(57)【要約】【課題】  本発明は、アジュバントを含まなくても免疫活性の高い経皮免疫製剤及びその製造方法を提供する。【解決手段】  アクリル酸エステル６０〜８５重量％とアクリル酸及び／又はジアセトンアクリルアミド４０〜１５重量％よりなる共重合体１００重量部、親水化剤５〜２０重量部及び化学的吸収促進剤としてのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−アルキルエーテル３〜４０重量部よりなる親水性基剤表面に抗原層が積層されており、無傷の皮膚への製剤の適用によって抗原に特異的な免疫応答を誘導することを特徴とする経皮免疫製剤であり、化学的吸収促進剤としては、ポリオキシエチレン（２０）−ポリオキシプロピレン（８）−セチルエーテルが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクリル酸エステル６０〜８５重量％とアクリル酸及び／又はジアセトンアクリルアミド４０〜１５重量％よりなる共重合体１００重量部、親水化剤５〜２０重量部及び化学的吸収促進剤としてのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−アルキルエーテル３〜４０重量部よりなる親水性基剤表面に抗原層が積層されており、無傷の皮膚への製剤の適用によって抗原に特異的な免疫応答を誘導することを特徴とする経皮免疫製剤。
【請求項２】
親水化剤が、グリセリン、ポリエチレングリコール、ソルビタントリオレート及びヒアルロン酸よりなる群から選ばれた一種の親水化剤であることを特徴とする請求項１記載の経皮免疫製剤。
【請求項３】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−アルキルエーテルが、ポリオキシエチレン（２０）−ポリオキシプロピレン（８）−セチルエーテルであることを特徴とする請求項１又は２記載の経皮免疫製剤。
【請求項４】
抗原を水又は含水アルコールに溶解又は懸濁させた水溶液又は懸濁液を、アクリル酸エステル６０〜８５重量％とアクリル酸及び／又はジアセトンアクリルアミド４０〜１５重量％よりなる共重合体１００重量部、親水化剤５〜２０重量部及び化学的吸収促進剤としてのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−アルキルエーテル３〜４０重量部よりなる親水性基剤表面に滴下し、水又は含水アルコールを基剤中に吸収させることにより、抗原が濃縮された抗原層を親水性基剤表面に積層することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の経皮免疫製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、抗原特異的免疫応答を誘導するための、経皮的免疫に有用な経皮免疫製剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  経皮的免疫を成立させるには、抗原が皮膚（皮膚は通常抗原を通さない）を通過することと、抗原に対する免疫応答の両方が必要である。抗原は通常１，０００ダルトンよりも大きい高分子物質であり、皮膚を通過することは極めて困難である。そのため、経皮免疫を行うためには、皮膚から角質層を剥離し、角質層を剥離した皮膚に抗原を含んだ製剤を貼付することが行われていた（例えば、特許文献１参照。）。しかし、皮膚から角質層を剥離することは抗原投与の手間がかかるばかりでなく剥離部位からの細菌感染などの恐れがあるなどの欠点を有していた。
【特許文献１】特開平１０−３１６５８５号公報
【０００３】  そのため、皮膚から角質層を剥離することなく無傷の皮膚へ貼付し、経皮的免疫が成立する経皮免疫製剤の研究が盛んに行われており、例えば、「１つ以上の抗原とアジュバント成分を含む経皮的免疫のための製剤であって、該成分の少なくとも１つは乾燥型であり、それにより無傷の皮膚への製剤の適用が、抗原に特異的な免疫応答を誘導する製剤及び経皮的免疫のための乾燥製剤の製造であって、（ａ）少なくとも１つの免疫活性成分を提供する工程（ここで製剤は、抗原活性を有する少なくとも１つの免疫活性成分を含有する）；（ｂ）免疫活性成分の少なくとも１つを溶解して、免疫活性液体を作成する工程；（ｃ）包帯等の固体基質上の色疫活性液体を乾燥する工程；そして（ｄ）免疫活性成分を一緒にして製剤を製造する工程を任意の順序で含み、ここで、少なくとも免疫すべき被験体の皮膚に製剤が適用されるまでは、免疫活性成分の少なくとも１つは乾燥型である、上記製造」（例えば、特許文献２参照。）が提案されている。
【特許文献２】特表２００３−５２３９３７号公報
【０００４】  アジュバントは、免疫系の抗原提示細胞（例えば、表皮のランゲルハンス細胞、皮膚樹状細胞、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球）を活性化するか、及び／又は抗原提示細胞を誘導して、抗原を貧食させると記載されている。しかしながら、アジュバンドはそれ自身、起炎性物質であり、皮膚に炎症を起こすのみならず免疫系のバランスを崩す作用もあり、人体への投与が好ましいものではない。又、上記製剤では抗原は包帯、ガーゼ等のマトリックスに分散付着されていたり、液体に溶解されているので、皮膚に接触する抗原濃度は薄く免疫活性が低かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明の目的は、上記欠点に鑑み、アジュバントを含まなくても免疫活性の高い経皮免疫製剤及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明の経皮免疫製剤は、アクリル酸エステル６０〜８５重量％とアクリル酸及び／又はジアセトンアクリルアミド４０〜１５重量％よりなる共重合体１００重量部、親水化剤５〜２０重量部及び化学的吸収促進剤としてのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−アルキルエーテル３〜４０重量部よりなる親水性基剤表面に抗原層が積層されており、無傷の皮膚への製剤の適用によって抗原に特異的な免疫応答を誘導することを特徴とする。【０００７】  本発明で使用される親水性基剤は、アクリル酸エステル６０〜８５重量％とアクリル酸及び／又はジアセトンアクリルアミド４０〜１５重量％よりなる共重合体１００重量部、親水化剤５〜２０重量部及び化学的吸収促進剤としてのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−アルキルエーテル３〜４０重量部よりなる。【０００８】  上記共重合体は、アクリル酸エステル６０〜８５重量％とアクリル酸及び／又はジアセトンアクリルアミド４０〜１５重量％が共重合された粘着性共重合体である。【０００９】  上記アクリル酸エステルは、アクリル系粘着剤の原料として一般に使用されている脂肪族アルコールとアクリル酸のエステルであり、炭素数４〜１８の脂肪族アルコールとアクリル酸のエステルが好ましく、例えば、アクリル酸ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸オクチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸イソオクチル、アクリル酸デシル、アクリル酸イソデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル等が挙げられ、粘着性の観点からアクリル酸２−エチルヘキシルが好ましい。【００１０】  上記共重合体は、アクリル酸エステルとアクリル酸及び／又はジアセトンアクリルアミドが共重合されてなるが、アクリル酸とジアセトンアクリルアミドは単独で共重合されてもよいし、併用して共重合されてもよい。アクリル酸及びジアセトンアクリルアミドの共重合比率は少なくなると、得られた親水性基剤の凝集力及び親水性が低下する傾向があり、多くなると、皮膚に貼付するのに適当な粘着性が得られなくなる傾向があるので、アクリル酸エステル６０〜８５重量％とアクリル酸及び／又はジアセトンアクリルアミド４０〜１５重量％が共重合されてなり、好ましくは、アクリル酸エステル７０〜８５重量％とアクリル酸及び／又はジアセトンアクリルアミド３０〜１５重量％が共重合されてなる。尚、アクリル酸単独で共重合する場合は１５〜２５重量％が望ましく、ジアセトンアクリルアミド単独で共重合する場合は２５〜４０重量％が望ましい。【００１１】  上記共重合体は架橋していると、水及び／又は含水アルコールの吸収によって膨潤しても共重合体の強度の低下は全くないか、あっても少ないので架橋されているのが好ましい。
架橋方法は、従来公知の任意の方法が採用されればよく、例えば、公知の多官能性イソシアネート、アルミニウムアセチルアセトネートなどの金属錯体を架橋剤として共重合体に添加すればよい。【００１２】  尚、上記共重合体に、アクリル酸及びジアセトンアクリルアミド以外のＮ−ビニル−２−ピロリドン、（メタ）アクリル酸、アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の極性モノマーを物性が低下しない範囲で共重合することは可能であるが、共重合しないほうが好ましい。【００１３】  上記親水化剤は、上記共重合体の水又は含水アルコールの吸収性を向上させるためのものであって、上記共重合体と相溶する親水性液体可塑剤及び親水性高分子が好ましい。親水性液体可塑剤としては、例えば、グリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレート、ソルビタントリオレート、ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート等が挙げられ、グリセリン及びソルビタントリオレートが好ましい。親水性高分子としては、例えば、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が挙げられ、ヒアルロン酸及びポリエチレングリコールが好ましい。【００１４】  親水化剤の添加量は、少なくなると共重合体の水又は含水アルコールの吸収性が低下し、多くなると共重合体がべたつくようになるので、共重合体１００重量部に対し５〜２０重量部である。尚、グリセリンの添加量は２〜１０重量部が好ましく、ヒアルロン酸の添加量は０．０１〜０．１重量部が好ましい。【００１５】  上記化学的吸収促進剤は、抗原の経皮吸収を促進させるためのものであり、抗原の経皮吸収性を高めることと共重合体の親水性を高め抗原水溶液の表面塗布を好適にするとの２つの作用を有するポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−アルキルエーテルが使用され、ポリオキシエチレン（２０）−ポリオキシプロピレン（８）−セチルエーテルが好ましい。尚、括弧内の数字は重合度を示す。【００１６】  又、従来公知の任意の化学的吸収促進剤が併用されてもよい。従来公知の化学的吸収促進剤としては、例えば、メンソール、カンフル、セチルアルコール等のアルコール類；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル等の脂肪酸エステル；モノラウリン酸グリセリン、モノオレイン酸グリセリン等のグリセリンエステル；ラウリン酸ジエタノールアミド等の酸アミド；ポリエチレングリコールジラウリルエーテル等の中性界面活性剤等が挙げられる。【００１７】  化学的経皮吸収促進剤の添加量は、少なすぎると経皮吸収効果が向上せず、多すぎると親水性基剤の粘着性が低下するので、共重合体１００重量部に対して３〜４０重量部であり、好ましくは５〜２０重量部である。【００１８】  従って、好ましい親水性基剤は、アクリル酸２−エチルヘキシル７５〜８５重量％とアクリル酸２５〜１５重量％の共重合体１００重量部、グリセリン２〜１０重量部、ヒアルロン酸０．０１〜０．１重量部及びポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−アルキルエーテル（特に、ポリオキシエチレン（２０）−ポリオキシプロピレン（８）−セチルエーテル）５〜２０重量部からなる親水性基剤である。【００１９】  又、異なる好ましい��水性基剤は、アクリル酸２−エチルヘキシル６０〜７５重量％とジアセトンアクリルアミド４０〜２５重量％の共重合体１００重量部、グリセリン２〜１０重量部、ヒアルロン酸０．０１〜０．１部及びポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−アルキルエーテル（特に、ポリオキシエチレン（２０）−ポリオキシプロピレン（８）−セチルエーテル）５〜２０重量部からなる親水性基剤である。【００２０】  上記抗原は、生物の免疫細胞に提示された時、特異的免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、単一の免疫原性エピトープ又はＢ細胞受容体（即ち、Ｂ細胞の膜上の抗体）若しくはＴ細胞受容体により認識される複数の免疫原性エピトープを含んでよい。【００２１】  上記抗原としては、細菌、ウイルス、真菌及び寄生体よりなる群から選択される生物を感染することができる病原体由来の抗原、細胞（例えば、腫瘍細胞又は正常細胞）を感染することができる病原体由来の抗原があげられる。【００２２】  抗原の分子量が１，０００ダルトン以下であると親水性基剤上に溶液状態で滴下した時内部に吸収されがちであり、抗原が親水性基剤の表面上に充分濃縮されないので抗原の分子量は、１０００ダルトンより大きいことが好ましい。【００２３】  本発明の経皮免疫製剤は親水性基剤表面に抗原層が積層されている。親水性基剤の厚さは特に限定されるものではいが、薄すぎると抗原の水又は含水アルコール水溶液又は懸濁液の水又は含水アルコールを充分に吸収できなくなり、厚すぎると柔軟性が失われて皮膚への接触性が低下するので２０〜５，０００μｍが好ましく、より好ましくは５０〜２，０００μｍである。親水性基剤の形状は特に限定されるものではないが、パッチ状であるのが好ましい。又、基剤及び抗原層の表面には、離型シートやポリエチレンフィルム、ポリプロピレンフィルム、ポリエチレンテレフタレートフィルム、ウレタンフィルム等の支持フィルムが積層されていてもよい。【００２４】  本発明の経皮免疫製剤はアジュバンドを含有する必要はないが、抗原層又は親水性基剤がアジュバンドを含有していてもよい。アジュバントとは、抗原に対する免疫応答の誘導を助ける物質であり、ある物質が、免疫刺激及び特異的抗体応答またはＴ細胞応答を誘導することにより、アジュバント及び抗原の両方として作用することがある。【００２５】  上記アジュバントとしては、例えば、油エマルジョン（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）、リーシュマニアメージャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＬｅＩＦの誘導体、コレラ毒素又はコレラ毒素Ｂ、細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素及びそのサブユニット、コレラ毒素、コレラ毒素Ｂ等があげられる。【００２６】  請求項４記載の経皮免疫製剤の製造方法は、抗原を水又は含水アルコールに溶解又は懸濁させた水溶液又は懸濁液を、アクリル酸エステル６０〜８５重量％とアクリル酸及び／又はジアセトンアクリルアミド４０〜１５重量％よりなる共重合体１００重量部、親水化剤５〜２０重量部及び化学的吸収促進剤としてのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−アルキルエーテル３〜４０重量部よりなる親水性基剤表面に滴下し、水又は含水アルコールを基剤中に吸収させることにより、抗原が濃縮された抗原層を親水性基剤表面に積層することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の経皮免疫製剤の製造方法である。【００２７】  本発明においては、先ず、抗原を水又は含水アルコールに溶解又は懸濁させて水溶液又は懸濁液を作成する。水又は含水アルコールとしては、水、水を含有するメタノール、エタノール等のアルコールがあげられ、これらの緩衝液が好適に用いられる。緩衝液としては、例えば、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋の無いリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、正常な食塩水（１５０ｍＭＮａＣｌ水溶液）、トリス緩衝液等があげられる。【００２８】  抗原は、一般に水又は含水アルコール及びその緩衝液に溶解するが、溶解しない抗原は、１０ｍＭの酢酸で可溶化し、次に中性の水、含水アルコール、緩衝液で所望の容量に希釈すればよい。又、酸性ｐＨでのみ溶解する抗原の場合は、希酢酸で可溶化した後、酸性ｐＨで酢酸−ＰＢＳを希釈剤として希釈すればよい。抗原がそれ自体が不溶性である疎水性抗原（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、膜を横切るドメインを含有するポリペプチド等）は界面活性剤で懸濁化してもよい。【００２９】  次に、得られた水溶液若しくは懸濁液を、前記親水性基剤表面に滴下し、水又は含水アルコールを基剤中に吸収させる。上記親水性基剤は水又は含水アルコールを吸収し膨潤する性質を有しているので、水溶液又は懸濁液中の水又は含水アルコールは容易に親水性基剤に吸収され、親水性基剤表面に抗原が取り残され濃縮した抗原層が形成される。【００３０】  皮膚を通過するか又は皮膚内に入った抗原は、免疫応答を直接誘導するか、又は表皮中の抗原提示細胞集団（例えば、マクロファージ、組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、表皮の樹状細胞、Ｂ細胞、またはクプファー細胞）を通過し、リンパ球に移動する。場合により抗原は、毛包又は皮膚小器官（例えば、汗腺、脂線）を介して角質層を通過する。【００３１】  抗原と接触後、一部のランゲルハンス細胞は活性化され、表皮を出て、局所的リンパ節のＴ細胞依存性領域に移動し、ここで成熟樹状細胞として局在化する。表皮を出てリンパ節に移動する過程で、抗原担持表皮ランゲルハンス細胞は、形態、表面表現型および機能の劇的な変化を示す。表皮ランゲルハンス細胞に比較して、リンパ系樹状細胞は基本的に非食作用性であり、タンパク質抗原の処理が非効率的であるが、高レベルのＭＨＣクラスＩとクラスＩＩ抗原および種々の同時刺激性分子を発現し、同定されている天然のＴ細胞の最も強力な刺激物質である。【００３２】  表皮ランゲルハンス細胞の強力な抗原提示能力は、経皮的に送達されるワクチンに利用することができる。皮膚免疫系を使用する経皮的免疫応答は、例えば、受動的拡散と、次にランゲルハンス細胞を活性化して抗原を取り込ませ、これらの抗原をＴ細胞に提示するためにリンパ節に運ばれ、次にその抗原（例えば、ＢＳＡ）に特異的な免疫応答を誘導する。【００３３】  上記経皮免疫製剤の無傷の皮膚への適用する前に、抗原の経皮透過を促進するために無傷の皮膚を酵素処理するのが好ましい。酵素としては、前述のプロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ等の酵素があげられる。酵素処理方法は、特に限定されるものではな���、例えば、酵素を適当なｐＨに調整した精製水等に溶解させた酵素水溶液を皮膚部位に適用する方法があげられる。その際、酵素水溶液をろ紙やその他多孔質単体にしみ込ませて適用すると実用上便利である。又、異なる酵素処理方法として、酵素を軟膏基剤に溶解させた酵素軟膏を皮膚に適用する方法、水性ゲル中に酵素を溶解させた酵素入り水性ゲルを皮膚に貼付する方法があげられる。
【発明の効果】
【００３４】  本発明の経皮免疫製剤の構成は上述の通りであるから、アジュバントを含まなくても免疫活性が高い。又、本発明の経皮免疫製剤の製造方法により、濃縮された抗原層を有する経皮免疫製剤を容易に製造方法することができ、皮膚が炎症を起こしたりすることなく免疫系のバランスを予防・治療に遊離なように偏向することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】  次に実施例を説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（実施例１〜３、比較例１〜７）
共重合体の調製
（１）共重合体１
攪拌機付きの５００ｍｌ反応容器に、酢酸エチル２００ｇ、アクリル酸２−エチルヘキシル１００ｇ、アクリル酸２０ｇ及びアゾビスイソブチロニトリル０．００５ｇを仕込み、反応容器内を窒素置換した後、７５℃で１５時間重合を行って共重合体１溶液を得た。【００３６】（２）共重合体２
攪拌機付きの５００ｍｌ反応容器に、酢酸エチル２００ｇ、アクリル酸２−エチルヘキシル１００ｇ、ジアセトンアクリルアミド３５ｇ及びアゾビスイソブチロニトリル０．００５ｇを仕込み、反応容器内を窒素置換した後、７５℃で１５時間重合を行って共重合体２溶液を得た。【００３７】親水性基剤の調製
表１に示した所定量の、得られた共重合体１及び２溶液（固形分換算）、ソルビタントリオレート、グリセリン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール６００（ナカライテスク社製、試薬）（以上、親水化剤）及びポリオキシエチレン（２０）−ポリオキシプロピレン（８）−セチルエーテル（日本油脂社製、商品名「ユニセーフ２０Ｐ−８」）、メンソール、ミリスチン酸イソプロピル、ラウリン酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレン（５）−ポリオキシプロピレン（４）−セチルエーテル（日本油脂社製、商品名「ユニセーフ５Ｐ−４」）、ポリオキシエチレン（１７）−ポリオキシプロピレン（１７）−ブチルエーテル（日本油脂社製、商品名「ユニルーブ５０ＭＢ−２６」）（以上、化学的吸収促進剤）を良く混合し得られた溶液をポリエチレンテレフタレートフィルム上に、乾燥後の厚さが２００μｍになるよう設定したナイフコーターを使用して塗膜をつくり、温度５０℃で２４時間溶媒を乾燥させて親水性基剤シートを得た。得られたシートを直径１ｃｍの円形に打ち抜いてパッチ状の親水性基剤を得た。【００３８】
【表１】
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親水化剤１：ソルビタントリオレート
親水化剤２：グリセリン
親水化剤３：ヒアルロン酸
親水化剤４：ポリエチレングリコール６００
化学的吸収促進剤５：ポリオキシエチレン（２０）−ポリオキシプロピレン（８）−セチルエーテル
化学的吸収促進剤６：メントール
化学的吸収促進剤７：ミリスチン酸イソプロピル
化学的吸収促進剤８：ラウリン酸ジエタノールアミド
化学的吸収促進剤９：ポリオキシエチレン（５）−ポリオキシプロピレン（４）−セチルエーテル
化学的吸収促進剤１０：ポリオキシエチレン（１７）−ポリオキシプロピレン（１７）−ブチルエーテル【００３９】経皮免疫製剤の調製
分子量４５，０００の蛋白質であるオバルミン（シグマ社製、商品名「オバルミン（ＯＶＡ）グレードＶ」）１０ｍｇをＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋の無いリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍｌに溶解した溶液１０μｌを得られた親水性基剤に滴下し、親水性基剤にＰＢＳを吸収させ親水性基剤表面に１００μｇのＯＶＡ層が積層された経皮免疫製剤を得た。得られた経皮免疫製剤の粘着性を官能試験で測定し、結果を表２に示した。【００４０】ＯＶＡ特異的抗体力価の測定
得られた経皮免疫製剤をＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ；７週齢、メス、エスエルエス社から購入）の耳介皮膚の両面に貼付して２週間第１回の免疫操作を行い、２週間後に貼付されていた経皮免疫製剤を剥離し、新しい経皮免疫製剤を貼付して更に２週間第２回の免疫操作を行った。第２回免疫操作後、マウスの眼窩よりヘマトクリット毛細管を用いて血液を採取した。【００４１】  採取した血液の血清中のＯＶＡ特異的抗体力価を酵素免疫測定法により測定し、結果を表２に示した。抗体力価は抗体の検出レベルが５０％未満まで減少する最高の希釈倍率をタイター値（Ｔｉｔｅｒ）として、Ｌｏｇ２Ｔｉｔｅｒ値の逆数で示した。この値をＯＶＡ特異的抗体力価とした。【００４２】  尚、酵素免疫測定法は以下の通りである。
ＯＶＡを固相化バッファーに１００μｇ／ｍｌの濃度に溶解し、エライザプレート（Ｎｕｎｃ社製、商品名「９６  ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅ」）に５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で１夜放置してＯＶＡを固相化した。固相化したプレートに２倍希釈したブロッキング剤（大日本住友製薬社製、商品名「Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ」）を２００μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートしてブロッキングした。【００４３】  次に、回収した血液から血清を分離し、ブロッキング剤を用いて２倍系列で段階希釈した。得られた希釈血清をブロッキングしたプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し３７℃で２時間インキュベートした。次に、プレートを緩衝液で３回洗浄し、ブロッキング剤で希釈したホースラディッシュパラオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識羊抗マウスＩｇＧ（５０００倍希釈）を５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。次に、３７℃で２時間インキュベートした後、緩衝液で３回洗浄し、ＨＲＰ基質溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。更に、１５分間インキュベートした後、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて反応を停止させ、吸光波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＯＶＡ特異的抗体力価を評価した。【００４４】
【表２】
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