(57)【要約】【課題】１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造方法を提供すること。【解決手段】１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースにアラビノースデヒドロゲナーゼを作用させて１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースにアラビノースデヒドロゲナーゼを作用させることを特徴とする１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造方法。
【請求項２】
上記作用を、Ｌ−キシロース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−アラビノースおよびＬ−フコースよりなる群より選ばれる糖の存在下に行う請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素を用いた１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール(以下１，５−ＡＧ)は、グルコースの１位の水酸基が還元された構造をもつポリオールであり、多くの動植物により生合成されることから、食品中にも広く分布している物質である。１，５−ＡＧは動物体内で代謝的に安定であり経口摂取された１，５−ＡＧで４８時間までに二酸化炭素として呼気中に排出される量は全体の１％以下であり（非特許文献１参照）、低カロリーあるいはノンカロリー甘味料としての利用も期待できる。また産業上では、研究試薬や臨床検査試薬として利用されている。
１，５−ＡＧの調製法としてはβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートから化学的に合成する方法（非特許文献２参照）が報告されている。その合成法はβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートをエーテルに溶解後、臭化水素により臭素化し、水素化アルミニウムリチウムにより脱アセチル化することにより行われる。
【０００３】
その他の調製法としてプロテア種の葉から１，５−ＡＧをエタノール、ヘキサン等の有機溶媒で抽出後、精製、晶析して調製する方法も報告されている（非特許文献３参照）。これらの化学合成法や植物からの抽出法は、プロセスが多段的で煩雑であり、さらにエーテルやヘキサン等の有機溶媒を用いるため、得られた１，５−ＡＧを食品とするには、それらを分離、処理する必要がある。更には安全性の点からも疑問が残る。
これらの問題点を解決する手段として、製造プロセスが簡略で、かつエーテル等の有機溶媒を用いない製造法が求められる。
１，５−ＡＧは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）により生合成されること（非特許文献１参照）が報告されている。しかし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）では、１，５−ＡＧはその大腸菌の培養時に培地中に分泌されるが、その生成量は培地１リットルあたりに数マイクログラム程度であり工業生産方法としては応用できるものではない。
【０００４】
その他パラディウム触媒存在下で１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース(以下１，５−ＡＦ)に水素を添加する１，５−ＡＧの調製法が報告されているが(非特許文献４参照)、１，５−ＡＧのみならずその他の反応生成物が生じ、１，５−ＡＧの生成量は反応生成物の２０％程度であり効率的に合成できない。
１，５−ＡＧの原料となり得る１，５−ＡＦは澱粉などのα−１、４−グルカンをα−１、４−グルカンリアーゼで分解することによって調製できる糖質であり、近年、その生産技術が提案された（特許文献１参照）。１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに効率よく変換する方法の開発が望まれているが、近年、１，５−ＡＧの工業的な生産方法として１，５−ＡＦを微生物に接触させて製造する方法が提案されている(特許文献２参照)。この方法では外因性の１，５−ＡＦが微生物によって１，５−ＡＧに変換される。この変換をし得る微生物として酵母が挙げられている。
【０００５】
一方で１，５−ＡＦを酵素反応により還元し１，５−ＡＧを製造する方法も考えられる。
１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに還元する酵素としては豚の肝臓(非特許文献５参照)やマウス（非特許文献６参照）由来の１，５−アンヒドロフルクトースデヒドロゲナーゼが報告されている。しかしながらこの酵素については大量調製などの検討はなされておらず、工業的に該酵素を使用することは困難である。
また１，５−ＡＦを還元する酵素としては微生物由来の還元酵素が報告されているが、反応生成物は１，５−アンヒドロマンニトールであり、１，５−ＡＧ生産には用いることができない(非特許文献７参照)。
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼは、Ｄ−アラビノースに作用してＤ−アラビノ−１，５−ラクトンに酸化すると共に、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(以下ＮＡＤＰ+)を還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸(以下ＮＡＤＰＨ)に還元する。この酵素については全アミノ酸配列がすでに報告されている(非特許文献８参照)。
【非特許文献１】生化学、第69巻、第12号、pp1361−1372（1997）
【非特許文献２】J.Am.Chem.Soc.72，4547−4553（1954）
【非特許文献３】Phytochemistry Vol.22,No9,1959−1960 (1983)
【非特許文献４】Carbohydrate Research 337 (2002) 873−890
【非特許文献５】J.Biochem.123,189−193(1998)
【非特許文献６】Biosci.Biotechnol.Biochem,72(3),872−876,2008
【非特許文献７】Applied and Environmental Microbiology,Feb.2006,p.1248−1257
【非特許文献８】Biochemica et Biophysica Acta 1429 (1998) 29-39
【非特許文献９】Biochim.Biophys.Acta1297,1-8（1996）
【非特許文献１０】The Journal of Biological Chemistry Vol.240 No.11,November 1965
【非特許文献１１】Eur.J.Biochem.127,391-396 (1982)
【特許文献１】特開２００５−１６８４５４号公報
【特許文献２】特開２００８−５４５３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は１，５−ＡＦを出発物質とし酵素を用いて１，５−ＡＧを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する各種微生物の酵素を探索した結果、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼがＮＡＤＰＨの存在下で１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換することを見出し本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、１，５−ＡＦを原料としてＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼを作用させることにより、酵素法で、簡便に、効率的に１，５−ＡＧを大量に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼはこれまでにカンディダ属（非特許文献９参照）、シュードモナス属(非特許文献１０参照)と酵母由来の酵素が報告されており、酵母由来の酵素のアミノ酸配列は図１の配列１に示すとおりである。
ここで示すアミノ酸は一文字略式を使用しており、略式は表１のとおりである。本発明に用いるＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼは配列１とのアミノ酸配列の相同性が６０％以上で且つ１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに還元する作用を有するものであれば良いが、好ましくは配列１との相同性が７０%以上で且つ１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに還元する作用を有するもの、より好ましくは配列１と相同性が８０％以上で且つ１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに還元する作用を有するものが良い。
【００１０】
【表１】
2010104239.tif 000002
【００１１】
以下に酵母由来のアラビノースデヒドロゲナーゼについて述べる。
酵母由来のＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼは、次のような還元反応を行う。
【００１２】
・  作用
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼは、次式に示すように１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに還元すると共にＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋に酸化する。
１，５−ＡＦ  ＋  ＮＡＤＰＨ  ＋  Ｈ＋  →  １，５−ＡＧ  ＋  ＮＡＤＰ＋
【００１３】
（２）酵素還元活性
本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの還元活性測定方法及び酵素活性値の表示方法は以下の通りである。
０．５Ｍビス−トリス緩衝液(ｐＨ６．５)、２５０ｍＭの１，５−ＡＦ溶液および５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を０．２ｍｌずつ混合し、蒸留水で１．８ｍｌに定容して基質とする。この基質溶液を３０℃の湯浴中で５分間保温した後に０．２ｍｌの酵素溶液を添加して反応を開始する。３０℃で２０分間反応させた後、分光光度計を用いた光路長１ｃｍのセルにて３７５ｎｍの吸光度を測定する。１分間当たりに減少した吸光度の値（Ａ）から、消費されたＮＡＤＰＨ量を下記の換算式に基づいて求めた。酵素の活性は１分間あたりに１μｍｏｌのＮＡＤＰＨを消費する酵素量を１ユニットとした（図２）。
【００１４】
【数１】
2010104239.tif 000003
【００１５】
（３）基質特異性
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの基質特異性を調べるために、基質濃度２５ｍＭの単糖類に対するＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの還元活性を求めた。その結果を、１，５−ＡＦに対する還元作用を１００とした相対活性として表２に示す。この結果からも明らかなように本酵素は１，５−ＡＦ以外の単糖類には、殆ど還元活性を示さなかった。
【００１６】
【表２】
2010104239.tif 000004
【００１７】
また、本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼは補酵素としてＮＡＤＰＨを要求し、ＮＡＤＨには殆ど作用を示さなかった。
（４）Ｋｍ値
ラインウイバー・バーク(ＬＩＮＥＷＥＡＶＥＲ・Ｂｕｒｋ)プロットにより、本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの１，５−ＡＦに対する還元反応のＫｍ値を求めたところ１．１７ｍＭであった（図３）。
【００１８】
（５）還元作用の至適ｐＨは、６．５〜７．５付近であった（図４）。
【００１９】
（６）至適温度は、３５〜４０度付近であった（図５）。
次に本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼは、次のような酸化反応を触媒する。
【００２０】
（１）作用
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼは、次式に示すようにＤ−アラビノースをＤ−アラビノ−１，５−ラクトンに酸化すると共にＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨに還元する。
【００２１】
Ｄ−アラビノース＋ＮＡＤＰ＋→Ｄ−アラビノ−１，５−ラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋
（２）本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの酸化活性測定方法及び酵素活性値の表示方法は以下の通りである。
０．２ｍｌの０．５Ｍトリス緩衝液(ｐＨ９．０)、０．２ｍｌの１ＭのＤ−アラビノース溶液および０．２ｍｌの５ｍＭのＮＡＤＰ＋溶液を混合し、蒸留水で１．８ｍｌに定容して基質とする。この基質溶液を３０℃の湯浴で５分間保温した後に、０．２ｍｌの酵素液を加えて混合して反応を開始する。３０℃で２０分間反応させた後、分光光度計を用いた光路長１ｃｍのセルにて３４０ｎｍの吸光度を測定する。１分間当たりに増加した吸光度の値（Ａ）から、生成するＮＡＤＰＨ量を下記の換算式に基づいて求めた。酵素の活性は、１分間あたりに１μｍｏｌのＮＡＤＰＨが生成する酵素量を１ユニットとした（図６）。
【００２２】
【数２】
2010104239.tif 000005
【００２３】
（３）基質特異性
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの基質特異性を調べるために、基質濃度１００ｍＭにおける各単糖類に対するＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの酸化作用を求めた。最も活性の高かったＬ−キシロースに対する酸化作用を１００とした相対活性で表すと表３になる。Ｄ−アラビノース以外にもＬ−キシロース、Ｌ−ガラクトースおよびＬ−フコースに高い活性を示めす。
また、該酵素のＫｍ値が先の報告で求められているが、(非特許文献８参照)Ｄ−アラビノース:１６１ｍＭ、Ｌ−キシロース:２４ｍＭ、Ｌ−フコース:９８ｍＭ、Ｌ−ガラクトース:１８０ｍＭと同様な結果である。
【００２４】
【表３】
2010104239.tif 000006
【００２５】
（４）還元作用の至適ｐＨは８．０〜９．０付近にある（図７）。
【００２６】
（５）１，５−ＡＧから１，５−ＡＦへの酸化反応
表３に示すように該酵素は１，５−ＡＧから１，５−ＡＦへの酸化反応を触媒しない。
【００２７】
これまで報告されている１，５−アンヒドロフルクトースレダクターゼによる（非特許文献５参照）１，５−ＡＦから１，５−ＡＧへの変換は、水素供与体であるＮＡＤＰＨから水素が受け渡され、ＮＡＤＰ＋となる。１，５−ＡＧ製造量は、ＮＡＤＰＨの供給量に依存することから、１，５−ＡＧと等モル量以上のＮＡＤＰＨを必要とした。ＮＡＤＰＨは非常に高価であるため、１，５−ＡＧ生産においてはこのＮＡＤＰＨの供給が問題となる。
この問題点を解消するひとつの手段として反応系内に蓄積したＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨへ再生することが考えられる。ＮＡＤＰＨの再生方法としては、ＮＡＤＰ＋要求性の他の酸化酵素を共役させた反応系で行うのが一般的である。
【００２８】
しかし、本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼは１，５−ＡＦの還元と上記したＬ−キシロースなどの還元糖の酸化の二つの反応を同時に触媒する。したがって該酵素を用いて、酸化還元の両反応を組み合わせることで図８に示す反応を行うことができる。
また、Ｄ−アラビノースを用いた場合、Ｄ−アラビノ−１，５−ラクトンは、酸化酵素（Ｄ−アラビノラクトンオキシダーゼ）の作用により、エリスロアスコルビン酸に(非特許文献８参照)、Ｌ−ガラクトースを用いた場合には、酸化酵素(Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ）の作用でアスコルビン酸に（非特許文献１１参照）変換することができる。
従って、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼのみを用いた共役反応系を用いて１，５−ＡＧの製造量を上げつつ、更にアスコルビン酸などの有用物質の製造を行うこともできる。
【００２９】
次に本発明で用いたＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼの製造法について説明する。
サッカロマイセス・セレビジエ（酵母） 培養のための１，５−ＡＦを含む培養液は、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて有機栄養源を含む培地を用いることができる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、その他が適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等を含有する酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物などが適宜使用される。無機イオンの供給には、マグネシウム塩、リン酸塩、カルシウム塩などが適宜使用される。その培地に、別にフィルター滅菌した１，５−ＡＦ水溶液を添加して培養液とした。
培養条件は特別な制限もないが、例えば好気条件下でｐＨ３〜７及び温度２０〜４０℃の範囲で行い、適当なｐＨと温度を保ちながら２〜７日程度培養を行う。
【００３０】
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの分離精製は、次のようにして行うことができる。本酵素は菌体内に存在するので、培養液を遠心分離、あるいはろ過などの方法で菌体だけを回収することが好ましい。該酵素を菌体から抽出する方法としては、ザイモリエイス等の酵素による細胞壁破砕、界面活性剤を用いた菌体膜の化学的溶解、ガラスビーズや超音波を用いた物理的破砕などの方法があげられる。これらの中から適当な方法を選択、あるいは適宜組み合わせて菌体から酵素を抽出できる。
これらの方法で抽出された粗酵素液からＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼを更に精製する必要がある場合には、通常実施されている一般的な酵素の精製手段である硫酸アンモニウム沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、疎水結合クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせるか、あるいは繰り返すことによって精製を行うことができる。
【００３１】
本発明で用いた酵素源となる微生物の代わりに、例えば紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等により創生した変異株、細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝学的手法により誘導される遺伝子組み換え株など、または他の細菌を形質転換したもので１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換し得るＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物を利用することができる。また、遺伝子操作技術により配列１に示すアラビノースデヒドロゲナーゼのアミノ酸の１０％までを置換、欠損、付加した酵素も利用できる。さらにこれらの酵素を他のホスト生物、例えばカビ、酵母、大腸菌などで酵素を産生させた酵素も含む。
【００３２】
Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼを用いた１，５−ＡＧの製法について説明する。
試料中の１，５−ＡＦは、ＮＡＤＰＨ存在下、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの作用により、１，５−ＡＧとＮＡＤＰ＋が生成する。酵素添加量は、１，５−ＡＦ濃度にもよるが、好ましくは１ｍｌあたり０．０１〜０．５ユニットで反応を行う。反応のｐＨは、好ましくは４．０〜１０．０、より好ましくは５．０〜９．０、さらに好ましくは６．０〜８．０である。反応温度は、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは２５〜４５℃、さらに好ましくは３０〜４０℃である。１，５−ＡＧ生成量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）あるいは高性能陰イオン交換クロマトグラフィーとパルスドアンペロメトリ検出器（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）で測定することができる。ＨＰＬＣ測定及びＨＰＡＥ−ＰＡＤ測定の詳細条件は以下に示す。
【００３３】
ＨＰＬＣ測定:分離カラム:ＳｈｏｄｅｘＳＰ８１０−ＭＣＩＧＥＬＣＫ０８Ｓ連結  （昭和電工（株）製、三菱化学（株）製）、移動相：蒸留水、流速:１．０ｍＬ／分、カラム温度:４０℃、検出器:示差屈折率検出器、サンプル供与量:２０μＬの条件で測定を実施した。
ＨＰＡＥ−ＰＡＤ測定:分離カラム:Ｃａｒｂｏｐａｃｋ  ＭＡ１ （Ｄｉｏｎｅｘ社製）、移動相:０．５Ｍ  ＮａＯＨ、流速:０．４ｍｌ／分、カラム温度:３５℃、検出器:パルスドアンペロメトリ検出器（Ｄｉｏｎｅｘ社製）、サンプル供与量:２５μＬの条件で測定した。
生成した１，５−ＡＧを含む反応溶液を通常実施される手段で反応液より分離、精製する。具体的には、活性炭で脱色、イオン交換樹脂で脱塩し、シロップ状とする。次いでイオン交換や吸着、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離などの操作を適宜組み合わせて１，５−ＡＧを分離し、濃縮後、結晶化することもできる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以後の説明中に用いる％は、特に断りがない限り容量（ｗ/ｖ）％である。
【００３５】
実施例１
＜酵母培養・菌体破砕＞
グルコース２．０％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス２．０％、ｐＨ６．０の培地を坂口フラスコに１００ｍＬずつ分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。
上記培地に、斜面培地（グルコース２．０％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス２．０％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．０）で培養したサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を１白金耳採取し、３０℃、３日間振とう培養した。これを種培養液とした。上記と同じ組成を有する液体培地５Ｌを容量１０Ｌのミニジャーファーメンターに入れ、孔径０．４５μＭのフィルターを通し除菌した１，５−ＡＦ水溶液を最終濃度１．０％となるように添加した。その１，５−ＡＦを含む培地に、前記種培養液５０ｍＬを加え、攪拌速度２５０ｒｐｍ、通気量４Ｌ／分、３０℃で４８時間培養した。
培養液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分）して菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水に懸濁して再度遠心分離後（４，０００×ｇ、１０分）洗浄し、湿重量１００ｇの菌体を得た。
【００３６】
２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに先に得た菌体を懸濁し、最終濃度１０ｍＭになるようにジチオスレイトールを加えて３０℃、２０分間、振とう器（１５０ｒｐｍ）で振とうし還元処理した。その後、遠心分離（４，０００×ｇ、１０分）で集菌した。２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）２５０ｍｌに懸濁してＹ−ＰＥＲ−Ｐｌｕｓ（登録商標）試薬２５０ｍｌ、最終濃度１０ｍＭになるようにフェニルメチルスルフォニルオライド（ＰＭＳＦ）を加えた。３０℃、２０分間、振とう器（１５０ｒｐｍ）で振とうして菌体から酵素を抽出した。遠心分離（２４，０００×ｇ、１５分）で分離した上澄み液を２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析しＹ−ＰＥＲ−Ｐｌｕｓ（登録商標）試薬を除去した。この溶液を粗抽出液とした。この際、１，５−ＡＦ還元酵素の総活性は２９４．０ユニットであり、比活性は０．０８ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
【００３７】
＜硫安分画＞
粗抽出液に、硫酸アンモニウムを３０％となるように添加して、４℃、１時間冷却し、遠心分離（２４，０００×ｇ、１５分）で分離した上澄み液を回収した。次にその上澄み液に硫酸アンモニウムを８０％となるように添加し４℃、１時間冷却し、遠心分離（２４，０００×ｇ、１５分）して沈殿物を回収した。その沈殿画分を２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに懸濁して透析膜に入れ、２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）中で透析し硫酸アンモニウムを除去した。遠心分離（２４，０００×ｇ、１５分）し、上澄み液を回収した。その時の１，５−ＡＦ還元酵素の総活性は２２４．０ユニットであり、比活性は０．１３ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
【００３８】
＜弱塩基性陰イオン交換−クロマトグラフィー＞
この上澄み液をあらかじめ２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したトヨパールＤＥＡＥ−６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨ社製）を充填したカラム（φ２．２×３０ｃｍ）に通した。同緩衝液で非吸着タンパク質を洗浄後、０．５Ｍ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）の直線濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させ、１，５−ＡＦ還元活性画分を回収した。活性画分の総活性は７９．９ユニットであり、比活性は０．８ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
【００３９】
＜アフィニティークロマトグラフィー＞
この活性画分を一晩２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し塩化ナトリウムを除去し、あらかじめ２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したトヨパール−ＡＦ−ｒｅｄ−６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨ社製）を充填したカラム（φ３．０×１０ｃｍ）に通した。同緩衝液で非吸着タンパク質を洗浄後１．５Ｍ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）の直線濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させ活性画分を回収した。活性画分の総活性は６９．７ユニットであり、比活性は１６．３ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
【００４０】
＜疎水性クロマトグラフィー＞
この活性画分に硫酸アンモニウムを３０％となるように添加したサンプルをあらかじめ硫酸アンモニウム３０％を含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴｓｋ−ＧＥＬ  ＰＨＥＮＹＬ−５ＰＷ  （ＴＯＳＯＨ社製  ７．５ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×７．５ｃｍ）に通した。硫酸アンモニウム３０％を含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で非吸着タンパク質を洗浄後、硫酸アンモニウム濃度が３０％から０％となるように直線濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させ活性画分を回収した。活性画分の総活性は７．８ユニットであり、比活性は１７．７ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
【００４１】
＜強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー＞
この活性画分を限外ろ過膜で脱塩・濃縮後、２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑ（４．６ｍｍ×１０ｃｍ）に通した。硫酸アンモニウム３０％を含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で非吸着タンパク質を溶出後、硫酸アンモニウム濃度が３０％から０％となるように直線濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させ活性画分を回収し精製酵素を得た。精製酵素の総活性は３．８ユニットであり、比活性は２４．４ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
【００４２】
＜物性評価、ゲルろ過クロマトグラフィー＞
精製酵素を、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴｓｋ−ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷ（７．５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ）に供試したところ、単一ピークとして検出され高純度に精製されたことがわかった。標準蛋白質として分子量１３，７００：リボヌクレアーゼＡ、分子量２５，０００：キモトリプシノーゲンＡ、分子量４３，０００：オブアルブミン、分子量６８，０００：アルブミン、分子量１５８，０００：アルドラーゼを用い、それらの移動度から本酵素の分子量を推測した結果、およそ７５，０００〜８０，０００程度であった（図９）。
【００４３】
＜物性評価、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動＞
精製酵素の分子量をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調べた結果、分子量３８，０００と分子量３７，０００の２つのバンドが確認された。このことから、この酵素が２量体であることがわかった（図１０）。
【００４４】
＜内部部分アミノ酸配列解析、逆相クロマトグラフィー＞
精製酵素を、０．１％トリフルオロ酢酸溶媒で平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社  ２．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ）に供試し、０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル溶媒の直線濃度勾配で溶出させ２量体を分離し、分子量３８，０００のサブユニット画分を得た。回収した画分を減圧乾燥器でアセトニトリル溶媒を除きアミノ酸配列決定用の試料とした。
【００４５】
１．ＴＣＡ沈殿
先の分取サンプル（タンパク量５０ｕｇ相当）にトリクロロ酢酸を最終濃度１０％となるように添加し、４℃で１０分間冷却した。遠心分離（１８，０００×ｇ、１５分）して沈殿を回収した。それにアセトンを加えて超音波洗浄器上で沈殿物を分散させ、トリクロロ酢酸を除去した。それを遠心分離（１８，０００×ｇ、１５分）し上澄みを除き沈殿を減圧乾燥器で乾燥させた。
【００４６】
２．還元アルキル化
ＴＣＡで濃縮した試料を、６Ｍ塩酸グアニジンを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で溶解し、タンパク質のジスルフィド結合を切断するため、還元剤であるジチオスレイトールを添加し、窒素置換を行い３０分間常温で保持した。システイン残基の再結合を抑えるため、ヨードアセトアミドを添加し、暗所で１時間保持して還元化された試料を得た。
【００４７】
３．メタノール・クロロホルムによる試料の濃縮及び脱塩
還元した試料をメタノール：クロロホルム：蒸留水=４：１：３混合液で攪拌して１０,０００×ｇで３分間遠心分離した。水相と有機溶媒相の間にタンパク質が得られ、水相を吸引器で除去した。その後、メタノールを添加して、１８，０００×ｇで１５分間遠心分離して上澄みを除き、沈殿を回収した。減圧乾燥を行い、プロテアーゼ消化用試料とした。
【００４８】
４．リジルエンドペプチダーゼ消化
先の脱塩・濃縮サンプルを6M尿素でよく溶解させ、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加えて攪拌した。サンプルタンパク重量の１／５０（Ｗ／Ｗ）となるようにリジルエンドペプチダーゼを添加した。３７℃で１６時間反応させ、ギ酸を添加し酵素反応を止めた。
【００４９】
５．逆相ＨＰＬＣによるペプチドマッピング
先のリジルエンドペプチダーゼで消化した試料を、０．１％トリフルオロ酢酸溶媒で平衡化したＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅＣ１８カラム（ＹＭＣ社  ２．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ）に供試し、０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル溶媒の直線濃度勾配で吸ペプチド断片を溶出した。紫外部吸収検出器の波長２１５ｎｍで検出した結果、およそ２０個のペプチド断片を得た。
【００５０】
６．アミノ酸配列解析
先に得たペプチド断片を、自動アミノ酸配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９Ｘ−ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ）で解析し５つの断片のアミノ酸配列情報を得た（図１１）。
この部分アミノ酸配列情報をもとに、ＦＡＳＴＡによるデータベース比較を行った結果、このペプチド断片は、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの内部アミノ酸配列と完全に一致した。先のゲルろ過による分子量とＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動、部分アミノ酸配列情報から、１，５−ＡＦを１，５−ＡＧへ変換する酵素が、Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼであると同定した（図１１）。また、このアラビノースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をこれまで報告されている２種の１，５−ＡＦに作用する還元酵素のそれと比較した。その結果、豚肝臓由来の１，５−ＡＦ還元酵素（非特許文献５）との相同性は３０．８％、微生物由来の１，５−ＡＦ還元酵素(非特許文献７)との相同性は１０．８％であった。
【００５１】
至適ｐＨ（還元活性）
０．５Ｍの各種緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５：酢酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．５：ビス−トリス緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０：トリス緩衝液、ｐＨ９．０〜ｐＨ１０．０：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液）を０．２ｍｌ、２５０ｍＭの１，５−ＡＦ溶液を０．２ｍｌ、５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を０．２ｍｌ、蒸留水で１．８ｍｌとする。３０℃で５分間保った後に、適当に希釈した酵素液を０．２ｍｌ加えて混合して反応を開始する。３０℃で２０分間保温後、３７５ｎｍの波長を測定する。吸光度の減少量から、還元酵素活性を求めた。最高の酵素活性を１００（％）とした。
【００５２】
至適ｐＨ（酸化活性）
０．５Ｍの各種緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５：酢酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．５：ビス−トリス緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０：トリス緩衝液、ｐＨ９．０〜ｐＨ１０．０：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液）を０．２ｍｌ、１ＭのＤ−アラビノース溶液を０．２ｍｌ、５ｍＭのＮＡＤＰ＋溶液を０．２ｍｌ、蒸留水で１．８ｍｌとする。３０℃で５分間保った後に、適当に希釈した酵素液を０．２ｍｌ加えて混合して反応を開始する。３０℃で２０分間保温後、３４０ｎｍの波長を測定する。吸光度の増加量から、酸化酵素活性を求めた。最高の酵素活性を１００（％）とした相対活性を算出した。
【００５３】
至適温度
０．５Ｍビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．５）を０．２ｍｌ、２５０ｍＭの１，５−ＡＦ溶液を０．２ｍｌ、５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を０．２ｍｌ、蒸留水で１，８００ｍｌとする。２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５℃で５分間保った後に、適当に希釈した酵素液を０．２ｍｌ加えて混合して反応を開始する。２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５℃で２０分間保温後、３７５ｎｍの波長を測定する。吸光度の減少量から、還元酵素活性を求めた。最高の酵素活性を１００（％）とした。
【００５４】
実施例２
１，５−ＡＦから１，５−ＡＧへの変換を以下の条件で行った。
最終濃度５０ｍＭのビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．５）、１００ｍＭの１，５−ＡＦ、２００ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｍｌあたり０．１ユニットのＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼとなるように各試料を混合し３０℃で保温した。０から２４時間までの８時間毎の経時変化のＨＰＬＣ測定結果クロマトグラムを示す。１，５−ＡＦから１，５−ＡＧへ変換され、１，５−ＡＧ以外の反応生成物を含まない反応溶液を得た（図１２）。
【００５５】
実施例３
最終濃度５０ｍＭのビス−トリス緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭの１，５−ＡＦ、２００ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｍｌあたり０．２ユニットのＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼとなるように各試料を混合し３０℃で保温した。０から２４時間までの８時間毎の経時変化のＨＰＬＣ測定結果クロマトグラムを示す。１，５−ＡＦから１，５−ＡＧへ変換され、１，５−ＡＧ以外の反応生成物並びに１，５−ＡＦも含まない反応溶液を得た。また、２４時間反応での１，５−ＡＧ含量は、９．７（ｇ／Ｌ）であった（図１３）。
【００５６】
実施例４
最終濃度５０ｍＭのビス−トリス緩衝液（ｐＨ７．５）、２５ｍＭの１，５−ＡＦ、２．０ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｍｌあたり０．０１ユニットのＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼとなるように各試料を混合したものをコントロールとした。次に上記溶液に、最終濃度１００ｍＭとなるように、Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、Ｌ−フコースまたはＬ−ガラクトースを添加して２４時間毎の１，５−ＡＧ生成量をＨＰＡＥ−ＰＡＤにて測定した。その経時変化のグラフを示す。Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、Ｌ−フコース、Ｌ−ガラクトースの添加群すべてにおいて、１，５−ＡＧ生成量が１．５〜２．５倍以上増加した（図１４）。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列１）
【図２】酵素活性計算式（還元反応）
【図３】Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの１，５−ＡＦへの還元反応酵素反応速度論からの解析：ラインウェーバーバーグプロット
【図４】還元反応の至適ｐＨ
【図５】至適温度
【図６】酵素活性計算式（酸化反応）
【図７】酸化反応の至適ｐＨ
【図８】Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの酸化還元反応を用いたカップリング反応
【図９】ゲル濾過クロマトグラフィーによる推定分子量
【図１０】ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
【図１１】Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼのペプチド断片の部分アミノ酸配列
【図１２】Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの１，５−ＡＦへの還元反応による１，５−ＡＧの生成  高速液体クロマトグラフィーを用いた経時変化のクロマトグラム酵素反応条件  ：  ｐＨ６．５、０．１Ｕ  ／  ｍｌ
【図１３】Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの１，５−ＡＦへの還元反応による１，５−ＡＧの生成  高速液体クロマトグラフィーを用いた経時変化のクロマトグラム酵素反応条件  ：  ｐＨ７．０、０．２Ｕ／ｍｌ
【図１４】Ｄ−アラビノースデヒドロゲナーゼの酸化還元反応を用いたカップリング反応による１，５−ＡＧの生成比較  高性能陰イオン交換クロマトグラフィーとパルスアンペロメトリ検出器による測定
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１０】
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