(57)【要約】【課題】検体中の特異ＩｇＭを、抗原抗体反応を利用して高感度に検出しつつ、検体中に含まれる特異ＩｇＭ以外のＩｇＭを特異ＩｇＭとして誤って検出することが低減された検出方法を提供すること。【解決手段】特定の抗原３１を認識する、検体１００中に含まれる特異ＩｇＭ２２を検出する検出方法であって、抗ＩｇＭ抗体２１が担持されたマイクロプレート１１と、抗原３１と、含有量が０．１ｗｔ％未満（但し０を除く）の界面活性剤とを含有する溶液２００とを用意する工程と、抗ＩｇＭ抗体２１に検体２００を接触させて、検体２００中に含まれる特異ＩｇＭ２２および特異ＩｇＭ２２以外のＩｇＭ２３を抗ＩｇＭ抗体２１に非特異的に認識させる工程と、特異ＩｇＭ２２およびＩｇＭ２３の双方に溶液２００を接触させて、特異ＩｇＭ２２に抗原３１を特異的に認識させる工程と、抗原３１を認識した特異ＩｇＭ２２を検出する工程とを有することを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の抗原を認識する、検体中に含まれる特異ＩｇＭを検出する検出方法であって、
非特異的にＩｇＭを認識する抗ＩｇＭ抗体が担持された基材と、
前記抗原と、界面活性剤とを、前記界面活性剤の含有量が０．１ｗｔ％未満（但し、０を除く）となるように調製された溶液とを用意する第１の工程と、
前記抗ＩｇＭ抗体に前記検体を接触させて、前記検体中に含まれる前記特異ＩｇＭおよび該特異ＩｇＭ以外のＩｇＭを前記抗ＩｇＭ抗体に非特異的に認識させる第２の工程と、
前記特異ＩｇＭおよび前記特異ＩｇＭ以外のＩｇＭの双方に前記溶液を接触させて、これらＩｇＭのうち、前記特異ＩｇＭに前記抗原を特異的に認識させる第３の工程と、
前記抗原を認識した前記特異ＩｇＭを検出する第４の工程とを有することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記第１の工程において、前記抗原を含む溶液に前記界面活性剤を添加する構成とすることにより、前記第３の工程において、前記特異ＩｇＭ以外のＩｇＭが、前記抗原を非特異的に認識するのを抑制する請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記抗原は、ウイルスである請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記ウイルスは、その表面にエンベロープを備えるものである請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン系の界面活性剤である請求項１ないし４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
前記溶液中での前記界面活性剤の含有量は、０．００１〜０．１ｗｔ％である請求項１ないし５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
前記溶液中での前記抗原の濃度は、０．０１〜１００μｇ／ｍＬである請求項１ないし６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
前記第３の工程において、前記特異ＩｇＭおよび前記特異ＩｇＭ以外のＩｇＭの双方に前記溶液を接触させる時間は、１分〜２４時間である請求項１ないし７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
前記第３の工程において、前記特異ＩｇＭおよび前記特異ＩｇＭ以外のＩｇＭの双方に前記溶液を接触させる際の前記溶液の温度は、５０℃以下である請求項１ないし８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１０】
前記第３の工程において、前記特異ＩｇＭおよび前記特異ＩｇＭ以外のＩｇＭの双方に前記溶液を接触させる際に、前記溶液を攪拌する請求項１ないし９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１１】
前記基材は、前記基材の前記抗ＩｇＭ抗体が担持されていない領域に、前記特異ＩｇＭとの相互作用が前記基材より低いタンパク質を主材料として構成される被覆層を有している請求項１ないし１０のいずれかに記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中に含まれる特異ＩｇＭを検出する検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
検体中に含まれる、検出すべき抗体を検出する方法として、抗原抗体反応を利用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）が知られている。
【０００３】
ＥＬＩＳＡ法は、１）検出すべき抗体を高感度で検出することができ、定量性にも優れていること、２）抗原抗体反応を利用して検出するため、検体中に夾雑物が混在する粗抽出段階で測定が可能であり、他の検査法で必要とされる精製や前処理といった煩雑なステップを必要としないこと、３）短時間で大量の検体を測定し得ること等の利点を有していることから、近年、広く用いられている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
このようなＥＬＩＳＡ法の一種であるサンドイッチ法を用いて、検体中の特異ＩｇＭを検出する場合、例えば、次のようにして特異ＩｇＭが検出される。
【０００５】
Ｉ）まず、非特異的にＩｇＭを認識する抗ＩｇＭ抗体が担持された基材を用意する。II）次に、基材に検体を供給して、検体中に含まれる検出すべき特異ＩｇＭおよびこの特異ＩｇＭ以外のＩｇＭを抗ＩｇＭ抗体に非特異的に認識させる。III）次に、基材に抗原を供給することにより、抗ＩｇＭ抗体を介して基材に担持された特異ＩｇＭに抗原を特異的に認識させる。なお、このとき抗ＩｇＭ抗体を介して基材に担持された特異ＩｇＭ以外のＩｇＭは、抗原に対する特異性を有さないことから、抗原を認識することができない。IV）次に、抗原を特異的に認識する特異ＩｇＧ（一次抗体）を含有する処理液を接触させることにより、特異ＩｇＧに抗原を特異的に認識させる。Ｖ）次に、酵素標識され、かつ特異ＩｇＧを非特異的に認識する酵素標識ＩｇＧ（二次抗体）を、前記工程IV）において、抗原を認識した特異ＩｇＧに作用させた後、特異ＩｇＧに結合していない酵素標識ＩｇＧを洗い流す。VI）次に、酵素標識ＩｇＧが備える酵素と反応する基質を添加して、この酵素と基質との反応を測定することにより、検体中の特異ＩｇＭの有無や含有量等を間接的に検出することができる。
【０００６】
かかる構成の検出方法において、検出方法の検出精度をより向上させるには、検体中に検出すべき特異ＩｇＭが含まれている場合には、偽陰性と判定することなく、この特異ＩｇＭを的確に検出することが求められ、さらに、検体中に検出すべき特異ＩｇＭが含まれていない場合には、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭを特異ＩｇＭとして誤って検出（偽陽性と判定）するのを的確に防止することが求められる。
【０００７】
【特許文献１】特開平９−１４５７１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、検体中の特異ＩｇＭを、抗原抗体反応を利用して高感度に検出しつつ、検体中に含まれる特異ＩｇＭ以外のＩｇＭを特異ＩｇＭとして誤って検出することが低減された検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような目的は、下記（１）〜（１１）の本発明により達成される。
（１）  特定の抗原を認識する、検体中に含まれる特異ＩｇＭを検出する検出方法であって、
非特異的にＩｇＭを認識する抗ＩｇＭ抗体が担持された基材と、
前記抗原と、界面活性剤とを、前記界面活性剤の含有量が０．１ｗｔ％未満（但し、０を除く）となるように調製された溶液とを用意する第１の工程と、
前記抗ＩｇＭ抗体に前記検体を接触させて、前記検体中に含まれる前記特異ＩｇＭおよび該特異ＩｇＭ以外のＩｇＭを前記抗ＩｇＭ抗体に非特異的に認識させる第２の工程と、
前記特異ＩｇＭおよび前記特異ＩｇＭ以外のＩｇＭの双方に前記溶液を接触させて、これらＩｇＭのうち、前記特異ＩｇＭに前記抗原を特異的に認識させる第３の工程と、
前記抗原を認識した前記特異ＩｇＭを検出する第４の工程とを有することを特徴とする検出方法。
これにより、検体中の特異ＩｇＭを、抗原抗体反応を利用して高感度に検出しつつ、検体中に含まれる特異ＩｇＭ以外のＩｇＭを特異ＩｇＭとして誤って検出してしまうのを的確に低減することができる。
【００１０】
（２）  前記第１の工程において、前記抗原を含む溶液に前記界面活性剤を添加する構成とすることにより、前記第３の工程において、前記特異ＩｇＭ以外のＩｇＭが、前記抗原を非特異的に認識するのを抑制する上記（１）に記載の検出方法。
これにより、検体中に含まれる特異ＩｇＭ以外のＩｇＭを、特異ＩｇＭとして誤って検出してしまうのを防止することができる。
【００１１】
（３）  前記抗原は、ウイルスである上記（１）または（２）に記載の検出方法。
ウイルスが備える抗体認識部位が界面活性剤により容易に変性、変質または分解されるほど、不安定であるため、本発明で用いる抗原として好適である。
【００１２】
（４）  前記ウイルスは、その表面にエンベロープを備えるものである上記（３）に記載の検出方法。
エンベロープを有するウイルスは、エンベロープに不安定な抗体認識部位がより多く存在すると推察されるので、本発明で用いる抗原としてより好適である。
【００１３】
（５）  前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン系の界面活性剤である上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の検出方法。
ポリオキシエチレン系の界面活性剤は、特に、タンパク質等に対する作用が温和であることから、非特異的にＩｇＭが認識する抗体認識部位のうち、抗原内部に存在しているものを抗原の表面に露出させることなく、表面に存在している抗体認識部位を選択的にＩｇＭにより認識されないものとすることができる。
【００１４】
（６）  前記溶液中での前記界面活性剤の含有量は、０．００１〜０．１ｗｔ％である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の検出方法。
これにより、検体中の特異ＩｇＭを、抗原抗体反応を利用して高感度に検出しつつ、検体中に含まれる特異ＩｇＭ以外のＩｇＭを特異ＩｇＭとして誤って検出してしまうのをより的確に低減することができる。
【００１５】
（７）  前記溶液中での前記抗原の濃度は、０．０１〜１００μｇ／ｍＬである上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の検出方法。
かかる範囲内に設定することにより、抗ＩｇＭ抗体に担持された特異ＩｇＭに抗原を確実に認識させることができる。
【００１６】
（８）  前記第３の工程において、前記特異ＩｇＭおよび前記特異ＩｇＭ以外のＩｇＭの双方に前記溶液を接触させる時間は、１分〜２４時間である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の検出方法。
これにより、特異ＩｇＭにより抗原を確実に認識させることができる。
【００１７】
（９）  前記第３の工程において、前記特異ＩｇＭおよび前記特異ＩｇＭ以外のＩｇＭの双方に前記溶液を接触させる際の前記溶液の温度は、５０℃以下である上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の検出方法。
これにより、特異ＩｇＭにより抗原を迅速かつ確実に認識させることができる。
【００１８】
（１０）  前記第３の工程において、前記特異ＩｇＭおよび前記特異ＩｇＭ以外のＩｇＭの双方に前記溶液を接触させる際に、前記溶液を攪拌する上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の検出方法。
これにより、抗原と特異ＩｇＭとが接触する機会が増大し、より確実に抗原を特異ＩｇＭに認識させることができる。
【００１９】
（１１）  前記基材は、前記基材の前記抗ＩｇＭ抗体が担持されていない領域に、前記特異ＩｇＭとの相互作用が前記基材より低いタンパク質を主材料として構成される被覆層を有している上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の検出方法。
これにより、特異ＩｇＭが基材に非特異的に結合（吸着）してしまうのを好適に防止することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明では、抗原に存在する抗体認識部位、即ち抗原提示部位(エピトープ)のうち、非特異的にＩｇＭが認識する部位が、選択的にＩｇＭにより認識されないものとなっていると推察される。そのため、本発明によれば、検体中の特異ＩｇＭを、抗原抗体反応を利用して高感度に検出しつつ、検体中に含まれる特異ＩｇＭ以外のＩｇＭを特異ＩｇＭとして誤って検出してしまうのを的確に低減することができる。
【００２１】
また、抗原を処理する界面活性剤として、ポリオキシエチレン系の界面活性剤を用いることにより、抗原の内部に存在している非特異的にＩｇＭが認識する抗体認識部位を抗原の表面に露出させることなく、表面に存在している非特異的にＩｇＭが認識する抗体認識部位を、より選択的にＩｇＭにより認識されないものとすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の検出方法について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
なお、以下では、基材として、複数のウェルの底面に抗ＩｇＭ抗体が担持されたマイクロプレートを用いる場合を一例に説明する。
図１および図２は、本発明の検出方法の好適実施形態を説明するための縦断面図である。
【００２３】
本実施形態の検出方法は、［１］ウェルの底面に抗ＩｇＭ抗体が担持されたマイクロプレートと、抗原と界面活性剤とを含有する溶液とを用意する工程と、［２］検出すべき特異ＩｇＭを含有する検体をウェル内に供給する工程と、［３］ウェル内を洗浄する工程と、［４］抗原と界面活性剤とを含有する溶液をウェル内に供給する工程と、［５］ウェル内を洗浄する工程と、［６］抗原を特異的に認識する特異ＩｇＧを含有する第１の処理液をウェル内に供給する工程と、［７］ウェル内を洗浄する工程と、［８］特異ＩｇＧを認識する、酵素標識された酵素標識ＩｇＧを含有する第２の処理液をウェル内に供給する工程と、［９］ウェル内を洗浄する工程と、［１０］酵素標識ＩｇＧが備える酵素と反応する基質を含有する第３の処理液をウェル内に供給する工程とを有する。
【００２４】
以下、各工程について順次説明する。
［１］  まず、ウェル１２の底面に抗ＩｇＭ抗体２１が担持されたマイクロプレート（基材）１１と、抗原３１と界面活性剤とを含有する溶液２００とを用意する（第１の工程）。
【００２５】
［１Ａ］  まず、ウェル１２の底面に抗ＩｇＭ抗体２１が担持されたマイクロプレート１１を用意する。
【００２６】
［１Ａ−１］  まず、マイクロプレート１１を用意し、このマイクロプレート１１が備えるウェル１２の底面に、抗ＩｇＭ抗体２１を担持させる（図１（ａ）参照）。
【００２７】
マイクロプレート１１の構成材料としては、抗ＩｇＭ抗体２１に対して高い親和性を示すものであれば特に限定されず、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル等の樹脂材料が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２８】
かかる構成のウェル１２の底面に抗ＩｇＭ抗体２１を担持させる場合、抗ＩｇＭ抗体２１を含有する処理液を、ウェル１２内に供給する。これにより、ウェル１２の底面に抗ＩｇＭ抗体２１が接触するため、マイクロプレート１１の構成材料と抗ＩｇＭ抗体２１との親和性の大きさに基づいて、抗ＩｇＭ抗体２１がウェル１２の底面に担持される（吸着する）。
【００２９】
ここで、マイクロプレート１１は、抗ＩｇＭ抗体２１に対して高い親和性を示す構成材料で構成されているので、ウェル１２の底面に抗ＩｇＭ抗体２１が強固に担持される。
【００３０】
処理液を調製する際に用いる溶媒としては、等張液（細胞やウイルス内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）が好適である。これにより、分散媒が抗ＩｇＭ抗体２１に接触した際における、抗ＩｇＭ抗体２１の変性・変質等を防止することができる。
【００３１】
この等張液には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ液（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）、Ｌｏｃｋｅ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｔｙｒｏｄｅ液、Ｅａｒｌｅ液、Ｋｒｅｂｓ液、生理食塩水等を用いることができる。
【００３２】
この処理液をマイクロプレート１１に接触させる時間は、１分〜２４時間程度であるのが好ましく、１０分〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、ウェル１２の底面に付着する抗ＩｇＭ抗体２１の数が少なくなり、検体中に含まれる特異ＩｇＭを検出する際に、この特異ＩｇＭを検出できるだけの量を、抗ＩｇＭ抗体２１で十分に認識できなくなるおそれがある。一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【００３３】
また、この際（処理時）の処理液の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４０℃程度であるのがより好ましい。処理時の処理液の温度が低く過ぎると、抗ＩｇＭ抗体２１の種類等によっては、ウェル１２の底面に抗ＩｇＭ抗体２１を効率よく付着させることができないおそれがある。一方、処理時の被処理液の温度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、抗ＩｇＭ抗体２１が変性・変質して、抗ＩｇＭ抗体２１が検体中のＩｇＭを認識する認識能が低下してしまうおそれがある。
【００３４】
［１Ａ−２］  次いで、抗ＩｇＭ抗体２１が担持されたマイクロプレート１１を洗浄する。
具体的には、ウェル１２内に洗浄液を供給し、その後、洗浄液を穏やかに攪拌等することにより、洗浄液中に、ウェル１２に担持されなかった抗ＩｇＭ抗体２１を分散させる。そして、抗ＩｇＭ抗体２１が洗浄液中に分散した状態で除去して廃棄することにより、ウェル１２内を洗浄する。
【００３５】
本工程［１Ａ−２］で用いる洗浄液としては、各種のものが使用可能であるが、抗ＩｇＭ抗体２１に変性・変質が生じるのを防止するために、等張液が好適に用いられる。この等張液には、前記工程［１Ａ−１］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【００３６】
また、本工程［１Ａ−２］は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、ウェル１２に担持されなかった抗ＩｇＭ抗体２１をより確実に除去することができる。
【００３７】
この場合、用いる洗浄液は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【００３８】
［１Ａ−３］  次いで、ウェル１２内の抗ＩｇＭ抗体２１が付着していない領域の少なくとも一部、より好ましくは、図１（ｂ）に示すように、ほぼ全てに、次工程以降でウェル１２内に供給する抗体（特異ＩｇＭ２２、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３、特異ＩｇＧ２４および酵素標識ＩｇＧ２５等のうち特に特異ＩｇＭ２２）との相互作用がウェル１２の内面よりも低いタンパク質を主材料として構成される被覆層４１を形成する。
【００３９】
かかる構成の被覆層４１は、例えば、ウェル１２の底面に抗ＩｇＭ抗体２１が担持されたマイクロプレート１１のウェル１２内に、抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質を含む処理液を供給する処理により形成される。
【００４０】
具体的には、ウェル１２内に抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質を含む処理液を供給し、その後、この処理液を攪拌等する。これにより、このタンパク質がウェル１２内の抗ＩｇＭ抗体２１が付着していない領域に接触して担持される。これにより、抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質を主材料として構成される被覆層４１が形成される。
【００４１】
なお、ここで言う「抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質」とは、抗体を担持（吸着）する能力、次工程以降でウェル１２内に供給する抗体と結合する能力等が無いか、極めて低いタンパク質のことを言う。
【００４２】
このような被覆層４１を備える構成とすれば、次工程以降に、ウェル１２内に供給する、特異ＩｇＭ２２、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３、特異ＩｇＧ２４および酵素標識ＩｇＧ２５等の抗体（特に、特異ＩｇＭ２２）がウェル１２の内面に非特異的に結合（吸着）してしまうのを好適に防止することができる。
【００４３】
このようなタンパク質としては、例えば、カゼイン、ビテリン、ホスビチン、シトクロムｃ、トランスフェリンのような金属タンパク質、アルブミンおよびミオグロビン等が挙げられる。これらの中でも、タンパク質としては、カゼインおよびアルブミンのうちの少なくとも１種を用いるのが好ましい。これらのタンパク質は、マイクロプレート１１の構成材料である樹脂材料への吸着能に優れている。さらに、これらの中でも、タンパク質としては、カゼインが最適である。カゼインは、前記樹脂材料への吸着能に優れ、かつ、抗体との相互作用が極めて低い。
【００４４】
処理液中におけるタンパク質濃度は、特に限定されないが、１００〜５０００ｍｇ／ｍＬ程度であるのが好ましく、５００〜２０００ｍｇ／ｍＬ程度であるのがより好ましい。タンパク質の濃度が低く過ぎると、タンパク質の種類等によっては、ウェル１２の内面を十分に被覆できない場合があり、一方、タンパク質の濃度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、タンパク質の種類によっては、抗ＩｇＭ抗体２１をも被覆層４１で被覆してしまうおそれがある。
【００４５】
また、処理液を調製する際に用いる溶媒としては、例えば、前記工程［１Ａ−１］で説明した溶媒と同様の等張液が好適である。
【００４６】
この処理液による処理時間は、１〜２４時間程度であるのが好ましく、１０〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、被覆層４１の形成が十分に行われないおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、抗ＩｇＭ抗体２１をも被覆層４１で被覆してしまうおそれがあり好ましくない。
【００４７】
また、この際（被覆層４１形成時）の処理液の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４０℃程度であるのがより好ましい。
【００４８】
また、処理液のｐＨは、４．５〜９．５程度とするのが好ましく、５．５〜８．５程度とするのがより好ましい。
【００４９】
処理液の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、タンパク質のウェル１２の内面への担持がより円滑に行われるようになり、被覆層４１を確実に形成することができる。
【００５０】
［１Ａ−４］  次いで、抗ＩｇＭ抗体２１が担持されていない領域に被覆層４１が形成されたマイクロプレート１１のウェル１２内を洗浄する。
これにより、ウェル１２に吸着されなかったタンパク質を除去する。
【００５１】
ウェル１２内を洗浄する方法としては、前記工程［１Ａ−２］で説明したのと同様の方法が用いられる。
【００５２】
なお、ウェル１２に担持されないタンパク質が含まれていたとしてもごく微量である場合には、本工程を省略することもできる。
【００５３】
以上のような工程を経て、ウェル１２の底面に抗ＩｇＭ抗体２１が担持されたマイクロプレート１１が得られる。
【００５４】
［１Ｂ］  次に、抗原３１と界面活性剤とを含有する溶液２００を調製する。
溶液２００は、界面活性剤が添加された溶液中に、抗原３１を溶解または分散することにより得られるが、本発明では、この溶液２００中での、界面活性剤の含有量が０．１ｗｔ％未満となっている。
【００５５】
このように本発明において、溶液２００中での界面活性剤の含有量を０．１ｗｔ％未満とする理由および界面活性剤の種類等については後に詳述する。
【００５６】
溶媒または分散媒としては、等張液（細胞やウイルス内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）が好適である。これにより、溶媒または分散媒が抗原に接触した際における、抗原内の浸透圧の違いによる抗原の破壊を防止することができる。
【００５７】
この等張液には、前記工程［１Ａ−１］で説明したのと同様の等張液が好適に用いられる。
【００５８】
また、抗原としては、検体中から検出する特異ＩｇＭ２２（検査対象物）が特異的に結合（認識）する抗体認識部位を有するものが選択される。
【００５９】
具体的には、例えば、バクテリア細胞、植物細胞、動物細胞等の各種細胞や、デングウイルスおよび日本脳炎ウイルスが属するフラビウイルス科、インフルエンザウイルスが属するオルトミクソウイルス科、風疹ウイルスが属するトガウイルス科、麻疹ウイルスおよびムンプスウイルスが属するパラミクソウイルス科のウイルスのようなエンベロープを有するウイルスならびにパピロマーウイルスが属するパピロマーウイルス科、レオウイルスおよびロタウイルスが属するレオウイルス科のウイルスのようなエンベロープを有さないウイルス等のウイルスが挙げられる。
【００６０】
［２］  次に、検出すべき特異ＩｇＭ２２を含有する検体１００を調製した後、この検体１００をウェル１２内に供給する。
これにより、抗ＩｇＭ抗体２１に検体１００が接触して、図１（ｃ）に示すように、検体１００中に含まれる特異ＩｇＭ２２およびこの特異ＩｇＭ２２以外のＩｇＭ２３が、抗ＩｇＭ抗体２１に非特異的に認識される。（第２の工程）。
【００６１】
［２−１］  まず、検出すべき特異ＩｇＭ２２を含有する検体１００を用意する。
検体１００としては、上述した抗原３１が有する抗体認識部位を特異的に認識する特異ＩｇＭ２２が含まれているか否かを判定するべきもの、すなわち感染症において感染が成立しているか否かを判定すべきものが用意され、例えば、血液、リンパ液、唾液、尿等の体液、または当該体液に対して希釈や、遠心分離による固体物の除去等の処理が施されたものが用いられる。
【００６２】
なお、検体１００として、体液の希釈物を用いる場合、体液を希釈するための希釈液としては、前記工程［１Ａ−１］で説明したのと同様の等張液が好適に用いられる。
【００６３】
［２−２］  次に、前記工程［２−１］で調製した検体１００を、ウェル１２内に供給する。
これにより、抗ＩｇＭ抗体２１に検体１００が接触する。このとき、検体１００中に、特異ＩｇＭ２２が含まれていると、抗ＩｇＭ抗体２１に特異ＩｇＭ２２が非特異的に認識される。さらに、検体１００中には、通常、この特異ＩｇＭ２２以外のＩｇＭ２３が含まれているが、抗ＩｇＭ抗体２１は、ＩｇＭを非特異的に認識するため、この特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３も、特異ＩｇＭ２２と同様に、抗ＩｇＭ抗体２１に非特異的に認識される。
【００６４】
その結果、ウェル１２の底面に、検体１００中に含まれる特異ＩｇＭ２２および特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３の双方が抗ＩｇＭ抗体２１を介して担持（吸着）される。
【００６５】
この検体１００をウェル１２内に留置しておく時間は、１分〜２４時間程度であるのが好ましく、１０分〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、抗ＩｇＭ抗体２１が認識する特異ＩｇＭ２２の数が少なくなるおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【００６６】
また、この際（処理時）の検体１００の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４０℃程度であるのがより好ましい。
【００６７】
また、検体１００のｐＨは、４．５〜９．５程度とするのが好ましく、５．５〜８．５程度とするのがより好ましい。
【００６８】
検体１００の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、検体１００中に含まれる特異ＩｇＭ２２および特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３を抗ＩｇＭ抗体２１がより迅速かつ確実に認識するようになる。
【００６９】
［３］  次に、マイクロプレート１１が備えるウェル１２内を洗浄する。
これにより、検体１００中に含まれる抗体のうち、抗ＩｇＭ抗体２１が認識しなかった抗体（特異ＩｇＭ２２および特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３）が、ウェル１２外に廃棄される。
【００７０】
ウェル１２内を洗浄する方法としては、前記工程［１Ａ−２］で説明したのと同様の方法が用いられる。
【００７１】
なお、ウェル１２に抗ＩｇＭ抗体２１が認識しなかった抗体（特異ＩｇＭ２２および特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３）が含まれていたとしてもごく微量である場合には、本工程を省略することもできる。
また、後工程［９］において、ウェル１２内を一括して洗浄するようにしてもよい。
【００７２】
［４］  次に、前記工程［１Ｂ］で調製した、抗原３１と界面活性剤とを含有する溶液２００をウェル１２内に供給する。
これにより、図１（ｄ）に示すように、溶液２００に含まれる抗原３１を特異ＩｇＭ２２に特異的に認識させる（第３の工程）。
【００７３】
その結果、抗ＩｇＭ抗体２１と特異ＩｇＭ２２とを介して、ウェル１２の底面に抗原３１が担持（吸着）される
ここで、本発明の検出方法において、特異ＩｇＭ２２を高感度に検出するには、本工程において、抗原３１を、特異ＩｇＭ２２以外のＩｇＭ２３が認識することなく、特異ＩｇＭ２２が特異的に認識する必要がある。
【００７４】
すなわち、検体中に特異ＩｇＭ２２が存在している（陽性検体の）場合には、図１（ｄ）に示すように、特異ＩｇＭ２２および特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３の双方が抗ＩｇＭ抗体２１を介してウェル１２の底面に担持されているが、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３に抗原３１を認識させることなく、特異ＩｇＭ２２だけに抗原３１を認識させる必要がある。また、検体中に特異ＩｇＭ２２が存在していない（陰性検体の）場合には、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３のみが抗ＩｇＭ抗体２１を介してウェル１２の底面に担持されることとなるが、このときには、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３に抗原３１を認識させない必要がある。
【００７５】
このように陽性検体および陰性検体の何れを検査する場合においても、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３に抗原３１を認識させない必要があるが、かかる方法について、本発明者は鋭意検討を重ねた結果、界面活性剤を含む溶液で抗原３１を処理すると、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３による抗原３１の認識能が変化し、この認識能の変化が濃度依存性を有することが判ってきた。そして、本発明者のさらなる検討の結果、溶液２００中の界面活性剤の含有量を０．１ｗｔ％未満（但し、０を除く）とすれば、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３が抗原３１を誤って認識することを的確に低減し得ることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００７６】
ここで、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３が抗原３１を認識してしまうのは、抗原３１にはＩｇＭが非特異的に認識する抗体認識部位が存在することによるものと考えられる。そして、界面活性剤の含有量が０．１ｗｔ％未満の溶液２００中に抗原３１を共存させることにより、この抗体認識部位が界面活性剤により取り囲まれたり、変性・変質さらには分解等されたりするため、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３が抗原３１を非特異的に認識するのが的確に抑制される。
【００７７】
さらに、界面活性剤の含有量が０．１ｗｔ％以上の溶液中に抗原３１を共存させることにより、再び、特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３が抗原３１を認識してしまうようになるのは、高濃度の界面活性剤により今度は抗原３１全体が変性・変質さらには分解等されたりするため、抗原３１内部に存在していた前記抗体認識部位が抗原３１の表面に露出することによると推察される。
【００７８】
なお、本発明者の検討により、溶液中２００で含有量が０．１ｗｔ％未満の界面活性剤と抗原３１を共存させたとしても、特異ＩｇＭ２２が認識する抗原３１が有する抗体認識部位の抗体認識能は、界面活性剤により大きく低減されないことが確認されている。そのため、本発明の分析方法では、検体１００中の特異ＩｇＭ２２を高感度で検出することができる。
【００７９】
また、上記のように非特異的にＩｇＭが認識する抗体認識部位が界面活性剤の処理によりＩｇＭにより認識されなくなるのは、抗原３１としてウイルスを選択したときに顕著に認められると推察される。これは、ウイルスが備える抗体認識部位が界面活性剤により容易に変性、変質または分解されるほど、不安定であることに起因すると考えられる。
【００８０】
さらに、ウイルスの中でもエンベロープを有するウイルスは、エンベロープにこのような不安定な抗体認識部位がより多く存在すると推察されるので、本発明の検出方法に用いられる抗原３１として好適に適用し得る。
【００８１】
また、界面活性剤としては、抗原３１に界面活性剤を接触させることにより、非特異的にＩｇＭが認識する抗体認識部位が界面活性剤の処理によりＩｇＭにより認識されなくなる機能を有するものであればよく、非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤のいずれであってもよいが、非イオン性界面活性剤であるのが好ましい。非イオン性界面活性剤は、イオン性界面活性剤と比較して、タンパク質等に対する作用が温和であることから、抗原３１内部に存在している前記抗体認識部位を抗原３１の表面に露出させることなく、その表面に存在している前記抗体認識部位を選択的にＩｇＭにより認識されないものとすることができる。
【００８２】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−α−Ｄ−グルコピラノシドのようなアルキルグルコシド系非イオン界面活性剤、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＥＷＷＮ２０）、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＷＥＥＮ４０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＷＥＥＮ６０）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＥＷＷＮ８０）のようなポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらの中でも、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤は、上述した非イオン性界面活性剤としての特性が特に優れることから、界面活性剤として好ましく用いられる。
【００８３】
また、溶液２００中における界面活性剤の含有量は、０．１ｗｔ％未満であればよいが、特に、０．００１〜０．１ｗｔ％程度であるのが好ましい。界面活性剤の含有量が低すぎると、抗原３１に対して界面活性剤が接触する機会が減少し、抗原３１の種類等によっては、抗原３１の非特異的にＩｇＭが認識する抗体認識部位に対する界面活性剤による処理が十分に行われないおそれがある。
【００８４】
さらに、溶液２００中における抗原３１の濃度は、抗原３１の種類によっても若干異なるが、０．０１〜１００μｇ／ｍＬ程度であるのが好ましく、０．２〜２０μｇ／ｍＬ程度であるのがより好ましい。抗原３１の濃度が低過ぎると、本工程［４］において、特異ＩｇＭ２２に認識される抗原３１の量が少なくなり過ぎるおそれがある。また、抗原３１の濃度が高過ぎると、界面活性剤による処理が均一に施されなくなるおそれがあり好ましくない。
【００８５】
この溶液２００をウェル１２内に留置しておく時間は、１分〜２４時間程度であるのが好ましく、１０分〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、特異ＩｇＭ２２に認識される抗原３１の数が少なくなるおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【００８６】
また、この際（処理時）の溶液２００の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４０℃程度であるのがより好ましい。
【００８７】
また、溶液２００のｐＨは、４．５〜９．５程度とするのが好ましく、５．５〜８．５程度とするのがより好ましい。
【００８８】
溶液２００の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、特異ＩｇＭ２２により溶液２００中に含まれる抗原３１がより迅速かつ確実に認識されるようになる。
【００８９】
［５］  次に、マイクロプレート１１が備えるウェル１２内を洗浄する。
これにより、溶液２００中に含まれる抗原３１のうち、特異ＩｇＭ２２に認識されなかった抗原３１が、ウェル１２外に廃棄される。
【００９０】
ウェル１２内を洗浄する方法としては、前記工程［１Ａ−２］で説明したのと同様の方法が用いられる。
【００９１】
なお、ウェル１２に特異ＩｇＭ２２に認識されなかった抗原３１が含まれていたとしてもごく微量である場合には、本工程を省略することもできる。
また、後工程［９］において、ウェル１２内を一括して洗浄するようにしてもよい。
【００９２】
［６］  次に、抗原３１を特異的に認識する特異ＩｇＧ２４を含有する第１の処理液３００をウェル１２内に供給する。
これより、図２（ａ）に示すように、第１の処理液３００に含まれる特異ＩｇＧ２４に抗原３１を認識させる。
【００９３】
その結果、抗ＩｇＭ抗体２１と特異ＩｇＭ２２と抗原３１を介して、ウェル１２の底面に特異ＩｇＧ（一次抗体）２４が担持（吸着）される
ここで、本発明では、溶液２００中で抗原３１が界面活性剤と共存する構成となっているため、非特異的にＩｇＭが認識する抗体認識部位を特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ２３が認識するのが抑制されているが、この抗原認識部位は、特異ＩｇＧ２４が認識する抗原認識部位とは異なる位置にあるため、たとえ非特異的にＩｇＭが認識する抗体認識部位の抗体認識能が低下していたとしても、特異ＩｇＧ２４は抗原３１を確実に認識できるため、後工程において、抗ＩｇＭ抗体２１を介してウェル１２の底面に担持された特異ＩｇＭ２２を高感度で検出することができる。
【００９４】
この第１の処理液３００をウェル１２内に留置しておく時間は、１分〜２４時間程度であるのが好ましく、１０分〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、抗原３１を認識する特異ＩｇＧ２４の数が少なくなるおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【００９５】
また、この際（処理時）の第１の処理液３００の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４０℃程度であるのがより好ましい。
【００９６】
また、第１の処理液３００のｐＨは、４．５〜９．５程度とするのが好ましく、５．５〜８．５程度とするのがより好ましい。
【００９７】
第１の処理液３００の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、第１の処理液３００中に含まれる特異ＩｇＧ２４により抗原３１をより迅速かつ確実に認識するようになる。
【００９８】
［７］  次に、マイクロプレート１１が備えるウェル１２内を洗浄する。
これにより、第１の処理液３００中に含まれる特異ＩｇＧ２４のうち、抗原３１を認識しなかった特異ＩｇＧ２４が、ウェル１２外に廃棄される。
【００９９】
ウェル１２内を洗浄する方法としては、前記工程［１Ａ−２］で説明したのと同様の方法が用いられる。
【０１００】
なお、ウェル１２に抗原３１を認識しなかった特異ＩｇＧ２４が含まれていたとしてもごく微量である場合には、本工程を省略することもできる。
また、後工程［９］において、ウェル１２内を一括して洗浄するようにしてもよい。
【０１０１】
［８］  次に、酵素標識された、特異ＩｇＧ２４を認識する酵素標識ＩｇＧ２５を含有する第２の処理液４００をウェル１２内に供給する。
【０１０２】
ここで、酵素標識された酵素標識ＩｇＧ（二次抗体）２５は、これに含まれる抗体として特異ＩｇＧ２４の由来となる動物由来のＩｇＧを特異的に認識するものが選択されているので、ウェル１２内に供給されると、図２（ｂ）に示すように、特異ＩｇＧ２４を認識する。
【０１０３】
その結果、抗ＩｇＭ抗体２１と特異ＩｇＭ２２と抗原３１と特異ＩｇＧ２４とを介して、ウェル１２の底面に酵素標識ＩｇＧ２５が担持（吸着）される
酵素標識ＩｇＧ２５に含まれる抗体を標識する酵素としては、特に限定されないが、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼ等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。このような酵素を用いれば、後工程［１０］において、この酵素と反応する際に発色反応や吸光度変化等をともなう基質と反応させて、この反応を観察することにより、抗ＩｇＭ抗体２１に担持された特異ＩｇＭ２２の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体１００中の特異ＩｇＭ２２の量を定量することが可能となる。
【０１０４】
また、第２の処理液４００としては、酵素標識ＩｇＧ２５を含有すればよく、特に限定されるものではないが、酵素標識ＩｇＧ２５を等張液中に溶解したものが好適に用いられる。
【０１０５】
さらに、等張液としては、前記工程［１Ａ−１］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【０１０６】
［９］  次に、マイクロプレート１１が備えるウェル１２内を洗浄する。
これにより、第２の処理液４００中に含まれる酵素標識ＩｇＧ２５のうち、特異ＩｇＧ２４を認識しなかった酵素標識ＩｇＧ２５が、ウェル１２外に廃棄される。
【０１０７】
ウェル１２内を洗浄する方法としては、前記工程［１Ａ−２］で説明したのと同様の方法が用いられる。
【０１０８】
［１０］  次に、酵素標識ＩｇＧ（二次抗体）２５が備える酵素と反応する基質２６を含有する第３の処理液５００を、マイクロプレート１１が備えるウェル１２内に供給する（図２（ｃ）参照）。
【０１０９】
ここで、この基質２６としては、酵素標識ＩｇＧ２５と反応する際に、発色反応や吸光度変化等を伴うものが選択されている。
【０１１０】
そのため、これら同士の反応を観察することにより、抗ＩｇＭ抗体２１に担持された特異ＩｇＭ２２の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体１００中の特異ＩｇＭ２２の定量を間接的に行うことが可能となる。
【０１１１】
このような基質としては、特に限定されないが、例えば、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等が挙げられる。
【０１１２】
また、第３の処理液５００としては、基質２６を含有すればよく、特に限定されるものではないが、基質２６を等張液中に溶解したものが好適に用いられる。
【０１１３】
さらに、等張液としては、前記工程［１Ａ−１］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【０１１４】
なお、本実施形態では、前記工程［６］〜［１０］により、抗原３１を認識した特異ＩｇＭ２２を検出する工程（第４の工程）が構成されているが、本発明ではかかる工程に限定されるものではない。
【０１１５】
例えば、ウェルの底部の縦断面形状がほぼＶ字状またはほぼＵ字状等の収斂形状をなす場合には、前記工程［６］において、抗原３１に代えて、着色された粒状の担体に抗原３１が担持された抗原担持体をウェル内に供給する。
【０１１６】
かかる構成とすれば、抗ＩｇＭ抗体２１に特異ＩｇＭ２２が担持されている場合、この抗原担持体は、特異ＩｇＭ２２に認識され、抗ＩｇＭ抗体２１および特異ＩｇＭ２２を介してウェルの底面に担持される。そのため、抗原担持体は、ウェルの底面に対してほぼ均一に担持されることとなる。その結果、ウェル内の液体が全体的に若干着色された状態が目視にて観察される。
【０１１７】
これに対して、抗ＩｇＭ抗体２１に特異ＩｇＭ２２が担持されていない場合、この抗原担持体は、抗ＩｇＭ抗体２１に接触したとしても、認識されることはない。そのため、ウェルの底部に沿って下方に移動（沈降）し、その頂部（底部の中心部）に集積する。その結果、この集積された抗原担持体が目視にて鮮明なスポットとして観察される。
以上のような工程としても、抗原３１を認識した特異ＩｇＭ２２を検出することができる。
【０１１８】
以上、本発明の検出方法を、図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１１９】
例えば、本発明の検体の検出方法では、必要に応じて、１以上の任意の目的の工程を追加してもよい。
【実施例】
【０１２０】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
・抗原として日本脳炎ウイルスを用いた検討
【０１２１】
（１）抗原と界面活性剤とを含有する溶液の調製
＜１Ａ＞  まず、日本脳炎ウイルス(２３４．７μｇ/ｍＬ・自社で作成)が１０μｇ／ｍＬとなるように、各抗原液を、表１中に示す各希釈液を用いて希釈した。
【０１２２】
【表１】
2010019689.tif 000003
【０１２３】
なお、表１中、ＰＢＳ−ＴはＴＷＥＥＮ２０含有ＰＢＳ溶液を表し、ＥＬＩＳＡ希釈ＴＷＥＥＮ２０濃度の列は、後工程＜４Ａ＞において、マイクロプレート上で各サンプルを希釈する際に用いるＴＷＥＥＮ２０含有ＰＢＳ溶液中に含まれるＴＷＥＥＮ２０濃度を示している。
【０１２４】
（２）検体中の抗日本脳炎ウイルスＩｇＭ（特異ＩｇＭ）の検出
＜１Ｂ＞  まず、図３に示すような、縦横８×１２＝９６個のウェルを備える９６−ｗｅｌｌマイクロプレートに抗ヒトＩｇＭ抗体が担持されたマイクロプレート（「Ｈａｐａｌｙｓｅ  ＪＥ検出ｋｉｔ用抗ヒトＩｇＭプレート  07C06、ペンタックス社製」）を２つ用意した。
【０１２５】
なお、以下では、説明の便宜上、図３または表２、３に示すように、それぞれ、マイクロプレートの横の行をＡ〜Ｈレーンと言い、各レーンのウェルを左から順にナンバリングして、例えば、Ａレーンの左から３番目（ウェルＮｏ．３）のウェルをウェルＡ−３、Ｅレーンの左から５番目（ウェルＮｏ．６）のウェルをウェルＥ−５とする。
【０１２６】
＜２Ｂ＞  次に、各マイクロプレートが備える各ウェル内を、それぞれ、０．１％ＰＢＳ−Ｔを供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＰＢＳ−Ｔによる各ウェルの洗浄を合計３回行った。
【０１２７】
＜３Ｂ＞  次に、抗日本脳炎ウイルスＩｇＭを含む陽性血清（ボランティア提供）と、抗日本脳炎ウイルスＩｇＭを含まない陰性血清（ボランティア提供）とを用意し、これらをＨａｐａｌｙｓｅ用希釈液でそれぞれ２００倍に希釈して、陽性検体と陰性検体とを得た後、陽性検体を一方のプレート（以下、これを「プレート１」と言う。）の各ウェル内に５０μＬずつアプライし、陰性検体を他方のプレート（以下、これを「プレート２」と言う。）の各ウェル内に５０μＬずつアプライした。
【０１２８】
＜４Ｂ＞  次に、各プレート１、２を、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、各検体（陽性検体および陰性検体）中に含まれるヒトＩｇＭをウェル内に担持された抗ＩｇＭ抗体に認識させた。
【０１２９】
＜５Ｂ＞  次に、各マイクロプレートが備える各ウェル内を、それぞれ、０．１％ＰＢＳ−Ｔを供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＰＢＳ−Ｔによる各ウェルの洗浄を合計３回行った。
【０１３０】
＜６Ｂ＞  次に、前記（１−１）で調製した、１０μｇ/ｍＬの抗原を含有する各サンプルを、それぞれ、表２、３に示す各プレート１、２におけるＡレーンのウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌ×２ｗｅｌｌずつアプライ（供給）した。そして、Ａレーンにアプライされた各サンプルを、表２のＥＬＩＳＡ希釈ＴＷＥＥＮ２０濃度に対応するＴＷＥＥＮ２０含有ＰＢＳ溶液を用いて、ＢおよびＣレーンまで段階希釈した。
また、Ｄレーンには抗原が含まれないコントロールを作製した。
【０１３１】
【表２】
2010019689.tif 000004
【０１３２】
【表３】
2010019689.tif 000005
【０１３３】
なお、各表中で、各ウェルに対応する位置（カラム）に記載されている数値（％）は、各ウェル内にアプライしたサンプル中に含まれるＴＷＥＥＮ２０の濃度を示している。
【０１３４】
＜７Ｂ＞  次に、各プレート１、２を、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、各サンプル中に含まれる抗原をウェル内に担持された抗日本脳炎ウイルスＩｇＭに認識させた。
【０１３５】
＜８Ｂ＞  次に、各マイクロプレートが備える各ウェル内を、それぞれ、ＰＢＳ−Ｔを供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＰＢＳ−Ｔによる各ウェルの洗浄を合計３回行った。
【０１３６】
＜９Ｂ＞  次に、第１処理液として、抗日本脳炎ウサギ血清（自社にて調整した血清）を１ｗｔ％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液により２０００倍希釈したものを用意した。
【０１３７】
＜１０Ｂ＞  次に、各プレート１、２の各ウェル内に、それぞれ、抗日本脳炎ウサギ血清を含む第１処理液を５０μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間静置することにより、第１処理液中に含まれる抗日本脳炎ウサギ抗体（一次抗体）にウェル内に担持された抗原を認識させた。
【０１３８】
＜１１Ｂ＞  次に、各プレート１、２の各ウェル内を、それぞれ、０．１ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を３００μＬずつ供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液による各ウェルの洗浄を合計３回行った。
【０１３９】
＜１２Ｂ＞  次に、抗日本脳炎ウサギ抗体を認識する、酵素標識された酵素標識抗体（二次抗体）を含有する第２処理液として、ＰＯＤ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体を１ｗｔ％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液により５００倍希釈したものを用意した。
なお、抗ウサギＩｇＧ抗体としては、「CAPPLE PROXDASE-CONJUGATED GOAT AFFYNITY PURIFIED  ANTIBODY TO RABBIT IGG Coad:5589 Lot#04347」を用いた。
【０１４０】
＜１３Ｂ＞  次に、各プレート１、２の各ウェル内に、それぞれ、抗ウサギＩｇＧ抗体（二次抗体）を含む試薬を５０μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、二次抗体にウェル内に担持された一次抗体を認識させた。
【０１４１】
＜１４Ｂ＞  次に、各プレート１、２の各ウェル内を、それぞれ、０．１ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を３００μＬずつ供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液による各ウェルの洗浄を合計３回行った。
【０１４２】
＜１５Ｂ＞  次に、各プレート１〜４の各ウェル内に、それぞれ、ＰＯＤの基質であるＴＭＢを含む試薬を５０μＬずつ供給して１６０秒間静置し、さらに１Ｎ・ＨＣｌを５０μＬずつ供給した後、各ウェル内の４５０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定した。
【０１４３】
なお、吸光度の測定は、吸光度測定装置（「GENios  Spectra FLUOR plus」、和光純薬社製）を用いて行った。
【０１４４】
測定された各ウェルＡ−１〜Ｄ−５での吸光度と、抗原処理物付着担体を形成する際のＴＷＥＥＮ２０濃度との関係をプレート毎に図４および図５に示す。
【０１４５】
図４に示すように、陽性検体が供給された各ウェルでは、ＴＷＥＥＮ２０濃度に関係なく、吸光度が０．５以上となった。
【０１４６】
すなわち、実施例および比較例に関係なく、検体中の抗日本脳炎ウイルスＩｇＭ（特異ＩｇＭ）を高感度で検出することができた。
【０１４７】
なお、ＴＷＥＥＮ２０濃度が１ｗｔ％（比較例）の場合には、他のＴＷＥＥＮ２０濃度と比較して、各抗原濃度ともに吸光度が低下する傾向を示した。これは、抗原をＴＷＥＥＮ２０で処理することにより、日本脳炎ウイルス抗原が有する抗原認識部位が高濃度のＴＷＥＥＮ２０により、取り囲まれたり、変質・変性または分解等したことに起因して、抗原認識部位の抗原認識能が低下したことによると推察される。
【０１４８】
また、図５に示すように、陰性検体が供給された各ウェルでは、各抗原濃度ともに、ＴＷＥＥＮ２０濃度が０ｗｔ％の比較例と比較して、ＴＷＥＥＮ２０を添加することにより、吸光度が低下し、ＴＷＥＥＮ２０濃度が増加して１ｗｔ％（比較例）となると、ＴＷＥＥＮ２０濃度が０ｗｔ％の時よりも吸光度が大きくなることが判った。
【０１４９】
ＴＷＥＥＮ２０を添加することにより、一度、吸光度が低下するのは、日本脳炎ウイルス抗原をＴＷＥＥＮ２０で処理することにより、日本脳炎ウイルスに存在する様々な抗体認識部位のうち、本来なら日本脳炎ウイルスに特異的でないＩｇＭが吸着しやすい抗体認識部位がＴＷＥＥＮ２０の影響を受け易く、ＴＷＥＥＮ２０の濃度が０．１％以下の際、ＴＷＥＥＮ２０により優先的に変質・変性または分解等したものと推察される。
【０１５０】
また、ＴＷＥＥＮ２０濃度が１ｗｔ％となると、ＴＷＥＥＮ２０濃度が０ｗｔ％の時よりも吸光度が大きくなるのは、高濃度のＴＷＥＥＮ２０で抗原を処理すると、抗原自体が変質・変性または分解等することとなり、抗原内部に存在しているヒトＩｇＭの非特異的な抗体認識部位が新たに抗原外に露出したものと推察される。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】本発明の検出方法の好適実施形態を説明するための縦断面図である。
【図２】本発明の検出方法の好適実施形態を説明するための縦断面図である。
【図３】抗原処理物が担持されるマイクロプレートを模式的に示す平面図である。
【図４】プレート１のウェルで測定された吸光度と、抗原とＴＷＥＥＮ２０とを含有する溶液中のＴＷＥＥＮ２０濃度との関係を示す図である。
【図５】プレート２のウェルで測定された吸光度と、抗原とＴＷＥＥＮ２０とを含有する溶液中のＴＷＥＥＮ２０濃度との関係を示す図である。
【符号の説明】
【０１５２】
１１          マイクロプレート
１２          ウェル
２１          抗ＩｇＭ抗体
２２          特異ＩｇＭ
２３          特異ＩｇＭ以外のＩｇＭ
２４          特異ＩｇＧ（一次抗体）
２５          酵素標識ＩｇＧ（二次抗体）
２６          基質
３１          抗原
４１          被覆層
１００        検体
２００        抗原と界面活性剤とを含有する溶液
３００        第１の処理液
４００        第２の処理液
５００        第３の処理液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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