(57)【要約】      （修正有）【課題】検体中の単一種類のグリコサミノグリカンを測定し、その測定とリソソーム病とを関連づけるステップを少なくとも含む、リソソーム病の検出方法を提供する。【解決手段】ムコ多糖症ＩＶ型に罹患している可能性のある動物由来の血液検体中におけるケラタン硫酸を測定し、その測定結果とムコ多糖症ＩＶ型とを関連づけるステップを含む、ムコ多糖症ＩＶ型の検出方法であって、ケラタン硫酸の測定結果が健常動物と比して高い場合は、ムコ多糖症ＩＶ型に罹患している可能性が高いと関連づけ、ケラタン硫酸の測定結果が健常動物における測定結果と同等である場合は、ムコ多糖症ＩＶ型ではないと関連付ける、ムコ多糖症ＩＶ型の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムコ多糖症ＩＶ型に罹患している可能性のある動物由来の血液検体中におけるケラタン硫酸を測定し、その測定結果とムコ多糖症ＩＶ型とを関連づけるステップを少なくとも含む、ムコ多糖症ＩＶ型の検出方法であって、
ケラタン硫酸の測定結果が健常動物と比して高い場合は、ムコ多糖症ＩＶ型に罹患している可能性が高いと関連づけ、
ケラタン硫酸の測定結果が健常動物における測定結果と同等である場合は、ムコ多糖症ＩＶ型ではないと関連付ける、ムコ多糖症ＩＶ型の検出方法。
【請求項２】
血液検体中のケラタン硫酸が他の成分と結合して複合体を形成している、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
ムコ多糖症ＩＶ型に罹患している可能性のある動物が新生児である、請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
ケラタン硫酸の測定が、ケラタン硫酸に特異的に結合するポリペプチドを用いて行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項５】
ポリペプチドが、ケラタン硫酸に特異的に結合する抗体または該抗体の抗原結合部位を有するポリペプチドである、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
ケラタン硫酸の測定が、下記（１）及び（２）の工程を少なくとも含む工程によって行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出方法。
（１）「ケラタン硫酸に特異的に結合する第１のポリペプチドが固着された固相」に「血液検体」を接触させて、「固相に固着された第１のポリペプチド−血液検体中のケラタン硫酸含有分子」からなる複合体を形成させる工程。
（２）工程（１）において形成された複合体を検出する工程。
【請求項７】
ケラタン硫酸の測定が、下記（１）〜（３）の工程を少なくとも含む工程によって行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出方法。
（１）「ケラタン硫酸に特異的に結合する第１のポリペプチドが固着された固相」に「血液検体」を接触させて、「固相に固着された第１のポリペプチド−血液検体中のケラタン硫酸含有分子」からなる複合体を形成させる工程。
（２）前記固相に、「ケラタン硫酸含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチド」を接触させて、「固相に固着された前記第１のポリペプチド−血液検体中のケラタン硫酸含有分子−第２のポリペプチド」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（３）工程（２）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
【請求項８】
第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドが、ケラタン硫酸に特異的に結合する抗体または該抗体の抗原結合部位を有するポリペプチドである、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
抗体が抗ケラタン硫酸抗体５Ｄ４である、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
第２のポリペプチドが、標識物質で標識されているか又は標識されることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１１】
ケラタン硫酸の測定が、下記（１）〜（３）の工程を少なくとも含む工程によって行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出方法。
（１）「ケラタン硫酸に特異的に結合する第３のポリペプチド」と「ケラタン硫酸含有分子が固着された固相」を接触させて、「第３のポリペプチド‐固相に固着されたケラタン硫酸含有分子」からなる第１の複合体を形成させる工程。
（２）血液検体中のケラタン硫酸と工程（１）によって得られた『第１の複合体』との結合に適した条件下で、血液検体に「『第１の複合体』と『第１の複合体を形成しなかった第３のポリペプチドとを含有する混合物』」を接触させて、「血液検体中のケラタン硫酸含有分子−第３のポリペプチド」からなる第２の複合体を形成させる工程。
（３）工程（２）において形成された第２の複合体を検出する工程。
【請求項１２】
第３のポリペプチドが、ケラタン硫酸に特異的に結合する抗体または該抗体の抗原結合部位を有するポリペプチドである、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
第２の複合体の検出が、「第３のポリペプチドに特異的に結合する第４のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われる、請求項１１または１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
第４のポリペプチドが、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドである請求項１３に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムコ多糖症の検出方法及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書において用いる略号を説明する。
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＫＳ：ケラタン硫酸
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳ−４Ｓ：コンドロイチン−４−硫酸
ＣＳ−６Ｓ：コンドロイチン−６−硫酸
ＤＳ：デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂともいう）
ＧＳＤ I：グリコーゲン蓄積疾患１型
ＧＳＤ II：グリコーゲン蓄積疾患２型（ポンペ病）
Ｈｅｐ：ヘパリン
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＬＩＰＯ：リポフシノーシス
ＭＰＳ：ムコ多糖症
ＭＬ：ムコリピドーシス
ＭＬＤ：メタクロマティック・ロイコジストロフィー
ＮＰ：ニーマン・ピック病
ＴＳ：タイ・サックス病
【０００３】
リソソーム病（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）は、リソソームに存在する酵素の異常に起因する疾患である。
ムコ多糖症(ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ)は、リソソーム病の一種であり、ＧＡＧの分解代謝に関係する酵素の障害(活性低下)によって起こる一連の遺伝病の総称である。障害される酵素の種類に応じて特異的なＧＡＧが組織中に蓄積し、体液中に分泌されることが知られている。ムコ多糖症の臨床症状は多様だが、多くは、粗な顔貌、多発性骨異常や内臓腫大を伴う。また聴力低下、心血管障害や精神発達の遅れを伴う場合もある。
ムコ多糖症の型とこれに対応して蓄積されるＧＡＧとの関係は、表１−１の通りであることが知られている（非特許文献１等参照）。
【０００４】
【表１】
2010014724.tif 000002
【０００５】
【表２】
2010014724.tif 000003
【０００６】
しかし、上記のムコ多糖症のそれぞれにおいて、上記のＧＡＧのみならずそれ以外のＧＡＧについても体液中に多量に排出されていることは知られていなかった。
【０００７】
また特許文献１には、第一受容体（抗ＫＳ抗体、抗ＣＳ抗体、抗ＨＳ抗体などの抗ＧＡＧ抗体）が固着した固相体と、第一リガンド（ＫＳ、ＣＳ、ＨＳなどのＧＡＧ）を含む検体とを接触させ、第一受容体と第一リガンドとの複合体の形成を第一標識物質で標識された第一受容体で検出することにより、検体中の第一リガンドを測定する方法が開示されている。そして、この方法によればＧＡＧに関連する疾患（モルキオ症、ハーラー症などのムコ多糖症など）の一次スクリーニングを簡便に行うことができる旨の開示がある。
【０００８】
しかしこの文献にも、前記のムコ多糖症のそれぞれにおいて、前記したＧＡＧ以外の種類のＧＡＧが体液中に排出されていることについては記載も示唆もない。そして、単一種類のＧＡＧを測定することによって、前記のムコ多糖症の分類（型）を問わず、全種類のムコ多糖症を検出しうることについての記載も示唆もない。
【０００９】
ムコリピドーシス（ｍｕｃｏｌｉｐｉｄｏｓｅｓ）もリソソーム病の一種であり、ムコ多糖症と同様の臨床症状がみられる疾患である。ムコリピドーシスの型に関しては表１−２の通りであることが知られている。
【００１０】
また、ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ）及びフコシドーシス(ｆｕｃｏｓｉｄｏｓｉｓ)もリソソーム病の一種であって、前者はβ−ガラクトシダーゼの障害によってＧＭ１ガングリオシド、β−ガラクトース残基を持つオリゴ糖や糖タンパク質が蓄積する疾患であり、後者はα−フコシダーゼの障害によってα−フコース残基を持つオリゴ糖や糖タンパク質が蓄積する疾患である。
【００１１】
また、ガラクトシアリドーシス（ｇａｌａｃｔｏｓｉａｌｉｄｏｓｉｓ）もリソソーム病の一種であって、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）やα-ノイラミニダーゼ(α−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ)の障害や、これらの酵素の安定化に関与するカテプシンＡ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ａ）の障害によって、シアリルオリゴ糖（ｓｉａｌｙｌｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ)やＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ）におけるのと同様の物質が蓄積する疾患である。
【００１２】
さらに、以下の疾患もリソソーム病の一種である。
メタクロマティック・ロイコジストロフィー（Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ  Ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、アリールスルファターゼＡ（ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ  Ａ）の障害によって、スルファチド（ｓｕｌｐｈａｔｉｄｅｓ）が蓄積する疾患である。
ニーマン・ピック（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ）病は、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）が蓄積する疾患である。
【００１３】
このうち、Ｂ型は酸性スフィンゴミエリナーゼ（ａｃｉｄ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）の障害によるものであり、Ｃ型はコレステロールのエステル化の障害（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔ）によるものである。
タイ・サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）病は、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼＡ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ａ)のα−サブユニットの障害によって、ＧＭ２ガングリオシド（ＧＭ２  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）が蓄積する疾患である。
【００１４】
サンドホッフ（Ｓａｎｄｈｏｆｆ）病は、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼＡ及びＢ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）のβ−サブユニットの障害によって、ＧＭ２ガングリオシド（ＧＭ２  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）が蓄積する疾患である。
【００１５】
ＧＭ２ガングリオシドーシス（ＧＭ２  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ）は、ＧＭ２活性化タンパク質（ＧＭ２  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の障害によって、GM2ガングリオシド（ＧＭ２  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）が蓄積する疾患である。
クラッベ（Ｋｒａｂｂｅ）病は、β−Ｄ−ガラクトセレブロシダーゼ（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）の障害によって、ガラクトセレブロシド（ｇａｌａｃｔｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ）が蓄積する疾患である。
【００１６】
ファブリー（Ｆａｂｒｙ）病は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ（α−D−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の障害によって、グロボシド（ｇｌｏｂｏｓｉｄｅｓ）が蓄積する疾患である。
【００１７】
ガウチャー（Ｇａｕｃｈｅｒ）病は、β−Ｄ−グルコセレブロシダーゼ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）の障害によって、グルコシルセラミド（ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）が蓄積する疾患である。
【００１８】
グリコーゲン蓄積疾患１型（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｙｐｅ  １）は、グルコース−６−フォスファターゼの障害によって、グリコーゲン(ｇｌｙｃｏｇｅｎ)が蓄積する疾患である。
【００１９】
グリコーゲン蓄積疾患２型（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｙｐｅ  ２）はポンペ病（Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）とも呼ばれ、α−Ｄ−グルコシダーゼ（α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）の障害によって、グリコーゲン（ｇｌｙｃｏｇｅｎ）が蓄積する疾患である。
【００２０】
リポフシノーシス（ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｅｓ）は、パルミトイル-プロテイン チオエステラーゼ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ）やトリペプチジルアミノペプチダーゼ-Ｉ（ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｍｉｎｏ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−Ｉ）の障害によって引き起こされる疾患である。
これらの疾患についても、ＧＡＧが体液中に多量に排出されていることは知られていなかった。
【００２１】
以下、ムコ多糖症、ムコリピドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスをまとめて「ムコ多糖症等」という。
【００２２】
ムコ多糖症等は通常、出生時には症状がなく、乳幼児期や小児期における身長の発達の低さ、骨の異常な発育、毛深さ等の症状によって明らかとなる。また、出生時においては正常でも、数年にわたって次第に精神発達の遅れを来す場合もある。したがって、未だ臨床症状が現れない出生後の早期にムコ多糖症等の診断がなされれば、早期に酵素補充療法、遺伝子治療、骨髄移植等を実施でき、精神発達の遅れ等をくい止めることができる可能性がある。従って、全ての新生児についてムコ多糖症等の診断が行われることが最も望ましい。
【００２３】
しかし、例えば日本国における新生児数は年間１００万人を超える一方、ムコ多糖症等の発生頻度は４万〜５万人に１人と極めて低く、しかも診断は酵素欠損や酵素異常を調べるという煩雑かつ高価なものであることから、その診断の前段階として、精度の高いスクリーニング法が求められている。すなわち、ムコ多糖症等の患者を漏れなく、高精度、高感度、簡便、迅速かつ安価に検出できる方法が提供されれば、全新生児についてムコ多糖症等の可能性の存否を調べることが可能となり、ムコ多糖症等の患者について漏れなく、的確な確定診断を経て早期に治療することが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】特開平１０−１５３６００号公報
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｅｓ  ｏｆ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，７ｔｈ  ｅｄｎ．，Ｓｃｒｉｖｅｒ  ＣＲ，Ｂｅａｕｄｅｔ  ＡＬ，Ｓｌｙ  ＷＳ，Ｖａｌｌｅ  Ｄ（ｅｄｓ），１９９５，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、リソソーム病についての高精度、高感度、簡便、迅速的かつ安価な検出方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、従来、ムコ多糖症の型（分類）に応じて特定種類のＧＡＧが体液中に多量に排出されると考えてられてきたところ、実はそれ以外の種類のＧＡＧについても体液中に多量に排出されている事実を発見した。
さらに、ムコリピドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスなどのリソソーム病についてもＧＡＧが体液中に多量に排出されている事実を発見した。そして、これに基づいてリソソーム病についての高精度、高感度、簡便、効率的かつ安価な検出方法及びキットを提供するに至り、本発明を完成した。
【００２８】
すなわち本発明は、検体中の単一種類のＧＡＧを測定し、その測定結果とリソソーム病とを関連づけるステップを少なくとも含む、リソソーム病の検出方法（以下、本発明方法という）を提供する。
本発明方法における「リソソーム病」は、ムコ多糖症、ムコリピドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスから選ばれる１以上の疾患であることが好ましい。
本発明方法における検体は、体液であることが好ましく、尿又は血液であることがより好ましい。
また本発明方法における単一種類のＧＡＧの測定は、ＧＡＧ含有分子に特異的に結合するポリペプチドを用いて行われることが好ましい。
【００２９】
なかでも下記（１）及び（２）の工程を少なくとも含む工程によって行われることが好ましい。
（１）「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第１のポリペプチドが固着された固相」、「検体」及び「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチド」を接触させ、「固相に固着された前記第１のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子−第２のポリペプチド」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（２）工程（１）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
【００３０】
そのなかでも特に、下記（１）〜（３）の工程を少なくとも含む工程によって行われることが好ましい。
（１）「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第１のポリペプチドが固着された固相」に「検体」を接触させて、「固相に固着された第１のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子」からなる複合体を形成させる工程。
（２）前記固相に、「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチド」を接触させ、「固相に固着された前記第１のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子−第２のポリペプチド」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（３）工程（２）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
前記の「第２のポリペプチド」は、標識物質で標識されているか又は標識されることが好ましい。
【００３１】
また、下記（１）及び（２）の工程を少なくとも含む工程によって行われることも好ましい。
（１）「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第３のポリペプチド」、「検体」及び「ＧＡＧ含有分子が固着された固相」を接触させ、「固相に固着されたＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第１の複合体及び「検体中のＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第２の複合体を形成させる工程。
（２）工程（１）において形成された「固相に固着されたＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第１の複合体及び「検体中のＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第２の複合体の少なくとも一方の複合体を検出する工程。
【００３２】
そのなかでも特に、下記（１）〜（３）の工程を少なくとも含む工程によって行われることが好ましい。
（１）「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第３のポリペプチド」と「検体」とを接触させて、「第３のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子」からなる第１の複合体を形成させる工程。
（２）「ＧＡＧ含有分子が固着された固相」に、工程（１）によって得られた「『第１の複合体』と『第１の複合体を形成しなかった第３のポリペプチド』とを含有する混合物」を接触させ、「固相に固着されたＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第２の複合体を形成させる工程。
（３）工程（２）において形成された第２の複合体を検出する工程。
【００３３】
この第２の複合体の検出は、「第３のポリペプチドに特異的に結合する第４のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることが好ましい。
【００３４】
また、これらの方法に用いられる「ポリペプチド」は、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドであることが好ましい。
【００３５】
本発明方法における「単一種類のＧＡＧ」は、硫酸基を有するＧＡＧであることが好ましい。硫酸基を有するＧＡＧは、ＫＳ、ＨＳ、ＣＳ又はＤＳであることが好ましい。本発明方法は、なかでも「硫酸基を有するＧＡＧ」がＫＳであって、かつ「ムコ多糖症」がＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＶＩ型及びＶＩＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものが好ましい。また、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＫＳであって、かつ、ムコリピドーシスがＩＩ型及びＩＩＩ型から選ばれる１以上のムコリピドーシスであるものが好ましい。また、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＨＳであって、かつ「ムコ多糖症」がＩＶ型及びＶＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるもの、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＨＳであって、かつ、「リソソーム病」がムコリピドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスから選ばれる１以上の疾患であるもの、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＣＳであって、かつ「ムコ多糖症」がＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるもの、及び「硫酸基を有するＧＡＧ」がＤＳであって、かつ「ムコ多糖症」がＩＩＩ型及びＩＶ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものも好ましい。
【００３６】
また本発明は、下記の構成成分を少なくとも含み、検体中の単一種類のＧＡＧの測定結果に基づいてムコ多糖症、ムコリピドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスから選ばれる１以上の疾患を検出するためのキット（以下、本発明キットという）を提供する。
（Ａ）ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第１のポリペプチドが固着された固相、及び、
（Ｂ）ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの。
【００３７】
本発明キットは、下記の構成成分を少なくとも含むものであってもよい。
（Ａ）ＧＡＧ含有分子が固着された固相、
（Ｂ）ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第３のポリペプチド、及び、
（Ｃ）第３のポリペプチドに特異的に結合する第４のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの
これらのポリペプチドは、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドであることが好ましい。
【００３８】
本発明キットにおける「単一種類のＧＡＧ」は、硫酸基を有するＧＡＧであることが好ましい。硫酸基を有するＧＡＧは、ＫＳ、ＨＳ、ＣＳ又はＤＳであることが好ましい。本発明キットは、なかでも「硫酸基を有するＧＡＧ」がＫＳであって、かつ「ムコ多糖症」がＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＶＩ型及びＶＩＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものが好ましい。また、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＫＳであり、かつ、ムコリピドーシスがＩＩ型及びＩＩＩ型から選ばれる１以上のムコリピドーシスであるものが好ましい。また、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＨＳであって、かつ「ムコ多糖症」がＩＶ型及びＶＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるもの、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＨＳであって、かつ、「リソソーム病」がムコリピドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスから選ばれる１以上の疾患であるもの、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＣＳであって、かつ「ムコ多糖症」がＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるもの、及び「硫酸基を有するＧＡＧがＤＳ」であって、かつ「ムコ多糖症」がＩＩＩ型及びＩＶ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものも好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ヒトの尿中のＫＳの測定結果を示す図である。
【図２】ヒトの尿中のＨＳの測定結果を示す図である。
【図３】ヒトの尿中のＣＳの測定結果を示す図である。
【図４】ヒトの尿中のＤＳの測定結果を示す図である。
【図５】ヒトの尿中のＫＳの測定結果を示す図である。
【図６】ヒトの血漿中のＫＳの測定結果を示す図である。
【図７】ヒトの血漿中のＫＳの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明方法
本発明方法は、検体中の単一種類のＧＡＧを測定し、その測定結果とリソソーム病とを関連づけるステップを少なくとも含む、リソソーム病の検出方法である。
本発明方法は、好ましくは、検体中の単一種類のＧＡＧを測定し、その測定結果とムコ多糖症、ムコリピドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスから選ばれる１以上の疾患とを関連づけるステップを少なくとも含む、ムコ多糖症、ムコリピドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスから選ばれる１以上の疾患の検出方法である。
【００４１】
本発明方法は、検体中の複数種類のＧＡＧを測定するのではなく「単一種類」のＧＡＧを測定することによって、ムコ多糖症を検出する点に大きな特徴がある。従来は、ムコ多糖症の型（分類）によって蓄積・排出されるＧＡＧの種類がまちまちであると考えられていたため、ある１種類のＧＡＧ（例えばＫＳ）の測定結果が陰性であったとしても、他の種類のＧＡＧ（例えばＨＳ、ＣＳ、ＤＳなど）についても測定しなければムコ多糖症の可能性が否定できないと考えられてきた。すなわち、ムコ多糖症を検出するためには１つの検体について複数種類のＧＡＧを測定せねばならないと考えられてきたのである。
これに対し、本発明方法は「単一種類のＧＡＧ」の測定のみをもってムコ多糖症との関連づけを可能とするものである。さらにムコ多糖症に止まらず、ムコリピドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスから選ばれる１以上の疾患との関連づけをも可能とするものである。
【００４２】
本発明方法における「検体」は特に限定されないが、体液であることが好ましい。「体液」は、リソソーム病において蓄積されたＧＡＧが含有されている、あるいはその可能性がある体液である限りにおいて特に限定されない。このような体液としては、例えば尿、血液（本明細書では、血清及び血漿を含む概念として用いる）、唾液、汗、涙液、関節液、軟骨の抽出液、細胞の培養上清等を挙げることができる。なかでも尿又は血液は新生児からも採取しやすく、現に通常の新生児検査においても採取されていることから好ましい。
【００４３】
「体液」として「血液」を用いる場合、採取した血液を処理せずそのまま用いてもよく、この血液から得られる血清や血漿を用いても良いが、血清又は血漿を用いることが好ましい。また、血液から親水性成分を抽出し、その抽出物溶液に含まれるＧＡＧを測定してもよい。親水性成分の抽出方法は特に限定されないが、例えば市販の濾紙に血液を滴下し、その濾紙から親水性成分を抽出することによって行うことができる。濾紙からの親水性成分の抽出は、血液が滴下された濾紙を水性溶液中に浸すこと等によって簡便に行うことができる。
「体液」が採取される対象も、リソソーム病に罹患する可能性がある動物である限りにおいて特に限定されないが、リソソーム病に罹患する可能性がある哺乳動物が好ましく、なかでもヒトが好ましい。ヒトのなかでも特に出生直後〜６ヶ月程度の新生児が好ましい。
【００４４】
本発明方法における「単一種類のＧＡＧ」とは、文字通り１種類のＧＡＧを意味するものである。ＧＡＧに他の成分が結合しているか否かは問わない。よって、ＧＡＧに他の成分が結合して複合体を形成しているような場合における「単一種類のＧＡＧ」とは、その複合体中に存在する「単一種類のＧＡＧ」を意味することになる。例えば、ＧＡＧがタンパク質と結合して「プロテオグリカン」を形成している場合における「単一種類のＧＡＧ」とは、そのプロテオグリカン分子中の「単一種類のＧＡＧ」を意味することとなる。
「ＧＡＧ」としては、ＫＳ、ＨＳ、ＣＳ、ＤＳ（コンドロイチン硫酸Ｂと呼ばれる場合もある）、Ｈｅｐ、ＨＡ等が例示されるが、硫酸基を有するＧＡＧであることが好ましい。なかでもＫＳ、ＨＳ、ＣＳ又はＤＳであることが好ましく、ＫＳ又はＨＳであることがより好ましく、ＫＳであることが特に好ましい。
そして、このようなＧＡＧにタンパク質が結合した「プロテオグリカン」としては、例えばデコリン（コアタンパク質にＤＳが結合している）、アグリカン（コアタンパク質にＣＳ及びＫＳが結合している）、バーシカン（コアタンパク質にＤＳが結合している）、ケラトカン（コアタンパク質にＫＳが結合している）、シンデカン（コアタンパク質にＣＳ及びＨＳが結合している）、パールカン（コアタンパク質にＨＳが結合している）等を例示することができる。
【００４５】
検体中に含まれるこれら単一種類のＧＡＧの「測定」の方法は、ＧＡＧを検出しうる方法である限りにおいて特に限定されない。なお、本発明方法における「測定」とは、ＧＡＧを定量的に検出することのみならず、定性的に検出すること（ＧＡＧの存否を検出すること）をも含む概念である。
単一種類のＧＡＧの測定（特定種類のＧＡＧの測定）は、例えば以下の方法で行うことができる。
ｉ）    ＧＡＧに特異的に結合するポリペプチドを用いる方法。
ｉｉ）  各種クロマトグラフィーを用いて分析する方法。クロマトグラフィーの方法は特に限定されず、ガスクロマトグラフィー法、液体クロマトグラフィー法をはじめとする各種のクロマトグラフィー法を用いることができる。例えば、特定種類のＧＡＧに特異的な分解酵素を検体中のＧＡＧに作用させ、これによって生ずる分解産物(二糖)のイオン交換カラムからの溶出時間を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析する方法（二糖分析）が例示される。
ｉｉｉ）特定種類のＧＡＧに特異的な分解酵素を検体中のＧＡＧに作用させ、ＧＡＧの分解の有無及び程度を、ＧＡＧに反応する色素を用いて分析する方法。
ｉｖ）  特定種類のＧＡＧに特異的な分解酵素を検体中のＧＡＧに作用させ、ＧＡＧの分解の有無及び程度を、当該ＧＡＧに特異的に結合するポリペプチドを用いて分析する方法。
このｉｖ）の方法は、後述の実施例１にも記載されている。
ｖ）    マススペクトロメトリーによって分析する方法。マススペクトロメトリーの方法は特に限定されず、タンデムマススペクトロメトリー法（ＭＳ／ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法等をはじめとする各種マススペクトロメトリー法を用いることができる。
これらのなかでも、ＧＡＧに特異的に結合するポリペプチドを用いて行われることが好ましい。
【００４６】
この「ポリペプチド」は、抗体又はその抗原結合部位（Ｆａｂ）を有するポリペプチドであることが好ましい。「抗体のＦａｂを有するポリペプチド」としては、例えば、抗体のＦａｂを含むフラグメントが例示される。Ｆａｂを含むフラグメントは、例えばＦａｂを分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で抗体を処理することによって製造することができる。「Ｆａｂを含むフラグメント」としては、Ｆａｂ以外に、Ｆａｂｃ、(Ｆａｂ')２等が例示される。
また「抗体のＦａｂを有するポリペプチド」としては、例えば、目的とするＦａｂを有するキメラ抗体を挙げることができる。抗体をコードする遺伝子の塩基配列や抗体のアミノ酸配列が決定されれば、目的とするＦａｂ部位を有するキメラ抗体や、目的とするＦａｂ部位を含むフラグメント等を遺伝子工学的に製造することができる。
【００４７】
この「ポリペプチド」は、予め精製されているものが好ましい。例えば、ポリペプチドが「抗体」であって、その免疫グロブリンクラスがＩｇＧである場合にはプロテインＡやプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。また、抗体の免疫グロブリンクラスがＩｇＭである場合には、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等によって精製することができる。
ここで用いる「抗体」は、「単一種類のＧＡＧ」に特異的に結合する抗体である限りにおいて特に限定されず、ポリクローナル、モノクローナルのいずれであってもよいが、特異性、均質性、再現性、大量かつ永続的な生産性等の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００４８】
「抗体」は、公知の方法（例えば、抗ＫＳ抗体については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１９８３）ｐ８８４８−８８５４に記載の方法、抗ＣＳ抗体については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１９８７）ｐ４１４６−４１５２に記載の方法等）を参照して製造することができる。また、以下の一般的な製造方法によっても製造することができる。
１）ポリクローナル抗体の製造方法：
抗原を、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリ等の被免疫動物の皮下、腹腔内、足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）等に投与する。
被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは、抗体産生細胞を賦活するので望ましい。また初回免疫後、２〜３週目に常法によって追加免疫を行うと力価の高い抗血清が得られる。最終免疫から約１週間後に血液を採取し、血清を分離する。この血清を熱処理して補体を失活させた後、通常の抗体の精製方法によって免疫グロブリン画分を精製してもよい。
２）モノクローナル抗体の製造方法：
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５））によって作製することができる。
【００４９】
例えば抗原をマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）等に投与する。
被免疫動物から脾臓細胞、リンパ細胞、末梢血液等を採取し、これらと腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを調製する。なお細胞融合に用いるミエローマ細胞は、種々の哺乳動物の細胞株を利用することができるが、被免疫動物と同種の動物の細胞株を用いることが好ましい。またミエローマ細胞は、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにするために、未融合のミエローマ細胞が生存できずハイブリドーマだけが増殖できるように、マーカーを有するものを用いることが好ましい。またミエローマ細胞は、固有の免疫グロブリンを分泌しない株を使用することが、ハイブリドーマの培養上清から目的の抗体を取得することが容易となる点で好ましい。
得られたハイブリドーマを連続増殖させ、抗原に対して特異的に結合する抗体を継続的に産生するハイブリドーマ株を選別する。
【００５０】
こうして選別されたハイブリドーマ株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナル抗体が得られる。なお、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマ株を培養し、腹水等から単離することによって、モノクローナル抗体を大量に製造することもできる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、通常の抗体の精製方法によって精製してもよい。
抗体の免疫グロブリンクラスは特に限定されないが、ＩｇＧであることが好ましい。免疫グロブリンクラスがＩｇＧである抗体は、抗ＩｇＧ抗体を用いたスクリーニングによって取得することができる。
【００５１】
「単一種類のＧＡＧ」の説明については前記の通りである。したがって「ＧＡＧに特異的に結合するポリペプチド」としては、硫酸基を有するＧＡＧに特異的に結合するポリペプチドが好ましく、ＫＳ、ＨＳ、ＣＳ又はＤＳに特異的に結合するポリペプチドがより好ましく、ＫＳ又はＨＳに特異的に結合するポリペプチドが特に好ましく、ＫＳに特異的に結合するポリペプチドが極めて好ましい。
【００５２】
「ＧＡＧに特異的に結合するポリペプチド」としては、例えば以下のような市販のものを用いることもできる。なお、カッコ内は免疫グロブリンの由来動物及びクラスを示す。
【００５３】
ＫＳに特異的に結合するポリペプチド：抗ＫＳ抗体「５Ｄ４」(マウス、ＩｇＧ１)。「５Ｄ４」はＫＳに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００５４】
ＨＳに特異的に結合するポリペプチド：抗ＨＳ抗体「ＨｅｐＳＳ−１」(マウス、ＩｇＭ)、「Ｆ５８−１０Ｅ４」(マウス、ＩｇＭ)、「ＨＫ−２４９」(マウス、ＩｇＭ)及び「Ｆ６９−３Ｇ１０」(マウス、ＩｇＧ２ｂ)、「ＪＭ４０３」(マウス、ＩｇＭ（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３７（３），ｐ３１３−３２０（１９９４））)。これらはいずれもＨＳに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００５５】
ＤＳ及びＣＳに特異的に結合するポリペプチド：抗ＣＳ抗体「ＣＳ−５６」(マウス、ＩｇＭ)、「ＭＯ−２２５」(マウス、ＩｇＭ)、「ＭＣ２１Ｃ」(マウス、ＩｇＭ)、「ＬＹ１１１」(マウス、ＩｇＭ)、「１−Ｂ−５」(マウス、ＩｇＧ１)、「２−Ｂ−６」(マウス、ＩｇＧ１)、「３−Ｂ−３」(マウス、ＩｇＭ)、「２Ｈ６」(マウス、ＩｇＭ)及び「４７３」(マウス、ＩｇＡ)。これらはいずれもＣＳに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
以上の抗体はいずれも公知であり、またＪＭ４０３以外については生化学工業株式会社（東京）から市販されていることから、当業者が適宜作製し又は入手することができる。
【００５６】
単一種類のＧＡＧの測定を、ＧＡＧに特異的に結合するポリペプチドを用いて行う方法としては、例えば以下のものを挙げることができる。
i) 第１のポリペプチドが固着された固相に検体を接触させ、次いでこれに第２のポリペプチドを接触させることによって、サンドイッチ状複合体を形成させ、この複合体を検出する方法（いわゆるサンドイッチ法）。
ii)固相に固着させたＧＡＧ含有分子、検体及びポリペプチド（検体及びポリペプチドは、予め接触させておいてもよい）の共存下で、固相に固着させたＧＡＧ含有分子と検体中のＧＡＧ含有分子とを競合させ、固相に結合したポリペプチドを検出することによって検体中のＧＡＧ量を求める方法（いわゆる阻害法）。
iii)ポリペプチドを固着させた微粒子に検体を接触させ、次いでこれにポリペプチドを接触させることによって微粒子を凝集させて、この凝集物（または沈殿物）を検出する方法（いわゆる凝集法）。
【００５７】
本発明方法は、なかでもサンドイッチ法によって行われることが好ましい。すなわち本発明方法は、下記（１）及び（２）の工程を少なくとも含む工程によって行われることが好ましい。
（１）「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第１のポリペプチドが固着された固相」、「検体」及び「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチド」を接触させ、「固相に固着された前記第１のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子−第２のポリペプチド」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（２）工程（１）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
この工程（１）は、「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第１のポリペプチドが固着された固相」、「検体」及び「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチド」の３者を同時に接触させてもよく、前２者を接触させた後にこれを後１者に接触させてもよく、また、後２者を接触させた後に前１者に接触させてもよい。この本発明方法は、なかでも前２者を接触させた後にこれを後１者に接触させることが好ましい。すなわち、下記（１）〜（３）の工程を少なくとも含む工程によって行われることがより好ましい。
【００５８】
（１）「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第１のポリペプチドが固着された固相」に「検体」を接触させて、「固相に固着された第１のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子」からなる複合体を形成させる工程。
（２）前記固相に、「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチド」を接触させ、「固相に固着された前記第１のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子−第２のポリペプチド」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（３）工程（２）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
【００５９】
以下、この方法を各工程ごとに詳述する。
工程（１）
工程（１）は、「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第１のポリペプチドが固着された固相」に「検体」を接触させて、「固相に固着された第１のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子」からなる複合体を形成させる工程である。
【００６０】
（１）−１  ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第１のポリペプチド
本明細書において「ＧＡＧ含有分子」とは、ＧＡＧを成分として含有する分子を意味する。このような分子としては、ＧＡＧ分子自体（他の成分を含まない）のほか、プロテオグリカン分子等が例示される。
【００６１】
ここで用いる「第１のポリペプチド」は、後述する「第２のポリペプチド」と同一であっても異なっていてもよいが、いずれか一方はＧＡＧ（ＧＡＧ分子自体）に特異的に結合するポリペプチドであることを要する。
【００６２】
「ＧＡＧ（ＧＡＧ分子自体）に特異的に結合するポリペプチド」の説明については前記の通りである。また、「ＧＡＧ含有分子（ＧＡＧ分子自体を除く）に特異的に結合するポリペプチド」としては、例えばプロテオグリカンのコアタンパク質部分に特異的に結合する抗体を例示することができる。このような抗体としては、「６−Ｂ−６」(マウス、ＩｇＧ１)（抗デコリン抗体）、「２−Ｂ−１」(マウス、ＩｇＧ１)（抗バーシカン抗体）、「ＨＫ−１０２」(マウス、ＩｇＧ２ｂ)（抗パールカン抗体）、「１−Ｇ−２」(マウス、ＩｇＧ１)（抗ニューロカン抗体）、「６−Ｂ−４」(マウス、ＩｇＭ)（抗フォスファカン抗体）等が例示される。なお、カッコ内は免疫グロブリンの由来動物及びクラスである。
【００６３】
これらはいずれもプロテオグリカンのコアタンパク質部分に特異的に結合するモノクローナル抗体である。これらの抗体は、いずれも生化学工業株式会社（東京）から市販されており、入手可能である。
【００６４】
例えば検体として「血液」を用いる場合、血液中のＧＡＧはプロテオグリカンとして存在していると考えられることから、第１のポリペプチド又は後述する第２のポリペプチドのいずれか一方に「ＧＡＧ含有分子（ＧＡＧ分子自体を除く）に特異的に結合するポリペプチド」を採用することができる。ただしこの場合、他方のポリペプチドとして「ＧＡＧ（ＧＡＧ分子自体）に特異的に結合するポリペプチド」を採用することが必要である。
【００６５】
（１）−２  固相
第１のポリペプチドを固着する固相は、ポリペプチドを固着させることができ、かつ、水、検体または測定反応液に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウエル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、微粒子状固相担体（ゼラチン粒子、カオリン粒子、ラテックス等の合成ポリマー粒子等）等を例示することができる。なかでも、正確な定量性と使用上の簡便性の点から、マイクロプレートが望ましい。
【００６６】
固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、テフロン（登録商標）、ポリアロマー、ポリエチレン、ガラス、アガロース等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
【００６７】
これらの固相に第１のポリペプチドを固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法などの固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を応用することができる。
【００６８】
これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
物理的吸着の具体的方法を例示すると以下の通りである。ここでは、第１のポリペプチドとして「抗ＫＳ抗体」を用いた場合の例を示す。
【００６９】
抗ＫＳ抗体をｐＨ７〜９程度の緩衝液（例えばリン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、炭酸緩衝液等）に溶解して固相（例えばマイクロプレート）に加え、３７℃程度で１〜２時間保存するか、４℃程度で一晩保存して固着させる。
【００７０】
また、第１のポリペプチドを固着させた固相の表面には、これらが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこに検体中に存在するＧＡＧ含有分子が非特異的に固着すると正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よって、検体を固相と接触させる前にブロッキング物質を添加して、第１のポリペプチドが固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、プルロニック等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
【００７１】
ブロッキングの方法として具体的には、ブロッキング物質を添加して、３７℃程度で３０分〜２時間保存するか、常温（１５〜２５℃）で１〜２時間保存する方法を例示することができる。
【００７２】
（１）−３  検体
前記の説明と同様である。
（１）−４  固相と検体との接触
固相と検体との接触方法は、当該固相に固着された第１のポリペプチド分子と、検体中に存在するＧＡＧ含有分子とが接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。例えば、固相に検体を添加して接触させても良く、また検体に固相を添加して接触させても良く、別体の容器に両者を同時に添加しても良い。接触の方法はこれらに限定されるものではなく、固相の形状や材質等に応じて当業者が適宜決定することができる。
【００７３】
これら両者を接触させた後、第１のポリペプチドと検体中のＧＡＧ含有分子とを十分に結合させるために、例えば４〜３７℃、好ましくは３７℃で１時間程度反応させることが好ましい。
【００７４】
この反応後に固相と液相を分離する。必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄し、非特異的吸着物や反応しなかった検体中の成分を除去することが好ましい。
【００７５】
洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液等）を用いることが好ましい。
【００７６】
第１のポリペプチドが固着された固相に検体を接触させることによって、「固相に固着された第１のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子」からなる複合体が形成される。
【００７７】
工程（２）
工程（２）は、工程（１）を経た前記固相に、ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチドを接触させ、「固相に固着された第１のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子−第２のポリペプチド」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程である。
【００７８】
（２）−１  ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチド
前記の「第１のポリペプチド」の説明と同様である。
この第２のポリペプチドは、検出を容易とするために標識物質で標識されているか又は標識されることが好ましい。標識に用いることができる標識物質は、通常のタンパク質の標識に使用可能なものであれば特に限定されないが、例えば酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性同位元素（１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈなど）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リスアミンローダミンＢ（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、フィコエリスリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）、ウンベリフェロン、ユーロピウム、フィコシアニン、トリカラー、シアニンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）、ハプテン（ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、２，４−ジニトロアニリンなど）、特異的結合対（ビオチンとアビジン類（ストレプトアビジンなど）、レクチンと糖鎖、アゴニストとアゴニストの受容体、ヘパリンとアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、多糖類とその結合タンパク質（ヒアルロン酸とヒアルロン酸結合性タンパク質（ＨＡＢＰ）など）のいずれか一方の物質等が例示される。
【００７９】
これらの標識物質のなかでも、特異的結合対の一方の物質を用いることが好ましく、ビオチンとアビジン類のいずれか一方の物質を用いることがより好ましい。特に、ビオチンを用いることが好ましい。
【００８０】
第２のポリペプチドを標識物質で標識する方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば酵素で標識する場合はグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法など、放射性同位元素で標識する場合はクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法など（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人（１９８７年）参照）から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのＮ−ヒドロキシサクシミドエステル誘導体又はヒドラジド誘導体を用いる方法（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｐ５７−６３，ＰＩＥＲＣＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯＭＰＡＮＹ，１９９４年発行参照）を用いることができる。
この第２のポリペプチドは、標識物質で予め標識されていることが好ましい。
【００８１】
（２）−２  工程（１）を経た前記固相と第２のポリペプチドとの接触
前記（１）−４と同様に行うことができる。反応後に固相と液相を分離する点、及び必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄して非特異的吸着物や反応しなかった検体中の成分を除去することが好ましい点についても（１）−４と同様である。また、用いることができる洗浄液についても（１）−４と同様である。
【００８２】
工程（１）を経た前記固相（「固相に固着された第１のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子」からなる複合体が形成されている）に、ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチドを接触させることによって、「固相に固着された前記第１のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子−第２のポリペプチド」からなるサンドイッチ状複合体が形成される。
【００８３】
工程（３）
工程（３）は、工程（２）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程である。
サンドイッチ状複合体の検出方法は特に限定されない。例えば第２のポリペプチドが標識物質で標識されている場合には、当該標識物質を検出することによって、当該複合体を検出することができる。
【００８４】
標識物質を検出する方法は、標識物質の種類に応じた公知の検出手段を適宜選択することができる。例えば、標識物質として特異的結合対の一方の物質（例えばビオチン）を使用した場合には、これに特異的に結合する他方の物質（例えばストレプトアビジン）を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加して、特異的結合対を形成せしめる。
次いで、これに該酵素の基質（例えば過酸化水素（酵素がペルオキシダーゼの場合））及び発色物質（例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）や、ジアミノベンチジン等）を添加して、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度で測定することによって、標識物質を検出することができる。
【００８５】
また、例えば標識物質として放射性同位元素、蛍光色素又は化学発光物質を使用した場合には、放射能のカウント、蛍光強度、蛍光偏光、発光強度等を測定する方法などが例示される。
【００８６】
このような標識物質の検出を介してサンドイッチ状複合体を検出することができ、これによって検体中の単一種類のＧＡＧ（特定種類のＧＡＧ）を測定することができる。この方法はサンドイッチ法であることから、標識物質が多く検出されたとすれば、それだけサンドイッチ状複合体の量が多いこと、すなわち検体中の単一種類のＧＡＧ量が多いこと意味することになる。
【００８７】
ＧＡＧの定性的な測定（ＧＡＧの存否の検出）を所望する場合には、標識物質の検出の有無をそのままＧＡＧの測定結果とすることができる。
【００８８】
また、ＧＡＧの定量的な測定（ＧＡＧの濃度の測定など）を所望する場合には、吸光度、放射能のカウント、蛍光強度、発光強度などをそのままＧＡＧ量の指標とすることができる。また、既知濃度のＧＡＧ標準溶液を用いてＧＡＧ濃度と標識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係について予め検量線又は関係式を作成しておき、これを用いて検体中のＧＡＧ濃度を求めることもできる。また検体として尿を用いた場合には、求められたＧＡＧ濃度を、尿中に含まれるクレアチニンなどの他の成分の濃度を基準に補正をしてもよい。
【００８９】
また本発明方法は、阻害法によって行われることも好ましい。すなわち本発明方法は、下記（１）及び（２）の工程を少なくとも含む工程によって行われることもより好ましい。
（１）「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第３のポリペプチド」、「検体」及び「ＧＡＧ含有分子が固着された固相」を接触させ、「固相に固着されたＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第１の複合体及び「検体中のＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第２の複合体を形成させる工程。
（２）工程（１）において形成された「固相に固着されたＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第１の複合体及び「検体中のＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第２の複合体の少なくとも一方の複合体を検出する工程。
【００９０】
この工程（１）では、「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第３のポリペプチド」、「検体」及び「ＧＡＧ含有分子が固着された固相」の３者を同時に接触させてもよく、前２者を接触させた後にこれを後１者に接触させてもよく、また、後２者を接触させた後に前１者に接触させてもよい。この本発明方法は、なかでも、前２者を接触させた後にこれを後１者に接触させることが好ましい。
【００９１】
またこの工程（２）では、「固相に固着されたＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第１の複合体及び「検体中のＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第２の複合体の、前者のみを検出してもよく、後者のみを検出してもよく、またこれらの両方を検出してもよい。この本発明方法は、なかでも前者のみを検出することが好ましい。
【００９２】
すなわち、下記（１）〜（３）の工程を少なくとも含む工程によって行われることがより好ましい。
（１）「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第３のポリペプチド」と「検体」とを接触させて、「第３のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子」からなる第１の複合体を形成させる工程。
（２）ＧＡＧ含有分子が固着された固相に、工程（１）によって得られた「『第１の複合体』と『第１の複合体を形成しなかった第３のポリペプチド』とを含有する混合物」を接触させ、「固相に固着されたＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第２の複合体を形成させる工程。
（３）工程（２）において形成された第２の複合体を検出する工程。
この第２の複合体の検出は、「第３のポリペプチドに特異的に結合する第４のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることが好ましい。
【００９３】
以下、この方法を各工程ごとに詳述する。
工程（１）
工程（１）は、「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第３のポリペプチド」と「検体」とを接触させて、「第３のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子」からなる第１の複合体を形成させる工程である。
【００９４】
「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第３のポリペプチド」については、前記の「ＧＡＧ（ＧＡＧ分子自体）に特異的に結合するポリペプチド」の説明と同様である。また検体についても前記の説明と同様である。第３のポリペプチドと検体との接触方法も、第３のポリペプチド分子と、検体中に存在するＧＡＧ含有分子とが接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。
【００９５】
第３のポリペプチドと検体とを接触させることによって、「第３のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子」からなる第１の複合体が形成される。その結果、工程（１）によって「『第３のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子からなる第１の複合体』と『第１の複合体を形成しなかった第３のポリペプチド』とを含有する混合物」が得られる。
【００９６】
工程（２）
工程（２）は、ＧＡＧ含有分子が固着された固相に、工程（１）によって得られた「『第１の複合体』と『第１の複合体を形成しなかった第３のポリペプチド』とを含有する混合物」を接触させ、「固相に固着されたＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第２の複合体を形成させる工程である。
【００９７】
ＧＡＧ含有分子を固着する固相は、ＧＡＧ含有分子を固着させることができ、かつ、水、検体または測定反応液に不溶性である限りにおいて特に限定されない。他の点については、前記の説明と同様である。
【００９８】
また、固相に固着するＧＡＧ含有分子についても前記の説明と同様である。なお、固相に固着するＧＡＧ含有分子は、第３のポリペプチドが特異的に結合する部位（一部分）を有している限りにおいて特に限定されない。すなわち、ＧＡＧ含有分子そのものは勿論、ＧＡＧ含有分子をＧＡＧに特異的な分解酵素によって処理して得られる断片であってもよい。
【００９９】
固相にＧＡＧ含有分子を固着させる方法も、物理的吸着法、共有結合法などの一般的な方法を採用することができる。なかでも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
【０１００】
ＧＡＧ含有分子が固着された固相と、工程（１）によって得られた混合物との接触も、前記と同様に行うことができる。反応後に固相と液相を分離する点、及び必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄して非特異的吸着物や反応しなかった検体中の成分を除去することが好ましい点についても前記と同様である。また、用いることができる洗浄液についても前記と同様である。
【０１０１】
ＧＡＧ含有分子が固着された固相と、工程１によって得られた混合物とを接触させることによって、「第１の複合体を形成しなかった第３のポリペプチド」が固相のＧＡＧ含有分子に特異的に結合し、「固相に固着されたＧＡＧ含有分子−第３のポリペプチド」からなる第２の複合体が形成される。
【０１０２】
工程（３）
工程（３）は、工程（２）において形成された第２の複合体を検出する工程である。
この第２の複合体の検出方法も特に限定されないが、「第３のポリペプチドに特異的に結合する第４のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることが好ましい。
【０１０３】
「第３のポリペプチドに特異的に結合する第４のポリペプチド」は、第３のポリペプチドに特異的に結合するものである限りにおいて特に限定されない。例えば、第３のポリペプチドが抗体（免疫グロブリン）である場合には、当該免疫グロブリンが由来する動物及びクラス等に応じて、その免疫グロブリンに特異的に結合する抗体等が例示される。例えば、第３のポリペプチドがマウスの免疫グロブリン（マウス由来のＩｇＧ１）である場合には、第４のポリペプチドとして抗マウスＩｇＧ１抗体を用いることができる。
【０１０４】
また、第４のポリペプチドの標識に用いることができる標識物質も前記と同様であるが、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）が好ましく、なかでもペルオキシダーゼが好ましい。
【０１０５】
第４のポリペプチドを標識物質で標識する方法や、この標識物質を検出する方法等についても、前記の説明と同様である。ただし、この方法は阻害法であることから、標識物質が多く検出されたとすれば、それだけ検体中の「『第３のポリペプチド−検体中のＧＡＧ含有分子』からなる第１の複合体を形成しなかった第３のポリペプチド」の量が多いこと（その分、当該複合体の量が少ないこと）、すなわち検体中の単一種類のＧＡＧ量が少ないこと意味することになる。
【０１０６】
本発明方法において、ＧＡＧの測定結果との関連づけがなされ、かつ、検出の対象となる「リソソーム病」は、当技術分野においてリソソーム病として認識される疾患である限りにおいて特に限定されない。リソソーム病は、なかでもムコ多糖症、ムコリピドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスから選ばれる１以上の疾患であることが好ましい。
【０１０７】
本発明方法において、ＧＡＧの測定結果との関連づけがなされ、かつ、検出の対象となる「ムコ多糖症」は、当技術分野においてムコ多糖症として認識される疾患である限りにおいて特に限定されないが、「Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、ＶＩ型及びＶＩＩ型から構成される一群のムコ多糖症」であることが好ましい。
【０１０８】
同様に、本発明方法における「ムコリピドーシス」、「ＧＭ１ガングリオシドーシス」、「フコシドーシス」、「ガラクトシアリドーシス」、「メタクロマティック・ロイコジストロフィー」、「ニーマン・ピック病」、「タイ・サックス病」、「サンドホッフ病」、「ＧＭ２ガングリオシドーシス」、「クラッベ病」、「ファブリー病」、「ガウチャー病」、「グリコーゲン蓄積疾患」及び「リポフシノーシス」は、当技術分野においてこれらの疾患として認識されるものである限りにおいて特に限定されない。「ムコリピドーシス」についてはＩＩ型又はＩＩＩ型であることが好ましい。また、「ニーマン・ピック病」についてはＢ型又はＣ型であることが好ましい。また、「ガウチャー病」についてはＩ型又はＩＩＩ型であることが好ましい。また、「グリコーゲン蓄積疾患」については、１型又は２型であることが好ましい。
【０１０９】
ＧＡＧの測定結果とリソソーム病とを関連づけるステップは、以下の通り行うことができる。
前記の通り、リソソーム病の動物の検体中ではＧＡＧが有意に増加する。よって単一種類のＧＡＧの測定結果（ＧＡＧの量）が、健常動物（リソソーム病でない動物）における測定結果（ＧＡＧの量）に比して高い場合には、「リソソーム病である」又は「リソソーム病である可能性が高い」と関連づけることができる。
【０１１０】
単一種類のＧＡＧの測定結果（ＧＡＧの量）が、健常動物における測定結果（ＧＡＧの量）と同等もしくはそれよりも低ければ、「リソソーム病ではない」又は「リソソーム病である可能性は低い」と関連づけることができる。
【０１１１】
また、ＧＡＧの測定結果とリソソーム病とを関連づけは「リソソーム病の可能性の有無」のみでなく、リソソーム病の進行の程度の検出も含まれる。例えばある個体の検体中のＧＡＧ量を定期的に測定し、ＧＡＧ量が増加傾向にある場合には「リソソーム病が進行している」又は「リソソーム病が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。ＧＡＧ量が減少傾向にある場合には「リソソーム病が改善方向にある」又は「リソソーム病が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。またＧＡＧ量に変化がない場合には「リソソーム病の進行（改善）に変化がない」又は「リソソーム病の進行（改善）に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。これにより、リソソーム病のモニタリング等に応用することができる。
【０１１２】
なお、リソソーム病との関連づけの基準となる測定結果（ＧＡＧ量）は、前記の検量線又は関係式を用いて求めたＧＡＧ濃度であっても良く、健常動物の検体中のＧＡＧ量に対する比であっても良い。
【０１１３】
本発明方法における「単一種類のＧＡＧ」は、硫酸基を有するＧＡＧであることが好ましいが、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＫＳであって、かつ、検出される「ムコ多糖症」がＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＶＩ型及びＶＩＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものが好ましい。従来、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＶＩ型及びＶＩＩ型のムコ多糖症においてＫＳが排出されることは全く知られていなかったことから、この点は本発明のなかでも特に重要な知見である。そのなかでも、検出される「ムコ多糖症」がＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＶＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものが好ましい。また、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＫＳであって、かつ、検出される「ムコリピドーシス」がＩＩ型及びＩＩＩ型から選ばれる１以上のムコリピドーシスであるものが好ましい。
【０１１４】
また本発明方法は、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＨＳであって、かつ、検出される「ムコ多糖症」がＩＶ型及びＶＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものも好ましい。従来、ＩＶ型及びＶＩ型のムコ多糖症においてＨＳが排出されることは全く知られていなかったことから、この点も本発明のなかで特に重要な知見である。
【０１１５】
また本発明方法は、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＨＳであって、かつ、「リソソーム病」がムコリピドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスから選ばれる１以上の疾患であるものも好ましい。
【０１１６】
また本発明方法は、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＣＳであって、かつ、検出される「ムコ多糖症」がＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものも好ましい。従来、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶＩ型のムコ多糖症においてＣＳが排出されることは全く知られていなかったことから、この点も本発明のなかで特に重要な知見である。
【０１１７】
また本発明方法は、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＤＳであって、かつ、検出される「ムコ多糖症」がＩＩＩ型及びＩＶ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものも好ましい。従来、ＩＩＩ型及びＩＶ型のムコ多糖症においてＤＳが排出されることは全く知られていなかったことから、この点も本発明のなかで特に重要な知見である。
【０１１８】
なお本発明方法はリソソーム病の「検出方法」であるが、「スクリーニング方法」や「診断方法」としての思想も包含することはいうまでもない。
【０１１９】
＜２＞本発明キット
本発明キットは、下記の構成成分を少なくとも含み、検体中の単一種類のＧＡＧの測定結果に基づいてムコ多糖症、ムコリピドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスから選ばれる１以上の疾患を検出するためのキットである。
【０１２０】
（Ａ）ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第１のポリペプチドが固着された固相
（Ｂ）ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの
【０１２１】
本発明キットにおける「単一種類のＧＡＧ」、「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第１のポリペプチド」、「第１のポリペプチドが固着された固相」、「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第２のポリペプチド」、「標識物質」、標識物質によるポリペプチドの標識方法、及び検出対象となる「ムコ多糖症等」等の説明は、いずれも前記の「＜１＞本発明方法」における説明と同様である。この本発明キットは、サンドイッチ法によるＧＡＧの測定を通じて、ムコ多糖症等の検出に用いることができる。
【０１２２】
また本発明キットは、上記の（Ａ）及び（Ｂ）に代えて、下記の構成成分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を少なくとも含むものも好ましい。
（Ａ）ＧＡＧ含有分子が固着された固相、
（Ｂ）ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第３のポリペプチド、及び、
（Ｃ）第３のポリペプチドに特異的に結合する第４のポリペプチドであって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの
【０１２３】
この本発明キットにおける「ＧＡＧ含有分子が固着された固相」、「ＧＡＧ含有分子に特異的に結合する第３のポリペプチド」、「第３のポリペプチドに特異的に結合する第４のポリペプチド」、「標識物質」、標識物質によるポリペプチドの標識方法、及び検出対象となる「ムコ多糖症等」等の説明は、いずれも前記の「＜１＞本発明方法」における説明と同様である。この本発明キットは、阻害法によるＧＡＧの測定を通じて、ムコ多糖症等の検出に用いることができる。
これらの本発明キットを用いたムコ多糖症等の検出は、前記の「＜１＞本発明方法」に従って行うことができる。
【０１２４】
本発明キットにおける「ポリペプチド」は、抗体又はその抗原結合部位を有するポリペプチドであることが好ましい。
【０１２５】
また本発明キットによる検出対象となる「ムコ多糖症」は、当技術分野においてムコ多糖症として認識される疾患である限りにおいて特に限定されず、「Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、ＶＩ型及びＶＩＩ型から構成される一群のムコ多糖症」であることが好ましい。同様に、本発明キットにおける「ムコリピドーシス」、「ＧＭ１ガングリオシドーシス」、「フコシドーシス」、「ガラクトシアリドーシス」、「メタクロマティック・ロイコジストロフィー」、「ニーマン・ピック病」、「タイ・サックス病」、「サンドホッフ病」、「ＧＭ２ガングリオシドーシス」、「クラッベ病」、「ファブリー病」、「ガウチャー病」、「グリコーゲン蓄積疾患」及び「リポフシノーシス」は、当技術分野においてこれらの疾患として認識されるものである限りにおいて特に限定されない。「ムコリピドーシス」についてはＩＩ型又はＩＩＩ型であることが好ましい。また、「ニーマン・ピック病」についてはＢ型又はＣ型であることが好ましい。また、「ガウチャー病」についてはＩ型又はＩＩＩ型であることが好ましい。また、「グリコーゲン蓄積疾患」については、１型又は２型であることが好ましい。
【０１２６】
また本発明キットにおける「単一種類のＧＡＧ」は、硫酸基を有するＧＡＧであることが好ましい。そして硫酸基を有するＧＡＧは、ＫＳ、ＨＳ、ＣＳ又はＤＳであることが好ましい。
【０１２７】
本発明キットは、なかでも「硫酸基を有するＧＡＧ」がＫＳであって、かつ「ムコ多糖症」がＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＶＩ型及びＶＩＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものが好ましい。そのなかでも、検出される「ムコ多糖症」がＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びVI型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものが好ましい。また、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＫＳであって、かつ、ムコリピドーシスがＩＩ型及びＩＩＩ型から選ばれる１以上のムコリピドーシスであるものが好ましい。
【０１２８】
また、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＨＳであって、かつ「ムコ多糖症」がＩＶ型及びＶＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるもの、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＨＳであって、かつ、「リソソーム病」がムコリピドーシス、メタクロマティック・ロイコジストロフィー、ニーマン・ピック病、タイ・サックス病、サンドホッフ病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、クラッベ病、ファブリー病、ガウチャー病、グリコーゲン蓄積疾患及びリポフシノーシスから選ばれる１以上の疾患であるもの、「硫酸基を有するＧＡＧ」がＣＳであって、かつ「ムコ多糖症」がＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶＩ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるもの、及び「硫酸基を有するＧＡＧがＤＳ」であって、かつ「ムコ多糖症」がＩＩＩ型及びＩＶ型から選ばれる１以上のムコ多糖症であるものも好ましい。これらの点も本発明方法と同様である。
【０１２９】
本発明キットは、前記の構成成分を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに検量線や関係式作成の標準となる既知濃度のＧＡＧ標準品や、標識物質の検出試薬等を構成として加えることができる。また、これらの構成の他に、前記ブロッキング物質、前記洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。さらに本発明キットには、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール（ＱＣコントロール）を含有させることもできる。
【０１３０】
これらの構成は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【０１３１】
なお本発明キットはムコ多糖症等の「検出キット」であるが、「スクリーニングキット」や「診断キット」としての思想も包含することはいうまでもない。
【０１３２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１３３】
ヒトの尿を検体とし、サンドイッチ法によってムコ多糖症の検出を試みた。
（１）本実施例において用いた検体、試薬等は以下の通りである。
（検体及び標準品）
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶＩ型のムコ多糖症のヒト（各１名）、及び健常なヒト（ムコ多糖症ではないヒト）（２名）の尿を検体とした。
またＧＡＧの標準品としては、以下のものを用いた。
【０１３４】
・ＨＳ（ウシ腎臓由来；生化学工業株式会社製）
このＨＳは、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００７００として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
窒素含量：２.６〜３.２％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）
硫黄含量：５.０〜６.０％（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１２３（１９５５）に記載の方法で測定）
ウロン酸含量：２８.０〜３０.０％（オルシノール反応）
３６.０〜４０.０％（カルバゾール反応）
グルコサミン含量：３０.０〜３５.０％（アミノ酸自動分析器）
ガラクトサミン含量：＜０.０１％
【０１３５】
・ＫＳ（ケラタンポリ硫酸；サメ軟骨由来；生化学工業株式会社製）
このＫＳは、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００６１０として同社から販売されているキットに含まれているものであり、以下の性質を有する。
窒素含量：２．５８％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）硫黄含量：９．７０％（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１２３（１９５５）に記載の方法で測定）グルコサミン含量：２３．５１％（アミノ酸自動分析器）ガラクトサミン含量：０．１１％（アミノ酸自動分析器）ガラクトース含量：２６．２６％（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，５０，２９８（１９５２））
【０１３６】
・ＣＳ（コンドロイチン硫酸Ｄ；サメ軟骨由来；生化学工業株式会社製）
このＣＳは、生化学工業株式会社の試薬カタログコード番号４００６７６として同社から販売されているものであり、以下の性質を有する。
窒素含量：２.２〜２.６％（Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ３６６（１８８３）に記載の方法で測定）硫黄含量：７.１〜７.７％（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ.，１２３（１９５５）に記載の方法で測定）ガラクトサミン含量：３０〜３５％（アミノ酸自動分析器）グルクロン酸含量：３２〜３５％（カルバゾール反応）
コンドロイチン硫酸Ｄは、「グルクロン酸残基とＮ−アセチルガラクトサミン残基とがβ１，３グリコシド結合した二糖単位」が連続して結合されてなる分子であって、「２位が硫酸化されたグルクロン酸残基−６位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン残基」からなる二糖単位を主たる構成成分とするＣＳである。
【０１３７】
・デコリン（ウシ関節軟骨由来；シグマ社製）
【０１３８】
（抗体）
固相に固着させる抗ＫＳ抗体としては「５Ｄ４」（生化学工業株式会社製）を使用した。
また、ビオチン化された抗ＫＳ抗体としては「ビオチン化５Ｄ４」（生化学工業株式会社製）を使用した。
【０１３９】
固相に固着させる抗ＨＳ抗体としては「Ｆ５８−１０Ｅ４」（生化学工業株式会社製）を使用した。また、ビオチン化された抗ＨＳ抗体としては「ビオチン化Ｆ５８−１０Ｅ４」（生化学工業株式会社製）を使用した。
【０１４０】
固相に固着させる抗ＣＳ抗体としては「ＬＹ１１１」（生化学工業株式会社製）を使用した。また、ビオチン化された抗ＣＳ抗体としては「ビオチン化ＬＹ１１１」（生化学工業株式会社製）を使用した。
プロテオグリカン（デコリン）のコアタンパク質に対する抗体としては、「６−Ｂ−６」（生化学工業株式会社製）を使用した。
【０１４１】
（抗体が固着されたプレート）
抗体固着プレート（５Ｄ４、Ｆ５８−１０Ｅ４、ＬＹ１１１又は６−Ｂ−６が固着されたプレート）は、以下の通り作製した；
抗体をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に溶解してタンパク質濃度を２０μｇ／ｍｌに調整した。これをイムノプレート（マキシソープ；ヌンク社製）に５０μｌ／ウエルで添加して、３７℃で１．５時間インキュベートした。
インキュベート後、ウエルをＰＢＳで２回洗浄し、ブロッキング剤（イムノアッセイスタビライザー；アプライド・バイオシステムズ社製）を２００μｌ／ウエルで添加して、３７℃にて１時間インキュベートした。
このようにして作製された抗体固着プレートは、洗浄液で３回洗浄してすぐに使用することができる。またプレートを乾燥して数ヶ月間保存した後でも使用することができる。
【０１４２】
（試薬等）
洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）
検体希釈液（１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ（−））
【０１４３】
（２）ＫＳ測定によるムコ多糖症の検出
各検体を検体希釈液で希釈して、希釈済の検体（０．５ｍｌ）を２セットずつ用意した。一方には２．５ｍＵのケラタナーゼＩＩ（生化学工業株式会社製）を添加し、他方にはこれを添加せずに、それぞれ室温で３時間インキュベートした。
処理後の検体を「測定用検体」とし、５Ｄ４固着プレートとビオチン化５Ｄ４を用いて、以下の方法でＧＡＧの測定を行った。
測定用検体を５０μｌ／ウエルで上記の抗体結合プレートに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、洗浄液を２００μｌ／ウエルで添加して４回洗浄した。
検体希釈液で０．５μｇ／ｍｌに調整したビオチン化５Ｄ４を５０μｌ／ウエルでプレートに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、洗浄液を２００μｌ／ウエルで添加して４回洗浄した。
検体希釈液で１０００倍に希釈したアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を５０μｌ／ウエルでプレートに添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、洗浄液を２００μｌ／ウエルで添加して４回洗浄した。
ＴＭＢ溶液（基質）（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ）を５０μｌ／ウエルでプレートに添加して、室温で５分間インキュベートした。その後、１Ｍ  ＨＣｌを５０μｌ／ウエルで添加して酵素反応を停止させた。その後、吸光光度計を用いて４５０−６３０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１４４】
吸光度の測定結果を図１に示す。なお、それぞれの棒グラフの左側はケラタナーゼＩＩ処理していないものの結果を、右側はケラタナーゼＩＩ処理したものの結果を示す。また図１〜図４における「ブランク」は検体を添加しなかった場合の結果を、「ＭＰＳ」はムコ多糖症を、「ノーマル」は健常者をそれぞれ示す。
【０１４５】
図１から、Ｉ型〜ＶＩ型のいずれのムコ多糖症患者の尿も、健常者に比して顕著に高い吸光度を示した。また、ケラタナーゼＩＩ（ＫＳを特異的に分解する）で処理したものについては、いずれも同程度かつ低い吸光度を示した。これらの結果から、Ｉ型〜ＶＩ型のムコ多糖症患者の尿で示された高い吸光度はＫＳに起因するものであり、いずれの型のムコ多糖症患者の尿においてもＫＳの量が顕著に増加していることが示された。特に、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＶＩ型のムコ多糖症患者の尿においてもＫＳ量が増加しているとの知見は、驚くべきものである。
したがって、体液（尿）中の単一種類のＧＡＧ（ＫＳ）の測定結果とムコ多糖症とを関連づけることによって、ムコ多糖症を検出できることが示された。
【０１４６】
（３）ＨＳ測定によるムコ多糖症の検出
各検体を検体希釈液で希釈して、希釈済の検体（０．５ｍｌ）を２セットずつ用意した。一方には１０ｍＵのヘパリチナーゼＩ（生化学工業株式会社製）を添加し、他方にはこれを添加せずに、それぞれ室温で１時間インキュベートした。また、標準品（ＨＳ）についても検体と同様に処理した。
処理後の検体を「測定用検体」とし、Ｆ５８−１０Ｅ４固着プレートとビオチン化Ｆ５８−１０Ｅ４を用いて、以下の方法でＧＡＧの測定を行った。
測定用検体を５０μｌ／ウエルで上記の抗体結合プレートに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、洗浄液を２００μｌ／ウエルで添加して４回洗浄した。
４℃の検体希釈液で１０００倍に希釈したアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）、及び、４℃の検体希釈液で１．０μｇ／ｍｌに調整したビオチン化Ｆ５８−１０Ｅ４をそれぞれ２５μｌ／ウエルでプレートに添加して、４℃で１時間インキュベートした。その後、洗浄液を２００μｌ／ウエルで添加して４回洗浄した。
ＴＭＢ溶液（基質）の添加から吸光度の測定までのステップは、前記（２）と同様に行った。
【０１４７】
吸光度の測定結果を図２に示す。なお、それぞれの棒グラフの左側はヘパリチナーゼＩ処理していないものの結果を、右側はヘパリチナーゼＩ処理したものの結果を示す。また「ＨＳ(＋)コントロール」は、標準品（ＨＳ）を用いた場合の結果を示す。
【０１４８】
図２から、Ｉ型〜ＶＩ型のいずれのムコ多糖症患者の尿も、健常者に比して顕著に高い吸光度を示した。また、ヘパリチナーゼＩ（ＨＳを特異的に分解する）で処理したものについては、いずれも同程度かつ低い吸光度を示した。これらの結果から、Ｉ型〜ＶＩ型のムコ多糖症患者の尿で示された高い吸光度はＨＳに起因するものであり、いずれの型のムコ多糖症患者の尿においてもＨＳの量が顕著に増加していることが示された。特に、ＩＶ型及びＶＩ型のムコ多糖症患者の尿においてもＨＳ量が増加しているとの知見は、驚くべきものである。
したがって、体液（尿）中の単一種類のＧＡＧ（ＨＳ）の測定結果とムコ多糖症とを関連づけることによって、ムコ多糖症を検出できることが示された。
【０１４９】
（４）ＣＳ測定によるムコ多糖症の検出
各検体を検体希釈液で希釈して、希釈済の検体（０．５ｍｌ）を用意した。
この検体を「測定用検体」とし、ＬＹ１１１固着プレートとビオチン化ＬＹ１１１を用いて、以下の方法でＧＡＧの測定を行った。
測定用検体を５０μｌ／ウエルで上記の抗体結合プレートに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、洗浄液を２００μｌ／ウエルで添加して４回洗浄した。
４℃の検体希釈液で１０００倍に希釈したアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）、及び、４℃の検体希釈液で１．０μｇ／ｍｌに調整したビオチン化ＬＹ１１１をそれぞれ２５μｌ／ウエルでプレートに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、洗浄液を２００μｌ／ウエルで添加して４回洗浄した。
【０１５０】
ＴＭＢ溶液（基質）の添加から吸光度の測定までのステップは、前記（２）と同様に行った。吸光度の測定結果を図３に示す。
図３から、Ｉ型〜ＶＩ型のいずれのムコ多糖症患者の尿も、健常者に比して顕著に高い吸光度を示した。この結果から、Ｉ型〜ＶＩ型のいずれのムコ多糖症患者の尿においてもＣＳの量が顕著に増加していることが示された。特に、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶＩ型のムコ多糖症患者の尿においてもＣＳ量が増加しているとの知見は、驚くべきものである。
したがって、体液（尿）中の単一種類のＧＡＧ（ＣＳ）の測定結果とムコ多糖症とを関連づけることによって、ムコ多糖症を検出できることが示された。
【０１５１】
（５）ＤＳ測定によるムコ多糖症の検出
各検体を検体希釈液で希釈して、希釈済の検体（０．５ｍｌ）を用意した。
この検体を「測定用検体」とし、６−Ｂ−６固着プレートとビオチン化ＬＹ１１１を用いて、以下の方法でＧＡＧの測定を行った。なお、６−Ｂ−６はプロテオグリカン（デコリン）のコアタンパク質に特異的に結合する抗体である。よって、ここでの測定対象となるＧＡＧは、プロテオグリカン（デコリン）分子中に存在するＤＳである。
測定用検体を５０μｌ／ウエルで上記の抗体結合プレートに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、洗浄液を２００μｌ／ウエルで添加して４回洗浄した。
４℃の検体希釈液で１０００倍に希釈したアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）、及び、４℃の検体希釈液で１．０μｇ／ｍｌに調整したビオチン化ＬＹ１１１をそれぞれ２５μｌ／ウエルでプレートに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、洗浄液を２００μｌ／ウエルで添加して４回洗浄した。
【０１５２】
ＴＭＢ溶液（基質）の添加から吸光度の測定までのステップは、前記（２）と同様に行った。吸光度の測定結果を図４に示す。
図４から、Ｉ型〜ＶＩ型のいずれのムコ多糖症患者の尿も、健常者に比して顕著に高い吸光度を示した。この結果から、Ｉ型〜ＶＩ型のいずれのムコ多糖症患者の尿においてもＤＳの量が顕著に増加していることが示された。特に、ＩＩＩ型及びＩＶ型のムコ多糖症患者の尿においてもＤＳ量が増加しているとの知見は、驚くべきものである。
したがって、体液（尿）中の単一種類のＧＡＧ（ＤＳ）の測定結果とムコ多糖症とを関連づけることによって、ムコ多糖症を検出できることが示された。
【実施例２】
【０１５３】
イヌ又はネコの血清又は尿を検体とし、阻害法によってムコ多糖症の検出を試みた。
（１）本実施例において用いた検体、試薬等は以下の通りである。
（検体）
ＩＩＩＢ又はＶＩＩ型のムコ多糖症のモデル動物（イヌ）、Ｉ、ＶＩ又はＶＩＩ型のムコ多糖症のモデル動物（ネコ）及び健常な動物（ムコ多糖症ではないイヌ及びネコ）の血清及び尿を検体とした。
またＧＡＧの標準品としては、ウシ角膜由来のＫＳ（シグマ社）を用いた。
【０１５４】
（抗体）
一次抗体として抗ＫＳ抗体「５Ｄ４」（１／２０／５Ｄ４；ＩＣＮ  イムノバイオロジカルズ）を使用した。また、二次抗体としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ)（ピアス社）を使用した。
【０１５５】
（抗原が固着されたプレート）
抗原固着プレート（ＫＳが固着されたプレート）は、以下の通り作製した；
１ｍｇのＫＳ（ウシ角膜由来；シグマ社）溶液あたり０．２ＵのコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社製）を添加して、振とうしながら３７℃で２時間インキュベートして、夾雑するＣＳ等を分解した。コンドロイチナーゼＡＢＣ処理後、ＫＳを希釈し、イムノプレート（ヌンク社製）に２００μｌ／ウエルで添加して、室温で２時間インキュベートした。
このようにして作製された抗原固着プレートは、洗浄してすぐに使用することもでき、少なくとも４℃で１ヶ月間程度保存した後でも使用することができる。
【０１５６】
（試薬等）
洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ５．３））
検体希釈液（１％  ＢＳＡ及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ５．３））
【０１５７】
（２）ＫＳ測定によるムコ多糖症の検出
イムノプレート（抗原は固着されていない）に検体（血清又は尿）を入れ、検体希釈液で希釈して１４０μｌ／ウエルとした。これに、検体希釈液で１８，０００倍に希釈した一次抗体を１４０μｌ／ウエル添加し、４℃で一晩インキュベートした。
抗原固着プレートのウエルを洗浄液で３回洗浄した後、これにインキュベート後の検体混合液（一次抗体と反応済）を２００μｌ／ウエルで添加して、４℃で１時間インキュベートした。その後、ウエルを洗浄液で３回洗浄した。
検体希釈液で１０００倍に希釈した二次抗体を２００μｌ／ウエルで添加して、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。その後、ウエルを洗浄液で３回洗浄した。
ＴＭＢ溶液（基質）（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ）を２００μｌ／ウエルでプレートに添加して、室温で発色の程度を見ながらインキュベートした。２Ｍ  ＨＣｌを５０μｌ／ウエルで添加して酵素反応を停止させ、吸光光度計を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の測定結果と、標準品を用いて予め作成しておいた検量線とを用いて、ＫＳ濃度を求めた。検体として尿を用いた結果を以下に示す。カッコ内の数値は、クレアチニン（Ｃｒｅ）濃度に対して補正した値である。
【０１５８】
（尿）
健常イヌ                １２１．３８ｎｇ／ｍｌ（１３２．４９ｎｇ／ｍｇＣｒｅ）
ＭＰＳ  ＩＩＩＢ型イヌ  ３８０．５２ｎｇ／ｍｌ（３４５．８５ｎｇ／ｍｇＣｒｅ）
ＭＰＳ  ＶＩＩ型イヌ    １９８８．２８ｎｇ／ｍｌ（４３５．０７ｎｇ／ｍｇＣｒｅ）
ＭＰＳ  Ｉ型ネコ        ３１５０．９０ｎｇ／ｍｌ（１０５７．３４ｎｇ／ｍｇＣｒｅ）
ＭＰＳ  ＶＩ型ネコ      １８１２．７８ｎｇ／ｍｌ（１０６６．３４ｎｇ／ｍｇＣｒｅ）
ＭＰＳ  ＶＩＩ型ネコ    ３２２４．６１ｎｇ／ｍｌ（１２５８．６３ｎｇ／ｍｇＣｒｅ）
【０１５９】
また、検体として血清を用いた結果を以下に示す。
（血清）
健常イヌ                ８９．１ｎｇ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＩＩＩＢ型イヌ  １８６．２ｎｇ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＶＩＩ型イヌ    ４５７ｎｇ／ｍｌ
健常ネコ                １２０ｎｇ／ｍｌ
ＭＰＳ  Ｉ型ネコ        ３９６ｎｇ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＶＩ型ネコ      ５５４．４ｎｇ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＶＩＩ型ネコ    ４８３．３ｎｇ／ｍｌ
【０１６０】
以上の結果から、ヒトのみならず、ヒト以外のムコ多糖症の動物の尿においてもＫＳの量が顕著に増加していることが確認された。さらに、尿のみならず血液（血清）においてもＫＳ量が顕著に増加していること、及び、サンドイッチ法のみならず阻害法によってもムコ多糖症の検出が可能であることが確認された。特に、Ｉ型、ＩＩＩ型（ＩＩＩＢ型）、ＶＩ型及びＶＩＩ型のムコ多糖症動物の尿及び血液(血清)においてもＫＳ量が増加しているとの知見は、驚くべきものである。
したがって、この結果からも、体液（尿や血液）中の単一種類のＧＡＧ（ＫＳ）の測定結果とムコ多糖症とを関連づけることによって、ムコ多糖症を検出できることが示された。
【実施例３】
【０１６１】
マススケールでのムコ多糖症の検出
ヒトの尿又は血漿を検体とし、サンドイッチ法によってマススケールでのムコ多糖症の検出を試みた。その方法は、実施例１の「（２）ＫＳ測定によるムコ多糖症の検出」と同様である。
検体として尿を用いた結果（クレアチニン（Ｃｒｅ）濃度に対して補正した値）を図５に、血漿を用いた結果を図６及び図７に示す。
なお、図５中の「コントロール」は健常なヒト（ｎ＝６７）の結果を、「全ＭＰＳ  ＩＶＡ」はムコ多糖症  ＩＶＡ型ヒト（年齢を問わない；ｎ＝７８）の全サンプルについての結果を、「重症」はムコ多糖症  ＩＶＡ型（重症型）ヒト（ｎ＝５４）の結果を、「軽症」はムコ多糖症  ＩＶＡ型（軽症型）ヒト（ｎ＝１１）の結果を、「コントロール  ０−５」は健常なヒト（０歳以上５歳未満；ｎ＝２１）の結果を、「ＩＶＡ  ０−５」はムコ多糖症  ＩＶＡ型ヒト（０歳以上５歳未満；ｎ＝１２）の結果を、「コントロール  ５−１０」は健常なヒト（５歳以上１０歳未満；ｎ＝２１）の結果を、「ＩＶＡ  ５−１０」はムコ多糖症  ＩＶＡ型ヒト（５歳以上１０歳未満；ｎ＝２８）の結果を、「コントロール  １０−１５」は健常なヒト（１０歳以上１５歳未満；ｎ＝１０）の結果を、「ＩＶＡ  １０−１５」はムコ多糖症  ＩＶＡ型ヒト（１０歳以上１５歳未満；ｎ＝９）の結果を、「コントロール  １５以上」は健常なヒト（１５歳以上；ｎ＝２９）の結果を、「ＩＶＡ  １５以上」はムコ多糖症  ＩＶＡ型ヒト（１５歳以上；ｎ＝１８）の結果をそれぞれ示す。
【０１６２】
また、図６中の「全コントロール」は健常なヒト（ｎ＝１１２）の結果を、「全ＭＰＳ」はムコ多糖症のヒト（年齢及び型を問わない；ｎ＝８８）の全サンプルについての結果を、「Ｉ」はムコ多糖症  Ｉ型ヒト（年齢を問わない；ｎ＝１７）の結果を、「ＩＩ」はムコ多糖症  ＩＩ型ヒト（年齢を問わない；ｎ＝１１）の結果を、「ＩＩＩ」はムコ多糖症  ＩＩＩ型ヒト（年齢を問わない；ｎ＝７）の結果を、「ＩＶＡ」はムコ多糖症  ＩＶＡ型ヒト（年齢を問わない；ｎ＝４２）の結果を、「ＩＶＢ」はムコ多糖症  ＩＶＢ型ヒト（年齢を問わない；ｎ＝３）の結果を、「ＶＩ」はムコ多糖症  ＶＩ型ヒト（年齢を問わない；ｎ＝2）の結果を、「ＶＩＩ」はムコ多糖症  ＶＩＩ型ヒト（年齢を問わない；ｎ＝６）の結果を、「ＭＬＩＩ」はムコリピドーシスＩＩ型ヒト（年齢を問わない；ｎ＝２）の結果を、「ＭＬＩＩＩ」はムコリピドーシスＩＩＩ型ヒト（年齢を問わない；ｎ＝３）の結果をそれぞれ示す。
【０１６３】
また、図７中の「全コントロール」は健常なヒト（ｎ＝１１２）の結果を、「帯血」は臍帯血の結果を、「全ＭＰＳ」はムコ多糖症のヒト（年齢及び型を問わない；ｎ＝８８）の全サンプルについての結果を、「コントロール  １−５」は健常なヒト（１歳以上５歳未満；ｎ＝７）の結果を、「ＭＰＳ  １−５」はムコ多糖症のヒト（１歳以上５歳未満；ｎ＝１９）の結果を、「コントロール  ５−１０」は健常なヒト（５歳以上１０歳未満；ｎ＝４）の結果を、「ＭＰＳ  ５−１０」はムコ多糖症のヒト（５歳以上１０歳未満；ｎ＝２７）の結果を、「コントロール  １０−１５」は健常なヒト（１０歳以上１５歳未満；ｎ＝３）の結果を、「ＭＰＳ  １０−１５」はムコ多糖症のヒト（１０歳以上１５歳未満；ｎ＝１２）の結果を、「コントロール  １５以上」は健常なヒト（１５歳以上；ｎ＝１１）の結果を、「ＭＰＳ  １５以上」はムコ多糖症のヒト（１５歳以上；ｎ＝１４）の結果をそれぞれ示す。
【０１６４】
図５〜図７中のボックスは、各群における２５％〜７５％の範囲を示す。ボックス中のバーは平均値を示す。また、ボックス外の縦のバーはレンジ（１０％〜９０％の範囲）を示し、丸印はこの範囲を逸脱したものを示す。
【実施例４】
【０１６５】
ムコリピドーシスの検出
ヒトの血清又は尿を検体とし、サンドイッチ法によってムコリピドーシスの検出を試みた。その方法は、実施例１の「（２）ＫＳ測定によるムコ多糖症の検出」と同様である。
検体として尿を用いた結果（クレアチニン（Ｃｒｅ）濃度に対して補正した値）を以下に示す。「健常なヒト」については「平均値±ＳＤ」で示した。
（尿）
健常なヒト                ０．２０８±０．１４２ｎｇ／ｍｇＣｒｅ
ＭＬ  ＩＩ型ヒト          ０．９２ｎｇ／ｍｇＣｒｅ
ＭＬ  ＩＩ型ヒト          ０．６１５ｎｇ／ｍｇＣｒｅ
ＭＬ  ＩＩＩ型ヒト        １．２５ｎｇ／ｍｇＣｒｅ
ＭＬ  ＩＩＩ型ヒト        ０．７５ｎｇ／ｍｇＣｒｅ
ＭＬ（型は不明）ヒト      ０．６１４ｎｇ／ｍｇＣｒｅ
また、検体として血清を用いた結果を以下に示す。「健常なヒト」については「平均値±ＳＤ」で示した。
【０１６６】
（血清）
健常なヒト（臍帯血）        ４４．２±２７．８７ｎｇ／ｍｌ
健常なヒト（１〜３歳）      １２７±２３．１８ｎｇ／ｍｌ
健常なヒト（４〜１４歳）    ２３７±５８ｎｇ／ｍｌ
健常なヒト（１８歳以上）    １３７±５１．７ｎｇ／ｍｌ
ＭＬ  ＩＩ型ヒト（０．９歳）２６３ｎｇ／ｍｌ
ＭＬ  ＩＩＩ型ヒト（１２歳）１１４７ｎｇ／ｍｌ
ＭＬ  ＩＩＩ型ヒト（１０歳）７４３ｎｇ／ｍｌ
ＭＬ  ＩＩＩ型ヒト（４０歳）３４０ｎｇ／ｍｌ
【０１６７】
以上の結果から、ムコ多糖症のみならず、ムコリピドーシスの動物においてもＫＳの量が顕著に増加していることが確認された。
したがって、この結果から、体液（尿や血液）中の単一種類のＧＡＧ（ＫＳ）の測定結果とムコリピドーシスとを関連づけることによって、ムコリピドーシスを検出できることが示された。
【実施例５】
【０１６８】
ＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス及びガラクトシアリドーシスの検出
ヒトの血清又は尿を検体とし、サンドイッチ法によってＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス及びガラクトシアリドーシスの検出を試みた。その方法は、実施例１の「（２）ＫＳ測定によるムコ多糖症の検出」と同様である。
検体として尿を用いた結果（クレアチニン（Ｃｒｅ）濃度に対して補正した値）を以下に示す。「健常なヒト」については「平均値±ＳＤ」で示した。
（尿）
健常なヒト                        ０．２１５±０．１４ｎｇ／ｍｇＣｒｅ
ＧＭ１ガングリオシドーシス  ヒト  ３．４０６ｎｇ／ｍｇＣｒｅ
フコシドーシス  ヒト              １．４４ｎｇ／ｍｇＣｒｅ
フコシドーシス  ヒト              １．３７ｎｇ／ｍｇＣｒｅ
ガラクトシアリドーシス  ヒト      １．１８ｎｇ／ｍｇＣｒｅ
以上の結果から、ムコ多糖症、ムコリピドーシスのみならず、ガラクトシアリドーシスの動物においてもＫＳの量が顕著に増加していることが確認された。
したがって、この結果から、体液（尿や血液）中の単一種類のＧＡＧ（ＫＳ）の測定結果とＧＭ１ガングリオシドーシス、フコシドーシス又はガラクトシアリドーシスとを関連づけることによって、これらの疾患を検出できることが示された。
【実施例６】
【０１６９】
ＨＰＬＣを用いた検出
ヒトの尿を検体とし、ＨＰＬＣを用いる方法（二糖分析）によってＧＡＧの検出を行った。結果を表２に示す。
なお、表２中の「全−ＣＳ」は全コンドロイチン硫酸を、「ＤＳ−４Ｓ」は４位硫酸化デルマタン硫酸を、「Ｃｒｅ」はクレアチニンを示す。
【０１７０】
【表３】
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【０１７１】
表２から、いずれの疾患についてもＧＡＧの量が増加していることが示された。このことから、抗体を用いない方法によっても本発明方法が実施可能であることが示された。
【実施例７】
【０１７２】
マススケールでのリソソーム病の検出
ヒトの血清又は尿を検体とし、サンドイッチ法によって各種リソソーム病の検出を試みた。その方法は、実施例１の「（３）ＨＳ測定によるムコ多糖症の検出」と同様である。
検体として血清を用いた結果を以下に示す。数値は「平均値」である。
（血清）
健常なヒト（ｎ＝５１）                          ４．８９Ｕ／ｍｌ
ＭＰＳ  Ｉ型ヒト（ｎ＝１６）                    ３８．０Ｕ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＩＩ型ヒト（ｎ＝２５）                  ８２．１Ｕ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＩＩＩＡ型ヒト（ｎ＝６）                ２２．０Ｕ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＩＩＩＢ型ヒト（ｎ＝６）                ２６．８Ｕ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＩＩＩＣ型ヒト（ｎ＝３）                １３．４Ｕ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＩＶＡ型ヒト（ｎ＝２９）                ７．５１Ｕ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＩＶＢ型ヒト（ｎ＝２）                  ９．４３Ｕ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＶＩ型ヒト（ｎ＝３）                    １２．０Ｕ／ｍｌ
ＭＰＳ  ＶＩＩ型ヒト（ｎ＝５）                  １８．９Ｕ／ｍｌ
ＭＬＤヒト（ｎ＝４）                            ９．８２Ｕ／ｍｌ
ＬＩＰＯヒト（ｎ＝１）                          １０３Ｕ／ｍｌ
ＴＳヒト（ｎ＝７）                              １３．０Ｕ／ｍｌ
ＧＳＤ  Ｉ型ヒト（ｎ＝１）                      １９．１Ｕ／ｍｌ
ＧＳＤ  ＩＩ型ヒト（ｎ＝１）                    ７．５７Ｕ／ｍｌ
サンドホッフ病（ＳＡＮ）  ヒト（ｎ＝３）        ７．５９Ｕ／ｍｌ
ＭＬ  ＩＩ型ヒト（ｎ＝２）                      ５４．１Ｕ／ｍｌ
ＭＬ  ＩＩＩ型ヒト（ｎ＝３）                    １２．２Ｕ／ｍｌ
ＮＰ  Ｂ型ヒト（ｎ＝５）                        ８．６７Ｕ／ｍｌ
ＮＰ  Ｃ型ヒト（ｎ＝４）                        ６．０６Ｕ／ｍｌ
ＧＭ２ガングリオシドーシス  ヒト（ｎ＝１）      １０．７Ｕ／ｍｌ
クラッベ病  ヒト（ｎ＝３）                      ６．６８Ｕ／ｍｌ
ファブリー病  ヒト（ｎ＝５）                    １０．６Ｕ／ｍｌ
ガウチャー病  Ｉ型（ＧＣＩ）ヒト（ｎ＝５）        ８．１８Ｕ／ｍｌ
ガウチャー病  ＩＩＩ型（ＧＣＩＩＩ）ヒト（ｎ＝２）  １１．７Ｕ／ｍｌ
【０１７３】
以上の結果から、ムコ多糖症等のみならず、種々のリソソーム病の動物においてもＨＳの量が増加していることが示唆された。
したがって、この結果から、体液（尿や血液）中の単一種類のＧＡＧ（ＨＳ）の測定結果と以上のようなリソソーム病とを関連づけることによって、リソソーム病を検出できることが示された。
【実施例８】
【０１７４】
本発明キットの作製（１）
以下の構成からなる本発明キットを作製した。このキットは、サンドイッチ法によるＧＡＧの測定を通じて、ムコ多糖症等の検出に用いることができる。
１．５Ｄ４が固着された９６ウェルのイムノプレート  １枚
２．ビオチン化５Ｄ４  １本
３．アビジン−ペルオキシダーゼ  １本
４．ＴＭＢ溶液  １本
５．反応停止液（１Ｎ  ＨＣｌ）  １本
６．洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）
７．検体希釈液（１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ（−））
８．ＫＳ標準溶液  １セット
【０１７５】
また、上記のイムノプレート及びビオチン化５Ｄ４を、それぞれＦ５８−１０Ｅ４が固着された９６ウェルのイムノプレート及びビオチン化Ｆ５８−１０Ｅ４に置換した本発明キットを作製した。
このキットにはＨＳ標準溶液を添付した。
【０１７６】
また、上記のイムノプレート及びビオチン化５Ｄ４を、それぞれＬＹ１１１が固着された９６ウェルのイムノプレート及びビオチン化ＬＹ１１１に置換した本発明キットを作製した。このキットにはＣＳ（コンドロイチン硫酸Ｄ）標準溶液を添付した。
さらに、上記のイムノプレート及びビオチン化５Ｄ４を、それぞれ６−Ｂ−６が固着された９６ウェルのイムノプレート及びビオチン化ＬＹ１１１に置換した本発明キットを作製した。このキットにはデコリン標準溶液を添付した。
【実施例９】
【０１７７】
本発明キットの作製（２）
以下の構成からなる本発明キットを作製した。このキットは、阻害法によるＧＡＧの測定を通じて、ムコ多糖症等の検出に用いることができる。
１．ＫＳが固着された９６ウェルのイムノプレート  １枚
２．５Ｄ４  １本
３．ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）  １本
４．ＴＭＢ溶液  １本
５．反応停止液（１Ｎ  ＨＣｌ）  １本
６．洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ５．３））
７．検体希釈液（１％  ＢＳＡ及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ(ｐＨ５．３)）
８．ＫＳ標準溶液  １セット
【０１７８】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【０１７９】
本出願は、２００２年４月３０日出願の米国仮特許出願６０／３７６，１９４および２００３年１月２２日出願の米国仮特許出願６０／４４１，３２５に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明方法は、リソソーム病（好ましくはムコ多糖症等）の検出を高精度、高感度、簡便、迅速かつ安価に実施できる方法であることから極めて実用性が高い。特に、わずか１種類のＧＡＧを測定することによってリソソーム病の可能性が検出できることから、複数種のＧＡＧを測定する必要がなく、簡便性、迅速性、廉価性が格段に向上するものである。また本発明キットは、本発明方法の実施をさらに簡便・迅速化するものであることから、極めて有用である。
【０１８１】
これにより全新生児についてリソソーム病の可能性が検出できれば、未だリソソーム病の臨床症状が現れない出生後の早期の段階で酵素補充療法、遺伝子治療、骨髄移植等を実施でき、精神発達の遅れ等をくい止めることができる可能性が高くなる。
なお本発明は、リソソーム病の検出のみならず、状態の把握、治療方針の決定、治療効果の確認、経過観察、モニタリング、医薬品開発の評価等へも応用することができ、極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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