(57)【要約】【課題】加齢黄斑変性を発症させるのに好適なモデル動物及びその作成方法を提供する。【解決手段】本発明に係る加齢黄斑変性モデル動物は、ＨＴＲＡ１（Human high-Temperature Requirement factor A1）ポリペプチド又は当該ＨＴＲＡ１の誘導体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片及び／又は発現ベクターを導入してなり、当該ＨＴＲＡ１ポリペプチドは、ヘマグルチニンエピトープタグを含む誘導体を備える。また、前記ＨＴＲＡ１ポリペプチドは、ビオチンタグ、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンエピトープタグ、又は、ｍｙｃタグを含む誘導体を備え、前記ＤＮＡ断片は、β−アクチンプロモーター及びポリＡ末端を備える。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＴＲＡ１（Human high-Temperature Requirement factor A1）ポリペプチド又は当該ＨＴＲＡ１の誘導体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片及び／又は発現ベクターを導入してなる、
ことを特徴とする加齢黄斑変性モデル動物。
【請求項２】
前記ＨＴＲＡ１ポリペプチドは、ビオチンタグ、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンエピトープタグ、又は、ｍｙｃタグを含む誘導体を備える、
ことを特徴とする請求項１に記載の加齢黄斑変性モデル動物。
【請求項３】
前記ＤＮＡ断片は、β−アクチンプロモーター及びポリＡ末端を備える、
ことを特徴とする請求項１に記載の加齢黄斑変性モデル動物。
【請求項４】
前記発現ベクターは、β−アクチンプロモーター及び転写終結配列を備え、かつ、前記動物において自律複製が可能である、
ことを特徴とする請求項１に記載の加齢黄斑変性モデル動物。
【請求項５】
前記ＤＮＡ断片及び／又は発現ベクターを、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、又は、レトロウィルスベクターに外来遺伝子を組み込んで感染させる方法によって前記動物に導入する、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の加齢黄斑変性モデル動物。
【請求項６】
ＨＴＲＡ１（Human high-Temperature Requirement factor A1）ポリペプチド又は当該ＨＴＲＡ１の誘導体をコードする遺伝子をＤＮＡ断片又は発現ベクターに導入する遺伝子導入工程と、
前記ＤＮＡ断片及び／又は発現ベクターをモデル動物に導入するベクター導入工程と、を備える、
ことを特徴とする加齢黄斑変性モデル動物の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加齢黄斑変性を発症させるのに好適なモデル動物及びその作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性（Age-related Macular Degeneration；以下「ＡＭＤ」とする。）は、原因不明の目の難病であり、網膜色素上皮細胞の異常な老化により黄斑部が変性して、視野の中心部分がぼけたり、歪んで見えたり、中心が見えなくなったり、暗くなる等の症状を引き起こす疾患である。
【０００３】
ＡＭＤには、萎縮型と滲出型がある。萎縮型は、黄斑部が損傷を受けて、網膜色素上皮細胞や脈絡膜毛細管板が萎縮するものである。一方、滲出型は、老廃物の刺激等で、黄斑部に脈絡膜由来の新生血管が伸展し、出血や滲出を生じるものである。
【０００４】
滲出型ＡＭＤは、網膜色素上皮剥離、脈絡膜血管の新生、網膜下出血が起こり視力喪失に繋がるため治療が必要とされる（特許文献１参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１０４８６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＡＭＤを治療するための治療剤や治療方法をより効率的に開発するためには、実験に使用するＡＭＤを発症したモデル動物が必要となる。従って、ＡＭＤを発症させることにより、有効な治療薬や治療方法を開発するのに好適なモデル動物が求められている。
【０００７】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、ＡＭＤを発症させるのに好適なモデル動物及びその作成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る加齢黄斑変性モデル動物は、
ＨＴＲＡ１（Human high-Temperature Requirement factor A1）ポリペプチド又は当該ＨＴＲＡ１の誘導体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片及び／又は発現ベクターを導入してなる、ことを特徴とする。
【０００９】
前記ＨＴＲＡ１ポリペプチドは、ビオチンタグ、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンエピトープタグ、又は、ｍｙｃタグを含む誘導体を備える、ことも可能である。
【００１０】
前記ＤＮＡ断片は、β−アクチンプロモーター及びポリＡ末端を備える、ことも可能である。
【００１１】
前記発現ベクターは、β−アクチンプロモーター及び転写終結配列を備え、かつ、前記動物において自律複製が可能である、ことも可能である。
【００１２】
前記ＤＮＡ断片及び／又は発現ベクターを、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、又は、レトロウィルスベクターに外来遺伝子を組み込んで感染させる方法によって前記動物に導入する、ことも可能である。
【００１３】
上記の目的を達成するため、本発明の第２の観点に係る加齢黄斑変性モデル動物の作成方法は、
ＨＴＲＡ１（Human high-Temperature Requirement factor A1）ポリペプチド又は当該ＨＴＲＡ１の誘導体をコードする遺伝子をＤＮＡ断片又は発現ベクターに導入する遺伝子導入工程と、
前記ＤＮＡ断片及び／又は発現ベクターをモデル動物に導入するベクター導入工程と、を備える、ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＡＭＤを発症させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下では、本発明のＡＭＤモデル動物の実施形態の一つについて説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
（ＡＭＤモデル動物）
本実施形態に係る加齢黄斑変性（ＡＭＤ）モデル動物は、特定の遺伝子（ＨＴＲＡ１ポリペプチド遺伝子若しくはＨＴＲＡ１ポリペプチドの誘導体をコードする遺伝子、又は、当該遺伝子を含むＤＮＡ断片）を体細胞染色体中に保有する哺乳動物である。本モデル動物は、滲出型のＡＭＤを発症する、又は、発症する可能性が極めて高い。ここで、滲出型のＡＭＤとは、老廃物の刺激等で、黄斑部に脈絡膜由来の新生血管が伸展し、出血や滲出によって脈絡膜、網膜色素上皮細胞、網膜の変性を生じるものをいう。
【００１７】
ＨＴＲＡ１ポリペプチド遺伝子は、米国ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）等に登録されているNC_000010  領域：124211047から124264413の53367塩基対から構成される。ＨＴＲＡ１ポリペプチド遺伝子は、図１に示すセリンプロテアーゼ１１を含んで構成される。
ここで、ＩＢはインスリン増殖因子であり、ＫＡＺＡＬはプロテアーゼ阻害剤であり、ＰＤＺは約９０アミノ酸からなるタンパク群である。
【００１８】
ＨＴＲＡ１ポリペプチド遺伝子の512塩基対上流には、一塩基変異多型（ＳＮＰ; Single Nucleotide Polymorphism）のrs11200638が存在する。rs11200638は、配列表の配列番号１に示すフォワードの塩基配列、及び／又は、配列表の配列番号２に示すリバースの塩基配列を含んで構成される。当該ＳＮＰのハロタイプは、ＡＡ型、Ａ／Ｇ型、ＧＧ型のいずれでもよいが、好ましくはＡＡ型である。当該ＳＮＰが、ＡＭＤの発症に関与する。
【００１９】
当該特定の遺伝子は、ＨＴＲＡ１ポリペプチド遺伝子を構成する塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有することもでき、また、rs11200638を含むこともできる。また、当該特定の遺伝子を構成する塩基配列のうち、１０％以下の塩基が置換された遺伝子とすることもできる。
【００２０】
ＨＴＲＡ１ポリペプチドには、導入されたポリペプチドが発現していることの検出を容易にするために付される標識、いわゆるタグを付された誘導体が含まれる。付されるタグとしては、抗原抗体反応、又は、水素結合によって強く結合可能な標識化合物等を用いて検出可能なタグであればよく、好ましくはアミノ酸またはポリペプチドであってＨＴＲＡ１ポリペプチドと一体に発現可能なタグである。
具体的には、ビオチンタグ、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンエピトープタグ（ＨＡタグ）、ｍｙｃタグ等が例示され、中でもＨＡタグが好ましい。
なお、当該誘導体は、タグを付され、さらに、生体内で一般的に生じることが知られている修飾を受けた誘導体であっても良い。
【００２１】
導入されるＨＴＲＡ１ポリペプチド遺伝子は、適切なｃＤＮＡライブラリから、適切なプライマーを使用して増幅し取得することもできる。ここで、ｃＤＮＡライブラリは、由来する種としてはＨＴＲＡ１を有する種であれば特に限定なく使用できるが、ヒト又はマウス由来のものが好ましく、ＨＴＲＡ１を発現する組織に由来するものであれば良い。
【００２２】
ＨＴＲＡ１を発現する組織の例としては、脳が例示される。ｃＤＮＡライブラリはＨＴＲＡ１遺伝子を含む物であれば市販のものを用いることができ、又は、ＨＴＲＡ１遺伝子を発現する組織または細胞のｃＤＮＡを公知の方法で調製して用いることができる。
【００２３】
ＨＴＲＡ１遺伝子を増幅するためのプライマーは当業者であれば当該種のＨＴＲＡ１をコードする核酸分子の配列に基づいて設計することができ、例えばチオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製model 1392）などを用いて作ることができる。
【００２４】
これらの方法で作製されたＨＴＲＡ１ポリペプチド及び／又はその誘導体をコードする核酸分子は、例えばシークエンサーを用いてその配列を決定し、所望する変異を含む配列と比較することにより、正しく変異導入されたか否かを確認することができる。
【００２５】
ＤＮＡ断片は、直鎖状の２本鎖ＤＮＡであり、かつ、プロモーター、ＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体をコードする遺伝子及びポリＡ末端により構成されていることが好ましい。
【００２６】
ここで、ポリＡ末端とは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されたＲＮＡの３’末端に約２００塩基のアデニル酸が次々に付加された部分をいう。
【００２７】
ベクターを用いる場合、ベクターは宿主において自律複製可能であると同時に、プロモーター、ＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体をコードする遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、ＤＮＡ断片及び／又はベクターには、エンハンサー等のプロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２８】
プロモーターとしては、β−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター等が例示される。これらのなかでも、β−アクチンプロモーターは、細胞骨格を構成するタンパク質であり、ＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体をコードする遺伝子が導入されたほぼ全ての細胞で発現可能となる。従って、プロモーターとしては、β−アクチンプロモーターが好ましい。
【００２９】
また、ＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体をコードする遺伝子の下流側に、さらに、導入された遺伝子の発現の検出を用意するためのポリペプチドをコードする遺伝子、いわゆるタグを含んでもよい。当該タグは、ＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体と同一ポリペプチド分子として発現されるものであってもよい。
【００３０】
ＤＮＡ断片にタグを含ませるには、公知のいかなる方法も用いることができる。例えば、所望するタグを別に組み込んだベクターを用意しておき、当該ベクターを適当な制限酵素で切断し、ＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体をコードする遺伝子をベクターに組み込み、公知の方法で増幅した後、当該ベクターを精製し、適当な制限酵素で切断してＤＮＡ断片を得ることができる。
【００３１】
タグを導入するためのベクターとしては、ｐｈＣＭＶ３が好適に使用される。また、プロモーターをβ−アクチンプロモーターに改変するためのベクターとしては、ｐＣＡＧＧＳが好適に使用される。
【００３２】
また、タグをコードする遺伝子が予め組み込まれたベクターは市販されており、所望のものを購入して用いても良い。ＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体をコードする遺伝子のプロモーターを所望のものに改変する場合も同様の方法で改変することができる。
【００３３】
ＤＮＡ断片又はベクターは、公知の方法に準じて調製することができる。ＤＮＡ断片又はベクターが導入された受精卵を、偽妊娠動物の子宮に移植し、胎仔が充分に生育した後に自然分娩または帝王切開により出産させる。出生した仔の皮膚や耳介等の体組織の一部または血液等を採取し、導入したＨＴＲＡ１ポリペプチドもしくはその誘導体またはこれらをコードする遺伝子の発現を確認することにより、当該個体がトランスジェニック動物であるか否かを判定することができる。さらにトランスジェニック動物である個体（Ｆ０、ファウンダー）を野生型動物又はトランスジェニック動物と交配して生まれたＦ１からトランスジェニック動物を選別し、これを繁殖させることにより、本発明のモデル動物であるトランスジェニック動物の系統維持を行うことができる。
【００３４】
モデル動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサル等を例示することができるが、実験動物としての汎用性や利便性を考慮してマウス、ラットであることが好ましく、マウスであることが特に好ましい。
【００３５】
マウスには特に限定はなく公知のマウスを使用することができるが、トランスジェニックマウスの作製が容易であること、汎用性があること、及び、遺伝子背景等の情報が豊富であること等の観点から、ＢＤＦ１／Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系であることが特に好ましい。
【００３６】
また、既にＨＴＲＡ１ポリペプチド及び／又はその誘導体の遺伝子が導入されたマウスに、他の系統をバッククロスさせることにより得られるトランスジェニックマウスも本発明に用いることができる。
【００３７】
さらに、本発明に係るモデル動物は、本来その動物が有するＨＴＲＡ１遺伝子の変わりに本発明のＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体をコードする遺伝子がゲノムに組み込まれた、いわゆるノックイン動物とすることもできる。
なお、本来の遺伝子に変えて変異ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込むには、相同組み換えを用いる公知の手法によって行うことができる。
【００３８】
（ＡＭＤモデル動物の作成方法）
本実施形態に係るＡＭＤモデル動物の作成方法は、ＨＴＲＡ１ポリペプチド遺伝子若しくはＨＴＲＡ１ポリペプチドの誘導体をコードする遺伝子、又は、当該遺伝子を含むＤＮＡ断片及び／又は発現ベクターをモデル動物に導入することにより、ＡＭＤを発症するＡＭＤモデル動物を作成する方法である。
【００３９】
ＨＴＲＡ１ポリペプチド及び／又はその誘導体の遺伝子をモデル動物へ導入する方法としては、特に限定はなく、例えば、ＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体の遺伝子を含むＤＮＡ断片、あるいは、ＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体の遺伝子を導入した発現ベクターを用いて、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、又は、レトロウィルスベクターに外来遺伝子を組み込んで感染させる方法により遺伝子を導入する。いずれの公知の方法によっても、ＤＮＡ断片又は発現ベクターに含まれるＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体の遺伝子を受精卵に導入することができる。
【００４０】
ＨＴＲＡ１ポリペプチドの遺伝子等をオーバーエクスプレッション（過剰発現）することにより、ＡＭＤを発症するモデル動物を作成することができる。
【００４１】
また、本来そのモデル動物が有するＨＴＲＡ１遺伝子の変わりに本発明のＨＴＲＡ１ポリペプチド又はその誘導体をコードする遺伝子をノックインすることにより、ＡＭＤを発症するモデル動物を作成することができる。
【００４２】
以上説明したように、本発明によれば、モデル動物にＡＭＤを発症させることができる。また、ＡＭＤを発症したモデル動物を利用することにより、有効な治療薬や治療方法を開発することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００４４】
ＨＴＲＡ１ポリペプチドの遺伝子をオーバーエクスプレッションしたマウスについて、ＡＭＤの発症を調べた。
【００４５】
（眼底検査）
小型眼底用カメラを固定し、マウスに散瞳剤等を点眼後、捕定して焦点があったところで眼底を撮影した。図２は、マウスの眼底を示す図である。図２の囲み部分は、ＡＭＤが発症している個所を示す。当該囲み部分には、他の部分と異なり、網膜および脈絡膜の変性が見られる。つまり、マウスにおいてＡＭＤが発症している。
【００４６】
（眼球薄片の検査）
マウスの眼球をスライスした組織薄片をヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）した。図３は、組織染色したマウスの眼球薄片を示す図（撮影倍率１００倍）である。また、図４は、図３の囲み部分を拡大した図（撮影倍率４００倍）である。
【００４７】
なお、細胞組織を染色する方法は、ＨＥ染色に限定されず、マッソン・トリクローム染色、銀染色等、任意である。
【００４８】
図３の囲み部分及び図４において、網膜、脈絡膜が変性している。これは、脈絡膜の変性によって網膜に向かって出血や血液中の水分が漏れ出したためである。従って、ＨＴＲＡ１ポリペプチドの遺伝子をオーバーエクスプレッションしたマウスにおいて、ＡＭＤを発症していることが判明した。
【００４９】
以上説明したように、ＨＴＲＡ１ポリペプチドの遺伝子をオーバーエクスプレッションしたマウスはＡＭＤを発症する。当該ＡＭＤを発症したマウスを利用することにより、有効な治療薬や治療方法を開発することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】セリンプロテアーゼ１１の構造を示す模式図である。
【図２】マウスの眼底を示す図である。
【図３】組織染色したマウスの眼球薄片を示す図である。
【図４】図３の囲み部分を拡大した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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