(57)【要約】【課題】  虚血後の細胞死を治療または予防するための医薬組成物を提供すること。【解決手段】有効量のプロスタノイドＤＰ−１受容体作動物質を含有する医薬組成物を剤形化し、虚血を生じた患者に投与する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血後の細胞死を治療または予防するための医薬組成物であって、プロスタノイドＤＰ−１受容体作動物質を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２】
虚血性心疾患及び虚血性心疾患後の再灌流障害を治療または予防することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記プロスタノイドＤＰ−１受容体が、プロスタグランジンＤ２、およびプロスタノイドＤＰ−１受容体に結合し活性化するプロスタグランジンＤ２の誘導体であることを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血後の細胞死を治療または予防するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳や心臓などの臓器や組織において虚血が生じた場合の急性期治療は急速な進歩を遂げ、血栓の溶解などで速やかに血流を再開させることにより、急性期死亡率は減少してきた。しかしながら、一定時間経過後に血流を再開させた場合、虚血に伴う細胞障害は、再灌流によって促進される。この現象を虚血再灌流障害と呼ぶ。
【０００３】
この虚血再灌流障害は、虚血性疾患によるだけでなく、臓器移植などの外科手術の際、一過的に必要とされる虚血状態の後にも生じうる。虚血再灌流障害においては、炎症性サイトカインの分泌やオキシラジカルの発生などにより、炎症反応や細胞死がもたらされ、場合によっては、重篤な臓器不全や.組織障害が引き起こされる。
【０００４】
これまで、虚血再灌流障害を予防するために、誘導低体温法や虚血プレコンディショニングなどの方法が開発されてきた（例えば、特許文献１参照）が、副作用も大きく、更なる予防方法の開発が期待されている。最近、虚血性心疾患において、ステロイドが虚血後の心臓細胞を障害から防御することが明らかにされてきた（例えば、非特許文献１〜５）。しかしながら、どのようにして、ステロイドが効果を発揮するのかについて、ほとんど明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開WO2007/012947号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Libby, P. et al., J.Clin.Invest. vol.52, p.599-607, 1973
【非特許文献２】Valen, G. et al., Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol. vol.279, H836-843, 2000
【非特許文献３】Varga, E. et al., Life Sci. vol.75, p.2411-2423, 2004
【非特許文献４】Skyschally, A. et al., Circulation vol.109, p.2337-2342, 2004
【非特許文献５】Giugliano, G.R. et al., Am.J.Cardiol vol.91, p.1055-1059, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、虚血後の細胞死を治療または予防するための医薬組成物を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、虚血性心疾患において、ステロイドがどのようにして機能するかを明らかにすべく鋭意努力する中、グルココルチコイドが、プロスタグランジン合成の中心となる酵素であるPLA2G4A及びCOX−2の発現を増強することが明らかになった。これまで、炎症性細胞では、グルココルチコイドは、PLA2G4A及びCOX−2の発現を抑制し、従ってプロスタグランジン合成を抑制することが知られていた（Pascual and Glass, Trends Endocrinol.Metab. vol.17, p.321-327, 2006; Hayashi et al., Eur.J.Phamacol. vol.500, p.51-62, 2004; De Bosscher et al., Endocr.Rev. vol.24, p.488-522, 2003）ので、この発見は当業者にとって予想外であった。こうして、プロスタグランジンＤ２がグルココルチコイドの作用分子であることを発見し、本発明の完成に至った。
【０００９】
そこで、本発明にかかる医薬組成物は、虚血後の細胞死を治療または予防するための医薬組成物であって、プロスタノイドＤＰ−１受容体の作動物質を有効成分として含有する。プロスタノイドＤＰ−１受容体の作動物質として、プロスタグランジンＤ２を含有することが好ましい。この医薬組成物は、虚血性心疾患及び虚血性心疾患後の再灌流障害を治療または予防するために用いられても良い。
【００１０】
また、本発明にかかる虚血後の細胞死を抑制するための方法は、虚血後の患者に、有効量のプロスタノイドＤＰ−１受容体の作動物質を投与する。プロスタノイドＤＰ−１受容体の作動物質として、プロスタグランジンＤ２を投与することが好ましい。この方法は、虚血性心疾患及び虚血性心疾患後の再灌流障害を治療または予防するためになされても良い。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、虚血後の細胞死を治療または予防するための医薬組成物を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態において、デキサメタゾン処理群（黒丸）、RU486-デキサメタゾン処理群（灰色丸）、対照群（白丸）のマウス心臓において虚血−再灌流処理を行った際のLVDP （左心室圧、LV developed pressure）の回復率（A）、LVEDP（左室拡張末期圧）（B）、心拍数の回復率（C）、 positive dP/dtの回復率（D）negative dP/dtの回復率（E）、乳酸脱水素酵素活性（F）を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施形態において、デキサメタゾン処理群（黒丸）、デキサメタゾン-NS398処理群（灰色丸）、対照群（白丸）のマウス心臓において虚血−再灌流処理を行った際のLVDP （左心室圧、LV developed pressure）の回復率（A）、LVEDP（左室拡張末期圧）（B）、心拍数の回復率（C）、 positive dP/dtの回復率（D）negative dP/dtの回復率（E）、乳酸脱水素酵素活性（F）を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施形態において、デキサメタゾン処理の有無による、野生型マウスおよびL-PGDSノックアウトマウスのL-PGDSタンパク質発現量の変化を示すウエスタンブロット（A）、デキサメタゾン処理群（黒丸）および対照群（白丸）のL-PGDSノックアウトマウス心臓において虚血−再灌流処理を行った際のLVDP （左心室圧）の回復率（B）；LVEDP（左室拡張末期圧）（C）；心拍数の回復率（D）； positive dP/dtの回復率（E）；negative dP/dtの回復率（F）；乳酸脱水素酵素活性（G）を示すグラフである。
【図４】本実施例の一実施形態において、対照siRNA、グルココルチコイド受容体（GR）siRNA、COX-2 siRNA、L-PGDS siRNAを導入し、コルチバゾール処理を施した心筋細胞（左端：未処理、siRNA非導入）のLIVE/DEAD Viability Cytotoxicity Assay Kitによる標識を示した蛍光顕微鏡写真（A）、コルチバゾール処理を受けたsiRNA非導入心筋細胞にRU486またはNS398処理を施した際のLIVE/DEAD Viability Cytotoxicity Assay Kitによる標識を示した蛍光顕微鏡写真（C）、および、Aの写真から算出した生細胞率（B）、Cの写真から算出した生細胞率（D）を示すグラフである。
【図５】本実施例の一実施形態において、PGD2処理した心筋細胞におけるMAPKシグナリング経路の一連のタンパク質の発現を示すウエスタンブロット（A、B）、PGD2処理およびBWA868C処理した心筋細胞、あるいはPGD2処理およびCY14071処理した心筋細胞におけるウエスタンブロット（C）、PGD2-BWA868C処理、PGD2-PD98059処理、あるいはPGD2-CY14071処理し、さらに低酸素処理−再酸素化処理した心筋細胞におけるLIVE/DEAD Viability Cytotoxicity Assay Kitによる標識を示した蛍光顕微鏡写真（D）、およびDの結果から算出した生細胞率を示すグラフ（E）、PGD2処理した各siRNA導入心筋細胞における、LIVE/DEAD Viability Cytotoxicity Assay Kitによる標識を示した蛍光顕微鏡写真(F)、およびFの結果から算出した生細胞率を示すグラフである。
【図６】本実施例の一実施形態において、各薬剤処理を受けたマウス心臓における、虚血処理前の心機能を示す各指標の測定値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の医薬組成物を患者に投与することによって、虚血後の細胞死を抑制することができるが、この医薬組成物は、プロスタノイドＤＰ−１受容体の作動物質を含有する。本発明において、プロスタノイドＤＰ１受容体作動物質とは、プロスタノイドＤＰ１受容体に作用するアゴニストまたはアゴニスト様の物質であれば、天然物または合成化合物として特に限定されない。好ましい例として、プロスタグランジンＤ２、およびプロスタノイドＤＰ−１受容体に結合し活性化するプロスタグランジンＤ２の誘導体、BW245c（Sigma-Aldrich社）などが挙げられる。プロスタグランジンＤ２の誘導体としては、例えば、特開平7-233144、特開2000-273082、特開2001-151749、WO01/19790およびWO01/12596に記載のプロスタグランジン誘導体が挙げられるが、これらの化合物に限定されない。なお、プロスタグランジンは、様々な種類が知られており、プロスタグランジンＡ、プロスタグランジンＢ、プロスタグランジンＣ、プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＦ２α、プロスタグランジンＧＧ、プロスタグランジンＧＨ、プロスタグランジンＧＩ２、プロスタグランジンＧＪなどがあるが、これらのプロスタグランジンは全て、その生理的作用が異なり、本発明ではプロスタノイドＤＰ−１受容体に結合し活性化するプロスタグランジンであるプロスタグランジンＤ２およびその誘導体を用いる。また、プロスタグランジンＤ２の誘導体がプロスタノイドＤＰ−１受容体に結合し活性化するかどうかを調べることは当業者には容易であり、例えば、実施例５に記載したように、プロスタグランジンＤ２の誘導体を細胞に投与し、ERKのリン酸化などを検出することにより、MAPKシグナリング経路の活性化を指標にすれば良い。
【００１４】
本発明にかかる医薬組成物の投与対象は、ヒトを含み、脊椎動物であれば特に限定されない。ここで、投与対象となる疾患は、虚血後の細胞死であるが、この虚血が引き起こされる臓器あるいは組織は特に限定されず、例えば、脳やそれ以外の神経組織、肝臓、胃、腸、腎臓、肺、皮膚、膵臓などが挙げられる。具体的な疾患として、脳梗塞などの脳虚血、心筋梗塞などの虚血性心疾患、虚血性肝炎、虚血性大腸炎、急性下肢虚血、低酸素血症等が挙げられるが、虚血性心疾患であることが好ましい。虚血の原因は、閉塞性虚血、圧迫性虚血、痙攣性虚血、代償性虚血など、特に限定されない。また、これらの疾患は、自然に発生ずる病気によるものであっても良いが、手術の際に一過的に虚血を生じさせた後に生じるものであっても良い。さらに、細胞死は、虚血自体によって引き起こされても良く、虚血が起きた後の再灌流障害によって引き起こされても良い。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、医薬品として用いるため、通常の方法により製造することができる錠剤、粉剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤などに剤形化されても良い。この薬剤は、有効量のプロスタノイドＤＰ−１受容体の作動物質を含み、当業者に知られた薬学的に許容できる添加剤、例えば賦形剤や担体を用いて製造される。
【００１６】
有効量のプロスタノイドＤＰ−１受容体の作動物質を含有する薬剤を患者に投与する方法は、特に限定されない。投与する時期としては、例えば、アテローム変性症などを有する患者は虚血が生じやすいと考えられるため、虚血が生じる前に予防的に投与しても良く、虚血が生じた直後に、虚血による細胞死を抑制するために、あるいは再灌流障害を予防するために投与しても良く、虚血を生じた後数時間経ってから、再灌流障害が生じると予測される時期に、再灌流障害を予防するために投与しても良く、虚血後に再灌流障害を生じた後、細胞死を拡大させないために、再灌流障害の治療として投与しても良い。
【００１７】
本発明の薬剤の投与は、全身的であっても局所的であってもよく、経口または非経口であっても良いが、静脈注射による投与が好ましい。投与量や投与回数は年齢、体重、病態等により、適宜選択される。
【実施例】
【００１８】
[実験方法]
＝＝ランゲンドルフ灌流法および虚血−再灌流処理法＝＝
マウスにヘパリン（1000 unit/kg）を腹腔内投与した後、開胸して心臓を摘出した。摘出心臓を、改変Krebs-Henseleit 灌流液（120 mmol/l NaCl、25 mmol/NaHCO3、5.9 mmol/l KCl、1.2 mmol/l MgSO4、1.75 mmol/l CaCl2、10 mmol/l glucose）で灌流し、ランゲドルフ法に従って95% O2/5% CO2のガスで曝気した改変Krebs-Henseleit バッファー中で37℃で維持した。動脈灌流の圧力は90 mmHgで行った。
【００１９】
ポリエチレンのバルーンが付属したプラスチック製のカテーテルを左心房から左心室まで挿入した。虚血処理前に、バルーンに水を満たすことにより左心室の拡張末期圧（LVEDP）を10 mmHgに調節した。その後、30分間灌流液を途絶することにより心臓の全虚血処理を行った後、60分間疎通して再灌流処理した。虚血処理前、処理中、および再灌流処理開始後、左心室の機能の指標（LVSP（左心室収縮期圧、LV systolic pressure）; LVEDP（左室拡張末期圧、LV end-diastolic pressure）; LVDP （左心室圧、LV developed pressure）, LVDP=LVSP-LVDP; positive dP/dt, LV（左室） peak positive dP/dt; negative dP/dt, LV（左室） peak negative dP/dt）を測定し、10分間隔で記録した（Terai et al., Mol.Cell Biol. vol.25, p.9554-9575, 2005を参照）。灌流液に含まれる全乳酸脱水素酵素（LDH）の活性を細胞障害の指標として、TOX7 In Vitro Toxicology Assay Kit（Sigma-Aldrich社）を用いて測定した。  
【００２０】
＝＝心筋細胞の調製＝＝
生後１−３日のウィスターラットから、公知の方法を用いて、心筋細胞を調製した（Kodama et al., Cric. Rec. vol.81, p.656-663, 1997）。
【００２１】
＝＝生細胞率検出方法＝＝
上記処理後の培養心筋細胞に対し、LIVE/DEAD Viability Cytotoxicity Assay Kit （Molecular Probes社）を用いて、生細胞をカルセイン AMにより標識し、死細胞をエチジウムホモダイマー−１により標識した後、蛍光顕微鏡（BZ-9000、Keyence社）で観察して、細胞の生死を判定した。全細胞あたりの生細胞の割合を生細胞率（％）として算出した。
【００２２】
＝＝ウエスタンブロット解析＝＝
マウス心臓組織細胞あるいは培養心筋細胞から、タンパク質サンプルを調製した（Sano M. et al., J. Biol. Chem. 282: 25970-25980, 2007を参照）。この調製サンプルを、変性SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、PVDF膜にブロットした。この膜上の各タンパク質を、特異的な一次抗体を用いて標識し、二次抗体としてホースラディッシュペルオキシターゼ標識二次抗体（Amersham Biosciences 社）で標識し、LAS-3000 Luminoimage analyzer （Fujifilm社）を用いて検出した。
【００２３】
＝＝統計処理＝＝
各実施例において、データは平均値+SEMで表わし、2群間の値はStudent’s t-testで有意差を検定した。また、3群以上の値はANOVAによって有意差を検定した。
【００２４】
[実施例１]
本実施例では、摘出された心臓組織をグルココルチコイドで前処理することにより、心筋の虚血再灌流障害を軽減できることを示す。
【００２５】
マウス（C57BL6J、１０週令、雄）に20 mg/kgのRU486（グルココルチコイド受容体アンタゴニスト、Sigma-Aldrich社）またはその溶媒であるDMSOを腹腔内投与した。その1時間後、さらに2 mg/kgのデキサメタゾン（グルココルチコイド臨床薬、Sigma-Aldrich社）またはその溶媒であるDMSOを腹腔内投与した（RU486-デキサメタゾン群、n=6）。なお、RU486の投与なしでデキサメタゾンのみ投与した群をデキサメタゾン群（n=5）、RU486投与のみを行った群をRU486群（n=6）とし、対照群（n=8）として、上記RU486およびデキサメタゾンのいずれも含まない溶媒DMSOのみを投与し、その後の工程は同様に行った。この段階で、左心室の機能を測定したところ、いずれの群にも異常が認められなかった（図６の表「野生型マウス」の欄参照）。
【００２６】
デキサメタゾン投与24時間後、上記「ランゲンドルフ灌流法」に従って心臓を摘出し、灌流処理を行った後、虚血−再灌流処理を行い、左心室の機能を測定した。
【００２７】
図１A〜Eは、対照群（白丸）、デキサメタゾン群（黒丸）、RU486-デキサメタゾン群（灰色丸）における心機能の指標となる各測定値を比較したグラフである。A、D、Eに示すように、全虚血後の再灌流を行うと、左心室の機能の指標であるLVDP回復率、positive dP/dt、negative dP/dtは、対照群およびRU486-デキサメタゾン群に比較し、デキサメタゾン群のマウス心臓で有意に高かった。
【００２８】
また、細胞障害の指標であるLDH活性は、対照群と比較してデキサメタゾン群で有意に低かった（p<0.05）。一方、デキサメタゾン群と比較してRU486-デキサメタゾン群では有意に高かった（p<0.05）。
【００２９】
以上の結果から、心臓の虚血−再灌流処理の前にデキサメタゾンを投与しておくことにより、再灌流処理後の心機能が回復しやすくなること、および心臓組織における細胞障害を軽減することができることが示される。さらに、デキサメタゾン投与により再灌流後に起こる心機能の回復や細胞障害の軽減の効果がグルココルチコイド受容体アンタゴニスト（RU486）により阻害されるという結果は、デキサメタゾンで促進される再灌流処理後の回復が、グルココルチコイド受容体を介して生じていることを示す。
【００３０】
[実施例２]
本実施例では、グルココルチコイド受容体を介するシグナリング経路への、COX-2の関与を示す。
【００３１】
マウスに2 mg/kgのデキサメタゾンを投与した後、心臓摘出の40分前に5 mg/kgのNS398（COX-2選択的阻害剤、Cayman Chemical社）を腹腔内投与した（デキサメタゾン-NS398群、n=6）。また、デキサメタゾンを投与していないマウスをNS398群（n=5）、デキサメタゾンのみを投与したマウスをデキサメタゾン群（n=5）として、その後の工程を同様に行った。また、対照群（n=8）は、上記RU486およびデキサメタゾンのいずれも含まない溶媒DMSOを投与し、その後の工程を同様に行った。この段階で、左心室の機能を測定したところ、いずれの群にも異常が認められなかった（図６の表「野生型マウス」の欄参照）。
【００３２】
デキサメタゾン投与から24時間後に、上記「ランゲンドルフ灌流法」に従って心臓を摘出し灌流した後、虚血−再灌流処理を行った。
【００３３】
図２A〜Eは、対照群（白丸）、デキサメタゾン群（黒丸）、デキサメタゾン-NS398群（灰色丸）における各心機能の指標値を比較したグラフである。LVDP回復率、positive dP/dt、negative dP/dtの各測定値は、対照群に比較してデキサメタゾン群で有意に高かったが、デキサメタゾン-NS398群ではデキサメタゾン群に比較して低かった。また、細胞障害の指標であるLDH活性は、対照群と比較してデキサメタゾン群で低かったが、このデキサメタゾン群に比較して、デキサメタゾン-NS398群で高かった。すなわち、デキサメタゾンにより生じる再灌流開始後の心機能の回復および細胞障害の軽減の効果をNS398が抑制した。
【００３４】
以上の結果は、虚血再灌流障害の軽減を引き起こすグルココルチコイド受容体を介するシグナリング経路の下流に、COX-2が位置していることを示す。
【００３５】
[実施例３]
本実施例では、グルココルチコイドにより生じる虚血−再灌流障害の改善に、プロスタグランジン合成酵素（L-PGDS、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素）が関与することを示す。
【００３６】
L-PGDSノックアウトマウス（Eguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1999）に、2 mg/kgデキサメタゾン（デキサメタゾン群、n=8）または溶媒であるDMSO（対照群、n=8）を腹腔内投与した。この段階で、左心室の機能を測定したところ、いずれの群にも異常が認められなかった（図６の表「L-PGDSノックアウトマウス」の欄参照）。
【００３７】
デキサメタゾン投与24時間後、上記「ランゲンドルフ灌流法」に従って心臓を摘出し灌流した後、虚血−再灌流処理を行った。また、野生型マウスに同様の処理を行った。
【００３８】
また、このマウス心臓試料において上記「ウエスタンブロット解析」を行った。一次抗体として、抗L-PGDSウサギポリクローナル抗体（Cayman Chemical社）を用いた。また、対照として、抗H（造血器型）-PGDSウサギポリクローナル抗体（Cayman Chemical社）を用いた。
【００３９】
図３Aに示すように、L-PGDSノックアウトマウスにおいては、デキサメタゾン群、対照群に関わらずL-PGDSタンパク質は検出されなかった。一方で、野生型マウスにおいては、対照群と比較してデキサメタゾン群でL-PGDSタンパク質の発現が高かった。
【００４０】
図３B〜FはL-PGDSノックアウトマウスのデキサメタゾン群（黒丸）と対照群（白丸）における、心機能指標の測定値を示す。また、図３Gは細胞障害の指標であるLDH活性測定値を示す。測定した何れの指標においても、デキサメタゾン群と対照群で有意な差がなかった。野生型マウス対照群における再灌流開始後のLVDP回復率（図１A、白丸、約37％）と比較すると、L-PGDSノックアウトマウスではデキサメタゾン群、対照群に関わらずLVDP回復率が有意に高かった（約62%、p<0.05）。
【００４１】
以上の結果は、L-PGDSを発現しないノックアウトマウスにおいては、グルココルチコイドにより生じる虚血−再灌流障害の改善が抑制されることを示す。すなわち、グルココルチコイドによる虚血−再灌流障害の改善にL-PGDSの関与するシグナルリング経路が関与していることを示している。
【００４２】
[実施例４]
本実施例では、虚血−再灌流処理を受けた心筋細胞の温存に、グルココルチコイド受容体、COX-2、L-PGDSを介した制御が必要であることを示す。なお、本実施例において、虚血−再灌流処理のモデルとして、低酸素処理−再酸素化処理を行った。
【００４３】
ラットのグルココルチコイド受容体、COX-2、L-PGDS、の各遺伝子に対するsiRNAおよび対照siRNAをAmbion社から購入した。これらの各siRNAを心筋細胞にLipofectamine RNAiMAX Regent（Invitrogen社）を用いてトランスフェクトした。その後、培地にコルチバゾール（合成グルココルチコイド）（Merck社より吉川教授（東京大学医科学研究所）に譲渡されたコルチバゾールが供与された；参考文献  Yoshikawa et al., J. Biol. Chem. 277 (7), 5529-5540, 2002）を最終濃度100 nMになるように加え、24時間培養した。
【００４４】
各心筋細胞の培地を、グルコース非含有DMEMに交換した。アネロパック・ケンキ（三菱ガス株式会社）1袋を嫌気培養用ジャー１L、三菱ガス株式会社）に入れて嫌気培養環境を作り、ここに上記心筋細胞を培地ごと設置して、5時間低酸素処理を行った。その後、培地を10％FBS含有DMEMに交換して培養し、数時間再酸素化した。その後、心筋細胞における生細胞率を検出した。なお、RU486はコルチバゾールを添加する１時間前に、NS398は再酸素化する１時間前に、最終濃度10 μMになるように培地に添加した。
【００４５】
図４A、Bに示すように、低酸素処理−再酸素化処理の際、コルチバゾール処理された心筋細胞では、グルココルチコイド受容体、COX-2、L-PGDSのいずれかを発現しない心筋細胞では生細胞率が低下した。
【００４６】
また、図４C、Dに示すように、低酸素処理−再酸素処理の際、コルチバゾールで処理された心筋細胞において、RU468（グルココルチコイド受容体アンタゴニスト）あるいはNS398（COX-2選択的阻害剤）の添加により生細胞率が低下した。
【００４７】
以上の結果は、心臓組織で虚血−再灌流の状態が生じた場合に、グルココルチコイド受容体、COX-2、L-PGDSを介した制御が心筋細胞の生存に必要であることを示している。
【００４８】
[実施例５]
本実施例では、プロスタグランジンＤ２処理により、心筋低酸素処理−再酸素化処理後に生細胞率が上昇することを示す。
【００４９】
まず、培養心筋細胞の培地にプロスタグランジンＤ２（PGD2、Cayman Chemical社）を加え、培養した。この時、PGD2処理時間を0〜120分まで、処理濃度を0〜30 nMまでの条件で行った。なお、心筋細胞の培地には、コルチバゾールを添加する１時間前に、BWA868C（プロスタノイドＤＰ−１受容体アンタゴニスト、Cayman Chemical社）を最終濃度10 μMになるように、あるいはPD98059（MEK阻害剤、CalBiochem社）を最終濃度20 nMになるように、あるいはCAY10471(CRTH2受容体アンタゴニスト)を最終濃度10 nMになるように、加えた。
【００５０】
上記処理を受けた心筋細胞において、MAPKシグナリング経路の一連のタンパク質であるERK1/2、リン酸化ERK1/2、JNK、リン酸化JNK、pMAPK、リン酸化pMAPKに対する一次抗体（全てCell Signaling Technology社）及び HRP 結合抗ウサギIgG抗体（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス社）を用い、ウエスタンブロット解析によって各タンパク質の発現を検出した。この時、各タンパク質に対する抗体で標識してブロット結果を記録した後、Stripping Solution（ナカライテスク社）を用いて抗体を膜から解離させ、対応するリン酸化型タンパク質の抗体で再度標識した。
【００５１】
次に、ラットのプロスタノイドＤＰ−１受容体、CRTH2受容体の各遺伝子に対するsiRNAおよび対照siRNA（Ambion社）を、Lipofectamine RNAiMAX Regent（Invitrogen社）を用いて心筋培養細胞にトランスフェクトした後、これらのsiRNA導入心筋培養細胞の培地にプロスタグランジンＤ２（PGD2、Cayman Chemical社）を最終濃度30 nMになるように加え、一晩、培養した。
【００５２】
また、上記各処理を受けた心筋細胞において、実施例４と同様に低酸素処理および再酸素化処理を行った後、生細胞率を調べた。
【００５３】
図５Aは、PGD2処理の時間と、MAPKシグナリング経路の各タンパク質の発現量を示す。ERKのリン酸化はPGD2処理開始から5分以内に生じ、120分後まで持続していた。図５BはERKのリン酸化はPGD2の濃度依存的に起こったことを示している。すなわち、PGD2により、MAPKシグナリング経路が活性化された。図５Cは、PGD2に加えCAY10471処理を行った場合には、PGD2のみによる処理と比較してERKのリン酸化に変化がなかったが、PGD2に加え、BWA868C処理を行った場合にERKのリン酸化が抑制されたことを示す。PGD2はCRTH2受容体及びプロスタノイドＤＰ−１受容体であるGPCRに結合することが知られているが、この結果はPGD2の効果が、CRTH2受容体を介さず、プロスタノイドＤＰ−１受容体を介していることを示している。
【００５４】
図５D、Eは、上記各薬剤処理および低酸素処理−再酸素化処理を受けた心筋細胞における生細胞率を示す。PGD2のみで処理した細胞およびCAY14071で処理した細胞において、溶媒のみで処理した細胞と比較して生細胞率が有意に高かった（p<0.05）。
【００５５】
図５F、Gは、低酸素処理−再酸素化処理を受けた各siRNA導入心筋培養細胞における生細胞率を示す。対照siRNA導入細胞と比較して、プロスタノイドＤＰ−１受容体siRNA導入細胞における生細胞率は有意に低かった。一方で、対照siRNA導入細胞と比較し、CRTH2受容体siRNA導入細胞における生細胞率は有意な差がなかった。
【００５６】
このように、PGD2が、プロスタノイドＤＰ−１受容体に結合して活性化し、それによりMAPKシグナリング経路を活性化する。さらに、本実施例の低酸素処理−再酸素化処理は虚血−再灌流処理を模しており、このような条件下でPGD2処理によって生細胞率が上昇する。一方で、PGD2によるMAPKシグナリング経路タンパク質リン酸化及び虚血−再灌流処理後の生細胞率の上昇には、CRTH2受容体を介していない。
【００５７】
従って、プロスタグランジンＤ２などのプロスタノイドＤＰ−１受容体作動物質処理により、心筋低酸素処理−再酸素化処理後に生細胞率が上昇するため、プロスタノイドＤＰ−１受容体作動物質は、虚血後の細胞死を治療または予防するための医薬組成物として有効である。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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