(57)【要約】【課題】本発明は、体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官などの癌のような活性酸素防御に関連する障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。【解決手段】本発明は、エネルギー恒常性、中性脂肪の代謝を調節し、そして（または）膜安定性および（または）細胞小器官の機能（作用）に寄与するＭｎｋ相同性タンパク質、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドを開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｎｋ２の機能的等価物であり、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるＭｎｋ２相同性ポリペプチド又はＭｎｋ２の機能的等価物であるその断片の酵素活性を増加または減少させる物質のスクリーニング方法であって、以下の工程
(a)下記の混合物をインキュベートする工程および
(aa)酵素的に活性なＭｎｋ２の機能的等価物であり、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるＭｎｋ２相同性ポリペプチド又はＭｎｋ２の機能的等価物であるその断片
(ab)蛍光体でラベルされているキナーゼ基質；および
(ac)候補物質
(ad)適切な反応バッファー
(b)キナーゼ基質のいかなるリン酸化を検出する工程、その際、上記候補物質が溶液中で上記蛍光体ラベルされたキナーゼ基質と結合し、その際、蛍光性の偏りが、上記Ｍｎｋ２の機能的等価物であり、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるＭｎｋ２相同性ポリペプチド又はＭｎｋ２の機能的等価物であるその断片の酵素活性における増加または減少を検証するのに用いられる、
を含む、Ｍｎｋ２の機能的等価物であり、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるＭｎｋ２相同性ポリペプチド又はＭｎｋ２の機能的等価物であるその断片の酵素活性を増加または減少させる物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
上記キナーゼ基質が、基質上に固定化される請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記キナーゼ基質が、立体障害をさけるために分子スペーサー腕によって上記特徴と関連する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
候補物質のために、キナーゼ基質と競争する蛍光性のトレーサー分子をさらに含み、
その際、間接的な蛍光性の偏りが、上記Ｍｎｋ２の機能的等価物であり、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるＭｎｋ２相同性ポリペプチド又はＭｎｋ２の機能的等価物であるその断片の酵素活性における増加または減少を検証するために使用される請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）遺伝子ファミリーの核酸配列およびそれによってコードされたアミノ酸配列の使用法、および体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および活性酸素防御、糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官の癌のような障害に関連する疾患および障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列またはＭｎｋ核酸またはポリペプチドのエフェクター、特にＭｎｋキナーゼ阻害剤および活性化剤の使用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
摂取熱量に対するエネルギー消費量がアンバランスというエネルギー不均衡に関連するヒトおよび動物代謝の疾患、例えば肥満症および激しい体重の減少がいくつか存在している。肥満症は世界に最も蔓延している代謝障害の１つである。この肥満症は、西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であり、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満とは、理想的な体重の２０％以上を超える体重として定義され、頻繁に著しい健康機能障害を結果としてもたらす。肥満は、心血管疾病、高血圧、糖尿病、高脂血症のリスクの増大および高い死亡率に関連する。肥満症に悩む個人は、病気にかかる深刻なリスクを抱えている上に、多くの場合、社会的に孤立している。
【０００３】
肥満症は、遺伝的要因、代謝要因、生化学的要因、心理学的要因、および行動的要因によって影響される。このような事情から、肥満症は、持続的でポジティブな臨床結果を達成するために、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合障害である。肥満症は単一の障害として考慮されるべきではなく、（潜在的な）複数の原因を有する異種性の状態群であると考慮されるべきであり、また、空腹時の血漿インスリンの上昇および経口グルコース摂取に対する過度なインスリン反応も特徴とする（Ｋｏｌｔｅｒｍａｎｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ６５、１９８０、１２７２−１２８４）。２型糖尿病における肥満症の明らかな介入は確認することができる（Ｋｏｐｅｌｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４、２０００、６３５−６４３）。
【０００４】
食物摂取および体重のバランスを調節する分子因子は完全に理解されていない。たとえ、レプチン、ＶＣＰＩ、ＶＣＰＬまたはペルオキシソーム増殖活性の受容体ガンマ活性化補助因子のような、体重／重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずのいくつかの候補遺伝子が記述されているとしても、肥満調節または体重／重量調節に影響を及ぼす特有の分子機構および（または）分子は知られていない。加えて、マウスにおいて肥満症を結果としてもたらすいくつかの単一遺伝子の突然変異が記載されており、肥満症の病因における遺伝的な因子を意味づけている（ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＬｅｉｂｅｌ、１９９０、Ｃｅｌｌ  ６９：２１７−２２０）。肥満したマウスにおいては、単一遺伝子の突然変異（肥満）は、糖尿病を伴う深刻な肥満症を結果としてもたらす（Ｆｒｉｅｄｍａｎらの、１９９１、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：１０５４−１０６２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｏｌｔｅｒｍａｎｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ６５、１９８０、１２７２−１２８４
【非特許文献２】Ｋｏｐｅｌｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４、２０００、６３５−６４３
【非特許文献３】ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＬｅｉｂｅｌ、１９９０、Ｃｅｌｌ  ６９：２１７−２２０
【非特許文献４】Ｆｒｉｅｄｍａｎらの、１９９１、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：１０５４−１０６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、熱産生体重調節および（または）エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす（病理学的な）代謝条件の調節のための手段と方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例を提供することによって達成することができる。
【０００８】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。本発明は、体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害に関連する疾患および障害、および、糖尿病、神経変性疾患、および癌のような活性酸素防御に関連する障害の調節に関与する特定の遺伝子を提供する。とりわけ、本発明ではヒトＭｎｋ遺伝子、特にヒトＭｎｋ２遺伝子変異体を上述した条件に関与するものとして記載する。
【０００９】
用語「ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号」とは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースエントリに関するものである（ＢｅｎｓｏｎらのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，２０００，１５−１８）。
【００１０】
タンパク質キナーゼは、多くの細胞機能調節に関与する重要な分子である。キイロショウジョウバエＬＫ６セリン／トレオニンキナーゼ遺伝子は、微小管に関連することができる短命なキナーゼとして記載されている（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１９９７  １１０（２）：２０９−２１９）。ショウジョウバエの複眼の発生・発育における遺伝的な分析により、ＲＡＳシグナル伝達経路の調節における役割が示唆された（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０００  １５６（３）：１２１９−１２３０）。本発明に記載したように、ヒト相同体に最も近いショウジョウバエＬＫ６キナーゼは、ＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ２（Ｍｎｋ２、例えば変異体Ｍｎｋ２ａおよびＭｎｋ２ｂ）およびＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ１（Ｍｎｋ１）である。すべての３タンパク質は大部分が細胞質に局在している。Ｍｎｋは、ｐｋ４２  ＭＡＰキナーゼＥｒｋ１およびＥｒｋ２およびｐ３８  ＭＡＰキナーゼによってリン酸化される。このリン酸化は、成長因子、ホルボールエステルおよびＲａｓおよびＭｏｓのような発癌遺伝子に反応してトリガされる他に、ストレスシグナル伝達分子およびサイトカインによってもトリガされる。Ｍｎｋタンパク質のリン酸化は、そのキナーゼ活性を原核開始因子４Ｅの方向に向かって刺激する（ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：１９０９−１９２０（１９９７）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９：１８７１−１８８０（１９９９）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：７４３−７５４（２００１））。原核開始因子４Ｅ（ｅｌＦ４Ｅ）のリン酸化は、タンパク質翻訳の調節を結果としてもたらす（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２２：５５００−５５１１（２００１））。
【００１１】
Ｍｎｋタンパク質によるタンパク質翻訳の刺激作用のモードを述べる異なる仮説が存在する。大部分の刊行物には、ＭＡＰキナーゼ結合キナーゼの活性化時点でのｃａｐ−依存のタンパク質翻訳に関するポジティブな刺激効果が記載されている。従って、Ｍｎｋタンパク質の活性化は、タンパク質翻訳の間接的な刺激作用または調節、例えば細胞質ホスホリパーゼ２α（ＢＢＡ１４８８：１２４−１３８、２０００）に対する作用につながる。
【００１２】
Ｍｎｋの阻害剤（ＣＧＰ５７３８０およびＣＧＰ０５２０８８と呼ばれる）は従来の技術に記載されている（Ｋｎａｕｆらの２００１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：５５００、Ｔｓｃｈｏｐｐらの２０００、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ３：２０５およびＳｌｅｎｔｚ−Ｋｅｓｌｅｒらの２０００、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６９：６３）。ＣＧＰ０５２０８８は、Ｍｎｋ１の生体外キナーゼ活性の阻害のための７０  ｎＭのＩＣ５０を備えたスタウロスポリン誘導体である。ＣＧＰ５７３８０は、Ｍｎｋ２（Ｍｎｋ２ａまたはＭｎｋ２ｂ）またはＭｎｋ１の選択的な低分子量、非細胞障害性の阻害剤である。ＣＧＰ５７３８０の細胞培養の細胞への添加は、Ｍｎｋ２（Ｍｎｋ２ａまたはＭｎｋ２ｂ）またはＭｎｋ１と形質移入し、リン酸化されたｅＩＦ４Ｅの強い低下を結果としてもたらした。
【００１３】
これまでには、Ｍｎｋキナーゼが体重の調節および熱産生に関与すること、よって肥満症のような代謝疾患、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官の癌のような活性酸素防御に関連する障害と関与し得ることは記載されていない。本適用例において、Ｍｎｋキナーゼの正しい遺伝子投与量がエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。遺伝子スクリーニングを用いて、Ｍｎｋキナーゼ相同性遺伝子の突然変異が主要なエネルギー保管物質である中性脂肪含有量の著しい増加による肥満症の原因となることを同定した。さらには、本発明は、脱共役タンパク質（ＵＣＰｓ）の活性に影響を及ぼし、その結果、改変ミトコンドリア活性につながるＭｎｋキナーゼにおける突然変異に関連するものである。また、本発明はＭｎｋ−特異阻害剤ＣＧＰ５７３８０およびその誘導体を用いた代謝障害治療に関連するものでもある。
【００１４】
本発明において、Ｍｎｋのキイロショウジョウバエ相同体の正しい遺伝子投与量が、ハエの成体におけるエネルギー恒常性の維持、およびミトコンドリアの脱共役タンパク質の活性にとって必須であることを実証する。遺伝子スクリーニングを用いて、Ｍｎｋ相同性遺伝子の突然変異が主要なエネルギー保管物質である中性脂肪含有量の著しい増加によるキイロショウジョウバエの肥満症の原因となることを同定した。脱共役タンパク質の活性を調節する因子を同定することを目的にデザインされた第２スクリーニングにおいて、発明者らはこのＭｎｋ相同性遺伝子の突然変異が脱共役タンパク質の活性の低減の原因となることを発見した。従って、本発明は、Ｍｎｋのショウジョウバエ相同体が細胞小器官、望ましくはミトコンドリア膜の安定性および（または）機能（作用）に寄与することの知見に基づくものでもある。ＬＫ６キナーゼにおける突然変異が脱共役タンパク質（ＵＣＰ）の活性に影響し、ミトコンドリア活性の変化につながることを見出した。
【００１５】
さらに、発明者らは、Ｍｎｋ２遺伝子のマウス相同体が絶食、および遺伝的に誘導された肥満症によって調節されることを明らかにする。さらには、Ｍｎｋ２のｍＲＮＡを生体外脂肪細胞分化中に強く上方制御する（実施例を参照）。本発明は、Ｍｎｋ２転写物が大部分のマウス組織において発現されること、その中で最も高い発現レベルを示すのは白色（ＷＡＴ）および茶色脂肪組織（ＢＡＴ）であることを明らかにする。白色脂肪組織における発現は、絶食マウスおよびｏｂ／ｏｂマウスにおいては約６０％減少する。
【００１６】
アクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ遺伝子組換えマウスの分析により、ｍＭｎｋ２ＤＮ導入遺伝子の異所性発現（実施例を参照）が体重の明らかな増加につながることが明らかにされた。それは、高脂肪食の場合のみならず食餌制限の場合にも見出されるので、その効果は食餌依存性であるように思われる。従って、発明者らはＭｎｋ２が体重の調節において重要な役割を果たしていることを結論する。
【００１７】
加えて、発明者らは、両者のヒトＭｎｋ２スプライス変異体の相対発現レベルが分析したすべての組織に対して同一であることを見出した。両Ｍｎｋ２変異体は共に、代謝障害、すなわち脂肪および筋肉組織に関連性のあるヒト組織において最も高い発現レベルを示す。さらには、両Ｍｎｋ２変異体は共に、ヒト脂肪細胞の分化中に上方制御される。従って、発明者らはＭｎｋ２  （またはその変異体）が成熟ヒト脂肪細胞の代謝における機能（作用）を有することを結論する。
【００１８】
また、発明者らは、細胞を過剰発現するＭｎｋ２における細胞の中性脂肪レベルが対照細胞のレベルと比較して、４〜１２日目の脂質生成において著しく低くなることを見出した。さらには、細胞を過剰発現するＭｎｋ２は、外来性グルコースから取り出した脂質の合成における効果が弱かった。その結果、脂質合成を刺激したインスリンのレベルは対照細胞と比較して、脂質生成の１２日目で著しく低下した。また、発明者らは、外来性脂肪酸の輸送が細胞を過剰発現するＭｎｋ２の血漿膜の全域にわたること、従ってこれらの代謝産物のエステル化は対照細胞と比較して脂質生成の１２日目で相当に低いことを見出した。
【００１９】
Ｍｎｋキナーゼファミリーのタンパク質に対して相同性を持つタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上記のように疾患および障害を調査研究するために好適である。Ｍｎｋキナーゼに関連する分子の発見は、上記のように疾患および障害の診断、治療、および予後において有用である新規組成物を提供することによって当分野における要望に応えることができる。
【００２０】
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載する方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００２１】
本発明は、Ｍｎｋ相同性タンパク質がエネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドの代謝と保管を調節することを開示する。また、本発明は、Ｍｎｋ相同性タンパク質が直接的にまたは間接的に膜安定性および（または）機能（作用）細胞小器官、特にミトコンドリア、および、本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドに関与することも開示する。本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関連するものである。また、本発明は、体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官の癌のような活性酸素防御に関連する障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。
【００２２】
よって、Ｍｎｋ相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ヒトＭｎｋ相同性ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸、特にポリペプチドおよびヒトＭｎｋ２タンパク質（図３Ｄおよび３Ｅに示したようにスプライス変異型Ｍｎｋ２ａ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５、または図３Ｆおよび３Ｇに示したようにスプライス変異型Ｍｎｋ２ｂ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７６またはＮＭ＿０１７５７２．１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５は提出者の要求により除去された旧番号Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０３０６３７に同一である；図３ＢにおけるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ複数配列アライメントを参照、また、図３Ｄ−Ｇにおける配列を参照）またはヒトＭｎｋ１タンパク質（図３Ｈおよび３Ｉに示したようにＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９．１およびＮＭ＿００３６８４．２）；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９は提出者要求により除去された旧番号Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１６００に同一である；図３ＣにおけるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ複数配列アライメントを参照）をコードする核酸である。
【００２３】
本発明は、特に、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝の調節に寄与し、および（または）細胞小器官の膜安定性および（または）機能（作用）に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関するものであり、当該核酸分子には下記が含まれるものである。
（ａ）Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５、ＮＭ＿０１７５７２．１、ＡＢ０００４０９．１、またはＮＭ＿００３６８４．２のヌクレオチド配列、および（または）その補体、
（ｂ）１  ｘ  ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液中で、５０℃にて（ａ）の核酸分子、特に図３に示したようにアミノ酸配列をコードする核酸に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、
（ｃ）遺伝暗号の変性内における（ａ）または（ｂ）の配列に対応する配列、
（ｄ）図３に示したように、少なくとも８５％、望ましくは少なくとも９０％、より望ましくは少なくとも９５％、より望ましくは少なくとも９８％および９９，６％までアミノ酸配列に同一のポリペプチドをコードする配列、
（ｅ）突然変異によって（ａ）〜（ｄ）の核酸分子と異なる配列であり、当該突然変異がコード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止を引き起こす配列または
（ｆ）少なくとも１５塩基、望ましくは少なくとも２０塩基、より望ましくは少なくとも２５塩基および最も望ましくは少なくとも５０塩基の長さを有する（ａ）〜（ｅ）のヌクレオチド配列の任意の部分的配列。
【００２４】
本発明は、Ｍｎｋ相同性タンパク質（本明細書中ではＭｎｋと呼ばれる）、特にＭｎｋ２  （Ｍｎｋ２ａまたはＭｎｋ２ｂ）またはＭｎｋ１、およびこれらをコードするポリヌクレオチドが中性脂肪保管の調節に関与し、それゆえエネルギー恒常性にも関与するという知見に基づく。また、本発明は、Ｍｎｋ相同性タンパク質が直接的にまたは間接的に膜安定性および（または）機能（作用）細胞小器官、特にミトコンドリア、および、本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドに関与することも開示する。本発明では、体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官の癌のような活性酸素防御に関連する障害の診断、試験、予防、または治療のための核酸分子またはポリペプチドを認識するヌクレオチド、タンパク質またはそのエフェクター、例えば抗体、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉ分子、ペプチド、低分子量の有機分子およびその他の受容体から成る組成物の使用法が記載されている。
【００２５】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において新規機能をともなう遺伝子を発見するため、モデル生物体キイロショウジョウバエ（Ｍｅｉｇｅｎ）を用いて機能的な遺伝子スクリーニングを実施した。キイロショウジョウバエは、生物学において最も集中的に研究された生物体の１つであり、ヒトを始めとした高等真核生物に共通する多くの発生過程および細胞過程の調査のためのモデルシステムとして役に立つ（例えば、Ａｄａｍｓらの、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２１８５−２１９５（２０００）を参照）。キイロショウジョウバエのモデル生物体としての成功の大部分は、生物学的プロセスに関与するフォーワード遺伝子スクリーニングの威力に起因する。（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ３：１７６−１８８（２００２）；Ｒｏｒｔｈ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３：１２４１８−１２４２２（１９９６）を参照）。スクリーニングのための１つのリソースは、専売のキイロショウジョウバエＥＰラインの在庫コレクションであった。このコレクションのＰベクターは、ＵＡＳ部位へのＧａｌ４の結合時に、隣接するゲノムショウジョウバエ配列に転写できる基底プロモーターに融合したＧａｌ４−ＵＡＳ結合部位を有する。これによって、ＥＰラインのコレクションの内在性側面遺伝子配列の過剰発現が可能となる。加えて、ＵＡＳ部位の活性化なしでは、ＥＰ因子の遺伝子への統合は、遺伝子活性の低下を引き起こす可能性があるので、機能喪失の表現型を評価することにより、その機能を確定することができる。
【００２６】
中性脂肪は、細胞において最も効果的なエネルギーの保管場所であり、肥満した患者において著しく増加されるものである。本発明において、発明者らは遺伝子スクリーニングを用いて、Ｌｋ６相同性遺伝子の突然変異が中性脂肪レベルの著しい変化によって反映される体重の変化の原因となることを同定した。エネルギー恒常性において機能を有する遺伝子を分離するため、数千のＥＰラインの中性脂肪含有量を長期にわたる食餌期間後に検査した。さらなる分析のための肯定的な候補として、中性脂肪含有量が顕著に変化したラインを選択した。本発明において、６日間の給餌後の同一遺伝子型を有するハエのプールの中性脂肪含有量を、例えば、中性脂肪測定法のような方法を使用して分析したが、これは本発明の範囲を限定するものではなく、その結果を以下に実施例の項において記載した。遺伝子機能の損失による中性脂肪含有量の変化は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【００２７】
中性脂肪含有量分析の結果を図１に示した。ＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６統合に対するハエのホモ接合性を中性脂肪測定法で分析した。ホモ接合性生存ラインＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６の中性脂肪含有量の平均増加はおよそ１４０％である（図１）。以上の点から、その染色体遺伝子座８６Ｆ７（推定、ＥＰ（３）３３３３ハエおよびＥＰ（３）３５７６ハエのＥＰベクターが結合している染色体部位）における非常に可能性が高い遺伝子活性の損失は、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から、両方の事例において、肥満したハエモデルを表している。遺伝子機能の損失による中性脂肪含有量の増加は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【００２８】
本発明のＭｎｋタンパク質をコード化をする核酸をプラスミド救出技術を使用して同定した。ＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６統合に対して直接的に３′局在するゲノムＤＮＡ配列を分離した。それらの分離したゲノム配列を用いて、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  ショウジョウバエゲノムプロジェクト（ＧａｄＦｌｙ；ＦｌｙＢａｓｅ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：８５−８８も参照）のような公共データベースをスクリーニングし、それによってＭｎｋ相同性遺伝子の５′エキソンの５′領域におけるＥＰ（３）３３３３の統合側、および代替５′エキソンの５′領域におけるＥＰ（３）３５７６を確認した（図２）。図２はこの遺伝子座の分子構造を示す。ゲノムＤＮＡ配列をアセンブリによって、ＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６の統合部位を含んだ中間の黒色点線として表した。数字は、ゲノムＤＮＡ座標（染色体３Ｌ上の７５４４５００位置から始まる）を表す。２つの「ｃＤＮＡ」ライン上の灰色バーは、予測遺伝子（ＧａｄＦｌｙ＆Ｍａｇｐｉｅ）を表し、「Ｐエレメント」ライン上の灰色記号はＥＰ−ベクター統合部位を表す。遺伝子ＣＧ１７３４２の予測エキソンは、濃灰色のバーとして、およびＥＰ（３）３２５１７および予測イントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。
【００２９】
Ｌｋ６（ショウジョウバエにおけるＭｎｋ相同性遺伝子）は、ＧａｄＦｌｙ配列分析プログラムによって予測される遺伝子に対してコード化する（ＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ１７３４２）。本発明においてＭｎｋと呼ばれる図３に示した遺伝子のために、肥満症および代謝疾患の調節を記載した機能的データは従来の技術には存在しない。
【００３０】
また、ポリペプチドが細胞小器官の膜安定性および（または）機能（作用）に寄与する核酸分子をコードし、ＵＣＰを修飾できることがわかっているショウジョウバエのタンパク質を表現することは好適である。補足実施例も参照。補足実施例において実証したように、本明細書に記載のポリペプチド（およびコード化核酸分子）は、キイロショウジョウバエ遺伝子ｄＵＣＰｙの過剰発現が原因で生じたショウジョウバエにおける特定の眼の表現型を修飾、例えば増強することができた。ショウジョウバエの複眼におけるｄＵＣＰｙ（ヒトＵＣＰｓに対する相同性を有する）の過剰発現は、遺伝的「修飾因子スクリーニング」の「読み取り」として使用できる、明確に視認できる眼障害を引き起こした。
【００３１】
当該「修飾因子スクリーニング」においては、その眼中発現を修飾するために、数千の異なる遺伝子を変異誘発さしめる。変異誘発した遺伝子の１つがｄＵＣＰｙと相互に影響し、その活性を修飾する場合には、眼障害の増強または抑制が発生するであろう。そのようなハエは識別が容易なので、選択して相互作用する遺伝子を単離することができる。補足実施例に示すように、ｄＵＣＰｙ活性によって誘発された眼障害を強化する遺伝子を推定した。この遺伝子は、上記のように、ヒトＭｎｋタンパク質に対して高い相同性を有するショウジョウバエのＬＫ６遺伝子と呼ばれる。本明細書に記載したＭｎｋ−ポリペプチド（および遺伝子）における突然変異は、修飾および改変されたミトコンドリア活性を備え得る表現型および（または）生理学的変化につながることが構想される。これは、次には、特に、エネルギー代謝の改変、変異熱産生および（または）エネルギー恒常性の改変につながる可能性がある。補足実施例に示すように、ｄＵＣＰｙ活性によって誘発された眼障害を強化する遺伝子を推定した。
【００３２】
よって、Ｍｎｋ相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ヒトＬｋ６／Ｍｎｋ相同体、特にＭｎｋ２変異体（Ｍｎｋ２ａまたはＭｎｋ２ｂ）またはＭｎｋ１をコードする核酸である。本発明は、Ｍｎｋ、特にＭｎｋ２変異体（Ｍｎｋ２ａまたはＭｎｋ２ｂ）またはＭｎｋ１のアミノ酸配列から成るポリペプチドを説明する。異なる種（ヒトおよびショウジョウバエ）のＭｎｋタンパク質間の比較（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ  １．８）を行って、図３Ａに示した。相同性に基づいて、本発明のＭｎｋタンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有する。
【００３３】
特定の実施例によれば、本発明には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５、ＮＭ＿０１７５７２．１、ＡＢ０００４０９．１、またはＮＭ＿００３６８４．２の核酸配列から成るポリヌクレオチドが包含される。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、Ｍｎｋをコードする多数のヌクレオチド配列（一部は既知であり天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する）を産生することが可能である。したがって本発明では、可能コドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作製し得るような、ありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体が考慮されている。この組み合わせは、天然のＭｎｋのヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号に従って作製されるものであり、このような変異は全て特異的に開示されているものと考慮される。Ｍｎｋおよびその変異体をコードするヌクレオチド配列は、望ましくは好適に選択されたストリンジェントな条件下で天然のＭｎｋのヌクレオチド配列に対してハイブリダイズ可能ではあるが、Ｍｎｋをコードするヌクレオチド配列、または実質上異なるコドンの使用法を有する誘導体を産出することは有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を増加するようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変更することなく、Ｍｎｋおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由には、天然の配列から産出される転写物より望ましい、例えば半減期が長いなどの特性を有するＲＮＡ転写物の産出がある。本発明には、Ｍｎｋおよびその誘導体をコードする、ＤＮＡ配列またはその部分を全て合成化学によって産出することも包含される。その産生後には、本発明の出願時に当分野で周知の試薬を用いて、この合成配列を任意の入手可能な多数の発現ベクターおよび細胞系中に挿入することが可能である。さらに、合成化学を用いて、Ｍｎｋまたはその任意の部分をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【００３４】
さらに本発明に包含されるのは、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のヌクレオチド配列、特にＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５、ＮＭ＿０１７５７２．１、ＡＢ０００４０９．１、またはＮＭ＿００３６８４．２で示される配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Ｗａｈｌ、Ｇ．Ｍ．およびＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９−４０７）およびＫｉｍｍｅｌ、Ａ．Ｒ．（１９８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７−５１１）で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度（Ｔｍ）に基づいており、定義されたストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、１時間  １  ｘ  ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて５０℃にて、望ましくは５５℃にて、より望ましくは６２℃にて、および最も望ましくは６８℃にて、特に１時間  ０．２  ｘ  ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中で５０℃にて、望ましくは５５℃にて、より望ましくは６２℃にて、および最も望ましくは６８℃にて洗浄後、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含されているＭｎｋをコードする変異核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入、または代替が含まれており、同一物または機能に同等なＭｎｋをコードするポリペプチドを結果としてもたらす。
【００３５】
コードされたタンパク質には、サイレント変化を産生し、機能的に等価なＭｎｋを結果としてもたらすアミノ酸残基の欠損、挿入、または置換も含まれ得る。計画的アミノ酸代替は、Ｍｎｋの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および（または）両親媒性特性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ；そして類似の親水性値を持つ非荷電極性ヘッドグループを有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシンおよびアラニン；アスバラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；フェニルアラニンおよびチロシンが含まれ得る。
【００３６】
また本発明の範囲内には、Ｍｎｋをコードする遺伝子の対立遺伝子も含まれている。本明細書で使用されているように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は遺伝子の代替形態であり、核酸配列において少なくとも１つの突然変異から生じ得る。対立遺伝子は、構造または機能が変異し得るかどうかわからない変異ｍＲＮＡｓまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。任意の遺伝子は、無、単一、または多くの対立遺伝子形態を持つことが可能である。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異性変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で１回以上生じ得る。当分野で公知であり、一般に入手可能なＤＮＡ  シーケンシングのための方法を用いて、本発明の任意の実施例を実行することが可能である。その方法では、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ  ＤＮＡポリメラーゼ（オハイオ州クリーブランド市のＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（イリノイ州シカゴ市のＡｍｅｒｓｈａｍ社）、またはＥＬＯＮＧＡＳＥ  増幅システム（メリーランド州ゲーサーズバーグのＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社）のような組換えポリメラーゼおよび校正エキソヌクレアーゼの組み合わせなどの、酵素を用い得る。望ましくは、そのプロセスを、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＩＣＲＯＬＡＢ  ２２００（ネバダ州リノ市のＨａｍｉｌｔｏｎ社）、Ｐｅｌｔｉｅｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  （ＰＴＣ２００；マサチューセッツ州ウォータタウンのＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）およびＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡ配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）などの機械を用いて自動化する。Ｍｎｋをコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知の種々の方法を使用することによって伸長させ、プロモーターおよび調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方法の１つである「制限部位ＰＣＲ法」は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す方法である（Ｓａｒｋａｒ、Ｇ．（１９９３）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：３１８−３２２）。また、逆ＰＣＲ法は、既知の領域に基づいた分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために使用することも可能である（Ｔｒｉｇｌｉａ、Ｔ．らのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６）。使用可能な別の方法としては、キャプチャＰＣＲ法があり、これにはヒトおよび酵母菌人工染色体ＤＮＡにおける既知の配列に近傍するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅が含まれる（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ、Ｍ．らのＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１〜１１９）。未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Ｐａｒｋｅｒ、Ｊ．Ｄ．らの方法が挙げられる（１９９１；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３０５５−３０６０）。加えて、ＰＣＲ法、ネステッドプライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリを用いて、ゲノムＤＮＡの中に入ることが可能である（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．��。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。
【００３７】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする際には、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリを使用することが望ましい。また、遺伝子の５′領域を含んだ、より多くの配列を含むランダムプライムライブラリも望ましい。ランダムプライムライブラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを産しない状況において特に望ましい。ゲノムライブラリは、５′および３′非転写調節領域への配列の伸長に対して有用であり得る。市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シーケンシング産生物またはＰＣＲ産生物のサイズを分析すること、またはそのヌクレオチド配列を確認することが可能である。具体的には、キャピラリー  シーケンシングは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザー駆動の４つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドあたり１個）、および電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによる発光波長の検出を用いることが可能である。出力および光の強度は、適切なソフトウェア（例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲおよびＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ）を使用して電気信号に変換することができ、試料の取り込みからコンピュータ分析までの全プロセス、および電子データ表示は、コンピュータ制御が可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定の試料に限られた量が存在する可能性のあるＤＮＡ小片のシーケンシング（配列決定）に特に望ましい。
【００３８】
本発明の他の実施例によれば、Ｍｎｋをコードするポリヌクレオチド配列、または融合タンパク質またはその機能的等価物またはその断片は、適切な宿主細胞内でＭｎｋの発現をさせるような組換えＤＮ分子内で使用することが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ、あるいは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列を産出することができ、これらの配列はＭｎｋをクローン化および発現するために利用することが可能である。当事者にとっては当然なことだが、非天然コドンを有するＭｎｋがコードするヌクレオチド配列を産出することは有益であろう。例えば、特定の真核宿主または原核宿主によって好適とされるコドンは、タンパク質の発現率を高めるため、または、例えば天然配列から作成された転写物の半減期よりも長い半減期などの好ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写を産生するために選択することが可能である。本発明のヌクレオチド配列は、種々の目的でＭｎｋのコードする配列を変えるために、当分野で公知の方法を使用して組換えることができ、この目的には、遺伝子産物のクローニング、処理、および（または）発現等が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーションおよびＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャフリングを用い、ヌクレオチド配列を遺伝子操作することが可能である。例えば、部位特異的変異誘導を用いて、新規制限部位を挿入、グリコシル化のパターンを改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の産生、または突然変異の導入、等々を行い得る。
【００３９】
本発明の他の実施例によれば、天然の核酸配列、修飾核酸配列またはＭｎｋをコードする組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコードすることができる。例えば、Ｍｎｋ活性の阻害剤に対してペプチドライブラリをスクリーニングするためには、市販の抗体によって識別可能なキメラ  Ｍｎｋタンパク質を作成することが有用であり得る。また、Ｍｎｋが異種部分から切断および精製され得るようにするため、融合タンパク質が、Ｍｎｋのコードする配列と異種タンパク質配列との間にある切断部位を含むように遺伝子操作することが可能である。他の実施例によれば、当分野で周知の化学的方法を用いて、Ｍｎｋをコードする配列の全部または一部を合成することが可能である（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７：２１５−２２３，Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７：２２５−２３２を参照）。あるいは、化学的な方法を用いて、Ｍｎｋのアミノ酸配列またはその一部分を合成するためにタンパク質自体を産出することが可能である。例えば、種々の固相技術を使用してペプチド合成を行うことができ（Ｒｏｂｅｒｇｅらの（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２−２０４）、例えばＡＢＩ  ４３１ペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を使用して自動合成を達成することが可能である。新規に合成したペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）によって実質上精製することが可能である。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析またはシーケンシングによって確認することが可能である（例えば、Ｅｄｍａｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ）。加えて、Ｍｎｋのアミノ酸配列またはその任意の一部は、直接合成中に変異させることができ、および（または）変異型ポリペプチドを産生するために、化学的方法を使用して、他のタンパク質またはその任意の一部から得た配列と結合させることが可能である。
【００４０】
生物学的に活性なＭｎｋを発現するために、Ｍｎｋをコードするヌクレオチド配列または機能的な等価物を好適な発現ベクターに挿入することができ、その発現ベクターとは、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターを指す。当業者に公知の方法を用いて、Ｍｎｋをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、生体外の組換えＤＮＡ技術、合成技術、および生体内の遺伝的な組換えが含まれる。その技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．らの（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．らの（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【００４１】
調節エレメントには、例えばプロモーター、開始コドン、終止コドン、ｍＲＮＡ安定性調節エレメント、およびポリアデニル化信号が含まれる。ポリヌクレオチドの発現は、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー領域のような構成型プロモーター、（ｉｉ）インシュリンプロモーター（Ｓｏｒｉａらの２０００，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１５７を参照）、ＳＯＸ２遺伝子プロモーター（Ｌｉらの１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：９７１−４を参照）、Ｍｓｉ−１プロモーター（Ｓａｋａｋｉバーａらの１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １７：８３００−８３１２を参照）、α−噴門ミオシン重鎖プロモーターまたはヒト心房性ナトリウム利尿因子プロモーター（Ｋｌｕｇらの１９９６，Ｊ．ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９８：２１６−２４；Ｗｕらの１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４７２−７９）のような組織特定のプロモーター、または（ｉｉｉ）テトラサイクリン誘導型システムのような誘導型プロモーターよって保証される。また、発現ベクターには、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはピューロマイシン耐性遺伝子のような、抗生物質耐性を授与する選択薬剤またはマーカー遺伝子を含むことができる。これらの方法には、生体外組換えＤＮＡ技術、合成技術、および生体内遺伝子組換え技術が含まれる。その技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．らの（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．らの（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。本発明のさらに他の実施例によれば、天然の核酸配列、修飾核酸配列または本発明のタンパク質および相同性タンパク質をコードする組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコードすることが可能である。
【００４２】
種々の発現ベクターと宿主系を利用して、タンパク質または融合タンパク質をコードする配列を保持および発現することが可能である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴のウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルスＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
「調節要素」または「調節配列」は、転写および翻訳を行なうために宿主細胞タンパク質と相互作用するベクター、例えばエンハンサー、プロモーター、５"および３"非翻訳領域の非翻訳領域である。このような要素の強度および特異性は様々である。利用されるベクターシステムおよび宿主にもよるが、構成型プロモーターおよび誘導型プロモーターを含んだ任意数の適切な転写要素および翻訳要素を利用することが可能である。例えば、細菌系においてクローニングを行なう場合、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミドのハイブリッドｌａｃＺプロモーターような誘導型プロモーター（カリフォルニア州ラ・ホヤのＳｔｒａｔａｇｔａｇｅｎｅ社）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）などを使用することが可能である。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において使用することが可能である。植物細胞のゲノム（例えば、熱ショックであるＲＵＢＩＳＣＯ；および保管タンパク質遺伝子など）または植物ウィルス（例えば、ウィルスのプロモーターおよびリーダー配列）に由来するプロモーターおよびエンハンサーは、ベクターにクローニングすることが可能である。哺乳動物の細胞系では、哺乳動物の遺伝子または哺乳動物のウィルスからのプロモーターが望ましいとされる。Ｍｎｋをコードする複数のコピーの配列を含む細胞株を作成する必要がある場合には、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づいたベクターを適切な選択可能マーカーと共に使用することが可能である。
【００４４】
細菌系では、多数の発現ベクターがＭｎｋの使用目的に応じて選択することが可能である。例えば、多量のＭｎｋが抗体の誘発のために必要な場合には、容易に精製される、融合タンパク質の高レベル発現を誘導するベクターを使用することが可能である。そのようなベクターには、多機能大腸菌クローニング、Ｍｎｋをコードする配列が、ハイブリッドタンパク質が産生されるようにアミノ末端  Ｍｅｔおよびその結果生じた７つのβ−ガラクトシダーゼの残基に対する配列を有するベクターフレームに結合することが可能であるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のような発現ベクター、ｐＩＮ  ベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）、その他が含まれているが、それらに限定されるものではない。また、ＧＥＸシリーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｉｅｓ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）のベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として発現することも可能である。一般に、そのような融合タンパク質は可溶であり、グルタチオンアガロースビーズに対する吸着、それに続く遊離グルタチオンの存在下における溶出によって産生した溶解細胞から容易に精製することができる。そのようなシステムで作られたタンパク質は、所定のクローンポリペプチドがＧＳＴ部分から意のままに開放することができるように、ヘパリン、トロンビン、またはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むようにデザインすることが可能である。酵母菌、サッカロミセスセレビジエにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの構成型プロモーターまたは誘導型プロモーターを含むいくつかのベクターを使用することが可能である。論評に関しては、前出のＡｕｓｕｂｅｌら、およびＧｒａｎｔらの（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５３：５１６−５４４を参照。
【００４５】
植物発現ベクターを使用する事例によれば、Ｍｎｋをコードする配列の発現をプロモーターの任意の１つによって駆動することが可能である。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウィルスプロモーターを単独またはＴＭＶからのオメガリーダー配列（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１）と共に使用することが可能である。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することが可能である（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．らの（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０、Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．らの（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３、およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．らの（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの作成物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性の形質移入によって、植物細胞内に導入することができる。そのような技術は、一般に入手できるいくつかの論評に記載されている（例えば、『マグローヒル科学技術年鑑』（ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１９９２）ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹのＨｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．を参照。ページ番号１９１−１９６）。
【００４６】
また、昆虫システムを用いてＭｎｋを発現することも可能である。例えば、昆虫系の１つでは、オートグラファ  カリフォルニア  ニュークレアの多面性ウィルス（ＡｃＮＰＶ）がベクターとして使用され、ハスモンヨウ近似種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞またはウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）の幼虫における外来遺伝子を発現している。Ｍｎｋをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子等のウィルスの不必須領域へクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれることが可能である。Ｍｎｋの首尾良い挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、外殻タンパク質に欠ける組換えウィルスを産出する。さらに、組換えウィルスを用いて、Ｍｎｋが発現され得るＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫のＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染することが可能である（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．らの（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【００４７】
哺乳動物の宿主細胞においては、いくつかのウィルスベースの発現系を利用することが可能である。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＭｎｋをコードする配列を結合し得る。ウィルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染した宿主細胞においてＭｎｋを発現する能力のある生ウィルスを得ることが可能である（Ｌｏｇａｎ、Ｊ．およびＳｈｅｎｋ、Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。加えて、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物の宿主細胞における発現を高めることが可能である。
【００４８】
特定の開始シグナルによって、Ｍｎｋをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。そのようなシグナルには、ＡＴＧ  開始コドンおよび近傍する配列が含まれる。Ｍｎｋをコードする配列、その開始コドン、および上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。但し、コーディング配列のみ、またはその一部のみが挿入される事例においては、ＡＴＧ  開始コドンを含んだ外来性翻訳調節シグナルが提供される必要がある。さらに、その開始コドンは、全挿入の翻訳を確実にするため、正しい読み取りフレーム中に存在する必要がある。外来性の翻訳要素および開始コドンは、天然および合成の両方を含めた様々な起源の産物であり得る。発現の効率は、文献  （Ｓｃｈａｒｆ、Ｄ．らの（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されたように、使用される特定の細胞系に対して適切なエンハンサーを包括することによって高めることが可能である。
【００４９】
加えて、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節する能力、または発現したタンパク質を所望の形態で処理する能力に対して選択することも可能である。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、それらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」形を切断する翻訳後の処理を用いて、正しい挿入、折りたたみ、および（または）機能を促進することが可能である。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８などの翻訳後の活性のための固有の細胞装置および特徴のある機構を有する種々の宿主細胞は、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択することが可能である。
【００５０】
長期にわたる、組換えタンパク質の高歩留産生のためには、安定した発現が望ましい。例えば、安定してＭｎｋを発現する細胞株は、複製発現因子および（または）内在性発現因子のウィルス起源を含み、選択可能マーカー遺伝子を同一ベクター上または別個のベクター上に含み得る発現ベクターを使用して、形質転換することが可能である。ベクターの導入後、細胞は選択培地に移行せしめる前に強化培地において１〜２日間増殖せしめることが可能である。選択可能マーカーの目的は、選択への抵抗性を与えることであり、その存在によって導入された配列を首尾良く発現する細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することが可能である。任意数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収することが可能である。この選択系には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．らの（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−２３）、およびｔｋ−細胞またはａｐｒｔ−細胞にそれぞれ用いることができるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．らの（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−２３）遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤の耐性は、その選択基準として用いることができ、例としてはメトトレキセートに耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．らの（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０）、アミノグリコシッドネオマイシンおよびＧ−４１８に耐性を与えるｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．らの（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）、およびクロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）とホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）にそれぞれ耐性を与えるａｌｓまたはｐａｔ（前出のＭｕｒｒｙ）などが挙げられる。追加の選択可能遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代替としてインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代替としてヒスチノルを利用することを可能にするｈｉｓＤなどは（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）に記載されている。最近、可視マーカーは好評を博しており、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーは、形質転換体を同定するためだけではなく、特定のベクター系に依存する一過性または安定したタンパク質発現を定量化するために広範に使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ、Ｃ．Ａ．らの（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【００５１】
生体内では、基質に対するＭｎｋ無修飾ポリペプチドの酵素性キナーゼ活性を適当な刺激によって促進することができ、Ｍｎｋのリン酸化をトリガーすることができる。これは、シグナル伝達分子または環境的な影響のような細胞外のまたは細胞内の刺激によって天然の状況において誘導することが可能である。活性化されたＭｎｋを含むシステムは、それが細胞または無細胞の環境の生物体、組織、培養であれ、外因的にこの刺激を適用することによって、または種々の技術でこの刺激を模倣することによって作成することが可能であり、さらにその一部を以下に記載した。活性化Ｍｎｋを含んだシステムは、（ｉ）体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官の癌のような活性酸素防御に関連する障害の診断、試験、予防、および治療の目的のため、（ｉｉ）本発明の遺伝子またはそれらのコード化されたポリペプチに影響を及ぼす治療薬候補、医薬品または薬物を同定または確証する目的のため、（ｉｉｉ）本発明の遺伝子によってコードした活性化ポリペプチドを含んだ細胞可溶化液を作成する目的のため、（ｉｖ）本発明の遺伝子によってコードしたこのソース活性化ポリペプチドから分離する目的のため産生することが可能である。
【００５２】
本発明の一実施例によれば、上記の当該目的のため、天然刺激非依存性の活性化Ｍｎｋを、例えば、限定するものではないが、（ｉ）天然の刺激を模倣する薬剤；（ｉｉ）ＭＡＰキナーゼ経路、ホルボールエステル、アニソマイシンの活性化剤、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ、およびＭＡＰキナーゼの構成型活性対立遺伝子のような下流の天然の刺激に作用する薬剤、または記述したとおりのＭｎｋ自体または作成したＭｎｋでもよい；（ｉｉｉ）構成型活性形態を作り出すためのＭｎｋ配列内での単一または複数のアミノ酸の置換、欠損または挿入の導入；（ｉｖ）Ｍｎｋの分離した断片の使用によって産生することが可能である。加えて、このシステムに対して活性化する組成物を同時転移することによって、異所性システム、真核または原核、生体内または生体外において酵素的に活性なＭｎｋを作成することが可能である。これらは、例えば、限定するものではないが、ＭＡＰキナーゼＥＲＫ１またはＥＲＫ２またはｐ３８  ＭＡＰＫイソ型と共に、ＭＡＰキナーゼキナーゼＭｅｋ１またはＭｋｋ６の構成型活性対立遺伝子のようなＭＡＰキナーゼ経路の組成物であり得る。例えば、１．０ｍＭアデノシン三リン酸、および５０ｍＭ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）／水酸化カリウムｐＨ  ７．４、５ｍＭの塩化マグネシウム、０．５ｍＭのジチオスレイトールのような好適な緩衝剤条件の存在下で分離したＥＲＫ２キナーゼと共に、アミノ酸置換Ｓ２１８ＤおよびＳ２２２Ｅを含んだＭｅｋ１の変異体ポリペプチドを用いて、溶液中の分離したＭｎｋタンパク質を活性化することが可能である（図１４を参照）。
【００５３】
マーカー遺伝子発現の有無は、所定の遺伝子の有無も示唆するが、その存在および発現は確認する必要がある。例えば、Ｍｎｋをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、Ｍｎｋをコードする配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＭｎｋをコードする配列と一列に配置することも可能である。マーカー遺伝子の発現は通常、誘発または選択に応答してタンデム遺伝子の発現も示す。あるいは、Ｍｎｋをコードする核酸配列を含み、Ｍｎｋを発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の方法を用いて同定することが可能である。これらの手順には、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、および核酸またはタンパク質の検出および（または）定量化のための膜系、溶液ベース、またはチップベースのテクノロジを含むタンパク質の生物学的試験法または免疫学的測定法が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００５４】
Ｍｎｋをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、Ｍｎｋをコードするポリヌクレオチドのプライマー、プローブ、または部分または断片を用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成法、または増幅によって検出することが可能である。核酸の増幅基調アッセイには、オリゴヌクレオチドの使用、またはＭｎｋをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含んだ形質転換体を検出するためにＭｎｋをコードする配列に基づいたオリゴマーが含まれる。本詳細書で使用された「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、最低約１０ヌクレオチド、および約６０ほどのヌクレオチド、望ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、およびより望ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプリマーとして使用されることが可能である。
【００５５】
タンパク質に固有のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＭｎｋの発現を検出および計測のためのさまざまなプロトコルは当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定（吸着）法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、および蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）が含まれる。Ｍｎｋ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、２部位モノクローナルベースの免疫学的測定法は好適ではあるが、競合結合アッセイを用いることが可能である。これらを含めた他の測定法は、Ｈａｍｐｔｏｎ、Ｒ．らの（ミネソタ州セントポール市、１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ）およびＭａｄｄｏｘ、Ｄ．Ｅ．らの（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）の諸所に記載されている。
【００５６】
多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。標識ハイブリダイゼーションを産生するための手段、またはＭｎｋをコードするポリヌクレオチドに関連する配列検出するためのＰＣＲプローブには、標識ヌクレオチドを使用するオリゴ標識、ダコン翻訳、末端標識またはＰＣＲ増幅が含まれる。
【００５７】
あるいは、Ｍｎｋをコードする配列またはその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野で周知であり、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６および標識ヌクレオチドのような適切なＲＮＡポリメラーゼを追加することによって、生体外ＲＮＡプローブの合成に使用することが可能である。このような手順は、市販されている種々のキット（ミシガン州カラマズーのＰｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ社）、Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州マディソン）、およびＵ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ社（オハイオ州クリーブランド）を用いて実行することが可能である。
【００５８】
また、使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子なども含まれる。
【００５９】
Ｍｎｋをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養する。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用される配列および（または）ベクターによるが、分泌または細胞内に含有せしめることが可能である。Ｍｎｋをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＭｎｋの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。その他の組換え構造を用いて、Ｍｎｋをコードする配列を水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することが可能である。そのような精製促進ドメインには、固定化金属上の精製を可能にするヒスチダイントライトファン分子のような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質Ａドメインおよびフラグ伸長・親和性精製システム（ワシントン州シアトル市のＩｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）において利用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＸＡ因子または精製ドメインとＭｎｋ間のエンテロキナーゼ（腸活素）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｌｉｆ．）等に対して特異的な切断可能リンカー配列の抱合は、精製を促進するために使用することが可能である。そのような単一発現ベクターは、Ｍｎｋを含む融合タンパク質の発現、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ（腸活素）切断部位に先行する、６ヒスチダイン残基をコードする核酸を提供する。エンテロキナーゼ（腸活素）切断部位は、融合タンパク質からＭｎｋを精製する手段を提供する一方、ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（Ｐｏｒａｔｈ、Ｊ．らの（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載された固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー）上での精製を促進する。融合タンパク質を含むベクターの論考は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．らの（１９９３；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１−４５３）で提供されている。組換え産出に加えて、Ｍｎｋの断片は、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を用いてペプチド合成を誘導することによって産生することができる。タンパク質合成は、手動または自動の何れの技術によっても実行することが可能である。自動合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１ペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いて達成することが可能である。Ｍｎｋの種々の断片は、完全長分子を産生するために化学的方法を使用して、個別に化学的な合成および結合を行なうことが可能である。
【００６０】
診断および治療
本発明において開示したデータは、ことを明らかにする。核酸および本発明のタンパク質およびそのエフェクター分子が、例えば、限定するものではないが、肥満症、糖尿病、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、すい臓の機能障害、動脈硬化症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）のような代謝障害、および上記のようなその他の疾患および障害に関連する診断目的および治療目的において有用である。従って、本発明のＭｎｋタンパク質の診断用途および治療用途は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）小分子薬剤標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療、診断、薬剤ターゲッティング／細胞毒性抗体）、（ｉｖ）診断および（または）予後マーカー、（ｖ）遺伝子療法（遺伝子送達と遺伝子除去）、（ｖｉ）研究ツール、および（ｖｉｉ）生体外および生体内における組織再生（これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生）。
【００６１】
本発明の核酸およびタンパク質は、上述した種々の疾患と障害および（または）その他の病理学および障害に関与する診断用途および治療目的において有用である。例えば、限定するものではないが、遺伝子療法、および本発明のＭｎｋタンパク質および特にそのヒト相同体において有用であり得る、本発明のＭｎｋタンパク質をコードするｃＤＮＡｓおよび特にそのヒト相同体は、それを必要とする被験体に投与された場合に有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、例えば、限定するものではないが、肥満症、糖尿病、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、すい臓の機能障害、動脈硬化症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）のような代謝障害、およびその他の疾患および障害、特に上記のような疾患および障害に苦しむ患者の治療に有効性を有する。
【００６２】
本発明のＭｎｋタンパク質をコードする核酸、またはその断片は、核酸またはタンパク質の存在または量が算定されるべき診断適用例においてもさらに有用であり得る。これらの材料はさらに、治療法または診断法における使用のため、本発明の新物質に対して免疫特異的に結合する抗体の作成において有用である。
【００６３】
例えば一実施態様においては、アンタゴニストとして直接的に、またはＭｎｋを発現する細胞や組織に薬剤をもたらすターゲッティングまたは輸送機構として間接的に、Ｍｎｋに特異な抗体を用いることが可能である。その抗体は当分野で周知の方法を用いて作成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体（すなわち、二量体の形成を阻害する抗体）は特に治療用に望ましい。
【００６４】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを含む種々の宿主は、Ｍｎｋの任意の断片またはオリゴペプチドであって免疫抗原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができる。宿主の種によるが、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることが可能である。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリゾレシチン、プルオニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノールのような表面活性物質などが含まれるが、それらに限定されるものではない。ヒトに使用されるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウムパルヴムが特に望ましい。Ｍｎｋに対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約５のアミノ酸からなり、より望ましくは少なくとも約１０のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが望ましい。これらが、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であること、および小さな天然分子の全アミノ酸配列を含み得ることが望ましい。Ｍｎｋアミノ酸の短い伸長部は、キメラ分子に対して産生されたキーホールリンペットヘモシニアンおよび抗体等の、別のタンパク質の伸長部と融合することができる。
【００６５】
Ｍｎｋに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ．らの（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒ、Ｄ．らの（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１−４２；Ｃｏｔｅ、Ｒ．Ｊ．らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ、Ｓ．Ｐ．らの（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０）が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００６６】
加えて、「キメラ抗体」を産出するために開発された技術、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．らの（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．らの（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、Ｍｎｋ特異性一本鎖抗体を作成する。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ成分の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって作成することが可能である（Ｂｕｒｔｏｎ、Ｄ．Ｒ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１１２０−３）。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生の誘導によって産生することが可能であり、または組換え免疫グロブリンライブラリまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても産生することが可能である（Ｏｒｌａｎｄｉ、Ｒ．らの（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３８３３−３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ．らの（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９）。
【００６７】
Ｍｎｋに対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることができる。例えば、そのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生できる蛋白分解性断片、例えばＦ（ａｂ′）２断片、およびＦ（ａｂ′）２のスルフィド架橋を還元することによって作成できるＦａｂ断片が含まれるが、それらに限定されるものではない。あるいは、組換え（型）の断片を作成することも可能である。例えば、Ｆａｂ発現ライブラリを作製して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にすることができる（Ｈｕｓｅ、Ｗ．Ｄ．らの（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２７５−１２８１）。
【００６８】
種々の免疫学的測定法をスクリーニングに対して用い、所望の特異性を有する抗体を同定することが可能である。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、Ｍｎｋとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。２つの非干渉性Ｍｎｋエピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナルベースの免疫学的測定法が望ましいが、競合結合アッセイを用いることも可能である（前出のＭａｄｄｏｘ）。
【００６９】
本発明の別の実施例によれば、Ｍｎｋポリヌクレオチドまたはその任意の断片、または核酸エフェクター分子、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイムまたはＲＮＡｉ分子を治療目的のために使用することが可能である。一実施態様において、組み合わせ核酸ライブラリの使用を含んだ手順のスクリーニングおよび選択によって、アプタマー、すなわち、Ｍｎｋタンパク質に対して結合し、その活性を調節する能力のある核酸分子を作成することが可能である。
【００７０】
さらなる実施態様によれば、Ｍｎｋをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子を、ｍＲＮＡの転写を阻止することが望ましいような状況において使用することが可能である。具体的には、Ｍｎｋをコードするポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することができる。このように、アンチセンス分子を用いてＭｎｋ活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することができる。今このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、Ｍｎｋをコードする配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニア  ウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することが可能である。当業者に公知の方法を用いて、Ｍｎｋをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）およびＡｕｓｕｂｅｌら（前出）の両方の文献に記載されている。Ｍｎｋをコードする遺伝子は、ハイレベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターまたはＭｎｋをコードするその断片を用いて、細胞または組織を形質転換することによって、オフにすることがでる。そのような作成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。ＤＮＡへの組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、ＲＮＡ分子が内在性ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）によって使用不可能になるまで継続してＲＮＡ分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって１ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より長く持続することが可能である。
【００７１】
上述したとおり、遺伝子発現の修飾は、アンチセンス分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡのような核酸アナログを、Ｍｎｋすなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンをコードする遺伝子の制御領域に対してデザインすることによって得ることができる。転写開始部位（例えば始動部位から−１０〜＋１０の間）由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制が可能となる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は文献に記載がある（Ｇｅｅ，Ｊ．Ｅ．らの（１９９４）Ｉｎ；Ｈｕｂｅｒ，Ｂ．Ｅ．ａｎｄ  Ｂ．Ｉ．Ｃａｒｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｆｕｔｕｒａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，Ｎ．Ｙ．）。また、アンチセンスは、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する目的でデザインすることも可能である。
【００７２】
また、酵素性ＲＮＡ分子であるリボソームを用いて、ＲＮＡの特異的切断を触媒することも可能である。リボザイム作用の機構は、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与する。使用することが可能な実施例には、Ｍｎｋをコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異性リボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣ配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって最初に同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む１５〜２０リボヌクレオチド間の短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造の特色に対して評価することが可能となる。候補標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護測定法を使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス容易性をテストすることにより、評価することが可能である。
【００７３】
エフェクター分子、例えば本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で知られている任意の方法を用いて調製することが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、ＭｎｋをコードするＤＮＡ配列の生体外および生体内における転写によってＲＮ分子を作成することもできる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６のような好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、ＲＮＡを構成的または誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ構成物アンチセンスは、細胞株、細胞、または組織内に導入することができる。ＲＮ分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の５′末端および（または）３′末端でのフランキング配列の追加、またはホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく２′Ｏ−メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、ＰＮＡの産出に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。
【００７４】
Ｍｎｋタンパク質の活性は、例えば、前出のＴｓｃｈｏｐｐら（２０００）によって記載されたような生体外キナーゼアッセイ、または以下に記載したようなその他任意の好適なアッセイ方式によってアッセイできる。このアッセイにおけるＭｎｋの阻害剤としては、前出のＴｓｃｈｏｐｐら（２０００）、または前出Ｋｎａｕｆら（２００１）によって記載されたように、ＣＧＰ５７３８０またはＣＧＰ０５２０８８のようなスタウロスポリン誘導体を使用することができる。ネガティブコントロールとしては、Ｍｎｋに対して不活性であるが、ＣＧＰ０５２０８８と類似の細胞障害性を示す化合物ＣＧＰ５２４２８、またはその他任意のＭｎｋに対する活性を例外としてキナーゼ阻害活性を備えた化学的実体を使用することができる。その上に、ＣＧＰ５７３８０の誘導体は、Ｍｎｋに対する活性のためにアッセイでき、上述したように代謝疾患の治療、予防、および診断のための物質である。ＣＧＰ５７３８０の誘導体は、例えば、従来の化学的、物理的および生化学的手段を通した修飾によって作成でき、組み合わせライブラリを産生するするために使用することが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などは、構造上の類似体を産出するために、有向またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。
【００７５】
さらに、本発明は、上述したように、代謝疾患の治療、予防または診断のためのＭｎｋキナーゼ阻害剤または活性化剤の使用法に関するものである。望ましくは、限定するものではないが、Ｍｎｋキナーゼ阻害剤はスタウロスポリン誘導体またはピラゾール誘導体とする。ピラゾール誘導体の実施例はＥＰ−Ａ−０  ８１９  １２９において記載してあり、引用することを以って本明細書の一部となす。ＣＧＰ５７３８０は最大で３０μＭまでは細胞障害性を示さないので、望ましくはこの物質を用いてキナーゼ活性、望ましくはＭｎｋ２を阻害することが可能であり、上述したように代謝疾患の治療、予防、および診断のための物質として使用することが可能である。
【００７６】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が提供されており、生体内、生体外およびｅｘ  ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。生体内外交通治療では、ベクターは、患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法を用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を含めた、好適な被験体に適用することが可能である。
【００７７】
本発明の追加実施例は、医薬用に許容できるキャリアと共に、上述の任意の治療効果のための医薬品組成物の投与に関するものである。このような医薬品組成物は、Ｍｎｋ、Ｍｎｋに対する抗体、および擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＭｎｋの阻害剤から構成され得る。本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも１つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水などを含めた、任意の消毒した、生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明で使用した医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することが可能であり、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
その活性成分に加えて、これらの医薬品組成物は、医薬用に使用することができる活性化合物の製剤への処理を促進する賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ペンシルベニア州イーストンのＭａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）の最新版を参照。経口投与用の医薬品組成物は、当分野で公知の医薬用に許容できるキャリアを使用して、経口投与に好適な投与量で製剤することができる。このようなキャリアを用いると、患者による摂取のために、医薬品組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液、その他に製剤することが可能となる。
【００７９】
本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の様式、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥プロセスなどの手段によって製造することが可能である。本医薬品成分は、塩として供給することが可能であり、多くの酸と共に形成することができ、例えば、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。医薬品組成物を調製した後には、適切な容器に充填して治療の対象となる適応症状を標識する。Ｍｎｋの投与に対する標識には、投与の量、頻度、および方法が明記される。
【００８０】
本発明に好適な医薬品組成物には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の定量は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物の場合には、細胞培養アッセイ、例えば前脂肪細胞の細胞株の細胞培養アッセイおいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの動物モデルにおいてのいずれかで、初めに治療に有効な投与量を推定することができる。また、動物モデルを好適な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することも可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療的に効果的な投薬量は、例えばＭｎｋ、その断片、特定の状態を治療するためのＭｎｋの抗体の活性処方成分の量に関連する。治療有効度および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準的な調剤手順によって決定することが可能であり、その例としては、ＥＤ５０（集団の５０％において治療に有効な量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）などが挙げられる。治療効果と毒性効果の間の投与量の比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の使用元、患者の感受性、および投与の経路によって、この範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するように調節する。配慮される要因には、疾患の重症度、被験者の身体全体の健康状態、被験者の年齢、体重、および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、３〜４日毎、１週間毎、または２週間毎に１回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約０．１〜１００，０００マイクログラムと異なり、合計投与量は約１グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者であれば、タンパク質または阻害剤とは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００８１】
別の実施例によれば、Ｍｎｋを特異的に結合する抗体は、Ｍｎｋの過剰発現または低発現と関連を有することによって特徴付けられる状態または疾患の診断、またはＭｎｋ、アゴニストまたは阻害剤で治療を受けている患者を監視するためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療で記載した方法と同様の様式で調製することが可能である。Ｍｎｋの診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液、または細胞や組織の抽出物にあるＭｎｋを検出する方法が含まれる。その抗体は、修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、共有結合または非共有結合のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を使用することが可能であり、そのいくつかのレポーター分子を上記した。
【００８２】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、およびＦＡＣＳを始めとしたＭｎｋを測定するための種々のプロトコルは当分野では周知であり、改変または異常レベルのＭｎｋの発現を診断する基準を提供する。Ｍｎｋ発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物から、望ましくはヒトから採取した体液または細胞をＭｎｋに対する抗体と結合させて確定する。標準複合体形成量は、種々の方法によって定量化できるが、測光的な手段を用いることが望ましい。対照サンプルおよび疾患サンプル、例えば生検組織において発現したＭｎｋの量を標準値と比較する。標準値と被験体の値の偏差は、疾患の診断のためのパラメータを樹立する。また、Ｍｎｋ発現の分析は、当技術分野で周知であり、以下に実施例の項において詳細に記載したアッセイ形式におけるＭｎｋ活性の定量によって実施することができる。
【００８３】
本発明の別の実施例によれば、Ｍｎｋに特定のポリヌクレオチドを診断のために用いることも可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子、およびＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、検体におけるＭｎｋの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現を検出および定量することが可能である。診断アッセイを用いて、Ｍｎｋの不在、存在および過剰発現を区別すること、および治療介入中にＭｎｋレベルの調節を監視することが可能である。
【００８４】
一実施形態によれば、Ｍｎｋまたは近縁の分子をコードするゲノム配列を始めとするポリヌクレオチド配列を検出する能力を持つＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションを用いて、Ｍｎｋをコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブの特異性は、それが高度に特異的な領域、例えば５′調節領域における独特のヌクレオチド、またはあまり特異的ではない領域、例えば特に３′コーディング領域のいずれから作られたに拘わらず、またそのハイブリダイゼーションまたは増幅（最大、高、中、または低）のストリンジェントの度合に拘わらず、そのプローブがＭｎｋ、対立遺伝子、または関連配列をコードする天然の配列のみを同定するかどうかを確定する。また、プローブは、関連する配列の検出に用いることもでき、望ましくは少なくとも５０％のＭｎｋをコードする任意の配列からのヌクレオチドが含まれているべきである。対象発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡであっても良く、ＡＦ２３７７７５、ＮＭ＿０１７５７２．１、ＮＭ＿００３６８４．２、またはＡＢ０００４０９．１のヌクレオチド配列、またはプロモーター、エンハンサーエレメント、および天然Ｍｎｋのイントロンを始めとしたゲノム配列に由来し得る。ＭｎｋをコードするＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製する方法には、Ｍｎｋ誘導体をコードする核酸配列を、ｍＲＮＡプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。当業者に知られ、市販されている、このようなベクターを用いて、好適なＲＮＡポリメラーゼおよび好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、生体内でＲＮＡプローブを合成することが可能である。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団、例えば３２Ｐまたは３５Ｓのような放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系などを介してプローブに結合したアルカリホスファターゼのような酵素標識によって標識することが可能である。
【００８５】
Ｍｎｋをコードするポリヌクレオチド配列は、条件の診断、またはＭｎｋの発現に関係する疾患のために使用することができる。そのような状態または疾患の実施例には、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。また、Ｍｎｋをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、糖尿病を始めとする膵臓の疾患および障害に対する治療を受けている患者の進歩状況を監視することも可能である。Ｍｎｋをコードするポリヌクレオチド配列は、変異Ｍｎｋの発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、およびＰＣＲ法、またはディップスティック法、ピンＥＬＩＳＡ法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。このような定量方法または定性方法は当分野で公知である。
【００８６】
特定の実施形態では、Ｍｎｋをコードするヌクレオチド配列は、肥満症、糖尿病、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、すい臓の機能障害、動脈硬化症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、ＲＯＳ産生に関連する障害、および神経変性疾患を始めとした、種々の代謝疾患および障害の活性化または誘発検出するアッセイにおいて有用であり得る。Ｍｎｋをコードするヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、そのシグナルを定量化し、標準値と比較する。対照試料に比較した試料において、Ｍｎｋをコードするヌクレオチド配列の改変レベルの存在は、関連疾病の存在を示す。また、このような測定法を用いて、動物研究、臨床試験、または個々の患者の治療の監視において、特定の治療上の療法の有効性を評価することも可能である。
【００８７】
Ｍｎｋの発現に関連する疾患の診断基準を提供するため、発現に対する正常概要または標準概要を確定する。これは、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被験者から抽出した体液または細胞を、Ｍｎｋをコードする配列またはその断片と結合させることによって達成し得る。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被験体から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことが可能である。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被験体値との間の偏差を用いて疾患の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を確定し、治療プロトコルを開始すると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し、患者の発現レベルが正常な患者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを評価することが可能である。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日〜数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すことが可能である。
【００８８】
肥満症、糖尿病、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、すい臓の機能障害、動脈硬化症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）を始めとした代謝疾患および障害、ＲＯＳ産生に関連する障害、および神経変性疾患に関して、個体からの生検組織におけるかなり多量の転写物の存在は、疾病発生の素因を示す可能性があり、また、実際の臨床的症状の出現に先行して疾病を検出する手段を提供する可能性もある。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防手段または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発達またはさらなる進行を防止することが可能となる。Ｍｎｋをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの診断上の追加用途には、ＰＣＲの利用が含まれる得る。このようなオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に作成するか、または組換えソースから産出することが可能である。オリゴマーは、望ましくは２つのヌクレオチド配列から成り、その１つはセンス方向（５′．ｆｗｄａｒｗ．３′）を有し、他の１つはアンチセンス方向（３′．ｒａｒｗ．５′）を有し、特定の遺伝子または状況を同定するために、最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセット、または縮重オリゴマーの集積である、２つの同一のオリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用いて、緊密に関連したＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の検出あるいは（または）定量化を行なうことが可能である。
【００８９】
Ｍｎｋの発現を定量するために用いことができる方法には、放射標識またはビオチンヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線等が含まれる（Ｍｅｌｂｙ，Ｐ．Ｃ．らの（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５９：２３５−２４４；Ｄｕｐｌａａ，Ｃ．らの（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：２２９−２３６）。複数試料の定量化速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にあるＥＬＳＡ形態のアッセイを実行することによって加速することが可能である。
【００９０】
また、本発明の別の実施例によれば、核酸Ｍｎｋ配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするために有用であるハイブリダイゼーションプローブ作成することも可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または公知の方法を用いて染色体の特定領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、ＦＩＳＨ、ＦＡＣＳ、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌Ｐ１構築または単一染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色構造があり、Ｐｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．（１９９３）Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．７：１２７−１３４，およびＴｒａｓｋ，Ｂ．Ｊ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：１４９−１５４．ＦＩＳＨ（Ｖｅｒｍａらによって記述されているとおり、（１９８８）Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）などの文献で論評されているように、他の物理的な染色体のマッピング技術および遺伝マップデータと相関することが可能である。遺伝マップデータの例は、１９９４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）に見出すことができる。物理的染色体マップ上のＭｎｋをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連するＤＮＡの領域を画定するのに役立ち得る。
【００９１】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。確定した染色体マーカーを用いた染色体標本および結合分析などの物理的マッピング技術の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝マップを拡張することが可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報を提供する。一旦疾患または症候群が、例えばＡＴ〜１１ｑ２２−２３（Ｇａｔｔｉ，Ｒ．Ａ．らの（１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：５７７−５８０）などの特定ゲノム領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがされると、その領域に対してマッピングする全ての配列は、さらなる究明用の関連遺伝子または調節遺伝子に相当することになる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することが可能である。
【００９２】
本発明の別の実施例によれば、、本発明のタンパク質、それらの触媒作用断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチド、生体外モデル、遺伝子操作を受けた細胞または動物を用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。１つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合し、その作用を調節するか、または模倣するエフェクター、例えば受容体、酵素、タンパク質、ペプチド、リガンドまたは基質を同定することはできるであろう。このようなスクリーニングで用いたタンパク質またはその断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。また、本発明のタンパク質とテストされる薬剤間の結合複合物の形成を測定することも可能である。また、薬剤が直接的または間接的に本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼすこともできる。標的機構には、例えば、キナーゼ活性、特にタンパク質またはペプチドのリン酸化が含まれ、最も望ましくは、限定するものではないが、セリンおよびトレオニン残基が含まれる。別の標的機構には、リン酸化、脱リン酸、アセチル化、アルキル化、ユビキチン結合、蛋白分解性処理の細胞内局在性または劣化のような翻訳後の修飾によるＭｎｋ機能（作用）の調節が含まれ得る。さらに別の標的機構には、例えば、限定するものではないが、ホスホリパーゼＡ、エストロゲン受容体、キナーゼ因子または翻訳因子のようなタンパク質結合パートナーを備えたＭｎｋの相互作用が含まれ得る。特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書中で使用した用語「薬剤」は、１つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品である。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは５０〜約２，５００ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上の相互作用に必要な機能グループが含まれ、および典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも２つの機能化学グループが含まれる。候補薬剤には多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および（または）１つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。
【００９３】
候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、プリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｅｓ）、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含んださまざまなソースから取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および直接合成のための多くの手段が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に産生することができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して、天然または合成的に産生したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを産生することが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などのような公知の薬剤は、構造上の類似体を産出するために、有向またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、１つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。
【００９４】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、公開  ＰＣＴ出願番号ＷＯ８４／０３５６４に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法においては、本発明のタンパク質に対して適用されたように、多数の異なる小さな試験用化合物、例えばアプタマー、ペプチド、低分子量化合物などをプラスチックピンまたは他表面などの固体基質上で提供または合成する。試験用化合物は、タンパク質またはその断片と反応させ、洗浄した。次に、結合したタンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したタンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例によれば、タンパク質と結合可能な中和抗体がタンパク質と結合するため試験用化合物と特に競合し、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では抗体を用いて、タンパク質と１つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。
【００９５】
また、候補薬剤は、さらに以下に記載したように修飾を含むかまたは含まないタンパク質またはペプチド、または他のキナーゼ基質が、本発明のタンパク質またはタンパク質断片によってリン酸化されるキナーゼアッセイにおいて見出すことが可能である。治療薬候補は、本発明のタンパク質の酵素性活性を増加または減少する能力によって同定することが可能である。キナーゼ活性は、リン酸化に起因する基質の化学的、物理的または免疫学的な特質の変化によって検出することが可能である。
【００９６】
一実施例としては、放射性同位体的に標識したリン酸基を適切なドナー分子から本発明のポリペプチドによって触媒したキナーゼ基質への転移が挙げられるであろう。基質のリン酸化に継いで、当技術分野で周知の技術を用いて基質オートラジオグラフィーを検出することが可能である。
【００９７】
さらに別の実施例によれば、そのリン酸化に起因する基質の質量変化は、質量分析技術によって検出することが可能である。
【００９８】
また、基質のリン酸化状態と非リン酸化状態とを区別する試薬を有する基質のリン酸化状態を検出することもできる。そのような試薬は、基質のリン酸化形態とび非リン酸化形態に対して異なる親和性を有することによって、またはリン酸基に対して特定の親和性を有することによって作用することが可能である。そのような試薬は、限定するものではないが、抗体または抗体誘導体、組換え（型）の抗体様構造、タンパク質、核酸、分子を含んだ複合型の金属イオン、アニオン交換クロマトグラフィーマトリックス、親和性クロマトグラフィーマトリックスまたはその他任意の基質に対してリン酸化依存選択性を有する分子であり得る。
【００９９】
そのような試薬は、酵素性反応中またはその後に固形担体上に固定したキナーゼ基質を検出するために利用することができる。試薬が抗体である場合、その基質に対する結合は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９９８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＣＳＨ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ．において記載されているように、種々の技術によって検出することができる。試薬分子が抗体でない場合には、その結合はその化学的、物理的または免疫学的な特質が内生的にその結合に関連することによって、またはその結合に対して人工的に操作することによって検出することが可能である。
【０１００】
さらに別の実施例によれば、キナーゼ基質は、基質のリン酸化状態の分析に好適な信号を作成するために、結合または検出を促進する目的で設計された特色または内因性の特色を有することが可能である。これらの特色は、限定するものではないが、ビオチン分子またはその誘導体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ部分、６以上の連続したヒスチジン残基の１部分、アミノ酸配列またはエピトープ（抗原決定基）タグとしての機能（作用）に対するハプテン、蛍光色素、酵素または酵素断片であり得る。キナーゼ基質は、これらまたは他の特色に対して、立体障害を回避するために分子のスペーサアームを用いて連鎖することが可能である。
【０１０１】
一実施例によれば、キナーゼ基質は蛍光色素を用いて標識することが可能である。溶液中における標識基質に対する試薬の結合の後に、文献（例えば、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｓ．らの（１９９９）Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔｉｃｓ（ＳＰＩＥ）３６０３：２６１；Ｐａｒｋｅｒ、Ｇ．Ｊ．らの（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５：７７−８８；Ｗｕ、Ｐ．らの（１９９７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：２９−３６を参照）において記載されているように蛍光偏光の技術を行うことが可能である。。この実施例の変形例によれば、蛍光性トレーサー分子は、分析物がキナーゼ活性を検出するために、当業者であれば間接蛍光偏光として公知の技術によって基質と競合することが可能である。
【０１０２】
本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて遺伝子組換え細胞株および動物を作成することができる。これらの遺伝子組換え動物は、本発明生体外のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。遺伝子組換え動物、特に哺乳動物の遺伝子組換え動物は、ヒトに共通する多くの発生プロセスおよび細胞プロセスの調査のためのモデルシステムとして役立つことができる。遺伝子組換え動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座が突然変異される場合、胚幹細胞における相同性組換を通して作製することができる。別法として、タンパク質をコードする核酸作成物を卵母細胞に注入し、ゲノムにランダムに統合する。また、本発明の遺伝子またはその変異体を、通常には発現されないか、または異常発生するような場所に発現することも可能であろう。さらには、アンチセンス分子を発現する特定の作成物のような本発明の遺伝子の変異体、または本発明のタンパク質の発現を阻止または変質する優性阻害突然変異の発現はゲノムにランダムに統合し得る。ｌａｃ  Ｚまたはルシフェラーゼのような検出可能なマーカーを、本発明の遺伝子の発現の上方制御が表現型における容易に検出可能な変化を結果としてもたらす本発明の遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスおよびその他の動物ウィルス、酵母菌人工染色体（ＹＡＣｓ）などが含まれる。相同性組換えＤＮＡ構成物には、所望の遺伝的な修飾を有する本発明の遺伝子の一部が少なくとも含まれており、標的遺伝子座に対する相同性領域が含まれる。好都合なことには、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーが含まれている。ランダム統合のためのＤＮＡ作成物には、組換えを仲介するための相同性の領域が含まれる必要はない。ランダム統合のためのＤＮＡ作成物は、本発明のタンパク質、調節元素（プロモーター）、イントロンおよびポリアデニル化信号をコードする核酸から成る。相同性組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を作成する方法は本分野で周知である。胚幹（ＥＳ）細胞に関しては、ＥＳ細胞株を用いるか、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得することが可能である。そのような細胞は適切な線維芽細胞−支持細胞層上で増殖し、そして白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で増殖する。ＥＳ細胞または胚細胞を形質移入してから、遺伝子組換え動物を産生するために用いることができる。形質移入後、ＥＳ細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって選択することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同性組換えの発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、胚操作および桑実胚凝集に用いることが可能である。つまり、桑実胚を４〜６週間目の過排卵メスから取得し、透明帯を除去し、桑実胚を組織培養皿の小さなくぼみに置く。ＥＳ細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を桑実胚の近くのそのくぼみに置く。次の日に、凝集体を偽妊娠のメスの子宮角に移す。次に、メスに出産させる。キメラの子孫は、外殻の変化によって容易に検出することができ、引き続いて���然変異の次世代への伝達のためにスクリーニングする（Ｆ１−世代）。Ｆ１−世代の子孫を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾を有するオスおよびメスを交尾させ、ホモ接合性の子孫を産生する。その遺伝子改変が成長の過程で死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植または類遺伝子性移植、または生体外培養用として維持することができる。遺伝子組換え動物は、実験動物、家畜など、例えば、マウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ウシ、ブタ、のような任意の非ヒト哺乳動物でよい。遺伝子組換え動物は、機能的研究、薬物［スクリーニング、およびその他の用途において使用され、本発明の生体内のタンパク質の機能および調節の試験おいて有用である。
【０１０３】
また、最終的に、本発明は少なくとも下記の１つから成るキットに関するものである。
（ａ）  Ｍｎｋ２（Ｍｎｋ２ａまたはＭｎｋ２ｂ）またはＭｎｋ１核酸分子またはその断片；
（ｂ）  （ａ）の核酸を含むベクター；
（ｃ）  （ａ）の核酸または（ｂ）のベクターを含む宿主細胞；
（ｄ）  （ａ）の核酸によってコードされたポリペプチド；
（ｅ）  （ａ）の核酸によってコードされた融合ポリペプチド；
（ｆ）  （ａ）の核酸または（ｄ）または（ｅ）のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
（ｇ）  （ａ）の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【０１０４】
本キットは、診断用または治療用に使用することが可能であり、または上記に述べたようにアプリケーションをスクリーニングするため使用すること
が可能である。さらに、キットには、取扱説明書が含まれることが可能である。
【０１０５】
各図は下記を示す：
図１は、Ｐベクター（ＥＰ対照群と比較して）のホモ接合性生存結合に起因する、ＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。ここに示したのは、中性脂肪の突然変異体のタンパク質含有量に対する比率をパーセント（％）で表したものである）。
【０１０６】
図２は変異型ＬＫ６遺伝子座の分子構造を示す。黒色の点線は、ＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６の統合部位を含むｃＤＮＡの位置（染色体３Ｒ上の位置７５４４５００から７５５９５００まで）を示す。転写されたＤＮＡ配列（ＥＳＴ）および予想エキソンは下部の２行目にバーとして示した。遺伝子ＣＧ１７３４２（ＧａｄＦｌｙ、Ｌｋ６）の予測エキソンは濃灰色のバーとして、およびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。Ｌｋ６は、ＧａｄＦｌｙ配列分析プログラムにより、ＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ１７３４２として予測される遺伝子に対してコードする。
【０１０７】
図３はＭｎｋタンパク質の比較を示す。
【０１０８】
図３Ａは、異なる種、ヒトＭｎｋ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５と同一）を参照するｈＸＰ＿０３０６３７、ヒトＭｎｋ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９．１と同一）を参照するｈＸＰ＿００１６００、およびＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ１７３４２を備えたショウジョウバエＬｋ６遺伝子でコードしたタンパク質を参照するＡＡＢ１８７８９からのＭｎｋタンパク質の比較（ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘ  １．８）を示す。
【０１０９】
アライメントにおけるギャップは、「−」として表す。
【０１１０】
図３Ｂは、ヒトＭｎｋ２タンパク質の比較（ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ  １．８２）を示す。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０３０６３７．３は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５と同一であり、およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１７５７２．１は異なるヒトＭｎｋ２タンパク質の変異型を示す。
【０１１１】
図３Ｃは、ヒトＭｎｋ１タンパク質の比較（ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ  １．８２）を示す。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１６００．２はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９．１と同一であり、およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３６８４．２はＭｎｋ１タンパク質の異なる変異型を示す。
【０１１２】
図３Ｄ．ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）２ａ（配列識別番号１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０３０６３７と同一）の核酸配列
図３Ｅ．ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）２ａ（配列識別番号２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０３０６３７と同一）のアミノ酸配列
図３Ｆ．ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）２ｂ（配列識別番号３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７６またはＮＭ＿０１７５７２）の核酸配列
図３Ｇ．ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）２ｂ（配列識別番号４；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７６またはＮＭ＿０１７５７２）のアミノ酸配列
図３Ｈ．ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）１（配列識別番号５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９またはＮＭ＿００３６８４またはＸＭ＿００１６００）の核酸配列
図３Ｉ．ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）１（配列識別番号６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９またはＮＭ＿００３６８４またはＸＭ＿００１６００）のアミノ酸配列
図４は、脱共役タンパク質活性を調節する因子を発見するために使用した、脱共役タンパク質（ｄＵＣＰｙ）の過剰発現によって誘導した眼表現型を示す。写真の左部に示したハエによれば、ｄＵＣＰｙは通常のレベルで発現される。写真の右部に示したハエによれば、ｄＵＣＰｙは過剰発現され、および眼は低下される。
【０１１３】
図５はＭｎｋ２遺伝子発現を示す。
【０１１４】
図５Ａは野生型マウス組織におけるＭｎｋ２のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【０１１５】
図５Ｂは絶食および肥満した（ｏｂ／ｏｂ）マウスにおけるマウスＭｎｋ２遺伝子の発現を示す。
【０１１６】
図５Ｃは絶食および肥満したマウスにおけるマウスＭｎｋ２遺伝子の発現を示す。
【０１１７】
図５Ｄは、哺乳動物の線維芽細胞（３Ｔ３−Ｌ１）細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ２発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示す。
【０１１８】
図５Ｅは、哺乳動物の線維芽細胞３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ２発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示す。
【０１１９】
図５Ｆは、哺乳動物の線維芽細胞ＴＡ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ２発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示す。
【０１２０】
図６はマウスＭｎｋ１遺伝子の発現を示す。
【０１２１】
図６Ａは、野生型マウス組織におけるＭｎｋ１のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【０１２２】
図６Ｂは、異なるマウスモデルにおけるＭｎｋ１発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示す。
【０１２３】
図６Ｃは、哺乳動物の線維芽細胞３Ｔ３−Ｌ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ１発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示す。
【０１２４】
図６Ｄは、哺乳動物の線維芽細胞３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ１発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示す。
【０１２５】
図６Ｅは、哺乳動物の線維芽細胞ＴＡ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ１発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示す。
【０１２６】
図７はＵＣＰｙ配列を示す。
【０１２７】
図７Ａは、ショウジョウバエＵＣＰｙタンパク質（配列認識番号７）をコードする核酸配列を示す。オープン・リーディング・フレームには下線を引いた。
【０１２８】
図７Ｂは、ショウジョウバエＵＣＰｙタンパク質（配列認識番号８）をコードするアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
図  ８：中性脂肪の保管、合成および輸送の定量のための生体外測定法
図８Ａは、対照細胞に比較してＭｎｋ２を過剰発現する細胞における細胞中性脂肪レベル（μｇ／ｍｇタンパク質）の低下を示す。全試料は繰り返して分析した（ｓ１；試料１、ｓ２；試料２）。Ｙ軸は細胞中性脂肪レベル（μｇ／ｍｇタンパク質）を示し、そしてＸ軸は細胞分化の日数を示す。
【０１３０】
図８Ｂは、対照細胞に比較してＭｎｋ２を過剰発現する細胞におけるインスリン刺激脂質合成（ｄｐｍ／ｍｇタンパク質）の低下を示す。全試料は繰り返して分析した（ｓ１；試料１、ｓ２；試料２）。ＣＢ（サイトカラシンＢ）：３Ｔ３Ｌ１における背景合成を図解する。「Ｏ」は、ベースラインまたは非刺激グルコース輸送を表現し、従って細胞における基礎脂質合成を表現し、一方、Ｉｎｓ（インスリン）は刺激されたグルコース輸送および結果としてのグルコースの３Ｔ３Ｌ１細胞における脂質への合成を示す。Ｙ軸はタンパク質１ｍｇにつき毎分の分解（ｄｐｍ／ｍｇタンパク質）を示し、そしてＸ軸は前記タンパク質を表示する。
【０１３１】
図８Ｃは、対照細胞に比較してＭｎｋ２を過剰発現する細胞の血漿膜の全域で遊離脂肪酸の能動輸送（ＡＴ）における低下を示す。全試料は繰り返して分析した（同一のシェーディングの２つのバーによって図解したように）。ＰＤ（受動拡散）：ベースラインまたは膜の全域で外来性脂肪酸の非エネルギー依存性輸送を図解した。ＡＴ（能動輸送）：膜の全域で脂肪酸のエネルギー依存性輸送を表現するＹ軸はタンパク質１ｍｇにつき毎分の分解（ｄｐｍ／ｍｇタンパク質）を示し、そしてＸ軸は前記タンパク質を表示する。
【０１３２】
図９は異なるヒト組織におけるヒトＭｎｋ２の発現を示す。
【０１３３】
図９Ａは異なるヒト組織におけるヒトＭｎｋ２ＡおよびＭｎｋ２Ｂの発現を示す
図９Ｂは脂肪細胞分化中のヒトＭｎｋ２ＡおよびヒトＭｎｋ２Ｂの発現を示す。
【０１３４】
図１０は、アクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ遺伝子組換えマウスにおける異所性マウスＭｎｋ２  （ｍＭｎｋ２ＤＮ）の導入遺伝子の発現を示す。
ここに示したのは、オスのアクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ遺伝子組換えマウスおよびオスの野生型同腹仔から分離された異なる組織のｔａｑｍａｎ分析である。データは、対応する野生型（ｗｔ）組織に相対したＲＮＡ誘発倍率として表現される。各バーの上部の番号は、対応するｗｔ組織に相対した誘発倍率を示す。ここに示したのは代表的な実験である。
【０１３５】
図１１は、アクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ遺伝子組換えマウスにおける異所性のマウスＭｎｋ２（ｍＭｎｋ２ＤＮ）の発現が体重の増加につながるたことを明らかにする。
ここに示したのは、１０週間にわたる高脂肪食後のオスのｂアクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ遺伝子組換えマウス（濃灰色グラフ）およびオスのｗｔ同腹仔（薄灰色グラフ）の成長曲線である。データは期間中の平均体重＋／−標準誤差として表現した。ここに示したのは、群当たりのマウスをそれぞれＮ＝８、Ｎ＝１０とした、代表的な実験である。
【０１３６】
図１２は、マウスＭｎｋ２遺伝子のエキソン／イントロン境界を示す。
マ０ウスＭｎｋ２遺伝子のエキソン／イントロン境界はこの図において図解する。ｃエキソン番号、ＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１０２５６）上のエキソンの位置、およびイントロン長も示す。イントロン配列は小文字で示し、そしてエキソン配列は大太文字で示す。
【０１３７】
図１３は相同性組換えによるマウスＭｎｋ２遺伝子の標的削除を図解する。
上部のラインはマウスＭｎｋ２の野生型遺伝子座を示し、中間部にあるグラフィックスはターゲッティングベクターを示し、そして図の底部にあるグラフィックスは標的遺伝子座を図解する。エキソンは黒色ボックスとして示す。制限部位、翻訳開始部位、および終止コドンも示してある。ＰＧＫ−ＮＥＯカセットおよびＴＫカセットは灰色ボックスとして示す。マウスＭｎｋ２遺伝子の４．４ｋｂのゲノム領域は、ＰＧＫ  ＮＥＯカセットによって置換する。除去された領域も表示した。サザンブロット分析に使用した外側フランキングプローブは黒色バーで示す。ＥｃｏＲ１消化ＤＮＡ上のこのプローブで検出したゲノム断片は矢印として示す。詳細は実施例を参照。
【０１３８】
図１４は、精製されたＭｎｋ２ａがキナーゼＥｒｋ２および二重点変異体Ｍｅｋ１  Ｓ２１８Ｄ  Ｓ２２２Ｅの製剤（調製）を用いて生体外で活性化できることを明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は、Ｐベクター（ＥＰ対照群と比較して）のホモ接合性生存結合に起因する、ＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６ハエの中性脂肪含有量の増加を示している。
【図２】図２は変異型ＬＫ６遺伝子座の分子構造を示している。
【図３Ａ】図３Ａは、異なる種、ヒトＭｎｋ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５と同一）を参照するｈＸＰ＿０３０６３７、ヒトＭｎｋ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９．１と同一）を参照するｈＸＰ＿００１６００、およびＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ１７３４２を備えたショウジョウバエＬｋ６遺伝子でコードしたタンパク質を参照するＡＡＢ１８７８９からのＭｎｋタンパク質の比較（ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘ  １．８）を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒトＭｎｋ２タンパク質の比較（ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ  １．８２）を示す。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０３０６３７．３は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５と同一であり、およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１７５７２．１は異なるヒトＭｎｋ２タンパク質の変異型を示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ヒトＭｎｋ１タンパク質の比較（ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ  １．８２）を示す。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１６００．２はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９．１と同一であり、およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３６８４．２はＭｎｋ１タンパク質の異なる変異型を示している。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）２ａ（配列識別番号１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０３０６３７と同一）の核酸配列を示している。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）２ａ（配列識別番号２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０３０６３７と同一）のアミノ酸配列を示している。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）２ｂ（配列識別番号３；  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７６またはＮＭ＿０１７５７２）の核酸配列を示している。
【図３Ｇ】図３Ｇは、ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）２ｂ（配列識別番号４；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７６またはＮＭ＿０１７５７２）のアミノ酸配列を示している。
【図３Ｈ】図３Ｈは、ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）１（配列識別番号５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９またはＮＭ＿００３６８４またはＸＭ＿００１６００）の核酸配列を示している。
【図３Ｉ】図３Ｉは、ヒトＭＡＰキナーゼ結合キナーゼ（Ｍｎｋ）１（配列識別番号６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９またはＮＭ＿００３６８４またはＸＭ＿００１６００）のアミノ酸配列を示している。
【図４】図４は、脱共役タンパク質活性を調節する因子を発見するために使用した、脱共役タンパク質（ｄＵＣＰｙ）の過剰発現によって誘導した眼表現型を示している。
【図５Ａ】図５Ａは野生型マウス組織におけるＭｎｋ２のリアルタイムＰＣＲ分析を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは絶食および肥満した（ｏｂ／ｏｂ）マウスにおけるマウスＭｎｋ２遺伝子の発現を示している。
【図５Ｃ】図５Ｃは絶食および肥満したマウスにおけるマウスＭｎｋ２遺伝子の発現を示している。
【図５Ｄ】図５Ｄは、哺乳動物の線維芽細胞（３Ｔ３−Ｌ１）細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ２発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示している。
【図５Ｅ】図５Ｅは、哺乳動物の線維芽細胞３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ２発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示している。
【図５Ｆ】図５Ｆは、哺乳動物の線維芽細胞ＴＡ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ２発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、野生型マウス組織におけるＭｎｋ１のリアルタイムＰＣＲ分析を示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、異なるマウスモデルにおけるＭｎｋ１発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、哺乳動物の線維芽細胞３Ｔ３−Ｌ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ１発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示している。
【図６Ｄ】図６Ｄは、哺乳動物の線維芽細胞３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ１発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示している。
【図６Ｅ】図６Ｅは、哺乳動物の線維芽細胞ＴＡ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＭｎｋ１発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較を示している。
【図７Ａ】図７Ａは、ショウジョウバエＵＣＰｙタンパク質（配列認識番号７）をコードする核酸配列を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ショウジョウバエＵＣＰｙタンパク質（配列認識番号８）をコードするアミノ酸配列を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、対照細胞に比較してＭｎｋ２を過剰発現する細胞における細胞中性脂肪レベル（μｇ／ｍｇタンパク質）の低下を示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、対照細胞に比較してＭｎｋ２を過剰発現する細胞におけるインスリン刺激脂質合成（ｄｐｍ／ｍｇタンパク質）の低下を示している。
【図８Ｃ】図８Ｃは、対照細胞に比較してＭｎｋ２を過剰発現する細胞の血漿膜の全域で遊離脂肪酸の能動輸送（ＡＴ）における低下を示している。
【図９Ａ】図９Ａは異なるヒト組織におけるヒトＭｎｋ２ＡおよびＭｎｋ２Ｂの発現を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは脂肪細胞分化中のヒトＭｎｋ２ＡおよびヒトＭｎｋ２Ｂの発現を示している。
【図１０】図１０は、アクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ遺伝子組換えマウスにおける異所性マウスＭｎｋ２（ｍＭｎｋ２ＤＮ）の導入遺伝子の発現を示している。
【図１１】図１１は、アクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ遺伝子組換えマウスにおける異所性のマウスＭｎｋ２（ｍＭｎｋ２ＤＮ）の発現が体重の増加につながるたことを示している。
【図１２】図１２は、マウスＭｎｋ２遺伝子のエキソン／イントロン境界を示している。
【図１３】図１３は相同性組換えによるマウスＭｎｋ２遺伝子の標的削除を示している。
【図１４】図１４は、精製されたＭｎｋ２ａがキナーゼＥｒｋ２および二重点変異体Ｍｅｋ１  Ｓ２１８Ｄ  Ｓ２２２Ｅの製剤（調製）を用いて生体外で活性化できることを示している。
【実施例】
【０１４０】
この実施例は、本発明を図解するものである。
【０１４１】
実施例１：変異型ハエの中性脂肪含有量の測定（図１）
特殊な発現系（ＥＰ−ｅｌｅｍｅｎｔ、Ｒｏｒｔｈ  Ｐ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６、９３（２２）：１２４１８−２２）を含んだキイロショウジョウバエの中性脂肪含有量の変化を測定した。変異体ハエはハエ変異在庫コレクションから取得する。ハエは、当業者であれば公知の標準条件下で増殖し、そして実験の過程で、追加摂食としてベーカーの酵母菌（サッカロミセスセレビジエ）を与える。特異的に、ホモ接合性オスのＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６ハエを対照ハエに比較して検討した（図１）。中性脂肪含有量の定量のため、ハエを、５分間、９０℃にて水溶性の緩衝液中において水浴を使用してインキュベートした後に熱抽出を行なった。さらなる５分間、９０℃にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Ｓｉｇｍａ  中性脂肪（ＩＮＴ  ３３６−１０または−２０）アッセイを使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することによって、ハエ抽出物の中性脂肪含有量を決定した。参照として、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＤＣタンパク質測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って、同一抽出のタンパク質含有量を測定した。その測定法を何度か繰返した。ＥＰコレクションの中性脂肪平均レベルを１００％として図１に示した。ＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６ホモ接合性ハエは、対照と比較して常に高い中性脂肪含有量を示す（およそ１４０  ％増）。つまり、遺伝子座８６Ｆ７（推定）における遺伝子活性の変化は、ＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６ハエのＥＰ−ベクターがＬｋ６遺伝子座にホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から両方の事例において、肥満したハエモデルを表している。
【０１４２】
実施例２：エネルギー保管中性脂肪の代謝における変化に関与するショウジョウバエ遺伝子の同定（図２）
ＥＰベクターの統合に対して直接的に近接して局在するゲノムＤＮＡ配列を分離した（本明細書中ではＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６）。それらの分離したゲノム配列を用いて、Ｂｅｒｋｅｌｅｙショウジョウバエ  ゲノムプロジェクト（ＧａｄＦｌｙ）のような公共データベースをスクリーニングし、それによってＥＰ（３）３３３３ベクターおよびＥＰ（３）３５７６ベクターのホモ接合性生存統合部位を確認した。図２はこの遺伝子座の分子構造を示す。図２において、ゲノムＤＮＡ配列は、ＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６の統合部位が含まれている黒色の点線としてアッセンブリによって表してある（染色体３Ｒ上の位置７５４４５００から７５５９５００まで）。転写されたＤＮＡ配列（発現した配列タグ、ＥＳＴ）および予想エキソンは下部の２行目にバーとして示す。遺伝子ＣＧ１７３４２（ＧａｄＦｌｙ、Ｌｋ６、Ｍｎｋに対して相同性を持つ）の予測エキソンは濃灰色バーとして示し、およびイントロンは図の中間部に細い灰色ラインとして示した。プラスミド救出方法を用いて、ゲノムＤＮＡ配列を直接的に局在化した３′のＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６統合部位を分離した。プラスミド救出ＤＮＡを用いて、公共ＤＮＡ配列データベースをスクリーニングし、それによってＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６統合部位をの同定し、中性脂肪含有量の増加を引き起こした。ＥＰ（３）３３３３は遺伝子ＣＧ１７３４２の５プライムエキソンの５′領域において、およびＥＰ（３）３５７６は代替５′エキソンの５′領域において、それぞれ統合する。Ｍｎｋは、ＧａｄＦｌｙ配列分析プログラムによってＣＧ１７３４２として予測される遺伝子に対してコード化する。以上の点から、ＣＧ１７３４２の発現は、ＥＰ（３）３３３３およびＥＰ（３）３５７６のホモ接合性生存統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増大および脱共役タンパク質活性の変化につながる。
【０１４３】
実施例３：ヒト脱共役タンパク質（ＵＣＰ）に対して相同性を有するイロショウジョウバエ遺伝子のクローニング（図７）
ヒトＵＣＰ２およびＵＣＰ３遺伝子に対して相同性を持つ配列は、公的に利用できる全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースのプログラムＢＬＡＳＴを用いて同定した（Ａｌｔｓｃｈｕｌらの、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照）。相同性検索により、ＵＣＰ相同性を有するショウジョウバエ遺伝子ファミリーの配列断片が産出された。それらは明らかに、隣接する関連ミトコンドリアのタンパク質（オキシグルタミン酸担体）と異なる。
【０１４４】
この遺伝子の１つの配列断片（本明細書ではｄＵＣＰｙと呼ぶ）を使用して、ＰＣＲ法プライマーペアを作成し（上位  ５′−ＣＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＡＴＡＧ（配列識別番号９）、下位５プライム−ＡＡＡＡＧＡＣＡＴＡＧＡＡＡＡＴＡＣＧＡＴＡＧＴ（配列識別番号１０）、そして標準ＰＣＲ法条件を使用して、ＰＣＲ反応をショウジョウバエｃＤＮＡ上に実施した。増幅生成物を放射的に標識化し、成体のショウジョウバエハエ（ストラタジーン社）から調製したｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために使用した。完全長ｃＤＮＡクローンを分離し、配列し（図７）、さらに先の実験に使用した。ｄＵＣＰｙのヌクレオチド配列は図７Ａ（配列識別番号７）に示し、推定したオープン・リーディングは図７Ｂ（配列識別番号８）に示す。
【０１４５】
実施例４：ｄＵＣＰｙ  ｃＤＮＡのショウジョウバエ発現ベクターへのクローニング
ショウジョウバエ細胞におけるｄＵＣＰｙの発現効果をテストするために、制限部位ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩを使用して、ｄＵＣＰｙ  ｃＤＮＡを発現ベクターｐＵＡＳＴにクローニングした（Ｂｒａｎｄ  Ａ＆Ｐｅｒｒｉｍｏｎ  Ｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９３，１１８：４０１−４１５）結果として生じた発現構成物を、ショウジョウバエ胚の生殖細胞系列およびショウジョウバエの菌株に注入して、安定した構成物の統合を作成した。発現ベクターｐＵＡＳＴは、ショウジョウバエ細胞には通常存在しない酵母菌転写因子Ｇａｌ４によって活性化されるので、ｄＵＣＰｙは、これらの遺伝子組換え動物には未だ発現されていない。ｐＵＡＳＴ−ｄＵＣＰｙハエが、組織特定の様式でＧａｌ４を発現する第２のショウジョウバエ菌株と交雑する場合、この交配による子孫ハエは、組織を発現するＧａｌ４においてｄＵＣＰｙを発現する。
【０１４６】
その本体の全細胞においてＧａｌ４を発現する菌株とのｐＵＡＳＴ−ｄＵＣＰｙハエの交雑種は（アクチンプロモーターの制御下にて）生存可能な子孫を示さなかった。これは、全細胞におけるｄＵＣＰｙの過剰発現が致死的であることを意味する。この発見は、ｄＵＣＰｙの過剰発現が細胞エネルギーの産出の崩壊を引き起こすという仮定と一致している。
【０１４７】
眼（「無眼」遺伝子の眼特異性プロモーターの制御下にあるＧａｌ４）のような非重要器官におけるｄＵＣＰｙの発現は結果として、可視に損傷した眼を有するハエを生じる。この容易に可視の眼表現型は、ＵＣＰ活性を修飾できる遺伝子産物の遺伝的スクリーニングの基盤である。
【０１４８】
実施例５：ｄＵＣＰｙ修飾因子スクリーニング（図４）
眼にＧａｌ４発現を有する菌株のゲノム部分とｐＵＡＳＴ−ｄＵＣＰｙ構成物を保有する菌株とを、ゲノム組換え（再結合）を用いて１つの染色体上に混合した。結果として生じたハエ菌株は、ｄＵＣＰｙ発現によって永久に損傷した眼を有する。この菌株のハエを、変異誘発したハエ菌株の大きな収集のハエと交雑種せしめた。この変異体収集において、特別発現システム（ＥＰエレメント、前出のＲｏｒｔｈ、１９９６を参照）を異なるゲノム座位でランダムに統合する。酵母菌転写因子Ｇａｌ４は、ＥＰエレメントに結合し、そしてＥＰエレメントの統合部位を閉じる内在性遺伝子の転写を活性化することができる。遺伝子の活性化は以上の点から、ｄＵＣＰｙを過剰発現する同一細胞（眼）において発生する。変異体収集は、ＥＰエレメントの異なる統合部位を有する数千の菌株を含むので、遺伝子の発現がｄＵＣＰｙ活性と相互作用するかどうかを確認するために、多数の遺伝子をテストすることが可能である。遺伝子が、ＵＣＰ活性エンハンサーとして作用する場合には、眼欠陥は悪化され、抑制因子として作用する場合には、その欠陥は回復される（図４を参照）。
【０１４９】
このスクリーニングを用いて、促進活性を備えた遺伝子を発見し、これがショウジョウバエにおけるＬＫ６キナーゼであることが判明した。
【０１５０】
実施例６：ショウジョウバエのＬｋ６のクローニング（図３Ａ）
ＥＰエレメントを救出する眼欠陥に近傍するゲノムＤＮＡを逆ＰＣＲ法によってクローニングし、配列した。この配列を、ショウジョウバエ遺伝子の公共データベースにおいて「ＢＬＡＳＴ」検索に用いた。ショウジョウバエ  タンパク質のアミノ酸配列を図３Ａに示す（ｄｍＡＡＢ１８７８９と呼ばれる）。
【０１５１】
実施例７：  哺乳動物のＬＫ６相同性タンパク質の同定（図３）
配列に対して相同性を持つショウジョウバエのＬｋ６は、公的に利用できる全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の非重複タンパク質データベースのプログラムＢＬＡＳＴＰ  ２．２．３を用いて同定した（Ａｌｔｓｃｈｕｌらの、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照）。
【０１５２】
よって、Ｍｎｋ相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ヒトＭｎｋ相同性ポリペプチドおよび核酸、特にヒトＭｎｋ２タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５およびＮＭ＿０１７５７２．１；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５は提出者の要求で除去された旧番号Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０３０６３７と同一；図３ＢのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ複数配列アライメントを参照）をコードするポリペプチドおよび核酸、またはヒトＭｎｋ１タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９．１およびＮＭ＿００３６８４．２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９．１は提出者の要求で除去された旧番号Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１６００と同一；図３ＣのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ複数配列アライメントを参照）をコードする核酸。
【０１５３】
図３Ａは、異なる種、ヒトＭｎｋ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５と同一）を参照するｈＸＰ＿０３０６３７、ヒトＭｎｋ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００４０９．１と同一）を参照するｈＸＰ＿００１６００、およびＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ１７３４２を備えたショウジョウバエ遺伝子でコードしたタンパク質を参照するｄｍＡＢ１８７８９からのＭｎｋタンパク質のアライメントを示す。
【０１５４】
本発明のマウス相同性ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６７４３７．１（マウス相同体ＭＡＰキナーゼ結合セリン／トレオニンキナーゼ２用；Ｍｎｋ２；ｃＤＮＡ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１０２５６）およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６７４３６．１（マウス相同体ＭＡＰキナーゼ結合セリン／トレオニンキナーゼ１用；Ｍｎｋ１）として同定した。
【０１５５】
実施例８：哺乳動物（マウス）の組織におけるポリペプチドの発現（図５および図６）
本発明において開示した哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、いくつかのマウス菌株（望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究であるマウス菌株Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ、Ｃ５７Ｂｌ／６  ｏｂ／ｏｂおよびＣ５７Ｂｌ／ＫＳ  ｄｂ／ｄｂ）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ  （３３１７８  Ｂｏｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、一定の温度下に維持し（望ましくは２２℃）、湿度４０パーセントおよび明／暗サイクルは望ましくは１４／１０時間とした。マウスには標準食を与えた（例えば、ｓｓｎｉｆｆ  Ｓｐｅｚｉａｌｉｔａｔｅｎ有限責任会社、製品番号ｓｓｎｉｆｆ  Ｍ−Ｚ  Ｖ１１２６−０００）。絶食実験（「絶食野生型マウス」）に関しては、野生型マウスを食物を与えずに水のみを適時に与えるだけで４８時間飢えさしめた（例えば、ＳｃｈｎｅｔｚｌｅｒらのＪ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９３  Ｊｕｌ；９２（１）：２７２−８０、ＭｉｚｕｎｏらのＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９６  Ａｐｒ  １６；９３（８）：３４３４−８を参照）。動物は６〜８週間目に達した時点で屠殺した。動物組織は、当業者であれば公知の標準手順に従って分離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで−８０℃にて保管した。
【０１５６】
本発明において開示した生体外分化におけるタンパク質の役割の分析のため、異なる哺乳動物細胞の培養細胞、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換、哺乳動物の線維芽細胞（３Ｔ３−Ｌ１）細胞（例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｋｅｈｉｎｄｅ、Ｃｅｌｌ  １：１１３−１１６、１９７４）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国バージニア州ハナサスのＡＴＣＣ、；ＡＴＣＣ−ＣＬ  １７３）から入手した。３Ｔ３−Ｌ１細胞は線維芽細胞として維持し、従来の技術に記述されたように脂肪細胞へ分化した（例えばＱｉｕ．らのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１１９８８−９５、２００１；ＳｌｉｅｋｅｒらのＢＢＲＣ  ２５１：２２５−９、１９９８）。手短に言えば、細胞はＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）において５０，０００細胞／ウェルおよび６ウェル  プラスチック皿の二通りにプレーティングし、５％の二酸化炭素、３７℃の加湿環境において培養した。集密日（０日目：ｄ０と定義した）細胞は、ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（３：１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、フェチュイン（３００μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）、トランスフェリン（２μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社）、パントテン酸（１７μＭ；Ｓｉｇｍａ社）、ビオチン（１μＭ；Ｓｉｇｍａ社）、およびＥＧＦ（０．８ｎＭ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社、Ｂａｓｅｌ、スイス）を含んだ無血清（ＳＦ）培地に移した。分化は、デキサメサゾン（ＤＥＸ；１μＭ；Ｓｉｇｍａ社）、３−メチル−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＭＩＸ；０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ社）、およびウシインスリン（５μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加することによって誘導した。集密日（ｄ４）後の４日間は、分化が完了するまで、細胞をウシインスリン（５μｇ／ｍｌ）を含んだＳＦ培地中に保持した。分化手順の異なる時点、第０日目（密集日）を始めに、第２日目（ホルモン追加；例えば、デキサメタゾンおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチンの追加）、および１０日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを２日毎に採取した。
【０１５７】
別法として、哺乳動物の線維芽細胞３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞（例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｋｅｈｉｎｄｅ，Ｃｅｌｌ  ７：１０５−１１３，１９７６）は、ハーバード大学医学部，細胞生物学科（米国マサチューセッツ州ボストン）から取得した。３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞は、線維芽細胞として維持し、前述のように脂肪細胞へ分化した（Ｄｊｉａｎ、Ｐ．らの、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２４：５５４−５５６、１９８５）。分化手順のいくつかの時点、第０日目（密集日およびホルモン、例えばインシュリン追加）を始めに、１０日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを２日毎に採取した。３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞は、ホルモン（インシュリン）追加後に既に密集段階の生体外で分化を始めている。
【０１５８】
本発明のタンパク質のＴａｑＭａｎ分析を行なった（図５および図６）。ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（例えば、ドイツ、ＫａｒｌｓｒｕｈｅのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して、マウス組織または細胞の培養細胞から分離し、さらに、ＲＮｅａｓｙキット（例えば、ドイツ、Ｑｉａｇｅｎ社製）と共に、ＤＮａｓｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔを使用し、製造者の指示に従って当業者であれば公知の方法で精製した。全ＲＮＡを逆転写（望ましくはドイツ、ＫａｒｌｓｒｕｈｅのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素を用いる）し、望ましくはＴａｑｍａｎ  ２ｘＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ドイツ、ＷｅｉｔｅｒｓｔａｄｔのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社；このミックスには、製造者によれば、例えばＡｍｐｌｉＴａｑ  ゴールドＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ、ｄＵＴＰ  を有するｄＮＴＰ、Ｒｏｘ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅおよび最適化された緩衝液成分などが含まれている）を使用してＴａｑｍａｎ分析をＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００配列検出システム（ドイツ、ＷｅｉｔｅｒｓｔａｄｔのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）上で行った。
【０１５９】
Ｍｎｋ２またはＭｎｋ１の発現の分析のため、次のプライマー／プローブ対を用いてｔａｑｍａｎ分析を実施した：
マウスＭｎｋ１フォーワードプライマー（配列識別番号１１）５′−ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＣ−３′；
マウスＭｎｋ１逆プライマー（配列識別番号１２）５′−ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  Ｇ−３′；
マウスＭｎｋ１  Ｔａｑｍａｎプローブ（配列識別番号１３）（５／６−ＦＡＭ）ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  （５／６−ＴＡＭＲＡ）
Ｔａｑｍａｎ−１８５６Ｆ  Ｍｎｋ２フォーワードプライマー（配列識別番号１４）：５′−ＴＧＣＡＣＴＴＧＡＴＴＧＡＣＣＣＣＧＡ−３′
Ｔａｑｍａｎ−１９２３Ｒ  Ｍｎｋ２逆プライマー（配列識別番号１５）：５′−ＴＴＴＣＴＧＡＴＴＧＴＣＡＡＣＣＣＴＣＣＡＡ−３′
Ｔａｑｍａｎ−１８７７Ｔ  Ｍｎｋ２  Ｔａｑｍａｎプローブ（配列識別番号１６）：（５／６−ＦＡＭ）−ＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＣ−（５／６−ＴＡＭＲＡ）
Ｔａｑｍａｎ分析は、Ｍｎｋ２がより興味深いハエＬｋ６遺伝子の相同体であることが明らかになった。その成果を図５および図６に示す。むしろ偏在的に発現するＭｎｋ１と比較して、Ｍｎｋ２は茶色および白色脂肪組織において最も高い発現レベルを示す（それぞれ図５Ａおよび６Ａ）。白色脂肪組織におけるＭｎｋ２の発現は代謝制御下で行われる：絶食マウスおよび肥満した（ｏｂ／ｏｂ）マウスにおいては、発現は野生型マウスのレベルの４０％に低下する（図５Ｃ；図５Ｂも参照）。加えて、Ｍｎｋ２の発現は３Ｔ３−Ｌ１（図５Ｄ）の生体外分化中に強く誘導され、同様に、２つの追加モデル系の発現は、前脂肪細胞の脂肪細胞への生体外分化、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞株およびＴＡ１細胞株に対して強く誘導される（それぞれ図５Ｅおよび図５Ｆ）。これとは反対に、Ｍｎｋ１の相対発現レベルはこれらの細胞株の分化中に変化しない（それぞれ図６Ｄおよび６Ｅ）。
【０１６０】
実施例９：哺乳動物（ヒト）の組織におけるポリペプチドの発現（図９）
ヒト初代脂肪細胞をＨａｕｎｅｒらの１９８９（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ８４（５）：１６６３−７０）によって記載されたように成熟脂肪細胞分化した。簡潔に、細胞をＤＭＥＭと栄養素混合Ｆ１２、１％のＰｅｎＳｔｒｅｐ、１７μＭのビオチン、３３μＭのパントテン酸（Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔ）、１０％の熱不活化されていない胎児の子ウシ血清で育てた。分化の０日目には、培地をＤＭＥＭ／栄養素混合Ｆ１２、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１７μＭのビオチン、３３μＭのパントテン酸（Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔ）、０，０１ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、ヒドロコルチゾン、２０ｎＭのヒトインスリン、０，２ｎＭのＴ３、２５ｎＭのデキサメサゾン、２５０μＭのＩＢＭＸ、３μＭのロシグリタゾンに変えた。分化の４日目には、培地をＤＭＥＭ／栄養素混合Ｆ１２  １％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１７μＭのビオチン、３３μＭのパントテン酸（Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔ）、０，０１ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、１００ｎＭのヒドロコルチゾン、２０ｎＭのトインスリン、０，２ｎＭのＴ３に変えた。分化手順のいくつかの時点、第０日目（密集日）および第４日目（ホルモン追加）を始めに、１４日間を最大とする分化中には、好適な細胞のアリコットを２日毎に採取した。ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（例えば、ドイツ、ＫａｒｌｓｒｕｈｅのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して、ヒト細胞の培養細胞から分離し、さらにＲＮｅａｓｙキット（例えば、ドイツ、Ｑｉａｇｅｎ社製）と共にＤＮａｓｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔを使用し、製造者の指示に従って当業者であれば公知の方法で精製した。
【０１６１】
異なる分化段階でヒト脂肪細胞から分離したＲＮＡに加えて、異なるヒト組織から分離されたＲＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツから取得した：（ｉ）成体骨格筋からの全ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の注文番号７３５０３０）；（ｉｉ）成体肺からの全ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の注文番号７３５０２０）；（ｉｉｉ）成体肝臓からの全ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の注文番号７３５０１８）；（ｉｖ）成体胎盤からの全ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の注文番号７３５０２６）；（ｖ）成体睾丸からの全ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の注文番号６４１０１−１）；（ｖｉ）ヒト通常の脂肪組織からの全ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の注文番号Ｄ６００５−０１）；（ｖｉｉ）通常すい臓からの全ＲＮＡヒト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の注文番号ＤＧ６１０１）；（ｖｉｉｉ）ヒト通常脳からの全ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の注文番号Ｄ６０３０−０１）。ＲＮＡをＤＮａｓｅを用いて、製造者（例えば、ドイツのＱｉａｇｅｎ社）の指示および当業者であれば公知の方法に従って処理した。
【０１６２】
全ＲＮＡを逆転写（望ましくはドイツ・Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素）し、Ｔａｑｍａｎ分析を望ましくはＴａｑｍａｎ  ２ｘＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ′（ページ６６、３１行目：ドイツ・Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社；実施例８を参照）を用いて行った。
【０１６３】
Ｔａｑｍａｎ分析は、望ましくは下記のプライマー／プローブペアを用いて実施する：
ヒトＭｎｋ２ａ増幅用：
ヒトＭｎｋ２ａフォーワードプライマー（配列識別番号１７）：５′−ｃｃａ  ｔｃｔ  ｃｃｃ  ｃｃｔ  ｃｔｇ  ｔａｃ  ａｔａ  ｇｇ−３′；ヒトＭｎｋ２ａ逆プライマー（配列識別番号１８）：５′−ｃｃｇ  ｇｃｔ  ｇｇｃ  ｇａｔ  ａｇｃ  ｔｔａ  ａ  −３′；Ｔａｑｍａｎプローブ（配列識別番号１９）：（５／６−ＦＡＭ）ｃａｃ  ｃｃｇ  ｔｃｃ  ｃｃｃ  ａａｔ  ｃａａ  ａｔｃ  ｔａａ  ａｇｇ（５／６−ＴＡＭＲＡ）
ヒトＭｎｋ２ｂ増幅用：
ヒトＭｎｋ２ｂフォーワードプライマー（配列識別番号２０）：５′−ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＧＧ  −３′；ヒトＭｎｋ２ｂ逆プライマー（配列識別番号２１）：５′−ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＣＣ  −３′；Ｔａｑｍａｎプローブ（配列識別番号２２）：（５／６−ＦＡＭ）ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＣＴＧ（５／６−ＴＡＭＲＡ）
図９Ａに示したように、ヒト組織におけるＭｎｋ２ａおよびＭｎｋ２ｂタンパク質の発現のリアルタイムＰＣＲ法（Ｔａｑｍａｎ）分析は、両タンパク質が脂肪組織、筋肉、肺、睾丸、および胎盤における高レベルの発現で分析したすべての組織において発現されることを明らかにした。
【０１６４】
両者のヒトＭｎｋ２スプライス変異体の相対発現レベルは分析したすべての組織に対して同一である。両者は共に、代謝障害、すなわち脂肪および筋肉組織に関連性のある組織において最も高い発現レベルを示す。
【０１６５】
図９Ｂに示したように、ヒト脂肪細胞分化中にＭｎｋ２ａおよびＭｎｋ２ｂは共に上方制御される。これは、成熟脂肪細胞の代謝における両タンパク質の機能（作用）を示唆する。
【０１６６】
実施例１０：中性脂肪の保管、合成および輸送を定量のための測定法（図８）
前脂肪細胞のレトロウイルス性の感染
パッケージング細胞を、リン酸カルシウム法を用いて、マウスＭｎｋ２導入遺伝子および選択マーカーを保有するレトロウイルス性のプラスミドｐＬＰＣＸで形質移入した。対照細胞を導入遺伝子を保有しないｐＬＰＣＸで感染せしめた。簡潔に、指数関数的に成長するパッケージング細胞を、形質移入の１日前に、２ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにおいて、６−ウェルあたり３５０，０００細胞の密度で播種した。形質移入の１０分前に、クロロキンを表面を覆う培地に直接添加した（２５μＭ最終濃度）。２５０μｌの形質移入のための混合物は、５μｇのプラスミド−ＤＮＡ（候補：ヘルパーウイルス、比率１：１）および２５０ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）から成り、１５ｍｌのプラスチック管において調製した。同一容量の２  ｘ  ＨＢＳ  （２８０μＭのＮａＣｌ、５０μＭのＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ  ７．０６）を加えた後、気泡を混合物に１５秒間注入した。形質移入混合物を滴下式でパッケージング細胞に添加および分布した後に、細胞を３７℃にて、５％のＣＯ２で６時間インキュベートした。細胞はＰＢＳで洗浄した後、培地を６−ウェル当たり２ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％のＣＳと交換した。形質移入の１日後、細胞を再び洗浄し、６−ウェル当たり１ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％のＣＳ、３２℃にて、５％のＣＯ２において２日間（ウイルスコレクション）インキュベートした。さらに、その上澄みを０．４５μｍのセルロース  アセテート  フィルタを通してフィルターし、そしてポリブレン（最終濃度８μｇ／ｍｌ）を添加した。半密集状態における哺乳動物の線維芽細胞（３Ｔ３−Ｌ１）細胞を調製したウイルスを含んだ培地で覆った。感染した細胞を２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて１週間選択した。その選択後、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光を用いて細胞における導入遺伝子の発現を確認した。過剰発現細胞を分化のために播種した。
【０１６７】
３Ｔ３−Ｌ１細胞は線維芽細胞として保ち、従来の技術および実施例８において記載されたように脂肪細胞に分化した。本発明で開示したタンパク質の役割を分析するため、中性脂肪の保管、合成および輸送を定量するための生体外測定法を実施した。
【０１６８】
代謝産物の分析のための細胞可溶化液の調製
集密日（Ｄ０）以来、細胞培地は４８時間毎に変えた。細胞および培地は次のように培地交換に８時間先行して収穫した。培地を収集し、ＰＢＳにおいて２回洗浄した６００μｌのＨＢ−緩衝剤（０．５％ポリオキシエチレン１０  ｔｒｉｄｅｃｙｌｅｔｈａｎ、１ｍＭのＤＴＡ、０．０１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）における溶解に先行して、細胞を２回洗浄した。７０℃にて５分間の不活性化後、細胞可溶化液をＢｉｏ  １０１系溶解マトリックスＢ（０．１ｍｍシリカ  ビーズ；Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）上で、２  ｘ  ４５秒間、４．５（Ｆａｓｔｐｒｅｐ  ＦＰ１２０、Ｂｉｏ  １０１  Ｔｈｅｒｍｏｓａｖａｎｔ社、Ｈｏｌｂｒｏｃｋ、ＵＳＡ）の速度で攪拌することによって調製した。溶解細胞の上澄みを、３０００ｒｐｍにて２分間の遠心分離後に収集し、後の分析のため、−８０℃にてアリコットに保管した。
【０１６９】
脂質生成中の細胞の中性脂肪レベルにおける変化（図８Ａ）
細胞可溶化液および培地のタンパク質および中性脂肪含有量の総量を、製造者の指示従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣタンパク質測定法試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）および修飾酵素性中性脂肪キット（ＧＰＯ−Ｔｒｉｎｄｅｒ；Ｓｉｇｍａ社）を用いて、６−ウェルプレートにおいて同時に分析し、簡潔に、試薬の最終容量を次のように９６−ウェル形式に調節した：１０μｌの試料を２００μｌの試薬Ａを用いて５分間３７℃でインキュベートした。グリセローム（初期の吸光度：５４０ｎｍ）の定量後、５０μｌ試薬Ｂを添加し、継いで、別のインキュベーションを５分間、３７℃にて行った（最終吸光度：５４０ｎｍ）。グリセローム濃度および中性脂肪濃度を、標準曲線を各測定に含むためにグリセローム標準セット（Ｓｉｇｍａ社）を用いて計算した。
【０１７０】
図８Ａに示したように、発明者らは、細胞過剰発現するＭｎｋ２における細胞の中性脂肪レベルが対照細胞のレベルと比較して、４〜１２日目の脂質生成において著しく低くなることを見出した（図８Ａ）。これらの結果は、Ｍｎｋ２が脂質代謝に関与する調節経路または酵素を標的とすることを示すものであり、発明者らは以下に記載した脂質合成およびＦＦＡ輸送測定法においてより詳細に分析した。
【０１７１】
脂質生成中の脂質の合成（図８Ｂ）
脂質生成の末端段階中（第１２日目）では、脂質を代謝する能力に関して細胞を分析した。脂質合成のため、Ｊｅｎｓｅｎらの（２０００）、ＪＢＣ  ２７５、４０１４８の方法に対する修飾プロトコルを樹立した。細胞は、０．１％のＦＣＳで補充したＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ−Ｈｅｐｅｓ緩衝剤（ＫＲＢＨ；１３４ｎＭのＮａＣｌ、３．５ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＫＨ２  ＰＯ４、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、１．５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）における２．５時間、３７℃にての血清飢餓に先行して、ＰＢＳで３回洗浄した。インスリン刺激脂質合成に関しては、細胞を１μＭのウシインスリン（Ｓｉｇｍａ社；キャリア：０．００５  ＮのＨＣｌ）で４５分間、３７℃にてインキュベートした。基礎脂質合成は、キャリアのみを用いて決定した。１４Ｃ（Ｕ）−Ｄ−グルコース（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）（１μＣｉ／ウェル／ｍｌの最終活性における）を５ｍＭのグルコースの存在下で３０分間３７℃にて添加した。背景放射能の算出対しては、２５μＭのサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ社）を使用した。すべての測定法は、二通りのウェルにおいて実施した。反応を終結するため、細胞を氷のように冷たいＰＢＳで３回洗浄し、１ｍｌ  ０．１ＮのＮａＯＨにおいて溶解した。各ウェルのタンパク質濃度は、標準Ｂｉｕｒｅｔ方法（タンパク質測定法試薬；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて評価した。全脂質は、Ｉｎｓｔａ−Ｆｌｕｏｒシンチレーション反応混液（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）において一晩抽出後に水溶性の位相から分離し、継いで、シンチレーションカウンティングを行った。
【０１７２】
結果は明確に、細胞を過剰発現するＭｎｋ２が外来性グルコースからの脂質合成において効果の弱いことを明らかにした。その結果、脂質合成を刺激したインスリンのレベルは対照細胞と比較して、脂質生成の１２日目で著しく低下した（図８Ｂ）。以上の点から、上記実験において観察された低脂質レベルは、結果  大部分  可能性もあるから取り出したａ低い脂質合成率からの結果で、増大した脂質貯蔵の代謝回転の結果ではない可能性が極めて高い。
【０１７３】
脂質生成中の全域にわたる遊離脂肪酸の輸送および代謝（図８Ｃ）
脂質生成（Ｄ１２）の末端段階中、細胞の長鎖脂肪酸を血漿膜全域に輸送する能力を分析した。脂肪酸の細胞輸送のため、Ａｂｕｍｒａｄらの（１９９１）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９１：８８；６００８−１２）の方法に対する修飾プロトコルを樹立した。要約すれば、血清飢餓に先行して、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。これに継いで、０．１％のＦＣＳで補充したＫＲＢＨ緩衝剤において、２．５時間、３７℃にてインキュベートした。外来性遊離脂肪酸の取り込みは、非放射性のオレイン酸および５ｍＭのグルコース存在下で、１μＣｉ／ウェル／ｍｌの最終活性において血清アルブミンに対して複合型の（３Ｈ）オレイン酸（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を含んだ同位体の培地の追加により、３０分間、室温（ＲＴ）にて開始した。血漿膜全域で能動輸送（ＡＴ）の不在下における、受動拡散（ＰＤ）の算出するため、グルコース遊離培地（Ｓｉｇｍａ社）における２０ｍＭのフロレチンを３０分間、室温（ＲＴ）にて添加した。すべての測定法は、二通りのウェルにおいて実施した。能動輸送を終結するため、グルコース遊離培地における２０ｍＭのフロレチンを細胞に添加した。細胞を１ｍｌ  ０．１ＮのＮａＯＨに溶解し、そして標準Ｂｉｕｒｅｔ方法（タンパク質測定法試薬；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて各ウェルのタンパク質濃度を評価した。エステル型の脂肪酸は、Ｉｎｓｔａ−Ｆｌｕｏｒシンチレーション反応混液（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）において一晩抽出を用いて遊離脂肪酸から分離し、継いで、シンチレーションカウンティングを行った。
【０１７４】
発明者らは、外来性脂肪酸の輸送が細胞を過剰発現するＭｎｋ２の血漿膜を横切ること、従ってこれらの代謝産物のエステル化は対照細胞と比較して、脂質生成の１２日目で相当に低いことを見出した（図８Ｃ）。まとめると、Ｍｎｋ２の過剰発現は、発明者らが３Ｔ３−Ｌ１細胞中で実施したすべての３測定法において中性脂肪代謝上に効果のあることを示し、Ｍｎｋ２は代謝障害を治療するための有望で興味深い薬物標的とみなされる。
【０１７５】
実施例１１：Ｍｎｋ２遺伝子組換え動物の作成および分析（β−アクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ）
遺伝子組換え動物の作成
当業者であれば公知のような標準プロトコルを用いて、、マウスＭｎｋ２のｃＤＮＡをマウス茶色脂肪組織（ＢＡＴ）から分離し次のプライマーペアを用いて、ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅した：
Ｍｎｋ２フォーワードプライマー（配列識別番号２３）：５′  ＡＡＧ  ＴＴＧ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＧＣＧ  ＴＴＡ  ＧＡＣ  ３′
Ｍｎｋ２逆プライマー（配列識別番号２４）：５′  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＡＧ  ３′。
【０１７６】
結果として得られたＭｎｋ２のｃＤＮＡを標準プロトコルに従ってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）へクローニングし、ｐＫＳ＋−ｍＭｎｋ２′と呼ばれるプラスミドを結果としてもたらした。ｐＫＳ＋−ｍＭｎｋ２  ｃのｃＤＮＡを、製造者の指示に従って、部位の定方向突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて変異した。Ｍｎｋ２上部オリゴ  （配列識別番号２５）：５′  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＡＧ  ３′およびＭｎｋ２底部オリゴ（配列識別番号２６）：５′  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＣＧ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＡＧ  ３′を用いて二点変異をｃＤＮＡに導入し、Ｍｎｋ２  ｃＤＮＡの位置Ｔ１９７とＴ２０２でＡ１９７とＡ２０２へのアミノ酸交換を結果としてもたらした。
【０１７７】
結果として得られた変異型ｃＤＮＡ（ｍＭｎｋ２ＤＮと呼ばれる）を、遺伝子組換え発現ベクターｐＴＧ−β−アクチン−Ｘ−ｈｇｈ−ｂｇｈ−ポリＡのＥｃｏＲＶ  クローニング部位へクローン化した。β−アクチン−Ｍｎｋ２ＤＮ導入遺伝子を、受精したマウス胚（望ましくは菌株Ｃ５７／ＢＬ６／ＣＢＡ  Ｆ１（Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ））の雄性前核へ微量注入した。注入した胚は偽妊娠の仮親マウスへ移した。遺伝子組換えの初代を、フォーワードプライマー（配列識別番号２７）：５′  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＡＧＡ  ＴＧＣ  Ｃ  ３′および逆プライマー（配列識別番号２８）：５′  ＧＧＧ  ＴＣＡ  ＴＧＣ  ＧＣＧ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ３′を用いて、ＰＣＲ分析によって検出した。β−アクチン−Ｍｎｋ２ＤＮ作成物を含んだ２つの非依存性遺伝子組換えマウスラインを樹立し、Ｃ５７／ＢＬ６の背景に保持した。簡潔に、分析用のＦ１マウスを作成するために、初代動物をＣ５７／ＢＬ６マウスと戻し交配した。遺伝子組換えマウスをＣ５７／Ｂｌ６背景上へ連続的に繁殖せしめた。
【０１７８】
異なるマウス組織における作成物の発現（図１０）
標準技術で、β−アクチン−Ｍｎｋ２ＤＮ導入遺伝子発現をＴａｑｍａｎ分析によって、フォーワードプライマー（配列識別番号２９）：５′  ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＣＧＴ  Ｇ  ３′、逆プライマー（配列識別番号３０）：５′  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  Ｃ  ３′およびプライマー（配列識別番号３１）：５′  ＣＡＧ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ３′用いて検証した。Ｔａｑｍａｎ分析は、マウス組織の代表的パネルを用いて実施した。
【０１７９】
ｂアクチン−Ｍｎｋ２ＤＮ導入遺伝子の発現を次の組織において観察した：ＷＡＴ、筋肉、肝臓、腎臓、胸腺、心臓、肺、および脾臓。導入遺伝子の発現レベルは、分析した組織によるが、野生型マウスにおけるＭｎｋ２の発現と比べて２．８〜１６．９倍増加した。Ｍｎｋ２導入遺伝子の発現は、ＢＡＴ組織においては検出されなかった（図１０を参照）。
【０１８０】
遺伝子組換えマウスの体重の分析（図１１）
離乳後、オスのβ−アクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ遺伝子組換えマウスおよびそれらの野生型（ｗｔ）同腹仔対照を４〜５動物（Ｎ＝４、最大でＮ＝５）群に分け、食餌制限（望ましくはＡｌｔｒｏｍｉｎ  Ｃ１０５７  ｍｏｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ、４．５％の粗脂肪または高脂肪食（望ましくはＡｌｔｒｏｍｉｎ  Ｃ１０５７ｍｏｄ．高脂肪、２３．５％粗脂肪）をした。１２〜１６週間の期間にわたって、動物の全体重を毎週測定した。
各食餌で、β−アクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ遺伝子組換えマウスの平均体重は、それぞれの食餌で野生型同腹仔に比較して明らかに増加した。両食餌で、平均体重の著しい相違が最初に観察されたのは、出世後第４週目終わり頃であった。高脂肪食での１０週間後、β−アクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ遺伝子組換えマウスの平均体重はｗｔ同腹仔に比較して８．８ｇ（＝ｗｔ同腹仔の平均体重と比べて２３％の増加）増加した（図１１）。食餌制限をしたｗｔマウスおよびβ−アクチン−ｍＭｎｋ２ＤＮ遺伝子組換えマウスの平均体重においても類似の相違が観察された（データ図示せず）。従って、これらの結果は、ｍＭｎｋ２ＤＮ導入遺伝子の異所性発現が体重の増加につながることを明らかに示す。本効果は、食餌制限と同様に高脂肪食の場合でも見られるように、与えると食餌とは無関係のように思われる。
【０１８１】
実施例１１：ｍＭｎｋ２−／−マウスの作成および分析（図１２および図１３）
ｍＭｎｋ２のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１０２５６；位置６１−６６５）の６０５ベースペア  プローブを、フォーワードプライマー（配列識別番号３２）：５′  ＡＣＡ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  Ａ  ３′および逆プライマー（配列識別番号３３）：５′  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ３′を用いてＰＣＲ法によって、マウス白色脂肪組織（ＷＡＴ）のｃＤＮＡから増幅した。このプローブは、１２９ＳＶＪゲノムファージライブラリをスクリーニングするために使用した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から取得した）。３つの非依存性クローンを分離し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＮｏｔＩクローニング部位へサブクローニングした（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）。これらのゲノムクローンを制限マッピングおよびシーケンシングのために用い、マウスＭｎｋ２のゲノム遺伝子座を特徴づけた（図１２）。ＰＧＫ−ネオマイシン  カセットをマウスＭｎｋ２の遺伝子座に挿入し、４，４ｋｂのゲノムＤＮＡを置換し、それによってｍＭｎｋ２の全翻訳領域を除去した。簡潔に、８ｋｂ  ＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ断片をＰＧＫ−ネオマイシン  カセットのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋上流のＸｂａＩ部位にクローニングし、それをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｍａＩ部位に挿入した。１ｋｂのゲノム断片を、次のプライマーペア（非プライミング  ヌクレオチド／付属的な制限部位は小文字表示）：Ｍｎｋ２−ＳＡフォーワードプライマー（配列識別番号３４）：ＥｃｏＲＩ    ５′  ｃｇｇ  ａａｔ  ＣＣＡ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ３′；Ｍｎｋ２−ＳＡ逆プライマー（配列識別番号３５）：ＣｌａＩ    ５′  ｃｃａ  ｔｃｇ  ａｔＧ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＧＴＡ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＡＧＴ  ＡＧ  ３′を用いて、ＰＣＲ法によって増幅した。結果として得られた断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ部位に挿入した。ネガティブ選択マーカーとしてチミジンキナーゼ  カセットをターゲッティング作成物のＣｌａＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。（図１３）作成物をＮｏｔＩ消化によって直線化し、そしてマウス胚幹（ＥＳ）細胞に電気穿孔した。ＥＳ細胞クローンを、Ｇ４１８およびガンシクロビル（Ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）治療（望ましくは３５０μｇのＧ４１８／ｍｌおよび２μｍのガンシクロビル）によって選択した。６００のネオマイシン耐性コロニーの中から２つの非依存性の相同性組み換えＥＳ細胞クローンをＰＣＲ法によって同定した。その結果は、３′フランキングプローブ（位置２４９５−３０６５ｍＭｎｋ２のｃＤＮＡ）を用いて、ＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって確認した。単一の統合イベントを、ネオマイシンプローブを用いて、ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡのサザンブロット分析によって確認した。ＥＳ細胞クローンをＮＭＲＩマウスから取り出した８−細胞−段階胚で凝集し、そして発生発達する胚盤胞をキメラを作成するため偽妊娠のマウスに移した。キメラをＣ５７／ＢＬ６マウスと繁殖させ、そして次のプライマー：  Ｍｎｋ２−ＥＳプライマー（配列識別番号３６）：５′  ＡＧＡ  ＣＴＡ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡ  ３′；Ｍｎ��２−ＫＯプライマー（配列識別番号３７）：５′  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＧＣＧ  Ａ  ３′；Ｍｎｋ２−ＷＴ    ５′  ＧＧＧ  ＧＴＧＴＡＧ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ３′を用いて、子孫の遺伝子型をＰＣＲ法によって同定した。ヘテロ接合性マウスを、さらに交雑させるためおよび分析ｊを行うために使用した。
【０１８２】
実施例１１：小分子のスクリーニング
Ｍｎｋ−関連の代謝障害の予防、治療または診断のために好適である化合物は、Ｍｎｋポリペプチド、Ｍｎｋポリペプチド断片またはその誘導体に関連する機能（作用）を測定するために、キナーゼアッセイ、結合アッセイまたは他の任意の好適な測定法を介して同定することが可能である。このキナーゼアッセイは、組換え（型）のヒトＭｎｋ２（Ｍｎｋ２ａまたはＭｎｋ２ｂ）またはＭｎｋ１タンパク質およびｅｌＦ４Ｅ標的配列から成る標識ペプチド、標識組換え（型）ｅｌＦ４Ｅ標的配列または基質としての標識組換え（型）ｅｌＦ４Ｅタンパク質を利用したものであってもよい。測定法は、放射性のキナーゼアッセイまたはＳｅｒ２０９にてｅｌＦ４Ｅリン酸化を認識する能力のある抗ホスホセリン抗体を利用した測定法であってもよい。
【０１８３】
例えば、キナーゼＭｎｋ２ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７７７５；図３Ｄおよび３Ｅも参照）、Ｅｒｋ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８４４８９）およびアミノ酸置換Ｓｅｒ２１８ＡｓｐおよびＳｅｒ２２２Ｇｌｕ（Ｓ２１８Ｄ  Ｓ２２２Ｅ）を含んだＭｅｋ１の二重点変異体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ０２７５０）を大腸菌において発現し、引き続いて当業者であれば公知の方法を用いて精製した。望ましくは、５０μｌのキナーゼ反応において、２００ｎＭのＥｒｋ２プラス２０ｎＭのＭｅｋ１  Ｓ２１８Ｄ  Ｓ２２２Ｅ（図１４における標識レーン１〜４）または５０ｎＭのＥｒｋ２プラス２．５ｎＭのＭｅｋ１  Ｓ２１８Ｄ  Ｓ２２２Ｅ  （図１４における標識レーン５〜８）を用いて、２．０μＭのＭｎｋ２ａを、１．０ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ、５ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．５ｍＭのＤＴＴの存在下で３０℃にてインキュベートした。所定の時点（０、１０、２０および４０分間、図１４を参照）で、試料を反応から取り出し、５０ｍＭのＥＤＴＡを含んだＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）試料緩衝剤中に希釈し、そしてＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離反応試料をニトロセルロース上にブロットし、そしてＭｎｋ活性化にとって必須であるホスホ−エピトープ（ｅｐｔｉｐｅ）に対する抗体でプローブした（ａｎｔｉ−Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｍｎｋ  Ｔｈｒ１９７／２０２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。抗ホスホ−Ｍｎｋ抗体を、他で記載されているように、ペルオキシダーゼ共役抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で検出した。（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９９８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。
【０１８４】
反応が進むにつれて、Ｍｎｋ２ａの活性化は抗ホスホ−Ｍｎｋ抗体とのＭｎｋｓ免疫反応性により可視化することができる（図１４の上部パネルを参照）。加えて、Ｍｎｋ２ａをゲルのクーマシー染色によって可視化した。矢印は、その移動性が増加するリン酸化のために遅延されるクーマシー染色されたＭｎｋ２ａを示す（図１４の下部パネルを参照）。
【０１８５】
Ｍｎｋ２ａの活性化にとって必須であるホスホ−エピトープの作成、およびこのプロセスの高度な効率（ほぼ完全な電気泳動移動性の変化によって示されたように）は、酵素的に活性なＭｎｋ２ａを産生するためのこのアプローチ適合性を実証する。
【０１８６】
測定法の確証に関しては、ＣＧＰ５７３８０またはＣＧＰ０２５０８８のような現在わかっているＭｎｋ阻害剤を使用することが可能である。（Ｋｎａｕｆらの、２００１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：５５００、Ｔｓｃｈｏｐｐらの、２０００、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ３：２０５およびＳｌｅｎｔｚ−Ｋｅｓｌｅｒらの、２０００、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６９：６３を参照、）。ネガティブコントロールとしては、ＣＧＰ０５２０８８を使用することが可能である。
【０１８７】
あるいは、スクリーニングには細胞ベースのスクリーニング系、例えばＭｎｋタンパク質を過剰発現する真核または原核細胞の使用を包むことが可能である。さらには、Ｍｎｋ２および（または）Ｍｎｋ１を過剰発現または低発現する能力のある遺伝子組換え動物を使用することも可能である。
【０１８８】
本明細書において開示した全ての刊行物および特許を言及することをもって本明細書の一部となす。
【０１８９】
本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は当業者に当然のことであり、本発明の範囲および精神から逸脱しない限り行い得るものとする。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことは当然のことながら共通認識とする。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ−１】
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【図３Ｈ−２】
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【図３Ｉ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図４】
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【配列表】
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