(57)【要約】      （修正有）【課題】オリゴヌクレオチド、合成ＤＮＡ及び合成ＲＮＡ等の合成により製造された生体分子の限外濾過による精製と濃縮の方法を提供する。【解決手段】約０．５ＫＤ〜約１０ＫＤの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）をもち、膜４表面が正電荷又は負電荷をもつ限外濾過（ＵＦ）膜を使用し、その荷電表面を使用して合成生体分子を跳ね返して残液に保持するか又は合成生体分子を膜濾過に優先的に吸引することにより合成生体分子を精製濃縮する。【選択図】図２
2010075185.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口と濾液出口をもつ濾過ホルダーと、全濾液が出口を通ってハウジングから流出する前に入口から流入して複数の膜を通過するように配置された複数の荷電限外濾過膜を含み、前記複数の膜が、膜表面が負電荷を有するとき、０．５ＫＤから５ＫＤ未満の公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有し、膜表面が正電荷を有するとき、０．５ＫＤ〜２０ＫＤの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有し、オリゴヌクレオチド、合成ＤＮＡおよび合成ＲＮＡより選択される０．５ＫＤ〜５ＫＤの範囲の分子量を有する荷電ターゲット分子の精製用システムであり、前記複数の荷電限外濾過膜の公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）が、前記荷電ターゲット分子の分子量より大きいことを特徴とする、前記精製用システム。
【請求項２】
前記複数の膜が、１ＫＤから４ＫＤ未満の公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有し、負電荷を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記複数の膜が、１．５ＫＤ〜５ＫＤの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有し、正電荷を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
残液出口と入口との間に流体連通する返送ループを更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
入口の上流にポンプを更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
残液出口と入口の間に流体連通する返送ループと、入口の上流に配置されたポンプを更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
残液出口と入口の間に流体連通する返送ループと、入口の上流に配置されたポンプと、残液出口と入り口の間で返送ループに配置された第２のポンプを更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
残液出口と入口の間に流体連通する返送ループと、返送ループと流体連通する残液緩衝液供給源を更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
オリゴヌクレオチド、合成ＤＮＡおよび合成ＲＮＡより選択される０．５ＫＤ〜５ＫＤの範囲の分子量を有する荷電ターゲット分子を含む供給源を供給する段階と、膜表面が負電荷を有するとき、公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）が０．５ＫＤから５ＫＤ未満であり、膜表面が正電荷を有するとき、公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）が０．５ＫＤ〜２０ＫＤである複数の荷電限外濾過膜を配置する段階と、残液流と濾過流が得られるように供給源を濾過する段階と、残液流と濾過流からなる群から選択される流れから前記荷電ターゲット分子を回収する段階を含む荷電ターゲット分子の精製方法であり、前記複数の荷電限外濾過膜の公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）が、前記荷電ターゲット分子の分子量より大きいことを特徴とする、前記精製方法。
【請求項１０】
前記複数の膜が、１ＫＤから４ＫＤ未満の公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有し、負電荷を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の膜が、１．５ＫＤ〜５ＫＤの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有し、正電荷を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
残液再循環ループを含む方法であって、ループを通して残液を循環させる段階と、残液を前記ターゲット分子供給源と混合する段階を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチド、合成ＤＮＡおよび合成ＲＮＡより選択される０．５ＫＤ〜５ＫＤの範囲の分子量を有する荷電ターゲット分子を、前記荷電ターゲット分子と不純物とキャリヤー液の混合物を含む溶液から分離する方法であり、前記混合物を含む溶液を供給する段階と、膜表面が負電荷を有するとき、公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）が０．５ＫＤから５ＫＤ未満であり、膜表面が正電荷を有するとき、公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）が０．５ＫＤ〜２０ＫＤであり、且つ、前記荷電ターゲット分子と同種の実電荷を有する複数の荷電限外濾過膜と前記混合物とを接触させる段階と、前記荷電ターゲット分子を前記複数の荷電限外濾過膜の上流に保持すると共に前記不純物および前記キャリヤー液を膜に通過させることにより、前記混合物から前記荷電ターゲット分子を分離する段階を含む前記方法であり、前記複数の荷電限外濾過膜の公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）が、前記荷電ターゲット分子の分子量より大きいことを特徴とする、前記方法。
【請求項１４】
前記ターゲット分子が膜の実電荷と同一の実電荷を有するように混合物のｐＨを調節する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の膜が前記ターゲット分子の電荷と同一の電荷をもつように混合物のｐＨを調節する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ターゲット分子が前記複数の膜の電荷と同一の電荷をもつように供給源のｐＨを調節する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の膜が前記ターゲット分子の電荷と同一の電荷をもつように供給源のｐＨを調節する、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
篩係数が同一型の非荷電膜よりも少なくとも１．５倍改善されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
篩係数が同一型の非荷電膜よりも少なくとも１．５倍改善されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
入口と濾液出口をもつ濾過ホルダーと、全濾液が出口を通ってハウジングから流出する前に入口から流入して複数の膜を通過するように配置された複数の荷電限外濾過膜を含み、前記複数の膜が、膜表面に正電荷を有して０．５ＫＤ〜２０ＫＤの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）有する、オリゴヌクレオチド、合成ＤＮＡおよび合成ＲＮＡより選択される０．５ＫＤ〜５ＫＤの範囲の分子量を有する荷電ターゲット分子の精製用システムであり、前記複数の荷電限外濾過膜の公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）が、前記荷電ターゲット分子の分子量より大きいことを特徴とする、前記精製用システム。
【請求項２１】
前記複数の荷電限外濾過膜が、１ＫＤ〜１０ＫＤの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記複数の荷電限外濾過膜が、１．５ＫＤ〜５ＫＤの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチド、合成ＤＮＡおよび合成ＲＮＡより選択される０．５ＫＤ〜５ＫＤの分子量を有する荷電ターゲット分子を含む供給源を供給する段階と、０．５ＫＤ〜２０ＫＤの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する複数の正荷電限外濾過膜を配置する段階と、残液流と濾過流が得られるように供給源を濾過する段階と、残液流と濾過流からなる群から選択される流れから前記荷電ターゲット分子を回収する段階を含む荷電ターゲット分子の精製方法であり、前記複数の正荷電限外濾過膜の公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）が、前記荷電ターゲット分子の分子量より大きいことを特徴とする、前記精製方法。
【請求項２４】
前記複数の正荷電限外濾過膜が、１ＫＤ〜１０ＫＤの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の正荷電限外濾過膜が、１．５ＫＤ〜５ＫＤの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
本願は米国仮特許出願第６０／５２４，６８２号(出願日２００２年１１月２４日）の優先権を主張する。そのの開示内容全体を本明細書に組込む。
【０００２】
本発明は合成により製造された生体分子の精製と濃縮に関する。より詳細には、本発明はオリゴヌクレオチド、合成ＤＮＡ及び合成ＲＮＡ等の合成により製造された生体分子の限外濾過による精製と濃縮に関する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチド、合成ＤＮＡ及び合成ＲＮＡ等の合成生体分子は治療剤として研究途上にある。これらの分子は天然又は組換え分子に代用できると考えられる。これには多数の理由がある。分子によっては天然に存在しないものや、何らかの理由でまだ組換え技術を使用して複製できないものがある。合成はこの問題を解決することができる。また、同一分子の変異体が存在することは多い。合成は分子を所望形に個別作製することができる。最後に、合成物質とその製品は多くの場合には製造費用が安く、また多くの場合にはバイオハザードに関する問題がない。
【０００４】
これらの分子は一般に合成化学前駆体により形成され、合成器内で種々の固体支持体上で集合される。
【０００５】
分子を形成後に、その後の処理又は製剤化のために精製し、多くの場合には濃縮することが必要である。
【０００６】
分子は一般にその固体支持体から分離した後に限外濾過又はクロマトグラフィー吸着等の精製段階により不純物を除去する。
【０００７】
所望分子は比較的小さく、一般に分子量約０．５〜約５キロダルトン（ＫＤ）である。
【０００８】
従って、分子を保持するために使用される膜細孔とほぼ同一サイズであることが多いので、限外濾過により精製濃縮するのは困難である。この結果、比較的低収率の生成物しか得られない。更に、細孔寸法の小さい膜は低流量であり、処理時間に数時間も要することがある。このため、処理コストが増すと共に、膜とシステムコンポーネントに不当な負荷がかかる。
【０００９】
この問題により、限外濾過はこの用途には広く受入られてからず、これらの分子を精製濃縮するにはクロマトグラフィー、沈殿又は蒸留法が使用されている。
【００１０】
これらの方法にはそれぞれ固有の欠点がある。これらの方法はバイオテクノロジー、殆どの場合は特に生産工程規模のクロマトグラフィーを利用しており、限外濾過よりも費用がかかる。沈殿は除去する必要のある付加薬品を導入することが多い。蒸留は特に熱感受性の分子に悪影響を与える恐れがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明はこの用途に限外濾過を実施できるようにするための手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は約０．５ＫＤ〜約１０ＫＤの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）をもち、膜表面が正電荷又は負電荷をもつ限外濾過（ＵＦ）膜に関する。本発明は荷電表面を使用して合成生体分子を跳ね返して残液に保持するか又は合成生体分子を膜濾過に優先的に吸引することにより合成生体分子を精製濃縮するために荷電ＵＦ膜を使用する方法にも関する。
【００１３】
本発明は更に低分子量不純物を除去することにより、同様の精製レベルを達成するためにクロマトグラフィーや他の段階の必要を減らすことができる。本発明は更に細孔寸法の大きい膜を使用することにより、流量を増加すると共に、処理測度と経済性を改善し、より高い収率の生成物を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明による膜と分子の概略図を示す。
【図２】合成生体分子を精製及び／又は濃縮するための本発明のシステムを示す。
【図３】本発明の垂直流システムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明はオリゴヌクレオチド、合成ＤＮＡ及び合成ＲＮＡ等の合成生体分子を精製及び／又は濃縮するための１個以上の正又は負荷電膜の使用に関する。
【００１６】
上述のように、合成生体分子の処理に限外濾過を使用する場合には２つの問題がある。第１に、分子自体が小さく、一般に約０．５〜約５ＫＤである。このため、非常に目の細かいＵＦ膜を使用する必要がある。それでもこれらの分子のサイズは膜の目と変わらないことが多い。その結果、ターゲット分子は膜を通過し、分子の収率が低下することが多い。第２に、このような目の細かい膜は流量特性が非常に低いため、所与時間に非常に僅かな材料しか通過しない。このため、目の粗い膜よりも所与量の液体を処理するのに時間がかかる。更に、流量が低いと膜とシステムにかかる背圧と膜通過圧が高くなり、この点も問題である。
【００１７】
本発明は正電荷又は負電荷を含む１個以上のＵＦ膜を使用する。
【００１８】
膜はターゲット分子と同種電荷を含むことが好ましい。同種電荷は反発し合うので、膜はターゲット分子をその表面から跳ね返す。この現象を利用することができる。こうして、ターゲット分子よりもＮＭＷＣＯの高い膜を使用してより高い流量とより高いスループットを達成しながら、ターゲット分子の収率も増加することができる。
【００１９】
同種電荷をもつターゲット分子はターゲット分子と膜の電荷により実際よりも大きなサイズであるかのように挙動する。従って、ターゲット分子は物理的に膜を通過できるにも拘わらず、同種電荷であるために通過できない。
【００２０】
更に、小さな不純物は同種電荷をもつ場合でも、そのサイズが小さく、濾過力が電荷反発力よりも大きいために膜を通過する。
【００２１】
図１は本発明による膜と分子の概略図を示す。この態様では、ターゲット分子２は負電荷をもつと仮定され、膜４の表面も負電荷をもつように作製されている。不純物６Ａ及びＢは負電荷でも正電荷でもよい。図面に示すように、ターゲット分子を含む液体が膜４に達すると分子２は同一電荷であるために膜４から跳ね返され、残液に保持される。不純物は同種電荷であるか逆電荷であるかに関係なく、そのサイズと濾過力により膜を通過して濾液側に移動する。
【００２２】
図２は合成生体分子を精製及び／又は濃縮するための本発明のシステムを示す。生体分子供給源２０がフィルターホルダー２２と流体連通している。この態様では、システムは接線流方式（ＴＦＦ）で運転される。供給源２０の下流にポンプ２４が配置されている。その出口２６はホルダー２２の入口２８に接続されている。下流には１個以上の膜３０が配置され、ホルダー２２を上流区画３２と下流区画３４に分離している。下流区画３４に到達する液体及び固体又は溶媒はまず１個以上の膜３０を通過しなければならない。上流区画３２は更に残液出口３６をもつ。場合により、図面に示すように、残液出口３６は更に残液を必要に応じてシステムに返送するために入口２８と流体連通する返送ループ３８をもつ。場合により配置する残液ポンプ４０も示す。図面に示すように、返送ループ３８はポンプ２４とホルダーの入口２８の間に配置されている。あるいは、供給源２０又は供給源２０と入口２８の間の任意点に返送してもよい。下流チャンバーに配置された濾液出口４２も示す。
【００２３】
運転中に、供給源からの液体はホルダー２２の入口２８に流入し、１個以上の膜３０を通過する。液体と不純物又はターゲット分子は膜を通過して下流区画３４に移動する。ターゲット分子と膜は同一電荷をもつことが好ましい。
【００２４】
図３は本発明の垂直流システムを示す。供給源１００はフィルター装置１０３の入口１０２と流体連通している。液体は限外濾過膜１０８により下流区画１０６から分離された上流区画１０４に入口１０２から流入する。下流区画１０６に到達する全液体、固体又は溶質は膜１０８を通過していなければならない。その後、濾液は出口１１０を通って装置から流出する。
【００２５】
あるいは、選択的返送ループ１８とポンプ２０を省略することにより図２の態様を垂直流方式で運転することもできる。
【００２６】
選択する膜又はフィルターの篩係数と透過性の２つの特性に注目することがこの関連では重要である。
【００２７】
篩係数は濾過後のフィルターの上流の分子の濃度に対するフィルターの下流の所望分子の濃度の比である。この値が大きいほど、所望分子がフィルターを通過する量は多い。従って、値が大きい場合には分子はフィルターを通過し易い。逆に、値が小さいと、分子の大半はフィルターの上流に保持されている。フィルターの上流（残液側）に分子を保持することが所望され、ターゲット分子と膜が同種電荷をもつ場合には、低い篩係数値が望ましい。逆に、（膜又はフィルターを通過する）濾液に分子を保持したい場合には、高い値が望ましい。
【００２８】
透過性は膜又はフィルターの濾過速度である。これは主に膜の細孔サイズ、気孔率及び厚さと、濾過する溶液の粘度と濃度により決定される。非荷電膜では、透過性は篩係数の低下と共に低下する。本発明の荷電膜では、篩係数が非荷電膜よりも改善される（篩係数値は分子が残液に含まれる場合には低下し、分子が濾液に含まれる場合には増加する）と共に、透過性は同じか又は僅かしか低下しないので、篩係数と透過性を総合すると非荷電システムよりも改善される。例えば、分子が膜と同種電荷であり、従って、残液に保持される場合には、篩係数値が低下すると共に透過性が全く又は殆ど低下しないという効果として改善が観察される。本発明によると、篩係数の改善は非荷電膜又はフィルターで達せられる篩係数値の少なくとも１．５倍、あるいは少なくとも２倍、あるいは少なくとも５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは５０倍になると思われる。
【００２９】
少なくとも運転条件下で所望電荷をもつことが可能な任意限外濾過膜が本発明では有用である。このような膜は当分野で周知である。
【００３０】
例えば、ＵＳ２００３／０１７８３６８Ａ１は荷電化合物又は電荷をもつように化学的に修飾することが可能な化合物で膜の表面を共有結合性修飾することにより荷電セルロース濾過膜を作製する方法を教示している。例えば、セルロース（セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、硝酸セルロース又はそのブレンド）膜は荷電表面を形成するように誘導体化されるヒドロキシル部分をもつ。多様な化合物を使用することができる。殆どの化合物は膜表面（その細孔の内面を含む）と反応することが可能なハロゲン化物部分と、正電荷又は負電荷を付与する第２のリガンドと反応することが可能なヒドロキシル部分をもつ。
【００３１】
ＵＳ４，８２４，５６８はポリマーコーティングを膜の表面に塗布した後に紫外線、電子ビーム又は別のエネルギー源で架橋させてＰＶＤＦ、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ＰＴＦＥ樹脂等の膜に電荷を注入する方法を教示している。
【００３２】
荷電コーティングを重合及び架橋する方法や、荷電材料を膜表面にグラフトする方法等の他の技術も使用することができる。
【００３３】
適切な膜としては限定されないが、いずれもＢｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓに所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＢＩＯＭＡＸ（登録商標）膜等のポリエーテルスルホン膜、Ｕｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）膜等の複合再生セルロース膜又はＰＬ膜等の再生セルロース膜が挙げられる。
【００３４】
これらの膜のＮＭＷＣＯは約０．５ｋＤ〜約２０ｋＤ、好ましくは約１ｋＤ〜１０ｋＤとすることができる。選択サイズは精製及び／又は濃縮する分子、その電荷、膜表面に導入することができる電荷レベル、システムをＴＦＦ、垂直流等のいずれで運転するか、更にはシステムを運転する圧力によって異なる。
【００３５】
場合により、合成生体分子又は膜が膜又は合成生体分子と同種電荷をもつように濾過する溶液のｐＨを調節することにより反発効果を増すことができる。例えば中性ｐＨ（ｐＨ＝７）では、分子は逆電荷又は中性電荷をもつと思われる。しかし、その等電点に応じてｐＨを増減すると、分子は膜と同種電荷を帯びるようになる。同様に、膜は逆電荷又は中性電荷をもつと思われる。しかし、その等電点に応じてｐＨを増減すると、膜は分離する分子と同種電荷を帯びるようになる。
【図１】
2010075185.tif 000003
【図２】
2010075185.tif 000004
【図３】
2010075185.tif 000005