(57)【要約】【課題】インフルエンザウイルス感染に対して高い抑制効果を示し、かつ、今までそのような抑制効果を有することが知られていなかった伝承医薬基原植物を見つけ、インフルエンザ治療又は予防のための医薬品等へ応用する。【解決手段】チリー産タデ科植物Ｍｕｅｈｌｅｎｂｅｃｋｉａ  ｈａｓｔｕｌａｔａ又は日本産ヤナギタデ（Ｐｅｒｓｉｃａｒｉａ  ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ）の抽出物若しくはその精製物は、高い抗インフルエンザウイルス活性を示した。そのため、これらは、インフルエンザウイルス感染に対して高い抑制効果をもつ安全な医薬組成物、健康補助食品（サプリメント）、薬用酒又は公衆衛生用組成物として利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タデ科植物Ｍｕｅｈｌｅｎｂｅｃｋｉａ  ｈａｓｔｕｌａｔａ又はＰｅｒｓｉｃａｒｉａ  ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒの抽出物若しくはその精製物を有効成分とする、抗インフルエンザウイルス素材。
【請求項２】
有効成分の本体がヒペリシン、プロトヒペリシン、フェオフォルバイドａ、又はこれらの類縁体のいずれか、あるいはそれら２種以上の混合物である、請求項１の抗インフルエンザウイルス素材。
【請求項３】
請求項１又は２の抗インフルエンザウイルス素材を含有する医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２の抗インフルエンザウイルス素材を含有する健康補助食品（サプリメント）。
【請求項５】
請求項１又は２の抗インフルエンザウイルス素材を含有する薬用酒。
【請求項６】
請求項１又は２の抗インフルエンザウイルス素材を含有する公衆衛生用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明はタデ科植物由来の抗インフルエンザウイルス素材及びその用途に関するものである。更に詳しくは、インフルエンザウイルス感染防止に有効なタデ科植物由来の抗インフルエンザウイルス素材、それを利用したインフルエンザ治療若しくは予防のための医薬組成物、インフルエンザウイルス感染を予防するための健康補助食品（サプリメント）又は薬用酒、あるいは、公衆衛生用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】  インフルエンザは、過去に小変異、大変異といわれる変異を経て周期的に人類を襲い、国家・地域を越えた脅威となっている。近年は、多くの地域において栄養・公衆衛生面が改善され、以前ほどの脅威がなくなったとはいえ、いまなお不特定多数の人々が感染し、特に、免疫能が十分でない小児や老人にとって毎年繰り返される脅威となっている。また、感染の流行による多くの労働者の就労時間の短縮とそれによって引き起こされる経済的損失が各国のＧＤＰの数パーセントに及ぶと試算される等、依然国家レベルの経済問題となっている。【０００３】  現在では、大変異に相当する新型インフルエンザの大流行の可能性が高く、国際的な監視体制が強化されている。新型インフルエンザのパンデミックな流行では、一国で感染が発生した場合、世界中に広まるのに二ヶ月もかからないと言われている。インフルエンザ感染症の対策は、ワクチン（能動免疫）による予防・治療とタミフル▲Ｒ▼［オセルタミビル（Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）］、リレンザ▲Ｒ▼［ザナミビル（Ｚａｎａｍｉｖｉｒ）］等の抗インフルエンザ薬による予防・治療の二本柱での対策に重点が置かれてきた。新型ウイルスに関しては、抗インフルエンザ薬の備蓄量による制限及びワクチン製造のリードタイムから、これら薬剤の供給は、医療従事者等の感染危険度の高い公的職場の人々へ限られると試算・想定されている。【０００４】  新型ウイルスのみならず季節性インフルエンザウイルスの感染拡大の制御には、薬剤の選択肢を充実させるとともに、個体における感染成立から集団における感染拡大までを俯瞰した各段階でのきめ細かな感染防御策が望まれる。具体的には、次のような点である。
１）予防に関しては、能動免疫であるワクチンに加えて、即効性でかつワクチンと同様にウイルス株特異的な抗血清（グロブリン製剤）、抗体医薬等の受動免疫製剤の投与；
２）環境から個体への侵入段階に関しては、ウイルスを捕捉・不活性化能を持つ機能性素材による侵入部位近傍による防御、具体的にはマスク、うがい液等による防御；
３）環境そのものの清浄化に関しては、環境中の浮遊ウイルスの除去に有効な空気清浄機の普及、安全で浮遊ウイルスを不活性化させる薬剤散布；等の多段階の感染（拡大）防御策を講じること。【０００５】  細菌・真菌感染症の場合、抗生剤及び殺菌性消毒剤による感染拡大の防御・治療が奏功している。ウイルス感染症においても、殺ウイルス剤のようなカテゴリーの製剤群、すなわち抗原性に依存せずウイルスを人体外部で有効に不活性化する安全な薬剤の開発が望まれる。現状では、ウイルスに対しては消毒用アルコール、塩素系薬剤、アルデヒド系薬剤等のタンパク質変性剤が市販され、肝炎ウイルス等によるウイルス汚染医療器材等の消毒に役立っている。しかしながら、これら薬剤は、効力が持続しないか、あるいは強い細胞毒性があるなど、上気道を感染経路とするインフルエンザウイルスに関しては適用範囲が限られる。生活環境中に撒布しても安全で、かつ効果の持続するインフルエンザウイルス不活性化剤の開発が望まれている。安全性の観点から、食用、治療用に長年用いられている伝承医薬基原植物等の天然物は、有望な資源候補と考えられる。【０００６】  抗インフルエンザ活性を有する天然物由来成分は、従来から様々知られている。例えば、茶や紅茶のポリフェノール成分の抗インフルエンザ活性、紅茶でのうがいによるウイルス感染の抑制、オウゴン由来のフラボノイド成分のインフルエンザ感染抑制効果、バラ科植物の花蕾または花弁の抽出物を有効成分とする抗インフルエンザ剤、ミカン属の種子成分の細菌及びウイルス等による感染症に対する予防効果、カカオ豆から得られる物質の抗インフルエンザ活性、等である。さらに漢方製剤である桂枝二越婢一湯、黒房すぐり抽出物、馬鈴薯アントシアニン色素、グァバ葉抽出物、羅布麻抽出物等の抗ウイルス効果も知られている。【０００７】  また、タデ科植物Ｍｕｅｈｌｅｎｂｅｃｋｉａ  ｈａｓｔｕｌａｔａ（チリでの現地名はＱｕｉｌｏ）及びタデ科植物イヌタデ属Ｐｅｒｓｉｃａｒｉａ  ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ（ヤナギタデ）に関しては、特許文献１−４及び非特許文献１において様々な生物活性が検討されているものの、抗インフルエンザウイルス活性の有無については言及されていない。【０００８】  その他のタデ科植物では、イヌタデ属タデアイ（Ｐｅｒｓｉｃａｒｉａ  ｔｉｎｃｔｏｒｉａ；旧分類法ではＰｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｍ）に関しては、当該植物水抽出物に抗インフルエンザウイルス活性がないことが記載され（非特許文献２）、また、酢酸エチル抽出画分に抗水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）活性物質が２種存在すること、及び抗ウイルス活性物質のインビトロの抑制効果は、５０％増殖阻害濃度で十数μｇ／ｍＬレベルであると記載されている（特許文献５）。また、当該植物に含まれる活性物質のうちフェオフォルバイドａに関しては、酢酸エチル抽出画分に見出されると記載されている。【０００９】  また、植物由来の抗ウイルス活性成分で、ウイルス等の病原体に対する光力学的作用で注目される二系統の物質群、すなわちテトラピロール類については非特許文献３−４及び特許文献６、７、８に記載があり、ヒペリシリン類については、非特許文献６−８及び特許文献９に記載が���る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】〔発明の目的又は動機〕
本発明者らは、抗インフルエンザ活性を有する素材として、古くから食品や香料、お茶などに利用されてきた安全性の高い伝承医薬基原植物又はそれの抽出物に注目するとともに、これらを外国（チリ）にまで幅広く求めて探索した結果、インフルエンザウイルス感染に対して高い抑制効果を示し、かつ、今までそのような抑制効果を有することが知られていなかった伝承医薬基原植物をいくつか見つけることができ、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】〔発明の要旨〕
すなわち、本発明は、タデ科植物Ｍｕｅｈｌｅｎｂｅｃｋｉａ  ｈａｓｔｕｌａｔａ又はＰｅｒｓｉｃａｒｉａ  ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒの抽出物若しくはその精製物を有効成分とする抗インフルエンザウイルス素材を提供する。【００１２】  また、本発明は、上記抗インフルエンザウイルス素材を含有する医薬組成物、健康補助食品（サプリメント）、薬用酒（薬味酒を含む）、又は公衆衛生用組成物も提供する。
【発明の効果】
【００１３】  タデ科植物のＭ．ｈａｓｔｕｌａｔａ又はＰ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒの抽出物（又はその精製物）にインフルエンザウイルス感染抑制効果があることは、本発明で初めて分かった新しい知見である。
本発明の抗インフルエンザウイルス素材は、従来の薬剤（素材）に加えて薬剤選択肢を充実させる。また、これを医薬組成物、健康補助食品（サプリメント）、薬用酒又は公衆衛生用組成物に利用すれば、新型ウイルスや季節性インフルエンザウイルスの感染の防御に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａから抽出・分離した活性画分（分画５及び分画８）の薄層クロマトグラム（ＴＬＣ像）。左半分は可視光下、右半分は紫外線（ＵＶ３６５）励起下のものである。
【図２】２ａは、画分ＬＨ５及び画分ＬＨ６のＴＬＣ像。２ｂは、精製された活性物質Ｂ及び活性物質ＣのＴＬＣ像。
【図３】活性物質ＣのＨＰＬＣパターン。
【図４】活性物質Ａの紫外・可視光吸収スペクトル。
【図５】活性物質Ｂ及び活性物質Ｃの紫外・可視光吸収スペクトル。
【図６】活性物質Ｂのメタノール溶液の蛍光スペクトル。
【図７】Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ及びＭ．ｈａｓｔｕｌａｔａから得た活性物質Ａ画分のＴＬＣ。レーンＰ：Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ由来１μｇ、レーンＭ：Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａ由来１μｇ、レーンＰ＋Ｍ：Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ由来及びＭ．ｈａｓｔｕｌａｔａ由来各々１μｇ。
【図８】Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａの活性画分ＢとＰ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒの精製画分のＴＬＣによる比較（可視光）。各試料１μｇを展開した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】〔発明の更に詳しい説明〕
本発明における原料であるタデ科植物Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａはチリ産のタデ科植物（チリでは”Ｑｕｉｌｏ“と呼ばれる）で、チリでは一般的なつる植物であり、従来から観賞用及び薬用に用いられ、生育条件に関して優れた適応性をもっている。チリのほかに、南米ではどこでも普遍的に生育できるので、医薬基原植物として安定供給が可能である。
【００１６】  本発明における原料のもう一つのタデ科植物Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ（ヤナギタデ）は、日本で多くの場所で自生し、収集・栽培が容易である。  これもチリ産のＭ．ｈａｓｔｕｌａｔａと同じように、古くから香辛料や薬用に供されており、医薬基原植物として安定供給が可能で、使いやすい。
なお、タデ科植物には、香辛料、染料（蓼藍）、生薬に古くから用いられてきた植物群が多く含まれている。
【００１７】  上記タデ科植物は、全体を原料として使用することができる。
上記タデ科植物の抽出物を得るためには、これを粉砕機で粉砕して粉砕物を得る。次いで、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン等の比較的親油性の高い有機溶媒を用いて、抽出処理を行う。有機溶媒として、水と相溶できる低級アルコール（メタノールやエタノール）を用いる抽出も有効である。
【００１８】  抽出条件としては特に制限はないが、遮光条件で３０〜５０℃で１〜２時間程度が好ましい。抽出物を濾過して抽出液を得たのち、抽出溶剤を留去し、減圧下において濃縮乾固または凍結乾燥したものをそのまま使用することができる。また、これらの抽出液から、公知の精製手段、例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ＴＬＣにより、更に分画精製したものも使用することができる。
【００１９】  本発明で得られた抗インフルエンザウイルス素材の用途の一つは医薬用途である。有効成分である植物抽出物又は精製物に医薬用の公知のいくつかの添加剤を添加して製剤化することができる。投与経路として経口投与、気道投与等が可能である。この場合成人への投与量は植物抽出物又は精製物で好ましくは１〜２００ｍｇ／日である。各種製剤への抽出物の添加量としては、その製剤の形態によって異なるが、通常は０．０００１重量％以上、好ましくは約０．００１重量％以上とする。
【００２０】  本発明で得られた抗インフルエンザウイルス素材の別の用途は健康補助食品（サプリメント）用途である。有効成分である植物抽出物又は精製物に公知のいくつかの添加剤を添加して錠剤化することができる。錠剤中の抽出物の含量は通常は０．０００１重量％以上、好ましくは約０．００１重量％以上とし、一日の摂取量は植物抽出物又は精製物で好ましくは１〜２００ｍｇである。
本発明で得られた抗インフルエンザウイルス素材のまた別の用途は薬用酒である。ホワイトリカー等の酒類に、本発明で得られた植物抽出物又は精製物を適量添加して調製する。薬用酒中の植物抽出物又は精製物の添加量は通常は０．００００１重量％以上、好ましくは約０．０００１重量％以上とし、一日の摂取量は植物抽出物又は精製物で好ましくは１〜２００ｍｇである。
【００２１】  本発明で得られた抗インフルエンザウイルス素材の用途のまた別の他のものは公衆衛生用途である。本発明の抗インフルエンザウイルス剤を、公衆衛生用品（例えば、うがい薬、感染防止用マスク、感染防止用ゴーグル、感染防止用衣類）に吸着、含浸、添加することにより、インフルエンザ予防に寄与しうる感染抑制用品を提供することができる。これら用途における植物抽出物又は精製物の添加量は、用品の形態に依存するが、好ましくは０．００１〜０．１重量％の割合になるように添加する。
本発明で得られた抗インフルエンザウイルス素材の有効成分の本体は、後述の実施例で示すように、ヒペリシン、プロトヒペリシン、フェオフォルバイドａ、又はこれらの類縁体である。これら有効成分が、単独で、あるいは、２種以上が複合的に存在することによって、抗インフルエンザウイルス活性が発揮されている。
【実施例】
【００２２】  以下に、実験１〜８により本発明を更に具体的に説明する。
＜実験１＞チリ産の薬用基原植物各種についての抗インフルエンザウイルス活性のスクリーニング
（ａ）各種植物抽出物の調製
十分に乾燥させた各種植物体（Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａを含むチリ産の薬用基原植物５０種）を、各々、小型高速粉砕機（大阪化成製ラボミルサーＬＭ−２、２０，０００回転６０ｓｅｃ）で粉砕し、粉末化した。これを、粉末重量の１０倍量（ｖ／ｗ）のクロロホルムに懸濁し、超音波洗浄機（東京理化学器械製）を用いて抽出し（４０℃、３０分）、吸引ろ過した（Ａｄｖａｎｔｅｃ東洋製Ｎｏ．２ろ紙）。残渣をさらに５倍量のクロロホルムに懸濁し、超音波洗浄機を用いて抽出し（４０℃、３０分）、吸引ろ過した（この操作を３回繰り返した）。濃黄緑色のクロロホルム抽出液を得た。これをエバポレータで濃縮乾固し、濃緑色の抽出物を得た。
クロロホルムで抽出できなかった植物体残渣から、更にメタノール（溶媒）を用いクロロホルム抽出の場合と同様に抽出処理した。【００２３】（ｂ）各種植物抽出物の抗インフルエンザウイルス活性
１）抗インフルエンザウイルス活性測定の概要；倍々希釈した植物抽出エキスと一定量のウイルスを混合処理し、この混合液をインフルエンザウイルス感受性細胞（ＭＤＣＫ）の培養液に加え（ＭＯＩ＝０．００２５〜０．００５）一定日数培養し、培養液を回収する。培養液中のウイルス量を当該ウイルスに特徴的な赤血球凝集活性により定量する。再現性を確認するため、すべての試験をｎ＝３で行なう。インフルエンザウイルス産生に対する植物抽出エキスのＭＩＣ（最小阻止濃度）を、抗インフルエンザ活性とした。
２）インフルエンザウイルスの調製；Ａ型インフルエンザ［Ａ／北九州／１５９／９３（Ｈ３Ｎ２）］１．０×１０８ＰＦＵ／ｍＬを５μｇ／ｍＬトリプシン／ＭＥＭ培地［（−）血清］で２×１０５倍希釈（＝５．０×１０２ＰＦＵ／ｍＬ）して用いた。【００２４】  ３）植物抽出エキス／ウイルス溶液の調製；倍々希釈系列の植物抽出エキス１６０μＬとウイルス液１６０μＬとを混合し（植物抽出エキス終濃度１００μｇ／ｍＬ以下、ウイルス終濃度２．５×１０２ＰＦＵ／ｍＬ）、室温で１時間放置した。【００２５】  ４）ＭＤＣＫ細胞へのインフルエンザウイルスの感染；１０ｃｍシャーレにコンフルエントにしたＭＤＣＫ細胞を回収し、ＭＥＭに懸濁し、９６穴プレートに１００μＬ（１．０×１０４個／ウエル）ずつ播種し、３４℃、５％ＣＯ２で４日間培養した。培養ウエルから培養液を除き、緩衝液で各ウエルを洗浄後、上記植物抽出エキス／ウイルス溶液１００μＬを加え、３４℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。【００２６】  ５）ウイルス価の測定；培養後、各ウエルの上清５０μＬを新しい９６ウエルプレートに回収し、０．５％ニワトリ赤血球／ＰＢＳ（−）液５０μＬを各ウエルに添加し、４℃で１時間静置し、赤血球凝集能（ＨＡ価）を判定した。但し、本試験法では、被験物質の抗ウイルス活性の作用機序がウイルスに対する直接作用か細胞自体の抗ウイルス性の誘導によるものか区別がつかないため、適宜、ウイルス感染前の被験物質による処理あるいは感染後の被験物質による細胞の処理等を行い、作用機序を推定した。【００２７】  スクリーニングした５０種の植物種のうち抗インフルエンザウイルス活性を示した２０種の抽出物の実験結果を表１にまとめた。この結果から、Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａの抗インフルエンザウイルス活性がズバ抜けて高く、その他の１９種の植物種の活性は高いものでもＭ．ｈａｓｔｕｌａｔａの１／４０程度であった。【００２８】
【表１】
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【００２９】＜実験２＞Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａクロロホルム抽出物からの抗インフルエンザウイルス活性成分の分離・精製
クロロホルム：アセトン＝１：１（容量比；以下同じ）混合液（溶離液Ｉ）を用いて充填・安定化したシリカゲルカラム（Ｗａｋｏｓｉｌ▲Ｒ▼  Ｃ−２００）を準備しておく。実験１と同様な試験で得たＭ．ｈａｓｔｕｌａｔａクロロホルム抽出物（収量は、出発植物体の粉末重量に対し４．７重量％であった）を３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように、クロロホルム：アセトン＝１：１混合液に溶解し、これを試料重量／ゲル体積＝１（ｍｇ／ｍＬ）の割合でシリカゲルカラム上に重層し、溶離液Ｉによるイソクラティック溶出を行った。その結果、順に、クロロフィルが主成分の画分１、黄色成分の画分２、及び抗インフルエンザ活性に関して比活性が向上した黒緑色の画分３に分離された。画分３の収量は、出発植物体の粉末重量に対し０．４６重量％であった。【００３０】  別に、クロロホルム：アセトン：メタノール＝２：２：１混合液（溶離液ＩＩ）を用いて充填・安定化したシリカゲルカラム（Ｗａｋｏｓｉｌ▲Ｒ▼  Ｃ−２００）を別に準備しておいた。上で得られた画分３を乾固し、クロロホルム：アセトン：メタノール＝２：２：１混合液に再溶解し、これを乾燥重量／ゲル体積＝１．２５（ｍｇ／ｍＬ）の割合で上記シリカゲルカラム上に重層し、溶離液ＩＩでイソクラティック溶出を行った。その結果、順に、黄色画分（画分４）、黒緑色の抗インフルエンザウイルス活性画分（画分５）、及び薄赤紫色の画分（画分６）に分画された。画分５の収量は、出発植物体の粉末重量に対し０．１３重量％であった。【００３１】  上記画分５の乾固物１２０ｍｇをアセトン：メタノール：水＝６：３：１混合液に溶解し、逆相カラム（ＯＤＳカラム；Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ５０１８、約３２０ｍＬ）に重層後、前記混合液（溶離液ＩＩＩ）によるイソクラティック溶出で分離精製した。黄色画分（画分７）と黒色画分（画分８；抗インフルエンザウイルス活性物質Ａ）が分離・精製出来た。画分８の収量は、出発植物体の粉末重量に対し０．０６１重量％であった。【００３２】  上記画分５及び画分８（活性物質Ａ）のＴＬＣの結果を図１に示した。図１の結果からも、画分８（活性物質Ａ）は単一スポットに精製されていることが分かる。【００３３】  Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａのクロロホルム抽出物及び画分８（活性物質Ａ）の抗インフルエンザウイルス活性試験を実験１（ｂ）と同様に行なった。その結果を表２に示した。画分８（活性物質Ａ）の抗インフルエンザウイルス活性はクロロホルム抽出物の活性（ＭＩＣ＝０．１２５μｇ／ｍＬ）に比べ約５倍高い活性（ＭＩＣ＝０．０２６μｇ／ｍＬ）を有していた。
なお、活性の総量に関しては、活性物質Ａはクロロホルム抽出物の主成分ではあるものの、当該植物の総活性量を説明するには不十分な量であり、他の活性成分の存在を推定するのが合理的と考えた（後述の実験３参照）。【００３４】
【表２】
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【００３５】＜実験３＞Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａクロロホルム抽出物から活性物質Ａ及びそれ以外の活性物質（活性物質Ｂ及びＣ）の分離・精製
１）実験２で述べたように、活性の総量に関しては、活性物質Ａはクロロホルム抽出物の主成分ではあるものの、当該植物の総活性量を説明するには不十分な量であり、他の活性成分の存在が推定された。そこで、Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａのクロロホルム抽出物から、活性物質Ａ以外の他の抗インフルエンザ活性成分の分離・精製を遮光条件下で試みた。セラミックポンプ（ＥＹＥＬＡ、ＶＳＰ−３０５０）付属のシリカゲル中圧カラム（山善ＵＬＴＲＡ  ＰＡＣＫ、径３．７ｃｍ、３０ｃｍ、３２２ｍＬ）に、Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａのクロロホルム抽出物（３０ｍｇ／ｍＬ）を１ｍｇ／ゲル体積の割合で重層し、それぞれ、クロロホルム：メタノール＝９：１あるいは８：１の溶離液でイソクラティック溶出して、画分ＣＭ１（クロロフィル画分）、画分ＣＭ２（活性画分、黒褐色）及び画分ＣＭ３（褐色）に分画した。２．９ｇのクロロホルム抽出物から画分ＣＭ２（活性画分、黒褐色）は濃縮乾固物として約１．２ｇが得られた。【００３６】２）得られた画分ＣＭ２を、中圧ＯＤＳカラム（ＷａｋｏｇｅｌＣ５０１８、３２０ｍＬ）で３回に分けて分画した。分離カラムに対して体積比１００分の１の同一吸着分離材のプレカラムを分離性能向上のため用いた。
試料を重層後、アセトン：メタノール：水＝６：３：１の溶離液でイソクラティック溶出を行い、順に、画分ＯＤＳ１（活性物質Ｂ及び活性物質Ｃを含有、赤黄色、４０１ｍｇ）、画分ＯＤＳ２（活性物質Ａを含有、黒緑色、１６１ｍｇ）及び画分ＯＤＳ３（濃黄色）を得た。【００３７】３）得られた画分ＯＤＳ１の３６０ｍｇをＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（３００ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）のゲルろ過法で精製した。画分ＯＤＳ１をメタノールに溶解、同液で平衡・安定化したＬＨ−２０カラムに重層し、溶出を行った。順に、画分ＬＨ３、画分ＬＨ４、画分ＬＨ５（紫色；主に活性物質Ｃ含有）、及び画分ＬＨ６（桃色；主に活性物質Ｂ含有）を得た。画分ＬＨ５及び画分ＬＨ６のＴＬＣ像を図２ａに示した。【００３８】４）ＬＨ−２０、ＯＤＳカラムあるいは下に示すシリカゲル順相カラムによる再クロマトを利用し、上記画分ＬＨ５及び画分ＬＨ６を更に精製した。精製された活性物質Ｂ及び活性物質Ｃをそれぞれ８．１ｍｇ及び６．４ｍｇ得た。
以下のシリカゲルの順相クロマトグラフィーを必要に応じて用いる：溶離液（クロロホルムアセトン：メタノール＝２：２：１）で安定化させたシリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−２００Ｅ、ゲル体積１５０ｍＬ）に、同溶離液に溶解した試料液を重層し、イソクラティック溶出した。活性物質Ｂ及びＣは最も早く溶出される赤紫色画分に含まれる。【００３９】  画分各々の精製度のチェックは、逆相ゲルを用いた薄層クロマトグラフィー（ＯＤＳ−ＴＬＣ；薄層プレート、Ｍｅｒｃｋ社、１１３７２４  ＨＰＴＬＣ  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０  ＲＰ−１８  Ｆ２５４ｓ）で、アセトン：メタノール：水＝６：３：１を展開溶媒として行ったほか、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ装置：島津ＬＣ２０ＡＢ、カラム：資生堂、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８ＭＧ  ＩＩ）を用いても行った。ＨＰＬＣの分離は、９０％アセトニトリル水溶液のイソクラティック溶出で行った。精製された活性物質Ｂ及び活性物質ＣのＴＬＣ像を図２ｂに示し、また、精製された活性物質Ｃ（１００μｇ／ｍＬ−メタノール）１０μＬのＨＰＬＣ像を図３に示した。【００４０】  図２ｂからも分かるように、精製された活性物質Ｂは、可視光、ＵＶ２５４、ＵＶ３６５の各薄層クロマトグラムで不純物が認められず、単一スポットであった。一方、精製された活性物質Ｃは可視光、ＵＶ２５４、ＵＶ３６５の各薄層クロマトグラムで単一スポットではなく、微量の他のスポットが認められ、この他のスポットは活性物質Ｂと同じ位置であった。
図３は、主ピーク（活性物質Ｃ）に続いて小さな分離ピーク（活性物質Ｂ）がＨＰＬＣカラムから溶出されることを示している。後述するように、活性物質Ｃは僅かな光暴露で活性物質Ｂへと変化しやすい。本実験で、精製された活性物質Ｃにおいても、微量の活性物質が存在したことは、不十分な分離・精製の結果ではなく、（完全な）分離後の変化・変質と考えている。なお、活性物質Ｃには発光が認められないことは図２ｂにおけるＵＶ３６５のクロマトグラムから明らかである。【００４１】  以上の各精製工程における各画分の収量（重量）、色相及び抗インフルエンザウイルス活性を次の表３にまとめた。精製された活性物質Ｂ及び活性物質Ｃは、いずれも活性物質Ａに比べ数倍〜１０倍程度高い活性（ＭＩＣ）を有していた。【００４２】
【表３】
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【００４３】＜実験４＞  活性物質Ａの物理化学的性状
実験２で得られた精製物（活性物質Ａ）を、以下に示すように種々の物理化学的機器で分析した。【００４４】１）紫外可視吸収スペクトル
紫外可視吸収（ＵＶ）スペクトルは  紫外可視分光光度計（島津製作所製ＵＶ−１７００）を用いて測定した。エタノールで１０μｇ／ｍＬの濃度に溶解した試料を測定したところ、ポルフィリンの特徴であるソーレー帯と４つに分裂したＱ帯と推定される吸収がそれぞれ４１０．５ｎｍ、５０８ｎｍ、５３８ｎｍ、６１１ｎｍ、６６８．５ｎｍに認められた（図４）。【００４５】  質量分析で得られた分子量を元に計算した６６８．５ｎｍ及び４１０．５ｎｍのモル吸光係数ελは、それぞれε６６８．５＝３．３２×１０４Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）及びε４１０．５＝６．７４×１０４Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）であった。【００４６】２）赤外分光法（ＩＲスペクトル）
活性物質Ａの赤外線吸収（ＩＲ）スペクトルはＪＡＳＣＯ  ＩＲ−５３００フーリエ変換赤外分光計（ＫＢｒ錠、ＡＴＲ法）にて測定した。
測定の結果、３８９１、２９６１、２３６１、１７３４、１６９４、１６２２、１２６０、１０８８、１０２２、７９７ｃｍ−１に吸収帯が観測された。このうち、３８９１ｃｍ−１は水酸基（−ＯＨ基）またはアミノ基などに基づく吸収帯と思われ、１７３４ｃｍ−１はエステル基、さらに１６９４ｃｍ−１はエステル基以外のカルボニル基に基づく吸収帯であると考えられる。【００４７】３）核磁気共鳴（１ＨＮＭＲスペクトル）
活性物質Ａの１Ｈ−核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルはＪＥＯＬ（日本電子）社製のＪＮＭ−ＡＬ３００型核磁気共鳴装置を用いて測定した。サンプルは重クロロホルムに溶解し、約５ｍｇ／ｍＬの濃度とした。また、内部標準物質としてＴＭＳ（テトラメチルシラン）を使用した。【００４８】  測定の結果、δ０．８１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、１．０４（１Ｈ、ｍ）、１．５８（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、１．７２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ）、２．１３（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ）、２．２７（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝８Ｈｚ）、２．５４（２Ｈ、ｑｌｉｋｅ）、３．１２（３Ｈ、ｓ）、３．２９（３Ｈ、ｓ）、３．５５（３Ｈ、ｓ）、３．５６（３Ｈ、ｓ）、３．７５（３Ｈ、ｓ）、４．１５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ）、４．３７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、６．０８〜６．１５（３Ｈ、ｍ）、６．２１（１Ｈ，ｓ）、７．８６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．１２Ｈｚ）、８．４７（１Ｈ、ｓ）、９．２５（１Ｈ、ｓ）、９．３７（１Ｈ、ｓ）の各シグナルが観測された。また、δ−１．４８（１Ｈ，ｓ）及び１．３１（１Ｈ，ｓ）にもシグナルが観測されている。【００４９】  これらのシグナルの存在はクロロフィルａのようなポルフィリン環の存在を強く示唆するものであり、特にδ−１．４８及び１．３１に各１Ｈずつ観測されたシグナルはポルフィリン環の内側にある、高磁場にシフトしたと考えられる。この他、δ３．１２、３．２９、３．５５（各３Ｈ，ｓ）はピロール環上の結合したメチル基、そして３．７５はカルボキシルメチル基（−ＣＯＯＣＨ３）に基づくシグナルと考えられる。
さらに、１．５８（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）と２．５４（２Ｈ，ｑｌｉｋｅ）の存在は１個のエチル基の存在を示唆する。【００５０】４）質量分析（ＭＳ）
活性物質Ａの質量分析（ＭＳ）スペクトルはＪＥＯＬ（日本電子社）製のＪＥＯＬ−Ｄｘ−３０３マススペクトロメーターにて測定した。測定はＦＡＢモードで行い、マトリックスとしてはｍ−ニトロベンジルアルコールを使用した。【００５１】  測定の結果、分子イオン（Ｍ＋１）として５９２が観測され、その他、ｍ／ｅ  ６１５（Ｍ＋Ｎａ）、５７７、５３３、５１９、５０５、４５９、４４５、４２９、４１１、３６９、３５５、２８１、２６７、２２１、２０７、等のピークが観測された。【００５２】  これらの結果から、活性物質Ａは、ポルフィリン類、中でも特にフェオフォルバイドａ（分子量５９１．２）と推定した。【００５３】５）活性物質Ａとフェオフォルバイドａ及びクロリン（ｃｈｌｏｒｉｎ  ｅ６  Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ）との比較
市販のフェオフォルバイドａ（和光純薬５５８−６８３１１）及びクロリン（和光純薬３０５−０１４８１）と活性物質Ａを各々クロロホルムに溶解し、実験２に記載の方法で２種類のＴＬＣ法で３物質の比較を行った。
結果を表４に示した。活性物質Ａ及びフェオフォルバイドａはＴＬＣ的には同一物質であった。また、実験１に記載の方法で抗インフルエンザウイルス活性を測定したところ活性物質Ａ、フェオフォルバイドａ及びクロリンともに、それぞれ単独で、ほぼ同等のＭＩＣ、すなわち強力な抗インフルエンザウイルス活性を示した。【００５４】
【表４】
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【００５５】  以上の結果をまとめて、活性物質Ａはクロロフィルａからマグネシウムイオンとフィチル基が欠けた化合物のフェオフォルバイドａと同定した。【００５６】  ポルフィリン類、特にフェオフォルバイド誘導体による抗腫瘍活性などの作用機構は、同物質群の特性である一重項酸素の生成によるものと推定されている。特にメチルフェオフォルバイドａ誘導体のウイルス不活性化に関する記載が、特許文献７（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，００２，９６２）と特許文献８（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０９３，３４９）にあるが、詳細な開示がない。インフルエンザウイルスに関しては、ＷＯ２００８／０５４４８１で生体膜に親和性があり、かつ光により活性化される（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ）１，５ｉｏｄｏｎａｐｈｔｈｙｌａｚｉｄｅ（ＩＮＡ）などの疎水性化合物を活性本体とする方法において、可視光による光増感剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）として当該物質が有効であることが開示されている。該発明の構成例として、不活性化したい被験物とＩＮＡの混合物への紫外線照射及び被験物、ＩＮＡと光増感剤の混合物への可視光照射による被験物質の不活性化法が例示されている。この可視光増感剤の例としてフェオフォルバイドａのほかクロロフィル、クロリン等が挙げられている。【００５７】  本発明では、タデ類植物のクロロホルム抽出物から、フロロフィルａ類縁化合物であるフェオフォルバイドａと推定される抗インフルエンザウイルス活性物質Ａを単離し、光活性化物質（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）なしにこれが単独でインフルエンザウイルスを不活性することを見出したのである。【００５８】＜実験５＞  精製された活性物質Ｂ及び活性物質Ｃの物理化学的性状
１）紫外可視吸収スペクトル
実験３で得られた活性画分（活性物質Ｂ及び活性物質Ｃ）を各々エタノールに溶解し、吸光スペクトルを測定した（図５）。活性物質Ａとは異なり、ポルフィリン類の特徴であるソーレー帯（Ｓｏｒｅｔ  ｂａｎｄ）の吸収は認められず、活性物質Ｂでは５４６−５４８ｎｍと５８７−５９２ｎｍに約１：２の比率の鋭い吸収ピークを示し、活性物質Ｃでは両吸収帯にまたがったブロードな吸収スペクトルを示した。
上記波長での活性物質Ｂ及び活性物質Ｃのモル吸光係数の推定値を表５に示した。【００５９】
【表５】
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【００６０】２）蛍光スペクトル
活性物質Ｂの蛍光スペクトルを島津分光蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣで測定した（図６）。吸収スペクトルと鏡像の発光スペクトルが得られた。【００６１】３）Ｈ１−核磁気共鳴（Ｈ１−ＮＭＲ）
日本電子社製のＪＮＭ−ＥＣＡ５００型核磁気共鳴装置を用いて測定した。試料（活性物質Ｂ及び活性物質Ｃ）は各々重メタノールに溶解し、約１０ｍｇ／ｍＬの濃度とした。また、内部標準物質としてＴＭＳ（テトラメチルシラン）を使用した。測定結果を以下に示す。【００６２】活性物質Ｂ（Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ様物質）；δ２．５０（６Ｈ、ｓ）、６．３５（２Ｈ、ｓ）、７．０３（２Ｈ，ｓ）、活性物質Ｃ（Ｐｒｏｔｏｈｙｐｅｒｉｃｉｎ様物質）；δ２．０５（６Ｈ，ｓ）、６．４３（２Ｈ，ｄ，ｊ＝１．７Ｈｚ）、６．６５（２Ｈ、ｓ）、７．１１（２Ｈ，ｄ，ｊ＝２．８Ｈｚ）【００６３】  以上の結果は、両化合物はヒペリシンのようなナフトジアントロン骨格を有していることを強く示唆する。【００６４】４）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法及びＦＡＢ法による質量分析
活性物質Ｂ及び活性物質Ｃの質量分析をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＶｏｙａｇｅｒＤＥ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法）と日本電子社製のＪＥＯＬ−Ｄｘ−３０３マススペクトロメーター（ＦＡＢ法）を用いて行った。マトリックスとしては、３−ヒドロキシピコリン酸（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法）及びｍ−ニトロベンジルアルコール（ＦＡＢ法）を使用した。尚、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法においてはキャリブレーションを合成オリゴヌクレオチド（分子量：２９９．０、８３９．４、１３７９．８）を用いて行った。【００６５】  測定の結果；
（１）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法では、活性物質Ｂは５０８．２０、活性物質Ｃでは５０９．２８に鋭いピークを認めた。
（２）ＦＡＢ法での測定は、活性物質Ｂにおいて偽分子イオンピーク（Ｍ＋Ｎａ）＋として５２７が観測され、その他、ｍ／ｚ５０４、２８９、１７６、１３７等のピークが観測された。また、活性物質Ｃにおいては偽分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋として５０７が観測され、その他ｍ／ｚ５２９、２８９、２２１、１３６等のピークが観測された。
（３）高分解能ＦＡＢ−ＭＳ（ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ）の結果を表６に示す。【００６６】
【表６】
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【００６７】  活性物質Ｂ及び活性物質Ｃは、その高い精製度にかかわらず、ＦＡＢ法では多くのピークが観測された。ほぼ単一ピークのスペクトル像を示したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法で得られたピークの質量数の近傍に相当するＦＡＢ法のピークから、両物質の質量数を、それぞれ５０４（活性物質Ｂ）及び５０６（活性物質Ｃ）と推定した。【００６８】５）活性物質Ｃから活性物質Ｂの生成
実験３の最終精製段階であるＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーの予備検討試験において、分離初期において明瞭であった活性物質Ｃ含有画分の紫色が展開後期で退色することが観察されたため、実験３における精製工程を遮光条件で行った。このようにして得られ、かつ遮光保存した紫色の溶出画分（活性物質Ｃ）を一定量とり、透明のエッペンドルフチューブに分注し、蛍光灯下で光暴露した。活性物質Ｃ及び光暴露により生成した活性物質Ｂを薄層クロマトグラフィーで比較した。その結果、精製した活性物質Ｃは数分の光暴露で活性物質Ｂに変換することが示された。また、ＴＬＣ（ＯＤＳ）上では、紫色の物質Ｃは、２５４ｎｍ及び３６５ｎｍの光の励起による可視光の発光は認められなかった（図２ｂ）。【００６９】  以上の結果をまとめて、活性物質Ｂ及び活性物質Ｃは、それぞれヒペリシン及びプロトヒペリシンであると同定した。【００７０】  ヒペリシンは、Ｂｒｏｏｋｍａｎらにより１９３９年に発見・報告され、以来、基原植物としてＨｙｐｅｒｉｃｕｍ属以外の植物に関する報告はない。本願発明により初めて、他科の植物から分離されたのである。
一方、類似化合物のｆａｇｏｐｙｒｉｎがタデ科のソバに見出されている。Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ属に特有な物質として知られているヒペリシンそのものが、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ属とは類縁性のないタデ科Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａに存在すること、またタデ科のソバが類似化合物のｆａｇｏｐｙｒｉｎを含むことを考えると系統進化学的にも極めて興味深い。さらに生物活性を一にするフェオフォルバイドａが高い含有量で同植物に存在することは、南米において広範囲な環境条件下で見出される普遍的植物であるＭ．ｈａｓｔｕｌａｔａの環境適応性および病害虫に対する高い抵抗性の分子的根拠の一部をなすものと考える。【００７１】＜実験６＞  活性物質Ａ、活性物質Ｂ及びクロリンにおける抗インフルエンザウイルス活性の光依存性
実験１の分注作業、ウイルスと被験物質の混合処理等を、作業に支障がない程度に暗所（ｄａｒｋ）下で行ない、明所（ｌｉｇｈｔ）下に行なったものと比較した。結果を表６に示した。表７の結果は、フェオフォルバイドａ、ヒペリシン及びクロリンはいずれも光依存性があり、光で抗インフルエンザ活性が上昇する（ＭＩＣは小さな値となる）ことが分かる。【００７２】
【表７】
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【００７３】  以上、南米で普遍的に自生しているタデ科植物Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａに強力な抗インフルエンザ活性物質が含まれていることを示したが、ソバ同様、日本の代表的なタデ科植物のひとつであるヤナギタデ（Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ）に関して、抗インフルエンザ活性ならびにフェオフォルバイドａおよびヒペリシンの含有の有無を検討した。【００７４】＜実験７＞Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ抽出物の抗インフルエンザウイルス活性
チリ産の薬用基原植物２０種のうち最も抗インフルエンザウイルス活性が高かったＭ．ｈａｓｔｕｌａｔａと同じタデ科植物に属する日本産の薬用基原植物Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒについて実験１と同様に実験した。
結果を表８に示す。この結果から、日本産の薬用基原植物Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒの抗インフルエンザウイルス活性は、チリ産のタデ科植物  Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａ  ほどには強くはなかったが、抗インフルエンザウイルス活性を示した１９種類の薬用基原植物からの抽出物（平均）と比べると、最小阻止濃度（ＭＩＣ）で約１２倍高い抗インフルエンザ活性を示していることから、比較的高活性な植物と言える。【００７５】
【表８】
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【００７６】＜実験８＞ヤナギタデ（Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ）クロロホルム抽出物のフェオフォルバイドａおよびヒペリシン含有の有無に関して検討した。【００７７】１）フェオフォルバイドａの存在に関する試験
第一段階のカラムクロマトグラフィー（シリカゲルカラム）の溶離液をクロロホルム：アセトン＝２：３としたほかは上記実験１および２に従い、Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ全草から実験２の画分３に相当する画分を分離した（表９）。この画分の主成分と実験３の画分３のフェオフォルバイドａが同一物質であるかどうかを確認するために、２種類のＴＬＣ条件、すなわちＯＤＳプレート（アセトン：メタノール：水＝６：３：１）及びシリカゲルプレート（クロロホルム：アセトン＝１：１）を用いるＴＬＣを行なった。ＴＬＣの結果を図７に示した。
Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒから得られた画分３のクロマトグラムでは、Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａから得られた画分３のフェオフォルバイドａとは、同じ場所に可視光を認め、ＵＶで励起した際も同じ性質の蛍光スポットを認めた。このＴＬＣの実験結果は、Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒから得られた画分３の主スポットと、Ｍ．ｈａｓｔｕｌａｔａから得られたフェオフォルバイドａが同一物質であることを示している。【００７８】
【表９】
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【００７９】２）ヒペリシンの存在に関する試験
１２０ｇの乾燥Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ全草を用い、実験３に従って分画した（表１０）。ヤナギタデ（Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒ）の精製画分（ＣＭ２、ＯＤＳ１）および対照のＭ．ｈａｓｔｕｌａｔａの精製画分（実験３のＯＤＳ１）を逆相薄層クロマトグラフィー（ＯＤＳプレート；アセトン：メタノール：水＝６：３：１）で比較した（図８）。
その結果、Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｒにはヒペリシン類相当のスポットは見出せなかった。【００８０】
【表１０】
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【００８１】  なお、特許文献４（特開２００６−２４１１４３）にはヤナギタデの生物活性成分に関して詳細に記述しているが、抗インフルエンザウイルス活性成分には言及していない。また特許文献４に開示されている生物活性成分と本願発明に開示した活性物質とは明らかに異なるものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００８２】
【特許文献１】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６５２，２６５
【特許文献２】ＷＯ／１９９６／０３００３４Ａ１
【特許文献３】特開平１１−９２３３０
【特許文献４】特開２００６−２４１１４３
【特許文献５】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５２４，６２５
【特許文献６】特開昭６３−１０１３８４
【特許文献７】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，００２，９６２
【特許文献８】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０９３，３４９
【特許文献９】日本特許第２５０２６５９号
【非特許文献】
【００８３】
【非特許文献１】Ｚ  Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ［Ｃ］．２００２  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；５７（９−１０）：８０１−４
【非特許文献２】Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２００５  Ｊｕｎ；６６（２−３）：１１９−２８．２００５  Ｍａｒ  ２７
【非特許文献３】Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉａ．１９５２  Ｓｅｐ  １；１５（５）：２６７−７４．
【非特許文献４】Ｂｏｌｌ  Ｃｈｉｍ  Ｆａｒｍ．１９７１  Ｊａｎ；１１０（１）：２０−４．
【非特許文献５】Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．１９８７  Ｊａｎ；７（１）：４３−５１．
【非特許文献６】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，５２３０−５２３４，１９８８
【非特許文献７】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，５９６３−５９６７，１９８９
【非特許文献８】Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．１９９０  Ｊｕｎ；１３（６）：３１３−２５
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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