(57)【要約】      （修正有）【課題】高度に保存された機能的ドメインにより隣接されるＩＴＳ２の非保存領域の使用による種同定に対する迅速なアプローチを提供する。【解決手段】特定の配列により規定されるヌクレオチド配列から本質的になる単離された２本鎖核酸。さらに他のいくつかの配列により定義されるヌクレオチド配列から本質的になる単離された２本鎖核酸。「ＡＬＬ−ＣＡＮ−ＴＥＴ」およびその相補体として言及される配列から本質的になる単離された２本鎖核酸。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１〜１６に対応するヌクレオチド配列またはその相補鎖からなる、単離された核酸。
【請求項２】
検出可能な部分に付着した、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記検出可能な部分は、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、ジゴキシゲニン標識、またはビオチン−アビジン標識を含む、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
本明細書に記載される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｃａｎｄｉｄａ属およびＣａｎｄｉｄａの異なる種ならびに他の微生物の検出および区別のための診断アッセイ、ならびにアッセイを行うための組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓは、胃腸管の共生生物である。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびより少ない程度でいくつかの他の関連種は、免疫が傷つけられた宿主における日和見病原体としてますます重要である。未知の性周期を有する２型性２倍体酵母である、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、免疫系がインタクトであるヒトの皮膚および粘膜組織から単離され得る内因性生物である。しかし、免疫系または内分泌系の混乱は、Ｃａｎｄｉｄａ種が共生状態から局所的または全身的のいずれかで組織を侵すことに変わる機会を生じ得る。この日和見の例は、ＨＩＶ感染に関連して遭遇する口−食道または膣のカンジダ症である。
【０００３】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおいて、５Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核ｒＤＮＡ遺伝子は、第７番染色体上に約１０ｋｂ単位長さの５０〜１００コピータンデム反復として見出される（Ｍａｇｅｅら、１９８７，Ｔｈｒａｓｈ−ＢｉｎｇｈａｍおよびＧｏｒｍａｎ，１９９２）。５Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子（１２１ｂｐ）は、小サブユニットと大サブユニットとの間に位置する２つの非転写領域によって隣接し、そして集合的に遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）と呼ばれる。リボソーム５．８Ｓ配列は、種々の真核生物からまとめられた（Ｄａｍｓら、１９８８）。さらに、５．８／２８Ｓの内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域の配列分析は、少なくとも１つの真菌種内で株変異を示したが（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，１９９２）、一方他の種は完全な保存を証明した（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９９２）。株特異的制限多型（ＲＦＬＰ）は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＩＧＳ領域において以前に観察された（Ｍａｇｅｅら、１９８７）。
【０００４】
日和見真菌であるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓはまた、重篤に免疫が傷つけられた宿主において全身性疾患を引き起こす。これは散在性（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ）カンジダ症の最も原因となる種であり、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓおよびＣ．ｇｌａｂｒａｔａが続く（Ｏｄｄｓ，１９８８）。散在は、Ｃａｎｄｉｄａが血流を介してまたは粘膜表面の内部器官への侵入により広がる（Ｏｄｄｓ，１９８８）。高い危険性の患者集団は、悪性疾患または好中球減少を有する個体、化学療法および／または複数の抗生物質を受けている個体、ならびに留置カテーテルを有する個体または少ない出生時体重の乳児を含む（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，１９８９）。
【０００５】
全身性カンジダ症の診断は、臨床的に区別する徴候の非存在、しばしばネガティブな血液培養物、および感染を検出するための信頼できる血清学的試験の非存在により複雑にされる。現在、散在性カンジダ症は、しばしば、最低少なくとも２つのポジティブな血液培養物により診断される（Ｏｄｄｓ，１９８８）。しかし、血液培養物だけでは、５０％もの散在性カンジダ症症例が剖検で診断されるので、散在性カンジダ症の診断に明らかに十分ではない（Ｔｅｌｅｎｔｉら、１９８９）。散在性疾患を有する免疫が傷つけられた患者のために選択した薬物であるアンホテリシンＢの腎毒性は、予防のためのその使用を妨げる。
【０００６】
散在性カンジダ症の発生率は、増大する数の免疫抑制された患者および術後患者に起因して近年において増加した。新たな抗真菌薬物の出現は、この疾患の治療技術についての見通しを改善した；しかし、診断は難しいままである。さらに、骨髄移植患者のフルコナゾール予防は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓにより引き起こされる散在性疾患の発生率を低減したが、フルコナゾールに先天的に耐性である他のＣａｎｄｉｄａ種（最も顕著には、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉおよびＣ．ｇｌａｂｒａｔａ）は、主要な原因となる薬剤として増加した。従って、Ｃａｎｄｉｄａ種の初期検出および同定は、抗真菌治療の正しい標的化に必須である。
【０００７】
血液からＣａｎｄｉｄａを確実に培養する困難ならびに疾患を検出するための感度のあるおよび特異的な血清学的試験の欠如と組み合わせて、これらの結果は、代替の診断アプローチを開発する必要性を強調する。
【０００８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用による、感染患者の血流からの細菌およびウイルスＤＮＡの検出のための技術が開発された。ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡが、アガロースゲル電気泳動、サザンブロッティングまたはドットブロットハイブリダイゼーションにより検出され得るように、ゲノムＤＮＡを幾何級数的に増幅する（Ｍｉｙａｋａｗａら、１９９２、Ｋａｆａｔｏｓら、１９７９、Ｌａｓｋｅｒら、１９９２）。
【０００９】
ＰＣＲに基づく診断方法は、生存能力のある生物が増幅または検出に必要とされないので、血液培養技術と比較して増大した感度を提供し得る。現在まで、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの使用による感染患者血液中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞の検出を記載する報告は１つしかない（Ｂｕｃｋｍａｎら、１９９０）。Ｂｕｃｋｍａｎらは、ＺＹＭＯＬＹＡＳＥおよびプロテイナーゼＫでＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を溶解し、そしてフェノールおよびクロロホルムでＤＮＡを抽出した。この方法による感度限界は、全血１ｍｌあたり１２０個の細胞である。記載されたように、この方法は、時間がかかり、大きな労働量を要し、そして毒性化学薬品（フェノールおよびクロロホルム）を繰返し使用し、そして容易に再現可能であることが示されていない。さらに、単一コピー遺伝子であるシトクロームＰ−４５０遺伝子はＤＮＡ増幅のための標的であり、従ってこの方法を非常に非感受性にさせた。Ｍｉｙａｋａｗａらは、Ｃａｎｄｉｄａ  ＤＮＡからのＰＣＲ産物の検出のためのサザンブロットハイブリダイゼーションの使用による改善した感度を記載した（非特許文献１）。それらの研究におけるサザンブロットによる感度限界は尿１ｍｌあたり１０個の細胞であり、そして血中の検出を扱わなかった。
【００１０】
体液中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＤＮＡを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく試験の使用は、いくつかの励みになる結果を生じた。しかし、カンジダ症検出のためのこれらの試験の日常的な適用は、難しいままである。現在の方法は、大きな労働量を要するサンプル調製、Ｃａｎｄｉｄａ  ＤＮＡの遊離のための値段の高い酵素、およびＰＣＲ増幅前にＤＮＡを精製するためのフェノール−クロロホルム抽出を必要とする。増幅後、ゲル電気泳動またはサザンブロッティングによるＰＣＲ産物の検出は、しばしば、臨床研究室設定において実用的ではない。感度は変わり易く、そして偽陽性ならびに偽陰性結果が報告されている。また、大部分の研究は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＤＮＡの検出に集中したが、非ａｌｂｉｃａｎｓ  Ｃａｎｄｉｄａ種に由来するＤＮＡに集中しなかった。
【００１１】
他方では、日常的な培養に基づくＣａｎｄｉｄａ種の同定は、純粋な培養物を得るために最初の陽性結果後少なくとも１日；発芽管形成によりＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ単離物を同定するためにもう１日；およびＡＰＩ−２０Ｃ糖同化小片試験およびコーンミール寒天形態学により非ａｌｂｉｃａｎｓ  Ｃａｎｄｉｄａ単離物を同定するためにさらに２日以上を必要とする。従って、種レベルまでＣａｎｄｉｄａ単離物を迅速かつ正確に同定するための試験は、臨床的および疫学的の両方で有用である。
【００１２】
血中のＣａｎｄｉｄａを検出する能力は、尿または粘膜分泌物からの検出が生物の正常な共生状態または局在化非散在性感染と混同され得るので、全身性カンジダ症の迅速かつ正確な診断に非常に重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｋａｗａ，ｙ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．」１９９２、３０：８９４−９００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
本発明は、高度に保存された機能的ドメインにより隣接されるＩＴＳ２の非保存領域の使用による種同定に対する迅速なアプローチを提供する。属および他の関連生物の同定はまた、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の「属」特異的領域の検出により増強される。本発明者らが本明細書に記載の生物を選択的に回収することを可能にする、この遺伝子の領域を見出すことは驚くべきことであった。
【００１５】
本発明は、配列表において配列番号５により規定されるヌクレオチド配列から本質的になる単離された２本鎖核酸を提供する。これはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＩＴＳ２配列であり、そしてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに特異的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む。本発明の単離された２本鎖核酸のさらなる例は、配列表において配列番号６〜９により定義されるヌクレオチド配列から本質的になる。これらは、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＣ．ｋｒｕｓｅｉのＩＴＳ２配列である。これらの核酸は、個々の生物に特異的なヌクレオチド配列を含み得る。
【００１６】
本発明は、表１に述べられ、そして「ＡＬＬ−ＣＡＮ−ＴＥＴ」およびその相補体として言及される配列から本質的になる単離された２本鎖核酸をさらに提供する。この配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列、特に最初の４つの塩基対（ＡＧＧＣ）またはそれらの相補体は、全て表４に示されるように、全てではないにしろ、多数のＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび少なくとも２つのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種を示す。これらの生物は日和見病原体であり、そしてそれらの存在の知識は、有用な処置情報を提供し得る。ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＣａｎｄｉｔａの両方の検出は、それらが同じ環境下で（例えば、骨髄移植片患者において）現れる傾向があるので重要である。処置は、一方またはもう一方または両方の属が検出されてもいなくても同様である。
【００１７】
本発明の核酸またはそのフラグメントと特異的にハイブリダイズするか、またはこれらを選択的に増幅する単離された核酸もまた意図される。上記の核酸に相補的な単離された核酸もまた提供される。
【００１８】
被験体において全身性カンジダ症を診断する方法もまた提供される。この方法は、以下の工程：（ａ）被験体からの血液を、界面活性剤、ポリプロピレングリコール、ポリアンエタノールスルホン酸ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含むチューブに収集する工程；（ｂ）攪拌しながら、ＺＹＭＯＬＡＳＥ−１００Ｔを用いてＣａｎｄｉｄａ細胞を溶解する工程；（ｃ）溶解された細胞からＤＮＡを抽出および沈殿する工程；（ｄ）ＣａｎｄｉｄａリボソームＤＮＡの内部転写スペーサー領域に由来するユニバーサル真菌プライマー対を用いて沈殿されたＤＮＡを増幅する工程；ならびに（ｅ）増幅されたＤＮＡをＣａｎｄｉｄａ  ＤＮＡと選択的にハイブリダイズするプローブとをハイブリダイズすることにより、Ｃａｎｄｉｄａに由来する増幅されたＤＮＡを検出する工程を含み、増幅されたＤＮＡの存在は、全身性カンジダ症を示す。
【００１９】
定義
他に定義されない限り、本明細書中に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるような同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｗａｌｋｅｒ（編）（１９８８）Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  ｐｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｉｃａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ（１９９１）Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）は全て、当業者に本発明において使用される用語のうちの多くの一般的な辞書を提供する。本明細書中に記載される方法および材料に類似したまたは等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、特定の好ましい方法および材料が記載される。本発明の目的のために、以下の用語が以下に定義される。
【００２０】
用語「単離された」または「生物学的に純粋な」は、その天然状態において見出されるような通常それに付随する成分を実質的または本質的に含まない材料をいう。
【００２１】
用語「核酸」は、１本鎖または２本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、他に限定されない限り、天然に生じるヌクレオチドに類似した様式で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む。他に示されない限り、特定の核酸配列は、必要に応じて、その相補配列を含む。
【００２２】
２つの１本鎖核酸は、それらが２本鎖２重らせんを形成する場合に「ハイブリダイズする」。２本鎖の要素をもつ領域は、１本鎖核酸の１つもしくは両方の完全長、または一方の１本鎖核酸の全ておよびもう一方の１本鎖核酸のサブ配列を含み得るか、あるいは２本鎖の要素をもつ領域は、各核酸のサブ配列を含み得る。核酸のハイブリダイゼーションに対する概説は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  第１部  第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。
【００２３】
核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンおよびノザンハイブリダイゼーション）の状況における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、そして異なる環境パラメーター下で異なる。核酸ハイブリダイゼーションに対する徹底的なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、前出において見出される。一般的に、高度にストリンジェントな洗浄条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは、（定義されたイオン強度およびｐＨでの）、標的配列の５０％が完全に適合したプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍ点に等しいように選択される。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であればなお実質的に同一である。これは、例えば、１コピーの核酸が遺伝コードにより許容される最大コドン縮重を用いて作られる場合に起こる。
【００２４】
２つの核酸配列の状況における用語「同一」は、最大一致で整列された場合に同じである２つの配列における残基をいう。核酸は、少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、必要に応じて約９０％以上同一である場合、参照核酸に対して実質的に同一である。
【００２５】
本明細書中で使用する用語「プライマー」は、精製された制限消化物におけるような天然に生じても、または合成的に生成されてもオリゴヌクレオチドをいい、そして標的配列鎖にハイブリダイズし得る。末端３’ヌクレオチドがハイブリダイズした場合、これは、プライマー伸長の合成が誘導される条件下で合成開始点として作用する。これらの条件は、代表的に、適切な緩衝液中のおよび適切な温度での、４つの異なるヌクレオチド三リン酸（ヌクレオチド試薬）および耐熱性酵素の存在を含む。プライマー対が本明細書中で言及される場合、この対は、２本鎖標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし得る１つのプライマー（「センスプライマー」）および２本鎖標的核酸のアンチセンス鎖にハイブリダイズし得る１つのプライマー（「アンチセンスプライマー」）を含むことが意味される。プライマー対は、それらが増幅されるべき標的核酸の領域に隣接し、そして増幅プロトコル（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）に置かれた場合、標的領域が増幅されるのを引き起こすように設計される。
【００２６】
ヌクレオチド配列に「実質的に相同な」または「実質的に相補的な」プライマーが意味するものは、安定かつ特異的な結合がプライマーと標的配列との間で起こる標的配列とハイブリダイズするために十分相補的な、天然に生じるヌクレオチドまたはそれらのアナログ（例えば、７−デアザグアノシンまたはイノシン）を含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。安定なハイブリダイゼーション複合体（２重らせん）の形成に必要とされる相同性の程度は、増幅培地のストリンジェンシーで変化する。プライマーは、増幅される各特異的配列の標的鎖に実質的に相同であるべきである。これは、プライマーが標準的な増幅条件下で適切な鎖とハイブリダイズするのに十分相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントは、鎖に相補的なプライマー配列の残りと共に、プライマーの５’末端に付着され得る。あるいは、プライマー配列が、それとハイブリダイズし、それにより伸長産物合成のためのテンプレートを形成する標的配列の配列と十分に相補性を有するならば、非相補塩基またはより長い配列はプライマーに分散され得る。
【００２７】
本発明はさらに、以下を提供し得る：
・項目１．以下の配列およびその相補体に対応するヌクレオチド配列から本質的になる、単離された二本鎖核酸：
【００２８】
【化１】
2010075203.tif 000002
・項目２．項目１に記載の核酸と特異的にハイブリダイズする単離された核酸であって、そして当該核酸は、項目１に記載の配列の少なくとも最初の４つの塩基、または当該最初の４つの塩基に対する相補体を含む、単離された核酸。
・項目３．表１に提供された核酸配列のうちの一つに特異的にハイブリダイズする、単離された核酸。
・項目４．サンプル中のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．およびＣａｎｄｉｄａ  ｓｐ．を検出するための方法であって、核酸ハイブリダイゼーションの条件下で当該サンプルを項目２に記載の単離された核酸に曝す工程、および次いでサンプルの核酸と項目２に記載の核酸との間のハイブリダイゼーション複合体について検出する工程を包含する、方法。
・項目５．Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．の検出のためのキットであって、項目２に記載の核酸プローブ、および上記検出方法についての説明書を含む、キット。
・項目６．Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．がさらに検出される、項目５に記載のキット。
・項目７．上記キットが、配列番号５〜９からなる配列の群に規定されるヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブをさらに含む、項目５に記載のキット。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、配列番号５により配列表において定義されるヌクレオチド配列から本質的になる単離された２本鎖核酸を提供する。これは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＩＴＳ２配列を含む。「単離された」は、天然に生じる生物において見出される他の核酸から分離されたことを意味する。核酸は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに特異的なヌクレオチド配列を含む。「特異的な」は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来する核酸との適切なポジティブハイブリダイゼーションの決定を妨げる他の核酸とハイブリダイズしない配列を意味する。２本鎖核酸と「特異的にハイブリダイズする」プローブは、１本鎖形態の場合、２本の鎖のうちの１本にハイブリダイズする。
【００３０】
本発明の単離された２本鎖核酸のさらなる例は、配列番号６により配列表において定義されるヌクレオチド配列から本質的になる。これは、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓのＩＴＳ２配列を含む。この核酸は、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓに特異的なヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
本発明の単離された２本鎖核酸の別の例は、配列番号７により配列表において定義されるヌクレオチド配列から本質的になる。これは、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＩＴＳ２配列を含む。この核酸は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓに特異的なヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
本発明の単離された２本鎖核酸のなおさらなる例は、配列番号８により配列表において定義されるヌクレオチド配列から本質的になる。これは、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ  ＩＴＳ２配列を含む。この核酸は、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａに特異的なヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
本発明の単離された２本鎖核酸の別の例は、配列番号９により配列表において定義されるヌクレオチド配列から本質的になる。これは、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ  ＩＴＳ２配列を含む。この核酸は、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉに特異的なヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
本発明の単離された２本鎖核酸の別の例は、配列番号 により配列表において定義される、Ａｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴと本明細書中で言及されるヌクレオチド配列から本質的になる。この核酸は、全てのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓに特異的なヌクレオチド配列を含むが、他の真菌、細菌またはヒトＤＮＡは表４において以下に記載されるように試験されていない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．が検出されるべき場合、サンプルは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ核酸を放出するために機械的破壊に供されることが所望される。
【００３５】
本発明の核酸またはそのフラグメントと特異的にハイブリダイズするか、またはこれらを選択的に増幅する単離された核酸もまた意図される。上記の核酸に相補的な単離された核酸もまた提供される。配列は、ヌクレオチド配列および特定の配列の有用性に基づいて選択され得る。より詳細には、本発明は、配列番号５〜９により配列表において定義されるヌクレオチド配列から本質的になる核酸と特異的にハイブリダイズする単離された核酸を提供する。
【００３６】
プライマーまたはプローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、代表的に、例えば、自動化合成器（例えば、Ｎｅｅｄｍａｎ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：６１５９−６１６８に記載される）を用いて、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９９１），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．，２２（２０）：１８５９−１８６２により記載される固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成される。オリゴヌクレオチドはまたカスタムメイドであり得、そして当業者に公知の種々の商業的供給源から注文され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、必要な場合、代表的に、ＰｅａｒｓｏｎおよびＲｅｇｎｉｅｒ（１９８３）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９に記載されるように、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれかにより行われる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＭｏｌｄａｖｅ（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６５：４９９−５６０におけるＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８０）の化学的分解法を用いて確認され得る。
【００３７】
当業者はまた、所定の核酸配列において変化を作製する多くの方法を認識する。このような周知の方法は、部位指定変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅、核酸を含む細胞の変異原薬剤または放射線への暴露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、大きな核酸を作製するための連結および／またはクローニングと共に）および他の周知の技術を含む。ＧｉｌｍａｎおよびＳｍｉｔｈ（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：８１−９７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１〜３巻；Ｉｎｎｉｓ，Ａｕｓｂｅｌ，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｎｅｅｄｈａｍ  ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒおよびＭｕｌｌｉｓ（全て前出）を参照のこと。
【００３８】
本明細書に記載のアッセイ法における使用のプライマーは、好ましくは、最大効率および増幅のために１本鎖であるが、あるいは２本鎖であり得る。２本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、その鎖を分離するように最初に処理される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、酵素の存在下で伸長産物の合成をプライムするために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの因子（温度、プライマーの供給源および方法の使用を含む）に依存する。最も代表的には、増幅プライマーは、長さが８〜１００ヌクレオチドであり、好ましくは長さが約１０〜３０ヌクレオチドである。より代表的には、プライマーは、長さが約１８〜２８核酸である。
【００３９】
個々の種または属を検出するための本発明のプローブは、標的配列と特異的にハイブリダイズし、そして標的配列の特異的単離をもたらすのに十分な長さのプローブである。これらのプローブは、長さが約４〜約２３４塩基対であり、好ましくは長さが約８〜約３５塩基対であり、そして最も好ましくは長さが約１５〜約２２塩基対である。長さが５塩基対である個々のＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．に対するプローブの例は以下の通りである：
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ：        ＣＡＡＡＣまたはＴＴＣＡＡまたはＣＴＴＣＡ
Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ：ＡＡＡＴＴまたはＣＡＡＡＴまたはＣＡＡＡＡ
Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ：    ＡＴＡＡＣまたはＴＴＣＡＴまたはＴＣＡＴＡ
Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ：        ＴＡＡＣＴまたはＴＴＡＡＧまたはＡＡＧＴＴ
Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ：            ＡＴＴＡＣまたはＴＣＡＴＡまたはＣＡＴＡＡ。
【００４０】
本明細書中で使用する用語「から本質的になる」は、核酸の特異性（属または種）が維持される限り、本発明の核酸に対する改変を含む。同様に、プライマーまたはプローブとして使用されるフラグメントは、十分に相補的な塩基が特異的ハイブリダイゼーションのために存在する限り、置換を有し得る（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７）。
【００４１】
核酸は、１を超えるＣａｎｄｉｔａ種に存在するヌクレオチド配列と相同性を有し得る。他のＣａｎｄｉｄａ種と共有されるこのような核酸配列は、例えば、１を超えるＣａｎｄｉｔａ種から核酸を同時に増幅するためのプライマーとして使用され得る。次いで、増幅された核酸は、属特異的診断または種特異的診断のいずれかを可能にするための本明細書中に記載される特異的核酸を用いて検出され得る。従って、特異的核酸は、Ｃａｎｄｉｄａ属に特異的であり得、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応およびハイブリダイゼーションのような方法においていずれのカンジダ症も検出するために使用され得る。
【００４２】
被験体における全身性カンジダ症を診断する方法もまた提供される。方法は、以下の工程：（ａ）被験体からの血液を、界面活性剤、ポリプロピレングリコール、ポリアンエタノールスルホン酸ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（（Ｎａ）２ＥＤＴＡ）を含むチューブに収集する工程；（ｂ）攪拌しながら、ＺＹＭＯＬＡＳＥ−１００Ｔを用いてＣａｎｄｉｄａ細胞を溶解する工程；（ｃ）溶解された細胞からＤＮＡを抽出および沈殿する工程；（ｄ）ＣａｎｄｉｄａリボソームＤＮＡの内部転写スペーサー領域に由来するユニバーサル真菌プライマー対を用いて沈殿されたＤＮＡを増幅する工程；および（ｅ）増幅されたＤＮＡとＣａｎｄｉｄａ  ＤＮＡと選択的にハイブリダイズするプローブとをハイブリダイズすることにより、Ｃａｎｄｉｄａに由来する増幅されたＤＮＡを検出する工程含み、増幅されたＤＮＡの存在は、全身性カンジダ症を示す。
【００４３】
この方法において、溶解工程は、ＺＹＭＯＬＡＳＥ−１００Ｔに加えてＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）キットに由来する溶解緩衝液を使用し得る。攪拌工程は、１分あたり約１６回転で振動させることによるものであり得る。抽出工程は、ＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）キットにおける抽出マトリクスを使用し得る。上記の方法の増幅工程において、プライマー対のプライマーの１つは、内部転写スペーサー１（ＩＴＳ１）に由来し、そしてプライマー対のもう１つのプライマーは、内部転写スペーサー２（ＩＴＳ２）に由来する。あるいは、プライマー対のプライマーの１つは、内部転写スペーサー３（ＩＴＳ３）に由来し、そしてプライマー対のもう１つのプライマーは、内部転写スペーサー４（ＩＴＳ４）に由来する。検出工程のハイブリダイゼーションは、属または種特異的Ｃａｎｄｉｄａプローブを使用するドットブロットハイブリダイゼーションによるものであり得る。
【００４４】
全身性カンジダ症を検出する方法において、増幅されるＤＮＡはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来し得、そしてプローブは、実施例２に記載される配列番号５の核酸の特異的なヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズし得る。本明細書中に提供されるような他の特異的核酸を使用することにより、実施例２の方法は、本明細書中に教示されるような他のＣａｎｄｉｄａのいずれかを検出するために使用され得る。増幅されるＤＮＡがＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓに由来する場合、プローブは、配列番号６の核酸の特異的なヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする。増幅されるＤＮＡがＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓに由来する場合、プローブは、配列番号７の核酸の特異的なヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする。増幅されるＤＮＡがＣ．ｇｌａｂｒａｔａに由来する場合、プローブは、配列番号８の核酸の特異的なヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする。増幅されるＤＮＡがＣ．ｋｒｕｓｅｉに由来する場合、プローブは、配列番号９の核酸の特異的なヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする。１を超えるＣａｎｄｉｄａ種と相同性を有する核酸はまた、全身性カンジダ症を検出するための、Ｃａｎｄｉｄａ  ＤＮＡを特異的にハイブリダイズするプローブとして使用され得る。
【００４５】
さらに、核酸（例えば、プローブおよびプライマー）は、（共有結合的または非共有結合的に）検出可能な部分に付着され得るか、またはこれで標識され得ることが意図される。プローブは、実施例２において教示されるドットブロットハイブリダイゼーション手順の例において後の視覚化のために、例えば、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識などを用いて適切に標識され得る。このような標識された核酸の例は、実施例２において提供されるジゴキシゲニン−ＵＴＰ標識プローブであるが、他は標準的な方法を用いて容易に作製され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）。所定のＣａｎｄｉｄａ種に特異的な核酸はそれぞれ、別々の検出可能な部分で標識され得、その結果いくつかの種に対する種特異的プローブは増幅されたＤＮＡの同じサンプルを用いて使用されて、種特異的診断を可能にし得る。各々の種特異的プローブに対する別々の標識は、特定の種に由来するＤＮＡが被験体に存在する場合、サンプル中で検出され得る。
【００４６】
本明細書中に記載されるような真菌ＤＮＡの検出はまた、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を用いて行われ得る。本質的に、当業者に公知であるこの反応は、検出されるべき各領域について、互いに隣接してまたは２つのプライマー配列間の１または２つのヌクレオチドと共に（すなわち、接合点に対して「直ぐ５’」または「直ぐ３’」）のいずれかで、標的ＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイズする２つのプライマーの使用を含む。リガーゼ反応は行われ、そして産物は、非常に小さなフラグメントを検出し得るゲル（例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル）を通して電気泳動される。ポジティブな結果は、２つのプライマーの合計にサイズが等しい産物が生成される結果である。なぜならこれは標的ＤＮＡ領域の全ての存在を示すからである。３つの反応が３つの別々のチューブで作動され、（１）第１の接合点、（２）第２の接合点、および（３）ポジティブＬＣＲコントロールとしての内部配列が検出において標的化されることが好ましい。ゲルを通して全てのＬＣＲ産物を共に電気泳動することを所望する場合、プライマーは、それらの個々のサイズが任意のＬＣＲ産物の予測サイズから区別され得るように、注意深く選択されなければならない。あるいは、各々の反応の産物は、別々に電気泳動され得る。プライマーは、好ましくは、標的領域に正確に相同であり、そして約２０〜４０ヌクレオチドのサイズのプライマーである。
【００４７】
キット
本明細書に記載される生物のアッセイおよび検出のためのキットがさらに意図される。上記で述べられるこの方法に有用な試薬の組み合わせ、特に、任意のプローブまたはプライマーは、記載されたアッセイにおいてそれらを使用するための説明書を用いて、単一または共にのいずれかでパッケージされ得る。好ましいキットは、単一の試験アリコートを用いてアッセイを行うための、表１で述べられるプローブおよび説明書を含む。
【００４８】
以下の実施例は、本発明を例示するが、本発明を限定することが意図される。それらは使用され得るものを代表するが、一方当業者に公知の他の手順は、代替的に使用され得る。
【実施例】
【００４９】
実施例１
Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよび関連種のＩＴＳ２領域のヌクレオチド配列分析
酵母株および維持
全てのＣａｎｄｉｄａ単離物は、以前に、同化（ＡＰＩ）プロフィールおよび形態学により特徴付けられた（Ｖａｎ  ｄｅｒ  ＷａｌｔおよびＹａｒｒｏｗ，１９８４）。さらに、全てのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ単離物は、以前に、電気泳動的に核型分類され、そして別々の関連しない株を示すことが知られている（Ｌａｓｋｅｒら、１９８９）。全ての単離物を増殖させ、そして酵母−ペプトン−デキストロース（ＹＰＤ）培地（ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ、１９９１）上で維持した。ＤＮＡ抽出のために、３７℃でＹＰＤ上で増殖された１０ｍｌの一晩培養物を１×ＴＥ緩衝液で２回洗浄し、そしてＤＮＡを標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）により抽出した。ＰＣＲ増幅の前に、ＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、１．０％アガロースゲル上で電気泳動し、そして臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色して、濃度および純度を確認した。
【００５０】
ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定
Ｔａｑポリメラーゼ、緩衝液およびＰＣＲのための条件は、１反応あたり１００ｎｇゲノムＤＮＡを使用する、売り主（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）により供給されたものであった。最初の適用のために、９５℃、５５℃、および７２℃（１分間隔）の３５サイクルに続いて、７２℃での５分間の最終伸長を行った。以下の「ユニバーサル」ＩＴＳプライマーを使用し、この計算されたＴｍは以前に報告されている（Ｗｈｉｔｅら、１９９０）：
ＩＴＳ１    ５’  ＴＣＣ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＧＣＧ  Ｇ  ３’（配列番号１）
ＩＴＳ３    ５’  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＧＣ  ３’（配列番号２）
ＩＴＳ４    ５’  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＴＡＴ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＧＣ  ３’（配列番号３）
プライマーＩＴＳ１は、１８Ｓ核サブユニットにおける保存３’ドメインに対するものである。プライマーＩＴＳ３は５．８Ｓサブユニットの末端から約２５ｂｐであり、そしてＩＴＳ４は、核大ｒＤＮＡの保存領域に対する逆プライマーである。さらに、２１Ｍ１３正プライマー配列（Ｍｅｓｓｉｎｇら、１９８１）を、正方向および逆方向、それぞれにおける配列決定のためにプライマーＩＴＳ１およびＩＴＳ４に対して５’末端に付加し、そして以下の配列からなった：
５’  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  Ｇ  ３’（配列番号１０）
ここでＩＴＳ１およびＩＴＳ４の末端５’Ｔは、１８ｂｐのアニーリング配列のうち１７ｂｐを作った。予備実験から、この配列の付加が得られるＰＣＲ産物の性質を変えなかったことが決定された。最初のＰＣＲ反応の水相をエタノール沈殿させ、乾燥し、そして８μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。全量を、１．５％アガロース、１．０％  ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル（Ｌｅｈｍａｎｎら、１９９２）の単一ウェルにロードし、１１０Ｖで電気泳動し、そしてＥｔＢｒで染色した。適切なサイズの単一の非常に濃く染色したバンドを切除し、そしてＤＮＡを、４０℃、１３０００×ｇで３０分間、Ｓｐｉｎ−Ｘ酢酸セルロースカラム（Ｃｏｓｔｅｒ，  Ｉｎｃ．）において抽出した。次いで、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、７０％ＥｔＯＨで２回洗浄し、手短に乾燥し、そして配列決定のためにＨ２Ｏに再懸濁した。自動化ＤＮＡ配列決定（Ｓｍｉｔｈら、１９８６）を、売り手（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により供給される条件を用いて、「Ｐｒｉｓｍ」ダイ−プライマージデオキシ配列決定反応（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）と共に、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔａｌｙｓｔ  ８００ワークステーションを用いて行った。沈殿させたＤＮＡを乾燥し、そして６μｌのホルムアミド／５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（５：１）に再懸濁し、９０℃で２分間変性し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  モデル３７３Ａ  ＤＮＡ配列決定機にロードした。全てのＤＮＡを正方向および逆方向の両方で配列決定し、そして複数の作業を、全ての種および所定の種内の大部分の株について行った。
【００５１】
５．８ｓ  ｒＤＮＡ
５．８Ｓ配列アラインメントを、手動でおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ大学Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４）からの「山積み（ｐｉｌｅｕｐ）」プログラムを用いての両方で行った。ＩＴＳアラインメントを、ＧＣＧ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  １９７０）により実行されたように、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて全ての可能な対様組み合せで行った。ＤＮＡ節減（ｐａｒｓｉｍｏｎｙ）およびブートストラップ分析を、マイクロ−ヴァックス（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐ．Ｃｏｒｐ．）クラスター上で実行される、Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ  １９８２）の「Ｐｈｙｌｉｐ」プログラムを用いて行った。系統樹を、包括的な選択（ｇｌｏｂａｌ  ｏｐｔｉｏｎ）を用いて、および他者集団として種々の異なる種を用いて構築した（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ  １９８５）。他の５．８Ｓ配列は以下の通りである：Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｕｍ、Ｅｐｉｃｈｌｏｅ  ｔｙｐｈｉｎａ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ。
【００５２】
複数の株が分析された、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓについて、全１５９ｂｐの５．８Ｓ領域内で完全なヌクレオオチド保存があった。この研究において使用された種についての最も大きな多様性度は、ｂｐ７９〜８５とｂｐ１１８〜１３６との間の２つの比較的保存されていない領域において見出された。Ｃａｎｄｉｄａ種間の全体にわたる平均の多様性度は、約３％であった。ｂｐ６２で単一のＣ−Ａトランスバーションを有するが、最小多様性度は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓとＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓとの間に見出された。興味深いことに、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｋｒｕｓｅｉの両方は、終結コンセンサスＴＣＡＴＴＴにおいてＡ−Ｇトランジションを含んだ。
【００５３】
系統発生的分析を、Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎにより実行されたような厳密な節減および統計ブートストラップ分析（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ  １９８２；１９８５）を用いて、全て既知の真菌５．８Ｓ配列を用いて行った。Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉを、真核生物のより大きなデータベースを用いた１８Ｓ分析に基づく以前の知見（Ｅｄｍａｎら、１９８８）を考慮して、他者集団として使用した。まとめられた真菌配列数について計４７の有益な部位（４つの単一塩基対ギャップを含む）があった。ギャップなしでセットされたデータの再分析は、樹形曲線（ｔｒｅｅ）のトポロジーを有意に変えなかった。計１００の繰返しからの累積数のポジティブな選択は、各分岐点で与えられる。得られた樹形曲線は、１８Ｓ配列についての加重差違アルゴリズムを用いた以前の調査と有意に異ならず、そしてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓおよびＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓがクレード内のＣ．ｋｒｕｓｅｉより密接に整列されるように、これらの種が関連するという考察を支持する。同様に、Ｃ．ｇｒａｂｒａｔａは、より離れて関連するようであり、そして酵母様真菌のより大きな枝内の多数の位置に等しく配置され得る。１００のランダムに試験されたサンプルのうち７０以上の値は、有意な程度の確率で同様の樹形曲線を示すことが、一般的に認められる。
【００５４】
ＩＴＳ２  ｒＤＮＡ
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＣ．ｋｒｕｓｅｉのＩＴＳ２領域の配列は、配列番号５〜９として配列表に示される。
【００５５】
代表的なおよび形態学的に（または生理学的に）異形型の株を示す、計１０個のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ単離物は、ＩＴＳ領域内でヌクレオチドレベルで同一であることが見出された。同様に、広範な電気泳動的核型およびランダムに増幅された多型（ＲＡＰＤ）を示す、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓの５つの株もまた、この種の基準株に同一であった。ＩＴＳ領域の全長は、種特異的であることが見出された。
【００５６】
５．８Ｓアラインメントの結果に類似して、本発明者らは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓおよびＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓがまた、このＩＴＳ領域において最も相同であることを見出した。この相同性は、５．８Ｓ配列終結の５’直ぐに隣接した最初の５７ｂｐにわたった。対照的に、３’領域は、ほとんど相同性を示さなかった。Ｃ．ｋｒｕｓｅｉおよびＣ．ｇｌａｂｒａｔａについては、この全ＩＴＳ領域にわたって、互いに対しても、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ群のメンバーに対してのいずれも明らかな相同性はなかった。配列は、全ての可能な対様組み合わせで整列され（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  １９７０）、そして平均の類似性度は、約４０％であることが見出された。
【００５７】
ＩＴＳ２領域の分析は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび恐らく他の密接に関連した種が、株間変異を示さないことを明らかにした。これに関して、この種は、日和見真菌Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓのようであり、そしてこの領域において変異を示す植物病原体Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍとは異なる。
【００５８】
実施例２
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用による血液中のＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ細胞からのＤＮＡの検出
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ３６Ｂ株を、２５℃で４８時間、Ｓａｂｏｕｒａｕｄのデキストロース寒天Ｅｍｍｏｎｓ傾斜（ｓｌａｎｔ）において増殖させた。細胞を、各傾斜を５ｍｌの０．８５％ＮａＣｌで洗浄することにより採集し、１５００×ｇで１０分間遠心分離し、そして新鮮に収集されたウサギ血液または０．８５％生理食塩水中に適切な濃度に再懸濁した。
【００５９】
酵母細胞溶解およびＤＮＡ精製
成体雌ウサギ（ニュージーランドホワイト、Ｍｙｒｔｌｅ’ｓ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｆａｒｍ）からの血液を、中心耳動脈から、１単位の精製サポニン水溶液、８ｍｌ／Ｌポリプロピレングリコール、９．６ｇ／Ｌ  ポリアンエタノールスルホン酸ナトリウムおよび１６ｇ／Ｌ  （Ｎａ）２ＥＤＴＡを含むＩＳＯＬＡＴＯＲ  １０（登録商標）細菌チューブ（Ｗａｍｐｏｌｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ）；ＥＤＴＡコートチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）；またはヘパリン化されたチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に収集した。次いで、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ３６Ｂ株（Ｑｕｅｂｅｃ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ）細胞を導入し、そしてサンプルを、３０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を除去し、そして等容量の脱イオン化水を添加して、残存血液細胞を溶解した。残存Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を０．８５％  ＮａＣｌで洗浄し、そして１５００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化した。ＩＳＯＬＡＴＯＲ  １０（登録商標）チューブは、血液からの生存能力のあるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞の回収のための他の血液収集系よりも優れていることがわかった（Ｊｏｎｅｓ，１９９０）。血液収集のためのＩＳＯＬＡＴＯＲ  １０（登録商標）チューブの使用は、カンジタＤＮＡのＰＣＲ増幅をもたらしたが、ＥＤＴＡコートまたはヘパリンコートされたチューブの使用はもたらさなかった。
【００６０】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＤＮＡを抽出し、そして製造者の説明書に従って、真菌を用いたその使用を可能にするためにＺＹＭＯＬＡＳＥ−１００Ｔを添加して（なぜならＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）キットは、哺乳動物細胞およびグラム陰性細菌のみに由来するＤＮＡの単離および精製のためにＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより開発されたからである）、ＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）核酸抽出キットを用いて精製した。簡単には、ペレット化した細胞を、１００μｌの溶解緩衝液を添加した後、１５分間１００μｌのサンプル緩衝液に懸濁した。混合物を、２５℃で１時間インキュベートした。選択されたサンプルは、溶解工程の間にザイモリアーゼ（ＺＹＭＯＬＹＡＳＥ−１００Ｔ、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ；１．０Ｍソルビトール、０．１Ｍクエン酸三ナトリウム、および０．１％  ２−メルカプトエタノール中の５ｍｇ／ｍｌ）を含み、そしてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞の破壊を最適化するために１分あたり約１６回転で振動させた。ザイモリアーゼの溶解工程への付加は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を用いた使用のためのＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）キットの首尾良い適応を可能にした。あるいは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を、ミニビーズビーター（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）を用いて破壊した（Ｇｌｅｅら、１９８７）。細胞（１ｍｌ）を、１ｍｌの０．５ｍｍ直径ガラスビーズを含むＳａｒｓｔｅｄｔマイクロフュージチューブに送達し、そして２分間最大速度でたたいた。第３の方法は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心チューブ中の２ｍｌの脱イオン水中で１ｍｌあたり１×１０７個の細胞を３０分間煮沸することによりＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＤＮＡを放出した。ビーズでたたくか、または煮沸することによるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞の機械的破壊は、ＰＣＲ増幅ＤＮＡを生成することにおいてあまり効果的ではなく；これらの方法はあまりにも厳しすぎ得、ＤＮＡの剪断またはフラグメント化をもたらす。ＤＮＡの沈殿のために、ＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）キットの酢酸ナトリウムおよび他の成分を、指示されたように使用した。
【００６１】
溶解後、ＤＮＡを、ＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）キットにおいて提供された抽出マトリクスを用いて精製し、イソプロパノールの存在下で酢酸ナトリウムを用いて沈殿し、そして沈殿したＤＮＡを、真空遠心分離により１５分間乾燥した。
【００６２】
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅
ユニバーサル真菌プライマー対、ＩＴＳ１および２またはＩＴＳ３および４を、ＣＤＣｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ．により合成し、そして天然のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２５０Ｕ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用するＧｅｎｅＡｍｐＲ  ＤＮＡ増幅試薬キットを、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅のために使用した（Ｓａｉｋｉら、１９８８）。これらのプライマーは、全ての真菌およびいくつかの寄生体からＤＮＡを増幅する。ＩＴＳ１、ＩＴＳ２、ＩＴＳ３およびＩＴＳ４プライマーの例を、それぞれ、配列番号１、４、２および３として配列表に示す。反応は以下からなる：５３．５μｌの２重に蒸留した滅菌水、１０μｌの１０×反応緩衝液、１６μｌの等モル（１．２５ｍＭ）量のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの混合物、５μｌの２０μＭ  ＩＴＳ１または３、５μｌの２０μＭ  ＩＴＳ２または４、１０μｌの標的ＤＮＡ、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ、ならびに６μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２。サンプルを、ＤＮＡ増幅の間の蒸発を最小にするために、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）に置く前に鉱物油で重層した。サンプルを、９５℃で５分間、サーマルサイクラーで最初に変性させた。これに続いて、以下の３０サイクルを行った：９５℃１分間の変性、５０℃で２分間のアニーリング、および７２℃で１．５分の伸長。最終伸長は、７２℃にて５分間で生じた。
【００６３】
増幅後、鉱物油を捨てた。等容量のクロロホルムをサンプルに添加し、次いでこれを４１００×ｇで５分間遠心分離して、残存鉱物油を抽出した。水層を取り出し、そしてＤＮＡを、２容量の氷冷１００％エタノールを添加し、続いて−７０℃で３０分間インキュベートすることにより、それから沈殿させた。次いで、サンプルを４１００×ｇで１分間遠心分離し、エタノールを除去し、サンプルを真空下で乾燥し、そして２０μｌのＴＥ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。増幅したＤＮＡを、臭化エチジウム染色またはドットブロットハイブリダイゼーション分析により、アガロース（１％アガロース＋ＴＥ緩衝液中の１％  Ｎｕ−Ｓｉｅｖｅ）ゲル電気泳動後に視覚化した。
【００６４】
ドットブロットハイブリダイゼーション
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ３３０７株のＤＮＡを、ドットブロットのためのプローブとして使用した。プローブを作製するために、２０ｎｇのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ３３０７のゲノムＤＮＡを、プライマー対としてＩＴＳ１およびＩＴＳ２またはＩＴＳ３およびＩＴＳ４を用いてＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて電気泳動し、そして得られたＤＮＡバンドをゲルから切り出した。産物を、Ｔｈｕｒｉｎｇら（Ｔｈｕｒｉｎｇら、１９７５）の凍結−圧搾法によりゲルから抽出した。ＤＮＡプローブを、製造者の説明書に従って、非放射性ＤＮＡ標識および検出キット（「Ｇｅｎｉｕｓ」キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からのジゴキシゲニン−ｄＵＴＰと一晩インキュベートすることにより標識した。配列番号５〜９の核酸に由来する他の属または種特異的プローブもまた、この方法において使用され得る。
【００６５】
１０μｌのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓＤＮＡをＴＥ緩衝液で２５μｌに希釈し、ＮａＯＨを０．３Ｍの最終濃度まで添加し、そして２５℃で１０分間インキュベートすることにより、サンプルをドットブロット（Ｋａｆａｔｏｓら、１９７９、Ｌａｓｋｅｒら、１９９２）のために調製した。次いで、等容量の２．０Ｍ酢酸アンモニウムを、氷上の各サンプルに添加した。次いで、各サンプルを、製造者の説明書に従ってドットブロット装置（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いて、ニトロセルロースフィルター上に真空下でドットした。次いで、フィルターを装置から取り出し、そして真空下で２時間−８０℃で乾燥した。乾燥したフィルターをプラスチックバックに入れ、密封し、そして６５℃水浴中で一晩、１本鎖サケ精子ＤＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）でプレハイブリダイズした。
【００６６】
ジゴキシゲニン標識プローブを、５分間煮沸することによって変性させ、プラスチックバック中のフィルターに添加し、そして６５℃水浴中に一晩入れた。次いで、フィルターを、クエン酸化生理食塩水（０．０３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む０．３Ｍ  ＮａＣｌ）および０．１％  ＳＤＳで、６０℃で３０分間ずつ２回洗浄した（Ｌａｓｋｅｒら、１９９２）。洗浄したフィルターを、アルカリホスファターゼで標識された抗ジゴキシゲニン抗体（１：５０００）と共に２５℃で３０分間インキュベートした。色原体（ニトロブルーテトラゾリウム塩および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）を添加し（Ｌａｓｋｅｒら、１９９２）、そして暗所で２５℃で６時間発色させた。
【００６７】
「ブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）」ＰＣＲ増幅
「ブースター」ＰＣＲ増幅を、Ｒｕａｎｏら（Ｒｕａｎｏら、１９８９）の方法により行った。簡単には、上記で概説されたのと同じプロトコルを使用したが、ＰＣＲ増幅の１５サイクル後に、サンプルをサーマルサイクラーから取り出し、そして新鮮なプライマーを４０μＭの最終濃度まで添加した。次いで、サンプルを、さらなる１５サイクルおよび最終伸長のためにサーマルサイクラーに戻した。血液に導入された細胞に由来するＰＣＲ産物の検出の感度レベルは、臭化エチジウム染色されたアガロースゲルにより検出した場合、１ｍｌあたり１０５個細胞から１ｍｌあたり１０３個細胞に改善された。しかし、この系の特異性は、ネガティブコントロールがポジティブになったので不十分であった。
【００６８】
アガロースゲル電気泳動による生理食塩水中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓからのＰＣＲ増幅産物の検出
ＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）キット単独を用いて生理食塩水から単離および精製されたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＤＮＡと、ザイモリアーゼ＋キットの使用により得られたものとの比較を行った。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞（１０７／ｍｌ食塩水）を、３７℃または２５℃のいずれかで溶解した。ザイモリアーゼとＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）キットとの組み合わせ使用（２５℃または３７℃いずれかでの）は、キット単独と比較して精製ＤＮＡの増強した回収をもたらした。
【００６９】
細胞破壊およびＤＮＡ精製についてザイモラーゼ＋ＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）法の感度を決定するために、次いで、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を、破壊前に生理食塩水に連続希釈した（１ｍｌあたり１０７〜１０１細胞）。臭化エチジウム染色したアガロースゲルは、１ｍｌあたり１０３個の細胞がこの方法により検出され得たことを証明した。これらの結果に基づいて、全ての後続の実験はザイモリアーゼを使用し、続いて２５℃でＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）を用いたＤＮＡ精製を行った。
【００７０】
アガロースゲル電気泳動による血液中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＰＣＲ増幅産物の検出
ザイモリアーゼ＋ＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）キット法を使用して、血液中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを検出し得るかどうかを決定するために、１ｍｌあたり１０７個のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を、上記のように、新鮮に収集されたウサギ血液に導入した。血液を以下のうちの１つに収集した：ＩＳＯＬＡＴＯＲ  １０（登録商標）細菌チューブ；ＥＤＴＡコートチューブ、またはヘパリン化されたチューブ。増幅ＤＮＡを、ＩＳＯＬＡＴＯＲ  １０（登録商標）チューブのみに吸い出された血液に導入された細胞から調製されたサンプルにおいて検出した。血液がＥＤＴＡコートのみされたチューブまたはヘパリンコートのみされたチューブのいずれかに吸い出されたサンプルでは、ＤＮＡは検出されなかった。
【００７１】
ザイモリアーゼ＋ＩＳＯＱＵＩＣＫ（登録商標）キット法を使用する血液中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＤＮＡの検出感度を、ＩＳＯＬＡＴＯＲ  １０（登録商標）チューブに吸い出された血液中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞（１ｍｌあたり１０７〜１０１細胞）を連続希釈することにより決定した。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色を用いて、１ｍｌあたり１０５個の細胞を検出し得た。
【００７２】
血液または生理食塩水中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＰＣＲ増幅産物の検出のためのドットブロットハイブリダイゼーション
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＤＮＡの検出感度を改善する努力において、ＰＣＲ産物の検出について、臭化エチジウム染色アガロースゲル法とドットブロットハイブリダイゼーション法との比較を行った。ドットブロット法は、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により検出された１ｍｌあたり１０３個の細胞に対し、生理食塩水中１ｍｌあたり１０１個の細胞の検出を可能にした。血液中に導入されたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞のＰＣＲ産物の検出感度は、ドットブロット法による１ｍｌあたり１０１個の細胞対臭化エチジウム染色アガロースゲル検出の１ｍｌあたり１０５個の細胞であった。上記のドットブロットに使用されたプローブは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ特異的であった。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＤＮＡおよびヒト胎盤ＤＮＡは、ドットブロットにおいて反応せず、これはプローブの特異性を支持する。従って、本明細書中に教示される方法は、臨床サンプル（例えば、血液）においてＣａｎｄｉｄａ  ＤＮＡを検出し得る。
【００７３】
本明細書中に記載のユニバーサル真菌プライマーは、全ての真菌からのＤＮＡ増幅の可能性を提供する。しかし、上記のドットブロットハイブリダイゼーション工程におけるようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ特異的ＤＮＡプローブを使用することにより、試験は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ特異的であった。ドットブロットアッセイを、本明細書中に記載されるような他のＣａｎｄｉｄａ種または他の真菌の特異的プローブを用いて行い得る。さらに、本発明の方法が、臨床サンプルから穏やかにＤＮＡを抽出し得るので、この方法はまた、ＰＣＲ反応のためのウイルスプライマー、細菌プライマー、または他の真菌プライマー、続いて上記のようなドットブロットにおいて、各属または種に特異的なＤＮＡプローブを使用し得る。
【００７４】
実施例３
ポリメラーゼ連鎖反応の使用による血液中のＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．からのＤＮＡの検出
Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．の検出および同定は、特に、新たに出現する非ａｌｂｉｃａｎｓ  Ｃａｎｄｉｄａ感染の増加のために重要になってきている。本発明者らは、１つの反応チューブ中で３つまでのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．を検出するための真菌特異的ＰＣＲプライマーおよび種特異的ＤＮＡプローブを使用した（ＴａｑＭａｎＴＭ  ＰＣＲ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。ｒＤＮＡの内部転写スペーサー領域に対するプローブを、３つの蛍光レポーター色素のうちの１つで標識した：ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン）、またはＨＥＸ（ヘキサ−クロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン）。各色素は、特異的な標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅の際に特徴的な波長を放射し、その結果３つまでのプローブがＰＣＲ反応中に同時に使用され得る。次いで、各プローブの異なるシグナルを、蛍光マイクロタイタープレートリーダーを使用することによりサーマルサイクリング直後に検出する。６つのプローブをこの研究において使用し：ＣＡ−ＦＡＭ、ＣＴ−ＴＥＴおよびＣＰ−ＨＥＸを、それぞれ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、およびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓの同時検出および同定のために１つのチューブに添加した。ＴＧ−ＦＡＭおよびＣＫ−ＴＥＴを、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＣ．ｋｒｕｓｅｉ（蛍光耐性種）検出のために第２のチューブに添加した。Ｃａｎｄｉｄａ属プローブであるＡｌｌＣＡＮ−ＴＥＴを第３のチューブに添加した。６１のポジティブな血液培養ボトル（２３のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、１８のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ、６つのＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、６つのＣ．ｋｒｕｓｅｉ、５つのＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、および３つの混合真菌血症）から回収されたＤＮＡを使用した。コントロールサンプルは、細菌（ｎ＝１０）または他の真菌血症（ｎ＝３）の培養物、または増殖なしのボトル（ｎ＝１０）を含んだ。ＴａｑＭａｎＴＭ  ＰＣＲは、６１の標本のうち５７（９３．４％）を検出し、そして正確に同定し、そして偽陽性結果を与えなかった。この方法は迅速であり、ＰＣＲ後ハイブリダイゼーションおよびインキュベーション工程を排除する。これは、血液培養ボトルからのＣａｎｄｉｄａ種を検出および同定するのに感度が良くおよび特異的であり、より迅速な診断および薬物治療の適切な標的化を可能にする。
【００７５】
本発明者らは、ポジティブな血液培養ボトルからのＣａｎｄｉｄａ単離物の迅速な検出および同定のための、臨床的に有用なＰＣＲに基づく方法を記載する。熱、界面活性剤、および機械的破壊を使用する単純な抽出方法を用いて、高価な酵素またはフェノール−クロロホルムの使用なしにＰＣＲを増幅するためのＣａｎｄｉｄａ  ＤＮＡを得た。単純で、迅速な、かつ感度のあるマイクロタイタープレートフォーマットおよび異なる放射波長を有する蛍光で標識されたプローブを使用して、３つまでのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．を同時に検出した。この方法は、蛍光プローブがＰＣＲ増幅の間に標的ＤＮＡにアニールするので、さらなるＰＣＲ後ハイブリダイゼーション工程を排除し、そして種同定までの時間を、従来の方法による平均３．５日から本発明者らの方法による５時間に減らした。
【００７６】
臨床サンプル
培養したＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ瓶（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｄｕｒｈａｍ，  Ｎ．Ｃ．）からの８１サンプルすべてを試験した。細菌血症または真菌血症に罹患していると疑われる患者由来の１０ミリリットルの血液をベッドサイドで収集し、そして各５ｍｌを直ちに好気性および嫌気性Ｂａｃ／Ａｌｅｒｔ瓶に接種した。接種した瓶をＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ装置中（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｄｕｒｈａｍ，  Ｎ．Ｃ．）で１分あたり６８サイクルの速度で連続的に振盪し、そして３５℃で５日間、すなわち瓶がＣＯ２の比色検出により陽性となるまで、インキュベートした。陽性の瓶からのアリコートをグラム染色し、そして継代培養した。グラム染色によりＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．を含むことが証明された瓶を選択し、２ｍｌのアリコートを取り出し、そして−３０℃で保存した。研究の期間の間に、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．が２４患者からの６１培養瓶から単離された。
【００７７】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．から単離された６１の瓶のうち、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ｂｌａｓｔｏｃｏｎｉｄｉａが２３瓶から単離され、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａが１８瓶から単離され、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓが６瓶から単離され、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉが６瓶から単離され、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓが５瓶から単離され、そしてＣ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの混合物が３瓶から単離された。凝集素陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（ｎ＝２）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．（ｎ＝２）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ（ｎ＝２）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＪＫ（ｎ＝１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、非ＪＫ（ｎ＝１）に起因するか、あるいはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．およびＳ．ａｕｒｅｕｓ（ｎ＝１）の混合物、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（ｎ＝１）の混合物に起因する、細菌血症に罹患した患者由来の１０の無作為に選択したサンプルもまた、陰性コントロールとして試験した。インキュベーションの間に陽性には決してならなかった臨床検体（ｎ＝１０）もまた、陰性コントロールとして試験した。
【００７８】
臨床サンプルに加えて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ株  Ｂ３１１を、２００μｌのウサギ全血あたり０、１０１、１０２、１０３、１０４、および１０５の出芽型分生子でスパイクした（ｓｐｉｋｅｄ）ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ瓶も試験した（ブロス対ウサギ血液比＝８：１）。
【００７９】
ＤＮＡの抽出
機械的破壊法を、使用した。２００マイクロリットルのサンプルを、滅菌１．５ｍｌ遠沈管中の８００μｌのＴＸＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ  ８．０，  １％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に添加し、そして室温で１０分間インキュベートした。溶解後、細胞残渣およびＣａｎｄｉｄａ出芽型分生子を、エッペンドルフ遠心分離器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｍｏｄｅｌ  ５４０３，  Ｇｅｒｍａｎｙ）において１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによりペレット化した。１ｍｌのＴＸＴＥ緩衝液での遠心分離による３回の洗浄後、ペレットを３００μｌのＴＸＴＥ緩衝液中に再懸濁し、そして２００μｌの０．５ｍｍジルコニウムビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，  ＯＫ）を含む２ｍｌのスクリューキャップコニカル底チューブへ移した。１５分間煮沸した後、混合物を機械的細胞破壊器（Ｍｉｎｉ−ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ，  Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）中で２０分間振盪させた。２０秒間の遠心分離後、上清を、ＰＣＲ増幅に使用するまで−２０℃で保存した。
【００８０】
精製ＤＮＡ
精製Ｃａｎｄｉｄａ  ＤＮＡ（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ，Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ，Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ，Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、およびＣ．ｋｒｕｓｅｉ  ＤＮＡを含む）（Ｆｕｊｉｔａら）を、各ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲのためのテンプレート標準として用いた。これらのＤＮＡならびに他のＣａｎｄｉｄａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ，  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ，  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ，  Ａ．ｆｌａｖｕｓ，  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉ，  Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ，  Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ，  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびヒト胎盤細胞株から精製されたＤＮＡを以前に記載される従来の手段（Ｆｕｊｉｔａら）により得た。使用したすべての微生物株は、Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ株およびＣ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ株、ＷＯ６９６以外は、以前に記載されている。これらの株は、ＣＤＣ菌類学委託研究室から得た。
【００８１】
蛍光プローブ設計および合成
プローブは、３つの利用可能な蛍光レポーター色素（ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）、またはＨＥＸ（ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）の１つを用いて５’末端で標識されるオリゴヌクレオチドからなった。プローブはまた、３’末端および３’−ブロッキングホスフェート付近のリンカーアーム改変ヌクレオチドに結合した消光色素であるＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）を含む。この研究で用いた６つのプローブを表１に列挙する：すべてのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．を検出するためのＡｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴ、およびそれぞれＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ，  Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ，  Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ，  Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＣ．ｋｒｕｓｅｉのＤＮＡを検出するためのＣＡ−ＦＡＭ、ＣＴ−ＴＥＴ，ＣＰ−ＨＥＸ，ＣＧ−ＦＡＭおよびＣＫ−ＴＥＴ。
【００８２】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ
プライマーＩＴＳ３およびＩＴＳ４（Ｆｕｊｉｔａら）ならびに以前に公表されたＰＣＲプロトコル（Ｆｕｊｉｔａら）の改変を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）蛍光標識プローブを用いてＰＣＲを実施した。Ｇ＋Ｃ成分に基づくと、ＣＡ、ＣＧ、ＣＰ、ＣＫ、およびＣＴプローブ（Ｆｕｊｉｔａら）の予測される融解温度（Ｔｍ）は、７０℃、７０℃、７０℃、７６℃、および７２℃であった。さらに、すべてのＣａｎｄｉｄａ種を検出するためのプローブを、ｒＤＮＡの５．８ｓ領域から設計した（Ａｌｌ−ＣＡＮプローブ、Ｔｍ＝８０℃）。他方、ＩＴＳ３およびＩＴＳ４プライマーのＴｍは、６２℃および５８℃であった。ＩＴＳプライマーを用いるＰＣＲ増幅が蛍光標識Ｃａｎｄｉｄａプローブの存在下で実施されるので、プローブを、Ｔｍがプライマー伸長を最適化し、そして１反応チューブ中で混合される場合に複数のプローブが同様の頻度で結合することを可能にするように再設計した。
【００８３】
プローブ混合物の３つのセットを設計した。第一に、ＣＡ−ＦＡＭ、ＣＴ−ＴＥＴ、およびＣＰ−ＨＥＸを、それぞれＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ，Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、およびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓを検出しそして同定するために同時にＰＣＲ混合物に添加した（ＰＣＲ「Ａ」）。第二に、プローブＣＧ−ＦＡＭおよびＣＫ−ＴＥＴを、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＣ．ｋｒｕｓｅｉ（生来のフルコナゾール耐性株）を検出しそして同定するためのＰＣＲ混合物に添加した（ＰＣＲ「Ｂ」）。第三に、Ａｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴプローブを使用してすべてのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．を検出した（ＰＣＲ「Ｃ」）。ＰＣＲを、１μｌサンプルで、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ  ８．３）、ＭｇＣｌ２（２．５〜５．０ＭＭ）、０．２ｍＭ（各）ｄＮＴＰ、各０．２μＭのプライマー、２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）および１、２、または３つの蛍光プローブ（１０〜５０ｎＭ最終濃度）を含む総量５０μｌの容積で実施した。組合せアニーリングおよび伸長温度を用いる二段階ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９６００サーモサイクラー（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡ）中で実施した。すべてのサイクルは、ＤＮＡ変性工程（９４℃で５分間）から始めた。この後、サイクルは、４０サイクルの、９５℃で３０秒間（変性）、および５８℃で９０秒間（アニーリングおよび伸長）からなった。使用した他のツーステップサイクルは、４５サイクルの、９５℃で３０秒間、５８℃で１分間からなった。７２℃で１０分間のプライマー伸長が最終サイクルに続いた。
【００８４】
ネガティブコントロール（テンプレートコントロールなし）を、テンプレートが非存在であること以外は同一の反応混合物を用いて、記載される増幅条件下で実施した。多重ＰＣＲのためのポジティブ標準は、検出される各Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．について、１ｎｇの精製ＤＮＡを使用した。
【００８５】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲの蛍光検出
ＰＣＲの後ただちに、または２４時間以内（サンプルは暗冷蔵庫に保存した）のいずれかで、４０μｌの各ＰＣＲ産物を、蛍光の検出のために設計された清潔な白色の９６ウェルマイクロタイトレーションプレート（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に移した。４０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を緩衝液ブランクとして使用した。プレートを、マイクロタイトレーションプレート読み取り付属品を用いてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ  ５０Ｂ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ上で読んだ。使用した励起波長は４８８ｎｍであった。各レポーター色素についての発光波長は、以下の通りであった：ＦＡＭ，５１８ｎｍ；ＴＥＴ，５３８ｎｍ；ＨＥＸ，５５６ｎｍ。消光色素（ＴＡＭＲＡ）についての発光波長は５８２ｎｍであった。励起スリット幅は４８８ｎｍであり、そして発光スリット幅は１０ｎｍであった。ＥＸＣＥＬ互換マクロを用いる蛍光データ管理システムを、データ分析に使用した。
【００８６】
データ分析および解釈
すべてのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．の検出のためのＡｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴプローブを用いるＰＣＲ
ＴａｑＭａｎ（登録商標）データワークシートおよびマクロを用いて、各サンプルについてのΔＲＱを自動的に計算した。ΔＲＱは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（ＲＱ＋）上の消光色素からの放出後のレポーター色素の発光強度比からインタクトなＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（ＲＱ−）上の消光レポーター色素の基底発光強度を引いた増分である。閾値ＲＱを計算して、３連の連プレートなしのコントロールサンプルから得られる標準偏差を用いて統計的に高い信頼性のレベル（９９％）を確実にする。本発明者らは、ポジティブ性についてのカットオフ値を、本研究で用いたすべてのネガティブコントロール（ｎ＝２０）についての平均のΔＲＱから３ＳＤを超える値に設定した。
【００８７】
２個または３個の蛍光プローブを同時に使用するＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ
本発明者らは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲの結果の解釈のために多成分データプログラムを使用した。多成分データプログラムは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）３Ａｌｌｅｌｅ−Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ＷｏｒｋｓｈｅｅｔまたはＷＰＲ（ウェルプレートリーダーソフトウェア）についての２レポーター多成分ワークシートのいずれかを使用した場合、「ＤＮＡなし」、テンプレート１（すなわち対立遺伝子１）、テンプレート２（対立遺伝子２）、またはテンプレート３（対立遺伝子３）として結果を示した。ＤＮＡなしの閾値を、ネガティブコントロールの平均（値＝１．００）を２ＳＤ超える値から自動的に計算した。本発明者らは、ＤＮＡなし値を、１から各ＤＮＡなし値を減ずることにより、「ＤＮＡ値」として標準化した。本発明者らは、ＤＮＡ値についてのカットオフ値を、コントロール値についての平均を１ＳＤ超えるもの、および各プローブについてのカットオフ値を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ反応におけるコントロール値についての平均を２ＳＤ超えるものとして、設定した。
【００８８】
品質コントロール
各反応を２連または３連で実施した。１ナノグラムのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｇｌａｂｒａｔａのＤＮＡを、各サンプルの実行についてのポジティブコントロールとして使用した。持ち越しを、アエロゾル耐性ピペットチップおよびＤＮＡサンプル調整およびＰＣＲ調製のための別の研究室区域を用いて除去した。
【００８９】
結果
ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲの最適化
ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲアッセイのために使用したプローブを、表１に示す。本発明者らは、ＭｇＣｌ２濃度、伸長時間、ＰＣＲサイクルの数、およびプローブ濃度の、ΔＲＱ値に対する効果を評価した。最適なマグネシウムイオン濃度を、９５℃で３０秒および５８℃で９０秒からなる４０サイクルを用いて、２．５ｎＭ〜５．０ｎＭの濃度を試験することによって決定した。３．５ｎＭのＭｇＣｌ２濃度を用いた場合、ΔＲＱは最も高かった（４．３７±０．３８，  ｎ＝４；  ３．３３〜５．１６の範囲）。このＭｇＣｌ２濃度の範囲は、（ＲＱ−）値（０．７１〜０．８４）を変化しなかった。
【００９０】
次いで、定常のＰＣＲ混合組成物を用いて、本発明者らは、ＰＣＲ伸長時間およびサイクル数の、ΔＲＱ値に対する効果を比較した。４５サイクルおよび１分の伸長時間（ΔＲＱ  ＝  ３．３３±０．４５，  ｎ＝２）を用いた場合、９０秒の伸長時間での４０サイクル（ΔＲＱ  ＝  ３．４６±０．１３，  ｎ＝２）と比較して、ΔＲＱ値における増加は得られなかった。従って、すべての実験は、４０サイクルおよび１分の伸長時間を用いた。  各プローブの濃度を、１０〜５０ｎＭの濃度を試験することによって最適化した。最適なプローブの濃度は、Ａｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴ、２５ｎＭ；  ＣＡ−ＦＡＭ，  ＣＴ−ＴＥＴ，  およびＣＧ−ＦＡＭ，  １０ｎＭであった。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓの同時検出ならびに同定のためのＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ（ＰＣＲ「Ａ」）において、そしてＣ．ｇｌａｂｒａｔｅおよびＣ．ｋｒｕｓｅｉの同時同定のためにＣＧ−ＦＡＭならびにＣＫ−ＴＥＴプローブを用いるＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ（ＰＣＲ「Ｂ」）において、１０ｎＭのプローブ濃度を用いた場合、ΔＲＱが最も高かった。従って、プローブを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲのために１０ｎＭ濃度にて使用した。
【００９１】
ＦＡＭで標識したプローブについてのΔＲＱ値は、一貫してより高く、次いでＴＥＴで標識したプローブについてのΔＲＱ値、次いでＨＥＸで標識したプローブについてのΔＲＱ値が高かった。ＣＫプローブの異なるバッチを、３つの蛍光標識のうちの１つで標識した場合、ＦＡＭ標識ＣＫプローブについての平均のΔＲＱは、１．３４±０．０４  （ｎ＝３）であり、一方ＴＥＴ標識ＣＫプローブについての平均のΔＲＱは、０．６１±０．２７  （ｎ＝６）であり、そしてＨＥＸ標識ＣＫプローブについての平均のΔＲＱは０．３０±０．０１  （ｎ＝３）であった。
【００９２】
臨床的サンプルについてのＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲアッセイの感度および特異性
カンジダ血症を有する患者由来の６１の臨床的サンプルのうち、５８のサンプルは、単一のＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．を含むことが証明された（表２）。相同のｓｐｐ．に対するＡｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴプローブを用いた平均ΔＲＱ値は、以下の通りであった：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ，  ３．４２±０．６７  （範囲＝１．１５〜４．５８）；Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ，  １．９２±１．３４  （範囲＝０．４５〜３．４８）；Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ，  １．７８±１．４８  （範囲＝０．８０〜４．２２）；Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ，  ２．８１±１．２４  （範囲＝０．５３〜４．６６）；およびＣ．ｋｒｕｓｅｉ，  ３．３８±０．９２  （範囲＝１．８７〜４．４０）（表３）。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの両方の混合培養物として同定された３つのサンプルを用いたＡｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴについてのΔＲＱ値は、それぞれ４．１４、３．４６、および３．５８であった。
【００９３】
相同種に対するＣａｎｄｉｄａ種特異的プローブについての平均のΔＲＱ値は以下の通りであった：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ単離物についてのＣＡ−ＦＡＭ，  ０．９５±０．６２  （ｎ＝２３）；Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ単離物についてのＣＴ−ＴＥＴ，  ０．４８±０．３８  （ｎ＝６）；Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ単離物についてのＣＰ−ＨＥＸ，  ０．３７±０．１２  （ｎ＝５）；Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ単離物についてのＣＧ−ＦＡＭ，  ０．６３±０．３９  （ｎ＝１８）；およびＣ．ｋｒｕｓｅｉ単離物についてのＣＫ−ＴＥＴ，  ０．７３±０．３３  （ｎ＝６）（表３）。ＤＮＡ値が０．１６以上であり（１ＳＤ）、ΔＲＱがＣＡ−ＦＡＭプローブについて０．７以上（２ＳＤ）、ＣＴ−ＴＥＴプローブについて０．１３以上（２ＳＤ）、そしてＣＰ−ＨＥＸプローブについて０．１９以上（２ＳＤ）である場合、ＰＣＲ「Ａ」アッセイによって試験した検体は陽性であると考えられた。従って、ＰＣＲ「Ａ」アッセイの感度および特異性は、それぞれ９１．９％（３４／３７）、および１００％（４４／４４）であった。
【００９４】
ＤＮＡ値が０．１５以上であり（１ＳＤ）、ΔＲＱがＣＡ−ＦＡＭプローブについて０．０４以上（２ＳＤ）であり、そしてＣＫ−ＴＥＴプローブについて０．０８以上（２ＳＤ）である場合、ＰＣＲ「Ｂ」アッセイによって試験した検体は陽性であると考えられた。従って、ＰＣＲ「Ｂ」アッセイ（フルコナゾール耐性Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．を検出するため）の感度および特異性は、それぞれ９６．３％（２６／２７）、および１００％（５４／５４）であった。
【００９５】
ΔＲＱが０．２５以上（３ＳＤ）である場合、ＰＣＲ「Ｃ」アッセイによって試験した検体は陽性であると考えられた。従って、ＰＣＲ「Ｃ」アッセイ（すべてのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．を検出するため）の感度および特異性は、それぞれ１００％（６１／６１）、および１００％（２０／２０）であった（表３）。
【００９６】
蛍光プローブを用いるＰＣＲによるＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．の検出および同定
カンジダ血症を有する２４人の患者の６１の血液培養物由来のＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．のＰＣＲ−ＥＩＡ同定（Ｆｕｊｉｔａら）を、以下のように同定した：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  （ｎ＝２３）、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ  （ｎ＝１８）、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ  （ｎ＝５）、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  （ｎ＝６）、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ  （ｎ＝６）、ならびにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｇｌａｂｒａｔａに起因する混合したカンジダ血症（ｎ＝３）。Ａｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴプローブを用いるＰＣＲ「Ｃ」アッセイは、６１のすべてのサンプル中のすべてのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐを検出した。ＰＣＲ「Ａ」および「Ｂ」アッセイ結果は、単一のＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．を含むと報告された５８個のサンプルのうちの５５個（２３個のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、１７個のＣ．ｇｌａｂｒａｔａ、４個のＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、５個のＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、および６個のＣ．ｋｒｕｓｅｉ）についてのＰＣＲ−ＥＩＡに関するこれらのアッセイ結果と適合した。慣習的なＰＣＲによって、およびＰＣＲ−ＥＩＡによって、混合カンジダ血症検体として同定された３つのサンプルのうちの２つはまた、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの両方を含むとして同定されたが、１つの混合カンジダ血症は、ＰＣＲ「Ａ」および「Ｂ」アッセイによってＣ．ｇｌａｂｒａｔａのみとして同定された（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは検出されなかった）（表２）。
【００９７】
５つのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ陽性ボトルは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．  （ｎ＝４）および凝固酵素（ｃｏａｇｕｌａｓｅ）陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  （ｎ＝１）を含む細菌とのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの共存を示した。すべてを、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを含むとして正確に同定した。菌血症を有する患者由来のランダムに選択したサンプルは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲによって全て陰性であった（表３）。
【００９８】
従って、Ａｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴプローブを用いるＰＣＲは、すべてのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．（１００％）を検出し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲアッセイ「Ａ」および「Ｂ」は、６１の臨床的血液培養物のうちの５７（９３．４％）中のすべてのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．を迅速かつ正確に同定した（表２）。
【００９９】
Ａｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴプローブの感度および特異性
Ａｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴプローブは、すべてのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ａ．  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、およびＡ．  ｆｌａｖｕｓを検出したが、試験した他の真菌ＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、またはヒトＤＮＡは検出されなかった（表４）。精製したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．，  ＤＮＡをＡｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴプローブで検出したが、使用された機械的サンプル調製法は、インタクトな細胞からＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ＤＮＡを放出しなかった。従って、異なるサンプル調製方法が、臨床的サンプルからＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ＤＮＡを得るために使用される必要があり、そしてＣａｎｄｉｄａおよびＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＤＮＡのみが、本明細書中で記載されるように処理された臨床的物質において検出されることが期待される。
【０１００】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ感度
本発明者らは、ウサギ血液を播種したＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ培養ボトル中に懸濁したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ｂｌａｓｔｏｃｏｎｉｄｉａを用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲ結果を、本発明者ら（Ｆｕｊｉｔａら）の実験室において開発したＰＣＲ−ＥＩＡ法からの結果と比較した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  Ｂ３１１  ｂｌａｓｔｏｃｏｎｉｄｉａ株を、ウサギの全血を含む２００μｌのＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ血液培養ブロス（ブロス対ウサギ＝８：１）当たり０、１０１、１０２、１０３、１０４、または１０５の濃度にて導入した。
【０１０１】
３つの実験における各２００μｌのサンプルのためのＡｌｌ−ＣＡＮ−ＴＥＴプローブについての平均のΔＲＱ値は、１０５細胞について３．１０±０．４５、１０４細胞について２．７５±０．１８、１０３細胞について０．６９±０．１２、および１０２細胞について０．３４±０．０７であった（表５）。従って、ＥＩＡによる検出の感度は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ｂｌａｓｔｏｃｏｎｉｄｉｄａを含まないコントロールサンプルと比較して、２００μｌのサンプル当たり１０２細胞、または２μｌのサンプル当たり１細胞であった（Ｐ＜０．０１）。これは、ＰＣＲ−ＥＩＡ法の検出限界に等しかった。ＥｔＢｒ染色による検出限界は、いずれの方法よりも１０倍低かった（２０μｌのサンプル当たり１０３細胞）。
【０１０２】
ＣＡ−ＦＡＭ、ＣＴ−ＴＥＴ、およびＣＰ−ＨＥＸを用いるＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲについての検出限界は、２００μｌのサンプル当たり１０３細胞、または２μｌのサンプル当たり１０細胞であった。これは、ＰＣＲ−ＥＩＡ法より１０倍低い感度、アガロースゲルのＥｔＢｒ染色による検出に等しい感度を示した（表５）。
【０１０３】
【表１】
2010075203.tif 000003
【０１０４】
【表２】
2010075203.tif 000004
【０１０５】
【表３】
2010075203.tif 000005
【０１０６】
【表４】
2010075203.tif 000006
【０１０７】
【表５】
2010075203.tif 000007
本出願を通じて、種々の刊行物が括弧内に参照される。これらの刊行物の十分な引用は、本明細書の終わりの配列表の直前に見出され得る。本発明が関係する当該分野の状況をより十分に記載するために、これらの刊行物の開示の全体が、本明細書中に参考として援用される。
【０１０８】
【表６】
2010075203.tif 000008
【０１０９】
【表７】
2010075203.tif 000009
【０１１０】
【表８】
2010075203.tif 000010
【０１１１】
【表９】
2010075203.tif 000011
（配列表）
【０１１２】
【表１０】
2010075203.tif 000012
【０１１３】
【表１１】
2010075203.tif 000013
【０１１４】
【表１２】
2010075203.tif 000014
【０１１５】
【表１３】
2010075203.tif 000015