(57)【要約】【課題】マウスクラスIII、抗ＣＥＡ  ｍＡｂの抗ＣＥＡ結合特性及びヒト患者におけるヒトｍＡｂの免疫原性を有する免疫学的試薬を提供する。【解決手段】異種抗体のフレームワーク領域に移植された親マウスクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体の相補性決定領域を有するヒト化モノクローナル抗体であって、このヒト化抗体が親マウスモノクローナル抗体の結合特異性は保持するものの、異種宿主においてそれよりも免疫原性が小さいヒト化モノクローナル抗体が提供される。好ましいマウスクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体はＭＮ１４抗体であり、好ましい異種抗体はヒトに由来するものである。このヒト化モノクローナル抗体を産生するＤＮＡ構築物及びベクター、並びにそれを用いる診断用及び治療用複合体も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体由来の軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）の各々とを含むヒト化モノクローナル抗体またはその断片であって、該ヒト化抗体は、該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の特異性を保持するものの、ヒト患者において該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体よりも免疫原性が小さく、該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲが、ＫＡＳＱＤ  ＶＧＴＳＶ  Ａ（配列番号２０）を含むＣＤＲL1と、ＷＴＳＴＲ  ＨＴ（配列番号２１）を含むＣＤＲL2と、ＱＱＹＳＬ  ＹＲＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲL3とを含んでなり、該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の重鎖可変領域のＣＤＲが、ＴＹＷＭＳ（配列番号２３）を含むＣＤＲH1と、ＥＩＨＰＤ  ＳＳＴＩＮ  ＹＡＰＳＬ  ＫＤ（配列番号２４）を含むＣＤＲH2と、ＬＹＦＧＦ  ＰＷＦＡＹ（配列番号２５）を含むＣＤＲH3とを含んでなることを特徴とするヒト化モノクローナル抗体またはその断片。
【請求項２】
親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域と、ヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域とを含んでなるキメラモノクローナル抗体又はその断片であって、該キメラ抗体は該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の特異性を保持するものの、ヒト患者において該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体よりも免疫原性が小さく、該キメラモノクローナル抗体は配列番号４の軽鎖可変領域と配列番号２の重鎖可変領域を含んでなることを特徴とするキメラモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項３】
請求項１又は２のモノクローナル抗体又は断片に結合している診断物質又は治療物質を含んでなる複合体。
【請求項４】
ガン患者の診断又は治療に使用するための請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又は請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその断片をコードする単離ＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結腸及び他のガンの診断及び治療用の免疫学的試薬に関する。特に、本発明は、対応するマウス抗ガン胎児性抗原（「ＣＥＡ」）モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）（ＭＮ１４）の結合親和特性並びにヒト抗体の抗原性及びエフェクター特性を有するヒト化抗ＣＥＡモノクローナル抗体に関する。さらに、本発明は、抗ＣＥＡマウスｍＡｂの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）がヒト抗体のフレームワーク領域に移植されているヒト化ｍＡｂ、そのようなＣＤＲを移植された抗体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを増殖させ、発現させるためのベクター及び形質転換宿主、並びに診断及び治療用途に有用な抗体の複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ガンの診断及び治療への有望なアプローチは、診断及び治療作用物質を悪性腫瘍に直接搬送するターゲッティング抗体の使用を包含する。過去１０年にわたって、様々な腫瘍特異的抗体及び抗体断片が、これらの抗体を薬物、毒素、放射性核種もしくは他の作用物質に複合する方法、及びこれらの複合体を患者に投与する方法と同様に、開発されている。これらの努力は多大な進歩をもたらしているが、様々のほとんど予期し得ない問題が、ある程度まで開発されている試薬の幾つかの診断上及び治療上の実用性を制限している。
【０００３】
その中で、最も扱いにくい問題は、ターゲッティング複合体に外来抗原として応答し得る、ヒト免疫系自体によって引き起こされるものである。すなわち、（ヒトに最も普通に用いられているターゲッティング抗体である）マウスモノクローナル抗体と複合体を形成している薬物又は放射性核種で処置された患者は、体内を循環しているヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びその複合体の抗体部分に対する一般化された即時型III型過敏性反応を発現する。さらに、副作用が最小である場合（例えば、単一の投与における場合）でさえ、循環ＨＡＭＡは患者におけるターゲッティング作用物質の有効濃度を低下させ、したがって、診断又は治療作用物質が標的部位に到達するのを制限する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この問題を克服又は回避するため、幾つかのアプローチが開発されているが、限られた成功しか収めていない。戦略の１つは、ターゲッティング抗体を化学的に修飾してその抗原性を抑制することである。例えば、ターゲッティング抗体へのポリエチレングリコールの複合（ＰＥＧ化）が、抗体の抗原性を低下させることが報告されている。別のアプローチは、抗体における抗原性の部位を特徴付けた後、それを除去することである。この手法においては、ＩｇＧ全体の代わりに、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２及び他の抗体断片が用いられている。加えて、血液からＨＡＭＡを血漿交換で除去することによりＨＡＭＡの副作用を低下させる試みがなされている。また、外来抗体の副作用を十分に低下させてターゲッティング作用物質での複数の治療を可能にするのに、免疫抑制技術も用いられている。
【０００５】
これらのアプローチで完全に満足に改善するものはない。ターゲッティング抗体及び抗体複合体に対する不利な免疫応答を減少または取り除く手段が、これらの診断及び治療作用物質の完全な利益を得るために、依然として要求されている。
【０００６】
この目標は、以下に説明されるＣＤＲを移植されたヒト化マウス抗ヒトＣＥＡ  ｍＡｂで達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、マウスクラスIII抗ＣＥＡ  ｍＡｂ（ＭＮ１４）のＣＤＲがヒト抗体又は抗体断片のアミノ酸配列に機能的に移植されたヒト化クラスIII抗ＣＥＡ  ｍＡｂを提供し、マウスクラスIII、抗ＣＥＡ  ｍＡｂの抗ＣＥＡ結合特性及びヒト患者におけるヒトｍＡｂの免疫原性を有する免疫学的試薬を提供することにある。
【０００８】
本発明の別の目的は、このような抗体をコードするＤＮＡ構築体を提供することにある。これに関する具体的な目的は、細胞培養及び抗体産生における有利な特性を有する、改良された抗体及びその抗体をコードするＤＮＡを生成する遺伝子操作を容易にする基質ＤＮＡである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、このＤＮＡを増殖させ、かつこの抗体を発現させるためのベクターを提供することにある。これに関連する本発明の目的は、保存、増殖、抗体産生及び治療用途のための、ベクターを有する細胞を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、診断及び治療において用いられる、抗体を含有する組成物を提供することにある。これに関しては、とりわけ、ex vivo及びin vivoにおける造影、診断、予後及び治療のための、造影剤及び治療剤と複合体を形成する抗体を含む複合体を提供することが目的である。
【００１１】
前述の目的の達成において、本発明の一側面に従い、異種（ヒト）抗体のフレームワーク領域に移植されたマウスクラスIII、抗ＣＥＡ  ｍＡｂ（ＭＮ１４）のＣＤＲを含むヒト化マウスｍＡｂであって、このようにヒト化されたｍＡｂ抗体がクラスIII、抗ＣＥＡ結合特異性は保持するものの、患者において親ＭＮ１４マウスモノクローナル抗体よりも免疫原性が小さいヒト化マウスｍＡｂが提供される。
【００１２】
特に好ましい態様においては、このヒト化抗体の軽鎖可変領域は下記式で特徴付けられる。ＦＲL1−ＣＤＲL1−ＦＲL2−ＣＤＲL2−ＦＲL3−ＣＤＲL3−ＦＲL4ここで、ＦＲの各々は個別にヒト抗体のフレームワーク領域であり、かつＣＤＲの各々は個別にＭＮ１４の軽鎖の相補性決定領域にあり、及び下付文字は軽「Ｌ」）鎖領域を指す。
【００１３】
重鎖可変領域は下記式で特徴付けられる。
ＦＲH1−ＣＤＲH1−ＦＲH2−ＣＤＲH2−ＦＲH3−ＣＤＲH3−ＦＲH4ここで、ＦＲ及びＣＤＲは上と同じ意味を有し、かつ下付文字「Ｈ」は重鎖領域を指す。）
【００１４】
態様の１つにおいて、ＣＤＲL1はアミノ酸配列  ＫＡＳＱＤ  ＶＧＴＳＶＡ（配列番号２０）を有し、ＣＤＲL2はアミノ酸配列  ＷＴＳＴＲ  ＨＴ（配列番号２１）を有し、ＣＤＲL3はアミノ酸配列  ＱＱＹＳＬ  ＹＲＳ（配列番号２２）を有し、ＣＤＲH1はアミノ酸配列  ＴＹＷＭＳ（配列番号２３）を有し、ＣＤＲH2はアミノ酸配列  ＥＩＨＰ  ＤＳＳＴＩ  ＮＹＡＰＳ  ＬＫＤ（配列番号２４）を有し、ＣＤＲH3はアミノ酸配列  ＬＹＦＧＦ  ＰＷＦＡＹ（配列番号２５）を有する。
【００１５】
他の態様において、ＦＲL1はアミノ酸配列  ＤＩＱＬＴ  ＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶ  ＧＤＲＶＴ  ＩＴＣ（配列番号２６）を有し、ＦＲL2はアミノ酸配列  ＷＹＱＱＫ  ＰＧＫＡＰ  ＫＬＬＩＹ（配列番号２７）を有し、ＦＲL3はアミノ酸配列  ＧＶＰ（Ｓ又はＤ）Ｆ  ＳＧＳ（Ｇ又はＶ）Ｓ  ＧＴＤＦＴ  ＦＴＩＳＳ  ＬＱＰＥＤ  ＩＡＴＹＹ  Ｖ（配列番号２８）を有し、ＦＲL4はアミノ酸配列  ＦＧＱＧＴ  ＫＶＩＥＫ（配列番号２９）を有し、ＦＲH1はアミノ酸配列  ＥＶＱＬＶ  ＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧ  ＲＳＬＲＬ  ＳＣＳＳＳ  ＧＦＤＦＴ（配列番号３０）、ＥＶＱＬＶ  ＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧ  ＲＳＬＲＬ  ＳＣＳＡＳ  ＧＦＤＦＴ（配列番号３１）又はＱＶＱＬＱ  ＥＳＧＰＧ  ＬＶＲＰＳ  ＱＴＬＳＬ  ＴＣＴＳＳ  ＧＦＤＦＴ（配列番号３２）を有し、ＦＲH2はアミノ酸配列  ＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬ  ＥＷＶＡ（配列番号３３）、ＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬ  ＥＷＩＡ（配列番号３４）、又はＷＶＲＱＰ  ＰＧＲＧＬ  ＥＷＩＡ（配列番号３５）を有し、ＦＲH3はアミノ酸配列  ＲＦＴＩＳ  ＲＤＮＳＫ  ＮＴＬＦＬ  ＱＭＤＳＬ  ＲＰＥＤＴ  ＧＶＹＦＣ  ＡＳ（配列番号３６）、ＲＦＴＩＳ  ＲＤＮＡＫ  ＮＴＬＦＬ  ＱＭＤＳＬ  ＲＰＥＤＴ  ＧＶＹＦＣ  ＡＳ（配列番号３７）、又はＲＶＴＭＬ  ＲＤＴＳＫ  ＮＧＳＦＬ  ＲＬＳＳＶ  ＴＡＡＤＴ  ＡＶＹＹＣ  ＡＳ（配列番号３８）を有し、ＦＲH4はアミノ酸配列  ＷＧＱＧＴ  ＰＶＴＶＳ  Ｓ（配列番号３９）、又はＷＧＱＧＴ  ＴＶＴＶＳ  Ｓ（配列番号４０）を有し、以上において、Ｃはスルフィドリル又はジスルフィドの形であってもよい。
【００１６】
別の好ましい態様は、クラスIII、抗ＣＥＡヒト化ｍＡｂと複合体を形成する診断又は治療剤を包含する。ここで、このクラスIII、抗ＣＥＡヒト化ｍＡｂにおいて、この抗体のＣＤＲはＭＮ１４マウスｍＡｂのＣＤＲに由来し、ＦＲは異種（ヒト）抗体のＦＲに由来し、この複合体はＭＮ１４のクラスIII、抗ＣＥＡ結合特異性を保持するものの、ヒトにおいてマウスＭＮ１４よりも免疫原性が小さい。そのような態様の１つにおいては、その軽鎖及び重鎖可変領域は上に示される通りに特徴付けられ、かつ同様に上に説明されるアミノ酸配列を有する。
【００１７】
さらに別の好ましい態様において、患者の診断又は治療方法が、前述の好ましい態様の複合体を適当な投与計画の下に投与するステップを含む。
【００１８】
別の好ましい態様は、上述のヒト化抗体の軽鎖、重鎖またはその両鎖をコードする単離精製ＤＮＡを含む。
別の好ましい態様は、上述のＣＤＲ及びＦＲのＤＮＡ配列を含む。
【００１９】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１（配列番号１及び配列番号２）は、マウスＮＥＷＭ  ＭＮ１４可変領域重鎖（「ＶＨ」）のコンセンサスＤＮＡ配列及びそのタンパク質翻訳産物を示す。ＣＤＲは四角で囲まれている。
【図２】図２（配列番号３及び配列番号４）は、マウスＭＮ１４可変領域軽鎖（「ＶＫ」）のコンセンサスＤＮＡ配列及びそのタンパク質翻訳産物を示す。ＣＤＲはボックスで囲まれている。
【図３】図３は、キメラもしくはヒト化ＭＮ１４の重鎖遺伝子の発現のためのベクターを示す。この模式図は、キメラ及び再構成重鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子の両者並びにｐＳＶｇｐｔ発現ベクターを示す。「キメラ」と表示されている最初の図は、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードするＤＮＡに連結したＭＮ１４マウスＶＨ領域をコードするＤＮＡを示すマップである。このＭＮ１４  ＶＨ領域において、３つの黒い領域により３つのＣＤＲが示されている。ＦＲは、４つの点で埋めた領域で示されている。「再構成」と表示されている真中の図は、マウスＦＲが、「ヒト」ＶＨ領域で４つの白抜き領域によって示されるヒトＦＲで置換されているＭＮ１４  ＶＨ領域のヒト化を示す。下方に示される発現ベクターｐＳＶｇｐｔの円形マップは、Ｉｇｈエンハンサー要素のすぐ下流の、再構成ＭＮ１４抗体遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ挿入部位を示す。また、このマップは、増殖のための大腸菌における複製起点（ｃｏｌＥｌ  ｏｒｉ）及び哺乳動物細胞における複製起点（ＳＶ４０プロモーター領域）、並びにこのベクターで形質転換されている細菌を培養するための選択マーカー（Ａｐｒ）及び哺乳動物細胞を培養するための選択マーカー（ｇｐｔ）をコードする遺伝子を含むこのベクター内の重要な機能的ドメインの幾つかも示す。この場合の抗体遺伝子の発現は、この抗体遺伝子のマップでＨｉｎｄＩＩＩ部位の近傍に黒塗りの丸で示されるＩｇプロモーターを介在する。
【図４】図４は、キメラもしくはヒト化ＭＮ１４κ鎖遺伝子の発現のためのベクターを示す。この図は、キメラ及び再構成ＭＮ１４κ軽鎖遺伝子及びｐＳＶｈｙｇ発現ベクターを示す。「キメラ」と表示される最初の図は、ヒトκ定常（「ＣＫ」）領域をコードするＤＮＡに結合するＭＮ１４マウスκ軽鎖可変領域領域（「ＶＫ」）をコードするＤＮＡを示すマップである。このマウスＶＫ領域において、３つのＣＤＲが３つの黒い領域で示され、ＦＲが４つの点で埋められている領域で示されている。「再構成」と表示される真中の図は、マウスＦＲが、「ヒト」ＶＫ領域において４つの白抜きの領域で示されるヒトＦＲで置換されているＭＮ１４  ＶＫ領域のヒト化を示す。最後の発現ベクターｐＳＶｈｙｇの円形マップは、Ｉｇｈエンハンサー要素のすぐ下流の再構成ＭＮ１４抗体遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ挿入部位を示す。このマップは、大腸菌増殖のための複製起点（ｃｏｌ  Ｅｌ  ｏｒｉ）及び哺乳動物細胞の増殖のための複製起点（ＳＶ４０プロモーター領域）、並びにこのベクターで形質転換されている細菌を培養するための選択マーカー（Ａｐｒ）及び哺乳動物細胞を培養するための選択マーカー（ｇｐｔ）をコードする遺伝子を含むこのベクター内の重要な機能的ドメインの幾つかも示す。この場合の抗体遺伝子の発現には、この抗体遺伝子のマップのＨｉｎｄＩＩＩ部位の近傍で黒塗りの丸で図示されるＩｇプロモーターが介在する。
【図５】図５は、マウスＭＮ１４可変領域（配列番号２及び配列番号４）の配列を、ヒト可変領域ＮＥＷＭ  ＶＨ（配列番号５）及びＲＥＩ  ＶＫ（配列番号６）と共に（図５Ａ）、並びにヒトＫＯＬ  ＶＨ領域（配列番号７）と共に（図５Ｂ）示す。ＣＤＲはボックスで囲まれ、このヒト化ＶＨに組込まれているマウスＶＨ  ＦＲは、Kabat, et al.SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,U.S.Government Printing Office,Washington,D.C.,1987のナンバリング・システムに従ってそれらの位置が印付けられている。ＫＬＨｕＶＨに含まれていたＣＤＲ外のマウスの残基は、黒丸で示されている。
【図６】図６は、マウスＭＮ１４  ＶＨフレームワーク領域（ＦＲ）（配列番号２）とヒト化ＭＮ１４  ＶＨフレームワーク領域（配列番号５、８〜１１、７及び１２〜１５）との間のアミノ酸配列の比較を示す。マウスと異なるヒトＦＲ残基のみが示されている。また、ＮＥＷＭ及びＫＯＬのＣＤＡも示されていない。それぞれのＦＲにおけるアミノ酸置換の領域が太字で強調され、その置換の位置がＫａｂａｔらのナンバリング・システムに従って示されている。３番目のＣＤＲが、ボックスで囲まれている。
【図７】図７は、ＭＮ１４  ＨｕＶＨ領域のＤＮＡ配列とそれに対応するアミノ酸配列（配列番号１６及び配列番号１７）を示す。ＣＤＲはボックスで囲まれている。
【図８】図８は、ＭＮ１４  ＨｕＶＫ領域のＤＮＡ配列とそれに対応するアミノ酸配列（配列番号１８及び配列番号１９）を示す。ＣＤＲはボックスで囲まれている。
【図９】図９は、（−○−）ＫＬＨｕＶＨ／ＨｕＶＫ、（−黒四角−）ＫＬＨｕＶＨＡＩＧ／ＨｕＶＫ、（−●−）ＫＬＨｕＶＫＡＩＧＡＹ／ＨｕＶＫ、（−□−）ＫＬＨｕＶＨＡＩＧＡ／ＨｕＶＫ、（−黒三角−）キメラ対照、及び（−△−）マウス対照を含むＫＬＨｕＶＨ変異体の相対結合親和性を比較する、ＭＮ１４の遮断（すなわち、競合）検定のグラフである。
【図１０】図１０は、ｈＭＮ１４を（ＦＲ１領域でグリコシル化されている）ＨＭＮ１４−ＮＶＴと比較する、ＭＮ１４遮断検定を示す。
【図１１】図１１は、結腸ガン患者に131Ｉ標識ｈＭＮ１４ＩｇＧ（左パネル）又はｍＭＮ１４ＩｇＧ（右パネル）を投与した後の、その患者の腹部のラジオオートグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
用語の説明
本出願においては、以下の用語又は略語が用いられる。この用語集に記される意味は、説明のためのみである。これらの用語の完全な意味は、当該技術分野の熟練者には明らかである。
【００２２】
「ＣＤＲ」は、相補性決定領域に対する略語として用いられる。これらは、主として、しかしながら他の可能性を除くわけではないが、抗原抗体結合の原因である、抗体の可変領域内の領域である。
【００２３】
「ＦＲ」は、フレームワーク領域に対する略語である。広く言えば、これらは、抗体の可変領域の、ＣＤＲに隣接し、もしくは並列する部分である。一般には、これらの領域は、その可変領域の立体配座に影響を与え、そのフレームワーク領域が抗体と抗原との相互作用に影響を及ぼし得るにもかかわらず、抗体への抗原の特異的結合の直接の原因とはほとんどならない多くの構造上の機能を有する。
【００２４】
「キメラ」は、その可変領域がマウス抗体に由来し、その定常領域が異種（別）の種の抗体に由来する抗体を指す。
【００２５】
「ヒト化」は、上に定義されるキメラ抗体ではあるが、ＦＲ可変領域がヒト抗体に由来するものを指す。
【００２６】
「ＨＡＨＡ」は、ヒト化マウス抗体に対するヒト抗体を指す。
「ＣＥＡ」は、内胚葉起源の消化器系上皮のほとんどのアデノカルシノーマ並びに乳ガン及び非小細胞肺ガンのような他のガンにおいて発現する１８０ｋＤａ糖タンパク質であるガン胎児性抗原を指す。
【００２７】
接頭辞としての「ｈ」という文字は、「ヒト化」を意味する。
他の略語は、Roitt et al., IMMUNOLOGY, 3rd ed. Mosby Year Book Europe Ltd. (1993)に従って用いられる。この文献は、引用することにより本明細書にそのまま組込まれる。
【００２８】
本明細書の開示において用いられるこれらの用語及び他の用語は、本発明が属する技術分野において通常用いられるものと同じ意味で用いられる。
【００２９】
過去に、ＭＮ１４のＣＥＡ結合特性を有する有効な非ＨＡＭＡ誘発性の抗ＣＥＡ抗体を開発することには失敗しているが、ＭＮ１４  ｍＡｂのＣＤＲをヒト抗体のＦＲに移植して、ＨＡＭＡの誘発が低下され、かつエフェクター活性が増大されていながら、ＭＮ１４の抗ＣＥＡ  ｍＡｂの抗原結合特性を有する抗体及び抗体誘導試薬を得ることが可能であることが見出されている。
【００３０】
マウス抗ＣＥＡのＩｇＧ１モノクローナル抗体ＭＮ１４、及びその生成は、以前に説明されている。Hansen et al., Cancer, 71:3478 (1993)、Primus et al.,米国特許第4,818,709号を参照。ＭＮ１４はクラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体の基準の全てを満たし、ＥＩＡで胎便と非反応性であり、かつ通常の組織とは反応しない。
【００３１】
遮断解析は、Hansen et al., 1993 上記、Losman et al., Int. Cancer, 56:580 (1994)、Hansen et al., Clin. Chem., 35:146 (1989)に従って行う。ＣＥＡの定量にこれらの参考文献に記述されるものと同じ条件を用いて、標識ＭＮ１４プローブに対するヒト化ＭＮ１４の結合を評価することができる。典型的なプローブは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に複合しているＭＮ１４である。標識及び非標識ＭＮ１４の両者を、マイクロタイタープレートのウェルのような固体支持体に固定されているＣＥＡ試料に加える。ＣＥＡに対する標識ＭＮ１４の結合の「遮断」の程度は、非標識ＭＮ１４の活性の直接の反映である。標準ＭＮ１４を用いて、ヒト化ＭＮ１４又はそれらの誘導体の未知試料の相対活性を決定することができる。典型的には、この反応はマイクロタイタープレートのウェルにおいて行われる。例えば２５μｇ／ウェルのレベルでこのウェルをＣＥＡで直接満たされ、又は間接的に満たされる。間接的に満たされる場合には、ＣＥＡと反応はするがＭＮ１４が相互作用するものとは異なるエピトープに反応する抗体が予め満たされている。このような抗体は、ＭＮ１５  ｍＡｂであってもよい。その後、ＣＥＡを間接的にそのウェルに固定することができる。次に、そのような満たされたプレートを用いて、競合結合ＥＩＡ検定を行うことができる。
【００３２】
前述のＨＲＰ標識ｍＡｂの代わりに、抗体を、通常、例えば131Ｉを用いて、クロラミンＴ法により、約１０ｍＣｉ／μｇの比活性まで放射ヨウ素化することが可能であり、遊離した放射性同位体はアクリルアミドゲルカラムでのクロマトグラフィーにより除去する（上記Hansen et al., 1993を参照）。
【００３３】
本明細書に説明される発明の実施に適切な分子生物学上の技術も、当該技術分野における熟練者には公知である。適切な技術は、とりわけ、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1987, 1988, 1989)（これらは、引用することにより、本明細書に補遺を含むそれら全体を組込むものとする）を含む多くのマニュアルや主要な刊行物に記述されている。
【００３４】
本明細書に開示されるＭＮ１４軽鎖及び重鎖ＣＤＲ及び修飾したＭＮ１４のＣＤＲは、上記参考文献に記述されているもののような公知の組換え技術を用いて、他の抗体に組込むことができる。
【００３５】
この目的に適切な具体的な方法は、下記例に示されている。本明細書に説明されるアミノ酸配列に基づいて、ＭＮ１４のＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチドを合成することができる。本明細書に説明されるアミノ酸配列を正確にコードするものに加えて、修飾ＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチドを作製することもできる。また、このオリゴヌクレオチドは、ＭＮ１４のＣＤＲのものに加えて、例えばクローニングを容易にするヌクレオチドを有していてもよい。オリゴヌクレオチドの合成技術は公知であり、多くの製造者から入手可能な自動装置で行うことができる。さらに、あらゆる特定の配列のオリゴヌクレオチドを購入することができる。
【００３６】
ＭＮ１４のＣＤＲ及び／又は特定のＦＲ残基をコードするオリゴヌクレオチド又はそれらの相補鎖に相当するオリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチドの末端、一般的には１２ヌクレオチドがテンプレートＤＮＡに完全にアニーリングするように設計されているという条件の下で、部位指向性突然変異誘発によるＶＨ又はＶＫ  ＤＮＡへのこれらの残基のコドンの導入に用いることができる。このテンプレートＤＮＡは、典型的には、必須ＦＲをコードする可変領域ＤＮＡを坦持するＭ１３ベクターに表される一本鎖ＤＮＡである。方法の１つにおいて、変異誘発性オリゴヌクレオチドをそれらの５’末端でリン酸化し、５’から可変領域ＤＮＡへの伸長を誘発するオリゴヌクレオチドと一緒に、このｓｓＤＮＡテンプレートにアニーリングする。このオリゴヌクレオチドを、Ｔ７ポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼによって一緒に連結する断片を用いて伸長させ、可変領域全体を包含する完全な変異鎖を得る。この変異鎖をテンプレートとして用い、熱サイクル反応においてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて適切なプライマーからその相補鎖の複数のコピーを合成することができる。変異鎖がこのように選択的に増幅されると、通常のＰＣＲにより、クローニング、配列決定及び発現のためにＤＮＡを増幅することが可能である。
【００３７】
抗体をコードしている適切なＤＮＡが開示により本明細書に示されるが、事実上、そのようなＤＮＡのあらゆるものが含まれる。様々なヒト抗体遺伝子が、公的に利用可能な寄託の形態で利用することができる。抗体及び抗体をコードしている遺伝子の多くの配列が公開されており、上述のように適切な抗体遺伝子をこれらの配列から合成することができる。
【００３８】
本発明の範囲には、本明細書に説明されるＤＮＡ配列の対立遺伝子、変種及び変異が含まれる。
【００３９】
本開示によるＣＤＲ移植は、確立されている技術を用いて行うことができる。抗体産生細胞系は、熟練技術者に公知の技術を用いて選択し、かつ培養することができる。そのような技術は、様々な実験マニュアル及び主要な刊行物に記述されている。例えば、以下に記述されるような本発明での使用に適する技術は、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)に記述されておる。この文献は引用することにより補遺を含むその全体が本明細書に組込まれる。
【００４０】
ＲＮＡは、元のハイブリドーマ細胞から、グアニジニウムイソチオシアネート抽出及び沈殿と、それに続く遠心もしくはクロマトグラフィーのような標準技術により、単離することができる。所望であれば、オリゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィーのような標準技術により、ｍＲＮＡを全ＲＮＡから単離することができる。これらの目的に適する技術は、前述の参考文献に記述されるように、当該技術分野において公知である。
【００４１】
抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、公知の方法に従って逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを用いて、同時に又は別々に作製することができる。これは、コンセンサス定常領域プライマーで、あるいは公開されている重鎖及び軽鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーで開始することができる。
【００４２】
抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンの単離にＰＣＲを用いることもできる。この場合、コンセンサスプライマー、又はマウスコンセンサス領域プローブのようなより大きな同種プローブでライブラリーをスクリーニングすることが可能である。必要な技術は当該技術分野における熟練者に公知であり、前述のSambrook及びAusubelの参考文献に説明されており、かつ以下に述べられる例により説明される。
【００４３】
抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、ＣＤＲを単離する前に、あらゆる適切な宿主のあらゆる適切なベクターにおいて増殖させることができる。以下の例に説明されるように、このクローンは、しばしば、この目的のために、大腸菌内で最も都合よく増殖される。しかしながら、熟練者に公知の他の様々なベクター及び宿主細胞を本発明のこの側面において有利に用いることができる。そのようなベクターの様々なものが前述の参考文献に説明されている。
【００４４】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡを、組換えＤＮＡ技術に関連する前述の参考文献に詳細に説明されている標準の公知技術に従い、細胞から単離し、制限地図を作製し、かつ配列決定することができる。
【００４５】
ベクターにより抗体重鎖及び軽鎖並びにそれらの断片をコードするＤＮＡを、キメラ及びＣＤＲを移植したヒト化ＭＮ１４抗体の構築に用いることができる。
【００４６】
ＭＮ１４の抗ＣＥＡ  ｍＡｂのＣＤＲが本明細書で同定され、説明され、かつ図１及び図２（それぞれ、配列番号２及び配列番号４）に示されている。これらの配列を用いて、ＭＮ１４重鎖及び軽鎖のＣＤＲを本発明で用いるために合成することができる。天然資源からＭＮ１４のＣＤＲを再クローニングする必要はない。そのＤＮＡ及びアミノ酸配列は本明細書に示されている。本発明のこの側面に適するオリゴヌクレオチド合成技術は熟練技術者に公知であり、幾つかの市販されている自動合成器のあらゆるものを用いて行うことができる。加えて、本明細書に説明されるＣＤＲをコードするＤＮＡは、商業ＤＮＡ合成販売者のサービスにより得ることができる。
【００４７】
本発明のこの側面によって合成されるポリヌクレオチドには、ＭＮ１４のＣＤＲを構成するものに加えて、このＣＤＲに由来するものではないものも含まれ得る。異種からのＦＲへのこのＣＤＲの結合を容易にするさらなる塩基を含んでいてもよい。この目的のために、制限部位又はオーバーラップした相補的な領域を含むこともできる。短い重複一本鎖ＤＮＡからの長い二本鎖ＤＮＡの合成は当該技術分野における熟練者に公知である。同様に、平滑末端ＤＮＡ及び少なくとも部分的に重複する相補的な末端を有するものを含むＤＮＡの末端間結合は公知である。これらの技術は、例えば、組換えＤＮＡ技術に関する前述の参考文献に説明されている。
【００４８】
また、ＭＮ１４重鎖及び軽鎖のＣＤＲも、特にはキメラもしくはヒト化抗体に組込んだ後に、クローニングしたＤＮＡ又はＲＮＡ、もしくは合成ＤＮＡ又はＲＮＡにおける塩基の削除、挿入及び変更を行うための公知の組換えＤＮＡ技術を用いて、修飾することが可能である。この目的に適切な部位特異的突然変異誘発技術は当該技術分野における熟練者に公知であり、組換えＤＮＡ技術に関する前述の参考文献に説明されている。また、削除及び挿入技術も説明されている。これらの方法は、例えば、ＭＮ１４のＣＤＲをコードするポリヌクレオチド又はクローニングした重鎖もしくは軽鎖遺伝子の他の領域への所望の変更の導入に用いることができる。
【００４９】
本発明に従い、ＭＮ１４のＣＤＲ及び修飾ＭＮ１４のＣＤＲをＦＲのあらゆるセットに実用的に導入することができる。これに関して、ポリヌクレオチドをクローニングし、操作する様々な公知の技術を効果的に使用できることを当該技術分野における熟練者は予期するであろう。このような技術は、前述の組換えＤＮＡに関連する参考文献に説明される方法によって示されている。
【００５０】
本発明の特に好ましい態様において、ＭＮ１４のＣＤＲがヒト抗体に移植される。この文脈において、ヒト抗体は、ヒト体内に生じるあらゆる抗体又は、幾つかの点において、ヒト免疫系と適合し得るように設計されている加工抗体を指すことは理解されるであろう。この目的のためには、広くは、患者において不利な免疫応答を引き起こすことがない抗体が特に好ましい。より具体的には、「ヒト抗体」という表現は、ヒト体内において実際に生じる遺伝子、又はそれらの対立遺伝子、変種もしくは変異体によってコードされる抗体を意味することが意図されている。
【００５１】
いったんＭＮ１４に由来するＣＤＲを移植された抗体をコードするＤＮＡが、ＭＮ１４のＶＨ及びＶＫ領域ＤＮＡ及び、それらにより形成されるヒト定常ドメインの軽鎖及び重鎖の各々と結合する可変領域から構築されると、通常の技術により、それを増殖及び発現のためのベクターに挿入することが可能である。この方法で、所望の量の抗体を得ることができる。
【００５２】
このＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト抗体は、造影化合物又は同位体と結合するこのヒト化抗体又はそれらのＦａｂ’を被検体に投与することにより、造影用途に用いることができる。
【００５３】
造影のためには、通常の方法を用いて、この抗体を標識に複合する。このような通常の方法には、１）抗体タンパク質又はそれらの断片の直接放射性ヨウ素化又は２）抗体又はそれらの断片への金属性核種の直接付着（例えば、Hansen et al., Cancer, 73: 761 (1994)を参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。様々な診断用及び治療用金属の抗体又はそれらの断片への結合に用いることができる二官能性キレートの使用も本発明の範囲内にある(Antibodies in Radiodiagnosis and Therapy, ed. M. R. Zalutsky, 1989, CRC Press, Boca Raton, FL、及びCancer Therapy with Radiolabeled Antibodies, ed. D. M. Goldenberg, 1994, CRC Press, Boca Raton, FLを参照）。複合手順及び生成物の特徴付けに続いて、ヒト患者において使用するための診断用組成物の生成に適する優良製造規範(Good Manufacturing procedures、「ＧＭＰ」）に合致する条件下において、十分に標識された複合体を均質に精製する。
【００５４】
ＭＮ１４のＣＤＲを移植された抗体及びこの複合体の造影剤部分との血清抗体の反応は、複合体の投与の前に得られた対照血清の反応を含めて、その診断手順の過程の全てにわたって決定することができる。同様の決定は、ＭＮ１４それ自体の類似の複合体で処置されている他の患者においても行われる。これらの試験によって検出される、ＣＤＲを移植されたＭＮ１４ヒト抗体と反応する血清抗体は、マウスＭＮ１４含有複合体で処置されている患者において複合体の抗体部分と反応する抗体ではほとんどあり得ない。
【００５５】
アミノデキストランに、及びホウ素に複合するヒト化ＭＮ１４抗体は、診断用途に用いることができる。アミノデキストラン−ホウ素付加物に複合するためのＭＮ１４及びＣＤＲを移植されたＭＮ１４抗体は、上に説明されるように調製することができる。アミノデキストラン−ホウ素付加物は、適切なホウ素ケージ化合物（例えば、アミノデキストラン官能基で適切に誘導形成されている１２−ホウ素炭酸塩）の反応により調製することができる。好ましい態様においては、アミノデキストランを過剰のハロアセチル酸エステル又は（無水ヨード酢酸のような）無水物と反応させ、それにより、通常、反応条件及びアミノデキストランのサイズに応じて１０〜１０００基の範囲をとる、所望の数のハロアセチル基を有するアミノデキストランを生成させる。メルカプトカルボランＢ１２のような適切なホウ素誘導体を、所望のモル過剰で、アルキル化反応により、ハロアセチル−アミノデキストランと反応させる。好ましい態様においては、ホウ素化ハロアセチルアミノデキストラン上の多数のハロアセチル基が未反応のまま残り、この付加物をタンパク質のチオール基に付着させるための「ハンドル」として用いることが可能である。
【００５６】
ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト化抗体及びそれらの誘導体は、それらの免疫原性の低下により、治療において、血清疾患もしくはアナフィラキーショックのような望まれない免疫反応を伴うことのない受動免疫、上述のような腫瘍の位置測定及びin vivo造影、活性作用物質の局部濃度が重要な因子である疾患細胞の特定の処置、例えば、細胞毒、免疫調節剤もしくは他の薬学的に活性な分子の部位指向性送達等に有用であり、それらにより、これらのヒト化抗体の実用上の用途が確立される。上述のように、in vivo造影のためには、ヒト化したＣＤＲ移植ＭＮ１４モノクローナル抗体を放射性標識し、又は放射性核種、例えばヨウ素、イットリウム、テクネチウム等と複合体を形成する金属キレート剤と複合させ、一次及び転移性ＣＥＡ腫瘍の検出に放射性走査技術を用いることができる。この目的のため、この放射性抗体を、例えば静脈内に、注射し、ガンマ造影機を用いて規則的な間隔で患者を走査する。ＣＥＡを発現する腫瘍は他の組織よりも多くの放射性抗体を取り込み、造影カメラにより容易に認識される。131Ｉで標識されているモノクローナル抗体が、優先的に、体重ｋｇ当り１５〜３０μＣｉに相当する３〜１０μｇの量で用いられる。細胞障害作用物質を用いる治療のためには、この抗体を、ドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、リシンＡ、放射性原子、毒性作用物質のような様々な既知の治療剤に複合させ、そのような複合体を薬学的に許容し得る無菌担体中に処方し、その製剤を通常の手段により投与する。治療上の投与量は、これらの技術分野における平均的な技量を有する利用者により、通常通りに、容易に決定することができる。哺乳動物の治療用量は、患者の状態及び投与様式に応じて、モノクローナル抗体自体については体重ｋｇ当り約１ｍｇ〜５ｍｇ、細胞障害薬剤との複合体については体重ｋｇ当り０．１ｍｇ〜５ｍｇである。あるいは、ＣＥＡが存在するガン細胞を被験者から除去するために、このヒト化抗体を、宿主の免疫系の要素、例えば補体系もしくは細胞介在応答と組み合わせて用いることができる。患者の免疫応答は、先行する方法により監視することができる。放射性造影及び治療のためのさらなる手順については、EP 0 323,806号、Hansen et al., Cancer 71: 3478-85 (1993)、及び米国特許第4,818,709号並びにそれらに含まれるを参考文献を参照のこと。これらの全ては引用することにより本明細書に組込まれる。
【００５７】
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1989に記述されるもののような非経口投与のための医薬調製品が好ましい。最終調製品は、０．０１％〜５０％の活性成分を含有する。このような複合体の製造方法及び診断及び治療におけるそれらの使用は、例えば、Shih et al., 米国特許第5,057,313号、Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832 (1988)、同時継続中の同一出願人による米国特許出願第08/162,912号、及びMcKearn et al., 米国特許第5,156,840号に示されており、それらの内容は引用することにより本明細書に組込まれる。
【００５８】
上述のように、治療のためには、ヒト化抗体複合体及び薬学的に許容し得る担体を治療上有効な量で患者に投与する。投与される量が生理学的に意味のあるものである場合、複合体と薬学的に許容し得る担体との組み合わせは、「治療上有効な量」で投与されると言われる。ある作用物質が存在することで、投与される患者の生理状態に検出可能な変化を生じる場合、その作用物質は「生理学的に意味がある」。標的とされる治療剤は、等価の非標的作用物質を全身投与したときに、それが投与された用量のより高い割合を目的の標的に送達し、その標的に付着する場合、「治療上有効」である。
【００５９】
治療上有効であるためには、複合体及び担体は、他の治療剤と組み合わせるか、又はより広範な治療投薬計画の一部として投与することが必要となることがある。現在、組み合わせ治療アプローチで用いられる場合に標的治療剤の効果がしばしば大きく増大し得るという意見が医師らの間にはある。例えば、単独で用いられた場合重度の血液毒性を引き起こすＢ細胞リンパ腫の高用量の放射免疫治療は、自己骨髄再注入と組み合わせて用いた場合、非常に効果的であることが示されている。Press et al., “Treatment of Relapsed B Cell Lymphomas with High Dose Radioimmunotherapy and Bone Marrow Transplantation" in CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, ed. (CRC Press, Boca Raton, 1994) ch. 17参照。別の例においては、腫瘍が予備照射されている場合、腫瘍による放射標識抗体の取り込みの５倍の増強が観察される。Leichner et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 14: 1033 (1987)参照。放射免疫治療の臨床上の効力を改善する潜在力を有することが示されている機構が、DeNardo et al., “Overview of Obstacles and Opportunities for Radioimmunotherapy of Cancer" in CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, Ed. (CRC Press, Boca Raton, 1994) ch. 11にも論じられている。用量制限副作用の研究並びに標的の狙い付け、取り込み及び有益な副作用の増強及び増幅に加えて、そのような組み合わせプロトコルを開発する方法はこの分野における熟練臨床技術者に公知であり、開発に過度の実験を必要としない。
【００６０】
診断及び治療剤とのヒト化ＭＮ１４の複合体を用いるin vivoでの実験は、動物モデル及びヒト患者で実施されている（以下の例１１を参照）。ＣＤＲを移植されたヒト化抗体複合体は、良好な治療上のプロフィールを示し、親であるＭＮ１４抗体複合体よりも長い治療投与計画で用いることが可能であった。ＣＤＲを移植された抗体複合体は、対照マウス抗体複合体よりも治療効果が良好であり、有害な副作用が少なかった。
【００６１】
例えば、誘導体形成の目的で、上記Shih et al.によって記述される方法を用い、炭水化物ヒドロキシル基を用いて、この抗体をアミノデキストラン結合メトトレキセートと共有結合により複合体を形成させた。免疫活性に対する抗体炭水化物基の寄与を決定するため、哺乳動物細胞において遮断遺伝子が発現する前にグリコシル化部位、ＮＶＴを導入するように、ｈＭＮ１４（接頭辞「ｈ」は「ヒト化」を意味することが意図されている）のＶＫ  ＦＲ１領域の１８〜２０位に変異を導入することができる。遮断細胞結合検定におけるｈＭＮ１４抗体と変異ｈＭＮ１４−ＮＴＶとの比較（図８）は、１８位の炭水化物部分にはこのヒト化抗体の免疫反応性に対する影響がないことを示している。
【００６２】
平均分子量４０ｋＤａのアミノデキストランをＮａＩＯ４で酸化して（ヒドロキシル基の酸化により）アルデヒドを形成する。反応条件及びタイミングを注意深く制御することにより、アミノデキストランのモル当たり約５０〜１５０モルのアルデヒド基が導入される。次に、このアルデヒドを過剰の１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンと反応させ、実質的に全てのアルデヒドとシッフ塩基を形成させる。次いで、このシッフ塩基を過剰のＮａＢＨ４で処理することにより還元する。その後、このアミン誘導デキストランをゲル排除クロマトグラフィーにより精製する。
【００６３】
細胞障害性薬剤メトトレキセート（ＭＴＸ）は、ジメチルホルムアミド中で、ジシクロカルボジアミドで処理し、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより活性化する。活性化されたＭＴＸを、水溶液中において、５０：１の比でアミノ誘導デキストランと混合する。この生成物から、精製後に、モル当たり約３５ＭＴＸモルを有するＭＴＸ誘導デキストランが得られる。このように得られたＭＴＸ付加物を、前出のShih et al.に記述される方法を用いて、ＭＮ１４のＣＤＲを移植された抗体に結合させる。例えば、抗体の炭水化物を酸化し、得られたアルデヒドを付加物中のデキストランの残留アミンと反応させる。それにより得られたシッフ塩基産物を、抗体の１０倍モル過剰のシアノホウ水素化ナトリウムで処理することにより還元する。この還元抗体−デキストラン−ＭＴＸ産物を検定の前に完全に精製し、患者に投与するために処方する。
【００６４】
対照として、同じ方法で、親ＭＮ１４抗体をデキストラン−ＭＴＸに結合させる。
【００６５】
このＣＤＲを移植された精製した抗体複合体は、ＣＥＡ産生ガンを有する患者に投与することができる（上を参照）。この治療に対する副作用、特に患者の免疫系が介在するものを含む応答を監視する。このＣＤＲを移植された抗体複合体で治療した患者は、治療結果の改善、その作用物質に対する免疫応答の減少及び治療の免疫介在有害作用の顕著な減少を示す。このＣＤＲを移植された抗体複合体を用いる治療は、親マウスＭＮ１４抗体を用いるものより高い投与量で、かつより長い期間行うことが可能であり、より積極的な治療と応答の改善を可能にする。
【００６６】
本発明を、以下の説明のための例を参照することによりさらに説明する。ＭＮ−１４軽鎖及び重鎖遺伝子をコードするＤＮＡクローンの単離に関する技術が、産生細胞からのあらゆる抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子の単離に有用なクローニング技術によって説明されることは、予期されるであろう。配列が開示されているので、本発明を実施するためにＭＮ１４重鎖及び軽鎖遺伝子を再単離する必要はない。
【００６７】
この詳細な説明及び具体的な例は、本発明の好ましい態様を示すものではあるが、説明のためだけに示されるものであることは理解されるべきである。これは、本発明の精神及び範囲内にある様々な変更および変形が、以下の説明のための記述から、当該技術分野における熟練者に明らかとなるためである。
【００６８】
実施態様例
以下は、本発明の実施態様例である。
１．親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体由来の軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）の各々とを含むヒト化モノクローナル抗体またはその断片であって、該ヒト化抗体は、該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の特異性を保持するものの、ヒト患者において該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体よりも免疫原性が小さく、該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲが、ＫＡＳＱＤ  ＶＧＴＳＶ  Ａ（配列番号２０）を含むＣＤＲL1と、ＷＴＳＴＲ  ＨＴ（配列番号２１）を含むＣＤＲL2と、ＱＱＹＳＬ  ＹＲＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲL3とを含んでなり、該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の重鎖可変領域のＣＤＲが、ＴＹＷＭＳ（配列番号２３）を含むＣＤＲH1と、ＥＩＨＰＤ  ＳＳＴＩＮ  ＹＡＰＳＬ  ＫＤ（配列番号２４）を含むＣＤＲH2と、ＬＹＦＧＦ  ＰＷＦＡＹ（配列番号２５）を含むＣＤＲH3とを含んでなることを特徴とするヒト化モノクローナル抗体またはその断片。
【００６９】
２．（ａ）軽鎖可変領域が、式ＦＲL1−ＣＤＲL1−ＦＲL2−ＣＤＲL2−ＦＲL3−ＣＤＲL3−ＦＲL4（ここで、ＦＲの各々はヒト抗体のフレームワーク領域であり、ＣＤＲの各々は該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の軽鎖の相補性決定領域である。）により特徴付けられ、（ｂ）重鎖可変領域が、式ＦＲH1−ＣＤＲH1−ＦＲH2−ＣＤＲH2−ＦＲH3−ＣＤＲH3−ＦＲH4（ここで、ＦＲの各々は、ヒト抗体のフレームワーク領域であり、ＣＤＲの各々は親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の重鎖の相補性決定領域である。）により特徴付けられるパラグラフ１に記載のヒト化モノクローナル抗体。
【００７０】
３．ＦＲL1が、ヒト抗体のＦＲL1に天然に生じる約２３個のアミノ酸の領域を含み、ＦＲL2が、ヒト抗体のＦＲL2に天然に生じる約１５個のアミノ酸の領域を含み、ＦＲL3が、ヒト抗体のＦＲL3に天然に生じる約３２個のアミノ酸の領域を含み、ＦＲL4が、ヒト抗体のＦＲL4に天然に生じる約１０個のアミノ酸の領域を含み、ＦＲH1が、ヒト抗体のＦＲH1に天然に生じる約２８〜３２個のアミノ酸の領域を含み、ＦＲH2が、ヒト抗体のＦＲH2に天然に生じる約２８〜３２個のアミノ酸の領域を含み、ＦＲH3が、ヒト抗体のＦＲH3に天然に生じる約３０〜３４個のアミノ酸の領域を含み、ＦＲH4が、ヒト抗体のＦＲH4に天然に生じる約９〜１３個のアミノ酸の領域を含むことを特徴とするパラグラフ２に記載のヒト化モノクローナル抗体。
【００７１】
４．ＦＲL1のアミノ酸配列が、DIQLT QSPSS LSASV GDRVT ITC（配列番号２６）であり、ＦＲL2のアミノ酸配列が、WYQQK PGKAP KLLIY（配列番号２７）であり、ＦＲL3のアミノ酸配列が、GVP(S又はD)R FSGS(G又はV) SGTDF TFTIS SLQPE DIATY YC（配列番号２８）であり、ＦＲL4のアミノ酸配列が、FGQGT KVIEK（配列番号２９）であり、ＦＲH1のアミノ酸配列が、EVQLV ESGGG VVQPG RSLRL SCSSS GFDFT（配列番号３０）、EVQLV ESGGG VVQPG RSLRL SCSAS GFDFT（配列番号３１）又はQVQLQ ESGPG LVRPS QTLSL TCTSS GFDFT（配列番号３２）であり、ＦＲH2のアミノ酸配列が、WVRQA PGKGL EWVA（配列番号３３）、WVRQA PGKGL EWIA（配列番号３４）又はWVRQP PGRGL EWIA（配列番号３５）であり、ＦＲH3のアミノ酸配列が、RFTIS RDNSK NTLFL QMDSL RPEDT GVYFC AS（配列番号３６）、RFTIS RDNAK NTLFL QMDSL RPEDT GVYFC AS（配列番号３７）又はRVTML RDTSK NGSFL RLSSV TAADT AVYYC AS（配列番号３８）であり、ＦＲH4のアミノ酸配列が、WGQGT PVTVS S（配列番号３９）又はWGQGT TVTVS S（配列番号４０）である（ここで、Ｃはスルフィドリル型又はジスルフィド型であってもよい）パラグラフ３に記載のヒト化モノクローナル抗体。
【００７２】
５．親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体又はその断片の軽鎖可変領域のＣＤＲを含んでなるヒト化抗体軽鎖又はその断片であって、該ＣＤＲが、KASQD VGTSV A（配列番号２０）を含むＣＤＲL1と、WTSTR HT（配列番号２１）を含むＣＤＲL2と、QQYSL YRS（配列番号２３）を含むＣＤＲL3とを含んでなることを特徴とするヒト化抗体軽鎖又はその断片。
【００７３】
６．親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体又はその断片の重鎖可変領域のＣＤＲを含んでなるヒト化抗体重鎖又はその断片であって、該ＣＤＲが、TYWMS（配列番号２３）を含むＣＤＲH1と、EIHPD SSTIN YAPSL KD（配列番号２４）を含むＣＤＲH2と、LYFGF PWFAY（配列番号２５）を含むＣＤＲH3とを含んでなることを特徴とするヒト化抗体重鎖又はその断片。
【００７４】
７．親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と、ヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域とを含んでなるキメラモノクローナル抗体又はその断片であって、該キメラ抗体は、該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の特異性を保持しつつ、ヒト患者において該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体よりも免疫原性が小さく、該キメラモノクローナル抗体が、配列番号４の軽鎖可変領域と、配列番号２の重鎖可変領域とを含んでなることを特徴とするキメラモノクローナル抗体またはその断片。
【００７５】
８．配列番号４を含むマウスクラスIII抗ＣＥＡ抗体軽鎖又はその断片。
９．配列番号２を含むマウスクラスIII抗ＣＥＡ抗体重鎖又はその断片。
【００７６】
１０．該マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、ＭＮ１４モノクローナル抗体であることを特徴とするパラグラフ１〜９のいずれか一に記載のモノクローナル抗体、軽鎖、又は重鎖。
【００７７】
１１．該断片が、F(ab')2 or Fab'であるパラグラフ１〜４又は７のいずれか一に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
１２．ガン患者の治療に使用するためのパラグラフ１〜４、７、１０又は１１の何れかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
１３．ガン患者の治療に使用するためのパラグラフ１２に記載のモノクローナル抗体又はその断片と治療物質との治療用組み合わせ物。
【００７８】
１４．ガン患者の診断又は治療に使用するための、パラグラフ１〜４、７、１０又は１１に記載のモノクローナル抗体又はその断片に結合している診断物質又は治療物質を含んでなる複合体。
【００７９】
１５．該治療物質が細胞障害剤を含むことを特徴とする、パラグラフ１２に記載のモノクローナル抗体又はその断片、パラグラフ１３に記載の治療用組み合わせ物、又はパラグラフ１４に記載の複合体。
【００８０】
１６．該細胞傷害剤が、ドキソルビシン、メソトレキセート、タキソール、リシンＡ、又は放射性核種であることを特徴とする、パラグラフ１５に記載のモノクローナル抗体、治療用組み合わせ物又は複合体。
１７．該放射性核種が131Ｉであることを特徴とする、パラグラフ１６に記載のモノクローナル抗体、治療用組み合わせ物、又は複合体。
【００８１】
１８．該治療物質が免疫調節剤であることを特徴とする、パラグラフ１２のモノクローナル抗体又はその断片、パラグラフ１３の治療用組み合わせ物、又はパラグラフ１４の複合体。
１９．該治療物質が、ガン患者の治療に使用するための治療物質と結合しているパラグラフ１４の複合体であることを特徴とするパラグラフ１３の治療用組み合わせ物。
【００８２】
２０．該治療物質が、ガン患者の診断に使用するためのイメージング剤を含むことを特徴とするパラグラフ１４の複合体。
２１．該イメージング剤が、放射性核種であることを特徴とするパラグラフ２０の複合体。
【００８３】
２２．パラグラフ１〜１１のいずれか一に記載のモノクローナル抗体、軽鎖、又は重鎖をコードする単離ＤＮＡ。
２３．パラグラフ２２のＤＮＡ配列を発現するためのベクター。
２４．パラグラフ２２のＤＮＡ配列を発現する形質転換した細胞。
【００８４】
２５．パラグラフ２０の形質転換した細胞を培養して、モノクローナル抗体、軽鎖又は重鎖を生成するステップを含む、パラグラフ１〜１１のいずれか一に記載のモノクローナル抗体、軽鎖、又は重鎖を発現するための方法。
【実施例】
【００８５】
例１
抗体産生細胞の培養
上記Hansen et al. (1993)及び上記Primus et al. (1983)に従い、クラスIII、抗ＣＥＡモノクローナル抗体を産性するマウス／マウスハイブリドーマ細胞系を確立した。
【００８６】
標準イソタイプ決定技術を用いて調整培地(conditioned medium)を試験することにより、κＩｇＧ１の分泌について細胞を選択した。このための様々なキットが市販されている。これらの細胞を、上述の標準遮断検定を用いて調整培地を試験することにより、抗体の産生についてスクリーニングした。この検定において確認された産生細胞のストックを増殖させ、液体窒素中で凍結した。
【００８７】
例２
産生細胞系からのＲＮＡの単離
ＭＮ１４産生細胞を培養で増殖させ、遠心によって集めて洗浄した。全ＲＮＡを、このペレットの細胞から、Favaloro et al., Methods in Enzymology 65: 718 (1980)及びOrlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 3833 (1989)に従って単離した。これらは、参照することにより組込まれる。
【００８８】
例３
ｃＤＮＡ合成及び重鎖可変領域の増幅
ＭＮ１４産生細胞からのｍＲＮＡを、以下に記述されるように、ｃＤＮＡ合成の標準技術を用いるｃＤＮＡ合成及びＰＣＲによるＤＮＡ増幅に用いた。一般には、ＰＣＲに用いられるプライマーは、増幅産物のクローニングを容易にするため、それらの５’末端に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有していた。マウスＩｇＧ１重鎖の第１の定常領域ドメイン（「ＣＨ１」）をコードするＤＮＡのセンス鎖の末端に相補的なオリゴヌクレオチドを、逆転写酵素による第１鎖ｃＤＮＡ合成の誘発に用いた。このプライマーの配列、ＣＧ１ＦＯＲ、を表１に示す。下記表１には、本明細書で用いられる他のオリゴヌクレオチド配列も示される。
【００８９】
【表１】
2010075190.tif 000002
【００９０】
クローニングを容易にするためにプライマーに組込まれている制限部位には下線が付されている。
【００９１】
次に、重鎖（「ＶＨ」）ｃＤＮＡの可変領域を、上に引用されるOrlandi et al. (1989)に記述されるように、ＰＣＲにより、同じプライマー、ＣＧ１ＦＯＲ、及びＶＨ遺伝子の５’末端のコンセンサス配列に基づくプライマー（ＶＨ１ＢＡＣＫ）を用いて増幅した。この反応のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。これにより、エチジウムブロマイド染色及び蛍光照明で、期待通り約４００ｂｐの１つの主要バンドが明らかになった。
【００９２】
第２のｃＤＮＡ調製品からの配列を確かめるため、ＰＣＲにおいてシグナル配列プライマーを用いてＮ末端の真正アミノ酸の決定を可能にした。重鎖シグナル配列コード領域に基づく分解オリゴヌクレオチドであるＳＨ１ＢＡＣＫ及びＳＨ２ＢＡＣＫを、ＣＧ１ＦＯＲに関連する別々の反応に用いた。ＣＧ１ＦＯＲ、ＳＨ１ＢＡＣＫ増幅から拡散産物バンドが得られた。
【００９３】
この産物のＶＨ含量を増大させるため、これを低融点アガロースから切り出し、ＳＨ１ＢＡＣＫ及び第４のフレームワーク領域コンセンサス配列に相補的なオリゴヌクレオチド、ＶＨ１ＦＯＲ、を用いて増幅した。この反応の産物は、アガロースゲル電気泳動で分析した場合、別のバンドであった。
【００９４】
例４
ＰＣＲにより得られた、ＭＮ１４重鎖可変領域をコードするＤＮＡのクローニング及び配列決定
ＣＧ１ＦＯＲ、ＶＨ１ＢＡＣＫプライマー対を用いて得られた増幅産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで別々に消化した。これらの酵素の開裂部位はこれらのＰＣＲプライマーに含まれる。このＶＨ内部にも部位があるのかどうかを決定することが好ましかった。この制限断片のアガロースゲル分析は、このＤＮＡの一端に近接する内部ＰｓｔＩ部位の存在を示した。このＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９にクローニングして、それぞれのクローンの挿入断片（インサート）のＤＮＡ配列を決定した。大部分のクローンが同じＶＨのＤＮＡの挿入断片を有していた。
【００９５】
この配列決定により、このさらなる予期せざるＰｓｔＩ部位の存在が確認された。この部位は、ＶＨの最後の２つのアミノ酸を部分的にコードするＣＧ１ＦＯＲプライマーの配列の３’末端に近接していた。この方法により幾つかの完全長ＶＨクローンが得られたが、さらなるＰＣＲ産物ＤＮＡをＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片としてクローニングした。このため、これらのクローンは完全ＶＨ配列は有するが、ＣＧ１ＦＯＲによって与えられる定常領域は有していなかった。ＶＫ１ＢＡＣＫ、ＣＧ１ＦＯＲ産物から、合計１６の完全長クローンが得られた。これらの実験において、分析されたクローンの約２５％がＶＨ領域と無関係の挿入断片を有していた。
【００９６】
第２のｃＤＮＡ調製品からのＶＨ配列を確認し、同時に、このＶＨのＮ末端に対応する、プライマーが指定するものではない本当のＤＮＡ配列を得るため、ＶＨ１ＦＯＲ及びＳＨ１ＢＡＣＫプライマーからのＰＣＲ産物をクローニングした。これらのプライマーは、上述のＣＧ１ＦＯＲ及びＶＨ１ＢＡＣＫのＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位ではなく、ＢｓｔＥＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を有する。この反応のＰＣＲ産物を、ＢｓｔＥＩＩで消化し、このＢｓｔＥＩＩ末端を埋め、ＥｃｏＲＩで消化し、このＥｃｏＲＩ及び平滑末端をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩで消化されているベクターに連結することによりクローニングした。このクローニング断片の配列を決定した。このＶＨ断片の収量は比較的少なかった。これは、おそらく、ＳＨ１ＢＡＣＫの縮重によって引き起こされるＰＣＲにおける特異性の欠如を反映している。しかしながら、配列決定された１８のクローンのうちの４つは、以前に配列決定されている通りのＭＮ１４のＶＨ領域をコードするＤＮＡを有していた。他の挿入断片はＶＨをコードしているＤＮＡ由来ではなかった。
【００９７】
全部で、２０の完全長ＭＮ１４のＶＨクローンが得られた。これらのＭＮ１４のＶＨ領域クローンにおける配列の中で、５つの一過性変異が観察された。これらの変異は、増幅の間に、Ｔａｑポリメラーゼによる誤った取り込みの結果として導入されたもののようである。
【００９８】
例５
ＭＮ１４の重鎖可変領域のアミノ酸配列の分析
ＶＨのＤＮＡ配列から翻訳されたマウスＭＮ１４重鎖可変領域のアミノ酸配列を図１に示す（配列番号１及び配列番号２）。この配列とマウスＶＨサブグループを表す配列との比較は、ＭＮ１４の重鎖可変領域がサブグループIIIＢ（Kabat et al. SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U. S. Government Printing Office, 1987を参照）に属することを示した。
【００９９】
ＭＮ１４のＣＤＲの配列は、前出のKabat et al.(1987)によって報告されているいかなるものとも異なる。さらに、ＭＮ１４重鎖ＶＨフレームワーク領域の４つの位置のアミノ酸が、他のサブグループIIIＢのＶＨ配列のフレームワーク領域のものとは異なる。これらの４つの置換（Ｓｅｒ１４、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ９４及びＰｒｏ１０８）は、IIIＢ  ＶＨサブグループ以外の他のマウスＶＨ領域において観察されているが、Kabatの１０８位のプロリンが最も異例である。
【０１００】
ＶＨ又はＶＫにおけるあらゆる異例の残基は、マウスＭＮ１４の結合に有利であることが立証されている体細胞変異を表すことがある。
【０１０１】
例６
ｃＤＮＡ合成及びＭＮ１４  ＶＫをコードするＤＮＡの増幅
ＭＮ１４のκ軽鎖をコードするｃＤＮＡを、上述の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡと同様の方法でクローニングした。κ鎖ｃＤＮＡの第１鎖を合成するための逆転写酵素を誘発するのに、幾つかのプライマーを用いた。プライマーの１つであるＣＫ２ＦＯＲの配列は、κ軽鎖遺伝子の定常領域（「ＣＫ」）の５’末端の配列から誘導した。他の２つのプライマー、ＶＫ１ＦＯＲ及びＶＫ３ＦＯＲ、の配列は、κ軽鎖遺伝子の可変領域（「ＶＫ」）の３’末端の配列をベースとした。
【０１０２】
第１鎖ＤＮＡ産物を、ＰＣＲにより、多くのプライマー対を用いて増幅した。一方向への合成を第１鎖の作製に用いたプライマーにより誘発した。もう一方の、「逆」方向への重合は、ＶＫ領域の５’末端の配列であるＶＫ１ＢＡＣＫ、ＶＫ２ＢＡＣＫ、ＶＫ３ＢＡＣＫ、ＶＫ４ＢＡＣＫ及びＶＫ８ＢＡＣＫ、又はシグナルペプチドの最後の４つのアミノ酸及び可変領域の最初の４つのアミノ酸をコードする配列であるＶＫ５ＢＡＣＫ、ＶＫ６ＢＡＣＫ及びＶＫ７ＢＡＣＫのいずれかに基づく配列を有する一連のκ軽鎖特異的プライマーで開始した。加えて、ＣＫ２ＦＯＲで誘発したｃＤＮＡも、ＶＫ１ＦＯＲ及びＶＫ８ＢＡＣＫを用いて増幅した。
【０１０３】
これらの増幅産物を、上記の例に記述されている方法で、ゲル電気泳動により分析した。ＶＫ１ＢＡＣＫ、ＶＫ３ＢＡＣＫ、ＶＫ５ＢＡＣＫ、ＶＫ７ＢＡＣＫ及びＶＫ８ＢＡＣＫで誘発する反応からの生成物が、期待通りの３５０ｂｐのバンドを生じた。
【０１０４】
例７
ＰＣＲによって得られたＭＮ１４κ軽鎖可変領域のクローニング及び配列決定
選択されたＰＣＲ産物を、上記例４においてＶＨについて説明されているのと同様の様式で増幅プライマーに含まれる制限部位を用いて、Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９にクローニングした。ヌクレオチド配列決定により、大部分の挿入断片がＶＫ関連ではなかったことが明らかとなった。これは、ＶＫのｃＤＮＡのクローニングを試みる場合、異例のことではなく、ＶＨ特異的プライマーよりもＶＫ特異的プライマーを設計することが困難であるように思われる。
【０１０５】
ＶＫ１ＦＯＲ／ＶＫ８ＢＡＣＫの組み合わせからＶＫのｃＤＮＡ挿入断片が得られたが、ＣＤＲL3をコードするｃＤＮＡ内でのフレームシフト及び２３位に不変Ｃｙｓが存在しないことにより、これは機能的なＶＫを生じなかった。このＶＫのｃＤＮＡは他のハイブリドーマから単離されており、これはＳｐ２／０融合パートナーに由来する。ＣＫ２／ＶＫ１ＢＡＣＫ産物は、この場合フレームワーク４の保存残基を欠く、さらなる４つの異なる異常ＶＫ  ｃＤＮＡ挿入断片を生じた。このプライマー対を用いて得られた５０のＶＫ挿入断片は、明らかにこのプライマーのミスマッチが誘発するずれによる現象であるＶＫ１ＢＡＣＫの３’末端でのフレーム移動を除いて、機能的ＶＫのものであった。この問題は、ＶＫ遺伝子までは伸長しないＶＫ８ＢＡＣＫを用いることにより、回避することができる。しかしながら、ＶＫ１ＦＯＲ／ＶＫ８ＢＡＣＫ産物からのさらなるクローンの分析は所望の挿入断片を生じなかった。
【０１０６】
推定ＶＫを優先的に増幅するため、その真正第４フレームワーク配列からＶＫ３ＦＯＲを設計し、ＶＫ１ＦＯＲの代替物として合成した。ＶＫ３ＦＯＲ及びＶＫ８ＢＡＣＫを用いるＶＫ３ＦＯＲ誘発ｃＤＮＡの増幅により所望のＶＫを含む４つのクローンが生じ、この戦略は成功した。
【０１０７】
マウスＭＮ１４κ軽鎖可変領域のＤＮＡ及びアミノ酸配列が図２に示されている（配列番号３及び配列番号４）。このＭＮ１４のＶＫは、KabatのＶＫサブグループＶに位置し得る。このＭＮ１４  ＶＫフレームワーク領域の僅か３つの残基（Ｍｅｔ１０、Ｖａｌ６６及びＴｈｒ７６）だけがこのサブグループの他のメンバーに現れない。Ｍｅｔ１０及びＶａｌ６６がこの３つのうちで最も異例である。これらは、Kabatに列挙されているマウスＶＫのいかなるものにも見出されない。これらのＭＮ１４のＶＫのＣＤＲには、Kabatにおいて以前報告されている配列はない。
【０１０８】
例８
ヒト抗体の可変領域へのＭＮ１４のＶＨ及びＶＫのＣＤＲの移植
８．１  キメラ抗体発現ベクターの構築
マウス可変領域及びヒト定常領域からなるキメラ抗体の生成において、親マウス抗体と一緒に試験することは、正しい可変領域ｃＤＮＡが単離されていることをチェックするのに役立った。また、成功したキメラ抗体は、ヒト化されたものの結合を評価する際、有用な対照としても機能する。発現のための可変領域のクローニングにおいて用いられた配列は前出のOrlandi et al. (1989)に記述されており、図３及び４に示されている。
【０１０９】
ＶＨのＤＮＡを、オリゴヌクレオチドＶＨ１ＢＡＣＫ及びＶＨ１ＦＯＲを使用するＰＣＲを用いて、Ｍ１３クローンＭＮＶＨ４１から増幅した。これらのプライマー中のＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩ制限部位は、発現のための正しい背景の下で、Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１にＶＨが挿入されることを可能にする。この時点で、ＶＨの内部ＢａｍＨＩ制限部位を部位指向性突然変異により除去した。Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片全体を包含するこの反応生成物をｐＳＶｇｐｔにクローニングし、ＶＨ配列を確認した。
【０１１０】
その後、上記Takahashi et al., Cell, 29: 671-679 (1962)によって公開されているヒトＩｇＧ１定常領域遺伝子をこの構築物にＢａｍＨＩ断片として加え、これにより、ｐＳＶｇｐｔＭＮ１４ＭｕＶＨＨｕＩｇＧ１と呼ばれるベクターを得た。
【０１１１】
同様に、プライマーＶＫ８ＢＡＣＫ及びＶＫ３ＦＯＲ並びにＭ１３ＶＫＰＣＲ１にクローニングされているＰｖｕＩＩ、ＢｇｌＩＩ消化産物を用いるＰＣＲ増幅より、Ｍ１３クローンＭＮＶＫ１５４からＶＫ  ＤＮＡを得、それにより可変領域の配列をチェックした。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＲＦのＤＮＡから切り出し、プラスミドｐＳＶｈｙｇに移した。この構築物は、Hieter et al., Cell, 22: 197-207 (1980)に記述されるように、既にヒトκ定常領域遺伝子を有する。このようにして得られた最終ベクターはｐＳＶｈｙｇＭＮ１４ＭｕＶＫＨｕＣＫと名付けられた。
【０１１２】
８．２  ハイブリッド抗体の発現及び試験
Ｍ１３ＫＬＨｕＶＨＡＩＧＡのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＳＶｇｐｔに挿入し、発現ベクターｐＳＶｇｐｔＫＬＨｕＡＩＧＡＨｕＩｇＧ１を得た。同様に、Ｍ１３ＨｕＶＫのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＳＶｈｙｇに挿入し、発現ベクターｐＳＶｈｙｇＭＮ１４ＲＥＩＨｕＶＫＨｕＣＫを得た。約５μｇのｐＳＶｇｐｔＭＮ１４ＭｕＶＨＨｕＩｇＧ１及び１０μｇのｐＳＶｈｙｇＭＮ１４ＭｕＶＫＨｕＣＫ  ＤＮＡをＰｖｕｌで直鎖状にして、１７０Ｖ、９６０μＦのシングルパルスのＢｉｏＲａｄモデル１６５ＢＲ１１６０ジーン・パルサー・エレクトロポレーター(Gene Pulser Electroporator)を通常通り用いるエレクトロポレーションにより、約１０７個の半集密ＳＰ２／０ミエローマ細胞に移した。２４ウェルプレートにおいて、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ成長培地にマイコフェノール酸及びキサンチンを添加することにより、ｇｐｔ遺伝子の発現について細胞を選択した。
【０１１３】
生存細胞のコロニーを含むウェルを同定した。その培地上清をこれらのウェルから取り除き、ヒト抗体について検定した。抗体を分泌するコロニーを増殖させ、より多量の抗体を単離するため０．５Ｌの調整培地を得た。
【０１１４】
通常通り、最初に、プロテインＡアガロースアフィニティクロマトグラフィーにより、この培地から抗体を精製した。精製した抗体を、未変性ＭＮ１４抗体、ヒト抗体及び他の対照を参照して、さらに特徴付けた。
【０１１５】
また、この抗体を、ＭＮ１４遮断検定におけるその反応プロフィールによっても特徴付けた。これにより、このハイブリッド抗体のＣＥＡ結合親和性と、ポジティブコントロールとして役に立つＭＮ１４マウス抗体によるＣＥＡ結合とによって、情報を提示する比較が得られた。
【０１１６】
８．３  ＭＮ１４抗体のヒト化
ヒトＮＥＷＭ  ＶＨ、ＫＯＬ  ＶＨ及びＲＥＩ  ＶＫフレームワークがヒト体内で寛容性であるように思われるため、それらを抗体の再構成のための基礎として選択した。ＭＮ１４のＶＨ（配列番号２）及びＶＫ（配列番号４）とこれらのヒト可変領域とを並べたものを図５に示す（配列番号５〜７）。
【０１１７】
Ａ．ＮＥＷＭベースのヒト化
ＭＮ１４のＣＤＲを導入するための開始点は、必須ＦＲ及び無関係のＣＤＲをコードするＤＮＡである。これらのテンプレートの可変領域は、用いられる発現ベクターに適合する形態、すなわち、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片中にあり、本明細書にはプロモーター領域、シグナルペプチド及びイントロンＤＮＡも含まれる（図３及び図４）。ＮＥＷＭ  ＶＨでのものについては、このテンプレートはＭ１３ＶＨＰＣＲ１（上記Orlandi et al.、及び下記８．３項）である。ＫＯＬ  ＦＲ及び無関係のＣＤＲを含む、このテンプレートの誘導体を、ＫＯＬコード領域の生成に用いた。Ｍ１３ＶＫＰＣＲ１（上記Orlandi et al.）の誘導体をＨｕＶＫベクターの作製において用いた。得られたベクターを、Ｍ１３ＮＭＨｕＶＨ、Ｍ１３ＫＬＨｕＶＨ及びＭ１３ＨｕＶＫと名付けた。ヒト化ＭＮ１４可変領域ＤＮＡを有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、本質的に例８．１においてキメラＭＮ１４発現ベクターの構築について記述される通りに、これらのＭ１３ベクターから発現ベクターに移した。
【０１１８】
ＮＥＷＭ  ＦＲは、Poljak et al. Biochemistry 16: 3412-20 (1977)に説明されている。そのマウス等価物のものに匹敵する、ＣＥＡに対する親和性を有するｈＭＮ１４の構築を、段階的なアプローチで達成した。キメラ抗体の生成は、ヒト化されたものの結合を評価する場合に、有用な対照を提供する。ヒトＮＥＷＭ  ＶＨ及びＲＥＩ  ＶＫフレームワークを抗体を再構成するための基礎として最初に選択した。これは、これらがヒト体内において寛容性であることが知られているためである。ＭＮ１４の残基Ｐｈｅ２７、Ａｓｐ２８及びＴｈｒ３０は保持した。これは、Ｋａｂａｔの超可変領域であるＣＤＲ１残基３１〜３５の一部ではないものの、それらのアミノ酸がＣＤＲ１構造ループ(Chothia et al., J. Mol. Biol. 176: 901-917 (1987))の一部であるためである。加えて、以下の理由により、ヒト化ＶＨへの組込みのために次の残基も選択した。すなわち、Ａｌａ２４、この残基はＣＤＲ１に接触する。Ａｒｇ７１、この残基の側鎖はこのドメインの中心を通して突き出し、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２と相互作用する。ほんの少しのＶａｌの置換はこれらのＣＤＲループの立体配座を変更し得る。ならびに、Ｓｅｒ９４、大部分の抗体はこの位置にＡｒｇを有しており、そこではＣＤＲ３のＡｓｐ残基と相互作用するものと考えられ、ＮＥＷＭがＡｒｇを含むとマウスＣＤＲとの望ましくない相互作用を形成することがあり得るという理由である。他の再構成分子において重要であることが立証されている領域に相当する３つの領域において、このバージョン（ＮＭＨｕＶＨ）に対する他の変更がなされた。これらの変更は以下のものであった。
【０１１９】
（ｉ）Ｇｌｎ７７Ｐｈｅ７８Ｓｅｒ７９からＴｈｒＬｅｕＴｙｒ（ＮＭＨｕＶｈＨＴＬＹ、配列番号９）
（ｉｉ）Ｓｅｒ８２Ｔｈｒ８３Ａｌａ８４Ａｌａ８５からＬｙｓＡｒｇＳｅｒＧｌｕ（ＮＭＨｕＶｈＨＫＲＳＥ、配列番号１０）
（ｉｉｉ）Ａｒｇ６６Ｖａｌ６７Ｔｈｒ６８Ｍｅｔ６９Ｌｅｕ７０からＬｙｓＰｈｅＩｌｅＶａｌＳｅｒ（ＮＭＨｕＶｈＫＦＩＶＳ、配列番号１１）
【０１２０】
このＮＥＷＭ  ＶＨフレームワークの異なるバージョン（配列番号５及び８〜１１）とＭＮ１４  ＶＨ（配列番号２）とのアラインメントを図６に示す。これらのバージョンの各々は、同じＨｕＶＫと対を形成している。ＴＬＹ又はＫＦＩＶＳモチーフのいずれかを含むことにより、約２倍の改善が得られた。
【０１２１】
上記Kabat et al.(1987)に示されているＮＥＷＮフレームワーク配列とは２つの相違がある。すなわち、Ｓ１０７からＴ及びＬ１０８からＴ。Kabatは、残基１をＰＣＡとして、かつ残基５及び６をＥ又はＱとして列挙している。
【０１２２】
Ｂ．ＫＯＬベースのヒト化
ＮＥＷＭ  ＶＨの使用と平行して、我々はヒトＫＯＬ  ＶＨも再構成している。ＫＯＬ  ＶＨは、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｚ．ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，３６４：７１３−７４７（１９８７）に説明されている。抗体のヒト化に用いられたＦＲはＫａｂａｔに示されるものと同様である。このＫＯＬベースのＶＨの本来のバージョンは、残基の可変性の観点で定義される（上記Kabat et al.）、ＭＮ１４のＣＤＲ及び３つのさらなるマウス残基を有していた。ＮＥＷＭ  ＶＨを用いた場合と同様に、これらの置換のうちの２つが生じた。これは、βシートフレームワークから伸びる実際のペプチドＣＤＲ１構造ループが残基２５〜３２からなる（上記Chothia et al. 1987）ためである。２８位及び３０位での変更は、このループが全体としてマウス抗体から移植されるのを可能にする。ＫＯＬ  ＶＨのＡｒｇ残基がＡｓｐ１１０との塩架橋に関与し、ＮＥＷＭ  ＶＨを用いた場合と同様に、Ａｒｇ９４の保持がＭＮ１４のＣＤＲ３構造を撹乱することがあるように思われたため、ＭＮ１４残基９４が含められた。残基９４の側鎖はＣＤＲ１の残基とも相互作用し得る。この基本ＭＮ１４  ＫＯＬＨｕＶＨ（配列番号１２）に対してなされた他の変更は以下の通りである。
【０１２３】
（ｉ）Ｓｅｒ２４からＡｌａ２４及びＶａｌ４８Ａｌａ４９からＩｌｅＧｌｙ（ＫＬＨｕＶｈＡＩＧ、配列番号１３）。
（ｉｉ）Ｓｅｒ２４からＡｌａ２４、Ｖａｌ４８Ａｌａ４９からＩｌｅＧｌｙ、及びＳｅｒ７４からＡｌａ（ＫＬＨｕＶｈＡＩＧＡ、配列番号１４）。
（ｉｉｉ）Ｓｅｒ２４からＡｌａ２４、Ｖａｌ４８Ａｌａ４９からＩｌｅＧｌｙ、Ｓｅｒ７４からＡｌａ及びＰｈｅ７９からＴｙｒ（ＫＬＨｕＶｈＡＩＧＡＹ、配列番号１５）。
【０１２４】
変異の論理的説明
Ａｌａ２４−ＣＤＲ１のループは、残基２９の側鎖のフレームワークへの浸透によって固定されている。残基２４は、それが相互作用するものの１つである(Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992))。
【０１２５】
Ｉｌｅ４８Ｇｌｙ４９−これらの残基の両者はＣＤＲ２超可変領域に隣接するものの、実際の構造ループからはかけ離れている。両残基は完全に埋もれており(Padlan, Mol.  Immunolog.  28:  489-498,  1991)、これらがそれらのパッキング相互作用により結合を行うことが可能であるように思われた。
【０１２６】
Ａｌａ７４−この残基はＶＨ抗原結合表面に見出される第４ループの一部であり、その側鎖は溶媒にほとんど完全に露出している（上記Padlan, 1991）。この残基と抗原との直接相互作用を予想することができた。
【０１２７】
Ｔｙｒ７９−残基７４と同様に、この残基は抗原結合部位に近接し、結合を行うことが可能である。
【０１２８】
ＫＯＬ  ＶＨフレームワークの異なるバージョン（配列番号７及び１２〜１５）とＮＥＷＭベースのバージョン（配列番号５及び８〜１１）及びマウスＭＮ１４（配列番号２）のアラインメントを図６に示す。
【０１２９】
ＭＮ１４ＨｕＶＨ及びＭＮ１４ＨｕＶＬのＤＮＡ配列及び翻訳産物をそれぞれ図７及び８に示す（それぞれ、配列番号１６〜１９）。
【０１３０】
抗体ＫＬＨｕＶＨＡＩＧＡ／ＨｕＶＫのようなヒト化ＫＬＨｕＶＨの変種を精製し、以下のように遮断検定において試験を行った。抗体を、指定された濃度で、ＨＲＰ標識ＭＮ１４と共に添加し、最終容積０．１ｍｌとした。３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄して未結合の抗体を除去した後、残留結合ペルオキシダーゼ活性から抗体の相対親和力を決定した。図９の検定データによって示されるように、「再構成」（すなわち、ＦＲにＣＤＲが移植されている）ヒト化抗体の活性は、キメラ及びマウス陽性対照のものと同等であった。
【０１３１】
ＫＬＨｕＶＨＡＩＧ／ＨｕＶＫ及びＫＬＨｕＶＨＡＩＧＡＹ／ＨｕＶＫ抗体を分泌する細胞からの上清液を用いて得られた結果は、これらが、ＫＬＨｕＶＨＡＩＧＡ／ＨｕＶＫ抗体のものと同等の遮断活性を有することを示唆する。
【０１３２】
Ｃ．ＲＥＩベースのヒト化
ＲＥＩ  ＶＬは、Epp et al., Eur. J. Biochem., 45: 513-24 (1974)に説明されている。ＲＥＩフレームワークにおいては、結合を改善するための変更は行わなかった。Kabat et al. (1987)に示される配列からの変更は、Ｍ４からＬ、Ｔ３９からＫ、Ｙ７１からＦ、Ｌ１０４からＶ、Ｑ１０５からＥ、及びＴ１０７からＫである。これらの変更は、ＭＮ１４  ＣＤＲを移植するときに用いられるテンプレートに予め存在し、結合を改善するために特異的に作製されはしなかった。Ｍ４のＬへの変更は制限部位を組込むが、残りの相違がＲＥＩフレームワークの異例の残基を取り除く。類似のフレームワークが、Foote et al., J. Mol. Biol. 224: 487-9 (1992)により、ヒトκサブグループＩのコンセンサスと呼ばれている。
【０１３３】
例９
ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト化抗体の発現
ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト抗体の発現について安定に形質転換された細胞を上述の方法で選択し、クローニングして個々の産生細胞系を確立した。これらの系の各々を検定し、正しい抗体の産生を決定して、産生の効力を評価した。抗体のクラスを決定し、抗ＣＥＡ結合親和性を評価した。
【０１３４】
最良の産生細胞を産生される抗体の全量についてさらに特徴付け、これらのうちの最良のものについて、トランスフェクション、組込み、増殖又は選別の間に抗体遺伝子に変異が生じていないことを保証するためそのｍＲＮＡから配列を得た。
【０１３５】
例１０
細胞培養物中で発現したＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト化抗体の精製
ＭＮ１４のＣＤＲを移植されたヒト抗体の最良産生細胞系を培養し、その成長培地を集めて、０．２ミクロン膜を通して濾過した。その後、抗体を、プロテインＡクロマトグラフィー、次いでイオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーのような他の通常の精製ステップにより精製した。通常の遠心により、細胞をペレット化した。その上清液から、上述のように抗体を精製した。
【０１３６】
例１１
診断におけるヒト化ＭＮ１４モノクローナル抗体の使用
Ａ．動物研究
ヒト結腸ガンを有するヌードマウスにおいて、標識ヒト化ＭＮ１４  ＩｇＧの生体内の分配を測定した。放射性位置測定研究に対しては、４〜５週齢雌胸腺欠損マウス（ｎｕ／ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に、胸腺欠損マウスにおいて順次増殖させた異種移植片から調製したＬＳ１７４Ｔヒト結腸アデノカルシノーマ(Sharkey et al., Cancer Res., 50: 828-34 (1990))の１０％懸濁液０．２ｍｌを皮下に移植した。腫瘍の発達を２週間待った後、これらのマウスに、２０μＣｉ（約２μｇ）の131Ｉ標識ヒト化ＭＮ１４モノクローナル抗体を静脈内注射した。その後、時々、４〜５匹のマウスの群を屠殺し、上記Sharkey et al.に従い、組織中で放射活性の位置を測定した。表２のデータは注射された用量／組織ｇの％及び腫瘍：非腫瘍比を示す。
【０１３７】
これらの結果は、この抗体の優れた腫瘍結合性を示し、その最大結合活性は２日以内に生じる。ｈＭＮ１４抗体の血液クリアランスは、親ｍＭＮ１４抗体よりも迅速であった。加えて、脾臓によるｈＭＮ１４の取り込みはｍＭＮ１４よりも高く、これはｈＭＮ１４抗体がマウスにとって「外来性」であるという事実を反映している。腫瘍：非腫瘍比は優れたものであった。これらの結果は、本発明のｈＭＮ１４  ｍＡｂがＣＥＡ産生腫瘍を標的とすることが可能であることを示す。
【０１３８】
【表２】
2010075190.tif 000003
【０１３９】
Ｂ．131Ｉ標識ヒト化ＭＮ１４のＩｇＧを用いた臨床研究
ヒト化ＭＮ１４  ＩｇＧのターゲッティング及び薬物速度論的挙動の先行調査のため、患者を、米国分子薬剤及び免疫学センター(Center for Molecular Medicine and Immunology)、Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪで、インスティチューショナル・レビュー・ボード(Institutional Review Board)認可プロトコルに処した。図１２に示されている結果の場合、その男性患者は、肝臓に転移している結腸直腸ガンを有していた。彼に131Ｉ−ｈＭＮ１４  ＩｇＧ（８ｍＣｉ、０．６ｍｇ抗体）を静脈注射し、６日間にわたって撮像した。続いて、この患者に等用量のｍＭＮ１４  ＩｇＧを注射した。図１２に示される像は、各注射の約１４０時間後の腹部前面の像を示す。これらの像は、直接比較することができるように、正確に同じ濃度に調整されている。これらの結果は、親マウス抗体のみならずこのヒト化抗体がＣＥＡ産生腫瘍によって取り込まれることを示す。これらの実験は、本発明のヒト化ＭＮ１４  ｍＡｂを用いるヒトＣＥＡ産生結腸ガンの診断が実用上有用なものであることを立証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月16日(2009.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体由来の軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域の各々とを含むヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、該ヒト化抗体は、該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の特異性を保持するものの、ヒト患者において該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体よりも免疫原性が小さく、該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲが、ＫＡＳＱＤ  ＶＧＴＳＶ  Ａ（配列番号２０）からなるＣＤＲL1と、ＷＴＳＴＲ  ＨＴ（配列番号２１）からなるＣＤＲL2と、ＱＱＹＳＬ  ＹＲＳ（配列番号２２）からなるＣＤＲL3とを含んでなり、該親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の重鎖可変領域のＣＤＲが、ＴＹＷＭＳ（配列番号２３）からなるＣＤＲH1と、ＥＩＨＰＤ  ＳＳＴＩＮ  ＹＡＰＳＬ  ＫＤ（配列番号２４）からなるＣＤＲH2と、ＬＹＦＧＦ  ＰＷＦＡＹ（配列番号２５）からなるＣＤＲH3とを含み、該ヒト化抗体が、さらにＡｌａ２４、Ａｓｐ２８、Ｔｈｒ３０、Ｖａｌ４８、Ａｌａ４９、Ａｌａ７４及びＡｒｇ９４を含む親マウスクラスIII抗ＣＥＡモノクローナル抗体の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸残基を含む、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
請求項１のヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片に結合した診断剤又は治療剤を含む複合体。
【請求項３】
該治療剤が、細胞障害剤又は免疫調節剤を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
該細胞障害剤が、ドキソルビシン、メソトレキセート、タキソール、リシンＡ又は放射性核種を含む、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
該診断剤が、イメージング剤を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項６】
該イメージング剤が、放射性核種又は金属キレート剤を複合した放射性核種である、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
該放射性核種が、ヨウ素、イットリウム又はテクネチウムである、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む、がん患者の診断又は処置のための組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離されたＤＮＡ。