(57)【要約】【課題】インビトロおよびインビボにおいて第ＶＩＩＩ因子の安定性おおよび半減期を増大させる、利用可能な第ＶＩＩＩ因子調製物を提供すること。【解決手段】本発明は、第ＶＩＩＩ因子由来のペプチドおよび第ＶＩＩＩ因子に対して作製された抗体の使用、ならびに第ＶＩＩＩ因子のＬＲＰとの相互作用の阻害に関する。さらに本発明は、第ＶＩＩＩとのＬＲＰの相互作用を阻害するための方法ならびに第ＶＩＩＩ因子の分解を減少させる方法、生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の半減期を延長させる方法、および／または血液凝固障害（特に血友病Ａ）に罹患する患者を処置する方法に関する。本発明はまた、血液凝固障害（特に血友病Ａ）の処置のための、生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の分解の減少、ＬＲＰとの第ＶＩＩＩ因子の相互作用の阻害、および／または生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の半減期の延長に有用な薬学的組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子由来のペプチドおよび第ＶＩＩＩ因子に対して産生された抗体の使用および第ＶＩＩＩ因子のＬＲＰとの相互作用の阻害に関する。さらに、本発明は、ＬＲＰの第ＶＩＩＩ因子との相互作用を阻害する方法、ならびに第ＶＩＩＩ因子の分解を減少させる方法、および／または生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の半減期を延長させる方法、および／または血液凝固障害（特に血友病Ａ）に罹患する患者を処置する方法に関する。本発明はまた、血液凝固障害（特に血友病Ａ）の処置のための、生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の分解の減少、ＬＲＰとの第ＶＩＩＩ因子の相互作用の阻害、および／または生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の半減期の延長に有用な薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固には、異なる止血反応経路（最終的に血栓の形成につながる）の組合せが関係する。血栓は、脈管壁の表面上の血液構成成分の塊であり、そして、凝集した血小板および不溶性の架橋フィブリンから主として成る。フィブリンの形成は、凝固酵素トロンビンによるフィブリノーゲンの限定的なタンパク質分解によって誘導される。この酵素は、凝固カスケード（活性型血小板および白血球ならびに多くの脈管細胞の表面で起こる一連のチモーゲン活性化である）の最終生成物である（例えば、Ｋ．Ｇ．Ｍａｎｎら、Ｂｌｏｏｄ，１９９０，Ｖｏｌ．７６，１−１６頁を参照のこと；本明細書中に参考として援用される）。
【０００３】
この凝固カスケードの重要な工程は、活性型第ＩＸ因子（第ＩＸａ因子）と活性型第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩ因子ａ）の複合体による、第Ｘ因子の活性化である。
【０００４】
第ＶＩＩＩ凝固因子は、このように凝固カスケードの内因性の経路における重要なタンパク質である。ＦＶＩＩＩの機能は、酵素ＦＩＸａのための補因子として役立ち、そして、このプロテアーゼの触媒効率を５〜６倍の規模で増加させる（ｖａｎ  Ｄｉｅｉｊｅら、１９８１．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５６：３４３３−３４４２；本明細書中に参考として援用される）。ＦＶＩＩＩの重要性は、重度の出血障害である血友病Ａ（活性型ＦＶＩＩＩの欠如によって特徴付けられる）によって示される（Ｋａｚａｚｉａｎら、１９９５．Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｉｎ：Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ｂｅａｄｅｔ，ＳｌｙおよびＶａｌｌｅ，編  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｉｎｃ．ＩＩＩ：３２４１−３２６７；本明細書中に参考として援用される）。
【０００５】
血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子の機能不全によって特徴付けられる伴性の出血障害である。この疾患は、男性の人口の約０．０１％で発症する。血友病Ａは、健全なドナーから得た第ＶＩＩＩ因子を含む血漿を投与することによって処置され得る。しかし、この処置には、いくつかの欠点がある。第ＶＩＩＩ因子の供給は限られており、非常に高価である；血中の第ＶＩＩＩ因子濃度は、わずか１００ｎｇ／ｍｌであり、そして、現在の血漿分別方法を用いると、収量が低い。第ＶＩＩＩ因子の供給源は、プールされたドナーの血液なので、レシピエントは、種々の感染症（ドナーの血中に存在し得る、非Ａ型肝炎ウイルス、非Ｂ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＡＩＤＳウイルスを含む）を得る高いリスクを負う。さらに、レシピエントは、外因性の第ＶＩＩＩ因子に対して抗体を産生し得、そのうちのいくらかは第ＶＩＩＩ因子の有効性を大きく減少させ得る。
【０００６】
上記のように、第ＶＩＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩＩ）は、第Ｘ因子のタンパク質分解性の活性化における活性型第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）のための補因子として、内因性凝固経路において役割を果たす（総説については、Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．（１９９９）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ８２，１９３−２００；Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．，およびＭｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２，３９８３−３９９６（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。第ＶＩＩＩ因子は、分離性のドメイン構造（Ａｌ−ａｌ−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）を有する、３００ｋＤａの糖タンパク質である（Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．，およびＭｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２，３９８３−３９９６；Ｖｅｈａｒ，Ｇ．Ａ．，Ｋｅｙｔ，Ｂ．，Ｅａｔｏｎ，Ｄ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｈ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｒｏｔｂｌａｔ，Ｆ．，Ｏｐｐｅｒｍａｎ，Ｈ．，Ｋｅｃｋ，Ｒ．，Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ｉ．，Ｈａｒｋｉｎｓ，Ｒ．Ｎ．，Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ，Ｅ．Ｇ．Ｄ．，Ｌａｗｎ，Ｒ．Ｍ．，およびＣａｐｏｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，３３７−３４２；本明細書中に参考として援用される）。ＡドメインおよびＣドメインは、構造上関連するタンパク質である第Ｖ因子のＡドメインおよびＣドメインと３０〜４０％の相応性を共有し、一方、Ｂドメインならびに短い酸性領域ａ１、ａ２およびａ３は、ＦＶＩＩＩに固有である（Ｃｈｕｒｃｈ，Ｗ．Ｒ．，Ｊｅｒｎｉｇａｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｔｏｏｌｅ，Ｊ．，Ｈｅｗｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｎｏｐｆ，Ｊ．，Ｋｎｕｔｓｏｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｎｅｓｈｅｉｍ，Ｍ．Ｅ．，Ｍａｎｎ，Ｋ．Ｇ．，およびＦａｓｓ，Ｄ．Ｎ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６９３４−６９３７；本明細書中に参考として援用される）。
【０００７】
血漿において、ＦＶＩＩＩは、９０〜２２０ｋＤａの重鎖（Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ）および８０ｋＤａの軽鎖（ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）から成る金属イオン連結ヘテロ二量体として循環する（Ｒｏｔｂｌａｔ，Ｆ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｇｏｏｄａｌｌ，Ａ．Ｈ．，およびＴｕｄｄｅｎｈａｍ，Ｅ．Ｇ．Ｄ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４，４２９４−４３００；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｗａｓｌｙ，Ｌ．Ｃ．，およびＤｏｍｅｒ，Ａ．Ｊ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６３５２−６３６２；本明細書中に参考として援用される）。不活性タンパク質は、そのキャリアタンパク質であるフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）と強固に会合する（Ｌｏｌｌａｒ，Ｐ．，Ｈｉｌｌ−Ｅｕｂａｎｋｓ，Ｄ．Ｃ．，およびＰａｒｋｅｒ，Ｃ．Ｇ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１０４５１−１０４５５；本明細書中に参考として援用される）。トロンビンまたは第Ｘａ因子のいずれかによる限定的なタンパク質分解は、ＦＶＩＩＩ前駆体をその活性型誘導体に変換する（Ｌｏｌｌａｒ，Ｐ．，Ｋｎｕｔｓｏｎ，Ｇ．Ｊ．，およびＦａｓｓ，Ｄ．Ｎ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４，８０５６−８０６４；Ｅａｔｏｎ，Ｄ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｈ．，およびＶｅｈａｒ  Ｇ．Ａ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５，５０５−５１２；本明細書中に参考として援用される）。次いで、ＢドメインおよびＡ３ドメインに接している酸性の領域が、分子から取り除かれ（Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｈａｉｄａｒｉｓ，Ｐ．Ｊ．，およびＳｍｕｄｚｉｎ，Ｔ．Ｍ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，８９５７−８９６２；本明細書中に参考として援用される）、ｖＷＦに対する高い結合親和性の損失を生じる（Ｌｏｌｌａｒ，Ｐ．，ら、（１９８８）前出）。得られた活性型ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）分子は、Ａ２−ａ２ドメイン（金属イオン連結Ａ１−ａ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２部分と非共有結合している）を含むヘテロ三量体から成る（Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．，ら、（１９９１）前出）。
【０００８】
ＦＶＩＩＩの重鎖および軽鎖内で、いくつかの領域がＦＩＸａ相互作用部位として同定されている（Ｆａｙ  Ｐ．Ｊ．，Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｔ．，Ｈｕｇｇｉｎｓ，Ｃ．Ｆ．，およびＲｅｇａｎ，Ｌ．Ｍ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２０５２２−２０５２７；Ｂａｊａｊ，Ｓ．Ｐ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｅ．，Ｍａｔｈｕｒ，Ａ．，Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｋ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｄ．，Ｍａｓｔｒｉ，Ｍ．，およびＦａｙ，Ｐ．Ｊ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６．１６３０２−１６３０９；Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，ｖａｎ  ｄｅ  Ｌｏｏ，Ｊ．Ｗ．Ｈ．Ｐ．，Ｄｏｎａｔｈ，Ｍ．Ｊ．，Ｓ．，Ｈ．，ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．，Ａ．，およびＭｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１９３５−１９４０；本明細書中に参考として援用される）。Ａ２ドメイン残基Ａｒｇ４８４−Ｐｈｅ５Ｏ９、Ｓｅｒ５５８−Ｇｌｎ５６５およびＡｒｇ６９８−Ａｓｐ７１２は、重鎖のＦＩＸａへの結合に寄与する（Ｆａｙ  Ｐ．Ｊ．，（１９９４）前出；Ｂａｊａｊ，．（２００１）前出；Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．，およびＳｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２９８２６−２９８３０；本明細書中に参考として援用される）。ＦＶＩＩＩ軽鎖内では、Ａ３ドメイン領域Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８が、ＦＩＸａ相互作用部位として同定されている（Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，（１９９６）前出）。さらに、ＦＶＩＩＩ領域Ａｒｇ４８４−Ｐｈｅ５０９およびＬｙｓ１８０４−Ｌｙｓ１８１８はまた、血友病患者において産生され得る抗体に対する標的エピトープとして同定されている。このような抗体は、ＦＶＩＩＩａと活性型ＦＩＸとの複合体アセンブリと干渉することによってＦＶＩＩＩ活性化を阻害する（Ｈａｅｌｅｙ，Ｊ．Ｆ．，Ｌｕｂｉｎ，Ｉ．Ｍ．，Ｎａｋａｉ，Ｈ．，Ｓａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ．，Ｈｏｙｅｒ，Ｌ．Ｗ．，Ｓｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．，およびＬｏｌｌａｒ，Ｐ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１４５０５−１４５０９；Ｆｉｊｎｖａｎｄｒａａｔ，Ｋ．，Ｃｅｌｉｅ，Ｐ．Ｈ．Ｎ．，Ｔｕｒｅｎｈｏｕｔ，Ｅ．Ａ．Ｍ．，ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．，ｔｅｎ  Ｃａｔｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｍ．，およびＶｏｏｒｂｅｒｇ，Ｊ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９１，２３４７−２３５２；Ｚｈｏｎｇ，Ｄ．，Ｓａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｆｅｌｃｈ，Ｍ．，およびＳｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２，１３６−１４２；本明細書中に参考として援用される）。
【０００９】
第ＶＩＩＩ因子の半減期は、例えば、第ＶＩＩＩ因子を関連したクリアランスのレセプターのためのその結合部位で改変することによって直接的にか、または、第ＶＩＩＩ因子とそのレセプターとの間の結合に影響を及ぼす化合物を用いることによって間接的にのいずれかで、そのクリアランスにおいて役割を果たすレセプターに対する第ＶＩＩＩ因子の親和性を減少することにより、第ＶＩＩＩ因子分解（クリアランス）のメカニズムに影響を与えることによって延長され得る。前記のプロセスに関する細胞内レセプターおよび第ＶＩＩＩ因子−レセプター相互作用に関する分子の部位が知られていないので、このような薬剤の産生は、困難であった。
【００１０】
非活性型第ＶＩＩＩ因子ヘテロ二量体の半減期は、第ＶＩＩＩ因子に対して大きな親和性を有し（しかし、第ＶＩＩＩａ因子に対しては持たない）、キャリアタンパク質として役立つフォン・ヴィレブランド因子の存在に依存する（Ｓａｄｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．およびＤａｖｉｅ，Ｅ．Ｗ．：血友病Ａ，Ｈａｅｒｎｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ｉｎ  Ｓｔａｒｎａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．ら（編）、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９８７，５７６−６０２頁）。３型フォン・ヴィレブランド病を有し、自身の循環系に検出可能なフォン・ヴィレブランド因子を示さない患者はまた、第ＶＩＩＩ因子の二次性機能不全を有することが知られている。さらに、これらの患者における静脈内に投与された第ＶＩＩＩ因子の半減期は、２〜４時間であり、それは、血友病Ａ患者について報告される１０〜４０時間より明らかに短い。
【００１１】
これらの調査結果は、第ＶＩＩＩ因子が循環系から迅速に除去される傾向があり、このプロセスは、天然のキャリアであるフォン・ヴィレブランド因子との複合体の形成によってある程度阻害されることを意味する。
【００１２】
最近、トロンビンによって活性化された第ＶＩＩＩ因子は、低密度リポタンパク質レセプタータンパク質（本明細書中で以降、ＬＲＰと称する）との結合に関連付けられている（Ｙａｋｈｙａｅｖ，Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９０（補遺１），１９９７，１２６−Ｉ，本明細書中に参考として援用される）。この文献の要約は、トロンビンで活性化された第ＶＩＩＩ因子フラグメントの細胞取り込みおよび分解を記載し、そして、第ＶＩＩＩａ因子ヘテロ三量体の他の２つのサブユニットでなく、Ａ２ドメインが細胞ＬＲＰと相互作用すると報告する。著者は、ＬＲＰに結合するＡ２ドメインが、さらに第ＶＩＩＩａ因子へテロ三量体のＡ２ドメイン間の相互作用を不安定化し、それによって第ＶＩＩＩａ因子活性がダウンレギュレートされることを提言する。
【００１３】
非活性型ＦＶＩＩＩが多機能性のエンドサイトーシスレセプターである低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（ＬＲＰ）と相互作用することがまた示されている（Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，Ｎｅｅｌｓ，Ｊ．Ｇ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．Ｍ．，Ｃｌｉｊｓｔｅｒｓ，Ｐ．Ｐ．Ｆ．Ｍ．，Ｍｅｉｊｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｗ．Ｅ．，Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．，ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．，およびｖａｎ  Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ，Ａ．，−Ｊ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２３７３４−２３７３９；ＷＯ  ００／２８０２１；Ｓａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ．，Ｙａｋｈｙａｅｖ，Ａ．Ｖ．，Ｍｉｋｈａｉｌｅｎｋｏ，Ｉ．，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｄ．Ｋ．，およびＳａｒａｆａｎｏｖ，Ａ．Ｇ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３７６８５−３７６９２；本明細書中に参考として援用される）。このレセプターが、循環からのＦＶＩＩＩのクリアランスにおいて役割を果たすということが示唆される（Ｓａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ．ら、前出；Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｈ．Ｐ．，Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｉｎｄｅｒ，Ｂ．，Ｍｉｈａｌｙ，Ｊ．，Ｄｅｎｉｓ，Ｃ．，Ｄｏｍｅｒ，Ｆ．，およびＴｕｒｅｃｅｋ，Ｐ．Ｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９５，１７０３−１７０８；本明細書中に参考として援用される）。
【００１４】
ＬＲＰは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターファミリー（ＬＤＬレセプター、超低密度リポタンパク質レセプター、ポリリポタンパク質Ｅレセプター２およびメガリンをまた含む）のメンバーである（総説としては、Ｎｅｅｌｓ  Ｊ．Ｇ．，Ｈｏｒｎ，Ｉ．Ｒ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．Ｍ．，Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．，およびｖａｎ  Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ，Ａ．−Ｊ．（１９９８）Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  １２，２１９−２４０；Ｈｅｒｚ，Ｊ．，およびＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｄ．Ｋ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８，７７９−７８４（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。ＬＲＰは、肝臓、肺、胎盤および脳を含む種々の組織において発現する（Ｍｏｅｓｔｒｕｐ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｌｉｅｍａｎｎ，Ｊ．，およびＰａｌｌｅｓｅｎ，Ｇ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２６９，３７５−３８２；本明細書中に参考として援用される）。このレセプターは、膜貫通型の８５ｋＤａのβ鎖に非共有結合性に連結される、細胞外の５１５ｋＤａのα鎖から成る（Ｈｅｒｚ，Ｊ．，Ｋｏｗａｌ，Ｒ．Ｃ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．，およびＢｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９，１７６９−１７７６；本明細書中に参考として援用される）。α鎖は、多くの構造的かつ機能的に無関係のリガンドの結合を媒介する、可変数の相補型反復の４つのクラスターを含む（Ｍｏｅｓｔｒｕｐ，Ｓ．Ｋ．，Ｈｏｔｌｅｔ，Ｔ．Ｌ．，Ｅｔｚｅｒｏｄｔ，Ｍ．，Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ，Ｈ．Ｃ．，Ｎｙｋｊａｅｒ，Ａ．，Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｐ．Ａ．，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｈ．Ｈ．，ＳｏｔｔｒｕｐＪｅｎｓｅｎ，Ｌ．，およびＧｌｉｅｍａｎｎ，Ｊ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１３６９１−１３６９６；Ｗｉｌｌｎｏｗ，Ｔ．Ｅ．，Ｏｒｔｈ，Ｋ．，およびＨｅｒｚ，Ｊ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１５８２７−１５８３２；Ｎｅｅｌｓ，Ｊ．Ｇ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．Ｍ．，Ｌｏｏｋｅｎｅ，Ａ．，Ｏｌｉｖｅｃｒｏｎａ，Ｇ．，Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．，およびｖａｎ  Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ，Ａ．−Ｊ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３１３０５−３１３１１；本明細書中に参考として援用される）。
【００１５】
β鎖は、膜貫通ドメインおよびエンドサイトーシスに不可欠である短い細胞質テールを含む。α鎖は、大きな外部ドメインとして機能し、そして、３つの型の反復を含む：表皮性増殖因子様ドメイン、Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ配列およびＬＤＬレレプタークラスＡドメイン。これらのクラスＡドメイン（リガンド結合に関連付けられている）は、クラスターＩ（２つのドメイン）、クラスターＩＩ（８つのドメイン）、クラスターＩＩＩ（１０のドメイン）および、クラスターＩＶ（１１のドメイン）と呼ばれる４つの別々のクラスターに存在する。
【００１６】
ＬＲＰはまた、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような細胞型において発現しており（ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ，Ｄ．Ｊ．，ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１２９，１９９５，１５３３−１５４１頁；本明細書中に参考として援用される）、これらは、第ＶＩＩＩ因子を含む補乳動物のタンパク質の発現のためにしばしば使用される（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ，Ｃｏａｇ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ，ｖｏｌ．８（補遺２），１９９７，３−１４頁；本明細書中に参考として援用される）。
【００１７】
ＬＲＰは、プロテアーゼ、Ｋｕｎｉｔｚ型インヒビター、プロテアーゼ−セルピン複合体、リパーゼおよびリポタンパク質を含む、多数のリガンドのクリアランスにおいて役割を果たし、これらは、いくらかの生理学的かつ病態生理学的なクリアランスのプロセスにおいてＬＲＰが役割を果たすと言われている（Ｎａｒｉｔａら、Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．２，５５５−５６０頁，１９９８；Ｏｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ，８９，７４２２−７４２６頁，１９９２；Ｋｏｕｎｎａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７１，６５２３−６５２９頁，１９９６；本明細書中に参考として援用される）。
【００１８】
ＬＲＰはまた、活性型の非酵素の補因子である第ＶＩＩＩａ因子に結合する（Ｙａｋｈｙａｅｖ，Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９０，（補遺１），１９９７，１２６−Ｉ）。この文献の開示は、第ＶＩＩＩａ因子の調節においてＬＲＰを関連付けているが、非活性型ヘテロ二量体である第ＶＩＩＩ因子の調節におけるＬＲＰの役割の示唆はない。
【００１９】
ＦＶＩＩＩ軽鎖は、組換えＬＲＰクラスターＩＩおよびＩＶと相互作用することが示されたが、ＬＲＰクラスターＩおよびＩＩＩへの結合は観察されなかった（Ｎｅｅｌｓ，Ｊ．Ｇ．，ら、（１９９９）前出）。
【００２０】
第ＶＩＩＩ因子の薬動力学的プロファイルを向上させるために、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのくつかの領域を改変するいくつかの試みがなされている：
ＷＯ  ８７／０７１４４は、アルギニン残基およびリジン残基を含むタンパク分解性の切断部位のいくらかの改変を示し、これは、特異的なプロテアーゼが触媒する切断（例えば、Ａｒｇ１７２１およびＡｌａ１７２２の間の第Ｘａ因子の切断部位）について分子の不安定性を減少する。
【００２１】
ＷＯ  ９５／１８８２７、ＷＯ  ９５／１８８２８およびＷＯ  ９５／１８８２９は、重鎖のＡ２領域に改変を有する第ＶＩＩＩ因子の誘導体を記載する。
【００２２】
ＷＯ  ９７／０３１９３は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドアナログを開示し、これらの修飾が分子の金属結合特性を変更する。
【００２３】
ＷＯ  ９７／０３１９５において、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子ポリペプチドアナログが記載され、Ａｒｇ残基に隣接して位置する１つ以上のアミノ酸残基の改変が提供される。
【００２４】
ＥＰ  ８０８  ９０１は、第ＶＩＩＩ因子の少なくとも１つの免疫優性領域に少なくとも１つの変異を有する第ＶＩＩＩ因子改変体の構成、および、第ＶＩＩＩ因子インヒビターを有する患者の処置のためのこの第ＶＩＩＩ因子改変体の使用を記載する。これらの改変は、半減期インビボまたはインビトロにおいて、第ＶＩＩＩ因子改変体の半減期を延長せず、また、第ＶＩＩＩ因子改変体の安定性を増大もしない。
【００２５】
さらに、ＷＯ  ００／２８０２１は、軽鎖のＡ３および／またはＣ１もしくはＣ２ドメインに改変を有し、そして、その改変が低密度リポ蛋白受容体タンパク質（ＬＲＰ）との結合親和性に影響を与えるという点で、特徴付けられる、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子活性を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを記載する。
【００２６】
ヒトのｍＲＮＡから得られた第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの分子クローニング、ならびに、その後の哺乳動物細胞、酵母細胞、および細菌細胞において第ＶＩＩＩ因子活性を有するタンパク質の産生が、報告されている（ＷＯ  ８５／０１９６１、ＥＰ  １６０  ４５７７、ＥＰ  １５０  ７３５およびＥＰ  ２５３  ４５５を参照のこと；本明細書中に参考として援用される）。形質転換された微生物を用いて第ＶＩＩＩ因子活性を有するタンパク質を産生する方法は、ＥＰ  ２５３  ４５５（本明細書中に参考として援用される）に開示される。欧州特許出願ＥＰ  １５０  ７３５および同ＥＰ  １２３  ９４５ならびにＢｒｉｎｋｈｏｕｓら、（１９８５）は、第ＶＩＩＩ因子のタンパク分解性の分解産物における第ＶＩＩＩ因子の活性を開示する（参照によってここに組み込まれる）。第ＶＩＩＩ因子の２つのタンパク分解性の分解産物の複合体（９２ｋＤａおよび８０ｋＤａのポリペプチド）は、増強された第ＶＩＩＩ因子活性を示す（Ｆａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８６）８７１：２６８−２７８；Ｆａｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）２５：５０５−５１２；本明細書中に参考として援用される）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
従って、本発明者らは、インビトロおよびインビボにおいて第ＶＩＩＩ因子の安定性おおよび半減期を増大させる、利用可能な第ＶＩＩＩ因子調製物の作製を目指した。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
（発明の要旨）
驚くべきことに、本発明者らは、第ＶＩＩＩ因子の部分的なアミノ酸配列、ならびに特定のペプチド内の特異的なエピトープに対する抗体を含む特定のペプチドが、インビトロおよびインビボにおいて第ＶＩＩＩ因子の安定性を有意に改善し得ることを発見した。
【００２９】
従って、本発明は一般に、第ＶＩＩＩ因子由来のペプチドおよび第ＶＩＩＩ因子に対して作製された抗体の使用、ならびに第ＶＩＩＩ因子のＬＲＰとの相互作用の阻害に関する。さらに、本発明は、ＬＲＰの第ＶＩＩＩ因子との相互作用を阻害する方法、第ＶＩＩＩ因子の分解を減少させる方法、および／または生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の半減期を延長させる方法、および／または血液凝固障害（特に血友病Ａ）に罹患する患者を処置する方法に関する。本発明はまた、血液凝固障害（特に血友病Ａ）の処置のための、生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の分解の減少、第ＶＩＩＩ因子のＬＲＰとの相互作用の阻害、および／または生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の半減期の延長に有用な薬学的組成物に関する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的な第ＶＩＩＩ因子活性を持たないものとして配列番号１、２、３または４のいずれかに定義されるアミノ酸配列を含むペプチド、または、該アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合し、第ＶＩＩＩ因子とＬＲＰとの相互作用を阻害する抗体の使用。
（項目２）
第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的な第ＶＩＩＩ因子活性を持たないものとして配列番号１、２、３または４のいずれかに定義されるアミノ酸配列を含むペプチド、または、該アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合し、生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の分解を減少させる抗体の使用。
（項目３）
第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的な第ＶＩＩＩ因子活性を持たないものとして配列番号１、２、３または４のいずれかに定義されるアミノ酸配列を含むペプチド、または、該アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合し、血中における第ＶＩＩＩ因子の半減期を延長させる抗体の使用。
（項目４）
第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的な第ＶＩＩＩ因子活性を持たないものとして配列番号１、２、３または４のいずれかに定義されるアミノ酸を含むペプチド、または、該アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体の、血液凝固障害および／または血栓溶解系もしくは線維素溶解系の一時的な機能障害の予防または処置のため医薬の調製のための使用。
（項目５）
前記血液凝固障害が血友病Ａまたはフォン・ヴィレブランド病であり、かつ、前記一時的な機能障害が外科的手術の間または外科的手術後に起こる、項目４に記載の使用。
（項目６）
前記抗体が、ＡＦ  ２３４２４７に記載のアミノ酸配列（ＶＨＫＭ３３）、またはＡＦ  ２３４２５８に記載のアミノ酸配列（ＶＬＫＭ４１）から本質的になる、項目１〜５のいずれか１項に記載の使用。
（項目７）
生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の分解を減少させる方法であって、第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的な第ＶＩＩＩ因子活性を持たないものとして配列番号１、２、３または４のいずれかに定義されるペプチド、または該アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体が、該生物学的流体に添加される、方法。
（項目８）
少なくとも１０％まで第ＶＩＩＩ因子の分解を減少させるために十分な量の前記ペプチドまたは前記抗体の量が添加される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記減少が少なくとも２０％である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記減少が少なくとも５０％である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記減少が本質的に１００％である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の半減期を延長させる方法であって、第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的な第ＶＩＩＩ因子活性を持たないものとして配列番号１、２、３または４のいずれかに定義されるペプチド、または該アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体が、該生物学的流体に添加される、方法。
（項目１３）
前記生物学的流体における前記第ＶＩＩＩ因子の半減期が少なくとも２倍延長される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記生物学的流体における前記第ＶＩＩＩ因子の半減期が少なくとも５倍延長される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記生物学的流体における前記第ＶＩＩＩ因子の半減期が少なくとも１０倍に延長される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
生物学的流体において、第ＶＩＩＩ因子とＬＲＰとの相互作用を阻害する方法であって、第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的な第ＶＩＩＩ因子活性を持たないものとして配列番号１、２、３または４のいずれかに定義されるペプチド、または該アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体が、該生物学的流体に添加される、方法。
（項目１７）
第ＶＩＩＩ因子とＬＲＰとの相互作用を少なくとも２０％の阻害程度を達成する量で、前記ペプチドまたは前記抗体が添加される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
相互作用の少なくとも５０％の程度の阻害程度が達成される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記抗体が、配列番号２０および配列番号２２に記載のアミノ酸配列（ＫＭ３３）、または配列番号１６および配列番号１８に記載のアミノ酸配列（ＫＭ４１）を含む、項目７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記抗体が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列（ＫＭ３３）または配列番号２５に記載のアミノ酸配列（ＫＭ４１）から本質的になる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
少なくとも１つのペプチドを含む薬学的組成物であって、該ペプチドは、第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的な第ＶＩＩＩ因子活性を持たないものとして配列番号１、２、３または４のいずれかに定義されるアミノ酸配列を含むか、または該アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体を含み、さらに、生理学的に受容可能な賦形剤、キャリア、希釈剤および／または安定化剤を含む、薬学的組成物。
（項目２２）
前記調製物が凍結乾燥されている、項目２０に記載の薬学的組成物。
（項目２３）
生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の分解を減少し、そして／あるいは第ＶＩＩＩ因子の半減期を延長し、そして／あるいは、ＬＲＰへの第ＶＩＩＩ因子の結合を阻害し、そして／あるいは血液凝固障害および／または血栓溶解系もしくは線維素溶解系の一時的な機能障害の予防または処置ための項目２１または２２に記載の薬学的組成物。
（項目２４）
前記ペプチドまたは前記抗体が項目８〜１１のいずれか１項で定義される第ＶＩＩＩ因子の分解の減少を達成するか、項目１７もしくは１８に記載のいずれか１項で定義されるＬＲＰと第ＶＩＩＩ因子との相互作用の阻害を達成するか、そして／または、項目１３〜１５のいずれか１項で定義される生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の半減期の延長を達成するのに十分な量で含まれる、項目２１または２２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
（項目２５）
前記血液凝固障害が血友病Ａまたはフォン・ヴィレブランド病であって、かつ一時的な機能障害が外科的手術の間、または外科的手術後に起こる、項目２３に記載の調製物。
（項目２６）
さらに第ＶＩＩＩ因子を含む、項目２１〜２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
（項目２７）
前記抗体が配列番号２０および配列番号２２に記載のアミノ酸配列（ＫＭ３３）、または配列番号１６および配列番号１８に記載のアミノ酸配列（ＫＭ４１）を含む、項目２１〜２６のいずれか記載の薬学的組成物。
（項目２８）
前記抗体が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列（ＫＭ３３）または配列番号２５に記載のアミノ酸配列（ＫＭ４１）から本質的になる、項目２７に記載の薬学的組成物。
（項目２９）
血液凝固障害に罹患する患者を処置する方法であって、前記方法が前記患者に項目２１〜２８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目３０）
前記血液凝固障害が血友病Ａまたはフォン・ヴィレブランド病であり、かつ前記一時的な機能障害が外科的手術の間、または外科的手術後に起こる、項目２９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＦＶＩＩＩ軽鎖フラグメントの固定されたＬＲＰへの結合。１６ｆｍｏｌ／ｍｍ２でＣＭ５センサ−チップに固定されたＬＲＰを、以下と共にインキュベートした：Ａ、ＦＶＩＩＩ軽鎖（１５０ｎＭ）（実線）および第Ｘａ因子切断軽鎖（１５０ｎＭ）（点線）。Ｂ、ａ３−Ａ３−Ｃ１フラグメント（１５０ｎＭ）（実線）および単離したＣ２ドメイン（７５０ｎＭ）（点線）。インキュベーションを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中にて２５℃で２分間、２０μｌ／分の流量で行った。分離を、緩衝液でリガンド溶液を置換して開始した。反応は、共鳴単位（ＲＵ）として示し、非特異的な結合（ＬＲＰコーティングしたチャネルと比較して５％未満）について補正する。
【図２】ＦＶＩＩＩ軽鎖の組換えＬＲＰフラグメントへの結合。ＦＶＩＩＩ軽鎖（ＬＣｈ）（２５ｎＭ）を、種々の濃度の組換えＬＲＰクラスターＩＩ（０〜６００ｎＭ）の存在下または非存在下で、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％（ｗ／ｖ）  ＨＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）の５０μｌ容積中にて、３７℃で２時間、固定されたＬＲＰクラスターＩＶと共にインキュベートした。同じ緩衝液で洗浄した後、結合したＦＶＩＩＩ軽鎖を、３７℃で１５分間、ペルオキシダーゼ結合体化抗ＦＶＩＩＩ抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ  １２と共にインキュベートすることによって定量した。残留結合は、競合物質の非存在下での結合の割合として表し、非特異的な結合（ＬＲＰクラスターＩＩを固定化したウェルへの結合と比較して５％未満）について補正する。挿入図、ＦＶＩＩＩ軽鎖の連続希釈物を固定されたＬＲＰクラスターＩＩ（１ｐｍｏｌ／ウェル）と共に、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）の５０μｌ容積中にて、３７℃で２時間インキュベートした。同じ緩衝液で洗浄した後、結合したＦＶＩＩＩ軽鎖を、上記のようにして定量した。データは、３つの実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図３】ＬＲＰクラスターＩＩの固定化されたＦＶａ軽鎖への結合。ＬＲＰクラスターＩＩ（１００ｎＭ）を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中にて、固定化されたＦＶＩＩＩ軽鎖（７１ｆｍｏｌ／ｍｍ２）（Ｉ）または固定化されたＦＶａ軽鎖（７６ｆｍｏｌ／ｍｍ２）（ＩＩ）のいずれかと共に、２０μ／分の流量にて２５℃で２分間インキュベートした。反応を、共鳴単位（ＲＵ）として示し、非特異的結合（コーティングされたチャネルと比較して５％未満）について補正する。
【図４】ＦＶＩＩＩ軽鎖とＬＲＰとの間の相互作用に及ぼすｓｃＦｖ抗体フラグメントの影響。Ａ、ＦＶＩＩＩ軽鎖（ＬＣｈ）（２５ｎＭ）を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）の５０μｌ容積中にて、種々の濃度（０〜１００ｎＭ）のｓｃＦｖ  ＫＭ４１（黒丸）またはｓｃＦｖ  ＫＭ３６（白丸）の存在下で、固定されたＬＲＰクラスターＩＩ（１ｐｍｏｌ／ウェル）と共に３７℃で２時間インキュベートした。同じ緩衝液で洗浄した後、結合したＦＶＩＩＩ軽鎖を、ペルオキシダーゼ結合体化ＦＶＩＩＩ抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ  １２と共に３７℃で１５分間インキュベートすることによって定量した。残留結合は、競合物質の非存在下における結合の割合を表し、非特異的な結合（ＬＲＰクラスターＩＩを固定化したウェルへの結合と比べて５％未満）について補正する。データは、３つの実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。Ｂ，ＦＶＩＩＩ軽鎖（５０ｎＭ）を、図１の説明文に記載されたように、固定されたＬＲＰ（１６ｆｍｏｌ／ｍｍ２）と共にインキュベートした。結合を、ｓｃＦｖ  ＫＭ４１の非存在下（曲線１）または増加した濃度のｓｃＦｖ  ＫＭ４１（２０ｎＭ、６０ｎＭ、３００ｎＭ、５００ｎＭ（それぞれ曲線２〜５））において評価した。複合体は、ＳＰＲ分析の前に、３０分間にわたって形成させた。
【図５】ＦＶＩＩＩ軽鎖とＬＲＰとの間の相互作用に及ぼすｓｃＦｖ  ＫＭ３３の影響。ＦＶＩＩＩ軽鎖（ＬＣｈ）（２５ｎＭ）を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）の５０μｌ容積中にて、種々の濃度（０〜３０ｎＭ）のｓｃＦｖ  ＫＭ３６（白丸）またはｓｃＦｖ  ＫＭ３３（黒丸）の存在下、固定化したＬＲＰクラスターＩＩ（１ｐｍｏｌ／ウェル）と共に３７℃で２時間インキュベートした。同じ緩衝液で洗浄した後、結合したＦＶＩＩＩ軽鎖を、ペルオキシダーゼ結合体化抗ＦＶＩＩＩ抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ  １２と共に３７℃で１５分間インキュベートすることによって定量した。残留結合は、競合物質の非存在下の結合の割合として表し、非特異的結合（クラスターでコーティングしたウェルへの結合と比較して５％未満）について補正する。データは、３つの実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図６】ＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８軽鎖キメラへのＬＲＰクラスターＩＩへの結合。ＣＭ５センサチップ上のＳｃＦｖ  ＥＬ１４（６７ｆｍｏｌ／ｍｍ２）を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）中２０ｆｍｏｌ／ｍｍ２の密度までの組換え野生型ＦＶＩＩＩ軽鎖または組換えＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８キメラのいずれかと共にインキュベートした。ＬＲＰクラスターＩＩ（２５〜１２５ｎＭ）を、ＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８キメラ（白丸）またはインタクトなＦＶＩＩＩ軽鎖（黒丸）をそれぞれ固定化した２つの別々のチャネル、および１つのコントロール（ｓｃＦｖ  ＥＬ１４でコーティングした）チャネルを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中、２５℃、２０μｌ／ｍｏｌの流速で２分間通過させた。結合したＬＲＰクラスターＩＩを２分後の会合量として表す。
【図７】ＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８軽鎖キメラへのｓｃＦｖ  ＫＭ４１の結合。ＣＭ５センサチップのｓｃＦｖ  ＥＬ１４（６７ｆｍｏｌ／ｍｍ２）を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中、２０ｆｍｏｌ／ｍｍ２の密度までの組換え野生型ＦＶＩＩＩ軽鎖または組換えＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８キメラのいずれかと共にインキュベートした。ＳｃＦｖ  ＫＭ４１（４０ｎＭ）を、それぞれインタクトなＦＶＩＩＩ軽鎖（Ｉ）またはＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８キメラ（ＩＩ）を固定化した２つの別々のチャネルを通過させた。反応を、共鳴単位（ＲＵ）として示し、非特異的結合について補正する。
【図８】実施例ＩＩに従って、マウスに、ヒトＦＶＩＩＩ単体、コントロールのｓｃＦｖフラグメント（ＫＭ３８）の存在下でのヒトＦＶＩＩＩ、および、推定ＦＶＩＩＩ−ＬＲＰ相互作用と特異的に干渉するｓｃＦｖフラグメント（ＫＭ３３）の存在下でのヒトＦＶＩＩＩのいずれかで注射した。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つの実施形態は、第ＶＩＩＩ因子由来であるが第ＶＩＩＩ因子のＬＲＰとの相互作用を阻害する任意の実質的な第ＶＩＩＩ因子活性を有さない配列番号１、２、３または４のいずれかで定義されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用に関する。
用語「ペプチド」は、ペプチド結合を介して結合された一連のアミノ酸から成る分子に関する。好ましくは本発明に有用なペプチドは、タンパク質において一般に見出される２０のアミノ酸からなる（例えば、周知の教科書である「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ａ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，第２版、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｃｓｈｅｒｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９７５））を参照のこと）。
【００３２】
本発明に有用なペプチドはまた、第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的に第ＶＩＩＩ因子活性を有さず、改変され、その結果、そのアミノ酸配列が、上記ペプチドの第ＶＩＩＩ因子とＬＲＰタンパク質との間の相互作用を減少する能力を有意に変更しない、１つ以上の欠失、付加、置換および／または変換を含む、配列番号１、２、３または４のいずれかで定義されるアミノ酸配列を含むペプチドの誘導体であり得る。
【００３３】
本発明に有用なペプチドが１つまたはアミノ酸置換を含む場合、前記１つ以上のアミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であることが、好ましい。例えば、置換がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンのような非極性の疎水性アミノ酸において発生する場合、置換されるアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンのような非極性の疎水性アミノ酸の中から選択されることが好ましい。同様に、置換がセリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、システインまたはグリシンのような非荷電極性アミノ酸において発生する場合、置換されるアミノ酸がセリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、システインまたはグリシンのような非荷電極性アミノ酸の中から選択されることが好ましい。置換がリジン、アルギニンまたはヒスチジンのような正に荷電した（塩基性）アミノ酸において発生する場合、置換されるアミノ酸がリジン、アルギニンまたはヒスチジンのような正に荷電した（塩基性）アミノ酸の中から選択されることが好ましい。同様に、置換がアスパラギン酸またはグルタミン酸のような負に荷電した（酸性）アミノ酸において発生する場合、置換されるアミノ酸がアスパラギン酸またはグルタミン酸のような負に荷電した（酸性）アミノ酸の中から選択されることが好ましい。本発明に有用なペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸またはＤ−およびＬ−アミノ酸の混合物からなり得る。
【００３４】
本発明に有用なペプチドはまた、例えば、これらのペプチドの１つ以上のタンデム反復または交互反復のような、配列番号１、２、３または４で定義されるペプチドの任意の重合形態を包含する。
【００３５】
前記のペプチドの特定のアミノ酸の化学改変（特に、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基の化学改変）がまた包含される。この化学改変は、末端アミノ基および／またはカルボキシ基を遮蔽し、インビボもしくはインビトロでの分解に対する上記ペプチドの安定性を増加し得、または、キャリア機能（アルブミンまたは他の血漿タンパク質を含む）、標的化機能もしくはペプチドの溶解性を改変するような機能を有する分子もしくは部分をペプチドに添加する。用語「改変」は、グリコシル残基の付加または除去をさらに包含する。
【００３６】
本発明に有用なペプチドは、標準のペプチド合成技術によって、または、組換えＤＮＡ技術によって、全体または一部が作製され得る。
【００３７】
本発明に有用な１つの特定のペプチドは、配列番号１（Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８）のアミノ酸配列を含む。本発明に有用なさらなる特定のペプチドは、配列番号２（Ｌｙｓ１８０４−Ｌｙｓ１８１８）または配列番号３（Ｔｙｒ１８１５−Ａｌａ１８３４）由来のアミノ酸配列を含む。このように、本発明に有用なさらなるペプチドは、アミノ酸配列Ｌｙｓ１８０４−Ａｌａ１８３４（配列番号４）を含む。
【００３８】
好ましくは、本発明に有用なペプチドは、上記の第ＶＩＩＩ因子活性についてのアッセイの１つで測定された、本発明の前記のペプチドが由来する天然に存在する第ＶＩＩＩ因子分子の対応する第ＶＩＩＩ因子活性と比較して、５．０％未満の第ＶＩＩＩ因子活性を有し、より好ましくは、１．０％未満の第ＶＩＩＩ因子活性を有し、そして最も好ましくは、本質的に活性を有さない。
【００３９】
第ＶＩＩＩ因子活性の評価は、適切なアッセイ手段（特に、サンプルの第ＶＩＩＩ因子活性を決定するために典型的に実施される任意のアッセイ（例えば、ＭｉｋａｅｌｓｓｏｎおよびＯｓｗａｌｄｓｏｎ，Ｓｃａｎ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．３３，７９−８６，１９８４に記載されるような１ステップクロットアッセイ、または、第ＶＩＩＩ因子  ＩＭＭＵＮＯＣＨＲＯＭ（Ｂａｘｔｅｒ）のような色素発色アッセイ））によって実行され得る。
【００４０】
第ＶＩＩＩ因子活性はまた、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換において第ＩＸａ因子のための補因子として作用する第ＶＩＩＩ因子の能力を測定することによって実施され得、色素発色基質が第Ｘ因子について使用される（Ｃｏａｔｅｓｔ第ＶＩＩＩ因子、Ｃｈｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｍｏｅｉｎｄａｌ、Ｓｗｅｄｅｎ）。
【００４１】
本発明のさらなる実施形態は、第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的に第ＶＩＩＩ因子活性を有さず、第ＶＩＩＩ因子とＬＲＰとの相互作用を阻害する、配列番号１、２、３または４のいずれかで定義されたアミノ酸配列を含むペプチド内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体の使用に関する。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（好ましくはモノクローナル抗体）およびそれらのフラグメントまたは領域、ならびに第ＶＩＩＩ因子もしくは本発明に有用なペプチド内の１つ以上のエピトープに特異的に結合することおよび第ＶＩＩＩ因子分子と低密度リポ蛋白受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）との間の相互作用を干渉することが可能であるそれらの誘導体を含むことを意味する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、本発明に有用なペプチドの全てまたは部分をいうことを意味し、このペプチドは、第ＶＩＩＩ因子において見出される全てまたは対応するアミノ酸の一部の１°、２°および／または３°構造を模倣し、第ＶＩＩＩ因子とＬＲＰとの間の相互作用を阻害する抗体によって特異的に認識され得る。エピトープは、ペプチド配列自体（すなわち、ペプチドの１°構造）、種々の三次元の形態におけるペプチド（すなわち、ペプチド配列の２°または３°構造）および／またはこのペプチドのアミノ酸への改変（例えば、糖分子の付加（例えば、グリコシル化ペプチド））を含み得る。作用の任意の特定の論理または生物学的メカニズムに束縛されずに、本発明を実施するのに有用なペプチドが少なくとも２つの異なるエピトープを含むことが可能である。１つのエピトープは、配列番号１（Ｇｌｙ１８１１−Ｌｙｓ１８１８）内に位置する主要なアミノ酸配列のようである。もう一方のエピトープは、前述の主要なエピトープに隣接して位置するアミノ酸配列の組合せから成り得る；すなわち、もう一方のエピトープは、配列番号２（Ｌｙｓ１８０４−Ｌｙｓ１８１８）および／または配列番号３（Ｔｙｒ１８１５−Ａｌａ１８３４）から形成され得る。このエピトープはまた、二次構造または三次構造エピトープであり得、そして、アミノ酸配列Ｌｙｓ１８０４−Ｌｙｓ１８１８およびＴｙｒ１８１５−Ａｌａ１８３４の両方を含み得る。
【００４４】
抗体のフラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖフラグメントを含む。これらのフラグメントは、当該分野で周知の方法（たとえば、パパインのような酵素でタンパク質分解性に切断してＦａｂフラグメントを生成するか、または、ペプシンのような酵素によりＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成するか）を用いて、インタクトな抗体から産生され得る。
【００４５】
１つの好ましい実施形態において、本発明の実施に有用な抗体は、ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。好ましくは、抗体は、実施例において、ＫＭ３３として記載される抗体のアミノ酸配列（ＫＭ３３の重鎖のアミノ酸配列については配列番号２０を、ＫＭ３３の軽鎖のアミノ酸配列については配列番号２２を、そして、ペプチドリンカーによって連結されるＫＭ３３の軽鎖および重鎖を含む融合タンパク質については配列番号２６を参照のこと）、および／または、ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号ＡＦ２３４２４７（ＶＨＫＭ３３）によって提供された抗体のアミノ酸配列、あるいは実施例においてＫＭ４１として記載される抗体のアミノ酸配列（ＫＭ４１の重鎖のアミノ酸配列については配列番号１６、ＫＭ４１の軽鎖のアミノ酸配列については配列番号１８、そして、ペプチドリンカーで結合されるＫＭ４１の軽鎖および重鎖を含む融合タンパク質については配列番号２５を参照のこと）、および／またはＧｅｎＢａｎｋ  登録番号ＡＦ２３４２５８（ＶＬＫＭ４１）によって提供された抗体のアミノ酸配列を含む。
【００４６】
これらおよび他のｓｃＦｖは、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｉｎｋ，Ｅ．Ｎ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９７（４），９６６−９７２（２００１）（本明細書中に参考として援用される）に記載されたようにして産生され得る。
【００４７】
好ましくは本発明に有用な抗体は、第ＶＩＩＩ因子と低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（ＬＲＰ）との間の相互作用を阻害することが可能であり、その結果、この相互作用は、たとえば、所定の供給源由来の第ＶＩＩＩ因子とＬＲＰとの間の相互作用と比較すると、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも９０％または９５％かそれ以上、減少される。
【００４８】
第ＶＩＩＩ因子とＬＲＰとの間の相互作用は、本明細書中に記載されたような表面プラズモン共鳴または固相結合アッセイを用いて決定され得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質」は、「ＬＲＰ」として省略され、これらの用語は、タンパク質の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターファミリーのメンバーである膜糖タンパク質をいうために交換可能に使用される（Ｇｌｉｅｍａｎｎ，Ｊ．ｉｎ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９，９５１−９６４（１９９８）（参考として援用される）を参照のこと）。ヒトＬＲＰは、３１のクラスＡのシステインリッチな反復（ＬＤＬＲＡとして知られている）ドメイン（クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶとして知られている４つのクラスターにおけるＬＲＰ分子において分配される）を含む。クラスターＩＩは、ＣＬ−ＩＩ−１／２（アミノ末端基の側面にある表皮性の成長因子の反復Ｅ４およびＬＤＬＲＡドメインＣ３−Ｃ７にわたる）として知られているドメインを含む。このＣＬ−ＩＩ−１／２ドメインは、第ＶＩＩＩ因子と相互作用する（Ｎｅｅｌｓ、Ｊ．Ｇ．ら、前出を参照のこと）。
【００５０】
本発明はまた、前期ペプチドが第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的に第ＶＩＩＩ因子活性を有さない配列番号１、２、３または４に定義されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのペプチド、または前記アミノ酸配列の中の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体、ならびに生理学的に受容可能な賦形剤、キャリア、希釈剤および／または安定化剤を含む薬学的組成物に関する。
【００５１】
本発明に従う薬学的組成物は、本発明に有用な１つ以上のペプチド、または本発明に有用な１つ以上の抗体またはそれらの誘導体を含み得る。本発明に従う薬学的組成物はまた、さらに、治療活性成分または予防活性成分のうちの１つ以上を含むことができる。１つの実施形態において、薬学的組成物は、本発明に有用な１つ以上のペプチドを含む。別の実施形態において、薬学的組成物は、前記ペプチドに対する本発明に有用な１つ以上の抗体を含む。薬学的組成物が発明に有用な１つ以上の抗体を含む場合、前記薬学的組成物はさらに、第ＶＩＩＩ因子を含み得る。そのような薬学的組成物における第ＶＩＩＩ因子は、あらゆる自然に存在する、合成の、または、組換えの供給源から得られ得る。
【００５２】
本発明に有用なペプチドおよび／または抗体は、薬学的に受容可能なビヒクル（たとえば、１つ以上の賦形剤、キャリア、希釈剤および安定化剤）と組み合わされて、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として処方され得る。適切なキャリアとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：希釈剤またはフィラー、無菌水媒体および種々の無毒性の有機溶剤。このようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液およびヒト血清アルブミン溶液である。リポソームおよび不揮発性油のような非水性ビヒクルがまた使用され得る。ビヒクルまたは凍結乾燥物は等張性（例えば、ＮａＣｌ、スクロース、マンニトール）および安定性（例えば、緩衝液および／または防腐剤）を維持する添加物を含み得る。適切な薬学的に受容可能なビヒクルは、Ａ．ＯｓｏｌによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（この分野における標準教科書）（参考として援用される）に記載されている。これらの組成物は、錠剤、カプセル、粉末、水性懸濁液または溶液、注射剤等の形で処方され得る。
【００５３】
好ましくは本発明に従う薬学的組成物は、凍結乾燥されている。
【００５４】
本発明の方法に基づいた薬学的組成物の投与は、好ましくは、改善が達成されるまで、最大の治療応答を保証する投薬レジメンを用いて実行されるべきである。概して、用量は、使われるペプチドの分子の大きさに依存する。約１５アミノ酸のペプチドについて、静脈内投与のための投薬量は、約０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは１〜５００ｍｇ／ｋｇの間、そして、最も好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｋｇの間で変化し得る。さらに大きなペプチドについては、その用量は、漸増し得る。経口投与のために、用量は、もちろん、適切な投薬がまた、薬物に対する応答に影響を与え得る、患者の身体全体の健康、年齢および他の因子に依存し得ることに留意して、大幅に高いかもしれない。薬物は、所望のレベルで治療効果を維持するために、連続的注入によって、または、約４〜５０時間の定期的な間隔で投与され得る。
【００５５】
本発明に従う薬学的組成物は、１つの成分調製物の形式であり得るか、または、キットにおいて１つ以上の他の成分と組み合わせて存在し得る。
【００５６】
本発明に従う薬学的組成物は、哺乳動物（好ましくはヒト）への投与が意図される。本発明に有用なペプチドが特定の哺乳動物（例えばヒト）への投与が意図される場合、前記ペプチドは、特定の哺乳動物由来であることが好ましい。本発明に有用な抗体が特定の哺乳動物（例えばヒト）への投与が意図される場合、前記抗体は、特定の哺乳動物由来のエピトープを用いて生成されることが好ましい。さらに、ヒトへの投与が意図される本発明に有用な抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であることが好ましい。
【００５７】
本発明に有用なペプチド、本発明に有用な抗体およびこれらの誘導体ならびに前記ペプチド、抗体および誘導体を含む薬学的組成物は、前記ペプチド、抗体おまたはこれらの誘導体が体内の作用部位に到達し得る任意の手段によって被験者に投与され得る。好ましくは発明に従うペプチド、抗体およびこれらの誘導体、ならびに、前記のペプチド、抗体および誘導体を含む薬学的組成物は、非経口（すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内）で投与される。
【００５８】
本発明に従う調製物は、特に血液凝固障害を持つ患者の予防または処置のために、第ＶＩＩＩ因子とＬＲＰとの相互作用を阻害し、第ＶＩＩＩ因子の分解を減少させ、または、第ＶＩＩＩ因子の半減期を延長させる薬剤の投与が必要な全ての被験者を処置するために使われ得る。このような血液凝固障害は、少なくとも部分的に、第ＶＩＩＩ因子の機能障害（例えば遺伝性または先天性の機能障害あるいは後天性の機能障害）によって引き起こされ得る。このような血液凝固障害はまた、第ＩＸ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子またはヴォン・ヴィレブランド因子を含む、凝固経路に関連している他のタンパク質における機能障害（例えば、遺伝性または先天性の機能障害あるいは後天性の機能障害）によって少なくとも部分的に引き起こされ得る。好ましくは、前記血液凝固障害は血友病Ａまたはフォン・ヴィレブランド病である。
【００５９】
このように、本発明はさらに、血液凝固障害の処置のための医薬の調製のための、第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的に第ＶＩＩＩ因子活性を有さない配列番号１、２、３もしくは４のいずれかに定義されるアミノ酸を含むペプチドの使用、または、上記アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体の使用に関する。
【００６０】
好ましい実施形態において、血液凝固障害は、血友病Ａまたはフォン・ヴィレブランド病である。
【００６１】
本発明に従う薬学的調製物はまた、例えば、手術もしくは外科的手術の直前、間、または後に、血栓溶解系または繊維素溶解系の一時的な障害を有する患者の予防または処置のために使われ得る。
【００６２】
本発明はまた、生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の分解を減少させるための、第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的に第ＶＩＩＩ因子活性を持たない配列番号１、２、３または４のいずれかで定義されるアミノ酸配列を含むペプチドの使用または前記アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体の使用に関する。
【００６３】
さらに関連の実施形態において、本発明は、生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の分解を減少させる方法を提供し、ここで、第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的に第ＶＩＩＩ因子活性を持たない配列番号１、２、３または４のいずれかで定義されるペプチドまたは前記アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体が前記生物学的流体に添加される。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「生物学的な流体」は、血液のような哺乳動物から単離された流体、または血漿もしくは血清のようなその画分、ならびに、真核細胞または原核細胞、細胞株または組織の培養物から得られた媒体またはそれらの画分を含む。
【００６５】
好ましくは前記ペプチドまたは前記抗体は、第ＶＩＩＩ因子の分解を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％ならびに最も好ましくは本質的に１００％減少させるのに十分な量で添加される。
【００６６】
本発明はさらに、生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の半減期を延長させるための、第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的に第ＶＩＩＩ因子活性を持たない配列番号１、２、３または４のいずれかで定義されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体の使用および関連する方法に関する。
【００６７】
好ましくは前記ペプチドまたは前記抗体は、生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子の半減期を少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、そして最も好ましくは少なくとも１０倍延長するのに十分な量で添加される。
【００６８】
本発明はさらに、（生物学的流体における第ＶＩＩＩ因子とＬＲＰとの相互作用を阻害するための、）第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的に第ＶＩＩＩ因子活性を持たない配列番号１、２、３または４のいずれかで定義されるペプチドまたは前記アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体の使用に関する。好ましくは、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも５０％の第ＶＩＩＩ因子のＬＲＰとの阻害程度を達成するのに十分な量の前記ペプチドまたは前記抗体が添加される。
【００６９】
本発明は、さらに血液凝固障害に罹患した患者を処置する方法であって、該方法は、第ＶＩＩＩ因子のＬＲＰとの相互作用を阻害するための、第ＶＩＩＩ因子由来であるが、本質的に第ＶＩＩＩ因子活性を持たない配列番号１、２、３または４のいずれかで定義されるペプチドまたは前記アミノ酸配列内の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体の有効量を前記患者に投与する工程を包含する、方法、または、前記ペプチドの１つ以上もしくは前記抗体の１つ以上を含む薬学的組成物に関する。
【００７０】
本発明は、引き続いて記載される実施例に例示されるが、本発明はこれに制限されることを意図しない。
【実施例】
【００７１】
（実施例Ｉ）
材料−ＣＮＢｒ−セファロース４Ｂは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製であった。マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）、細胞培養フラスコ、Ｏｐｔｉｍｅｍ  Ｉ培地、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）製であった。グレースのＩｎｓｅｃｔ培地（ＴＮＭ−ＦＨ）およびＩｎｓｅｃｔ−ＸＰＲＥＳＳ培地は、ＢｉｏＷｈｉｆｔａｋｅｒ  （Ａｌｋｍａａｒ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。
【００７２】
タンパク質−血漿由来のＦＶＩＩＩ軽鎖、およびその第Ｘａ因子切断誘導体を、以前に示されたように調製した（Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，Ｄｏｎａｔｈ，Ｍ．Ｊ．Ｓ．Ｈ．，ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．，およびＭｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，７１５０−７１５５；Ｄｏｎａｔｈ，Ｍ．Ｓ．Ｊ．Ｈ．，Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．，およびＭｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０．３６４８−３６５５；本明細書中に参考として援用される）。抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ  Ａ、ＣＬＢ−ＣＡｇ  １１７およびＣＬＢ−ＣＡｇ  １２が、以前に記載されている（Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．ら、（１９９４），前出；Ｌｅｙｔｅ，Ａ．，Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．，Ｄｉｓｔｅｌ，Ｂ．，Ｅｖｅｒｓ，Ｒ．Ｆ．，ｄｅ  Ｋｅｙｚｅｒ−Ｎｅｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｒｏｅｎｅｎ−ｖａｎ  Ｄｏｏｒｅｎ，Ｍ．Ｍ．，ｄｅ  Ｂｒｕｉｎ，Ｊ．，Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．，ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．，およびＶｅｒｂｅｅｔ，Ｍ．Ｐ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６３，１８７−１９４；本明細書中に参考として援用される）。抗ＦＶａ軽鎖モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＦＶ  ５は、標準のハイブリドーマ技術によって得た。
【００７３】
ＦＶＩＩＩの軽鎖に対するドメイン可変単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖｓ）を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ株ＴＧ  １に発現させ、そして、金属器レートクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、ｓｃＦｖｓ  ＫＭ３６、ＫＭ４１およびＫＭ３３を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００ｍＭ  イミダゾールおよび２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．４）中で溶出したことを除き、以前に記載されるように（３２〜３４）精製した。
【００７４】
ヒトＦＶＩＩＩ領域Ｔｒｐ１７０７−Ａｒｇ１７２１（ＷＤＹＧＭＳＳＰＨＶＬＲＮＲ）（配列番号５）、Ｌｙｓ１８０４−Ｌｙｓ１８１８（ＫＮＦＶＫＰＮＥＴＫＴＹＦＷＫ）（配列番号２）、Ｔｙｒ１８１５−Ａｌａ１８３４（ＹＦＷＫＶＱＨＨＭＡＰＴＫＤＥＦＤＣＫＡ）（配列番号３）、Ｈｉｓ１８２２−Ａｌａ１８３４（ＨＭＡＰＴＫＤＥＦＤＣＫＡ）（配列番号６）、Ｔｈｒ１８９２−Ａｌａ１９０１（ＴＥＮＭＥＲＮＣＲＡ）（配列番号７）、Ｇｌｕ１９０８−Ｈｉｓ１９１９（ＥＤＰＴＦＫＥＮＹＲＦＨ）（配列番号８）、Ｔｈｒ１９６４−Ｌｙｓ１９７２（ＴＶＲＫＫＥＥＹＫ）（配列番号９）、Ｌｙｓ２０４９−Ｇｌｙ２０５７（ＫＬＡＲＬＨＹＳＧ）（配列番号１０）およびＡｓｐ２１０８−Ｇｌｙ２１１７（ＤＧＫＫＷＱＴＹＲＧ）（配列番号１１）を包含する合成ペプチドを、手動の「Ｔ−ｂａｇ」法（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｒ．Ａ．（１９８５）ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，５１３１−５１３５；ＷＯ９６／４１８１６；本明細書中に参考として援用される）によってＦｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）化学によって、または４３０Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｏｓｅｎｄａａｌ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｍｅｄｐｒｏｂｅ  ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用して合成した。
【００７５】
ペプチドは、９５％以上純粋（高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって測定）であり、これらの同一性を質量分析によって裏付けた。精製した胎盤由来のＬＲＰを、記載されたように得た（Ｍｏｅｓｔｒｕｐ，Ｓ．Ｋ．，およびＧｌｉｅｍａｎｎ，Ｊ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１４０１１−１４０１７；本明細書中に参考として援用される）。グルタチオンＳ−トラスフェラーゼ融合レセプター関連タンパク質（ＧＳＴ−ＲＡＰ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＤＨ５αに発現させ、記載されたとおりにグルタチオン−セファロースを用いて精製した（Ｈｅｒｚ，Ｊ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｄ．Ｋ．，Ｈｏ，Ｙ．Ｋ．，およびＢｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２１２３２−２１２３８；本明細書中に参考として援用される）。組換えＬＲＰリガンド結合クラスターＩＩおよびＩＶを発現するＢａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞が以前に記載されている（Ｎｅｅｌｓ、Ｊ．Ｇ．ら、（１９９９）、前出）。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、ＣＬＢ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の製品部門製であった。タンパク質を、標準としてＨＡＳを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｌｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４；本明細書中に参考として援用される）によって定量した。
【００７６】
組換えタンパク質−ＦＶＩＩＩ  Ｂドメイン欠失変異体であるＦＶＩＩＩ−ｄｅｌ（８６８−１５６２）をコードするプラスミドｐＣＬＢ−ＢＰＶｄＢ６９５は以前に記載されており（Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．，Ｄｏｎａｔｈ，Ｍ．Ｊ．Ｓ．Ｈ．，ｖａｎ  Ｌｅｅｎ，Ｒ．Ｗ．，ｄｅ  Ｋｅｙｚｅｒ−Ｎｅｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｍ．，Ｖｅｒｂｅｅｔ，Ｍ．Ｐ．，Ｋｌａａｓｓｅ  Ｂｏｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｅｙｔｅ，Ａ．，およびｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．（１９９３）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８５，１３３−１４２；本明細書中に参考として援用される）、そして、ＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８キメラをコードするプラスミドを構築するためのテンプレートとして用いた。ＦＶＩＩＩ／ＦＶコドン置換を含むＦＶＩＩＩ軽鎖配列由来のオリゴヌクレオチドプライマー（以下の表ＩＩ）を用い、Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ変異誘発法を用いてプラスミドを構築した（Ｔａｏ，Ｂ．Ｙ．，およびＬｅｅ  Ｋ．Ｃ．Ｐ．（１９９４）ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．編），７１−７２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；本明細書中に参考として援用される）。配列決定分析を、プラスミドにおける変異の存在を証明するために、実施した。ＦＶＩＩＩをコードするプラスミドのマウス線維芽（Ｃ１２７）細胞へのトランスフェクションを、以前に記載されたとおりに実施した（Ｍｅｒｔｅｎｓ、Ｋ．ら、（１９９３）、前出）。野生型ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８キメラを発現する安定な細胞株を、５％  ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢおよび０．８μｇ／ｍｌ  デスオキシコール酸を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中の１−Ｉ細胞工場（ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ）に維持した。ＦＶＩＩＩ１を含む培地を１週間に３回回収した。引き続いて、細胞片を除去するためにこの培地を濾過し、中空糸カートリッジ（Ｈｅｍｏｆｉｏｗ  Ｆ５，Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いておおよそ１０倍に濃縮した。ベンズアミジンを、１０ｍＭの最終濃度で加え、濃縮物を−２０℃で保管した。ＦＶＩＩＩを、確立した手順（Ｍｅｒｔｅｎｓ、Ｋ．ら、（１９９３）、前出）に従って、抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ  １１７およびＱ−セファロースクロマトグラフィーを用いる、免疫親和性クロマトグラフィーによって濃縮した培地から精製した。ＦＶＩＩＩ軽鎖を、４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）を含む緩衝液中、ＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８キメラおよび野生型ＦＶＩＩＩを２５℃で４時間インキュベートすることによって調製した。続いて、ＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８軽鎖キメラおよび野生型ＦＶＩＩＩ軽鎖を、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーを用いて精製した。組換タンパク質を、１Ｍ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）を含む緩衝液中で溶出し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）に対して透析し、そして、４℃で保管した��組換えＣ２ドメイン（すなわち、残基Ｓｅｒ２１７３−Ｔｙｒ２３３２）をコードするプラスミドの構築は、以前に記載されている（Ｆｉｊｎｖａｎｄｒａａｔ、Ｋ．、ら、（１９９８）、前出）。ＦＶＩＩＩａ３−Ａ３−Ｃ１フラグメント（すなわち、残基Ｇｌｕ１６４９−Ａｓｎ２１７２）をコードするプラスミドｐＡＣｇｐ６７ｂ−Ｈｉｓ−ａ３−Ａ３−Ｃ１を、ｐＣＬＢ−ＢＰＶｄＢ６９５を鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプライマー、５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴＡＣＴＣ−３’（センス）（配列番号１３）、および５’−ＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＴ−３’（アンチセンス）（配列番号１４）を用いてポリメラーゼ連鎖反応によって構築した（Ｍｅｒｔｅｎｓ、Ｋ．ら、（１９９３）、前出）。増幅されたＤＮＡフラグメントを精製し、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結した。得られた構築物は、配列決定によって証明した。続いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ａ３−Ａ３−Ｃｌを、ＥｓｐＩおよびＮｏｔｌで消化し、そして、得られたフラグメントを精製し、ＥｓｐＩ／ＮｏｔＩで消化したｐＡＣｇｐ６７ｂ−８０Ｋプラスミドに連結した（Ｆｉｊｎｖａｎｄｒａａｔ，Ｋ．，Ｔｕｒｅｎｈｏｕｔ，Ｅ．Ａ．Ｍ．，ｖａｎ  ｄｅｎＢｒｉｎｋ，Ｅ．Ｎ．，ｔｅｎ  Ｃａｔｅ，Ｊ．Ｗ．，ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｍ．，およびＶｏｏｒｂｅｒｇ，Ｊ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ８９，４３７１−４３７７；本明細書中に参考として援用される）。Ｈｉｓ−タグ（５’−ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡ−３’）（配列番号１５）をコードするＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化し、そして、ＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩで消化したｐＡＣｇｐ６７ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１プラスミド中にクローニングした。バキュロ・ウイルス表現系を使って、組換えａ３−Ａ３−Ｃ１およびＣ２フラグメントを、記載されたとおりに昆虫細胞の感染によって得た（Ｆｉｊｎｖａｎｄｒａａｔ、Ｋ．ら（１９９８）、前出）。ａ３−Ａ３−Ｃ１フラグメントを免疫親和性クロマトグラフィーを用いてＩｎｓｅｃｔ−ＸＰＲＥＳＳ培地から精製した（親和性マトリクスとしてＣＮＢｒ−セファロース４Ｂと連結された抗Ａ３ドメイン抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ  Ａを用いる）。ＣＬＢ−ＣＡｇ  Ａ−セファロースを、ａ３−Ａ３−Ｃ１フラグメントを含む培地と共に４℃で１６時間インキュベートした。結合の後、免疫親和性マトリクスを回収して、１Ｍ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）を含む緩衝液で洗浄し、そして、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５５％（ｖ／ｖ）エチレングリコールおよび５０ｍＭリジン（ｐＨ  １１）で溶出した。溶離画分をすぐに、１Ｍ  イミダゾール（ｐＨ  ６．０）で中和し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）に対して透析し、そして、−２０℃で保管した。同様の免疫親和性クロマトグラフィー技術を用いて組換えＣ２ドメインを精製した。但し、抗Ｃ２ドメイン抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ  １１７をＣＬＢ−ＣＡｇ  Ａの代わりに用いた。
【００７７】
第Ｖａ因子軽鎖の精製−ヒト第Ｖ因子（ＦＶ）を、本発明者らの組織（ＣＬＢ、オランダ）によって供給されたヒト血漿から得た。全長ＦＶを、免疫親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。ＦＶａ軽鎖を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）を含む緩衝液中、ＦＶ（１０μＭ）をトロンビン（２μＭ）と共に３７℃で２時間インキュベートすることによって調製した。トロンビンを、ヒルジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって不活化し、そして、抗第Ｖ因子軽鎖モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＦＶ  ５（５ｍｇ／ｍｌ）に結合したＣＬＢｒ−セファロース４Ｂを用いる免疫親和性クロマトグラフィーを用いて、ＦＶａ軽鎖を精製した。免疫親和性マトリックスを、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）で洗浄し、そして、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５５％（ｖ／ｖ）エチレングリコールおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）で溶出した。精製したＦＶａ軽鎖を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）に対して透析し、そして、−２０℃で保管した。
【００７８】
組換え型ＬＲＰフラグメントの発現および精製−組換えＬＲＰクラスターＩＩおよびＩＶを、１単位／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン１００を補充したＯｐｔｉｍｅｍ  Ｉ培地を用いてＢＨＫ細胞中に発現させた（Ｎｅｅｌｓ、Ｊ．Ｇ．ら、（１９９９）、前出）。培地を回収した後、ＣａＣｌ２を、１０ｍＭの最終濃度まで添加した。馴化培地からのＬＲＰクラスターＩＩおよびＩＶの精製は、１つの精製工程によって行った（親和性マトリクスとしてＣＮＢｒ−セファロース４Ｂと連結されたＧＳＴ−ＲＡＰを使って）。このマトリックスを、カラムに回収し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．４）を含む緩衝液で洗浄し、そして、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．４）で溶出した。続いて、精製したＬＲＰクラスター調製物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０コンセントレーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，−ＭＡ）を用いて、４℃、４０００×ｇで１時間の連続回転の遠心分離により濃縮した。最終的に、それらの調製物を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．４）に対して透析し、そして、−４℃で保管した。
【００７９】
固相結合アッセイ−組換えＬＲＰクラスターＩＩまたはＩＶ（１ｐｍｏｌ／ウェル）を、５０μｌの容量の５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ９．８）中のマイクロタイターウェルに、４℃で１６時間吸着させた。ウェルを、２００μｌの容量の２％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）で、３７℃で１時間ブロッキングした。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）で３回急速に洗浄した（各５秒未満）後、ＦＶＩＩＩ軽鎖またはその誘導体を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）を含む５０μｌの容量の緩衝液中にて、３７℃で２時間、種々の濃度でインキュベートした。結合したリガンドを、同じ緩衝液中でペルオキシダーゼ結合体化モノクローナル抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ  １２と共に３７℃で１５分間インキュベートすることによって検出した。抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ  １２は、ＦＶＩＩＩフラグメントのＬＲＰまたはＬＲＰクラスターのフラグメントへの結合をに干渉しなかった（データ示さず）。競合実験において、ＦＶＩＩＩ軽鎖（２５ｎＭ）を、５０μｌの容量の競合物質の限界希釈の存在下または非存在下のいずれかにおいて、固定されたＬＲＰクラスターを含むウェルにて、３７℃で２時間インキュベートした。上で記載されたように、残留ＦＶＩＩＩ結合を検出した。データを、空のマイクロタイターウェル（固定されたＬＲＰクラスターを含むマイクロタイターウェルへの結合と比較して５％未満であった）について補正した。
【００８０】
表面プラズモン共鳴−ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ２０００バイオセンサーシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使って、タンパク質相互作用の動力学を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって決定した。ＬＲＰ（１６ｆｍｏｌ／ｍｍ２）、ＦＶＩＩＩ軽鎖（７１ｆｍｏｌ／ｍｍ２）、ａ３−Ａ３−Ｃｌフラグメント（６７ｆｍｏｌ／ｍｍ２）、ＦＶａ軽鎖（７６ｆｍｏｌ／ｍｍ２）またはｓｃＦｖ  ＥＬ１４（６７ｆｍｏｌ／ｍｍ２）は、製造業者によって指定されたようなアミン結合キットを用いて、第１級アミノ基を介しての活性化されたＣＭ５−センサチップのデキストラン表面に共有結合した。１つのコントロールフローチャネルを、タンパク質の非存在下で、慣例的に活性化し、ブロックした。分析物の会合を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．４）中、２５℃で２０μｌ／分の流速で２分間評価した。同じ緩衝液流中で２分間解離させた。センサチップを、１００ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４または２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．４）のいずれかの中にて、２０μｌ／分の流速で数回のパルスを用いて再生した。会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使うことによって決定した。データを、バルク屈折率変化について較正し、２部位結合モデルに従う非線形回帰分析によって適合した。平衡解離定数（ｋｄ）を、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算した。低親和性の相互作用についてのｋｄ値は、ＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使うことによって定常状態の親和性の分析を用いて見積った。競合実験において、ＦＶＩＩＩ軽鎖（５０ｎＭ）を、競合物質の限界希釈の存在下もしくは非存在下のいずれかにおいて、２０μｌ／分の流速で２分間、固定化されたＬＲＰ（１６ｆｍｏｌ／ｍｍ２）と共にインキュベートした。
【００８１】
ＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８軽鎖キメラのＬＲＰクラスターＩＩへの結合−１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）を含む緩衝液中で、組換えＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８軽鎖キメラまたは組換え野生型ＦＶＩＩＩ軽鎖を、２０ｆｍｏｌ／ｍｍ２の密度まで、固定されたｓｃＦｖ  ＥＬ１４に結合した。ＬＲＰクラスターＩＩ（２５〜１２５ｎＭ）を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．４）中、２０μｌ／分の流速にて、２５℃で２分間、それぞれ、ＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８軽鎖キメラまたは野生型組換えＦＶＩＩＩ軽鎖を固定化した別々のチャネル、および、１つのコントロール（ｓｃＦｖ  ＥＬ１４でコーティングされている）チャネルを通した。
【００８２】
（結果：）
ＬＲＰとＦＶＩＩＩ軽鎖フラグメントとの間の相互作用−単離されたＦＶＩＩＩ  Ｃ２ドメイン（すなわち、残基Ｓｅｒ２１７３−Ｔｙｒ２３３２）は、インタクトなＦＶＩＩＩ軽鎖よりも効果的にＬＲＰに会合しない（Ｌｅｎｔｉｎｇ、Ｐ．Ｊ．、ら、（１９９９）、前出；ＷＯ００／２８０２１、前出）。本研究において、ＦＶＩＩＩ軽鎖の別の部位がＬＲＰ結合に寄与する可能性を探究した。この目的のために、ＳＰＲ分析を用いて、固定化されたＬＲＰとの４つのＦＶＩＩＩ誘導体の相互作用をモニタリングした。これらの誘導体としては、ＦＶＩＩＩ軽鎖、ａ３−Ａ３−Ｃ１部分（すなわち、残基Ｇｌｕ１６４９−Ａｓｎ２１７２）、Ｃ末端Ｃ２ドメインおよびＦＶＩＩＩ軽鎖フラグメント（第Ｘ因子による位置Ａｒｇ１７２１での切断を用いて、Ｎ末端の酸性の領域を欠失している（すなわち、残基Ａｌａ１７２２−Ｔｙｒ２３３２））が挙げられる。
【００８３】
図１において示されたように、全てのＦＶＩＩＩフラグメントは、固定されたＬＲＰとの時間依存的な会合を示し、その後分離した（最も高い反応が最高ＬＲＰ密度で観察されたので、用量依存的であるように思われる（データ示さず））。ＦＶＩＩＩ軽鎖、第Ｘ因子切断軽鎖およびａ３−Ａ３−Ｃ１フラグメントの得られたデータを適切に示すのに、２部位結合モデルを必要とした。このモデルに従う計算された会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、これらのフラグメントについて同じオーダーにあった（以下の表Ｉ）。これは、固定されたＬＲＰとの高い親和性および僅かに低い親和性の相互作用を示す、同等のＫｄ値（すなわちＦＶＩＩＩ軽鎖について１８ｎＭおよび５９ｎＭ、第Ｘ因子切断軽鎖について２２ｎＭおよび６０ｎＭ、ならびにａ３−Ａ３−Ｃ１誘導体について２６ｎＭおよび７４ｎＭを生じる（以下の表Ｉ）。対照的に、単離したＣ２ドメインは、任意の結合モデルによって正確に記載されるにはあまりにも速い解離速度を示した。従って、定常状態の親和性の計算を用いて、このフラグメント（３．４μＭ）の親和性（Ｋｄ）を推測によって見積った。まとめると、これらの結果は、Ａ３−Ｃ１領域（すなわち、残基Ａ１７２２−Ａｓｎ２１７２）に高い親和性ＬＲＰ結合部位が存在し、そしてＣ２ドメインに低い親和性の部位が存在することを示す。
【００８４】
【表１】
2010202664.tif 000002
【００８５】
（表１に対する注意事項：ＦＶＩＩＩ軽鎖およびその誘導体の固定化されたＬＲＰへの結合についての動力学的パラメーター。固定されたＬＲＰ（１６ｆｍｏｌ／ｍｍ２）への、種々の濃度のＦＶＩＩＩ軽鎖（１０〜２５０ｎＭ）、６７ｋＤａフラグメント（１０〜２５０ｎＭ）、ａ３−Ａ３−Ｃ１フラグメント（１０〜２５０ｎＭ）またはＣ２ドメイン（５００〜２０００ｎＭ）の会合および解離を「実験手順」で示されたように評価した。得られたデータを２部位結合モデルを用いて分析して、会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を計算した。各クラスの結合部位を、それぞれ１および２と称する。親和定数（Ｋｄ）は、比率  ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算した。Ｃ２ドメインとＬＲＰとの間の相互作用を、定常親和性分析を用いて評価した。データを、各測定について少なくとも５つの異なる濃度を用いた、３〜６回の測定に基づく。データは、平均±Ｓ．Ｄ．を表す。）
固定されたＬＲＰクラスターＩＩおよびＩＶへのＦＶＩＩＩ軽鎖の結合−以前の研究において、ＬＲＰリガンド結合クラスターＩＩおよびＩＶが、ＶＩＩＩ軽鎖との相互作用を媒介することが示された（Ｎｅｅｌｓ、Ｊ．Ｇ．ら（１９９９）、前出）。本研究において、ＬＲＰクラスターＩＩおよびＩＶがＦＶＩＩＩ軽鎖への結合に競合し得るか否かという問題に取り組むために固相結合アッセイを用いた。図２の挿入図において示したように、ＦＶＩＩＩ軽鎖は、固定されたＬＲＰクラスターＩＩに用量依存性の様式で結合し得た。この観察は、以前の調査結果（ＳＰＩＲ分析を用いて、ＬＲＰクラスターＩＩと固定されたＦＶＩＩＩ軽鎖との間の相互作用をモニタリングした）（Ｎｅｅｌｓ、Ｊ．Ｇ．ら（１９９９）、前出）と一致している。競合研究は、ＬＲＰクラスターＩＩおよびＩＶが、ＦＶＩＩＩ軽鎖への結合に競合することを明らかにした（図２）。ＬＲＰクラスターＩＩは、固定されたＬＲＰに結合するＦＶＩＩＩ軽鎖クラスターＩＶの用量依存性の阻害を示した。これらのデータは、ＬＲＰクラスターＩＩおよびＩＶが、ＦＶＩＩＩ軽鎖内の同様の結合領域を共有することを意味する。
【００８６】
ＬＲＰクラスターＩＩの固定化されたＦＶａ軽鎖への結合−ＦＶＩＩＩとＦＶとの間の公知の相同性（Ｃｈｕｒｃｈ，Ｗ．Ｒ．ら（１９８４）、前出）を考慮すると、ＦＶＩＩＩおよび活性化されたＦＶの軽鎖がＬＲＰクラスターＩＩへの結合特性を共有するか否かという問題が生じ得る。この目的のために、ＬＲＰクラスターＩＩの連続希釈を、固定化されたＦＶＩＩＩ軽鎖およびＦＶａ軽鎖と共にインキュベートした。図３に示すように、ＦＶａおよびＦＶＩＩＩの軽鎖は、ＦＶＩＩＩのみがＬＲＰクラスターＩＩに対して高親和性の結合を示すという点で異なることを証明した。これらの観察は、ＦＶＩＩＩ軽鎖のａ３−Ａ３−Ｃｌドメインは、ＦＶａ軽鎖には保存されてない高親和性のＬＲＰ相互作用領域を含むことを示す。
【００８７】
合成のペプチドの、ＦＶＩＩＩ軽鎖のＬＲＰクラスターＩＩへの結合に及ぼす影響−ａ３−Ａ３−Ｃｌドメインの表面ループを模倣する合成ペプチドのパネルを構築した（ＷＯ  ９６／４１８１６、前出）。ＦＶａ軽鎖がＬＲＰクラスターＩＩと効率的に会合しないという観察を、ＦＶＩＩＩに固有の合成のペプチドの構築のための選択基準として使用した。これらのループの溶媒接触能を、ヒドロパシー分析（Ｌｅｎｔｉｎｇ、Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）、前出）を用いて、および、インタクトなＦＶＩＩＩヘテロ二量体の三次元モデル（Ｓｔｏｉｌｏｖａ−ＭｃＰｈｉｅ，Ｓ．，Ｖｉｌｌｏｕｔｒｅｉｘ，Ｂ．Ｏ．，Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．，Ｋｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋ，Ｇ．，およびＨｏｌｚｅｎｂｕｒｇ，Ａ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９，１２１５−１２２３；本明細書中に参考として援用される）を研究することによって確定した。合成のペプチドは、以下の残基を含んだ：Ｔｒｐ１７０７−Ａｒｇ１７２１、Ｌｙｓ１８０４−Ｌｙｓ１８１８、Ｔｙｒ１８１５−Ａｌａ１８３４、Ｈｉｓ１８２２−Ａｌａ１８３４、Ｔｈｒ１８９２−Ａｌａ１９０１、Ｇｌｕ１９０８−Ｈｉｓ１９１９、Ｔｈｒ９６４−Ｌｙｓ１９７２、Ｌｙｓ２０４９−Ｇｌｙ２０５７およびＡｓｐ２１０８−Ｇｌｙ２１１７（表ＩＩ）。
【００８８】
【表２】
2010202664.tif 000003
【００８９】
（表ＩＩに対する注意事項：合成のペプチド由来のＦＶＩＩＩ  ａ３−Ａ３−Ｃ１フラグメントの、ＦＶＩＩＩ軽鎖とＬＲＰクラスターＩＩとの間の相互作用への影響。ＦＶＩＩＩ軽鎖（２５ｎＭ）を、種々の濃度の合成ペプチド（０〜１ｍＭ）の存在下または非存在下において、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）５０μｌの容量中にて、固定されたＬＲＰクラスターＩＩ（１ｐｍｏｌ／ウェル）と共に３７℃で２時間インキュベートした。同じ緩衝液で洗浄した後、ＦＶＩＩＩ軽鎖を、ペルオキシダーゼ結合体化抗−ＦＶＩＩＩ抗体ＣＬＢ−ＣＡｇ  １２と共に３７℃で１５分間インキュベートする事によって定量した。最大半減阻害定数（ＩＣ５０）は、３回の実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。）
続いて、これらのペプチドを、ＦＶＩＩＩ軽鎖と固定されたＬＲＰクラスターＩＩとの間の相互作用を阻害するそれらの能力について試験した。表ＩＩに示したように、合成ペプチドＬｙｓ１８０４−Ｌｙｓ１８１８（配列番号２）およびＴｙｒ１８１５−Ａｌａ１８３４（配列番号３）は、ＦＶＩＩＩ軽鎖と固定されたＬＲＰクラスターＩＩとの間の相互作用を効率的に阻害した。最大半減阻害（ＩＣ５０）は、各々、約１．９μＭおよび１６．８μＭのペプチド濃度に達した。他の合成ペプチドは、このような阻害効果を示さなかった。これらの観察は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメイン内の配列Ｌｙｓ１８０４−Ａｌａ１８３４が、ＬＲＰとの相互作用に関する重要な残基を含むことを示唆する。
【００９０】
ＳｃＦｖ抗体フラグメントがＬＲＰクラスターＩＩへのＦＶＩＩＩ軽鎖の結合に及ぼす影響−以前に、領域Ｇｌｎ１７７８−Ａｓｐ１８４０内の残基に対する阻害性抗体を持つ患者由来の組換えｓｃＦｖ抗体フラグメントを分離するために、ファージディスプレイを用いた（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ，Ｅ．Ｎ．，Ｔｕｒｅｎｈｏｕｔ，Ｅ．Ａ．Ｍ．，Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎ，Ｎ．，Ｈｅｉｊｎｅｎ，Ｂ．Ｇ．，Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｍ．およびＶｏｏｒｂｅｒｇ，Ｊ（２００１），Ｂｌｏｏｄ  ９７，９６６−９７２；Ｖｏｏｒｂｅｒｇ，Ｊ．，ら、Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；国際特許出願番号ＷＯ  ９９／５８６８０；これらは本明細書中に参考として援用される）。これらのｓｃＦｖｓを、ＦＶＩＩＩ軽鎖とＬＲＰまたはクラスターＩＩとの間の相互作用を阻害するそれらの能力について評価した。第１のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ  ＫＭ３６称される）は、Ｇｌｎ１７７８−Ａｓｐ１８４０内の領域に指向するが、ＦＶＩＩＩへの結合のために残基Ａｒｇ１８０３−Ｌｙｓ１８１８を必要としない（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋら（２００１）、前出；ＷＯ  ９９／５８６８０、前出）。第２のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ  ＫＭ４１として命名された）は、領域Ａｒｇ１８０３−Ｌｙｓ１８１８に指向し、かつＦＶＩＩＩの凝固促進性活性を阻害する（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋら（２００１）、前出；ＷＯ  ９９／５８６８０、前出）。ｓｃＦｖ  ＫＭ４１の重鎖のアミノ酸配列ならびに対応するＤＮＡ塩基配列を配列番号１６に示す。ｓｃＦｖ  ＫＭ４１の軽鎖のアミノ酸配列ならびに対応するＤＮＡ塩基配列を配列番号１８に示す。ＫＭ４１の重鎖および軽鎖は、ペプチドリンカー（配列番号２４）で結合され得、かつ、Ｃ末端にヒスチジンタグを有し得る。発現されたｓｃＦｖ  ＫＭ４１タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２５に示す。第３のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ  ＫＭ３３と称される）は、ｓｃＦｖ  ＫＭ４１と類似している。但し、そのＦＶＩＩＩ軽鎖との相互作用のためにＡ３ドメイン領域１７７８−１８１８を必要としない（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋら（２００１）、前出；ＷＯ  ９９／５８６８０、前出）。ｓｃＦｖ  ＫＭ３３の重鎖のアミノ酸配列ならびに対応するＤＮＡ塩基配列を配列番号２０に示す。ｓｃＦｖ  ＫＭ３３の軽鎖のアミノ酸配列ならびに対応するＤＮＡ塩基配列を配列番号２２に示す。重鎖および軽鎖は、ペプチドリンカー（配列番号２４）で連結され得、かつ、Ｃ末端にヒスチジンタグを有し得る。発現されたｓｃＦｖ  ＫＭ３３タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２６に示す。図４Ａにおいて、ｓｃＦｖ  ＫＭ３６がＦＶＩＩＩ軽鎖と固定されたＬＲＰクラスターＩＩとの間の相互作用に影響を及ぼさなかったことを示した。対照的に、ｓｃＦｖ  ＫＭ４１の存在は、ＦＶＩＩＩ軽鎖のＬＲＰクラスターＩＩへの結合を阻害した（図４Ａ）。ｓｃＦｖ  ＫＭ４１がＦＶＩＩＩ軽鎖とＬＲＰとの間の相互作用に及ぼす影響を、ＳＰＩＲ分析を用いてさらに研究した。図４Ｂに示したように、ＦＶＩＩＩ軽鎖の固定されたＬＲＰへの会合は���ｓｃＦｖ  ＫＭ４１の存在下で効率的に阻害された。図５に示したように、ｓｃＦｖ  ＫＭ３３は、ＦＶＩＩＩ軽鎖の固定されたＬＲＰクラスターＩＩへの結合を用量依存性の様式で効率的に阻害した。見かけ上の阻害定数は、約５ｎＭであったが、これは、同じｓｃＦｖへのＦＶＩＩＩ軽鎖の結合についてのＫｄ値と類似している（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋら（２００１）、前出；ＷＯ  ９９／５８６８０、前出）。これらのデータは、ｓｃＦｖ  ＫＭ３３、ｓｃＦｖ  ＫＭ４１およびＬＲＰがＦＶＩＩＩの軽鎖内の重複する結合部位を共有することを強力に示唆する。
【００９１】
ＦＶＩＩＩ軽鎖配列Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８は、ＬＲＰのための結合部位を含む−合成のペプチドＬｙｓ１８０４−Ｌｙｓ１８１８およびＴｙｒ１８１５−Ａｌａ１８３４は、ＦＶＩＩＩａ−ＦＩＸａ複合体のアセンブリを妨害することによる、ＦＶＩＩＩ凝固促進活性の効果的なインヒビターである（Ｌｅｎｔｉｎｇ、Ｐ．Ｊ．、ら、（１９９６）、前出；ＷＯ  ９６／４１８１６、前出）が、ｓｃＦｖｓ  ＫＭ３３およびＫＭ４１は、ＦＶＩＩＩａ−ＦＩＸａ複合体のアセンブリを妨害することによる、ＦＶＩＩＩ凝固促進活性の効果的なインヒビターである（Ｌｅｎｔｉｎｇ、Ｐ．Ｊ．、ら、（１９９６）、前出；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｉｎｋら、（２００１）、前出；ＷＯ  ９９／５８６８０、前出）。ＦＶＩＩＩ  Ａ３ドメイン残基Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８は、ＦＩＸａとの相互作用に関与する（Ｌｅｎｔｉｎｇ、Ｐ．Ｊ．、ら、（１９９６）、前出；ＷＯ  ９６／４１８１６、前出）ので、この特定のＦＶＩＩＩ軽鎖領域を、ＬＲＰとの相互作用におけるその役割に関して調査した。ＦＶａ軽鎖がＬＲＰクラスターＩＩと相互作用しなかったので、ＦＶの対応する残基（すなわち、残基１７０４ＳＳＹＴＹＶＷＨ１７１１；（配列番号１２））によって残基Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８を交換してＦＶＩＩＩ軽鎖キメラを、構築した。単離したキメラ（ＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８）を、ＳＰＲ分析を用いて野生型組換えＦＶＩＩＩ軽鎖とＬＲＰクラスターＩＩとの会合に関して比較した。図６に示したように。ＬＲＰクラスターＩＩは、野生型のＦＶＩＩＩ軽鎖と比較して固定化したＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８との２〜３倍減少した会合を示した。
【００９２】
次いで、単離したキメラ（ＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８）を、ＳＰＲ分析を用いて、ｓｃＦｖ  ＫＭ４１と相互作用する能力について評価した。図７に示すように、ｓｃＦｖ  ＫＭ４１は、固定化したＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８キメラを認識せず、一方、固定化した野生型の組換えＦＶＩＩＩ軽鎖と容易に反応した。これらの観察は、ＦＶＩＩＩ  Ａ３ドメイン領域Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８が、ｓｃＦｖ  ＫＭ４１に結合するために重要な残基を含むことを示す。これらのデータは、ＦＶＩＩＩ軽鎖領域Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８が、ＬＲＰ−ＦＶＩＩＩ軽鎖複合体のアセンブリに重要な役割を果たすことを示す。
【００９３】
本発明の研究において、ＦＶＩＩＩ軽鎖のＡ３ドメイン領域Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８は、ＬＲＰとの高い親和性の相互作用に寄与することが示される。いくつかの系統の証拠が、この結論を支持する。第１に、合成ペプチドＬｙｓ１８０４−Ｌｙｓ１８１８およびＴｙｒ１８１５−Ａｌａ１８３４由来のＡ３ドメインは、ＦＶＩＩＩ軽鎖とＬＲＰクラスターＩＩとの間の相互作用に影響を及ぼした（表ＩＩ）。第２に、ＦＶＩＩＩ軽鎖キメラ（領域Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８がＦＶの対応する残基と交換される）は、野生型ＦＶＩＩＩ軽鎖と比較してＬＲＰクラスターＩＩとの会合の減少を示した（図６）。第３に、領域Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８に対する組換えｓｃＦｖ抗体フラグメントが、ＦＶＩＩＩ軽鎖のＬＲＰまたはＬＲＰクラスターＩＩフラグメントへの結合を阻害した（図４）。
【００９４】
多くのＬＲＰリガンド（ＲＡＰ、リポタンパク質リパーゼ、およびα２−マクログロブリンが挙げられる）について、リガンド表面の正に荷電した残基がＬＲＰとの相互作用に関与することが確立されている（Ｍｅｉｍａｎ，Ｌ．，Ｃａｏ，Ｚ．Ｆ．，Ｒｅｎｎｋｅ，Ｓ．，Ｐａｚ  Ｍａｒｚｏｌｏ，Ｍ．，Ｗａｒｄｅｌｌ，Ｍ．Ｒ．およびＢｕ，Ｇ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６．２９３３８−２９３４６；Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，Ｆｒｙ，Ｇ．Ｌ．，Ｗａｋｎｉｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｍｕｈｏｎｅｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｐｌａｄｅｔ，Ｍ．Ｗ．，Ｉｖｅｒｉｕｓ，Ｐ．Ｈ．およびＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｄ．Ｋ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４１６８−１４１７５；Ｈｏｗａｒｄ，Ｇ．Ｃ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｍｉｓｒａ，Ｕ．Ｋ．，Ｇａｗｄｉ，Ｇ．，Ｎｅｌｓｅｎ，Ａ．，ＤｅＣａｍｐ，Ｄ．Ｌ．およびＰｉｚｚｏ，Ｓ．Ｖ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１４１０５−１４１１１；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｈｏｌｔｅｔ，Ｔ．Ｌ．，Ｅｔｚｅｒｏｄｔ，Ｍ．，Ｍｏｅｓｔｒｕｐ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｌｉｅｍａｎｎ，Ｊ．，Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．およびＴｈｏｒｇｅｒｓｅｎ，Ｈ．Ｃ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１２９０９−１２９１２；本明細書中に参考として援用される）。興味深いことに、ＦＶＩＩＩ  Ａ３ドメイン領域Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８（すなわち、残基１８１１ＥＴＫＴＹＦＷＫ１８１８（配列番号１））もまた、１８１３位および１８１８位に２つの露出された正に荷電したリジン残基を含む。ＦＶのＡ３ドメイン内の相同体部分（すなわち、残基１７０４ＳＳＹＴＹＶＷＨ１７１１）と比較すると、これらのリジン残基は、ＦＶＩＩＩ  Ａ３ドメインに対して固有であるようである（Ｃｈｕｒｃｈ，Ｗ．Ｒ．ら、（１９８４）、前出）。ＦＶＩＩＩ残基Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８のＦＶの対応する残基への置換は、ＬＲＰクラスターＩＩへの低下した結合を生じた（図６）。これらの結果は、領域Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８内の正に荷電した残基がＬＲＰとの静電的相互作用を媒介することを示唆する。
【００９５】
今日までに、ＬＲＰ−ＦＶＩＩＩ軽鎖複合体のアセンブリに寄与する、ＦＶＩＩＩ軽鎖内の２つのアミノ酸領域が確認されている。本発明の研究において発見されたＡ３ドメイン領域Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８についての役割に加えて、カルボキシ末端のＣ２ドメインもまた、ＬＲＰとの相互作用に寄与することが知られている（Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．、Ｎｅｅｌｓ，Ｊ．Ｇ．、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．Ｍ．、Ｃｌｉｊｓｔｅｒｓ，Ｐ．Ｐ．Ｆ．Ｍ．、Ｍｅｉｊｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｗ．Ｅ．、Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．、ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．、Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．およびｖａｎ  Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ，Ａ．，−Ｊ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２３７３４−２３７３９；Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．ら  Ａ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＬＣ−ａｃｔｉｖｉｔｙ．国際特許出願ＷＯ  ００／２８０２１；本明細書中に参考として援用される）。単離したＣ２ドメインはＬＲＰとの低い親和性の相互作用（Ｋｄ  約３．４μＭ）を示すので、Ａ３ドメインのＬＲＰ相互作用部位は、Ｃ２ドメインのうちの１つよりも優性であるようにみえる（表Ｉ）。これは、単離したＣ２ドメインがＬＲＰとわずかな会合のみを示した過去の研究と一致する（Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９９）、前出；ＷＯ  ００／２８０２１、前出）。さらに、ＦＶＩＩＩ軽鎖のＬＲＰへの結合親和性は、Ｃ２ドメインの欠失に影響されない（表Ｉ）。しかし、抗Ｃ２ドメインモノクローナル抗体（ＥＳＨＨ４）は、ＦＶＩＩＩ軽鎖とＬＲＰとの間の相互作用を完全に阻害することが示された（Ｌｅｎｔｉｎｇ、Ｐ．Ｊ．ら（１９９９）、前出；ＷＯ  ００／２８０２１、前出）。抗体ＥＳＨ４がＬＲＰ結合を阻害するメカニズムは、まだ解明されていない。抗Ｃ２抗体は、そのＦＶＩＩＩ軽鎖との相互作用のために領域Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８を必要としない（Ｓｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｅ．，Ｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｎａｋａｉ，Ｈ．，Ｅａｌｅｓｏｎ，Ｃ．，Ｆｅｌｃｈ，Ｍ．，Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｒ．，Ｒａｊａｌａｋｓｍｉ，Ｋ．Ｊ．，Ｈｏｙｅｒ，Ｌ．Ｗ．およびＳａｅｎｋｏ，Ｅ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８６，１８１１−１８１９；本明細書中に参考として援用される）ので、ＥＳＨ４がＡ３ドメインにおける同様の部位への結合に関してＬＲＰと競合することはなさそうである。従って、阻害に寄与し得るメカニズムのうちの１つは、立体障害を含む。
【００９６】
対照的に、ｓｃＦｖ  ＫＭ４１は、ほんの部分的にＦＶＩＩＩ軽鎖とＬＲＰとの間の相互作用を阻害する（図４）。これは、完全抗体（約１５０ｋＤａ）と比較して、比較的小さいサイズのｓｃＦｖ抗体フラグメント（約３０ｋＤａ）に起因し得る。これらの観察は、領域Ｇｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８に加えて、Ａ３−Ｃ１ドメイン内の他の表面の露出された構造エレメント（すなわち、残基Ａｌａ１７２２−Ａｓｎ２１７２）がＬＲＰ−ＦＶＩＩＩ軽鎖複合体のアセンブリに寄与することを示唆する。これは、ＦＶＩＩＩ／ＦＶ１８１１−１８１８軽鎖キメラが、ＬＲＰクラスターＩＩに対する残基結合を示したという観察の系統にある（図６）。この文脈において、ＦＶＩＩＩ軽鎖のＡ３ドメイン内のＧｌｕ１８１１−Ｌｙｓ１８１８領域が、タンパク質表面に露出されるより大きなセグメントの一部（すなわち、残基Ｇｌｕ１８０４−Ｌｙｓ１８１８）であることを言及すべきである（Ｌｅｎｔｉｎｇ、Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）、前出）。Ｌｙｓ１８１３位およびＬｙｓ１８１８位のリジン残基に加えて、この領域は、Ｌｙｓ１８０４位およびＬｙｓ１８０８位に２つのさらなるＦＶＩＩＩ固有のリジン残基を含み、これは、ＬＲＰとの相互作用において役割を果たし得る。
【００９７】
（実施例ＩＩ）
実験手順：ｖＷＦノックアウトマウス（健全な動物の第ＶＩＩＩ因子と比較して、内因的な第ＶＩＩＩ因子が２０％減少している）を、ヒトの組換え型第ＶＩＩＩ因子（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅＴＭ；２００Ｕ／ｋｇ）および過剰量の組換えｓｃＦｖ（ＫＭ３３）（３ＯｎＭ  対  ３ｎＭ  血漿中の第ＶＩＩＩ因子）で処理した。対照実験において、第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩ因子分子上の提案した追加のＬＲＰ結合部位として異なるドメインに結合する対照ｓｃＦｖフラグメント（ＫＭ３８）を同じ濃度で使用した。任意に付加することなく組換えＦＶＩＩＩの注入を用いて、このモデル系における第ＶＩＩＩ因子のクリアランスをモニタリングした。
【００９８】
注射後の確定時点（１５分、３０分、６０分、１２０分および２４０分）で、血液を心臓穿刺によって回収し、引き続いて血漿を単離し、ショック凍結し、そして、第ＶＩＩＩ因子活性について分析した。各時点にて１０匹のマウスを用い、血漿を３つの濃度（１：２０、１：６０および１：１００）に希薄し、そして、２連で分析した。第ＶＩＩＩ因子レベルは、定量的ＥＬＩＳＡを実施することによって定量した。
【００９９】
結果：第ＶＩＩＩ因子対照群からのデータは、１５分で０．３５Ｕ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子活性を示し、これは、１４％の回復に対応する。３０分で第ＶＩＩＩ因子活性は約０．２Ｕ／ｍＬに減少し、これは、これらのマウスの第ＶＩＩＩ因子活性バックグラウンド（８％の回復に対応する）である。ＦＶＩＩＩ濃度のそれ以上の変化は、次の時点で検出されなかった。データは、このマウス系において、組換え型第ＶＩＩＩ因子が最初の３０分以内に動物循環から除去されることを示す。
【０１００】
ＦＶＩＩＩおよびＬＲＰでブロッキングしたｓｃＦｖフラグメント（ＫＭ３３）で処置したマウス由来の血漿サンプルの分析は、適用の１５分後に、約０．８Ｕ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子が検出され得ることを示した。これは、３０．４％の回復に変換された。第ＶＩＩＩ因子活性レベルは、次の１５分間で０．５Ｕ／ｍＬ（２０％の回復）まで減少し、そして、６０分後に０．３５Ｕ／ｍＬ（１４％の回復）に達した。注射の４時間後、ＦＶＩＩＩ活性レベルは、マウスの第ＶＩＩＩ因子のバックグラウンド活性に達した。ＦＶＩＩＩ対照群と比較して、１５分後および３０分後の循環におけるこの高用量のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩのクリアランスからの非常に良好な保護を示す。
【０１０１】
第２群の動物に、第ＶＩＩＩ因子にＬＲＰとは異なる部位で結合するｓｃＦｖフラグメント（ＫＭ３８）とヒトＦＶＩＩＩとの同時注射を与えた。これらの動物に関して、第ＶＩＩＩ因子の対照群と同様の結果が得られた（図８）。
【０１０２】
ＦＶＩＩＩ−ＬＲＰ相互作用と干渉する抗体フラグメントを用いると、ｖＷＦノックアウトマウスにおけるＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅＴＭの半減期が有意に増加することが可能であった。さらに、マウスのｖＷＦ−ＫＯ系におけるヒトＦＶＩＩＩの回復は、倍以上に増加し得ることが明白に示され得る。
【０１０３】
当業者の範囲内の変更が、本発明の範囲内であると考えられるべきである。特に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般と理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または相当する任意の方法および材料が、本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料をここに記載する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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