(57)【要約】      （修正有）【課題】コイヘルペスウィルス（以下、「ＫＨＶ」という）感染に対する阻害活性を示す抗体を調製するための組換え蛋白質を提供する。【解決手段】下記の性質を示すことを特徴とする組換え蛋白質。1)．組換え蛋白質３種はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって３９．８、３４．１、２７．２ｋＤａの分子量を示す。2)．それぞれ特定のＮ末端アミノ酸配列を有する。3)．組換え蛋白質の宿主動物への投与によってコイヘルペスウィルスに対する感染阻害活性を有する抗体を調製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を示すことを特徴とする組換え蛋白質。
1)．SDS-PAGE電気泳動によって３９．８ｋＤａの分子量を示す。
2)．配列番号１に示すＮ末端アミノ酸配列を有する。
3)．組換え蛋白質の宿主動物への投与によってコイヘルペスウィルスに対する感染阻害活性を有する抗体を調製する。
【請求項２】
下記の性質を示すことを特徴とする組換え蛋白質。
1)．SDS-PAGE電気泳動によって３４．１ｋＤａの分子量を示す。
2)．配列番号３に示すＮ末端アミノ酸配列を有する。
3)．組換え蛋白質の宿主動物への投与によってコイヘルペスウィルスに対する感染阻害活性を有する抗体を調製する。
【請求項３】
下記の性質を示すことを特徴とする組換え蛋白質。
1)．SDS-PAGE電気泳動によって２７．２ｋＤａの分子量を示す。
2)．配列番号５に示すＮ末端アミノ酸配列を有する。
3)．組換え蛋白質の宿主動物への投与によってコイヘルペスウィルスに対する感染阻害活性を有する抗体を調製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換え蛋白質に関し、特にコイヘルペスウィルス（以下、「ＫＨＶ」という）感染に対する阻害活性を示す抗体を調製するための組換え蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
コイヘルペスウィルス（以下、単に「ＫＨＶ」ともいう）は鯉のえら、腎臓、脾臓、腸管および肝臓など広範にわたって感染し、ＫＨＶに感染した鯉には緩慢行動、平衡感覚失調、摂餌不良となり、外観的にはえらの退色、びらん、巣状壊死などが見られ、感染した鯉の多くが死亡に至る。
【０００３】
これに対し、ＫＨＶを単離し、魚細胞培養物に再播種し、その操作を繰り返して弱毒化した生ウィルスを得るか、又あるいはＫＨＶのゲノムに変異を導入することによって弱毒化し又は不活化した生ウィルスを得て、これらの生ウィルスと免疫活性剤など水中に投入して鯉にＫＨＶ免疫性を与えるようにした方法が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−５１２０７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１記載の方法では繰り返し操作などが煩雑であり、弱毒化又は不活化したウィルスを大量に調製することが難しい。
【０００６】
また、錦鯉の養殖場では、鯉の生死に関わらず、ＫＨＶを保有している個体が１尾でも存在すれば、全て殺処分しなければならないが、特許文献１記載の方法では宿主（鯉）にＫＨＶの感染に対して抵抗性を付与するだけであって、ウィルス感染の阻止、保菌魚の発生阻止について保障するものではない。
【０００７】
本発明はかかる問題点に鑑み、ＫＨＶ感染に対する阻害活性を示す抗体を簡単に調製することのできるようにした組換え蛋白質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る組換え蛋白質は、下記の性質を示すことを特徴とする。
１）．組換え蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって３９．８ｋＤａの分子量を示す。
２）．配列番号１を示すＮ末端アミノ酸配列を有する。
３）．組換え蛋白質の宿主動物への投与によってコイヘルペスウィルスに対する感染阻害活性を有する抗体を調製する。
【０００９】
１）．組換え蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって３４．１ｋＤａの分子量を示す。
２）．配列番号３に示すＮ末端アミノ酸配列を有する。
３）．組換え蛋白質の宿主動物への投与によってコイヘルペスウィルスに対する感染阻害活性を有する抗体を調製する。
【００１０】
１）．組換え蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって２７．２ｋＤａの分子量を示す。
２）．配列番号５に示すＮ末端アミノ酸配列を有する。
３）．組換え蛋白質の宿主動物への投与によってコイヘルペスウィルスに対する感染阻害活性を有する抗体を調製する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
【実施例１】
【００１２】
〔ＤＮＡの抽出〕
ウィルス培養液からＫＨＶゲノムを抽出する。核酸抽出は次のように行った。ＫＨＶ（２００３年霞ヶ浦分離株）を錦鯉由来培養細胞であるＫＦ−１細胞に接種し、十分に細胞変性効果が発現した段階で培養液を回収する。このウィルス培養液からＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ／Ｍａｘｉ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりウイルスゲノムを抽出する。
【００１３】
〔ＰＣＲによる増幅〕
抽出した２本鎖ＤＮＡをテンプレートとし、ＯＲＦ９９（ｐｒｅｄｉｃｔ  ｍｅｍｂｒａｎｃｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、の一部の領域を増幅する。９４°Ｃで１本鎖ＤＮＡに変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させ、５５°Ｃでプライマーを結合させ、７２°Ｃで耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖を合成させ、これらの操作を繰返してウィルス粒子表面の感染に関係する糖蛋白に調製するＤＮＡの領域を増幅した。これらの領域はＧＣｒｉｃｈであるため、増幅効率を高めるために、ＴａＫａＲａＬＡｔａｑ（登録商標）およびＴａＫａＲａＬＡｔａｑ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒを使用して反応を行う。
【００１４】
プライマーには、
９９−５：（塩基配列：ｇｇｃｔｔｃａａｇｃａｇｃｔｃａｃｃａａｃａ）
９９−３：（塩基配列：ｇａａａｇｔｃｃａｃｇａｔｇｃｃｇｃｔｇａａ）
を用いた。
【００１５】
ＰＣＲ産物は配列番号２に示す塩基配列を有していた。
【００１６】
このＰＣＲ産物の同定は次のように行った。
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてシークエンス反応を行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて塩基配列を決定した。
【００１７】
〔発現ベクター構築〕
こうしてＰＣＲ産物が得られると、これをプラスミドベクターに組み込み、発現ベクターを構築した。プラスミドにはｐＱＥ−３０  ＵＡ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用した。
【００１８】
〔トランスフェクション〕
次に、大腸菌に発現ベクターを導入し、組換え蛋白質の産出を確認する。確認はウエスタンブロット法にて次のように行った。コンピテントＭ１５〔ｐＲＥＰ４〕細胞とライゲーション反応液とを混合し、加熱処理後、カナマイシンおよびアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングした。その後、コロニーを回収し、コロニーPCRによって目的のプラスミドを持つクローンを選抜した。コロニーPCRにはマルチクローニングサイトを挟む領域に設計したプライマー（ｐＱＥ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ．ＱＩＡＧＥＮ社製）ならびに前述のプライマーを用い、オリエンテーションの確認も同時に行った。また、目的とするＤＮＡが正確にプラスミドに挿入されているかどうかを確認するため、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌よりプラスミドを抽出し、ＰＣＲ産物の同定と同様の方法によって塩基配列の特定を行った。
【００１９】
〔培養〕
得られた大腸菌をカナマイシン、アンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、さらにＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｙ１−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して発現を誘導した。培養後菌体を回収し、細胞溶解液を用いて菌体を破壊し、組換え蛋白質を精製した。精製は次のように行った。細菌ライセートから平衡化したＮｉ−ＮＡＴ樹脂カラムを用いて６×Ｈｉｓタグタンパクを精製、溶出し、抗6×Hisタグ抗体を用いたウェスタンブロットにより組換え蛋白質の産生確認を行った。
【００２０】
〔組換え蛋白質〕
得られた組換え蛋白質は次のような性質を有していた。
１）．組換え蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって３９．８ｋＤａの分子量を示す。
２）．配列番号１に示すＮ末端アミノ酸配列を有する。
３）．組換え蛋白質の宿主動物への投与によってコイヘルペスウィルスに対する感染阻害活性を有する抗体を調製する。
【００２１】
この組換え蛋白質の同定は次のように行った。 
得られた組換え蛋白質は、プロテインシーケンサーＰＰＳＱ−２１Ａ（島津製作所）を用いてＮ末端アミノ酸配列を推定した。
【００２２】
〔スクリーニング〕
得られた組換え蛋白質がウィルス感染にかかわっているかどうかは抗体を使ったウィルス中和試験によって確認した。上述の方法によって得られた組換え蛋白質を鶏（宿主動物）に注射し、組換え蛋白質に対する抗体を作らせる。次に、鶏から血液を採取し、血清を分離し、ウィルスと抗体を反応させ、感染阻害を起こるかどうかを観察した。
【００２３】
鶏への免疫は以下のようにして行った。得られた組換え蛋白質は透析後、産卵鶏（ごとうもみじ）の胸筋内にタンパク量として１００μｇずつ接種した。なお初回免疫時にはフロイント完全アジュバントとのエマルジョンを用い、追加接種時にはフロイント不完全アジュバントを使用した。追加接種は２週おきに２回実施し、最終免疫の翌日に採血を行った。
ウィルス中和試験は以下のように実施した。熱非働化（５６°Ｃ３０分）した鶏血清を2倍ずつ段階希釈し、これと１００ＴＣＩＤ５０の攻撃ウィルスとを２０°Ｃで１時間反応させた後に、錦鯉由来の培養細胞であるＫＦ−１細胞にその混合液を接種し、２週間培養して細胞変性効果の有無を記録した。抗ＯＲＦ９９鶏血清のＫＨＶに対する中和力価は１：３２０で、組換え蛋白質に抗ＫＨＶ中和活性が認められた。なお、非免疫の鶏血清の中和力価は検出限界以下（１：４０以下）であった。
【実施例２】
【００２４】
〔ＤＮＡの抽出・ＰＣＲによる増幅〕
ウィルス培養液からＫＨＶゲノムを抽出し、抽出した２本鎖ＤＮＡをテンプレートとし、ＯＲＦ２５（ｐｒｅｄｉｃｔ  ｍｅｍｂｒａｎｃｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、の一部の領域を増幅した。
プライマーには、
２５−５：（塩基配列：ａａｇａａｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｇｔｃｔａｃｇａ）
２５−３：（塩基配列：ａｃｇａｃｔｃｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｔｃ）
を用いた。
ＰＣＲ産物は配列番号４に示す塩基配列を有していた。
【００２５】
その後、実施例１と同様にして発現ベクター構築、トランスフェクション及び培養を行った。
得られた組換え蛋白質は次のような性質を有していた。
１）．組換え蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥAGE電気泳動によって３４．１ｋＤａの分子量を示す。
２）．配列番号３に示すＮ末端アミノ酸配列を有する。
３）．組換え蛋白質の宿主動物への投与によってコイヘルペスウィルスに対する感染阻害活性を有する抗体を調製する。
【００２６】
その後、スクリーニングを行い、感染阻害を起こすかどうかを観察した。抗ORF25鶏血清は１：６４０で、組換え蛋白質に抗ＫＨＶ中和活性が認められた。非免疫の鶏血清の中和力価は検出限界以下（１：４０以下）であった。
【実施例３】
【００２７】
〔ＤＮＡの抽出・ＰＣＲによる増幅〕
ウィルス培養液からＫＨＶゲノムを抽出し、抽出した２本鎖ＤＮＡをテンプレートとし、ＯＲＦ１４６（ｐｒｅｄｉｃｔ  ｍｅｍｂｒａｎｃｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、の一部の領域を増幅した。
プライマーには、
１４６−５：（塩基配列：ｇｇｔｇａａａｇｇａｔａｇａｇｇｇａｇａｇｇａｇｔｃ）
１４６−３：（塩基配列：ｃｇａａｇｔｔｃｃａｃａｇｃｇｔｃｔｃｇｔｔｃｔ）
を用いた。
ＰＣＲ産物は配列番号６に示す塩基配列を有していた。
【００２８】
その後、実施例１と同様にして発現ベクター構築、トランスフェクション及び培養を行った。
得られた組換え蛋白質は次のような性質を有していた。
１）．組換え蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって２７．２ｋＤａの分子量を示す。
２）．配列番号５に示すＮ末端アミノ酸配列を有する。
３）．組換え蛋白質の宿主動物への投与によってコイヘルペスウィルスに対する感染阻害活性を有する抗体を調製する。
【００２９】
その後、スクリーニングを行い、感染阻害を起こるかどうかを観察した。抗ＯＲＦ１４６鶏血清は１：３２０で、組換え蛋白質に抗ＫＨＶ中和活性が認められた。非免疫の鶏血清の中和力価は検出限界以下（１：４０以下）であった。
【配列表】
2010202645000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月22日(2010.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
プライマーには、
９９−５：（塩基配列：ｇｇｃｔｔｃａａｇｃａｇｃｔｃａｃｃａａｃａ）
９９−３：（塩基配列：ｔｇｇｇｇｔｃａａａｇｔｔｇｃａｃａｔｇｇｇ）
を用いた。