(57)【要約】【課題】免疫調節性抗体、特に抗Ｂ７、抗ＣＤ２３、もしくは抗ＣＤ４０Ｌ抗体と、Ｂ細胞枯渇性抗体、特に抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、もしくは抗ＣＤ３７抗体とを使用するＢ細胞悪性病変治療向けの併用抗体療法を提供する。【解決手段】この併用療法は、抗Ｂ７及び抗ＣＤ２０抗体の投与を含むことが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ８０抗体を含む、ヒト患者におけるＢ細胞腫瘍を治療するために抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて同時又は逐次に使用するための医薬組成物。
【請求項２】
Ｂ細胞リンパ腫又は白血病であるＢ細胞腫瘍を治療するためのものである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｂ細胞リンパ腫であるＢ細胞腫瘍を治療するためのものである請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、低悪性度／濾胞性ＮＨＬ、濾胞中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小円型細胞ＮＨＬ、バルキー病ＮＨＬ又はワルデンストレーム大グロブリン血症であるＢ細胞リンパ腫を治療するためのものである、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）であるリンパ腫を治療するためのものである請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＡＬＬ−Ｌ３（バーキット型白血病）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）又は単球細胞性白血病である白血病を治療するためのものである請求項２記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗ＣＤ８０抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗ＣＤ８０ヒト、ヒト化又はキメラ抗体がヒトＩｇＧ1又はＩｇＧ３定常領域を含む請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗ＣＤ８０抗体がＩＤＥＣ−１１４である請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗ＣＤ８０抗体がＢリンパ腫細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗ＣＤ８０抗体がＢリンパ腫細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記抗ＣＤ８０抗体がサイトトキシンに結合している請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記サイトトキシンが、放射性核種、細胞分裂抑制剤、生体毒素又はプロドラッグである、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記抗ＣＤ２０抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗ＣＤ２０ヒト、ヒト化又はキメラ抗体がヒトＩｇＧ1又はＩｇＧ３定常領域を含む請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記抗ＣＤ２０抗体がリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）である請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記抗ＣＤ２０抗体が悪性Ｂ細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記抗ＣＤ２０抗体が悪性Ｂ細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する請求項１〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記抗ＣＤ２０抗体がＢ細胞枯渇活性を有する請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記抗ＣＤ２０抗体がサイトトキシンに結合している請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記サイトトキシンが、放射性核種、細胞分裂抑制剤、生体毒素又はプロドラッグである、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて同時又は逐次に使用するためのものであって、さらに、ヒト患者におけるＢ細胞腫瘍を治療するために１以上の化学療法剤と組み合わせて同時又は逐次に使用するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
抗ＣＤ８０抗体を含む、悪性Ｂ細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強するために抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて同時又は逐次に使用するための医薬組成物。
【請求項２４】
リンパ腫又は白血病細胞である悪性Ｂ細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強するためのものである請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
細胞傷害がイン・ビボで起こる請求項２３又は２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記抗ＣＤ８０抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記抗ＣＤ８０抗体がＩＤＥＣ−１１４である請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記抗ＣＤ２０抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記抗ＣＤ２０抗体がリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）である請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記抗ＣＤ２０抗体がＢ細胞枯渇活性を有する請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて同時又は逐次に使用するためのものであって、さらに、悪性Ｂ細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強するために１以上の化学療法剤と組み合わせて同時又は逐次に使用するための、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年１月３１日出願の米国出願第０９／７７２，９３８号、２００１年５月１６日出願の同出願第０９／８５５，７１７号、２００１年１１月５日出願の同出願第０９／９８５，６４６号、及び２００１年１１月９日出願の同仮出願第６０／３３１，１８７号に優先権を主張するものであり、それぞれを参照により全体として本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、新生物、特にＢ細胞リンパ腫及び白血病の治療用の相乗的な抗体併用療法に関する。好ましい実施形態では、この相乗的な抗体の組合せは、たとえばＢ細胞／Ｔ細胞の相互作用、及び／又はＢ細胞の活性、分化、もしくは増殖を調節することによって免疫系を調節又は制御する抗体（たとえば抗Ｂ７、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ２３、又は抗ＣＤ４０Ｌ）と、任意選択で、実質的なＢ細胞枯渇活性を有する少なくとも１種の抗体（たとえば抗ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＣＤ３７抗体）とを含み、他の好ましい実施形態では、本発明は、抗ＣＤ４０Ｌと抗Ｂ７など、２種の免疫調節性抗体の相乗的な組合せを含んでよい。
【背景技術】
【０００３】
脊椎動物（たとえば、ヒト、類人猿、サルなどを含む霊長類）の免疫系は、脊椎動物の宿主を襲う外来の微生物（「抗原」）を正確かつ特異的に認識し、そのような外来微生物に特異的に結合し、さらにそのような外来微生物を排除／破壊するように進化したいくつかの臓器及び細胞型からなる。リンパ球、並びに他の種類の細胞は、免疫系と外来微生物の排除及び破壊にとって極めて重要である。リンパ球は、胸腺、脾臓、及び骨髄（成人）で産生され、ヒト（成人）の循環器系に存在する白血球細胞全体の約３０％に相当する。リンパ球の２大亜集団は、Ｔ細胞及びＢ細胞である。Ｔ細胞は細胞免疫を担い、Ｂ細胞は抗体産生（液性免疫）を担う。しかし、Ｔ細胞及びＢ細胞は、互いに依存しているとみなすことができる。典型的な免疫応答では、抗原提示細胞表面上の主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）糖タンパク質に結合されている抗原の断片にＴ細胞受容体が結合したときにＴ細胞が活性化され、この活性化によって、生物学的媒介物質（「インターロイキン」又は「サイトカイン」）が放出され、本質的に、この物質がＢ細胞を刺激してこれを分化させて、その抗原に対する抗体（「免疫グロブリン」）を産生させるのである。
【０００４】
宿主内では、各Ｂ細胞がその表面上に異なる抗体を発現し、したがって、１つのＢ細胞が１個の抗原に特異的な抗体を発現し、その間別のＢ細胞が違う抗原に特異的な抗体を発現することになる。それゆえに、Ｂ細胞は、実に多様であり、この多様性は、免疫系にとって極めて重要である。ヒトでは、各々のＢ細胞が、膨大な数（すなわち約１０7〜１０8個）の抗体分子を産生できる。最も一般には、このような抗体産生は、外来抗原が中和されると停止（かなり低下）する。しかし、ある特定のＢ細胞の増殖が衰えず続く場合があり、このような増殖状態は、「Ｂ細胞リンパ種」と呼ばれる癌をもたらし得る。
【０００５】
非ホジキンリンパ腫は、Ｂリンパ球の悪性の成長を特徴とする、リンパ腫の１種類である。アメリカ癌学会によると、推定５４，０００件の新しい症例が診断されており、その６５％は、中悪性度又は高悪性度のリンパ腫であると分類されるであろう。中悪性度リンパ腫であると診断された患者の平均生存率は２〜５年であり、高悪性度リンパ腫であると診断された患者が生存するのは、診断後平均６カ月〜２年である。
【０００６】
従来の治療には、化学療法及び放射線が含まれ、適切なドナーが求めに応じられ、かつ骨髄が、収集した場合に非常に多くの腫瘍細胞を含んでいれば、その後自家もしくは同種間の骨髄又は幹細胞移植が伴うこともある。患者が従来の治療に応答することは多いが、通常数カ月以内に再発する。
【０００７】
Ｂ細胞の悪性病変、たとえばＢ細胞リンパ腫及び白血病は、Ｂ細胞枯渇活性を有する、Ｂ細胞抗原に特異的な抗体を使用すると、成功裏に治療できることが知られている。Ｂ細胞の悪性病変の治療に実際又は潜在的に適用できることが報告されているＢ細胞抗体の例には、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、及びＣＤ４０に特異的な抗体が含まれる。
【０００８】
また、Ｂ細胞枯渇活性を有する抗ＣＤ３７抗体の使用に、Ｂ細胞リンパ腫を治療する可能性があることが詳しく報告されている。たとえば、Ｐｒｅｓｒ等のＪ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．第７巻（８）：１０２７〜１０３８ページ（１９８９年８月）；Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ等のＢｌｏｏｄ第８巻（４）：８６３〜８７６ページ（１９９２年８月１５日）を参照されたい。
【０００９】
ＣＤ２０は、９０％を超えるＢ細胞リンパ腫上に発現する細胞表面抗原であり、脱落することなく、腫瘍細胞中で変化することもない（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等のＪ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．第１６巻：２８２５〜２８３３ページ（１９９８ｂ））。ＣＤ２０抗原は、細胞内の情報伝達、Ｂ細胞の分化、及びカルシウム・チャネル調節に関与する、３５ｋＤａの非グリコシル化Ｂ細胞膜タンパク質である（Ｃｌａｒｋ等の  Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５２巻：８１〜１４９ページ（１９８９年）；Ｔｅｄｄｅｒ等のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ第１５巻：４５０〜４５４ページ（１９９４年））。この抗原は、ヒトＢ細胞系列の初期マーカーとして出現し、様々な抗原密度で、遍在して正常及び悪性Ｂ細胞集団上に発現する。しかし、この抗原は、完全に成熟したＢ細胞（たとえば血漿細胞）、初期Ｂ細胞集団、及び幹細胞上には存在せず、そのため、抗体療法に適するターゲットになる。
【００１０】
抗ＣＤ２０抗体は、研究及び治療の両方における使用向けに調製されている。抗ＣＤ２０抗体の１つが、単クローンＢ１抗体である（米国特許第５，８４３，３９８号）。抗ＣＤ２０抗体は、Ｂ細胞リンパ腫治療用の放射性核種の形（たとえば、131Ｉ標識抗ＣＤ２０抗体）、並びに前立腺及び乳癌の転移によって引き起こされた骨痛緩和用の89Ｓｒ標識の形でも調製されている（Ｅｎｄｏの癌と化学療法第２６巻：７４４〜７４８ページ（１９９９年））。
【００１１】
マウス・モノクローナル抗体である１Ｆ５（抗ＣＤ２０抗体）は、報告によれば、連続的な静脈注入によって、Ｂ細胞リンパ腫患者に投与されている。しかし、報告によれば、循環する腫瘍細胞を枯渇させるには極度に高濃度（＞２グラム）の１Ｆ５が必要とされ、結果は、「一過性」であったと記載されている（Ｐｒｅｓｓ等、Ｂｌｏｏｄ第６９巻：５８４〜５９１ページ（１９８７年））。治療においてモノクローナル抗体を使用することに伴う潜在する問題は、非ヒト・モノクローナル抗体（たとえばマウス・モノクローナル抗体）が、通常ヒトのエフェクター機能を欠いていること、たとえば、特に、補体依存的な溶解の媒介となることや抗体依存的な細胞傷害もしくはＦｃ受容体媒介性の食作用によってヒトの標的細胞を溶解することができない点である。その上、非ヒト・モノクローナル抗体は、ヒト宿主によって外来タンパク質として認識される可能性があり、したがってそのような外来抗体を繰り返し注射すれば、有害な過敏性反応をもたらす免疫応答が誘発され得る。マウス系モノクローナル抗体では、これをしばしば、ヒト抗マウス抗体応答、又は「ＨＡＭＡ」応答と呼ぶ。さらに、このような「外来」抗体は、宿主の免疫系によって攻撃されて、実際には、これらがその標的部位に到達する前に中和される可能性がある。
【００１２】
リツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ）（登録商標）（リツキシマブ、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８、及びＣ２Ｂ８としても知られている）は、ＦＤＡに最初に認可されたモノクローナル抗体であり、ヒトＢ細胞リンパ腫の治療用にＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが開発したものである（米国特許第５，８４３，４３９号、同第５，７７６，４５６号、及び同第５，７３６，１３７号を参照されたい）（Ｒｅｆｆ等のＢｌｏｏｄ第８３巻：４３５〜４４５ページ（１９９４年））。リツキサン（登録商標）は、成長抑制性の抗ＣＤ２０キメラ単クローン（ＭＡｂ）であり、報告によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである特定のリンパ腫細胞系の化学療法薬によるアポトーシスを感作する（Ｄｅｍｉｄｅｍ等のＣａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ第１２巻：１７７〜（１９９７年））。リツキサン（登録商標）は、マウス異種移植動物モデルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、抗腫瘍活性も示している。リツキサン（登録商標）は、ヒトの補体に効率的に結合し、ＦｃＲに強力に結合し、かつ補体依存的（ＣＤＣ）及び抗体依存的（ＡＤＣＣ）機序の両方によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトリンパ球を効率的に死滅させることができる（Ｒｅｆｆ等のＢｌｏｏｄ第８３巻：４３５〜４４５ページ（１９９４年））。マカクでは、この抗体は、血液及びリンパ節からの正常なＢ細胞を選択的に枯渇させる。
【００１３】
リツキサン（登録商標）は、低悪性度又は濾胞性のＢ細胞非ホジキンリンパ腫患者の治療用に推奨されてきた（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等のＯｎｃｏｌｏｇｙ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔ）第１２巻：１７６３〜１７７７ページ（１９９８年ａ）；Ｍａｌｏｎｅｙ等のＯｎｃｏｌｏｇｙ第１２巻：６３〜７６ページ（１９９８年）；Ｌｅｇｅｔ等のＣｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．第１０巻：５４８〜５５１ページ（１９９８年））。ヨーロッパでは、リツキサン（登録商標）は、再発したＩＩＩ／ＩＶ期濾胞性リンパ腫の治療用に認可されており（Ｗｈｉｔｅ等のＰｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ第２巻：９５〜１０１ページ（１９９９年））、報告によると、濾胞中心細胞リンパ腫（ＦＣＣ）に有効である（Ｎｇｕｙｅｎ等のＥｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ第６２巻：７６〜８２ページ（１９９９年））。リツキサン（登録商標）によって治療されている他の障害には、濾胞中心細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞性Ｂリンパ腫（ＤＬＣＬ）、及び小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病が含まれる（ＳＬＬ／ＣＬＬ）（Ｎｇｕｙｅｎ等、１９９９年））。報告によると、難治性もしくは不治のＮＨＬの患者は、リツキサン（登録商標）とＣＨＯＰ（たとえば、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン、及びドキソルビシン）の併用療法に応答した（Ｏｈｎｉｓｈｉ等の癌と化学療法第２５巻：２２２３〜８ページ（１９９８年））。第Ｉ相及び第ＩＩ相の臨床研究では、リツキサン（登録商標）が、悪性度の低い非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）において最小限の毒性及び有意な治療活性を示している（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ等のＡｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．第９巻：９９５〜１００１ページ（１９９８年））。
【００１４】
リツキサン（登録商標）は、再発性又は難治性の低悪性度もしくは濾胞性ＮＨＬに対して、通常毎週３７５ｍｇ／Ｍ2の用量で４週間、Ｂ細胞ＮＨＬの治療に単独で使用すると、十分に忍容され、かつ有意な臨床活性を伴った（Ｐｉｒｏ等のＡｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．第１０巻：６５５〜６１ページ（１９９９年）、Ｎｇｕｙｅｎ等（１９９９年）、及びＣｏｉｆｆｉｅｒ等のＢｌｏｏｄ第９２巻：１９２７〜１９３２ページ（１９９８年））。しかし、抗体を使用する治験の際、最高で毎週５００ｍｇ／Ｍ2の用量を４週間投与することも行われている（Ｍａｌｏｎｅｙ等のＢｌｏｏｄ第９０巻：２１８８〜２１９５ページ（１９９７年））。リツキサン（登録商標）はまた、低悪性度又は濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫患者を治療するために、ＣＨＯＰ（たとえば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソン）などの化学療法薬と併用されている（Ｃｚｕｃｚｍａｎ等のＪ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．第１７巻：２６８〜７６ページ（１９９９年）及びＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等（１９９８年ａ））。
【００１５】
さらにまた、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡されている特許が、Ｂ細胞リンパ腫治療への抗Ｂ７抗体の使用に言及した（米国特許第６，１１３，１９８号）。しかし、この特許の焦点は、免疫抑制が治療上有益となる疾患の治療のためにそれを使用することであった。例としては、アレルギー、自己免疫、及び移植の適応症が含まれる。
【００１６】
ＣＤ４０は、成熟Ｂ細胞の細胞表面上、並びに白血病性及びリンパ球性Ｂ細胞上、ホジキン病（ＨＤ）のホジキン細胞及びリード・スタンバーグ（ＲＳ）細胞上に発現する（Ｖａｌｌｅ等のＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１９巻：１４６３〜１４６７ページ（１９８９年）及びＧｒｕｓｓ等のＬｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ第２４巻：３９３〜４２２ページ（１９９７年））。ＣＤ４０は、正常Ｂ細胞、及び非ホジキン濾胞性リンパ腫などの悪性Ｂ細胞の活性化及び生存をもたらすＢ細胞受容体である（Ｊｏｈｎｓｏｎ等のＢｌｏｏｄ第８２巻：１８４８〜１８５７ページ（１９９３年）及びＭｅｔｋａｒ等のＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．第４７巻：１０４ページ（１９９８年））。ＣＤ４０受容体を介する情報伝達によって、未成熟Ｂ細胞及びＢ細胞リンパ腫がＩｇＭもしくはＦａｓ誘発アポトーシスから保護される（Ｗａｎｇ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第１５５巻：３７２２〜３７２５ページ（１９９５年））。同様に、マントル細胞リンパ腫細胞は、ＣＤ４０のレベルが高く、外来性のＣＤ４０Ｌが加わると、その生存性が向上し、フルダラビン誘発アポトーシスから免れた。（Ｃｌｏｄｉ等のＢｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１０３巻：２１７〜２１９ページ（１９９８年））。対照的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ等のＢｌｏｏｄ第８３巻：２７８７〜２７９４ページ（１９９４年））及びｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｍｕｒｐｈｙ等のＢｌｏｏｄ第８６巻：１９４６〜１９５３ページ（１９９５年））の両方で、ＣＤ４０の刺激が、腫瘍性のＢ細胞成長を抑制するかもしれないという報告がある。
【００１７】
抗ＣＤ４０抗体（米国特許第５，８７４，０８２号及び同第５，６６７，１６５号を参照されたい）をマウスに投与すると、ヒトＢ細胞リンパ腫を有するマウスの生存性が向上した（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ等（１９９４年）及びＴｕｔｔ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６１巻：３１７６〜３１８５ページ（１９９８年））。ＣＤ４０Ｌの作用を模倣し、それによって死滅シグナルを送達する抗ＣＤ４０抗体を使用して、Ｂ細胞リンパ腫及びＥＢＶ誘発リンパ腫を含む新生物を治療する方法が、米国特許第５，６７４，４９２号（１９９７年）に記載されており、これを参照により全体として本明細書に組み込む。ＣＤ４０の情報伝達は、ＣＤ２０との相乗的な相互作用とも関連付けられてきた（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ等のＣｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ第４４巻：６７〜７２ページ（１９９４年））。抗ＣＤ４０抗体の調製及び使用を記載している追加の参照文献には、米国特許第５，８７４，０８５号（１９９９年）、同第５，８７４，０８２号（１９９９年）、同第５，８０１，２２７号（１９９８年）、同第５，６７４，４９２号（１９９７年）、及び同第５，６６７，１６５号（１９９７年）が含まれ、これらを参照により全体として本明細書に組み込む。
【００１８】
ＣＤ４０リガンドのｇｐ３９（ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０Ｌ、又はＣＤ１５４とも呼ばれる）は、活性化しているが、静止状態でないＣＤ４+Ｔｈ細胞上に発現する（Ｓｐｒｉｇｇｓ等のＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１７６巻：１５４３〜１５５０ページ（１９９２年）、Ｌａｎｅ等のＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２２巻：２５７３〜２５７８ページ（１９９２年）、及びＲｏｙ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５１巻：１〜１４ページ（１９９３年））。ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌのどちらもが、クローン化され、特徴付けされている（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉ等のＥＭＢＯ  Ｊ．第８巻：１４０３〜１４１０ページ（１９８９年）、Ａｒｍｉｔａｇｅ等のＮａｔｕｒｅ第３５７巻：８０〜８２ページ（１９９２年）、Ｌｅｄｅｒｍａｎ等のＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１７５巻：１０９１〜１１０１ページ（１９９２年）、及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ等のＥＭＢＯ  Ｊ．第１１巻：４３１３〜４３２１ページ（１９９２年））。ヒトＣＤ４０Ｌは、米国特許第５，９４５，５１３号にも記載されている。ＣＤ４０Ｌ遺伝子が形質移入され、その表面にＣＤ４０Ｌタンパク質を発現する細胞によって、Ｂ細胞の増殖が誘発され、それと共に他の刺激性シグナルによって抗体産生が誘発される（Ａｒｍｉｔａｇｅ等（１９９２年）及び米国特許第５，９４５，５１３号）。ＣＤ４０Ｌは、ホジキン病部位の腫瘍濾胞又はリード・スタンバーグ細胞（ＣＤ４０+）の範囲内での、細胞接触に依存的な腫瘍Ｂ細胞（ＣＤ４０+）間の相互作用において重要な役割を担っているかもしれない（Ｃａｒｂｏｎｅ等のＡｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．第１４７巻：９１２〜９２２ページ（１９９５年））。抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体は、ＬＰ−ＢＭ５感染マウスにおけるマウスＡＩＤＳ（ＭＡＩＤＳ）誘発の抑制に使用すると有効であったことが報告されている（Ｇｒｅｅｎ等のＶｉｒｏｌｏｇｙ第２４１巻：２６０〜２６８ページ（１９９８年））。しかし、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０の情報伝達が、悪性Ｂ細胞の細胞死応答に対する生存性をもたらす機構は不明である。たとえば、濾胞性リンパ腫細胞では、アポトーシスを誘発するＴＲＡＩＬ分子（ＡＰＯ−２Ｌ）のダウンレギュレーション（Ｒｉｂｅｉｒｏ等のＢｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１０３巻：６８４〜６８９ページ（１９９８年））及びＢＣＬ−２の過剰発現が、並びにＢ−ＣＬＬの場合では、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）のダウンレギュレーション（Ｌａｙｔｒａｇｏｏｎ−Ｌｅｗｉｎ等のＥｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．第６１巻：２６６〜２７１ページ（１９９８年））が、生存機構として提示されている。対照的に、濾胞性リンパ腫に存在する証拠は、ＣＤ４０の活性化が、ＴＮＦ（Ｗｏｒｍ等のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．第６巻：１８８３〜１８９０ページ（１９９４年））、ＣＤ９５分子（Ｐｌｕｍａｓ等のＢｌｏｏｄ第９１巻：２８７５〜２８８５ページ（１９９８年））のアップレギュレーションをもたらすというものである。
【００１９】
米国特許第５，８７４，０８２号（１９９９年）に記載されているように、抗ＣＤ４０抗体は、アレルギー及び自己免疫傷害など、抗原を媒介とする疾患を予防又は治療するためにも調製されている。報告によれば、抗ＣＤ４０抗体は、抗ＣＤ２０抗体と併用すると有効であり、細胞培養物中の非ホジキンＢ細胞リンパ腫の成長抑制に付加的な効果をもたらした（Ｂｅｎｏｉｔ等のＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ第３５巻：１２９〜１３９ページ（１９９６年））。マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、すべてでなく数種のリンパ腫系を有するマウスの生存を促進することでは、個々に投与した抗ＣＤ４０抗体よりも抗ＣＤ２０抗体の方が効果的であることを示したとされている（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１９巻：９３〜１０１ページ（１９９６年））。抗ＣＤ１９抗体も、２種の同系マウスＢ細胞リンパ腫、すなわちＢＣＬ１及びＡ３１の治療においてｉｎ  ｖｉｖｏで有効であったことが報告されている（Ｔｕｔｔ等（１９９８））。ＣＤ４０Ｌに対する抗体は、Ｂ細胞活性化に随伴する傷害を治療するための使用についても記載されている（ヨーロッパ特許第５５５，８８０号（１９９３年））。抗ＣＤ４０Ｌ抗体には、米国特許第５，７４７４，０３７号（１９９８年）に記載のモノクローナル抗体３Ｅ４、２Ｈ５、２Ｈ８、４Ｄ９−８、４Ｄ９−９、２４−３１、２４−４３、８９−７６、及び８９−７９、並びに米国特許第５，８７６，７１８号（１９９９年）に記載の、移植片対宿主病の治療に使用された抗ＣＤ４０Ｌ抗体が含まれる。
【００２０】
ＣＤ２２に対するモノクローナル抗体の合成及び治療レジメでのその使用も報告されている。ＣＤ２２は、Ｂ細胞の接着に関与する、Ｂ細胞に特異な分子であり、ホモタイプ又はヘテロタイプな相互作用の中で機能していると思われる（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ等のＮａｔｕｒｅ第３４４巻：７４ページ（１９９０年）、Ｗｉｌｓｏｎ等のＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１７３巻：１３７ページ（１９９１年）、Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ等のＣｅｌｌ第６６巻：１１３３ページ（１９９１年））。ＣＤ２２タンパク質は、プロジェニターＢ細胞及びプレＢ細胞の細胞質中に発現するが（Ｄｏｒｋｅｎ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１３６巻：４４７０ページ（１９８６年）；Ｄｏｒｋｅｎ等の「Ｂ細胞個体発生における細胞質内ＣＤ２２の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＣＤ２２  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｏｎｔｏｇｅｎｙ）」、出典：「血球分類ＩＩＩ、白血球分化抗原（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩＩ，  Ｗｈｉｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ）」、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ他編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、４７４ページ（１９８７年）；Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇ等のＢｌｏｏｄ第６５巻：９７４ページ（１９８５年）、Ｍａｓｏｎ等のＢｌｏｏｄ第６９巻：８３６ページ（１９８７年））、成熟Ｂ細胞の表面上でしか見られず、表面ＩｇＤと同時に存在する（Ｄｏｒｋｅｎ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１３６巻：４４７０ページ（１９８６年））。ＣＤ２２の発現は、活性化に従って増加し、さらなる分化に伴って消滅する（Ｗｉｌｓｏｎ等のＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１７３巻：１３７ページ（１９９１年）、Ｄｏｒｋｅｎ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１３６巻：４４７０ページ（１９８６年））。リンパ系組織では、ＣＤ２２は、濾胞外套帯及び周辺帯のＢ細胞によって発現するが、週に１度だけは胚中心Ｂ細胞によって発現する（Ｄｏｒｋｅｎ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１３６巻：４４７０ページ（１９８６年）；Ｌｉｎｇ等の「Ｂ細胞及び血漿抗原：新規及びこれまでに定義されたクラスター」（Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：ｎｅｗ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ））、出典：白血球分類ＩＩＩ、白血球分化抗原、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ他編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、３０２ページ（１９８７年））。しかし、インシトゥハイブリダイゼーションによって、胚中心内でＣＤ２２のｍＲＮＡが最も顕著に発現し、外套帯での発現はそれより弱いことが明らかになっている（Ｗｉｌｓｏｎ等のＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１７３巻：１３７ページ（１９９１年））。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤ２２ｍＡｂのＢ細胞への結合が、細胞内の遊離カルシウムの増加及び表面Ｉｇの架橋後に誘発される分化を増大させることが判明しているので、ＣＤ２２は、Ｂ細胞活性化の調節に関与していると推測される（Ｐｅｚｚｕｔｔｏ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１３８巻：９８ページ（１９８７年）、Ｐｅｚｚｕｔｔｏ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４０巻：１７９１ページ（１９８８年））。しかし、他の研究は、抗Ｉｇによって誘発される分化の増大がそれほどでないという決定を下した（Ｄｏｒｋｅｎ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１３６巻：４４７０ページ（１９８６年））。ＣＤ２２は、恒常的にリン酸化されるが、細胞をＰＭＡで処理した後では、リン酸化のレベルが増大する（Ｂｏｕｅ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４０巻：１９２ページ（１９８８年））。さらに、可溶性の形のＣＤ２２は、ＣＤ３を媒介とするヒトＴ細胞の活性化を抑制するので、ＣＤ２２は、Ｔ細胞−Ｂ細胞の相互作用において重要であることが示唆される（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ等のＣｅｌｌ第６６巻：１１３３ページ（１９９１年））。
【００２１】
ＣＤ２２受容体を特異的に結合するリガンドは、様々な疾患、特にＢ細胞リンパ腫及び自己免疫疾患の治療において応用できる可能性があると報告されている。特に、標識及び非常識抗ＣＤ２２抗体をこのような疾患の治療に使用することが報告されている。
【００２２】
たとえば、Ｔｅｄｄｅｒ他の米国特許第５，４８４，８９２号は、ＣＤ２２を高い親和性で結合し、ＣＤ２２と他のリガンドとの相互作用を遮断するらしい。このようなモノクローナル抗体は、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、壊死性血管炎、リンパ節炎、結節性動脈周囲炎、全身性エリテマトーデス、関節炎、血小板減少性紫斑病、無顆粒球症、自己免疫性溶血性貧血など、自己免疫疾患の治療において、並びに妊娠中の胎児抗原などの外来抗原に対する免疫反応、重症筋無力症、インスリン抵抗性糖尿病、グレーブス病、及びアレルギー応答を抑制するために有用であると開示されている。
【００２３】
またＬｅｕｎｇ等の米国特許第５，７８９，５５７号は、ＣＤＲ移植によって生成した抗ＣＤ２２キメラヒト化モノクローナル抗体、並びにその結合型及び非結合型をＢ細胞リンパ腫及び白血病の治療及び診断に使用することを開示している。この参照文献は、特に、化学療法薬、毒素、重金属、及び放射性核種などの細胞傷害剤に結合させた抗体を開示している。（１９９８年８月４日に公告され、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓに譲渡されている、Ｌｅｕｎｇ他の米国特許第５，７８９，５５４号を参照されたい）。
【００２４】
さらに、ＰＣＴ出願のＷＯ９８／４２３７８、ＷＯ００／２０８６４、及びＷＯ９８／４１６４１は、ＣＤ２２に特異的なモノクローナル抗体、コンジュゲート、及び断片、並びに、特にＢ細胞関連疾患を治療するためのその治療上の使用を記載している。
【００２５】
また、抗ＣＤ２２抗体の自己免疫疾患及び癌治療への使用も提示されている。（たとえば、診断及び治療のため、特にウイルス及び細菌感染疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、及び癌の治療のための抗ＣＤ２２免疫複合体の記載を趣旨とする、１９９５年８月２２に公告され、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ  Ｉｎｃ．に譲渡されているＨａｎｓｅｎ他の米国特許第５，４４３，９５３号、並びにＣＤ２２接着機能の遅滞又は遮断が治療上有益である疾患、特に自己免疫疾患の治療のための、ＣＤ２２指向性の様々なモノクローナル抗体の記載を趣旨とする、１９９８年１月１６日に公告され、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．に譲渡されているＴｅｄｄｅｒ他の米国特許第５，４８４，８９２号を参照されたい。）これらの参照文献は、断片の抗ＣＤ２２抗体を、所望の作動体部分、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫アッセイもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断の際の酵素、フルオロフォア、放射性核種、電子伝達薬など、検出できる標識、又は治療用作動体部分、たとえば毒素、薬物、もしくは放射性同位体に直接又は間接的に結合させることを提唱している。
【００２６】
さらに、ＩｇＧ１アイソタイプの抗ヒトＣＤ２２モノクローナル抗体は、Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販品として入手でき、報告によれば、Ｂ細胞リンパ腫、及び毛用細胞白血病を含む白血病の治療に有用である（Ｃａｍｐａｎａ，Ｄ．等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１３４巻：１５２４ページ（１９８５年））。さらにまた、Ｄｏｒｋｅｎ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５０巻：４７１９ページ（１９９３年）及びＥｎｇｅｌ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５０巻：４５１９ページ（１９９３年）の両方が、ＣＤ２２に特異的なモノクローナル抗体を記載している。
【００２７】
また、抗ＣＤ１９抗体及びその断片のリンパ腫治療への使用も文献で報告されている。たとえば、１９９７年１１月１１日に公告され、テキサス大学に譲渡されているＵｈｒ他の米国特許第５，６８６，０７２号は、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２抗体と免疫毒素の、白血病リンパ腫の治療への使用を開示している。この特許の全体を参照により本明細書に組み込む。
【００２８】
さらに、抗ＣＤ１９抗体を白血病の状態及び予後の分類のために使用することも報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
したがって、前述のことから、非常に多くの個々の抗体が、腫瘍疾患を治療する治療上の可能性を有すると報告されてきたことは明らかである。この事実にもかかわらず、本発明の目的は、リンパ腫及び白血病を含む様々な悪性病変の治療用の新規な抗体投与計画を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
この目的に対して、本発明の目的は、あらゆる悪性度のホジキン及び非ホジキンリンパ腫など、Ｂ細胞悪性病変を含む様々な腫瘍疾患を治療するための新規な改良された抗体療法を提供することである。
【００３１】
より具体的には、本発明の目的は、少なくとも１種の免疫制御性もしくは免疫調節性抗体と、任意選択の少なくとも１種のＢ細胞枯渇性抗体とを投与することを含む、腫瘍疾患治療のための新規な抗体投与計画を提供することである。
【００３２】
さらに具体的には、本発明の目的は、好ましくは、抗Ｂ７抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、及び抗ＣＤ４抗体からなる群から選択された少なくとも１種の免疫調節性もしくは免疫制御性抗体と、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２２抗体、及び抗ＣＤ３７抗体からなる群から好ましく選択された任意選択の少なくとも１種のＢ細胞枯渇性抗体を投与することを含む、腫瘍疾患治療のための新規な抗体療法を提供することである。特に好ましい実施形態では、この治療又は療法は、治療有効量の抗Ｂ７抗体の投与と治療有効量の抗ＣＤ２０抗体の投与との組合せを含む。
【００３３】
他の実施形態では、本発明の特別な目的は、治療有効量のＣＤ４０Ｌに対する抗体と治療有効量のＢ７に対する抗体とを組み合わせて投与することを含む、腫瘍疾患の治療法又は予防法を提供することである。この抗体の組合せを、非ホジキンリンパ腫や慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）など、Ｂ細胞悪性病変の治療のために投与することが好ましく、米国特許第６，１１３，８９８号で開示されたＢ７抗体と、米国特許第６，００１，３５８号で開示された抗ＣＤ４０Ｌ抗体を含むことがより好ましい。
【００３４】
したがって、本発明の重要な態様は、哺乳動物の腫瘍疾患を治療する方法であって、
前記哺乳動物に治療有効量の第１の免疫調節性抗体を投与するステップと、
前記哺乳動物に治療有効量の第２の免疫調節性抗体又はＢ細胞枯渇性抗体を投与するステップとを含み、前記第１及び第２の免疫調節性抗体が別の抗原に結合し、第１の免疫調節性抗体と第２の免疫調節性抗体もしくはＢ細胞枯渇性抗体を任意の順又は同時に投与してよい方法を含む。
【００３５】
本発明の別の目的は、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病におけるＢ細胞悪性病変を含む腫瘍疾患を治療するための新規な組成物、製品、及び／又はキットであって、キット又は製品が少なくとも１種の免疫制御性もしくは免疫調節性抗体と、任意選択の少なくとも１種のＢ細胞枯渇性抗体を含むものを提供することである。免疫抑制性もしくは免疫調節性抗体が、少なくとも１種の抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、又は抗Ｂ７抗体を含み、Ｂ細胞枯渇性抗体が、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ３７に特異的であることが好ましい。キット又は製品が、抗ＣＤ４０Ｌもしくは抗Ｂ７抗体、又はこれらの組合せと、任意選択の抗ＣＤ２０抗体を含むことが最も好ましい。さらに、製品は、その内容物が腫瘍疾患の治療において有用であることを示す挿入物、説明書、又はラベル付けされた容器を含む。
【００３６】
本発明の別の目的は、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病治療のための併用療法であって、抗ＣＤ４０Ｌ抗体もしくは抗体断片もしくはＣＤ４０Ｌ拮抗物質と、少なくとも１種の以下のもの、すなわち、（ａ）化学療法薬もしくは化学療法薬の組合せ、（ｂ）放射線療法、（ｃ）抗ＣＤ２０抗体もしくはその断片、（ｄ）抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、（ｅ）抗ＣＤ１９抗体もしくはその断片、（ｆ）抗ＣＤ２２抗体もしくはその断片、（ｇ）サイトカイン、（ｈ）抗Ｂ７抗体もしくはその断片を含み、抗体が毒素又は標識用放射性同位体と結合していてもよく、又はヒト抗体のエフェクター機構を誘発する、すなわち標的細胞のアポトーシスもしくは死をもたらすようにヒト定常部で操作されていてもよい併用療法を提供することである。
【００３７】
本発明の他の目的、特徴、及び有利点は、その例となる以下の好ましい実施形態の詳細な説明を考慮することによって、当分野の技術者に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】アドリアマイシンに対する４時間暴露後のＢリンパ腫細胞の感受性を示すグラフである。
【図２Ａ】抗ＣＤ４０Ｌ（ＩＤＥＣ−１３１）が、ＡＤＭによる死滅作用に対するＢリンパ腫細胞のＣＤ４０Ｌ媒介型抵抗性を無効にすることを示すグラフである。
【図２Ｂ】リツキサン（登録商標）が標準及びｓＣＤ４０Ｌ前処理ＤＨＬ−４細胞に及ぼす影響を示すグラフである。
【図３Ａ】抗ＣＤ４０Ｌ抗体（ＩＤＥＣ−１３１）によって、ＣＤ４０Ｌに媒介されたＢ−ＣＬＬ細胞の生存がブロックされること示すグラフである。
【図３Ｂ】リツキサン（登録商標）によって、ＣＤ４０Ｌに媒介されたＢ−ＣＬＬの生存がブロックされることを示すグラフである。
【図４】ＣＤ１９+ＣＬＬ細胞をｓＣＤ４０Ｌと共に培養したもの及びｓＣＤ４０Ｌと共に培養しなかったものにおけるＨＬＡ−ＤＲの発現を含むＦＡＣＳ分析を示すグラフである。
【図５】ＣＤ８０分子を発現しているＣＨＯ細胞を使用するフローサイトメトリによって定量した、２種の異なるロットのＩＤＥＣ−１１４の膜結合型ＣＤ８０細胞への結合活性を示すグラフである。
【図６】ＳＢ又はＳＫＷ細胞におけるＩＤＥＣ−１１４及びリツキシマブのＡＤＣＣ活性を示すグラフである。
【図７】２名の供与者Ａ及びＢから得た活性化宿主細胞におけるＩＤＥＣ−１１４、リツキシマブ、及びその組合せのＡＤＣＣ活性を示すグラフである。
【図８】Ａは、ＣＤ８０発現ＣＨＯ細胞におけるＩＤＥＣ−１１４のＣＤＣ活性を示すグラフである。
【図８】Ｂは、ＣＤ８０発現ＳＫＷ細胞におけるＩＤＥＣ−１１４及びリツキシマブのＣＤＣ活性を示すグラフである。
【図８】Ｃは、ＣＤ８０発現Ｄａｕｄｉ細胞におけるＩＤＥＣ−１１４及びリツキシマブのＣＤＣ活性を示すグラフである。
【図９Ａ】ＩＤＥＣ−１１４に対するＳＫＷ／ＳＣＩＤマウスの抗腫瘍応答を示すグラフである。
【図９Ｂ】リツキシマブに対するＳＫＷ／ＳＣＩＤマウスの抗腫瘍応答を示すグラフである。
【図１０】リツキシマブと併用したＩＤＥＣ−１１４に対するＳＫＷ／ＳＣＩＤマウスの抗腫瘍応答を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、多くの異なる形態で具現化してよいが、本発明の原理を例証する具体的で例示的なその実施形態をここに開示する。本発明が、例示されるこの特定の実施形態に限定されないことを強調しておきたい。
【００４０】
本発明は、少なくとも１種の免疫制御性もしくは免疫調節性抗体（この用語は、この開示の目的では、交換可能に使用してよい）、たとえば抗Ｂ７抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ４０抗体、もしくは抗ＣＤ４０Ｌ抗体と、任意選択の実質的なＢ細胞枯渇活性を有する少なくとも１種のＢ細胞枯渇性抗体、たとえば抗ＣＤ２０、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、もしくは抗ＣＤ３７抗体の投与を含む、新規な抗体投与計画を提供する。
【００４１】
このような組合せは、抗体が治療利益を引き出す、異なる機構に基づく相乗的な成果をもたらす。特に、この補完的な作用機序は、２種以上の免疫調節性抗体もしくは１種の免疫調節性抗体と、Ｂ細胞枯渇性抗体とによって一斉にどんな腫瘍細胞も攻撃できるので、より耐久性があり、かつ強力な臨床応答をもたらすと理論づけられる。たとえば、いくつかの実施形態では、Ｂ細胞枯渇性抗体によって、抗Ｂ７や抗ＣＤ４０Ｌ抗体などの免疫制御性もしくは免疫調節性抗体の作用に抵抗し得る活性化Ｂ細胞を枯渇させる。このような活性化Ｂ細胞は、Ｔ細胞、並びに抗体産生細胞のための有効な抗原提示細胞として別な働きもする。Ｂ細胞悪性病変の関連では、このような活性化Ｂ細胞には、根絶されない限り新しい癌細胞及び腫瘍のもとになる悪性細胞が含まれる。
【００４２】
したがって、本発明の好ましい一実施形態は、治療有効量の免疫調節性抗体の組合せ又は単独の免疫調節性抗体をＢ細胞枯渇性抗体と共に投与することを含む、腫瘍疾患罹患患者の治療方法を含む。特に好ましい実施形態では、免疫調節性抗体の組合せは、ＣＤ４０Ｌに指向性の抗体もしくはその免疫反応性断片とＢ７に指向性の抗体もしくはその免疫反応性断片を含む。当分野の技術者ならば、この２種の免疫調節性抗体を任意の順又は同時に投与してよいこと、並びによく知られている技術を使用して、治療有効量を構成するものが容易に見分けられることがわかるであろう。さらに、免疫調節性抗体と、Ｂ細胞枯渇性抗体などの補助的療法、化学療法、放射免疫療法とを組み合わせて投与することも当該発明の範囲内である。
【００４３】
本明細書で使用する「Ｂ細胞枯渇性抗体」は、投与すると、実証可能なＢ細胞の枯渇をもたらす抗体又は断片である。通常、このような抗体は、Ｂ細胞表面上に発現したＢ細胞抗原又はＢ細胞マーカーに結合する。このような抗体を投与後、通常はだいたい数日以下で、Ｂ細胞数が約５０％以上まで枯渇することが好ましい。好ましい実施形態では、Ｂ細胞枯渇性抗体は、リツキサン（登録商標）（抗ＣＤ２０キメラ抗体）、又はリツキサン（登録商標）とほぼ同じもしくは少なくともその２０〜５０％の細胞枯渇活性を有するものとなる。
【００４４】
本明細書では、「Ｂ細胞表面マーカー」又は「Ｂ細胞ターゲット」又は「Ｂ細胞抗原」は、それに結合する作用物質又は拮抗物質の標的となり得るＢ細胞表面上に発現する抗原である。典型的なＢ細胞表面マーカーには、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、及びＣＤ８６（Ｂ７．２）白血球表面マーカーが含まれる。特に注目されるＢ細胞表面マーカーは、哺乳動物の他の非Ｂ細胞組織よりもＢ細胞上に優先的に発現し、前駆Ｂ細胞及び成熟Ｂ細胞の両方に発現することがある。一実施形態では、マーカーは、幹細胞段階から終点の血漿細胞への分化の直前までの系列が分化する間じゅうＢ細胞上に見出されるＣＤ２０又はＣＤ１９のようなものである。本明細書では、好ましいＢ細胞表面マーカーは、ＣＤ１９及びＣＤ２０である。本明細書では、好ましいＢ細胞表面マーカーは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６である。
【００４５】
本明細書で使用する「免疫制御性抗体」又は「免疫調節性抗体」は、Ｂ細胞の枯渇とは異なる機序、たとえばＣＤＬ及び／又はＡＤＣＣ活性によって免疫系に効果を引き出す抗体を指し、拮抗物質でもよい。そのような例には、たとえば寛容を引き出すことによってＴ細胞免疫、Ｂ細胞免疫を抑制する抗体（抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ４０）、又は他の免疫抑制性抗体、たとえば、Ｂ７細胞の情報伝達を阻害するもの（抗Ｂ７．１、抗Ｂ７．２、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２３など）が含まれる。事例によっては、免疫調節性抗体が、アポトーシスを増強する能力を有することもある。また、通常はＢ細胞枯渇性抗体である抗体を、ヒト定常部で置換して異なる作動体機序を利用することによって、免疫調節性になるように操作することもできる。
【００４６】
本発明を論じる前に、以下に追加の定義を示す。
【００４７】
本明細書で使用する用語「抗体」には、指摘したタンパク質もしくはそのペプチドに特別に反応性がある免疫グロブリン及びその断片が含まれるものとする。抗体には、ヒト抗体、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質もしくは標識用放射性同位体と融合した抗体、及び抗体断片を含めることができる。さらに、用語「抗体」は、本明細書では、最も広い意味で用い、特に、インタクト・モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種のインタクト抗体から形成された多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）、及び所望の生理活性を示す長さの抗体断片が範囲に含まれる。別段の注釈がない限り、又は用いた状況によって規定されない限り、用語「抗体」は、当該出願及び特許請求の範囲の意図では、広く解釈されるものであり、本明細書に記載の所望の調節もしくは枯渇効果をもたらすすべての変形形態、その断片もしくは免疫反応性構築物を含むことを明示しておく。
【００４８】
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合部もしくは可変部を含む、インタクト抗体部分を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）；線状抗体；一本鎖抗体分子；ドメイン欠損抗体（ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。従来の技術を使用して、抗体断片を単離してもよい。たとえば、Ｆ（ａｂ1）2断片は、抗体をペプシンで処理することによって得られる。得られたＦ（ａｂ1）2断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元すると、Ｆａｂ1断片が生成される。
【００４９】
「自然抗体」は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各軽鎖は、１個のジスルフィド共有結合によって重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリン・アイソタイプの重鎖間で様々である。各重鎖及び軽鎖はまた、鎖間に一定の間隔をおいてジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、片側に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、そこにいくつかの定常ドメインが追随する。各軽鎖は、片側に可変ドメイン（ＶＬ）、その他方の側に定常ドメインを有しており、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン間に界面を形成していると考えられている。
【００５０】
用語「可変」は、可変ドメインのある部分の配列が抗体間で広範囲に異なることを指し、特定の各抗体のその特定の抗原への結合及び特異性において使用する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン中のいたるところに一様に分布するものではない。可変性は、軽鎖及び重鎖両方の可変ドメイン中の超可変領域と呼ばれる３箇所の断片に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。自然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主として、ループ連結部を形成する３箇所の高頻度可変領域によって連結されたＢシート立体配置を採用し、場合によってはＢシート構造の部分を形成する４箇所のＦＲを含む。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって、他の鎖からの超可変領域と極めて接近してまとまり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ等の「免疫学的に注目されるタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、国立保健研究所Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、メリーランド州ベセズダ（１９９１年））。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接には関与しないが、その抗体が抗体依存的な細胞内細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与するなど、様々なエフェクター機能を示す。
【００５１】
抗体をパパインで消化することによって、それぞれが１個の抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２個の同一な抗原結合断片と、それが容易に結晶化できることを反映した名前をもつ、残りの「Ｆｃ」断片が得られる。ペプシン処理によって、２個の抗原結合部位を有し、その時点でも抗原を架橋できるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００５２】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、１重鎖及び１軽鎖の可変ドメインが共有結合せずに密接した二量体からなる。各可変ドメインの３箇所の超可変領域が相互に作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上で抗原結合部位を規定するのは、この立体配置の形においてである。６箇所の超可変領域によって、集合的に抗体への抗原結合特異性がもたらされる。しかし、１個の可変ドメイン（抗原に特異的な３箇所の超可変領域しか含まない半分のＦｖ）でさえ、結合部位全体よりも親和性が弱いものの、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【００５３】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣHＩ）も含む。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣHＩドメインのカルボキシ末端に、抗体のヒンジ部からの１個又は複数のシステインを含む数個の残基が加わる点で、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１個の遊離チオール基を有するＦａｂ’の意味である。Ｆ（ａｂ’）Ｚ抗体断片は、当初は、その間にヒンジのシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成されていた。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００５４】
任意の脊椎動物に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる明らかに異なる２種類の片方に振り分けることができる。
【００５５】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なるクラスに振り分けることができる。主要な５クラスのインタクト抗体、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分けられる。異なる各抗体クラスに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ぶ。重鎖定常ドメインは、γ−１、γ−２、γ−３、及びγ−４定常部を満たすことが好ましい。これらの定常ドメインは、米国特許第６，０１１，１３８号で開示されたＰ及びＥ変更など、抗体の安定性を高める変更を含むことも好ましく、この特許の全体を参照により本明細書に組み込む。異なる各免疫グロブリンクラスのサブユニット構造及び３次元立体配置は、よく知られている。
【００５６】
「１本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインが、１本のポリペプチド鎖中に存在している。Ｆｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメイン間に、ｓｃＦｖが抗原を結合するための所望の構造を形成できるようにするポリペプチド・リンカーをさらに含むことが好ましい。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎの「モノクローナル抗体の薬理学（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９〜３１５ページ（１９９４年）を参照されたい。
【００５７】
用語「二重抗体」は、２個の抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上のその２箇所のドメインが対合できない位に短いリンカーを使用することによって、そのドメインを別の鎖の相補的なドメインと強制的に対合させ、２個の抗原結合部位を作る。二重抗体は、たとえば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻：６４４４〜６４４８ページ（１９９３年）で、より十分に述べられている。
【００５８】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、その集団を構成する個々の抗体が、わずかに存在するかもしれない可能性としての自然発生突然変異を除き、同一である集団から得た抗体を指す。モノクローナル抗体は、特異性が高く、１個の抗原性部位に指向性である。さらに、通常は異なる決定基（エピトープ）に指向性ある異なる抗体を含む普通の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体が、問題の抗原の１個の決定基に指向性である。モノクローナル抗体は、その特異性に加え、融合細胞腫培養によって合成され、他の免疫グロブリンが混入していないという点で有利である。
【００５９】
「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体、一般にはマウス抗体に由来する抗体であり、親抗体の抗原結合特性を保持し、又はほとんど保持しているが、ヒトにおいてそれほど免疫原性をもたないものを意味する。これは、（ａ）ヒト定常部に非ヒト可変ドメイン全体をグラフトとして、キメラ抗体を作製する方法、（ｂ）決定的なフレームワーク残基を含む、又は含まないヒトフレームワーク領域及び定常部に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）だけをグラフトする方法、及び（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってそれをヒト様切片で「覆い隠す」方法を含む様々な方法によって実現すればよい。このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８１巻：６８５１〜５ページ（１９８４年）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等のＡｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４４巻：６５〜９２ページ（１９８８年）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等のＳｃｉｅｎｃｅ第２３９巻：１５３４〜１５３６ページ（１９８８年）、ＰａｄｌａｎのＭｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．第２８巻：４８９〜４９８ページ（１９９１年）、及びＰａｄｌａｎのＭｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．第３１巻：１６９〜２１７ページ（１９９４年）で開示されており、これらをすべて、参照により全体として本明細書に組み込む。ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、１９９５年１１月７日に出願された米国特許第６，００１，３５８号に記載のとおりに調製することができ、この特許も参照により全体として本明細書に組み込む。
【００６０】
「ヒト抗体」は、知られている標準の方法によって生成された、ヒト軽鎖及び重鎖に加えて、定常部の全体を含む抗体を意味する。
【００６１】
「霊長類化抗体」は、サル（又は他の霊長類）抗体、特にカニクイザル抗体の可変Ｈドメイン及びＬドメインを含むように操作され、ヒト定常ドメイン配列、好ましくはヒト免疫グロブリンγ１もしくはγ４定常ドメイン（又はＰＥ変異体）を含む組換え抗体を意味する。このような抗体の調製は、Ｎｅｗｍａｎ等のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１０巻：１４５８〜１４６０ページ（１９９２年）、同様に同じ譲受人に譲渡されている０８／３７９，０７２、０８／４８７，５５０、又は０８／７４６，３６１に記載されており、これらをすべて、参照により全体として本明細書に組み込む。このような抗体は、ヒト抗体に対する相同性が高度、すなわち８５〜９８％であり、ヒトエフェクター機能を示し、免疫原性が低下しており、さらにヒト抗原に高い親和性を示し得ることが報告されている。
【００６２】
「抗体断片」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、及びｓｃＦｖなど、抗体の断片を意味する。
【００６３】
「キメラ抗体」は、通常は別の種のものである２種の異なる抗体から得られた配列を含む抗体を意味する。最も一般には、キメラ抗体は、ヒト及びマウスの抗体断片を含み、一般にヒト定常部とマウス可変部である。
【００６４】
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血又はリンパ系臓器由来の９０％を超えるＢ細胞の表面上に見出される、約３５ｋＤａの非グリコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は、初期のプレＢ細胞発達段階の間に発現し、血漿細胞に分化するまで残存する。ＣＤ２０は、悪性Ｂ細胞だけでなく正常Ｂ細胞にも存在する。文献にあるＣＤ２０の他の名称には、「Ｂリンパ球拘束抗原」及び「Ｂｐ３５」が含まれる。ＣＤ２０抗原は、Ｃｌａｒｋ等のＰＮＡＳ（ＵＳＡ）第８２巻：１７６６ページ（１９８５年）に記載されている。
【００６５】
「ＣＤ１９」抗原は、たとえば、ＨＤ２３７−ＣＤ１９又はＢ４抗体によって確認された約９０ｋＤａの抗原を指す（Ｋｉｅｓｅｌ等のＬｅｕｋｅｍｉａ  ＲｅｓｅａｒｃｈＩＩ、第１２巻：１１１９ページ（１９８７年））。ＣＤ１９は、ＣＤ２０のように、幹細胞段階から終点の血漿細胞への分化の直前までの系列が分化する間じゅう細胞上に見出される。ＣＤ１９に拮抗物質が結合すると、ＣＤ１９抗原が内部移行することがある。
【００６６】
「ＣＤ２２」抗原は、「ＢＬ−ＣＡＭ」及び「ＬｙｂＢ」としても知られている、Ｂ細胞情報伝達及び接着に関与する、Ｂ細胞上に発現している抗原である。（Ｎｉｔｓｃｈｋｅ等のＣｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．第７巻：１３３ページ（１９９７年）、Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ等のＮａｔｕｒｅ第３４５巻：７４ページ（１９９０年）を参照されたい）。この抗原は、膜Ｉｇが連結されると、チロシンリン酸化される、膜免疫グロブリン結合抗原である。（Ｅｎｇｅｌ等のＪ．Ｅｔｙｐ．Ｍｅｄ．第１８１巻（４）：１５２１〜１５８６ページ（１９９５年））。この抗原をコードする遺伝子はクローン化されており、そのＩｇドメインは特徴付けされている。
【００６７】
Ｂ７抗原には、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、及びＢ７．３抗原が含まれ、これらは、Ｂ細胞上に発現している膜貫通抗原である。ヒトＢ７．１及びＢ７．２抗原を含む、Ｂ７抗原を特異的に結合する抗体が、当技術分野で知られている。好ましいＢ７抗体は、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡されているＡｎｄｅｒｓｏｎ他の米国特許第６，１１３，８９８号で開示されているｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）Ｂ７抗体、並びにヒト及びヒト化Ｂ７抗体を含む。
【００６８】
ＣＤ２３は、Ｂ細胞及び他の細胞の側に発現しているＩｇＥの低親和性受容体を指す。本発明では、ＣＤ２３は、ヒトＣＤ２３抗原であることが好ましい。ＣＤ２３抗原も、当技術分野で知られている。本発明では、ＣＤ２３抗体は、ヒトＩｇＧＩもしくはＩｇＧ３定常ドメインを含むヒトもしくはキメラヒトＣＤ２３抗体であることが最も好ましい。
【００６９】
Ｂ細胞「拮抗物質」は、Ｂ細胞表面マーカーに結合すると、哺乳動物のＢ細胞を破壊し、もしくは枯渇させ、かつ／又は、たとえば、Ｂ細胞が誘発した体液性応答を低下させ、又は妨げることによって１種又は複数のＢ細胞機能を妨害する分子である。拮抗物質は、好ましくは、それによって治療した哺乳動物のＢ細胞を枯渇させる（すなわち、循環Ｂ細胞レベルを低下させる）ことができる。このような枯渇は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／もしくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｂ細胞増殖の抑制、及び／又は（たとえば、アポトーシスによる）Ｂ細胞死の誘発など、様々な機序によって実現すればよい。本発明の範囲内に含まれる拮抗物質には、任意選択で細胞傷害性の薬品と結合もしくは融合させた、Ｂ細胞マーカーに結合する抗体、人工もしくは自然配列のペプチド、及び小分子抗原が含まれる。
【００７０】
ＣＤ４０Ｌ拮抗物質は、ＣＤ４０Ｌを特異的に結合し、好ましくは、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の相互作用に拮抗する分子である。その例には、ＣＤ４０Ｌを特異的に結合する抗体及び抗体断片、可溶性ＣＤ４０、可溶性ＣＤ４０融合タンパク質、並びにＣＤ４０Ｌを結合する小分子が含まれる。本発明による好ましい拮抗物質は、ＣＤ４０に特異的な抗体もしくは抗体断片を含む。
【００７１】
「抗体依存性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲｓ）を発現している非特異的なキラー細胞（たとえば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上の結合された抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主たる細胞であるＮＫ細胞が、ＦｃｙＲＩＩＩのみを発現しているのに対し、単球は、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、及びＦｃｙＲＩＩＩを発現している。造血細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）上のＦｃＲの発現をまとめて示したものが、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔのＡｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ第９巻：４５７〜９２ページ（１９９１年）の４６４ページの表３である。問題の分子のＡＤＣＣ活性を評価するには、米国特許第５，５００，３６２号又は同第５，８２１，３３７号に記載のものなど、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイを実施すればよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。別法又は追加として、問題の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、たとえば、Ｃｌｙｎｅｓ等のＰＮＡＳ（ＵＳＡ）第９５巻：６５２〜６５６ページ（１９９８年）で開示されているものなど、動物モデルで評価してもよい。
【００７２】
「ヒトエフェクター細胞」は、１種又は複数のＦｃＲを発現しており、エフェクター機能を果たす白血球である。この細胞が、少なくともＦｃｙＲＩＩＩを発現しており、ＡＤＣＣのエフェクター機能を果たすことが好ましい。ＡＤＣＣの媒介となるヒト白血球の例には、末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、キラーＴ細胞、及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その自然の供給源、たとえば血液から単離してもよいし、本明細書に記載のＰＢＭＣでもよい。
【００７３】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を述べるのに用いる。好ましいＦｃＲは、自然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｅＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）を結合するものであり、これには、これらの受容体のアレル変異体、及び別な方法でスプライシングされた形を含む、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、及びＦｃｙＲＩＩサブクラスが含まれる。ＦｃｙＲＩＩ受容体には、主にその細胞質内ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有するＦｃｙＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃｙＲＵＢ（「抑制受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃｙＲＩＩＡは、その細胞質内ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制受容体ＦｃｙＲＩＩＢは、その細胞質内ドメインに免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（ＤａｅｏｎのＡｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５巻：２０３〜２３４ページ（１９９７年）の概説Ｍを参照されたい）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔのＡｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第９巻：４５７〜９２ページ（１９９１年）、Ｃａｐｅｌ等のＩｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ第４巻：２５〜３４ページ（１９９４年）、及びｄｅ  Ｈａａｓ等のＪ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．第１２６巻：３３０〜４１ページ（１９９５年）で概説されている。将来確認されることになるものを含む他のＦｃＲは、本明細書では、用語「ＦｃＲ」に含まれる。この用語には、胎児への母系ＩｇＧの運搬を担う新生児受容体のＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１１７巻：５８７ページ（１９７６年）及びＫｉｍ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２４巻：２４９ページ（１９９４年））。
【００７４】
「補体依存的細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下で標的を溶解する能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が、同属の抗原と複合体をなした分子（たとえば抗体）に結合することによって開始される。補体活性化を評価するには、たとえば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第２０２巻：１６３ページ（１９９６年）に記載されているようなＣＤＣアッセイを実施すればよい。
【００７５】
「成長抑制性」拮抗物質は、その拮抗物質が結合する抗原を発現する細胞の増殖を妨げ、又は低下させるものである。たとえば、この拮抗物質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏかつ／又はｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｂ細胞の増殖を妨げ、又は低下させ得る。
【００７６】
「アポトーシスを誘発する」拮抗物質とは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の消失、細胞の断片化、及び／又は（アポトーシス小体と呼ばれる）膜小胞の形成によって判定される、たとえばＢ細胞のプログラム細胞死を誘発するものである。
【００７７】
用語「超可変領域」は、本明細書で使用する場合、抗原との結合を担う、抗体のアミノ酸残基を指す。この超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（たとえば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７（Ｌ３）と、重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ等の「免疫学的に注目されるタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、国立保健研究所Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、メリーランド州ベセズダ（１９９１年））由来のアミノ酸残基、及び／又は「超可変ループ」（たとえば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）と、重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ  ｌ．のＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１９６巻：９０１〜９１７ページ（１９８７年））由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、本明細書で定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７８】
問題の抗原、たとえばＢ細胞表面マーカーを「結合する」拮抗物質とは、その拮抗物質が、細胞、すなわちその抗原を発現しているＢ細胞を標的とする治療薬として有用である程度に十分な親和性でその抗原を結合できるものである。
【００７９】
本明細書では、「抗ＣＤ２０抗体」は、ＣＤ２０抗原、好ましくはヒトＣＤ２０を特異的に結合し、測定可能なＢ細胞枯渇活性、好ましくは少なくともリツキサン（登録商標）の約１０％のＢ細胞枯渇活性を有する抗体である（参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第５，７３６，１３７号を参照されたい）。
【００８０】
この前でも触れたが、本明細書では、用語「リツキシマブ」又は「リツキサン（登録商標）」は、ＣＤ２０抗原に指向性の遺伝子改変されたマウス／ヒト・キメラ・モノクローナル抗体、及び参照により本明細書に特に組み込まれている米国特許第５，７３６，１３７号で示された「Ｃ２Ｂ８」を指す。この抗体は、マウスの軽鎖及び重鎖可変部配列とヒト定常部配列を含むＩｇＧＩκ免疫グロブリンである。リツキシマブのＣＤ２０抗原への結合親和性は、約８．０ｎＭである。
【００８１】
本明細書では、「抗ＣＤ２２抗体」は、ＣＤ２２抗原、好ましくはヒトＣＤ２２を特異的に結合し、測定可能なＢ細胞枯渇活性、好ましくは少なくともリツキサン（登録商標）の約１０％のＢ細胞枯渇活性を有する抗体である。
【００８２】
本明細書では、「抗ＣＤ１９抗体」は、ＣＤ１９抗原、好ましくはヒトＣＤ１９を特異的に結合し、測定可能なＢ細胞枯渇活性、好ましくは少なくともリツキサン（登録商標）の約１０％のＢ細胞枯渇活性を有する抗体である。
【００８３】
本明細書では、「抗ＣＤ３７抗体」は、ＣＤ３７抗原、好ましくはヒトＣＤ３７を特異的に結合し、測定可能なＢ細胞枯渇活性、好ましくは少なくともリツキサン（登録商標）の約１０％のＢ細胞枯渇活性を有する抗体である。
【００８４】
本明細書では、「抗Ｂ７抗体」は、Ｂ７．１、Ｂ７．２、又はＢ７．３、最も好ましくはヒトＢ７．３を特異的に結合し、Ｂ７／ＣＤ２８の相互作用を阻害し、その上Ｂ７／ＣＴＬＡ−４の相互作用はそれほど阻害しない抗体、より一層好ましくは、参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第６，１１３，８９８号に記載の特定の抗体である。ＩＤＥＣ−１１４（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、米カリフォルニア州サンディエゴ）は、現在ＩＩ期臨床治験中の抗Ｂ７抗体であり、当該発明の好ましい実施形態に適合する。最近では、このような抗体がアポトーシスを促進することが報告されている。したがって、これらは、抗新生物の適用例に好適である。Ｂ７抗原を結合する抗体の他の例には、Ｌｉｎｓｌｅｙ他に対して公告された米国特許第５，８８５，５７７号で報告されているＢ７抗体、ＤｅＢｏｅｒ他で公告され、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡されている米国特許第５，８６９，０５０号で報告されている抗Ｂ７抗体が含まれる。
【００８５】
「抗ＣＤ４０Ｌ抗体」は、（ＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＴＢＡＭとしても知られている）ＣＤ４０Ｌを特異的に結合する抗体、好ましくは作用物質（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）活性を有するものである。好ましい抗Ｃｄ４０Ｌ抗体は、参照により全体として本明細書に組み込まれている（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡されている）米国特許第６，０１１，３５８号で開示されているヒト化抗体の特異性を有するものである。ＩＤＥＣ−１３１（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、米カリフォルニア州サンディエゴ）は、現在ＩＩ期臨床治験中の抗ＣＤ４０Ｌ抗体であり、当該発明の好ましい実施形態に適合する。
【００８６】
「抗ＣＤ４抗体」は、ＣＤ４、好ましくはヒトＣＤ４を特異的に結合するもの、より好ましくは霊長類化もしくはヒト化抗ＣＤ４抗体である。
【００８７】
「抗ＣＤ４０抗体」は、米国特許第５，８７４，０８５号、同第５，８７４，０８２号、同第５，８０１，２２７号、同第５，６７４，４４２号、ｓｎｆ５，６６７，１６５号で開示されたものなど、ＣＤ４０、好ましくはヒトＣＤ４０を特異的に結合する抗体であり、これらの特許をすべて、参照により本明細書に組み込む。
【００８８】
Ｂ細胞枯渇性抗体及び免疫調節性抗体の両方がヒト定常ドメインを含むことが好ましい。適切な抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４アイソタイプが含まれる。
【００８９】
ＣＤ２０抗原を結合する抗体の具体例には、「リツキシマブ」（「ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）」）（参照により本明細書に特に組み込まれている米国特許第５，７３６，１３７号）、イットリウム［９０］標識２Ｂ８マウス抗体「Ｙ２Ｂ８」（参照により本明細書に特に組み込まれている米国特許第５，７３６，１３７号）；任意選択で131Ｉ標識されたマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」、「131ＩＢ１」抗体（ＢＥＸＸＡＲ（商標））（参照により本明細書に特に組み込まれている米国特許第５，５９５，７２１号）；マウス・モノクローナル抗体「１Ｆ５」（Ｐｒｅｓｓ等のＢｌｏｏｄ第６９巻（２）：５８４〜５９１ページ（１９８７年）；及び「キメラ２Ｈ７」抗体（参照により本明細書に特に組み込まれている米国特許第５，６７７，１８０号）が含まれる。
【００９０】
ＣＤ２２を結合する抗体の具体例には、現在非ホジキンリンパ腫について臨床治験中の、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって報告されたＬｙｍｐｈｏｃｉｄｅ（商標）が含まれる。
【００９１】
ＣＤ２３を結合する抗体の具体例は、よく知られており、これには、１９９９年７月４日に出願され、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．及び生化学工業株式会社に共に譲渡されているＲｅｆｆ等の米国特許第６，０１１，１３８号で報告されている、ヒトＣＤ２３に特異的なｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）抗体；Ｂｏｎｎｅｆｏｙ他の９６１２７４１号、Ｒｅｃｔｏｒ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第５５巻：４８１〜４８８ページ（１９８５年）、Ｆｌｏｒｅｓ−Ｒｕｍｅｏ等のＳｃｉｅｎｃｅ第２４１巻：１０３８〜１０４６ページ（１９９３年）、Ｓｈｅｒｒ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４２巻：４８１〜４８９ページ（１９８９年）、及びＰｅｎｅ等のＰＮＡＳ，ＵＳＡ第８５巻：６８２０〜６８２４ページ（１９８８年）で報告されているものが含まれる。ＩＤＥＣ−１５２（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、米カリフォルニア州サンディエゴ）は、現在ＩＩ期臨床治験中の抗ＣＤ２３抗体であり、当該発明の好ましい実施形態に適合する。この種の抗体は、アレルギー、自己免疫疾患、及び炎症性疾患の治療に有用であることが報告されている。
【００９２】
「単離された」拮抗物質とは、同定され、かつその自然な状態の成分から分離及び／もしくは回収されているものである。その自然な状態の混入成分とは、拮抗物質を診断又は治療に使用する妨げになる物質であり、これには、酵素、ホルモン、及び他のタンパクもしくは非タンパク溶質が含まれる。好ましい実施形態では、拮抗物質は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって定量して、拮抗物質の９５重量％、最も好ましくは９９重量％より高くまで、（２）スピニングカップ・シーケンサーを使用することによって、少なくともＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）還元もしくは非還元条件下、クーマシーブルー染色、又は好ましくは銀染色を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで精製する。単離された拮抗物質には、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの拮抗物質が含まれる。その拮抗物質の自然状態の少なくとも１成分が存在しなくなるからである。しかし、普通は、少なくとも１段階の精製ステップによって単離された拮抗物質を調製する。
【００９３】
治療の目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、これには、ヒト、飼育及び畜産動物、及びイヌ、ウマ、ネコ、ウシなど、動物園、競技、もしくはペット用動物が含まれる。哺乳動物がヒトであることが好ましい。
【００９４】
「治療」は、治療処置及び予防手段の両方を指す。治療の必要のあるものには、すでに疾患又は傷害を伴っているものに加え、疾患又は傷害を予防しようとするものが含まれる。したがって、哺乳動物は、疾患もしくは傷害を罹っていると診断されていてもよく、疾患の素因もしくは疑いがあってもよい。
【００９５】
上で詳述したように、本発明は、その治療が必要な哺乳類の対象において腫瘍疾患を治療するための化合物、組成物、キット、及び方法を提供する。対象は、ヒトであることが好ましい。腫瘍疾患（たとえば、癌及び悪性病変）は、黒色腫、神経膠腫、肉腫、癌腫などの固形腫瘍だけでなく、リンパ腫や白血病など、骨髄もしくは血液の悪性病変を含んでよい。一般に、開示された本発明を使用すれば、改変抗体が癌細胞を標的とするのを可能にする抗原マーカーを含む任意の新生物を予防的もしくは治療的に処置することができる。治療してよい典型的な癌には、それだけに限らないが、前立腺、大腸、皮膚、乳、卵巣、肺、及び膵臓癌が含まれる。好ましい実施形態では、当該発明の選択された抗体の組合せを、大腸癌又は他の胃癌の診断又は治療に使用してよい。より詳細には、当該発明の抗体は、カポジ肉腫、ＣＮＳ腫瘍（毛細血管芽腫、髄膜腫、及び大脳への転移）、黒色腫、消化管及び腎臓の肉腫、横紋筋肉腫、膠芽腫（好ましくは多形性膠芽腫）、平滑筋肉腫、網膜芽細胞腫、卵巣の乳頭状嚢胞腺癌、ウィルムス腫瘍、又は小細胞肺癌の治療に使用してよい。大掛かりな実験をせずとも、この開示を考慮して、適切な抗体の組合せを、前述の腫瘍の各々に関係のある腫瘍結合抗原へと誘導すればよいことがわかるであろう。
【００９６】
開示された本発明による治療が受け入れられる典型的な血液悪性病変には、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、並びにＡＬＬ−Ｌ３（バーキット型白血病）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び単球細胞白血病を含む白血病が含まれる。本発明の化合物及び方法が、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞性リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度  免疫芽細胞ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小円型細胞ＮＨＬ、バルキー病ＮＨＬ、及びワルデンストレーム大グロブリン血症を含む、様々なＢ細胞リンパ腫の治療において特に有用であることが評価されよう。当分野の技術者には、分類体系の変更により、これらのリンパ腫及び白血病がしばしば異なる名称をもつようになること、並びに異なる名称に属して分類された血液悪性病変に罹患している患者も本発明の併用治療法から恩恵を受け得ることは、言うまでもないはずである。開示された本発明を有利に利用して、前述の腫瘍疾患に加え、適合性のある腫瘍結合抗原を有する追加の悪性病変を治療してもよいことがわかるであろう。
【００９７】
好ましい実施形態では、腫瘍疾患は、Ｂ細胞悪性病変を含む。本発明によれば、これには、任意のＢ細胞悪性病変、たとえばＢ細胞リンパ腫及び白血病が含まれる。好ましい例には、ホジキン病（すべての型、たとえば再発性ホジキン病、抵抗性ホジキン病）、非ホジキンリンパ腫（低悪性度、中悪性度、高悪性度、及び他の種類）が含まれる。例には、小リンパ球性／Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病（ＳＬＬ／ＢＣＬＬ）、リンパ形質球リンパ腫（ｌｙｍｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症、小リンパ球、濾胞性、びまん性大細胞、びまん性小非円型細胞、大細胞免疫芽細胞リンパ芽球腫；小円型、バーキット及び非バーキット、濾胞性大細胞優性、濾胞性小非円型細胞優性、及び濾胞性小非円及び大細胞混合型リンパ腫が含まれる。Ｇａｉｄｏｎｏ等の「リンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）」、出典：「癌：腫瘍学の原理と実践（ＩＮ  ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＆  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ）」、第２巻：２１３１〜２１４５ページ（ＤｅＶｉｔａ他編、第５版、１９９７年）を参照されたい。
【００９８】
リンパ腫分類の他の種類には、免疫細胞性ワンデンストロームＭＡＬＴ型／単球Ｂ細胞、マントル細胞リンパ腫Ｂ−ＣＬＬ／ＳＬＬ、びまん性大Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びプレカーサＢ−ＬＢＬが含まれる。
【００９９】
言及したように、Ｂ細胞悪性病変には、特に、ＡＬＬ−Ｌ３（バーキット型白血病）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性白血球性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、単球性白血病、骨髄性白血病、及び前骨髄球性白血病、及び単球細胞性白血病などの白血病がさらに含まれる。
【０１００】
表現「治療有効量」は、問題のＢ細胞悪性疾患を予防、改善、又は治療するのに有効な拮抗物質量を指す。
【０１０１】
本明細書で使用する補助療法のための用語「免疫抑制薬」は、本明細書で扱う哺乳動物の免疫系を抑制又は遮蔽するように作用する物質を指す。これには、サイトカイン産生を抑制し、自己抗原の発現をダウンレギュレートもしくは抑制し、又はＭＨＣ抗原を遮蔽する物質が含まれることになる。そのような抗原の例には、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン（米国特許第４，６６５，０７７号を参照されたく、この開示を参照により本明細書に組み込む）；アザチオプリン；シクロホスファミド；ブロモクリプリン；ダナゾール；ダプソン；（ＭＨＣ抗原を遮蔽する、米国特許第４，１２０，６４９号に記載の）グルタルアルデヒド；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イデオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；副腎皮質ステロイドなどのステロイド、たとえばプロドニソン、メチルプレドニソロン、及びデキサメタゾン；抗インターフェロンα−、β−、もしくはδ−抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体、抗腫瘍壊死因子β抗体、抗インターロイキン２抗体、及び抗ＩＬ−２受容体抗体を含む、サイトカインもしくはサイトカイン受容体拮抗物質；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ−１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗リンパ球グロブリン；ｐａｎ−Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３もしくは抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ−３結合ドメインを含む可溶性ペプチド（７／２６／９０に公告されたＷＯ９０／０８１８７）であるストレプトラナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｌａｎａｓｅ）；ＴＧＦ−β；ストレプトドロナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｄｏｒｎａｓｅ）；宿主由来のＲＮＡもしくはＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ−６１４４３；デオキシスペルグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）；ラパマイシン；Ｔ細胞受容体（Ｃｏｈｅｎ他の米国特許第５，１１４，７２１号）；Ｔ細胞受容体断片（Ｏｆｆｎｅｒ等のＳｃｉｅｎｃｅ、第２５１巻：４３０〜４３２ページ（１９９１年）；ＷＯ９０／１１２９４；ｌａｎｅｗａｙのＮａｔｕｒｅ、第３４１巻：４８２ページ（１９８９年）；及びＷＯ９１／０１１３３）；及びＴ１０Ｂ９などのＴ細胞受容体抗体（ＥＰ３４０，１０９）が含まれる。
【０１０２】
本明細書で使用する「細胞毒又は細胞傷害剤」は、細胞の成長及び増殖に有害であり、悪性病変に作用するとそれを低減、抑制、又は破壊しようと働き得る任意の薬品を意味する。典型的な細胞毒には、それだけに限らないが、放射性核種、生体毒素、細胞分裂抑制もしくは細胞毒性治療薬、プロドラッグ、免疫活性のあるリガンド、及びサイトカインなどの生体応答変更因子が含まれる。以下でより詳細に論じるが、当該発明における使用には、放射性核種細胞毒が特に好ましい。しかし、悪性細胞の成長を遅らせ、もしくは緩慢化し、又は悪性細胞を排除するように作用し、かつ本明細書で開示された改変抗体を結合させてよいどんな細胞毒も、本発明の範囲内である。
【０１０３】
これまでの研究において、放射性同位体で標識した抗腫瘍抗体が、固形腫瘍中の細胞、並びに動物モデル、場合によってはヒトのリンパ腫／白血病の消滅に成功を収めていることはわかるであろう。放射性核種は、核のＤＮＡにおいて鎖を複合的に破壊する電離放射線を生じることによって作用し、細胞死をもたらす。治療向けコンジュゲートを作製するのに使用される放射性同位体は、通常、治療上有効な経路長を有する高エネルギーα、γ、もしくはβ粒子を生じる。このような放射性核種は、互いに近接している細胞、たとえばコンジュゲートが結合し、又は侵入した腫瘍細胞を死滅させる。これらは、一般に、非局在型細胞にはほとんど又はまったく影響を及ぼさない。放射性核種は、本質的に非免疫原性である。
【０１０４】
本発明による放射標識したコンジュゲートの使用に関しては、抗体を（ヨウ素化などによって）直接に標識しても、キレート剤を使用することによって間接的に標識してもよい。本明細書で使用する語句「間接標識」及び「間接標識手法」は両方とも、抗体にキレート剤を共有結合させ、キレート剤に少なくとも１種の放射性核種を結合させることを意味する。そのようなキレート剤は、ポリペプチド及び放射性同位体の両方を結合するので、一般に二機能性キレート剤と呼ばれる。特に好ましいキレート剤は、１−イソチオシクマトベンジル−３−メチルジオテレントリアミン五酢酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）及びシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体を含む。他のキレート剤は、Ｐ−ＤＯＴＡ及びＥＤＴＡ誘導体を含む。特に好ましい間接標識用の放射性核種には、111Ｉｎ及び90Ｙが含まれる。
【０１０５】
本明細書で使用する語句「直接標識」及び「直接方式手法」は両方とも、放射性核種を（通常、アミノ酸残基を介して）抗体に直接に共有結合させることを意味する。より具体的には、このような結合技術には、ランダム標識及び部位指向性（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）標識が含まれる。後者の場合では、標識化が、コンジュゲートのＦｃ部分上にしか存在しないＮ結合糖残基など、二量体又は四量体上の特定の部位に向けられる。さらに、様々な直接標識技術及びプロトコルが当該発明に適合し得る。たとえば、テクネチウム９９ｍ標識抗体は、リガンド交換法によって調製しても、ペルテクナート（Ｔｃ０４）をスズイオン溶液で還元し、還元されたテクネチウムをＳｅｐｈａｄｅｘカラム上にキレート化し、さらに抗体をこのカラムにかけることによって調製しても、又はバッチ標識技術によって、たとえばペルテクナート、ＳｎＣｌ2などの還元剤、ナトリウム−カリウムフタル酸溶液などの緩衝溶液、及び抗体をインキュベートすることによって調製してもよい。とにかく、直接標識抗体に好ましい放射性核種は、当技術分野でよく知られており、直接標識に特に好ましい放射性核種は、チロシン残基を介して共有結合させた131Ｉである。本発明による抗体は、たとえば、放射性のナトリウムもしくはカリウムヨウ化物と、次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴなどの化学系酸化剤もしくはラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースなどの酵素系酸化剤によって得てもよい。しかし、本発明の目的では、間接標識手法が特に好ましい。
【０１０６】
キレート剤及びキレート剤コンジュゲートに関する特許は、当技術分野で知られている。たとえば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、多置換ジエチレントリアミンペンタ酢酸キレート及びそれを含むタンパク質のコンジュゲート、並びにその調製方法を対象としている。Ｇａｎｓｏｗの米国特許第５，０９９，０６９号、同第５，２４６，６９２号、同第５，２８６，８５０号、同第５，４３４，２８７号、及び同第５，１２４，４７１号も、多置換ＤＴＰＡキレート物に関する。これらの特許の全体を本明細書に組み込む。適合性のある金属キレート剤の他の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＴＰＡ又はＣＨＸ−ＤＴＰＡが特に好ましく、以下で広範囲に例示する。やがて発見されることになるものを含む、適合性のあるさらに他のキレート剤は、当業者によって容易に判別されるものであり、明らかに本発明の範囲に含まれる。
【０１０７】
適合性のあるキレート剤には、同時係属の出願番号０８／４７５，８１３、０８／４７５，８１５、及び０８／４７８，９６７のキレート化を促進するのに使用する特定の二機能性キレート剤が含まれ、そうしたキレート剤は、三価の金属に対して高い親和性をもたらし、腫瘍対非腫瘍比の増大及び骨吸収の低下、並びに標的部位、すなわちＢ細胞リンパ腫部位での放射性核種のｉｎ  ｖｉｖｏ滞留の向上を示すように選択することが好ましい。しかし、他の二機能性キレート剤も、これらの特性をすべて有するものもそうでないものもあるが、当技術分野で知られており、腫瘍治療において有益であるといえる。
【０１０８】
本明細書の教示によれば、抗体を診断及び治療の目的で、異なる放射標識に結合させてもよいことがわかるであろう。参照により全体が本明細書に組み込まれている前述の同時係属出願は、そのため、治療用抗体投与前の、診断上の腫瘍「画像処理」向け放射標識治療用コンジュゲートを開示している。「Ｉｎ２Ｂ８」コンジュゲートは、ヒトＣＤ２０抗原に特異的なマウス・モノクローナル抗体である２Ｂ８が、二機能性キレート剤、すなわち１−イソチオシアナートベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡと１−メチル−３−イエオチオシアナートベンジル−ＤＴＰＡの１：１の混合物を含むＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン四酢酸）を介して111Ｉｎに結合したものを含む。約１〜約１０ｍＣｉの間では、毒性が検出されることなく安全に投与でき、かつ画像データによって、その後の90Ｙ標識抗体の分布を大体予測できるので、111Ｉｎは、診断用放射性核種として特に好ましい。画像分析研究の大部分は、５ｍＣｉ111Ｉｎ標識抗体を利用している。この線量は、これよりも少ない線量より安全であり、かつ画像処理効率が向上しており、抗体投与後３〜６日目に最適な画像が得られるからである。たとえば、ＭｕｒｒａｙのＪ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．第２６巻：３３２８ページ（１９８５年）及びＣａｒｒａｇｕｉｌｌｏ等のＪ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．第２６巻：６７ページ（１９８５年）を参照されたい。
【０１０９】
上で指摘したように、種々の放射性核種が本発明に適用でき、当分野の技術者ならば、様々な状況下で、どの放射性核種が最も適切であるかを容易に決定できると思われる。たとえば、131Ｉは、標的を定めた免疫療法に使用される、最もよく知られている放射性核種である。しかし、131Ｉの臨床での有用性は、８日間の物理的半減期、血中及び腫瘍部位の両方におけるヨウ素化抗体の脱ハロゲン化、及び発光特性（たとえば、γ成分の多さ）を含むいくつかの要因によって制限される可能性があり、腫瘍における局所的な線量沈着が最適以下になり得る。優れたキレート剤の出現に伴い、タンパク質に金属キレート基を結合させるようになったので、111Ｉｎや90Ｙなどの他の放射性核種を利用する機会が増してきている。90Ｙは、放射線免疫療法の適用例で活用できるいくつかの利益をもたらす。すなわち、90Ｙの６４時間の半減期は、腫瘍による抗体の蓄積を可能にするだけの長さであり、たとえば131Ｉと異なり、90Ｙは、１００〜１，０００細胞直径の組織の範囲でその崩壊にγ線照射を伴わない、高エネルギーの純粋なβエミッターである。その上、透過放射線量が最小限であるので、外来患者に90Ｙ標識抗体を投与することが可能になる。さらに、標識抗体が内部に移行するのに、細胞が死滅する必要がなく、標的抗原を欠いている近接する腫瘍細胞にとっては、電離放射線の局所での発光が致死的となるはずである。
【０１１０】
90Ｙで標識した改変抗体の単独治療有効線量（すなわち、治療有効量）は、約５と約７５ｍＣｉの間、好ましくは約１０と約４０ｍＣｉの間の範囲である。131Ｉ標識抗体の単独治療有効非髄質破壊性（ｎｏｎ−ｍａｒｒｏｗ  ａｂｌａｔｉｖｅ）線量は、約５と約７０ｍＣｉの間、より好ましくは約５と約４０ｍＣｉの間の範囲である。131Ｉ標識抗体の単独治療有効破壊性線量（すなわち、自家骨髄移植が必要となる）は、約３０と約６００ｍＣｉの間、より好ましくは約５０と約５００ｍＣｉ未満の間の範囲である。キメラ抗体に関連しては、マウス抗体に対する循環半減期がより長いので、ヨウ素１３１標識キメラ抗体の単独治療有効非髄質破壊性線量は、約５と約４０ｍＣｉの間、より好ましくは約３０ｍＣｉ未満の範囲である。たとえば111Ｉｎ標識についての画像処理基準は、通常は約５ｍＣｉ未満である。
【０１１１】
相当な量の臨床実験が131Ｉ及び90Ｙを用いて実現されてきたが、他の放射標識も当技術分野で知られており、同様の目的で使用されている。さらに他の放射性同位体も画像処理に使用される。たとえば、当該発明の範囲に適合する追加の放射性同位体には、それだけに限らないが、123Ｉ、125Ｉ、32Ｐ、57Ｃｏ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、77Ｂｒ、81Ｒｂ、81Ｋｒ、87Ｓｒ、113Ｉｎ、127Ｃｓ、129Ｃｓ、132Ｉ、197Ｈｇ、203Ｐｂ、206Ｂｉ、177Ｌｕ、186Ｒｅ、212Ｐｂ、212Ｂｉ、47Ｓｃ、105Ｒｈ、109Ｐｄ、153Ｓｍ、188Ｒｅ、199Ａｕ、225Ａｃ、211Ａｔ、及び213Ｂｉが含まれる。この態様では、α、γ、及びβエミッターは、どれも当該発明に適合する。さらに、当分野の技術者ならば、この開示を考慮して、大掛かりな実験をせずとも、どの放射性核種が選択された治療方針に適合するかを容易に決定できるはずである。そのため、臨床診断ですでに使用されている追加の放射性核種には、125Ｉ、123Ｉ、99Ｔｃ、43Ｋ、52Ｆｅ、67Ｇａ、68Ｇａに加え、111Ｉｎが含まれる。標的を定めた免疫療法における潜在的な使用向けにも、抗体が様々な放射性核種で標識されている。Ｐｅｉｒｅｒｓｚ等のＩｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第６５巻：１１１〜１２５ページ（１９８７年）。そのような放射性核種には、188Ｒｅ及び186Ｒｅ、並びに程度のより弱い199Ａｕ及び67Ｃｕが含まれる。米国特許第５，４６０，７８５号は、このような放射性同位体に関する追加のデータを提供しており、これを参照により本明細書に組み込む。
【０１１２】
本発明の改変抗体は、放射性核種に加えて、いくつかの生体応答変更因子、薬剤、毒素、又は免疫活性のあるリガンドのいずれか１種と結合又は会合させてもよい。当分野の技術者ならば、このような非放射性コンジュゲートは、選択した細胞毒に応じ、様々な技を使用して構築すればよいことがわかるであろう。たとえば、ビオチンとのコンジュゲートは、たとえば改変抗体とビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど、ビオチンの活性化エステルとを反応させることによって調製する。同様に、蛍光マーカーとのコンジュゲートは、結合剤、たとえば上で挙げたものの存在下で調製しても、又はイソチオシアナート、好ましくはフルオレセインイソチオシアナートと反応させることによって調製してもよい。本発明のキメラ抗体と細胞分裂抑制性／細胞傷害性物質及び金属キレートとのコンジュゲートも、同様の方法で調製する。
【０１１３】
本発明での使用に好ましい薬品は、細胞傷害剤、特に癌治療に使用されるものである。そのような薬物には、一般に、細胞分裂抑制薬、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗増殖薬、チューブリン結合薬、ホルモン、及びホルモン拮抗薬などが含まれる。本発明に適合する典型的な細胞分裂抑制薬には、メクロレタミン、トリエチレンホスホラミド、シクロホスファミド、イホスファミド、クロランブシル、ブスルファン、メルファラン、トリアジコンなどのアルキル化物質に加え、カルムスチン、ロムスチン、セムスチンなどのニトロソ尿素化合物が含まれる。他の好ましい細胞傷害剤クラスには、たとえば、アントラサイクリン・ファミリーの薬物、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害ヌクレオシド、プテリジン・ファミリーの薬物、ジイネン（ｄｉｙｎｅｎｅ）、及びポドフィロトキシンが含まれる。これらのクラスの特に有用なメンバーには、たとえば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ミトラマイシン、ストレプトニグリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、フロキシウリジン、フトラフール、６−メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、エトポシドやリン酸エトポシドなどのポドフィロトキシンもしくはポドフィロトキシン誘導体、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、リューロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、リューロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）などが含まれる。本明細書の教示に適合するさらに他の細胞毒には、タキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、テノポシド、コルキシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、及びこれらの類似体もしくは同族体が含まれる。副腎皮質ステロイド、たとえばプレドニソン；プロゲスチン、たとえばヒドロキシプロゲステロンもしくはメドロプロゲステロン；エストロゲン、たとえばジエチルスチルベステロール；抗エストロゲン、たとえばタモキシフェン；アンドロゲン、たとえばテストステロン；及びアロマターゼ阻害薬、たとえばアミノグルテチミドなど、ホルモン及びホルモン拮抗薬も、本明細書の教示に適合する。これまでに言及したように、その化合物の反応を本発明のコンジュゲートを調製するのにより好都合なものにする目的で、当分野の技術者が所望の化合物に化学修飾を施してもよい。
【０１１４】
特に好ましい細胞毒の一例は、エンジイン・ファミリーの抗腫瘍抗生物質のメンバー又は誘導体を含み、これには、カリケアマイシン、エスペラマイシン、又はディネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）が含まれる。これらの毒素は、極めて強力であり、核のＤＮＡを切断することによって作用し、細胞死をもたらす。ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されて、不活性であるが、免疫原性である多くのポリペプチド断片をもたらし得るタンパク質毒素とは異なり、カリケアマイシン、エスペラマイシン、及び他のエンジイン類などの毒素は、本質的に非免疫原性の小分子である。モノクローナル抗体及び他の分子を標識するのにこれまでに使用されてきた技術によって、このような非ペプチド毒素を二量体又は四量体に化学的に結合させる。そのような結合技術には、コンジュゲートのＦｃ部分上にしか存在しないＮ結合糖残基を介する部位特異的な結合が含まれる。このような部位指向性の結合法には、コンジュゲートの結合特性に影響し得る結合作用を低減するという有利点がある。
【０１１５】
これまでに触れたように、適合性のある細胞毒は、プロドラッグを含んでもよい。本明細書で使用する用語「プロドラッグ」は、腫瘍細胞に対する毒性が親薬物よりも弱く、酵素によって活性化され、又はより活性のある親の形に変換されることが可能な、薬剤活性のある物質の前駆体又は誘導体の形を指す。本発明に適合するプロドラッグには、それだけに限らないが、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意選択で置換されたフェノキシアセタミド含有プロドラッグもしくは任意選択で置換されたフェニルアセタミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオリジンプロドラッグが含まれ、これらは、より活性のある細胞傷害性の遊離型薬物に変換される。本発明で使用するためにプロドラッグの形に誘導できる細胞傷害剤の別の例は、上述の化学療法薬を含む。
【０１１６】
他の細胞毒の中では、抗体を、リシンのサブユニットＡ、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌス、シアンギノシン（ｃｙａｎｇｉｎｏｓｉｎ）、サキシトキシン、シガトキシン、テタヌス、テトロドトキシン、トリコテセン、ベルコロゲン（ｖｅｒｒｕｃｏｌｏｇｅｎ）、毒性酵素などの生体毒素と結合させてもよいことがわかるであろう。このような構築物は、抗体−毒素構築物の直接の発現を可能にする遺伝子操作技術を使用して作製することが好ましい。本発明の改変抗体に結合させてよい他の生体応答変更因子は、リンホカインやインターフェロンなどのサイトカインを含む。さらに、上で指摘したように、免疫活性のあるリガンド（たとえば、抗体又はその断片）と本発明の改変抗体を結合させるのにも、同様の構築物を使用することができる。このような免疫活性のあるリガンドが、免疫活性エフェクター細胞表面上の抗原に指向性であれば好ましい。このような場合では、その構築物を使用して、Ｔ細胞やＮＫ細胞などのエフェクター細胞を、腫瘍結合抗原を有する腫瘍細胞の極めて近くに導き、それによって所望の免疫応答を誘発することができる。当分野の技術者ならば、この開示を考慮し、従来の技術を使用して、このような構築物を容易に生成できるはずである。
【０１１７】
「化学療法薬」とは、癌治療において有用な化学化合物である。化学療法薬の例には、チオテパやシクロスホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化薬；ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファンなどのアルキルスルホナート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、ウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びキオランブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのトリメチルオロメラミン窒素マスタードを含むエチレンイミン及びメチルアメラミン；カルマスチン、クロロゾトシン、ホテマスチン、ロムスチン、ミマスチン、ラニマスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カラジノフィリン、クロニオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトニビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルブシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポロフロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートや５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシタビン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎皮質ホルモン薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリニン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；マイトグアゾン；マイトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミ���ラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、たとえばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、米ニュージャージー州プリンストン）及びドキセタキセル（タキソテール、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、仏Ａｎｔｏｎｙ、）；クロランブシル；ゲミシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンやカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロナート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；及び上述のもののいずれかの薬剤として許容される塩、酸、もしくは誘導体が含まれる。この定義には、たとえばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシラモキシフェン、トリオキシフェン、ケトオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（ファレストン）を含む抗エストロゲン；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、ゴセレリンなどの抗アンドロゲン；及び上述のもののいずれかの薬剤として許容される塩、酸、もしくは誘導体など、腫瘍へのホルモン作用を調節又は抑制するように働く抗ホルモン剤も含まれる。
【０１１８】
用語「サイトカイン」は、細胞間媒介物質として別の細胞に作用する、１細胞集団によって放出されたタンパク質の総称である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び旧来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子α及びβ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン結合ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−１３などの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αやＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロンα、β、及びγなどのインターフェロン；マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−ｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αやＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用する用語サイトカインには、天然もしくは組換え細胞培養物由来のタンパク質、及び生理活性のある自然配列サイトカイン等価物が含まれる。
【０１１９】
本出願で使用する用語「プロドラッグ」は、腫瘍細胞に対する毒性が親薬物よりも弱く、酵素によって活性化され、又はより活性のある親の形に変換させることが可能な、薬剤活性のある物質の前駆体又は誘導体の形を指す。たとえば、Ｗｉｌｍａｎの「癌化学療法におけるプロドラッグ（Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、第１４巻、３７５〜３８２ページ、第６１５回大会、ベルファスト（１９８６年）、及びＳｔｅｌｌａ等の「プロドラッグ：標的を定めた薬物送達のための化学的アプローチ（Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ他編、２４７〜２６７ページ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５年）を参照されたい。本発明のプロドラッグには、それだけに限らないが、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸で改変したプロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、１３−ラクタム含有プロドラッグ、任意選択で置換されたフェノキシアセタミド含有プロドラッグもしくは任意選択で置換されたフェニルアセタミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれ、これらは、より活性のある細胞傷害性の遊離型薬物に変換される。プロドラッグの形に誘導して、本発明で使用できる細胞傷害剤の例には、それだけに限らないが、上述の化学療法薬が含まれる。
【０１２０】
「リポソーム」は、様々な種類の脂質、リン脂質、及び／又は界面活性剤からなる小胞であり、哺乳動物への薬物（本明細書で開示された拮抗薬、及び任意選択の化学療法薬）の送達に有用である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質配置に類似した二重層構造で配置される。
【０１２１】
用語「添付文書」は、治療用製品の市販品パッケージ中に習慣的に収められた説明書を指し、適応症、用法、用量、投与法、禁忌症、及び／又はその治療用製品の使用に関する警告についての情報を含む。
【０１２２】
本発明の製造方法及び製品には、免疫調節活性を有する少なくとも１種の抗体、たとえば抗Ｂ７、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ４、もしくは抗ＣＤ４０抗体と、任意選択の少なくとも１種のＢ枯渇活性を有するＢ細胞表面マーカーに結合させた抗体、たとえば抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ１９、もしくは抗ＣＤ３７抗体が使用され、又は含まれる。したがって、本明細書では、このような抗体を得る方法を述べる。
【０１２３】
抗原を作製又はスクリーニングするのに使用する分子は、たとえば、所望のエピトープを含む抗原又はその部分の可溶性の形でよい。別法もしくは追加として、その表面に抗原を発現している細胞を使用して、拮抗物質を生成又はスクリーニングすることもできる。拮抗物質を生成するのに有用な他の形のＢ細胞表面マーカーは、当分野の技術者にわかるであろう。本発明による抗体を作製するのに適する、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３７、ＣＤ４、及びＢ７抗原（たとえばＢ７．１、Ｂ７．２）抗原のための抗原供給源は、よく知られている。あるいは、アミノ酸配列に基づき、ペプチドを合成によって調製することもできる。たとえば、ＣＤ４０Ｌに関して、Ａｒｍｉｔａｇｅ等（１９９２）がこれを開示している。
【０１２４】
ＣＤ４０Ｌ抗体又は抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、１９９９年６月１４日に出願され、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡されている米国特許第６，００１，３５８号で開示されているヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体とすることが好ましい。
【０１２５】
好ましいＣＤ４０Ｌ拮抗物質は抗体であるが、抗体以外の拮抗物質を投与してもよい。たとえば、拮抗物質は、可溶性ＣＤ４０、ＣＤ４０融合タンパク質、又は任意選択で（本明細書に記載のものなどの）細胞傷害剤に融合もしくは結合させた小分子拮抗物質を含んでよい。小分子のライブラリを、本明細書で問題としているＢ細胞表面マーカーを用いるスクリーニングにかけて、その抗原に結合する小分子を特定してもよい。その小分子を、その拮抗特性についてさらにスクリーニングし、かつ／又は細胞傷害剤に結合させてもよい。
【０１２６】
拮抗物質は、たとえば、合理的設計又はファージディスプレイによって生成したペプチドでもよい（１９９８年８月１３日公告のＷ０９８／３５０３６）。一実施形態では、選択した分子は、たとえば、抗体のＣＤＲに基づいて設計した「ＣＤＲ模倣物」又は抗体類似体でよい。ペプチドは、単独でも拮抗性をもち得るが、（たとえば、ペプチドにＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を与えるために）ペプチドを任意選択で細胞傷害剤又は免疫グロブリンＦｃ領域と融合させてもよい。
【０１２７】
本発明に従って使用する抗体拮抗物質を生成する典型的な技術を述べる。
【０１２８】
ポリクローナル抗体は、該当する抗原及びアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）もしくは腹腔内（ｉｐ）注射することによって増やすことが好ましい。二機能性又は誘導体化用の薬品、たとえば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、又はＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ1は、異なるアルキル基である）を使用して、免疫化しようとする種において免疫原性であるタンパク質、たとえばキーホール・リンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、もしくはダイズトリプシンインヒビターに該当する抗原を結合させることは有用であるといえる。
【０１２９】
たとえば、（それぞれウサギもしくはマウス用の）１００μｇもしくは５μｇのタンパク質又はコンジュゲートと３容のフロイント完全アジュバントとを合わせ、この溶液を複数の部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体で動物を免疫化する。１カ月後、最初の量の１／５〜１／１０のフロイント完全アジュバント中ペプチド又はコンジュゲートを複数部位に皮下注射することによって、動物に追加免疫を施した。７〜１４日後、動物から採血し、血清の抗体力価のアッセイを行う。力価が安定水準に達するまで動物から採血する。同じ抗原であるが、異なるタンパク質に結合し、かつ／又は異なる架橋剤を介しているコンジュゲートを有する動物から採血することが好ましい。コンジュゲートは、組換え細胞培養物中で、タンパク質融合物として作製することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に使用して、免疫応答を向上させる。
【０１３０】
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかに存在するかもしれない可能性としての自然発生突然変異を除き、同一である集団から得る。したがって、修飾語「単クローン」は、別々の抗体の混合物でないという抗体の特徴を示す。
【０１３１】
たとえば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ等のＮａｔｕｒｅ、第２５６巻：４９５ページ（１９７５年）で最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製しても、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製してもよい。
【０１３２】
ハイブリドーマ法では、マウス、又はハムスターなどの他の相応する宿主動物を上述のように免疫化して、免疫化に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、又は産生できるリンパ球を顕在化させる。あるいは、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な細胞融合剤（ｆｕｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を使用して、リンパ球と骨髄腫細胞を融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇの「モノクローナル抗体：原理と実践（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、５９〜１０３ページ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。
【０１３３】
そうして調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合されていない親骨髄腫細胞の成長及び生存を抑制する１種又は複数の物質を含有する適切な培地に播種し、成長させる。たとえば、親骨髄腫細胞の酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）が欠損していれば、そのハイブリドーマの培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質が、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる。
【０１３４】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択した抗体を産生する細胞による安定な高レベル抗体産生の支えとなり、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性のあるものである。これらの中でも好ましい骨髄腫細胞が、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、米カリフォルニア州サンディエゴから入手できるＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来のものなど、マウス骨髄腫系、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米ヴァージニア州マナッサスから入手できるＳＰ−２もしくはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒト・モノクローナル抗体の産生向けに、ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫系も記載されている（ＫｏｚｂｏｒのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３巻：３００  １ページ（１９８４年）、Ｂｒｏｄｅｕｒ等の「モノクローナル抗体の産生技術と応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、５１〜６３ページ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７年））。
【０１３５】
問題の抗原に指向性のあるモノクローナル抗体の産生について、ハイブリドーマ細胞が成長途中にある培地を評価する。ハイブリドーマ細胞がもたらすモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって決定することが好ましい。
【０１３６】
モノクローナル抗体の結合親和性は、たとえば、Ｍｕｎｓｏｎ等のＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１０７巻：２２０ページ（１９８０年）の３０Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定できる。
【０１３７】
ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生することを確認した後、クローンを、限界希釈手順によってサブクローニングし、標準の方法によって成長させればよい（Ｇｏｄｉｎｇの「モノクローナル抗体：原理と実践（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、５９〜１０３ページ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。この目的のための適切な培地には、たとえば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＬ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物中で腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏで成長させてもよい。
【０１３８】
サブクローニングによって選別されたモノクローナル抗体は、たとえば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水液、又は血清から適宜分離する。
【０１３９】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（たとえば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド・プローブを使用することによって）、直ちに単離し、配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ＤＮＡを単離したなら、発現ベクター中に入れ、次いでこれを、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など、他に免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を実現する。抗体をコードするＤＮＡのバクテリア中での組換え発現について概説する論文には、Ｓｋｅｒｒａ等のＣｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第５巻：２５６〜２６２ページ（１９９３年）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎのＩｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．、第１３０巻：１５１〜１８８ページ（１９９２年）が含まれる。
【０１４０】
ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、もしくはＣＤ４０タンパク質又はペプチドに対して反応性のある特定の抗体又は抗体断片（たとえば、米国特許第５，９４５，５１３号に記載のｇｐ３９融合タンパク質など）を得る別の方法は、細菌中に発現した免疫グロブリン遺伝子又はそのタンパク質をコードする発現ライブラリを、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、もしくはＣＤ２２タンパク質又はペプチドを用いてスクリーニングすることである。たとえば、ファージ発現ライブラリを使用すると、細菌中に完全なＦａｂ断片、ＶH領域、及びＦｖ領域を発現させることができる。たとえば、Ｗａｒｄ等のＮａｔｕｒｅ第３４１巻：５４４〜５４６ページ（１９８９年）、Ｈｕｓｅ等のＳｃｉｅｎｃｅ第２４６巻：１２７５〜１２８１ページ（１９８９）年、及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等のＮａｔｕｒｅ第３４８巻：５５２〜５５４ページ（１９９０年）を参照されたい。このようなライブラリを、たとえばＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２２、ＣＤ１９、又はＣＤ２０ペプチドでスクリーニングすると、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２２、ＣＤ１９、又はＣＤ２０に反応性のある免疫グロブリン断片を特定できる。あるいは、（Ｇｅｎｐｈａｒｍから入手できる）ＳＣＩＤ−ｈｕマウスを使用して、抗体又はその断片を産生させることができる。
【０１４１】
別の実施形態では、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等のＮａｔｕｒｅ、第３４８巻：５５２〜５５４ページ（１９９０年）に記載の技術を使用して得た抗体ファージライブラリから抗体又は抗体断片を単離できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ等のＮａｔｕｒｅ、第３５２巻：６２４〜６２８ページ（１９９１年）及びＭａｒｋｓ等のＪ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＬ、第２２２巻：５８１〜５９７ページ（１９９１年）は、ファージライブラリを使用するマウス及びヒト抗体の単離をそれぞれ記載している。その後の刊行物は、鎖混合法（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の作製（Ｍａｒｋｓ等のＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０巻：７７９〜７８３ページ（１９９２年））、並びに極めて大規模なファージライブラリを構築する戦略としてのコンビナトリアル感染及びｉｎ  ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等のＮｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、第２１巻：２２６５〜２２６６ページ（１９９３年））を記載している。したがって、このような技術は、モノクローナル抗体を単離する旧来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代わる実現性のある代替法である。
【０１４２】
ヒトＣＤ４０Ｌ及びマウスＣＤ４０Ｌを含むＣＤ４０Ｌに指向性のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）と、本発明の方法での使用に適するモノクローナル抗体を生成する方法は、「抗ｇｐ３９抗体及びその使用（Ａｎｔｉ−ｇｐ３９  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｆｏｒ）」と題されたＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９５／０６６６６に記載されており、この特許の教示全体を参照により本明細書に組み込む。本発明の特に好ましい抗ヒトＣＤ４０Ｌ抗体は、ハイブリドーマ２４−３１及び８９−７６によってそれぞれ生成されたＭＡｂ２４−３１及び８９−７６である。それぞれ８９−７６及び２４−３１抗体を生成する８９−７６及び２４−３１ハイブリドーマは、ブタペスト条約の規定に従い、１９９４年９月２日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９）に預けた。８９−７６ハイブリドーマには、ＡＴＣＣ受入れ番号ＨＢ１１７１３が与えられ、２４−３１ハイブリドーマには、ＡＴＣＣ受入れ番号ＨＢ１１７１２が与えられた。
【０１４３】
たとえば、相同的なマウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を用いることによって（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ、第８１巻：６８５１ページ（１９８４年））、又は免疫グロブリンのコード配列を非免疫グロブリンポリペプチド・コード配列の全体もしくは部分と共有結合させることによって、ＤＮＡを改変してもよい。
【０１４４】
通常、抗体の定常ドメインの代わりに、又は抗体の抗原結合部位の可変ドメイン代わりにそのような非免疫グロブリンポリペプチドを用いて、ある抗原に特異的な１個の抗原結合部位、及び異なる抗原に特異的な別の抗原結合部位を含む２価のキメラ抗体を作り出す。
【０１４５】
ヒト化非ヒト抗体向けの方法は、当技術分野で記載されている。ヒト化抗体は、ヒトでない供給源からの１個又は複数のアミノ酸残基がそこに導入されていることが好ましい。このような非ヒトアミノ酸残基はしばしば、「移入」残基と呼ばれ、通常は「移入」可変ドメインから受け取る。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒと同僚らの方法（Ｊｏｎｅｓ等のＮａｔｕｒｅ、第３２１巻：５２２〜５２５ページ（１９８６年）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ等のＮａｔｕｒｅ、第３３２巻：３２３〜３２７ページ（１９８８年）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等のＳｃｉｅｎｃｅ、第２３９巻：１５３４〜１５３６ページ（１９８８年））に従い、ヒト抗体の代わりに対応する超可変領域配列を用いることによって行うことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、インタクト・ヒト可変ドメインよりもかなり少ない配列がヒトでない種に由来する対応する配列で置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、通常、若干の超可変領域残基及び可能性としての若干のＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
【０１４６】
ヒト化抗体の作製において使用するヒト可変ドメインの選択は、軽鎖及び重鎖共に、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「最適な」方法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメイン配列を、知られているヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体でスクリーニングする。次いで、げっ歯類に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体用のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）とする（Ｓｕｎｓ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１５１巻：２２９６ページ（１９９３年）、Ｃｈｏｔｈｉａ等のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、第１９６巻：９０１ページ（１９８７年））。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定亜群のヒト抗体すべての共通配列から得た特定のフレームワーク領域を使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に同じフレームワークを使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒ等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻：４２８５ページ（１９９２年）、Ｐｒｅｓｔａ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１５１巻：２６２３ページ（１９９３年））。
【０１４７】
さらに、抗原への高い親和性及び他の好都合な生物学的特性を保ったまま抗体をヒト化することが重要である。好ましい方法によれば、この目的を達成するために、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的なヒト化産物を分析するプロセスによってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、普通に入手でき、当分野の技術者によく知られている。選択された免疫グロブリン配列候補のもっともらしい三次元の立体配置構造を図にし、表示するコンピュータ・プログラムが利用できる。このような表示物を調べることによって、免疫グロブリン配列候補の機能の中でその残基が担いそうな役割の分析、すなわち免疫グロブリン候補の抗原結合能に影響を与える残基の分析が可能になる。この手段では、標的抗原に対する親和性の向上など、所望の抗体特性が得られるよう、ＦＲ残基をレシピエント配列及び移入配列から選択し、合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接かつほとんど実質的に関与している。
【０１４８】
組換え抗体を得るための非常に効率のよいもう１つの手段は、ＮｅｗｍａｎのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０巻：１４５５〜１４６０ページ（１９９２年）に記載されている。より詳細には、この技術によって、サルの可変ドメインとヒトの定常配列を含む霊長類化抗体が得られる。この参照文献の全体を参照により本明細書に組み込む。さらに、この技術は、１９９５年１月２５日に出願された米国特許出願番号０８／３７９，０７２に記載されており、この特許は、１９９２年６月１０日に出願された米国連続番号０７／９１２，２９２の継続出願であり、この特許は、１９９２年３月２３日に出願された米国連続番号０７／８５６，２８１の一部継続出願であり、この特許は、最終的に１９９１年７月２５日に出願された米国連続番号０７／７３５，０６４の一部継続出願である。０８／３７９，０７２及びその親特許をすべて、参照により全体として本明細書に組み込む。
【０１４９】
この技術では、抗体がヒトに投与されて抗原として拒絶されないようにこれを改変する。この技術は、カニクイザルをヒトの抗原又は受容体で免疫化するものである。この技術は、ヒト細胞表面抗原に指向性のある高親和性モノクローナル抗体を生み出すために開発された。
【０１５０】
ヒトＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、もしくはＣＤ１９に対するマカク抗体の同定は、参照により全体として本明細書に組み込まれている１９９５年６月７日に出願され、同じ譲受人に譲渡されている米国特許出願第０８／４８７，５５０号に記載の方法を使用して、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、もしくはＣＤ１９で免疫化したサルからのＢリンパ球を使用するファージディスプレイ・ライブラリのスクリーニング又はそれを使用して得たサルヘテロハイブリドーマによって実施できる。
【０１５１】
これらの出願に記載の方法を使用して得た抗体は、以前から、ヒトエフェクター機能を示し、免疫原性が低下しており、血清半減期が長いことが報告されている。この技術は、カニクイザルが、系統的にヒトに類似しているにもかかわらず、それでも多くのヒトタンパク質を外来であると認識し、したがって免疫応答が備わっているということを利用するものである。さらに、カニクイザルは、系統的にヒトに近いので、このサルにおいて発生した抗体は、ヒトにおいて発生した抗体に対するアミノ酸相同性が高度であることが発見されている。実際、マカク免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変部遺伝子が配列決定された後で、各遺伝子ファミリーの配列が、そのヒト対応物に対して８５〜９８％相同的であることが判明した（Ｎｅｗｍａｎ等、１９９２年）。この方法で生成された最初の抗体、すなわち抗ＣＤ４抗体は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の共通配列に対して９１〜９２％相同的であった（Ｎｅｗｍａｎ等、１９９２年）。
【０１５２】
上述のように、本発明の一部は、ヒトＣＤ４０Ｌ抗原に特異的であり、かつＣＤ４０情報伝達を阻害し、又はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を抑制することが可能なモノクローナル抗体又はその霊長類化された形の使用に関する。ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌ間の一次活性化部位を、確認された抗体（又は治療上有効なその断片）でブロックしながら、プラスの同時刺激への不可知論的な（ａｇｎｏｓｔｉｃ）効果とマイナスの情報伝達への作用物質効果とを合わせて可能にすることが、再発型の悪性病変、特にＢ細胞リンパ腫及び白血病に介入する有用な治療手法となる。確認された抗体の機能上の活性は、それらがＩｇＭもしくはＦａｓ誘発性アポトーシスにもかかわらず生存し、これを回避するのを可能にするＣＤ４０シグナルをブロックすることにある。
【０１５３】
ヒトＣＤ４０Ｌを特異的に結合するモノクローナル抗体、並びにそれから誘導された霊長類化抗体は、共にＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡されている米国特許第６，００１，３５８号もしくは同第５，７５０，１０５号に記載の方法、又は他の知られている方法を使用して製造することができる。このような抗体は、好ましくは、ＣＤ４０Ｌに対して高い親和性をもち、したがって、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０経路を阻害する免疫抑制抑制薬として使用してよい。同様の技術によって、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ４０に特異的なサル抗体が得られる。
【０１５４】
サル・モノクローナル抗体の調製は、ＣＤ４０Ｌ（たとえば、ヒトＣＤ４０Ｌ）で免疫化したサルから得たＢリンパ球を使用して、ファージディスプレイ・ライブラリをスクリーニングするか、又はサルへテロハイブリドーマを調製することによって行う。また、米国特許第５，９４５，５１３号に記載の融合タンパク質からヒトＣＤ４０を得ることもできる。
【０１５５】
言及したように、抗ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＣＤ４０抗体を得る第１の方法は、組換えファージディスプレイ技術を使用する。通常、この方法は、標的に対する組換え免疫グロブリン・ライブラリ、すなわち繊維状ファージ表面上に表示されるＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ４０、もしくはＣＤ４０Ｌ抗原の合成、及びＣＤ４０Ｌに対する親和性をもつ抗体を分泌するファージの選択を含む。上で触れたように、ヒトＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４０の両方に結合する抗体を選択することが好ましい。このような方法を実施するために、本発明者らは、組換えの可能性を低減し、安定性を向上させる、サルライブラリ用の特殊なライブラリを作り出した。
【０１５６】
本来、マカクライブラリと共に使用するファージディスプレイを採用するために、このベクターは、サル免疫グロブリン遺伝子を増幅するＰＣＲ用の特定のプライマーを含む。これらのプライマーは、霊長類化技術、及びヒト配列を含むデータベース開発の際に得られたマカク配列に基づく。適切なプライマーは、参照により本明細書に組み込まれた、同じ譲受人に譲渡されている０８／３７９，０７２に記載されている。
【０１５７】
第２の方法は、サル、すなわちマカクを所望の抗原標的、すなわちヒトＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、もしくはＣＤ４０Ｌで免疫化するものである。モノクローナル抗体の発生についてのマカクに特有の有利点は、上で述べている。特に、このようなサル、すなわちカニクイザルは、ヒト抗原で免疫化しても、受容体で免疫化してもよい。さらに、参照により全体として組み込まれているＮｅｗｍａｎ等（１９９２年）、及び１９９５年１月２５日に出願され、同じ譲受人に譲渡されているＮｅｗｍａｎ等の米国連続番号０８／３７９，０７２の方法に従い、得られた抗体を使用して、霊長類化抗体を作製してもよい。
【０１５８】
カニクイザルから得た抗体の有意な有利点は、このようなサルが、多くのヒトタンパク質を外来であると認識し、それによって抗体の生成に備えるが、その抗体によっては所望のヒト抗原、たとえばヒト表面タンパク質及び細胞受容体に対する親和性が高いという点である。さらに、このようなサルは、系統的にヒトに近いので、得られた抗体は、ヒトにおいて産生された抗体に対するアミノ酸相同性が高度である。上で触れたように、マカク免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変部遺伝子が配列決定された後で、各遺伝子ファミリーの配列が、そのヒト対応物に対して８５〜８８％相同的であることが判明した（Ｎｅｗｍａｎ等、１９９２年）。
【０１５９】
より詳細には、マカクのカニクイザルにヒトＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、もしくはＣＤ４０Ｌ抗原を投与し、Ｂ細胞をそれから単離する、たとえば動物からリンパ節生検材料を採取し、次いでポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用してＢリンパ球をＫＨ６／Ｂ５（マウス×ヒト）ヘテロ黒色腫細胞と融合する。次いで、ヒトＣＤ４０Ｌを結合する抗体を分泌するヘテロハイブリドーマを特定する。
【０１６０】
ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ４０に結合する抗体の場合では、このような抗体を、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０、すなわちその対応する受容体との相互作用を阻害するために使用する可能性があるので、ＣＤ４０情報伝達を妨害又は調節するように行うことが好ましい。１個を超えるＣＤ４０ＬもしくはＣＤ４０上エピトープに対する抗体を開発することができ、抗体を一緒に利用する場合、抗体複合活性によって相乗効果がもたらされるかもしれない。
【０１６１】
開示している本発明は、特定の抗体を産生するように準備した動物（たとえば、オランウータン、ヒヒ、マカク、カニクイザルなどの霊長類）を使用する。ヒトＣＤ４０Ｌに対する抗体を得るのに使用してよい他の動物には、それだけに限らないが、以下のもの、すなわちマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ブタ、ヤギ、及びウサギが含まれる。
【０１６２】
次いで、本質的に、共に参照により本明細書に組み込まれているＮｅｗｍａｎ等（１９９２）、１９９５年１月２５日出願の及びＮｅｗｍａｎ等の米国連続番号３７９，０７２に記載されているとおりに、ヒトＣＤ４０Ｌ抗原に特異的に結合する抗体を発現する細胞系を使用して、可変ドメイン配列をクローン化し、霊長類化抗体の製造に備える。これには、本質的に、そこからのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、及びＩｇに特異的なプライマーを使用するＰＣＲによるその増幅が伴う。適切なプライマーは、Ｎｅｗｍａｎ等の１９９２年、及び米国連続番号３７９，０７２に記載されている。同様の技術によって、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、又はＣＤ２２に特異的な抗体を発現する細胞系を得る。
【０１６３】
次いでクローン化したサルの可変遺伝子を、ヒト重鎖及び軽鎖定常部遺伝子を含む発現ベクターに導入する。ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれるＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の専売発現ベクターを使用してこれを行うことが好ましい。このベクターは、サイトメガロウイルス・プロモーター／エンハンサー、マウスβグロブリン主プロモーター、ＳＶ４０複製開始点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンリン酸転移酵素エキソン１及びエキソン２、ヒト免疫グロブリンκもしくはλ定常部、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ヒト免疫グロブリンγ１もしくはγ４ＰＥ定常部、及びリーダー配列を含む。このベクターは、サル可変部遺伝子を導入し、ＣＨＯ細胞に形質移入し、その後Ｇ４１８含有培地及びメトトレキサート中で選択し、増幅させると、非常に高レベルで霊長類化抗体を発現することが判明している。
【０１６４】
たとえばこの発現系は、これまでに、ＣＤ４及び他のヒト細胞表面受容体に対する結合力の高い（Ｋｄ≦１０-10Ｍ）霊長類化抗体をもたらすことが開示されている。さらに、この抗体は、元のサル抗体と同じ親和性、特異性、及び機能活性を示すことが判明している。このベクター系は、参照により本明細書に組み込まれている、同じ譲受人に譲渡されている米国連続番号３７９，０７２、並びにこれも参照により全体として本明細書に組み込まれている１９９３年１１月３日に出願の米国連続番号０８／１４９，０９９で実質的に開示されている。この系は、高い発現レベル、すなわち＞３０ｐｇ／細胞／日を賄う。当然、同じ方法を利用して、ＣＤ１９、Ｃ２０、ＣＤ２２、又はＣＤ４０に特異的な抗体を産生する細胞系を生成することができる。
【０１６５】
ヒト化に代わるものとして、ヒト抗体を得ることができる。たとえば、現在では、免疫化すると、内在性の免疫グロブリンを産生することなく、全レパートリーのヒト抗体を産生できる形質転換動物（たとえばマウス）の作製が可能である。たとえば、キメラ生殖系列突然変異マウスにおいて、抗体重鎖結合領域ＰＨ）遺伝子を同型接合的に欠失させると、内在性の抗体産生が完全に抑制される。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系列突然変異マウス中に移すと、抗原負荷後にヒト抗体が産生される。たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等のＰｒｏｃ．Ｍａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻：２５５ページ１（１９９３年）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等のＮａｔｕｒｅ、第３６２巻：２５５〜２５８ページ（１９９３年）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ等のＹｅａｒ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏ．、第７巻：３３ページ（１９９３年）、並びに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、及び同第５，５４５，８０７号を参照されたい。
【０１６６】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等のＮａｔｕｒｅ第３４８巻：５５２〜５５３ページ（１９９０年））を使用して、免疫化した供与体に由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体及び抗体断片を生成することもできる。この技術によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３やｆｄなど、糸状バクテリオファージの主要コートタンパク質又は微量コートタンパク質遺伝子中にインフレームでクローン化し、ファージ粒子表面上に機能性抗体断片として提示させる。糸状粒子は、ファージ・ゲノムの１本鎖ＤＮＡの複製を含んでいるので、抗体の機能特性に基づいて選択すれば、このような特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択することにもなる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性を若干模倣している。ファージディスプレイは、様々な形式で実施でき、その概説については、たとえば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．及びＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第３巻：５６４〜５７１ページ（１９９３年）を参照されたい。ファージディスプレイには、いくつかのＶ遺伝子セグメント供給源が使用できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ等のＮａｔｕｒｅ、第３５２巻：６２４〜６２８ページ（１９９１年）では、免疫化したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の無秩序な小規模コンビナトリアルライブラリから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離している。本質的に、Ｍａｒｋｓ等のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、第２２２巻：５８１〜５９７ページ（１９９１年）、又はＧｒｉｆｆｉｔｈ等のＥＭＢＯ  Ｊ．第１２巻：７２５〜７３４ページ（１９９３年）に記載の技術に従えば、免疫化していないヒト供与体に由来する１レパートリーのＶ遺伝子を構築することができ、（自己抗原を含む）抗原の多様なアレイに対する抗体を単離できる。米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号も参照されたい。
【０１６７】
ヒト抗体は、ｖｉｔｒｏで活性化したＢ細胞によって生成してもよい（米国特許第２０  ５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたい）。ＳＣＩＤマウスを使用してヒト抗体を生成する好ましい手段は、同じ権利者に所有されている、同時継続出願で開示されている。
【０１６８】
抗体断片を生成する様々な技術が開発されている。旧来、このような断片は、未処置抗体をタンパク質分解によって消化して得ていた（たとえば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ等のＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ第２４巻：１０７〜１１７ページ（１９９２年）及びＢｒｅｎｎａｎ等のＳｃｉｅｎｃｅ、第２２９巻：８１ページ（１９８５年）を参照されたい）。しかし、このような断片は現在、組換え宿主細胞によって直接に産生される。たとえば、上で論じた抗体ファージライブラリから抗体断片を単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接に回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する（Ｃａｒｔｅｒ等のＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１０巻：１６３〜１６７ページ（１９９２年））。別の手法によれば、組換え宿主細胞培養物からＦ（ａｂ’）２断片を直接に単離できる。当業者には、抗体断片を生成する他の技術が明らかとなろう。他の実施形態では、選択した抗体が、１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片は、たとえば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「線状抗体」でもよい。このような線状の抗体断片は、単一特異的でも二重特異的でもよい。
【０１６９】
二重特異性抗体は、少なくとも２個のエピトープへの結合特異性を有する抗体である。典型的な二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面マーカーの２個の異なるエピトープに結合し得る。他のそのような抗体は、第１のＢ細胞マーカーを結合し、さらに第２のＢ細胞表面マーカーを結合し得る。あるいは、抗Ｂ細胞マーカーを結合する腕が、Ｔ細胞受容体分子（たとえば、ＣＤ２又はＣＤ３）や、ＦｃｙＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃｙＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＩｇＧＦｃ受容体（ＦｃｙＲ）など、白血球上の誘発分子に結合する腕と合体させて、細胞の防御機構をＢ細胞に集中させてもよい。二重特異性抗体を使用して、細胞傷害剤をＢ細胞に局在させてもよい。このような抗体は、Ｂ細胞マーカーを結合する腕と、細胞傷害剤（たとえば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、又は放射性同位体ハプテン）を結合する腕とを有する。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（たとえば、Ｆ（ａｂ）２二重特異性抗体）として調製できる。
【０１７０】
二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野で知られている。旧来の全長二重特異性抗体の生成は、２本の鎖が異なる特異性を有する２対の免疫グロブリン重鎖−軽鎖の同時発現に基づいている（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ等のＮａｔｕｒｅ、第３０５巻：５３７〜５３９ページ（１９８３年））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無秩序に寄せ集められるので、このようなハイブリドーマ（クアロドーマ）では、そのうちの１種だけが正しい二重特異性構造を有する１０種の異なる潜在的混合物が生成される。正確な分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィーの諸段階によって行われるが、かなり煩わしく、生成物の収率も低い。同様の手順が、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等のＥＭＢＯ  Ｊ．、第１０巻：３６５５〜３６５９ページ（１９９１年）に記載されている。
【０１７１】
別の手法によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。少なくともヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインに融合させることが好ましい。軽鎖との結合に必要な部位を含む第１重鎖定常部（ＣＨＩ）が融合物の少なくとも１個に存在していることが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物をコードしているＤＮＡ、及び所望であれば免疫グロブリン軽鎖を別々の発現ベクターに導入し、適切な宿主生物に同時形質移入する。同等でない比の３本のポリペプチド鎖をこの構築に使用して最適な収率がもたらされる場合では、これによって、３個のポリペプチド断片の共通部分を調節する際の高度な柔軟性を実施形態に付与する。しかし、同等な比の少なくとも２本のポリペプチド鎖によって高い収率がもたらされる場合、又はその比が特に重要でない場合、２本又は３本すべてのポリペプチド鎖のコード配列を１個の発現ベクターに導入することが可能である。
【０１７２】
この手法の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、第１の結合特異性を有する一方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、（第２結合特異性をもたらす）他方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対とから構成されている。免疫グロブリン軽鎖が二重特異性抗体の２分の１しか存在しないことが、分離の容易な手段を与えるので、この非対称構造によって不必要な免疫グロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物を分離しやすくなることが判明した。この手法は、ＷＯ９４／０４６９０で開示されている。二重特異性抗体生成の更なる詳細については、たとえば、Ｓｕｒｅｓｈ等のＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１２１巻：２１０ページ（１９８６年）を参照されたい。
【０１７３】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載の別の手法によれば、抗体分子対の間の中間面を操作すると、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣH３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面に由来する１個又は複数の小さいアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（たとえば、チロシン又はトリプトファン）で置換する。第２の抗体分子の界面には、大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの（たとえば、アラニン又はチロシン）で置換することによって、その大きめの側鎖と同一又はそれより小さいサイズの代償的な「空洞」を作り出す。これによって、ヘテロ二量体の収量をホモ二量体など、他の不必要な最終産物よりも増大させる機構がもたらされる。
【０１７４】
二重特異性抗体には、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。たとえば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体をアビジンに結合させ、他方をビオチンに結合させることができる。このような抗体は、たとえば、免疫系細胞が不必要な細胞を標的とするように（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療向けに（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９）企図されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して作製すればよい。適切な架橋剤は、当技術分野でよく知られており、いくつかの架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号で開示されている。
【０１７５】
抗体断片から二重特異性を生成する技術も、文献に記載されている。たとえば、化学結合を利用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ等のＳｃｉｅｎｃｅ、第２２９巻：８１ページ（１９８５年）は、未処置抗体をタンパク質分解によって切断してＦ（ａｂ’）２断片を生成する手順を記載している。このような断片をジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、近隣のジチオールを安定化し、分子内のジスルフィド形成を防ぐ。次いで、生じたＦａｂ’断片をチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１種類を、メルカプトエチルアミンで還元することによってＦａｂ’−チオールに還元し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した抗体は、酵素を選択的に固定化する薬品として使用できる。
【０１７６】
最近の進歩によって、化学結合させると二重特異性抗体を生成し得るＦａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接に回収しやすくなった。Ｓｈａｌａｂｙ等のＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１７５巻：２１７〜２２５ページ（１９９２年）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）2分子の生成を記載している。各Ｆａｂ’断片を大腸菌から別々に分泌させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接に化学結合させて、二重特異性抗体を生成した。このようにして生成した二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現している細胞、及び正常ヒトＴ細胞に結合するだけでなく、ヒト乳房腫瘍ターゲットに対するヒト細胞傷害リンパ球の溶解活性を誘発する能力があった。
【０１７７】
組換え細胞培養物から二重特異性抗体断片を直接に作製し、単離する様々な方法も記載されている。たとえば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が生成されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４８巻（５）：１５４７〜１５５３ページ（１９９２年）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパー・ペプチドを遺伝子融合によって２種の異なる抗体のＦａｂ’部分に結合させた。抗体ホモ二量体のヒンジ部を還元して、単量体を生成し、次いで再度酸化させて抗体ヘテロ二量体を生成した。この方法は、抗体ホモ二量体の生成にも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻：６４４４〜６４４８ページ（１９９３年）に記載の「二重抗体」技術は、二重特異性抗体断片を作製する代替機構を提供している。この断片は、同じ鎖上の２箇所のドメインが対合できない位に短いリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶL）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。したがって、ある断片のＶH及びＶLドメインを別の断片の相補的なＶL及びＶHドメインと強制的に対合させ、それによって２個の抗原結合部位を形成する。１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することによって二重特異性抗体断片を作製する別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１５２巻：５３６８ページ（１９９４年）を参照されたい。
【０１７８】
２価より高い価の抗体が企図されている。たとえば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４７巻：６０ページ（１９９１年）。
【０１７９】
本明細書では、抗体の他の変形形態を企図する。たとえば、様々な非タンパク質重合体の１種類、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体に抗体を結合させてもよい。
【０１８０】
本明細書で開示した抗体は、リポソームとして製剤してもよい。拮抗物質含有リポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８２巻：３６８８ページ（１９８５年）、Ｈｗａｎｇ等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７７巻：４０３０ページ（１９８０年）、米国特許第４，４８５，０４５号、同第４，５４４，５４５号、及び１９９７年１０月２３日に公告されたＷＯ９７／３８７３１に記載のものなど、当技術分野で知られている方法によって調製する。米国特許第５，０１３，５５６号では、循環時間が延長されたリポソームが開示されている。
【０１８１】
ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧで誘導したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって、特に有用なリポソームを生成できる。リポソームを、規定された孔径のフィルターを介する押出しにかけて、所望の直径のリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎ等のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７巻：２８６〜２８８ページ（１９８２年）に記載のとおりに、ジスルフィド交換反応によってリポソームに結合される。化学療法薬は、場合によってリポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎ等のＪ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．第８１巻（１９）１４８４ページ（１９８９年）を参照されたい。
【０１８２】
本明細書に記載のタンパク質もしくはペプチド拮抗物質のアミノ酸配列の変更を企図する。たとえば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましいといえる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードする核酸に、相応するヌクレオチドの変更を導入するか、又はペプチド合成によって調製する。このような変更には、たとえば、拮抗物質のアミノ酸配列内での残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換が含まれる。欠失、挿入、及び置換をどのように組み合わせても最終構築物が生じるが、ただし、最終構築物が所望の特性を有するものとする。アミノ酸の変更によって、グリコシル化部位の数又は位置を変更するなど、拮抗物質の翻訳後プロセスを変えてもよい。
【０１８３】
Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓのＳｃｉｅｎｃｅ、第２４４巻：１０８１〜１０８５ページ（１９８９年）に記載されているように、突然変異誘発に好ましい位置となる抗体の所定の残基又は領域を特定する有用な方法は、「アラニンスキャン突然変異誘発法（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」と呼ばれる。そこで、残基又は標的残基集団を特定し（たとえば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｇｌｕなどの荷電アミノ酸）、中性又は負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニン又はポリアラニン）で置換して、アミノ酸と抗原を相互に作用させる。次いで、置換部位に更なる変異体又は他の変異体を導入することによって、置換に対する官能基感受性を示すアミノ酸位置を精製する。したがって、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決められているのに対し、変異の性質は、それ自体が予め決められている必要がない。たとえば、所与の部位での変異の成績を分析するために、標的コドンもしくは領域でａｌａスキャン又は無作為な突然変異誘発を行い、発現した拮抗物質変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０１８４】
アミノ酸配列の挿入物には、１個の残基から、１００個以上の残基を含むポリペプチドに及ぶ範囲の長さのアミノ及び／もしくはカルボキシ末端融合物、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物が含まれる。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する拮抗物質又は細胞傷害ポリペプチドに融合させた拮抗物質が含まれる。拮抗物質分子の他の挿入用変異体には、酵素拮抗物質のＮもしくはＣ末端との融合物、又は拮抗物質の血清半減期を延長するポリペプチドが含まれる。
【０１８５】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基で置換された拮抗物質分子中に少なくとも１個のアミノ酸残基を有する。抗体拮抗物質の置換型突然変異誘発について最も注目される部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲ変更も企図する。表１の「好ましい置換」の項目に保存的な置換を示す。そのような置換が生理活性の変化をもたらす場合、表１で「模範的な置換」と呼び、又は以下でアミノ酸クラスに関してさらに記載するようなより実質的な変更を導入してよく、産物は、スクリーニングにかける。
【０１８６】
【表１】
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【０１８７】
抗体の生物学的特性の実質的な変更は、（ａ）たとえばシートもしくはヘリックス高次構造のような、置換区域のポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）分子の標的部位の電荷もしくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の体積の保持への影響が異なる置換基を選択することによって実現する。自然に生じた残基は、共通の側鎖特性、すなわち、
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、
（２）中性疎水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、
（５）鎖の配向性に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
に基づいてグループ分けする。
【０１８８】
非保存的な置換は、このようなクラスのうちの１クラスのメンバーが別のクラスに交換されるものである。
【０１８９】
拮抗物質の正確な高次構造の維持に関与しない任意のシステイン残基は、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐために、一般にセリンで置換してよい。逆に、（特に、拮抗物質がＦｖ断片などの抗体断片である場合、）拮抗物質にシステイン結合を加えて、その安定性を向上させてもよい。
【０１９０】
置換変異体の特に好ましいタイプは、親抗体（たとえば、ヒト化もしくはヒト抗体）の１個又は複数の超可変領域残基の置換を伴うものである。一般に、得られた変異体を更なる開発向けに選択したものは、それらを得たもとの親抗体よりも生物学的特性が向上している。そのような置換変異体を生成する好都合な方法は、ファージディスプレイを利用する親和性成熟である。簡単に述べれば、いくつかの超可変領域部位（たとえば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位で起こり得るすべてのアミノ酸置換を起こす。このようにして生成した抗体変異体は、各粒子に収められたＭ１３ｇｅｎｅＩＩＩ産物との融合物としての糸状ファージ粒子から一価の形で提示される。次いで、本明細書で開示したとおりに、ファージによって提示された変異体を、その生理活性（たとえば、結合親和性）についてスクリーニングする。変更する超可変領域部位候補を特定するために、アラニンスキャン突然変異誘発法を実施すると、抗原結合に実質的に寄与する超可変領域残基を特定できる。別法又は追加として、抗原抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原間の接触点を特定することも有益であるといえる。そのような接触残基及び近隣残基は、本明細書で詳述した技術に従う置換の候補である。このような変異体を生成したなら、本明細書に記載のとおりに変異体パネルをスクリーニングにかけ、１種又は複数の関係のあるアッセイにおいて優れた特性を有する抗体を選択し、更なる開発に備えればよい。
【０１９１】
別の種類の抗体アミノ酸変異体は、拮抗物質の本来のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、拮抗物質中に見出される１個又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は拮抗物質中に存在しない１個又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
【０１９２】
ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合型又はＯ結合型である。Ｎ結合型は、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に結合することを指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素による結合を認識する配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在が、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ結合型グリコシル化は、糖類のＮ−アセチガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのヒドロキシアミノ酸、最も一般にはセリン又はスレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンを使用してもよい。
【０１９３】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列を１本又は複数含むようにアミノ酸配列を変更することによって好都合に実施する（Ｎ結合型グリコシル化部位について）。もとの拮抗物質の配列に対して１個又は複数のセリンもしくはスレオニン残基を付加し、又はこれらで置換することによって変更してもよい（Ｏ結合型グリコシル化部位）。
【０１９４】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で知られている様々な方法によって調製する。そのような方法には、それだけに限らないが、自然供給源からの単離（天然のアミノ酸配列変異体の場合）、又は拮抗物質の既調製変異体もしくは非変異体バージョンにオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を行うことによる調製が含まれる。
【０１９５】
本発明で使用する抗体を変更して、エフェクター機能を改良する、たとえば、拮抗物質の抗原依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強することが望ましいといえる。この方法は、抗体拮抗物質のＦｃ領域に１個又は複数のアミノ酸置換基を導入することによって実現する。別法又は追加として、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入し、それによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にしてもよい。そのようにして生成したホモ二量体抗体は、内部移行能が向上し、かつ／又は補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞内細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増強していてもよい。Ｃａｒｏｎ等のＪ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．第１７６巻：１１９１〜１１９５ページ（１９９２年）及びＳｈｏｐｅｓのＢ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４８巻：２９１８〜２９２２ページ（１９９２）を参照されたい。Ｗｏｌｆｆ等のＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第５３巻：２５６０〜２５６５ページ（１９９３年）に記載されているように、ヘテロ二機能性架橋リンカー（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）を使用して、抗腫瘍活性を増強したホモ二量体抗体を調製してもよい。あるいは、２箇所のＦｃ領域を有し、そのために補体による溶解能及びＡＤＣＣ能が増強している可能性のある抗体を操作することもできる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等のＡｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ第３巻：２１９〜２３０ページ（１９８９年）を参照されたい。
【０１９６】
抗体の血清半減期を延長するため、たとえば米国特許第５，７３９，２７７号に記載のように、拮抗薬（具体的には、抗体断片）にサルベージ受容体結合エピトープを組み込んでもよい。本明細書で使用する用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期の延長を引き起こす、ＩｇＧ分子（たとえば、ＩｇＧＩ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）Ｆｃ領域のエピトープを指す。
【０１９７】
本発明に従って使用する拮抗物質を含む治療製剤は、純度が所望の程度である拮抗物質と任意選択の薬剤として許容される担体、賦形剤、又は安定剤とを混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形で貯蔵できるように調製する（「レミントンの製薬学第１６版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）」、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年））。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられた用量及び濃度でレシピエントに対して毒性がないものであり、これらには、リン酸、クエン酸、他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（残基約１０個未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属錯体（たとえばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１９８】
免疫調節性抗体及びＢ細胞枯渇性抗体は、同じ製剤中に入れてもよいし、異なる製剤にして投与してもよい。組成物は、他の非抗体拮抗物質、たとえばＣＤ４０Ｌ又はＢ７拮抗物質をさらに含んでもよい。その例には、可溶性ＣＤ４０、Ｂ７、及びその融合物が含まれる。同時投与も逐次投与もでき、いずれの順序でも有効である。
【０１９９】
典型的な抗ＣＤ２０抗体製剤は、参照により本明細書に特に組み込まれているＷＯ９８／５６４１８に記載されている。この刊行物は、４０ｍｇ／ｍＬのリツキシマブ、２５ｍＭのアセタート、１５０ｍＭのトレハロース、０．９％のベンジルアルコール、０．０２％のｐＨ５．０のポリソルベート２０を含み、２〜８℃で保管して最小有効期間が２年である液体複数回投与製剤を記載している。注目される別の抗ＣＤ２０製剤は、９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム中１０ｍｇ／ｍＬのリツキシマブ、７．３５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及びｐＨ６．５の注射用無菌水を含む。
【０２００】
ＷＯ９７／０４８０１には、凍結乾燥製剤を皮下投与に適合させたものが記載されている。そのような凍結乾燥製剤は、適切な希釈剤で戻して、抗タンパク質濃縮物にすればよく、戻した製剤を、本明細書で治療しようとする哺乳動物に皮下投与すればよい。
【０２０１】
本明細書では、製剤は、治療する特定の適応症に必要な１種以上の活性化合物、好ましくは、互いに有害に作用しない補助的な活性を有する化合物も含んでよい。たとえば、化学療法薬、サイトカイン、又は免疫抑制薬（たとえば、サイクロスポリンや、Ｔ細胞を結合する抗体、たとえばＬＦＡ−１を結合するものなど、Ｔ細胞に作用するもの）をさらに提供することが望ましい。このような他の薬品の有効量は、製剤中に存在する拮抗物質の量、疾患もしくは障害又は治療の種類、及び上で論じた他の要因に応じて変わる。これらは、通常はこれまでに利用されている投与経路でそれと同じ投与量を使用し、又はこれまでに採用された用量の約１〜９９％を使用する。
【０２０２】
活性成分は、それぞれ３０コアセルベーション技術又は界面重合によって調製したマイクロカプセル、たとえば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン・マイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリラート）マイクロカプセル；コロイド状薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミン・マイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）；又はマクロエマルジョン中に閉じ込めてもよい。このような技術は、「レミントンの製薬学第１６版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）」、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年）で開示されている。
【０２０３】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放放出製剤の適切な例には、造形品の形、たとえばフィルム又はマイクロカプセルの形の、拮抗物質を含む固体疎水性重合体製半透性マトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタマートの共重合体、分解性エチレン−ビニル酢酸共重合体、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸リュープロリドからなる注射用マイクロスフィア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する製剤は無菌にするべきである。これは、無菌濾過膜での濾過によって容易に行うことができる。
【０２０４】
Ｂ細胞枯渇性抗体及び／又は免疫調節性抗体を含む組成物は、有効な医用慣行に沿って、製剤し、適量に分け、投与する。これに関連して、考慮することになる要因には、治療する特定の悪性病変又は疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患もしくは障害の原因、薬品の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に知られている他の要因が含まれる。投与する抗体の治療有効量は、このような条件に左右される。
【０２０５】
上で包括的に論じたように、選択された本発明の実施形態は、放射線療法や化学療法などの１種又は複数の補助的療法と併用又は協同で、患者に抗体を投与することを含む（すなわち、併用治療法）。選択された別の抗体又は補助的療法と協同又は併用で抗体を投与するとは、本明細書で使用する場合、開示された抗体及び／又は治療の逐次、同時、同期間（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）、同時期、両立、又は同時存在の投与又は適用を意味する。当分野の技術者ならば、併用治療法の様々な成分の投与又は適用のタイミングを計って、全体からみた治療効率を上げればよいことがわかるであろう。たとえば、免疫調節性抗体は、数週間以内に後からＢ細胞枯渇性抗体を用いる、標準の、よく知られている治療経過で投与することができる。逆に、Ｂ細胞枯渇性抗体に結合させたサイトトキシンを静脈内投与してから、腫瘍に絞った外部ビーム照射を行うこともできる。さらに他の実施形態では、１度の通院で、免疫調節性抗体と１種又は複数の選択されたＢ細胞枯渇性抗体を同時に投与してもよい。当業者（たとえば、経験を積んだ腫瘍遺伝子学者）ならば、大掛かりな実験をせずとも、選択された抗体及び当該明細書の教示に基づいて、有効な併用治療法を容易に判別できるはずである。
【０２０６】
これに関して、選択した抗体の組合せは、患者に治療利益をもたらすならどんな順序及び時間枠で投与してもよい。すなわち、免疫調節性抗体、及び任意選択のＢ細胞枯渇性抗体は、あらゆる順序で、又は同時に投与してよい。選択された実施形態では、予めＢ細胞枯渇処置を受けている患者に本発明の免疫調節性抗体を投与する。さらに他の実施形態では、選択された免疫調節性抗体（たとえば、抗１３７及び抗ＣＩＤ４０Ｌ）をほぼ同時又は同時期に投与する。好ましい実施形態では、（免疫調節性にせよ、Ｂ細胞枯渇性にせよ）選択された抗体を互いに１年以内で投与する。他の好ましい実施形態では、選択された抗体を互いに１０、８、６、４、又は２カ月以内で投与する。さらに他の好ましい実施形態では、選択された抗体を互いに４、３、２、又は１週間以内に投与する。さらに他の実施形態では、選択された抗体を互いに５、４、３、２又は１日以内に投与する。患者に選択された薬品又は治療を時間又は分の数の範囲内で（すなわち、ほぼ同時に）投与してもよいことがさらにわかるであろう。
【０２０７】
一般の案として、非経口的に投与する治療有効量の抗体の１回分は、通常、１日あたり約０．１〜５００ｍｇ／患者の体重ｋｇの範囲であり、使用する拮抗物質の最初の範囲は通常、約２〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【０２０８】
好ましいＢ細胞枯渇性抗体は、リツキサン（登録商標）である。この抗体の適切な用量は、たとえば、約２０ｍｇ／ｍ2〜約１０００ｍｇ／ｍ2の範囲である。この抗体の用量は、非ホジキンリンパ腫の治療向けにリツキサン（登録商標）について現在推奨されているものと同じでも異なっていてもよい。たとえば、その用量が約２０ｍｇ／ｍ2〜約２５０ｍｇ／ｍ2、たとえば約５０ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2の範囲である場合、患者に３７５ｍｇ／ｍ2よりもかなり少ない抗体を１又は複数回分投与してもよい。
【０２０９】
さらに、１回又は複数回、初回投与量の抗体を投与し、その後１回又は複数回、後続投与量を投与してもよく、この場合では、後続投与量の抗体のｍｇ／ｍ2用量は、初回投与量の抗体のｍｇ／ｍ2用量を上回らない。たとえば、初回投与量は、約２０ｍｇ／ｍ2〜約２５０ｍｇ／ｍ2（たとえば、約５０ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2）の範囲でよく、後続投与量は、約２５０ｍｇ／ｍ2〜約１０００ｍｇ／ｍ2でよい。
【０２１０】
しかし、上で触れたように、免疫調節性抗体及びＢ細胞枯渇性抗体のこれらの提案量は、相当に慎重な治療判断に委ねられる。適正な用量及びスケジュールを選択する際の鍵となる要素は、上で示したような、得られた結果である。たとえば、進行中及び急性の疾患の治療については、最初に比較的多い用量が必要になるといえる。最も効果的な結果を得るために、その特定のＢ細胞悪性病変に応じて、疾患もしくは傷害の最初の兆候、診断、出現、もしくは発症からできるだけ近いうちに、又は疾患もしくは傷害の寛解期間中に拮抗物質を投与する。
【０２１１】
抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む任意の適切な手段によって、さらに所望であれば、局所的な免疫抑制治療については、病巣内投与によって投与する。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。さらに、たとえば抗体の用量を徐々に減らしながらのパルス注入（ｐｕｌｓｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）によって適宜投与してもよい。投薬は、ある程度は投与が短期間であるか長期間であるかに応じて、注射によって、最も好ましくは静脈内又は皮下注射によって行うことが好ましい。
【０２１２】
さらに、本明細書の抗体と共に、化学療法薬、免疫抑制薬、及び／又はサイトカインなどの他の化合物を投与してもよい。併用投与には、別々の製剤又は単一の製剤を使用する共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、及びいずれかの順序での逐次投与が含まれ、両方（又はすべて）の活性薬が同時にその生理活性を発揮する期間が存在することが好ましい。
【０２１３】
患者への抗体の投与とは別に、本出願は、遺伝子治療による抗体の投与を企図する。抗体をコードする核酸のそのような投与は、表現「治療有効量の拮抗物質の投与」に含まれる。たとえば、１９９６年３月１４日に公告された、細胞内抗体を生成するための遺伝子治療の使用に関するＷＯ９６／０７３２１を参照されたい。
【０２１４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏで患者の細胞に（任意選択で、ベクター中に含まれている）核酸を入れる手法は主に２通りある。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達については、患者の、通常は拮抗物質が必要な部位に核酸を直接に注射する。ｅｘ  ｖｉｖｏ治療については、患者の細胞を取り出し、単離したその細胞に核酸を導入し、改変した細胞を患者に直接に投与し、又はこれらをたとえば多孔質膜に閉じ込めたものを患者に埋め込む（たとえば、米国特許第４，８９２，５３８号及び同第５，２８３，１８７号を参照されたい）。生存細胞に核酸を導入するのに利用できる技術は様々である。そうした技術は、核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養細胞に移入するのか、又はｉｎ  ｖｉｖｏで目的の宿主の細胞に移入するのかに応じて様々に変わる。核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞に移入するのに適する技術には、リポソーム、電気穿孔法、微量注入、細胞融合、ＤＥＡＦ−デキストランの使用、カルシウムリン酸沈殿法などが含まれる。遺伝子のｅｘ  ｖｉｖｏ送達に通常使用されるベクターは、レトロウイルスである。
【０２１５】
最近好んで用いられているｉｎ  ｖｉｖｏの核酸移入技術には、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純疱疹ウイルスＩ型、又はアデノ随伴ウイルスなど）の形質移入と、脂質ベースの系（脂質を仲介とする遺伝子移入に有用な遺伝子は、たとえばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌである）が含まれる。状況によっては、核酸供給源に、細胞表面膜タンパク質もしくは標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上受容体のリガンドなど、標的細胞を標的とする薬品を与えることが望ましい。リポソームを用いる場合、たとえば、特定の細胞型に指向性のキャプシドタンパク質もしくはその断片、循環中に内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、及び細胞内への局在化を目指し、細胞内半減期を延長するタンパク質を標的とし、かつ／又はその取込みを促進するために、飲細胞作用に随伴する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を使用してもよい。受容体を仲介とする飲細胞作用の技術は、たとえば、Ｗｕ等のｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ第２６２巻：４４２９〜４４３２ページ（１９８７年）、及びＷａｇｎｅｒ等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８７巻：３４１０〜３４１４ページ（１９９０年）に記載されている。最近の知られている遺伝子作製及び遺伝子治療プロトコルの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ等のＳｃｉｅｎｃｅ第２５６巻：８０８〜８１３ページ（１９９２年）を参照されたい。ＷＯ９３／２５６７３及びそこで引用されている参照文献も参照されたい。
【０２１６】
これまでに論じたように、本発明の抗体、その免疫反応性断片もしくは組換え体は、哺乳動物の悪性病変のｉｎ  ｖｉｖｏ治療向けに薬剤として有効な量を投与してよい。これに関して、開示された抗体を製剤して、投与しやすくし、活性薬の安定性を助長することはわかるであろう。本発明による薬剤組成物は、生理食塩水、非毒性緩衝剤、保存剤など、薬剤として許容される非毒性の無菌担体を含むことが好ましい。当該出願の目的では、細胞傷害薬に結合させた、又は結合させていない治療用抗体、その免疫反応性断片もしくは組換え体の薬剤として有効な量は、腫瘍細胞上の選択した免疫反応性抗原と有効に結合し、このような細胞の死を増加させるのに十分な量を意味すると考えるべきである。当然、本発明の薬剤組成物は、１回もしくは複数回で投与して、薬剤として有効な量の改変抗体を与えればよい。
【０２１７】
より具体的には、開示された抗体及び方法は、腫瘍サイズの縮小、腫瘍成長の抑制、及び／又は腫瘍を有する動物の生存期間の延長に有用なはずである。したがって、本発明はまた、ヒト又は他の動物に、有効な非毒性量の少なくとも１種の免疫調節性抗体と、任意選択の少なくとも１種のＢ細胞枯渇性抗体を投与することによって、そのようなヒト又は他の動物の腫瘍を治療する方法に関する。当分野の技術者ならば、慣例の実験によって、悪性病変を治療する目的で、改変抗体の有効な非毒性量がどれくらいであるかを決定できるはずである。たとえば、改変抗体の治療活性量は、対象の疾患の段階（たとえば、Ｉ期対ＩＶ期）、年齢、性別、合併症（たとえば、免疫が抑制された状態もしくは疾患）、及び体重、並びに対象で抗体が所望の応答を誘発する能力に応じて様々に変化するといえる。最適な治療応答が得られるように投与計画を調整してもよい。たとえば、数回に分けた用量を毎日投与してもよく、又は治療状況の緊急性に応じて、指示通りに用量を減らしてもよい。しかし、一般に、有効用量は、体重１キログラムあたり１日約０．０５〜１００ミリグラム、より好ましくは体重１キログラムあたり１日約０．５〜１０ミリグラムの範囲であると予想される。
【０２１８】
この開示の範囲と一致して、本発明の抗体は、前述の治療方法に従って、治療又は予防程度のそのような効果を生じるのに十分な量でヒト又は他の動物に投与すればよい。本発明の抗体は、知られている技術に従って本発明の抗体と従来の薬剤として許容される担体もしくは希釈剤を合わせることによって調製した従来の剤形の形でそうしたヒト又は他の動物に投与することができる。当分野の技術者ならば、薬剤として許容される担体又は希釈剤の型及び特徴が、それと合わせる活性成分の量、投与経路、及び他のよく知られている変動要素によって決まることに気が付くであろう。当分野の技術者ならさらに、１種又は複数の種の本発明によるモノクローナル抗体を含む反応混液が特に有効であると証明される可能性にうなずけよう。
【０２１９】
抗体、その免疫反応性断片もしくは組換え体のコンジュゲート、並びに治療薬の調製及び投与方法は、当分野の技術者によく知られており、容易に決定される。本発明の抗体（又はその断片）の投与経路は、経口、非経口、吸入、又は局所でよい。本明細書で使用する用語非経口には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、又は経膣投与が含まれる。静脈内、動脈内、皮下、及び筋肉内の形の非経口投与が一般に好ましい。これらの投与形態はすべて、明らかに本発明の範囲内であると考えるが、好ましい投与形態は、注射用、特に静脈内又は動脈内の注射又は点滴用の溶液である。通常、注射に適する薬剤組成物は、緩衝液（たとえば、酢酸、リン酸、クエン酸緩衝液）、界面活性剤（たとえば、ポリソルベート）、任意選択の安定剤（たとえば、ヒトアルブミン）などを含んでよい。しかし、本発明の教示に適合する他の方法では、抗体を悪性病変部位の部位に直接に送達し、それによって腫瘍組織に治療薬をますますよく作用させることができる。
【０２２０】
局所投与用製剤には、無菌の水溶液もしくは非水性溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、生理食塩水及び緩衝剤処理媒質を含む乳濁液もしくは懸濁液が含まれる。主題発明では、薬剤として許容される担体には、それだけに限らないが、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝剤、又は０．８％の生理食塩水が含まれる。他の一般の非経口用賦形剤には、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定油が含まれる。静脈内用賦形剤には、リンゲルデキストロース・ベースのものなど、流体及び栄養補給剤、電解質補給剤などが含まれる。たとえば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなど、保存剤及び他の添加剤が存在してもよい。
【０２２１】
より詳細には、注射用の使用に適する薬剤組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）もしくは分散液、及び無菌注射用の溶液もしくは分散液の即時製剤用無菌粉末が含まれる。このような場合、組成物は無菌でなければならず、注射しやすくなる程度に流動性であるべきである。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定であるべきであり、細菌や真菌などの微生物による汚染作用を防いで保存することが好ましい。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切なその混合物を含有する溶媒又は分散媒質とすることができる。たとえば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合では必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって、適正な流動性を維持することができる。
【０２２２】
微生物による作用は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって予防できる。多くの場合、組成物中に、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、たとえば、糖類、マンニトールやソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムを含ませることが好ましい。吸収を遅らせる薬品、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含ませることによって、注射用組成物の吸収を長引かせることができる。
【０２２３】
いずれにせよ、無菌注射用溶液は、必要に応じて本明細書で列挙した成分の１種類又は混合物を含む適切な溶媒に、必要な量の活性化合物（たとえば、単独又は他の活性薬と組み合わせた改変抗体）を混ぜ、その後濾過滅菌（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）することによって調製できる。一般に、分散液は、塩基性の分散媒質及び上で列挙したものからの必要な他の成分を含有する無菌賦形剤に活性化合物を混ぜることによって調製する。無菌注射用溶液調製用の無菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌したその溶液から、活性成分及び任意の必要な追加成分の粉末を得る真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０２２４】
注射用製剤は、当技術分野で知られている方法に従って、無菌条件下で加工し、アンプル、袋、瓶、注射器、バイアルなどの容器に充填し、密閉する。さらに、製剤を包装し、各々が参照により本明細書に組み込まれている同時係属の米国連続番号０９／２５９，３３７及び同０９／２５９，３３８に記載のものなど、キットの形で販売してもよい。製品又はキットは、全体として、１種又は数種の組成物を含んでよい。これら組成物のうちの１組成物中の少なくとも１種の活性薬が、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ４、抗Ｂ７抗体など、免疫調節活性を有する抗体である。他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針、及び注射器を含む、市場及び利用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。このような製品は、それが添えられた組成物が、癌、悪性病変、もしくは腫瘍疾患に罹患しているか、又はその素因のある対象を治療するのに有用であることを表示するラベル、説明書、又は添付文書を備えていることが好ましい。好ましい実施形態では、説明書又はラベルによって、その癌又は悪性病変がＢ細胞腫瘍であることが表示される。
【０２２５】
本発明の更なる詳細は、以下の非限定的な実施例によって例示する。本明細書で引用したすべてのものの開示を参照により本明細書に組み込むことを強調しておく。
【実施例１】
【０２２６】
Ｂリンパ種細胞であるＤＨＴ−４細胞の特性
ＩＤＥＣ−１３１、及びアドリアマイシン（ＡＤＭ）に曝したＢリンパ腫細胞系のＤＨＬ−４（Ｒｏｏｓ等のＬｅｕｋ．Ｒｅｓ第１０巻：１９５〜２０２ページ（１９８６年））を使用して、抗ＣＤ４０Ｌ抗体が、悪性Ｂ細胞が化学療法誘発性毒性／アポトーシスからＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０を媒介として生き残る妨げになり得るという考えをｉｎ  ｖｉｔｒｏで検証した。ＩＤＥＣ−１３１は、マウス単クローン抗ヒトＣＤ４０Ｌ抗体の２４−３１をヒト化したものである。
【０２２７】
最初に、ＤＨＬ−４細胞に異なる濃度のＡＤＭを４時間作用させることによって、ＤＨＬ−４細胞に対してＡＤＭ細胞傷害性である最小濃度を決定した。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ、すなわち生きている細胞による色素還元アッセイによって、培養して５日後のＤＨＬ−４細胞の細胞への細胞傷害性を測定した（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ等のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．第２０２巻：１６３〜１７１ページ（１９９７年）を参照されたい）。簡潔に述べると、細胞培養管において、成長培地（１０％のウシ胎児血清を添加したＲＭＰＩ−１６４０）中で１×１０5個のＤＨＬ−４細胞を様々な濃度のＡＤＭ（１×１０-6Ｍ〜１×１０-8Ｍ）と共に３７℃で４時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を洗浄し、１×１０5細胞／ｍｌの濃度で成長培地に再懸濁させ、９６穴平底プレートの各ウェルに２００μｌの細胞懸濁液を加えた。プレートを３７℃でインキュベートし、細胞傷害性を異なる時間で試験した。インキュベートの最後の１８時間の間、５０μｌの酸化還元色素Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号ＤＡＬ１１００）を各ウェルに加えた。インキュベートしてから、室温で１０分間、振盪機上でインキュベートすることによってプレートを冷却し、細胞内での色素の還元を定量した。９６穴蛍光光度計を使用して、５３０ｎｍで励起し、５９０ｎｍで発光させ、蛍光を読み取った。結果は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示す。細胞傷害性百分率は、以下の式、すなわち、
［１−（試験サンプルの平均ＲＦＵ÷対照細胞の平均ＲＦＵ）］×１００％によって算出した。ＡＤＭ細胞傷害性の滴定曲線を定め、後続のアッセイに向けて、薬物の細胞傷害最小濃度を選択した。
【０２２８】
図１に示す結果は、培養前にＡＤＭ（２×１０-7Ｍ及び４×１０-8ＭのＡＤＭ）を４時間作用させてから５日間培養したＤＨＬ−４細胞の、細胞への細胞傷害性を示す。被作用後、細胞を１度洗浄し、成長培地で５日間培養し、上述のようなＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ色素取込みアッセイによって細胞傷害性を決定した。さらに、フローサイトメトリによって、選択されたＣＤ分子の膜上発現について、ＤＨＬ−４細胞の特徴付けを行った。ＤＨＬ−４細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０分子を発現することが判明したが、ＣＤ４０Ｌの発現は検出されなかった。
【実施例２】
【０２２９】
抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、アドリアマイシンによる死滅作用に対するリンパ種細胞のＣＤ４０Ｌ媒介型抵抗性を無効にする
図２Ａは、抗ＣＤ４０Ｌ抗体が、ＡＤＭ誘発細胞死に対する、ＤＨＬ−４細胞のＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０媒介型抵抗性に及ぼす影響を示す。１０μｇ／ｍｌの可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ；Ｐ．Ａ．Ｂｒａｍｓ、Ｅ．Ａ．Ｐａｄｌａｎ、Ｋ．Ｈａｒｉｈａｒａｎ、Ｋ．Ｓｌａｔｅｒ、Ｊ．Ｌｅｏｎａｒｄ、Ｒ．Ｎｏｅｌｌｅ、及びＲ．Ｎｅｗｍａｎの「ヒト化抗ヒトＣＤ１５４モノクローナル抗体は、ＣＤ１５４−ＣＤ４０媒介型ヒトＢ細胞活性化を妨げる（Ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ  １５４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｌｏｃｋｓ  ＣＤ  １５４−ＣＤ４０  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」、（提出された原稿））の存在下、ＤＨＬ−４細胞（０．５×１０6細胞／ｍｌ）を３７℃で１時間インキュベートした。１時間インキュベートした後、低濃度のＡＤＭ（２×１０-7Ｍ〜４×１０-8Ｍ）を加え、ＣＤ４０Ｌ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、又はこれなしで、さらに４時インキュベートした。ＡＤＭを作用させた後、細胞を洗浄し、０．５×１０6細胞／ｍｌの濃度で成長培地に再懸濁させ、ｓＣＤ４０Ｌ添加又は無添加の２通りとして、９６穴平底プレートの各ウェルに１００μｌの細胞懸濁液を加えた。ＡＤＭ処理の間ｓＣＤ４０Ｌを継続的に作用させていた培養物と、ＡＤＭを作用させる間ｓＣＤ４０Ｌを含んでいなかった培養物とに、ｓＣＤ４０Ｌ（１０μｇ／ｍｌ）を加えた。さらに、培養物に１０μｇ／ｍｌのＩＤＥＣ−１３１を加えて、ｓＣＤ４０Ｌ及びＡＤＭと共にインキュベートしたＤＨＬ−４細胞へのその影響を決定した。５日後、記載したようなＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ色素取込みアッセイによって、細胞傷害性を測定した。
【０２３０】
データは、ｓＣＤ４０ＬがＡＤＭ処理後のＤＨＬ−４細胞の生存を長引かせるが、ｓＣＤ４０ＬなしでＡＤＭを作用させた細胞では、予想どおり、細胞傷害性の増大が認められたことを示している。さらに、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（ＩＤＥＣ−１３１）を加えることによって、ＣＤ４０Ｌに媒介される細胞の生存が逆転し、細胞への細胞傷害性が増大した（図２Ａ）。
【０２３１】
ＩＤＥＣ−１３１を単独で加えても、ｓＣＤ４０Ｌで処理したＤＨＬ−４細胞への影響はなく、この抗体が、単独ではＤＨＬ−４細胞への直接のどんな抑制もしくは細胞傷害活性ももたないことを示唆している（図２Ｂ）。ＤＨＬ−４細胞をｓＣＤ４０Ｌと共にプレインキュベートしたもの及びそれなしでプレインキュベートしたものを、異なる濃度のＩＤＥＣ−１３１、リツキサン（登録商標）、抗ＣＤ２０抗体ＣＥ９．１、及び抗ＣＤ４抗体の存在下で培養した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等のＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．＆  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．第８４巻：７３〜８４ページ（１９９７年））。５日後、上述のＡｌａｍａｒ  ＢｌｕｅアッセイによってＤＨＬ−４細胞の細胞傷害性／増殖を決定した。図２Ｂでは、ＤＨＬ−４細胞の増殖又は細胞傷害性へのＩＤＥＣ−１３１による影響は示されていないが、リツキサン（登録商標）は、予想どおり細胞の増殖を抑制し、細胞傷害性を誘発した。抗ＣＤ４抗体と共に培養したＤＨＬ−４細胞には、影響が見られなかった。
【実施例３】
【０２３２】
ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０情報伝達は、抗ＣＤ２０抗体のリツキサン（登録商標）によるＢリンパ腫細胞のアポトーシスを妨げる
ＤＨＬ−４細胞及びリツキサン（登録商標）の表面架橋を利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用して、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０を媒介とする情報伝達がＢリンパ腫細胞の抗ＣＤ２０抗体誘発性アポトーシスに及ぼす影響を決定した。ＤＨＬ−４細胞（０．５〜１×１０6細胞／ｍｌ）をｓＣＤ４０Ｌ（１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で培養した。終夜培養した後、細胞を収集し、ｓＣＤ４０Ｌ（１０μｇ／ｍｌ）を加え、又は加えずに、１０μｇ／ｍｌのリツキサン（登録商標）又は対照抗体（ＣＥ９．１、抗ＣＤ４抗体）と共に氷上でインキュベートした。１時間インキュベートした後、細胞を遠心分離にかけて結合していない抗体を除き、成長培地（５％のＦＣＳ−ＲＰＭＩ）に１×１０6細胞／ｍｌで再懸濁させ、組織培養管で培養した。細胞表面結合抗体を、１５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇ−Ｆｃγ特異的抗体のＦ（ａｂ’）2断片をスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）によって架橋し、アポトーシスのアッセイを行うまで、培養物を３７℃でインキュベートした。フローサイトメトリ・カスパーゼ３アッセイを利用して、アポトーシスを検出した。細胞を４時間目及び２４時間目に収集し、洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キット、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号２０７５ＫＫ）を使用して４℃で固定した。２０分間固定化した後、細胞を洗浄し、アフィニティー精製したＰＥ結合多クローンウサギ抗カスパーゼ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号６７３４５）１５μｌ及びｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号２０７５ＫＫ）５０μｌを加えた。暗所において、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、細胞を１度洗浄し、ｃｙｔｏｐｅｒｍ中に再懸濁させた。フローサイトメトリのデータは、ＦＡＣＳｃａｎで得、Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＨｏｕｓｅのＷｉｎＬｉｓｔソフトウェアを使用して分析した。
【０２３３】
表Ｉは、ｓＣＤ４０Ｌを作用させることによる、ＤＨＬ−４リンパ腫細胞におけるリツキサン（登録商標）誘発性アポトーシスへの抵抗性を示す。我々のこれまでの研究によって、カスパーゼ３とＴｕｎｅｌアッセイの関係が良好であることが明らかになっているので、これらの研究では、カスパーゼ３の活性化を代理マーカーとして使用した。ｓＣＤ４０Ｌ存在下、ＤＨＬ−４細胞表面上でリツキサン（登録商標）を架橋させると、アポトーシスのレベルが低下したが、ｓＣＤ４０Ｌを作用させなかった細胞は、アポトーシスを受けた。同じアイソタイプの抗体の存在下でインキュベートした培養物を比較すると、対照抗体（ＣＥ９．１）は、細胞のアポトーシスをもたらさなかった。したがって、このデータは、ｓＣＤ４０Ｌ誘発性のｓＣＤ４０経路の情報伝達が、リツキサン（登録商標）に媒介されるＢリンパ腫細胞の死滅の発生をもたらし得ることを示している。
【０２３４】
【表２】
2010059208.tif 000003
【実施例４】
【０２３５】
ＩＤＥＣ−１３１が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞の生存に及ぼす影響
ＩＤＥＣ−１３１がｉｎ  ｖｉｔｒｏのＢ−ＣＬＬ細胞の成長及び生存に及ぼす影響を決定するために、ＣＤ４０Ｌの存在下、ＩＤＥＣ−１３１を加え、又は加えないＢ−ＣＬＬ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。フィコール−ハイパック勾配遠心法を使用して、ＣＬＬ患者の血液から末梢血単球（ＰＢＭＣ）を単離した。トリパンブルー色素排除によって生存度を判定すると、＞９８％であった。フローサイトメトリによる分析によって、リンパ球の＞７０％がＣＤ１９+／ＣＤ２０+であったことが判明した。ＣＬＬ細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＬＬ成長培地（たとえば、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを補給した５％のＦＣＳ又は２％の自家性ドナー血漿を補給したＲＰＭＩ−１６４０培地）で培養した。さらに、いくつかの実験については、ＣＤ１９+Ｂ細胞を、ＣＤ１９+Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｄｙｎａｌ、カタログ番号１１１．０３／１１１．０４）を使用し、製造者の説明書に従って精製し、上述のとおりに培養した。成長培地で培養したＣＬＬ又は精製Ｂ−ＣＬＬ細胞は、大部分が自発的なアポトーシス細胞死を受けた。しかし、このような細胞をｓＣＤ４０Ｌの存在下で培養すると、培養物中でのその生存度が延長した。表ＩＩは、ｓＣＤ４０Ｌ（５μｇ／ｍｌ）の存在下、又はそれなしで成長させたＣＤ１９+Ｂ−ＣＬＬ細胞の異なる時間の細胞生存度を示すものであり、ＣＬＬ細胞のより長い生存が示されている。ｓＣＤ４０Ｌと共に培養した患者＃１のＢ−ＣＬＬ細胞では、２週間より後の生存度が≧６０％であったが、ｓＣＤ４０Ｌなしで成長させた細胞の生存度は、１０％未満であった。
【０２３６】
【表３】
2010059208.tif 000004
【０２３７】
図３Ａは、ＩＤＥＣ−１３１が７日間培養後のＢ−ＣＬＬ細胞の成長及び生存に及ぼす影響を示す。ＣＬＬ患者から得た精製Ｂ−ＣＬＬ細胞（２×１０6細胞／ｍｌ）を２本の培養管に分け入れた。一方の管の細胞は、等しい体積の成長培地中でｓＣＤ４０Ｌ（５μｇ／ｍｌ）と混合し、他方の管は、対照として等しい体積の成長培地と共にインキュベートした。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を穏やかに混合し、様々な濃度のＩＤＥＣ−１３１（１０μｇ／ｍｌ〜０．３μｇ／ｍｌ）を加え、又は加えない２通りの９６穴平底プレートの各ウェルに、１００μｌの細胞懸濁媒質を加えた。７日後、上述のＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイによって培養物の細胞生存／死亡を判定した。データは、ｓＣＤ４０Ｌ添加培養物中の細胞が生存していたことを示した。培養物にＩＤＥＣ−１３１を加えると、細胞死が増加し、細胞生存の逆転又は細胞死への感作が示唆された。さらに、リツキサン（登録商標）をＩＤＥＣ−１３１と同じ濃度で投与すると、細胞死への影響は、ＩＤＥＣ−１３１と比べてそれほど低くなかった（図３Ｂ）。
【実施例５】
【０２３８】
Ｂ−ＣＬＬにおけるＨＬＡ−ＤＲ分子のＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０媒介性アップレギュレーション
ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０情報伝達経路が無傷であるかを判定するために、ＣＬＬ患者から得たＣＬＬ細胞を、５μｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌを加え、又は加えずに３７℃で培養した（５×１０5細胞／ｍｌ）。４８時間及び１４４時間目に、標準の手順を使用するフローサイトメトリによって、ＣＤ１９+細胞上にクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現しているかを判定した。簡潔に述べれば、培養したリンパ球を異なる時間に収集し、単一又は二重染色用のフルオレセイン（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）のいずれかに結合する抗体を用い、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターを使用して、分子の表面発現について分析した。フローサイトメトリに向けて染色するために、培養管中の１×１０6細胞を、以下のもの、すなわち、散乱プロット上のリンパ球集団をゲート選別する（ｇａｔｅ）ための抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ；ＣＤ１９+及び／又はＣＤ２０+Ｂ細胞を判定するための抗ＣＤ１９−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号３０６５５）もしくは抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号３３２６４）抗体；Ｔ細胞をゲート遮断する（ｇａｔｅ−ｏｆｆ）ための抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号３０１０４）；ＣＤ１９+細胞上のＰクラスＩＩの発現を判定するための抗ＣＤ１９−ＲＰＥ及び抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号３２３８４）のような相応する抗体と共にインキュベートした。細胞を、２ｍｌの冷ＰＢＳと共に遠心分離（２００×ｇで６分間）することによって１度洗浄し、氷上で抗体と共に３０分間インキュベートし、その後細胞を１度洗浄し、０．５％のパラホルムアルデヒドで固定し、分析にかけるまで４℃で保管した。フローサイトメトリのデータは、ＦＡＣｓａｎで得、ＷｉｎＬｉｓｔソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ）を使用して分析した。ＲＰＥもしくはＦＩＴＣのどちらか１色で染色された細胞、染色されていない細胞、又は二重染色された細胞を含む四分円を調べられるよう機械を自動ゲート選別にセットした。図４は、ｓＣＤ４０Ｌと共に培養したＣＤ１９+ＣＬＬ細胞と、ｓＣＤ４０Ｌと共に培養しなかったＣＤ１９+ＣＬＬ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ発現の比較を示すものである。ｓＣＤ４０Ｌ存在下で培養したＢ−ＣＬＬ細胞上でより高いレベルのＨＬＡ−ＤＲ発現が検出された（表ＩＩＩ）。
【０２３９】
【表４】
2010059208.tif 000005
【実施例６】
【０２４０】
ＩＤＥＣ−１３１及びリツキサン（登録商標）製剤
ＣＤ４０+悪性病変の治療では、対象に、ｐＨ６．５の製剤緩衝液１０ｍＭクエン酸Ｎａ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ポリソルベート８０中約１０〜約５０ｍｇ／ｍｌのＩＤＥＣ−１３１を静脈内（ｉｖ）注入する。ＩＤＥＣ−１３１は、リツキサン（登録商標）の前、後、又はこれと共に投与する。リツキサン（登録商標）の注入量は、約３〜約１０ｍｇ／対象の体重ｋｇの範囲である。
【実施例７】
【０２４１】
ＩＤＥＣ−１３１及びＣＨＯＰ製剤
ＣＨＯＰに応答するＣＤ４０+悪性病変（たとえば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、及び慢性リンパ球性白血病、並びに細胞がＣＤ４０+である悪性病変向けサルベージ療法）の治療では、ＩＤＥＣ−１３１は、ＣＨＯＰサイクル開始の直前に、患者重量ｋｇあたり約３〜約１０ｍｇの範囲の用量で注入する。ＩＤＥＣ−１３１の投与は、各ＣＨＯＰサイクルの前に合計４〜８サイクルを繰り返す。
【実施例８】
【０２４２】
抗ＣＤ４０Ｌ又は抗Ｂ７をリツキサン（登録商標）と併用投与して、対象のＢ細胞リンパ腫を治療する
併用療法は、サルベージ療法として、又は再発性もしくは活動性の形のＣＤ４０+悪性病変（たとえば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、及びＣＬＬ）治療向けに特に有用である。ＩＤＥＣ−１３１をＣＨＯＰ及びリツキサン（登録商標）と併用投与しようとする場合、ＩＤＥＣ−１３１を上の実施例６で述べたとおりに投与してから、実施例７のＣＨＯＰ−ＩＤＥＣ−１３１投与について明細に述べたスケジュールを実施する。あるいは、ＩＤＥＣ−１３１（抗ＣＤ４０Ｌ）が実質的に抗Ｂ７抗体中に含まれた、同じ投与計画を行う。
【実施例９】
【０２４３】
リンパ腫細胞系を使用する抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
リンパ腫治療向け併用療法投与計画として抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ２０を用いることについての科学的根拠を補強する目的で、リンパ細胞系を使用して、以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を行った。
【０２４４】
使用した細胞系：細胞系は、以下のように入手し、維持した。ＣＤ２０及びＢ７発現Ｂリンパ腫細胞系（ＳＫＷ、ＳＢ、及びＤａｕｄｉ細胞）を完全培地で培養した。完全培地は、１０％の熱不活性化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭのｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ａｎａ）である。ＳＫＷ細胞系は、プスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）陽性であり、この細胞系にＩｇＭを分泌させることができる（ＳＫＷ６．４、ＡＴＣＣ）。ＳＢ細胞系は、急性リンパ芽球性白血病患者由来であり、ＥＢＶ陽性である（ＣＣＬ−１２０、ＡＴＣＣ）。Ｄａｕｄｉ細胞は、バーキットリンパ腫患者から単離した（ＣＣＬ−２１３、ＡＴＣＣ）。ネオマイシン耐性ＣＤ８０発現チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ専売のベクター系を使用して得た。
【０２４５】
使用した抗体：これらの実験で使用した特定の抗体は以下のとおりである。ＩＤＥＣ−１１４は、ヒトγ１の重鎖を含むＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗ヒトＣＤ８０ｍＡｂ（Ｌｏｔ１１４Ｓ００４Ｆ、コード３００２Ｇ７１０；Ｌｏｔ  ＺＰＰＢ−０１）であり、リツキシマブは、抗ヒトＣＤ２０特異的マウスγ１キメラ抗体（Ｌｏｔ  Ｅ９１０７Ａ１；Ｌｏｔ  Ｄ９０９７Ａ１）である。使用した他の抗体には、マウス抗ヒトＣＤ８０ｍＡｂＬ３０７．４（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米カリフォルニア州サンディエゴ）、ヒトγ１鎖を含む霊長類化抗ヒトＣＤ４ｍＡｂＣＥ９．１（Ｌｏｔ  Ｍ２ＣＤ４１５６）、及びＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓで開発したマウスのアイソタイプ一致（ＩｇＧ１）対照抗体３Ｃ９が含まれる。
【０２４６】
ある特定のリンパ腫細胞系でのＣＤ８０及びＣＤ２０の発現
ある特定のリンパ腫細胞系でのＣＤ８０及びＣＤ２０の細胞表面発現を評価する目的で、以下のように、蛍光標示式細胞選別法（ＦＡＣＳ）によってこれらの細胞系でのＩＤＥＣ−１１４及びＲｉｔｕｘａｎによる結合を判定した。試験抗体又は対照抗体を冷ＦＡＣＳ結合緩衝液中に最終体積２００μｌまでの様々な濃度に希釈したものを、細胞培養管中で１×１０6個の細胞と共にインキュベートした。ＩＤＥＣ−１１４及びリツキシマブを試験抗体として使用し、ＣＥ９．１をアイソタイプ一致陰性対照として使用した。細胞を氷上で６０分間インキュベートし、インキュベート後、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で１度洗浄した。細胞を２００μｌのＦＡＣＳ結合緩衝液中に再懸濁させ、細胞１０6個あたり２μｌのＦＩＴＣ結合ヤギＦ（ａｂ’）2抗ヒトＩｇγ鎖特異的抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米アラバマ州バーニングハム）を加えた。氷上でさらに３０分間インキュベートしてから、細胞を１度洗浄し、２００μｌの冷ＨＢＳＳ中に再懸濁させ、２００μｌの１％ホルムアルデヒドで固定した。
【０２４７】
図５は、２種の異なるロット（Ｌｏｔ１１４Ｓ００４Ｆ及びＬｏｔ１１４Ｓ０１５）からのＩＤＥＣ−１１４のＣＤ８０−ＣＨＯ細胞への特異的結合を濃度に応じて示すものである。予想どおり、特異性が不適切なアイソタイプ一致対照抗体（ＩＤＥＣ−１５２）は、ＣＤ８０−ＣＨＯ細胞に結合しなかった。ＩＤＥＣ−１１４のＣＤ８０への結合をＳＫＷ及びＳＢリンパ腫細胞系で試験すると、陽性細胞の割合の低さ（表ＩＶ）、及び平均蛍光強度の低さ（表Ｖ）によって実証されるとおり、リツキシマブよりも結合が弱かった。
【０２４８】
【表５】
2010059208.tif 000006
【０２４９】
【表６】
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【０２５０】
これらの結果は、抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ２０がリンパ腫治療薬として適することを補強するものである。
【０２５１】
抗体依存性細胞内細胞障害（ＡＤＣＣ）
抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ２０がリンパ腫治療薬として適することをさらに実証するために、各抗体の例のＡＤＣＣ媒介能についてアッセイを行った。ＡＤＣＣアッセイでは、ＳＫＷもしくはＳＢ細胞及び活性化ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）をそれぞれ標的細胞及びエフェクター細胞として使用した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、米ミズーリ州セントルイス）を使用して、健康な供与者の全血からＰＢＭＣを単離した。７５ｃｍ2組織培養フラスコにおいて、完全培地中５×１０6細胞／ｍｌの濃度のＰＢＭＣを、２０Ｕ／ｍｌの組換え型ヒトＩＬ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）と共に、３７℃かつ５％ＣＯ2存在下で培養した。終夜培養した後、３７℃かつ５％のＣＯ2存在下、１×１０6個のＳＫＷ又はＳＢ標的細胞を、１５０μＣｉの51Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、米ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）で１時間かけて標識した。細胞を４回洗浄し、５ｍｌの完全培地中に再懸濁させ、等体積の試験抗体又は対照抗体を含む各ウェルに、５０μｌの細胞懸濁液を分注した。
【０２５２】
リツキシマブ（Ｌｏｔ  Ｅ９１０７Ａ１）又はＩＤＥＣ−１１４（Ｌｏｔ１１４Ｓ００４Ｆ、コード３００２Ｇ７１０）を試験抗体として使用した。アイソタイプ一致ＣＥ９．１（Ｌｏｔ  Ｍ２ＣＤ４１５６）もしくはＬ３０７．４（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、又は特異性の不適切なマウスアイソタイプ一致（ＩｇＧ1）抗体である３Ｃ９を使用した。どのウェルでも、９６穴丸底組織培養プレートに３通りに蒔いて培養した。エフェクター細胞を収集し、完全培地で１度洗浄し、ウェル毎１００μｌ体積中１×１０6個の細胞として加えて、エフェクター対標的比を５０：１とした。以下の対照ウェル、すなわち、自発性の放出を定量するための、１００μｌの完全培地と共にインキュベートした標的細胞と、最大放出を定量するための、１００μｌの０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．）と共にインキュベートした標的細胞も３通りでインキュベートした。培養物を３７℃かつ５％ＣＯ2存在下でインキュベートし、細胞溶解のために培養物の上清中に放出された51Ｃｒをガンマカウンター（ＩＳＯＤＡＴＡ）によって定量した。細胞傷害性は、特異的溶解の百分率として示し、以下、すなわち、
【０２５３】
【数１】
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【０２５４】
図６は、ＣＤ２０+／ＣＤ８０+ＳＢ及びＳＫＷ細胞でのＩＤＥＣ−１１４及びリツキシマブのＡＤＣＣ活性を示す。全体として、ＳＫＷ細胞よりもＳＢ細胞でより高いレベルのＡＤＣＣ活性が観察された。ＩＤＥＣ−１１４は、ＳＢ及びＳＫＷ細胞を用量依存的に死滅させ、それぞれ１０μｇ／ｍｌで最大の７５％及び４６％を死滅させた。リツキシマブは、同程度の抗体濃度でＩＤＥＣ−１１４よりも高いＡＤＣＣ活性（ＳＢ細胞で９７％及びＳＫＷ細胞で６５％）を示し、リツキシマブの細胞結合活性がＩＤＥＣ−１１４よりも高いことと相関していた。予想どおり、ヒトＦｃ受容体に結合しないマウスＬ３０７．４は、ＡＤＣＣ活性が弱かった。アイソタイプのヒト及びマウス対照（それぞれ、ＣＥ９．１及び３Ｃ９）ではバックグラウンド・レベルのＡＤＣＣしか観察されなかった。
【０２５５】
ＩＤＥＣ−１１４とリツキシマブの併用効果によって、宿主エフェクターを媒介とする腫瘍細胞の死滅が増大するかを判定するため、実験を行った。これらの実験では、Ｂリンパ腫細胞上のＣＤ２０密度が低く、Ｂ７発現が正常であれば、腫瘍を有効に死滅させることができるという筋書きを反映するよう、決まった濃度のＩＤＥＣ−１１４を様々な濃度のリツキシマブと組み合わせた。図７は、ＩＤＥＣ−１１４とリツキシマブの併用によって、ＳＫＷリンパ腫細胞でのＡＤＣＣ活性が向上することを示している。１０μｇ／ｍｌの決まった濃度のＩＤＥＣ−１１４と０．１〜０．０１μｇ／ｍｌの濃度のリツキシマブを併用することが、ＳＫＷ細胞の死滅を向上させる媒介となった。２例の供与者からの宿主エフェクター細胞を使用して得られた結果は、ＡＤＣＣ活性において同じ傾向を示した。
【０２５６】
補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）
Ｂ細胞系及びヒト補体（Ｃ）を使用して、ＩＤＥＣ−１１４及びリツキシマブのＣＤＣ活性を判定した。抗体を４倍に希釈し、５０μｌを２組の各９６ウェルに分注した。３７℃かつ５％のＣＯ2存在下、ＳＫＷ又はＤａｕｄｉ細胞を51Ｃｒ（１５０μＣｉ／１０6細胞）で１時間かけて標識した。細胞を４回洗浄し、完全培地中に再懸濁させ、５０μｌ中１×１０4個の細胞を各ウェルに分注した。完全培地で１：４又は１：８に希釈した正常ヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ、米カリフォルニア州サンディエゴ）１００μｌを加えた。自発性放出及び最大放出対照についての方法、及び装備は、上でＡＤＣＣ実験について述べたものと同じである。培養物を３７℃かつ５％ＣＯ2存在下で４時間インキュベートした。培養物の上清に放出された放射能をガンマカウンターによって定量した。特異的な細胞溶解の百分率を算出する式も、ＡＤＣＣ実験について上で述べたとおりである。
【０２５７】
リツキシマブがＣＤ２０抗原に結合した後、補体カスケードが活性化されると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＢリンパ腫細胞が効率的に死滅する。Ｒｅｆｆ  ＭＥ、Ｃａｒｎｅｒ  Ｋ、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＫＳ、Ｃｈｉｎｎ  ＰＣ、Ｌｅｏｎａｒｄ  ＪＥ、Ｒａａｂ  Ｒ等の「ＣＤ２０に対するマウスヒトキメラ・モノクローナル抗体によるｉｎ  ｖｉｖｏＢ細胞枯渇（Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＣＤ２０）」、Ｂｌｏｏｄ  １９９４年、第８３巻（２）：４３５〜４５ページ。したがって我々は、ＩＤＥＣ−１１４が、ＣＤ８０+標的細胞の補体依存的な死滅を媒介する能力を評価した。結果は、ＩＤＥＣ−１１４がＣＤ８０発現ＣＨＯ細胞のＣＤＣを媒介することを示した（図８ａ）。しかし、ＩＤＥＣ−１１４のＣＤ８０+Ｄａｕｄｉ及びＳＫＷリンパ腫細胞への結合では、ＣＤＣの証拠が示されなかった（それぞれ、図８ｂ及び図８ｃ）。対照的に、ＳＫＷ細胞系よりもＤａｕｄｉ細胞系がＣＤＣに対して敏感であったものの、リツキシマブは、両方の細胞系でＣＤＣ活性を示した（それぞれ、図８ｂ及び図８ｃ）。
【実施例１０】
【０２５８】
腫瘍サンプルから単離した細胞を使用する、抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
リンパ腫治療向け併用治療投与計画として抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ２０を用いることについて、科学的根拠をさらに評価するため、腫瘍サンプルから単離した細胞を使用して、以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を行った。
【０２５９】
ＣＤ８０は、活性化Ｂ細胞及び活性化ＡＰＣの表面上に一過性に発現されるが、休止Ｂ細胞及び休止ＡＰＣ上では発現が弱い、又は発現されない。ＣＤ８０は、Ｂ細胞活性化マーカーであるので、主に分裂及び／活性化リンパ腫細胞上に発現される。報告では、ＣＤ８０が、悪性Ｂ細胞上に恒常的に発現されることが示されている。このような報告を確認するために、２０人の患者から得たリンパ腫及び白血病検体のパネルにおいて、フローサイトメトリによってＣＤ８０の発現を試験した。結果は、リンパ腫及び白血病においてＣＤ８０が異なる密度で発現されることを示している（表ＶＩ）。
【０２６０】
【表７】
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【０２６１】
濾胞性小非円型低悪性度リンパ腫及び小円型バーキットリンパ腫において、最も高いＣＤ８０発現が観察された。一件の慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）サンプル及び１件の小円型高悪性度リンパ腫では、発現が最も低かった。濾胞性小非円型低悪性度リンパ腫サンプルにおけるＣＤ８０の発現を表ＶＩＩに示す。
【０２６２】
【表８】
2010059208.tif 000010
【０２６３】
これらリンパ腫細胞でのＣＤ８０発現は、サンプル中腫瘍細胞の２５％〜９０％の範囲であった。しかし、同じリンパ腫の中で、「大」細胞が９０％〜１００％陽性であったのに対し、「小」細胞が２５％〜１００％陽性であったことは興味深い。ＣＤ８０が、分化途中又は活性化悪性Ｂ細胞上に発現される可能性はあり、これによって、試験したリンパ腫サンプル内で発現が変わりやすいことの説明がつく。
【実施例１１】
【０２６４】
ＳＣＩＤマウスモデルを使用する抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ２０のｉｎ  ｖｉｖｏ研究
併用療法の有効性を試験する目的で、抗ＣＤ８０（ＩＤＥＣ−１１４）及び抗ＣＤ２０（リツキサン（リツキシマブ））を使用して、以下のｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った。
【０２６５】
リンパ腫におけるＩＤＥＣ−１１４及びリツキシマブ単一剤療法のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果
重症免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスのヒトリンパ腫腫瘍モデルを開発した。簡潔に述べると、３×１０6〜４×１０6個のヒトＳＫＷリンパ腫細胞を６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃＳＣＩＤマウスに静脈内（ＩＶ）接種し、その生存を４５〜６０日間モニターした。接種後、ＳＫＷ細胞をマウスの全体にわたって汎発させ、主に肺及び肝臓で成長させる。１、３、５、７、９、及び１１日目に、治療群のマウス（Ｎ＝８）に、１００μｇ、２００μｇ、もしくは４００μｇのＩＤＥＣ−１１４（ａ）又はリツキシマブ（ｂ）を腹腔内注射した。死亡してしまう前に、すべてのマウスに麻痺性の形の疾患を発症させた。重症の麻痺を起こしたマウスを犠牲にし、死亡した印をつけた。統計学的分析システム（ＳＡＳ）を使用してＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を行い、Ｌｏｇ階数検定によってｐ値を求めた。
【０２６６】
図９Ａ及び９Ｂは、３段階の用量（１００、２００、及び４００μｇ）の抗体を使用する、単一剤ＩＤＥＣ−１１４（図９Ａ）及び単一剤リツキシマブ（図９Ｂ）療法の抗腫瘍応答を示すものである。ＩＤＥＣ−１１４及びリツキシマブの単一剤療法では、すべての用量で疾患の進行が抑制された。ＩＤＥＣ−１１４で観察された抗腫瘍応答は、同じ用量及び治療スケジュールのリツキシマブの抗腫瘍応答に匹敵していた。
【実施例１２】
【０２６７】
リンパ腫におけるＩＤＥＣ−１１４／リツキシマブ併用療法のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果
単一剤としてのＩＤＥＣ−１１４の抗腫瘍活性に基づき、ＩＤＥＣ−１１４とリツキシマブの併用を、単一剤での研究について上で述べたのと同じ腫瘍モデルにおいて、同じ投与スケジュールで評価した。
【０２６８】
ＳＫＷ／ＳＣＩＤマウスに２００μｇのＩＤＥＣ−１１４及び２００μｇのリツキシマブを注射し、２００μｇもしくは４００μｇのＩＤＥＣ−１１４、又は２００μｇもしくは４００μｇのリツキシマブのいずれかを注射したマウスと比較した。図１０は、ＩＤＥＣ−１１４／リツキシマブ併用療法で治療したマウスの生存が、単一剤療法としてのＩＤＥＣ−１１４又はリツキシマブのいずれかで治療したマウスと比べて有利であることを示す。結果は、ＩＤＥＣ−１１４とリツキシマブの併用が、単独のいずれかの抗体と比べて、疾患を伴わない生存を増加させることを示している。併用療法群では、７０％（７／１０）のマウスが、最後の抗体注射後５０日間より長く生存した。対照的に、ＩＤＥＣ−１１４又はリツキシマブ単独で治療したマウスは、研究の終わりには１０％未満しか生存していなかった。生存データをＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ及びＬｏｇ階数検定によって分析した（表ＶＩＩＩ）。
【０２６９】
【表９】
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【０２７０】
ＩＤＥＣ−１１４／リツキシマブ併用療法は、２００μｇもしくは４００μｇのＩＤＥＣ−１１４又はリツキシマブ単一剤療法よりも統計学的に有意な応答をもたらした。
【０２７１】
当分野の技術者ならば、その精神又は中心の属性から外れない範囲で、本発明を他の特定の形に具現化してもよいことがさらに深くわかるであろう。本発明のこれまでの記述では、その例示的な実施形態しか開示していないので、他の変形形態を本発明の範囲内であると考えることを理解されたい。したがって、本発明は、本明細書で詳細に述べてきた特定の実施形態に限定されない。むしろ、本発明の範囲及び内容を示す添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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