(57)【要約】【課題】本発明の目的は、観察対象が振動していても、生体に操作や刺激を行うことができる生体観察装置を提供することにある。【解決手段】本発明は、振動する生体の観察像を結像する観察用撮像手段と、前記生体の特定部位からの光を結像する振動検出用撮像手段と、前記観察用撮像手段および振動検出用撮像手段に光を結像させる光学系と、前記振動検出用撮像手段によって撮像された画像から前記生体の特定部位の変位ベクトルを算出する第１の制御手段と、前記変位ベクトルに応じて駆動可能な対物レンズ駆動手段と、生体操作ツールと、前記生体操作ツールを制御する第２の制御手段と、前記生体を静置する試料台と、を具備する、生体観察装置を提供する。【選択図】図１
2010014966.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
振動する生体の観察像を結像する観察用撮像手段と、
前記生体の特定部位からの光を結像する振動検出用撮像手段と、
前記観察用撮像手段および振動検出用撮像手段に光を結像させる光学系と、
前記振動検出用撮像手段によって撮像された画像から前記生体の特定部位の変位ベクトルを算出する第１の制御手段と、
前記変位ベクトルに応じて駆動可能な対物レンズ駆動手段と、
生体操作ツールと、
前記生体操作ツールを制御する第２の制御手段と、
前記生体を静置する試料台と
を具備する、生体観察装置。
【請求項２】
前記生体操作ツールが、前記光学系に組み込まれている、請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項３】
前記生体操作ツールが、前記対物レンズ駆動手段に固定されている、請求項１に記載の生体装置。
【請求項４】
前記生体操作ツールが、生体操作駆動手段に取り付けられ、かつ前記生体操作駆動手段が、前記対物レンズ駆動手段に固定されている、請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項５】
前記生体操作ツールが、生体操作駆動手段に取り付けられ、かつ前記生体操作駆動手段が、前記生体を静置する試料台に固定されている、請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項６】
前記生体操作ツールが、生体操作駆動手段に取り付けられ、かつ前記生体操作駆動手段が、前記生体操作ツールを１軸方向に移動可能な突出量調整ステージで構成され、前記生体操作ツールの先端部を所望の観察部位に移動することができる、請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項７】
前記生体操作ツールが、生体操作駆動手段に取り付けられ、かつ前記生体操作駆動手段が、前記生体操作ツールを任意の位置に移動することができるXYZステージで構成されている、請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項８】
前記生体操作ツールが、生体操作駆動手段に取り付けられ、
前記生体操作駆動手段が、前記生体操作ツールを任意の位置に移動することができ、かつ前記生体操作ツールの先端部を所望の観察部位に配向させることができるXYZθステージで構成されている、請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項９】
前記生体操作ツールが、光による刺激を行う機能、試薬による刺激を行う機能、生体分子のマニュピレーション機能、生体以外の分子のマニピレーションによる刺激を行う機能、生体分子間の力を測定する機能、インジェクション機能、パッチクランプ機能、細胞内電位測定機能、電気による刺激を行う機能、ダイセクション機能、およびこれらの組み合わせ、からなる群から選択された機能を有する生体操作ツールにより構成される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の生体観察装置。
【請求項１０】
振動する生体の観察像を結像する観察用撮像手段と、
前記生体の特定部位からの光を結像する振動検出用撮像手段と、
前記観察用撮像手段および振動検出用撮像手段に光を結像させる光学系と、
前記振動検出用撮像手段によって撮像された画像から前記生体の特定部位の変位ベクトルを算出する第１の制御手段と、
前記変位ベクトルに応じて駆動可能な対物レンズ駆動手段と、
生体操作ツールと、
前記生体操作ツールを制御する第２の制御手段と、
前記生体を静置する試料台と
を具備する、生体観察装置を使用した生体観察方法であって、
前記第１の制御手段を起動し、前記対物レンズ駆動手段を駆動させて対物レンズを生体（但し、ヒトを除く）の振動に追従させる工程と、
前記第２の制御手段を起動し、前記生体操作ツールによる生体の操作を行う工程と
を含む、生体観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体振動による像ブレを抑制する生体振動抑制機能を備えた生体観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体機能の解析や病理解明などのため、生体を観察する手法に関心が集まってきている。しかし、生体は生きているがゆえに呼吸や拍動・脈動による振動を有している。この振動は観察像をブレさせるなど、観察を阻害する要因として非常に大きな問題である。
【０００３】
像ブレを抑制する技術として、第１に、生体を物理的に押圧し、観察範囲における生体の振動そのものを抑制する技術が開発されている（特許文献１）。特許文献１では、振動している生体をスタビライザで物理的に押圧し、スタビライザ内側に配置される観察範囲の振動そのものを抑制することによって、像ブレの少ない鮮明な画像を得ることができる。
【０００４】
像ブレを抑制する技術として、第２に、生体の振動そのものを抑制するのではなく、逆に対物レンズを生体の振動に追従させて、像ブレを抑制する技術が開発されている（特許文献２）。特許文献２では、対物レンズを生体振動に追従させるために、振動検出用カメラ、制御装置および対物レンズ駆動装置を設けている。前記振動検出用カメラによって撮像された画像情報を前記制御装置によって演算処理し、生体振動の変位量をデータ化する。この変位量を応じて前記対物レンズ駆動装置を駆動させることにより、対物レンズを生体振動に追従させる。
【０００５】
一方で、生体や生体材料を解析する手法として、細胞に操作や刺激を与え、その応答を計測する手法がよく用いられている。たとえば、試薬刺激、LaserTweezer、Killing、induction、bleaching、photactivation、細胞内電位測定、インジェクション、パッチクランプ、電気刺激などである。このような手法は、薬剤開発、病理の解明などに非常に有益である。また、ガンなどの遺伝子解析などを行う際には、病変部のみを取り出して遺伝子解析を行わなければ正確な解析を行うことができない。したがって、病変部を正確に切り出すことが重要になる。特に、生体において各種反応を観察できることは、基礎研究から臨床応用にわたる広範な領域に貢献可能な重要な技術である。
【特許文献１】特開２００７−２７９３８８
【特許文献２】特開２００７−１８７８１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前述のように生体の振動が存在するために、生体に対して操作や刺激を行うことはこれまで不可能であった。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、観察対象が振動していても、生体に操作や刺激を行うことができる生体観察装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、鋭意研究の結果、上記課題を解決するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、振動する生体の観察像を結像する観察用撮像手段と、前記生体の特定部位からの光を結像する振動検出用撮像手段と、前記観察用撮像手段および振動検出用撮像手段に光を結像させる光学系と、前記振動検出用撮像手段によって撮像された画像から前記生体の特定部位の変位ベクトルを算出する第１の制御手段と、前記変位ベクトルに応じて駆動可能な対物レンズ駆動手段と、生体操作ツールと、前記生体操作ツールを制御する第２の制御手段と、前記生体を静置する試料台と、を具備する、生体観察装置を提供する。
【００１０】
また、本発明は、振動する生体の観察像を結像する観察用撮像手段と、前記生体の特定部位からの光を結像する振動検出用撮像手段と、前記観察用撮像手段および振動検出用撮像手段に光を結像させる光学系と、前記振動検出用撮像手段によって撮像された画像から前記生体の特定部位の変位ベクトルを算出する第１の制御手段と、前記変位ベクトルに応じて駆動可能な対物レンズ駆動手段と、生体操作ツールと、前記生体操作ツールを制御する第２の制御手段と、前記生体を静置する試料台と、を具備する、生体観察装置を使用した生体観察方法であって、前記第１の制御手段を起動し、前記対物レンズ駆動手段を駆動させて対物レンズを生体（但し、ヒトを除く）の振動に追従させる工程と、前記第２の制御手段を起動し、前記生体操作ツールによる生体の操作を行う工程と、を含む、生体観察方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、観察対象が振動していても、生体に操作や刺激を行うことができる生体観察装置を提供する。本発明は、生体に対して、細胞レベルの操作や刺激を行うことができるので、生体機能や病理解明、薬理の解明など基礎研究から臨床にいたる広範囲な分野において非常に有用な知見を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面を用いて本発明の実施形態について説明する。なお、以下に示す各実施形態は、本発明の構成を詳細に説明するために例示的に示したものに過ぎない。従って、本発明は、以下の各実施形態に記載された説明に基づいて限定解釈されるべきではない。本発明の範囲には、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内にある限り、以下の各実施形態の種々の変形、改良形態を含む全ての実施形態が含まれる。
【００１３】
＜第１の実施形態＞
図１
図１は、第１の実施形態における生体観察装置100の模式図である。本発明の生体観察装置100は、振動する生体の観察像を結像する高感度カメラ110と、前記生体の特定部位からの光を結像する高速度カメラ120と、高感度カメラ110および高速度カメラ120に光を結像させる光学系と、高速度カメラ120によって撮像された画像から前記生体の特定部位の変位ベクトルを算出する第１の制御手段130と、前記変位ベクトルに応じて駆動可能な対物レンズ駆動手段３と、生体操作ツール１と、生体操作ツール１を制御する第２の制御手段130と、前記生体を静置する試料台101とを具備する、顕微鏡装置である。
【００１４】
試料Ａは、実際に生きている生体であり、例えば、実験小動物の各種組織（例えば、上皮組織、結合組織、筋組織および神経組織）および上記各種組織で構成された臓器（例えば、心臓、脳、肝臓、胃）を観察対象とする。所望の観察部位は、通常の外科的手法により外界に露出される。
【００１５】
前記観察用撮像手段は、例えば高感度カメラ110によって構成され、試料Ａの精細な観察画像を撮像する。撮像された画像データはPC 111に送信され、モニタ112に表示される。
【００１６】
前記振動検出用撮像手段は、例えば高速度カメラ120によって構成され、生体の特定部位を撮像する。ここで、生体の特定部位とは、観察範囲内にある識別可能な任意の生体部位である。この生体の特定部位の移動距離から変位ベクトルを算出し、生体の振動に追従した対物レンズ１の制御を行う。生体の特定部位を直接観察する代わりに生体マーカを生体に配置してもよい。この場合、生体マーカ９を高速度カメラ120で連続的に撮像し、この生体マーカ９の移動距離から変位ベクトルを算出し、この変位ベクトルに基づいて対物レンズを生体の振動に追従させる。
【００１７】
第１の制御手段130は、高速度カメラ120によって撮像された画像からマーカの変位ベクトルを算出し、この算出された変位ベクトルに応じて対物レンズ駆動手段３を駆動させる位置制御演算装置である。
【００１８】
対物レンズ駆動手段は、例えば前記変位ベクトルに応じて駆動可能なXYZステージ３で構成され、XYZステージ３には対物レンズ４が取り付けられている。ここで、XYZステージとは、３次元空間座標（X,Y,Z）で表される空間の所望の位置に対物レンズを駆動可能なステージを意味する。生体は３次元空間座標（X,Y,Z）上を振動する。従って、制御手段130によって算出される変位ベクトルは（X,Y,Z）で表される３次元ベクトルであり、対物レンズ駆動手段は、XYZステージ３で構成される必要がある。その他、XYZステージ３は、レボルバー145および昇降機構に取り付けられ、対物レンズの変更、交換および昇降が可能となっている。
【００１９】
XYZステージ３の駆動は、例えば、XYZステージ３に取り付けられたエンコーダ141によって行われる。エンコーダ141は、XYZステージ３の変位を検出し、該検出結果を検出回路133へ出力する。検出回路133は、エンコーダ141の出力に基づいてXYZステージ３の位置を検出し、この検出された位置情報に基づいて第１の制御手段130が、XYZステージ３の位置制御演算を行う。
【００２０】
また、Z方向におけるXYZステージ３の変位を検出するために、Z変位検出装置131を設けてもよい。Z変位検出装置131は、生体観察装置100に取り付けられ、レーザ光の発信および受信を行い、例えばレーザ変位計のような構成をとる。具体的には、試料Ａに照射されたレーザ光の反射光を受信し、該受信結果をZ変位検出回路132へ出力する。Z変位検出回路132は、Z変位検出装置131からの出力に基づいて試料ＡのZ方向における位置を検出し、この検出された位置情報に基づいて第１の制御装置130が、XYZステージ３のZ軸方向への位置制御演算を行う。
【００２１】
なお、第１の制御装置130から出力された制御信号は、アンプ134によって増幅され、XYZステージ３に供給される。
【００２２】
第１の実施形態において、光学系は、例えば、ダイクロイックミラー（Dichroic Mirror; 以下、DMなどという）および励起フィルタ（Excitation Filter; 以下、EXフィルタなどという）により構成される。
【００２３】
例えば、ランプ140によって照射された光は、EXフィルタ160を介してDM1 171へ入射し、DM1 171によってDM2 172側へ反射される。その後、光はDM2 172によって対物レンズ４側へ反射され、DM4 174を通過した後、対物レンズ４によって試料Ａに照射される。
【００２４】
次に、試料Ａからの蛍光／反射光は、対物レンズ４を介してDM2 172に入射し、DM2 172によってDM1 171側へ反射され、DM1 171を透過した後に高感度カメラ110に入射する。
【００２５】
なお、高感度カメラ110へのマーカの光の映り込みを防止するため、高感度カメラ110側にバリアフィルタを設け、マーカの光を遮断してもよい。
【００２６】
一方、試料Ａからの蛍光／反射光は、対物レンズ４、DM4 174、DM2 172およびDM3 173を透過した後、高速度カメラ120に入射する。このとき、高速度カメラ120は生体の特定部位からの光を結像している。生体マーカ９を使用する場合、高速度カメラ120には生体マーカ９からの光が結像される。
【００２７】
次に、生体操作ツール１について説明する。生体操作ツールは、生体に対して何らかの作用を与えるツールを意味する。本明細書中、「操作」には「刺激」が含まれる。
【００２８】
第１の実施形態では、生体操作ツール１が光学系の途中に組み込まれている。生体操作ツール１（以下、単に操作ツールなどという）は、例えば、光による刺激を行う機能を有する操作ツール（光刺激ツール）である。光刺激ツールは、レーザ照射部として構成され、レーザ照射部がレーザ光源６と一体となって構成されている。そして、レーザ光源６は第２の制御手段130に接続され、第２の制御手段130によってレーザ光の照射を制御することができる。なお、図中では第１および第２の制御手段を同一の制御手段として表している。第１および第２の制御手段は、同一ＰＣ内で適宜制御可能である。光刺激ツールから照射されたレーザ光はDM4 174によって対物レンズ４側に反射され、対物レンズ４を介して生体の観察部位に照射される。対物レンズ４は、第１の制御手段130および対物レンズ駆動手段３によって生体の振動に追従して動いている。したがって、対物レンズ３から射出されるレーザ光も自動的に試料Ａの特定の観察部位に照射される。
【００２９】
生体操作ツールを光学系に直に組み込むことによって振動する生体の観察と一体となった生体操作が可能になる。特に、光刺激ツールから照射されたレーザ光は対物レンズ４から射出されるので、試料Ａの観察部位にレーザ光を容易に照射することができる。このように構成することによって、単純な構成でかつ確実に任意の場所に操作を行うことが可能となる。
【００３０】
なお、観察部位の周辺の任意の位置にレーザ光を照射することも可能である。この場合、例えば、光学系内にミラーを設け、このミラーによってレーザ光の照射部位を調節すればよい。
【００３１】
図２
図２は、第１の実施形態における生体観察装置の操作手順のフローチャートである。
【００３２】
第１の実施形態では、先ず、ユーザは、おおよその合焦位置に対物レンズ４をおろす（１１）。試料Ａは動いているため、安定して合焦位置を探すことができない。そこで、できるだけ長い時間合焦していると思われる位置を選択する。ここで、完全には合焦できないまでもユーザによって対物レンズ４の位置を調整することにより、対物レンズ駆動機構３のＺステージのストロークを小さくすることができ、ステージを小型化することが可能となる。
【００３３】
次に、生体振動抑制機能（制御装置130）を有効にする（１２）。すると、生体振動に追従して対物レンズ駆動機構３の制御が開始される（１３）。ここで、合焦位置と生体の位置ずれが検出され、対物レンズは合焦位置に移動する。また、試料Ａに追従して対物レンズ４が駆動されるので、試料Ａを安定して観察できるようになる。
【００３４】
ユーザは試料台（ステージ101）を操作し、観察したい視野を探す（１４）。生体振動抑制機能によって安定して観察が可能となっているので、ユーザが最も見たい部分を自由にかつ簡単に探すことができる。ここで、ユーザによる試料台の移動による像の移動の影響を除去し生体振動に対してのみ対物レンズ４を追従させるために、図３のブロック図に示すような対物レンズの追従制御システムが使用される。
【００３５】
図３のシステム構成では、ＸＹ方向の変位量として検出される値は、１サンプリング間で動いた量である（差分検出３１）。この値は、試料台操作量の移動量と生体振動の移動量の合成値である。よって、検出された差分値３１から試料台操作量３５を減じて、生体振動のズレ量を求める。このズレ量と対物レンズ駆動ステージの位置情報を加算して、生体振動をステージの原点位置に対する絶対値に変換する（３２）。これが制御指令値である。この制御指令値を元に制御演算を行い（３３）、対物レンズを駆動する（３４）。ここで、試料台をユーザが操作していないときは、試料台操作量がゼロになるので、検出されたズレ量がそのまま生体振動のズレ量となる。
【００３６】
ユーザは観察したい部分（細胞、組織など）が見つかったら、刺激もしくは操作を行いたい位置を視野の中心に移動させる（１５）。目分量でもよいが、ソフト上で視野の中心と操作対象部分の位置ずれを表示するようにしてもよい。この場合、たとえばユーザがモニタに表示された観察画像上をクリックすることによって、真中に配置したい位置をコンピュータに知らせる。すると、コンピュータはその座標を算出し、ユーザが移動させた試料台の移動量から、操作対象部分と視野中心の誤差を表示する。この誤差がユーザの許容範囲であったら、調整終了としてもよい。また、操作ツール１が実行可能な範囲内に操作対象部分が入ったときに位置調整完了をユーザに知らせる表示等を行ってもよい。
【００３７】
次に、撮影条件および操作条件を設定する（１６）。撮像条件とは、露出時間、撮像開始から操作までの時間、または操作から撮像終了までの時間等をいう。操作条件とは、操作や刺激に用いる波長や光量、その他の各種操作ツール１に必要な設定条件等をいう。
【００３８】
撮影条件および操作条件の設定後、細胞操作開始ボタンを押下する（１７）。細胞操作開始ボタンが押下されると、必要に応じて撮像が開始される（１８）。
【００３９】
操作の種類によっては撮像は不要である。たとえばダイセクションなどを行う場合、操作中は操作の確認のためにモニタに画像を表示し続けるものの、操作中の画像を保存する必要はほとんどない。このような場合は、撮像は行わず、モニタへの表示のみにとどめればよい。もちろんユーザはこれらの条件を任意に設定することができる。
【００４０】
次に、生体の操作が開始される。光刺激ツールを備える第１の実施形態では、光刺激ツールから刺激用レーザが照射される（１９）。刺激用レーザは、たとえば、Argon, Krypton Argon, He-Ne Green/Redなどである。
【００４１】
高感度カメラ110による撮像は、生体の操作中または生体の操作後にかかわらず、設定された撮像時間にわたって連続的に行われる。設定された時間を経過後、撮像は終了する（２０）。
【００４２】
撮像終了後、ユーザが生体振動抑制機能を無効にする（２１）。生体振動抑制機能を無効にすると、対物レンズの生体に対する追従制御が終了する（２２）。
【００４３】
＜第２の実施形態＞
図４
図４は、第２の実施形態における生体観察装置200の模式図である。生体観察装置200の基本的構成は、第１の実施形態と同様であるが、生体操作ツール１が光学系に組み込まれる代わりに、対物レンズ駆動手段３に取り付けられている。生体操作ツール１は対物レンズ駆動手段３に直接固定されているため、生体操作ツール１単独での位置移動は起こらない。対物レンズ駆動手段３は、第１の制御手段130による制御指令によって試料Ａの振動に追従して移動しているので、この対物レンズ駆動手段３に直接固定された生体操作ツール１もまた、試料Ａの振動に追従して移動する。このように構成することによって、単純な構成でかつ確実に任意の場所に操作を行うことが可能となる。
【００４４】
対物レンズ駆動手段３に対する生体操作ツール１の固定位置については、操作ツール１が常に観察視野に対して同じ位置に操作を与えることができる位置に配置されていればよい。この位置は任意であるが、例えば、視野の中心に刺激を与えられる構成にすると、観察の際に生体の応答を操作を行った細胞の周囲に渡って観察できる。
【００４５】
第２の実施形態で使用される操作ツール１には、例えば、光刺激ツールが採用される。光刺激ツールは、レーザ照射部として構成され、レーザ照射部がレーザ光源６と一体となって構成されている。そして、レーザ光源６は第２の制御手段130に接続され、第２の制御手段130によってレーザ光の照射を制御することができる。操作ツール１として光刺激ツールを採用する場合、光刺激ツールから照射されたレーザ光を対物レンズ４から射出されるように構成すると、試料Ａの観察部位にレーザ光を容易に照射することができる。
【００４６】
第２の実施形態における操作ツール１としては、光刺激ツールの他に、例えば、マニピレーションツール、電極ツールおよび試薬刺激ツールなどが挙げられる。
【００４７】
例えば、マニピレーションツールを取り付けた場合は、対物レンズの先端近傍に操作ツール１を設けるとよい。このような構成にすることによって、操作ツール１を短くすることができる。操作ツール１は、細胞等の微細な対象を操作するものであるので、先端が非常に細く構成されている。したがって、短くすることにより共振点を高周波側にシフトさせることにより、制御中の不要な振動を低減することが可能となる。
【００４８】
第２の実施形態は、基本的には、光刺激ツールなどの観察対象に直接触れなくてよい刺激ツール、試薬刺激ツールなどの観察視野近傍にツールの先端が配置されればよい刺激ツール、電極ツールなど細胞や組織の一定の位置にツールの先端が保持されればよい刺激ツールを取り付ける場合に特に適している。なお、試薬刺激ツールは流路を有するツールである。試薬は、ポンプなどに送液されてもよいし、吸引動作後吐出動作を行うタイプのものであってもよい。ツールの先端は対物レンズの観察視野近傍に配置される。
【００４９】
なお、第２の実施形態における生体観察装置の操作手順は、図２に示した第１の実施形態と同じである。
【００５０】
＜第３の実施形態＞
図５
図５は、第３の実施形態における生体観察装置300の模式図である。生体観察装置300の基本的構成は、第１の実施形態と同様であるが、生体操作ツール１が、生体操作駆動手段に取り付けられ、かつ生体操作駆動手段が、生体操作ツール１を１軸方向に移動可能な突出量調整ステージ５で構成され、生体操作ツール１の先端部を所望の観察部位に移動することができる。
【００５１】
突出量調整ステージ５は、操作ツール１を１軸方向に移動可能に構成されている。対物レンズの合焦位置にツールの先端がくるように調整をしたり、視野から除去したりするのに用いる。このように構成することによって、操作ツール１が観察の邪魔にならない。また、光刺激以外のツールにおいては、観察している期間のうち、必要なタイミングでだけ操作や刺激を行うことができるので、操作の自由度が非常に高くなる。
【００５２】
突出量調整ステージ５の駆動は、例えば、突出量調整ステージ５に取り付けられたエンコーダ142によって行われる。エンコーダ142は、突出量調整ステージ５の変位を検出し、該検出結果を検出回路133へ出力する。検出回路133は、エンコーダ142の出力に基づいて突出量調整ステージ５の位置を検出し、この検出された位置情報に基づいて第２の制御手段130が、突出量調整ステージ５の位置制御演算を行う。
【００５３】
第３の実施形態では、任意のタイミング、任意の期間にわたって操作や刺激を行うことができる。また、第３の実施形態は、操作や刺激を行うにあたって、ツールの位置を１方向にだけ動作可能であればよい手法に適しており、たとえば、光刺激、試薬刺激、インジェクション、生体分子間の力測定、パッチクランプ、細胞内電位測定などが挙げられる。
【００５４】
たとえば、光刺激ツールは、レーザ光が対物レンズの合焦位置に照射されるようにツール先端を動かせばよい。
【００５５】
インジェクションツールは、たとえばガラスキャピラリー、パスツールピペットのようなツールを用いて行う。このツールの先端にインジェクションする遺伝子や生理活性物質、その他を保持し、細胞内に注入する。イオントフォレシスによる導入なども考えられる。細胞質、細胞核等、インジェクションする場所によって変更するなどの操作を行う。本発明の生体観察装置は、高精度に生体振動に追従しているので、微小な核へのインジェクションも可能となる。
【００５６】
パッチクランプや細胞内電位測定などでは、観察開始後、電極を任意のタイミングで細胞に接するように制御する。
【００５７】
なお、可動部を有する分、ツールの長さを長くする必要があるので、操作に用いる極先端部のみ細くし、細い部分を極力短くする。このような構成にすることによって低周波の共振が発生するのを防ぐ。
【００５８】
図６
図６は、第３の実施形態における生体観察装置の操作手順のフローチャートである。
【００５９】
第３の実施形態では、第１の実施形態と同様、先ず、ユーザは、おおよその合焦位置に対物レンズをおろす（４１）。生体は動いているため、安定して合焦位置を探すことができない。そこで、できるだけ長い時間合焦していると思われる位置を選択する。
【００６０】
次に、生体振動抑制機能を有効にする（４２）。生体振動に追従して対物レンズ駆動機構の制御を開始する（４３）。ここで、合焦位置と生体の位置ずれが検出され、対物レンズは合焦位置に移動する。また、生体に追従して対物レンズが駆動されるので、生体を安定して観察できるようになる。
【００６１】
ユーザは試料台を操作し、観察したい視野を探す（４４）。生体振動抑制機能によって安定して観察が可能となっているので、ユーザが最も見たい部分を自由にかつ簡単に探すことができる。
【００６２】
ユーザは観察したい部分（細胞、組織など）が見つかったら、プレビューが表示されているモニタ上で、操作したいポイントを指定する（４５）。指定方法は、クリックでもよいし、座標指定でもよい。プレビュー画面上に十字等の表示がされるとなおよい。
【００６３】
そして、指定された位置が視野の中央に来るように試料台を駆動する（４６）。
【００６４】
次に、撮像条件および操作条件を設定する（４７）。撮像条件とは、露出時間、撮像開始から生体操作や生体刺激までの時間、または生体操作や生体刺激から撮像終了までの時間等をいう。操作条件とは、生体操作や生体刺激に用いる波長や光量、その他の各種操作ツール１に必要な設定条件等をいう。
【００６５】
撮像条件および操作条件の設定後、細胞操作開始ボタンを押下する（４８）。細胞操作開始ボタンが押下されると、必要に応じて撮像が開始される（４９）。
【００６６】
ここで、設定された操作開始時間に、ツールの先端部が対物レンズの合焦位置近傍に配置されるように突出量調整ステージが制御される。
【００６７】
先ず、対物レンズの焦点位置と、使用する操作ツール１の種類によって、ツールに必要な送り出し量をメモリから呼び出し（５０）、ツールに必要な送り出し量を設定する（５１）。その後、ツールの先端位置の制御が開始され（５２）、ツールをこの送り出し量だけ送り出し、所定位置までツールがきたら停止させる（５３）。このとき、ツールの先端は対物レンズの合焦位置に近づいている。
【００６８】
そして、操作条件に応じた操作が開始される（５４）。
【００６９】
生体操作ツール１による操作の終了後、速やかにツールは元の位置に戻される（５５）。ここで、元の位置とは、たとえば、原点位置であり、観察や他の操作の邪魔にならない位置を意味する。
【００７０】
高感度カメラ110による撮像は、生体操作中または生体操作後にかかわらず、設定された撮像時間にわたって連続的に行われる。設定された時間を経過後、撮像は終了する（５６）。
【００７１】
撮像終了後、ユーザが生体振動抑制機能を無効にする（５７）。生体振動抑制機能を無効にすると、対物レンズの生体に対する追従制御が終了する（５８）。
【００７２】
＜第４の実施形態＞
図７
図７は、第４の実施形態における生体観察装置400の模式図である。生体観察装置400の基本的構成は、第１の実施形態と同様であるが、生体操作ツール１が、生体操作駆動手段２に取り付けられ、かつ生体操作駆動手段２が、生体操作ツール１を任意の位置に移動することができるXYZステージ（またはXYZθステージ）で構成されている。
【００７３】
先ず、生体操作ツール１が取り付けられた生体操作駆動手段２が対物レンズ駆動手段３に取り付けられているため、生体操作駆動手段２もまた生体の振動に追従して動いている。したがって、観察対象が絶えず振動していても、生体操作駆動手段２は常に生体の位置に対して相対的に同位置をとる。したがって、生体の振動をほぼ無視して、操作や刺激のための位置もしくは速度制御を行えばよく、ツールの制御が容易になる。
【００７４】
さらに、生体操作駆動手段が、XYZステージ２で構成されているため、生体操作ツール１を任意の位置に自由に移動することができる。ここで、XYZステージとは、３次元空間座標（X,Y,Z）で表される空間の所望の位置に操作ツール１を移動可能なステージを意味する。従って、例えば、マニピレーションやダイセクションといった高度の生体操作を自由に行うことができる。
【００７５】
さらにまた、生体操作駆動手段が、生体操作ツール１の先端部を所望の観察部位に配向させることができるXYZθステージ２で構成されてもよい。ここで、XYZθステージとは、３次元空間座標（X,Y,Z）で表される空間の所望の位置に操作ツール１を移動可能であることに加え、操作ツール１を任意の方向θに配向可能なステージを意味する。生体操作駆動手段をXYZθステージで構成することにより、操作ツール１を観察面に対して任意に傾けられるようになり、生体操作ツール１の動作の自由度がさらに向上する。その結果、より厳密かつ正確な生体操作や生体刺激が実現される。
【００７６】
XYZステージ２（またはXYZθステージ２）の駆動は、例えば、XYZステージ２に取り付けられたエンコーダ142によって行われる。エンコーダ142は、XYZステージ２の変位を検出し、該検出結果を検出回路133へ出力する。検出回路133は、エンコーダ141の出力に基づいてXYZステージ２の位置を検出し、この検出された位置情報に基づいて第２の制御手段130が、XYZステージ２の位置制御演算を行う。第２の制御装置130から出力された制御信号は、アンプ134によって増幅され、XYZステージ２に供給される。
【００７７】
なお、位置制御と速度制御や加速度制御を併用することによって、操作ツール１の不要な振動を低減することも可能である。特に、ステップ状の動作が発生する場合、細い操作ツール１は振動しやすい。そこで、たとえばS字カーブ状に動作させることによって、急激な加速度の変化による振動を低減するとよい。
【００７８】
生体操作および生体刺激の条件は、XY方向の位置、Z方向の位置で指定する。合焦位置に対する相対位置で指定してもよいし、絶対座標系で指定してもよい。
【００７９】
また、XY方向はモニタ上のプレビュー画面で指定し、Z方向はユーザが画面もしくは生体との位置関係を見ながらジョグダイアログで下ろしてもよい。このような場合、操作ツール１の先端の位置が合焦位置に対して、どちらの方向にどのぐらいずれているかもあわせて表示するとよい。なお、XYZともにジョグダイアル等で操作できるようにしてもよい。
【００８０】
生体操作駆動手段がXYZθステージで構成される場合、前記XYZ方向への位置指定に加え、操作ツール１の配向θも指定する必要がある。
【００８１】
また、刺激する時間、刺激する角度なども指定できるようにするとよい。
【００８２】
さらにまた、XYZステージ２（またはXYZθステージ２）は、操作ツール１を１軸方向に移動可能に構成されていてもよい。このような構成にすることによって、任意にツールの位置を動かせるので、操作ツール１が観察の邪魔にならない。また、光刺激以外のツールにおいては、観察している期間のうち、必要なタイミングでだけ操作や刺激を行うことができるので、操作や刺激の自由度が非常に高くなる。このとき、可動部を有する分、ツールの長さを長くする必要があるので、操作や刺激に用いる極先端部のみを細くし、細い部分を極力短くするとよい。このような構成にすることによって、低周波の共振が発生するのを防ぐことができる。
【００８３】
さらにまた、オプションツールとして、操作ツール１の動きを観察するツール観察用カメラ７を設けてもよい。このように高感度カメラ110、高速度カメラ120とは別個にツールを観察するツール観察用カメラ７を設けることによって、対物レンズの焦点深度外、視野外にツールが存在するときもその動きをユーザが容易に確認できる。
【００８４】
このとき、観察画像を表示するモニタで観察画像と重ね合わせて表示すると観察像との相対関係が分かりやすくなる。このように重ね合わせて表示する際は、観察画像の精細さを失わないように、ツールの像だけを重ね合わせるのが望ましい。特にジョグダイアルなどでユーザがツールの操作を行う場合、操作性の向上に大きく寄与する。
【００８５】
さらにまた、操作や刺激を行うのに必要な薬剤、色素または分子などを入れる試薬容器８などを備えてもよい。
【００８６】
第４の実施態様では、試薬による刺激を想定し、ピストン操作部９も図示したが、試薬を送り出す手段は手動によるものであってもよい。
【００８７】
＜第５の実施形態＞
図８は、第５の実施形態における生体観察装置500の模式図である。生体観察装置500の基本的構成は、第４の実施形態と同様であるが、生体操作駆動手段２が、前記生体を静置する試料台101側に固定されている。生体操作駆動手段２が、剛性のある試料台101上に固定されているので、共振による影響などが低減され、操作ツール１の制御が容易になる。また、第５の実施形態の場合、対物レンズ駆動手段３に生体操作駆動手段２が取り付けられない分、対物レンズ駆動手段３に重量負荷がかからないので、高振動の生体であっても厳密な生体追従が可能になる。
【００８８】
第５の実施形態では、生体操作駆動手段２が試料台101側に固定されているため、生体操作駆動手段２側で生体の振動を加味した制御を行う必要がある。すなわち、生体操作駆動手段２によって操作ツール１を駆動させる場合、操作ツール１の移動距離は、第１の制御手段130によって算出された生体振動の移動距離と操作ツール１自体の移動距離の総和になる。
【００８９】
具体的には、第１の制御手段が、対物レンズ駆動手段３と生体操作駆動手段２の両方に接続され、第１の制御手段によって算出された生体振動の変位ベクトルデータが、対物レンズ駆動手段３と生体操作駆動手段２の両方に送信される。
【００９０】
対物レンズ駆動手段３は、第１の制御手段によって算出された生体振動の変位ベクトルデータに従って生体振動に追従する。一方、生体操作駆動手段２は、同時に第２の制御手段に接続され、第２の制御手段によって算出された操作ツール１の移動ベクトルデータが生体操作駆動手段２に送信される。なお、図中では第１および第２の制御手段を同一の制御手段として表している。
【００９１】
この場合の制御系を図９に示す。図９は、対物レンズ駆動手段３の追従誤差を考慮して行う操作ツール１の制御システムのブロック図である。差分検出量６１を絶対値変換後（６２）、これに細胞操作に必要な移動量６５を加えたものを制御指令値として使用している。この制御指令値を元に制御演算を行い（６３）、操作ツールを駆動する（６４）。
【００９２】
図９のブロック図から明らかなように、高速度カメラ120によって検出された偏差と、細胞操作に必要な移動量６５との和を制御指令値として使用して制御を行うことによって、生体振動への追従誤差の影響を低減し、より高精度な制御を行うことが可能となる。
【００９３】
生体操作駆動手段が、XYZステージ２（またはXYZθステージ２）で構成されている点は第４の実施形態と同じである。生体操作駆動手段をXYZθステージ２で構成することにより、操作ツール１を観察面に対して任意に傾けられるようになり、操作ツール１の動作の自由度がさらに向上する。その結果、より厳密かつ正確な生体操作および生体刺激が実現される。
【００９４】
その他、制御系および生体操作、生体刺激の条件、オプションツール等については、第４の実施形態と同じである。
【００９５】
第４および第５の実施態様では、操作ツール１の自由度が高く、生体の操作や刺激に使用される多様なアプリケーションに対応することができる。以下に具体的例を示す。なお、繰り返しになるが、以下に示す種々の生体操作を、振動する生体上で行える点に本発明の特徴がある。
【００９６】
１．ダイセクションを行う場合
ファイバーガイドをXYZθステージに固定する。
【００９７】
ファイバーガイドには光ファイバーが内包されている。ファイバーガイド先端から露出した光ファイバーが生体の所望の位置に配置される。
【００９８】
θステージは図中矢印の方向と矢印に直交する方向にファイバーガイドを揺動させることができるので、任意の角度から細胞に光を照射することができる。
【００９９】
ユーザがモニタに表示された観察画像の所望の切除範囲を囲む。また、同時に深さ方向にどの程度切除するのかについて条件を設定する。例えば、臓器表面を薄く切る場合、厚さも指定できるとよく、円錐状に塊を切り取る場合、円錐の頂点の深さを指定できるとよい。
【０１００】
切除範囲を示す境界線のある画素位置が、位置情報に変換されてXY座標として記憶される。このXY座標のリストを指令値として、ファイバーガイドが駆動する。ファイバーガイドはレーザを照射しながら、細胞群を囲んだ切除線にそって移動する。レーザの照射角度は照射目的に応じて異なる。例えば、表面を薄く切り取る場合は、臓器に垂直な方向からレーザを照射し、臓器から切除した細胞群を切り離す場合は、臓器の横からレーザを照射する。また、円錐状に切り取る場合は、設定された深さになるように斜めからレーザを照射する。ファイバーガイドは一軸のみ揺動させ、試料を回転させてもよい。
【０１０１】
ダイセクションは、例えば、癌の切除などにも用いることができる。ガン細胞だけを選択的に切り取ることができるので、その後の遺伝子解析などにおいて、精度のよい解析が可能となる。
【０１０２】
２．インジェクションを行う場合
インジェクションツールは、たとえばガラスキャピラリー、パスツールピペットのようなツールを用いて行う。このツールの先端にインジェクションする遺伝子や生理活性物質、その他を保持し、細胞内に注入する。イオントフォレシスによる導入なども考えられる。細胞質、細胞核等、インジェクションする場所によって変更するなどの操作を行う。本発明の生体観察装置は、高精度に生体振動に追従しているので、微小な核へのインジェクションも可能となる。
【０１０３】
３．光ピンセットによるマニピレーションを行う場合
ファイバーガイドを、XYZθステージに固定する。波長１マイクロメータ程度の赤外光を照射して、細胞内オルガネラや染色体をトラッピングする。
【０１０４】
４．LaserKillingを行う場合
発生途中の胚の細胞の核にレーザを照射して目的の細胞を殺す。
【０１０５】
その後の発生の過程や成長後の影響を解析することによって、生体を構成する細胞の系譜を調べることができる。
【０１０６】
たとえば、神経細胞を破壊した場合の刺激に対する応答の変化や行動異常を調べることができる。
【０１０７】
５．PhotoBleachingを行う場合
細胞膜の脂質分子は流動的で自由に動くことができる。流動性は、細胞の種類やさまざまな条件で変化する。この膜の流動性や細胞内の細胞骨格たんぱく質の置き換わり方を解析できる。
【０１０８】
膜や目的のたんぱく質を蛍光色素で標識して、レーザを照射して退色させる。
【０１０９】
その後の回復の経過を観察することによって解析する。
【０１１０】
６．Photoactivationを行う場合
生理活性物質等の生体内での重要な物質もしくは標識のための蛍光物質の性質を化学的にブロックしておく。
【０１１１】
このブロックはパルスレーザの近紫外光照射によって解除でき、元の活性な物質に転換する。
【０１１２】
たとえば細胞骨格たんぱく質分子を標識しておく。その後、部分的に解除光を照射し、蛍光を発するようになった分子が、どのように移動していくかを観察する。
【０１１３】
７．パッチクランプを行う場合
パッチクランプを行うときは、ツールは微小なガラス電極である。この電極を細胞膜に押し当てて密着させ、その部分の膜とイオンチャンネルを周囲から絶縁し、このイオンチャンネルを化学的電気的操作する。
【０１１４】
細胞に電気刺激を与える刺激装置や測定された電流を増幅するアンプ、測定するためのオシロスコープが必要である。
【０１１５】
カルシウムイオン解析と併用することによって、細胞膜をはさんだイオンの移動の様子（膜電位変化あるいは膜を通過するイオンによる電流測定）と濃度変化を同時に測定することができる。
【０１１６】
８．細胞内電位測定を行う場合
細胞内電位測定では、太さ１mm程度のガラス管を熱で融かしプラーを使って引いて作った微小電極を細胞に二本刺す。一本は膜電位を測定するのに使用し、もう一本は電流を流し込むのに使う。微小ガラス電極の中は濃い塩化カリウム溶液と金属の電極を入れる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】第１の実施形態における生体観察装置100の模式図
【図２】第１の実施形態における生体観察装置の操作手順のフローチャート
【図３】対物レンズの追従制御システムのブロック図
【図４】第２の実施形態における生体観察装置200の模式図
【図５】第３の実施形態における生体観察装置300の模式図
【図６】第３の実施形態における生体観察装置の操作手順のフローチャート
【図７】第４の実施形態における生体観察装置400の模式図
【図８】第５の実施形態における生体観察装置500の模式図
【図９】操作ツール１の制御システムのブロック図
【符号の説明】
【０１１８】
１・・・操作ツール、２・・・ＸＹＺθステージ、３・・・ＸＹＺステージ、４・・・対物レンズ、５・・・突出量調整ステージ、６・・・レーザ光源、７・・・カメラ、８・・・試薬容器、９・・・ピストン操作部、100、200、300、400、500・・・本発明の生体観察装置、101・・・ステージ、102・・・調節つまみ、103・・・徐振台、110・・・高感度カメラ、111・・・PC、112・・・モニタ、120・・・高速度カメラ、130・・・制御装置、131・・・Z変位検出装置、132・・・Z変位検出回路、133・・・検出回路、134・・・アンプ、140・・・ランプ、141、142・・・エンコーダ、145・・・レボ、160・・・励起フィルタ、171、172、173、174・・・ダイクロックミラー。
【図１】
2010014966.tif 000003
【図２】
2010014966.tif 000004
【図３】
2010014966.tif 000005
【図４】
2010014966.tif 000006
【図５】
2010014966.tif 000007
【図６】
2010014966.tif 000008
【図７】
2010014966.tif 000009
【図８】
2010014966.tif 000010
【図９】
2010014966.tif 000011