(57)【要約】【課題】本発明は、化学物質が有する催奇形性を、簡便かつ高精度に予測できる方法を提供することを目的とする。【解決手段】  化学物質が有する催奇形性の予測方法であって、（１）下記にそれぞれ定義される、阻害活性ＳＤ、阻害活性ＤＧ、および必要に応じて阻害活性ＳＧを測定する工程、（２）前記阻害活性ＳＧまたはＤＧを、予め設定された基準値と比較する工程、および（３）前記阻害活性ＳＤを、前記阻害活性ＤＧと、比較する工程、を有する方法。  前記阻害活性ＳＤは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性であり、  前記阻害活性ＤＧは、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性であり、および  前記阻害活性ＳＧは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質が有する催奇形性の予測方法であって、
（１）下記にそれぞれ定義される、阻害活性ＳＤ、阻害活性ＤＧ、および必要に応じて阻害活性ＳＧを測定する工程、
（２）前記阻害活性ＳＧまたはＤＧを、予め設定された基準値と比較する工程、および
（３）前記阻害活性ＳＤを、前記阻害活性ＤＧと、比較する工程、
を有する方法。
前記阻害活性ＳＤは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性であり、
前記阻害活性ＤＧは、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性であり、および
前記阻害活性ＳＧは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性である。
【請求項２】
前記哺乳動物が、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、およびウサギから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、組織幹細胞、および人工多能性幹細胞から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分化細胞が、繊維芽細胞、神経細胞、羊膜細胞、脂肪細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨細胞、および軟骨細胞から選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害活性ＤＧおよび阻害活性ＳＧの測定が、
哺乳動物由来の分化細胞および幹細胞を用意すること、
前記哺乳動物由来の分化細胞および幹細胞を、それぞれ、化学物質の存在下、培養器内で細胞が飽和する前までの一定期間培養すること、
当該培養後の分化細胞および幹細胞の細胞数を、それぞれ、測定すること
を含む方法により行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
催奇形性を、陽性および陰性の２段階で判定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害活性ＳＤが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を５０％阻害する化学物質濃度であり、
前記阻害活性ＤＧが、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度であり、および
前記阻害活性ＳＧが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度である、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記阻害活性ＳＤが、前記化学物質がマウスＥＳ細胞の心筋への分化を５０％阻害する化学物質濃度ＥＳ  ＩＤ５０であり、
前記阻害活性ＤＧが、前記化学物質がマウス３Ｔ３細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度３Ｔ３  ＩＣ５０であり、および
前記阻害活性ＳＧが、前記化学物質がマウスＥＳ細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度ＥＳ  ＩＣ５０である、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＳＤ、ＤＧ、およびＳＧが
条件式１：ＳＧまたはＤＧ≦ｋ１（ｋ１は定数を表す）を満たす場合、または
条件式２：ＳＤ／ＤＧ≦ｋ２（ｋ２は定数を表す）を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ｋ１が０．０１〜１μｇ／ｍＬであり、および
ｋ２が０．９〜１．１である、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｋ１が０．１μｇ／ｍＬであり、および
ｋ２が１．０である、
請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質が有する催奇形性の予測方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品、農薬、化粧品、工業製品等の化学物質のヒトに対する安全性を評価するためには、通常、動物個体を用いた多くの毒性試験が行われる。これらの毒性試験のうち、親動物における配偶子形成、受胎能、妊娠維持といった生殖性及び胎児や出生児の発生に対する毒性は、総じて生殖・発生毒性と称され、ほぼ全ての医薬品及び農薬の製造・販売に際して試験の実施が求められている。発生毒性試験の一例として、化学物質を哺乳動物の妊娠期に投与し、該哺乳動物の胎児の生存性及び形態的な変化等を調べる試験を催奇形性試験といい、一般的には、ラット（げっ歯類）及びウサギ（非げっ歯類）を用いて、化学物質を胎児の器官形成期に投与し、胎児の外形、内臓及び骨格等を詳細に観察することにより、該化学物質の催奇形作用の有無が評価される。
しかしながら、動物個体を使用した催奇形性試験は、妊娠動物の作出から化学物質の投与、熟練した技術を要する胎児観察に至るまで多大な労力と経費を要する他、動物愛護の観点から使用動物数の削減が求められている。そこで、その代替試験法として様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験法が開発されている。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験法として、例えば、マウス胚性幹細胞（以下、マウスＥＳ細胞）を用いた試験法（ＥＳＴ  ：  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｔｅｓｔ）、ラット胎児の肢芽を用いる小塊培養法（Ｍｉｃｒｏ  ｍａｓｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）及びラットの初期胚を用いた全胚培養法（Ｗｈｏｌｅ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ）等の哺乳動物の細胞や組織等を用いた試験系が確立されている。
例えば、非特許文献１には、マウスＥＳ細胞の収縮する心筋細胞への分化、マウスＥＳ細胞における毒性、および３Ｔ３マウス繊維芽細胞における毒性を分析することを含む、発生毒性の予測における胚性幹細胞の使用が開示されている。
【非特許文献１】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００６年、Ｖｏｌｕｍｅ：  ３２９、ｐ．３７１−３９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、いずれの方法も予測精度の問題から、現状ではスクリーニング試験としても汎用されていない。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、株化細胞のみで実施できる優位性をもつマウスＥＳ細胞を用いた試験法（ＥＳＴ法）に改良を加え、化学物質が有する催奇形性を、簡便かつ高精度に予測できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、鋭意検討の結果、化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性、化学物質が当該化学物質の哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性、および化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性を、特定の方法で比較および評価することにより、従来法よりも高い精度で化学物質の催奇形性を予測できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］
化学物質が有する催奇形性の予測方法であって、
（１）下記にそれぞれ定義される、阻害活性ＳＤ、阻害活性ＤＧ、および必要に応じて阻害活性ＳＧを測定する工程、
（２）前記阻害活性ＳＧまたはＤＧを、予め設定された基準値と比較する工程、および
（３）前記阻害活性ＳＤを、前記阻害活性ＤＧと、比較する工程、
を有する方法；
前記阻害活性ＳＤは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性であり、
前記阻害活性ＤＧは、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性であり、および
前記阻害活性ＳＧは、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性である；
［２］
前記哺乳動物が、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、およびウサギから選択される、上記［１］に記載の方法；
［３］
前記幹細胞が、胚性幹細胞、組織幹細胞、および人工多能性幹細胞から選択される、上記［１］または［２］に記載の方法；
［４］
前記分化細胞が、繊維芽細胞、神経細胞、羊膜細胞、脂肪細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨細胞、および軟骨細胞から選択される上記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法；
［５］
前記阻害活性ＤＧおよび阻害活性ＳＧの測定が、
哺乳動物由来の分化細胞および幹細胞を用意すること、
前記哺乳動物由来の分化細胞および幹細胞を、それぞれ、化学物質の存在下、培養器内で細胞が飽和する前までの一定期間培養すること、
当該培養後の分化細胞および幹細胞の細胞数を、それぞれ、測定すること
を含む方法により行われる、上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法；
［６］
催奇形性を、陽性および陰性の２段階で判定する、上記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法；
［７］
前記阻害活性ＳＤが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を５０％阻害する化学物質濃度であり、
前記阻害活性ＤＧが、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度であり、および
前記阻害活性ＳＧが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度である、
上記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法；
［８］
前記阻害活性ＳＤが、前記化学物質がマウスＥＳ細胞の心筋への分化を５０％阻害する化学物質濃度ＥＳ  ＩＤ５０であり、
前記阻害活性ＤＧが、前記化学物質がマウス３Ｔ３細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度３Ｔ３  ＩＣ５０であり、および
前記阻害活性ＳＧが、前記化学物質がマウスＥＳ細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度ＥＳ  ＩＣ５０である、
上記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法；
［９］
ＳＤ、ＤＧ、およびＳＧが
条件式１：ＳＧまたはＤＧ≦ｋ１（ｋ１は定数を表す）を満たす場合、または
条件式２：ＳＤ／ＤＧ≦ｋ２（ｋ２は定数を表す）を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断する、上記［７］または［８］に記載の方法；
［１０］
ｋ１が０．０１〜１μｇ／ｍＬであり、および
ｋ２が０．９〜１．１である、
上記［９］に記載の方法；ならびに
［１１］
ｋ１が０．１μｇ／ｍＬであり、および
ｋ２が１．０である、
上記［９］に記載の方法
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、化学物質が有する催奇形性を、簡便かつ高精度に予測できる方法が、提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明において「化学物質」は、医薬、農薬、化粧品、工業製品等の哺乳動物が、摂取または接触により暴露される可能性のある物質の全てを包含し、純物質であってもよく、混合物であってもよい。
本発明において、「催奇形性」とは、哺乳動物の胎児に奇形を起こす性質を意味する。したがって、本発明において、胚・児致死作用を有するものであっても、胎児に奇形を起こす性質を有さない化学物質は、「催奇形性」を有さない。
本発明において「哺乳動物」としては、ヒトおよびサル等の霊長類、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等が挙げられる。
【０００７】
本明細書中、前記阻害活性ＳＤは、化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を阻害する活性であり、
本明細書中、前記阻害活性ＤＧは、化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を阻害する活性であり、および
本明細書中、前記阻害活性ＳＧは、化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を阻害する活性である。
【０００８】
本発明の、化学物質が有する催奇形性の予測方法は、
（１）阻害活性ＳＤ、阻害活性ＤＧ、および阻害活性ＳＧを測定する工程
を有する。
【０００９】
本発明の予測方法で用いられる、「哺乳動物由来の幹細胞」、および「哺乳動物由来の分化細胞」における「哺乳動物」としては、前記で例示したものが挙げられる。なかでも、マウスが特に好ましい。「哺乳動物由来の幹細胞」における「哺乳動物」と「哺乳動物由来の分化細胞」における「哺乳動物」とは、好ましくは、同種である。
本発明の予測方法で用いられる「幹細胞」としては、例えば、胚性幹細胞、組織幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられる。なかでも、胚性幹細胞（例、マウスＥＳ細胞）が好ましい。
本発明の予測方法で用いられる「分化細胞」としては、例えば、繊維芽細胞、神経細胞、骨格筋細胞、骨細胞、および軟骨細胞が挙げられる。なかでも、繊維芽細胞が好ましく、マウス胎児由来繊維芽細胞（例、マウス３Ｔ３細胞）がより好ましい。
このような細胞は、公知の方法によって調製してもよいが、ＡＴＣＣ等の機関から入手可能である。
【００１０】
「阻害活性ＳＤ」の測定
前記「阻害活性ＳＤ」の測定は、具体的には、例えば、
哺乳動物由来の未分化な幹細胞を用意すること（工程１）、
前記幹細胞を、化学物質の存在下で、分化誘導培養すること（工程２）、
前記幹細胞の分化率を計測すること（工程３）、
を含む方法により行われる。
【００１１】
以下に、「阻害活性ＳＤ」の測定の、好ましい一態様を説明する。
前記工程１では、例えば、未分化性を維持して培養された哺乳動物由来の幹細胞をトリプシン処理等により分散させる。当該培養に用いられる培地としては、哺乳動物由来の細胞の培養に通常用いられる培地（例、非働化処理済み牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）、マウスＥＳ細胞ではカルチセル無血清培地（ＥＳ細胞用）（大日本製薬）も使用可）にマウスＥＳ細胞ではＬＩＦ（白血病阻止因子、ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）を添加したものを用いればよい。培養条件は、哺乳動物由来の細胞の培養に通常用いられる条件を用いればよい。その例としては、例えば、５％  ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
【００１２】
前記工程２では、種々の濃度の化学物質を含有する分化誘導用の培地中で、前記分散細胞を、ハンギングドロップ法（懸滴培養法）などにより凝集塊を作らせて胚様体が形成されるまで培養する。分化誘導用の培地は、用いられる未分化細胞および分化により生じさせる分化細胞の種類によって異なるが、例えば、マウスＥＳ細胞を心筋細胞に分化させる場合、ＬＩＦを含有しない非働化処理済み牛胎児血清を含有する培地を用いればよい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％  ＣＯ２、３７℃が挙げられる。培養期間は、マウスＥＳ細胞であれば好ましくは２〜３日間である。
次いで、前記工程１で得られた胚様体を、種々の濃度の化学物質を含有する分化誘導用の培地で更に（例えば、マウスＥＳ細胞であれば２〜３日間（懸滴培養開始から合計５日後まで））、浮遊培養する。「種々の濃度の化学物質を含有する分化誘導用の培地」における培地としては、前記工程１における培地と同じものを用いることが好ましい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％  ＣＯ２、３７℃が挙げられる。対照としては、化学物質を含有しない媒体のみを添加した群を用いる。前記媒体は、好ましくは、前記化学物質を溶解させる溶媒である。
次いで、胚様体を、接着系のマルチウェルプレートに移し、例えば、マウスＥＳ細胞であれば分化誘導開始から合計１２日後まで接着培養する。当該接着培養における培地としては、前記工程２における培地と同じものを用いることが好ましい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％  ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
【００１３】
前記工程３では、各ウェル内の培養細胞の形態観察などにより、各化学物質濃度における、細胞の分化率を求める。分化の判断は、例えば、心筋細胞の場合、拍動の有無によって、行う事ができる。
このようにして測定された分化率に基づく数値（例えば、分化を５０％阻害する化学物質濃度）として、阻害活性ＳＤを得ることができる。
【００１４】
「阻害活性ＤＧ」の測定
前記「阻害活性ＤＧ」の測定は、具体的には、例えば、
哺乳動物由来の分化細胞を用意すること（工程１）、
前記哺乳動物由来の分化細胞を、化学物質の存在下で、培養すること（工程２）、
前記分化細胞の細胞数を計測すること（工程３）、
を含む方法により行われる。
【００１５】
以下に、「阻害活性ＤＧ」の測定の、好ましい一態様を説明する。
前記工程１では、培養中の哺乳動物由来の分化細胞をトリプシン処理等により分散させ、哺乳動物由来の分化細胞を用意する。当該培養に用いられる培地としては、哺乳動物由来の分化細胞の培養に通常用いられる培地（例、非働化処理済み牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）を用いればよい。培養条件は、哺乳動物由来の分化細胞の培養に通常用いられる条件を用いればよい。その例としては、例えば、５％  ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
前記細胞は、好ましくは、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５００〜２，０００の範囲内の所定の細胞数（好ましくは、１，０００個／ウェル）になるように播種する。
【００１６】
前記工程２では、培地中の前記工程１で用意した分化細胞に、化学物質を加え、次いで、前記分化細胞を前記化学物質の存在下で培養する。前記化学物質は、好ましくは、培地中に溶解または懸濁させて、添加される。当該培地としては、工程１で用いられる培地と同じものを用いることが好ましい。対照としては、化学物質を含有しない媒体のみを添加した群を用いる。前記媒体は、好ましくは、前記化学物質を溶解させる溶媒である。
培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％  ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
培養期間は、用いられる細胞の種類および培養条件に応じて適宜変更することができるが、通常、ウェル内で細胞が飽和する前までの一定期間（マウス３Ｔ３細胞の場合は、好ましくは、３〜５日間）である。
これらのように、培養期間を設定することは、化学物質の細胞への影響を正確に検出し、催奇形性を高い精度で予測することを可能にするために重要である。
当該培養においては、好ましくは、培地の交換は行わない。
【００１７】
工程（３）では、前記哺乳動物由来の分化細胞の生細胞数を計測する。生細胞数の計測は、例えば、市販の細胞数測定キット（例、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８（同仁化学））等を用いて、行うことができる。
このようにして測定された生細胞数に基づく数値（例えば、細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度）として、阻害活性ＤＧを得ることができる。
【００１８】
「阻害活性ＳＧ」の測定
前記「阻害活性ＳＧ」の測定は、具体的には、例えば、
哺乳動物由来の未分化な幹細胞を用意すること（工程１）、
前記幹細胞を、化学物質の存在下で、分化培養すること（工程２）、
前記幹細胞の細胞数を計測すること（工程３）、
を含む方法により行われる。
【００１９】
以下に、「阻害活性ＳＧ」の測定の、好ましい一態様を説明する。
前記工程１では、未分化性を維持して培養された哺乳動物由来の幹細胞をトリプシン処理等により培養細胞を分散させ、哺乳動物由来の幹細胞を用意する。当該未分化維持培養に用いられる培地としては、哺乳動物由来の幹細胞の未分化維持培養に通常用いられる培地（例、牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地、マウスＥＳ細胞ではカルチセル無血清培地（ＥＳ細胞用）（大日本製薬）も使用可）を用いればよい。培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％  ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
前記細胞は、好ましくは、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５００〜２，０００の範囲内の所定の細胞数（好ましくは、１，０００個／ウェル）になるように播種する。
【００２０】
前記工程２では、培地中の前記工程１で用意した幹細胞に、化学物質を加え、次いで、前記幹細胞を前記化学物質の存在下で未分化維持培養する。前記化学物質は、好ましくは、培地中に溶解または懸濁させて、添加される。当該培地としては、工程１で用いられる培地と同じものを用いることが好ましい。対照としては、化学物質を添加しない群を用いる。
培養条件は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる条件を採用すればよい。その例としては、例えば、５％  ＣＯ２、３７℃が挙げられる。
培養期間は、用いられる細胞の種類および培養条件に応じて適宜変更することができるが、通常、ウェル内で細胞が飽和する前までの一定期間（マウスＥＳ細胞の場合は、好ましくは、３〜５日間）である。
これらのように、培養期間を設定することは、化学物質の細胞への影響を正確に検出し、催奇形性を高い精度で予測することを可能にするために重要である。
当該維持培養においては、好ましくは、培地の交換は行わない。
【００２１】
工程（３）では、前記哺乳動物由来の幹細胞の生細胞数を計測する。生細胞数の計測は、例えば、市販の細胞数測定キット（例、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８（同仁化学））等を用いて、行うことができる。
【００２２】
このようにして測定された生細胞数に基づく数値（例えば、細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度）として、阻害活性ＳＧを得ることができる。
【００２３】
本発明の方法は、以下の考えに基づく。
胚・胎児の組織は癌細胞や成体の消化管粘膜、皮膚、骨髄等のように細胞増殖が盛んであるため、細胞毒性が強い化学物質に対して強い影響を受ける。したがって、抗がん剤のような化学物質の多くが催奇形作用を有することが知られている。本条件式では、ある一定の基準以下の阻害活性ＳＧまたはＤＧを有する場合は、催奇形性が陽性と予測する。
次いで、上記の基準で陰性と判定された化合物に対して、以下の概念から確立された基準を適用する。
阻害活性ＳＤは、胎児の発生および分化に対する毒性を、
阻害活性ＤＧは、親動物に対する毒性を、および
阻害活性ＳＧは、胎児の成長に対する毒性を、
それぞれ表していると仮定する。
この仮定に基づき、化学物質の、親動物に対する毒性を基準とする、胎児の発生および分化に対する相対毒性が高い場合には、化学物質の催奇形性が陽性であると予測する。
したがって、本発明の、化学物質が有する催奇形性の予測方法は、
（２）前記阻害活性ＳＧまたはＤＧを、予め設定された基準値と比較する工程、および
（３）前記阻害活性ＳＤを、前記阻害活性ＤＧと、比較する工程、
を更に有する。
また、本発明の方法は、上記の原理に基づき、好ましくは、催奇形性を陽性および陰性の２段階で判定する。
ただし、前記仮定は、単に、本発明を発明する契機になったものにすぎず、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の方法において、具体的には、好ましくは、
前記阻害活性ＳＤが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の分化を５０％阻害する化学物質濃度であり、
前記阻害活性ＤＧが、前記化学物質が哺乳動物由来の分化細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度であり、および
前記阻害活性ＳＧが、前記化学物質が哺乳動物由来の幹細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度である。
ここで、ＳＤ、ＤＧ、およびＳＧが
条件式１：ＳＧまたはＤＧ≦ｋ１（ｋ１は定数を表す）を満たす場合、または
条件式２：ＳＤ／ＤＧ≦ｋ２（ｋ２は定数を表す）を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断する。
当業者に明らかなように、ＳＤ、ＤＧ、およびＳＧの測定値、およびＳＤ／ＤＧの計算値は、適宜、四捨五入されて、条件式に当てはめられる。好ましくは、有効数字２桁になるように四捨五入される。
【００２５】
本発明の方法において、具体的には、より好ましくは、
前記阻害活性ＳＤが、前記化学物質がマウスＥＳ細胞の心筋への分化を５０％阻害する化学物質濃度ＥＳ  ＩＤ５０であり、
前記阻害活性ＤＧが、前記化学物質がマウス３Ｔ３細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度３Ｔ３  ＩＣ５０であり、および
前記阻害活性ＳＧが、前記化学物質がマウスＥＳ細胞の細胞増殖を５０％阻害する化学物質濃度ＥＳ  ＩＣ５０である。
ここで、ＥＳ  ＩＤ５０、３Ｔ３  ＩＣ５０、およびＥＳ  ＩＣ５０が
条件式１：ＥＳ  ＩＣ５０または３Ｔ３  ＩＣ５０≦ｋ１（ｋ１は定数を表す）を満たす場合、または
条件式２：ＥＳ  ＩＤ５０／３Ｔ３  ＩＣ５０≦ｋ２（ｋ２は定数を表す）を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断する。
当業者に明らかなように、ＥＳ  ＩＤ５０、３Ｔ３  ＩＣ５０、およびＥＳ  ＩＣ５０の測定値、およびＥＳ  ＩＤ５０／３Ｔ３  ＩＣ５０の計算値は、適宜、四捨五入されて、条件式に当てはめられる。好ましくは、有効数字２桁になるように四捨五入される。
【００２６】
上記の条件式において、好ましくは、
ｋ１が０．０１〜１μｇ／ｍＬであり、および
ｋ２が０．９〜１．１である。
また、上記の条件式において、より好ましくは、
ｋ１が０．１μｇ／ｍＬであり、および
ｋ２が１．０である。
【実施例】
【００２７】
以下に、本発明を実施例によって、更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１
（１）マウスＥＳ細胞の未分化培養
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）よりマウスＥＳ細胞（ＥＳ−Ｄ３株）を入手した。ＥＳ−Ｄ３株はマウスＬＩＦ（白血病阻害因子：ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）及びβ−メルカプトエタノールを添加した１５％の非働化処理済み牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地あるいはカルチセル無血清培地（ステムセルサイエンス社）を用いて未分化維持培養を行った。ゼラチンコートされた６０ｍｍ接着系シャーレに３０万個の細胞を５ｍＬの培養液を用いて培養した。２日間に１回の頻度で継代を行うが、週末など培養期間が３日間になる場合は、細胞数を１０万個に減らした。
（２）マウス３Ｔ３細胞の培養
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）よりマウス３Ｔ３細胞（ＢＡＬＢ  ３Ｔ３細胞株）を入手した。ＢＡＬＢ  ３Ｔ３細胞株は、１０％の非働化処理済み牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて維持培養を行った。６０ｍｍ接着系シャーレに３０万個の細胞を５ｍＬの培養液を用いて培養した。２日間に１回の頻度で継代を行うが、週末など培養期間が３日間になる場合は、細胞数を１０万個に減らした。
（３）マウスＥＳ細胞あるいはマウス３Ｔ３細胞を用いた細胞毒性試験
維持培養中の各細胞を０．２５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて細胞を分散させた後、９６ウェルプレートに１ｗｅｌｌ当り２０，０００個／ｍＬの細胞懸濁液を５０μＬ播種した。約２時間後に表１の化学物質を様々な濃度に含有した１５０μＬの培養液を添加し、実験を開始した。本実験で使用した培養液は、ＥＳ細胞はＬＩＦを含まない１５％の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地、３Ｔ３細胞は維持培養と同じ培地とした。培養開始から培地交換を１度も行わずに、４日後にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８（同仁化学）及びマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて対照及び化学物質添加群の細胞数（試薬の発光度して検出）を測定した。得られた結果から対照群の５０％相当の細胞増殖度を示す化学物質濃度を算出した。
（４）マウスＥＳ細胞の心筋細胞への分化誘導試験
未分化で培養中のマウスＥＳ細胞を０．２５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて細胞を分散させた。ＬＩＦを含まない１５％の非働化処理済み牛胎児血清を含む培地を用いて、１滴（２０μＬ）あたり約４００個の細胞を含むように、直径１０ｃｍシャーレの蓋に懸滴培養（本培養方法をハンギングドロップ法とも呼ぶ）により３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２〜３日間培養を行い、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）を形成した。本培養から実験終了まで、化学物質添加群では、使用する各培地中の化合物濃度が同じになるように、各培地に表１の化学物質を加えた。胚様体は更に２〜３日間、非接着性６ｃｍシャーレ（グライナー社）で浮遊培養した後、懸滴培養開始から合計５日後に胚様体を接着系の２４ウェルプレートに１個ずつ計２４個移行した。そして、懸滴培養開始から合計１２日後に、収縮を繰り返す心筋細胞を顕微鏡下で確認した。通常、対照群は接着させた２４個全てに収縮が認められることから、対照群の５０％相当の心筋分化度、すなわち２４個中１２個に収縮がみられる化学物質濃度を算出した。
（５）予測式を用いた判定
細胞毒性試験で得られた２つの指標（ＥＳ  ＩＣ５０、３Ｔ３  ＩＣ５０）及び心筋細胞への分化誘導実験で得られた指標（ＥＳ  ＩＤ５０）から、
ＥＳ  ＩＤ５０、３Ｔ３  ＩＣ５０、およびＥＳ  ＩＣ５０が
条件式１：ＥＳ  ＩＣ５０または３Ｔ３  ＩＣ５０≦ｋ１（ｋ１は定数を表す）を満たす場合、または
条件式２：ＥＳ  ＩＤ５０／３Ｔ３  ＩＣ５０≦ｋ２（ｋ２は定数を表す）を満たす場合には、前記化学物質の催奇形性が陽性であると判断し、それ以外の場合は前記化学物質の催奇形性が陰性であると判断した。
その結果、催奇形性を有する化合物と催奇形性を有さない化合物とを含む１０化合物の全てについて、催奇形性の予測結果と、催奇形性に関する動物実験の公知の知見とが一致した（表１）。
なお、ｎ＝１の結果ではあるが、非特許文献１の方法に従って本発明者が試験を行ったところでは、表中の１０化合物のうち、ペニシリンG ナトリウム、D-(+)-カンフル、フタル酸ジメチル、メトトレキサート水和物、ホウ酸においては、催奇形性の予測結果と、催奇形性に関する動物実験の公知の知見とが一致しなかった。
【表１】
2010075054.tif 000002
各指標は２回あるいは３回の平均値。ＥＳ ＩＣ５０（ｎ＝３）、３Ｔ３ ＩＣ５０（ｎ＝３）、ＥＳ ＩＤ５０（ｎ＝２）
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明の方法は、農薬及び医薬の候補化合物等の化学物質の催奇形性の予測に利用することが出来る。