは、培地を単独で受け入れている。ついで、細胞を５％のＣＯ2の存在下で３７℃で一晩インキュベートした。２ＸＣａ2+結合バッファー(NeXins B.V.)にアネキシン-Ｖ-ビオチン(１ｕｇ／ｍｌ)が入ったものを０．０５ｍｌ、ウェルに添加し、振盪器で３０分間混合した。２ＸＣａ2+結合バッファー(NeXins B.V.)に０．０５ｍｌのストレプタビジン-［Ｓ−３５］が入ったもの(最終濃度は２．５ｘ１０4ｃｐｍ／ウェル)(Amersham)をウェルに添加し、振盪器で３０分間混合した。ついでプレートを密封し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。アポトーシスの程度を評価するため、ついでプレートをTrialux Microbeta計測器(Wallace)で計測し、アネキシン-Ｖ-結合に相当するｃｐｍ値を得た。
図１３Ｃ及び１４Ｂに示すように、１６Ｅ２と２０Ｅ６抗体は、ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞において、アポトーシスを拮抗的に誘導した。
【０２０４】
Ｂ．クリスタルバイオレットアッセイ
上述のアネキシン-Ｖ-ビオチン／ストレプトアビジン-［Ｓ-３５］アッセイに加えて、ｓｃＦｖ抗体(上述の実施例１４に記載)の、Ａｐｏ-２媒介性アポトーシスを誘導する能力について、クリスタルバイオレットを利用するアッセイを介してテストした。
簡単には、ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞を、４Ｘ１０4細胞／ウェルでアッセイ用培地(上記のＡ部に記載)に配し、３７℃で一晩付着させた。培地を除去し、最終濃度が５０ｕｇ／ｍｌであるｓｃＦｖを含有するアッセイ用培地(上記のＡ部に記載)を適切なウェルに０．１ｍｌ添加した(ｓｃＦｖが添加されていないウェルは培地交換を受ける)。選択されたウェルには、１０ｕｇ／ｍｌのｓｃＦｖ１６Ｅ２と１００ｕｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体とを、プレートへの添加前に４℃で５時間混合し続けて組合せた「前複合」試料が収容されている。プレートを室温で１時間インキュベートした。
【０２０５】
ｓｃＦｖ培地を除去し、１０ｕｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ(Qiagen、カタログ番号1007671)又はアッセイ培地に希釈された抗-ｃ-ｍｙｃ抗体を０．１ｍｌ、ウェルに添加した(ｓｃＦｖが添加されていないウェルは培地交換を受ける)。ついで、プレートを室温で３０分間インキュベートした。
ついで培地を除去し、アッセイ用培地に希釈された１０ｕｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ(Fcフラグメント特異性-ICN cst．No.67-029)を０．１ｍｌ、適切なウェルに添加した(抗Fcのないウェルは培地交換を受ける)。ついで、プレートを１５分間インキュベーターに配し、ｐＨを７．０に戻した。
Ａｐｏ-２Ｌ(ｐＨ７．０のリン酸カリウムバッファーに１００μｇ／ｍｌで保存)を２μｇ／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌを適切なウェルに添加した。プレートにつき段階２倍希釈を実施した。ついでプレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【０２０６】
全ての培地をウェルから除去し、プレートに多量のクリスタルバイオレット溶液を注いだ。プレートを１５分間染色した。流生水を大量にプレートに注いでクリスタルバイオレットを除去した。ついでプレートを一晩乾燥させた。
プレートを、５４０ｎｍにおいてＳＬＴプレート読取器で読み、Excel macro及び4p-fitを使用し、データを分析した。
図１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａ及び１４Ｂに示すように、１６Ｅ２と２０Ｅ６抗体は、ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞において、アポトーシスを拮抗的に誘導した。
【０２０７】
実施例１６
アポトーシスを拮抗的に誘導するｇＤタグｓｃＦｖの能力のアッセイ
１６Ｅ２ｓｃＦｖの精製したｇＤタグ型の、Ａｐｏ-２媒介性アポトーシスを誘導する能力について、上記の実施例１５に記載されたクリスタルバイオレットアッセイで試験した。
Ａ．ｇＤタグを有するｓｃＦｖの作成
１６Ｅ２のｓｃＦｖ形態のＳｆｉ ＩからＮｏｔ Ｉフラグメントを、元のライブラリのｌａｃＺプロモーターとハイブリッドシグナル配列ではなく、ｐｈｏＡプロモーターとｓｔＩＩシＫグナル配列を含むｐＡＫ１９の誘導体［Carterら，Methods：A Companion to Methods in Enzymolngy，3：183-192(1991)］にサブクローン化した。精製を容易にするため、単純ヘルペスウィルス１型糖タンパクＤ［Laskyら，DNA，3：23-29(1984)］由来の１２アミノ酸(met-ala-asp-pro-asn-arg-phe-arg-gly-lys-asp-leu、配列番号：１４)をコードするＤＮＡフラグメントを合成し、Cambridge Antibody Technologiesのライブラリクローンに当初は存在する(ｈｉｓ)6及びｃ-ｍｙｃエピトープの代わりに、ＶＬドメインの３'末端に挿入した。
【０２０８】
Ｂ．大腸菌における発現
ｓｃＦｖ１６Ｅ２-ｇＤに対する遺伝子を含むプラスミドを、振盪フラスコ培養で発現させるために、大腸菌株３３Ｄ３中に形質転換させた。カルベニシリンとグルコースを含有する２ＹＴを５ｍｌ使用し、３０℃で一晩培養して増殖させた。２．５ｍｌのこれらの培養物を２５０ｍｌの同じ培地で希釈し、ＯＤ600が約１．０になるまで増殖させた。細胞をペレット状にし、カルベニシリン(１００μｇ／ｍｌ)を含有する変性ＡＰ-５最小培地５００ｍｌに再懸濁させ、３０℃でさらに１６時間増殖させた。ついで細胞をペレット状にし、凍らせた。
【０２０９】
Ｃ．ｇＤタグを有するｓｃＦｖの精製
冷凍細胞のペーストを、１ｇｍ／１０ｍｌのショッカートバッファー(２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０％のスクロース、１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ７．２)に再懸濁させ、氷上で４時間ゆっくりと攪拌した。ついで細胞懸濁液をPolytronマイクロ流動化装置(Brinkman)により加工した。細胞屑を１００００ｘｇで３０分間遠心分離することにより除去した。０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過した後、ＰＢＳで平衡にしたＣＮＢｒセファロースに結合した抗ｇＤ抗体５Ｂ６［Paborskyら，タンパク質工学（Protein Engineering，3：547-553(1990)］からなるアフィニティーカラム(２．５ｘ９．０ｃｍ)に上清を充填した。カラム流出液の吸光度がベースラインに等しくなるまで、カラムをＰＢＳで１８時間洗浄した。全ての工程を、２５ｃｍ／時間の線形流量で４℃において実施した。溶出は、０．１Ｍの酢酸、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．９で行った。カラムフラクションを２８０ｎｍの吸光度でモニターし、ピークのフラクションをプールして、１．０Ｍのトリス(ｐＨ８．０)で中和し、ＰＢＳで透析して滅菌濾過した。得られたタンパク質調製物を、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。
【０２１０】
Ｄ． クリスタルバイオレットアッセイ
試料がプレートにおいて滅菌希釈１：３され、１６Ｅ２-ｇＤタグ抗体を、１６Ｅ２ｓｃＦｖの２つの他の調製物(図１４Ｃにおいて調製物Ａ及び調製物Ｂと称されているもの)に加えて試験していることを除けば、本質的に実施例１５(Ｂ)に記載されたようにして、アポトーシスアッセイを行った。１６Ｅ２-ｇＤ抗体により、ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞において誘導されるアポトーシスを示すアッセイの結果を図１４Ｃに図示する。
【０２１１】
★ ★ ★ ★ ★
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 UniversityBoulevard，Manassas，Virginia，USA(ATCC)に寄託した：材料 ATCC寄託番号 寄託日pRK-アポ2 209021 1997年5月8日3F11.39.7 HB-12456 1998年1月13日 この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。
【０２１２】
寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死滅もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のもの即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０２１３】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。
実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１Ａ】図１Ａは、天然配列ヒトＡｐｏ-２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：２)及びその誘導アミノ酸配列(配列番号：１)を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、天然配列ヒトＡｐｏ-２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：２)及びその誘導アミノ酸配列(配列番号：１)を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、天然配列ヒトＡｐｏ-２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：２)及びその誘導アミノ酸配列(配列番号：１)を示す。
【図２】図２Ａは、天然配列ヒトＡｐｏ-２の誘導アミノ酸配列を示し、推定シグナル配列には下線をひき、推定膜貫通ドメインは囲み、推定デスドメイン配列には破線の下線を付している。２つのシステインに富んだドメインのシステインには、個々に下線を引いている。図２Ｂは、天然配列ヒトＡｐｏ-２、ＤＲ４、アポ３／ＤＲ３、ＴＮＦＲ１、及びＦａｓ／アポ１(ＣＤ９５)のデスドメイン配列のアラインメントと比較を示す。星印はＴＮＦＲ１による死のシグナル伝達に必須である残基を示す［Tartagliaら，上掲］。
【図３】図３は、Ａｐｏ-２ＬとのＡｐｏ-２ＥＣＤの相互作用を示す。フラッグエピトープタグ付きＡｐｏ-２ＥＣＤでトランスフェクトされた２９３細胞又は擬似トランスフェクトされた２９３細胞の上清をポリ-Ｈｉｓ-タグ付きＡｐｏ-２Ｌと共にインキュベートし、抗フラッグ抱合又はニッケル抱合アガロースビーズで免疫沈降させた。沈殿したタンパク質をポリアクリルアミドゲルによる電気泳動法で分離し、抗Ａｐｏ-２Ｌ又は抗フラッグ抗体を用いた免疫ブロットにより検出した。
【図４Ａ−Ｂ】図４は、Ａｐｏ-２によるアポトーシスの誘導と、可溶性Ａｐｏ-２ＥＣＤによるＡｐｏ-２Ｌ活性の阻害を示す。ヒト２９３細胞(Ａ、Ｂ)又はＨｅＬａ細胞(Ｃ)を、Ａｐｏ-２及び／又はＣｒｍＡをコードしたｐＲＫベクター又はｐＲＫ５ベースプラスミドによりトランスフェクトした。アポトーシスを、形態学的(Ａ)、ＤＮＡ断片化(Ｂ)、又はＦＡＣＳ(Ｃ-Ｅ)により評価した。
【図４Ｃ−Ｅ】ヒト２９３細胞(Ａ、Ｂ)又はＨｅＬａ細胞(Ｃ)を、Ａｐｏ-２及び／又はＣｒｍＡをコードしたｐＲＫベクター又はｐＲＫ５ベースプラスミドによりトランスフェクトした。アポトーシスを、形態学的(Ａ)、ＤＮＡ断片化(Ｂ)、又はＦＡＣＳ(Ｃ-Ｅ)により評価した。可溶性Ａｐｏ-２Ｌを、バッファーでプレインキュベートし、あるいは抗フラッグ抗体又はＡｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシン又はＤＲ４又はＴＮＦＲ１イムノアドヘシンと共にアフィニティー精製し、ＨｅＬａ細胞に添加した。後で細胞のアポトーシスを分析した(Ｄ)。また、Ａｐｏ-２ＥＣＤイムノアドヘシンを備えたＡｐｏ-２Ｌを使用して用量反応分析を行った(Ｅ)。
【図５Ａ−Ｂ】図５は、Ａｐｏ-２、ＤＲ４及びＡｐｏ-２ＬによるＮＦ-κＢの活性化を示す。(Ａ)ＨｅＬａ細胞を、示したタンパク質をコードする発現プラスミドでトランスフェクトした。核抽出物を調製し、電気泳動易動度シフトアッセイにより分析した。(Ｂ)ＨｅＬａ細胞又はＭＣＦ７細胞をバッファー、Ａｐｏ-２Ｌ又はＴＮＦ-アルファで処理し、ＮＦ-κＢ活性をアッセイした。
【図５Ｃ】(Ｃ)ＨｅＬａ細胞をＡｐｏ-２Ｌの添加前に、バッファー、ＡＬＬＮ又はシクロヘキサミドと共にプレインキュベートした。後にＦＡＣＳによりアポトーシスを分析した。
【図６】図６Ａは、ヒト組織のポリＡ ＲＮＡブロットのノーザンハイブリッド形成により分析した、ヒト組織におけるＡｐｏ-２ｍＲＮＡの発現を示す。図６Ｂは、ヒトのガン株化細胞のポリＡ ＲＮＡブロットのノーザンハイブリッド形成により分析した、ヒトのガン株化細胞におけるＡｐｏ-２ｍＲＮＡの発現を示す。
【図７】図７は、ＩｇＧ対照(点線)と比較したＡｐｏ-２抗体３Ｆ１１.３９.７(太線で示す)のＦＡＳＣ分析を示す。３Ｆ１１.３９.７抗体は、ヒト９Ｄ細胞において発現されたＡｐｏ-２レセプターを認識した。
【図８】図８は、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃの不在下において、Ａｐｏ-２抗体３Ｆ１１.３９.７により９Ｄ細胞において誘導されたアポトーシスパーセント(％)を示すグラフである。
【図９】図９は、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃの存在又は不在下における、Ａｐｏ-２抗体３Ｆ１１.３９.７による９Ｄ細胞での、Ａｐｏ-２Ｌと比較した、アポトーシスパーセント(％)を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、９Ｄ細胞においてＡｐｏ-２Ｌにより誘導されるアポトーシスをブロックする、Ａｐｏ-２抗体３Ｆ１１.３９.７の能力を示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、Ａｐｏ-２、及びＤＲ４、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２と称される他の既知のＡｐｏ-２Ｌレセプターに対するＡｐｏ-２抗体３Ｆ１１.３９.７の結合性をテストする酵素結合免疫吸着検定(ELISA)の結果を示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ａｐｏ-２、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＣＤ４-Ｉｇに対する１６Ｅ２抗体の結合性を評価するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、Ａｐｏ-２、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＣＤ４-Ｉｇに対する２０Ｅ６抗体の結合性を評価するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、Ａｐｏ-２、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＣＤ４-Ｉｇに対する２４Ｃ４抗体の結合性を評価するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞を使用するアポトーシスアッセイ(クリスタルバイオレット染色)における、Ａｐｏ-２Ｌと比較した、１６Ｅ２抗体のアゴニスト活性を示すグラフである。
【図１３Ｂ−Ｃ】図１３Ｂは、ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞を使用するアポトーシスアッセイ(クリスタルバイオレット染色)における、７Ｄ５ ｓｃＦｖ抗体(抗組織因子抗体)と比較した、１６Ｅ２抗体のアゴニスト活性を示す棒グラフである。図１３Ｃは、ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞を使用するアポトーシスアッセイ(アネキシンＶ-ビオチン／ストレプトアビジン-［Ｓ35］)における、７Ｄ５ ｓｃＦｖ抗体と比較した、１６Ｅ２抗体のアゴニスト活性を示す棒グラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞を使用するアポトーシスアッセイ(クリスタルバイオレット染色)における、Ａｐｏ-２Ｌと比較した、２０Ｅ６抗体のアゴニスト活性を示すグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、クリスタルバイオレット及びアネキシン Ｖ-ビオチン／ストレプトアビジン-［Ｓ35］アポトーシスアッセイにおいて得られた結果を比較することにより、２０Ｅ６抗体のアゴニスト活性を示すグラフである。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞を使用するアポトーシスアッセイ(クリスタルバイオレット染色)における、Ａｐｏ-２Ｌと比較した、ｇＤタグ１６Ｅ２抗体のアゴニスト活性を示すグラフである。
【図１５Ａ−Ｂ】図１５Ａは、１６Ｅ２と称される単鎖抗体(ｓｃＦｖ)フラグメントのヌクレオチド配列を示す(配列番号：６)。図１５Ｂは、２０Ｅ６と称される単鎖抗体(ｓｃＦｖ)フラグメントのヌクレオチド配列を示す(配列番号：７)。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、２４Ｃ４と称される単鎖抗体(ｓｃＦｖ)フラグメントのヌクレオチド配列を示す(配列番号：８)。
【図１６】図１６は、それぞれ同定された重鎖及び軽鎖ＣＤＲ領域(ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域に下線を付する)及びシグナル配列のアミノ酸配列を有する、１６Ｅ２、２０Ｅ６及び２４Ｃ４と称される単鎖抗体(ｓｃＦｖ)フラグメントを示す。
【図１Ａ】
2010075184.tif 000012
【図１Ｂ】
2010075184.tif 000013
【図１Ｃ】
2010075184.tif 000014
【図２】
2010075184.tif 000015
【図３】
2010075184.tif 000016
【図４Ａ−Ｂ】
2010075184.tif 000017
【図４Ｃ−Ｅ】
2010075184.tif 000018
【図５Ａ−Ｂ】
2010075184.tif 000019
【図５Ｃ】
2010075184.tif 000020
【図６】
2010075184.tif 000021
【図７】
2010075184.tif 000022
【図８】
2010075184.tif 000023
【図９】
2010075184.tif 000024
【図１０】
2010075184.tif 000025
【図１１】
2010075184.tif 000026
【図１２Ａ】
2010075184.tif 000027
【図１２Ｂ】
2010075184.tif 000028
【図１２Ｃ】
2010075184.tif 000029
【図１３Ａ】
2010075184.tif 000030
【図１３Ｂ−Ｃ】
2010075184.tif 000031
【図１４Ａ】
2010075184.tif 000032
【図１４Ｂ】
2010075184.tif 000033
【図１４Ｃ】
2010075184.tif 000034
【図１５Ａ−Ｂ】
2010075184.tif 000035
【図１５Ｃ】
2010075184.tif 000036
【図１６】
2010075184.tif 000037
【配列表】
2010075184000001.app
【外国語明細書】
2010075184000001.pdf
2010075184000002.pdf
2010075184000003.pdf
2010075184000004.pdf