(57)【要約】【課題】本発明は、蛍光集団の統計データを簡単かつ高精度に取得する。【解決手段】本発明の蛍光集団の評価装置は、蛍光集団の蛍光観察画像（Ｉｆ）と、その蛍光観察画像と同一視野の透過観察画像（Ｉｔ）とを入力する入力手段と、前記入力された透過観察画像上で前記蛍光集団の像の存在する第１領域群を検出する第１検出手段（Ｍｔ）と、前記入力された蛍光観察画像上で前記第１領域群に相当する領域群を参照領域群に設定する設定手段（Ｉｆ’）と、前記蛍光観察画像上に設定された参照領域群から統計データを取得する解析手段とを備えたことを特徴とする。【選択図】      図３
2010019656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光集団の蛍光観察画像と、その蛍光観察画像と同一視野の透過観察画像とを入力する入力手段と、
前記入力された透過観察画像上で前記蛍光集団の像の存在する第１領域群を検出する第１検出手段と、
前記入力された蛍光観察画像上で前記第１領域群に相当する領域群を参照領域群に設定する設定手段と、
前記蛍光観察画像上に設定された参照領域群から統計データを取得する解析手段と
を備えたことを特徴とする蛍光集団の評価装置。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光集団の評価装置において、
前記入力された蛍光観察画像上で高輝度像の存在する第２領域群を検出する第２検出手段を更に備え、
前記設定手段は、
前記第１領域群と前記第２領域群との論理和を算出し、前記入力された蛍光観察画像上で前記論理和に相当する領域群を参照領域群とする
ことを特徴とする蛍光集団の評価装置。
【請求項３】
請求項２に記載の蛍光集団の評価装置において、
前記設定手段は前記論理和の算出に先立ち、
前記第１領域群における領域間の境界線を算出し、前記第２領域群のうち前記境界線上に位置する領域をその境界線で分離する
ことを特徴とする蛍光集団の評価装置。
【請求項４】
蛍光集団の蛍光観察画像と、その蛍光観察画像と同一視野の透過観察画像とを入力する入力手順と、
前記入力された透過観察画像上で前記蛍光集団の像の存在する第１領域群を検出する第１検出手順と、
前記入力された蛍光観察画像上で前記第１領域群に相当する領域群を参照領域群に設定する設定手順と、
前記蛍光観察画像上に設定された参照領域群から統計データを取得する解析手順と
を含むことを特徴とするコンピュータ実行可能な蛍光集団の評価プログラム。
【請求項５】
請求項４に記載のコンピュータ実行可能な蛍光集団の評価プログラムにおいて、
前記入力された蛍光観察画像上で高輝度像の存在する第２領域群を検出する第２検出手順を更に含み、
前記設定手順では、
前記第１領域群と前記第２領域群との論理和を算出し、前記入力された蛍光観察画像上で前記論理和に相当する領域群を参照領域群とする
ことを特徴とするコンピュータ実行可能な蛍光集団の評価プログラム。
【請求項６】
請求項５に記載のコンピュータ実行可能な蛍光集団の評価プログラムにおいて、
前記設定手順では前記論理和の算出に先立ち、
前記第１領域群における領域間の境界線を算出し、前記第２領域群のうち前記境界線上に位置する領域をその境界線で分離する
ことを特徴とするコンピュータ実行可能な蛍光集団の評価プログラム。
【請求項７】
蛍光集団の蛍光観察画像を取得する光学系と、
前記蛍光観察画像と同一視野の透過観察画像を取得する光学系と、
請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の蛍光集団の評価装置と
を備えたことを特徴とする蛍光集団の評価システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光染色された細胞集団などの蛍光集団を評価する蛍光集団の評価装置、及びコンピュータ実行可能な蛍光集団の評価プログラムに関する。また本発明は、蛍光集団を評価する蛍光集団の評価システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光染色された細胞集団の溶液を光透過性チューブへ通し、そのチューブへ励起光を照射しながら蛍光の発光量の時間変化を測定し、その時間変化から細胞集団の蛍光に関する統計データを取得する細胞集団の評価装置（フローサイトメータ）が知られている（特許文献１）。
【０００３】
近年、細胞集団の溶液をチューブへ通す代わりに細胞集団の蛍光顕微鏡画像を取得し、その蛍光顕微鏡画像を画像処理することで同様の統計データを取得する細胞集団の評価装置（以下、「画像処理サイトメータ」と称する。）が提案された（特許文献２）。
【０００４】
この画像処理サイトメータは、煩雑な測定手順を経る必要が無く、また細胞内の構造に関わる詳細なデータをも取得できるので、有用性が高い。
【０００５】
但し、蛍光顕微鏡画像には多くのノイズが発生するので、画像処理サイトメータでは細胞像とノイズとを区別し、統計データの取得前に後者を除去する必要がある。実際、特許文献２に記載の画像処理サイトメータでは、蛍光顕微鏡画像のうち輝度値が閾値を超える輝点を細胞像とみなし、輝度値が閾値以下である輝点をノイズとみなし、後者を除去している。
【特許文献１】特開平９−１４５５９３号公報
【特許文献２】特開２００６−１９４７１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら個々の細胞の染色程度は様々なので、細胞像によっては蛍光強度が低くなり、背景レベル（ノイズレベル）と同等になることもある。このような細胞像はノイズとして除去されてしまうので、統計データに誤差が生じる。
【０００７】
なお、閾値を低く設定すれば細胞像が誤って除去される可能性は少なくなるが、その代わりに多くのノイズが残存する可能性が増えるため、統計データの誤差を確実に低減することはできない。
【０００８】
そこで本発明は、蛍光集団の統計データを簡単かつ高精度に取得することのできる蛍光集団の評価装置、コンピュータ実行可能な蛍光集団の評価プログラム、及び蛍光集団の評価システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の蛍光集団の評価装置は、蛍光集団の蛍光観察画像と、その蛍光観察画像と同一視野の透過観察画像とを入力する入力手段と、前記入力された透過観察画像上で前記蛍光集団の像の存在する第１領域群を検出する第１検出手段と、前記入力された蛍光観察画像上で前記第１領域群に相当する領域群を参照領域群に設定する設定手段と、前記蛍光観察画像上に設定された参照領域群から統計データを取得する解析手段とを備えたことを特徴とする。
【００１０】
なお、本発明の蛍光集団の評価装置は、前記入力された蛍光観察画像上で高輝度像の存在する第２領域群を検出する第２検出手段を更に備えてもよく、前記設定手段は、前記第１領域群と前記第２領域群との論理和を算出し、前記入力された蛍光観察画像上で前記論理和に相当する領域群を参照領域群としてもよい。
【００１１】
また、前記設定手段は前記論理和の算出に先立ち、前記第１領域群における領域間の境界線を算出し、前記第２領域群のうち前記境界線上に位置する領域をその境界線で分離してもよい。
【００１２】
また、本発明の蛍光集団の評価プログラムは、蛍光集団の蛍光観察画像と、その蛍光観察画像と同一視野の透過観察画像とを入力する入力手順と、前記入力された透過観察画像上で前記蛍光集団の像の存在する第１領域群を検出する第１検出手順と、前記入力された蛍光観察画像上で前記第１領域群に相当する領域群を参照領域群に設定する設定手順と、前記蛍光観察画像上に設定された参照領域群から統計データを取得する解析手順とを含むことを特徴とする。
【００１３】
なお、本発明の蛍光集団の評価プログラムは、前記入力された蛍光観察画像上で高輝度像の存在する第２領域群を検出する第２検出手順を更に含んでもよく、前記設定手順では、前記第１領域群と前記第２領域群との論理和を算出し、前記入力された蛍光観察画像上で前記論理和に相当する領域群を参照領域群としてもよい。
【００１４】
また、前記設定手順では前記論理和の算出に先立ち、前記第１領域群における領域間の境界線を算出し、前記第２領域群のうち前記境界線上に位置する領域をその境界線で分離してもよい。
【００１５】
また、本発明の蛍光集団の評価システムは、蛍光集団の蛍光観察画像を取得する光学系と、前記蛍光観察画像と同一視野の透過観察画像を取得する光学系と、本発明の何れかの蛍光集団の評価装置とを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、蛍光集団の統計データを簡単かつ高精度に取得することのできる蛍光集団の評価装置、コンピュータ実行可能な蛍光集団の評価プログラム、及び蛍光集団の評価システムが実現する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態を説明する。本実施形態は、画像処理サイトメータの実施形態である。
【００１８】
先ず、画像処理サイトメータの構成を説明する。
【００１９】
図１は、画像処理サイトメータの全体構成図である。図１に示すとおり画像処理サイトメータには、二次元移動ステージ１２と、顕微鏡装置３０と、コンピュータ５３と、表示器５６と、入力器５７とが備えられる。
【００２０】
二次元移動ステージ１２の中央には開口部１１Ａが設けられており、その開口部１１Ａを覆うようにして試料１が載置される。試料１は、例えばスライドガラスであり、その中央には蛍光発光色素で染色された細胞集団の溶液が予め滴下されている。なお、溶液の表面は乾燥防止のためにカバーガラスで覆われている。因みに、溶液が滴下される面はスライドガラスの下面である。
【００２１】
なお、ここではＥＧＦＰ（蛍光蛋白質）の発現量にばらつきのある細胞集団を評価する場合や、細胞集団に含まれる個々の細胞の表面抗原を蛍光抗体法で検出する場合などを想定し、試料１中の細胞集団には、蛍光強度の異なる少なくとも２種類の細胞群が含まれていると仮定する。
【００２２】
顕微鏡装置３０には、対物レンズ３１、焦点調節機構３２、励起光照明装置３３、蛍光フィルタブロック３４、第二対物レンズ３５、光路切替器３６、撮像装置３７、透過照明装置４０、コンデンサレンズ４３が備えられる。このうち透過照明装置４０及びコンデンサレンズ４３は試料１の上方に配置され、それ以外の要素は試料１の下方に配置される。また、蛍光フィルタブロック３４にはダイクロイックミラー、励起フィルタ、蛍光フィルタなどが装着されており、光路切替器３６には光路に対して挿脱可能なミラー３６ａが備えられている。
【００２３】
対物レンズ３１は、比較的広い視野を有した対物レンズである（例えば倍率４倍の対物レンズ）。対物レンズ３１は、焦点調節機構３２により光軸ＡＸの方向（Ｚ方向）に移動可能である。この移動により試料１に対する対物レンズ３１の焦点調節が行われる。
【００２４】
二次元移動ステージ１２は、光軸ＡＸと垂直な方向であるＸ方向及びＹ方向へ移動可能である。この移動により試料１における対物レンズ３１の視野（観察領域）の位置調節が行われる。
【００２５】
透過照明装置４０は、明視野観察用の照明光束を出射することが可能である（符号４１は光源であり、符号４２はコリメータレンズである。）。この透過照明装置４０は、明視野観察時にオンされ、蛍光観察時にオフされる。
【００２６】
励起光照明装置３３は、蛍光観察用の励起光束を出射することが可能である。この励起光照明装置３３は、蛍光観察時にオンされ、明視野観察時にオフされる。
【００２７】
明視野観察時、透過照明装置４０から射出した照明光束は、コンデンサレンズ４３を通り、試料１の観察領域を照明する。試料１を透過した光束は、対物レンズ３１に入射する。対物レンズ３１に入射した光束は、蛍光フィルタブロック３４、第二対物レンズ３５を通り、光路切替器３６へ入射する。光路切替器３６のミラー３６ａが光路に挿入されている場合、その光束はミラー３６ａで反射して不図示の接眼レンズへ導かれ、光路切替器３６のミラー３６ａが光路から離脱されている場合、その光束は光路切替器３６を通過して撮像装置３７へ入射する。撮像装置３７へ入射した光束は、撮像装置３７内の撮像素子３７ａ上に上述した観察領域の明視野像を形成する。撮像素子３７ａは、その明視野像を撮像して画像データ（以下、「透過画像」という。）を取得する。
【００２８】
蛍光観察時、励起光照明装置３３から射出した励起光束は、調光フィルタ３３ａ、蛍光フィルタブロック３４を通り、像側から対物レンズ３１へ入射すると、その対物レンズ３１を介して試料１の観察領域を照射する。その励起光束に応じて試料１で発生した蛍光は、物体側から対物レンズ３１へ入射し、蛍光フィルタブロック３４、第二対物レンズ３５を通り、光路切替器３６へ入射する。光路切替器３６のミラー３６ａが光路に挿入されている場合、その光束はミラー３６ａで反射して不図示の接眼レンズへ導かれ、光路切替器３６のミラー３６ａが光路から離脱されている場合、その光束は光路切替器３６を通過して撮像装置３７へ入射する。撮像装置３７へ入射した光束は、撮像装置３７内の撮像素子３７ａ上に上述した観察領域の蛍光像を形成する。撮像素子３７ａは、その蛍光像を撮像して画像データ（以下、「蛍光画像」という。）を取得する。
【００２９】
コンピュータ５３は、二次元移動ステージ１２、及び顕微鏡装置３０の各駆動部（透過照明装置４０、焦点調節機構３２、励起光照明装置３３、光路切替器３６など）を制御する制御機能を有する。この制御によりコンピュータ５３は、例えば試料１上の観察領域の位置を調節したり、蛍光観察と明視野観察との間の切り替えを行ったり、目視観察と画像観察との間の切り替えを行ったりすることができる。
【００３０】
また、コンピュータ５３は、顕微鏡装置３０が取得した画像（蛍光画像、透過画像）を処理する情報処理機能を有する。例えば、コンピュータ５３は、顕微鏡装置３０から画像（蛍光画像、透過画像）を取り込んでコンピュータ５３の内部のフレームメモリへ格納し、それらの画像に基づき前述した観察領域内の細胞集団の統計データを取得し、その統計データを表示器５６へ表示することができる。
【００３１】
なお、コンピュータ５３の動作は、入力器５７から入力されるユーザの指示に従って行われる。また、その動作に必要なプログラムは、コンピュータ５３に予めインストールされている。このインストールは記憶媒体を介して行われてもよく、またインターネットなどの通信網を介して行われてもよい。
【００３２】
次に、コンピュータ５３の動作フローを説明する。
【００３３】
図２は、本実施形態のコンピュータ５３の動作フローチャートであり、図３は、各ステップで生成される画像の模式図である。以下、図２、図３を参照しながら各ステップを順に説明する。
【００３４】
ステップＳ１：コンピュータ５３は顕微鏡装置３０に明視野観察を実行させ、その明視野観察で取得された透過画像Ｉｔを顕微鏡装置３０から取り込み、フレームメモリへ格納する。
【００３５】
ステップＳ２：コンピュータ５３は顕微鏡装置３０に蛍光観察を実行させ、その蛍光観察で取得された蛍光画像Ｉｆを顕微鏡装置３０から取り込み、フレームメモリへ格納する。この蛍光画像Ｉｆは、ステップＳ１で取得された透過画像Ｉｔと同一視野の画像である。
【００３６】
図３では、画像上に蛍光強度の強い細胞の像Ｃｂと蛍光強度の弱い細胞の像Ｃｄとが１つずつ存在していたと仮定した（実際は数十個〜数万個である。）。なお、符号ｎで示す像はノイズである。
【００３７】
また、図３では、画像を横切る直線上の輝度分布グラフを各画像の下部に示した（上述した撮像装置３７のビット数を例えば１２としたならば、各画像の各画素の輝度値は０〜４０９５の何れかの値をとる。）。
【００３８】
この輝度分布グラフから明らかなとおり、透過画像Ｉｔ上では蛍光強度の強い細胞像Ｃｂと蛍光強度の弱い細胞像Ｃｄとの双方の輝度値が背景レベル（ノイズレベル）Ｔ0よりも十分に高くなっているのに対し、蛍光画像Ｉｆ上では、蛍光強度の弱い細胞像Ｃｄの輝度値が背景レベル（ノイズレベル）Ｔ0に埋もれている。
【００３９】
また、図３には表さなかったが、透過画像Ｉｔの背景レベルＴ0は略均一であるのに対し、蛍光画像Ｉｆの背景レベルＴ0は不均一になり易い。
【００４０】
したがって、蛍光画像Ｉｆのみに基づいても、蛍光画像Ｉｆ上に存在する細胞像Ｃｂ、Ｃｄとノイズｎとを正確に区別することはできないが、透過画像Ｉｔに基づけば、蛍光画像Ｉｆ上に存在する細胞像Ｃｂ、Ｃｄとノイズｎとを正確に区別することができる。
【００４１】
ステップＳ１１：コンピュータ５３は、フレームメモリに格納された透過画像Ｉｔを読み出す。
【００４２】
ステップＳ１２：コンピュータ５３は、その透過画像Ｉｔに対して二値化処理を施すことにより、マスク画像Ｍｔを作成する。
【００４３】
図３に示すとおり、マスク画像Ｍｔの開口パターンは、透過画像Ｉｔ上に存在する細胞像Ｃｂ、Ｃｄの分布パターンと略一致している（マスク部の輝度値及び開口部の輝度値は、ソフトウエアにより０及び２５５、或いは０及び６５５３５、或いは０及び１であるが、本質的には同じなので、ここでは０及び１とする。）。
【００４４】
このようなマスク画像Ｍｔを得るために、本ステップにおける二値化処理の閾値ＴAは、透過画像Ｉｔの背景レベルＴ0よりも十分に高く、かつ透過画像Ｉｔの細胞輝度レベルＴ1よりも十分に低い値に設定される必要がある。
【００４５】
そこで本ステップにおけるコンピュータ５３は、二値化処理に先立ち、透過画像Ｉｔの輝度ヒストグラムを作成し、その輝度ヒストグラムの低輝度側のピークを与える輝度値を背景レベルＴ0とみなし、その輝度ヒストグラムの最高輝度値を細胞輝度レベルＴ1とみなし、背景レベルＴ0と細胞輝度レベルＴ1との間の値（例えば中間値）を、閾値ＴAとする。このような閾値設定により、マスク画像Ｍｔの開口パターンを、透過画像Ｉｔ上に存在する細胞像Ｃｂ、Ｃｄの分布パターンと略一致させることができる。
【００４６】
但し、マスク画像Ｍｔの開口パターンは、透過画像Ｉｔ上に存在する細胞像Ｃｂ、Ｃｄの分布パターンと完全に一致しているとは限らない。なぜなら、透過画像Ｉｔ上にはノイズｎ（気泡やゴミなどの像である。）も存在しており、ノイズｎの輝度値が閾値ＴAより高い可能性もあるからである。
【００４７】
ステップＳ１３：コンピュータ５３は、マスク画像Ｍｔの不要な開口部を除去するべく次のとおりマスク画像Ｍｔを調整する。
【００４８】
先ず、コンピュータ５３は、マスク画像Ｍｔに形成されている個々の開口部のサイズ及び形状を参照し、サイズ又は形状の少なくとも一方が異常な開口部（細胞像のサイズ又は形状とは明らかに異なる開口部）を見いだす。そして、コンピュータ５３は、その開口部をマスク部へと置換することにより、調整後のマスク画像Ｍｔ’を得る。調整後のマスク画像Ｍｔ’の開口パターンは、透過画像Ｉｔ上に存在する細胞像Ｃｂ、Ｃｄの分布パターンと完全に一致している。
【００４９】
なお、本ステップにおいて開口部のサイズが異常であるか否かの判断基準は、顕微鏡装置３０の観察条件（観察倍率）に応じて設定されることが望ましく、開口部の形状が異常であるか否かの判断は、真円度からの乖離度によって行われることが望ましい。
【００５０】
ステップＳ１４：コンピュータ５３は、フレームメモリに格納された蛍光画像Ｉｆを読み出す。
【００５１】
ステップＳ１５：コンピュータ５３は、その蛍光画像Ｉｆに対してマスク画像Ｍｔ’によるマスク処理を施すことにより、マスク処理後の蛍光画像Ｉｆ’を得る。図３に示すとおり、マスク処理後の蛍光画像Ｉｆ’は、マスク画像Ｍｔ’と蛍光画像Ｉｆとの論理積に相当し、蛍光画像Ｉｆの背景に発生していたノイズｎは完全に除去されている。
【００５２】
ステップＳ１６：コンピュータ５３は、マスク画像Ｍｔ’に形成されている個々の開口部の位置座標を認識し、蛍光画像Ｉｆ’上でそれらの開口部に相当する各領域にＲＯＩを設定する。そして、コンピュータ５３は、蛍光画像Ｉｆ’上に設定された個々のＲＯＩから輝度最高値、輝度平均値、輝度積分値などの蛍光データを抽出する。
【００５３】
ここで、個々のＲＯＩには、蛍光データだけでなく蛍光画像Ｉｆの背景レベルＴ0までもが含まれているので、コンピュータ５３は、蛍光データの抽出に先立ち、蛍光画像Ｉｆの輝度ヒストグラムを作成し、その輝度ヒストグラムの低輝度側のピークを与える輝度値を、背景レベルＴ0とみなし、その背景レベルＴ0を個々のＲＯＩから差し引く。
【００５４】
なお、上述したとおり蛍光画像Ｉｆの背景レベルＴ0は不均一である。よって、コンピュータ５３は、背景レベルＴ0の算出を、蛍光画像Ｉｆを複数に分割してできる部分領域毎に行うことが望ましい。
【００５５】
その後、全てのＲＯＩから各種の蛍光データ（輝度最高値、輝度平均値、輝度積分値など）を抽出すると、コンピュータ５３はそれらの蛍光データに基づき輝度最高値のヒストグラム、輝度平均値のヒストグラム、輝度積分値のヒストグラムを集計結果として作成する。各ヒストグラムの縦軸は、ＲＯＩの個数、すなわち細胞数である。
【００５６】
ステップＳ１７：コンピュータ５３は、作成した各種ヒストグラムを、マスク処理後の蛍光画像Ｉｆ’と共に表示器５６へ表示する。これによってフローが終了する。
【００５７】
以上、本実施形態のコンピュータ５３は、マスク処理で使用されるマスク画像Ｍｔ’を、蛍光画像Ｉｆと同一視野の透過画像Ｉｔに基づき作成する。
【００５８】
この透過画像Ｉｔは、細胞像Ｃｂ、Ｃｄの蛍光データを全く含まないものの、蛍光画像Ｉｆとは異なりＳＮ比が高く、背景レベルＴ0も均一である。このため、本実施形態で作成されたマスク画像Ｍｔ’によれば、細胞像Ｃｂ、Ｃｄを誤って除去したり、ノイズｎが残存したりする可能性を確実に防ぐことができる。
【００５９】
したがって、本実施形態の画像処理サイトメータによれば、細胞集団の統計データを高精度に取得することができる。
【００６０】
なお、本実施形態のコンピュータ５３は、透過画像Ｉｔ、蛍光画像Ｉｆ、部分領域の各々の背景レベルＴ0の算出を自動的に行ったが、透過画像、蛍光画像、部分領域の少なくとも一つに関する背景レベルＴ0の算出を半自動で行ってもよい。
【００６１】
その場合、コンピュータ５３は、背景レベルＴ0の算出対象である画像を表示器５６に表示し、その表示画面上でユーザに任意形状かつ任意サイズの背景ウィンドウを指定させ、指定された背景ウィンドウ内の輝度平均値を、その画像の背景レベルＴ0とみなせばよい。
【００６２】
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態を説明する。本実施形態も、画像処理サイトメータの実施形態である。ここでは、第１実施形態との相違点のみ説明する。
【００６３】
第１実施形態では説明しなかったが、蛍光画像Ｉｆ上では、蛍光強度の強い細胞像Ｃｂは、蛍光強度の弱い細胞像Ｃｄよりも膨張する傾向にある。しかも、その膨張の程度は、蛍光強度と強い相関がある。
【００６４】
しかしながら第１実施形態のコンピュータ５３は、透過画像Ｉｔのみから作成したマスク画像Ｍｔ’をマスク処理に使用するので、蛍光強度の強い細胞像Ｃｂの膨張部分（周縁部）がノイズｎと共に除去されてしまう。この場合、膨張部分の蛍光データが集計結果に反映されないので、集計結果に一定の誤差が生じる。
【００６５】
そこで、本実施形態のコンピュータ５３は、マスク処理に使用すべきマスク画像を、透過画像Ｉｔと蛍光画像Ｉｆとの双方に基づき作成する。
【００６６】
図４は、本実施形態のコンピュータ５３の動作フローチャートであり、図５は、各ステップで生成される画像の模式図である。図４において図２との相違点は、ステップＳ１４の後段にステップＳ１４１が挿入され、かつステップＳ１５の前段にステップＳ１４２が挿入された点にある。以下、図４、図５を参照しながらステップＳ１４１、Ｓ１４２を順に説明する。
【００６７】
ステップＳ１４１：コンピュータ５３は、蛍光画像Ｉｆに対して二値化処理を施すことにより、マスク画像Ｍｆを作成する。
【００６８】
図５に示すとおり、このマスク画像Ｍｆの開口パターンは、蛍光画像Ｉｆ上に存在する蛍光強度の強い細胞像Ｃｂの分布パターンと一致しており、蛍光画像Ｉｆ上に存在する蛍光強度の弱い細胞像Ｃｄの存在領域はマスク部となっている。
【００６９】
このようなマスク画像Ｍｆを得るために、本ステップにおける二値化処理の閾値ＴBは、蛍光画像Ｉｆの背景レベルＴ0よりも十分に高く、かつ蛍光画像Ｉｆの細胞輝度レベルＴ1よりも十分に低い値に設定される必要がある。
【００７０】
そこで本ステップにおけるコンピュータ５３は、二値化処理に先立ち、蛍光画像Ｉｆの輝度ヒストグラムを作成し、その輝度ヒストグラムの低輝度側のピークを与える輝度値を背景レベルＴ0とみなし、その輝度ヒストグラムの最高輝度値を細胞輝度レベルＴ1とみなし、背景レベルＴ0と細胞輝度レベルＴ1との間の値（例えば中間値）を、閾値ＴBとする。このような閾値設定により、マスク画像Ｍｆの開口パターンを、蛍光画像Ｉｆ上に存在する蛍光強度の強い細胞像Ｃｂの分布パターンと一致させることができる。
【００７１】
ステップＳ１４２：コンピュータ５３は、透過画像Ｉｔから作成されたマスク画像Ｍｔ’と、蛍光画像Ｉｆから作成されたマスク画像Ｍｆとの論理和をとることにより、合成マスク画像Ｍｃを作成する。図５に示すとおり、この合成マスク画像Ｍｃの開口パターンは、蛍光画像Ｉｆ上に存在する細胞像Ｃｂ、Ｃｄの分布パターンと完全に一致している。そして、本実施形態のマスク処理（ステップＳ１５）では、この合成マスク画像Ｍｃが使用される。
【００７２】
したがって、本実施形態のマスク処理によれば、細胞像Ｃｂの膨張部分が蛍光画像Ｉｆ’から欠落することは無い。よって、本実施形態では、集計結果の精度が第１実施形態のそれよりも高まる。
【００７３】
［第３実施形態］
以下、本発明の第３実施形態を説明する。本実施形態も、画像処理サイトメータの実施形態である。ここでは、第２実施形態との相違点のみ説明する。
【００７４】
第２実施形態では説明しなかったが、図７に示すとおり、蛍光画像Ｉｆ上に蛍光強度の強い２つの細胞像Ｃｂが近接して存在していた場合、蛍光画像Ｉｆから作成されたマスク画像Ｍｆ上では、それら細胞像Ｃｂに対応する２つの開口部が連結することがある。その場合、それら細胞像Ｃｂの蛍光データが１つの細胞像の蛍光データとして集計されてしまうので、集計結果に誤差が生じる。
【００７５】
そこで、本実施形態のコンピュータ５３は、蛍光画像Ｉｆから作成されたマスク画像Ｍｆを調整する。
【００７６】
図６は、本実施形態のコンピュータ５３の動作フローチャートであり、図７は、各ステップで生成される画像の模式図である。図６において図４との相違点は、ステップＳ１４１の後段にステップＳ１４１１が挿入された点にある。以下、挿入されたステップＳ１４１１を説明する。
【００７７】
ステップＳ１４１１：コンピュータ５３は、透過画像Ｉｔから作成されたマスク画像Ｍｔ’に基づき、蛍光画像Ｉｆから作成されたマスク画像Ｍｆを次のとおり調整する。
【００７８】
先ず、コンピュータ５３は、マスク画像Ｍｔ’に形成されている開口間の境界線を算出し、その境界線パターンと同じ開口パターンを有した仮のマスク画像Ｍｔ”を作成する。そして、コンピュータ５３は、仮のマスク画像Ｍｔ”とマスク画像Ｍｆとの論理積をとることにより調整後のマスク画像Ｍｆ’を得る。
【００７９】
図７に示すとおり、調整後のマスク画像Ｍｆ’に形成されている開口部の個数及び配置関係は、蛍光画像Ｉｆ上に存在する蛍光強度の強い細胞像Ｃｂの個数及び配置関係と完全に一致している。
【００８０】
そして、本実施形態のマスク合成（ステップＳ１４２）では、マスク画像Ｍｆの代わりに調整後のマスク画像Ｍｆ’が使用される。
【００８１】
したがって、図７に示すとおり、本実施形態の合成マスク画像Ｍｃ’では、開口部の個数及び配置関係が、透過画像Ｉｔ上に存在する細胞像Ｃｂ、Ｃｄの個数及び配置関係と完全に一致する。よって、本実施形態では、集計結果の精度が第２実施形態のそれよりも高まる。
【００８２】
［その他］
なお、上述した何れかの実施形態では、透過画像Ｉｔを取得する際の観察方法として、明視野観察法を適用したが、位相差観察法、微分干渉観察法、偏光観察法など他の透過観察方法を適用してもよい。
【００８３】
また、上述した何れかの実施形態では、透過画像Ｉｔにおける細胞輝度レベルＴ1が背景レベルＴ0よりも高い場合を説明したが、細胞の種類と観察方法の種類との組み合わせによっては細胞輝度レベルＴ1が背景レベルＴ0より低くなる場合もある。その場合は、透過画像Ｉｔから作成されたマスク画像Ｍｔに対して反転処理を施す必要がある。
【００８４】
また、上述した何れかの実施形態では、透過画像Ｉｔにおける細胞輝度レベルＴ1が背景レベルＴ0と異なる場合を説明したが、細胞の種類と観察方法の種類との組み合わせによっては細胞輝度レベルＴ1が背景輝度レベルＴ0と同程度になる場合もある。その場合は、細胞輝度レベルＴ1の代わりに細胞像のエッジの輝度レベルに基づき閾値ＴAを設定すればよい。但し、その場合、マスク画像Ｍｔの開口部が面状でなく閉曲線状となるので、その閉曲線内を開口部に置換する処理をそのマスク画像Ｍｔへ施す必要がある。
【００８５】
また、上述した何れかの実施形態では、蛍光発光色素で染色された細胞集団を評価対象としたが、他の粒子状の蛍光集団、例えばプラスチックやガラスのビーズ、リポソーム、液滴などを評価対象としてもよい。
【実施例】
【００８６】
以下、上述した第２実施形態に対応する実施例を説明する。
【００８７】
先ず、胸腺細胞株 BW5147 を予め用意した。また、蛍光タンパク質 EGFP の遺伝子を含むプラスミド DNApMRX-IRES-EGFP をレトロウイルスパッケージング細胞 Plat-E に導入し、それによって生産されたレトロウイルスを含む培養上清を回収した。その培養上清を、予め用意した胸腺細胞株 BW5147 に感染させた。そして、感染後のBW5147細胞をフローサイトメータにかけることにより、EGFPを発現するBW5147細胞のみを抽出した。以下、抽出された細胞集団を「蛍光強度の強い細胞集団」と称す。
【００８８】
その一方で、上記プラスミドを導入していない細胞集団を用意した。以下、その細胞集団を「蛍光強度の弱い細胞集団」と称す。
【００８９】
その後、蛍光強度の強い細胞集団と、蛍光強度の弱い細胞集団とを同種の培地で別々に培養した。その培地は、RPMI 1640であり、10％ fetal calf serum (FCS), 50μM2-mercaptoethanol, 10mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1X nonessential amino acides, 1 mM sodium pyruvate, 100 U/mL penicillin, and 100 μg/mL streptomycin を含む。また、培養に使用した培養装置は、温度37℃、ＣＯ2濃度５％のインキュベータであった。
【００９０】
培養後、蛍光強度の強い細胞集団と蛍光強度の弱い細胞集団との混合液１滴をスライドグラスに滴下し、カバーグラスをかけたものを試料として用意し、その試料を倒立顕微鏡（Nikon TE2000-E）の二次元移動ステージにカバーグラス面が下になるように設置した。
【００９１】
倒立顕微鏡に使用されたコンデンサーレンズはLWDコンデンサーであり、倒立顕微鏡に使用された対物レンズは、開口数が0.2のPlan Apo 4Xであった。
【００９２】
また、倒立顕微鏡に使用された励起光照明装置は、Intensilight ファイバー光源であり、倒立顕微鏡に使用された蛍光フィルタブロックは、励起フィルタとしてEX465-495, ダイクロイックミラーとしてDM505, 蛍光フィルタとしてBA515-555を組み合わせたものであった。
【００９３】
また、倒立顕微鏡に使用された撮像装置のカメラは、白黒カメラ Ds-Qi1 であり、カメラ制御及び画像取得処理には、NIS-Elements AR 2.3 が使用された。カメラの画素数は1280×1000であり、各画素の階調数は12bitであった。
【００９４】
明視野観察時におけるカメラの露光時間、蛍光観察時におけるカメラの露光時間は、それぞれ５秒程度に設定した。その設定下で、明視野観察、蛍光観察を順に行った。
【００９５】
明視野観察によって取得された透過画像（12bitの階調を持つ）は図８に示すとおりであり、蛍光観察によって取得された蛍光画像（12bitの階調を持つ）は図９に示すとおりであった。なお、これらの図８、図９、及び以下の各図では、細胞像を見易くするために、画像の一部を拡大して示した。
【００９６】
続いて、透過画像及び蛍光画像に対しコンピュータ上で以下の処理を施した。
【００９７】
先ず、12bitの階調を持つ透過画像（図８）へ二値化処理を施した。この二値化処理では、閾値を2753とし、その閾値を超える輝度値を有した画素を、輝度値１の画素に変換し、閾値以下の輝度値を有した画素を、輝度値０の画素に変換した。なお、閾値2753は、以下の式により導出した。
【００９８】
閾値＝（4095-背景レベル）×15％＋透過画像の背景レベル
但し、式中の値4095はカメラの輝度最大値である。このようにして作成されたマスク画像は、図１０に示すとおりであった。
【００９９】
次に、12bitの階調を持つ蛍光画像（図９）へ二値化処理を施した。この二値化処理では、閾値を553とし、その閾値を超える輝度値を有した画素を、輝度値１の画素に変換し、閾値以下の輝度値を有した画素を、輝度値０の画素に変換した。なお、閾値553は、以下の式により導出した。
【０１００】
閾値＝（4095-背景レベル）×10％＋蛍光画像の背景レベル
但し、式中の値4095は、カメラの輝度最大値である。このようにして作成されたマスク画像は、図１１に示すとおりであった。
【０１０１】
次に、図１０に示すマスク画像と図１１に示すマスク画像との論理和をとり合成マスク画像を生成した。生成された合成マスク画像は、図１２に示すとおりであった。
【０１０２】
次に、図１２に示す合成マスク画像と図９に示す蛍光画像との論理積をとることにより、その蛍光画像へマスク処理を施した。マスク処理後の蛍光画像は、図１３に示すとおりであった。
【０１０３】
マスク処理後の蛍光画像（図１３）の全体には、596個の細胞像が存在していた。個々の細胞像の輝度積分値を計算し、その輝度積分値の常用対数（底が１０の対数）をとり、その結果を0．05刻みでヒストグラムを作成した。作成されたヒストグラムは、図１４に示すとおりとなった。
【０１０４】
このヒストグラムには２つのピークが現れている。２つのピークが現れた理由は、試料中に蛍光強度の強い細胞集団と蛍光強度の弱い細胞集団とが混在していたことにある。
【０１０５】
このヒストグラムからは、蛍光強度の強い細胞集団の細胞数は104であり、蛍光強度の弱い細胞集団の細胞数は492であったことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】画像処理サイトメータの全体構成図である。
【図２】第１実施形態のコンピュータ５３の動作フローチャートである。
【図３】第１実施形態で生成される各画像の模式図である。
【図４】第２実施形態のコンピュータ５３の動作フローチャートである。
【図５】第２実施形態で生成される各画像の模式図である。
【図６】第３実施形態のコンピュータ５３の動作フローチャートである。
【図７】第３実施形態で生成される各画像の模式図である。
【図８】実施例で取得された透過画像（一部）である。
【図９】実施例で取得された蛍光画像（一部）である。
【図１０】実施例の透過画像から作成されたマスク画像（一部）である。
【図１１】実施例の蛍光画像から作成されたマスク画像（一部）である。
【図１２】実施例で作成された合成マスク画像（一部）である。
【図１３】実施例におけるマスク処理後の蛍光画像（一部）である。
【図１４】実施例で作成されたヒストグラムである。
【符号の説明】
【０１０７】
１２…二次元移動ステージ、３０…顕微鏡装置、５３…コンピュータ、５６…表示器、５７…入力器、１１Ａ…開口部、１…試料、３１…対物レンズ、３２…焦点調節機構、３３…励起光照明装置、３４…蛍光フィルタブロック、３５…第二対物レンズ、３６…光路切替器、３７…撮像装置、４０…透過照明装置、４３…コンデンサレンズ
【図１】
2010019656.tif 000003
【図２】
2010019656.tif 000004
【図３】
2010019656.tif 000005
【図４】
2010019656.tif 000006
【図５】
2010019656.tif 000007
【図６】
2010019656.tif 000008
【図７】
2010019656.tif 000009
【図８】
2010019656.tif 000010
【図９】
2010019656.tif 000011
【図１０】
2010019656.tif 000012
【図１１】
2010019656.tif 000013
【図１２】
2010019656.tif 000014
【図１３】
2010019656.tif 000015
【図１４】
2010019656.tif 000016