(57)【要約】      （修正有）【課題】糸状菌の組み換え産性菌株の溝築のために、一般的に利用できる方法を提供する。【解決手段】ゲノム内に少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、該ドメインは組み換えＤＮＡ分子の１種以上のコピーを組み込むのに適しており、またこれらＤＮＡドメインの少なくとも２つが組み換えＤＮＡ分子の組み込まれたコピーを含む糸状菌、および該糸状菌の製造方法。また、組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む該ＤＮＡドメインを、遺伝子変換または増幅によって、増殖させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの実質的に相同な、染色体のドメインに組み込まれた、組み換えＤＮＡ分子を有する糸状菌であって、該ＤＮＡドメインが、そのリボソームＤＮＡ反復体ではないことを特徴とする、上記糸状菌。
【請求項２】
組み換えＤＮＡ分子が、該実質的に相同なＤＮＡドメイン各々に組み込まれている、請求項１に記載の糸状菌。
【請求項３】
該ＤＮＡドメインが、アンプリコンである、請求項１または２に記載の糸状菌。
【請求項４】
該ＤＮＡドメインが、その天然状態において、高レベルで発現可能な、内因性遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の糸状菌。
【請求項５】
該内因性遺伝子が、解糖酵素、澱粉分解酵素、セルロース分解酵素および抗生物質生合成酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項４に記載の糸状菌。
【請求項６】
該内因性遺伝子が、グルコアミラーゼ遺伝子、ＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼ遺伝子およびペニシリウム生合成遺伝子からなる群から選択される、請求項５に記載の糸状菌。
【請求項７】
該内因性遺伝子が、該ＤＮＡドメインの各コピーにおいて、不活性化されている、請求項４〜６のいずれか一項に記載の糸状菌。
【請求項８】
該内因性遺伝子が、少なくともその一部を不可逆的に削除することによって、不活性化されている、請求項７に記載の糸状菌。
【請求項９】
該不可逆的削除が、プロモータおよび上流側の活性化配列の少なくとも一部を含む、請求項８に記載の糸状菌。
【請求項１０】
該ＤＮＡドメインの各バージョンが、固有の配列標識によって、該ドメインのその他のバージョンから区別される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の糸状菌。
【請求項１１】
該配列標識が、制限サイトである、請求項１０に記載の糸状菌。
【請求項１２】
該組み換えＤＮＡ分子が、所定の遺伝子を発現するための発現カセットを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の糸状菌。
【請求項１３】
該所定の遺伝子が、分泌性酵素をコードする、請求項１２に記載の糸状菌。
【請求項１４】
該所定の遺伝子が、細胞内酵素をコードする、請求項１２に記載の糸状菌。
【請求項１５】
細胞内酵素用の、１またはそれ以上の発現カセットを含む、１またはそれ以上の組み換えＤＮＡ分子が、該ＤＮＡドメインに組み込まれており、かつ該細胞内酵素が、該糸状菌にとって固有のものではない、代謝経路の一部である、請求項１４に記載の糸状菌。
【請求項１６】
該細胞内酵素が、デアセトキシセフアロスポリンＣシンセターゼ（エキスパンダーゼ）およびデアセチルセフアロスポリンＣシンセターゼ（ヒドロキシラーゼ）を含む群から選択される、請求項１５に記載の糸状菌。
【請求項１７】
該組み換えＤＮＡ分子が、選別性マーカー遺伝子を欠いている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の糸状菌。
【請求項１８】
選別性マーカー遺伝子を欠いている、請求項１７に記載の糸状菌。
【請求項１９】
アスペルギルス、トリコデルマ、ペニシリウム、セファロスポリウム、アクレノニウム、フサリウム、ムコール、リゾファス、ファネロカエト、ニューロスポラ、フミコーラ、クラビセプス、ソルダリア、ウスチラゴ、シゾフィラム、ブラケスレア、モルチエレラ、フィコマイセス、およびトリポクラジウムからなる群から選択される属に属するものである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の糸状菌。
【請求項２０】
アスペルギルスニガー群、アスペルギルスオリザエ、トリコデルマリーゼイおよびペニシリウムクリソゲナムからなる群から選択される、請求項１９に記載の糸状菌。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の糸状菌製造方法であって、
（ａ）糸状菌の１またはそれ以上の染色体内に、組み換えＤＮＡ分子の１またはそれ以上のコピーを組み込むのに適した、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含む糸状菌を、組み換えＤＮＡ分子で形質転換する工程と、ここで該ＤＮＡドメインは、該菌のリボソームのＤＮＡ反復体ではなく、
（ｂ）該ＤＮＡドメインの少なくとも一つに組み込まれた、少なくとも一つの組み換えＤＮＡ分子をもつ形質転換体を選別する工程と、
（ｃ）該工程（ｂ）で得られた形質転換体を増殖させ、かつその子孫から、該ＤＮＡドメインの少なくとも２つが、該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む菌株を選別する工程
を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項２２】
該工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に加えて、
（ｄ）該ＤＮＡドメインの少なくとも２つが、組み込まれたＤＮＡ分子を含む該菌株を増殖させ、かつその子孫から、該ＤＮＡドメインの付随的なコピーが該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む、菌株を選別する工程、
（ｅ）該工程（ｄ）を、該ＤＮＡドメインの各々が、該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む菌株が得られるまで繰り返す工程
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該組み換えＤＮＡ分子が、該ＤＮＡドメインと実質的に相同な配列を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記工程（ａ）における該糸状菌の形質転換のために、二方向性の選別性マーカーを使用し、かつ該工程（ｃ）を実施する前に、該二方向性の選別性マーカーをもたない形質転換体を選別する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
該二方向性の選別性マーカーが、優性マーカーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）請求項１〜２０のいずれか一項に記載の糸状菌を、対象とするタンパクの発現を誘発する条件下で培養する工程、および
（ｂ）該対象とするタンパクを回収する工程
を含むことを特徴とする、対象とするタンパクの製造方法。
【請求項２７】
該対象とするタンパクが、分泌性タンパクである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象とする代謝産物の製造方法であって、
（ａ）該対象とする代謝産物の生産を誘発する条件下で、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の糸状菌を培養する工程、および
（ｂ）該対象とする代謝産物を回収する工程
を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項２９】
該対象とする代謝産物が、二次代謝産物である、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
工業的組み換え生物を溝築するための手段としての遺伝子変換
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、工業的な発酵法において使用する、微生物の遺伝子操作に関するものである。
【０００３】
［発明の背景］
絶えず増え続ける数の製品を、工業的規模の微生物発酵によって製造している。このような製品は、一次および二次代謝を由来とするもの、例えばそれぞれクエン酸および抗生物質から、イーストまたはバイオマス等としての、タンパク質、酵素並びに完全な微生物にさえも及んでいる。伝統的には、対象とする該微生物は、古典的な菌株改良ブログラムに付され、該プログラムは、連続する一連の変異形成およびそれに続く改善された特性を持つ変異体の選別からなっている。
【０００４】
ごく最近、遺伝子操作、即ち組み換えＤＮＡ技術が、工業用の微生物に適用されるようになってきた。この技術は、天然において対象とする微生物によって生産されている、生成物の生産レベルを更に改善するのみならず、全く新しい生成物および／または製法、例えば異種タンパクまたは代謝経路の操作などの開発をも可能としている。
【０００５】
遺伝子操作は、対象とする該生物内への組み換えＤＮＡ分子の導入および通常はまた該生物内での発現を必要とする。この方法は、形質転換と呼ばれる。微生物の安定した形質転換は、該導入された組み替えＤＮＡ分子が、世代から世代に渡り、該細胞内に維持されること、即ち安定した遺伝を必要とする。基本的に、該導入された組み替えＤＮＡ分子を維持する方法は、２つある。第一に、該組み換えＤＮＡは、その宿主細胞のゲノムに組み込まれ、例えばその染色体の一つに組み込まれる。一旦組み込まれた該組み換えＤＮＡは、この染色体の一部となり、またかくしてこの染色体と共に複製されることによって維持されるであろう。第二に、該組み換えＤＮＡは、該細胞に自己複製、即ち該宿主ゲノムとは無関係な複製を可能とする、ＤＮＡ分子の一部として、該細胞内に導入される。このような自己複製ベクターは、しばしば天然に産するプラスミドまたは該組み換えＤＮＡの組込みを許容するように順応したウイルス由来のものである。
【０００６】
工業的な微生物産性生物に関連して、該自己および組込みベクター系各々は、夫々の固有の利点および欠点を有している。該自己複製ベクター系、例えば導入すべきＤＮＡ配列の数および／または長さにおけるポーズ制限（ｐｏｓｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓ）は、一般的にさほど安定ではないと考えられており、しかも通常は該組み換え系と比較して、１遺伝子コピー当たりの低い発現レベルを与える。しかしながら、幾つかの極めて重要な工業的な微生物、特に糸状菌類、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）について最も重要なことは、安定な自己複製性のベクター系が容易に入手されないことである。
【０００７】
該組み換えベクター系を使用した場合の該欠点は、ある程度までは組み換えのために使用した方法に依存する。相同組み替えによる所定のゲノム配列への組み込みは、該組み換えＤＮＡ分子のコピー数と組み合わせることは困難である。該組み換えＤＮＡ分子の多数のコピーのランダムな組込みは、しばしば糸状菌において適用されているように、該形質転換体の予想不可能な遺伝子型を与えるであろう。このことは、該形質転換された産性菌株の有利な諸特性の喪失を招くばかりか、かかる菌株の予想不可能なかつ漠然とした特性は、政府当局者に容易には許容されない。
【０００８】
ＷＯ  ９１／００９２０は、酵母菌株を開示しており、そこでは組み換えＤＮＡ分子の多数のコピーが、リボソームＤＮＡ反復体クラスター中に組み込まれている。この場合には異種遺伝子に対する発現ベクターである、該組み換えＤＮＡ分子は、また欠失選別マーカー遺伝子並びに酵母リボソームＤＮＡ配列両者を含み、その後者は、相同組み替えにより、該ベクターを該リボソームＤＮＡ反復体クラスター中に組み込むことを可能とする。該欠失選別性マーカー遺伝子は、該リボソームＤＮＡ反復体クラスター中に組み込まれた該ベクターの複数のコピーを含む菌株の、選別および安定維持のために必要とされる。更に、ＷＯ  ９１／００９２０は、リボソームＤＮＡ反復体への多数のコピーの組込みが、一般的に糸状菌、例えばアスペルギルス種を包含する、菌類にも適用可能であることを示唆している。しかしながら、ＷＯ  ９１／００９２０に記載されている、該多数のコピーの組込み系は、欠失選別性マーカー遺伝子の使用に依存している。更に、ＷＯ  ９１／００９２０はゲノム環境への組み込みについては記載しておらず、該組み込み自体は、タンパクコード遺伝子の、高レルベルでのＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写を維持するのに適している。
【０００９】
最近、ＥＳ  ２，０９４，０８８は、ペニシリウムクリソゲナムＥ−１およびペニシリウムクリソグナムＡＳ−Ｐ−７８のペニシリン過剰生産菌株において増幅されたＤＮＡ領域を記載した。該増幅ＤＮＡ領域のサイズが、それぞれ７５および１０６ｋｂであり、またこれが該増幅された領域の１６．５ｋｂフラグメント内に、遺伝子ｐｃｂＡＢ、ｐｃｂＣおよびｐｅｎＤＥを含むことを記載されている。この増幅された領域の左側および右側の端部に存在する該ＤＮＡ配列が、ベクターの溝築のために使用でき、該ベクターにマーカー遺伝子を導入して、特にニトロソグアニジンによるランダムな変異形成によって、より高いペニシリン産性をもつ菌株を得て、該微生物のゲノムに一旦組み込まれた場合には、該ベクターのコピー数を増大する目的で、該マーカー遺伝子間に位置する遺伝物質の増幅を促進する。しかしながら、ＥＳ  ２，０９４，０８８は、上で概説した方法が、上首尾で利用できたか否かについては、記載していない。事実、ＥＳ  ２，０９４，０８８に記載された方法は、いくつかの欠点を持つ。例えば、複雑なＤＮＡ構造の増幅は、低頻度でのみ起こる。更に、該突然変異源としてのニトロソグアニジンは、該微生物のゲノム内に、望ましくない一時的な突然変異をもたらす。その上、突然変異源による処理は、該ベクター中に存在する該増幅された領域の配列の欠失を招き、結果としてこれらの間に位置する興味ある遺伝子の欠失を招く。これについては、Ｆｉｅｒｒｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，６２００−６２０４をも参照のこと。また、上記のごとく、該微生物のゲノムへの該ベクターのランダムな組み込みは、該形質転換体の予想外の遺伝子型を与えるであろう。
【００１０】
かくして、本発明に係わる技術的な課題は、糸状菌の組み換え産性菌株の溝築のために一般的に利用できる方法を提供することにあり、該菌株は該微生物ゲノムの、明確な所定のターゲット遺伝子座に組み込まれた、組み換えＤＮＡ分子の多数のコピーを含み、またこの系は、形質転換のための、特定の型の選別マーカーの使用には依存しない。
【００１１】
［図面の簡単な説明］
図面で使用する略号：
［制限酵素および制限サイト］
Ａ＝ＡｐａＩ；Ｂａ＝ＢａｍＨＩ；Ｂ＝ＢｇｌＩＩ；Ｂｓ＝ＢｓｓＨＩＩ；Ｅ＝ＥｃｏＲＩ；Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｋ＝ＫｐｎＩ：Ｎ＝ＮｄｅＩ：Ｎｏ＝ＮｏｔＩ；Ｐｓ＝ＰｓｔＩ；Ｐ＝ＰｖｕＩＩ；Ｓａ＝ＳａｌＩ；Ｓｃ＝ＳｃａＩ；Ｓ＝ＳｍａＩ；Ｓｎ＝ＳｎａＢＩ；Ｓｐｅ＝ＳｐｅＩ；Ｓｐ＝ＳｐｈＩ；Ｓｓ＝ＳｓｔＩＩ；Ｘｂ＝ＸｂａＩ；Ｘ＝ＸｈｏＩ；Ｎｒ＝ＮｒｕＩ；Ｈｐ＝ＨｐａＩ；Ｓｆ＝ＳｆｉＩ；Ｎｓ＝ＮｓｉＩ；Ｂｓｔ＝ＢｓｔＸＩ。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１図は、各々種々の制限サイト（ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩまたはＢｇｌＩＩ）で記された、Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７（１９９７年４月１１日付けで、オランダ国、ＢａａｒｎのＣｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されている）形質転換体（ＩＳＯ−５０５）の、ｇｌａＡ  ＤＮＡアンプリコンにおける、３つのΔｇｌａＡ遺伝子座を模式的に示した図である。各ｇｌａＡ遺伝子座の切り捨ては、２０または６０ｂｐだけ異なっており、かくしてＰＣＲ−に基くＤＮＡ−フラッグテスト（ＤＮＡ−ｆｌａｇ  ｔｅｓｔ）によって、各切り捨てられたｇｌａＡ遺伝子座が可視化される。
【図２】第２図は、親菌株Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７における該ｇｌａＡ遺伝子座（上部）および組み換え菌株Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５における３つの切り捨てられた「Ｘ−で記された」ｇｌａＡ遺伝子座（Ｘは、制限サイトＢａｍＨＩ、ＳａｌＩまたはＢｇｌＩＩを表す）の物理的マップである。
【図３】第３図は、中間ベクターｐＧＢＧＩＡ１６の溝築経路を示す図である。
【図４ａ】第４図は、３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡ配列のＫｐｎＩ＋を破壊し、かつ適当なクローニングのためのボーダーにおいて、クローニングサイトを、該中間ベクターｐＧＢＧＬＡ１８中に生じたｐＧＢＧＬＡ１６に付加するための、融合ＰＣＲを模式的に示す図である。
【図４ｂ】第４図は、３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡ配列のＫｐｎＩ＋を破壊し、かつ適当なクローニングのためのボーダーにおいて、クローニングサイトを、該中間ベクターｐＧＢＧＬＡ１８中に生じたｐＧＢＧＬＡ１６に付加するための、融合ＰＣＲを模式的に示す図である。
【図５ａ】第５図は、該５’−および３’−ｇｌａＡ配列間にＢａｍＨＩ制限サイトを含め、かつ適当なクローニングのためのボーダーにおいて、クローニングサイトを、遺伝子−置換ベクターｐＧＢＤＥＬ５内に生じたｐＧＢＧＬＡ１８内に付加するための、融合ＰＣＲを模式的に示す図である。
【図５ｂ】第５図は、該５’−および３’−ｇｌａＡ配列間にＢａｍＨＩ制限サイトを含め、かつ適当なクローニングのためのボーダーにおいて、クローニングサイトを、遺伝子−置換ベクターｐＧＢＤＥＬ５内に生じたｐＧＢＧＬＡ１８内に付加するための、融合ＰＣＲを模式的に示す図である。
【図６ａ】第６図は、該５’−および３’−ｇｌａＡ配列間にＳａｌＩ制限サイトを含め、かつ適当なクローニングのためのボーダーにおいて、クローニングサイトを、遺伝子−置換ベクターｐＧＢＤＥＬ９内に生じたｐＧＢＧＬＡ１８内に付加するための、融合ＰＣＲを模式的に示す図である。
【図６ｂ】第６図は、該５’−および３’−ｇｌａＡ配列間にＳａｌＩ制限サイトを含め、かつ適当なクローニングのためのボーダーにおいて、クローニングサイトを、遺伝子−置換ベクターｐＧＢＤＥＬ９内に生じたｐＧＢＧＬＡ１８内に付加するための、融合ＰＣＲを模式的に示す図である。
【図７ａ】第７図は、該５’−および３’−ｇｌａＡ配列間にＢｇｌＩＩ制限サイトを含め、かつ適当なクローニングのためのボーダーにおいて、クローニングサイトを、遺伝子−置換ベクターｐＧＢＤＥＬ１１内に生じたｐＧＢＧＬＡ１８内に付加するための、融合ＰＣＲを模式的に示す図である。
【図７ｂ】第７図は、該５’−および３’−ｇｌａＡ配列間にＢｇｌＩＩ制限サイトを含め、かつ適当なクローニングのためのボーダーにおいて、クローニングサイトを、遺伝子−置換ベクターｐＧＢＤＥＬ１１内に生じたｐＧＢＧＬＡ１８内に付加するための、融合ＰＣＲを模式的に示す図である。
【図８ａ】第８図は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブした、該親菌株Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７から単離した染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図である。
【図８ｂ】第８図は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブした、該親菌株Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７から単離した染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図である。
【図９ａ】第９図は、Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７形質転換体から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、ここで該線状化されたｐＧＢＤＥＬ５ベクターは、二重の交差を介して該ｇｌａＡターゲット遺伝子座に組み込まれており、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。個々の形質転換体のゲノムにおいては、宿主の該３’−ｇｌａＡ配列内に位置する元のＫｐｎＩサイトは、該二重交差組み換え事象の結果として、破壊される可能性があるが（Ｋ＊）、必ずしも破壊されていなくてもよい。
【図９ｂ】第９図は、Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７形質転換体から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、ここで該線状化されたｐＧＢＤＥＬ５ベクターは、二重の交差を介して該ｇｌａＡターゲット遺伝子座に組み込まれており、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。個々の形質転換体のゲノムにおいては、宿主の該３’−ｇｌａＡ配列内に位置する元のＫｐｎＩサイトは、該二重交差組み換え事象の結果として、破壊される可能性があるが（Ｋ＊）、必ずしも破壊されていなくてもよい。
【図１０ａ】第１０図は、該ａｍｄＳ選別マーカー遺伝子を含まない形質転換体Ａ．ニガーＧＢＡ−２０１から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、一つの「ＢａｍＨＩ−で記された」ΔｇｌａＡ  ＤＮＡアンプリコンおよび２つの残留する元のｇｌａＡアンプリコンを含み、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。
【図１０ｂ】第１０図は、該ａｍｄＳ選別マーカー遺伝子を含まない形質転換体Ａ．ニガーＧＢＡ−２０１から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、一つの「ＢａｍＨＩ−で記された」ΔｇｌａＡ  ＤＮＡアンプリコンおよび２つの残留する元のｇｌａＡアンプリコンを含み、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。
【図１１ａ】第１１図は、Ａ．ニガーＧＢＡ−２０１形質転換体から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、ここで該線状化されたｐＧＢＤＥＬ９ベクターは、二重の交差を介して組み込まれており、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。  個々の形質転換体のゲノムにおいては、宿主の該３’−ｇｌａＡ配列内に位置する元のＫｐｎＩサイトは、該二重交差組み換え事象の結果として、破壊される可能性があるが（Ｋ＊）、必ずしも破壊されていなくてもよい。
【図１１ｂ】第１１図は、Ａ．ニガーＧＢＡ−２０１形質転換体から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、ここで該線状化されたｐＧＢＤＥＬ９ベクターは、二重の交差を介して組み込まれており、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。  個々の形質転換体のゲノムにおいては、宿主の該３’−ｇｌａＡ配列内に位置する元のＫｐｎＩサイトは、該二重交差組み換え事象の結果として、破壊される可能性があるが（Ｋ＊）、必ずしも破壊されていなくてもよい。
【図１２ａ】第１２図は、該ａｍｄＳ選別マーカー遺伝子を含まない形質転換体Ａ．ニガーＧＢＡ−２０２から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、二っの「ＢａｍＨＩ−およびＳａｌＩ−で記された」ΔｇｌａＡ  ＤＮＡアンプリコンおよび一つの残留する元のｇｌａＡアンプリコンを含み、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。
【図１２ｂ】第１２図は、該ａｍｄＳ選別マーカー遺伝子を含まない形質転換体Ａ．ニガーＧＢＡ−２０２から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、二っの「ＢａｍＨＩ−およびＳａｌＩ−で記された」ΔｇｌａＡ  ＤＮＡアンプリコンおよび一つの残留する元のｇｌａＡアンプリコンを含み、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。
【図１３ａ】第１３図は、Ａ．ニガーＧＢＡ−２０２形質転換体から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、ここで該線状化されたｐＧＢＤＥＬ１１ベクターは、二重の交差を介して組み込まれており、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。個々の形質転換体のゲノムにおいては、宿主の該３’−ｇｌａＡ配列内に位置する元のＫｐｎＩサイトは、該二重交差組み換え事象の結果として、破壊される可能性があるが（Ｋ＊）、必ずしも破壊されていなくともよい。
【図１３ｂ】第１３図は、Ａ．ニガーＧＢＡ−２０２形質転換体から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、ここで該線状化されたｐＧＢＤＥＬ１１ベクターは、二重の交差を介して組み込まれており、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。個々の形質転換体のゲノムにおいては、宿主の該３’−ｇｌａＡ配列内に位置する元のＫｐｎＩサイトは、該二重交差組み換え事象の結果として、破壊される可能性があるが（Ｋ＊）、必ずしも破壊されていなくともよい。
【図１４ａ】第１４図は、該ａｍｄＳ選別マーカー遺伝子を含まない形質転換体Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、三つの「ＢａｍＨＩ−、ＳａｌＩ−およびＢｇｌＩＩ−で記された」ΔｇｌａＡ  ＤＮＡアンプリコンを含み、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。
【図１４ｂ】第１４図は、該ａｍｄＳ選別マーカー遺伝子を含まない形質転換体Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５から単離した、染色体ＤＮＡを、ＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩにより消化した後に観測される、ハイブリダイゼーションパターンを模式的に示す図であり、三つの「ＢａｍＨＩ−、ＳａｌＩ−およびＢｇｌＩＩ−で記された」ΔｇｌａＡ  ＤＮＡアンプリコンを含み、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ａ）またはＳａｌＩ／ＳａｌＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメント（ｂ）でプローブされている。
【図１５】第１５図は、アセタミド選別マーカーおよびｇｌａＡターゲットベクターｐＧＢＡＡＳ−１の物理的地図である。
【図１６】第１６図は、フィターゼ発現およびｇｌａＡターゲットベクターｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１の物理的地図である。
【図１７】第１７図は、ｐｈｙＡ発現カセット（ａ）またはａｍｄＳカセット（ｂ）が、形質転換体Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５中の３’３”−ｇｌａＡターゲット遺伝子座の一つに隣接して標的とされるか否かを決定するための、ターゲットＰＣＲテストを模式的に示す図である。これらカセットの一方を標的とすることは、何れの場合にも、４．２ｋｂなるサイズのＤＮＡフラグメントの増幅をもたらす。
【図１８】第１８図は、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５中の３つのΔｇｌａＡドメインを模式的に示す図である。そのハイブリダイゼーションパターンは、２．２ｋｂＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントによってプローブされた、ＢｇｌＩＩ消化物を示す。
【図１９】第１９図は、ｐＧＢＡＡＳ−１／ｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１  Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５形質転換体における、ΔｇｌａＡドメイン（夫々Ｂ＊、Ｓａ＊およびＢａ＊で記されている）の模式的な表示である。ここで、多数のａｍｄＳカセットは、該Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５宿主の３つのΔｇｌａＡドメインの一つをターゲットとする。そのハイブリダイゼーションパターンは、２．２ｋｂのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  ３”−ｇｌａＡＤＮＡフラグメントでプローブされた、ＢｇｌＩＩ消化物を示すものである。該７．５ｋｂのｇｌＩＩブリッド化フラグメントの存在並びにその強度は、組み込まれたａｍｄＳカセットの数（ｎ）に依存することが分かる。
【図２０】第２０図は、ｐＧＢＡＡＳ−１／ｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１  Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５形質転換体における、３つのΔｇｌａＡドメイン（夫々Ｂ＊、Ｓａ＊およびＢａ＊で記されている）の模式的な表示である。ここで、多数のｐｈｙＡは、該Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５宿主の３つのΔｇｌａＡドメインの一つの、３’−３”−ｇｌａＡターゲット配列に隣接して組み込まれ、その下流側には更に１または複数のａｍｄＳカセットをもつ。そのハイブリダイゼーションパターンは、２．２ｋｂのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  ３”−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントでプローブされた、ＢｇｌＩＩ消化物を示すものである。該７．５ｋｂのＢｇｌＩＩハイブリッド化フラグメントの強度は、組み込まれたｐｈｙＡおよびａｍｄＳカセットの数（ｎ）に依存することが分かる。
【図２１】第２１図は、ｐＧＢＡＡＳ−１／ｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１  Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５形質転換体における、３つのΔｇｌａＡドメイン（夫々Ｂ＊、Ｓａ＊およびＢａ＊で記されている）の模式的な表示である。ここで、多数のａｍｄＳカセットは、該Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５宿主の３つのΔｇｌａＡドメインの一つの、３’−３”−ｇｌａＡターゲット配列に隣接して組み込まれ、その下流側には更に１または複数のａｍｄＳカセットをもつ。そのハイブリダイゼーションパターンは、２．２ｋｂのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  ３”−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントでプローブされた、ＢｇｌＩＩ消化物を示すものである。該７．５ｋｂのＢｇｌＩＩハイブリッド化フラグメントの強度は、組み込まれたｐｈｙＡおよびａｍｄＳカセットの数（ｎ）に依存することが分かる。
【図２２】第２２図は、ｐＧＢＡＡＳ−１／ｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１  Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５形質転換体における、３つのΔｇｌａＡドメイン（夫々Ｂ＊、Ｓａ＊およびＢａ＊で記されている）の模式的な表示である。ここで、多数のｐｈｙＡカセットは、該Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５宿主の３つのΔｇｌａＡドメインの一つの、３’−３”−ｇｌａＡターゲット配列に隣接して組み込まれ、その下流側には更に１または複数のｐｈｙＡおよびａｍｄＳカセットをもつ。そのハイブリダイゼーションパターンは、２．２ｋｂのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  ３”−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントでプローブされた、ＢｇｌＩＩ消化物を示すものである。該７．５ｋｂのＢｇｌＩＩハイブリッド化フラグメントの強度は、組み込まれたｐｈｙＡおよびａｍｄＳカセットの数（ｎ）に依存することが分かる。
【図２３】第２３図は、ｐＧＢＡＡＳ−１／ｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１  Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５形質転換体における、３つのΔｇｌａＡドメイン（夫々Ｂ＊、Ｓａ＊およびＢａ＊で記されている）を模式的に示す図である。ここで、多数のａｍｄＳカセットは、該Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５宿主の３つのΔｇｌａＡドメインの一つの、３’−３”−ｇｌａＡターゲット配列に隣接して組み込まれ、その下流側には更に１または複数のａｍｄＳおよびｐｈｙＡカセットをもつ。そのハイブリダイゼーションパターンは、２．２ｋｂのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  ３”−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントでプローブされた、ＢｇｌＩＩ消化物を示すものである。
【図２４ａ】第２４図は、「ＢａｍＨＩで記された」ΔｇｌａＡ遺伝子座をターゲットとした、一つのｐｈｙＡコピー（ａ）、２つのｐｈｙＡコピー（ｂ）および３つのｐｈｙＡ遺伝子コピー（ｃ）を含み、ａｍｄＳ遺伝子を含まない、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５形質転換体の物理的地図を示す。模式的なハイブリダイゼーションパターンは、３”−ｇｌａＡプローブでプローブされた、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ消化物を示す。
【図２４ｂ】第２４図は、「ＢａｍＨＩで記された」ΔｇｌａＡ遺伝子座をターゲットとした、一つのｐｈｙＡコピー（ａ）、２つのｐｈｙＡコピー（ｂ）および３つのｐｈｙＡ遺伝子コピー（ｃ）を含み、ａｍｄＳ遺伝子を含まない、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５形質転換体の物理的地図を示す。模式的なハイブリダイゼーションパターンは、３”−ｇｌａＡプローブでプローブされた、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ消化物を示す。
【図２４ｃ】第２４図は、「ＢａｍＨＩで記された」ΔｇｌａＡ遺伝子座をターゲットとした、一つのｐｈｙＡコピー（ａ）、２つのｐｈｙＡコピー（ｂ）および３つのｐｈｙＡ遺伝子コピー（ｃ）を含み、ａｍｄＳ遺伝子を含まない、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５形質転換体の物理的地図を示す。模式的なハイブリダイゼーションパターンは、３”−ｇｌａＡプローブでプローブされた、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ消化物を示す。
【図２５】第２５図は、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５−２形質転換体における、該３つのｇｌａＡドメインを模式的に示す図であり、ここで２つのｐｈｙＡカセットは、「ＢａｍＨＩで記された」ΔｇｌａＡアンプリコンにおいて攻撃されており、本図には該「ＤＮＡ−フラッグ」遺伝子型ＢａｍＨＩ＋／ＳａｌＩ＋／ＢｇｌＩ＋（Ａ）、ＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ−／ＢｇｌＩＩ＋（Ｂ）およびＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ＋／ＢｇｌＩＩ−（Ｃ）が示されている。そのハイブリダイゼーションパターンは、２．２ｋｂのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  ３”−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントでプローブされた、ＢａｍＨＩ消化物を示すものである。両ＢａｍＨＩハイブリッド化フラグメントの強度は、異なるアンプリコンの存在およびその数に依存することが分かる。
【図２６】第２６図は、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５−２形質転換体における、該３つのｇｌａＡドメインを模式的に示す図であり、ここで２つのｐｈｙＡカセットは、「ＢａｍＨＩで記された」ΔｇｌａＡアンプリコンにおいて攻撃されており、本図には該「ＤＮＡ−フラッグ」遺伝子型ＢａｍＨＩ＋／ＳａｌＩ＋／ＢｇｌＩＩ＋（Ａ）、ＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ−／ＢｇｌＩＩ＋（Ｂ）およびＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ＋／ＢｇｌＩＩ−（Ｃ）が示されている。そのハイブリダイゼーションパターンは、１．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントでプローブされた、ＢｇｌＩＩ消化物を示すものである。ＢｇｌＩＩハイブリッド化フラグメントの強度は、異なるアンプリコンの存在およびその数に依存することが分かる。
【図２７】第２７図は、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５−２形質転換体における、該ｇｌａＡドメインを模式的に示す図であり、ここで２つのｐｈｙＡカセットは、「ＢａｍＨＩで記された」ΔｇｌａＡアンプリコンにおいて攻撃されており、本図には該「ＤＮＡ−フラッグ」遺伝子型ＢａｍＨＩ３＋／ＳａｌＩ−／ＢｇｌＩＩ−（Ａ）、ＢａｍＨＩ３＋／ＳａｌＩ＋／ＢｇｌＩＩ−（Ｂ）およびＢａｍＨＩ４＋／ＳａｌＩ−／ＢｇｌＩＩ−（Ｃ）が示されている。そのハイブリダイゼーションパターンは、１．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントでプローブされた、ＢａｍＨＩ消化物を示すものである。両ＢａｍＨＩハイブリッド化フラグメントの強度は、異なるアンプリコンの存在およびその数に依存することが分かる。
【図２８】第２８図は、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５−２形質転換体における、該ｇｌａＡドメインを模式的に示す図であり、ここで２つのｐｈｙＡカセットは、「ＢａｍＨＩで記された」ΔｇｌａＡアンプリコンにおいて攻撃されており、本図には該「ＤＮＡ−フラッグ」遺伝子型ＢａｍＨＩ３＋／ＳａｌＩ−／ＢｇｌＩＩ−（Ａ）、ＢａｍＨＩ３＋／ＳａｌＩ＋／ＢｇｌＩＩ（Ｂ）およびＢａｍＨＩ４＋／ＳａｌＩ−／ＢｇｌＩＩ−（Ｃ）が示されている。そのハイブリダイゼーションパターンは、２．２ｋｂのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  ３”−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントでプローブされた、ＢｇｌＩＩ消化物を示すものである。両ＢａｍＨＩハイブリッド化フラグメントの強度は、異なるアンプリコンの存在およびその数に依存することが分かる。
【図２９】第２９図は、Ｐ．クリソゲナムにおけるＰＥＮアンプリコンを示す。単一のアンプリコン内の該ペニシリン生合成遺伝子、ＨＥＬＥおよびＨＥＬＦの相対的な位置（括弧内）。複数のＰＥＮアンプリコンが、直列反復体（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅａｐｅａｔｓ）（ｎ）として存在する。ＨＥＬＦの３’末端は、隣接するＰＥＮアンプリコンに伸びていることに注意すべきである。
【図３０】第３０図は、サザン分析によるＰＥＮアンプリコンの定量を示す。ＢｓｔＸＩサイト、プローブおよび予想されるハイブリダイゼーションフラグメントの、該ｎｉａＤ遺伝子座（Ａ）およびＰＥＮアンプリコン（Ｂ）からの相対的な位置。該ＨＥＬＥプローブとのＤＮＡハイブリダイゼーションの量は、ＰＥＮアンプリコンの数（ｎ）に依存する。
【図３１】第３１図は、ＣＨＥＦによる、ＰＥＮアンプリコンの量。ＮｏｔＩサイトおよびＨＥＬＥプローブの相対的な位置が示されている。該ＮｏｔＩサイトは、該ＰＥＮアンプリコンの外側に位置する。ハイブリッド化フラグメントの予想されるサイズは、ＰＥＮアンブリコン（３０＋ｎ×５７）ｋｂの数に依存する。
【図３２】第３２図は、標的組み込みを示す。（Ａ）発現ベクターは、対象となる該遺伝子を含み、適当なプロモータ（Ｐ）およびターミネータ（Ｔ）によって調節される。該カセットは、該ターゲットサイトと相同な５”および３”領域（”および’は、夫々ゲノム配列からベクター配列を識別するためのものである）によってフランキング状態にある。カセットおよびフランキング部は、該発現ベクターの増殖のために、Ｅ．コリベクター内でクローニングされる。形質転換に先立って、該発現ベクターを、制限酵素Ｒで消化して、線状フラグメントを生成し、かつ該Ｅ．コリ配列を除去する。（Ｂ）組み込みは、組み換えのためのホットスポットとしての、該形質転換フラグメントの５’および３’末端を持つ、該ゲノムの領域において起こる。（Ｃ）得られる形質転換体は、該ターゲットサイトにおいて組み込まれた、該形質転換フラグメントの１または複数のコピー（ｎ）（括弧内）を含む。
【図３３】第３３図は、発現ベクターｐＨＥＬＥ−Ａ１を示す。ＨＥＬＥの５’および３’領域によってフランキング状態にある、該ａｍｄＳ発現カセットを含む、該形質転換フラグメントは、ＳｆｉＩフラグメントとして単離された。これらサイトは、対応するフランキング部をＰＣＲ処理するために使用した該オリゴを介して導入された。
【図３４】第３４図は、発現ベクターｐＨＥＬＦ−Ａ１を示す。ＨＥＬＦの５’および３’領域によってフランキング状態にある、該ａｍｄＳ発現カセットを含む、該形質転換フラグメントは、ＳｆｉＩフラグメントとして単離された。これらサイトは、対応するフランキング部をＰＣＲ処理するために使用した該オリゴを介して導入された。
【図３５】第３５図は、発現ベクターｐＨＥＬＥ−Ｅ１を示す。ＨＥＬＥの５’および３’領域によってフランキング状態にある、該ＣｅｆＥ発現カセットを含む、該形質転換フラグメントは、ＳｆｉＩフラグメントとして単離された。
【図３６】第３６図は、発現ベクターｐＨＥＬＦ−Ｆ１を示す。ＨＥＬＥの５’および３’領域によってフランキング状態にある、該ＣｅｆＦ発現カセットを含む、該形質転換フラグメントは、ＳｆｉＩフラグメントとして単離された。
【図３７】第３７図は、組み換えによるａｍｄＳの喪失を示す。（Ａ）該５’および３’フランキング部の直列反復体は、発現カセットのタンデム組込みによって生ずる。（Ｂ）該５’および３’フランキング対および組み換えは、単一の交差によって起こる。（Ｃ）交差サイト間の該領域は、失われる。（対象とする遺伝子を包含する）任意の数のカセットが失われる可能性があることに注意すべきであり、これはその全てが、直列反復体によって、フランキング状態にあるからである。
【図３８】第３８図は、ＨＥＬＥ内へのＣｅｆＥの組込みを示す。ＨＥＬＥ内の（Ａ）単一または（Ｂ）複数のＣｅｆＥカセットの物理的地図。ＮｒｕＩサイト、ＣｅｆＥプローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されるサイズの相対的な位置が示されている。該６．０ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって生じ、またその強度は、存在するカセットの数（ｎ）に依存する。
【図３９】第３９図は、ＴＡＦＥによって決定された、ＨＥＬＥ中へのＣｅｆＥの組込みを示す。ＨｐａＩサイト、プローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されるサイズの相対的な位置が示されている。該ハイブリッド化フラグメントのサイズは、組み込まれたカセット（５．９＋ｎ×６．０）ｋｂの数（ｎ）に依存する。
【図４０ａ】第４０図は、カセットおよびターゲットＰＣＲを示す。特定の鋳型とオリゴとの組み合わせを、模式的に示す。ターゲットＰＣＲにとって必須のことは、一個のオリゴが、該５’フランキングの上流に位置することである。従って、いくつかのカセットが存在し得るが、このオリゴの該カセット３’のみがＰＣＲ生成物を生成する。関連するドメイン、オリゴおよびＰＣＲ生成物の予想されるサイズが、示されている。（Ａ）ｃｅｆＥのカセットＰＣＲ、（Ｂ）ＨＥＬＥ中のＣｅｆＥのターゲットＰＣＲＮ（Ｃ）ＨＥＬＥ中のａｍｄＳのターゲットＰＣＲ、（Ｄ）ａｍｄＳのカセットＰＣＲ、（Ｅ）ｃｅｆＦ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｆ）ａｍｄＳ−ｃｅｆＥの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｇ）ａｍｄＳ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｈ）ｎｉａＤ遺伝子座のカセットＰＣＲ、（Ｉ）ｃｅｆＦのカセットＰＣＲ、（Ｊ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたｃｅｆＦのターゲットＰＣＲ、（Ｋ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたａｍｄＳのターゲットＰＣＲ。
【図４０ｂ】第４０図は、カセットおよびターゲットＰＣＲを示す。特定の鋳型とオリゴとの組み合わせを、模式的に示す。ターゲットＰＣＲにとって必須のことは、一個のオリゴが、該５’フランキングの上流に位置することである。従って、いくつかのカセットが存在し得るが、このオリゴの該カセット３’のみがＰＣＲ生成物を生成する。関連するドメイン、オリゴおよびＰＣＲ生成物の予想されるサイズが、示されている。（Ａ）ｃｅｆＥのカセットＰＣＲ、（Ｂ）ＨＥＬＥ中のＣｅｆＥのターゲットＰＣＲＮ（Ｃ）ＨＥＬＥ中のａｍｄＳのターゲットＰＣＲ、（Ｄ）ａｍｄＳのカセットＰＣＲ、（Ｅ）ｃｅｆＦ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｆ）ａｍｄＳ−ｃｅｆＥの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｇ）ａｍｄＳ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｈ）ｎｉａＤ遺伝子座のカセットＰＣＲ、（Ｉ）ｃｅｆＦのカセットＰＣＲ、（Ｊ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたｃｅｆＦのターゲットＰＣＲ、（Ｋ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたａｍｄＳのターゲットＰＣＲ。
【図４０ｃ】第４０図は、カセットおよびターゲットＰＣＲを示す。特定の鋳型とオリゴとの組み合わせを、模式的に示す。ターゲットＰＣＲにとって必須のことは、一個のオリゴが、該５’フランキングの上流に位置することである。従って、いくつかのカセットが存在し得るが、このオリゴの該カセット３’のみがＰＣＲ生成物を生成する。関連するドメイン、オリゴおよびＰＣＲ生成物の予想されるサイズが、示されている。（Ａ）ｃｅｆＥのカセットＰＣＲ、（Ｂ）ＨＥＬＥ中のＣｅｆＥのターゲットＰＣＲＮ（Ｃ）ＨＥＬＥ中のａｍｄＳのターゲットＰＣＲ、（Ｄ）ａｍｄＳのカセットＰＣＲ、（Ｅ）ｃｅｆＦ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｆ）ａｍｄＳ−ｃｅｆＥの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｇ）ａｍｄＳ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｈ）ｎｉａＤ遺伝子座のカセットＰＣＲ、（Ｉ）ｃｅｆＦのカセットＰＣＲ、（Ｊ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたｃｅｆＦのターゲットＰＣＲ、（Ｋ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたａｍｄＳのターゲットＰＣＲ。
【図４０ｄ】第４０図は、カセットおよびターゲットＰＣＲを示す。特定の鋳型とオリゴとの組み合わせを、模式的に示す。ターゲットＰＣＲにとって必須のことは、一個のオリゴが、該５’フランキングの上流に位置することである。従って、いくつかのカセットが存在し得るが、このオリゴの該カセット３’のみがＰＣＲ生成物を生成する。関連するドメイン、オリゴおよびＰＣＲ生成物の予想されるサイズが、示されている。（Ａ）ｃｅｆＥのカセットＰＣＲ、（Ｂ）ＨＥＬＥ中のＣｅｆＥのターゲットＰＣＲＮ（Ｃ）ＨＥＬＥ中のａｍｄＳのターゲットＰＣＲ、（Ｄ）ａｍｄＳのカセットＰＣＲ、（Ｅ）ｃｅｆＦ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｆ）ａｍｄＳ−ｃｅｆＥの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｇ）ａｍｄＳ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｈ）ｎｉａＤ遺伝子座のカセットＰＣＲ、（Ｉ）ｃｅｆＦのカセットＰＣＲ、（Ｊ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたｃｅｆＦのターゲットＰＣＲ、（Ｋ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたａｍｄＳのターゲットＰＣＲ。
【図４０ｅ】第４０図は、カセットおよびターゲットＰＣＲを示す。特定の鋳型とオリゴとの組み合わせを、模式的に示す。ターゲットＰＣＲにとって必須のことは、一個のオリゴが、該５’フランキングの上流に位置することである。従って、いくつかのカセットが存在し得るが、このオリゴの該カセット３’のみがＰＣＲ生成物を生成する。関連するドメイン、オリゴおよびＰＣＲ生成物の予想されるサイズが、示されている。（Ａ）ｃｅｆＥのカセットＰＣＲ、（Ｂ）ＨＥＬＥ中のＣｅｆＥのターゲットＰＣＲＮ（Ｃ）ＨＥＬＥ中のａｍｄＳのターゲットＰＣＲ、（Ｄ）ａｍｄＳのカセットＰＣＲ、（Ｅ）ｃｅｆＦ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｆ）ａｍｄＳ−ｃｅｆＥの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｇ）ａｍｄＳ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｈ）ｎｉａＤ遺伝子座のカセットＰＣＲ、（Ｉ）ｃｅｆＦのカセットＰＣＲ、（Ｊ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたｃｅｆＦのターゲットＰＣＲ、（Ｋ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたａｍｄＳのターゲットＰＣＲ。
【図４０ｆ】第４０図は、カセットおよびターゲットＰＣＲを示す。特定の鋳型とオリゴとの組み合わせを、模式的に示す。ターゲットＰＣＲにとって必須のことは、一個のオリゴが、該５’フランキングの上流に位置することである。従って、いくつかのカセットが存在し得るが、このオリゴの該カセット３’のみがＰＣＲ生成物を生成する。関連するドメイン、オリゴおよびＰＣＲ生成物の予想されるサイズが、示されている。（Ａ）ｃｅｆＥのカセットＰＣＲ、（Ｂ）ＨＥＬＥ中のＣｅｆＥのターゲットＰＣＲＮ（Ｃ）ＨＥＬＥ中のａｍｄＳのターゲットＰＣＲ、（Ｄ）ａｍｄＳのカセットＰＣＲ、（Ｅ）ｃｅｆＦ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｆ）ａｍｄＳ−ｃｅｆＥの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｇ）ａｍｄＳ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｈ）ｎｉａＤ遺伝子座のカセットＰＣＲ、（Ｉ）ｃｅｆＦのカセットＰＣＲ、（Ｊ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたｃｅｆＦのターゲットＰＣＲ、（Ｋ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたａｍｄＳのターゲットＰＣＲ。
【図４０ｇ】第４０図は、カセットおよびターゲットＰＣＲを示す。特定の鋳型とオリゴとの組み合わせを、模式的に示す。ターゲットＰＣＲにとって必須のことは、一個のオリゴが、該５’フランキングの上流に位置することである。従って、いくつかのカセットが存在し得るが、このオリゴの該カセット３’のみがＰＣＲ生成物を生成する。関連するドメイン、オリゴおよびＰＣＲ生成物の予想されるサイズが、示されている。（Ａ）ｃｅｆＥのカセットＰＣＲ、（Ｂ）ＨＥＬＥ中のＣｅｆＥのターゲットＰＣＲＮ（Ｃ）ＨＥＬＥ中のａｍｄＳのターゲットＰＣＲ、（Ｄ）ａｍｄＳのカセットＰＣＲ、（Ｅ）ｃｅｆＦ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｆ）ａｍｄＳ−ｃｅｆＥの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｇ）ａｍｄＳ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｈ）ｎｉａＤ遺伝子座のカセットＰＣＲ、（Ｉ）ｃｅｆＦのカセットＰＣＲ、（Ｊ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたｃｅｆＦのターゲットＰＣＲ、（Ｋ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたａｍｄＳのターゲットＰＣＲ。
【図４０ｈ】第４０図は、カセットおよびターゲットＰＣＲを示す。特定の鋳型とオリゴとの組み合わせを、模式的に示す。ターゲットＰＣＲにとって必須のことは、一個のオリゴが、該５’フランキングの上流に位置することである。従って、いくつかのカセットが存在し得るが、このオリゴの該カセット３’のみがＰＣＲ生成物を生成する。関連するドメイン、オリゴおよびＰＣＲ生成物の予想されるサイズが、示されている。（Ａ）ｃｅｆＥのカセットＰＣＲ、（Ｂ）ＨＥＬＥ中のＣｅｆＥのターゲットＰＣＲＮ（Ｃ）ＨＥＬＥ中のａｍｄＳのターゲットＰＣＲ、（Ｄ）ａｍｄＳのカセットＰＣＲ、（Ｅ）ｃｅｆＦ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｆ）ａｍｄＳ−ｃｅｆＥの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｇ）ａｍｄＳ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｈ）ｎｉａＤ遺伝子座のカセットＰＣＲ、（Ｉ）ｃｅｆＦのカセットＰＣＲ、（Ｊ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたｃｅｆＦのターゲットＰＣＲ、（Ｋ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたａｍｄＳのターゲットＰＣＲ。
【図４０ｉ】第４０図は、カセットおよびターゲットＰＣＲを示す。特定の鋳型とオリゴとの組み合わせを、模式的に示す。ターゲットＰＣＲにとって必須のことは、一個のオリゴが、該５’フランキングの上流に位置することである。従って、いくつかのカセットが存在し得るが、このオリゴの該カセット３’のみがＰＣＲ生成物を生成する。関連するドメイン、オリゴおよびＰＣＲ生成物の予想されるサイズが、示されている。（Ａ）ｃｅｆＥのカセットＰＣＲ、（Ｂ）ＨＥＬＥ中のＣｅｆＥのターゲットＰＣＲＮ（Ｃ）ＨＥＬＥ中のａｍｄＳのターゲットＰＣＲ、（Ｄ）ａｍｄＳのカセットＰＣＲ、（Ｅ）ｃｅｆＦ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｆ）ａｍｄＳ−ｃｅｆＥの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｇ）ａｍｄＳ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｈ）ｎｉａＤ遺伝子座のカセットＰＣＲ、（Ｉ）ｃｅｆＦのカセットＰＣＲ、（Ｊ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたｃｅｆＦのターゲットＰＣＲ、（Ｋ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたａｍｄＳのターゲットＰＣＲ。
【図４０ｊ】第４０図は、カセットおよびターゲットＰＣＲを示す。特定の鋳型とオリゴとの組み合わせを、模式的に示す。ターゲットＰＣＲにとって必須のことは、一個のオリゴが、該５’フランキングの上流に位置することである。従って、いくつかのカセットが存在し得るが、このオリゴの該カセット３’のみがＰＣＲ生成物を生成する。関連するドメイン、オリゴおよびＰＣＲ生成物の予想されるサイズが、示されている。（Ａ）ｃｅｆＥのカセットＰＣＲ、（Ｂ）ＨＥＬＥ中のＣｅｆＥのターゲットＰＣＲＮ（Ｃ）ＨＥＬＥ中のａｍｄＳのターゲットＰＣＲ、（Ｄ）ａｍｄＳのカセットＰＣＲ、（Ｅ）ｃｅｆＦ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｆ）ａｍｄＳ−ｃｅｆＥの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｇ）ａｍｄＳ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｈ）ｎｉａＤ遺伝子座のカセットＰＣＲ、（Ｉ）ｃｅｆＦのカセットＰＣＲ、（Ｊ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたｃｅｆＦのターゲットＰＣＲ、（Ｋ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたａｍｄＳのターゲットＰＣＲ。
【図４０ｋ】第４０図は、カセットおよびターゲットＰＣＲを示す。特定の鋳型とオリゴとの組み合わせを、模式的に示す。ターゲットＰＣＲにとって必須のことは、一個のオリゴが、該５’フランキングの上流に位置することである。従って、いくつかのカセットが存在し得るが、このオリゴの該カセット３’のみがＰＣＲ生成物を生成する。関連するドメイン、オリゴおよびＰＣＲ生成物の予想されるサイズが、示されている。（Ａ）ｃｅｆＥのカセットＰＣＲ、（Ｂ）ＨＥＬＥ中のＣｅｆＥのターゲットＰＣＲＮ（Ｃ）ＨＥＬＥ中のａｍｄＳのターゲットＰＣＲ、（Ｄ）ａｍｄＳのカセットＰＣＲ、（Ｅ）ｃｅｆＦ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｆ）ａｍｄＳ−ｃｅｆＥの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｇ）ａｍｄＳ−ａｍｄＳの組み合わせのターゲットＰＣＲ、（Ｈ）ｎｉａＤ遺伝子座のカセットＰＣＲ、（Ｉ）ｃｅｆＦのカセットＰＣＲ、（Ｊ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたｃｅｆＦのターゲットＰＣＲ、（Ｋ）ＨＥＬＦ中に組み込まれたａｍｄＳのターゲットＰＣＲ。
【図４１】第４１図は、ＨＥＬＥへのａｍｄＳの組み込みを示す。ＨｐａＩサイト、ａｍｄＳプローブおよび該ハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置が示されている。
【図４２】第４２図は、プローブを示す。プローブを調製するために単離されたＤＮＡフラグメント：（Ａ）ｃｅｆＥプローブ：ｐＨＥＬ−Ｅ１のＮｄｅＩ−ＮｓｉＩフラグメント、（Ｂ）ｃｅｆＦプローブ：ｐＨＥＬ−Ｆ１のＮｄｅＩ−ＮｓｉＩフラグメント、（Ｃ）ａｍｄＳプローブ：ｐＨＥＬＥ−Ａ１のＮｏｔＩフラグメント、（Ｄ）ＨＥＬＥプローブ：ｐＨＥＬＥ−Ａ１のＳｐｈＩ−ＮｏｔＩフラグメント、（Ｅ）ｎｉａＤプローブ：鋳型としてＰ．クリソゲナム染色体ＤＮＡをもつ、オリゴ２８および２９のＰＣＲ生成物。
【図４３】第４３図は、遺伝子変換を示す。ａｍｄＳを、他のＰＥＮアンプリコン（括弧内）中のｃｅｆＥで置換することによる、遺伝子変換および得られるｃｅｆＥの複製。
【図４４】第４４図は、一アンプリコンにおける（ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）の組込みを示す。同一のアンプリコン中の、ＨＥＬＥにおけるｃｅｆＥとＨＥＬＦにおけるｃｅｆＦとの組込みに対して特異的な、ＮｏｔＩサイト、ＨＥＬＥプローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置を示す。ＮｏｔＩサイトは、ｃｅｆＦおよびｃｅｆＥカセットの組込みを通して組み込まれることに注意。
【図４５ａ】第４５図は、ＨＥＬＦへのｃｅｆＦの組込みを示す。ＨＥＬＦにおける（Ａ）単一のまたは（Ｂ）複数のｃｅｆＦカセットの物理的地図。ＮｒｕＩサイト、ｃｅｆＦプローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置を示す。５．７ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって起こり、その強度は存在するカセットの数（ｎ）に依存する。
【図４５ｂ】第４５図は、ＨＥＬＦへのｃｅｆＦの組込みを示す。ＨＥＬＦにおける（Ａ）単一のまたは（Ｂ）複数のｃｅｆＦカセットの物理的地図。ＮｒｕＩサイト、ｃｅｆＦプローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置を示す。５．７ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって起こり、その強度は存在するカセットの数（ｎ）に依存する。
【図４６ａ】第４６図は、（ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）遺伝子変換体におけるｃｅｆＥの定量を示す。ＨＥＬＥにおける（Ａ）単一のまたは（Ｂ）複数のｃｅｆＥカセットに対するＮｒｕＩサイト、プローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置。該６．０ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって起こり、またその強度は、存在するカセットの数（ｎ）に依存する。（Ｃ）ｎｉａＤ遺伝子座。遺伝子変換体は、その親菌株と同一のハイブリッド化パターンを持つであろうが、該ｎｉａＤシグナルに相対的に高い強度を持つ。
【図４６ｂ】第４６図は、（ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）遺伝子変換体におけるｃｅｆＥの定量を示す。ＨＥＬＥにおける（Ａ）単一のまたは（Ｂ）複数のｃｅｆＥカセットに対するＮｒｕＩサイト、プローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置。該６．０ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって起こり、またその強度は、存在するカセットの数（ｎ）に依存する。（Ｃ）ｎｉａＤ遺伝子座。遺伝子変換体は、その親菌株と同一のハイブリッド化パターンを持つであろうが、該ｎｉａＤシグナルに相対的に高い強度を持つ。
【図４６ｃ】第４６図は、（ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）遺伝子変換体におけるｃｅｆＥの定量を示す。ＨＥＬＥにおける（Ａ）単一のまたは（Ｂ）複数のｃｅｆＥカセットに対するＮｒｕＩサイト、プローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置。該６．０ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって起こり、またその強度は、存在するカセットの数（ｎ）に依存する。（Ｃ）ｎｉａＤ遺伝子座。遺伝子変換体は、その親菌株と同一のハイブリッド化パターンを持つであろうが、該ｎｉａＤシグナルに相対的に高い強度を持つ。
【図４７ａ】第４７図は、（ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）遺伝子変換体におけるｃｅｆＦの定量を示す。ＨＥＬＦにおける（Ａ）単一のまたは（Ｂ）複数のｃｅｆＦカセットに対するＮｒｕＩサイト、プローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置。該５．７ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって起こり、またその強度は、存在するカセットの数（ｎ）に依存する。（Ｃ）ｎｉａＤ遺伝子座。遺伝子変換体は、その親菌株と同一のハイブリッド化パターンを持つであろうが、該ｎｉａＤシグナルに相対的に高い強度を持つ。
【図４７ｂ】第４７図は、（ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）遺伝子変換体におけるｃｅｆＦの定量を示す。ＨＥＬＦにおける（Ａ）単一のまたは（Ｂ）複数のｃｅｆＦカセットに対するＮｒｕＩサイト、プローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置。該５．７ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって起こり、またその強度は、存在するカセットの数（ｎ）に依存する。（Ｃ）ｎｉａＤ遺伝子座。遺伝子変換体は、その親菌株と同一のハイブリッド化パターンを持つであろうが、該ｎｉａＤシグナルに相対的に高い強度を持つ。
【図４７ｃ】第４７図は、（ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）遺伝子変換体におけるｃｅｆＦの定量を示す。ＨＥＬＦにおける（Ａ）単一のまたは（Ｂ）複数のｃｅｆＦカセットに対するＮｒｕＩサイト、プローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置。該５．７ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって起こり、またその強度は、存在するカセットの数（ｎ）に依存する。（Ｃ）ｎｉａＤ遺伝子座。遺伝子変換体は、その親菌株と同一のハイブリッド化パターンを持つであろうが、該ｎｉａＤシグナルに相対的に高い強度を持つ。
【図４８ａ】第４８図は、ｃｅｆＥ遺伝子変換体の定量を示す。ＨＥＬＥにおける（Ａ）単一のまたは（Ｂ）複数のｃｅｆＥカセットに対するＮｒｕＩサイト、プローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置。該６．０ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって起こり、またその強度は、存在するカセットの数（ｎ）に依存する。（Ｃ）ｎｉａＤ遺伝子座。遺伝子変換体は、その親菌株と同一のハイブリッド化パターンを持つであろうが、該ｎｉａＤシグナルに相対的に高い強度を持つ。
【図４８ｂ】第４８図は、ｃｅｆＥ遺伝子変換体の定量を示す。ＨＥＬＥにおける（Ａ）単一のまたは（Ｂ）複数のｃｅｆＥカセットに対するＮｒｕＩサイト、プローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置。該６．０ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって起こり、またその強度は、存在するカセットの数（ｎ）に依存する。（Ｃ）ｎｉａＤ遺伝子座。遺伝子変換体は、その親菌株と同一のハイブリッド化パターンを持つであろうが、該ｎｉａＤシグナルに相対的に高い強度を持つ。
【図４８ｃ】第４８図は、ｃｅｆＥ遺伝子変換体の定量を示す。ＨＥＬＥにおける（Ａ）単一のまたは（Ｂ）複数のｃｅｆＥカセットに対するＮｒｕＩサイト、プローブおよびハイブリッド化フラグメントの予想されたサイズの相対的な位置。該６．０ｋｂのフラグメントは、該カセットの複数の組込みによって起こり、またその強度は、存在するカセットの数（ｎ）に依存する。（Ｃ）ｎｉａＤ遺伝子座。遺伝子変換体は、その親菌株と同一のハイブリッド化パターンを持つであろうが、該ｎｉａＤシグナルに相対的に高い強度を持つ。
【００１３】
［発明の説明］
第一の局面において、本発明は糸状菌に関連し、該糸状菌では、その染色体の少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインに、組み換えＤＮＡ分子が組み込まれており、ここで該ＤＮＡドメインは、リボソームＤＮＡ反復体ではない。本発明の糸状菌は、そのゲノム内に、少なくとも２つのこのようなＤＮＡドメインをもつ糸状菌を、組み換えＤＮＡ分子によって形質転換し、該ＤＮＡドメインの少なくとも一つに組み込まれた、少なくとも一つの組み換えＤＮＡ分子をもつ形質転換体について同定し、かつ引き続き該形質転換体の子孫における菌株について同定することによって調製され、該組み換えＤＮＡ分子を含む該ＤＮＡドメインは、該ＤＮＡドメインの他のバージョンによる遺伝子変換を通して、または該組み換えＤＮＡ分子を含む該ＤＮＡドメインの増幅によって、増殖する。換言すれば、本発明の糸状菌には、そのゲノム内の、内性のＤＮＡドメインの少なくとも一つにおいて、少なくとも一つの該組み換えＤＮＡ分子が組み込まれている。
【００１４】
本発明の糸状菌は、真核微生物であり、真菌界の真菌門のあらゆる糸状菌型を包含する（例えば、Ｌａｓｕｒｅ  ＆  Ｂｅｎｎｅｔｔ，１９８５，Ｆｕｎｇａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｉｎ：ｇｅｎｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，ｐｐ．５３１−５３５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。本発明の糸状菌は、形態学的、生理学的および遺伝学的に酵母とは異なっている。即ち、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母と比較して、糸状菌の増殖的成長は、菌糸の伸長によっており、また炭素代謝は、偏性好気性である。その上、Ｓ．セレビシアエ等の酵母は、極めて安定なディプロイド期を持つが、例えばアスペルギルスニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）等の糸状菌においては、ディプロイド期は、減数分裂に先立って、ほんの短期間存在するに過ぎない。更に、多くの工業的に重要な糸状菌は、デューテロマイコチナ（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）の亜門に属し、既知の如何なる性別型をももたないことによって識別される、真菌の人工的な群である、不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）とも呼ばれている。本発明の好ましい糸状菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アクレノニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、リゾファス（Ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ）、ファネロカエト（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クレビセプス（Ｃｌｅｖｉｃｅｑｓ）、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）、ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ブラケスレア（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、フィコマイセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）およびトリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属に属する。本発明の最も好ましい糸状菌は、Ｒａｐｅｒ  ＆  Ｆｅｎｎｅｌｌ（１９６５，Ｉｎ：Ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｔｈｅ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，バルチモア）によって定義された如き、アスペルギルスニガー群に属する真菌、例えばＡ．ニガー、Ｒａｐｅｒ  ＆  Ｆｅｎｎｅｌｌ（上記文献）によって定義されたようなアスペルギルスフラブス（ｆｕｌａｖｕｓ）群、例えばＡ．オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）、並びに真菌類トリコデルマリーゼイ（ｒｅｅｓｅｉ）およびペニシリウムクリソゲナムである。本発明を、糸状菌類Ａ．ニガーおよびＰ．クリソゲナムによって例示する。
【００１５】
本発明による該糸状菌類は、そのゲノム内に、組み換えＤＮＡ分子の１以上のコピーを組み込むのに適したＤＮＡドメインの、少なくとも２つの実質的に相同なバージョンを含み、ここで該ＤＮＡドメインは、リボソーム以外のＤＮＡである。本発明の実施例において、Ａ．ニガーの増幅されたグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子座およびＰ．クリソゲナムの増幅されたペニシリンクラスターは、該組み換えＤＮＡ分子を組込むためのＤＮＡドメインとして使用される。ペニシリン生合成遺伝子ｐｃｂＡＢ、ｐｃｂＣおよびｐｅｎＤＥを含む、Ａ．ニガーのｇｌａＡ遺伝子座およびＰ．クリソゲナムのペニシリンクラスター両者は、夫々野生型のＡ．ニガーおよびＰ．クリソゲナム菌株のゲノム内に単一のコピーとして現れる。本発明の実施例で使用するように、これらＤＮＡドメインの複数のコピーを含む菌株は、夫々改良されたグルコアミラーゼまたはペニシリン産性をもつ菌株について選別することによって、古典的な菌株改良プログラムにおいて、得ることが出来る。しばしば、このような産性の改善は、該選択された菌株のＤＮＡドメインの増幅の結果である。このように増幅されたＤＮＡドメインは、以下においてアンプリコンと呼ばれる。本発明は、好ましくは該組み換えＤＮＡ分子を組み込むためのＤＮＡドメインとして、このようなアンプリコンを使用するが、本発明はこれに制限されるものではない。事実、２以上の実質的に相同なバージョンが糸状菌内で起こる、任意のＤＮＡドメインを、以下の２つの基準を満たす限りにおいて、使用することが出来る。１）該ＤＮＡドメインは、組み換えＤＮＡ分子の組込みを許容するのに適したものであるべきであり、２）該ＤＮＡドメインは、遺伝子変換を介して、該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子の増殖を達成するために、該真菌ゲノムの該ドメインの、他の実質的に相同なバージョンとの組み換えを可能とするものであるべきである。
【００１６】
該第一の基準を満たすためには、ＤＮＡドメインは、十分な長さを有していて、相同組み換えを介して、該ドメイン内への該組み換えＤＮＡ分子の攻撃を可能とする必要がある。このために、ＤＮＡドメインは、少なくとも１００ｂｐ、好ましくは少なくとも１ｋｂおよびより好ましくは少なくとも２ｋｂを含むべきである。組み換えＤＮＡ分子をＤＮＡドメインに組み込むための、該ＤＮＡドメインの適性は、更に該ＤＮＡドメインへの組込みが、対象とする該糸状菌の生存性に必須の機能を破壊するものであってはならない、と言う要件によって決定される。
【００１７】
該第二の機能上の基準に関連して、該真菌ゲノムの該ドメインの、他の実質的に相同なバージョンとの組み換え可能性は、種々のバージョンに係わる該ＤＮＡドメイン間の遺伝子変換を可能とするために必要とされる。この目的を達成するための最小の要件は、該ドメインの各バージョンが、ＤＮＡ配列によって、該ドメインの何れかの端部上でフランキング状態にあることであり、該ＤＮＡ配列は、該フランキング配列間の相同組み換えを可能とするように、該ＤＮＡドメインの、他のバージョンの対応するフランキング配列と実質的に相同である。この相同組み換えの結果は、遺伝子変換であり、そこでは、該ＤＮＡドメインの１バージョンが、該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む、該他のＤＮＡドメインの複製されたバージョンによって置き換えられている。依然として遺伝子変換を可能とする、該フランキング配列の相同性の長さおよび程度に関連する、該最小の要件は、正確には知られておらず、また対象とする生物に依存して変動する可能性がある。恐らく、少なくとも６０％の全体としての相同性をもつ、１００ｂｐと言う最小の長さは、依然遺伝子変換を可能とするであろう。明らかに、遺伝子変換の頻度は、該ＤＮＡドメインからフランキング状態にある該配列の長さおよび相同性の増加に伴って増大するであろう。好ましくは、該異なるドメインは、少なくとも８０％の相同性ををもつ、少なくとも１ｋｂの配列によってフランキング状態にある。該真菌ゲノムは、上で定義したように、１または種々の型のＤＮＡドメインを含むことが出来る。相互に完全なコピーではない、種々の型のこのようなドメインの例は、対立遺伝子変異体、遺伝子群および／またはイソ酵素をコードする遺伝子である。最も好ましいものは、相互に正確なコピーであり、多くとも組み込まれた組み換えＤＮＡ分子の存在においてのみ異なる、ドメインである。このような同等なドメインの例は、アンプリコンである。かくして、本発明の好ましい態様においては、組み換えＤＮＡ分子の１以上のコピーの組込みに適した、該ＤＮＡドメインは、アンプリコンである。
【００１８】
該ＤＮＡドメインの全体としての長さは、重要ではなく、１ｋｂ未満から、数百ｋｂの範囲内で変動でき、例えば本発明の実施例においては、該ＤＮＡドメインの長さは、該増幅されたペニシリンクラスターに対する１単位当たり５７ｋｂから、該増幅されたｇｌａＡ遺伝子座に対する１単位当たり８０ｋｂを越える値までの範囲に及ぶ。
【００１９】
該組み換えＤＮＡ分子は、本発明の糸状菌に、所定の遺伝的変更を導入するのに必要な、遺伝子要素の任意の組み合わせを含む。該組み換えＤＮＡ分子は、任意の遺伝子要素、その一部またはその組み合わせ、例えば遺伝子（コード部分または完全な遺伝子座）、ｃＤＮＡ、プロモータ、ターミネータ、イントロン、シグナル配列、任意の調節ＤＮＡ配列またはＤＮＡ−結合タンパクの認識配列を含む。該遺伝的要素は、また変性された、即ち１以上のヌクレオチド改変（例えば、挿入、欠失、置換）を含む、ＤＮＡ配列を含むことができる。
【００２０】
該所定の遺伝子の変性は、選択された糸状菌におけるＮＡ配列の任意の改変、即ち挿入、欠失および／または置換を含み、これらの改変は、形質転換または該組み換えＤＮＡ分子の同時の形質転換による、該真菌への、上記した１以上の遺伝的要素の導入の結果である。数種のこのような遺伝的改変を、独立した形質転換工程で導入することが出来ることが、理解されよう。
【００２１】
本発明の１態様に従えば、該糸状菌の該ＤＮＡドメインに組み込まれた該組み換えＤＮＡ分子は、１以上の所定の遺伝子を発現させるための、１以上の発現カセットを含む。ここにおいて、発現カセットとは、発現すべき所定の遺伝子を含み、かつ該遺伝子の発現を実施しかつ調節することの出来る、適当な発現要素と機能可能に結合している、ＤＮＡフラグメントを意味するものと理解される。このような発現要素は、プロモータ、シグナル配列、ターミネータ等を包含する。
【００２２】
該糸状菌に、異種または同種のタンパクまたは酵素を生産させようとする場合、該所定の遺伝子は、好ましくは分泌性のタンパクまたは酵素をコードし、従って該酵素の分泌を行うシグナル配列を含む。この態様は、例えば本発明においては、Ａ．ニガーのｇｌａＡアンプリコン中の該Ａ．ニガーフィターゼ遺伝子を含む発現カセットの組込みによって、実施される。しかしながら、本発明が対象とする任意のタンパクまたは酵素に適用できることは、当業者には明らかであろう。
【００２３】
また、本発明の糸状菌に、一次または二次代謝産物を生産させようとする場合には、該所定の遺伝子は、通常これらの代謝産物の生合成に関与する、１種以上の細胞内酵素をコードするであろう。本発明のこの局面に従う好ましい態様において、該糸状菌は、該ＤＮＡドメインに組み込まれた１種以上の組み換えＤＮＡ分子を含み、結果として該組み換えＤＮＡ分子は、該糸状菌には本来備わっていない、代謝経路の一部である、細胞内酵素のための１種以上の発現カセットを含む。このような糸状菌の例は、デアセトキシセフアロスポリンＣシンセターゼ（エキスパンダーゼ）およびデアセチルセファロスポリンＣシンセターゼ（ヒドロキシラーゼ）の発現カセットを、ペニシリンアンプリコン中に組み込んだ、Ｐ．クリソゲナム菌株を包含し、該カセットはこれら菌株が夫々アジポイル−７−アミノデアセトキシセフアロスポラン酸およびアジポイルアミノデアセチルセファロスポラン酸を合成することを可能とする。
【００２４】
該組み換えＤＮＡ分子が、該ＤＮＡドメインに組み込まれるメカニズムは、本発明にとって重要ではなく、また本発明を適用する対象に依存する。該ＤＮＡドメインへの該組み換えＤＮＡ分子の組込みは、ランダムな組込みによって起こる可能性があり、しかもより好ましくは、組み込みは、単一の交差組み換え事象、即ち該組み換えＤＮＡ分子の挿入をもたらす組み換え事象、該組み換えＤＮＡ分子による置換、即ち該ＤＮＡドメインの元の配列の一部の置換をもたらす、二重交差組み換え事象の何れかによる、相同組み換えによって起こる。相同組み換えによる組込みを促進するために、該組み換えＤＮＡは、好ましくは該ＤＮＡドメインに組込むためのターゲット配列に対して相同である、配列を含んでいる。好ましくは、該組み換えＤＮＡ分子中のこのようなターゲット配列は、該ＤＮＡドメイン内のターゲット配列と同様である。
【００２５】
本発明の好ましい態様において、該糸状菌中に存在する実質的に相同なＤＮＡドメインの各バージョンは、該組み換えＤＮＡ分子の組み込まれたコピーを含む。該真菌に存在する全ての該ＤＮＡドメインの、組み込まれた組み換えＤＮＡ分子による完全な占有は、該組み換えＤＮＡ分子の可能な最大のコピー数をもたらし、しかもより安定な状況をもたらす。というのは、このような真菌が、「中空（ｅｍｐｔｙ）」ＤＮＡドメインを含まないからである。該中空ＤＮＡドメインは、中実ＤＮＡドメインによる遺伝子変換におけるドナーとして機能でき、結果として該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子のコピー数を減じる。同一の型のＤＮＡドメインの各バージョンは、組み換えＤＮＡ分子によって占有されるか、あるいは該ＤＮＡドメインの異なる型の各バージョンが該分子によって占有される。好ましくは、該糸状菌のゲノムに存在する、該実質的に相同な全ての型のＤＮＡドメインの各バージョンは、該組み換えＤＮＡ分子の組み込まれたコピーを含む。
【００２６】
本発明の有利な１局面において、該組み換えＤＮＡ分子の組込みのために使用する該ＤＮＡドメインは、その本来の状態において、高いレベルでの発現を可能とする内在性遺伝子を含む。組み込まれた組み換え遺伝子の発現レベルは、該遺伝子が組み込まれている、ゲノム遺伝子座に依存して大幅に変動する可能性があることが、一般的に知られている。発現すべき組み換え遺伝子の組込みに高度に発現されたドメインを使用する利点は、これらドメインが、少なくとも該内在性遺伝子の高いレベルでの発現を維持できることにある。従って、このようなドメインはまた、組み込まれた組み換え遺伝子の高いレベルでの発現をも維持するであろうと考えられる。事実、我々は、Ａ．ニガーの該ｇｌａＡドメインへの組込みおよびＰ．クリソゲナムの該ペニシリンクラスターへの組込みが、本明細書の実施例において記載されるように、幾つかの他の遺伝子座における組込みと比較して、遺伝子コピー当たりの高い発現レベルを与えることを見出した。これに関連して、高いレベルの発現を可能とする遺伝子は、最大レベルで発現された場合に、全ｍＲＮＡ集団の少なくとも０．１％、好ましくは該全ｍＲＮＡの少なくとも０．５％およびもっとも好ましくは該全ｍＲＮＡの少なくとも１％を構成する、ｍＲＮＡを生成する遺伝子として定義される。本発明の組み換えＤＮＡ分子の組込みに特に適した該ドメインを含む、このような高度に発現性の内在性遺伝子の例は、解糖酵素、澱粉分解酵素、セルロース分解酵素および／または抗生物質生合成酵素をコードする遺伝子である。
【００２７】
より一層好ましいものは、工業的過程に関与しており、かつ高いレベルで、グルコアミラーゼ遺伝子、ＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、セロバイオヒドロラーゼ遺伝子およびペニシリン生合成遺伝子を発現することが知られている、遺伝子を含むドメインである。本発明の更なる局面において、該高度に発現された内在性遺伝子は、該内在性遺伝子の発現が必要とされない場合には、該ＤＮＡドメインの各コピー内で不活性化される。このような場合において、該内在性遺伝子の該高レベルでの発現の不活性化は、更に別の対象とする遺伝子の発現を可能とする、エネルギーおよび資源の利用を可能とする。該組み換えＤＮＡ分子の組込みによって製造される該所定の酵素並びに該内在性遺伝子によってコードされる酵素両者が、分泌型酵素である場合には、該内在性酵素の不活性化は、該所定の酵素のより純粋な処方物をもたらす。好ましくは、該内在性の遺伝子は、該内在性遺伝子の少なくとも一部を不可逆的に除去して、該不活性化の復帰を排除することによって不活性化される。より好ましくは、該内在性遺伝子の不活性化は、不可逆的な除去によって行われ、該除去はプロモータおよび上流側の活性化配列の少なくとも一部の除去を含む。これは、該組み換えＤＮＡ分子の組込みによる、製造すべき酵素をコードする所定の遺伝子の発現が、該内在性の遺伝子を由来とするプロモータから誘導される場合に特に有利である。というのは、該所定の遺伝子の発現のために必要な転写因子を強く制限する競合を、排除するからである。
【００２８】
本発明の更なる態様において、該ＤＮＡドメインの各バージョンは、固有の配列標識によって、該糸状菌の該ドメインのその他のバージョンから識別される。このような配列標識は、該種々のドメイン間の遺伝子変換を追跡することを可能とし、該種々のドメインは、所定の遺伝子型をもつ変換体のスクリーニングおよび／または選別を容易にする。任意の型の配列標識を使用できるが、該ドメインの、例えばサザンブロットで検出される制限サイトから、容易にアッセイできる表現型を与える、完全に選別可能なマーカー遺伝子に及ぶ、種々のバージョンの検出を可能とするものである必要がある。該配列標識の特に有用な態様を、ここに例示するが、これらは、該ＰＣＲを刺激するための一対のオリゴヌクレオチドを使用する単一のＰＣＲにおいて、該ドメイン各々を検出することを可能とする。該ドメインは、該ＰＣＲにおいて、該ドメインの各バージョンが、固有の長さを持つＰＣＲフラグメントを製造するように変性される。得られるＰＣＲフラグメントの長さおよび強度は、夫々該ドメイン各々の存在並びにコピー数の指標となる。「ＤＮＡフラッグ」と呼ばれるこの型の配列標識は、多数の変換体コロニーの遺伝子型の迅速な解析を可能とし、結果として所定の遺伝子型をもつ変換体を得ることを可能とする。
【００２９】
本発明は、更に該本発明の糸状菌の製法にも関連する。これら方法は、糸状菌を形質転換する工程を含み、該糸状菌は１以上のその染色体内に、組み換えＤＮＡ分子の１種以上のコピーを組み込むのに適した、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、また該ＤＮＡドメインは、組み換えＤＮＡ分子を含む、リボソームＤＮＡ反復体ではない。糸状菌の形質転換は、今日では当業者にとっては日常的な作業であり、糸状菌に適した種々の形質転換プロトコールが利用可能である。
【００３０】
該組み換えＤＮＡ分子による該糸状菌の形質転換は、選別可能なマーカー遺伝子の使用を必要とし、該遺伝子は、形質転換遺伝子を取り込んだ真菌細胞を、形質転換されていない細胞から識別することを可能とする。種々の選別可能なマーカー遺伝子が、糸状菌の形質転換のために利用可能である。適当なマーカーは、アミノ酸またはヌクレオチド代謝に関与する、栄養要求性マーカー遺伝子、例えばオルニチン−トランスカルバミラーゼ（ａｒｇＢ）、オロチジン−５’−デカボキシラーゼ（ｐｙｒＧ）またはグルタミン−アミド−トランスフェラーゼインドールグリセロール−ホスフェート−シンターゼホスホリボシル−アンスラニレートイソメラーゼ（ｔｒｐＣ）、あるいは炭素または窒素代謝に関与するマーカー、例えばｎｉａＤまたはｆａｃＡ、並びに抗生物質耐性マーカー、例えばフレオマイシン、ブレオマイシンまたはネオマイシンに対する耐性を与える遺伝子（Ｇ４１８）を包含する。好ましくは、正および負の遺伝子選別両者を可能とする、２方向性の選別マーカーを使用する。このような２方向性の選別マーカーの例は、ｐｙｒＧ、ｆａｃＡおよびａｍｄＳ遺伝子である。
【００３１】
その２方向性の故に、これらマーカーは、該導入された組み換えＤＮＡ分子を所定の位置に残したまま、形質転換された糸状菌から取り出して、選別性のマーカーを含まない糸状菌を得ることを可能とする。このＭＡＲＫＥＲ  ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥＴＭ形質転換技術の本質は、ＥＰ−Ａ−０，６３５，５７４に記載されている。これを本発明の参考文献とする。これら選別マーカーの中で、支配的に２方向性の選別マーカー、例えばＡ．ニドランス、Ａ．ニガーおよびＰ．クリソゲナムのａｍｄＳ遺伝子等の、アセタミダーゼ遺伝子を使用することが最も好ましい。この２方向性に加えて、これらマーカーは、変異（栄養要求性）菌株の使用を必要とせず、しかも直接野生型の菌株で使用できる、支配的選別マーカーであると言う利点をも与える。
【００３２】
従って、本発明の更なる態様は、本発明の糸状菌に関連し、そこで該組み換えＤＮＡ分子は選別マーカー遺伝子に欠乏しており、あるいはより好ましくは選別マーカー遺伝子を全く含まない、本発明による糸状菌に関連する。
【００３３】
本発明の糸状菌を該組み換えＤＮＡ分子によって形質転換するのに使用する、該選別マーカーは、形質転換すべき該組み換えＤＮＡ分子と物理的に結合しているか、あるいはこれらは該所定の該組み換えＤＮＡ分子と同時に形質転換される別のＤＮＡ分子上に存在できる。同時形質転換は、当業者により日常的に利用されている。というのは、これが糸状菌内で比較的高い頻度で起こるからである。
【００３４】
本発明の糸状菌を製造する方法の次の段階は、該糸状菌の該ＤＮＡドメインの少なくとも１つに組み込まれた、少なくとも１つの組み換えＤＮＡ分子を有する形質転換体を選別する工程である。当業者は、多数の日常的な技術を利用して、得られた形質転換体の何れが、そのＤＮＡドメインの１つに組み込まれた組み換えＤＮＡ分子をもつかを決定することが出来る。更なる段階において、該選択された形質転換体を、増殖し、その子孫から、該ＤＮＡドメインの少なくとも２つが組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む菌株を選別する。このことは、該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む該ＤＮＡドメインが、「中空」ＤＮＡドメインによる遺伝子変換または増幅を介して、増幅された菌株を選別することを意味する。このような遺伝子変換および増幅事象は、自発的には低頻度で起こる。これら事象が発生する正確な頻度は、対象とする該真菌およびその数、該ＤＮＡドメインの相同性の長さおよびその程度を包含する、種々の変数に依存するものと考えられる。しかし、我々は、これらの頻度が、今日利用可能な解析技術を用いて、これら事象が発生している菌株のスクリーニングおよび選別を可能とするのに十分に高いことを見出した。該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む該ＤＮＡドメインが、増幅されている菌株は、例えば該組み換えＤＮＡ分子によって合成が行われている、生成物の高いレベルでの産性をもつ菌株について単にスクリーニングすることによって同定でき、あるいはまたこのような菌株は、例えば上で概説した「ＤＮＡ−フラッグ」テストによって、その遺伝子型を分析することによって、同定することが出来る。
【００３５】
本発明の方法は、付随的な工程を含むことが出来、該工程においては、組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む、該ＤＮＡドメインの増幅が起こっている該菌株の一つを増殖し、その子孫から、該ＤＮＡドメインの付随的なコピーが、該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む、菌株を選別する。次いで、該ＤＮＡドメイン各々が、該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む菌株を与えるまで、これら菌株をこの手順にかける。上で概説したように、このような菌株は、該組み換えＤＮＡ分子のコピー数が高く、また安定性が改善されていると言う利点を与える。
【００３６】
本発明による糸状菌の調製方法の更なる局面においては、該組み換えＤＮＡ分子は、該ＤＮＡドメインと実質的に相同な配列を含む。該組み換えＤＮＡ分子におけるこのような実質的に相同な配列の存在は、該組み換えＤＮＡ分子が、該ＤＮＡドメインに組み込まれる頻度を、実質的に高める。該組み換えＤＮＡ分子における該実質的に相同な配列に関連する最小の要件は、知られていないが、実際には少なくとも１ｋｂ、好ましくは少なくとも２ｋｂの相同なターゲット配列によって、妥当なターゲット頻度が得られる。
【００３７】
上記のように、本発明の１局面は、該糸状菌の該組み換えＤＮＡ分子による形質転換のための、２方向性の選別性マーカーの使用に関連する。一旦このような形質転換が達成されると、これらを、該２方向性のマーカーが存在しないことについて、逆選別することが有利である。このようなマーカーを持たない形質転換体を、次に更に形質転換にかけるか、あるいは増殖させて、その子孫から該組み換えＤＮＡ分子を含む該ＤＮＡドメインの遺伝子変換および／または増幅を含む菌株を選別することが出来る。
【００３８】
本発明によるもう一つの糸状菌の製法においては、糸状菌を、組み換えＤＮＡ分子で形質転換し、所定のゲノムターゲット配列中に組み込まれた、少なくとも１つの組み換えＤＮＡ分子を含む形質転換体を選別する。この形質転換体を、次に増殖させ、その子孫から、該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子を含む、少なくとも２つのＤＮＡドメインを含む菌株を選別する。この場合において、該組み換えＤＮＡ分子で形質転換すべきレシピエント糸状菌は、必ずしも該ＤＮＡドメインを含む必要はない。該ＤＮＡドメインは、寧ろ該組み換えＤＮＡ分子がそこに組み込まれた後に、増幅される。
【００３９】
本発明は、組み換え糸状菌の調製を可能とし、該糸状菌は、その染色体１以上に、組み換えＤＮＡ分子の１以上のコピーを組み込むのに適した、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含んでおり、ここで該ＤＮＡドメインは、リボソームＤＮＡ繰り返し体ではなく、また該ＤＮＡドメインの少なくとも２つは、組み換えＤＮＡ分子の組み込まれたコピーを含む。これら組み換えられた真菌は、興味ある製品を生産するための方法で利用できる。このような方法は、通常該興味ある製品の製造を促す媒体中で、該組み換え細胞を培養する工程、および該培養培地および／または該真菌から、該興味ある製品を回収する工程を含む。該興味ある製品は、タンパク例えば酵素および／または一次代謝産物、例えばＣＯ２、アルコールまたは有機酸、および／または二次代謝産物、例えば抗生物質またはカロチノイド等であり得る。該興昧ある製品は、また該組み換えられた真菌自体であり得、例えばこの方法によって得られたバイオマスであり得る。本発明の糸状菌において生産し得る酵素およびタンパクの例は、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ラムノシダーゼ、アピオシダーゼ、キモシン、ラクトフェリン、細胞壁分解酵素、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ラムノガラクッロナーゼ等を包含する。
【００４０】
本発明の糸状菌およびその製法の利点の幾つかを以下にまとめる。
−本発明は、糸状菌における組み換えＤＮＡ分子の、非−ランダム性多重コピ−組込み用のこれまでに利用可能な系と比較して、極めて高い融通性を与える。この大きな融通性は、本発明が形質転換に対して、欠陥のある選別マーカー遺伝子の使用に制限しておらず、また本発明が組込みのためのターゲット遺伝子として、リボソームＤＮＡ配列のみの使用に制限していないからである。
【００４１】
−本発明の糸状菌は、組み換えＤＮＡ分子が、タンデムアレイ状にランダムに組み込まれている、従来の組み換え糸状菌と比較して、該組み換えＤＮＡ分子の組み込まれた多数のコピーの、より高い遺伝的安定性を与える。特に、ランダムに組み込まれた組み換えＤＮＡ分子の高いコピー数を持つ糸状菌は、通常ほんの僅かなゲノム遺伝子座に組み込まれた、タンデム状に繰り返された組み換えＤＮＡ分子の大きな数を持つであろう。この立体配置は、本発明の立体配置よりも本来的に不安定であり、後者では該組み換えＤＮＡ分子のほんの僅かなタンデム状に繰り返されたコピーのみ（好ましくは、５コピー以下）が、幾つかの異なるゲノムサイト、例えば該実質的に相同なＤＮＡドメインに組み込まれる。例えば、本発明の糸状菌は、コピー数１５を持つことができ、結果として該真菌は、５つの実質的に相同なＤＮＡドメインに組み込まれた、組み換えＤＮＡ分子の３つのタンデム状に繰り返されたコピーを持つことができる。これとは対照的に、コピー数１５を有する従来の組み換え糸状菌は、一つの明らかにされていないゲノムサイトに組み込まれた１０個のコピーおよびもう一つの明らかにされていないゲノムサイトに組み込まれた５個のコピーを持つことができる。本発明により、同一のコピー数をもつ本発明の真菌と比較して、後者の立体配置が、該組み換えＤＮＡ分子の喪失に関して、より不安定であることが分かった。
【００４２】
−本発明の糸状菌は、リボソームＤＮＡへの組込みを含む糸状菌と比較して、遺伝子コピー当たりの高い発現レベルを与えることが予想される。というのは、後者が、タンパクコード遺伝子の高いレベルでのＲＮＡ−ポリメラーゼＩＩ転写を維持することが明らかとなっていないからである。
【００４３】
−本発明の糸状菌は、多重コピー菌株であり、その遺伝子型は、少なくとも該組み込まれた組み換えＤＮＡ分子が関与している限りにおいて、完全に定義することができる。このことは、これら真菌が関与している過程および生成物について、規制上の承認を得ることを容易にするであろう。
【００４４】
−同様な理由から、該糸状菌の表現型は、該組み換えＤＮＡ分子がランダムに組み込まれている、従来の組み換え糸状菌と比較して、より一層予測性が高く、これは該ランダムな組込みが、該組込みサイトまたはその近傍に存在する未知の遺伝子の発現を変更する可能性があるからである。
【００４５】
−本発明の該糸状菌の製法は、初期の古典的な菌株改良プログラムとの共同作用と言う利点を与える。上に概説したように、本発明の好ましい態様においては、工業的な糸状菌が使用され、これは古典的な菌株改良プログラムにおいて得たものである。このような真菌の使用は、これらがしばしば本発明に従って組み換えＤＮＡ分子を組み込みかつ引き続き増殖させるのに適したアンプリコンを含むばかりか、該工業的糸状菌が、蓄積された（多数の）突然変異を持つであろうことから有用であり、該突然変異は該菌株改良プログラムが、目的としている生成物（「以前の」生成物）にとって有利であるばかりでなく、その他の新規な生成物にとっても有利である。これら改良された工業的な糸状菌の変性によって、該遺伝子が、該「以前の」生成物の生産に関与して、該真菌が新規な生成物を製造することを可能とし、該有利な突然変異は、今度は該新規な生成物の効率的な生産に関与するであろう。このように、本発明は新規産性菌株の開発における甚大な努力を減ずることを可能とする。
【００４６】
−本発明は、組み換え糸状菌の「設計並びに溝築」を可能とする。該「設計並びに溝築」なる用語によって、我々は、単一のコピーレベルで、ＤＮＡドメインに導入すべき所定のあらゆる遺伝子変性の設計を行うことを意味する。例えば、所定のタンパクを生産する場合に、該タンパクに関する１以上の発現カセットを、該ＤＮＡドメインに組み込み、また該所定のタンパクの発現に負の影響を与える可能性のある、同一のドメインに存在する、内在性の遺伝子は、不活性化される。タンパク混合物を製造しようとする場合には、該設計は、該種々のタンパクの発現レベルを所定の比率に調製することを含むであろう。後者は、代謝経路の操作において特に有利であり、該経路の操作において、新規な代謝経路の一部を構成する幾つかの新規な代謝活性が、所定の比率で導入される。単一のコピーレベルにおいて、これら所定の遺伝的変性のこれら設計が、一旦確立されると、該溝築工程を開始することができる。このことは、該設計された単一のコピードメインが、該所定の産性レベルに達するまで、該所定の遺伝的変性を含む該ドメインの、遺伝子変換および／または増幅によって、増殖される。
【００４７】
［ＥＸＡＭＰＬＥＳ］
命名
Ａ．ニガー  アスベルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）
Ｐ．クリソゲナム  ペニシリウムクリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）
Ｓ．クラブリゲルス  ストレプトミセスクラブリゲルス（Ｓｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕ  ｓ）
Ａ．ニデュランス  アスペルギルスニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）
ｐｈｙＡ  Ａ．ニガーｐｈｙＡ遺伝子，フィターゼをコードする。
ａｍｄＳ  Ａ．ニデュランスａｍｄＳ遺伝子，アセタミダーゼをコード  する。（Ｃｏｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８７  Ｇｅｎｅ  ５３：６３−７１）
ｃｅｆＥ  Ｓ．クラブリゲルスｃｅｆＥ遺伝子，デアセトキシセファロスポリ  ンＣシンセターゼをコードする。（Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ，１９８９  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：７５４−７６０）
ｃｅｆＦ  Ｓ．クラブリゲルスｃｅｆＦ遺伝子，デアセチルデアセトキシセフ  アロスポリンＣシンセターゼをコードする。（Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ，Ｓ．ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｒ．１９９１  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ．１７３：３９８−４００）
ｎｉａＤ  Ｐ．クソソグナムｎｉａＤ遺伝子、ニトレートリダクターゼをコードする。（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３０９：８１−８４）
ｇｌａＡ  Ａ．ニガーｇｌａＡ遺伝子、グルコアミラーゼをコードする。
ｇｐｄＡ  Ａ．ニデュランスｇｐｄＡ遺伝子，グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする。（Ｐｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ，１９８８  Ｇｅｎｅ  ６９：４９−５７）
ｐｃｂＣ  Ｐ．クリソゲナムｐｃｂＣ遺伝子，イソペニシリンＮシンターゼ（Ｉ  ＰＮＳ）をコードする。（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８６  Ｇｅｎｅ  ４８：２５７−２６６）
ＰｇｐｄＡ  ｇｐｄＡプロモータ
ＰｇｌａＡ  ｇ１ａＡプロモータ
ＰｐｃｂＣ  ｐｃｂＣプロモータ
ＴｐｅｎＤＥ  ｐｅｎＤＥターミネータ
ＴａｍｄＳ  ａｍｄＳターミネータ
ＴｇｌａＡ  ｇ１ａＡターミネータ
ＧＬＡ  Ａ．ニガーグルコアミラーゼタンパク
【００４８】
略号
ＣＨＥＦ  クランプ均一電場（Ｃｌａｍｐｅｄ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｉｅｌｄｓ（電気泳動  （ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））
ＴＡＦＥ  横交流電場電気泳動（Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  Ａｌｔｅｍａｔｉｎｇ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ  ｓ）
ｋｂ  キロベース
ｂｐ  塩基対
ＡＤＣＡ  アミノデアセトキシセフアロスポラン酸
ＡＤＡＣ  アミノデアセチルセファロスポラン酸
ｏｌｉｇｏ  オリゴヌクレオチド
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
【００４９】
オリゴヌクレオチド：
【００５０】
【表１】
2010075204.tif 000002
【００５１】
【表２】
2010075204.tif 000003
【００５２】
【表３】
2010075204.tif 000004
【００５３】
物質および方法
［一般的手順］
標準的な分子クローニング技術、例えばＤＮＡ単離、ゲル電気泳動、核酸の酵素的制限変性、サザン分析、Ｅ．コリ形質転換法各々は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＩｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＰＣＲｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａｇｕｉｄｅｔｏｍｅｔｈｏｄｓａｎｄａｐｐｈｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンジエゴに記載のように実施した。合成オリゴデオキシヌクレオチドは、ＩＳＯＧＥＮ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（オランダ国、Ｍａａｒｓｓｅｎ）から入手した。ＤＮＡ配列合成は、Ａｐｐｈｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３Ａ  ＤＮＡ配列決定装置にて、製造業者の指示に従って実施した。
【００５４】
アスペルギルスニガーの形質転換
Ａ．ニガーの形質転換は、以下のような変更を施した、Ｔｉｌｂｕｒｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｇｅｎｅ，２６，２０５−２２１およびＫｅｎｙ，Ｊ．＆  Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．，４，４７５−４７９に記載の方法にしたがって実施した。
【００５５】
胞子を、アスペルギルス最小培地中で、３０℃にて１６時間、ロータリーシェーカーを使用し、３００ｒｐｍにて成長させた。アスペルギルス最小培地は、１１当たり以下の成分を含む：６ｇのＮａＮＯ３：０．５２ｇのＫＣｌ；１．５２ｇのＫＨ２ＰＯ４；１．１２ｍｌの４Ｍ  ＫＯＨ；０．５２ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；１０ｇのグルコース；１ｇのカザアミノ酸；２２ｍｇのＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；１１ｍｇのＨ３ＢＯ３；５ｍｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；１．７ｍｇのＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ；１．６ｍｇのＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ；５ｍｇのＭｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏ；１．５ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ；５０ｍｇのＥＤＴＡ；２ｍｇのリボフラビン；２ｍｇのチアミン−ＨＣｌ；２ｍｇのニコチンアミド；１ｍｇのピリドキシン−ＨＣｌ；０．２ｍｇのパントテン酸；４μｇのビオチン；１０ｍｌのペニシリン（５０００ＩＵ／ｍｌ）ストレプトマイシン（５０００ＵＧ／ｍｌ）溶液（Ｇｉｂｃｏ）。
【００５６】
−ヘリカーゼの代わりに、Ｎｏｖｏｚｙｍ２３４（Ｎｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を、原形質体の調製のために使用した。
【００５７】
−原形質体の調製後（６０−９０分）に、ＫＣバッファー（０．８ＭＫＣｌ、９．５ｍＭクエン酸、ｐＨ６．２）を、最終体積４５ｍｌまで添加し、該原形質体上澄を、４℃にて、スイング−バケットローター中で、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理した。該原形質体を、２０ｍｌのＫＣバッファーに再懸濁し、引き続き２５ｍｌのＳＴＣバッファー（１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＣａＣｌ２）を添加した。該原形質体上澄を、４℃にて、スイングーバケットローター中で、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理し、ＳＴＣバッファーで洗浄し、１０８原形質体／ｍｌなる濃度でＳＴＣバッファーに再懸濁した。
【００５８】
−この原形質体上澄２００μｌに、１０μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解したＤＮＡフラグメント、１００μｌのＰＥＧ溶液（２０％のＰＥＧ  ４０００（Ｍｅｒｃｋ）、０．８Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＣａＣｌ２）を添加した。
【００５９】
−該ＤＮＡ−原形質体上澄を、室温にて１０分間インキュベートしたのち、１．５ｍｌのＰＥＧ溶液（６０％のＰＥＧ  ４０００（Ｍｅｒｃｋ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＣａＣｌ２）を徐々に添加し、一方で該試験管を繰り返し混合した。室温にて２０分間インキュベートした後、懸濁液を５ｍｌの１．２Ｍソルビトールで希釈し、反転によって混合し、室温にて４０００ｒｐｍで１０分間遠心処理した。該原形質体を、１ｍｌの１．２Ｍソルビトール中に穏やかに再懸濁し、リボフラビン、チアミン．ＨＣｌ、ニコチンアミド、ピリドキシン、パントテン酸、ビオチン、カザミノ酸およびグルコースを含まず、唯一の窒素源として１０ｍＭのアセタミド、１Ｍのスクロースを補充し、２％の微生物学的寒天＃１（英国、Ｏｘｏｉｄ）で固化させた、アスペルギルス最小培地からなる選択再生培地に入れた。３０℃にて６−１０間インキュベートした後、該プレートを、スクロースの代わりに２％のグルコースを、また寒天の代わりに１．５％のアガロースを含む、アスペルギルス最小培地からなる選択アセタミドプレート上に転写塗布した。単一の形質転換体を、３０℃にて５−１０日間生育させた後に単離した。
【００６０】
ペニシリウムクリソゲナムの形質転換  Ｃａ−ＰＥＧ媒介原形質体形質転換手順を使用する。Ｐ．クリソゲナム原形質体の調製および形質転換を、以下の改良を加えたＧｏｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｍａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，２０：１８９−２００に記載の方法に従って実施した。
【００６１】
−形質転換後、該原形質体を１．２Ｍのスクロースで浸透圧を安定化させた、唯一の窒素源として０．１％のアセタミドを含有し、１．５％の微生物学的寒天＃１（英国、Ｏｘｏｉｄ）で固化させた、アスペルギルス最小培地からなる選択再生培地プレート上に塗布した。
【００６２】
−２５℃にて５−８日後に、形質転換が見られた。
【００６３】
ＴＡＦＥ
２０−５０ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧｅｎｅｈｎｅＴＭＩＩ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用し、該製造業者の指示に従って、ＴＡＦＥにより１％アガロースゲル上で分離した。電気泳動パラメータ：３００ｍＡにて、４秒Ａ、４秒Ｂパルス時間、１４℃にて約１８時間。
【００６４】
ＣＨＥＦ
約５０ｋｂを越えるＤＮＡフラグメントを、ＣＨＥＦ電気泳動によって、１％アガロースゲル上に分離したが、ここではＰｕｌｓｅｗａｖｅ  ７６０  Ｓｗｉｔｃｈｅｒ，Ｍｏｄｅｌ  ２００／２．０電源を備え、ＣＨＥＦ電気泳動セルを使用する、ＣＨＥＦ−ＤＲＩＩモジュール（ＢｉｏＲａｄ）を使用した。電気泳動パラメータ：初期時間５０秒、最終時間９０秒、開始時点の比１．０、１４℃にて２００Ｖで２０−２４時間。
【００６５】
ＰＣＲ生成物およびハイブリダイゼーションシグナルの定量
ＰＣＲ生成物およびハイブリダイゼーションシグナルを、夫々エチジウムブロミドで染色したアガロースゲルの写真またはオートラジオグラムによって、ＩｍａｇｅＱｕａＮＴＴＭソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に従って定量した。
【００６６】
ＤＮＡ標識およびハイブリダイゼーション
ＤＮＡ標識およびハイブリダイゼーションは、ＥＣＬＴＭ直接核酸標識および検出装置に従って実施した。（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ，英国、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ）。
【００６７】
Ａ．ニガーコロニーに関するカセット−およびＤＮＡ−フラッグ特異的ＰＣＲ手順
Ａ．ニガーの胞子をＰＤＡ−プレート（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ）；製造業者の支持に従って調製）上に塗布した。３０℃にて４８時間生育させた後に、単一のコロニーの菌糸体の１／２−１／４部分を、５０μｌのｎｏｖｏｚｙｎｌ（ＫＣ（０．８ＭのＫＣｌ、９．５ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．２）１ｍｌ当たり５ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍ  ２３４（Ｎｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）に移し、３７℃にて１時間インキユベートした。次いで、３００μｌのＤＮＡ希釈バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５；１０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ）を添加し、その上澄を１００℃にて５分間煮沸し、元の菌糸を激しく攪拌することによって破壊させた。５μｌのこれら混合物を、５μｌの１０×Ｓｕｐｅｒ  Ｔａｑ  ＰＣＲバッファー１（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）、８μｌのｄＮＴＰ（各１．２５ｍＭ）、２０−８０ｎｇの各オリゴヌクレオチドおよび１ＵのＳｕｐｅｒ  Ｔａｑ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．ＵＫ、ケンブリッジ）を含有する５０μｌのＰＣＲ反応液における鋳型として使用した。オリゴの最適量は、各購入したバッチについて実験的に決定した。
【００６８】
２５増幅サイクル（各々：９４℃で１分、５５℃で１分および７２℃で１．５分）を、ＤＮＡ−増幅装置（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｈｙｂａｉｄ）を使用して実施した。
【００６９】
該ＤＮＡ−フラッグテストのために、プライマーとして、オリゴ群４０／４１を使用し、該ｐｈｙＡカセットＰＣＲテストのために、オリゴ群４２／４３を、および該ａｍｄＳカセットテストのために、オリゴ群１５／１６を使用した。
【００７０】
引き続き、ＰＣＲ生成物を分析するために、２０μｌの該ＰＣＲ混合物を、ＴＢＥバッファー（０．０９ＭのＴｒｉｓ、０．０９ＭのＨ３ＢＯ３、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中で、２％アガロースゲル上で、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００７１】
アスペルギルスニガーに対するターゲット特異的ＰＣＲ法
ＤＮＡ−鋳型の調製およびＰＣＲ反応条件は、ペニシリウムに対するターゲットＰＣＲテストに対して記載されたものを使用した。プライマー群として、オリゴ４６／４８を使用して、該ａｍｄＳカセットが該ｇｌａＡターゲット遺伝子座近傍を攻撃するか否かを決定し、またオリゴ群４６／４７を使用して、該ｐｈｙＡカセットが、該ｇｌａＡターゲット遺伝子座近傍を攻撃するか否かを決定した。使用したＰＣＲ条件は、ペニシリウムに対するターゲットＰＣＲテストについて記載されたものであった。
【００７２】
Ｐ．クリソグナム形質転換体のターゲットＰＣＲ
４日齢のコロニーの約１／３を、５ｍｇ／ｍｌのＮｏｖｏｚｙｍＴＭ２３４を補充した５０μｌのＫＣバッファー（６０ｇ／ｌ  ＫＣｌ、２ｇ／ｌクエン酸、ｐＨ６．２）中で、３７℃にて２時間インキュベートした。次いで、１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ、ｐＨ８および４００μｌのＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭＰＢバッファー（Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡチャッツワース）を添加した。抽出液を穏やかに再懸濁し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭスピンカラムにかけた。小型遠心分離機で、１３０００ｒｐｍにて１分間カラムを遠心処理し、５００μｌのＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭＰＢバッファーで１回洗浄した。痕跡のエタノールを最終的な迅速スピン処理で除去した。染色体ＤＮＡ（ＰＣＲ鋳型）を、５０μｌの水の添加によって該カラムから溶出し、次いで１３０００ｒｐｍにて１分間遠心分離処理した。ＰＣＲ反応液は、最終容積５０μｌ中に、１０μｌのｅＬＯＮＧａｓｅＴＭＢバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｒｅｄａ，オランダ）、１４μｌのｄＮＴＰ（各１．２５ｍＭ）、１μｌのｅＬＯＮＧａｓｅＴＭＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ、１μｌの鋳型、および３０−５０ｎｇの各オリゴを含んでいた。オリゴの最適量は、各購入したバッチについて実験的に決定した。平均３０〜５０ｎｇを使用した。反応は、以下のサイクル条件下で実施した：１×（９４℃にて２分間）、１０×（９４℃にて１５秒間、５５℃にて３０秒間、６８℃にて４分間）、２０×（９４℃にて１５秒間、５５℃にて３０秒間、６８℃にて４分間、サイクル当たり２０秒の勾配で）、１×（６８℃にて１０分間）。８μｌのサンプルを、ＰＣＲ生成物の分析のために、アガロースゲル上に置いた。
【００７３】
Ｐ．クリソゲナム形質転換体のカセットＰＣＲ
４日齢のコロニーの約１／３を、５ｍｇ／ｍｌのＮｏｖｏｚｙｍＴＭ２３４を補充した２００μｌのＤＶＢバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中で、３７℃にて２時間インキュベートした。この混合物を８時間煮沸し、次いで激しく攪拌して、元の菌糸体を破壊した。５μｌのこれら混合物を、５μｌの１０×Ｓｕｐｅｒ  Ｔａｑ  ＰＣＲバッファー（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．，ＵＫ，ケンブリッジ）、８μｌのｄＮＴＰ（各１．２５ｎ１Ｍ）、１ＵのＳｕｐｅｒ  Ｔａｑおよび２０−８０ｎｇの各オリゴを含有する、５０μｌのＰＣＲ反応における鋳型として使用した。オリゴの最適量は、各購入したバッチについて実験的に決定した。平均２０〜８０ｎｇを使用した。反応は、以下のサイクル条件下で実施した：２５×（９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１．５分間）、１×（７２℃にて８分間）。１５μｌのサンプルを、ＰＣＲ生成物の分析のために、アガロースゲル上に置いた。
【００７４】
染色体ＤＮＡの単離
Ａ．ニガーおよびＰ．クリソゲナムの胞子を、１００ｍｌの三角フラスコ中で、２０ｍｌのアスペルギルス最小培地（Ａ．ニガーの形質転換を参照のこと）内でインキュベートし、回転シェーカーで３００ｒｐｍにて３０℃で、２０−２４時間生育させた。十分に生育した培養物５−１０ｍｌを、１００ｍｌの新たなアスペルギルス最小培地中でインキュベートし、回転シェーカーで３００ｒｐｍにて３０℃で、更に２０−２４時間生育させた。生育後に、菌糸をＭｉｒａｄｏｔｈ（Ｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）フィルターでろ過し、１５ｍｌのＫＣバッファー（０．８ＭのＫＣｌ、９．５ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．２）で洗浄することにより、収穫した。該洗浄した菌糸（１００ｍｌの培養液３−５ｇ）１ｇ当たり、４ｍｌのＫＣバッファーおよび０．２５ｍｌのｎｏｖｏｚｙｍ（５０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍ  ２３４（Ｎｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）／ｍｌＫＣバッファー）を添加し、穏やかに攪拌しつつ、３０℃にて原形質体を形成させた。原形質体の形成後に、ＫＣバッファーを４５ｍｌまで添加し、その上澄をスイングバケットローター中で、４℃にて５分間、３０００ｒｐｍにて遠心分離処理した。原形質体を２０ｍｌのＫＣバッファー中に再懸濁した。次いで、２５ｍｌのＳＴＣバッファー（１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＣａＣｌ２）を添加し、次いで、混合した後に、該懸濁液をスイングバケットローター中で、４℃にて５分間、３０００ｒｐｍにて遠心分離処理し、５０ｍｌのＳＴＣバッファーに再懸濁し、再度スイングバケットローター中で、４℃にて５分間、２５００×ｇにて遠心分離処理した。この原形質体ぺレット０．３−０．６ｍｌに、６０μｌのプロテイナーゼ−Ｋ（２０ｍｇ／ｍｌ）および１ｍｌの低融点アガロース（１Ｍソルビトール／０．４５Ｍ  ＥＤＴＡ中０．８％）を添加した。攪拌によって混合した後に、この懸濁液を、予め成形したプレキシグラス型のウエルに移し、約１５分間氷上に置いた。次いで、アガロースプラグを、２．５ｍｌのサルコシル溶液（０．５ＭのＥＤＴＡ中の、１％のＮａ−ラウロイルサルコシン）に移した。６０μｌのプロテイナーゼ−Ｋ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、５０℃にて１６−２０時間インキュベートした後に、該サルコシル溶液を、１０ｍｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で置換した。５０℃にて２時間インキュベートした後、該ＥＤＴＡ溶液を１０ｍｌの新たなＥＤＴＡ溶液で置換し、５０℃にて更に２時間インキュベートした。
最後に、該ＥＤＴＡ溶液を１０ｍｌの新たな５０ｍＭＥＤＴＡ溶液で置換し、該アガロースプラグを４℃にて保存した。
【００７５】
染色体ＤＮＡアガロースプラグの制限酵素消化
１−３μｇの染色体ＤＮＡを含む、（上記のようにして調製した）ＤＮＡアガロースプラグの一部を、１ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で、３７℃にて１時間インキュベートした。この１ｍｌのＴＥ−バッファーを、新鮮なものと交換し、３７℃にて更に１時間インキュベーションを継続した。次いで、該ＴＥ−バッファーを、供給業者によって推奨されたように、各制限酵素に適したバッファー２００μｌで置換した。３７℃にて１時間のインキュベート後に、該制限酵素バッファーを、新鮮なもの（５０μｌ）と置換し、該アガロースが溶解するまで、６５℃にて１０分間インキュベートした。最後に、２０−４０単位の該適当な制限酵素を添加し、この消化混合物を、各制限酵素の供給業者によって推奨された温度にて、１６時間インキュベートした。
【００７６】
ＡｍｄＳ逆選別手順
多くの誘導されたベクターにおいて、該ａｍｄＳ選別マーカー遺伝子は、ＤＮＡ反復体間に位置している。そのために、これらベクターをもつ、実際に作成された形質転換体においては、該カセット内で、フランキングＤＮＡ反復体に対する、内部組み換えによって、あるいは単一の交差事象を介して組込みによって生成された反復体に対して相同組み換えすることによって、該ａｍｄＳ選別マーカー遺伝子を除去することが出来る。該ａｍｄＳ選別マーカーを失っている細胞の選別は、フルオロアセタミドを含有するプレート上で生育することによって達成される。該ａｍｄＳ遺伝子を係留する細胞は、フルオロアセタミドをアンモニウムおよび該細胞にとって有害なフルオロアセテートに代謝する。結果として、該ａｍｄＳ遺伝子を失った細胞のみが、フルオロアセタミドを含有するプレート上で生育できる。
【００７７】
アスペルギルス形質転換体から該ａｍｄＳマーカーを除去する場合、これら形質転換体の胞子は、１０ｍＭのアセタミドの代わりに、５ｍＭのフルオロアセタミドおよび５ｍＭのウレアム（ｕｒｅｕｍ）を、１Ｍのスクロースの代わりに１．１％のグルコースを、および２％の代わりに１．１％の微生物学的な寒天＃１（英国、Ｏｘｏｉｄ）を含有する（上記の）選別再生培地上に配置する。３０℃にて７−１０日の生育後に、単一のコロニーを収穫し、０．４％のポテトデキストロース寒天（英国、Ｏｘｏｉｄ）上に塗布した。
【００７８】
ペニシリウムの形質転換体から該ａｍｄＳマーカーを除去する場合、これら形質転換体からの胞子を、１０ｍＭのフルオロアセタミドおよび５％のグルコースを含有し、１．５％の微生物学的な寒天＃１（英国、Ｏｘｏｉｄ）で固化した、アセペルギルス最小培地上に塗布した。２５℃にて５−１０日間生育させた後に、耐性のコロニーが出現した。
【００７９】
Ｅ．コリバイオアッセイ
形質転換体を、ＹＰＤ寒天培地上で５日間生育した。Ｅ．コリＥＳＳ２２３１を、重層寒天中の指示バクテリアとして使用したが、該重層寒天はペニシリンとセファロスポリン産性間の識別を可能とすべくＢａｃｔｏペナーゼ（ｐｅｎａｚｅ）をも含み、該識別は当分野で周知の方法（Ｇｕｔｔｉｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９１，２２５：５６−６４）に従って実施した。ＣｅｆＥを発現する形質転換体は、該コロニー近傍の該重層寒天の透明化によって明らかにされた。
【００８０】
Ｐ．クリソゲナムの工業的菌株の改良
当業者には周知の標準的な変異形成およびスクリーニング法（Ｒｏｗｌａｎｄｓ，１９８４，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６：３−１０）を利用して、Ｗｉｓ５４−１２５５（ＡＴＣＣ  ２８０８９）から、Ｐ．クリソゲナム菌株ＣＢＳ  ６４９．９７を単離した（１９９７年、４月１１日付けで、オランダ国、バーンのＣｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されている）。
【００８１】
アジボイル−７−ＡＤＣＡおよびアジボイル−７−ＡＤＡＣの発酵
アジポイル−７−ＡＤＣＡおよびアジポイル−７−ＡＤＡＣの発酵による製造および定量は、３’−カルボキシメチルチオプロピオン酸の代わりに、３ｇ／ｌのアジピン酸を培地に添加したことを除いて、本質的に、２−（カルボキシエチルチオ）アセチル−および３−（カルボキシメチルチオ）プロピオニル−７−ＡＤＣＡ（ＷＯ  ９５／０４１４８）の製造について記載されている通りであった。基準基質として合成アジポイル−７−ＡＤＣＡおよびアジポイル−７−ＡＤＡＣを使用した。
【００８２】
アスペルギルスニガー振とうフラスコ発酵
組み換えおよびコントロールＡ．ニガーの、胞子の大バッチを、供給業者の指示に従って調製した、ＰＤＡ−プレート（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ，Ｏｘｏｉｄ）上に、胞子または菌糸を塗布することによって発生させた。３０℃にて３−７日生育した後に、該プレートに０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、次いで生成した胞子を集めた。無菌水で洗浄した後に、選別された形質転換体およびコントロール菌株の約１０７個の胞子を、振とうフラスコに接種した。該フラスコは、２０ｍｌの液状予備培養培地を含み、該予備培養培地は、１１当たり以下の成分を含んでいた：３０ｇのマルトース．Ｈ２Ｏ、５ｇの酵母抽出液、１０ｇの加水分解カゼイン、１ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇのＺｎＣｌ２、０．０２ｇのＣａＣｌ２、０．０１ｇのＭｎＳＯ４．４Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３ｇのＴｗｅｅｎ  ８０、１０ｍｌのペニシリン（５０００ＩＵ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（５０００  ＵＧ／ｍｌ）、ｐＨ５．５。これら培養物を、３４℃にて２０−２４時間生育させた。１０ｍｌのこの培養物を、１１当たり以下の成分を含むＡ．ニガー発酵培地１００ｍｌに接種した：７０ｇのマルトデキストリン、２５ｇの加水分解カゼイン、１２．５ｇの酵母抽出液、１ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＫ２ＳＯ４、０．５ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇのＺｎＣｌ２、０．０２ｇのＣａＣｌ２、０．０１ｇのＭｎＳＯ４．４Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１０ｍｌのペニシリン（５０００ＩＵ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（５０００ＵＧ／ｍｌ）。４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４でｐＨを５．６に調節した。これら培養物を３４℃にて６日間生育させた。該発酵ブロスから採取したサンプルを、遠心処理（スイングバケット遠心分離機で、５０００ｒｐｍにて１０分間）し、上澄を集めた。これら上澄について、グルコアミラーゼまたはフィターゼ活性に関するアッセイ（以下の記載を参照）を実施した。
【００８３】
グルコアミラーゼ活性に関するアッセイ
このグルコアミラーゼ活性は、０．０３２Ｍ  ＮａＡＣ／ＨＡＣ、ｐＨ４．０５中の該培養上澄の６倍希釈サンプル１０μｌを、０．０３２Ｍ  ＮａＡＣ／ＨＡＣ、ｐＨ４．０５中の、０．２％（ｗ／ｖ）ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ）１１５μｌと共にインキュベートすることによって決定した。室温にて３０分間インキュベートした後に、５０μｌの０．３Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を添加し、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。このＡ４０５ｎｍが、該ＧＬＡ生産の尺度である。
【００８４】
フィターゼ活性のアッセイ
振とうフラスコ−またはマイクロタイターアスペルギルスニガー発酵生成物の（必要に応じて希釈した）１００μｌの上澄（基準として１００μｌの脱塩水（ｄｅｍｉｗａｔｅｒ））を、０．２５Ｍの酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．５、１ｍＭのフィチン酸（ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ  Ｐ−３１６８）を含む混合物９００μｌに添加し、および３７℃にて３０分間インキュベートした。この反応を、１ｍｌの１０％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）の添加によって停止させる。この反応が完了した後に、２ｍｌの試薬（３．６６ｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、５０ｍｌのモリブデン酸アンモニウム溶液（２．５ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ）および８ｍｌのＨ２ＳＯ４中、脱塩水で２５０ｍｌまで希釈）を添加する。６９０ｎｍにおける青色に対する吸光度を分光光度法により測定する。測定は、０−１ｍＭ／ｌの範囲内の、燐酸塩の検量線との関係で、放出された燐酸塩の量の指標となる。
【００８５】
微生物の培養
Ｓ．クラブリゲラス菌株、ＡＴＣＣ  ２７０６４を、トリプシン大豆ブロス（Ｄｉｆｃｏ）中で、２７℃にて培養した。
【００８６】
Ｐ．クリソゲナム菌株を、完全ＹＰＤ培地（１％の酵母抽出液、２％のペプトン、２％のグルコース）中で、２５℃にて培養した。固体培地に対しては、２％のＢａｃｔｏ−アガーを添加した。形質転換体を、ＹＰＤアガー上で反復的に培養することによって精製した。単一の安定なコロニーを使用して、胞子製造用の寒天傾斜培地を調製した。
【００８７】
Ａ．ニガー菌株を、ＰＤＡ含有プレート上で、３０℃にて培養した。形質転換体を、ＰＤＡプレート上で反復的に培養することによって精製した。ここでも、単一の安定なコロニーを使用して、胞子製造用の寒天傾斜培地を調製した。
【００８８】
Ｅ．コリ菌株を、標準的な手順に従って（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）培養した。
【００８９】
実施例：Ａ．ニガー
１．１  アスペルギルスニガー宿主の選別および特徴付け
１．１．ａ  原理的説明：ゲノムにおける反復的なＤＮＡドメインの存在は、挿入された組み換え発現カセットを増幅するための手段として、遺伝子変換の利用にとって不可欠である。例えば、高いグルコアミラーゼ産性をもつＡ．ニガー菌株のｇｌａＡ遺伝子は、このような増幅されたＤＮＡドメイン上に存在する可能性がある。工業的な酵素の生産にとって適した宿主を同定するために、我々は改良されたグルコアミラーゼ産性を持つＡ．ニガー菌株につきスクリーニングした。本例において、我々は該所定のＤＮＡアンプリコンを含有する、このようなＡ．ニガー菌株を、選別し、かつ特徴付け（キャラクタリゼーション）する手順を説明する。
【００９０】
１．１．ｂ  Ａ．ニガー突然変異体の選別：
Ａ．ニガーＣＢＳ  ５１３．８８（１９８８年１０月１０日付けで寄託）から、振とうフラスコレベルで改善されたグルコアミラーゼの産性を示す、数種の変異株を選別した。変異形成は、ＵＶ−処理によってＡ．ニガーＣＢＳ  ５１３．８８の胞子について実施した。生存している胞子（約１％）を、物質＆方法において記載したような、振とうフラスコ発酵においてグルコアミラーゼを生産する能力についてテストした。６日間の生育後に、グルコアミラーゼ酵素活性を、物質＆方法において記載したように測定した。
【００９１】
６００Ｕグルコアミラーゼ／ｍｌにも及ぶ高いグルコアミラーゼ産性レベルを示す、数種のＡ．ニガー変異株を選別することが出来た。該親菌株Ａ．ニガーＣＢＳ  ５１３．８８は、約２００Ｕグルコアミラーゼ／ｍｌのレベルを達成する。最良の産性を示すＡ．ニガー変異株を、１９９７年４月１１日付けで、オランダ国バーンのＣｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｅａｕｖｏｏｒ  ＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにＡ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７として寄託した。
【００９２】
１．１．ｃ  Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７の遺伝的特性：
上記の高いグルコアミラーゼ産性が、ｇｌａＡ遺伝子座の増幅の結果であるか否かを決定するために、染色体ＤＮＡを該変異体菌株Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７およびその親菌株Ａ．ニガーＣＢＳ  ５１３．８８から単離した。単離ＤＮＡについてサザン分析を実施し、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、グルコアミラーゼ／フィターゼＤＮＡフラグメント（特許出願ＥＰ  ０４２０３５８Ａ１に記載されている、ｇｌａＡ／ｐｈｙＡ融合体：ｐＦＹＲ３由来のＥｃｏＲＩｆＢａｍＨＩフラグメント）でプローブした。オートラジオグラフは、明らかに改良されたグルコアミラーゼ変異株が、複数の（３−４）ｇｌａＡ遺伝子コピーを含むことを示している。
【００９３】
１．１．ｄ  該変異Ａ．ニガー菌株におけるｇｌａＡアンプリコンのサイズ：
ＴＡＦＥ分析は、大きなＤＮＡフラグメントが、該選別された変異Ａ．ニガー菌株中で増幅されたことを示した。物質＆方法において記載したように、該元のＡ．ニガーＣＢＳ  ５１３．８８および該Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７から誘導された。ＨｉｎｄＩＩＩおよび８点−切断制限酵素ＮｏｔＩ、ＳｗａＩ、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩによる消化を実施し、次いでｐＡＢ６−１から誘導した数種のｇｌａＡ遺伝子座特異的プローブを使用した、ＴＡＦＥ−分析にかけた（特許出願ＥＰ  ０３５７１２７Ａ１を参照）。該親および該変異株間には、上記の制限酵素による該ｇｌａＡハイブリッドＤＮＡフラグメントのサイズについて、何の差違も観測できなかった。最大のハイブリッドＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＳｗａＩを使用した全ての場合に検出され、約８０ｋｂであった。唯一の観測された差違は、該ｇｌａＡハイブリッドＤＮＡバンドの強度であった。該ハイブリッドｇｌａＡバンドの強度を正確に定量することは困難であるが、ＴＡＦＥ−オートラジオグラフは、明確に該変異株Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７が、該観測されたｇｌａＡアンプリコンの付随的なコピーを含むことを示している。
【００９４】
更に、我々は、該検出されたｇｌａＡアンプリコンの外側を切断する他の制限酵素を見出すことは出来なかった。このことは、該ｇｌａＡアンプリコンが、そのサイズにおいて、少なくとも８０ｋｂまたはそれ以上に及ぶことを意味する。
【００９５】
１．２  Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７菌株の、種々のアンプリコンにおけるｇｌａＡ遺伝子座の変性
１．２．ａ  原理的説明：
前に記載したように（特許出願ＥＰ  ０６３５５７４Ａ１）、「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ」法を利用して、Ａ．ニガーにおけるゲノムターゲット遺伝子を適当に除去できる。該特許出願において、Ａ．ニガーＣＢＳ  ５１３．８８のゲノムにおけるｇｌａＡ特異的ＤＮＡ配列をどのようにして除去するかに関する例を、詳細に記載している。記載の置換ベクターは、二重交差相同組み換えを介して、該Ａ．ニガーｇｌａＡゲノム配列に組み込む。消去ベクターは、該ｇｌａＡターゲット遺伝子座およびｇｐｄＡプロモータ配列によって誘導された該ａｍｄＳ選別性マーカー遺伝子と相同なＤＮＡ領域を含む。更に、このベクターにおいては、該ａｍｄＳ選別性マーカー遺伝子は、直列ＤＮＡ反復配列として、ｇｌａＡ配列によって両側にフランキングされ、結果として該ａｍｄＳマーカー遺伝子の適切な除去を容易にしている。
【００９６】
このようなベクターは、該ａｍｄＳマーカー遺伝子による、該ｇｌａＡ遺伝子の置換に導く。結局、これら形質転換体について、該フルオロアセタミド逆選別を実施することによって、該ａｍｄＳマーカー遺伝子は、３’−ｇｌａＡＤＮＡ直列反復配列間の、内部組み換え事象によって適切に消去し得る。
【００９７】
これは、ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ  ΔｇｌａＡ組み換えＡ．ニガーＣＢＳ  ５１３．８８菌株を与え、これは最終的に外来ＤＮＡ配列を全く含まない。
【００９８】
この「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ」法は、反復的に宿主ゲノム配列を変性し、削除するのに特に有用である。
【００９９】
本例は、一連の３つの「特別に設計された」ｐＧＢＤＥＬ置換ベクターを使用することにより、３回の連続する形質転換実験における、Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７の全ｇｌａＡプロモータおよびコード配列の適当な消去について説明する。これら３つの消去実験のために、更に３つ以上またはそれ以下の一連の、同一のｇｌａＡ遺伝子−置換ｐＧＢＤＥＬベクターを溝築し、使用した。各ｐＧＢＤＥＬベクター中に、固有の制限酵素識別ＤＮＡ配列を含める理由は、誘導されたΔｇｌａＡ組み換えＡ．ニガー菌株中の、各切り捨てｇｌａＡ遺伝子座を、サザン分析によって（実施例１．２．ｅに記載されている）別々に識別し、かつ可視化するためである。各ｐＧＢＤＥＬベクターの固有の制限サイトは、該切り捨てｇｌａＡ遺伝子座の５’−ボーダーに位置する。しかし、各ｐＧＢＤＥＬベクターにおいて、該ｇｌａＡ遺伝子座の一つにおける該遺伝子−置換ベクターの攻撃に導く、該包含されるｇｌａＡ配列は、僅かに異なっている。その結果、該Ａ．ニガー宿主における各切り捨てｇｌａＡ遺伝子座も、僅かに異なっている。この僅かな相違を含む理由は、コロニーに関する迅速ＰＣＲテスト、即ち所謂「ＤＮＡ−フラッグ」テストによって、各切り捨てｇｌａＡ遺伝子座を可視化することにある（第１図）。不可欠ではないが、この組み込まれたＤＮＡの特徴は、Ａ．ニガーのｇｌａＡアンプリコン間の遺伝子変換事象に関する、本明細書に記載した現象の助けを借りて、該（フィターゼ）発現カセットを増幅するための「溝築」過程を追跡するのに特に有用であり、該カセットは、該Ａ．ニガー宿主のこれら切り捨てｇｌａＡ遺伝子座の一つをターゲットとする。Ａ．ニガーのｇｌａＡアンプリコン間の該変換事象を利用する、酵素製造のための、ｒＤＮＡ株を誘導するためのこの「溝築」過程の詳細は、以下に記載される（実施例１．５および１．６）。
【０１００】
１．２．ｂ  ｇｌａＡ置換ｐＧＢＤＥＬベクターの説明：
あらゆる溝築されたｐＧＢＤＥＬ置換ベクターは以下のものを含む：
−ｇｌａＡプロモータ配列における固有のＸｈｏＩサイト上流側の、ＨｉｎｄＩＩＩサイトから、ｐＧＢＤＥＬ−５では２００ｂｐまで、ｐＧＢＤＥＬ−９では１８０ｂｐまで、およびｐＧＢＤＥＬ−１１では１４０ｂｐまでの、２ｋｂのサイズを持つ５’−ｇｌａＡターゲット配列；
−該ｇｌａＡ停止コドンから、ＳａｌＩサイトまでの、２ｋｂのサイズを持つ３’−ｇｌａＡターゲット配列；
−ｇｐｄＡプロモータの制御下にある選別性のマーカーとしての、該ａｍｄＳ遺伝子；
−後の該ａｍｄＳ選別性マーカー遺伝子の除去を容易にする、２つの１ｋｂサイズの３’−ｇｌａＡＤＮＡ直列反復配列；
−該ｇｌａＡ切り捨て部に位置する、付随的な制限サイト（ｐＧＢＤＥＬ−５におけるＢａｍＨＩ、ｐＧＢＤＥＬ−９におけるＳａｌＩおよびｐＧＢＤＥＬ−１１におけるＢｇｌＩＩ）。
【０１０１】
これらｐＧＢＤＥＬ置換ベクターの使用によって、Ａ．ニガー宿主における４．３ｋｂのｇｌａＡ配列は、後に消去されることになり、２ｋｂサイズのｇｌａＡプロモータ配列（該ＸｈｏＩ上流側の、ｐＧＢＤＥＬ−５、ｐＧＢＤＥＬ−９およびｐＧＢＤＥＬ−１１夫々における２００、１８０ｂｐまたは１４０ｂｐから、該開始コドンまで）および全ｇｌａＡコード配列を含む。
【０１０２】
１．２．ｃ  ｐＧＢＧＬＡ中間ベクターの溝築：
この中間ベクターｐＧＢＧＬＡ１６を溝築するために、２つのオリゴヌクレオチド（３０／３１）を合成した。これらは酵素制限サイト：ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩを含んでいる。オリゴは、５’−末端においてＨｉｎｄＩＩＩ制限サイトと適合され、また３’−末端においてＥｃｏＲＩ制限サイトと適合された。ＰＴＺ１８Ｒへのこのオリゴヌクレオチドの挿入により、該ＥｃｏＲＩサイトは破壊されるであろう。
【０１０３】
オリゴヌクレオチド３０および３１両者を、プラスミドｐＴＺ１８Ｒの該ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトに、クローニングした。コントロール消化を、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに対する所定の酵素制限サイトが適切に組み込まれるか、および該ＥｃｏＲＩサイトが破壊されるかを確認するために実施した。誘導されたプラスミドを、ｐＴＭ１（第３図参照）と命名した。
【０１０４】
ｐＴＭ１から、該ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ  ＤＮＡフラグメントを単離し、かつ両制限酵素で消化した後に、ゲル電気泳動によって精製し、ＰｇｐｄＡ／ａｍｄＳ配列を含む、ｐＧＢＤＥＬ４ＬのＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩフラグメントを挿入した。このｐＧＢＤＥＬ４Ｌの溝築は、我々の以前の特許出願（ＥＰＡ  ０６３５５７４Ａ１）に詳しく記載されている。ｐＧＢＤＬ４Ｌは、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ（最後のものは、同一のサイズを持つｐＧＢＤＥＬ４Ｌの、別のＤＮＡフラグメントの分子クローニングを防止するためである）によって消化した。ＰｇｐｄＡ／ａｍｄＳ配列を含む、この正確なＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ  ＤＮＡフラグメントを、ゲル電気泳動によって精製し、かつｐＴＭ１の該ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩサイトにクローニングした。この中間ベクターを、ｐＧＢＧＬＡ１６と命名した（第３図参照）。
【０１０５】
この２．２ｋｂサイズの３’−ｇｌａＡ配列を、該ｐＧＢＧＬＡ１６に適切に挿入するために、該フラグメントを、まず幾分か変更する必要がある。融合ＰＣＲを、ｐＡＢ６−１を鋳型として、また２組のオリゴヌクレオチドをプライマー（３２／３３および３４／３５）として用いて実施して、２．２ｋｂの３’−ｇｌａＡ配列内の該ＫｐｎＩ制限サイトを破壊し、かつ該５’−ボーダー（ＫｐｎＩ）および該３’−ボーダー（ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ）に適当なクローニングサイトを生成した。鋳型ｐＡＢ６−１は、ｐＵＣ１９中の１６ｋｂの大きなＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含み、これは該ｇｌａＡゲノム遺伝子座を含む（分子クローニングは、ＥＰＡ  ０３５７１２７Ａ１に詳細に記載されている）。
【０１０６】
この第１のＰＣＲにおいては、オリゴヌクレオチド３２および３３をプライマー群として使用して、該３’−ｇｌａＡ配列の一部（１ｋｂ）を増幅した。該第２のＰＣＲにおいては、オリゴヌクレオチド３４および３５を使用して、該３’−ｇｌａＡフランキングの残りの１．２ｋｂ配列を増幅した。
【０１０７】
ゲル電気泳動によって精製した後に、増幅したフラグメント両者を、プライマー群としてオリゴヌクレオチド３２および３５を使用した、融合ＰＣＲにおける鋳型として使用した。このＰＣＲ融合を、第４図に模式的に示す。この得られた２．２ｋｂの３’−ｇｌａＡ  ＰＣＲ融合フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製し、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、分子クローニングによって、ｐＧＢＧＬＡ１６のＫｐｎＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入して、ｐＧＢＧＬＡ１８を得た（第４図参照）。
【０１０８】
１．２．ｄ  ｇｌａＡ置換ｐＧＢＤＥＬベクターの溝築：
該３つの最終的なｐＧＢＤＥＬベクターを得るに際して、該５’−ｇｌａＡターゲット配列、各ベクターに対する固有の制限サイト、および直列反復体としての該１ｋｂの３’−ｇｌａＡ配列を、ｐＧＢＧＬＡ１８の該ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入する必要がある。そのために、３回の別々の融合ＰＣＲを実施して、ｐＧＢＤＥＬ５、−９および−１１を溝築した。
【０１０９】
ｐＧＢＤＥＬ５の溝築
第１のＰＣＲを実施して、２つの合成オリゴヌクレオチドで、該３’−ボーダーにおける該５’−ｇｌａＡターゲット配列を変性した。該合成オリゴヌクレオチドは、ｐＵＣ１９のヌクレオチド配列の一部、該５’−ｇｌａＡ配列のＨｉｎＩＩＩサイトを含む３６および該ｇｌａＡプロモータにおける該ＸｈｏＩサイトの上流約２００ｂｐに一致し、付随的なＢａｍＨＩサイト、全ての読み取り枠における停止コドンおよび該１ｋｂの３’−ｇｌａＡ直列反復配列の、初めの１８ヌクレオチド（５’−ボーダー）をも含む、オリゴヌクレオチド３７である。該第２のＰＣＲを実施して、該５’−ボーダーにおける該３’−ｇｌａＡ直列反復配列を、オリゴヌクレオチド３８および３９を使用して変性した。ここで、オリゴヌクレオチド３８は、オリゴヌクレオチド３７の逆配列を持つものであり、オリゴヌクレオチド３９は、該３’−ｇｌａＡ直列反復配列の該ＥｃｏＲＩサイト近傍の配列と整合するものであり、これらには、夫々ｐＴＺ１８ＲおよびｐＧＢＧＬＡ１８にクローニングするのに適した、該制限サイトＸｂａＩおよびＮｏｔＩが付加されている。これら両ＰＣＲ増幅においては、ｐＡＢ６−１を鋳型として使用した。これら両ＰＣＲ増幅の増幅されたＤＮＡフラグメントを、ゲル電気泳動によって分離し、プライマーとしての３６および３９と共に、該融合ＰＣＲにおける鋳型として使用した。この得られた３ｋｂサイズのＤＮＡ融合フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、次いでｐＧＢＧＬＡ１８の適当なサイトに分子クローニングして、第１の遺伝子置換ベクターｐＧＢＤＥＬ５を生成した（第５図参照）。
【０１１０】
ＰＧＢＤＥＬ９の溝築
該第１のＰＣＲを、（上記のような）オリゴ３６および４９を使用して実施した。ここで、該オリゴは、該ｇｌａＡプロモータにおける該ＸｈｏＩサイトの上流約１８０ｂｐと一致し、付随的なＳａｌＩサイト、全ての読み取り枠における停止−コドンおよび該１ｋｂ３’−ｇｌａＡ直列反復体の初めの１８ヌクレオチド（５’−ボーダー）を含む。該第２のＰＣＲを実施して、該５’−ボーダーにおける該３’−ｇｌａＡ直列反復体を、４９の逆であるオリゴヌクレオチド５０およびオリゴヌクレオチド３９によって変性した。
【０１１１】
これら両ＰＣＲ変性においては、ｐＡＢ６−１を鋳型として使用した。これら両ＰＣＲにおける増幅されたＤＮＡフラグメントを、ゲル電気泳動によって精製し、プライマーとしてのオリゴ３６および３９と共に、該融合ＰＣＲにおける鋳型として使用した。この得られた３ｋｂサイズのＤＮＡ融合フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、次いでｐＧＢＧＬＡ１８の適当なサイトに分子クローニングして、第２のｇｌａＡ遺伝子置換ベクターｐＧＢＤＥＬ９を得た（第６図参照）。
【０１１２】
ＰＧＢＤＥＬ１１の溝築  該第１のＰＣＲを、オリゴ３６および５１を使用して実施した。ここで、該オリゴは、該ｇｌａＡプロモータにおける該ＸｈｏＩサイトの上流約１４０ｂｐと一致し、これは付随的なＢｇｌＩＩサイト、全ての読み取り枠中の停止コドンおよび該１ｋｂ３’−ｇｌａＡ直列反復配列の、最初の１８ヌクレオチド（５’−境界）を含む。該第２のＰＣＲを実施して、該５’−ボーダーにおける該３’−ｇｌａＡ直列反復配列を、オリゴ５１の逆のオリゴヌクレオチド５２およびオリゴヌクレオチド３９で変性した。
【０１１３】
これら両ＰＣＲ増幅においては、ｐＡＢ６−１を鋳型として使用した。これら両ＰＣＲの、増幅されたＤＮＡフラグメントを、ゲル電気泳動によって分離し、プライマーとしてのオリゴ３６および３９と共に、該融合ＰＣＲにおける鋳型として使用した。この得られた３ｋｂサイズのＤＮＡ融合フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、次いでｐＧＢＧＬＡ１８の適当なサイトに分子クローニングして、第３のｇｌａＡ遺伝子置換ベクターｐＧＢＤＥＬ１１を得た（第７図参照）。
【０１１４】
１．２．ｅ  ｇｌａＡプロモータおよびコード配列の削除およびＡ．ニガーへの特異的「ＤＮＡ−フラッグ」の組込み：
本実施例においては、Ａ．ニガー６４６．９７中に存在する３種全てのｇｌａＡ遺伝子の、３回の連続する形質転換実験において、該ｐＧＢＤＥＬベクターおよび該「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ」技術を利用した、連続的な削除について説明する。
【０１１５】
ｐＧＢＤＥＬベクターをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで線状化することによって、および該ｒＤＮＡカセットが、該宿主ゲノムの該ｇｌａＡターゲット遺伝子座に相同なＤＮＡ配列によってフランキング状態にあると言う事実によって、ｐＧＢＤＥＬベクターは、該宿主の該ｇｌａＡ遺伝子座の一つにおいて、二重交差事象によって組み込まれ、該ｐＧＢＤＥＬベクターの該切り捨てｇｌａＡ遺伝子座による、該ｇｌａＡ配列の置換をもたらすであろう。
【０１１６】
しかし、ｐＧＢＤＥＬベクターの、二重交差事象による攻撃の頻度は、制限されており、かつ該宿主の該ｇｌａＡゲノムターゲット遺伝子座の数に依存する。従って、両フランキング部に、２ｋｂサイズのｇｌａＡ相同ベクターを含む、線状化されたベクターを使用したとしても、依然として、生成する形質転換体の大多数は、ランダムに組み込まれたベクターを含む。
【０１１７】
しかし、所定の遺伝的な特徴を持つ形質転換体を、ａ）該ＰＣＲに基くＤＮＡ−フラッグテスト、ｂ）ターゲット特異的ＰＣＲ−手順およびｃ）物質＆方法において詳細に示されたサザン分析によって、容易に選別し、かつ明らかにすることができる。
【０１１８】
最後に、一旦適当な形質転換体の存在を、遺伝的に立証した後に、該ａｍｄＳマーカー遺伝子を、上記のフルオロアセタミド逆選別手順を適用して、除去した。
【０１１９】
該ＰｇｐｄＡ／ａｍｄＳマーカー遺伝子カセットがフランキング状態にある、３−ｇｌａＡ  ＤＮＡ反復体の組込みのために、各実験後に、該ａｍｄＳ選別マーカーは、内部組み換え事象によって排除された。かくして得た改良Ａ．ニガー菌株を、連続的な形質転換実験にかけて、残りのｇｌａＡ遺伝子座を排除または変性した。
【０１２０】
Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７中に存在する第１のｇｌａＡアンプリコンの、ｐＧＢＤＥＬ５による変性：
ＡニガーＣＢＳ６４６．９７を、５μｇの線状化された（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ）ｐＧＢＤＥＬ５  ＤＮＡによって形質転換した。形質転換体を、アセタミドおよび選択培地上で繰り返し生育させた後に調製された胞子を含有する、選択プレート上で選別した。
【０１２１】
限られた数の形質転換体を選別し、単離した染色体ＤＮＡを、プローブとして該２．２ｋｂ  ＳａｌＩ３’−ｇｌａＡフラグメント、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ消化物および該５’−ｇｌａＡＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩを使用したサザン分析で徹底的に解析した。該宿主菌株の該△ｇｌａＡ遺伝子座の、該ＢａｍＨＩハイブリダイゼーションパターンと、該形質転換体の２つの残りのΔｇｌａＡ遺伝子座との比較については、第８図を参照のこと。
【０１２２】
第９図に示したように、予想されるハイブリダイゼーションパターンを示す形質転換体を選別した。
【０１２３】
次いで、これら形質転換体について、上記の逆選別手順を実施した。胞子を、フルオロアセタミド含有培地（詳細については、物質＆方法の項を参照）に接種した。平均して、該接種した胞子の１−２％が、これら選別条件にて生育できた。プライマーとしてａｍｄＳ特異的オリゴ１５および１６を使用して、菌糸について直接実施した、カセットＰＣＲ解析は、全ての生育した細胞が、該ａｍｄＳマーカー遺伝子を失った、組み換え細胞であることを、実際に明らかにした。しかしながら、驚いたことに、多くの組み換え細胞に関する詳細なサザン分析が、多くの場合において（約９０％の頻度）、一種の切り捨てｇｌａＡ遺伝子座および二種の残りの元のｇｌａＡ遺伝子座に対する予想されたパターンではなく、該親菌株６４６．９７に対してのみ特徴的な、ハイブリダイゼーションパターンが観測された。更に、ハイブリッド化ＤＮＡフラグメントの強度は、ｇｌａＡアンブリコンの数が、これらａｍｄＳ−ネガティブな菌株において減衰しないことを指摘した。該細胞の約１０％が、第１０図に示したように、予想されたハイブリダイゼーションパターンを示す。従って、これらの場合においては、該ａｍｄＳマーカー遺伝子は、予想されるように、該フランキング３’−ｇｌａＡ直列反復配列に渡り、該内部組み換え事象を介して、実際に除去された。
【０１２４】
該ａｍｄＳ−ネガティブな菌株の殆どにおける、この予想外の組み換え事象は、遺伝子−変換と呼ばれる、遺伝的現象の発生によってのみ説明できる。後に（実施例１．５および１．６）使用される、特徴の一つは、該Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７宿主の該切り捨てｇｌａＡアンプリコンの一つにおいて攻撃された、酵素コード発現カセットを増幅することにある。
【０１２５】
第１０図に示したように、一つの切り捨てｇｌａＡ遺伝子座および二つの元のｇｌａＡ遺伝子座に対するハイブリダイゼーションパターンを示す、ａｍｄＳ−ネガティブ菌株を、Ａ．ニガーＧＢＡ−２０１と命名し、ｐＧＢＤＥＬ−９による第２の形質転換にかけた。
【０１２６】
ＡニガーＣＢＳ  ６４６．９７の第二のｇｌａＡアンプリコンの、ｐＧＢＤＥＬ９による変性  Ａ．ニガーＧＢＡ−２０１を、５μｇの線状化した（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ）ｐＧＢＤＥＬ９  ＤＮＡによって形質転換した。形質転換体を、再度アセタミドおよび選択培地上で繰り返し生育させた後に調製された胞子を含有する、選択プレート上で選別した。ｐＧＢＤＥＬ９の攻撃は、該宿主の前の「ＢａｍＨＩ−標識」ｇｌａＡ切り捨て遺伝子座上でも起こり得るので、これら形質転換体だけを選別し、かつサザン解析によって分析したところ、依然としてこの切り捨て「ＢａｍＨＩ」ｇｌａＡ遺伝子座の存在を示した。そのため、該ＰＣＲを基にした「ＤＮＡ−フラッグ」テストを、これら形質転換体の菌糸について実施した。
【０１２７】
該「ＢａｍＨＩ」切り捨てｇｌａＡ遺伝子座に対して特徴的な該２００ｂｐのＤＮＡフラグメントの存在を示す、形質転換体のみを、該ＰＣＲ法によって分析し、次いで上記のように徹底的なサザン分析を行った。
【０１２８】
次いで、該正確なハイブリダイゼーションパターンを示す（第１０図）形質転換体の胞子を、フルオロアセタミド含有培地（詳細については、物質＆方法の項参照）に接種した。ここでも、平均して、該接種した胞子の１−２％が、これら選択条件にて生育可能であった。これら全てが、これらマロニーの菌糸に対して該カセットＰＣＲテストを適用することによって明らかになるように、該ａｍｄＳ遺伝子を喪失しているものと考えられた。
【０１２９】
第二の選択基準として、該「ＤＮＡ−フラッグ」テストを実施した。夫々、該「ＢａｍＨＩ」切り捨てｇｌａＡアンプリコンおよび「ＳａｌＩ」切り捨てｇｌａＡアンプリコンの存在に対して特徴的な、該所定のＤＮＡ−フラッグパターン（２００および２２０ｂｐの、２つのバンド）を示す、形質転換体のみを、上記のような詳細なサザン分析にかけた。
【０１３０】
２つのｇｌａＡ切り捨てアンプリコンおよび１つの元のｇｌａＡアンプリコンに対するハイブリダイゼーションパターンを示す（第１２図）、一つのａｍｄＳ−ネガティブ菌株を、Ａ．ニガーＧＢＡ−２０２と命名し、ｐＧＢＤＥＬ−１１による第３の形質転換に付した。
【０１３１】
Ａ．ニガーＣＢＳ  ６４６．９７における第３のｇｌａＡアンプリコンのｐＧＢＤＥＬ１１による変性：
Ａ．ニガーＧＢＡ−２０２を、５μｇの線状化した（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ）ｐＧＢＤＥＬ−１１  ＤＮＡによって形質転換した。形質転換体を、再度アセタミドおよび選択培地上で繰り返し生育させた後に調製された胞子を含有する、選択プレート上で選別した。この場合にも、ｐＧＢＤＥＬ−１１の攻撃は、該宿主の前のｇｌａＡ切り捨てアンプリコンの一種上で起こり得る。該「ＤＮＡ−フラッグ」テストを実施することによって、これら形質転換体のみを選別し、かつサザン分析によって解析したところ、依然として２００および２２０ｂｐフラグメントの存在を示したが、これらは前の２つの切り捨て「ＢａｍＨＩ」および「ＳａｌＩ」ｇｌａＡアンプリコンに対応する。
【０１３２】
第１３図に示すような正確なハイブリダイゼーションパターンを示す形質転換体を、該逆選別手順にかけて、マーカー遺伝子を含まない組み換え体を得た。ここでも、平均して、該接種した胞子の１−２％が、これら選別条件にて生育できた。
【０１３３】
これら全てが、そのＰｇｐｄＡ／ａｍｄＳマーカー遺伝子カセットを喪失していることが分かった。このことは、これらコロニーの菌糸に対して該ａｍｄＳカセットＰＣＲ−テストを適用することにより明らかになった。
【０１３４】
第二の選別基準として、該「ＤＮＡ−フラッグ」テストを実施した。夫々、「ＢａｍＨＩ」並びに「ＳａｌＩ」および「ＢａｌＩＩ」切り捨てｇｌａＡアンプリコンの存在を示す、３つのバンド（２００、２２０および３００ｂｐ）をもつ所定のＤＮＡ−フラッグパターンを示す、該形質転換体のみを、上記の詳細なサザン分析にかけた。３種全ての切り捨てｇｌａＡアンプリコンに対するハイブリダイゼーションパターン（第１４図）を示す、１種のａｍｄＳ−ネガティブ菌株を、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５と命名した。
【０１３５】
１．３．ｐＧＢＡＡＳ−１およびｐＧＢＴ０ＰＦＹＴ−１発現ベクターの説明および溝築１．３．ａ原理的説明：
ある酵素に対する発現カセットを含むｐＧＢＴＯＰベクターを、ａｍｄＳ選択性マーカー遺伝子含有ベクターとの、同時形質転換によって、該Ａ．ニガー宿主菌株に導入する。ここで後者のベクターは、ｐＧＢＡＡＳ−１と命名される。これら両ベクターは、Ａ．ニガー宿主菌株のｇｌａＡ遺伝子座と相同な２つのＤＮＡドメインを含み、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５の該切り捨てｇｌａＡ遺伝子座の１種に対する線状化されたプラスミドの攻撃を誘導する。夫々２ｋｂのサイズを持つこれらドメインは、下流側の非コード性ｇｌａＡ配列と相同であり、かつ３’−および３”−ｇｌａＡドメインとして特定される。これらドメイン間には、固有の制限サイト（ｐＧＢＡＡＳ−１ではＸｈｏＩおよびｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１ではＨｉｎｄＩＩＩ）が組み込まれて、Ｅ．コリｐＴＺ１８Ｒクローニングベクターの除去後、消化による形質転換前に、該宿主の該ｇｌａＡターゲット遺伝子座に対して相補性のＤＮＡ酵素制限末端を与える。
【０１３６】
ＰＧＢＡＡＳ−１において、該ａｍｄＳ遺伝子は、強力なｇｐｄＡプロモータによって始動される。このようなプロモータを使用することによって、得られる形質転換体の大多数は、只一つの組み込まれた選別マーカーカセットをもつであろう。このような形質転換体を入手することは、以下の段階を実施する上で重大である。即ち、以前に記載したＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ技術の適用による、ＭＡＲＫＥＲＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ組み換え菌株の選別。多数のａｍｄＳ遺伝子の存在は、「一段階逆選別手順」における、該遺伝子を除去する頻度に、確実に影響を与え、あるいは除去を不能にさえするであろう。
【０１３７】
ｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１において、ｐｈｙＡはＰｇｌａＡによって始動される。既に、上に示したように、このベクターの組成は、線状化された発現カセットが、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５における該ｇｌａＡターゲット遺伝子座の一つにおいて組み込まれるように設計されている。両者共に該宿主ゲノムの同一のｇｌａＡターゲット遺伝子座をターゲットとし、只一回の形質転換実験によって得られる、該コーベクターの単一のコピーを持つもの（最終的にＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ組み換え菌株を得る必要がある）に対して、該発現カセットの複数のコピーを含む形質転換体を得るためには、両カセットの線状化されたＤＮＡフラグメントの比が重要である。
【０１３８】
３．１．ｂ  組み換えベクターｐＧＢＡＡＳ−１の溝築
ｐＧＢＡＡＳ−１の溝築に関連する全ての詳細は、以前の我々の特許出願の一つＥＰＡ０６３５５７４Ａ１に見出すことが出来る。この特許出願において、該ａｍｄＳ選別マーカー遺伝子ベクターｐＧＢＧＬＡ−５０を、詳細に記載している。命名の理由のみに関連して、後にこのベクターは、ｐＧＢＡＡＳ−１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ＡｍｄＳ  Ｓｈｕｔｔｌｅ）として、再度命名した。物理的地図については、第１５図を参照のこと。
【０１３９】
３．１．ｃ  該組み換えベクターｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１の溝築
該ｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１の溝築も、上記と同一の特許出願に見出すことができる。この特許出願において、該フィターゼ発現ベクターｐＧＢＧＬＡ−５３が、詳細に説明されている。ここでも、命名の理由のみに関連して、この発現ベクターは、後に、ｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１（Ｔｏｏｌ  ｔｏ  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）として、再度命名した。物理的地図については、第１６図を参照のこと。
【０１４０】
１．４  全てＡ．ニガーＩＳＯ−５０５の１種の切り捨てｇｌａＡアンプリコンをターゲットとする、１または複数の多重フィターゼ発現カセットを含む、ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ、フィターゼ産性Ａ．ニガー菌株の開発
１．４．ａ原理的説明：
この実施例の目的は、発現カセット（ただ一つまたは複数のコピー）が、完全に、選別性のマーカー遺伝子をもつベクターによる、同時形質転換によって、宿主細胞のゲノム中の予め特定されたターゲット遺伝子座に導き得るかを示すことにある。第二の部分では、該ターゲット（複数）酵素発現カセットを失うこと無しに、内部組み換え事象によって、該選別性マーカー遺伝子を除去する方法を示す。
【０１４１】
この場合、選択されたターゲット遺伝子座は、該ｇｌａＡ停止コドンの直ぐ下流に位置する４ｋｂのｇｌａＡ配列である。線状化されたプラスミドｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１およびｐＧＢＡＡＳ−１両者の組込みは、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５菌株の切り捨てられかつ標識されたｇｌａＡ遺伝子座の一つにおける、単一の交差事象を介して起こる。
【０１４２】
最終的なＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ組み換え体を得るために、該宿主ゲノムの同一の標識されたｇｌａＡ遺伝子座にて、適当な様式で攻撃目標とされる両プラスミドをもつ形質転換体のみを、後のフルオロアセタミド逆選別手順のために選択するであろう。
【０１４３】
１．４．ｂ  線状化されたｐＧＢＡＡＳ−１およびｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１  ＤＮＡをもつＡ．ニガーＩＳＯ−５０５の同時形質転換：
両プラスミドｐＧＢＡＡＳ−１およびｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１を、夫々ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することによって線状化した。２．８ｋｂのＥ．コリクローニング配列を、形質転換前に、ゲル電気泳動によって除去した。夫々、ｐＧＢＡＡＳ−１およびｐＧＢＴＯＰＦＴＹ−１の線状化ＤＮＡ  １〜５μｇを、物質＆方法の項に記載したように、Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５の形質転換のために使用した。形質転換体をアセタミドプレート上で選別した。これら形質転換体の胞子を、各コロニーをＰＤＡ−プレート上に塗布することによって単離した。約５００個の形質転換体を、該カセットＰＣＲ−テストにかけた。
【０１４４】
１．４．ｃ  同時形質転換体の選別：
該ａｍｄＳマーカー遺伝子並びに該ｐｈｙＡ発現カセットをもつ形質転換体を、プライマーとしてフィターゼ特異的オリゴヌクレオチド４２／４３を使用して、該カセットＰＣＲテストによって同定した。１または複数のｐｈｙＡ発現カセットを含む正の形質転換体が、サイズ４８２ｂｐをもつ特異的ＤＮＡバンドを示すであろう。同時形質転換頻度は、１０〜５０％の範囲で変動した。
【０１４５】
１．４．ｄ  攻撃されたａｍｄＳ＋、ｐｈｙＡ＋同時形質転換体の選別：同定された同時形質転換体について、２組のオリゴヌクレオチド４６１４７（プライマーセット１）および４６’４８（プライマーセット２）を使用したターゲットＰＣＲテストを実施した。これら２組のブライマーセットの一方について正の結果（４．２ｋｂＤＮＡフラグメントの増幅、第１７図参照）を示す、同時形質転換体を選別した。負の結果は、全てのカセットがランダムに組み込まれたことを示し、プライマーセット１または２についての正の結果は、該ｐｈｙＡまたはａｍｄＳが、夫々該ｇｌａＡターゲット遺伝子座に隣接して位置することを示す。５−５０％の範囲の該同時形質転換体が、正であることが分かった。
【０１４６】
限られた数の同定された菌株が、詳細なサザン分析のために選択された。
【０１４７】
１．４．ｅ  サザン分析による攻撃されたａｍｄＳおよびｐｈｙＡ攻撃された同時形質転換体の遺伝的解析：
染色体ＤＮＡを単離し、該ａｍｄＳおよびプローブとしての２．２ｋｂのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  ３”−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントとハイブリッド化した、ＢｇｌＩＩ消化物を使用して、サザン分析を実施した。主として観測された６つのＤＮＡハイブリダイゼーションパターンを、模式的に第１８〜２３図に示す。単一のａｍｄＳコピーおよび１または複数のｐｈｙＡカセットもつものとして特徴付けられる、ハイブリダイゼーションパターン（第２０〜２３図）を示す同時形質転換体を、フルオロアセタミド逆選別手順にかけて、最終的に該ａｍｄＳ選別マーカー遺伝子を除去した。
【０１４８】
１．４  ｆａｍｄＳ遺伝子を含まない（ａｍｄＳ−）フィターゼ産性菌株の選別：
該ａｍｄＳ発現カセットのターゲット組込みによって作成した、該直列反復体に渡る組み換えは、該ａｍｄＳカセットの喪失に導き、かつフルオロアセタミド培地上で選別可能となる。
【０１４９】
ここでは、我々は、フルオロアセタミド逆選別手順を使用して、依然として該隣接（多重）組込みｐｈｙＡ発現カセットを含んでいる、ａｍｄＳを含まない組み換え菌株の選別について説明する。選別したターゲットａｍｄＳ＋／ｐｈｙＡ＋同時形質転換体の胞子を、フルオロアセタミドプレートに塗布した。初めに、生育したコロニーを、幾つかの連続するＰＣＲに基くテストによって分析した。まず、全ての子孫を、その遺伝子型、ａｍｄＳ−についてテストした。ａｍｄＳ−遺伝子型の選別は、物質＆方法の項に記載したように、該ａｍｄＳ特異的プライマーを使用して、コロニーについて該カセットＰＣＲテストを実施することにより行った。しかし、驚いたことに後のＰＣＲに基く「ＤＮＡ−フラッグ」テストでは、該子孫全体において、全ｇｌａＡアンプリコンも失われた。更に、多くのａｍｄＳ−組み換え体においても、ｐｈｙＡ特異的プライマーセットを使用して実施した第３のＰＣＲ−テストにみられるように、該ターゲットｐｈｙＡカセットが失われた。
【０１５０】
これら結果は、遺伝子変換として知られる、一つの現象の出現によってのみ説明できる。幾つかの場合においては、寧ろ大きなＤＮＡフラグメントまたは完全なｇｌａＡアンプリコン（≧８０ｋｂ）のサイズにも及ぶフラグメントが、別のｇｌａＡアンプリコンで置換された。しかしながら、多くの子孫（９０％を越える）において、全ｇｌａＡアンプリコンが、削除されるものと考えられた。従って、観測された結果を全体としてみれば、アンプリコン変換および削除については、より適切である。観測された現象を利用して、同時形質転換体における全てのａｍｄＳおよびｐｈｙＡカセットが、同一の切り捨てｇｌａＡ遺伝子座を標的とするか、およびその何れであるかを決定した。これを決定するために、各同時形質転換体のただ一つまたは２つのフルオロアセタミド耐性コロニーを、ｐｈｙＡおよび「ＤＮＡ−フラッグ」オリゴヌクレオチドプライマーセットを使用した、混合ＰＣＲ−テストを実施して、その何れが該遺伝子型：ａｍｄＳ−／ｐｈｙＡ−／ｇｌａＡ−アンプリコン２＋を与えるかについてテストした。その結果は、同時形質転換体が、該３つのｇｌａＡアンプリコンの内の一つに組み込まれたａｍｄＳおよびｐｈｙＡカセットをもつことが明らかであることを示す。引き続き、このような同定された同時形質転換体から、付随的な子孫を、ｐｈｙＡおよび「ＤＮＡ−フラッグ」プライマーセットを使用した、混合ＰＣＲ−テストを適用することによってテストした。該所定の遺伝子型：ａｍｄＳ−／ｐｈｙＡ＋／ｇｌａＡ−アンプリコン３＋は、個々の同時形質転換体の子孫において、大きく（１〜２０％）変動した。この頻度は、該予備選別同時形質転換体の、該ｇｌａＡアンプリコンのａｍｄＳおよびｐｈｙＡカセットの遺伝子組成に大きく依存することを示した。
【０１５１】
複数のカセットが一つのｇｌａＡ遺伝子座において攻撃される、同時形質転換体の場合において、多くの反復体が生成される。該フルオロアセタミド逆選別手順の結果は、該ａｍｄＳカセットの喪失が様々な様式で現れ、数の異なるｐｈｙＡカセットをもつａｍｄＳ−を与える。
【０１５２】
このため、各予備選別された同時形質転換体の幾つかの子孫組み換え体が、選別される（全て該所定のａｍｄＳ−／ｐｈｙＡ＋／ｇｌａＡ−アンプリコン３＋遺伝子型を示す）が、異なる数の残留ｐｈｙＡカセットを含む。
【０１５３】
このような子孫菌株に関する予備選別は、上記のＰＣＲテストにおける、該３つのｇｌａＡアンプリコンを表す、ＤＮＡバンドに対して、増幅されたｐｈｙＡ特異的ＤＮＡバンドの強度における差を比較することによって容易に行うことが出来る。
【０１５４】
最後に、選別されたａｍｄＳ子孫の遺伝子組成を確認するために、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌｌｌによって消化され、特異的プローブとしての２．２ｋｂ  ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  ３’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントとハイブリッド化された染色体ＤＮＡについて、サザン分析を実施した。該ＢａｍＨＩ−標識ｇｌａＡアンプリコンの一つにおいて攻撃された１、２または３個のｐｈｙＡカセットをもつものに対する、第２４図に示されたようなハイブリダイゼーションパターンを示す菌株を選別し、それぞれをＡ．ニガーＮＰ５０５−１、−２および−３と命名した。
【０１５５】
該フィターゼカセットを、該他の２つのｇｌａＡアンプリコンの一つにもつ菌株と共に、これら菌株を、引き続きそのフィターゼを生産する能力についてテストした。
【０１５６】
物質＆方法の項に示したように、振とうフラスコ発酵を実施した。その上澄における該フィターゼ活性の測定は、全ての菌株が、ｐｈｙＡ遺伝子コピー当たり、同一の量（１００Ｕ／ｍｌ）のフィターゼを生産すること、および該ｐｈｙＡ遺伝子が局在している該ｇｌａＡアンプリコンには無関係であることを明らかにした。
【０１５７】
１．５  フィターゼカセットにおける１から２への増加を含む変換体の選別
１．５．ａ  原理的説明：
ＤＮＡアンプリコンにおいて攻撃された、発現カセットのコピー数は、遺伝子変換を介して高めることができる。結局、該遺伝子によってコードされる酵素の生産性を高めることができる。ここでは、我々は、高いフィターゼ産性を示すｐｈｙＡ変換体の選別およびキャラクタリゼーションについて説明する。
【０１５８】
１．５．ｂ  推定ｐｈｙＡ変換体の選別：
一例として、菌株Ａ．ニガーＮＰ５０５−２を選択した。
【０１５９】
別のｇｌａＡアンプリコンにおいて攻撃された、少数のまたは多数のｐｈｙＡカセットを含む組み換え菌株をも使用することが可能である。ＢａｍＨＩ−標識ｇｌａＡアンプリコンにおいて攻撃された、２つのｐｈｙＡカセットを含む、Ａ．ニガー菌株ＮＰ５０５−２の胞子を、ＰＤＡ培地を含むプレート上に接種し、２−３日後に、該ｐｈｙＡＤＮＡ−フラッグ特異的プライマー（物質＆方法の項参照）を使用して、個々のコロニーについて、該ＤＮＡ−フラッグＰＣＲテストを実施した。この方法を利用して、これら３種の標識ｇｌａＡ−アンプリコン間の、遺伝子交換（変換Ｉ増幅または削除）を、極めて迅速に可視化することができる。得られる遺伝子型の頻度は、大幅に変動するが、平均して、我々は、テストしたコロニーの９５％以上が、これら３種のｇｌａＡアンブリコンについて何の変化も示さないことを観測した。該子孫の５％が、１または２種のｇｌａＡアンプリコン削除または該ｇｌａＡアンプリコンの一種の増幅を示し、また所定の変換体も、該「ＢａｍＨＩ−標識」ｇｌａＡ遺伝子座と、他の２つのｇｌａＡアンプリコンとの間の変換（各々の例を第２５図に示す）の結果として、検出された。
【０１６０】
１．５．ｃ  ｐｈｙＡ変換体のサザン分析：
これら変換体のｐｈｙＡのコピー数が、二倍となるか否かを決定するために、このような変換体（遺伝子型ＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ＋／ＢｇｌＩＩ−またはＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ−／ＢｇｌＩＩ＋）の幾つかを、夫々該ｇｌａＡ特異的ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｈｏｌ５’−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントおよび該Ｓａｌｌ／ＸｈｏＩ  ３”−ｇｌａＡ  ＤＮＡフラグメントによってプローブした、ＢａｍＨＩおよびＢｇＩＩＩ消化物を使用して、詳細なサザン分析にかけた。
【０１６１】
該親菌株および選別した変換体のＢａｍＨＩ消化物に関するハイブリダイゼーションパターンを、第２５図に示す。予想されるように、また親菌株Ａ．ＮＰ５０５−２と比較して、該ＰＣＲによって同定されたＢａｍＨＩ２＋遺伝子型は、実際にＢａｍＨＩ消化物中において、２．５ｋｂおよび４．２ｋｂのハイブリッド化ＤＮＡフラグメントに対する反転した強度を示した。該ＢａｍＨＩ２＋遺伝子型において、該２．５ｋｂフラグメントは、２つのＢａｍＨＩ−標識ｇｌａＡアンプリコンを表し、また４．２ｋｂのフラグメントは、選別されたＢａｍＨＩ２＋変換体の遺伝子型に依存して、残部のＳａｌＩまたはＢｇｌＩＩ  ｇｌａＡアンプリコンを表す。観測された結果は、明らかに予め規定されたアンプリコンが、他の関連するアンプリコンを犠牲にして、「遺伝子変換」によって増幅できることを示している。
【０１６２】
ＢｇｌＩＩ消化物のハイブリダイゼーションパターンは、明らかに選別されたＢａｍＨＩ２＋変換体においては、ｐｈｙＡ遺伝子コピーの数も二倍となることを示した。第２６図に示したように、親菌株の染色体ＤＮＡのＢｇｌＩＩ消化物は、プローブとして３”−ｇｌａＡを使用した場合に、５個のハイブリッド化ＤＮＡフラグメントを示す。１４．９、１１．７、７．５、５．７および５．６の５つのバンドは、夫々５’−フランキングｇｌａＡ配列、ＳａｌＩ−標識アンプリコン、ｐｈｙＡ−ｐｈｙＡトランジション、３’−フランキングｇｌａＡ配列およびＢｇｌＩＩ−標識ｇｌａＡアンプリコンを表す。該親菌株において、これらバンド全ては、多かれ少なかれ同一のハイブリッド化強度をもつ。第２６図にも示したように、遺伝子型ＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ＋／ＢｇｌＩＩ−またはＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ−／ＢｇｌＩＩ＋をもつ選別された変換体においては、該５．６ｋｂまたは１１．７ｋｂのＤＮＡフラグメント夫々は、存在せず、一方１４．９、７．５および５．７ｋｂのハイブリッド化フラグメントの強度は、二倍となる。
【０１６３】
この結果は、該親菌株のＢａｍＨＩ−標識ｇｌａＡアンプリコン内に局在する該２つのｐｈｙＡカセットも、選別されたＢａｍＨＩ２＋変換体における該変換事象によって、二倍となることを示している。
【０１６４】
１．５．ｄ  フィターゼ生産用のｐｈｙＡ変換体の解析：
選別されたｐｈｙＡ変換体が、実際に高いフィターゼ産性を示すか否かを決定するために、振とうフラスコ発酵を、物質＆方法の項に記載したようにして実施した。
【０１６５】
平均して、該親菌株ＮＰ５０５−２（２つのｐｈｙＡ遺伝子コピーを持つ）のフィターゼ発現を測定したところ、約２００Ｕ／ｍｌのレベルであった。予想されるように、遺伝子型ＢａｍＨＩ２＋ＳａｌＩ＋またはＢａｍＨＩ２＋／ＢｇｌＩＩ＋を有する、選別された変換体両者については、４００Ｕ／ｍｌまでのフィターゼレベルを観測できた。
【０１６６】
Ａ．ニガーＮＰ５０５−４および−５と命名された両菌株を、実施例１．６で使用して、該ｐｈｙＡ遺伝子コピー数を更に高めた。
【０１６７】
１．６  複数の変性ＤＮＡアンプリコンを含む変換体の選別
１．６．ａ  原理的説明：
宿主菌株中に存在する、該ＤＮＡアンプリコンの一種において攻撃された発現カセットを、該菌株の子孫をスクリーニングし、所定の変換が起こっている組み換え菌株について選別することによって、増幅することができる。上記のように、程度は低いが、これらＤＮＡアンプリコンの中で、変換は自発的に起こる。遺伝子変換のこの過程を、繰り返し利用して、多数の（ｐｈｙＡ）変性ＤＮＡアンプリコンをもつ新たな変換体を得ることができる。この方法を利用することによって、我々は、最終的に６個のｐｈｙＡ遺伝子アンプリコンをもつ変換体を同定した。これら遺伝子コピーは、該Ａ．ニガーＩＳＯ−５０５宿主の該３つの変性ｇｌａＡアンプリコンに渡って分割されていた。
【０１６８】
「酵素発現カセットの富化」の程度は、該宿主菌株中に元々存在するＤＮＡアンプリコンの数に依存する。しかし、このＰＣＲに基くＤＮＡ−フラッグテストの適用によって、ＤＮＡ−フラッグプロフィールをもつ子孫を単離することも可能であることが分かった。このことは、３つのｇｌａＡ  ＤＮＡアンプリコンの一つの自発的な増幅によってのみ説明できた。この工程を繰り返し利用することによって、組み換え菌株を、最終的に選別することが出来た。この組み換え菌株は、該宿主菌株と比較して、各々２個のｐｈｙＡ発現カセットを含む、付随的なｇｌａＡ−ＤＮＡアンプリコンをもつ。
【０１６９】
１．６．ｂ  ６個のｐｈｙＡ遺伝子コピーを含む、推定的変換体の選別：
全体で４個のｐｈｙＡ発現カセット（各ＢａｍＨＩ−標識ｇｌａＡアンプリコンに、２個のｐｈｙＡカセットをもつ）を含む、実施例１．５．（ｄ）に記載した、Ａ．ニガー菌株ＮＰ５０５−４の胞子を、ＰＤＡプレートに接種し、２−３日後に、該ＤＮＡ−フラッグ特異的プライマーを使用して、各子孫について、該ＤＮＡ−フラッグＰＣＲテストを実施した。前に述べたように、ここでも約９５％のテストしたコロニーが、ｇｌａＡアンプリコン遺伝子型に何の変化も示さなかった。約５％の該子孫が、該ＢａｍＨＩ−またはＳａｌＩ−標識アンプリコンの一つの削除またはＢａｍＨＩ−標識ｇｌａＡ−アンプリコンの一つの増幅に導く、ＤＮＡ−フラッグパターンを示した。これら組み換え菌株以外にも、該所定のＤＮＡ−フラッグパターン、即ち僅かに強度の増加した、２００ｂｐサイズのＢａｍＨＩ  ＤＮＡ−フラッグバンドをもつ変換体が、同様に同定された。遺伝子型「ＢａｍＨＩ３＋」および「ＢａｍＨＩ３＋／ＳａｌＩＩ＋」を示す全ての子孫をサザン分析にかけた。
【０１７０】
該「ＢａｍＨＩ３＋／Ｓａｌｉｉ＋」変換体中のｐｈｙＡ遺伝子数を８にまで増大するために、胞子をＰＤＡプレートに接種し、生育の２−３日後に、該ＤＮＡ−フラッグ特異的プライマーを使用して、各子孫について、該ＤＮＡ−フラッグＰＣＲテストを実施した。寧ろ低頻度（１０００当たり１）にて、「ＢａｍＨＩ４＋」変換体は、高い強度の該２００ｂｐＢａｍＨＩ−フラッグＤＮＡフラグメントおよびその後の残留２２０ｂｐサイズのＳａｌｌ−フラッグＤＮＡフラグメントの喪失を示す、ＤＮＡ−フラッグパターンを示した（第２７図）。この変換体菌株も、サザン分析にかけた。
【０１７１】
１．６．ｃ  サザン分析による変換体の遺伝子キャラクタリゼーション：
上記同定した変換体（ＰＣＲに基く遺伝子型：「ＢａｍＨＩ３＋」、「ＢａｍＨＩ３＋／ＳａｌＩ＋」および「ＢａｍＨＩ４＋」）のｐｈｙＡ遺伝子コピー数を、プローブとして夫々ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ５’−ｇｌａＡおよびＳａｌＩ／ＸｈｏＩ  ３”−ｇｌａＡ特異的ＤＮＡフラグメントとハイブリッド化された、ＢａｍＨＩ御ＢｇｌＩＩ消化物を使用した、サザン分析によって決定した。該親変換体（遺伝子型：ＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ＋／ＢｇｌＩＩ−またはＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ−／ＢｇｌＩＩ＋）および選別されたその変換体の該ＢａｍＨＩ消化物の、予想されたハイブリダイゼーションパターンを、第２５および２７図に示す。ＢａｍＨＩ消化物は、実際に、該「ＢａｍＨ３＋」変換体に対する、唯一の２．５ｋｂをもつハイブリッド化フラグメントを示す。該「ＢａｍＨＩ３＋／ＳａｌＩ＋」変換体については、４．２ｋｂの付随的なバンドが検出され、このことは、該ＤＮＡ−フラッグパターンから得られた結果に基づいて予測されるように、依然として該ＳａｌＩ−標識アンプリコンが、この変換体中に存在していることを示す。変換体「ＢａｍＨＩ４＋」は、該「ＢａｍＨＩ３＋」変換体と同一のハイブリダイゼーションパターンを示す。元の親菌株Ａ．ニガーＮＰ５０５−２および２種の親変換体菌株ＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ＋／ＢｇｌＩＩ−およびＢａｍＨＩ２＋／ＳａｌＩ−／ＢｇｌＩＩ＋のハイブリダイゼーションパターンの比較については、上記図面を参照のこと。
【０１７２】
上記菌株から単離したＤＮＡについての、ＢｇｌＩＩ消化物の予想されるハイブリダイゼーションパターンを、第２８図に示す。変換体「ＢａｍＨＩ４＋」並びに「ＢａｍＨＩ３＋」に関連して、３つのハイブリッド化バンド（１４．５、７．５および５．７）が検出され、全て等しい強度を有しており、このことは、該５’−および３’−フランキング配列以外に、該ｐｈｙＡ遺伝子コピーが、夫々６および８まで増大することを意味する。変換体「ＢａｍＨＩ３＋／ＳａｌＩ＋」については、予想通りのパターンが観測され、１１．７ｋｂのサイズをもつバンド（該ＳａｌＩアンプリコンの存在に特徴的なもの）を含んでいた。このバンドの強度は、勿論３倍低い。
【０１７３】
これら結果は、明らかに、全て２個のｐｈｙＡカセットを含んでいる、３および４個ものＢａｍＨＩ−標識ｇｌａＡアンプリコンを含む、変換体を選別することが可能であることを、示している。
【０１７４】
１．６．ｄ  振とうフラスコ発酵フィターゼ産性の分析：
選別された「ＢａｍＨＩ４＋」並びに「ＢａｍＨＩ３＋」変換体が、実際に高いフィターゼ産性を示すか否かを決定するために、物質＆方法の項に記載したように、振とうフラスコ発酵を実施した。平均して、該親菌株ＮＰ５０５−２（２個のｐｈｙＡ遺伝子コピーを持つ）のフィターゼ発現を測定したところ、約２００Ｕ／ｍｌのレベルであった。これら３つの選別された変換体について予想されたように、測定されたフィターゼレベルは、「ＢａｍＨＩ３＋／ＳａｌＩ＋」および「ＢａｍＨＩ３＋」遺伝子型に対して約６００Ｕ／ｍｌ・および該「ＢａｍＨＩ４＋」変換体菌株について約８００Ｕ／ｍｌであった。
【０１７５】
その後、これら菌株を、夫々Ａ．ニガーＮＰ５０５−６、−７および−８と命名した。
【０１７６】
１．７  高いフィターゼ産性レベルをもつ組み換え体の直接的選別
１．７．ａ  原理的説明：
該ｇｌａＡ  ＤＮＡアンプリコンが、所謂ＤＮＡ−フラッグによって標識されていると言う事実のために、変換体は、単に該ＰＣＲに基くＤＮＡ−フラッグテストを実施することによって選別できた。この遺伝子に基くスクリーニング法を適用することによって、我々は、該ｐｈｙＡ発現カセットが、該ｐｈｙＡ変性ＢａｍＨＩ−標識ｇｌａＡアンプリコンおよびその他の２つのアンプリコンの間の変換の結果として、増幅されることを示し、かつ立証することができた。
【０１７７】
上記のように、我々は、ｐｈｙＡ遺伝子コピー数とフィターゼ産性レベルとの間に線形関係を観測したが、このことは、発現に基づいて選別することも可能であることを示す。この実施例において、我々は、初めのＢａｍＨＩ−ｇｌａＡターゲットｐｈｙＡ組み換え菌株の子孫を、マイクロ−ウエルプレート中での、高いフィターゼ発現レベルについてスクリーニングすることによって、高いｐｈｙＡ遺伝子コピー数をもつ変換体の単離について説明する。
【０１７８】
１．７．ｂ  高いフィターゼ発現レベルについてのスクリーニング：
菌株Ａ．ニガーＮＰ５０５−２の、単一のコロニーの胞子を、物質＆方法の項に記載したような、９６−ウエルプレートに接種した。３４℃、１００％湿度にて、僅かに攪拌しつつ、７日間生育した後に、各ウエルの上澄の該フィターゼ酵素活性を測定した。約１０００個の子孫の酵素発現レベルを、テストした。高いフィターゼ活性を示す細胞を収穫し、胞子を集め、更にマイクロ−タイタースクリーニング実験にかけた。再度、高いフィターゼ酵素活性をもつ細胞が見出された。
【０１７９】
後の振とうフラスコ発酵において、このような同定された菌株は、６００Ｕ／ｍｌまでのフィターゼ発現レベルを示す。
【０１８０】
１．７．ｃ  同定した組み換え菌株の遺伝子キャラクタリゼーション：
上記菌株の観測されたフィターゼ産性における改善は、該ｐｈｙＡ含有ＢａｍＨＩ−標識ｇｌａＡ遺伝子座の増幅または変換の何れかにより、該ｐｈｙＡ遺伝子コピー数が増加した結果であると思われた。まず、これら選別された菌株の遺伝子型を、該ＤＮＡ−フラッグテストを適用することによって決定し、次いでサザン分析を行った。
【０１８１】
該ＤＮＡ−フラッグテストは、明らかに、あらゆる種類の「ＤＮＡ−フラッグ」遺伝子型が、該選別された菌株中に存在することを示した。これら菌株は、以下のものを選別基準とする、該ＤＮＡ−フラッグテストを実施することによって、既に単離されているものと同一の遺伝子型を示した：ＢａｍＨＩ２＋／ｌＳａｌ＋／ＢｇｌＩＩ−、ＢａｍＨＩ２＋／Ｓａｌ＋／ＢｇｌＩＩ−、ＢａｍＨＩ３＋／Ｓａｌ＋／ＢｇｌＩＩ−、ＢａｍＨＩ２＋／Ｓａｌ−／ＢｇｌＩＩ＋、ＢａｍＨＩ３＋／Ｓａｌ−／ＢｇｌＩＩ−。
【０１８２】
これら全ての遺伝子型は、前の実施例で記載したように、サザン分析によって確認した。
【０１８３】
実施例：ペニシリウム
２．１  Ｐ．クリソゲナム宿主の選別とキャラクタリゼーション
２．１．ａ原理的説明：
遺伝子変換による挿入遺伝子の増幅は、そのゲノム内に、複数の相同ＤＮＡドメインの存在を必要とする。このようなドメインは、Ｐ．クリソゲナムについて記載されている（この報告において、ＰＥＮアンプリコンと呼ばれている：Ｆｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２：６２００−６２０４）。ペニシリン生合成遺伝子ｐｃｂＡＢ、ｐｃｂＣおよびｐｅｎＤＥを包含する、１５ｋｂのドメインであるペニシリンクラスターは、これらＰＥＮアンプリコン上に位置している（第２９図）（Ｄｉｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２６５：１６３５８−１６３６５；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１９９０，９：７４１−７４７）。ここでは、我々は、該ＰＥＮアンプリコンの複数のコピーを含む、Ｐ．クリソゲナム宿主菌株ＣＢＳ  ６４９．９７の選別およびキャラクタリゼーションについて説明する。
【０１８４】
２．１．ｂ  ＰＥＮアンプリコンの定量：
Ｐ．クリソゲナム菌株ＣＢＳ  ６４９．９７を、単一のＰＥＮアンプリコンを含む、菌株Ｗｉｓ５４−１２５５（ＡＴＣＣ  ２８０８９）から、伝統的な菌株改善法によって得た（Ｆｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２：６２００−６２０４）。菌株ＣＢＳ  ６４９．９７中のＰＥＮアンプリコンの数は、サザン分析によって測定した。そのために、染色体ＤＮＡを、ＢｓｔＸＩで消化し、ＨＥＬＥおよびｎｉａＤプローブとハイブリッド化した。Ｗｉｓ５４−１２５５と比較して、ＣＢＳ  ６４９．９７に対して７−倍高いＨＥＬＥ／ｎｉａＤハイブリダイゼーション比を検出した（第３０，４２図）。同様に、ＣＨＥＦによって分離されたＮｏｔＩ−消化ＤＮＡは、ＨＥＬＥプローブとハイブリッド化された（第４２図）。Ｗｉｓ５４−１２５５におけるよりも、ＣＢＳ  ６４９．９７において約４２０ｋｂ大きな、主ハイブリダイゼーションシグナルを検出じた（第３１図）。これら結果は、菌株ＣＢＳ  ６４９．９７において約７個のＰＥＮアンプリコンが存在することを示した。
【０１８５】
２．２  発現ベクターの溝築
２．２．ａ  原理的説明：
ゲノムへのｒＤＮＡ分子の指向性挿入（ターゲット）は、相同性組み換えを介して起こる。従って、ｒＤＮＡカセットは、該ゲノム内の該ターゲットサイトと相同性のＤＮＡフラグメントがフランキング状態にある必要がある（第３２図）。ＨＥＬＥおよびＨＥＬＦとして定義される、該ペニシリンクラスター内の２つのターゲットドメインを、該発現カセットの、該ＰＥＮアンプリコンへの指向性挿入のために選択した（第２９図）。ここでは、我々は、本報告において使用する、ａｍｄＳ、ｃｅｆＥおよびｃｅｆＦ発現ベクターの設計および溝築について説明する。
【０１８６】
２．２．ｂ  発現ベクターの基本的な設計：
線状ＤＮＡ分子は、該ゲノムへのターゲット組込みのために重要である。その上、５’および３’末端（フランキング部）両者は、所定の組込みサイトに対して相同なＤＮＡからなる必要がある。従って、形質転換フラグメントは、該５’および３’ターゲットドメインがフランキング状態にある、該発現カセット（適当なプロモータおよびターミネータによって調節される対象とする遺伝子）を含む。これらフラグメントを、Ｅ．コリベクター内にクローニングして、該プラスミドの増殖を行う。得られる発現ベクターは、Ｅ．コリ配列が、該形質転換フラグメントの線状化および単離の際に除去されるように設計される（第３２図）。従って、組み換え菌株は、Ｅ．コリＤＮＡを含まないであろう（Ｅ．Ｐ．０６３５５７４Ａ１）。
【０１８７】
２．２．ｃ  発現ベクターｐＨＥＬＥ−Ａ１の溝築：
該５’ＨＥＬＥターゲットドメインを、オリゴ１および２を用いて、Ｐ．クリソゲナム菌株ＣＢＳ  ６４９．９７の染色体ＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。得られた生成物を、ｐＺＥｒＯＴＭ−１（ＵＳＡ，カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にＮｏｔＩ−ＳｐＨＩフラグメントとしてクローニングして、プラスミドｐＨＥＬＥ５’を生成した。同様に、該３’ＨＥＬＥターゲットドメインを、オリゴ３および４を使用して、ＰＣＲにより増幅し、ｐＨＥＬＥ５’内にＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてクローニングして、プラスミドｐＨＥＬＦ５３を得た。ＰｇｐｄＡおよびＴａｍｄＳによって調節されるａｍｄＳを包含する、該ａｍｄＳ発現カセットを、オリゴ５および６を使用して、プラスミドｐＧＢＤＥＬ４Ｌ（Ｅ．Ｐ．０６３５５４７Ａ１）から、ＰＣＲによって増幅した。得られた生成物を、ＮｏｔＩフラグメントとして、ｐＨＥＬＥ５３内にクローニングして、発現ベクターｐＨＥＬＥ−Ａ１を得た（第３３図）。
【０１８８】
２．２．ｄ  発現ベクターｐＨＥＬＦ−Ａ１の溝築：
該５’ＨＥＬＦターゲットドメインを、オリゴ７および８を使用して、Ｐ．クリソゲナム菌株ＣＢＳ  ６４９．９７の染色体ＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。得られた生成物を、ｐＺＥｒＯＴＭ−１（ＵＳＡ，カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にＮｏｔＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてクローニングして、プラスミドｐＨＥＬＦ５’を生成した。同様に、該３’ＨＥＬＦフランキングを、オリゴ９および１０を使用して、ＰＣＲにより増幅し、ｐＨＥＬＦ５’内にＰｓｔＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてクローニングして、プラスミドｐＨＥＬＦ５３を得た。ＰｇｐｄＡおよびＴａｍｄｓによって調節されるａｍｄＳを包含する、該ａｍｄＳ発現カセットを、オリゴ５および６を使用して、プラスミドｐＧＢＤＥＬ４Ｌ（Ｅ．Ｐ．０６３５５４７Ａ１）から、ＰＣＲによって増幅した。得られた生成物を、ＮｏｔＩフラグメントとして、ｐＨＥＬＦ５３内にクローニングして、発現ベクターｐＨＥＬＦ−Ａ１を得た（第３４図）。
【０１８９】
２．２．ｅ  発現ベクターｐＨＥＬＥ−Ｅ１の溝築：
該ＰｐｃｂＣを、オリゴ１１および１２を使用して、Ｐ．クリソゲナム菌株ＣＢＳ  ６４９．９７の染色体ＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。得られた生成物を、ｐＧＳＥＷＡ（ＷＯ  ９５／０４１４８）内にＸｈｏＩ−ＮｄｅＯＩフラグメントとしてクローニングして、ｐＩＳＥＷＡ−Ｎを生成した。最後に、ＰｐｃｂＣおよびＴｐｅｎＤＥによって調節される該ｃｅｆＥ発現カセットを、ｐＨＥＬＥ５３中に、ｐＩＳＥＷＡ−Ｎ由来のＮｏｔＩフラグメントとしてクローニングして、発現ベクターｐＨＥＬＥ−Ｅ１を得た（第３５図）。
【０１９０】
２．２．ｆ  発現ベクターｐＨＥＬＦ−Ｆ１の溝築：
該ｃｅｆＦ遺伝子を、オリゴ１３および１４を使用して、ＥｘｐａｎｄＴＭ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従って、Ｓ．クラブリゲルスＡＴＣＣ  ２７０６４のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによって増幅した。サイクル条件：３０×（９８℃で１分間、７０℃で５分間）、１×（７２℃で７分間）。得られた生成物を、ｐＩＳＥＷＡ−Ｎ（置換ｃｅｆＥ）内にＮｄｅＩ−ＮｓｉＩフラグメントとしてクローニングして、ｐＩＳＦＷＡを得た。最後に、ＰｐｃｂＣおよびＴｐｅｎＤＥによって調節される該ｃｅｆＦ発現カセットを、ｐＨＥＬＦ５３中に、ｐＩＳＦＷＡ由来のＮｏｔＩフラグメントとしてクローニングして、発現ベクターｐＨＥＬＦ−Ｆ１を得た（第３６図）。
【０１９１】
２．３  ｃｅｆＥによるＰＥＮアンプリコンの変性
２．３．ａ  原理的説明：
形質転換体の効率的な選別は、選別性マーカーを必要とする。真菌の同時形質転換は、周知の手順であり、これによって、該宿主は、異なる２つのｒＤＮＡ分子によって、同時に形質転換される。該ｒＤＮＡ分子の一方は、対象とする遺伝子を含み、かつその他方は該選別マーカーを含む。二方向性ａｍｄＳマーカーの使用は、該Ｐ．クリソゲナム宿主の反復的な形質転換を可能とする（Ｅ．Ｐ．０６３５５４７Ａ１）。ターゲット組込みによって生成される、該直列反復体の組み換えは、該ａｍｄＳカセットの喪失をもたらし、またフルオロアセタミド培地上で選別できる（第３７図）。本例では、我々は、該ＰＥＮアンプリコンの一つに組み込まれた該ｃｅｆＥ発現カセットを含み、ａｍｄＳを含まない組み換え体の選別について説明する。
【０１９２】
２．３．ｂ  ターゲットａｍｄＳ、ｃｅｆＥ同時形質転換体の選別：
Ｐ．クリソゲナムＣＢＳ  ６４９．９７を、ＳｆｉＩ線状化ＨＥＬＥ−Ａ１およびＨＥＬＥ−Ｅ１フラグメントによって、同時形質転換処理した（第３３，３５図）。ａｍｄＳを含む形質転換体を、アセタミドプレート上で選別し、オリゴ１７および１８を使用して、カセットＰＣＲによって、ｃｅｆＥについてテストした（第４０ａ図）。ＨＥＬＥ内に組み込まれたａｍｄＳまたはｃｅｆＥを含む同時形質転換体を、オリゴ１９、２０および２１を使用して、ターゲットＰＣＲによって同定した（第４０ｂ，ｃ図）。
【０１９３】
２．３．ｃ  ａｍｄＳ−（マーカーを含まない）ｃｅｆＥ組み換え体の選別：
上記２．３．ｂに記載した、ａｍｄＳ、ｃｅｆＥ同時形質転換体の胞子を、フルオロアセタミド培地に塗布した。
【０１９４】
ｃｅｆＥを保持する組み換え体を、Ｅ．コリバイオアッセイによって同定した。ａｍｄＳを喪失したが、少なくとも一つのｃｅｆＥコピーが存在することを、オリゴ１５、１６、１７および１８を使用した、カセットＰＣＲで確認した（第４０ａ，ｄ図）。これら菌株を、サザン分析のために選別した。
【０１９５】
２．３．ｄ  ａｍｄＳ−組み換え体のサザン分析：
ＨＥＬＥへのｃｅｆＥの組込みおよびａｍｄＳ−中のｃｅｆＥコピー数、ｃｅｆＥ＋組み換え体を、サザンおよびＴＡＦＥによって分析した。そのために、組み換え体の染色体ＤＮＡをＮｒｕＩで消化し、ｃｅｆＥプローブにハイブリッド化した（第３８，４２図）。同様なハイブリッド化を、ＨｐａＩ−消化ＤＮＡについて実施し、ＴＡＦＥによって分離した（第３９図）。ＨＥＬＥへのｃｅｆＥの組込みに対して予想されるハイブリダイゼーションパターンをもつ組み換え菌株を、更なる実験のために選別した。
【０１９６】
２．４  第２のアンプリコンのａｍｄＳによる変性
２．４．ａ  原理的説明：
遺伝子変換は、本質的にドナーＤＮＡストランドにより、アクセプタＤＮＡストランド由来の遺伝情報を置換する。ドナーおよびアクセプタストランド両者は、この事象を可視化するために標識できる。２．３において述べたような菌株は、既にｃｅｆＥによって標識された、一つのアンプリコンを有している（この場合は、該ドナーストランド）。ここでは、我々は、ｃｅｆＥ以外の異なるＰＥＮアンプリコンに、単一のａｍｄＳカセットを挿入することによる、アクセプタストランドの変性について説明する。
【０１９７】
２．４．ｂ  ａｍｄＳによる第２のＰＥＮアンプリコンの攻撃：
一つのアンプリコン中にｃｅｆＥを含有する、２．３．ｄに記載した如き菌株を、ＳｆｉＩ−線状化ＨＥＬＥ−Ａ１フラグメントで形質転換した（第３３図）。ａｍｄＳの組込みおよびＨＥＬＥの攻撃を、夫々オリゴ１５、１６および１９、２０を用い、カセットおよびターゲットＰＣＲによってテストした（第４０ｃ，ｄ図）。ｃｅｆＥに隣接するａｍｄＳの組込みまたは単一のＨＥＬＥ遺伝子座における複数のａｍｄＳコピーは、オリゴ２０、２１、２２および２３を使用したターゲットＰＣＲによって同定した（第４０ｅ，ｆ，ｇ図）。従って、第二のアンプリコンに組み込まれた単一のａｍｄＳカセットを含む、残りの菌株を、サザン分析のために選別した。
【０１９８】
２．４．ｃ  ａｍｄＳ形質転換体のサザン分析：
２．４．ｂに記載した形質転換体の染色体ＤＮＡを、ＨｐａＩで消化し、ａｍｄＳプローブとハイブリッド化した（第４１，４２図）。ＨＥＬＥへの正確なａｍｄＳの組込みに対して予想されるハイブリダイゼーションパターンをもつ菌株を、遺伝子変換実験のために選別した。
【０１９９】
２．５  遺伝子変換による生産性の増加
２．５．ａ  原理的説明：
組み込まれた遺伝子のコピー数は、遺伝子変換を介して増大する（第４３図）。結局、該遺伝子によってコードされる酵素の、生産性およびその触媒活性を高めることができる。ｃｅｆＥを発現する組み換えＰ．クリソゲナム菌株は、適当な条件下で発酵させた場合に、アジポイル−７−ＡＤＣＡを生産する（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９５，１３：５８−６２）。ここでは、我々は、ｃｅｆＥ遺伝子変換体の選別およびキャラクタリゼーション並びに達成されるアジポイル−７−ＡＤＣＡ産性における増加について記載する。
【０２００】
２．５．ｂ  ｃｅｆＥ遺伝子変換体の選別：
２．５．ａに記載した、異なるアンプリコンにｃｅｆＥおよびａｍｄＳを含む菌株の胞子を、フルオロアセタミド培地に接種して、ａｍｄＳ−組み換え体を製造した。これら組み換え体の該ａｍｄＳ−、ｃｅｆＥ＋遺伝子型を、オリゴ１５、１６、１７、１８、２６および２７を使用した、カセットＰＣＲによって確認した（第４０ａ，ｄ，ｈ図）。オリゴ２６および２７は、該固有のｎｉａＤ遺伝子座のフラグメントを増幅するために含められた。該遺伝子座は、該ＰＣＲ生成物の相対的な定量のための基準として機能する。親菌株に比して高いｃｅｆＥ／ｎｉａＤ比によって判定された如く、該ａｍｄＳマーカーを喪失したが、ｃｅｆＥコピーを獲得した菌株として同定された遺伝子変換体を、サザン分析のために選別した。
【０２０１】
２．５．ｃ  ｃｅｆＥ遺伝子変換体のサザン分析：
２．５．ｂにおいて選別された菌株の染色体ＤＮＡを、ＮｒｕＩで消化し、ｃｅｆＥおよびｎｉａＤプローブとハイブリッド化した。親菌株と同等なハイブリダイゼーションパターンをもつが、高いｃｅｆＥ／ｎｉａＤハイブリダイゼーションシグナル比をもつ菌株を、アジポイル−７−ＡＤＣＡの発酵のために選別した。
【０２０２】
２．５．ｄ  ｃｅｆＥ遺伝子変換体のアジポイル−７−ＡＤＣＡ産性：
２．７．ｂで選別された遺伝子変換体のアジポイル−７−ＡＤＣＡ産性を、振とうフラスコ発酵によって測定した。選別された菌株全てが、対応する親菌株よりも、有意に多量のアジポイル−７−ＡＤＣＡを生産した。
【０２０３】
２．６  遺伝子変換体による、異なる発現カセットの同時の増加
２．６．ａ  原理的説明：
該アンプリコンの大きなセグメントを包含し、あるいは更に該アンプリコンのボーダーを延長するドメインが、遺伝子変換に関与し得る。従って、相互に隣接する、異なる遺伝子のコピー数を、遺伝子変換によって同時に大きくすることができる。ｃｅｆＥおよびｃｅｆＦを発現する組み換えＰ．クリソゲナム菌株は、適当な条件下で発酵させた場合に、アジポイル−７−ＡＤＣＡを生産する（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯ／Ｔｅｄｍｏｌ．，１９９５，１３：５８−６２）。ここでは、我々は、同一のＰＥＮアンプリコン（ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）上の異なる遺伝子座を攻撃することによる、ｃｅｆＦＣおよびｃｅｆＥ発現カセットの同時遺伝子変換並びに達成されるアジボイル−７−ＡＤＣＡ産性における増加について記載する。
【０２０４】
２．６．ｂ（ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）形質転換体の選別：
ＨＥＬＥ中に組み込まれたｃｅｆＥを含む、２．３．ｄに記載したような菌株を、ＳｆｉＩ線状化ＨＥＬＦ−Ａ１およびＨＥＬＦ−Ｆ１フラグメントによって同時に形質転換した（第３４，３６図）。形質転換体をアセタミドプレート上で選別し、オリゴ１５、１６、１７および２５を使用して、ｃｅｆＦおよびａｎ１ｄＳにつき、カセットＰＣＲによってテストした（第４０ｄ，ｊ図）。ＨＥＬＦへのｃｅｆＥまたはａｍｄＳの組込みは、オリゴ２０、２１および２４を使用する、ターゲットＰＣＲによって測定した（第４０ｊ，ｋ図）。これら菌株の染色体ＤＮＡを，ＮｍｔＩで消化し、ブロッティングし、ＨＥＬＥプローブとハイブリッド化した（第４４図）。既にｃｅｆＥを含んでいるＰＥＮアンプリコン上のＨＥＬＦへの、ｃｅｆＦまたはａｍｄＳの組込みに相当する、ハイブリッド化フラグメントをもつ菌株を、マーカーを含まない（ａｍｄＳ−）組み換え体の選別のために使用した。
【０２０５】
２．６．ｃ  マーカー遺伝子を含まない（ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）組み換え体の選別：
２．６．ｂに記載した菌株の胞子を、ａｍｄＳ−組み換え体の選別のために、フルオロアセタミド培地に塗布した。ａｍｄＳを喪失したが、ｃｅｆＥおよびｃｅｆＦを獲得した組み換え体を、オリゴ１５、１６、１７、１８および２５を使用して、カセットＰＣＲによって同定した（第４０ａ，ｄ，ｊ図）。これら菌株の染色体ＤＮＡを，ＮｒｕＩで消化し、ｃｅｆＦプローブとハイブリッド化した（第４４、４５図）。ＨＥＬＦに正確に組み込まれたｃｅｆＦを含む菌株を、遺伝子変換体の選別のために使用した。
【０２０６】
２．６．ｄ（ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）遺伝子変換体の選別：
２．６．ｃに記載した菌株の胞子を、生育させて、単一のコロニーを得、オリゴ１７、１８、２５、２６および２７を使用して、カセットＰＣＲによって、ｃｅｆＥ、ｃｅｆＦおよびｎｉａＤの量について分析した（第４０ａ，ｈ．ｉ図）。
【０２０７】
遺伝子変換体は、親菌株に比して、同時に増大した比：ｃｅｆＥ／ｎｉａＤおよびｃｅｆＥ／ｎｉａＤによって同定した。ｃｅｆＥおよびｃｅｆＦの高いコピー数は、サザン分析によって確認した。そのために、染色体ＤＮＡを、ＮｒｕＩで消化し、かつｃｅｆＥおよびｎｉａＤプローブとハイブリッド化した（第４６図）。ブロットをストリッピングし、次いでｃｅｆＦおよびｎｉａＤプローブとハイブリッド化した（第４７図）。親菌株に比して、高い比：ｃｅｆＥ／ｎｉａＤおよびｃｅｆＦ／ｎｉａＤ両者をもつ菌株を、アジポイル−７−ＡＤＡＣ生産のために選別した。
【０２０８】
２．６．ｅ  （ｃｅｆＥ＋ｃｅｆＦ）遺伝子変換体のアジポイル−７−ＡＤＡＣ生産：
２．６．ｄにおいて選別された遺伝子変換体のアジポイル−７−ＡＤＣＡ産性を、振とうフラスコ発酵によって測定した。選別された菌株全てが、その親菌株に比して、高い量のアジポイル−７−ＡＤＡＣを生産した。
【図１】
2010075204.tif 000005
【図２】
2010075204.tif 000006
【図３】
2010075204.tif 000007
【図４ａ】
2010075204.tif 000008
【図４ｂ】
2010075204.tif 000009
【図５ａ】
2010075204.tif 000010
【図５ｂ】
2010075204.tif 000011
【図６ａ】
2010075204.tif 000012
【図６ｂ】
2010075204.tif 000013
【図７ａ】
2010075204.tif 000014
【図７ｂ】
2010075204.tif 000015
【図８ａ】
2010075204.tif 000016
【図８ｂ】
2010075204.tif 000017
【図９ａ】
2010075204.tif 000018
【図９ｂ】
2010075204.tif 000019
【図１０ａ】
2010075204.tif 000020
【図１０ｂ】
2010075204.tif 000021
【図１１ａ】
2010075204.tif 000022
【図１１ｂ】
2010075204.tif 000023
【図１２ａ】
2010075204.tif 000024
【図１２ｂ】
2010075204.tif 000025
【図１３ａ】
2010075204.tif 000026
【図１３ｂ】
2010075204.tif 000027
【図１４ａ】
2010075204.tif 000028
【図１４ｂ】
2010075204.tif 000029
【図１５】
2010075204.tif 000030
【図１６】
2010075204.tif 000031
【図１７】
2010075204.tif 000032
【図１８】
2010075204.tif 000033
【図１９】
2010075204.tif 000034
【図２０】
2010075204.tif 000035
【図２１】
2010075204.tif 000036
【図２２】
2010075204.tif 000037
【図２３】
2010075204.tif 000038
【図２４ａ】
2010075204.tif 000039
【図２４ｂ】
2010075204.tif 000040
【図２４ｃ】
2010075204.tif 000041
【図２５】
2010075204.tif 000042
【図２６】
2010075204.tif 000043
【図２７】
2010075204.tif 000044
【図２８】
2010075204.tif 000045
【図２９】
2010075204.tif 000046
【図３０】
2010075204.tif 000047
【図３１】
2010075204.tif 000048
【図３２】
2010075204.tif 000049
【図３３】
2010075204.tif 000050
【図３４】
2010075204.tif 000051
【図３５】
2010075204.tif 000052
【図３６】
2010075204.tif 000053
【図３７】
2010075204.tif 000054
【図３８】
2010075204.tif 000055
【図３９】
2010075204.tif 000056
【図４０ａ】
2010075204.tif 000057
【図４０ｂ】
2010075204.tif 000058
【図４０ｃ】
2010075204.tif 000059
【図４０ｄ】
2010075204.tif 000060
【図４０ｅ】
2010075204.tif 000061
【図４０ｆ】
2010075204.tif 000062
【図４０ｇ】
2010075204.tif 000063
【図４０ｈ】
2010075204.tif 000064
【図４０ｉ】
2010075204.tif 000065
【図４０ｊ】
2010075204.tif 000066
【図４０ｋ】
2010075204.tif 000067
【図４１】
2010075204.tif 000068
【図４２】
2010075204.tif 000069
【図４３】
2010075204.tif 000070
【図４４】
2010075204.tif 000071
【図４５ａ】
2010075204.tif 000072
【図４５ｂ】
2010075204.tif 000073
【図４６ａ】
2010075204.tif 000074
【図４６ｂ】
2010075204.tif 000075
【図４６ｃ】
2010075204.tif 000076
【図４７ａ】
2010075204.tif 000077
【図４７ｂ】
2010075204.tif 000078
【図４７ｃ】
2010075204.tif 000079
【図４８ａ】
2010075204.tif 000080
【図４８ｂ】
2010075204.tif 000081
【図４８ｃ】
2010075204.tif 000082
【配列表】
2010075204000001.app