(57)【要約】【課題】瘡患者ならびに種々の慢性炎症性疾患および自己免疫疾患を有する患者を管理すること。【解決手段】患者における１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することにより、患者における自己免疫疾患および慢性炎症性疾患、特に全身性紅斑性狼瘡および慢性間接リウマチを診断またはモニタリングする方法を、記載する。自己免疫疾患および慢性炎症性疾患、特に全身性紅斑性狼瘡および慢性間接リウマチを診断およびモニタリングするための診断用オリゴヌクレオチド、該診断用オリゴヌクレオチドを含むキットまたはシステムもまた、記載する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、米国仮特許出願第１０／１３１，８２７号（２００２年４月２４日出願）
の優先権を主張し、本明細書中で、この出願の全体が援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の分野）
この出願は、慢性炎症性疾患の分野にある。特に、この発明は、慢性炎症性疾患を診断
およびモニタリングするための方法および組成物に関する。
【０００３】
（発明の背景）
疾患の診断、予後、重症度分類、および治療における現在の欠点の多くに対して、疾患
の基礎を成す分子機構の同定、ならびに疾患状態の発生または進行を発現パターンにより
予測するか、または特定の治療的介入に対する患者の反応を予測するヌクレオチド配列（
またはヌクレオチド配列の集合）の発見を介して、取り組みがなされ得る。特に、容易に
アクセス可能な細胞および組織からの、予測値によるヌクレオチド配列およびヌクレオチ
ド配列集合の同定は、非常に価値がある。例えば、末梢血は、全ての患者から得られ得、
そして低コストかつ多くの時点で採取することができる。このことは、容易に入手できな
いか、もしくは侵襲的で有害な手順を介してのみ入手可能な大部分の他の細胞型および組
織型に対して、望ましい対照である。また、所望する場合、遺伝子発現分析に先立って血
液試料中の多くの細胞型を容易に分離し得るため、循環血液中に存在する種々の細胞型は
、発現プロファイリング実験にとって理想的である。発現プロファイリング技術を用いた
疾患の研究にとって、また診断技術の開発および治療標的の同定にとって、血液が非常に
魅力的な基質を提供する一方で、血液試料中の発現プロファイリングの値は、それらの細
胞型における遺伝子発現の変化が、疾患に対する予兆、ならびに疾患の病因および進行に
関連する程度に依存する。
【０００４】
幅広い範囲の疾患過程（例えば心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患およびリウマチ
性疾患、感染性疾患、移植拒絶、癌および悪性腫瘍、ならびに内分泌疾患が挙げられる）
において、好中球を含む白血球（例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、単球、ならびに
顆粒球のような広範なクラス）の役割を支持する詳細な文献が、存在する。
【０００５】
特に興味深いことは、全身性紅斑性狼瘡および慢性間接リウマチのような慢性炎症性疾
患における白血球および白血球遺伝子発現の役割である。全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）お
よび慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、免疫系の調節不全によって特徴づけられ、種々の器官
に損傷を引き起こす、慢性の自己免疫性かつ炎症性の障害である。これらの疾患は、白血
球における差次的遺伝子発現を、明らかに含む。それらの患者およびその医師にとっては
、疾患の診断およびモニタリング用ツールが著しく不足している。白血球発現プロファイ
ルを適用することにより、ＳＬＥおよびＲＡに対する発現マーカーを見出し、それらを臨
床設定における患者管理ツールとして適用し得る。また、変形性関節症は、ＲＡと混同さ
れ得る変性間接疾患である。この疾患は、白血球に影響を及ぼし、変形性関節症に関連し
た白血球の発現プロファイリングが、この疾患に対する診断および治療の新たなアプロー
チの発見をもたらし得る。
【０００６】
特に、ＳＬＥは、慢性的で通常一生涯にわたる、潜在的かつ致死的な自己免疫疾患であ
り、多様な臨床症状による予測不可能な再燃および寛解によって特徴付けられる。ＳＬＥ
は、予測不可能な再燃および寛解、ならびに間接、皮膚、腎臓、脳、漿膜、肺、心臓、お
よび胃腸管の臨床的併発の偏向が目立つ。疾患の病理学的特徴は、再発性で、広範囲にわ
たる多様な血管障害である。
【０００７】
ＳＬＥは、まれな障害ではない。人生の両極端で報告（例えば、乳児期および９０歳代
に診断）されるが、主に小児を授かる年代の女性に影響を及ぼす。小児のあいだでは、一
般にＳＬＥは男子よりも女子で３倍多く発症する。ＳＬＥ患者の６０％が思春期と３０代
との間に発病しており、そのうちの男女比率（女性：男性）は９：１である。その後、女
性優位は再び思春期前の少年少女において観察された程度にまで減少する。
【０００８】
この障害は、アメリカ白人よりもアフリカ系アメリカ黒人において３倍以上多く見られ
る。また、ＳＬＥはアジア人でより一般的であり、中国では慢性間接リウマチよりも一般
的であり得る。最もリスクの高い人種集団は、アフリカ系カリブ黒人である。ＳＬＥの年
間発生率は、相対的に低リスクの集団から高リスクの集団において人口１００，０００人
あたり新規症例が６から３５例までの範囲にわたる。米国でのＳＬＥの有病率は、かなり
の議論の争点である。有望率は、２５０，０００と５００，０００との間の有病率推定は
、最近の全国的電話世論調査（１００万と２００万との間である有病率を示唆する）によ
って否定されている。
【０００９】
ＳＬＥ患者の予後は、最近の数十年間にわたって大きく改善されており、全ての患者の
うちの少なくとも８０〜９０％が１０年間生存している。その後、平均余命は同一年齢の
コントロールのものに近似している。この改善は、健康管理（すなわち、透析、抗生物質
、抗高血圧薬、毒性定量に対するより好ましい効力を有する新規の免疫抑制薬）での一般
的前進のみならずＳＬＥを有する患者が利用可能な専門的なケアも反映する。
【００１０】
そのような専門医療は、最先端の診断および治療手段を利用する経験豊かな臨床医によ
るケアも含まれ、改善された結果およびリソースの最も費用効果の高い利用をもたらす。
ＳＬＥを有する患者の専門的なケアは、制御不能な疾患再燃に次ぐ入院を少なくし、長期
の透析を必要とする末期腎疾患を経験する患者が減少して重症腎疾患を少なくし、完全関
節置換を必要とする虚血壊死症状の発症を少なくし、そして重度の骨粗鬆症および骨折を
減らす。さらに、ステロイドおよびステロイド減量剤（ｓｐａｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の
より慎重な使用もまた、アテローム性動脉硬化症の重症度を減少させるとともに、結果と
して生じる心筋梗塞および脳血管偶発症候の発病率を低下させ得、そのことが現在ＳＬＥ
の自然歴を複雑にしている。ＳＬＥの改善されたモニタリング、診断、および予後は、Ｓ
ＬＥ患者に対して適切なケア（例えば、使用する薬物および投薬量の決定が挙げられる）
を臨床医が決定する手助けとるべきである。
【００１１】
分子レベルでは、ＳＬＥは免疫調節不全により特徴づけられる自己免疫疾患であり、抗
核抗体（ＡＮＡ）の産生、循環免疫複合体の生成、および補体系の活性化を生ずる。ＳＬ
Ｅは、さらに、循環性抗体の沈着ならびにそれに続く補体媒介性炎症およびＦｃレセプタ
ー媒介性炎症から生ずる終末器官損傷によって、特徴づけられる。さらに、免疫系の広範
囲な異常（Ｔリンパ球機能の変化および自然発生的なアポトーシスが挙げられる）は、リ
ンパ球減少、さらに相当な罹患率をもたらす感染に対する感受性に寄与する。
【００１２】
ＳＬＥの臨床像は、変幻自在であり、感染性単球増加症、リンパ腫、または他の全身疾
患を模倣し得る。したがって、米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  
ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）は、ＳＬＥを有する患者を包含する一方で、他の障害
の患者を除外するための基準を開発した。これらの基準は、疫学的研究または調査研究に
とって被検者が適切であることを保証する際に最も用いられる。多くの患者は、最初は厳
格な基準を満たさないが、ある期間にわたって追跡した場合、多くの患者がそれを満たす
。
【００１３】
ＳＬＥの疫学は、未知のままである。遺伝的素因、性ホルモン、および環境的トリガー
が、疾患を象徴する免疫応答傷害をもたらすと考えられる。
【００１４】
遺伝学的役割は、ＳＬＥ、ＨＬＡ−ＤＲ２、およびＨＬＡ−ＤＲ３を有する患者におけ
る２つの組織適合抗原の増加率によって示唆される。また、拡張ハプロタイプＨＬＡ−Ａ
１、Ｂ８、およびＤＲ３の頻度が増加している。遺伝的役割は、一卵性双胎児間でこの疾
病が一致することによってさらに支持される。しかし、この遺伝的要因の多遺伝子的性質
、および環境因子の寄与は、中程度でしかない一致率（２５〜６０％であると報告される
）によって示唆されている。
【００１５】
ＳＬＥにおける自己抗体産生の起源は不明ではあるが、抗原により駆動されるプロセス
、自発的Ｂ細胞過敏症、または免疫調節傷害に対し、役割が示唆されている。自己抗体産
生の病因に関係なく、ＳＬＥは、ＣＲ１発現減少、Ｆｃレセプター機能欠損、またはＣ４
Ａのような初期補体成分の欠乏に続いて循環免疫複合体のクリアランスが低下することに
関連する。
【００１６】
自己免疫の起源よりもＳＬＥにおける血管障害の原因となる病原性細胞性事像または分
子的事像について、より多くが知られている。疾患発現は、免疫複合体析出、白血球血栓
症、または血栓症による再発性血管病変に起因して生じる。その上、特定の細胞抗原に対
する抗体が細胞機能を崩壊させ得る一方で、細胞傷害抗体は、自己免疫溶血性貧血および
血小板減少を媒介し得る。後者の例は、抗ニューロン抗体と神経精神病学的ＳＬＥとの間
の結合である。
【００１７】
ＳＬＥを有する患者の健康状態は、疾患活性だけでなく、疾患発赤（すなわち、変形性
関節症、萎縮肺、末期腎疾患、有機精神的症候群など）、ならびに処置の有害な作用（す
なわち、骨の虚血壊死、感染症および早発アテローム性動脈硬化症など）の疾患の再発の
発現から生ずる傷害にも関係する。
【００１８】
疾患の診断、予後、およびモニタリングのための発現プロフィルに基づく技術の精度は、もし問題の疾患に対してある程度の感度および特異性をそれぞれ有する数多くの差次的発現ヌクレオチド配列が、協調した様式で同定およびアッセイされ得る場合、激的に高まる。診断用途に多数の遺伝子（遺伝子セット）の発現を用いることは、アッセイおよび集団のばらつきの克服を助ける。Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈの特許文献１「ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＰＲＯＦＩＬＩＮＧ」は、差次的発現ヌクレオチドのセットを同定している。
【００１９】
このような精度の改善を達成するために、ひとたび同定された適切なヌクレオチド配列
のセットを、関連臨床データと組み合わせて数多くの試料に対して確認する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第０２／０５７４１４号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（発明の要旨）
これらの要求に応えるために、本発明は、狼瘡患者ならびに種々の慢性炎症性疾患およ
び自己免疫疾患を有する患者を管理するための診断ツールとしての臨床的有用性を有する
遺伝子および遺伝子セットを同定する。したがって、本発明は、患者の慢性の自己免疫疾
患または感染性疾患を診断またはモニタリングする方法に関する。本発明の方法は、表２
Ｅに示した遺伝子等の１つ以上の遺伝子および該遺伝子由来の代理物（ｓｕｒｒｏｇａｔ
ｅｓ）の患者発現を検出する工程を包含する。例示的な代理物を表２Ｄに提供する。さら
に、本発明は、患者における自己免疫疾患または慢性炎症性疾患を診断またはモニタリン
グするために、該患者における１つ以上の遺伝子または該遺伝子の代理物の発現レベルを
検出することにより、該患者における自己免疫疾患または慢性炎症性疾患を診断またはモ
ニタリングする方法に関し、ここで、上記遺伝子は、配列番号５０３、配列番号５０４、
配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、
配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、
配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、
配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、配列番号５２４、
配列番号５２５、配列番号５２６、配列番号５２７、配列番号５２８、配列番号５２９、
配列番号５３０、配列番号５３１、配列番号５３２、配列番号５３３、配列番号５３４、
配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３８、配列番号５３９、
配列番号５４０、配列番号５４１、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４４、
配列番号５４５、配列番号５４６、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５４９、
配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、
配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、
配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配列番号５６４、
配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、
配列番号５７０、配列番号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７４、
配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５７９、
配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配列番号５８４、
配列番号５８５、配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５８９、
配列番号５９０、配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５９４、
配列番号５９５、配列番号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号５９９、
配列番号６００、配列番号６０１、配列番号６０２、配列番号６０３、配列番号６０４、
配列番号６０５、配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、
配列番号６１０、配列番号６１１、配列番号６１２、配列番号６１３、配列番号６１４、
配列番号６１５、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、
配列番号６２０、配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、
配列番号６２５、配列番号６２６、配列番号６２７、配列番号６２８、配列番号６２９、
配列番号６３０、配列番号６３１、配列番号６３２、配列番号６３３、配列番号６３４、
配列番号６３５、配列番号６３６、配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、
配列番号６４０、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、
配列番号６４５、配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、
配列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、
配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、
配列番号６６０、配列番号６６１、配列番号６６２、配列番号６６３、配列番号６６４、
配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、
配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、
配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、配列番号６７８、配列番号６７９、
配列番号６８０、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、
配列番号６８５、配列番号６８６、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、
配列番号６９０、配列番号６９１、配列番号６９２、配列番号６９３、配列番号６９４、
配列番号６９５、配列番号６９６、配列番号６９７、配列番号６９８、配列番号６９９、
配列番号７００、配列番号７０１、配列番号７０２、配列番号７０３、配列番号７０４、
配列番号７０５、配列番号７０６、配列番号７０７、配列番号７０８、配列番号７０９、
配列番号７１０、配列番号７１１、配列番号７１２、配列番号７１３、配列番号７１４、
配列番号７１５、配列番号７１６、配列番号７１７、配列番号７１８、配列番号７１９、
配列番号７２０、配列番号７２１、配列番号７２２、配列番号７２３、配列番号７２４、
配列番号７２５、配列番号７２６、配列番号７２７、配列番号７２８、配列番号７２９、
配列番号７３０、配列番号７３１、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３４、
配列番号７３５、配列番号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、
配列番号７４０、配列番号７４１、配列番号７４２、配列番号７４３、配列番号７４４、
配列番号７４５、配列番号７４６、配列番号７４７、配列番号７４８、配列番号７４９、
配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、
配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、
配列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、
配列番号７６５、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、
配列番号７７０、配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、
配列番号７７５、配列番号７７６、配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、
配列番号７８０、配列番号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、
配列番号７８５、配列番号７８６、配列番号７８７、配列番号７８８、配列番号７８９、
配列番号７９０、配列番号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、
配列番号７９５、配列番号７９６、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９、
配列番号８００、配列番号８０１、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、
配列番号８０５、配列番号８０６、配列番号８０７、配列番号８０８、配列番号８０９、
配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１２、配列番号８１３、配列番号８１４、
配列番号８１５、配列番号８１６、配列番号８１７、配列番号８１８、配列番号８１９、
配列番号８２０、配列番号８２１、配列番号８２２、配列番号８２３、配列番号８２４、
配列番号８２５、配列番号８２６、配列番号８２７、配列番号８２８、配列番号８２９、
配列番号８３０、配列番号８３１、配列番号８３２、配列番号８３３、配列番号８３４、
配列番号８３５、配列番号８３６、配列番号８３７、配列番号８３８、配列番号８３９、
配列番号８４０、配列番号８４１、配列番号８４２、配列番号８４３、配列番号８４４、
配列番号８４５、配列番号８４６、配列番号８４７、配列番号８４８、配列番号８４９、
配列番号８５０、配列番号８５１、配列番号８５２、配列番号８５３、配列番号８５４、
配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、
配列番号８６０、配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６３、配列番号８６４、
配列番号８６５、配列番号８６６、配列番号８６７、配列番号８６８、配列番号８６９、
配列番号８７０、配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、配列番号８７４、
配列番号８７５、配列番号８７６、配列番号８７７、配列番号８７８、配列番号８７９、
配列番号８８０、配列番号８８１、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８４、
配列番号８８５、配列番号８８６、配列番号８８７、配列番号８８８、配列番号８８９、
配列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、配列番号８９３、配列番号８９４、
配列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、
配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、
配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、
配列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１２、配列番号９１３、配列番号９１４、
配列番号９１５、配列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８、配列番号９１９、
配列番号９２０、配列番号９２１、配列番号９２２、配列番号９２３、配列番号９２４、
配列番号９２５、配列番号９２６、配列番号９２７、配列番号９２８、配列番号９２９、
配列番号９３０、配列番号９３１、配列番号９３２、配列番号９３３、配列番号９３４、
配列番号９３５、配列番号９３６、配列番号９３７、配列番号９３８、配列番号９３９、
配列番号９４０、配列番号９４１、配列番号９４２、配列番号９４３、配列番号９４４、
配列番号９４５、配列番号９４６、配列番号９４７、配列番号９４８、配列番号９４９、
配列番号９５０、配列番号９５１、配列番号９５２、配列番号９５３、配列番号９５４、
配列番号９５５、配列番号９５６、配列番号９５７、配列番号９５８、配列番号９５９、
配列番号９６０、配列番号９６１、配列番号９６２、配列番号９６３、配列番号９６４、
配列番号９６５、配列番号９６６、配列番号９６７、配列番号９６８、配列番号９６９、
配列番号９７０、配列番号９７１、配列番号９７２、配列番号９７３、配列番号９７４、
配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配列番号９７９、
配列番号９８０、配列番号９８１、配列番号９８２、配列番号９８３、配列番号９８４、
配列番号９８５、配列番号９８６、配列番号９８７、配列番号９８８、配列番号９８９、
配列番号９９０、配列番号９９１、配列番号９９２、配列番号９９３、配列番号９９４、
配列番号９９５、配列番号９９６、配列番号９９７、配列番号９９８、配列番号９９９、
配列番号１０００、配列番号１００１、配列番号１００２、配列番号１００３、および配
列番号１００４から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
本発明の方法において、モニタリングの診断は、２つ以上の遺伝子、３つ以上の遺伝子
、４つ以上の遺伝子、５つ以上の遺伝子、６つ以上の遺伝子、７つ以上の遺伝子、８つ以
上の遺伝子、９つ以上の遺伝子、１０個以上の遺伝子、１５個以上の遺伝子、２０個以上
の遺伝子、３０個以上の遺伝子、５０個以上の遺伝子、１００個以上の遺伝子、２００個
以上の遺伝子、または５０２個の全遺伝子の発現レベルを検出することによって実行され
得る。
【００２３】
本発明の方法はまた、患者における自己免疫疾患および慢性炎症性疾患を診断またはモ
ニタリングするために、該患者での１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することにより
、該患者における自己免疫および慢性炎症性疾患を診断またはモニタリングする方法を包
含し、上記１つ以上の遺伝子は、配列番号５０３、配列番号５０５、配列番号５０６、配
列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配
列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配
列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配
列番号５２３、配列番号５２４、配列番号５２５、配列番号５２６、配列番号５２７、配
列番号５２８、配列番号５２９、配列番号５３０、配列番号５３１、配列番号５３２、配
列番号５３３、配列番号５３４、配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配
列番号５３８、配列番号５３９、配列番号５４０、配列番号５４１、配列番号５４２、配
列番号５４３、配列番号５４４、配列番号５４５、配列番号５４６、配列番号５４７、配
列番号５４８、配列番号５４９、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５２、配
列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配
列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配
列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配
列番号５６８、配列番号５６９、配列番号５７０、配列番号５７１、配列番号５７２、配
列番号５７３、配列番号５７４、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配
列番号５７８、配列番号５７９、配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２、配
列番号５８３、配列番号５８４、配列番号５８５、配列番号５８６、配列番号５８７、配
列番号５８８、配列番号５８９、配列番号５９０、配列番号５９１、配列番号５９２、配
列番号５９３、配列番号５９４、配列番号５９５、配列番号５９６、配列番号５９７、配
列番号５９８、配列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０１、配列番号６０２、配
列番号６０４、配列番号６０５、配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配
列番号６０９、配列番号６１０、配列番号６１１、配列番号６１２、配列番号６１３、配
列番号６１４、配列番号６１５、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配
列番号６１９、配列番号６２０、配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配
列番号６２４、配列番号６２５、配列番号６２６、配列番号６２７、配列番号６２８、配
列番号６２９、配列番号６３０、配列番号６３１、配列番号６３２、配列番号６３３、配
列番号６３４、配列番号６３５、配列番号６３６、配列番号６３７、配列番号６３８、配
列番号６３９、配列番号６４０、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配
列番号６４４、配列番号６４５、配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配
列番号６４９、配列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配
列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配
列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１、配列番号６６２、配列番号６６３、配
列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配
列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配
列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、配列番号６７８、配
列番号６７９、配列番号６８０、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配
列番号６８４、配列番号６８５、配列番号６８６、配列番号６８７、配列番号６８８、配
列番号６８９、配列番号６９０、配列番号６９１、配列番号６９２、配列番号６９３、配
列番号６９４、配列番号６９５、配列番号６９６、配列番号６９７、配列番号６９８、配
列番号６９９、配列番号７００、配列番号７０１、配列番号７０２、配列番号７０３、配
列番号７０４、配列番号７０５、配列番号７０６、配列番号７０７、配列番号７０８、配
列番号７０９、配列番号７１０、配列番号７１１、配列番号７１２、配列番号７１３、配
列番号７１４、配列番号７１５、配列番号７１６、配列番号７１７、配列番号７１８、配
列番号７１９、配列番号７２０、配列番号７２１、配列番号７２２、配列番号７２３、配
列番号７２４、配列番号７２５、配列番号７２６、配列番号７２７、配列番号７２８、配
列番号７２９、配列番号７３０、配列番号７３１、配列番号７３２、配列番号７３３、配
列番号７３４、配列番号７３５、配列番号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配
列番号７３９、配列番号７４１、配列番号７４２、配列番号７４３、配列番号７４４、配
列番号７４５、配列番号７４６、配列番号７４７、配列番号７４８、配列番号７４９、配
列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配
列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配
列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配
列番号７６５、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配
列番号７７０、配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配
列番号７７５、配列番号７７６、配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配
列番号７８０、配列番号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配
列番号７８５、配列番号７８６、配列番号７８７、配列番号７８８、配列番号７８９、配
列番号７９０、配列番号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配
列番号７９５、配列番号７９６、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９、配
列番号８００、配列番号８０１、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配
列番号８０５、配列番号８０６、配列番号８０７、配列番号８０８、配列番号８０９、配
列番号８１０、配列番号８１３、配列番号８１４、配列番号８１５、配列番号８１６、配
列番号８１７、配列番号８１８、配列番号８１９、配列番号８２０、配列番号８２１、配
列番号８２２、配列番号８２３、配列番号８２４、配列番号８２５、配列番号８２６、配
列番号８２７、配列番号８２８、配列番号８２９、配列番号８３０、配列番号８３１、配
列番号８３２、配列番号８３３、配列番号８３４、配列番号８３５、配列番号８３６、配
列番号８３７、配列番号８３８、配列番号８３９、配列番号８４０、配列番号８４１、配
列番号８４２、配列番号８４３、配列番号８４４、配列番号８４５、配列番号８４６、配
列番号８４７、配列番号８４８、配列番号８４９、配列番号８５０、配列番号８５１、配
列番号８５２、配列番号８５３、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配
列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、配列番号８６１、配列番号８６２、配
列番号８６３、配列番号８６４、配列番号８６５、配列番号８６６、配列番号８６８、配
列番号８６９、配列番号８７０、配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、配
列番号８７４、配列番号８７５、配列番号８７６、配列番号８７７、配列番号８７８、配
列番号８７９、配列番号８８０、配列番号８８１、配列番号８８２、配列番号８８３、配
列番号８８４、配列番号８８５、配列番号８８６、配列番号８８７、配列番号８８８、配
列番号８８９、配列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、配列番号８９３、配
列番号８９４、配列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配
列番号８９９、配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配
列番号９０４、配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配
列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１３、配列番号９１４、配
列番号９１５、配列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８、配列番号９１９、配
列番号９２０、配列番号９２１、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配
列番号９２６、配列番号９２７、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３０、配
列番号９３１、配列番号９３２、配列番号９３３、配列番号９３４、配列番号９３５、配
列番号９３６、配列番号９３７、配列番号９３８、配列番号９３９、配列番号９４０、配
列番号９４１、配列番号９４２、配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９４５、配
列番号９４６、配列番号９４７、配列番号９４８、配列番号９４９、配列番号９５１、配
列番号９５２、配列番号９５３、配列番号９５４、配列番号９５５、配列番号９５６、配
列番号９５７、配列番号９５８、配列番号９５９、配列番号９６０、配列番号９６１、配
列番号９６２、配列番号９６３、配列番号９６４、配列番号９６５、配列番号９６６、配
列番号９６７、配列番号９６８、配列番号９６９、配列番号９７０、配列番号９７２、配
列番号９７３、配列番号９７４、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配
列番号９７８、配列番号９７９、配列番号９８０、配列番号９８１、配列番号９８２、配
列番号９８３、配列番号９８４、配列番号９８５、配列番号９８６、配列番号９８７、配
列番号９８８、配列番号９８９、配列番号９９０、配列番号９９１、配列番号９９２、配
列番号９９３、配列番号９９４、配列番号９９５、配列番号９９６、配列番号９９７、配
列番号９９８、配列番号９９９、配列番号１０００、配列番号１００１、配列番号１００
２、配列番号１００３、および配列番号１００４からなる群から選択される、ヌクレオチ
ド配列によって同定される。
【００２４】
本発明の方法は、さらに、上記患者における１つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを
検出して、患者における自己免疫疾患および慢性炎症性疾患を検出またはモニタリングす
る工程を包含し得、上記１つ以上のさらなる遺伝子が、配列番号５０４、配列番号５０７
、配列番号６０３、配列番号７４０、配列番号８１１、配列番号８１２、配列番号８５４
、配列番号８６７、配列番号９１２、配列番号９２２、配列番号９５０、および配列番号
９７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列によって同定される。
【００２５】
本発明の方法において、慢性炎症性疾患または自己免疫疾患は、全身性紅斑性狼瘡（Ｓ
ＬＥ）、慢性関節リウマチ、胆嚢炎、シェーグレン疾患、クレスト症候群、強皮症、強直
性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性硬化性胆管炎、虫垂炎、憩室炎、原発性胆
管硬化症（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂｉｌｉａｒｙ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ヴェグナー肉芽腫
症、結節性多発性動脈炎、ウィップル病、乾癬、顕微鏡的多発性血管炎、高安病、川崎病
、自己免疫性肝炎、喘息、チャーグ−ストラウス病、バージャー氏病、レイノー病、また
は胆嚢炎であってもよい。
【００２６】
一態様において、発現は、遺伝子からのＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルの測定に
よって検出される。そのような検出の検出工程の例として、血清中のタンパク質の測定、
細胞表面タンパク質の測定、および蛍光活性細胞分別機（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）を用いた測定が挙げられる。
【００２７】
本発明の方法において、ＲＮＡは、表２Ｅに示したような遺伝子の発現の検出に先立っ
て、患者から単離され得る。ＲＮＡレベルは、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションによ
って検出され得る。ヌクレオチド配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、または合成オリゴヌクレオチドが挙げられ得る。本発明のハイブリダイゼーション方
法として、高ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、または低ストリンジェ
ンシーのハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。
【００２８】
本発明の方法において、ＲＮＡは、配列番号５０３、配列番号５０４、配列番号５０５
、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０
、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５
、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０
、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、配列番号５２４、配列番号５２５
、配列番号５２６、配列番号５２７、配列番号５２８、配列番号５２９、配列番号５３０
、配列番号５３１、配列番号５３２、配列番号５３３、配列番号５３４、配列番号５３５
、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３８、配列番号５３９、配列番号５４０
、配列番号５４１、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４４、配列番号５４５
、配列番号５４６、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５４９、配列番号５５０
、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５
、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０
、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５
、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、配列番号５７０
、配列番号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７４、配列番号５７５
、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５７９、配列番号５８０
、配列番号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配列番号５８４、配列番号５８５
、配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５８９、配列番号５９０
、配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５９４、配列番号５９５
、配列番号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号５９９、配列番号６００
、配列番号６０１、配列番号６０２、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５
、配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、配列番号６１０
、配列番号６１１、配列番号６１２、配列番号６１３、配列番号６１４、配列番号６１５
、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、配列番号６２０
、配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、配列番号６２５
、配列番号６２６、配列番号６２７、配列番号６２８、配列番号６２９、配列番号６３０
、配列番号６３１、配列番号６３２、配列番号６３３、配列番号６３４、配列番号６３５
、配列番号６３６、配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、配列番号６４０
、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、配列番号６４５
、配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０
、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５
、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０
、配列番号６６１、配列番号６６２、配列番号６６３、配列番号６６４、配列番号６６５
、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０
、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５
、配列番号６７６、配列番号６７７、配列番号６７８、配列番号６７９、配列番号６８０
、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、配列番号６８５
、配列番号６８６、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配列番号６９０
、配列番号６９１、配列番号６９２、配列番号６９３、配列番号６９４、配列番号６９５
、配列番号６９６、配列番号６９７、配列番号６９８、配列番号６９９、配列番号７００
、配列番号７０１、配列番号７０２、配列番号７０３、配列番号７０４、配列番号７０５
、配列番号７０６、配列番号７０７、配列番号７０８、配列番号７０９、配列番号７１０
、配列番号７１１、配列番号７１２、配列番号７１３、配列番号７１４、配列番号７１５
、配列番号７１６、配列番号７１７、配列番号７１８、配列番号７１９、配列番号７２０
、配列番号７２１、配列番号７２２、配列番号７２３、配列番号７２４、配列番号７２５
、配列番号７２６、配列番号７２７、配列番号７２８、配列番号７２９、配列番号７３０
、配列番号７３１、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３４、配列番号７３５
、配列番号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４０
、配列番号７４１、配列番号７４２、配列番号７４３、配列番号７４４、配列番号７４５
、配列番号７４６、配列番号７４７、配列番号７４８、配列番号７４９、配列番号７５０
、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５
、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０
、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５
、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０
、配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５
、配列番号７７６、配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０
、配列番号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５
、配列番号７８６、配列番号７８７、配列番号７８８、配列番号７８９、配列番号７９０
、配列番号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配列番号７９５
、配列番号７９６、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９、配列番号８００
、配列番号８０１、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８０５
、配列番号８０６、配列番号８０７、配列番号８０８、配列番号８０９、配列番号８１０
、配列番号８１１、配列番号８１２、配列番号８１３、配列番号８１４、配列番号８１５
、配列番号８１６、配列番号８１７、配列番号８１８、配列番号８１９、配列番号８２０
、配列番号８２１、配列番号８２２、配列番号８２３、配列番号８２４、配列番号８２５
、配列番号８２６、配列番号８２７、配列番号８２８、配列番号８２９、配列番号８３０
、配列番号８３１、配列番号８３２、配列番号８３３、配列番号８３４、配列番号８３５
、配列番号８３６、配列番号８３７、配列番号８３８、配列番号８３９、配列番号８４０
、配列番号８４１、配列番号８４２、配列番号８４３、配列番号８４４、配列番号８４５
、配列番号８４６、配列番号８４７、配列番号８４８、配列番号８４９、配列番号８５０
、配列番号８５１、配列番号８５２、配列番号８５３、配列番号８５４、配列番号８５５
、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０
、配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６３、配列番号８６４、配列番号８６５
、配列番号８６６、配列番号８６７、配列番号８６８、配列番号８６９、配列番号８７０
、配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、配列番号８７４、配列番号８７５
、配列番号８７６、配列番号８７７、配列番号８７８、配列番号８７９、配列番号８８０
、配列番号８８１、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８４、配列番号８８５
、配列番号８８６、配列番号８８７、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０
、配列番号８９１、配列番号８９２、配列番号８９３、配列番号８９４、配列番号８９５
、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、配列番号９００
、配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５
、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１０
、配列番号９１１、配列番号９１２、配列番号９１３、配列番号９１４、配列番号９１５
、配列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８、配列番号９１９、配列番号９２０
、配列番号９２１、配列番号９２２、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５
、配列番号９２６、配列番号９２７、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３０
、配列番号９３１、配列番号９３２、配列番号９３３、配列番号９３４、配列番号９３５
、配列番号９３６、配列番号９３７、配列番号９３８、配列番号９３９、配列番号９４０
、配列番号９４１、配列番号９４２、配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９４５
、配列番号９４６、配列番号９４７、配列番号９４８、配列番号９４９、配列番号９５０
、配列番号９５１、配列番号９５２、配列番号９５３、配列番号９５４、配列番号９５５
、配列番号９５６、配列番号９５７、配列番号９５８、配列番号９５９、配列番号９６０
、配列番号９６１、配列番号９６２、配列番号９６３、配列番号９６４、配列番号９６５
、配列番号９６６、配列番号９６７、配列番号９６８、配列番号９６９、配列番号９７０
、配列番号９７１、配列番号９７２、配列番号９７３、配列番号９７４、配列番号９７５
、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配列番号９７９、配列番号９８０
、配列番号９８１、配列番号９８２、配列番号９８３、配列番号９８４、配列番号９８５
、配列番号９８６、配列番号９８７、配列番号９８８、配列番号９８９、配列番号９９０
、配列番号９９１、配列番号９９２、配列番号９９３、配列番号９９４、配列番号９９５
、配列番号９９６、配列番号９９７、配列番号９９８、配列番号９９９、配列番号１００
０、配列番号１００１、配列番号１００２、配列番号１００３、および配列番号１００４
から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼー
ションによって、検出され得る。
【００２９】
本発明の方法は、さらに、以下の群から選択されるヌクレオチド配列によってコードさ
れるアミノ酸配列を有する、１つ以上の遺伝子によって発現されるタンパク質の検出を包
含する：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４
、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号
２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列
番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、
配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３
７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番
号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配
列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４
、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号
６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列
番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、
配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７
７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番
号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配
列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４
、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号
１００、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号
１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号
１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号
１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号
１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号
１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号
１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号
１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号
１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号
１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号
１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号
１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号
１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号
１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号
１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号
１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号
１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号
１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号
１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号
１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号
２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号
２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号
２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号
２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号
２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号
２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号
２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号
２３６、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号
２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号
２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号
２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号
２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号
２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号
２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号
２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号
２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号
２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号
２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号
２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号
２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号
３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号
３０７、配列番号３０８、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号
３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号
３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号
３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号
３２９、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号
３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号
３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号
３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号
３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号
３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号
３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号
３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７０、配列番号
３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号
３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号
３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号
３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号
３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号
３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号
４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号
４０６、配列番号４０７、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１１、配列番号
４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号
４１７、配列番号４１８、配列番号４１９、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号
４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号
４２８、配列番号４２９、配列番号４３０、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号
４３３、配列番号４３４、配列番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号
４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号
４４３、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号
４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号
４５４、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号
４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号
４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号
４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号
４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号
４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号
４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号
４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号
４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号
５００、配列番号５０１、および配列番号５０２である。
【００３０】
本発明の方法は、配列番号２、配列番号５、配列番号１０１、配列番号２３８、配列番
号３０９、配列番号３１０、配列番号３５２、配列番号３６５、配列番号４１０、配列番
号４２０、配列番号４４８、および配列番号４６９の群から選択されるヌクレオチド配列
によってコードされるアミノ酸配列を有する、１つ以上のさらなる遺伝子によって発現さ
れる１つ以上のタンパク質の検出を、さらに含む。
【００３１】
本発明は、さらに慢性または炎症性の疾患を検出するための診断用オリゴヌクレオチド
に関し、該オリゴヌクレオチドは、配列番号５０３、配列番号５０４、配列番号５０５、
配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、
配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、
配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、
配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、配列番号５２４、配列番号５２５、
配列番号５２６、配列番号５２７、配列番号５２８、配列番号５２９、配列番号５３０、
配列番号５３１、配列番号５３２、配列番号５３３、配列番号５３４、配列番号５３５、
配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３８、配列番号５３９、配列番号５４０、
配列番号５４１、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４４、配列番号５４５、
配列番号５４６、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５４９、配列番号５５０、
配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、
配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、
配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、
配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、配列番号５７０、
配列番号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７４、配列番号５７５、
配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５７９、配列番号５８０、
配列番号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配列番号５８４、配列番号５８５、
配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５８９、配列番号５９０、
配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５９４、配列番号５９５、
配列番号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号５９９、配列番号６００、
配列番号６０１、配列番号６０２、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５、
配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、配列番号６１０、
配列番号６１１、配列番号６１２、配列番号６１３、配列番号６１４、配列番号６１５、
配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、配列番号６２０、
配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、配列番号６２５、
配列番号６２６、配列番号６２７、配列番号６２８、配列番号６２９、配列番号６３０、
配列番号６３１、配列番号６３２、配列番号６３３、配列番号６３４、配列番号６３５、
配列番号６３６、配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、配列番号６４０、
配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、配列番号６４５、
配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０、
配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５、
配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、
配列番号６６１、配列番号６６２、配列番号６６３、配列番号６６４、配列番号６６５、
配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、
配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、
配列番号６７６、配列番号６７７、配列番号６７８、配列番号６７９、配列番号６８０、
配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、配列番号６８５、
配列番号６８６、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配列番号６９０、
配列番号６９１、配列番号６９２、配列番号６９３、配列番号６９４、配列番号６９５、
配列番号６９６、配列番号６９７、配列番号６９８、配列番号６９９、配列番号７００、
配列番号７０１、配列番号７０２、配列番号７０３、配列番号７０４、配列番号７０５、
配列番号７０６、配列番号７０７、配列番号７０８、配列番号７０９、配列番号７１０、
配列番号７１１、配列番号７１２、配列番号７１３、配列番号７１４、配列番号７１５、
配列番号７１６、配列番号７１７、配列番号７１８、配列番号７１９、配列番号７２０、
配列番号７２１、配列番号７２２、配列番号７２３、配列番号７２４、配列番号７２５、
配列番号７２６、配列番号７２７、配列番号７２８、配列番号７２９、配列番号７３０、
配列番号７３１、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３４、配列番号７３５、
配列番号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４０、
配列番号７４１、配列番号７４２、配列番号７４３、配列番号７４４、配列番号７４５、
配列番号７４６、配列番号７４７、配列番号７４８、配列番号７４９、配列番号７５０、
配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、
配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、
配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５、
配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、
配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、
配列番号７７６、配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、
配列番号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、
配列番号７８６、配列番号７８７、配列番号７８８、配列番号７８９、配列番号７９０、
配列番号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配列番号７９５、
配列番号７９６、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９、配列番号８００、
配列番号８０１、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８０５、
配列番号８０６、配列番号８０７、配列番号８０８、配列番号８０９、配列番号８１０、
配列番号８１１、配列番号８１２、配列番号８１３、配列番号８１４、配列番号８１５、
配列番号８１６、配列番号８１７、配列番号８１８、配列番号８１９、配列番号８２０、
配列番号８２１、配列番号８２２、配列番号８２３、配列番号８２４、配列番号８２５、
配列番号８２６、配列番号８２７、配列番号８２８、配列番号８２９、配列番号８３０、
配列番号８３１、配列番号８３２、配列番号８３３、配列番号８３４、配列番号８３５、
配列番号８３６、配列番号８３７、配列番号８３８、配列番号８３９、配列番号８４０、
配列番号８４１、配列番号８４２、配列番号８４３、配列番号８４４、配列番号８４５、
配列番号８４６、配列番号８４７、配列番号８４８、配列番号８４９、配列番号８５０、
配列番号８５１、配列番号８５２、配列番号８５３、配列番号８５４、配列番号８５５、
配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、
配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６３、配列番号８６４、配列番号８６５、
配列番号８６６、配列番号８６７、配列番号８６８、配列番号８６９、配列番号８７０、
配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、配列番号８７４、配列番号８７５、
配列番号８７６、配列番号８７７、配列番号８７８、配列番号８７９、配列番号８８０、
配列番号８８１、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８４、配列番号８８５、
配列番号８８６、配列番号８８７、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０、
配列番号８９１、配列番号８９２、配列番号８９３、配列番号８９４、配列番号８９５、
配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、配列番号９００、
配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５、
配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１０、
配列番号９１１、配列番号９１２、配列番号９１３、配列番号９１４、配列番号９１５、
配列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８、配列番号９１９、配列番号９２０、
配列番号９２１、配列番号９２２、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、
配列番号９２６、配列番号９２７、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３０、
配列番号９３１、配列番号９３２、配列番号９３３、配列番号９３４、配列番号９３５、
配列番号９３６、配列番号９３７、配列番号９３８、配列番号９３９、配列番号９４０、
配列番号９４１、配列番号９４２、配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９４５、
配列番号９４６、配列番号９４７、配列番号９４８、配列番号９４９、配列番号９５０、
配列番号９５１、配列番号９５２、配列番号９５３、配列番号９５４、配列番号９５５、
配列番号９５６、配列番号９５７、配列番号９５８、配列番号９５９、配列番号９６０、
配列番号９６１、配列番号９６２、配列番号９６３、配列番号９６４、配列番号９６５、
配列番号９６６、配列番号９６７、配列番号９６８、配列番号９６９、配列番号９７０、
配列番号９７１、配列番号９７２、配列番号９７３、配列番号９７４、配列番号９７５、
配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配列番号９７９、配列番号９８０、
配列番号９８１、配列番号９８２、配列番号９８３、配列番号９８４、配列番号９８５、
配列番号９８６、配列番号９８７、配列番号９８８、配列番号９８９、配列番号９９０、
配列番号９９１、配列番号９９２、配列番号９９３、配列番号９９４、配列番号９９５、
配列番号９９６、配列番号９９７、配列番号９９８、配列番号９９９、配列番号１０００
、配列番号１００１、配列番号１００２、配列番号１００３、および配列番号１００４か
ら選択されるヌクレオチドを有する。上記診断用オリゴヌクレオチドとして、ＤＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ＰＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドが挙げられ得る。
【００３２】
本発明の方法は、さらに、診断および／またはモニタリングにもとづいた適当な治療を
選択する工程を包含する。そのような治療として、適当な薬物（例えば、αインターフェ
ロンを標的化する薬物）の投与が挙げられ得る。
【００３３】
本発明の方法は、患者由来の体液または患者における体液（例えば末梢血および尿）に
適用され得る。
【００３４】
本発明は、さらに、患者における慢性炎症性疾患または自己免疫疾患を診断またはモニ
タリングするための、単離されたＤＮＡ分子を含むシステムまたはキットに関し、この単
離されたＤＮＡ分子は、表２Ｅに列挙された遺伝子の発現を検出する。本発明のシステム
において、ＤＮＡ分子は、合成ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＰＮＡ、またはｃＤＮＡであり得
る。単離されたＤＮＡ分子は、アレイ上に固定され得る。そのようなアレイとして、チッ
プアレイ、プレートアレイ、ビーズアレイ、ピンアレイ、膜アレイ、固体表面アレイ、液
体アレイ、オリゴヌクレオチドアレイ、ポリヌクレオチドアレイまたはｃＤＮＡアレイ、
マイクロタイタープレート、膜、およびチップが挙げられ得る。
【００３５】
本発明は、さらに、差次的遺伝子発現を検出するためのシステムに関する。一態様にお
いて、このシステムは、１つ以上の単離されたＤＮＡ分子を有し、各々の単離されたＤＮ
Ａ分子は、配列表に示されるオリゴヌクレオチドに対応する遺伝子の群から選択される遺
伝子の発現を検出する。本発明のＤＮＡ配列およびオリゴヌクレオチドは、本明細書中で
同定されたものと僅かに異なる配列を有し得ることが理解される。当業者は、そのような
配列のばらつきが、その配列の遺伝子発現検出能力に有意に影響を及ぼさない、配列内の
変化であることを理解する。
【００３６】
本発明によって包含される配列は、本明細書中に開示した配列に対し、少なくとも４０
〜５０、５０〜６０、７０〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、または９５〜
１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ分子は、おおよそ
以下の長さ（塩基または塩基対で）のいずれよりも小さい：１０，０００；５，０００；
２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０
；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；５０；２５；１０。いくつかの実施
形態において、ＤＮＡ分子は、おおよそ以下の長さ（塩基または塩基対で）のいずれより
も大きい：１０；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；
１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００
；２０００；５０００；７５００；１００００；２００００；５００００。あるいは、Ｄ
ＮＡ分子は、任意の範囲の大きさであり得る。この範囲は、１０，０００；５，０００；
２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０
；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；５０；２５；または１０の上限、お
よび１０；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０
；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００；２０
００；５０００；７５００の独立して選択された下限を有し、該下限は上限よりも小さい
。
【００３７】
遺伝子発現系は、候補ライブラリー、診断薬、診断用オリゴヌクレオチドセット、また
は診断用プローブセットであり得る。ＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ、タンパク質核酸（Ｐ
ＮＡ）、ｃＤＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドであり得る。
【００３８】
一態様では、遺伝子発現系は、アレイ上に固定される。このアレイは、チップアレイ、
プレートアレイ、ビーズアレイ、ピンアレイ、膜アレイ、固体表面アレイ、液体アレイ、
オリゴヌクレオチドアレイ、ポリヌクレオチドアレイ、ｃＤＮＡアレイ、マイクロフィル
タプレート、膜、またはチップであり得る。
【００３９】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
患者の自己免疫および慢性炎症性疾患を診断またはモニタリングするための方法であって
、前記患者における自己免疫および慢性炎症性疾患を診断またはモニタリングするために
、前記患者において１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含し、前記１つ以
上の遺伝子が、配列番号５０３、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０８、配
列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配
列番号５１４、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配
列番号５１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、配
列番号５２４、配列番号５２５、配列番号５２６、配列番号５２７、配列番号５２８、配
列番号５２９、配列番号５３０、配列番号５３１、配列番号５３２、配列番号５３３、配
列番号５３４、配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３８、配
列番号５３９、配列番号５４０、配列番号５４１、配列番号５４２、配列番号５４３、配
列番号５４４、配列番号５４５、配列番号５４６、配列番号５４７、配列番号５４８、配
列番号５４９、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配
列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配
列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配
列番号５６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配
列番号５６９、配列番号５７０、配列番号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配
列番号５７４、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配
列番号５７９、配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配
列番号５８４、配列番号５８５、配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配
列番号５８９、配列番号５９０、配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配
列番号５９４、配列番号５９５、配列番号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配
列番号５９９、配列番号６００、配列番号６０１、配列番号６０２、配列番号６０４、配
列番号６０５、配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、配
列番号６１０、配列番号６１１、配列番号６１２、配列番号６１３、配列番号６１４、配
列番号６１５、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、配
列番号６２０、配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、配
列番号６２５、配列番号６２６、配列番号６２７、配列番号６２８、配列番号６２９、配
列番号６３０、配列番号６３１、配列番号６３２、配列番号６３３、配列番号６３４、配
列番号６３５、配列番号６３６、配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、配
列番号６４０、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、配
列番号６４５、配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配
列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配
列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配
列番号６６０、配列番号６６１、配列番号６６２、配列番号６６３、配列番号６６４、配
列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配
列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配
列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、配列番号６７８、配列番号６７９、配
列番号６８０、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、配
列番号６８５、配列番号６８６、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配
列番号６９０、配列番号６９１、配列番号６９２、配列番号６９３、配列番号６９４、配
列番号６９５、配列番号６９６、配列番号６９７、配列番号６９８、配列番号６９９、配
列番号７００、配列番号７０１、配列番号７０２、配列番号７０３、配列番号７０４、配
列番号７０５、配列番号７０６、配列番号７０７、配列番号７０８、配列番号７０９、配
列番号７１０、配列番号７１１、配列番号７１２、配列番号７１３、配列番号７１４、配
列番号７１５、配列番号７１６、配列番号７１７、配列番号７１８、配列番号７１９、配
列番号７２０、配列番号７２１、配列番号７２２、配列番号７２３、配列番号７２４、配
列番号７２５、配列番号７２６、配列番号７２７、配列番号７２８、配列番号７２９、配
列番号７３０、配列番号７３１、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３４、配
列番号７３５、配列番号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配
列番号７４１、配列番号７４２、配列番号７４３、配列番号７４４、配列番号７４５、配
列番号７４６、配列番号７４７、配列番号７４８、配列番号７４９、配列番号７５０、配
列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配
列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配
列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５、配
列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配
列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、配
列番号７７６、配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配
列番号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配
列番号７８６、配列番号７８７、配列番号７８８、配列番号７８９、配列番号７９０、配
列番号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配列番号７９５、配
列番号７９６、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９、配列番号８００、配
列番号８０１、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８０５、配
列番号８０６、配列番号８０７、配列番号８０８、配列番号８０９、配列番号８１０、配
列番号８１３、配列番号８１４、配列番号８１５、配列番号８１６、配列番号８１７、配
列番号８１８、配列番号８１９、配列番号８２０、配列番号８２１、配列番号８２２、配
列番号８２３、配列番号８２４、配列番号８２５、配列番号８２６、配列番号８２７、配
列番号８２８、配列番号８２９、配列番号８３０、配列番号８３１、配列番号８３２、配
列番号８３３、配列番号８３４、配列番号８３５、配列番号８３６、配列番号８３７、配
列番号８３８、配列番号８３９、配列番号８４０、配列番号８４１、配列番号８４２、配
列番号８４３、配列番号８４４、配列番号８４５、配列番号８４６、配列番号８４７、配
列番号８４８、配列番号８４９、配列番号８５０、配列番号８５１、配列番号８５２、配
列番号８５３、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配
列番号８５９、配列番号８６０、配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６３、配
列番号８６４、配列番号８６５、配列番号８６６、配列番号８６８、配列番号８６９、配
列番号８７０、配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、配列番号８７４、配
列番号８７５、配列番号８７６、配列番号８７７、配列番号８７８、配列番号８７９、配
列番号８８０、配列番号８８１、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８４、配
列番号８８５、配列番号８８６、配列番号８８７、配列番号８８８、配列番号８８９、配
列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、配列番号８９３、配列番号８９４、配
列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、配
列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配
列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配
列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１３、配列番号９１４、配列番号９１５、配
列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８、配列番号９１９、配列番号９２０、配
列番号９２１、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、配
列番号９２７、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３０、配列番号９３１、配
列番号９３２、配列番号９３３、配列番号９３４、配列番号９３５、配列番号９３６、配
列番号９３７、配列番号９３８、配列番号９３９、配列番号９４０、配列番号９４１、配
列番号９４２、配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９４５、配列番号９４６、配
列番号９４７、配列番号９４８、配列番号９４９、配列番号９５１、配列番号９５２、配
列番号９５３、配列番号９５４、配列番号９５５、配列番号９５６、配列番号９５７、配
列番号９５８、配列番号９５９、配列番号９６０、配列番号９６１、配列番号９６２、配
列番号９６３、配列番号９６４、配列番号９６５、配列番号９６６、配列番号９６７、配
列番号９６８、配列番号９６９、配列番号９７０、配列番号９７２、配列番号９７３、配
列番号９７４、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配
列番号９７９、配列番号９８０、配列番号９８１、配列番号９８２、配列番号９８３、配
列番号９８４、配列番号９８５、配列番号９８６、配列番号９８７、配列番号９８８、配
列番号９８９、配列番号９９０、配列番号９９１、配列番号９９２、配列番号９９３、配
列番号９９４、配列番号９９５、配列番号９９６、配列番号９９７、配列番号９９８、配
列番号９９９、配列番号１０００、配列番号１００１、配列番号１００２、配列番号１０
０３、および配列番号１００４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法
。
（項目２）
前記患者における１つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出して患者における自己免
疫疾患および慢性炎症性疾患を診断またはモニタリングする工程をさらに包含する、請求
項１に記載の方法であって、該１つ以上のさらなる遺伝子が、配列番号５０４、配列番号
５０７、配列番号６０３、配列番号７４０、配列番号８１１、配列番号８１２、配列番号
８５４、配列番号８６７、配列番号９１２、配列番号９２２、配列番号９５０、および配
列番号９７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目３）
少なくとも２つの前記遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する、項目１に記載の
方法。
（項目４）
少なくとも１０の前記遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する、項目１に記載の
方法。
（項目５）
少なくとも１００の前記遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する、項目１に記載
の方法。
（項目６）
全ての前記遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記慢性炎症性疾患および自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、胆嚢炎、全身性紅斑性狼
瘡、シェーグレン疾患、クレスト症候群、強皮症、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大
腸炎、原発性硬化性胆管炎、虫垂炎、憩室炎、原発性胆管硬化症、ヴェグナー肉芽腫症、
結節性多発性動脈炎、ウィップル病、乾癬、顕微鏡的多発性血管炎、高安病、川崎病、自
己免疫性肝炎、喘息、チャーグ−ストラウス病、バージャー氏病、レイノー病、および胆
嚢炎からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記疾患が、全身性紅斑性狼瘡である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記疾患が慢性関節リウマチである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記発現レベルが、前記１つ以上の遺伝子によって発現されたＲＮＡレベルを測定するこ
とによって検出される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記１つ以上の遺伝子によって発現される前記ＲＮＡレベルの検出の前に、前記患者から
ＲＮＡを単離する工程をさらに包含する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＲＮＡレベルをＰＣＲによって検出する、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記ＰＣＲが、［配列番号Ｚ−プライマー対］からなる群から選択されるヌクレオチド配
列からなるプライマーを用いる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ＲＮＡレベルが、ハイブリダイゼーションによって検出される、項目１０に記載の
方法。
（項目１５）
前記ＲＮＡレベルが、オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって検出
される、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号５０３、配列番号５０４、配列番号５０５、配列番
号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番
号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１４、配列番号５１５、配列番
号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０、配列番
号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、配列番号５２４、配列番号５２５、配列番
号５２６、配列番号５２７、配列番号５２８、配列番号５２９、配列番号５３０、配列番
号５３１、配列番号５３２、配列番号５３３、配列番号５３４、配列番号５３５、配列番
号５３６、配列番号５３７、配列番号５３８、配列番号５３９、配列番号５４０、配列番
号５４１、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５４４、配列番号５４５、配列番
号５４６、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５４９、配列番号５５０、配列番
号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番
号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番
号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、配列番
号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、配列番号５７０、配列番
号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７４、配列番号５７５、配列番
号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５７９、配列番号５８０、配列番
号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配列番号５８４、配列番号５８５、配列番
号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５８９、配列番号５９０、配列番
号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５９４、配列番号５９５、配列番
号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号５９９、配列番号６００、配列番
号６０１、配列番号６０２、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５、配列番
号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、配列番号６１０、配列番
号６１１、配列番号６１２、配列番号６１３、配列番号６１４、配列番号６１５、配列番
号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、配列番号６２０、配列番
号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、配列番号６２５、配列番
号６２６、配列番号６２７、配列番号６２８、配列番号６２９、配列番号６３０、配列番
号６３１、配列番号６３２、配列番号６３３、配列番号６３４、配列番号６３５、配列番
号６３６、配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、配列番号６４０、配列番
号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、配列番号６４５、配列番
号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０、配列番
号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番
号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番
号６６１、配列番号６６２、配列番号６６３、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番
号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番
号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番
号６７６、配列番号６７７、配列番号６７８、配列番号６７９、配列番号６８０、配列番
号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、配列番号６８５、配列番
号６８６、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配列番号６９０、配列番
号６９１、配列番号６９２、配列番号６９３、配列番号６９４、配列番号６９５、配列番
号６９６、配列番号６９７、配列番号６９８、配列番号６９９、配列番号７００、配列番
号７０１、配列番号７０２、配列番号７０３、配列番号７０４、配列番号７０５、配列番
号７０６、配列番号７０７、配列番号７０８、配列番号７０９、配列番号７１０、配列番
号７１１、配列番号７１２、配列番号７１３、配列番号７１４、配列番号７１５、配列番
号７１６、配列番号７１７、配列番号７１８、配列番号７１９、配列番号７２０、配列番
号７２１、配列番号７２２、配列番号７２３、配列番号７２４、配列番号７２５、配列番
号７２６、配列番号７２７、配列番号７２８、配列番号７２９、配列番号７３０、配列番
号７３１、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３４、配列番号７３５、配列番
号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４０、配列番
号７４１、配列番号７４２、配列番号７４３、配列番号７４４、配列番号７４５、配列番
号７４６、配列番号７４７、配列番号７４８、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番
号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番
号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番
号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５、配列番
号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番
号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、配列番
号７７６、配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配列番
号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配列番
号７８６、配列番号７８７、配列番号７８８、配列番号７８９、配列番号７９０、配列番
号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配列番号７９５、配列番
号７９６、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９、配列番号８００、配列番
号８０１、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８０５、配列番
号８０６、配列番号８０７、配列番号８０８、配列番号８０９、配列番号８１０、配列番
号８１１、配列番号８１２、配列番号８１３、配列番号８１４、配列番号８１５、配列番
号８１６、配列番号８１７、配列番号８１８、配列番号８１９、配列番号８２０、配列番
号８２１、配列番号８２２、配列番号８２３、配列番号８２４、配列番号８２５、配列番
号８２６、配列番号８２７、配列番号８２８、配列番号８２９、配列番号８３０、配列番
号８３１、配列番号８３２、配列番号８３３、配列番号８３４、配列番号８３５、配列番
号８３６、配列番号８３７、配列番号８３８、配列番号８３９、配列番号８４０、配列番
号８４１、配列番号８４２、配列番号８４３、配列番号８４４、配列番号８４５、配列番
号８４６、配列番号８４７、配列番号８４８、配列番号８４９、配列番号８５０、配列番
号８５１、配列番号８５２、配列番号８５３、配列番号８５４、配列番号８５５、配列番
号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、配列番
号８６１、配列番号８６２、配列番号８６３、配列番号８６４、配列番号８６５、配列番
号８６６、配列番号８６７、配列番号８６８、配列番号８６９、配列番号８７０、配列番
号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、配列番号８７４、配列番号８７５、配列番
号８７６、配列番号８７７、配列番号８７８、配列番号８７９、配列番号８８０、配列番
号８８１、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８４、配列番号８８５、配列番
号８８６、配列番号８８７、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０、配列番
号８９１、配列番号８９２、配列番号８９３、配列番号８９４、配列番号８９５、配列番
号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、配列番号９００、配列番
号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５、配列番
号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番
号９１１、配列番号９１２、配列番号９１３、配列番号９１４、配列番号９１５、配列番
号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８、配列番号９１９、配列番号９２０、配列番
号９２１、配列番号９２２、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番
号９２６、配列番号９２７、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３０、配列番
号９３１、配列番号９３２、配列番号９３３、配列番号９３４、配列番号９３５、配列番
号９３６、配列番号９３７、配列番号９３８、配列番号９３９、配列番号９４０、配列番
号９４１、配列番号９４２、配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９４５、配列番
号９４６、配列番号９４７、配列番号９４８、配列番号９４９、配列番号９５０、配列番
号９５１、配列番号９５２、配列番号９５３、配列番号９５４、配列番号９５５、配列番
号９５６、配列番号９５７、配列番号９５８、配列番号９５９、配列番号９６０、配列番
号９６１、配列番号９６２、配列番号９６３、配列番号９６４、配列番号９６５、配列番
号９６６、配列番号９６７、配列番号９６８、配列番号９６９、配列番号９７０、配列番
号９７１、配列番号９７２、配列番号９７３、配列番号９７４、配列番号９７５、配列番
号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配列番号９７９、配列番号９８０、配列番
号９８１、配列番号９８２、配列番号９８３、配列番号９８４、配列番号９８５、配列番
号９８６、配列番号９８７、配列番号９８８、配列番号９８９、配列番号９９０、配列番
号９９１、配列番号９９２、配列番号９９３、配列番号９９４、配列番号９９５、配列番
号９９６、配列番号９９７、配列番号９９８、配列番号９９９、配列番号１０００、配列
番号１００１、配列番号１００２、配列番号１００３、および配列番号１００４からなる
群から選択されるヌクレオチド配列からなる、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または
合成オリゴヌクレオチドを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記発現レベルが、前記１つ以上の遺伝子によって発現される１つ以上のタンパク質を測
定することによって検出される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記１つ以上のタンパク質が、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列
番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番
号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配
列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４
、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号
３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列
番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、
配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４
７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番
号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配
列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４
、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号
７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列
番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、
配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８
７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番
号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配
列番号９９、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列
番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列
番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列
番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列
番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列
番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列
番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列
番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列
番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列
番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列
番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列
番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列
番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列
番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列
番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列
番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列
番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列
番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列
番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列
番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列
番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列
番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列
番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列
番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列
番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列
番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列
番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列
番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４０、配列
番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列
番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列
番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列
番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列
番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列
番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列
番号２７１、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列
番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列
番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列
番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列
番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列
番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列
番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列
番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３１１、配列番号３１２、配列
番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列
番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２２、配列
番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列
番号３２８、配列番号３２９、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３２、配列
番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列
番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列
番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列
番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５３、配列
番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列
番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列
番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列
番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列
番号３７５、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列
番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列
番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列
番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列
番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列
番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列
番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７、配列番号４０８、配列番号４０９、配列
番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列
番号４１６、配列番号４１７、配列番号４１８、配列番号４１９、配列番号４２１、配列
番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列
番号４２７、配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３０、配列番号４３１、配列
番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３５、配列番号４３６、配列
番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列
番号４４２、配列番号４４３、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４６、配列
番号４４７、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１、配列番号４５２、配列
番号４５３、配列番号４５４、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列
番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列
番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列
番号４６８、配列番号４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列
番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列
番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配列
番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列
番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列
番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列
番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、および配列番号５０２からなる群から選
択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載
の方法。
（項目２０）
前記１つ以上の遺伝子の前記発現レベルが、該１つ以上の遺伝子によって発現される１つ
以上のタンパク質を測定することによって検出され、そして前記１つ以上のさらなる遺伝
子の前記発現レベルが、該１つ以上のさらなる遺伝子によって発現される１つ以上のタン
パク質を測定することによって検出される、項目２に記載の方法。
（項目２１）
前記１つ以上の遺伝子によって発現される前記１つ以上のタンパク質が、配列番号１、配
列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１
０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番
号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配
列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７
、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号
３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列
番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５
０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番
号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配
列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７
、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号
７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列
番号７９、配列番号８０、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、
配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９
０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番
号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０２
、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７
、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２
、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７
、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２
、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７
、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２
、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７
、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２
、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７
、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２
、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７
、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２
、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７
、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２
、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７
、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２
、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７
、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２
、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７
、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２
、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７
、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２
、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７
、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２
、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７
、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２
、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７
、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３
、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８
、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３
、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８
、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３
、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８
、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２、配列番号２７３
、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８
、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３
、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８
、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３
、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８
、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３
、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８
、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５
、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０
、配列番号３２１、配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５
、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、配列番号３３０
、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５
、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０
、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５
、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０
、配列番号３５１、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６
、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１
、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６７
、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２
、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３７６、配列番号３７７
、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２
、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７
、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２
、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７
、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２
、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７
、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３
、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、配列番号４１８
、配列番号４１９、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４
、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、配列番号４２９
、配列番号４３０、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４
、配列番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９
、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４３、配列番号４４４
、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４９、配列番号４５０
、配列番号４５１、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５４、配列番号４５５
、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０
、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５
、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４７０、配列番号４７１
、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６
、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１
、配列番号４８２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６
、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１
、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６
、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１
、および配列番号５０２からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ
るアミノ酸配列を含み、そして
前記１つ以上のさらなる遺伝子によって発現される前記１つ以上のタンパク質が、配列番
号２、配列番号５、配列番号１０１、配列番号２３８、配列番号３０９、配列番号３１０
、配列番号３５２、配列番号３６５、配列番号４１０、配列番号４２０、配列番号４４８
、および配列番号４６９からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ
るアミノ酸配列を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記測定が、血清の測定を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記タンパク質が、細胞表面タンパク質である、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記測定が、蛍光活性化セルソーターの使用を包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記検出された発現レベルが、患者の体液中の発現レベルである、項目１に記載の方法
。
（項目２６）
前記体液が、末梢血である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
適切な治療を選択する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記治療が、αインターフェロンを標的化する薬物の投与を包含する、項目２７に記載
の方法。
（項目２９）
少なくとも２つの単離されたポリヌクレオチドを含む、体液中の遺伝子発現を検出するた
めのシステムであって、該単離されたポリヌクレオチドは遺伝子の発現を検出し、該遺伝
子が、配列番号５０３、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５
０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５
１４、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５
１９、配列番号５２０、配列番号５２１、配列番号５２２、配列番号５２３、配列番号５
２４、配列番号５２５、配列番号５２６、配列番号５２７、配列番号５２８、配列番号５
２９、配列番号５３０、配列番号５３１、配列番号５３２、配列番号５３３、配列番号５
３４、配列番号５３５、配列番号５３６、配列番号５３７、配列番号５３８、配列番号５
３９、配列番号５４０、配列番号５４１、配列番号５４２、配列番号５４３、配列番号５
４４、配列番号５４５、配列番号５４６、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５
４９、配列番号５５０、配列番号５５１、配列番号５５２、配列番号５５３、配列番号５
５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５
５９、配列番号５６０、配列番号５６１、配列番号５６２、配列番号５６３、配列番号５
６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５
６９、配列番号５７０、配列番号５７１、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５
７４、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５
７９、配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２、配列番号５８３、配列番号５
８４、配列番号５８５、配列番号５８６、配列番号５８７、配列番号５８８、配列番号５
８９、配列番号５９０、配列番号５９１、配列番号５９２、配列番号５９３、配列番号５
９４、配列番号５９５、配列番号５９６、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号５
９９、配列番号６００、配列番号６０１、配列番号６０２、配列番号６０４、配列番号６
０５、配列番号６０６、配列番号６０７、配列番号６０８、配列番号６０９、配列番号６
１０、配列番号６１１、配列番号６１２、配列番号６１３、配列番号６１４、配列番号６
１５、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８、配列番号６１９、配列番号６
２０、配列番号６２１、配列番号６２２、配列番号６２３、配列番号６２４、配列番号６
２５、配列番号６２６、配列番号６２７、配列番号６２８、配列番号６２９、配列番号６
３０、配列番号６３１、配列番号６３２、配列番号６３３、配列番号６３４、配列番号６
３５、配列番号６３６、配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、配列番号６
４０、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４４、配列番号６
４５、配列番号６４６、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６
５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６
５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６
６０、配列番号６６１、配列番号６６２、配列番号６６３、配列番号６６４、配列番号６
６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６
７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６
７５、配列番号６７６、配列番号６７７、配列番号６７８、配列番号６７９、配列番号６
８０、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８４、配列番号６
８５、配列番号６８６、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配列番号６
９０、配列番号６９１、配列番号６９２、配列番号６９３、配列番号６９４、配列番号６
９５、配列番号６９６、配列番号６９７、配列番号６９８、配列番号６９９、配列番号７
００、配列番号７０１、配列番号７０２、配列番号７０３、配列番号７０４、配列番号７
０５、配列番号７０６、配列番号７０７、配列番号７０８、配列番号７０９、配列番号７
１０、配列番号７１１、配列番号７１２、配列番号７１３、配列番号７１４、配列番号７
１５、配列番号７１６、配列番号７１７、配列番号７１８、配列番号７１９、配列番号７
２０、配列番号７２１、配列番号７２２、配列番号７２３、配列番号７２４、配列番号７
２５、配列番号７２６、配列番号７２７、配列番号７２８、配列番号７２９、配列番号７
３０、配列番号７３１、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３４、配列番号７
３５、配列番号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７
４１、配列番号７４２、配列番号７４３、配列番号７４４、配列番号７４５、配列番号７
４６、配列番号７４７、配列番号７４８、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７
５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番号７
５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７
６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４、配列番号７６５、配列番号７
６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７
７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、配列番号７
７６、配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配列番号７
８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配列番号７
８６、配列番号７８７、配列番号７８８、配列番号７８９、配列番号７９０、配列番号７
９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配列番号７９５、配列番号７
９６、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９、配列番号８００、配列番号８
０１、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８０５、配列番号８
０６、配列番号８０７、配列番号８０８、配列番号８０９、配列番号８１０、配列番号８
１３、配列番号８１４、配列番号８１５、配列番号８１６、配列番号８１７、配列番号８
１８、配列番号８１９、配列番号８２０、配列番号８２１、配列番号８２２、配列番号８
２３、配列番号８２４、配列番号８２５、配列番号８２６、配列番号８２７、配列番号８
２８、配列番号８２９、配列番号８３０、配列番号８３１、配列番号８３２、配列番号８
３３、配列番号８３４、配列番号８３５、配列番号８３６、配列番号８３７、配列番号８
３８、配列番号８３９、配列番号８４０、配列番号８４１、配列番号８４２、配列番号８
４３、配列番号８４４、配列番号８４５、配列番号８４６、配列番号８４７、配列番号８
４８、配列番号８４９、配列番号８５０、配列番号８５１、配列番号８５２、配列番号８
５３、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８
５９、配列番号８６０、配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６３、配列番号８
６４、配列番号８６５、配列番号８６６、配列番号８６８、配列番号８６９、配列番号８
７０、配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、配列番号８７４、配列番号８
７５、配列番号８７６、配列番号８７７、配列番号８７８、配列番号８７９、配列番号８
８０、配列番号８８１、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８４、配列番号８
８５、配列番号８８６、配列番号８８７、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８
９０、配列番号８９１、配列番号８９２、配列番号８９３、配列番号８９４、配列番号８
９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、配列番号９
００、配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９
０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９
１０、配列番号９１１、配列番号９１３、配列番号９１４、配列番号９１５、配列番号９
１６、配列番号９１７、配列番号９１８、配列番号９１９、配列番号９２０、配列番号９
２１、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、配列番号９
２７、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３０、配列番号９３１、配列番号９
３２、配列番号９３３、配列番号９３４、配列番号９３５、配列番号９３６、配列番号９
３７、配列番号９３８、配列番号９３９、配列番号９４０、配列番号９４１、配列番号９
４２、配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９４５、配列番号９４６、配列番号９
４７、配列番号９４８、配列番号９４９、配列番号９５１、配列番号９５２、配列番号９
５３、配列番号９５４、配列番号９５５、配列番号９５６、配列番号９５７、配列番号９
５８、配列番号９５９、配列番号９６０、配列番号９６１、配列番号９６２、配列番号９
６３、配列番号９６４、配列番号９６５、配列番号９６６、配列番号９６７、配列番号９
６８、配列番号９６９、配列番号９７０、配列番号９７２、配列番号９７３、配列番号９
７４、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配列番号９
７９、配列番号９８０、配列番号９８１、配列番号９８２、配列番号９８３、配列番号９
８４、配列番号９８５、配列番号９８６、配列番号９８７、配列番号９８８、配列番号９
８９、配列番号９９０、配列番号９９１、配列番号９９２、配列番号９９３、配列番号９
９４、配列番号９９５、配列番号９９６、配列番号９９７、配列番号９９８、配列番号９
９９、配列番号１０００、配列番号１００１、配列番号１００２、配列番号１００３、お
よび配列番号１００４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、そして該遺伝
子が、自己免疫関連症状または慢性炎症性疾患関連症状を罹患している個体の体液中で、
該症状を罹患していない個体の白血球中の前記遺伝子の発現と比較して、差次的に発現さ
れる、システム。
【００４０】
（配列表の簡単な説明）
配列表の簡単な説明を、以下に示す。記入項目数は、１０６５である。配列表は、ヒト
白血球、植物、およびウィルス遺伝子に由来する、５０マーのオリゴヌクレオチド配列を
示す。これらは、配列番号５０３〜１００４として列挙される。５０マーの配列および対
応遺伝子配列もまた、表２に列挙される。これら５０マーのほとんどが表２中および配列
表中の遺伝子配列から設計された。
【００４１】
配列番号１〜５０２は、ＳＬＥを有する患者において発現が変化した遺伝子のｍＲＮＡ
配列を示す。
【００４２】
配列番号２〜１００４は、血液中のＲＮＡ発現をモニターするためにプローブとして使
用される５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
配列番号１００５〜１０３７は、１〜５０２から選択された遺伝子の発現をモニターす
るために使用されるＰＣＲプライマーおよびプローブである。
【００４４】
配列番号１０３８〜１０６５は、実施例で検討される配列である。
【００４５】
（表の簡単な説明）
表１：アレイおよびＰＣＲ発現プロファイリング実験で用いた試料。試料は、適当な施
設内倫理委員会（ＩＲＢ）による許可およびインフォームドコンセントを得た一カ所の医
療センターで患者から得た。各患者に対する最初の臨床診断は、米国リウマチ学会診断基
準（ＳＬＥ＝全身性紅斑性狼瘡、ＲＡ＝慢性関節リウマチ、Ｃ＝健康なコントロール、Ｏ
Ａ＝変形性関節症）に従っておこなった。従属変数を、患者の臨床診断から分析のために
定義した。Ｄｘ１について、患者を狼瘡（１）または非狼瘡（０）に分類した。Ｄｘ２に
ついて、狼瘡が静止性である患者、狼瘡が不確実である患者、もしくは狼瘡の治療を最近
受けた患者のいずれをも、分析から除いた（２）。ＰＣＲは、ｘと記した試料のセットに
対しておこなった。
【００４６】
表２：ＳＬＥおよび自己免疫疾患の遺伝子発現マーカー。
【００４７】
Ａ．マイクロアレイ（狼瘡／自己免疫マーカー）に対する有意性分析（ＳＡＭ）。各々
の遺伝子の同定は、オリゴヌクレオチド（配列番号５０マー）、ＶＥＲＳＩＯＮ（ＡＣＣ
）からのＧｅｎｂａｎｋ登録番号、完全長（または最長として知られている）ＲＮＡ転写
産物（配列番号ＦＬ）、およびユニジーン番号（ｕｎｉｇｅｎｅ  ｎｕｍｂｅｒ）ＶＥＲ
ＳＩＯＮ（ＨＳ）によって、おこなう。血液遺伝子発現のマイクロアレイ分析結果（実施
例１１）は、誤検出率（ＳＡＭ  ＦＤＲ）ならびに狼瘡患者とコントロールとの間の発現
変化の方向（ＳＡＭアップ／ダウン）として与えられる。
【００４８】
Ｂ．実時間ＰＣＲ遺伝子発現分析。実施例１１に記載したように、実時間ＰＣＲを用い
てマーカー遺伝子発現の挙動を確認および定量化した。各遺伝子を、オリゴヌクレオチド
（配列番号５０マー）、ＶＥＲＳＩＯＮ（ＡＣＣ）からのＧｅｎｂａｎｋ登録番号、完全
長（または最長として知られている）ＲＮＡ転写産物（配列番号ＦＬ）、およびユニジー
ン番号ＶＥＲＳＩＯＮ（ＨＳ）によって、同定する。狼瘡患者とコントロールとの間の倍
変化（ＰＣＲ倍）、ならびに対でないｔ−検定の結果（ＰＣＲ  ｐ値）とが与えられる。
Ｃ．マイクロアレイデータの多重相加的回帰木（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  
Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ）分析。
ＭＡＲＴアルゴリズムを用いて、実施例１１に記載したように、マーカー遺伝子および遺
伝子セットの同定をおこなった。各遺伝子は、オリゴヌクレオチド（配列番号５０マー）
、ＶＥＲＳＩＯＮ（ＡＣＣ）からのＧｅｎｂａｎｋ登録番号、完全長（または最長として
知られている）ＲＮＡ転写産物（配列番号ＦＬ）、およびユニジーン番号（ｕｎｉｇｅｎ
ｅ  ｎｕｍｂｅｒ）ＶＥＲＳＩＯＮ（ＨＳ）によって、同定する。ＭＡＲＴモデルでの遺
伝子の重要性（ＭＡＲＴ重要度）、遺伝子を同定したモデルの誤り率（ＭＡＲＴ誤り）、
およびこれら２つの変数（重要度／誤り）の比を与える。
【００４９】
Ｄ．階層的クラスタリングによる経路および経路遺伝子の同定。遺伝子は、マイクロア
レイまたはＰＣＲ分析からの有意な遺伝子の近似同時発現によって同定する（階層的クラ
スター配列番号）。この分析は、遺伝子発現の経路の違いを同定する。
【００５０】
表３：表３は、白血球プロファイリングによる研究に影響を受けやすい疾患または症状
のいくつかを列挙である。
【００５１】
表４：実時間ＰＣＲアッセイレポーターおよびクエンチャー色素。レポーターおよびク
エンチャー色素の様々な組み合わせが、実時間ＰＣＲにとって有用である。レポーターお
よびクエンチャー色素は、それらのスペクトルによって定義される具体的な組み合わせで
、最適に作用する。各レポーターについて、適当なクエンチャー色素の選択を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、ヌクレオチド配列および／または新規ヌクレオチド配列の予測タンパク質配列の特徴付けのための指示セットを説明する模式的フローチャートである。
【図２】図２は、ＰＣＲプライマー効率検査を示す。２つの遺伝子について、Ｃｔ値対開始ＲＮＡ量対数（ｌｏｇ）値の基準曲線を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明を実施する上で有用なキットを説明する。図３Ａは、マイクロアレイを用いた診断用ヌクレオチドを発見する上で有用なキットの内容を説明する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明を実施する上で有用なキットを説明する。図３Ｂは、マイクロアレイを用いた診断用ヌクレオチドセットの適用のために有用なキットの内容を説明する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明を実施する上で有用なキットを説明する。図３Ｃは、実時間ＰＣＲを用いた診断用ヌクレオチドセットの適用に有用なキットの内容を説明する。
【図４】図４は、種々の白血球基準ＲＮＡに対する正中バックグラウンド（ｍｅｄｉａｎ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）減数発現シグナルを比較したグラフを示す。
【図５−１】図５は、全身性紅斑性狼瘡を同定するための診断用遺伝子、遺伝子セット、および診断用アルゴリズムを示す。図５Ａは、狼瘡とコントロール試料とのあいだのオリゴヌクレオチドと配列番号１６（シアルトランスフェラーゼ４Ａ）との相対的発現レベルを示す。遺伝子は、０．５％のＳＡＭアルゴリズムからの差次的発現の誤検出率を有するように同定される。図５Ｂは、分析の際に試料に対して与えられたシアルトランスフェラーゼ（配列番号１６）に対するスケール比率（ｓｃａｌｅｄ  ｒａｔｉｏ）を示す。各群の平均比を該比の標準偏差とともに示す。コントロールから狼瘡への平均倍率変化は、１．４８である。
【図５−２】図５は、全身性紅斑性狼瘡を同定するための診断用遺伝子、遺伝子セット、および診断用アルゴリズムを示す。図５Ｃは、ＳＬＥを診断するためのＣＡＲＴ遺伝子発現モデルを示す。各モデルについて、使用した遺伝子の数、１０分割交差（１０  ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ）検定による相対コスト、配列番号、遺伝子座登録番号、名前、ならびにＣＡＲＴモデル内での位置および値が与えられる。与えられたＣＡＲＴ値は、分岐点（ｎｏｄｅ）の後のＳＬＥとして試料を分類するための発現レベル閾値である。例えば、単一遺伝子モデルＩＩでは、決定木（ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｔｒｅｅ）の第１の分岐点（ｎｏｄｅ  １）は、配列番号２の遺伝子の発現が＞０．１０３で有る場合について尋ねる。そうである（ｙｅｓである）場合、試料は狼瘡クラスに置かれる。図５Ｄは、モデル１の感度および特異性を示す。感度および特異性は、２および３の遺伝子モデルの両方ならびにトレーニングセットおよび交差検定上の両方に対して、与えられる。相対コストは、交差検定に対して与えられる。
【図５−３】図５は、全身性紅斑性狼瘡を同定するための診断用遺伝子、遺伝子セット、および診断用アルゴリズムを示す。図５Ｅは、ＣＡＲＴモデルＩの２遺伝子を示す。上記モデルは、２つの遺伝子を単一の分岐点で使用することで、試料を狼瘡（クラス１）または非狼瘡（クラス２）に分類する。図５Ｆは、ＣＡＲＴモデルＩの３遺伝子を示す。上記モデルは、トレーニングセットのために、第２の分岐点を用いてすべての試料を正しく狼瘡（クラス１）または非狼瘡（クラス２）に分類する。Ｇ２４１２＝配列番号５１４、Ｇ２６４８＝配列番号５１０、Ｇ１４３６＝配列番号５０９。
【図６】図６は、ＰＣＲプライマーのエンドポイント検査を示す。電気泳動法および微量流体法（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を用いて、遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの産物を評価する。図６Ａは、β−ＧＵＳゲル像である。レーン３はＧＵＳプライマーの像である。レーン２および１は、それぞれテンプレート非含有コントロールおよび−ＲＴコントロールに対応する。図６Ｂは、β−ＧＵＳプライマーの電気泳動（ゲル像から得たレーン３のグラフ図）を示す。図６Ｃは、β−アクチンのゲル像である。レーン３は、アクチンプライマーのエンドポイント検査のための像である。レーン２および１は、それぞれテンプレート非含有コントロールおよび−ＲＴコントロールに対応する。図６Ｄは、β−アクチンプライマーの電気泳動（ゲル像から得たレーン３のグラフ図）を示す。
【図７−１】図７は、マイクロアレイを用いて発見した遺伝子の差次的発現の、実時間ＰＣＲを使用した検証の図である。図７Ａは、Ｒ５０コントロールＲＮＡのＣｔとともに多重アッセイ上の各患者試料についてのＣｔを示す。三角形は、−ＲＴ（逆転写酵素）コントロールを表す。
【図７−２】図７は、マイクロアレイを用いて発見した遺伝子の差次的発現の、実時間ＰＣＲを使用した検証の図である。図７Ｂは、グランザイムＢ発現と基準アクチンとの間の倍差（ｆｏｌｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を示し、ＣＭＶ疾患を持つ患者およびＣＭＶ疾患を持たない患者から得た３つの試料に対して示されている。
【図８】実時間ＰＣＲコントロール遺伝子分析。同一患者から得た６つの単核球試料（ｍｏｎｏｎｕｃｕｌｅａｒ  ｓａｍｐｌｅｓ）（ＣＰＴ）と対をなす６つの全血試料（ＰＡＸ）上で実時間ＰＣＲを用いて、１１個の候補コントロール遺伝子を試験した。各試料を２回試験した。各遺伝子に対して、これらの試料での該遺伝子の可変性を縦軸（上側のグラフ）に示す。各遺伝子の平均Ｃｔ値もまた、示す（下側のグラフ）。ＰＡＸ試料に対して２μｇのＲＮＡを用い、単核試料（ＣＰＴ）に対して０．５μｇの全ＲＮＡを用いた。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
（発明の詳細な説明)
（定義）
別段に定めない限り、すべての科学用語および技術用語を、それらの用語が関連する技
術分野で慣用されている意味と同様の意味を有するものとして理解する。本発明の目的の
ために、以下の用語を下記のように定義する。
【００５４】
本発明の脈絡の中では、用語「遺伝子発現系（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙ
ｓｔｅｍ）」は、遺伝子発現を検出するための任意の系、装置（デバイス）、または手段
のことを意味し、診断薬、候補ライブラリーオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドセ
ット、またはプローブ等が含まれる。
【００５５】
用語「診断用オリゴヌクレオチド（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ）」または「診断用オリゴヌクレオチドセット（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｏｌｉｇ
ｏｎｕｌｃｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｔ）」は、一つのオリゴヌクレオチドまたは２個以上のオ
リゴヌクレオチドからなるセットを意味し、差次的発現について評価した際に、それらの
オリゴヌクレオチドに対応した遺伝子は、予測的データを集合的に生成する。そのような
予測データは、概して診断、予後、治療結果のモニタリング等に関する。一般に、診断用
オリゴヌクレオチドまたは診断用オリゴヌクレオチドセットの構成要素は、予測値を与え
るＤＮＡ配列の突然変異または多型よりはむしろ、診断用オリゴヌクレオチドセットの構
成要素の発現パターンであるという点で、疾患等の特定の形質または表現型と相関するこ
とから、個体の遺伝子型を直接決定するためにＤＮＡ分析によって評価されるオリゴヌク
レオチド配列と区別される。診断用オリゴヌクレオチドセットの特定の構成要素（または
成分）が、場合によっては、種々の周知分析法（例えばサザンブロット法、ＲＦＬＰ、Ａ
ＦＬＰ、ＳＳＣＰ、およびＳＮＰ）のいずれかによる直接的な遺伝子タイピングに従う一
つ以上の突然変異または多型を示すこともできると理解される。
【００５６】
「診断用遺伝子（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｇｅｎｅ）」は、発現が診断用オリゴヌクレ
オチドまたは診断用オリゴヌクレオチドセットによって検出される遺伝子である。
【００５７】
「疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａ
ｒｇｅｔ  ｏｒｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」  は、疾患または疾
患群に対する治療標的であるポリペプチド、最も一般的にはタンパク質、あるいは治療マ
ルチサブユニットタンパク質の一サブユニットをコードする遺伝子または他のオリゴヌク
レオチドである。
「候補ライブラリー（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）」または「候補オリゴヌク
レオチドライブラリー（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｂ
ｒａｒｙ）」は、一つ以上の基準によって特定の疾患または疾患群と関連している可能性
が高い複数のオリゴヌクレオチド配列（または遺伝子配列）からなる集合を意味する。上
記基準は、例えば、疾患状態での差次的発現パターンまたは科学的もしくは技術的文献で
報告されたようなインビトロでの活性化または休止している白血球での差次的発現パター
ン、配列データベースで報告されているような組織特異的発現、あるいは目的とする組織
もしくは細胞型での差次的発現である。一般に、候補ライブラリーは、少なくとも２つの
成分または構成要素、より一般的にはライブラリーは、約１０以上、または約１００、ま
たは約１，０００、またはそれ以上の成分または構成要素を有する。
【００５８】
用語「疾患基準（ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）」は、本明細書では疾患の指
標を示すために用いられ、該指標として、例えば、診断因子、予後因子、病歴または家族
歴によって示される因子、遺伝的要因、または症候、同様に、上記リストから選択される
ようないくつかの指標に関連した疾患の明白な、または確かな診断が挙げられる。疾患基
準として、過去にさかのぼる健康データまたは将来の健康データ（例えば、患者の病歴、
臨床検査結果、診断試験結果、臨床イベント、投薬、リスト、治療に対する反応、および
危険因子）を含む患者の健康状態を記述したデータが挙げられる。
【００５９】
自己免疫疾患は、患者の免疫系がその患者の器官または組織にある抗原を外来のものと
して認識して活性化される疾患状態として定義される。活性化免疫細胞は、さらに、刺激
されている器官もしくは組織に対して損傷を与えることがあり、または他の器官もしくは
組織に対して損傷を与えることがある。場合によっては、上記疾患は、自己抗原を外来の
ものと認識することよりも、免疫系細胞の制御不調によって引き起こされるかもしれない
。無調整な免疫細胞は、前進炎症を引き起こす炎症性サイトカインを分泌する可能性があ
り、または自己抗原を外来のものと認識する可能性がある。
【００６０】
自己免疫疾患の例として、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、１型糖尿病
、リウマチ性関節炎、乾癬、全身性紅斑性狼瘡、  橋本甲状腺炎，グレーヴズ病、強直製
脊椎関節炎  シェーグレン疾患，クレスト症候群，強皮症、および多くの疾患が挙げられ
る。
【００６１】
多くの自己免疫疾患は、慢性炎症性疾患でもある。このことは、炎症細胞（白血球）の
長期（＞６ヶ月）活性化に伴う疾患プロセスとして定義される。慢性炎症は、患者の器官
または組織の損傷につながる。多くの疾患が慢性炎症性疾患であるが、自己免疫性の土台
をなすものを持つことは知られていない。例えば、アテローム性動脉硬化症、溢血性心不
全、クローン病  疾患、潰瘍性大腸炎、結節性多発性動脈炎、ウィップル病、原発性硬化
性胆管炎  、および数多くの疾患が挙げられる。
【００６２】
用語「分子的特徴（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」または「発現プロフ
ィル（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ）」は、候補ライブラリーを構成する複数
の成分（例えば、少なくとも２、多くの場合約１０、約１００，約１，０００、もしくは
それ以上）に対する発現値の集合を意味する。多くの場合、分子的特徴は、候補もしくは
診断用ヌクレオチド配列または遺伝子のライブラリーまたはアレイのヌクレオチド配列全
てに対する発現パターンを表す。あるいは、上記分子的特徴は、候補ライブラリーの１つ
以上のサブセットの発現パターンを表す。用語「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ）」は、２つ以上のヌクレオチドを意味する。ヌクレオチドは、天然また
は合成のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「健康な個体（ｈｅａｌｔｈｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」
は、特定の疾患または疾患基準に関連している。すなわち、個体は特定の疾患基準を示す
ものではなく、また特定の疾患と診断されるものではない。問題となっている個体は、も
ちろん、症状を示すことができるか、もしくは別の疾患に対する種々の指標因子を持つこ
とができることがわかるだろう。
【００６４】
同様に、「疾患と診断された個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｗｉ
ｔｈ  ａ  ｄｉｓｅａｓｅ）」は、特定の疾患（または疾患基準）と診断された個体を意
味する。そのような個体は、別の疾患（関連または非関連疾患）に関連した、または該疾
患と診断された疾患基準も示す。
【００６５】
用語「モニタリング（ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）」は、本明細書では、個体または個体の
健康もしくは疾患状態についての有用な状態を提供するために遺伝子セットを使用するこ
との説明に用いられる。「モニタリング」として、予後の決定、重症度分類、薬物療法の
選択、進行中の薬物療法の評価、結果の予測，治療に対する応答測定、疾患または疾患合
併症、時間とともに疾患の進行を追うことまたは患者健康状態に関して任意の情報を提供
すること、投薬が標識を持つ必要がない疾患の小さなサブユニットにとって重要であると
思われる既知の作用分子機構である実験的治療から得られる利益を得そうな患者を選択す
ること、より侵襲的／高価な試験、例えば非侵襲的血液試験からより侵襲的なオプション
（例えば生検）に至る検査のカスケードを決定する手助けするために、患者集団をスクリ
ーニングすること、または別の適応症を治療するために用いられる薬物の副作用を評価す
る検査が挙げられる。
【００６６】
「アレイ（ａｒｒａｙ）」は、空間的または論理的に組織化された集まり、例えばオリ
ゴヌクレオチドによってコードされたＲＮＡまたはタンパク質等のオリゴヌクレオチド配
列またはヌクレオチド配列産物である。いくつかの実施形態では、アレイは候補ライブラ
リーの産物に特異的な抗体または他の結合試薬を含む。
【００６７】
発現パターンに言及する場合、遺伝子発現での「質的（ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ）」な
違いは、相対値が割り当てられない違いを意味する。すなわち、そのような違いは、「全
か無の（ａｌｌ  ｏｒ  ｎｏｔｈｉｎｇ）」の評価によって示される。そのような全か無
の評価は、例えば発現が検出閾値を上回るか、または下まわるか（発現のオン／オフ／パ
ターン）であることができる。あるいは、質的違いは発現産物の異なる種類、例えば異な
る対立遺伝子（突然変異または多形対立遺伝子等）および変異体（配列変異体および翻訳
後修飾変異体を含む）を意味する。
【００６８】
対照的に、遺伝子発現のパターンについて言及する場合、「量的（ｑｕａｎｔｉｔａｔ
ｉｖｅ）」違いは、段階的なスケールで値を割り当てることができる発現の違いを意味す
る（例えば、０〜５または１〜１０スケール、＋〜＋＋＋スケール、または１等級〜５等
級スケール；説明のために選択される数が完全に任意なものであり、発明を制限するため
に解釈されるべきものではないと理解される）。
【００６９】
（遺伝子発現系と遺伝子発現を検出するための方法）
本発明は、配列表に示したオリゴヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出するヌク
レオチド配列を持つ１つ以上のＤＮＡ分子を持つ遺伝子発現系による遺伝子発現の検出方
法を目的とする。一態様では、オリゴヌクレオチドは、白血球で差次的発現する遺伝子の
発現を検出する。上記遺伝子発現系は、候補ライブラリー、診断薬、診断用オリゴヌクレ
オチドセット、または診断用プローブセットであってもよい。上記ＤＮＡ分子は、ゲノム
ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質核酸（ＰＮＡ）、ｃＤＮＡ、または合成オリゴヌクレオチド
であってもよい。本明細書で教示した処置に続いて、白血球での遺伝子発現を分析するた
めに目的とする配列を同定することができる。そのような配列は疾患状態を予測すること
が可能である。
【００７０】
（本発明の診断用オリゴヌクレオチド）
本発明は、相関が個体の健康状態とヌクレオチド配列に対応するＲＮＡまたはタンパク
質産物の個体での発現とのあいだに存在する、表２および配列表に記した白血球候補ライ
ブラリーの成分を含む診断用オリゴヌクレオチドおよび診断用オリゴヌクレオチドセット
に関する。場合によっては、そのような検出に必要なオリゴヌクレオチドは１つだけであ
る。診断用オリゴヌクレオチドセットの成分を、ＲＮＡまたはタンパク質産物の発現を検
出することが可能な任意の手段によって同定することができ、該手段として、限定される
ものではないが、差次的発現スクリーニング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＡＧＥ分析、》
高性能配列解読装置、マイクロアレイ、液体または他のアレイ、タンパク質をベースとし
た方法（例えば、ウェスタンブロット法、プロテオミクス、および本明細書に記載した他
の方法）、ならびに、本明細書でさらに記載されるように、データマイニング法が挙げら
れる。
【００７１】
一実施形態では、診断用オリゴヌクレオチドセットは、少なくとも１つの疾患基準なし
で個体での発現に関連して少なくとも１つの白血球が関与する疾患に対する少なくとも１
つの疾患基準で、個体の白血球で差次的に発現される表２または配列表に記された少なく
とも２つのオリゴヌクレオチド配列を含み、２つ以上のヌクレオチドの発現が、以下に述
べるように、少なくとも１つの疾患基準と相関している。
【００７２】
別の実施形態では、診断用オリゴヌクレオチドセットは、差次的に発現され、かつ差次
的発現／相関がこれまでは記述されていなかった表２または配列表に記されたオリゴヌク
レオチド配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態
では、診断用オリゴヌクレオチドセットは、アレイ上に固定される。
【００７３】
別の実施形態では、診断用オリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドセット）は
、表２および配列表に記された白血球候補ライブラリーの成分に関連しており、それに対
して相関が個体の健康状態（または疾患基準）のあいだに存在する。診断用オリゴヌクレ
オチドは、表２および配列表に記された候補ライブラリーの成分の完全長遺伝子配列（ま
たは予測された完全長遺伝子配列）に部分的または全体的に含まれる（または由来する）
。
【００７４】
上記診断用オリゴヌクレオチドは、相関配列または完全長遺伝子と共発現する他の遺伝
子に由来するものであってもよい。複数の遺伝子は、複数の発現パターンを共有すること
ができる。なぜなら、それらは同一の分子経路で調節されるからである。発現に類似性が
あることから、行動遺伝子が診断用遺伝子セットにおける診断用遺伝子の代わりとなりう
る点で、該行動遺伝子が代理物として同定される。実施例４は、上記データからの代理物
の発見を明示する。代理オリゴヌクレオチドおよび代理オリゴヌクレオチドセットを、代
理遺伝子の発現を検出し、それによって疾患を持つ患者の診断またはモニタリングをおこ
なうことに利用することができる。
【００７５】
本明細書で使用されるように、用語「遺伝子クラスター（ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ）
」または「クラスター（ｂｌｕｓｔｅｒ）」は、発現パターンによって関連づけられた遺
伝子からなる群を意味する。すなわち、遺伝子のクラスターは、異なる条件（例えば、慢
性自己免疫疾患もしくは慢性炎症性疾患を有する患者または慢性自己免疫疾患または慢性
炎症性疾患を持たない患者）でも同様の調節がなされた遺伝子からなる遺伝子クラスター
である。１つのクラスター内の各々の遺伝子の発現プロファイルは、そのクラスター内の
少なくとも１つの他の遺伝子の発現プロファイルと相関させるべきである。相関の評価は
、種々の統計学的方法を用いておこなってもよい。この明細書で用いられるように、用語
「代理物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）」は、診断分析で診断用遺伝子の代わりとして用いるこ
とが可能な発現プロファイルを持つ遺伝子を意味する。そのような遺伝子は、しばしば診
断用遺伝子としての同一遺伝子クラスターのメンバーである。そのような診断用遺伝子セ
ットの各成分に対して、以下に説明するような類似の発現パターンを持つ遺伝子の同定を
介して、潜在的な代理物のセットを同定することができる。
【００７６】
多くの統計解析は、相関係数を発生することで、２つの遺伝子発現パターン間の相関性
を記述する。相関係数が０．８以上の場合、パターンは相関していると考えてもよい。好
ましい実施形態では、相関係数は０．８５、０．９、または０．９５を超えなければなら
ない。他の統計学的方法は、一定量の相互情報を生成して、２つの遺伝子発現パターン間
の相関性を記述する。標準化相互情報値が０．７以上の場合、パターンは相関していると
考えられる。好ましい実施形態では、標準化相互情報値は、０．８、０．９、または０．
９５を超えなければならない。パターンが遺伝子発現データの階層的クラスタリングに密
接に集まる場合、該パターンも同様に考えることができる（Ｅｉｓｅｎら，１９９８）。
類似パターンは、階層的クラスタリングで最も近い１、２、５、１０、２０、５０、また
は１００の隣り合うものの中にあるか、あるいは類似度（Ｅｉｓｅｎら，１９９８）が０
．５、０．７、０．８、０．９、０．９５、または０．９９を上回る遺伝子である可能性
がある。類似パターンを、ＣＡＲＴ（Ｂｒｅｎｎａｎら，１９９４）による分類木の中で
代理物であるとわかる遺伝子として同定することも可能である。しばしば、しかし常にで
はないが、遺伝子クラスターの成分は、類似の遺伝子発現パターンに加えて、類似の生物
学的機能を持っている。
【００７７】
本発明の診断用遺伝子に対して、相関している遺伝因子、クラスター、および代理物が
同定されている。これらの代理物を、アッセイの際に、代用物として診断用遺伝子の代わ
りに、または該診断用遺伝子に加えて用いることが可能であると理解される。
【００７８】
本発明も、診断用プローブセットを提供する。プローブが、限定されるものではないが
、増幅ＤＮＡ、増幅ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、部分的または完全長核
酸配列を含む診断用ヌクレオチドセットのヌクレオチド配列を特異的に同定することが可
能な任意の試薬を含むものであると理解される。また、プローブは、診断ヌクレオチド配
列のタンパク質産物（例えば、抗体および他の親和性試薬）を識別することが可能である
。
【００７９】
また、各々のプローブが１つの遺伝子に対応、複数のプローブが１つの遺伝子に対応、
もしくはその両方、または１つのプローブが２つ以上のプローブに対応すると理解される
。
【００８０】
開示された核酸分子の相同体と変異体とを本発明で用いてもよい。標準の方法を使用し
て整列配置する場合、これらの核酸分子の相同体および変異体は配列同一性が比較的高い
。本発明に包含される配列は、本明細書で開示した配列に対して、配列同一性が少なくと
も４０〜５０、５０〜６０、７０〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、または
９５〜１００％である。
【００８１】
発現プロファイリングに関して、開示された配列での変異が依然として遺伝子発現の検
出を可能とすることが理解される。遺伝子発現検出に求められる配列同一性の程度は、オ
リゴマーの長さに依存して変化する。６０マー（ヌクレオチド数が６０個のオリゴヌクレ
オチド）では、６０マー中での６〜８のランダム突然変異または６〜８のランダム欠失は
、遺伝子発現検出に影響を及ぼさない。Ｈｕｇｈｅｓ，ＴＲ，ら，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ
ｂｙ  ａｎ  ｉｎｋ  ｊｅｔ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｒ．」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：３４３−３４７（２００１
）。ＤＮＡ配列の長さが増加するにつれて、まだ遺伝子発現検出が可能なあいだ、許容さ
れる突然変異数または欠失数が増加する。
【００８２】
当業者によって認められるように、本発明の配列は配列決定エラーを含む可能性がある
。すなわち、誤ったヌクレオチド、フレームシフト、未知のヌクレオチドまたは配列決定
エラーの他の型が配列のいずれかにある可能性がある。しかし、正しい配列は本明細書で
は相同体および厳密性の定義に入る。
【００８３】
ヒトゲノムでの特異的ハイブリダイゼーションのために必要なオリゴヌクレオチドプロ
ーブの最小長は、２通りの方法を使用して推定されることができる。第１の方法は、プロ
ーブが偶然にヒトゲノムにおいてユニークであるという統計議論を使用する。手短に言う
と、複雑さＣのゲノムで長さＬのオリゴヌクレオチドに対して予想される独立完全一致（
Ｐｏ）の数は、以下の等式によって求めることができる（Ｌａｉｒｄ  ＣＤ，Ｃｈｒｏｍ
ｏｓｏｍａ  ３２：３７８（１９７１）。すなわち、
Ｐｏ＝（１／４）Ｌ＊２Ｃ
である。
【００８４】
ほ乳類ゲノムの場合、２Ｃ＝〜３．６ｘ１０９であり、１４〜１５ヌクレオチドのオリ
ゴヌクレオチドはゲノムで一度だけ見られると思われる。しかし、哺乳類のゲノムのコー
ド配列中のヌクレオチドの配分は無作為でなく（Ｌａｔｈｅ，Ｒ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．１８３：１（１９８５））、より長いオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションの
特異性の増加にとって好ましいと思われる。実際的な条件では、このことは長さが１９〜
４０ヌクレオチドのプローブでうまくいく（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（上掲））。特異的
プローブの長さを推定する第２の方法は、選択された条件下でハイブリダイズするのに十
分な長さのプローブを用いることで、またその配列をサーチしてヒトゲノム中の配列に一
致させ、ユニークな一致を選択するコンピュータを使用することである。プローブ配列は
、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）の第１１章で記述されるように、所望のハイブリダイゼー
ション特性に基づいて選択される。ＰＲＩＭＥＲ３プログラムは、これらのプローブを設
計することに役立つ（（Ｓ．Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ  １９９６，
１９９７；プライマー３はウェブサイト（ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎ
ｏｍｅｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／プライマー３．ｈｔｍｌ）で入手可能である。こ
れらのプローブの配列は、ＢＬＡＳＴまたはＭＥＧＡＢＬＡＳＴのようなプログラムを使
用して、ヒトゲノム配列のデータベースに対して、ペアワイズで比較される（Ｍａｄｄｅ
ｎ，Ｔ．Ｌら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１）。大部
分のヒトゲノムが現在データベースに含まれるので、一致する数が測定される。所望のタ
ーゲット配列に対してユニークであるプローブ配列が選択される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、診断用オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプロー
ブは、アレイ上に固定される。このアレイは、任意に、一つ以上のチップアレイ、プレー
トアレイ、ビーズアレイ、ピンアレイ、膜アレイ、固体表面アレイ、液体アレイ、オリゴ
ヌクレオチドアレイ、ポリヌクレオチドアレイもしくはｃＤＮＡアレイ、マイクロタイタ
ープレート、ピンアレイ、ビーズアレイ、膜、またはチップを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、上記白血球関連疾患は、表３に記された疾患から選択される
。別の実施形態では、上記疾患は慢性自己免疫および炎症性疾患、全身性紅斑性狼瘡（Ｓ
ＬＥ）、ならびにリウマチ性関節炎である。
【００８７】
いくつかの実施形態で、本発明の診断用オリゴヌクレオチドは、疾患状態に関連してい
ることがしられている遺伝子（「既知のマーカー」）と組み合わせて診断用遺伝子として
用いられる。既知のマーカーを診断用オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることで、
既知マーカー単独では得られない情報を提供することができる。既知マーカーとして、提
供した従来の表によって同定されたものが挙げられる。
【００８８】
（一般分子生物学的参考文献）
本発明の文脈のなかで、核酸および／またはタンパク質は、周知の分子生物学的技術に
よって操作される。そのような数々の方法についての詳細なプロトコールは、例えば、Ａ
ｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ（２０００年を通して増補）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．
１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓ
ｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」），な
らびに  ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖ
ｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ（「Ｂｅｒｇｅｒ」）に記載されている。
【００８９】
上記参照に加えて、例えば本発明のｃＤＮＡプローブの増幅に有用なインビトロ増幅技
術、例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑレプリカーゼ
増幅、および他媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）のＲＮＡポリメラーゼのプロトコールは
、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（
Ｉｎｎｉｓら，編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
（１９９０）（「Ｉｎｎｓ」）；ＡｒｎｈｅｉｍおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０）Ｃ
＆ＥＮ  ３６；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）
３：８１；Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８
６，１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら，（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃ
ｉ  ＵＳＡ  ８７：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら，（１９８９）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  
３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７
７；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１；Ｗｕお
よびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら，（１９
９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７，ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９
５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３に見いだされる。本発明の文脈で核酸の
クローニングに有用なさらなる方法として、Ｗａｌｌａｃｅら，の米国特許第５，４２６
，０３９号が挙げられる。ＰＣＲによる大きな核酸を増幅する改善された方法が、Ｃｈｅ
ｎｇら，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４およびそこに挙げられた参照にまと
められている。
【００９０】
本発明の特定のポリヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドは、モノヌクレオチド
および／またはトリヌクレオチドに基づくホスホラミダイトカップリング化学を含む種々
の固相戦略を利用して合成することができる。例えば、核酸配列は、活性モノマーおよび
／またはトリマーを、伸びているポリヌクレオチド鎖へ連続的に追加することによって合
成することができる。例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら，（１９９２）Ｍｅｔｈ  
Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３を参照。
【００９１】
所望の配列を合成する代わりに、本質的にどのような核酸であっても種々の商業的供給
元に特別注文することが可能である。そのような供給元として、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒ
ｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、
Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ），
ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ，Ｉｎｃ．（ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ｏｐｅｒｏｎ．ｃｏｍ）、その他多くがある。
【００９２】
同様に、核酸およびタンパク質マイクロアレイの商業的供給元が利用可能であり、例え
ばＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ  ａｎｄ  Ａ
ｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡが挙げられる。
【００９３】
本発明に関連した一領域は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションである。当
業者は、ハイブリダイゼーションの厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）に基づくハイブリダ
イゼーション条件を区別する。例えば、厳密性の高い（高ストリンジェント）条件として
、０．５  Ｍ  ＮａＨＰＯ４，７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、  および１  ｍ
Ｍ  ＥＤＴＡ中、６５℃でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションをお
こない、６８℃で０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄することを含むことも可能であ
る（（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら，，ｅｄｓ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  
＆  ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ａｔ  ｐ．２．１０．３）。中程度のスト
リンジェント条件として、例えば、０．２ＸＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ、４２℃での洗浄
が含むことも可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら，，１９８９，上掲）。
【００９４】
本発明は、本発明のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、そのことから該ＤＮＡ配列の相補
体でもある核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も含む。そのようなハイブリダイゼーション
条件は、上記したように、厳密性の高いものであっても、厳密性がやや劣るものであって
もよい。例えば、核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ（ｏｌｉｇｏ）」で
ある場合、高ストリンジェント条件は、例えばピロリン酸ナトリウム、３７℃（１４塩基
オリゴヌクレオチド用）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチド用）、５５℃（２０塩基
オリゴヌクレオチド用）、および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチド用）で６×ＳＳＣ
／０．０５％ナトリウムピロホスフェート中で洗浄することを意味することができる。こ
れらの核酸分子は、標的ヌクレオチド配列アンチセンス分子として作用することができ、
該分子は標的ヌクレオチド配列調節で、および／または標的ヌクレオチド配列核酸配列の
増幅反応でのアンチセンスプライマーとして、有用である。さらに、そのような配列は、
リボザイムの一部として、および／またはトリプルへリックス配列にとっても有用である
と思われ、また標的ヌクレオチド配列制御にも有用である。またさらに、そのような分子
を、疾患を生ずる対立遺伝子の存在が検出可能である診断方法の構成要素として用いるこ
とができる。
【００９５】
（候補ライブラリー）
白血球で差次的に発現される候補遺伝子のライブリーは、診断用オリゴヌクレオチドお
よびオリゴヌクレオチドセットと疾患特異的標的ヌクレオチド配列の同定および評価用の
基質である。
【００９６】
白血球という用語は、一般的に、有核赤血球ではない任意の有核血液細胞のことをいう
ために使用される。より具体的には、白血球は大まかに２つのクラスに分離される。第１
のクラスは顆粒球、最も広く行き渡って、例えば好中球が含まれ、同様に低い頻度で好酸
球および好塩基球が含まれる。第２のクラスは、非顆粒または単核の白血球であり、単球
およびリンパ球（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）が含まれる。炎症性およびリウマチ性疾
患、神経変性疾患（例えば、例えばアルツハイマーの痴呆）、心血管疾患、内分泌疾患、
移植拒絶、悪性腫瘍、および感染疾患、ならびに表３に示す他の疾患等の多種多様な疾患
プロセスにおける白血球（例えば、好中球、単球、およびリンパ球）に関連した詳細な技
術文献がある。単核球は、慢性免疫応答（白色顆粒球）に含まれ、白血球のほぼ６０％を
占めており、急性炎症性刺激に対する非特異的で型にはまった反応を示し、しばしば生存
期間は２４時間のみである。
【００９７】
多数の疾患関連プロセスでのそれらの広範囲にわたる関与および／または影響に加えて
、白血球は種々の理由から、臨床的および実験的な評価にとって特に魅力的な基質である
。最も重要なことは、それらが本質的にあらゆる潜在的被験体から低コストで容易に利用
されることである。採取は、最小限に侵襲的でほとんど痛みがなく、障害も少なく、ある
いは回復時間も最小限である。採取は、種々の臨床および非臨床的設定で、著しい技術的
支出なしに、最小限に訓練された人員（例えば採血者、医療技術者等）によって行うこと
ができる。また、白血球を新しくすることができ、一人の被験体に対して複数の時間点で
利用可能である。
【００９８】
（初期候補ライブラリーのアセンブリー）
初期候補ライブラリーは、「マイニング」刊行物および配列データベースと差次的発現
ライブラリーの構築とから組み立てられた。ライブラリー内の候補オリゴヌクレオチド配
列は、完全長または部分的な核酸配列、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列、ｃＤＮＡ配列
、ＲＮＡ配列、合成オリゴヌクレオチド配列等によって示され得る。核酸配列は、長さが
少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチ
ド、少なくとも１００ヌクレオチド、またはそれ以上の長さのものとすることができる。
あるいは、候補ヌクレオチド配列のタンパク質生成物は、さらに後述のように、標準的方
法を使用して候補ライブラリー中に示され得る。診断用オリゴヌクレオチドの選択および
確認では、長さが５０ヌクレオチドの核酸配列を使用して、８，０３１の候補オリゴヌク
レオチド配列からなる初期ライブラリーを、後述のように構築した。
【００９９】
（候補ヌクレオチドライブラリー）
発明者らは、活性化白血球と休止白血球で差次的に発現される初期候補ヌクレオチドラ
イブラリーの成分を同定した。その初期候補ヌクレオチドライブラリーから、５０２候補
からなるプールを選択した。したがって、本発明は配列表および表２に示されるヌクレオ
チド配列を含む候補白血球ヌクレオチドライブラリーを提供する。別の実施形態では、本
発明は表２および配列表に示される少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む候補ライブ
ラリーを提供する。もう一つの実施形態では、少なくとも２つのヌクレオチド配列は、長
さが１８ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、ま
たは少なくとも１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列
は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列、リボ核酸（ＲＮＡ）配列、合成オリゴヌクレオチ
ド配列、またはゲノムＤＮＡ配列を含む。ヌクレオチド配列が各々１つの遺伝子と一致す
る可能性があり、あるいはいくつかのヌクレオチド配列が１つの遺伝子と一致する可能性
があり、さもなければ単一のヌクレオチド配列が同義遺伝子と一致する可能性があると理
解される。
【０１００】
本発明は、候補ヌクレオチドライブラリーに対するプローブも提供する。本発明の一実
施形態では、プローブは表２または配列表でリストされる少なくとも２つのヌクレオチド
配列を含む。これらのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの白血球関連疾患のための少
なくとも１つの疾患基準を持つ個体の白血球および少なくとも１つの疾患基準を持たない
個体の白血球で差次的に発現される。２つ以上のヌクレオチド配列の発現は、少なくとも
１つの疾患基準と相関している。プローブが候補ヌクレオチドライブラリーのＲＮＡ発現
またはタンパク質生成物発現を検出する可能性があると理解される。代わりに、またはそ
れに加えて、プローブは、さらに後述するように、候補ヌクレオチド配列に関連した遺伝
子型を検出することができる。別の実施形態では、候補ヌクレオチドライブラリーのプロ
ーブがアレイの上で固定される。
【０１０１】
本発明の候補ヌクレオチドライブラリーは、本発明の診断用ヌクレオチドセットを同定
することに有用であり、それ自身が、後述するように、本発明の診断用ヌクレオチドセッ
トである。候補ヌクレオチド配列を、さらに特徴づけることが可能であり、また疾患標的
ヌクレオチド配列として、後述するように、同定してもよい。後述するように、候補ヌク
レオチド配列は、像形成（イメージング）試薬としての用途にも適していると思われる。
【０１０２】
（発現パターンの生成）
（ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質試料の獲得）
差次的に発現された候補ヌクレオチド配列のライブラリーの同定または構築した後で、
候補ライブラリーの複数成分に対応した白血球発現プロフィールが得られる。一人以上の
被検体からの白血球試料が標準的な方法によって得られる。最も代表的に、これらの方法
では、末梢血を経皮−静脈経由で採血する。末梢血管系から全血の循環白血球を採取する
ことが、一般的に最も単純で、侵襲が最小であり、さらに最も低コストの選択肢である一
方で、多数の他の採取法があり、ある状況下では好ましく用いられることはいうまでもな
い。実際、例えば、正中線（ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｉｎｅ）、中心動脈、または実際に心臓
カテーテル、あるいは中央血管系に接近する外科的手技の際に得られる末梢血管系から採
取された白血球間には、関連する差異が存在しない。また、少なくとも部分的に白血球か
ら構成される他の体液および組織も所望の白血球試料である。例えば、気管支鏡検査法の
間、肺から得られる流体試料は、白血球が豊富であり、かつ本発明の文脈中で発現プロフ
ァイリング、例えば診断、予後、または肺移植拒絶、炎症性肺疾患、もしくは感染肺疾患
のモニタリングが影響を受けやすい。他の組織の流体試料、例えば結腸、洞、食道、胃、
小腸、膵管、胆管系、膀胱、尿管、膣、頸部または子宮、その他の内視鏡検査によって得
たものも好適である。試料を、白血球を含む他の源、例えば尿、胆汁、脳脊髄液、大便、
胃または腸管の分泌物、精液、または固形の器官もしくは関節生検から得てもよい。
【０１０３】
最も高い頻度で、白血球の混合集団（例えば全血で見いだされたもの）を本発明の方法
で利用する。粗分離（例えば赤血球からの混合白血球の粗分離）および／または濃縮化（
例えばショ糖、パーコール、もしくはフィコール勾配上での濃縮化）または他の公知方法
を用いて、十分な濃度でＲＮＡまたはタンパク質の発現産物の回収を促進し、および非特
異的バックグラウンドを減少させることができる。いくつかの例では、白血球の亜母集団
を精製することが好ましくあり得、それを行う方法、例えば密度または親和性勾配、フロ
ーサイトメトリー、標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）、免疫磁気分離、「パニング」等が入
手可能な文献および下記に説明されている。
【０１０４】
（発現プロファイリングのためのＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質試料の入手）
種々の技術は、全血からのＲＮＡの単離に利用され得る。細胞（ｒＲＮＡおよびｔＲＮ
Ａの存在または非存在下で）からのｍＲＮＡの単離を可能にするいかなる技術でも、利用
され得る。手短に言えば、後に続く遺伝子発現分析に好適な信頼性が高い全ＲＮＡの単離
を可能にする１つの方法を以下に説明する。被験体から末梢血（静脈または動脈のいずれ
か）を抗凝固剤（例えばＥＤＴＡ、クエン酸塩、ヘパリンなど）の入った１本以上の滅菌
した内毒素無しの試験管に取る。代表的には、上記試料は少なくとも２つの部分に分けら
れる。ＤＮＡまたはタンパク質の将来の分析のために、例えば、５〜８ｍｌの全血の一部
を凍らせて保存しておく。第２の部分、例えば約８ｍｌの全血の第２の部分は、Ｓａｍｂ
ｏｏｋ，Ａｕｓｕｂｅｌ、下記、および米国特許第５，７２８，８２２号および第４，８
４３，１５５号等に記載されたような種々の技術のいずれかによる全ＲＮＡの単離用に処
理される。
【０１０５】
代表的に、約８ｍｌの全血（ほとんどの状況下で直ちに成人被験体から入手可能な量）
から得られる単核白血球の被験体試料から、完全ＲＮＡが５〜２０μｇ得られる。この量
は、例えば、少なくとも２つのプローブアレイに対して標識およびハイブリダイゼーショ
ンを行う上で十分な量である。候補ライブラリーのヌクレオチドの発現パターンを分析す
るための標識プローブを、標準的な方法を用いて被験体のＲＮＡの試料から調製する。多
くの場合、ｃＤＮＡはポリＴプライマー標識（例えば放射性または蛍光）ヌクレオチドと
を用いて、全ＲＮＡから合成される。次に、結果として生じる標識ｃＤＮＡを、候補ヌク
レオチドライブラリーの成分に対応するプローブとハイブリダイズさせ、ライブラリーの
各ヌクレオチド配列に対して、発現データを得る。被験体試料（例えば、他の生物学的流
体および試料から得た白血球または末梢血白血球）から単離したＲＮＡを候補ライブラリ
ーのヌクレオチドの発現パターンの分析のために用いる。
【０１０６】
場合によっては、しかし、白血球試料から抽出されるＲＮＡの量が制限されるので、Ｒ
ＮＡの増幅が望ましい。増幅は、プローブ標識の効率を増加させることによって、または
標識前にＲＮＡ試料を増幅することによって達成可能である。増幅プロセスの間、いかな
るバイアス（遺伝子発現レベルに関して）も導入しない増幅手順を選択するために、注意
しなければならないことが理解される。
【０１０７】
いくつかの方法は利用でき、これらの方法は、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ（ガラス蛍光標
識キット（Ｇｌａｓｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ））もしく
はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（フェアプレイマイクロアレイ標識キット（Ｆａｉｒｐｌａｙ  
Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ））、またはマイクロマックスキット
（Ｍｉｃｒｏｍａｘ  ｋｉｔ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｉｎｃ．）
を用いて、限定量のＲＮＡからのシグナルを増加する。あるいは、標識がない状態でＴ７
−ポリＴプライマーを用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（３Ｄ
ＮＡ  Ｓｕｂｍｉｃｒｏ）由来のＤＮＡデンドリマーをプライマー上でポリＴ配列とハイ
ブリダイズさせるか、もしくは蛍光標識配列に対して相補的な種々の「キャプチャー配列
」とハイブリダイズさせる。各々の３ＤＮＡ分子は２５０個の蛍光分子を持つので、各ｃ
ＤＮＡを強く標識することができる。
【０１０８】
あるいは、ＲＮＡ試料を標識に先立って増幅する。例えば、米国特許第６，１３２，９
９７号に記載されるように、線形増幅をおこなってもよい。Ｔ７−ｐｏｌｙＴプライマー
を用いてＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成する。次いで、第２のＤＮＡ鎖を作って増幅のた
めの基質を完成させる。プライマーに組み込まれたＴ７プロモーターを用いて、Ｔ７ポリ
メラーゼにより、オリジナルＲＮＡのアンチセンスコピーを多数作る。蛍光色素標識した
ヌクレオチドを、直接ＲＮＡに組み込む。あるいは、アミノアリル標識ヌクレオチドをＲ
ＮＡに取り込み、次いで、Ｈｕｇｈｅｓら、２００１の記載にしたがって、蛍光色素をア
ミノアリル基に化学的に結合させる。増幅のための他の例示的な方法は後述する。
【０１０９】
単離されたＲＮＡは、白血球由来のＲＮＡを含むはずであるが、程度の差はあっても他
の細胞型のＲＮＡを含む可能性があると考えられる。その上、単離ＲＮＡは、先に述べた
ように白血球（例えば単球および／またはＴリンパ球）のサブセットに由来する可能性が
ある。ＲＮＡ誘導のために使用される細胞型のそのような考慮は、使用される発現プロフ
ァイリングの方法に依存する。白血球のサブセットは、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ
）、微量流体法（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）細胞分離システム、または種々の他の方
法によって得られることができる。細胞分取は、診断用遺伝子セットの発見のために、産
物としての遺伝子セットの実現または両方のために、必要と思われる。細胞分取は、種々
の技術（Ｇａｌｂｒａｉｔｈら、１９９９，Ｃａｎｔｏｒら、１９７５を参照のこと、ま
たＧｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡの技術を参照のこと）
で、達成できる。
【０１１０】
ＤＮＡ試料は、ＤＮＡ突然変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、または他の多型の存在につい
て分析するために入手し得る。ＤＮＡは、標準技術（例えばＭａｎｉａｔｕｓ、上掲）を
用いて単離される。
【０１１１】
候補ヌクレオチド産物の発現もプロテオミクスを使用して評価可能である。タンパク質
は、患者血清または白血球細胞タンパク質由来の試料で検出される。血清の調製は、標準
の方法を用いて全血の遠心によっておこなう。血清中に存在するタンパク質は、種々の白
血球および非白血球細胞のいずれかから産生され得、白血球から分泌されたタンパク質を
含み得る。あるいは、白血球または白血球の所望の亜母集団の調製は、先に述べたようお
こなう。白血球のサンプルからの細胞タンパク質の調製は、当該分野で周知の方法によっ
ておこなう（例えばＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，カタログ番号１５５９６１０８；Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．およびＳａｃ
ｃｈｉ，Ｎ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６；Ｓｉｍｍｓ，Ｄ
．，Ｃｉｚｄｚｉｅｌ，Ｐ．Ｅ．およびＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．（１９９３）Ｆｏ
ｃｕｓ（登録商標）１５，９９；Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．，Ｂｏｗｅｒｓ−Ｆｉｎ
ｎ，Ｒ．およびＳａｂａｔｉｎｉ，Ｌ．（１９８７）Ｊ．ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓ．６，８
３；Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５，
５３２；Ｂｒａｃｅｔｅ，Ａ．Ｍ．，Ｆｏｘ，Ｄ．Ｋ．およびＳｉｍｍｓ，Ｄ．（１９９
８）Ｆｏｃｕｓ  ２０，８２；Ｓｅｗａｌｌ，Ａ．およびＭｃＲａｅ，Ｓ．（１９９８）
Ｆｏｃｕｓ  ２０，３６；Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８４  Ａｐｒ；１３８（１）
：１４１−３、Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｃ
ｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｄｉｌｕｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔ
ｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄｓ；Ｗｅｓ
ｓｅｌ  Ｄ，Ｆｌｕｇｇｅ  ＵＩ．（１９８４）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８４  
Ａｐｒ；１３８（１）：１４１−１４３）。
【０１１２】
それ自体のアッセイは、タンパク質マーカーの細胞表面での発現にもとづいて細胞が選
別および／または計数される細胞分取アッセイであってもよい（Ｃａｎｔｏｒら、１９７
５，Ｇａｌｂｒａｉｔｈら、１９９９を参照のこと）。
【０１１３】
（発現パターンの入手）
次に、候補ライブラリーの成分に対応する複数のヌクレオチドの発現パターンまたはプ
ロファイルを、一つ以上の試料の白血球で評価する。代表的には、白血球は患者末梢血試
料に由来するが、すでに示したように、多くの他の試料供給源もまた好適である。これら
の発現パターンは、いくつかのＲＮＡまたはタンパク質産物に対する相対的または絶対的
発現値のセットを構成するもので、該産物は複数の評価ヌクレオチド配列に対応し、本明
細書ではそれをそれらのヌクレオチド配列に対する患者の「発現プロファイル」と称する
。候補ライブラリーのわずか１つの独立成分のための発現パターンが入手し得る一方で、
一般に、より多くのヌクレオチド配列（例えば約２、約５、約１０、約２０、約５０、約
１００、約２００、約５００、約１０００、またはそれ以上）に対応している発現パター
ンを得ることが好ましい。ライブラリーの差次的発現した各々の発現構成要素の発現パタ
ーンは、診断、予後、モニタリング等の予測値に関して限られた特異性および感度を与え
る。
【０１１４】
（臨床研究、データ、患者群）
議論を目的として、被験体または白血球の被験体試料という用語は、健康および／また
は疾患状態に関係なく個体をいう。被験体は、患者、試験参加候補者、コントロール被験
体、スクリーニング被験体または白血球試料が得られる他のいかなるクラスの個体とする
ことができ、本発明の文脈の中で入手され、かつ本明細書の文脈の中で評価され得る。し
たがって、被験体は、疾患で診断可能であり、疾患の１つ以上の症状、または疾病素質、
例えば疾患に対する家族（遺伝的）歴または病歴（医学的）因子、その他を１つ以上を示
し得る。あるいは、被験体は、上記因子または基準のいずれかに関して健康であり得る。
用語「健康な（ｈｅａｌｔｈｙ）」は本明細書で使用される場合、特定の疾患または疾患
因子もしくは疾患基準に関連するもので、任意の絶対的評価または状態に対応するように
定義することはできないことが理解される。したがって、任意の特定の疾患または疾患基
準に関連して健康であると判断された個体は、実際のところ、他の１つ以上の任意の疾患
を有すると診断され得るか、もしくは任意の他の１つ以上の疾患基準を示しうる。
【０１１５】
さらに、本発明の議論が集中し、かつヒト配列および試料を用いて例証される一方で、
実験動物（例えばマウス、ラット、モルモット、およびウサギ）、家畜（例えば、ウシ、
ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびニワトリ）、ならびにペット（例えば、イヌおよびネコなど
）のようなヒト以外の動物に対して、適切な候補ライブラリーの構成または選択を通して
、本発明が等しく適用される。
【０１１６】
（発現データを得るための方法）
発現データを得る多数の方法が公知であり、これらの技術の任意の一つ以上を単独また
は組合わせたものが、本発明の文脈で発現プロファイルを決定する上で好適である。例え
ば、発現パターンは、ノーザン分析、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｔａｑ  Ｍａｎ分析、また
はＦＲＥＴ検出、一つ以上の分子標識のモニタリング、オリゴヌクレオチドアレイに対す
るハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡアレイに対するハイブリダイゼーション、ポリヌク
レオチドアレイに対するハイブリダイゼーション、液状マイクロアレイに対するハイブリ
ダイゼーション、マイクロエレクトリックアレイに対するハイブリダイゼーション、分子
標識、ｃＤＮＡ配列決定、クローンハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡフラッグメントフ
ィンガープリンティング、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、サブトラクティブハイブ
リダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイおよび／またはディファレンシャル
スクリーニング（例えば、ＬｏｃｋｈａｒｔおよびＷｉｎｚｅｌｅｒ（２０００）Ｎａｔ
ｕｒｅ  ４０５：８２７−８３６，およびそこに引用された文献を参照のこと）で評価さ
れ得る。
【０１１７】
例えば、特定のＰＣＲプライマーは、候補ヌクレオチドライブラリーの成分に対して設
計される。ｃＤＮＡを、ポリｄＴオリゴヌクレオチドプライマーからの逆転写によって被
験体試料ＲＮＡから調製し、ＰＣＲにかける。二本鎖ｃＤＮＡは、ＰＣＲ産物の逆転写に
好適なプライマーを用いて調製可能であり、続いてインビトロ転写を用いてｃＤＮＡの増
幅がおこなわれる。インビトロ転写の産物は、候補ライブラリーのオリジナル成分に対応
するセンスＲＮＡである。ＰＣＲ産物を当該技術分野で公知の多くの方法で評価してもよ
い。そのような方法としては、ＴａｑＭａｎまたは分子標識プローブ等の標識プライマー
の検出を用いた実時間評価が挙げられる。ＰＣＲ産物の分析に好適な技術プラットフォー
ムとしては、ＡＢＩ７７００、５７００または７０００配列決定システム（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｏｐｔｉｃｏｎ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｌ
ｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏ
ｌｉｓ，ＩＮ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ４０００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が挙げられる。あるいは、分子標識を用い
て増幅していないＲＮＡまたはＤＮＡ試料中の核酸配列の存在を検出し、もしくは続いて
任意の方法、例えばＩＶＴ（インビトロ転写）またはＮＡＳＢＡ（核酸配列にもとづいた
増幅）を用いて配列の増幅をおこなう。分子標識は、候補ヌクレオチドライブラリーの成
分に対する配列相補性により設計され、蛍光標識に結合している。各々のプローブは、非
オーバーラップ放射波長で異なる蛍光標識を有している。例えば、１０個の遺伝子の発現
は、１０種類の異なる配列に特異的な分子標識を使用して評価可能である。
【０１１８】
代わりにまたは加えて、分子標識は、すぐに複数のヌクレオチド配列の発現を評価する
のに用いられる。診断用ヌクレオチドセットの成分に相補的な配列による分子標識を設計
して蛍光標識に結合する。使用される各々の蛍光標識は、非オーバーラップ放射波長を有
するはずである。例えば、１０個のヌクレオチド配列の評価は、増幅ＲＮＡもしくは非増
幅ＲＮＡまたはｃＤＮＡ試料に１０個の配列特異的分子標識（各々が、異なる蛍光分子に
より、標識されている）をハイブリダイズさせることによっておこなうことができる。そ
のようなアッセイは、試料標識手順の必要を回避する。
【０１１９】
代わりにまたは加えて、ビーズアレイを用いて、一度に複数の配列の発現を評価するこ
とができる（例えば、ＬａｂＭＡＰ  １００，Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，Ａｕｓｔｉｎ
，Ｔｅｘａｓを参照のこと）。代わりにまたは加えて、エレクトリックアレイは、Ｍｏｔ
ｏｒｏｌａ（Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ．）のｅ−センサー技術またはＮａｎｏｇｅｎ（Ｓ
ａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）のナノチップ技術により例示され、複数の配列の発現を評価
するために使用される。
【０１２０】
もちろん、選択された特定の方法は、回収ＲＮＡ量、開業医の好み、利用可能な試薬お
よび装置、検出器等のような因子に依存する。しかし、代表的には、選択された方法は、
目的とする多数の試料およびプローブを処理することに好適である。高スループット発現
分析方法については、以下に議論する。
【０１２１】
あるいは、遺伝子発現のタンパク質産物レベルでの発現が実行される。例えば、白血球
試料では、タンパク質発現は、ウェスタン分析、二次元ゲル分析、クロマトグラフィ分離
、質量分析検出、タンパク質融合レポーター構築物、比色アッセイ、タンパク質アレイへ
の結合およびポリソームｍＲＮＡの特徴の内から選択される１つ以上の方法によって評価
することができる。特に好ましいアプローチの一つとして、候補ライブラリーの成分に特
異的な抗体のアレイに対して標識タンパク質発現産物を結合させることが含まれる。抗体
を産生および評価する方法は、当該技術で広範囲にわたる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（上
掲）；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ（「ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ」）。候補ヌクレオチド配列の産物に対して特異
的な抗体試薬の選択によって、本発明に対して適用可能な種々の免疫学的方法および免疫
学的検定手順に関するさらに詳しい説明は、例えばＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ（編）（
１９９１）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第７版、お
よびＰａｕｌ（上掲）に見いだすことができる。別のアプローチは、脱着分光分析を実行
するためのシステムを用いる。商業的に入手可能なシステムは、例えばＣｉｐｈｅｒｇｅ
ｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から入手可能なものが、
特にタンパク質発現の定量分析にかなり適している。実際、脱着分光測定によるアプロー
チに、使用されるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ（登録商標）アレイ（例えば、ウェブサイト
ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ．ｃｏｍを参照のこと）は、タンパク質発現検出用のアレイを提供す
る。あるいは、タンパク質産物のエピトープを認識する親和性試薬（例えば、抗体、小分
子など）が開発される。親和性アッセイは、タンパク質アレイアッセイで用いられ、例え
ば特定のタンパク質の有無を検出するために使用される。あるいは、上記方法を用いて、
発現の検出をおこなうために、親和性試薬が使用される。白血球の細胞表面で発現された
タンパク質の場合、標識結合性試薬は白血球の集団に結合し、標示式細胞分取器（ＦＡＣ
Ｓ）を用いてタンパク質を発現する白血球を同定かつ計数する。
【０１２２】
本発明で議論される発現評価の方法は、診断用ヌクレオチドセットの発見の文脈のなか
で議論されるけれども、例えば以下にさらに議論するように、疾患を診断するために診断
用ヌクレオチドセットを用いた場合の発現評価にもまた適用可能であることが認められる
。
【０１２３】
（高スループット発現アッセイ）
多くの適切な高スループットフォーマットが、遺伝子発現を評価するために存在する。
代表的に、高スループットという用語は、１日あたり、少なくとも約１００のアッセイま
たは少なくとも約５００のアッセイでまたは少なくとも約１０００のアッセイまたは少な
くとも約５０００のアッセイで実行するフォーマット、あるいは少なくとも約１０，００
０のアッセイ、またはそれ以上のアッセイを実行するフォーマットをいう。アッセイを数
える場合、評価した候補ヌクレオチド配列の数または試料の数のどちらかを考慮すること
ができる。例えば、候補ヌクレオチド配列に対応した単一プローブを用いたグリッドアレ
イ（例えば、ドットブロット）で実行された例えば、約１００個の試料のノーザン分析は
、高スループット分析であると考えられ得る。しかし、より代表的には、このようなアッ
セイは一連の二連ブロットとして実行され、各々が候補ライブラリーの異なる成分に対応
した異なったプローブによって評価される。あるいは、１つ以上の試料で、または多数の
試料で約１００以上の候補ヌクレオチド配列の発現を同時に評価する方法が高スループッ
トと考えられる。
【０１２４】
高スループット発現分析を実行するための多数の技術的プラットフォームが公知である
。通常、そのような方法は、被験体試料または候補ライブラリーのいずれか、またはその
両方の論理的または実際的アレイを含む。一般のアレイフォーマットには、液相アレイお
よび固相アレイの両方が含まれる。例えば、核酸のハイブリダイゼーション、抗体もしく
は他のレセプターのリガンドへの結合等の液相アレイを用いたアッセイを、マルチウェル
またはマイクロタイタープレートで実施することができる。９６ウェル、３８４ウェル、
または１，５３６ウェルのマイクロタイタープレートが幅広く利用されており、より多く
のウェル数（例えば３，４５６および９，６００）であっても使用することができる。一
般に、マイクロタイタープレートの選択は、方法および設備（例えば、試料調製および分
析に使われるロボット操作およびローディングシステム）によって決定される。例示的な
システムとして、例えばＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏ
ｎ，ＣＡ）のＯＲＣＡ（登録商標）システムおよびＺｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）のＺｙｍａｔｅシステムが挙げられる。
【０１２５】
あるいは、種々の固相アレイを、本発明の文脈中で発現パターンを決定するために好適
に用いることができる。例示的なフォーマットとして、膜アレイまたはフィルタアレイ（
例えば、ニトロセルロース、ナイロン）、ビンアレイ、およびビーズアレイ（例えば、液
体「スラリー」中で）が挙げられる。代表的に、候補ライブラリーの成分に対応する発現
産物と特異的に相互作用する（例えば、ハイブリダイズまたは結合する）核酸またはタン
パク質試薬に対応するプローブを、固体支持体上に、例えば直接または間接的に架橋する
ことによって固定する。本質的に、特定の発現アッセイを実行するために必要な条件およ
び試薬に耐えることが可能な任意の固体支持体を用いることができる。例えば、機能性ガ
ラス、シリコン、二酸化ケイ素、修飾シリコン、種々のポリマーのいずれか、例えば（ポ
リ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオライド、ポリスチレン、ポリ
カーボネート、またはそれらの組み合わせのすべてを固相アレイに対する基質として用い
ることができる。
【０１２６】
好ましい実施形態で、アレイは、例えば、上記の特定の材料のうちの１つから構成され
る「チップ（ｃｈｉｐ）」である。ポリヌクレオチドプローブ，（例えば、ＲＮＡもしく
はＤＮＡ，例えばｃＤＮＡ，合成オリゴヌクレオチド等、または候補ライブラリーの個々
の成分の発現産物と特異的に相互作用する抗体等の結合タンパク質が、論理的順序様式で
、すなわちアレイ内でチップに添付される。さらに、マーカーヌクレオチド配列（試料の
標識の設計に依存）のセンスまたはアンチセンス配列のいずれかに対して特異的親和性を
有する任意の分子（例えば、マーカーの特異的核酸配列を特異的に認識するタンパク質、
リボザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または特異的親和性を有する他の化学物質もしく
は分子）を、マーカーに対する特異的親和性を失うことなくアレイ表面に固定することが
でき、さらに、アレイ生産のために得ることができ、かつ生産することができる。
【０１２７】
核酸およびタンパク質をチップ基質に結合させる方法についての詳細な議論は、例えば
、Ｐｉｒｒｕｎｇらの米国特許第５，１４３，８５４号（「Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐ
ｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｏ
ｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｃｒｅ
ｅｎｉｎｇ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）（１９９２年９月１日発行）、Ｃｈｅｅらの米国特許第
５，８３７，８３２号（「Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅ
ｓ  Ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｉｐｓ」）（１９９８年１１月１７日発行）、Ｄ
ａｌｅの米国特許第６，０８７，１１２号（「Ａｒｒａｙｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｍ
ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」）（２０００年７月１１日発行）、Ｂａｈｌらの米国特許第５，２
１５，８８２号（「Ｍｅｔｈｏｄ  Ｏｆ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  
Ａｃｉｄ  Ｏｎ  Ａ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｆｏｒ  Ｕｓｅ  Ｉｎ  Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ」）（１９９３年６月
１日発行）、Ｋａｔｏの米国特許第５，７０７，８０７号（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎ
ｄｅｘｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」）（１９９
８年１月１３日発行）、Ｂｒｏｗｎらの米国特許第５，８０７，５２２号（「Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ  Ｆｏｒ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅｓ」）（１９９８年９月１５日発行）、Ｇａｍｂｌｅらの米国特
許第５，９５８，３４２号（「Ｊｅｔ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｅｖｉｃｅ」）（１９９９年
９月２８日発行）、Ｃｈｅｎｃｈｉｋらの米国特許第５，９９４，０７６号（「Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ  Ｏｆ  Ａｓｓａｙｉｎｇ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」
）（１９９９年１１月３０日発行）、Ｗａｎｇの米国特許第６，００４，７５５号（「Ｑ
ｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓ
ａｙｓ」）（１９９９年１２月２１日発行）、Ｂｒａｄｌｅｙらの米国特許第６，０４８
，６９５号（「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｔ
ｏ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ」）（２０００年４月１１日発行）、Ｋａｍｂらの米国
特許第６，０６０，２４０号（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｒｅｌ
ａｔｉｖｅ  Ａｍｏｕｎｔｓ  Ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｉｎ  Ａ  Ｃｏｍｐ
ｌｅｘ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓ  Ｔｈｅｒｅｆｒｏｍ」）（２０００年５月９日発行）、Ｋａｔｏの米国
特許第６，０９０，５５６号（「Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｇｅｎｅ」）（
２０００年７月１８日発行）、およびＬｏｃｋｈａｒｔらの米国特許第６，０４０，１３
８号（「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ  Ｔｏ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙ
ｓ」）（２０００年３月２１日発行）に見いだされ、本明細書ではそれらの各々の全体が
参照として援用される。
【０１２８】
例えば、標準のＴＡクローニングベクターにある候補ヌクレオチド配列に対応するｃＤ
ＮＡインサートを、約３０〜４０サイクルにわたってポリメラーゼ鎖反応により増幅する
。増幅ＰＣＲ産物を、米国特許第５，１４３，８５４号に記載されたＶＳＬＩＰＳＴＭ技
術等の種々の周知技術のいずれかによってガラス支持対上に配列する。被験者試料から単
離されたＲＮＡ、またはＲＮＡに対応するｃＤＮＡを、蛍光タグ等で標識し、ＲＮＡ（ま
たはｃＤＮＡ）を含む溶液を、ハイブリダイゼーションにとって好適な条件下で「プロー
ブ」チップとともにインキュベートする。インキュベーションし、かつ非特異的ハイブリ
ダイゼーションを除去するために洗浄した後、チップに結合した標識核酸を定性的または
定量的に検出し、さらに結果として生じた対応の候補ヌクレオチド配列の発現プロファイ
ルを記録する。非特異的なハイブリダイゼーションを除去するためにインキュベーション
と水洗の後で、チップに結合されるラベルをつけられた核酸は質的にまたは量的に検出さ
れる、そして、対応する候補ヌクレオチド配列のための結果として生じる発現プロファイ
ルは記録される。診断目的のために使用されるプローブが診断用ヌクレオチド配列の発見
および検証の間、使用されるプローブと同一である可能性があると認められる。あるいは
、プローブ配列は診断用ヌクレオチド配列の発見および検証に使用される配列とは異なる
可能性がある。オーバーラップしない、または部分的にオーバーラップするヌクレオチド
配列からの複数のｃＤＮＡを使用することができる。
【０１２９】
別のアプローチでは、候補ヌクレオチドライブラリーの成分に対応するオリゴヌクレオ
チドを合成してアレイ上にスポットする。あるいは、オリゴヌクレオチドを、周知の方法
（例えば、Ｈｕｇｈｅｓら，上掲）を用いて合成する。オリゴヌクレオチドは、候補ヌク
レオチド配列の任意の部分に対する相補性を持つように設計される。また、診断用オリゴ
ヌクレオチドセットの診断用途等のための発現分析の文脈のなかで、以下にさらに詳しく
説明するように、オリゴヌクレオチドが特定のハイブリダイゼーション特性または特定の
特性および／または感度を示すように、設計することができる。
【０１３０】
ハイブリダイゼーションシグナルを、周知の方法を用いて増幅することが可能であり、
また本明細書に記載したように、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈキット（ガラス蛍光標識キット
）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅキット（ＦａｉｒＰｌａｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｌａｂｅ
ｌｉｎｇ  Ｋｉｔ）、Ｍｉｃｒｏｍａｘキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａ
ｒ，Ｉｎｃ．）、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅキット（３ＤＮＡ  Ｓｕｂｍｉｃｒｏ）、線形増
幅、例えば米国特許第６，１３２，９９７号またはＨｕｇｈｅｓ，ＴＲら，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：３４３−３４７（２００１）および／または  Ｗ
ｅｓｔｉｎら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１９９−２０４が挙げられる。いくつか
の例では、増幅技術は、シグナル強度を増加させないが、アッセイが少量のＲＮＡで実施
される。
【０１３１】
あるいは、蛍光性にラベルをつけられたｃＤＮＡは、公知の方法を用いてマイクロアレ
イに直接ハイブリダイズする。例えば、標識ｃＤＮＡの生成は、Ｃｙ３−およびＣｙー５
共役デオキシリボヌクレオチドを用いた逆転写によりおこなわれる。診断用ヌクレオチド
セットの同定に有用な発現データのシグナル増幅方法もまた、診断目的のための発現デー
タの増幅に有用であることが理解される。
【０１３２】
マイクロアレイ発現は、種々のレーザーまたはＣＣＤをベースとしたスキャナーによっ
てマイクアレイを走査し、多数のソフトウェアパッケージ、例えばＩｍａｇｅｎｅ（Ｂｉ
ｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（
Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｓｃａｎａｌｙｚｅ（Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．１９９９）（（Ｅｉｓｅｎ，
Ｍ．１９９９．ＳＣＡＮＡＬＹＺＥ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ；Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎ
ｉｖ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ．Ｖｅｒ  ２．３２．），ＧｅｎｅＰｉｘ（Ａｘｏｎ  
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により特徴を抽出することで検出可能である。
【０１３３】
別のアプローチでは、マイクロエレクトリックアレイに対するハイブリダイゼーション
を、例えばＵｍｅｋら（２００１）Ｊ  Ｍｏｔ  Ｄｉａｇｎ．３：７４−８４の記載通り
に実行した。親和性プローブ（例えば、ＤＮＡ）を金属表面に蒸着する。各々のプローブ
の基礎をなしている金属面は、金属導線および電気シグナル検出システムに接続している
。非標識ＲＮＡもしくはｃＤＮＡをアレイにハイブリダイズさせるか、またはＲＮＡもし
くはｃＤＮＡ試料をハイブリダイゼーション前に、例えばＰＣＲ等によって増幅させる。
試料ＲＮＡまたはｃＤＮＡの特異的ハイブリダイゼーションは、検出器に送られる電気シ
グナルの生成をもたらす。Ｗｅｓｔｉｎ（２０００）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１
９９−２０４（マイクロエレクトロニックチップアレイのアンカー複合増幅（ａｎｃｈｏ
ｒｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を記載）；Ｅｄｍａｎ（１
９９７）ＮＡＲ  ２５：４９０７−１４；Ｖｉｇｎａｌｉ（２０００）Ｊ  Ｉｒｍｎｕｎ
ｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２４３−５５を参照。
【０１３４】
別のアプローチでは、微量流体チップをＲＮＡ試料調製および分析に用いる。このアプ
ローチによって、試料調製および分析が簡素化されるため、効率が高まる。手短に言うと
、微量流体法を用いることで、ＲＮＡ調製および分析の前に特異的白血球亜母集団をソー
トすることが可能である。例えば、微量流体チップはＲＮＡ（逆転写、ＲＴ−ＰＣＲ）を
必要とするＲＮＡ調製および反応に役立つ。明らかに、小量の全抗凝集血を微量流体チッ
プ、例えばＣａｌｉｐｅｒ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）またはＮａｎｏｇｅｎ
（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）から入手可能なチップ上に載せる。微量流体チップは、
細胞が移動し、かつ反応が行われるチャンネルおよびリザーバーを含むものであってもよ
い。細胞を移動させて試薬にさらすために、機械、電気、磁気、重力、遠心、その他の力
を利用する。例えば、全血の細胞を低緊張の塩類を含むチャンバーに入れて、インキュベ
ーション２０分後に赤血球の選択的溶解をおこなう。次に、残留細胞（白血球）を洗浄液
チャンバーに入れ、最終的にグアニジンイソチオシネートのような溶解緩衝液を含むチャ
ンバーに持ち込まれる。白血球細胞可溶化物は、チップの中のＲＮＡ単離のために更に処
理されるか、またはさらにプロセッシング（例えば標準の方法によるＲＮＡ単離）のため
に除去される。あるいは、微量流体法チップは、環状のディスクである。血液試料を上記
ディスクの中央に注入し、該ディスクに対して単核球の密度勾配分離に適した遠心力を与
え、さらなる分析または処理のために分離単核細胞を集める。
【０１３５】
上記発現評価の方法は、診断用ヌクレオチドセットの発見の文脈のなかで議論したけれ
ども、診断用ヌクレオチドセットを疾患の診断等に用いることで、さらに以下に記載する
ように、発現評価にも適用可能であることが理解される。
【０１３６】
（発現パターンの評価）
発現パターンの評価は、質的なおよび／または量的測定尺度によっておこなうことがで
きる。遺伝子発現（ＲＮＡまたはタンパク質産物として）を評価するための一定の上記技
術が事実上、主に質的であるデータを与える。すなわち、上記方法は、発現の量的側面に
関して有意情報を提供することなく異なったモードに発現を分類する発現での差異を検出
する。例えば、それが候補ヌクレオチド配列（すなわち発現のオン／オフパターン）の発
現の有無を検出する場合、技術は質的な技術と説明することができる。あるいは、遺伝子
産物の異なる対立形質または変異体の存在（および／または不在）を質的な技術が測定す
る。
【０１３７】
対照的に、いくつかの方法は、量的方法において発現を特徴づけるデータを提供する。
すなわち、方法は数値尺度での発現に関係するもので、例えば数値尺度を０〜５のスケー
ル、１〜１０のスケール、＋〜＋＋＋のスケール、グレード１からグレード、グレードａ
からグレードｚ、その他とする。数値およびシンボルの例は任意のものであり、いかなる
段階的なスケール（または段階的なスケールの任意な象徴的表現）を本発明の文脈におい
て用いることで、ヌクレオチド配列発現での量的違いを説明することができる。一般的に
、そのような方法は、相対的な発現の増加または減少に対応する。
【０１３８】
量的または質的発現データのいずれかを生成する方法は、被験者の白血球試料での候補
ヌクレオチド配列の発現を評価するのに好適である。場合によっては、多数の方法を用い
て複数の候補ヌクレオチドに対する発現パターンの決定する場合、ヌクレオチド配列の回
収データ（例えば発現プロファイル）は定量的データと定性的データとの組み合わせであ
る。
【０１３９】
いくつかの用途では、複数の候補ヌクレオチド配列の発現を順番に評価する。このこと
は、概して低スループットから中等度のスループットとして特徴づけることができる。そ
れとは対照的に、選ばれたアッセイのスループットが増加するので、一つの白血球試料ま
たは複数の白血球試料での複数の候補ヌクレオチド配列に対する発現のアッセイが同時に
おこなわれる。また、上記方法（およびスループット）は一人の開業医によって主に決定
されるが、一般に、迅速な、例えば時間節約および費用効果の尺度で自動化もしくは部分
的自動化された調製および検出を許容する方法を用いることが好ましい。
【０１４０】
先行する議論が候補ライブラリー成分の発現評価をめざす一方で、以下にさらに説明す
るように、診断用ヌクレオチドセットの成分の発現を評価することにも適用されることが
理解される。
【０１４１】
（ゲノタイピング）
発現プロファイルと臨床データとの相関に加えて、またはそれと組み合わせて、発現パ
ターンと被験体の遺伝子型とを１つ以上の遺伝子座において相関させること、あるいは、
発現プロファイルおよび遺伝子座の両方と臨床データとを相関させることはしばしば望ま
しい。例えば、選択された遺伝子座は、候補ライブラリーの１つ以上の成分に対応する染
色体座、マーカーの遺伝子座に対する多形対立形質、または疾患（または疾患基準）に関
係していると推定される代わりとなる疾患関連遺伝子座（候補ライブラリーには貢献せず
）とすることができる。実際、ある遺伝子座での（多型）対立遺伝子座が疾患（または疾
患に対する疾病素質）に関連している場合、対立形質の存在は、それ自身が疾患基準とな
る。
【０１４２】
個体の遺伝子型を評価する多数の周知方法が存在し、該周知方法として、多くの他の有
用な方法の中でも、サザン分析、制限フラッグメント長多型（ＰＦＬＰ）分析、ポリメラ
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、増幅長多型（ＡＦＬＰ）分析、および単一ヌクレオチド多型（Ｓ
ＮＰ）分析（例えば、ＰＣＲ、Ｔａｑｍａｎまたは分子ビーコン）が挙げられる多くのそ
のような方法を高スループットおよび／または自動化（もしくは半自動化）試料調製およ
び分析方法に、適用可能である。ほとんどは、発現プロファイリング用の材料を生じたも
のと同様の白血球試料から単純な方法を介して回収された核酸試料上で実行することがで
きる。典型的な技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ（上掲）に記
載されている。
【０１４３】
（本発明の診断用オリゴヌクレオチドおよびヌクレオチドセットの同定）
診断用オリゴヌクレオチドおよびヌクレオチドセットならびに疾患特異的標的分子の同
定は、白血球発現プロファイルと患者の健康状態に関するデータとの相関によって進行し
、「分子的特徴」と称されるデータセットを生成する。被験者の健康状態（「疾患基準」
ともいう）に関するデータの例を、後述の「選択された疾患」と題したセクションで説明
する。相関分析に有用な方法を本明細書の別の場所に記載する。
【０１４４】
通常、被験者の健康状態に関する関連データとして、例えば被験者の病歴というかたち
で被験者、内科医、または第三者によって提供される遡及的または潜在的な健康データ（
例えば、内科的診断、臨床検査結果、診断検査結果、臨床イベントまたは投薬リスト）が
挙げられる。そのようなデータは、治療および／または特定の投薬に対する患者の反応に
関する情報と既に特徴づけられた「危険因子（ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ）」の存在に関す
るデータとを含むものであってもよい。例えば、タバコ喫煙および肥満が心臓疾患に関し
て事前に同定された危険因子である。疾患および疾患基準を含む健康状態の他の例が、選
択された疾患と題したセクションに記載されている。            
【０１４５】
一般的に、データは先のイベントと評価（すなわち遡及的なデータ）を記述する。しか
し、サンプリングに続いて収集されたデータ（すなわち、予測データ）もまた発現プロフ
ァイルに相関すると思われる。サンプリングした組織、例えば末梢血、気管支洗浄（ｂｒ
ｏｎｃｈｉａｌ  ｌａｖａｇｅ）等を１つ以上の多数時点（多数時点ｓ）で得ることがで
き、被験者データが試料獲得の時間に関して遡及的または潜在的であると考えられる。
【０１４６】
複数時点で収集したデータ（「時系列データ（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｄａｔａ）
」と呼ぶ）は、しばしば有用であることから、本発明は異なる時点で同一患者から収集し
た患者データの分析を包含する。対試料（一人の患者から異なる時点で採取した試料等）
の分析は、患者に対して特異的な遺伝的変位性が比較によって制御されることから、疾患
状態に対して特異的に関連する差異の同定を可能とする。また、患者間に存在する他の変
数（例えば炎症疾患（例えば、慢性間接リウマチ）の有無、白血球遺伝子発現に影響する
と考えられる薬物療法の使用、および共病的状態（ｃｏ−ｍｏｒｂｉｄ  ｃｏｎｄｉｔｉ
ｏｎｓ）の有無）をこのように制御することができる。さらに、複数の発現プロファイル
を収集することによって生成した発現プロファイルのパターンを分析することで、時間と
ともに変化する発現レベルの変化に関連した情報が得られる。それによって、変化率、軌
跡、または発現曲線の決定を可能としてもよい。２つの時系列（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａ
ｌ）試料を時間とともに変化する遺伝子発現に関する情報を提供する一方で、３つの時系
列試料が遺伝し発現の「軌跡（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ）」を決定するのに必要と思われる
。そのような情報は、疾患の診断に関連するものであってもよい。例えば、遺伝因子の発
現は個体間で変動しうるものであるが、臨床イベント（例えば心臓発作）は発現のレベル
が各々の患者において２倍になる可能性がある。この例では、各個体での発現の絶対レベ
ルに対して、臨床的に関心のある情報は、発現レベルの変化から収集される。    
【０１４７】
単一の患者試料を得たとしても、その試料の発現プロファイルをいくつかの参照発現プ
ロファイルと比較することが望ましいと思われる。この場合、患者試料と、その患者およ
び問題となっている医学的状態にとって適当である参照発現プロファイルとのあいだでの
発現の変化を決定することができる。例えば、参照発現プロファイルを、問題となってい
る疾患基準なしに、類似の特性（年齢、性別、人種、診断等）を持つすべての患者につい
て決定することができる。
【０１４８】
通常、１０〜２０人から得た小サイズの試料を１０〜４０個用いて、診断用ヌクレオチ
ドセットの同定をおこなう。多種多様な大規模の患者母集団で使用する診断用ヌクレオチ
ドセットの検証では、より大きな試料サイズが一般に求められる。例えば、様々な人種集
団、人口統計学的群、国、民族または人種に対する遺伝子発現相関の延長は、目的とする
人口の発現相関実験を必要とするかもしれない。
【０１４９】
（発現参照標準）
患者（すなわち、疾患と診断された被験者、該疾患の症状を呈する被験者、疾患基準を
示す被験者、または疾患に対して医師によるケアを受けている被験者）由来の発現プロフ
ァイルを、コントロールまたは標準発現ＲＮＡと比較して、互いに関連した一群の患者か
ら得た発現プロファイル（例えば、候補ヌクレオチドセットのもの）を該群の他の患者ま
たは別の群の他の患者との比較を促す。
【０１５０】
使用する参照ＲＮＡは、低コストかつ大規模生産が簡単であるという所望の特徴を持た
なければならない。また、参照ＲＮＡは、可能な限り候補ライブラリーの遺伝子と同じほ
どの測定可能な量を含まなければならない。
【０１５１】
例えば、診断用ヌクレオチドセットを同定する一つのアプローチでは、患者試料由来の
発現プロファイルを発現参照「標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）」と比較する。発現参照標準を
、例えば、休止培養白血球由来のＲＮＡまたは市販の参照ＲＮＡ（例えばＳｔｒａｔａｇ
ｅｎｅのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）とすることができる。Ｎａ
ｔｕｒｅ，Ｖ４０６，８−１７−００，ｐ．７４７−７５２を参照せよ。例えば、アレイ
、およびある種の他の用途（例えば、定性ＰＣＲ、ＰＴ−ＰＣＲ等）で大量のヌクレオチ
ド配列の発現をアッセイする場合、さらに／あるいは、大量の発現プロファイル（例えば
、患者母集団）を比較しようとする場合、発現参照標準の使用が特に有用であり、試料プ
ロファイルと標準プロファイルとを比較することが求められている。概して、発現参照標
準は大量に利用可能でなければならず、増幅および標識反応にとって良好な基質でなけれ
ばならず、さらに適当なプロファイリング技術を用いて候補核酸のかなりの割合を検出す
る能力を持たなければならない。
【０１５２】
代わりに、または加えて、患者試料に由来する発現プロファイルを、内部参照コントロ
ール遺伝子（例えばβアクチンまたはＣＤ４）の発現と比較する。プロファイリングされ
た遺伝子と内部参照コントロール遺伝子との相対的発現（同一個体間）が得られる。参照
ＲＮＡが内部参照コントロールを使用する場合もある。例えば、「遺伝子１」の発現プロ
ファイルとＣＤ４をコードする遺伝子とを患者試料中および参照ＲＮＡ中で決定すること
ができる。遺伝子１の発現比率（試料／参照）をＣＤ４（試料／参照）で割ってもよく、
それによってＣＤ４に対する遺伝子１の相対的発現が得られる。
【０１５３】
本発明はまた、発現プロファイリングで有用なバッフィーコートコントロールＲＮＡと
、バッフィーコート細胞の集団（全血を遠心することで得られた白血球細胞層）から産生
されたコントロールＲＮＡを用いる方法とを提供する。バッフィーコートは、顆粒球、単
核球、および血小板を含むすべての白血球細胞を含有する。本発明は、白血球の発現プロ
ファイル分析のために、バッフィーコート細胞からコントロールＲＮＡを調製する方法も
提供する。バッフィーコート分画は、例えば、血液銀行から、または直接個体から得られ
、好ましくは多くの人から得ることで、個体試料からの偏りを避けてＲＮＡ試料が健康的
な集団の平均的な発現を示すようにする。約５０もしくは約１００、あるいはそれ以上の
個体から得たバッフィーコート分画が好ましい。各々の個体から得たバッフィーコート１
０ｍｌを使用する。バッフィーコート試料を赤血球溶解緩衝液で処理し、赤血球を選択的
に取り除く。バッフィーコート層の白血球を遠心によって回収する。あるいは、特定の白
血球亜母集団、例えば単核球またはＴリンパ球を得るために、バッフィー細胞試料をさら
にエンリッチすることができる。単核球についてエンリッチするために、上記バッフィー
細胞ペレットをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で希釈し、密度を１．０７７＋／−０．００
１ｇ／ｍｌに合わせたポリスクロースおよびジアトリゾア酸ナトリウム溶液非ポリスチレ
ンチューブに充填する。Ｔリンパ球についてエンリッチするために、全血４５ｍｌをＲｅ
ｓｅｔｔＳｅｐｅ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、室温で
２０分間インキュベートする。混合を、等量のＰＢＳ＋２％ＦＢＳで希釈して転倒混合す
る。希釈混合物３０ｍｌをＤＭＬ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１
５ｍｌの最上部に積層する。チューブを１，２００ｘｇで遠心し、血漿：培地境界面にあ
るエンリッチされた細胞層を除去し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗い、さらに細胞を１，２０
０ｘｇで遠心して回収する。氷上で、細胞ペレットを赤血球溶解緩衝液（ＥＬ緩衝液、Ｑ
ｉａｇｅｎ）によって１０分間処理し、エンリッチされたＴリンパ球を遠心により回収す
る。
【０１５４】
加えて、または代わりに、バッフィー細胞（バッフィーコートまたは亜母集団全体、例
えば単核分画）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、サイトカインまたは活性化試薬（例えば、
ホルボールエステルまたはイオノマイシン）によって刺激することができる。そのような
刺激によって、活性化免疫細胞で発現するヌクレオチド配列の発現を増加させることが可
能であり、白血球発現プロファイリング実験にとって重要かもしれない。
【０１５５】
先に述べたように亜母集団選択および／またはさらなる処理（例えば上記したような刺
激）を施した後で、ＲＮＡの調製を標準的方法を用いておこなう。例えば、細胞をペレッ
ト状にし、フェノール／グアニジンチオシアネートで溶解することで、ＲＮＡを調製する
。ＲＮＡはまた、シリカゲル系精製カラムを用いて単離することもでき、また該カラム法
をフェノール／グアニジンチオシアネート法によって単離したＲＮＡに使用することがで
きる。個体バッフィーコート試料由来のＲＮＡをこのプロセスの過程でプールすることが
でき、結果として生じる参照ＲＮＡが多くの個体のＲＮＡを表し、また個体の偏りが最小
化または取り除かれる。また、バッフィーコート参照ＲＮＡの新たなバッチを最後のバッ
チと直接比較することで、１つのバッチからもう一方のバッチで発現パターンの類似性が
確実となる。１つ以上の発現参照コントロールを実験で用いる。例えば、以下の供給元に
由来するＲＮＡは実験のコントロールとして使用することができる。すなわち、刺激され
たか刺激されていない末梢単核球、刺激されたか刺激されていない末梢単核球、もしくは
刺激されたか刺激されていないＴリンパ球である。
【０１５６】
あるいは、発現参照標準を任意の被験者由来とすることができ、または被験者のクラス
として、健康な被験者または同一もしくは異なる疾患または疾患基準で診断された被験者
が含まれる。２つ以上の異なるクラスの被験者から得た発現プロファイルを比較して、後
述するように、候補ライブラリーのヌクレオチド配列のどのサブセットが最も被験者クラ
ス間を区別することができるかについて判断する。本文脈では「異なるクラス（ｄｉｓｔ
ｉｎｃｔ  ｃｌａｓｓｅｓ）」という用語は、目的とする疾患に関連した少なくとも１つ
の識別可能な基準（「疾患基準」）に関連することがわかる。  
上記クラスは、もちろん、他の疾患基準に関して、または疾患診断、予後、またはその他
に関して有意な重複（または同一性）を示すことができる。発見のモードは、例えば、異
なる被験者クラスの分子的特徴を互いに比較するか（例えば、管理すべき患者、第２の疾
患を持つ患者に対する第１の診断を持つ患者）、または異なる時間点を取った単一個体の
分子的特徴を比較することが含まれる。本発明は、以下にさらに説明するように、幅広い
範囲の疾患、疾患基準、状態、ならびに他の臨床および／または疫学的問題に適用するこ
とができる。
【０１５７】
現在の議論が発現参照コントロールの使用に関係する間、診断用ヌクレオチドセットを
同定する間、発現参照コントロールもまた、さらに後述するように、診断用ヌクレオチド
セット（例えば疾患診断のために診断用ヌクレオチドセットの使用）の使用の際に役立つ
と認められる。
【０１５８】
（発現プロファイルの分析）
容易なアクセスを促すために、例えば、比較、再検討、回収、および／または修飾のた
め、概して分子的特徴／発現プロファイルがデータベースに記録される。最も一般的に、
データベースはコンピュータ装置でアクセス可能なリレーショナルデータベースではある
が、他のフォーマット、例えば写真、アナログもしくはデジタル画像処理読み出し、スプ
レッドシート、その他として発現プロファイルのインデックスファイルに手動でアクセス
可能なフォーマットも使用することができる。好ましい実施形態に関するさらなる詳細を
以下に示す。初めに記録される発現パターンが事実上、アナログもしくはデジタルにかか
わらず、さらに／またはそれらが発現での質的もしくは量的な違いを表すかどうかにかか
わらず、発現パターン、発現プロファイル（集合的発現パターン）および分子的特徴（相
関発現パターン）がデジタル的に保存され、かつデータベースを介してアクセスされる。
一般に、データベースは、局所的および／または遠隔的に利用可能であるアクセスにより
、中央の施設で編集され、かつ維持される。
【０１５９】
追加試料を得て、それらの発現プロファイルを決定して関連被験者データと相関させる
ことで、後に続く分子的特徴が同様にしてデータベースに記録される。しかし、本質的に
受動的なやり方で追加される各々の次の追加よりもむしろ、一つの試料からのデータは第
２（先行または後に続く）試料に由来するデータにほとんど関係なく、アルゴリズムは任
意かつさらに、既存のデータベースに対して追加試料を照会し、分子的特徴と疾患基準と
のあいだの関連をさらに改善する。さらに、１つ（または複数）の分子的特徴を含むデー
タセットは、追加または他の疾患基準の拡張セットに対して、任意に照会される。統合シ
ステムおよびウェブ（Ｗｅｂ）実施形態の使用をさらに後述する。
【０１６０】
（アレイ由来の発現プロファイルデータの分析）
発現データは、周知の方法（Ｉｍａｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏｄｉｓｃ
ｏｖｅｒｙ，Ｍａｒｉｎａ  ｄｅｌ  Ｒｅｙ，ＣＡ）、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔ
ｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、およびＳｃａｎａ
ｌｙｚｅ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が挙げられる）を用いて分析され
る。以下の議論において、「特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）」はアレイ上でＤＮＡの独立したス
ポットをいう。各遺伝子は、１つ以上の特徴によって表され得る。例えば、ハイブリダイ
ズしたマイクロアレイを、ＧｅｎｅＰｉｘ３．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてＡｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
のスキャナーで走査および分析する。ＧｅｎｅＰｉｘによって抽出されたデータを、全て
の下流品質管理（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）および発現
評価のために用いる。このデータは、以下のようにして得る。ソフトウェアによって「見
あたらない（ｎｏｔ  ｆｏｕｎｄ）」というフラッグがたてられたすべての特徴について
のデータを個々のハイブリダイゼーションについてのデータセットから除去する。Ｇｅｎ
ｅＰｉｘによる「見あたらない」フラッグは、ソフトウェアが上記特徴をバックグラウン
ドと区別することができなかったことを示す。各特徴を調べ、そのシグナルの値を決定す
る。特徴の正中ピクセル強度（Ｆｎ）からバックグラウンドの正中ピクセル強度（Ｂｎ）
を引いて、バックグラウンド減数シグナル（以下、「ＢＧＳＳ」とする）を生成する。バ
ックグランドピクセルの標準偏差によってＢＧＳＳを割ることで、シグナル対ノイズ比（
以下、「Ｓ／Ｎ」とする）を得る。Ｃｙ３チャンネル（試料ＲＮＡに対応）およびＣｙ５
チャンネル（参照ＲＮＡに対応）の両方で３以上のＳ／Ｎ値を持つ特徴を用い、さらなる
分析をおこなう（以下、「利用可能な特徴（ｕｓｅａｂｌｅ  ｆｅａｔｕｒｅｓ）」とい
う）。あるいは、異なるＳ／Ｎ値を、分析のための発現データ選択に用いる。例えば、３
より大きいシグナル対ノイズ比（＞３）を有する発現データのみを分析に用い得る。ある
いは、３未満のＳ／Ｎ値（＜３）を有する特徴がそのようにフラッグが立てられ、分析に
含まれ得る。そのようなフラッグが立てられたデータセットは、より多くの値を含み、さ
もなければ見落としてしまうかもしれない発現マーカーの発見を可能にし得る。しかし、
そのようなデータセットは、フィルタにかけたデータよりも高い可変性を有し得、所見（
ｆｉｎｄｉｎｇｓ）の有意性または相関統計のパフォーマンスを減少させ得る。
【０１６１】
各々の使用可能な特徴（ｉ）について、発現レベル（ｅ）は、Ｃｙ５チャンネル（参照
ＲＮＡ）に対するＢＧＳＳによって割られたＣｙ３（試料ＲＮＡ）チャンネルに対するバ
ックグランド減数シグナル（以下、ＢＧＳＳという）の対数比（Ｒ）として、発現される
。この「対数比」の値は、他の実験との比較のために使用される。
【０１６２】
【数１】
2010104368.tif 000002
【０１６３】
ハイブリダイゼーション中のシグナルの変動は、ハイブリダイゼーション、ＤＮＡスポ
ッティング、洗浄条件、および標識効率に影響を及ぼす多くの因子によって生じ得る。
【０１６４】
単一の参照ＲＮＡを実験的なＲＮＡ全てに使用し得、独立した比較に加えて多重比較を
可能にする。試料ＲＮＡを同じ参照と比較することによって、各試料からの遺伝子発現レ
ベルがアレイ全体で比較され、それによって我々の実験的な比率に対して、一貫した分母
の使用を可能にする。データを分析する代替法は、（１）参照チャンネルによる基準化な
しに試料チャンネルを用いること、（２）参照チャンネルにおけるシグナルが大きい場合
に、より大きな相関を与える参照に基づいた強度依存基準化（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ−ｄｅ
ｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を用いること、（３）バックグラウンド
減算なしのデータを用いるか、もしくはバックグラウンド自体よりもむしろバックグラウ
ンド強度の経験的派生関数を減じることを、含む。
【０１６５】
（スケーリング）
実験の範囲内で標識およびハイブリダイゼーションの可変性について、データのスケー
リング（基準化）を公知の方法を用いておこなって、管理することができる。スケーリン
グは、異なる実験、患者等などの間でデータの比較を促すので、好ましい。一般に、ＢＧ
ＳＳを、因数（例えば正中（ｍｅｄｉａｎ）、平均、標本削除平均、および百分位数）に
スケーリングする。追加のスケーリング方法として、０と１との間でスケーリングするこ
と、平均値を引くこと、または正中値を引くことが挙げられる。
スケーリングは、より詳細に上で記載したように、共通の参照ＲＮＡを用いて得た発現パ
ターンとの比較によってもおこなわれる。他のスケーリング方法を用い、参照ＲＮＡは、
発現データの多重比較（例えば、患者間、試料間など）を容易にする。参照ＲＮＡの使用
は、実験的な比率に対して一貫した分母を与える。
【０１６６】
参照ＲＮＡの使用に加えて、独立した発現レベルを調節して、異なるハイブリダイゼー
ション実験間での標識効率の違いを正し、例えば、異なる全体的なシグナル強度を有する
実験間での直接的な比較が可能にし得る。スケーリング因子（ａ）を、個々の発現レベル
を以下のように調節することに用い得る。スケーリング因子（ａ）の正中（例えばＢＧＳ
Ｓ）は、３を上回るＳ／Ｎ値を有する全ての特徴のセットに対して、決定される。次に、
ＢＧＳＳｉ（各特徴「ｉ」についてのＢＧＳＳ）を全ての特徴（ａ）に対する正中によっ
て割ることで、スケール比率が生ずる。スケール比率は、特徴（ｅｉ）に対する発現値ま
たは対数比を決定するために用いられる。
【０１６７】
【数２】
2010104368.tif 000003
【０１６８】
さらに、またはあるいは、コントロール特徴は、実験の範囲内で標識およびハイブリダ
イゼーションの可変性のためにデータを基準化するために用いられる。コントロール特徴
は、植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の遺伝子に対するｃＤＮＡであ
り得、ミニアレイをスポッティングする際に含まれる。コントロールｃＤＮＡに対して相
補的である等量のＲＮＡを、それらが標識される前に試料の各々に添加する。これらコン
トロール遺伝子由来のシグナルを用いて、基準化定数（Ｌ）が以下の式に従って決定され
る：
【０１６９】
【数３】
2010104368.tif 000004
【０１７０】
ここで、ＢＧＳＳｉは、特定の特徴に対するシグナルであり、ＮはＡ．ｔｈａｌｉａｎａ
コントロール特徴の数、Ｋはハイブリダイゼーションの数、およびＬｊは各々の独立した
ハイブリダイゼーションに対する基準化定数である。
【０１７１】
上記式を用いて、特定のハイブリダイゼーションおよび色素（例えば、Ｃｙ３）につい
ての全てのコントロール特徴に対する平均値を計算する。全てのＣｙ３ハイブリダイゼー
ションについてのコントロール特徴手段が平均化され、ハイブリダイゼーションにおける
コントロール特徴手段を全てのハイブリダイゼーションの平均で割って、等式（０．３）
においてａとして用いられる特定のＣｙ３ハイブリダイゼーション（Ｌｊ）に対する基準
化定数を生じる。同一の基準化ステップは、Ｃｙ３値およびＣｙ５値について実行され得
る。
【０１７２】
代替スケーリング方法もまた、用いられ得る。緑／赤比の対数（ｌｏｇ）を、全ての特
徴について決定する。全ての特徴に対する正中ｌｏｇ比の値を決定する。次に、以下の式
を用いて特徴値のスケーリングを行う：Ｌｏｇスケーリングした特徴比＝Ｌｏｇ特徴比−
正中Ｌｏｇ比
基準化のための多くのさらなる方法が存在し、データに適用され得る。一つの方法にお
いて、Ｃｙ３ＢＧＳＳ／Ｃｙ５ＢＧＳＳの平均比が、一つのアレイ上の全ての特徴に対し
て決定される。この比を、次に何らかの任意の数（例えば１、または何らかの別の数）に
スケーリングされる。つぎに、平均比を選択されたレベルに持っていくために必要とされ
るスケーリング因子によって、各プローブに対する比が乗じられる。これは、分析におい
て、各アレイについて、実行される。あるいは、上記比率を、分析における全てのアレイ
にまたがる平均比に基準化させる。基準化の他の方法は、標準分布で、または最も多くの
場合、アレイ上の他のオリゴヌクレオチドに関連する各オリゴヌクレオチドのシグナルの
ランクを用いて、それらを数多くの一定のポイント（四分位数または十分位数等）に移す
ことで、種々のアレイのシグナル強度の分布をよりいっそう一致させることを含む。
【０１７３】
遺伝子配列またはオリゴヌクレオチドごとに複数の特徴を用いる場合、それらの繰り返
しを各遺伝子に対する平均的発現値を誘導するために使用し得る。もし複製特徴のいくつ
かが質に劣り、分析の必要条件に合致しない場合、残りの特徴を遺伝子または遺伝子配列
を表すために使用し得る。
【０１７４】
（相関分析）
相関分析は、どのアレイプローブが、特定の臨床状態を表す試料群に近いマーカーを最
もよく識別する発現挙動、またはマーカーとして最もよく寄与する発現挙動を有するかを
決定するために実行される。相関分析、すなわち異なる疾患基準（例えば、臨床状態）を
表す複数の試料の間での比較は、標準統計学的方法を用いて実行される。多数のアルゴリ
ズムは、発現データの相関分析に有用であり、アルゴリズムの選択は、実行されるべきデ
ータ分析に部分的に依存している。例えば、アルゴリズムは、試料を確実に分類する発現
挙動を備えた最も有益な１つの遺伝子を同定するか、あるいは試料を分類するのに有益な
遺伝子全てを同定するのに使用され得る。あるいは、アルゴリズムは、２つまたはそれ以
上の遺伝子のどのセットが試料を正確に分類する集団的発現挙動を有するかの決定を適用
し得る。診断用の複数の発現マーカーの使用は、個体間の遺伝子の発現における可変性を
克服し得るか、あるいはアッセイ固有の可変性を克服し得る。複数の発現マーカーは、２
つまたはそれ以上の遺伝子あるいはプローブが診断に関する同一の情報を提供し得る点で
、重複しているマーカー（代理物）を含み得る。これは、例えば２つまたはそれ以上の遺
伝子あるいは遺伝子プローブが強調的に発現される場合に生じ得る。診断用途のために、
アッセイにおいて、遺伝子および１つまたはそれ以上のその代理物を利用することが適切
であり得る。この重複性は、試料を識別する１つのマーカーの機能停止（技術的あるいは
生物学的）を克服し得る。あるいは、１つまたはそれ以上の代理物は、発現レベルのより
高いベースライン、より良い細胞特異性、ＰＣＲプライマーあるいは相補的プローブの設
計についての試料群またはより特異的な配列間のより高い倍変化のような、アッセイ開発
にとって一層相応しい特性を有し得る。上記議論は、ＲＮＡ発現プロファイルの分析に関
するものであるが、その議論は、タンパク質あるいは他の分子マーカーのプロファイルの
分析に同様に適用可能であることが、理解され得る。
【０１７５】
分析前に、発現プロファイルデータは、当該分野において公知の方法を用いて、分析の
ために初期化あるいは作製され得る。例えば、アレイプローブごとに対数比で目盛られた
発現データは、しばしば以下の式を用いて算出される：
ｌｏｇ（Ｃｙ３ＢＧＳＳ／Ｃｙ５ＧＳＳ）
ここで、Ｃｙ３シグナルは、臨床試料における遺伝子の発現に対応し、Ｃｙ５シグナルは
、参照ＲＮＡにおける遺伝子の発現に対応する。
【０１７６】
データは、以下に述べられるように処理されるべき特異的分析に依存して、さらにフィ
ルタに通され得る。例えば、フィルタリングは、ある一定レベル以上の発現を備えた試料
のみ、あるいは試料セット間のある一定レベル以上の可変性を有するプローブを選択する
ことを意図され得る。
【０１７７】
次の非限定の議論は、当該分野において公知の数種の統計学的方法を考慮する。簡単に
言うと、ｔ−検定およびＡＮＯＶＡは、それぞれ集団間あるいは集団内の発現差で１つの
遺伝子を同定するために使用される。多変量解析方法は、いかなる１つの遺伝子の発現よ
りも特異的な２つの疾患状態の間を識別する発現について、２つまたはそれ以上の遺伝子
のセットを同定するために使用される。
【０１７８】
（ｔ−検定）
２つの群の間の差の最も簡単な測定法はスチューデントのｔ−検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’
ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）である。例えば、Ｗｅｌｓｈら（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａ
ｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１１７６−８１（卵巣癌試料とコントロール組織試料に
おける差次的遺伝子発現の発見のための不対のスチューデントのｔ−検定の使用を示す）
を参照のこと。このｔ−検定は、等しい偏差および正規分布データを仮定する。この検定
は、２つの試料群間で１つの遺伝子の発現に差がある確率を同定する。統計学的有意性を
達成するために必要な各群内の試料数は各群内の試料間のばらつきに依存する。ｔ−検定
の標準式は；
【０１７９】
【数４】
2010104368.tif 000005
【０１８０】
であり、ここで、
【０１８１】
【数５】
2010104368.tif 000006
【０１８２】
は、ｃ群とｔ群との間の遺伝子ｉの平均発現レベルの差であり、ｓｉ，ｃは、ｃ群の遺伝
子ｘの偏差であり、ｓｉ，はｔ群の遺伝子ｘの偏差であり、ｎｃおよびｎｔはｃ群および
ｔ群における試料数である。
【０１８３】
ｔ統計値と自由度［ｍｉｎ（ｎｔ，ｎｃ）−１］との組み合わせは、意味のない仮説を
排除する確率であるｐ値を与える。平均発現レベルが２つの群間の差である確率９９％で
あること（平均発現レベルが実際のところ差ではなく、統計学的確率によって生じたと観
察される差であるような１％の確率）を示す０．０１以下のｐ値はしばしば許容し得ると
考えられる。
【０１８４】
大きなスケールで、例えば約８０００個の遺伝子の大きなデータセット上で検定を実行
する場合、実行されている個々の検定の数を調節するための補正因子が含まれなければな
らない。最も一般的で簡単な補正は、検定実施数でｐ値を割る複数検定用のＢｏｎｆｅｒ
ｒｏｎｉ補正である。８０００個のデータセット上でこの検定を使用することは、２つの
検定条件間の正確な差となるらしい遺伝子を同定するために０．０００００１２５以下の
ｐ値が必要とされることを示す。
【０１８５】
（マイクロアレイに関する有意性分析（ＳＡＭ））
マイクロアレイに関する有意性分析（ＳＡＭ）（Ｔｕｓｈｅｒ  ２００１）は、発現値
と応答ベクターとの間の補正を備えた遺伝子が統計学的に発見されかつ統計学的有意性を
割り当てられた方法である。有意な遺伝子に対する誤った有意性の割合は、疑似発見率（
Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）（ＦＤＲ）である。これは、閾値ごとに、
有意であると呼ばれる遺伝子のセットが存在し、ＦＤＲがこの要求に対する信頼レベルを
与えることを意味する。仮にある遺伝子が５％のＦＤＲで、ＳＡＭにより２つのクラス間
で差次的に発現されるといわれる場合、上記遺伝子が上記クラス間の実際に差次的に発現
される確率が９５％存在する。ＳＡＭは、マイクロアレイの可変性および多数の変数を考
慮に入れる。ＳＡＭは、上記クラス間で最も包括的に差次的に発現される遺伝子を同定す
る。したがって、異常値の試料または患者を同定しかつ分類するための重要な遺伝子は、
ＳＡＭにより同定され得ない。
【０１８６】
（非パラメータ検定）
Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号付き検定法は、非パラメータ検定の一例であり、一対比較検定
に利用されている。例えば、ＳｏｋａｌおよびＲｏｈｌｆ（１９８７）Ｉｎｔｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  第２版，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋを参照のこと。この統計を適用するには少なくとも６対が必要である。この検
定は対の発現データ（例えば、薬物投与の前後に採取された試料を有する患者群）の分析
に有用である。閾値を有するＦｉｓｈｅｒ  Ｅｘａｃｔ検定およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎ
ｅｙ検定は、使用され得る他の非パラメータ検定である。
【０１８７】
（ＡＮＯＶＡ）
多数の関連した群にわたる遺伝子発現の差は、当該分野において周知の方法である、分
散分析法（ＡＮＯＶＡ）（ＭｉｃｈｅｌｓｏｎおよびＳｃｈｏｆｉｅｌｄ，１９９６）を
用いて評価され得る。
【０１８８】
（多変量解析）
多変量解析に適した多くのアルゴリズムは当該分野で公知である（Ｋａｔｚ  １９９９
）。一般に、発現がいかなる１つの遺伝子の発現よりも特異的な２つの疾患状態間を識別
する２つまたはそれ以上の遺伝子セットは、識別基準（例えば、遺伝子Ｘの発現は通常か
ら３００％増加すべきであるが、一方、遺伝子ＹおよびＺの発現は通常から７５％減少す
るべきである）を用いて遺伝子の可能性のある組み合わせを検索することによって同定さ
れる。通常、検索は１つの遺伝子で開始し、その後に、検索ステップごとに次の最も適し
た遺伝子を加える。あるいは、検索は遺伝子全てで開始し、識別を支援しない遺伝子が段
階的に排除される。
【０１８９】
（対の試料）
対の試料、すなわち同一の患者から異なる時点で採取された試料は、上述したように、
しばしば有用である。例えば、対の試料の使用は、個体間の遺伝的ばらつきに起因するば
らつきの低減を可能にする。さらに、対の試料の使用は、対の試料由来のデータが減少し
たばらつきを認識する異なった様式で算出され得る点で、統計学的有意性を有する。例え
ば、対の試料に関するｔ−検定のための式は、
【０１９０】
【数６】
2010104368.tif 000007
【０１９１】
であり、ここで、Ｄは対の各試料セット間の差であり、ｂは試料対の数である。
【０１９２】
【数７】
2010104368.tif 000008
【０１９３】
は上記対のメンバー間の差の平均である。この検定では、対の試料間の差のみが検討され
、その後に、一緒にまとめられている（通常のｔ−検定の場合、群間の可能な全ての差を
取得するのに対して）。対のデータを使用するさらなる統計学的検定、例えばＡＮＯＶＡ
およびＷｉｌｃｏｘｏｎの符号付き検定は上記で議論されている。
【０１９４】
（診断分類）
一旦遺伝子の識別用セットが同定されたら、診断用分類子（発現データに基づく診断分
類に試料を割り当てる数学的関数）を未知の試料発現レベルに適用する。
【０１９５】
この分析に用いられ得る方法としては、以下の非制限的なリストが挙げられる：
ＣＬＥＡＶＥＲは、有用な発現プロファイルデータの分類のために用いられるアルゴリ
ズムである。Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ  １９：１８９−１９３を参照せよ。ＣＬＥＡＶＥＲは、正の訓練試料（例えば特定
の患者または試料診断分類、疾患、あるいは疾患基準に由来することが既知の試料からの
発現プロフィール）、負の訓練試料（例えば特定の患者または試料診断分類、疾患、ある
いは疾患基準に由来しないことが既知の試料からの発現プロフィール）、および検査試料
（例えば患者から得た発現プロフィール）を使用して、検査試料が特定の疾患または疾患
基準に相関するかあるいは特定の疾患または疾患基準に相関しないかを決定する。ＣＬＥ
ＡＶＥＲはまた、分類のための２０の大部分の予測遺伝子のリストも生成する。
【０１９６】
人工ニューラルネットワーク（以下、「ＡＮＮ」）を用いて、複合データセットにおけ
るパターンを認識し得、かつＡＮＮは、試料を２より多い群に分類する発現基準を発見し
得る。オリゴヌクレオチド発現マイクロアレイによって生成される発現データを用いて癌
に対する遺伝子発現診断を発見するための人工神経ネットワークの使用は、Ｋｈａｎら（
２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７：６７３−９によって実証される。Ｋｈａｎは、９
６の遺伝子が腫瘍分類での０％誤り率を提供することを見出した。その後、各遺伝子の発
現における変化への分類の感度を測定することによって、分類用のこれらの遺伝子の最も
重要なものを決定した。９６の遺伝子を用いた階層的クラスタリングによって、癌を診断
分類に正しいグループ化をもたらす。
【０１９７】
Ｇｏｌｕｂは、ｃＤＮＡマイクロアレイおよび識別算出を用いて、骨髄性白血病および
リンパ性白血病を区別する発現挙動を有する遺伝子を同定する。Ｇｏｌｕｂら（１９９９
）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５３１−７を参照せよ。新規クラス発見のために、自己組織
マップを用いた。「１つ除外（ｌｅａｖｅ  ｏｎｅ  ｏｕｔ）」分析を用いて、交差検定
（ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を行った。５０の遺伝子を有用なマーカーとして
同定した。これは、等価診断正確度でわずか１０の遺伝子まで減少した。
【０１９８】
臨床試料のサブセット（例えば、狼瘡を有するサブセットおよび有さないサブセット）
に相関する遺伝子群を同定するために、階層的クラスタリング方法および非階層的クラス
タリング方法もまた、有用である。Ａｌｉｚａｄｅｈは、遺伝子発現プロファイルデータ
に基づき、異なる種類のびまん性Ｂ細胞リンパ腫を識別する主要ツールとして階層的クラ
スタリングを使用した。Ａｌｉｚａｄｅｈら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５０３
−１１を参照せよ。Ａｌｉｚａｄｅｈは、遺伝子発現プロファイルデータに基づいて異な
る種類のびまん性Ｂ細胞リンパ腫を識別する主要ツールとして階層的クラスタリングを使
用した。１７８５６のプローブを保持するｃＤＮＡアレイをこれらの実験のために用いて
、９６の試料を１２８のアレイ上で評価して、３８０の遺伝子のセットを試料分類に有用
であるとして同定した。
【０１９９】
Ｐｅｒｏｕは、発現プロファイルデータに基づいた乳癌試料の分子分類に対する階層的
クラスタリングの使用を実証した。Ｐｅｒｏｕら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７
４７−５２を参照せよ。この研究において、８１０２の遺伝子プローブを保持するｃＤＮ
Ａアレイを用いた。これらの遺伝子の１７５３が乳癌間で高い可変性を有することが見出
され、分析用に用いられた。
Ｈａｓｔｉｅは、発現マーカーの発見に対する遺伝子主成分分析（ｇｅｎｅ  ｓｈａｖｉ
ｎｇ）の使用について記載する。Ｈａｓｔｉｅら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１（２）：
ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ０００３．１−０００３．２１。遺伝子主成分分析アルゴリズムは、
類似または整合している発現パターンを有するが、条件（ＲＮＡ試料、試料クラス、患者
クラス）にわたってより大きな可変性を有する遺伝子のセットを同定する。この手法にお
いて、診断群内で密接な発現パターンを有するが、また、診断にわたって高い可変性を有
する遺伝子も、一緒にグループ化する。アルゴリズムは、１つのグループ化ステップで両
方の特性を利用する。例えば、遺伝子主成分分析（ｇｅｎｅ  ｈａｖｉｎｇ）は、共調節
発現を有する有用なマーカー遺伝子を同定し得る。有用なマーカー遺伝子のセットを、分
類における任意の非重複値を提供する各遺伝子を用いて、より少ないセットに減少させ得
る。Ａｌｉｚａｄｅｈら（上掲）が記載するデータセット上で、このアルゴリズムを用い
て、３８０の有益な遺伝子マーカーのセットを、２３４まで減少させた。
【０２００】
発現木の管理回収（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ  ｔｒｅｅ）（Ｈａｓｔｉｅ  ２００１）は、データセット上の他のもの全て
から１つのクラスを最もよく区別する遺伝子またはクラスターを同定する。該方法を用い
て、互いから、２つ以上のクラスまたは全てのクラスを含むデータセットに対して１つの
クラス対他の全てを最もよく分離する遺伝子／クラスターを同定する。診断用遺伝子セッ
トの発見または検査のために、このアルゴリズムを用い得る。
【０２０１】
ＣＡＲＴは、決定木分類アルゴリズム（Ｂｒｅｉｍａｎ  １９８４）である。遺伝子発
現および／または他のデータから、ＣＡＲＴは、試料分類に対する決定木を開発し得る。
決定木上の各ノードは、１つ以上の遺伝子の発現レベルまたは変数についての質問を含む
。閾値より上にある試料は、決定木の１つの枝を下がり、そうでない試料は、他の枝を下
がる。分類分析におけるその使用の更なる記載および診断用遺伝子セットを発見および実
行する上でのその有用性の例については、実施例１０および１６を参照せよ。ＣＡＲＴは
、各スプリッターに対する代理物（分類で有用な遺伝子に対する次に良い代替である遺伝
子）を同定する。
【０２０２】
群を識別するために決定木を構築する分類アルゴリズムであるという点で、多重相加的
回帰木（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ）（Ｆ
ｒｉｅｄｍａｎ，ＪＨ  １９９９，ＭＡＲＴ）はＣＡＲＴと類似している。ＭＡＲＴは、
任意の分類問題について多数の木を構築して、得られたモデルは多数の木の組み合わせを
含む。ＭＡＲＴは、モデルを構築するため、８０００の遺伝子マイクロアレイに由来する
ような、大量のデータセットに用いられ得るので、変数を選択し得る。ＭＡＲＴが多くの
木の組み合わせを用いて、任意の１本の木からはあまり多くの情報をとらないので、訓練
に耐える。ＭＡＲＴは、分類子として使うための遺伝子のセットおよびアルゴリズムを同
定する。
【０２０３】
Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら（２００２）に記載される方法によって、ニアレストシュラン
クンセントロイドクラシファイア（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｓｈｒｕｎｋｅｎ  Ｃｅｎｔｒｏｉ
ｄｓ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）をマイクロアレイまたは他のデータセットに適用し得る。
このアルゴリズムもまた、分類のために遺伝子セットを同定し、試料の各クラスに対して
、それらの１０分割交差検定（１０−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）誤
り率を決定する。アルゴリズムは、セット中の１つの遺伝子から全ての遺伝子まで、どん
なサイズのモデルに対する誤り率でも決定する。特定数の遺伝子が用いられるとき、どち
らかのまたは両方の試料クラスに対する誤り率が最小化され得る。この遺伝子数が測定さ
れるとき、選択した遺伝子と関連するアルゴリズムが同定され、将来の試料の上で分類子
として使用され得る。
【０２０４】
一旦遺伝子のセットおよびそれらの遺伝子に対する発現基準を分類のために構築したら
、交差検定（ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を行う。１０分割交差検定（１０  ｆ
ｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）分析を含む多くの手法が存在し、この際、
訓練試料の１０％を分析外として、分類アルゴリズムを残りの９０％で構築する。１０％
は、その後、アルゴリズムに対する検査セットとして用いられる。試料の１０％を各回の
検査セットとして残したまま、この過程を１０回繰り返す。この分析を介して、予測（検
査）試料で用いるアルゴリズムの強力さを推定するために役立つ交差検定（ｃｒｏｓｓ  
ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）誤りを導き出し得る。
【０２０５】
発現分析のために用いられる全ての患者試料に対して臨床データを集める。臨床変数は
、定量的または非定量的でありうる。定量的である臨床変数を、有意性または分類分析用
の変数として用い得る。患者の性別のような非定量的臨床変数も、任意の統計学的ツール
とともに、有意性分析または分類分析において用いられ得る。条件に対して最も有用な診
断用遺伝子セットは、１つ以上の予測臨床変数とともに考慮されるとき最適であると認識
される。臨床データは、相関分析用の監視ベクトルとしても用いられうる。すなわち、各
試料に関連する臨床データを用いて、分析に対して意味のある診断分類に試料を分け得る
。例えば、任意の診断基準（ａ）の存在または非存在に基づいて、２つ以上の群に試料を
分け得る。さらに、臨床データを利用して、相関分析のために患者を選択すること、ある
いは任意の望ましくない特性（例えば、進行中の感染、医薬品、または任意の他の案件）
に基づいて患者を除外し得る。臨床データはまた、結果の検査前の可能性を評価するため
にも用いられ得る。例えば、女性患者は、男性患者よりも全身性紅斑性狼瘡に羅患してい
ると診断される可能性が非常に大きい。
【０２０６】
一旦、試料を許容可能な精度で分類する遺伝子セットを同定する。遺伝子セットを発見
するために使用されなかった新規試料を用いて、これらの遺伝子をセットとして検証する
。これらの試料は、発見臨床研究からの凍結保管庫（ｆｒｏｚｅｎ  ａｒｃｈｉｅｖｅｓ
）から、または将来の新規患者から入手され得る。マイクロアレイとともに遺伝子セット
の発現プロファイリングを用いて、または検査セット試料上の各遺伝子に対する実時間Ｐ
ＣＲを用いて、試料の「検査セット」を用いた検証が行われ得る。あるいは、異なる発現
プロファイリング技術が、用いられ得る。
【０２０７】
（診断用ヌクレオチドセットの検証および正確度）
本発明の診断用プローブセットの広範な適用に先立って、該プローブの予測値を検証す
る。発現分析に基づいて、マイクロアレイによって診断用プローブセットを発見するとき
、実時間ＰＣＲ等のあまり可変せず、かつ定量性の大きい正確な技術によって、成分遺伝
子の差次的発現を検証することが可能である。この種類の実験では、ＰＣＲ反応の間で、
増幅産物を測定する。これによって、任意の試薬が増幅に対する割合の制限を受ける前に
、研究者が増幅を観察することが可能になる。運動ＰＣＲでは、測定は、ＣＴ（閾値サイ
クル）またはＣｐ（交差点）である。この測定（ＣＴ＝Ｃｐ）は、増幅曲線が閾値蛍光値
を交差する点である。反応の全てが増幅のそれらの線形位相に存在する領域の内の点に閾
値を設定する。ＣＴを測定するとき、以前のサイクル数は、閾値がより急速に越えられた
ことを意味するため、より低いＣＴ値は、より高量の開始材料を表す。
【０２０８】
複数の蛍光方法論は、実時間ＰＣＲで増幅産物を測定するために利用できる。Ｔａｑｍ
ａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、プ
ローブが配列特異的結合およびＴａｇ  ３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される
まで、プローブからのシグナルを阻害するための蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を
用いる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）もＦＲＥＴ技術を使用し、それによって、ヘアピン構造が増幅ＤＮＡに結合す
る特異的プローブによって緩和されるとき、蛍光が測定される。第３の一般に使用される
化学は、ＤＮＡ結合色素であるＳｙｂｒグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，
Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）である。増幅産物が多いほど、シグナルが高くなる。Ｓｙｂｒグリ
ーン方法は、非特異的な増幅産物に高感度であり、プライマー設計と選択の重要性を増加
させる。臭化エチジウムまたは他のＤＮＡ結合色素および蛍光色素／クエンチャー色素Ｔ
ａｑｍａｎ化学の多くの修飾、例えば刺激等の他の検出化学を用いることもできる。
【０２０９】
実時間ＰＣＲ検証を実施例８のように行うことができる。
【０２１０】
通常、例えばオリゴヌクレオチド特異的プライマーを用いたＤＮＡシーケンシングによ
って、各プローブのオリゴヌクレオチド配列を確認する。得られた部分的配列は、一般に
、オリゴヌクレオチドプローブのアイデンティティを確認するのに十分である。また、相
補的ポリヌクレオチドを蛍光標識して、アレイにまたはオリゴヌクレオチドプローブの再
合成型を含有する異なるアレイにハイブリダイズさせて、正確なプローブの検出を確認す
る。
【０２１１】
通常、診断用プローブセットに対する分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）と選択した指
標との間の対応性の正確度を統計学的に評価することによって、検証を実行する。例えば
、２つの被験体クラス間のヌクレオチド配列で差次的な発現を相対的発現の単一比として
表すことができる。以下の方程式で記載されるように、選択した指標を有する被験体中の
ヌクレオチド配列の発現を、選択した指標を持たない被験体中のそのヌクレオチド配列の
発現と比較することができる。すなわち、
【０２１２】
【数８】
2010104368.tif 000009
【０２１３】
群Ａの成分でのヌクレオチド配列ｘの平均発現
【０２１４】
【数９】
2010104368.tif 000010
【０２１５】
群Ｂの成分でのヌクレオチド配列ｘの平均発現
【０２１６】
【数１０】
2010104368.tif 000011
【０２１７】
群ＡおよびＢ間のヌクレオチド配列ｘの平均差次的発現
であり、式中、Σは、和を表し、Ｅｘは、標準に対するヌクレオチド配列ｘの発現であり
、ａｉは、群Ａの個々の成分であり、群Ａは、Ｎ個の成分を有し、ｂｉは、群Ｂの個々の
成分であり、群ＢはＭ個の成分を有する。
【０２１８】
診断用プローブセットのそれぞれの個々の構成要素は、被験体群間で識別するための所
定の感度および特異性を有する。このような個々のヌクレオチド配列を診断用プローブセ
ットとして協調させて使用して、評価の感度および特異性を増加させることができる。分
子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）のデータベースにアルゴリズムによって質問をして、被
験体群間の最も高い平均差次的発現を有するヌクレオチド配列のセット（すなわち、プロ
ーブセットの成分に対応する）を同定する。通常、診断用プローブセット中のヌクレオチ
ド配列の数が増加するにつれて、予測値、すなわちプローブセットの感度および特異性も
増加する。プローブセットを定義するとき、下記で論じるように、診断および患者モニタ
リングに対してそれらを用いることが可能である。所定の使用に対するプローブセットの
診断感度および特異性を、上記に示したように、特定の発現レベルを有する所定のプロー
ブセットに対して測定することができる。診断として各ヌクレオチド配列を使用する上で
必要となる発現閾値を変更することによって、医師がプローブセットの感度および特異性
を変更することができる。例えば、セット中の各ヌクレオチド配列に対する発現差次的閾
値の量を低下させることによって、検査の感度を増加するが、特異性は減少する。前述の
考察から明らかであるように、感度および特異性は、反比例的に関連しあい、プローブセ
ットの予測正確度は、連続的であり、各ヌクレオチド配列に対する発現閾値セットに依存
する。感度および特異性は、発現閾値を変更するとき、反比例的関係である傾向があるが
、予測値を有するヌクレオチド配列を診断用ヌクレオチドセットに付加するとき、両パラ
メータを増加させることができる。さらに、単一のまたは少数のマーカーは、患者集団に
わたって信頼できる発現マーカーでありうる。これは、測定、個体、および時間にわたる
個体間に存在する発現での可変性および発現の測定が原因である。多数の候補ヌクレオチ
ド配列または診断用ヌクレオチドセット中の多数のヌクレオチド配列を内包することによ
って、全てのヌクレオチド配列が診断用閾値を満たす必要はないが、この可変性を可能に
する。一般に、より多いマーカーが単一マーカーよりも優れている。多くのマーカーを用
いて、診断をする場合、ランダムな可変性に基づいて、全ての発現マーカーが任意の閾値
を満たすわけではない可能性は低いので、検査によって与えられる偽陰性はより少なくな
る。代理マーカーがこれらの目的のために有用である。これらは、協調して発現するマー
カーまたは遺伝子である。代理マーカーは、本質的に冗長情報を与えるが、この冗長度は
、アッセイ可変性が原因の誤りを減少させることによって、正確度を改善することができ
る。
【０２１９】
診断用ヌクレオチドセットの所望の診断感度および特異性は、そのセットの意図する使
用によって変わることが認識される。例えば、特定の使用では、高特異性および高感度が
望ましい。例えば、どの患者集団が副作用を経験するかを予測するための診断用ヌクレオ
チドセットは、そのような患者を治療することを避けるように高感度を必要とする。他の
設定では、高感度が所望される一方で、特異性の減少は許容される。例えば、副作用のほ
とんどない有益な治療の場合では、薬剤に応答するできるだけ多くの患者（高感度）を同
定することが重要であり、応答しない複数の患者の治療は許容されるかもしれない。他の
設定では、高特異性が所望され、感度の減少は許容される。例えば、早期相での臨床試験
に対する患者を同定するとき、特定の治療に応答することが可能な患者を同定することが
重要である。この設定での低めの感度は、研究に登録される患者の減少を生じるのみであ
るかまたは登録用にスクリーニングされる患者を増やすことが必要になるだけなので許容
される。
【０２２０】
正確に診断するか、または国内中または世界中で患者を分類するために適用される遺伝
子セットを発見および検証するためには、臨床設定で生じる患者の種類を表す試料を用い
て、該遺伝子セットを開発および検証することを確実に行うことが必要である。例えば、
多様な民族性、薬剤使用、および診療パターンは全て、この種の患者での検査作用を確実
にするための発見および検証で表されていなければならない。
【０２２１】
（免疫モニタリング）
白血球遺伝子発現を用いて、免疫系をモニタリングすることができる。免疫モニタリン
グは、所定の細胞型中の遺伝子セット対するおよび細胞型選択的方法で発現する遺伝子に
対する遺伝子発現レベルを試験する。遺伝子発現モニタリングも、新規細胞型、前駆細胞
、細胞分化等の有無を検出する。遺伝子発現パターンは、疾患状態への応答性を担う免疫
系の細胞の活性化または静止状態に関連する可能性がある。例えば、狼瘡および他の自己
免疫疾患の過程では、免疫系の細胞は、自己抗原によって活性化される。この過程をモニ
タリングおよび診断する遺伝子および遺伝子セットは、免疫系活性化のレベルおよび種類
の尺度を提供している。免疫系をモニタリングする上で有用な遺伝子および遺伝子セット
は、免疫系に関与する全ての疾患の診断およびモニタリングのために有用である。いくつ
かの例としては、慢性関節リウマチ、狼瘡、炎症性腸疾患、多発性硬化症、ＨＩＶ／ＡＩ
ＤＳ、ならびにウイルス性、細菌性、真菌性感染がある。本明細書に開示される全ての障
害および疾患を考慮する。免疫活性化をモニタリングする遺伝子および遺伝子セットは、
免疫活性化を減少させるために用いられる免疫抑制薬物療法に対する応答をモニタリング
するために有用である。遺伝子は、任意の他の検査によって測定されたように、試料中の
免疫活性化および静止状態の既知の存在に対する発現パターンの相関によって、免疫活性
化に相関すると判明した。
【０２２２】
（選択した疾患）
基本的には、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのサブセットが、疾患基準また
は疾患を持つ１つ以上の個体および疾患基準または疾患を持たない１つ以上の個体に由来
する試料中で差次的に発現する限り、本発明の個々のオリゴヌクレオチドおよび診断用オ
リゴヌクレオチドセットを開発して、任意の疾患または疾患基準に本質的に適用すること
が可能であり、この際、該個体は、異なる時間点でサンプリングされた同一個体であるか
、または該個体は、異なる個体（又は個体集団）であってもよい。例えば、オリゴヌクレ
オチド配列のサブセットは、疾患または疾患基準を持たない被験体（例えば疾患を持たな
い患者（コントロール患者）と比べて、疾患または疾患基準を持つ被験体（例えば疾患ま
たは疾患基準を持つ患者）のサンプリングされた組織で差次的に発現する。代替として、
または追加的に、オリゴヌクレオチド配列のサブセットは、例えば異なる時間点、異なる
疾患段階、治療前および後、危険因子の存在または非存在下等で、同一患者から得た異な
る試料で差次的に発現する。
【０２２３】
診断には相関しないが、疾患の特定の態様に相関するオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド配列セットに対応する発現プロファイルを用いて、本発明の診断用オリゴヌ
クレオチドセットおよび疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列を同定することもできる
。例えば、このような態様または疾患基準は、被験体の病歴、家系、例えば自己免疫疾患
の発生、小児期の疾患、親または他の親類の死亡原因、過去の外科的処置または他の介入
、投薬、研究値および診断検査（放射線、病理等）の結果、症状（症状の開始および／ま
たは継続期間を含む）等に関連することができる。また、疾患基準は、診断、例えば狼瘡
、慢性関節リウマチ、変形性関節症等の慢性炎症性疾患、あるいは予後（例えば将来の診
断、事象、または合併症の予測）、例えば狼瘡に由来する腎不全、慢性関節リウマチ、慢
性関節リウマチ、または全身性紅斑性狼瘡疾患活性に対する関節置手術等に関連すること
ができる。他の場合では、疾患基準は、治療結果、例えば投薬への応答、関節に対する外
科的処置または物理療法への応答に対応する。また、疾患基準は、先行して同定されたま
たは古典的な危険因子に一致し、予後または将来の疾患診断に対応することが可能である
。上記に示したように、疾患基準は、１つ以上の遺伝子座に対する遺伝子型にも対応する
ことができる。異なる時間点での同一患者から、異なる患者から、疾患（基準）を有する
患者およびコントロール集団を表す患者間から等、疾患基準（患者データを含む）を採取
（および比較）することが可能である。時系列データ、すなわち個体（または個体群）か
ら異なる時間点で採取されたデータを、異なる時間点で個体（個体群）から得た試料の比
較のために用いて、疾患状態と特に関連する差の同定を可能にすることと、時間経過での
発現の変化率または軌道を含む時間経過での発現の変化に関連する情報を得ることとが可
能である。「本発明の診断用ヌクレオチドセットの同定」と表題した本セクションで時系
列データの有用性をさらに論じる。
【０２２４】
現行の診断手段がない状態を診断する際用いるために、診断用オリゴヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチドセットを開発することが可能であることがさらに理解される。例え
ば、慢性関節リウマチでは、多くの場合、患者が状態の徴候を経験する前に関節破壊が進
行している。患者が症状を提示することに部分的に依存する現行の診断手段を用いること
ができるときよりも早い段階で、リウマチ関節破壊を診断する診断用ヌクレオチドまたは
ヌクレオチドセットを開発することが可能である。診断用ヌクレオチドセットを開発して
、現行の診断処置を置換または増強することが可能である。例えば、狼瘡を診断するため
の診断用ヌクレオチドまたはヌクレオチドの使用は、現行の診断検査および戦略を置換ま
たは増強することが可能である。
【０２２５】
疾患の以下の考察は、典型的かつ非制限的であることが理解され、通常、上記に論じた
一般的基準、例えば家族の病歴を下記に論じる特定の疾患に適用可能であることがさらに
理解される。
【０２２６】
白血球に加えて、全体を通して記載されるように、一般的方法が、組織または細胞型の
試料を採取および評価することによって、被験体組織または細胞型で差次的に発現するオ
リゴヌクレオチド配列に適用可能である。しかし、多くの場合は、このような試料の採取
は、現状の技術に与えられた有意な技術または医療問題を提示する。
【０２２７】
（全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ））
ＳＬＥは、全米で２００万人もの人が患っているとされる免疫系制御不調に特徴づけら
れる慢性全身炎症性疾患である。ＳＬＥの症状としては、発疹、関節痛、異常な血球数、
腎機能障害および腎障害、感染症、中枢神経系疾患、鉛関節痛、および自己免疫病等が挙
げられる。同時に、患者はアテローム性動脉硬化症を初期発症している可能性もある。
現在の診断試験とアルゴリズムでは、確実なＳＬＥの診断をするのは難しいとされている
。抗体テストでは、疾患の特異性が認められることもあるが、多くの場合感度が欠落して
いる。臨床診断では、高い感度および特異性がともに欠落している可能性がある。ＳＬＥ
疾患をもたない患者と比較すると、ＳＬＥという疾患は、白血球中の差次的遺伝子発現に
関連していることは明確である。
【０２２８】
診断用オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド一式を同定し、ＳＬＥ疾患の活性
および進行の診断監視に用いる有効性を検証する。疾患の基準は、症候性発疹、関節痛、
鉛関節痛、倦怠感、発疹、血球数、（白血球赤血球）等の臨床データ、また例えば、クレ
アチニン、血中尿素窒素（以下「ｂｕｎ」と称す）の表現除去（ｃｒｅａｔｉｖｅ  ｃｌ
ｅａｒａｎｃｅ）等の腎機能検査、ＣＲＰ、ＥＳＲ、ＡＮＡ，血清ＩＬ６，Ｓｏｌｕｂｌ
ｅ  ＣＤ４０  リガンド、鑑別完全血球数、ＬＤＬ、ＨＤＬ、抗ＤＮＡ抗体、リウマチ因
子、Ｃ３、Ｃ４、血清クレアチニン、各種薬物治療レベル等を含む実験室試験で得たデー
タ、鎮痛剤、累積投与量または免疫抑制療法の必要性、症状または頸動脈アテローム性動
脉硬化症の発現（例、超音波診断、その他疾患の発現）、部分切除した組織およびバイオ
プシー（例、腎臓、中枢神経）の総計的結果および病理学的評価の等の外科手術（処置）
、薬理学的な療法と治療の変化の情報、疾患「増悪（ｆｌａｒｅ）」の臨床診断、入院、
死亡、薬物治療後の反応、量的共同試験、健康評価アンケートの結果（ＨＡＱｓ）、なら
びにその他患者の症状障害の臨床検査と一致する。さらに、疾患の基準は、ＳＬＥＤＡＩ
（Ｂｏｍｂａｄｉｅｒ  Ｃ，Ｇｌａｄｍａｎ  ＤＤ，Ｕｒｏｗｉｔｚ  ＭＢ，Ｃａｒｏｎ
Ｄ，Ｃｈａｎｇ  ＣＨ  および予後研究委員会：狼瘡患者用ＳＬＥＤＡＩの導出：Ａｒ
ｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３５：６３０−６４０，１９９２）の名称で知られる臨床
スコアと一致する。診断用ヌクレオチド一式は、例えば、ＳＬＥの診断、進行性腎機能障
害、頸動脈のアテローム性動脉硬化症、および中枢神経系機能障害を含む疾患の進行を監
視、ならびに副作用の発生を予測するのに用いられる。
【０２２９】
（慢性関節リウマチ）
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は米国において約２００万人の患者に影響を及ぼしている、
慢性かつ衰弱性の炎症性関節炎であり、とりわけ関節に痛みと破壊をもたらす。ＲＡはし
ばしば患者が痛みを感じないために診断未確定となることもあるが、疾患は活発に関節を
破壊し続ける。ＲＡと分かった他の患者では、症状を軽減するための治療が行われるが、
関節破壊の進行度合いは容易には観察できない。薬物治療も可能であるが、最も効果的な
薬には毒性があり（例えば、ステロイド、メトトレキサート）、したがって注意深く使わ
れねばならない。新しい種類の薬（ＴＮＦ  ブロッカー）は大変効果的ではあるが、そう
した薬は高価で、副作用があり、かつ全ての患者に効果があるわけではない。副作用は一
般的で、免疫抑制、臓器系への毒性、アレルギー、および代謝障害を含んでいる。
【０２３０】
本発明の診断用オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドセットはＲＡの診断と治療に
使用するために開発され、有効性が確認された。疾患基準は、疾患症状（例えば、関節の
痛み、関節の腫れ、関節の堅さ、およびＲＡ診断のための米国リュウマチ学会（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｆｏｒ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）基準のいずれかのもの
。アーネット（Ａｒｎｅｔｔ）他（１９８８）関節とリューマチ（Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕ
ｍ．）３１：３１５〜２４参照）、関節破壊の進行（例えば、連続携帯レントゲン写真（
ｓｅｒｉａｌ  ｈａｎｄ  ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｓ）により測定されたもの、関節の機能
や可動性の評価）、手術、薬物治療の必要性、炎症および非炎症状態の追加的な診断、そ
して分画での全血球数測定（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｕｎｔｓ  ｗｉｔｈ  
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓ）、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、赤血球沈降速度（ＥＳＲ
）、抗核抗体（ＡＮＡ）、血清ＩＬ６，可溶性ＣＤ４０リガンド、低比重リボタンパク質
（ＬＤＬ）、高比重リボタンパク質（ＨＤＬ）、抗ＤＮＡ（Ａｎｔｉ−ＤＮＡ）抗体、リ
ウマチ因子、Ｃ３、Ｃ４、血清クレアチン、死亡、入院そして関節破壊による身体障害を
含む臨床検査測定に対応している。加えて、または選択的に、疾患基準は薬物治療への反
応および副作用の有るまたは無し、あるいは米国リューマチ学会により「２０％」と「５
０％」の対応改善率（ｒｅｓｐｏｎｓｅ／ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｒａｔｅｓ）と例示
された改善指標に対応している。フェルソン（Ｆｅｌｓｏｎ）他（１９９５）関節とリュ
ウマチ（Ａｒｔｈｒ  Ｒｈｅｕｍ）３８：５３１−３７を参照。診断用ヌクレオチドセッ
トはフレアリング（ｆｌａｒｉｎｇ）（関節痛または他の症状を伴う疾患の急性な悪化）
を含む疾患の進行を監視し予測することが認められており、薬物治療や副作用の可能性に
対応する。
【０２３１】
抹消白血球に加え、リウマチ関節の手術標本が白血球発現プロファイリング実験に使わ
れることができる。診断用ヌクレオチドセットの成分は、例えば慢性関節リウマチのため
の薬剤標的候補として、白血球標的ヌクレオチド配列のための候補である。滑液標本（Ｓ
ｙｎｏｖｉａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）は発現プロファイリングに使われることができ、
またはその組織（白血球のサブセットのような）に由来しかつ選別された細胞も使われる
ことができる。細胞は、蛍光活性細胞選別（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉ
ｎｇ）または磁気親和性試薬技術あるいは幾つかの他の技術により分離されうる。滑液標
本と血液は同じ患者から取得され、これら２つの試料タイプの間での遺伝子発現が比較さ
れる。
【０２３２】
（変形性関節症）
米国においては２千万〜４千万人の変形性関節症の患者がいる。患者グループは異質で
あり、早い時期に発病した人（ｅａｒｌｉｅｒ  ｏｎｓｅｔ）、関節損傷の激しい人、よ
り炎症のある人（白血球浸潤）のサブセットがある。  白血球診断学が変形性関節症を慢
性関節リウマチ  や他の違った診断から区別するのに使われてきており、ＮＳＡＩＤ治療
（ノンステロイド対炎症薬）または他の対炎症療法に対応した可能性や程度を規定してい
る。関節損傷の進行率もまた評価され得る。診断用ヌクレオチドセットは治療処置の選定
や滴定に使うために開発された。疾患基準は、治療への対応とある療法を用いた場合の疾
患の進行、薬物療法への反応、関節手術の必要性、関節の痛みおよび身体障害に対応して
いる。
【０２３３】
抹消白血球に加え、変形性関節症の関節の手術標本が白血球発現プロファイリング実験
に使われることができる。診断用オリゴヌクレオチドと診断用オリゴヌクレオチドセット
は、例えば変形性関節症のための薬剤標的候補として、白血球標的ヌクレオチド配列のた
めの候補である。滑液標本（Ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）は発現プロファイ
リングに使われることができ、  またはその組織（白血球のサブセットのような）に由来
しかつ選別された細胞も使われることができる。細胞は、蛍光活性細胞選別または磁気親
和性試薬技術あるいは幾つかの他の技術により分離されうる。滑液標本と血液は同じ患者
から取得され、これら２つの試料タイプの間での遺伝子発現が比較される。
【０２３４】
他の例として、診断用ヌクレオチドセットは人工装具周辺骨溶解の治療に使用するため
に開発され、有効性が確認された。この疾患においては、膝や腰といった人工装着関節が
時間とともに緩むことが見出され、反復手術が必要となる。幾つかの患者において、緩み
は人口装具の異質材料に刺激された炎症反応によって起こるとされている。疾患基準は、
関節の緩み、人工装具周辺骨溶解のレントゲン写真証拠、反復手術の必要性、  薬物治療
への反応、そして／または組織学的（生体検査または手術からの）または生化学的（アル
カリ性ホスファターゼといった骨代謝マーカー）な骨溶解の証拠を含む。発現プロファイ
リングのために使われる組織には、抹消白血球または白血球のサブセット、人工装具周辺
組織、または滑液流体を含めることができる。更に、遺伝子セットは、免疫細胞がその中
で接合剤や  チタニウムといった人工装具材料にさらされる試験管モデルを用いることで
発見することができた。
【０２３５】
（薬理遺伝学）
薬理遺伝学は、特定薬剤療法（複数の療法の組み合わせ）に反応する個体的な生来の傾
向の研究である。この文脈では、反応とは、特定薬剤が特定の患者、例えば１つの薬剤に
反応するが他の薬剤に反応しない何人かの患者に作用するか否かを指す場合がある。この
一例は、複数のインターフェロン（ＩＦＮｓ）を標的とする薬剤に反応する患者を予測す
ることであろう。また、反応は、治療の成功の可能性あるいは治療における進捗状況の評
価を指す場合もある。また、この記述においては、特定患者への薬剤の滴定療法も含まれ
、例えば異なる患者は所定の薬物の異なる用量に反応する場合がある。この実施態様は、
副作用を有する薬剤あるいは他の薬剤療法との相互作用が考慮される場合に重要となる可
能性がある。
【０２３６】
診断用オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセットは、患者が特定の療法に反
応するか否かの評価用および／または患者の薬剤療法（複数の療法）に対する反応性のモ
ニタリング用として開発されかつ実証されている。疾患の基準となる条件は、臨床的な徴
候あるいは臨床的な終点の有無、副作用の存在、あるいは他の薬剤（複数の薬剤）との相
互作用が該当する。診断用ヌクレオチドセットは、活動状態の疾患に対する薬剤療法の標
的あるいはマーカーであるヌクレオチド配列をさらに含めてもよい。
【０２３７】
診断用オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセットは、患者が特定の薬剤毒性
、あるいは作用が関係した環境または他の薬剤による毒性を有するか否かの評価用として
開発されかつ実証されている。また、患者に対する被曝は、戦争に使用される生物学的あ
るいは生化学的な物質に関連づけられてもよい。診断用オリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチドセットは、毒性あるいは被曝の早期診断を可能にし、あるいは毒性反応の重
篤さおよび過程をモニターすることが可能である。
【０２３８】
（診断用オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセットの使用方法）
また、本発明は、診断用オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセットを、疾患
の診断あるいはモニター；疾患の重篤さの評価；発症見込みの予測；合併症併発見込みの
予測；疾患予後の確認；患者の危険率の評価あるいは患者グループの階層化；現行薬剤療
法に対する反応性の評価；現行の非薬理療法に対する反応性の評価；患者に対する最も適
切な薬物投与あるいは療法の決定；患者が特定薬剤に反応する見込みがあるか否かの予測
；および他の臨床的かつ疫学的な関連用途の中から患者にとって最も適切な診断検査法の
決定に、使用する方法を提供する。
【０２３９】
本発明の診断用オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセットは、医師、健康管
理者、病院勤務者、研究者、患者、付き添い人、および他の施設関係者によって種々の目
的のために利用可能である。先に示されたように、少なくとも１つのヌクレオチド配列が
白血球の母集団（あるいは部分母集団）内で特異的に表されている本質的に、いかなる疾
患、症状あるいは状態も、本発明の診断用オリゴヌクレオチドセットおよび方法を用いて
評価、例えば診断およびモニターされることが可能である。個体レベルで健康状態を評価
することに加えて、本発明の診断用オリゴヌクレオチドセットは、“母集団レベル”で、
例えば疫学的研究すなわち症状あるいは疾患ごとに選別する母集団で被験者を評価するの
に適している。
【０２４０】
（試料の採取および調製）
ＲＮＡ、タンパク質および／またはＤＮＡは、この明細書でさらに記述されるように、
この技術分野において周知の方法によって調製される。ＲＮＡ試料が全血の対象試料から
調製される前に遅延という事態が導入される可能性があり、例えば全血試料が更なる処理
のために臨床検査室に即座に送られない可能性があるため、本発明の方法で使用されるた
めに採取された対象試料が概ね臨床設定で採取されることが正当に評価されている。さら
に、複数の試料が概ね任意の時点において処理されるため、遅延は臨床検査室環境で導入
される可能性がある。この理由から、室温で無傷の白血球を非常に長い時間培養すること
を特徴とする方法は、白血球の発現プロファイルが長い期間中ずっと変化する可能性があ
るため、好ましくない。例えば、ＲＮＡは、例えば米国特許番号第５，３４６，９９４号
および同第４，８４３，１５５号に記述されているように、フェノール／グアニジンイソ
チオシアナート試薬あるいは他の直接的な全血溶解法を用いて全血から単離することがで
きる。この方法は、全血ＲＮＡ抽出物から回収されたＲＮＡの大部分が白血球数に対して
１０００倍と数でまさる赤血球由来であるので、特定の状況下ではむしろ好ましくない可
能性がある。赤血球ＲＮＡおよびタンパク質の存在がＲＮＡ発現プロファイルデータ内で
バイアスを誘発しないか、あるいはプローブの不十分な感度あるいは特異性を導かない点
を保証することに注意が払われなければならない。
【０２４１】
一方、無傷の白血球は、例えば米国特許番号第５，９７３，１３７号および同第６，０
２０，１８６号に記述されているように、選択的に赤血球を溶解するが白血球を溶解しな
い溶解緩衝液を用いて全血から収集されてもよい。無傷の白血球はその後に、遠心分離に
よって収集され、白血球ＲＮＡはこの明細書に記述されているように標準的なプロトコル
を用いて単離される。しかしながら、この方法は、望ましい場合には、白血球の部分母集
団、例えば単核細胞を分離することができない。さらに、上記発現プロファイルは、非常
に多くの試料が任意の時点で調製される特に忙しい臨床検査室において、溶解緩衝液中で
、長い培養期間中ずっと変化する可能性がある。
【０２４２】
一方、特異的な白血球の細胞タイプは、密度勾配試薬（Ｂｏｙｕｍ，Ａ、１９６８）を
用いて分離することができる。例えば、単核細胞は、米国特許番号第４，１９０，５３５
号、同第４，３５０，５９３号、同第４，７５１，００１号、同第４，８１８，４１８号
および同第５，０５３，１３４号、に記述されているように、密度勾配試薬を用いて全血
から分離されてもよい。血液は、抗凝固剤および密度試薬（ＦｉｃｏｌｌあるいはＰｏｒ
ｃｏｌｌ等）を含む試験管内に直接、抜き取られる。この試験管の遠心分離は、血液を白
血球および顆粒白血球の層、単核細胞懸濁液および血漿層に分離することになる。単核細
胞層は容易に除去され、その細胞は遠心分離によって収集され、溶解され、および凍結す
ることができる。凍結試料はＲＮＡが単離されるまで安定している。しかしながら、密度
遠心分離は、室温で処理されなければならず、仮に、忙しい臨床検査室のように処理が過
度に長期間になる場合には、発現プロファイルは変化する可能性がある。
【０２４３】
一方、細胞は、遺伝子あるいはタンパク質の発現に基づいて細胞をサブセットに分割す
る蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）あるいは他の方法を用いて分離することができる。
この方法は対象細胞の試料を濃縮する点で望ましくあり得るが、遺伝子発現プロファイル
の変動（Ｃａｎｔｏｒら，１９７５；Ｇａｌｂｒａｉｔｈら，１９９９）を招く細胞操作
および時間の遅延を持ち込む可能性もある。
【０２４４】
各臨床用ＲＮＡ試料の質および量は、この技術分野において公知の方法を用いてアレイ
ハイブリダイゼーションのための増幅およびラベル化前に検査されるのが望ましい。例え
ば、各試料の１マイクロリットルは、ＲＮＡ６０００ナノラボチップ（Ｃａｌｉｐｅｒ，
Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ．ＵＳＡ）を用いてバイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎ
ｔ  ２１００  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａ．ＵＳＡ）で分析可能である。分解ＲＮＡは、
１８ＳのリボソームＲＮＡに対する２８ＳのリボソームＲＮＡの減少割合および／または
２５から１００までの範囲のヌクレオチドにおける大量のＲＮＡの存在によって同定され
る。
【０２４５】
診断用オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットと使用されるＲＮＡ試料は
、診断用ヌクレオチドセットを同定するのに使用されるような同一または異なる細胞母集
団、部分母集団および／または細胞タイプから生成されてもよいことは正当に評価されて
いる。例えば、単核細胞から抽出されたＲＮＡを用いて同定された診断用オリゴヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチドセットは、診断ヌクレオチドセットの成分の特定の特徴に
依存して、全血または単核細胞から抽出されたＲＮＡの分析用として適切である可能性が
ある。一般に、診断用オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットは、診断用遺
伝子セットを得る際に使用されるものと異なる細胞母集団、部分母集団あるいは細胞タイ
プ由来のＲＮＡと使用される場合に検査されかつ実証されなければならない。診断用ヌク
レオチドセットの成分の細胞特異的遺伝子の発現、診断用ヌクレオチドセットの成分によ
って与えられた情報の重複性、診断用ヌクレオチドセットの成分の発現レベル、および診
断用ヌクレオチドセットの一要素の発現の細胞特異的変化のような要因は、診断用ヌクレ
オチドセットの成分を同定する際に使用されるものと異なるＲＮＡ供給源の有用性に貢献
する。全血由来のＲＮＡを分析し、血液から特定の細胞タイプを単離する必要性をなくす
ことは、望ましくあり得ることが、正当に評価されている。
【０２４６】
（発現プロファイル用の高品質ＲＮＡの臨床設定における生成に適したＲＮＡ迅速抽出
方法）
ある臨床設定において、発現プロファイリングに適した高品質のＲＮＡ標本を白血球の
所望の母集団から採取することはある技術的な挑戦を呈するものであり、この挑戦は臨床
設定での迅速な試料処理能力の欠如と、処理（忙しい検査室あるいは臨床設定で）の遅延
が例えばあるヌクレオチド配列の発現プロファイルの移動を許すことによってＲＮＡ品質
に悪影響を及ぼす可能性を含むものである。また、フェノールなどの毒性を有する高価な
試薬の使用は、このような試薬の輸送および取り扱いに関係した追加費用のために臨床設
定において不評を買う可能性もある。
【０２４７】
白血球発現プロファイリングに有用なＲＮＡ単離方法は、細胞の発現プロファイルを防
止しながら、時宜を得た方法で単球およびリンパ球ＲＮＡの単離を可能にして、再現可能
な高品質ＲＮＡ試料の安価な生成を可能にするものである。したがって、本発明は、発現
プロファイルが「凍結」されかつＲＮＡ分解が低減されるように、ＲＮＡ転写の阻害剤（
単数または複数）および／またはタンパク質合成の阻害剤（単数または複数）の添加方法
を提供するものである。所望の白血球の母集団または部分母集団はその後に単離され、試
料は、ＲＮＡ抽出の更なる処理前に凍結されるか、あるいは溶解されてもよい。血液は対
象の母集団から抜き取られ、転写を阻害するアクチノマイシンＤ（最終濃度１０μｇ／ｍ
ｌになる）およびタンパク質合成を阻害するシクロヘキシミド（最終濃度１０μｇ／ｍｌ
になる）に曝される。阻害剤（単数または複数）は、血液が抜き取られるとすぐに液体の
状態で血液採取管に注入可能であるか、あるいは試験管は凍結乾燥した阻害剤あるいは抗
凝固剤を含む溶液中に存在する阻害剤のいずれかを含むように製造可能である。この点で
、血液試料は、他に記述されているように、所望の白血球母集団あるいは部分母集団が分
離されるまで室温で保存可能である。ＲＮＡは、例えば、上述したように標準法を用いて
分離されるか、あるいは細胞ペレットまたは細胞抽出物はＲＮＡの更なる処理の都合がよ
くなるまで凍結可能である。
【０２４８】
また、本発明は、低温密度勾配を用いて所望の白血球試料を分離する方法をも提供する
ものである。他の実施の形態では、本発明は低温密度勾配の使用と、転写および／または
タンパク質合成の阻害剤の使用との組み合わせを提供するものである。所望の白血球母集
団は、０℃から４℃までの温度で細胞分離のための所定の密度および粘度を維持する細胞
分離用の密度勾配溶液を用いて分離される。血液は、上記溶液を含む試験管内に抜き取ら
れ、低温が細胞処理を遅くしかつ発現プロファイルの変化を最小限にするので、処理前お
よび処理中に冷却されてもよい。標準法を用いて、白血球は分離され、ＲＮＡは単離され
る。一方、細胞ペレットまたは細胞抽出物はＲＮＡの更なる処理の都合がよくなるまで凍
結される。さらなる処理ステップ中に試料の復温を回避することに注意が払われなければ
ならない。
【０２４９】
一方、本発明は、上述したように、アクチノマイシンＡおよびシクロヘキサミドの使用
と組み合わせられた低温密度勾配分離を用いる方法を提供するものである。
【０２５０】
（診断用発現の評価）
対象試料中のオリゴヌクレオチドあるいは診断用オリゴヌクレオチド配列のセットの発
現プロファイルは、各成分のオリゴヌクレオチド配列の発現を確認するいかなる方法によ
っても評価可能である。発現の分析に適した方法はこの技術分野において公知であり、多
くの実施例が上記の「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ  ｄａｔａ」および「ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓ
ｓａｙｓ」という名称の部分で論じられている。
【０２５１】
多くの場合では、発現プロファイルの評価は最も効率的であり、費用効果的であり、Ｒ
ＮＡ発現を分析することによって実行される。一方、診断用ヌクレオチドセットの各成分
によってコード化されたタンパク質は、例えば上述したようなタンパク質発現を確認でき
るいかなる方法によっても診断目的で検出される。発現プロファイルは診断オリゴヌクレ
オチドあるいはオリゴヌクレオチドセットを同定しかつ実証するのに使用されるものと同
一あるいは異なる方法を用いて対象の白血球試料で評価可能である。例えば、ｃＤＮＡの
マイクロアレイ上のサブセット配列として同定された診断用ヌクレオチドセットは、配列
が同定される同一のアレイ上で診断（あるいは予後あるいはモニタリングなど）目的に利
用可能である。一方、所定の疾患あるいは症状に関する診断用ヌクレオチドセットは、上
記目的のために割り当てられたサブアレイ上で構成可能である。仮に、診断用ヌクレオチ
ドセットが１つの方法、例えばＲＮＡ発現プロファイリングを用いて発見されたが、他の
方法、例えばタンパク質発現プロファイリングを用いた診断として適用される場合に、上
記ヌクレオチド（あるいは遺伝子、あるいはタンパク質）セットが新しい方法で診断目的
として概ね実証されなければならない点に留意することは重要である。さらに、１つの用
途、例えば特定の疾患を診断するために開発された診断用ヌクレオチドセットが後日、別
の用途、例えば特定の疾患が生じる可能性を予測するために有用であると発見されてもよ
いことは正当に評価される。一般に、診断用ヌクレオチドセットは別の環境内での使用が
実証される必要がある。この明細書で論じられているように、診断用ヌクレオチドセット
の成分の配列は、ヌクレオチド配列の特定の増幅を与える、この技術分野において公知の
方法を用いてＲＮＡあるいはｃＤＮＡから増幅可能である。
【０２５２】
（一般的なタンパク質方法）
本発明のヌクレオチド配列のタンパク質産物としては、機能的に等価な遺伝子産物を表
すタンパク質を挙げることが可能である。このような等価な遺伝子産物は、上述のヌクレ
オチド配列にコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換を含
むことが可能であるが、これはサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）な変化を生じるため、機能的
に等価なヌクレオチド配列産物を生成する。関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性
、親水性、および／または両親媒性での類似性に基づいて、アミノ酸置換を行うことが可
能である。
【０２５３】
例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バ
リン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。
極性アミノ酸としては、極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、シ
ステイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷を持つ（塩
基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびとヒスチジンが挙げられる。負電
荷を持つ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
本明細書で使用するように、「機能的に等価な」とは、本明細書に記載されるヌクレオチ
ドにコードされる内在遺伝子産物と実質的に類似のインビボ活性を示すことができるタン
パク質を指す。
【０２５４】
当技術で周知の技術を用いた組み換えＤＮＡ技術によって、遺伝子産物（ヌクレオチド
配列のタンパク質産物）を生成することが可能である。当業者には周知の方法を用いて、
新規なヌクレオチド配列タンパク質コーディング配列および適当な転写／翻訳制御シグナ
ルを含有する発現ベクターを構築することができる。このような方法としては、例えばイ
ンビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組み換え／遺伝子組み換えが挙
げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら，１
９８９，前出に記載される技術を参照せよ。また、例えば合成機を用いて、新規なヌクレ
オチド配列タンパク質配列をコードすることができるＲＮＡを化学的に合成することが可
能である。例えば「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，１９８４
，Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄに記載される技術を参照の
こと。これは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５５】
種々の宿主−発現ベクター系を用いて、本発明のヌクレオチド配列コーディング配列を
発現することが可能である。このような宿主−発現系は、対象コーディング配列を産生し
、続いて単離することを可能にする媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅ）を表すが、適当なヌクレオ
チドコーディング配列で形質転換またはトランスフェクションされるときに、インサイチ
ュで本発明のヌクレオチド配列にコードされるタンパク質を提示し得る細胞も表す。その
ようなものとしては、限定はされないが、ヌクレオチド配列タンパク質コーディング配列
を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮ
Ａ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物；ヌクレオチド配列タンパク質コーディング配列を
含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えばサッカロミケス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピシア（Ｐｉｃｈｉａ））；ヌクレオチド配列タンパク質コー
ディング配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感
染させた昆虫細胞系；組み換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイ
ルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させたか、またはヌクレ
オチド配列タンパク質コーディング配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター（例
えばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳類細胞のゲノム由来のプ
ロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルス由来のプロモ
ーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモー
ター）を含有する組み換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、
ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられる。
【０２５６】
細菌系では、発現させるヌクレオチド配列タンパク質の使用目的によって、多数の発現
ベクターを有利に選択することが可能である。例えば、多量の該タンパク質を生産すると
き、抗体の生成のためにまたはペプチドライブラリーをスクリーニングするためには、例
えば容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが望ましくあ
り得る。そのようなベクターとしては、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現
ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら，１９８３，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１；）が
挙げられ、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃ  Ｚコーディング領域とともにイン
フレームで、ヌクレオチド配列タンパク質コーディング配列を該ベクターに個々にライゲ
ートすることが可能である；ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ，１９８
５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅ
ｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３；
−５５０９）およびｐＧＥＸベクターなどを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来ポリペプチドを発現させることも可能であ
る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビー
ズへの吸着後に、遊離グルタチオンの存在下で溶離することによって溶解細胞から容易に
精製することができる。トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように
ｐＧＥＸを設計するため、クローニングした標的ヌクレオチド配列タンパク質をＧＳＴ部
分から分離することができる。本発明に有用な他の系としては、ＦＬＡＧエピトープまた
は６−ＨＩＳ系の使用が挙げられる。
【０２５７】
昆虫系では、オートグラファ核多角体ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ））
をベクターとして用いて、外来ヌクレオチド配列を発現させる。該ウイルスは、ヨトウガ
（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。ヌクレオチド配列
コーディング配列を、該ウイルスの非必須領域（例えば多角体遺伝子）中に個々にクロー
ニングして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば多角体プロモーター）の制御下に置くこと
が可能である。ヌクレオチド配列コーディング配列の挿入が成功することによって、多角
体遺伝子の不活性化および非閉塞組み換えウイルス（すなわち、多角体遺伝子にコードさ
れるタンパク様外被を持たないウイルス）の産生を生じる。その後、これらの組み換えウ
イルスを用いて、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞に感染
させて、  該細胞内で、挿入ヌクレオチド配列が発現する（例えばＳｍｉｔｈら，１９８
３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４；Ｓｍｉｔｈ、米国特許第４，２１５，０５１号を参
照せよ）。
【０２５８】
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルスを用いる発現系を使用することができる。アデノ
ウイルスを発現ベクターとして用いる場合、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例え
ば後期プロモーターおよび三分節（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列に、対象ヌクレ
オチド配列コーディング配列をライゲートすることが可能である。その後、インビトロま
たはインビボ組み換えによって、このキメラヌクレオチド配列をアデノウイルスゲノムに
挿入することが可能である。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）
内の挿入によって、感染宿主内で生存可能であり、かつヌクレオチド配列にコードされる
タンパク質を発現することができる組み換えウイルスを生じる（例えばＬｏｇａｎおよび
Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３６５
５−３６５９を参照せよ）。挿入ヌクレオチド配列コーディング配列の効率的な翻訳のに
は、特定の開始シグナルも必要となりうる。これらシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドン
および隣接配列が挙げられる。自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全ヌクレオチド配
列を適当な発現ベクターに挿入する場合、付加的な翻訳制御シグナルが必要とされない可
能正がある。しかし、ヌクレオチド配列コーディング配列の部分のみを挿入する場合、恐
らくＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳制御シグナルを設けなければならない。さらに
、開始コドンは、完全な挿入の翻訳を確実にするために、所望のコーディング配列のリー
ディングフレームと同相でなければならない。これらの外来性の翻訳制御シグナルおよび
開始コドンは、種々の起源、すなわち天然および合成でありうる。適当な転写エンハンサ
ーエレメント、転写ターミネーターなどを内包することによって、発現効率を高めること
が可能である（Ｂｉｔｔｎｅｒら，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．
１５３：５１６−５４４を参照せよ）。
【０２５９】
さらに、挿入配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式でヌクレオチド配列産
物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択することが可能である。タンパク質
産物のそのような修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）は、
そのタンパク質の機能にとって重要でありうる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後
プロセッシングおよび修飾に対して特有かつ特定のメカニズムを有する。適当な細胞系ま
たは宿主系を選択して、発現させる外来タンパク質の正確な修飾およびプロセッシングを
確実にすることができる。このためには、１次転写物の適切なプロセッシング、遺伝子産
物のグリコシル化、およびリン酸化に対する細胞内機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を有する
真核宿主細胞を用いることが可能である。そのような哺乳類宿主細胞としては、限定はさ
れないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、
ＷＩ３８などが挙げられる。
【０２６０】
組み換えタンパク質の長期間かつ高収率の生産のためには、安定した発現が好ましい。
例えば、ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質を安定して発現する細胞系を操作す
ることが可能である。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いる代わりに、適
当な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネータ
ー、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで宿
主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作した細胞を濃縮培
地で１〜２日間増殖させることができ、その後、選択培地に切り換える。組み換えプラス
ミド内の選択可能なマーカーは、選択に耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に
安定に取り込み増殖して、次に細胞系にクローニングおよび増殖され得る細胞増殖巣を形
成することを可能にする。この方法を有利に用いて、ヌクレオチド配列にコードされるタ
ンパク質を発現する細胞系を操作することが可能である。このような操作した細胞系は、
ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の内在性の活性に作用する化合物をスクリー
ニングおよび評価する上で特に有用である。
【０２６１】
多数の選択系を用いることができ、該選択系としては、限定はされないが、単純疱疹ウ
イルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ら，１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３；）、
ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａおよ
びＳｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４
８：２０２６；）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ら，
１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７；）遺伝子が挙げられ、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ
−、またはａｐｒｔ−細胞系で用いることができる。メトトレキセートに対する耐性を付
与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，ら，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  
７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅ，ら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ  ７８：１５２７；）、マイコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍ
ｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ  ７８：２０７２；）、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ
（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ら，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：
１）、およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，
ら，１９８４，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７；１４７）遺伝子用の選択基準として代謝拮抗物
質耐性を用いることもできる。
【０２６２】
代替の融合タンパク質系によって、ヒト細胞系で発現する非変性融合タンパク質の容易
な精製が可能になる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，ら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８９７２−８９７６）。この系では、対象ヌクレオチド配列
を、６個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグにこのヌクレオチド配列のオープンリ
ーディングフレームが翻訳的に融合されるようにワクシニア組み換えプラスミドにサブク
ローニングする。組み換えワクシニアウイルスに感染させた細胞からの抽出物を、Ｎｉ２
＋−ニトリロ酢酸−アガロースカラムにかけて、イミダゾール含有緩衝液によってヒスチ
ジンタグタンパク質を選択的に溶出する。
【０２６３】
組み換えＤＮＡ技術を用いて、該アッセイ系用のヌクレオチド配列にコードされるタン
パク質を生産する場合、標識、固定化、および／または検出を容易にすることができる融
合タンパク質を操作することが有利であり得る。
【０２６４】
（抗体）
間接標識には、ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質に特異的に結合する標識抗
体などのタンパク質の使用を伴う。そのような抗体としては、限定はされないが、ポリク
ローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラッグメント、およびＦａｂ発現
ライブラリーによって産生されるフラッグメントが挙げられる。
【０２６５】
本発明は、ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質に対する抗体も提供する。１つ
以上のヌクレオチド配列エピトープを特異的に認識することができる抗体の生産方法を本
明細書に記載する。そのような抗体としては、限定はされないが、ポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラッグ
メント、Ｆ（ａｂ’）２フラッグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフ
ラッグメント、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体、および上記の任意のもののエ
ピトープ結合フラッグメントを挙げることが可能である。例えば生物学的試料中のヌクレ
オチド配列の検出で、または代わりに、異常性遺伝子活性の阻害用の方法として、下記さ
らに記載するように例えば疾患標的ヌクレオチド配列の阻害で、このような抗体を用いる
ことが可能である。従って、このような抗体を、心血管または他の疾患治療方法の一環と
して利用することが可能であり、かつ／あるいは診断技術の一環として利用することが可
能である。該診断技術によって、ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の異常レベ
ルに関してまたはこのようなタンパク質の異常形態の存在に関して患者を試験することが
可能である。
【０２６６】
ヌクレオチド配列に対する抗体の生産のために、ヌクレオチド配列またはその部分にコ
ードされるタンパク質を用いた注入によって、種々の宿主動物を免疫化することが可能で
ある。そのような宿主動物としては、限定はされないが、少数ではあるが例を挙げるとす
れば、ウサギ、マウス、およびラットが挙げられ得る。宿主種に応じた種々のアジュバン
トを用いて、免疫学的応答を増大させることが可能であり、該アジュバントとしては、限
定はされないが、フロイントの（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）（完全および不完全）アジュバント
、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレチシンなどの界面活性物質、プルロニック
ポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマ
ルジョン、スカシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノ
ール、およびＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇ
ｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウムパルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  
ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。
【０２６７】
ポリクローナル抗体は、遺伝子産物などの抗原またはその抗原的機能性誘導体で免疫化
した動物の血清由来の抗体分子の異種の集まり、である。ポリクローナル抗体の生産のた
めに、上述のアジュバントを補充した遺伝子産物の注入によって、上述したような宿主細
胞を免疫化することが可能である。
【０２６８】
培養で継続的細胞系による抗体分子の産生を与える任意の技術によって、特定の抗原に
対する抗体の同種の集まりであるモノクローナル抗体を得ることが可能である。このよう
なものとしては、限定はされないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリド
ーマ技術（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；および米国特許第４，３
７６，１１０号）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｌｅら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶハイブリドーマ技
術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃ
ａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）
が挙げられる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその
任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンのクラスのものでありうる。この発明のｍ
Ａｂを産生するハイブリドーマをインビトロまたはインビボで培養することが可能である
。
【０２６９】
さらに、適当な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともに、適当な抗原特異性のマ
ウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによって、「キメラ抗体」を産生す
るために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，１９８４，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４
５２−４５４）を用いることができる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂに由来する可変領域
およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどの、異なる部分が異なる動物種に由
来する分子である。
【０２７０】
また、一本鎖抗体を産生するために記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号
；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら，１
９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；
およびＷａｒｄら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４６）を適合させて、
ヌクレオチド配列−一本鎖抗体を生産することができる。アミノ酸架橋を介してＦｖ領域
の重鎖および軽鎖フラッグメントを結合させ、一本鎖ポリペプチドを生じることによって
、一本鎖抗体を形成する。
【０２７１】
既知の技術によって、特異的エピトープを認識する抗体フラッグメントを生成すること
が可能である。例えば、そのようなフラッグメントとしては、限定はされないが、抗体分
子のペプシン消化によって生産することができるＦ（ａｂ’）２フラッグメント、および
Ｆ（ａｂ’）２フラッグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成すること
ができるＦａｂフラッグメントが挙げられる。また、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して
（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）、所望の特異
性を有するモノクローナルＦａｂフラッグメントの迅速かつ容易な同定を可能にし得る。
【０２７２】
（疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列）
本発明は、疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列および疾患特異的標的オリゴヌクレ
オチド配列セットも提供する。上述のように同定する診断用オリゴヌクレオチドセット、
そのサブセット、新規なオリゴヌクレオチド配列、および診断用オリゴヌクレオチドセッ
トの個々の成分も疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列である。具体的には、差次的に
調節されるか、あるいは疾患または疾患基準に強く相関する予測値を有する個々のオリゴ
ヌクレオチド配列が疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列として得に有利である。共調
節される遺伝子セットも疾患特異的標的オリゴヌクレオチドセットとして同定することが
可能である。そのようなオリゴヌクレオチド配列および／またはオリゴヌクレオチド配列
産物は、種々の薬剤および技術による調節に対する標的である。例えば標的特異的モノク
ローナル抗体または小分子インヒビター、あるいは患者へのオリゴヌクレオチド配列また
はオリゴヌクレオチド配列遺伝子産物の送達によって、例えば疾患特異的標的オリゴヌク
レオチド配列（あるいは該オリゴヌクレオチド配列の産物または疾患特異的標的オリゴヌ
クレオチド配列のセット）を阻害または活性化することができる。種々の薬剤および技術
によって、遺伝子セットも阻害または活性化することができる。標的オリゴヌクレオチド
配列の特定の有用性は、標的オリゴヌクレオチド配列が発見された被験体集団と、標的オ
リゴヌクレオチドが相関する疾患または疾患基準とに依存する。
【０２７３】
（白血球接着に関与するヌクレオチド配列の同定）
本発明には、白血球接着に関与するヌクレオチド配列の同定方法も包括される。内皮細
胞と白血球との間の相互作用は、全ての炎症性障害の根本をなすメカニズムであり、該炎
症性障害としては、表３に列記した疾患が挙げられる。例えば、アテローム性動脈硬化症
の第１の明白な異常は、内皮への接着および単核細胞（例えばＴ細胞および単球）の血管
外遊出である。内皮への侵襲（例えば、サイトカイン、タバコ、糖尿病、高血圧、および
他の多くのもの）によって、内皮細胞活性化を生じる。その後、内皮は、単核細胞に対す
るカウンターレセプターを有する接着分子を発現する。白血球レセプターが内皮接着分子
に結合したら、該白血球レセプターは、内皮に接着し、短距離を回転移動（ｒｏｌｌ）し
て停止し、内皮外へと遊走（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）する。急性および慢性炎症両方
で、類似の接着事象が起こる。白血球が内皮接着分子に、あるいは内皮または他の細胞に
よって分泌される可溶性サイトカインに結合するとき、遺伝子発現プログラムが白血球内
で活性化される。この発現プログラムによって、白血球回転移動（ｒｏｌｌｉｎｇ）、強
固な接着、および血管壁または実質組織への遊走（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を生
じる。この過程の阻害は、抗炎症薬剤開発で非常に望まれる目標である。さらに、この過
程で差次的に発現する白血球ヌクレオチド配列および上皮細胞ヌクレオチド配列は、疾患
特異的標的ヌクレオチド配列でありうる。
【０２７４】
標準的方法を用いて、例えばヒト冠状動脈、ヒト大動脈、ヒト肺動脈、ヒト臍静脈、ま
たは微小血管内皮細胞に由来するヒト内皮細胞をコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）
な単層として培養する。その後、サイトカインまたは酸化ＬＤＬ、高血糖、剪断応力、ま
たは低酸素などの別の活性化刺激に内皮細胞のいくつかをさらす（Ｍｏｓｅｒら，１９９
２）。いくつかの内皮細胞は、そのような刺激にさらさず、コントロールとして機能させ
る。例えば、ヒト組み換えＩＬ−１α  ５Ｕ／ｍｌまたはＴＮＦ（腫瘍壊死因子）１０ｎ
ｇ／ｍｌを含有する培養培地を用いて、内皮細胞単層を数分から一晩インキュベートする
。培養培地組成を変更して、またはフラスコを密封して低酸素を誘引する。さらに、組織
培養プレートを回転させて、剪断応力を誘発する。
【０２７５】
クロンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）製のＬＧＭ−３倍地を用いて、ヒトＴ細胞およ
び／または単球を組織培養フラスコまたはプレートで培養する。３７℃で、５％ＣＯ２、
および９５％湿度で、細胞をインキュベートする。これらの白血球を、内皮細胞単層上に
白血球の懸濁液を添加することによって活性化またはコントロール内皮層にさらす。組織
培養処理プレート／フラスコ上、または微孔性膜上で、内皮細胞単層を培養する。暴露の
可変させる継続期間後、全ての細胞をトリプシンで処理して、ＰＥＣＡＭ−１等の内皮細
胞特異的マーカーに対する磁気親和試薬による白血球から内皮細胞を選別することによっ
て内皮細胞および白血球を別々に回収する（幹細胞技術）。標準的技術によって、ＲＮＡ
を単離細胞から抽出する。白血球ＲＮＡを上述のように標識し、白血球候補ヌクレオチド
ライブラリーにハイブリダイズする。上皮細胞ＲＮＡも標識して、白血球候補ヌクレオチ
ドライブラリーにハイブリダイズする。また、白血球候補ライブラリーに対して上述した
方法に従って調製して、上皮細胞ＲＮＡを上皮細胞候補ヌクレオチドにハイブリダイズす
る。
【０２７６】
候補ヌクレオチドライブラリーへのハイブリダイゼーションによって、接着を受ける白
血球および／または上皮細胞中で上方調節または下方調節されるヌクレオチド配列が明ら
かになる。差次的に調節されるヌクレオチド配列は、上述のように、例えば完全長配列を
単離および配列決定すること、ＤＮＡおよび予測タンパク質配列の分析、およびヌクレオ
チド配列のタンパク質産物の機能的特徴付けによってさらに特徴付けられる。更なる特徴
付けによって、炎症過程の調節に対する候補標的でありうる白血球接着特異的標的ヌクレ
オチド配列の同定を生じる。小分子または抗体インヒビターを開発して、標的ヌクレオチ
ド配列機能を阻害することができる。このようなインヒビターを、白血球接着を阻害する
それらの能力に対して、上述の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験で試験する。
【０２７７】
（集積システム）
発現プロファイルおよび分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の収集および分析と、その
編集、本発明のデータベースの保存およびアクセスとに対するの集積システムとしては、
配列検索および分析に対する命令セットを含むソフトウエアと、任意でハイスループット
流体管理ソフトウエア、画像分析ソフトウエア、データ判読ソフトウエア、デジタルコン
ピューターに操作可能に接続したソースから目的地（検出装置等の）に解を移すためのロ
ボット的コントロールアーマチュア、デジタルコンピューターに被験体データを入力する
ため、または分析操作もしくはロボット的コントロールアーマチュアによるハイスループ
ット試料移動を制御するための入力装置（例えばコンピューターキーボード）を有するデ
ジタルコンピューターが挙げられる。任意で、集積システムは、標識アッセイ構成要素、
例えば候補ライブラリーマイクロアレイにハイブリダイズした標識核酸からの標識シグナ
ルをデジタル化するための画像スキャナをさらに有する。画像スキャナを画像分析装置と
接続して、ハイブリダイズした標識の存在または強度の測定、すなわちオン／オフ発現パ
ターンあるいは発現での増加または減少の指標を提供することができる。
【０２７８】
標準的オペレーティングシステムを用いた容易に入手できるコンピューターハードウエ
アリソースが十分に適しており、例えばＰＣ（Ｉｎｔｅｌ  ｘ８６またはＰｅｎｔｉｕｍ
（登録商標）チップ互換ＤＯＳ（登録商標）、ＯＳ２（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（登
録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＮＴ、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９５、ＷＩ
ＮＤＯＷＳ（登録商標）９８、ＬＩＮＵＸ（登録商標）、あるいはＭａｃｉｎｔｏｓｈ（
登録商標）、Ｓｕｎ、またはＰＣでも十分である）が本発明の集積システムで使用される
。本明細書で上述したように、設計、例えばオープンアーキテクチャオブジェクト指向発
見的アルゴリズム、または発現分析用の命令セットの設計に対して、ソフトウエア技術で
の現在の技術が同様に適している（すなわち、多数の成熟段階のプログラミング言語およ
びソースコードサプライヤー）。例えば、本明細書の方法に従って、Ｖｉｓｕａｌ  ｂａ
ｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）等の標準的プログラミング
言語を用いる技術を有する者によって、分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）をアラインメ
ントまたは操作するためのソフトウエアを構築することができる
様々な方法と、遺伝的アルゴリズムおよびニューラルネットワークを含むアルゴリズム
とを用いて、データ収集、相関、および保存機能とともに、本明細書で上述したような他
の望ましい機能を実行することができる。さらに、デジタルまたはアナログコンピュータ
ーシステム等のデジタルまたはアナログシステムは、ディスプレイならびに／または入力
および出力ファイルの制御等の様々な他の機能を制御することができる。
【０２７９】
例えば発現パターンまたはプロファイル、被験体医療または背景データ、分子的特徴（
ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）等に対応する１つ以上の文字列を、デジタルシステムのメモリにロ
ードしたソフトウエアに入力して、命令セットで示されるオペレーションを実行すること
によって、例えば文書処理ソフトウエア（例えばＣｏｒｅｌ  ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ(
登録商標)またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄ(登録商標)）およびデータベースソフト
ウエア（例えばＣｏｒｅｌ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｏ(登録商標)、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  
Ｅｘｃｅｌ(登録商標)等の表計算ソフトウエアあるいはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ａｃｃｅｓ
ｓ(登録商標)またはＰａｒａｄｏｘ(登録商標)等のデータベースプログラム）等の標準的
デスクトップ用途を本発明に適合させることができる。例えば、システムには、例えばＷ
ｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標）、またはＬＩＮＵＸシステ
ム等の標準的オペレーティングシステムと併用するユーザーインターフェースと組み合わ
せて用いる適当な文字列情報を有する前述のソフトエアを含むことができる。例えば、必
要なオペレーションをアプリケーションにプログラミングすることによって、またはユー
ザーによる手操作で実行される必要なオペレーションを用いて（あるいはその両方で）、
文字列を操作するための命令セットである。例えば、ＰＩＬＥＵＰまたはＢＬＡＳＴ等の
特殊配列アラインメントプログラムも、例えば核酸またはタンパク質（あるいは対応する
文字列）のアラインメント用に本発明のシステムに組み込むことができる。
【０２８０】
上述の統計学的方法のプログラミングされた実施形態等の、例えば発現プロファイルと
診断用ヌクレオチドライブラリー成分のサブセットとの間の相関を決定するために、本発
明に必要な統計学的方法を実行するためのソフトウエアも本発明のコンピューターシステ
ムに包含される。また、主成分分析（ＰＣＡ）または最小二乗解析等の方法を実行するた
めのプログラミング要素も該デジタルシステムに包含して、データ間の関係を同定するこ
とができる。このような方法に典型的なソフトウエアは、Ｐａｒｔｅｋ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ
．Ｐｅｔｅｒ，Ｍｅ；ウエブサイトｐａｒｔｅｋ．ｃｏｍで提供される。
【０２８１】
任意のコントローラまたはコンピューターは、必要に応じてモニターを含み、該モニタ
ーとしては、平面型ディスプレイ（例えば、アクティブマトリックス液晶表示装置、液晶
表示装置）、陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、または例えば予測的データを出力す
るためにユーザーインターフェースとして機能する別の表示装置が挙げられる。マイクロ
プロセッサー、メモリ、インターフェース回路等の多数の集積回路チップを含むコンピュ
ーター回路は、多くの場合、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスク
ドライブ、書き込み可能ＣＤ−ＲＯＭ等の高容量挿抜可能ドライブ、および他の通常の周
辺構成部品を必要に応じて備えるケーシングまたはボックスに置かれる。
【０２８２】
キーボード、マウス、タッチスクリーン等の入力装置は、任意で、例えば比較すべきま
たは関連コンピューターシステムで操作すべき配列またはデータセットのユーザーの入力
およびユーザー選択を提供する。コンピューターは、通常、セットパラメータまたはデー
タフィールドへのユーザー入力形態で、またはプログラミングされた命令、例えば種々の
異なる特定のオペレーションに対してプログラミングされた命令形態で、ユーザー命令を
受け取るための適当なソフトウエアを含む。その後、ソフトウエアは、システムに命令し
て任意の所望のオペレーションを実行するための適当な言語にこれらの命令を変換する。
【０２８３】
集積システムを特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）またはプログラム可能倫理回路（Ｐ
ＬＤ）回路内に組み入れることも可能である。このような場合、ＡＳＩＣまたはＰＬＤを
作製するために用いることができるコンピューター読み取り可能記述子言語に本発明を組
み込む。ＰＤＡ、ラップトップ型コンピューターシステム、ディスプレイ、画像編集装置
等の種々の他のデジタル装置の回路または倫理プロセッサ内に集積システムを組み込むこ
ともできる。
【０２８４】
デジタルシステムは、発現プロファイルおよび関連被験体データを物理的アッセイと組
み合わせてコンパイルまたはモニターする、かつ相関、例えば疾患に対する予測値を用い
た分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を確立または改良する学習構成要素を含むことがで
きる。組み合わせの成功および不成功をデータベース中に記録しておき、特定の疾患また
は状態に対する高予測精度で、診断用ヌクレオチドセットのユーザーまたはデジタルシス
テムに基づく選択用の位置揃え／基本設定を提供する。
【０２８５】
集積システムは、自動化ワークステーションを含むこともできる。例えば、そのような
ワークステーションは、ヒト血液試料由来のＲＮＡを調製することと、同位体標識または
非同位体標識でＲＮＡを標識することと、候補ライブラリーの全てまたは部分を有する少
なくとも１つのアレイに標識ＲＮＡをハイブリダイズさせることと、ハイブリダイゼーシ
ョンパターンを検出することとを含む事象の配列を実行することによって、白血球ＲＮＡ
試料を調製および分析することができる。ハイブリダイゼーションパターンを適当なデー
タベースにデジタル化および記録する。
【０２８６】
（自動化ＲＮＡ調製ツール）
本発明は、全血試料由来の単核細胞の調製および単核細胞由来のＲＮＡの調製用の自動
化ＲＮＡ調製ツールも含む。好ましい実施形態では、ＲＮＡ調製ツールの使用を完全に自
動化するため、細胞分離およびＲＮＡ単離には、人による操作が不要である。完全自動化
は、延滞を最小にし、かつ異なるライブラリーにわたって試料調製を規格化するので有利
である。この規格化によって、結果の再現精度が増加させる。
【０２８７】
本発明のＲＮＡ調製ツールが実行する過程は以下のとおりである。すなわち、装置の主
要構成要素は、遠心機である。密度勾配溶液、転写／翻訳インヒビター、および遠心後に
単核細胞および血清から赤血球を分離するゲル障壁を含有する全血のチューブを遠心機に
入れる。該障壁は、遠心中で赤血球および顆粒球を透過できるが、単核細胞を通過させな
い（または該障壁物質は、遠心中に単核細胞が障壁のレベルを超えて残るような密度を有
する）。遠心後、赤血球および顆粒球を障壁の下でトラップして、単核細胞および血清層
の単離を促進する。メカニカルアームがチューブを取り出し、反転させて、単核細胞層お
よび血清を混和する。次に、該アームは、上清を新しいチューブに注ぐ一方で、赤血球お
よび顆粒球は障壁の下に残る。または、ニードルを用いて、上清を吸引して、新しいチュ
ーブに移す。該装置のメカニカルアームは、蓋の開閉をし、ＰＢＳを分配し、遠心による
単核細胞の回収を促進して、遠心機の内外にチューブを移動させる。遠心に続いて、上清
を注いで、真空装置によって除去して、単離単核細胞ペレットを残す。該細胞からのＲＮ
Ａの精製を自動的に実行するとともに、遠心ステップの前および後に、溶解緩衝液および
他の精製溶液を自動的に分配および除去する。その結果、精製ＲＮＡ溶液が生じる。別の
実施形態では、カラムまたはフィルター方法を用いて、ＲＮＡ単離を実行する。さらに別
の実施形態では、本発明は、細胞溶解で使用するための内蔵ホモジナイザーを含む。
【０２８８】
（他の自動化システム）
固相または液相ハイスループット試料調製および評価用の自動化および／または半自動
化方法が利用可能であり、市販の装置によってサポートされる。例えば候補ライブラリー
の生産および特徴付けを容易にするための例えば細菌コロニーからの核酸の調製用のロボ
ット的装置は、例えば１０，０００／４時間までの異なるクローンを同定、サンプリング
、および９６ウエルマイクロタイター皿に植菌することができる自動化コロニーピッカー
（例えばＱ−ｂｏｔ，Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｕ．Ｋ．）を含む。代替としてまたは追加として
、液体取り扱い用のロボット的システムが種々のソースから利用可能であり、例えばＴａ
ｋｅｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＬＴＤ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａ
ｎ）が開発した自動合成装置等の自動化ワークステーションと、科学者が実行する手操作
を模倣するロボットアームを利用したロボット的システム（Ｚｙｍａｔｅ  ＩＩ，Ｚｙｍ
ａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ．；Ｏｒｃａ，Ｂｅｃ
ｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ））がある。上記の装
置の任意のものが、本発明とともに使用するために、例えばライブラリー旺盛要素または
被験体白血球試料のハイスループット分析に適している。本明細書に記載されるように操
作することができるようなこれらの装置（もち使用する場合は）に対する変更の性質およ
び実施は、当業者には自明である。
【０２８９】
関連アッセイに適当な全手順、例えば試料および試薬ピペッティング、液体分配、時間
的インキュベーション、および検出装置のマイクロプレートの最終読み取りを自動化する
ハイスループットスクリーニングシステムが市販されている。（例えばＺｙｍａｒｋ  Ｃ
ｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕｌ
ｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，
ＭＡ等を参照せよ）。これらの設定変更可能なシステムは、高度の柔軟性およびカスタマ
イゼーションとともに、ハイスループットおよび迅速な起動を提供する。同様に、アレイ
およびアレイ読み取り装置は、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ、および他のところから入手可能である。
【０２９０】
このようなシステムの製造元は、詳細なプロトコルに様々なハイスループットを提供し
ている。従って、例えばＺｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写、リガンド結合等の調
節を検出するためのスクリーニングシステムを記載する技術公報を提供している。
【０２９１】
例えば光学および蛍光検出装置、光学および蛍光顕微鏡、プレート読み取り装置、ＣＣ
Ｄアレイ、  ホスホルイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）、シンチレーショ
ンカウンター、光電管、フォトダイオード等を含む様々な市販の周辺装置およびソフトウ
エアを、ＰＣ（Ｉｎｔｅｌ  ｘ８６またはｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）チップ互換ＤＯＳ
(登録商標)、ＯＳ２(登録商標)ＷＩＮＤＯＷＳ(登録商標)、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＮＴあるいは、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９５を用いた機器）、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨ(登
録商標)、またはＵＮＩＸ（登録商標）を用いた（例えばＳＵＮ(登録商標)ワークステー
ション）コンピューターを用いてデジタル画像あるいはデジタル光学アッセイまたは他の
アッセイ結果をデジタル化、保存、および分析するために利用することができる。
【０２９２】
（ウエブサイトでの実施形態）
現地化または分散化コンピューター環境で、上述の方法を実施することができる。例え
ば、現地化コンピューター環境を用いる場合、候補ヌクレオチドライブラリーまたは診断
用ヌクレオチドセットを含むアレイを検出装置に近接して構成し、該検出装置は、今度は
、ユーザー入出力機能を備えたコンピューター装置に連結する。
【０２９３】
分散化コンピューター環境では、複数のプロセッサを有する単一コンピューター上、ま
たは複数のコンピューター上で、該方法を実施することができる。例えば共有バスを介し
て、該コンピューターを連結することもできるが、通常は、該コンピューターは、ネット
ワーク上のノードである。該ネットワークを現地レベルで一般化または公共使用化するこ
と、あるいは広範な地理的領域にわたって分散させることができる。特定の実施形態では
、該コンピューターは、イントロネットまたはインターネットの構成要素である。
【０２９４】
被験体分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）（例えば発現プロファイル、または関連診断
、予後、またはモニタリング結果）に対応する予測的データを種々の関係者（ｐａｒｔｙ
）によって共有することができる。具体的には、このような情報は、被験体、被験体の医
療開業医または提供者、会社または他の機関、あるいは科学者によって利用されうる。コ
ンピューター読み取り媒体に記録された個々の被験体データ、データベースサブセット、
または全データベースに、任意の通信手段によって、ユーザーが直接アクセスすることが
でき、該通信手段としては、限定はされないが、インターネットが挙げられる。適当なコ
ンピューター装置、集積システム、通信ネットワークを用いて、遠隔地にいるユーザーと
、近くにいるユーザーとが、例えば同様の物理的容易さで、記録された情報にアクセスす
ることができる。任意で、データサブセットにアクセスすることを可能にする重複しない
英数字パスワードを用いて、データベースへのアクセスを制御することができる。このよ
うな規定を用いて、例えばプライバシー、匿名性等を確実にすることができる。
【０２９５】
通常、クライアント（例えば患者、開業医、提供者、科学者等）は、ウエブブラウザを
動作して、ウエブサーバーを動作するサーバーコンピューターにリンクする。ウエブブラ
ウザは、例えばＩＢＭ’ｓ  Ｗｅｂ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ｅｘｐｌｏ
ｒｅｒ、ＮｅｔＳｃａｐｅ、またはＭｏｓａｉｃ等のプログラムである。ウエブサーバー
は、必ずしもそうではないが通常、ＩＢＭ’ｓ  ＨＴＴＰ  Ｄａｅｍｏｎまたは他のＷ  
Ｗ  Ｗ  ｄａｅｍｏｎ（例えばＬＩＮＵＸを用いたプログラム形態）である。クライアン
トのコンピューターは、回線上でまたはワイヤレスシステムを解してサーバーコンピュー
ターに双方向的に連結する。今度は、サーバーコンピューターは、この発明の方法を実施
するソフトウエアへのアクセスを提供するウエブサイト（ウエブサイトのホストとして働
くサーバー）と双方向的に連結する。
【０２９６】
インターネットに接続したクライアントのユーザーまたはインターネットによって、ク
ライアントは本明細書に記載される方法の実施を提供するアプリケーションのホストとし
て働くウエブサイトの部分であるリソースを要求することが可能である。その後、サーバ
ープログラムは、要求を処理して、特定のリソースを返す（それらが現在も利用可能であ
ると仮定して）。Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｌｏｃａｔｏｒ（「ＵＲＬ」）と
して知られる標準的な表記法が採用されている。この方法は、Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒ
ａｎｓｐｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（「ｈｔｔｐ」）、Ｆｉｌｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  
Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（「ｆｔｐ」）、ｇｏｐｈｅｒ、およびＷｉｄｅ  Ａｒｅａ  Ｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（「ＷＡＩＳ」）等のサブクラスを現在含んでいる複数
種類のロケーション名を包括する。リソースをダウンロードするとき、付加的な離そーツ
のＵＲＬも含むことが可能である。従って、クライアントのユーザーは、該ユーザーが特
定的に要求した新規リソースの存在を容易に知ることができる。
【０２９７】
イントラネットを実施する方法ならびに／あるいはコンピューターおよび／またはデー
タアクセス過程のイントラネット実施形態は、当業者に周知であり、例えばＡＣＭ  Ｐｒ
ｅｓｓ，ｐｐ．３８３−３９２；ＩＳＯ−ＡＮＳＩ，Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｄｒａｆｔ，”Ｉ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  
ＳＱＬ”，Ｊｉｍ  Ｍｅｌｔｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇ
ａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｊｕｌ．１９９２
；ＩＳＯ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｄｒａｆｔ，”Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  ＳＱ
Ｌ−Ｐａｒｔ  ２：Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＳＱＬ／Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）”，ＣＤ９
０７５−２：１９９．ｃｈｉ．ＳＱＬ，Ｓｅｐ．１１，１９９７；およびＣｌｕｅｒら，
（１９９２）Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｏｐｔｉｍｉ
ｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｂｊｅｃｔ−Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｑｕｅｒｉｅｓ，Ｐｒｏｃ  Ｓ
ＩＧＭＯＤ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｎａｇｅ
ｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄａｔａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｊｕｎ．２−
５，１９９２，ＳＩＧＭＯＤ  Ｒｅｃｏｒｄ，ｖｏｌ．２１，Ｉｓｓｕｅ  ２，Ｊｕｎ．
，１９９２；Ｓｔｏｎｅｂｒａｋｅｒ，Ｍ．，Ｅｄｉｔｏｒに記載されている。他のリソ
ースは、例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ、ＩＢＭ、Ｓｕｎ、および他のソフトウエア開発会社
から入手可能である。
【０２９８】
上述のツール用いて、発見または診断ツールとしての試薬、方法、およびデータベース
のユーザーは、発現および被験体データを用いて、中心部データベースに質問することが
できる。データの各登録を、データベース中の発現および被験体情報の全体に付加する。
データを付加するので、付加した臨床および発現データを組み込んだ新規の相関統計分析
が自動的に実行される。従って、予測精度および記録分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）
の相関種類が増加するにつれて、データベースが増加する。
【０２９９】
例えば、患者等の被験体は、彼らの白血球試料の発現分析の結果と、患者が属する任意
の特定の診断（または予後、またはモニタリング、またはリスク集団）の見込みに関する
任意の蓄積知識、すなわち彼らの発現プロファイルおよび／または分子的特徴（ｓｉｇｎ
ａｔｕｒｅ）とにアクセスすることができる。任意で、被験体は、診断、試験結果、発現
プロファイリング時から生じている臨床または他の関連事象に付加的な情報を与えること
によって、データベースの予測精度を増すことができる。任意の通信形態を介して、その
ような情報をデータベースに与えることができ、該通信形態としては、限定はされないが
、インターネットが挙げられる。そのようなデータを用いて、診断集団を連続的に定義（
および再定義）することができる。例えば、１０００人の患者が、彼らの発現プロファイ
リングから５年にわたって心筋梗塞の発生に関するデータを提出し、これら患者のうち３
００人が心筋梗塞を経験したと報告しかつ７００人が経験していないと報告する場合、該
３００人の患者は、新規の「集団Ａ」と定義される。アルゴリズムを用いて、データベー
スに連続的に質問および改訂をするので、集団ＡおよびＢ（すなわち、５年期間内で心筋
梗塞であったか、またはなかった）を区別する新規の診断用ヌクレオチドセットを同定す
る。その後、この新規に定義されるヌクレオチドセットを、５年期間にわたる心筋梗塞の
発生を予測する判断材料として用いる（上述の方法で）。患者による直接的な提出を上記
に例示したが、関連データを提出するアクセスおよび権限を有する任意の個体、例えば患
者の開業医、研究技術者、医療または研究執行者等がそのようにすることもできる。
【０３００】
上記の例から明らかであるように、インターネットを介した（またはイントラネットを
介した）情報の送信は、必要に応じて双方向である。すなわち、例えば、通信システムを
介して、発現プロファイル、被験体データ等に関するデータをデータベースに送信する一
方で、分子的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）、予測分析等に関する情報がデータベースから
ユーザーに送信される。例えば、診断用ヌクレオチドセットを有するマイクロアレイを含
む集積システムの適当な構成を用いて、コンピューター装置に連結した検出装置は、本発
明の方法に従った分析用の中央データーベースに、発現プロファイルおよび対応する個々
の識別子を直接送信（現地的に、またはかなりの距離の遠隔ワークステーションから、例
えばデータベースから数百または数千マイル離れて）することができる。例えば上述のア
ルゴリズムに従って、個々の識別子を１つ以上の診断（または予後、またはモニタリング
等）分類に割り当てる。その後、例えば同様の通信モードを介して、同じまたは異なるイ
ンターネット（またはイントラネット）アドレスにいる受取人この分類結果を中継する。
【０３０１】
（キット）：
本発明をユーザーにキットとして、任意に提供する。一般的に、キットには本発明の一
つ以上の診断用ヌクレオチドセットが含まれる。あるいは、キットには本発明の候補であ
るヌクレオチドライブラリが含まれる。ほとんどの場合、診断用ヌクレオチドプローブセ
ット、または他の候補ライブラリの部分セット（例えば、いづれかの発現プロファイリン
グ技術を用いて診断用遺伝子セットを試験するためのｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ま
たは抗体マイクロアレイ、もしくは試薬など）が適切な容器に収められている。さらに、
このキットは、一つ以上の付加試薬（例えば、発現産物を標識するための基質、ラベル、
プライマー）、チューブおよび／または他の付属品、採血試料、緩衝液（例えば、赤血球
溶解緩衝液、白血球溶解緩衝液）、ハイブリダイゼーションチェンバー、カバーガラス等
、ならびにソフトウェアパッケージ（例えば、本発明の統計学的方法を含めて、すなわち
上記のとおり、編集されたデータベースにアクセスするためのパスワードおよび／または
アカウント番号）を含む。さらに、キットには、本発明の方法において診断用ヌクレオチ
ドセットを使用する好ましい方法を詳述している取扱説明書一式、またはユーザー向けマ
ニュアルを任意に含めることができる。１つの実施形態において、マイクロアレイを使用
して診断用ヌクレオチドセットを発見するのに有用な内容物を含めても良い。キットには
、エンドトキシン、およびＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）を含まない無菌の血液採取チ
ューブを含めることができる。キットにはまた、アルコール消毒綿、止血帯、血液採取セ
ット、および／またはＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水；実施例８の方法を単核細胞由来のＲＮ
Ａに使用する場合に必要とされる）を含めることができる。キットにはまた、細胞溶解緩
衝液を含めてもよい。キットは、ＲＮＡ単離キット、ＲＮＡを標識するための基質（さま
ざまな発現プロファイリング技術用に変えることができる）を含むことができる。キット
はまた、以下の一つ以上を含む蛍光マイクロアレイ発現プロファイリング用の材料を含む
ことができる。：すなわち、逆転写酵素および１０×ＲＴ緩衝液、Ｔ７（ｄＴ）２４プラ
イマー（５’末端にＴ７プロモーターを有するプライマー）、ＤＴＴ（ジチオスレイトー
ル）、デオキシヌクレオチド、任意にそれぞれ１００ｍＭ、ＲＮａｓｅ抑制薬、二番目の
鎖ｃＤＮＡ緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼリ
ボヌクレオチド、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  転写緩衝液、および／またはＣｙ３およびＣｙ５標
識されたリボヌクレオチド。キットはまた、候補の遺伝子ライブラリ、スライド用カバー
ガラスおよび／またはハイブリダイゼーションチェンバーを含むマイクロアレイを含むこ
とができる。さらに、キットは、データから診断用遺伝子セットを同定するためのソフト
ウェアパッケージを含むことができ、これは統計学的方法を含み、および／または所望の
遺伝子セットの感度および特異性において交換可能である。ソフトウェアは更に、中央に
位置するデータベースサーバによるアクセスとデータ分析を容易にすることができる。ソ
フトウェアは更に、中央のデータベースサーバにアクセスするためにパスワードとアカウ
ント番号を含むことができる。加えて、キットはユーザー向けキットマニュアルを含むこ
とができる。
【０３０２】
もう一つの実施形態で、キットには、マイクロアレイを用いて診断用ヌクレオチドセッ
トを適用するのに有用な内容物を含むことができる。キットには、エンドトキシン、およ
び／またはＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）を含まない無菌の血液採取チューブを含める
ことができる。キットはまた、アルコール消毒綿、止血帯および／または血液採取セット
を含むことができる。キットは、更にＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水；実施例７の方法を単核
細胞由来のＲＮＡに使用する場合に必要とされる）、細胞溶解緩衝液、および／またはＲ
ＮＡ単離キットを含めることができる。加えて、キットは、ＲＮＡを標識するための基質
（さまざまな発現プロファイリング技術用に変えることができる）を含むことができる。
蛍光マイクロアレイ発現プロファイリング用に、構成材料には、逆転写酵素および１０×
ＲＴ緩衝液、Ｔ７（ｄＴ）２４プライマー（５’末端にＴ７プロモーターを有するプライ
マー）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、デオキシヌクレオチド（任意にそれぞれ１００
ｍＭ）、ＲＮａｓｅ抑制薬、二番目の鎖ｃＤＮＡ緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓ
ｅ  Ｈ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  転写緩衝液
、および／またはＣｙ３およびＣｙ５標識されたリボヌクレオチドを含むことができる。
キットには更に、候補遺伝子ライブラリを含むマイクロアレイを含めることができる。キ
ットは、また、スライド用カバーガラスおよび／またはハイブリダイゼーションチェンバ
ーを含むことができる。キットは、データから診断用遺伝子セットを同定するためのソフ
トウェアパッケージを含むことができる。ソフトウェアパッケージは、統計学的方法を含
み、所望の遺伝子セットの感度および特異性において交換可能であり、および／または中
央に位置するデータベースサーバによるアクセスとデータ分析を容易にすることができる
。ソフトウェアパッケージは、中央のデータベースサーバにアクセスするためのパスワー
ドとアカウント番号を含むことができる。加えて、キットは、ユーザー向けキットマニュ
アルを含むことができる。
【０３０３】
もう一つの実施形態で、キットは、実時間ＰＣＲを使用して診断用ヌクレオチドセット
を適用するのに有用な内容物を含むことができる。このキットには、エンドトキシン、お
よび／またはＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）を含まない無菌の血液採取チューブを含め
ることができる。キットは更に、アルコール消毒綿、止血帯および／または血液採取セッ
トを含むことができる。キットはまた、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水；実施例７の方法を単
核細胞由来のＲＮＡに使用する場合に必要とされる）を含むことができる。加えて、キッ
トは、細胞溶解緩衝液および／またはＲＮＡ単離キットを含むことができる。キットはま
た、実時間ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）用基質を含むことができ、
これはポリｄＴプライマー、ランダムな六量体プライマー、逆転写酵素とＲＴ緩衝液、Ｄ
ＴＴ、デオキシヌクレオチド１００ｍＭ、Ｒｎａｓｅ  Ｈ、診断用および制御用遺伝子セ
ットに対するプライマー一組、１０×ＰＣＲ反応緩衝液、および／またはＴａｑ  ＤＮＡ
ポリメラーゼを含めて、様々な実時間ＰＣＲ技術によって変わる。キットはまた、診断用
および制御用遺伝子セットのための蛍光プローブ（あるいは、二重鎖ＤＮＡだけと結合す
る蛍光色素）を含むことができる。更に、キットは、試料同定用バーコード、セット全体
の１つのバーコード、またはプレートの反応チューブごとの個々のバーコードを有する９
６穴プレート、試料追跡用バーコードの有無にかかわらず反応チューブを含むことができ
る。キットはまた、データから診断用遺伝子セットを同定するためのソフトウェアパッケ
ージ、および／または統計学的方法を含むことができる。ソフトウェアパッケージは、所
望の遺伝子セットの感度および特異性において交換可能にすることができ、および／また
は中央に位置するデータベースサーバによるアクセスとデータ分析を容易にすることがで
きる。キットは、中央のデータベースサーバにアクセスするためにパスワードとアカウン
ト番号を含むことができる。最後に、キットはユーザー向けキットマニュアルを含むこと
ができる。
【０３０４】
本発明は、以下の限定されない実施例を参照することによってさらに良く理解されるで
あろう。
【実施例】
【０３０５】
実施例１：発現プロファイリングのための単核細胞からのＲＮＡの調製
実施例２：白血球発現プロファイリングで使用するための普遍コントロールＲＮＡの調製
実施例３：リウマチ様間接炎の診断で使用するための診断用オリゴヌクレオチドセットの
同定
実施例４：全身性紅斑性狼瘡を診断するための診断用オリゴヌクレオチドセットの同定  
実施例５：オリゴヌクレオチドプローブの設計
実施例６：８０００スポット５０  ｍｅｒオリゴヌクレオチドのアレイの生産
実施例７：全ＲＮＡの増幅、標識、およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハイブ
リダイゼーション
実施例８：アレイ発現結果の実時間ＰＣＲ検証
実施例９：相関および分類分析
実施例１０：アッセイ試料調製
実施例１１：狼瘡および自己免疫疾患の診断およびモニタリング用の遺伝子発現マーカー
の同定および検証
（実施例）
（実施例１：発現プロファイリングのための単核細胞からのＲＮＡの調製）
以下の方法を用いて、白血球発現プロファイリングのために、被験体から血液を単離し
た。
【０３０６】
すなわち、患者毎に２つのチューブを用いた。標準的末梢静脈血抽出物から、あるいは
大腿動脈、大腿静脈、鎖骨下静脈、または内頚静脈に挿入した大量の動脈内または静脈内
カテーテルから直接血液を抽出した。ヘパリンが後のＲＮＡ反応物を干渉し得るので、血
管内カテーテルからヘパリンを用いて、試料汚染を避けるための処理を行った。
【０３０７】
各チューブに対して、全血８ｍｌを、抗凝血作用クエン酸塩、２５℃密度勾配溶液（例
えばＦｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ）、および遠心するとＲＢＣおよび顆粒球は透過する
が単核細胞は透過しないポリエステルゲル障壁を含有するチューブ（ＣＰＴ，Ｂｅｃｔｏ
ｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  注文番号３６２７５３）に抽出した。チューブを数回反転して
抗凝血剤と血液を混和した。スイングアウトローター中で、室温で２０分間、チューブを
１７５０×ｇで遠心した。遠心機からチューブを取り出して、５〜１０回反転して、単核
細胞と血漿を混和した一方で、ゲル障壁の下でＲＢＣと顆粒球はトラップした。血漿／単
核細胞混合物をｌ５ｍｌチューブにデカントして、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）５ｍｌを
添加する。１５ｍ１チューブを１７５０×ｇで５分間回転させ、細胞をペレットにした。
上清を破棄して、ＲＬＴ溶解緩衝液１．８ｍｌを単核細胞ペレットに添加する。緩衝液と
細胞を上下にピペッティングして、ペレットの完全な溶解を確実にした。全ＲＮＡの単離
を進めることが都合よくなるまで、細胞溶解物を凍結保存した。
【０３０８】
均質化（Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒカラム）およびオンカラムＤＮａｓｅ処理を含む全Ｒ
ＮＡ単離に対して製造元（１０／９９バージョン）が指示するように、Ｑｉａｇｅｎ  Ｒ
ｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、溶解単核細胞から全ＲＮＡを精製した。
精製ＲＮＡを水５０ｕｌ中で溶出した。
【０３０９】
以下のように、異なるプロトコールによって複数の試料を調製した。
【０３１０】
すなわち、抗凝固剤（クエン酸塩）、２５℃密度勾配溶液（Ｆｉｃｏｌｌ）、および遠
心するとＲＢＣおよび顆粒球は透過するが単核細胞は透過しないポリエステルゲル障壁を
含有するチューブ（ＣＰＴ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、注文番号３６２７５３
）に、末梢静脈から２つの８ｍｌ血液試料を抽出した。単核細胞および血漿が障壁上に残
存する一方で、ＲＢＣおよび顆粒球は下にトラップした。チューブを数回反転させて、抗
凝固剤と血液を混和して、２０分間室温で、スイングアウトローター中で該チューブを１
７５０×ｇで遠心にかけた。チューブを遠心機から取り出して、濁った単核細胞層より上
にある透明な血漿層を吸引および破棄した。濁った単核細胞層を吸引して、ＰＢＳ（リン
酸緩衝食塩水）を用いて、ゲル障壁の表面から、単核細胞の全てを注意してすすいだ。単
核細胞懸濁物約２ｍｌを、２ｍｌ微量遠心用チューブに移し、微量遠心機中で１６，００
０ｒｐｍで３分間遠心して、細胞をペレットにした。上清を破棄して、細胞を溶解してＲ
Ｎａｓｅを不活性化するＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）１．８ｍｌを単核細胞ペレッ
トに添加した。細胞および溶解緩衝液を上下にピペッティングして、ペレットの完全な溶
解を確実にした。全ＲＮＡの単離を進めることが都合よくなるまで、細胞溶解物を凍結保
存した。
【０３１１】
ＲＮＡ試料を８ｍＬ全血から単離した。収量は、８ｍＬ血液に対して、２μｇから２０
μｇ全ＲＮＡの範囲であった。Ａ２６０／Ａ２８０分光光度比は、１．６ないし２．０で
あり、これは試料の純度を示した。臭化エチジウム存在下で、各試料の２ｕ１をアガロー
スゲル上で泳動させた。ＲＮＡ試料の分解およびＤＮＡ汚染は、見られなかった。
【０３１２】
いくつかの場合では、単核細胞の特異的サブセットをヒト被験体の末梢血から単離した
。これを行った際、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ
，Ｃａｎａｄａ）製のＳｔｅｍＳｅｐ細胞分離キット（マニュアルバージョン６．０．０
）を用いた。この同じプロトコールを、Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、Ｂ細
胞、単球、ＮＫ細胞、および他の細胞の単離に適用することができる。抗体による負の選
択を用いる細胞型の単離は、抗体による標的細胞の活性化を避けることが所望され得る。
【０３１３】
実施例２：白血球発現プロファイリングで使用するための一般的なコントロールＲＮＡ
の調製
軟膜由来の全ＲＮＡおよび／または軟膜から単離した濃縮単核細胞由来の全ＲＮＡを用
いて、イオノマイシンおよびＰＭＡによる刺激を伴うおよび伴わないの両方で、コントロ
ールＲＮＡを調製した。以下のコントロールＲＮＡを調製した。すなわち、
コントロール１：軟膜全ＲＮＡ
コントロール２：単核細胞全ＲＮＡ
コントロール３：刺激軟膜全ＲＮＡ
コントロール４：刺激単核全ＲＮＡ
コントロール５：５０％軟膜全ＲＮＡ／５０％刺激軟膜全ＲＮＡ
コントロール６：５０％単核細胞全ＲＮＡ／５０％刺激単核全ＲＮＡである。
【０３１４】
以下のプロトコールを用いて、複数の試料を調製した。すなわち、３８の個体由来の軟
膜を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒから得た。各軟膜は、１つの個体か
ら得た約３５０ｍＬまでの全血に由来する。１０ｍｌ軟膜を袋から取り出して、５０ｍｌ
チューブに入れた。Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＬ（Ｑｉａｇｅｎ）４０ｍｌを添加し、チューブを
混和して、氷上に１５分間置き、その後４℃で１０分間、２０００×ｇで遠心することに
よって細胞をペレットにした。上清をデカントし、細胞ペレットをＱｉａｇｅｎ  Ｂｕｆ
ｆｅｒ  ＥＬ  １０ｍｌ中に再懸濁した。その後、４℃で１０分間、チューブを２０００
×ｇで遠心した。その後、軟膜試料毎にＴＲＩＺＯＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）２０ｍｌ中で
細胞ペレットを再懸濁して、回転ホモジナイザーを用いて混合物を破砕し、その後、ＲＮ
Ａ単離を進めるまで溶解物を−８０℃で凍結した。
【０３１５】
軟膜から調製した濃縮単核細胞から他のコントロールＲＮＡを調製した。上述したよう
に、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒから軟膜を得た。５０ｍｌポリプロピ
レンチューブに軟膜１０ｍｌを添加し、リン酸塩緩衝液塩類（ＰＢＳ）１０ｍｌを各チュ
ーブに添加した。希釈試料に対して等容積の１．０７７＋／−０．０００１ｇ／ｍｌ密度
溶液であるポリスクロース（５．７ｇ／ｄＬ）およびジアトリゾア酸ナトリウム（９．０
ｇ／ｄＬ）溶液を調製した（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７，Ｓｉｇｍａ  カタログ番
号１０７７−１）。このステップおよびその後のステップ全てを室温で実行した。５０ｍ
ｌチューブ中のｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ溶液１５ｍｌの上で、希釈軟膜／ＰＢＳ  １５ｍｌ
を層状にした。室温で３０分間、チューブを４００×ｇで遠心した。遠心後、単核細胞を
含んでいる不透明な中間層の０．５ｃｍ以内に対する溶液の上層を破棄した。不透明な中
間層を新たな遠心チューブに移した。等容積のＰＢＳを各チューブに添加して、室温で１
０分間、３５０×ｇで遠心した。上清を破棄した。Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＬ（Ｑｉａｇｅｎ）
５ｍｌを用いて、残留細胞ペレットを再懸濁して、室温で１０分間、チューブを２０００
×ｇで遠心した。上清を破棄した。処理済みの個々の軟膜のそれぞれに対して、ＴＲＩＺ
ＯＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）２０ｍｌ中でペレット再懸濁した。試料を、回転ホモジナイザ
ーを用いて均質化して、ＲＮＡを単離するまで−８０℃で凍結した。
【０３１６】
以下のように、冷凍溶解軟膜試料からＲＮＡを単離した。すなわち、冷凍試料を解凍し
て、クロロホルム４ｍｌを各軟膜試料に添加した。ボルテックスによって試料を混和して
、５分間２０００×ｇで遠心した。水層を新しいチューブへ移し、その後、ＲＮｅａｓｙ
Ｍａｘｉ  ＲＮＡクリーンアップキットを用いて、製造元の指示（Ｑｉａｇｅｎ（ＰＮ
７５１６２））に従い再精製した。収量、純度、および完全性を、分光光度計とゲル電
気泳動法によって評価した。  
【０３１７】
以下のように、複数の試料を、異なるプロトコールによって調製した。このプロトコー
ルを用いて調製したＲＮＡの更なる使用については、実施例７に記載する。  
【０３１８】
５０の全血試料を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  
Ｃｅｎｔｅｒで、同意した血液ドナーからランダムに選択した。約３５０ｍｌまでの個体
の提供血液から各軟膜試料を生産した。室温で８分間、全血試料を約４，４００×ｇで遠
心すると、３つの異なる層が生じた。すなわち、血漿の上層、軟膜の第２の層、および赤
血球の第３の層である。軟膜画分２５ｍｌを得て、等容積のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）
で希釈した。５０ｍＬプラスチックチューブ中で、１．０７７＋／−０．００１  ｇ／ｍ
ｌの密度に調節したジアトリゾア酸ナトリウム溶液（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（
Ｓｉｇｍａ））１５ｍｌ上で希釈軟膜３０ｍｌを層状にした。室温で１０分間、チューブ
を８００ｇで回転した。チューブの３０ｍｌ印まで、血漿層を取り出し、単核細胞層を新
たなチューブに移して、等容積のＰＢＳを用いて洗浄して、室温で１０分間、２０００ｇ
で遠心することによって回収した。ボルテックスによって、Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＬ（Ｑｉａ
ｇｅｎ）１０ｍｌ中に細胞ペレットを再懸濁し、１０分間氷上でインキュベートして、い
ずれの残存赤血球も除去した。４℃で１０分間、単核細胞を２０００ｇで回転した。フェ
ノール／チオシアン酸グアニジニウム溶液（ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）２５ｍｌ中で細胞ペレットを溶解した。ＰｏｗｅｒＧｅｎｅ５回転式ホモジ
ナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＯｍｉｎｉ使い捨てジェネレー
タプローブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、試料を均質にした。Ｔｒ
ｉｚｏｌ溶解物を、次のステップまで−８０℃で凍結した。
【０３１９】
試料を解凍して、５分間室温でインキュベートした。クロロホルム５ｍｌを、各試料に
添加して、ボルテックスによって混和して、３分間室温でインキュベートした。水層を、
新しい５０ｍｌチューブへ移した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（ＰＮ
７５１６２）を用いて、製造元のプロトコール（１９９９年１０月）毎に、全ＲＮＡを
含有する水層をさらに精製した。各回転前の１分のインキュベーションとともに、ＲＮａ
ｓｅ非含有水１ｍｌを用いてカラムを２回溶出した。標準的方法を用いて、ＲＮＡの量お
よび質を評価した。通常、１．５６の２６０／２８０比と１．７８の２８Ｓ／１８Ｓ比と
による軟膜８７０μｇ毎の平均収量および全ＲＮＡ４３．５ｍｇの推定全収量で、１０個
の軟膜のバッチから一度にＲＮＡを単離した。
【０３２０】
ＲＮＡ  ６０００微量流体法（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）チップを用いたＡｇｉｌ
ｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、ＲＮＡの質を試験した。５つの異
なるバッチに対するＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒから得た電気泳動図の分析によって、バッチ
間の質での再現性が実証された。  
【０３２１】
全ての５つのバッチから得た全ＲＮＡを組み合わせ、５０ｍｌチューブ中で混和して、
その後、以下のようにアリコートした。すなわち、１５ｍｌチューブ中の２×１０ｍｌの
アリコートと、１．５ｍｌ微量遠心チューブ中の１００μｌアリコートでの残りとである
。アリコートによって、ＲＮＡ純度、大きさ、および完全性に関する高度に再生可能な結
果を得た。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０３２２】
（参照ＲＮＡの試験ハイブリダイゼーション）
ＢＣ３８および刺激単核参照試料を比較したとき、図４に示す他の参照試料より良好で
ない場合は、Ｒ５０を同様に実行した。
【０３２３】
ハイブリダイゼーション分析では、本明細書に記載される方法を用いて、Ｒ５０標的を
Ｃｙ−５で蛍光的に標識し、実施例６で記載するオリゴヌクレオチドアレイに、増幅およ
び標識ａＲＮＡをハイブリダイズする（実施例７の通りに）。Ｒ５０は、３より大きいシ
グナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を有するプローブの９７．３％と、１より大きいＳ／Ｎを有
するプローブの９９．９％を検出した。
【０３２４】
（実施例３：慢性間接リウマチの処置および／または進行のモニタリングに使用するた
めの診断用オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセットの同定）
慢性関節リウマチ（以下、「ＲＡ」）は、慢性で消耗性の炎症性関節炎である。ＲＡの
診断は、臨床基準とＸ線写真によって行われる。新規クラスの投薬、すなわちＴＮＦ遮断
薬は効果的であるが、該薬剤は高価であり、副作用を有し、全ての患者が治療に応答する
というわけではない。さらに、疾患症状の軽減は、必ずしも関節破壊の阻害と相関しない
。これらの理由のために、治療法の滴定のための代替のメカニズムが、必要である。  
【０３２５】
ＲＡの診断用のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ
（以下、「ＡＲＣ」）基準を満たしている患者のコホートを同定する観察研究を実行した
。Ａｒｎｅｔｔら，（１９８８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｌｒｅｕｍ  ３１：３１５−２
４。患者はインフォームドコンセントを行い、本明細書に記載する方法によって、末梢血
単核細胞ＲＮＡ試料を得た。利用可能な際は、変化が起きた関節および滑液由来の骨また
は滑膜の外科標本からＲＮＡ試料も得た。また、発現分析のための一部の患者に対して、
末梢血からＴ細胞を単離した。実施例１で与えたプロトコールを用いてこれを行った。  
【０３２６】
各患者から、利用できるならば、以下の臨床情報を得た。すなわち、人口統計情報と、
ＲＡのＡＣＲ基準に関する情報と、炎症性および非炎症性状態の追加的な診断の有無と、
差を持つ全血数、ＣＲＰ、ＥＳＲ、ＡＮＡ、血清ＩＬ６、可溶性ＣＤ４０リガンド、ＬＤ
Ｌ、ＨＤＬ、抗ＤＮＡ抗体、リウマチ因子、Ｃ３、Ｃ４、血清クレアチニン、および任意
の投薬レベルを含む臨床検査から得たデータと、総手術所見ならび切除組織および生検の
病理学的評価等の外科的処置から得たデータと、薬理学的療法および処理変化に関する情
報と、疾患「増悪（ｆｌａｒｅ）」の臨床診断と、入院と、定量的関節試験と、健康評価
アンケート（ｈｅａｌｔｈ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＨＡ
Ｑ））から得た結果と、患者症状と障害の他の臨床尺度と、関節併発（ｊｏｉｎｔ  ｉｎ
ｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）、滑膜肥厚、骨欠損および侵食、ならびに関節隙狭細および変形を
評価する外診結果とＸ線撮影データとがある。いくつかの場合では、データには、ＲＡお
よびコントロール患者由来の滑膜および関節組織の病理学的評価が含まれる。病理学スコ
アリングシステムを用いて、疾患分類、炎症、炎症性浸潤の種類、滑膜炎症の細胞性およ
び構成を決定した。  
【０３２７】
複数の滑膜検体に対して、単核細胞または単核細胞サブセット（Ｔ細胞等）を発現プロ
ファイリング用に単離することができる。蛍光細胞分析分離（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）によって、複数の検体用のリンパ球
サブセットの相対数を測定することができる。例としては、検体に対するＣＤ４／ＣＤ８
Ｔ細胞比の決定がある。他の結果に相関する変数としてまたは相関分析に対する結果と
して、この情報を用いることができる。
【０３２８】
これらのデータから、２０％ＡＣＲと５０％の応答／改善割合によって例証されるよう
に、ＲＡでの改善の尺度が引き出される（Ｆｅｌｓｏｎら，１９９６）。若干の期間にわ
たる疾患活性の尺度は、疾患進行の尺度としてのこれらのデータに由来する。進行の客観
的決定（例えば関節隙狭細、関節周囲オステオポローシス、滑膜肥厚）に対して、変化が
生じた関節の連続Ｘ線撮影を用いる。疾患活性は、臨床スコア、病歴、身体検査、研究室
での研究、外科および病理学的所見から決定される。  
【０３２９】
収集した臨床データ（疾患基準）を用いて、発現データの相関に対する患者または試料
群を定義する。比較、例えば有用なまたは興味深い臨床的区別を有する患者群対該区別を
持たない患者群について、患者群を同定する。収集した臨床データを基にして行うことが
できる有用かつ興味深い患者区別の例をここで列記する。すなわち、
臨床的に診断したＲＡ増悪（ｆｌａｒｅ）中の患者由来の試料対無症候のときの同じま
たは異なる患者由来の試料。
【０３３０】
その後高い尺度の疾患活性を有する患者由来の試料対その後低い疾患活性を有する同じ
または異なる患者由来の試料。
【０３３１】
その後高い尺度の疾患進行を有する患者由来の試料対その後低い疾患進行を有する同じ
または異なる患者由来の試料。
【０３３２】
その後所定の投薬または治療養生法に応答する患者由来の試料対その後所定の投薬また
は治療養生法（例えば、ＴＮＦ経路遮断投薬）に応答しない同じまたは異なる患者由来の
試料。
【０３３３】
変形性関節症の診断を受けた患者由来の試料対慢性関節リウマチの患者由来の試料。
【０３３４】
高度の炎症を示す組織生検結果を有する患者由来の試料対生検に関して炎症の低めの組
織学的証拠を有する患者由来の試料。
【０３３５】
ＲＡの進行に相関する発現プロファイルを同定する。上記の手順に従って、ＲＡの進行
に対する予測値を有する候補ライブラリーのサブセット（または先行して同定された診断
用ヌクレオチドセット）を同定する。
【０３３６】
ＴＮＦ遮断薬への応答を予測する診断用ヌクレオチドセットを同定する。これらの投薬
を用いた処置の前および途中で患者をプロファイリングする。患者は、症状の軽減、副作
用、および関節破壊の進行に対して、例えば手操作Ｘ線写真によって測定するように、経
過観察される。ＴＮＦ遮断薬に応答と相関している表現プロファイルを同定する。上記の
手順に従って、ＴＮＦ遮断薬への応答に対する予測値を有する候補ライブラリーのサブセ
ット（または先行して同定された診断用ヌクレオチドセット）を同定する。
【０３３７】
実施例４：全身性紅斑性狼瘡を診断するための診断用オリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチドセットの同定
ＳＬＥは、免疫系の制御不調によって特徴づけられる慢性かつ全身炎症性疾患である。
臨床症状は、あらゆる器官系に影響を及ぼして、皮膚発疹、腎機能異常、ＣＮＳ障害、関
節痛、および血液学的な異常を含む。ＳＬＥ臨床症状は、断続的に繰り返され（または「
増悪し（ｆｌａｒｅ」）て、時間とともに進行する傾向があり、永続的な末端器傷害に至
る傾向がある。  
【０３３８】
ＳＬＥの診断用のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇ
ｙ（以下、「ＡＣＲ」）基準を満たしている患者のコホートを同定する観察研究を実行し
た。Ｔａｎら，（１９８２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２５：１２７１−７を参
照せよ。患者はインフォームドコンセントを行い、実施例１に記載される方法によって、
末梢血単核細胞ＲＮＡ試料または末梢Ｔ細胞試料を得た。  
【０３３９】
各患者から、利用できるならば、以下の臨床情報を得た。すなわち、人口統計情報と、
ＳＬＥのＡＣＲ基準と、炎症性および非炎症性状態の追加的な診断、差を持つ全血数、Ｃ
ＲＰ、ＥＳＲ、ＡＮＡ、血清ＩＬ６、可溶性ＣＤ４０リガンド、ＬＤＬ、ＨＤＬ、抗ＤＮ
Ａ抗体、リウマチ因子、Ｃ３、Ｃ４、血清クレアチニン（腎機能不全の他の尺度）、投薬
レベルを含む臨床検査から得たデータと、総手術所見ならび切除組織および生検（例えば
腎臓、ＣＮＳ）の病理学的評価等の外科的処置から得たデータと、薬理学的療法および処
理変化に関する情報と、疾患「増悪（ｆｌａｒｅ）」の臨床診断と、入院と、定量的関節
試験と、健康評価アンケート（ｈｅａｌｔｈ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｑｕｅｓｔｉｏｎ
ｎａｉｒｅ（ＨＡＱ））から得た結果と、ＳＬＥＤＡＩ（多くの臨床変数を評価するＳＬ
Ｅ活性に対する臨床スコア（Ｂｏｍｂａｄｉｅｒ  Ｃ、Ｇｌａｄｍａｎ  ＤＤ、Ｕｒｏｗ
ｉｔｚ  ＭＢ、Ｃａｒｏｎ  Ｄ、Ｃｈａｎｇ  ＣＨ、およびｔｈｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ
ｏｎ  Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ＳＬＥ：Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  
ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＬＥＤＡＩ  ｆｏｒ  Ｌｕｍｐｕｓ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｒｔｈｒｉ
ｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３５：６３０−６４０，１９９２））と、患者症状と障害の他の臨
床尺度と、外診結果と、頚動脈超音波検査とがある。  
【０３４０】
収集した臨床データ（疾患基準）を用いて、発現データの相関に対する患者または試料
群を定義する。比較、例えば有用なまたは興味深い臨床的区別を有する患者群対該区別を
持たない患者群について、患者群を同定する。ＳＬＥでの疾患活性の尺度は、上述の臨床
データに由来し、若干の期間にわたってまたは任意の時間点での１回で、より高い疾患活
性およびより低い疾患活性を有する群に患者（および患者試料）を分ける。そのようなデ
ータは、ＳＬＥＤＡＩスコアおよび他の臨床スコア、すなわち炎症マーカーまたは補体の
レベル、入院数、投薬使用および変化、生検結果、ならびに進行性腎不全、頸動脈のアテ
ローム性動脈硬化症、およびＣＮＳ機能障害を含む末端器傷害または末端器傷害進行を測
定するデータである。
【０３４１】
末端器傷害および末端器傷害の進行に対応する表現プロファイルを含むＳＬＥの進行と
相関する発現プロファイルを同定する。発現プロファイルを同定して疾患進行または疾患
「増悪（ｆｌａｒｅ）」、治療への応答または治療への応答の見込み、「低い」または「
高い」疾患尺度の予測見込み（任意で、ＳＬＥＤＡＩスコアを用いて説明される）、およ
び発達する未成熟な頚動脈のアテローム性動脈硬化症の存在または見込みを予測する。上
記の手順に従って、ＳＬＥの進行に対する予測値を有する候補ライブラリーのサブセット
（または先行して同定した診断用ヌクレオチドセット）を同定する。
【０３４２】
収集した臨床データを基にして行うことができる有用かつ興味深い患者区別のさらなる
例をここに列記する。試料をグループ分けすることができ、グループを比較して、診断用
遺伝子セットを発見する。すなわち、
１．臨床的に診断したＳＬＥ増悪（ｆｌａｒｅ）中の患者由来の試料対無症候のときま
たは文献にある感染にかかっているときの同じまたは異なる患者由来の試料。
【０３４３】
２．その後高い尺度の疾患活性を有する患者由来の試料対その後低い疾患活性を有する
同じまたは異なる患者由来の試料。
【０３４４】
３．その後高い尺度の疾患進行を有する患者由来の試料対その後低い疾患進行を有する
同じまたは異なる患者由来の試料。
【０３４５】
４．その後所定の投薬または治療養生法に応答する患者由来の試料対その後所定の投薬
または治療養生法に応答しない同じまたは異なる患者由来の試料。
【０３４６】
５．超音波検査に関する未成熟な頸動脈のアテローム性動脈硬化症患者由来の試料対未
成熟なアテローム性動脈硬化症ではないＳＬＥ患者由来の試料。
【０３４７】
（狼瘡を診断するための診断用オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットの
同定）
実施例１に記載されるプロトコールを用いて、ＳＬＥ患者およびリウマチ様または変形
性関節症（ＲＡとＯＡ）の患者あるいはコントロールから単核ＲＮＡ試料を収集した。Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙより用いられるもの
等の標準的診断アルゴリズムを用いて、患者の診断を決定した（例えばＴａｎら，（１９
８２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２５：１２７１−７；Ａｒｎｅｔｔら，（１９
８８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３１：３１５−２４を参照せよ）。
【０３４８】
３２の試料を分析に含めた。１５の試料は、ＳＬＥの臨床診断患者に由来し、残りは、
ＲＡ患者（９）、ＯＡ患者（４）に由来し、既知の病気に羅患していない被験体（４）を
コントロールとした。患者の既往歴、身体検査、および研究室での研究等の客観的および
主観的な基準に基づいて、患者の医師によって、ＳＬＥまたはＲＡ患者から得た試料を（
疾患活性に関して）「活性」または「抑制」として分類した。投薬使用、性別、年齢、二
次的診断等の重要な変数に関して、ＳＬＥ患者およびコントロールが釣りあうように試み
た。
【０３４９】
ＲＮＡの調製（実施例１）後、実施例６に記載されるオリゴヌクレオチドマイクロアレ
イを用いて実施例７に記載されるように、増幅、標識、ハイブリダイゼーション、スキャ
ニング、特徴摘出、およびデータ処理を行った。Ｃｙ３（患者試料）／Ｃｙ５（Ｒ５０参
照ＲＮＡ）の発現の得られたログ比率を分析用に用いた。
【０３５０】
最初に、マイクロアレイ（ＳＡＭ、Ｔｕｓｈｅｒ  ２００１、実施例９）に対する有意
性分析を用いて、それが７つの狼瘡試料と１７のコントロール試料との間で、差次的に発
現したことを発見した。全てのコントロール中よりも狼瘡患者中でより高度に発現する１
つの遺伝子を同定した。この遺伝子は、ＳＡＭを用いて、０．５％偽検出率を有していた
。これは、狼瘡およびコントロール試料間で正確に遺伝子が差別的に発現する可能性が統
計学的に９９．５％あることを意味する。この遺伝子は、オリゴヌクレオチドおよび配列
番号５１８であった。該オリゴヌクレオチド：ＧＣＣＴＣＴＴＧＣＴＴＧＧＣＧＴＧＡＴ
ＡＡＣＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＴＴＡＴＧは、特異的ヒト遺伝
子：シアリルトランスフェラーゼ（ＳＩＡＴ４Ａ）、Ｕｎｉｇｅｎｅ：Ｈｓ．３０１６９
８、Ｌｏｃｕｓ：ＮＭ＿００３０３３、ＧＩ：４５０６９５０を検出する。該遺伝子に対
する発現比を図５Ａ〜Ｂで試料ごとに示す。ＳＬＥおよびコントロール間の発現での平均
倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）は、１．４８であった。
【０３５１】
より大きいデータセットを用いたとき、１５のＳＬＥ試料を１７のコントロールと比較
した。ＳＡＭを用いて、狼瘡とコントロールの間でかなり差別的に発現するような遺伝子
を同定した。管理回収分類（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｃｌａｓｓ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｘ−Ｍｉｎｅ，Ｂｒｉｓｂａｎｅ，ＣＡ）およびＣＡＲＴ（Ｓａ
ｌｆｏｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）も同データ上で用いて、どの
遺伝子セットが最もＳＬＥとコントロール試料を見分けるかについて決定した（実施例９
）。
【０３５２】
ＣＡＲＴを用いて、アレイから得た遺伝子発現データを用いて狼瘡または狼瘡ではない
として試料を分類するための決定木を構築した。分析によって、狼瘡患者に由来する試料
を正確に同定するために共に用いられ得る遺伝子セットを同定する。決定木に対する遺伝
子セットおよび同定した閾値発現レベルは、「モデル」と称される。狼瘡の診断用の多数
のモデルは、ＣＡＲＴアルゴリズムに対する異なる設定およびパラメータを用いることお
よび分析での遺伝子の異なるセットを用いることによって導かれた。ＣＡＲＴを使用する
とき、独立変数の数を制限することが所望され得る。アレイ上の遺伝子の場合、ＳＡＭま
たはいくつかの他のアルゴリズムを用いることによって発見されたかなり差次的発現に基
づくＣＡＲＴでの分析に対して、約８０００までのサブセットを選択することができる。
【０３５３】
モデルＩは、３２の試料（１５のＳＬＥと１７の非ＳＬＥ）からなるデータセットに基
づいた。これらの試料は、モデルを導き出すために用いられ、「訓練セット」として言及
される。モデルＩは、２９の遺伝子に対する発現値を用い、これは、上述のＳＡＭを用い
た分析でのＳＬＥおよび非ＳＬＥ試料を区別する際に最も有意であるとわかった。ＳＬＥ
試料をクラス１と称し、非ＳＬＥ試料をクラス２と称した。この分析のために、以下の設
定をＭＯＤＥＬ  ＳＥＴＵＰ（ＣＡＲＴ，Ｓａｌｆｏｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄ
ｉｅｇｏ，ＣＡ．）で用いた。Ｍｏｄｅｌ設定では、分析のために選択される木の種類は
、分類であった。Ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ設定では、デフォルト値を用いた。Ｔｅｓｔｉ
ｎｇ設定では、Ｖ分割交差検定（Ｖ−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を
１０の値で選択した。Ｓｅｌｅｃｔ  Ｃａｓｅｓ設定では、デフォルト値を用いた。Ｂｅ
ｓｔ  Ｔｒｅｅ設定では、デフォルト値を用いた。Ｃｏｍｂｉｎｅ設定では、デフォルト
値を用いた。Ｍｅｔｈｏｄ設定では、分類木の種類としてＳｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｇｉｎｉ
を選択し、そしておよび分割用の一次結合も選択した。デフォルト値を一次結合に対して
用いた。Ａｄｖａｎｃｅ  設定では、デフォルト値を用いた。Ｃｏｓｔ設定では、デフォ
ルト値を用いた。Ｐｒｉｏｒ設定では、ＥｑｕａｌをＣｌａｓｓに対する事前値（ｐｒｉ
ｏｒ）として選択した。ペナルティー設定では、デフォルト値を用いた。
【０３５４】
この分析から、ＣＡＲＴによって、２つのモデル、すなわち２遺伝子モデルおよび３遺
伝子モデル（図５Ｃ〜Ｅ）を構築した。２つの遺伝子モデルの訓練セット試料での狼瘡の
同定に対する感度および特異性はそれぞれ、１００％および９４％であった。２遺伝子モ
デルの１０分割交差検定（１０−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）セット
に対する感度および特異性はそれぞれ、０．１１８の相対的なコストで、１００％および
８８％であった。３遺伝子モデルの訓練セットに対する感度および特異性はそれぞれ、１
００％および１００％であった。３遺伝子モデルの１０分割交差検定（１０−ｆｏｌｄ  
ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）セットに対する感度および特異性はそれぞれ、０．
１２５の相対的コストで、９３％および９４％であった。
【０３５５】
モデルＩＩは、３２の試料、１５のＳＬＥおよび１７の非ＳＬＥ（訓練セット）、なら
びに試料の少なくとも８０％に対する発現値を有する６０４４の遺伝子からなるデータセ
ットに基づいた。このデータセットの分析用のＭＯＤＥＬ  ＳＥＴＵＰは、以下の修正以
外は、上記の分析と同様であった。Ｍｅｔｈｏｄ設定では、分類系図を生成しない分析後
に、分割に対する一次結合（ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）は未検査であった
。一次結合設定における変更によって、以下のことを生じた。
【０３５６】
１遺伝子モデルの訓練セットに対する感度および特異性はそれぞれ、８７％および８２
％であった。１遺伝子モデルの１０分割交差検定（１０−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ  ｖａｌ
ｉｄａｔｉｏｎ）セットに対する感度および特異性はそれぞれ、０．６１２の相対的コス
トで、８０％および５９％であった。３遺伝子モデルの訓練セットに対する感度および特
異性はそれぞれ、１００％および８８％であった。３遺伝子モデルの１０分割交差検定セ
ットに対する感度および特異性はそれぞれ、０．６８６の相対的コストで、６７％および
６５％であった。５遺伝子モデルの訓練セットに対する感度および特異性はそれぞれ、１
００％および９４％であった。５遺伝子モデルの１０分割交差検定に対する感度および特
異性はそれぞれ、０．７４５の相対的コストで、６７％および５９％であった。結果およ
びモデルは、図５Ｃおよび図Ｆで概説される。
【０３５７】
分類に有用であると判明したそれらの遺伝子を表２に示す。
【０３５８】
これらの遺伝子を単独であるいは他の遺伝子または変数と組み合わせて用いて、診断用
遺伝子セットまたは分類アルゴリズムを構築することができる。これらの遺伝子を狼瘡用
の既知の遺伝子マーカー（先行技術で同定されたもの等）と併せて用いて、診断用アルゴ
リズムを提供することができる。
【０３５９】
実施例８に記載するような遺伝子のいくつかに対して、実時間ＰＣＲ検証のためのプラ
イマーを設計し、表２Ｂに列記した。
【０３６０】
最も有用な遺伝子のいくつかに対する代理物を同定した。狼瘡を検出する方法での診断
用遺伝子に加えて、または該遺伝子の代わりに、あるいは診断用遺伝子セット中で、代理
物を用いることができる。ＣＡＲＴでのスプリッターであった遺伝子に対して、ソフトウ
エアによって代理物が同定および報告された。この場合で、最も利用可能な代理物を列記
する。他の遺伝子に対して、デフォルト設定（ｘ−ｍｉｎｅｒ、Ｘ−ｍｉｎｅ、Ｂｒｉｓ
ｂａｎｅ，ＣＡ）を用いて、データの階層的クラスタリングを実行して、遺伝子発現クラ
スターの成分を示した。対象遺伝子を含むクラスターを選択して、そのクラスターの成分
を表２Ｄに示した。
【０３６１】
（実施例５：オリゴヌクレオチドプローブの設計）
例証として、このセクションは、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｖｅｒ  １．１（Ｐ
ｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ）を用いた４つのオリゴヌクレオチドプローブの設計を記載する。この過程での主なス
テップを初めに示す。
【０３６２】
１）ＧｅｎＢａｎｋから、ｍＲＮＡの最良の可能配列を得る。完全長配列参照配列が利
用できない場合、部分配列を用い、５’末端よりも３’末端を優先する。配列がアンチセ
ンス鎖を表すことが既知であるとき、配列の逆相補体をプローブ設計のために用いる。プ
ローブ設計時にＧｅｎＢａｎｋで有意のマッチがないサブトラクテッド（ｓｕｂｔｒａｃ
ｔｅｄ）白血球発現ライブラリーで表される配列に対して、本発明の配列を用いる。
【０３６３】
２）ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ等のアルゴリズムを用いて、配列中の低複雑領域および
反復エレメントをマスキングする。
【０３６４】
３）Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ，ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１等のプローブ設計ソフト
ウエアを用いて、特定の物理的および化学的特性を有する５０残基の配列を選択する。３
’末端に最も近い５０残基は検索フレームを構成する。それが含む残基を適合性について
試験する。それらが特定の基準を満たさない場合、５’末端側に近づいて１残基分移動し
て、今度はそれが含む５０残基を試験する。適切な５０マーが見つかるまで、この過程を
繰り返す。
【０３６５】
４）そのような５０マーが配列内に存在しない場合、適切な５０マーが見つかるまで、
物理的および化学的基準を調整する。
【０３６６】
５）ＮＣＢＩでＢＬＡＳＴｎ検索ツールを用いて、ｄｂＥＳＴ、ＵｎｉＧｅｎｅクラス
ターセット、および集まったヒトゲノムとプローブを比較して、関連する同定情報を得て
、プローが１つより多い遺伝子に有意な類似性を持たないことを確認する。
【０３６７】
（クローン４０Ｈ１２）
クローン４０Ｈ１２を配列決定して、ＢＬＡＳＴ検索ツールを用いて、ＮＣＢＩでｎｒ
、ｄｂＥＳＴ、およびＵｎｉＧｅｎｅデータベースと比較する。配列は、寄託番号ＮＭ＿
００２３１０、すなわちゼロのＥ値が報告されている白血球阻害因子レセプター（ＬＩＦ
Ｒ）ｍＲＮＡをコードする’ｃｕｒａｔｅｄ  ＲｅｆＳｅｑ  ｐｒｏｊｅｃｔ’配列（Ｐ
ｒｕｉｔｔら（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：４４−４７を参照せよ）に
マッチした。ゼロのＥ値は、全ての実用目的のために、配列の長さと、データベースの組
成およびサイズとに基づいて、類似性がランダムである可能性がないということを示す。
寄託番号ＮＭ＿００２３１０として登録されるこの配列は、クローン４０Ｈ１２の配列よ
りもかなり長く、ポリＡ尾を持っている。これによって、寄託番号ＮＭ＿００２３１０と
して登録されるこの配列がセンス鎖であり、特に３’末端でクローン４０Ｈ１２配列より
もｍＲＮＡのより完全な表現であることが示された。寄託番号「ＮＭ＿００２３１０」は
、センス鎖ｍＲＮＡを表す寄託番号のテキストファイルに包括され、Ｂａｔｃｈ  Ｅｎｔ
ｒｅｚウエブインターフェースを用いたＥｎｔｒｅｚ検索問合せとして所望の寄託番号を
含有するテキストファイルをアップロードし、かつＦＡＳＴＡファイルとして局所的な結
果を保存することによって、センス鎖ｍＲＮＡに対する配列を得た。以下の配列を得て、
クローン４０Ｈ１２のアラインメントの領域を概説する。
【０３６８】
【数１１】
2010104368.tif 000012
【０３６９】
【数１２】
2010104368.tif 000013
【０３７０】
。
【０３７１】
ＮＭ＿００２３１０の配列を含むＦＡＳＴＡファイルを、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒウ
ェブインターフェース（Ｓｍｉｔ，ＡＦＡ＆Ｇｒｅｅｎ，Ｐ  ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ
（ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＲＭ／ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ．ｈ
ｔｍｌ，ＳｍｉｔおよびＧｒｅｅｎ））を用いてマスキングした。具体的には、マスキン
グの間、配列の以下の種類を、「Ｎ」：ＳＩＮＥ／ＭＩＲ＆ＬＩＮＥ／Ｌ２、ＬＩＮＥ／
Ｌ１、ＬＴＲ／ＭａＬＲ、ＬＴＲ／Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ、Ａｌｕ、および単純反復等の
他の低情報含有量配列と取り替えた。下記は、マスキング後の配列である。
【０３７２】
【数１３】
2010104368.tif 000014
【０３７３】
【数１４】
2010104368.tif 000015
【０３７４】
【数１５】
2010104368.tif 000016
【０３７５】
。
【０３７６】
バッチ、自動化コンピューター方法、ならびに配列を用いて、この配列の長さを測定し
、センス鎖、その長さ、ｍＲＮＡの３’末端に近いプローブ配列の所望の位置をＡｒｒａ
ｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｖｅｒ  １．１（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）にサブミットした。検索の質を１００％
で設定して、最良プローブ数を１、長さ範囲を５０塩基対、Ｔａｒｇｅｔ  Ｔｍを７５℃
＋／−５℃、Ｈａｉｒｐｉｎ最大ΔＧを６．０−ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｓｅｌｆ  ｄｉｍｍ
ｅｒ最大ΔＧを６．０−ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｒｕｎ／ｒｅｐｅａｔ（ジヌクレオチド）最
大長を５、Ｐｒｏｂｅ部位最小オーバーラップを１で設定した。４９の可能プローブのう
ち基準を満たすものがなかったとき、プローブ部位を配列の５’末端により近い５０塩基
対に移動して、分析のためにＡｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒに再サブミットする。可能な
プローブが基準を満たさなかったとき、プローブ配列が生成されるように、融解温度の変
動を＋／−８℃まで上げ、実行での同一塩基対数を６まで増加させた。
【０３７７】
上記の配列で、上記に示した基準を用いて、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｖｅｒ  
１．１は、以下の配列のオリゴヌクレオチド（配列番号１０４１）によるプローブを設計
して、上記の配列中、下線で示す。それは、６８．４℃の融解温度と、６ヌクレオチドの
最大実行とを持ち、ｍＲＮＡの３’末端に近いオリゴヌクレオチドを得るために、Ａｒｒ
ａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｖｅｒ  １．１でのプローブ設計の基準を緩和する一症例を表
す（低融解温度を可能とした）。
【０３７８】
（クローン４６３Ｄ１２）
クローン４６３ＤＩ２を配列決定して、ＢＬＡＳＴ検索ツールを用いて、ＮＣＢＩでｎ
ｒ、ｄｂＥＳＴ、およびＵｎｉＧｅｎｅデータベースと比較した。配列は、寄託番号ＡＩ
１８４５５３、すなわち定義行列「ｇｂ：Ｍ２９５５０  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＨＯＳＰＨ
ＡＴＡＳＥ  ２Ｂ  ＣＡＴＡＬＹＴＩＣ  ＳＵＢＵＮＩＴ  １（ＨＵＭＡＮ）；，ｍＲＮ
Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅに類似するｇｄ６０ａ０５．ｘ１  Ｓｏａｒｅｓ＿ｔｅｓｔｉｓ＿
ＮＨＴ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＩＭＡＧＥ；１７３３８４
０  ３’」を有するＥＳＴ配列とマッチした。アラインメントのＥ値が１．００×１０−
１１８であった。ＧｅｎＢａｎｋ配列は、ポリＴ領域で始まって、それがアンチセンス鎖
であり、５’から３’方向へ読み取ることが示唆された。この配列の開始は、ｍＲＮＡセ
ンス鎖の３’末端に相補的である。この配列の寄託番号は、アンチセンス配列を表す寄託
番号のテキストファイルに包括された。Ｂａｔｃｈ  Ｅｎｔｒｅｚウエブインターフェー
スを用いたＥｎｔｒｅｚ検索問合せとして所望の寄託番号を含有するテキストファイルを
アップロードし、かつＦＡＳＴＡファイルとして局所的な結果を保存することによって、
アンチセンス鎖ｍＲＮＡの配列を得た。以下の配列を得て、クローン４６３Ｄ１２のアラ
インメント領域を概説する。
【０３７９】
【数１６】
2010104368.tif 000017
【０３８０】
。
【０３８１】
ＡＡ１８４５５３の配列を含むＦＡＳＴＡファイルを、その後、以下に示すように、Ｒ
ｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒウェブインターフェースを用いてマスキングした。クローン４６
３Ｄ１２のアラインメントの領域を概説する。
【０３８２】
【数１７】
2010104368.tif 000018
【０３８３】
。
【０３８４】
配列を上述のようにＡｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒにサブミットしたが、プローブの所
望の位置を塩基対５０で示し、プローブが基準を満たさない場合は、３’方向へ移動した
。元の配列はアンチセンスであったので、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒから得た相補配
列を用いた。Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒによって設計されたオリゴヌクレオチドは、
以下の配列オリゴヌクレオチド（配列番号１０４４）を有し、上記の下線部の配列に相補
的である。このプローブは、７２．７℃の融解温度と、４ヌクレオチドの最大実行を有す
る。
【０３８５】
（クローン７２Ｄ４）
クローン７２Ｄ４を配列決定して、ＢＬＡＳＴ検索ツールを用いて、ＮＣＢＩでｎｒ、
ｄｂＥＳＴ、およびＵｎｉＧｅｎｅデータベースと比較した。これらのデータベースのい
ずれでも、有意なマッチは見つけられなかった。ヒトゲノムドラフトと比較したとき、下
記に示す参照配列ＮＴ＿００８０６０の３つの連続した領域に有意なアラインメントを見
出し、挿入配列が、非同定遺伝子の３つのスプライシングされたエキソンを含有すること
が示唆された。
【０３８６】
（マッチング残基上の残基数）
クローン７２Ｄ４配列        ＮＴ＿００８０６０上の番号
１〜１９８              ４７８６４６〜４７８８４３
１９７〜４８９              ４７９８７６〜４８０１６８
４９１〜５８５              ４８９２７１〜４８９３６５
参照配列がイントロンを含有し、この遺伝子に対するコーディング鎖または非コーディ
ング鎖のいずれかを表す可能性があるので、ＢｉｏＣａｒｄｉａ自体の配列ファイルを用
いて、オリゴヌクレオチドを設計した。２つの相補的なプローブを設計して、センス鎖が
表されることを確実にした。クローン７２Ｄ４中の挿入配列を、３つの推定エキソンに輪
郭を取って以下に示す。
【０３８７】
【数１８】
2010104368.tif 000019
【０３８８】
。
【０３８９】
配列をＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒにサブミットしたが、反復配列は見つからなかった。
上記に示した配列を用いて、上述のようにＡｒｒａｙ  Ｄｓｉｇｎｅｒを用いて２つの５
０マープローブを設計した。プローブを下記に表す配列中で、太字で示す。配列番号１０
４６および配列番号１０４７。
【０３９０】
【数１９】
2010104368.tif 000020
【０３９１】
。
【０３９２】
（プローブ配列の確認）
プローブ設計後、ＮＣＢＩでＢＬＡＳＴｎを用いて、ｄｂＥＳＴ，ＵｎｉＧｅｎｅクラ
スターセット、および集まったヒトゲノムに対して配列を比較することによって、各プロ
ーブ配列を確認した。アラインメント、寄託番号、ｇｉ番号、ＵｎｉＧｅｎｅクラスター
番号、および名称を検査して、最も一般的な配列をプローブとして用いた。最終的なプロ
ーブセットは、表２に編集した。この表では、配列リストに対応する配列番号を示す。ア
レイ中の配列の起源は、実施例１で記載したｃＤＮＡライブラリーの１つ由来の、実施例
２および１１で記載されるデータベース由来の、または公表文献からの同定のように示す
。既知であるときは、各配列について、Ｕｎｉｇｅｎｅ番号、Ｇｅｎｅｂａｎｋ寄託番号
、およびＧＩ番号も示す。寄託番号に関連する遺伝子の名称を示す。最後に、各プローブ
のヌクレオチド配列も示す。
【０３９３】
（実施例６：８０００スポット５０マーオリゴヌクレオチドのアレイの生産）
本発明者らは、８０００スポット５０マーオリゴヌクレオチドのアレイを生産した。実
施例１１および１２によって、このアレイ用のプローブの設計および選択を例証する。
【０３９４】
Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）によって、標準的
ホスホラミダイト化学を用いて、０．０５μｍｏｌｅの合成の開始スケールで、非修飾５
０マーのオリゴヌクレオチドを合成した（例えばＲ．Ｍｅｙｅｒｓ，ｅｄ．（１９９５）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏ
ｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅを参照せよ）。要約すると、合
成を開始するために、５’末端にジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を有する３’ヒドロキ
シルヌクレオシドを固相支持体に結合させた。結合反応のために５’ヒドロキシルを遊離
させるために、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて、ＤＭＴ基を除去した。次に、テトラ
ゾールおよび次のヌクレオチドのホスホラミダイト誘導体を添加した。テトラゾールはホ
スホラミダイトの窒素をプロトン化して、それが求核攻撃を受けやすいようにする。ヒド
ロキシル基の５’末端のＤＭＴ基は、過度にヌクレオチドがさらに添加されることを妨げ
る。次に、酸素ドナーとして酸化剤および水を用いた酸化ステップで、ヌクレオチド間結
合をホスホトリエステル結合に変換する。過剰ヌクレオチドをろ過して、次のヌクレオチ
ドのためのサイクルをＤＭＴ保護基の除去によって始めた。合成後、オリゴを固相支持体
から切断した。オリゴヌクレオチドを脱塩し、１００または２００μＭの濃度で水中で再
懸濁して、９６ディープウエル形式に入れた。オリゴヌクレオチドをＷｈａｔｍａｎ  Ｕ
ｎｉｐｌａｔｅ  ３８４ウエルポリプロピレンＶ底プレートに再アレイした。１×  Ｍｉ
ｃｒｏ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｌｕｓ（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ／ａｒｒａ
ｙｉｔ．ｃｏｍ、ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）中で、オリゴヌクレオチドを全量１５μｌ
で最終濃度３０μＭに希釈した。全体で、８，０３１のオリゴヌクレオチドを、２１個の
３８４ウエルプレートへアレイした。
【０３９５】
Ｔｅｌｅｃｈｅｍ／ａｒｒａｙｉｔ．ｃｏｍ  Ｓｕｐｅｒアミンガラス基板（Ｔｅｌｅ
ｃｈｅｍ／ａｒｒａｙｉｔ．ｃｏｍ）上でアレイを生産し、これは、２５×７６×０．９
６ｍｍの正確な寸法を有する０．１ｍｍのフィルタをかけられた清潔な部屋で製造した。
アレイは、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  ４８ピンＭｉｃｒｏ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇ  Ｐｒｉｎｔｈｅ
ａｄとともにＶｉｒｔｅｋ  Ｃｈｉｐｗｒｉｔｅｒを用いてプリントした。Ｐｒｉｎｔｈ
ｅａｄは、直径１１０−１１５ミクロンのスポットサイズを有するスライド上にオリゴヌ
クレオチドをプリントするために用いた４８  Ｓｔｅａｌｔｈ  ＳＭＰ３Ｂ  ＴｅｌｅＣ
ｈｅｍ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇ  Ｐｉｎを積載していた。
【０３９６】
（実施例７：全ＲＮＡの増幅、標識、およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハ
イブリダイゼーション）
（増幅、標識、ハイブリダイゼーション、およびスキャニング）
インタクトな全ＲＮＡの少なくとも０．５から２μｇからなる試料をアレイハイブリダ
イゼーション用にさらに処理した。利用可能であるときは、インタクトな全ＲＮＡ２μｇ
を増幅のために用いる。３つの連続した酵素反応で、全ＲＮＡ試料の増幅および標識を実
行する。第１に、ＲＮＡの一本鎖ＤＮＡコピーを作製した（以下、「ｓｓ−ｃＤＮＡ」）
。第２に、ｓｓ−ｃＤＮＡを相補ＤＮＡ鎖に対するテンプレートとして用いて、二本鎖の
ｃＤＮＡ（以下、「ｄｓ−ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ」）を生成した。第３に、細菌Ｔ７プ
ロモーターからインビトロ転写によって線形増幅を実行した。このステップの間、蛍光連
結ヌクレオチドを、増幅ＲＮＡ（以下、「ａＲＮＡ」）に組み込んだ。
【０３９７】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎキット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）を用いて、第１鎖ｃＤ
ＮＡを生産した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ
ＭｇＣｌ２（１×  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）、０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ
ｄＣＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２００Ｕ  逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ
，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１８０６４０１４）、１５Ｕ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｒ
ＮＡＧｕａｒｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｎｎａｃｉａ，＃２７−０８１５−０１）、
５μＭ  Ｔ７Ｔ２４プライマー（５’−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣ
ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
Ｔ−３’（配列番号１０４８）、および０．５〜２μｇの選択した試料全ＲＮＡで構成さ
れる反応で、第１の鎖ｃＤＮＡを生成した。植物シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の複数の精製組み換えコントロールｍＲＮＡを、２〜２０ｐ
ｇの反応混合物：以下の遺伝子、すなわちＣＡＢ、ＲＣＡ、ＬＴＰ４、ＮＡＣ１、ＲＣＰ
１、ＸＣＰ２、ＲＢＣＬ、ＬＴＰ６、ＴＩＭ、およびＰＲＫａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ，それぞれ＃２５２２０１、＃２５２２０２、＃２５２２０４、＃２５２２０８、＃２
５２２０７、＃２５２２０６、＃２５２２０３、＃２５２２０５、＃２５２２０９、＃２
５２２１０）に添加した。これらの植物遺伝子に対する対応するセンスオリゴヌクレオチ
ドプローブがマイクロアレイ上に存在するため、コントロールＲＮＡによって、臨床試料
中の個々のｍＲＮＡに対するコピー数の推定が可能になる。２０μｌの最終反応容積を９
０分間４２℃でインキュベートした。
【０３９８】
第２ｃＤＮＡ鎖の合成のために、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅを先の反応に添
加して、最終量を１５０μｌにした。先の内容物を希釈して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ  ７．０）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐ
Ａ  ＃ＢＰ  １７５６−１００）、９０ｍＭ  ＫＣ１（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈａｌｆ  Ｍｏ
ｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ，＃０３１３−５００）、４．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｔｅｋｎｏｖａ
，Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，ＣＡ，＃０３０４−５００）、１０ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃Ａ７０２−５００）（１×  Ｓｅｃｏｎ
ｄ  Ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２６６ｍＭ  ｄＧＴＰ
、０．２６６ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２６６ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．２６６ｍＭ  ｄＣＴＰ、
４０  Ｕ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１８０
１０−０２５）、および２Ｕ  ＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１８０２１−０
１４）の最終濃度に新たな基質を添加した。第２鎖合成を１５０分間１６℃で行った。
【０３９９】
第２鎖合成後、増幅に進む前に、フェノール−クロロホルム抽出を用いて酵素、ｄＮＴ
Ｐ、および緩衝液からｄｓ−ｃＤＮＡを精製して、その後、グリコーゲン存在下でｃＤＮ
Ａのエタノール沈殿を行った。
【０４００】
また、シリカゲルカラムを用いて、ｃＤＮＡを精製した（例えばＱｉａｇｅｎ製のＱｉ
ａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲクリーンアップ、＃２８１０４）。グリコーゲン存在下で、エタノ
ール沈殿によって、カラム精製ｃＤＮＡの容積を減らして、この際、＞１０，０００ｘｇ
で３０分間の遠心によってｃＤＮＡを回収し、上清を吸引して、７０％エタノール１５０
μｌ、３０％水を添加して、ＤＮＡペレットを洗浄した。遠心の後で、上清を除去し、残
留エタノールを室温で蒸発させた。また、真空蒸発装置中で、カラム精製ｃＤＮＡの容積
を減らした場合、上清を最終容積７．４μｌに減らした。
【０４０１】
ｃＤＮＡのインビトロ転写によってｃＤＮＡの線形増幅を実行した。上述のステップか
ら得たｃＤＮＡペレットを水７．４μｌ中に再懸濁して、７．５ｍＭ  ＧＴＰ、７．５ｍ
Ｍ  ＡＴＰ、７．５ｍＭ  ＴＴＰ、２．２５ｍＭ  ＣＴＰ、１．０２５ｍＭ  Ｃｙ３連結
ＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，＃ＮＥＬ−５８０）、１×反
応緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ，Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｋｉｔ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ  ａｎｄ
＃１３３４）、および１％Ｔ７ポリメラーゼ酵素混合物（Ａｍｂｉｏｎ，Ｍｅｇａｓｃ
ｒｉｐｔ  Ｋｉｔ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ  ａｎｄ  ＃１３３４）を含有する最終容積２０
μｌにインビトロ転写反応緩衝液を添加した。この反応物を一晩３７℃でインキュベート
した。インビトロ転写後、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃ
Ａ；＃  ７４１０６）を用いて、販売元のプロトコールに記載されるように、酵素、緩衝
液、および過剰ＮＴＰからＲＮＡを精製した。第２の溶出ステップを実行し、２つの溶出
液を組み合わせて、最終容積６０μｌにした。ＲＮＡ  ６０００ナノＬａｂＣｈｉｐとと
もにＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを用いて、ＲＮＡを定量した。
【０４０２】
Ｃｙ３ＣＴＰの代わりにＣｙ５−ＣＴＰを組み込んだことを除いて、参照ＲＮＡを上述
のように調製した。５つの反応物由来の参照ＲＮＡ（各反応は、全ＲＮＡ２μｇで開始し
た）を一緒にプールして、上述のように定量化した。
【０４０３】
（アレイへのハイブリダイゼーション）
以下のように、ハイブリダイゼーション用にＲＮＡを調製した。すなわち、ｌ８ｍｍ×
５５ｍｍアレイに対して、増幅ＲＮＡ（ａＲＮＡ）２０μｇを、参照ａＲＮＡ２０μｇと
組み合わせた。真空蒸発器中で、１０μｌに水を蒸発させることによって、組み合わせた
試料および参照ａＲＮＡを濃縮した。試料を９５℃で３０分間加熱して、ＲＮＡを５０〜
２００ｂｐ断片に細分することによって、試料を断片化した。または、真空蒸発器中で、
５μｌに水を蒸発させることによって、組み合わせた試料および参照ａＲＮＡを濃縮した
。２０ｍＭ酢酸亜鉛５μｌをａＲＮＡに添加して、混合物を６０℃で１０分間インキュベ
ートした。断片化後、ハイブリダイゼーション緩衝液４０μｌを添加して、競合相手ＤＮ
ＡとしてＣｏｔ−１ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．１μｇ／ｕｌを有する５×ＳＳ
Ｃおよび０．２０％ＳＤＳの最終濃度を達成した。最終ハイブリダイゼーション混合物を
９８℃まで加熱して、その後１秒につき０．１℃で、５０℃に低下させた。
【０４０４】
また、ホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に含ませ、ハイブリダイゼーショ
ン温度を低下させた。
【０４０５】
ハイブリダイゼーション混合物を、ガラスカバースリップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃２９３
５−２４６）で覆った６５℃予熱マイクロアレイ表面に適用して、６５℃で予熱したハイ
ブリダイゼーションチャンバー（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ．ＡＨＣ−１０）に入れた。５×ＳＳ
Ｃの１５ｕｌをハイブリダイゼーションチャンバー中の貯蔵器それぞれに入れて、チャン
バーを密封して、６２℃で一晩（１６〜２０時間）水中に置いた。インキュベーション後
、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、スライドを３０℃で５分間洗浄し、その後２×ＳＳ
Ｃ中で、３０℃で５分間、その後２×ＳＳＣ中で、３０℃で更に５分間、その後０．２×
ＳＳＣ中で、室温で２分間洗浄した。アレイを２分間１０００×ｇで回転させ、乾燥させ
た。乾燥したマイクロアレイを、その後上述の方法によってスキャニングする。
【０４０６】
Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）スキャナーＧ２５６５ＡＡ上でマイクロ
アレイを画像化した。Ａｇｉｌｅｎｔソフトウエアを用いたスキャン設定は、次の通りで
あった。すなわち、ＰＭＴ感度（１００％赤色および１００％緑色）、スキャン解像度（
１０ミクロン）、赤色および緑色色素チャネル、円形コンベアー中の全てのスライドに対
してデフォルトスキャン領域を使用すること、最大スキャン領域を使用すること、機器Ｉ
Ｄに対するスキャンデータ、およびスライドＩＤに対するバーコードに対してである。Ａ
ｇｉｌｅｎｔスキャナーによって生成される完全像を反転および回転させ、ＴＩＦＦＳｐ
ｌｉｔｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いた２つの画像（各シ
グナルチャネルに対する１つ）に分割した。２つのチャネルは、５３２ｎｍ（Ｃｙ３標識
試料）および６３３ｎｍ（Ｃｙ５標識Ｒ５０）での出力である。個々の画像を特徴摘出の
ためのＧｅｎｅＰｉｘ  ３．０（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉ
ｔｙ，ＣＡ）にロードして、開いたファイルに一致する励起波長（赤色は６３３ｎｍに、
緑色は５３２ｎｍに等しい）に各画像を割り当てた。設定ファイル（ガル）を開き、格子
での各点が特徴の＞５０％でオーバーラップするように、格子を画像上に重ねた。その後
、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウエアを用いて、特徴に対する最小閾値を設定することなく特徴
を見出した。低シグナル強度を持つ特徴に対しては、ＧｅｎｅＰｉｘは「見つからない（
ｎｏｔ  ｆｏｕｎｄ）」と報告する。全ての特徴に対しては、直径設定を必要に応じて特
徴だけを含むように調整した。
【０４０７】
ＧｅｎｅＰｉｘソフトウエアによって、両方のチャネルで、各特徴（Ｆｉ）に対する中
央画素強度および各特徴（Ｂｉ）に対するローカルバックグラウンドの中央画素強度を決
定した。それぞれに対する標準偏差（ＳＤＦｉおよびＳＤＢｉ）も決定する。ＧｅｎｅＰ
ｉｘがバックグラウンドから特徴を区別することができなかった特徴は、後述するように
「フラッグが立てられた（ｆｌａｇｇｅｄ）」。
【０４０８】
「．ｇｐｒ」ファイルへの特徴摘出の後で、．ｇｐｒファイルの書誌的情報を変更して
、データベースに正確な情報を伝えた。Ｅｘｃｅｌマクロは、以下の情報を含むために書
き込まれた。すなわち、元のｔｉｆ画像ファイルの名称、スライドＩＤ、特徴摘出ソフト
ウエアのバージョン、ＧｅｎｅＰｉｘアレイリストファイル、ＧｅｎｅＰｉｘ設定ファイ
ル、スキャンＩＤ、スライドをスキャニングした者の名称、緑色ＰＭＴ設定、赤色ＰＭＴ
設定、摘出ｌＤ（データ．ｇｐｒファイルをｙｙｙｙ．ｍｍ．ｄｄ−ｈｈ．ｍｍ．ｓｓと
して作製およびフォーマットする）、結果ファイル名称（．ｇｐｒファイル名称と同じ）
）、保存ＣＤ、および摘出コメントである。
【０４０９】
（Ｅｘｃｅｌテンプレートによる前処理）
画像分析とデータ取り出し後に、各ハイブリダイゼーションから得たデータを前処理し
て、データベースに入力され、かつその後分析用に用いられるデータを取り出した。Ｇｅ
ｎｅＰｉｘでの特徴摘出によって生成された完全なＧＰＲファイルをエクセルファイル前
処理テンプレートにインポートするか、またはＡＷＫスクリプトを用いて処理した。両プ
ログラムは、同じ処理論理を用いて、同一の結果を生む。同じエクセルテンプレートまた
はＡＷＫスクリプトを用いて、各ＧＰＲファイルを処理した。テンプレートは、データ上
で一連の計算を行い、正確でない特徴を他のものから区別し、かつ各プローブに対する単
一のデータ点に二重または三重の特徴データを組み合わせる。
【０４１０】
前処理において使用されるデータカラムは、以下の通りであった。すなわちオリゴＩＤ
、Ｆ６３３  Ｍｅｄｉａｎ（Ｃｙ５色素に対する特徴での全ての画素からの中央値）、Ｂ
６３３  Ｍｅｄｉａｎ（Ｃｙ５に対する選択した特徴のローカルバックグラウンドでの全
ての画素の中央値）、Ｂ６３３  ＳＤ（Ｃｙ５に対する選択した特徴のローカルバックグ
ラウンドでの画素に対する値の標準偏差）、Ｆ５３２  Ｍｅｄｉａｎ（Ｃｙ３色素に対す
る特徴での全ての画素からの中央値）、Ｂ５３２  Ｍｅｄｉａｎ（Ｃｙ３に対する選択し
た特徴のローカルバックグラウンドでの全ての画素の中央値）、Ｂ５３２  ＳＤ（Ｃｙ３
に対する選択した特徴のローカルバックグラウンドでの画素に対する値の標準偏差）、お
よびＦｌａｇｓである。ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｆｌａｇｓカラムは、特徴摘出の間、フラッグ
セットを含む。「−７５」は、その位置でアレイにプリントされる特徴がなかったことを
示し、「−５０」は、ＧｅｎｅＰｉｘが特徴シグナルをローカルバックグラウンドと区別
することができなかったことを示し、「−１００」は、ユーザが劣っているとして特徴を
評価したことを示す。
【０４１１】
一旦インポートされたら、−７５フラッグを持つ特徴に関連するデータを用いなかった
。その後、Ｂ６３３  ＳＤおよびＢ５３２  ＳＤの中央値を、「０」のフラッグ値を持つ
全ての特徴にわたって算出した。Ｂ６３３  ＭｅｄｉａｎおよびＢ５３２  Ｍｅｄｉａｎ
の最小値を同定し、「０」のフラッグ値に関連するそれらの値のみを考慮した。各特徴に
対して、蛍光シグナルからローカルバックグラウンド（ＢＧＳＳ）を引いて、それをロー
カルバックグラウンドの標準偏差によって割ることによって、全ての色素に対してシグナ
ル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を算出した。すなわち、
【０４１２】
【数２０】
2010104368.tif 000021
【０４１３】
である。
【０４１４】
Ｓ／Ｎが３未満の場合、調整バックグランド減算シグナルを、スライドの上の最小ロー
カルバックグラウンドを引いた蛍光として算出した。その後、そのチャネルに対する全て
の特徴に関する中央ノイズによって割った調整バックグラウンド減算シグナルとして、調
整Ｓ／Ｎを算出した。調整Ｓ／Ｎが３より大きく、元のＳ／Ｎが３未満であった場合、２
５のフラッグをＣｙ５チャネルに対して設定して、２３のフラッグをＣｙ３チャネルに対
して設定し、両方がこれらの基準を満たした場合は、２８のフラッグを設定した。調整Ｓ
／Ｎおよび元のＳ／Ｎ両方が３未満であった場合、６５のフラッグをＣｙ５に対して設定
して、６３をＣｙ３に対して設定して、色素チャネルが３未満の調整Ｓ／Ｎを有する場合
は６８を設定した。ノイズ算出に対する全てのシグナル、調整バックグラウンド減算シグ
ナル、および調整Ｓ／Ｎを各色素チャネルに対して算出した。ＢＧＳＳ値が６４０００以
上であった場合、フラッグを設定して（Ｃｙ５に対して５５、Ｃｙ３に対して５３、両方
に対して５８）、彩度を示した。
【０４１５】
元のＳ／Ｎが３以上であった場合、更なる算出用に用いたＢＧＳＳは元のＢＧＳＳであ
った。元のＳ／Ｎ比が３未満かつ調整Ｓ／Ｎが３以上であった場合、調整ＢＧＳＳを用い
た。調整Ｓ／Ｎ比が３未満の場合、フラッグ状態の知識を有する調整ＢＧＳＳを用いた。
【０４１６】
アレイ間の比較を容易にするために、Ｃｙ３およびＣｙ５データをスケール変更した。
緑／赤の比のログ値を全ての特徴に対して決定した。良好な特徴（Ｆｌａｇｓ  ０、２３
、２５、２８、６３）に対する中央ログ比値を測定した。特徴値は、以下の公式を用いて
スケール変更した。すなわち、Ｌｏｇ＿Ｓｃａｌｅｄ＿Ｆｅａｔｕｒｅ＿Ｒａｔｉｏ＝Ｌ
ｏｇ＿Ｆｅａｔｕｒｅ＿Ｒａｔｉｏ−Ｍｅｄｉａｎ＿Ｌｏｇ＿Ｒａｔｉｏである。
【０４１７】
各特徴に対するフラッグ設定を用いて、各プローブに対する発現比、１つ、２つ、また
は３つの特徴の選択を決定した。全ての特徴が同じカテゴリー（ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ＝
ｎｅｇａｔｉｖｅｓ、０対２８、５３−５８、および６３−６８）でフラッグ設定を持つ
場合、３つのスケール変更した逆対数特徴比の平均を算出した。３つの特徴が同じカテゴ
リーでフラッグを持たない場合、特徴または最良質のフラッグを有する特徴を用いた（０
＞２５＞２３＞２８＞５５＞５３＞５８＞６５＞６３＞６８）。負のフラッグを持つ特徴
は全く用いなかった。最高のフラッグが同じカテゴリーの中の２または３つの特徴であっ
たとき、逆対数平均を用いた。単一特徴が他の２つより良いフラッグカテゴリーを持つ場
合、その特徴比の逆対数を用いた。
【０４１８】
一旦プローブ発現が１、２、または３つの特徴から算出されたら、スケール変更した平
均値のログを後述するように得て、データを分析する際使用するために保存した。どの特
徴を用いて、プローブ値を算出する場合でも、それらの特徴から得たフラッグを取り出し
て、そのプローブに対するフラッグ値として保存した。２つの異なるデータセットを分析
のために用いることができる。フラッグを立てたデータは、フラッグを有するものを含む
全ての値を用いる。分析前にフラッグを立てたデータをセットから除去することによって
、選別したデータセットを作製する。
【０４１９】
（実施例８：アレイ発現結果の実時間ＰＣＲ検証）
白血球マイクロアレイ遺伝子発現を用いて、発現マーカーおよび臨床結果に対する診断
用遺伝子セットを発見した。実時間ＰＣＲ等のより高感度かつ定量的な技術を用いて、各
遺伝子に対する遺伝子発現結果を検証することが望ましい。さらに、診断用ヌクレオチド
セットが実時間ＰＣＲパネルとして診断試験として実行されることが可能である。または
実時間ＰＣＲ検証によって提供される定量的情報を利用して、代替の定量的または半定量
的遺伝子発現技術を用いた診断試験を設計することができる。  
【０４２０】
マイクロアレイ実験の結果を検証するために、本発明者らは実時間、キネティックＰＣ
Ｒを用いた。この種の実験では、増幅産物がＰＣＲ反応の間測定される。これによって、
任意の試薬が増幅に対する割合の制限を受ける前に、研究者が増幅を観察することが可能
になる。キネティックＰＣＲでは、測定は、ＣＴ（閾値サイクル）またはＣｐ（交差点）
である。この測定（ＣＴ＝Ｃｐ）は、増幅曲線が閾値蛍光値と交差する点である。反応の
全てが増幅のそれらの線形位相に存在する領域の内の点に閾値を設定する。ＣＴを測定す
るとき、以前のサイクル数は、閾値がより急速に越えられたことを意味するため、より低
いＣＴ値は、より高量の開始材料を表す。
【０４２１】
複数の蛍光方法論は、実時間ＰＣＲで増幅産物を測定するために利用できる。Ｔａｑｍ
ａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、プ
ローブが配列特異的結合およびＴａｇ  ３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される
まで、プローブからのシグナルを阻害するための蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を
用いる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）もＦＲＥＴ技術を使用し、それによって、ヘアピン構造が増幅ＤＮＡに結合す
る特異的プローブによって緩和されるとき、蛍光が測定される。第３の一般に使用される
化学は、ＤＮＡ結合色素であるＳｙｂｒグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，
Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）である。増幅産物が多いほど、シグナルが高くなる。Ｓｙｂｒ  グ
リーン方法は、非特異的な増幅産物に高感度であり、プライマー設計と選択の重要性を増
加させる。臭化エチジウムまたは他のＤＮＡ結合色素および蛍光色素／クエンチャー色素
Ｔａｑｍａｎ化学の多くの修飾等の他の検出化学を用いることもできる。
【０４２２】
（試料調製およびｃＤＮＡ合成）
実時間ＰＣＲ反応のための入力は、遺伝子特異的プライマー、特定の患者試料由来のｃ
ＤＮＡ、および標準試薬である。ｃＤＮＡは、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマー（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ，１８４１８−０１２）およびＲａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ，４８１９０−０１１）を用いた逆転写によって、それぞれ０．５ｎｇ／μｌお
よび３ｎｇ／μｌの最終濃度で、単核ＲＮＡ（実施例１のとおりに調製）から生成した。
第１の鎖反応混合に対して、単核全ＲＮＡ０．５μｇまたは全血ＲＮＡ２μｇおよびＯｌ
ｉｇｏ  ｄＴ／Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒ混合物１μｌを水に添加して、１１．５μ
ｌの最終容積にした。試料混合物は、その後１０分間７０℃で配置した。７０℃インキュ
ベーションの後で、試料を氷上で冷やし、スピンダウンして、第１鎖緩衝液混合物８８．
５μｌを反応チューブに分配した。最終的な第１鎖緩衝液は、１×第１の鎖緩衝液（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｙ００１４６，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｙ００１４７）、０．５ｍＭ  ｄＡＴＰ（ＮＥＢ，Ｎ０４４０Ｓ，Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ（ＮＥＢ，Ｎ０４４２Ｓ）、０．５ｍＭ  
ｄＴＴＰ（ＮＥＢ，Ｎ０４４３Ｓ）、０．５ｍＭ  ｄＣＴＰ（ＮＥＢ，Ｎ０４４１Ｓ）、
２００Ｕ  逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１８０
６４−０１４）、および１８Ｕ  ＲＮａｓｅインヒビター（ＲＮＡＧａｕｒｄ  Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２７−０８１５−０１，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）
の最終濃度を生成する。反応物を９０分間４２℃でインキュベートした。インキュベーシ
ョンの後、酵素を１５分間７０℃で熱不活化し、ＲＮＡｓｅ  Ｈを２Ｕ反応チューブに添
加して、２０分間３７℃でインキュベートした。
【０４２３】
（プライマー設計）
２つの方法を用いて、プライマーを設計した。第一は、ソフトウエアＰｒｉｍｅｒ  Ｅ
ｘｐｒｅｓｓＴＭおよびＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔ
ｙ，ＣＡ）に提供されるＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍが与えるプライマー設計に対する推奨を使用した。プライ
マー設計のために用いた第２の方法は、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ウエブサイトｇｅｎ
ｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／ｐｒｉ
ｍｅｒ３．ｈｔｍｌ）から入手できるＰＲＩＭＥＲ３  ｖｅｒ  ０．９プログラムであっ
た。該プログラムは、ウェブサイトｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉ
ｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉでアクセスすることができる。プラ
イマーおよびＴａｑｍａｎ／ハイブリダイゼーションプローブを両方のプログラムを用い
て後述するように設計した。
【０４２４】
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ文献には、プライマーは、融解温度５８℃と６０℃との
間で設計すべきであると説明される一方で、Ｔａｑｍａｎプローブに対しては、供給され
た試薬の塩条件下で、６８〜７０℃の融解温度にすべきである。塩濃度は、ソフトウエア
で固定する。プライマーは、１５塩基対長と３０塩基対長との間であるべきである。プラ
イマーは、５０塩基対と１５０塩基対との間のサイズの単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ
）生成し、２０％と８０％との間のＣ−Ｇ含有量を有し、互いに隣り合う４を超えない同
一塩基対を有し、３’末端の最後の５塩基中の２を超えないＣおよびＧを有するべきであ
る。プローブは、５’末端上にＧを持つことができず、最少のＧを有する鎖をプローブと
して用いるべきである。
【０４２５】
Ｐｒｉｍｅｒ３は、多数のパラメータを有する。融解温度以外の全てに対するデフォル
トを用いて、単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の最適サイズを１００塩基に設定する。
最大基準の１つは、プローブおよびプライマーの融解温度に影響することから塩濃度であ
る。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓに相当する融解温度を有するプライマーおよびプロー
ブを生成するために、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓによって設計される多数のプライマ
ーおよびプローブを、ＰＲＩＭＥＲ３を用いて実験した。５０ｍＭの塩濃度を用いること
によって、これらのプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓの予測よりも３．７℃
高い平均融解温度を有した。ＰＲＩＭＥＲ３を用いて、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓと
同等の融解温度を持つプライマーおよびプローブを設計するために、６２．７℃＋／−１
．０℃の融解温度をプライマーに対するＰＲＩＭＥＲ３で用いて、７２．７℃＋／−１．
０℃を５０ｍＭの塩濃度を有するプローブに対して用いた。
【０４２６】
Ｐｒｉｍｅｒ３に対するＣソースコードをダウンロードして、ＧＣＣコンパイラを用い
てＳｕｎ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ２５０サーバー上でコンパイルした。その後、プログ
ラムは、ソフトウエアに伴われるヘルプファイルによって記載されるような入力パラメー
タとともに、プライマーおよびプローブを設計したい配列を含有する入力ファイルを用い
たコマンドラインから使用された。スクリプトを用いて、多数の配列を入力して、多数の
可能プローブおよびプライマーを自動的に生成することを可能にした。
【０４２７】
β−Ａｃｔｉｎ（β  Ａｃｔｉｎ，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｌｏｃｕｓ：ＮＭ＿００１１０１
）およびβ−ＧＵＳ：グルクロニダーゼβ（ＧＵＳＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｌｏｃｕｓ：Ｎ
Ｍ＿０００１８１）に対するプライマー、２つの参照遺伝子を、両方の方法を用いて設計
して、例としてここで示す。
【０４２８】
すなわち、第１のステップは、ウエブサイトｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｇｅｎｏｍｅ
．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ（Ｓｍｉ
ｔ，ＡＦＡおよびＧｒｅｅｎ，Ｐ「ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ」（ウェブサイトｆｔｐ．
ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＲＭ／ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ．ｈｔ
ｍｌ）でアクセス可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを用いてｍＲＮＡ中で見い
だされる反復配列をマスクアウトすることである。
その後、マスキングした配列の最後の３’末端上の最後の５００塩基対を、以下の典型的
な入力配列を用いてＰＲＩＭＥＲ３に送信した。すなわち、
【０４２９】
【数２１】
2010104368.tif 000022
【０４３０】
ＰＲＩＭＥＲ３を実行した後、プライマーおよびプローブの１００セットをＡＣＴＢお
よびＧＵＳＢに対して生成した。このセットから、左のプライマー両方を右のプライマー
両方と対にして、単一のＴａｑｍａｎプローブを正しいサイズの挿入配列上で用いること
ができるかどうかに基づいて、重なり（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを選択した。多くの経
験から、本発明者らは、プライマー選択に対して混合および適合手法を用いずに予測プラ
イマーの上の対の複数だけを用いることに決定した。
【０４３１】
ＡＣＴＢに対しては、これが判明した。すなわち、
【０４３２】
【数２２】
2010104368.tif 000023
【０４３３】
試験した上で、Ｆ７５およびＲ１７８最良に機能した。
【０４３４】
ＧＵＳＢに対して、以下のプライマーを選択した。すなわち、
【０４３５】
【数２３】
2010104368.tif 000024
【０４３６】
これらのＧＵＳＢ対の組み合わせで、よく機能するものはなかった。
【０４３７】
上記のプライマー対に加えて、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓは、ＧＵＳＢに対して以
下のプライマーを予測した。すなわち、
Ｆｏｗａｒｄ１７８  ＴＡＣＣＡＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＴＣ（配列番号１０５９）
およびＲｅｖｅｒｓｅ  ２４２  ＧＡＧＧＣＡＣＴＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧ（配列番
号１０６０）である。プライマーのこの対が機能して、ＧＵＳＢｍＲＮＡを増幅した。
【０４３８】
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓでこれらのプライマーを予測するために用いたパラメー
タは、以下の通りであった。すなわち、
プライマー  Ｔｍ：最小５８、最大＝６０、最適  ５９、最大差＝２度
プライマー  ＧＣ：最小２０％、最大＝８０％、３’Ｇ／Ｃクランプなし
プライマー：長さ：最小＝９、最大＝４０、最適＝２０
単位複製配列：最小Ｔｍ＝０、最大Ｔｍ＝８５
最小＝５０ｂｐ  最大＝１５０ｂｐ
プローブ：Ｔｍ１０度＞プライマー、５’末端上のＧで開始しない
その他：最大塩基対反復＝３
不明瞭残基の最大数＝０
２次的構造：最大連続ｂｐ＝４、最小総ｂｐ＝８
Ｕｎｉｑｕｅｎｅｓｓ：最大連続マッチ＝９
最大％マッチ＝７５
最大３’連続マッチ＝７
グランザイムＢは、移植拒絶のマーカーである。
【０４３９】
グランザイムＢに対して、以下の配列（ＮＭ＿００４１３１）（配列番号１０６１）を
Ｐｒｉｍｅｒ３に対する入力として用いた。すなわち、
【０４４０】
【数２４】
2010104368.tif 000025
【０４４１】
グランザイムＢに対して、以下のプライマーを試験用に選択した。すなわち、
【０４４２】
【数２５】
2010104368.tif 000026
【０４４３】
試験によって、Ｆ８１およびＲ１７８がよく機能することが実証された。
【０４４４】
この手法を用いて、同種移植拒絶に相関する発現パターンを持つことが示された全ての
遺伝子に対してプライマーを設計した。この手法を用いて、標的遺伝子の任意の領域から
プライマーを設計することができる。
【０４４５】
（プライマーエンドポイント試験）
プライマーを初めに検査して、それが非特異的な増幅なしで正確なサイズの産物を生成
するかどうか調べた。ＲｏｘおよびＳｙｂｒグリーン色素なしで、標準の実時間ＰＣＲプ
ロトコールを用いた。実施例２（Ｒ５０）で記載したように、５０の個体から産生された
汎用単核白血球参照ＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの上で各プライマー対を検査した。  
【０４４６】
ＰＣＲ反応は、１Ｘ実時間ＰＣＲ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、２ｍ
Ｍ  ＭｇＣｌ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｂ０２９５３）、０．２ｍＭ
ｄＡＴＰ（ＮＥＢ）、０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ（ＮＥＢ）、０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ（ＮＥ
Ｂ）、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ（ＮＥＢ）、．６２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ゴールド（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、使用する各プ
ライマー（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）０．３μ
Ｍ、Ｒ５０逆転写反応物５μｌ、および水からなり、最終容積１９μｌであった。
【０４４７】
４０サイクルのＰＣＲの後で、１：７２，０００の最終希釈率で、各産物１０マイクロ
リットルをＳｙｂｒグリーンと組み合わせた。ＡＢＩ７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で、各ＰＣＲ産物に対する溶融曲線
を測定し、１つの明瞭なピークを有する産物を生成するプライマー対を更なる分析用に選
択した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ  １０００チップ（Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）上でのアガロースゲル電気泳動法によって、これらのプライマー対由
来の産物の１マイクロリットルを調べた。２つの遺伝子に対する結果を図６に示す。プラ
イマー設計および標的遺伝子の配列から、増幅ＤＮＡ産物の予測サイズを算出することが
できる。所望の産物の増幅および汚染物質の最少増幅をもつプライマー対のみを実時間Ｐ
ＣＲに対して用いた。異なるサイズの多数の産物を生成したプライマーは、対象遺伝子に
特異的ではないと考えられるので、多数の遺伝子または染色体遺伝子座を増幅する可能性
がある。
【０４４８】
（プライマー最適化／効率）
一旦プライマーがエンドポイントＰＣＲを通過したら、該プライマーを検査して、実時
間ＰＣＲ反応での反応効率を測定した。上述のように、開始全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成
した。Ｒ５０逆転写ｃＤＮＡの５つの希釈系列のセット（上述のように）を水で作製する
。すなわち、１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、および１：１６０である。
【０４４９】
Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔ
ｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｎ８０８−０２２８）を用いて、Ｓｙｂｒグリーン実時間ＰＣＲ
反応を実行した。プライマーおよびテンプレート以外の全ての試薬からなるマスター混合
物を作製した。反応での全ての成分の最終濃度は、１Ｘ  Ｔａｑｍａｎ緩衝液Ａ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙ
ｓｔｅｍｓ）、２００μＭ  ｄＡＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２０
０μＭ  ｄＣＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２００μＭ  ｄＧＴＰ（
Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、４００μＭ  ｄＵＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂ
ｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、１：４００，０００希釈Ｓｙｂｒグリーン色素（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、１．２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑゴールド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉ
ｏＳｙｓｔｅｍｓ）であった。ＰＣＲマスター混合物を２つの耐光性チューブに分配した
。各β−ＡｃｔｉｎプライマーＦ７５およびＲ１７８（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｔ
ｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）をＰＣＲマスター混合物の１つのチューブに添加し、
各β−ＧＵＳプライマーＦ１７８およびＲ２４２（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）をＰＣ
Ｒマスター混合物のもう一方のチューブに添加して、３００ｎＭの最終プライマー濃度に
した。β−Ａｃｔｉｎまたはβ−ＧＵＳマスター混合物４５μｌを９６ウエルプレート（
Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）のウエル中に分配した。テンプレート希釈系列
の５μｌを各プライマーに対して３つのウエルに分配した。ＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ
）上で、以下の条件で反応を実行した。すなわち、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間
を４０サイクル、その後５０℃で始まり９５℃で終わる解離曲線である。
【０４５０】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖ２．０ソフトウエアを用い
て、各ウエルからの蛍光シグナルを分析した。高エンドの基線を８〜２０サイクルに調整
して、任意のデータ曲線への影響を低減させるが、基線ドリフトを低減させるためにでき
るだけ高くする。増幅の線形位相の間、大部分の増幅曲線が閾値を越えることできるよう
に閾値を選択した。各ウエルに対する解離曲線を、そのマーカーに対する他のウエルと比
較した。この比較によって、「劣った」ウエル、すなわち増幅させなかったか、間違った
サイズの産物を増幅したか、または多数の産物を増幅したものの同定を可能にした。。各
増幅曲線が閾値（ＣＴ）を越えたサイクル数は記録し、そのファイルを更なる分析のため
にＭＳ  Ｅｘｃｅｌに転送した。三組のウエルに対するＣＴ値を平均化した。算出したＲ
ＮＡ開始濃度のログ１０の関数として、データをプロットした。ＲＴ反応で用いたＲＮＡ
の元の量、ＲＴ反応の希釈率、および実時間ＰＣＲ反応で用いた量（５μｌ）を基にして
、各ｃＤＮＡ希釈に対する開始ＲＮＡ濃度を測定した。各遺伝子に対して、線形回帰直線
を、希釈系列点の全てを介してプロットした。線の傾斜を利用して、下記の方程式を用い
て各プライマーセットに対する反応効率を算出した。すなわち、
【０４５１】
【数２６】
2010104368.tif 000027
【０４５２】
この方程式（Ｐｆａｆｆｌ  ２００１，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓ
ｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２）用いて、これらのβ−アクチンプライマーに対する効率
は、１．２８であり、これらのβ−ＧＵＳプリマーに対する効率は、１．１４である（図
６）。多数の遺伝子および多数の試料間で発現レベルを比較したとき、この効率を用いた
。この同法を用いて、検査した各遺伝子のためのプライマー対に対する反応効率を算出し
た。効率が再現的に０．７〜２．４の間であると測定される場合、プライマー対が成功し
たとみなした。
【０４５３】
（ＳＹＢＲグリーンアッセイ）
一旦マーカーがＰｒｉｍｅｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＱＰＣＲに合格したら（上述の
通り）、それを実時間ＰＣＲアッセイで用いた。患者ＲＮＡ試料は、ｃＤＮＡに対して逆
転写され（上記のように）、１：１０希釈率を水で作製した。患者試料に加えて、不テン
プレートコントロール（ＮＴＣ）および上記のプールした参照（実施例２参照）を全ての
プレートに包含した。
【０４５４】
Ｔａｑｍａｎ  Ｃｏｒｅ  ＰＣＲ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ
，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｎ８０８−０２２８）を用いて、Ｓｙｂｒグリーン実
時間ＰＣＲ反応を実行した。プライマーおよびテンプレート以外の全ての試薬からなるマ
スター混合物を作製した。反応での全ての成分の最終濃度は、ＩＸ  Ｔａｑｍａｎ緩衝液
Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  
ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２００μＭ  ｄＡＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ
ｓ）、２００μＭ  ｄＣＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、２００μＭ  
ｄＧＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、４００μＭ  ｄＵＴＰ（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、１：４００，０００希釈Ｓｙｂｒグリーン色素（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、１．２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑゴールド（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）であった。ＰＣＲマスター混合物を８つ耐光チューブにア
リコートして、１つが試料セットにわたって調べる各マーカーに対する。各マーカーに対
して最適化したプライマ対を、その後、ＰＣＲマスター混合物に添加して、３００ｎＭの
最終プライマー濃度にした。各マーカーマスター混合物１８μｌを３８４ウエルプレート
（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  ）のウエルに分配した。１：１０希釈コント
ロールまたは患者ｃＤＮＡ試料を、各プライマー対に対して３組のウエルに分配した。上
記のサイクル条件を用いて、ＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）上で反応を実行した。
【０４５５】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖ２，０ソフトウエア（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、各ウエルに対する蛍光シグナルを分析し
た。高エンドの基線を８〜２０サイクルに調整して、任意のデータ曲線への影響を低減さ
せるが、基線ドリフトを低減させるためにできるだけ高くする。増幅の線形位相の間、大
部分の増幅曲線が閾値を越えることできるように閾値を選択した。各ウエルに対する解離
曲線を、そのマーカーに対する他のウエルと比較した。この比較によって、「劣った」ウ
エル、すなわち増幅させなかったか、間違ったサイズの産物を増幅したか、または多数の
産物を増幅したものの同定を可能にした。各増幅曲線が閾値（ＣＴ）を越えたサイクル数
は記録し、そのファイルを更なる分析のためにＭＳ  Ｅｘｃｅｌに転送した。解離曲線の
分析によって劣っているとして同定された任意のウエルを表すＣＴ値を削除した。３組の
ウエルに対するＣＴ値を平均化した。標準偏差（Ｓｔｄｅｖ）および変動係数（ＣＶ）を
３組のウエルに対して算出した。ＣＶが２より大きかった場合、３つのウエル間の域外値
を同定および削除した。その後、平均を再算出した。各プレートで、コントロール（β−
Ａｃｔｉｎまたはβ−ＧＵＳ）の平均ＣＴから標的マーカーの平均ＣＴを引くことによっ
て、各マーカー−コントロール組み合わせに対するΔＣＴを算出した。標的マーカーのΔ
ＣＴの羃乗に２を与えることによって、コントロールマーカーに対する発現を算出した。
たとえば、β−Ａｃｔｉｎに対する発現を以下の方程式によって算出する。すなわち、
【０４５６】
【数２７】
2010104368.tif 000028
【０４５７】
全てのプレートを二重に行い、同様の方法で分析した。第１のプレートに対するＲＥか
ら第２のプレートに対するＲＥ値の絶対値を引いて、平均によってそれを割ることによっ
て、各試料−マーカー組み合わせ（関連発現）に対するパーセント値変動を測定した。２
５％より多いプレート上の変動算出が５０％より多い場合、第３のプレートを実行した。
【０４５８】
（ＴＡＱＭＡＮプロトコール）
Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ化学を用いて、実時間ＰＣＲアッセイも実行した。
【０４５９】
Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ
ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，＃４３２４０１８）を用いて
、Ｔａｑｍａｎ実時間ＰＣＲ反応を実行した。マスター混合物を８つの耐光性チューブに
アリコートし、１つが各マーカーに対する。各マーカーに対して最適化したプライマー対
を、その後、ＰＣＲマスター混合物の正確にラベル付けしたチューブに添加した。ＦＡＭ
／ＴＡＭＲＡデュアル標識Ｔａｑｍａｎプローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ、Ｎａｖｏｔｏ、ＣＡ、ＤＬＯ−ＦＴ−２）を、その後、ＰＣＲマスター混合
物の正確にラベル付けしたチューブに添加した。また、表４に示すように、クエンチャー
のための吸光波長はレポーターの発光波長に合致するような蛍光レポーター色素およびク
エンチャーの異なる組み合わせを用いることができる。各マーカーマスター混合物１８μ
ｌを３８４ウエルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）に分配した。テン
プレート試料の２μｌを、各プライマー対に対して３組のウエルに分配した。各試薬の最
終濃度は、１Ｘ  ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、
３００ｎＭ各プライマー、０．２５ｎＭプローブ、２μ１  １：１０希釈テンプレートで
あった。標準条件（９５℃で１０分、９５℃で１５秒を４０サイクル、６０℃で１分）を
用いて、ＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）の上で反応を実行した。
【０４６０】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｖ２．０ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉ
ｏＳｙｓｔｅｍｓ）は、よい各々からまばゆい信号を分析するのに用いられた。高エンド
の基線を８〜２０サイクルに調整して、任意のデータ曲線への影響を低減させるが、基線
ドリフトを低減させるためにできるだけ高くする。増幅の線形位相の間、大部分の増幅曲
線が閾値を越えることできるように閾値を選択した。各増幅曲線が閾値（ＣＴ）を越えた
サイクル数は記録し、そのファイルを更なる分析のためにＭＳ  Ｅｘｃｅｌに転送した。
３組のウエルに対するＣＴ値を平均化した。標準偏差（Ｓｔｄｅｖ）および変動係数（Ｃ
Ｖ）を３組のウエルに対して算出した。ＣＶが２より大きかった場合、３つのウエル間の
域外値を同定および削除した。その後、平均を再算出した。各プレートで、コントロール
（β−Ａｃｔｉｎまたはβ−ＧＵＳ）の平均ＣＴから標的マーカーの平均ＣＴを引くこと
によって、各マーカー−コントロール組み合わせに対するΔＣＴを算出した。標的マーカ
ーのΔＣＴの羃乗に２を与えることによって、コントロールマーカーに対する発現を算出
した。全てのプレートを二重に行い、同様の方法で分析した。第１のプレートに対するＲ
Ｅから第２のプレートに対するＲＥ値の絶対値を引いて、平均によってそれを割ることに
よって、各試料−マーカー組み合わせ（関連発現）に対するパーセント値変動を測定した
。２５％より多いプレート上の変動算出が５０％より多い場合、第３のプレートを実行し
た。
【０４６１】
（ＢＩ−ＰＬＥＸＩＮＧ）
実時間ＰＣＲアッセイの変動は、反応の間でのＲＮＡ開始材料の等しくない量から生じ
る可能性がある。いくつかのアッセイでは、変動を減らすために、コントロール遺伝子増
幅を標的遺伝子と同じ反応ウエルに包含する。２つの遺伝子からのシグナルを区別するた
めに、異なる蛍光色素をコントロール遺伝子に対して用いた。β−Ａｃｔｉｎをコントロ
ール遺伝子として用い、使用するＴａｑＭａｎプローブ遺伝子を、蛍光色素ＶＩＣおよび
クエンチャーＴＡＭＲＡ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎａｖｏｔ
ｏ、ＣＡ、ＤＬＯ−ＦＴ−２）で標識した。また、対象遺伝子に対するレポーターの発光
波長が、標的に対して用いるレポーラーの波長と十分に異なる限り、蛍光レポーター色素
およびクエンチャーの他の組み合わせ（表４）を用いることができる。反応での制限的な
濃度（１５０ｎＭプライマーおよび０．１２５ｎＭプローブ）で、コントロール遺伝子プ
ライマーおよびプローブを用いて、標的マーカーを増幅するための十分な試薬が存在する
ことを確実にした。同じプロトコール下でプレートを実行して、同方法でデータを分析し
、ＶＩＣシグナルに対して異なる基線および閾値を用いる。ＦＡＭおよびＶＩＣシグナル
チャネル両方から、域外値を上記のように除去した。コントロール遺伝子からのＶＩＣシ
グナルを用いて、上述のように、コントロールに対する発現を算出した。
【０４６２】
【数２８】
2010104368.tif 000029
【０４６３】
（絶対定量）
参照マーカーに対する発現を算出する代わりに、実時間ＰＣＲを用いて、絶対定量実行
することができる。各マーカーの絶対量を測定するために、プレート上の各マーカーに対
する既知量のテンプレートから得た希釈系列を用いて、標準曲線を構築する。細菌から精
製したクローン遺伝子を用いて、または合成相補オリゴヌクレオチドを用いて、標準曲線
を作製することが可能である。いずれにせよ、予測発現範囲を網羅する希釈系列を、プレ
ート中の一連のウエルでテンプレートとして用いる。これらの既知量のテンプレートに対
するＣＴ値から、標準曲線をプロットすることができる。この曲線から、未知のものに対
するＣＴ値を用いて、ｃＤＮＡの開始濃度を同定する。これらの絶対量を疾患クラス（す
なわち拒絶対非拒絶）間で比較することができ、またはコントロール遺伝子に対する発現
として考慮し、試料収集、ＲＮＡ精製および定量、ｃＤＮＡ合成、ならびにＰＣＲ増幅で
の試料間の変動を修正することができる。
【０４６４】
（細胞型特異的表現）
いくつかのマーカーは、特異的な細胞型のみで発現する。これらのマーカーは、非拒絶
試料からの拒絶試料の区別のための有用であり、または単一の細胞型で他のマーカーの差
次的発現を同定するために用いられうる。細胞傷害Ｔリンパ球（ＣＤ８等）に対する特異
的マーカーを用いて、試料中の細胞集団の差を同定することができる。この細胞型で発現
することが既知である他のマーカーを、ＣＤ８のレベルと比較して、ＣＤ８Ｔ細胞内の差
次的遺伝子発現を示すことができる。
【０４６５】
（ＰＣＲ用のコントロール遺伝子）
上記のように、標準曲線を用いた遺伝子発現の絶対定量として、またはコントロール遺
伝子と比較される対象遺伝子の総体的発現として、ＰＣＲ発現測定を行うことができる。
後者の場合は、対象遺伝子およびコントロール遺伝子を同じ試料で測定する。これは、異
なる反応または同じ反応（ｂｉｐｌｅｘ形式、上記参照）で行うことができる。いずれに
せよ、遺伝子発現に対する最終的な測定は、コントロール遺伝子発現に対する遺伝子発現
の比率として表される。コントロール遺伝子にとって、対象標的組織内で構成的に発現す
ることおよび個体間または個体に由来する試料間での細胞毎の基準に関する発現での最小
の変動を有することが重要である。遺伝子が、この種の発現挙動を持つ場合、相対発現比
は、アッセイで用いる試料ＲＮＡの量での可変性を修正するために役立つ。さらに、理想
的なコントロール遺伝子は、アッセイする遺伝子と比較して、対象試料での高度の発現を
有する。これは、対象遺伝子およびコントロール遺伝子をｂｉｐｌｅｘ形式で用いる場合
重要である。コントロール遺伝子がＣｔ閾値に早期に達するように該アッセイを設定して
、対象遺伝子を用いた制限的な試薬に競合しないようにプライマーによってその増幅を制
限する。
【０４６６】
アッセイ用の理想的なコントロール遺伝子を同定するために、上述のように、ＲＮＡ調
達および調製方法ならびに実時間ＰＣＲアッセイを用いて、試料間の可変性と、単核ＲＮ
Ａ試料および全血ＲＮＡ試料両方での発現とに対して多数の遺伝子を検査した移植レシピ
エントに由来する６つの全血および６つの単核ＲＮＡ試料を検査した。両方の試料型で、
二重実験での各遺伝子の強度レベルおよび可変性を図８に示す。
【０４６７】
試料にわたる低可変性および高発現の基準に基づいて、β−アクチン、１８ｓ、ＧＡＰ
ＤＨ、ｂ２ミクログロブリンは、ＰＡＸ試料に対するコントロール遺伝子の良い例である
ということが判明した。内部ｂｉｐｌｅｘコントロールがアッセイであるので、単一のコ
ントロール遺伝子を組み込むことが可能である。
【０４６８】
（実時間ＰＣＲでの変動に対する管理）
試薬、実験者、および調製方法での相違、ならびにピペッティングステップでの可変性
が原因で、実時間ＰＣＲ実験では、有意のプレート毎での変動がある。自動化（可変性お
よび間違いを低減するために）、試薬ロット品質管理、および最適データ取り扱いによっ
て、この変動を低減することができる。しかし、複製のプレート上の結果は、異なる時間
で、機器中で実行することから、依然として異なる可能性がある。
【０４６９】
変動をデータ摘出および分析に入れることもできる。蛍光強度（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＤＳ  ｖ２．１  ソフトウエアでのΔＲｎ）がユーザ決定閾値（Ｃ
Ｔ）を越える時間（ＰＣＲサイクルで測定）として、実時間ＰＣＲ結果を測定する。相対
定量を実行するとき、標的遺伝子に対するＣＴ値を、コントロール遺伝子に対するＣＴ値
から引く。この差（ΔＣＴと呼ばれている）は、試料間で相違があるかどうかを決定する
ための実験中で比較される値である。閾値を設定する上での変動によって、追加的な間違
い導かれうる。これは特に、標的遺伝子よびコントロール遺伝子両方が同じ反応チューブ
で測定されるｄｕｐｌｅｘ実験形式では事実である。２つの遺伝子のそれぞれに特異的な
色素を用いて、デュプレキシングを実行する。２つの異なる蛍光色素をプレート上で用い
るので、２つの異なる閾値が設定される。これらの閾値の両方とも、各ＡＣＴに寄与する
。１つのプレートから次のプレートまでの各色素の閾値設定でのわずかな差（他の色素に
対する）が、ΔＣＴに大きく影響を及ぼす可能性がある。
【０４７０】
ＰＣＲプレートに対して閾値を設定する方法がいくつかある。以前のバージョンのＳＤ
Ｓソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、プレートに対する平均基
線蛍光および基線の標準偏差を決定する。閾値は、基線の標準偏差ｘ１０に設定する。Ｓ
ＤＳ  ２．０では、ユーザは、自身で基線を決めなければならない。他の機械製造元から
のソフトウエアでは、ユーザ自身が閾値を設定するか、または異なるアルゴリズムを使用
することが必要になる。ＳＤＳソフトウエアの最新版（ＳＤＳ  ２．１）は、自動的な基
線および閾値設定を含む。ソフトウエアは、検出可能なレベルに先立つサイクルで、ΔＲ
ｎを用いて、プレートの上の各ウエルに対して、基線を別々に設定する。  
【０４７１】
プレート間の可変性は、再現的な閾値設定に依存する。これは、閾値設定プロトコール
に駆動される数学的または実験的データを必要とする。標準の公式によって閾値を再現的
に設定することによって、閾値設定過程に導入されるかもしれない変動を最小にする。  
【０４７２】
さらに、データ構成要素に閾値を設定することによって減少させることができるプレー
と間の実験的変動がありうる。発明者らは、閾値キャリブレーター（ＴＣｂ）と呼ばれる
各プレーと上の反応セットを使用するシステムを開発した。ＴＣｂウエルを用いて、全て
のプレート上の閾値を設定する。
【０４７３】
１．ＴＣｂウエルは、実験内の全てのプレート間で共通のテンプレート、プライマー、
およびプローブを含有する。
【０４７４】
２．上記で決定した最小閾値および最高閾値内で閾値を設定する。
【０４７５】
３．ＴＣｂウエルに対して平均ＣＴ値を生じるこの範囲内の値が全てのプレートで同様
であるように閾値を設定する。
【０４７６】
（実施例９：相関および分類分析）
実施例７で記載したように、マイクロアレイから得た発現データセットの生成および処
理後、大部分のその後の分析用ログ比を用いる。これは、試料および汎用レフェレンス間
の各遺伝子に対する発現比の対数である。この処理アルゴリズムは、多数のフラッグを、
低シグナル対ノイズの、飽和シグナルの、あるいは低いまたは不確かな質の他の方法での
データに割り当てる。全てのデータ（フラッグを立てたデータを含む）を用いて相関分析
を進めることができるか、またはフラッグを立てたデータがデータから除去される選別デ
ータセット上で行うことができる。選別データは、より少ない可変性およびノイズを持ち
、より有意なまたは予測の結果を生じることが可能である。フラッグを立てたデータは、
利用可能な全てのデータを含有し、選別データセットでは見逃した遺伝子の発見を可能に
する。
【０４７７】
上記および実施例７の質に対するデータを選別した後、欠けているデータは、マイクロ
アレイデータセットで共通である。いくつかのアルゴリズムは、完全なデータセットを必
要とせず、このように欠けている値を許容することができる。他のアルゴリズムは、欠け
ているデータの入力値で最適となるか、または該値を必要とする。欠けている値を有する
データセットの分析を進めることができる。分析での全ての試料にわたって欠けている値
を５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％または他の％より多く有する分析から
全ての遺伝子を選別することによって、欠けている値を有するデータセットの分析を進め
ることができる。列平均、カラム平均、最も近接のまたは他の算出数値を用いるような種
々の方法によって、欠けている値に対するデータの帰属を実行することができる。明記し
た場合を除き、選別および帰属に対するデフォルト設定を用いて、全ての分析用ソフトウ
エアパッケージに対するデータを調製した。
【０４７８】
表現データに加えて、臨床データが分析に含まれる。連続変数、例えば超音波心臓検査
で測定される心臓の駆出分画または白血球数が、相関分析のために使われることができる
。研究被験体上で集められる臨床データの任意の断片を、相関または分類分析で用いるこ
とができる。場合によっては、分析の前に値の対数を得ることが望ましい。これらの変数
を遺伝子発現値とともに分析に含むことができ、その場合には、それらは別の「遺伝子」
として処理される。患者の状態を診断するために機能するマーカーセットを発見すること
ができ、これらには、遺伝子および臨床パラメータを含むことができる。男性または女性
等の分類変数も相関分析用の変数として用いることができる。例えば、患者の性別は、分
類木のための重要なスプリッターでありうる。
【０４７９】
発現データの有意性または分類分析に対する監視ベクトル（従属変数）として臨床デー
タを用いる。この場合、試料と関連する臨床データを用いて、相関または分類分析のため
に試料を臨床的に意味がある診断カテゴリーに分ける。例えば、腎生検からの病理的検体
を用いて、狼瘡患者を腎臓疾患持つおよび持たない群に分けることができる。第３のまた
はより多いカテゴリーも含むことができる（例えば「未知」または「未報告」）。監視ベ
クトルの発現データおよび定義の生成後に、相関、有意性、および分類分析を用いて、ど
の遺伝子セットが患者および患者試料の診断および分類に最も適当であるかを決定する。
【０４８０】
発現データ分析の２つの主要な種類を通常、異なる結果および目的で、発現データ上で
実行する。第一は、有意性分析または差の分析である。この場合、分析の目標は、試料群
間で差次的発現する遺伝子を同定すること、および統計学的信頼を同定されるそれらの遺
伝子に割り当てることである。これらの遺伝子は、問題となっている疾患過程のマーカー
でありえ、さらに指標のための診断ツールとして研究および開発される。
【０４８１】
分析の第２の主要なタイプは、分類分析である。有意性分析が試料群間で差次的に発現
する個々の遺伝子を同定する一方で、分類分析は、試料（患者）群を最適に識別する遺伝
子発現値に対する遺伝子セットおよびアルゴリズムを同定する。結果として生じる遺伝子
発現パネルおよびアルゴリズムを用いて、診断検査を作製および実行することができる。
遺伝子のセットおよび診断ツールとしてのそれらを用いるためのアルゴリズムは、本明細
書でしばしば「モデル」と言及される。個々のマーカーを用いても、遺伝子発現診断モデ
ルを作製することができる。しかし、多数の遺伝子（または遺伝子セット）が多くの場合
より有用かつ正確な診断ツールである。
【０４８２】
（マイクロアレイに対する有意性分析（ＳＡＭ））
マイクロアレイ（Ｔｕｓｈｅｒ  ２００１）に対する有意性分析（ＳＡＭ）は、それら
の発現値および応答ベクトル間の相関を持つ遺伝子が統計学的に発見され、統計学的有意
性を割り当てるこを介した方法である。有意遺伝子に対する偽有意性の比率は、Ｆａｌｓ
ｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ（ＦＤＲ）である。これは、各閾値に対して、有意で
あると言われる複数の遺伝子があり、ＦＤＲによって、この主張に対する信頼レベルを与
えられることを意味する。ＳＡＭによって遺伝子が２つのクラス間で差次的に発現すると
称する場合、５％のＦＤＲとともに、遺伝子がクラスの間で実際に差次的に発現する９５
％の可能性がある。ＳＡＭは、該クラス間で差別的に発現する遺伝子を同定する。アルゴ
リズムは、分類に有用ではあるが、多くの試料中で差次的に発現しない遺伝子を同定しな
いことが可能である。例えば、男性でなく女性にある疾患に有用なマーカーである遺伝子
は、ＳＡＭ分析では、非常に有意なマーカーではないかもしれないが、多遺伝子アルゴリ
ズムの診断用の遺伝子セットの部分としては有用でありうる。監視ベクトルとして臨床デ
ータを用いて、患者試料から得たデータおよび分類定義を生成した後、ＳＡＭを用いて、
グループ分けの中で差次的に発現する可能性がある遺伝子を検出する。ここで述べるよう
に、最も高い有意性を持つそれらの遺伝子を実時間ＰＣＲ（実施例８）によって検証する
ことができるか、分類アルゴリズムを構築するために用いることができる。
【０４８３】
（分類）
分類アルゴリズムを用いて、遺伝子セットと、診断および疾患モニタリング検査として
適用することができるそれらの遺伝子の発現レベルの公式を同定する。同じ分類アルゴリ
ズムを、マイクロアレイおよびＰＣＲを用いた発現データを含む全ての種類の発現および
プロテオミクスのデータに適用することができる。下記の考察は、使用するアルゴリズム
および使用方法について記載する。
【０４８４】
分類および回帰樹（ＣＡＲＴ）は、決定木分類アルゴリズムである（Ｂｒｅｉｍａｎ  
１９８４）。遺伝子発現からおよび／または他のデータに対して、ＣＡＲＴは、試料分類
のための決定木を呈することができる。決定木の各ノードは、１つ以上の遺伝子または変
数の発現レベルについての質問を伴う。閾値より上にある試料は、決定木の１つの枝を下
がり、閾値より上にはない試料は他の枝を下がる。発現データセット由来の遺伝子は、Ｓ
ＡＭ分析（または他の有意性検査）での有意な差次的発現、監督した木−収穫分析による
確認、試料属との間の高い倍変化またはターゲット疾患の分類への既知の関連によってＣ
ＡＲＴで分類法建設のために選択されることができる。さらに、臨床問題に対する既知の
重要性であるか、多変量解析または他のいくらかの技術による有意な予測値であるとわか
るＣＡＲＴに対して、臨床データを独立変数として用いることができる。ＣＡＲＴは、分
類（診断）のに対する予測変数とそれらの関連する決定法則を同定する。ＣＡＲＴは、各
スプリッター（分類での有用な遺伝子のための次善の代用である遺伝子）に対する代理物
も同定する。アッセイの所望のパフォーマンスを最適化するために誤分類コストを増加さ
せることによって、分析をＣＡＲＴで実行する。例えば、所定の診断に対する検査の感度
が９０％  ＞であることは、最も重要である。１０分割交差検定（１０−ｆｏｌｄ  ｃｒ
ｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）またはｖ−分割交配検証（後述参照）を用いてＣＡＲＴ
モデルを構築および検査することができる。ＣＡＲＴは、変数（５〜５０）のより少ない
数で、最もよく作用する。
【０４８５】
群を識別するために決定木を構築する分類アルゴリズムであるという点で、多変量加法
回帰木（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，ＪＲ  １９９９，ＭＡＲＴ）はＣＡＲＴと類似している。Ｍ
ＡＲＴは、任意の分類問題のために対して多数の木を構築して、得られたモデルは多数の
木の組み合わせを含む。ＭＡＲＴは、モデルを構築するため、８０００の遺伝子マイクロ
アレイに由来するもの等の、大量のデータセットに用いられることができるので、変数を
選択することができる。ＭＡＲＴが多くの木の組み合わせを用いて、任意の１本の木から
はあまり多くの情報をとらないので、訓練に耐える。ＭＡＲＴは、分類子として使うため
の遺伝子セットおよびアルゴリズムを同定する。
Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら，２００２に記載される方法によって、ニアレストシュランクン
セントロイドクラシファイア（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｓｈｒｕｎｋｅｎ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄｓ
Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）をマイクロアレイまたは他のデータセットに適用することがで
きる。このアルゴリズムも分類のために遺伝子セットを同定し、試料の各クラスに対して
、それらの１０分割交差検定（１０−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）誤
り率を決定する。アルゴリズムは、セット中の１つの遺伝子から全ての遺伝子に至るまで
、どんなサイズのモデルに対する誤り率でも決定する。特定数の遺伝子が用いられるとき
、どちらかのまたは両方の試料クラスに対する誤り率が最小化されうる。この遺伝子数が
測定されるとき、選択した遺伝子と関連するアルゴリズムが同定され、将来の試料の上で
分類子として使用されうる。
【０４８６】
各分類アルゴリズムに対して、かつ有意性分析に対して、構築される遺伝子セットおよ
び診断アルゴリズムは、交差検定（ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）と予測検定（ｐ
ｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）によって試験される。これらの手段での
アルゴリズムの検証は、標的集団上のアルゴリズムの予測値の推定を産む。訓練試料の１
０％がある分析が残した１０分割交差検定（１０  ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａ
ｔｉｏｎ）分析を含む多くの手法が存在し、この際、訓練試料の１０％を分析外として、
分類アルゴリズムを残りの９０％で構築する。１０％は、その後、アルゴリズムに対する
検査セットとして用いられる。試料の１０％を各回の検査セットとして残したまま、この
過程を１０回繰り返す。この分析を介して、予測（検査）試料で用いるアルゴリズムの強
力さを推定するために役立つ交差検定（ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）誤りを導き
出すことができる。試料の任意の％を、交差検定（ｖ−分割交差検定（ＬＯＯＣＶ））の
ために残しておくことができる。許容される交差検定誤りを持つ診断に対して遺伝子セッ
トを構築するとき、初期分析には含まれない試料（検査試料）を用いて、遺伝子のこのセ
ットを試験する。これらの試料を、臨床試験の間に発生するアーカイブから取り出すこと
が可能である。また、試料を入手して、遺伝子セットを用いて、患者診断を予測する場合
、新規の予測臨床試験を開始することができる。
【０４８７】
（実施例１０：アッセイ試料調製）
本発明の白血球特異的マーカーを全血で検出することができることを示すために、発明
者らはＰＡＸｇｅｎｅ全血収集、安定化、ＲＮＡ単離キット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）
を用いて、全血ＲＮＡを収集した。様々な量の全血ＲＮＡを初期ＲＴ反応（１、２、４、
および８ｕｇ）で用いて、様々な希釈率の異なるＲＴ反応を試験した（１：５、１：１０
、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０）。発明者らは、ＸＤｘのマーカーに特異
的なプライマーを用いて実時間ＰＣＲアッセイを行い、全血中で容易にこれらのマーカー
を見つけることができることを示した。
【０４８８】
移植レシピエント由来の１４の全血試料（ＰＡＸｇｅｎｅ，ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）
と対にした１４の単核試料（ＣＰＴ，ＢＤ）から全ＲＮＡを調製した。全ＲＮＡ２μｇを
開始材料として用いて、各試料からｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡを１：１０で
希釈し、Ｓｙｂｒグリーン実時間ＰＣＲアッセイを実行した。
【０４８９】
実時間ＰＣＲアッセイに対して、１５〜３０のＣｔ値が各遺伝子にとって望ましい。遺
伝子のＣｔ値が３０をかなり超える場合、結果は可変でありかつ非線形である可能性があ
る。ＰＡＸ試料に対しては、標的ＲＮＡをＣＰＴ試料中にあるよりも希釈されているよう
にする。ｃＤＮＡ希釈は、Ｃｔ値を３０未満とするのが適当である。
【０４９０】
全血ＲＮＡ（ＰＡＸ）および単核ＲＮＡ（ＣＰＴ）両方に関して、このように試験した
最初の５つの遺伝子に対するＣｔを下記の表に示す。
【０４９１】
【表５】
2010104368.tif 000030
【０４９２】
１つの例外とともに、遺伝子は、全血でより高いＣｔ値を有する。このプロトコールを
用いて、Ｃｔｓ＜３５で全ての遺伝子を検出することができる。標的試料中で３０を超え
るＣＴ値を有するとわかった遺伝子に対しては、ｃＤＮＡをより少なく希釈することが必
要であるかもしれない。
【０４９３】
（実施例１１：狼瘡および自己免疫疾患の診断およびモニタリング用の遺伝子発現マー
カーの同定および検証）
実施例４に記載したように、患者を臨床試験で登録した。
【０４９４】
ＳＬＥに関してＡＣＲ基準を満たしている２２人の患者、慢性関節リウマチ（ＲＡ）の
２０人の患者、変形性関節症（ＯＡ）の６人の患者、および１０人の健康なドナー（ＨＤ
）のからの５８の末梢血試料を集めた（表１参照）。収集の１時間以内に、密度勾配遠心
沈殿法によって試料を処理し、実施例１に記載した技術を用いて単核細胞を溶解および凍
結した。
１．完全ＲＮＡを細胞ペレットから調製し、増幅して、蛍光Ｃｙ３を用いて標識し、活性
化したまたは静止状態の白血球での差次的または特異的発現によって選択する８１４３の
ＤＮＡ配列のカスタムオリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズした。規格化
の後、Ｃｙ５（プールした参照白血球ＲＮＡ）に対するＣｙ３（ドナー試料）のログ比を
、ＳＬＥ試料対全ての非ＳＬＥ試料で差別的に発現する遺伝子配列の分析のために用いた
。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ臨床基準あるい
はＳＬＥの臨床診断を有するが、古典的な徴候もしくは症状または免疫抑制を増加させる
最近の治療はあまり持たない患者に従って、ＳＬＥ試料を古典的なまたは非常に高い可能
性のＳＬＥ診断に分割した。
【０４９５】
マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ，Ｔｕｓｈｅｒら，２００１）を用いて、狼瘡患
者およびコントロール間で差次的に発現する遺伝子を同定した（実施例９）。これらのデ
ータを表２に示しており、表２では、ＳＬＥで過剰に発現するかまたは少なく発現する遺
伝子および誤検出率（ＦＤＲ）の様々なレベルでのコントロール試料が列記される。これ
らの遺伝子のそれぞれは、疾患または疾患活性に相関を持っている可能性がある。また、
実施例９の方法を用いて、多変量加法回帰木（ＭＡＲＴ）も使用して、また、多重遺伝子
分類モデル（表２Ｃ）用いる際にＳＬＥをコントロール試料から最も区別した遺伝子を同
定した。この分析は、遺伝子セットを同定し、関連遺伝子を配合して、狼瘡に対する診断
またはモニタリングアッセイを作製する。患者試料上で低い分類誤り率を有する多重遺伝
子アルゴリズムの一部であり、かつアルゴリズムでの重要度が高度である遺伝子が高い優
先遺伝子マーカーである。
【０４９６】
実施例８に記載した技術による実時間ＰＣＲを用いて、選択した遺伝子配列（表２Ｂ）
の差次的発現を確認および定量化した。全てのマーカー遺伝子用のＰＣＲプライマーをこ
れらの同法によって設計することができる。試験される遺伝子の多数は、検証され、狼瘡
試料に非常に有意な相関または反相関を見せた。
【０４９７】
階層的クラスター分析（Ｅｉｓｅｎら，１９９８（実施例９））によって、ＳＳＥのマ
ーカー（表２Ｄ）であるとしてアレイまたはＰＣＲデータで見込みを示した遺伝子と共発
現する既知および未記載の遺伝子両方を同定した。従って、遺伝子を経路に分類した。
【０４９８】
有意性および分類分析によって同定される遺伝子の中で、多くは、ＩＦＮ調節因子また
はインターフェロン誘導遺伝子ファミリーの成分である。分子および経路のインターフェ
ロンアルファファミリーは、ある期間で狼瘡の病因に関与していた。慢性ウイルス感染の
ためにインターフェロンアルファで治療された患者は、自己免疫現象および狼瘡の副作用
を有する可能性がある。ＩＦＮ−ａレベルは、ＳＬＥ、ＲＡ、シェーグレン症候群、およ
び強皮症患者由来の血清の中で上昇する。ＩＦＮ−ａも、自己免疫を開始する最も初期の
事象に関与している可能性がある。ＳＬＥで発現する特異的なＩＦＮ−ａ遺伝子産物の同
定によって、病原性サイトカインの選択的治療ターゲティングが可能になる一方で、ウイ
ルス感染の状況で予防的であるそれらのＩＦＮのものを節約する。
【０４９９】
【表１−１】
2010104368.tif 000031
【０５００】
【表１−２】
2010104368.tif 000032
【０５０１】
【表２−１】
2010104368.tif 000033
【０５０２】
【表２−２】
2010104368.tif 000034
【０５０３】
【表２−３】
2010104368.tif 000035
【０５０４】
【表２−４】
2010104368.tif 000036
【０５０５】
【表２−５】
2010104368.tif 000037
【０５０６】
【表２−６】
2010104368.tif 000038
【０５０７】
【表２−７】
2010104368.tif 000039
【０５０８】
【表２−８】
2010104368.tif 000040
【０５０９】
【表２−９】
2010104368.tif 000041
【０５１０】
【表２−１０】
2010104368.tif 000042
【０５１１】
【表２−１１】
2010104368.tif 000043
【０５１２】
【表２−１２】
2010104368.tif 000044
【０５１３】
【表２−１３】
2010104368.tif 000045
【０５１４】
【表２−１４】
2010104368.tif 000046
【０５１５】
【表２−１５】
2010104368.tif 000047
【０５１６】
【表２−１６】
2010104368.tif 000048
【０５１７】
【表２−１７】
2010104368.tif 000049
【０５１８】
【表２−１８】
2010104368.tif 000050
【０５１９】
【表２−１９】
2010104368.tif 000051
【０５２０】
【表２−２０】
2010104368.tif 000052
【０５２１】
【表２−２１】
2010104368.tif 000053
【０５２２】
【表２−２２】
2010104368.tif 000054
【０５２３】
【表２−２３】
2010104368.tif 000055
【０５２４】
【表２−２４】
2010104368.tif 000056
【０５２５】
【表２−２５】
2010104368.tif 000057
【０５２６】
【表２−２６】
2010104368.tif 000058
【０５２７】
【表２−２７】
2010104368.tif 000059
【０５２８】
【表２−２８】
2010104368.tif 000060
【０５２９】
【表２−２９】
2010104368.tif 000061
【０５３０】
【表２−３０】
2010104368.tif 000062
【０５３１】
【表２−３１】
2010104368.tif 000063
【０５３２】
【表２−３２】
2010104368.tif 000064
【０５３３】
【表２−３３】
2010104368.tif 000065
【０５３４】
【表２−３４】
2010104368.tif 000066
【０５３５】
【表２−３５】
2010104368.tif 000067
【０５３６】
【表２−３６】
2010104368.tif 000068
【０５３７】
【表２−３７】
2010104368.tif 000069
【０５３８】
【表２−３８】
2010104368.tif 000070
【０５３９】
【表２−３９】
2010104368.tif 000071
【０５４０】
【表２−４０】
2010104368.tif 000072
【０５４１】
【表２−４１】
2010104368.tif 000073
【０５４２】
【表２−４２】
2010104368.tif 000074
【０５４３】
【表２−４３】
2010104368.tif 000075
【０５４４】
【表３】
2010104368.tif 000076
【０５４５】
【表４】
2010104368.tif 000077
【０５４６】
（配列表）
【０５４７】
【化１】
2010104368.tif 000078
【０５４８】
【化２】
2010104368.tif 000079
【０５４９】
【化３】
2010104368.tif 000080
【０５５０】
【化４】
2010104368.tif 000081
【０５５１】
【化５】
2010104368.tif 000082
【０５５２】
【化６】
2010104368.tif 000083
【０５５３】
【化７】
2010104368.tif 000084
【０５５４】
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【化６９１】
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【１２３８】
【化６９２】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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