(57)【要約】【課題】被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、バックグラウンドとなる凝集率が低く、被検出物質を高感度かつ高精度に検出できる方法を提供すること。【解決手段】光学特性が異なる２種類の担体粒子を使用する。また、第１の担体粒子には、被検出物質の第１のエピトープを認識する抗体を固定化し、第２の担体粒子には、被検出物質の第２のエピトープを認識する抗体を固定化する。隣接する２つの修飾粒子が被検出物質を介して会合しているかどうかを、隣接する修飾粒子の光学特性を指標として判別し、抗原抗体反応により形成された真の凝集物と、担体粒子の非特異的な凝集により形成された偽の凝集物および画像上で偶然重なっている担体粒子群とを区別する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、
被検出物質に特異的に結合する第１の認識物質および第１の担体粒子を含む第１の修飾粒子、ならびに前記被検出物質に特異的に結合する第２の認識物質および第２の担体粒子を含む第２の修飾粒子を準備するステップであって、
前記第１の担体粒子は前記第２の担体粒子と光学特性が異なり、
前記第１の認識物質が前記被検出物質に結合する部位は前記第２の認識物質が前記被検出物質に結合する部位と異なる、ステップと、
試料、前記第１の修飾粒子および前記第２の修飾粒子を含む混合液を調製するステップと、
前記混合液に交流電圧を印加して前記修飾粒子をパールチェーン化させるステップと、
前記交流電圧の印加を停止した後に前記修飾粒子の凝集状態を観察するステップと、
を含む検出方法。
【請求項２】
前記観察ステップにおいて、前記修飾粒子が前記被検出物質を介して他の修飾粒子に会合しているかどうかを、隣接する２つの修飾粒子の光学特性を指標として判別する、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記観察ステップにおいて、隣接する２つの修飾粒子間で前記光学特性が異なる場合に、前記被検出物質を介して会合していると判別する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記光学特性は光の透過率である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
前記光学特性は光の吸収波長である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項６】
前記第１の担体粒子は無色の粒子であり、
前記第２の担体粒子は青色の粒子である、
請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
前記第１の担体粒子および前記第２の担体粒子の直径は０.５〜１０μｍである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項８】
前記第１の認識物質および前記第２の認識物質は前記被検出物質に特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項９】
前記第１の認識物質および前記第２の認識物質は前記被検出物質に特異的に結合する核酸である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項１０】
基板と、前記基板上に配置された一対の電極と、前記一対の電極の間に設けられた流路と、前記流路内に配置され、被検出物質に特異的に結合する第１の認識物質および第１の担体粒子を含む第１の修飾粒子ならびに前記被検出物質に特異的に結合する第２の認識物質および第２の担体粒子を含む第２の修飾粒子を含む固形物と、を有し、
前記第１の担体粒子は前記第２の担体粒子と光学特性が異なり、
前記第１の認識物質が前記被検出物質に結合する部位は前記第２の認識物質が前記被検出物質に結合する部位と異なる、
パルスイムノアッセイ法用の検出デバイス。
【請求項１１】
前記固形物は凍結乾燥物である、請求項１０に記載の検出デバイス。
【請求項１２】
前記固形物は風乾乾燥物である、請求項１０に記載の検出デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法およびそれに用いられる検出デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料に含まれる被検出物質を検出するために、被検出物質に特異的に結合しうる抗体を利用する方法が数多く開発されている。そのひとつに、抗原抗体反応によって生じた免疫凝集物を光学的に検出する方法がある。
【０００３】
この方法では、被検出物質を含む液体試料に被検出物質に特異的に結合しうる抗体を一定量加えて免疫凝集物を形成させる。凝集物を形成させた後、液体試料に光を照射すると、光は凝集物に当たって散乱する。この散乱光の量は凝集物の量に応じて変化し、凝集物の量は被検出物質の濃度に応じて変化する。したがって、この散乱光を測定することで、液体試料中の被検出物質の濃度を求めることができる。一般的に散乱光を検出する免疫比朧法と透過光を測定する免疫比濁法とは区別されているが、凝集物による光の散乱を観察するという点ではいずれも同じ検出原理である。したがって、散乱光だけでなく透過光または反射光を測定しても、液体試料中の被検出物質の濃度を求めることができる。
【０００４】
この原理を用いて感度をさらに向上させた方法が、ラテックス凝集法である。前述の方法において抗体をラテックス粒子の表面に固定化させておくと、被検出物質と抗体とが結合することでラテックス粒子の凝集物が形成される。ラテックス粒子の凝集物は抗原および抗体からなる凝集物よりもはるかに光の散乱が大きいため、ラテックス凝集法では被検出物質をより高感度に検出することができる。
【０００５】
ラテックス凝集法をさらに高感度化させた方法として、パルスイムノアッセイ法が知られている（例えば、特許文献１参照）。以下、図７および図８を用いてパルスイムノアッセイ法について説明する。図７（Ａ）は、反応用チップの断面図であり、図７（Ｂ）は、反応測定装置の構成を示すブロック図である。図８は、反応用チップの流路部分の拡大図である。
【０００６】
図７（Ａ）に示されるように、反応用チップは、２枚のスライドグラス１０，１２と、その間に配置された１対の電極１４，１６とから構成されている。電極１４，１６の厚さは０.０２ｍｍであり、電極間の間隔は０.５ｍｍである。２枚のスライドグラス１０，１２および１対の電極１４，１６に囲まれた流路１８内には、抗体を固定化されたラテックス粒子２０と液体試料とを含む混合液が供給される。
【０００７】
流路１８内に混合液を提供した後、電極１４，１６に交流電源供給装置３０を用いて交流電圧を印加してラテックス粒子２０に誘電分極を生じさせることで、図８（Ａ）に示されるように、複数のラテックス粒子２０を直鎖状に並べることができる（パールチェーン化）。その後、交流電圧の印加を停止すると、図８（Ｂ）に示されるように、直鎖状に並んでいたラテックス粒子２０はブラウン運動により分散する。液体試料中に被検出物質が存在すると、交流電圧の印加を停止した後もラテックス粒子２０の凝集物が観察される。図７（Ｂ）に示されるように、顕微鏡２２、ＣＣＤカメラ２４、画像処理ボード２６およびパーソナルコンピューター２８から構成される画像処理装置を用いてラテックス粒子２０の凝集状態を観察して、被検出物質を検出する。パルスイムノアッセイ法は、複数の担体粒子を積極的に接触させることで凝集反応を促進させることができるため、ブラウン運動に依存したラテックス凝集法に比べてより迅速かつ高感度に被検出物質を検出することができる。
【特許文献１】特開平７−８３９２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来のパルスイムノアッセイ法では、抗原抗体反応により形成された真の凝集物と、非特異的な凝集により形成された偽の凝集物とを区別することができなかった。
【０００９】
被検出物質が存在するときは、担体粒子に固定化されている抗体が被検出物質に結合することで粒子の凝集物（真の凝集物）が形成される。このとき、一方の粒子は、抗体−被検出物質（抗原）−抗体のいわゆるサンドイッチ構造を介して他方の粒子と会合する。被検出物質が存在しないときは、このサンドイッチ構造が形成されないため、粒子の凝集物は本来形成されない。しかし、担体粒子の表面状態によっては粒子が非特異的に凝集してしまい、偽の凝集物が形成されてしまうことがある。このように偽の凝集物が形成されると、上記従来のパルスイムノアッセイ法では、真の凝集物と偽の凝集物とを区別することができないため、粒子の凝集率が本来の値よりも高い値となってしまう。
【００１０】
また、従来のパルスイムノアッセイ法では、画像処理装置が撮像した画像上において真の凝集物と担体粒子群（実際は接触していないが画像上では接触しているように見える複数の担体粒子）とを区別することができなかった。
【００１１】
反応用チップの流路はある程度の深さがあるため、特に粒子数が多い場合は、画像処理装置が撮像した画像上で複数の粒子が重なることがある。従来のパルスイムノアッセイ法では、真の凝集物と担体粒子群とを区別することができないため、粒子の凝集率が本来の値よりも高い値となってしまう。
【００１２】
以上のように、従来のパルスイムノアッセイ法には、担体粒子の非特異的な凝集や凝集物の誤認識などの理由によりバックグラウンドとなる凝集率が上昇してしまうため、被検出物質を高感度かつ高精度に検出できないという問題があった。
【００１３】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、バックグラウンドとなる凝集率が低く、被検出物質を高感度かつ高精度に検出できる方法およびそれに用いられる検出デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、光学特性が異なる２種類以上の担体粒子を使用することで上記課題を解決しうることを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明の第一は、以下の検出方法に関する。
【００１６】
［１］試料に含まれる被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、被検出物質に特異的に結合する第１の認識物質および第１の担体粒子を含む第１の修飾粒子、ならびに前記被検出物質に特異的に結合する第２の認識物質および第２の担体粒子を含む第２の修飾粒子を準備するステップであって、前記第１の担体粒子は前記第２の担体粒子と光学特性が異なり、前記第１の認識物質が前記被検出物質に結合する部位は前記第２の認識物質が前記被検出物質に結合する部位と異なる、ステップと、試料、前記第１の修飾粒子および前記第２の修飾粒子を含む混合液を調製するステップと、前記混合液に交流電圧を印加して前記修飾粒子をパールチェーン化させるステップと、前記交流電圧の印加を停止した後に前記修飾粒子の凝集状態を観察するステップと、を含む検出方法。
［２］前記観察ステップにおいて、前記修飾粒子が前記被検出物質を介して他の修飾粒子に会合しているかどうかを、隣接する２つの修飾粒子の光学特性を指標として判別する、［１］に記載の検出方法。
［３］前記観察ステップにおいて、隣接する２つの修飾粒子間で前記光学特性が異なる場合に、前記被検出物質を介して会合していると判別する、［２］に記載の検出方法。
［４］前記光学特性は光の透過率である、［１］〜［３］に記載の検出方法。
［５］前記光学特性は光の吸収波長である、［１］〜［３］に記載の検出方法。
［６］前記第１の修飾粒子は無色の修飾粒子であり、前記第２の修飾粒子は青色の修飾粒子である、［５］に記載の検出方法。
［７］前記第１の修飾粒子および前記第２の修飾粒子の直径は０.５〜１０μｍである、［１］〜［６］に記載の検出方法。
［８］前記第１の認識物質および前記第２の認識物質は前記被検出物質に特異的に結合する抗体である、［１］〜［７］に記載の検出方法。
［９］前記第１の認識物質および前記第２の認識物質は前記被検出物質に特異的に結合する核酸である、［１］〜［７］に記載の検出方法。
【００１７】
本発明の第二は、以下の検出デバイスに関する。
【００１８】
［１０］基板と、前記基板上に配置された一対の電極と、前記一対の電極の間に設けられた流路と、前記流路内に配置され、被検出物質に特異的に結合する第１の認識物質および第１の担体粒子を含む第１の修飾粒子ならびに前記被検出物質に特異的に結合する第２の認識物質および第２の担体粒子を含む第２の修飾粒子を含む固形物と、を有し、前記第１の担体粒子は前記第２の担体粒子と光学特性が異なり、前記第１の認識物質が前記被検出物質に結合する部位は前記第２の認識物質が前記被検出物質に結合する部位と異なる、パルスイムノアッセイ法用の検出デバイス。
［１１］前記固形物は凍結乾燥物である、［１０］に記載の検出デバイス。
［１２］前記固形物は風乾乾燥物である、［１０］に記載の検出デバイス。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、特異的な凝集により形成された真の凝集物と、非特異的な凝集により形成された偽の凝集物および画像上で偶然重なっている粒子群とを区別することができるため、バックグラウンドとなる凝集率を低減させることができる。したがって、本発明によれば、被検出物質を高感度かつ高精度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の検出方法は、被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、１）被検出物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている修飾粒子を準備する第１のステップと、２）試料と第１のステップで準備した修飾粒子とを含む混合液を調製する第２のステップと、３）第２のステップで調製した混合液に交流電圧を印加して修飾粒子をパールチェーン化させる第３のステップと、４）前記交流電圧の印加を停止した後に修飾粒子の凝集状態を観察する第４のステップと、を含む。
【００２１】
本発明の検出方法は、光学特性が異なる担体粒子を少なくとも２種類使用することを特徴とする。本明細書において「検出」とは、特定の物質の有無を調べる意味だけでなく、特定の物質の濃度や量を測定する意味も含む。
【００２２】
［第１のステップ］
第１のステップでは、被検出物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている修飾粒子を準備する。
【００２３】
認識物質を固定化される担体粒子の種類は、特に限定されない。担体粒子の例には、ラテックス粒子、セラミックス粒子、シリカ粒子、磁性粒子、金属粒子、金属コート粒子やベントナイト、カオリン、金コロイド、赤血球細胞、白血球細胞、血小板、ゼラチン、リポソーム、花粉、微生物、およびアミノ基やスルフヒドリル基、カルボキシル基など反応性の高い官能基が修飾された粒子などが含まれる。この中ではラテックス粒子が好ましい。ラテックス粒子の例には、ポリスチレン系ラテックス粒子、ポリビニルトルエン系ラテックス粒子、ポリメタクリレート系ラテックス粒子、金属コートラテックス粒子などが含まれる。
【００２４】
担体粒子の直径（平均粒径）は、光学顕微鏡で識別可能な０.５μｍ以上、かつブラウン運動による分散が容易に生じうる１００μｍ以下であることが好ましい。担体粒子の直径が１００μｍを超えると、第４のステップにおいて、凝集していない修飾粒子がブラウン運動により混合液中に分散しにくくなる。担体粒子の直径（平均粒径）は、例えば、光学顕微鏡を用いて観察したり、コールターカウンターを用いて電気抵抗を測定したり、光散乱法で散乱光変化量を測定したりすることで測定することができる。
【００２５】
前述の通り、本発明の検出方法は、光学特性が異なる担体粒子を少なくとも２種類使用することを特徴とする。ここでいう光学特性は、光学顕微鏡や蛍光顕微鏡などで観察したときに一方の担体粒子と他方の担体粒子とを区別しうる特性であれば特に限定されない。光学特性の例には、担体粒子の光の透過率、担体粒子の光の吸収波長（担体粒子の色）、担体粒子の蛍光波長などが含まれる。例えば、担体粒子に色素を含ませることで、光の透過率または光の吸収波長が異なる担体粒子を調製することができる。また、担体粒子に蛍光色素を含ませることで、光の蛍光波長が異なる担体粒子を調製することができる。また、異なる種類の担体粒子（例えば、光の透過率が異なるラテックス粒子と金属粒子）を用いてもよい。
【００２６】
担体粒子に固定化される認識物質は、被検出物質に特異的に結合しうる物質であれば特に限定されない。認識物質の例には、抗体や核酸、酵素、補酵素（例えば、ビオチン）、レクチン、糖タンパク質、ヘムやポルフィリンなどの有機合成物などが含まれる。これらの認識物質を担体粒子に固定化する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、抗体を担体粒子に固定化する場合、疎水性相互作用を利用した物理吸着や、アミノ基やスルフヒドリル基などを利用した化学修飾などを用いることができる。
【００２７】
本発明の検出方法では少なくとも２種類の担体粒子を使用するが、一方の担体粒子に固定化される認識物質と、他方の担体粒子に固定化される認識物質とは異なることが好ましい。より正確には、第１の担体粒子に固定化される第１の認識物質が被検出物質に結合する部位と、第２の担体粒子に固定化される第２の認識物質が前記被検出物質に結合する部位とは、異なることが好ましい。例えば、血液中の脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain natriuretic peptide；以下「ＢＮＰ」と略記する。）を検出する場合は、マウス抗ＢＮＰモノクローナル抗体５０Ｅ１（ヒトＢＮＰ前駆体の７７〜１０８アミノ酸残基からなるポリペプチドを抗原として作製された抗体）を第１の認識物質とし、マウス抗ＢＮＰモノクローナル抗体２４Ｃ５または２６Ｅ２（いずれもヒトＢＮＰの１１〜２２アミノ酸残基からなるポリペプチドを抗原として作製された抗体）を第２の認識物質とすればよい。また、腫瘍マーカーの１つであるα−フェトプロテイン（α-fetoprotein；以下「ＡＦＰ」と略記する）を検出する場合は、ヤギ抗ＡＦＰポリクローナル抗体Ｃ−１９（ヒトＡＦＰのＣ末端を認識する抗体）を第１の認識物質とし、ウサギ抗ＡＦＰポリクローナル抗体Ｈ−１４０（ヒトＡＦＰの１７１〜３１０アミノ酸残基を認識する抗体）を第２の認識物質とすればよい。したがって、抗原抗体反応を利用する場合、被検出物質（抗原）は２以上の異なるエピトープを有することが好ましい。
【００２８】
図１は、修飾粒子の一例を示す模式図である。図１（Ａ）に示されるように、第１の修飾粒子１００ａは、青色の第１の担体粒子１１０ａと、第１の担体粒子１１０ａの表面に固定化された第１の抗体１２０ａ（第１の認識物質）を含む。図１（Ｂ）に示されるように、第２の修飾粒子１００ｂは、無色の第２の担体粒子１１０ｂと、第２の担体粒子１１０ｂの表面に固定化された第２の抗体１２０ｂ（第２の認識物質）を含む。第１の抗体１２０ａおよび第２の抗体１２０ｂは、同一の被検出物質１３０に結合する抗体であるが、それぞれ異なるエピトープを認識する。すなわち、第１の抗体１２０ａは、被検出物質１３０の第１のエピトープに結合し、第２の抗体１２０ｂは、被検出物質１３０の第２のエピトープに結合する。
【００２９】
図２は、図１の２種類の修飾粒子が会合した様子を示す模式図である。図２（Ａ）に示されるように、被検出物質１３０が存在する場合は、第１の修飾粒子１００ａの第１の抗体１２０ａは被検出物質１３０の第１のエピトープに結合し、第２の担体粒子１００ｂの第２の抗体１２０ｂは被検出物質１３０の第２のエピトープに結合する。このように被検出物質を介して修飾粒子が会合した場合は、隣接する修飾粒子は常に異なる色（光学特性）となる。このように被検出物質を介して形成された修飾粒子の凝集物を「真の凝集物」という。
【００３０】
一方、同一種類の抗体を有する同一種類の修飾粒子間では、１つの被検出物質に同一のエピトープが複数存在しない限り、被検出物質の有無に関係なく本来は凝集しないはずである。したがって、図２（Ｂ），（Ｃ）に示されるように、第１の修飾粒子１００ａ同士または第２の修飾粒子１００ｂ同士が会合している場合は、被検出物質１３０を介していない非特異的な凝集であると考えられる。このように被検出物質を介さずに形成された修飾粒子の凝集物を「偽の凝集物」という。
【００３１】
このように、担体粒子ごとに異なる認識物質を固定化することで、隣接する２つの修飾粒子が被検出物質を介して会合しているかどうかを、隣接する修飾粒子の光学特性（上記の例では色（吸収波長））を指標として判別することができる。
【００３２】
修飾粒子は、使用する際に各自で調製してもよいし、市販品を購入してもよい。
【００３３】
［第２のステップ］
第２のステップでは、試料と第１のステップで準備した修飾粒子を含む混合液を調製する。
【００３４】
試料は、特に限定されず、検出対象や検出目的などに応じて適宜選択すればよい。試料の例には、血液、血漿、血清、それらの希釈物などが含まれる。
【００３５】
混合液の調製方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、第１のステップで修飾粒子を懸濁液として準備した場合は、試料にその懸濁液を適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。また、第１のステップで修飾粒子を固形物（例えば、上記懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）として準備した場合は、その固形物に液体試料を適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。
【００３６】
混合液のｐＨは特に限定されないが、認識物質として抗体を使用する場合は６.０〜１１.０の範囲内であることが好ましく、６.０〜９.０であることが特に好ましい。抗原抗体反応が生じやすくなるからである。ｐＨの調整方法は特に限定されず、塩酸や水酸化ナトリウムを用いて適宜調整すればよい。
【００３７】
［第３のステップ］
第３のステップでは、第２のステップで調製した混合液に交流電圧を印加して、修飾粒子をパールチェーン化させる。
【００３８】
混合液に外部電場を与えると、担体粒子内で双極子が誘起され、この双極子の相互作用により修飾粒子が泳動し（誘電泳動）、修飾粒子が電界方向と並行に一列に並ぶ（パールチェーン化）。このとき、混合液内に被検出物質が存在すれば、修飾粒子は被検出物質を介して他の修飾粒子に会合するため、複数の修飾粒子が凝集する（図２（Ａ）参照）。
【００３９】
混合液に交流電圧を印加する方法（装置）は、特に限定されず、従来のパルスイムノアッセイ法と同じ方法（装置）でよい。例えば、１）ガラスなどからなる基板と、前記基板上に対向するように配置された一対の電極と、前記一対の電極の間に設けられた流路とを有する検出デバイスを準備し；２）各電極を交流電源供給装置に接続し；３）第２のステップで調製した混合液を注入口から流路内に提供した後に電極間に交流電圧を印加すればよい。
【００４０】
検出デバイスは、上記の例に限られず、従来のパルスイムノアッセイ法で用いられてきた検出デバイスから選択してもよい。また、検出デバイスの流路内には、第１のステップで準備した２種類以上の修飾粒子を予め配置しておいてもよい。すなわち、混合液を調製する第２のステップが、流路内で行われてもよい。例えば、２種類以上の修飾粒子を含む固形物（担体粒子懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）を予め流路内に配置しておくことで、試料を注入口から流路内に提供するのみで第２のステップを終えることができ、本発明の検出方法をより簡便に行うことができる。
【００４１】
混合液に印加する交流電圧の波形は、正弦波、矩形波、方形波、三角波などであればよく、連続波でもパルス波でもよい。また、周波数は、特に限定されないが、１０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲内であることが好ましい。
【００４２】
混合液に印加する交流電圧の電界強度は、５〜１００Ｖ（波高値）／ｍｍの範囲内であることが好ましい。電界強度が５Ｖ／ｍｍよりも小さいと、パールチェーン化が生じにくくなり、凝集反応を十分に促進することができない。一方、電界強度が１００Ｖ／ｍｍより大きいと、混合液の電気分解が生じやすくなり、検出感度が低下してしまう。
【００４３】
図３は、本発明の検出デバイスの一例を示す模式図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）は断面図である。図３（Ａ），（Ｂ）に示されるように、検出デバイス２００は、下基板２１０、１対の対向電極２２０、１対のスペーサー２３０および上基板２４０を有し、１対の対向電極２２０の間に両端が開口した流路２５０が形成されている。流路２５０の一方の開口部は注入口２６０であり、他方の開口部は排出口２７０である。流路２５０内の注入口２６０近傍には、２種類以上の修飾粒子を含む固形物２８０（担体粒子懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）が配置されている。
【００４４】
下基板２１０および上基板２４０は、流路２５０内の修飾粒子を観察する観点から少なくとも一方は透明であることが好ましい。例えば、下基板２１０および上基板２４０は、スライドガラスである。
【００４５】
対向電極２２０は、下基板２１０上に形成された電極である。対向電極２２０は、流路２５０に平行であればその形状は特に限定されず、図３（Ａ）に示されるように外部装置（交流電源供給装置）と接続可能な端子部２９０と接続されていることが好ましい。対向電極２２０の材料は、導電性を有するものであれば特に限定されない。対向電極２２０の材料の例には、金、銀、銅などの無機物質が含まれる。下基板２１０上に対向電極２２０を形成する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、スパッタ法、印刷法、ディップコート法などを用いることができる。
【００４６】
スペーサー２３０は、流路２５０の幅および深さを規定する部材であり、下基板２１０と上基板２４０との間に配置される。スペーサー２３０は、例えばＰＥＴ樹脂である。
【００４７】
図３に示される本発明の検出デバイス２００では、修飾粒子を含む固形物２８０が流路２５０内に配置されているため、試料を注入口２６０から流路２５０内に提供するだけで第２のステップを終えることができる。また、対向電極２２０間に交流電圧を印加することで、第３のステップを行うことができる。
【００４８】
［第４のステップ］
第４のステップでは、交流電圧の印加を停止した後に、修飾粒子の凝集状態を観察する。
【００４９】
交流電圧の印加を停止すると、凝集していない修飾粒子はブラウン運動により混合液中に分散するが、特異的結合により凝集した修飾粒子は凝集した状態が維持される。したがって、修飾粒子の凝集率を求めることにより、被検出物質の有無を検出したり濃度を測定したりすることができる。本発明の検出方法では、修飾粒子の光学特性を指標として真の凝集物のみを選択し、真の凝集物を構成する修飾粒子の数から凝集率を算出する。
【００５０】
凝集率の算出方法は、特に限定されず観察方法（装置）に応じて適宜選択すればよい。例えば、光学顕微鏡に接続したカメラ（ＣＣＤカメラなど）で混合液中の修飾粒子の凝集状態を撮像し、得られた画像から画像認識技術を用いて真の凝集物を抽出し、真の凝集物を構成する修飾粒子の数から凝集率を算出すればよい。修飾粒子の凝集率は、例えば以下の式により算出することができる。
凝集率（％）＝（真の凝集物を構成する修飾粒子の数）／（総粒子数）×１００
【００５１】
図４は、本発明の検出方法における凝集率の算出方法を説明するための模式図である。ここでは、第１のステップにおいて第１の修飾粒子１００ａおよび第２の修飾粒子１００ｂを準備したものとして説明する（図１参照）。
【００５２】
第１の修飾粒子１００ａおよび第２の修飾粒子１００ｂを含む混合液を検出デバイスの流路に提供すると、各粒子１００ａ，ｂは流路内に分散する（図４（Ａ）参照）。この状態で交流電圧を印加すると、各粒子１００ａ，ｂは誘電泳動力によりパールチェーン１４０を形成する（図４（Ｂ）参照）。交流電圧の印加を停止すると、各粒子１００ａ，ｂはブラウン運動により再度分散する（図４（Ｃ）参照）。このとき、被検出物質が存在していれば、抗原抗体反応により真の凝集物１５０ａが形成される。また、粒子１００ａ，ｂの表面状態によっては、被検出物質の有無に関係なく偽の凝集物１５０ｂも形成される。図２を参照して説明したように、２つの粒子が被検出物質を介して会合しているときは、隣接する２つの粒子の光学特性は必ず異なる。一方、隣接する２つの粒子の光学特性が同じときは、２つの粒子が被検出物質を介さずに会合しているか、または画像上で偶然重なっている担体粒子群であると考えられる。このように、本発明の検出方法では、凝集物を構成する修飾粒子の光学特性を指標とすることで、真の凝集物のみを抽出することができ、真の凝集物を構成する修飾粒子の数から凝集率を算出することができる。
【００５３】
図５は、従来の検出方法と本発明の検出方法の違いを説明するための模式図である。図５（Ａ）に示されるように、１種類の担体粒子を用いる従来の方法では、真の凝集物と偽の凝集物とを区別することができず、凝集物はすべて真の凝集物とみなして凝集率を算出する。したがって、図５（Ａ）の例では、凝集率は５０％（＝６／１２）と算出される。一方、光学特性が異なる２種類以上の担体粒子を用いる本発明の方法では、修飾粒子の光学特性を指標として、真の凝集物と偽の凝集物とを区別することができる。したがって、図５（Ｂ）の例では、凝集率は１６.７％（＝２／１２）と算出される。このように、本発明の検出方法では、認識物質と被検出物質との特異的な反応（例えば、抗原抗体反応）により形成された真の凝集物と、修飾粒子間の非特異的な凝集により形成された偽の凝集物および画像上で偶然重なっている担体粒子群とを区別することができるため、バックグラウンドとなる凝集率を大幅に低減させることができる。
【００５４】
図６は、検出システムの構成の一例を示すブロック図である。図６に示されるように、検出システム３００は、光学顕微鏡３１０、ＣＣＤカメラ３２０、画像処理ボード３３０、パーソナルコンピューター３４０および交流電源供給装置３５０を有する。
【００５５】
交流電源供給装置３５０は、検出デバイス２００の対向電極２２０間に交流電圧を印加して、流路２５０内の修飾粒子１００ａ，ｂをパールチェーン化させる。交流電圧の印加を停止した後、ＣＣＤカメラ３２０は、光学顕微鏡３１０を介して検出デバイス２００の流路２５０内の修飾粒子１００ａ，ｂを撮像する。得られた画像は画像処理ボード３３０に入力される。パーソナルコンピューター３４０および画像処理ボード３３０は、画像上の各凝集物について、真の凝集物（光学特性が異なる粒子から構成された凝集物）と偽の凝集物（光学特性が同じ粒子から構成された凝集物）とを画像認識技術を用いて判別する。次いで、パーソナルコンピューター３４０は、真の凝集物を構成する修飾粒子の数から凝集率を算出する。
【００５６】
以上のように、本発明の検出方法は、光学特性が異なる２種類以上の担体粒子を使用することで、認識物質と被検出物質との特異的な反応（例えば、抗原抗体反応）により形成された真の凝集物と、担体粒子の非特異的な凝集により形成された偽の凝集物および画像上で偶然重なっている担体粒子群とを区別することができるため、バックグラウンドとなる凝集率を低減させることができる。したがって、本発明の検出方法は、被検出物質を高感度かつ高精度に検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の検出方法および検出デバイスは、例えば、血液や血漿を検体としてパルスイムノアッセイ法による検査を行う方法およびそれに用いる検出デバイスとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の検出方法で用いられる修飾粒子の一例を示す模式図である。
【図２】本発明の検出方法で用いられる修飾粒子が会合した様子を示す模式図である。
【図３】本発明の検出デバイスの一例を示す模式図である。
【図４】本発明の検出方法における凝集率の算出方法を説明するための模式図である。
【図５】本発明の検出方法と従来の検出方法の違いを説明するための模式図である。
【図６】本発明の検出システムの一例を示す模式図である。
【図７】（Ａ）は従来の反応用チップの断面図、（Ｂ）は従来の反応測定装置のブロック図である。
【図８】従来の反応用チップの流路部分の拡大図である。
【符号の説明】
【００５９】
１０，１２  スライドグラス
１４，１６  電極
１８  流路
２０  ラテックス粒子
２２  顕微鏡
２４  ＣＣＤカメラ
２６  画像処理ボード
２８  パーソナルコンピューター
３０  交流電源供給装置
１００ａ  第１の修飾粒子
１００ｂ  第２の修飾粒子
１１０ａ  第１の担体粒子
１１０ｂ  第２の担体粒子
１２０ａ  第１の認識物質
１２０ｂ  第２の認識物質
１３０  被検出物質
１４０  パールチェーン化された修飾粒子
１５０ａ  真の凝集物
１５０ｂ  偽の凝集物
２００  検出デバイス
２１０  下基板
２２０  対向電極
２３０  スペーサー
２４０  上基板
２５０  流路
２６０  注入口
２７０  排出口
２８０  固形物
２９０  端子部
３００  検出システム
３１０  光学顕微鏡
３２０  ＣＣＤカメラ
３３０  画像処理ボード
３４０  パーソナルコンピューター
３５０  交流電源供給装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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