(57)【要約】【課題】動脈硬化性疾患の予防及び治療薬の提供、並びに動脈硬化性疾患を検出するための方法及び試薬の提供。【解決手段】ヘレグリンβ1を有効成分として含む動脈硬化性疾患治療剤、及び生体試料中のヘレグリンβ1を測定することを含む、動脈硬化性疾患を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘレグリンβ1を有効成分として含む動脈硬化性疾患治療剤。
【請求項２】
動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される請求項１記載の動脈硬化性疾患治療剤。
【請求項３】
生体試料中のヘレグリンβ1を測定することを含む、動脈硬化性疾患を検出する方法。
【請求項４】
動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される請求項３記載の動脈硬化性疾患を検出する方法。
【請求項５】
生体試料が、血清、血漿及び尿からなる群から選択される請求項３又は４に記載の動脈硬化性疾患を検出する方法。
【請求項６】
生体試料中のヘレグリンβ1を測定することを含む、動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
【請求項７】
動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される請求項６記載の動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
【請求項８】
生体試料が、血清、血漿及び尿からなる群から選択される請求項６又は７に記載の動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
【請求項９】
ヘレグリンβ1からなる、動脈硬化性疾患を検出するための診断用マーカー。
【請求項１０】
動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される請求項９記載の動脈硬化性疾患を検出するための診断用マーカー。
【請求項１１】
抗ヘレグリンβ1抗体を含む、ヘレグリンβ1を動脈硬化性疾患の検出のための診断用マーカーとして用いる、動脈硬化性疾患の検出用試薬。
【請求項１２】
動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される請求項１１記載の動脈硬化性疾患の検出用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘレグリンβ1をターゲットとして、動脈硬化性疾患を予防又は治療する薬剤に関し、さらに、ヘレグリンβ1をターゲットとして、動脈硬化性疾患を検出する方法及び検出薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
平成18年（2006年）の厚生労働省人口動態統計によると、本邦のがんによる死亡者数は32万9千人で死因の第一位を占める。がんに続き、死因の第二位を心臓病（17万3千人）、第三位を脳卒中（12万8千人）が占める。心臓病と脳卒中による死亡者数を合計するとほぼがんによる死亡者数に匹敵する。その中で特に、心臓病の代表である虚血性心疾患や、脳卒中の代表的病型である脳梗塞は動脈硬化を基礎病態として発症する。従って動脈硬化の発症・進展を予防することは、国民の健康維持、増進に重要な意味をもつ。
【０００３】
動脈硬化の初期病変に特徴的な病理所見に、細胞内にコレステロールエステルを蓄積したマクロファージ由来泡沫細胞の集積がある。マクロファージは種々のスカベンジャー受容体(CD36、scavenger receptor class A [SR-A])を介して酸化低密度リポタンパク質（酸化LDL）やアセチル化LDLなどの変性LDLを細胞内に取込む。変性LDLの主要コレステロールであるコレステロールエステルはリソソームで遊離コレステロールと脂肪酸に分解される。細胞内の遊離コレステロールが過剰になると、２つの機構により調節を受ける。第1はATP-binding cassette transporter A1（ABCA-1）、ATP-binding cassette transporter G1 (ABCG-1)、scavenger receptor class BI (SR-BI)による細胞外へのコレステロールの排出で、第2はacyl-CoA:cholesterol acyltransferase-1（ACAT-1）によるコレステロールエステルへの変換である。コレステロールエステルが細胞質に蓄積するとマクロファージは泡沫細胞に変化する。マクロファージ由来泡沫細胞は種々のサイトカインを分泌し、動脈中膜から内膜への血管平滑筋細胞の遊走や内膜での増殖を誘導する。内膜に遊走してきた血管平滑筋細胞は細胞外マトリックスを合成分泌し、その結果内膜が肥厚する。内膜の肥厚によって血管内腔は狭窄し血流が減少する。動脈硬化の中期以降には血管平滑筋細胞に由来する泡沫細胞も認められる。
【０００４】
ヘレグリン(Heregulin)は、ニューレグリン（Neuregulin）ファミリーのタイプI（細胞外ドメインに上皮成長因子(EGF)様構造ドメイン及びIgDドメインを持つ膜タンパク質）に属するタンパク質である（非特許文献１）。ヘレグリンは、サブタイプとして選択的スプライシングの違いにより、α、β1、β2及びβ3がある。ヘレグリンαは６７残基アミノ酸からなり、ヘレグリンβ１は７２残基アミノ酸からなる（図１）。ヘレグリンα、β1ともにerbB3受容体及びerbB4受容体と結合するが、erbB3受容体よりerbB4受容体に高い親和性を示し、またerbB4受容体に対しての結合能はβがαの100倍以上である。ヘレグリンの生体内での役割に関しては、シュワン細胞の増殖による神経ネットワークの構築への関与、血管新生への関与（非特許文献２）、心機能の改善への関与（非特許文献３及び４）、ヒト内皮細胞での血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の発現増加への関与（非特許文献５）、THP-1 (Human acute monocytic leukemia cell line)での高発現（非特許文献６）、ヒト動脈硬化巣での発現（非特許文献７及び８）、ラット頸動脈バルーン傷害後の血管平滑筋細胞増殖による再狭窄の抑制（非特許文献９）等が報告されてきた。しかし、脂質蓄積を伴うマクロファージの泡沫化による粥状動脈硬化に対するヘレグリンのはっきりとした作用は未だに明らかにされてこなかった。
【０００５】
【非特許文献１】Holmes WE et al., Science 1992;256:1205-10
【非特許文献２】Russell KS et al., Am J Physiol Heart Circ Phisiol 1999; 46:H2205-11
【非特許文献３】Liu X et al., J Am Coll Cardiol 2006;48:1438-47
【非特許文献４】Fukazawa R et al., J Mol Cell Cardiol 2003;35:1473-9
【非特許文献５】Bagheri-Yarmand R et al., J Biol Chem 2000;275:39451-7
【非特許文献６】Mograbi B et al., Eur Cytokine Netw 1997;8:73-81
【非特許文献７】Panutsopulos D et al., J Vasc Res 2005;42:463-74
【非特許文献８】Sigala F et al., Eur J Vasc Endovasc Surg 2006;32:238-45
【非特許文献９】Clement CM et al., J Vasc Res 2007;44:303-12
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、動脈硬化性疾患の予防及び治療薬の提供を目的とし、さらに動脈硬化性疾患を検出するための方法及び試薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヒト動脈硬化病巣に発現しているヘレグリンβ1は、既知の血管作動性物質であるアンジオテンシンII、ウロテンシンIIやセロトニンと同様にマクロファージに作用してマクロファージの泡沫化に影響を与え、動脈硬化病変の形成に何らかの役割を担っているのではないかと推測した。そこで、本発明者等は、マクロファージ泡沫化の制御、並びに、それに必要不可欠な細胞内コレステロールエステル化酵素であるACAT-1の発現調節、スカベンジャー受容体及びコレステロール細胞外搬出の機能制御に焦点を当て、ヘレグリンβ1の効果を検討することにより、動脈硬化病変形成においてヘレグリンβ1が病態生理学的に一定の役割を担っていることを見出した。具体的には、本発明者等は、ヘレグリンβ1がマクロファージの泡沫化を直接抑制すること、かつ、動脈硬化の病変形成を抑制することを証明し、ヘレグリンβ1が動脈硬化性疾患の予防又は治療に用いることができることを見出した。また、生体試料すなわち血漿及び動脈硬化病変サンプル中のヘレグリンβ1の濃度や発現の低下が動脈硬化の存在や重症度を示すことを明らかにし、ヘレグリンβ1を動脈硬化性疾患の検出のマーカーとして用いることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  ヘレグリンβ1又はヘレグリンβ1のアゴニストを有効成分として含む動脈硬化性疾患治療剤。
[２]  動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される[１]の動脈硬化性疾患治療剤。
[３]  生体試料中のヘレグリンβ1を測定することを含む、動脈硬化性疾患を検出する方法。
【０００９】
[４]  動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される[３]の動脈硬化性疾患を検出する方法。
[５]  生体試料が、血清、血漿及び尿からなる群から選択される[３]又は[４]の動脈硬化性疾患を検出する方法。
[６]  生体試料中のヘレグリンβ1を測定することを含む、動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
【００１０】
[７]  動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される[６]の動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
[８]  生体試料が、血清、血漿及び尿からなる群から選択される[６]又は[７]の動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
[９]  ヘレグリンβ1からなる、動脈硬化性疾患を検出するための診断用マーカー。
【００１１】
[１０]  動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される[９]の動脈硬化性疾患を検出するための診断用マーカー。
[１１]  抗ヘレグリンβ1抗体を含む、ヘレグリンβ1を動脈硬化性疾患の検出のための診断用マーカーとして用いる、動脈硬化性疾患の検出用試薬。
[１２]  動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される[１１]の動脈硬化性疾患の検出用試薬。
【発明の効果】
【００１２】
実施例に記載のように、ヘレグリンβ1は、マクロファージの泡沫化を抑制することにより、動脈硬化病変形成を抑制するので、動脈硬化性疾患の予防又は治療剤として用いることができる。さらに、血漿及び動脈硬化病変サンプル等の生体試料中のヘレグリンβ1の濃度の極端な低下は、動脈硬化病変の形成及び進展と深く関連しているので、生体試料中のヘレグリンβ1を動脈硬化性疾患の検出やリスク評価のためのマーカーとして用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
ヘレグリンβ1は、７２残基のアミノ酸からなるペプチドである（配列番号１）。図１にヘレグリンα（配列番号２）、ヘレグリンβ1、ヘレグリンβ2（配列番号３）、ヘレグリンβ3（配列番号４）のアミノ酸配列を示す。
【００１４】
ヘレグリンβ1は、ヒト単球由来マクロファージにおいて、アチル化LDLによるコレステロールエステル蓄積（泡沫化）を抑制させる。その分子機序として、ヘレグリンβ1によってACAT-1発現の抑制による細胞内コレステロールエステル蓄積の減少、SR-A発現抑制によるアチル化LDLの取込み減少、及びABCA-1発現促進によるapoA1を介するコレステロール搬出機構の増加がみられることが挙げられる。
【００１５】
また、動脈硬化モデル動物であるapoE欠損マウスに対しヘレグリンβ1を慢性持続投与すると動脈硬化形成の抑制が認められる。さらに、労作性狭心症患者や急性冠症候群患者（発症時）の血漿ヘレグリンβ1濃度の顕著な低下が認められる。
【００１６】
マクロファージの泡沫化とは、マクロファージが酸化LDLやアチル化LDL等の変性LDLを取込むことにより起こり、血管壁において脂質の沈着をもたらす現象である。マクロファージの泡沫化は、細胞内でのコレステロールエステルの生成・蓄積に起因する。アセチル化LDLがマクロファージの細胞膜上のSR-Aを介して取込まれると、アセチル化LDL由来のコレステロールから産生されたコレステロールエステルが細胞内に蓄積する結果、マクロファージの泡沫化が生じる。マクロファージが泡沫細胞に変化すると粥腫（プラーク）の形成が起こり、これを中核とした動脈硬化の初期病変が形成される。
【００１７】
ヘレグリンβ1は、マクロファージの泡沫化を抑制することにより、動脈硬化病変形成を抑えるので、ヘレグリンβ1は動脈硬化性疾患の予防又は治療に用いることができる。また、ヘレグリンβ1のアゴニストもヘレグリンβ1と同様に動脈硬化性疾患の予防又は治療に用いることができる。ここで、ヘレグリンβ1のアゴニストとは、ヘレグリンβ1の作用を促進するあらゆる化合物が含まれる。例えば、ヘレグリンβ1の受容体に結合し、ヘレグリンβ1と同様の作用を示す化合物やアゴニスティックな活性を有する抗ヘレグリンβ1受容体抗体等が挙げられる。
【００１８】
動脈壁が厚くなり弾力性が失われて硬くなったり、内部にコレステロールエステルが沈着して（プラークの形成）、血管の通り道が狭くなったり（狭窄）、詰ったり（閉塞）、あるいは動脈壁が部分的に拡張したり（動脈瘤）、動脈全体が拡張したり（拡張症）、内膜の亀裂により中膜が裂けたり（解離）、破裂する（出血）ことにより、組織や臓器全体に血行障害を起こす病気を総称して動脈硬化性疾患という。本発明においては、これらの動脈硬化性疾患のみならずこれらに起因する急性冠症候群、心筋梗塞や狭心症などの虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症、閉塞性動脈硬化症等の予防又は治療を動脈硬化性疾患の予防又は治療という。ここで、急性冠症候群とは、動脈硬化性プラークの破裂により血栓が形成され、冠動脈の血流が極端に減少又は完全に途絶して生じる病態をいい、臨床的には不安定狭心症や急性心筋梗塞等が含まれる。また動脈硬化には、(1)大動脈や脳動脈、冠動脈などの比較的太い動脈に起こり、動脈の内膜にコレステロールエステル（融点：40℃）が粥状に蓄積してアテロームプラークができ、次第に肥厚することで動脈の内腔を狭めるアテローム硬化、(2)高血圧による変化で、脳や腎臓内の細い動脈に起き易く、詰まったり（梗塞）、血管壁全体が破裂して出血する細動脈硬化、(3)動脈の中膜にカルシウムが沈着し硬く脆くなるメンケルベルグ型硬化を含む。また、本発明は主に動脈壁の肥厚やプラーク形成に対する予防又は治療に用いることもできる。
【００１９】
ヘレグリンβ1は、アミノ酸配列情報に従って、化学合成により作製することや遺伝子工学的に作製することができる。また、アミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、ヘレグリンβ1の活性を有するペプチドを本発明の動脈硬化性疾患の予防又は治療薬として用いることができる。ここで、１個又は数個とは、１〜３個、好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個である。
【００２０】
ヘレグリンβ1は、動脈硬化性疾患の予防又は治療剤として用いることができる。
投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、1日約0.01〜1000 mgであり、これらを1回又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、1回約0.01〜1000 mgを皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。また、投与時期としては、動脈硬化性疾患の臨床症状が生ずる前でも後でもよい。
【００２１】
本発明の予防又は治療剤は、種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注射剤、点滴剤、坐剤等による非経口投与を挙げることができる。
【００２２】
本発明のヘレグリンβ1を含む動脈硬化性疾患の予防又は治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。実際の添加物は、本発明の予防又は治療剤の剤型に応じて上記の中から単独又は適宜組み合わせで選択されるが、もちろんこれらに限定するものではない。
【００２３】
本発明は、さらに生体試料中のヘレグリンβ1を測定することにより、生体試料を採取した被験体が動脈硬化性疾患に罹患しているか否かを検出する方法、動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法、及び動脈硬化性疾患に罹患するリスクを評価する方法を包含する。特に、狭心症及び急性冠症候群の虚血性心疾患の検出に好適に用いることができる。
【００２４】
生体試料としては、全血、血清、血漿、尿等が挙げられる。これらの生体試料中のヘレグリンβ1を定量又は定性により測定すればよい。
【００２５】
ヘレグリンβ1の測定は、放射性免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法(EIA)、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、蛍光測定法等の免疫学的測定法により行うことができる。
【００２６】
ヒト血漿中のヘレグリンβ1の濃度は、健常者39例の7.8±1.2 ng/mL (Mean±SEM、以下同じ)に対し、労作性狭心症患者33例では2.0±0.4 ng/mL、急性冠症候群患者27例では1.3±0.3 ng/mLと有意に低かった(p<0.0001)。従って、被験体の血漿中ヘレグリンβ1濃度がカットオフ値より低い場合に、該被験体は、動脈硬化性疾患に罹患しているか、又は動脈硬化性疾患に罹患するリスクが極めて高いと判定することができる。今回、上記集団を対象にカットオフ値を検討した結果、労作性狭心症及び急性冠症候群の虚血性心疾患を示すヘレグリンβ1のカットオフ値を£1.4 ng/mLとしたところ、感度は57%、特異度は90%、診断効率は70%であった。また、労作性狭心症及び急性冠症候群の虚血性心疾患において、冠動脈の１枝病変、２枝病変、３枝病変と、動脈硬化病変が進行した被験体ほど、血漿中のヘレグリンβ1濃度が低く、血漿ヘレグリンβ1濃度は動脈硬化性疾患の重篤度が大きいほど低下する。
【００２７】
さらに、被験体から採取した生体試料中のヘレグリンβ1を定期的に測定し、ヘレグリンβ1濃度をモニターすることにより、動脈硬化性疾患の進行の把握や治療効果の判定に役立つことができる。
【００２８】
ヘレグリンβ1は、動脈硬化性疾患の検出・診断のためのマーカーとして用いることができる。本発明は、ヘレグリンβ1の、動脈硬化性疾患を検出するための検出用マーカーとしての使用を包含し、さらにヘレグリンβ1からなる、動脈硬化性疾患を検出・診断するための疾患検出・診断用マーカーを包含する。
【実施例】
【００２９】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３０】
実施例１  ヒト単球・マクロファージにおけるヘレグリン、ヘレグリンβ1、それらの受容体であるerbB3及びerbB4のタンパク質発現の変化
ヒト末梢血液から単球を調製し、７日間培養してマクロファージに分化させた。ヒト末梢血液からの単球の調製は公知の方法で行った。3.5 cm dishに10% ヒト血清含有RPMI-1640培養液 1 mL中に1.3×10６になるように単球を播種し、5% CO2、37℃の条件下で７日間培養した。播種後1日目、3日目、5日目、7日目に培養液を全量採取し、dishをPhosphate buffered saline (PBS)で洗浄後、一旦-80℃で冷凍した。7日目に解凍し、7日目の細胞とともに80μLの10％ Sodium dodecyl sulfate (SDS)で可溶化した。セルスクレーパーで細胞抽出液をかき集め1 mLテルモシリンジ、23Gの注射針で破砕、断片化した後、15,000 rpm（日立himac CF15D2微量高速冷却遠心機）で3分間遠心した。上清のタンパク質濃度をBicinchoninic acid (BCA) 法(Pierce)で測定し、細胞抽出液としてウエスタンブロットに使用した。また採取した培養液はELISAキット(human NRG-β1/HRG-β1, R&D)にてヘレグリンβ1濃度を測定した。
【００３１】
ヘレグリン、ヘレグリンβ1、erbB3、erbB4タンパク質の検出
各々の一次抗体であるanti-heregulin antibody (Sigma)、anti-human NRG-β1/HRG-β1 antibody (R&D)、anti-erbB3 antibody (Sigma)、anti-human erbB4 antibody (Abgent)と室温で１時間反応させた後、各々の2次抗体と室温で１時間反応させた。PBS-0.1% Tween 20で洗浄後に、Lumi-Light Plus (PerkinElmer Life Sciences)を用いて各々のタンパク質を検出した。
【００３２】
ヘレグリン及びヘレグリンβ1のタンパク質発現は、単球からマクロファージに分化する過程の５日目から増加し、マクロファージに分化し終わった７日目において有意に増加していた(p<0.001、p<0.05、図2A及び図2B)。erbB3及びerbB4受容体の発現は、培養３日目、５日目で有意に増加し(p<0.05)、７日目でも有意に増加していた(p<0.01、図2C及び図2D)。また、培養液中の内因性ヘレグリンβ1濃度は、培養３日目から有意に増加し(p<0.005)、５日目及び７日目ではその増加はプラトーに達した(p<0.05、図3)。
【００３３】
実施例２  ヒト単球由来マクロファージの泡沫化（細胞内コレステロールエステル蓄積）に対するヘレグリンα及びβ1の効果
マクロファージの泡沫化を測定する方法としてCholesterol esterification assayを用いた[Goldstein JL et al., Methods Enzymol 1983;98:241-60]。マクロファージはスカベンジャー受容体を介してアセチル化LDLを細胞内に取込みリソソーム分解に導く。リソソームで生じた遊離コレステロールが小胞体に運搬され、ACAT反応によりコレステロールエステルに変換される。培地中に[3H]oleateを添加しておくと[3H]oleateは細胞内に取込まれアシルCoAシンターゼにより[3H]oleoyl-CoAに変換される。ACATはアセチル化LDL由来の遊離コレステロールとこの[3H]oleoyl-CoAを基質としてcholesterol [3H]oleateを産生する。細胞内に蓄積したcholesterol [3H]oleateの放射活性がコレステロールエステル蓄積の鋭敏な指標となる。
【００３４】
ヒト血漿LDLは以下の方法で精製した。
ヒト血漿からSequential flotation ultracentrifugationによりLDL (d = 1.019-1.063)を精製した[Schumaker VN et al., Methds Enzymol 1986;128:155-70]。ヒト血漿 350 mLを6本の遠心管に分注しRP-42 Rotorを用いて、100,000 x g (36,000 rpm)、4℃で20時間超遠心した。カイロミクロンと超低密度リポタンパク質 (VLDL)を含む白濁した上層を除き、アスピレーターを用いて下層の黄色層を回収した。このカイロミクロン、VLDLを除いた血漿画分の容積をメスフラスコで、比重を浮沈式比重計 (Hydrometer)で測定し、d = 1.063になるまでsolid KBrを加えた。カイロミクロン、VLDLを除いた血漿画分の容積をV、比重をDとすると、比重1.063g/mLを得るために加えるべきKBrの量は次の式で近似できる。
KBr (g) = V (1.063-D) / 0.68323。
【００３５】
d = 1.063に調整したLDLを含む血漿画分の半量を6本の遠心管に分注し、Density solution (d = 1.063)を遠心管の肩まで入れた。RP-42 Rotorを用いて100,000 x g (36,000 rpm)、4℃で20時間超遠心し、上層の黄色層（粗LDL）をパスツールピペットで回収した。残りの半量も同様に分注して超遠心し、上層の黄色層（粗LDL）を回収した。２回の操作で得られた粗LDLを合体し、再び６本の遠心管に分注した。Density solution (d = 1.063)を遠心管の肩まで入れ、RP-42 Rotorを用いて100,000 x g (36,000 rpm)、4℃で20時間超遠心し、上層の黄色層(精製LDL)を回収した。LDLを透析膜に入れ、低温室内でEDTA-Saline 4 Lを用いて透析を行った。この12時間の透析を3回繰り返した。Ultrafiltration Cell Model 8200（Amicon）でタンパク質濃度を2 mg/mL程度まで濃縮し、フィルターでろ過滅菌した。BCA法でタンパク質濃度を測定し、以下のアセチル化LDLの調製に用いた。
【００３６】
アセチル化LDLは以下の方法で調製した。
LDL 30 mg protein（2.0 mg protein/mLであれば15 mL）に同じ容積の飽和酢酸ナトリウムを加えた。氷上で冷却、スターラーバーで撹拌しながら、無水酢酸150μL (5μL/LDL mg protein)を5μLずつ滴下した[Miyazaki A et al., J Biol Chem 1994;269:5264-9]。この時pHメータでモニターし、pHが6.5以下にならないように、5 N NaOHを滴下して中和した。氷上で１時間静置した後、低温室内でEDTA-Saline 4 Lを用い透析を行った。この12時間の透析を3回繰り返した後、Ultrafiltration Cell Model 8200で濃縮し、フィルターでろ過滅菌した。BCA法を用いてタンパク質濃度を測定し、実験に用いた。
【００３７】
以下の操作において、用いた試薬は以下のとおりである。
[9,10(n)-3H] oleic acid (185 MBq in toluene 1mL, GE Healthcare Bio-Science), oleic acidのモル濃度は0.625 mM
3 mM Oleic acid-Albumin from bovine serum (Sigma)；Albuminの濃度は100 mg/mL (1.5 mM)で、1 mol当たり2 molのoleic acidが結合している。
【００３８】
3mM [3H]oleic acid mixtureの調製
[9,10(n)-3H] oleic acid 50μL (9.25 MBq)をガラス製ビーカーに入れ、窒素で乾固した。ガラス製ビーカーに3 mM Oleic acid-Albumin from bovine serum (Sigma) 5 mLを注ぎ、スターラーバーで5時間撹拌した後、0.2μmのフィルターでろ過滅菌した。
【００３９】
薄層クロマトグラフィー(TLC)は以下のように行った。
TLC standard として、isopropanol 4 mLにcholesterol oleate (Sigma) 20 mgを添加して温浴中で60℃に加温して溶解し、さらに0.91 g/mL glyceryl trioleate (Sigma) 20μLを加えた。 TLC aluminum sheets 20×20 cm, silica gel 60 F254 (Merck)にキャピラリーでTLC standardを60μLスポットした。展開溶媒として hexane/diethylether/acetic acid (90：10：1, v/v)を調製した。
【００４０】
末梢血ヒト単球（1.3×106/3.5 cm dish）を10%ヒト血清含有RPMI-1640培地1 mLで７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時に0〜25 ng/mLのヘレグリンα (Sigma)又はヘレグリンβ1 (Sigma)を添加しておき、細胞内コレステロールエステル蓄積に対する効果を検討した。7日目に培地を交換し、0〜10μg/mLのアセチル化LDL、3 mM [3H]oleic acid mixture 67μL（最終濃度は0.1 mM）、上記濃度のヘレグリンβ1を添加し、適量の培地を加えて計1 mLとし、さらに18時間培養した。細胞をPBSで3回洗浄後、hexane/isopropanol (3：2, v/v) 1 mLをdishに加え、室温で1時間静置した。hexane/isopropanolを脂質抽出管に回収し、さらに新しい同液1 mLをdishに加え細胞とdish壁を洗い込んで同じ脂質抽出管に回収した。脂質抽出後のdishにはタンパク質抽出のため1 N NaOH 1 mLを加えた。脂質抽出管をvortexし、室温で30分間静置した後、窒素で乾固した。抽出した細胞脂質をisopropanol 60μLを加えてvortexしながら溶解した。全量をstandard spotの間にブロードにスポットし、展開溶媒hexane /diethylether /acetic acid (90：10：1, v/v)がTLCプレートの上端に達するまでTLCで展開した。ガラスチャンバー内にTLCプレートを置いてヨードで脂質を発色させ、cholesterol oleateに相当する位置をハサミで切り取り、シンチレーションバイアルに入れた。シンチレーションカクテル(Perkin Elmer) 3 mLを加え測定した。先程dishに加えておいた1N NaOHを回収し、BCA法にて細胞タンパク質を定量した。3 mM [3H]oleic acid mixtureの比活性(dpm/nmol)を測定し、細胞内で産生されたcholesterol [3H]oleateの放射活性(dpm)を[3H]oleic acidの比活性(dpm/nmol)と細胞タンパク質量(mg)で除してcholesterol esterification (nmol/mg cell protein)を算出した。
【００４１】
ヘレグリンを添加していない細胞（コントロール）では、アセチル化LDL (0、5、10μg/mL)の濃度依存性にcholesterol [3H]oleateの蓄積は増加した(p<0.0001、図4A)。ヘレグリンβ1 (10 ng/mL)は、アセチル化LDL (5、10μg/mL)によるcholesterol [3H]oleateの蓄積を40％程度に減少させた(p<0.05、図4A)。一方、同濃度のヘレグリンαには有意な作用を認めなかった(図4A)。
【００４２】
並びに、アセチル化LDLの濃度を10μg/mLとした時の、細胞内cholesterol [3H]oleateの蓄積に対するヘレグリンα又はβ1の濃度依存性の効果を検討した。ヘレグリンαには、有意な作用は認められなかったが、ヘレグリンβ1は濃度依存性にcholesterol [3H]oleateの蓄積を有意に減少させ、10 ng/mLの濃度で最大40％減少させた(p<0.001、図4B)。
【００４３】
実施例３  ヒト単球・マクロファージにおけるSR-A、CD36、ACAT-1、ABCA-1、ABCG-1、SR-BIのタンパク質発現に対するヘレグリンα及びβ1の効果
ヘレグリンα又はβ1とともに同条件下で培養したヒト単球／マクロファージをPBSで２回洗浄後、各dishに10%SDS 80μLを加えて可溶化した。セルスクレープ後、同注射器で破砕、断片化し、15,000 rpmで3分間遠心した。上清のタンパク質濃度をBCA法で測定し、細胞抽出液としてウエスタンブロットに使用した。
【００４４】
本発明の実施例におけるウエスタンブロットによるヒト単球・マクロファージにおけるACAT-1をはじめその他の遺伝子のタンパク質の解析は以下の方法で行った。
【００４５】
ACAT-1タンパク質の検出
ACAT-1タンパク質検出のため、ウサギを免疫して作成した抗ヒトACAT-1ポリクローナル抗体(DM10, Dartmouth Medical School, Chang教授より供与)[Chang CCY et al., J Biol Chem 1995;270:29532-40]を１次抗体として使用し（最終濃度0.5μg/mL）、室温でtransfer membraneと１時間反応させた。PBS-0.1% Tween 20でtransfer membraneの洗浄を行い、2次抗体（anti-rabbit IgG donkey antibody conjugated with horseradish peroxidase [GE Healthcare Bio-Science]）と室温で１時間反応させた。PBS-0.1% Tween 20で洗浄後、Lumi-Light Plus を用いてACAT-1タンパク質を検出した。
【００４６】
SR-A、CD36、ABCA-1、ABCG-1、SR-BIタンパク質の検出
各々の一次抗体であるanti-human SR-A antibody (R&D)、anti-human CD36 antibody (R&D)、anti-human ABCA-1 antibody (Novus)、anti-human ABCG-1 antibody (Novus)、anti-human SR-BI (Novus)と室温で１時間反応させた後、各々の2次抗体と室温で１時間反応させた。PBS-0.1% Tween 20で洗浄後に、Lumi-Light Plusを用いて各々のタンパク質を検出した。
【００４７】
末梢血ヒト単球（1.3×106 cells/3.5 cm dish）を10%ヒト血清含有 RPMI-1640培地1 mLで７日間培養してマクロファージに分化させた。SR-A、CD36、ACAT-1、ABCA-1、ABCG-1、SR-BIのタンパク質発現に対するヘレグリンα又はβ1の用量依存的効果を検討するため、0〜25 ng/mLのヘレグリンα又はβ1を培養当初から培地に添加した。ヘレグリン及び培地交換は３日毎に行った。単球からマクロファージに分化した7日目の細胞をPBSで洗浄後、80μLの10％SDSで可溶化し、前記の特異抗体を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、ヘレグリンβ1は濃度依存的にSR-A及びACAT-1のタンパク質発現を抑制し、10 ng/mLの濃度で各々50％まで抑制した（p<0.05、図5B; p<0.005、図7B）。またヘレグリンβ1はABCA-1のタンパク発現を濃度依存的に増加させ、1 ng/mLの濃度で2.2倍に増加させた(p<0.005、図7B)。しかし、ヘレグリンβ1はCD36、ABCG-1、SR-BIのタンパク質発現に対しては有意な変化を及ぼさなかった（図6B、図9B及び図10B）。一方、ヘレグリンαはABCA-1のタンパク質発現を1.8倍に増加させたが(p<0.05、図8A)、それ以外の遺伝子の発現に対しては有意な作用を示さなかった（図5A、図6A、図7A、図9A及び図10A）。
【００４８】
次に、単球・マクロファージの分化段階におけるヘレグリンα又はβ1の前記で変化を認めたSR-A、ACAT-1、ABCA-1のタンパク質発現に対する時間依存的効果を検討した。単球の分化マーカーとしてCD68のタンパク質発現と比較検討した。ヒト末梢血単球（1.3×106 cells/3.5 cm dish）を7日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時にSR-A及びACAT-1の検討には10 ng/mLのヘレグリンα又はβ1を、ABCA-1の検討には1 ng/mLのヘレグリンα又はβ1を添加して、播種後1日目、3日目、5日目、7日目にそれぞれのdishをPBSで洗浄した。1日目、3日目、5日目に反応を止めたdishは一旦-80℃で冷凍して7日目に解凍し、7日目の細胞とともに80μLの10％SDSで可溶化した。ウエスタンブロット法で検討した結果、ヘレグリン添加なしで単球からマクロファージに分化させた細胞（コントロール）ではSR-A、ACAT-1、ABCA-1はCD68とともに発現が増加した（図11）。ヘレグリンαはSR-A及びACAT-1の発現に対しては有意な作用を示さなかったが、ABCA-1の発現を培養７日目で３倍に増加させた(p<0.05、図11)。ヘレグリンβ1で処理した細胞では、培養７日目でSR-A及びACAT-1の発現は各々50%まで減少しており(p<0.05)、ABCA-1の発現は3.8倍に増えヘレグリンαで処理された細胞よりも増加していた(p<0.01、図11)。
【００４９】
実施例４  ヒト単球由来マクロファージにおけるSR-A、ACAT-1、ABCA-1のmRNA発現に対するヘレグリンβ1の効果
Rneasy（登録商標）Protect Mini Kit (Qiagen)を用いてRNAを抽出した。
7日間培養した細胞の培地をぬき、細胞破砕のためBuffer RLT 400μLを加え、スクレープした。細胞ライセートをQIA Shredder Spin Column (Qiagen)にて15,000 rpmで2分間遠心(日立himac CF15D2)し、ホモジナイズ後、ライセートと同量の70%エタノールを加え、ピペッティングした。サンプルをRneasyスピンカラムにて12,000 rpmで15秒間遠心し、RNAをトラップした後、Buffer RW1 700μLを加えて12,000 rpmで15秒間遠心し、カラムメンブレンを洗浄した。そのRNeasyスピンカラムにBuffer RPE 500μLを加え12,000 rpmで15秒間 + 2分間遠心し、カラムメンブレンを洗浄、乾燥させた。同RNeasyスピンカラムを15,000 rpmで1分間遠心し、水分を完全に除去した後にRnaseフリー水 30μLを加えて12,000 rpmで1分間遠心し、RNAを溶出した。このRNA溶液の濃度を260 nmの波長で吸光度を測定することで求め、各濃度が同一になるようにRnaseフリー水を加えた。
【００５０】
次いで、SR-A、ACAT-1、ABCA-1 mRNAについてreal-time reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)法を用いてRNA発現を定量解析した。
【００５１】
下記のそれぞれのhuman mRNA配列を用いてPrimer Express Version 1.0 (PE Biosystems)  によりprimer配列を決定した。
SR-A
Forward  Primer：5’-CACGAGGATTTCCAGGTCCAA（配列番号５）
Reverse  Primer：5’-CGACCAGTCGAACTTTCGTAAATG（配列番号６）
ACAT-1
Forward  Primer：5’-TTCGGAATATCATCAAACAGGAGCC（配列番号７）
Reverse  Primer：5’-CACACCTGGCAAGATGGAGTT（配列番号８）
ABCA-1
Forward  Primer：5’-ATTCGCTCTGAGATGAGCACCA（配列番号９）
Reverse  Primer：5’-TTTCAAGCGGGCATAGAACCA（配列番号１０）
GAPDH
Forward  Primer：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC（配列番号１１）
Reverse  Primer：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA（配列番号１２）
【００５２】
ヘレグリンβ1 (0、1、10 ng/mL)で処理した末梢血ヒト単球（4×106 cells/6 cm dish）を10% ヒト血清含有 RPMI-1640培地2 mLで７日間培養してマクロファージに分化させた。ヘレグリンβ1で処理した細胞と、無処理の細胞からtotal RNAを抽出し、このtotal RNA 1μｇをHigh Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems)を用いて逆転写反応を行いcDNAを合成した。
【００５３】
このcDNAからSYBR Premix Ex Taq（商標） II (Takara)を用いてreal-time PCRをABI Prism（登録商標）7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)にて行った。
【００５４】
次いで、以下の方法により逆転写反応を行った。
Total RNA溶液25μL（1μg）にRT buffer 100μL、RT enzyme mix 10μL、Rnaseフリー水65μLを加え、37℃で1時間反応させた。95℃で5分間変性後、氷上冷却した。
【００５５】
Real-time RT-PCRは以下の方法により行った。
逆転写反応で得られたcDNA溶液2μLにSYBR Premix Ex TaqII 25μL、primer溶液（Forward + Reverse 10μM each）2μL、Rox Reference Dye 1μL、Rnaseフリー水2μLを加え反応させた。
【００５６】
PCR cycleは95℃で10秒間、次いで（95℃で5秒間、60℃で31秒間）の40サイクル後、95℃で15秒間、60℃で1分間、95℃で15秒間行った。
【００５７】
ヘレグリンβ1 (10 ng/mL)はSR-AのmRNA発現を20%抑制し(p<0.001、図12A)、ACAT-1のmRNA発現を50%抑制した(p<0.001、図12B)。またヘレグリンβ1 (1 ng/mL)はABCA-1のmRNA発現を1.8倍に促進した(p<0.0001、図12C)。
【００５８】
実施例５  アセチル化LDLの細胞取込み能（SR-A活性）の検討
スカベンジャー受容体は、マクロファージに発現するリポタンパク質受容体で、酸化LDLやアセチル化LDLなどの変性LDLを認識してエンドサイトーシスに導く。細胞内に取込まれたこれらのリガンドはリソソームで分解される。スカベンジャー受容体はマクロファージの泡沫細胞化には極めて重要な役割を果たしている。スカベンジャー受容体には、SR-A、CD36、Lectin-like oxidized LDL receptor-1 (LOX-1)、CD68などが知られる[Greaves DR et al., J Lipid Res 2005;46:11-20]。酸化LDLはこれら４種のスカベンジャー受容体すべてに結合するが、アセチル化LDLが結合するスカベンジャー受容体はSR-Aのみである。
【００５９】
本実験では変性LDLの代表としてアセチル化LDLをリガンドとして用い、アセチル化LDLを認識する唯一のスカベンジャー受容体であるSR-Aの活性を測定した。細胞内に取込まれたアセチル化LDLのタンパク質部分（apoB100）はリソソームでのタンパク質分解酵素によってペプチドまで分解され、細胞外に排出される。Association assayでは細胞表面又は細胞内に存在する125Iの放射活性を測定し、Degradation assayではリソソームでペプチドに断片化され細胞外に排出された[125I]アセチル化LDL（apoB100の断片ペプチド）の放射活性を測定した。この２つのassayによりSR-A活性を測定した。
【００６０】
末梢血ヒト単球（1.3×106cells/3.5 cm dish）を10% ヒト血清含有 RPMI-1640培地1 mLで７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時に0〜10 ng/mLのヘレグリンβ1を添加し、[125I]アセチル化LDLのエンドサイトーシス活性（SR-A活性）に対する効果を検討した。7日目に培地を交換し、[125I]アセチル化LDL (10μg/mL)と上記濃度のヘレグリンβ1、適量の培地を加えて全量を1 mLとし、18時間培養後、Association assay及びDegradation assayを行った。
【００６１】
(1) Association assay
細胞を3%ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBSで一度洗った後、PBSで二度洗った。0.1 N NaOH 1 mLを加えて室温で30分間静置した。細胞をポリスチレンチューブ（15 mL）に回収し、さらに1 mLの0.1N NaOHで洗い込んで回収した。細胞抽出液の全量をγカウンターで測定し、その一部を用いてBCA 法にてタンパク質濃度を測定した。細胞抽出液の放射活性(cpm)を[125I]アセチル化LDLの比活性 (cpm/μg)、dish当たりの細胞タンパク質量(mg)で除して、[125I]アセチル化LDLのCell-association (μg/mg cell protein)を算出した[Miyazaki A et al., J Biol Chem 1994;269:5264-9]。
【００６２】
(2) Degradation assay
上記細胞の培養上清から750μLをポリスチレンチューブ（15 mL）に分取し、40%トリクロロ酢酸を250μL、0.7 M AgNO3を200μL加え、vortexしてから2,500 rpm（TOMY, LC-120低速遠心機, ローター 7015-06）で10分間遠心した。アセチル化LDLのヨードラベルの段階でタンパク質と反応しなかったフリーの125Iはゲルろ過により大半が除去されるが、一部残存がみられる。この段階でAgNO3を加えることにより残存した125IをAg[125I]として沈殿させることができる。従って培養上清のトリクロロ酢酸不溶性分画には、細胞に取込まれなかった[125I]アセチル化LDL並びにフリーの125Iに由来するAg[125I]が含まれ、トリクロロ酢酸可溶性分画には細胞によってプロセスされた[125I]アセチル化LDL由来のペプチドのみが検出される。遠心後上清600μLを別のチューブに取り、γカウンターで測定した。測定結果からdish当たりの培養上清中のトリクロロ酢酸可溶性の総放射活性(cpm)を計算し、[125I]アセチル化LDLの比活性(cpm/μgアセチル化LDL protein)、dish当たりの細胞タンパク質量(mg)で除し、これを[125I]アセチル化LDLのdegradation (μg/mg cell protein)とした。
【００６３】
ヘレグリンβ1は濃度依存性に[125I]アセチル化LDLのCell-association及びDegradationを有意に抑制し、ヘレグリンβ1の濃度10 ng/mLの時にCell-associationを15% (p<0.005、図13A)、Degradationを20%抑制していた(p<0.0005、図13B)。
【００６４】
実施例６  ヒト単球由来マクロファージにおけるACAT活性に対するヘレグリンβ1の効果
ヘレグリンβ1によってACAT-1タンパク質発現に変化が見られたため、ACAT酵素活性に対する効果を検討した。ACAT活性測定にはリポソーム再構成法を用いた。この方法は小胞体に存在するACAT-1タンパク質をcholesterol/phosphatidylcholineからなるmixed micelleによってリポソームに再構成し、ACAT-1が基質として利用できるコレステロールの濃度を飽和レベルまで高くするシステムである[Cheng D et al., J Biol Chem 1995;270:685-95]。従来用いられてきたミクロソーム法は、小胞体に内因性に存在するコレステロールを基質として利用していたが、一般に小胞体膜はコレステロールに乏しく、ACATの基質であるコレステロールが飽和状態に達していなかったため、ACAT活性を過小評価してきたと考えられる。もう一つの基質である[14C]oleoyl-CoAを反応系に加え、ACAT反応によって生じたcholesterol [14C]oleateを測定することによりACATの酵素活性を測定した。
【００６５】
本実施例で用いる細胞抽出液は以下のように調製した。
末梢血ヒト単球(4×106 cells/2 mL)を6 cm dishに8枚播種し、7日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時に各４枚ずつに0、10 ng/mLのヘレグリンβ1を添加してACAT活性に対する効果を検討した。7日間の培養後、細胞を4℃に冷却したPBSで２回洗い、hypotonic buffer (1 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4)を2 mL/dish加え5分間静置した。この操作の目的は、浸透圧によって細胞膜を破砕し、流出した細胞質タンパク質を洗浄してACAT-1を含む膜タンパク質を濃縮することにある。Dishを逆さにしてbufferをよく切り、使用直前にprotease inhibitor cocktail (Sigma)を1/1000 volume加えたbuffer A (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4)を100μL加え、セルスクレーパーで細胞を回収した。この100μLを同じ条件で培養した次のdishに移して同様の操作を行い、4枚のdishを合体して膜タンパク質を濃縮した。回収した細胞抽出液を1 mL用のテフロンホモジナイザーに入れホモジナイズした。20 strokeを1 setとして3 set行った。すべて氷上で行いset間は1分程おいた。ホモジナイズした細胞抽出液のタンパク質濃度をBCA 法で測定した。細胞抽出液に1/3 volume の 4 M KCl並びに1/9 volumeの20％CHAPSを加えた（最終濃度はKCl 1M、CHAPS 2%）。1 M KCl、2 %CHAPSを含むbuffer Aでタンパク質濃度をそろえ、室温で10分間静置した。
【００６６】
Mixed micelleは以下のように調製した。
100 mg/mL L-α-phosphatidylcholine from egg yolk (Sigma) in chloroform 172.4μLと20 mg/mL cholesterol (Sigma) in benzene 62μLをシンチレーションバイアルに入れ、vortex後窒素ガスで乾固させた。ここに10% taurocholic acid (Sigma) 100μL, 10×buffer A 100μL, 滅菌精製水800μＬを加えvortexした。バイアル内の空気を窒素ガスに置換して遮光の上10分間ソニケーションし、5分間氷上で冷却した。この操作を10回程繰り返し、液色を透明に近づけた。ソニケーション後、滅菌精製水 1 mLを加えよく混和した。
【００６７】
0.25 mM [14C]oleoyl-CoA mixtureは1 mM [14C]oleoyl-CoA (GE Healthcare Bio-Science, CFA634, 1.85 MBq) 160μL、34 mM cold oleoyl-CoA (Sigma) 10μL、30 mg/mL BSA in 0.25 M Tris-HCl (pH 7.8) 834μL、及び滅菌精製水996μLを混合し、2,000μLの溶液を作製することにより調製した。
【００６８】
氷上で一定のタンパク質量の細胞抽出液(125μg)と140μLのmixed micelleを加え、ゆっくり混和した。10分間氷上で静置後、20μLの[14C]oleoyl-CoA mixtureを加え、泡立てないように混和した。37℃で30分間保温して反応させた後、chloroform/methanol (2：1, v/v) 3 mLと滅菌精製水1 mLを加えvortexして反応を停止した。2,500 rpm（TOMY LC-120低速遠心機, ローター 7015-06）で10分間遠心した後、上層（水層）を除き、下層（油層）を窒素ガスで乾固した。抽出した脂質をisopropanol 60μLで溶解し、standard spotの間にブロードにスポットした。ガラスチャンバー内で展開溶媒がTLCプレートの上端に達するまで脂質を展開した。ヨードを少量散布した別のガラスチャンバー内にTLCプレートを移し、TLC standardの脂質を発色させた。cholesterol oleateに相当する位置をハサミで切りとり、バイアルに入れた。シンチレーションカクテル3 mLを加え測定した。比活性測定のため[14C]oleoyl-CoA mixture 10μLの放射活性を測定した。ACAT反応で生じたcholesterol [14C]oleateの放射活性(cpm)を反応系に用いた細胞タンパク質量 (mg)、[14C]oleoyl-CoAの比活性 (cpm/pmol)並びに反応時間 (30分間)で除してACAT活性値（pmol/min/mg cell protein）を算出した。
【００６９】
その結果、ヘレグリンβ1 (10 ng/mL)で処理した細胞のACAT活性は、ヘレグリンβ1 (0 ng/mL)のコントロール細胞に比べ30％減少していた(p<0.005、図14)。
【００７０】
実施例７  ヒト単球由来マクロファージにおけるapoA1によるコレステロール搬出機構（ABCA-1活性）に対するヘレグリンβ1の効果
マクロファージにおけるコレステロール細胞外搬出(cholesterol efflux)には、apoA1又はHDLによるものの２つが存在し、apoA1によるcholesterol effluxにはABCA-1が関与し、HDLによるものにはABCG-1及びSR-BIが関与していることが明らかにされている。
今回の検討では、ヘレグリンβ1によってABCA-1タンパク質発現のみに変化を認めたため、apoA1によるcholesterol effluxに対するヘレグリンβ1の効果を検討した。
【００７１】
末梢血ヒト単球（1.3×106 cells/3.5 cm dish）を10%ヒト血清含有 RPMI-1640培地1 mLで７日間培養してマクロファージに分化させた。ポリスチレンチューブ(50 mL)にアセチル化LDL (10μg/mL)＋[1,2-3H]Cholesterol (Perkin Elmer) 74 kBq/mL＋10%ヒト血清含有RPMI-1640（Loading Medium）を加え、プレインキュベーションを温浴中(37℃)で８時間行った。培養dishのMediumを捨て、ヘレグリンβ1 (0、1、10 ng/mL)を含むLoading Medium 1 mLに置換し、CO2インキュベーターで24時間培養し、マクロファージを泡沫化させた。Loading Mediumを捨て、上記濃度のヘレグリンβ1を含む0.1%BSA-RPMI-1640 (37℃) 1 mLに置換し、２時間培養して平衡化を行った。0.1%BSA-RPMI-1640 (37℃)で1回洗浄後、上記濃度のヘレグリンβ1を含む、0.1%BSA-RPMI-1640 ± Human ApoA1 (Academy Bio-Medical) 15μg/mLの溶液1 mLに置換し、CO2インキュベーターで16 時間培養した。培養液上清1 mLをエッペンチューブに回収し、遠心機(Tomy MX-200)にて15,000 x gで10分間遠心後、上清400μLをシンチレーションバイアルに採取し、シンチレーションカクテル3 mLを加えvortex後、シンチレーションカウンター(Packard 1900TR)で測定した。先程、培養液上清を取り去られた細胞の方は4℃に冷却したPBSで2回洗浄した。1 N NaOH 300μLを加え、細胞を溶解後、スクレープした。300μL中の50μLをシンチレーションバイアルに採取し、シンチレーションカクテル 3 mLを加えvortex後、同シンチレーションカウンターで測定した。残りから100μLを試験管に採取し、BCA法でタンパク質を測定した。
【００７２】
【数１】
2010059088.tif 000002
【００７３】
マクロファージにおけるapoA1 (15μg/mL)によるcholesterol effluxは、35%増加した(p<0.001、図14)。ヘレグリンβ1を添加しておくと、1 ng/mLの濃度で最大、cholesterol effluxはさらに25%増加した(p<0.005、図15)。ヘレグリンβ1の濃度1 ng/mLは、ABCA-1のタンパク質及びmRNA発現を最も促進させた濃度に一致していた。
【００７４】
実施例１から７までの結果から、ヒト単球由来マクロファージにおいて、ヘレグリンβ1はアチル化LDLによるコレステロールエステル蓄積（泡沫化）を有意に抑制させた。その分子機序として、ヘレグリンβ1によって(1) ACAT1発現の抑制によるコレステロールエステルへの変換抑制、(2) SR-A発現抑制によるアチル化LDLの取込み減少、(3) ABCA1発現促進によるapoA1を介するコレステロール搬出機構の増加がみられた。このようにヘレグリンβ1はマクロファージの泡沫化を抑制することをin vitroで証明したが、次ではヘレグリンβ1のin vivoでの動脈硬化病変形成に対する抑制効果を実証した。
【００７５】
実施例８  ヘレグリンβ1の持続投与による動脈硬化病変形成に対する抑制作用
動脈硬化モデル動物であるapoE欠損マウスにおいて、ヘレグリンβ1の持続投与による動脈硬化病変形成に対する抑制作用を検討した。
【００７６】
本動物実験は、日本国昭和大学動物実験実施指針に基づいて施行された。本研究に使用したapoE欠損マウスは全てJackson Laboratory (Bar Harbor, 米国)から購入した。
【００７７】
普通食を摂取している17週齢の雄性apoE欠損マウス10匹を５匹づつ２群に分け、生理食塩水（対照）又はヘレグリンβ1 (2 nmol/kg/h)をオスモミニポンプを用いて４週間持続皮下投与した。オスモミニポンプ及び内容液は１週間毎に交換した。ヘレグリンβ1の投与量は、マウスの血中濃度を有意に増加させた最少濃度を予備実験から設定された（図16）。
【００７８】
大動脈の動脈硬化病変の解析
採取した大動脈を長軸方向に切開し、オイルレッドO染色にて脂質沈着を伴う粥状硬化病変の面積を検討した。Adobe Photoshop（登録商標）を用いて動脈硬化病変を同定し、NIH Scion Imageを用いて解析し、病変面積を測定した。また大動脈近位部（大動脈弁部）での横断切片を作成し、オイルレッドO染色による動脈硬化病変の解析に加え、抗単球／マクロファージ抗体であるMOMA2による染色でマクロファージの病変部への浸潤・集積の解析を行った。
【００７９】
生理食塩水投与４週間後の21週齢のapoE欠損マウスでは、大動脈のオイルレッドOで赤く染色された動脈硬化病変は、胸部大動脈近位部、大動脈弓、腹部大動脈にかけて広範囲に認められ（図17A）、著明なプラーク形成（図17B）及びプラーク内部に無数のマクロファージ集積（図17C）を認めた。一方、ヘレグリンβ1を投与した同週齢のapoＥ欠損マウスでは、大動脈近位部に若干の動脈硬化病変を認めたに過ぎず（図17D）、プラーク形成（図17E）やマクロファージの集積（図17F）は生理食塩水投与マウス（対照）に比べ、圧倒的に減少していた。各群５匹で計測された動脈硬化病変面積の平均値は、ヘレグリンβ1投与群では生理食塩水投与群に比べ３分の１に減少していた(p<0.02、図18)。
【００８０】
その他のパラメーターの検討
全マウスの体重及び収縮期血圧は投与前後で測定した。採血は投与終了時に行い、血漿中のヘレグリンβ1はELISAキット(human NRG-β1/HRG-β1, R&D)で測定し、総コレステロール、中性脂肪、グルコースの濃度は酵素法測定キット（和光）で測定した。
【００８１】
血漿ヘレグリンβ1濃度は、ヘレグリンβ1投与群では、生理食塩水投与群（対照）に比べ2.1倍に増加していた（p<0.05、表１）。体重、収縮期血圧、血漿中の総コレステロール、中性脂肪、グルコース濃度は、生理食塩水投与及びヘレグリンβ1投与の両群間では有意差を認めなかった（表１）。
【００８２】
【表１】
2010059088.tif 000003
【００８３】
以上から、動脈硬化モデル動物であるapoE欠損マウスへのヘレグリンβ1の慢性持続投与によって、動脈硬化病変形成を有意に抑制できることを実証した。次には、ヒトでの血中及び組織中のヘレグリンβ1の減少と冠動脈病変の重症度との関係を検討した臨床データを示す。
【００８４】
実施例９  血漿ヘレグリンβ1をマーカーとして用いた労作性狭心症及び急性冠症候群の虚血性心疾患の検出
労作性狭心症患者33例（男性22例、女性11例; 年齢50〜86歳）、発症４時間以内の急性冠症候群患者31例（不安定狭心症8例、急性心筋梗塞23例; 男性26例、女性5例; 年齢49〜95歳）の計64例の虚血性心疾患、その対照として、軽症の本態性高血圧（血圧：140-159/90-99 mmHg）患者34例（男性21例、女性13例; 年齢39〜87歳）、及び健常者40例（男性25例、女性15例、年齢24〜81歳）より、採血を行い、血漿ヘレグリンβ1濃度をELISAキット (human NRG-β1/HRG-β1, R&D)で測定した。虚血性心疾患を有する全64例の患者に対し冠動脈造影検査を施行し、動脈硬化病変を認めた冠動脈の罹患枝数（右冠動脈＋左冠動脈前下行枝＋左回旋枝＝計３枝）から冠動脈病変の重症度を評価した。
【００８５】
血漿ヘレグリンβ1濃度は、健常者では7.8±1.2 ng/mL（Mean±SEM、以下同じ）、本態性高血圧患者では7.6±2.9 ng/mL、労作性狭心症患者では2.0±0.4 ng/mL、急性冠症候群患者では1.3±0.3 ng/mLであった（図19）。労作性狭心症又は急性冠症候群患者の血漿ヘレグリンβ1濃度は、健常者及び本態性高血圧患者に比べ有意に低かった(p<0.05、p<0.01、図19)。また労作性狭心症及び急性冠症候群の虚血性心疾患群64症例の血漿ヘレグリンβ1濃度は1.7±1.5 ng/mLであり、虚血性心疾患を有さない群（本態性高血圧患者及び健常者）74症例の7.7±1.5 ng/mLに比べ有意に低い値であった(p=0.0005)。更に、この虚血性心疾患患者64例の冠動脈造影検査の結果、26例に１枝病変、21例に２枝病変、17例に３枝病変を認めた。血漿ヘレグリンβ1濃度は、１枝病変群では2.2±0.5 ng/mL、２枝病変群では1.6±0.3 ng/mL、３枝病変群では0.9±0.4 ng/mLであった（図20）。３枝病変群では１枝病変群に比べ、血漿ヘレグリンβ1濃度は有意に低値を示していた（p<0.05、図20）。
【００８６】
以上より、労作性狭心症及び急性冠症候群からなる虚血性心疾患での血漿ヘレグリンβ1濃度は有意に低下しており、さらに冠動脈病変が重症なほどより一層低下していることが分かり、抗動脈硬化作用を有するヘレグリンβ1が虚血性心疾患の発症やその重症度を推定するマーカーとして有用性が高いことが判明した。次に、急性冠症候群の発症時にプラーク破裂により形成された動脈硬化性血栓におけるヘレグリンβ1の発現を検討した。
【００８７】
実施例10  急性冠症候群発症時のヒト冠動脈内動脈硬化性血栓におけるヘレグリンβ1、erbB3受容体、erbB4受容体の発現
動脈硬化性血栓とは、粥状動脈硬化巣（プラーク）の破綻に伴い閉塞性血栓が形成されたもので、急性冠症候群の発症に極めて重要な成因である。急性冠症候群発症４時間以内に緊急冠動脈造影検査を行い、責任冠動脈病変部に対して血栓吸引療法を直ちに施行した。得られた動脈硬化性血栓から病理切片を作製し、anti-heregulin antibody (Thermo)、anti-human NRG-β1/HRG-β1 antibody (R&D)、anti-erbB3 antibody (Abgent)、anti-human erbB4 antibody (Abgent)を用いて染色した。動脈硬化性血栓内のプラーク破裂部位に存在するマクロファージ由来泡沫細胞にerbB4受容体は強く発現していたが（図21D）、erbB3受容体の発現はあまり強くなかった（図21C）。しかし、ヘレグリン及びヘレグリンβ1の発現は同プラーク内にはほとんど認められなかった（図21A、B）。
【００８８】
よって、急性冠症候群発症時に形成された冠動脈内動脈硬化性血栓にはヘレグリンβ1の発現は極めて低下していたことから、動脈硬化に対して善玉作用を持つヘレグリンβ1の進行病変部での極端な低下が急性冠症候群の病因、病態に深く関連しているものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
ヘレグリンβ1又はヘレグリンβ1のアゴニストは、動脈硬化性疾患の予防・治療に用いることができる。また、生体試料中のヘレグリンβ1をマーカーとして動脈硬化性疾患の検出を行うことができる。このように、本発明は医療の分野に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ヘレグリン(HER)α及びβ1のアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ａ】ヒト単球-マクロファージの分化過程におけるヘレグリンのタンパク質発現を示す図である。
【図２Ｂ】ヒト単球-マクロファージの分化過程におけるヘレグリンβ1のタンパク質発現を示す図である。
【図２Ｃ】ヒト単球-マクロファージの分化過程におけるerbB3受容体のタンパク質発現を示す図である。
【図２Ｄ】ヒト単球-マクロファージの分化過程におけるerbB4受容体のタンパク質発現を示す図である。
【図３】ヒト単球-マクロファージの分化過程における培養液中の内因性ヘレグリンβ1濃度の変化を示す図である。
【図４Ａ】ヒト単球由来マクロファージの泡沫化（コレステロールエステル[CE]蓄積）に対するヘレグリンα又はβ1の効果を示す図であり、ヘレグリンα又はβ1の濃度を10 ng/mLにしてアセチル化LDL の濃度を0、5、10μg/mLに変化させた時のCE蓄積の結果を示す。
【図４Ｂ】ヒト単球由来マクロファージの泡沫化（コレステロールエステル[CE]蓄積）に対するヘレグリンα又はβ1の効果を示す図であり、アセチル化LDLの濃度を10μg/mLにしてヘレグリンα又はβ1の濃度を0、0.1、1、10、25 ng/mLに変化させた時のCE蓄積の結果を示す。
【図５Ａ】ヒト単球由来マクロファージにおけるscavenger receptor class A (SR-A)のタンパク質発現に対するヘレグリンαの用量依存的効果を示す図である。
【図５Ｂ】ヒト単球由来マクロファージにおけるscavenger receptor class A (SR-A)のタンパク質発現に対するヘレグリンβ1の用量依存的効果を示す図である。
【図６Ａ】ヒト単球由来マクロファージにおけるCD36のタンパク質発現に対するヘレグリンαの用量依存的効果を示す図である。
【図６Ｂ】ヒト単球由来マクロファージにおけるCD36のタンパク質発現に対するヘレグリンβ1の用量依存的効果を示す図である。
【図７Ａ】ヒト単球由来マクロファージにおけるacyl-CoA:cholesterol acyltransferase-1 (ACAT-1)のタンパク質発現に対するヘレグリンαの用量依存的効果を示す図である。
【図７Ｂ】ヒト単球由来マクロファージにおけるacyl-CoA:cholesterol acyltransferase-1 (ACAT-1)のタンパク質発現に対するヘレグリンβ1の用量依存的効果を示す図である。
【図８Ａ】ヒト単球由来マクロファージにおけるATP-binding cassette transporter A-1 (ABCA-1)のタンパク質発現に対するヘレグリンαの用量依存的効果を示す図である。
【図８Ｂ】ヒト単球由来マクロファージにおけるATP-binding cassette transporter A-1 (ABCA-1)のタンパク質発現に対するヘレグリンβの用量依存的効果を示す図である。
【図９Ａ】ヒト単球由来マクロファージにおけるATP-binding cassette transporter G-1 (ABCG-1)のタンパク質発現に対するヘレグリンαの用量依存的効果を示す図である。
【図９Ｂ】ヒト単球由来マクロファージにおけるATP-binding cassette transporter G-1 (ABCG-1)のタンパク質発現に対するヘレグリンβ1の用量依存的効果を示す図である。
【図１０Ａ】ヒト単球由来マクロファージにおけるscavenger receptor B-I (SR-BI)のタンパク質発現に対するヘレグリンαの用量依存的効果を示す図である。
【図１０Ｂ】ヒト単球由来マクロファージにおけるscavenger receptor B-I (SR-BI)のタンパク質発現に対するヘレグリンβ1の用量依存的効果を示す図である。
【図１１】ヒト単球-マクロファージの分化過程におけるSR-A、ACAT-1、ABCA-1のタンパク質発現に対するヘレグリンα又はβ1の時間依存的効果を示す図である。単球の分化マーカーであるCD68のタンパク質発現と比較検討した。
【図１２Ａ】ヒト単球由来マクロファージのSR-AのmRNA発現に対するヘレグリンβ1の効果を示す図である。
【図１２Ｂ】ヒト単球由来マクロファージのACAT-1のmRNA発現に対するヘレグリンβ1の効果を示す図である。
【図１２Ｃ】ヒト単球由来マクロファージのABCA-1のmRNA発現に対するヘレグリンβ1の効果を示す図である。
【図１３Ａ】ヒト単球由来マクロファージのSR-A活性に対するヘレグリンβ1の効果を示す図であり、Association assayの結果を示す。
【図１３Ｂ】ヒト単球由来マクロファージのSR-A活性に対するヘレグリンβ1の効果を示す図であり、Degradation assayの結果を示す。
【図１４】ヒト単球由来マクロファージのACAT活性に対するヘレグリンβ1の効果を示す図である。
【図１５】ヒト単球由来マクロファージにおけるアポリポタンパク質A1 (apoA1)による細胞外コレステロール細胞外搬出(cholesterol efflux)機能すなわちABCA-1活性に対するヘレグリンβ1の効果を示す図である。
【図１６】ApoE欠損マウスに４週間投与したヘレグリンβ1の用量と血漿中ヘレグリンβ1濃度の増加との関係を示す図である。
【図１７】ApoE欠損マウスにヘレグリンβ1を４週間投与した際の動脈硬化病変形成に対する抑制効果を示す写真である。図17A及びDは大動脈長軸切開標本をオイルレッドOで赤く染色した脂質沈着に富む粥状動脈硬化病変（矢印）、図17B及びEは大動脈近位部の横断切片をオイルレッドで赤く染色したプラーク（矢印）、図17C及びFは大動脈近位部の横断切片をMOMA2で赤く染色したマクロファージの集族（矢印）を示す。
【図１８】ApoE欠損マウスにヘレグリンβ1を４週間投与した際の動脈硬化病変面積に対する縮小効果を示す図である。
【図１９】労作性狭心症(AP)及び急性冠症候群（ACS）の虚血性心疾患患者、軽症の本態性高血圧(HT)患者、健常者の血漿ヘレグリンβ1濃度の比較を示す図である。
【図２０】労作性狭心症(AP)及び急性冠症候群(ACS)の虚血性心疾患患者において、冠動脈硬化を示す１枝病変群、２枝病変群、３枝病変群の血漿ヘレグリンβ1濃度を示す図である。
【図２１】急性冠症候群(ACS)発症４時間以内に冠動脈内血栓吸引療法で採取した動脈硬化性血栓の中に含まれるプラーク破裂部分におけるヘレグリン(A)、ヘレグリンβ1 (B)、erbB3 (C)、erbB4 (D)の発現を示す写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号５〜１２：プライマー
【図１】
2010059088.tif 000004
【図２Ａ】
2010059088.tif 000005
【図２Ｂ】
2010059088.tif 000006
【図２Ｃ】
2010059088.tif 000007
【図２Ｄ】
2010059088.tif 000008
【図３】
2010059088.tif 000009
【図４Ａ】
2010059088.tif 000010
【図４Ｂ】
2010059088.tif 000011
【図５Ａ】
2010059088.tif 000012
【図５Ｂ】
2010059088.tif 000013
【図６Ａ】
2010059088.tif 000014
【図６Ｂ】
2010059088.tif 000015
【図７Ａ】
2010059088.tif 000016
【図７Ｂ】
2010059088.tif 000017
【図８Ａ】
2010059088.tif 000018
【図８Ｂ】
2010059088.tif 000019
【図９Ａ】
2010059088.tif 000020
【図９Ｂ】
2010059088.tif 000021
【図１０Ａ】
2010059088.tif 000022
【図１０Ｂ】
2010059088.tif 000023
【図１１】
2010059088.tif 000024
【図１２Ａ】
2010059088.tif 000025
【図１２Ｂ】
2010059088.tif 000026
【図１２Ｃ】
2010059088.tif 000027
【図１３Ａ】
2010059088.tif 000028
【図１３Ｂ】
2010059088.tif 000029
【図１４】
2010059088.tif 000030
【図１５】
2010059088.tif 000031
【図１６】
2010059088.tif 000032
【図１７】
2010059088.tif 000033
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2010059088.tif 000036
【図２１】
2010059088.tif 000037
【配列表】
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