(57)【要約】【課題】検体中の抗体を、抗原抗体反応を利用して高感度に検出し得る抗原処理物付着担体の製造方法、および、かかる抗原処理物付着担体の製造方法で製造された抗原処理物付着担体を提供すること。【解決手段】本発明の抗原処理物付着担体の製造方法は、抗原処理物２１がウェル１２の底面に担持された抗原処理物付着担体１を得るに際し、抗原処理物２１の前記底面への担持に前後して、界面活性剤を含有する処理液で抗原を処理して、前記抗原が有する抗体認識部位を前記処理前よりも多く露出した状態の抗原処理物２１とする。また、抗原処理物２１を前記底面に担持した後に、ウェル１２の抗原処理物が付着していない領域に、抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質を主材料として構成される被覆層３１を形成するのが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原処理物が基材に担持された抗原処理物付着担体を得るに際し、
前記抗原処理物の基材への担持に前後して、界面活性剤を含有する処理液で抗原を処理して、前記抗原が有する抗体認識部位を前記処理前よりも多く露出した状態の前記抗原処理物とすることを特徴とする抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項２】
前記抗原処理物は、前記界面活性剤の処理により、前記抗原が変性、変質または分解した状態で、前記基材に付着している請求項１に記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項３】
前記処理により前記抗原処理物を得た後に、該抗原処理物を基材に担持させる請求項１または２に記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項４】
前記抗原は、ウイルスである請求項１ないし３のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項５】
前記ウイルスは、その表面にエンベロープを備えるものである請求項４に記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項６】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン系の界面活性剤である請求項１ないし５のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項７】
前記基材は、平板状をなし、その上面に複数の穴部を備えている請求項１ないし６のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項８】
前記基材は、主として樹脂材料で構成される請求項１ないし７のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項９】
前記処理液中での前記抗原の濃度は、０．０１〜５０００μｇ／ｍＬである請求項１ないし８のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項１０】
前記処理液中での前記界面活性剤の濃度は、１．０×１０−５〜１０ｗｔ％である請求項１ないし９のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項１１】
前記抗原を前記処理液で処理する時間は、１０秒〜４週間である請求項１ないし１０のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項１２】
前記抗原を前記処理液で処理する際の前記処理液の温度は、５０℃以下である請求項１ないし１１のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項１３】
前記抗原を前記処理液で処理する際に、前記処理液を攪拌する請求項１ないし１２のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項１４】
前記抗原処理物を基材に担持した後に、前記基材の前記抗原処理物が付着していない領域に、抗体との相互作用が前記基材より低いタンパク質を主材料として構成される被覆層を形成する請求項１ないし１３のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項１５】
前記被覆層は、前記界面活性剤が含まれるように形成する請求項１４に記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法で製造されたことを特徴とする抗原処理物付着担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原処理物付着担体の製造方法および抗原処理物付着担体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
検体中に含まれる、抗原または抗体を検出する方法として、抗原抗体反応を利用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）が知られている。
【０００３】
ＥＬＩＳＡ法は、１）検出すべき抗原または抗体を高感度で検出することができ、定量性にも優れていること、２）抗原抗体反応を利用して検出するため、検体中に夾雑物が混在する粗抽出段階で測定が可能であり、他の検査法で必要とされる精製や前処理といった煩雑なステップを必要としないこと、３）短時間で大量の検体を測定し得ること等の利点を有していることから、近年、広く用いられている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
このようなＥＬＩＳＡ法の一種である直接吸着法（間接競合ＥＬＩＳＡ法）を用いて、検体中の抗体を検出する場合、例えば、次のようにして抗体が検出される。
【０００５】
Ｉ）まず、検出すべき抗体が特異的に認識する抗原を担体に接触させることにより担持させる。II）次に、前記抗原が担持された担体に、抗体（一次抗体）を含有する検体を接触させることにより、これら一次抗体と抗原との間に抗原抗体反応を起こさせる。III）次に、酵素標識され、かつ一次抗体を認識する二次抗体を、前記工程II）において、抗原を認識した一次抗体に作用させた後、一次抗体に結合していない二次抗体を洗い流す。IV）次に、二次抗体が備える酵素と反応する基質を添加して、この酵素と基質との反応を測定することにより、抗体（一次抗体）の有無や含有量等を検出することができる。
【０００６】
かかる手順で抗体が検出される直接吸着法において、感度を向上させるためには、より多くの抗原を担体に付着させる必要があるが、抗原の担持量を多くするとコストが嵩むという問題がある。そのため、担体への担持に供される抗原の量を少なくしても、優れた感度を発揮させ得る担体の製造方法が求められている。
【０００７】
【特許文献１】特開平９−１４５７１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、検体中の抗体を、抗原抗体反応を利用して高感度に検出し得る抗原処理物付着担体の製造方法、および、かかる抗原処理物付着担体の製造方法で製造された抗原処理物付着担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような目的は、下記（１）〜（１６）の本発明により達成される。
（１）  抗原処理物が基材に担持された抗原処理物付着担体を得るに際し、
前記抗原処理物の基材への担持に前後して、界面活性剤を含有する処理液で抗原を処理して、前記抗原が有する抗体認識部位を前記処理前よりも多く露出した状態の前記抗原処理物とすることを特徴とする抗原処理物付着担体の製造方法。
【００１０】
これにより、検体中の抗体を、抗原抗体反応を利用して高感度に検出し得る抗原処理物付着担体を製造することができる。
【００１１】
（２）  前記抗原処理物は、前記界面活性剤の処理により、前記抗原が変性、変質または分解した状態で、前記基材に付着している上記（１）に記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００１２】
これにより、抗原処理物は、抗原が有する抗体認識部位を処理前よりも多く露出した状態となる。
【００１３】
（３）  前記処理により前記抗原処理物を得た後に、該抗原処理物を基材に担持させる上記（１）または（２）に記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００１４】
これにより、抗原処理物が形成された後に、抗原処理物が基材に担持されることから、より均一な状態で基材の全体にわたって担持させることができる。
【００１５】
（４）  前記抗原は、ウイルスである上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００１６】
ウイルスは、界面活性剤により容易に変性、変質または分解されるため、抗原として好適に用いられる。
【００１７】
（５）  前記ウイルスは、その表面にエンベロープを備えるものである上記（４）に記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００１８】
エンベロープを有するウイルスは、エンベロープの内部に抗体認識部位を取り込んでいると推察されるので、エンベロープを界面活性剤により変性、変質または分解することにより、この内部に存在する抗体認識部位を露出した状態とすることができる。
【００１９】
（６）  前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン系の界面活性剤である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００２０】
ポリオキシエチレン系の界面活性剤は、特に、タンパク質等に対する作用が温和であり、その浸透作用に優れることから、抗体認識部位に変性等を生じさせることなく、抗体認識部位を確実に表面に露出させることができる。
【００２１】
（７）  前記基材は、平板状をなし、その上面に複数の穴部を備えている上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
これにより、検体中の抗体が抗原処理物を認識したのを検出することができる。
【００２２】
（８）  前記基材は、主として樹脂材料で構成される上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００２３】
これらは、抗原処理物に対して高い親和性を示すものであるため、基材に抗原処理物を強固に担持することができる。
【００２４】
（９）  前記処理液中での前記抗原の濃度は、０．０１〜５０００μｇ／ｍＬである上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００２５】
かかる範囲内に設定すれば、検体中の抗体が抗原処理物を認識したのを検出することができる程度に、基材に抗原処理物を担持させることができる。
【００２６】
（１０）  前記処理液中での前記界面活性剤の濃度は、１．０×１０−５〜１０ｗｔ％である上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００２７】
かかる範囲内に設定することにより、抗原に対して界面活性剤を確実に接触させることができ、より多くの抗体認識部位を表面に露出させることができる。
【００２８】
（１１）  前記抗原を前記処理液で処理する時間は、１０秒〜４週間である上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
これにより、抗原の界面活性剤による処理を十分に行うことができる。
【００２９】
（１２）  前記抗原を前記処理液で処理する際の前記処理液の温度は、５０℃以下である上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００３０】
これにより、界面活性剤による抗原の処理がより円滑に行われるようになり、より多くの抗体認識部位を表面により確実に露出させることができる。
【００３１】
（１３）  前記抗原を前記処理液で処理する際に、前記処理液を攪拌する上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００３２】
これにより、処理液中の抗原に対して均一に界面活性剤を接触させることができる。その結果、界面活性剤で均一に処理された抗原処理物が得られる。
【００３３】
（１４）  前記抗原処理物を基材に担持した後に、前記基材の前記抗原処理物が付着していない領域に、抗体との相互作用が前記基材より低いタンパク質を主材料として構成される被覆層を形成する上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００３４】
これにより、抗原処理物が備える抗体認識部位を認識する抗体が抗体認識部位に特異的に結合する際に、この特異的に結合する抗体以外の抗体が基材に非特異的に結合してしまうのを好適に防止することができる。
【００３５】
（１５）  前記被覆層は、前記界面活性剤が含まれるように形成する上記（１４）に記載の抗原処理物付着担体の製造方法。
【００３６】
これにより、被覆層としての機能が向上して、検体中の抗体が非特異的に基材または被覆層に結合してしまうのをより確実に防止することができる。
【００３７】
（１６）  上記（１）ないし（１５）のいずれかに記載の抗原処理物付着担体の製造方法で製造されたことを特徴とする抗原処理物付着担体。
【００３８】
これにより、検体中の抗体を、抗原抗体反応を利用して高感度に検出し得る抗原処理物付着担体とすることができる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、抗原処理物付着担体が備える抗原処理物を界面活性剤による処理前よりも抗原認識部位をより多く露出した状態となる。さらに、隣り合った抗原処理物が分散することにより、抗体同士の立体障害が無くなり効率良く抗原抗体反応が行われる。これらのことが相まって、検体中の抗体を、抗原抗体反応を利用して高感度に検出し得る抗原処理物付着担体を製造することができる。
【００４０】
また、抗原を処理する界面活性剤として、ポリオキシエチレン系の界面活性剤を用いることにより、抗原認識部位としての機能を維持しつつ、確実にこのものを露出した状態とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明の抗原処理物付着担体の製造方法および抗原処理物付着担体について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００４２】
まず、本発明の抗原処理物付着担体の製造方法について説明する。
なお、以下では、抗原処理物を付着させる担体として、マイクロプレートを用い、このマイクロプレートが備える複数のウェル内に抗原処理物が付着している抗原処理物付着担体を製造する場合を一例に説明する。
【００４３】
図１は、本発明の抗原処理物付着担体の製造方法で製造される抗原処理物付着担体の実施形態を示す縦断面図である。
【００４４】
本発明の抗原処理物付着担体の製造方法で製造される抗原処理物付着担体１は、図１に示すように、複数のウェル（穴部）１２を備える平板状をなすマイクロプレート（基材）１１と、ウェル１２内に担持された抗原処理物２１と、抗原処理物２１が担持されていないウェル１２内の表面を被覆する被覆層３１とを有している。
【００４５】
かかる構成の抗原処理物付着担体１は、本発明の抗原処理物付着担体の製造方法を用いて、例えば、次のようにして製造される。
【００４６】
本実施形態の抗原処理物付着担体の製造方法では、［１Ａ］抗原処理物を得る工程と、［２Ａ］マイクロプレートに抗原処理物を担持させる工程と、［３Ａ］抗原処理物が担持されたマイクロプレートを洗浄する工程と、［４Ａ］マイクロプレートに被覆層を形成する工程と、［５Ａ］被覆層が形成されたマイクロプレートを洗浄する工程とを有する。
【００４７】
以下、各工程について順次説明する。
［１Ａ］  まず、抗原を界面活性剤で処理して抗原処理物２１を得る（第１の工程）。
［１Ａ−１］  まず、界面活性剤で処理する抗原を用意する。
【００４８】
界面活性剤で処理する抗原としては、後述する検体の検出方法において、検体中から検出する抗体（検査対象物）が特異的に結合（認識）する抗体認識部位を有するものが選択される。
【００４９】
具体的には、例えば、バクテリア細胞、植物細胞、動物細胞等の各種細胞や、デングウイルスおよび日本脳炎ウイルスが属するフラビウイルス科、インフルエンザウイルスが属するオルトミクソウイルス科、風疹ウイルスが属するトガウイルス科、麻疹ウイルスおよびムンプスウイルスが属するパラミクソウイルス科のウイルスのようなエンベロープを有するウイルスならびにパピロマーウイルスが属するパピロマーウイルス科、レオウイルスおよびロタウイルスが属するレオウイルス科のウイルスのようなエンベロープを有さないウイルス等のウイルスの他、各種アレルギー関連物質等が挙げられる。
【００５０】
［１Ａ−２］  次いで、抗原を処理する界面活性剤を用意する。
界面活性剤としては、抗原を次工程［１Ａ−３］において、抗原に界面活性剤を接触させることにより、抗原が変性、変質または分解等して、検体中から検出すべき抗体が特異的に結合する抗体認識部位を、その表面により多く露出させ得るものであればよく、非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤のいずれであってもよいが、非イオン性界面活性剤であるのが好ましい。非イオン性界面活性剤は、イオン性界面活性剤と比較して、タンパク質等に対する作用が温和であり、その浸透作用に優れることから、抗体認識部位に変性等を生じさせることなく、抗体認識部位を確実に表面に露出させることができる。
【００５１】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−α−Ｄ−グルコピラノシドのようなアルキルグルコシド系非イオン界面活性剤、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＥＷＷＮ２０）、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＷＥＥＮ４０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＷＥＥＮ６０）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（ＴＥＷＷＮ８０）のようなポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらの中でも、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤は、上述した非イオン性界面活性剤としての特性が特に優れることから、界面活性剤としてより好ましく用いられる。
【００５２】
［１Ａ−３］  次いで、抗原に界面活性剤を接触させることにより、抗原処理物２１を得る。
【００５３】
抗原に界面活性剤を接触させる方法としては、特に限定されないが、抗原が分散液中に懸濁した状態の処理液中に、界面活性剤を供給した後、攪拌する方法が好適に用いられる。かかる方法によれば、目的とする処理条件で、処理液中の抗原に対して均一に界面活性剤を接触させることができる。その結果、界面活性剤で均一に処理された抗原処理物２１が得られる。
【００５４】
このように、抗原に界面活性剤を接触させると、抗原は、そのものが変性、変質または分解、分散した状態となり、通常、その表面に露出している抗体認識部位ばかりでなく、内部に取り込まれている抗体認識部位までもその表面に露出し、且つ抗原同士が分散していると推察される。そこで、本明細書では、このように抗体認識部位が抗原の処理前よりも多く露出し、分散した状態の抗原を抗原処理物２１ということとする。
【００５５】
ところで、上記のように抗原の界面活性剤による処理で内部に取り込まれている抗体認識部位までもその表面に露出し分散するようになるのは、抗原としてウイルスを選択したときに顕著に認められると推察される。これは、ウイルスが界面活性剤により容易に変性、変質または分解されることに起因すると考えられる。
【００５６】
さらに、ウイルスの中でもエンベロープを有するウイルスは、エンベロープの内部に抗体認識部位を取り込んでいると推察されるので、本発明の抗原処理物付着担体の製造方法が好適に適用される。
【００５７】
分散液としては、等張液（細胞やウイルス内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）が好適である。これにより、分散液が抗原に接触した際における、抗原内の浸透圧の違いによる抗原の破壊を防止することができる。
【００５８】
この等張液には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ液（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）、Ｌｏｃｋｅ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｔｙｒｏｄｅ液、Ｅａｒｌｅ液、Ｋｒｅｂｓ液、生理食塩水等を用いることができる。
【００５９】
処理液中における抗原の濃度は、抗原の種類によっても若干異なるが、０．０１〜５０００μｇ／ｍＬ程度であるのが好ましく、０．１〜５００μｇ／ｍＬ程度であるのがより好ましい。抗原の濃度が低過ぎると、次工程［２Ａ］において抗原処理物２１をウェル１２内に担持させる際に、担持される抗原処理物２１の量が少なくなり過ぎるおそれがある。また、抗原の濃度が高過ぎると、界面活性剤による処理が均一に施されなくなるおそれがあり好ましくない。
【００６０】
また、処理液中における界面活性剤の含有量は、処理する抗原の種類によっても若干異なるが、１．０×１０−５〜１０ｗｔ％程度であるのが好ましく、０．００１〜１ｗｔ％程度であるのがより好ましい。界面活性剤の含有量が低すぎると、抗原に対して界面活性剤が接触する機会が減少し、抗原の種類等によっては、抗原の内部に存在する抗体認識部位を表面に露出できなくなるおそれがある。また、界面活性剤の濃度を高くしても、それ以上の効果の増大が期待できないばかりか、抗原認識部位そのものを界面活性剤により変性または変質させてしまうおそれがあり好ましくない。
【００６１】
この抗原の界面活性剤による処理時間は、１０秒〜４週間程度であるのが好ましく、１分〜１週間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、界面活性剤と抗原が均一に混ざらないおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、抗原認識部位そのものを界面活性剤により変性または変質させてしまうおそれがあり好ましくない。
【００６２】
また、この際（処理時）の処理液の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、５〜５０℃程度であるのがより好ましい。
【００６３】
また、処理液のｐＨは、４．５〜１０．０程度とするのが好ましく、５．５〜９．０程度とするのがより好ましい。
【００６４】
処理液の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、界面活性剤による抗原の処理がより円滑に行われるようになり、抗原認識部位を抗原の内部からその表面により確実に露出させることができる。
【００６５】
［２Ａ］  次に、マイクロプレート１１に抗原処理物２１を担持させる。
本実施形態では、図１に示すように、マイクロプレート１１は、底面が平坦面で構成される複数のウェル１２を備えており、このウェル１２の底面に、抗原処理物２１が担持される。
【００６６】
マイクロプレート１１の構成材料としては、抗原処理物２１に対して高い親和性を示すものであれば特に限定されず、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル等の樹脂材料が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６７】
かかる構成のウェル１２の底面に抗原処理物２１を担持させる場合、前記工程［１Ａ−３］で得られた抗原処理物２１を含有する処理液を、ウェル１２内に供給する。これにより、ウェル１２の底面に抗原処理物２１が接触するため、マイクロプレート１１の構成材料と抗原処理物２１との親和性の大きさに基づいて、抗原処理物２１がウェル１２の底面に担持される（吸着する）。
【００６８】
ここで、マイクロプレート１１は、抗原処理物２１に対して高い親和性を示す構成材料で構成されているので、ウェル１２の底面に抗原処理物２１が強固に担持される。
【００６９】
この処理液をマイクロプレート１１に接触させる時間は、１〜２４時間程度であるのが好ましく、２〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、ウェル１２の底面に付着する抗原処理物２１の数が少なくなり、抗原処理物付着担体１を用いて検体中に含まれる目的とする抗体を検出する際に、この目的とする抗体を十分に認識できなくなるおそれがある。一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【００７０】
また、この際（処理時）の処理液の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４４℃程度であるのがより好ましい。処理時の処理液の温度が低く過ぎると、抗原処理物２１の種類等によっては、ウェル１２の底面に抗原処理物２１を付着させるのに時間を要するおそれがある。一方、処理時の被処理液の温度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、抗原処理物２１が変性・変質して、検体中の抗体が抗原処理物２１を認識する認識能が低下してしまうおそれがある。
【００７１】
なお、本実施形態では、本工程［２Ａ］と前記工程「１Ａ」とを別工程とし、工程［１Ａ］の後に工程「２Ａ」を行う構成、すなわち、抗原を界面活性剤で処理して抗原処理物２１を得た後、この抗原処理物２１をウェル１２の底面に担持させる構成としたが、このような場合に限定されるものではない。
【００７２】
例えば、工程［２Ａ］の後に工程［１Ａ］を行う構成としてもよい。すなわち、抗原をウェル１２の底面に担持させた後に、底面に担持された抗原を界面活性剤で処理して抗原処理物２１としてもよい。
【００７３】
さらに、工程［１Ａ］と工程［２Ａ］とを１つの工程としてもよい。すなわち、界面活性剤による処理をウェル１２内で直接行い、抗原処理物２１の生成と抗原処理物２１の底面への担持を同時に行うようにしてもよい。
【００７４】
ただし、本実施形態のように、工程［１Ａ］の後に工程「２Ａ」を行う構成とすれば、抗原処理物２１が形成された後に、抗原処理物２１がウェル１２の底面に担持されることから、より均一な状態でウェル１２の底面全体にわたって担持させることができるという利点が得られる。
【００７５】
［３Ａ］  次に、抗原処理物２１が担持されたマイクロプレート１１を洗浄する。
具体的には、ウェル１２内に洗浄液を供給し、その後、洗浄液を穏やかに攪拌等することにより、洗浄液中に、ウェル１２に担持されなかった抗原処理物２１を分散させる。そして、抗原処理物２１が洗浄液中に分散した状態で除去して廃棄することにより、ウェル１２内を洗浄する。
【００７６】
本工程［３Ａ］で用いる洗浄液としては、各種のものが使用可能であるが、抗原処理物２１に変性・変質が生じるのを防止するために、等張液が好適に用いられる。この等張液には、前記工程［１Ａ］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【００７７】
また、本工程［３Ａ］は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、ウェル１２に担持されなかった抗原処理物２１をより確実に除去することができる。
【００７８】
この場合、用いる洗浄液は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【００７９】
なお、次工程［４Ａ］において形成する被覆層を、界面活性剤を含有する構成とする場合には、本工程を省略してもよい。また、これとは別に、本工程に用いる洗浄液を、界面活性剤を含有するものとすることによっても、次工程［４Ａ］において形成する被覆層を、界面活性剤を含有するものとすることができる。
【００８０】
［４Ａ］  次に、マイクロプレート１１の抗原処理物２１が付着していない領域の少なくとも一部（より好ましくは、ほぼ全て）に、抗体との相互作用がウェル１２の内面よりも低いタンパク質を主材料として構成される被覆層３１を形成する。
【００８１】
かかる構成の被覆層３１は、例えば、ウェル１２の底面に抗原処理物２１が担持されたマイクロプレート１１のウェル１２内に、抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質を含む処理液を供給する処理により形成される。
【００８２】
具体的には、ウェル１２内に抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質を含む処理液を供給し、その後、この処理液を攪拌等する。これにより、このタンパク質がウェル１２内の抗原処理物２１が付着していない領域に接触して担持される。これにより、抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質を主材料として構成される被覆層３１が形成される。
【００８３】
なお、ここで言う「抗体」とは、検体中に含有され、抗原処理物２１を認識する抗体以外の複数種の抗体を含み、一般的な抗体のことを指す。また、「抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質」とは、抗体を担持（吸着）する能力、抗体と結合する能力等が無いか、極めて低いタンパク質のことを言う。
【００８４】
このような被覆層３１を備える構成とすれば、抗原処理物２１が備える抗体認識部位を認識する抗体が抗体認識部位に特異的に結合する際に、この特異的に結合する抗体以外の抗体がウェル１２の内面に非特異的に結合（吸着）してしまうのを好適に防止することができる。
【００８５】
このようなタンパク質としては、例えば、カゼイン、ビテリン、ホスビチン、シトクロムｃ、トランスフェリンのような金属タンパク質、アルブミンおよびミオグロビン等が挙げられる。これらの中でも、タンパク質としては、カゼインおよびアルブミンのうちの少なくとも１種を用いるのが好ましい。これらのタンパク質は、マイクロプレート１１の構成材料である樹脂材料への吸着能に優れている。さらに、これらの中でも、タンパク質としては、カゼインが最適である。カゼインは、前記樹脂材料への吸着能に優れ、かつ、抗体との相互作用が極めて低い。
【００８６】
また、被覆層３１には、その構成材料として、界面活性剤が含まれているのが好ましい。これにより、被覆層３１としての機能が向上して、検体中の抗体が非特異的にウェル１２の内面または被覆層３１に結合してしまうのをより確実に防止することができる。このような界面活性剤を含有する被覆層３１は、前記工程［３Ａ］を省略するか、前記工程［３Ａ］に用いられる洗浄液を、界面活性剤を含有するものとすればよい。
【００８７】
処理液中における抗体との相互作用がウェル１２の内面より低いタンパク質の濃度は、特に限定されないが、１００〜５０００ｍｇ／ｍＬ程度であるのが好ましく、５００〜２０００ｍｇ／ｍＬ程度であるのがより好ましい。タンパク質の濃度が低く過ぎると、タンパク質の種類等によっては、ウェル１２の内面を十分に被覆できない場合があり、一方、タンパク質の濃度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、タンパク質の種類によっては、抗原処理物２１をも被覆層３１で被覆してしまうおそれがある。
【００８８】
また、タンパク質を溶解する溶媒としては、例えば、前記工程［１Ａ］で説明した分散液と同様の等張液が好適である。
【００８９】
この処理液による処理時間は、１０分以上であるのが好ましく、２０分〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、被覆層３１の形成が十分に行われないおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、抗原処理物２１が変性、分解により失活するおそれがあり好ましくない。
【００９０】
また、この際（被覆層３１形成時）の処理液の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、５〜５０℃程度であるのがより好ましい。
【００９１】
また、処理液のｐＨは、４．５〜１０．０程度とするのが好ましく、５．５〜９．０程度とするのがより好ましい。
【００９２】
処理液の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、タンパク質のウェル１２の内面への担持がより円滑に行われるようになり、被覆層３１を確実に形成することができる。
【００９３】
［５Ａ］  次に、抗原処理物２１が担持されていない領域に被覆層３１が形成されたマイクロプレート１１を洗浄する。
【００９４】
具体的には、前記工程［３Ａ］と同様にして、ウェル１２内に洗浄液を供給し、その後、洗浄液を穏やかに攪拌等することにより、洗浄液中に、ウェル１２に吸着されなかったタンパク質を溶解させる。そして、タンパク質が洗浄液中に溶解した状態で除去して廃棄することにより、ウェル１２内を洗浄する。
【００９５】
本工程［５Ａ］で用いる洗浄液としては、各種のものが使用可能であるが、前記工程［３Ａ］で説明したのと同様の理由により、等張液が好適に用いられる。
【００９６】
また、この等張液には、前記工程［１Ａ］で説明したのと同様のものが挙げられる。
さらに、本工程［５Ａ］は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、ウェル１２に吸着されなかったタンパク質をより確実に除去することができる。
【００９７】
この場合、用いる洗浄液は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【００９８】
なお、ウェル１２に担持されないタンパク質が含まれていたとしてもごく微量である場合には、本工程を省略することもできる。
以上のような工程を経て、抗原処理物付着担体１が製造される。
【００９９】
このような本発明の抗原処理物付着担体の製造方法では、抗原を界面活性剤による処理前よりもその表面に抗原認識部位をより多く露出した状態の抗原処理物２１がウェル１２の底面に付着することとなる。そのため、ウェル１２の底面に抗原を直接付着させた場合と比較して、より高感度に検体中の目的とする抗体を検出することができる。さらに、底面に付着させる抗原処理物２１の担持量を少なくしても、抗原を付着させた場合と、ほぼ同様の検出感度が期待できることから、製造コストの削減をも図ることができる。
【０１００】
なお、本実施形態では、ウェル１２は、その底面が平坦面で構成されるものを用いたが、このような形状のものに限定されず、例えば、その断面形状がＶ字形、Ｕ字形またはその変形形状をなしたものであってもよい。
【０１０１】
次に、上述した本発明の抗原処理物付着担体を用いて、検体中の抗体を検出する抗体の検出方法について説明する。
【０１０２】
図２は、本発明の抗原処理物付着担体を用いて、検体中の抗体を検出する抗体の検出方法を説明するための縦断面図である。
【０１０３】
本実施形態の抗体の検出方法は、［１Ｂ］検体中の抗体に抗原処理物を認識させる工程と、［２Ｂ］検体中の抗体が付着したマイクロプレートを洗浄する工程と、［３Ｂ］酵素標識された抗体にマイクロプレートに付着した抗体を認識させる工程と、［４Ｂ］酵素標識された抗体が付着したマイクロプレートを洗浄する工程と、［５Ｂ］酵素と反応する基質を供給する工程とを有する。
【０１０４】
以下、各工程について順次説明する。
［１Ｂ］  まず、検出すべき抗体２５を含有する検体２００を用意し、この検体２００を、マイクロプレート１１が備えるウェル１２内に供給することにより、検体２００中に含まれる検出すべき抗体（検査対象物）２５に、ウェル１２の底面に担持されている抗原処理物２１を認識させる。
【０１０５】
［１Ｂ−１］  まず、検出すべき抗体２５を含有する検体２００を用意する。
検体２００としては、上述した抗原処理物２１が有する抗体認識部位を特異的に認識する抗体２５が含まれているか否かを判定するべきものが用意され、例えば、血液、リンパ液、唾液、尿等の体液、または当該体液対して希釈や、遠心分離による固体物の除去等の処理が施されたものが用いられる。
【０１０６】
なお、検体２００として、体液の希釈物を用いる場合、体液を希釈するための希釈液としては、前記工程［１］で説明したのと同様の等張液が好適に用いられる。
【０１０７】
また、以下では、検体中に含まれる検出すべき抗体２５を「一次抗体」と言うこともある。
【０１０８】
［１Ｂ−２］  次に、前記工程［１Ｂ−１］で準備した検体２００を、ウェル１２内に供給する。
【０１０９】
これにより、検体２００中に含まれる検出すべき抗体（一次抗体）２５に、ウェル１２の底面に担持されている抗原処理物２１を認識させる。すなわち、ウェル１２の底面に、検体２００中に含まれる一次抗体２５が抗原処理物２１を介して、特異的に担持（吸着）される（図２（ａ）参照。）。
【０１１０】
この検体２００をウェル１２内に留置しておく時間は１０分〜２４時間程度であるのが好ましく、２０分〜１２時間程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、抗原処理物２１を認識する一次抗体２５の数が少なくなるおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【０１１１】
また、この際（処理時）の検体２００の温度は、５０℃以下であるのが好ましく、２〜４０℃程度であるのがより好ましい。
【０１１２】
また、検体２００のｐＨは、４．５〜９．５程度とするのが好ましく、５．０〜９．０程度とするのがより好ましい。
【０１１３】
処理液の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、検体２００中に含まれる一次抗体２５が抗原処理物２１をより迅速かつ確実に認識するようになる。
【０１１４】
［２Ｂ］  次に、マイクロプレート１１が備えるウェル１２内を洗浄する。
これにより、検体２００中に含まれる抗体のうち、抗原処理物２１を認識した一次抗体２５以外の抗体が、ウェル１２外に廃棄される。
【０１１５】
具体的には、ウェル１２内に洗浄液を供給し、その後、洗浄液を穏やかに攪拌等することにより、抗原処理物２１を認識しなかった抗体を洗浄液中に溶解または分散させる。そして、抗原処理物２１が洗浄液中に溶解または分散した状態で洗浄液を除去して廃棄する。
【０１１６】
なお、検体２００中に、一次抗体２５以外の抗体が含まれる場合、洗浄液中には、抗原処理物２１を認識しなかった一次抗体２５と、一次抗体２５以外の抗体が含まれることとなる。
【０１１７】
本工程［２Ｂ］で用いる洗浄液としては、各種のものが使用可能であるが、等張液が好適に用いられ、この等張液には、前記工程［１Ａ］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【０１１８】
また、本工程［２Ｂ］は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、抗原処理物２１を介してウェル１２に担持されなかった抗体をより確実に除去することができる。
【０１１９】
この場合、用いる洗浄液は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【０１２０】
［３Ｂ］  次に、酵素標識された抗体２６を含有する試薬３００を、マイクロプレート１１が備えるウェル１２内に供給する。
【０１２１】
ここで、酵素標識された抗体（以下、このものを「二次抗体」と言うこともある。）２６に含まれる抗体は、一次抗体２５を認識する抗体（抗一次抗体抗体）が選択されているため、ウェル１２内に供給されると、ウェル１２の底面に、抗原処理物２１を介して、担持されている一次抗体２５を認識する（図２（ｂ）参照。）。すなわち、ウェル１２の底面に、試薬３００中に含まれる二次抗体２６が、ウェル１２の底面側から抗原処理物２１および一次抗体２５をこの順に介して担持（吸着）される。
【０１２２】
抗体を標識する酵素としては、特に限定されないが、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼ等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。このような酵素を用いれば、後工程［５Ｂ］において、この酵素と反応する際に発色反応や吸光度変化等をともなう基質と反応させて、この反応を観察することにより、抗原処理物２１に担持された一次抗体２５の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体２００中の一次抗体２５の量を定量することが可能となる。
【０１２３】
また、試薬３００としては、二次抗体２６を含有すればよく、特に限定されるものではないが、二次抗体２６を等張液中に溶解または分散したものが好適に用いられる。
さらに、等張液としては、前記工程［１］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【０１２４】
［４Ｂ］  次に、マイクロプレート１１が備えるウェル１２内を洗浄する。
これにより、試薬３００中に含まれる二次抗体２６のうち、一次抗体２５を認識することなく溶液中に残存しているものが、ウェル１２外に廃棄される。
【０１２５】
具体的には、ウェル１２内に洗浄液を供給し、その後、洗浄液を穏やかに攪拌等することにより、一次抗体２５を認識しなかった二次抗体２６を洗浄液中に溶解または分散させる。そして、二次抗体２６が洗浄液中に溶解または分散した状態で洗浄液を除去して廃棄する。
【０１２６】
本工程［４Ｂ］で用いる洗浄液としては、各種のものが使用可能であるが、等張液が好適に用いられ、この等張液には、前記工程［１Ａ］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【０１２７】
また、本工程［４Ｂ］は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、抗原処理物２１および一次抗体２５を介してウェル１２に担持されなかった二次抗体２６をより確実に除去することができる。
【０１２８】
この場合、用いる洗浄液は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【０１２９】
［５Ｂ］  次に、酵素標識された抗体（二次抗体）２６に含まれる酵素と反応する基質２７を含有する試薬４００を、マイクロプレート１１が備えるウェル１２内に供給する（図２（ｃ）参照）。
【０１３０】
ここで、この基質２７としては、二次抗体２６と反応する際に、発色反応や吸光度変化等を伴うものが選択されている。そのため、これら同士の反応を観察することにより、抗原処理物２１に担持された一次抗体２５の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体２００中の一次抗体２５の定量を間接的に行うことが可能となる。
【０１３１】
このような基質としては、特に限定されないが、例えば、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等が挙げられる。
【０１３２】
また、試薬４００としては、基質２７を含有すればよく、特に限定されるものではないが、基質２７を等張液中に溶解したものが好適に用いられる。
さらに、等張液としては、前記工程［１］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【０１３３】
以上、本発明の抗原処理物付着担体の製造方法および抗原処理物付着担体を、図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１３４】
例えば、本発明の抗原処理物付着担体は、前記実施形態のうち、任意の１つまたは２つ以上の構成を組み合わせたものであってもよい。
【０１３５】
また、本発明の抗原処理物付着担体の製造方法、および、本発明の検体の検出方法では、必要に応じて、１以上の任意の目的の工程を追加してもよい。
【０１３６】
例えば、前記実施形態では、抗原処理物を担持させる基材として、平板状をなすマイクロプレートを用いる場合について説明したが、このような場合に限定されず、基材としては、粒状、ブロック状（塊状）またはペレット状をなすものを用いることができる。この場合、少なくとも表面付近が主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されたものが好ましく用いられる。
【０１３７】
そして、粒状をなす担体を用いる場合、この担体に担持された抗原処理物と一次抗体との反応による、担体の凝集反応を観察することにより、検体中の一次抗体の有無等を判定することができる。
【実施例】
【０１３８】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．抗原として日本脳炎ウイルスを用いた検討
（１−１）抗原処理物付着担体の製造
＜１Ａ＞  まず、日本脳炎ウイルス抗原（２３４．７μｇ／ｍＬ）を用意し、この日本脳炎ウイルス抗原（ＪＥ抗原）５ｍＬに対して、それぞれ、表１に示すＡ〜Ｄの抗原液が得られるようにＴＷＥＥＮ２０含有量が異なるβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）溶液を添加し、その後、３７℃の恒温水槽に３０分間静置し、さらに４℃で１週間静置することにより、日本脳炎ウイルスの不活化を行った。
【０１３９】
【表１】
2010014613.tif 000003
【０１４０】
＜２Ａ＞  次に、得られる各サンプル中の抗原量が１０μｇ／ｍＬとなるように、各抗原液Ａ〜Ｄを、表２中に示す各希釈液を用いて希釈した。
【０１４１】
【表２】
2010014613.tif 000004
【０１４２】
なお、表２中、ＰＢＳ−ＴはＴＷＥＥＮ２０含有ＰＢＳ溶液を表し、ＥＬＩＳＡ  ＰＬＡＴＥ  Ｎｏ.の列は、後工程＜４Ａ＞において、各サンプルをアプライするマイクロプレートＮｏ．を示し、ＥＬＩＳＡ希釈ＴＷＥＥＮ２０濃度の列は、後工程＜４Ａ＞において、マイクロプレート上で各サンプルを希釈する際に用いるＴＷＥＥＮ２０含有ＰＢＳ溶液中に含まれるＴＷＥＥＮ２０濃度を示している。
【０１４３】
＜３Ａ＞  次に、図３に示すような、縦横８×１２＝９６個のウェルを備えるポリスチレン製の９６−ｗｅｌｌマイクロプレート（ベクトンデッキンソン社製）を４つ用意した。
【０１４４】
なお、以下では、説明の便宜上、表３〜６に示すように、それぞれ、マイクロプレートの横の行をＡ〜Ｈレーンと言い、各レーンのウェルを左から順にナンバリングして、例えば、Ａレーンの左から３番目（ウェルＮｏ．３）のウェルをウェルＡ−３、Ｅレーンの左から５番目（ウェルＮｏ．６）のウェルをウェルＥ−５と言うこととする。
【０１４５】
＜４Ａ＞  次に、前記工程＜２Ａ＞で調製した、各サンプルを、それぞれ、表３〜６に示す各プレート１〜４におけるＡレーンのウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌ×２ｗｅｌｌずつアプライ（供給）した。そして、Ａレーンにアプライされた各サンプルを、表２のＥＬＩＳＡ希釈ＴＷＥＥＮ２０濃度に対応するＴＷＥＥＮ２０含有ＰＢＳ溶液またはＰＢＳ溶液を用いて、Ｂ〜Ｇレーンまで段階希釈した。
また、Ｈレーンには抗原が含まれないコントロールを作製した。
【０１４６】
【表３】
2010014613.tif 000005
【０１４７】
【表４】
2010014613.tif 000006
【０１４８】
【表５】
2010014613.tif 000007
【０１４９】
【表６】
2010014613.tif 000008
【０１５０】
なお、各表中で、各ウェルに対応する位置（カラム）に記載されている数値（％）は、各ウェル内にアプライした試料中に含まれるＴＷＥＥＮ２０の濃度を示している。
【０１５１】
＜５Ａ＞  次に、各プレート１〜４を、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、抗原（不活化日本脳炎ウイルス抗原）が界面活性剤（ＴＷＥＥＮ２０）で処理された抗原処理物を各プレートのウェル内に担持させた。
【０１５２】
＜６Ａ＞  次に、各プレート１〜４の各ウェル内に、それぞれ、１ｗｔ％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液を１００μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、各ウェル内の抗原処理物が担持されていない領域に、ＢＳＡを吸着させて、主としてＢＳＡで構成される被覆層を形成した。
【０１５３】
なお、本工程に先立って行うウェル内の洗浄を省略したため、本工程で形成された被覆層には、ＴＷＥＥＮ２０を含有する状態で形成されている。
【０１５４】
＜７Ａ＞  次に、各プレート１〜４の抗原処理物が担持され、被覆層が形成された各ウェル内を、それぞれ、０．１ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−Ｔ）を約３００μＬずつ供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液による各ウェルの洗浄を合計３回行った。
以上のような工程を経て、抗原処理物付着担体（プレート１〜プレート４）を得た。
【０１５５】
（１−２）検体中の抗体の検出
＜１Ｂ＞  まず、検体として、抗日本脳炎ウサギ血清を１ｗｔ％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液により２０００倍希釈したものを用意した。
【０１５６】
＜２Ｂ＞  次に、各プレート１〜４の各ウェル内に、それぞれ、抗日本脳炎ウサギ血清を含む検体を５０μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間静置することにより、検体中に含まれる抗日本脳炎ウサギ抗体（一次抗体）にウェル内に担持された抗原処理物を認識させた。
【０１５７】
＜３Ｂ＞  次に、各プレート１〜４の各ウェル内を、それぞれ、０．１ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を３００μＬずつ供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液による各ウェルの洗浄を合計３回行った。
【０１５８】
＜４Ｂ＞  次に、酵素標識された抗体（二次抗体）を含有する試薬として、ＰＯＤ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体を１ｗｔ％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液により５００倍希釈したものを用意した。
【０１５９】
なお、抗ウサギＩｇＧ抗体としては、「CAPPLE PROXDASE-CONJUGATED GOAT AFFYNITY PURIFIED  ANTIBODY TO RABBIT IGG Coad:5589 Lot#04347」を用いた。
【０１６０】
＜５Ｂ＞  次に、各プレート１〜４の各ウェル内に、それぞれ、抗ウサギＩｇＧ抗体（二次抗体）を含む試薬を５０μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、二次抗体にウェル内に抗原処理物を介して担持された一次抗体を認識させた。
【０１６１】
＜６Ｂ＞  次に、前記工程＜３Ｂ＞と同様にして各ウェル内を洗浄した。
＜７Ｂ＞  次に、各プレート１〜４の各ウェル内に、それぞれ、ＰＯＤの基質であるＴＭＢを含む試薬を５０μＬずつ供給して１６０秒間静置し、さらに１Ｎ・ＨＣｌを５０μＬずつ供給した後、各ウェル内の４５０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定した。
【０１６２】
なお、吸光度の測定は、吸光度測定装置（「GENios  Spectra FLUOR plus」、和光純薬社製）を用いて行った。
【０１６３】
測定された各ウェルでの吸光度と、抗原処理物付着担体を形成する際のＴＷＥＥＮ２０濃度との関係を図４〜図７に示す。
【０１６４】
各図に示すように、抗原をＴＷＥＥＮ２０で処理したウェル（実施例）では、抗原をＴＷＥＥＮ２０で処理していないウェル（比較例）と比較して、吸光度が明らかに高くなった。このことは、抗原をＴＷＥＥＮ２０で処理することにより、抗原自体が変性、変質または分解したため、抗原に含まれる抗体認識部位がその表面により多く露出したものと推察される。
【０１６５】
また、同一の抗原濃度で処理された抗原処理物が担持されているウェルでは、ＴＷＥＥＮ２０濃度が増加するにしたがって、吸光度が高くなったことから、抗体認識部位の抗原表面への露出は、ＴＷＥＥＮ２０濃度に対して依存性を示すと考えられた。
【０１６６】
なお、このような抗原をＴＷＥＥＮ２０で処理することによる吸光度の増加は、ＴＷＥＥＮ２０を添加する時期が抗原を不活化する際または抗原を不活化した後の双方で認められたことから、その添加時期は特に問われないことが判った。
【０１６７】
２．抗原としてデングウイルスを用いた検討
（２−１）抗原処理物付着担体の製造
＜１Ｃ＞  まず、デングＭＩＸ（蔗糖密度勾配超遠心を用いて精製したデングウイルス１型、２型、３型、４型を混合した溶液）（１８６μｇ／ｍＬ）を用意し、この不活化デングＭＩＸに含まれるデングウイルスの含有量が５μｇ／ｍＬとなるように、１．０２７ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を用いて希釈することにより、デングウイルス抗原含有量が５μｇ／ｍＬで、ＴＷＥＥＮ２０含有量が１ｗｔ％の抗原・界面活性剤含有液を得た。
【０１６８】
＜２Ｃ＞  次に、ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液に含まれるＴＷＥＥＮ２０の含有量が、０．１０２７ｗｔ％、０．０１０２７ｗｔ％、０．００１０２７ｗｔ％および０．０００１０２７ｗｔ％のものを用いた以外は、前記工程＜１Ｃ＞と同様にして、不活化デングＭＩＸ抗原含有量が５μｇ／ｍＬで、ＴＷＥＥＮ２０含有量が、それぞれ、０．１ｗｔ％、０．０１ｗｔ％、０．００１ｗｔ％、０．０００１ｗｔ％、の抗原・界面活性剤含有液を得た。
【０１６９】
＜３Ｃ＞  次に、縦横８×１２＝９６個のウェルを備えるポリスチレン製の９６−ｗｅｌｌマイクロプレート（ベクトンデッキンソン社製）を２つ用意した。
【０１７０】
＜４Ｃ＞  次に、前記工程＜１Ｃ＞、＜２Ｃ＞で調製した、ＴＷＥＥＮ２０含有量が１〜０．０００１ｗｔ％の抗原・界面活性剤含有液を、それぞれ、表７、８に示す各プレート１、２におけるＡレーンのウェルＡ−１〜Ａ−６に５０μＬ／ｗｅｌｌ×２ｗｅｌｌずつアプライ（供給）した。
【０１７１】
＜５Ｃ＞  次に、プレート１を用意し、Ｂレーン〜Ｈレーンのウェルに、Ａレーンの各ナンバーにアプライした抗原・界面活性剤含有液に含まれるＴＷＥＥＮ２０と同様の濃度のＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を、それぞれ、各ナンバーのウェルに対応するようにして５０μＬずつアプライした。
【０１７２】
＜６Ｃ＞  次に、プレート２を用意し、Ｂレーン〜Ｈレーンのウェルに、ＰＢＳ溶液をそれぞれ５０μＬずつアプライした。
【０１７３】
＜７Ｃ＞  次に、プレート１およびプレート２に対して、それぞれ、以下のような操作を同様に行った。
【０１７４】
すなわち、ＡレーンのウェルＡ−１〜Ａ−６から抗原・界面活性剤含有液を５０μＬずつ分注し、これらのものを、それぞれの各ナンバーが対応するようにして、ＢレーンのウェルＢ−１〜Ｂ−６にアプライした。そして、この操作を、ＢレーンからＣレーンに、ＣレーンからＤレーンへと、Ｇレーンにまで同様にして段階希釈を行うことにより、Ａレーン〜Ｇレーンに含まれる抗原量が５〜０．０７８１２５μｇ／ｍＬとなるように調製した。
【０１７５】
なお、かかる操作により、Ｈレーンには抗原が含まれておらず、このＨレーンをコントロールとした。
【０１７６】
＜８Ｃ＞  次に、各プレート１、２を、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、抗原（不活化デングＭＩＸ抗原）を界面活性剤（ＴＷＥＥＮ２０）で処理された抗原処理物を得つつ、この抗原処理物を各ウェルＡ−１〜Ｇ−６内に担持させた。
【０１７７】
＜９Ｃ＞  次に、各プレート１、２の抗原処理物が担持された各ウェルＡ−１〜Ｇ−６内を、それぞれ、０．１ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を約３００μＬずつ供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液による各ウェルの洗浄を合計３回行った。
【０１７８】
＜１０Ｃ＞  次に、各プレート１、２の各ウェルＡ−１〜Ｇ−６内に、それぞれ、１ｗｔ％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液を１００μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、各ウェル内の抗原処理物が担持されていない領域に、ＢＳＡを吸着させて、主としてＢＳＡで構成される被覆層を形成した。
【０１７９】
＜１１Ｃ＞  次に、各プレート１、２の抗原処理物が担持され、被覆層が形成された各ウェルＡ−１〜Ｇ−６内を、それぞれ、０．１ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を約３００μＬずつ供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液による各ウェルの洗浄を合計３回行った。
以上のような工程を経て、抗原処理物付着担体（プレート１、プレート２）を得た。
【０１８０】
【表７】
2010014613.tif 000009
【０１８１】
【表８】
2010014613.tif 000010
【０１８２】
なお、各表中で、各ウェルに対応する位置（カラム）に記載されている数値（％）は、各ウェル内にアプライした試料中に含まれるＴＷＥＥＮ２０の濃度を示している。
【０１８３】
（２−２）検体中の抗体の検出
＜１Ｄ＞  まず、検体として、αＤｅｎｇｕｅＭｉｘ−ＭＵ（一次抗体）をＰＢＳにより５００倍希釈したものを用意した。
【０１８４】
なお、αＤｅｎｇｕｅＭｉｘ−ＭＵとは、Ｄｅｎｇｕ１型〜４型のウイルスを接種した数種類のマウスから得られた血清に含まれるＤｅｎｇｕ１型〜４型抗体の抗体価をそろえて混合したものである。
【０１８５】
＜２Ｄ＞  次に、各プレート１、２の各ウェルＡ−１〜Ｈ−６内に、それぞれ、αＤｅｎｇｕｅＭｉｘ−ＭＵ（一次抗体）を含む検体を５０μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、一次抗体にウェル内に担持された抗原処理物を認識させた。
【０１８６】
＜３Ｄ＞  次に、各プレート１、２の各ウェルＡ−１〜Ｈ−６内を、それぞれ、０．１ｗｔ％ＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液を３００μＬずつ供給した後、このものを除去することにより、洗浄した。このＴＷＥＥＮ２０／ＰＢＳ溶液による各ウェルの洗浄を合計３回行った。
【０１８７】
＜４Ｄ＞  次に、酵素標識された抗体（二次抗体）を含有する試薬として、ＰＯＤ標識αＭＵＩｇＧＦＣ（cat:64-6420 Zymed）をＰＢＳにより３００倍希釈したものを用意した。
【０１８８】
＜５Ｄ＞  次に、各プレート１、２の各ウェルＡ−１〜Ｈ−６内に、それぞれ、ＰＯＤ標識αＭＵＩｇＧＦＣ（二次抗体）を含む試薬を５０μＬずつ供給した後、大気中、３７℃で３０分間放置することにより、二次抗体にウェル内に抗原処理物を介して担持された一次抗体を認識させた。
【０１８９】
＜６Ｄ＞  次に、前記工程＜３Ｄ＞と同様にして各ウェルＡ−１〜Ｈ−６内を洗浄した。
【０１９０】
＜７Ｄ＞  次に、各プレート１、２の各ウェルＡ−１〜Ｈ−６内に、それぞれ、ＰＯＤの基質であるＴＭＢを含む試薬を５０μＬずつ供給して３０秒間放置し、さらに１Ｎ・ＨＣｌを５０μＬずつ供給した後、各ウェル内の４５０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定した。
【０１９１】
なお、吸光度の測定は、吸光度測定装置（「GENios  Spectra FLUOR plus」、和光純薬）を用いて行った。
【０１９２】
測定された各ウェルでの吸光度と、抗原処理物付着担体を形成する際のＴＷＥＥＮ２０濃度との関係を図８、図９に示す。
【０１９３】
各図に示すように、抗原として不活化デングＭＩＸ抗原を用いた場合も、日本脳炎ウイルス抗原を用いた場合と同様に、同一の抗原濃度で処理された抗原処理物が担持されているウェルでは、ＴＷＥＥＮ２０濃度が増加するにしたがって、吸光度が高くなる傾向を示した。このことから、不活化デングＭＩＸ抗原おいても、抗原自体が変性、変質または分解し、抗原に含まれる抗体認識部位がその表面により多く露出しているものと推察された。
【０１９４】
このようなＴＷＥＥＮ２０濃度の増加による吸光度の増加は、抗原濃度が１．２５〜０．６２５ｍｇ／ｍＬである場合、ＴＷＥＥＮ２０濃度が０．０１〜０．００１ｗｔ％である時に顕著に認められた。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】本発明の抗原処理物付着担体の製造方法で製造される抗原処理物付着担体の実施形態を示す縦断面図である。
【図２】本発明の抗原処理物付着担体を用いて、検体中の抗体を検出する抗体の検出方法を説明するための縦断面図である。
【図３】抗原処理物が担持されるマイクロプレートを模式的に示す平面図である。
【図４】プレート１のウェルで測定された吸光度と、抗原処理物付着担体を形成する際のＴＷＥＥＮ２０濃度との関係を示す図である。
【図５】プレート２のウェルで測定された吸光度と、抗原処理物付着担体を形成する際のＴＷＥＥＮ２０濃度との関係を示す図である。
【図６】プレート３のウェルで測定された吸光度と、抗原処理物付着担体を形成する際のＴＷＥＥＮ２０濃度との関係を示す図である。
【図７】プレート４のウェルで測定された吸光度と、抗原処理物付着担体を形成する際のＴＷＥＥＮ２０濃度との関係を示す図である。
【図８】プレート１のウェルで測定された吸光度と、抗原処理物付着担体を形成する際のＴＷＥＥＮ２０濃度との関係を示す図である。
【図９】プレート２のウェルで測定された吸光度と、抗原処理物付着担体を形成する際のＴＷＥＥＮ２０濃度との関係を示す図である。
【符号の説明】
【０１９６】
１            抗原処理物付着担体
１１          マイクロプレート
１２          ウェル
２１          抗原処理物
２５          検出すべき抗体（一次抗体）
２６          酵素標識された抗体（二次抗体）
２７          基質
３１          被覆層
２００        検体
３００        試薬
４００        試薬
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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