(57)【要約】【課題】  実生段階においても個体が日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体か否かの判定を高い精度で行うことができる、リンゴ果実の日持ち性の予見方法を提供すること。【解決手段】  リンゴの組織（果実を除く）を用いてＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子の５’隣接領域に存在するグアニンとアデニンで構成されるＳＳＲの回数を調べ、回数が１５〜２５回の遺伝子型を有する個体を日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体として判定することを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴの組織（果実を除く）を用いてＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子の５’隣接領域に存在するグアニンとアデニンで構成されるＳＳＲの回数を調べ、回数が１５〜２５回の遺伝子型を有する個体を日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体として判定することを特徴とするリンゴ果実の日持ち性の予見方法。
【請求項２】
配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６記載の塩基配列からなるリバースプライマーを用いたＰＣＲを行った後、配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７記載の塩基配列からなるリバースプライマーを用いたＰＣＲを行うことで、指標とするＳＳＲを含む遺伝子断片を増幅し、当該遺伝子断片の塩基配列を決定することによってＳＳＲの回数を調べることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１記載の判定を実生段階の組織を用いて行い、日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体として判定された個体を選抜し、選抜された個体を育成系統として育種を行うことを特徴とする日持ち性に優れた果実を結実するリンゴの育種方法。
【請求項４】
配列番号４記載のアミノ酸配列を有する２８９位がバリンであるＭｄＡＣＳ３ａをコードしてなることを特徴とする遺伝子。
【請求項５】
配列番号４記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする２８９位がバリンであるＭｄＡＣＳ３ａ。
【請求項６】
配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６記載の塩基配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーセットと、配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７記載の塩基配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーセットを少なくとも含んでなることを特徴とする請求項１記載のリンゴ果実の日持ち性の予見方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンゴ果実の日持ち性の予見方法に関する。より詳細には、ＤＮＡマーカーを用いて日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体か否かを判定することによって行うリンゴ果実の日持ち性の予見方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンゴ果実の日持ち性は、商品としての価値に大きく影響するので、現在、生産現場から流通全般を通して日持ちの低下を招く要因（高温など）の排除に多くの労力やコストがかけられている。かかる観点から、日持ち性に優れた果実を結実する品種の開発が行われているが、リンゴは実生から初結実まで長期間（約１０年）を要する幼若期が非常に長い果樹であるため、結実した後にその果実の日持ち性を果肉の軟化速度を調べるなどして評価することができるようになるまでの期間の育成や管理には多大な負担が伴う。故に、実生段階で個体が結実する果実の日持ち性を予見することができる方法が必要とされている。
【０００３】
一般に、果実の完熟（後熟）の進行は、果実自体が産生するエチレンによって開始される。この点に基づき、本発明者は、リンゴ果実の完熟に関連する遺伝子として知られている、エチレンの生合成に関与する１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸合成酵素（ＡＣＳ）遺伝子の１つであるＭｄＡＣＳ１遺伝子が対立遺伝子を有すること、この対立遺伝子型が果実の完熟時のエチレン産生量を規定することを明らかにし、対立遺伝子に由来する転写産物レベルの差異から個体が結実する果実の収穫前の落果性を予見する方法を提案している（非特許文献１）。しかしながら、種々のリンゴの品種の日持ち性をこの方法で確認すると、必ずしもＭｄＡＣＳ１の対立遺伝子型だけでは品種間の日持ち性の違いを説明することができないことから、より正確に日持ち性を予見することができる方法が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】原田竹雄、リンゴ果実のエチレン生合成制御に関する遺伝子工学、ｐ１−３８，４６−５２、２０００年３月発行、弘前大学農学生命科学部（出版者）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、実生段階においても個体が日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体か否かの判定を高い精度で行うことができる、リンゴ果実の日持ち性の予見方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、ＭｄＡＣＳ１遺伝子と同様に、リンゴ果実の完熟に関連する遺伝子であるＭｄＡＣＳ３遺伝子のサブファミリーに属し、果実が完熟する直前で発現することが知られているＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子（例えば“ゴールデンデリシャス”由来のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ２４３０６０：配列番号１記載の塩基配列からなるもの、必要であれば本発明者による特開２００７−４９９６１号公報を参照のこと）には、酵素活性中心にアミノ酸の置換を生じる変異型のＭｄＡＣＳ３ａをコードする対立遺伝子が存在すること、この対立遺伝子がコードするＭｄＡＣＳ３ａは酵素活性中心に生じたアミノ酸の置換によって酵素活性が失われていることでエチレンが生成しないこと、この対立遺伝子中にはＣＤＳに連鎖する特徴的なＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔ）が５’隣接領域に存在することを見出し、そのＳＳＲをＤＮＡマーカーとして用いれば、この対立遺伝子型を有することにより、完熟の進行が遅いことで日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体か否かの判定を実生段階においても高い精度で行うことができることを知見した。
【０００７】
上記の知見に基づいてなされた本発明のリンゴ果実の日持ち性の予見方法は、請求項１記載の通り、リンゴの組織（果実を除く）を用いてＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子の５’隣接領域に存在するグアニンとアデニンで構成されるＳＳＲの回数を調べ、回数が１５〜２５回の遺伝子型を有する個体を日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体として判定することを特徴とする。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６記載の塩基配列からなるリバースプライマーを用いたＰＣＲを行った後、配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７記載の塩基配列からなるリバースプライマーを用いたＰＣＲを行うことで、指標とするＳＳＲを含む遺伝子断片を増幅し、当該遺伝子断片の塩基配列を決定することによってＳＳＲの回数を調べることを特徴とする。
また、本発明の日持ち性に優れた果実を結実するリンゴの育種方法は、請求項３記載の通り、請求項１記載の判定を実生段階の組織を用いて行い、日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体として判定された個体を選抜し、選抜された個体を育成系統として育種を行うことを特徴とする。
また、本発明の遺伝子は、請求項４記載の通り、配列番号４記載のアミノ酸配列を有する２８９位がバリンであるＭｄＡＣＳ３ａをコードしてなることを特徴とする。
また、本発明の２８９位がバリンであるＭｄＡＣＳ３ａは、請求項５記載の通り、配列番号４記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
また、本発明の請求項１記載のリンゴ果実の日持ち性の予見方法を実施するためのキットは、請求項６記載の通り、配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６記載の塩基配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーセットと、配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７記載の塩基配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーセットを少なくとも含んでなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、実生段階においても個体が日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体か否かの判定を高い精度で行うことができる、リンゴ果実の日持ち性の予見方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明によって可能となる日持ち性に優れた果実を結実するリンゴの育種方法の概念図である。
【図２】実施例におけるＰＣＲプライマー部位を示す図である。
【図３】ＭｄＡＣＳ３ａの対立遺伝子の構造的特徴を示す図である。
【図４】ＭｄＡＣＳ３ａ−ＧとＭｄＡＣＳ３ａ−ＶのＡＣＣ合成酵素活性を比較した結果を示すグラフである。
【図５】両酵素のアミノ酸の置換部位を示す図である。
【図６】各種のリンゴ品種の対立遺伝子型の判定結果を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のリンゴ果実の日持ち性の予見方法は、リンゴの組織（果実を除く）を用いてＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子の５’隣接領域に存在するグアニンとアデニン（以下、「ＧＡ」と略称する）で構成されるＳＳＲの回数を調べ、回数が１５〜２５回の遺伝子型を有する個体を日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体として判定することを特徴とするものである。既に知られている前出のＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子の翻訳産物（４４６個のアミノ酸からなるタンパク質：配列番号２）は、酵素活性中心に位置する２８９位がグリシンであり、酵素活性を有していることでエチレンが生成するが、本発明においてＤＮＡマーカーとして用いるＳＳＲの回数が１５〜２５回であるＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子（例えば“ゴールデンデリシャス”由来の配列番号３記載の塩基配列からなるもの）の翻訳産物は、前出のＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子の翻訳産物と同じく４４６個のアミノ酸からなるタンパク質であるが（配列番号４）、酵素活性中心に位置する２８９位がバリンであることによって酵素活性を失っていることでエチレンが生成しない。従って、２８９位がバリンであるＭｄＡＣＳ３ａをコードする遺伝子をホモで有する個体は、結実する果実の日持ち性がよい（完熟の進行が遅い）個体であると判定することができ、２８９位がバリンであるＭｄＡＣＳ３ａをコードする遺伝子をヘテロで有する個体は、日持ち性に優れた果実を結実し得ると判定することができる。逆に、２８９位がバリンであるＭｄＡＣＳ３ａをコードする遺伝子を持たない個体（２８９位がグリシンであるＭｄＡＣＳ３ａをコードする遺伝子をホモで有する個体）は、結実する果実の日持ち性が劣ると判定することができる。故に、リンゴ果実の日持ち性の予見を高い精度で行うことができる。よって、本発明によれば、指標とするＳＳＲの回数を実生段階の組織（例えば子葉など）を用いて調べることにより、日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体の選抜が可能となるので、選抜された個体を育成系統として採用することにより、日持ち性に優れた果実を結実するリンゴの育種を効率的に行うことができる。リンゴの品種育成は交雑育種法によって行われるが、上述したようにリンゴは幼若期が非常に長い果樹であるため、実生段階で果実の形質を予見できるＤＮＡマーカーによる選抜効果は極めて大きい（図１）。なお、本発明において、「ＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子の５’隣接領域」とは、より詳細には、ＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子の−６００〜−２００の領域（転写開始点より上流２００〜６００ｂｐの領域）を意味する。
【００１１】
ＤＮＡマーカーとして用いるＳＳＲの回数を１５〜２５回と規定するのは、塩基配列を決定する際の困難性（スリッページの発生）に起因して間違ったカウントをしてしまう可能性を考慮したものであるが、多くの場合、結果は１８〜２４回である。一方、２８９位がグリシンであるＭｄＡＣＳ３ａをコードする遺伝子が同領域に持つＧＡで構成されるＳＳＲの回数は、多くの場合、８〜１０回である。従って、両者の回数の差異は明確であることから、一方を他方と間違うことはない。
【００１２】
指標とするＳＳＲの回数は、配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６記載の塩基配列からなるリバースプライマーを用いたＰＣＲを行った後、配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７記載の塩基配列からなるリバースプライマーを用いたＰＣＲを行うことで、指標とするＳＳＲを含む遺伝子断片を増幅し、当該遺伝子断片の塩基配列を決定することによって調べることができる。２段階でＰＣＲを行うのは、ＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子と同様に、ＭｄＡＣＳ３遺伝子のサブファミリーに属する遺伝子として知られているＭｄＡＣＳ３ｂ遺伝子とＭｄＡＣＳ３ｃ遺伝子が由来の断片の混入を防ぐためである。なお、ＰＣＲの実行とＳＳＲの回数のカウントは、当業者に周知の方法によって行えばよい。配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６記載の塩基配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーセットと、配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７記載の塩基配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーセットを少なくとも含んでなる上記のＰＣＲを実行するためのキット（ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰなどを含んでいてもよい）を予め準備しておくことで、上記の操作を効率的に行うことができる。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１４】
（１）ＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子が有するＳＳＲの分析
複数種類の品種のリンゴの子葉から抽出したゲノムＤＮＡを用いてＳＮＰｓ解析を行うことで、既に知られている酵素活性中心に位置する２８９位がグリシンであるＭｄＡＣＳ３ａをコードする遺伝子とともに、その対立遺伝子として、酵素活性中心に位置する２８９位がバリンであるＭｄＡＣＳ３ａをコードする遺伝子を見出した（ＭｄＡＣＳ３ａの２８９位が酵素活性中心に位置することはＹｉｐ  ＷＫ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  １−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８７，７９３０−７９３４．による）。また、それぞれの遺伝子は、ＣＤＳに連鎖するＧＡで構成される特徴的なＳＳＲをＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子の−４００〜−３００の領域に持つことを見出した。具体例として、既に知られている“ゴールデンデリシャス”由来の前者の遺伝子の塩基配列とその翻訳産物のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１と配列番号２に、今回、新たに見出された“ゴールデンデリシャス”由来の後者の遺伝子の塩基配列とその翻訳産物のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３と配列番号４に示す。配列番号１記載の塩基配列においては９３１〜９５０位が指標とするＳＳＲ（繰り返し回数は１０回）で１３００位が転写開始点であり（ＣＤＳ：１３７２．．１５５１，１６６８．．１９６９，２２１９．．３０７７）、配列番号３記載の塩基配列においては９３１〜９７８位が指標とするＳＳＲ（繰り返し回数は２４回）で１３２８位が転写開始点である（ＣＤＳ：１４００．．１５７９，１６９６．．１９９７，２２４７．．３１０５）。なお、対立遺伝子型の判定のためのＰＣＲは、ＭｄＡＣＳ３ｂ遺伝子とＭｄＡＣＳ３ｃ遺伝子が由来の断片の混入を防ぐため、最初に、フォワードプライマーとして５’−ＴＧＴＡＴＧＣＡＧＣＣＣＴＡＧＡＴＡＴＣ−３’（ＭｄＡＣＳ３ａ−１Ｆ：配列番号５）、リバースプライマーとして５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＡＴＡＣＡＡＡＣＴＧＡＴＴＧＴＧ−３’（ＭｄＡＣＳ３ａ−２Ｒ：配列番号６）を用いて、９４℃３分→（９４℃１０秒→５８℃５秒→７２℃３分）×３５サイクル→７２℃３分の条件で行い、次に、フォワードプライマーとして前出のフォワードプライマー、リバースプライマーとして５’−ＣＴＡＣＡＴＧＴＡＣＣＣＡＡＣＡＡＣＴＧ−３’（ＭｄＡＣＳ３ａ−１Ｒ：配列番号７）を用いて、９４℃３分→（９４℃３０秒→５８℃３０秒→７２℃１分）×３５サイクル→７２℃３分の条件で行うことによって２段階で行った。図２に２８９位がグリシンであるＭｄＡＣＳ３ａをコードする遺伝子を例にとってＰＣＲプライマー部位を示す（下線部分がＧＡで構成されるＳＳＲである）。
【００１５】
（２）ＭｄＡＣＳ３ａの対立遺伝子の構造的特徴
図３に示す。上記の分析により、２８９位がグリシンであるＭｄＡＣＳ３ａ（ＭｄＡＣＳ３ａ−Ｇ）をコードする遺伝子は、５’隣接領域にＧＡで構成される８〜１０回のＳＳＲを持つことがわかった。一方、２８９位がバリンであるＭｄＡＣＳ３ａ（ＭｄＡＣＳ３ａ−Ｖ）をコードする遺伝子は、５’隣接領域にＧＡで構成される１８〜２４回のＳＳＲを持ち、ＭｄＡＣＳ３ａ−Ｇをコードする遺伝子に対し、第３エクソンにおいてＧからＴへの塩基置換が存在することがわかった。以上の結果から、図中に示したプライマーを用いたＰＣＲを行うことによってＧＡで構成されるＳＳＲの回数を判定することにより、両遺伝子型の判定が可能であることがわかった。
【００１６】
（３）ＭｄＡＣＳ３ａ−ＧとＭｄＡＣＳ３ａ−ＶのＡＣＣ合成酵素活性の比較
ＭｄＡＣＳ３ａ−Ｇの全長ｃＤＮＡとＭｄＡＣＳ３ａ−Ｖの全長ｃＤＮＡのそれぞれを、大腸菌ｐＥＴベクター（ｐＥＴ１１ｄ：ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）に挿入し、大腸菌（ＢＬ２１）内で発現させた。大腸菌から翻訳産物を抽出し、Ｌｉｚａｄａらの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１００，１４０−１４５，１９７９）に従って、基質であるＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）と補酵素ピリドキサル５リン酸を加えて反応させ、生成した１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸を塩化水銀（ＨｇＣｌ２）と塩素酸ナトリウムを加えることで化学的にエチレンに変換し、その量をガスクロマトグラフィーにて測定することによってＡＣＣ合成酵素活性を調べた。また、ポジティブコントロールとして、ＭｄＡＣＳ１についても、その遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＤＵ８９１５６）を用いて同様の方法でＡＣＣ合成酵素活性を調べた。結果を図４に示す。図４から明らかなように、ＭｄＡＣＳ３ａ−Ｇは、ＭｄＡＣＳ１の約１／４０のＡＣＣ合成酵素活性を有していたが、ＭｄＡＣＳ３ａ−Ｖは、２８９位がバリンであるが故にＡＣＣ合成酵素活性が失われていた（図５に両酵素のアミノ酸の置換部位を枠線で示す）。
【００１７】
（４）各種のリンゴ品種の対立遺伝子型の判定結果
ＰＣＲ産物をアクリルアミドゲル（Ａｃｒｙｋａｎｕｄｅ：Ｂｉｓ＝３０：１、６％）により１５００Ｖで１時間電気泳動を行った結果を図６に示す。図６から品種毎の遺伝子型が明らかとなった。“はつあき（Ｈａｔｓｕａｋｉ）”は果実の日持ち性が優れている品種として知られているが、この事実は２８９位がバリンであるＭｄＡＣＳ３ａをコードする遺伝子（ＭｄＡＣＳ３ａ−Ｖ）をホモで有していることによって裏付けられた。
【００１８】
（５）まとめ
以上の実験結果から、ＭｄＡＣＳ３ａ遺伝子の５’隣接領域に存在するＧＡで構成されるＳＳＲの回数を調べ、回数が１５〜２５回の遺伝子型を有する個体は、ＡＣＣ合成酵素活性が失われた２８９位がバリンであるＭｄＡＣＳ３ａを発現するので、日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体であると判定することができることから、この判定結果によって果実の日持ち性を予見することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明は、実生段階においても個体が日持ち性に優れた果実を結実する、または、結実し得る個体か否かの判定を高い精度で行うことができる、リンゴ果実の日持ち性の予見方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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