(57)【要約】【課題】一過性脳虚血後に生じる神経細胞傷害の予防、および治療に有効な薬剤を探索する【解決手段】ミッドカインファミリータンパク質を有効成分とする、虚血による細胞障害を治療または予防するための薬剤、およびミッドカインファミリータンパク質を有効 成分とする、虚血性疾患を治療または予防するための薬剤を提供する。本発明によって、ミッドカインが虚血性疾患の治療または予防に有効であり、また、虚血による細胞障害の治療または予防に有効であり、例えば、虚血性脳疾患の代表である脳梗塞発症を顕著に防止することが明らかにされた。本発明の治療・予防剤は、脳虚血性疾患、例えば脳梗塞、一過性脳虚血疾患、頭部外傷、のほか、例えばクモ膜下出後の脳血管攣縮症、アルツハイマー病、アルツハイマー型痴呆症、脳血管性痴呆症等および他の脳血管疾患、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮退行性疾患等の治療・予防剤としても有効である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカイン（ＭＫ）ファミリータンパク質を有効成分とする、虚血あるいはストレスによる細胞障害を治療または予防するための薬剤。 
【請求項２】
虚血あるいはストレスによる細胞障害が脳実質の障害である請求項１に記載の薬剤。 
【請求項３】
脳実質の障害が海馬ＣＡ１錐体細胞障害である請求項２に記載の薬剤。 
【請求項４】
ミッドカイン（ＭＫ）ファミリータンパク質を有効成分とする、虚血あるいはストレス性細胞障害に起因する疾患を治療または予防するための薬剤。 
【請求項５】
虚血性疾患が脳梗塞である請求項４に記載の薬剤。 
【請求項６】
虚血性疾患が心筋梗塞である請求項４に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ：以下、ＭＫと略す）を有効成分とする虚血性疾患の治療または予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血（ｉｓｃｈｅｍｉａ）とは、体の一部において、血流が完全に遮断されるか、著しく減少した状態であり、酸素不足、基質供給の減少、代謝産物の蓄積が同 時に進行する病態と考えられる。虚血の程度は、血管閉塞の緩急、持続時間、あるいは組織の感受性、副血行路の発達の程度にも関係するが、虚血に陥った臓器ないし組織には機能障害が現れ、長く持続すれば、組織は萎縮、変性、壊死に至る。
【０００３】
たとえば、虚血性脳血管障害の発症機序は、血栓性、塞栓性、血行動態性の３型に分類されるが、いずれにしても脳の虚血がその基本病態であり、脳の組織障害の程度は、虚血の重症度と持続時間により規定される。この際、重度の虚血が生じた場所は、急速に神経細胞や血管内皮細胞が不可逆的障害を被り、典型的な壊 死による梗塞巣が形成される。一方、虚血辺縁部（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｅｎｕｍｂｒａ）では、血流は中程度に低下し、神経細胞の機能は停止しているが、生存能力はいまだ失われておらず、脳血管の反応性が一部保たれていることにより、側副血行を介した血流の再開により機能の回復が期待できる。
【０００４】
また、冠状動脈を侵し、心筋に虚血をきたす疾患群である虚血性心疾患では、冠状動脈閉塞時間の延長に伴い、虚血心筋細胞障害の程度は、可逆性細胞障害から不可逆性細胞障害へと進行する。
【０００５】
したがって、このような虚血による細胞傷害を予防したり、再生を促進したりする薬剤は、虚血性脳疾患や心疾患の根本的治療につながると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓａｎｄ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：９９４−１０００，１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この考えに基づいて、一過性脳虚血後に生じる神経細胞傷害の予防、および治療に有効な薬剤を探索する目的で、スナネズミの不完全前脳虚血モデルを用いて、虚血脳保護因子の候補物質を、虚血処置前後に脳室内注入、あるいは末梢投与して、その効果を形態学的、および機能的に検討した報告がある。たとえば、プロサポシン（ｐｒｏｓａｐｏｓｉｎ）をスナネズミ脳室に注入すると、虚血後の学習行動障害が有意に軽減され、海馬ＣＡ１領域の病理学的検索においても、対照と比較してＣＡ１錐体細胞数の明らかな増加が認められる（Ｓａｎｄ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：９９４−１０００，１９９４）。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）やインターロイキン６（ＩＬ−６）もプロサポシンと同様、脳室内注入により、用量に依存して有意に海馬のＣＡ１錐体細胞数、およびＣＡ１領域シナプス数を改善することが明らかとなっている（Ｗｅｎ，Ｔ−Ｃ ｅｔ ａｌ．：Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１９１：５５−５８，１９９５）（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ：Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２０４：１０９−１１２，１９９６）。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を、プロサポシン、ＣＮＴＦ、および ＩＬ−６の場合と同様に脳室内注入した場合は、わずかではあるが、有意な虚血海馬保護効果が認められる（Ｗｅｎ，Ｔ−Ｃ．ｅｔ ａｌ：Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ６５：５１３−５２１，１９９５）。しかし、これらの虚血脳保護因子の作用メカニズムの詳細はいまだ明らかとはなってはいない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ミッドカイン（ＭＫ）ファミリータンパク質を有効成分とする、虚血あるいはストレス性細胞死に起因する各種疾患を治療または予防するための新たな薬剤を提供する。より詳しくは、本発明は、（１）ミッドカイン（ＭＫ）ファミリータンパク質を有効成分とする、虚血あるいはストレスによる細胞障害を治療または予防するための薬剤、（２）虚血あるいはストレスによる細胞障害が脳実質の障害である（１）に記載の薬剤、（３）脳実質の障害が海馬ＣＡ１錐体細胞障害である（２）に記載の薬剤、（４）ミッドカイン（ＭＫ）ファミリーに属するタンパク質を有効成分とする、虚血あるいはストレス性細胞障害に起因する疾患を治療または予防するための薬剤、（５）虚血性疾患が脳梗塞である（４）に記載の薬剤、（６）虚血性疾患が心筋梗塞である（４）に記載の薬剤、を提供する。
【０００９】
ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ：ＭＫ）は、胚性腫瘍細胞のレチノイン酸による分化誘導過程で、一過性に発現される遺伝子の産物として発見された、塩基性アミノ酸とシステインに富むヘパリン結合性の分泌タンパク質である（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５１：１３１２−１３１８，１９８８；Ｔｏｍｏｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０７６５−１０７７０，１９９０；Ｔｏｍｏｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１：６０３，１９９０）。その後に発見されたプレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｅｒｏｐｈｉｎ：ＰＴＮ）とは４５％の相同性を示し（Ｍｅｒｅｎｉｍｉｅｓ，Ｊ．＆Ｒａｕｖａｌａ，Ｈ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６７２１−１６７２４，１９９０）、ＭＫファミリーを形成する（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．：Ｄｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，３６：１−８，１９９４）。
【００１０】
ＭＫの機能については、これまでに多くのデータが集積しており、これからも新らたな重要な機能が発見される可能性が極めて高い。ＭＫの主要な機能としては、次の５つが挙げられる。すなわち、１）神経栄養因子活性：神経細胞の生存および突起伸長を促進する（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１５９：３９２，１９９３；Ｍｉｃｈｉｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，３５：５３０，１９９３；ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｓ．：ｅｔ ａｌ．：１６０，１９９３）、２）創傷治癒：ＭＫは、白色光連続照射による網膜変性を軽減予防し（Ｕｎｏｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３５：４０６３，１９９４）、また、ラットの実験的脳梗塞および心筋梗塞後の早期に、梗塞巣周辺部に発現誘導される（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，８５：２５−３０，１９９５；Ｏｂａｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ：Ｒｅｓｅａｃｈ，１８：１４５−１５２，１９９８）、３）個体発生：ＭＫは、胎生中期をピークとする一過性発現を示し、後期には、ほぼ腎臓に収束する、４）線溶系亢進：ＭＫは、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でウシ大動脈由来の血管内皮細胞のプラスミノーゲンアクチベーター活性を３〜５倍に増大させる（Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：９５９０，１９９５）、５）癌：ウイルムス腫瘍、乳癌、肺癌、神経芽腫、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌でｍｋの高頻度発現が認められる（Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３：１２９１，１９９３；Ｇａｒｖｅｒ Ｒ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ，７４：１５８４，１９９４；Ｇａｒｖｅｒ Ｒ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．：Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，９：４６３，１９９３；Ｎａｋａｇａｗａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：１７９２，１９９５；Ａｒｉｄｏｍｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｊｐｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，８６：６５５，１９９５）、である。
【００１１】
上記したように、ＭＫはラットの実験的脳梗塞後の早期に、梗塞巣周辺部に発現誘導されるが、その発現部位は、アストロサイトに限局して発現していることが明らかにされている（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，８５：２５−３０，１９９５）。一方、ＭＫとファミリーを形成するＰＴＮにおいても、ラット一過性前脳虚血後４日目に海馬、ＣＡ１領域を中心としてＰＴＮが強く発現しており、その大部分はアストロサイトに発現している（Ｔａｋｅｄａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，６８：５７−６４，１９９５）。従来、虚血に伴うアストロサイトの活性化は、細胞保護的に作用するもの理解されている。このようなことから、ＭＫおよびＰＴＮは、虚血侵襲後の中枢神経系の修復過程において一定の役割を担っているものと考えられる。
【００１２】
本発明者らは、ヒトの脳梗塞患者においても、発症後に一過性のＭＫが発現しているのではないかと想定し、健常人１５０人と脳梗塞患者３６人の血清中のＭＫ濃度を測定した。その結果、健常人の血清中のＭＫ濃度の平均値は、０．３ｎｇ／ｍｌであったのに対し、患者のそれの平均値は、０．９ｎｇ／ｍｌであった。そして、発症直後の検体ほど、また、梗塞部位が大きいほど、ＭＫ濃度は高い傾向にあった。この現象は、虚血領域周辺で一過性に発現されたＭＫが血液中を循環しているからではないかと考えられる。
【００１３】
近年、外傷・虚血などの神経損傷に際する種々の神経栄養因子の発現・増加が報告されている（Ｆｒａｕｔｓｃｈｙ，Ｓ Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，５５３：２９１，１９９１；Ｈａｙｎｅｓ，Ｌ Ｗ．：Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２：２６３，１９８８）。これらの神経栄養因子は、神経損傷後の修復機転に関連し、直接的に、あるいはグリア細胞などを介して間接的に神経細胞に作用し、その生存・修復に重要な役割を果たしているものと推測される。
【００１４】
このようなことから、本発明者らは、ＭＫが、他の神経栄養因子のように、神経損傷の修復機転に関わっているかを、脳虚血モデルを用いてその評価を試みた。その一つとして、虚血処置前、あるいは虚血処置後のスナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ ｇｅｒｂｉｌｓ）の脳室内にＭＫを注入して、ＭＫによる海馬ＣＡ１神経細胞の脱落抑制効果を形態学的に調べた。スナネズミでは、内頸動脈系と椎骨動脈系の吻合が８週令以降退縮するため、両側総頸動脈をクリップで３〜５分間閉塞することにより、高度の不完全前脳虚血を容易に作製することができ、虚血後の再灌流によって、４８時間から７２時間にかけて、特定の部位（海馬ＣＡ１領域）に、一定の神経細胞変性（遅発性神経細胞死）が惹起される。したがって、スナネズミ一過性前脳虚血モデルは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける虚血脳保護因子の評価系として有用である（Ｋｉｒｉｎｏ，Ｔ ｅｔ ａｌ．：Ｂｒａｉｎ，Ｒｅｓ．２３７：５７−６９，１９８２；Ｍｉｔａｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１３１：１７１−１７４，１９９１）。
【００１５】
虚血処置前のスナネズミの脳室内に、ＭＫを投与して、ＭＫの虚血脳保護効果を調べた。スナネズミの脳ブレグマの位置より外側２ｍｍ、深さ２ｍｍの穴をあけ、生理食塩水に溶解したＭＫを、マイクロシリンジで０．０６３、０．１２５、０．２５、０．５、１．０、２．０μｇ、ＰＴＮを０．５、１．０、２．０μｇ、そして、比較のために虚血脳保護効果を有するとされるｂＦＧＦを１．０、２．０μｇ、それぞれスナネズミの脳室内に注入した。４分経過後に両側の総頸動脈を結紮し、５分間血流を遮断して、一過性の前脳虚血を作製した。その後血流を再開し、９６時間後、あるいは７日後に、脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。このパラフィンブロックから、５μｍの切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン染色し、左の海馬ＣＡ１神経細胞の海馬領域１ｍｍ当たりの生存神経細胞数を数えた。その結果、表１、あるいは表２に示すように、ＭＫを注入した群は、対照群（生理食塩水注入群）に対して、０．５μｇ以上で、また、ＰＴＮを注入した群は、２．０μｇ以上で、それぞれ海馬ＣＡ１神経細胞の脱落を有意に抑制していることが認められた。
【００１６】
ｂＦＧＦの場合は、対照群に対して、２．０μｇ以上で、海馬ＣＡ１神経細胞の脱落を有意に抑制していることが認められた。すなわち、ＭＫあるいはＰＴＮを予め脳室内に投与しておくと、その後の虚血および随伴する再灌流に起因する脳細胞傷害を抑制（予防）することが可能であると考えられる。
【００１７】
また、虚血処置後のスナネズミの脳室内にＭＫを投与して、ＭＫの虚血脳保護効果を調べた。上記と同様の方法で、一過性前脳虚血を作製後、血流を再開し、４８時間後に上記と同様に、ＭＫを脳室内注入した。注入後７日目に上記と同様に５μｍの切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン染色し、左の海馬ＣＡ１神経細胞の海馬領域１ｍｍ当たりの生存神経細胞数を数えた。その結果、海馬１ｍｍ当たり約１６０個の生存神経細胞が観察された（実施例１．２）。この生存神経細胞数は、虚血処置直前に、ＭＫを０．５μｇ投与した場合とほぼ同数である。
【００１８】
ところで、記憶・学習という高次精神機能は、ヒトにおける精神活動の基礎となっていることは確かである。そこで、記憶・学習の障害を改善させ得る薬物の開発は、神経科学の最も興味ある課題の一つとなっている。学習・記憶障害モデルは、従来より多数知られており、その試験法もきわめて多様である。その中で、受動回避試験は、マウスでよく用いられている。
【００１９】
本発明において、一過性前脳虚血処置の前、あるいはその後の一定時間内に、ＭＫあるいはＰＴＮを脳室内投与した場合、海馬ＣＡ１神経細胞の脱落が、対照群に対して有意に抑制されることが明らかにされた。一方、海馬神経細胞数と、ステップダウン型受動回避学習試験における反応潜時の改善とは、よく相関しているとの報告（Ａｒａｋｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．３８：８９−９４，１９８６；Ｓａｎｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：９９４−１０００，１９９４；Ｗｅｎ，Ｔ．−Ｃ．ｅｔ ａｌ．：Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，６５：５１３−５２１；Ｗｅｎ，Ｔ．−Ｃ．ｅｔ ａｌ．：Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１９１：５５−５８）がある。したがって、虚血負荷の前後に、ＭＫあるいはＰＴＮを脳室内へ注入することにより、反応潜時の改善が期待できる。
【００２０】
脳虚血およびそれに随伴する再灌流に起因する神経細胞傷害に対して、最も脆弱性を示すのが海馬ＣＡ１神経細胞であることを考慮すると、虚血前あるいは虚血後にＭＫあるいはＰＴＮを注入した群において、海馬ＣＡ１神経細胞の脱落が、対照群に対して有意に抑制されたこと、そして、ステップダウン型受動回避学習試験における反応潜時を有意に改善することが期待されることから、ＭＫ、あるいはＰＴＮが、脳虚血およびそれに随伴する血液再灌流に起因する神経細胞傷害に対して、その予防や治療に有用であり、かつ薬物の最終目的である精神症状の改善も期待できることを示すものである。
【００２１】
また、虚血によるストレスだけではなく、外傷等によるストレスにより、神経細胞が損傷を受けた場合も、ＭＫは、早期にその損傷に応答して、その損傷を受けた部分の周辺に発現することが、実施例３により明らかにされた。
【００２２】
したがって、ＭＫあるいはＰＴＮは、種々の脳神経疾患の根本的な病因である虚血、外傷、老化、あるいは原因不明の病因による全般的な、あるいは特定の領域の神経細胞の機能低下、変性、細胞死に対し、直接的にそれを予防したり、再生を促進させることにより、疾患の予防あるいは治療に用いることができると期待される。また、ＭＫとは作用機作の異なる神経栄養因子、例えばｂＦＧＦと併用することにより、虚血あるいはストレスに起因する神経細胞死に対して、相乗的あるいは相加的な保護効果が期待できる。具体的な疾患としては、脳梗塞、一過性脳虚血、クモ膜下出血後遺症の脳血管攣縮による脳障害、痴呆症、心停止後蘇生時の脳障害、等をあげることができる。
【００２３】
また、本発明者らは、ラットの左前下行冠動脈を結紮することにより、実験的心筋梗塞モデルを作製し、心筋細胞におけるＭＫの発現を免疫組織化学染色で調べた（Ｏｂａｍａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．：Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ，１８：１４５−１５２，１９９８）。その結果、正常な心臓の場合、大部分の心筋細胞には、ＭＫの発現は認められなかったが、心室に面する数カ所の心筋細胞にＭＫの発現が認められた（図４および５）。一方、心筋梗塞モデルの心臓の場合、右心室壁（ＲＶ）、中隔、および左心室に面する左心室壁（ＬＶ）の心内膜領域に、ＭＫの強い発現が認められた（図６）。細胞死領域に相当する左心室壁のその他の部分は染色されなかった。ＭＫ染色の特異性は、抗ＭＫ抗体による吸収操作を行うと、ＭＫが染色されないことから確認される（図７）。すなわち、本発明者らにより、心筋梗塞において、著明なＭＫの発現が、免疫組織化学により明らかとされた。驚くべきことに、ＭＫの染色活性の著明な増強は、左心室の梗塞部に隣接する領域のみでなく、ＲＶ全体、および中隔の大部分に認められる（図６）。
【００２４】
染色域と非染色域とは、はっきりとした線で区分されており、それは、冠状動脈領域間の境界に相当する。興味深いことに、心筋梗塞モデルにおけるＭＫの発現パターンは、同モデルにおけるｂＦＧＦのそれとは異なっている（図には示さず）。
【００２５】
梗塞モデルにおけるＭＫの発現をさらに詳細に調べてみると、ＲＶ（図８）および中隔（図９）それぞれにＭＫ染色の出現が認められる（矢印および矢頭）。中隔を強拡大してみると、毛細管，あるいは毛細管の内皮細胞に面する心筋細胞の辺縁領域が強く染色されているのが認められる（図１０）。また、心筋細胞の内部も強く染色される（アスタリスク）。染色領域が非染色領域からはっきりと分離されていることが、中隔とＬＶとの間の境界によって明白である（図１０）。上記したように、ＭＫ染色活性は、心内膜筋細胞を除いては、ＬＶにおいて不均一な染色が少し認められるのみである（図１２）。
【００２６】
梗塞モデルラットと正常ラットのＲＶおよび中隔におけるｍＲＮＡの発現をノーザンブロット分析で比較すると、前者（梗塞モデルラット）においてｍＲＮＡの増加が認められる。１．０ｋｂ ＭＫ ｍＲＮＡの他に、ＭＫ ｃＤＮＡと反応する１．８ｋｂのバンドが認められるが、このバンドは、ＭＫ ｍＲＮＡのイソホームであるかも知れない。この結果は、梗塞後間もない心臓におけるＭＫ免疫反応活性の増加は、転写活性、あるいはｍＲＮＡの安定的増加に起因することを示している。
【００２７】
ラットの左前冠動脈（ＬＡＤ）の結紮によって生じる心筋梗塞では、ＭＫ発現が顕著に増強されていることが明らかである。この増強はＭＫｍＲＮＡの増加に起因し、そして６時間以内の早期に発生する。梗塞心臓では、ＭＫが広い範囲で発現しているにもかかわらず、細胞死を運命づけられている領域では、ＭＫの発現が認められないことは、ＭＫが、損傷した心臓組織の修復に関与していることを示唆している。
【００２８】
上記したように、脳梗塞後まもなく、壊死の周辺の浮腫領域にＭＫが発現していることと考えあわせると、ＭＫの発現は、様々な病的状態における修復あるいは治癒の過程に関与している可能性を示すものである。事実、連続光照射に曝露されることにより生じる網膜変性を、ＭＫを予め投与しておくと、その変性を防止することが明らかにされている（Ｕｎｏｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．：Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ Ｓｃｉ．，３５：４０６３−４０６８，１９９４）。
【００２９】
ｂＦＧＦは、心筋梗塞に関連して発現し、心臓保護作用（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）があることが知られている（Ｓｐｅｉｒ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．：Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，７１：２１５−２５９，１９９２）。しかしながら、本発明者らは、ＭＫが、本発明者らの実験条件のもとでは、ＭＫがｂＦＧＦよりもさらに多く発現することを、明確に示すことができた。ＭＫとｂＦＧＦは、大動脈の内皮細胞におけるプラズミノーゲンアクチベーター活性を共同して増強するが故に（Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：９５９０−９５９６，１９９５）、また、歯の間充織細胞（ｔｏｏｔｈ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）の増殖を増強するが故に（Ｍｉｔｓｓｉａｄｉｓ ＴＡ．，ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２９：２６７−２８１，１９９５）、ＭＫとｂＦＧＦは、損傷を受けた心臓組織の修復にも共同して働く可能性があると考えられる。
【００３０】
また、本発明者らは、正常な心臓においても、ＭＫが心筋細胞で弱く、そして心内膜で強く発現していることを見出している。この局所的なＭＫの発現は、ｂＦＧＦのそれと類似しているが（Ｓｐｅｉｒ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．：Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．，７１：２１５−２５９，１９９２）、梗塞後の発現の増強モードは互いに異なっている。正常な心筋細胞においては、ｂＦＧＦは、ＤＮＡ合成を刺激し、生存を促進し、老化を遅らせ、移動を調節し、細胞外マトリックスの産生に関与していると考えられている（Ｓｐｅｉｒ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．：Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．，７１：２１５−２５９，１９９２）。ＭＫも心臓において同様な役割を果たしているのかも知れない。心筋梗塞後のＭＫ発現の増強は、梗塞領域に隣接した領域のみならず、心臓から遠い部位においても観察される。このＭＫの発現の増強は、心室だけでなく心房壁でも観察される。
【００３１】
このようなことから、ＭＫが心臓の形成と修復の両方に重要な働きをしていることは明らかであり、ＭＫ発現、あるいはそのシグナル伝達システムの異常性は、心臓疾患も含めて、様々な疾患に関与している可能性がある。したがって、冠状動脈の閉塞、または急激な血流の減少により心筋の壊死をきたす心筋梗塞などの虚血性心疾患の予防・治療薬にも、ＭＫは有用であると考えられる。さらに虚血やストレスによる細胞障害に起因するその他の疾患群、例えば消化管領域における血行障害に起因する虚血性大腸炎、あるいは腸間膜動脈閉塞症、などの疾患の予防・治療薬にも、ＭＫあるいはＰＴＮは有用であると考えられる。
【００３２】
本発明の虚血による細胞障害を基盤とする疾患の治療・予防に用いるＭＫあるいはＰＴＮは、ヒト組換えＭＫあるいはＰＴＮ、さらには、その生物活性を有する部分ペプチドが好ましい。ｎａｔｉｖｅＭＫの場合、糖鎖が付加されていないが、このような糖鎖のないＭＫは、本発明にむしろ好ましいと考えられる。ＭＫ の場合、１２１アミノ酸残基よりなるヒトＭＫ（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．：Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ．３６：１−８，１９９４）が対応するが、当該アミノ酸配列を有するＭＫに限定されない。
【００３３】
マウスＭＫの場合、１３９個のアミノ酸からなる前駆体からシグナルペプチドが切り離され、成熟型ＭＫ（アミノ酸１１８個分子量１３ｋＤａ）ができる。１１８個のうち３０個を塩基性アミノ酸、１０個をシステインが占める。このシステインがつくる５つのジスルフィド結合によってＮ末側とＣ末側の二つのドメインが形成される。この二つのドメインは、互いに生化学的特性と生物学的特性を異にしており、ｉｎ ｖｉｖｏにおける機能発現に際しても、役割を分担している可能性がある。ヘパリン結合能は、Ｎ末側よりＣ末側のほうが強い（Ｍｕｒａｍａａｔｓｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０３：１１３１，１９９４）。また、神経突起伸長能、線溶系亢進能もＣ末側がその大部分を担っている（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０３：１１３１，１９９４；Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０６：４６８，１９９５）。したがって、このようなＭＫ本来の生物活性を有する部分ポリペプチドも本発明の実施に包含される。
【００３４】
本発明の薬剤の活性を高めたり、安全性を向上させる目的で、ヒトＭＫのアミノ酸配列において特定のアミノ酸の欠失、あるいは他のアミノ酸の挿入、または配列中のアミノ酸の置換等を行うことは、組換えＤＮＡ技術により容易に行うことができる。例えば、特定の部位のアミノ酸残基を化学的に同等のアミノ酸で置換することができる。例えば、疎水性のアミノ酸（Ａｌａなど）を他の疎水性のアミノ酸（Ｇｌｙなど）で置換することができるが、あるいはより疎水性のアミノ酸（Ｖａｌ，ＬｅｕまたはＩｌｅなど）で置換することもできる。同様に、１つの陰性に帯電したアミノ酸残基を他のアミノ酸と置換する（ＡｓｐをＧｌｕで置換するなど）、あるいは１つの陽性に帯電したアミノ酸残基を他のアミノ酸と置換する（ＬｙｓをＡｒｇに置換するなど）ことができる。また、ＭＫのＣ末端側の半分、例えば６０位−１２１位（Ｃ−ｈａｌｆ６０−１２１）、あるいはＣ末端側から６２位−１０４位（Ｃ−Ｈａｌｆ６２−１０４）（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．：ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０３：１１３１−１１３９，１９９４）には、ＭＫの神経突起伸長能を担い、ヘパリン結合部位もこの部分に存在するので本発明の薬剤に用いることができると予想される。また、ＭＫの生物活性に望ましくない影響が認められない場合は、疎水性アミノ酸の帯電したアミノ酸への変化は望ましいと考えられる。当業者であれば、望ましいＭＫの生物活性をもつように、これらの修飾を行うことが可能である。また一般に、タンパク性医薬品は、タンパク分解酵素の攻撃や、不必要なレセプターの関与により、その薬効を発揮できない場合が多く、ＭＫやＰＴＮの場合もその例外ではない可能性がある。したがって、ＭＫやＰＴＮに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロヂドン、あるいはデキストラン等を結合させて、体内での安定性を向上させることが考えられる。例えばＩＬ−６の血中滞留性の向上を目的として、ＰＥＧハイブリッド化ＩＬ−６が作製され成功している。本発明には、このような化学修飾された、ＭＫやＰＴＮも包含する。
【００３５】
本明細書に記載の「ミッドカイン」または「ＭＫ」とは、本来の生物活性を有する限り、全てのこのような修飾および変化を有するＭＫを含み、本発明の「ＭＫファミリー」とは、本来の生物活性を有する限り、全てのこのような修飾および変化を有する「ＭＫファミリー」に属するタンパク質（ＭＫ、ＰＴＮ）を含む。
【００３６】
本発明のＭＫファミリーに属するタンパク質を有効成分として医薬組成物を調製し、脳梗塞、心筋梗塞、虚血性大腸炎あるいは上腸間膜動脈閉塞症などの予防又は治療剤として用いる場合、ＭＫそのものを直接投与することもできるが、有効成分としてＭＫを含有していれば、公知の製剤学的製造法によって、製剤化して投与することもできる。例えば、薬剤として一般的に用いられる適当な担体、または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油等）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム）、安定剤（例、糖、糖アルコール、アルブミン）、または保存剤（パラベン）、等と適宜組み合わせて、生体に効果的に投与するのに適した注射剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経口剤等の医薬用製剤、好ましくは注射剤に調製することができる。例えば、注射剤の製剤としては、凍結乾燥品や、注射用水剤や、浸透圧ポンプに封入した形等で提供できる。本発明の製剤は、脳の実質や心筋細胞に直接作用し、効果を発揮するＭＫ，あるいはＰＴＮを含有するので、いままで用いられてきた脳代謝賦活薬や脳循環改善薬等の対症療法剤と異なり、種々の脳神経疾患の根本的な病因である虚血、外傷、老化、あるいは原因不明の病因による全般的な、あるいは特定の領域の神経細胞の機能低下、変性、壊死に対し、直接的に，それを予防したり、再生を促進させることにより，疾患の治療に用いることができる。
【００３７】
また、ＭＫあるいはＰＴＮ遺伝子のプロモーター領域を用いて、虚血性疾患部位におけるＭＫあるいはＰＴＮタンパクの発現増強を図る、いわゆる遺伝子治療の可能性が考えられる。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、例えばＭＫ、あるいはＰＴＮタンパクとして、一日約０．００１−１００μｇ／ｋｇを、１回から６回に分けて、動脈内注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、脳室内注射、脊髄内注射、等の方法によって投与することができる。また、脳室内や髄内にカテーテルを埋め込み、これから直接薬物を投与することもできる。あるいは、浸透圧ポンプ等に封入し、生体に留置することにより、連続的に投与することもできる。
【００３９】
また、頚動脈よりマンニトールや尿素等の高張液を注入すると一過性に脳血液関門の透過性が上昇すること（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４８１−４８５，１９７９）、また、アルキルグリセロール等の物質に、他の薬物の脳移行性を促進する作用があること、などが報告されており、このような手法を用いて投与することもできる。また、カチオン化したカチオンアルブミンは、何らかの機構で脳内に取り込まれる可能性が示唆されており（Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．７０：２８９−２９５，１９８２）、このような手法を用いて、ＭＫ、あるいはＰＴＮタンパク質を化学修飾した後、投与することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、 ドライアイス処置２日後の脳細胞の顕微鏡写真（×１０）である。Ａは、ドライアイスによって生じた梗塞部とその周辺の細胞をヘマトキシリン−エオジン染色（Ｈ・Ｅ染色）したものである。Ｂは損傷の程度の強い梗塞部を示したＨ・Ｅ染色の像である。ＣはＢと類似の部分を抗ＭＫ抗体で染色した像である。
【図２】図２は、ドライアイス処置２日後の脳細胞の顕微鏡写真である。Ｄは梗塞部周囲の抗ＭＫ抗体陽性の細胞を拡大（×５０）して見たものである。ＥはＤと同様の部分を、ＴＵＮＥＬ法（ＴａＫａＲａ Ｉｎ ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用）でアポトーシス染色した写真である。核の断片化が起こりＴＵＮＥＬ反応陽性のアポトーシスを起こした細胞が確認できる。
【図３】図３は、頭部外傷モデルラットの脳細胞の写真である。Ａ、Ｃ、Ｅは、Ｈ・Ｅ染色。Ｂ、Ｄ、Ｆは、Ａ、Ｃ、Ｅに対応する抗ＭＫ抗体によって染色した像である。顕微鏡倍率は、Ａ、Ｂは２５倍、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆは１００倍でる。
【図４】図４は、正常心臓におけるＭＫの分布を示す顕微鏡写真である。
【図５】図５は、正常心臓におけるＭＫの分布を示す顕微鏡写真である。
【図６】図６は、左前方下行冠状動脈閉塞後のラット心臓におけるＭＫの分布を示す顕微鏡写真である。
【図７】図７は、中和抗ＭＫ抗体で処理した、左前方下行冠状動脈閉塞後のラット心臓におけるＭＫの分布を示す顕微鏡写真のコントロールの顕微鏡写真である。
【図８】図８は、心筋梗塞形成６時間後のラット心臓の右心室壁におけるＭＫの分布を示す顕微鏡写真である。
【図９】図９は、心筋梗塞形成６時間後のラット心臓の中隔におけるＭＫの分布を示す顕微鏡写真である。
【図１０】図１０は、心筋梗塞形成６時間後のラット心臓の中隔と梗塞部位をもつ心室壁、左心室壁との間の境界領域におけるＭＫの分布を示す顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、心筋梗塞形成６時間後のラット心臓の中隔におけるＭＫの分布を示す顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、心筋梗塞形成６時間後のラット心臓の左心室壁におけるＭＫの分布を示す顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、心筋梗塞形成６時間後のラット心臓の左心室内の心内膜におけるＭＫの分布を示す顕微鏡写真である。
【図１４】図１４は、心筋梗塞患者の血清中ＭＫ量を経時的に測定した結果をまとめたグラフである。
【図１５】図１５は、脳梗塞患者の血清中ＭＫ量を測定した結果をグラフにまとめたものである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
［実施例１］ 一過性前脳虚血モデルにおける虚血脳保護物質の評価
１．１ 虚血処置前の虚血脳保護物質投与
１．１．１ＭＫの虚血脳保護効果
組換えヒトＭＫは、特開平９−９５４５４号公報の実施例１に記載の方法に従って作製したものを本実施例、実施例１．１．２および実施例１．２に使用した。１群６〜１６匹の雄性スナネズミ（６〜８週令、体重６０〜８０ｇ）を、フローセン専用麻酔薬送り込み装置「ＨＯＮＥＹ ＭＡＴＩＣ Ｍ−３」（木村医科器械（株））に入れ、吸入麻酔剤「フローセン」（日本薬局方ハロタン）を容器内に適度に充満させ、麻酔を施した。スナネズミは、注入器固定装置付手術台（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ ＬＡＢ．；ＴＹＰＥ ＳＲ−５Ｎ，Ｎｏ．９７０２４）に固定した。頭部を正中切開した後、ブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）の位置より２ｍｍ左眼球側にずれたところに、歯科用ドリルを用いてシリンジが入るような適当な穴を開けた。この穴から、ＭＫ０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、あるいは２ｍｇ／ｍＬ溶液（生理食塩水溶液）を、マイクロシリンジ（ＨＡＭＩＬＴＯＮ ＭＩＣＲＯＬＩＴＥＲ ＃７０１）を用いて、１μＬずつ（０．５μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ）脳室内に注入した。対照群として、生理食塩水（日本薬局方生理食塩水：大塚生食注、大塚製薬株式会社）のみを注入した群、および偽手術群（Ｓｈａｍ−ｏｐ群）を設けた。脳室内に注入後４分間放置し、その後手術部を縫合した。続いて胸部を正中に切開し、左右の総頸動脈を露出し、「Ｎｏ．２３動脈クレンメ直」で両側の総頸動脈を結紮し血流を５分間遮断した後、血流を再開した。虚血負荷中は、脳温、体温を一定（３７±０．２℃）に保った。個体識別を施し、麻酔がとけた後、飼育ケージに戻し、自由給水、自由摂食の下で飼育を続け、９６時間後に０．２％の割合でヘパリン（ノボ・ヘパリン注１００；日本ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社）を含む生理食塩水と４％パラホルムアルデヒド溶液で灌流固定した。断頭した頭部から脳を取り出した。脳は４％パラホルムアルデヒド固定液中に１日放置した後、背側海馬を含む組織片を脱水・透徹後、パラフィン包埋した。
【００４２】
このパラフィンブロックから、海馬の最先端より０．５〜１．０ｍｍ、または矢状縫合の後方１．４〜１．９ｍｍに相当する厚さ５μｍの切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジンで染色（Ｈ・Ｅ染色）した。この組織標本について、キルビメーター片面型を使用して海馬ＣＡ１の長さを５回測定し、その平均値を算出した。左の海馬錘体細胞（神経細胞）の海馬領域の細胞数を２００倍の倍率下に数え、上記平均値で除して海馬ＣＡ１１ｍｍ当りの生存神経細胞数を算出した。その結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2010270156.tif 000002
【００４４】
表１から明らかなように、ＭＫはワンショット０．５μｇ以上の投与量で、海馬ＣＡ１領域の遅発性神経細胞死を著明に防止している。
【００４５】
１．１．２  ＭＫと他の虚血脳保護因子との虚血脳保護効果比較
各虚血脳保護因子は、２μＬずつを脳室内に投与した。さらに、両側の総頸動脈の結紮には杉田脳動脈瘤クリップ（スタンダードタイプ；ＭＩＺＵＨＯ）を使用し、片方に２本ずつかけた。脳の灌流固定は、１週間後に行った。この３点をの除けば、１．１．１の実施例と同様の方法で行った。組換えヒトプレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ：ＰＴＮ）および組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（フナコシ）から購入した。それぞれの投与量は、ＰＴＮ２μｇ、１μｇ、０．５μｇ、ｂＦＧＦ２μｇ、１μｇであった。その結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
2010270156.tif 000003
【００４７】
本実施例においても、ＭＫが統計的に有意に虚血脳保護効果を発揮する量は、上記１．１．１の実施例にほぼ一致して、０．５μｇ以上と推定される。０．１２５μｇでも生理食塩水投与群より多くの神経細胞の生存を認めるが、統計的には有意でない。ＰＴＮの場合、有意に虚血脳保護効果を発揮する量は、ほぼ２μｇと、ＭＫに比較して約４倍量を必要とする。また、虚血脳保護効果があるとされるｂＦＧＦ（Ｎａｋａｔａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，６０５：３５４−３５６，１９９３）の場合、有意に虚血脳保護効果を発揮する量は２μｇであるが、その生存神経細胞数は、同量のＭＫを投与した場合のほぼ半分以下である。以上より、虚血に起因する脳神経細胞死を抑制する因子として、ＭＫは、既存のプロサポシン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、あるいはＩＬ−６等の虚血脳保護因子によるスナネズミ一過性前脳虚血モデルの虚血脳保護効果と比較して、遜色がないことが明らかとなった。
【００４８】
１．２ 虚血処置血液再灌流一定時間後の虚血脳保護物質投与
虚血処置血液再灌流４８時間後に、ＭＫを投与すること以外は、１．１．２の実施例と全く同様の方法で実施した。ＭＫを２μｇ投与した場合、４８時間後の生存海馬ＣＡ１神経細胞は、海馬１ｍｍあたり１６０個であった。これは、１．１．２の実施例でのＭＫ０．５μｇ投与場合の生存数とほぼ同等であった。すなわち、一過性脳虚血後血液が再灌流して一定時間以内に、ＭＫを投与しても、虚血脳保護作用効果が期待できることがこの実験で明らかとなった。
【００４９】
以上のことから、ＭＫファミリータンパクは、既存のタンパク性虚血脳保護因子とは異なる作用機序で効果を発揮する可能性が期待できる。近年、外傷・虚血など神経損傷に際する様々な神経栄養因子の発現・増加が報告されている。これらの神経栄養因子は、神経損傷後の修復機転に関連し、直接的にあるいはグリア細胞などを介して間接的に神経細胞に作用し、その生存・修復に重要な役割を果たしていると思われる。このようなことから、ＭＫと他の神経栄養因子とを組み合わせて用いることにより、相乗的効果あるいは相加的効果が期待できると考えられる。
【００５０】
［実施例２］ ドライアイス脳損傷（Ｃｏｌｄ Ｉｎｊｕｒｙ）モデルにおけるＭＫの発現
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａＷｌｅｙ ラット（ＳＤラット）（体重：１６０ｇ）１０匹を使用した。４％抱水クロラール（１０ｍＬ／ｋｇ）をラットの腹腔に注射し麻酔した。ハサミで頭皮を切開し、頭蓋の上から、７ｍｍ×１０ｍｍ（厚さは２ｍｍ程度）にカットしたドライアイスを１０秒間押しつけた。その後、頭皮を縫合し、再度自由吸水、自由給餌にて飼育を続けた。ドライアイス処置後、１、２、４、７、および１４日目に、各２匹のラットに対して、４％抱水クロラールを腹腔投与（１０ｍＬ／ｋｇ）して麻酔した後、０．２％ヘパリン（ノボ・ヘパリン注１００；日本ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社）を含む生理食塩水（日本薬局方生理食塩水：大塚生食注、大塚製薬株式会社）と４％パラホルムアルデヒド固定液にて灌流固定した。十分に固定したところで、断頭し、ハサミを使用して脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒド固定液に入れた。２４時間固定し、脳が十分に堅くなったところで、両刃かみそり（ＦＥＡＴＨＥＲ）を用いて、脳を前方より４分割した。このうち、梗塞部が観察できる組織片を脱水・透徹後、全自動包埋機にてパラフィン包埋した。このパラフィンブロックより、５μｍの厚さの切片を作製した。これらのパラフィン切片に対して、１）ヘマトキシリン−エオジン染色（Ｈ・Ｅ染色）、２）抗ＭＫ抗体（ウサギ抗マウスＭＫポリクローナル抗体）染色、３）アポトーシス検出を行った。
【００５１】
図１に、ドライアイス処置２日後における脳細胞のＨ・Ｅ染色、および抗ＭＫ抗体による染色の顕微鏡写真を示す（×１０）。Ａはドライアイスによって生じた梗塞巣とその周辺の細胞を、Ｂは損傷の強い梗塞巣を、ＣはＢと類似の部分の抗ＭＫ抗体染色をそれぞれ示す。図１のＣ（抗ＭＫ抗体による染色）から、梗塞部位の周辺にＭＫの強い発現が観察される。
【００５２】
また図２に、ドライアイス処置２日後における脳細胞の抗ＭＫ抗体による染色、およびアポトーシス染色の顕微鏡写真を示す。Ｄは梗塞部周囲の抗ＭＫ抗体陽性の細胞を拡大図（×５０）である。ＥはＤと同様の梗塞部周囲の細胞がアポトーシスをおこしているかどうかを、ＴＵＮＥＬ法（ＴａＫａＲａ Ｉｎ ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用）により検出した顕微鏡写真を示す。核の断片化が起こりＴＵＮＥＬ反応陽性の細胞が確認できる。図２に示すように、梗塞巣はＨ・Ｅ染色の染色性が薄くなるほど、細胞が強くダメージを受けている。
【００５３】
［実施例３］ ラット脳損傷モデルにおけるＭＫの発現
実施例２では虚血による脳梗塞モデルにおけるＭＫの発現を調べたが、本実施例では、機械的なストレスによる梗塞モデルを作製しＭＫの発現を調べた。雄性ＳＤラット（体重：３２０ｇ）１０匹を使用した。ラットの腹腔に４％抱水クロラール（１０ｍＬ／ｋｇ）を注射して麻酔した。大脳皮質を剥離し、脳損傷モデルを作製した。ハサミで頭皮を切開し、冠状縫合に沿って左眼の方へ３ｍｍ、さらに矢状縫合に沿って後頭部側へ３ｍｍの位置で、直径４ｍｍ、深さ３ｍｍになるように大脳皮質を剥離した。剥離には、ディスポパンチ（ディスポーザブル皮膚トレパン）（スティーフェル・ラボラトリウム社）を使用した。剥離が完全に実行されたことを確認した後、頭部を縫合し、再度自由吸水、自由給餌にて飼育を続けた。脳損傷モデル作製後、１、２、４、７、１４日目のそれぞれの日に、各２匹のラットから、実施例２と同様に５μｍの厚さの切片を作製した。これらのパラフィン切片に対して、Ｈ・Ｅ染色および抗マウスＭＫ抗体により染色を行った。脳損傷モデル作製後１日目の結果を図３のＡ、Ｃ、ＥにＨ・Ｅ染色を、Ｂ、Ｄ、Ｆに抗ＭＫ抗体で染色を示す。機械的な損傷に対してＭＫは非常に早く反応することが確認された。Ａ、Ｃ、ＥのＨ・Ｅ染色像から、機械的な損傷に対して、脳細胞が大きな損傷を受けていることが観察される。この脳細胞の損傷に一致して、Ｂ、Ｄ、Ｆの抗ＭＫ抗体染色像から、主として出血の確認される周囲と脳細胞の損傷の強い部分に、抗体染色陽性の細胞が多く観察される。これらの結果は、虚血によるストレスだけではなく、機械的なストレスにより、神経細胞が損傷を蒙る場合でも、ＭＫはその損傷に早期に応答して、その損傷を受けた部分の周囲に発現してくることが明らかとなった。
【００５４】
［実施例４］ 心筋梗塞モデルにおけるＭＫの発現
４．１ 心筋梗塞モデルの作製
Ｆｉｎｅ，Ｇ．らの方法（Ｆｉｎｅ，Ｇ．，Ｍｏｒａｌｅｓ，Ａ．ａｎｄ Ｓｃｅｒｐｅｌｌａ，Ｊ．Ｒ：Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈ．８２：４−８，１９６６）に準じて、ウイスターラット（７週令の雄）の左前方下行冠状動脈（ＬＡＤ）を結紮して、左心室壁に実験的ラット心筋梗塞を形成させた。結紮６時間後、ラットを殺し、直ちに、解析のために心臓を取り出した。心筋細胞の生存を確認（Ｆｉｓｈｂｅｉｎ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．：Ａｍ．Ｈｅａｒｔ，Ｊ．１０１：５９３−６００，１９８１）するために、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）の染色して心筋梗塞の領域と大きさを測定した。
【００５５】
４．２ ＭＫ，抗ＭＫ抗体、および抗ｂＦＧＦ抗体
ＭＫおよびアフィニティー精製ウサギ抗マウスＭＫ抗体は、Ｔａｋｅ，Ｍ．らの方法（Ｔａｋｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６：１０６３−１０６８，１９９４）に準じて調製した。アフィニティー精製抗ＭＫ抗体の特異性は、Ｍｕｒａｍａｔｓｕらの文献の抗体（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）と殆ど同じであった。この抗体は、ウエスタンブロット解析において、ＭＫと反応したが、ＰＴＮとは反応しなかった。マウス抗ヒトｂＦＧＦモノクローナル抗体としては、ＭＡｂ５２（和光純薬製）を用いた。この抗体は、ラットのｂＦＧＦを認識する（Ｔａｋａｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．９０：１−１０，１９９２）。
【００５６】
４．３ 免疫組織化学分析
ラット心臓の心室領域の水平断面切片を取り出して、中性バッファーホルマリン固定液中で室温で固定した後、パラフィン包埋した。ついで、５μｍの厚さの切片を調製した。脱パラフィン後、０．３％過酸化水素水含有１００％メタノール中で３０分間内因性ペルオキシダーゼをブロッキングした。１％牛血清アルブミンを添加し、３０分間反応させた。ＭＫを検出するために、これらの切片を４℃で一晩、アフィニティー精製ウサギ抗ＭＫポリクローナル抗体（８μｇ／ｍＬ）とインキュベートした。ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と３０分インキュベート後、ビオチン化アルカリフォスファターゼ−ストレプトアビジン複合体（Ｄａｋｏ，Ｇｉｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と３０分間インキュベートさせた。また、ｂＦＧＦの検出のために、切片を４℃で一晩、マウス抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体（５μｇ／ｍＬ）と反応させた。次に、ビオチン化ウサギ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と３０分間インキュベート後、ビオチン化アルカリフォスファターゼ−ストレプトアビジン複合体（Ｄａｋｏ，Ｇｉｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と３０分間インキュベートさせた。免疫反応は、Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ／Ｎａｐｈｔｈｏｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により可視化した。対比染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎｉｎｇ）は、ヘマトキシリンで行った。ＭＫの免疫染色の特異性を決定するために、抗ＭＫ抗体を組換えＭＫにより吸収操作した後、ヘパリンセファロースアフィニティークマトグラフィーにかけた（Ｙａｓｕｈａｒａ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：２４６−２５１，１９９３）。
【００５７】
その結果を図４〜図１３に示す。
【００５８】
図４〜図７は、左前方下行冠状動脈閉塞後のラット心臓における、ＭＫ染色性の増強を示す顕微鏡写真である。図４及び図５は、正常なラットの心臓を免疫組織化学的染色したもので、心室に面している心筋細胞のあるものには、ＭＫが発現している。また、心中隔の他の心筋細胞にも弱いがＭＫの免疫反応が認められる。しかし、大部分の心筋細胞はＭＫを殆ど発現していない。図６は、心筋梗塞形成６時間後のラット心臓の顕微鏡写真で、中隔（ＳＥ）、右心室壁（ＲＶ）、及び左心室壁（ＬＶ）の心内膜（矢印で示す領域）では、ＭＫの強い染色が認められる。左心室壁と中隔との免疫染色の違いは非常に明白である。染色領域と非染色領域とは、これらの領域に栄養を供給するそれぞれの冠動脈の境界領域に対応して一つの明白な境界によって分けられている。なお、ＬＶの細胞死領域の心筋細胞は染色されていない。なお、梗塞部位をもつ心臓に観察されるＭＫの発現パターンは、同じ心臓におけるｂＦＧＦの発現パターンと異なっていた。図７は、中和抗ＭＫ抗体によるコントロール染色を示す顕微鏡写真であり、中和抗ＭＫ抗体で処理すると染色が起こらなくなることから、この染色がＭＫ特異的なものであることが確認された。図に示すバーは、図４、６及び７では１５００μｍを示し、図５では１５０μｍを示す。
【００５９】
図８〜図１３は、心筋梗塞形成６時間後のラット心臓におけるＭＫ発現について、その詳細を示す顕微鏡写真である。右心室壁（図８）、中隔（図９、図１１）、中隔と梗塞部位をもつ心室壁、左心室壁との間の境界領域（図１０）、左心室壁（図１２）および左心室内の心内膜（図１３）にＭＫの免疫組織化学的染色が認められた。ＭＫの免疫反応は、心筋細胞（図１１及び図１３中のアステリスクで示す部分）と内皮細胞に面する心筋細胞の辺縁領域または内皮細胞自身（矢印及び矢印の頭で示される部分）で観察された。中隔を高倍率写真でみると（図１１）、血管に面した心筋細胞の辺縁部、または血管内皮細胞にＭＫの強い染色が認められる。心筋細胞の内側（図１３）も、強くあるいは中程度に染色されている（アステリスクで示す部分）。なお、中隔とＬＶの間の境界で、非染色領域と染色領域とは、はっきりと識別された（図１０）。図に示すバーは、図８，９及び１０では２００μｍを示し、図１１、１２及び１３では５０μｍを示す。
【００６０】
［実施例５］ 梗塞患者血清中のＭＫの測定
特開平１０−１６０７３５号公報に記載のＥＩＡシステムを用いて、心筋梗塞および脳梗塞患者の血清中のＭＫ量を測定した。各血清は、患者より採血後、３０００回転、１５分間（室温）の遠心操作により得られた血清を用いた。血清は、−８０℃に保存した。図１４は心筋梗塞患者の血清を経時的に測定した場合の一例である。心筋梗塞発症後、ＭＫは比較的早期に発現し、その血中濃度は増加し、発症後１２時間後をピークに達している。そして、２４時間後には発症６時間後と同じレベルまで低下し、３１時間後には、健常人の平均値である約０．１６ｎｇ／ｍＬまで低下している。心筋梗塞後の血中のＭＫの量的変化は、ＭＫ独特のものと考えられ、心筋梗塞とＭＫとの関連は、梗塞周辺部位での早期のＭＫ発現との関連も含めて心筋の修復機転にＭＫの関与が示唆される。図１５は脳梗塞患者の血清中のＭＫ量を測定したものである。脳梗塞患者の場合も、患者Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｆのように比較的梗塞発症後早期に採血されたと考えられる患者においては、血中のＭＫ濃度は非常に高い値を示した。このことは、脳梗塞発症早期にその周辺に多量のＭＫが観察される事実を個体レベルで考察する上で興味深いデータであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のミッドカインファミリータンパク質またはその部分ペプチドは、虚血による細胞障害、または該細胞障害を基盤とする虚血性疾患の治療または予防に有効である。例えば、脳血管障害である、脳梗塞、一過性脳虚血疾患、頭部外傷、のほか、例えばクモ膜下出後の脳血管攣縮症、アルツハイマー病、アルツハイマー型痴呆症、脳血管性痴呆症等および他の脳血管疾患、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮退行性疾患等の治療・予防剤としても有効である。さらに、虚血性心疾患である心筋梗塞、労作性狭心症、あるいは虚血性大腸炎、上陽間膜動脈閉塞症などの治療・予防剤として期待できる。また、虚血部位で、ＭＫやＰＴＮの遺伝子プロモーターを活性化しＭＫやＰＴＮのタンパク質を発現させるいわゆる遺伝子治療の可能性も期待できる。
【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年9月14日(2010.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカイン（ＭＫ）タンパク質又はプレイオトロフィンを有効成分とする、虚血による細胞障害を治療または予防するための薬剤。
【請求項２】
虚血による細胞障害が脳実質内にある請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
脳実質の障害が本質的に海馬ＣＡ１領域の錐体細胞障害からなる請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
ミッドカイン（ＭＫ）タンパク質又はプレイオトロフィンを有効成分とする、虚血による細胞障害の治療又は予防において、梗塞周辺部位の細胞のアポトーシスを予防するための薬剤。
【請求項５】
虚血が起こる前に使用するための、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
虚血が起こった後に使用するための、請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
血清ＭＫレベルが高い対象において使用するための、請求項４から６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項８】
梗塞において内在性ＭＫのレベルを補充するための、請求項４から６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項９】
カテーテルによる投与用に製剤化された、請求項４から８のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１０】
注射による投与用に製剤化された、請求項４から８のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１１】
ＭＫ以外の神経栄養因子の１つ又は複数をさらに含む、請求項４から１０のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記虚血が脳内にある、請求項４から１１のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記虚血が脳実質内にある、請求項１２に記載の薬剤。
【請求項１４】
前記虚血が脳の海馬ＣＡ１領域内にある、請求項１２又は１３に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記虚血が脳梗塞に関連する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記虚血が心臓組織内にある、請求項４から１１のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記虚血が心筋梗塞に関連する、請求項１６に記載の薬剤。