(57)【要約】      （修正有）【課題】中性セラミダーゼ、及びアルカリ性セラミダーゼの少なくともいずれかに対して阻害活性を有する化合物、及びその製造方法、並びに、前記化合物の生産菌である新規微生物、及び前記化合物を利用したセラミダーゼ阻害剤、又は、医薬組成物の提供。【解決手段】該阻害活性を有する化合物がセラミダスチンであり、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、前記化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、前記培養工程で得られた培養物から前記化合物を採取する採取工程とを含むことを特徴とする前記化合物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）で表されることを特徴とする化合物。
【化１】
2010059069.tif 000005
【請求項２】
請求項１に記載の化合物の製造方法であって、
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、請求項１に記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から請求項１に記載の化合物を採取する採取工程と
を含むことを特徴とする化合物の製造方法。
【請求項３】
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、請求項１に記載の化合物を生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５８０のペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株である請求項２に記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、請求項１に記載の化合物を生産する能力を有することを特徴とする微生物。
【請求項５】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５８０のペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株である請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物を含むことを特徴とする中性セラミダーゼ、及びアルカリ性セラミダーゼの少なくともいずれかのセラミダーゼ阻害剤。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
アトピー性皮膚炎治療薬である請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性セラミダーゼ、及びアルカリ性セラミダーゼの少なくともいずれかに対して、阻害活性を有する新規化合物、その製造方法、及び、その用途、並びに、前記新規化合物の生産菌である新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎は、痒みが強く悪化と改善を繰り返す難治性の慢性湿疹であり、アレルギー体質の上に環境など様々な刺激が加わって生じると考えられている。
皮膚は生体内の水分の蒸散や細菌感染を防ぐためのバリア機能を有しているが、アトピー性皮膚炎においてはこのバリア機能が低下し、極度の乾燥によるアレルゲンの侵入や細菌感染などが起こることで、症状の更なる悪化が繰り返される。この増悪化の原因の１つが、緑膿菌が産生する中性／アルカリ性セラミダーゼであることが知られている（例えば、非特許文献１〜２参照）。すなわち、アトピー性皮膚炎患者の皮膚には高頻度で緑膿菌が感染しており、この緑膿菌が産生する中性／アルカリ性セラミダーゼによって皮膚のセラミドが分解、減少することで、皮膚のバリア機能が低下し、アトピー性皮膚炎が増悪化すると考えられる。
【０００３】
それゆえ、緑膿菌の産生するセラミダーゼを阻害する物質はセラミドの低下を防ぎ、アトピー性皮膚炎の増悪化を阻止する事が期待される。しかしながら、アトピー性皮膚炎の治療法としては、皮膚を清潔に保ち、ステロイド剤や保湿剤などが塗布されているが、決定的な治療法は見出されていないのが現状であり、中性／アルカリ性セラミダーゼに対して、優れた阻害活性を有する新たな化合物の開発や、より有効かつ安全な新規アトピー性皮膚炎治療薬の開発が望まれている。
【０００４】
【非特許文献１】Ｏｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  １４３６８−１４３７３，  １９９８
【非特許文献２】Ｏｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ３６６１６−３６６２２，  １９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、中性セラミダーゼ、及びアルカリ性セラミダーゼの少なくともいずれかに対して、優れた阻害活性を有する新規化合物、及びその製造方法、並びに、前記新規化合物の生産菌である新規微生物、及び前記新規化合物を利用したセラミダーゼ阻害剤、又は、医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、新規な微生物として、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する菌株を分離することに成功し、この菌株が、新規な構造骨格を有するセラミダーゼ阻害物質を産生していることを見出した。本発明者らは、前記セラミダーゼ阻害物質の化学構造を分析することで、これが新規化合物であることを確認し、本発明の完成に至った。なお、本発明者らは、この新規化合物を「セラミダスチン」と命名した。
【０００７】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記構造式（１）で表されることを特徴とする化合物である。
【化２】
2010059069.tif 000002
＜２＞  前記＜１＞に記載の化合物の製造方法であって、
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、前記＜１＞に記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から前記＜１＞に記載の化合物を採取する採取工程と
を含むことを特徴とする化合物の製造方法である。
＜３＞  ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、前記＜１＞に記載の化合物を生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５８０のペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株である前記＜２＞に記載の化合物の製造方法である。
＜４＞  ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、前記＜１＞に記載の化合物を生産する能力を有することを特徴とする微生物である。
＜５＞  受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５８０のペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株である前記＜４＞に記載の微生物である。
＜６＞  前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする中性セラミダーゼ、及びアルカリ性セラミダーゼの少なくともいずれかのセラミダーゼ阻害剤である。
＜７＞  前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする医薬組成物である。
＜８＞  アトピー性皮膚炎治療薬である前記＜７＞に記載の医薬組成物である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、中性セラミダーゼ、及びアルカリ性セラミダーゼの少なくともいずれかに対して、優れた阻害活性を有する新規化合物、及びその製造方法、並びに、前記新規化合物の生産菌である新規微生物、及び前記新規化合物を利用したセラミダーゼ阻害剤、又は、医薬組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（化合物）
本発明の化合物は、下記構造式（１）で表されることを特徴とする。下記構造式（１）で表される化合物は、本発明者らが分離した新規化合物である（以下、「セラミダスチン」と称することがある）。
【化３】
2010059069.tif 000003
【００１０】
−理化学的性状−
前記構造式（１）で表される化合物の理化学的性状としては、次の通りである。
（１）  色、及び性状  ：  白色粉末
（２）  分子式  ：  Ｃ２６Ｈ３４Ｏ１１
（３）  マススペクトル（ＨＲＥＳＩ−ＭＳ）（ｍ／ｚ）  ：
（ネガティブ・モード）  ：実験値５２１．２０１１２  （Ｍ−Ｈ）−
：計算値５２１．２０２２９  （Ｍ−Ｈ）−
（ポジティブ・モード）  ：実験値５４５．２０４６５  （Ｍ＋Ｎａ）＋
：計算値５４５．１９９８８  （Ｍ＋Ｎａ）＋
（４）融点  ：  １２１℃〜１２４℃
（５）紫外線吸収スペクトル  ：
λｍａｘ  ｎｍ
［Ｈ２Ｏ］：Ｅｎｄ
［０．０１Ｎ  ＨＣｌ］：２７５（ｓｈ）
紫外線吸収スペクトルは、日立２２８Ａ分光計を用いて測定した。図１に、紫外線吸収スペクトルのチャートを示す。
（６）比旋光度  ：  ［α］Ｄ２４  ＝  ＋２９．０°（ｃ＝０．５７，Ｈ２Ｏ）
（７）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  ：
δ（ｐｐｍ）  ：  ０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），  １．２０，  １．２０，  １．２０，  １．２３，  １．３５，  １．８５，  ２．０５，  ２．２５，  ２．３５，  ２．４５，  ２．６２，  ２．８０，  ３．１０（１Ｈ，ｍ），  ３．２０，  ３．５０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１０．４，７．２，４．０Ｈｚ），  ３．９０，  ３．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），  ４．１２，  ４．８４，  ４．９０，  ５．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），  ５．５５（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１５．３，５．０Ｈｚ），  ５．６５（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１５．３，７．０Ｈｚ），  ５．９５。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、日本電子ＪＮＭ  Ａ４００を用いて測定した。図２に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのチャートを示す。
（８）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  ：
δ（ｐｐｍ）  ：  １３．５，  ２２．０，  ２４．１，  ２５．７，  ２８．０，  ３１．０，  ３１．８，  ３５．５，  ３５．８，  ３６．０，  ４７．０，  ６１．７，  ６３．０，  ６８．８，  ７１．５，  ７８．０，  １２６．５，  １３２．５，  １３８．４，  １４２．５，  １４３．８，  １４８．０，  １６３．０，  １６５．８，  １６６．４，  １６７．０。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、日本電子ＪＮＭ  Ａ４００を用いて測定した。図３に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのチャートを示す。
【００１１】
化合物が、前記構造式（１）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記マススペクトル、前記紫外線吸収スペクトル、前記１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、前記１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、等の分析を行うことにより、確認することができる。
【００１２】
前記セラミダスチンは、前記セラミダスチンの生産菌から得られたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよい。中でも、前記セラミダスチンは、後述する本発明の、化合物の製造方法により、得られることが好ましい。
【００１３】
前記セラミダスチンは、後述する試験例１に示されるように、中性／アルカリ性セラミダーゼに対して優れた阻害活性を有するものである。そのため、前記セラミダスチンは、例えば、後述する本発明のセラミダーゼ阻害剤や、医薬組成物の有効成分として、好適に利用可能である。
【００１４】
（化合物の製造方法）
本発明の化合物、即ちセラミダスチンの製造方法は、培養工程と、採取工程とを少なくとも含み、必要に応じてさらにその他の工程を含む。
【００１５】
−培養工程−
前記培養工程は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、セラミダスチンを生産する能力を有する微生物を培養する工程である。
【００１６】
前記微生物としては、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、セラミダスチンを生産する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明者らの分離したペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−５８０、詳細は後述する本発明の微生物の項目に記す）が挙げられる。また、セラミダスチンを生産できるその他の菌株についても、常法によって、自然界より分離することが可能である。なお、前記ペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株を含め、セラミダスチンの生産菌を、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、セラミダスチンの生産能を高めることも可能である。さらに、遺伝子工学的手法によるセラミダスチンの生産も可能である。
【００１７】
前記培養は、セラミダスチンを生産する生産菌（以下、単に「セラミダスチン生産菌」と称することがある）を栄養培地中に接種し、セラミダスチンの生産に良好な温度で培養することによって行われる。
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来カビの培養に利用されている公知のものを使用することができる。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、炭素源として、グルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動植物油などが使用でき、窒素源として、大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素などが使用できる。また、必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸、及びその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することができる。さらに、セラミダスチン生産菌の発育を助け、セラミダスチンの生産を促進するような有機物、及び無機物を適宜添加することができる。これらの材料は、セラミダスチン生産菌が利用し、セラミダスチンの生産に役立つものであればよく、公知のカビの培養材料はすべて用いることができる。
【００１８】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、振とう培養、静置培養、タンク培養などが挙げられる。中でも、好気的条件の培養方法が好ましく、振とう培養法が特に好ましい。
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２５℃〜３０℃が好ましく、２５℃がより好ましい。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、セラミダスチンの蓄積に合わせて適宜選択することができる。通常、培養２日間〜１０日間でセラミダスチンの蓄積が最高となる。
【００１９】
−採取工程−
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からセラミダスチンを採取する工程である。
前記セラミダスチンは、上述した理化学的性状を有するので、その性状に従って培養物から採取することができる。
【００２０】
前記採取の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、有機溶媒を用いて培養物からセラミダスチンを抽出した後、吸着剤を用いた吸脱着法、ゲル濾過剤を用いた分子分配法などを用いて、前記セラミダスチンを精製し、採取することができる。また、例えば、有機成分を含む培養物を酢酸エチルにより抽出し、前記抽出液を減圧濃縮した後、少量のアセトニトリルなどの有機溶剤に溶解し、アセトニトリル／水などの溶媒系で高速液体クロマトグラフィーを行うことにより、セラミダスチンを単離し、採取することができる。
【００２１】
以上のようにして前記製造方法を行うことができ、これにより、セラミダスチンを得ることができる。
【００２２】
（微生物）
本発明の微生物は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、上述した本発明の化合物、即ちセラミダスチンを生産する能力を有することを特徴とする。前記微生物は、ペニシリウム属に属し、セラミダスチンを生産する能力を有し、そのために、上述した本発明の化合物の製造方法において、セラミダスチン生産菌として使用され得る微生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
このような微生物の中でも、特に、ペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株を使用することが好ましい。前記ペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株の菌学的性状は、以下の通りである。
【００２４】
１．各種培地における性状
（１）ポテトデキストロースアガロース（ＰＤＡ）プレート、（２）モルトアガー（ＭＡ）プレート、及び（３）オートミールアガー（ＯＡ）プレートにおけるコロニーの肉眼的観察、及び光学顕微鏡観察の結果は、以下の通りである。なお、色調に関する記述は、Ｍｅｔｈｕｅｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｏｌｏｕｒ（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ  ａｎｄ  Ｗａｎｓｃｈｅｒ，  １９７８）に従った。
（１）ＰＤＡプレート
２５℃での生育：普通からやや遅く、培養１週間で直径３．０ｃｍ〜３．７ｃｍの生育をした。
色調：Ｇｒｅｙｉｓｈ  ｂｌｕｅ（２３Ｃ−４）からＯｒａｎｇｅ（５Ａ６−７）。
表面性状：羊毛状からビロード状。
可溶性色素の産生：認められない。
（２）ＭＡプレート
２５℃での生育：普通からやや遅く、培養１週間で直径３．０ｃｍ〜３．７ｃｍの生育をした。
色調：Ｏｌｉｖｅ（１Ｆ−８）からＰａｌｅ  ｏｒａｎｇｅ（５Ａ−３）。
表面性状：ビロード状。
可溶性色素の産生：認められない。
（３）ＯＡプレート
２５℃での生育：普通からやや遅く、培養１週間で直径３．０ｃｍ〜３．７ｃｍの生育をした。
色調：Ｄａｒｋ  ｇｒｅｅｎ（２５Ｆ−７）からＬｉｇｈｔ  ｏｒａｎｇｅ（５Ａ４−５）。
表面性状：羊毛状からビロード状。
可溶性色素の産生：認められない。
【００２５】
２．形態的性状
光学顕微鏡による観察から、菌糸は寒天表面上、若しくは寒天内に形成され、無色、平滑、有隔壁菌糸の形成が認められた。
分生子柄は、栄養菌糸に直生し、無色、表面は平滑であった。分生子柄の先端部からメトレが形成され、その先に分生子形成細胞であるフィアライドが形成される二輪生のペニシルスの形成が主に観察された。メトレは円筒形、フィアライドは針状であった。分生子は、フィアロ型分生子で、フィアライドから鎖状に連なって形成され、亜球形から球形、１細胞、表面模様は平滑であった。
約２週間の培養検体において、優性生殖器官の形成は観察されなかった。
【００２６】
以上の菌学的性状、及び２８Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２領域の塩基配列を用いた分子系統解析により、Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属すると考えられた。そこで、前記Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株をペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株とした。なお、前記Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに寄託申請し、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５８０として受託された。
【００２７】
なお、他のカビにも見られるように、前記Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株は、性状が変化し易いが、例えば、前記Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株に由来する突然変異株（自然発生、又は誘発性）、形質接合体、遺伝子組換体などであっても、セラミダスチンを生産する能力を有するものは、本発明の微生物に含まれる。
【００２８】
（セラミダーゼ阻害剤、医薬組成物）
−セラミダーゼ阻害剤−
本発明のセラミダーゼ阻害剤は、上述した本発明の化合物、即ちセラミダスチンを含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
本発明のセラミダーゼ阻害剤は、中性セラミダーゼ、及びアルカリ性セラミダーゼの少なくともいずれかの阻害剤として用いることができる。
【００２９】
前記セラミダーゼ阻害剤中のセラミダスチンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記セラミダーゼ阻害剤は、セラミダスチンそのものであってもよい。
【００３０】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記セラミダーゼ阻害剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、セラミダスチンの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記セラミダーゼ阻害剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記セラミダーゼ阻害剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００３１】
−医薬組成物−
本発明の医薬組成物は、上述した本発明の化合物、即ちセラミダスチンを含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
本発明の医薬組成物は、緑膿菌が産生する中性／アルカリ性セラミダーゼを阻害することができるので、アトピー性皮膚炎治療薬として、特に好適に用いることができる。
【００３２】
前記医薬組成物中のセラミダスチンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬組成物は、セラミダスチンそのものであってもよい。
【００３３】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記医薬組成物中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、セラミダスチンの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記医薬組成物は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００３４】
−剤型−
前記セラミダーゼ阻害剤、及び前記医薬組成物の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、カプセル状、錠剤状、軟膏状、液状等の剤型とすることができる。これらの剤型の前記セラミダーゼ阻害剤、及び前記医薬組成物は、常法に従い製造することができる。
【００３５】
−投与−
前記セラミダーゼ阻害剤、及び前記医薬組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記セラミダーゼ阻害剤、及び前記医薬組成物の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記セラミダーゼ阻害剤、及び前記医薬組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記セラミダーゼ阻害剤、及び前記医薬組成物の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記セラミダーゼ阻害剤、及び前記医薬組成物の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例及び試験例に何ら限定されるものではない。また、以下の実施例及び試験例中、「％」は、特に明記のない限り「質量％」を表す。
【００３７】
（実施例１：セラミダスチンの製造）
−培養工程−
種培地として、ポテトデンプン  ２．０％、グルコース  １．０％、ソイプロ（Ｊ−オイルミルズ社製）  ２．０％、リン酸二水素カリウム  ０．１％、硫酸マグネシウム７水和物  ０．０５％、ガラスビーズ  ３個を含む液体培地（ｐＨ無調整）を用いた。前記種培地１００ｍＬを分注した５００ｍＬ三角フラスコを１２０℃で１５分間殺菌した後、斜面寒天培養したペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）Ｍｅｒ−ｆ１７０６７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−５８０として寄託）の１白金耳を前記培地に植菌した。その後、２５℃、２２０ｒｐｍにて３日間振とう培養し、種培養液を得た。
【００３８】
生産培地として、マルトース水和物  ５．０％、ファルマメディア（Ｔｒａｄｅｒｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ社製）  １．５％、モルトエキス  １．０％、硫酸アンモニウム  ０．５％、ミネラル水溶液  １．０体積％（ミネラル成分として、塩化コバルト（ＩＩ）６水和物  ２．０％、塩化カルシウム  ２．０％、塩化マグネシウム  ２．０％）を含む液体培地（ｐＨ７）を用いた。前記生産培地１００ｍＬを分注した５００ｍＬワッフル付き三角フラスコを１２０℃で１５分間殺菌した後、上述した種培養液  １ｍＬを前記培地に植菌し、２５℃、２２０ｒｐｍにて４日間振とう培養した。
【００３９】
−採取工程−
このようにして得られた培養液  ５Ｌを濾紙にて菌体と培養上清に分けた後、培養上清をダイアイオン  ＨＰ２０  カラム（５００ｍＬ、三菱化学社製）に通過吸着させた。その後、水  ２Ｌ、２０体積％アセトン（アセトン：水＝２０：８０、体積比）  ２Ｌにて洗浄し、次いで、７５体積％アセトン（アセトン：水＝７５：２５、体積比）  ２Ｌにて溶出し、溶出液を得た。
前記溶出液に含まれるアセトンを減圧下にて留去した後、水を加えて２．２Ｌにし、１％炭酸アンモニウム溶液でｐＨ８に調整した後、等量のブタノール  ２．２Ｌを加え、攪拌し水層を回収した。前記回収した水層中に含まれるブタノールを減圧下にて留去した後、１Ｍ硫酸水素カリウム溶液を少量ずつ加えｐＨ３に調整した後、水を加えて２．６Ｌにし、次いで、半量の酢酸エチルで２回抽出し、酢酸エチル層を回収した。前記回収した酢酸エチル層に、等量の飽和食塩水を加えて洗浄した後、硫酸ナトリウム（無水）を加え、脱水した。その後、前記脱水した酢酸エチル層を濃縮乾固し、粗精製物  １．５ｇを得た。
【００４０】
前記粗精製物  １．５ｇを、２０体積％アセトニトリル−０．１体積％ＴＦＡで８．５ｍＬに溶解させた後、ＨＰＬＣクロマトグラフィー（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３、内径  ２０ｍｍ、長さ  ２５０ｍｍ）を０．１体積％ＴＦＡ含有２０体積％−６０体積％アセトニトリル（７ｍＬ／分）の展開溶媒で５回に分けて行い、セラミダスチンを含む画分を回収した。
前記回収した画分に１０倍量の水を加えた後、水で平衡化したダイアイオン  ＨＰ２０  カラム（５００ｍＬ、三菱化学社製）に吸着させた後、水洗いによりＴＦＡを除去し、その後、１００体積％アセトンで溶出させ、溶出液を得た。
前記溶出液に含まれるアセトンを減圧下にて留去して試料を得た後、前記試料のｐＨを８より上げないようにして、０．１％炭酸アンモニウム溶液を少量ずつ添加し、前記試料を溶解させた。その後、前記溶解させた試料を凍結乾燥し、２４５ｍｇのセラミダスチンを得た。
【００４１】
得られたセラミダスチンの理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、セラミダスチンが、下記構造式（１）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１）  色、及び性状  ：  白色粉末
（２）  分子式  ：  Ｃ２６Ｈ３４Ｏ１１
（３）  マススペクトル（ＨＲＥＳＩ−ＭＳ）（ｍ／ｚ）  ：
（ネガティブ・モード）  ：実験値５２１．２０１１２  （Ｍ−Ｈ）−
：計算値５２１．２０２２９  （Ｍ−Ｈ）−
（ポジティブ・モード）  ：実験値５４５．２０４６５  （Ｍ＋Ｎａ）＋
：計算値５４５．１９９８８  （Ｍ＋Ｎａ）＋
（４）融点  ：  １２１℃〜１２４℃
（５）紫外線吸収スペクトル  ：
λｍａｘ  ｎｍ
［Ｈ２Ｏ］：Ｅｎｄ
［０．０１Ｎ  ＨＣｌ］：２７５（ｓｈ）
紫外線吸収スペクトルは、日立２２８Ａ分光計を用いて測定した。図１に、紫外線吸収スペクトルのチャートを示す。
（６）比旋光度  ：  ［α］Ｄ２４  ＝  ＋２９．０°（ｃ＝０．５７，Ｈ２Ｏ）
（７）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  ：
δ（ｐｐｍ）  ：  ０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），  １．２０，  １．２０，  １．２０，  １．２３，  １．３５，  １．８５，  ２．０５，  ２．２５，  ２．３５，  ２．４５，  ２．６２，  ２．８０，  ３．１０（１Ｈ，ｍ），  ３．２０，  ３．５０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１０．４，７．２，４．０Ｈｚ），  ３．９０，  ３．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），  ４．１２，  ４．８４，  ４．９０，  ５．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），  ５．５５（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１５．３，５．０Ｈｚ），  ５．６５（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１５．３，７．０Ｈｚ），  ５．９５。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、日本電子ＪＮＭ  Ａ４００を用いて測定した。図２に、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのチャートを示す。
（８）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  ：
δ（ｐｐｍ）  ：  １３．５，  ２２．０，  ２４．１，  ２５．７，  ２８．０，  ３１．０，  ３１．８，  ３５．５，  ３５．８，  ３６．０，  ４７．０，  ６１．７，  ６３．０，  ６８．８，  ７１．５，  ７８．０，  １２６．５，  １３２．５，  １３８．４，  １４２．５，  １４３．８，  １４８．０，  １６３．０，  １６５．８，  １６６．４，  １６７．０。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、日本電子ＪＮＭ  Ａ４００を用いて測定した。図３に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのチャートを示す。
【化４】
2010059069.tif 000004
【００４２】
また、得られたセラミダスチンの中性／アルカリ性セラミダーゼに対する阻害活性を、以下の試験例１で確認した。
【００４３】
（試験例１）
−中性／アルカリ性セラミダーゼの製造−
種培地として、脱イオン水  １００ｍＬにニッスイトリプトブイヨン（日水製薬社製）  ３ｇを溶解し、３ｍＬずつ試験管に分注した後、高圧滅菌したものを使用した。これに緑膿菌（ヒト臨床分離株）を２体積％植菌しウォーターバスにて３７℃、１００ｒｐｍで３時間種培養した。
本培養用の合成培地として、脱イオン水に塩化アンモニウム  ０．０５％、リン酸水素二カリウム  ０．０５％、塩化ナトリウム  ０．５％を溶解し、ｐＨ７．２に調整した後、高圧滅菌し、次いで、メタノール溶解したＴａｕｒｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（シグマ・アルドリッチ社製）、及びＳｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ（シグマ・アルドリッチ社製）を、それぞれ０．０５％になるように前記滅菌した培地に添加したものを用いた（Ｏｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  １４３６８−１４３７３，  １９９８）。滅菌した試験管に、前記本培養用の合成培地を３ｍＬ分注し、前記種培養した緑膿菌種培養液を２体積％植菌し、ウォーターバスにて３０℃、１００ｒｐｍで２４時間本培養した。２４時間後、培養液をＫＵＲＡＢＯ  Ｓｔｅｒａｄｉｓｃ  ２５  ０．２μｍ（倉敷紡績社製）にて濾過滅菌し、中性／アルカリ性セラミダーゼの酵素液を得た。
【００４４】
−中性／アルカリ性セラミダーゼ活性阻害試験−
上記で得られた中性／アルカリ性セラミダーゼの酵素液を用いて、以下のようにして、中性／アルカリ性セラミダーゼ活性阻害試験を行った。
中性／アルカリ性セラミダーゼ活性の測定はＯｋｉｎｏらの方法（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  １４３６８−１４３７３，  １９９８）を一部改変して行なった。
まず、ポリプロピレン９６穴プレートにセラミダスチン溶液  ５μＬを撒いた。前記セラミダスチン溶液は、セラミダスチンの最終濃度が、０μｇ／ｍＬ（コントロール）、２００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、３．１２μｇ／ｍＬ、及び１．５６μｇ／ｍＬになるものを用いた。
基質液として、氷上にてガラスチューブに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ  ８．５）を５００μＬ入れ、そこにクロロホルム−メタノール（２：１、体積比）にて１．８ｍＭに溶解した基質  Ｃ１２−ＮＢＤ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ  （ＮＢＤ）−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｎ−ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌｓｐｈｉｎｏｇｏｓｉｎｅ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）を３μＬ添加し、攪拌溶解したものを用いた。
前記基質液１０μＬと、上記で得られた中性／アルカリ性セラミダーゼの酵素液１０μＬとを、セラミダスチン溶液の入った９６穴プレートの各ウェルに加え、３７℃で２．５時間反応させた。
そして、各ウェルにクロロホルム−メタノール（２：１、体積比）を１００μＬずつ加え、反応を停止させた。その後、真空ポンプにて乾燥させ、次いで、クロロホルム−メタノール（２：１、体積比）を１００μＬ加えて溶解し、溶解液を得た。
【００４５】
前記溶解液を、ＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ  ２５  ＴＬＣ  ｐｌａｔｅｓ  ２０×２０ｃｍ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４）に２０μＬずつスポットし、展開（クロロホルム：メタノール：アンモニア（２５％）＝９０：２０：０．５、体積比）した後、Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＦＬＡ  ５０００（富士フィルム社製）にて基質の蛍光を測定し、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂ  ２００１  ＩｍａｇｅＧａｕｇｅ（富士フィルム社製）にて基質分解物の阻害率を求めた。
図４は、ＴＬＣの結果を示す図であり、図５は、セラミダスチンの中性／アルカリ性セラミダーゼ阻害活性を示すグラフである。
上記の結果、セラミダスチンの中性／アルカリ性セラミダーゼ阻害活性は、ＩＣ５０（酵素活性を５０％阻害する濃度）が６．２５μｇ／ｍＬであり、優れた阻害活性を有していることが示された。
【００４６】
（試験例２）
−アトピー性皮膚炎様モデルマウスの治療効果−
アトピー性皮膚炎様モデルマウスを用いて、セラミダスチンのアトピー性皮膚炎に対する治療効果を試験した。具体的には、前記マウスに対し、上記で得られた酵素液を塗布することにより、表皮角質層、及び炎症の増悪化を調べ、また、前記酵素液と、セラミダスチンとを塗布し、中性／アルカリ性セラミダーゼ活性を阻害することによる皮膚への影響を調べた。
アトピー性皮膚炎様モデルマウスとして、ＮＣ／Ｎｇａ６週令、雌マウス（日本チャールスリバー株式会社）を用いた。前記ＮＣ／Ｎｇａマウスは、アトピー性皮膚炎モデルとして用いられており（Ｈｉｒｏｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７６，  １７５−１８３，  １９９８）、皮膚組織では肥満細胞数の増加が見られる。
【００４７】
−−脱脂−−
前記ＮＣ／Ｎｇａ６週令、雌マウスをあらかじめ麻酔下にて除毛し（１群６匹）、ネンブタール麻酔下にてアセトン−エーテル（１：１）を含ませた脱脂綿を１５秒間押し当て、その後、滅菌蒸留水を含ませた脱脂綿を３０秒間押し当て皮脂を脱脂した。
−−中性／アルカリ性セラミダーゼ塗布−−
脱脂後、４倍に希釈した前記酵素液を０．２ｍＬ皮膚に塗布した。
−−セラミダスチン塗布−−
中性／アルカリ性セラミダーゼ塗布の３０分後に、滅菌蒸留水で溶解したセラミダスチン１ｍｇ／ｍＬを０．２ｍＬ塗布した。
【００４８】
前記脱脂、セラミダーゼ塗布、セラミダスチン塗布を、朝晩２回、週５日の間隔で、計４７回塗布した後、皮膚を切り取り、ホルマリン固定し、パラフィン包埋後、組織切片を作製し、トルイジンブルー染色を行い、組織内の肥満細胞数を顕微鏡下にて観察した。
図６は、脱脂のみを行った場合（以下、「無処理の場合」と称することがある。）のマウス皮膚切片をトルイジンブルー染色した結果を示す図であり、図７は、脱脂、及び中性／アルカリ性セラミダーゼ塗布を行った場合（以下、「セラミダーゼ塗布の場合」と称することがある。）のマウス皮膚切片をトルイジンブルー染色した結果を示す図であり、図８は、脱脂、中性／アルカリ性セラミダーゼ塗布、及びセラミダスチン塗布を行った場合（以下、「セラミダーゼ塗布＋セラミダスチン塗布の場合」と称することがある。）のマウス皮膚切片をトルイジンブルー染色した結果を示す図である。
図９は、マウス皮膚組織の肥満細胞数を示すグラフである。肥満細胞数は、「無処理の場合」が、１３．０４±４．３８個であり、「セラミダーゼ塗布の場合」が、２２．６±８．５個であり、「セラミダーゼ塗布＋セラミダスチン塗布の場合」が、１５．５±５．２個であった。また、「セラミダーゼ塗布の場合」と「セラミダーゼ塗布＋セラミダスチン塗布の場合」との間にＰ＞０．００１で有意差が認められた。
【００４９】
上記の結果、「セラミダーゼ塗布の場合」、「無処理の場合」と比べて、皮膚組織の肥満細胞数が増加し、また、表皮角質層、及び炎症の増悪化が見られた。一方、「セラミダーゼ塗布＋セラミダスチン塗布の場合」では、肥満細胞数の増加が有意に阻害された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の新規化合物（セラミダスチン）は、中性／アルカリ性セラミダーゼに対して、優れた阻害活性を有することから、新たなセラミダーゼ阻害剤として好適に利用でき、また、医薬用組成物、中でも、アトピー性皮膚炎などの細菌感染性の皮膚疾患の予防・治療を目的とした医薬組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、セラミダスチンの０．０１Ｎ  ＨＣｌ溶液中、０．０１Ｎ  ＮａＯＨ溶液中、及び水中での紫外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸：吸光度（Ａｂｓ）、横軸：波長（ｎｍ）。
【図２】図２は、セラミダスチンの重ＤＭＳＯ中で、２５℃にて測定した４００ＭＨｚにおける１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図３】図３は、セラミダスチンの重ＤＭＳＯ中で、２５℃にて測定した１００ＭＨｚにおける１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図４】図４は、試験例１のＴＬＣの結果を示す図である。
【図５】図５は、セラミダスチンの中性／アルカリ性セラミダーゼ阻害活性を示すグラフである。
【図６】図６は、脱脂のみを行った場合のマウス皮膚切片をトルイジンブルー染色した結果を示す図である。
【図７】図７は、脱脂、及び中性／アルカリ性セラミダーゼ塗布を行った場合のマウス皮膚切片をトルイジンブルー染色した結果を示す図である。
【図８】図８は、脱脂、中性／アルカリ性セラミダーゼ塗布、及びセラミダスチン塗布を行った場合のマウス皮膚切片をトルイジンブルー染色した結果を示す図である。
【図９】図９は、マウス皮膚組織の肥満細胞数を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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