(57)【要約】      （修正有）【課題】高まった熱安定性及び／又は糖基質を利用しての高まった比活性を示す親真菌グルコアミラーゼの変異体を提供する。【解決手段】アスペルギルス・ニガー由来のグルコアミラーゼに部位特異的突然変異をおこない特定の配列を有する熱安定性及び比活性の高まった変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親グルコアミラーゼの変異体であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列内の下記の位置もしくは領域において
領域：１−１８，
領域：１９−３５，
領域：４０−６２，
領域：７３−８０，
領域：９３−１２７，
領域：１７０−１８４，
領域：２００−２１２，
領域：２３４−２４６，
領域：２８７−３１９，
領域：３３４−３４１，
領域：３５３−３７４，
領域：３８８−４１４，
領域：４４５−４７０，
及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す相同グルコアミラーゼ内の対応の位置もしくは領域において１又は複数の突然変異を含んで成るが、但し以下の置換は除く、変異体：Ｎ２０Ｃ，Ａ２７Ｃ，Ｓ３０Ｐ，Ｙ４８Ｗ，Ｙ５０Ｆ，Ｗ５２Ｆ，Ｒ５４Ｋ／Ｌ，Ｄ５５Ｇ／Ｖ，Ｇ５７Ａ，Ｋ１０８Ｒ，Ｄ１１２Ｙ，Ｙ１１６Ａ／Ｗ，Ｓ１１９Ｃ／Ｗ／Ｅ／Ｇ／Ｙ／Ｐ，Ｗ１２０Ｈ／Ｌ／Ｆ／Ｙ，Ｇ１２１Ｔ／Ａ，Ｒ１２２Ｙ，Ｐ１２３Ｇ，Ｑ１２４Ｈ，Ｒ１２５Ｋ，Ｗ１７０Ｆ，Ｎ１７１Ｓ，Ｑ１７２Ｎ，Ｔ１７３Ｇ，Ｇ１７４Ｃ，Ｙ１７５Ｆ，Ｄ１７６Ｎ／Ｅ，Ｌ１７７Ｈ／Ｄ，Ｗ１７８Ｒ／Ｄ，Ｅ１７９Ｑ／Ｄ，Ｅ１８０Ｄ／Ｑ，Ｖ１８１Ｄ／Ａ／Ｔ，Ｎ１８２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｙ／Ｓ，Ｇ１８３Ｋ，Ｓ１８４Ｈ，Ｗ２１２Ｆ，Ｒ２４１Ｋ，Ａ２４６Ｃ，Ｄ２９３Ｅ／Ｑ，Ａ３０２Ｖ，Ｒ３０５Ｋ，Ｙ３０６Ｆ，Ｄ３０９Ｎ／Ｅ，Ｙ３１２Ｗ，Ｗ３１７Ｆ，Ｅ３８９Ｄ／Ｑ，Ｈ３９１Ｗ，Ａ３９２Ｄ，Ａ３９３Ｐ，Ｎ３９５Ｑ，Ｇ３９６Ｓ，Ｅ４００Ｑ／Ｃ，Ｑ４０１Ｅ，Ｇ４０７Ｄ，Ｅ４０８Ｐ，Ｌ４１０Ｆ，Ｓ４１１Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｈ／Ｄ，Ｓ４６０Ｐ。
【請求項２】
下記の突然変異のうちの１又は複数を含んで成る、請求項１記載の変異体：Ａ１Ｖ，Ｔ２Ｅ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｈ／Ｍ，Ｌ３Ｐ／Ｎ，Ｎ９Ａ，Ａ１１Ｐ／Ｅ，Ｉ１８Ｖ，Ｌ１９Ｎ，Ｎ２０Ｔ，Ｇ２３Ａ，Ａ２４Ｓ／Ｔ，Ｄ２５Ｓ／Ｔ／Ｒ，Ｇ２６Ａ，Ａ２７Ｓ／Ｔ，Ｗ２８Ｒ／Ｙ，Ｓ３０Ｔ／Ｎ，Ｇ３１Ａ，Ａ３２Ｖ，Ｄ３３Ｒ／Ｋ／Ｈ，Ｓ３４Ｎ，Ｓ４０Ｃ，Ｔ４３Ｒ，Ｔ５１Ｄ／Ｓ，Ｔ５３Ｄ，Ｓ５６Ａ／Ｃ，Ｖ５９Ｔ／Ａ，Ｌ６０Ａ，Ｎ９３Ｔ，Ｐ９４Ｖ，Ｓ９５Ｎ，Ｄ９７Ｓ，Ｌ９８Ｐ／Ｓ，Ｓ１００Ｔ／Ｄ，Ａ１０２Ｓ／* ，Ｎ１１０Ｔ，Ｖ１１１Ｐ，Ｄ１１２Ｎ，Ｅ１１３Ｍ／Ａ，Ｔ１１４Ｓ，Ａ１１５Ｑ／Ｇ，Ｙ１１６Ｆ，Ｓ１１９Ａ，Ｇ１２７Ａ，Ｎ１８２Ｅ，Ａ２０１Ｄ，Ｆ２０２Ｌ，Ａ２０３Ｌ，Ｔ２０４Ｋ，Ａ２０５Ｒ／Ｓ，Ｖ２０６Ｌ／Ｎ，Ｇ２０７Ｎ，Ｓ２０８Ｈ／Ｔ／Ｄ，Ｓ２０９Ｔ，Ｓ２１１Ｐ，Ｗ２１２Ｎ／Ａ／Ｔ，Ａ２４６Ｔ，Ｙ３１２Ｑ，Ｎ３１３Ｔ／Ｓ／Ｇ，Ａ３５３Ｄ／Ｓ，Ｓ３５６Ｐ／Ｎ／Ｄ，Ｄ３５７Ｓ，Ａ３５９Ｓ，Ｔ３６０Ｖ，Ｇ３６１Ｓ／Ｐ／Ｔ／Ａ，Ｔ３６２Ｒ，Ｓ３６４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，Ｓ３６５Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，Ｓ３６６Ｔ，Ｓ３６８Ｐ／Ｔ／Ａ，Ｔ３６９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，Ｓ３７１Ｙ／Ｈ／Ｎ／Ｄ，Ｓ３７２Ｆ／Ｙ／Ｃ／Ｌ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｉ／Ｔ／Ｎ／Ｓ／Ｖ／Ａ／Ｄ／Ｇ，Ｔ３９０Ｒ，Ａ３９３Ｒ，Ｓ３９４Ｒ／Ｐ，Ｍ３９８Ｌ，Ｓ３９９Ｃ／Ｑ／Ｔ，Ｙ４０２Ｆ，Ｄ４０３Ｓ，Ｓ４０５Ｔ，Ｄ４０６Ｎ，Ｅ４０８Ｃ／Ｒ，Ｌ４１０Ｉ／Ｒ，Ｓ４１１Ｖ，Ａ４１２Ｃ，Ｄ４１４Ａ，Ｇ４４７Ｓ，Ｓ４６５Ｐ。
【請求項３】
改善された熱安定性を有する親グルコアミラーゼの変異体であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列内の下記の位置もしくは領域において
領域：１−１８，
領域：１９−３５，
領域：７３−８０，
領域：９３−１２７，
領域：１７０−１８４，
領域：２００−２１２，
領域：２３４−２４６，
領域：２８７−３１９，
領域：３３４−３４１，
領域：３５３−３７４，
領域：３８８−４１４，
領域：４４５−４７０，
及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す相同グルコアミラーゼ内の対応の位置もしくは領域において１又は複数の突然変異を含んで成るが、但しＮ２０Ｃ，Ａ２７Ｃ，Ｓ３０Ｐ，Ａ２４６Ｃの置換は除く、変異体。
【請求項４】
比活性の高まった親グルコアミラーゼの変異体であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列内の下記の位置もしくは領域において
領域：１−１８，
領域：４０−６２，
領域：９３−１２７，
領域：１７０−１８４，
領域：２００−２１２，
領域：２３４−２４６，
領域：２８７−３１９，
領域：３８８−４１４，
及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す相同グルコアミラーゼ内の対応の位置もしくは領域において１又は複数の突然変異を含んで成るが、但しＳ４１１Ｇの置換は除く、変異体。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列内の下記の領域において
領域：２８７−３００，
領域：３０５−３１９，
及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す相同グルコアミラーゼ内の対応の位置もしくは領域において１又は複数の突然変異を含んで成る、請求項４記載の変異体。
【請求項６】
前記親相同グルコアミラーゼがアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）Ｇ１グルコアミラーゼである、請求項１〜５のいずれか１項記載の変異体。
【請求項７】
前記グルコアミラーゼが、特にＣ末端においてトランケーションされたグルコアミラーゼである、請求項１〜６のいずれか１項記載の変異体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載のグルコアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構築体。
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡ構築体を担持する組換発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８記載のＤＮＡ構築体又は請求項９記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項１１】
微生物、例えば細菌又は真菌である、請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
プロテアーゼ欠陥アスペルギルス・オリザ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ニガーである、請求項１１記載の細胞。
【請求項１３】
デンプン又は部分加水分解デンプンをデキストロース含有シロップへと変換するための方法であって、請求項１〜７のいずれか１項記載のグルコアミラーゼ変異体の存在下でデンプン加水分解物を糖化する工程を含む方法。
【請求項１４】
グルコアミラーゼの投与物が乾燥固形分１ｇ当り０．０５〜０．５AGU の範囲で存在している、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
乾燥固形分の少なくとも３０重量％のデンプン加水分解物の糖化を含んで成る、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
前記糖化をプルラナーゼ及びイソアミラーゼの群から選ばれる枝切り酵素、好ましくはバチルス・アシドプルリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）もしくはバチルス・デラミフィカンス（Ｂ．ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）由来のプルラナーゼ又はシュードモナス・アミロデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）由来のイソアミラーゼの存在下で行う、先の請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記糖化を３〜５．５のpH及び６０〜８０℃の温度、好ましくは６３〜７５℃で、２４〜７２時間、好ましくはpH４〜４．５で３６〜４８時間行う、先の請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
液化デンプン溶液を糖化する方法であって、
（ｉ）糖化工程、その際、１又は複数回の糖化段階を実施する、及びその後の下記の工程
（ii）１又は複数回の高温膜分離工程を含んで成り、ここで酵素的糖化を請求項１〜７のいずれか１項記載のグルコアミラーゼ変異体を利用して実施する、方法。
【請求項１９】
デンプン変換方法における請求項１〜７のいずれか１項記載のグルコアミラーゼ変異体の利用。
【請求項２０】
連続デンプン変換方法における請求項１〜７のいずれか１項記載のグルコアミラーゼ変異体の利用。
【請求項２１】
前記連続デンプン変換方法が請求項１８記載の連続糖化方法を含む、請求項２０記載の利用。
【請求項２２】
オリゴ糖を製造するための方法における請求項１〜７のいずれか１項記載のグルコアミラーゼ変異体の利用。
【請求項２３】
特製シロップを製造するための方法における請求項１〜７のいずれか１項記載のグルコアミラーゼ変異体の利用。
【請求項２４】
燃料エタノールの製造のための方法における請求項１〜７のいずれか１項記載のグルコアミラーゼ変異体の利用。
【請求項２５】
飲料品の製造のための方法における請求項１〜７のいずれか１項記載のグルコアミラーゼ変異体の利用。
【請求項２６】
有機化合物、例えばクエン酸、アスコルビン酸、リジン、グルタミン酸の製造のための発酵方法における請求項１〜７のいずれか１項記載のグルコアミラーゼ変異体の利用。
【請求項２７】
親グルコアミラーゼの熱安定を高める及び／又は比活性を高めるための方法であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列内の下記の１もしくは複数の位置もしくは領域において
領域：１−１８，
領域：１９−３５，
領域：４０−６２，
領域：７３−８０，
領域：９３−１２７，
領域：１７０−１８４，
領域：２００−２１２，
領域：２３４−２４６，
領域：２８７−３１９，
領域：３３４−３４１，
領域：３５３−３７４，
領域：３８８−４１４，
領域：４４５−４７０，
及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す相同グルコアミラーゼ内の対応の位置もしくは領域において突然変異を設けることによる方法。
【請求項２８】
１又は複数の下記の置換が伴う、請求項２７記載の方法：Ａ１Ｖ，Ｔ２Ｅ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｈ／Ｍ，Ｌ３Ｐ／Ｎ，Ｎ９Ａ，Ａ１１Ｐ／Ｅ，Ｉ１８Ｖ，Ｌ１９Ｎ，Ｎ２０Ｔ，Ｇ２３Ａ，Ａ２４Ｓ／Ｔ，Ｄ２５Ｓ／Ｔ／Ｒ，Ｇ２６Ａ，Ａ２７Ｓ／Ｔ，Ｗ２８Ｒ／Ｙ，Ｓ３０Ｔ／Ｎ，Ｇ３１Ａ，Ａ３２Ｖ，Ｄ３３Ｒ／Ｋ／Ｈ，Ｓ３４Ｎ，Ｓ４０Ｃ，Ｔ４３Ｒ，Ｔ５１Ｄ／Ｓ，Ｔ５３Ｄ，Ｓ５６Ａ／Ｃ，Ｖ５９Ｔ／Ａ，Ｌ６０Ａ，Ｎ９３Ｔ，Ｐ９４Ｖ，Ｓ９５Ｎ，Ｄ９７Ｓ，Ｌ９８Ｐ／Ｓ，Ｓ１００Ｔ／Ｄ，Ａ１０２Ｓ／* ，Ｎ１１０Ｔ，Ｖ１１１Ｐ，Ｄ１１２Ｎ，Ｅ１１３Ｍ／Ａ，Ｔ１１４Ｓ，Ａ１１５Ｑ／Ｇ，Ｙ１１６Ｆ，Ｓ１１９Ａ，Ｇ１２７Ａ，Ｎ１８２Ｅ，Ａ２０１Ｄ，Ｆ２０２Ｌ，Ａ２０３Ｌ，Ｔ２０４Ｋ，Ａ２０５Ｒ／Ｓ，Ｖ２０６Ｌ／Ｎ，Ｇ２０７Ｎ，Ｓ２０８Ｈ／Ｔ／Ｄ，Ｓ２０９Ｔ，Ｓ２１１Ｐ，Ｗ２１２Ｎ／Ａ／Ｔ，Ａ２４６Ｔ，Ｙ３１２Ｑ，Ｎ３１３Ｔ／Ｓ／Ｇ，Ａ３５３Ｄ／Ｓ，Ｓ３５６Ｐ／Ｎ／Ｄ，Ｄ３５７Ｓ，Ａ３５９Ｓ，Ｔ３６０Ｖ，Ｇ３６１Ｓ／Ｐ／Ｔ／Ａ，Ｔ３６２Ｒ，Ｓ３６４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，Ｓ３６５Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，Ｓ３６６Ｔ，Ｓ３６８Ｐ／Ｔ／Ａ，Ｔ３６９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，Ｓ３７１Ｙ／Ｈ／Ｎ／Ｄ，Ｓ３７２Ｆ／Ｙ／Ｃ／Ｌ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｉ／Ｔ／Ｎ／Ｓ／Ｖ／Ａ／Ｄ／Ｇ，Ｔ３９０Ｒ，Ａ３９３Ｒ，Ｓ３９４Ｒ／Ｐ，Ｍ３９８Ｌ，Ｓ３９９Ｃ／Ｑ／Ｔ，Ｙ４０２Ｆ，Ｄ４０３Ｓ，Ｓ４０５Ｔ，Ｄ４０６Ｎ，Ｅ４０８Ｃ／Ｒ，Ｌ４１０Ｉ／Ｒ，Ｓ４１１Ｖ，Ａ４１２Ｃ，Ｄ４１４Ａ，Ｇ４４７Ｓ，Ｓ４６５Ｐ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親ＡＭＧの新規のグルコアミラーゼ変異体（突然変異体）、特に例えばデンプン変換、例えばデンプンからのグルコースの製造のために適当な改善された熱安定性及び／又は高まった比活性を有するものに関する。より詳しくは、本発明はグルコアミラーゼ酵素変異体及びかかる変異酵素の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコアミラーゼ（１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．３）はデンプン又は近縁のオリゴ糖及び多糖分子の非還元末端からのＤ−グルコースの遊離を触媒する酵素である。グルコアミラーゼはいくつかの糸状菌及び酵母により産生され、そのうちアスペルギルス由来のものが最も商業的に重要である。
【０００３】
商業的には、グルコアミラーゼ酵素はα−アミラーゼによりグルコースへと既に部分的に加水分解しておいたコーンデンプンの変換に用いられている。このグルコースはグルコースイソメラーゼによりほぼ等量のグルコースとフルクトースとから成る混合物へと更に変換される。この混合物又はフルクトースに更に富む混合物は世界中に商品化された汎用の高フルクトースコーンシロップである。このシロップは酵素方法により生産される世界中で最大のトン級製品である。デンプンのフルクトースへの変換に関与する種類の酵素がとりわけ最も重要な生産された工業用酵素である。
【０００４】
高フルクトースコーンシロップの生産におけるグルコアミラーゼの商業的利用に関する現状の主たる問題の一つはグルコアミラーゼの相対的に低い熱安定性にある。グルコアミラーゼはα−アミラーゼやグルコースイソメラーゼほどに熱的に安定ではなく、そしてそれはα−アミラーゼやグルコースイソメラーゼよりも低いpHで最も活性であり、且つ安定である。従って、それは低めの温度及びpHの別の槽の中で使用しなければならない。
【０００５】
アスペルギルス・ニガー由来のグルコアミラーゼは触媒（ａａ１〜４４０）及びデンプン結合ドメイン（ａａ５０９〜６１６）を有し、それらは長くて高度にＯ−グルコシル化されたリンカーにより分けられている（Svenssonら（1983）Carlsberg Res. Commun. 48, 529-544, 1983及び（1986), Eur. J. Biochem. 154, 497-502）。Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）の品種Ｘ１００由来のグルコアミラーゼの触媒ドメイン（ａａ１〜４７１）は（α／α）6 −フォルドを帯びており、その中の６本の保存化α→αループセグメントが外部及び内部バレルを接続している（Aleshin ら（1992), J. Biol. Chem. 267, 19291-19298）。１−デオキシノジリマイシン（Harrisら（1993), Biochemistry, 32, 1618-1626）並びにシュードテトラサッカライドインヒビターアカルボース及びＤ−グルコ−ジヒドロアカルボース（Aleshin ら（1996), Biochemistry 35, 8319-8328 ）との複合体におけるグルコアミラーゼの結晶構造は更に一般の酸及び塩基としてそれぞれ作用するグルタミン酸１７９及び４００と調和性である。触媒の際のこれらの残基の重要な役割もプロテインエンジニアリングを利用して研究されている（Sierksら（1990）, Protein Engng. 3, 193-198 ; Frandsenら（1994), Biochemistry, 33, 13808-13816）。４つのグリコシル残基結合サブ部位−１、＋１、＋２及び＋３においてのグルコアミラーゼ−炭水化物相互作用がグルコアミラーゼ−複合構造において注目され（Aleshin ら、(1996), Biochemistry 35, 8319-8328）、そして結合及び触媒のために重要な残基が部位特異的突然変異体と反応速度解析とを利用してかなり研究されている（Sierksら（1989), Protein Engng. 2, 621-625 ; Sierksら（1990), Protein Engng. 3, 193-198 ; Berland ら（1995), Biochemistry, 34, 10153-10161 ; Frandsenら（1995), Biochemistry, 34, 10162-10169 ）。
【０００６】
熱安定性を高めるためのＡ．ニガーグルコアミラーゼ内での様々な置換が発表されている：ｉ）α−ヘリックスグリシンの置換：Ｇ１３７Ａ及びＧ１３９Ａ（Chenら（1996), Prot. Engng. 9, 499-505）；ii）フラジルＡｓｐ−Ｘペプチド結合Ｄ２５７Ｅ及びＤ２９３Ｅ／Ｑの排除（Chenら（1995）Prot. Engng. 8, 575-582 ）；Ｎ１８２内での脱アミド化の防止（Chenら（1994), Biochem. J. 301, 275-281) ; iv ）追加のジスルフィド結合Ａ２４６Ｃの操作（Fierobe ら、(1996), Biochemistry, 35, 8698-8704)；並びにｖ）Ａ４３５及びＳ４３６位におけるＰｒｏ残基の導入（Liら（1997), Protein Engng. 10, 1199-1204 ）。更に、Clark Ford氏は１９９７年１０月１７日の論文を紹介している：ENZYME ENGINEERING 14, Beijing／China １０月１２〜１７日、９７、アブストラクトNo : Abstract Book p.0-61 ）。このアブストラクトはアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼにおけるＧ１３７Ａ，Ｎ２０Ｃ／Ａ２７Ｃ及びＳ３０Ｐ位の突然変異が熱安定性を高めることを提唱している。
【０００７】
グルコアミラーゼについての更なる情報はインターネットホームページ（http://www.public.iastate.edu/-pedro/glase/glase.html ）に載っている。Pedro m. Coutinho 氏の「Glucoamylase www page 」（９７／１０／００最終更新）はグルコアミラーゼ、例えばアスペルギルス株に由来しうるグルコアミラーゼについての情報を開示する。アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ中の化学及び部位特異的修飾がリストされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の課題は例えばデンプン変換方法の糖化工程において利用するのに適当な熱安定性の高まった及び／又は比活性の高まった改良グルコアミラーゼ変異体の提供にある。
【０００９】
本発明との関係での「熱安定性の高まったグルコアミラーゼ変異体とは、対応の親グルコアミラーゼよりも長いＴ1/2 （半減期）を有するグルコアミラーゼ変異体を意味する。Ｔ1/2 の決定（方法Ｉ及び方法II）は「材料と方法」の章に記載されている。
【００１０】
本発明との関係での「比活性の高まったグルコアミラーゼ変異体」とは、注目の糖内のα−１，４−結合に対する比活性の高まったグルコアミラーゼ変異体を意味する。この比活性はkcat又はAGU/mgとして決定される（「材料と方法」の章に記載の通りに測定）。比活性が高まるということは、kcat又はAGU/mg値が、対応の親グルコアミラーゼのkcat又はAGU/mgのそれぞれと比べて高いことを意味する。
【００１１】
本発明の発明者は対応の親酵素との対比において熱安定性の高まった及び／又は比活性の高まったいくつかの親グルコアミラーゼの改良変異体を提供する。この熱安定の高まりは親グルコアミラーゼ中の選定の位置の置換により獲得できる。これを以下に詳細する。
【００１２】
命名法
本明細書及び請求の範囲において、アミノ酸残基の慣用の１文字及び３文字コードを使用する。便宜上、本発明のグルコアミラーゼ変異体は下記の命名法を利用して記述する：
もとのアミノ酸：位置：置換化アミノ酸
【００１３】
この命名法に従うと、例えば３０位のアラニンの置換は以下の通りである：
Ａｌａ３０Ａｓｎ又はＡ３０Ｎ
同位置のアラニンの欠失は以下の通りである：
Ａｌａ３０* 又はＡ３０*
そして、追加のアミノ酸残基、例えばリジンの挿入は以下の通りである：
Ａｌａ３０Ａｌａ  Ｌｙｓ又はＡ３０ＡＫ
【００１４】
アミノ酸残基の連続ストレッチ、例えばアミノ酸残基３０−３３の欠失は（３０−３３）* 又はΔ（Ａ３０−Ｎ３３）として示す。
【００１５】
特定のグルコアミラーゼがその他のグルコアミラーゼとの対比において「欠失」を含み、そして挿入がその位置に施されている場合、これは以下の通りに示す：
*３６Ａｓｐ又は *３６Ｄ
（３６位でのアスパラギン酸の挿入）。
【００１６】
多重突然変異は＋記号で分けている。即ち：
Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ
（３０位及び３４位のアラニン及びグルタミン酸のアスパギン及びセリンそれぞれによる置換の突然変異を示す）。多重突然変異は以下のように分けることもできる。即ち、＋記号と同じ意味である：
Ａｌａ３０Ａｓｐ／Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ／Ｅ３４Ｓ
【００１７】
１又は複数個の択一的なアミノ酸残基を所定の位置に挿入してよい場合、それは以下の通りに示す：
Ａ３０Ｎ，Ｅ又はＡ３０Ｎ／Ｅ、又はＡ３０Ｎ又はＡ３０Ｅ
【００１８】
更に、修飾のために適当な位置を任意の特定の修飾を示すことなく本明細書において特定する場合、任意のアミノ酸残基はその位置に存在するアミノ酸残基で置換してよいものと理解される。かくして、例えば３０位のアラニンの修飾を言及するが特定しないとき、アラニンは欠失しているか、又は任意のその他のアミノ酸、即ち、Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ａ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖのいずれかで置換されていてよいことと理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】アスペルギルス・ニガーＧ１グルコアミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＡＭＧ９１。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な開示
本発明の基礎となる研究の目標は真菌生物、特にアスペルギルス属の特定の株から得られることができ、且つそれ自体はデンプン変換又はアルコール発酵におけるその適当な特性を基準に選別される特定のグルコアミラーゼの熱的安定性を高める及び／又は比活性を高めることにある。
【００２１】
高められた熱安定性及び／又は高められた比活性を得るために突然変異すべき位置及び／又は領域の同定
分子動力学（ＭＤ）シミュレーションはタンパク質構造内のアミノ酸の挙動を示す（McCammon, JA and Harvey, SC., (1987), 「Dynamics of proteins and nucleic acids」Cambridge University Press. ）。かかるタンパク質動力学は往々にして結晶学Ｂ因子に対して比較される（Stout, GH and Jensen, LH, (1989), 「X-ray structure determination 」, Wiley 参照）。ＭＤシミュレーションを様々なプロトン化状態の力価検定可能な残基において行うことにより、残基のpH関連挙動がシミュレーションされる。最大の挙動又はフレキシビリティー（ここでは等方性変動）を有する領域をランダム突然変異誘発のために選択される。タンパク質の所定の領域において見い出せる高い挙動性はこのような残基の中の残基を置換することにより熱的に改善できると理解できる。この置換は、残基の動力学的挙動を、例えばその近傍環境内の残基との接触性を高める能力を有するより大きめの側鎖及び／又は残基へと変えるであろう残基に対して向けられる。アスペルギルス・ニガー由来のＡＭＧがＭＤシミュレーションのために利用された。ＭＤシミュレーションのやり方は以降の「材料と方法」の章に記載してある。
【００２２】
高まった熱的安定性及び／又は高まった比活性を獲得することを所望するときの突然変異のために適当な分子動力学（ＭＤ）シミュレーションにより認められた領域は下記の通りである：
領域：１−１８，
領域：１９−３５，
領域：７３−８０，
領域：２００−２１２，
領域：２３４−２４６，
領域：３３４−３４１，
領域：３５３−３７４，
領域：４０７−４１１，
領域：４４５−４７０。
【００２３】
比活性を高める及び／又は熱安定性を高めると認められた注目の領域は活性部位に近位の領域である。α−ヘリックス間に位置し、且つ基質結合部位においてのα−ヘリックスのＮ及びＣ末端の両側の位置を含む領域が酵素の活性のために重要である。このような領域は以下の領域を構成する：
領域：４０−６２，
領域：９３−１２７，
領域：１７０−１８４，
領域：２３４−２４６，
領域：２８７−３１９，
領域：３８８−４１４。
【００２４】
リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、例えばタラロマイセス・エメルソニイ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（ＷＯ９９／２８４４８号に開示）及びシエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）はマルトース及びマルトヘパトース等のマルトデキストリンに対して高度な比活性を有する。従って、高い比活性に関して（高い比活性をもたらす）特に注目の領域は以下の通りである：
領域：２００−２１２，
領域：２８７−３００，
領域：３０５−１３９。
【００２５】
本発明者は親グルコアミラーゼの熱安定性を高める及び／又は比活性を高めることが、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基の修飾により事実上可能であることを見い出した。本発明はこの発見に基づく。
【００２６】
従って、第一の観点において、本発明は以下に更に説明する領域及び位置において１又は複数の突然変異を含んで成る親グルコアミラーゼの改良変異体に関する。
【００２７】
親グルコアミラーゼ
本発明に従って考慮される親グルコアミラーゼには真菌グルコアミラーゼ、特にアスペルギルス株から入手可能な真菌グルコアミラーゼ、例えばアスペルギルス・ニガー又はアスペルギルスアワモリグルコアミラーゼ、並びにその変異体又は突然変異体、相同グルコアミラーゼ、そして更にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と構造的及び／又は機能的に類似なグルコアミラーゼが挙げられる。特に考慮されるのはBoelら(1984),「Glucoamylases G1 and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs 」EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102 に開示のアスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼＧ１及びＧ２である。Ｇ２グルコアミラーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に開示する。Ｇ１グルコアミラーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に開示する。考慮される別のＡＭＧ骨格はタラロマイセス・エメルソニイ、特にＷＯ９９／２８４４８（Novo Nordisk）に開示のタラロマイセス・エメルソニイＤＳＭである。
【００２８】
市販の親グルコアミラーゼ
市販の親グルコアミラーゼにはNovo Nordisk由来のＡＭＧ及び、そして更にはGenecor Inc.社ＵＳＡ及びGist-Brocades Delft 社、オランダ由来のグルコアミラーゼである。
【００２９】
グルコアミラーゼ変異体
第一の観点において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列内の以下の位置もしくは領域において
領域：１−１８，
領域：１９−３５，
領域：４０−６２，
領域：７３−８０，
領域：９３−１２７，
領域：１７０−１８４，
領域：２００−２１２，
領域：２３４−２４６，
領域：２８７−３１９，
領域：３３４−３４１，
領域：３５３−３７４，
領域：３８８−４１４，
領域：４４５−４７０，
及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す相同グルコアミラーゼ内の対応の位置もしくは領域において１又は複数の突然変異を含んで成る親グルコアミラーゼの変異体に関する。但し、ここで以下の置換は除かれる：Ｎ２０ｃ，Ａ２７Ｃ，Ｓ３０Ｐ，Ｙ４８Ｗ，Ｙ５０Ｆ，Ｗ５２Ｆ，Ｒ５４Ｋ／Ｌ，Ｄ５５Ｇ／Ｖ，Ｇ５７Ａ，Ｋ１０８Ｒ，Ｄ１１２Ｙ，Ｙ１１６Ａ／Ｗ，Ｓ１１９Ｃ／Ｗ／Ｅ／Ｇ／Ｙ／Ｐ，Ｗ１２０Ｈ／Ｌ／Ｆ／Ｙ，Ｇ１２１Ｔ／Ａ，Ｒ１２２Ｙ，Ｐ１２３Ｇ，Ｑ１２４Ｈ，Ｒ１２５Ｋ，Ｗ１７０Ｆ，Ｎ１７１Ｓ，Ｑ１７２Ｎ，Ｔ１７３Ｇ，Ｇ１７４Ｃ，Ｙ１７５Ｆ，Ｄ１７６Ｎ／Ｅ，Ｌ１７７Ｈ／Ｄ，Ｗ１７８Ｒ／Ｄ，Ｅ１７９Ｑ／Ｄ，Ｅ１８０Ｄ／Ｑ，Ｖ１８１Ｄ／Ａ／Ｔ，Ｎ１８２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｙ／Ｓ，Ｇ１８３Ｋ，Ｓ１８４Ｈ，Ｗ２１２Ｆ，Ｒ２４１Ｋ，Ａ２４６Ｃ，Ｄ２９３Ｅ／Ｑ，Ａ３０２Ｖ，Ｒ３０５Ｋ，Ｙ３０６Ｆ，Ｄ３０９Ｎ／Ｅ，Ｙ３１２Ｗ，Ｗ３１７Ｆ，Ｅ３８９Ｄ／Ｑ，Ｈ３９１Ｗ，Ａ３９２Ｄ，Ａ３９３Ｐ，Ｎ３９５Ｑ，Ｇ３９６Ｓ，Ｅ４００Ｑ／Ｃ，Ｑ４０１Ｅ，Ｇ４０７Ｄ，Ｅ４０８Ｐ，Ｌ４１０Ｆ，Ｓ４１１Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｈ／Ｄ，Ｓ４６０Ｐ。
【００３０】
一の態様において、突然変異領域は領域：１−１８である。
【００３１】
特に考慮される好適な位置は以下のうちの１又は複数が挙げられる：１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８。
特異的な突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ａ１Ｖ，Ｔ２Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｈ／Ｍ／Ｅ／Ｋ，Ｌ３Ｎ，Ｎ９Ａ，Ａ１１Ｅ／Ｐ，Ｉ１８Ｖ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ａ１Ｖ＋Ｌ６６Ｒ＋Ｙ４０２Ｆ＋Ｎ４２７Ｓ＋Ｓ４８６Ｇ，
Ｔ２Ｋ＋Ｓ３０Ｐ＋Ｎ４２７Ｍ＋Ｓ４４Ｇ＋Ｖ４７０Ｍ，
Ｔ２Ｅ＋Ｔ３７９Ａ＋Ｓ３８６Ｋ＋Ａ３９３Ｒ，
Ｔ２Ｑ＋Ａ１１Ｐ＋Ｓ３９４Ｒ，
Ｔ２Ｒ＋Ｌ６６Ｖ＋Ｓ３９４Ｐ＋Ｙ４０２Ｆ，
Ｔ２Ｍ＋Ｎ９Ａ＋Ｔ３９０Ｒ＋Ｄ４０６Ｎ＋Ｌ４１０Ｒ，
Ｔ２Ｒ＋Ｓ３８６Ｒ＋Ａ３９３Ｒ，
Ａ１１Ｐ＋Ｔ２Ｑ＋Ｓ３９４Ｒ，
Ａ１１Ｅ＋Ｅ４０８Ｒ，
Ｉ１８Ｖ＋Ｔ５１Ｓ＋Ｓ５６Ａ＋Ｖ５９Ｔ＋Ｌ６０Ａ。
【００３２】
一の態様において、突然変異領域は領域：１９−３５である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２１−２６，３１−３５。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：１９，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２８，２９，３１，３２，３３，３４，３５。
【００３３】
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ｌ１９Ｎ，Ｎ２０Ｔ，Ｇ２３Ａ，Ａ２４Ｓ／Ｔ，Ｄ２５Ｓ／Ｔ／Ｒ，Ｇ２６Ａ，Ａ２７Ｓ／Ｔ，Ｗ２８Ｒ／Ｙ，Ｓ３０Ｔ／Ｎ，Ｇ３１Ａ，Ａ３２Ｖ，Ｄ３３Ｒ／Ｋ／Ｈ，Ｓ３４Ｎ。
一の態様において、突然変異領域は領域：４０−６２である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：４０−４７，５８−６２。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４９，５１，５３，５６，５８，５９，６０，６１，６２。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ４０Ｃ／Ａ／Ｇ，
Ｔ４３Ｒ，
Ｔ５１Ｓ／Ｄ，
Ｔ５３Ｄ，
Ｓ５６Ａ／Ｃ，
Ｖ５９Ｔ／Ａ，
Ｌ６０Ａ。
【００３４】
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｔ５１Ｓ＋Ｓ５６Ａ＋Ｖ５９Ｔ＋Ｌ６０Ａ＋Ｉ１８Ｖ
Ｖ５９Ａ＋Ａ３９３Ｒ＋Ｔ４９０Ａ＋ＰＬＡＳＤ（Ｎ−末端伸長）。
【００３５】
一の態様において、突然変異領域は領域：７３−８０である。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ７３Ｐ／Ｄ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｅ，
Ｌ７４Ｉ／Ｄ，
Ｌ７５Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、好ましくはＩ／Ｎ／Ｄ，
Ｓ７６Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＴ／Ａ）
Ｔ７７Ｖ／Ｔ，
Ｉ７８Ｖ，
Ｅ７９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＱ／Ｒ／Ｋ）
Ｎ８０Ａ／Ｒ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＨ／Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｋ／Ｔ／Ｓ／Ｙ。
【００３６】
一の態様において、突然変異領域は領域：９３−１２７である。
別の態様において、サブ領域は以下の通りである：領域：９３−１２４。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：９３−１０７，１０９−１１１，１１３−１１５。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６，１０９，１１０，１１１，１１３，１１４，１１５，１１７，１１８，１２６，１２７。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ｎ９３Ｔ，
Ｐ９４Ｖ，
Ｓ９５Ｎ，
Ｄ９７Ｓ，
Ｌ９８Ｓ／Ｐ，
Ｓ１００Ｔ／Ｄ，
Ａ１０２Ｓ／* ，
Ｐ１０７Ｍ／Ｌ／Ａ／Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｉ，
Ｎ１１０Ｔ，
Ｖ１１１Ｐ，
Ｄ１１２Ｎ，
Ｅ１１３Ｍ／Ａ，
Ｔ１１４Ｓ，
Ａ１１５Ｑ／Ａ，
Ｙ１１６Ｆ，
Ｓ１１９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｑ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｔ／Ｖ、好ましくはＡ，
Ｒ１２２Ａ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｖ，
Ｇ１２７Ａ。
【００３７】
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ１１９Ｐ＋Ｇ４４７Ｓ，
Ｓ１１９Ｐ＋Ｙ４０２Ｆ，
Ｓ１１９Ｐ＋Ａ３９３Ｒ，
Ｓ１１９Ｐ＋Ｉ１８９Ｔ＋２２３Ｆ＋Ｆ２２７Ｙ＋Ｙ４０２Ｆ
Ｓ１１９Ｐ＋Ｔ４１６Ｈ＋Ｙ４０２Ｆ＋Ｙ３１２０。
一の態様において、突然変異領域は領域：１７０−１８４である。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｎ１７１Ｒ／Ｋ／Ｑ／Ｅ／Ｗ／Ｆ／Ｙ，
Ｑ１７２Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ｔ１７３Ｋ／Ｒ／Ｓ／Ｎ／Ｑ，
Ｇ１７４Ａ，Ｓ，
Ｙ１７５Ｎ／Ｑ／Ｄ／Ｅ，
Ｄ１７６Ｌ
Ｌ１７７Ｉ
Ｅ１８０Ｎ／Ｍ
Ｖ１８１Ｉ／Ｔ
Ｎ１８２Ｒ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ．
Ｇ１８３Ａ
Ｓ１８４Ｄ／Ｎ／Ｅ／Ｑ／Ｌ／Ｉ／Ｔ／Ｒ／Ｋ。
【００３８】
一の態様において、突然変異領域は領域：２００−２１２である。
好適なサブ領域には２００−２１１が挙げられる。
考慮される好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２００，２０１，２０２，２０３，２０４，２０５，２０６，２０７，２０８，２０９，２１０，２１１。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ａ２０１Ｄ，Ｆ２０２Ｌ，Ａ２０３Ｌ，Ｔ２０４Ｋ，Ａ２０５Ｒ／Ｓ，Ｖ２０６Ｌ／Ｎ，Ｇ２０７Ｎ，Ｓ２０８Ｈ／Ｔ／Ｄ，Ｓ２０９Ｔ，Ｓ２１１Ｐ，Ｗ２１２Ｎ／Ａ／Ｔ。
【００３９】
一の態様において、突然変異領域は領域：２３４−２４６である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２３４−２４０，２４２−２４５。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２３４，２３５，２３６，２３７，２３８，２３９，２４０，２４２，２４３，２４４，２４５。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｌ２３４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ．
Ａ２３５Ｓ
Ｆ２３７Ｙ／Ｈ／Ｎ／Ｄ．
Ｄ２３８Ｔ／Ｓ．
Ｓ２３９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｖ．
Ｓ２３９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｖ．
Ｓ２４０Ｇ
Ｓ２４２Ｓ／Ｐ／Ｔ／Ａ／Ｙ／Ｈ／Ｎ／Ｄ．
Ｇ２４３Ｓ／Ｐ／Ｔ／Ａ／Ｙ／Ｈ／Ｎ／Ｄ．
Ｋ２４４Ｒ，
Ａ２４６Ｔ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ａ２４６＋Ｔ７２Ｉ。
【００４０】
一の態様において、突然変異領域は領域：２８７−３１９である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２８７−２９２，２９４−３０１，３１３−３１６。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２８７，２８８，２８９，２９０，２９１，２９２，２９４，２９５，２９６，２９７，２９８，２９９，３００，３０１，３０３，３０７，３０８，３１０，３１１，３１３，３１４，３１５，３１６，３１８，３１９。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ２８７Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｔ／Ｖ，
Ｉ２８８Ｌ／Ｎ／Ｑ，
Ｙ２８９Ｆ，
Ｔ２９０Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｖ，
Ｌ２９１Ｉ／Ｄ／Ｎ，
Ｎ２９２Ｄ，
Ｄ２９３Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ，
Ｇ２９４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｖ，
Ｌ２９５Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ，
Ｓ２９６Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｔ／Ｖ，
Ｄ２９７Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｖ，
Ｓ２９８Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｔ／Ｖ，
Ｅ２９９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ．
Ｖ３０１Ｔ／Ｉ，
Ａ３０２Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＳ，
Ｖ３０３Ｔ／Ｉ，
Ｇ３０４Ａ，
Ｒ３０５Ａ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ｙ３０６Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｖ．
Ｅ３０８Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、好ましくはＱ，
Ｄ３０９Ｌ，
Ｔ３１０Ｖ／Ｓ，
Ｙ３１１Ｎ，
Ｙ３１２Ｑ／Ｎ，
Ｎ３１３Ｔ／Ｓ／Ｇ
Ｎ３１５Ｑ／Ｅ／Ｒ，
Ｆ３１８Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＹ。
【００４１】
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｙ３１２Ｑ＋Ｓ１１９Ｐ＋Ｔ４１６Ｈ＋Ｙ４０２Ｆ，
Ｙ３１２Ｑ＋Ｓ１１９Ｐ＋Ｙ４０２Ｆ＋Ｔ４１６Ｈ＋Ｓ４１１Ｖ，
Ｙ３１２Ｑ＋Ｔ４１６Ｈ
Ｎ３１３Ｇ＋Ｆ３１８Ｙ。
【００４２】
一の態様において、突然変異領域は領域：３３４−３４１である。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：３３４，３３５，３３６，３３７，３３８，３３９，３４０，３４１。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｄ３３６Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ．
Ｋ３３７Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ．
Ｑ３３８Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｖ．
Ｇ３３９Ｓ／Ｐ／Ｔ／Ａ．
Ｓ３４０Ｉ／Ｔ／Ｎ／Ｖ／Ａ／Ｄ／Ｇ．
Ｌ３４１Ｆ／Ｌ／Ｉ／Ｖ。
【００４３】
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ３４０Ｇ＋Ｄ３５７Ｓ＋Ｔ３６０Ｖ＋Ｓ３８６Ｐ。
【００４４】
一の態様において、突然変異領域は領域：３５３−３７４である。
考慮される好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：３５３，３５４，３５５，３５６，３５７，３５８，３５９，３６０，３６１，３６２，３６３，３６４，３６５，３６６，３６７，３６８，３６９，３７０，３７１，３７２，３７３，３７４。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ａ３５３Ｄ／Ｓ，
Ｓ３５６Ｐ／Ｎ／Ｄ，
Ｄ３５７Ｓ，
Ａ３５９Ｓ，
Ｔ３６０Ｖ，
Ｇ３６１Ｓ／Ｐ／Ｔ／Ａ，
Ｔ３６２Ｒ，
Ｓ３６４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ｓ３６５Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ｓ３６６Ｔ，
Ｓ３６８Ｐ／Ｔ／Ａ，
Ｔ３６９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ｓ３７１Ｙ／Ｈ／Ｎ／Ｄ，
Ｓ３７２Ｆ／Ｙ／Ｃ／Ｌ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｉ／Ｔ／Ｎ／Ｓ／Ｖ／Ａ／Ｄ／Ｇ．
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ３５６Ｐ＋Ｓ３６６Ｔ，
Ｄ３５７Ｓ＋Ｔ３６０Ｖ＋Ｓ３７１Ｈ．
Ｄ３５７Ｓ＋Ｔ３６０Ｖ＋Ｓ３８６Ｐ＋Ｓ３４０Ｇ。
【００４５】
一の態様において、突然変異領域は領域：３８８−４１４である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：３９７−３９９，４０２−４０６，４１２−４１４。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：３８８，３８９，３９０，３９４，３９７，３９８，３９９，４０２，４０３，４０４，４０５，４０６，４０９，４１２，４１３，４１４．
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ｔ３９０Ｒ，
Ａ３９３Ｒ，
Ｓ３９４Ｐ／Ｒ，
Ｍ３９８Ｌ，
Ｓ３９９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＴ／Ｑ／Ｃ，
Ｙ４０２Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、好ましくはＦ，
Ｄ４０３Ｓ，
Ｓ４０５Ｔ，
Ｄ４０６Ｎ，
Ｅ４０８Ｃ／Ｒ，
Ａ４０９Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＰ，
Ｌ４１０Ｒ／Ｉ，
Ｓ４１１Ｒ／Ｎ／Ｑ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＶ，
Ａ４１２Ｃ，
Ｒ４１３Ａ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ．
Ｄ４１４Ａ。
【００４６】
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ａ３９３Ｒ＋Ｔ４９０Ａ＋Ｖ５９Ａ＋ＰＬＡＳＤ（Ｎ−末端伸長）
Ｓ３９４Ｒ＋Ｔ２Ｑ＋Ａ１１Ｐ，
Ｙ４０２Ｆ＋Ｓ４１１Ｖ，
Ｙ４０２Ｆ＋Ｓ４１１Ｖ＋Ｓ１１９Ｐ
Ｙ４０２Ｆ＋Ｓ４１１Ｖ＋Ｓ１１９Ｐ＋Ａ３９３Ｒ，
Ｙ４０２Ｆ＋Ｙ３１２Ｑ＋Ｓ１１９Ｐ＋Ｔ４１６Ｈ，
Ｅ４０８Ｒ＋Ｓ３８６Ｎ，
Ｅ４０８Ｒ＋Ａ４２５Ｔ＋Ｓ４６５Ｐ＋Ｔ４９６Ａ，
Ｌ４１０Ｒ＋Ａ３９３Ｒ，
Ｙ４０２Ｆ＋Ｙ３１２Ｑ＋Ｓ１１９Ｐ＋Ｔ４１６Ｈ＋Ｓ４１１Ｖ＋Ａ３９３Ｒ。
【００４７】
一の態様において、突然変異領域は領域：４４５−４７０である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：４４５−４５９，４６１−４７０。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：４４５，４４６，４４７，４４８，４４９，４５０，４５１，４５２，４５３，４５４，４５５，４５６，４５７，４５８，４５９，４６１，４６２，４６３，４６４，４６５，４６６，４６７，４６７，４６８，４６９，４７０。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ｇ４４７Ｓ，Ｇ４５６Ｃ／Ｐ，Ｓ４６５Ｐ。
【００４８】
特定の変異体には１又は複数の下記の置換を有する変異体が挙げられる：Ａ１Ｖ，Ｔ２Ｅ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｈ／Ｍ，Ｌ３Ｐ／Ｎ，Ｎ９Ａ，Ａ１１Ｐ／Ｅ，Ｉ１８Ｖ，Ｌ１９Ｎ，Ｎ２０Ｔ，Ｇ２３Ａ，Ａ２４Ｓ／Ｔ，Ｄ２５Ｓ／Ｔ／Ｒ，Ｇ２６Ａ，Ａ２７Ｓ／Ｔ，Ｗ２８Ｒ／Ｙ，Ｓ３０Ｔ／Ｎ，Ｇ３１Ａ，Ａ３２Ｖ，Ｄ３３Ｒ／Ｋ／Ｈ，Ｓ３４Ｎ，Ｓ４０Ｃ，Ｔ４３Ｒ，Ｔ５１Ｄ／Ｓ，Ｔ５３Ｄ，Ｓ５６Ａ／Ｃ，Ｖ５９Ｔ／Ａ，Ｌ６０Ａ，Ｎ９３Ｔ，Ｐ９４Ｖ，Ｓ９５Ｎ，Ｄ９７Ｓ，Ｌ９８Ｐ／Ｓ，Ｓ１００Ｔ／Ｄ，Ａ１０２Ｓ／* ，Ｎ１１０Ｔ，Ｖ１１１Ｐ，Ｄ１１２Ｎ，Ｅ１１３Ｍ／Ａ，Ｔ１１４Ｓ，Ａ１１５Ｑ／Ｇ，Ｙ１１６Ｆ，Ｓ１１９Ａ，Ｇ１２７Ａ，Ｎ１８２Ｅ，Ａ２０１Ｄ，Ｆ２０２Ｌ，Ａ２０３Ｌ，Ｔ２０４Ｋ，Ａ２０５Ｒ／Ｓ，Ｖ２０６Ｌ／Ｎ，Ｇ２０７Ｎ，Ｓ２０８Ｈ／Ｔ／Ｄ，Ｓ２０９Ｔ，Ｓ２１１Ｐ，Ｗ２１２Ｎ／Ａ／Ｔ，Ａ２４６Ｔ，Ｙ３１２Ｑ，Ｎ３１３Ｔ／Ｓ／Ｇ，Ａ３５３Ｄ／Ｓ，Ｓ３５６Ｐ／Ｎ／Ｄ，Ｄ３５７Ｓ，Ａ３５９Ｓ，Ｔ３６０Ｖ，Ｇ３６１Ｓ／Ｐ／Ｔ／Ａ，Ｔ３６２Ｒ，Ｓ３６４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，Ｓ３６５Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，Ｓ３６６Ｔ，Ｓ３６８Ｐ／Ｔ／Ａ，Ｔ３６９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，Ｓ３７１Ｙ／Ｈ／Ｎ／Ｄ，Ｓ３７２Ｆ／Ｙ／Ｃ／Ｌ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｉ／Ｔ／Ｎ／Ｓ／Ｖ／Ａ／Ｄ／Ｇ，Ｔ３９０Ｒ，Ａ３９３Ｒ，Ｓ３９４Ｒ／Ｐ，Ｍ３９８Ｌ，Ｓ３９９Ｃ／Ｑ／Ｔ，Ｙ４０２Ｆ，Ｄ４０３Ｓ，Ｓ４０５Ｔ，Ｄ４０６Ｎ，Ｅ４０８Ｃ／Ｒ，Ｌ４１０Ｉ／Ｒ，Ｓ４１１Ｖ，Ａ４１２Ｃ，Ｄ４１４Ａ，Ｇ４４７Ｓ，Ｓ４６５Ｐ。
【００４９】
高められた熱的安定性
第二の観点において、本発明は高められた熱的安定性を、特に４０〜８０℃、好ましくは６０〜８０℃の範囲及びPh４〜５において安定性を有する親グルコアミラーゼの変異体に関連し、ここで当該変異体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列内の下記の位置もしくは領域において
領域：１−１８，
領域：１９−３５，
領域：７３−８０，
領域：９３−１２７，
領域：１７０−１８４，
領域：２００−２１２，
領域：２３４−２４６，
領域：２８７−３１９，
領域：３３４−３４１，
領域：３５３−３７４，
領域：３８８−４１４，
領域：４４５−４７０，
及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す相同グルコアミラーゼ内の対応の位置もしくは領域において１又は複数の突然変異を含んで成る、但し、Ｎ２０Ｃ，Ａ２７Ｃ，Ｓ３０Ｐ，Ａ２４６Ｃの置換は除く。
【００５０】
基質結合が安定領域９３−１２７を良くするため、領域：１７０−１８４，領域：３０５−３１９も本発明に係る熱安定化のために考慮される。
【００５１】
一の態様において、突然変異領域は領域：１−１８である。
【００５２】
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ａ１Ｖ，Ｔ２Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｈ／Ｍ／Ｅ，Ｎ９Ａ，Ａ１１Ｅ／Ｐ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ａ１Ｖ＋Ｌ６６Ｒ＋Ｙ４０２Ｆ＋Ｎ４２７Ｓ＋Ｓ４８６Ｇ，
Ｔ２Ｋ＋Ｓ３０Ｐ＋Ｎ４２７Ｍ＋Ｓ４４Ｇ＋Ｖ４７０Ｍ，
Ｔ２Ｅ＋Ｔ３７９Ａ＋Ｓ３８６Ｋ＋Ａ３９３Ｒ，
Ｔ２Ｒ＋Ｓ３８６Ｒ＋Ａ３９３Ｒ，
Ａ１１Ｐ＋Ｔ２Ｑ＋Ｓ３９４Ｒ，
Ｔ２Ｑ＋Ａ１１Ｐ＋Ｓ３９４Ｒ，
Ｔ２Ｒ＋Ｌ６６Ｖ＋Ｓ３９４Ｐ＋Ｙ４０２Ｆ，
Ｔ２Ｍ＋Ｎ９Ａ＋Ｔ３９０Ｒ＋Ｄ４０６Ｎ＋Ｌ４１０Ｒ，
Ｔ２Ｒ＋Ｓ３８６Ｒ＋Ａ３９３Ｒ，
Ａ１１Ｅ＋Ｅ４０８Ｒ。
【００５３】
一の態様において、突然変異領域は領域：１９−３５である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２１−２６，３１−３５。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：１９，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２８，２９，３１，３２，３３，３４，３５。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ｌ１９Ｎ，Ｎ２０Ｔ，Ｇ２３Ａ，Ａ２４Ｓ／Ｔ，Ｄ２５Ｓ／Ｔ／Ｒ，Ｇ２６Ａ，Ａ２７Ｓ／Ｔ，Ｗ２８Ｒ／Ｙ，Ｓ３０Ｔ／Ｎ，Ｇ３１Ａ，Ａ３２Ｖ，Ｄ３３Ｒ／Ｋ／Ｈ，Ｓ３４Ｎ。
【００５４】
一の態様において、突然変異領域は領域：７３−８０である。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ７３Ｐ／Ｄ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｅ，
Ｌ７４Ｉ／Ｄ，
Ｌ７５Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、好ましくはＩ／Ｎ／Ｄ，
Ｓ７６Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＴ／Ａ）
Ｔ７７Ｖ／Ｔ，
Ｉ７８Ｖ，
Ｅ７９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＱ／Ｒ／Ｋ）
Ｎ８０Ａ／Ｒ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＨ／Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｋ／Ｔ／Ｓ／Ｙ。
【００５５】
一の態様において、突然変異領域は領域：９３−１２７である。
別の態様において、サブ領域は領域：９３−１２４。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：９３−１０７，１０９−１１１，１１３−１１５。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６，１０９，１１０，１１１，１１３，１１４，１１５，１１７，１１８，１２６，１２７。
好適な突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｐ１０７Ｍ／Ｌ／Ａ／Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｉ，
Ｓ１１９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｑ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｔ／Ｖ、好ましくはＡ，
Ｒ１２２Ａ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｖ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ１１９Ｐ＋Ｇ４４７Ｓ．
Ｓ１１９Ｐ＋Ａ３９３Ｒ。
【００５６】
一の態様において、突然変異領域は領域：１７０−１８４である。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｎ１７１Ｒ／Ｋ／Ｑ／Ｅ／Ｗ／Ｆ／Ｙ，
Ｑ１７２Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ｔ１７３Ｋ／Ｒ／Ｓ／Ｎ／Ｑ，
Ｇ１７４Ａ，Ｓ，
Ｙ１７５Ｎ／Ｑ／Ｄ／Ｅ，
Ｄ１７６Ｌ
Ｌ１７７Ｉ
Ｅ１８０Ｎ／Ｍ
Ｖ１８１Ｉ／Ｔ
Ｎ１８２Ｒ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ．
Ｇ１８３Ａ
Ｓ１８４Ｄ／Ｎ／Ｅ／Ｑ／Ｌ／Ｉ／Ｔ／Ｒ／Ｋ。
【００５７】
一の態様において、突然変異領域は領域：２００−２１２である。
好適なサブ領域には２００−２１１が挙げられる。
考慮される好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２００，２０１，２０２，２０３，２０４，２０５，２０６，２０７，２０８，２０９，２１０，２１１。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ａ２０３Ｌ，Ｓ２１１Ｐ。
【００５８】
一の態様において、突然変異領域には領域：２３４−２４６が挙げられる。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２３４−２４０，２４２−２４５。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２３４，２３５，２３６，２３７，２３８，２３９，２４０，２４２，２４３，２４４，２４５。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｌ２３４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ａ２３５Ｓ，
Ｆ２３７Ｙ／Ｈ／Ｎ／Ｄ，
Ｄ２３８Ｔ／Ｓ，
Ｓ２３９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｖ，
Ｓ２４０Ｇ，
Ｓ２４２Ｓ／Ｐ／Ｔ／Ａ／Ｙ／Ｈ／Ｎ／Ｄ，
Ｇ２４３Ｓ／Ｐ／Ｔ／Ａ／Ｙ／Ｈ／Ｎ／Ｄ，
Ｋ２４４Ｒ，
Ａ２４６Ｔ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ａ２４６＋Ｔ７２Ｉ。
【００５９】
一の態様において、突然変異領域は領域：２８７−３１９である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２８７−２９２，２９４−３０１，３１３−３１６。
【００６０】
別の態様において、サブ領域には３０５−３１９が挙げられる。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２８７，２８８，２８９，２９０，２９１，２９２，２９４，２９５，２９６，２９７，２９８，２９９，３００，３０１，３０２，３０３，３０７，３０８，３１０，３１１，３１３，３１４，３１５，３１６，３１８，３１９。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｙ３１２Ｑ，
Ｆ３１８Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＹ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｎ３１３Ｇ＋Ｆ３１８Ｙ，
Ｙ３０２Ｑ＋Ｓ１１９Ｐ＋Ｔ４１６Ｈ＋Ｙ４０２Ｆ。
【００６１】
一の態様において、突然変異領域は領域：３３４−３４１である。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：３３４，３３５，３３６，３３７，３３８，３３９，３４０，３４１。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｄ３３６Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ．
Ｋ３３７Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ．
Ｑ３３８Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｖ．
Ｇ３３９Ｓ／Ｐ／Ｔ／Ａ．
Ｓ３４０Ｉ／Ｔ／Ｎ／Ｖ／Ａ／Ｄ／Ｇ．
Ｌ３４１Ｆ／Ｌ／Ｉ／Ｖ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ３４０Ｇ＋Ｄ３５７Ｓ＋Ｔ３６０Ｖ＋Ｓ３８６Ｐ。
【００６２】
一の態様において、突然変異領域は領域：３５３−３７４である。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：３５３，３５４，３５５，３５６，３５７，３５８，３５９，３６０，３６１，３６２，３６３，３６４，３６５，３６６，３６７，３６８，３６９，３７０，３７１，３７２，３７３，３７４。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ａ３５３Ｄ／Ｓ，
Ｓ３５６Ｐ／Ｎ／Ｄ，
Ｄ３５７Ｓ，
Ａ３５９Ｓ，
Ｔ３６０Ｖ，
Ｇ３６１Ｓ／Ｐ／Ｔ／Ａ，
Ｔ３６２Ｒ，
Ｓ３６４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ｓ３６５Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ｓ３６６Ｔ，
Ｓ３６８Ｐ／Ｔ／Ａ，
Ｔ３６９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ｓ３７１Ｙ／Ｈ／Ｎ／Ｄ，
Ｓ３７２Ｆ／Ｙ／Ｃ／Ｌ／Ｐ／Ｈ／Ｒ／Ｉ／Ｔ／Ｎ／Ｓ／Ｖ／Ａ／Ｄ／Ｇ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ３５６Ｐ＋Ｓ３６６Ｔ，
Ｄ３５７Ｓ＋Ｔ３６０Ｖ＋Ｓ３７１Ｈ
Ｄ３５７Ｓ＋Ｔ３６０Ｖ＋Ｓ３８６Ｐ＋Ｓ３４０Ｇ。
【００６３】
一の態様において、突然変異領域は領域：３８８−４１４である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：３９７−３９９，４０２−４０６，４１２−４１４。
別の態様において、サブ領域は４０７−４１１である。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：３８８，３８９，３９０，３９４，３９７，３９８，３９９，４０２，４０３，４０４，４０５，４０６，４０９，４１２，４１３，４１４。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ｔ３９０Ｒ，
Ａ３９３Ｒ，
Ｓ３９４Ｐ／Ｒ，
Ｓ３９９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＴ／Ｑ／Ｃ，
Ｙ４０２Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、好ましくはＦ，
Ｄ４０３Ｓ，
Ｓ４０５Ｔ，
Ｄ４０６Ｎ，
Ｅ４０８Ｃ／Ｒ，
Ｑ４０９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＰ，
Ｌ４１０Ｉ／Ｒ，
Ｓ４１１Ｖ，
Ａ４１２Ｃ，
Ｒ４１３Ａ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ．
Ｄ４１４Ａ。
【００６４】
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ａ３９３Ｒ＋Ｔ２Ｒ＋Ｓ３８６Ｒ，
Ａ３９３Ｒ＋Ｔ４９０Ａ＋Ｖ５９Ａ＋ＰＬＡＳＤ（Ｎ−末端伸長），
Ｓ３９４Ｒ＋Ｔ２Ｑ＋Ａ１１Ｐ，
Ｙ４０２Ｆ＋Ｔ２Ｒ＋Ｌ６６Ｖ＋Ｓ３９４Ｐ，
Ｙ４０２Ｆ＋Ｓ４１１Ｖ＋Ｓ１１９Ｐ
Ｙ４０２Ｆ＋Ｓ４１１Ｖ，
Ｙ４０２Ｆ＋３１２Ｑ＋Ｓ１１９Ｐ＋Ｔ４１６Ｈ，
Ｓ４１１Ｖ＋Ａ３９３Ｒ，
Ｅ４０８Ｒ＋Ｓ３８６Ｎ，
Ｅ４０８Ｒ＋Ａ４２５Ｔ＋Ｓ４６５Ｐ＋Ｔ４９４Ａ，
Ｌ４１０Ｒ＋Ａ３９３Ｒ，
Ｓ４１１Ｖ＋Ｓ１１９Ｐ＋４０２Ｆ＋Ａ３９３Ｒ，
Ｓ４１１Ｖ＋Ｓ１１９Ｐ＋４０２Ｆ＋Ａ３９３Ｒ＋Ｔ４１６Ｈ。
【００６５】
一の態様において、突然変異領域は領域：４４５−４７０である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：４４５−４５９，４６１−４７０。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：４４５，４４６，４４７，４４８，４４９，４５０，４５１，４５２，４５３，４５４，４５５，４５６，４５７，４５８，４５９，４６１，４６２，４６３，４６４，４６５，４６６，４６７，４６７，４６８，４６９，４７０。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ｇ４４７Ｓ，Ｇ４５６Ｃ／Ｐ，Ｓ４６５Ｐ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｇ４４７Ｓ＋Ｓ１１９Ｐ，
Ｓ４６５Ｐ＋Ｅ４０８Ｒ＋Ａ４２５Ｔ＋Ｔ４９４Ａ。
【００６６】
高められた比活性
第三の観点において、本発明は高められた比活性を有する親グルコアミラーゼの変異体に関連し、これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列内の下記の位置もしくは領域において
領域：１−１８，
領域：４０−６２，
領域：９３−１２７，
領域：１７０−１８４，
領域：２００−２１２，
領域：２３４−２４６，
領域：２８７−３１９，
領域：３８８−４１４，
及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す相同グルコアミラーゼ内の対応の位置もしくは領域において１又は複数の突然変異を含んで成る。但し、Ｓ４１１Ｇの置換は除く。
【００６７】
一の態様において、突然変異領域は領域：１−１８である。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９。
特定の突然変異は：Ｌ３Ｎ，Ｉ１８Ｖである。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｉ１８Ｖ＋Ｔ５１Ｓ＋Ｓ５６Ａ＋Ｖ５９Ｔ＋Ｌ６０Ａ。
一の態様において、突然変異領域は領域：４０−６２である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：４０−４７，５８−６２。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４９，５１，５３，５６，５８，５９，６０，６１，６２。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ４０Ｃ，Ｔ４３Ｒ，Ｔ５１Ｓ／Ｄ，Ｔ５３Ｄ，Ｓ５６Ａ／Ｃ，Ｖ５９Ｔ，Ｌ６０Ａ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｔ５１Ｓ＋Ｓ５６Ａ＋Ｖ５９Ｔ＋Ｌ６０Ａ＋Ｉ１８Ｖ。
【００６８】
一の態様において、突然変異領域は領域：９３−１２７である。
別の態様において、サブ領域は領域：９３−１２４である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：９３−１０７，１０９−１１１，１１３−１１５。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６，１０９，１１０，１１１，１１３，１１４，１１５，１１７，１１８，１２６，１２７。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ｎ９３Ｔ，Ｐ９４Ｖ，Ｓ９５Ｎ，Ｄ９７Ｓ，Ｌ９８Ｓ／Ｐ，Ｓ１００Ｔ／Ｄ，Ａ１０２Ｓ／* ，Ｎ１１０Ｔ，Ｖ１１１Ｐ，Ｄ１１２Ｎ，Ｅ１１３Ｍ／Ａ，Ｔ１１４Ｓ，Ａ１１５Ｑ／Ｇ，Ｙ１１６Ｆ，Ｓ１１９Ａ，Ｇ１２７Ａ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ１１９Ｐ＋Ｙ４０２Ｆ，
Ｓ１１９Ｐ＋Ｙ４０２Ｆ＋Ｉ１８９Ｔ＋Ｙ２２３Ｆ＋Ｆ２２７Ｙ。
【００６９】
一の態様において、突然変異領域は領域：１７０−１８４である。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｎ１７１Ｒ／Ｋ／Ｑ／Ｅ／Ｗ／Ｆ／Ｙ，
Ｑ１７２Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ｔ１７３Ｋ／Ｒ／Ｓ／Ｎ／Ｑ，
Ｇ１７４Ａ，Ｓ，
Ｙ１７５Ｎ／Ｑ／Ｄ／Ｅ，
Ｄ１７６Ｌ
Ｌ１７７Ｉ
Ｅ１８０Ｎ／Ｍ
Ｖ１８１Ｉ／Ｔ
Ｎ１８２Ｒ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、好ましくはＥ，
Ｇ１８３Ａ
Ｓ１８４Ｄ／Ｎ／Ｅ／Ｑ／Ｌ／Ｉ／Ｔ／Ｒ／Ｋ。
【００７０】
一の態様において、突然変異領域は領域：２００−２１２である。
好適なサブ領域には２００−２１１が挙げられる。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２００，２０１，２０２，２０３，２０４，２０５，２０６，２０７，２０８，２０９，２１０，２１１。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ａ２０１Ｄ，Ｆ２０２Ｌ，Ａ２０３Ｌ，Ｔ２０４Ｋ，Ａ２０５Ｒ／Ｓ，Ｖ２０６Ｌ／Ｎ，Ｇ２０７Ｎ，Ｓ２０８Ｈ／Ｔ／Ｄ，Ｓ２０９Ｔ，Ｗ２１２Ｎ／Ａ／Ｔ。
【００７１】
一の態様において、突然変異領域は領域：２３４−２４６である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２３４−２４０，２４２−２４５。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２３４，２３５，２３６，２３７，２３８，２３９，２４０，２４２，２４３，２４４，２４５。
【００７２】
一の態様において、突然変異領域は領域：２８７−３１９である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２８７−２９２，２９４−３０１，３１３−３１６。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：２８７，２８８，２８９，２９０，２９１，２９２，２９４，２９５，２９６，２９７，２９８，２９９，３００，３０１，３０２，３０３，３０７，３０８，３１０，３１１，３１３，３１４，３１５，３１６，３１８，３１９。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｓ２８７Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｔ／Ｖ，
Ｉ２８８Ｌ／Ｎ／Ｑ，
Ｙ２８９Ｆ，
Ｔ２９０Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｖ，
Ｌ２９１Ｉ／Ｄ／Ｎ，
Ｎ２９２Ｄ，
Ｄ２９３Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ，
Ｇ２９４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｖ，
Ｌ２９５Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ，
Ｓ２９６Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｔ／Ｖ，
Ｄ２９７Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｖ，
Ｓ２９８Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｔ／Ｖ，
Ｅ２９９Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｇ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ．
Ｖ３０１Ｔ／Ｉ，
Ａ３０２Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ／、好ましくはＳ，
Ｖ３０３Ｔ／Ｉ，
Ｇ３０４Ａ，
Ｒ３０５Ａ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｖ，
Ｙ３０６Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｖ，
Ｅ３０８Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、好ましくはＱ，
Ｄ３０９Ｌ，
Ｔ３１０Ｖ／Ｓ，
Ｙ３１１Ｎ，
Ｙ３１２Ｑ／Ｎ、好ましくはＱ，
Ｎ３１３Ｔ／Ｓ／Ｇ、好ましくはＳ，
Ｎ３１５Ｑ／Ｅ／Ｒ。
【００７３】
一の態様において、突然変異領域は領域：３８８−４１４である。
好適なサブ領域には以下のうちの１又は複数が挙げられる：３９７−３９９，４０２−４０６，４１２−４１４。
考慮される特に好適な位置には以下のうちの１又は複数が挙げられる：３８８，３８９，３９０，３９４，３９７，３９８，３９９，４０２，４０３，４０４，４０５，４０６，４０９，４１２，４１３，４１４。
特定の突然変異には以下のうちの１又は複数が挙げられる：Ｍ３９８Ｌ，Ｓ３９９Ｃ／Ｑ／Ｔ，Ｙ４０２Ｆ，Ｄ４０３Ｓ，Ｓ４０５Ｔ，Ｅ４０８Ｃ／Ｒ，Ｓ４１１Ｖ，Ａ４１２Ｃ，Ｄ４１４Ａ。
好適な突然変異の組合せには以下のうちの１又は複数が挙げられる：
Ｙ４０２Ｆ＋Ｓ１１９Ｐ，
Ｙ４０２Ｆ＋Ｓ１１９Ｐ＋Ｉ１８９Ｔ＋Ｙ２２３Ｆ＋Ｆ２２７Ｙ。
【００７４】
本発明の好適な態様において、突然変異すべき領域は下記の通りである：
領域：２８７−３００，
領域：３０５−３１９，
及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す相同グルコアミラーゼ内の対応の位置又は領域。
【００７５】
ホモロジー（同一性）
親グルコアミラーゼについて上述したホモロジーは２つのタンパク質配列間の同一性の度合いとして決定され、第一配列の第二配列からの誘導を示唆する。このホモロジーは適切には当業界公知のコンピュータープログラムを介して決定されうる。例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ内のＧＡＰ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, p. 443-453）。ギャップ及びポリペプチド配列対比のための下記の設定値、３．０のギャップ・クリエーションペナルティー及び０．１のギャップ・エクステンションペナルティーを利用し、本発明の類似ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの成熟部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列の成熟部分と好ましくは６０％以上、例えば７０％、８０％以上、９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性の度合いを示す。
【００７６】
好ましくは、親グルコアミラーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列；又はそのアレル変異体；又はグルコアミラーゼ活性を有するそのフラグメントを含んで成る。
【００７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のフラグメントはこのアミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端から１又は複数個のアミノ酸が欠失したポリペプチドである。例えば、ＡＭＧ  Ｇ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）はグルコアミラーゼ活性を有するアスペルギルス・ニガーＧ１グルコアミラーゼ（Boelら、(1984), EMBO J. 3 (5), p.1097-1102）のフラグメントである。アレル変異体は同じ染色体座を占める遺伝子の２以上の択一的な形態のいずれかを意味する。アレル変異体は突然変異を介して自然に生じ、そして集団内に多形態をもたらしうる。遺伝子突然変異はサイレントであってよく（コードポリペプチドに変化なし）、又は異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうる。ポリペプチドのアレル変異体は遺伝子のアレル変異体によりコードされるポリペプチドをいう。
【００７８】
相同親グルコアミラーゼのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列と、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は欠失及び／又は１又は複数のアミノ酸残基の別のアミノ酸残基による置換により相違しうる。好ましくは、アミノ酸変化はささいなもの、即ちタンパク質のフォルディング及び／又は活性に有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換；典型的には１〜約３０個のアミノ酸の小欠失；小アミノ又はカルボキシル末端伸長、例えば１個のアミノ末端メチオニン残基；約２０〜２５残基までの小リンカーペプチド；又は正味電荷又はその他の機能を改変することにより精製を促進する小伸長、例えばポリヒスチジントラクト、抗原エピトープ又は結合ドメインである。
【００７９】
別の態様において、単離された親グルコアミラーゼは超低ストリンジェンシー条件下、好ましくは低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中−高ストリンジェンシー条件下、更により好ましくは高ストリンジェンシー条件下、そして最も好ましくは超高ストリンジェンシー条件下で、同条件下のもとで（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の核酸配列、（ii）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のｃＤＮＡ配列、（iii ）（ｉ）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（ｉ），（ii）又は（iii ）の相補鎖とハイブリダイズする核酸プローブにハイブリダイズする核酸によりコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のサブ配列は１００ヌクレオチド以上、又は好ましくは２００ヌクレオチド以上であってよい。更に、このサブ配列はグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードしうる。この親ポリペプチドはグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドのアレル変異体又はフラグメントであってもよい。
【００８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の核酸配列又はそのサブ配列、並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列又はそのフラグメントを、当業界周知の方法に従って
様々な属又は種の株からグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定及びクローニングするための核酸プローブを設計するのに用いることができうる。詳しくは、かかるプローブは注目の属又は種の中の対応の遺伝子を同定及び単離するため、標準のサザンブロット手順に従い、その中のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに利用できうる。かかるプローブは長さが全配列よりもかなり短くてよいが、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、そしてより好ましくは少なくとも３５ヌクレオチドであるべきである。このプローブは典型的には対応の遺伝子の検出のためにラベルしておく（例えば、32Ｐ， 3Ｈ，35Ｓ，ビオチン又はアビジン）。かかるプローブは本発明に包含される。
【００８１】
かくして、かかるその他の生物から調製したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを上記のプローブとハイブリダイズし、且つグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡでスクリーニングすることができうる。かかるその他の生物に由来するゲノム又はその他のＤＮＡはアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はその他の分離技術により分離できうる。ライブラリー由来のＤＮＡ又は分離ＤＮＡをニトロセルロース又はその他の適当な担体材料に転写して固定化してよい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と相同性なクローン又はＤＮＡ又はそのサブ配列を同定するため、この担体材料をサザンブロットに利用する。本発明の目的のため、ハイブリダイゼーションは核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す核酸配列に対応する核酸プローブ、その相補鎖、又はそのサブ配列に超低乃至超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを示唆する。このような条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子はＸ線フィルムを用いて検出する。
【００８２】
長さ１００ヌクレオチド以上の長いプローブの場合、担体材料を最終的に３回、２×のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて毎回15分、好ましくは４５℃以上（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは５０℃以上（低ストリンジェンシー）、より好ましくは５５℃以上（中ストリンジェンシー）、より好ましくは６０％以上（中−高ストリンジェンシー）、更により好ましくは６５℃以上（高ストリンジェンシー）、そして最も好ましくは７０℃以上（超高ストリンジェンシー）において洗浄する。
【００８３】
長さ約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブの場合、ストリンジェンシー条件はmL当り０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  pH７．６、６mMのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、１×のＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１mMのピロリン酸ナトリウム、１mMの一塩基リン酸ナトリウム、０．１mMのＡＴＰ、及び０．２mgの酵母ＲＮＡ中での標準のサザンブロット手順に従う、Bolton and McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48 : 1390）による計算を利用してもとめたＴｍより５℃〜１０℃低い温度でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄後ハイブリダイゼーションと定義する。
【００８４】
長さ約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブの場合、担体材料を６×のＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳの中で１回洗浄し、そして６×のＳＳＣを用いて計算Ｔｍより５℃〜１０℃低い温度で１５分づつ２回洗浄する。
【００８５】
本発明は更に（ａ）ＤＮＡを超低、低、中、中−高、高、又は超高ストリンジェンシー条件下でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列又はその相補鎖とハイブリダイズさせ；そして（ｂ）この核酸配列を単離することにより製造した単離核酸配列に関する。このサブ配列は好ましくは１００以上のヌクレオチドの配列、例えばグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする配列である。
【００８６】
考慮される親グルコアミラーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の成熟ポリペプチドのグルコアミラーゼ活性の２０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、更により好ましくは８０％以上、更により好ましくは９０％以上、そして最も好ましくは１００％以上の活性を有する。
【００８７】
好適な態様において、本発明の変異体は好ましくは約６０〜８０℃、好ましくは６３〜７５℃の温度間隔、好ましくは４〜５のpH、特に４．２〜４．７のpHにおいて、基質としてマルトデキストリンを用い、高まった熱安定性及び／又は高まった比活性を有する。
【００８８】
別の好適な態様において、本発明の変異体は例えばアルコール発酵用のものである。
【００８９】
好適な態様において、当該親グルコアミラーゼはアスペルギルス・ニガーＧ１グルコアミラーゼである（Boelら (1984), EMBO J. 3 (5) p.1097-1102）。この親グルコアミラーゼはトランケーションされたグルコアミラーゼ、例えばＡＭＧ  Ｇ２グルコアミラーゼであってよい。
【００９０】
親グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング
親グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列は当業界周知の様々な方法を利用して注目のグルコアミラーゼを生産する任意の細胞又は微生物から単離できうる。第一に、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーを研究すべきグルコアミラーゼを生産する生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを利用して構築すべきである。次いで、このグルコアミラーゼのアミノ酸配列がわかっているなら、ラベル化オリゴヌクレオチドプローブを合成して、注目の生物から調製したゲノムライブラリー由来のグルコアミラーゼコードクローンを同定するのに利用できうる。他方、別のグルコアミラーゼの既知の遺伝子に対して相同な配列を含むラベル化オリゴヌクレオチドプローブを超低乃至超高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用し、グルコアミラーゼコードクローンを同定するためのプローブとして用いることができうる。これは既に上記した。
【００９１】
グルコアミラーゼコードクローンを同定するための更なる別の方法はゲノムＤＮＡのフラグメントを発現ベクター、例えばプラスミドの中に挿入し、グルコアミラーゼ陰性細菌を得られるゲノムＤＮＡライブラリーで形質転換し、次いでこの形質転換細菌をグルコアミラーゼのための基質（即ち、マルトース）を含むアガーの上にまき、これによりこのクローンに同定すべきグルコアミラーゼを発現させる。
【００９２】
他に、この酵素をコードするＤＮＡ配列を確立された標準方法、例えばS. L. Beaucage and M. H. Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22, p.1859-1869 に記載のホスホロアミジット法、又はMatthes ら（1984) EMBO J. 3, p.801-805に記載の方法により合成的に調製してよい。このホスホロアミジット法では、オリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡシンセサイザーで合成し、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、そして適当なベクターにクローニングする。
【００９３】
最後に、このＤＮＡ配列は標準の技術に従い、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源のフラグメント（適宜、フラグメントは全ＤＮＡ配列の様々な部分に対応する）をライゲーションすることによって調製した混合ゲノム及び合成起源、混合合成及びｃＤＮＡ起源、又は混合ゲノム及びｃＤＮＡ起源のものであってよい。このＤＮＡ配列は例えば米国特許第４，６８３，２０２号又はR. K. Saiki ら、（1988) Science 239, 1988, pp.487-491 に記載の特異的プライマーを利用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製することもできうる。
【００９４】
部位特異的突然変異誘発
グルコアミラーゼコードＤＮＡ配列が単離でき、そして突然変異のための所望の部位が同定できたなら、突然変異を合成オリゴヌクレオチドを用いて導入してよい。これらのオリゴヌクレオチドは所望の突然変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。特定の方法において、グルコアミラーゼコード配列であるＤＮＡの一本鎖ギャップをグルコアミラーゼ遺伝子を担持するベクターの中で作る。次いで所望の突然変異を抱える合成ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの相同部分にアニーリングする。次いで残りのギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）で埋め、そしてこの構築体をＴ４リガーゼを用いてライゲーションする。この方法の特定の例はMorinagaら（1984), Biotechnology 2, p.646-639 に記載されている。米国特許第４，７６０，０２５号はカセットのささいな改変を実施することによる多重突然変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、更に広いバラエティーの突然変異とMorinagaの方法によりいつでも導入してよく、なぜなら様々な長さのオリゴヌクレオチドを導入できるからである。
【００９５】
グルコアミラーゼコードＤＮＡ配列の中に突然変異を導入する別の方法はNelson and Long (1989), Analytical Biochemistry 180, p.147-151に記載されている。これはＰＣＲ反応におけるプライマーの一つとして化学的に合成したＤＮＡ鎖を利用することにより導入した所望の突然変異を含むＰＣＲフラグメントの３段構築を包含する。ＰＣＲ構築フラグメントから、突然変異を担持するＤＮＡフラグメントを制限エンドヌクレアーゼによる切断を介して単離でき、そして発現プラスミドの中に再挿入することができる。
【００９６】
更に、Sierksら（1989), Protein Eng., 2, 621-625 ; Sierksら（1990), Protein Eng. Vol. 3, 193-198 ; もアスペルギルスグルコアミラーゼ内での部位特異的突然変異誘発を述べている。
【００９７】
ランダム突然変異誘発
ランダム突然変異誘発は注目のアミノ酸配列へと翻訳される遺伝子の少なくとも３部、又は遺伝子全体の中に局在した又は領域特異的ランダム突然変異誘発として適宜実施する。
【００９８】
親グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列のランダム突然変異誘発は当業界公知の任意の方法を利用して簡単に実施できうる。
【００９９】
以上との関連で、本発明の更なる観点は親グルコアミラーゼの変異体を構築するための方法に関連し、そこでこの変異体は親グルコアミラーゼと比べて高まった熱安定性を示す。この方法は：
（ａ）親グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列をランダム突然変異誘発にかけ、
（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異ＤＮＡ配列を宿主細胞の中で発現させ、そして
（ｃ）親グルコアミラーゼと比べて改変された特性（即ち、熱安定性）を有するグルコアミラーゼ変異体を発現する宿主細胞をスクリーニングする；
ことを含んで成る。
【０１００】
本発明の上記の方法の工程（ａ）は好ましくは本明細書における実施例（後述）に記載の通り、ドープド（ｄｏｐｅｄ）プライマーを利用して実施する。
【０１０１】
例えば、ランダム突然変異誘発は適当な物理又は化学的突然変異誘発因子を利用して、適当なオリゴヌクレオチドを利用して、又はＤＮＡ配列でＰＣＲ構築突然変異誘発にかけることにより実施してよい。更に、このランダム突然変異誘発はこのような突然変異誘発因子の任意の組合せを利用することにより実施してよい。この突然変異誘発剤は例えばトランジション、トランスバーション、インバーション、スクランブリング、欠失、及び／又は挿入を誘導するものであってよい。
【０１０２】
本目的のために適当な物理又は化学突然変異誘発因子の例には紫外（ＵＶ）線、ヒドロキシアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチド類似体が挙げられる。かかる因子を使用するとき、突然変異誘発は典型的には突然変異すべき親酵素をコードするＤＮＡ配列を突然変異誘発を行うための適当な条件下で選定の突然変異誘発因子の存在下でインキュベーションし、そして所望の特性を有する突然変異ＤＮＡを選択することにより実施する。
【０１０３】
突然変異をオリゴヌクレオチドを利用して実施する場合、オリゴヌクレオチドをその合成の際に変化させるべき位置において３つの非親ヌクレオチドでドーピング又はスパイキングしてよい。このドーピング又はスパイキングは不要のアミノ酸のコドンが回避されるように実施することができうる。このドーピング又はスパイキングしたオリゴヌクレオチドは任意の公開技術により、例えば適当と認められるＰＣＲ，ＬＣＲ又は任意のＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼを用い、グルコアミラーゼ酵素をコードするＤＮＡの中に組込んでよい。
【０１０４】
好ましくは、ドーピングは「コンスタントランダムドーピング」を利用して実施し、それにおいては各位置における野生型と突然変異との％を予め決定する。更に、ドーピングは所定のヌクレオチドの導入の優先、それ故１又は複数の特定のアミノ酸残基の導入の優先を目的としてよい。ドーピングは例えば各位置における９０％の野生型及び１０％の突然変異の導入が可能となるように行ってよい。ドーピングスキームの選定におけるその他の検討事項は遺伝的及びタンパク質構造的拘束に基づく。ドーピングスキームは、とりわけストップコドンの導入が回避されるＤＯＰＥプログラムを利用することにより行ってよい。
【０１０５】
ＰＣＲ構築突然変異を利用するとき、親グルコアミラーゼをコードする化学処理又は非処理遺伝子を、ヌクレオチドの誤組込みを高める条件下でＰＣＲにかける（Deshler 1992 ; Leungら、Technique Vol. 1, 1989, pp.11-15）。
【０１０６】
Ｅ．ｃｏｌｉ（Fowlerら、Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp.179-191 ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又は任意のその他の微生物の突然変異誘発株を、グルコアミラーゼをコードするＤＮＡのランダム突然変異誘発のため、例えば親グルコシラーゼを含むプラスミドをこの突然変異誘発株に形質転換し、このプラスミドを有する突然変異誘発株を増殖させ、そして突然変異したプラスミドをこの突然変異誘発株から単離することにより、利用することができうる。この突然変異プラスミドを発現生物の中にその後形質転換せしめてよい。
【０１０７】
突然変異すべきＤＮＡ配列は親グルコアミラーゼを発現する生物から調製したゲノム又はｃＤＮＡライブラリーの中に通常存在しうる。他方、このＤＮＡ配列は適当なベクター、例えばプラスミドはバクテリオファージ上に存在してよく、それをそのまま突然変異誘発因子とインキュベーション又はそれに曝露してよい。突然変異すべきＤＮＡは宿主細胞の中に、この細胞のゲノムの中に組込まれて存在しているか、又は細胞の中に定着したベクター上に存在していてよい。最後に、突然変異すべくＤＮＡは単離形態であってよい。ランダム突然変異誘発にかけるべくＤＮＡ配列は好ましくはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列であることが理解されるであろう。
【０１０８】
状況によっては、発現工程ｂ）又はスクリーニング工程ｃ）を実施する前に突然変異ＤＮＡ配列を増幅することが好都合でありうる。かかる増幅は当業界公知の方法に従って実施してよく、現状好ましい方法は親酵素のＤＮＡ又はアミノ酸配列を基準に調製したオリゴヌクレオチドプライマーを利用するＰＣＲ構築増幅である。
【０１０９】
突然変異誘発因子とのインキュベーション又はそれへの曝露の後、突然変異ＤＮＡを発現が行われる条件下でＤＮＡ配列を担持する適当な宿主細胞を培養することにより発現させる。この目的のために用いる宿主細胞は、任意的にベクター上に存在する突然変異ＤＮＡ配列で形質転換されたもの、又は突然変異誘発処理の際に親酵素をコードするＤＮＡ配列を担持するものであってよい。適当な宿主細胞の例は下記の通りである：グラム陽性菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ；及びグラム陰性菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ。
【０１１０】
この突然変異ＤＮＡ配列は更にこの突然変異ＤＮＡの発現を可能にする機能をコードするＤＮＡ配列を含んで成ってよい。
【０１１１】
局在化ランダム突然変異誘発
ランダム突然変異誘発は好都合には注目の親グルコアミラーゼの一部に局在化させてよい。これは例えば酵素の所定の領域が酵素の所定の特性のために極めて重要であると同定されたとき、そしてそれを修飾したときに改善された特性を有する変異体をもたらすと予測されるときに有利でありうる。かかる領域は通常親酵素の三次構造が同定され、そして酵素の機能と関連するときに同定されうる。
【０１１２】
この局在化、又は領域特異的ランダム突然変異誘発は好都合には上記のＰＣＲ構築突然変異誘発又は任意のその他の当業界公知の技術を利用して実施する。他方、改変すべきＤＮＡ配列の一部でコードするＤＮＡ配列は例えば適当なベクターへの挿入により単離することができ、そしてこの部分は上記の任意の突然変異誘発法を利用することによりその後突然変異誘発にかけることができうる。
【０１１３】
本発明の変異体を提供する別の方法には例えばＷＯ９５／２２６２５（Affymax Technologies N.V.）又はＷＯ９６／００３４３（Novo Nordisk A/S）に記載の遺伝子シャフリングが挙げられる。
【０１１４】
グルコアミラーゼ変異体の発現
本発明に従うと、上記の方法又は当業界公知の任意のその他の方法により製造される変異体をコードするＤＮＡ配列は一般にプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意的にリプレッサー遺伝子又は様々なアクチベーター遺伝子を含む発現ベクターを利用して酵素形態で発現できる。
【０１１５】
発現ベクター
本発明のグルコアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を担持する組換発現ベクターは組換ＤＮＡ手順に簡単にかけることができうる任意のベクターであってよく、そしてベクターの選定は往々にしてそれを導入する宿主細胞に依存するであろう。このベクターは宿主細胞に導入したとき、宿主細胞ゲノムの中に組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に複製するものであってよい。適当な発現ベクターの例にはｐＭＴ８３８が挙げられる。
【０１１６】
プロモーター
ベクター中で、ＤＮＡ配列は適当なプロモーター配列に作用可能式に連結されているべきである。プロモーターは選定の宿主細胞内で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、そして宿主細胞に対して同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。
【０１１７】
本発明のグルコアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を指令する特に細菌宿主内の適当なプロモーターの例にはＥ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロンのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  α−アミラーゼのプロモーター（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター等である。真菌宿主内での転写の場合、有用なプロモーターの例はＡ．ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼをコードする遺伝子由来のもの、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）プロモーター（Alber ら（1982), J. Mol. Appl. Genet 1, p.419-434 ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロティナーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａ．ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａ．ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ又はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。
【０１１８】
発現ベクター
本発明の発現ベクターは適当な転写ターミネーターを含んで成ってもよく、そして真核細胞では、本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に作用可能式に連結されたポリアデニル化配列を含んで成ってよい。ターミネーション及びポリアデニル化配列はプロモーターと同じ起源に由来するのが適切でありうる。
【０１１９】
ベクターは更に注目の宿主細胞内でのベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列を含んで成ってよい。かかる配列の例はプラスミドｐＵＣ１９，ｐＡＣＹＣ１７７，ｐＵＢ１１０，ｐＥ１９４，ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製起点である。
【０１２０】
ベクターは選択マーカー、例えば宿主細胞内の欠陥を補う生成物を供する遺伝子、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を授ける遺伝子も含んで成ってよい。更に、このベクターはアスペルギス選択マーカー、例えばａｍｄＳ，ａｒｇＢ，ｎｉａＤ及びｓＣ、ヒグロマイシン耐性を供するマーカーを含んで成ってよく、又は選別は例えばＷＯ９１／１７２４３に記載同時形質転換により成し遂げてもよい。
【０１２１】
グルコアミラーゼ変異体をコードする本発明のＤＮＡ構築体、プロモーター、ターミネーター及びその他の要素それぞれをライゲーションし、そしてそれらを複製のために必要な情報を含む適当なベクターに挿入するために利用する手順は当業者に周知である（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989を参照のこと）。
【０１２２】
宿主細胞
上記の本発明のＤＮＡ構築体又は発現ベクターのいずれかを含んで成る本発明の細胞は本発明のグルコアミラーゼ変異体の組換製造における宿主細胞として好適に利用される。この細胞は当該変異体をコードする本発明のＤＮＡ構築体で、それを宿主染色体の中に（１又は複数のコピーで）組込むことにより簡単に形質転換できうる。この組込みが一般に有利と考えられ、なぜならこのＤＮＡ配列は細胞の中で安定的に維持されがちだからである。宿主染色体へのＤＮＡ構築体の組込みは慣用の方法に従い、例えば相同又は異種組換により実施できうる。他方、この細胞は様々なタイプの宿主細胞との関係で上述した通りに発現ベクターで形質転換されうる。
【０１２３】
本発明の細胞は高等生物、例えば哺乳動物又は昆虫の細胞であってよいが、好ましくは微生物細胞と、例えば細菌又は真菌（例えば酵母）細胞である。
【０１２４】
適当な細菌の例はグラム陽性菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、又はグラム陰性菌、例えばＥ．ｃｏｌｉである。細菌の形質転換は例えば周知の手段でのプロトプラスト形質転換により、又はコンピテント細胞を利用して行うことができうる。
【０１２５】
酵母生物は好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種から選んでよく、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【０１２６】
宿主細胞は糸状菌、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種、最も好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、又はＦｕｓａｒｉｕｍの株、例えばＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ（完全な状態では名称Ｇｒｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ、従来のＳｐｈａｅｒｉａ  ｚｅａｅ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｒｏｓｅｕｍと同義、及びＧｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｒｏｓｅｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｃｅｒｅａｌｉｓ）又はＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ（完全な状態では名称Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｐｕｒｉｃａｒｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓと同名、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ及びＦｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｋｋｗｅｌｌｎｓｅと同義）又はＦｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍの株であってもよい。
【０１２７】
本発明の好適な態様において、宿主細胞はプロテアーゼ欠陥又はプロテアーゼマイナス株である。
【０１２８】
これは例えばアルカリプロテアーゼ遺伝子「ａｌｐ」の欠失したプロテアーゼ欠陥株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＪａＬ１２５であってよい。この株はＷＯ９７／３５９５６（Novo Nordisk）に記載してある。
【０１２９】
糸状菌はプロトプラストの形成及びそのプロトプラストの形質転換、しかる後の周知の方法での細胞壁の再生を包含する方法により形質転換されうる。宿主微生物としてのアスペルギルスの利用はＥＰ２３８，０２３（Novo Nordisk A/S）に記載してある。その内容は引用することで本明細書に組入れる。
【０１３０】
グルコアミラーゼ変異体を製造する方法
更なる別の観点において、本発明は本発明のグルコアミラーゼ変異体を製造する方法に関連し、この方法は宿主細胞をこの変異体の生産を誘導する条件下で培養し、そしてこの細胞及び／又は培養培地からこの変異体を回収することを含んで成る。
【０１３１】
細胞を培養するために用いる培地は注目の宿主細胞を増殖させ、そして本発明のグルコアミラーゼ変異体の発現を獲得するのに適当な任意の慣用の培地であってよい。適当な培地は商業的供給者から入手可能であるか、又は公開の手順（例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載）に従って調製されうる。
【０１３２】
宿主細胞から分泌したグルコアミラーゼ変異体は周知の手順、例えば遠心分離又は濾過により細胞を培地から分離し、そして培地のタンパク質性成分を塩、例えば硫酸アンモニウムにより沈殿させ、それからクロマトグラフィー手順、例えばイオン変換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を利用することにより培養培地から簡単に回収できうる。
【０１３３】
デンプンの変換
本発明はデンプンからグルコース等を生成するために本発明のグルコアミラーゼ変異体を利用する方法を提供する。一般に、この方法はα−アミラーゼの存在下で前駆体デンプンを部分的に加水分解し、次いで更にα−（１→４）及びα−（１→６）グルコシド結合を切断することによりグルコアミラーゼの存在下でデンプン又は近縁のオリゴ糖及び多糖の非還元末端からＤ−グルコースが遊離するように加水分解する工程を含む。
【０１３４】
α−アミラーゼを利用する前駆体デンプンの部分的加水分解は内部α−（１→４）結合を加水分解することによりデンプン分子の一次分解を供する。商業的用途において、α−アミラーゼを利用する一次加水分解は約１０５℃の温度で行う。一般に固形分３０％〜４０％の極めて高いデンプン濃度が処理される。この一次加水分解は通常この高温で５分行う。この部分加水分解したデンプンを二次タンクに移し、そして約１〜２時間、８５℃〜９８℃の温度でインキュベーションして１０〜１５のデキストロース当量（Ｄ．Ｅ．）へと導くことができる。
【０１３５】
グルコアミラーゼの存在下でのデンプン又は近縁のオリゴ糖及び多糖の非還元末端からのＤ−グルコースの遊離のための更なる加水分解工程を３０〜６２℃の低めの温度の別のタンクの中で通常実施する。好ましくは、この基質液の温度は５５〜６０℃に下げる。この溶液のpHは約５．５〜６．５から３〜５．５の範囲にまで下げる。好ましくは、溶液のpHは４〜４．５とする。グルコアミラーゼをこの溶液に加え、そして反応を２４〜７２時間、好ましくは３６〜４８時間実施する。
【０１３６】
本発明の熱安定性グルコアミラーゼ変異体を利用することにより、糖化方法は伝統的なバッチ糖化方法よりも高い温度で実施してよい。本発明に従うと、糖化は６０〜８０℃より高い範囲、好ましくは６３〜７５℃の温度で実施してよい。これは伝統的なバッチ方法（上記）及び連続糖化方法の双方に当てはまる。
【０１３７】
事実、１又は複数回の膜分離工程、即ち濾過工程を含む連続糖化方法は、膜上での妥当な高流速を維持する又は微生物夾雑を最少限にするには６０℃超の温度で実施しなければならない。従って、本発明の熱安定性変異体は、妥当な費用及び／又は少なめの酵素タンパク質投与量で、工業的糖化方法に許容される時間内で大量スケール連続糖化方法を実施する可能性を提供する。本発明に従うと、糖化時間は更に短くしてよい。
【０１３８】
本発明のグルコアミラーゼ変異体（例えばＡＭＧ変異体）の活性は一般に伝統的に利用されている３０〜６０℃の温度よりも６０℃〜８０℃の温度にて実質的に高い。従って、グルコアミラーゼが作用する温度を高めることにより、この糖化方法は短い時間内で実施することができうる。
【０１３９】
更に、熱安定性を高めることにより、Ｔ1/2 （「材料と方法」の章で定義する半減期）は向上する。本発明のグルコアミラーゼ変異体の熱安定性が向上すると、糖化方法の際に不活性化するグルコアミラーゼに代わるために加える必要のあるグルコアミラーゼの量は微量でよい。本発明に係る糖化方法の際により多くのグルコアミラーゼの活性が維持される。更に、微生物の夾雑のおそれも糖化方法を６３℃超の温度で行うと低まる。
【０１４０】
グルコアミラーゼ、酸性アミラーゼ及びプルラナーゼによる典型的な糖化試験によるグルコース収率は９５．５〜９６．５％である。残りの炭水化物は典型的には１％のマルトース、１．５〜２％のイソマルトース及び１〜１．５％の高級オリゴ糖から成る。二糖類が生成されるのは、高濃度のグルコース及び高い乾燥固形分レベルではグルコアミラーゼは反転生成物を形成しがちだからである。
【０１４１】
液化後の溶液中に存在する糖類及び糖化の際に形成される糖類に対して高まった比活性を有するグルコアミラーゼは少なめの酵素タンパク質投与量又は短めの処理時間の利用で足りるため有利であろう。一般に、グルコアミラーゼは短鎖糖類と比べて長鎖糖類から成る基質を優先し、それ故例えばマルトヘプタオースに対する比活性はマルトースに対するそれよりも約６倍高い。短鎖糖類、例えばマルトースに対する高まった比活性（オリゴ糖に対する活性が弱まることなく）はそれ故少なめの酵素投与量及び／又は短めの処理時間の利用も可能にする。
【０１４２】
更に、高グルコース収率が高まったα−１，４加水分解活性（もしα−１，６活性がそのまま、又は低まっているなら）を有するグルコアミラーゼ変異体により得ることができ、なぜなら少ない量の酵素タンパク質が利用され、それ故α−１，６反転生成物の生成は少なくなるからである（少ないイソマルトース）。
【０１４３】
比活性は「材料と方法」の章に記載の方法を利用し、３７℃又は６０℃で測定されうる。
【０１４４】
本発明のグルコアミラーゼ変異体を利用することのできうる糖化方法の例にはＪＰ３−２２４４９３；ＪＰ１−１９１６９３；ＪＰ６２−２７２９８７；ＥＰ４５２，２３８及びＷＯ９９／２７１２４号に記載の方法が挙げられる（全て引用することで本明細書に組入れる）。
【０１４５】
更なる観点において、本発明は液化デンプン溶液を糖化する方法に関連する。この方法は
（ｉ）糖化段階、その際、１又は複数回の酵素的糖化段階を実施する、しかる後の次の工程
（ii）１又は複数回の膜分離工程；
を含んで成る。ここでこの酵素的糖化は本発明の熱安定性グルコアミラーゼ変異体を利用して実施する。
【０１４６】
本発明のグルコアミラーゼ変異体は本発明の方法において、少なくとも４個のグルコシル残基を有する分子内のα−（１→６）グルコシド結合だけを加水分解する酵素と組合せて使用してよい。好ましくは、本発明のグルコアミラーゼ変異体はプルラナーゼ又はイソアミラーゼと組合せて使用してよい。枝切りのためのイソアミラーゼ及びプルラナーゼの利用、酵素の分子特性、並びに酵素とグルコアミラーゼとの潜在的な利用はG.M.A. van Beynum らStarch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985, 101-142に記載してある。
【０１４７】
更なる観点において、本発明はデンプン変換方法における本発明のグルコアミラーゼ変異体の利用に関連する。
【０１４８】
更に、本発明のグルコアミラーゼ変異体は連続糖化工程を含む連続デンプン変換方法に利用してよい。
【０１４９】
本発明のグルコアミラーゼ変異体は固定化形態に利用してもよい。これは適当であり、そして特製シロップ、例えばマルトースシロップを製造するため、そして更にはフルクトースシロップの製造との関連でのオリゴ糖のラフィネート流のためによく利用される。
【０１５０】
本発明のグルコアミラーゼは燃料用エタノール又は飲料の製造方法にも利用でき、又は有機化合物、例えばクエン酸、アスコルビン酸、リジン、グルタミン酸の製造のための発酵方法に利用してよい。
【０１５１】
材料と方法
材料：
酵素：
ＡＭＧ  Ｇ１：Boelら（1984) EMBO J. 3 (5), 1097-1102及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に開示のアスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼＧ１。Novo Nordiskより入手可能。
ＡＭＧ  Ｇ２：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すトランケーションされたアスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼＧ１。Novo Nordiskより入手可能。
【０１５２】
溶液：
バッファー：０．０５Ｍの酢酸ナトリウム（１ＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中６．８ｇ）、pH４．５。
停止液：０．４ＭのＮａＯＨ
ＧＯＤ−ｐｅｒｉｄ, 124036, Boehringer Mannheim
【０１５３】
基質：２９mM（１００mlの５０mMの酢酸ナトリウム、pH４．５中１ｇのマルトース）（Sigma ）
マルトヘプタオース：１０mM、１１５mg／１０ml（Sigma ）
【０１５４】
宿主細胞：
Ａ．オリザ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＪａＬ２５：アスペルギルス・オリザＩＦＯ４１７７。大阪発酵研究所、日本国，大阪府，淀川区，十三反町２丁目より入手可能。マーカーとしてＡ．オリザｐｙｒＧ遺伝子を用い、アルカリプロテアーゼ遺伝子「ａｌｐ」（Murakami Kら（1991) Agric. Biol. Chem. 55, p. 2807-2811 に記載）が一段遺伝子交換法（G. May「Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi 」(1992) p.1-25 、編J.R. Kinghorn and G.Turner ; Blackie Academic and Professional に記載）により欠失。株ＪａＬ１２５はＷＯ９７／３５９５６（Novo Nordisk）に更に開示してある。
【０１５５】
微生物：
株：サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＹＮＧ３１８：ＭＡＴαｌｅｕ２−Δ２  ｕｒａ３−５２  ｈｉｓ４−５３９  ｐｅｐ４−Δ１〔ｃｉｒ＋〕
【０１５６】
プラスミド：
ｐＣＡＭＧ９１：図１参照。アスペルギルス・ニガーＧ１グルコアミラーゼ（ＡＭＧ  Ｇ１）を含んで成るプラスミド。ｐＣＡＭＧ９１の構築はBoelら（1984), EMBO J. 3 (7) p.1581-1585に記載されている。
【０１５７】
ｐＭＴ８３８：トランケーション化アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼＧ２をコードするプラスミド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。
【０１５８】
ｐＪＳＯ０２６（Ｓ．セレビシアエ発現プラスミド）（J.S. Okkels, (1996)“A URA3-promoter deletion in a pYES vector increases the expression level of a fungal lipase in Saccharomyces cerevisiae. Recombinant DNA Biotechnology III : The Integration of Biological and Engineering Sciences, vol. 782 of the Annals of the New York Academy of Sciences）。より詳しくは、発現プラスミドｐＪＳＯ３７はｐＹＥＳ２．０から、ｐＹＥＳ２．０の誘導性ＧＡＬ１−プロモーターをサッカロマイセス・セレビジエ由来の構成的発現型ＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）−プロモーター（Albert and Karwasaki (1982) J. Mol. Appl Genet., 1, 419-434 ）と交換し、そしてＵＲＡ３プロモーターの一部を欠失させることにより誘導される。
【０１５９】
方法：
サッカロマイセス・セレビジエＹＮＧ３１８の形質転換
ＤＮＡフラグメント及び開環ベクターを混合し、そして標準の方法によりサッカロマイセス・セレビジエＹＮＧ３１８酵母に形質転換した。
【０１６０】
Ｋｃａｔ（ｓｅｃ．-1）としての比活性の測定
７５μｌの基質（１％のマルトース、５０mMの酢酸ナトリウム、pH４．３）を選定の温度、例えば３７℃又は６０℃で５分インキュベーションする。
【０１６１】
酢酸ナトリウムに希釈した５０μｌの酵素を加える。１００μｌのアリコートを０，３，６，９及び１２分後に取り出し、そして１００μｌの０．４Ｍの水酸化ナトリウムに移して反応を停止させる。ブランクを含ませる。
２０μｌをマイクロタイタープレートに移し、そして２００μｌのＧＯＤ−ｐｅｒｉｄ溶液を加える。吸収は室温で３０分のインキュベーション後に６５０nmで測定する。
グルコースを標準として用い、そして比活性をＫｃａｔ（ｓｅｃ．-1）として計算する。
【０１６２】
ＡＧＵ活性の AGU／mgとしての測定
１Novoアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）は３７℃及びpH４．３で１分当り１μmoleのマルトースを加水分解する酵素の量として定義する。分析方法（ＡＥＬ−ＳＭ−０１３１）の詳細な説明はNovo Nordiskより注文に応じて入手できる。
活性は AGU／mlとして、Boehringer Mannheim, 124036 由来のグルコースＧＯＰ−Ｐｅｒｉｄキットを利用して改良方法（ＡＥＬ−ＳＭ−０１３１）により決定される。標準品：ＡＭＧ−標準品バッチ７−１１９５，１９５ AGU／ml。
【０１６３】
３７５μｌの基質（５０mMの酢酸ナトリウム中１％のマルトース、pH４．３）を３７℃で５分インキュベーションする。酢酸ナトリウムに希釈した２５μｌの酵素を添加する。反応を１０分後に１００μｌの０．２５ＭのＮａＯＨの添加により停止させる。２０μｌを９６穴マイクロタイタープレートに移し、そして２００μｌのＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ溶液を加える。室温で３０分後、吸収を６５０nmで測定し、そしてＡＭＧ標準から AGU／mlの活性を求める。
【０１６４】
AGU／mgの比活性は活性（ AGU／ml）をタンパク質濃度（mg／ml）で除して計算する。
【０１６５】
アスペルギルス・オリザの形質転換（一般手順）
１００mlのＹＰＤ（Sherman ら（1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory ）にＡ．オリザの胞子を接種し、そして振盪しながら約２４時間インキュベーションする。菌糸体をミラクロスでの濾過により回収し、そして２００mlの０．６ＭのＭｇＳＯ4 で洗う。菌糸体を１５mlの１．２ＭのＭｇＳＯ4 、１０mMのＮａＨ2 ＰＯ4 、pH５．８に懸濁する。この懸濁物を氷上で冷やし、そして１２０mgのＮｏｖｏｚｙｍ（商標）２３４を含むバッファー１mlを加える。５分後、１mlの１２mg／mlのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｔｙｐｅ  Ｈ２５）を加え、そしてサンプル中に大量のプロトプラストが顕微鏡で観察できるようになるまで３７℃で１．５〜２．５時間静かに撹拌しながらインキュベーションを続ける。
【０１６６】
この懸濁物をミラクロスで濾過し、その濾液を無菌チューブに移し、そして５mlの０．６Ｍのソルビトール、１００mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０をかぶせる。遠心分離を１０００ｇで１５分行い、そしてプロトプラストをＭｇＳＯ4 クッションの頂部から集める。２容量のＳＴＣ（１．２Ｍのソルビトール、１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．５、１０mMのＣａＣｌ2 ）をこのプロトプラスト懸濁物に加え、そしてこの混合物を１０００ｇで５分遠心分離する。このプロトプラストを３mlのＳＴＣに再懸濁し、そして再びペレットにする。これを繰り返す。最後に、これらのプロトプラストを０．２〜１mlのＳＴＣに再懸濁する。
【０１６７】
１００μｌのプロトプラスト懸濁物を１０μｌのＳＴＣ中の５〜２５μｇのｐ３ＳＲ２（Hynes ら、Mol. and Cel. Biol., Vol. 3, No.8, 1430-1439, 1983年８月に記載のA. nidulans amd S 遺伝子担持プラスミド）と混合する。この混合物を室温で２５分放置する。０．２mlの６０％のＰＥＧ４０００（ＢＤＨ２９５７６）、１０mMのＣａＣｌ2 及び１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．５を加え、そして慎重に混合し（２回）、そして最後に０．８５mlの同溶液を加え、そして慎重に混合する。この混合物を室温で２５分放置し、２５００ｇで１５分遠心し、そしてそのペレットを１．２Ｍのソルビトール２mlの中に再懸濁する。もう一回の沈降の後、プロトプラストを１．０Ｍのスクロース、pH７．０、窒素源としての１０mMのアセトアミド及び２０mMのＣｓＣｌを含む最少プレート（Cove (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56）にまき、バックグランド増殖を阻止した。３７℃で４〜７日間のインキュベーション後、胞子をひろい、無菌水に懸濁し、そして孤立コロニーのためにまいた。この手順を繰り返し、そして２回目の再単離を経た孤立コロニーの胞子を形質転換体と規定して保存した。
【０１６８】
供給バッチ発酵
供給バッチ発酵は炭素源としてのマルトデキストリン、窒素源としての尿素、及び酵母エキスを含んで成る培地の中で実施する。供給バッチ発酵は注目のＡ．オリザ宿主細胞の振盪フラスコ培養物を３．５％の炭素源及び０．５％の窒素源を含んで成る培地の中に接種することにより実施する。pH５．０及び３４℃での２４時間の培養後、追加の炭素及び窒素源の連続供給を開始する。この炭素源を律速因子として維持し、そして酵素が過剰に存在することを確実にした。供給バッチ培養は４日間続け、しかる後酵素は遠心分離、限外濾過、浄化濾過及び細菌濾過により回収できる。
【０１６９】
精製
培養液を濾過し、そして硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）を１．７ＭのＡＭＳの濃度にまで加え、そしてpHをpH５に調整する。沈殿材料を遠心分離により除去し、そしてグルコアミラーゼ活性含有溶液を予め１．７ＭのＡＭＳ、２０mMの酢酸ナトリウム、pH５で平衡にしておいたＴｏｙｏ  Ｐｅａｒｌブチルカラムに載せる。未結合の物質を平衡バッファーで洗浄する。結合タンパク質を１０カラム容量で１．７〜０ＭのＡＭＳの線形勾配を利用し、１０mMの酢酸ナトリウムpH４．５で溶出させる。グルコアミラーゼ含有画分を集め、そして２０mMの酢酸ナトリウムpH４．５に対して透析する。次いでこの溶液を予め１０mMのピペラジン、Ｓｉｇｍａ、pH５．５で平衡にしておいたＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに載せる。未結合の物質を平衡バッファーで洗浄する。結合タンパク質を１０カラム容量で１０mMのピペラジン、pH５．５中の０〜０．３Ｍの塩化ナトリウムの線形勾配により溶出させる。グルコアミラーゼ含有画分を集め、そして純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【０１７０】
Ｔ1/2 （半減期）方法Ｉ
変異体の熱安定性を下記の方法を利用してＴ1/2 として決定する：９５０μｌの５０mMの酢酸バッファー（pH４．３）（ＮａＯＡｃ）を６８℃又は７０℃で５分インキュベーションする。バッファー中の５０μｌの酵素（４ AGU／ml）を加える。２×４０μｌのサンプルを０，５，１０，２０，３０及び４０分回にとり、そして氷の上で冷やす。インキュベーションする前（０分）の活性（ AGU／ml）を対照として用いる（１００％）。安定性の傾き（％）をインキュベーション時間の関数として計算する。％残留グルコアミラーゼ活性を様々な時間において測定する。Ｔ1/2 は％比活性が５０％にまで下がる時間である。
【０１７１】
Ｔ1/2 （半減期）（方法II）
Ｔ1/2 は注目の酵素（約０．２ AGU／ml）を３０％のグルコース、５０mMの酢酸ナトリウムの中で、pH４．５において注目の温度（例えば７０℃）でインキュベーションすることにより測定する。サンプルを設定の時間間隔で抜き取り、そして氷の上で冷やし、そして残留酵素活性をｐＮＰＧ法（前述）により測定する。
【０１７２】
％残留グルコアミラーゼ活性を様々な時間において決定する。Ｔ1/2 は％比活性が５０％にまで下がる時間である。
残留酵素活性（ｐＮＰＧ法）
ｐＮＰＧ試薬
０．２ｇのｐＮＰＧ（Ｐ−ニトロフェニルグルコピラノシド）を０．１Ｍの酢酸バッファー（pH４．３）に溶かし、１００mlにする。
【０１７３】
硼酸溶液：
３．８ｇのＮａ2 Ｂ4 Ｏ7 ・１０Ｈ2 ＯをＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、そして１００mlにする。
２５μｌのサンプルを５０μｌの基質に加え、そして５０℃で２hrインキュベーションする。反応を１５０μｌの硼酸溶液の添加により停止させる。光学密度を４０５nmで測定し、そして残留活性をもとめる。
【０１７４】
ｐＡＭＧＹの構築
ｐＡＭＧＹベクターは下記のようにして構築した：ｐＪＳＯ０２６中のリパーゼ遺伝子をＡＭＧ遺伝子に置き換え、それをフォワードプライマー：ＦＧ２：5'-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3'及びリバースプライマー：ＲＧ２：5'-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT-3' により、ＡＭＧ遺伝子を含む鋳型プラスミドｐＬＡＣ１０３を用いてＰＣＲ増幅した。ｐＪＳＯ０２６プラスミドをＸｂａＩ及びＳｍａＩで３７℃で２時間かけて消化し、そしてＰＣＲアンプリコンをクレノウフラグメントを用いてブラント末端にし、次いでＸｂａＩで消化した。このベクターフラグメント及びＰＣＲアンプリコンをライゲーションし、そしてエレクトロトランスフォメーションによりＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。得られるベクターをｐＡＭＧＹと命名する。
【０１７５】
ｐＬａＣ１０３の構築
Ａ．ニガーＡＭＧII  ｃＤＮＡクローン（Boelら（1984）前掲）をＡＭＧのＧII形態のＳ．セレビジエ発現を狙いとしてｐＬａＣ１０３の構築のための起源として用いる。
構築は後述の通り、数段階で行う。
【０１７６】
ｐＴ７−２１２（ＥＰ３７８５６／米国特許第５，１６２，４９８号）をＸｂａＩで切断し、クレノウＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰでブラント末端にする。ＥｃｏＲＩで切断後、得られるベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動から精製し、そしてｐＢｏｅｌ５３の２．０５kbのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントにライゲーションし、これにより得られるプラスミドｐＧ２Ｘ中のＡＭＧコードフラグメントのＥｃｏＲＶ末端にＸｂａＩ部位を再構築する。
【０１７７】
ＡＭＧｃｄｓのＤＮＡ上流を除去し、そして適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位をもつＡＭＧコードＤＮＡを仕上げるため、以下の構築体を作った：
ｐ５３の９３０bpのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントを単離し、そしてＡｌｕＩ切断にかけ、得られる７７１bpのＡｌｕ−ＰｓｔＩフラグメントをブラント末端化ＥｃｏＲＩ部位をもつｐＢＲ３２２（前述）にライゲーションし、そしてＰｓｔＩで切断する。得られるプラスミドｐＢＲ−ＡＭＧ’において、ＥｃｏＲＩ部位はＡＭＧｃｄｓの開始コドンからまさに３４bpに再構築された。
【０１７８】
ｐＢＲ−ＡＭＧ’から７７５bpのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントを単離し、そしてｐＧ２Ｘ由来の１１５１bpのＰｓｔＩ−ＸｂａＩフラグメントにｐＴ７−２１２のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩベクターフラグメントを含むライゲーション反応で連結した。
【０１７９】
得られるプラスミドｐＴ７Ｇ１１をアルカリホスファターゼの存在下でＢａｍＨＩ切断にかけ、次いでホスファターゼの不活性化後に部分ＳｐｈＩ切断を行った。この反応からＡＭＧIIｃｄｓに連結したｓ．ｃ．ＴＰＩプロモーターを囲む２４８９bpのＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩフラグメントが得られた。
【０１８０】
上記のフラグメントをｐＴ７ＧIIの１０５２bpのＢａｍＨＩフラグメントと一緒にｐＭＴ７４３のアルカリホスファターゼ処理ベクターフラグメント（ＥＰ３７８５６／ＵＳ５１６２４９８）にライゲーションし、ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ消化物を得る。得られるプラスミドはｐＬａＣ１０３である。
【０１８１】
熱安定性ＡＭＧ変異体のスクリーニング
ライブラリーを下記の熱安定性フィルターアッセイでスクリーニングする。
【０１８２】
熱安定性についてのフィルターアッセイ
酵母ライブラリーをＳＣＦｕｒａアガープレート上の酢酸セルロース（OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）とニトロセルロースフィルター（Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell. Dassel, Germany）とのサンドイッチの上に１００μｇ／mlのアンピシリンと共に３０℃で７２hr以上載せておく。このコロニーをメタノールで１分活性化しておいたＰＶＤＦフィルター（Immobilon-P. Millipore, Bedford ）又はＰｒｏｔｒａｎフィルター（活性化なし）にレプリカプレートし、次いで０．１ＭのＮａＡｃの中で洗浄し、そして室温で２時間インキュベーションする。コロニーをＰＶＤＦ／Ｐｒｏｔｒａｎフィルターから水道水で洗う。各フィルターサンドイッチ及びＰＶＤＦ／Ｐｒｏｔｒａｎフィルターを針で特異的に印を付け、それからインキュベーションし、スクリーニング後のフィルター上の陽性変異体の位置を決定した。変異体の結合したＰＶＤＦフィルターを０．１ＭのＮａＡｃ、pH４．５の入った容器に移し、そして４７℃又はＰｒｏｔｒａｎフィルターの場合は６７〜６９℃で１５分インキュベーションする。ＳＣｕｒａ−アガープレート上の酢酸セルロース及びニトロセルロースフィルターのサンドイッチを室温で使用するまで保存する。インキュベーション後、残留活性を５％のマルトース、１％のアガロース、５０mMのＮａＡｃ、pH４．５を含むプレート上で検出する。ＰＶＤＦフィルターに付いたアッセイプレートをフィルターサンドイッチと同じようにして印を付け、そして５０℃で２hrインキュベーションする。ＰＶＤＦフィルターの除去後、アッセイプレートをグルコースＧＯＤ−ｐｅｒｉｄ（Boehringer Mannheim GmbH, Germany ）で染色する。残留活性を有する変異体はアッセイプレート上で白色背景上の濃緑色点として検出される。改良変異体は保存プレート上に載っている。改良変異体を第一スクリーニングと同じ条件下で２回再スクリーニングする。
【０１８３】
ドーププログラムを利用することによるランダム突然変異誘発の一般方法
ランダム突然変異誘発は下記の工程により実施できうる：
１．親酵素内の修飾のための注目の領域を選定し、
２．選定した領域内の突然変異部位及び非突然変異部位を決定し、
３．例えば構築する変異体の所望の安定性及び／又は性能との関係でどのような突然変異を実施するかを決定し、
４．構造的な妥当な突然変異を選定し、
５．工程４との関係で工程３により選定した残基を調整し、
６．ヌクレオチド分布を適当なドープアルゴリズムを利用して分析し、
７．必要なら、所望の残基を遺伝子コードリアリズムに合わせ（例えば、遺伝子コードに由来する拘束を考慮して）、例えばストップコドンの導入を回避する。当業者は一部のコドンの組合せは現実に利用できず、従って採用する必要がないことを念頭に入れているであろう。
８．プライマーを作り、
９．このプライマーを利用してランダム突然変異誘発を行い、
１０．所望の改良特性についてのスクリーニングにより
得られるグルコアミラーゼ変異体を選別する。
【０１８４】
ドープアルゴリズム
工程６で利用するための適当なドープアルゴリズムは当業界において周知である。一のかかるアルゴリズムはTomandl, D. ら 1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11 : 29-38. Another algorithm is DOPE (Jensen, LJ, Andersen, KV, Svendsen, A, and Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids Research 26 : 697-702 ）に記載されている。
【０１８５】
分子シミュレーションを利用する温度活性に重要な領域の抽出方法
注目の酵素、ここではＡＭＧのＸ−線構造及び／又はモデルビルド構造を分子動力学シミュレーションにかける。分子動力学シミュレーションはＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ（ＭＳＩ）より）プログラム又はその他の適当なプログラム、例えばＤＩＳＣＯＶＥＲ（ＭＳＩより）を用いて行う。動力学は真空で行うか、又は結晶水を含ませて、又は注目の酵素を適当な水に埋没させて（例えば球状又は箱状）行う。シミュレーションは３００ピコ秒（ps）以上、例えば３００〜１２００ps行う。構造間のＣＡ炭素についての等方変動を抽出し、そして構造間での比較を行う。等方変動をどのようにして得るかの詳細はＣＨＡＲＭＭマニュアル（ＭＳＩより入手可能）にあり、そして引用することで本明細書に組入れる。
【０１８６】
分子動力学シミュレーションは帯電可能なアミノ酸上の標準電荷を利用して実施できる。例えば、Ａｓｐ及びＧｌｕは負に帯電しており、そしてＬｙｓ及びＡｒｇは正に帯電している。この条件は約７．０の中性pHを模倣する。低めのpHを分析するため、分子の滴定を行ってpH２〜１０内の正常な滴定可能な残基、Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｔｙｒ及びＨｉｓの改変ｐＫａを得ることができる。また、Ｓｅｒ，Ｔｈｒ及びＣｙｓも滴定可能であるが、ここでは考慮しない。ここではpHに基づく改変電荷を述べ、なぜならＡｒｇ，Ｌｙｓは全て高pHで負であり、そしてＡｓｐ，Ｇｌｕは全て帯電していないからである。これはＡｓｐ及びＧｌｕの滴定が通常行われる４〜５付近のpHを模倣する。
【０１８７】
注目の酵素のモデルビルディングはＭＳＩプログラムパッケージのＨＯＭＯＬＯＧＹモデルを利用することにより得ることができる。アスペルギルス・アワモリ変異体Ｘ１００の結晶構造は例えばＢｒｏｏｋｈａｖｅｎデータ・ベース中の３ＧＬＹ及び１ＤＯＧにある。
【実施例】
【０１８８】
例１
ＡＭＧ  Ｇ２変異体の構築
部位特異的突然変異誘発：
ＡＭＧ  Ｇ２の変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の構築のため、市販のキットＣｈａｍｅｌｅｏｎ二本鎖部位特異的突然変異誘発キットを製造者の仕様に従って利用した。
【０１８９】
注目のＡＭＧ  Ｇ２酵素をコードする遺伝子をＡＭＧ  Ｇ１形態を含んで成るプラスミドｐＣＡＭＧ９１（図１）内のＧ２ｎｔ．１３６２とＧ２ｎｔ．１５３０との間のＤＮＡを欠失させることにより調製したｐＭＴ８３８上にある。
【０１９０】
製造者の仕様に従い、ｐＭＴ８３８のアンピシリン遺伝子のＳｃａＩ部位を下記のプライマーを用いてＭｌｕＩ部位へと変える：
７２５８：5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3' (ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（これにより、アンピシリン耐性遺伝子内のＳｃａＩ部位を変え、そしてＭｌｕＩ部位の切断に用いた）。注目のＡＭＧ遺伝子を含んで成る
ｐＭＴ８３８ベクターを次いでＤＮＡポリメラーゼのための鋳型として、オリゴ７２５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）及び２１４０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）と一緒に用いた。
プライマーｎｏ，２１４０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は選択プライマーとして用いた。
２１４０１：5'p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gca tat acc acg cct tgg acc tgc gtt ata gcc 3' （アミノ酸配列を変えることなく、ＡＭＧ遺伝子内にあるＳｃａＩ部位を変える）。
【０１９１】
所望の突然変異（例えばシステイン残基の導入）を注目のＡＭＧ遺伝子の中に、所望の突然変異を含んで成る適当なオリゴの付加により導入する。
【０１９２】
プライマー１０７５８１はＴ１２Ｐの導入のために用いた。
１０７５８１：5' pgc aac gaa gcg ccc gtg gct cgt ac 3'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
【０１９３】
突然変異は遺伝子全体の配列決定により確認する。このプラスミドをＡ．オリザの中に、上記の「材料と方法」の章に記載の方法を利用して形質転換させる。この変異体を上記の「材料と方法」の章に記載の通りにして発酵及び精製する。
【０１９４】
例２
親酵素と比較して向上した熱安定性を有するＡ．ニガーＡＭＧ変異体の局在化ランダムドープ突然変異誘発による構築
Ａ．ニガーＡＭＧの熱安定性を高めるため、予め選定した領域内でランダム突然変異誘発を行った。
残基
領域：Ｌ１９−Ｇ３５
領域：Ａ３５３−Ｖ３７４
【０１９５】
ＤＯＰＥソフトウェア（材料と方法参照）を、ストップコドンを最少限にする上記の領域内の提晶の変化各々についてスパイキングされたコドンを決定するために用いて（表１参照）。ヌクレオチドの正確な分布をコドンの３つの位置で計算し、アミノ酸変化の推定集団を得た。ドープ領域は表示の位置で特異的にドーピングし、所望の残基は得られ、しかもその他の可能性も残す機会を得た。
【０１９６】
第一列は突然変異すべきアミノ酸であり、第二列は野生型のパーセンテージであり、そして第三列は新たなアミノ酸を規定する。
【０１９７】
【表１】
2010154865.tif 000002
【０１９８】
得られるドーピングされたオリゴヌクレオチド鎖を表２にセンス鎖として、プライマー配列、野生型ヌクレオチド配列、親アミノ酸配列、及び各々のドーピング位置についてのヌクレオチドの分布と共に示す。
【０１９９】
【表２】
2010154865.tif 000003
【０２００】
【表３】
2010154865.tif 000004
【０２０１】
【表４】
2010154865.tif 000005
【０２０２】
得られるドーピングされたオリゴヌクレオチド鎖を表４にセンス鎖として、プライマー配列、野生型ヌクレオチド配列、親アミノ酸配列、及び各々のドーピング位置についてのヌクレオチドの分布と共に示す。
【０２０３】
【表５】
2010154865.tif 000006
【０２０４】
【表６】
2010154865.tif 000007
【０２０５】
【表７】
2010154865.tif 000008
【０２０６】
ランダム突然変異誘発
表２及び３から明らかとなったスパイキングされたオリゴヌクレオチド（一般用語としてＦＡＭＧと命名）並びにＬ１９−Ｇ３５領域についてのリバースプライマーＲＡＭＧ及びＮ−末端（ＦＧ２：5'-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3' （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）とＣ−末端（ＲＧ２：5'-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）とをカバーする特異的ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２プライマーを重複伸長法（Hortonら、Gene, 77 (1989), pp.61-68 ）により、２１塩基対の重複で、ＰＣＲ−ライブラリーフラグメントを構築するのに用いた。プラスミドｐＡＭＧＹはポリメラーゼ連鎖反応のための鋳型である。ＰＣＲフラグメントはＥ．ｃｏｌｉ／酵母シャトルベクターｐＡＭＧＹにおいて相同組換によりクローニングする（材料と方法参照）。
【０２０７】
スクリーニング
このライブラリーを上記の「材料と方法」の章に記載の通り、Ｐｒｏｔｒａｎフィルターを用い、そして６７〜６９℃でインキュベーションする熱安定性フィルターアッセイでスクリーニングした。
【０２０８】
例３
親酵素と比較して向上した熱安定性を有するＡ．ニガーＡＭＧ変異体の、ＤＮＡオリゴによりスパイキングするＰＣＲシャフリングによる構築
ＡＭＧ遺伝子及び隣接領域を担持するＤＮＡフラグメントの調製のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用した。約１０μｇのＤＮＡをＤｎａｓｅで消化し、そして２％のアガロースゲル上に泳動させた。５０〜１５０bpのフラグメントをゲルから精製した。約１μｇの精製フラグメントを所望の突然変異を担持する５〜１５倍過剰量のオリゴと混合した。オリゴは以下の通りである（Ｈｋｌｉｂ１、Ｈｋｌｉｂ２、Ｈｋｌｉｂ３、等、それぞれに関し）：
【０２０９】
【化１】
2010154865.tif 000009
【０２１０】
【化２】
2010154865.tif 000010
【０２１１】
【化３】
2010154865.tif 000011
【０２１２】
【化４】
2010154865.tif 000012
【０２１３】
【化５】
2010154865.tif 000013
【０２１４】
【化６】
2010154865.tif 000014
【０２１５】
ＤＮａｓｅ処理ＤＮＡ及びオリゴの混合物をヌクレオチド、ＰＣＲバッファー及びＴａｑ／Ｐｗｏポリメラーゼに加えた。ＰＣＲアセンブリー反応をまず９４℃で２分、次いで下記のインキュベーション時間を３５〜４０サイクル：９４℃、３０秒；４５℃、３０秒；７２℃、６０秒；そして最後に７２℃で５分により行った。ＰＣＲ増幅反応を鋳型として１μｌのアセンブリー反応で実施し、そしてＡＭＧ遺伝子に隣接する領域にアニーリングするプライマーを加えた。パラメーターは以下の通りである：まず９４℃で２分；次いで以下のインキュベーション時間を３５〜４０サイクル：９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、９０秒；そして最後に７２℃で１０分。
【０２１６】
得られるＰＣＲ生成物を１％のアガロースゲルから精製し、線形化ベクターと混合し、そして上記の通りにしてコンピテント酵母細胞に形質転換した。
【０２１７】
例４
比活性
ＡＭＧ  Ｇ２変異体を例１に記載の通りにして構築した。Ｋｃａｔとしての比活性を精製サンプルについて、pH４．３、３７℃で、基質としてマルトース及びマルトヘプタオースを用い、上記の「材料と方法」の章に記載の通りにして測定した。 AGU／mgとしての比活性もpH４．３、３７℃で、基質としてマルトースを用い、上記の「材料と方法」の章に記載の通りにして測定した。
【０２１８】
【表８】
2010154865.tif 000015
【０２１９】
例５
７０℃での熱安定性
ＡＭＧ  Ｇ２  Ｓ１１９Ｐ変異体を例１に記載のアプローチを利用して構築した。
熱安定性は方法Ｉを利用してＴ1/2 として、また５０mMのＮａＯＡｃ、pH４．５、７０℃、０．２ AGU／ml中での３０分のインキュベーション後の％残留活性として、上記の「材料と方法」の章に記載の通りにして決定した。この試験の結果を以下の表に挙げ、そして野生型Ａ．ニガーＡＭＧ  Ｇ２と比較した。
【０２２０】
【表９】
2010154865.tif 000016
【０２２１】
例６
６８℃での熱安定性
ＡＭＧ  Ｇ２変異体を例３に記載のアプローチを利用して構築したが、但し下記の表の変異体１及び２はＷＯ９５／２２６２５（Affymax Technologies N.V.）に記載のシャフリングにより調製した。
【０２２２】
熱安定性は「材料と方法」の章に記載の通りにして方法Ｉを利用して６８℃でＴ1/2 として決定し、そして同条件下で野生型Ａ．ニガーＡＭＧ  Ｇ２と比較した。変異体の評価を上清液の濾過後の培養培地について行った。
【０２２３】
【表１０】
2010154865.tif 000017
【０２２４】
【表１１】
2010154865.tif 000018
【０２２５】
例７
６８℃での熱安定性
ＡＭＧ  Ｇ２変異体を例３に記載のアプローチを利用するシャフリングにより構築し、次いで陽性変異体のシャフリングを行った。
【０２２６】
熱安定性は「材料と方法」の章に記載の通りにして方法Ｉを利用して６８℃でＴ1/2 として決定し、同条件下で野生型Ａ．ニガーＡＭＧ  Ｇ２と比較した。変異体の評価を上清液の濾過後の培養液について行った。
【０２２７】
【表１２】
2010154865.tif 000019
【０２２８】
例８
６８℃での熱安定性
ＡＭＧ  Ｇ２変異体を例３に記載のアプローチを利用して構築した。熱安定性を「材料と方法」の章に記載の通りにして方法Ｉを利用して６８℃でＴ1/2 として決定し、そして同条件下で野生型Ａ．ニガーＡＭＧ  Ｇ２と比較した。変異体の評価を上清液の濾過後の培養液について行った。
【０２２９】
【表１３】
2010154865.tif 000020
【０２３０】
例９
７０℃での熱安定性
ＡＭＧ  Ｇ２変異体を例１に記載のアプローチを利用して構築し、そして半精製（Ｇ−２５カラムでの脱塩による培養液の濾過）サンプルとして評価した。
【０２３１】
熱安定性は％残留活性として、方法Ｉを利用し、５０mMのＮａＯＡｃ、pH４．５、７０℃の中で上記の「材料と方法」の章に記載の通りにして決定した。試験の結果を下記の表に挙げ、そして野生型Ａ．ニガーＡＭＧ  Ｇ２と比較した。
【０２３２】
【表１４】
2010154865.tif 000021
【０２３３】
例１０
３０％のグルコースの存在下での７０℃での熱安定性
ＡＭＧ  Ｇ２変異体を例３に記載のアプローチを利用して構築した。
熱安定性はＴ1/2 として、方法IIを利用し、７０℃にて「材料と方法」の章に記載の通りにして決定し、そして同条件下で野生型Ａ．ニガーＡＭＧ  Ｇ２と比較した。
【０２３４】
【表１５】
2010154865.tif 000022
【０２３５】
例１１
ＡＭＧ変異体Ｓ１１９Ｐ＋Ｙ４０２Ｆ＋Ｓ４１１Ｖ及びＰＬＡＳＤ（Ｎ末端）＋Ｖ５９Ａ＋Ａ３９３Ｒ＋Ｔ４９０Ａのそれぞれの糖化性能
共に向上した熱安定性を有するＡＭＧ変異体Ｓ１１９Ｐ＋Ｙ４０２Ｆ＋Ｓ４１１Ｖ及びＰＬＡＳＤ（Ｎ末端）＋Ｖ５９Ａ＋Ａ３９３Ｒ＋Ｔ４９０Ａそれぞれの糖化性能を下記の通りにして７０℃で試験した。
【０２３６】
対照酵素は野生型Ａ．ニガーＡＭＧ  Ｇ２である。糖化は下記の条件で行った：
基質  １０ＤＥデキストリン、約３０％  ＤＳ（ｗ／ｗ）
温度  ７０℃
初期pH  ４．３（７０℃で）
酵素投与量  ０．２４ AGU／ｇ  ＤＳ
【０２３７】
糖化
糖化のための基質はマルトデキストリン（一般のコーンから調製）を沸騰Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶かし、そして乾燥物質を約３０％（ｗ／ｗ）に調整することにより行う。pHは４．３に調整する。１５ｇの乾燥固形分に相当する基質のアリコートを５０mlのブルーキャップガラスフラスコに移し、そして浴槽の中に入れて撹拌する。酵素を加え、そして必要ならpHを再調整する。実験は二重測定で行う。サンプルを定期的に取り、そして炭水化物組成の決定のためにＨＰＬＣで分析する。
【図１】
2010154865.tif 000023
【配列表】
2010154865000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月8日(2010.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親グルコアミラーゼの変異体であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列内の下記の位置もしくは領域において
領域：１−１８，
領域：１９−３５，
領域：４０−６２，
領域：７３−８０，
領域：９３−１２７，
領域：１７０−１８４，
領域：２００−２１２，
領域：２３４−２４６，
領域：２８７−３１９，
領域：３３４−３４１，
領域：３５３−３７４，
領域：３８８−４１４，
領域：４４５−４７０，
及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す相同グルコアミラーゼ内の対応の位置もしくは領域において１又は複数の突然変異を含んで成るが、但し以下の置換は除く、変異体：Ｎ２０Ｃ，Ａ２７Ｃ，Ｓ３０Ｐ，Ｙ４８Ｗ，Ｙ５０Ｆ，Ｗ５２Ｆ，Ｒ５４Ｋ／Ｌ，Ｄ５５Ｇ／Ｖ，Ｇ５７Ａ，Ｋ１０８Ｒ，Ｄ１１２Ｙ，Ｙ１１６Ａ／Ｗ，Ｓ１１９Ｃ／Ｗ／Ｅ／Ｇ／Ｙ／Ｐ，Ｗ１２０Ｈ／Ｌ／Ｆ／Ｙ，Ｇ１２１Ｔ／Ａ，Ｒ１２２Ｙ，Ｐ１２３Ｇ，Ｑ１２４Ｈ，Ｒ１２５Ｋ，Ｗ１７０Ｆ，Ｎ１７１Ｓ，Ｑ１７２Ｎ，Ｔ１７３Ｇ，Ｇ１７４Ｃ，Ｙ１７５Ｆ，Ｄ１７６Ｎ／Ｅ，Ｌ１７７Ｈ／Ｄ，Ｗ１７８Ｒ／Ｄ，Ｅ１７９Ｑ／Ｄ，Ｅ１８０Ｄ／Ｑ，Ｖ１８１Ｄ／Ａ／Ｔ，Ｎ１８２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｙ／Ｓ，Ｇ１８３Ｋ，Ｓ１８４Ｈ，Ｗ２１２Ｆ，Ｒ２４１Ｋ，Ａ２４６Ｃ，Ｄ２９３Ｅ／Ｑ，Ａ３０２Ｖ，Ｒ３０５Ｋ，Ｙ３０６Ｆ，Ｄ３０９Ｎ／Ｅ，Ｙ３１２Ｗ，Ｗ３１７Ｆ，Ｅ３８９Ｄ／Ｑ，Ｈ３９１Ｗ，Ａ３９２Ｄ，Ａ３９３Ｐ，Ｎ３９５Ｑ，Ｇ３９６Ｓ，Ｅ４００Ｑ／Ｃ，Ｑ４０１Ｅ，Ｇ４０７Ｄ，Ｅ４０８Ｐ，Ｌ４１０Ｆ，Ｓ４１１Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｈ／Ｄ，Ｓ４６０Ｐ。