(57)【要約】  【課題】ナシ属植物の倍数体を人為的に得ることができる、ナシ属植物の倍数体の作出方法、およびナシ属植物の倍数体を提供する。  【解決手段】ナシ属植物の芽条を減圧下において倍数体誘発剤で処理する減圧倍数化工程を有する、ナシ属植物の倍数体の作出方法とした。このとき、減圧倍数化工程が、ナシ属植物の芽条を倍数体誘発剤を含む倍数体誘発溶液に浸漬させた状態で、周囲の雰囲気を減圧する減圧処理工程と、減圧処理工程で得られた芽条を倍数体誘発溶液に浸漬させた状態のままで、減圧下にある周囲の雰囲気を徐々に常圧に戻す常圧復帰工程と、常圧復帰工程で得られた芽条を常圧雰囲気下で倍数体誘発溶液に所定時間浸漬させておく常圧浸漬工程とを備えることが好ましい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナシ属植物の芽条を減圧下において倍数体誘発剤で処理する減圧倍数化工程を有する、ナシ属植物の倍数体の作出方法。
【請求項２】
減圧倍数化工程が、
ナシ属植物の芽条を倍数体誘発剤を含む倍数体誘発溶液に浸漬させた状態で、周囲の雰囲気を減圧する減圧処理工程と、
該減圧処理工程で得られた芽条を倍数体誘発溶液に浸漬させた状態のままで、減圧下にある周囲の雰囲気を徐々に常圧に戻す常圧復帰工程と、を備える、
請求項１記載のナシ属植物の倍数体の作出方法。
【請求項３】
減圧処理工程では、周囲の雰囲気が５０ｋＰa以下に減圧され、
常圧復帰工程では、減圧下にある周囲の雰囲気が５分以上の時間をかけて徐々に常圧に戻される、
請求項２記載のナシ属植物の倍数体の作出方法。
【請求項４】
減圧倍数化工程が、
常圧復帰工程の後、常圧復帰工程で得られた芽条を常圧雰囲気下で倍数体誘発溶液に所定時間浸漬させておく常圧浸漬工程を備える、
請求項２又は３記載のナシ属植物の倍数体の作出方法。
【請求項５】
倍数体誘発溶液が、界面活性剤を含むものである、
請求項２〜４何れか記載のナシ属植物の倍数体の作出方法。
【請求項６】
減圧倍数化工程の後に、
倍数体誘発剤で処理された芽条を洗浄して、芽条に付着した倍数体誘発剤を除去する芽条洗浄工程と、
該芽条洗浄工程で得られた芽条のうち、倍数体に変異したものを選別する倍数体選別工程と、を有する、
請求項１〜５何れか記載のナシ属植物の倍数体の作出方法。
【請求項７】
倍数体選別工程が、
芽条洗浄工程で得られた芽条の先端部を切り出して培養する倍数体培養工程と、
該倍数体培養工程で得られた芽条の先端部から先端葉を採取して倍数体細胞の組織占有率を評価し、倍数体細胞の組織占有率が所定割合以上の芽条のみを選抜する選抜工程と、を備え、
前記倍数体培養工程と前記選抜工程の後、前記選抜工程で選抜された芽条を芽条洗浄工程で得られた芽条の代わりに用いて、前記倍数体培養工程と前記選抜工程とからなる一連の工程を、複数回繰り返して行う工程である、
請求項６記載のナシ属植物の倍数体の作出方法。
【請求項８】
複数回行われる各選抜工程のうち最後の選抜工程で、倍数体細胞の組織占有率が５０％以上であり、かつ直近の３回の選抜工程で倍数体細胞の組織占有率が安定していた芽条のみを選抜して、周縁キメラの倍数体又は完全な倍数体を得る、請求項７記載のナシ属植物の倍数体の作出方法。
【請求項９】
複数回行われる各選抜工程のうち最後の選抜工程で、倍数体細胞の組織占有率が１００％の芽条のみを選抜して、完全な倍数体を得る、請求項７又は８記載のナシ属植物の倍数体の作出方法。
【請求項１０】
倍数体誘発剤がコルヒチンである、
請求項１〜９いずれか記載のナシ属植物の倍数体の作出方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか記載のナシ属植物の倍数体の作出方法で得られうる、ナシ属植物の完全な倍数体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はナシ属植物の倍数体を人為的に作出する方法、および人為的に作出されたナシ属植物の倍数体に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の染色体を倍加して得られる倍数体植物は、生産性や形質を改良する上で有用であり、種々の作物において利用、実用化されている。このような倍数体植物を人為的に作出する方法として、芽条（茎頂）、脇芽、根端部等を倍数体誘発剤で処理する方法が知られている。このような倍数化処理に用いられる倍数体誘発剤としては、コルヒチン、コルセミド、ピンプラスチン、ポドフィロトキシン、笑気ガス、クマリン等がある。
【０００３】
ここで、特許文献１には、ユーカリ属であるシトリオドーラ(レモンユーカリ)のシュート（芽条）をコルヒチン処理して倍数体を得る方法が記載されている。また、特許文献２には、薬用ニンジンの不定胚集塊をコルヒチン溶液に浸漬して４倍体を誘導する方法が記載されている。
【０００４】
一方、非特許文献１には、本来２倍体であるニホンナシに関し、新潟県月潟村で発見された新興の枝変わりの２系統（友坂系、時田系）が、２倍体細胞と４倍体細胞とが混在したキメラの倍数体である可能性が高い旨、報告されている。
ここで、植物の成長点（頂端分裂組織）は一般的に３層からなり、これらの組織起源層は外側から第１層（Ｌ−Ｉ）、第２層（Ｌ−ＩＩ）、第３層（Ｌ−ＩＩＩ）と呼ばれており、キメラの倍数体とはひとつの分裂組織の中に２つ以上の異なる倍数体の細胞が共存している状態を指している。また、キメラの種類は、周縁キメラ、区分キメラ及び周縁区分キメラの３つに分類されている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−３２０９９４号公報（段落００２０、００２１）
【特許文献２】特開平６−１５３７３１号公報（段落０００６）
【非特許文献１】ニホンナシ枝変わり系統の倍数性判別  園学雑７２別２,’０３［ポ１５６  遺伝・育種］
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ナシ属植物においては、上記非特許文献１にあるような突然変異による倍数体の報告例は存在するものの、人為的に倍数体を得ることができなかった。
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するものであり、ナシ属植物の倍数体を人為的に得ることができる、ナシ属植物の倍数体の作出方法、およびナシ属植物の倍数体を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明のナシ属植物の倍数体の作出方法は、ナシ属植物の芽条（成長点組織を含んでいる）を減圧下において倍数体誘発剤で処理する減圧倍数化工程を有する、ナシ属植物の倍数体の作出方法とした。
【０００９】
本件発明者は、従来の方法では、ナシ属植物について人為的に倍数体を得ることができなかったことに関し、コルヒチン等の倍数体誘発剤がナシ属植物の組織に十分作用していないのではないかと考え、試行錯誤の結果、減圧下において倍数体誘発剤を作用させるという技術的思想に到達し、本発明に至ったのである。
この作出方法によって、人為的にナシ属植物の倍数体を得ることができる。即ち、減圧下において倍数体誘発剤を作用させることによって、植物組織（成長点組織）の間隙に存在する空気が排出され、ここに倍数体誘発剤を浸透させることができ、その結果、倍数体誘発剤を植物組織に有効に作用させることができるのである。
倍数体誘発剤としては、種々のものを用いることが可能であるが、コルヒチンを用いることが好ましい。
【００１０】
このとき、減圧倍数化工程が、ナシ属植物の芽条を倍数体誘発剤を含む倍数体誘発溶液に浸漬させた状態で、周囲の雰囲気を減圧する減圧処理工程と、減圧処理工程で得られた芽条を倍数体誘発溶液に浸漬させた状態のままで、減圧下にある周囲の雰囲気を徐々に常圧に戻す常圧復帰工程と、を備える、ナシ属植物の倍数体の作出方法とすることができる。
ここで、周囲の雰囲気を減圧するとは、芽条が浸漬している倍数体誘発溶液の周囲の雰囲気を減圧することを示す。例えば、芽条と倍数体誘発溶液が入った容器（栓等がされておらず容器内側と外側が連通している）を減圧装置の内部に投入して、減圧装置の内部を減圧することで、芽条が浸漬している倍数体誘発溶液の周囲の雰囲気を減圧することができる。
このように周囲の雰囲気を減圧することで、ナシ属植物の植物組織間隙に存在する空気が排出されるのである。
【００１１】
この作出方法によれば、ナシ属植物の芽条を倍数体誘発剤を含む倍数体誘発溶液に浸漬させた状態で周囲の雰囲気を減圧する減圧処理工程を備えることで、植物組織間隙に存在する空気が排出され、ここに倍数体誘発剤を浸透させることができる。
また、減圧下にある、倍数体誘発溶液の周囲の雰囲気を徐々に常圧に戻す常圧復帰工程を備えることで、倍数体誘発剤が植物組織間隙の全体にムラなく浸透しやすくなるとともに、植物組織に与えるダメージを少なくできるため、より多くの倍数体を得ることができる。
【００１２】
ここで、減圧処理工程では、周囲の雰囲気が５０ｋＰa以下に減圧され、常圧復帰工程では、減圧下にある周囲の雰囲気が５分以上の時間をかけて徐々に常圧に戻される、ナシ属植物の倍数体の作出方法とすることが好ましい。
ここで、減圧処理工程における周囲の雰囲気は、より好ましくは３０ｋＰa以下の圧力、最も好ましくは１０ｋＰa以下の圧力である。
また、常圧復帰工程において減圧下にある周囲の雰囲気を常圧に戻す時間は、より好ましくは１０分以上、最も好ましくは１５分以上である。周囲の雰囲気を常圧に戻す際には、単位時間あたりの回復圧力がほぼ等しくなるように直線的に常圧に戻すことが好ましい。
【００１３】
このとき、減圧倍数化工程が、常圧復帰工程の後、常圧復帰工程で得られた芽条を常圧雰囲気下で倍数体誘発溶液に所定時間浸漬させておく常圧浸漬工程を備える、ナシ属植物の倍数体の作出方法とすることが好ましい。
【００１４】
この作出方法によれば、一定期間、倍数体誘発剤を植物組織に作用させることができ、より一層、倍数体を得ることが容易になる。
ここで、「浸漬させておく」とは、静置状態で浸漬させておくだけでなく、例えば、倍数体誘発溶液に浸漬させた芽条を水平ロータリーシェイカー等で撹拌することも含む概念である。
浸漬させておく時間は、頂端分裂組織における始源細胞群のほぼ全てが細胞分裂の中期を迎えるまでの時間が好ましく、ナシ属植物の種類にもよるが、３０〜１００時間とすることが好ましい。浸漬させておく時間は、より好ましくは４０〜８５時間であり、最も好ましくは４８〜７２時間である。
【００１５】
またこのとき、倍数体誘発溶液が、界面活性剤を含むものである、ナシ属植物の倍数体の作出方法とすることも好ましい。
【００１６】
この作出方法によれば、倍数体誘発剤を植物組織により有効に作用させることができる。その作用メカニズムは十分に解明されていないが、植物組織間隙に倍数体誘発剤をより浸透させることができるとともに、倍数体誘発剤が細胞壁や細胞膜を透過しやすくなるためであると推察される。
【００１７】
また、減圧倍数化工程の後に、倍数体誘発剤で処理された芽条を洗浄して、芽条に付着した倍数体誘発剤を除去する芽条洗浄工程と、芽条洗浄工程で得られた芽条のうち、倍数体に変異したものを選別する倍数体選別工程と、を有する、ナシ属植物の倍数体の作出方法とすることもできる。
【００１８】
このとき、倍数体選別工程が、芽条洗浄工程で得られた芽条の先端部を切り出して培養する倍数体培養工程と、倍数体培養工程で得られた芽条の先端部から先端葉を採取して倍数体細胞の組織占有率を評価し、倍数体細胞の組織占有率が所定割合以上の芽条のみを選抜する選抜工程と、を備え、倍数体培養工程と選抜工程の後、選抜工程で選抜された芽条を芽条洗浄工程で得られた芽条の代わりに用いて、倍数体培養工程と選抜工程とからなる一連の工程を、複数回繰り返して行う工程である、ナシ属植物の倍数体の作出方法とすることが好ましい。ここで、倍数体選別工程が、倍数体培養工程と選抜工程とからなる一連の工程を、５回以上行う工程である、ナシ属植物の倍数体の作出方法とすることが好ましい。
【００１９】
この作出方法によれば、倍数体として安定した、ナシ属植物の倍数体を選別することができるようになる。
【００２０】
このとき、複数回行われる各選抜工程のうち最後の選抜工程で、倍数体細胞の組織占有率が５０％以上であり、かつ直近の３回の選抜工程（最後の選抜工程を含む）で倍数体細胞の組織占有率が安定していた芽条のみを選抜して、周縁キメラの倍数体又は完全な倍数体を得る、ナシ属植物の倍数体の作出方法とすることが好ましい。ここで、直近の３回の選抜工程で倍数体細胞の組織占有率が、最後の選抜工程における倍数体細胞の組織占有率に対して±１０％の範囲で安定していた芽条のみを選抜することが好ましい。
【００２１】
この作出方法によれば、２倍体細胞と４倍体細胞とが混在したキメラの倍数体（Ｃｈｉｍｅｒａｅ  ４Ｘ）のナシ属植物のうちでも先祖返りしにくい周縁キメラのものと、完全な倍数体（Ｓｏｌｉｄ  ４Ｘ）のナシ属植物とを選抜することができる。ここで、「完全な倍数体」とは、第１層（Ｌ−Ｉ）、第２層（Ｌ−ＩＩ）、第３層（Ｌ−ＩＩＩ）の全てが倍数体（４倍体）の細胞である状態を指している。
また、キメラの倍数体のうち、区分キメラと周縁区分キメラのものは、先祖返りしやすいが、倍数体培養工程と選抜工程を繰り返すうちに倍数体細胞の組織占有率が大きく低下するため、上記作出方法で排除することができる。
【００２２】
このとき、複数回行われる各選抜工程のうち最後の選抜工程で、倍数体細胞の組織占有率が１００％の芽条のみを選抜して、完全な倍数体を得る、ナシ属植物の倍数体の作出方法とすることが好ましい。
【００２３】
この作出方法によれば、完全な倍数体のナシ属植物（ナシ属植物の完全な倍数体）を選抜することができる。完全な倍数体のナシ属植物は、２倍体細胞と４倍体細胞とが混在したキメラの倍数体のものと比較して、より大きな実が得られるとともに、先祖返りする可能性が殆どないものであり、著しく有用性が高い。
【００２４】
また、このナシ属植物の倍数体の作出方法で得られうる、ナシ属植物の完全な倍数体も有用である。このナシ属植物の完全な倍数体は人為的に得られたものである。
【００２５】
ここで、前述した非特許文献１には、ニホンナシに関し、新潟県月潟村で発見された新興の枝変わりの２系統（友坂系、時田系）が、２倍体細胞と４倍体細胞とが混在したキメラの倍数体である可能性が高い旨記載されているが、仮にそうであったとしても、これらは、４倍体細胞のみからなる完全な倍数体とは異なるものであり、本発明で得られる完全な倍数体（完全な４倍体）のナシ属植物は、今まで存在していなかったものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、ナシ属植物の倍数体を人為的に得ることができる、ナシ属植物の倍数体の作出方法、およびナシ属植物の倍数体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明のナシ属植物の倍数体の作出方法、およびナシ属植物の倍数体を詳細に例示説明する。本発明のナシ属植物の倍数体の作出方法は、ナシ属植物の芽条を減圧下において倍数体誘発剤で処理する減圧倍数化工程を有するものである。なお、図１には、本発明のナシ属植物の倍数体の作出方法のフローを例示してある。
【００２８】
Ａ［芽条の準備］
本発明に用いる芽条としては、種々のナシ属植物のものを用いることができる。例えば、ニホンナシ（Pyrus pyrifolia ）、セイヨウナシ（Pyrus communis）、チュウゴクナシ（Pyrus ussuriensis）、マメナシ（Pyrus calleryana）、マンシュウマメナシ（Pyrus betulaefolia）等を用いることができる。ここで、ニホンナシ（Pyrus pyrifolia ）としては、例えば、二十世紀、幸水、豊水、長十郎、王秋、大原紅、新甘泉、なつひめ等を用いることができる。セイヨウナシ（Pyrus communis）としては、例えば、シルバーベル, ラ・フランス, ル・レクチェ等を用いることができる。チュウゴクナシ（Pyrus ussuriensis）としては、例えば、 鴨梨、慈梨、紅梨等を用いることができる。これらのナシ属植物は、全て２倍体のものである。
【００２９】
また、本発明では、ナシ属植物の芽を採取して無菌的に成長点培養して得られた芽条を用いることが好ましい。このとき、培養時には例えばオーキシン、サイトカイニン、及びジベレリンを添加した培地を用いて、頂芽優勢の組織増殖を誘導しておくことが好ましい。
【００３０】
Ｂ［減圧倍数化工程］
次に、上記ナシ属植物の芽条を倍数化する減圧倍数化工程を説明する。この減圧倍数化工程は、ナシ属植物の芽条を減圧下において倍数体誘発剤で処理して倍数体（４倍体）を得る工程であり、以下に述べるように、例えば、減圧処理工程と常圧復帰工程と常圧浸漬工程とを備えたものとすることができる。
【００３１】
１．減圧処理工程
減圧処理工程は、ナシ属植物の芽条を倍数体誘発剤を含む倍数体誘発溶液に浸漬させた状態で、周囲の雰囲気を減圧する工程である。以下、倍数体誘発剤、倍数体誘発溶液、および減圧処理する方法について例示説明する
【００３２】
○倍数体誘発剤
減圧処理工程で用いられる倍数体誘発剤は特に制限されず、例えば、コルヒチン、コルセミド、ピンプラスチン、ポドフィロトキシン、笑気ガス、クマリンを用いることができる。なかでも、コルヒチンが、微小管の重合を阻害する能力が高く、好ましい。
【００３３】
○倍数体誘発溶液
倍数体誘発剤を含む倍数体誘発溶液としては、例えば、ＷＰＭ（Loyd and McCown Prop. Int. Plant Prop. Soc.、30:421-427、1980）培地をベースに少量の倍数体誘発剤を配合したものを用いることができる。
倍数体誘発剤の濃度としては、ナシ属植物の種類にも依るが、０．１〜０．５％（Ｗ/Ｖ）とすることが好ましい。倍数体誘発剤の濃度が０．１％よりも高いと、倍数体がより得られやすくなる。また、倍数体誘発剤の濃度が０．５％よりも低いと、芽条に与えるダメージが少なくなり、やはり倍数体がより得られやすくなる。
【００３４】
また、倍数体誘発溶液には、倍数体誘発剤に加えて界面活性剤を加えることが好ましい。これによって、より一層、倍数体が得られやすくなる。界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０(＝Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate  東京化成工業株式会社)を用いることができる。界面活性剤は、０．０１〜０．１％（Ｖ/Ｖ）配合することが好ましい。界面活性剤を０．０１％より多く配合すると、倍数体がより得られやすくなる。また、０．１％より多く配合してもあまり効果に影響を与えない。界面活性剤は、０．０２〜０．０６％（Ｖ/Ｖ）配合することがより好ましい。
【００３５】
○減圧処理する方法
上記倍数体誘発溶液とナシ属植物の芽条（成長点組織を含んでいる）を、例えば、培養フラスコに入れる。このとき、倍数体誘発溶液は、ナシ属植物の芽条が浸かる程度の量を、培養フラスコに入れる。培養フラスコの開口部には完全に栓をすることなく、例えば、ミリシールや綿栓などのフィルターを取り付けた栓をするなどして周囲の圧力変化に応じて培養フラスコ内の圧力も変化するようにしておく。
【００３６】
次に、倍数体誘発溶液とナシ属植物の芽条が入った培養フラスコを、例えば、真空デシケータの内部に投入する。そして、真空デシケータの扉を閉じて、真空デシケータの内部を減圧雰囲気にする。これによって、芽条が浸漬している倍数体誘発溶液の周囲の雰囲気が減圧されることになる。
【００３７】
ここで、真空デシケータの内部を圧力が５０ｋＰa以下の減圧雰囲気にすることが好ましい。真空デシケータの内部の雰囲気（周囲の雰囲気）が５０ｋＰa以下の圧力であると、植物組織間隙に存在する空気がより排出されやすくなり、倍数体誘発剤を植物組織により有効に作用させることができる。真空デシケータの内部の雰囲気は、より好ましくは３０ｋＰa以下の圧力、最も好ましくは１０ｋＰa以下の圧力である。内部の雰囲気の圧力下限値は特に制限されず、真空ポンプの能力に依り、通常、１０-9Ｐaが限界である。
また、常圧から減圧状態になるまでの時間は、特に制限されず、目標とする減圧雰囲気と真空ポンプの能力によるところが大きいが１〜１０分であることが好ましく、２〜５分であることがより好ましい。
【００３８】
目標とする減圧雰囲気に到達したら、所定時間、減圧雰囲気を維持する。減圧雰囲気を維持する時間（以下、減圧維持時間と称する）は、５分〜１時間であることが好ましい。減圧維持時間が５分以上であると、植物組織間隙に存在する空気をより排出させやすくなり、倍数体誘発剤を植物組織により有効に作用させることができる。一方、減圧維持時間が１時間以下であると、芽条に対するダメージを抑えることができる。減圧維持時間は、より好ましくは１０〜３０分であり、最も好ましくは１５〜２５分である。所定時間、減圧雰囲気を維持したら、真空デシケータの内部雰囲気を常圧に戻すことになる。このとき、以下に述べるような常圧復帰工程を経ることができる。
【００３９】
２．常圧復帰工程
常圧復帰工程は、前述した減圧処理工程で得られた芽条を、倍数体誘発溶液に浸漬させた状態のままで、減圧下にある周囲の雰囲気を徐々に常圧に戻す工程である。以下、この常圧復帰工程を例示説明する。
【００４０】
減圧下にある真空デシケータの内部に、例えば空気流入用のバルブを開いて、空気を徐々に流入させる。これによって、真空デシケータ内部の雰囲気（減圧下にある周囲の雰囲気）を徐々に常圧に戻すことができる。このとき、真空デシケータ内部の雰囲気（減圧下にある周囲の雰囲気）を、５分以上の時間をかけて徐々に常圧に戻すことが好ましい。具体的には、真空デシケータの内部容量と常圧に戻すための目標時間とから決定される単位時間あたりの空気流入量を算出し、この算出数値に空気流量計の値が対応するように、空気流入用のバルブを開くことができる。このようにすれば、真空デシケータ内部の雰囲気（減圧下にある周囲の雰囲気）を、単位時間あたりの回復圧力が等しくなるように直線的に常圧に戻すことができる。
【００４１】
この常圧復帰工程の後、以下に述べるような常圧浸漬工程を経ることができる。
【００４２】
３．常圧浸漬工程
常圧浸漬工程は、常圧復帰工程の後、この常圧復帰工程で得られた芽条を常圧雰囲気下で倍数体誘発溶液に所定時間浸漬させて、頂端分裂組織における始源細胞群のほぼ全てが細胞分裂の中期に至るまでの一定期間、倍数体誘発剤を細胞に作用させる工程である。以下、この常圧浸漬工程を例示説明する。
【００４３】
常圧復帰工程の後、倍数体誘発溶液とナシ属植物の芽条が入った培養フラスコを真空デシケータから取り出す。そして、取り出された培養フラスコを、例えば、水平ロータリーシェイカーで撹拌しながらインキュベーションするのである。ここで、倍数体誘発溶液とナシ属植物の芽条が入った培養フラスコを真空デシケータから取り出さずに、真空デシケータの内部で単に放置してもよい。
【００４４】
浸漬させておく時間は、ナシ属植物の種類にもよるが、３０〜１００時間とすることが好ましい。浸漬させておく時間が３０時間より長いと、細胞分裂の中期を迎えた植物組織に倍数体誘発剤を十分作用させることができ、微小管重合を阻害しやすくなる。一方、浸漬させておく時間が１００時間より短いと、植物組織に与えるダメージを少なくすることができる。浸漬させておく時間は、より好ましくは４０〜８５時間であり、最も好ましくは４８〜７２時間である。
【００４５】
以上で減圧倍数化工程が終了する。この後、以下に述べるような芽条洗浄工程を経ることができる。
【００４６】
Ｃ［芽条洗浄工程］
芽条洗浄工程は、減圧倍数化工程の後に、倍数体誘発剤で処理された芽条を洗浄して、芽条に付着した倍数体誘発剤を除去する工程である。以下、この芽条洗浄工程を例示説明する。
【００４７】
倍数体誘発剤で処理された芽条を倍数体誘発溶液から取り出して、例えば滅菌水で洗浄する。細胞間隙に残存している倍数体誘発剤をできるだけ洗い流すため、芽条を液体培地に沈めて、例えば水平ロータリーシェイカーで数時間程度シェイキングしてもよい。
【００４８】
この芽条洗浄工程の後、以下に述べるような倍数体選別工程を経ることができる。
【００４９】
Ｄ［倍数体選別工程］
倍数体選別工程は、上記芽条洗浄工程の終了後、芽条洗浄工程で処理された芽条から、倍数体のものを選別する工程であり、完全な倍数体のものと周縁キメラの倍数体のものを選別するためには、例えば、以下に述べるように、倍数体培養工程と選抜工程からなる一連の工程を複数回繰り返して行う工程とすることができる。例えば、１次倍数体培養工程→１次選抜工程→２次倍数体培養工程→２次選抜工程→３次倍数体培養工程→３次選抜工程→４次倍数体培養工程→４次選抜工程…→Ｎ次倍数体培養工程→Ｎ次選抜工程といったようにである。倍数体培養工程と選抜工程からなる一連の工程は３〜１０回行うことが好ましく、より好ましくは４〜８回、最も好ましくは５回である。
【００５０】
１．倍数体培養工程
倍数体培養工程は、芽条洗浄工程又は選抜工程（後で詳説する）で得られた芽条の先端部を切り出して培養する工程である。
培養するための培地は特に限定されないが、ＷＰＭ培地をベースに、植物ホルモン等を配合したものを使用することができる。
【００５１】
また、複数回行われる、倍数体培養工程と選抜工程からなる一連の工程のうち、芽条洗浄工程の後、最初に行う倍数体培養工程では、減圧雰囲気下における倍数化処理でダメージ（ストレス）を受けた植物組織を回復させるために、何度か継代培養を行うことが好ましい。ここで用いる培地は、頂芽優勢の組織増殖を誘導させるために、例えば、オーキシン（ＩＢＡ）に対するサイトカイニン（ＢＡＰ）の濃度比率を低下させ、ジベレリン（ＧＡ）を添加したものとすることが好ましい。
【００５２】
また、複数回行われる、倍数体培養工程と選抜工程からなる一連の工程のうち、最後に行う倍数体培養工程では、腋芽の増殖を誘導するため、オーキシン（ＩＢＡ）に対するサイトカイニン（ＢＡＰ）の濃度比率を高めることが好ましい。そして、芽条が４〜８本程度になるまでこの培養を繰り返すことが好ましい。
【００５３】
２．選抜工程
選抜工程は、上記倍数体培養工程で得られた芽条の先端部から先端葉を採取して倍数体細胞の組織占有率を評価し、倍数体細胞の組織占有率が所定割合以上の芽条のみを選抜する工程である。
【００５４】
具体的には、フローサイトメータを用いて倍数性を評価し、この評価結果において、倍数体細胞（４倍体細胞）の組織占有率が高い芽条を選抜することができる。例えば、倍数体細胞の組織占有率が５０％以上の芽条を選抜することができる。また、倍数体培養工程と選抜工程からなる一連の工程を複数回繰り返して行う場合の各選抜工程において、倍数体細胞の組織占有率の選別基準値を異なる値としてもよい。例えば、最初の１次選抜工程では３０％以上、次の２次選抜工程では４０％以上、次の３次選抜工程では５０％以上、次の４次選抜工程では５０％以上、次の５次選抜工程では５０％以上といったようにである。
【００５５】
また、複数回行われる各選抜工程のうち最後の選抜工程で、倍数体細胞の組織占有率が５０％以上であり、かつ直近の３回の選抜工程で倍数体細胞の組織占有率が安定していた芽条のみを選抜してもよい。これによって、周縁キメラの倍数体（４倍体）の芽条と完全な倍数体（４倍体）の芽条を選抜することができる。例えば、直近の３回の選抜工程で倍数体細胞の組織占有率が、最後の選抜工程における倍数体細胞の組織占有率に対して±１０％の範囲で安定していた芽条のみを選抜することができる。このとき、倍数体細胞の組織占有率に対して±５％の範囲で安定していた芽条のみを選抜することが好ましい。
【００５６】
また、複数回行われる各選抜工程のうち最後の選抜工程で、倍数体細胞の組織占有率が１００％の芽条のみを選抜してもよい。これによって、完全な倍数体（４倍体）の芽条のみを選抜することができる。
【００５７】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に例示説明する。
【実施例１】
【００５８】
Ａ［芽条の準備］
本実施例では、ナシ属植物の芽条として、二十世紀、幸水及び大原紅（何れも２倍体である）のものを用いた。具体的には、採取したこれらの芽を、まず、培地（ＷＰＭ＋ＢＡＰ：１ｍｇ/Ｌ＋ＩＢＡ：０．１ｍｇ/Ｌ＋Ｓｕｃｒｏｓｅ：２０ｇ/Ｌ＋Ａｇｅｒ：８ｇ/Ｌ、ｐＨ５．８）の入ったカルチャーボトル内において、３０日間サイクルで培地を交換しながら培養し、これを１２回繰り返した。これによって、多くの脇芽を成長させた。ＢＡＰは、サイトカイニンの一種であるベンジルアミノプリン、ＩＢＡは、オーキシンの一種であるインドール−３−酪酸のことである。
【００５９】
その後、得られた芽条を、培地（ＷＰＭ＋ＢＡＰ：０．３ｍｇ/Ｌ＋ＩＢＡ：０．１ｍｇ/Ｌ＋ＧＡ：１．０ｍｇ/Ｌ＋Ｓｕｃｒｏｓｅ：２０ｇ/Ｌ＋Ａｇｅｒ：７ｇ/Ｌ、ｐＨ５．８）の入ったカルチャーボトル内において、３０日間培養した。この培地は、頂芽優勢の組織増殖を誘導させるために、サイトカイニン（ＢＡＰ）の濃度を低下させ、ジベレリン（ＧＡ）を添加したものである。
【００６０】
上記培養の後、得られた芽条の先端から１ｃｍ程度を切り出した。このとき、斜め４５°にカットして切断面を広くした。
【００６１】
Ｂ［減圧倍数化工程］
図３は、減圧倍数化工程で用いられる倍数化装置を例示したものである。以降、本図を用いて減圧倍数化工程を説明する。本例では、減圧倍数化工程は、減圧処理工程と常圧復帰工程と常圧浸漬工程とを備えている。
【００６２】
１．減圧処理工程
まず、切り出された芽条11を倍数体誘発溶液12とともに２００ｍＬ培養フラスコ31に入れた。倍数体誘発溶液12は倍数体誘発剤としてのコルヒチンと界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ２０を含んだものである（ＷＰＭ＋コルヒチン：０．１５％（Ｗ/Ｖ）＋Ｔｗｅｅｎ２０：０．０４％（Ｖ/Ｖ）＋Ｓｕｃｒｏｓｅ：２０ｇ/Ｌ）。培養フラスコ31の内部に撹拌子22を沈めた後、培養フラスコ31の開口部にアルミキャップ33で蓋をし、アルミキャップ33に空いた貫通孔にミリシール32（０．４５μｍ、φ１８ｍｍ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を貼り付けた。
【００６３】
次に、倍数体誘発溶液12とナシ属植物の芽条11が入った培養フラスコ31を、マグネティックスターラー21（ＯＣＴＯＰＵＳ製）の上に載置した状態で、真空デシケータ41（ＡＳ ＯＮＥ製  ＭＶＤ−１００）の内部に投入した。真空デシケータ41には、真空スタビライザー43（ＳＭＣ製  Ｔ２０３―１―０２３Ｇ）を介してオイルレスの真空ポンプ44（Ｗｅｌｃｈ製  ２５６２−５６）が接続されており、真空デシケータ41の内部の雰囲気を減圧することができるようになっている。
【００６４】
そして、真空デシケータ41の扉を閉じて、真空ポンプ44を作用させると、約３分程度で、真空デシケータ41の内部の圧力が１０ｋＰa以下の減圧雰囲気となったので、真空ポンプ44を停止し、この減圧雰囲気を２０分間維持した。このとき、マグネティックスターラー21の動作スイッチはＯＮであり、培養フラスコ31の内部の撹拌子22が回転している状態である。
【００６５】
２．常圧復帰工程
上記減圧処理工程の終了後、真空デシケータ41（容量約１２Ｌ）に接続されている空気流入用のニードルバルブ51（ＫＯＦＬＯＫ製）を開いて真空デシケータ41内部に空気を徐々に流入させた。このとき空気流量計52の値が０．５５Ｌ/分を指すようにニードルバルブ51を調節した。すると、真空デシケータ41内部の雰囲気（減圧下にある、倍数体誘発溶液の周囲の雰囲気）が、約２０分の時間をかけて徐々に常圧に復帰した。
【００６６】
３．常圧浸漬工程
上記常圧復帰工程の終了後、倍数体誘発溶液12とナシ属植物の芽条11が入った培養フラスコ31を真空デシケータ41から取り出し、水平ロータリーシェイカー（図示せず）を用いて６０ｒｐｍで旋回させながら４８時間インキュベーションした。
【００６７】
Ｃ［芽条洗浄工程］
上記常圧浸漬工程の終了後、倍数体誘発剤で処理された芽条を倍数体誘発溶液から取り出して滅菌水で１０秒程度洗浄した。さらに、滅菌水を用いてデカンテーションでの表面洗浄を３回行った。最後に、ＷＰＭ培地にＳｕｃｒｏｓｅ（２０ｇ/Ｌ）を加えた溶液中に芽条を入れて水平ロータリーシェイカーで４時間程度シェイキングした。
【００６８】
Ｄ［倍数体選別工程］
上記芽条洗浄工程の終了後、芽条洗浄工程で得られた芽条から、倍数体のものを選別した。本実施例では、倍数体選別工程として、倍数体培養工程と選抜工程からなる一連の工程を５回（１次〜５次）繰り返して行った。
【００６９】
１．１次倍数体培養工程
上記芽条洗浄工程で得られた芽条を、カルチャーボトルで２０日間培養した（１次倍数体培養工程a）。カルチャーボトルには、予め、１５０ｍＬの培地（ＷＰＭ＋ＢＡＰ：
０．３ｍｇ/Ｌ＋ＩＢＡ：０．１ｍｇ/Ｌ＋ＧＡ：１．０ｍｇ/Ｌ＋Ｓｕｃｒｏｓｅ：２０ｇ/Ｌ＋Ａｇｅｒ：７ｇ/Ｌ、ｐＨ５．８）を入れておいた。
培養後、得られた芽条を除葉し、芽条先端部の約５ｍｍを切断部が斜め４５°になるように切り出して上記同様の手順で２０日間培養した（１次倍数体培養工程b）。培養後、葉色の濃い芽条と葉の厚い芽条を目視判断して予備選抜し、除葉後、芽条先端部の約５ｍｍを斜めに切り出して上記同様の手順で２０日間培養した（１次倍数体培養工程ｃ）。
【００７０】
２．１次選抜工程
上記１次倍数体培養工程で得られた芽条に識別番号を付け、芽条の先端葉を２４穴プレートに採取した。そして、フローサイトメータ（Ｐａｒｔｅｃｈ Ｉｎｃ. ＰＡ型）を用いて倍数性を評価した。最後に、フローサイトメータの評価結果において、４倍体細胞の組織占有率が３０％以上の芽条を選抜した（フローサイトメトリーによる選抜）。
【００７１】
３．２次倍数体培養工程
上記１次選抜工程の終了後、選抜された芽条の先端部５ｍｍ程度を切断部が斜め４５°になるようにカットし、この先端部を直径４０ｍｍの試験管で２０日間培養した。試験管には、予め、培地（ＷＰＭ＋ＢＡＰ：０．５ｍｇ/Ｌ＋ＩＢＡ：０．２ｍｇ/Ｌ＋ＧＡ：１．０ｍｇ/Ｌ＋Ｓｕｃｒｏｓｅ：２０ｇ/Ｌ＋Ａｇｅｒ：７ｇ/Ｌ、ｐＨ５．８）を入れておいた。この培地は、サイトカイニンとオーキシンの濃度を相対的に高めて、頂芽優勢を維持した状態で組織増殖効率を高めるための組成となっている。
【００７２】
４．２次選抜工程
上記２次倍数体培養工程の終了後、前記１次選抜工程と同様の手順で、フローサイトメータを用いて倍数性を評価した。本工程では、フローサイトメータの評価結果において４倍体細胞の組織占有率が４０％以上の芽条を選抜した。
【００７３】
５．３次倍数体培養工程
上記２次選抜工程の終了後、選抜された芽条を前記２次倍数体培養工程と同様の手順で培養した。
【００７４】
６．３次選抜工程
上記３次倍数体培養工程の終了後、前記１次選抜工程と同様の手順で、フローサイトメータを用いて倍数性を評価した。本工程では、フローサイトメータの評価結果において、４倍体細胞の組織占有率が５０％以上の芽条を選抜した。
【００７５】
７．４次倍数体培養工程
上記３次選抜工程の終了後、選抜された芽条を前記２次倍数体培養工程と同様の手順で培養した。
【００７６】
８．４次選抜工程
上記４次倍数体培養工程の終了後、前記１次選抜工程と同様の手順で、フローサイトメータを用いて倍数性を評価した。本工程では、フローサイトメータの評価結果において、４倍体細胞の組織占有率が５０％以上の芽条を選抜した。
【００７７】
９．５次倍数体培養工程
上記４次選抜工程の終了後、選抜された芽条の先端部５ｍｍ程度を切断部が斜め４５°になるようにカットし、この先端部をプラントボックスで２０日間培養した。プラントボックスには、予め、培地（ＷＰＭ＋ＢＡＰ：１ｍｇ/Ｌ＋ＩＢＡ：０．１ｍｇ/Ｌ＋ＧＡ：１．０ｍｇ/Ｌ＋Ｓｕｃｒｏｓｅ：２０ｇ/Ｌ＋Ａｇｅｒ：８ｇ/Ｌ、ｐＨ５．８）を入れておいた。この培地は、サイトカイニン（ＢＡＰ）の濃度を相対的に高めて、腋芽増殖を誘導する組成となっている。
また、５次倍数体培養工程では、培養組織を上記同様の培地で、さらに２０日間培養した。これによって、芽条の数が１系統につき５本程度にまで培養された。
【００７８】
１０．５次選抜工程
上記５次倍数体培養工程の終了後、前記１次選抜工程と同様の手順で、フローサイトメータを用いて倍数性を評価した。本工程では、フローサイトメータの評価結果において、４倍体細胞の組織占有率が５０％以上であり、かつ直近３回の選抜工程で４倍体細胞の組織占有率が、５次選抜工程における４倍体細胞の組織占有率に対して±１０％の範囲で安定していた芽条を選抜した。この様にして選抜された芽条は、完全な４倍体又は周縁キメラで安定した４倍体であった。また、最終の５次選抜工程で４倍体細胞の組織占有率が１００％であったものも選抜した。この芽条は完全な４倍体であった。
【００７９】
得られた４倍体の芽条は、プラントボックス内で接穂養成の培養を行い、台木への接ぎ木、ガラスハウス内での育苗（５〜１２ヶ月）を経て約２ｍの１年苗となった。この１年苗から穂木を採取し、成木のマチ枝に切り接ぎして側枝を更新し、高接ぎを行って２年後（３年目）に初結果となった。また、図４に、この１年苗を圃場に定植して３年後（４年目）の生育状況を示す。なお、本圃場は研究開発用の圃場であり第三者の入場が禁止されている。
【００８０】
得られた二十世紀の４倍体系統について、２倍体従来品種との特性比較を表１に示す。
【００８１】
【表１】
2010104273.tif 000003
【００８２】
４倍体の二十世紀は、２倍体の従来品種と比較して果実が顕著に大きくなり（図２参照）、糖度と酸度はほぼ同等で、果肉は若干柔らかくなる傾向があることが明らかになった。
また、４倍体の二十世紀において、１花叢あたりの花数は２倍体の従来品種と比較して１花程度少ないことがわかった。これによって、摘果労力が若干低減できる。
さらに、４倍体の二十世紀について、２倍体従来品種との正逆交雑試験を行い、自家和合性の有無を検討した。その結果を表２に示す。
【００８３】
【表２】
2010104273.tif 000004
【００８４】
表２に示すように４倍体の二十世紀は自家和合性を示した。上記結果から、本来具備すべきである自家不和合性の喪失はその花粉に起因していることがわかる。また、上記正逆交雑試験に用いた花粉の発芽率について確認した結果を表３に示す。
【００８５】
【表３】
2010104273.tif 000005
【００８６】
表３に示すように、どちらの花粉も発芽率が約５５％であり、花粉採取樹の倍数性（花粉の倍数性）の違いによる発芽率の差は認められなかった。
【００８７】
また、これらの特徴は、幸水及び大原紅の４倍体においても同様であった。なお、コルヒチンを含んだ倍数体誘発溶液を芽条に作用させる際に、減圧処理を施さなかったものについては、４倍体を得ることができなかった。
【００８８】
上記実施例では、二十世紀、幸水及び大原紅について４倍体を得ることができたが、これら以外にも、本発明であるナシ属植物の倍数体の作出方法を用いて、既に多くの品種で４倍体を得ることに成功している（表４及び表５参照）。これらの品種は、いずれも完全な４倍体（Ｓｏｌｉｄ  ４Ｘ）が得られている。また、いずれも自家和合性をはじめとした上記特徴を有していると推定される。
【００８９】
また、完全な４倍体のナシ属植物（二十世紀、幸水、なつひめ、及び新甘泉）について、高接ぎを行って３年後（４年目）の成木から葉を採取し、フローサイトメータを用いて倍数性を確認した。その結果は、何れも完全な４倍体であり先祖返りしていなかった。
【００９０】
このように、本発明で得られるナシ属植物の倍数体は、自家和合性を有するばかりか、大玉果実となり、加えて、１花叢あたりの花数が少ないため摘果労力が若干低減できるという大きな特徴を有するものであり、その実用性や有用性は非常に高い。
【００９１】
【表４】
2010104273.tif 000006
【００９２】
表４において、園芸試験場Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋは、鳥取県園芸試験場で保有する品種である。園芸試験場Ｄは、おさ二十世紀の雄しべに秀玉の花粉を交配して得られた群から選ばれたもの（内部番号No.11）である。園芸試験場Eは、筑水の雄しべにおさ二十世紀の花粉を交配して得られた群から選ばれたもの（内部番号No.37）である。園芸試験場Ｇは、おさ二十世紀の雄しべに鳥幸の花粉を交配して得られた群から選ばれたもの（内部番号No.19）である。園芸試験場Ｉは、おさ二十世紀の雄しべに豊水の花粉を交配して得られた群から選ばれたもの（内部番号No.78）である。園芸試験場Ｋは、おさ二十世紀の雄しべに新雪の花粉を交配して得られた群から選ばれたもの（内部番号No.21）である。これらの品種は、本発明の追試験の必要があれば、鳥取県園芸試験場から希望者に提供する。
【００９３】
【表５】
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【００９４】
表５の品種は、主に台木として用いられる品種であり、鳥取県園芸試験場で保有している。Ｈ１８，Ｈ２１及びＨＪは、マメナシ系統であり、ＰＢＫ，ＰＢＴ及びＰＢＷは、マンシュウマメナシ系統である。これらの品種も、本発明の追試験の必要があれば、鳥取県園芸試験場から希望者に提供する。
【００９５】
なお、表４及び表５において、１次選抜〜４次選抜までの選抜芽条数については、簡易的に、各選抜段階で４倍体細胞の組織占有率が１００％の芽条数をＳとし、各選抜段階において４倍体細胞の組織占有率が規定値以上であった芽条数から４倍体細胞の組織占有率が１００％の芽条数Ｓを引いた数をＣとしてある。
【００９６】
以上、特定の実施形態及び実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、当該技術分野における熟練者等により、本出願の願書に添付された特許請求の範囲から逸脱することなく、種々の変更及び修正が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明のナシ属植物の倍数体の作出方法を示すフローである。
【図２】４倍体の二十世紀と２倍体の二十世紀との果実を示す写真である。
【図３】減圧倍数化工程で用いられる倍数化装置を例示した図である。
【図４】本発明で開発した４倍体のナシ属植物が圃場で育成されている様子を示す写真である。
【符号の説明】
【００９８】
11  芽条
12  倍数体誘発溶液
21  マグネティックスターラー
22  撹拌子
23  スターラーコントローラー
31  培養フラスコ
32  ミリシール
33  アルミキャップ
34  パラフィンテープ
41  真空デシケータ
42  真空ゲージ
43  真空スタビライザー
44  真空ポンプ
51  ニードルバルブ
52  空気流量計
【図１】
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【図２】
2010104273.tif 000009
【図３】
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【図４】
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