(57)【要約】      （修正有）【課題】副作用が少なく、優れたＣ型肝炎ウイルス産生抑制作用を有するＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤の提供。【解決手段】プロアントシアニジンからなる組成物を有効成分とするＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤であって、組成物中のプロアントシアニジンは、式（１）2010059096.tif 000014で表されるフラバン−３−オール骨格を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロアントシアニジンからなる組成物を有効成分とするＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤であって、
前記組成物中のプロアントシアニジンは、下記一般式（１）
【化１】
2010059096.tif 000013
［式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。］
で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で３以上互いに結合した構造を有しており、
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
前記組成物中のプロアントシアニジンにおける全フラバン−３−オール骨格のうち、前記一般式（１）中のＲ１及びＲ３がいずれも水酸基であるフラバン−３−オール骨格の割合が４０％以下である、Ｃ型肝炎ウイルス産生抑制剤。
【請求項２】
前記一般式（１）中のＲ４が、置換基を有していてもよいガレート基を示す、請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤。
【請求項３】
Ｃ型肝炎ウイルス活性を５０％阻害するのに要する濃度が、細胞増殖活性を５０％阻害するのに要する濃度に対し１／１０以下である、請求項１又は２記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤。
【請求項４】
前記組成物中のプロアントシアニジンが、前記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、前記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で５〜１０互いに結合した構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を含有する、Ｃ型肝炎ウイルス由来の肝疾患の治療剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を含有する、Ｃ型肝炎ウイルス由来の肝疾患の発症又は進展抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を含有する、Ｃ型肝炎ウイルス由来の肝疾患の、発症若しくは進展の抑制用又は治療用医薬組成物又はそのプロドラッグ。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を含有する、Ｃ型肝炎ウイルス由来の肝疾患の、発症若しくは進展の抑制用又は治療用飲食組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ）（以下、「ＨＣＶ」という。）は、１９８９年に、輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因ウイルスとして発見された。ＨＣＶは、エンベロープを有する１本鎖プラス鎖型ＲＮＡウイルスであり、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のヘパチウイルス属（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）に属する。
【０００３】
ＨＣＶの宿主免疫機構回避の機序はいまだ明らかではなく、免疫機構の発達した大人に感染した場合でも、持続感染が成立することが多い。ＨＣＶ感染者の症状は、通常肝炎から始まり、上記持続感染により、多くの場合、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌へと進展する。肝細胞癌まで進展した場合、手術により患部を摘出しても、非癌部で引き続き持続感染が起こるため、肝細胞癌再発の危険性は高い。
【０００４】
このようなＨＣＶ感染者において、ＨＣＶの産生や増殖を抑制する方法、又はＨＣＶを消失させる方法としては、従来、インターフェロン療法が有効とされている。インターフェロン療法によれば、約３割のＨＣＶ感染者において、ＨＣＶを消失させることができる。ＨＣＶ消失率を高めるために、抗ウイルス薬であるリバビリンをインターフェロンと併用することもある。症状の進展を抑制して肝細胞癌の発症を遅延させることを目的として、インターフェロンの少量継続投与も行われている。
【０００５】
その他、特許文献１には、「ブルーベリー葉の加工処理物を有効成分とするＣ型肝炎ウイルス産生抑制材料」が開示されている。また、特許文献２には、ピクノジェノールを含む組成物が、その抗ウイルス作用から、Ｃ型肝炎ウイルス等の感染者のクオリティオブライフ（ＱＯＬ）の向上に有用である旨が記載されており、特許文献３には、プロアントシアニジンを含む組成物が抗ウイルス作用を有し、肝炎等に適用される旨が記載されている。
【特許文献１】特開２００７−１１９３９８号公報
【特許文献２】特開２００５−２３９５８１号公報
【特許文献３】特表２００６−５１１５０９号公報
【非特許文献１】飯野四郎、  「Ｃ型慢性肝炎に対する最近の話題  ＩＦＮの副作用とその対策」、  “ＭＥＤＩＣＡＬ  ＤＩＧＥＳＴ”、  １９９７年、  第４６巻、  第６号、  ｐ．１９−２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、インターフェロン療法によっても、約５割の感染者は、依然として肝細胞癌発症の危険性を抱えたままである。また、インターフェロンは、脱毛、食欲減退、鬱、血小板減少などの副作用を生じる場合があるため、長期にわたる継続的治療には不適である（非特許文献１参照）。
【０００７】
特許文献１には、ブルーベリー葉に含まれるＨＣＶ産生抑制作用を有する成分について、具体的に開示されていない。
【０００８】
特許文献２には、他の多くのウイルスと共にＣ型肝炎ウイルスが例示されているに過ぎず、ピクノジェノールによるＨＣＶ産生抑制作用に関する具体的な記述はない。しかも、ＨＣＶは、特許文献２の実施例に記載の脳心筋炎ウイルスとは異なり、実験動物に摂取できない。したがって、特許文献２は、実質的にピクノジェノールによるＨＣＶ産生抑制作用について開示したものではない。
【０００９】
特許文献３には、プロアントシアニジンがフラビウイルス科の西ナイルウイルスに対して抗ウイルス作用を有する旨が開示されているが、西ナイルウイルスとＨＣＶとでは、分類学上の属が異なり、感染部位も異なる。また、プロアントシアニジンが肝炎に適用される旨は記載されているが、プロアントシアニジンのＨＣＶ産生抑制作用を示唆する記載はない。
【００１０】
そこで、本発明は、副作用が少なく、優れたＣ型肝炎ウイルス産生抑制作用を有するＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、先にブルーベリー葉に強い抗ＨＣＶ活性があることを見出していたが（特許文献１参照）、その有効成分は未だ不詳であった。そこで、まずブルーベリー葉の抗ＨＣＶ活性有効成分を特定したところ、プロアントシアニジン（以下、本発明の有効成分であるプロアントシアニジンを「ＰＡＣ」という。）であることが判明した。次いで、ＰＡＣを含有することが知られている他の天然素材を含めて、含有ＰＡＣの構造と抗ＨＣＶ活性につき鋭意研究を行った結果、特定構造のＰＡＣに特異的に抗ＨＣＶ効果があることを見出し、本発明に至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、プロアントシアニジンからなる組成物を有効成分とするＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤であって、組成物中のプロアントシアニジンは、下記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で３以上互いに結合した構造を有しており、組成物中のプロアントシアニジンにおける全フラバン−３−オール骨格のうち、一般式（１）中のＲ１及びＲ３がいずれも水酸基であるフラバン−３−オール骨格の割合が４０％以下である、Ｃ型肝炎ウイルス産生抑制剤である。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
【００１３】
【化１】
2010059096.tif 000002
【００１４】
式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。
【００１５】
本発明のＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤（以下、「ＨＣＶ産生抑制剤」という。）は、上記のような構成を備えることにより、副作用が少なく、長期使用が可能で、かつ優れたＣ型肝炎ウイルス産生抑制作用を有するものとなる。
【００１６】
本発明のＨＣＶ産生抑制剤は、上記一般式（１）中のＲ４が、置換基を有していてもよいガレート基を示すものであることが好ましい。
【００１７】
本発明のＨＣＶ産生抑制剤においては、Ｃ型肝炎ウイルス活性を５０％阻害するのに要する濃度（ＩＣ５０）が、細胞増殖活性を５０％阻害するのに要する濃度（ＣＣ５０）に対し１／１０以下であることが好ましい。このようなＨＣＶ産生抑制剤は、副作用が少なく、長期使用が可能である。
【００１８】
本発明のＨＣＶ産生抑制剤は、上記組成物中のプロアントシアニジンが、上記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で５〜１０互いに結合した構造を有するものであることが好ましい。
【００１９】
別の側面において、本発明は、上記ＨＣＶ産生抑制剤を含有する、Ｃ型肝炎ウイルス由来の肝疾患の治療剤である。
【００２０】
別の側面において、本発明は、上記ＨＣＶ産生抑制剤を含有する、Ｃ型肝炎ウイルス由来の肝疾患の発症又は進展抑制剤である。
【００２１】
別の側面において、本発明は、上記ＨＣＶ産生抑制剤を含有する、Ｃ型肝炎ウイルス由来の肝疾患の、発症若しくは進展の抑制用又は治療用医薬組成物又はそのプロドラッグである。
【００２２】
別の側面において、本発明は、上記ＨＣＶ産生抑制剤を含有する、Ｃ型肝炎ウイルス由来の肝疾患の、発症若しくは進展の抑制用又は治療用飲食組成物である。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、副作用が少なく、長期の服用が可能で、かつ優れたＣ型肝炎ウイルス産生抑制作用を有するＣ型肝炎ウイルス産生抑制剤を提供することが可能となる。
【００２４】
本発明のＨＣＶ産生抑制剤は、非常に強い抗ＨＣＶレプリコン活性を有するにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性が軽微である。したがって、本発明のＨＣＶ産生抑制剤を有効成分とする、ＨＣＶ由来の肝疾患の、治療剤、発症又は進展抑制剤、発症若しくは進展の抑制用又は治療用医薬組成物又はそのプロドラッグなどは、インターフェロンの代替治療薬等として有用である。これらは、インターフェロンと比べて副作用が少なく、長期にわたって用いることができる。ＨＣＶを病因とする肝疾患は、ＨＣＶ感染から肝炎の発症、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌まで、約３０年余の長期に及ぶことから、長期使用が可能であることは極めて重要である。特に、ＨＣＶ由来の肝硬変患者や、肝細胞癌摘出手術後の患者の多くは、白血球又は血小板が減少しているため、インターフェロン療法を施せない場合が少なくない。本発明のＨＣＶ産生抑制剤を用いた治療は、このようなインターフェロン療法を施せない肝疾患患者に対しても、優れた代替治療手段となり得る。また、本発明のＨＣＶ産生抑制剤を有効成分とする、ＨＣＶ由来の肝疾患の、発症若しくは進展の抑制用又は治療用飲食組成物は、機能性食品や健康補助食品として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２６】
実施形態に係るＨＣＶ産生抑制剤は、多くの場合、複数のＰＡＣからなる組成物を有効成分としている。ＰＡＣは一般式（１）に示すユニットを含み、ユニットの重合度（ｎ）は少なくとも３である。
【００２７】
すなわち、有効成分であるＰＡＣは、一般式（１）に示すユニットが、（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合、（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合、（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合、のいずれかの結合様式で３以上（好ましくは、５以上、更には５〜１０）互いに結合した化合物である。
【化２】
2010059096.tif 000003
【００２８】
式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。
【００２９】
上記一般式（１）中のＲ４が示す一価の有機基としては、ガレート基、有機酸残基、糖残基等が挙げられる。有機酸残基のもとになる有機酸としては、p−クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸、p−ヒドロキシ安息香酸、没食子酸、酢酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸等が挙げられる。
【００３０】
また、Ｒ４は、ガレート基や有機酸基に糖が結合した配糖体形成残基であってもよい。その場合、例えば、糖は、ガレート基や有機酸基のフェノール水酸基とエステル結合を介して任意の位置で結合する。その配糖体形成残基の例としては、ピラノース型のヘキース残基、フラノース型のペントース残基等を挙げることができる。糖の形態としては、グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース等の単糖類の他に、２糖類や３糖類を挙げることができる。
【００３１】
なかでも、Ｒ４は、置換基を有していてもよいガレート基を示すことが好ましい。「置換基を有していてもよいガレート基」には、「ガレート基」及び「置換基を有するガレート基」が含まれ、「置換基を有するガレート基」には、「糖が結合したガレート基」等が含まれる。
【００３２】
なお、式（１）中、Ａ環の５位及び／又は７位の水酸基は、ガレート基、糖、有機酸などが結合した修飾基であってもよい。
【００３３】
上記組成物中のプロアントシアニジンにおける全フラバン−３−オール骨格のうち、上記一般式（１）中のＲ１及びＲ３がいずれも水酸基であるフラバン−３−オール骨格の割合は４０％以下である。この割合が４０％を超えると、ＨＣＶ産生抑制効果が十分でなくなる傾向がある。上記割合は、チオール開裂法により求める。
【００３４】
上記（ｉ）の結合様式によりフラバン−３−オール骨格が互いに結合した構造を有するプロアントシアニジンとしては、例えば、下記一般式（２）で表されるものがある。
【化３】
2010059096.tif 000004
【００３５】
上記（ｉｉｉ）の結合様式によりフラバン−３−オール骨格が互いに結合した構造を有するプロアントシアニジンとしては、例えば、下記一般式（３）で表されるものがある。
【化４】
2010059096.tif 000005
【００３６】
一般式（１）中のＲ１及びＲ３はＨ又はＯＨであり、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基であり、組成物中のＰＡＣにおける全フラバン−３−オール骨格のうち、Ｒ１及びＲ３がともにＯＨである割合が多くとも４０％である。かかる構造を有するＰＡＣ組成物は、優れた抗ＨＣＶ活性を顕す。上記割合が４０％を超えると、抗ＨＣＶ活性が急激に低下する。
【００３７】
一般式（１）で示されるユニットにおいて、Ａ環の５位及び／又は７位は、ＯＨであるが、必要に応じて水酸基を介する修飾基（すなわち、水酸基との結合により生じた一価の基）であっても良い。代表的な修飾基としては、ガレート基、糖、有機酸などを挙げることができる。
【００３８】
本発明において、抗ＨＣＶ活性とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＨＣＶレプリコン細胞の増殖抑制活性作用を意味し、基本的には抗ＨＣＶ活性値（ＩＣ５０；μｇ／ｍｌ）、及び抗ＨＣＶ活性値（ＩＣ５０）と細胞毒性値（ＣＣ５０；μｇ／ｍｌ）との比（Ｒａｔｉｏ）で表すことができる。抗ＨＣＶ活性（ＩＣ５０）値は、インターフェロンのＩＣ５０値との観点から、１．０μｇ／ｍｌ以下とするのが望ましい。また、医薬としての有効性の観点からは、抗ＨＣＶ活性値（ＩＣ５０）と細胞毒性値（ＣＣ５０）との比は、一般的に１０以上とされている（坂本直哉ら、  「ＨＣＶ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ産生細胞株の樹立とその応用」、  “日本臨床”、  ２００４年、  第６２巻、  ｐ．１１６−１２０参照）。本発明の効果は、抗ＨＣＶ活性値（ＩＣ５０）と細胞毒性値（ＣＣ５０）との比により評価することができる。
【００３９】
ＰＡＣは様々な植物に広く含有される縮合型タンニンであり、酸処理によってシアニジン、デルフィニジン、ペラルゴニジン、オーランチニジン、ルテオリニジン、ペオニジン、マルビジン、ペチュニジン、ヨーロピニジン、ロシニジン、ヒルスチジン、アピゲニニジンなどを得ることができる。一般式（１）及び下記式に示すように、ＰＡＣは、主としてカテキン類すなわちフラバン−３−オールを構成単位（骨格）とする重合度が２以上の縮重合体からなるポリフェノール成分である（式中Ｒは、上記ＯＲ４に相当する。また、フラバン環３位水酸基にしばしば没食子酸がエステル結合する）。すなわち、ＰＡＣとはフラバン骨格を基本として種々な部位に水酸基を有する単量体が重合した、非常に多様な化合物群の総称である。重合体の構成単位のうち、基端部をターミナルユニット、その他をエクステンションユニットと呼び、重合度は二量体、三量体のものから１００量体以上の高分子にまで及ぶ。
【化５】
2010059096.tif 000006
【００４０】
ある特定の単量体（骨格）が重合したＰＡＣには慣用名が与えられ、代表的なＰＡＣとしては、Ｂ環の水酸基の数に応じて定義・分類された、プロペラルゴニジン（４’−ＯＨ）、プロシアニジン（３’−ＯＨ、４’−ＯＨ）及びプロデルフィニジン（３’−ＯＨ、４’−ＯＨ、５’−ＯＨ）が挙げられる。例えば、Ａ環５位の水酸基を欠く成分を構成単位とした重合体であるプロガイボールチニジン、プロフィセチニジン、及びプロロビネチニジンがあり、さらにその他特定部位の水酸基の有無に応じて、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン、プロルテオリニジン等の慣用名を持つ成分が挙げられる。
【００４１】
本発明においてＰＡＣは、好ましくは、プロシアニジン、プロペラルゴニジン又はプロデルフィニジンである。「プロシアニジン」の構成単位（骨格）は、同一又は異なっていてもよく、カテキン、エピカテキン、カテキンガレート及びエピカテキンガレートから選択できる。「プロデルフィニジン」の構成単位は、同一又は異なっていてもよく、ガロカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキンガレート及びエピガロカテキンガレートから選択できる。
【００４２】
本発明において、一般式（１）で表されるＰＡＣにおけるＲ４が一価の有機基である場合、その具体例としては、ガレート基、糖残基、有機酸残基などを挙げることができる（ここで、残基とは、分子中の原子又は基が除かれて生じる一価の基を意味する）。有機酸残基を形成する有機酸としては、p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸、p-ヒドロキシ安息香酸、没食子酸、酢酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、及びリンゴ酸等を挙げることができる。
【００４３】
糖残基を形成する糖は必要に応じて、例えばフェノール水酸基とエステル結合を介して任意の位置で修飾される。その配糖体形成残基の例としては、ピラノース型のヘキース残基、フラノース型のペントース残基を挙げることができる。具体的には、糖の形態として、グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース等の単糖類の他に、２糖類や３糖類を挙げることができる。
【００４４】
ＰＡＣの構成単位同士の主たる結合部位としては、上記のように（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式があるが、具体例としては、例えば、Ａ−タイプ結合；４位と８位および２位と７位酸素の２箇所、また例えば、Ｂ−タイプ結合；４位と６位または４位と８位のいずれか１箇所が挙げられる。またこれら結合からなる種々の立体配置を有するＰＡＣが存在する。
【００４５】
また、ＰＡＣには、上記一般式（２）、（３）に例示すように、Ａ−タイプとＢ−タイプが存在するが、本発明者等の知見によれば、Ａ−タイプ、Ｂ−タイプの例で言えば、その延鎖方式のかかる相違、あるいはその混合比は、抗ＨＣＶ活性に直接的な影響を与えない。因みに、ブルーベリー葉抽出ＰＡＣではＢ−タイプが支配的である。なお、例示の一般式（２）、（３）において、重合度とＢ環のＯＨ基の割合（パーセンテージ）については、本発明の要件を満たすことが必要である。
【００４６】
上述のようにＰＡＣは、各環上の結合位置の違い、構成単位内の置換基の立体配座、更には異なる構成単位の重合体内での結合順序など、非常に多様な化合物が知られている。本発明に含まれるＰＡＣの化学名（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｎａｍｅ）を下記に例示する。なお、括弧内は分子式（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍｕｌａ）である。なお、本発明においては、これらのＰＡＣが更にカテキン、エピカテキンなどの構成単位あるいは他のＰＡＣと縮合した、より高重合度のＰＡＣをも包含する。
【００４７】
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ＰＺ  ５  （Ｃ７５  Ｈ６２  Ｏ３１），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ＢＰ  １  （Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ＲＰ  ４  （Ｃ１２９  Ｈ１０６  Ｏ６７），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ＲＰ  ３  （Ｃ１３６  Ｈ１２０  Ｏ７０），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ＣＳ  ４  （Ｃ１３６  Ｈ１２０  Ｏ７０），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ＣＳ  ３  （Ｃ１２７  Ｈ１２８  Ｏ６９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ＣＳ  ２  （Ｃ１１３  Ｈ１１０  Ｏ６２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ＣＳ１  （Ｃ１２１  Ｈ１１８  Ｏ６５），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ＲＰ  ２  （Ｃ１２０  Ｈ１１４  Ｏ６４），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ＲＰ１  （Ｃ１２５  Ｈ１３０  Ｏ６９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  Ｔ４  （Ｃ１２８  Ｈ１２２  Ｏ６５），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  Ｔ３（Ｃ１０５  Ｈ１０２  Ｏ５９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  Ｔ２  （Ｃ６７  Ｈ５４  Ｏ２９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  Ｔ１  （Ｃ８７  Ｈ７２  Ｏ４３），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  Ｃ１  （Ｃ４５  Ｈ３８  Ｏ１８）
【００４８】
本発明において、有効成分であるＰＡＣの平均重合度は、図１１に示すように抗ＨＣＶの観点から好適には５以上である。但し、前述の重合度ユニット（一般式（１））の平均重合度ｎが３以上の重合体が含まれていれば、ＰＡＣ中に、モノマーやダイマー、その他の断片が存在しても、結果的に後述する表４〜表５に示すように、抗レプリコン活性値（ＩＣ５０）が１．０μｇ／ｍｌ以下で、抗レプリコン活性値（ＩＣ５０）と細胞毒性値（ＣＣ５０）の比は１０以上であれば許容できる。
【００４９】
なお、本発明において平均重合度とは、（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式でフラバン−３−オール骨格が互いに結合している平均個数を意味し、例えば、後述する実施例１に示す方法などにより、測定することができる。
【００５０】
ＰＡＣは、天然物由来、あるいは合成品を使用することができるが、植物由来のＰＡＣが好ましく、最も典型的には、野菜、ナッツ、樹皮、及びポリフェノール化合物を含む他の植物材料のような、植物から誘導される植物材料からの原料を用いることができる。例えば、殆どの色のついた果実、イチゴ類、及び野菜は、ポリフェノール化合物を含むことが知られている。ポリフェノール化合物を含む植物、果実、イチゴ類、及び野菜の例には、例えば、ブルーベリー葉、ブドウ種子、サトイモ、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、ブラックベリー、ストロベリー、レッドカーラント、ブラックカーラント、クランベリー、チェリー、ラズベリー、グレープ実、カーラント、ハイビスカスの花、シシトウガラシ、豆、エンドウ豆、大豆皮、赤キャベツ、パープルコーン、紫サツマイモが含まれるが、それらに限定されるものではない。特に好ましい植物材料としては、ブルーベリー葉、ブドウ種子、サトイモを挙げることができる。サトイモにおいては、特に皮の部分に本発明のプロアントシアニジンが多く含まれおり好ましい。
【００５１】
本発明の出発素材において、使用する植物の部分は、葉、花弁、萼片、花、葉柄、新芽、根、茎、種子、鞘、塊茎、樹皮、形成層、材木、菌こぶ、果実、野菜、ハーブ、シダ、樹液、樹脂、ブドウ、リンゴ、タマネギやアボカドなどの皮、柑橘類の皮、果物の外皮を含む皮、リンゴ、ワインの絞りかす、穀粒の外皮、藁、干し草、オリーブ、アブラナ或いはカノラ由来の油製種子の塊、及びその他油料作物抽出物等を任意に用いることができる。
【００５２】
本発明で好ましい出発素材の一つ後述する実施例１から明らかなようにブルーベリーである。ブルーベリーは、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）サイアノコカス節（Ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）に属するアメリカ原産の落葉性もしくは常緑性の低木または半高木果樹である。ブルーベリーはおよそ６種類からなるが、果樹園芸上重要なのは下記の三種である。本発明では、使用するブルーベリーについて、種類、由来、原産地を特に制限するものではない。
【００５３】
（１）ハイブッシュブルーベリー（Ｈｉｇｈｂｕｓｈ  ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ，  Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ  Ｌ．）：オニール、シャープブルー、ジョージアジェム、フローダブルー、レベレイ、スパルタン、ダロウ、デューク、バークレイ、ハリソン等。
【００５４】
（２）ラビットアイブルーベリー（Ｒａｂｂｉｔｅｙｅ  ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ，  Ｖ． ａｓｈｅｉ  Ｒｅａｄｅ，  Ｖ． ｖｉｒｇａｔｕｍ  Ａｉｔｏｎ）：ウッダード、ガーデンブルー、ティフブルー、ホームベル、マイヤー等。
【００５５】
（３）ローブッシュブルーベリー（Ｌｏｗｂｕｓｈ  ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ，  Ｖ． ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ  Ａｉｔｏｎ；  Ｖ． ｍｙｒｔｉｌｌｏｉｄｅｓ  Ｍｉｃｈａｕｘ）：チグネクト、ブロンズウィック、ブロミドン等。
【００５６】
上記出発素材の中で、好ましいものはラビットアイブルーベリーである。
【００５７】
本発明の有効成分であるＰＡＣは、目的に応じて以下の工程を適宜組み合わせることにより得ることができる。
（１）前処理加工：
葉、皮、果実、茎、根等の全草部位に応じて、あらかじめ水洗、濾別などにより物理的に不純物を除く。あるいは、葉緑素、繊維素等、本発明のＰＡＣ以外の成分を溶媒で留去することもできる。この溶媒には、留去する対象により異なるが、クロロホルム、ヘキサン、アセトン等を用いることができる。生の素材は、そのまま粉砕しても乾燥後粉砕して、粉末状で次工程に供してもよいし、生素材からの搾汁液、抽出液を次工程に供してもよい。搾汁又は抽出液は、濃縮又は乾燥して粉末状で次工程に供してもよい。
【００５８】
乾燥手段には、本発明の薬理効果を損なわなければ特に制限はなく、真空凍結乾燥、熱風乾燥、遠赤外線乾燥、減圧乾燥、マイクロ波減圧乾燥、及び過熱蒸気乾燥等を広く用いることができる。なかでも、成分変化の少ない真空凍結乾燥も採用可能である。真空凍結乾燥条件は、原料葉の状態によって異なるので特定できないが、例えば生葉をそのまま乾燥する際、凍結温度は−３０℃〜−２０℃、乾燥温度は−３０〜３０℃、乾燥時間は１５時間〜２４時間の範囲が望ましい。
【００５９】
（３）抽出工程：
前工程で得られた加工処理物は、次に溶媒抽出する。溶媒抽出には、下記の溶媒を適宜組み合わせて、必要に応じ多段抽出する。使用する抽出溶媒は特に制限されないが、水又は水と相溶性のある極性溶媒の使用が好適である。水と相溶性のある極性溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の炭素数１〜４の低級アルキルアルコール；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコールを挙げることができる。アルコールとしては、安全性の観点から低級アルコール、特にメタノールやエタノールの使用が実際的である。
【００６０】
他の有機溶媒としては、例えばアセトン、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル、キシレン、クロロホルム、トルエン、ヘキサンなどを挙げることができる。水と極性溶媒の組み合わせを含め、これらの溶媒は、単独あるいは2種以上を組み合わせて使用してもよい。例えば、アセトンとエチルエーテルの混合溶媒、好ましくはアセトンとエチルエーテルの１：１（ｖ／ｖ）混合液の使用が可能である。一般的には、極性溶媒と水との混合溶媒（含水溶媒）の使用が望ましい。含水溶媒としては、含水アルキルアルコール、より好ましくは含水メタノール、含水エタノールである。含水アルコール中のアルコール濃度は、５〜９０容量％、好ましくは３０〜９０容量％、より好ましくは５０〜９０容量％である。アルコール以外の好ましい混合溶媒としては、水とアセトンの混液が好ましい。
【００６１】
抽出操作としては、加工処理物を溶媒に冷浸、温浸等、浸漬処理する。通常は、加温下で撹拌しながら抽出し、ろ過して抽出液を得る。例えば、８０容量％エタノール水溶液による撹拌抽出では、溶液温度は望ましくは室温、浸漬時間は温度により異なるが３０秒〜１時間の範囲内が好適である。また、パーコレーション法によることもできる。
【００６２】
（４）精製工程：
得られた抽出物は、必要に応じてろ過又は遠心分離により固形物を除去する。濾液は、次工程の要求に応じてそのまま用いるか、又は溶媒を留去して一部濃縮もしくは乾燥して用いてもよい。必要に応じて、これらの抽出、濃縮物は精製する。精製方法は、特に限定されないが、例えばカラム法や溶媒による分割法などを挙げることができる（例えば、ＷＯ２０００−６４８８３号公報参照）。
【００６３】
本発明のＰＡＣの植物素材として用いることのできるサトイモ科植物は、サトイモ科（Ａｒａｃｅａｅ）サトイモ属（Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）に属する東南アジア原産の栽培植物である。茎の地下部分である塊茎を食用とする。また葉柄も食用にされる。コンニャク属（Ａｍｏｒｐｈｏｐｈａｌｌｕｓ ｒｉｖｉｅｒｉ  ｖａｒ．  ｋｏｎｊａｃ）も加工して食品となる。観賞用としてもいくつかの属が存在する。本発明では、使用するサトイモについて、種類、由来、原産地を特に制限するものではない。サトイモ科植物の塊茎に含まれる成分としてムチン、ガラクタン、カリウムが知られる。ムチンは粘膜の損傷を防ぎ胃腸壁の潰瘍予防となることが知られている。ガラクタンは脳細胞の活性化、免疫力を高めるなどの効果が知られている。カリウムはナトリウムを排泄して高血圧を予防すると言われている。しかし、これまでサトイモ科植物の塊茎によるＨＣＶ産生抑制機能の報告はない。
【００６４】
サトイモ科植物の塊茎は加工処理して用いる。加工処理方法としては、塊茎をそのまま粉砕する方法も使用できるが、塊茎の乾燥粉砕、塊茎の搾汁、塊茎の溶媒抽出が実用的である。ＨＣＶ産生抑制作用を効果的に発揮するために、塊茎皮の処理物を用いることが好適である。
【００６５】
乾燥粉砕物の調製方法としては、塊茎をそのまま乾燥した後粉砕するか、または細く切断した後乾燥する方法を挙げることができる。乾燥方法は、先述のブルーベリー葉の場合に準じて実施することができる。また、抽出工程、精製工程も同様に、ブルーベリー葉の場合と同様にして実施することができる。
【００６６】
本発明の有効成分であるＰＡＣは、抽出液、濃縮エキス、ペースト、乾燥、半乾燥物等、最終利用形態としてはさまざまな形で利用できる。本発明の精製されたＰＡＣは、単純な抽出物に比べて、より高い抗ＨＣＶ活性を有する。
【００６７】
抗ＨＣＶ活性の評価は、ＨＣＶが霊長類以外に感染しないため、一部のキメラマウスを除いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適正な評価系がない。したがって、本発明における抗ＨＣＶ活性の評価には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価系として知られているＨＣＶレプリコン細胞（Ｌｏｈｍａｎｎ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．、  “Ｓｃｉｅｎｃｅ”、  １９９９年、  第２８５巻、  ｐ．１１０−１１３参照）を用いる。ＨＣＶレプリコン細胞は、ウイルス粒子を構成するコアとエンベロープの構造タンパク質翻訳領域、及びウイルスゲノム複製などに機能する非構造タンパク質翻訳領域からなる。ＨＣＶレプリコン細胞は、この非構造領域部分を利用している。このアッセイ系におけるＨＣＶ−ＲＮＡの複製は、そのメカニズムから肝細胞に感染した全長ＨＣＶ−ＲＮＡゲノムの複製と同一と見做すことができる。
【００６８】
本発明のＨＣＶ産生抑制剤に用いるＰＡＣにおいて、一般式（１）に示すユニットの重合度ｎは、少なくとも３の整数である。表１に示すように、ｎ＝１のカテキン、ｎ＝２のカテキンダイマーには抗ＨＣＶ活性が認められない。他のエピカテキン、アフゼレチン、エピアフゼレチンも同様と推定できる。
【表１】
2010059096.tif 000007
【００６９】
また、一般式（１）中、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ１及びＲ３はＨ又はＯＨであり、Ｒ４はＨ又は修飾体である。全ポリマー組成中におけるＲ１及びＲ３がともにＯＨである割合は、多くとも４０％である。即ち、プロデルフィニジンと総称されるＢ環のＲ１、Ｒ２、Ｒ３が全てＯＨであるガロカテキンやエピガロカテキンの構造単位が全ポリマー組成物中に含まれる量は、表２に示すように含量反比例的に抗ＨＣＶ活性を有する。例えば、クロトン樹液のように４０％程度を超えると細胞属性が強く、実施例１の表３に示すように、ＩＣ５０とＣＣ５０のＲａｔｉｏが１０以下となり、実用に適さない。
【００７０】
ＰＡＣは、化学的あるいは生物学的に生成されたもの、天然由来、特に植物からの抽出精製物のいずれであっても、前記本発明の構造、機能特性を備えるものであればよい。
【００７１】
ＰＡＣは、抽出液、濃縮エキス、ペースト、乾燥、半乾燥物等、最終利用形態としてはさまざまな形で利用できる。本発明の精製されたＰＡＣは、抽出物に比べて、より高いＨＣＶ産生抑制活性を有する。
【００７２】
ＰＡＣを有効成分とするＨＣＶ産生抑制剤は、そのまま、もしくはプロドラッグ、又は薬剤として利用できる。ＰＡＣとしては、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物をそのまま投与してもよいが、一般的には、有効成分である上記の物質と薬理学的及び製剤学的に許容される添加物を含む医薬組成物を調製して投与することが好ましい。
【００７３】
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。
【００７４】
本発明のＰＡＣを医薬品とする場合は、投与単位形態で投与することが好ましく、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）又は経直腸的に投与することができる。
【００７５】
経口投与剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等から適宜選択すればよい。また経口投与用液状医薬製剤としては、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などの形態を挙げることができる。製剤にあたっては、各種製剤に応じた賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤、pH調整剤等を適宜配合することができる。例えば、錠剤の場合は、必要に応じて、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、又は多層錠とすることができる。錠剤の形態に調製するに際しては、担体として、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第4級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などが例示できる。
【００７６】
組織内投与剤形としては、注射剤を挙げることができる。注射剤として調製する場合には、非毒性の溶液、乳剤及び懸濁剤などの形態とすることができる。これらは、殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましい。これら液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に調製するに際しては、希釈剤として、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを用いることができる。また、等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、グルコース、又はグリセリン、及び通常の溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤なども配合することができる。これら注射剤は、皮下、筋肉内又は静脈内に投与することができる。
【００７７】
局所投与剤形としては、例えば、局所用液剤、クリーム剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤を挙げることができる。これらは、ＰＡＣもしくはそのプロドラッグ、又は製薬上許容されうるそれらの塩の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより調製することができる。
【００７８】
経直腸的投与剤形としては、坐剤を挙げることができる。坐剤の形態に調製するに際しては、基材として、例えばパルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、高級アルコール類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、ゼラチン、半合成グリセリド、これらの混合物などの低融点基材を挙げることができる。座剤は、ＰＡＣもしくはそのプロドラッグ、又は製薬上許容されうるそれらの塩を上記のような基材に混入し、成型することにより調製することができる。
【００７９】
前記のＰＡＣ、もしくはそのプロドラッグ、又は製薬上許容されうるそれらの塩を含むＨＣＶ産生抑制剤を医薬品として投与する場合、その有効投与量は、年齢、体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質、程度等を考慮した上で決定する。通常は、ヒト成人に対しては、有効成分量として、一日当たり、１〜２０００ｍｇの範囲である。患者の状態などに応じて、上記範囲未満又は上記範囲を超える用量を投与することもできる。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。本発明の医薬品の用途は、ＨＣＶ産生抑制に起因する肝疾病の病態であればよいが、ＨＣＶ産生抑制剤又は肝炎、肝硬変の予防剤にも適用可能である。
【００８０】
医薬品の有効投与量は、所望の治療効果、投与法、治療期間、性別、投与経路、その他患者の病状等の条件に応じて異なるので特定できないが、例えば、体重６０ｋｇのヒトに対する投与量は、本発明の有効成分であるＰＡＣ換算量として、１投与あたり約（１００〜１０００）ｍｇの範囲から適宜選択するのが望ましい。投与時期は、特に限定されないが、望ましくはＨＣＶ感染により病状が進展しつつある患者の肝炎急性期、慢性期、肝硬変の時期が有効である。
【００８１】
更に、本発明のＰＡＣは、ＨＣＶ感染による肝疾患の予防剤あるいは進展抑制剤としての機能性を有する健康補助食品としても利用できる。投与は、固体状、液体状、エマルジョン等で可能であるが、必要に応じて薬学的もしくは食品上許容される担体又は添加剤を配合することもできる。添加剤には、一般的な剤形補助剤等の外、他の薬剤、機能性成分、例えばビタミン類、その他の微量成分等の有効成分を含めることができる。剤形は、特に問わないが、経口に適した形態であることが好ましい。医薬品の場合、ＰＡＣの有効含量は、投与量又は服用量との関係で一概に特定できないが、０．１〜９９．５重量％、好ましくは０．５〜９０重量％の範囲で選択すればよい。
【００８２】
ＰＡＣを機能性健康補助飲食物として用いる場合も、その形態は特に制限されない。例えば、必要に応じて食品上配合が許容される担体や添加剤とともに、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、トローチ剤、又は溶液（ドリンク）等の形態に調製することができる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。以下の実施例において、「％」は、特に言及しない限り、「ｗ／ｗ％（質量％）」を意味する。
【００８４】
［試験方法］
本実施例において、抗レプリコン活性試験（レプリコンアッセイ）及び細胞毒性試験は、以下のように行った。
【００８５】
ＨＣＶのゲノムＲＮＡ構造タンパク質翻訳領域を、ルシフェラーゼ翻訳領域・脳心筋ウイルス内部リボゾーム結合配列・ネオマイシン耐性遺伝子に置換し、サブゲノムレプリコンＲＮＡを作成した。得られたＲＮＡを、ヒト肝がん細胞Ｈｕｈ−７の細胞質に導入した。得られた細胞を、ＨＣＶレプリコンＲＮＡの産生量の評価に用いた。ＨＣＶレプリコンＲＮＡの産生量は、ルシフェラーゼアッセイ法により測定した。
【００８６】
抗レプリコン活性試験（レプリコンアッセイ）
ＨＣＶ−ＲＮＡのコピー数を定量するために、ＨＣＶ−ＲＮＡの中にレポーター遺伝子としてホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を導入した。ルシフェラーゼ遺伝子の導入は、Ｋｒｉｅｇｅｒら（Ｋｒｉｅｇｅｒら、  “Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．”、  ２００１年、  第７５巻、  p．４６１４−４６２４参照）の方法に従い、ＨＣＶ遺伝子のＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ）の直下に、ネオマイシン耐性遺伝子と融合する形で行った。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、当該ＲＮＡを合成後、エレクトロポレーション法でＨｕｈ−７細胞に導入し、Ｇ４１８耐性クローンとして単離した。ホタル・ルシフェラーゼＨＣＶレプリコン細胞（３−１）を、５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ．  ｎｏ．  ＳＨ３００７１．０３）を含むダルベッコＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ．  ｎｏ．  １０５６９−０１０）に懸濁し、９６穴プレートに５０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で一夜培養した。
【００８７】
約２０時間後、希釈した試験化合物を、ウェルあたり１０μｌ加え、さらに３日間培養した。アッセイプレートを２系統用意し、１つは白色プレート、他はクリアープレートでアッセイを行った。培養終了後、白色プレートは、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ．  ｎｏ．  Ｅ２５２０）に用いた。すなわち、ウェルあたり１００μｌの試薬を入れ、３〜４回ピペットで混ぜ、５分間放置後にマルチモードプレートリーダー  ＤＴＸ８００（ベックマン・コールター）にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、試料未添加の値を阻害０％として、各試料のＩＣ５０を算出した。
【００８８】
細胞毒性試験
細胞毒性の測定には、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（（株）同仁化学研究所カタログＮｏ．ＣＫ０４）を用いた。クリアープレートに１０μｌのＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８を添加し、３７℃で３０〜６０分間保温した。９６穴プレートリーダーにて、波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍで吸光度を測定した。細胞未添加の値を、バックグランドとして全ての値から差し引き、試料未添加の値を阻害率０％として、各試料のＣＣ５０（５０％細胞阻害濃度）を算出した。
【００８９】
図１に、ブルーベリー葉由来のＰＡＣのレプリコンアッセイ結果を例示する。このサンプルのレプリコン産生抑制活性（ＩＣ５０）は０．５６μｇ／ｍｌで、細胞毒性（ＣＣ５０）は１６．２６μｇ／ｍｌであった。ＩＣ５０は１．０μｇ／ｍｌ以下であり、ＩＣ５０に対するＣＣ５０の比（Ｒａｔｉｏ）は１０以上であったことから、このブルーベリー葉から調製したＰＡＣは、レプリコン産生抑制活性を有していると言える。
【００９０】
［実施例１］
ブルーベリー葉に含まれるＨＣＶレプリコン産生抑制活性を有する化合物の同定
１．抽出及び液−液分配
凍結粉砕したラビットアイブルーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ  Ａｉｔｏｎ）の葉１ｇに、メタノール１００ｍｌを加えて１５分間浸透抽出した。デカンテーションにより上澄みを回収し、Ｎｏ．２の濾紙でろ過し、メタノール抽出物（ＭｅＯＨ  Ｅｘｔｒａｃｔ）４４０ｍｇを得た。そのメタノール抽出物にクロロホルム１００ｍｌを加え、遠心分離（１，０００ｐｐｍ、１０ｍｉｎ）によって上清部と沈殿部とに分け、沈殿部をメタノールに溶解後、エバポレーターで濃縮し、凍結乾燥した（ＣＭＷ−ｐｐｔ：６３．７ｍｇ）。さらに、上清部に水１５０ｍｌとＭｅＯＨを加え、液−液抽出を行い、クロロホルム相を回収した。さらにクロロホルムを１００ｍｌ加えてよく振盪し、クロロホルム相を回収し、先の回収液をと合わせエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥した（ＣＭＷ−C：５６．３ｍｇ）。水相も濃縮後、凍結乾燥した（ＣＭＷ−Ｗ：２８４．２ｍｇ）。
【００９１】
回収したＣＭＷ−C画分にはレプリコン産生抑制活性は確認できなかったが、ＣＭＷ−ｐｐｔ画分とＣＭＷ−Ｗ画分には活性が見られた。回収重量が高く回収した総活性量の多いＣＭＷ−Ｗ画分を以後の精製に用いた。
【００９２】
２．ＨＰＬＣでの分取
（ＨＰＬＣによる溶出位置の確認）
まず、ＨＣＶレプリコン産生抑制活性を有する化合物の逆相ＨＰＬＣによる溶出パターンの確認を行った。ＨＰＬＣは、ＵＶ検出器とフォトダイオードアレイ検出器を備えた「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ」（（株）島津製作所製、商品名）を用いた。その他の分離条件は下記に示す。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＬＣ−２０Ａ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８，  ４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ，  ３μｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）、４０℃
・移動相（溶出液）：（Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ  １５％（０分）→２５％（１２．５分）→１００％（１７．５分）→１００％（２５分）
・移動相流速：０．７０ｍｌ／分
・検出器：ＵＶ  ２５４ｎｍ
【００９３】
上記ＣＭＷ−Ｗ画分を３０ｍｌのメタノールに溶解させ、５０μｌインジェクトした。溶出液は２．３分から１９．５分まで２７画分（Ｎｏ．０〜２６）回収し、それぞれの画分についてレプリコンアッセイを行い、レプリコン産生抑制活性を測定した。レプリコンアッセイは各画分１％、５％、１０％の濃度３点で行った。
【００９４】
図２（Ａ）に、ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、（Ｂ）に、回収した画分位置（Ｎｏ．０〜２６）ごとのレプリコン産生抑制活性を示した。ＨＰＬＣクロマトグラムにおける溶出時間17分のピークと、レプリコン産生抑制活性を示す画分とは一致しているが、その他の溶出パターンと活性に相関は見られないことから、活性成分は複数存在していることが示唆された。また、ブルーベリー葉に多く含まれている溶出時間6分あたりのクロロゲン酸と溶出時間１１分あたりのルチンには活性がないようであった。
【００９５】
（分取１）
最初の分取は、分離カラムを「Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３」（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３μm、Ｗａｔｅｒｓ製）の逆相カラムを用いた他は、上記と同じシステムを用いて行った。移動相（溶出液）の組成も上記と同じにしたが、グラジエントプログラムは以下のように変更した。
溶出液Ｂ  ３０％（０分）→３０％（７．５分）→１００％（１２．５分）→１００％（２０分）
【００９６】
上記ＣＭＷ−Ｗ画分を１００μｌインジェクトし、溶出液の２．１分から１８分まで計２６画分（Ｎｏ．０〜２５）を回収した。それぞれの画分について、上記と同様にしてレプリコン産生抑制活性を測定した。図３（Ａ）に、ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、（Ｂ）に、回収した画分位置（Ｎｏ．０〜２５）ごとのレプリコン産生抑制活性を示した。
【００９７】
溶出液の極性を少し下げることで活性画分を早く溶出させ、活性のない極性の低い部分を除く目的でグラジエントプログラムを作成した。活性の高い溶出時間３．３分から５．２分の画分を集め、１４０．２ｍｇの分取１画分を回収した。
【００９８】
（分取２）
装置とカラムは分取１と同じ条件にし、グラジエントプログラムを以下のようにした。
溶出液Ｂ  ２０％（０分）→２０％（７．５分）→１００％（１２．５分）→１００％（２０分）
【００９９】
分取１画分１４０．２ｍｇをメタノール１１ｍｌに溶解した後、１００μｌインジェクトし、溶出液の２．１分から１８分まで計２６画分（Ｎｏ．０〜２５）を回収した。それぞれの画分について、上記と同様にしてレプリコン産生抑制活性を測定した。図４（Ａ）に、ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、（Ｂ）に、回収した画分位置（Ｎｏ．０〜２５）ごとのレプリコン産生抑制活性を示した。
【０１００】
分取１より少し極性を上げ、各成分を保持させるプログラムを組んだ。活性画分は複数存在し、一つは溶出時間３．９分から１０分までのブロードに溶出した画分で、もう一つは１２分あたりの強い活性を示す画分であった。この活性の強い溶出時間１１．９分から１３．２分の部分を集め、２４．６ｍｇの分取２画分を回収した。
【０１０１】
（分取３）
溶出液Ｂをアセトニトリルからメタノールに変更し、以下のプログラムで分取を行った。
溶出液Ｂ  ４０％（０分）→６５％（１２．５分）→１００％（１７．５分）→１００％（２５分）
【０１０２】
分取２画分２４．６ｍｇをメタノール２．５ｍｌに溶解させた後、１００μｌインジェクトし、溶出液の２．３分から１７．５分まで計２６画分（Ｎｏ．０〜２５）を回収した。それぞれの画分について、上記と同様にしてレプリコン産生抑制活性を測定した。図５（Ａ）に、ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、（Ｂ）に、回収した画分位置（Ｎｏ．０〜２５）ごとのレプリコン産生抑制活性を示した。
【０１０３】
その結果、早い段階で溶出し、活性の高い溶出時間３．１分から６．２分までを回収して、分取３画分（活性画分）２．９ｍｇを得た。
【０１０４】
表２は、上記メタノール抽出物、ＣＭＷ−Ｗ画分、分取１画分（ＬＣ分取１）、分取２画分（ＬＣ分取２）、及び分取３画分（ＬＣ分取３）の各精製段階についてまとめたものである。初めのメタノール抽出物のレプリコン産生抑制のＩＣ５０は５．４７μｇ／ｍｌであったが、精製を重ねるに従って活性は上昇し、最終的には０．０８７μｇ／ｍｌとなり、精製度として約６３倍活性の上がった精製画分を得ることができた。メタノール抽出物の全活性の値が約８０であるのに対して、ＣＭＷ−Ｗ画分と分取１画分における全活性の値が１００を超えているのは、レプリコン産生抑制活性を抑制する化合物が液−液分配（クロロホルム−メタノール−水）で除去されたことが一因であると考えられる。
【０１０５】
【表２】
2010059096.tif 000008
【０１０６】
３．電子線マイクロアナライザー（ＥＰＭＡ）による構成元素分析
ＨＰＬＣによる分取によって精製したＨＣＶレプリコン産生抑制の活性画分の構成元素をＥＰＭＡ（「ＥＰＭＡ−１６００」、（株）島津製作所製、商品名）を用いて以下の条件で測定した。
加速電圧：１５ｋＶ、ビーム電流：１００ｎＡ、ビーム径：５０μm
サンプルは前もってカーボン蒸着を行った。図６に示されるように、この精製画分は、窒素（Ｎ）を含まず、炭素（Ｃ）と酸素（Ｏ）と水素（Ｈ）で構成されていることが判明した。
【０１０７】
４．ＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦによる組成推定
ブルーベリー葉からＨＣＶレプリコン産生抑制活性を指標にして調製した精製化合物の組成を推定するため、ＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−Ｉｏｎ  Ｔｒａｐ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）を用いて解析を実施した。装置は、フォトダイオードアレイを装備した「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム」（（株）島津製作所製）に「ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ」（（株）島津製作所製）検出器を備えたシステムを使用した。その他の分析条件は以下に示す。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３，  ２．１mm  I．D．×１００mm，  ３μm（Ｗａｔｅｒｓ製）、４０℃
・移動相（溶出液）：（Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：Ｂ  １０％（０分）→２５％（７．５分）→１００％（１２．５分）→１００％（２０分）
・移動相流速：０．２５ｍｌ／分
・検出器１：フォトダイオードアレイ２８０ｎｍ
・検出器２：ＡＰＣＩ−ＭＳ
（Ｎｅｇａｔｉｖｅ−Ｉｏｎ  Ｍｏｄｅ、インターフェイス電圧：−３．０ｋＶ、インターフェイス温度：４５０℃、ＣＤＬ温度：２００℃、ネブライズガス流量：２．０Ｌ／分、ドライガス圧力：７０ｋＰａ、ヒートブロック温度：２００℃）
【０１０８】
ＬＣ／ＭＳの分析において、当初イオン化プローブはＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）を用いて行った。フォトダイオードアレイ検出器では、目的化合物を検出していたが、ＥＳＩ−ＭＳでは検出できなかったため、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）に替えた。しかし、ＡＰＣＩでも通常のイオン化温度域（インターフェイス温度として２００〜３００℃）ではほとんどイオン化しなかったため、上記のような条件となった。
【０１０９】
検出されたＭＳスペクトルを図７に示す。ｍ／ｚ＝６８９．１１３５と４０１．０４９４は、それぞれｍ／ｚ＝５７５．１１９６と２８７．０５５３のトリフルオロ酢酸の付加イオンとして検出され、ＭＳ／ＭＳスペクトルから、ｍ／ｚ＝４４９．０８７０と２８７．０５５３は、ｍ／ｚ＝５７５．１１９６のフラグメントイオンであることが分かった。このことから、親イオンをｍ／ｚ＝５７５．１１９６と推定し組成推定を行ったところ、Ｃ３０Ｈ２４Ｏ１２（Ｅｒｒｏｒ＝０．１７ｐｐｍ）と推定した。この組成式から既存の化合物を検索した結果、A−タイプのプロシアニジンであることが分かった。
【０１１０】
５．ブタノール−塩酸加水分解法（ポーター法）によるＰＡＣの同定
下記文献の方法に従い、ポーター法を用いて精製画分の分析を行った。
・Ｐｏｒｔｅｒ  Ｌ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．、  “Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、  １９８６年、  第２５巻、  ｐ．２２３−２３０
・Ｓｈｏｊｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．、  “Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．”、  ２００６年、  第５４巻、  ｐ．８８４−８９２
【０１１１】
ＰＡＣは酸性条件下における加熱により、フラバン間の結合が切断され、カルベニウムイオンとカテキン類を与える。前者はさらに酸化されて赤色のアントシアニジンとなる。この原理を利用した呈色法がポーター法であり、５４０ｎｍの吸光度の上昇により、試料中のＰＡＣを鋭敏に検出できる。
【０１１２】
（１）ポーター法によるＰＡＣの定性及び定量
精製画分をメタノールに溶解し、その２００μｌに５％（ｖ／ｖ）塩酸を含む１−ブタノール７５０μｌと１％（ｗ／ｖ）硫酸鉄アンモニウムを含む２ｍｏｌ／Ｌ塩酸５０μｌを添加し、１０５℃で４０分間反応させた。反応液を室温に戻し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとしてプロシアニジンＢ２（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
【０１１３】
（２）組成分析；ＬＣ／ＭＳ法
ＬＣ／ＭＳを用いて上記ポーター法反応分解物の分析を実施した。もしブルーベリー葉から精製したレプリコン産生抑制活性を有する化合物がＰＡＣであれば、アントシアニジンを検出するはずである。ＬＣ／ＭＳに用いた装置及び条件は下記の通りである。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３，  ２．１ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×１００ｍｍ，  ３μｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）、４０℃
・移動相（溶出液）：（Ａ）５ｍＭギ酸アンモニウムを含む０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ  １０％（０分）→４０％（１５分）→１００％（１５分）→１００%（２２．５分）
・移動相流速：０．２５ｍｌ／分
・検出器１：フォトダイオードアレイ５４０ｎｍ
・検出器２：ＥＳＩ−ＭＳ
（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｉｏｎ  Ｍｏｄｅ、インターフェイス電圧：４．５ｋＶ、
ＣＤＬ温度２００℃、ネブライズガス流量：１．５Ｌ／分、
ドライガス圧力：２００ｋＰａ、ヒートブロック温度：２００℃）
【０１１４】
精製した画分をポーター法で分析した結果、その反応液は赤色を呈したことから、ＰＡＣの存在が明らかとなった。さらにプロシアニジンB2を標品として定量したところ、精製画分のＰＡＣ含量は８６．３３％となった。さらに、ＬＣ／ＭＳ分析の結果を図８に示した。図８（Ａ）がシアニジン標品（ｍ／ｚ＝２８７．０５５０）のＭＳ／ＭＳスペクトルで、（Ｂ）がブルーベリー葉精製物のポーター法分解物（ｍ／ｚ＝２８７．０５５５）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。ポーター法反応分解物のメインピークの溶出時間はシアニジン標品と同じであり、さらにＭＳ／ＭＳスペクトルも一致した。また、その分解物のほとんどがシアニジンもしくはシアニジン誘導体であり、極微量であるがデルフィニジンも検出した。これらのことから、ＨＣＶレプリコン産生抑制活性を有する化合物は、ＰＡＣであると判明した。
【０１１５】
６．チオール開裂によるＰＡＣの平均重合度と構成ユニット組成の解析
上記実施例の結果より、ブルーベリー葉由来のＨＣＶレプリコン産生抑制活性化合物の主成分がＰＡＣであることが示された。次いでここでは、ＰＡＣの構成単位、結合様式及び重合度を調べるために、Ｇｕｙｏｔらの方法（Ｇｕｙｏｔ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、  “Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．”、  ２００１年、  第４９巻、  ｐ．１４−２０参照）に基づきチオール開裂分析を行った。
【０１１６】
図９に、チオール開裂の基本反応を示す。チオール開列の基本反応においては、ＰＡＣを酸性条件下でトルエン−α−チオールと反応させることにより、エクステンションユニットはベンジルチオエーテル付加物となり、ターミナルユニットは遊離のフラバン−３−オールとなる。それらチオール開裂反応産物を逆相ＨＰＬＣで分析することにより、ターミナルユニットとエクステンションユニットの各組成や平均重合度（ｍＤＰ）の情報を得ることができる。平均重合度（ｍＤＰ）は、以下の式により求めることができる。
式
平均重合度（ｍＤＰ）＝［ターミナルユニット＋エクステンションユニット］／［ターミナルユニット］
標品としてカテキンとエピカテキンを用い、チオール開裂の反応中に生じる遊離のフラバン−３−オールの異性化も考慮に入れて補正を行った（Ｇｕ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．、  “Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．”、  ２００２年、  第５０巻、  ｐ．４８５２−４８６０参照）。
【０１１７】
（１）チオール開裂、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件
ブルーベリー葉由来活性化合物ＰＡＣを、メタノールで１ｍｇ／ｍｌに調製し、５０μｌを取り、３．３％（ｖ／ｖ）塩酸メタノール５０μｌを加え、５％（ｖ／ｖ）トルエン−α−チオール１００μｌを加え、５０℃で３０分間反応させた後、反応液を５倍にメタノールで希釈し、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＬＣ−２０Ａ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３，  ４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ，  ３μｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）、４０℃
・移動相（溶出液）：（Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ  １５％（０分）→２５％（１０分）→１００％（４０分）→１００％（４５分）
・移動相流速：０．７０ｍｌ／分
・検出器：ＵＶ２８０ｎｍ
【０１１８】
（２）反応物の同定；液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）
上記反応物を同様にＬＣ／ＭＳに供し各検出ピークの同定を行った。分析条件は下記に示す。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３，  ２．１ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）
・移動相（溶出液）：（Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ  １５％（０分）→２５％（１０分）→６０％（４０分）→１００％（４０分）
・移動相流速：０．２５ｍｌ／分
・検出器１：フォトダイオードアレイ２８０ｎｍ
・検出器２：ＥＳＩ−ＭＳ
（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｉｏｎ  Ｍｏｄｅ、インターフェイス電圧：４．５ｋＶ、
ＣＤＬ温度２００℃、ネブライズガス流量：１．５Ｌ／分、
ドライガス圧力：２００ｋＰａ、ヒートブロック温度：２００℃）
【０１１９】
ブルーベリー葉から精製したレプリケーション抑制の活性化合物をチオール開裂し、ＨＰＬＣで分離したところ、主に８本のメインピークが確認できた。ＨＰＬＣの結果を図１０に示す。カテキン、エピカテキンとトルエン−α−チオールは、標品の溶出時間より確認を行い、ピークAはカテキン、ピークCはエピカテキン、そしてピークHはトルエン−α−チオールと判明した。他のピークはＬＣ／ＭＳで再度分析を行い、各ピークのＭＳスペクトルを確認した。
【０１２０】
ピークEはｍ／ｚ＝４１１．０８９２を検出し、この組成を組成推定によりＣ２２Ｈ２０Ｏ６Ｓ（Ｅｒｒｏｒ＝−３．８ｐｐｍ）と推定した。また、ＭＳ／ＭＳスペクトルにｍ／ｚ＝２８７．０５１０を検出し、親ＭＳとＭＳ／ＭＳの差が１２４．０３８２であったことから、ピークＥはベンジルチオエーテル付加物であることが推定された。加えて、親イオンから推定した組成式Ｃ２２Ｈ２０Ｏ６Ｓからトルエン−α−チオールの組成式Ｃ７Ｈ８Ｓの部分を差し引くとＣ１５Ｈ１４Ｏ６となり、これらのことからピークＥはカテキンもしくはエピカテキンのベンジルチオエーテル付加物であることが確認できた。さらに、プロシアニジンＢ２標品をチオール開裂した場合、エピカテキンとエピカテキンベンジルチオエーテルが生成する。この分解物を分析したとき、エピカテキンベンジルチオエーテルとピークＥの溶出時間が同じであったことから、ピークEはエピカテキンベンジルチオエーテルとした。
【０１２１】
ピークＧは、親イオンとしてｍ／ｚ＝６９７．１３８５を、ＭＳ／ＭＳにｍ／ｚ＝５７３．０９８７を検出し、その差が１２４．０３９８になることからこのピークもベンジルチオエーテル付加物であることが分かった。この精密質量からＣ３７Ｈ３０Ｏ１２Ｓと推定した。この組成からベンジルチオエーテル付加物を除くと、Ｃ３０Ｈ２４Ｏ１２となることから、ピークＧはカテキンやエピカテキンからなるＡ−タイプ２量体のベンジルチオエーテル付加物であると推定された。
【０１２２】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｒ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、  “Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  Ｉ”、  １９７２年、  ｐ．１３８７−１３９９参照）によると、Ａ−タイプのフラバン間結合はチオール開裂に対して抵抗性があるとされている。チオール開裂反応後、ターミナルユニットにＡ−タイプが存在すれば、それに対応するＡ−タイプ２量体として遊離し、エクステンションユニットにあればそれに相当するベンジルチオエーテル付加物が検出される（Ｆｏｏ  Ｌ．  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．、  “Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．”、  ２０００年、  第６３巻、  ｐ．１２２５−１２２８参照）。
【０１２３】
ピークＢの親イオンはｍ／ｚ＝８６３．１８２２で、この精密質量から組成を推定するとＣ４５Ｈ３６Ｏ１８（Ｅｒｒｏｒ＝−０．８６ｐｐｍ）となった。Ｂ−タイプ３量体の分子式はＣ４５Ｈ３８Ｏ１８であり、Ａ−タイプはＣ４５Ｈ３４Ｏ１８であることから、このピークＢはＡ−タイプとＢ−タイプが混在した３量体と推測した。
【０１２４】
また、ピークDはｍ／ｚ＝９８５．２００９であり、ベンジルチオエーテル付加物を除くとＣ４５Ｈ３６Ｏ１８となり、この化合物はＡ−Ｂ−タイプ混在型の３量体ベンジルチオエーテルであることが推測できた。
【０１２５】
ピークＦはｍ／ｚ＝６０５．１４４９を検出し、ＭＳ／ＭＳでｍ／ｚ＝４８１．１１０９を検出したことから、このピークはベンジルチオエーテル付加物と考えられたが、付加物を除くとＣ２５Ｈ２４Ｏ１０となりそれ以上の情報は得られなかったため、表３ではＵｎｋｎｏｗｎと表示している。
【０１２６】
レプリコン産生抑制活性を有するＰＡＣをチオール開裂した結果、その分解物にフラバン−３−オールモノマーとフラバン−３−オールモノマーのベンジルチオエーテル付加物以外に遊離の3量体とＡ−タイプ２量体と３量体ベンジルチオエーテル付加物が検出され、その組成比が比較的多いことから、ｍＤＰの計算方法を改めた。
【０１２７】
すなわち、検出されたフラバン−３−オールの重合度をｎとすると（ベンジルチオエーテル付加物も含めて）ｍＤＰは、以下の式により求める値とした。
式
ｍＤＰ＝［（ベンジルチオエーテル付加物×ｎ）の総和＋（遊離フラバン−３−オール×ｎ）の総和］／［遊離フラバン−３−オールの総和］
【０１２８】
加えて、検出されたフラバン−３−オールとそのベンジルチオエーテル付加物の面積比は、既知のプロシアニジンＢ２標品のチオール開裂反応物から算出し、それぞれ補正を行った。その結果、表３に示すとおり、ブルーベリー葉から精製したＰＡＣのｍＤＰは７．７であった。加えて、その組成は全体的にエピカテキンの比率が高く、ターミナルユニットでは６５．１％、エクステンションユニットでは５８．１％であったが、検出されたＡ−タイプ２量体やＡ−Ｂ−タイプ混在３量体の組成が不明なので、検出されたモノマーのみで全体の組成を見ると、約９５％がエピカテキンで構成されていることが分かった。
【０１２９】
【表３】
2010059096.tif 000009
【０１３０】
［実施例２］
ＰＡＣを含有する素材の抽出及びそのレプリコン産生抑制活性
１．各素材からのＰＡＣの調製
実施例１の結果より、ブルーベリー葉由来のＨＣＶレプリコン産生抑制活性を有する化合物がＰＡＣであることが示された。このＰＡＣは、上述のとおり、広く植物界から見いだされている。ＰＡＣを含有することが報告されている下記に挙げる素材（試料１〜９及び試料N）を入手し、ＰＡＣ画分を調製して、レプリコン産生抑制活性を調べた。
【０１３１】
・試料１：ブルーベリー葉
・試料２：ブルーベリー実
・試料３：サトイモ皮
・試料４：マツ樹皮抽出物（ピクノジェノールＴＭ）
・試料５：ブドウ種子抽出物（グラヴィノールＴＭ：キッコーマン株式会社）
・試料６：リンゴポリフェノール（アップルフェノンＴＭ：アサヒビール株式会社）
・試料７：グランベリー（クランベリーパウダー：キッコーマン株式会社
・試料８：ストロベリー果実（ストロベリーパウダー：ナチュリ・フルーツ）
・試料９：落花生種皮
・試料Ｎ：クロトン樹液（Ｓａｎｇｒｅ  ｄｅ  Ｄｒａｇｏ；  Ｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）
【０１３２】
（ブルーベリー葉（試料１）由来ＰＡＣ画分の調製）
ラビットアイブルーベリー種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ  Ａｉｔｏｎ）の生葉を、凍結乾燥（ＦＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄｕｒａ−Ｔｏｐ  ＭＰ＆Ｄｕｒａ−Ｄｒｙ  ＭＰ）し、超遠心粉砕機（ＭＲＫ＆ＲＥＴＳＣＨ、ＥＭ−１）で粉砕することで、ブルーベリー葉の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末１０ｇに１００ｍｌのヘキサンを加え、室温で３０分間振盪抽出し、デカンテーションにより残渣を回収した。この抽出操作を３回繰り返し、ブルーベリー葉ヘキサン洗浄物を得た。
【０１３３】
さらに、得られたブルーベリー葉ヘキサン洗浄物に、１００ｍｌの酢酸エチルを加え、同様に３０分間振盪抽出し、デカンテーションにて残渣を回収した。これも同様に３回繰り返し、ヘキサン−酢酸エチル洗浄物を得た。
【０１３４】
次に、ヘキサン−酢酸エチル洗浄物に１００ｍｌのメタノールを加え、３０分間振盪抽出し、ろ過にて抽出液を回収し、残渣に再度メタノール１００ｍｌを加え、同様に３回繰り返し抽出液を合わせた。
【０１３５】
抽出液をエバポレーターで減圧濃縮後、凍結乾燥し、ブルーベリー葉メタノール抽出物約３．５gを得た。さらに、この抽出物約５００ｍｇを６０％メタノールに溶解し、６０％メタノールで平衡化したセファデックスＴＭＬＨ−２０（容量１００ｍｌ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）カラムにアプライし、６０％メタノール４００ｍｌで洗浄し、次に１００％メタノール４００ｍｌで洗浄した。その後７０％アセトン４００ｍｌで溶出させ、減圧濃縮後、凍結乾燥し、ブルーベリー葉由来ＰＡＣ画分を約１００ｍｇ得た。同様に以下の試料を調製した。
【０１３６】
（試料２〜９及び試料Ｎ由来のＰＡＣ画分の調製）
試料２、３及び９は、素材を直接入手して、試料４〜９は、ＰＡＣを含有している製品を購入して、１００％メタノールで抽出を行い、減圧濃縮後、凍結乾燥した。その後、上記調製と同じように、セファデックスＬＨ−２０でＰＡＣ画分を調製した。
【０１３７】
２．ＰＡＣ調製物の組成解析
各起源から抽出された上記試料１〜９及びＮについて、上述のポーター法とチオール開裂反応を用いて、ＰＡＣ純度、各フラバン−３−オール組成及び平均重合度を調べた。表４に、各試料のＰＡＣ画分の平均重合度及び組成を示す。
【０１３８】
また、チオール開裂の結果から、プロペラルゴニジン（ＰＤ）、プロシアニジン（ＰＣ）及びプロデルフィニジン（ＰＤ）の組成を算出し、レプリコン産生抑制活性とＰＡＣ含量を表５に示した。表５において、ＰＡＣ含量を表記していない起源のサンプルは、ＰＡＣ画分調製の際、回収量が少なく測定できなかったものである。
【０１３９】
表４〜６に示されるように、各起源のＰＡＣ調製物は、それぞれ特徴を有していた。ブルーベリー由来のＰＡＣ（試料１及び２）は、平均重合度が１２前後で、エピカテキンリッチな組成を有しており、Ａ−タイプの結合を持っていることが明らかになった。サトイモ皮（試料３）は、平均重合度が１０．５で、ほとんどがエピカテキンで構成されており、一部Ａ−タイプの結合を有していた。ピクノジェノール（試料４）は、平均重合度が約６．５で、エクステンションユニットはエピカテキンの組成比が高いが、ターミナルユニットはカテキンが多く存在していた。
【０１４０】
グラヴィノール（試料５）は、平均重合度が比較的長く１４．４で、エピカテキンガレートの組成比が高いのが特徴であった。アップルフェノン（試料６）の平均重合度は、ストロベリー（試料８）と同程度で比較的短い４．４で、エピカテキンの組成比が高かったが、ストロベリーは、エピカテキンリッチであるものの、エピアフゼレチンが約１０％含まれているのが特徴であった。クランベリー（試料７）と落花生種皮（試料９）の平均重合度は、それぞれ６．６と７．４で、それぞれエピカテキン組成比が比較的高いが、両サンプルとも、Ａ−タイプの結合存在比が高いのが特徴であった。最後にクロトン種樹液（試料Ｎ）は、平均重合度が８．３で、エピカテキンリッチな組成を有しているが、他の起源と比較すると、ガロカテキンとエピガロカテキンが検出され、プロデルフィニジン（ＰＤ）組成比に換算すると３７．４％になった。
【０１４１】
また、レプリコン産生抑制活性は、試料１から試料９までは、ＩＣ５０が１．０μｇ／ｍｌ以下で、ＩＣ５０に対するＣＣ５０の比（Ｒａｔｉｏ）は１０以上となっているため、活性があると判断した。しかし、試料Nのクロトン種樹液由来のＰＡＣは、ＩＣ５０が１．０μｇ／ｍｌ以上でＲａｔｉｏが１０以下のため、活性がないと判断された。
【０１４２】
これらの結果から、様々な植物由来のほとんどのＰＡＣにレプリコン産生抑制活性を確認できたが、クロトン種樹液由来のＰＡＣのように、プロデルフィニジン（ＰＤ）組成比の多いものには活性がないということが分かった。
【０１４３】
【表４】
2010059096.tif 000010
【０１４４】
【表５】
2010059096.tif 000011
【０１４５】
【表６】
2010059096.tif 000012
【０１４６】
［実施例３］
ブルーベリー葉由来ＰＡＣの大量調製
ブルーベリー葉凍結乾燥粉末１０５ｇに、クロロフィルを除く目的でアセトン１２００ｍｌを加え、室温で１０分間振盪抽出し、デンカンテーションにより上清を除去した。この操作を5回繰り返し、アセトン洗浄物を得た。その後、上記試料１の調製と同じ方法で、メタノール抽出物を約３０ｇ得た。但し、使用した各溶媒量は１２００ｍｌずつとした。
【０１４７】
その後、上記試料１と同様にセファデックスＬＨ−２０（容量約１８００ｍｌ）で分画を実施した。各画分の溶出量は９０００ｍｌずつ年、１０００ｍｌ毎回収した。ＰＡＣオリゴマーが回収できる１００％メタノール画分は全部で９画分得られ、合計３．３ｇ回収できた。さらに、ポリマー画分（７０％アセトン溶出画分）も計９画分、合計１．３ｇ回収できた。これらの画分について、レプリコン産生抑制活性試験と、チオール開裂による平均重合度の解析と、組成解析を実施した。
【０１４８】
図１２に、ブルーベリー葉由来のＰＡＣ各画分の平均重合度（ｍＤＰ）と、レプリコン産生抑制活性の相関を示した。横軸に平均重合度（ｍＤＰ）、縦軸にレプリコン産生抑制活性（比活性）を取りプロットした。その結果、活性が高い画分は、１００％メタノールの８番目の画分であり、平均重合度が８．７５であった。また、平均重合度が８くらいまでは、重合度の増加につれて比活性が上昇しているが、平均重合度が９を超えると、比活性は低下していく傾向にあった。本実施形態において、平均重合度は５以上が好ましい。
【０１４９】
（考察）
表４〜６から明らかなように、チオール開裂分析で組成分析をした結果、ＰＡＣ中のプロデルフィニジンユニット（Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝ＯＨ）の含量が高いと、試料Ｎのように、ＩＣ５０が１．０μｇ／ｍｌ以上、かつＩＣ５０に対するＣＣ５０の比（Ｒａｔｉｏ）が１０以下となり、抗ＨＣＶ剤としては使用できない。すなわち、本発明のＰＡＣ組成物は、重合度が３以上で、デルフィニジン含量が低いほど、レプリコン産生抑制活性値が高くなり、抗ＨＣＶ剤として有用である。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明のＨＣＶ産生抑制剤は、優れたＨＣＶ産生抑制効果を有するため、インターフェロンに代わるＨＣＶ由来肝疾患の治療剤や、健康補助食品等に適用される。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】ブルーベリー葉由来のＰＡＣのレプリコンアッセイの結果を例示した図である。
【図２】（Ａ）はブルーベリー葉メタノール抽出物のＨＰＬＣ溶出パターンであり、（Ｂ）はそのレプリコン産生抑制活性を示した図である。
【図３】（Ａ）は分取１画分（ＬＣ分取１）の溶出パターンであり、（Ｂ）はそのレプリコン産生抑制活性を示した図である。
【図４】（Ａ）は分取２画分（ＬＣ分取２）の溶出パターンであり、（Ｂ）はそのレプリコン産生抑制活性を示した図である。
【図５】分取３画分（ＬＣ分取３）の溶出パターンとそのレプリコン産生抑制活性を示した図である。
【図６】ブルーベリー葉精製物の電子線マイクロアナライザー（ＥＰＭＡ）解析結果を示した図である。（ｉ）はＲＡＰ、（ｉｉ）はＰＢＳＴ、（ｉｉｉ）はＬＩＦ、（ｉｖ）はＰＥＴのスペクトルをそれぞれ示す。
【図７】精製物のＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦによるＭＳスペクトルである。
【図８】（Ａ）はシアニジン標品のＭＳ／ＭＳスペクトルで、（Ｂ）はブルーベリー葉精製物のポーター法分解物のＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図９】ＰＡＣを酸性条件下、トルエン−α−チオールと反応させるチオール開裂を模式的に示した図である。
【図１０】ブルーベリー葉精製物のチオール開裂反応生成物の逆相クロマトグラムを示した図である。
【図１１】ブルーベリー葉の分画物における平均重合度と比活性との関係を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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