(57)【要約】【課題】バイオ検出の工程、ＤＮＡ解析におけるハイブリダイゼーション工程、ＥＬＩＳＡにおける抗原定着工程、ブロッキング工程、抗原抗体反応工程、発色反応工程、および病原菌の同定、ＣＲＰ検査、液体培地における細胞や大腸菌などの菌の増殖方法、又は化学分析の迅速化に利用できる１ｍＬ以下の微少量液滴の電界下における非接触撹拌方法、非接触撹拌装置、それを用いた核酸ハイブリダイゼーション反応方法、反応装置、試料中の核酸を検出する方法、核酸検出装置、試料中の抗体を検出する方法、及び抗体検出装置を提案する。【解決手段】本発明の非接触撹拌方法は、湿度６０±１０％の環境下で、印加電圧の主電圧としてプラス側に０．３５〜２．５ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電圧０．２〜２．２ｋＶ／ｍｍを加えることで、プラス側に偏った繰り返し方形波を生成し、０．１〜８００Ｈｚの周波数をさらに２〜４０本に束ね与えることで、電界の波に変化をもたせた高電圧交流電界を１ｍＬ以下の微少量液滴に非接触に与える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
湿度６０±１０％の環境下において、印加電圧の主電圧としてプラス側に０．３５〜２．５ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電圧０．２〜２．２ｋＶ／ｍｍを加えることで、プラス側に偏った繰り返し方形波を生成し、０．１〜８００Ｈｚの周波数をさらに２〜４０本に束ね与えることで、電界の波に変化をもたせた高電圧交流電界を１ｍＬ以下の微少量液滴に非接触に与えるようにしたことを特徴とする非接触撹拌方法。
【請求項２】
請求項１の非接触撹拌方法を用いて、ＲＮＡ又はＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーション反応方法。
【請求項３】
請求項１の非接触撹拌方法を用いて、ＲＮＡ又はＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させ、次いで生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中の核酸を検出する方法。
【請求項４】
請求項１の非接触撹拌方法を用いて、タンパク質をプラスチック基板に定着させ、該タンパク質に特異的に結合するタンパク質を用いて抗原抗体反応を行わせることを特徴とする試料中の抗体を検出する方法。
【請求項５】
湿度６０±１０％の環境下において、印加電圧の主電圧としてプラス側に０．３５〜２．５ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電圧０．２〜２．２ｋＶ／ｍｍを加えることで、プラス側に偏った繰り返し方形波を生成し、０．１〜８００Ｈｚの周波数をさらに２〜４０本に束ね与えることで、電界の波に変化をもたせた高電圧交流電界を１ｍＬ以下の微少量液滴に非接触に与えることを特徴とする非接触撹拌装置。
【請求項６】
請求項２に記載の核酸ハイブリダイゼーション反応を実施するための装置であって、平行平板電極、プラスチック製プローブＤＮＡ固定化基板、ヒーター温度制御装置、断熱密閉容器で構成され、撹拌用電界を生成する装置群としては、ファンクションジェネレータで基本波形を発生させ、その信号を高電圧アンプで昇圧し、与える波形の観測はオシロスコープで行って、このような電界を前記平行平板電極に供給し、高電圧アンプから供給する電界のプラス端子を平行平板電極の下側へ、一方アース側を平行平板電極の上側に接続することを特徴とする核酸ハイブリダイゼーション反応装置。
【請求項７】
請求項３に記載の試料中の核酸を検出する方法を実施するための装置であって、平行平板電極、プラスチック製プローブＤＮＡ固定化基板、ヒーター温度制御装置、断熱密閉容器で構成され、撹拌用電界を生成する装置群としてはファンクションジェネレータで基本波形を発生させ、その信号を高電圧アンプで昇圧し、与える波形の観測はオシロスコープで行って、このような電界を前記平行平板電極に供給し、高電圧アンプから供給する電界のプラス端子を平行平板電極の下側へ、一方アース側を平行平板電極の上側に接続することを特徴とする核酸検出装置。
【請求項８】
請求項４に記載の試料中の抗体を検出する方法を実施するための装置であって、平行平板電極、プラスチック製抗原固定化基板、断熱密閉容器で構成され、撹拌用電界を生成する装置群としてはファンクションジェネレータで基本波形を発生させ、その信号を高電圧アンプで昇圧し、与える波形の観測はオシロスコープで行って、このような電界を前記平行平板電極に供給し、高電圧アンプから供給する電界のプラス端子を平行平板電極の下側へ、一方アース側を平行平板電極の上側に接続することを特徴とする抗体検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ検出の工程、遺伝子解析におけるハイブリダイゼーション工程や、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：試料中に含まれる抗体あるいは抗原の濃度を検出・定量する際に用いられる）における抗原定着工程、ブロッキング工程、抗原抗体反応工程、発色反応工程、または病原菌の同定、ＣＲＰ検査（C Reactive  Protein：炎症や感染、組織の損傷がないかを探るタンパク質の有無を調べる）、または液体培地における細胞や大腸菌などの菌の増殖方法、化学分析の迅速化に利用できる１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量液滴の高電圧交流電界下における非接触撹拌方法、非接触撹拌装置、それを用いた核酸ハイブリダイゼーション反応方法、反応装置、試料中の核酸を検出する方法、核酸検出装置、試料中の抗体を検出する方法（ＥＬＩＳＡ反応）、及び抗体検出装置（ＥＬＩＳＡ反応装置）に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
将来のテーラーメイド医療のため、遺伝子解析やＥＬＩＳＡにおける抗原定着工程、ブロッキング工程、抗原抗体反応工程、発色反応工程、または病原菌の同定、ＣＲＰ検査、化学分析などバイオ検出の工程にて、検体溶液を撹拌させつつ反応を行うことは、極めて時間がかかるため、迅速化が求められている。
産業的にも、臨床検査、食品検査、環境検査等幅広い分野において、細胞、糖、タンパク質、核酸などの各種生体成分の分析および定量が日常的に行われ、特に、臨床検査の分野では、血液、尿などの体液中の、特定の生体成分の分析および定量を行うことにより、病気の診断や治療効果の判定、抗体量の測定を行っている。一般的な生体成分の分析および定量方法としては、ＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid ：デオキシリボ核酸）とインターカレーターの相互作用を利用した反応、疎水結合による抗原定着反応、抗原抗体反応、対象物の物理的化学的性質を利用した電気泳動法などを用いる方法がある。しかし、これらの方法においても、対象とする生体成分によっては、反応や操作に長時間を要しているものや、精度が不足し、原理的な限界があって、正確な分析ができていないものもある。
【０００３】
例えば遺伝子解析における核酸ハイブリダイゼーション工程では、静置反応の場合、６０分〜６時間程度を要し、反応時間が長い。また、振とう器を用いた撹拌の場合、液量は１ｍＬ以上必要で、至適温度に達するまで一定の時間を要し、迅速化が困難である。そこで溶液量を１ｍＬ以下、特にμＬオーダーに微少量化することで、至適温度に達する時間を短縮し、さらに微少量液滴内部に活発な撹拌を加えることで、ハイブリダイゼーション反応速度の向上を図る。
核酸ハイブリダイゼーション反応では、対になる分子種が鎖状であるため、１回の衝突によって反応は完了できず、複数回の分子衝突によって連続鎖の対合反応が進行すると考えられる。すなわち撹拌によって相互に衝突することで反応時間が大幅に短縮できる可能性がある。
例えばＥＬＩＳＡにおける免疫反応では、一般に５０μＬ〜１００μＬの液量で、各工程静置３０分〜１時間を要し、全工程を完了するには４時間程度必要である。反応は分子拡散によって進行する。そのため、溶液の微少量化、並びに撹拌によって反応時間を大幅に短縮できる可能性がある。
【０００４】
前述のように１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量の溶液で反応速度を向上させ、高品位な結果を迅速に得るためには、回転子や撹拌子を用いない新たな非接触撹拌技術が求められる。
既に提案されている非接触撹拌技術としては、溶液に振とう（波動形揺動）を与える振とう器が製品化され、その他にも溶液の表面に気体を吹き付ける方法、超音波を与える方法などが知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記振とう器は、溶液を収容するシリンダーやセル、フラスコ等の容器に波動形揺動を与えるものであるため、比較的容量の多い溶液においては相応の撹拌効果が見込まれるものの、１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量液滴では十分な撹拌効果は認められないか、極めて長時間の反応を要するものであった。すなわち微少量の溶液では重力下における反応から液滴の表面張力が支配的となり、液滴内部の撹拌が起こりにくいことが知られている。
また、溶液表面に気体を吹き付ける方法では、液面を揺らすことにより撹拌効果を与えるものであって、液内部の十分な撹拌効果は認められなかった。
さらに、超音波を与えつつ撹拌を行う方法は、２０〜４０ｋＨｚの超音波を照射することによって分子の運動が促進されるために、それらの分子衝突頻度が高まり、核酸ハイブリダイゼーション反応が相対的に速くなり、相応の撹拌効果が認められる。しかし、この超音波撹拌を行うと、キャビテーションによる液温の上昇が起こり、ハイブリダイゼーションなど温度に依存する反応が成り立たないという問題があった。また、１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量液滴に超音波によって生じるキャビテーション技術による撹拌を適用すると、微少量液滴は瞬時に散逸し、撹拌が不可能となる等の問題点があった。また、分子衝突によりＤＮＡに損傷を与える場合もあった。さらに、２０ｋＨｚ前後の超音波を用いた場合には騒音が発生するという問題もあった。
そこで、本発明は、前記のような問題を生ずることなく、１ｍＬ以下、特にμＬオーダーにの微少量液滴を非接触にて撹拌でき、例えば遺伝子解析における核酸ハイブリダイゼーション反応やＥＬＩＳＡにおける抗原定着工程、ブロッキング工程、抗原抗体反応工程、発色反応工程、および病原菌の同定、ＣＲＰ検査においてその反応時間を短縮することができ、その分析の感度を高めることで再現性の確度を高めることができる方法を提案することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記に鑑み提案されたもので、物理的な手段の１つである高電圧交流電界によるクーロン力による液滴の吸引現象に着目して鋭意検討したところ、１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量液滴の非接触撹拌に利用でき、遺伝子解析における核酸ハイブリダイゼーション反応やＥＬＩＳＡにおける抗原定着工程、抗原抗体反応工程においても、外部より電界を与えることにより、著しく反応時間を短縮できることが分かった。
具体的には、炭酸カルシウム（観察のために粒径５０ｎｍ濃度０．０５％）を入れた滅菌超純水１０μＬをプラスチック製基板に滴下し、０．５ｋＶ／ｍｍ、０．１Ｈｚ、矩形波でプラス側のみの電圧波形を与えても液滴の表面は小刻みに振動するが、内容物の撹拌が進行していなかった。そこで、印加電界の周波数を上昇させて、液滴を観察したところ、８５Ｈｚ〜９５Ｈｚで良好な撹拌現象を確認した。
検体ＤＮＡとハイブリダイゼーション溶液の混合物の撹拌条件について以下に示す。この溶液１０μＬをプラスチック製基板に滴下し（この溶液は、温度３０℃以下では増粘し固化するため、加温、加湿状態で観察する。また、この液滴は、水に比べて粘度が高く、そのため液滴の応答周波数が低い。この液滴の良好な撹拌現象は３０〜４０Ｈｚで確認された。）、高電圧交流電界印加による非接触撹拌状態で５分間ハイブリダイゼーションを進行させた後、解析すると、明瞭な結果が得られた。なお、その際のハイブリダイゼーション液には、ＳＳＣバッファー（クエン酸ナトリウムと塩化ナトリウム）とＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）を用いた。
抗原溶液と抗体溶液の撹拌条件について以下に示す。はじめに、抗原溶液１μＬをポリスチレン製などのプラスチック製基板に滴下し（抗原溶液と抗体溶液は、水に比べて粘度が高く、そのため液滴の応答周波数が低い。この液滴の良好な撹拌現象は２００Ｈｚで確認された。）、室温・保湿下で１０分間電界非接触撹拌技術を用いて反応させた。洗浄後、従来方法のブロッキング時においては、３０分を要するが、室温・保湿下で電界非接触撹拌技術を用いると、１５分間で処理が完了する。次に、抗体溶液１μＬを滴下し、室温・保湿下で１５分間電界非接触撹拌技術を用いて反応させ、洗浄後、発色基質を反応させ、解析すると、安定した発色を示した。なお、この際の抗原溶液の組成は、BSA（３３３μｇ／ｍＬウシ血清アルブミンin PBS）を用いた。ブロッキング液の組成は、１％ eggアルブミンin PBSを用いた。抗体溶液の組成は、１．１μｇ／ｍＬ HRP標識 抗BSA抗体in １％egg アルブミンを用いた。発色基質は、３ｍM ABTS in 0.1％H2O2 in 0.1Mクエン酸バッファー  pH４．０を用いて実施した。
【０００７】
すなわち本発明は、湿度６０±１０％の環境下で、印加電圧の主電圧としてプラス側に０．３５〜２．５ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電圧０．２〜２．２ｋＶ／ｍｍを加えることで、プラス側に偏った繰り返し方形波を生成し、０．１〜８００Ｈｚの周波数をさらに２〜４０本に束ね与えることで、電界の波に変化をもたせた高電圧交流電界を１ｍＬ以下（特にμＬオーダーが望ましい）の微少量液滴に非接触に与えるようにしたことを特徴とする非接触撹拌方法、及び非接触撹拌装置に関するものである。
【０００８】
また、本発明は、前記電界非接触撹拌方法を用いて、ＲＮＡ又はＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーション反応方法をも提案する。
【０００９】
さらに、本発明は、前記電界非接触撹拌方法を用いて、ＲＮＡ又はＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させ、次いで生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中の核酸を検出する方法をも提案するものである。
【００１０】
さらに、本発明は、前記電界非接触撹拌方法を用いて、タンパク質をプラスチック基板に定着させ、該タンパク質に特異的に結合する性質をもつタンパク質を反応させる抗原抗体反応を行わせることを特徴とする試料中の抗体を検出する方法（ＥＬＩＳＡ反応）をも提案するものである。
【００１１】
また、本発明は、前記核酸ハイブリダイゼーション反応を実施するための装置として、平行平板電極、プラスチック製プローブＤＮＡ固定化基板、ヒーター温度制御装置、保湿断熱密閉容器で構成され、撹拌用電界を生成する装置群としてはファンクションジェネレータで基本波形を発生させ、その信号を高電圧アンプ（利得×１０００）で昇圧し、与える波形の観測はオシロスコープで行って、このような電界を前記平行平板電極に供給し、高電圧アンプから供給する電界のプラス端子を平行平板電極の下側へ、一方アース側を平行平板電極の上側に接続することを特徴とする核酸ハイブリダイゼーション反応装置をも提案するものである。
【００１２】
また、本発明は、前記試料中の核酸を検出する方法を実施するための装置として、平行平板電極、プラスチック製プローブＤＮＡ固定化基板、ヒーター温度制御装置、保湿断熱密閉容器で構成され、撹拌用電界を生成する装置群としては、ファンクションジェネレータで基本波形を発生させ、その信号を高電圧アンプで昇圧し、与える波形の観測はオシロスコープで行って、このような電界を前記平行平板電極に供給し、高電圧アンプから供給する電界のプラス端子を平行平板電極の下側へ、一方アース側を平行平板電極の上側に接続することを特徴とする核酸検出装置をも提案する。
【００１３】
また、本発明は、前記試料中の抗体を検出する方法（ＥＬＩＳＡ反応）を実施するための装置として、平行平板電極、プラスチック製抗原固定化基板、保湿断熱密閉容器で構成され、撹拌用電界を印加する装置群としては、ファンクションジェネレータで基本波形を発生させ、その信号を高電圧アンプ（利得×１０００）で昇圧し、与える波形の観測はオシロスコープで行って、このような電界を前記平行平板電極に供給し、高電圧アンプから供給する電界のプラス端子を平行平板電極の下側へ、一方アース側を平行平板電極の上側に接続することを特徴とする抗体検出装置（ＥＬＩＳＡ反応装置）をも提案する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、高電圧交流電界によるクーロン力を１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量液滴に与えることにより、微少量溶液内部を非接触に撹拌することができ、各種の産業分野、例えばバイオ検出の工程、遺伝子解析における核酸ハイブリダイゼーション工程、又はＥＬＩＳＡにおける抗原定着工程、ブロッキング工程、抗原抗体反応工程、発色反応工程、および、病原菌の同定、ＣＲＰ検査、化学分析、液体培地における細胞や大腸菌などの菌の増殖の迅速化などに利用することができる。
例えば前記従来の非接触撹拌方法である振とう方法に比べると、撹拌時間は１／５程度に短縮できる。
また、本発明の電界非接触撹拌方法では、回転子や撹拌子を用いないため、コンタミネーションを起こし難く、工程時間の短縮化が図れ、ばらつきが抑制された明瞭な結果を得られる。また前記従来の超音波撹拌に比べて騒音の発生がないという利点もある。
さらに、固-液反応、液-液反応の何れにも対応可能であり、撹拌条件を外部の電界で容易に制御することが可能であり、また装置が単純な構成のため、小型化も容易であり、また透明電極を用いると、液の動きや溶液の発色反応の進行度を同時に確認可能である。しかも、温度、湿度、真空状態、ガス雰囲気などの各種の環境下での撹拌が可能である。
【００１５】
また、本発明の核酸ハイブリダイゼーション反応方法は、高電圧交流電界によるクーロン力を与えつつ、ＲＮＡ又はＤＮＡ及び該ＲＮＡ又は該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させるものであって、前記非接触撹拌方法をハイブリダイゼーション反応に適用したものである。
そして、本発明の核酸ハイブリダイゼーション反応方法では、前記従来の超音波撹拌を用いる方法に比べてより少ない量のＤＮＡを用いて迅速にハイブリダイゼーションを実行できる。ＤＮＡの取り扱う量が少なくなるとＰＣＲプロトコールも短縮できる。なぜなら、温度上下のプロセスが容易となるためである。すなわち高電圧交流電界を与えることで１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量液滴を非接触に撹拌する技術を開発し、遺伝子解析工程であるハイブリダイゼーションに適応させることで、反応効率の向上、反応時間の短縮化を得る。さらにインターカレート時にも高電圧交流電界を与えて非接触撹拌を行い、迅速化と高い信頼性が得られる解析結果を得る。
このように外部より０．１〜８００Ｈｚ程度の高電圧交流電界を断続的に印加することにより、その反応時間を短縮することが可能となる上、少ないＤＮＡ量にてハイブリダイゼーションを実行できるため、極めて実用的価値が高い。
また、本発明のＥＬＩＳＡ法は、高電圧交流電界によるクーロン力を与えつつ、抗原及び該抗原に特異的な抗体との反応を促進させるものであって、前記微少量液滴用電界非接触撹拌方法を抗原定着反応及び抗原抗体反応に適用したものである。
そして、本発明のＥＬＩＳＡ法では、前記従来の静置法に比べてより少ない液量で迅速に抗原定着反応、抗原抗体反応を実行できる。
このように外部より０．１〜８００Ｈｚ程度の高電圧交流電界を断続的に印加することにより、その反応時間を短縮することが可能となる上、１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの反応液量にて抗原定着反応、抗原抗体反応を実行できるため、極めて実用的価値が高い。
【００１６】
本発明の試料中の核酸を検出する方法では、前記ハイブリダイゼーションに次いで生成した反応生成物を測定し、試料中の核酸を検出することが可能であり、再現性が高く、分析の精度を高めることが可能である。
そのため、臨床検査、食品検査、環境検査などの分野での利用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実験例１、実験例２、実験例３において用いた電界非接触撹拌装置の概要を示す断面図である。
【図２】段落［００３１］における炭酸カルシウム−滅菌超純水液滴量と撹拌が生じた電界強度（ｋＶ／ｍｍ）の関係を示すグラフである。
【図３】段落［００３１］における炭酸カルシウム−滅菌超純水液滴量と撹拌が生じた印加周波数の関係を示すグラフである。
【図４】実験例１における検出結果を示す写真、及びそれより得られた解析データを示す表である。従来の振とう法では、特異発光が弱く、遺伝子型の判別が困難であったが、電界非接触攪拌を用いると、特異発光が強まり、遺伝子型の判別が可能になった。
【図５】実験例４、実験例５において用いた電界非接触撹拌装置の概要を示す断面図である。
【図６】実験例４における実験工程を示す図である。抗原定着反応時に、電界非接触撹拌技術を適用した。
【図７】実験例４における解析結果を示す写真、及びそれより得られた解析データを示す表である。従来の１/６の時間で、発色があり、電界非接触撹拌によって抗原定着反応が短時間で良好に行われたことを確認できた。
【図８】実験例５における実験工程を示す表である。抗原定着反応、抗原抗体反応時に電界非接触撹拌技術を適用した。
【図９】実験例５における解析結果を示す写真、及びそれより得られた解析データを示す表である。抗原抗体反応は、従来の１／２の時間で発色が見られ、電界非接触撹拌技術によって抗原抗体反応が良好に行われたことを確認できた。電界印加時間には最適値があり、印加時間が長すぎると結合が切られ、正常な反応が抑制される挙動を示すことがある。本件では１５分間を採用した。
【図１０】実験例４および５における実験的な解析時間の結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、高電圧交流電界によるクーロン力を１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量液滴に与えることにより、液滴内部を非接触に撹拌することができるものである。具体的には湿度６０±１０％の環境下で、印加電圧の主電圧としてプラス側に０．３５〜２．５ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電圧０．２〜２．２５ｋＶ／ｍｍを加えることで、プラス側に偏った繰り返し方形波を生成し、０．１〜８００Ｈｚの周波数をさらに２〜４０本に束ね与えることで、電界の波に変化をもたせた（＝バースト波形を構成させた）高電圧交流電界を１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量液滴に非接触に与える。
印加電界強度（ｋＶ／ｍｍ）は、プラス側に２．５ｋＶ／ｍｍより強いと放電する可能性があり、０．３５ｋＶ／ｍｍより低いと撹拌が生じない。
また、オフセット電圧は、２．２５ｋＶ／ｍｍより強いと放電する可能性があり、０．２ｋＶ／ｍｍより低いと撹拌が生じない。
さらに、撹拌作用に影響を与える電界強度・周波数は液滴量に依存するが、この電界強度と液量、周波数と液量の関係は後述する図２、図３に示す。
【００１９】
また、本発明は、前記電界非接触撹拌方法をハイブリダイゼーション反応に利用した核酸ハイブリダイゼーション反応方法をも提案する。すなわち高電圧交流電界によるクーロン力を与えつつ、ＲＮＡ又はＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させるのである。
さらに、本発明は、前記電界非接触撹拌方法を抗原定着反応、抗原抗体反応に利用したＥＬＩＳＡ方法をも提案する。すなわち高電圧交流電界によるクーロン力を与えつつ、抗原の基板への効率的な定着と、抗原と特異的な抗体との迅速な反応を可能にさせるのである。
【００２０】
本発明においてＲＮＡとしては、前核生物、真核生物及びウイルス由来のｍＲＮＡなどがある。
また、本発明においてＤＮＡとしては、前核生物、真核生物由来の染色体ＤＮＡの他、オルガネラ由来のミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡなど、及びウイルス染色体、プラスミドＤＮＡなどが挙げられる。
標識物質としては、蛍光色素、放射性同位元素（３２Ｐ，３２Ｐ，３５Ｓなど）、検出可能な物質と結合し得る物質、例えばビオチンなど、またはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素などが挙げられる。
ＲＮＡ又はＤＮＡ結合タンパク質としては、ＤＮＡ構造に変化を与えて遺伝子発現を調節する二重鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えばラムダファージｃｒｏタンパク質、ｃＩリプレッサーやラクトースオペロンリプレッサーなどの遺伝子発現調節タンパク質など）、複製、組換え、修復の過程に必須な一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えば大腸菌から高等生物に至る生物種に見いだされているＳＳＢ）、染色体に強く結合し、染色体の高次構造の保持に関与するタンパク質（例えばヒストンや非ヒストンタンパク質など）、ヘリカーゼなどのＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ（例えばｒｅｐヘリカーゼ、ｎ’やｄｎａＢなどの複製タンパク質、ｒｅｃＡやｒｅｃＢなどの組換えタンパク質など）やＤＮＡコンホメーションに変化を与えるトポイソメラーゼ（例えばトポイソメラーゼＩ、ＩＩ、ラムダファージｉｎｔタンパク質やφＸ１７４遺伝子Ａタンパク質など）などがある。高電圧交流電界印加条件は、上記した核酸のハイブリダイゼーション反応におけるものと同様である。
【００２１】
本発明の核酸ハイブリダイゼーション反応方法では、まずＲＮＡ又はＤＮＡをプラスチック製基板上に固定したものに対し、ハイブリダイゼーション溶液に、ＲＮＡ又はＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を入れたものを滴下し、その基板を平行平板電極間に挿入する。これらを保湿断熱密閉容器に設置し、高電圧交流電界によるクーロン力を作用させる。この高電圧交流電界印加条件はハイブリダイゼーションのみならず、インターカレートにも適用できる。
【００２２】
前記核酸ハイブリダイゼーション反応を実施するための装置を以下に示す。反応溶液を滴下したプローブＤＮＡ固定化プラスチック製基板を平行平板電極間に挿入する。電極底部には温度制御装置付きヒーターを配置し、これらを保湿断熱密閉容器に設置する。平行平板電極に印加する高電圧交流電界は、基本波を発生するファンクションジェネレータならびに高電圧アンプ（利得×１０００）と波形観察のためのオシロスコープからなる。高電圧アンプの＋側を下電極に結線し、アースを上部電極に結線し、高電圧交流電界を平行平板電極に印加する。
【００２３】
そして、前述のように本発明では、前記超音波撹拌を用いる方法に比べて、より少ない量のＤＮＡを用いて迅速にハイブリダイゼーションを実行できる。本発明で用いるＤＮＡの濃度は１５ｎｇ／μＬ以上，２０ｎｇ／μＬ程度であり、ハイブリダイゼーション液量は０．５μＬ〜１０μＬ／ＤＮＡｓｐｏｔであるが、前記従来の超音波撹拌では１１３ｎｇ／μＬのラムダＤＮＡを取り扱っており、本発明に比べて約５倍多い量のＤＮＡ（液量は少なくとも数十μＬ以上）を取り扱っている。
このことから、前記超音波撹拌では、処理量（用いる溶液量）を多くしてＤＮＡに与える影響を抑えていると推定される。なお、本発明では、１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量液滴に、高電圧交流電界によるクーロン力を与えるが、このような微少量液滴には超音波撹拌を適用することが困難である。
【００２４】
また、本発明は、試料中のＲＮＡ又はＤＮＡを相補的なＲＮＡ又はＤＮＡに、高電圧交流電界によるクーロン力を与えながら反応させ、次いで生成した反応生成物を測定する試料中の核酸を検出する方法をも提案する。これはＤＮＡ又はＲＮＡが相補的な配列をもつＤＮＡ又はＲＮＡ（ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブ）とハイブリダイゼーションするという性質を利用したものである。高電圧交流電界印加条件は、上記したＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡ又はＤＮＡに相補的な核酸に高電圧交流電界を作用させながら反応させる核酸ハイブリダイゼーション反応方法と同様である。
【００２５】
また、本発明のハイブリダイゼーション反応を利用する方法では、そのプローブ作製時に、酵素反応を利用して核酸の末端のリン酸基を外し、アイソトープでラベルされたリン酸基を結合させる操作を行うことがある。この酵素反応においても、外部より高電圧交流電界を作用させてもよい。高電圧交流電界印加条件は、上記条件と同じである。
【００２６】
また、本発明は、ＥＬＩＳＡにおける基板への抗原定着反応、抗原抗体反応において、高電圧交流電界によるクーロン力を与えながら反応させ、次いで生成した反応生成物を測定することで、試料中の抗体を検出する方法をも提案する。これは抗原の官能基が疎水性の基板に静電的に結合する性質、および、抗原が抗体と特異的に結合する性質を利用したものである。
高電圧交流電界印加条件は、上記した抗原定着反応及び抗原と特異的な抗体に高電圧交流電界を作用させながら反応させるＥＬＩＳＡ法と同様である。
【００２７】
また、本発明のＥＬＩＳＡ法では、抗原定着後に、ブロッキングを行う。このブロッキング工程においても、外部より高電圧交流電界を作用させてもよい。高電圧交流電界印加条件は、上記条件と同じである。
また、本発明のＥＬＩＳＡ法では、抗体量測定時に、酵素反応を利用して発色基質を発色させる。この発色反応においても、外部より高電圧交流電界を作用させてもよい。高電圧交流電界印加条件は、上記条件と同じである。
【００２８】
図１に原理を示すと、プラス電界にて水を吸引することが可能なため電界をプラス側で繰り返し波形として与え、かつ偏らせることで、微少量液滴の波面を揺らすことが出来る。さらに前記波形を約２〜２０サイクル程度をひとまとめに束ねてＯＮ  ＯＦＦさせることで、前記液滴波面に緩やかな振動を供給できるため、これにより内容物が撹拌運動を示す。
本発明のハイブリダイゼーション反応では、はじめに検体ＤＮＡに相補的な配列を有するＤＮＡをプラスチック基板の上に固定化したものに対し、検体ＤＮＡとハイブリダイゼーション溶液の混合物を滴下する。この時の周囲温度は４３〜４７℃とし、また湿潤下６０±１０％内で行うことが望ましい。ＤＮＡ固定化基板は平行平板電極（底面が＋極）の間に挿入し、前記と同様条件下の高電圧交流電界を印加する。印加時間は５分間である。
本発明のＥＬＩＳＡ法では、抗原をプラスチック基板に固定する際、および抗原に特異的な抗体を反応させる際に、前記と同様条件下の高電圧交流電界を印加する。印加時間は抗原定着工程では１０分間、抗原抗体反応工程では１５分間である。このときの周囲温度は２５±２℃とし、湿潤下６０±１０％で行うことが望ましい。
【００２９】
他の実施例として浮遊培養があり，これは，細胞の着床を防ぐために、培養液中のカルシウムイオン濃度を低くしてリン酸イオンを高くすることで、マグネチックスターラーで細胞を撹拌する。浮遊培養は、一定容積の培養液中に培養細胞数を多く発生させることが出来ることが特徴である。 
この浮遊培養において本発明の高電圧交流電界を印加して非接触撹拌現象を用いることで、高能率に細胞が培養できる。
他の実施例として病原菌の同定があり、これは、凝集反応の有無で判定し、通常５時間程度を必要とする。この凝集反応時において本発明の電界非接触撹拌技術を用いることで、短時間に病原菌の同定が可能になる。
他の実施例としてＣＲＰ検査があり、これは、炎症や組織破壊の有無を診断する指標となるＣＲＰを濁度測定により判定するもので、この反応時において本発明の電界非接触撹拌技術を用いることで、短時間に濁度測定が可能になる。
【００３０】
本発明の電界非接触撹拌技術の利用法には、ハイブリダイゼーション後のインターカレート時の反応促進、ＥＬＩＳＡにおけるブロッキング工程の反応促進や発色反応促進、さらに病原菌の同定、ＣＲＰ検査、細胞の培養、ＰＣＲの反応時間短縮などがある。このように臨床検査、食品検査、環境検査等幅広い産業分野での利用が可能となる。
【００３１】
印加電界強度（ｋＶ／ｍｍ）は、試料の液量により最適化される。
炭酸カルシウム（観察のために粒径５０ｎｍ  濃度０．０５％）を入れた滅菌超純水の液滴をプラスチック製基板に滴下し、平行平板電極間において電界下の動きを観察したところ、０．６μＬでは０．７５ｋＶ／ｍｍ（電極間距離４ｍｍ）、１〜２μＬでは０．６３ｋＶ／ｍｍ（電極間距離４ｍｍ）、５〜１５μＬでは０．５ｋＶ／ｍｍ（電極間距離４ｍｍ）、１００〜１０００μＬでは０．４２ｋＶ／ｍｍ（電極間距離７ｍｍ）で液滴内部の炭酸カルシウム粒子が活発に動く様子を確認した。
この結果を図２のグラフにして示す。
また、印加電界周波数は、試料の液量により最適化される。
炭酸カルシウム（観察のために粒径５０ｎｍ  濃度０．０５％）を入れた滅菌超純水１０μＬの液滴をプラスチック製基板に滴下し、電界下の動きを観察したところ、液量０．６μＬでは３８０〜４２０Ｈｚ、１μＬでは２６０〜３１０Ｈｚ、２μＬでは１９５〜２２０Ｈｚ、５μＬでは１２５〜１４０Ｈｚ、１０μＬでは８５〜９５Ｈｚ、１５μＬでは７０〜８５Ｈｚ、１００μＬでは３０Ｈｚ、５００μＬでは１３〜１５Ｈｚ、１０００μＬでは１０Ｈｚで、液滴内部の炭酸カルシウムが活発に動く様子を確認した。この結果を図３のグラフにして示す。
【００３２】
ハイブリダイゼーションにおける実施例
始めにプローブＤＮＡをプラスチック製基板に固定し、これに検体ＤＮＡとハイブリダイゼーション溶液の混合物を滴下し、これをクリアランス４ｍｍの平行平板電極間に挿入する。電界はファンクションジェネレータにて基本電圧と波形と周波数を決定し、高圧アンプにて昇圧し電極へ電界を印加する。電極間の温度は温度制御装置の付いたヒーターまたはペルチェ素子で一定に保持され、温度４３〜４７℃とする。湿度は６０±１０％とし、反応は断熱密閉容器内で行うことで、清浄な環境でクロスコンタミネーションの発生を抑制し、高品位な解析結果が得られる。
【００３３】
ＥＬＩＳＡにおける実施例
始めにアレルゲンとなる抗原１μＬをポリスチレン製などのプラスチック基板に滴下し、クリアランス４ｍｍの平行平板電極間に挿入する。電界はファンクションジェネレータにて基本電圧、波形、周波数を決定し、高圧アンプにて昇圧し電極へ電界を印加する。洗浄後、ブロッキングを２５℃ ３０分 静置で行う。洗浄後、検体となる血清を同様に１μＬ滴下し、クリアランス４ｍｍの平行平板電極板間に挿入する。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識二次抗体１μＬを滴下し、クリアランス４ｍｍの平行平板電極板間に挿入する。洗浄後、０．１％Ｈ２Ｏ２存在下で、発色基質溶液１μＬを加え、２５℃ ３０分間、静置、遮光下で反応させる。これらの反応は湿度６０±１０％の密閉環境下で実施し、断熱密閉容器内で行うことで、清浄な環境でクロスコンタミネーションの発生を抑制し、高品位な解析結果が得られる。
【００３４】
細胞培養における実施例
細胞培養は主に培養液を入れたシャーレや試験管・培養器の中で行われる。多くの場合、培養過程でサンプルの選定や殺菌・滅菌の手段が重要である。細胞は播種後、融合しながら、増殖し、スフェロイドへと成長する。従来は単層培養が一般的であるが、生体内では細胞は３次元的に存在しており、生体外でも、細胞を３次元化（スフェロイドを形成）することによって、細胞同士のコミュニケーションが活性化されるとも言われている。このため、スフェロイド培養では、より生体内に近い状態で細胞を培養することが可能になる。細胞は播種後、プレート上を歩きまわり融合しながら、増殖し、スフェロイドへと成長していく。例えばＢＴ４７４（乳がん由来細胞株）では、従来方法では５日間培養に要する。これに本発明の電界非接触撹拌方法を適用することで迅速な培養を行うことができる。
また  植物においては、プロトプラストを固体培地（アガロース）中に封入して、これに液体培地を加えて、定期的に液体培地部分を交換する培養方法（アガロースビーズ法）を用いる。材料となる葉を１ｇ用意して殺菌し、クリーンベンチ内で葉脈を取り除いて切り刻み、ろ過滅菌処理を施し酵素液中に入れて処理を行う。酵素処理時間は、恒温振とう器３７℃設定で２時間処理する。処理後、プロトプラストの精製を行うため遠心分離器（８００ｒｐｍ）で３分間行い、沈殿したプロトプラストを残して上澄みを吸い取り、洗浄液を加えて遠心をかける。これを以後２回繰り返し、トーマ氏血球計算盤を用いて計測し、１ｍＬあたり１０４〜１０５個の濃度に調整する。このように従来方法では、酵素処理時間に恒温振とう器３７℃設定で２時間処理を要する。この工程に本発明の非接触撹拌方法を適用し、高電圧交流電界を与えて処理時間を迅速化することができる。
【実施例】
【００３５】
本実施例においてプローブＤＮＡを固定化する基板の材質は、ハイブリダイゼーション液（主にＳＤＳ：界面活性剤と、ＳＳＣ：塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウム）に対して撥水効果を発揮し、接触角が４５度以上（この時の液量は１０μＬ）となる材料が望ましい。
ガラスなどの親水性基板に対しては、撥水性ペンで滴下領域を定めた後に溶液を滴下すると、溶液の接触角が未処理の場合よりも大きくなる。そのため、溶液に対する電界非接触撹拌方法の効果が高まり、液内部の撹拌が活発になる。これにより、反応の高品位化、反応時間の迅速化が可能となる。
既存の撹拌方法ではタイテック（TAITEC）社製恒温槽付き振とう器を用いて４３〜４７℃、湿度６０±１０％の環境下で１０分間ハイブリダイゼーションを行っている。
以下、本発明の実施例を用いて詳細に説明する。
【００３６】
〔実験例１（実施例１）〕
電界非接触撹拌方法のハイブリダイゼーションに対する効果を確認する実験は、図１に示すプローブＤＮＡを固定化した基板を用いて行った。プローブＤＮＡの長さは７０ｍｅｒ，濃度は５μＭ，滴下直径は約１ｍｍのものを用いた。検体ＤＮＡはＸＸ型を用いた。基板は２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ（厚み）のプラスチック製基板であり、このプローブＤＮＡ固定化部分に、１５ｎｇ／μＬ以上のＤＮＡ溶液とハイブリダイゼーション液の１：１混合物を９４℃で５分間熱変性後、４℃にて急冷したものを１０μＬ滴下した。この基板を４６℃、湿度６０±１０％断熱密閉容器内の平行平板電極間（電極クリアランス３ｍｍ）に挿入し、５分間高電圧交流電界を印加した。電界印加条件は、３２Hz、２．６kＶ、オフセット電圧１．７kＶ、バースト１６サイクルとした。洗浄液による洗浄、基板表面の水分除去後、蛍光インターカレーター試薬（５×SYBR GreenＩ）を滴下し、５分間静置し、滅菌超純水で洗浄後、水分を除去し、さらに基板表面に滅菌超純粋水を滴下し、蛍光顕微鏡を用いて４８８ｎｍの波長を照射し、解析を行った。
解析結果として、蛍光顕微鏡より得られる蛍光色の解析データを、図４中に示した。光の三原色であるＲ赤、Ｇ緑、Ｂ青を０から２５５の階調成分に区切って、各々比較することにより、蛍光顕微鏡で得られた発色結果を定量的に表現することが可能になった。得られた解析結果は、従来の振とう器で液に振動を加えた場合（４６℃、１０分振とう、電界なし）よりも、特異的発光の輝度が非特異発光の輝度より明らかに大きい数値を示した。これより、電界非接触撹拌方法は、ハイブリダイゼーション反応に対して高い信頼性を発現できることを明解に示す技術である。
【００３７】
〔実験例２（実施例２）〕
図１に示す電界非接触撹拌装置を用い、高電圧交流電界印加によるハイブリダイゼーション液滴の非接触撹拌挙動を実体顕微鏡下にて実施し、並びに従来の非接触撹拌方法における液滴の挙動観察を以下のように実施した。
実験条件は、ハイブリダイゼーション液滴１０μＬの液滴中に炭酸カルシウム（観察のために粒径５０ｎｍ、濃度０．０５％）を入れて、４６℃、湿度６０％±１０％において電界下（電極クリアランス３ｍｍ  ３２Ｈｚ、２．６ｋＶ、オフセット電圧１．７ｋＶ、バースト１６サイクル）で行った。
非接触挙動観察結果としては、無電界時には液滴内部に何等動きはなく、電界印加時には液滴内部にて炭酸カルシウム粒子が激しく運動する様子が観察された。
なお、比較（比較例１）のため、従来の非接触撹拌方法として、タイテック（TAITEC）社製恒温槽付き振とう器を用いて液量１０μＬにて１０分間の振とう時に、液滴の運動を振とう器の動きに合わせてＣＣＤカメラを用いて観察すると、表面は振動していたが内容物の撹拌現象は確認できなかった。
【００３８】
〔実験例３（実施例３）〕
図１に示す電界非接触撹拌装置を用い、基板に固定したプローブＤＮＡに検体ＤＮＡを反応させる状況にて、微少量液滴１０μＬにて各種ハイブリダイゼーション撹拌条件による蛍光インターカレーター（５×SYBR GreenＩ）による解析結果を蛍光顕微鏡にて観察した。
実験は、４６℃、５分、３２Ｈｚ、２．６ｋＶ、オフセット電圧１．７ｋＶ（電極クリアランス３ｍｍ）、（上電極−、下電極＋に接続、バースト１６サイクル）にて行い、検体ＸＸＤＮＡを用いた。またプローブＤＮＡの長さは７０ｍｅｒ，濃度５μＭ，滴下直径約１ｍｍのものを用いた。
解析結果として、ｘ型プローブの非特異状態では緑色の蛍光強度が低く、Ｘ型プローブの特異状態では緑色の蛍光強度が高かった。これより十分な撹拌によって良好なハイブリダイゼーションが進行していると判定された。
なお、比較（比較例２）のため、従来の非接触撹拌方法として、タイテック（TAITEC）社製恒温槽付き振とう器を用いて４６℃で液量１０μＬにて１０分の振とうを行い、同様の実験を行ったが、判別が不能であり、内容物が撹拌できないことが確認された。
また、比較（比較例３）のため、前記実施例２と同じ電界非接触撹拌装置を用い、４６℃で液量１０μＬにて５分，１１０Ｈｚ，２．６ｋＶ,オフセット電圧１．７ｋＶ（上電極−、下電極＋に接続）にて同様の実験を行ったが、判別が不能であり、内容物が撹拌できないことが確認された。
【００３９】
〔実験例４（実施例４）〕
電界非接触撹拌方法の抗原定着反応への利用の効果は、図５に示す抗原溶液を滴下したプラスチック基板（ポリスチレン製基板）を用いて行った。反応はすべて２５±２℃、６０±１０％の密閉容器内で行った。実験工程を図６に示す。
まず、ポリスチレン製基板に３３３μｇ／ｍＬの牛血清アルブミン（BSA）in PBS １μＬを滴下した。次に、図５に示す電界非接触撹拌装置を用い、１０分間電界を印加した。電界条件は、２００Ｈｚ、３ｋＶ、オフセット電圧２ｋＶ（上電極−、下電極＋に接続、バースト３サイクル）にて行った。次に、０．０５％ Tween２０in PBSにて洗浄後、１％eggアルブミンin PBS溶液にて３０分静置にてブロッキング処理を行った。洗浄後、１．１μｇ／ｍＬ抗BSA抗体in １％ eggアルブミン溶液１μＬを滴下し、３０分静置にて反応させた。洗浄後、３ｍＭ-ＡＢＴＳ in ０．１％Ｈ２Ｏ２ in ０．１Ｍクエン酸バッファー１μＬを滴下し、１５分静置後、発色の彩度を測定した。
解析結果として、図７に示すように、抗原定着反応時間は１０分の場合でも、従来法と同程度の発色を示した。これより、電界非接触攪拌方法により、抗原定着反応が活発となり、反応時間を１／６に短縮可能であることを確認できた。
電界非接触撹拌方法によって抗原定着反応を迅速化できたことに関する推察
アルブミンは、６６ｋＤの単量体タンパクである。アルブミンの大きさは、３０Å（３ナノ）である。Ｘ線解析では分子表面に凹凸が存在することが知られている。  疎水性アミノ酸のカルボキシ基（-ＣＯＯ−）は基板である疎水性のプラスチックに静電的にファンデルワールス力によって結合する。ファンデルワールス力は近距離で作用するため、電界非接触撹拌方法を用いると微少量液滴内部に撹拌作用が発現し、抗原と抗体間にファンデルワールス力が作用し、抗原の基板定着が効率的に行われる。これより、十分な撹拌によって、短時間で良好な抗原定着が可能になったと推察された。
【００４０】
〔実験例５（実施例５）〕
電界非接触撹拌方法の抗原抗体反応への利用の効果は、図５に示す３３３μg／ｍＬ BSA in PBS溶液を定着させたプラスチック基板（ポリスチレン製基板）を用いて行った。反応はすべて２５±２℃  ６０±１０％  密閉容器内で行った。実験工程を図８に示す。
まず、１．１μｇ／ｍＬ抗ＢＳＡ抗体in １％ eggアルブミン溶液１μＬを抗原定着基板に滴下した。次に、図５に示す電界非接触撹拌装置を用い、１５分間電界を印加した。電界条件は、実験例４と同様である。洗浄工程、ブロッキング工程、発色工程は、実験例４と同様である。
解析結果として、図９に示すように、抗原抗体反応は１５分の場合でも、発色が十分確認できた。さらに短時間では、発色を確認できなかった。これより、抗原抗体反応時間を１／２に短縮可能であることを確認できた。
電界非接触撹拌方法によって抗原抗体反応が迅速化したことに関する推察
抗体はファンデルワールス力、疎水性効果、水素結合、イオン対などの相互作用で抗原に結合する。その結合力は酵素・基質結合の親和性と同程度であることが知られている。ファンデルワールス力は距離に依存するため、電界非接触撹拌方法を用いると液内部に振動が起こり、分子の衝突が起こり、ファンデルワールス力が作用しやすい環境になり、抗原抗体反応の迅速化が可能になったと考えられる。
これより、図１０に示すように、電界非接触撹拌方法を用いて、ＥＬＩＳＡ解析時間を１／３に短縮できることを確認できた。
【００４１】
以上本発明を図面の実施の形態に基づいて説明したが、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載の構成を変更しない限りどのようにでも実施することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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