(57)【要約】  【課題】  木材特有のＤＮＡ分析に不利な条件を克服し、効率よく木材のＤＮＡを分析するための前処理方法を提供する。  【解決手段】  木材を切片とし、該切片を水またはバッファーに浸漬して振動を与えた後固液分離し、液相部分を遠心分離し、得られた沈殿物をＤＮＡ分析用標本とすることを特徴とする木材のＤＮＡを分析するための前処理方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
木材を切片とし、該切片を水またはバッファーに浸漬して振動を与えた後固液分離し、液相部分を遠心分離し、得られた沈殿物をＤＮＡ分析用標本とすることを特徴とする木材のＤＮＡを分析するための前処理方法。
【請求項２】
前記切片が、ミクロトームまたはカッターナイフ等の刃物を用いて切片化したものである請求項１に記載の前処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、木材からＤＮＡを効率よく分析するための前処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、木材のＤＮＡを分析する場合、木材を一辺数ミリ程度の小片に粗切後、粉砕機や乳鉢、乳棒を用いて粉末化し、得られた木粉を試料として、確立されているＤＮＡ抽出法やＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出する工程が必要である。ＤＮＡ抽出に供する試料を作る際には、１試料当たり20分程度の時間と凍結状態を保って粉砕するためのエネルギーや労力を必要とする。これは木材の細胞壁が他の植物と比較して固く、しかも粘弾性があるためであり、細胞壁の破壊は細胞内のＤＮＡを溶出させるために必要な行程である。木材は他の生物に比べて重量あたりのＤＮＡ量が非常に少ないという特徴を有する。さらに、細胞壁中や細胞内腔には二次代謝産物として多様な成分が含まれ、これらはＤＮＡに付着してＤＮＡの抽出効率を低下させたり、後のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を阻害する要因となる。木粉化された木材ではそういった成分も溶出されやすくなる。また、粉砕して調製した木粉は粒子が細かくしかも大きさが一定でないため、ＤＮＡ抽出工程において木粉や二次代謝産物からＤＮＡを分離するのが困難である。
【０００３】
また、木粉からのＤＮＡ抽出は複数の工程からなる煩雑で時間のかかる（1試料当たり約2時間）操作であるにもかかわらず、木粉からのＤＮＡ収率は、他の生物試料（動物組織や葉）に比べると概して低い。
【０００４】
従来、木材等の植物資料からＤＮＡを調製するには、以下のような操作を行う必要があった。
【０００５】
すなわち、まず細胞中からＤＮＡを取り出すために細胞を破砕する必要があるが、細胞を取り囲む細胞壁は常温では弾性があり破砕されにくい。また、細胞内にはＤＮＡを分解するＤＮＡ分解酵素群が特別な区画に隔離されて存在しており、細胞を破砕する際に、ＤＮＡとＤＮＡ分解酵素の接触を回避しなければならない。これらの目的のため、通常は液体窒素（-196℃）等で凍結して細胞壁を脆化するとともに、酵素等分子の流動を止めた状態で乳鉢・乳棒あるいは破砕機を用いて破砕する。その後、試料が融解する前にＤＮＡ分解酵素の活性を阻害する試薬（臭化セチルトリメチルアンモニウム、エチレンジアミン四酢酸塩等）を含有するバッファーを破砕試料に加え混和する。遠心分離により細胞残渣を沈殿として分離、除去した後のＤＮＡ抽出液（水溶液）には、ＤＮＡの他にタンパク質や糖質、脂質、二次代謝産物等の物質が混在しており、ＤＮＡの定量や分析に悪影響を与える。これらの混在物は、ＤＮＡ抽出液に有機溶剤（クロロホルムやフェノール）を混和して混在物質を有機溶媒に移行させて除去する。市販のＤＮＡ抽出用キットでは、ＤＮＡを特別なメンブレンに吸着させ、混在物質を洗い流すという方法で混在物を除去している。また、溶液中のＤＮＡ濃度が低い場合には、精製を兼ね、エタノールと塩を加えることによりＤＮＡを析出・沈殿させ濃縮する場合がある。上記のように、一般的なＤＮＡの抽出では、試料の破砕（凍結下）、抽出、混在物の除去という過程を経て、分析に供することが可能な純度のＤＮＡを得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、木材特有のＤＮＡ分析に不利な条件を克服し、効率よく木材のＤＮＡを分析するための前処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための手段は以下のとおりである。
（１）  木材を切片とし、該切片を水またはバッファーに浸漬して振動を与えた後固液分離し、液相部分を遠心分離し、得られた沈殿物をＤＮＡ抽出用標本とすることを特徴とする木材のＤＮＡを分析するための前処理方法。
（２）  前記切片が、ミクトクロームまたはカッターナイフ等の刃物を用いて切片化したものである（１）項に記載の前処理方法。
【発明の効果】
【０００８】
従来のＤＮＡ分析は、木粉化、ＤＮＡ抽出、PCRによるＤＮＡの増幅、ＤＮＡの分析という工程を経て行う。この工程においては、初めに刃物を用いて木材を粗切し、その後、粉砕機等を用いて木粉化する必要がある。本発明では、刃物で切片化し、水溶液に浸漬後、機械的な振動を加えることによって、細胞壁に付着および細胞内に残存するＤＮＡまたはＤＮＡを含む細胞内小器官を液中に遊離させ、その後、メッシュまたはメンブレンフィルタと遠心機を用いて固液を分離する。これにより、もっとも時間と労力を要する木粉化作業を省くことができるとともに、木材残渣とＤＮＡ抽出液が容易に分離ができる。また、本処理によって調製された産物は、不純物が少ないため、さらにＤＮＡ抽出工程を省いて、PCRによるＤＮＡの特定領域の増幅に供することができる。したがって、木材や木材製品の定性的な分析には、本発明処理の後、PCRのみ行うことによってＤＮＡ分析を実施することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、木材のＤＮＡを効率よく抽出するにあたり、木材を切片化することを特徴とする。
【００１０】
本発明における、木材とは、植物界の被子植物門と裸子植物門に属する植物の二次木部の組織である。
【００１１】
本発明の前処理方法においては、まず木材を切片化する。
【００１２】
本発明における、切片化とは、ミクロトームまたはカッターナイフ等の刃物を用いて木材を切片とすることである。柔細胞の一部が切断され内部が露出する程度に薄片化すればよく、例えば、数μｍ〜数百μｍの切片とする。
【００１３】
木材は大部分が木化した細胞壁からなっている。細胞壁は粘弾性があるため、粉末化する場合には一辺数mm程度の小片に粗切後、液体窒素等を用いて低温で脆化してから、粉砕器や乳鉢、乳棒を用いて破砕する。このため、多くの時間と労力が必要になり、得られる木粉の大きさは一定しない。木材は重量あたりのＤＮＡ量が非常に少ないうえに、細胞壁中または細胞内腔に含まれる二次代謝産物等成分もＤＮＡを抽出する際に同時に溶出される。それらの中にはＤＮＡと挙動を共にし、後のPCRを阻害する成分もある。木粉は表面積が広いため溶出される二次代謝産物等の量も多い。これらの特徴、すなわち、木粉の大きさの不定性、粉末化することによる溶出成分の増加のため、ＤＮＡの抽出工程において、木粉や二次代謝産物からＤＮＡを分離するのが困難である。
【００１４】
木材を切片化して処理を行う場合、上述のように問題の多い粉末化が不要であり時間と労力を大きく節約できる。また、粉末化に比べてエレメントのサイズが大きく、固液の分離が容易である。さらに、試料中の細胞壁の表面積が小さいため、ＤＮＡが主に存在している柔細胞を切断することで回収されるＤＮＡまたはＤＮＡを含む細胞内小器官の量に対し、溶出成分の量を著しく低減できる。得られるＤＮＡの純度が高いため、ＤＮＡの抽出工程を省略できるため、時間、労力の節約につながる。
【００１５】
次いで木材の切片に、10〜500倍（絶乾重量／容量）の水またはバッファーを加えて浸漬する。
【００１６】
木材の切片を浸漬した溶液に、物理的な振動を与える。振動を与える手段としては、卓上型の振動発生装置（振動数2,000〜4,000rpm）および超音波発生装置を用いて（周波数20〜60kHz）物理的な振動を与える。
バッファーとしては、Tris?塩酸バッファー、リン酸バッファー、カコジル酸バッファー等の一般的なバッファーを挙げることができる。
【００１７】
振動を与えた後、固液分離を行い液相と切片を分離し、細胞内容物を得る。固液分離する方法としては、0.4〜80μmのメッシュまたはメンブレンフィルタを用いて、1,000Ｇ程度の遠心により分離する方法が挙げられるが、溶液と切片を分離できる方法であれば、遠心分離に限定されるものではない。遠心分離によって、溶液と切片を同時に各種粗さのメッシュまたはメンブレンフィルタを通すことにより、細胞内容物のみを得ることができる。細胞の断片等の残渣の大部分はメッシュ上またはメンブレンフィルタ上に残っているため容易に取り除くことができる。
【００１８】
固液分離した液相部分を遠心分離することにより、多量の細胞内容物が含まれた沈殿物が得られる。遠心分離は、10,000〜15,000Ｇで、1〜5分間行えばよい。
【００１９】
以上のようにして調製したＤＮＡ標本は、そのままPCRを行って増幅し、分析に供することができる。
【実施例１】
【００２０】
スギ(Cryptomeria japonica)およびクヌギ(Quercus acutissima)材を用いて本発明方法を検証した。カミソリ刃を用いて材を切片化した該木材を1.5mlチューブに入れ500μlの水を加えた。超音波処理装置で10分間処理し、80μmメッシュのメンブレンを挿入した1.5mlチューブに移して、1,000Gで１分間処理することによって固液を分離した。液層部分を15,000Ｇで３分間遠心処理して得た沈殿物をもとに、PCRによって葉緑体遺伝子の約500塩基対のＤＮＡ領域を増幅した。PCRの条件は次の通りである。94℃、9分30秒の変性に続き、94℃・30秒、56℃・30秒、72℃・50秒を1サイクルとする温度変化を40サイクル（約2時間半）。PCR終了後の反応物をアガロースゲル電気泳動法で分離し、目的とする遺伝子をバンドとして可視化した（約30分）。全分析にかかった時間は約6時間で、そのうち切片化からPCR処理前までに要した時間は約30分であった。
【００２１】
これを従来の方法である木粉化とＤＮＡ抽出を経て行うと、1試料当たりにかかる時間は、木材の粗切に10分、木粉化に10分、ＤＮＡ抽出に2時間で、PCR処理前までに要した時間は計約2時間20分であり、本発明による時間の4倍以上となった。
【００２２】
手法の有効性を確認するために、振動処理前後の切片と固液分離後の液層中の沈殿物を顕微鏡で観察した。その結果、振動処理によって切片中の細胞内容物の消失が見られ、液層の沈殿物にはＤＮＡの存在を示す細胞内容物が多数見られた。そのため、振動処理によってＤＮＡを有する細胞小器官が細胞壁から外れ、液層中に遊離したことが確認され、それらが有するＤＮＡがPCR反応によって増幅されたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明方法により、従来の方法に比べて、木材から不純物のより少ないＤＮＡを短時間かつ低労力で取り出すことが可能になる。そのため、本処理によって得られた産物からは、ＤＮＡの抽出工程を経ることなく、PCRによるＤＮＡの特定領域の増幅に供することが可能である。そのため、ＤＮＡを用いた木材の樹種や個体の識別等の定性的な分析には、本発明は非常に有効である。
【００２４】
木材の輸出入に関する通関手続き、商品の品質表示、環境負荷の少ない木材種の証明、犯罪捜査等、様々な状況で木材の樹種を明確にする必要性は高くなってきている。木材の樹種を識別するためには、一般に、木材の切片を切り出し、顕微鏡観察によって行われている。この方法では、顕微鏡による組織観察に熟練が必要であるとともに、生物学的な属レベルまでの識別が限界であった。ＤＮＡ分析を用いると、生物学的な種レベルの識別や個体識別が可能であり、樹木を含む多くの生物で種や個体の識別が行われている。木材の識別においても、ＤＮＡ分析によるそれらの識別は可能であることは認められているが、ＤＮＡ抽出にかかる労力やコスト、ＤＮＡ収率の低さによって、普及していない。
【００２５】
本発明方法は、そういったＤＮＡ抽出にかかる時間や労力、コストを軽減でき、木材や木材製品のＤＮＡ分析技術の一般化に有用である。