(57)【要約】【課題】米糠、米胚芽等の植物素材から得られたスフィンゴ糖脂質の精製画分について、ｉＮＫＴ細胞の新規リガンドを同定すると共に、その作用機序を明らかにし、各種病態（感染症、腫瘍、アレルギー等）への有効性を検討し、医薬品及び診断薬への応用の可能性を提供すること、すなわち、本精製画分を用いたｉＮＫＴ細胞活性化剤の提供。【解決手段】米糠、米胚芽及び／又はこれら由来のスフィンゴ糖脂質からなるｉＮＫＴ細胞活性化剤であり、米糠、米胚芽及び／又はこれら由来の素材を有機溶媒抽出して得たスフィンゴ糖脂質含有粗製画分を、クロマトグラフィー及び／又は再結晶により分画したスフィンゴ糖脂質精製画分からなることを特徴とする上記のｉＮＫＴ細胞活性化剤であり、またｉＮＫＴ細胞活性化作用に基づく機能性食品、機能性健康飲料、食品添加物、化粧品、医薬部外品、医薬品、診断薬、生化学研究用試薬等である。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
米糠、米胚芽及び／又はこれら由来のスフィンゴ糖脂質からなるｉＮＫＴ細胞（インバリアントナチュラルキラーＴ細胞）活性化剤。
【請求項２】
スフィンゴ糖脂質が米糠、米胚芽及び／又はこれら由来の素材を有機溶媒抽出して得たスフィンゴ糖脂質含有粗製画分を、クロマトグラフィー及び／又は再結晶により分画したスフィンゴ糖脂質精製画分からなることを特徴とする請求項１に記載のｉＮＫＴ細胞活性化剤。
【請求項３】
有機溶媒抽出がアルコール、ケトン、塩化炭化水素及び／又はこれらの混合溶媒、及び／又は水とこれらの混合溶媒抽出である請求項２に記載のｉＮＫＴ細胞活性化剤。
【請求項４】
クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーである請求項２に記載のｉＮＫＴ細胞活性化剤。
【請求項５】
クロマトグラフィーが液体クロマトグラフィーである請求項２に記載のｉＮＫＴ細胞活性化剤。
【請求項６】
再結晶がアルコール、ケトン及びこれらの混合溶媒、及び／又は水とこれらの混合溶媒である請求項２に記載のｉＮＫＴ細胞活性化剤。
【請求項７】
スフィンゴ糖脂質がβ−グルコシルセラミドである請求項１に記載のｉＮＫＴ細胞活性化剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｉＮＫＴ細胞活性化剤を含有することを特徴とする医薬。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｉＮＫＴ細胞活性化剤を含有することを特徴とする診断薬。
【請求項１０】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のｉＮＫＴ細胞活性化剤を含有することを特徴とする機能性飲食物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米糠、米胚芽等の植物素材から得られたスフィンゴ糖脂質からなるｉＮＫＴ細胞（インバリアントナチュラルキラーＴ細胞）活性化剤に関し、詳しくは、かかるｉＮＫＴ細胞活性化剤を含有してなる医薬、特に免疫増強剤、抗癌剤、抗アレルギー剤、感染抵抗性増強剤、更にはｉＮＫＴ細胞新規リガンド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
コメは古くから日本人の主食として、我が国において最も広く栽培されてきた穀物資源である。コメは、玄米のまま食用とされることは少なく、精米後白米として食用に供されている。これまで、精米過程で生じる大量の米糠は、一部は飼料・肥料として利用されてきたものであるが、その多くは農業廃棄物として処理されてきた。
【０００３】
近年、コメ原油（米糠由来）からコメ油を精製する過程で生じるガム質からレシチン、セラミド等が、また、ワックスから高級脂肪酸等が、ダーク油からγ−オリザノール、フェルラ酸等が、スカム（scum：浮き滓）からトコトリエノール、ビタミンＥ等多くの有用な生理活性物質が単離・精製されてきており、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品添加物、食品等として広く用いられるようになった。
【０００４】
また、コメ油を絞った後に生じる脱脂糠には、ＧＡＢＡ、フィチン酸、イノシトール等の生理活性物質が含まれており、有用な天然生理活性物質として利用されている。特に、コメセラミド（コメスフィンゴ糖脂質）は、種々のβ−グルコシルセラミド（β−ＧｌｕＣｅｒ）からなり、動物性セラミドと同様に保湿効果並びに血中脂質低下作用等を有することから、化粧品や健康食品等として用いられており、最近では、脂質代謝に関与する可能性のあることが示唆されている（特許文献１）。
【０００５】
さらにコメセラミド（コメスフィンゴ糖脂質）に限らず、スフィンゴ糖脂質を含有するＮＫＴ細胞活性化用組成物、ＩＬ−４産生促進用組成物、ＩＦＮ−γ産生促進用組成物、樹状細胞活性化用組成物、ＩＬ−１２産生促進用組成物、ＩＬ−１０産生促進用組成物、ＮＫ細胞活性化用組成物、抗腫瘍作用組成物、抗アレルギー作用組成物、感染抵抗性増強用組成物、抗ウイルス作用組成物、ＩＬ−６産生促進用組成物、ＮＯ産出促進用組成物等に関する提案もなされている（特許文献２）。
【０００６】
また更に、広く植物素材を原料としたスフィンゴ糖脂質含有物の製造方法（特許文献３）、更にはスフィンゴ糖脂質を配合した大腸癌予防剤なども提案されている（特許文献４）。
一方、非食性の海綿由来のスフィンゴ糖脂質（α−ガラクトシルセラミド；α-GalCer）にｉＮＫＴ細胞活性化作用のあることが知られており、免疫増強剤や抗癌剤としての可能性が指摘されている（特許文献５）。
【０００７】
しかしながら、コメセラミド、そのなかでも特にコメスフィンゴ糖脂質のｉＮＫＴ細胞活性化作用、あるいはｉＮＫＴ細胞のリガンドについては殆ど明らかにされておらず、また、混合物であるコメスフィンゴ糖脂質のどの成分が活性を示すのかについては全く明らかにされていないのが現状である。
【特許文献１】国際公開特許ＷＯ２００５／０６８０４１号
【特許文献２】特開２００５−２６３７９７号公報
【特許文献３】特開２００５−１２０３２１号公報
【特許文献４】特開２００５−１８７３９１号公報
【特許文献５】特開２００６−２９０８５６号公報
【非特許文献１】Science, 278: 1626, 1997
【非特許文献２】Annu. Rev. Immunol., 23: 877, 2005
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 1351, 2005
【非特許文献４】Nature, 434: 520, 2005
【非特許文献５】Nature, 434: 525, 2005
【非特許文献６】Eur. J. Immunol., 35: 1692, 2005
【非特許文献７】Nat. Immunol., 7: 978, 2006
【非特許文献８】Science, 306: 1786, 2004
【非特許文献９】Nature, 434: 525, 2005
【非特許文献１０】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 5977, 2007
【０００８】
現在のところ、癌（腫瘍）に対する予防策は殆どなく、治療にのみに委ねられている。その治療方法は、各種抗癌（腫瘍）剤、放射線、外科的摘出、若しくは何れかを組み合わせることにより行われているが、抗癌剤の場合には強い副作用があること、放射線療法の場合には多額の費用がかかること、外科的に摘出した場合には患者にかなりの負担がかかること、及びこれらの治療を施したとしても再発の可能性が非常に高いことから、有効な治療方法がないというのが現状である。
このように、癌（腫瘍）に対する既存の予防法・治療法の限界に加えて、食生活や日常生活におけるストレスが急増している昨今、癌疾患への罹患数が世界的に増加していることから、癌（腫瘍）に対する安全、確実かつ簡便に提供できる新規予防薬・治療薬の開発が急務である。
【０００９】
また、これまで、種々の感染症に対する予防策としてワクチンが広く用いられてきた。ワクチンは、目的とする病原微生物に対する特異的免疫応答が長期間持続することを利用したものであるが、対象となる病原微生物によって効果の持続期間が大きく異なること、病原体によっては変異を起こすこと、並びに個体差を生じる場合があることから、必ずしも有効な予防策とはいえない。また、生ワクチンでは使用する弱毒株の変異する可能性があり、安全面において問題がある。
【００１０】
一般に、感染症に罹患した場合の治療薬として、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤などの抗生物質が使用されている。抗生物質はヒトの細胞を破壊することなく体内の微生物を減少（あるいは死滅）させると共に、生体の免疫応答によって残存する病原微生物を殺傷・排除させるために投与される。
しかし、近年、抗生物質の多用によって多剤耐性菌が出現し、院内感染・日和見感染など、社会的問題となっていることから、緊急な対策が必要とされる。
このように、感染症に対する既存の予防法・治療法の限界に加えて、再興感染症並びに新興感染症への罹患数が世界的に増加していることから、安全、確実かつ簡便に提供できる新規予防薬・治療薬の開発が急務である。
【００１１】
かかる現状下において、本発明者等は、これまで農業廃棄物として処理されてきた米糠の有効利用を目的に、米糠より得られたスフィンゴ糖脂質を高濃度に含有する精製画分について、ｉＮＫＴ細胞の新規リガンドを単離・同定すると共に、その作用機序を明らかにすることにより、機能性食品、機能性健康飲料、食品添加物、化粧品、医薬部外品、医薬品、診断薬、生化学研究用試薬等としての有用性を明確にするべく検討を加えた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
すなわち本発明は、米糠、米胚芽等の植物素材から得られたスフィンゴ糖脂質の精製画分について、ｉＮＫＴ細胞の新規リガンドを単離・同定すると共に、その作用機序を明らかにし、各種病態（感染症、腫瘍、アレルギー等）への有効性を検討し、医薬品及び診断薬への応用の可能性を提供すること、すなわち、本精製画分を用いたｉＮＫＴ細胞活性化剤を提供することを課題とする。
【００１３】
かかる課題を解決するべく本発明者等は鋭意検討を行った結果、米糠、米胚芽等の植物素材の有機溶媒抽出画分を分離、精製することにより得られたスフィンゴ糖脂質含有精製画分に強いｉＮＫＴ細胞活性化作用があること、したがって、かかるｉＮＫＴ細胞活性化作用を介した免疫増強作用があること、特に癌転移抑制作用、感染抵抗性増強作用等があることを確認し、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
而して、上記した課題を解決するための本発明は、その基本的態様として、米糠、米胚芽及び／又はこれら由来のスフィンゴ糖脂質からなるｉＮＫＴ細胞活性化剤である。
【００１５】
具体的には、本発明は、スフィンゴ糖脂質が米糠、米胚芽及び／又はこれら由来の素材を有機溶媒抽出して得たスフィンゴ糖脂質含有粗製画分を、クロマトグラフィー及び／又は再結晶により分画したスフィンゴ糖脂質精製画分からなることを特徴とする上記のｉＮＫＴ細胞活性化剤である。
【００１６】
より具体的には、有機溶媒抽出がアルコール、ケトン、塩化炭化水素及び／又はこれらの混合溶媒、及び／又は水とこれらの混合溶媒抽出である上記のｉＮＫＴ細胞活性化剤である。
【００１７】
さらに具体的には、クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィー、或いは液体クロマトグラフィーである上記のｉＮＫＴ細胞活性化剤である。
【００１８】
また本発明は、再結晶がアルコール、ケトン及びこれらの混合溶媒、及び／又は水とこれらの混合溶媒である上記のｉＮＫＴ細胞活性化剤である。
【００１９】
例えば、本発明は、より具体的には、有機溶媒抽出がエタノール抽出であり、クロマトグラフィーがシリカゲルカラムクロマトグラフィーであり、さらにカラムクロマトグラフィーの溶出溶媒として、順次クロロホルム／クロロホルム−アセトン混液／メタノールにより溶出して得たスフィンゴ糖脂質精製画分からなるｉＮＫＴ細胞活性化剤である。
【００２０】
このようにして精製された分画のなかで、スフィンゴ糖脂質はメタノール溶出部分に存在し、そのままでも用いることができるが、更に精製工程を加えることができる。
【００２１】
すなわち、メタノール溶出画分をメタノールで再結晶して得られた白色結晶性粉末であるスフィンゴ糖脂質は、更に高活性である。
【００２２】
あるいは、メタノール溶出画分を分取液体クロマトグラフィーにより更に精製して得られた白色結晶性粉末であるスフィンゴ糖脂質は、更に高活性である。
【００２３】
この白色結晶性粉末であるスフィンゴ糖脂質はβ−グルコシルセラミドであった。
【００２４】
また本発明は別の態様として、上記したｉＮＫＴ細胞活性化剤を含有する医薬を提供するものであり、具体的には、免疫増強剤、抗癌剤、癌転移抑制剤、感染抵抗性増強剤、抗アレルギー剤である。
【００２５】
具体的には、本発明はｉＮＫＴ細胞活性化、それに基づく顆粒球（好中球）誘導・活性化、マクロファージ（以下、「ＭΦ」と記す場合もある）活性化作用を介した抗癌剤、癌転移抑制剤、抗アレルギー剤及び感染抵抗性増強剤である。
【００２６】
さらに本発明は別の態様として、上記したｉＮＫＴ細胞活性化作用によるｉＮＫＴ細胞活性化診断薬及び／又はｉＮＫＴ細胞検出試薬であり、また、ｉＮＫＴ細胞活性化剤を含有することを特徴とする機能性飲食物である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、米糠中に存在する、ｉＮＫＴ細胞の新規リガンドが同定され、本リガンドの各種病態に対する有効性、並びに作用機序を明確にすることによって、我が国の主食である安全性に優れた米を原料とした新たな機能性食品素材、医薬品原料、診断薬及び生化学研究用試薬を提供することができる。
【００２８】
これまで、食物素材中にｉＮＫＴ細胞を選択的に活性化する物質は見つかっていないことから、本発明は米糠中にｉＮＫＴ細胞の新規リガンドが存在する可能性、並びに本細胞の活性化を介して種々の病態を改善する作用を有することを見出したという点において本発明の効果は格別顕著なものである。
【００２９】
特に、本発明が明らかにした米糠抽出成分であるスフィンゴ糖脂質含有抽出物のｉＮＫＴ細胞を選択的に活性化することによる免疫増強作用は、日本人が主食とする米の重要性を再認識すると共に、その多くが農業用廃棄物として処理されていた米糠の新規利用方法を見出したという点において、その貢献度は多大なものである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明のFr.８のメタノール再結晶画分のHPLCによるPeak １〜５のチャートを示した図である。
【図２】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８のＮＫＴ細胞に及ぼす影響の結果を示した図である。
【図３】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８のα-CalCer/CD1d tetramer反応性Ｔ細胞（ｉＮＫＴ細胞）に及ぼす影響の結果を示した図である。
【図４】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８のＮＫＴ細胞に及ぼす影響について、ｉＮＫＴ細胞活性化作用は米糠に特有のものであることを示した図である。
【図５】スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８のうち、Peak ５のみを除去した画分のＮＫＴ細胞に及ぼす影響の結果を示した図である。
【図６】ｉＮＫＴ細胞のリガンドがFr.８中のPeak ５を含む分画に存在することを示した図である。
【００３１】
【図７】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８の再結晶品について、ｉＮＫＴ細胞活性化作用を測定した図である。
【図８】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８の腫瘍転移に及ぼす影響の結果を示した図である。
【図９】メラノーマ細胞転移マウスへ米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８を投与し、腫瘍細胞の消失の結果を示した写真である。
【図１０】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８のリステリア感染に対する影響の結果を示した図である。
【図１１】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８投与後の好中球数並びにその活性化マーカーの発現を示した図である。
【図１２】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８投与後９０分後肝内白血球中の顆粒球（好中球）数の結果を示した図である。
【００３２】
【図１３】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８投与により増加の認められた好中球のリステリア排除に及ぼす影響の結果を示した図である。
【図１４】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８のＭΦの殺菌能に及ぼす影響の結果を示した図である。
【図１５】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８のＭΦ活性化に及ぼす影響の結果を示した図である。
【図１６】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８のIFN-γ産生への影響の結果を示した図である。
【図１７】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８のＮＯ産生への影響の結果を示した図である。
【図１８】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８をCAPCELL PAK UG120で分析した結果を示した図である。
【図１９】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８をCAPCELL PAK UG120で分析して得られたPeak １〜７のＮＫＴ細胞に及ぼす影響の結果を示した図である。
【図２０】米糠スフィンゴ糖脂質精製画分Fr.８のマウス経口投与による結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は上記したように、その基本的態様は、米糠、米胚芽及び／又はこれら由来のｉＮＫＴ細胞活性化剤であり、より具体的には、米糠、米胚芽及び／又はこれら由来の素材を有機溶媒抽出して得たスフィンゴ糖脂質含有粗製画分を、クロマトグラフィー及び／又は再結晶により分画したスフィンゴ糖脂質精製画分からなることを特徴とするｉＮＫＴ細胞活性化剤である。
かかるスフィンゴ糖脂質精製画分は、具体的には、米糠或いは米胚芽、更にはこれらの素材、例えば、米糠或いは米胚芽を原料とするコメ油の製造過程で得られる残渣を用いても得ることができる。
【００３４】
より具体的には、米糠、米胚芽及び／又はこれら由来の素材を有機溶媒、特にアルコール、好ましくはエタノールを用いて抽出してスフィンゴ糖脂質含有粗製画分を得る。
本発明にあっては、かかるアルコール抽出処理に際し、その前処理として、例えばヘキサンにより混合処理し、脂溶性の不純物を除去しておくのが好ましい。
【００３５】
本発明における有機溶媒抽出手段は、一般的な抽出操作方法を適用することができる。また、抽出温度、抽出時間は一概に限定することはできず、室温〜加温下に１〜２４時間程度行えばよい。
具体的には、米糠、米胚芽及び／又はこれら由来の素材を、有機溶媒、特にアルコール、好ましくはエタノールを添加し、攪拌等の処理を適宜加え、溶媒抽出を行う。アルコールの添加量は、原料素材１重量部に対して０．５〜１０重量部程度、好ましくは、１〜５重量部である。アルコールの添加量が少なければその抽出操作は容易になるが、要はスフィンゴ糖脂質の抽出量を高める添加量を選択すべきである。
抽出温度は室温〜７０℃程度、好ましくは３０℃〜６０℃の範囲内で行うのがよい。抽出時間は１〜２４時間程度、好ましくは２〜５時間程度である。
【００３６】
アルコール抽出が終了した時点で、濾過して得たアルコール溶媒を減圧下に留去して残留物を得る。得られた残留物にアセトンを適量加えて加熱溶解し、得られた粗結晶を再度アルコールに溶解する。アルコール可溶化部分を含む溶液をイオン交換樹脂にて処理を行い、溶媒を留去した後、適量のアセトン処理を行い、スフィンゴ糖脂質含有粗抽出物（すなわち、粗製画分）を得る。
【００３７】
かくして調製されたスフィンゴ糖脂質含有粗抽出物におけるスフィンゴ糖脂質の純度は、製造ロットにより異なるが、約６０〜８０％程度である。本粗抽出物もｉＮＫＴ細胞活性作用や顆粒球（好中球）誘導・活性化、ＭΦ活性化作用を示す。
本発明が提供するスフィンゴ糖脂質精製画分は、かかるスフィンゴ糖脂質含有粗抽出物をさらに分画して得た精製画分であるが、その分画は例えば、カラムクロマトグラフィー等の処理で行うことができる。
【００３８】
具体的には、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーが好ましく、カラム溶出溶媒としてはクロロホルム、アセトン、アルコール、好ましくはメタノールを挙げることができる。
本発明者等の検討によれば、特に、順次クロロホルム／クロロホルム−アセトン混液／メタノールで溶出するのがよく、この溶出により、メタノール溶出画分に、ｉＮＫＴ細胞活性化作用を示すスフィンゴ糖脂質が比較的高純度に含有されていることが判明した。
得られたスフィンゴ糖脂質は、β−グルコシルセラミドを主成分とし、グルコース、スフィンゴイド塩基部位、脂肪酸残基からなるものであった。
【００３９】
さらに、高純度に精製するには、メタノール溶出画分をメタノールで再結晶することにより、ｉＮＫＴ細胞活性化作用を示すスフィンゴ糖脂質を高純度に濃縮するのがよい。
【００４０】
あるいは、ｉＮＫＴ細胞活性化作用を示すスフィンゴ糖脂質を単一の物質として単離・精製するには、逆相系のカラムを用いた分取液体クロマトグラフィーに付すことにより行うことができる。
【００４１】
以上のようにして調製された本発明のスフィンゴ糖脂質精製画分について、その作用を検討した結果、得られたスフィンゴ糖脂質含有精製画分には強いｉＮＫＴ細胞活性化作用が認められ、かかるｉＮＫＴ細胞活性化作用を介した免疫増強作用があること、特に癌転移抑制作用、感染抵抗性増強作用があることが確認された（後記試験例を参照）。
したがって本発明は、得られたスフィンゴ糖脂質含有精製画分をもとに、ｉＮＫＴ細胞の新規リガンドを単離・同定し、本リガンドの各種病態に対する有効性、並びに作用機序を明確にすることができた。
【００４２】
その点からみれば、本発明は、我が国の主食である安全性に優れた米を原料とした新たな機能性食品素材、生化学研究用試薬及び医薬品原料を提供するものであり、得られたスフィンゴ糖脂質精製画分について、幅広い用途が期待できる。
【００４３】
現在、国民の多くが健康志向にあり、それに伴って健康食品ブームが過熱化していること、アンチエイジング（抗加齢・抗老化）に対する国民の関心がこれまで以上に高まっていること、並びに最近の研究により、免疫系の異常が加齢と深く関わっていることが明らかにされている。したがって、安全性の高い健康食品、健康飲料、化粧品、そのなかでも特に免疫能を高めるような食品、飲料、化粧品の開発が社会的に強く要求されている。
【００４４】
また、これまでの疾病に加えて新たな疾病が出現すると共に、癌や新興感染症、再興感染症、花粉症に代表されるアレルギーなどが増大し、これら疾病に対する早急な対策が社会的に必要とされている。本発明は、上述した課題克服に貢献する可能性が極めて高いものといえる。
【００４５】
これまで、食物にｉＮＫＴ細胞を選択的に活性化する物質は見つかっていないことから、本発明は米糠中にｉＮＫＴ細胞の新規リガンドが存在する可能性、並びに本細胞の活性化を介して種々の病態を改善する作用を有することを見出したという点においては、極めて特異的なものである。
今回明らかになった米糠より抽出・分画したスフィンゴ糖脂質画分（新規ｉＮＫＴ細胞リガンド）による免疫増強作用は、日本人が主食とする米の重要性を再認識すると共に、多くが農業用廃棄物として処理されていた米糠の新規利用方法を見出したという点において、その貢献度は多大なものである。
【００４６】
近年、化学的に合成された（もともとは海綿中に発見された）α-GalCer がｉＮＫＴ細胞のリガンドであり、ｉＮＫＴ細胞依存性に強い抗腫瘍効果や感染制御作用を示すことが明らかになったことから（非特許文献１及び２）、抗癌剤・抗感染症薬・抗アレルギー薬としての期待が高まっている。しかし、ヒトを含めた哺乳類が海綿と遭遇する可能性は極めて低いことから、その後多くの研究者によってナチュラルリガンドの探索が始まった。その結果、Sphingomonas・Ehrlichia の細胞壁に存在するα−グルクロノシルセラミド（非特許文献３〜６）、Borreliaに存在するα−ガラクトシルジアシルグリセロール（非特許文献７）等が本細胞のナチュラルリガンドであることが明らかとなった（リソソームに存在するイソグロボトリヘキソシルセラミドも本細胞のナチュラルリガンドであると報告されたが（非特許文献８及び９）、現在は否定的である（非特許文献１０））。
【００４７】
現在、化学的に合成したスフィンゴ糖脂質を用いてｉＮＫＴ細胞のリガンドを探索している研究者は多いが、何れもα−GalCer のような強い活性は認められておらず、本当の意味でのナチュラルリガンドが存在しているか否かについては今日まで不明であることから、今回明らかになった米糠由来精製スフィンゴ糖脂質中に見出された新規ｉＮＫＴ細胞ナチュラルリガンドは、免疫に関する生化学研究及び医療の分野において多大なる貢献を示すものといえる。
【００４８】
本スフィンゴ糖脂質精製画分から成るｉＮＫＴ細胞活性化剤、並びに該活性化剤を含有する抗癌（癌転移抑制）剤、感染抵抗性増強剤、抗アレルギー剤、顆粒球（好中球）誘導・活性化剤、マクロファージ活性化剤、研究用試薬は、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って、本画分を、そのまま、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等の医薬製剤として安全に投与することができる。
【００４９】
具体的には、本スフィンゴ糖脂質精製画分の含有量は、製剤全体の１〜１００重量％であればよいが、１０〜１００重量％が好ましく、５０〜１００重量％がより好ましい。
本スフィンゴ糖脂質精製画分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法等により異なるため、特に制限されないが、一般的に、患者（体重６０ｋｇとして）に対して、１日につき０．１〜１００ｍｇ、好ましくは１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは１．０〜２０ｍｇ程度である。
本スフィンゴ糖脂質精製画分の投与方法は、特に制限されず、適宜選択することができる。なかでも、好ましくは静脈注射である。但し、固形腫瘍においては局所に投与してもよいことはいうまでもない。
【００５０】
薬理学的に許容される担体としては、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。さらに必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。
【００５１】
崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００５２】
懸濁化剤としては、例えば、ポリソルベート、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
【００５３】
等張化剤としては、例えばブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。無痛化剤としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等が挙げられる。
【００５４】
本法により得られたスフィンゴ糖脂質は、化学的に合成したものであってもよいが、安全面から米糠、米胚芽及び／又はこれら由来の素材から得たものが好ましい。
【００５５】
なお、本発明のスフィンゴ糖脂質精製画分からなるｉＮＫＴ細胞活性化剤、並びに該活性化剤を含有する抗癌（癌転移抑制）剤、感染抵抗性増強剤、抗アレルギー剤、顆粒球（好中球）誘導・活性化剤、マクロファージ活性化剤、更に研究用試薬は、本スフィンゴ糖脂質精製画分に治療又は予防効果があることに基づいて上述した疾病の予防や治療に用いられる薬剤を意味し、他の有効成分と共に本スフィンゴ糖脂質精製画分を単にアジュバントなどとして含む薬剤は意味しない。
【実施例】
【００５６】
以下に本発明を、具体的な米糠スフィンゴ糖脂質の単離の実際、並びに得られたスフィンゴ糖脂質精製画分の作用を記載することにより、詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００５７】
試験例１：米糠スフィンゴ糖脂質の単離
米原油に水を加えて得られる水和ガムを、脱脂、中和後、不溶物を除去し、スフィンゴ糖脂質１％程度を含む原料を得た。
この原料５００ｇを適量のヘキサンに加熱溶解し、脂溶性の不純物を除去した。溶媒を留去して得た残留物にエタノール７５０ｍＬを加えて攪拌し、溶媒を除去した。得られた残留物にアセトンを適量加えて加熱溶解し、再結晶した。得られた粗結晶をエタノールに再溶解して配糖体を除去した後、エタノール可溶画分を陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９００：オルガノ社製）、及び陽イオン交換樹脂（アンバーライト２００−Ｃ：オルガノ社製）処理を行った。樹脂処理物の溶媒を除去して、残留物を適量のアセトンで再結晶して、米糠スフィンゴ糖脂質１．０ｇ（収率０．５％）を単離した。このようにして得られたスフィンゴ糖脂質の純度は、ＥＬＳＤ−ＨＰＬＣ（光散乱検出機付き液体クロマトグラフィー）で定量した結果、ロットにより異なるが、約６０〜８０％程度であった。
同様の方法により、トウモロコシ、蒟蒻、小麦及びブタ脳などからスフィンゴ糖脂質を得ることができた。
【００５８】
試験例２：米糠スフィンゴ糖脂質の分離
上記試験例１で得られた米糠スフィンゴ糖脂質８ｇをクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（フラッシュクロマトグラフィー用シリカゲル４０ｇをクロロホルムに懸濁：球状、関東化学社製）で分画した。
分画は、クロロホルム：アセトン＝１０：０→９：１→８：２→７：３→６：４→５：５→４：６の各６００ｍＬ、及びメタノール６００ｍＬで溶出し、溶媒を除去した。
このようにして得られた各画分の回収例は、下記表１に示すとおりであった。
【００５９】
【表１】
2010270104.tif 000003
【００６０】
各画分のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ：シリカゲル、クロロホルム：メタノール＝１０：１、濃硫酸で呈色）及び液体クロマトグラフィーの結果より、フラクション５及び６（Fr.５及びFr.６）は配糖体を、フラクション７及び８（Fr.７及びFr.８）はスフィンゴ糖脂質を主成分とするスフィンゴ糖脂質精製画分であった。
【００６１】
上記したフラクション８（Fr.８）は、ODS-120A（4.6mm(ID)15.0cm）カラムを使用し、溶離溶媒としてメタノール/水＝15/1（流量：1.00mL/分）により４０℃条件下でＨＰＬＣ分析を行った結果、少なくとも５つのピーク（Peak １〜5）から構成されており、これを更にメタノールで再結晶した結果、Peak ５が濃縮されていることが明らかとなった。
このＨＰＬＣ上におけるピーク状態を図１に示した。
【００６２】
また、別の抽出・分離・精製方法を用いて精製したスフィンゴ糖脂質画分をＨＰＬＣにより解析したところ、上記したPeak ５のみが欠失しているフラクションの精製にも成功した。
【００６３】
同様の方法により、トウモロコシ、蒟蒻、小麦、並びにブタの脳から抽出・分離したスフィンゴ糖脂質精製画分を解析したところ、上記したPeak ５は認められなかった。
【００６４】
以上のようにして得られたスフィンゴ糖脂質精製画分について、その薬理作用を検討した。
なお、生体に対する安全性（細胞増殖能および細胞生存率）については、安全性試験において確認済みである。
【００６５】
薬理試験例：
［使用マウス］
C57BL/6マウス並びに各種ｉＮＫＴ細胞欠損マウス（何れも雌マウス８〜１２週齢）を実験に供した。
【００６６】
［使用腫瘍株］
メラノーマ細胞株（B16）並びにT lymphoma（EL4）を実験に供した。
【００６７】
［使用菌株］
Listeria monocytogenes（ＥＧＤ株）（リステリア）並びにSalmonella enterica Serovar Typhimurium（LT-2株）を実験に供した。
【００６８】
［投与］
C57BL/6マウス並びに各種ｉＮＫＴ細胞欠損マウスの腹腔内に各画分を１５０μｇ投与した。
なお、以下の実験では、各群間での体重差が１ｇ未満のマウスを用いた。
【００６９】
［抗体］
Fcγreceptor (R)(2.4G2)並びにLy6G（Gr-1：RB6-8C5）に対するモノクローナル抗体（monoclonal antibody: mAb）は、ハイブリドーマ培養上清より精製したものを、また fluorescein isothiocyanate (FITC) 標識抗CD3ε mAb（145-2C11）、FITC標識抗TCR-β mAb（H57-597）、Phycoerythrin（PE）標識抗CD11b mAb（Mac-1: M1/70）、FITC標識抗Ly6G mAb（Gr-1: REB-8C5）、並びにビオチン標識抗NK1.1 mAb（PK136）は、BD PharMingen（Hamburg, Germany）より購入したものを実験に供した。
【００７０】
［試薬］
牛胎児血清（Fetal calf serum: FCS）は Trace Biosciences（Castle Hill, HSW, Australia）、パーコール（比重：1.124 g/mL）は Biochrom（Berlin, Germany）、RPMI 1640は日水製薬株式会社（Tokyo, Japan）、ＨＥＰＥＳは同仁化学研究所（Kumamoto, Japan）、Ｌ−グルタミン及びペニシリン / ストレプトマイシンはInvitrogen（Carlsbad, CA, USA）、２−メルカプトエタノール、炭酸水素ナトリウム、塩化アンモニウム、TRIS（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）及びアジ化ナトリウムは和光純薬工業株式会社（Osaka, Japan）、ウシ血清アルブミン（Bovine serum albumin: BSA）はThermo（Hamilton, New Zealand）、ストレプトアビジン（streptavidin: SA）標識 Cy5 はBD PharMingen（Hamburg, Germany）、パラホルムアルデヒドはMerck（Darmstadt, Germany）より購入したものを実験に供した。
【００７１】
［α−GalCer/CD1d tetramer の作製］
マウスCD1d/β2-ミクログロブリン（β2-microglobulin: β2m）tetramerはBirA biotinylation siteとCD1dを用いたバキュロウイルス発現系を用いて調製した。すなわち、Sf9 昆虫細胞株（BD Bioscience, Heidelberg, Germany）にマウスCD1d/β2mを発現したウイルスを感染させ、Sf-900 無血清培地中で培養した。感染後３又は４日目の培養上清を回収し、hollow fiber tangential flow module（MiniKros 1100 cm2, Spectrum, MembraPure, Boddenheim, Germany）により濃縮した。CD1d 分子は、コバルト塩化物イオン荷電したNTA-セファロースカラム（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を用いた金属キレートクロマトグラフィー（Chelating sepharose Fast flow, Amersham Pharmacia Biotech）で精製した。タンパクは200 mMイミダゾールで溶出し、ultrafiltration（Ultrafree Units, Millipore, Bedford, MA）により0.5 mL まで濃縮し、その精度とタンパク量はそれぞれ SDS-PAGE 並びに Bradford reagent（BioRad, Munich, Germany）にて確認した。精製したCD1dタンパクはBirA 酵素でビオチンと結合させ、ゲル濾過（Superdex 200 HR10/30, Amersham Pharmacia Biotech）により精製した。モル濃度が 3：1（脂質：タンパク）になるように 0.5% Tween 20 添加リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline: PBS）に溶解したα-GalCer（Kirin Pharma, Co., LTD., Tokyo, Japan）とCD1d/β2mタンパクを混合し、室温にて一晩反応させた。α-GalCer/CD1d/β2m monomerにSA-PEをモル濃度で1：4（monomer：SA-PE）の割合となるように加え、４量体を生成し、ゲル濾過（Superdex 200 HR10/30, Amersham Pharmacia Biotech）によりα-GalCerと結合したPE 標識α-GalCer/CD1d/β2m tetramerを精製した。
【００７２】
［肝内白血球の調製］
C57BL/6マウスを頸椎脱臼若しくはジエチルエーテルにより安楽死させ、complete medium（CM: 20 mM HEPES/10%重炭酸ナトリウム／Ｌ−グルタミン（293μg/mL）/ペニシリン（100 U/mL）/ストレプトマイシン（100μg/mL）/10% FCS/２−メルカプトエタノール（10５M）含有 RPMI 1640培地）にて灌流後、肝臓を摘出した。肝臓は金属メッシュで潰し、細胞浮遊液を500rpmで20秒間遠心した。上清を1,500rpmで５分間遠心後、沈渣に40%パーコール（CMで希釈）を加え、70% パーコール（CMで希釈）に重層した。1,800rpmで２３分間遠心した後、40%並びに70%パーコールの中間層を回収した。溶血用緩衝液（蒸留水に塩化アンモニウム8.3mgを溶解し、0.17 M Tris緩衝液（pH 7.6）111mLを加えたもの）により溶血後、CMにて洗浄し、1×10６/mLとなるように細胞をCMに浮遊させた。
【００７３】
［肝内顆粒球（好中球）の調製］
C57BL/6マウスを頸椎脱臼により安楽死させた後、肝臓をCM にて灌流し、肝臓を摘出した。金属メッシュで潰した後、比重1.095g/mLのパーコール 溶液の上に1.085g/mL、1.070g/mLのパーコール 溶液を重層した最上部に細胞浮遊液を重層した。500gで４℃、３０分間遠心した後、1.085g/mLと1.095g/mLパーコール 溶液の中間層を回収し、洗浄後、phenol red 不含HEPES・10% FCS含有MEM培地に浮遊した。本法により９５％以上の顆粒球（好中球）が得られ、抗 Ly6G mAb による染色により、本画分中に９４〜９６％の顆粒球（好中球）の存在していることが確認された。
【００７４】
［腹腔内細胞並びに腹腔ＭΦの調製］
C57BL/6マウスをジエチルエーテルにより安楽死させた後、CM 5mLを腹腔内に投与し、腹腔内細胞を回収した。洗浄後、6-well tissue culture plate (Corning Inc., Canton, NY) 中で３７℃、２時間培養し、付着性細胞と非付着性細胞を別々に回収した。なお、本法により得られた付着性細胞の９５％以上がＭΦであることは、フローサイトメトリー並びに免疫組織染色により確認した。
【００７５】
［フローサイトメトリー］
抗体の非特的結合を防ぐため、細胞を抗FcγR mAbと４℃、１５分間反応させた後、FITC、PE、ビオチン 標識 mAb と４℃、１５分間反応させた。ビオチン標識抗体はSA-標識 5（BD ParMingen）にて視覚化した。染色後、細胞を１％ paraformaldehyde（PFA）含有PBS（-）で固定後、フローサイトメーター（FACSCalibur（BD Biosciences））により取り込み、CellQuest software（BD Biosciences）により解析した。α-CalCer/CD1d tetramerによる染色は、blocking 後、PE標識 α-CalCer/CD1d tetramerと室温で１５分間反応させた。
【００７６】
［ｉＮＫＴ細胞の動態解析］
予め米糠由来スフィンゴ糖脂質精製画分、或いはVehicle を腹腔内投与したC57BL/6マウスの肝臓より上述したごとく白血球を調製した後、ｉＮＫＴ細胞の動態をフローサイトメトリー（mAb・α-GalCer/CD1d tetramerの両者）により解析した。
【００７７】
［顆粒球（好中球）の動態解析］
予め米糠由来スフィンゴ糖脂質精製画分、或いはVehicleを腹腔内投与したC57BL/6マウスの肝臓より上述したごとく白血球を調製し、顆粒球（好中球）の動態をフローサイトメトリーにより解析した。
【００７８】
［腫瘍転移抑制実験］
予め米糠由来スフィンゴ糖脂質精製画分、或いはVehicleを腹腔内投与したC57BL/6マウスに、メラノーマ細胞（B16）或いはT Lymphoma（EL4）を接種し、接種後の生存率、並びにB16接種マウスにあっては、接種後４０日目の肺における転移の程度を肉眼的に観察した。
また、マウスにB16を接種後２５日目に米糠由来スフィンゴ糖脂質精製画分を投与し、投与後６０日目の肺における転移の程度を肉眼的に観察した。
【００７９】
［感染実験］
予め米糠由来スフィンゴ糖脂質精製画分、或いはVehicleを腹腔内投与したC57BL/6マウスに、リステリアを感染し、感染４日目のマウスの脾臓を肉眼的に観察すると共に、肝臓、並びに脾臓における生菌数を測定した。
【００８０】
［顆粒球（好中球）消失実験］
マウスの腹腔内に150μg の 抗 Ly6G mAbをリステリア感染１日前に投与した。９５％以上のLy6G+ 細胞 が消失していることを蛍光標識した抗-Ly6G mAbを用いてフローサイトメトリー並びに免疫組織化学染色により確認した。抗Ly6G mAbを投与した群においては、蛍光標識したラットIgG2b（抗-Ly6G mAbに対する２次抗体）により Ly6G+ 細胞が検出できない（抗体が細胞に結合しているのではなく、細胞が完全に消失している）ことを確認した。
【００８１】
［顆粒球（好中球）のrespiratory burstの測定］
上述したごとく肝臓より顆粒球（好中球）を純化し、respiratory burst をluminol 依存性 chemiluminescence（CL）により測定した。すなわち、200μLの顆粒球（好中球）浮遊液（5×105 cells/mL）を50μLのluminol溶液（1.0×10-６M; Laboscience Co., Tokyo, Japan）と緩やかに攪拌しながら３７℃で５分間反応させた。200μLのオプソニン化したリステリア（107 CFU/mL）あるいは 10-6MのN-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin（FMLP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を添加後、３７℃に維持しながら luminometer（Lumiphotometer TD-4000, Laboscience）により１５分間測定した。
【００８２】
［ＭΦの殺菌能の測定］
マウスの腹腔内より純化した付着性細胞（ＭΦ）（１×10-6/well）を24-well tissue culture plates（Corning）にて２時間培養後、リステリア（１×10７/well）（MOI : 10）を感染した。６０分間反応させた後、細胞を予め温めておいた10%FCS 並びにゲンタマイシン（Sigma-Aldrich, Tokyo, Japan）（5μg/mL）含有 RPMI 1640で、ＭΦに取り込まれなかった菌体を除去した（P60）。細胞を更に10% FCS 並びにゲンタマイシン（5μg/mL）含有RPMI 1640で３０分間培養した（B30）。細胞を0.5% サポニン (Sigma-Aldrich)で処理し、超音波処理後、Tryptic soy agar platesに撒き、生菌数（Colony-forming unit: CFU）を４８時間後に測定した。殺菌能は以下の計算式により求めた。
100−{（B30 / P60）×100} (%)
データは以下の計算式により算出し、Bactericidal indexとして表した。
処理群{100−（（B30 / P60）×100）} / 未処理群{100−（（B30 / P60）×100）}
【００８３】
［IFN−γ並びにIL-4の測定］
IFN-γ並びにIL-4の産生はQuantikine（登録商標/R&D Systems Inc., Minneapolis, MN）を用いて測定した。検出限界は２pg/mLであった。
【００８４】
［Nitric oxide（ＮＯ）の測定］
ＮＯはGriess Reagent System（登録商標/ Promega Co., WI）により測定した。検出限界は2.5μMであった。
【００８５】
［ＭΦのRespiratory burstの測定］
腹腔ＭΦのrespiratory burstはCLにより測定した。すなわち、400μLの腹腔 ＭΦ浮遊液（1.2〜1.5x106細胞）に30μLのluminol 溶液（1.0×10−６M）を添加し、緩やかに攪拌しながら３７℃、５分間反応させた。その後、オプソニン化したリステリア（108 CFU /150μL）を添加し、Light release をLumiphotometer TD-4000（Laboscience）で１５分間反応させ、ピークを測定した。
【００８６】
［マウス経口投与によるｉＮＫＴ細胞活性化作用の測定］
C57BL/6 マウスを用い、Fr. ８を100nmのナノ分散末とし、経口ゾンデを用いてその200mg/mLナノ分散液の500μL（100mg/マウスに相当）を３日間連続投与し、最終投与２４時間後の肝内白血球をフローサイトメトリーにより解析した。
【００８７】
［結果と考察］
１．米糠スフィンゴ糖脂質精製画分の肝内白血球に及ぼす影響
マウスに米糠スフィンゴ糖脂質精製画分、或いはVehicleを投与し、２４時間後に肝臓内に存在する白血球をフローサイトメトリーにより解析した。
Vehicle 投与群では各細胞集団に殆ど変化は認められなかった。米糠スフィンゴ糖脂質粗製物を分画して得た各画分を投与した場合、Fr.８以外の画分を投与した場合には、大きな変化は認められなかったが、Fr.８投与群では、NK（CD3-NK1.1+）細胞、並びにＢ（CD3-NK1.1-）細胞はほとんど影響を受けなかったものの、NKT（CD3＋NK1.1+）細胞が選択的に著減し、それに伴ってＴ細胞の増加が認められた（図２にその結果を示した）。実施例１で得られた未精製のスフィンゴ糖脂質のうち、Peak ５を含むロットでは、程度の違いはあるものの、同様の現象が認められた。
ＮＫＴ細胞は幾つかの亜集団から構成されているが、その中でもＴ細胞受容体（TCR）としてVα14/Jα18を発現するｉＮＫＴ細胞だけが選択的に検出できなくなることをα-GalCer/CD1d tetramerを用いて確認した（図３にその結果を示した）。
【００８８】
トウモロコシ、蒟蒻、小麦、並びにブタの脳から同様に抽出したスフィンゴ糖脂質の活性の有無・強度を上記した方法により検討したところ、ｉＮＫＴ細胞の消失は全く認められなかった。
すなわち、検出された活性が米糠に特有のものであることが検証された（図４にその結果を示した）。
【００８９】
上記したごとく、Fr.８は少なくとも５つのピーク（Peak１〜５）から構成されているが、Peak５が欠失しているフラクションの活性を上記した方法により検討したところ、本フラクションにはｉＮＫＴ細胞活性化作用（ｉＮＫＴ細胞の消失）が全く認められなかった（図５にその結果を示した）。
また、再結晶を繰り返すことによりPeak ５を豊富に含むフラクションのｉＮＫＴ細胞への影響を検討したところ、本画分、すなわち再結晶分画に強いｉＮＫＴ細胞活性化作用（ｉＮＫＴ細胞の消失）が認められた（図６にその結果を示した）。
このことより、ｉＮＫＴ細胞のリガンドがFr.８中のPeak ５を含む画分に存在するものと決定付けた。
【００９０】
再結晶は、Fr.８の9.13gを50mLのメタノールに溶解させ、４℃にて一夜放置して結晶（Ppt 1）を3.80g得、さらに得られた結晶（Ppt 1）のうち2.08gを150mLのメタノールに溶解させ、同様４℃にて一夜放置して結晶（Ppt 2）を0.83g得た。
一方、最初の結晶を得た母液を濃縮乾固し固体5.45gを得（Sup. 1）さらに２回目の再結晶の母液を濃縮乾固して1.2固体（Sup 2）をそれぞれ得た。
この再結晶操作により得た一次結晶（Ppt 1）、二次結晶（Ppt 2）、一次母液固体（Sup 1）及び二次母液固体（Sup 2）のそれぞれについてｉＮＫＴ細胞活性化作用（ｉＮＫＴ細胞の消失）を、再結晶前のFr.８との対比で検討した結果、いずれのサンプルでもｉＮＫＴ細胞活性化作用（ｉＮＫＴ細胞の消失）が確認され、特に再結晶サンプルではその作用が強いものであった。
したがって、Fr.８の再結晶品にはさらに強いｉＮＫＴ細胞活性化作用があることが確認された（図７にその結果を示した）。
【００９１】
２．米糠スフィンゴ糖脂質精製画分の腫瘍転移に及ぼす影響
予め米糠スフィンゴ糖脂質精製画分、或いはVehicleを投与したマウスにメラノーマ細胞（B16）を静脈より接種し、経日的に生存率、並びに肺の状態を観察した。
未処理群並びにVehicle処理群では、B16の肺への転移（肺の黒変）が観察され、早期より死亡が認められたが、Fr.８投与群では、肺への転移が全く認められず、マウスは半年経過した時点でも全例生存していた（図８にその結果を示した。図中、＊はp<0.01である）。
ｉＮＫＴ細胞欠損マウスにおいては、米糠スフィンゴ糖脂質精製画分を投与しておいても、ほとんど効果が認められなかった。なお、同様な現象はEL4を用いた場合にも認められた。
また、マウスにB16を接種し、B16が肺へ転移したマウスにFr.８を投与すると、B16が肺から完全に排除された。すなわち、マウスにB16を接種すると、接種後２５日目において既に肺への転移が認められたが、その時点でFr.８を投与すると、肺に転移したB16（肺の黒変）は完全に消失していた（図９にその結果を示した）。
【００９２】
３．米糠スフィンゴ糖脂質精製画分の感染防御に及ぼす影響
予め米糠スフィンゴ糖脂質精製画分、或いはVehicleを投与したマウスにリステリアを静脈より感染させ、感染後の脾臓を肉眼的に観察すると共に、生存率並びに感染４日目の肝臓、脾臓内の生菌数を測定した。
未処理群、Vehicle処理群共、感染後の脾臓に強い炎症が認められた（サラミ状になった）が、米糠スフィンゴ糖脂質粗製物を分画して得た各画分を投与した場合、Fr.８以外の画分を投与した場合には、大きな変化は認められなかった。他方、Fr.８処理群の脾臓には全く炎症像が認められず、感染前と殆ど同じ状態であった。
Vehicle処理群に比べ、Fr.８処理群では、肝臓並びに脾臓内の生菌数が有意に抑制された（図１０に肝内生菌数の結果を示した。図中、＊は、p<0.05：Fr.８ vs. Vehicleである）。
【００９３】
４．米糠スフィンゴ糖脂質精製画分の好中球誘導に及ぼす影響
C57BL/6 マウスに米糠スフィンゴ糖脂質精製画分、或いはVehicle を投与し、２４時間後に肝臓内に存在あるいは集積する顆粒球（好中球）をフローサイトメトリーにより解析した。未処理あるいはVehicle 処理群ではSSCにおいて高値を示す細胞（顆粒球（好中球））が殆ど検出されなかった。米糠スフィンゴ糖脂質粗製物を分画して得た各画分を投与した場合、Fr.８以外の画分を投与した場合には大きな変化は認められなかったが、Fr.８を投与した群ではSSCにおいて高値を示す細胞（顆粒球（好中球））が多数検出された。
通常、顆粒球はLy6G 並びにCD11bを高頻度に発現することから、それらの細胞を蛍光標識した抗Ly6G mAb 並びに抗CD11b mAbを用いて解析したところ、その殆どがLy6G+CD11b+（顆粒球（好中球））であった（図１１にその結果を示した。図中、＊及び＊＊はp<0.01：Fr.８ vs. Vehicleである）。
また、顆粒球（好中球）の動態を更に詳細に検討したところ、米糠スフィンゴ糖脂質粗製物を分画して得た各画分のうちFr.８を投与すると、既に９０分後に顆粒球（好中球）顕著な増加が認められ、肝内白血球の５０％近くを占めること、並びにその効果はα-GalCerよりも遙かに強いことが明らかとなった（図１２にその結果を示した）。
【００９４】
５．米糠スフィンゴ糖脂質精製画分の投与により増加の認められた好中球のリステリア排除に及ぼす影響
顆粒球（好中球）を生体内から消失させるため、C57BL/6マウスに予め 抗Ly6G mAb を投与し、リステリア感染に対する抵抗性がどのように変化するかを、感染４日目の肝臓におけるCFUを測定することにより解析した。
PBS処理群の肝臓におけるCFUは、顆粒球（好中球）を消失させることにより増加したが、その増加の程度はFr.８投与群のほうが有意に高値を示した（図１３にその結果を示した。図中、＊はp<0.05：抗Ly6G mAb vs. PBS；＊＊はp<0.05：Fr.８ vs. PBS；＊＊＊はp<0.01：Fr.８ vs. Fr.８＋抗Ly6G mAbである）。
【００９５】
６．米糠スフィンゴ糖脂質精製画分の好中球活性化に及ぼす影響
リステリアは細胞内寄生細菌であるため、貪食細胞の中で生存・増殖することは可能であるが、その多くは顆粒球（好中球）によって殺菌・処理される。顆粒球（好中球）内での殺菌は主にRespiratory（Oxidative）burstによることから、肝臓内に存在あるいは集積した顆粒球（好中球）をFMLP あるいはオプソニン化したリステリアで刺激した際のCL応答を、Vehicle処理群並びにFr.８処理群間で比較検討した。FMLP 並びにオプソニン化したリステリアで刺激した場合、Fr.８を投与した群において、CLの応答性が増加した（下記表２）。
【００９６】
【表２】
2010270104.tif 000004
【００９７】
ａ： p<0.05：Fr.８ vs. Vehicle
ｂ： p<0.01：オプソニン化したリステリア、FMLP vs. PBS
ｃ： p<0.005：オプソニン化したリステリア、FMLP vs. PBS
ｄ： p<0.05：オプソニン化したリステリア vs. FMLP
【００９８】
表中に示したように、Vehicle 処理群においても、FMLP 並びにオプソニン化したリステリアで刺激した場合、CLの応答性が増加したが、増加の程度はFr.８を投与しておいた群に比べて有意に低値を示した。また、Fr.８を投与した場合、可溶性の刺激物よりも、病原体に対するほうが顆粒球のRespiratory (Oxydative) burstが高値を示した。他方、ｉＮＫＴ細胞を欠損したマウスでは、Fr.８を投与してもRespiratory (Oxydative) burstの上昇は認められなかった。
【００９９】
７．米糠スフィンゴ糖脂質精製画分のＭΦの殺菌能に及ぼす影響
顆粒球（好中球）に加えて、ＭΦもリステリアを排除するためには必須であることから、ＭΦの殺菌能に及ぼすFr.８の影響を検討した。Fr.８あるいはVehicleを投与したC57BL/6マウスの腹腔内より調製したＭΦにin vitroでリステリアを感染し、一定時間にどの程度殺菌したのかを測定した。すなわち、ＭΦにリステリアを６０分間貪食させた後、貪食されなかった細菌を洗浄により除去し、その後３０分間にどの程度の菌が殺菌されるかを解析した。Fr.８を投与したマウスより回収したＭΦの殺菌能のほうが、未処理あるいはVehicle 処理したマウスより回収したＭΦよりも高い殺菌能を示した（図１４にその結果を示した。図中、＊はp<0.05：Fr.８ vs. Vehicle、Nilである）。
Vehicle 処理によっても若干殺菌能は増加したが、その程度はFr.８を投与したマウスから回収したＭΦの殺菌能に比べて明らかに低値を示した。
他方、ｉＮＫＴ細胞を欠損したマウスでは、Fr.８を投与しても殺菌能の増加は認められなかった。
【０１００】
８．米糠スフィンゴ糖脂質精製画分のＭΦの貪食能に及ぼす影響
Fr.８あるいはVehicle 投与マウスの腹腔から純化したＭΦにリステリアを感染し、ＭΦ内に貪食されたリステリアの数を、蛍光標識した抗リステリアAbを用いて免疫組織化学的手法により比較検討した。ＭΦ内に貪食されたリステリアの数はFr.８処理群のほうが、Vehicle あるいは未処理群に比べて顕著に高かった。
他方、ｉＮＫＴ細胞を欠損したマウスでは、Fr.８を投与しても貪食能の増加は認められなかった。
【０１０１】
９．米糠スフィンゴ糖脂質精製画分のＭΦ活性化に及ぼす影響
Fr.８によるＭΦの活性化に、ｉＮＫＴ細胞から産生される液性因子が関与しているか否かを明らかにするため、C57BL/6マウスの腹腔内から純化したＭΦを、予めFr.８あるいはVehicle 処理したマウスの腹腔内から調製した腹腔内液の存在・非存在下において培養し、上述したと同様の方法により比較検討した。未処理あるいはVehicle 処理群の腹腔内より調製した腹腔内液を処理した場合には、ＭΦのリステリアに対する殺菌能の増加は全く観察されなかったが、Fr.８処理群の腹腔内より調製した腹腔内液を処理した場合には、ＭΦのリステリアに対する殺菌能が有意に亢進した（図１５にその結果を示した。図中、＊はp<0.05：Fr.８ vs. Vehicle、Nilである）。
他方、Fr.８を投与したｉＮＫＴ細胞を欠損したマウスから調製した腹腔内液とＭΦを共培養しても殺菌能の亢進は認められなかった。
【０１０２】
１０．米糠スフィンゴ糖脂質精製画分のIFN-γ産生への影響
IFN-γはＭΦを強く活性化すること、並びにリステリア感染に対する防御に必須であることから、Fr.８のIFN-γ産生誘導能を検討した。
未処理群の腹腔内液中には全くIFN-γは検出されなかったが、Fr.８を処理した群の腹腔内液中には多量のIFN-γが検出された（図１６にその結果を示した。図中、＊はp<0.05：Vehicle vs. Nil；＊＊はp<0.01：Fr.８ vs. Vehicle；＋はp<0.005：Fr.８ vs. Nilである）。
Vehicle 処理群の腹腔内液中にも若干IFN-γの産生は確認されたが、米糠スフィンゴ糖脂質精製画分を処理した群に比べて明らかに低値を示した。
【０１０３】
１１．米糠スフィンゴ糖脂質精製画分のＮＯ産生への影響
ＮＯはリステリア感染後ＭΦから産生されるだけでなく、リステリアの殺菌に重要な役割を演じていること、並びにＮＯの産生はIFN-γによって誘導されることから、ＭΦのＮＯ産生に及ぼすFr.８の影響を解析した。
予めFr.８あるいはVehicle を投与したC57BL/6マウスの腹腔内より調製したＭΦをin vitroで培養し、培養上清中のＮＯの量を比較検討した。
未処理群には全くＮＯは検出されなかったが、Fr.８処理群には多量のＮＯが検出された（図１７にその結果を示した。図中、＊はp<0.05：Vehicle vs. Nil；＊＊はp<0.01：Fr.８ vs. Vehicle；＋はp<0.005：Fr.８ vs. Nilである）。
Vehicle処理群にも若干ＮＯの産生は確認されたが、米糠スフィンゴ糖脂質精製画分を処理した群に比べて明らかに低値を示した。
【０１０４】
以上記載のように、本発明が提供するｉＮＫＴ細胞活性化剤は、米糠、米胚芽糖の植物素材から得られたスフィンゴ糖脂質の精製画分から成るものであり、安全性が高い上に、免疫増強作用を有するものであることが理解される。
【０１０５】
上記した試験例２の米糠スフィンゴ糖脂質の分離においては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいて、Fr.１〜８の画分に分画され、そのFr.８の画分に高濃度で米糠スフィンゴ糖脂質が含有されていることが判明した。
また、このFr.８の画分は、ODS-120A（4.6mm(ID)15.0cm）カラムを使用し、溶離溶媒としてメタノール/水＝15/1（流量：1.00mL/分）により４０℃条件下でＨＰＬＣ分析を行った結果、少なくとも５つのピーク（Peak １〜5）から構成されているものであった。
【０１０６】
そこで、このFr.８の分画をさらに別の条件によるＨＰＬＣ分析を試み、米糠スフィンゴ糖脂質の分離を検討した。
【０１０７】
カラムとして、CAPCELL PAK UG120（資生堂）4.6Φ×250mmを使用し、４０℃の条件下で、溶離溶媒：メタノール/水＝95/5にて流量：1.00mL/分、検出波長：220nmで分析した結果、少なくとも７つのピーク（Peak 1〜7）で構成されていることが判明した。
このＨＰＬＣ上におけるピーク状態を図１８に示した。
【０１０８】
この各ピーク（Peak 1〜7）の分画物ｉＮＫＴ細胞に及ぼす影響について検討した。
各ピークをC57BL/6 マウスの腹腔内に100μgずつ投与し、２４時間後の肝内白血球をフローサイトメトリーにより解析した。Vehicle処理群では高頻度にα-GalCer/CD1d tetramer 反応性細胞が検出されたが、Peak 1、2、6および7を処理したマウスの肝臓では、同細胞は殆ど検出出来なくなった。また、Peak ４、5を投与した群においても完全ではないが、α-GalCer/CD1d tetramer 反応性細胞の消失が認められた。ｉＮＫＴ細胞にリガンドが結合した場合にのみｉＮＫＴ細胞の消失が認められることから、これらの結果はPeak 3を除く全てのピークに、程度の違いはあるものの、ｉＮＫＴ細胞のリガンドの存在していることを示唆している。なお、解析は各群２匹のマウスを用い行い、全く同様な結果が得られたため、代表的な結果を示した。
その結果を図１９に示した。
【０１０９】
１２．マウス経口投与によるｉＮＫＴ細胞活性化作用
C57BL/6 マウスを用い、Fr. ８を湿式法にて約100nmのナノ分散液とし、経口ゾンデを用いてそのナノ分散液の100μg相当量/マウスを３日間連続投与し、最終投与２４時間後の肝内白血球をフローサイトメトリーにより解析した。投与サンプルとしては、Lot.119及びLot.124のナノ分散液の２サンプルを用いた。
その結果、Vehicle 処理群では高頻度にCD3+NK1.1+細胞が検出されたが、Lot.119及びLot.124の分散液を投与したマウスの肝臓では、完全ではないが同細胞の著しい減少が認められた。
CD3+NK1.1+細胞の殆どがｉＮＫＴ細胞であること、並びにｉＮＫＴ細胞にリガンドが結合した場合にのみCD3+NK1.1+細胞の消失が認められることから、これらの結果は本発明のスフィンゴ糖脂質画分（Fr. ８）が腸管から吸収されるだけでなく、腸管から吸収されたスフィンゴ糖脂質が肝臓に侵入し、ｉＮＫＴ細胞に結合したことを示唆している。
なお、解析は各群２匹のマウスを用い、全く同様な結果が得られたため、代表的な結果を図２０に示した。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明により、米糠中にｉＮＫＴ細胞の新規リガンドが単離・同定され、本リガンドの各種病態に対する有効性、並びに作用機序を明確にすることによって、我が国の主食である安全性に優れた米を原料とした新たな機能性食品素材、及び医薬品原料を提供することができる。
本発明が提供する米糠抽出成分であるスフィンゴ糖脂質精製画分の有するｉＮＫＴ細胞活性化作用を介する免疫増強作用は、日本人が主食とする米の重要性を再認識すると共に、その多くが農業用廃棄物として処理されていた米糠の新規利用方法を見出したという点において、その貢献度は多大なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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