(57)【要約】【課題】  マルトオリゴ糖を含有した乳酸発酵物を単一工程で生成し、そのまま飲食品や飼料などに利用可能なマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物を提供すること。【解決手段】  デンプンを主とする炭素源を含む培地で、デンプン分解能を有する乳酸菌を、該乳酸菌の増殖を抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することができる水素イオン濃度又は温度で培養すると共に乳酸発酵させると、グルコース及びマルトースが消費され、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されることにより、マルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物を製造することができる。【選択図】  図３
2010119350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプンを主とする炭素源を含む培地で、デンプン分解能を有する乳酸菌を、該乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することができる水素イオン濃度又は温度で培養すると共に乳酸発酵させて、グルコース及びマルトースが消費され、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されて得られるマルトオリゴ糖を含有する乳酸発酵物を得ることを特徴とするマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法。
【請求項２】
乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することができる水素イオン濃度ｐＨ３．５〜ｐＨ６好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ５．５で、又は温度３０°Ｃ〜５０°Ｃ好ましくは４０°Ｃ〜５０°Ｃで培養することを特徴とする請求項１記載のマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法。
【請求項３】
デンプン分解能を有する乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、又はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属の乳酸菌であることを特徴とする請求項１又は２記載のマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法。
【請求項４】
デンプンを主とする炭素源を含む培地で、デンプン分解能を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、又はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属の乳酸菌を、該乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することのできる水素イオン濃度ｐＨ３．５〜ｐＨ６好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ５．５で、又は温度３０°Ｃ〜５０°Ｃ好ましくは４０°Ｃ〜５０°Ｃで培養すると共に乳酸発酵させて、グルコース及びマルトースが消費され、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されて得られるマルトオリゴ糖を含有する乳酸発酵物を得ることを特徴とするマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかの項に記載した製造方法で製造したことを特徴とするマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物。
【請求項６】
デンプンを主とする炭素源を含む培地で、デンプン分解能を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、又はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属の乳酸菌を、該乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することのできる水素イオン濃度ｐＨ３．５〜ｐＨ６好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ５．５で、又は温度３０°Ｃ〜５０°Ｃ好ましくは４０°Ｃ〜５０°Ｃで培養すると共に乳酸発酵させて、グルコース及びマルトースが消費され、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されて得られるマルトオリゴ糖を含有することを特徴とするマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかの項に記載した製造方法で製造したマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物を利用することを特徴とする飲食品、飼料、又はこれらの原材料。
【請求項８】
デンプンを主とする炭素源を含む培地で、デンプン分解能を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、又はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属の乳酸菌を、該乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することのできる水素イオン濃度ｐＨ３．５〜ｐＨ６好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ５．５で、又は温度３０°Ｃ〜５０°Ｃ好ましくは４０°Ｃ〜５０°Ｃで培養すると共に乳酸発酵させて、グルコース及びマルトースが消費され、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されて得られるマルトオリゴ糖を含有するマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物を利用することを特徴とする飲食品、飼料、又はこれらの原材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプンを主とする炭素源を含む培地でデンプン分解能を有する乳酸菌を培養するとともに乳酸発酵によってマルトオリゴ糖を生成して得られるマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物、その製造方法及びそれを含有する飲食品、飼料、又はこれらの原材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
デンプン分解能を有する乳酸菌はこれまでにも知られており、そのデンプン分解酵素に関する報告はあるが、乳酸菌の培養によりオリゴ糖を蓄積させたという報告はない（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
マルトオリゴ糖の製造に関しては、食品に利用可能な微生物を利用した方法として、デンプンの糖化後に培養物中に生成する目的のオリゴ糖より低分子の糖を酵母に資化させることによりオリゴ糖を製造する方法がある。
【０００４】
例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母であって、マルトトリオースよりもグルコース及び／又はマルトースを優先的に資化しうる酵母菌体を、優先資化上有効な糖濃度のデンプン糖化液に作用させてマルトトリオース高含有組成物を製造し、酵母菌体の除去工程などを経て、食品又は医薬品の原材料などに利用するマルトトリオース製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
この方法では、マルトトリオースを製造するために、デンプン糖化工程なる１次工程と、酵母菌体を添加し発酵させる２次工程を必要とし、さらに食品又は医薬品の原材料などに利用するためには酵母菌体の除去工程などを必要とする場合が多い。
【０００６】
また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母菌体を、炭素源としてマルトース及び／又はマルトトリオースを含む栄養培地にて好気的に培養し、該酵母菌体内にα―グルコシダーゼ活性を誘導蓄積せしめた後、これを固定化処理して得られた固定化酵母菌体を、オリゴ糖を含有する糖液に添加作用させることにより、糖液中のマルトトリオース、マルトース及びグルコースを資化せしめてマルトテトラオース以上の高純度マルトオリゴ糖を製造する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００７】
この方法では、オリゴ糖を含有する糖液を作る１次工程と、培養し固定化処理した酵母菌体を該糖液に添加し発酵させる２次工程とを必要としている。
【０００８】
乳酸菌のデンプン分解能を利用し、他の糖化酵素や麹などの微生物を用いず乳酸菌のみを食品製造に利用したものには、デンプン分解能を有する乳酸菌及びその発酵液で米飯中のデンプンを糖化することにより甘酒様飲料を製造する方法が開示されているが、糖化のみに言及したものでオリゴ糖生成に関する言及は認められない（例えば、特許文献３参照）。
【０００９】
工業的にマルトトリオースを生成するには、ミクロバクテリウム菌体を使用する方法があるが、該ミクロバクテリウム菌体を含有したオリゴ糖含有組成物を、オリゴ糖含有食品としてそのまま摂取するには健康上問題がないということが確立されていないため、該ミクロバクテリウム菌体などを除去する精製工程が必要となり、精製に要する設備費、製造コストが高くなるという問題があった（例えば、特許文献４参照）。
【００１０】
また、食品添加物には食品衛生法により食品添加物としての表示が必要であるが、消費者は食の安全安心という意識から、食品添加物による健康への影響を懸念し食品添加物の記載された食品を遠ざけるという傾向がある。
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−２１５４９５号公報
【特許文献２】特開昭５９−１７３０９２号公報
【特許文献３】特許第３５５７４５８号公報
【特許文献４】特許第２９６４０４２号公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ８０巻２月号  １２４から１３０ページ、１９９５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、健康の維持と増進に役立つ乳酸菌を利用し、マルトオリゴ糖を単一工程で生成し、該マルトオリゴ糖を含有した乳酸発酵物を精製することなく、そのまま飲食品や飼料などに利用可能なマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明において、「乳酸発酵物」とは、乳酸菌の生菌体及び／又は死菌体と、マルトオリゴ糖などのデンプン分解生成物と、乳酸と、並びにデンプン、タンパク質、又はミネラルなどの原料又は材料の由来物との混合物を意味する。
【００１４】
本発明において、「原材料」とは、飲食品や飼料に利用される原材料を意味する。
【００１５】
本発明において、グルコースをＧ１、マルトースをＧ２、マルトトリオースをＧ３、マルトテトラオースをＧ４、マルトペンタオースをＧ５と表すことがある。
【００１６】
本発明者らは、鋭意研究した結果、デンプンを主とする炭素源とした培地でデンプン分解能を有する乳酸菌を培養していくと、菌の増殖を抑制するが乳酸菌の生菌体が存することができる条件下ではグルコース及びマルトースは消費され、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースは蓄積されてマルトオリゴ糖を含む乳酸発酵物が生成されることを見いだした。
【００１７】
請求項１に係るマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法の発明は、デンプンを主とする炭素源を含む培地で、デンプン分解能を有する乳酸菌を、該乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することができる水素イオン濃度又は温度で培養すると共に乳酸発酵させて、グルコース及びマルトースが消費され、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されて得られるマルトオリゴ糖を含有する乳酸発酵物を得ることを特徴とする。
【００１８】
請求項２に係るマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法の発明は、請求項１において、乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することができる水素イオン濃度ｐＨ３．５〜ｐＨ６好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ５．５で、又は温度３０°Ｃ〜５０°Ｃ好ましくは４０°Ｃ〜５０°Ｃで培養することを特徴とする。
【００１９】
請求項３に係るマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法の発明は、請求項１又は２において、デンプン分解能を有する乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、又はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属の乳酸菌であることを特徴とする。
【００２０】
請求項４に係るマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法の発明は、デンプンを主とする炭素源を含む培地で、デンプン分解能を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、又はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属の乳酸菌を、該乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することのできる水素イオン濃度ｐＨ３．５〜ｐＨ６好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ５．５で、又は温度３０°Ｃ〜５０°Ｃ好ましくは４０°Ｃ〜５０°Ｃで培養すると共に乳酸発酵させて、グルコース及びマルトースが消費され、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されて得られるマルトオリゴ糖を含有する乳酸発酵物を得ることを特徴とする。
【００２１】
請求項５に係るマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法で製造したことを特徴とする。
【００２２】
請求項６に係るマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の発明は、デンプンを主とする炭素源を含む培地で、デンプン分解能を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、又はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属の乳酸菌を、該乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することのできる水素イオン濃度ｐＨ３．５〜ｐＨ６好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ５．５で、又は温度３０°Ｃ〜５０°Ｃ好ましくは４０°Ｃ〜５０°Ｃで培養すると共に乳酸発酵させて、グルコース及びマルトースが消費され、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されて得られるマルトオリゴ糖を含有することを特徴とする。
【００２３】
請求項７に係る飲食品、飼料、又はこれらの原材料の発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法で製造したマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物を使用する飲食品、飼料又は原材料であることを特徴とする。
【００２４】
請求項８に係る飲食品、飼料、又はこれらの原材料の発明は、デンプンを主とする炭素源を含む培地で、デンプン分解能を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、又はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属の乳酸菌を、該乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することのできる水素イオン濃度ｐＨ３．５〜ｐＨ６好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ５．５で、又は温度３０°Ｃ〜５０°Ｃ好ましくは４０°Ｃ〜５０°Ｃで培養すると共に乳酸発酵させて、グルコース及びマルトースが消費され、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されて得られるマルトオリゴ糖を含有するマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物を利用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
請求項１に記載のマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法の発明は、デンプン分解能を有する乳酸菌を利用し、培養によって初めてマルトオリゴ糖を蓄積させたという効果がある。
【００２６】
また、デンプン糖化工程なる１次工程や酵母菌体を添加し発酵させる２次工程を必要とせず、デンプン分解能を有する乳酸菌の培養によりデンプンの糖化と乳酸発酵を同時に行う単一工程で、マルトオリゴ糖を生成できるという効果がある。
【００２７】
さらに、乳酸菌は人体に有益であるため、生成されたオリゴ糖含有組成物から乳酸菌体を除去するなどの精製工程が不必要となり、精製に要する設備費、製造コストが安く抑えられるという効果がある。
【００２８】
なお、マルトオリゴ糖を添加物として食品に添加した場合は食品衛生法により食品添加物としての表示が必要であるが、本発明のマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物は食品添加物としての表示は不要である。
【００２９】
請求項２に記載のマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法の発明は、請求項１の発明と同じ効果がある。さらに、マルトオリゴ糖を、より高含有させた乳酸発酵物を生成できるという効果がある。
【００３０】
請求項３に記載のマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法の発明は、請求項１又は２の発明と同じ効果がある。
【００３１】
請求項４に記載のマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の製造方法の発明は、請求項１乃至３のいずれかの発明と同じ効果がある。
【００３２】
請求項５に記載のマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の発明は、請求項１乃至３のいずれかの発明と同じ効果がある。
【００３３】
請求項６に記載のマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物の発明は、請求項４の発明と同じ効果がある。
【００３４】
請求項７に記載のマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物を含有する飲食品、飼料、又はこれらの原材料の発明は、請求項１乃至３のいずれかの発明と同じ効果がある。さらに、マルトオリゴ糖を高含有した乳酸発酵物を食品に利用すると、デンプンの老化を防止させる働きを有するため、例えば、パンや菓子などに利用すると、パンや菓子などの硬化を遅らせるという効果がある。
【００３５】
その上、ヨーグルト、飲料や飼料に利用すると、マルトオリゴ糖の添加効果に併せてデンプン原料の利用によって粘度などの食感や甘味の改良ができ、また植物性乳酸菌による乳酸発酵によって風味を変えることもでき、さらに腸内腐敗菌の生育を抑制できるという効果がある。
【００３６】
請求項８に記載のマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物を含有する飲食品、飼料、又はこれらの原材料の発明は、請求項４、６又は７のいずれかの発明と同じ効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明で用いる乳酸菌は、デンプン分解能を有し、可溶性デンプンなどを分解して乳酸を生成する乳酸菌であればよく、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、又はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属のいずれの乳酸菌でもよい。
【００３８】
培地には、乳酸菌の培地として一般的なＭＲＳ培地の炭素源を、グルコースに代えて乳酸菌が分解できるデンプン、例えば可溶性デンンプン及び／又は変性デンプンなどにしたものを用いる。実施例では、可溶性デンプンに代えたものを用い、該培地をＭＲＳ−可溶性デンプン培地と表す。
【００３９】
前培養には、ＭＲＳ−可溶性デンプン培地を用い、乳酸菌を３０°Ｃ、２４時間静置培養した。
【００４０】
培養には、全容量２リットルのジャーファーメンター（ミツワ製）を用い、前記前培養した乳酸菌の菌体を１０％（ｖ／ｖ）接種し、実容量１リットル、無通気で、乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌が生きている水素イオン濃度又は温度で行った。
【００４１】
乳酸菌の増殖を抑制するが該乳酸菌が生きている水素イオン濃度で培養する場合は、ｐＨコントローラを使用し、２ＮのＮａＯＨ溶液を用いて水素イオン濃度をｐＨ３．５〜ｐＨ６好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ５．５に制御し、培養中は１００ｒｐｍで穏やかに攪拌した。
【００４２】
また、乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌が生きている温度で培養する場合は、温度を３０°Ｃ〜５０°Ｃ好ましくは４０°Ｃ〜５０°Ｃに制御し、培養中は１００ｒｐｍで穏やかに攪拌した。
【００４３】
前記水素イオン濃度又は温度で培養する場合、生成したオリゴ糖のうちマルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積される。
【００４４】
これは、乳酸菌株が生産するデンプン分解酵素により可溶性デンプンが分解されオリゴ糖が生成されるが、これは、デンプン分解酵素がオリゴ糖のうちマルトヘキサオースなどグルコース数が多いものに優先的に作用し、グルコース数がより少ないマルトトリオース及びマルトテトラオースには、該デンプン分解酵素が遅く作用するためと考えられる。
【００４５】
そして、乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することができる水素イオン濃度又は温度に制御すると、生菌体により、グルコース及びマルトースが優先して消費され、遅れてデンプン分解酵素によりマルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが分解されると考えられる。
【００４６】
最終的には、蓄積されたマルトトリオース及びマルトテトラオースもすべて消費されるが、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されているときに菌体による糖の消費を停止又は抑制することにより、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースを高含有する乳酸発酵物ができる。
【００４７】
菌体による糖の消費の停止は、乳酸発酵物の加熱殺菌又は冷凍などにより、また菌体による糖の消費の抑制は冷蔵などにより行う。
【００４８】
さらに、マルトオリゴ糖を高含有する乳酸発酵物を利用した飲食品、飼料、又はこれらの原材料を製造することができる。
【００４９】
乳酸菌を利用した発酵物を用いた飲食品の例としては、乳酸菌を利用した発酵物を米粉や水などと蒸練したのち混練し、成形し、該成形物を焼成して造る風味ある菓子や、乳酸菌を利用した発酵物をパン生地に添加して造られる風味あるパンなどが知られており、本発明で生成される乳酸発酵物も米粉や水などと蒸練したのち混練し、成形し、該成形物を焼成して風味ある菓子を造ることができ、パン生地に添加して風味あるパンを造ることができるなど、本発明で生成される乳酸発酵物を利用して飲食品、飼料、又はこれらの原材料を造ることができる。
【００５０】
マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースなどを含有したマルトオリゴ糖を生産するには、一般にデンプン糖化工程の１次工程と発酵工程の２次工程からなる工程で生産するが、本発明は乳酸菌による糖化と乳酸発酵を同時並行して行う単一工程で生産できるという効果がある。
【００５１】
マルトオリゴ糖を高含有した乳酸発酵物中の乳酸菌は人体に有益であることから、マルトオリゴ糖を高含有する乳酸発酵物を飲食品、飼料、又はこれらの原材料に利用するに際し、菌体除去などの精製工程を設置する必要がなく、マルトオリゴ糖を高含有した乳酸発酵物を菌体除去などせずにそのまま利用して飲食品、飼料、又はこれらの原材料を製造できるという効果がある。
【００５２】
マルトオリゴ糖を高含有した乳酸発酵物を食品に利用すると、デンプンの老化を防止させる働きを有するため、例えば、パンや菓子などに利用すると、パンや菓子などの硬化を遅らせるという効果がある。
【００５３】
また、ヨーグルト、飲料や飼料に利用すると、マルトオリゴ糖の添加効果に併せてデンプン原料の利用によって粘度などの食感や甘味の改良ができ、また植物性乳酸菌による乳酸発酵によって風味を変えることができ、さらに腸内腐敗菌の生育を抑制できるという効果がある。
【００５４】
次に、本発明の実施例を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５５】
例えば、実施例で利用した乳酸菌は、本発明者が小麦フスマから分離した乳酸菌であり、該乳酸菌の場合の乳酸菌の増殖は抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することが可能な水素イオン濃度や温度を記載しているが、他の乳酸菌を利用した場合における、乳酸菌の増殖を抑制するが該乳酸菌の生菌体が存することが可能な水素イオン濃度や温度が、本発明の実施例により限定されるものでない。
【００５６】
次に、各実施例で使用した指標又は測定方法を記載する。
【００５７】
生育の指標としては、波長６６０ｎｍの光学的濁度（Ｏ．Ｄ．６６０）を測定した。
【００５８】
培養液中の乳酸量は、Ｆ−キット（Ｄ−乳酸／Ｌ−乳酸）（製造元：Ｒｏｃｈｅ（ドイツ），輸入元：株式会社Ｊ．Ｋ．インターナショナル）を用いて測定した。
【００５９】
全糖量は、フェノール−硫酸法で測定し、グルコース量として表した。
【００６０】
オリゴ糖量の測定には、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ、Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０カラム（４．６×２５０ｍｍ）、ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−３３００ＲＩ  Ｍｏｎｉｔｏｒ、溶離液アセトニトリル／水（６０／４０）、流速１．０ミリリットル／ｍｉｎ、温度３０°Ｃ）を用いた。
【００６１】
菌体外デンプン分解酵素活性の測定は、培養液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分間）した後、上清を粗酵素液とし、特に示さない限り３７°Ｃで３０分間反応を行った。
【００６２】
該反応に使用する反応液量は１０ミリリットルで、８ｇ／リットル可溶性デンプン（２０ｇ／リットル可溶性デンプン、４ミリリットル）、５０ｍＭ酢酸緩衝液（１００ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０、５ミリリットル）、１０％粗酵素液（培養液上清、１ミリリットル）とし、この場合の反応液のｐＨは４．５で、反応は沸騰水中で５分間加熱することにより停止させた。
【００６３】
また、図４に示す反応液ｐＨの酵素活性に及ぼす影響に関する試験には、各ｐＨの緩衝液に、１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２〜３．０）、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）、又は１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５〜８．０）を用いた。
【００６４】
そして、酵素活性は、ヨウ素−デンプン結合色の測定により残存デンプンを測定し、３０分間で１０ｍｇの可溶性デンプンを分解する酵素量を１ｕｎｉｔとして表した。
【実施例１】
【００６５】
デンプン分解能を有する乳酸菌は、本発明者が小麦フスマから分離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ａ３０５株を用いた。
【００６６】
なお、以下の各実施例において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ａ３０５株を、Ａ３０５株と表すことがある。
【００６７】
該Ａ３０５株は、デンプン分解能を有し、可溶性デンプン、α化デンプン、生コムギデンプン、又は米粉などを発酵して乳酸を生成することができる。
【００６８】
実施例で用いた培地は、表１に示すように、ＭＲＳ培地の炭素源をグルコースから可溶性デンプンに代えたものを用いた。
【００６９】
【表１】
2010119350.tif 000003
【００７０】
培養には、全容量２リットルのジャーファーメンター（ミツワ製）を用い、前培養液を１０％（ｖ／ｖ）接種し、実容量１リットル、３７°Ｃ、無通気、ｐＨ制御なしで行い、培養中は１００ｒｐｍで穏やかに攪拌した。
【００７１】
前記前培養液は、表１に示したＭＲＳ−可溶性デンプン培地を用い、Ａ３０５株を３０°Ｃ、２４時間静置培養したものである。
【００７２】
図１に培養時間の経過と全糖量、乳酸量、Ｏ．Ｄ．６６０、オリゴ糖量、及びｐＨの推移の関係を示しており、図１（イ）から、ｐＨは培養初めのｐＨ６．７が８時間後にｐＨ４．１、さらに２４時間後にはｐＨ３．７となって、乳酸の生成に伴ってｐＨが低下している。
【００７３】
図１(ロ)によれば、培養液中に、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオースのオリゴ糖は検出されたが、グルコース及びマルトースは検出されなかった。
【００７４】
図１（ハ）により、Ｏ．Ｄ．６６０（光学的濁度）の推移をみると、培養９時間でＡ３０５株菌体の増殖はほぼ最大となって増殖が停止しており、また、全糖量と乳酸量をみれば２４時間後にはデンプンが糖として全て消費されて乳酸が生成したことが示されている。
【００７５】
Ａ３０５株の増殖停止の一つの原因は、ｐＨが４．１程度に低下したためである。
【００７６】
しかし、糖の消費がすすんでいるのは、生菌体が存しているためであると考えられる。
【００７７】
以上により、実施例１より水素イオン濃度を変えていくと水素イオン濃度によっては、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが主要なマルトオリゴ糖を高含有する乳酸発酵物を製造できることが得られた。
【実施例２】
【００７８】
実施例１と同じ乳酸菌及び培地を使用し、実施例１とは異なりｐＨ制御を実施した。炭素源を可溶性デンプン２０ｇ／リットルとし、前培養液を１０％（ｖ／ｖ）接種し、ｐＨ６．５、３７°Ｃで培養を開始し、ｐＨコントローラを使用し、２ＮのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨ６．５に制御し、培養中は１００ｒｐｍで穏やかに攪拌した。
【００７９】
前記前培養液は、表１に示したＭＲＳ−可溶性デンプン培地を用い、Ａ３０５株を３０°Ｃ、２４時間静置培養したものである。
【００８０】
図２に、炭素源を可溶性デンプン２０ｇ／リットルとし、ｐＨ６．５、３７°Ｃで培養を開始し、ｐＨ６．５に制御した場合の結果を示しているが、図２（ホ）より、糖が残存しているにもかかわらず早期に約７時間目以降は増殖が停止し、糖の消費及び乳酸の生成ともほぼ停止した。
【００８１】
また、図２（ニ）より、デンプンの分解産物であるオリゴ糖量をみると、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオースが、３〜４時間目までに少量検出された。
【００８２】
これは、中性域ｐＨ６．５に制御したｐＨがデンプンの分解酵素の至適ｐＨ域からはずれていたため、酵素が作用できず、炭素源のデンプンを分解して、菌体が利用可能な糖を生成できなかったため、菌の増殖には適するｐＨにもかかわらず炭素源の欠乏で生育が停止したと考えられる。
【００８３】
以上より、Ａ３０５株の培養において、ｐＨ６．５付近ではデンプン分解酵素が作用できずデンプンを分解しにくいため、オリゴ糖の生成が進まないことがわかる。
【実施例３】
【００８４】
次に、実施例１と同じ乳酸菌を使用し、デンプン分解酵素の至適ｐＨ範囲であるｐＨ４．５又はｐＨ５．０で制御を行った。
【００８５】
実施例１と同じ培地で、可溶性デンプン濃度を４０ｇ／リットルに変え、前培養液を１０％（ｖ／ｖ）接種し、ｐＨ５．６、３７°Ｃで培養を開始し、約３時間でｐＨ５．０に低下後はｐＨ５．０に制御してＡ３０５株を培養する場合と、約５時間でｐＨ４．５に低下後はｐＨ４．５に制御してＡ３０５株を培養する場合を実施した。
【００８６】
前記前培養液は、表１に示したＭＲＳ−可溶性デンプン培地を用い、Ａ３０５株を３０°Ｃ、２４時間静置培養したものである。
【００８７】
図３（ヘ）及び（ト）において、デンプン分解酵素の至適ｐＨであるｐＨ５．０又はｐＨ４．５にｐＨ制御しＡ３０５株を培養した結果をみると、ｐＨ５．０制御では、２４時間後に糖がほぼ消費され、ｐＨ４．５制御では２４時間後でも糖がわずかに残存している。
【００８８】
また、ｐＨ５．０制御の方がｐＨ４．５制御よりオリゴ糖の消費が早かったのは、ｐＨ５．０の方がより菌株の増殖に適するｐＨであったためと考えられる。
【００８９】
培養当初にはマルトースの検出が見られるものの約６〜１０時間以降には検出されていない。
【００９０】
これは、菌体が増殖せず生菌体が存するだけならば、生菌体によりグルコース及びマルトースが消費され、遅れてデンプン分解酵素によりマルトトリオース及びマルトテトラオースが分解されるためと考えられる。
【００９１】
また、ｐＨ４．５制御の方がｐＨ５．０制御よりピーク時のオリゴ糖の生成量が多くなっているが、これはｐＨ４．５の方がｐＨ５．０に比べると増殖が遅かったため、糖の消費量が少なく、デンプンが分解されて生成したマルトトリオース及びマルトテトラオースの分解が遅れたためと考えられる。
【００９２】
以上より、Ａ３０５株を培養した場合、デンプン分解酵素の至適ｐＨ範囲であるｐＨ４．５〜ｐＨ５．０に制御すれば、グルコース及びマルトースが菌体により消費され、デンプン分解酵素で分解されにくいマルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されて得られるマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物を製造することができる。
【００９３】
ここで、本発明者は、実施例１〜３の検証の他に、実施例１と同じ乳酸菌を使用し、実施例１と同じ培地ではあるが炭素源として可溶性デンプンをグルコース２０ｇ／リットルに代え、ｐＨ制御なしの場合も検証を行って、炭素源の違い及びｐＨ制御の有無によるＡ３０５株の培養特性を表２及び表３にまとめた。
【００９４】
【表２】
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【００９５】
【表３】
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【００９６】
表２及び表３において、「＊」は培養時の温度３７°Ｃで培養１０時間後の値を表し、「＃」は培養時の温度３７°Ｃで培養２４時間後の値を表す。
【００９７】
表２及び表３より、可溶性デンプンを炭素源とした場合はグルコースを炭素源とした場合よりも最大比増殖速度が小さいが、これは、グルコースの場合は菌体がグルコースをそのまますぐ利用できるのに対し、可溶性デンプンの場合は菌体が自ら生成する酵素でデンプンを分解してから利用しなければならないためと考えられる。
【００９８】
図１（ハ）より、ｐＨ４．１程度になると菌体の増殖が停止すること、及び表３より、ｐＨ４．５の場合の方がｐＨ５．０の場合より増殖量を示すＯ．Ｄ．６６０の最終値が小であるので、ｐＨ４．５の場合には菌株の増殖が抑制されていると考えられるので、ｐＨ４．５の近傍値であるｐＨ５．０の場合も菌株の増殖が抑制されていると考えられる。
【実施例４】
【００９９】
Ａ３０５株が生産する培養液中のデンプン分解酵素の至適ｐＨを調べるため、基質を可溶性デンプン８ｇ／リットルとし、３７°Ｃ、デンプン分解酵素活性０．３ｕｎｉｔｓ／ミリリットルで、３０分間反応をさせて酵素活性を測定し、各ｐＨでの反応液中に生成するオリゴ糖量を調べた。
【０１００】
なお、本菌株のデンプン分解酵素は菌体外に存することが認められたため、酵素反応には培養液を遠心分離した上清を用いた。
【０１０１】
図４（チ）及び（リ）において、デンプン分解酵素活性はｐＨ３．５〜５．５のときに高く、マルトトリオース（Ｇ３）乃至マルトペンタオース（Ｇ５）のオリゴ糖が多く生成されていることから、Ａ３０５株のデンプン分解酵素の至適ｐＨは３．５〜５．５の酸性域であることがわかる。
【０１０２】
次に、基質を可溶性デンプン８ｇ／リットルとし、ｐＨ４．６、３７°Ｃ、デンプン分解酵素活性０．４ｕｎｉｔｓ／ミリリットルで反応させ、酵素反応による生成オリゴ糖量の推移をみると、図５のように、デンプン分解酵素による可溶性デンプンの分解によりグルコース（Ｇ１）乃至マルトペンタオース（Ｇ５）が生成され、そのうち主要分解物はマルトトリオース（Ｇ３）乃至マルトペンタオース（Ｇ５）であり、マルトースは生成量は多くないが徐々に生成し、グルコースは低いレベルで検出されている。
【０１０３】
一方、マルトヘキサオース（Ｇ６）以上のオリゴ糖は検出されていない。
【０１０４】
以上より、Ａ３０５株の場合、デンプン分解酵素活性の高いｐＨ３．５〜５．５域においては、主要分解物はマルトトリオース（Ｇ３）乃至マルトペンタオース（Ｇ５）で、グルコース及びマルトースも少量生成されているが、マルトヘキサオース（Ｇ６）以上のオリゴ糖は検出されていない。
【実施例５】
【０１０５】
実施例１と同じ乳酸菌及び培地を使用し、培地量を２５５ミリリットルとして、前培養液を２％（ｖ／ｖ）接種し、ｐＨ制御なしで静置培養し、３０°Ｃ、３５°Ｃ、４０°Ｃ、及び４５°Ｃのそれぞれの温度に制御した場合におけるＯ．Ｄ．６６０、全糖量、乳酸量、及びオリゴ糖生成量との関係を検証した。
【０１０６】
前記前培養液は、表１に示したＭＲＳ−可溶性デンプン培地を用い、Ａ３０５株を３０°Ｃ、２４時間静置培養したものである。
【０１０７】
図６乃至図８において、培養温度４５°Ｃに制御した場合の方が３０°Ｃ、３５°Ｃ、又は４０°Ｃに制御した場合と比較して、Ａ３０５株の生育度（Ｏ．Ｄ．６６０）が低いことから増殖が抑制されており、そのため消費される糖が少なくなって残存する全糖量が多く、かつ乳酸の生成量が少なくなることが示されている。
【０１０８】
また、オリゴ糖生成量と温度との関係は、図９乃至図１２において３０°Ｃ、３５°Ｃ、４０°Ｃ、又は４５°Ｃに温度制御した場合を示しているが、いずれの場合もグルコース、マルトース、及びマルトヘキサオース以上のオリゴ糖は検出されず、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオースが検出されている。
【０１０９】
また３０°Ｃ、３５°Ｃ、又は４０°Ｃに温度制御した図９乃至図１１においては、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオースとも、培養開始から約１０時間後までは増加しているが、その後培養時間の経過とともに減少し、３０°Ｃ及び３５°Ｃでは２４〜３０時間で検出されなくなり、４０°Ｃでは４８時間経過後には検出されなくなった。
【０１１０】
しかし、４５°Ｃに温度制御した図１２においては、マルトトリオース及びマルトテトラオースは培養開始から７２時間経過後でも増加傾向を示し、マルトペンタオースは２４時間経過後から約３０時間経過後を最大量としその後緩やかに減少しているが７２時間経過後も検出されている。
【０１１１】
これは、３０°Ｃ、３５°Ｃ、又は４０°Ｃに制御した場合は、図６より当該温度下では菌体が短時間に増殖していることから、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオースとも、デンプン分解酵素により直ちに分解され菌体により消費されるためである。
【０１１２】
これに対し、４５°Ｃに制御した場合は、図６より菌体の増殖は抑制されているが生菌体が存していることから、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオースとも、デンプン分解酵素による分解と菌体による消費が遅れて蓄積が進んでいると考えられ、この状況は例えば図３に示すｐＨ制御した場合とほぼ同じ状況である。
【０１１３】
以上より、Ａ３０５株の場合、培養温度を４５°Ｃ付近で制御すると、グルコース及びマルトースが消費され、マルトトリオース及び／又はマルトテトラオースが蓄積されて得られるマルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】Ａ３０５（乳酸菌）株を、ｐＨ制御なしで、炭素源を可溶性デンプン２０ｇ／リットルとし、３７°Ｃで培養した場合における、（イ）は培養時間とｐＨの関係を示す図、（ロ）は培養時間とオリゴ糖量の関係を示す図、（ハ）は培養時間と全糖量、乳酸量、生育度を示す図である。
【図２】Ａ３０５（乳酸菌）株を、ｐＨ６．５に制御し、炭素源を可溶性デンプン２０ｇ／リットルとし、３７°Ｃで培養した場合における、（ニ）は培養時間とオリゴ糖量の関係を示す図、（ホ）は培養時間と全糖量、乳酸量、生育度を示す図である。
【図３】Ａ３０５（乳酸菌）株を、炭素源を可溶性デンプン４０ｇ／リットルとし、３７°Ｃで培養した場合における、（ヘ）はｐＨ５．０に制御した場合の図、（ト）はｐＨ４．５に制御した場合の図である。
【図４】Ａ３０５（乳酸菌）株の培養液上清を用い、基質を可溶性デンプン８ｇ／リットルとし、３７°Ｃで、３０分間反応した場合における、（チ）は反応液のｐＨとデンプン分解酵素の相対活性の関係を示す図、（リ）は反応液のｐＨと反応液中のオリゴ糖量の関係を示す図である。
【図５】Ａ３０５（乳酸菌）株の培養液上清を用い、基質を可溶性デンプン８ｇ／リットルとし、ｐＨ４．６、３７°Ｃで反応した場合における、反応時間と反応液中のオリゴ糖量の関係を示す図である。
【図６】Ａ３０５（乳酸菌）株を、ｐＨ制御なしで、炭素源を可溶性デンプン２０ｇ／リットルとし、温度を変えて静置培養した場合の培養時間とＯ．Ｄ．６６０の関係を示す図である。
【図７】Ａ３０５（乳酸菌）株を、炭素源を可溶性デンプン２０ｇ／リットルとし、温度を変えて静置培養した場合の培養時間と全糖量の関係を示す図である。
【図８】Ａ３０５（乳酸菌）株を、炭素源を可溶性デンプン２０ｇ／リットルとし、温度を変えて静置培養した場合の培養時間と乳酸量の関係を示す図である。
【図９】Ａ３０５（乳酸菌）株を、炭素源を可溶性デンプン２０ｇ／リットルとし、温度３０°Ｃで静置培養した場合の培養時間とオリゴ糖量の関係を示す図である。
【図１０】Ａ３０５（乳酸菌）株を、炭素源を可溶性デンプン２０ｇ／リットルとし、温度３５°Ｃで静置培養した場合の培養時間とオリゴ糖量の関係を示す図である。
【図１１】Ａ３０５（乳酸菌）株を、炭素源を可溶性デンプン２０ｇ／リットルとし、温度４０°Ｃで静置培養した場合の培養時間とオリゴ糖量の関係を示す図である。
【図１２】Ａ３０５（乳酸菌）株を、炭素源を可溶性デンプン２０ｇ／リットルとし、温度４５°Ｃで静置培養した場合の培養時間とオリゴ糖量の関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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