(57)【要約】【課題】  本発明は、優れたＮＫ活性増強剤を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＨＳＫ２０１株（ＮＩＴＥＰ−５８９）の生菌・死菌の菌体、菌体培養物、菌体処理物又はその抽出物を有効成分として含有するＮＫ活性増強剤に係るものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＨＳＫ２０１株（ＮＩＴＥＰ−５８９）の生菌・死菌の菌体、菌体培養物、菌体処理物又はその抽出物を有効成分として含有するＮＫ活性増強剤。
【請求項２】
請求項１に記載のＮＫ活性増強剤を配合してなる、免疫賦活作用を有する経口投与用医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のＮＫ活性増強剤を配合してなる、免疫賦活作用を有する飲食品又は動物用飼料。
【請求項４】
請求項１に記載のＮＫ活性増強剤を配合してなる、免疫賦活作用を有する皮膚外用医薬組成物又は化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌に属するラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）の菌体又はその処理物を含んでなるＮＫ活性増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に免疫力の代表的な指標は、ＮＫ細胞の活性化（ＮＫ活性）であるといわれている。このＮＫ活性とは、ＮＫ細胞が、癌細胞やウイルス感染細胞などを攻撃し、アポトーシスを誘導させる働きのことである。通常、ＮＫ活性は、２０歳代でピークに到達し、加齢とともに徐々に低下していくといわれている。さらに、ＮＫ活性が低い人は高い人よりも発癌率が約２倍近く高くなることがわかっている。
また、感染初期にマクロファージや単球などから、サイトカインであるＩＬ−１２が産生され、産生されたＩＬ−１２はＮＫ細胞やヘルパーＴ細胞などを活性化させてＩＦＮ−γを産生し、活性化されたキラーＴ細胞等の作用で種々の感染源を排除するといわれている。
したがって、生体に備わっているウイルスなどの感染や癌細胞に対する防御機構である免疫力を高めるためには、ＮＫ細胞の活性化（ＮＫ活性）と共にキラーＴ細胞、マクロファージなどを活性化させるＩＬ−１２、ＩＦＮ−γなどのサイトカイン類の産生を促進することが極めて重要である。
【０００３】
近年、古くから、発酵乳製品や漬け物などとして広く食されている乳酸菌の免疫賦活効果に関しての研究が進み、乳酸菌のラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）などのラクトバチルス属に属する各種菌株のうちから、ＮＫ細胞の活性化能を高め、免疫賦活作用がある菌株が次々と発見されてきており(特許文献１〜３、８、非特許文献１)、アスコルビン酸、ビタミンＥ、オーツ麦などの免疫増強物質との併用により、より高い免疫賦活効果を発揮させること（特許文献４〜６）、炊飯用組成物として摂取すること（特許文献７）等が提案されている。
特に、ラクトバチルス・プランタラムに属する菌株については、Ｌ−１３７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１７、特許文献１、４、５、７、非特許文献１）が、ＩＬ−１２の産生の誘導能が高く、ＩＦＮ−γ産生も増強することが知られており、優れたＮＫ細胞の活性化作用が期待されており、ＮＨＴ４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６４、特許文献８）も、ＩＬ−１２産生誘導能が極めて高く、ＩＦＮ−γ産生増強作用も高い菌株で、免疫賦活作用が期待されている。
ラクトバチルス・プランタラム菌株を用いたＮＫ活性増強剤は、乳酸菌飲料等の各種乳酸菌製品として食品加工しやすく、継続摂取にも負担が少ないため、安全性や健康効果そして経済性の面からも極めて有効であると考えられる。また、各種の免疫増強物質（特許文献４〜６）を併用することで、より高い免疫賦活効果が期待できる。
そこで、ラクトバチルス・プランタラムに属する他の菌株の中から、公知のＬ−１３７株及びＮＨＴ４株よりもさらに高いＩＬ−１２の誘導活性及びＩＦＮ−γ産生増強効果を有すると共に、ヒトのＮＫ細胞に対しても確実に活性作用を発揮する菌株を特定できれば、優れたＮＫ活性増強剤となることが期待できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４０６４４８１号公報
【特許文献２】特開２００５−１９４２５９号公報
【特許文献３】特開２００８−５０１０１３号公報
【特許文献４】特開２００１−６４１７４号公報
【特許文献５】特開２００２−８０３６４号公報
【特許文献６】特開２００６−６９９９３号公報
【特許文献７】特許第４０３４６３２号公報
【特許文献８】特開２００８−９９６３２号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Nutr. 136:3069-3073, 2006
【非特許文献２】J. Dairy Sci., 89:2873-2881
【非特許文献３】長谷川隆則、松本貴之、森松文毅、木元広実、小林美穂、野村将、鈴木チセ、日本農芸化学会関東支部２００７年度大会（２００７．１１．１０）要旨
【非特許文献４】平川標、長谷川隆則、松本貴之、亀岡良美、前山佳昭、桑木野幸紀、森松文毅、木村章利、第５５回日本食品科学工学会（２００８．０９．０５−０７）要旨
【非特許文献５】長谷川隆則、平川標、松本貴之、森松文毅、日本食品免疫学会２００８年度大会（２００８．０５．１３−１４）要旨
【非特許文献６】平川標、長谷川隆則、松本貴之、森松文毅、第３８回日本免疫学会（２００８．１２．１−３）要旨
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒトのＮＫ細胞に対しても確実に活性作用を発揮するラクトバチルス・プランタラムに属する菌株を特定し、優れたＮＫ活性増強剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、以前にラクトバチルス・プランタラムに属し、高い抗アレルギー活性効果を有する菌株であるラクトバチルス・プランタラム  ＨＳＫ２０１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−５８９）を単離しており、鼻アレルギーモデルマウスを用いた実験で、アレルギー症状緩和及びＩｇＥ抗体上昇抑制を確認していた（非特許文献３）が、最近当該ＨＳＫ２０１株が顕著なアトピー性皮膚炎緩和機能も有していることを見出し、特許出願している（特願２００８−２１２２４８号）。
【０００８】
ラクトバチルス・プランタラム  ＨＳＫ２０１株は、下記「表１」に示す菌学的性質を有し、抗アレルギー活性向上機能も既知のラクトバチルス・プランタラムと比較し格段に優れているものであり、下記「表２」に示すように、既知のラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１７）とは、アラビノース、ラムノース及びグルコン酸の資化性において異なり、同ＮＨＴ４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６４）とは、ラムノース、エスクリンの資化性において異なる別菌株である。
本発明者らは、このＨＳＫ２０１株が、高いＮＫ活性も有している可能性を想定し、ヒト末梢血単核細胞の試験系により評価した。ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株と、所有している各乳酸菌種でヒト細胞を用いたＮＫ活性を比較したところ、ＨＳＫ２０１株のみが顕著にＮＫ活性を増強することを確認した。比較した菌株中には、ラクトバチルス・プランタラムに属するＨＳＫ２０１株以外の菌株も含まれていたが、いずれの菌株でも特段のＮＫ活性増強効果はみられなかった。
そこで、ラクトバチルス・プランタラムに属する菌株のうちの数種を用いて、同様のヒト末梢血単核細胞を用いた試験でＨＳＫ２０１株と比較したところ、ＨＳＫ２０１株では、顕著なＮＫ活性を発揮するのに対して、ＨＳＫ２０１株以外の菌株ではほとんどＮＫ活性の増強効果を示さなかった。さらに、ＨＳＫ２０１株は、ＩＬ−１２の産生促進能においても、ＩＦＮ−γ産生能においても、他のラクトバチルス・プランタラムと比較して顕著な増強効果を示すことが確認された。
以上のような知見を得たことで、ラクトバチルス・プランタラム  ＨＳＫ２０１株を用いたＮＫ活性増強剤に係る本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＨＳＫ２０１株（ＮＩＴＥＰ−５８９）の生菌・死菌の菌体、菌体培養物、菌体処理物又はその抽出物を有効成分として含有するＮＫ活性増強剤。
〔２〕  前記〔１〕に記載のＮＫ活性増強剤を配合してなる、免疫賦活作用を有する経口投与用医薬組成物。
〔３〕  前記〔１〕に記載のＮＫ活性増強剤を配合してなる、免疫賦活作用を有する飲食品又は動物用飼料。
〔４〕  前記〔１〕に記載のＮＫ活性増強剤を配合してなる、免疫賦活作用を有する皮膚外用医薬組成物又は化粧料。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＨＳＫ２０１株は、マクロファージからのＩＬ−１２産生促進能が極めて高く、ＮＫ細胞が活性化することで産生されるＩＦＮ−γ産生能増強効果も高い上に、ヒト末梢血単核細胞を用いたＮＫ活性の定量試験により、その顕著なＮＫ活性が確認されていることから、優れたＮＫ活性増強剤として用いることができる。
また、死菌であっても細胞培養物であっても同様の効果が発揮できることから殺菌工程にも耐えられ、簡単に乳酸菌飲料等の各種乳酸菌製品として加工しやすく、継続摂取可能であり、安全性、経済性の面からも極めて有効である。また、各種の免疫増強物質を併用することで、より高い免疫賦活効果が期待できることから、加齢とともに低下するＮＫ活性の低下を効果的に抑制して免疫力の低下を防ぎ、癌や感染症などの発症率を低下させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株刺激によるマウス腹腔マクロファージからのＩＬ−１２産生促進を示した結果である。図中、ＬＰＳは、マクロファージ活性化物質のリポポリサッカライド添加を示す。
【図２】図２は、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株と各乳酸菌刺激がヒト末梢血単核細胞の細胞傷害活性に与える影響を示した結果である。
【図３】図３は、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株と各乳酸菌刺激がヒトＣＤ５６陽性細胞のＣＤ６９発現率に与える影響を示した結果である。
【図４】図４は、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株と各乳酸菌刺激がヒト末梢血単核細胞からのＩＬ−１２産生に与える影響を示した結果である。
【図５】図５は、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株と各乳酸菌刺激がヒト末梢血単核細胞からのＩＦＮ−γ産生に与える影響を示した結果である。
【図６】図６は、マウスにおけるラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株を摂取したマウスの脾臓細胞の細胞傷害活性能を示した結果である。
【図７】図７は、ラクトバチルス・プランタラム菌種間でのヒト末梢血単核細胞の細胞傷害活性能に与える影響を示した結果である。図中、比較菌株１及び２は、ラクトバチルス・プランタラムに属するその他の菌株である。なお、ＪＣＭ１１４９は、公知のラクトバチルス・プランタラム基準株である。
【図８】図８は、ラクトバチルス・プランタラム菌種間でのヒト末梢血単核細胞からのＩＬ−１２産生に与える影響を示した結果である。図中、比較菌株１及び２は図７と同じ菌株であり、比較菌株３及び４は、その他のラクトバチルス・プランタラムに属する菌株である。なお、ＪＣＭ１０５７はＪＣＭ１１４９と同様にラクトバチルス・プランタラム基準株である。
【図９】図９は、ラクトバチルス・プランタラム菌種間でのヒト末梢血単核細胞からのＩＦＮ−γ産生に与える影響を示した結果である。図中、比較菌株１〜４は、図８で用いたものと同じ菌株である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．本発明で用いるラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株の菌学的性質
本発明で用いるＨＳＫ２０１株はキャベツのザワークラウトより分離された、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する乳酸菌であり、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ）に寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５８９として寄託されている。
【００１３】
本発明によるラクトバチルス・プランタラム ＨＳＫ２０１株の菌学的性質は表１の通りである。
【００１４】
【表１】
2010202557.tif 000002
【表１】
2010202557.tif 000003
【００１５】
本菌株はメリビオース、ラフィノース、α−メチル−Ｄグルコシド、Ｄ−ツラノースに対する資化性がＪＣＭ１０５７基準株と異なり、ラムノース、乳糖、Ｄ−ツラノースに対する資化性がＪＣＭ１１４９基準株と異なっている。また、特許文献１に記載されたラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１７）とは、アラビノース、ラムノース及びグルコン酸の資化性において異なっており、特許文献８に記載されたラクトバチルス・プランタラムＮＨＴ４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−２６４）とは、ラムノース、エスクリンの資化性において異なっている。
本菌株と前記基準株ＪＣＭ１０５７株、ＪＣＭ１１４９株及びラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株及びＮＨＴ４株との糖資化性を比較すると表２の通りになる。
【００１６】
【表２】
2010202557.tif 000004
【表２】
2010202557.tif 000005
【００１７】
２．ＨＳＫ２０１株の特徴・機能性
本発明のＨＳＫ２０１株が属するラクトバチルス・プランタラムは、ヒトの腸内に生息
している菌であり、さらに漬物等にも常在しているほか、この菌株を用いた乳酸菌飲料が
すでに市販されていることから、安全性には問題はなく、人工胃液、人工腸液に対する耐
性を持っていることも確認されている（非特許文献４）。
また、ＨＳＫ２０１株は、以下の優れた特性が確認されている。
（１）ヒト試験において、８週間ＨＳＫ２０１株含有乳飲料を摂取してもらったところ、便通改善効果が確認された（非特許文献４）。
（２）アレルギーモデルマウス（Ｎｃ／Ｎｇａ）に、ＨＳＫ２０１株を摂取させたところ、アレルギーの指標である血清中のＩｇＥ値が有意に減少した（非特許文献５）。
（３）花粉症患者を対象に、８週間ＨＳＫ２０１株含有乳飲料を摂取してもらったところ、プラセボ群と比較して、ＨＳＫ２０１株を摂取していた群ではＴｈ１／Ｔｈ２のバランス改善効果を示し、スギ特異的ＩｇＥ値の上昇抑制効果も確認された。また、自覚症状においても、ＨＳＫ２０１株を摂取することで改善効果が見られた（非特許文献６）。
【００１８】
３．ＨＳＫ２０１株の調製方法
本発明において用いるラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株は、菌体の培養法、分離法に特に制限はない。培地は、該菌用であれば特に制限はなく、天然培地、合成培地、半合成培地などの培地に培養することができる。培地としては、窒素源及び炭素源を含有するものが用いられる。窒素源の具体例としては、肉エキス、ペプトン、大豆粉、大豆加水分解物、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等が挙げられ、炭素源の具体例としては、グルコース、フラクトース、ラクトース、ソルビトール、イノシトール、スクロース、水飴、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、等が挙げられる。このほか、無機質として、例えば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、食塩、炭酸カルシウム、鉄、マンガン、モリブデン更に各種ビタミン類その他を添加することができる。
培養温度は１０〜５０℃、更に好ましくは２５〜４５℃であり、培養時間は６〜４８時間程度であり、通気振盪、通気撹拌してもよい、培地のｐＨは３〜１０好ましくは５〜７である。
本発明において用いるラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株の分離法は、例えば培養終了後、菌体を採取し遠心分離や膜分離などの手段により上清を除き、蒸留水もしくは生理食塩水を加え、必要によりこの操作を繰り返し、遠心分離又は濾過等により菌体を採取することができる。
【００１９】
４．本発明のＮＫ活性増強剤の調製法について
本発明において、「ＮＫ活性の増強」というとき、典型的には、ＮＫ細胞自体のＮＫ活性（細胞傷害活性）を増強することを指すが、リンパ球中のＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）数が増加することによってもＮＫ活性が増大するので、両者を区別せず、両方の作用によりＮＫ活性が増強されることをいう。
本発明のＮＫ活性増強剤は、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株乳酸菌を生菌又は発酵物として利用する場合を含むものであり、乳酸菌の培養物は培養液ごとそのまま、もしくは濃縮して用いることができ、菌体のみを分離し、生菌体、死菌体として、又は菌体を加熱、凍結、磨砕、溶菌、抽出などの処理をした処理物として利用することができる。
また、ＨＳＫ２０１株の分離した菌体又は分離後上記の処理をした菌体の処理物は採取した状態のまま、あるいは適当な液体（例えば、分岐デキストリン溶液）に懸濁して液体状で使用することができるが、さらにこれを乾燥させて使用することもできる。乾燥法としては、例えば自然乾燥法、加熱法、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等の通常の方法を使用することができる。
また、ＨＳＫ２０１株の単離した生菌体をそのまま使用し、又は乳製品、果実類、穀物又はこれらの加工物（食品）にこの生菌を付与し乳酸発酵させた状態の発酵物（処理物）として利用することができる。
また、ＨＳＫ２０１株は、単離した菌体を、加熱、紫外線照射、ホルマリン処理等により不活性化して食品に添加、あるいは製剤化して使用することもできる。分離された生菌体、死菌体はさらに摩砕、破砕処理し、得られた処理物を必要により加熱滅菌、無菌濾過した後に、その濾液を凍結乾燥して使用することもできる。菌体の処理物は、例えば、上記摩砕物、破砕物、それらからの抽出液、凍結乾燥品等の形態が挙げられる。
【００２０】
５．ＮＫ活性増強剤組成物について
本発明のＮＫ活性増強剤は、免疫賦活活性も高いため、ウイルス、バクテリア等の微生物による感染症、例えば、経口感染によるコレラ菌、毒素原性大腸菌、赤痢菌、サルモネラ、ウイルス等の感染性腸炎や、気道感染によるインフルエンザ、かぜ症候群や、口腔内感染による口内炎、歯周疾患等、また、各種悪性腫瘍、例えば、消化管や呼吸器粘膜、肝・腎等臓器に発生する上皮性悪性腫瘍や、運動器や軟部組織などに発生する非上皮性悪性腫瘍の予防や治療に有効である。
また、本発明のＮＫ活性増強剤はＩＬ−１２産生誘導作用と共に、ＩＦＮ−γ産生誘導作用を有していることから、ヘルパーＴ細胞機能を活性化し、腫瘍により誘導される免疫抑制状態や抗癌剤治療により誘導される免疫機能低下からの回復にも適している。ＡＩＤＳ発症予防、リステリア菌、サルモネラ菌、結核菌、癩菌等の細胞内寄生性細菌の防除、Ｉ型アレルギーの予防や治療、ストレスに起因するＩ型ヘルパーＴ細胞の免疫機能低下の改善等に有効であり、加齢に伴う免疫機能低下の抑制等にも適している。また、細胞内寄生性細菌のクラミジア菌に対する感染防御作用により、クラミジア菌感染との関わりが強く示唆されている動脈硬化発症に対しても予防的に働く。したがって、種々の生体機能調節、各種疾患に対する抵抗性の向上、日常の保健強壮の促進に有効である。
【００２１】
本発明のＮＫ活性増強剤は、ＨＳＫ２０１株のＮＫ活性増強の有効量を単独で用いても良いが、免疫活性賦活効果を有する公知の乳酸菌又はその他の免疫活性賦活効果が知られる薬剤と併用して用いてもよい。
その際に併用できる乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)に属する他の菌株、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)があげられ、生菌、死菌、菌の処理物などのいずれの形態で配合してもよい。
本発明のＮＫ活性増強剤において、ＨＳＫ２０１株と併用可能な他の免疫賦活剤としては、ビタミンＥ、ニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトースなどのニゲロオリゴ糖、オーツ麦などのイネ科穀粒、キノコ菌糸の細胞壁に含まれる植物繊維を酵素的に処理した活性化へミセルロース、サルノコシカケの菌糸体成分であるＰＳＫ、スエヒロタケの菌糸体成分であるＳＰＧ、シイタケの菌糸体成分であるレンチナン、並びにアガリクス、霊芝、ニンギョータケ、カワリハラタケ、マイタケ等の菌糸体成分や、溶連菌の菌体成分であるＯＫ−４３２等が挙げられる。
これら他の成分を併用する場合は、配合量を適宜選択できるが、通常、ＨＳＫ２０１株に対し０．０１〜１００、好ましくは０．０５〜１０、さらに好ましくは０．１〜１重量比である。
【００２２】
６．ＮＫ活性増強剤の製剤化について
本発明のＮＫ活性増強剤に用いるＨＳＫ２０１株は、味覚的にも安全性にも問題のない乳酸菌である上に、腸への生存到達性が高いため、経口投与用の製剤化が好ましい。
本発明のＮＫ活性増強剤は、ＨＳＫ２０１株のＮＫ活性増強のための有効量を、単独で、又は免疫活性賦活効果を有する公知の乳酸菌製剤もしくはその他の免疫活性賦活効果が知られる薬剤と併用して、周知の賦形剤、増量剤等の薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。その際の製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末、ゼリー、ドリンク剤などの種々の形態とすることができ、漬物類、菓子類、ヨーグルト、乳酸菌飲料等の飲食品又はサプリメントに対して直接添加するか、又は食品用添加剤などに配合して添加することができ、ヒトに限らず畜産動物又は愛玩動物、観賞用又は養殖用魚類などの飼料として用いることもできる。
また、必要に応じて、可溶化等の公知の技術に従って、非経口投与の形態としてもよく、注射剤とすることもできる。また、公知の賦形剤ないし担体を用いて、例えば、軟膏剤、スプレー剤、貼付剤などの皮膚外用剤、又は乳液、クリーム、化粧水、パック、シャンプー、リンス、洗浄料などの化粧料剤形として外用経路で適用することもできる。
本発明によるＮＫ活性増強剤の有効量は、具体的には一日１０００万個〜１兆個、好ましくは１０億〜１０００億個相当量が投与されればよい。乳酸菌製剤中の本発明の乳酸菌含有量は、乾燥菌体重量に換算して０．０２〜２０００ｍｇ、好ましくは２〜２００ｍｇに設定し、投与するヒトの症状や年齢、性別等を考慮し、ＮＫ活性増強機能のための有効量の範囲内で適宜決定すればよい。
【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
（製造例１）ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１乾燥菌体(生菌)の製造
ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株を以下に示す組成のＭＲＳ培地に接種し（菌数：１０４個／ｍｌ）、３７℃で１５〜４８時間培養し、生菌数約１０８個／ｍｌの培養液を得た。得られた培養液を３，０００ｘｇで２０分間遠心分離して集菌し、蒸留水で２回洗浄して菌体を得た。この菌体を蒸留水に懸濁し、凍結乾燥して、乾燥菌体を得た。（以下乾燥菌体）
ＭＲＳ培地の組成を示す（Difco Lactobacilli MRS Broth #288130）。
プロテオースペプトンＮｏ．３      １０ｇ
牛肉エキス                        １０ｇ
酵母エキス                          ５ｇ
Ｄ−グルコース                    ２０ｇ
ポリソルベート８０                  １ｇ
クエン酸アンモニウム                ２ｇ
酢酸ナトリウム                      ５ｇ
硫酸マンガン                    ０．１ｇ
硫酸マグネシウム              ０．０５ｇ
リン酸２カリウム                    ２ｇ
蒸留水                      １０００ｍｌ
ｐＨ６．５
１２１℃で１５分加熱滅菌
【００２５】
（製造例２）ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１乾燥菌体(死菌)の製造
製造例１と同様の方法で得た生菌体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、１００℃で３０分加熱し、これを凍結乾燥して死菌乾燥菌体（以下乾燥死菌体）を得た。以下の各実施例では、特に記載がない場合は、当該製造例で得られた乾燥死菌体を用いて行っている。
【００２６】
（実施例１）ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株によるマウス腹腔マクロファージからのＩＬ−１２産生促進作用
本実施例では、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株のマウス腹腔マクロファージからのＩＬ−１２産生性に対する促進効果を検証した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１５週齢、雌）の腹腔に無菌的にＲＰＭＩ１６４０培地を注入し、腹腔をよく揉んだ後、注入したＲＰＭＩ１６４０培地を回収し腹腔細胞浮遊液を得た。マクロファージを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌにＲＰＭＩ１６４０で調整し、９６穴組織培養プレートに1穴当たり１００μｌ播種した。３７℃で２時間培養し、腹腔マクロファージを各穴に付着させ、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地を１００μｌ加えた。これに、（１）対照としてＲＰＭＩ１６４０培地のみ、（２）マクロファージ活性化物質のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を０．２μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液、（３）ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株を０．２μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液をそれぞれ１穴当たり１００μｌ加え、３７℃で１５時間培養し、培養上清を回収後、エンザイムイムノアッセイ法によりQuantikine  Immunoassay  kit（R&D  system社製）を用いてＩＬ−１２を測定した。
その結果、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株はマウス腹腔マクロファージからのＩＬ−１２産生を促進させ、さらにポジティブコントロールであるＬＰＳよりもＩＬ−１２産生を増強させることが確認された（図１）。また、同条件下において、高いＩＬ−１２産生誘導活性能を有するラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株では、対照と比較してＩＬ−１２産生誘導能が６倍であると報告されているが、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株では対照と比較して９倍のＩＬ−１２産生誘導活性能を示した。
【００２７】
（実施例２）ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株がヒト末梢血単核細胞の細胞傷害活性に与える影響
本実施例では、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株と各菌種の乳酸菌菌体を比較して、これらがヒト末梢血単核細胞の細胞傷害活性を増強する効果について検証した。
ヒト全血からFicoll-Paque PLUSを用いて密度勾配法により、末梢血単核細胞を回収し、ＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁したものを、末梢血単核細胞懸濁液とした。細胞懸濁液の細胞数を自動血球計測装置にて測定した後、細胞数を４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようＡＩＭ−Ｖ培地で調整し、これを６穴組織培養プレートに１穴当たり１ｍｌを播種した。さらに各乳酸菌体を１μｇ／ｍｌの濃度になるよう添加した後、最終的に２ｍｌになるようＡＩＭ−Ｖ培地を添加した。３７℃で３日間培養後、細胞を回収し、これをエフェクター細胞とした。ターゲット細胞としては、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞を用いた。
細胞傷害活性を測定する方法として、CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（promega社製）を用いて製品プロトコールに従って測定した。エフェクター細胞とターゲット細胞の比率は４０：１とし、３７℃で４時間培養後の細胞傷害活性能を求めた。
その結果、ＨＳＫ２０１株刺激によるヒト末梢血単核細胞の細胞傷害活性能の値は７６．３％を示し、他の乳酸菌種と比べて著しく高くＮＫ活性が増強することが確認された（図２）。一方、同じ菌種であるラクトバチルス・プランタラム  ＪＣＭ１１４９菌株刺激では低い活性能を示したことから、ラクトバチルス・プランタラム全般で活性があるのではなく、菌株特異的なものであることが考えられる。
【００２８】
（実施例３）乳酸菌刺激がヒトＣＤ５６陽性細胞の活性化に及ぼす影響
本実施例では、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株と各菌種の乳酸菌菌体を比較して、これらの刺激がＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）の活性化に与える影響を検証した。
ヒト全血から、Ficoll-Paque PLUSを用いて密度勾配法により、末梢血単核細胞を回収し、ＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁したものを末梢血単核細胞懸濁液とした。細胞懸濁液中の細胞数を自動血球計測装置にて測定した後、細胞数を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようＡＩＭ−Ｖ培地で調整し、４８穴組織培養プレートに１穴当たり５００μｌを播種した。さらに各乳酸菌体を１μｇ／ｍｌの濃度になるよう添加した。３７℃で３日間乳酸菌刺激を行った後、細胞を回収した。回収した細胞に、ＮＫ細胞の表面マーカーであるＣＤ５６を認識する抗体とリンパ球活性化マーカーであるＣＤ６９を認識する抗体を添加し、室温３０分で反応させ、フローサイトメーターにてＣＤ５６陽性細胞におけるＣＤ６９の発現率を解析した。
その結果、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株刺激によりＣＤ６９発現の誘導能が５６．１％の値という高い発現率を示し、他の乳酸菌種と比べて著しく高いＣＤ６９発現が認められた（図３）。なお、ラクトバチルス・プランタラムに属し、免疫賦活効果が知られているＮＨＴ４株の誘導能は４０．９％であり、ＨＳＫ２０１株には及ばなかった。
【００２９】
（実施例４）乳酸菌刺激がヒト末梢血単核細胞からのサイトカイン産生に与える影響
本実施例では、各菌種の乳酸菌菌体による刺激が、ヒト末梢血単核細胞からのＩＬ−１２及びＩＦＮ−γ産生に与える影響を検証した。ヒト全血から、Ficoll-Paque PLUSを用いて密度勾配法により、末梢血単核細胞を回収し、ＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁したものを末梢血単核細胞懸濁液とした。細胞懸濁液中の細胞数を自動血球計測装置にて測定した後、細胞数を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようＡＩＭ−Ｖ培地で調整し、４８穴組織培養プレートに１穴当たり５００μｌを播種した。さらに各乳酸菌菌体を１μｇ／ｍｌの濃度になるよう添加した後、３７℃で３日間培養し、培養上清中のＩＬ−１２及びＩＦＮ−γをエンザイムイムノアッセイで測定した。エンザイムイムノアッセイはQuantikine Immunoassay kit（R&D Systems社製）を用いて、Ｈｕｍａｎ ＩＬ−１２ 及びＨｕｍａｎ ＩＦＮ−γ を測定した。
その結果、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株において、in vitroの刺激によりＩＬ−１２は、７０４．３ｐｇ／ｍｌもの顕著な産生が観察され（図４）、ＩＦＮ−γは、４．０ｎｇ／ｍｌの産生を示した（図５）。同じラクトバチルス属に属する他の菌株と比較しても極めて高い産生能を示している。
【００３０】
（実施例５）ＨＳＫ２０１株を摂取したマウスの免疫力増強効果の検討
本実施例では、ラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株の摂取が、細胞傷害活性に与える影響を検証した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、８週齢）４０匹を１群２０匹で、ＨＳＫ２０１株摂取群と対照群の２群に分けた。ＨＳＫ２０１株摂取群には、１個体当たり１日２０ｍｇのＨＳＫ２０１株を通常餌粉末に混合して摂取させ、対照群においては、非乳酸菌含有の通常餌粉末をそれぞれ４週間摂取させた。
４週間摂取後、個々のマウスより脾臓を無菌的に摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地で脾臓細胞懸濁液を５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう調整し、これをエフェクター細胞とした。ターゲット細胞としてＹＡＣ−１細胞を用いて、細胞傷害活性をフローサイトメーターにより測定した。ターゲット細胞であるＹＡＣ−１細胞は3,3’-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(以下ＤｉＯＣとする）により蛍光染色した後、脾臓細胞とともに１．５ｍｌチューブを用いて３７℃で４時間培養を行った。培養終了前にPropidium Iodide(以下ＰＩとする)を培養液に加え、死細胞を染色した。培養終了後、Ｊｏｈａｎｎの論文及び特開２００５−１９４２５９を参考にフローサイトメーターを用いてＤｉＯＣ、ＰＩともに染色された細胞を死滅したＹＡＣ−１細胞として検出し、細胞傷害活性を求めた（Johann S, J. Immunol Methods, 185(2), 209-16(1995)）。なお、エフェクター細胞とターゲット細胞の比率は４０：１とした。
その結果、対照群と比較して、ＨＳＫ２０１株を摂取した群で有意に細胞傷害活性の増強が確認された（図６）。このことから、ＨＳＫ２０１株を経口摂取することで、細胞傷害能を有する細胞等を活性化させ、免疫力を増強させることが考えられる。
【００３１】
（実施例６）ラクトバチルス・プランタラム菌種間での細胞傷害活性の検討
本実施例では、数種のラクトバチルス・プランタラムの菌体を用いて、ヒト末梢血単核細胞に対するラクトバチルス・プランタラムＨＳＫ２０１株の細胞傷害活性に与える影響を検証した。すなわち、以下のＨＳＫ２０１株と同様の操作を、同じラクトバチルス・プランタラムに属する他の菌株（比較菌株１、２）、ラクトバチルス・プランタラム基準株のＪＣＭ１１４９株に対して行った。
ヒト全血からFicoll-Paque PLUSを用いて密度勾配法により、末梢血単核細胞を回収し、ＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁したものを末梢血単核細胞懸濁液として得た。細胞懸濁液の細胞数を自動血球計測装置にて測定した後、細胞数を４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようＡＩＭ−Ｖ培地で調整し、これを６穴組織培養プレートに１穴当たり１ｍｌを播種した。さらに各プランタラム菌体を１μｇ／ｍｌの濃度になるよう添加した後、最終的に２ｍｌになるようＡＩＭ−Ｖ培地を添加した。３７℃で３日間培養後、細胞を回収し、これをエフェクター細胞とした。ターゲット細胞としては、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞を用いて、細胞傷害活性をフローサイトメーターにて測定した。細胞傷害活性測定方法としては、実施例２と同じ方法で行った。
その結果、ラクトバチルス・プランタラムの中でも特にＨＳＫ２０１株刺激により細胞傷害活性の増強が確認された。この効果はプランタラム特異的なものではなく、ＨＳＫ２０１株特異的な効果であった（図７）。
【００３２】
（実施例７）ラクトバチルス・プランタラム菌種間でのサイトカイン誘導能の比較
本実施例では、免疫賦活効果が知られているＮＨＴ４株を含め、数種のラクトバチルス・プランタラムの菌体による刺激が、ヒト末梢血単核細胞からのＩＬ−１２及びＩＦＮ−γ産生に与える影響を比較した。すなわち、以下のＨＳＫ２０１株と同様の操作を、ＮＨＴ４株と共に、同じラクトバチルス・プランタラムに属する他の菌株（比較菌株１〜４、なお、比較菌株１及び２は実施例６と同一菌株である。）、ラクトバチルス・プランタラム基準株のＪＣＭ１１４９株及びＪＣＭ１０５７株に対して行った。
ヒト全血から、Ficoll-Paque PLUSを用いて密度勾配法により、末梢血単核細胞を回収し、ＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁したものを末梢血単核細胞懸濁液とした。細胞懸濁液中の細胞数を自動血球計測装置にて測定した後、細胞数を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようＡＩＭ−Ｖ培地で調整し、４８穴組織培養プレートに１穴当たり５００μｌを播種した。さらに各乳酸菌菌体を１μｇ／ｍｌの濃度になるよう添加した後、３７℃で３日間培養し、培養後の培養上清のＩＬ−１２及びＩＦＮ−γをエンザイムイムノアッセイで測定した。エンザイムイムノアッセイはQuantikine Immunoassay kit（R&D Systems社製）を用いて、Ｈｕｍａｎ ＩＬ−１２ 及びＨｕｍａｎ ＩＦＮ−γ を測定した。
その結果、ＨＳＫ２０１株刺激によるＩＬ−１２産生の誘導活性（図８）及びＩＦＮ−γ産生の誘導活性（図９）は、同じラクトバチルス・プランタラムに属する他の菌株と比較して顕著に高いことが確認された。その効果は、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γ産生能が極めて高いことで知られるＮＨＴ４株と比較しても２倍もしくはそれ以上の顕著なものであった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のＨＳＫ２０１株を用いたＮＫ活性増強剤は、飲食品や飼料として摂取したり、医薬品として投与することで、免疫機能の低下を抑制でき、かつ免疫賦活効果が奏せられるから、食品産業、畜産業、医薬品産業での利用が可能である。
【受託番号】
【００３４】
ＮＩＴＥ  Ｐ−５８９
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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