(57)【要約】【課題】  従来法と比較して温和な条件下、少量の試薬で効率よく、スペーサー末端にカルボン酸を導入することができるアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体、及びその製造方法、並びにそれを用いて製造される新規なアフィニティークロマトグラフィー用分離剤、その製造方法、及びその用途を提供する。【解決手段】  クロマトグラフィー用担体の表面に、チオール基を含有するカルボン酸基を有するアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体と、一級アミノ基を含有するリガンドとを、脱水縮合剤を用いて反応させ、当該カルボキシル化担体に、一級アミノ基を含有するリガンドが、アミド結合にて固定化されたアフィニティークロマトグラフィー用分離剤を得る。【選択図】  図１
2010133734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィー用担体の表面に、チオール基を含有するカルボン酸基を導入したカルボキシル化担体に、一級アミノ基を含有するリガンドが、アミド結合にて固定化されたアフィニティークロマトグラフィー用分離剤。
【請求項２】
クロマトグラフィー用担体の表面に、チオール基を含有するカルボン酸基を導入したアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体。
【請求項３】
チオール基を含有するカルボン酸基の量が、カルボキシル化担体１ｍＬ（湿潤容量）当たり０．００５〜０．５ｍｅｑの範囲であることを特徴とする請求項２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体。
【請求項４】
チオール基を含有するカルボン酸基が、下記式（１）
【化１】
2010133734.tif 000009
（上記式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ａはカルボン酸基又はそれらの塩を表す。）
で示されることを特徴とする請求項２又は請求項３に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体。
【請求項５】
クロマトグラフィー用担体が、天然高分子系担体、合成高分子系担体、又は無機系担体であることを特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体。
【請求項６】
クロマトグラフィー用担体の形状が、球状粒子、非球状粒子、膜、又はモノリス（連続体）であることを特徴とする請求項２乃至請求項５のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体。
【請求項７】
下記の工程を含む請求項２乃至請求項６のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
（１）クロマトグラフィー用担体にエポキシ基を導入する第１の工程、及び、
（２）このエポキシ基に、分子内にチオール基とカルボン酸基を有する化合物を反応させる第２の工程。
【請求項８】
第１の工程において、エピクロルヒドリン、多官能エポキシ化合物又はエポキシ基含有シラン処理剤を使用して、クロマトグラフィー用担体にエポキシ基を導入することを特徴とする請求項７に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
【請求項９】
多官能エポキシ化合物が、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテル、及びソルビトールポリグリシジルエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項８に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
【請求項１０】
エポキシ基含有シラン処理剤が、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、及び３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項８に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
【請求項１１】
第２の工程において、分子内にチオール基とカルボン酸基を有する化合物が、下記式（２）
【化２】
2010133734.tif 000010
（上記式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ａはカルボン酸基又はその塩を表す。）
からなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項７乃至請求項１０のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
【請求項１２】
式（２）で示される化合物が、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、及びそれらの塩類からなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項１１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
【請求項１３】
請求項２乃至請求項６のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体に、一級アミノ基を含有するリガンドを、脱水縮合剤を用い、アミド結合にて固定化することを特徴とする請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用分離剤の製造方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用分離剤をクロマトグラフィー用カラムに充填してなるアフィニティークロマトグラフィー用充填カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体、及びそれを用いたアフィニティークロマトグラフィー用分離剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アフィニティークロマトグラフィーは、目的の化合物に対して親和性のある化合物（リガンド）をクロマトグラフィー用担体に固定化し、この担体を用いて目的化合物を分離精製する手法である。
【０００３】
クロマトグラフィー用担体にリガンドを固定化する方法としては、リガンド中のアミノ基を介して固定化する方法が用いられている。例えば、クロマトグラフィー用担体にエポキシ基、アルデヒド基又はトレシル基を導入した後、リガンド中のアミノ基を反応させ固定化する方法である。しかしながら、この方法では、１、２及び３級のアミノ基が反応するため、リガンドが多点で結合し、リガンドの機能が低下する。
【０００４】
一方、カルボキシル基を有する担体や該カルボキシル基にＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを反応させた担体は、リガンド中の１級アミノ基とのみ反応するため多点結合が抑制され、リガンド機能の高い充填剤が得られるため、カルボキシル基を有する担体はアフィニティークロマトグラフィーにおいて有用なものとして知られている。
【０００５】
カルボキシル基を有する担体を調製する方法としては、水酸基を有する担体に高濃度アルカリ存在下、ハロゲン化酢酸塩類を反応させる方法（例えば、特許文献１参照）アミノ基を有する担体にジカルボン酸無水物を反応させる方法（例えば、特許文献２参照）、エポキシ基を有する担体にアミノカプロン酸等のカルボキシル基を有するアミノ化合物を反応させる方法、アリル基を有する担体を過マンガン酸塩類で酸化させる方法（例えば、特許文献３参照）等が知られている。
【０００６】
しかしながら、水酸基を有する担体に高濃度アルカリ存在下、ハロゲン化酢酸類、ハロゲン化エタンスルホン酸類、ハロゲン化プロパンスルホン酸類を反応させる方法は、アルカリでハロゲン基が水酸基に置換される反応も進行するため多量の薬剤を使用する必要がある。また、アルカリで溶解するシリカや加水分解を受ける担体には使用できない。
【０００７】
また、アミノ基を有する担体にジカルボン酸無水物を反応させる方法では、未反応のアミノ基が残存するため無水酢酸等で残存するアミノ基をブロックする必要がある。
【０００８】
ところで、クロマトグラフィー用担体では、分離する目的化合物と担体の非特異的相互作用を軽減するために、担体とイオン交換基の間に一般にスペーサーが導入される。このようなスペーサーを形成する化合物としては、例えば、エピクロルヒドリン、多官能エポキシ化合物又はアリル基を有する化合物等が使用される。具体的には、クロマトグラフィー用担体にスペーサーが導入され、この導入されたスペーサー末端にイオン交換基が導入される。
【０００９】
この導入されたスペーサー末端にイオン交換基を導入するには、スペーサー末端のエポキシ基とアミノカプロン酸等のカルボン酸基を有するアミノ化合物とを反応させる方法が一般に用いられる。しかしながら、アミノ基の反応性が低いため、カルボン酸基の導入量は極めて少ない。また、エポキシ基とアミノ基の結合では、結合したアミノ基もイオン交換性を有し、両性のイオン交換体となる。
【００１０】
一方、アリル基を有する化合物をスペーサーとした場合、スペーサー末端へのイオン交換基の導入方法としては、アリル基を酸化してカルボン酸にする方法があるが、疎水性の高い未反応のアリル基が残存するという問題がある。
【００１１】
【特許文献１】特開平１−２６２４６８号公報
【特許文献２】米国特許第４５６０７０４号明細書
【特許文献３】米国特許第４０２９５８３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来法と比較して温和な条件下、少量の試薬で効率よく、スペーサー末端にカルボン酸を導入することができるアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体、及びその製造方法、並びにそれを用いて製造される新規なアフィニティークロマトグラフィー用分離剤、その製造方法、及びその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体、及びアフィニティークロマトグラフィー用分離剤を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下に示すとおりのアフィニティークロマトグラフィー用分離剤、その製造方法、及びその用途、並びにアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体、及びその製造方法である。
【００１４】
［１］クロマトグラフィー用担体の表面に、チオール基を含有するカルボン酸基を導入したカルボキシル化担体に、一級アミノ基を含有するリガンドが、アミド結合にて固定化されたアフィニティークロマトグラフィー用分離剤。
【００１５】
［２］クロマトグラフィー用担体の表面に、チオール基を含有するカルボン酸基を導入したアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体。
【００１６】
［３］チオール基を含有するカルボン酸基の量が、カルボキシル化担体１ｍＬ（湿潤容量）当たり０．００５〜０．５ｍｅｑの範囲であることを特徴とする上記［２］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体。
【００１７】
［４］チオール基を含有するカルボン酸基が、下記式（１）
【００１８】
【化１】
2010133734.tif 000003
（上記式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ａはカルボン酸基又はそれらの塩を表す。）
で示されることを特徴とする上記［２］又は［３］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体。
【００１９】
［５］クロマトグラフィー用担体が、天然高分子系担体、合成高分子系担体、又は無機系担体であることを特徴とする上記［２］乃至［４］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体。
【００２０】
［６］クロマトグラフィー用担体の形状が、球状粒子、非球状粒子、膜、又はモノリス（連続体）であることを特徴とする上記［２］乃至［５］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体。
【００２１】
［７］下記の工程を含む上記［２］乃至［６］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
（１）クロマトグラフィー用担体にエポキシ基を導入する第１の工程、及び、
（２）このエポキシ基に、分子内にチオール基とカルボン酸基を有する化合物を反応させる第２の工程。
【００２２】
［８］第１の工程において、エピクロルヒドリン、多官能エポキシ化合物又はエポキシ基含有シラン処理剤を使用して、クロマトグラフィー用担体にエポキシ基を導入することを特徴とする上記［７］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
【００２３】
［９］多官能エポキシ化合物が、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテル、及びソルビトールポリグリシジルエーテルからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする上記［８］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
【００２４】
［１０］エポキシ基含有シラン処理剤が、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、及び３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする上記［８］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
【００２５】
［１１］第２の工程において、分子内にチオール基とカルボン酸基を有する化合物が、下記式（２）
【００２６】
【化２】
2010133734.tif 000004
（上記式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ａはカルボン酸基又はその塩を表す。）
からなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする上記［９］乃至［１０］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
【００２７】
［１２］上記式（２）で示される化合物が、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、及びそれらの塩類からなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする上記［１１］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法。
【００２８】
［１３］上記［２］乃至［６］のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体に、一級アミノ基を含有するリガンドを、脱水縮合剤を用い、アミド結合にて固定化することを特徴とする請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用分離剤の製造方法。
【００２９】
［１４］上記［１］に記載のアフィニティークロマトグラフィー用分離剤をクロマトグラフィー用カラムに充填してなるアフィニティークロマトグラフィー用充填カラム。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体は、従来法と比較して温和な条件下、少量の試薬で効率よく、クロマトグラフィー用担体の表面にカルボン酸基又はスルホン酸基を導入することができ、かつ１級アミノ基を有するリガンドをアミド結合により固定化することができる。そして、このようにして調製されたアフィニティークロマトグラフィー用分離剤は、固定化されたリガンドに親和性のある物質の分離、分析又は分取に使用することができるため、本発明は工業的に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体は、クロマトグラフィー用担体の表面に、チオール基を含有するカルボン酸基を導入した担体である。
【００３２】
そして、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用分離剤は、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体に、一級アミノ基を含有するリガンドが、アミド結合にて固定化されたものである。
【００３３】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体において、チオール基を含有するカルボン酸基としては、例えば、下記式（１）
【００３４】
【化３】
2010133734.tif 000005
（上記式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ａはカルボン酸基又はそれらの塩を表す。）
で示されるイオン交換基が挙げられる。
【００３５】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体を構成するクロマトグラフィー用担体の素材としては、後述するエポキシ基を導入できるものであれば、特に制限なく使用することができ、例えば、天然高分子系担体、合成高分子系担体、無機系担体等を用いることができる。
【００３６】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体において、天然高分子系担体としては、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類が挙げられる。合成高分子担体としては、例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等の水酸基含有単量体を、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン等の架橋性単量体と混合し、重合開始剤の存在下に重合することにより調製したもの等が挙げられる。無機系担体としては、例えば、シリカ、ゼオライト等が挙げられる。また、それら担体の形態としては、例えば、球状粒子、非球状粒子、膜、モノリス（連続体）等が挙げられるが、特に制限されない。
【００３７】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体の製造方法としては、特に限定するものではないが、例えば、以下の工程により製造することが好ましい。
（１）クロマトグラフィー用担体にエポキシ基を導入する第１の工程、及び、
（２）このエポキシ基に、分子内にチオール基とカルボン酸基を有する化合物を反応させる第２の工程。
【００３８】
上記（１）の工程において、クロマトグラフィー担体へのエポキシ基の導入は、公知の方法により行うことができる。例えば、天然高分子担体又は合成高分子担体の場合、エピクロルヒドリン、又は多官能エポキシ化合物を、ＮａＯＨ、ＫＯＨ等のアルカリ存在下で反応させる方法が挙げられる。多官能エポキシ化合物としては、具体的には、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル等を例示できる。
【００３９】
また、無機系担体の場合、例えば、エポキシ基含有シラン処理剤で反応させる方法が挙げられる。エポキシ基含有シラン処理剤としては、具体的には、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランを例示できる。
【００４０】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体は、上記（２）の工程において、上記（１）の工程でエポキシ基を導入したクロマトグラフィー用担体（以下、エポキシ化担体と称する場合がある。）と、分子内にチオール基とカルボン酸基を有する化合物とを反応させることにより調製される。具体的には、これらを溶液中（ｐＨ７〜９の範囲）、２５〜４０℃の反応温度で５〜２４時間反応させることが好ましい。
【００４１】
上記したエポキシ化担体に導入されているエポキシ基の量としては、特に限定するものではないが、通常、エポキシ化担体１ｇ（乾燥重量）当たり０．０２〜２ｍｏｌの範囲である。
【００４２】
上記（２）の工程において、分子内にチオール基とカルボン酸基を有する化合物としては、例えば、下記式（２）
【００４３】
【化４】
2010133734.tif 000006
（上記式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ａはカルボン酸基又はそれらの塩を表す。）
で示される化合物が挙げられる。具体的には、メルカプト酢酸（チオグリコール酸）、メルカプトプロピオン酸、メルカプトブタン酸、又はそれらの塩類等が例示され、これらのうち、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸又はそれらの塩類がより好ましい。
【００４４】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体に導入されている、チオール基を含有するカルボン酸基の量（すなわち、イオン交換容量）としては、特に限定するものではないが、当該カルボキシル化担体１ｍＬ（湿潤容量）当たり０．００５〜０．５ｍｅｑの範囲が好ましい。
【００４５】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用分離剤は、上記した本発明のアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体に、一級アミノ基を含有するリガンドを、脱水縮合剤を用い、アミド結合にて固定化することにより製造される。
【００４６】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用分離剤において、一級アミノ基を含有するリガンドとしては、目的物質に特異的に結合する化合物であればよく、特に限定するものではないが、例えば、分子構造中に一級アミノ基を有する低分子化合物、アミノ酸、ペプチド、糖誘導体、蛋白質等が挙げられる。具体的には、γ−グロブリン及び免疫グロブリンを分離するためのＬ−フェニルアラニン、トリプトファン、又はＬ−ヒスチジン等のアミノ酸リガンド及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ等のタンパク質リガンド等が例示される。
【００４７】
また、上記した固定化方法において、脱水縮合剤としては、ペプチド合成用の縮合剤として一般に使用されるものであればよく、特に限定するものではないが、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）等が好適なものとして挙げられる。これらのうち、ＥＤＣが特に好ましく使用される。
【００４８】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用分離剤は、例えば、ガラス、金属製等のクロマトグラフィー用カラムに充填し、アフィニティークロマトグラフィー用充填カラムとして、固定化されたリガンドに親和性のある物質の分離、分析又は分取に使用することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定して解釈されるものではない。なお、以下の実施例において、エポキシ基の量、イオン交換容量は以下のとおり測定した。
【００５０】
エポキシ基の定量方法．
５００ｍＬのセパラブルフラスコに濃硫酸１００ｍＬを入れ、濃塩酸３０ｍＬを滴下ロートで滴下した。発生する塩化水素をジオキサン１５００ｍＬを加えた２Ｌのセパラブルフラスコにガラス管で吹き込み、０．２Ｎの塩酸−ジオキサン溶液を調整した。エポキシ化担体Ｗｇ（乾燥重量）を２００ｍＬの三角フラスコに入れ、２５ｍＬの０．２Ｎの塩酸−ジオキサン溶液を加え、マグネットスターラーで２５℃、３時間攪拌した。攪拌後、５０ｍＬのエチルアルコール、１ｍＬのフェノールフタレイン溶液を加え、０．１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液で過剰の塩酸を滴定した（滴定量ＡｍＬ）。同様に、エポキシ化担体を添加せずに２５ｍＬの０．２Ｎの塩酸−ジオキサン溶液を０．１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液で滴定した（滴定量ＴｍＬ）。エポキシ基の量は以下の式より算出した。
【００５１】
【数１】
2010133734.tif 000007
イオン交換容量の定量方法．
５０ｍＬビーカーに１０ｍＬ（湿潤容量）のカチオン交換体、０．５Ｎ−ＨＣＬ溶液２０ｍＬを加え分散させた。このスラリーをグラスフィルターでろ過し、カチオン交換体をろ液が中性になるまで純水で洗浄した。このカチオン交換体を２００ｍＬのビーカーに加え、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させた。スターラーチップを入れ、攪拌させながら０．５Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を用いて自動滴定装置（平沼産業社製ＣＯＭ−４５０）で終点をｐＨ７として滴定した（滴定量ＢｍＬ）。カチオン交換体のイオン交換容量は以下の式より算出した。
【００５２】
【数２】
2010133734.tif 000008
実施例１．
クロマトグラフィー用担体として、デキストランをベースとしたＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅ（ＧＥ社製）を純水で洗浄した後、その湿潤重量６０ｇを滴下ロート付の三口フラスコに入れ、純水６６ｇ、エピクロルヒドリン６０ｇ添加し、４０℃で分散させた。水酸化ナトリウム２１ｇを純水３６ｇに溶解させた後、この溶液を滴下ロートより２時間で滴下した。滴下後更に２時間反応させた。反応終了後、ガラスフィルターを用いて担体を分離し、純水で洗浄し、エポキシ化担体を得た。導入されたエポキシ基の量は、当該担体１ｇ（乾燥重量）当たり０．８３ｍｍｏｌであった。
【００５３】
以上のようにして得られたエポキシ化担体（５０ｇ）を３００ｍＬの三口フラスコに計り取り、これに０．５ｍｏｌ／Ｌのメルカプト酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５）１００ｇを加え、４０℃で１６時間反応させた。反応終了後、ガラスフィルターで生成物を分離し、純水で洗浄した。このようにして製造されたアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体のイオン交換容量は当該担体１ｍＬ（湿潤容量）当たり０．２３ｍｅｑであった。
【００５４】
実施例２．
クロマトグラフィー用担体として、水酸基を有する親水性ビニルポリマーであるＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＨＷ−６５Ｃ（東ソー社製）に変更した以外は、実施例１と同様の工程にてエポキシ化を実施した。導入されたエポキシ基の量は当該担体１ｇ（乾燥重量）当たり０．４０ｍｍｏｌであった。
【００５５】
以上のようにして得られたエポキシ化担体（５０ｇ）を３００ｍＬの三口フラスコに計り取り、これに０．５ｍｏｌ／Ｌのメルカプト酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５）１００ｇを加え、４０℃で１６時間反応させた。反応終了後、ガラスフィルターで生成物を分離し、純水で洗浄した。このようにして製造されたアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体のイオン交換容量は当該担体１ｍＬ（湿潤容量）当たり０．０６７ｍｅｑであった。
【００５６】
実施例３．
クロマトグラフィー用担体として、水酸基を有する親水性ビニルポリマーであるＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＨＷ−６５Ｃ（東ソー社製）を純水で洗浄した後、その湿潤重量６０ｇ、０．６ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液（６０ｇ）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（６０ｇ）添加し、２５℃で１６時間反応させた。反応終了後、ガラスフィルターを用いて担体を分離し、純水で洗浄し、エポキシ化担体を得た。導入されたエポキシ量は当該担体１ｇ（乾燥重量）当たり０．２２ｍｍｏｌであった。
【００５７】
以上のようにして得られたエポキシ化担体（５０ｇ）を実施例２と同様の条件でカルボキシル基を導入した。製造されたアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体のイオン交換容量は当該担体１ｍＬ（湿潤容量）当たり０．０４０ｍｅｑであった。
【００５８】
実施例４．
クロマトグラフィー用担体として、シリカゲルであるワコーゲルＴＭＣ−３００（和光純薬社製）１０ｇを純水で洗浄した後、３００ｍＬの三口フラスコに加えた。純水９５ｇ、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン５ｇを加え、ｐＨを６．０に調整後、９０℃で３０分間反応させた。反応終了後、ガラスフィルターを用いて担体を分離し、純水で洗浄し、エポキシ化担体を得た。導入されたエポキシ量は、当該担体１ｇ（乾燥重量）当たり０．４０ｍｍｏｌであった。
【００５９】
以上のようにして得られたエポキシ化担体（１０ｇ）を１００ｍＬの三口フラスコに計り取り、これに１．０ｍｏｌ／Ｌのチオグリコール酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０）５０ｇを加え、２５℃で１６時間反応させた。反応終了後、ガラスフィルターで生成物を分離し、純水で洗浄した。このようにして製造されたアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体のイオン交換容量は当該担体１ｍＬ（湿潤容量）当たり０．１９ｍｅｑであった。
【００６０】
実施例５．
実施例２にて得られたアフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体（２ｍＬ）、２０ｍＭ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）２ｍＬにｐ−アミノベンズアミジン二塩酸塩１００ｍｇを溶解した溶液を３０ｍＬ三角フラスコに加え、１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液にてｐＨを５．０に調整した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１００ｍｇ）を加え、２５℃で３時間振とうさせ反応した。このｐ−アミノベンズアミジン固定化担体は担体１ｍＬ当たりブタトリプシン１０ｍｇを吸着した。
【００６１】
以上のようにして得られたｐ−アミノベンズアミジン固定化担体を５．０ｍｍＩ．Ｄ．×５０ｍｍＬカラムに充填し、トリプシンの分離を行った。
【００６２】
測定装置：ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（ＧＥ社製），
溶離液Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸緩衝液＋０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム＋１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム（ｐＨ８．０），
溶離液Ｂ：１００ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ３．０），
グラジエント：３．５ｍＬの溶出位置で溶離液Ａ  １００％から溶離液Ｂ  １００％にステップワイズ勾配，
流速：０．５ｍＬ／分，
サンプル：ブタトリプシン，
サンプル注入量：２ｍｇ，
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ。
【００６３】
図１に上記測定の結果を示す。溶出位置４．５−５ｍＬに溶出しているピークがブタトリプシンである。図１より実施例５のｐ−アミノベンズアミジン固定化担体はトリプシンの分離に使用することが可能であることがわかった。
【００６４】
実施例６．
実施例３にて得られたカルボキシル化担体（２ｍＬ）、２０ｍＭ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．５）２ｍＬにｒＰｒｏｔｅｉｎＡＴＭ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製）１２ｍｇを溶解した溶液を３０ｍＬ三角フラスコに加え、２５℃で振とうさせた。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．２ｍｇ）を加え、２５℃で更に２時間振とうさせ反応した。反応終了後のｒＰｒｏｔｅｉｎＡの固定化量は担体１ｍＬ（湿潤容量）当たり４ｍｇであった。このｒＰｒｏｔｅｉｎＡ固定化担体は担体１ｍＬ（湿潤容量）当たり２６ｍｇのヒト抗体を吸着した。
【００６５】
以上のようにして得られたｒＰｒｏｔｅｉｎＡ固定化担体を４．６ｍｍＩ．Ｄ．×７５ｍｍＬカラムに充填し、モノクローナル抗体の分離を行った。
【００６６】
測定装置：ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（ＧＥ社製），
溶離液Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液＋０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４），
溶離液Ｂ：１００ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ３．０），
グラジエント：２５ｍＬの溶出位置で溶離液Ａ  １００％から溶離液Ｂ  １００％にステップワイズ勾配，
流速：１．０ｍＬ／分，
サンプル：モノクローナル抗体を含むＣＨＯ細胞培養液，
サンプル注入量：２０ｍＬ，
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ，
図２に上記測定の結果を示す。溶出位置２６−２７ｍＬに溶出しているピークがモノクローナル抗体である。図２より実施例６のｒＰｒｏｔｅｉｎＡ固定化担体は抗体の分離に使用することが可能であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】実施例５で実施した蛋白質分離の液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【図２】実施例６で実施した蛋白質分離の液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【図１】
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【図２】
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