(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＧＤ２産生のバイオマーカーとなり得る新規なＰＧＤ２代謝物を提供する。また、生体試料に含まれるＰＧＤ２代謝物の検出方法及び測定方法、該ＰＧＤ２代謝物を検出及び／又は測定するＰＧＤ２関連疾患の診断方法、並びにＰＧＤ２代謝物を検出するための診断用キットを提供する。【解決手段】生体試料を、逆相カラムを用い、溶離液として水系溶媒と水溶性有機溶媒との混液を用い、プロスタグランジンＤ２を標品として、液体クロマトグラフ質量分析のネガティブイオンモードによる分析に付す。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を、逆相カラムを用いて、溶離液として水系溶媒と水溶性有機溶媒との混液を用いる液体クロマトグラフィーに付す工程を含むことを特徴とする下記式（Ｉ）で表わされる化合物、下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、下記式（Ｖ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び下記式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の検出及び／又は測定方法。
【化１】
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【請求項２】
生体試料が、尿である請求項１に記載の検出及び／又は測定方法。
【請求項３】
生体試料に含まれる下記式（Ｉ）で表わされる化合物、下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、下記式（Ｖ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び下記式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定することを特徴とするプロスタグランジンＤ２関連疾患治療薬の投与が有効な患者の選別方法。
【化２】
2010002416.tif 000027
【請求項４】
生体試料が、尿である請求項３に記載の選別方法。
【請求項５】
検出及び／又は測定する方法が、逆相カラムクロマトグラフィーを用い、下記化合物（ｂ１）〜（ｂ６）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定する方法である請求項３又は４に記載の選別方法：
プロスタグランジンＤ２を標品として液体クロマトグラフ質量分析のネガティブイオンモードによる分析に付した際に、（ｂ１）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．２０〜０．２２であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２９である化合物、（ｂ２）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．６７〜０．６９であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約２９９である化合物、（ｂ３）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．７９〜０．８１であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約２９７である化合物、及び（ｂ４）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．８２〜０．８４であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２５である化合物、並びに（ｂ５）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．２７〜０．２９であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２７である化合物及び（ｂ６）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．９４〜０．９６であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２３である化合物。
【請求項６】
下記式（Ｉ）で表わされる化合物、下記式（Ｖ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩ）で表わされる化合物及び下記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物。
【化３】
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【請求項７】
下記化合物（ｂ１）〜（ｂ４）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物；
逆相カラムクロマトグラフィーを用いた分析において、プロスタグランジンＤ２を標品として液体クロマトグラフ質量分析のネガティブイオンモードによる分析に付した際に、（ｂ１）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．２０〜０．２２であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが３２９である化合物、（ｂ２）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．６７〜０．６９であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが２９９である化合物、（ｂ３）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．７９〜０．８１であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが２９７である化合物、及び（ｂ４）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．８２〜０．８４であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが３２５である化合物。
【請求項８】
プロスタグランジンＤ２産生に由来するバイオマーカーとしての下記式（Ｉ）で表わされる化合物、下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、下記式（Ｖ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び下記式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用。
【化４】
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【請求項９】
下記式（Ｉ）で表わされる化合物、下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、下記式（Ｖ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び下記式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を標品として検出及び／又は測定することを特徴とするプロスタグランジンＤ２関連疾患診断用キット。
【化５】
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロスタグランジンＤ２代謝物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマーカーは、特定の疾病や体の状態に相関して量的に変化する、細胞や尿、血液を含む生体液中に含まれる生体由来の指標物質である。バイオマーカー量の測定は、疾病の診断、治癒の確認、新たな治療法の開発等に有用であり、さらに、疾患を予防するための日常的な指標としても有用である。バイオマーカーの検査に用いられる生体試料としては血液、尿等があるが、採血よりも採尿の方が簡便で患者に負担が少ないため好ましいとされる。
【０００３】
プロスタグランジンＤ２（以下、ＰＧＤ２ともいう）は、生体中アラキドン酸カスケードで産生される化学伝達物質の一つであり、アレルギー疾患などに関与すると考えられている。このため、生体内におけるＰＧＤ２量の変化の指標となるバイオマーカーは、ＰＧＤ２が関与する様々な疾患の診断等に有用である。しかしながら、アラキドン酸カスケードで産生される物質は一般に不安定な化合物であると考えられたためか、その代謝物そのものをバイオマーカーとすることは、従来行われたことがなかった。
【０００４】
尿に含まれるＰＧＤ２代謝物を化学修飾して誘導体とし、該誘導体についてＬＣ−ＭＳ又はＧＣ−ＭＳにより分析を行って代謝物の構造を推定したことが報告されている。
例えば、尿に含まれるＰＧＤ２の代謝物として、ヒト及びマウスにＰＧＤ２を静脈投与すると、11,15-Dioxo-9α-hydroxy-2,3,4,5-tetranorprostan-1,20-dioic acid（tetranor PGDM）が検出されたと報告されている（非特許文献１）。また、肥満細胞症の女性の尿に含まれる内因性ＰＧＤ２の代謝物を化学修飾により誘導体化し、該誘導体の構造をマススペクトルで分析したことが開示されている（非特許文献２）。
放射性元素でラベルしたＰＧＤ２を健常人の静脈に投与し、尿中に排出されたＰＧＤ２代謝物を化学修飾して誘導体化し、該誘導体の構造をＧＣ−ＭＳにより決定したことが開示されている（非特許文献３）。また、サルに３Ｈ７標識ＰＧＤ２を投与し、尿中のＰＧＤ２代謝物を化学修飾により誘導体化し、該誘導体の構造をＧＣ−ＭＳにより同定したことが開示されている（非特許文献４）。
しかしながら、尿中のＰＧＤ２代謝物を誘導体化せずにその構造を決定したことについては未だ報告されていない。また、ＰＧＤ２代謝物を誘導体化せずに直接検出又は測定（定量）する方法についても、未だ開発されていない。誘導体化は、その誘導体化反応が完結するかどうかの確認や反応のバリデーション(工程が期待する結果を与えるかどうかの検証)が必要であり、また、反応の種類によっては複数の誘導体が生成するため総量としての誘導体量を測定することが困難な場合がある。
このため、上述するように、生体内におけるＰＧＤ２産生に由来するバイオマーカーが望まれているが、特に、測定時に誘導化せずに測定することができる、ＰＧＤ２産生に由来する安定なバイオマーカーが望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】The Journal of Biological Chemistry Vol. 283, No. 2, pp.1179-1188, 2008
【非特許文献２】Prostaglandins Vol. 30, No. 3, pp.383-400, 1985
【非特許文献３】The Journal of Biological Chemistry, Vol. 260, No. 24, pp.13172-13180, 1985
【非特許文献４】The Journal of Biological Chemistry Vol. 254, No. 10, pp.4152-4163, 1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＰＧＤ２産生のバイオマーカーとなり得る新規なＰＧＤ２代謝物を提供することを目的とする。本発明はまた、生体試料に含まれる該ＰＧＤ２代謝物の検出方法及び測定方法、該ＰＧＤ２代謝物を検出及び／又は測定するＰＧＤ２関連疾患の診断方法、並びにＰＧＤ２代謝物を検出するための診断用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題に鑑み、本発明者等は鋭意研究を行った結果、ＰＧＤ２を投与したサルの尿中に、ＰＧＤ２代謝物として下記式（Ｉ）で表わされる化合物、下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、下記式（Ｖ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び下記式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物、又は下記（ａ１）〜（ａ６）の化合物、（ｂ１）〜（ｂ６）の化合物若しくは（ｃ１）〜（ｃ６）の化合物が含まれることを見出した。また、尿に含まれるこれらのＰＧＤ２代謝物を誘導体化することなく、簡便な操作で検出及び測定することができる方法を見出し、これらのＰＧＤ２代謝物がＰＧＤ２産生のバイオマーカーとして、すなわちＰＧＤ２関連疾患治療のためのバイオマーカーとして有用であることを見出した。本発明者らは、この知見に基づきさらに鋭意研究を行い、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記〔１〕〜〔１１〕からなる。
〔１〕生体試料を、逆相カラムを用いて、溶離液として水系溶媒と水溶性有機溶媒との混液を用いる液体クロマトグラフィーに付す工程を含むことを特徴とする下記式（Ｉ）で表わされる化合物、下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、下記式（Ｖ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び下記式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の検出及び／又は測定方法。
【０００９】
【化１】
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【００１０】
〔２〕生体試料が、尿である上記〔１〕に記載の検出及び／又は測定方法。
〔３〕生体試料に含まれる上記式（Ｉ）で表わされる化合物、上記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、上記式（Ｖ）で表わされる化合物、上記式（ＶＩ）で表わされる化合物、上記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び上記式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定することを特徴とするプロスタグランジンＤ２関連疾患の診断方法。
〔４〕生体試料が、尿である上記〔３〕に記載の診断方法。
〔５〕検出及び／又は測定する方法が、逆相カラムクロマトグラフィーを用い、下記化合物（ｂ１）〜（ｂ６）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定する方法である上記〔３〕又は〔４〕に記載の診断方法；
プロスタグランジンＤ２を標品として液体クロマトグラフ質量分析のネガティブイオンモードによる分析に付した際に、（ｂ１）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．２０〜０．２２であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２９である化合物、（ｂ２）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．６７〜０．６９であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約２９９である化合物、（ｂ３）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．７９〜０．８１であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約２９７である化合物、及び（ｂ４）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．８２〜０．８４であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２５である化合物、並びに（ｂ５）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．２７〜０．２９であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２７である化合物及び（ｂ６）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．９４〜０．９６であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２３である化合物。
〔６〕生体試料に含まれる上記式（Ｉ）で表わされる化合物、上記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、上記式（Ｖ）で表わされる化合物、上記式（ＶＩ）で表わされる化合物、上記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び上記式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定することを特徴とするプロスタグランジンＤ２関連疾患治療薬の投与が有効な患者の選別方法。
〔７〕生体試料が、尿である上記〔６〕に記載の選別方法。
〔８〕検出及び／又は測定する方法が、逆相カラムクロマトグラフィーを用い、下記化合物（ｂ１）〜（ｂ６）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定する方法である上記〔６〕又は〔７〕に記載の選別方法：
プロスタグランジンＤ２を標品として液体クロマトグラフ質量分析のネガティブイオンモードによる分析に付した際に、（ｂ１）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．２０〜０．２２であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２９である化合物、（ｂ２）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．６７〜０．６９であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約２９９である化合物、（ｂ３）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．７９〜０．８１であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約２９７である化合物、及び（ｂ４）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．８２〜０．８４であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２５である化合物、並びに（ｂ５）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．２７〜０．２９であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２７である化合物及び（ｂ６）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．９４〜０．９６であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが約３２３である化合物。
〔９〕下記式（Ｉ）で表わされる化合物、下記式（Ｖ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩ）で表わされる化合物及び下記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物。
【００１１】
【化２】
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【００１２】
〔１０〕下記化合物（ｂ１）〜（ｂ４）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物；
逆相カラムクロマトグラフィーを用いた分析において、プロスタグランジンＤ２を標品として液体クロマトグラフ質量分析のネガティブイオンモードによる分析に付した際に、（ｂ１）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．２０〜０．２２であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが３２９である化合物、（ｂ２）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．６７〜０．６９であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが２９９である化合物、（ｂ３）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．７９〜０．８１であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが２９７である化合物、及び（ｂ４）液体クロマトグラムにおけるプロスタグランジンＤ２に対する相対保持時間が０．８２〜０．８４であり、かつ質量分析によるｍ／ｚが３２５である化合物。
〔１１〕プロスタグランジンＤ２産生に由来するバイオマーカーとしての下記式（Ｉ）で表わされる化合物、下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、下記式（Ｖ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩ）で表わされる化合物、下記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び下記式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用。
【００１３】
【化３】
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【００１４】
〔１２〕上記式（Ｉ）で表わされる化合物、上記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、上記式（Ｖ）で表わされる化合物、上記式（ＶＩ）で表わされる化合物、上記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び上記式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を標品として検出及び／又は測定することを特徴とするプロスタグランジンＤ２関連疾患診断用キット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生体試料に含まれるＰＧＤ２代謝物を簡便な操作で、誘導化することなく検出及び／又は測定することができるので、ＰＧＤ２の関与が深い疾患患者群を簡便に選択でき、また、特定疾患におけるＰＧＤ２の関与を特定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】３Ｈ−ＰＧＤ２の尿中代謝物をＨＰＬＣにより分析した際のラジオクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１．化合物（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）
本発明の化合物は、上記式（Ｉ）で表わされる化合物（以下、化合物（Ｉ）ともいう）、式（Ｖ）で表わされる化合物（以下、化合物（Ｖ）ともいう）、式（ＶＩ）で表わされる化合物（以下、化合物（ＶＩ）ともいう）及び式（ＶＩＩ）で表わされる化合物（以下、化合物（ＶＩＩ）ともいう）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である。
これらの化合物や、上記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）ともいう）及び式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物（以下、化合物（ＶＩＩＩ）ともいう）は、生体試料に含まれるＰＧＤ２代謝物であり、ＰＧＤ２産生のバイオマーカーとすることができるものである。
【００１８】
バイオマーカーは、病態と相関して生体内における量が増減する物質である。ＰＧＤ２が過剰に産生されることによってＰＧＤ２関連疾患に羅患したときには、生体内において、式（Ｉ）で表わされる化合物、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、式（Ｖ）で表わされる化合物、式（ＶＩ）で表わされる化合物、式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物は、その量が増加する。また、ＰＧＤ２が過剰に産生されることによるＰＧＤ２関連疾患が治癒に向かっているときには、生体内において、式（Ｉ）で表わされる化合物、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、式（Ｖ）で表わされる化合物、式（ＶＩ）で表わされる化合物、式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物は、その量が減少する。
【００１９】
上記化合物（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）は、例えば、以下の方法で製造することができる。以下の反応スキーム中、ＴＨＰはテトラヒドロピラニル基を表わし、Ｂｎはベンジル基を表わし、Ｍｅはメチル基を表わし、Ａｃはアセチル基を表わし、Ｔｒはトリチル基を表わす。
【００２０】
本発明においては、特に断わらない限り、当業者にとって明らかなように記号
【００２１】
【化４】
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【００２２】
は紙面の向こう側（すなわちα−配置）に結合していることを表わし、
【００２３】
【化５】
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【００２４】
は紙面の手前側（すなわちβ−配置）に結合していることを表わす。
【００２５】
また、上記化合物（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）は塩であってもよく、薬理学的に許容される塩であれば、すべて含まれる。薬理学的に許容される塩は毒性の低い、水溶性のものが好ましく、適当な塩として、例えば、アルカリ金属（例えば、カリウム、ナトリウム、リチウム等）の塩、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム等）の塩等が挙げられる。
【００２６】
また、上記化合物（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）は、例えば、ＰＧＤ２の代謝物を含む生体由来の試料を、後述する液体クロマトグラフィー等に付し、適当な条件下分取することにより得ることもできる。
【００２７】
上記化合物（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）の製造方法として好ましくは、反応スキーム１、２、３、４、５、又は７で示される化学合成による製造である。
化合物（Ｉ）の合成方法
化合物（Ｉ）は、下記反応スキーム１に示す工程１〜１４の反応を行なうことにより製造することができる。
下記反応スキーム１中、式１で表わされる化合物（化合物１）は、例えば、文献J.Am.Chem.Soc. 93巻1490頁（1971）に記載の方法で製造することができる。式２で表わされる化合物（化合物２）は、化合物１に、ハロゲン化ベンジル及び有機溶媒中塩基を加えて反応させることにより製造することができる。式３で表わされる化合物（化合物３）は、化合物２を還元反応に付すことにより製造することができる。化合物２から化合物３を製造する反応では、有機溶媒中（トルエンなど）、低温下でジイソブチル水素化アルミニウムを用いるのが好ましい。式４で表わされる化合物（化合物４）は、化合物３をメトキシメチルトリフェニルホスフィニウムハライドと、有機溶媒中塩基の存在下Wittig反応を行うことで製造することができる。式５で表わされる化合物（化合物５）は、化合物４を酸性条件下で加水分解することで製造することができる。式６で表わされる化合物（化合物６）は化合物５を酸化条件に付すことにより製造することができる。化合物５から化合物６を製造する反応では、特に塩基性水溶液中酸化銀（Ｉ）を用いるのが好ましい。式７で表わされる化合物（化合物７）は、化合物６を有機溶媒中で酸触媒存在下、ジヒドロピランと反応させることにより製造することができる。式８で表わされる化合物（化合物８）は、化合物７を水素雰囲気下に有機溶媒中パラジウム−炭素触媒を用いて水素化反応に付すことにより製造することができる。式９で表わされる化合物（化合物９）は、化合物８を酸化反応に付すことにより製造することができる。式１０で表わされる化合物（化合物１０）は、化合物９をmethyl 7-(dimethoxyphosphoryl)-6-oxoheptanoateと有機溶媒中塩基存在下でHoner-Emons反応に付すことにより製造することができる。methyl 7-(dimethoxyphosphoryl)-6-oxoheptanoate は、例えば文献J. Org. Chem. 59巻5453頁(1994)に記載の方法で製造することができる。式１１で表わされる化合物（化合物１１）は、化合物１０から製造される。具体的には、化合物１０を、化合物８を製造したのと同様の反応に付すことで、化合物１１を製造することができる。式１２で表わされる化合物（化合物１２）は、化合物１１を有機溶媒中酸触媒存在下で１，２−エタンジチオールと反応させることにより製造することができる。式１３で表わされる化合物（化合物１３）は、有機溶媒中トリフェニルホスフィン及びジエチルアゾジカルボキシレートの存在下で化合物１２と酢酸とを光延反応させることで製造することができる。式１４で表わされる化合物（化合物１４）は、化合物１３を水−有機溶媒混合溶媒中ＣＡＮ存在下反応させることで製造することができる。化合物（Ｉ）は、化合物１４を塩基存在下加水分解反応に付すことで製造することができる。
【００２８】
反応スキーム１
【００２９】
【化６】
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【００３０】
上記化合物（Ｉ）の製造工程を表す反応スキーム１中、工程１〜１４で表わされる反応は以下の通りである。
工程１：ベンジル化反応、工程２：還元反応、工程３：Ｗｉｔｔｉｇ反応、工程４：酸性加水分解反応、工程５：酸化反応、工程６：テトラヒドロピラニル化反応、工程７：水素化反応、工程８：酸化反応、工程９：Ｈｏｎｅｒ−Ｅｍｏｎｓ反応、工程１０：水素化反応、工程１１：チオケタール化反応、工程１２：光延反応、工程１３：カルボニル基の保護基の脱保護反応、工程１４：塩基性加水分解反応。
化合物（ＩＩＩ）の合成
化合物（ＩＩＩ）は、以下の反応スキーム２に示す反応を行うことによって製造することができる。
式１５で表わされる化合物（化合物１５）は、化合物１２を有機溶媒中酸化反応に付すことにより製造することができる。式１６で表わされる化合物（化合物１６）は、化合物１５から、上記反応スキーム１の化合物１４を製造する方法（工程１３）と同様の方法で製造することができる。化合物（ＩＩＩ）は、化合物１６から化合物（Ｉ）を製造するのと同様の方法で、すなわち化合物１６を、上記工程１４と同様に加水分解することにより製造することができる。
【００３１】
反応スキーム２
【００３２】
【化７】
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【００３３】
上記化合物（ＩＩＩ）の製造工程を表す反応スキーム２中、工程１５〜１７で表わされる反応は以下の通りである。
工程１５：酸化反応、工程１６：カルボニル基の保護基の脱保護反応、工程１７：塩基性加水分解反応。
化合物（Ｖ）の合成
化合物（Ｖ）は、以下の反応スキーム３に示す反応によって製造することができる。
反応スキーム３中、式１７で表わされる化合物（化合物１７）は、diethyl (2-oxoheptyl)phosphonate を用いて化合物１０を製造するのと同様の方法（工程９）で製造することができる。diethyl (2-oxoheptyl)phosphonateは、例えばAldich社(カタログ番号36969-89-8)から購入することができる。式１８で表わされる化合物（化合物１８）は、化合物１７から化合物１１を製造するのと同様の方法（工程１０）で製造することができる。式１９で表わされる化合物（化合物１９）は、化合物１８から化合物１２を製造するのと同様の方法（工程１１）で製造することができる。式２０で表わされる化合物（化合物２０）は、化合物１９から化合物１３を製造するのと同様の方法（工程１２）で製造することができる。式２１で表わされる化合物（化合物２１）は、化合物２０から化合物１４を製造するのと同様の方法（工程１３）で製造することができる。化合物（Ｖ）は、化合物２１から化合物（Ｉ）を製造するのと同様の方法（工程１４）で製造することができる。
【００３４】
反応スキーム３
【００３５】
【化８】
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【００３６】
上記化合物（Ｖ）の製造工程を表す反応スキーム３中、工程１８〜２３で表わされる反応は以下の通りである。
工程１８：Ｈｏｎｅｒ−Ｅｍｏｎｓ反応、工程１９：水素化反応、工程２０：チオケタール化反応、工程２１：光延反応、工程２２：カルボニル基の保護基の脱保護反応、工程２３：塩基性加水分解反応。
化合物（ＶＩ）の合成
化合物（ＶＩ）は、以下の反応スキーム４に示す反応によって製造することができる。
反応スキーム４中、式２３で表わされる化合物（化合物２３）は、化合物１９から化合物１５を製造するのと同様の方法（工程１５）で製造することができる。式２４で表わされる化合物（化合物２４）は、化合物２３から化合物１４を製造するのと同様の方法（工程１３）で製造することができる。化合物（ＶＩ）は、化合物２４から化合物（Ｉ）を製造するのと同様の方法（工程１４）で製造することができる。
【００３７】
反応スキーム４
【００３８】
【化９】
2010002416.tif 000011
【００３９】
上記化合物（ＶＩ）の製造工程を表す反応スキーム４中、工程２４〜２６で表わされる反応は以下の通りである。
工程２４：酸化反応、工程２５：カルボニル基の保護基の脱保護反応、工程２６：塩基性加水分解反応。
化合物（ＶＩＩ）の合成
化合物（ＶＩＩ）は、以下の反応スキーム５に示す反応によって製造することができる。
反応スキーム５中、式２５で表わされる化合物（化合物２５）は、例えばJ. Am. Chem. Soc. 92巻397頁に記載の方法で製造することができる。式２６で表わされる化合物（化合物２６）は、化合物２５から化合物１１を製造するのと同様の方法（工程１０）で製造することができる。式２７で表わされる化合物（化合物２７）は、化合物２６から化合物１２を製造するのと同様の方法（工程１１）で製造することができる。式２８で表わされる化合物（化合物２８）は、化合物２７から化合物（Ｉ）を製造するのと同様の方法（工程１４）で製造することができる。式２９で表わされる化合物（化合物２９）は、化合物２８から化合物７を製造するのと同様の方法（工程６）で製造することができる。式３０で表わされる化合物（化合物３０）は、化合物２９から化合物３を製造するのと同様の方法（工程２）で製造することができる。式３１で表わされる化合物（化合物３１）は、有機溶媒中塩基存在下、化合物３０を式４０で表わされる化合物（化合物４０）とWittig反応させることで製造することができる。化合物４０は、反応スキーム６中の式３９で表わされる化合物（化合物３９）を有機溶媒中塩基存在下でトリフェニルホスフィンと反応させることにより製造することができる。化合物３９は、例えばJ. Chem. Res., Synop、806頁、2003年に記載の方法で製造することができる。式３２で表わされる化合物（化合物３２）は、化合物３１を有機溶媒中塩基存在下で酢酸ハライドと反応させることにより製造することができる。式３３で表わされる化合物（化合物３３）は、化合物３２をメタノールなどのアルコール溶媒中酸触媒を用いて反応させることで製造することができる。式３４で表わされる化合物（化合物３４）は、化合物３３に有機溶媒中塩基存在下でトリチルクロライドを反応させることで製造することができる。式３５で表わされる化合物（化合物３５）は、化合物３４から化合物１３を製造するのと同様の方法（工程１２）で製造することができる。式３６で表わされる化合物（化合物３６）は、化合物３５を有機溶媒中、酸で処理することにより製造することができる。式３７で表わされる化合物（化合物３７）は、化合物３６から化合物１４を製造するのと同様の方法（工程１３）で製造することができる。式３８で表わされる化合物（化合物３８）は、有機溶媒中で化合物３７をジョーンズ酸化することで製造することができる。化合物（ＶＩＩ）は、化合物３８から化合物（Ｉ）を製造するのと同様の方法（工程１４）で製造することができる。
【００４０】
反応スキーム５
【００４１】
【化１０】
2010002416.tif 000012
【００４２】
上記化合物（ＶＩＩ）の製造工程を表す反応スキーム５中、工程２７〜４０で表わされる反応は以下の通りである。
工程２７：水素化反応、工程２８：チオケタール化反応、工程２９：塩基性加水分解反応、工程３０：テトラヒドロピラニル化反応、工程３１：還元反応、工程３２：Ｗｉｔｔｉｇ反応、工程３３：アセチル化反応、工程３４：アルコールの保護基の脱保護反応、工程３５：トリチル化反応、工程３６：光延反応、工程３７：アルコールの保護基の脱保護反応、工程３８：カルボニル基の保護基の脱保護反応、工程３９：酸化反応、工程４０：塩基性加水分解反応。
【００４３】
反応スキーム６
【００４４】
【化１１】
2010002416.tif 000013
【００４５】
化合物４０の製造工程を示す反応スキーム６中、工程４１の反応は、リンイリド化反応である。
化合物（ＶＩＩＩ）の合成
化合物（ＶＩＩＩ）は、以下の反応スキーム７に示す反応によって製造することができる。
反応スキーム７中、式４１で表わされる化合物（化合物４１）は、化合物３４から化合物１５を製造するのと同様の方法（工程１５）で製造することができる。式４２で表わされる化合物（化合物４２）は、化合物４１から化合物３６を製造するのと同様の方法（工程３７）で製造することができる。式４３で表わされる化合物（化合物４３）は、化合物４２から化合物１４を製造するのと同様の方法（工程１３）で製造することができる。式４４で表わされる化合物（化合物４４）は、化合物４３から化合物３８を製造するのと同様の方法（工程３９）で製造することができる。化合物（ＶＩＩＩ）は、化合物４４から化合物（Ｉ）を製造するのと同様の方法（工程１４）で製造することができる。
【００４６】
反応スキーム７
【００４７】
【化１２】
2010002416.tif 000014
【００４８】
上記化合物（ＶＩＩＩ）の製造工程を表す反応スキーム７中、工程４２〜４６で表わされる反応は以下の通りである。
工程４２：酸化反応、工程４３：アルコールの保護基の脱保護反応、工程４４：カルボニル基の保護基の脱保護反応、工程４５：酸化反応、工程４６：塩基性加水分解反応。
【００４９】
要するに上記した本発明の化合物はいずれも、公知方法又は自体公知の方法に従って、容易に製造できる。また、下記する化合物も同様である。
２．化合物（ａ１）〜（ａ６）、（ｂ１）〜（ｂ６）及び（ｃ１）〜（ｃ６）
下記（１）〜（３）に記載する化合物（ａ１）〜（ａ６）、（ｂ１）〜（ｂ６）及び（ｃ１）〜（ｃ６）も、ＰＧＤ２産生のバイオマーカーとすることができるものである。これらの化合物も、本発明の１つである。
なお、以下に示される保持時間および相対保持時間は、例え実験条件を同じくした場合においても、多少は増減するものであり、厳密に解釈されるべきものではない。
（１）下記分析条件で液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）に付した際に、（ａ１）液体クロマトグラム（以下、ＬＣともいう）における保持時間が１２．１〜１３．１分であり、かつ質量分析（以下、ＭＳともいう）によるｍ／ｚが約３２９である化合物、（ａ２）ＬＣにおける保持時間が４０．０〜４１．０分であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約２９９である化合物、（ａ３）ＬＣにおける保持時間が４６．８〜４７．８分であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約２９７である化合物、及び（ａ４）ＬＣにおける保持時間が４８．８〜４９．８分であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約３２５である化合物、並びに（ａ５）ＬＣにおける保持時間が１５．７〜１６．７分であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約３２７である化合物及び（ａ６）ＬＣにおける保持時間が５５．７〜５６．７分であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約３２３である化合物；
ＬＣ−ＭＳ分析条件
（ＬＣ分析条件１）
カラム：ZORBAX SB-C18、5 μm、4.6 mm I.D.×250 mm L.（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)
溶離液：Ａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．０）
Ｂ）アセトニトリル
溶出条件：１０→７０％  Ｂ）、１２０分でリニアグラジエントを行う
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：３５℃
（ＭＳ分析条件）
Polarity：Negative 
質量範囲：ｍ／ｚ  ２００−８００
（２）上記分析条件でＰＧＤ２を標品としてＬＣ−ＭＳに付した際に、（ｂ１）ＬＣにおけるＰＧＤ２に対する相対保持時間が０．２０〜０．２２であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約３２９である化合物、（ｂ２）ＬＣにおけるＰＧＤ２に対する相対保持時間が０．６７〜０．６９であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約２９９である化合物、（ｂ３）ＬＣにおけるＰＧＤ２に対する相対保持時間が０．７９〜０．８１であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約２９７である化合物、及び（ｂ４）ＬＣにおけるＰＧＤ２に対する相対保持時間が０．８２〜０．８４であり、かつＭＳによるｍ／ｚ約３２５である化合物、並びに（ｂ５）ＬＣにおけるＰＧＤ２に対する相対保持時間が０．２７〜０．２９であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約３２７である化合物及び（ｂ６）ＬＣにおけるＰＧＤ２に対する相対保持時間が０．９４〜０．９６であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約３２３である化合物。
標品のＰＧＤ２は、例えばJ. Org. Chem. 38巻2115頁(1973)に記載の方法で合成することができる。また、ＰＧＤ２の市販品を購入して用いてもよい。市販のＰＧＤ２は、例えば、Cayman社（カタログ番号  １２０１０）から購入することができる。
（３）下記分析条件でＬＣ−ＭＳに付した際に、（ｃ１）ＬＣにおける保持時間が１３．８〜１４．８分であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約３２９である化合物、（ｃ２）ＬＣにおける保持時間が４１．３〜４２．３分であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約２９９である化合物、（ｃ３）ＬＣにおける保持時間が４８．９〜４９．９分であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約２９７である化合物、及び（ｃ４）ＬＣにおける保持時間が５１．４〜５２．４分であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約３２５である化合物、並びに（ｃ５）ＬＣにおける保持時間が１８．２〜１９．２分であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約３２７である化合物及び（ｃ６）ＬＣにおける保持時間が５８．９〜５９．９分であり、かつＭＳによるｍ／ｚが約３２３である化合物；
ＬＣ−ＭＳ分析条件
（ＬＣ分析条件２）
カラム：ZORBAX SB-C18、5 μm、4.6 mm I.D.×250 mm L.（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)
溶離液：Ａ）０．１％  ギ酸水溶液
Ｂ）０．１％  ギ酸を含むアセトニトリル
溶出条件：１０→７０％  Ｂ）、１２０分でリニアグラジエントを行う
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：３５℃
（ＭＳ分析条件）
Polarity：Negative 
質量範囲：ｍ／ｚ  ２００−８００
図１に、３Ｈで標識したＰＧＤ２（３Ｈ−ＰＧＤ２）をカニクイザルに静脈内投与後、０〜６時間に尿を氷冷下採取し、上記ＬＣ分析条件１でＨＰＬＣ分析した際のラジオクロマトグラムを示す。図１においては、放射能検出にはフローシンチレーションアナライザー（RAD、ParkinElmer社製）を用いている。図１において、Ｉで示されるピークは、保持時間が１２．６分であり、（ａ１）の化合物のピークである。ＩＩＩで示されるピークは、保持時間が１６．２分であり、（ａ５）の化合物のピークである。Ｖで示されるピークは、保持時間が４０．５分であり、（ａ２）の化合物のピークである。ＶＩで示されるピークは、保持時間が４７．３分であり、（ａ３）の化合物のピークである。ＶＩＩで示されるピークは、保持時間が４９．３分であり、（ａ４）の化合物のピークである。ＶＩＩＩで示されるピークは、保持時間が５６．２分であり、（ａ６）の化合物のピークである。なお、標品である３Ｈ−ＰＧＤ２の保持時間は、５７．９分である。
化合物（ａ１）〜（ａ６）、（ｂ１）〜（ｂ６）及び（ｃ１）〜（ｃ６）として具体的には、上記化合物（Ｉ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）が挙げられる。
【００５０】
生体試料に含まれる化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）並びに上記（ａ１）〜（ａ６）、（ｂ１）〜（ｂ６）及び（ｃ１）〜（ｃ６）の化合物は、ＰＧＤ２の代謝物であることから、ＰＧＤ２産生のバイオマーカーとして利用することができるものである。従って、生体試料に含まれるこれら化合物の少なくとも１種を検出及び／又は測定することにより、ＰＧＤ２の関与が深い疾患患者群を簡便に選択でき、また、特定疾患におけるＰＧＤ２の関与を特定することができる。
【００５１】
上記したネガティブイオンモードとは、液体クロマトグラフィー質量分析において負の電荷を持つイオンを観測する方法を意味し、本願記載の液体クロマトグラフィー質量分析において、ネガティブイオンモードを用いるのが好ましい。
３．生体試料に含まれる化合物の検出方法及び測定方法
生体試料に含まれる上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種の検出及び／又は測定は、例えば、生体試料を、ＯＤＳカラム等の逆相カラムを用いて、溶離液として水系溶媒と水溶性有機溶媒との混液を用いる液体クロマトグラフィーに付す工程を含む方法により、行うことができる。このような検出方法及び／又は測定方法も、本発明の１つである。
生体試料としては、上記ＰＧＤ２の代謝物を含む生体由来の試料であれば特に限定されず、例えば、ヒトを含む動物の尿、血液、組織抽出液、唾液、涙液、その他の体液等の生体から採取した試料が挙げられる。中でも、採取が簡便であり患者への負担が少ないことから尿が好ましい。また、本発明の方法においては、生体試料を液体クロマトグラフィーに付する前に、例えば、生体試料中に含まれるタンパク質等を除去するために生体試料に前処理を施すことが好ましい。さらに、本発明の方法においては、ＰＧＤ２の代謝物である上記化合物を誘導体化せずに検出及び／又は測定することができるため、生体試料を化学処理して化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種を誘導体化する工程を含まないことが好ましい。
【００５２】
前処理としては、遠心分離、除タンパク、抽出（例えば、液液抽出法、固相抽出法）又は濃縮操作等が挙げられる。除タンパクの方法としては、公知の方法でよく、例えば、有機溶媒処理（例えば、フェノール、クロロホルム、クロロホルム−メタノール混液、アセトン、ベンゼン、アセトニトリル、メタノール、２−メチル−２−ブタノール等）又は熱処理等が挙げられる。液液抽出法において、上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）を抽出する溶媒としては、例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ベンゼン、ジオキサン、ｎ−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、クロロホルム又は酢酸エチル−ｎ−へキサン混液等が挙げられる。固相抽出法は、例えば、上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種の保持（吸着）に適した固相に該化合物を保持（吸着）させ、次いで溶出溶媒により固相に保持（吸着）された該化合物を溶出させる公知の方法により実施できる。溶出する溶媒としては、例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ベンゼン、ジオキサン、ｎ−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、クロロホルム又は酢酸エチル−ｎ−へキサン混液等が挙げられる。濃縮操作としては、例えば、減圧濃縮や凍結乾燥等が挙げられる。
これら前処理は１種又は複数組み合わせて行うことができるが、処理時間の短縮化、簡便性、迅速性又は省力化等の観点から固相抽出法を含むことが好ましい。固相抽出法における固相としては、例えば、逆相系シリカゲル、イオン交換型シリカゲル、逆相系ポリマー、イオン交換型ポリマー等が挙げられるがこれらに限定されない。また、これら固相は１種又は２種以上を組み合わせて使用できる。好ましい固相としては、例えば、逆相系ポリマーである。固相抽出法は、上記固相が充填された市販のカートリッジ又はミニカラム等を用いることができる。そのようなカートリッジ又はミニカラム等としては、例えば、ＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ（Ｗａｔｅｒｓ社）、ＦＯＣＵＳ（Ｖａｒｉａｎ社）等が挙げられるが、これらに限定されない。上記カートリッジ又はミニカラム等は１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。また、固相抽出法には、固相マイクロ抽出法（ＳＰＭＥ）が含まれる。ＳＰＭＥとしては、上記固相を結合させた細いニードル等が挙げられる。固相抽出法における、固相に保持（吸着）された上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）を溶出する溶媒としては、固相の種類に応じて適宜選択すればよく、例えば逆相系シリカゲルや逆相系ポリマー系固相ではアセトニトリルやメタノール等が挙げられ、例えばイオン交換型シリカゲルやイオン交換型ポリマー固相では、酸性の水溶液等が挙げられる。
また、固相は、試料注入前に化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種を保持（吸着）し得るようコンディショニングすることが好ましい。コンディショニングは、固相により異なり、例えば、逆相系シリカゲルや逆相系ポリマー系固相ではメタノールで洗浄した後水の一定量を、イオン交換型シリカゲルやイオン交換型ポリマー固相ではメタノール続いて水で洗浄した後に塩基性水溶液の一定量を、固相が充填されたカートリッジ又はミニカラムに通すことにより実施できる。
上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種を保持した固相は、例えば水性溶媒［例えば、水、水／酢酸混液（約１００：１〜８０：１（Ｖ／Ｖ））、塩酸（０．１〜０．２Ｎ）等］の一定量で洗浄されるのが好ましい。該洗浄により、固相に負荷された試料に含まれる化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）以外の夾雑物を除去し得る。
固相抽出法により得られた化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種を含む溶液は、次いで濃縮操作により濃縮されることが好ましい。さらに、得られた濃縮物を後述する液体クロマトグラフィーの溶離液と同じ溶媒に溶解させることにより、試料を調製することができる。
【００５３】
また、処理時間の短縮化、簡便性、迅速性又は省力化等の観点から、遠心分離操作のみを行い、濃縮操作を行うことなく前処理することも好ましい。遠心分離操作としては、遠心分離処理であれば特に限定されず、例えば、遠心分離処理（１２，０００ｒｐｍ、５℃、５分間）して不溶物を沈殿させて、その上清をそのまま濃縮することなく、試料として用いることができる。
【００５４】
試料の調製においては、内標準物質を添加することが好ましい。内標準物質の添加により、試料中に夾雑物が存在し、上記化合物の測定に影響を与える場合においても、正確に目的化合物の測定を行うことができる。内標準物質としては、上述したＰＧＤ２、同位体元素で標識した化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物が好ましい。
生体試料に含まれる上記化合物の検出及び／又は測定は、必要により前述の前処理を施した生体試料を、逆相カラムとして、例えばＯＤＳカラムを用い、溶離液として水系溶媒と水溶性有機溶媒との混液を用いる液体クロマトグラフに付すことにより行われる。本明細書において、ＯＤＳカラムとは、例えば、シリカゲル担体に、オクタデシルシリル基（OctaDecylSilyl＝ＯＤＳ基、C18基）が化学結合した充填剤が詰められた逆相クロマトグラフィーで用いられるカラムを意味する。ＯＤＳカラムとしては、ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ（ＹＭＣ社製）、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８（ＹＭＣ社製）、Ｓｕｎｆｉｒｅ  ＴＭ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）、Ｘｂｒｉｄｇｅ  ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）、Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）、Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ−Ｃ１８（Ｉｍｔａｋｔ社製）、又はＣａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（Ｉｍｔａｋｔ社製）等が挙げられる。中でも、ZORBAX SB-C18、5 μm、4.6mm(I.D.)×250mm(L.)（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)等が好ましい。
液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度としては、２０〜４０℃が好ましく、２５〜３５℃がより好ましい。
水系溶媒としては、精製水、蒸留水又はＨＰＬＣ用水等が挙げられる。水系溶媒には、例えばギ酸、酢酸、ギ酸アンモニウム又は酢酸アンモニウム等の揮発性物質が添加されることが好ましく、酢酸アンモニウム、ギ酸が特に好ましい。揮発性物質の濃度は、例えば０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましく、１０〜２５ｍｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。また、水系溶媒は、ｐＨ２．０〜４．０に調整されることが好ましい。水系溶媒のｐＨ調整は、例えば、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸等により行うことができる。
本発明の検出方法及び／又は測定方法においては、水系溶媒をＡ）液とし、アセトニトリルをＢ）液とし、以下の条件で液体クロマトグラフィーにより分離を行うことが好ましい。まず、溶離液の流速を、例えば、約０．２〜１．０ｍＬ／ｍｉｎ、好ましくは１．０ｍＬ／ｍｉｎとし、Ｂ）液０〜１００％、好ましくは０〜１０％でカラムを平衡化する。次いで、３０〜１８０分間、好ましくは６０〜１２０分間のリニアグラジエントで、Ｂ液の最終濃度を５５〜１００％とする。試料の注入量は、１０〜１００μＬが好ましく、２０〜５０μＬがより好ましい。
【００５５】
本発明の検出方法及び／又は測定方法における好ましいＬＣ分析条件の一例を、下記に示す。
ＬＣ分析条件１
カラム：ZORBAX SB-C18、5 μm、4.6 mm I.D.×250 mm L.（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)
溶離液：Ａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．０）
Ｂ）アセトニトリル
溶出条件：１０→７０％  Ｂ）、１２０分でリニアグラジエントを行う。
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：３５℃
ＬＣ分析条件２
カラム：ZORBAX SB-C18、5 μm、4.6 mm I.D.×250 mm L.（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)
溶離液：Ａ）０．１％  ギ酸水溶液
Ｂ）０．１％  ギ酸を含むアセトニトリル
溶出条件：１０→５５％  Ｂ）、７０分でリニアグラジエントを行う
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：３５℃
例えば、上記ＬＣ分析条件１によれば、化合物（Ｉ）の保持時間は１２．１〜１３．１分であり、化合物（ＩＩＩ）の保持時間は１５．７〜１６．７分であり、化合物（Ｖ）の保持時間は４０．０〜４１．０分であり、化合物（ＶＩ）の保持時間は４６．８〜４７．８分であり、化合物（ＶＩＩ）の保持時間は４８．８〜４９．８分であり、化合物（ＶＩＩＩ）の保持時間は５５．７〜５６．７分である。
【００５６】
また、上記ＬＣ分析条件２によれば、化合物（Ｉ）の保持時間は１３．８〜１４．８分であり、化合物（ＩＩＩ）の保持時間は１８．２〜１９．２分であり、化合物（Ｖ）の保持時間は４１．３〜４２．３分であり、化合物（ＶＩ）の保持時間は４８．９〜４９．９分であり、化合物（ＶＩＩ）の保持時間は５１．４〜５２．４分であり、化合物（ＶＩＩＩ）の保持時間は５８．９〜５９．９分である。
液体クロマトグラフィーにおいて、検出器は、紫外分光検出器、多波長検出器、蒸発光散乱検出器、コロナ荷電化粒子検出器、質量分析検出器が好ましい。中でも、質量分析検出器、コロナ荷電化粒子検出器が好ましい。紫外分光検出器、多波長検出器の場合、測定波長は、１９０〜２６０ｎｍが好ましく、１９５〜２１５ｎｍがより好ましい。質量分析検出器としては、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、フーリエ変換型が好ましい。さらに、生体試料中の放射能標識したＰＧＤ２代謝物を検出及び／又は測定する場合には、検出にフローシンチレーションアナライザーを用いることもできる。
生体試料に含まれる上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）の測定、すなわち生体試料中のこれらの化合物の濃度の算出方法としては、例えば、これらの化合物の標準溶液を用いて作成した検量線を用いて行う方法が挙げられる。具体的には、例えば、液体クロマトグラフィーにより測定を行う場合の検量線は、これらの化合物の標準溶液に内標化合物を添加した溶液を用いて上記分析条件にて液体クロマトグラフィーによる分析を実施して得られる測定値から作成され得る。また、生体試料中の上記化合物の測定は、ＭＳ／ＭＳ分析法により、予め既知濃度のものを用いて用意しておいた検量線に基づいて行うことができる。ＭＳ／ＭＳ分析法としては、選択反応モニタリング法等が挙げられる。
本発明の検出方法又は測定方法を用いれば、例えば、１〜１００ｍＬの尿量で尿中の上記化合物の検出及び／又は測定を行うことが可能となる。好ましくは、１〜１０ｍＬ程度の尿を用いる。
生体試料に含まれる上記（ａ１）〜（ａ６）、（ｂ１）〜（ｂ６）及び（ｃ１）〜（ｃ６）の化合物を検出及び／又は測定する方法は、上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）の検出方法又は測定方法と同様である。
本発明の検出方法及び測定方法は、生体試料に含まれるＰＧＤ２の代謝物を簡便に検出及び／又は測定することができるため、ＰＧＤ２関連疾患の診断のために利用し得る。また、ＰＧＤ２関連疾患の予防及び／又は治療、並びに新たな治療法の開発のために利用し得る。例えば、ある個体由来の生体試料から化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）並びに上記（ａ１）〜（ａ６）、（ｂ１）〜（ｂ６）及び（ｃ１）〜（ｃ６）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物が検出され、一方、健常個体由来の生体試料においては該化合物が検出されないか、検出されても量が少ない場合には、該生体試料を採取した個体におけるＰＧＤ２関連疾患の発症、進行等が示唆される。
４．ＰＧＤ２関連疾患の診断方法
生体試料に含まれる式（Ｉ）で表わされる化合物、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、式（Ｖ）で表わされる化合物、式（ＶＩ）で表わされる化合物、式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定するＰＧＤ２関連疾患の診断方法も、本発明の１つである。生体試料としては、尿が好ましい。これらの化合物を検出及び／又は測定する方法としては、上述した方法が好適である。
本発明の診断方法においては、検出及び／又は測定する方法が、逆相カラムクロマトグラフィーを用い、上記（ｂ１）〜（ｂ６）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定する方法であることが好ましい。すなわち上記（ｂ１）〜（ｂ６）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定することにより、式（Ｉ）で表わされる化合物、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、式（Ｖ）で表わされる化合物、式（ＶＩ）で表わされる化合物、式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定することができる。
ＰＧＤ２は、アラキドン酸カスケードの中の代謝産物として知られており、アレルギー疾患、例えば、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性結膜炎等に関与する化学伝達物質の１つと考えられている。また、ＰＧＤ２は主として肥満細胞から産生及び遊離され、遊離されたＰＧＤ２は気管支収縮、血管透過性亢進、血管拡張又は収縮、粘液分泌促進、血小板凝集阻害作用等を示すことが知られている。さらにＰＧＤ２は、インビボ（in vivo）においても気道収縮や鼻閉症状を誘起することが報告されており、全身性マストサイト−シス（肥満細胞症）患者、鼻アレルギー患者、アトピー性皮膚炎患者、蕁麻疹患者等の病態局所でＰＧＤ２量の増加が認められる（N Engl J Med 1980; 303: 1400-4、Am Rev Respir Dis 1983; 128: 597-602、J Allergy Clin Immunol 1991; 88: 33-42、Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1987; 113: 179-83、J Allergy Clin Immunol 1988; 82: 869-772、J Immunol 1991; 146: 671-6、J Allergy Clin Immunol 1989; 83: 905-12、N Engl J Med 1986; 315: 800-4、Am Rev Respir Dis 1990; 142: 126-32、J Allergy Clin Immunol 1991; 87: 540-8、J Allergy Clin Immunol 1986; 78: 458-61）。従って、これらの疾患は、本発明におけるＰＧＤ２関連疾患に含まれる。
また、ＰＧＤ２は、神経活動（睡眠や摂食）、ホルモン分泌、疼痛、血小板凝集、グリコーゲン代謝、眼圧調整等にも関与しているとの報告もあるため、これらに関連する疾患もＰＧＤ２関連疾患に含まれる。
また、ＰＧＤ２は、その受容体の１つであるＤＰ受容体に結合することによりその作用を発揮するため、ＰＧＤ２がＤＰ受容体に作動して誘発される疾患もＰＧＤ２関連疾患として挙げられる。
ＤＰ介在性疾患、すなわちＤＰが介在するＰＧＤ２関連疾患としては、例えばアレルギー性疾患（例えば、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、食物アレルギー等）、全身性肥満細胞症、全身性肥満細胞活性化障害、アナフィラキシーショック、気道収縮、蕁麻疹、湿疹、にきび、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、副鼻腔炎、片頭痛、鼻茸、過敏性血管炎、好酸球増多症、接触性皮膚炎、痒みを伴う疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、接触性皮膚炎等）、フラッシングを伴う疾患、炎症、慢性閉塞性肺疾患、虚血再灌流障害、脳血管障害、自己免疫疾患、脳外傷、肝障害、移植片拒絶、関節リウマチ、胸膜炎、変形性関節症、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎、筋ジストロフィー、多発性筋炎、多発性硬化症又は睡眠障害（例えば、ナルコレプシー等）等が挙げられる。また、血小板凝集にも関わっており、これらの疾患もＰＧＤ２関連疾患として挙げられる。
本発明は従って、このような疾患の診断に有用である。
５．プロスタグランジンＤ２関連疾患治療薬の投与が有効な患者の選別方法
生体試料に含まれる式（Ｉ）で表わされる化合物、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、式（Ｖ）で表わされる化合物、式（ＶＩ）で表わされる化合物、式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定するＰＧＤ２関連疾患治療薬の投与が有効な患者の選別方法も、本発明の１つである。生体試料としては、尿が好ましい。これらの化合物を検出及び／又は測定する方法としては、上述した方法が好適である。
本発明の選別方法においては、検出及び／又は測定する方法が、逆相カラムクロマトグラフィーを用い、上記（ｂ１）〜（ｂ６）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定する方法であることが好ましい。すなわち上記（ｂ１）〜（ｂ６）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定することにより、式（Ｉ）で表わされる化合物、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、式（Ｖ）で表わされる化合物、式（ＶＩ）で表わされる化合物、式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定することができる。
前記４．ＰＧＤ２関連疾患の診断方法の項で列挙した疾患において、その成因は必ずしも一つとは限らない。例えば、アレルギー性鼻炎の原因としては、ＰＧＤ２以外にも、ヒスタミン、ロイコトリエン等が挙げられる。あるアレルギー性鼻炎患者において、ＰＧＤ２の関与が小さければ、ＤＰ拮抗剤を投与しても治療効果は小さい。反対に、ＰＧＤ２の関与が大きければ、ＤＰ拮抗剤を投与したときの治療効果は大きい。ＰＧＤ２の関与の程度は、生体試料に含まれるＰＧＤ２の代謝物の量、すなわち式（Ｉ）で表わされる化合物、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物、式（Ｖ）で表わされる化合物、式（ＶＩ）で表わされる化合物、式（ＶＩＩ）で表わされる化合物及び式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を検出及び／又は測定することにより判定することができるので、本発明は、ＰＧＤ２関連疾患治療薬の投与が有効な患者を選別する方法として有用である。
さらに、上記したＰＧＤ２関連疾患治療薬の投与が有効な患者の選別方法はＰＧＤ２関連疾患の重症度を判定する方法としても有用である。例えば、該選別方法においてＰＧＤ２の関与が深い疾患患者であると選別された患者の該疾患の重症度を軽症、中等症、重症であると判定することができる。つまり、健常個体由来の生体試料と比較して、該患者の生体試料から化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）並びに上記（ａ１）〜（ａ６）、（ｂ１）〜（ｂ６）及び（ｃ１）〜（ｃ６）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物が検出された程度に応じて、該患者の重症度を上記したように軽症、中等症、重症であると判定することができる。
６．診断用キット
上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を標品として検出及び／又は測定することを特徴とするＰＧＤ２関連疾患診断用キットも、本発明の１つである。このようなキットを用いると、生体試料に含まれる上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）を効率よく検出及び／又は測定することができる。検出及び／又は測定する方法としては、例えば、上記液体クロマトグラフィーを用いる方法のほか、放射免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ等）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ（例えば、ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ等））等を用いた方法が用いられる。例えば、放射免疫測定法で検出及び／又は測定を行う場合には、上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）そのもの若しくはその標識体が用いられる。このため、放射免疫測定法で検出及び／又は測定を行う場合のキットは、上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種、又はその標識体を少なくとも含むことが好ましい。また、酵素免疫測定法で検出及び／又は測定を行う場合には、上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）の抗体が用いられる。このため、酵素免疫測定法で検出及び／又は測定を行う場合のキットは、上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種に対する抗体を含むことが好ましい。
【００５７】
また、該ＰＧＤ２関連疾患診断用キットに標品として用いられる上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）としては、化学合成によって製造されたものを用いてもよく、生体由来の試料から本願で後述される実施例に記載された液体クロマトグラフィー等に付し、適当な条件下分取されたものを用いてもよい。標品として用いられるのものとして、好ましくは、化学合成によって製造された上記化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（Ｖ）、化合物（ＶＩ）、化合物（ＶＩＩ）及び化合物（ＶＩＩＩ）である。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．３Ｈ−ＰＧＤ２をサルに投与後の尿中代謝物分析
１−１．３Ｈで標識したＰＧＤ２
３Ｈで標識したＰＧＤ２（３Ｈ−ＰＧＤ２）はPerkinElmer社より７０％エタノール溶液として入手した。この３Ｈ−ＰＧＤ２は、比放射能が6.327 TBq/mmol、Radiochemical purity >97 %であった。
１−２．投与液の調製方法
公知の方法で製造した非標識ＰＧＤ２をエタノールに溶解し、５μｇ／ｍＬ溶液を調製した。３Ｈ−ＰＧＤ２（３．７ＭＢｑ）（３．７ＭＢｑ／ｍＬ、７０％エタノール溶液）に５μｇ／ｍＬの非標識ＰＧＤ２溶液２００μＬを添加した。この溶液を、ロータリーエバポレーターを用いて蒸発乾固させた後、生理食塩液２ｍＬを加え、氷冷下で３分間超音波処理した。激しく撹拌後、氷冷下で１分間放置した。氷冷下での超音波処理とその後の撹拌および氷冷下に１分放置する操作をさらに５回繰り返した後、生理食塩液約４ｍＬを加えて投与液を調製した。
１−３．投与液の投与と尿の採取
投与前１６時間絶食させた雄性カニクイザルに、１−２で調製した投与液全量を、橈側皮静脈内に単回投与した。３Ｈ−ＰＧＤ２を投与したサルを代謝ケージに収め、投与後０〜６時間までの尿を氷冷下採取した。
１−４．尿中代謝物の分析
採取した尿を遠心分離（１，８００ｇ、４℃、５分）した後、その上清を以下の条件でＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣのラジオクロマトグラムを図１に示す。
カラム:  ZORBAX SB-C18、5 μm、4.6 mm I.D.×250 mm L.（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)
溶離液:  A) 10 mmol/L Ammonium Acetate aq. (pH4.0)
B) CH3CN
Time (min)/B% = 0/10 → 120/70（リニアグラジエント）
流速:  1.0 mL/min
カラム温度：  ３５℃
注入量：  ５０μＬ
放射能検出:  フローシンチレーションアナライザー（RAD、PerkinElmer社製）
２．ＰＧＤ２をサルに投与後の尿中代謝物分析
２−１．ＰＧＤ２
ＰＧＤ２として、公知の方法で製造したものを用いた。
ＰＧＤ２は、例えばJ. Org. Chem. 38巻2115頁(1973)に記載の方法で合成することができる。また、Cayman社（カタログ番号  １２０１０）から購入することもできる。
２−２．投与液の調製
秤量したＰＧＤ２に０．０７ｗ／ｖ％炭酸水素ナトリウムを含む生理食塩液を添加して超音波処理を施し１ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。これを原液として、生理食塩液で希釈し、４８μｇ／ｍＬ溶液を調製後、０．４５μｍのセルロースアセテート製メンブレンフィルター（DISMIC、ADVANTEC社製）で濾過し、投与液とした。
２−３．コントロール尿の採取
一夜絶食させたサルの排尿を確認しプレ採尿を行った後、塩酸ケタミン（動物用ケタラール５０、三共エール薬品社製）１０ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与することで導入麻酔を行った。３７℃に設定した保温マット上に動物を横臥位に固定し、両側の後肢伏在静脈に留置針を挿入した。一方からは三方活栓を介してプロポフォール（１％ディプリバン、アストラゼネカ社製）と輸液用電解質液（ソリタＴ−３号、味の素ファルマ社製）とを投与した。プロポフォールは３ｍｇ／ｋｇをbolus投与後、１１０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎで持続投与した。輸液用電解質液は２〜３秒／滴の速度で点滴静注した。また他方は、生理食塩液が入った注射筒を接続した。塩酸リドカインゼリー（キシロカインゼリー、アストラゼネカ社製）を塗布した気管内チューブ（シェリダンＣＦ気管内チューブ、ＫＥＮＤＡＬＬ社製）を気管へ挿管後、人工呼吸器（ＳＮ−４８０−５、シナノ製作所社製）に接続し、実験中は約１０ｍＬ／ｋｇ、２５回／分の送気を行った。
【００５９】
導入麻酔から約５０分後、生理食塩液の静脈内持続投与を開始し、０．５ｍＬ／ｋｇ／ｈの速度で投与開始から３時間後まで持続投与した。投与終了後の動物は、自発呼吸を確認後、輸液用電解質液の点滴を止め、抜管し、飼育ケージへ戻した。その後、投与８時間後まで排尿ごとに採尿を行った。
【００６０】
採尿及びサンプル調製は以下のように行った。採尿バットに尿が確認された場合は、遠心管に移し、３，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間で遠心分離を行った後、上清を別チューブに回収した。回収した尿サンプルは−８０℃で凍結保存した。
２−４．非標識ＰＧＤ２投与尿の採取
一夜絶食したサルの排尿を確認しプレ採尿を行った後、塩酸ケタミン（動物用ケタラール５０、三共エール薬品社製）１０ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与することで導入麻酔を行った。３７℃に設定した保温マット上に動物を横臥位に固定し、両側の後肢伏在静脈に留置針を挿入した。一方からは三方活栓を介してプロポフォール（１％ディプリバン、アストラゼネカ社製）と輸液用電解質液（ソリタＴ−３号、味の素ファルマ社製）とを投与した。プロポフォールは３ｍｇ／ｋｇをbolus投与後、１１０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎで持続投与した。輸液用電解質液は２〜３秒／滴の速度で点滴静注した。また他方は、ＰＧＤ２投与液が入った注射筒を接続した。塩酸リドカインゼリー（キシロカインゼリー、アストラゼネカ社製）を塗布した気管内チューブ（シェリダンＣＦ気管内チューブ、ＫＥＮＤＡＬＬ社製）を気管へ挿管後、人工呼吸器（ＳＮ−４８０−５、シナノ製作所社製）に接続し、実験中は約１０ｍＬ／ｋｇ、２５回／分の送気を行った。
【００６１】
導入麻酔から約５０分後、４８μｇ／ｍＬ  ＰＧＤ２投与液を０．５ｍＬ／ｋｇ／ｈ（ＰＧＤ２を２４μｇ／ｋｇ／ｈ）の速度で３時間静脈内持続投与した。投与終了後の動物は、自発呼吸を確認後、輸液用電解質液の点滴を止め、抜管し、飼育ケージへ戻した。その後、投与８時間後まで排尿ごとに採尿を行った。
【００６２】
採尿及びサンプル調製は以下のように行った。採尿バットに尿が確認された場合は、遠心管に移し、３，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間で遠心分離を行った後、上清を別チューブに回収した。回収した尿サンプルは−８０℃で凍結保存した。
２−５．サル尿中ＰＧＤ２代謝物のＬＣ−ＭＳによる分析
２−５−１．ＬＣ−ＭＳ分析用サンプルの調製
２−３及び２−４で採取した尿サンプルのうち、生理食塩液投与終了後最初の採尿サンプル（Ｃ１尿）又は非標識ＰＧＤ２投与液投与終了後最初の採尿サンプル（Ｓ１尿）を以下の手順で処理し、ＬＣ−ＭＳ分析およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用サンプルを調製した。
Ｃ１尿及びＳ１尿各１ｍＬを４℃、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各上清を採取して各々に１Ｎ  ＨＣｌ  ５０μＬを加えた。ＭｅＯＨ  １ｍＬ２回と水１ｍＬ２回を用いてＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ（Ｗａｔｅｒｓ社）固相抽出カラム１ｍＬ用のコンディショニングを行い、減圧下Ｃ１尿及びＳ１尿の各上清の試料負荷を行った。各カラムを水１ｍＬ２回で洗浄した後、ＭｅＯＨ  １ｍＬ２回で溶出を行い、Ｃ１尿及びＳ１尿の各溶出液を遠心濃縮機で蒸発乾固後、水各２００μＬで再溶解し、ＬＣ−ＭＳ分析用サンプルを調製した。
２−５−２．ＬＣ−ＭＳによる分析
２−５−１で調製したＣ１尿及びＳ１尿のＬＣ−ＭＳ分析用サンプルを用いてＬＣ−ＭＳ分析及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
ＬＣ−ＭＳ分析
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：          ZORBAX SB-C18、5 μm、4.6 mm I.D.×250 mm L.（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)
溶離液：          A) 10 mmol/L Ammonium Acetate aq. (pH4.0)
B) CH3CN
Time (min)/B% = 0/10 → 120/70
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
注入量：          ５０μＬ
＜ＭＳ条件＞
測定機器： Applied Biosystems社製 QTRAP
Ion Source： Turbo Spray
Polarity： Negative 
Scan Mode： Enhanced MS
Source Temp.：５００℃
Declustering Potential：−３０ｖ
Ionspray Voltage：−４５００ｖ
ネブライザーガス：５０ｐｓｉ
ターボガス：８０ｐｓｉ質量範囲：ｍ／ｚ  ２００−８００
Ｃ１尿及びＳ１尿のＬＣ−ＭＳ分析により、図１中の放射能クロマトグラムの主要代謝物である化合物Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに相当するピークについて表1に示す結果が得られた。
【００６３】
【表１】
2010002416.tif 000015
【００６４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：          ZORBAX SB-C18、5 μm、4.6 mm I.D.×250 mm L.（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)
溶離液：          A) 0.1% Formic acid aq.
B) 0.1% Formic acid in CH3CN
Time (min)/B% = 0/10 → 70/55
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
注入量：５０μＬ
＜MS/MS条件＞
測定機器： Thermo Fisher Scientific社製 LTQ-Orbitrap XL
イオン化法: Negative ESI 
キャピラリー温度：３５０ｄｅｇ．
スプレー電圧：４ｋＶ
Ｓｅａｔｈガス流速：４０ａｒｂ．
Ａｕｘガス流速：５ａｒｂ．
キャピラリー電圧：−２０Ｖ
チューブレンズ電圧：−４０Ｖ
ＨＣＤ  ＣＥ：５０％、９０％、１１０％
コリジョンエネルギー：３５％
設定分解能： MS1 30,000（m/z 400）、MS/MSn 7,500（m/z 400）
Ｃ１尿及びＳ１尿の分析用サンプルを用いて測定を行い、ＳＩＥＶＥソフトウェアを用いてＰＧＤ２投与によりＳ１尿中にのみ増加したピークを抽出した。このうちＬＣ−ＭＳ分析で得られた化合物Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに対応するｍ／ｚ値の各ピークについてその精密質量測定値から分子式を、またＭＳ／ＭＳ測定の情報からその構造推定を行った。なお、以下の開裂スキーム中、ｅｘｐは測定値を表わし、ｔｈｅｏｒは理論値を表わす。
（１）化合物Ｉ
保持時間  １４．４分
m/z 329.1607 (M-H)- C16H25O7
開裂スキーム
【００６５】
【化１３】
2010002416.tif 000016
【００６６】
これらのデータから化合物Ｉの構造を以下のように推定した。
【００６７】
化合物Ｉ
【００６８】
【化１４】
2010002416.tif 000017
【００６９】
化合物Ｉの分子式  Ｃ１６Ｈ２６Ｏ７、Ｍ．Ｗ．３３０
（２）化合物ＩＩＩ
保持時間  １８．７分
m/z 327.0763 (M-H)- C16H23O7
開裂スキーム
【００７０】
【化１５】
2010002416.tif 000018
【００７１】
これらのデータから化合物ＩＩＩの構造を以下のように推定した。
【００７２】
化合物III
【００７３】
【化１６】
2010002416.tif 000019
【００７４】
化合物ＩＩＩの分子式  Ｃ１６Ｈ２４Ｏ７、Ｍ．Ｗ．３２８
（３）化合物Ｖ
保持時間  ４１．８分
m/z 299.186 (M-H)- C16H27O5
開裂スキーム
【００７５】
【化１７】
2010002416.tif 000020
【００７６】
これらのデータから化合物Ｖの構造を以下のように推定した。
【００７７】
化合物V
【００７８】
【化１８】
2010002416.tif 000021
【００７９】
化合物Ｖの分子式  Ｃ１６Ｈ２８Ｏ５、Ｍ．Ｗ．３００
（４）化合物ＶＩ
保持時間  ４９．４分
m/z 297.171 (M-H)- C16H25O5
開裂スキーム
【００８０】
【化１９】
2010002416.tif 000022
【００８１】
これらのデータから化合物ＶＩの構造を以下のように推定した。
【００８２】
化合物VI
【００８３】
【化２０】
2010002416.tif 000023
【００８４】
化合物ＶＩの分子式  Ｃ１６Ｈ２６Ｏ５、Ｍ．Ｗ．２９８
（５）化合物ＶＩＩ
保持時間  ５１．９分
m/z 325.202 (M-H)- C18H29O5
分子式  Ｃ１８Ｈ３０Ｏ５、Ｍ．Ｗ．３２６
（６）化合物ＶＩＩＩ
保持時間  ５９．４分
m/z 323.187 (M-H)- C18H27O5
分子式  Ｃ１８Ｈ２８Ｏ５、Ｍ．Ｗ．３２４
２−６．サル尿中ＰＧＤ２代謝物のＬＣ−ＮＭＲ／ＭＳによる分析
２−６−１．ＬＣ−ＮＭＲ／ＭＳ分析用サンプルの調製
Ｓ１尿１２ｍＬに飽和コハク酸水溶液７ｍＬを加え、４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後上清を採取した。この上清に酢酸エチル１２ｍＬを加えよく振とうし、４℃、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後有機相を採取した。分離した水相に酢酸エチル１２ｍＬを加えよく振とうし、４℃、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後有機相を採取した。有機相を合わせて水浴上２０℃でロータリーエバポレーターを用いて減圧下濃縮乾固し、ＣＤ３ＯＤ  １００μＬに溶解させ、０．２μｍのフィルターを用いて遠心ろ過を行いＬＣ−ＮＭＲ／ＭＳ分析用サンプルを調製した。
２−６−２．ＬＣ−ＮＭＲ／ＭＳによる分析
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：          ZORBAX SB-C18、5 μm、 4.6 mm I.D.×250 mm L.（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)
溶離液：          A) D2O containing 0.01% DCO2D
B) CD3CN
Time (min)/B% = 0/10 → 75/45
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
注入量：          ５０μＬ
＜ＭＳ条件＞
イオン化法：Negative ESI
質量範囲：ｍ／ｚ  ２００−９００
＜ＮＭＲ条件＞
測定機器：Varian社製600MHz核磁気共鳴分析装置 VNMRS 600
プローブ：600MHz 1H{13C/15N}5 mm Φ PFG Triple Resonance 13C Enhanced Cold Probe
分画採取法：フラクションループ法
化学シフト基準：      ＴＳＰ−ｄ４  （０ｐｐｍ）
測定法：          １次元  １Ｈ  ＮＭＲ、wetTOCSY法
２−６−１で調製したＬＣ−ＮＭＲ／ＭＳ分析用サンプルをＨＰＬＣに注入し、保持時間とｍ／ｚ値を用いてフラクションループに採取した。採取した分画のうち化合物ＶＩＩ及び化合物ＶＩＩＩに相当する分画についてＮＭＲで測定を行い、以下のデータを得た。
化合物ＶＩＩ
保持時間５６．５分、ｍ／ｚ  327 (M-3H+2D)-
δ(ppm) 5.70 (m, 1H), 5.55 (m, 1H), 4.23 (m, 2H), 3.12 (m, 2H), 2.62 (m, 1H), 2.52 (m, 1H), 2.50 (m, 2H), 2.23 (m, 2H), 1.90 (m, 1H), 1.75-1.50 (m, 5H), 1.35-1.15 (m, 4H), 0.84 (m, 3H)
化合物ＶＩＩＩ
保持時間６３．６分、ｍ／ｚ  324 (M-2H+D)-
δ(ppm) 5.70 (m, 1H), 5.55 (m, 1H), 3.12 (m, 2H), 2.60-2.10 (m, 10H), 1.82 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.52 (m, 2H), 1.35-1.20 (m, 4H), 0.86 (m, 3H)
ＬＣ−ＮＭＲ／ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析結果より、化合物ＶＩＩ及び化合物ＶＩＩＩの構造を以下のように推定した。
【００８５】
化合物VII
【００８６】
【化２１】
2010002416.tif 000024
【００８７】
化合物ＶＩＩの分子式  Ｃ１８Ｈ３０Ｏ５、Ｍ．Ｗ．３２６
化合物VIII
【００８８】
【化２２】
2010002416.tif 000025
【００８９】
化合物ＶＩＩＩの分子式  Ｃ１８Ｈ２８Ｏ５、Ｍ．Ｗ．３２４
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、ＰＧＤ２関連疾患の診断、プロスタグランジンＤ２関連疾患治療薬の投与が有効な患者の選別、ＰＧＤ２関連疾患の治癒の確認、ＰＧＤ２関連疾患の新たな治療法の開発等に有用である。
【図１】
2010002416.tif 000031