(57)【要約】  【課題】  サイトカインを産生する細胞の容器内の位置を特定する、簡易な方法を提供する。  【解決手段】  本発明のサイトカイン産生細胞検出方法は、固体表面上の表面に接着した培養細胞上に、無血清培地に浸漬したタンパク質吸着性膜を載置し、培養細胞から産生されたサイトカインをタンパク質吸着性膜に吸着させ、前記タンパク質吸着性膜を洗浄した後に、目的とするサイトカインに対する一次抗体溶液に浸漬し、二次抗体を用いて反応させた後に、サイトカイン産生細胞を検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体表面上の表面に接着した培養細胞上に、無血清培地に浸漬したタンパク質吸着性膜を載置し、培養細胞から産生されたサイトカインをタンパク質吸着性膜に吸着させ、
前記タンパク質吸着性膜を洗浄した後に、目的とするサイトカインに対する一次抗体溶液に浸漬し、
二次抗体を用いて反応させた後に、サイトカイン産生細胞を検出する、サイトカイン産生細胞検出方法。
【請求項２】
前記タンパク質吸着性膜には、細胞刺激薬剤が含まれている、請求項１に記載のサイトカイン産生細胞検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡易な方法でサイトカイン産生細胞を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体を構成する約２００種類の細胞は、その細胞特有のサイトカイン（生理活性を有する分泌タンパク質の総称）を分泌する。生体細胞由来の培養細胞もサイトカインを分泌している。
【０００３】
培養細胞が分泌するサイトカインを測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）が知られている。この方法では、特定のサイトカインに対する抗体を固定した９６穴マイクロプレートのウェルに細胞培養液を加え、抗体に結合したサイトカイン量を測定する。したがって、培養容器中に複数種の細胞が存在する場合には、どの細胞からサイトカインが分泌されたかはわからない。
【０００４】
近年、培養容器内で培養細胞の中からサイトカインを産生する細胞の容器内の位置を特定することが重要になっている。例えば、（１）ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）培養系に刺激を加え、刺激に反応し分化を生じた細胞の中から、特定のサイトカインを分泌するようになった細胞を検出する、（２）あるいは、多種類の細胞を同一培養容器内に秩序正しく配置した細胞アレーにおいて、薬物を加えることによりどの細胞が特定のサイトカインを産生するようになったかを検出する、などである。
【０００５】
サイトカインを産生する細胞の容器内の位置を特定するためには、培養容器中の狭いエリアで生じているサイトカインの産生を、他のエリアに拡散させずに検出する必要がある。
【０００６】
サイトカインを産生する細胞の容器内の位置を特定する方法としては、例えば培養細胞上にアガロースやメチルセルロースを加えた半固形培地を載せ、液性因子が培地中に拡がることを防いだ上で、半固形培地の上に抗サイトカイン抗体を染み込ませたニトロセルロースを載せる方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００７】
しかし、この方法では、半固形培地を必要とする。さらに、簡易な方法でサイトカインを産生する細胞の容器内の位置を特定する方法があると望ましい。
【非特許文献１】Ｈ．Ｃｈｅｎ，  Ｈ．  Ｓａｔｏ，  Ｔ．  Ｔｏｔａｎｉ，  Ｈ．Ｉｗａｔａ，  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ，Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３６６，１３７−１４３  （２００７）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
すなわち、本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、サイトカインを産生する細胞の容器内の位置を特定する、簡易な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、以下の発明を見い出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１０】
本発明のサイトカイン産生細胞検出方法は、固体表面上の表面に接着した培養細胞上に、無血清培地に浸漬したタンパク質吸着性膜を載置し、培養細胞から産生されたサイトカインをタンパク質吸着性膜に吸着させ、前記タンパク質吸着性膜を洗浄した後に、目的とするサイトカインに対する一次抗体溶液に浸漬し、二次抗体を用いて反応させた後に、サイトカイン産生細胞を検出する。
【００１１】
本発明では、細胞上に直接タンパク質吸着性膜を載置する。これにより細胞から分泌されたサイトカインが培地中に拡がることなく、タンパク質吸着性膜に捕獲される。
【００１２】
前記タンパク質吸着性膜には、細胞刺激薬剤が含まれていてもよい。これにより、細胞への薬物刺激とサイトカイン検出とを同時に行うことができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明では、培養細胞上に、無血清培地に浸漬したタンパク質吸着性膜を載置する。すなわち、半固形培地を用いずに、サイトカイン産生細胞を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明で検出の対象となる細胞の種類は、サイトカインを分泌する細胞であれば特に限定されない。例えば、生殖系列細胞、体性細胞、分化全能細胞、多分化能細胞、実質組織細胞、上皮細胞、不死化細胞、または形質転換細胞などが挙げられる。
【００１６】
通常の方法に基づいて培養されている上記培養細胞を、所定の細胞数となるように培養容器に播種する。
【００１７】
播種した培養細胞を３７℃、ＣＯ２雰囲気下でインキュベートし、培養容器表面に接着させる。インキュベートする時間は、培養容器表面に培養細胞が接着することができる時間であればよく、例えば２時間程度である。この培養容器に、公知の血清培地を加えて、３７℃、ＣＯ２雰囲気下で約２４時間程度インキュベートする。
【００１８】
基本培地としては、一般的に用いられる基礎培地を用いることができる。一般的に用いられる基礎培地とは、通常動物細胞が同化しうる炭素源、消化しうる窒素源および無機塩などを含有させたものをいう。また、必要に応じて、微量栄養促進物質、前駆物質などの微量有効物質を配合してもよい。このような基礎培地としては、細胞培養のための全ての公知培地を使用することができる。具体的には、ＨａｍＦ１０培地、ＨａｍＦ１２培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）−１６４０培地、ＭＥＭ−α培地、ＣＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ）−ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣由来）培地などのケミカリー・ディファインド培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。動物細胞培養培地として用いる場合には、グルタミン０．５〜５ｍＭ、抗生物質（ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、Ｇ４１８（０．３ｍｇ／ｍＬ））などを添加してもよい。
【００１９】
その後、培養容器から血清培地を除去し、その後にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などで、培養容器を洗浄する。
【００２０】
次に、この培養容器の細胞表面に、無血清培地に浸漬したタンパク質吸着性膜を載置する。無血清培地としては、上記基本培地が使用できる。また、この無血清培地に細胞刺激薬剤を含有させてもよい。細胞刺激薬剤は、培養細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。
【００２１】
タンパク質吸着性膜としては、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜などが挙げられる。
【００２２】
上記タンパク質吸着性膜の上に無血清培地に浸漬したろ紙を載置し、３７℃、ＣＯ２雰囲気下でインキュベートする。インキュベートする時間は、１０分〜２４時間、好ましくは１時間〜２時間程度である。
【００２３】
その後、タンパク質吸着性膜を外し、この膜の細胞接触面を上向きにして、公知の方法によりブロッキングを行う。次に、目的とするサイトカインに対する一次抗体溶液に浸漬して、目的とするサイトカインが存在する部分に一次抗体を結合させる。
【００２４】
次に、酵素やビオチンで標識された検出用の二次抗体を用いて反応させる。これに酵素標識ストレプトアビジンなどの基質を添加して検出用の二次抗体に結合させる。得られたスポットは、解剖顕微鏡やスポットリーダを用いて、サイトカイン産生細胞の位置を検出する。
【００２５】
本発明のサイトカイン産生細胞検出方法を用いると、簡単な操作で、培養細胞中のサイトカインを産生する細胞を検出することができる。
【実施例】
【００２６】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げて説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１）
［Ｌ９２９細胞を用いたＦＧＦ−２の検出］
Ｌ９２９細胞（マウス線維芽組織由来）を用いて、以下のようにして線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）を産生する細胞位置の検出を行った。
【００２８】
（１）３．５ｃｍの接触細胞用シャーレに、恒常的にＦＧＦ−２を産生しているＬ９２９細胞を細胞数がそれぞれ６０００、３０００、１５００、７５０、３８０、１９０となるように、Ｌ９２９細胞含有培地２０μｌをスポット状に播種した。
【００２９】
（２）上記シャーレを、３７℃、ＣＯ２５％インキュベータ内に２時間放置し、細胞を接着させた。この後、血清入りＤＭＥＭ培地を３ｍｌ加え、２４時間培養した。
【００３０】
（３）次に、血清入りＤＭＥＭ培地を除き、１×ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。
【００３１】
（４）タンパク質吸着性膜として、蒸留水に浸漬し、オートクレーブ滅菌をしたニトロセルロース膜を用いた。無血清培地（ＤＭＥＭ）に浸漬したニトロセルロース膜を上記シャーレ中の細胞の上に直接載置し、３７℃、ＣＯ２５％インキュベータ内に２時間、６時間、２４時間放置した。
【００３２】
（５）その後膜を回収し、上記ニトロセルロース膜の細胞接触面を上向きにして、３ｍｌの２．５％スキムミルク  ｉｎ  ＴＢＳ−Ｔ溶液（ブロッキングバッファー）中で２時間ブロッキングを行った。なお、ＴＢＳ−Ｔ溶液とは、１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２０ｍｌ、塩化ナトリウム８．７７ｇ、２０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２．５ｍｌをｍｉｌｌｉＱ水（超純水）に溶解し、全量を１ｌにしたものをいう。
【００３３】
（６）ＦＧＦ−２抗体（５０μｇ／μｌ）２μｌを１ｍｌブロッキングバッファーに入れたものを、上記ニトロセルロース膜に載せ、１．５時間放置した。
【００３４】
（７）次に、５ｍｌのＴＢＳ−Ｔ溶液を用いて、余分な抗体を洗い流した。操作は、１回３分をかけて３回繰り返した。
【００３５】
（８）ストレプトアビジン−アルカリホスホターゼ（０．５μｌ）とＴＢＳ−Ｔ溶液（２．５ｍｌ）を混合し、ニトロセルロース膜上に載せ、１．５時間放置した。
【００３６】
（９）次に、５ｍｌのＴＢＳ−Ｔ溶液を用いて、ニトロセルロース膜を洗浄した。操作は、１回３分をかけて３回繰り返した。
【００３７】
（１０）アルカリフォスファターゼ発色用基質であるＢＣＩＰ／ＮＢＴ（基質）を１０ｍｌの蒸留水に溶かし、ニトロセルロース膜をこの液に浸漬し、染色した。結果を図１に示す。
【００３８】
図１において、数字は細胞数を示す。数字の上に見えるスポットは、ＦＧＦ−２をポジティブコントロールとしたものである。図１から、細胞とニトロセルロース膜を２時間接触させると、細胞が産生するＦＧＦ−２を位置特異的に検出することができることが判った。
【００３９】
（実施例２）
［Ｊ７７４細胞を用いたＴＮＦ−αの検出］
Ｊ７７４細胞（マウス・マクロファ−ジ細胞株）を用いて、以下のようにして腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）を産生する細胞位置の検出を行った。
【００４０】
（１）リポサッカイライド（ＬＰＳ）刺激でＴＮＦ−αを産生するＪ７７４細胞を、３．５ｃｍの接触細胞用シャーレに、細胞数がそれぞれ６０００、３０００、１５００、７５０、３８０、１９０となるように、Ｊ７７４細胞含有培地２０μｌをスポット状に播種した。
【００４１】
（２）上記シャーレを、３７℃、ＣＯ２５％インキュベータ内に２時間放置し、細胞を接着させた。この後、血清入りＤＭＥＭ培地を３ｍｌ加え、２４時間培養した。
【００４２】
（３）次に、培地をＬＰＳ含有（１μｇ／ｍｌ）血清入りＤＭＥＭ培地に交換し、１０分間、２時間、４時間、ＬＰＳ刺激を行った。
【００４３】
（４）タンパク質吸着性膜として、蒸留水に浸漬し、オートクレーブ滅菌をしたニトロセルロース膜を用いた。ＬＰＳ含有（２０μｇ／ｍｌ）無血清培地（ＤＭＥＭ）に浸漬したニトロセルロース膜を上記シャーレ中の細胞の上に直接載置した。この上に、無血清培地（ＤＭＥＭ）を染み込ませたろ紙をおいた。これを、３７℃、ＣＯ２５％インキュベータ内に１時間、４時間、２４時間放置した。
【００４４】
（５）その後膜を回収し、上記ニトロセルロース膜の細胞接触面を上向きにして、３ｍｌの２．５％スキムミルク  ｉｎ  ＴＢＳ−Ｔ溶液（ブロッキングバッファー）中２時間でブロッキングを行った。
【００４５】
（６）ＴＮＦ−α抗体（５０μｇ／μｌ）２μｌを１ｍｌブロッキングバッファーに入れたものを、上記ニトロセルロース膜に載せ、１．５時間放置した。
【００４６】
（７）次に、５ｍｌのＴＢＳ−Ｔ溶液を用いて、余分な抗体を洗い流した。操作は、１回３分をかけて３回繰り返した。
【００４７】
（８）ストレプトアビジン−パーオキシダーゼ  ポリマー  ウルトラセンシティヴ（０．５μｌ）とＴＢＳ−Ｔ溶液（２．５ｍｌ）を混合し、ニトロセルロース膜上に載せ、１．５時間放置した。
【００４８】
（９）次に、５ｍｌのＴＢＳ−Ｔ溶液を用いて、ニトロセルロース膜を洗浄した。操作は、１回３分をかけて３回繰り返した。
【００４９】
（１０）ストレプトアビジン−パーオキシダーゼ発色用基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質３ｍｌを、ニトロセルロース膜にかけ、染色した。結果を図２に示す。
【００５０】
図２において、数字は細胞数を示す。数字の上に見えるスポットは、ＴＮＦ−αをポジティブコントロールとしたものである。図２から、細胞とニトロセルロース膜を２時間接触させると、細胞が産生するＴＮＦ−αを位置特異的に検出することができることが判った。
【００５１】
（比較例１）
比較例としてＬＰＳ刺激を行わなかったものも準備した。
【００５２】
（実施例３）
実施例３として（３）でＬＰＳ刺激を行わず、ニトロセルロース膜に染み込ませたＬＰＳだけで刺激を行ったものも準備した。
【００５３】
図２は、実施例２（図中、「ＬＰＳ（＋）」）、比較例１（図中、「ＬＰＳ（−）」）を行ったもので、ニトロセルロース膜に２４時間接触させたものの結果を示す写真である。数字の上に見えるスポットは、ＴＮＦ−αをポジティブコントロールとしたものである。図２から、実施例２のＬＰＳ刺激を行った細胞のみが、細胞数３８０個までにＴＮＦ−αが検出されていることがわかる。また、ニトロセルロース膜に２時間接触させたものにおいても、同様の結果が得られた。
【００５４】
図３は、実施例３のニトロセルロース膜に２４時間接触させたものの結果を示す写真である。図３から、本発明の方法を用いれば、薬剤における刺激とサイトカインの検出を同時に行えることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、実施例１の結果を示す写真である。
【図２】図２は、実施例２、比較例１の結果を示す写真である。
【図３】図３は、実施例３の結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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